(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、生物学的活性を有意に低下させることなく、複数のポリマーをインターフェロンに結合させることである。【解決手段】  実質的に非抗原性のポリマーへコンジュゲートしたα‐インターフェロンを含有する組成物を開示する。前記コンジュゲートの少なくとも約30％では、α‐インターフェロンがヒスチジンにおいて該実質的に非抗原性のポリマーへ共有結合している。前記コンジュゲートを製造する方法も開示する。この方法には、α‐インターフェロンをスクシンイミジルカーボネートで活性化された実質的に非抗原性のポリマーと、該ポリマーをα‐インターフェロンのヒスチジンへ共有結合させるのに充分なpHで接触させることが含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α‐インターフェロンとアルコキシ末端基付きポリアルキレンオキシドとのコンジュゲートの位置異性体混合物を含んでなる医薬組成物であって、該位置異性体の少なくとも15％は、α‐インターフェロンがヒスチジン残基にてアルコキシ末端基付きポリアルキレンオキシドへ共有結合しているものである、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記α‐インターフェロンがインターフェロンα2bである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ヒスチジン残基がHis34である、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記α‐インターフェロンの位置異性体混合物が、少なくとも約３種の位置異性体を含むものである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記α‐インターフェロンの位置異性体混合物が、少なくとも約６種の位置異性体を含むものである、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記α‐インターフェロンの位置異性体混合物が、少なくとも約８種の位置異性体を含むものである、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記α‐インターフェロンがα‐インターフェロン2bであり、位置異性体がCys1、Lys31、His34、Lys49、Lys83、Lys121、Lys131およびLys134からなる群より選ばれるものである、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ポリアルキレンオキシドがモノメトキシ‐ポリエチレングリコール(mPEG)である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ポリマーの分子量が約200〜約35,000である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ポリマーの分子量が約1,000〜約15,000である、請求項10記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ポリマーの分子量が約2,000〜約12,500である、請求項11記載の医薬組成物。
【請求項１３】
α‐インターフェロンとポリマーとのコンジュゲートの位置異性体混合物を含んでなる医薬組成物であって、前記位置異性体の少なくとも15％は、α‐インターフェロンがヒスチジン残基にてポリマーへ共有結合しているものであり、前記ポリマーが、ポリプロピレングリコール、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコールおよび炭水化物をベースとするポリマーからなる群から選択されるものである、前記医薬組成物。
【請求項１４】
α‐インターフェロンとアルコキシ末端基付きポリアルキレンオキシドとのコンジュゲートの位置異性体混合物を含んでなるα‐インターフェロン含有組成物であって、前記位置異性体の少なくとも15％は、アルコキシ末端基付きポリアルキレンオキシドが前記α‐インターフェロンのヒスチジン残基に共有結合しているものである、前記組成物。
【請求項１５】
前記組成物のα‐インターフェロン部分がα‐インターフェロン2bであり、前記ヒスチジンがHis34である、請求項14記載の組成物。
【請求項１６】
前記コンジュゲートの少なくとも約30％では、前記ポリマーが前記α‐インターフェロンのヒスチジン‐34に共有結合している、請求項14記載の組成物。
【請求項１７】
前記コンジュゲートの少なくとも約40％では、前記ポリマーが前記α‐インターフェロンのヒスチジン‐34に共有結合している、請求項16記載の組成物。
【請求項１８】
α‐インターフェロン2bとポリマーとのコンジュゲートの位置異性体混合物を含んでなる医薬組成物であって、位置異性体の約30〜約60％では、前記ポリマーがα‐インターフェロンのHis34に結合しており、位置異性体の約７〜約20％では、前記ポリマーがα‐インターフェロンのCys1に結合しており、位置異性体の約７〜約15％では、前記ポリマーがα‐インターフェロンのLys121に結合している、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
位置異性体の約55％では、前記ポリマーがα‐インターフェロンのHis34に結合しており、位置異性体の約15％では、前記ポリマーがα‐インターフェロンのCys1に結合しており、位置異性体の約15％では、前記ポリマーがα‐インターフェロンのLys121に結合している、請求項18記載の医薬組成物。
【請求項２０】
α‐インターフェロンコンジュゲートの製造方法であって、α‐インターフェロンを、充分量のオキシカルボニル-オキシ-N-ジカルボキシイミドで活性化されたアルコキシ末端基付きポリアルキレンオキシドと、位置異性体の少なくとも15％ではα‐インターフェロンがヒスチジン残基にてアルコキシ末端基付きポリアルキレンオキシドへ共有結合しているような、α-インターフェロンとアルコキシ末端基付きポリアルキレンオキシドとのコンジュゲートの位置異性体混合物を得るのに十分な条件下で接触させることを含む該方法。
【請求項２１】
前記オキシカルボニル‐オキシ‐N‐ジカルボキシイミドがスクシンイミジルカーボネートである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
前記条件に、前記接触を約7.0以下のpHで行うことが含まれる、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
前記条件に、前記接触を約6.8以下のpHで行うことが含まれる、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記活性化されたポリマーが、前記α‐インターフェロンに対して過剰モル量で存在する、請求項20記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリマーの過剰モル量が約１〜約８倍である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリマーの過剰モル量が約1.5〜約７倍である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリマーの過剰モル量が約1.75〜約５倍である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールである、請求項20記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリマーの分子量が約200〜約35,000である、請求項20記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリマーの分子量が約1,000〜約15,000である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリマーの分子量が約2,000〜約12,500である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
