(57)【要約】      （修正有）【課題】多剤耐性化若しくは低感受性化し難治性感染症の原因として問題視されている黄色ブドウ球菌等に優れた効力を発揮する、新規抗菌薬の探索のための標的となるポリペプチドの提供。【解決手段】黄色ブドウ球菌等の細菌の生育又は増殖に必須であり、かつＡＴＰ分解活性を有する、特定配列で表される、黄色ブドウ球菌由来のポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１で特定されるポリペプチド。
【請求項２】
細菌の生育又は増殖に必須である請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
細菌の生育又は増殖に必須であるポリペプチドであって、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項４】
さらにＡＴＰ分解活性を有する請求項２又は３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
細菌がグラム陽性菌である請求項２ないし４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
細菌がスタフィロコッカス属の細菌である請求項２ないし４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
細菌が黄色ブドウ球菌である請求項２ないし４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列表の配列番号２で特定されるポリヌクレオチドである請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のポリヌクレオチドを含むポリペプチド発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターで形質転換された微生物。
【請求項１２】
細菌の生育又は増殖を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、下記の工程：
（A）被検物質存在下で請求項１ないし７のいずれか一項に記載のポリペプチドのＡＴＰ分解活性及び／又はＡＴＰ結合能を測定する工程
（B）上記工程（A）において該ポリペプチドのＡＴＰ分解活性及び／又はＡＴＰ結合能が阻害された場合に該被検物質を細菌の生育又は増殖を阻害する物質であると判定する工程を含む方法。
【請求項１３】
細菌の生育又は増殖を阻害する物質をスクリーニングするためのキットであって、請求項１ないし７のいずれか一項に記載のポリペプチド及びＡＴＰを含むキット。
【請求項１４】
請求項１２に記載のスクリーニング方法で選定された、細菌の生育又は増殖を阻害する物質。
【請求項１５】
細菌の生育又は増殖を阻害するための医薬であって、請求項１４に記載の物質を有効成分として含む医薬。
【請求項１６】
細菌がグラム陽性菌である請求項１５に記載の医薬。
【請求項１７】
細菌がスタフィロコッカス属の細菌である請求項１５に記載の医薬。
【請求項１８】
細菌が黄色ブドウ球菌である請求項１５に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
近年、多剤に耐性化若しくは低感受性化した黄色ブドウ球菌、肺炎球菌、腸球菌、緑膿菌、結核菌などが増加し、難治性感染症の原因として問題視されている。このような既存薬耐性／低感受性菌に対しても優れた効力を発揮する薬剤としては、既存薬と異なる新規な作用機作を有する新規骨格（新規化学構造）の薬剤が最も有望である。
【０００２】
近年の医薬探索のアプローチは、化合物の構造修飾が始点となる従来の方法論から変化しつつあり、薬剤の標的となりうる蛋白質を遺伝子解析等によって同定し、その機能又は活性に影響を与える物質を生化学的な手法で探索する方法論が重要となっている。また、ロボットを用いた高速スクリーニング技術や、バーチャルスクリーニング、ストラクチャーベースド・ドラッグ・デザイン技術等、多くの技術の進歩によって創薬研究パラダイムはより網羅的かつ効率的な方向に変化している。しかしながら、このような状況であっても、新たな創薬標的候補を同定するとともに検証し、有望な創薬標的（蛋白質）を提供することはひとつの重要な課題である。
【０００３】
現在、多数の細菌のゲノムＤＮＡ塩基配列が解読されているが、この様なゲノム情報が創薬研究上有用であることは言うまでもない。例えば、黄色ブドウ球菌のゲノム情報は２００１年に、２種の菌株（Ｎ３１５株及びＭｕ５０株）で明らかにされた（非特許文献１：Kuroda, M. et al., Lancet, 357: 1225-1240, 2001）。２００２年には、もう１種の菌株（ＭＷ２株）について報告がなされた（非特許文献２：Baba, T. et al., Lancet, 359: 1819-1827, 2002）。そして現在ではインターネットで公開されたデータベースには、少なくともさらに４種（２５２株、４７６株、ＣＯＬ株、およびＮＣＴＣ８３２５株）の黄色ブドウ球菌株のゲノムＤＮＡ塩基配列情報が存在する（例えば、非特許文献３：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi?にて相同性検索が可能）。
【非特許文献１】Lancet, 357: 1225-1240, 2001
【非特許文献２】Lancet, 359: 1819-1827, 2002
【非特許文献３】http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi?
