(57)【要約】      （修正有）【課題】  植物胚を自動的に収穫し、多段階でスクリーニングして、加工種子中への取り入れに適した胚を特定する方法及びシステムを提供する。【解決手段】本方法は一般に３つの工程を含む。第１に、概略のサイズ／形状に従って植物胚を例えば振動ふるい分けによって自動的に選別し、単数化して別個の胚単位にする。第２に、選別され、単数化された植物胚を、第１の分類方法を使用して分類する。例えば、各胚をカメラによって画像化し、画像を使用して、胚のより正確なサイズ／形状を確認する。第３に、第１の分類方法に合格した胚に、第２の分類方法を適用する。例えば、推定発芽力に従って胚を分類するための予め開発済みの分類アルゴリズムを、第１の分類方法において使用したのと同じ画像に適用して、発芽しそうな胚を特定することからなる。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物胚を自動的に収穫し、多段階でスクリーニングする方法であって：
植物胚を自動的に選別し、単数化することと；
選別され、単数化された植物胚を、第１の分類方法を使用して自動的に分類することと；
前記第１の分類方法に合格した前記植物胚を、第２の分類方法を使用して自動的に分類することと；を含む方法。
【請求項２】
自動選別及び単数化工程は、植物胚を発生培地から自動的に除去することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
植物胚の自動除去は、該植物胚を前記発生培地から水性液体を使用して洗い流すことを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
胚を選別し、単数化する工程は、フローサイトメーターを使用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
胚を選別し、単数化する工程は、前記胚をふるい分けのために多孔質材料の上に置くことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記多孔質材料上に置かれた前記胚に水性液体を噴霧して、任意の胚柄組織または残留胚柄塊（ＥＳＭ）を前記胚から除去する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記多孔質材料は多孔質コンベヤーベルトを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記胚は、前記胚を前記多孔質コンベヤーベルトの上に吐出するリザーバー中に置かれ、該リザーバーは、調節された仕方で前記胚を前記ベルトの上に吐出するように構成される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記リザーバーはパイプを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ふるい分け後に選別され、単数化される前記植物胚は分類コンベヤーベルト上に置かれ、これに沿って第１及び第２の自動分類方法は実行される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
選別され、単数化された植物胚は、前記多孔質コンベヤーベルトから前記分類コンベヤーベルトに重力によって移送される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記分類コンベヤーベルトは前記多孔質コンベヤーベルトに対して略垂直に延在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記選別され、単数化された植物胚は、前記分類コンベヤーベルトの長手方向に一列になって前記分類コンベヤーベルト上に置かれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記植物胚は互いに間隔を置いて離れて一列になって置かれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１または第２の自動分類方法によって望ましくないと分類された胚を前記分類コンベヤーベルトから自動的に除去する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
望ましくない胚の自動除去はジェットによって実行される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１及び第２の自動分類方法によって望ましいと分類された胚を前記分類コンベヤーベルトから自動的に除去する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
望ましい胚を自動的に除去する工程は、望ましい胚を受け入れ表面の上に予め規定されたアレイにして移送することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記受け入れ表面は、前記分類コンベヤーベルトに対してトレーの位置を調節するように構成された動力化プラットホーム上に取り付けた前記トレーを含み、その結果、重力によって前記分類コンベヤーベルトから予め規定されたアレイ中に落下する前記胚を受け入れる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
重力による前記分類コンベヤーベルトからの前記胚の落下はジェットによって援助される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記選別され、単数化された植物胚は、前記多孔質コンベヤーベルト上にある間に前記第１の分類方法に従って分類され、前記第１の分類方法に合格した前記植物胚は前記多孔質コンベヤーベルトからインデックストレーの上に予め規定されたアレイにして移送される、請求項７に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２の分類方法は、前記インデックストレー上に置かれた前記植物胚に関して実行される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２３】
第１の分類工程は前記胚をその形状及びサイズに基づいて分類し、第２の分類工程は前記胚をその推定発芽力に基づいて予め規定された分類モデルに従って分類する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２の分類方法は、前記第１の分類方法よりも選択的であり、多くの時間を要する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
植物胚を自動的に収穫し、多段階でスクリーニングするシステムであって：
植物胚を自動的に選別し、単数化するための手段と；
選別され、単数化された植物胚を、第１の分類方法を使用して自動的に分類するための手段と；
前記第１の分類方法に合格した前記植物胚を、第２の分類方法を使用して自動的に分類するための手段と；を備えるシステム。
【請求項２６】
植物胚を自動的に収穫し、多段階でスクリーニングする方法であって：
