(57)【要約】【課題】  局所的に反応させたい部位に容易かつ確実に装着することのできる固定化酵素を製造する方法、および、その方法によって得られた固定化酵素を利用したバイオセンサーを提供する。【解決手段】  本発明の固定化酵素の製造方法は、シリコーン樹脂を主成分として含み、さらに、有機溶媒、塩類、ナノカーボンなどが含まれる固定化担体と、酵素とを混合した後に、当該シリコーン樹脂を硬化させることによって固定化酵素を製造するというものである。この方法によって得られた固定化酵素は、シリコーン樹脂を主成分として含むために接着性に富むとともに、その種々の形状に成形することが可能であるため、針型のバイオセンサーの検出部に容易かつ確実に装着することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリコーン樹脂を主成分として含む固定化担体と酵素とを混合する混合工程と、
上記混合工程の後に、シリコーン樹脂を硬化させる硬化工程と、
を含むことを特徴とする固定化酵素の製造方法。
【請求項２】
上記固定化担体には、有機溶媒がさらに含まれていることを特徴とする請求項１に記載の固定化酵素の製造方法。
【請求項３】
上記固定化担体には、塩類がさらに含まれているとともに、
上記硬化工程の後に、上記固定化担体の脱塩を行う脱塩工程がさらに含まれていることを特徴とする請求項１または２に記載の固定化酵素の製造方法。
【請求項４】
上記固定化担体には、ナノカーボンがさらに含まれていることを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載の固定化酵素の製造方法。
【請求項５】
上記硬化工程の前に、当該固定化酵素を薄膜状または球状に成形する成形工程がさらに含まれることを特徴とする請求項１ないし４の何れか１項に記載の固定化酵素の製造方法。
【請求項６】
請求項１ないし５の何れか１項に記載の製造方法によって得られる固定化酵素。
【請求項７】
請求項６に記載の固定化酵素を生体中に含まれる成分の検出を行うための検出部として有することを特徴とするバイオセンサー。
【請求項８】
上記検出部の形状は針型であることを特徴とする請求項７に記載のバイオセンサー。
【請求項９】
上記バイオセンサーは、食品中の成分の検出、または、食品中の成分の濃度測定に用いられることを特徴とする請求項７または８に記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
上記固定化酵素に含まれる酵素は、グルコースオキシダーゼであり、上記バイオセンサーはグルコース量の測定に用いられることを特徴とする請求項７ないし９の何れか１項に記載のバイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シリコーン樹脂を担体として用いた固定化酵素の製造方法、この製造方法によって得られる固定化酵素、および、その固定化酵素を用いたバイオセンサーに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、酵素は水に溶解させて使用することが多かったが、酵素を固定化する種々の周辺技術が開発されたことにともなって、近年、酵素を固定化することによって得られる固定化酵素が実用化されてきている。この固定化酵素は、安定化され、連続反復使用可能であるため、バイオセンサーの分子識別素子（あるいは、検出素子）やバイオリアクターの反応触媒として必要不可欠な存在となっている。
【０００３】
酵素の固定化の技術としては、（１）担体に共有結合法や吸着法で酵素を結合する方法、（２）酵素のまわりを高分子物質で囲む包括固定化法、などが挙げられる。このような技術を用いて酵素を固定化する場合には、セルロース、光架橋性樹脂、セラミックスなどの水不溶性担体として使用する方法が広く一般的に用いられている。その一例として、非特許文献１および２には、シリコーン樹脂と考えられる物質を固定化担体として使用した固定化酵素について開示されている。
【非特許文献１】Malpass CA, Millsap KW, Sidhu H, Gower LB. J. Biomed Mater Res. 2002; 63(6): 822-829
【非特許文献２】Kawakami K, Abe T, Yoshida T. Enzyme Microb Technol. 1992 May; 14(5): 371-375
【非特許文献３】Wang J, Musameh M. Analyst. 2003 Nov; 128(11): 1382-1385
【非特許文献４】Korf J, Tiessen RG, Venema K, Rhemrev MM. Ned Tijdschr Geneeskd. 2003 Jun; 147(25): 1204-1208
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、固定化酵素を検出素子として用いてバイオセンサーを構成する場合、バイオセンサーシステムの形状によっては、その適用が困難な場合が多々指摘されている。
【０００５】
例えば、最近になって、バイオセンサーを直径が０．５〜１．５ｍｍ程度の注射針（ニードル）のように微小化することによって、直接試料に刺入して測定が可能な針型センサーシステムの開発が、食品分析や医用計測の分野で精力的に行われている。しかし、このような針型のセンサーを作製する場合、針状の細いセンサーにどのように酵素を固定化するかが、大きな課題となっている。針型のバイオセンサーに関する過去のいくつかの報告例にも、試料への刺入時に酵素が試料表面と接触して脱離してしまうという問題が指摘されている。
【０００６】
また、バイオリアクターシステムを構築する場合には、固定化酵素と基質とを効率的に接触させることが、反応物の生成効率を高めるための重要なファクターとなる。しかし、システムの形状によっては、固定化酵素を効率よく反応器内に充填することが困難なものが存在し、実用化する上で問題となっている。
【０００７】
なお、非特許文献３および４には、針型のバイオセンサーの一例が開示されている。しかしながら、これらは、その針の部分の直径がマイクロメートルオーダーのセンサーを構築することを目的とするものであり、本発明のバイオセンサーとはその構成が大きく異なるものである。それゆえ、これらの文献においては、直径１ｍｍ程度の針型の検出部に酵素をどのように固定化するかという課題については、何ら検討されていない。
