(57)【要約】【課題】  植物の遺伝子変異株の選抜を簡易に行うための培地の提供および該培地を用いた植物の遺伝子変異株の選抜方法の提供。【解決手段】  植物の変異株を選抜するための固体培地であって、培地中に変異株を選抜するための物質の濃度勾配を形成させた変異株選抜固体培地ならびに該変異株選抜培地を用いて植物の変異株を選抜する方法であって、変異株選抜培地中の変異株を選抜するための物質を含まない部分に変異原で処理した植物を置床または播種し、濃度勾配に沿って植物組織を生育伸長させることを含む、植物組織の生育伸長の程度により植物が前記物質に感受性であるかまたは耐性であるかを判定し、植物の変異株を選抜する方法。【選抜図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の変異株を選抜するための固体培地であって、培地中に変異株を選抜するための物質の濃度勾配を形成させた変異株選抜固体培地。
【請求項２】
植物を置床または播種する部位からの距離に対応して、培地中の変異株を選抜するための物質の濃度が徐々に濃くなる濃度勾配をつけた請求項１記載の変異株選抜固体培地。
【請求項３】
植物の変異株を選抜するための物質を含む固体培地と該物質を含まない固体培地が、固体培地の一端では該物質を含む培地のみが存在し、他端では該物質を含まない培地のみが存在するように、斜めに重層されている、請求項１または２に記載の変異株選抜固体培地。
【請求項４】
植物の変異株を選抜するための培地中に変異株を選抜するための物質の濃度勾配を形成させた変異株選抜固体培地を作製する方法であって、培養用容器を傾けた状態で、該容器内に植物変異株を選抜するための物質を含む培地または該物質を含まない培地を添加し固まらせ、次いで培養用容器を水平状態で、該容器内に植物変異株を選抜するための物質を含まない培地または該物質を含む培地を添加し、重層させることを含む、変異株選抜固体培地を作製する方法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項に記載の変異株選抜培地を用いて植物の変異株を選抜する方法であって、変異株選抜培地中の変異株を選抜するための物質を含まない部分に変異原で処理した植物を置床または播種し、濃度勾配に沿って植物組織を生育伸長させることを含む、植物組織の生育伸長の程度により植物が前記物質に感受性であるかまたは耐性であるかを判定し植物の変異株を選抜する方法。
【請求項６】
植物がシロイヌナズナであり、変異株を選抜するための物質が金属または抗生物質である、請求項５記載の変異株を選抜する方法。
【請求項７】
変異株を選抜するための物質がカドミウムまたはカナマイシンである、請求項６記載の変異株を選抜する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、シロイヌナズナ等の植物の遺伝子変異株の選抜を行うための生育培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来からのEMS（エチルメタンスルホネート）を変異原として用いたシロイヌナズナの変異株の選抜に用いる培地は一般的には図2に示すようなシャーレ上のものである。この培地中には変異株を選抜するための目的の物質が均一な濃度で混合されており、シロイヌナズナの生育状況を目的物質を含有しない対象区のものと比較することによって、前記目的物質に耐性または感受性の性質を持つ変異株を選抜していた（非特許文献１参照）。
【０００３】
【非特許文献１】Arabidopsis(Heyerowitz, E. M. and Somerville, C. R. ed.) コールド・スプリング ハーバー ラボラトリープレス(1994 年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、以上の従来技術によれば、候補変異株の培養とは別個に対象区の植物の培養を必要とすること、平面培地であるため生育している植物の根の生育状況を容易に見られない、培地中の物質の濃度が1種類しか設定できないなどの不都合があった。
【０００５】
そこで、この発明はこのシロイヌナズナ等の植物の遺伝子変異株の選抜を簡易に行える方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記の問題点を解決するために、培地に変異株を選抜するための物質の濃度勾配をつけて変異原で処理した植物を培養した。該物質が非存在の培地部分から該物質濃度が高くなる培地部分に向かって植物の根等の組織が伸長するように培養することにより、それぞれの植物個体の前記物質に対する感受性に応じて培地中で該物質の濃度に応じて植物の組織の伸長度が異なり、該伸長度により個々の植物の前記物質に対する感受性を判定できることを見出し本発明を完成させるに至った。すなわち、従来一般的に用いられていた深さの小さい円形シャーレではなく植物の組織が伸長するに十分な深さのある容器、例えば、直方体状の角型シャーレに植物の組織が伸長する方向に前記目的物質の濃度勾配を形成させ、該勾配を有する培地上で植物を培養し、植物の組織の伸長度を判定することにより、前記物質の濃度が大きい部分まで組織が伸長した植物個体は前記物質に対して感受性が低い、すなわち耐性であると判定できる、本発明の方法を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