植物胚を自動的に選別し、単数化することと；
選別され、単数化された植物胚を、それらの推定発芽力に従って自動的に分類することと；
分類工程によって発芽しそうであると分類された胚を受け入れ表面の上に予め規定されたアレイにして自動的に置くことと；を含む方法。
【請求項２７】
自動選別及び単数化工程は、植物胚を発生培地から自動的に除去することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
自動選別及び単数化工程は、前記胚をふるい分けのために多孔質材料の上に置くことを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
自動分類工程は各胚の画像解析を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記自動分類は前記胚が分類コンベヤーベルト上で輸送される間に実行され、望ましいと分類された胚を受け入れ表面の上に自動的に置くことは、前記胚を前記分類コンベヤーベルトから前記受け入れ表面に移送することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記受け入れ表面は、前記分類コンベヤーベルトに対してトレーの位置を調節するように構成された動力化プラットホーム上に取り付けた前記トレーを含み、その結果、重力によって前記分類コンベヤーベルトから予め規定されたアレイ中に落下する前記胚を受け入れる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記受け入れ表面は、前記胚がミニロボットピックアンドプレイスシステムの使用によって正確に上に移送されるトレーを含む、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、加工種子（manufactured seed）に関し、より詳細には、大量生産植物胚を自動的に収穫し、多段階でスクリーニングして、加工種子中への取り入れに適した胚を特定する方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
選択された植物品種を組織培養によって再現することは、長年にわたって商業的な成功を収めてきた。この手法は、遺伝的に同一の選択された観賞植物、農業用植物及び森林種の大量生産を可能にした。この最後の群における木本は恐らく最大の難問だった。針葉樹を用いた若干の成功が１９７０年代に器官発生手法を使用して実現され、ここで、芽または他の器官は培養基上に置かれ、これは最終的に何度も複製された。新たに生じた芽を、根の発生を誘発する異なる培地上に置いた。これから、茎及び根を有する芽を土壌に植え付けた。
【０００３】
針葉樹の器官発生はブレイクスルーだったが、多量の取り扱いが必要だったためにコストは高かった。また、可能な遺伝的修正について若干の懸念があった。１０年後に、体細胞胚形成が、針葉樹組織培養のための主な手法になるのに十分な成功率を実現した。体細胞胚形成の場合、外植片（通常は種子または種子胚）を初期培地上に置き、ここでこれは増殖して多数の遺伝的に同一の未成熟胚になる。こうしたものを培養中に長時間保持し、増殖させて、特に望ましいクローンを増大させることができる。最終的には、未成熟胚を発生培地上に置き、ここでこれは成長して成熟種子胚の体細胞類似体になる。本説明において使用する“体細胞”胚は、対応する植物の種子から除去される植物胚である接合胚とは対照的に、実験室での全能性植物細胞の培養によってまたは誘発された分割多胚発生（induced cleavage polyembryogeny）によって発生する植物胚である。こうした胚を次に個別に選択し、さらなる発生のために発芽培地上に置く。他に、胚を、加工種子として周知の人工種子において使用してよい。
【０００４】
現在、植物の胚形成に関する多量の一連の一般的な技術文献及び増大しつつある一連の特許文献が存在する。針葉樹組織培養のための手順の例は、Gupta et al.に付与された米国特許第5,036,007号及び同第5,236,841号、Robertsに付与された同第5,183,757号、Attree et al.に付与された同第5,464,769号、並びにGuptaに付与された同第5,563,061号に見い出される。さらに、加工種子の幾つかの例は、Carlson et al.に付与された米国特許第5,701,699号に見い出すことができ、この開示を特に本明細書において参考のために引用する。簡潔に述べると、典型的な加工種子は、様々な材料の例えばセルロース系材料から製造され、合成配偶体（発芽培地）を充填された種皮（またはカプセル）で形成され、この中に、管様制限体によって囲繞される胚が受け入れられる。加工種子を土壌に植え付けた後に、種皮内部の胚は根を発生させ、最終的には発芽の最中に制限体を種皮と一緒に脱落させる。
【０００５】
胚形成手順におけるより労働集約的で独自の工程のうちの１つは、発芽に適した（例えば、加工種子中への取り入れに適した）個々の胚の発生培地からの選択的な収穫である。胚は、成熟度及び発生の多数の段階において存在してよい。成功裏に発芽して正常な植物に恐らくなりそうなものを、多数の目視により評価されるスクリーニング判定基準を使用して優先的に選択する。熟練した技術者は、発生培地中に埋込まれた各胚の形態学的特徴の例えば胚のサイズ、形状（例えば、軸対称）、子葉発生、表面テクスチャー、色、及びその他のものを評価し、望ましい胚を発生培地からピンセットを用いて人手で摘採する。摘採した望ましい胚を次に、さらなる処理のためにトレー上に２次元アレイにして注意深く並べる。これは極めて熟練を要し、しかもなお多くの時間を要し、費用のかかる煩雑な仕事である。さらに、これは、最終的な所望の出力が何百万もの植物である場合、生産上の大きなボトルネックとなる。
【０００６】
胚の選択のため、上記に説明した目視評価を補足するかまたは取って代わるある形態の機器画像解析を使用することが提案されてきた。例えば、ＰＣＴ出願第PCT/US00/40720号（WO 01/113702 A2）は、胚の画像を収集し、デジタル記憶する画像化カメラを含む、加工種子のための胚送達システムを開示している。画像を次にコンピュータに送り、これは、ＰＣＴ出願第PCT/US99/12128号（WO 99/63057）において開示されている分類方法を使用し、予め定められたパラメータ（軸対称、子葉発生、表面テクスチャー、色等）に基づいて、望ましさ（すなわち、発芽し、成長して正常な植物になる公算）に従って胚を分類する。望ましいと分類された胚をその後にミニロボットピックアンドプレイスシステムによって除去し、加工種子中に挿入する。こうした２つのＰＣＴ出願の開示を、特に本明細書において参考のために引用する。
【０００７】
