(57)【要約】  【課題】  新規な作用機序に基づく、安全性の高い抗炎症剤、及び、サイトカイン誘導剤を提供すること。炎症性サイトカインの発現を誘導・抑制する物質をスクリーニングする方法を提供すること。  【解決手段】  γ−ＧＴＰ（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）が、炎症性サイトカイン（ＭＩＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１等）を誘導するという新知見に基づく抗炎症剤、サイトカイン誘導剤を提供する。また、前記新知見に基づくスクリーニング方法を提供する。  【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性サイトカインの発現を誘導することを特徴とする配列番号２のγ−ＧＴＰ（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）。
【請求項２】
前記炎症性サイトカインはＩＬ−１、ＩＬ−６、ＭＩＰ−１のいずれかであることを特徴とする請求項１に記載のγ−ＧＴＰ。
【請求項３】
請求項１に記載のγ−ＧＴＰの発現又は活性を抑制することを特徴とする抗炎症剤。
【請求項４】
請求項１に記載のγ−ＧＴＰを主成分とする医薬組成物であって、前記サイトカインの誘導を促進することを特徴とする医薬組成物。
【請求項５】
炎症性サイトカインの発現を誘導するポリペプチドであって、請求項１に記載のγ−ＧＴＰのアミノ酸配列の一部と同一のアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項６】
前記炎症性サイトカインはＩＬ−１、ＩＬ−６、ＭＩＰ−１のいずれかであることを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項５に記載のポリペプチドの活性を抑制することを特徴とする抗炎症剤。
【請求項８】
請求項５に記載のポリペプチドを主成分とする医薬組成物であって、前記サイトカインの誘導を促進することを特徴とする医薬組成物。
【請求項９】
γ−ＧＴＰに特異的に結合する抗γ−ＧＴＰ抗体であることを特徴とする請求項３又は請求項７に記載の抗炎症剤。
【請求項１０】
γ−ＧＴＰをコードする遺伝子である配列番号１の塩基配列の一部と同じ塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡであって、ＲＮＡ干渉により、前記γ−ＧＴＰの発現を抑制する二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項３又は請求項７に記載の抗炎症剤。
【請求項１１】
慢性関節リウマチに適用することを特徴とする請求項９又は請求項１０に記載の抗炎症剤。
【請求項１２】
骨粗鬆症に適用することを特徴とする請求項９又は請求項１０に記載の抗炎症剤。
【請求項１３】
エイズ治療に適用することを特徴とする請求項４又は請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
配列番号２のγ−ＧＴＰ（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）によって誘導される炎症性サイトカインを検出・測定することによって、
前記サイトカインの発現を誘導又は抑制する化合物を探索することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載のγ−ＧＴＰとアミノ酸配列の一部が同一のポリペプチドによって誘導される炎症性サイトカインを検出・測定することによって、