[１]  植物の変異株を選抜するための固体培地であって、培地中に変異株を選抜するための物質の濃度勾配を形成させた変異株選抜固体培地、
[２]  植物を置床または播種する部位からの距離に対応して、培地中の変異株を選抜するための物質の濃度が徐々に濃くなる濃度勾配をつけた[１]の変異株選抜固体培地、
[３]  植物の変異株を選抜するための物質を含む固体培地と該物質を含まない固体培地が、固体培地の一端では該物質を含む培地のみが存在し、他端では該物質を含まない培地のみが存在するように、斜めに重層されている、[１]または[２]の変異株選抜固体培地、
[４]  植物の変異株を選抜するための培地中に変異株を選抜するための物質の濃度勾配を形成させた変異株選抜固体培地を作製する方法であって、培養用容器を傾けた状態で、該容器内に植物変異株を選抜するための物質を含む培地または該物質を含まない培地を添加し固まらせ、次いで培養用容器を水平状態で、該容器内に植物変異株を選抜するための物質を含まない培地または該物質を含む培地を添加し、重層させることを含む、変異株選抜固体培地を作製する方法、
[５]  [１]から[３]のいずれかの変異株選抜培地を用いて植物の変異株を選抜する方法であって、変異株選抜培地中の変異株を選抜するための物質を含まない部分に変異原で処理した植物を置床または播種し、濃度勾配に沿って植物組織を生育伸長させることを含む、植物組織の生育伸長の程度により植物が前記物質に感受性であるかまたは耐性であるかを判定し、植物の変異株を選抜する方法、
[６]  植物がシロイヌナズナであり、変異株を選抜するための物質が金属または抗生物質である、[５]の変異株を選抜する方法、ならびに
[７]  変異株を選抜するための物質がカドミウムまたはカナマイシンである、[６]の変異株を選抜する方法。
【発明の効果】
【０００８】
この発明によれば培地中に生育する植物の根等の組織の伸長度によって、その植物体が目的とする物質に対して耐性または感受性を持つのかを簡易に選抜することができる。本発明の方法では、従来の選抜方法で必須であった、対象区の栽培を必要とせず、また平面培地のように植物の組織の伸長度の観察の困難性はなく、さらに濃度勾配を形成させた培地を用いるので、濃度を変えた複数の培養容器を用いた栽培を行う必要もなく、容易に所望の植物を選抜することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
この発明の一実施形態を、図１に示す。この選抜培地は角型シャーレに作成し、目的の化合物の濃度が徐々に濃くなるような勾配がつけられている。この選抜培地を用いて植物の変異株の選抜を行う。
【００１０】
変異原処理した植物の組織を濃度勾配選抜培地の上（図1の播種エリア）に置床または播種し、培地を垂直に立てて、生育させることで、植物組織の伸長度を指標に植物各個体の目的物質に対する耐性の強弱が容易に判断できるようになる。
【００１１】
本発明の方法で選抜する植物の種類は限定されず、シロイヌナズナ、イネ等種々の植物を用いることができる。本発明で「培養」とは植物の部分を生育させることをいい、植物の部分は、限定されず、完全個体でもよいし、葉、茎、根、成長点、種子、胚、花粉等の組織、カルス等の組織培養物であってもよい。また、挿し木、挿し穂等の植物の栄養生殖体でもよい。本発明における「植物の培養」とは「植物の栽培」をも包含する。
【００１２】
本発明の方法で変異株を選抜するための物質も限定されず、植物の生育に影響を与えることが知られている物質あるいは予測されるあらゆる物質が含まれる。例えば、カドミウム等の金属、塩化ナトリウム等の塩類等、カナマイシン等の抗生物質等が挙げられる。本発明の方法によりこれらの物質に感受性または耐性を有する変異株を選抜することができる。
【００１３】
本発明で培養する植物は、あらかじめ変異原で処理して変異を誘発し、変異株の中から所望の耐性または感受性を有する植物を選抜するが、用いる変異原は限定されず、広く突然変異の誘発に用いられている化学的変異原、物理的変異原を用いることができる。化学的突然変異源として、例えばメタンスルホン酸エチル(EMS)、エチルニトロソ尿素(ENS)、2-アミノプリン、5-ブロモウラシル(5-BU)、アルキル化剤などが用いることができる。また、物理的変異原としては、放射線、紫外線等を用いることができる。これらの変異原を用いた変異の誘発は公知の方法で行うことができる。
【００１４】
培地は、一般的に植物の組織培養や栽培で用いられている公知の培地を基本培地として用い、適宜アミノ酸、糖類、植物ホルモン、塩類、必須金属等を捕足すればよい。基本培地として、例えばMurashige & Skoogの培地（ＭＳ培地）等が挙げられる。また、本発明の方法においては、固体培地が用いられ、寒天、アガロース、ジェランガムといった固化剤を添加する。これらの、固化剤の添加量も一般的な固体培地を調製する際に用いられる量である。
【００１５】
培養しようとする植物の組織および培養に用いる培地は、滅菌しておくのが好ましい。滅菌は公知の方法で行うことができる。
【００１６】
用いる培養用容器は、変異株を選抜するための物質の濃度勾配を形成させることができ、植物の組織が十分伸張できる大きさがあり、外部から植物の生育状態を観察しうる容器ならば限定されない。例えば、植物の根等の組織が十分伸長できる深さのある容器、例えば直方体の角型シャーレを用いることができる。また、培養しようとする植物個体の数や大きさに応じて適宜容器の大きさを選択すればよい。
【００１７】