前記α‐インターフェロンがインターフェロンα2bである、請求項20記載の方法。
【請求項３３】
哺乳動物のインターフェロン感受性症状を治療するための請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３４】
哺乳動物のインターフェロン感受性症状を治療するための請求項14記載の医薬組成物。
【請求項３５】
哺乳動物のインターフェロン感受性症状を治療するための請求項18記載の医薬組成物。
【請求項３６】
請求項20に記載の方法に従って製造されたポリマーとインターフェロンとのコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターフェロン‐ポリマーコンジュゲートに関する。特に本発明は、新規なインターフェロン‐ポリマー結合プロフィールを有するコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的に活性なタンパク質をポリマーへコンジュゲートさせることは、in vivoにおける循環寿命、水溶性または抗原性の特性のうち１つ以上を改良するものとして提案されている。例えば、ペプチドまたはポリペプチドをポリエチレングリコール(PEG)および類似の水溶性ポリマーへカップリングさせる初期の概念のいくつかは、米国特許第4,179,337号に記載されている（前記米国特許の開示内容は、引用により本明細書中に含まれるものとする）。
【０００３】
インスリンおよびヘモグロビンはコンジュゲート形成された最初の治療剤の一つであった。これらの比較的大きなポリペプチドは、複数の遊離リシンε‐アミノ結合部位を含んでいる。生物学的活性を有意に低下させることなく、複数のポリマーを結合させることができる。
【０００４】
しかしながら、多くの生物学的に活性な物質にとって、コンジュゲーション工程は困った問題が無いわけではない。コンジュゲーション反応に起因する生物学的活性の喪失を抑えるよう、注意を払わなければならない。例えば、活性化ポリマーが標的タンパク質またはポリペプチドへ過剰に結合すれば、生物学的活性が著しく低下するか喪失する可能性がある。さらに、ポリマーをタンパク質へ結合させるのに不適切なリンカーを用いたり、標的へ結合するポリマーの量が充分でない場合には、得られたコンジュゲートの治療上の価値がかなり制限される。多くの場合、このようなコンジュゲートは、生物活性の低下を補償するのに充分な循環寿命の増加を示すものではない。治療成分の活性部位（即ち、生物活性に関連する基が存在する部位）が、ポリマーが結合した結果ブロックされる場合にも、問題が生じる可能性がある。この問題は、ポリマーとタンパク質が典型的には溶液系反応において結合するため、回避するのが困難である。活性部位をピリドキサールリン酸等の物質で予めブロックすることが提案されているが、結果は一貫していない。この問題は、低分子量タンパク質およびペプチドを用いた場合に特に深刻である。これらの生物活性物質は、生物活性とは関連しない結合部位をほとんど持っていないことが多い。
【０００５】
インターフェロン（以下、「IFN」ともいう）は、改良型ポリマーコンジュゲーション技術が有効であるタンパク質の特定例である。例えば、米国特許第4,766,106号および同第4,917,888号を参照されたい。これらの米国特許には、とりわけ、mPEG‐2,4,6‐トリクロロ‐S‐トリアジン、mPEG‐N‐スクシンイミジルグルタレートまたはmPEG‐N‐スクシンイミジルスクシネート等の活性化ポリマーとコンジュゲートされたβ‐インターフェロンが記載されている。特許権者は、該タンパク質の共有結合修飾をpH5〜9で行い、タンパク質がリシン残基を介して反応する場合にはタンパク質の共有結合修飾をpH8〜9で行うことを開示している。活性化ポリマーは比較的高い過剰モル量（10、20および50倍）でも使用される。
【０００６】
欧州特許公開公報第0236987号には、好ましくはpHが約7〜9であることを含む条件下で、α‐およびγ‐インターフェロンを高過剰モル量のアルキルイミドエステル活性化ポリエチレングリコールと反応させることが記載されている。欧州特許公開公報第0510356号には、α‐インターフェロンをピリジニルカルボニルおよびチオカルボニル活性化PEGとpH7〜9でコンジュゲートさせることが記載されている。これらの開示には、リシン以外のアミノ酸がコンジュゲーションに関わっていることも、そうすることが有利であることも記載されていない。
【０００７】
上記の開示に係わらず、多くのインターフェロン‐ポリマーコンジュゲートがある理由または別の理由によって許容できないものと思われていた。
【０００８】
本発明は、これらの欠点に取り組むものである。
【発明の開示】
【０００９】
一態様では、本発明は、モノ‐ポリマー鎖化α‐インターフェロンコンジュゲートの混合物を含む医薬組成物を包含する。この混合物では、どのアミノ酸残基がポリマーに共有結合するかに応じて、個々のモノ‐ポリマー‐IFNコンジュゲートは位置異性体(positional isomer)として既定される。この混合物には、α‐インターフェロンのヒスチジン残基においてポリマーと共有結合したα‐インターフェロンからなる異性体が含まれている。この組成物は、少なくとも、組成物の一部として含まれている少なくとも約15％、好ましくは少なくとも約30％のインターフェロンコンジュゲートがα‐インターフェロンのヒスチジンに共有結合したポリマーを有するという事実のため、先行技術の生成物と区別することが可能である。しかしながら、好ましくは、コンジュゲートまたは位置異性体には、ポリマーが結合している場所に係わらず、α‐インターフェロン当たり約１本のポリマー鎖が含まれる。
【００１０】
本発明のさらに別の態様は、α‐インターフェロンコンジュゲートを製造する方法および前記方法によって製造される組成物を包含する。IFN‐ポリマーコンジュゲートは、α‐インターフェロンを含む溶液を充分な量のオキシカルボニル‐N‐ジカルボキシイミド(N‐dicarboximide)活性化ポリマー（例えば、スクシンイミジルカーボネート活性化PEG）と、ポリマーをインターフェロン、少なくとも一部にはHis残基（例えば、α‐インターフェロンのHis34）へ共有結合させるのに充分な条件下で反応させることによって製造する。これらの条件の一部には、少なくともポリマー鎖の一部をインターフェロン分子のヒスチジン残基のアミノ基へ容易に共有結合させるのに充分なpH範囲内でコンジュゲーション反応を行うことが含まれる。
【００１１】
適切なα‐インターフェロンとしては、組換え体および哺乳動物から単離した非組換え体α‐インターフェロンが挙げられる。コンジュゲートのポリマー部分は、好ましくは、モノメトキシポリエチレングリコール(mPEG)等のポリアルキレンオキシド(PAO)である。別の実施形態では、実質的に非抗原性の他のポリマーを使用することもできる。ポリマーは好ましくは約200〜約35,000の分子量を有する。
【００１２】
コンジュゲーションを行う条件には、α‐インターフェロンに対してほぼ等モル量〜比較的低い過剰モル量の活性化ポリマーとの結合反応を行うことが含まれる。この条件には、約７未満のpH、好ましくは約4.5〜約6.8のpHで反応を行うことがさらに含まれる。
【００１３】
本発明は、哺乳動物のα‐インターフェロン感受性症状を治療する方法も包含する。この態様では、治療には、本明細書に記載のIFNコンジュゲートを含む組成物の有効量をこのような療法を必要とする哺乳動物へ投与することが含まれる。
【００１４】