【非特許文献４】J. Biol. Chem., 277: 28380-28383, 2002
【非特許文献５】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 4678-4683, 2003
【非特許文献６】Science, 293: 2266-2269, 2001
【非特許文献７】Mol. Micobiol., 43: 1387-1400, 2002
【非特許文献８】EMBO J., 22: 427-437, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、新規抗菌薬の探索のための標的となる蛋白質（ポリペプチド）を提供することにある。この課題の解決のため、本発明者らは、いずれの黄色ブドウ球菌株ゲノムにも普遍的に見出されている推定上の遺伝子、特にＮ３１５株における一連番号としてＳＡ０７７５に着目した。
【０００５】
該遺伝子の産物であるポリペプチドは、各種公開データベースを用いた一般的なバイオインフォマティクス解析の結果に基づくと、大腸菌において鉄-硫黄クラスター形成を担う機構の一種のＳＵＦマシナリー（非特許文献４：Takahashi, Y. and Tokumoto, U., J. Biol. Chem., 277: 28380-28383, 2002）を構成する蛋白質のひとつ、ＳｕｆＢのホモログであると考えられた。すなわちこの遺伝子は、大腸菌のＳＵＦマシナリーを構成する蛋白質の遺伝子（ｓｕｆＡ，ｓｕｆＢ，ｓｕｆＣ，ｓｕｆＤ，ｓｕｆＳ，およびｓｕｆＥ）のオルソログと考えられる数種の遺伝子と隣接してゲノム上に存在し、アミノ酸配列においてＳｕｆＢと２５％の同一率が認められている。ＳｕｆＢは大腸菌の鉄-硫黄クラスター形成に必要であることは示唆されているが、具体的にどのように機能するのか、或いはＳｕｆＢ自体がどのような活性を有するのかは、未だ解明されていない（非特許文献４）。
【０００６】
鉄-硫黄クラスターは、種々の酸化還元反応に関係する酵素の活性発現に必須であり、細菌の生育および増殖に必須である。大腸菌（およびプロテオバクテリア門の各種細菌）は鉄-硫黄クラスター形成を担う主要な機構としてＩＳＣマシナリーを有している。したがって、ＳＵＦマシナリーを構成する蛋白質は、大腸菌の増殖には必ずしも必須ではないことが知られている（非特許文献４）。しかしながら、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、腸球菌、肺炎球菌などのグラム陽性菌では、大腸菌（グラム陰性菌）とは異なりＩＳＣマシナリーが存在しないことが各種細菌のゲノム情報から推定されている。
【０００７】
一方、グラム陽性菌である枯草菌では、大腸菌のＳＵＦマシナリーを構成する蛋白質の遺伝子に対応する数種のオルソログ（ｙｕｒＵ，ｙｕｒＶ，ｙｕｒＸ，およびｙｕｒＹ）が不活化（ノックアウト）され得ず、これらは菌の生育又は増殖に必須であると最近報告された（非特許文献５：Kobayashi, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 4678-4683, 2003）。それ以前には、黄色ブドウ球菌では、枯草菌のｙｕｒＸと最も相同性が高い遺伝子（Ｎ３１５株におけるＳＡ０７７５）が菌の生育又は増殖に必須である可能性が示されたが（非特許文献６：Ji, Y. et. al., Science, 293: 2266-2269, 2001）、また別の報告（非特許文献７：Forsyth, R.A. et. al., Mol. Micobiol., 43: 1387-1400, 2002）では、該遺伝子の必須性は示されていない（非特許文献７：Forsyth, R.A. et. al., Mol. Micobiol., 43: 1387-1400, 2002；両報告ともにアンチセンス法による解析）。すなわち、黄色ブドウ球菌におけるｓｕｆＢ或いはｙｕｒＸのオルソログと推定された遺伝子の必須性は確立されていなかった。
【０００８】
また、ｓｕｆＢと隣接して存在するｓｕｆＣは、コードする蛋白質ＳｕｆＣがアミノ酸配列上公知のＡＴＰａｓｅモチーフを有する。ある種の細菌（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）におけるＳｕｆＣホモログは、ＡＴＰａｓｅ活性、及び自身のＳｕｆＢホモログとの相互作用を示すことから（非特許文献８：Nachin, L., et. al., EMBO J., 22: 427-437, 2003）、ｓｕｆＢとｓｕｆＣとの機能的関連性が示唆されていた。