(57)【要約】【課題】  本発明は、グリセロールから１，３−プロパンジオールを製造する際の効率性を改善し、工業上有用なプロセスを提供することを目的とする。【解決手段】  グリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子、ミディアムサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び／又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子及び／又はプロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子、を含む形質転換体。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子、ミディアムサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び／又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子及び／又はプロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子、を含む形質転換体。
【請求項２】
グリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットをコードする遺伝子がLactobacillus reuteriに由来する、請求項１記載の形質転換体。
【請求項３】
グリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子が以下の(a)又は(b)のタンパク質：
(a)配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニット及びスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子であり、
グリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニットをコードする遺伝子が以下の(c)又は(d)のタンパク質：
(c)配列番号５又は７で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(d)配列番号５又は７で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニット及びスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子であり、
グリセロールデヒドラターゼのスモールサブユニットをコードする遺伝子が以下の(e)又は(f)のタンパク質：
(e)配列番号９又は１１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(f)配列番号９又は１１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニット及びミディアムサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子である、請求項２記載の形質転換体。
【請求項４】
グリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子が、以下の(a)又は(b)のＤＮＡ：
(a)配列番号２又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(b)配列番号２又は４で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニット及びスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含み、
グリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニットをコードする遺伝子が、以下の(c)又は(d)のＤＮＡ：
(c)配列番号６又は８で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(d)配列番号６又は８で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニット及びスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含み、
グリセロールデヒドラターゼのスモールサブユニットをコードする遺伝子が、以下の(e)又は(f)のＤＮＡ：
(e)配列番号１０又は１２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(f)配列番号１０又は１２で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニット及びミディアムサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含む、請求項２記載の形質転換体。
【請求項５】
プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を含み、該遺伝子がLactobacillus reuteriに由来する、請求項１〜４のいずれか１項記載の形質転換体。
【請求項６】
プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子である請求項５記載の形質転換体：
(a)配列番号１３又は１５で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号１３又は１５で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項７】
プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が、以下の(a)又は(b)のＤＮＡを含む、請求項５記載の形質転換体：
(a)配列番号１４又は１６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(b)配列番号１４又は１６で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を含み、該遺伝子がLactobacillus reuteriに由来する、請求項１〜７のいずれか１項記載の形質転換体。
【請求項９】
１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子である請求項８記載の形質転換体：
(a)配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号１７で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が、以下の(a)又は(b)のＤＮＡを含む、請求項８記載の形質転換体：
(a)配列番号１８で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(b)配列番号１８で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び／又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子の各サブユニットをコードする遺伝子がLactobacillus reuteriに由来する、請求項１〜１０のいずれか１項記載の形質転換体。
【請求項１２】
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子が以下の(a)又は(b)のタンパク質：
(a)配列番号１９又は２１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号１９又は２１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子であり、
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットをコードする遺伝子が以下の(c)又は(d)のタンパク質：
(c)配列番号２３又は２５で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(d)配列番号２３又は２５で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子である、請求項１１記載の形質転換体。
【請求項１３】
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子が、以下の(a)又は(b)のＤＮＡ：
(a)配列番号２０又は２２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(b)配列番号２０又は２２で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含み、