本発明の結果、インターフェロン‐ポリマーコンジュゲート組成物のさらなる改良が可能であることが予想外に見出された。例えば、コンジュゲーション条件を改変することによって、α‐インターフェロンの一部がユニークな位置でポリマーへ結合している比較的高活性のモノ‐ポリマーIFNコンジュゲートを含む組成物を得ることが可能である。さらに、スクシンイミジルカーボネートおよび数種の関連したオキシカルボニル‐N‐ジカルボキシイミド型の活性化ポリマー（例えば、SC‐PEG）とのコンジュゲーション反応を、コンジュゲーションに典型的に用いられるpHレベルよりも酸性のpHレベルで行うことで、ポリマーがIFN分子の予想されるリシン部位だけでなく、ヒスチジン部位（例えば、α‐インターフェロンの好適なHis34アミノ酸）にも選択的に結合することが見出された。
【００１５】
本発明をより良く理解するために、以下の説明と図面を参照されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
１．インターフェロン
ポリマーコンジュゲートのインターフェロン(IFN)部分は、大腸菌中で発現する合成遺伝子を用いるような組換え技術を含む様々なソースから製造し、また取得することができる。Pestka,”Interferon α” in Human Cytokines, Blackwell Scientific Publications 1‐16 (1992)も参照のこと（開示内容は引用により本明細書に含まれるものとする）。またIFNは、ヒト、反芻動物(ruminant)またはウシα‐インターフェロン等の哺乳動物を起源とする抽出物であってもよい。特に好適なIFNの一つはIFNα‐2bであり、これはSchering Corp. (Kenilworth,NJ)の組換え技術によって作られた製品である。
【００１７】
本明細書中では用語「インターフェロン」または「IFN」は、ウイルス複製および細胞増殖を抑制し、免疫応答をモジュレートする相同性の高い種特異的タンパク質のファミリーを意味する。ヒトのインターフェロンは、その細胞起源および抗原性に基づいて3つのクラスに分類される：α‐インターフェロン（白血球）、β‐インターフェロン（繊維芽細胞）およびγ‐インターフェロン（B細胞）。各グループの組換え体が開発されており、市販されている。各グループのサブタイプは抗原／構造特性に基づく。明確に異なるアミノ酸配列を有する少なくとも24種のインターフェロンα（サブタイプA〜Hに分類される）が、これらのペプチドをコードするＤＮＡを単離し、配列決定することで同定されている。Viscomi, 1996 Biotherapy 10:59‐86も参照のこと（開示内容は引用により本明細書に含まれるものとする）。用語「α‐インターフェロン」「インターフェロンα」および「ヒト白血球インターフェロン」は、本出願ではこのグループのメンバーを記載するのに互換的に使用される。米国特許第4,897,471号（開示内容は引用により本明細書に含まれるものとする）に記載されているようなコンセンサス・インターフェロンを含めて、天然と組換え体の双方のα‐インターフェロンを本発明の実施に使用することができる。
【００１８】
全血のバッフィコート画分から単離したヒト白血球からのインターフェロンαの精製は、米国特許第4,503,035号に記載されている。このように調製したヒト白血球インターフェロンには、異なるアミノ酸配列を有するヒト白血球インターフェロンの混合物が含まれている。本発明の実施に使用し得る精製された天然ヒトα‐インターフェロンおよびこれらの混合物としては、Sumitomo (Japan)より市販されているSumiferon（登録商標）インターフェロンα‐n1、Glaxo‐Wellcome Ltd. (London, Great Britain)より市販されているWellferon（登録商標）インターフェロンα‐n1(Ins)、およびPurdue Frederick Co. (Norwalk, CT)より市販されているAlferon（登録商標）インターフェロンα‐n3が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
インターフェロン製造に適用される組換えＤＮＡ技術の出現は、複数のヒト・インターフェロンの合成を成功させ、その結果各種インターフェロンの大規模な醗酵、製造、単離および精製を可能にし、均一性をもたらした。組換え技術によって製造したインターフェロンは、そのin vitroおよびin vivoにおける抗ウイルス活性および免疫調節活性(immunomodulatory activity)を保持している。この組換え技術が、組換え技術によって誘導したポリペプチド上に、炭水化物成分を付加するためのグリコシル化部位を含みうることも明らかである。
【００２０】
ヒト白血球インターフェロンの少なくとも一部をコードする配列を含む組換えＤＮＡプラスミドの構築と、ヒト白血球インターフェロンの免疫学的活性または生物学的活性を有するポリペプチドの大腸菌中での発現は、米国特許第4,530,901号および欧州特許第EP0032134号に開示されている。異なるサブタイプ配列の組み合わせ（例えば、AおよびD、AおよびB、AおよびF）を含むハイブリッドα‐インターフェロン遺伝子の構築は、米国特許第4,414,150号、同第4,456,748号および同第4,678,751号に開示されている。本発明の実施に使用し得る典型的な適切な組換えα‐インターフェロンとしては、Schering Corporation (Kenilworth, N.J.)より市販されているIntron（登録商標）A等のインターフェロンα‐2b、Hoffmann‐La Roche (Nutley N.J.)より市販されているRoferon（登録商標）AおよびAmgen (Thousand Oaks, CA)より市販されているInfergen（登録商標）等のインターフェロンα‐2aが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
所望であれば、外来のαIFNが完全には自己由来のものではない別の実施形態を使用することも可能である。しかしながら、重要なのは、非自己由来αIFNが標的哺乳動物において充分な生物活性または抗ウイルス活性等のαIFN作用を有することである。αIFN画分または先租ポリペプチド(predecessor polypeptide)を含む他の物質も、本発明のコンジュゲートに含めることができる。本明細書中、「哺乳動物におけるα‐IFN作用」とは、αIFN類について観察される活性に相当するin vivo活性を意味する。これらの物質は、組織培養、動物起源からの抽出等の当業者に公知の技術を使用して、または組換えＤＮＡ法によって製造される。αIFNおよび関連成分のトランスジェニック供給源も考えられる。このような物質は、αIFNタンパク質が乳汁、血液または他の組織中に発現されるトランスジェニック動物（即ち、マウス、ブタ、ウシ等）から得られる。本発明のコンジュゲート用のαIFNを製造する方法は、本明細書に記載されたものに限られない。本発明では、生化学的および血清学的特性のため、αIFNが好適である。特に、αIFNは抗ウイルス特性が実証されており、血流中へは他のインターフェロンよりも効率的に拡散する。
【００２２】
２．非抗原性ポリマー
IFNをポリ(アルキレンオキシド)等のポリマーへコンジュゲートさせるためには、ポリマーのヒドロキシル末端基の一つがコンジュゲーションを可能にする反応性官能基へ変換される。この工程は「活性化(activation)」と呼ばれることが多く、生成物は「活性化(activated)」ポリマーまたは活性化ポリ(アルキレンオキシド)という。実質的に非抗原性の他のポリマーも、同様に「活性化」つまり官能化される。
【００２３】
リシンのε‐アミノ基、N末端システインのアミノ基、および以下に記載するようにヒスチジンのアミノ基で結合が起こるように、活性化ポリマーをαIFNと反応させる。IFN上の、利用可能であれば、遊離のカルボン酸基、適切に活性化されたカルボニル基、酸化された炭水化物部分およびメルカプト基を補足的な結合部位として所望により使用することもできる。
