(57)【要約】【課題】  単純かつ有効な核酸の固定化方法、この固定化を利用する核酸の検出方法、この方法で使用するための試薬および対応する試薬キットを提供すること。【解決手段】  核酸を捕獲プローブと一緒にハイブリダイズすることによる核酸固定化方法であって、捕獲プローブが形成されたハイブリッドの酵素的伸長および／または酵素的分解に対して保護されることを特徴とする核酸固定化方法、この固定化を利用する核酸の検出方法、この方法で使用するための試薬および対応する試薬キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
Ｐ−Ｚ−Ｂ−Ｅ        (Ｉ)
[式中、
Ｐは、トリホスファート基またはトリホスファートアナログ基であり、
Ｚは、糖または糖アナログ基であり、
Ｂは、核塩基または核塩基アナログ基であり、
Ｅは、エレクトロケミルミネッセンス基である]
で示されるモノヌクレオシド三リン酸。
【請求項２】
構造式Ｉa：
【化１】
2005097316.tif 000013
[式中、
Ｘは、水素またはＯＲ1基であり、
Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基、Ｃ1〜Ｃ6アルキレン基または水素であり、
Ｂは、プリン、デアザプリンまたはピリミジン基であり、
Ａは、スペーサー基であり、
Ｋは、エレクトロケミルミネッセンス性配位錯体である]
で示される請求項１記載のモノヌクレオシド三リン酸ならびにそのアルカリおよびアルカリ土類塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の固定化方法、この固定化を利用する核酸の検出方法、この方法で使用するための試薬および対応する試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を検出する場合、ホモジーニアス(homogeneous)アッセイ法とヘテロジーニアス(heterogeneous)アッセイ法とに区別される。ホモジーニアスアッセイ法では、検出プローブおよび検出されるべき核酸が溶液中でアッセイされ、一方、ヘテロジーニアスアッセイ法では、検出されるべき核酸が固定化される。この固定化は、共有結合を介して核酸を固相に直接結合させるか、または親和性対の一方に核酸を結合させ、この対の残りの方を固相に結合させることによって行われる。
【０００３】
結合は、固相に結合され、かつ、検出されるべき核酸と少なくとも一部相補的であるいわゆる捕獲プローブ(capture probe)に核酸をハイブリダイズさせて該核酸を固定化させることによっても行われうる。捕獲プローブは、いずれかの望ましい手段で固相に結合される。ヘテロジーニアス法の長所は、標識された試薬成分が検出されるべき核酸から容易に分離されうることである。
【０００４】
検出されるべき核酸が捕獲プローブを介して固定化される方法の例は、直接結合を開示している特許文献１および親和性対を介する結合を開示している特許文献２に開示されている。該特許文献に開示されているアッセイ方法の特徴は、検出されるべき核酸の、該検出されるべき核酸とハイブリダイズされうる捕獲プローブとのハイブリダイゼーションである。過剰の検出プローブを除去した後、捕獲プローブの標識化基を介して固相で、形成されたハイブリッドが検出される。
【０００５】
核酸診断薬に標的特異的増幅法を導入すると、他の場合にはめったに生じない核酸を多量に生じる可能性があった。増幅核酸中にジゴキシゲニン標識を取り込ませるこの種の方法は、特許文献３に開示されている。
【特許文献１】ＥＰ−Ａ−０ ０７９ １３９
【特許文献２】ＥＰ−Ａ−０ １９２ １６８
【特許文献３】ＷＯ ９２／０６２１６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、特に単純かつ有効な固定化方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、捕獲プローブが形成されたＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの酵素的伸長および／または酵素的分解に対して保護されることを特徴とする、核酸を捕獲プローブとハイブリダイズさせることによる核酸固定化方法を提供するものである。
【０００８】
本発明は、また、この固定化方法による固定化およびこの目的に好適な試薬を利用する核酸の検出方法を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
捕獲プローブは、他の核酸とハイブリダイズさせることができるか、あるいは、固定化される核酸である。固定化は、核酸を固相に結合させる手段である。これは、直接結合(固相の表面への捕獲プローブの共有結合)であっても、間接結合(イオン性、吸着性、または生物特異的結合)であってもよい。本発明では、好ましい核酸は、生物特異的対の相手で標識され、一方、固定化される核酸である。生物特異的対は、抗原／抗体、ハプテン／抗体、ビタミン／受容体、ホルモン／受容体、および糖／レクチンなどの組合せである。好ましい組合せは、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、またはハプテン／抗体である。かかる標識核酸は、例えば、対応して標識された活性モノヌクレオシド誘導体を使用する化学的オリゴヌクレオチド合成によって、または、対応して標識されたモノヌクレオシド三リン酸の取込みを介する酵素合成によって、または完全に合成された核酸を化学的に修飾することによって製造されうる。
【００１０】
酵素的伸長は、生きている細胞中または活性酵素を含有するかかる細胞から誘導される流体中で生じるプロセスである。該プロセスは、核酸を伸長させるポリメラーゼなどの酵素によって引き起こされる。これらの伸長反応は、特に、対応する酵素を試料に添加して、増幅プロセスを行う場合、核酸の測定を有意に妨害する。
【００１１】
この伸長反応を抑制するために、本発明は、捕獲プローブを伸長に対して保護することを提案する。これは、伸長酵素の３'−または５'−末端への立体的接近を阻害する化学残基を結合させることによって行うことができる。これらの残基は、捕獲プローブの固定化核酸とのハイブリダイゼーションをしばしば阻害するか、または完全に予防するので、伸長が起こるヒドロキシル基を不活性基に置き換えるのが好ましい。
【００１２】
かかる基としては、例えば、水素またはＣ1〜Ｃ3アルキル基が挙げられ、好ましくは、水素である。したがって、それらの末端では、得られた捕獲プローブは、３'−または５'−デオキシリボヌクレオシド残基または２',３'−または２',５'−ジデオキシリボヌクレオシド残基を含有する。捕獲プローブの３'−末端は、保護されるべき好ましい末端である。
【００１３】
酵素的分解は、生物学的試料液における一般的な現象でもある。かかる分解は、ＤＮＡseまたはＲＮＡseなどのエンド−またはエキソヌクレアーゼによって引き起こされる。これは、また、制限酵素も含む。例えば、ＲＮＡが固定化されるべき核酸として使用されるべきである場合、このＲＮＡは、捕獲プローブとしてのＤＮＡおよびＲＮＡからなるハイブリッドが形成されるとすぐに、ＲＮＡｓｅＨによって分解させられる。これは、非修飾ＤＮＡ捕獲プローブによる固定化が非常に無効果であるかまたは不可能であることを意味する。本発明は、捕獲プローブを修飾することによってこれを除外しようとするものであり、その結果、前記酵素は、もはや、捕獲プローブおよび検出されるべき核酸のハイブリッドを基質として認識しなくなった。
【００１４】