前記サイトカインの発現を誘導又は抑制する化合物を探索することを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症剤及びサイトカイン誘導剤と、サイトカイン誘導を利用したスクリーニング方法に関する。より詳しくは、γ−ＧＴＰ（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）が、サイトカインを誘導するという新知見に基づく、抗炎症剤及びサイトカイン誘導剤と、サイトカイン誘導を利用したスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症とは、鼻炎、皮膚炎、肝炎、歯周炎、関節炎等のように、異物、物理的又は化学的刺激等によって生じる一種の生体防衛反応で、発赤、腫脹、局所熱感、疼痛を主症状とするものをいう。炎症は、生体防衛反応として重要であるが、その反応が強すぎると、自己の組織・細胞等に対して損傷を与える場合もある。
【０００３】
そのため、炎症を抑える対症療法剤として、抗炎症剤が広く用いられている。現在広く用いられている抗炎症剤としては、ステロイド性抗炎症薬と非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）がある。
【０００４】
ステロイド性抗炎症剤としては、糖質コルチコイド（コルチゾール等）及び該ホルモンと類似の化学構造を持つ合成ステロイドがある。慢性関節リウマチ等の重篤な炎症に対して用いられることが多い。
【０００５】
非ステロイド性抗炎症剤としては、サリチル酸誘導体（アスピリン等）、インドール酢酸誘導体（インドメタシン等）、フェニル酢酸誘導体、プロフェン誘導体等、多数の薬剤が開発されている。非ステロイド性抗炎症剤は、前記慢性関節リウマチ等の重篤な炎症に対して用いられるほか、肩関節周囲炎、咽喉頭炎等にも用いられている。また、軟膏として皮膚炎等に用いられたり、貼付剤として筋肉痛等に用いられたりしているものもある。
【０００６】
ステロイド性抗炎症剤としては、例えば、特許文献１、特許文献２が、非ステロイド性抗炎症剤としては、例えば、特許文献３、特許文献４がある。
【特許文献１】特開平２−２７９６９４号公報
【特許文献２】特開平４−２７５２９７号公報
【特許文献３】特開平６−２１１８１９号公報
【特許文献４】特開平１０−５９９７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来の抗炎症剤は副作用があり、長期にわたる連続的な服用が困難であるという問題があった。
【０００８】
例えば、ステロイド性抗炎症薬は、抗炎症作用は強力であるが、免疫能の低下、糖尿病誘発等の重篤な副作用や、満月様顔貌等の全身的副作用等を生じるため、他の薬物では症状の改善が望めない重篤な炎症患者に対してのみ用いられる場合が多い。
【０００９】
非ステロイド性抗炎症薬についても、胃腸障害や免疫力低下等の副作用を持つ薬剤が多い。また、非ステロイド性抗炎症剤が、インフルエンザ脳症を引き起こすことが明らかになっており、非ステロイド性抗炎症薬は、安全性の面で、まだ十分であるとはいえない。
【００１０】
また、炎症反応は、本来、生体防衛機構であるため、炎症を薬剤により強力に抑制してしまう従来の抗炎症薬は、本来的に、副作用を伴いやすく、薬剤の安全性を確保することが難しい。
【００１１】
そこで、本発明は、新規な作用機序に基づく、安全性の高い抗炎症剤を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明に係るγ−ＧＴＰ（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）は、腎臓、すい臓、肝臓等、多くの組織の細胞に存在する酵素で、アルコール代謝亢進時や黄疸の際に血液中に遊出するため、肝疾患の診断等に用いられている。しかし、γ−ＧＴＰの具体的な機能・働きは、明らかになっていない。
【００１３】
本願発明者は、今回、γ−ＧＴＰが、炎症性サイトカインである、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＭＩＰ−１の発現を誘導することを新規に見い出した。ここで、炎症性サイトカインとは、生体内における様々な炎症症状を引き起こす原因因子として関与するサイトカインをいう。
【００１４】
今回のこの知見は、γ−ＧＴＰが、階層的な炎症制御機構の上流に位置することを示す点で重要である。この発見によって、炎症反応では、以下のような作用機序が働くことが示唆される。
【００１５】