【００２４】
本発明の好適な態様では、ウレタン（カルバメート）結合をαIFNアミノ酸アミノ基（即ち、リシン、ヒスチジン、N末端）の一つと活性化ポリマーとの間に形成する。好ましくは、スクシンイミジルカーボネート基等の末端オキシカルボニル‐オキシ‐N‐ジカルボキシイミド基を利用してウレタン結合を形成する。別の活性化基としては、N‐スクシンイミド、N‐フタルイミド、N‐グルタルイミド、N‐テトラヒドロフタルイミドおよびN‐ノルボレン(norborene)‐2,3‐ジカルボキシドが挙げられる。これらのウレタン形成基は、共通に所有された米国特許第5,122,614号に記載されている（この開示内容は引用により本明細書に含まれるものとする）。この特許は、標的リシンアミノ基とウレタン結合を形成し得るポリエチレングリコールを含むポリアルキレンオキシドのN‐スクシンイミドカーボネート誘導体の形成についても開示している。
【００２５】
実質的に非抗原性のポリマーの中では、モノ‐活性化されたアルコキシ末端基付きポリアルキレンオキシド(PAO)、例えばモノメトキシ末端基付きポリエチレングリコール(mPEG)が好適である。αIFNを架橋するために、またはポリマー‐αIFNコンジュゲートを特定の領域（例えば、肝臓）へ局在化させるターゲティング剤等の他の成分を結合する手段を提供するために、ビス‐活性化されたポリエチレンオキシド(グリコール)も考えられる。
【００２６】
適切なポリマーは実質的に分子量によって変わる。本発明では、数平均分子量が約200〜約35,000のポリマーが通常選択される。約1,000〜約15,000の分子量が好適であり、2,000〜約12,500が特に好適である。
【００２７】
含まれるポリマー物質はまた、室温で水溶性であることが好ましい。このようなポリマーのリスト（但し、限定するものではない）には、ポリエチレングリコール（PEG）またはポリプロピレングリコール等のポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、これらのコポリマーおよびこれらのブロックコポリマー（但し、ブロックコポリマーの水溶性は維持される）が挙げられる。mPEG以外にも、C1‐4アルキル末端基付きポリマーも有用である。
【００２８】
PAO系のポリマーの代替としては、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド（例えば、HPMA‐ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリビニルアルコール、炭水化物をベースとするポリマー、これらのコポリマー等の事実上非抗原性の物質を使用することができる。当業者であれば、前述のリストが単なる例示に過ぎず、本明細書に記載の特性を有する全てのポリマー物質が考えられることは理解できるであろう。本発明の場合には、「実質的にまたは事実上非抗原性の」とは、非毒性であり、哺乳動物において明らかな免疫原性応答を惹起するものではないと当該技術分野で理解される全ての物質を意味する。
【００２９】
３．反応条件
コンジュゲーション反応（PEG化反応とも呼ぶ）は、多くの場合、ポリマーがどこでタンパク質に結合するかに係わらず、溶液中で行う。このような技術は、通常、αIFNをコンジュゲートさせるため、わずかにアルカリ性（即ち、pH7＋〜約9）で行われる。しかしながら、本発明の重要な点は、ポリマーをヒスチジン（好ましくはIFNα2bのHis34）へ結合させれば、保持されるIFN生物活性が最大になり得るということである。αIFNの様々な種がアミノ酸34にヒスチジンを有していてもいなくても、インターフェロンコンジュゲートがそれに係わりなく、好ましくは、利用可能なヒスチジンに結合したポリマーを含有する少なくとも数種の位置異性体を含むことは、当業者には明らかであろう。
【００３０】
従って、本発明の方法は、α‐インターフェロンを含有する溶液を、ある量のスクシンイミジルカーボネート活性化mPEG等のオキシカルボニル‐オキシ‐N‐ジカルボキシイミド活性化ポリマーと、ポリマー鎖の少なくとも一部と個々のインターフェロン分子のヒスチジン（例えば、IFNα2bのHis34）との共有結合を促進するのに充分なpHで反応させることを含む。特に、pHは好ましくはわずかに酸性（即ち、約7.0以下、より好ましくは約6.8以下、最も好ましくは約4.5〜約6.8の範囲）とする。
【００３１】
コンジュゲーションを行う反応条件には、α‐インターフェロンに対してほぼ等モル量〜比較的低い過剰モル量の活性化ポリマーとの結合反応を行うことがさらに含まれる。この点については、本発明の方法は約１〜８倍過剰モル量、好ましくは約1.5〜７倍過剰モル量、最も好ましくは約1.75〜５倍過剰モル量で行うことができる。コンジュゲーション反応は、ほぼ室温（即ち、20〜25℃）で行うことができる。カップリング反応を、むしろ短時間（即ち、１〜２時間）で進行させて、その後停止させることも好適である。実際に、この反応条件によってポリマー‐IFN位置異性体の混合物が得られる。好ましくは、各異性体には、アミノ酸残基を介してインターフェロンに結合した単一ポリマー鎖が含まれる。別の実施形態では、この方法の結果として結合したポリマーが、１本よりも多く含まれる。これらのコンジュゲートを含有する溶液もそのままで有用であり、また分子量に基づいてコンジュゲートを分離するためにさらに処理を行ってもよい。
【００３２】
好適な１本ポリマー鎖‐IFNコンジュゲート(異性体)の特性決定を、カチオン交換クロマトグラフィーにより行ってピークに分離したところ、ポリマーがIFNα2b分子の最大約８個までの異なる部位に結合し得ることが判明した。これらの部位は、個々の位置異性体に該当するものであり、Cys1、Lys31、His34、Lys49、Lys83、Lys121、Lys131、Lys134である。いくつかの好適な実施形態では、モノ‐ポリマー‐IFNコンジュゲートを含む反応プールは、比較的高い割合のHis34位置異性体（即ち、約30〜60％）、Cys1位置異性体（約7〜20％）、およびLys121位置異性体（約7〜15％）を含むことができ、残りはその他の位置異性体で占められている。別のIFNでは、出発物質のアミノ酸配列に応じて位置異性体の分布が違ってくることは理解できるであろう。
【００３３】
溶液系のコンジュゲーション反応の特質のため、組成物は、インターフェロン分子上の異なる部位に結合したポリマー鎖を含む種の不均一な混合物である。コンジュゲートを含有するいずれの溶液にも、少なくとも約3種、好ましくは約6種、より好ましくは約8種の位置異性体の混合物が含まれていると考えられる。例えば、IFNα2bを用いる場合、溶液には、インターフェロンのCys１、Lys31、His34、Lys49、Lys83、Lys121、Lys131およびLys134のうちの１つ以上に結合したポリマーを有するコンジュゲート異性体が含まれるであろう。IFNα2bと本明細書に記載の好適な形態の活性化ポリマーの場合には、3ヵ所の最も顕著な結合部位はHis34（55％）、Cys1（15％）およびLys121（15％）である。
【００３４】
本発明の好適な組成物は、少なくとも約15％のHis‐ポリマー置換IFNを含むIFN‐ポリマー異性体の混合物である。即ち、コンジュゲートの少なくとも約15％では、α‐インターフェロンと実質的に非抗原性のポリマーとがHisにおいて共有結合している。より好適な態様ではコンジュゲートの少なくとも約30％、最も好適な本発明の態様ではコンジュゲートの少なくとも約40％に、His34ポリマー共有結合が含まれる。IFNα2bまたは関連のIFNを用いる場合には、ヒスチジン結合部位は好ましくはHis34である。
【００３５】
４．PEG‐IFN位置異性体の分布に対する反応pHの影響