機器画像化解析及びそれに続いて望ましい胚を加工種子中に自動挿入することは、胚形成手順の効率を増大させる上で成功だったが、胚を収穫する完全自動化プロセス、例えば、胚を発生培地から除去し、サイズ／形状に従って胚を選別し、単数化（singulate）して別個の単位にし（例えば、任意の望ましくない組織または他のデブリを除去することによって）、加工種子中への取り入れのために望ましさに従って分類するプロセスがなかった。すなわち、望ましい胚を発生培地から摘採し、さらなる成熟処理に適したアレイにして置くという現在の手作業に取って代わる可能性がある自動化プロセスがなかった。本発明は、現在の手作業に取って代わる可能性がある体細胞胚を収穫する完全自動化プロセスを提供することに関する。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、植物胚を自動的に収穫する方法及びシステムを提供する。１態様によれば、本発明の自動収穫方法は、植物胚を多段階でスクリーニングして、加工種子中への取り入れに適した胚、すなわち、加工種子中への取り入れに物理的に適合し（大きすぎず、小さすぎず、曲がりすぎていない等）かつまた発芽し、成長して正常な植物になりそうであると定性的に決定される胚を特定する。本自動収穫方法は一般に３つの工程を含む。第１に、サイズ／形状に従って植物胚を自動的に選別し、また単数化して別個の胚単位にする。例えば、胚を発生培地から（例えば、発生パッドから）水性液体を使用して洗い流し、多孔質材料を通してふるい分けしてよい。ふるい分けの間中、胚に水性液体をさらに噴霧して、望ましくない材料の例えば網下の胚、組織、及び残留胚柄塊（ＥＳＭ）（residual embryonal suspensor masses）を、多孔質材料の穴を通して除去し洗い流すことを促進する。１好適な具体例においては、多孔質材料を可動多孔質コンベヤーベルトとして形成して、その結果、選別され、単数化された胚をそれに続く分類段階に同時に輸送する。第２に、選別され、単数化された植物胚を、第１の分類方法を使用して分類する。例えば、胚の各々をカメラによって画像化し、画像を使用して、胚のサイズ／形状を確認する。予め規定されたサイズ／形状の範囲内の胚は第１の分類方法に合格したとみなされる。第３に、少なくとも第１の分類方法に合格した胚に、第２の分類方法を適用して、加工種子中への取り入れのために望ましい胚をさらに選択する。例えば、推定発芽力（putative germination vigor）（すなわち、成功裏に発芽する公算）に従って胚を分類するための予め開発済みの分類アルゴリズムを、第１のサイズ／形状分類方法において使用したのと同じ画像に適用して、発芽しそうな胚を特定してよい。第１及び第２の分類方法の両方に合格した胚を、加工種子中への取り入れに適したものとして特定する。
【０００９】
１態様によれば、第１及び第２の分類方法を分類コンベヤーベルトに沿って実行し、同時に、選別され、単数化された胚をこの上で輸送する。幾つかの分類方法においては、胚は一般に一列になって分類コンベヤーベルト上に配列することが好ましい。一列形状を実現するための様々な手段が提案される。例えば、分類コンベヤーベルトを、胚を選別し、単数化する多孔質コンベヤーベルトに対して略垂直に配列してよい。この形状に従って、多孔質コンベヤーの端部に輸送された選別され、単数化された胚は、重力によって分類コンベヤーベルトの上に落下して、一般にその上で一列になってよい。一列になった胚同士の間に十分な間隔を実現するために、適切な光学式走査システムによって観察される多孔質コンベヤーベルトから分類コンベヤーベルトの上に落下する胚の実際の速度に恐らく基づいて、胚を発生培地から多孔質コンベヤーベルトの上に洗い流す初期速度または多孔質コンベヤーベルトの速度を調節してよい。
【００１０】
別の態様によれば、本方法はさらに、第１または第２の分類方法で不合格になった望ましくない胚を、分類コンベヤーベルトから自動的に除去する工程を含む。例えば、コンピュータ制御の空気または液体ジェットを使用して、望ましくない胚を排出してよい。ジェット起動の正確なタイミングをコンピュータ制御することができ、というのは、各胚を画像化したカメラの撮影時刻（firing time）及び分類コンベヤーベルトの速度に基づいて、各望ましくない胚の位置は正確に分かっているからである。
【００１１】
さらに別の態様によれば、本方法はさらに、第１及び第２の分類方法の両方に合格した望ましい胚を、分類コンベヤーベルトから自動的に除去する工程を含む。１具体例においては、望ましい胚を、様々なさらなる成熟処理に適した一様に間隔を置いたアレイにして受け入れ表面の上に自動的に移送する。例えば、分類コンベヤーベルトに対してトレーの位置を調節するように構成された動力化プラットホーム上に取り付けたトレーによって、受け入れ表面が提供されてよい。各望ましい胚が分類コンベヤーベルトから落下する時に、各望ましい胚の既知の位置に基づいてトレーの位置を調節することによって、望ましい胚を一様に間隔を置いた２次元アレイにしてトレー上に受け入れてよい。
【００１２】
さらに別の態様によれば、本方法は、１つ以上の初期分類方法に合格した望ましい胚を、コンベヤーベルトから自動的に除去する工程を含んでよい。例えば、ミニロボットシステムを使用して、許容可能なサイズ／形状の範囲内であると決定された胚を拾い上げ、一様に間隔を置いた２次元アレイにして受け入れトレー上に正確に置いてよい。この時点で、胚を均一に配向してよく、例えば、その子葉端部は同じ方向を向く。トレー中で適切に配向し、正確に間隔を置いて離した胚を次に前進させて、さらなる処理、例えば、乾燥及びそれに続くさらなる分類方法を受けさせてよい。その後、トレー中のこうした適切に配向し、間隔を置いて離した胚は、容易に移送することができ、好都合にそれに対応して一様に間隔を置いたアレイにして配列してよい加工種子中に挿入することができる。
【００１３】
多段階で胚を分類することは、胚の効果的なスクリーニングを実現する。例えば、比較的に洗練されておらず、多くの時間を要しない分類方法を最初に使用して胚を分類することによって、より洗練され、より多くの時間を要する第２の分類方法に前進させる胚の数を低減することができる。従って、組み合わせるべき適切な分類方法を注意深く選択することによって、時間効率の良い仕方で次第に選択性と識別力とが増大する胚の分類を実現することができる。また、本発明は、胚を選別し、単数化することと（胚を発生培地から除去することから始める）、選別され、単数化された胚を推定発芽力に従って分類することと、望ましいと分類した胚を、さらなる成熟処理に適した仕方で、例えば、一様に間隔を置いた２次元アレイにしてトレー上にさらに配列することとを含む、体細胞胚を収穫する完全自動化プロセスを提供する。従って、本発明の自動化収穫方法及びシステムは、望ましい胚を発生培地から摘採するという現在の手作業に取って代わる可能性がある。
【００１４】
本発明の前述の態様と附随する利益の多くとは、添付図面と合わせて以下の詳細な説明を参照することによってより良く理解されるにつれて、より容易に了解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、大量生産胚の例えば体細胞胚を自動的に収穫し、好ましくは次第に複雑になるように多段階でスクリーニングして、加工種子中への取り入れに適した胚を特定する方法及びシステムに関する。本明細書において使用する加工種子中への取り入れに適した胚は、生化学的に成熟し（すなわち、発芽し、成長して正常な植物になりそうな）かつ加工種子中への取り入れに形態学的にまたは物理的に適した（すなわち、加工種子中に含まれるのに適切なサイズ／形状を有する）胚を意味する。