【０００８】
また、非特許文献１および２において記載されている、シリコーン樹脂と考えられる物質を固定化担体として使用した固定化酵素については、その固定化法について開示されているのみであり、この固定化法によって得られた固定化酵素をバイオセンサーに適用するということに関しては何ら示されていない。つまり、非特許文献１および２においては、固定化酵素をバイオセンサー化する場合に発生する上述のような問題点（固定化酵素をどのように局所的に反応させたい部位に装着するかという課題）を克服するような試みはなされていない。実際、これらの文献に記載の固定化酵素は、局所的に反応させたい部位に装着することは不可能であると考えられる。
【０００９】
このように、固定化酵素をバイオセンサーやバイオリアクターに適用する場合には、その検出部や反応器に固定化酵素をどのように固定化するかということが大きな課題となっている。本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであって、シリコーン樹脂を固定化担体として用いることによって、局所的に反応させたい部位に容易かつ確実に装着することのできる固定化酵素を製造する方法、および、その方法によって得られた固定化酵素を利用したバイオセンサーを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者は、上記の問題点について鋭意検討し、建材などの接着剤として幅広く使用されているシリコーン樹脂（本明細書においては、シリコーン、シリコーンゴム、シリコーン接着剤などを含むものとする。）を固定化担体として用い、この担体とグルコースオキシダーゼを混合させた後、硬化させることによって固定化酵素を作製した。そして、この固定化酵素を針の先端に接着させてグルコース測定用のバイオセンサーとして用いたところ、測定中に剥がれることなく確実にグルコース濃度を測定することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明にかかる固定化酵素の製造方法は、シリコーン樹脂を主成分として含む固定化担体と酵素とを混合する混合工程と、上記混合工程の後に、シリコーン樹脂を硬化させる硬化工程とを含むことを特徴とするものである。
【００１２】
本発明の製造方法によって得られる固定化酵素は、担体の主成分としてシリコーン樹脂を用いているため、柔軟性に富んでおり、その形状を種々に変化させることができる。また、シリコーン樹脂は、接着剤としての性質を有しているため、当該固定化酵素もまた、使用目的に応じたあらゆる物に容易に接着させて利用することができる。
【００１３】
また、本発明の固定化酵素の製造方法において、上記固定化担体には、有機溶媒がさらに含まれていることが好ましい。
【００１４】
上記固定化担体に有機溶媒を含ませることによって、得られる固定化酵素の形状をさらに自由に加工することが可能となる。特に、固定化酵素の形状を薄膜状にする場合には、その厚さをより薄くすることができるため効果的である。
【００１５】
また、本発明の固定化酵素の製造方法において、上記固定化担体には、塩類がさらに含まれているとともに、本発明の固定化酵素の製造方法には、上記硬化工程の後に、上記固定化担体の脱塩を行う脱塩工程がさらに含まれていることが好ましい。
【００１６】
上記のように、上記固定化担体に塩類を含ませておき、シリコーン樹脂を硬化させた後に脱塩工程によって当該塩類を脱離させることによって、担体内に微小孔を形成することができる。これによって、本発明の固定化酵素と反応させる試料を、当該固定化酵素に浸透させ易くすることができ、酵素の反応効率を高めることができる。
【００１７】
また、本発明の固定化酵素の製造方法において、上記固定化担体には、ナノカーボンがさらに含まれていることが好ましい。
【００１８】
上記固定化担体にナノカーボンを含ませることによって、得られる固定化酵素の酵素活性を向上させることができる。
【００１９】
また、本発明の固定化酵素の製造方法には、上記硬化工程の前に、当該固定化酵素を薄膜状または球状に成形する成形工程がさらに含まれることが好ましい。
【００２０】
上記のように、本発明の製造方法によって得られる固定化酵素を薄膜状または球状に成形することによって、当該固定化酵素をバイオセンサーシステムやバイオリアクターシステムの素子として利用する場合に、システムの形状に容易かつ確実に適用させてこれらのシステムに装着することができる。なお、本発明にかかる固定化酵素は、固定化担体としてシリコーン樹脂を用いているために、その形状を薄膜状や球状に容易に成形することができる。
【００２１】
本発明にかかる固定化酵素は、上述の何れかの製造方法によって得られるものである。
【００２２】
本発明の固定化酵素は、上述のようにシリコーン樹脂を主成分として含む固定化担体に固定化されているものである。それゆえ、固定化担体の形状を目的に応じた多様な形状に成形できるだけでなく、シリコーン樹脂の接着性を利用して、局所的に酵素反応を進行させたい部位に容易に装着することができる。
【００２３】
従って、本発明の固定化酵素は、例えば、微小な注射針の先端に装着することによって、生体中の成分を検出するバイオセンサーの検出部として利用することができる。この他にも、本発明の固定化酵素は、食品の製造、環境修復、医学的な治療などにおいて、局所的に酵素反応を進行させたい部分に装着して、反応を進行させるために用いることも可能である。以上のように、本発明の固定化酵素は幅広い分野における利用可能性を有している。
【００２４】
また、本発明の固定化酵素は、上記のように、その形状を多様に変化させることができることによって、使用目的に応じてその形状を変化させることができるだけでなく、例えば、酵素の反応基質とより広い面積で接触できるような薄膜状や多孔性の形状に成形することによって、酵素の反応効率を高めることも可能となる。
【００２５】
本発明にかかるバイオセンサーは、上記の本発明の固定化酵素を生体中に含まれる成分の検出を行うための検出部として有することを特徴とするものである。
【００２６】