例えば２位での、捕獲プローブの糖残基の修飾は、非常に有効であることが証明された。ＲＮＡseＨの存在下でのＲＮＡの固定化についての特に好ましい組合せは、デオキシリボヌクレオチドの２'−ヒドロキシル基がＯ−アルキルまたはＯ−アルキレン基によって置き換えられているものである。特に好ましい組合せは、ＷＯ ９１／１５４９９に開示されている。
【００１５】
驚くべきことに、記載された指標を同時に使用することによって、ＲＮＡ／ＤＮＡ−ハイブリッドの酵素的分解および酵素的伸長に対して有効に核酸を保護することが可能である。修飾は、それらの効果および作用がお互いに負に影響しないように選択される。
【００１６】
捕獲プローブとしては、さらに修飾されていてもよいオリゴまたはポリヌクレオチドが挙げられる。しかしながら、この修飾は、ハイブリダイゼーションが固定化されるべき核酸と塩基対にさせることによって不可能になる可能性を排除しなければならない。
【００１７】
固定捕獲プローブは、固相に結合される核酸である。結合は、共有結合を形成することによって、または、パートナーの一方が捕獲プローブに結合し、他方が固相に結合する生物特異的結合を形成する２つのパートナー(例えば、ハプテン／抗体、ビタミン／レセプター、好ましくは、ビオチン／ストレプトアビジン)を介して生物特異的に行われうる。
【００１８】
固定化されうる捕獲プローブは、固相に結合していないが、前記固定捕獲プローブになりうる核酸である。これを行うためには、固定捕獲プローブは、固相との化学的反応能を有する残基(例えば、光活性化されうる残基)または生物特異的結合のパートナーを含有する。
【００１９】
可能な固相としては、キュベット、微量滴定プレートまたは粒子(例えば、プラスチック被覆磁気ビーズ)が挙げられる。
【００２０】
本発明の核酸固定化を行うためには、捕獲プローブを、固定化されるべき核酸を含有する試料と接触させる。ハイブリダイゼーションは、使用される核酸の長さおよび捕獲プローブに依存する条件下で行われる。当業者は、いくつかの実験で、例えば、融点を測定することによって、これらの条件を決定することができる。しかしながら、一般に、これらの条件は、捕獲プローブと同一の(非修飾の)ヌクレオチド配列を有する核酸に関する条件と異ならない。
【００２１】
使用される捕獲プローブが既に固定化された核酸である場合、捕獲プローブの核酸とのハイブリダイゼーションは、核酸の固定化と同時に起こる。所望により、固相で形成されたハイブリッドを、核酸を含有する液体から分離することができる。次いで、固相結合ハイブリッドを洗浄することができ、所望により、さらなる反応について利用可能である。
【００２２】
捕獲プローブが固定化されうるものである場合、ハイブリッド含有液体を、捕獲プローブ固定化能を有する固相と接触させる。これを行うためには、固相は、捕獲プローブを固定化させるために使用される基の結合相手を含有するのが好ましい。固定捕獲プローブを用いる場合、さらなるプロセシング工程が続く。
【００２３】
固定化されるべき核酸は、望ましい種類および望ましい起源のものであり得る。これらは、天然試料、例えば、体液または培養試料中で生じる核酸であるが、天然試料をプロセシングすることによって得られた試料中で生じる核酸であってもよい。故に、それらは、修飾されていても非修飾であってもよい。修飾は、核酸の配列、長さ、および／または化学構造に関することができる。好ましい場合、核酸は、核酸のコピーまたは試料中に初めから含有されていた核酸配列である。さらにまた、好ましいコピーは、初期核酸の一部のin vitro増殖によって生じる増幅産物である。特に好ましい増幅産物は、初期核酸での核酸の酵素的伸長によって鋳型として形成されるものである。かかるin vitro増幅の例としては、ＰＣＲ、ＬＣＲまたはプロモーター制御増幅が挙げられる。
【００２４】
他の好ましい具体例では、核酸は、検出可能な基を取り込むことによって修飾される。この取込みは、酵素的または化学的反応を介して行われうる。酵素的反応は、それらが前記増幅の間に生じるので特に好ましい。この場合、伸長のために検出可能な修飾モノヌクレオシド三リン酸を使用することが特に好都合であることが証明された。好ましい方法では、次いで、全ての取り込まれていない検出可能な基を分離する。固定化されるべき核酸が検出されうるように修飾される場合、固定化された後、公知の方法で固相で検出することができる。故に、検出工程は、固定化工程に続く。本発明の別の課題は、本発明の固定化工程に次ぐ固定ハイブリッドの検出を使用する核酸検出方法である。特に好ましい方法では、検出可能な基は、固定核酸で測定される。
【００２５】
検出可能な基は、直接または間接的に検出可能な基である。直接検出可能な基としては、例えば、放射性(32Ｐ)基、有色基または蛍光性基または金属原子が挙げられる。間接的に検出可能な基としては、例えば、抗体、抗原、ハプテンまたは酵素または酵素学的に活性な部分酵素などの免疫学的または酵素学的に有効な化合物が挙げられる。それらは、次反応または反応のシーケンスで検出可能である。ハプテンは、それらが一般にポリメラーゼの基質として標識ヌクレオシド三リン酸と一緒に良く供され、ハプテンまたはハプテン化ヌクレオシドに対する標識抗体との次反応が容易に行われうるので特に好ましい。かかるヌクレオシド三リン酸は、例えば、臭素−ヌクレオシド三リン酸またはジゴキシゲニン、ジゴキシン−またはフルオレセイン結合ヌクレオシド三リン酸である。ＥＰ−Ａ−０ ３２４ ４７４に開示されているステロイドおよびその検出は、特に好適であることが証明された。
【００２６】
本発明の方法の第１の具体例では、検出されるべき核酸は、それにハイブリダイズされる検出プローブを介して検出される。この検出プローブは、検出されるべき核酸のセグメントにハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有する。該セグメントは、捕獲プローブがハイブリダイズするものと異なる。結果は、捕獲プローブ、検出されるべき核酸および検出プローブからなる、いわゆるサンドイッチハイブリッドである。これら３つの核酸のハイブリダイゼーション配列は、主に、自由に選択され得る。好ましい方法では、サンドイッチ形成は、実質的に同時に生じる。特に好ましいサンドイッチ試験の具体例では、検出されるべき核酸を含有する試料に捕獲プローブを添加する。次いで、検出されるべき核酸またはその一部を増幅させ、次に、検出プローブの助けによって、ハイブリダイゼーション条件下で形成されたハイブリッドを検出する。捕獲プローブによくあることであるが、酵素的伸長／分解に対して検出プローブを同様に保護すること、および増幅の前または間にそれを添加することも可能である。
【００２７】
好ましい具体例では、検出されるべき核酸は、検出可能な標識ヌクレオチド、特に、モノヌクレオチドを酵素的に取り込みつつ、固相に固定化される捕獲プローブの存在下で増幅される。過剰のモノヌクレオチドの可能な分離後、取り込まれた検出可能なヌクレオチドの量を介して、固相に固定化された核酸を測定する。特に好ましい本発明に係る増幅は、ＥＰ−Ａ−０ ３２９ ８２２に開示されている方法である。本発明方法の特に優れている点は、固定化されるべきＲＮＡ(転写物)が捕獲プローブおよびＲＮＡのハイブリッドによって分解に対して保護されるように捕獲物を修飾することである。
【００２８】
固定化可能な捕獲プローブを使用する場合、本発明は、２つの具体例を有する。第１の具体例では、検出されるべき核酸を固定化可能な捕獲プローブおよび検出可能な標識モノヌクレオチドの存在下で増幅させる。全ての公知の増幅方法を使用することができる。好ましい方法は、サイクルの間に変性させる熱サイクルを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＥＰ−Ｂ−０ ２０１ １８４）である：該増幅反応は、所望の容器中で行うことができる。次いで、反応混合物を、固相に固定化可能な捕獲プローブを固定化させることができる容器に移す。過剰のモノヌクレオシドを分離し、検出されるべき核酸の存在についての指標として固相の標識を使用するのが好ましい。