しかし、この示唆も、ＳｕｆＢ及びそのホモログ自体の活性及び必須性を示すものではなく、該遺伝子の機能あるいはコード蛋白質の活性は不明なままであった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、Ｎ３１５株におけるＳＡ０７７５遺伝子がスタフィロコッカス属の黄色ブドウ球菌の生育又は増殖に必須であることを明らかにし、その産物にあたるポリペプチドを初めて遺伝子工学的に製造して該ポリペプチドがＡＴＰ分解活性を有することを見出した。本発明は、該知見を基にして完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明により、配列表の配列番号１で特定されるポリペプチドが提供される。また、本発明により、細菌の生育又は増殖に必須である上記ポリペプチド；細菌の生育又は増殖に必須であるポリペプチドであって、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；及びさらにＡＴＰ分解活性を有する上記いずれかのポリペプチドが提供される。本発明の好ましい態様によれば細菌がグラム陽性菌である上記いずれかのポリペプチド、より好ましい態様によれば、細菌がスタフィロコッカス属の細菌である上記いずれかのポリペプチド、さらに好ましい態様によれば細菌が黄色ブドウ球菌である上記いずれかのポリペプチドが提供される。
【００１１】
さらに、本発明により、上記いずれかのポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド；配列表の配列番号２で特定されるポリヌクレオチドである上記のポリヌクレオチド；上記いずれかのポリヌクレオチドを含むポリペプチド発現ベクター；及び該ベクターにより形質転換された微生物が提供される。
【００１２】
別の観点からは、本発明により、細菌の生育又は増殖を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、下記の工程：
（A）被検物質存在下で上記いずれかのポリペプチドのＡＴＰ分解活性及び／又はＡＴＰ結合能を測定する工程
（B）上記工程（A）において該ポリペプチドのＡＴＰ分解活性及び／又はＡＴＰ結合能が阻害された場合に該被検物質を細菌の生育又は増殖を阻害する物質であると判定する工程を含む方法が提供される。
【００１３】
また、本発明により、細菌の生育又は増殖を阻害する物質をスクリーニングするためのキットであって、上記いずれかのポリペプチド及びＡＴＰを含むキットが提供される。
【００１４】
さらに別の観点からは、本発明により、上記のスクリーニング方法で選定された細菌の生育又は増殖を阻害する物質が提供される。また、本発明により、細菌の生育又は増殖を阻害するための医薬であって、該物質を有効成分として含む医薬、細菌がグラム陽性菌である上記の医薬、細菌がスタフィロコッカス属の細菌である上記の医薬及び細菌が黄色ブドウ球菌である上記の医薬が提供される。
また、別の観点からは、細菌感染症の予防及び／又は治療方法であって、上記物質の有効量をヒトを含む哺乳動物に投与する工程を含む方法；及び、細菌の生育又は増殖を阻害する方法であって、上記物質の有効量を該細菌に接触させる工程を含む方法が提供される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は黄色ブドウ球菌などの細菌の生育又は増殖に必須であり、該ポリペプチドの機能を阻害する物質の探索によって、細菌の生育又は増殖を阻害するための医薬の開発が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
一般に、ある遺伝子（およびコードされる蛋白質）の必須性の解析法としてはアンチセンス法よりも、上述の枯草菌を対象とした研究に適用されたような遺伝子を破壊或いは不活化できるか否か検討する方法が、より直接的で確実なアプローチである。本発明の配列番号１のポリペプチドをコードする配列番号２のポリヌクレオチドを含む黄色ブドウ球菌の染色体上の推定遺伝子は、後述の実施例に示すように不活化（破壊）することができない。この事実から、配列番号２のポリヌクレオチドを含む遺伝子は確かに機能し、該遺伝子がコードする配列番号１で特定されるポリペプチドは、黄色ブドウ球菌を含む細菌の生育又は増殖に必須であるものと理解できる。
【００１７】
細菌としては好ましくはグラム陽性菌、さらに好ましくはスタフィロコッカス属の細菌が挙げられる。スタフィロコッカス属の細菌としては、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・オーレウス）及び表皮ブドウ球菌のほか、腐性ブドウ球菌（スタフィロコッカス・サプロフィティカス）やスタフィロコッカス・ヘモリティカスを好ましい例として挙げることができるが、最も好ましいのは黄色ブドウ球菌である。
【００１８】