異物、物理的又は化学的刺激等により、組織が傷害を受けると、その傷害から生体を防衛するために、様々な生体内の応答があり、最初の炎症反応が起きる。その際に、その傷害部位に浸潤したマクロファージから、炎症性サイトカインとともに、γ−ＧＴＰが放出される。その放出されたγ−ＧＴＰは、別のサイトカイン産生細胞であるストローマ細胞（線維芽細胞）の受容体に結合し、新たな炎症性サイトカインの発現・生産を誘導する。そして、新たにストローマ細胞で生産された炎症性サイトカインにより炎症がさらに誘起され、炎症が増強されたり、持続的・慢性的な炎症が起こったりする。
【００１６】
また、ストローマ細胞で生産された炎症性サイトカインは、直接的又は間接的に、マクロファージを活性化する作用も持つ。そのため、マクロファージから、また、γ−ＧＴＰが生産、放出される。そして、マクロファージを介して、γ−ＧＴＰが繰り返し生産されることにより、ストローマ細胞が慢性的に炎症性サイトカインを発現することとなり、炎症が慢性化する。従って、γ−ＧＴＰは、特に、炎症が慢性化する作用機序において、重要な役割を果たしていると考えられる（図２参照）。
【００１７】
そこで、本願発明者は、炎症性サイトカインの発現を誘導する作用を有する配列番号１のγ−ＧＴＰを提供する。γ−ＧＴＰに炎症性サイトカインの発現を誘導する作用があることが明らかになったことにより、γ−ＧＴＰを利用して、炎症反応を調節したり、炎症性サイトカインの発現を人為的に誘導したりすることができる。
【００１８】
今回の実験では、γ−ＧＴＰは、特に、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＭＩＰ−１の３つのサイトカインの発現を誘導することが明らかになった。従って、本発明は、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＭＩＰ−１の３つのサイトカインが関与する疾患や炎症反応において、特に有効である。
【００１９】
また、γ−ＧＴＰに炎症性サイトカインの発現を誘導する作用があることが明らかになったため、γ−ＧＴＰの発現又は活性を抑制することにより、炎症性サイトカインの発現を抑制し、炎症の増幅・慢性化を防ぐことができる。そこで、本願発明者は、γ−ＧＴＰの発現又は活性を抑制する作用を有する抗炎症剤を提供する。
【００２０】
前記のとおり、従来の抗炎症薬は、炎症反応を強力に抑制してしまうものが多い。それに対し、本願発明に係る抗炎症剤は、γ−ＧＴＰが、ストローマ細胞に作用し、炎症性サイトカインを誘導する段階を抑制するので、炎症の初期段階を抑制せず、重篤化、慢性化した段階の炎症反応だけを予防、改善することができる。従って、生体防御機構としての炎症反応を抑制せずに、重篤化、慢性化した炎症のみを予防、改善できるという利点がある。
【００２１】
抗炎症剤としては、例えば、γ−ＧＴＰに特異的に結合する抗γ−ＧＴＰ抗体を用いることができる。抗γ−ＧＴＰ抗体は、γ−ＧＴＰと特異的に結合し、複合体を形成する。その複合体は生体内で分解されるため、γ−ＧＴＰも分解されて生理活性を失い、サイトカインの発現が誘導されるのを防ぐ。
【００２２】
抗炎症剤として、γ−ＧＴＰをコードする配列番号２の遺伝子の塩基配列（配列番号１）の一部と同じ塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡであって、ＲＮＡ干渉により、γ−ＧＴＰの発現を抑制する二本鎖ＲＮＡを用いることもできる。ＲＮＡ干渉により、γ−ＧＴＰの発現自体が抑制されるため、サイトカインの発現が誘導されるのを防ぐことができる。
【００２３】
その他、一部の疾患については、炎症性サイトカインの誘導を促進する必要がある場合もある。そのような疾患に適応する目的で、γ−ＧＴＰを主成分とする医薬組成物であって、炎症性サイトカインの誘導を促進する医薬組成物を利用することもできる。
【００２４】