ここで、上記生体とは、一般に生体の範疇に含まれる、生物そのもの、および、これらを構成しているあらゆる組織や細胞のことを意味するが、これら以外に上記生体を原料として製造・加工された食品等についても生体に含まれるものとする。また、上記生体中に含まれる成分とは、上記固定化酵素に含まれる酵素によって検出することが可能な生体中のあらゆる成分のことを指す。逆に言えば、本発明のバイオセンサーは、検出したい生体中の成分に合わせて、上記固定化酵素中に固定される酵素を選択すればよい。
【００２７】
本発明のバイオセンサーは、上記の固定化酵素を検出部として有するものであるため、当該検出部は、センサー本体に確実に装着されている。それゆえ、上記バイオセンサーを用いて生体中の成分を検出する場合に、上記固定化酵素がセンサー本体から脱離することなく、確実に成分の検出を行うことができる。
【００２８】
また、本発明のバイオセンサーにおいて、上記検出部の形状は針型であることが好ましい。
【００２９】
上記のように、バイオセンサーの検出部が針型であれば、測定対象となる試料に刺入して使用することができるため、バイオセンサーの実用性や利便性をより高めることができる。本発明にかかるバイオセンサーの検出部に用いられる針としては、例えば、注射針として一般に用いられる針程度の太さのものを使用することができる。具体的には、その太さ（直径）は、０．１〜２．０ｍｍ程度である。
【００３０】
また、本発明のバイオセンサーは、食品中の成分の検出、または、食品中の成分の濃度測定に用いられることが好ましい。
【００３１】
また、本発明のバイオセンサーにおいて、上記固定化酵素に含まれる酵素は、グルコースオキシダーゼであり、上記バイオセンサーはグルコース量の測定に用いられることが好ましい。
【発明の効果】
【００３２】
本発明にかかる固定化酵素の製造方法は、以上のように、シリコーン樹脂を主成分として含む固定化担体と酵素とを混合した後に、シリコーン樹脂を硬化させることによって固定化酵素を製造するものである。
【００３３】
つまり、本発明の製造方法によって得られる固定化酵素は、担体の主成分としてシリコーン樹脂を用いているため、柔軟性に富んでおり、その形状を種々に変化させることができる。また、シリコーン樹脂は、接着剤としての性質を有しているため、当該固定化酵素もまた、使用目的に応じたあらゆる物に容易に接着させて利用することができる。
【００３４】
そのため、本発明の固定化酵素は、食品の製造、環境修復、医学的な治療などにおいて、局所的に酵素反応を進行させたい部分に装着して、反応を進行させるために用いることが可能となり、幅広い分野における利用可能性を有している。
【００３５】
また、本発明のバイオセンサーは、以上のように、本発明の固定化酵素を検出部として有するものであるため、当該検出部は、センサー本体に確実に装着されている。それゆえ、上記バイオセンサーを用いて生体中の成分を検出する場合に、上記固定化酵素がセンサー本体から脱離することなく、確実に成分の検出を行うことができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、本発明についてより詳細に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。本実施の形態では、まず、本発明にかかる固定化酵素の製造方法について説明し、その後、この製造方法によって得られる固定化酵素の利用について説明する。
【００３７】
（１）固定化酵素の製造方法
本発明にかかる固定化酵素の製造方法は、シリコーン樹脂を主成分として含む固定化担体と酵素とを混合する混合工程と、上記混合工程の後に、シリコーン樹脂を硬化させる硬化工程とを含んでいることを特徴としている。
【００３８】
そして、本発明の固定化酵素の製造工程においては、上記硬化工程の前に、当該固定化酵素を薄膜状または球状に成形する成形工程がさらに含まれていてもよい。つまり、本発明の製造方法では、シリコーン樹脂を主成分とする固定化担体を用いているため、得られる固定化酵素の形状を目的に応じて種々に変更することができるという利点を有している。上記のように、その形状を薄膜状あるいは球状に成形することによって、その利用の幅を広げることができるとともに、酵素の反応効率を高めることも可能となる。
【００３９】
また、本発明の固定化酵素は、種々の形状に成形することが可能であるという利点に加えて、シリコーン樹脂を主成分として含むことによって接着性に富んだ性質を有するため、従来は確実に装着することの困難であった、直径が０．１〜２．０ｍｍ程度の針型のバイオセンサーの検出部に容易かつ確実に装着することができるという利点も有している。
【００４０】
図１（ａ）および（ｂ）には、本発明にかかる固定化酵素の製造方法の一例として、酵素としてグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）を用い、その形状を薄膜状に成形する場合の固定化酵素製造の様子を模式的に示す。
【００４１】
固定化酵素を製造する場合には、まず、図１（ａ）に示すように、シリコーン樹脂を主成分として含む固定化担体とグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）とを（１０〜１００）：１の割合で混合して混合物１０ａを得る（混合工程）。そして、この混合物１０ａを、ステンレス板１１上にパラフィルム１２を載せた積層板上に置く。
【００４２】
続いて、図１（ｂ）に示すように、混合物１０ａが置かれた積層板に、上記積層板と同じステンレス板１１上にパラフィルム１２を載せた積層板を置き、２枚のパラフィルムの間に挟み込む。そして、プレスマシンで圧力１０〜２００ｋｇｆをかけて混合物１０ａを薄膜状に成形する（成形工程）。そして、成形された混合物１０ａを室温で１２〜２４時間放置し、シリコーン樹脂を硬化させれば（硬化工程）、本発明の固定化酵素を得ることができる。
【００４３】
次に、本発明の固定化酵素の製造方法において用いられる固定化担体について説明する。上記固定化担体にはシリコーン樹脂が主成分として含まれているが、このシリコーン樹脂は、一般にシリコーン樹脂に分類される室温硬化型の液状ゴムであれば、特に限定されることなくあらゆる種類のものを用いることができる。このシリコーン樹脂として具体的には、脱アセトン縮合型、脱アミン縮合型、脱オキシム縮合架橋型、脱アルコール縮合架橋型、付加反応架橋型のものなどを挙げることができる。
【００４４】
また、上記固定化担体には、シリコーン樹脂に加えて有機溶媒がさらに含まれていることが好ましい。このように有機溶媒を含ませることによって、得られる固定化酵素の形状をさらに自由に加工することが可能となる。特に、固定化酵素の形状を薄膜状にする場合には、その厚さをより薄くすることができるため効果的である。