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットをコードする遺伝子が、以下の(c)又は(d)のＤＮＡ：
(c)配列番号２４又は２６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(d)配列番号２４又は２６で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含む、請求項１１記載の形質転換体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の形質転換体をグリセロールの存在下で培養することにより、１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子、ミディアムサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び／又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子及び／又はプロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子、を含む形質転換体を用いてグリセロールから１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，３−プロパンジオールはポリエステル繊維の生産並びにポリウレタン及び環状化合物の製造に使用されるモノマーである。１，３−プロパンジオール合成経路としては、種々ものが知られている。例えば、ホスフィン、水、一酸化炭素、水素及び酸の存在下、触媒上でのエチレンオキサイドの変換により製造する方法；アクロレインの触媒的液相水和、続いての還元により製造する方法；一酸化炭素及び水素存在下、周期律表のＶＩＩＩ族の原子を持っている触媒上で炭化水素（例えば、グリセロール）を反応させることにより製造する方法などが報告されている。しかしながら、伝統的化学合成法は、費用がかかるとともに、環境汚染物質を含んでいる一連の廃棄物を発生するという問題を有していた。
【０００３】
これに対し、１，３−プロパンジオールを製造するための生物学的方法として、グリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵を触媒する酵素を有する微生物を利用する方法が報告されている（特許文献１〜６参照）。グリセロールから１，３−プロパンジオールを生産できる細菌株が、例えば、Citrobacter属、Clostridium属、Enterobacter属、Salmonella属、Klebsiella属、Lactobacillus属、Caloramator属及びListeria属に属する細菌の群で発見されている。
【０００４】
生物学的系において、グリセロールは２段階の酵素触媒反応を経て、１，３−プロパンジオールに変換される。第１段階において、グリセロールデヒドラターゼがグリセロールを３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）及び水へ変換する（グリセロール→３−ＨＰＡ＋Ｈ２Ｏ）。第２段階において、３−ＨＰＡがＮＡＤ＋−結合オキシドレダクターゼにより１，３−プロパンジオールに還元される（３−ＨＰＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋→１，３−プロパンジオール＋ＮＡＤ＋）。１，３−プロパンジオールはそれ以上代謝されず、結果として媒体中に堆積する。
【０００５】
しかし、生物学的系におけるグリセロールからの１，３−プロパンジオールの生産は、一般に嫌気性条件下でグリセロールを単独の炭素源とし、他の外因性還元当量受容物質の不在下で行われるため、最初に、ＮＡＤ＋−（又はＮＡＤＰ＋−）結合グリセロールデヒドロゲナーゼによるグリセロールのジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）への酸化（グリセロール＋ＮＡＤ+→ＤＨＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ）というグリセロールに関する平行経路が働く。そして、ＤＨＡは、ＤＨＡキナーゼによってジヒドロキシアセトンリン酸へリン酸化され、生合成及びＡＴＰ生成のために利用される。
【０００６】
従って、従来の微生物を用いた１，３−プロパンジオールの製造方法においては、原料であるグリセロールの半分が上記平行経路において消費され、原料グリセロールに対する生成物の収率が低く、効率性及びコストの点で問題があった。
【０００７】
一方、３−ヒドロキシプロピオン酸及びそのエステルは、脂肪族ポリエステルの原料として有用な化合物であり、また、これらから合成されるポリエステルは生分解性の環境にやさしいポリエステルとして注目されている。
【０００８】
３−ヒドロキシプロピオン酸は、通常、アクリル酸に対する水の付加により、又はエチレンクロロヒドリンとシアン化ナトリウムとの反応により製造される。アクリル酸を水和する反応は平衡反応であるため、反応率が制限されるという問題があった。エチレンクロロヒドリンの反応の場合は、毒性の強い物質の使用が必要であり、さらに加水分解工程を追加しなくてはならない。この場合、塩化ナトリウム及びアンモニウム塩が大量に生じるという問題がある。
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ９８／２１３３９
【特許文献２】ＷＯ９８／２１３４１
【特許文献３】米国特許第５，８２１，０９２号
【特許文献４】米国特許第５，２５４，４６７号
【特許文献５】米国特許第５，６３３，３６２号
【特許文献６】米国特許第５，６８６，２７６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、グリセロールから１，３−プロパンジオールを製造する際の効率性を改善し、工業上有用なプロセスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記問題を解決すべく鋭意検討を行った結果、グリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子の各サブユニットをコードする遺伝子、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子及び／又はプロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝、を含む形質転換体を、グリセロールの存在下で培養することにより、２種類の有用な化合物を効率的に製造できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）グリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子、ミディアムサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び／又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子及び／又はプロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子、を含む形質転換体。
【００１３】
（２）グリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットをコードする遺伝子がLactobacillus reuteriに由来する、（１）記載の形質転換体。
【００１４】
（３）グリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子が以下の(a)又は(b)のタンパク質：
(a)配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニット及びスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子であり、
グリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニットをコードする遺伝子が以下の(c)又は(d)のタンパク質：
(c)配列番号５又は７で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(d)配列番号５又は７で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニット及びスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子であり、
グリセロールデヒドラターゼのスモールサブユニットをコードする遺伝子が以下の(e)又は(f)のタンパク質：
