(57)【要約】【課題】環境ホルモン作用が疑われているビスフェノールＡを分解する微生物を提供すること。【解決手段】ビスフェノールＡを強力に且つ広いｐＨ範囲で分解するアガリクス属菌、その培養物、その培養濾液及びその培養上清を提供する。また、これらのアガリクス属菌の培養物、培養濾液又は培養上清を用いてビスフェノールＡを効率的に分解する方法を提供する。本発明の方法に好適に使用できるアガリクス属菌としては、アガリクス・アルヴェンシス、アガリクス・ビスポルス、アガリクス・カンペストリスなどが挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アガリクス属に属する真菌を用いてビスフェノールＡ（ＢＰＡ）を分解する方法。
【請求項２】
アガリクス属に属する真菌がアガリクス・アルヴェンシス、アガリクス・ビスポルス、アガリクス・カンペストリスから成る群から選択される種に属する株である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
アガリクス属に属する真菌がこの菌を培養して得られる培養液である、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
アガリクス属に属する真菌が、この菌を培養して得られる培養液を濾過して得られる培養濾液である、請求項１〜請求項３いずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
アガリクス属に属する真菌が、この菌を培養して得られる培養液又は培養濾液を遠心分離して得られる培養上清である、請求項１〜請求項４いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＢＰＡを分解する方法が、ＢＰＡの水溶液とアガリクス属菌を接触させる工程を含むものである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＢＰＡを分解する方法が、ＢＰＡの水溶液とアガリクス属菌の培養液を接触させる工程を含むものである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ＢＰＡを分解する方法が、ＢＰＡの水溶液とアガリクス属菌の培養濾液を接触させる工程を含むものである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ＢＰＡを分解する方法が、ＢＰＡの水溶液とアガリクス属菌の培養上清を接触させる工程を含むものである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
ＢＰＡを分解する方法が、ｐＨ４〜ｐＨ８の範囲で行なわれるものである、請求項６〜請求項９いずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＢＰＡ分解活性を有するアガリクス属菌。
【請求項１２】
ＢＰＡ分解活性を有するアガリクス属菌がアガリクス・アルヴェンシス、アガリクス・ビスポルス、アガリクス・カンペストリスから成る群から選択される種に属する株である、請求項１１記載のアガリクス属菌。
【請求項１３】
請求項１１又は請求項１２記載のＢＰＡ分解活性を有するアガリクス属菌の培養液。
【請求項１４】
請求項１１〜請求項１３いずれか１項に記載のＢＰＡ分解活性を有するアガリクス属菌の培養濾液。
【請求項１５】
請求項１１〜請求項１４いずれか１項に記載のＢＰＡ分解活性を有するアガリクス属菌の培養上清。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は環境汚染物質であるビスフェノールＡの生物分解に関する。より具体的には、本発明は環境汚染物質であるビスフェノールＡを微生物を用いて分解する方法及びビスフェノールＡを分解する能力を有する微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、環境中に２０万種以上存在すると言われる化学物質の一部が生物に対してホルモン様作用をするとして注目を集めるようになった。このような化学物質は、内分泌攪乱物質、いわゆる環境ホルモンと呼ばれる。広く用いられる化学物質の中で、環境ホルモン作用が疑われているビスフェノールＡ（２，２−ビス（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロパン，ＢＰＡ）は、弱い女性ホルモン作用を示す。ＢＰＡはプラスチックの合成原料として世界中で使用されており、製品中から溶出したＢＰＡが女性ホルモン作用を示すと一般に言われている。環境中のＢＰＡ量や生物に対してどの程度作用するのかという点に関しては、意見の分かれるところであるが、現在もＢＰＡの環境ホルモン作用に対する不安は解消されていないのが実状である。
