(57)【要約】【課題】アスタキサンチンなどのカロテノイドを産生することができる細菌を培養してカロテノイドを高収率で製造する方法を提供する。【解決手段】カロテノイド生産菌［例；アグロバクテリウム・アウランティアカス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）  ｓｐ．ｎｏｖ  Ｎ−８１１０６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３）またはその変異体］を、０．５ｐｐｍ未満の酸素が存在する培養液、又は酸化還元電位−２００ｍＶ〜−７０ｍＶの培養液で培養し、その菌体または培養液からカロテノイドを回収する。【選択図】    選択図なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カロテノイド生産菌を、０．５ｐｐｍ未満の酸素が存在する培養液、又は酸化還元電位−２００ｍＶ〜−７０ｍＶの培養液で培養し、その菌体または培養液からカロテノイドを回収すること特徴とする、カロテノイドの製造法。
【請求項２】
請求項１に記載の製造法において、カロテノイド生産細菌がアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の製造法において、アグロバクテリウム属細菌が、アグロバクテリウム・アウランティアカス  ｓｐ．ｎｏｖ  Ｎ−８１１０６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３）またはその変異体であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂溶性色素であるカロテノイド、特にアスタキサンチンを製造する方法に関するものである。アスタキサンチンは養殖サケ・マス・マダイの色揚げ剤や鶏卵の色調改善剤、健康補助食品、医薬品として有用な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
アスタキサンチンはβ−カロチンやリコペンなどと同じカロテノイド系の色素で、オキアミ、カニ、エビなどの甲殻類やマダイ、サケ、マスなどの魚類、フラミンゴなどの鳥類、藻類や微生物等に広く分布する天然の化合物である。近年、アスタキサンチンはサケやマス、マダイ等の養殖魚の色揚げ剤や鶏卵の色調改善剤として需要が増加している他、抗酸化活性や抗癌活性などの様々な生理的作用が確認され、医薬品や健康補助食品としての利用も注目されている。
【０００３】
アスタキサンチンの製造方法としては、化学合成品、天然物からの抽出品、微生物による発酵生産品などがあるが、現在は主に価格等の要因から化学合成品が使われている。しかし、化学合成品は原料に臭素および塩素を含むハロゲン系化合物や重金属類を使用するため安全性に懸念があり（例えば特許文献１参照）、消費者の自然、天然志向にともない天然物由来のアスタキサンチンが注目されている。
【０００４】
天然物からの抽出品としてはオキアミ等からの抽出品があるが、これらは含量が低く、採取、抽出、精製などに多大な労力を要し、コスト的に問題があった。
【０００５】
微生物を利用した製法としては、酵母ではファフィア・ロドチーマ（Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）（例えば非特許文献１参照）、藻類ではヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）（例えば非特許文献２参照）、細菌ではアグロバクテリウム・アウランティアカス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）（例えば非特許文献３参照）の報告がある。
【０００６】
ファフィア酵母は増殖速度が遅いため培養日数が長く、細胞壁の破壊が困難なために抽出効率が低く、含量が少ないためコスト高である。ヘマトコッカス藻類は増殖速度が非常に遅いために非常に培養日数が長く、光を必要とするため立地条件や設備などに制約がある他、クロロフィルなどの夾雑物の除去が必要になりコスト高である。細菌による方法は増殖速度が早いため培養時間が短く、細胞壁が破壊し易いため抽出が容易で、カロテノイドの工業的生産に適している。
【０００７】
アグロバクテリウム・アウランティアカスを用いたカロテノイド合成の研究は横山らにより報告され、液量や振とう条件を変えることでカロテノイド成分が異なることを見出した（例えば非特許文献４参照）。すなわち、培養液中の溶存酸素濃度がカロテノイドの成分に影響することを示し、通常の好気性細菌よりも低い酸素供給条件が適していることがわかった。しかしながらこの報告はフラスコを用いた結果であるため、具体的な最適酸素濃度についてはわからず、工業的な生産を考えた場合に問題があった。また、他の細菌としてはパラコッカス属細菌による例があり、酸素電極を用いて溶存酸素濃度をかえることでカロテノイドの成分が変化することを示し、２０〜３０％の飽和酸素濃度がアスタキサンチン生産に適することを報告している（例えば特許文献２参照）。しかし飽和酸素濃度５％以下の酸素濃度については報告がなく、酸化還元電位についても示されていない。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４２８３５５９号
【０００９】
【非特許文献１】Ａｎｄｒｅｗｅｓ，Ａ．Ｇ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５，１００３，１９７６
【非特許文献２】Ｒｅｎｓｔｒｏｍ，Ｂら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０，２５６１，１９８１
【非特許文献３】Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８，１８４２，１９９４
【非特許文献４】ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，１２８，１３９，１９９５
【特許文献２】特開２００１−３５２９９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、アスタキサンチンなどのカロテノイドを産生することができる細菌を培養してカロテノイドを高収率で製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、培養液中の酸素濃度または酸化還元電位を制限することにより、効率良くカロテノイドが生産されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、カロテノイド生産菌を、０．５ｐｐｍ未満の酸素が存在する培養液、又は酸化還元電位−２００ｍＶ〜−７０ｍＶの培養液で培養し、その菌体または培養液からカロテノイドを回収すること特徴とする、カロテノイドの製造法である。以下に本発明を更に詳細に説明する。
【００１３】
