(57)【要約】 【課題】  汚染土壌中の有機塩素系化合物の分解方法を提供することにある。【解決手段】  乳酸菌、酵母、光合成細菌などの混合培養液である有用微生物群を土壌に投入するステップと、投入された有用微生物群により土壌中の各種微生物活動が促進され、有機塩素系化合物を分解する蛍光性Pseudomonas属やBacillus属のごとき微生物が増殖するステップと、これらの有機塩素系化合物を分解する微生物が核となり、他の生物群も菌群クラスターを形成し、複合的な作用により有機塩素化合物の分解が促進されるステップを含むものである。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌、酵母、光合成細菌などの混合培養液である有用微生物群を土壌に投入するステップと、投入された有用微生物群により土壌中の各種微生物活動が促進され、有機塩素系化合物を分解する蛍光性Pseudomonas属やBacillus属のごとき微生物が増殖するステップと、これらの有機塩素系化合物を分解する微生物が核となり、他の生物群も菌群クラスターを形成し、複合的な作用により有機塩素化合物の分解が促進されるステップとを含むことを特徴とする土壌中の有機塩素系化合物の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリクロロエチレン、ジクロロエチレン、テトラクロロエチレン、PCB、ダイオキシン等などの有機塩素系化合物を分解する土壌中の有機塩素系化合物の分解方法に係るものである。
【背景技術】
【０００２】
トリクロロエチレンは、過去にドライクリーニングやハイテク機器などの洗浄に大量に使用された有機塩素系化合物であり、土壌や地下水の汚染例も多く、人体に対しても極めて有害であるが、難分解性の有機ハロゲンに位置することもあり、対応が遅れている。
また、トリクロロエチレンに性質が似た１，１−ジクロロエチレンやテトラクロロエチレンについても同様に土壌や地下水の汚染例が報告されている。
さらに、製造はされていないものの、ごみなどの燃焼過程や紙やパルプの漂白過程などにおいて生成され、大気や土壌などの環境中に排出されるダイオキシンについても毒性が強いことで知られ、汚染土壌などについては早急な対応が求められている。このような化合物は、VOCといわれ、広く存在するが、揮発性のために大気中に蒸散されやすい特徴がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、上記した実状に鑑みてなされたもので、乳酸菌、酵母、光合成細菌などの混合培養液である有用微生物群を土壌に投入するステップと、投入された有用微生物群により土壌中の各種微生物活動が促進され、有機塩素系化合物を分解する蛍光性Pseudomonas属やBacillus属のごとき微生物が増殖するステップと、これらの有機塩素系化合物を分解する微生物が核となり、他の生物群も菌群クラスターを形成し、複合的な作用により有機塩素化合物の分解が促進されるステップを含む、土壌中の有機塩素系化合物の分解方法を提供することを目的とするものである。
微生物は、現位置（現場）では、難分解性の有機塩素系化合物を通常では、分解することは出来ない。しかし、微生物は環境への適応性があり、他に炭素源が存在しないような状況では、汚染物質である有機塩素系化合物を分解する酵素遺伝子を発現させることにより、しだいに分解可能な酵素が出現することになる。
このような酵素は、微生物の有する遺伝子である核外遺伝子に形質導入をされるか、遺伝子コ-ドの自己変換により分解可能な酵素が存在するようになるものである。
また、塩素基が4以上存在する有機塩素系化合物は、分解は大変に難しいとされている。そこで、本実験では、汚染土壌から高分離カラムクロマトグラフイーにて、分離した検体をGC-MSにて化合物の挙動を詳細に検討した。
【０００４】
【表１】
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【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に係る土壌中の有機塩素系化合物の分解方法は、表１に示す乳酸菌、酵母、光合成細菌などの混合培養液である有用微生物群を土壌に投入するステップと、投入された有用微生物群により土壌中の各種微生物活動が促進され、有機塩素系化合物を分解する蛍光性Pseudomonas属やBacillus属のごとき微生物が増殖するステップと、これらの有機塩素系化合物を分解する微生物が核となり、他の生物群も菌群クラスターを形成し、複合的な作用により有機塩素化合物の分解が促進されるステップを含んでなるものである。