続いて、本発明は、上記のように、γ−ＧＴＰがサイトカイン産生細胞（ストローマ細胞）の受容体に結合することによって、炎症性サイトカインの新たな発現を誘導することを利用したものである。γ−ＧＴＰの配列番号２のアミノ酸配列の中で、サイトカイン産生細胞の受容体と結合する部位は、γ−ＧＴＰの酵素活性を有する部位とは、別の部分にある。従って、γ−ＧＴＰのアミノ酸配列のうち、サイトカイン産生細胞の受容体と結合する部分と同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドであれば、上記と同様に、炎症性サイトカインの発現を誘導する作用を持つ。そこで、炎症性サイトカインの発現を誘導するポリペプチドであって、γ−ＧＴＰの配列番号２のアミノ酸配列の一部と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、γ−ＧＴＰと同様、炎症性サイトカイン、特に、ＩＬ−１，ＩＬ−６、ＭＩＰ−１の発現を誘導する作用を持つ。また、γ−ＧＴＰのアミノ酸配列のうち、酵素活性を有する部分を除外してあるので、γ−ＧＴＰの本来有する酵素作用による影響や予期しない副作用等をなくすことができ、γ−ＧＴＰを安全に利用することが可能になる。
【００２５】
このポリペプチドについても、γ−ＧＴＰと同様に、ポリペプチドの活性を抑制する作用を有する物質を抗炎症剤として利用することができる。
【００２６】
例えば、ポリペプチドに対する抗体を抗炎症剤として用いることができる。このポリペプチドは、γ−ＧＴＰのアミノ酸配列のうち、サイトカイン産生細胞のγ−ＧＴＰ受容体と結合する部分の配列を含むため、このポリペプチドに対する抗体は、該ポリペプチドとγ−ＧＴＰの両方に対して結合することができる。従って、このポリペプチドに対する抗体を用いることにより、サイトカインの発現が誘導されることを防ぐことができる。
【００２７】
その他、一部の疾患について、炎症性サイトカインの発現の誘導を促進する必要がある場合にも、γ−ＧＴＰと同様に、このポリペプチドを利用することができる。
【００２８】
次に、上記の新規発明に基づいて、炎症症状を示す各疾患について、個別に、本発明の持つ作用を示す。なお、本発明は、以下に示す疾患にのみ適用されるものではなく、それらに限定されない。
【００２９】
例えば、本発明は、慢性関節リウマチに適用できる。慢性関節リウマチは、自己免疫反応に起因する全身性炎症性疾患で、ＩＬ−１、ＩＬ−６等の炎症性メディエーターが自己免疫反応を増幅させることがわかっている。また、ＩＬ−６等が、破骨細胞を活性化し、骨・軟骨組織を破壊する（最新医学・５７巻・４号Ｐ８９−９４、Ｐ１６−３１参照）。本発明に係る抗炎症薬は、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６）の発現を抑制するので、自己免疫反応を抑制し、破骨細胞の活性化も防止することができる。従って、本発明に係る抗炎症剤は、慢性関節リウマチに有効である。
【００３０】
骨粗鬆症では、ＩＬ−１、ＩＬ−６の産生が増加することにより、破骨細胞が活性化され、骨吸収が促進されると考えられている（松本俊夫編、「新・分子骨代謝学と骨粗鬆症」（２００１年）、メディカルレヴュー社、Ｐ２９１参照）。本発明に係る抗炎症剤を用いることによって、ＩＬ−１、ＩＬ−６の発現を抑制することができるため、破骨細胞の活性化を抑制し、骨吸収を少なくすることができる。従って、本発明に係る抗炎症剤は、骨粗鬆症にも有効である。
【００３１】
末期がん患者の多くは、悪性腫瘍が骨に転移し、その骨転移に起因する癌性疼痛を経験するといわれている。悪性腫瘍の骨転移部では、腫瘍細胞から、ＩＬ−１、ＩＬ−６等のサイトカインが放出され、炎症反応や破骨細胞の活性化が起こる。そして、炎症細胞、破骨細胞等から放出されるサイトカイン等が原因で疼痛が発生すると考えられている（日本放射線技術学会雑誌、第５６巻、第７号、Ｐ８８５参照）。また、骨に高効率に転移する悪性腫瘍である多発性骨髄腫では、腫瘍細胞からＭＩＰ−１αが産生されることにより、骨破壊が進展する
（Choi,S.J.et al.,L.Clin.Invest.,108,1833-1841,2001、参照）。従って、本発明に係る抗炎症剤を適用すれば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＭＩＰ−１等のサイトカインの発現を抑制することができ、悪性腫瘍の骨転移に起因する癌性疼痛を抑制することができる。
【００３２】