本発明の配列番号１のポリペプチドと高い相同性を有する蛋白質をコードすると推定される遺伝子は、スタフィロコッカス属に属する表皮ブドウ球菌（スタフィロコッカス・エピダーミデス）にも見出され、コードされる蛋白質のアミノ酸配列は８７％の同一性を有していた。従って、配列表の配列番号１のポリペプチド或いは同じ機能を有する相同なポリペプチド（一般にホモログと呼ばれる）は、例えばスタフィロコッカス属に属する細菌には普遍的に存在すると考えることができる。
【００１９】
このような観点からも、本発明の範囲には、細菌の生育又は増殖に必須でありかつＡＴＰ分解活性を有するポリペプチドであって、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１ないし数個若しくは数十個（例えば１ないし６０個、より好ましくは１ないし４０個、さらに好ましくは１ないし２０個、特に好ましくは１ないし１０個）のアミノ酸が欠失、置換、又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、「改変ポリペプチド」と呼ぶ場合がある）が含まれる（以下、配列表の配列番号１に示されたポリペプチド及び改変ポリペプチドを「本発明のポリペプチド」と呼ぶ場合がある）。
【００２０】
改変ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも３０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上の同一性を有することが望ましい。改変ポリペプチドが所望の活性を有するか否かは、本明細書の実施例に具体的に記載された方法に従って改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを作製し、該ベクターにより微生物を形質転換後、発現したポリペプチドを精製してその活性を調べることにより確認可能である。
【００２１】
本発明の範囲には、配列表の配列番号１により特定されるアミノ酸配列を有するポリペプチド及び上記の改変ポリペプチドのほか、これらのポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドも包含される。このようなポリペプチドは、好ましくは全長（アミノ酸残基数）が４００ないし２０００程度、より好ましくは４００ないし１０００程度である。特定のアミノ酸配列を部分配列として有する蛋白質の発現方法は当業者に周知かつ慣用であり、当業者は本発明のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドを容易に入手可能である。
【００２２】
配列表の配列番号１により特定されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一例を配列表の配列番号２に示すが、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはこの特定の態様に限定されるものではなく、該ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドはすべて本発明の範囲に包含されることを理解すべきである。また、上記の改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲に包含される（以下、配列表の配列番号１に示されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを「本発明のポリヌクレオチド」と呼ぶ場合がある）。本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡ及びＲＮＡを包含する概念である。さらに、本発明のポリヌクレオチドを部分配列として含むポリヌクレオチドも本発明の範囲に包含される。その好ましい例として、本発明のポリヌクレオチドを含むポリペプチド発現ベクターを挙げることができる。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドを含むポリペプチド発現ベクターの製造方法は、本明細書の実施例に具体的に記載されており、当業者は容易に所望のポリペプチド発現ベクターを作製することができる。本発明で使用できるベクターとしては、pMAL-c2が好適な例として挙げられるが、ベクターの種類はこれに限定されることはなく、この分野で通常使用されるものを適宜選択してよい。また、発現ベクターにより微生物を形質転換する方法も当業者に周知かつ慣用であり、例えば、エレクトロポレーション法、超音波法、界面活性剤法などの遺伝子導入方法として利用可能ないかなる方法により形質転換体を製造してもよい。これらの方法の一例は本明細書の実施例に具体的に示されており、当業者は本発明の形質転換体を容易に製造できる。また、ポリペプチド発現ベクターで形質転換される微生物は、本発明のポリペプチドを発現できれば任意の微生物でよく、細菌、酵母、及び真菌のいずれを用いてもよい。ポリペプチド発現ベクターで形質転換された微生物などの細胞或いは無細胞蛋白質発現系の反応液から、該ベクターのポリヌクレオチド配列に基づき発現したポリペプチドを取得及び精製する方法も、特に限定されるものではなく、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