【００４５】
上記有機溶媒としては、トルエン、キシレン、ベンゼン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、エチルエーテル、工業用ガソリンなどを用いることが好ましい。これによれば、後述の実施例にも示すように、固定化担体の形状をより自由に成形できるという効果が得られる。そして、実施例にも示されるように、上記有機溶媒としてトルエンを用いることによって、得られる固定化酵素の反応効率を大きく向上させることができる。なお、上記固定化担体に含まれる有機溶媒の量は、シリコーン樹脂１００ｍｇに対して１０〜１００ｍｇ程度であることが好ましく、これによって、固定化酵素の形状をより加工し易くなる。
【００４６】
また、上記固定化担体には、シリコーン樹脂に加えて食塩などの塩類がさらに含まれていることが好ましい。そして、上記固定化担体に塩類が含まれている場合、本発明の製造方法には、上記硬化工程の後に、当該固定化担体から塩類を取り除くための脱塩工程がさらに含まれている。
【００４７】
このように、上記固定化担体に塩類を含ませておき、シリコーン樹脂を硬化させた後に脱塩工程によって当該塩類を脱離させることによって、担体内に微小孔を形成することができる。また酵素の基質が糖類でない場合は、塩類の代わりに糖類（グルコース、スクロース、マルトース等）を用いても差し支えない。これによって、本発明の固定化酵素と反応させる試料を、当該固定化酵素に浸透させ易くすることができ、酵素の反応効率をさらに高めることができる。
【００４８】
上記塩類として具体的には、食塩（ＮａＣｌ）、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどを挙げることができるが、後述の実施例にも示すように、食塩を含ませることによって、実際に固定化酵素の活性を向上させるという効果が得られることが確認されているため、上記塩類として食塩を用いることがより好ましい。そして、上記固定化担体にＮａＣｌが含まれる場合、当該ＮａＣｌの含有量は、シリコーン樹脂の重量に対して、１０〜２００％程度であることが好ましく、これによって、固定化担体中に形成される微小孔の量を適度に保つことができる。なお、後述の実施例にも示すように、グルコース測定用のバイオセンサーを構築した場合には、特に低濃度のグルコースの測定時に、固定化担体に食塩が含まれているグルコースオキシダーゼ固定化酵素を用いると効果的である。
【００４９】
また、上記固定化担体には、シリコーン樹脂に加えてナノカーボンがさらに含まれていることが好ましい。上記固定化担体にナノカーボンを含ませることによって、得られる固定化酵素の酵素活性を向上させることができる。そして、上記固定化担体にナノカーボンが含まれる場合、当該ナノカーボンの含有量は、シリコーン樹脂の重量に対して、１〜５％程度であることが好ましく、これによって、酵素の酸化還元反応を向上させるという効果が得られる。なお、後述の実施例にも示すように、グルコース測定用のバイオセンサーを構築した場合には、特に低濃度のグルコースの測定時に、固定化担体にナノカーボンが含まれているグルコースオキシダーゼ固定化酵素を用いると効果的である。
【００５０】
続いて、本発明の固定化酵素の製造方法に用いられる酵素について説明する。本発明の固定化酵素の製造に用いる酵素としては、一般に生体触媒として機能する酵素に分類されるものであれば、特に限定されることなくあらゆる種類のものを用いることができる。つまり、後述の実施例においては、グルコースオキシダーゼを固定化した固定化酵素について述べているが、本発明はこれに限定されることなく、他の酵素（例えば、酸化還元酵素類、転移酵素類、加水分解酵素類、リアーゼ類、イソメラーゼ類、補酵素類、酵素メディエーター類など）も固定化して固定化酵素とすることが可能である。そして、上記混合工程において混合される際の酵素の形態としては、水または有機溶媒に可溶な粉体状態、あるいは、水または有機溶媒などに溶解された溶液状態であればよい。
【００５１】
また、本発明にかかる固定化酵素の製造方法は、シリコーン樹脂を主成分とする固定化担体に酵素を包み込む包括法であるため、酵素を化学的に固定化する化学架橋法とは異なり、酵素の立体構造を壊しにくく、酵素にとってやさしい固定化方法であると言える。それゆえ、有機溶媒にある程度の耐性を有する酵素であれば、その活性を失わせることなく、固定化することができる。
【００５２】
そして、本発明の固定化酵素の製造方法においては、得られる固定化酵素の利用目的に応じて、種々の酵素を固定化させればよい。例えば、実施例に示すようにグルコースオキシダーゼを固定化した場合には、得られる固定化酵素をグルコースの検出や定量を行うためのバイオセンサーとして利用することができる。また、アルコールオキシダーゼを固定化した場合には、アルコールの検出や定量を行うことが可能であるし、コレステロールオキシダーゼを固定化した場合には、コレステロールの検出や定量を行うことが可能である。
【００５３】
そして、本発明にかかる固定化酵素は、上述の製造方法によって製造されたものである。つまり、シリコーン樹脂を主成分として含む固定化担体に酵素が固定化されているものである。それゆえ、固定化担体の形状を目的に応じた多様な形状に成形できるだけでなく、シリコーン樹脂の接着性を利用して、局所的に酵素反応を進行させたい部位に容易に装着することができる。
【００５４】
（２）本発明の固定化酵素の利用方法
本発明の固定化酵素は、上述のように、シリコーン樹脂を固定化担体として用いたものであることから、その形状を多様に変えて成形することができるとともに、シリコーン樹脂の接着性を利用して局所的に反応させたい部位に容易に装着することができる。そのため、本発明の固定化酵素を微小な注射針の先端に装着したバイオセンサーとして利用することができる。またその他に、食品の製造・分析、環境修復、医学的治療などにも利用することができる。以下には、本発明の固定化酵素の利用方法の具体例を示す。
【００５５】
（２−１）食品分析への利用
本発明の固定化酵素を用いて針型バイオセンサーを作製し、食品素材に針の部分を直接刺入することによって、食品中の成分を非破壊的に測定することができる。この場合の測定対象としては、例えば、果物や野菜の糖度、ビタミン濃度、あるは、魚肉や畜肉の鮮度やアレルゲンなどが挙げられる。