良性のリンパ増殖性疾患であるＣａｓｔｌｅｍａｎ病や、原因不明の炎症性腸疾患であるＣｒｏｈｎ病等、ＩＬ−６の過剰な発現が見られる疾患（最新医学・５７巻・４号、Ｐ２５−３１）では、本発明に係る抗炎症剤を用いることにより、ＩＬ−６の発現を抑制することができるので、本発明は、これらの疾患に対しても有効である。
【００３３】
歯肉に炎症部位が限定されているものを歯肉炎といい、症状が進行して歯周組織にまで炎症部位が広がったものを歯周炎という。歯肉炎が悪化して歯肉組織の細胞が、傷害されたり細胞死が起こったりすると、その細胞からγ−ＧＴＰが遊出し、ＩＬ−１の発現が誘導されて（kakiy.tripod.co.jp/page010.html、参照）、破骨細胞の分化と活性化を促し、歯周炎に移行すると考えられる。従って、本発明に係る抗炎症剤は、歯周炎、特に、歯肉炎が歯周炎に移行するのを予防する効果があると考えられる。
【００３４】
心不全が慢性に移行した際には、ＩＬ−６の過剰発現が、心不全の悪化に関与しているため
（e-medicine.sumitomopharm.co.jp/e-medicine/view/data/d_00068.html、参照）、ＩＬ−６の発現を抑制することにより、症状を改善することができる。従って、本発明に係る抗炎症剤は、心不全、特に、慢性心不全にも適用できる。
【００３５】
動脈硬化性疾患の場合、動脈硬化の血管病変を病理学的に観察すると、動脈硬化巣は、炎症像を呈し、マクロファージの活性化、ＩＬ−１、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインの産生増大が認められることが明らかになっている
（例えば、www.oups.ac.jp/supported/koho/koukai/ab0206.html、参照）。また、動脈硬化巣におけるＭＩＰ−１の発現や、血管内皮や血管平滑筋におけるＭＩＰ−１の発現から、ＭＩＰ−１は、動脈硬化の促進や維持に関与していると考えられている
（例えば、Wilcox JN, et al”Local expression of inflammatory cytokines in human atherosclerotic plaques.”,J Atheroscler Thromb.1994;Suppl 1:S10-3、参照）。従って、本発明に係る抗炎症剤を用いることにより、動脈の内膜における炎症を抑制し、症状を改善することができる。
【００３６】
その他、インフルエンザ脳症についても、脳脊髄液中のＩＬ−６濃度が高くなるという報告があるので
（www.geoties.co.jp/Beautycare/2308/sub4-influenza-encephalopatyy.htm、参照）、本発明に係る抗炎症剤が、インフルエンザ脳症に対する治療剤として有効である可能性がある。
【００３７】
次に、炎症性サイトカインの発現を誘導することによって、症状を改善することができる疾患について、個別に、本発明の持つ作用を示す。なお、本発明は、以下に示す疾患にのみ適用されるものではなく、それらに限定されない。
【００３８】
肝細胞に傷害があり、肝細胞が壊死している状態の場合、ＩＬ−６が肝細胞の再生を促進していることが明らかになっている
（www.naoru.com/mansei-kanen.htm、参照）。例えば、慢性肝炎の場合、傷害や炎症によって肝細胞が壊死したことにより、γ−ＧＴＰが遊出し、ＩＬ−６の発現が誘導され、発現したＩＬ−６の作用によって、肝細胞の再生が促されると考えられる。従って、本発明に係るγ−ＧＴＰを主成分とする医薬組成物、又は、本発明に係るポリペプチドを主成分とする医薬組成物は、ＩＬ−６の発現を誘導するため、慢性肝炎や肝組織の再生が必要な疾患に有効である。
【００３９】
炎症性サイトカインのＭＩＰ−１は、マクロファージで産生され、好中球を呼び集める作用を持つサイトカイン様分子で、ケモカイン（細胞遊走を誘導するサイトカイン様分子）の一種である。ＭＩＰ−１には、エイズの抑制効果が認められている（‘Identification of RANTES, MIP-1 alpha, and MIP-1 beta as the major HIV-suppressive factors produced by CD8+T cells’