【０００３】
これまで、ジャガイモのポリフェノールオキシダーゼがＢＰＡを分解すると報告されている（非特許文献１を参照）。また、トラメテス・ヴィローサ由来のラッカーゼ（非特許文献２，３）、担子菌や食用茸レンチヌラ・エドデス由来のラッカーゼ（非特許文献４，５）、リグニン分解性担子菌由来のラッカーゼ及びマンガンペルオキシダーゼ（非特許文献６）、白色腐朽菌と呼ばれるプレウロトゥス・オストレアトゥス由来のマンガンペルオキシダーゼ（非特許文献７，８）などがＢＰＡを分解するとの報告がある。しかし、これらの酵素はすべてラッカーゼ又はマンガンペルオキシダーゼであり、これらの活性もあまり強くなく、その作用するｐＨ範囲も狭く、環境中のＢＰＡの分解に適しているとは思われない。
【非特許文献１】スアン  ワイジェイ，エンドー  ワイ，フジモト  ケイ：ポテトから調製された粗酵素によるビスフェノールの酸化的分解，Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００２  Ｏｃｔ  ２３；  ５０（２２）：６５７５−８。
【非特許文献２】ウチダ  エイチ，フクダ  ティー，ミヤモト  エイチ，カワバタ  ティー，スズキ  エム，ウワジマ  ティー：トラメテス・ヴィローサ由来の精製ラッカーゼによるビスフェノールＡの重合，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００１  Ｓｅｐ  ２１；２８７。
【非特許文献３】フクダ  ティー，ウチダ  エイチ，タカシマ  ワイ，ウワジマ  ティー，カワバタ  ティー，スズキ  エム：トラメテス・ヴィローサ由来の精製ラッカーゼによるビスフェノールの分解，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００１  Ｊｕｎ  １５；２８４。
【非特許文献４】タナカ，ティー；ヤマダ，ケイ；トノサキ，ティー；コニシ，ティー；ゴトー，エイチ；タニグチ，エム：アルキルフェノール、ビスフェノールＡ、合成エストロゲン及びフタール酸エステルの酵素分解，ＷＡＴＥＲ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，４２（７−８）：８９−９５  ２０００。
【非特許文献５】ナガイ  エム，サトー  ティー，ワタナベ  エイチ，サイトー  ケイ，カワタ  エム，エネイ  エイチ：食用茸レンチヌラ・エドデス由来の細胞外ラッカーゼの精製及び特性決定、及び化学的に異なる色素の脱色，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２  Ｎｏｖ；  ６０（３）：３２７−３５．Ｅｐｕｂ  ２００２  Ｏｃｔ  ０２。
【非特許文献６】ツツミ  ワイ，ハネダ  ティー，ニシダ  ティー：リグニン分解性担子菌由来の酸化的酵素によるビスフェノールＡ及びノニルフェノールのエステトゲン活性の除去，Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ，２００１  Ｊａｎ；４２（３）：２７１−６。
【非特許文献７】ヒラノ，ティー，ワイ．ホンダ，ティー．ワタナベ及びエム．クワハラ：白色腐朽性バシディオミセーテス，プレウロトゥス・オストレアトゥスが生産するリグニン分解酵素、マンガンペルオキシダーゼによるビスフェノールＡの分解，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．；６４（９），１９５８−１９６２（２０００）。