本発明の方法は、α‐インターフェロン上のポリマー結合部位が、反応系のpHによって大いに影響を受けるという発見を利用するものである。反応溶液のpHを変えると、特定の形態の活性化ポリマーに対する各種官能基（例えば、α‐アミン、イミダゾールおよびε‐アミン）の反応性が変わるであろう。典型的には、リシンε‐アミノ基での結合を最大にするため、ポリマーコンジュゲーション反応を塩基性のpHで行う。例えば、Zalipskyら, Biotech. & App. Biochem., Vol 15, p.100‐114 (1992)では、PEG化についてSC‐PEG試薬を評価しており、約pH9.3で最適な反応性となることが報告されている。しかしながら、本発明の方法は、活性化ポリマー鎖の一部をヒスチジンアミノ基へ結合させ、リシン結合部位にあまり重きを置かないようにするために（しかし、除外するものではない）、より低いpHで反応を行うことを包含するものである。
【００３６】
さらに、各種のポリマーコンジュゲート位置異性体の生物学的活性が、位置異性体の各々のポリマー置換度が同じであっても、予想外に異なることも見出した。
【００３７】
本明細書に記載の方法は、PEG等のポリマーをIFN分子の特定のヒスチジン残基へ結合させる新規な結合を提供するものである。好適な実施形態では、コンジュゲーション反応の結果、かなりの量（即ち、少なくとも約30％）のコンジュゲートがIFNα2bのHis34等のIFNヒスチジン部位に結合している。
【００３８】
位置異性体の相対的な分布が、コンジュゲーション反応を行うpHに大きく依存していることも予想外に判明した。pHを塩基性からわずかに酸性のpH（5.5〜6.5）へ変えると、IFNα2bのHis34に結合したコンジュゲートと、これより少ないがN末端(Cys1)に結合したコンジュゲートの形成が有利になる。一方、コンジュゲーション反応の際にpH(8〜10)を用いると、カチオン交換クロマトグラフィーで確認されるように、リシンに関連する結合部位の形成が有利になる。IFNα2bが含まれないような場合には、当然His34部位が常に存在するわけではない。それにもかかわらず、この反応条件は活性化ポリマーのHisへの共有結合を可能にする。このように本出願人は、反応系のpHが、タンパク質表面におけるいくつかのタイプの活性化ポリマーの配置に対して、特に異なるアミノ酸残基（即ち、リシン対N末端アミン対ヒスチジン）に関して、影響を及ぼすことを明らかにした。
【００３９】
５．コンジュゲートの分画
本発明の方法は、単一ポリマー鎖を有するコンジュゲートを相当な量で製造するものであるが、ポリアルキレンオキシド置換度が異なるコンジュゲートも得られる。コンジュゲートを形成していないPAOとαIFNも残存している。この混合物は、典型的には、１種以上のリン酸アニオン、塩化物アニオンおよび重炭酸アニオンを含有する反応緩衝液中に含まれる。PAO、αIFNおよびコンジュゲートからなる混合物の分画は、好ましくは約１〜10mg/mlのPAO‐αIFNコンジュゲートを含有する緩衝溶液中で行う。適切な分画用溶液のpHは約7.0〜約9.0であり、好ましくは約7.5〜約8.5である。この溶液には、好ましくはKCl、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、NaHCO3、NaBO4、(NH4)2CO3およびグリシンNaOHから選ばれる１種以上の緩衝塩が含まれる。リン酸ナトリウム緩衝液が好適である。
【００４０】
反応緩衝液に応じて、αIFN‐ポリマーコンジュゲートを含有する溶液を、最初に緩衝液交換／限外濾過にかける必要がある。例えば、αIFNコンジュゲート溶液を、低分子量カットオフ(10,000〜30,000ダルトン)膜で限外濾過することができる。これにより、界面活性剤が含まれている場合は、それも大部分が除去されるであろう。
【００４１】
所望の種へのコンジュゲートの分画は、好ましくはアニオン交換媒体を用いて行う。このような媒体は、１〜４本のポリマー鎖を有するαIFN‐ポリマーコンジュゲート、過剰のポリマーおよび未修飾αIFNを選択的に結合することができる。こうした分画が起こるのは、各種置換度のαIFN分子が、いくぶん予想可能な様式で変化する等電点を有することによる。例えば、αIFNの等電点はタンパク質の表面に存在し得る有効なアミノ基の数で決まる。これらのアミノ基は、ポリアルキレンオキシドコンジュゲートの結合点としても作用する。従って、ポリアルキレンオキシドの置換度が増加するにつれて等電点は低下し、アニオン交換樹脂に対するコンジュゲートの結合能は弱くなる。
【００４２】
本発明の方法には、極性の強いアニオン交換樹脂の使用が特に好適である。このため、第四級アミンでコーティングされたアニオン交換樹脂を利用する。第四級アミン樹脂は、ポリマーマトリックスまたはシリカマトリックスのいずれへもコーティングすることができるが、ポリマーマトリックスが好適である。多くのテトラメチルアミン（即ち、第四級メチルアミン）のアニオン交換樹脂は、支持マトリックスへコーティングされたものが市販されている。本発明での使用に適した市販の第四級アニオン交換樹脂としては、Bio‐Sepraより市販されているQ‐HD;Sepracor, Inc. (Marlborough, Massachusetts)のためにIBF (Garenne, France)が製造したポリマーマトリックス上へコーティングされた第四級アミン樹脂であるQATRISACRYL（登録商標）およびQMA‐SPHEROSIL（登録商標）;EM‐Separators (Gibbstown, New Jersey)製のポリマーマトリックス上へコーティングされたテトラメチルアミノエチル樹脂であるTMAE650M（登録商標）;TosoHaas(Montgomeryville, PA)製のポリマーマトリックス上へコーティングされた第四級アミン樹脂であるQAE550C（登録商標）およびSUPERQC（登録商標）が挙げられる。Millipore (Millford, MA)製のQMAAccellおよびJTBaker (Phillipsburg, NJ)製のPEI樹脂を使用してもよい。
【００４３】
アニオン交換樹脂をカラムへ充填し、常法で平衡化させる。コンジュゲートさせたαIFN溶液とpHおよび重量オスモル濃度が同一の緩衝液を使用する。次いで、コンジュゲートを含有する溶液をカラムへ吸着させる。ローディングが完了したら、塩濃度を次第に増加させた溶離緩衝液の勾配流をカラムに流し、ポリアルキレンオキシドをコンジュゲートさせたαIFNの所望の画分を溶離させる。この画分は本質的に均一な分子量と置換度である。
【００４４】
好適なIFNコンジュゲート画分はαIFN分子当たり１〜４本のポリマー鎖を有する。より好ましくは、この画分はαIFN分子当たり約１〜２本のポリマー鎖を含み、最も好ましくは約１本のポリマー鎖を含む。溶離緩衝液には、好ましくはKCl、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、NaHCO3、NaBO4および(NH4)2CO3から選ばれる１種以上の塩が含まれる。これらの画分は、実質的に他のコンジュゲートを含まない。次いで、いずれの未コンジュゲート種も、従来の技術によってカラムから逆洗することができる。
【００４５】
濃度を次第に増加させた複数の無勾配工程を利用する技術も使用できる。濃度を次第に増加させた複数の無勾配溶離工程は、αIFN‐ポリマーコンジュゲートの逐次溶離をもたらす。各々の画分内ではポリマーコンジュゲーションの程度は実質的に均一である。しかしながら、各々の画分のポリマーコンジュゲーションの程度は、溶離時間が長くなると減少するであろう。例えば、Sepracor, Inc.製のQ‐HDカラムと希リン酸ナトリウム溶液(10mM NaPO4イオン)を用いて、コンジュゲートのイオン交換精製を行うこともできる。サンプルを10mM NaPO4で洗浄して未反応のPAOを除去し、その後NaClでの段階的な勾配溶離を利用する。10mMNaClでの溶離によって、IFN当たり3本より多くのポリマー鎖PAOを有するコンジュゲートを含有する画分を回収し、50mMNaClでの溶離によって、１〜２本のポリマー鎖を含有するコンジュゲートを回収し、150mMNaClでの溶離によって、未修飾IFNを回収する。