【００２４】
本発明のポリペプチドは、後述の実施例に示すようにＡＴＰ分解活性を有する。従って、このＡＴＰ分解活性を指標として、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子が関与する細菌の生育又は増殖を阻害する物質のスクリーニングが可能である。具体的には下記の工程：
（A）被検物質存在下で本発明のポリペプチドのＡＴＰ分解活性及び／又はＡＴＰ結合能を測定する工程
（B）上記工程（A）において該ポリペプチドのＡＴＰ分解活性及び／又はＡＴＰ結合能が阻害された場合に該被検物質を細菌の生育又は増殖を阻害する物質であると判定する工程
を含む方法である。該方法におけるＡＴＰ分解活性又はＡＴＰ結合能の測定方法としては、具体的には、本明細書の実施例に示すＡＴＰの加水分解に伴って遊離するリン酸量を指標とする測定方法が挙げられるが、これに限定されることはない。  
【００２５】
また、本発明のポリペプチドと物理化学的な相互作用を有する物質をスクリーニングすることにより細菌の生育又は増殖を阻害する物質をスクリーニングすることも可能である。このようなスクリーニングにより選抜された物質は、本発明のポリペプチドを直接の作用点とする物質であって、本発明のポリペプチドが有する細菌の生育又は増殖に必須な機能を阻害する物質の候補として有用である。本発明のポリペプチドと核酸、蛋白質、又は低分子化合物との物理化学的相互作用を確認する方法としては、当業界で利用可能な蛍光偏光解消法や表面プラズモン共鳴法の手法などを適宜利用することができる（例えば国際公開ＷＯ０１／１６６００に説明されている相互作用確認法などを利用可能である）。
【００２６】
本発明のポリペプチドは細菌の生育又は増殖に必須であるため、新規抗菌薬の探索のための標的となり、該ポリペプチドを標的とした上記のスクリーニング方法で選定された物質は、医薬の有効成分として用いることが可能である。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：遺伝子の必須性解析
（Ａ）菌株
黄色ブドウ球菌はRN4220株を用いた。また、プラスミド調製のため、大腸菌MC1061株を用いた。
（Ｂ）培地
2×YT培地（Difco Laboratories, Sparks, MD, U.S.A.）およびLuria-Bertani寒天培地（Difco Laboratories）を用いて大腸菌を培養し、Brain Heart Infusion培地（BHI；Difco Laboratories）およびその寒天培地（BHIA；Difco Laboratories）を用いて黄色ブドウ球菌を培養した。尚、必要に応じてアンピシリン（Amp；Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, U.S.A.） を終濃度が100μg/mlとなるように、あるいはテトラサイクリン（Tc；Sigma-Aldrich Chemical Co.）を5μg/mlとなるように添加した。
【００２８】
（Ｃ）プラスミド
大腸菌と黄色ブドウ球菌のシャトルベクタープラスミドpYT3（Kuwahara-Arai, K. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 40: 2680-2685, 1996）を用いた。本プラスミドは温度感受性の複製起点を有し、黄色ブドウ球菌体内では30℃で複製するが42℃では複製しない。また、本プラスミドはAmp耐性遺伝子およびTc耐性遺伝子を含む。
（Ｄ）PCR用プライマー（合成オリゴヌクレオチド）5'-TAGACAACTGATATTTTGAACATTT-3'［F1プライマー：組換え対象とした推定遺伝子の蛋白質翻訳開始コドン（ATG）を終止コドン（下線部）に置換した配列からなる］、5'-ATCAAGTAGGAGGAAAAAGTTATG-3'（F2プライマー）、5'-CATCACCTTTTACATCGTGTTGTTT-3'（R1プライマー）、および5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'（RV-Mプライマー）を用いた。尚、図１(A)に、後述の遺伝子相同組換え用プラスミドおよび期待されるゲノム上での遺伝子組換え（プラスミドインテグレーション）の概略とともに、上記プライマーが相補する凡その位置を示した。