(e)配列番号９又は１１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(f)配列番号９又は１１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニット及びミディアムサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子である、（２）記載の形質転換体。
【００１５】
（４）グリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子が、以下の(a)又は(b)のＤＮＡ：
(a)配列番号２又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(b)配列番号２又は４で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニット及びスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含み、
グリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニットをコードする遺伝子が、以下の(c)又は(d)のＤＮＡ：
(c)配列番号６又は８で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(d)配列番号６又は８で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニット及びスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含み、
グリセロールデヒドラターゼのスモールサブユニットをコードする遺伝子が、以下の(e)又は(f)のＤＮＡ：
(e)配列番号１０又は１２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(f)配列番号１０又は１２で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニット及びミディアムサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含む、（２）記載の形質転換体。
【００１６】
（５）プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を含み、該遺伝子がLactobacillus reuteriに由来する、（１）〜（４）のいずれかに記載の形質転換体。
【００１７】
（６）プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子である（５）記載の形質転換体：
(a)配列番号１３又は１５で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号１３又は１５で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質。
【００１８】
（７）プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が、以下の(a)又は(b)のＤＮＡを含む、（５）記載の形質転換体：
(a)配列番号１４又は１６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(b)配列番号１４又は１６で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１９】
（８）１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を含み、該遺伝子がLactobacillus reuteriに由来する、（１）〜（７）のいずれかに記載の形質転換体。
【００２０】
（９）１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子である（８）記載の形質転換体：
(a)配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号１７で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質。
【００２１】
（１０）１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が、以下の(a)又は(b)のＤＮＡを含む、（８）記載の形質転換体：
(a)配列番号１８で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(b)配列番号１８で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２２】
（１１）グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び／又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子の各サブユニットをコードする遺伝子がLactobacillus reuteriに由来する、（１）〜（１０）のいずれかに記載の形質転換体。
【００２３】
（１２）グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子が以下の(a)又は(b)のタンパク質：
(a)配列番号１９又は２１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号１９又は２１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子であり、
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットをコードする遺伝子が以下の(c)又は(d)のタンパク質：
(c)配列番号２３又は２５で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(d)配列番号２３又は２５で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子である、（１１）記載の形質転換体。
【００２４】
（１３）グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子が、以下の(a)又は(b)のＤＮＡ：
(a)配列番号２０又は２２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(b)配列番号２０又は２２で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含み、
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットをコードする遺伝子が、以下の(c)又は(d)のＤＮＡ：
(c)配列番号２４又は２６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(d)配列番号２４又は２６で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含む、（１１）記載の形質転換体。
【００２５】
（１４）（１）〜（１３）のいずれかに記載の形質転換体をグリセロールの存在下で培養することにより、１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、グリセロールから１，３−プロパンジオールを製造する際の原料グリセロールのロスを低減し、かつ１，３−プロパンジオールと合わせて３−ヒドロキシプロピオン酸を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の形質転換体は、グリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子、ミディアムサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び／又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子及び／又はプロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を含む。
【００２８】
本発明の形質転換体は、グリセロールを脱水して、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド及び水へ変換する反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む。そのようなタンパク質としては、グリセロールデヒドラターゼ及びジオールデヒドラターゼが挙げられる。グリセロールデヒドラターゼ及びジオールデヒドラターゼは、ラージサブユニット、ミディアムサブユニット及びスモールサブユニットの３種のサブユニットから構成される。本発明の形質転換体には、グリセロールデヒドラターゼの３種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含むもの、ジオールデヒドラターゼの３種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含むもの、ならびにグリセロールデヒドラターゼの３種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子とジオールデヒドラターゼの３種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含むもののいずれをも包含する。