尚、地盤の硬化情況と汚染の深さ等により、エタノール等の炭化水素化合物を土壌に注入すると、分解をより効果的にすることができる。
【発明の効果】
【０００６】
供試モデル１における有機塩素系化合物の分解率を表２に示す。それによれば、トリクロロエチレンは９６％、１，１−ジクロロエチレンは９２％の分解率を示した。テトラクロロエチレンについては２％の分解率に留まった。しかし、実験方法を、考量すればかなりの分解をする。例えば、テトラクロロエチレンの分解に関する研究では、テトラクロロエチレンを土壌に対して５％を混練したスラリ状の供試体を作成して試験に供与した。EM活性液は、およそ供試体の濃度が１％程度になる濃度で添加した。培養条件は、３０℃で３日間培養を行い、その後、コントロールとの比較を含め、テトラクロロエチレンの濃度の分析試験を実施した。試験では、培養の際に紫外線除去の目的で、ガラスの培養試験管をアルミ箔にて包摂した供試体を用いた。試験結果では、アルミ箔で遮光した供試体分解率は、最大で６８.８％の高分解率を示した。
【０００７】
【表２】
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【０００８】
また、供試モデル11における有機塩素系化合物の分解率を表３に示す。それによれば、トリクロロエチレンは２２％、１，１−ジクロロエチレンは１５％の分解率を示した。テトラクロロエチレンについては０％の分解率を示した。
【０００９】
【表３】
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【００１０】
これにより、有用微生物群を添加した場合は、トリクロロエチレンおよび１，１−ジクロロエチレンについて、高い割合で有機塩素系化合物を分解することが認められた。
ＥＭ（有用微生物群）には、微生物の代謝により生成された、インドール酢酸、植物成長ホルモンの他に、フェノール系の化合物などが存在する。このフェノール系の化合物を一種の伝達手段として、微生物と土壌、微生物と微生物が情報を交換することにより、汚染された土壌を浄化するのに必要なクラスターを形成し、集積すると推察される。つまりは微生物群クラスターが生成する各種有機酸が糊の役割を果たし、高次の土壌団粒構造形成が促進され、土壌のイオン交換能機能が高まり塩化物イオンが排除され、結果的に有機塩素系化合物からの塩素の乖離が促進されるものと推定される。
また、有用微生物群を添加しない自然状態の土壌でも、有機塩素系化合物を分解することが示されたが、これについては、自然状態の微生物の働き、および土壌団粒構造に伴う力によって、有機塩素系化合物が土壌に吸着されている可能性があると考えられる。本実験ではこのような土壌の影響を考量して標準土壌を供試体として団粒構造が一定の土壌において分解促進を調べている。そのため、土壌の影響をわずかに伴う結果を得ることが出来たと想定した。微生物による分解能を最大限にみることが可能であった。
【００１１】
供試モデル１、11のグラム陽性、陰性菌数
表４および表５に供試モデル１におけるグラム陽性菌とグラム陰性菌の数をそれぞれ示す。本結果により、供試モデル１においてはグラム陽性菌とグラム陰性菌の両方が認められ、その平均合計を比較すると、グラム陽性菌はグラム陰性菌の約２倍となり、微生物の数としては大差ない。
【００１２】
【表４】
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【００１３】
【表５】
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【００１４】
次に、表６および表７に供試モデル11におけるグラム陽性菌とグラム陰性菌の数をそれぞれ示す。供試モデル11は供試モデル１よりも菌数が少なく、供試モデル１と比較するとグラム陽性で１０７個、グラム陰性で１０８個ほど少ないことが判読できる。  また、供試モデ11では、グラム陰性菌は、グラム陽性菌の約１／１０程度である。
【００１５】
【表６】