【非特許文献８】ハインフリング  エイ，ルイツ−デュナス  エフジェイ，マルチネス  エムジェイ，ベルグバウアー  エム，セブツィック  ユー，マルチネス  エイティー：プレウロトゥス・エリンギー及びビエルカンデラ・アドゥスタ由来のマンガン酸化性ペルオキシダーゼの還元性基質に関する研究，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９８  Ｍａｙ  ２９；４２８（３）：１４１−６。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明はＢＰＡを分解する活性がより強く、より広いｐＨ範囲でＢＰＡを分解する微生物を発見することを第１の目的とする。
【０００５】
また、ＢＰＡを分解する活性を有する、かかる微生物を用いてＢＰＡを分解する方法を提供することを第２の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の目的を達成するため、鋭意研究を進め、アガリクス属に属する菌類が優れたＢＰＡ分解活性を有することを発見し、さらに研究を進めて本発明を完成するに至ったものである。
【０００７】
即ち、本発明の骨子は、
（１）  アガリクス属に属する真菌を用いてビスフェノールＡ（ＢＰＡ）を分解する方法、
（２）  アガリクス属に属する真菌がアガリクス・アルヴェンシス、アガリクス・ビスポルス、アガリクス・カンペストリスから成る群から選択される種に属する株である、前記（１）記載の方法、
（３）  アガリクス属に属する真菌がこの菌を培養して得られる培養液である、前記（１）又は（２）記載の方法、
（４）  アガリクス属に属する真菌が、この菌を培養して得られる培養液を濾過して得られる培養濾液である、前記（１）〜（３）いずれかに記載の方法、
（５）  アガリクス属に属する真菌が、この菌を培養して得られる培養液又は培養濾液を遠心分離して得られる培養上清である、前記（１）〜（４）いずれかに記載の方法、
（６）  ＢＰＡを分解する方法が、ＢＰＡの水溶液とアガリクス属菌を接触させる工程を含むものである、前記（１）記載の方法、
（７）  ＢＰＡを分解する方法が、ＢＰＡの水溶液とアガリクス属菌の培養液を接触させる工程を含むものである、前記（１）記載の方法、
（８）  ＢＰＡを分解する方法が、ＢＰＡの水溶液とアガリクス属菌の培養濾液を接触させる工程を含むものである、前記（１）記載の方法、
（９）  ＢＰＡを分解する方法が、ＢＰＡの水溶液とアガリクス属菌の培養上清を接触させる工程を含むものである、前記（１）記載の方法、
（１０）  ＢＰＡを分解する方法が、ｐＨ４〜ｐＨ８の範囲で行なわれるものである、前記（６）〜（９）いずれかに記載の方法、
（１１）  ＢＰＡ分解活性を有するアガリクス属菌、
（１２）  ＢＰＡ分解活性を有するアガリクス属菌がアガリクス・アルヴェンシス、アガリクス・ビスポルス、アガリクス・カンペストリスから成る群から選択される種に属する株である、前記（１１）記載のアガリクス属菌、
（１３）  前記（１１）又は（１２）記載のＢＰＡ分解活性を有するアガリクス属菌の培養液、
（１４）  前記（１１）〜（１３）いずれかに記載のＢＰＡ分解活性を有するアガリクス属菌の培養濾液、並びに
（１５）  前記（１１）〜（１４）いずれかに記載のＢＰＡ分解活性を有するアガリクス属菌の培養上清、に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明のＢＰＡ分解に使用される本発明の微生物は腐生菌と呼ばれるアガリクス属に属する真菌であり、例えば、アガリクス・アルヴェンシス、アガリクス・ビスポルス、アガリクス・カンペストリス、アガリクス・ブラゼイ種に属する菌株が本発明に好適に用いられる。特に好ましい株を挙げれば、アガリクス・アルヴェンシス  ＩＦＯ  ３２１９０、アガリクス・ビスポルス  ＡＴＣＣ  ２４６２６、アガリクス・ビスポルス  ＡＴＣＣ  ２４６３５、アガリクス・ビスポルス  ＡＴＣＣ  ２４６５２、アガリクス・ビスポルス  ＡＴＣＣ  ２４６６６、アガリクス・ビスポルス  ＡＴＣＣ  ２００１９２、アガリクス・ビスポルス  ＡＴＣＣ  ２００１９５、アガリクス・ビスポルス  ＡＴＣＣ  ２００１９８、アガリクス・ビスポルス  ＩＦＯ  ７１２４、アガリクス・ビスポルス  ＩＦＯ  ８３３３、アガリクス・ビスポルス  ＩＦＯ  ３０７７４、アガリクス・ビスポルス  ＩＦＯ  ３０７７４、アガリクス・ビスポルス  ＩＦＯ  ３０７８２、アガリクス・ビスポルス  ＩＦＯ  ３０８７４、アガリクス・カンペストリス  ＡＴＣＣ  ２６８１５、アガリクス・カンペストリス  ＡＴＣＣ  ２６８１６、アガリクス・カンペストリス  ＡＴＣＣ  ２６８１７、アガリクス・カンペストリス  ＩＦＯ  ３１０９９、アガリクス・カンペストリス  ＩＦＯ  ３１１００などである。