【００１６】
図１Ａを参照すると、発生室１０において、体細胞胚は、胚柄塊（ＥＳＭ）から発生し、発生表面１６中にまたはこの上に支持／懸濁される。発生表面は、図示するように発生パッドによって提供されてよく、またはゲル形態培地を含む任意の他の適切な発生培地によって提供されてよく、または発生培地上に置く介在表面の例えばステンレス鋼メッシュによって提供されてよい。以下の説明は、発生パッドを使用して発生表面を提供する場合を示すが、本出願において使用する発生表面は、ＥＳＭから発生した胚を支持するかまたは懸濁する任意の表面を指すことは理解できるはずである。
【００１７】
体細胞胚を発生する方法は周知であって、様々な刊行物において説明されており、これは上記の背景の節において検討した通りである。望ましい胚は、不完全に発生した胚、異常に形成された胚、網下または網上胚、及び非胚植物材料の他の部片と一緒に、様々な程度にパッド１６中の胚柄組織及び残留発生不良ＥＳＭ（または培養材料）に付着しかつこの中に埋込まれる。発生パッド１６中に懸濁した胚を収穫及び分類室１２に前進させ、ここで胚（培養材料中に埋込まれている）を発生パッドから除去し、さらに自動的に選別し、単数化し、望ましさに従って分類する。分類を、多段階の次第に洗練されしかもなお多くの時間を要するようになる分類方法を使用して実行して、次第に高くなる選択精度及び作業効率を実現してよい。望ましいと分類された胚をその後前進させてさらなる成熟処理を受けさせ、例えば、貯蔵及びそれに続く加工種子中への取り入れのために乾燥させるために発生後処理室（図示した具体例においては、乾燥室）１４に前進させる。本発明は一般に、収穫及び分類室１２において起きる、胚を収穫し、分類する自動化プロセスに関する。収穫及び分類を好ましくは、処理される胚の生存度を支えるようにコンディショニングされた湿潤したクリーンルームにおいて実行することが予測される。
【００１８】
さらに図２を参照すると、本発明の方法は１具体例においては一般に４つの工程を含む。第１に、図１Ａ及び２の工程“Ａ”を参照すると、適切に配列したノズル１８からの水性液体（例えば、等張栄養素溶液）の圧力制御噴霧を使用して、胚を発生表面（例えば、発生パッド表面）１６から洗い流す。この洗い流しプロセスは、胚を含む培養材料を発生表面１６から分離するが、この箇所では胚の少なくとも幾つかは胚柄組織、残留発生不良ＥＳＭ、及び他の材料中に埋込まれるかまたはこれに付着したままである。図示するように、発生表面１６を傾斜表面２０上に置いて、胚を含む培養材料の洗い流し及び除去（重力によってリザーバー２２（またはハイドロサイクロンタイプセパレーター）に向かう）を促進する。リザーバー２２の底部２６は細長い開口部（スリット）を有し、これはコンベヤーベルト２４の方向に対して略垂直に延在し、コンベヤーベルト２４の幅の実質的に全体にわたって延在して、その結果、胚（胚柄組織または残留ＥＳＭ中に埋込まれるかまたはこれに付着している）を略広がるかまたは空間的に均一な仕方でコンベヤーベルト２４の上に置く。他に、リザーバー２２からの液体分散胚の流れを、例えば狭窄部、流れ通路長さの調節等の様々な他の手段によって調節して、調節された空間的に均一な仕方で胚をコンベヤーベルト２４上に置くことができる。
【００１９】
次に工程“Ｂ”を参照すると、コンベヤーベルト２４は、適切なモータ（図示せず）によって駆動する多孔質連続ベルト２８で形成され、これはふるい分けによって胚を選別し、単数化する。本明細書において使用する“選別し、単数化する”は、サイズ／形状に従って胚を初歩的に分類し、また例えば胚を分離して離すことによって、また任意の望ましくない材料を各胚から除去することによって胚を分離して別個の単位にすることを意味する。例えば、多孔質連続ベルト２８によってふるい分けすることは、任意の網下材料の例えば網下胚及びデブリを穴を通して落下させることによって、選別と単数化の両方を実現する。
【００２０】
特に、多孔質コンベヤーベルト２８上にある間に、恐らく依然として胚柄組織及び残留ＥＳＭ中に埋込まれている胚にさらに第２のノズル３０からの水性液体を噴霧して、胚（及び他の接着性材料）を水性液体中にさらに分散させる。液体噴霧は、接着性胚柄組織及び残留ＥＳＭを胚から離し、洗い流し、多孔質ベルト２８を通して落下させる。任意の網下または不完全に形成された胚もまた多孔質ベルト２８を通って落下しよう。１具体例においては、コンベヤーベルト２４は、コンベヤーベルト技術分野において周知の振動タイプとしてよく、選別し、単数化するプロセスをさらに促進する。多孔質ベルト２８を通って落下した任意の材料を、多孔質ベルト２８の下に置かれた廃棄物容器３２中に集めてよい。任意に、第２のより粗い多孔質ベルト（図示せず）を、第１の多孔質ベルト２８を有する第１のコンベヤーベルト２４と直列に恐らく第１の多孔質ベルト２８の前に提供して、任意の網上胚及び材料の他の網上部片を運び去ってよい。従って、一般に所望のサイズ及び／または形状を有する大部分単数化された胚のみ（胚柄組織及び他の微細植物材料をほとんど含まない）が、第１の多孔質ベルト２８上に残存する。多孔質ベルト２８の（及び任意の他の追加の多孔質ベルトの）メッシュ（穴）サイズ／形状を調節することによって、望ましいサイズ／形状の範囲内の胚のみを選択することができる。上記に説明した１つ以上の多孔質コンベヤーベルトの他に、ワイヤまたは他のメッシュの１つ以上のふるい（例えば、振動傾斜ふるい）を使用してよいが、単数または複数の多孔質コンベヤーベルトの使用が好ましく、というのはこれは胚を同時にふるい分け、輸送する（次の段階に）からであることに注意されたい。
【００２１】
上記に説明したように、工程“Ａ”及び“Ｂ”の最中に、異質の環境（例えば、許容可能な品質の胚、許容不可能な胚、胚柄組織、残留ＥＳＭ、及び他の植物材料を含む）を水性液体中に分散させ、それらの物理的性質（質量、サイズ、形状、比重、抵抗係数、湿潤性等）に基づいて異なって成分に働く物理的力によって（例えば、ふるい分けによって）成分の分離を施す。この結果、微細植物材料及び胚接着性胚柄組織を除去し、任意の他の望ましくない成分の量が低減して、胚柄組織を実質的に含まない大部分単数化された胚を含む集団を与える。
【００２２】
噴霧援助ふるい分けプロセスの後に、工程“Ｃ”を参照すると、第１のコンベヤーベルト２４の端部で、選別され、単数化された胚が重力によって別のコンベヤーベルトまたは分類コンベヤーベルト３４の上に落下する。分類コンベヤーベルト３４は第１のコンベヤーベルト２４に対して略垂直に配列されて、その結果、胚の落下は一般に、それに続く画像化に適した１本の列３６を選択コンベヤーベルト３４の長手方向に形成しよう。胚が、第１のコンベヤーベルト２４に粘着する傾向があり、容易に落下できない場合には、第１のコンベヤーベルト２４からの胚の分離を様々な手段によって援助してよい。例えば、胚除去を、第１のコンベヤーベルト２４の端部３５の近くで多孔質ベルト２８の下に適切に配列した空気／液体ジェット（例えば、栄養素溶液の穏やかな噴出または空気の一吹き−図示せず）、または第１のコンベヤーベルト２４の端部３５の近くに対して略垂直及び真上に置いた微細振動ワイヤによって援助してよく、その結果、表面張力を破壊し、胚を第１のコンベヤーベルト２４から取り除く。他に、乾燥機（図示せず）を、第１のコンベヤーベルト２４に隣接させて配列して、胚が第１のコンベヤーベルト２４上を移動する時に乾燥させる。