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【００１６】
【表７】
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【００１７】
さらに、供試モデル１の寒天培地を観察すると、グラム陰性菌のコロニーに、赤、緑、ピンク等の色素生産菌が多く見られた。そこでその中から赤と緑のコロニーを抽出し、蛍光顕微鏡で観察したところ、これが有機塩素系化合物を分解する蛍光性Pseudomonas属の微生物であることが判明した。従って、これらのことから、
(1) 有用微生物群を使用することで、供試モデル１の総微生物数が増加した。
(2) 本試験で使用した土壌では、元来、グラム陽性菌が優先しているが、有用微生物群を使用することで、供試モデル１のグラム陽性菌、グラム陰性菌ともに増加した。
(3)増加したグラム陰性菌には、蛍光性Pseudomonas属の微生物が含まれ、これが供試モデル１において、蛍光性Pseudomonas属の微生物が認められなかった供試モデル11よりも高い割合で有機塩素系化合物が分解したことに関係する。
ことが推定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
1.1 本発明に係る実験で使用した試材、試薬を以下に示す。
(1)標準土壌（日本土壌肥料学会  NDG-1）
(2)トリクロロエチレン（和光純薬特級）
(3) １，１−ジクロロエチレン（和光純薬特級）
(4)テトラクロロエチレン（和光純薬特級）
(5)有用微生物群（ＥＭ１号：ＥＭ研究所製）
【実施例】
【００１９】
1.2 試料モデル１（有用微生物群処理区）の作製
(1)土壌の調整  
アルミ合金製容器を準備し、標準土壌27kgを3 kgずつ均等に分配して9個の試料を準備した。
(2) 有用微生物群希釈液の調整
有用微生物群（ＥＭ１号）の原液を、精製水で１％，３％，５％となるよう希釈した。
(3)試薬の調整
トリクロロエチレン、１，１−ジクロロエチレン、およびテトラクロロエチレンを、マイクロピペットでそれぞれ0.35mg/l,0.005mg/l,0.15mg/lとなるよう、精製水にて希釈した。
(4) 試料モデル１の調整
乳酸菌、酵母、光合成細菌などの混合培養液である有用微生物群を土壌に投入するステップである。
土壌に有用微生物群（濃度 1％，3％，5％）をそれぞれ3群ずつ散布し、合計9ケースの有用微生物群処理標準土壌を作製した。この際、均一に有用微生物群が行き渡るよう、土壌3
kgに対して1lの有用微生物群を施用し、土壌を乾燥させながら金属ヘラにて混練した。その後、トリクロロエチレン、１，１−ジクロロエチレン、およびテトラクロロエチレンの希釈液を、土壌の重量と同量混練した。
【００２０】
1.3 試料モデル11（有用微生物群未処理区）の作製
前述の試料モデル１の作製と同様に、トリクロロエチレン、１，１−ジクロロエチレン、およびテトラクロロエチレンの希釈液を、土壌の重量と同量混練した。
【００２１】
1.4 試料モデルの有機塩素系化合物分解試験  
試料モデル１および11を、1,000mlの三角フラスコに入れ、有機塩素系化合物が揮発しないようにそれぞれシリコンゴム栓で蓋をし、さらにラボフィルムで覆い蒸散を防止する処理を施した後、試料モデル中の有用微生物群の活動が促進されるようインキュベータにて37℃で7日間培養した。その後、試料モデルをメタノール（和光純薬特級）とジクロロメタン 1:3 （和光純薬特級）の２種類の溶媒による還流抽出を実施した。この際、各試料モデルの土壌3
kgあたり、9lの溶媒を使用して、３時間の還流を行った。さらに、濾紙による濾過を１回実施し、溶媒抽出液をロータリーエバポレータで減圧濃縮し、約1／10の容積まで濃縮した。
【００２２】
1.5 試料モデルの有機塩素系化合物測定
分解試験を施した試料モデルに含まれるトリクロロエチレン、１，１−ジクロロエチレン、テトラクロロエチレンの定量および定性方法について以下に示す。
分析には、ＪＭＳ−７００型ガスクロマトグラフィー（以下ＧＣ−ＭＳ  日本電子製）を用いた。その分析パラメーターは次の通りである。
(1) カラム：ＳＰ―２３３１
(2) 昇温：１２０℃（２min），２００−２６０℃
(3) 注入温度：２６０℃
(4) 注入方式：スピリットレス
(5) 分解機能 ：１０，０００以上
(6) イオン化電流：600μA