【００２９】
グリセロールデヒドラターゼ又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットをコードする遺伝子としては、公知のものを使用でき、例えば、Lactobacillus属、Citrobacter属、Clostridium属、Klebsiella属、Enterobacter属、Caloramator属、Salmonella属、及びListeria属等に属する細菌に由来するものを使用することができる。本発明においては、Lactobacillus属細菌に由来するグリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットの遺伝子、特にLactobacillus reuteri由来のグリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットの遺伝子、さらにLactobacillus reuteri JCM1112株及びLactobacillus reuteri ATCC 53608株由来のグリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットの遺伝子が好ましい。
【００３０】
Lactobacillus reuteri由来のグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットのアミノ酸配列を配列番号１及び３に、ミディアムサブユニットのアミノ酸配列を配列番号５及び７に、スモールサブユニットのアミノ酸配列を配列番号９及び１１に例示する。Lactobacillus reuteri由来のグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２及び４に、ミディアムサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号６及び８に、スモールサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１０及び１２に、例示する。
【００３１】
各アミノ酸配列を含むタンパク質は、その他２種のサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する限り、各アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。
【００３２】
また、各配列番号で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、その他２種のサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を用いる場合も本発明に含まれる。
【００３３】
各サブユニットをコードする遺伝子は、同一の宿主で発現させる限り、同一のベクターに導入して形質転換を行ってもよいし、別々のベクターに導入して形質転換を行ってもよい。また。３種のサブユニットは、同一の種又は同一の株に由来するものを用いるのが好ましい。
【００３４】
本発明の形質転換体は、プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子若しくは１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼコードする遺伝子のいずれか、又はその双方を含む。
【００３５】
本発明において、プロパンジオールオキシドレダクターゼとは、当技術分野において通常用いられる意味を有し、すなわち３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを還元し、プロパンジオールに変換する反応を触媒することができる酵素活性を有するタンパク質を意味する。
【００３６】
プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子は、公知のものを使用でき、例えば、Lactobacillus属、Citrobacter属、Clostridium属、Klebsiella属、Enterobacter属、Caloramator属、Salmonella属、及びListeria属等に属する細菌に由来するものを使用することができる。本発明においては、Lactobacillus属細菌に由来する１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子、特にLactobacillus reuteri由来の１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子、さらにLactobacillus reuteri JCM1112株及びLactobacillus reuteri ATCC 53608株由来のプロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子が好ましい。
【００３７】
配列番号１３及び１５にLactobacillus reuteri由来のプロパンジオールオキシドレダクターゼのアミノ酸配列を、配列番号１４及び１６にLactobacillus reuteri由来のプロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子の塩基配列を例示する。これらのアミノ酸配列を含むタンパク質がプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有する限り、配列番号１３又は１５で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。
【００３８】
また、配列番号１４又は１６で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を用いる場合も本発明に含まれる。
【００３９】
本発明において、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼとは、当技術分野において通常用いられる意味を有し、すなわち３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを還元し、１，３−プロパンジオールに変換する反応を触媒することができる酵素活性を有するタンパク質を意味する。
【００４０】
１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子は、公知のものを使用でき、例えば、Lactobacillus属、Citrobacter属、Clostridium属、Klebsiella属、Enterobacter属、Caloramator属、Salmonella属、及びListeria属等に属する細菌に由来するものを使用することができる。本発明においては、Lactobacillus属細菌に由来する１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子、特にLactobacillus reuteri由来の１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子、さらにLactobacillus reuteri JCM1112株及びLactobacillus reuteri ATCC 53608株由来の１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子が好ましい。
【００４１】
配列番号１７にLactobacillus reuteri由来の１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼのアミノ酸配列を、配列番号１８にLactobacillus reuteri由来の１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子の塩基配列を例示する。これらのアミノ酸配列を含むタンパク質が１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有する限り、配列番号１７で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。
【００４２】
また、配列番号１８で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を用いる場合も本発明に含まれる。
【００４３】