Science.15;270(5242):1811-5.1995、参照）。従って、本発明に係るγ−ＧＴＰを主成分とする医薬組成物、又は、本発明に係るポリペプチドを主成分とする医薬組成物は、ＩＬ−６の発現を誘導するため、エイズの抑制効果があり、エイズ治療薬として有効である。
【００４０】
続いて、本願発明者は、γ−ＧＴＰ（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）によって誘導される炎症性サイトカインを検出・測定することによって、サイトカインの発現を誘導又は抑制する化合物を探索するスクリーニング方法を提供する。本発明によって、γ−ＧＴＰがサイトカイン産生細胞にあるγ−ＧＴＰ受容体に結合することによって、炎症性サイトカインが誘導されることが明らかになった。そのため、この一連の作用機序を利用して、炎症性サイトカインを検出・測定することにより、サイトカインの発現を誘導又は抑制する化合物を探索することができる。このスクリーニング方法を用いることにより、例えば、γ−ＧＴＰを失活させる物質、サイトカイン産生細胞のγ−ＧＴＰ受容体にγ−ＧＴＰと競合的に結合する物質、γ−ＧＴＰと該受容体の結合を阻害する物質等、炎症性サイトカインの発現、誘導を阻害する物質を探索することができる。また、例えば、γ−ＧＴＰ存在下で、前記スクリーニング方法を用いることにより、炎症性サイトカインの発現誘導を促進する物質についても、探索することができる。
【００４１】
また、前記のスクリーニング方法は、γ−ＧＴＰとアミノ酸配列の一部が同一であって、炎症性サイトカインの発現を誘導する作用を持つポリペプチドを用いても、行うことができる。該ポリペプチドを用いたスクリーニング方法は、γ−ＧＴＰを用いたスクリーニング方法と比べて、γ−ＧＴＰのアミノ酸配列のうち、サイトカイン産生細胞の受容体に結合する部分の配列以外の部分に作用して、γ−ＧＴＰが失活した場合にも、探索されてしまうという可能性を除去できる、という利点がある。
【発明の効果】
【００４２】
本発明によって奏される効果は、以下の通りである。
【００４３】
炎症反応は、生体防衛反応であるため、炎症が過剰でない限り、炎症を抑えることは、生体防衛機能・免疫機能を弱めることになり、好ましくない。本発明に係る抗炎症剤は、炎症反応が起きた後、その炎症が増幅したり、慢性に移行したりする反応に関与すると考えられるγ−ＧＴＰに関するものである。従って、本発明は、生体防衛機能・免疫機能を過剰に抑制せず、炎症反応が増幅したり、炎症が慢性に移行したりする際に、その反応を抑制することができるという効果がある。
【００４４】
従って、過剰に炎症反応を抑制せず、副作用がなく、安全性の高い抗炎症剤を提供することができる。
【００４５】
また、γ−ＧＴＰ又は本発明に係るポリペプチドを主成分とする医薬組成物を適用することにより、新規なサイトカイン誘導剤を提供できる。
【００４６】
その他、炎症性サイトカインの発現、誘導を抑制する物質、及び、該サイトカインの発現、誘導を促進する物質を、本発明に係るスクリーニング方法によって探索することができる。
【実施例１】
【００４７】
実施例１は、γ−ＧＴＰを添加することにより、サイトカインの発現が上昇したことを実証した実験である。手順は、以下の通りに行った。
【００４８】
まず、４個の１０ｃｍディッシュを用意し、それぞれのディッシュに、ストローマ細胞の一種であるマウスＳＴ２細胞を、コンフルエントになるまで培養した。ここで、ストローマ細胞とは、特定の機能を担う細胞・組織を取り巻き、支持する細胞のことをいい、サイトカインの産生やその他の相互作用によって、取り巻く細胞・組織の分化や機能発現を誘導・促進する性質を持つ。
【００４９】
次に、マウスＳＴ２細胞を培養している各ディッシュに、γ−ＧＴＰを、終濃度１μｇ／ｍｌになるように添加し、それぞれ、γ−ＧＴＰ添加後０、６、１２、２４時間後に培地を吸引して採取した。
【００５０】