【００２３】
1.6 試料モデル中の微生物構成
分解試験を施した試料モデルにおける微生物の構成を把握するため、試料モデルの一部を滅菌生理食塩水に浸漬した後、約２８℃の室内で２４時間保存し、その上澄み液を、１ＹＧ、２ＢＴＢ、３ＢＨＩの３種類の寒天培地に塗布した。その後、この培地をインキュベーター（大和科学製）にて３７℃で５日間培養した後、発育した微生物コロニーを目視並びに蛍光顕微鏡（オリンパス製）にて観察した。
【００２４】
1.7 蛍光性Pseudomonas属、およびBacillus属の分離
有用微生物群は乳酸菌、酵母、光合成細菌などの混合培養液である。この種の微生物は直接有機塩素系化合物を分解はしないが、自然状態で環境に存在する他の微生物の働きを活発にすることが知られている。そこで、有用微生物群を施用したことにより、広く自然界に存在し、有機塩素系化合物を分解することで知られる微生物の蛍光性Pseudomonas属、およびBacillus属が、本試料モデルにおいてどのような動態を示すかを調べるため、その分離を行った。
試料モデルの一部を滅菌生理食塩水に浸漬した後、約２８℃の室内で２４時間保存し、その上澄み液を蛍光性Pseudomonas属およびBacillus属の選択培地に塗布した。その後、これらの培地をインキュベーター（大和科学製）にて３７℃で４８時間培養した後、発育した微生物コロニーを目視並びに蛍光顕微鏡（オリンパス製）にて観察し、１６ｒｓＲＮＡ解析装置（宝バイオ）にて菌体の遺伝子を同定した。
【００２５】
1.8  蛍光性Pseudomonas属、およびBacillus属による有機塩素系化合物の分解について
試料モデルから分離した蛍光性Pseudomonas属、およびBacillus属を、ＹＧ液体培地にて３７℃で２４時間培養した。その後に、トリクロロエチレン、１，１−ジクロロエチレン、およびテトラクロロエチレンを、最終倍率がそれぞれ0.35mg/l,0.005mg/l,0.15mg/lとなるようＹＧ培地に添加し、インキュベーター（大和科学製）にて３７℃で７日間培養した。
培養後の培地を遠心分離機にかけ、ガーゼにて濾過を行って検体を作製した。これを減圧濃縮した後、ＧＣ−ＭＳにて有機塩素系化合物の残量を測定した。
【００２６】
1.9  有機塩素系化合物の分解機作の特定
トリクロロエチレンは、微生物の生成する酵素（オキシゲナーゼ）の作用によって酸素が遊離し、トリクロロオキシドになる。また、他の酵素（モノオキシゲナーゼ）によりクロラールが生成される。その後、このクロラールが、蟻酸、グリオキシル酸、トリクロエタノール、クロロ酢酸などに分解される。そこで、これらの存在を確認するため、これらと同じ化合物を標準物質（メルク特級）として、分解試験後の試料モデル抽出物をＧＣ−ＭＳで分析した。
図１は、トリクロロエチレンの分解経路である。また、図２は、トリクロロエチレンの分解メカ二ズムのＥＭによる挙動を示した説明図で、上記の分解のメカ二ズムと異なり、表土壌の分解をGC−MSにより調査を実施した結果である。１から４までの分解機構は、全ての環境情況が異なる分解反応機構を示している。特に４は嫌気分解後、ＥＭによる酸化分解と示唆された。さらに図３は、現位置を想定して、泥に５％の、テトラクロロエチレンを均等に分散させたモデルを作成して分解率を調べた結果を示す説明図である。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
汚染土壌に存在するトリクロロエチレン、ジクロロエチレンなどの有機塩素系化合物を、微生物群クラスターが生成する各種の酵素の働きにより分解するとともに、炭素源として微生物の代謝活動に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明に係る有機塩素系化合物の分解方法によるトリクロロエチレンの分解経路を示す説明図である。
【図２】図２は、トリクロロエチレンの分解メカ二ズムのＥＭによる挙動を示した説明図である。
【図３】図３は、現位置を想定して、泥に５％の、テトラクロロエチレンを均等に分散させたモデルを作成して分解率を調べた結果を示す説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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