(57)【要約】【課題】  植物におけるＴｍ−１様形質の有無を、簡便に、比較的短時間で判定する方法及び判定キットを提供する。【解決手段】  被験植物の脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液の中で、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡと、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのゲノムＲＮＡとを、それぞれ独立して、翻訳及び複製させ、複製された野性型トバモウイルスのＲＮＡとＴｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのＲＮＡとの量を比較する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験植物の脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液の中で、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡと、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのゲノムＲＮＡとを、それぞれ独立して、翻訳及び複製させるゲノム複製試行工程と、
上記ゲノム複製試行工程において複製された野性型トバモウイルスのＲＮＡ及びＴｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのＲＮＡを検出するＲＮＡ検出工程と、
上記ＲＮＡ検出工程によって検出された、野性型トバモウイルスのＲＮＡ量と、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのＲＮＡ量とを比較するＲＮＡ量比較工程とを含むことを特徴とする植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法。
【請求項２】
上記無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液は、さらに、被検植物以外の他の植物の脱液胞化プロトプラスト抽出液を含むことを特徴とする請求項１に記載の植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法。
【請求項３】
上記他の植物は、タバコであることを特徴とする請求項２に記載の植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法。
【請求項４】
さらに、上記ゲノム複製試行工程において、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質、並びに、トバモウイルスのＴｍ−１抵抗性打破変異株のゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質を検出するタンパク質検出工程と、
上記タンパク質検出工程において検出された、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の量と、トバモウイルスのＴｍ−１抵抗性打破変異株のゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋ及び１３０ｋタンパク質の量とをそれぞれ比較するタンパク質生産量比較工程とを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法。
【請求項５】
さらに、被験植物の脱液胞化プロトプラスト抽出液を調製する脱液胞化プロトプラスト抽出液調製工程を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法。
【請求項６】
上記トバモウイルスは、トマトモザイクウイルス又はタバコモザイクウイルスであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法。
【請求項７】
上記Ｔｍ−１様形質は、トマトのＴｍ−１形質であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法。
【請求項８】
上記植物はトマトであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法。
【請求項９】
被験植物の脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液の中で、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡと、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのゲノムＲＮＡとを、それぞれ独立して、翻訳及び複製させ、
複製された野性型トバモウイルスのＲＮＡとＴｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのＲＮＡとの量を比較することによって、植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定するために利用される判定キットであって、
少なくとも、脱液胞化プロトプラスト抽出液を調製するための試薬、無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液を調製するための試薬、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡ、及びＴｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのゲノムＲＮＡを含むことを特徴とする植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定キット。
【請求項１０】
Ｔｍ−１形質を有する植物の脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液の中で、被験トバモウイルスのゲノムＲＮＡと、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破という遺伝的変異が導入されていないトバモウイルスのゲノムＲＮＡとを、それぞれ独立して、翻訳及び複製させるゲノム複製試行工程と、
上記ゲノム複製試行工程において複製された被験トバモウイルスのＲＮＡ及びＴｍ−１様形質抵抗性打破という遺伝的変異が導入されていないトバモウイルスのＲＮＡを検出するＲＮＡ検出工程と、