【００２３】
それに続く画像化のために、分類コンベヤーベルト３４上で胚を互いに十分に間隔を置いて離す。１本の列３６になった胚同士の間に十分な間隔を実現するために、胚を発生表面１６から洗い流す初期速度を調節してよい。また、上記に説明したように、リザーバー２２（またはハイドロサイクロンタイプセパレーター）の形状を調節して、第１のコンベヤーベルト２４の上への胚の制御された吐出、従って第１のコンベヤーベルト２４から分類コンベヤーベルト３４の上への胚の制御された落下を実現してよい。リザーバー２２は図１Ａの噴霧ふるい分けプロセスの上流に位置決めするように示されているが、リザーバー２２を噴霧ふるい分けプロセスの下流の第１のコンベヤーベルト２４の端部３５の近くに配設して、その結果、第１のコンベヤーベルト２４から分類コンベヤーベルト３４の上に胚を受け入れ、制御可能に落下させてよいことは理解できるはずである。さらに別の例として、コンピュータ４０によって制御される電子式胚位置地図作製機（図示せず）を、噴霧ふるい分けプロセスの下流の第１のコンベヤーベルト２４の端部３５の近くに位置決めしてよい。胚位置地図作製機は適切な光学センサー及び検出器の組合せからなり、各胚の位置を、これが第１のコンベヤーベルト２４上を運ばれる時に決定する。コンピュータ４０は、胚位置地図作製機から受け取る位置情報に基づいて、第１のコンベヤーベルト２４及び／または分類コンベヤーベルト３４のベルト速度を連続的に調節して、その結果、第１のコンベヤーベルト２４から分類コンベヤーベルト３４の上への胚の均一な落下速度を実現する。上文で説明した方法のいずれでも一緒に組み合わせてよい。例えば、第１のコンベヤーベルト２４の端部３５の近くに位置決めされた胚位置地図作製機を使用して、胚を発生表面１６から洗い流す初期速度を制御してよい。また、当業者には明白であるように、胚が第１のコンベヤーベルト２４の上に置かれた時に、胚同士の間に十分な間隔を実現する任意の他の方法を使用してよい。
【００２４】
１他の具体例においては、パイプに沿った液体分散胚の流れを利用することによって、画像化のために好ましい一列形状を得てよい。特に、図３Ａを参照すると、図１Ａに示す具体例と同様に、胚を、適切に配列したノズル１８からの水性液体を使用して発生表面１６から洗い流し、リザーバー２２中に置く。リザーバーは適切に選択した直径を有するパイプ２１と連通し、これを通って好ましくは予め規定された制御可能な速度で液体分散胚は依然として他の組織、ＥＳＭ、及び植物デブリ、流れと絡み合い、多孔質コンベヤーベルト２５の上に出る。１具体例においては、パイプ２１は透明で、その結果、透明なパイプ２１に沿って配列する光学式スキャナー２３はこれを通る流れを観察して、胚を発生培地から洗い流す初期速度へのフィードバックを提供して、パイプ２１を通過する材料（例えば、胚）間の所望のレベルの間隔を確実にすることができる。前と同様に、コンベヤーベルト２５は少なくともその上流部分において多孔質であって、その結果、任意の網下胚及び他の微細材料（胚柄組織、残留ＥＳＭ等）はベルト２５を通って落下し、これはノズル３０からの水性液体噴霧によってさらに促進される。図示するように、パイプ２１から吐出される培養流れは一般に多孔質コンベヤーベルト２５上に整列するので、噴霧ふるい分けプロセス後にベルト２５上に残存している胚は既に一列形状３４になっている。従って、胚は、同じコンベヤーベルト２５上でのさらなる分類の間、例えば、カメラ３８による画像収集及びそれに続く望ましくない胚のエジェクター４２による選択的な除去の間（両方ともコンピュータ４０によって制御される）真直ぐに延びて続いていることができる。胚は最終的にコンベヤーベルト２５の端部から受け入れトレー５４の上に落下し、これを下記により十分に説明する。
【００２５】
一列形状を実現するさらに他の方法として、図３Ｂを参照すると、フローサイトメーターを使用して、胚を選別し、単数化してよい。この具体例においては、前の具体例と同様に、胚を、適切に配列したノズル１８からの水性液体を使用して発生表面１６から洗い流し、リザーバー２２中に置き、その後透明なパイプ２１を通って進行させる。従来技術において周知のフローサイトメーター（または細胞セパレーター）２７は、透明なパイプ２１に沿って配列して、望ましい胚を観察し、他の材料の例えば網下／網上胚、胚柄組織、及び残留ＥＳＭから分離する。簡潔に述べると、フローサイトメーターは、液体中を輸送される様々な細胞を光学センサー２７ａによって観察して細胞特性に基づいて区別し、さらにインクジェット技術に基づくデフレクター２７ｂを使用して、すなわち標的細胞を含む選択的に帯電した液体小滴をそらすことによって細胞を静電的に選別する（分離する）。図示した具体例においては、フローサイトメーター２７を使用して、予め規定されたサイズ／形状判定基準を満たす胚３１を分類コンベヤーベルト３４の上に選別し、分離（分岐）し、一方他の材料３３の例えば網下または網上胚及び胚柄組織及び残留ＥＳＭは不合格容器２９中に落下する。従って、フローサイトメーター２７は、胚を選別し、単数化するのみならず、これを略一列にして分類コンベヤーベルト３４上に置く。
【００２６】
戻って図１Ａ及び２を参照すると、工程“Ｃ”において、分類コンベヤーベルト３４上に好ましくは一列になって置かれ、互いに間隔を置いて十分に離れた選別され、単数化された胚を、望ましさに従って分類する。例えば、胚の各々を、分類コンベヤーベルト３４に隣接して（例えば、上に）置かれたカメラ３８によって画像化してよい。各胚の画像をコンピュータ４０に送信して解析し、１つ以上の高速アルゴリズムに従って分類する。
【００２７】
１具体例においては、胚の各画像（単色またはカラーで）を２段階で解析する。第１に、図２のブロック４６を参照すると、適切なアルゴリズムを使用して、加工種子中に取り入れるための基本的なサイズ及び形状判定基準を満たさない胚を特定する。第２に、ブロック４８を参照すると、予め開発済みの分類モデルの例えば上記に検討したＰＣＴ出願第PCT/US99/12128号（WO 99/63057）において開示されているものを、残存している胚（すなわち、第１のサイズ／形状判定基準を満たす胚）に適用して、発芽のより低い確率（発芽力を欠く）を有する胚を特定する。簡潔に述べると、画像及び実際の発芽データが得られた胚の試料集団に基づいて、適切な分類モデルを開発することができる。好適な例においては、推定発芽力に従って胚を分類するための予め開発済みの分類モデルを、第１のサイズ／形状分類工程において使用したのと同じ画像に適用して、その結果、単一の画像を第１及び第２の分類工程の両方において使用することができる。さらに図１Ａを参照すると、カメラ３８によって生成した画像に基づいて胚の実際の分類及び他の評価を達成するプログラム（アルゴリズム）、例えば、予め開発済みの分類モデルを、コンピュータ４０中に記憶させる。
【００２８】