【０００９】
本発明のアガリクス属菌はポテトデキストロース（ポテト煮沸抽出液２００ｇ、デキストロース２０ｇ、水１リットル、寒天２０ｇ）の斜面培地に２７℃で継代培養することができる。
【００１０】
本発明のアガリクス属菌の培養物は、斜面培地上に増殖したアガリクス属菌の菌糸を、例えばポテトデキストロース液体培地（サイコロ状に切断したポテト２００ｇを１リットルの水に入れて煮沸し、濾過して固形物を除いた濾液に水を加えて総量１リットルとし、これに２０ｇのグルコースを添加して調製する）を入れた坂口フラスコ又は三角フラスコに接種し、通常２５〜３２℃、好ましくは３０℃で２４時間〜９６時間又はそれ以上振盪培養を行なって又は２週間〜５週間又はそれ以上静置培養を行なって調製する。得られた培養物は使用するまで冷蔵保存する。
【００１１】
本発明のアガリクス属菌の培養濾液は、上記のようにして培養したアガリクス属菌の培養物を濾紙で濾過して菌体等を除くことにより得られる。得られた培養濾液は使用するまで冷蔵保存する。
【００１２】
本発明のアガリクス属菌の培養上清は、上記のようにして培養したアガリクス属菌の培養物又は培養上清を遠心分離（通常、１５０００ｒｐｍ、４℃、５分間）して菌体等を除くことにより得られる。得られた培養上清は使用するまで冷蔵保存する。
【００１３】
ＢＰＡ（試薬グレードのもの）は市販されており、例えば東京化成株式会社から購入できる。ＢＰＡは通常極めて薄い濃度で環境中に存在するが、以下の実験では、５ｍｇ／ｍｌの濃度のＢＰＡ溶液（ＢＰＡを６０％メタノール水に溶解して調製する）を基質溶液として使用する。
【００１４】
本発明のアガリクス属菌によるＢＰＡの分解反応は以下の条件の下で行なう。まず、反応容器に３ｍｌの所定のｐＨの緩衝液を入れ、これに５ｍｇ／ｍｌの濃度のＢＰＡ溶液を５０μｌ及びアガリクス属菌の培養液又は培養濾液又は培養上清を０．３ｍｌ添加し、３７℃で所定の期間インキュベートしてＢＰＡを分解させる。
【００１５】
ＢＰＡの分解は次のようにして測定する。上記の条件下で本発明のアガリクス属菌、その培養物又はその培養上清をＢＰＡに作用させた後、所定の時間に反応液の一部（通常２００μｌ）を採取し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、５分間）した後上清を回収し、試料１０μｌをＨＰＬＣにかけてＢＰＡに対応するピーク面積の変化からＢＰＡの減少率を計算する。
【００１６】
ＨＰＬＣの分析条件は、通常、流速：１．０ｍｌ／分、温度：４０℃、溶離液：６０％メタノール水溶液、試料量：１０μｌ、検出：２１０ｎｍ、カラム：マイティーシル RP-18 GP 250-4.6 （５μｌ）、ポンプ：ＰＵ９８０ｉ（ジャスコ）、検出器：ＵＶ−９７０（ジャスコ）である。
【００１７】
上記の方法を用いて、本発明のアガリクス属菌のＢＰＡ分解活性を検討したところ、以下の実施例において具体的に明らかにするように、本発明のアガリクス属菌の培養液、培養濾液及び培養上清は、ｐＨ４〜８の範囲で強いＢＰＡ分解活性を示す熱に不安定な物質である。これらの物質はその中にＢＰＡ分解活性を有する酵素を含むと思われるが、この酵素の主体は、以下の実施例で示すように、従来からＢＰＡ分解活性を示すことが知られているラッカーゼやマンガンペルオキシダーゼやリグニン分解活性を示す酵素のいずれでもない。本発明のアガリクス属菌、アガリクス属菌の培養液、培養濾液及び培養上清は従来知られていなかったＢＰＡ分解活性を有する物質を生産し又は含むことは明らかであり、従ってそれを用いて環境汚染物質であるＢＰＡを広いｐＨ範囲で分解除去できることも明らかである。