【００５６】
（２−２）環境修復への利用
本発明の固定化酵素に含まれるシリコーン樹脂が接着性を有することから、環境的な汚染を改善したい箇所に本発明の固定化酵素を装着することによって、局所的かつ持続的な環境修復を行うための酵素反応を進行させることが可能となる。例えば、重油汚染などで汚れた珊瑚や岩礁に本発明の固定化酵素を接着させて、重油を分解させるという利用も可能である。なお、上記固定化酵素は、シリコーン樹脂を主成分として含むものであるため、使用後はせん断力をかければ容易に剥がすことが可能である。
【００５７】
（２−３）医療分野での利用
本発明は、人体において局所的に反応させたい部分に、治療能力のある酵素を固定化し、当該部分に対して局所的な治療を行うという治療方法に利用することができる。例えば、本発明の固定化酵素として、プロテアーゼあるいはリパーゼを含むものを作製し、これを皮膚の疾病箇所に固定化すれば、タンパク質や脂肪を分解することによって皮膚病の治療を行うことができる。また、シリコーン樹脂は生理的に極めて不活性であるため、本発明の固定化酵素は、酵素を含有した洗顔パックなどのような化粧品として利用することも可能である。
【００５８】
（２−４）本発明の固定化酵素を用いたバイオセンサー
ここでは、本発明の固定化酵素のより具体的な利用例として、バイオセンサーの検出部として利用する方法について説明する。つまり、このバイオセンサーは、本発明の固定化酵素を生体中に含まれる成分の検出を行うための検出部として有することを特徴とするものである。このバイオセンサーについても、本発明の範囲内に含まれる。
【００５９】
図２（ａ）には、本発明にかかるバイオセンサーの一例である、針型グルコースバイオセンサーを有するセンサーシステムの構成を示す。本システムは、バイオセンサーを試料に直接刺入して、非破壊かつリアルタイムのモニタリングを実現するために考案されたものである。以下に、グルコースバイオセンサーシステムの構成について説明する。
【００６０】
図２（ａ）に示すように、本システムは、大きく分けてグルコースバイオセンサー（バイオセンサー）１００、アナログ／デジタル型分光器（Ocean optics社製ＵＳＢ２０００）３０、パーソナルコンピューター（ＰＣ）４０から構成されている。
【００６１】
バイオセンサー１００は、その先端部が針型の形状を有している酵素測定用の針型光ファイバープローブ２０で形成されている。そして、針型光ファイバープローブ２０は、針の直径が１８〜２１Ｇ（１．４〜０．７ｍｍ）程度であり、その最も先端の位置から２〜５ｍｍ程度後方に溝が設けられている。この溝の内部には、固定化酵素１０およびルテニウム錯体１３が取り付けられ、検出部１０１として機能するようになっている。図２（ｂ）は、バイオセンサー１００に用いられる針型の検出部１０１の実際の大きさを示すための模式図である。この検出部１０１は、測定対象となる試料５０へ刺入されることで、試料中のグルコース量を測定することができる。また、アナログ／デジタル型分光器３０は、分光計３１と青色ＬＥＤ光源３２とから構成されている。
【００６２】
続いて、上記針型バイオセンサーシステムによって、グルコースの量を測定する仕組みについて説明する。まず、分光器３０より励起光Ｅｘ（４８８ｎｍ）を発生させ、光ファイバープローブ２０を通じてバイオセンサー１００の検出部に取り付けられたルテニウム錯体１３に照射する。この錯体は、試料５０中の酸素濃度に依存して蛍光強度（６００ｎｍ）が変化するため、グルコースオキシダーゼの酸化反応において消費する酸素量を蛍光値から知ることができる。すなわち、酸素量は基質の濃度に比例するので、蛍光強度の変化を分光器で測定し、出力信号をデジタル化してＰＣ４０上で解析することにより、目的物質の濃度を測定することができる。なお、図２（ａ）では、蛍光をＥｍで表し、励起光をＥｘで表している。
【００６３】
なお、上述の針型バイオセンサーシステムへ本発明の固定化酵素を装着する場合には、その製造工程の途中である、混合工程の後にマイクロスパチュラなどを用いて、針型のバイオセンサー１００の検出部１０１に接着させ、その後、硬化工程を行えばよい。これによって、検出部１０１に固定化酵素１０を確実に装着することができる。
【００６４】
以上のように、本発明のバイオセンサーの一例である、上述のグルコースバイオセンサーは、グルコースオキシダーゼを酵素として含む固定化酵素を用いたものであり、グルコース量の測定に用いることができる。より一般的に言えば、本発明のバイオセンサーは、食品中の成分の検出、また、食品中の成分の濃度測定に用いることができる。
【００６５】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明の実施例について説明する。
【００６７】
〔実施例１〕
実施例１では、上述の本発明にかかる固定化酵素の製造方法を利用し、酵素としてグルコースオキシダーゼを用いて薄膜状の固定化酵素を作製し、その活性についての評価を行った。
【００６８】
（１）固定化酵素の作製
本実施例では、まず、酵素としてグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）を用い、シリコーン樹脂（株式会社スリーボンド製、１２０９高耐熱性液状ガスケット）を固定化担体の主成分として含む、以下のような３種類の固定化酵素を作製した。
（ｉ）シリコーン樹脂のみを含む固定化担体とグルコースオキシダーゼの粉体とを混合したもの
（ii）シリコーン樹脂および各種有機溶媒（トルエン、キシレン、ベンゼン）を含む固定化担体と、グルコースオキシダーゼの粉体とを混合したもの
（iii）シリコーン樹脂を含む固定化担体およびグルコースオキシダーゼの粉体の混合物に、試料が浸透しやすいように微小孔を形成させるためにＮａＣｌを添加したもの
なお、（ｉｉ）において有機溶媒を採用したのは、シリコーン樹脂がこれらの溶媒に容易に溶解することから、形状を自由に加工しやすく、かつより薄い薄膜が形成できると考えたからである。
【００６９】