【００２９】
第２の好ましい具体例では、増幅反応は、すでに、固定化可能な核酸を内壁に結合させることができる容器中で生じる。これは、増幅混合物を別の容器中に移すことは、もはや必要ではないという点で優れている。熱循環的に制御された増幅反応、例えば、ＰＣＲまたはＬＣＲを使用する場合、本発明は、同様のコーティングを有する熱安定容器を使用することを提案する。
【００３０】
該反応容器がすでにハイブリッドを検出するのに好適であることを条件とし、直接標識を使用する場合、該反応は、試薬を添加せずに、増幅の開始から検出の最後まで制御されうる。
【００３１】
現在公知の方法は、増幅法の後に、反応混合物がプローブを添加するための環境に曝露されなければならないという欠点（汚染）を有する。プローブが増幅試薬と一緒に添加される場合、該方法は、好都合には、あまりピペッティング工程を必要とせず、次に、反応容器を増幅および試薬（例えば、捕獲プローブ）の添加後に再度開放してはならない。この特徴は、標識を検出するために試薬の添加を必要としない直接標識を用いる方法について特に好都合である。かかる場合、例えば、エレクトロケミルミネセンス標識の場合、増幅の開始からアナライト依存性シグナルの測定まで試薬を添加しない。しかしながら、試薬の添加は、いつでも可能である。
【００３２】
本発明の他の課題は、修飾されて核酸および相補的核酸のハイブリッドにおける核酸の酵素的分解ならびに酵素的伸長に対して保護される核酸、さらにまた、核酸を固定化させるための捕獲プローブとしてのその使用である。好ましい方法では、これらの核酸は、核塩基(nucleobase)の位置で、特に、相補的核酸に対する水素結合能を有する機能性アミノ基で修飾される。それらは、天然核塩基に関しては修飾されない。
【００３３】
本発明の別の課題は、核酸を伸長させるための酵素を有する第１容器Ａおよび本発明の捕獲プローブを有する第２容器Ｂからなる試薬キットを提供することである。
【００３４】
これまたは他の容器は、好ましくは、核酸の固定化および増幅または検出に必要な全ての他の試薬を含有する。かかる試薬は、バッファー、モノヌクレオシド三リン酸、標識化試薬などである。
【００３５】
特に好ましい容器Ｂは、本発明に従って修飾されている検出可能な検出プローブまたは検出可能なモノヌクレオシド三リン酸を特徴とする。さらにまた、容器Ａは、核酸、特に、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡを分解する酵素を含有することができる。
【００３６】
本発明の課題は、特定のエレクトロケミルミネセンス標識モノヌクレオシド三リン酸を提供することでもある。
【００３７】
エレクトロケミルミネセンス特性を有する基は知られている。それらは、以下、エレクトロケミルミネセンス基Ｅと記す。Ｅの特に好ましいエレクトロケミルミネセンス性成分は、５００g／molを超える原子量、好ましくは、５５０〜２０００g／molを有する配位錯体Ｋである。好ましい金属イオンは、周期表のＶIIｂおよびＶIIIｂ亜族のイオンであり、特に、Ｒu、Ｏs、Ｒeであり、特に好ましくは、ルテニウムである。
【００３８】
配位錯体における金属イオンの好適なリガンドは、特に、ＷＯ ９２／１０２６７またはＥＰ−Ａ−０ ３４０ ６０５に開示されているような有機リガンドまたは基である。
【００３９】
好適な有機リガンドは、窒素、酸素または硫黄などの、対応する金属原子に対して電子供与体として作用する原子を含有する炭化水素である。電子供与体は、金属イオンと錯体形成させるような幾何学的配置に配置されるのが好適である。ルテニウムの場合、ビピリジル残基が好ましいリガンドである。
【００４０】
さらにまた、リガンドの１つを介して、錯体をモノヌクレオシド三リン酸に結合させる。好ましい方法では、配位錯体とヌクレオシド三リン酸の原子との間にスペーサー基Ａを配置させる。スペーサー基は、好ましくは、所望により鎖の側部に結合されるさらなる基を有する、３個、特に、５〜１５個、より特に、４〜１０個の原子からなる原子鎖である。この原子の鎖は、ヘテロ原子、例えば、−Ｏ−(酸素)またはＮＲ2−基(ここで、Ｎは、窒素であり、Ｒ2は、水素またはＣ1〜Ｃ6アルキル基である)によって中断されていてもよい炭化水素鎖を含有するのが好ましい。この原子の鎖は、成分−(ＣＲ32−ＣＲ32−Ｏ)(ここで、Ｒ3は、水素またはＣ1〜Ｃ6アルキル基である)を１回含有するのが好ましい。スペーサー基は、１０００g／mol未満の分子量を有するのが好ましい。
【００４１】
好ましくは、エレクトロケミルミネセンス基Ｅは、モノヌクレオチドの核塩基の原子Ｎに共有結合される。
【００４２】
結合のための好ましい部位は、ピリミジンのＣ５、Ｃ６、Ｃ４またはＮ４およびプリンのＣ８またはＮ６およびデアザプリンのＣ７である。
【００４３】
好ましいモノヌクレオシド三リン酸は、式Ｉ：
Ｐ−Ｚ−Ｂ−Ｅ          (Ｉ)
[式中、
Ｐは、トリホスファート基またはトリホスファートアナログ基であり、
Ｚは、糖または糖アナログ基であり、
Ｂは、核塩基または核塩基アナログ基であり、
Ｅは、エレクトロケミルミネセンス基である]
で示されるモノヌクレオシド三リン酸である。
【００４４】
トリホスファート、糖、および核塩基は、天然モノヌクレオシド三リン酸中に含有される基である。アナログ基は、１個または数個の原子を置き換えることによって得られるこれらの基であり、式Ｉで示される化合物の特性、すなわち、核酸における取込みを実質的に阻害しないこれらの基である。
【００４５】
トリホスファートアナログは、例えば、１個または数個の酸素原子を硫黄原子と置き換えた基である。糖アナログは、環内酸素原子が−ＣＲ42−基(ここで、Ｒ4は、水素またはＣ1〜Ｃ6アルキル基である)によって置き換えられた基である。核塩基アナログは、例えば、デアザプリン、好ましくは、７−デアザプリンである。
【００４６】
好ましいモノヌクレオシド三リン酸は、式Ｉa：
【化１】
2005097316.tif 000002
[式中、
Ｘは、水素またはＯＲ1−基であり、
Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基、Ｃ1〜Ｃ6アルキレン基または水素であり、
Ｂは、プリン、デアザプリンまたはピリミジン基であり、
Ａは、スペーサー基であり、
Ｋは、エレクトロケミルミネセンス性配位錯体である]
で示される化合物またはそのアルカリおよびアルカリ土類塩である。
【００４７】
驚くべきことに、実験によって、前記金属錯体と同じくらい大きな基でさえ、核酸におけるモノヌクレオシド三リン酸の取込みを触媒する酵素による標識化されたモノヌクレオシド三リン酸の取込みを実質的に妨害しないことが判明した。取り込まれた標識モノヌクレオシド三リン酸の量は、エレクトロケミルミネセンスによる標識化された核酸の検出のために充分である。本発明の方法は、エレクトロケミルミネセンスを使用する従来技術方法と比較して非常に高度の感度を示す。
【００４８】
特に驚くべきことに、非常に高い動的測定範囲、すなわち、モノヌクレオシド三リン酸の所定濃度で測定されるべき核酸の最少の定量可能な量に対する最大の定量可能な量の比を示す。この比は、１０7の値を超えることもある。
【００４９】
別の方法で、モノヌクレオシド三リン酸を取り込むことができる。
【００５０】