【００１８】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。                                                    以下の実施例においては全て、アガリクス属菌としてアガリクス・ビスポルス  ＡＴＣＣ  ２００１９２株を使用した。
なお、以下の実施例におけるＨＰＬＣの条件は、全て以下のとおりである。
流速：１．０ｍｌ／分、温度：４０℃、溶離液：６０％メタノール水溶液、試料量：１０μｌ、検出：２１０ｎｍ、カラム：マイティーシル RP-18 GP 250-4.6 （５μｌ）、ポンプ：ＰＵ９８０ｉ（ジャスコ）、検出器：ＵＶ−９７０（ジャスコ）。
【実施例１】
【００１９】
アガリクス属菌の培養上清によるＢＰＡの分解と培養日数
ポテトデキストロース液体培地１００ｍｌが入った５００ｍｌ容三角フラスコをオートクレーブ後、アガリクス属菌の菌糸をその斜面培養から接種した。３０℃で、フラスコの液面に菌糸が広がるまで５週間静置培養した。その間０、８、１６、２３、２５、２９、３５日目に約２ｍｌずつ試料を採取した。採取した試料を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、５分間）にかけ、その上清を用いてＢＰＡ分解活性を調べた。
【００２０】
採取した上清０．３ｍｌに、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３ｍｌと５ｍｇ／ｍｌのＢＰＡ溶液を５０μｌ加え、３７℃でインキュベートした。０時間と１時間後に反応液から２００μｌずつ反応液を採取し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、５分間）した後の上清を回収し、その１０μｌをＨＰＬＣに供し、ピークエリアの変化からＢＰＡ減少率を求めた結果を図１に示す。
図１から明らかなように、培養上清のＢＰＡ分解活性は培養３５日までほぼ直線的に上昇していることが分かる。菌糸の成長とＢＰＡ分解活性とはほぼ平行しているようである。
【実施例２】
【００２１】
アガリクス属菌の培養濾液によるＢＰＡの分解
ポテトデキストロース液体培地２０ｍｌが入った１００ｍｌ容三角フラスコをオートクレーブした後、アガリクス属菌の菌糸をその斜面培養から接種した。３０℃でフラスコの液面に菌糸が広がるまで３週間静置培養した。その後、菌体を含む培養液をアドバンテックＮｏ．２濾紙を用いて濾過して菌体を除き、培養濾液を得た。
【００２２】
得られたアガリクス属菌の培養濾液によるＢＰＡの分解は以下のようにして行なった。まず、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３ｍｌに５ｍｇ／ｍｌのＢＰＡ溶液を５０μｌ加え、これにアガリクス属菌の培養濾液を０．３ｍｌ加え、３７℃でインキュベートした。０、１、２、３、４、５、２４、４８時間後に反応液から２００μｌずつ試料を採取し、遠心分離（１５０００ rpm、４℃、５ min）した後上清を回収し、その１０μｌをＨＰＬＣに供し、ピークエリアの変化からＢＰＡの減少率を求めた。その結果を図２に示す。
【００２３】
図２から明らかなように、上記のアガリクス属菌培養濾液は、１時間で約５０％、２４時間で９０％以上のＢＰＡを分解することが確認された。
【実施例３】
【００２４】
アガリクス属菌の培養上清のＢＰＡ分解活性の熱安定性
実施例２と同様にして、アガリクス属菌の培養上清を得た。この培養上清を１ｍｌずつ採り、未処理、１００℃で１０分湯浴処理、１００℃で２０分湯浴処理、オートクレーブ（１２１℃で１５分）処理に付した。処理した又は無処理の培養上清それぞれから０．３ｍｌを採り、これに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌのＢＰＡ溶液を５０μｌ加え、３７℃でインキュベートした。インキュベーションの０時間と２４時間後に反応液から２００μｌずつ採取し、遠心分離（１５０００ rpm、４℃、５ min）した後上清を回収し、その１０μｌをＨＰＬＣに供し、ピークエリアの変化からＢＰＡ減少率を求めた。その結果を図３に示す。
【００２５】