（ｉ）の固定化酵素の作製は、以下のようにして行った。まず、図１（ａ）に示すように、シリコーン樹脂とグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）を１０：１（１００ｍｇ：１０ｍｇ）の割合で混合した混合物１０ａを、ステンレス板１１上にパラフィルム１２を載せた積層板上に置いた。続いて、図１（ｂ）に示すように、混合物１０ａが置かれた積層板に、上記積層板と同じステンレス板１１上にパラフィルム１２を載せた積層板を置き、２枚のパラフィルムの間に挟み込んだ。そして、プレスマシンで圧力１０〜８０ｋｇｆをかけて混合物１０ａを薄膜状に成形した。これを室温で２４時間放置しシリコーン樹脂を硬化させて、固定化酵素を得た。
【００７０】
（ii）の固定化酵素の作製は、以下のようにして行った。まず、図１（ａ）に示すように、各有機溶媒０．１ｍｌに対しシリコーン樹脂３００ｍｇの割合で両者を混合した。この混合物とＧＯＤを１０：１の割合（重量比）で混合した混合物１０ａを、ステンレス板１１上にパラフィルム１２を載せた積層板上に置いた。その後の手順は、上述の（ｉ）の固定化酵素と同様にして行った。この方法で、固定化担体に有機溶媒を含む固定化酵素を取得した。
【００７１】
（iii）の固定化酵素の作製は、以下のようにして行った。まず、シリコーン樹脂とＧＯＤを１００ｍｇ：１０ｍｇの割合で混合した。この混合物にＮａＣｌ  １００ｍｇを添加した混合物１０ａを、図１（ａ）に示すように、ステンレス板１１上にパラフィルム１２を載せた積層板上に置いた。続いて、図１（ｂ）に示すように、混合物１０ａが置かれた積層板に、上記積層板と同じステンレス板１１上にパラフィルム１２を載せた積層板を置き、２枚のパラフィルムの間に挟み込み、おもりで約２ｋｇの圧力をかけて膜状に成形した。次に、室温で２４時間放置してシリコーン樹脂を硬化させた後、パラフィルム１２から膜を剥離した。そして、ＮａＣｌを溶解して微小孔を形成させるために、５００ｍｌ溶ビーカーに成形された膜を入れ、蒸留水を８分目まで注いで、マグネティックスターラーで２４時間攪拌して脱塩を行った。この手順によって、微小孔を有する薄膜状の固定化酵素を取得した。
【００７２】
（２）固定化酵素の酵素活性評価
続いて、上述の手順で作製された３種類の薄膜状の固定化酵素の酵素活性を評価するために、図３に示すような酸素電極を用いてグルコースバイオセンサーを作製した。固定化酵素の酵素活性は、上記センサーの出力電流値の変化量によって評価された。
【００７３】
ここで、酵素活性評価に用いられたグルコースバイオセンサー１１０を備えた酵素活性評価システムについて、図３を用いて簡単に説明する。この酵素活性評価システムは、その先端部分に固定化酵素が取り付けられた酸素電極６０、この酸素電極６０によって検出される電流値をモニタリングするために、当該酸素電極６０と接続されたポテンシオスタット７４、ＡＤＣ−１６  ７５、および、パソコン７６などから構成されている。
【００７４】
また、この酵素活性評価システムは、緩衝液の入った２つの恒温槽Ａ  ７１および恒温槽Ｂ  ７２を備えており、緩衝液はこの２つの恒温槽間を循環している。酸素電極６０は、恒温槽Ａ  ７１の内部に配置されており、この恒温槽Ａ  ７１内の緩衝液は、スターラー７３によって攪拌されている。そして、酵素活性を評価する際には、酵素反応の基質となるグルコース溶液は、恒温槽Ａに注入される。
【００７５】
図３のＡに示す実線で囲んだ内部の図は、酸素電極６０の構成をより詳細に示した図である。酸素電極６０は、図３のＡに示すように、アノード（銀）６３、カソード（白金）６２、テフロン（登録商標）膜６４、電解液（ＫＣｌ）６５、Ｏリング６６などから構成されている。そして、薄膜状の固定化酵素６１は、酸素電極６０の先端にＯリング６６によって取り付けられている。
【００７６】
この酵素活性評価システムにおいては、グルコースバイオセンサーに取り付けられた固定化酵素の作用によって、恒温槽７１内に注入されたグルコース溶液は、図３の四角枠で囲んだ部分に示すような酵素反応を起こす。つまり、この反応式に示すように、グルコースオキシダーゼはグルコースを酸化して、酸素を消費する。これに酸素電極６０が応答し、減少した酸素濃度に応じて電流値が変化する。この電流値は、グルコースバイオセンサー１１０と接続されているポテンシオスタット７４およびＡＤＣ−１６  ７５を介して、パソコン７６にてモニタリングされる。つまり、この電流値の変化が大きいほど酵素活性も大きいことになる。
【００７７】
以下に、本実施例において作製された各条件の固定化酵素の酵素活性評価の結果を示す。
【００７８】
（３−１）固定化酵素を成形する時の印加圧力について検討
ここでは、上記固定化酵素の成形時におけるプレスマシンの印加圧力についての検討を行った。上記（ｉ）の固定化酵素を、異なる印加圧力１０ｋｇｆ、８０ｋｇｆ、２００ｋｇｆで成形した場合のそれぞれの酵素活性について評価を行った。図４にはその結果を示す。図４（ａ）は、グルコース濃度が高濃度域における結果を示すものであり、図４（ｂ）は低濃度域における結果（図４（ａ）のＢで示す部分）を示すものである。
【００７９】
図４に示すように、高濃度域においては、１０ｋｇｆの印加圧力の場合に、比較的高い活性が認められるが、低濃度域を拡大してみると、１０ｋｇｆ及び２００ｋｇｆで調製した固定化酵素では、測定値のバラツキが認められる。しかし、８０ｋｇｆで調製した固定化酵素では、安定した応答が得られた。この結果から、本実験では８０ｋｇｆの圧力が最適であると考えられる。
【００８０】
（３−２）固定化担体に添加される添加物（有機溶媒、ＮａＣｌ）の影響
図５（ａ）には、は各種有機溶媒を添加した（ii）の固定化酵素と、添加物を加えない（ｉ）の固定化酵素の酵素活性を比較した結果を示す。この結果から、トルエン添加した固定化酵素の応答が際立って高いことがわかる。
【００８１】
また、図５（ｂ）には、（iii）の固定化酵素と（ｉ）の固定化酵素の酵素活性を比較した結果を示す。この図から、ＮａＣｌ添加した固定化酵素のほうがやや応答が高いことがわかる。これはＮａＣｌ添加によって、薄膜状の固定化酵素内に微小孔が生じ、試料の拡散速度が増加したためと考えられる。
【００８２】
以上の結果から、本発明の固定化酵素においては、固定化担体にトルエンあるいはＮａＣｌが添加されることによって、その酵素活性がより向上されることが確認された。
【００８３】
（３−３）従来の酵素固定化法によって作製された固定化酵素との比較