変異株を選抜するための物質の濃度勾配が形成された選抜培地の調製方法は限定されないが、例えば以下に示す方法で行うことができる。図１に示す培地を作成するためには変異株の選抜を目指す、変異株を選抜するための物質を含む培地を斜めに傾けた角型シャーレに添加し、固める（図１の横から見た図における白い部分の培地の調製）。次に変異株の選抜を目指す、変異株を選抜するための物質を含まない培地を上に添加する（図１の横から見た図における黒い部分の培地の調製）ことによって目的とする物質において濃度勾配が形成された選抜用培地が完成する。これとは逆に、変異株の選抜を目指す、変異株を選抜するための物質を含まない培地を先に添加し、固めた後に変異株の選抜を目指す、変異株を選抜するための物質を含む培地を添加してもよい。
【００１８】
この際、培養用容器の勾配を形成させる辺の長さを変化させたり、変異株を選抜するための物質を含まない培地を調製するときの容器の傾きの角度を変えることにより、濃度勾配の大きさを変えることができる。選抜する植物の種類、変異株を選抜するための物質に応じて適宜勾配の大きさを設定すればよい。例えば、培養用容器の勾配を形成させる辺を長くすることにより、緩やかな濃度勾配を形成させることができ、変異株を選抜するための物質を含まない培地を調製するときの容器の傾きの角度を大きくすることにより、急峻な濃度勾配を形成させることができる。この方法により、図１に示すように、培養容器中の培地は、変異株を選抜するための物質を含む培地部分と、変異株を選抜するための物質を含まない培地部分に分けられ、変異株を選抜するための物質を含む培地から含まない培地に該物質が徐々に移動し、全体として濃度勾配が形成される。
【００１９】
また、培地を容器に充填するときに変異株を選抜するための物質を含む培地と含まない培地を変異株を選抜するための物質濃度が徐々に小さくなるように混合しながら、充填することによっても濃度勾配を形成させることができる。この方法により濃度勾配を形成させる場合、変異株を選抜するための物質を含む培地中の該物質の濃度または混合するときの該物質を含む培地と含まない培地の混合比を変えることにより該物質の濃度勾配の大きさを適宜設定することができる。
【００２０】
このようにして、変異株を選抜するための物質の濃度勾配を形成させた培地で直物を選抜培養する際には、変異株を選抜するための物質を含まない培地部分に植物を置床または播種し、植物を生育させる。植物を置床または播種した培地部分には、変異株を選抜するための物質が含まれていないため、植物は該物質の影響を受けることなく生育伸張する。植物が生育伸張するにつれ、変異株を選抜するための物質の濃度が大きくなるため、植物の生育は影響を受ける。該物質に感受性である植物株は生育が阻害され伸長が止まり、該物質に耐性である植物株は、生育が阻害されることなく伸張を続ける。感受性が大きい植物ほど、早く伸張が止まり、耐性が大きい植物ほど伸張が続く。最終的に植物の伸張度により、植物株が変異株を選抜するための物質に対して感受性であるか、耐性であるかを判定することが可能である。
【００２１】
上記のように、変異株を選抜するための目的物質に対して耐性を示す変異体のスクリーニングが簡便となり、スクリーニングに要する時間及び労力の大幅な軽減につながる。
【実施例】
【００２２】
植物体にとって有害な重金属であるカドミウムに耐性を持つシロイヌナズナの変異株の選抜を本発明による技術を用いて行った。
【００２３】
培地の調製は、以下のようにして行った。培養容器としては、144×104×16mmの角型シャーレを用いた。基本培地としては2%のショ糖を含む1/2MS培地を用いた。
【００２４】
カドミウム含有培地は該基本培地に、カドミウムを100μMの濃度で添加した。濃度勾配培地の調製はまずはカドミウムを含む培地35mlを上記容器に添加し、約2.5度傾けて約30分間静置し、培地を固まらせた。次いで、基本培地を50ｍｌ添加し、約30分間静置し、固まらせた。
【００２５】
選抜に用いたシロイヌナズナの種子はEMS（メタスルホン酸エチル）により変異を誘発した種子をLEHLE SEEDS社より購入した。
この変異を誘発したシロイヌナズナの種子を培地1枚あたり13個、合計で約6,400個播種し、上記のように作製した培地を用いて植物を栽培した。
【００２６】
植物は温度23℃、光強度8,000 lux、明期16時間、暗期8時間の条件で人工気象器内で14日間生育させ、根の伸張が良好な植物を選抜した。
この結果、約6,400個の変異原処理を行った種子からの生育させた植物体より目指す変異株の選抜を行うことができた。
【００２７】
一般にシロイヌナズナの変異株の選抜には約20,000から60,000個の変異原処理した種子を用いる場合が多く、本発明の技術を用いることによりその数を大幅に抑えることができた。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】培地中に変異株を選抜するための物質の濃度勾配を形成させた変異株選抜固体培地を示す図である。
【図２】従来用いられた培地を示す図である。
【符号の説明】
【００２９】
１  角型シャーレ
２  植物の変異株を選抜するための物質を含まない培地
３  植物の変異株を選抜するための物質を含む培地
【図１】
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【図２】
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