本発明の形質転換体は、グリセロールの３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド及び水への変換反応を触媒することにより失活したグリセロールデヒドラターゼ又はジオールデヒドラターゼにおける反応中心部分の補酵素Ｂ１２を入れ替えて、再度活性を取り戻させる役割を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む。そのようなタンパク質としては、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及びジオールデヒドラターゼ再活性化因子が挙げられる。グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及びジオールデヒドラターゼ再活性化因子は、ラージサブユニット及びスモールサブユニットの２種のサブユニットから構成される。本発明の形質転換体には、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子の２種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含むもの、ジオールデヒドラターゼ再活性化因子の２種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含むもの、ならびにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子の２種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子とジオールデヒドラターゼ再活性化因子の２種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含むもののいずれをも包含する。
【００４４】
同様の作用を有するものであれば、特に制限なく使用できる。グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子としては、ＷＯ９８／２１３４１；Daniel et al., J. Bacteriol., 177, 2151(1995);Toraya and Mori, J. Biol. Chem., 274, 3372(1999);及びTobimatsu et al., J. Bacteriol. 181, 4110(1999)に記載のものなどが挙げられる。
【００４５】
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子の各サブユニットをコードする遺伝子としては、一般に嫌気条件下でグリセロールを資化することのできる細菌群が有するｇｄｈレギュロン、ｐｄｕオペロンと呼ばれる遺伝子郡内に存在するものが含まれ、例えば、ｇｄｒＡ、ｇｄｒＢ、ｐｄｕＧ、ｐｄｕＨ、ｄｄｒＡ、ｄｄｒＢ、ｄｈａＦ、ｄｈａＧ、ｏｒｆＺ、及びｏｒｆＹなどが挙げられる。
【００４６】
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子の各サブユニットをコードする遺伝子としては、公知のものを使用でき、例えば、Lactobacillus属、Citrobacter属、Clostridium属、Klebsiella属、Enterobacter属、Caloramator属、Salmonella属、及びListeria属等に属する細菌に由来するものを使用することができる。本発明においては、Lactobacillus属細菌に由来するグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び／又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子の各サブユニットの遺伝子、特にLactobacillus reuteri由来のグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び／又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子の各サブユニットの遺伝子、さらにLactobacillus reuteri JCM1112株及びLactobacillus reuteri ATCC 53608株由来のグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び／又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子の各サブユニットの遺伝子が好ましい。
【００４７】
好ましくは、グリセロールデヒドラターゼの３種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含む形質転換体は、少なくともグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子の２種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含み、ジオールデヒドラターゼの３種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含む形質転換体は、少なくともジオールデヒドラターゼ再活性化因子の２種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含む。
【００４８】
Lactobacillus reuteri由来のグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットのアミノ酸配列を配列番号１９及び２１に、スモールサブユニットのアミノ酸配列を配列番号２３及び２５に例示する。Lactobacillus reuteri由来のグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２０及び２２に、スモールサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２４及び２６に、例示する。
【００４９】
各アミノ酸配列を含むタンパク質は、もう一方のサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子活性を有する限り、各アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。
【００５０】
また、各配列番号で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、もう一方のサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を用いる場合も本発明に含まれる。
【００５１】
各サブユニットをコードする遺伝子は、同一の宿主で発現させる限り、同一のベクターに導入して形質転換を行ってもよいし、別々のベクターに導入して形質転換を行ってもよい。また。３種のサブユニットは、同一の種又は同一の株に由来するものを用いるのが好ましい。
【００５２】
本明細書において、各配列番号で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じたアミノ酸配列とは、各配列番号で表されるアミノ酸配列の１個、又は好ましくは１０〜２０個、より好ましくは５〜１０個、さらに好ましくは２〜３個のアミノ酸が欠失してもよく、又は各配列番号で表されるアミノ酸配列に１個、又は好ましくは、１０〜２０個、より好ましくは５〜１０個、さらに好ましくは２〜３個のアミノ酸が付加してもよく、又は、各配列番号で表されるアミノ酸配列の１個、又は好ましくは、１０〜２０個、より好ましくは５〜１０個、さらに好ましくは２〜３個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよいことを意味する。
【００５３】
本明細書において、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、すなわち、各遺伝子に対し高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件は、０．５〜１ＭのＮａＣｌ存在下４２〜６８℃で、又は５０％ホルムアミド存在下４２℃で、又は水溶液中６５〜６８℃で、ハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（saline sodium citrate）溶液を用いて室温〜６８℃でフィルターを洗浄することにより達成できる。
【００５４】
ここで、「一部の配列」とは、各遺伝子の塩基配列の一部分を含むＤＮＡの塩基配列であって、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるのに十分な塩基配列の長さを有するもの、例えば、少なくとも５０塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。
【００５５】