【００４６】
溶離を行う温度範囲は、約４℃〜約25℃である。好ましくは、約６℃〜約22℃の温度で溶離を行う。PAO‐αIFN画分の溶離は、254nmにおけるUV吸光度で検出する。画分回収は、単純な時間溶離プロフィールによって行うことができる。好適な画分は、溶離緩衝液中にプールすることもできる。
【００４７】
６．界面活性剤
別の好適な態様では、反応条件に界面活性剤の有無が含まれる。本発明の方法で使用される界面活性剤は、イオン性の界面活性剤である。特に好適な界面活性剤の一つは、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)である。ドデシル硫酸リチウム、第四級アンモニウム化合物、タウロコール酸、カプリル酸、デカンスルホン酸等のその他のイオン性界面活性剤を用いることもできる。非イオン性界面活性剤を使用してもよい。例えば、ポリオキシエチレンソルビタン(Tweens)、ポリオキシエチレンエーテル(Tritons)等の物質を用いることができる。Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry (1992) Calbiochem Corp.も参照されたい。本発明の方法に使用する界面活性剤の種類に対する制限は、IFNを実質的に変性させないことと、ポリマーコンジュゲーションを完全には抑制しないことだけである。界面活性剤は、反応混合物中に約0.01〜0.5％、好ましくは0.05〜0.5％、最も好ましくは約0.075〜0.25％の量で含まれる。界面活性剤の混合物も考慮される。
【００４８】
７．薬物動態パラメーター
上述したように、本発明の組成物は、ポリマー鎖がインターフェロン分子の異なる部位に結合しているポリマー‐IFN種の不均一混合物を含むものである。コンジュゲートの不均一な特性にも係わらず、本発明の組成物はインターフェロンの治療効果を最大にする予測可能なin vivo薬物動態プロフィールを有する。
【００４９】
IFNαを含有する本発明の組成物には、好ましくは少なくとも約15％のポリマー‐Hisコンジュゲートが含まれ、より好ましくは少なくとも約30％、最も好ましくは少なくとも約40％のポリマー‐Hisコンジュゲートが含まれる。理論に拘束されるものではないが、本発明の組成物に含まれるHis‐位置異性体の結合は、Lys‐位置異性体の結合に比べて比較的不安定であると考えられる。その結果、生理学的なpHでは、この組成物は、投与後に活性を比較的円滑に発揮し、効果も持続される。このプロフィールのため、この組成物を未修飾IFNの場合よりも少ない頻度で投与することが可能となる。
【００５０】
８．治療方法
本発明の別の態様は、哺乳動物（好ましくは、ヒト）における様々な医学的症状の治療方法を提供するものである。この方法には、本明細書に記載の通りに製造された、有効量のαIFN‐ポリマーコンジュゲート含有組成物を、このような治療を必要とする哺乳動物へ投与することが含まれる。コンジュゲートは、特にインターフェロン感受性症状またはインターフェロン療法に対して陽性つまり有効に応答する症状（これらの用語は医学分野で知られている）の治療に有用である。
【００５１】
本発明に従って治療できる症状は、通常、インターフェロンαを用いた治療に感受性を示す症状である。例えば、感受性症状としては、インターフェロンα療法に対して陽性つまり有効に応答する症状（これらの用語は医学分野で知られている）が挙げられる。本発明の場合、インターフェロンα療法で治療できる症状としては、インターフェロンαによる治療がある程度の有効性を示すものの、負の副作用が治療の利益よりも勝るためにインターフェロンαで治療できない症状が挙げられる。例えば、α療法に付随する副作用のため、インターフェロンαを用いるエプスタイン‐バーウイルスの治療が事実上禁止されている。本発明を実施することで、従来のインターフェロンα治療に比べて副作用が実質的に軽減または除去される。
【００５２】
インターフェロンで治療できる典型的な症状としては、細胞増殖性疾患、特に癌（例えば、ヘアリーセル白血病、カポジ肉腫、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、基底細胞癌および悪性黒色腫、卵巣癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫）並びにウイルス感染症が挙げられるが、これらに限定されない。何の制限もなしに、インターフェロンによる治療を使用して、インターフェロン感受性ウイルスの複製を抑制することが有効な症状を治療してもよい。本発明に従って治療し得るウイルス感染症としては、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、他の非A非B型肝炎、ヘルペスウイルス、エプスタイン‐バーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、単純ヘルぺス、ヒト・ヘルペスウイルス６(HHV‐6)、乳頭腫、ポックスウイルス、ピコルナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、ヒトTリンパ球好性ウイルス１型および２型(HTLV‐1/‐2)、ヒト・ロタウイルス、狂犬病、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)を含むレトロウイルス、脳炎および呼吸器ウイルス感染症が挙げられる。本発明の方法は、各種免疫応答を調節するのに使用することもできる。
【００５３】
インターフェロンαの変異体は、ヘアリーセル白血病、性病いぼ、カポジ肉腫、および慢性非A非B型肝炎の治療に対して米国および他の諸国で現在認可されており、INTRON（登録商標）Aの商品名で販売されているインターフェロンα‐2b（Schering Corporation, Kenilworth N.J.）、Roferon（登録商標）Aの商品名で販売されているインターフェロンα‐2a（Hoffmann‐La Roche, Nutley, N.J.）、およびInfergenTMの商品名で販売されているコンセンサス・インターフェロン（Amgen, Thousand Oaks, CA）がある。全てのインターフェロンのうち、インターフェロンα‐2bが慢性C型肝炎感染の治療に対して世界中で最も広く認可されているため、インターフェロンα‐2bを本発明の実施に従って慢性C型肝炎の治療に用いるのがもっとも好適である。
【００５４】
明記された投与量を一日おきに投与してもよいが、好ましくは週に１回または２回投与する。用量は、通常、注射により少なくとも24週間投与する。
【００５５】
用量の投与は、静脈内、皮下、筋肉内、または他の許容可能な全身投与法で行うことができる。臨床医の判断に基づいて、投薬量と使用する治療レジメは、もちろん治療される患者の年齢、性別および病歴、好中球数（即ち、好中球減少症の重篤度）、特定の疾患症状の重篤度、並びに患者の治療に対する許容度（これは、局所的な毒性および全身性の副作用より明白となる）に依存する。投薬量と頻度は、好中球数の初期スクリーニング中に決定することができる。
【００５６】
本発明のコンジュゲートを含有する組成物を使用して通常の医薬製剤を調製することもできる。この製剤は、治療上有効な量のインターフェロン‐ポリマーコンジュゲート組成物と製薬上許容可能な担体とを含むものである。例えば、必要であれば、アジュバント、希釈剤、保存剤および／または可溶化剤を本発明の実施に用いてもよい。本発明の組成物を含めてインターフェロン医薬組成物は、ある範囲のpHとイオン強度を有する各種緩衝液の希釈剤（例えば、Tris‐HCl、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液）、担体（例えば、ヒト血清アルブミン）、可溶化剤（例えば、tween、ポリソルベート）、および保存剤（例えば、チメロサール(thimerosol)、ベンジルアルコール）を含んでいてもよい。例えば、米国特許第4,496,537号を参照のこと。