上記ＲＮＡ検出工程によって検出された、被験トバモウイルスのＲＮＡ量と、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破という遺伝的変異が導入されていないトバモウイルスのＲＮＡ量とを比較するＲＮＡ量比較工程とを含むことを特徴とするトバモウイルスのＴｍ−１様形質抵抗性を打破する能力の有無を判定する判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法、判定キット及びその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来からトマトにおけるＴｍ−１形質は、トマトにおいてトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ、以下適宜「ＴｏＭＶ」と略記する。）の増殖を抑制する形質として知られている（例えば、非特許文献１、２参照）。Ｔｍ−１形質はトマトの野生種（Lycopersicon hirsutum）を起源とし、育種上、栽培種に広く利用されているものの、Ｔｍ−１遺伝子がクローニングされ、塩基・アミノ酸配列が特定されるまでには至っていない。これまでのところ、Ｔｍ−１遺伝子のマッピングが進められ、Ｔｍ−１遺伝子は第２染色体の動原体近くに座乗していると考えられているが、その正確な位置については明らかになっていない（例えば、非特許文献３参照）。
【０００３】
Ｔｍ−１形質は半優性形質であり、Ｔｍ−１／Ｔｍ−１（ホモ接合体）ではＴｍ−１／＋（ヘテロ接合体）よりも、ＴｏＭＶの増殖が抑制される程度は大きい。ＴｏＭＶの増殖においては、ＴｏＭＶがコードする１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質（１８３ｋタンパク質及び１２６ｋタンパク質と称されることもある）が翻訳（合成）される。これらのタンパク質は、ゲノムＲＮＡの複製に必要であることがわかっており、これらのタンパク質が翻訳されていることはゲノムＲＮＡの複製の前提である。また、ＴｏＭＶの増殖に随伴して、ゲノムＲＮＡの複製、１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の翻訳に加えて、サブゲノミックＲＮＡの複製、ＴｏＭＶがコードする移行タンパク質（movement protein）及び外被タンパク質（coat protein）の翻訳（合成）も行われる。Ｔｍ−１形質を有するトマトにＴｏＭＶを感染させると、ＴｏＭＶウイルスの増殖が抑制されるが、これが、１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質が合成されないことによるもの（翻訳阻害）であるのか、これらのタンパク質は合成されているがＲＮＡが複製されないこと（ＲＮＡ複製阻害）によるものかは明らかになっていない。
【０００４】
また、Ｔｍ−１形質を有するトマトにおいて増殖することができる、ＴｏＭＶのＴｍ−１抵抗性打破変異株Ｌｔａ１が知られている（例えば、非特許文献４参照）。このＬｔａ１は、野生型ＴｏＭＶと比較して、１８０ｋタンパク質及び１３０ｋの複製タンパク質のヘリカーゼドメインをコードする領域に変異を有する。Ｔｍ−１形質を有するトマトにおいてＴｏＭＶの増殖が抑制されるメカニズムについてはよくわかっていないが、このことから、Ｔｍ−１形質遺伝子のターゲットが１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質である可能性が指摘されている。
【非特許文献１】Pelham,J., Resistance in Tomato to Tabacco Mosaic virus, Euphytica, 15(1966):258-267
【非特許文献２】Buck,kenneth W., Replication of tobacco mosaic virus RNA, Phil.Trans.R.Soc.Lond.B(1999)354,613-627
【非特許文献３】Ohmori,T., Murata,M., Motoyoshi,F., Molecular characterization of RAPD and SCR markers linked to the Tm-1 licus in tomato, Theor Appl Genet(1996)92:151-156
【非特許文献４】Meshi,T., Motoyoshi,F., Adachi,A., Watanabe,Y., Takamatsu,N., Okada,Y., (1988)Two concomitant base substitutions in the putative replicase genes of tobacco mosaic virus confer the the ability to overcome the effects of a tomato resistance gene, Tm-1. EMBO J. 7:1575-1581
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ｔｍ−１形質は、上述したように、例えばトマトにおいては、栽培種に広く利用されている形質であるが、この形質の有無は外見上からは判定できない。Ｔｍ−１形質によりトバモウイルスの増殖が抑制されるメカニズムを解析するためにも、また、育種上の利用という観点からも、植物におけるＴｍ−１形質の有無を簡便に、比較的短時間で判定する方法の開発が強く望まれている。
【０００６】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、Ｔｍ−１形質の有無を簡便に、比較的短時間で判定することができる、植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法、判定キット及びその利用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、最近本発明者らが確立した脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞タンパク質合成液を用いた in vitro でのＴｏＭＶのＲＮＡからの翻訳複製システムを用いて、ＴｏＭＶの野生型株及びＴｍ−１抵抗性打破変異株Ｌｔａ１のゲノムＲＮＡを、それぞれ複製翻訳させた。その結果、Ｔｍ−１形質の有無にかかわらず、１３０ｋタンパク質及び１８０ｋタンパク質が生産され、野生型ＴｏＭＶＲＮＡと変異株ＲＮＡとの間でタンパク質の蓄積量に差は見られなかった。