１つの方法は、検出されるべき核酸にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチド、いわゆるプライマーの伸長である。ポリメラーゼ、好ましくは、ＤＮＡ−ポリメラーゼによって触媒される反応で、核酸のセグメントをプライマーの３'−末端に結合させる。このセグメントは、対応する検出されるべき核酸のセグメントと実質的に相補的である。この反応は、存在する核酸のセグメントを増幅させつつ、形成された伸長生成物を使用して循環的に行うことができる。かかる方法は、ＥＰ−Ａ−０ ２０１ １８４に開示されている。
【００５１】
別の可能性は、複製起源またはプロモーターを含有する核酸の複製または転写である。この場合、核酸は、プライマー伸長なしでモノヌクレオチドだけからなる。実施例は、ＷＯ ９１／０３５７３またはＷＯ ９１／０２８１８から公知である。
【００５２】
取込みの間に、モノヌクレオチドの少なくとも１つのタイプ((d)ＡＴＰ、(d)ＣＴＰ、(d)ＧＴＰ、またはdＴＴＰ／(d)ＵＴＰ)は、反応混合物中で、部分的に、または、完全に、エレクトロケミルミネセンス性モノヌクレオシド三リン酸によって置き換えられる。好ましい方法では、モノヌクレオシド三リン酸の１つのタイプ(例えば、dＵＴＰ)の１０〜５０％が標識アナログ(例えば、ルテニウム錯体標識dＵＴＰ)によって置き換えられる。標識モノヌクレオシド三リン酸の好ましい濃度は、２０〜７０μＭの範囲であり、特に好ましくは、２５〜４０μＭの範囲である。取込み反応の全ての他の条件は、前記文献に開示されているものと実質的に異ならない。
【００５３】
それらの構造に依存して、エレクトロケミルミネセンス標識モノヌクレオシド三リン酸は、種々の方法で生成されうる。
【００５４】
基を核塩基に結合させるべきである場合、天然塩基のアミノ基を、求電子基、例えば、スペーサー基の活性エステル基と反応させうる。
【００５５】
これらのモノヌクレオシド三リン酸と、アミノ基を有するスペーサー基を塩基の一原子ですでに有している反応性エレクトロケミルミネセンス性化合物との反応が、特に好都合であることが証明された。例としては、５位においてアルキルアミノ基で置換されたモノヌクレオシド三リン酸が含有されることが挙げられる[プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,ＵＳＡ)、７８、６６３３−３７(１９９１)]。
【００５６】
反応性基を有するエレクトロケミルミネセンス性化合物は、例えば、イゲン・カンパニー(ＩＧＥＮ company)から購入することができる。アミドは、活性エステルおよびアミンからアミドを慣用的に形成することに適用される条件と同様の条件下で形成される。
【００５７】
以下に、添付図面について説明する。
「図１」は、増幅のためにＰＣＲを使用する本発明の検出方法を示す流れ図である。
「図２」は、増幅のためにＮＡＳＢＡを使用する本発明の検出方法を示す流れ図である。
「図３」は、プローブを用いないＰＣＲ(黒い棒)と比較して、本発明のＨpbadw２１−ＤＮＡ測定(プローブを用いるＰＣＲ)の結果を示すグラフである。
「図４」は、ＮＡＳＢＡ(プローブを用いる：黒い棒)を使用するリステリア(Ｌisteria)測定のための同様のグラフである。
「図５」は、ＮＡＳＢＡを用いる捕獲プローブの存在におけるエレクトロケミルミネセンス性標識を使用するＨＩＶ Ｉ測定の結果を示す。
「図６」は、ジゴキシゲニン標識モノヌクレオシドが転写物に取り込まれるＮＡＳＢＡを使用する核酸の増幅および検出のための反応スキームを示す流れ図である。
「図７」は、Ｒu(bpyr)3−ＡＡ−dＵＴＰの構造を示す。
「図８」は、Ｒu(bpyr)3−ＤＡＤＯＯ−dＵＴＰの構造を示す。
「図９」の(ａ)および(ｂ)は、標識核酸の分子量の差異を示すためのアガロースゲルを用いたクロマトグラムの図面代用写真である。
「図１０」は、ゲルにおけるビオチン標識プローブとのハイブリダゼーションによって取り込まれた種々の量の(bpyr)3−ＡＡ−dＵＴＰまたはＲu(bpyr)3−ＤＡＤＯＯ−dＵＴＰを用いた増幅生成物の検出のためのクロマトグラムの図面代用写真である。
「図１１」は、反応において使用されるルテニウム標識モノヌクレオシドの量に対するシグナルの高さの依存性を示すグラフである。
「図１２」は、ルテニウム標識が取り込まれた場合の核酸の量依存性検出を示す別のグラフである。
「図１３」は、本発明の別の具体例と比較するグラフである。縦縞の棒は、第２容器が捕獲プローブを特異的に結合するのに使用される具体例についての値を示しており、横縞の棒は、増幅および壁結合が単一の容器中で行われる例の値を示す。点を付した棒は、酵素反応の間に発生した溶液の色を検出するために反応混合物を検出容器に移した具体例に関する値を示す。
【００５８】
以下の実施例において、本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００５９】
捕獲プローブの直接および次なる使用を用いるＨＢＶの検出
反応混合物あたり１ng〜１００atgの濃度のＨpbadw２１をポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)(ＥＰ−Ａ−０ ２００ ３６２)についての標的として使用した。ＰＣＲ混合物についての容量は１００μlであった。
混合物は、以下の成分からなっていた：
【００６０】
【表１】
2005097316.tif 000003
【００６１】
１０ Ｘ ＰＣＲバッファー：１００mＭ トリス(Ｔris)／ＨＣl、５００mＭ ＫＣl、１５mＭ ＭgＣl2、１mg／mlゼラチン、pＨ９.０。
プライマー１：オリゴデオキシヌクレオチド、１８mer、d(GGAGTGTGGATTCGCACT)(位置２２６７−２２８４；ＥＭＢＬ、サブタイプadw、配列番号１)。
プライマー２：オリゴデオキシヌクレオチド、１８mer、d(TGAGATCTTCTGCGACGC)(位置２４３６ｃ−２４１９ｃ、ＥＭＢＬ、サブタイプadw、配列番号２)。
Ｈpbadw２１：クローン化されたＨＢＶ−ＤＮＡ；pＵＣＢＭ２０(ベーリンガー・マンハイム)においてクローン化され、直線化されたＨＢＶadw−配列のヌクレオチド２９−２６０６(ＥＭＢＬ)。
ビオチニル化された捕獲プローブ：d(AGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTAT)５'−ビオチニル化(配列番号３)位置２２９０−２３１６；ＥＭＢＬ、サブタイプadw、参考文献：オノ(Ｏno)ら、(１９８３)、ニュークリイック・アシッズ・リサーチ(Ｎucl.Ａcids Ｒes.)１１。
【００６２】
以下のサイクル条件下で、パーキン・エルマー・サーマル・サイクラー(Ｐerkin Ｅlmer Ｔhermal Ｃycler)でＰＣＲ混合物を増幅させる：９３℃で３分間；(９４℃で１分間、５０℃で１分間、７０℃で２分間)×３０；９５℃で５分間、３７℃で５分間。
【００６３】
ビオチン標識プローブは、反応混合物あたり１００ngの濃度であった。ＰＣＲの間に、Ｂio−１６−ddＵＴＰ(ベーリンガー・マンハイム、Ｃat.Ｎo.１４２７,５９８)を用いて、プローブをその３'−末端でブロックした(参考文献：シュミッツ,ゲー・ゲー(Ｓchmitz,Ｇ.Ｇ.)ら、(１９９０)アナリティカル・バイオケミストリー(Ａnal.Ｂiochem.)１９２、２２２)。
【００６４】
検出のためにストレプトアビジン被覆微量滴定プレートを使用した(ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング、ＥＰ−Ａ−０ ２６９ ０９２)。
【００６５】