図６には、上記の（ii）の固定化酵素のうちトルエン添加したものの酵素活性と、後述する従来法により調製した薄膜状の固定化酵素の酵素活性との比較を行った結果を示す。この図に示すように、従来法である酵素包括法によって得られた固定化酵素（光架橋樹脂ＰＶＡ−Ｓｂ固定化膜）や酵素架橋法によって得られた固定化酵素（メンブレンフィルター固定化膜）と比較して、かなり大きな応答が得られていることがわかる。つまり、本発明にかかる固定化酵素は、従来のものと比較して反応効率が高いことが確認された。
【００８４】
ここで、従来の酵素固定化法（架橋法および包括法）による薄膜状の固定化酵素の作製方法について、以下に説明する。
【００８５】
〔１〕架橋法による作製方法
リン酸緩衝液（０．１Ｍ／ｐＨ７．８）９００μｌにウシ血清アルブミンを０．１ｇ溶解し、１０％ウシ血清アルブミン溶液を調製した。また、リン酸緩衝液（０．１Ｍ／ｐＨ７．０）４００μｌにＧＯＤを約２ｍｇ（マイクロスパチュラで約２杯分）溶解し、酵素溶液を調製した。エッペンドルフチューブ内にこれらを各々４００μｌずつ注入・混合し、そこへメンブレンフィルター（直径約６ｍｍの円形に切ったもの）（孔径０．４５μｍ、ＮＣ、アドバンテック東洋社製）を６枚入れた。室温で２０分間浸漬させた後、ガラスシャーレ内に移し、５０％グルタルアルデヒドを膜に直接触れないように少量滴下した。そのシャーレをパラフィルムで密封し、３０℃インキュベータ内にて２時間放置して薄膜状の固定化酵素を調製した。保存は乾燥を防ぐためバイヤル瓶内に貼り付け（固定化した面が触れないように）、少量の緩衝液を入れた上でパラフィルムで密封し、冷蔵庫（５℃）内にて行った。
【００８６】
〔２〕包括法による作製方法
リン酸緩衝液（０．１Ｍ／ｐＨ７．０）４００μｌにＧＯＤを約２ｍｇ（マイクロスパチュラ約２杯分）溶解、酵素溶液を調製した。透析膜をシャーレに広げ、蒸留水で隙間に空気が入らないようにして貼り付け、埃がかからないようにして自然乾燥させた。光架橋性樹脂（ＰＶＡ−ＳｂＱ）８０ｍｇと酵素溶液２５μｌをよく混合し、透析膜の表面に格子状に擦り込むようにして塗った。これを遮光状態で３０分間乾燥させた後、光を当てて１時間架橋させて薄膜状の固定化酵素を調製した。調製後は冷蔵庫（５℃）内で保存した。
【００８７】
〔実施例２〕
実施例２では、針型の光ファイバープローブを用いてグルコースバイオセンサーシステムを構築し、その性能を調査した。本実施例では、酸素測定用針型光ファイバープローブに、上述の固定化酵素製造方法にて作製したグルコースオキシダーゼ固定化酵素を装着し、グルコースの定量を試みた。
【００８８】
（１）針型グルコースバイオセンサーシステムの構築
図２（ａ）には、本実施例において構築した針型グルコースバイオセンサーシステムの構成を示す。この針型グルコースバイオセンサーシステムは、上述の実施の形態において説明したものと同様のものであるため、本システムについての詳細な説明は省略する。但し、本実施例で用いられたグルコースバイオセンサー１００の検出部１０１の針の直径は１８Ｇ（１．４ｍｍ程度）であり、固定化酵素を取り付けるための溝は、上記針の最先端部から約３ｍｍ後方に設けられている（図２（ｂ）参照）。
【００８９】
（２）針型光ファイバープローブへの固定化酵素の装着
次に、上述の針型バイオセンサーシステムへ固定化酵素を装着する方法について説明する。ここでは、以下の（ｉ）〜（iii）という３種類の固定化酵素の原料となる混合物１０ａを、図７に示すように、マイクロスパチュラ８１を用いて、針型のバイオセンサー１００の検出部１０１に接着した。これを室温で１２時間放置し、シリコーン樹脂を硬化させた。
（ｉ）シリコーン樹脂のみを含む固定化担体とグルコースオキシダーゼの粉体とを混合したもの
（ii）シリコーン樹脂を含む固定化担体およびグルコースオキシダーゼの粉体の混合物に、ＮａＣｌを添加したもの
（iii）シリコーン樹脂を含む固定化担体およびグルコースオキシダーゼの粉体の混合物に、ナノカーボンを添加したもの
具体的には、（ｉ）の固定化酵素は、以下のように作製した。粉末状のグルコースオキシダーゼを約０．２ｍｇと接着用シリコーン樹脂約２ｍｇを混ぜ合わせた後、マイクロスパチュラ８１で検出部１０１へ直接塗りつけ、そのまま１２時間室温で放置した。
【００９０】
また、（ii）の固定化酵素は、以下のように作製した。粉末状のグルコースオキシダーゼを約０．２ｍｇと接着用シリコーン樹脂約２ｍｇ、マイクロスパチュラで磨り潰したＮａＣｌ約２ｍｇを混ぜ合わせた後、マイクロスパチュラ８１で検出部１０１へ（ｉ）の固定化酵素と同様、直接塗りつけた。そのまま１２時間室温で放置し、シリコーン樹脂を硬化させた。硬化後、５００ｍｌビーカーに蒸留水を入れ、そこに光ファイバープローブ先端の検出部を浸し、スターラーで１２時間攪拌し、脱塩した。
【００９１】
また、（iii）の固定化酵素は、以下のように作製した。粉末状のグルコースオキシダーゼを約０．２ｍｇと接着用シリコーン樹脂約１ｍｇ、ナノカーボン（ナノカーボンＰＣ  ルブダイヤシリーズ  ＮＣＰＯＰ２Ｂ：東洋ドライルーブ株式会社製）約１ｍｇを混ぜ合わせた後、マイクロスパチュラ８１で検出部１０１へ（ｉ）の固定化酵素と同様、直接塗りつけた。そのまま１２時間室温で放置した。
【００９２】
（３）グルコースバイオセンサーの応答
続いて、本実施例で構築したグルコースバイオセンサーシステムについて、グルコースに対する応答を確認した。ここでは、（ｉ）の固定化酵素、あるいは、（ii）の固定化酵素をセンサーの検出部１０１に装着した場合のグルコースに対する応答値を測定し、その比較を行った。応答値の測定は、２０ｍＭのグルコース溶液中にバイオセンサー１００の検出部１０１を刺入して、１分間当たりの酸素減少値（ｐｐｍ）をＰＣ４０によってモニタリングし、この値をセンサーの応答値とすることによって実施した。
【００９３】
その結果を図８、図９に示す。図８は、（ii）の固定化酵素の場合の応答曲線を示すグラフであり、図９は、（ｉ）の固定化酵素の場合の応答曲線を示すグラフである。それぞれの図において、Ａで示す位置が、検出部１０１をグルコース溶液中に刺入した時点である。また、Ｂの破線をベースラインとし、この酸素濃度を示す時点から１分経過後の酸素濃度の減少量をＣで示す。
【００９４】
これらの図に示されるように、（ii）の固定化酵素の方が大きな応答が得られていることがわかる。これはＮａＣｌによって、固定化担体内に微細孔が形成され、基質の拡散速度が増大し、酵素反応が活発に行われたためと考えられる。一方、（ｉ）の固定化酵素の方は、応答は小さいものの、固定化担体に厚みがあるため、基質の拡散速度が減少することが考えられる。そのため、（ｉ）の固定化酵素は、高濃度のグルコースの測定に適していると考えられる。