第１の分類工程によってサイズ／形状判定基準を満たさないとして（ブロック４６）または第２の分類工程によって発芽しそうにないとして（ブロック４８）不合格になった胚をその後、分類コンベヤーベルト３４から、例えば、コンピュータ４０によって制御される正確にタイミングを調節した空気／液体ジェット４２によって、廃棄物容器４４中に排出してよい。ジェット起動の正確なタイミングをコンピュータ制御することができ、というのは、各胚を画像化したカメラ３８の撮影時刻及び分類コンベヤーベルト３４の既知の速度に基づいて、各望ましくない胚の位置は正確に分かっているからである。望ましくない材料をコンベヤーベルトから除去するための画像作動精密ジェットの使用は食品産業において周知であり、例えば視覚的特性に基づいて食品を選別するために使用される。望ましくない胚を除去した後、第１及び第２の分類工程の両方に合格した胚のみが分類コンベヤーベルト３４上に残存する。他に、望ましい胚をさらなる成熟処理のために分類コンベヤーベルト３４から別の位置の上に例えば別のコンベヤーベルトまたは収穫チャンバの上に除去するようにエジェクター４２を構成してよく、これは当業者には明白であろう。
【００２９】
胚分類工程“Ｃ”は、データ収集及び分類／スクリーニング作業のさらなる工程または段階を含んでよい。例えば、上記に説明したように、２段階カメラ画像解析（図２のブロック４６及び４８）を実行した後で、望ましくない胚を選択コンベヤーベルト３４から除去する前に、胚に、さらなる画像化解析（例えば、ブロック５０）またはＩＲ、ＮＩＲ、若しくはラマン分光法を使用した分光分析（ブロック５２）を行ってよく、これを下記により十分に説明する。他に、上記に説明した２段階カメラ画像解析が完了し、任意の望ましくない胚を排出した後に、残存している望ましい胚をトレー中に置き、貯蔵のために乾燥し（工程“Ｄ”）、その後（後に）データ収集及び分類のさらなる段階、または“二次”分類工程“Ｅ”を行う。これを下記により十分に説明する。すなわち、本発明によれば、胚に任意の数の分類段階を行ってよく、さらに、全ての分類段階が同時に行われる必要は無い。
【００３０】
当業者には明白であるように、カメラ３８は単色またはカラーの任意の適切なタイプとしてよいが、好ましくはデジタル記憶装置に結合する電荷結合デバイス（ＣＣＤ）を含むデジタルカメラを使用して、その結果、収集した画像のそれに続くデジタル処理を可能にする。さらに、カメラ３８は単一図カメラ（single-view camera）（例えば、分類コンベヤーベルト３４上を運ばれる各胚の平面図のみを撮影する）または多数図カメラ（multiple-view camera）（例えば、各胚の平面図、側面図、及び端面図を撮影する）としてよい。胚の多数の図を収集するために、１台のカメラが多数の位置に移動してよく、または多数のカメラを使用してもよい。しかしながら、好ましくは、単一のカメラ及び適切に配列した反射面（例えば、プリズム）を使用して胚の多数の図を同時に画像化する方法及びシステムを使用して、その結果、多数の図を得るために必要な時間及び作業を短縮する。このような、胚の多数の図を同時に画像化する方法及びシステムは、本明細書と同時に出願した"Method and System for Simultaneously Imaging Multiple Views of a Plant Embryo"という名称の同時係属の米国特許出願（代理人名簿番号ＷＥＹＥ−１−２０６５１）において開示されており、本明細書において参考のために明示して引用する。分類モデルアルゴリズムを次に胚の多数の図の各々に適用して、推定発芽力に従って胚を分類してよい。
【００３１】
これに加えてまたはこの他に、胚分類工程“Ｃ”の最中、植物胚の子葉端部に位置する頂端ドーム（apical dome）を３次元的に画像化し、解析して、胚の発芽力（germinant vigor）（すなわち、発芽後の迅速な上胚軸発生のための可能性）を決定してよい。（図２のブロック５０を参照されたい）。頂端ドームは植物体を与える大部分の植物細胞が形成される場所なので、ドームの形態学的特徴（サイズ、形状等）は、胚が発芽後に迅速に成長する傾向に関する信頼性の高い指標であることが確定している。すなわち、胚の頂端ドームの３次元情報を、望ましさに従ってさらに胚を分類するための分類モデルアルゴリズムへの入力として使用することができる。植物胚の頂端ドームを３次元的に画像化する幾つかの方法は、本明細書と同時に出願した"Method and System for Three-Dimensionally Imaging an Apical Dome of a Plant Embryo"という名称の同時係属の米国特許出願（代理人名簿番号ＷＥＹＥ−１−２０６６５）に見い出すことができ、本明細書において参考のために明示して引用する。
【００３２】
さらにこれに加えてまたはこの他に、胚分類工程“Ｃ”の最中、分光分析方法の例えばＩＲ分光法、ＮＩＲ分光法、またはラマン分光法を使用して胚を分析してよい。（図２のブロック５２を参照されたい）。上記に検討したＰＣＴ出願第PCT/US99/12128号（WO 99/63057）において開示されている分類モデルを胚の任意の吸収、透過率、または反射スペクトルに適用して、化学組成に従ってさらに定性的に胚を分類する。簡潔に述べると、分光分析は各胚の化学的性質の特定、従って胚中の単数若しくは複数の標的化学薬品または被検体の特定を可能にする。生化学的に成熟し、発芽しそうな胚は、特定のレベルの標的化学薬品または被検体の例えば糖アルコールを含むことが周知である。従って、胚の分光分析は、生化学的に成熟した胚を定性的に特定する信頼性の高い方法である。ＮＩＲ分光法を使用して胚を分光学的に分析し、分類する幾つかの方法は、上記に検討したＰＣＴ出願第PCT/US99/12128号（WO 99/63057）において開示されている。さらに、ラマン分光法を使用して胚の品質を評価する方法は、本明細書と同時に出願した"Method for Classifying Plant Embryos Using Raman Spectroscopy"”という名称の同時係属の米国特許出願（代理人名簿番号ＷＥＹＥ−１−２０６４９）において開示されており、本明細書において参考のために明示して引用する。本明細書において使用する分光分析は、一般に多スペクトル画像化（化学的画像化、化学的地図作製）として周知の１つ以上の特定のスペクトルバンドにおいて測定した画像の分析を包含する。
【００３３】
上記に説明した分類方法のいずれかに加えてまたはこの他に、胚の生化学組成または形態学的構造を決定するための他の画像化または分光技術を使用してよいことに注意されたい。新たな画像化または分光技術が出現するかまたは成熟するにつれて、こうした技術を、植物胚の自動化収穫及び多段階スクリーニングの本方法中に容易に取り入れることができる。例えば、テラヘルツ線（Ｔ−線）を使用して、植物胚を分光学的に画像化してその化学及び物理組成を認識してよい。さらなる例として、蛍光標識技術の例えばクアンタム・ドット・コーポレーション、ヘイワード、カリフォルニア（Quantum Dot Corporation of Hayward, California）によって開発されたクアンタムドット技術を使用して、特定の化合物を検出し、また植物胚内部の生物学的事象を追跡してよい。なおさらに、宇宙線を利用して、胚の密度を測定してよい。当業者には明白であるように、こうした例に基づいて、電磁波の広いスペクトルの使用に基づいて植物胚の生化学的または形態学的（構造）特性を決定する可能性がある任意の他の技術を本発明に従って使用してよい。