１．プローブを用いないＰＣＲに次ぐハイブリダイゼーションの検出
増幅工程の後に、ＰＣＲ混合物２０μlにビオチン標識捕獲プローブ４０ngを添加した。この混合物を９５℃まで５分間加熱し、次いで、氷上で冷却し、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、ハイブリダイゼーションバッファー(５０mＭリン酸塩バッファー、７５０mＭ ＮaＣl、７５mＭ クエン酸ナトリウム、０.０５％ＢＳＡ、pＨ６.８)１８０μlを添加し；次いで、この混合物をストレプトアビジン被覆(ＳＡ)微量滴定プレートのウエル中にピペットで移し、３７℃で１時間インキュベートした。該混合物を０.９％ＮaＣlで３回洗浄した後、０.２Ｕ／ml抗ジゴキシゲニン−ＰＯＤ(ベーリンガー・マンハイム)を有するコンジュゲートバッファー(１００mＭ トリスｘＨＣｌ、０.９％ＮaＣl、１％ＢＳＡ、pＨ７.５)２００μlをピペット操作によって添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。再度３回洗浄した後、検出のためにＡＢＴＳR(１.９mmol／l)２００μlを使用し、吸光度をＨg４０５nmで測定した。
【００６６】
２．ＰＣＲの間に直接使用されるプローブを用いるＰＣＲの検出(本発明によって提案された)
捕獲プローブ１００ngの存在下で増幅を行った。
増幅後、ＰＣＲ反応混合物２０μlにハイブリダイゼーションバッファー１８０μlを直接添加し、前記１の記載に従って処理した。
結果を「図３」に示す。
【実施例２】
【００６７】
プローブを直接使用する場合およびしない場合のプロモーター制御増幅(ＮＡＳＢＡ)
使用するアナライトは、反応混合物あたり５０ng〜５fgの濃度の単離した染色体リステリア(Ｌisteria)単核細胞質遺伝子(monocytogene)ＤＮＡ(ＷＯ ９０／０８１９７を参照)であった。ＮＡＳＢＡは、ＥＰ−Ａ−０ ３２９ ８２２に開示されている。
ＮＡＳＢＡは、Ｔ7−ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を使用して、二本鎖アナライトＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変換させる反応の前に行われる(ＰreＮＡＳＢＡ)。これは、通常、シークエナーゼ(ＳequenaseR)を使用することによって行われる。しかしながら、主に、ＤＮＡポリメラーゼが好適である。
【００６８】
【表２】
2005097316.tif 000004
【００６９】
この混合物を９５℃まで５分間加熱し、次いで、氷上で冷却した。
１０mＭジチオトレイトール(ＤＴＴ)に調節し；次いで、１３ Ｕ Ｔ7−ＤＮＡポリメラーゼ(シークエナーゼ(ＳequenaseR)、ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカルズ(Ｕnited Ｓtates Ｂiochemicals)による)を添加した。次いで、該混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、再度、９５℃まで加熱し、再度、氷上で冷却した。
【００７０】
IIＡ ＮＡＳＢＡ増幅：反応工程１
ａ．反応混合物の組成
ＮＡＳＢＡについて使用した容量は、２５μlであった(ＮＡＳＢＡ−Ｍix ２３μl ＋ ＰreＮＡＳＢＡ−Ｍix ２μl、実施例２のパートＩから)。
【００７１】
【表３】
2005097316.tif 000005
【００７２】
１０ ｘ ＮＡＳＢＡバッファー：４００nＭ トリス／ＨＣl、５００mＭ ＫＣl、１２０mＭ ＭgＣl2、pＨ８.５。
プライマー３：
【化２】
2005097316.tif 000006
配列番号４、ＰIII−領域(位置３５−５６)。下線部は、Ｔ7−ＲＮＡ−ポリメラーゼプロモーター配列である。
プライマー４：d(GTAATCATCCGAAACCGCTCA)、配列番号５、ＰIII−領域(位置１９６ｃ−２１６ｃ)。
【００７３】
ＮＡＳＢＡ増幅を、４０℃で１.５〜２時間生じさせた。
【００７４】
ｂ）ハイブリダイゼーション
増幅後、ＮＡＳＢＡ混合物にビオチニル化プローブ２００ngを添加し、９５℃まで５分間加熱し、次いで、氷上で冷却した。次いで、該混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。
【００７５】
プローブ：d(CGTTTTACTTCTTGGACCG)、配列番号６、５'−末端で、ビオチナマイト(biotinamite)(アプライド・バイオシステムズ(Ａpplied Ｂiosystems))でビオチニル化した。ＰIII領域(位置１６２ｃ−１８０ｃ)。
【００７６】
ｃ．微量滴定プレートにおける検出
ハイブリダイゼーション混合物５μlにハイブリダイゼーションバッファー(５０mＭリン酸塩バッファー、７５０mＭ ＮaＣl、７５mＭ クエン酸ナトリウム、０.０５％ＢＳＡ、pＨ６.８)１９５μlを添加した。次いで、該混合物を微量滴定プレートのウエル中にピペットで移し、３７℃でさらに１時間インキュベートした。０.９％ＮaＣl溶液で３回洗浄した後、３７℃で２０分間、コンジュゲートバッファー(１００mＭトリス−ＨＣl、０.９ ＮaＣl、１％ＢＳＡ、pＨ７.５)中、０.２Ｕ／ml抗−ジゴキシゲニン−ＰＯＤ(ベーリンガー・マンハイム)２００μlと一緒にインキュベートし続けた。該混合物を再度３回洗浄し、次いで、ＡＢＴＳR(ベーリンガー・マンハイム)(１.９mmol／l)２００μlを添加し、吸光度をＨg４０５nmで測定した。
【００７７】
IIＢ ＮＡＳＢＡ増幅：反応工程２
ａ．反応混合物の組成
ＮＡＳＢＡ反応混合物の組成は、IIＡで使用したものと一致する。さらに、増幅の間に、捕獲プローブを混合物あたり１４０ngの濃度で直接添加した。
ＮＡＳＢＡ反応の間に、捕獲プローブの直接使用のために、５'−末端でビオチン標識化(アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド(Ａpplied Ｂiosystems Ｉnc.)によるビオチンアミド)し、３'−末端で親水性リンカーでブロックした２'−Ｏ−アリルリボオリゴヌクレオチドを使用した。２'−Ｏ−アリル修飾オリゴヌクレオチドの「ＲＮＡ鎖」は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド中でＲＮＡseＨによって分解されない(参考文献：イノウエ,エイチ(Ｉnoue,Ｈ.)ら(１９８７)ＦＥＢＳ Ｌett.２１５、３２７−３３０)ので、これを捕獲プローブとして使用した。該オリゴヌクレオチドの３'−末端をブロックして、ポリメラーゼ反応の間に非特異的な伸長を回避する。
【００７８】
配列：５'−ビオチン−CGU UUU ACU UCU UGG ACC−G−３'−ブロック(配列番号７)
C＝２'−Ｏ−アリルシチジン
G＝２'−Ｏ−アリルグアノシン
A＝２'−Ｏ−アリルアデノシン
U＝２'＝Ｏ＝アリルウリジン
３'−ブロック：
【化３】
2005097316.tif 000007
【００７９】
ファルマシア(Ｐharmacia)によるオリゴヌクレオチド合成器(ジーン・アセンブラー(Ｇene Ａssembler))を使用して、イリバレン(Ｉribarren)ら(参考文献：イリバレン,エイ・エム(Ｉribarren,Ａ.Ｍ.)ら(１９９０)ＰＮＡＳ８７、７７４７−７７５１)によるプロトコールに従って、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ(Ｂoehringer Ｍannheim Ｂiochemicals)による２'−Ｏ−アリルヌクレオシドホスホラスアミダイトを用いて、この捕獲プローブを合成した。