培地の採取後、直ちに、ＳＶ  Ｔｏｔａｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ製）を用いて、その培地からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。次いで、ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）用いて、前記の通り調製したＴｏｔａｌ  ＲＮＡ３μｇから二本鎖ｃＤＮＡを合成し、さらに、ＩＶＴ  Ｔ７  Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ反応により、マウスＳＴ２細胞の中に発現していたＲＮＡと同じ塩基配列を持つ、ビオチン標識・断片化したｃＲＮＡ（複数のｃＲＮＡの混合溶液）を得た。
【００５１】
上記の方法で得たｃＲＮＡ１０μｇ分をＤＮＡマイクロアレイ（Ｇｅｎｅ  Ａｒｒａｙ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）に供給し、該ｃＲＮＡには、どのタンパク質をコードする遺伝子と相補的なものが、どれくらい含まれているかを検出・測定した。ＤＮＡマイクロアレイのスライド上に固定されているオリゴヌクレオチドプローブと相補的な塩基配列を持つプローブが、上記調製したｃＲＮＡ中に含まれている場合、両者がハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーションしたプローブに、Ｃｙ５標識ストレプトアビジンを結合させ、洗浄後、染色し、シグナルを検出・測定して、発現した遺伝子を同定した。ＤＮＡマイクロアレイを用いた実験手順は、キットに添付されているプロトコルに従った。
【００５２】
上記の通り、ＤＮＡマイクロアレイを用いて、ハイブイダイゼーションするｃＲＮＡを調べることにより、γ−ＧＴＰを添加した０、６、１２、２４時間後に、マウスＳＴ２培養細胞の細胞内で、どの遺伝子が発現したかを調べた。結果は図１に示したとおりである。
【００５３】
図１に示すように、γ−ＧＴＰを添加することによって、各種サイトカインの発現が上昇した。ｍＲＮＡの発現が上昇したのは、ＭＩＰ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＦＧＦ２１、ＧＭ−ＣＳＦ等のサイトカインで、特に、ＭＩＰ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−６は、ｍＲＮＡの発現が顕著に増加した。また、これらのサイトカインは、６時間後にｍＲＮＡの発現が上昇しただけでなく、２４時間後には、さらに１０倍以上もｍＲＮＡの発現が増加している。この結果は、γ−ＧＴＰが、ＭＩＰ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−６等の発現を誘導していることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明によって、炎症性サイトカインを誘導する目的で、γ−ＧＴＰを用いることができるため、医薬等の目的のほか、炎症性サイトカインに関する実験用キットや、炎症性サイトカインの生産等の目的で、γ−ＧＴＰが用いられる可能性がある点で、炎症性サイトカインの発現を誘導するγ−ＧＴＰは、産業上利用する可能性がある。
【００５５】
また、本発明は、γ−ＧＴＰが、炎症性サイトカインの発現を誘導するという新知見に基づき、抗炎症剤及びサイトカイン誘導剤を提供する点で、産業上の利用性がある。特に、本発明は、炎症反応の新規な作用機序に基づくものであり、全く新しい抗炎症剤等を提供する点で、産業上有用である。
【００５６】
また、前記新知見に基づき、炎症性サイトカインの発現、誘導を促進又は抑制する物質をスクリーニングする方法を提供する点で、産業上利用性がある。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】実施例１の実験結果を示す図。
【図２】本発明に係る反応を模式的に示した図。
【図１】
2005080629.tif 000003
【図２】
2005080629.tif 000004
【配列表】
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