なお、遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutan-K（TAKARA社製）、Mutan-G（TAKARA社製））などを用いて、又は、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキットを用いて行うことができる。なお、上記手法により塩基配列が決定された後は、化学合成によって、又は染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって、又は該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００５６】
本発明においてアルデヒドデヒドロゲナーゼとは、当技術分野において通常用いられる意味を有し、すなわちアルデヒドを酸化してカルボン酸又はアシル基を生成する酵素活性を有するタンパク質を意味する。
【００５７】
アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子としては、公知のものを使用でき、例えば、Alcaligenes属、Aspergillus属、Bacillus属、Candida属、Chromobacterium属、Clostridium属、Corynebacterium属、Escherichia属、Lactobacillus属、Lactococcus属、Oceanobacillus属、Pichia属、Pseudomonas属、Rhizobium属、Rhodobacter属、Rhodococcus属、Saccharomyces属、Salmonella属、Sulfolobus属、Thermotoga属等に属する細菌に由来するものを使用することができる。
【００５８】
形質転換体の作成
本発明の形質転換体は、上記４種の遺伝子又はその一部を適当なベクターに連結し、得られた組換えベクターを本発明の遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。「一部」とは、宿主中に導入された場合に各遺伝子がコードするタンパク質を発現することができる各遺伝子の一部分を指す。
【００５９】
バクテリアゲノムから所望の遺伝子を得る方法は、分子生物学の分野において周知である。例えば遺伝子の配列が既知の場合、制限エンドヌクレアーゼ消化により適したゲノムライブラリを作り、所望の遺伝子配列に相補的なプローブを用いてスクリーニングすることができる。配列が単離されたら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，２０２号）のような標準的増幅法を用いてＤＮＡを増幅し、形質転換に適した量のＤＮＡを得ることができる。
【００６０】
本発明においては、グリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットをコードする遺伝子、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子、プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び／又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子の各サブユニットをコードする遺伝子及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、別々にベクターに導入して複数のベクターで形質転換を実施してもよいし、複数種の遺伝子を１つのベクターに導入して形質転換を行ってもよい。
【００６１】
本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、コスミドＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、例えばｐＢＲ３２２、ｐＳＣ１０１、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＡＣＹＣ１１７、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＥＴＤｕｅｔ−１、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１等が挙げられ、ファージＤＮＡとしては、例えばλｇｔ１０、Ｃｈａｒｏｎ ４Ａ、ＥＭＢＬ−、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９等が挙げられる。
【００６２】
宿主としては、目的とする遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、Ralstonia eutrophaなどのRalstonia属に属する細菌、Pseudomonas putidaなどのPseudomonas属に属する細菌、Bacillus subtilisなどのBacillus属に属する細菌、大腸菌などのEscherichia属に属する細菌、Saccharomyces cerevisiaeなどのSaccharomyces属に属する酵母、Candida maltosaなどのCandida属に属する酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などの動物細胞、ＳＦ９細胞などの昆虫細胞などが挙げられる。
【００６３】
宿主細胞においては、グリセロールデヒドロゲナーゼを発現しない宿主細胞、すなわちグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有しない細胞及びグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子をノックアウトした細胞を使用するのが好ましい。これらを用いることにより、グリセロールが酸化されてジヒドロキシアセトンに変換される経路を遮断することができ、より高い収率で１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸を製造することができる。
【００６４】
グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子をノックアウトした細胞とは、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されて発現できないような状況にある細胞を意味する。具体的には、該細胞は、細胞中のグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子を標的遺伝子として、標的遺伝子の任意の位置で相同組換えを起こすベクター（ターゲティングベクター）を用いて当該遺伝子を破壊する方法（ジーンターゲティング法）や、標的遺伝子の任意の位置にトラップベクター（プロモーターを持たないレポーター遺伝子）を挿入して当該遺伝子を破壊しその機能を失わせる方法（遺伝子トラップ法）、それらを組み合わせた方法等の通常当技術分野でノックアウト細胞、トランスジェニック動物（ノックアウト動物含む）等を作製する際に用いられる方法を用いて該細胞中のグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊することによって作製される。相同置換を起こす位置又はトラップベクターを挿入する位置は、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現の消失をもたらす変異を生じる位置であれば特に限定されないが、好ましくは転写調節領域、より好ましくは第２エクソンを置換する。またグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子をノックアウトする他の方法としては、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子のアンチセンスｃＤＮＡを発現するベクターを導入する方法や、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子の２重鎖ＲＮＡを発現するベクターを細胞に導入する方法が挙げられる。当該ベクターとしては、ウイルスベクターやプラスミドベクター等が包含され、通常の遺伝子工学的手法に基づき、例えばMolecular cloning 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に従い作製することができる。又、市販されているベクターを任意の制限酵素で切断し所望の遺伝子等を組み込んで半合成することもできる。
【００６５】
グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子がノックアウトされているか否かは、該ベクターが導入された細胞についてサザンブロットを行い正しく相同組換えが起こっていることを確認することによって、ターゲティングベクターに宿主細胞が有しない薬剤耐性遺伝子を入れておき薬剤耐性の形質が組み込まれたものを選抜することによって、破壊導入後、選抜した株のゲノム、菌体、菌体培養液等をテンプレートにして、破壊するグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子のＦ側とＲ側のプライマーを用いてＰＣＲをかけ、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子と破壊導入部位の配列を合わせた大きさのＤＮＡ断片の増幅を確認することによって、もしくはそれをクローニングして配列解析することによって、又はジヒドロキシアセトンが生成しないことを確認することによっても知ることができる。