【００５７】
上述の症状を治療するのに投与されるα‐IFNポリマーコンジュゲートの量は、ポリマーコンジュゲートのIFN活性に基づく。これは、陽性の臨床応答に有意に作用するのに充分な量である。臨床上の用量は数人の患者にあるレベルの副作用を起こすことがあるが、ヒトを含む哺乳動物に対する最大用量は、管理できない臨床上重大な副作用を引き起こすことのない最高用量である。本発明では、このような臨床上重大な副作用は、重篤なインフルエンザ様の徴候、中枢神経系抑制、重篤な胃腸障害、脱毛、激しい痒みまたは発疹のために療法の中断を余儀なくされる副作用である。実質的な白血球および／または赤血球および／または肝酵素の異常あるいは貧血様症状も用量を制限するものである。
【００５８】
当然、各種αIFN組成物の投与量は、αIFN成分と選択されたポリマーに応じて多少変化するであろう。しかしながら、一般に、哺乳動物の症状に応じて、１日に約100,000〜約数100万IU/m2の量でコンジュゲートを投与する。上述した範囲は例示に過ぎず、当業者であれば、臨床経験と治療徴候に基づいて、選択したコンジュゲートの最適用量を決められるであろう。
【００５９】
医薬組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、凍結乾燥粉末等の剤形であってよく、当業界で周知の方法に従って調製される。医師の要望に応じて経口または吸入経路を利用してもよいが、このような組成物の投与を主に非経口経路で行うことも考えられる。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、以下の実施例は決して本発明の有効な範囲を限定するものではない。
【００６１】
実施例１
SDS(0.1％)の存在下でのrαIFN‐PEG5,000の製造
本実施例では、Schering‐Plough Corporation (Kenilworth, New Jersey)の製品である組換えαIFN‐2b（rαIFN）を、米国特許第5,122,614号に記載の活性化ポリエチレングリコール‐N‐スクシンイミドカーボネート(SC‐PEG)とコンジュゲートさせた。このポリマーの分子量は約5,000であった。
【００６２】
36mgのrαIFNを、Centricon‐10［Amicon Corporation (Beverly, Mass.)の製品］を用いて0.1Mのリン酸ナトリウム(pH7.5)で透析した。rαIFNの最終濃度を約3mg/mlとした。0.1mlの10％SDSをrαIFNへ添加し、室温で10分間インキュベートした。その後、42mgのSC‐PEG5,000をタンパク質‐SDS溶液へ添加し、室温で2時間攪拌し、次いでグリシンでクエンチした。次に、反応混合物を10ｍMのリン酸ナトリウム(pH8)へ透析し、Centricon‐30を用いてPEG化されたIFNを分画した。
【００６３】
実施例２
SDS(0.1％)の存在下でのrαIFN‐PEG12,000の製造
本実施例では、ポリエチレングリコールの分子量を約12,000とした以外は実施例１の工程を繰り返した。反応工程を厳密に同一とし、PEG12,000コンジュゲートを得た。
【００６４】
実施例３
2PEG5,000rαIFNの分画
本実施例では、実施例１に従って製造したコンジュゲートを分画して所望の2‐PEG5,000画分を得た。リン酸ナトリウム緩衝液中のPEG‐αIFNをQHDアニオン交換カラムへロードした。2‐PEG画分を０〜400mM塩化ナトリウム勾配（10mMリン酸緩衝液中、pH8）で溶離した。2‐PEG画分をサイズ排除クロマトグラフィーとSDS‐PAGEを用いて確認した。
【００６５】
実施例４
2PEG12,000rαIFNの分画
実施例２のポリマーコンジュゲートを実施例３に記載の手順で分画し、同様に確認した。
【００６６】
実施例５〜８
これらの実施例では、界面活性剤を使用しなかった以外は上述した通りにPEG12,000‐rαIFNの調製物をさらに製造した。コンジュゲーション反応の後、サンプルを残存活性とPEG数について試験した。結果を下記の表に示す。
【表１】
2005015464.tif 000002
実施例９
比較データ
本実施例では、実施例３の生成物（SDS‐2‐PEG‐5,000rαIFN）、界面活性剤の不在下で作製した2‐PEG5,000rαIFN、およびコンジュゲートされていないrαIFNを試験した。A549ヒト肺ガン細胞にチャレンジするEMCウイルスの活性をCPEアッセイを用いて求めた。循環寿命は、1,000,000単位を投与した群のラット３匹の血液から得られた平均値を用いて求めた（測定は７日間にわたって行った）。
【表２】
2005015464.tif 000003
【００６７】
このデータより、本発明の方法の利点は明らかである。残存活性は標準技術を使用して得られたものの２倍以上である。
【００６８】
実施例10
本実施例では、上述の方法に従って製造した2PEG‐rαIFNコンジュゲートを用いて様々な薬物動態データを得た。これらのサンプルを表４のプロトコールに従って未修飾IFNと比較した。サンプルBはSDSを用いて調製した。
【表３】
2005015464.tif 000004
【００６９】
例えば：
【表４】
2005015464.tif 000005
【００７０】
PEG‐インターフェロンの薬物動態データの要約
【表５】
2005015464.tif 000006
【表６】
2005015464.tif 000007
【００７１】
以上のデータより以下の結論が得られる：
分子量5,000および12,000の双方で製造した2‐PEG‐rαIFNコンジュゲートは、哺乳動物の未修飾インターフェロンに比べて明らかな利点を有している。皮下投与した組成物の場合、タンパク質と約２個のPEGとのコンジュゲーションによってTmaxが実質的に増加している。慢性症状の場合には、Tmaxは長い方が望ましく、効果の持続期間が長くなるため反復投与を行う間隔をあけることが可能になる。しかしながら、さらに予測できなかったのは、2‐PEG12,000コンジュゲートが予想外にAUCを10倍以上増加し得るということであった。この曲線下面積の劇的な増加は、付加ポリマーの重量に比例するものではなかった。明らかに、この予想外の増加によって治療上の利点が認められる。
【００７２】
実施例11
PEG化に対するpHの影響
この影響を調べるため、mPEG12,000（界面活性剤は使用せず）を用いて様々なpH（5.4、6.5、8.0および10.0）で実施例５〜８のポリマーコンジュゲーション(PEG化)反応を繰り返した。pH5.4、6.5および8.0における反応では、2.6gのSC‐PEG12,000と１gのIFNとの比（モル比3.9:1）を使用し、pH10における反応では、2.1gのSC‐PEG12,000と１gのIFNとの比（モル比3.2:1）を使用した。反応の終了時に、グリシンを添加して残存しているPEG化試薬をクエンチした。次いで、各反応で得られた生成物をQ‐hyperD樹脂を用いてpH８で塩溶離により精製し、未反応の成分を除去した。
【００７３】
様々なpHで得られた精製コンジュゲートを、その生物学的活性、ヒドロキシルアミン感受性および位置異性体の分布について評価した。生物学的活性は比活性で測定した(MTT‐CPEアッセイ)。
【００７４】