【００８０】
ｂ）ハイブリダイゼーション
適用しない。
【００８１】
ｃ）ＭＴＰ検出
この方法は、ＮＡＳＢＡ混合物５mlを用いてＩcのために使用した方法と同一であった。
結果を「図４」に示す。
【実施例３】
【００８２】
ＮＡＳＢＡを使用するＨＩＶ−１の検出
以下の実施例では、ＮＡＳＢＡ増幅系(ＥＰ−Ａ−０ ３２９ ８２２)の助けによってＨＩＶ−１を検出した。ビオチン標識捕獲プローブの存在下でＮＡＳＢＡを行った。取り込まれた標識(ルテニウム標識ＵＴＰ)を介して、増幅生成物を直接検出した。
【００８３】
この試験は、ＡＩＤＳまたはＡＲＣ(ＡＩＤＳ症候群)に罹っている患者のＨＩＶ陽性血清を網羅した。マニアティス(Ｍaniatis)ら[モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Ｍolecular Ｃloning: Ａ laboratory manual)(コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ(Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌab.)、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、１９４−１９５、１９８２)]に従って、グアニジナム・ホット・フェノール法(Ｇuanidinum Ｈot Ｐhenol Ｍethod)の後に、ＲＮＡを単離し、ＲＮＡ溶液のアリコット１０μlを−７０℃で貯蔵した。ＮＡＳＢＡ反応の前に、ＲＮＡ溶液を１：１０、１：１００、１：１０００、１：１００００に希釈し、ＮＡＳＢＡ反応に各２μlを使用した。
【００８４】
ＮＡＳＢＡ反応および反応混合物の組成については、実施例２ IIｂに言及されており、digＵＴＰの代わりに３０μＭルテニウム標識ＵＴＰ(＝Ｒu(bpyr)3−ＡＡ−ＵＴＰ)を使用した(合成の詳細については、実施例４を参照)。
【００８５】
使用したプライマーおよびプローブ：
ＯＴ１８８：
【化４】
2005097316.tif 000008
Ｐ１(配列番号８)
ＯＴ４２：  ACAGGAGCAGATGATACAGTATTAG
Ｐ２(配列番号９)
ＯＴ１５：  ５'−Ｂio−UGGAAGAAAUCUGUUGACUCAGAUUGGUUGC−ブロック−３'
試料(配列番号１０)
【００８６】
配列ＯＴ１８８の下線部は、Ｔ7−ＲＮＡ−ポリメラーゼプロモーターと一致する。
【００８７】
オリゴヌクレオチドＯＴ１５は、その３'−末端で２'−Ｏ−アリルリボオリゴヌクレオチドに対してブロックされ(実施例２ IIＢを参照)、その５'−末端でビオチニル化されている。
参考文献：キエヴィッツ,ティ(Ｋievits,Ｔ.)ら(１９９１)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・メソッズ(Ｊ.of Ｖiol.Ｍethods)２７３−２８６。
【００８８】
増幅生成物の検出
反応後、ＮＡＳＢＡ反応混合物５μlにリン酸塩バッファー(６２mＭ リン酸ナトリウム、０.９４Ｍ ＮaＣl、９４mＭ クエン酸ナトリウム、pＨ７)２０μl中の磁気ビーズ(ダイナビーズ(ＤynabeadsR) Ｍ−２８０、ストレプトアビジン、ダイナル(Ｄynal))１０μg(２×１０6ビーズ)を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、磁石を使用して試料カップの底にビーズを集めた。毎回リン酸塩バッファー１００μlを用いて２回洗浄した。次いで、ビーズを該リン酸バッファー１００μlに懸濁させ、ＥＣＬアッセイバッファー(０.２Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、０.０５Ｍ ＮaＣl、０.１Ｍトリプロピルアミン、pＨ７.５；参考文献：ジェイ・ケイ・リランド(Ｊ.Ｋ.Ｌeland)ら(１９９０)、ジャーナル・オブ・エレクトロケミカル・ソサイエティ(Ｊ.Ｅlectrochem.Ｓoc.)、１３７：３１２７−３３)２５０μlを添加した。９４０Ｖの光電子増倍管電圧を用いてＥＣＬアナライザー(オリゲン(Ｏrigen)１.０；イゲン・インコーポレイテッド(Ｉgen Ｉnc.)によって製造された)で測定を行った。測定時間は、２Ｖ／秒のランプで２秒間であった。各試料についての全測定サイクルは、２分であった。
結果を「図５」に示す。
【実施例４】
【００８９】
Ｒu(bpyr)3-ＡＡ−ＵＴＰの合成
オリゲン(ＯrigenR)標識(イゲン・インコーポレイテッド)＝[４−(Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピル)−４'−メチル−２,２'−ビピリジン−ビス(２,２'−ビピリジン)]−ルテニウム(II)−ジヘキサフルオロホスファート
ＡＡ−ＵＴＰ＝５−(３−アミノアリル)−ウリジン三リン酸は、ランガー(Ｌanger)ら[プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,ＵＳＡ)、７８、６６３３−３７、１９８１]に従って製造した。
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
【００９０】
ＡＡ−ＵＴＰ(リチウム塩)５.５mg(０.０１mmol)を０.１Ｍホウ酸ナトリウムバッファー(pＨ８.５)２mlに溶解させた。これは、ＤＭＳＯ １.５mlにオリゲン(ＯrigenR)標識１５.８mg(０.０１５mmol)の溶液を添加し、室温で一晩撹拌して行った。次いで、イオン交換クロマトグラフィー(セファデックス(Ｓephadex)ＤＥＡ、Ｃl型；勾配液：０〜０.４Ｍ ＬiＣl)によって、Ｒu(bpyr)3−ＡＡ−ＵＴＰ生成物を精製した。収量：７mg(理論値の４６％)。
【実施例５】
【００９１】
Ｒu(bpyr)3−ＡＡ−dＵＴＰおよびＲu(bpyr)3−ＤＡＤＯＯ−dＵＴＰの合成
ランガー(Ｌanger)ら(１９８１)プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,ＵＳＡ)、７８：６６３３−３７に従って、５−(３−アミノアリル)−dＵＴＰ(＝ＡＡdＵＴＰ)を製造した；５−水銀−dＵＴＰをＮ−アリル−Ｎ'−(８−アミノ−３,５−ジオキサ−オクチル)尿素と反応させることによって、ＤＡＤＯＯ−dＵＴＰを得た。
【００９２】
Ｒu(bpyr)3−ＡＡ−dＵＴＰ(「図７」)の合成
０.１Ｍホウ酸ナトリウムバッファーにＡＡdＵＴＰ ３.２mgを溶解させ、オリゲン(ＯrigenR)標識５.６mgのＤＭＳＯ ５６０μl中溶液と一緒にＲＴで一晩撹拌した。
該反応をＴＬＣおよびペーパー電気泳動を介して制御し、次いで、イオン交換クロマトグラフィーによって、生成物を精製した。
収量：３.８mg(理論値の４８％)。
[Ｍ＋Ｈ]+：１１８０.１
【００９３】
Ｒu(bpyr)3−ＤＡＤＯＯ−ｄＵＴＰ(「図８」)の合成
ａ．Ｎ−アリル−Ｎ'−(８−アミノ−３,５−ジオキサオクチル)尿素の合成
ジアミノジオキサオクタン(メルク(Ｍerck))１５g(０.１mol)をジイソプロピルエーテル５００ml中で−４０℃に冷却した。アリルイソシアナート(フルカ(Ｆluka))５.５g(０.０６mol)をゆっくりと滴下した。−４０℃で３０分間撹拌した後、該混合物をＲＴにし、蒸留によってジイソプロピルエーテルを除去した。残留物を酢酸エステル６００mlと一緒に１時間撹拌し、沈殿物を濾過によって取り出し、酢酸エステルで３回洗浄した。合わせた酢酸エステルフラクションを濃縮し、得られた生成物を、９：１〜８：２の酢酸エステル／メタノール溶媒勾配液を用いてフラッシュクロマトグラフィーに付して精製した。