これに対してＴｍ−１形質を有しないトマトの培養細胞を用いた場合には、トマトモザイクウイルスＲＮＡと変異株ＲＮＡとの間で複製されたＲＮＡ量に差は見られなかったが、Ｔｍ−１を有するトマトの培養細胞を用いた場合には、野生型ＴｏＭＶＲＮＡは変異株ＲＮＡよりも複製が低く抑えられた。この知見に基づき、ＴｏＭＶの野生型株とＴｍ−１抵抗性打破変異株Ｌｔａ１との間で、複製されたＲＮＡ量を比較することにより、Ｔｍ−１形質の有無を簡便に、比較的短時間で判定できることを見出し本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明にかかる植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法は、被験植物の脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液の中で、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡと、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのゲノムＲＮＡとを、それぞれ独立して、翻訳及び複製させるゲノム複製試行工程と、上記ゲノム複製試行工程において複製された野性型トバモウイルスのＲＮＡ及びＴｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのＲＮＡを検出するＲＮＡ検出工程と、上記ＲＮＡ検出工程によって検出された、野性型トバモウイルスのＲＮＡ量と、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのＲＮＡ量とを比較するＲＮＡ量比較工程とを含むことを特徴としている。
【０００８】
上記構成によれば、脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液を用いることにより、簡便に、比較的短時間で、安定して、トバモウイルスのゲノムＲＮＡの翻訳及び複製を行うことができるため、植物におけるＴｍ−１様形質の有無を、簡便に、比較的短時間で判定することが可能となる。
【０００９】
また、上記無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液は、さらに、被検植物以外の他の植物の脱液胞化プロトプラスト抽出液を含むことが好ましく、上記他の植物はタバコであることがより好ましい。
【００１０】
上記構成によれば、トバモウイルスのゲノムＲＮＡの翻訳及び複製の活性を向上させることができるため、植物におけるＴｍ−１様形質の有無を、より安定的に判定することが可能となる。
【００１１】
上記植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法は、さらに、上記ゲノム複製試行工程において、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋ及び１３０ｋタンパク質、並びに、トバモウイルスのＴｍ−１抵抗性打破変異株のゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質を検出するタンパク質検出工程と、上記タンパク質検出工程において検出された、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の量と、トバモウイルスのＴｍ−１抵抗性打破変異株のゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋ及び１３０ｋタンパク質の量とをそれぞれ比較するタンパク質生産量比較工程とを含んでいることが好ましい。
【００１２】
上記構成によれば、１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の生産量を比較するため、植物におけるＴｍ−１様形質の有無をより確定的に判定することが可能となる。
【００１３】
本発明にかかる植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法は、さらに、被験植物の脱液胞化プロトプラスト抽出液を調製する脱液胞化プロトプラスト抽出液調製工程を含んでいてもよい。
【００１４】
上記トバモウイルスは、トマトモザイクウイルス又はタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ、以下適宜「ＴＭＶ」と略記する。）であることが好ましい。また、上記Ｔｍ−１様形質は、トマトのＴｍ−１形質であることが好ましい。さらに、上記植物はトマトであることが好ましい。
【００１５】
本発明にかかる植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定キットは、被験植物の脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液の中で、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡと、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのゲノムＲＮＡとを、それぞれ独立して、翻訳及び複製させ、複製された野性型トバモウイルスのＲＮＡとＴｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのＲＮＡとの量を比較することによって、植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定するために利用される判定キットであって、少なくとも、脱液胞化プロトプラスト抽出液を調製するための試薬、無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液を調製するための試薬、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡ、及びＴｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのゲノムＲＮＡを含むことを特徴としている。上記キットを用いることにより、簡便、かつ、効率的に植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定することが可能となる。
【００１６】