【００６６】
大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、組換えベクターが該宿主中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、目的とするＤＮＡ、転写終結配列を含む構成であることが好ましい。発現ベクターとしては、広範囲の宿主において複製・保持されるＲＫ２複製起点を有するｐＬＡ２９１７（ATCC 37355）やＲＳＦ１０１０複製起点を有するｐＪＲＤ２１５（ATCC 37533）等が挙げられる。
【００６７】
プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組換えベクターの導入方法としては、特に限定されないが、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Current Protocols in Molecular Biology, 1, 181（1994））やエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００６８】
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えばＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等が挙げられる。プロモーターとしては、例えばｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＧＡＰプロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、特に限定されないが、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 192, 9-1933（1978））、酢酸リチウム法（J. Bacteriol., 153, 163-168（1983））等が挙げられる。
【００６９】
動物細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社）等が用いられる。プロモーターとしては、例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等が挙げられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、特に限定されないが、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００７０】
遺伝子の単離及び形質転換体の作成については、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
【００７１】
１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸の製造
本発明において、１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸の製造は、グリセロールの存在下、本発明の形質転換体を培養し、培養物（培養菌体又は培養上清）中に１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸を生成蓄積させ、該培養物から１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸を採取することにより実施できる。
【００７２】
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って、炭素源としてグリセロールを用いることにより行われる。例えば、比較的リッチな培地、例えば２培地等を用いて好気培養し、菌体量を増やしてから嫌気条件にし、グリセロールを与えて発酵を行う。ｐＨは、宿主の生育を妨害せず、かつ発酵液から酸を分離するときの障害とならない試薬を用いて調整する。炭酸ナトリウム、アンモニア、ナトリウムイオン供給源、例えば塩化ナトリウムを添加してもよい。また、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化アンモニウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液等の一般的なアルカリ試薬を用いてもよい。培養期間中ｐＨは、５．０〜８．０、好ましくは５．５〜７．５に保持する。
【００７３】
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。また、無機物としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
【００７４】
培養中は、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、インデューサーを培地に添加することもできる。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加することができる。
【００７５】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えばＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地にウシ胎児血清を添加した培地が用いられる。培養は、通常５％ＣＯ２存在下、３０〜４０℃で１〜３０日間行う。培養中はカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００７６】
あるいは、上記において得られた形質転換体の培養物から遠心分離などによって集菌を行い、適当な緩衝液に懸濁する。この菌体懸濁液をグリセロールを含む緩衝液に懸濁し、反応を行うことによって、１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸を製造することができる。反応の条件は、例えば、反応温度は１０〜８０℃、好ましくは１５〜５０℃、反応時間は５分〜９６時間、好ましくは１０分〜７２時間、ｐＨは５．０〜８．０、好ましくは５．５〜７．５である。
【００７７】
また、該培養物の処理物を用いて反応を行うこともできる。該処理物としては、菌体破砕物、菌体破砕物又は培養上清から調製した粗酵素、精製酵素等が挙げられる。また、常法により担体に固定化した菌体、該処理物、酵素等を用いることができる。
【００７８】
培養培地からの１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸の精製法は当該技術分野において周知である。例えば、有機溶媒を用いる抽出、蒸留及びカラムクロマトグラフィーに反応混合物を供することにより、培地から１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸を得ることができる（米国特許第５，３５６，８１２号）。また、限外濾過膜や水などの低分子のみが透過できるゼオライト分離膜などで発酵液の濃縮を行うのが好ましい。濃縮を行うことにより、水を蒸発させるためのエネルギーを低減することができる。
【００７９】
培地を高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析にかけることにより、１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸を直接同定することもできる。
【実施例】
【００８０】
（実施例１）グリセロールデヒドラターゼ遺伝子の取得
合成オリゴヌクレオチドプライマー（フォワードプライマー：5'-ATGAAACGTCAAAAACGATTTGAAGAACTAGAAAAAC-3'（配列番号２７）、リバースプライマー：5'-TTAGTTATCGCCCTTTAGCTTCTTACGACTTT-3'（配列番号２８）を作成し、Lactobacillus reuteri JCM1112株のゲノムを鋳型にして、以下の条件でＰＣＲ反応を実施した。
【００８１】
ＰＣＲ反応組成（μl）
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ＫＯＤｐｌｕｓ   ５
２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                  ５
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４                 ２
ゲノム  １１１ｎｇ／μｌ            １