収量：４.５g(理論値の２９％)、無色の液体。
【００９４】
ｂ．５−水銀−dＵＴＰとの反応
ベルグストローム(Ｂergstrom)ら(１９７７)、Ｊ.Ｃarbohydr.Ｎucleosides,Ｎucleotides、４：２５７に従って、５−水銀−dＵＴＰ(＝ＨgdＵＴＰ)を製造した。
酢酸ナトリウムバッファー(pＨ５)２０mlにＨgdＵＴＰ ３７０mg(０.５４mmol)およびＫ2ＰdＣl4 １１３mgを溶解させた。次いで、Ｎ−アリル−Ｎ'−(８−アミノ−３,５−ジオキサオクチル)尿素０.５g(２.１６mmol)を滴下し、ＲＴで一晩撹拌した。濾過によって沈殿物を除去し、濾液を濃縮し、０〜０.３Ｍ ＬiＣlのバッファー勾配液を用いてイオン交換クロマトグラフィー(ＤＥＡＥ−セファデックス−ＣＬ−型)によって精製した。次いで、生成物をアセトン／エタノール(２：１)から２回沈殿させ、該沈殿物を濾過によって取り出し、洗浄し、次いで、乾燥させた。ＤＡＤＯＯ−dＵＴＰ ６０mg(理論値の１５.７％)を得た。
【００９５】
ｃ．ＤＡＤＯＯ−dＵＴＰをオリゲン(ＯrigenR)標識と反応させることによって、Ｒu(bpyr)3−ＡＡ−dＵＴＰについての記載に従って、合成を行った。
【実施例６】
【００９６】
ＰＣＲ増幅およびＲu(bpyr)3−ＡＡ−dＵＴＰおよびＲu(bpyr)3−ＤＡＤＯＯ−dＵＴＰによるＨＢＶ−ＤＮＡの標識
Ｈpbadw２１ １ngを増幅させた；ＰＣＲ反応混合物の容量は、１００μlであった(ＰＣＲ Ｍix ８０μl、試料２０μl)。
【００９７】
ＰＣＲ Ｍixは、以下の組成を有した：
【００９８】
【表４】
2005097316.tif 000009
【００９９】
１０ ｘ ＰＣＲ−バッファー：１００mＭ トリス／ＨＣl、５００mＭ ＫＣl、１５mＭ ＭgＣl2、１００mg／mlゼラチン、pＨ９.０
プライマー１：オリゴデオキシヌクレオチド、１８mer、
d(GGAGTGTGGATTCGCACT)配列番号１、
(位置２２６７−２２８４；ＥＭＢＬ、サブタイプadw)
プライマー２：オリゴデオキシヌクレオチド、１８mer、
d(TGAGATCTTCTGCGACGC)配列番号２、
(位置２４３６Ｃ−２４１９Ｃ；ＥＭＢＬ；サブタイプadw)
Ｈpbadw２１： pＵＣ ＢＭ２０(ベーリンガー・マンハイム)中でクローン化され、直線化されたadw２１
【０１００】
９４℃で６０秒、５０℃で６０秒、および７０℃で１２０秒を３０サイクル用いて、パーキン・エルマー・サーマル・サイクラー(Ｐerkin Ｅlmer Ｔhermal Ｃycler)において、ＰＣＲ反応混合物を増幅させた。
Ｒu(bpyr)3−ＡＡ−dＵＴＰおよびＲu(bpyr)3−ＤＡＤＯＯ−dＵＴＰ濃度を、６６μＭ、３０μＭ、１０μＭ、１μＭおよび０.１μＭ〜０.０１μＭで変化させ、増幅混合物中の合計Ｒu(bpyr)3−dＵＴＰ／dＴＴＰ濃度２００μＭを有するようにdＴＴＰ濃度を増加させた。
【０１０１】
比較するために、種々の濃度のジゴキシゲニン−１１−dＵＴＰ(ベーリンガー・マンハイム、Ｃat.Ｎo.１０３９ ０８８)を取り込んだ同一のＰＣＲ反応混合物を試験し、修飾ヌクレオチドを取り込んでいないＰＣＲ反応混合物も試験した。
【０１０２】
【表５】
2005097316.tif 000010
【０１０３】
【表６】
2005097316.tif 000011
【０１０４】
【表７】
2005097316.tif 000012
【０１０５】
１％アガロースゲル上に種々のＰＣＲ反応混合物を各１０μl適用し、臭化エチジウムによって、増幅生成物を肉眼で見ることができるようにした(「図９」)。そのより高い分子量のために、取り込まれたＲu(bpyr)3−ＤＡＤＯＯ−dＵＴＰ(＝長いスペーサー)を有する増幅生成物は、ゲル上で、Ｒu(bpyr)3−ＡＡ−dＵＴＰ生成物(＝短いスペーサー)よりも遅い。しかしながら、これは、より高濃度の修飾ヌクレオチドが存在し、かくして、増幅反応の間に、対応して多量の標識が取り込まれる場合にだけ生じる。結果は、非修飾生成物と比較して分子量が増加する。
【実施例７】
【０１０６】
ビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブとのフィルターハイブリダイゼーション
ビオチニル化捕獲プローブ：
ビオチナミダイト(アプライド・バイオシステムズ(Ａpplied Ｂiosystems))でビオチニル化されたd(AGA CCA CCA AAT GCC CCT AT)配列番号１１は、ＨＢＶadw−配列の位置２２９７−２３１６と一致する；ＥＭＢＬ配列データバンク。参考文献：オノ(Ｏno)ら(１９８３)、ヌークリイック・アシッズ・リサーチ(Ｎucl.Ａcids Ｒes.)、１１：１７４７−１７５７。
【０１０７】
１％アガロースゲル上に、ＰＣＲ反応混合物１〜６、１／１〜６／１および１／３〜２／３ １０μlを適用し、次いで、ナイロン膜上にブロットし、シー・エイチ・ケスラー(ＣＨ.Ｋessler)ら(１９８０)「ノン−レイディオオクティブ・ラベリング・アンド・ディテクション・オブ・ヌークリイック・アシッズ」(Ｎon-radioactive labelling and detection of nucleic acids)、Ｂio.Ｃhem.Ｈoppe−Ｓeyler、３７１：９１７−９２７に従って、前記ビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブ１００ngと一緒に４５℃で一晩ハイブリダイズさせた。ストレプトアビジンおよびアルカリホスファターゼ(ベーリンガー・マンハイム、Ｃat.Ｎo.１０９３ ２６６)、ＮＢＴ／Ｘ−ホスファート(ベーリンガー・マンハイム、Ｃat.Ｎo.１３８３ ２１３および７６０ ９８６)からなるコンジュゲートを用いて、ビオチンを検出した。「図１０」に示すとおり、所望の増幅生成物は、増幅生成物に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーションによって全てのＰＣＲ反応混合物において検出される。
【実施例８】
【０１０８】
ハイブリダイゼーションおよび検出
８.１  ２段アッセイ
混合物１、４および６ならびに１／１、４／１および６／１ １０μlを０.０５Ｍ ＮaＯＨで１：１０に希釈した。５分後、この混合物１００μlを、既に濃度９４ng／mlのビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブを含有しているハイブリダイゼーションバッファー(６２.５mＭリン酸ナトリウム、０.９４Ｍ ＮaＣl、９４mＭクエン酸ナトリウム、pＨ＝６.５)４００μlで中和した。同時に、ＰＣＲ反応混合物１、４および６ならびに１／１、４／１および６／１を１００℃まで加熱し、次いで、氷上で冷却することによって熱変性に付した。３７℃で１時間、ハイブリダイズさせた後、ストレプトアビジン被覆磁気粒子(ダイナビーズ(ＤynabeadsR)Ｍ−２８０、ストレプトアビジン、ダイナル(Ｄynal))のハイブリダイゼーションバッファー(濃度６００μg／ml)中懸濁液５０μlを添加し、３７℃でさらに１時間インキュベートした。次いで、磁石を用いて、磁気ビーズを試料カップの底に集め、上澄み液をデカントし、ビーズを、再度、毎回リン酸塩バッファー(５０mＭリン酸ナトリウムバッファー、pＨ７.４)５００μlで２回洗浄した。最後に、ビーズをリン酸塩バッファー２００μl中に懸濁させ、次いで、ＥＣＬアッセイバッファー５００μlを添加し(ブラックバーン(Ｂlackburn)ら(１９９１)、Ｃlin.Ｃhem.３７：１５３４−１５３９を参照)、次いで、ＥＣＬアナライザー(オリゲン(ＯrigenR)１.０、イゲン(ＩＧＥＮ)、アメリカ合衆国ロックヴィル)上で測定した。