【００２９】
（Ｅ）黄色ブドウ球菌ゲノムDNAの調製
黄色ブドウ球菌をBHIに接種後、37℃で16時間培養し、集菌した。菌体を緩衝液TE［10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA（pH 8.0）］で懸濁後、終濃度10 μg/ml となるようにリソスタフィン（和光純薬工業株式会社、大阪）を加え、37℃で2時間保温した。さらに、0.7% SDS含有TEを等量加えた後、終濃度30 μg/ml となるようにプロテイナーゼK（Sigma-Aldrich Chemical Co.）を加え、55℃で2時間保温した。続いてフェノール処理、フェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール処理を行ない、エタノール沈殿によりゲノムDNAを精製した。該DNAは、終濃度が500 ng/ml となるようにRNaseA（Sigma-Aldrich Chemical Co.）を加えたTEを用い、4℃で溶解させた。
【００３０】
（Ｆ）遺伝子相同組換え用プラスミドの構築
F1およびR1プライマーを用い、RN4220株ゲノムDNA（400 ng/reaction）を鋳型としてPCR［ExpandTM High-Fidelity PCR System（Roche Diagnostics, Basel, Switzerland）による；94℃で2分間反応後、94℃で30秒間、50℃で30秒間、72℃で30秒間の一連の反応を25サイクル、最後に72℃で2分間反応］を行ない、組換え対象とする推定遺伝子の5’（蛋白質翻訳開始コドン）および3’側欠失DNA断片（約200 bp）を増幅した。得られたDNA断片を精製後、末端に平滑化・リン酸化処理を施した。その後、該処理DNA断片と、予めBamHI処理、次いで末端の平滑化および脱リン酸化処理を施したpYT3をライゲーション後、大腸菌DH5α株に導入し、目的とするプラスミド［図１(A)参照］を取得した。構築プラスミドにおけるDNA断片（欠失遺伝子）挿入方向は、RV-M およびF1 プライマーを用いたPCR（30サイクルとした以外は上述の通り）によって増幅される向きとした［図１(A)参照］。
【００３１】
（Ｇ）黄色ブドウ球菌へのプラスミド導入
黄色ブドウ球菌RN4220株をBHIに接種し、37℃でOD600が1.0となるまで培養した。集菌後、10% ショ糖溶液で2回、続いて10% ショ糖・10% グリセロール溶液で1回洗浄し、最後に同溶液で再懸濁したものをコンピテントセルとした。そのコンピテントセル（80μl）と遺伝子相同組換え用プラスミド（1μg）を混和し、25 μF、2.5 kV、100 Ωの条件でpulse controller（Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.）によりエレクトロポレーションを行った。次いで10% ショ糖 含有BHI 1 mlを加えて37℃で1時間培養後、その菌液の一部をTc 含有BHIA プレートに播種し、30℃で約20時間培養後形成されたコロニーをプラスミド導入体（形質転換体）として取得した。
【００３２】
（Ｈ）プラスミドインテグレーションの誘起および検出
菌体内に染色体上の配列と同一の配列を有するプラスミドが存在する場合、その同一の配列間で相同組換えが起こり、プラスミドが染色体内へ組み込まれることがある。この現象をプラスミドインテグレーション（plasmid integration: PI）と呼ぶ。本実施例ではこの現象を利用し、複製温度感受性の上記遺伝子相同組換え用プラスミドがPIを起こした場合、組換えを起こした遺伝子が不活化（破壊）されるように設計された。すなわち、本来の蛋白質コード領域は、PIによって3’側を欠損する；同時に、ゲノムに挿入されたプラスミドの下流には蛋白質翻訳開始コドン（ATG）が終止コドン（TAG）となった遺伝子が残るが、蛋白質の発現は不可能な塩基配列である［図１(B)参照］。
【００３３】
実施手順としてはまず、遺伝子相同組換え用プラスミド導入RN4220株を再度Tc含有BHIAプレートに播種し、30℃で20時間培養した。その後、形成されたコロニーをBHIに接種し、プラスミド複製非許容温度である42℃で約20時間培養した（培養<1>：PIを誘起）。次いで、その菌液をTc含有BHIに1：10希釈となるように接種し、42℃で20時間培養した（培養<2>：PIが非必須遺伝子で起こった場合、そのPI体は増殖）。さらに、その菌液を適宜希釈してTc含有BHIA プレートに播種し、42℃で16時間培養した（培養<3>：PI体のコロニーの取得）。相同組換えに基づく特異的PIの検出は、培養<1>および<2>由来菌体から抽出したゲノムDNA（400 ng/reaction）あるいは培養<3>で形成されたコロニーを用い、F2プライマーおよびプラスミドに特異的なRV-M プライマー［図１(B)参照］によるPCR［（Ｆ）に記載した条件下、30サイクル］で行った。