本発明にかかるトバモウイルスのＴｍ−１様形質抵抗性を打破する能力の有無を判定する判定方法は、Ｔｍ−１形質を有する植物の脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液の中で、被験トバモウイルスのゲノムＲＮＡと、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破という遺伝的変異が導入されていないトバモウイルスのゲノムＲＮＡとを、それぞれ独立して、翻訳及び複製させるゲノム複製試行工程と、上記ゲノム複製試行工程において複製された被験トバモウイルスのＲＮＡ及びＴｍ−１様形質抵抗性打破という遺伝的変異が導入されていないトバモウイルスのＲＮＡを検出するＲＮＡ検出工程と、上記ＲＮＡ検出工程によって検出された、被験トバモウイルスのＲＮＡ量と、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破という遺伝的変異が導入されていないトバモウイルスのＲＮＡ量とを比較するＲＮＡ量比較工程とを含むことを特徴としている。
【００１７】
上記構成によれば、脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液を用いることにより、簡便に、比較的短時間で、安定して、トバモウイルスのゲノムＲＮＡの翻訳及び複製を行うことができるため、トバモウイルスのＴｍ−１様形質抵抗性を打破する能力の有無を簡便に、比較的短時間で判定することが可能となる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法は、以上のように、被験植物の脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液の中で、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡと、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのゲノムＲＮＡとを、それぞれ独立して、翻訳及び複製させ、複製された野性型トバモウイルスのＲＮＡとＴｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのＲＮＡとの量を比較する構成を備えているので、脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液を用いることにより、簡便に、比較的短時間で、安定して、トバモウイルスのゲノムＲＮＡの翻訳及び複製を行うことができる。また、複製されたＲＮＡの量の大小を比較することのみによって、植物におけるＴｍ−１様形質の有無を簡便、迅速に判定することができる。それゆえ、植物におけるＴｍ−１様形質の有無を、簡便に、比較的短時間で判定することが可能となるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法、判定キット及びその利用を提供するものである。そこで以下では、植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法、判定キット、該方法を変形して利用するトバモウイルスのＴｍ−１様形質抵抗性を打破する能力の有無を判定する方法について、より詳細に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。
【００２０】
〔１〕植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法
本発明に係る植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法（以下、適宜「判定方法」と略記する。）は、被験植物の脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液の中で、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡと、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのゲノムＲＮＡとを、それぞれ独立して、翻訳及び複製させるゲノム複製試行工程と、上記ゲノム複製試行工程において複製された野性型トバモウイルスのＲＮＡ及びＴｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのＲＮＡを検出するＲＮＡ検出工程と、上記ＲＮＡ検出工程によって検出された、野性型トバモウイルスのＲＮＡ量と、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのＲＮＡ量とを比較するＲＮＡ量比較工程とを含むものである。
【００２１】
上記判定方法は、さらに、上記ゲノム複製試行工程において、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質、並びに、トバモウイルスのＴｍ−１抵抗性打破変異株のゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質を検出するタンパク質検出工程と、上記タンパク質検出工程において検出された、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の量と、トバモウイルスのＴｍ−１抵抗性打破変異株のゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の量とをそれぞれ比較するタンパク質生産量比較工程とを含んでいてもよい。
【００２２】
また、上記判定方法は、上記ゲノム複製試行工程の前に、さらに、被験植物の脱液胞化プロトプラスト抽出液を調製する脱液胞化プロトプラスト抽出液調製工程を含んでいてもよいし、その他の工程を含んでいてもよい。
【００２３】
以下、上記工程について、（１−１）ゲノム複製試行工程、（１−２）ＲＮＡ検出工程及びＲＮＡ量比較工程、（１−３）タンパク質検出工程及びタンパク質生産量比較工程、（１−４）脱液胞化プロトプラスト抽出液調製工程の順に説明する。
【００２４】
（１−１）ゲノム複製試行工程
ゲノム複製試行工程は、被験植物の脱液胞化プロトプラスト抽出液（evacuolated protoplast lysate：ＥＰＬ、以下、適宜「ＥＰＬ」と略記する。）を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液の中で、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡと、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのゲノムＲＮＡとを、それぞれ独立して、翻訳及び複製させる工程である。
【００２５】
上記ゲノム複製試行工程においては、トバモウイルスのゲノムＲＮＡ由来の、ゲノムＲＮＡ及びサブゲノミックＲＮＡの複製、並びに、トバモウイルスのゲノムＲＮＡがコードするタンパク質のうち、少なくとも、１３０ｋタンパク質及び１８０ｋタンパク質の翻訳（合成）が行われる。