図３から明らかなように、未処理の培養上清と比べ、１００℃で１０分処理の培養上清ではＢＰＡ分解活性が激減しており、１００℃２０分処理の培養上清では、１００℃で１０分処理の培養上清よりもさらにＢＰＡ分解活性が低下した。そしてオートクレーブ（１２１℃で１５分）処理では、ＢＰＡ活性は消失した。このことから、本発明のアガリクス属菌培養上清のＢＰＡ分解活性は熱に不安定であることが分かる。
【実施例４】
【００２６】
アガリクス属菌の培養上清のＢＰＡ分解活性のｐＨ依存性
ポテトデキストロース液体培地２０ｍｌが入った１００ｍｌ容三角フラスコをオートクレーブした後、これにアガリクス属菌をその斜面培養から植菌し、フラスコの液面に菌糸が広がるまで、３０℃で３週間静置培養した。その後、菌体を含む培地を遠心分離（１５０００ rpm、４℃、５ min）して菌体を除き培養上清を得て、以下の実験に使用した。
【００２７】
ｐＨ２．２から１０の範囲の緩衝液各３ｍｌに５ｍｇ／ｍｌのＢＰＡ溶液を５０μｌ加え、これにアガリクス培養上清０．３ｍｌを加えて３７℃でインキュベートした。０．１時間後に反応液から２００μｌずつ採取し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、５分）を行なって上清を回収し、その１０μｌをＨＰＬＣで分析した。得られた結果を図５に示す。
【００２８】
使用した緩衝液は以下の通りである。
ｐＨ２．２〜ｐＨ８：  ０．１Ｍクエン酸／０．２Ｍ  Ｎａ2 ＨＰＯ4 緩衝液、
ｐＨ７〜ｐＨ９：  ０．１Ｍ  ＫＨ2 ＰＯ4 ／０．０５Ｍ  Ｎａ2 Ｂ4 Ｏ7 緩衝液、
ｐＨ９〜ｐＨ１０：  ０．２ＭのＮａＨＣＯ3 ／０．２ＭのＮａ2 ＣＯ3 緩衝液。
【００２９】
図５から明らかなように、本発明のアガリクス培養上清はｐＨ４〜ｐＨ８までの広いｐＨ範囲でＢＰＡ分解活性を示す。従って、本発明のアガリクス培養上清は種々のｐＨ環境下でのＢＰＡで汚染された環境の浄化に優れた効果を発揮するものと思われる。
【実施例５】
【００３０】
アガリクス培養上清のラッカーゼ活性、マンガンペルオキシダーゼ活性、及びリグニン分解活性
ポテトデキストロース液体培地２０ｍｌが入った１００ｍｌ容三角フラスコをオートクレーブした後、これにアガリクス属菌をその斜面培養から植菌し、フラスコの液面に菌糸が広がるまで、３０℃で３週間静置培養した。その後、菌体を含む培地を遠心分離（１５０００ rpm、４℃、５ min）して菌体を除き培養上清を得て、以下の実験に使用した。
【００３１】
培養上清のラッカーゼ活性の測定
ラッカーゼの基質として、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を和光純薬工業（株）から購入して使用した。
ラッカーゼ活性は次のように測定した。即ち、０．１ｍｌの１０ｍＭのＡＢＴＳ、０．５ｍｌの下記の緩衝液、８０倍希釈した培養上清０．４ｍｌから成る反応液を３０℃でインキュベートし、２０分後に１ｍｌの５％ＴＣＡを加えて反応を停止させ、４２０ｎｍの吸光度を測定した。
使用した緩衝液はｐＨ３からｐＨ１０の範囲をカバーする下記緩衝液を用いた。
ｐＨ３〜ｐＨ８：  ０．１Ｍクエン酸／０．２Ｍ  Ｎａ2 ＨＰＯ4 緩衝液、
ｐＨ９〜ｐＨ１０：  ０．２ＭのＮａＨＣＯ3 ／０．２ＭのＮａ2 ＣＯ3 緩衝液。
【００３２】
アガリクス培養上清のラッカーゼ活性（ｐＨ４．０）
ｐＨ４．０におけるアガリクス培養上清のラッカーゼ活性は下記のとおりである。アガリクス培養上清のタンパク質量並びに比活性及び総活性も併記する。
活性：          ６６２．５（Ｕ／ｍｌ）
タンパク質量：  ０．１５（ｍｇ／ｍｌ）
比活性：        ４４１６．７（Ｕ／ｍｇ）
総活性：        ５５２０．８（Ｕ／フラスコ）
【００３３】
なお、１Ｕは、１分間に１μＭの基質を変化させる酵素量である。また、タンパク質量はＣＢＢ法によって測定した。即ち、汚れていない乾燥した試験管にＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を０、２、４、６、８、１０μｌそれぞれ入れた。試料も同様に試験管に５０、１００、２００μｌそれぞれ入れた。各試験管に２ｍｌのＣＢＢ溶液を加えた。室温で２０分間放置した後５９５ｎｍの吸光度を測定し、ＢＳＡ検量線から試料中のタンパク質量を求めた。
【００３４】