【００３４】
その結果、培養<1>由来菌体から抽出したゲノムDNAでは特異的PIが検出されたものの、培養<2>由来菌体から抽出したゲノムDNAを用いた場合、PCR産物量、つまりPI体の量が明らかに少なかった。また、培養<3>で形成されたコロニーでは特異的PIを検出できなかった。すなわち、特異的PIを起こした菌は増殖できないと判断され、相同組換え対象とした推定上の遺伝子は確かに機能し、菌の生育又は増殖に必須であることが判った。（培養<3>でコロニーが得られたのは、相同組換えに基づかなくともプラスミドがゲノム中にランダムに取り込まれることがあるため、あるいは極めて低頻度であるが菌が突然変異によってTc耐性となることがあるためと理解できる。）
【００３５】
例２：遺伝子の単離と蛋白質の取得
（Ａ）菌株および培地
黄色ブドウ球菌はRN4220株を用いた。プラスミド調製のため、大腸菌DH5α株（東洋紡株式会社、大阪）を用いた。また、蛋白質生産のため、大腸菌BL21(DE3)株（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, U.S.A.）を用いた。使用培地は上述の実施例１に準じた。
（Ｂ）プラスミド
マルトース・バインディング・プロテイン（MBP）融合蛋白質発現用プラスミドpMAL-c2（New Englad Biolabs, Beverly, MA, U.S.A.）、グルタチオン S-トランスフェラーゼ（GST）融合蛋白質発現用プラスミドpGEX-5X-1（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, U.S.A.）、およびHisタグ付 蛋白質発現用プラスミドpET28a（Novagen brand, EMD Biosciences, Inc., Darmstadt, Germany）を用いた。pMAL-c2およびpGEX-5X-1はAmp耐性遺伝子を、pET28aはカナマイシン耐性遺伝子を含む。
【００３６】
（Ｃ）PCR用プライマー（合成オリゴヌクレオチド）
5'-ACACACGGATCCATGACAACTGATATTTTG-3'（F3プライマー；下線部はBamHI認識配列）、5'-ATGACAACTGATATTTTGAACATTTC-3'（F4プライマー）、5'-ACACACGGATCCTTATGACAACTGATATTT-3'（F5プライマー；下線部はBamHI認識配列）、および5'-ACACACGTCGACTTATTTAGAAACTTTGCG-3'（R3プライマー；下線部はSalI認識配列）を用いた。
【００３７】
（Ｄ）遺伝子の単離ならびに蛋白質発現ベクターの構築
F4およびR3プライマーを用い、RN4220株ゲノムDNA（400 ng/reaction）を鋳型としてPCR［ExpandTM High-Fidelity PCR System（Roche Diagnostics）による；94℃で2分間反応後、94℃で30秒間、50℃で30秒間、72℃で1分30秒間の一連の反応を25サイクル、最後に72℃で2分間反応］を行ない、DNA断片（約1.3 kbp）を増幅した。そのDNA断片を精製し、末端に平滑化・リン酸化処理を施した後、SalIにて処理した。これを予めXmnIおよびSalIで処理したpMAL-c2とライゲーション後、大腸菌DH5α株に導入し、MBP融合蛋白質発現ベクターを取得した。
また、F5およびR3プライマーを用いて上述のようにPCRを行ない得られたDNA断片（約1.3 kbp）を精製し、BamHIおよびSalIにて処理した。これを予めBamHIおよびSalIで処理したpGEX-5X-1とライゲーション後、大腸菌DH5α株に導入し、GST融合蛋白質発現ベクターを取得した。
【００３８】
さらに、F3およびR3プライマーを用いて上述のようにPCRを行ない得られたDNA断片（約1.3 kbp）を精製し、BamHIおよびSalIにて処理した。これを予めBamHIおよびSalIで処理したpET28aとライゲーション後、大腸菌DH5α株に導入し、Hisタグ付蛋白質発現ベクターを取得した。
尚、いずれの蛋白質発現ベクターについても、挿入DNA断片の塩基配列を解析・決定し、決定した塩基配列から、発現される蛋白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号１であると確認した。
【００３９】
（Ｅ）蛋白質の取得