本発明に用いる細菌としてはカロテノイド生産性のものであれば特に限定はないが、例えばアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌を用いることができ、中でもアグロバクテリウム・アウランティアカス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）  ｓｐ．ｎｏｖ  Ｎ−８１１０６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３）やその変異株が好ましい。そのような変異株として例えばＴＳＵＧ１Ｃ１１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１４６）をあげることができる。
【００１４】
本発明に用いる培養液としては、カロテノイド生産菌が増殖しカロテノイドを生産し得るものであればいずれを使用してもよく、例えば炭素源には廃糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸などが、窒素源にはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分や、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩等やグルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン等のアミノ酸類が、無機塩にはリン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩や塩化ナトリウムなどが、金属イオンには塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、塩化第１鉄、塩化第２鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム・２水和物、硫酸カルシウムなどが、ビタミン類として酵母エキスやビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン等が使用できる。
【００１５】
本発明では、カロテノイド生産菌を０．５ｐｐｍ未満の酸素が存在する培養液、又は酸化還元電位−２００ｍＶ〜−７０ｍＶの培養液で培養する。好ましくは通常の酸素電極の最低検出限界０．１ｐｐｍ未満の酸素が存在する培養液、または酸化還元電位が−１８０〜−１００ｍＶの培養液である。培養液の酸素濃度は直接測定してもよいが、０．５ｐｐｍ未満という希薄なために測定が困難な場合は、酸化還元電位をその指標とすることができるため、酸化還元電位−２００ｍＶ〜−７０ｍＶの培養液を用いればよい。
【００１６】
それ以外の培養の条件については、カロテノイド生産菌が増殖しカロテノイドを生産し得るものであれば特に限定はないが、例えば培養温度は１５〜３５℃が好ましく、ｐＨは６〜９が好ましく、培養時間は２４〜１６８時間が好ましい。なお、より効率的にカロテノイドを製造するためには、培養の初期には上述のものより高い酸素濃度または酸化還元電位の培養液で培養して菌体数を増加させ、その後、上述の範囲の酸素濃度または酸化還元電位の培養液を用いて培養することが好ましい。
【００１７】
本発明におけるカロテノイドの回収方法は、菌体または培養液から安定に効率良く回収されれば特に限定はなく、例えば抽出溶媒としてはメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド等がよい。抽出されたカロテノイドの定量は、各種カロテノイドが分離され定量性に優れる高速液体クロマトグラフィーにより行なうことが好ましい。
【００１８】
本発明で製造されるカロテノイドとしては、例えばアスタキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、β−カロテンなどがあげられる。特にアスタキサンチンが本法により好ましく製造される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によって、培養液の酸素濃度又は酸化還元電位を制御することにより、アスタキサンチンなどのカロテノイド化合物を効率良く生産することが可能になった。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２１】
カロテノイドの定量法
カロテノイドの定量は逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにて測定し、以下の操作手順で行なった。すなわち培養液の一部を遠心分離して菌体を回収し、適量の純水を加えチューブミキサーにて１０分間懸濁させる。次いで純水に対して９倍量のアセトンを加えてチューブミキサーにて３０分間攪拌後、１４，０００回転５分間遠心分離を行ない上清を回収し、一部を高速液体クロマトグラフィー（ＴＳｋ−ｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ、商品名、東ソー（株）製を使用）にて生成したカロテノイドを定量した。
【００２２】
実施例１
表１に示した組成の培地３００ｍｌを、５００ｍｌ容の三角フラスコに入れ１２１℃、２０分間で滅菌後、アグロバクテリウム・アウランティアカス  ｓｐ．ｎｏｖ  Ｎ−８１１０６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３）を植菌し、２５℃で１日間、毎分１００回転の振とう速度にて培養した液を前培養液とした。表１に示した培地の内、ペプトンを３０ｇ／Ｌ、酵母エキスを１５ｇ／Ｌ、グルコースを５０ｇ／Ｌに変更した培地２．５Ｌを５Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃、２０分間で滅菌後、得られた前培養液を植菌した。培養条件は温度２２℃、攪拌数毎分３５０回転、ｐＨ７．０〜７．２、通気は空気にて１ＶＶＭで制御し、約７２時間培養した。培養終了後の菌体内の総カロテノイド量、培養２４時間以降の平均酸化還元電位および溶存酸素濃度を表２に、カロテノイド成分の分析結果を表３に示した。酸化還元電位電極および溶存酸素電極はメトラー・トレド社製を使用した。
【００２３】
【表１】
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実施例２
攪拌数を毎分４５０回転としたこと以外は実施例１と同様な手順で培養を行ない、途中グルコースを７０ｇ加えた。この培養で得られた菌体内の総カロテノイド量、培養２４時間以降の平均酸化還元電位および溶存酸素濃度を表２に、カロテノイド成分の分析結果を表３に示した。
【００２４】
実施例３
攪拌数を毎分５００回転としたこと以外は実施例１と同様な手順で培養を行ない、途中グルコースを６３ｇ加えた。この培養で得られた菌体内の総カロテノイド量、培養２４時間以降の平均酸化還元電位および溶存酸素濃度を表２に、カロテノイド成分の分析結果を表３に示した。
【００２５】
比較例１
攪拌数を毎分５５０回転としたこと以外は実施例１と同様な手順で培養を行なった。この培養で得られた菌体内の総カロテノイド量、培養２４時間以降の平均酸化還元電位および溶存酸素濃度を表２に、カロテノイド成分の分析結果を表３に示した。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
【表３】
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