ＫＯＤｐｌｕｓ                      １
水                                  ３４
フォワードプライマー  ２０ｐＭ      １
リバースプライマー    ２０ｐＭ      １      
反応系体積            計            ５０
反応サイクル：９４℃ ２分×１、９４℃ １５秒、４５〜６５℃ ３０秒、６８℃ ５分×３０回、４℃ ∞。
【００８２】
断片溶液にＴａｑプレミックスを等量加えて、７２℃で１０分、３’Ａ−オーバーハング処理し、精製したサンプルをｐＣＲ４−ＴＯＰＯにＴＡクローニングした。シーケンサーはＡＢＩのＰＥＩＳＭ３１０、３１００を使用した。その結果、配列番号２で示されるグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列、配列番号６で示されるグリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列、並びに配列番号１０で示されるグリセロールデヒドラターゼのスモールサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を決定した。
【００８３】
また、フォワードプライマー：5'-ATGAAACGTCAAAAACGTTTTGAAGAACTA-3'（配列番号２９）、リバースプライマー：5'-CTAGTTATCACCCTTGAGCTTCTTT-3'（配列番号３０）を作成し、Lactobacillus reuteri ATCC 53608株のゲノムを鋳型にして、上記と同様にＰＣＲ反応及びＤＮＡシークエンスを実施した。その結果、配列番号４で示されるグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列、配列番号８で示されるグリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列、並びに配列番号１２で示されるグリセロールデヒドラターゼのスモールサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を決定した。
【００８４】
（実施例２）プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子の取得
フォワードプライマー：5'-ATGGGAGGCATAATTCCAATGGAAAAATA-3'（配列番号３１）、リバースプライマー：5'-TTAACGAATTATTGCTTCGTAAACCATCTTC-3'（配列番号３２）を作成し、Lactobacillus reuteri JCM1112株のゲノムを鋳型にして、実施例１と同様にＰＣＲ反応及びＤＮＡシークエンスを実施した。その結果、配列番号１４で示されるプロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子の塩基配列を決定した。
【００８５】
また、フォワードプライマー：5'-ATGGGAGGCATAATGCCGATG-3'（配列番号３３）、リバースプライマー：5'-TTAACGAATTATTGCTTCGTAAATCATCTTC-3'（配列番号３４）を作成し、Lactobacillus reuteri ATCC 53608株のゲノムを鋳型にして、実施例１と同様にＰＣＲ反応及びＤＮＡシークエンスを実施した。その結果、配列番号１６で示されるプロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子の塩基配列を決定した。
【００８６】
（実施例３）１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子の取得
フォワードプライマー：5'-ATGAATAGACAATTTGATTTCTTAATGCCAAG-3'（配列番号３５）、リバースプライマー：5'-TTAGTAGATGCCATCGTAAGCCTTTT-3'（配列番号３６）を作成し、Lactobacillus reuteri JCM1112株のゲノムを鋳型にして、実施例１と同様にＰＣＲ反応及びＤＮＡシークエンスを実施した。その結果、配列番号１８で示される１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子の塩基配列を決定した。
【００８７】
（実施例４）グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子の取得
フォワードプライマー：5'-ATGGCAACTGAAAAAGTAATTGGTGTTGATATT-3'（配列番号３７）、リバースプライマー：5'-TCACCTGTTTGCCATTTCCTTAAAAGGGATT-3'（配列番号３８）を作成し、Lactobacillus reuteri JCM1112株のゲノムを鋳型にして、実施例１と同様にＰＣＲ反応及びＤＮＡシークエンスを実施した。配列番号２０で示されるグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子、並びに配列番号２４で示されるグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を決定した。
【００８８】
また、フォワードプライマー：5'-ATGGCAACTGAAAAAGTAATTGGTGTTG-3'（配列番号３９）、リバースプライマー：5'-TCACCTGTTTACCATTTCCTTAAAGG-3'（配列番号４０）を作成し、Lactobacillus reuteri ATCC 53608株のゲノムを鋳型にして、実施例１と同様にＰＣＲ反応及びＤＮＡシークエンスを実施した。その結果、配列番号２２で示されるグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子、並びに配列番号２６で示されるグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を決定した。
【００８９】
（実施例５）１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸の製造
(1)組み換え微生物の作成
Novagen社のｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターのマルチクローニングサイト１に乳酸菌のグリセロールデヒドラターゼ遺伝子、マルチクローニングサイト２に１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子を導入したプラスミド１と、Novagen社のｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクターのマルチクローニングサイト１にグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子、マルチクローニングサイト２にアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（大腸菌のａｌｄＢ アクセッションナンバー L40742）を導入したプラスミド２をそれぞれ作成し、これをＢＬ２１（ＤＥ３）−ＲＩＬに、Bio-RadのGENE PULSER IIエレクトロポレーションで導入した。
【００９０】
(2)組み換え微生物の培養
この菌株１μｌループ１掻き分を、クロラムフェニコール１００μｇ／ｍｌ、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む２培地５ｍｌ（グリセロール４０ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム １０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４６ｇ／ｌ、酵母エキス４０ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム七水和物１ｇ／ｌ、消泡剤アデカノール２０滴／ｌ）で、３７℃にて振とうしながら好気条件で、対数増殖後期（ＯＤ６６０＝５０）まで培養した。この培養液１ｍｌをとり、再度５００ｍｌ坂口フラスコに入れたクロラムフェニコール１００μｇ／ｍｌ、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む２培地１００ｍｌに植え継ぎ、３７℃にて振とうしながら好気条件で、対数増殖後期（ＯＤ６６０＝５０）まで培養した。
【００９１】
ここでＩＰＴＧを１ｍＭとなるように投入し、２時間おいた。菌体を遠心分離で回収し、１Ｍのグリセロール１００ｍｌに加え、気相部を窒素に置換した１００ｍｌボトルをボトルローラー上に３７℃で５時間おき、その後、液を分析した。その結果、液中には１，３−プロパンジオールが０．４Ｍ、３−ヒドロキシプロピオン酸が０．４Ｍ含まれていた。
【配列表フリーテキスト】
【００９２】
配列番号２７〜４０：合成オリゴヌクレオチド
【配列表】
2005278414000001.app