アガリクス培養上清のラッカーゼ活性のｐＨ依存性
アガリクス培養上清のラッカーゼ活性のｐＨ依存性は、最も活性が高かったｐＨにおける活性を１００とし、他のｐＨの活性をこれに対する百分率として表したものが図３である。図３から明らかなように、アガリクス培養上清のラッカーゼ活性の至適ｐＨは３．５であり、ｐＨ７のラッカーゼ活性はｐＨ３．５の活性の約１／１０に過ぎない。
【００３５】
従って、ｐＨ７におけるアガリクス培養上清のＢＰＡ分解活性に対してアガリクス培養上清のラッカーゼ活性は殆ど寄与していないことが明らかである。
【００３６】
培養上清のマンガンペルオキシダーゼ活性の測定
マンガンペルオキシダーゼの基質には、ｏ−メトキシフェノール（グアイアコール）を和光純薬工業（株）から購入して使用した。
マンガンペルオキシダーゼ活性は次のようにして測定した。即ち、０．２ｍｌの０．４ｍＭグアイアコール、０．１ｍｌの０．１ｍＭのＭｎＳＯ4 、０．４ｍｌの下記緩衝液から成る混合溶液に０．１ｍｌの０．１ｍＭのＨ2 Ｏ2 及び０．２ｍｌのアガリクス培養上清を同時に加えてインキュベートした後、５分間経時的に、４５６ｎｍの吸光度を測定した。
使用した緩衝液は、ｐＨ２．２〜ｐＨ８をカバーする０．１Ｍクエン酸／０．２Ｍ  Ｎａ2 ＨＰＯ4 緩衝液であった。
【００３７】
アガリクス培養上清のマンガンペルオキシダーゼ活性（ｐＨ４．０）
活性：          １０（Ｕ／ｍｌ）
タンパク質量：  ０．１５（ｍｇ／ｍｌ）
比活性：        ６６．７（Ｕ／ｍｇ）
総活性：        ８３．３（Ｕ／フラスコ）
【００３８】
アガリクス培養上清のマンガンペルオキシダーゼ活性のｐＨ依存性
アガリクス培養上清のマンガンペルオキシダーゼ活性のｐＨ依存性は、最も活性の高いｐＨにおける活性を１００として他のｐＨにおける活性をその百分率で表した。その結果を図６に示す。
【００３９】
図６から明らかなように、アガリクス培養上清のマンガンペルオキシダーゼ活性はｐＨ５が至適ｐＨであり、ｐＨ７では活性を示さないことが分かる。従って、ｐＨ７における本発明のアガリクス培養上清のＢＰＡ分解活性には、この培養上清に含まれるマンガンペルオキシダーゼ活性は寄与していないことが分かる。
【００４０】
アガリクス培養上清のリグニン分解活性の測定
リグニン分解活性（リグニンペルオキシダーゼ）のための基質としては、３，４−ジメトキシベンジルアルコール（ベラトリルアルコール）を和光純薬工業（株）から購入して使用した。
アガリクス培養上清としては、ラッカーゼ及びマンガンペルオキシダーゼ活性を測定するために使用したアガリクス培養上清と同じものを使用した。
測定方法は次のとおりである。即ち、０．２ｍｌの１０ｍＭベラトリルアルコール、０．５ｍｌの０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）の混合溶液に０．１ｍｌの５ｍＭのＨ2 Ｏ2 、０．２ｍｌの培養上清を同時に加え、５分間、経時的に３１０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４１】
結果
リグニン分解活性（リグニンペルオキシダーゼ活性）は検出できなかった。
従って、本発明のアガリクス培養上清のＢＰＡ分解活性にはリグニン分解活性は寄与していないことが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、アガリクス属菌の静置培養時間とその培養上清のＢＰＡ分解活性の関係を示す図である。
【図２】図２は、アガリクス属菌の培養濾液による３７℃でのＢＰＡの分解を示す図である。
【図３】図３は、アガリクス属菌の培養上清における、そのＢＰＡ分解活性の熱安定性を示す図である。
【図４】図４は、アガリクス属菌の培養上清における、そのＢＰＡ分解活性のｐＨ安定性を示す図である。
【図５】図５は、アガリクス属菌の培養上清におけるラッカーゼ活性のｐＨ依存性を示す図である。
【図６】図６は、アガリクス属菌の培養上清におけるマンガンペルオキシダーゼ活性のｐＨ依存性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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