【００３４】
上文で説明した方法は、まず初歩的サイズ／形状判定基準に基づくふるい分けによって（工程“Ｂ”）、次に工程“Ｃ”の最中の次第に洗練され、従って一般に多くの時間を要する手段によって、例えば画像に基づくサイズ／形状解析（ブロック４６）、画像に基づく分類モデル解析（ブロック４８）、画像に基づく頂端ドーム解析（ブロック５０）、及びスペクトルに基づく化学分析（ブロック５２）によって胚を多段階でスクリーニングまたは分類することに注意されたい。さらに追加のスクリーニング判定基準が開発されるにつれてより多くの分類方法を加えてよいことは理解できるはずである。例えば、何らかのセンサーを使用して、胚の耐病性を決定する方法を開発してよい。次に耐病性判定基準に基づいて胚を分類するための分類段階を加えて、全分類プロセスをさらに洗練させてよい。より多くのスクリーニング判定基準が開発され、それに対応する分類方法が本方法中に取り入れられるにつれて、本方法は、成長して、強く、健康で、様々な他の望ましい特性を有する植物に恐らくなりそうな胚を特定することができよう。
【００３５】
複雑なスクリーニング段階はより多くの時間を要する傾向があるので、前の分類段階に合格した胚のみをそれに続くスクリーニング段階に前進させると、その結果、恐らく次第に洗練され、複雑になるより後のスクリーニング段階によって評価するために必要な胚の数はより少なくなる。しかしながら、幾つかの状況においては、２つ以上のスクリーニング段階を平行して実質的に同時に実行してよい。例えば、分類モデルに従って、胚の多数の図（例えば、平面図、側面図、及び端面図）を撮影し、分析する場合に（ブロック４８）、図のうちの１つ（例えば、頂端ドームの３次元情報を含む子葉端部の図）を同時に広範囲に分析して、胚の頂端ドームの形態学的特徴を確認してよい（ブロック５０）。
【００３６】
なお図１Ａ及び２を参照すると、工程“Ｄ”において、分類コンベヤーベルト３４の端部で、コンベヤーベルト３４上に残存している望ましい胚は重力によって（恐らく、空気／液体ジェットによって援助される−図示せず）、コンピュータ４０によって制御される２次元駆動システム（または動力化プラットホーム）５６上に取り付けたトレー（またはパッド、または任意の適切な表面）５４の上に落下する。駆動システム５６は２次元的に（または恐らく３次元的に）トレー５４の位置を分類コンベヤーベルト３４の端部に対して調節して、その結果、これから一様に間隔を置いたアレイ（例えば、２次元アレイ）中に落下する胚を受け入れる。分類コンベヤーベルト３４の端部に対するトレー５４の位置決めは、分類コンベヤーベルト３４上の各胚の正確に分かっている位置を基準として、カメラ３８の撮影時刻及びコンベヤーベルト３４の速度に従って決定される。従って、分類コンベヤーベルト３４上の望ましい胚の幾分不規則に間隔を置いた線形アレイでさえも、トレー５４上の一様に間隔を置いた２次元アレイに変換させることができる。駆動システム５６の構成及び動作は当業者には明白なはずであり、従って本明細書において詳細に説明する必要は無い。一様に間隔を置いたアレイにして配列した恐らく１００以上の胚を含むトレー５４をその後前進させて、さらなる成熟処理を受けさせてよい。例えば、トレー５４を発生後処理室（図示した具体例においては、乾燥室）１４に前進させて、胚を貯蔵のために及びそれに続く加工種子中への取り入れのために乾燥する。
【００３７】
さらに、特に図２を参照すると、工程“Ｅ”において、トレー５４中に置き、乾燥した胚に、加工種子中への取り入れの前にさらなる二次系列の分類段階を行ってよい。胚は、各用途によって、二次系列の分類段階の前に再水和してよいかまたは二次系列の分類段階のうちの１つ以上の間中乾燥したままでよい。前の分類工程“Ｃ”と同様に、二次分類工程“Ｅ”はまた、次第に高くなる選択精度及び作業効率を実現するための次第に洗練され、複雑になる１つ以上の分類段階を含んでよい。前の分類工程“Ｃ”に合格した比較的に少数の胚のみがこの時点で残存しているので、より洗練され、従って多くの時間を要する分類方法を実行することができ、これは例えば分類モデル（ブロック５４）、頂端ドーム解析（ブロック５６）、または恐らく多数の図も使用する分光分析（ブロック５８）を使用した多数図カラー画像化解析である。またロボットピックアンドプレイスシステムを使用して、自動的に胚を拾い上げ、加工種子中に挿入する場合、このために各胚の位置を確認するために幾つかのデジタル画像化が必要かもしれず、従ってこのデジタル画像化を、この二次分類工程“Ｅ”の最中の分類段階のうちの１つ以上にとって必要な画像収集と好都合に組み合わせることができることが予測される。
【００３８】
例えば、１具体例においては、工程“Ａ”において発生培地から除去し、工程“Ｂ”においてさらに選別し、単数化した後で、胚分類工程“Ｃ”の最中に、胚に２つの分類段階を行ってよい。第１に、単一図（例えば、平面図）単色画像解析を実行して、基本サイズ／形状判定基準を満たさない胚を除く（ブロック４６）。第２に、分類モデルを同じ単一図単色画像に適用して、発芽しそうにない胚を除く（ブロック４８）。工程“Ｄ”において、２つの分類段階の両方に合格した残存している胚をトレー中に置き、乾燥する。その後、二次分類工程“Ｅ”の最中、胚を工程“Ｄ”から前進させて、恐らくより洗練され従って多くの時間を要するさらなる系列の分類段階を行う。例えば、胚に多数図（例えば、平面図、側面図、及び端面図）カラー画像解析を施して、分類モデルに従って望ましくない胚を除いてよく（ブロック５４）、さらに頂端ドーム解析（ブロック５６）及び／または分光分析（ブロック５８）を施して、再度適切な分類モデルに従ってなおさらに望ましくない胚を除いてよい。
【００３９】
図１Ｂは、植物胚の自動化収穫及び多段階スクリーニングのシステムの他の具体例を示す。図１Ａの具体例と同様に、胚を発生表面から洗い流し、多孔質コンベヤーベルト２４の上に置き、ふるい分け、これは恐らく水性液体を用いた追加の洗浄によって援助される（図２の工程“Ａ”及び“Ｂ”に対応する）。コンベヤーベルト２４上に残存している胚を次にカメラ３８によって画像化する。各胚の画像をコンピュータ４０に送信して解析し、それらの形態学的特徴に従って分類する（図２の工程“Ｃ”に対応する）。例えば、適切なアルゴリズムを使用して、加工種子中に取り入れるための基本的なサイズ及び形状判定基準を満たす胚を特定する。
【００４０】