【００９５】
（４）グルコースの定量
まず、上記の（ｉ）〜（iii）の固定化酵素を用いたそれぞれのグルコースバイオセンサーにおいて、グルコース標準液のグルコース量を測定し、検量線を作成した。得られた検量線を図１０に示す。図１０（ａ）は、（ｉ）の固定化酵素の検量線であり、図１０（ｂ）は、（ii）の固定化酵素の検量線であり、図１０（ｃ）は、（iii）の固定化酵素の検量線である。なお、図１０（ａ）〜（ｃ）において、上段はグルコース濃度が高濃度域の場合の結果であり、下段はグルコース濃度が低濃度域の場合の結果である。
【００９６】
これらの結果から、いずれの場合もグルコース濃度とセンサーの出力との間に直線関係が認められた。しかしながら、（ii）の固定化酵素および（iii）の固定化酵素については、濃度の増加と共に相関性がなくなった。これは、（ii）の固定化酵素については、微細孔により、基質の拡散速度が増加したため、酵素反応が飽和状態になったためと考えられる。また、（iii）の固定化酵素については、ナノカーボンにより低濃度域での酵素反応が促進され、これにより高濃度域での酵素反応が飽和状態になったためと考えられる。
【００９７】
低濃度域においては、いずれの場合も良い直線関係が得られた。特に、（ii）の固定化酵素では、（ｉ）の固定化酵素に比べて応答値も高くなった。したがって、広範囲の濃度のグルコースの測定には（ｉ）の固定化酵素を、また低濃度域のグルコースの測定には（ii）の固定化酵素を用いることが好ましいと考えられる。
【００９８】
また、図１０（ｃ）に示すように、（iii）のナノカーボンを添加した固定化酵素は、他の場合に比べて、さらに検量線の傾きが大きくなっていることが確認された。これは、固定化酵素の活性が増加したことを示唆している。この理由としてナノカーボンを添加することによって、酵素の酸化還元反応を促進されていると考えられる。以上の結果から、低濃度域の測定にはナノカーボンを添加する固定化酵素を用いることが最も好ましいと考えられる．
以上の結果から、本発明の製造方法によって得られた固定化酵素を用いることによって、針型グルコースセンサーを構築することができ、グルコースの定量を迅速に行えることが明らかとなった。
【００９９】
さらに、モデル食品としてリンゴの果肉を用いて、この果肉部分に、本グルコースセンサーの検出部を刺入してグルコースの測定を試みた。その結果を図１１に示す。図１１のＡで示す位置が、リンゴの果肉にセンサーの検出部を刺入した時点である。この図に示すように、検出部を刺入した時点から酸素濃度の低下が見られ、グルコース濃度を測定することができた。この結果から、実際に本グルコースセンサーを用いて食品中のグルコース濃度の測定が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明の固定化酵素は、シリコーン樹脂を用いて製造されているため、その形状を自由に変えて加工することができるとともに、目的とする部位に接着させることができる。そのため、バイオセンサーやバイオリアクターの素子として利用することができる。このようなバイオセンサーやバイオリアクターは、食品の分析および製造という食品加工に関する分野、環境修復という環境汚染対策に関する分野、および、臨床検査や治療といった医療に関する分野などで幅広く利用できる可能性を有している。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】（ａ）および（ｂ）は、本発明にかかる固定化酵素を製造する様子を示す模式図である。
【図２】（ａ）は、本発明にかかるバイオセンサー含むセンサーシステムの構成の一例を示す模式図である。（ｂ）は、（ａ）に示すバイオセンサーの針型の検出部を大きさを示すための模式図である。
【図３】本実施例において使用した酵素活性評価システムの構成を示す模式図である。
【図４】（ａ）および（ｂ）は、本実施例において、固定化酵素の成形時の印加圧力と酵素活性との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図５】（ａ）は、本実施例において、各種有機溶媒を添加して作製された固定化酵素の酵素活性について調べた結果を示すグラフである。（ｂ）は、本実施例において、ＮａＣｌを添加して作製された固定化酵素の酵素活性について調べた結果を示すグラフである。
【図６】本実施例において、本発明にかかる固定化酵素の酵素活性と、従来法によって作製された固定化酵素の酵素活性とを比較した結果を示すグラフである。
【図７】本実施例において、グルコースバイオセンサーに固定化酵素を装着する様子を示す模式図である。
【図８】本実施例において、ＮａＣｌを添加した固定化酵素を用いたグルコースバイオセンサーのグルコースに対する応答値を測定した結果を示すグラフである。
【図９】本実施例において、シリコーン樹脂のみを固定化担体として使用した固定化酵素を用いたグルコースバイオセンサーのグルコースに対する応答値を測定した結果を示すグラフである。
【図１０】（ａ）〜（ｃ）は、本実施例において作製した３種類の固定化酵素を用いて構築されたグルコースバイオセンサーにおいて、グルコース標準液のグルコース量を測定し、検量線を作成した結果を示すグラフである。
【図１１】本実施例において構築されたグルコースバイオセンサーを用いてリンゴの果肉のグルコース濃度を測定した結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１０２】
１０      固定化酵素
１００    バイオセンサー
１０１    検出部
【図１】
2005278489.tif 000002
【図２】
2005278489.tif 000003
【図３】
2005278489.tif 000004
【図４】
2005278489.tif 000005
【図５】
2005278489.tif 000006
【図６】
2005278489.tif 000007
【図７】
2005278489.tif 000008
【図８】
2005278489.tif 000009
【図９】
2005278489.tif 000010
【図１０】
2005278489.tif 000011
【図１１】
2005278489.tif 000012