【０１０９】
９４０Ｖの光電子増倍管電圧で測定を行った。測定時間は、２Ｖ／秒のランプ圧で２秒であった。各試料についての完全な測定サイクルは、２分であった。
【０１１０】
８.２  １段アッセイ
この第２の、より簡単なアッセイ法では、ＰＣＲ反応混合物の変性およびビオチニル化捕獲プローブとのハイブリダイゼーションは、２段階アッセイについて前記したとおり行った。３７℃で２時間のハイブリダイゼーション後、この溶液中にさらなる磁気ビーズ５０μlをピペットで移し、次いで、「結合／遊離」の分離なしでＥＣＬアナライザーで直接測定した。測定したブランクは、ハイブリダイゼーションブッファー中のＲu(bpyr)3−ＡＡ−dＵＴＰの対応する濃度であった。
光電子倍増管の電圧は、８００Ｖであり、他のすべての測定条件は、前記条件と同じであった。
「図１１」に、増幅混合物中の種々の濃度のＲu(bpyr)3−ＡＡ−dＵＴＰおよびＲu(bpyr)3−ＤＡＤＯＯ−dＵＴＰに依存して測定されたＥＬＣピーク度を示す。
【実施例９】
【０１１１】
ＨＢＶプラスミド−ＤＮＡの検出
標的は、Ｈpbadw ２１に対してであった。以下の濃度：１ng、１pg、１００fg、１fg、２００agを用いた。ＰＣＲにおいて最終濃度１０μＭ Ｒu(bpyr)3−ＡＡ−dＵＴＰ／１９０μl dＴＴＰを使用した後、および３０μＭ Ｒu(bpyr)3−ＡＡ−dＵＴＰ／１７０μl dＴＴＰを使用した後、実施例２の条件に従って、増幅を行った。ビオチニル化捕獲プローブ(配列番号３)とハイブリダイズさせ、「結合／遊離」分離せずに「一段アッセイ」に従ってＳＡ磁気ビーズに結合させた後、該増幅生成物をオリゲン(ＯrigenR)１.０アナライザーで測定した。使用した光電子倍増管電圧は、９００Ｖであり、他のすべての条件は、４.２項に記載した条件と同じであった。
「図１２」に、種々の標的濃度に依存して測定されたＥＬＣピーク度を示す。
【実施例１０】
【０１１２】
熱安定性ＳＡで被覆した微量滴定プレートにおけるthreＰＣＲの間に間接的にプローブを使用するＨＢＶの検出
実施例１の記載に従って、ＰＣＲ混合物を調製した。しかしながら、混合物の体積を５０μlに減少させ、シグマ(Ｓigma)鉱油(シグマ・ミネラル・オイル(Ｓigma Ｍineral Ｏil)、淡白色油Ｍ−３５１６)３０μlで覆った。プライマー、ビオチニル化捕獲プローブIIおよび鋳型ならびに使用濃度は、同一であった。当該工程を開始する前に、熱安定性ストレプトアビジン(ＳＡ)で被覆したテクネプレート(Ｔechne plate)(Ｃat.Ｎo.１４０８００)においてＰＣＲを行った。増幅のために、ＭＷ−２ Ｔechne−Ｃyclerを使用した。サイクル条件は、実施例１において使用した条件と同一であった。ＰＣＲ後、該混合物を３７℃で３０分間放置した。次いで、３回洗浄し(実施例1を参照)、プレートを、各ウエルについてコンジュゲートバッファー(実施例１を参照)１００μlと一緒にインキュベートした。次いで、３回洗浄し、次に、ＡＢＴＳR溶液(実施例１を参照)１００mlと反応させた。測定した吸光度を「図１３」に示す。右側(ＳＡ−ＭＴＰ ＰＣＲ)の棒は、種々の濃度についての吸光度を示す。
【実施例１１】
【０１１３】
熱安定性ＳＡで被覆した微量滴定プレートにおけるthreＰＣＲの間に間接的にプローブを使用するＨＢＶの検出
ＰＣＲ Ｃycler９６００について使用した容器は、０.５ml容のパーキン・エルマー(Ｐerkin Ｅlmer)カップ(Ｃat.Ｎo.：Ｎ８０１.０５３７)であった。ＥＰ−Ｂ−０ ３３１ １２７に従って、カップの内側を熱安定性ストレプトアビジンで被覆した。実施例１０と同様に、反応混合物を調製した。しかしながら、反応混合物の容量は、１００μlであり、ＰＣＲは、油で覆わなかった。該カップにコンジュゲートバッファーおよびＡＢＴＳRを２００μl／カップ添加した。ＡＢＴＳRと一緒に１５分間インキュベートした後、該混合物をヌンクプレート(Ｎunc plate)(Ｃat.Ｎo.：８３８７１３)中に移し、測定器で測定した。測定した吸光度を「図１３」に示す(中央の棒)。
【実施例１２】
【０１１４】
熱安定性ストレプトアビジンでのテクネプレートおよびＥＰ−カップの被覆
ＥＰ−Ｂ−０ ３３１ １２７に従って被覆を行った。
【０１１５】
本発明の核酸固定化方法を使用すると、簡単で有効な固定化を行うことができた。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】増幅のためにＰＣＲを使用する本発明の検出方法を示す流れ図。
【図２】増幅のためにＮＡＳＢＡを使用する本発明の検出方法を示す流れ図。
【図３】プローブを用いないＰＣＲ(黒い棒)と比較して本発明のＨｐｂａｄｗ２１−ＤＮＡ測定(プローブを用いるＰＣＲ)の結果を示すグラフ。
【図４】ＮＡＳＢＡ(プローブを用いる：黒い棒)を使用するリステリア(Ｌisteria)測定の結果を示すグラフ。
【図５】ＮＡＳＢＡを用いる捕獲プローブの存在におけるエレクトロケミルミネセンス標識を使用するＨＩＶ Ｉ測定の結果を示すグラフ。
【図６】ジゴキシゲニン標識モノヌクレオシドが転写物に取り込まれるＮＡＳＢＡを使用する核酸の増幅および検出のための反応スキームを示す流れ図。
【図７】Ｒu(ｂｐｙｒ)3−ＡＡ−ｄＵＴＰの構造式を示す図。
【図８】Ｒu(ｂｐｙｒ)3−ＤＡＤＯＯ−ｄＵＴＰの構造式を示す図。
【図９】(ａ)および(ｂ)は、標識核酸の分子量の差異を示すためのアガロースゲルを用いたクロマトグラムの図面代用写真。
【図１０】ゲルにおけるビオチン標識プローブとのハイブリダゼーションによって取り込まれた種々の量の(ｂｐｙｒ)3−ＡＡ−ｄＵＴＰまたはＲu(ｂｐｙｒ)3−ＤＡＤＯＯ−ｄＵＴＰを用いた増幅生成物の検出のためのクロマトグラムの図面代用写真。
【図１１】反応において使用されるルテニウム標識モノヌクレオシドの量に対するシグナルの高さの依存性を示すグラフ。
【図１２】ルテニウム標識が取り込まれた場合の核酸の量依存性検出を示すグラフ。
【図１３】本発明の別の具体例と比較するグラフ。
【配列表フリーテキスト】
【０１１７】
配列番号１：Synthetic DNA；配列番号２：Synthetic DNA；配列番号３：Synthetic DNA；配列番号４：Synthetic DNA；配列番号５：Synthetic DNA；配列番号６：Synthetic DNA；配列番号７：Synthetic DNA；配列番号８：Synthetic DNA；配列番号９：Synthetic DNA；配列番号１０：Synthetic DNA；配列番号１１：Synthetic DNA
【図１】
2005097316.tif 000014
【図２】
2005097316.tif 000015
【図３】
2005097316.tif 000016
【図４】
2005097316.tif 000017
【図５】
2005097316.tif 000018
【図６】
2005097316.tif 000019
【図７】
2005097316.tif 000020
【図８】
2005097316.tif 000021
【図９】
2005097316.tif 000022
【図１０】
2005097316.tif 000023
【図１１】
2005097316.tif 000024
【図１２】
2005097316.tif 000025
【図１３】
2005097316.tif 000026
【配列表】
2005097316000001.app