次に、コンピュータ４０の制御下のスマートミニロボット移送システム６０を使用して、基本的なサイズ及び形状判定基準を満たす胚の各々を拾い上げ、受け入れトレー５４の上に一様に間隔を置いたアレイにして置く。簡潔に述べると、移送システム６０は、レール６２に沿って横方向に可動なハウジング６１及びハウジング６１から延在し、真空チップ端部を含むロボットアーム６３を含む。ロボットアーム６３は長手方向に延在可能であり、また軸方向に回転可能である。本具体例において使用するのに適したミニロボット移送システム６０の１例の詳細はＰＣＴ出願第PCT/US00/40720号（WO 01/13702 A2）において開示されており、これは上記に参考のために引用されている。図１Ｂの図示した具体例においては、胚をアーム６３によってコンベヤーベルト２４から拾い上げた後に、ハウジング６１をレール６２に沿って並進運動させて新たな位置６１’に至らせ、この箇所でアーム６３’は下方へ延在して胚をトレー５４上に置く。この箇所で、カメラ３８によって画像化し、コンピュータ４０中に記憶した胚の最初の配向に基づいて、アーム６１’を軸方向に制御可能に回転させて、その結果、トレー５４上に置かれる胚は適切に配向し、例えば、その子葉端部は全て同じ方向を向く。１好適な具体例においては、胚をトレー５４上に同じ配向で正確に置き、その子葉端部は互いに正確に整列している。本説明においては、胚を同じ配向で正確なアレイにして配列しているトレー（例えば、その子葉端部の位置が正確に分かっている）を“インデックストレー”と呼ぶ。
【００４１】
その後、インデックストレー５４を前進させて成熟処理を受けさせ、例えば、胚を脱水するために発生後処理室（図示した具体例においては、乾燥室）１４に前進させる（図２の工程“Ｄ”に対応する）。次に、胚を再水和し、二次分類プロセスを行ってよい（図２の工程“Ｅ”に対応する）。特に、各胚の適切に配向し一様に間隔を置いたアレイを保持するインデックストレー５４を二次分類コンベヤーベルト６４上に置いてよく、コンベヤーベルト６４上で輸送される時に胚に追加の分類段階を施してよい。例えば、コンピュータ７０に結合した適切なスキャナー６８を使用して、さらに胚を分類して、成功裏に発芽し、成長して正常な植物になりそうなものを特定する。二次分類の最中、インデックストレー５４の使用は好都合なことがあり、というのはこれはトレー上の各胚の局在化分析を可能にするからである。例えば、各胚の局在化領域（例えば、その子葉端部部分）に関して、特定の画像化または分光分析を実行してよい。インデックストレー５４上の胚（例えば、その子葉端部）の正確な位置が分かっているので、このような局在化分析が可能である。
【００４２】
二次分類コンベヤーベルト６４の端部に、別のロボット胚配置システム７１を提供して、望ましいとさらに選択された胚のみを拾い上げ、これを加工種子７６中に挿入する。図示した具体例においては、胚配置システム７１は、レール７３に沿って並進運動するハウジング７２及びハウジング７２から延在するロボットアーム７４を含む。望ましい胚をアーム７４によって拾い上げた後に、ハウジング７２をレール７３に沿って並進運動させて新たな位置７２’に至らせ、この箇所でアーム７４’は下がって胚を加工種子７６（または加工種子の管状制限体）中に置くことができる。適切な胚配置システムの詳細は、上記に検討したＰＣＴ出願第PCT/US00/40720号（WO 01/13702 A2）において開示されている。胚を移送し、加工種子７６中に挿入する様々な他の別のシステムが可能であり、これは当業者には明白であろう。例えば、ハウジング７２及びアーム７４は２または３次元的に可動としてよい。また、複数の加工種子７６を保持するトレーを１、２、または３次元的に可動に製造して、その結果、胚配置システム７１によって運ばれる胚に対して種子７６の各々を正確に位置決めしてよい。
【００４３】
特に、インデックストレー５４上の胚の正確な位置が分かっているので、胚配置システム７１は、各胚をトレー５４から拾い上げる時に各胚の位置及び／または配向を決定または補正する能力を有する必要は無い。例えば、各胚の既知の位置及び配向を基準として、胚配置システム７１が、各胚の子葉端部を加工種子７６内部に正確に位置決めすることが可能である。
【００４４】
本発明によれば、体細胞胚を自動的に収穫する完全な方法及びシステムが得られ、これは、大量生産胚を選別し、単数化し、さらに推定発芽力に従って分類する工程を含む現在の手作業に取って代わる可能性がある。胚の分類を多段階で実行して、加工種子中への取り入れに適した胚を効果的に特定する。一緒に組み合わせるべき適切な分類方法を注意深く選択することによって、現在極めて熟練した技術者によってのみ実現可能な選択率のレベルに一致するかまたはこれを超えると思われる次第に高くなる選択精度を実現することができる。さらに、多段階スクリーニング（分類）の本自動化方法のスループットを計算すると約五百万胚／年であり、これは、加工種子の大量生産のために選別され、単数化された胚の分類にとって必要な１．５〜２秒／胚の速度を満たすのに十分である。
【００４５】
本発明の好適な具体例を示し、説明してきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更を行い得ることは了解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】本発明による、植物胚の自動化収穫及び多段階スクリーニングのシステムを概略で示す。
【図１Ｂ】本発明による、植物胚の自動化収穫及び多段階スクリーニングの他のシステムを概略で示す。
【図２】本発明による、胚を自動的に収穫し、多段階でスクリーニングする方法の全フローを示すフローチャートである。
【図３】図３Ａは、本発明による、胚を自動的に選別し、単数化する他の方法を示す。図３Ｂは、本発明による、胚を自動的に選別し、単数化する他の方法を示す。
【符号の説明】
【００４７】
１０    発生室
１２    収穫及び分類室
１４    発生後処理室
１６    発生表面
１８    ノズル
２０    傾斜表面
２１    パイプ
２２    リザーバー
２３    光学式スキャナー
２４    第１のコンベヤーベルト
２５    多孔質コンベヤーベルト
２６  リザーバーの底部
２７    フローサイトメーター
２７ａ  光学センサー
２７ｂ  デフレクター
２８    多孔質連続ベルト
２９    不合格容器
３０    第２のノズル
３１    胚
３２    廃棄物容器
３３    他の材料
３４    分類コンベヤーベルト
３５    第１のコンベヤーベルトの端部
３６    列
３８    カメラ
４０    コンピュータ
４２    エジェクター
４４    廃棄物容器
５４    受け入れトレー
５６    ２次元駆動システム
６０    スマートミニロボット移送システム
６１    ハウジング
６１’  新たな位置
６２    レール
６３    ロボットアーム
６３’  アーム
６４    二次分類コンベヤーベルト
６８    スキャナー
７０    コンピュータ
７１    ロボット胚配置システム
７２    ハウジング
７２’  新たな位置
７３    レール
７４    ロボットアーム
７４’  アーム
７６    加工種子
【図１Ａ】
2005040131.tif 000003
【図１Ｂ】
2005040131.tif 000004
【図２】
2005040131.tif 000005
【図３】
2005040131.tif 000006
【外国語明細書】
2005040131000001.pdf