上記各種蛋白質発現ベクターをそれぞれ、大腸菌BL21(DE3)株に導入した。MBP融合蛋白質発現ベクターあるいはGST融合蛋白質発現ベクターを導入した大腸菌株はAmp（100μg/ml）含有2×YT培地にて、Hisタグ付蛋白質発現ベクターを導入した大腸菌株はカナマイシン（50μg/ml）含有2×YT培地にて、それぞれ37℃で一晩培養後、一部を新鮮な各同培地に再接種し（1：100希釈）、37℃でOD600が0.8となるまで培養した。その後、蛋白質発現を誘導するためイソプロピル-(-D-チオガラクトピラノシド（Sigma-Aldrich Chemical Co.）を終濃度0.4 mMとなるように添加し、さらに37℃で2時間培養した。回収した菌は緩衝液TGED（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、1 mM DTT、10% グリセロール）にて懸濁後、超音波破砕した。その破砕液を遠心（15,000 rpm、2分間）して得られた上清および沈殿物をそれぞれ、可溶性画分および不溶性画分とした。
この時点で、各蛋白質発現ベクター導入大腸菌株由来の上記両画分に含まれる蛋白質をSDS-PAGEにより解析した。その結果、MBP融合蛋白質のみが可溶性画分に主に存在することが判明した。
【００４０】
そこで、MBP融合蛋白質発現ベクター導入大腸菌株由来の可溶性画分から該蛋白質を精製・取得した。すなわち、上記可溶性画分とアミロースレジン（New Englad Biolabs）を混和後、TGEDによってレジンを遠心洗浄し（3回）、10 mM maltose含有TGEDによってレジン吸着蛋白質を溶出させた。
pMAL-c2プラスミドは、MBPと融合して発現する蛋白質の連結部分に蛋白質分解酵素Factor Xa認識配列が付加されるように設計されている。そこで、上述のようにして得た融合蛋白質をFactor Xa（New Englad Biolabs）にて処理後、SDS-PAGEによって解析した。その結果、期待されたように一ヶ所でポリペプチドの切断が起こり、該処理によってMBPは除去されることが確認された（図２）。
【００４１】
例３：蛋白質活性の測定
活性測定に供した蛋白質は、基本的には上述の実施例２に記載したように大腸菌にて発現させ精製・取得したが、MBP融合蛋白質発現ベクター導入大腸菌株の培養温度を30℃；菌破砕（超音波処理）時の菌懸濁緩衝液 を200 mM NaCl、1 mM EDTA、および10 mM 2-メルカプトエタノールを含む20 mM Tris-HClとしたことが条件として異なる。但し、この差異は蛋白質に本質的な影響を与えるものではない。尚、対照として、pMAL-c2導入大腸菌BL21(DE3)株から上述の場合と同様にして得たMBP も用いた。
ATP分解活性は、ATPの加水分解に伴って遊離するリン酸量を指標として測定した。5 mM MgCl2を含む25 mM Tris-HCl（pH7.5）に精製蛋白質あるいはMBP 42 pmol、Factor Xa 250 ng、およびATP 100 nmolを加え（反応容量0.2 ml）、37℃で1時間反応させた。その後、反応液にマラカイト・グリーン試薬（5.7 %モリブデン酸アンモニウム含有6 N HCl、2.3 %ポリビニルアルコール、0.081 %マラカイトグリーン、および水を1：1：2：2の分量で混和して30分間放置）を1 ml加え、15分間静置後にOD630値を測定した。遊離リン酸量は、上記反応系において精製蛋白質の替わりに各種濃度のKH2PO4を用い、その濃度と最終的に測定したOD630値との関係から作成した検量線（一次回帰直線）に基づいて算出した。
【００４２】
その結果、MBP融合蛋白質として取得した精製蛋白質（およびFactor Xa）存在下では、約3 nmolの遊離リン酸が検出された。一方、MBP（およびFactor Xa）存在下ではそれが、0.2 nmol以下であった。以上の結果とMBP融合蛋白質はFactor XaによってMBP部分が分離されうる事実（実施例２参照）から、ATP分解活性を有するのはMBPではなく、それと融合して発現した蛋白質／ポリペプチドであると理解できる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】黄色ブドウ球菌の推定遺伝子の組換えに用いたプラスミドの概略、並びに組換え［プラスミドインテグレーション（PI）］後の染色体上の該遺伝子の状態を、PCRに用いたプライマーが相補する位置の概略とともに示した図である。図中、（Ａ）はPI用プラスミドの概略とPCRプライマーが相補する位置、（Ｂ）はPI後の染色体上遺伝子の状態と特異的PI検出PCRに用いたプライマーが相補する位置を示す。
【図２】大腸菌を用いて生産・取得した蛋白質のSDS-PAGE解析像を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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