ヒドロキシルアミン感受性を考慮して、コンジュゲートの何％がヒスチジン部位（IFN‐His34を含む）でPEG化されたかを求めた。ヒドロキシルアミンは、本発明者らによってPEGをIFNヒスチジンから選択的に切断することが見出された既知の試薬である。各サンプルのアリコート(50μl)を0.45mlの10mMリン酸ナトリウムpH7.0で希釈した。このタンパク質溶液のアリコート(150μl)を150μlの0.5Mヒドロキシルアミンで処理し、室温で60分間インキュベートした。その後、75μl容量をカチオン交換クロマトグラフィー用のMini‐Sカラム(PharmaciaBiotech)へロードした。移動相Aには、10mM酢酸ナトリウムpH5.3緩衝液と25％2‐プロパノールを含ませた。移動相Bには、移動相Aに溶解した500mM塩化ナトリウムを含ませた。流速を0.5ml／分に設定し、溶離タンパク質を214nmで検出した。個々のPEG‐IFN溶液を、2‐プロパノール(5％)を含有する10mM酢酸ナトリウムpH5.3で１mg/mlのタンパク質濃度へ希釈した。注入容量は、タンパク質濃度に応じて10〜30μlとした。直線勾配を使用した。結果を下記表７および図１に示す。
【００７５】
図１には、異なるpH反応生成物のMono‐Sカチオン交換クロマトグラフィーカラムから得られたクロマトグラムを重ねて示す。各位置異性体に対するポリマーコンジュゲーションの部位を、カチオン交換クロマトグラフィーの個々のピークをタンパク質分解酵素（トリプシン、V8‐プロテアーゼ、キモトリプシンまたはサブチリシン）を用いて消化し、PEG化された断片を単離し、N末端配列決定および質量分析によって分析することにより決定した。
【００７６】
図から明らかなように、位置異性体の分布は、反応のpHが変わると有意に変化する。pHが高いほど、His34‐結合PEG‐IFN生成物が減少し、あまり劇的ではないがCysl‐結合PEG‐IFN生成物も減少する。
【００７７】
表７には、MTT‐CPEバイオアッセイを用いて決定したIFNの生物活性の比活性と、様々なコンジュゲート生成物について0.5Mヒドロキシルアミンで２時間25℃にて処理した際に放出されたIFNの量とを要約する。これらの所見より、図１に見られる差異は、生成物の生物学的特性が異なることにも関連しているものと認められる。コンジュゲーションを高いpH（即ち、８または10）で行うと、形成される生成物は生物活性が低く、ヒドロキシルアミンに対する耐性が高くなる。これは、高pHではHis34に結合するポリマーが少なくなることを意味する。
【表７】
2005015464.tif 000008
【００７８】
上記の結果より、pHがコンジュゲーション反応を変えることのできるカギであり、位置異性体の相対分布がpHによって劇的に変化することが判る。予想外に、得られたPEG‐IFNの位置異性体混合物の生物活性も影響を受ける。
【００７９】
実施例12
ウレタン結合を形成する活性化ポリマーの比較
本実施例では、異なるタイプのウレタンリンカーを用いて反応条件に対するpHの影響を比較し、活性化基がポリマー結合部位と生物活性とを決定する際に役割を担うか否か検討した。特に、インターフェロンα‐2b(IFN)用の活性化ポリマー試薬として、先の実施例で使用したメトキシポリ(エチレングリコール)‐スクシンイミジルカーボネートMW12,000（SC‐PEG12,000）を、米国特許第5,382,657号に開示のメトキシポリ(エチレングリコール)‐2‐ピリジルカーボネートMW12,000（PC‐PEG12,000）と比較した。コンジュゲーション反応を、SC‐PEG12,000とPC‐PEG12,000の両方の試薬についてpH6.5および10.0で行った。分析のため、４種のモノPEG化IFNサンプルを作製するのに使用した条件は、１）SC‐PEG12,000についてpH6.5、２）PC‐PEG12,000についてpH6.5、３）SC‐PEG12,000についてpH10.0、および４）PC‐PEG12,000についてpH10.0とした。pH6.5の各場合には、モル比3.9:１のPEG:IFNを使用した。pH10.0の各場合には、モル比3.2:１のPEG:IFNを使用した。これらの条件を選択して、反応pHとリンカーの双方が最終生成物の組成物に及ぼす影響を評価した。
【００８０】
各反応条件でコンジュゲートさせた材料を回収し、Mini‐Sクロマトグラフィーアッセイを用いて生物活性（CPEアッセイ）と位置異性体の分布について試験した。
【００８１】
IFNをPC‐PEG12,000とpH6.5で反応させて作製したPEG‐IFNは、両試薬ともウレタン結合を形成するにも係わらず、SC‐PEG12,000で作製したものよりも生物学的活性が低かった。従って、リンカー同士が似ているにも係わらず、オキシカルボニル‐オキシ‐N‐ジカルボキシイミド活性化ポリマーであるSC‐PEGがより優先的にHis34へ結合することが判明した。しかしながら、興味深いことに、PC‐PEG12,000とSC‐PEG12,000の双方を用いて反応をpH10で行って作製したPEG‐IFN生成物は、同様の生物学的活性を有していた。しかしながら、両者の場合、活性はSC‐PEG12,000についてpH6.5で得られるものよりも低かった。
【００８２】
Mini‐Sクロマトグラフィーアッセイにより、ヒスチジン‐34‐結合PEG‐IFNが、SC‐PEG12,000をpH6.5で用いた場合に存在する主要な位置異性体であることが判明した。リシン‐121‐結合PEG‐IFNは、反応をpH6.5にてPC‐PEG12,000を用いて行った場合に存在する主要な位置異性体である。pH10では、リシン‐121‐結合PEG‐IFNが、いずれの試薬を用いても主要な生成物である。表8を参照されたい。
【００８３】
このように、酸性pHとオキシカルボニル‐オキシ‐N‐ジカルボキシイミド活性化ポリマー（即ち、SC‐PEG）を用いることで、SC‐PEG12,000の代わりにPC‐PEG12,000等の別のウレタン結合形成活性化ポリマーで置き換えても再現することのできない特有の生成物であるコンジュゲートが製造される。
【００８４】
上記の材料には、サイズ排除HPLCアッセイで示されるように、合計５％未満のジ‐PEGおよびマルチ‐PEG‐IFNが含まれていた。
【表８】
2005015464.tif 000009
【００８５】
実施例13
カチオン交換クロマトグラフィーによる特性決定
本実施例では、ポリマー結合部位を決定し、個々の位置異性体を同定するために、実施例11に記載の手順(pH6.5)を用いて製造したPEG‐IFN生成物の複数のバッチを、カチオン交換クロマトグラフィーを用いて分析用に分離した。カチオン交換器はMini‐Sカラム(Pharmacia Biotech)とした。移動相Aには10mM酢酸ナトリウムpH5.3緩衝液と25％2‐プロパノールを含ませた。移動相Bには、移動相Aに溶解した500mM塩化ナトリウムを含ませた。流速を0.5ml／分に設定し、溶離タンパク質を214nmで検出した。個々のPEG‐IFN溶液を、2‐プロパノール(5％)を含有する10mM酢酸ナトリウムpH5.3で１mg/mlのタンパク質濃度へ希釈した。注入容量は、タンパク質濃度に応じて10〜30μlとした。以下の直線勾配を使用した：
2005015464.tif 000010
【００８６】
結果を下記表９に示し、図２に図示する。
【表９】
2005015464.tif 000011
【００８７】
これらの結果より、コンジュゲートの大部分がピーク３と４（His‐34結合PEG‐IFN）に見出されたことが判る。この結果は、予想に反して、コンジュゲートの多くが、リシンアミノ基の１つよりもむしろヒスチジンへポリマーを結合させることで形成されたことも示している。
【００８８】
本発明の他の実施形態は、本明細書および本明細書に開示した本発明の実施を考慮すれば当業者には明らかであろう。明細書および実施例は単なる例示に過ぎず、本発明の真の範囲と概念は以下の請求の範囲で示されるものと理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】実施例11で言及する一連のクロマトグラムである。
【図２】実施例13で言及する一連のクロマトグラムである。
【図１】
2005015464.tif 000012
【図２】
2005015464.tif 000013