【００２６】
＜被験植物のＥＰＬを含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液＞
本工程で用いる無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液は、被験植物のＥＰＬを含み、無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製系として用いることができるものであれば特に限定されるものではない。従って、上記無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液は、被験植物のＥＰＬのみを含むものであってもよいし、さらに「他の無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製液」を含むものであってもよい。
【００２７】
ここで、無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製液とは、無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製系において用いられる翻訳・複製液をいう。「無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製系」とは、生体のウイルスＲＮＡ翻訳・複製系を人工の容器内で再現する系であり、生細胞を用いる遺伝子工学的ウイルスＲＮＡ翻訳・複製系と比較し、操作が簡便で、タンパク質合成に要する時間も比較的短時間で済み、細胞毒性をもつタンパク質の合成も可能になる等多くの利点を有する。
【００２８】
また、ＥＰＬとは、植物細胞より調整されたプロトプラストから液胞が除去され、かつ液胞以外の細胞内膜成分（細胞内膜系とも呼ぶ）を含むものであればよい。ＥＰＬには液胞以外の細胞内膜成分が保持されているため、無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製系として用いることが可能となる。
【００２９】
「プロトプラスト」とは、細菌、菌類、植物等の細胞壁を持つ細胞から細胞壁を取り除き、原形質膜で囲まれた状態にした細胞をいう。「液胞」とは、高等植物等にみられる細胞内小器官であり、周囲の原形質から脂質膜により明確に区画され、水溶液を満たした細胞内小器官をいう。この水溶液中には、無機イオン、有機酸、炭水化物等と共に、タンパク質成分としてプロテアーゼやＲＮａｓｅを含むことが知られている。そのため、これらの成分が無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製系に存在する事はウイルスＲＮＡ翻訳・複製の効率を低下させるため好ましくないと考えられる。「細胞内膜成分」とは、細胞質内に存在する脂質膜よりなる細胞小器官をいい、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、葉緑体、液胞等の細胞内顆粒全般を指す。特に小胞体、ゴルジ体はタンパク質の翻訳後修飾に重要な役割を果たしており、膜タンパク質や分泌タンパク質の成熟に必須な細胞成分である。
【００３０】
ＥＰＬを用いることにより、翻訳後修飾が可能となり、１３０ｋタンパク質及び１８０ｋタンパク質のような高分子タンパク質を効率よく合成することができる。本発明者らは、従来から無細胞タンパク質合成液として用いられてきたコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系でＴＭＶのＲＮＡ由来の１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の合成を試みたが、１８０ｋタンパク質は検出不能であり、１３０ｋタンパク質はかろうじてスメアなバンドとして検出される程度であった。これに対し、ＥＰＬを用いた無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製系を用いた場には多量の１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質が検出された。従って、ＥＰＬを用いることにより、翻訳された１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の量を検出し比較することができるため、判定の信頼性を向上させることが可能となる。
【００３１】
本工程で用いる無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液が、被験植物のＥＰＬ以外に含むことができる上記「他の無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製液」としては、該無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液の中でトバモウイルスのゲノムＲＮＡが複製できるものであれば、特に限定されるものではない。具体的には例えば、被験植物以外の他の植物のＥＰＬであることが好ましい。上記被験植物及び他の植物の細胞は、特に限定されるものではないが、これらの培養細胞であることが好ましい。株化された培養細胞は、均一な細胞集団を大量に得ることができるという利点がある。また、上記他の植物とは、タバコ（Nicotina Tabacum）、トマト、チョウセンアサガオ、ナス、ジャガイモ、トウガラシ、ホオズキ、クコ等のナス科植物、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）等であることがより好ましく、タバコであることがさらに好ましい。
【００３２】
また、本工程で用いられる無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液が、被験植物のＥＰＬに加えて、上記「他の無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製液」を含む場合、被験植物のＥＰＬと上記「他の無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製液」との割合は、トバモウイルスのゲノムＲＮＡが安定して翻訳複製できれば、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、本工程で用いられる無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液が、他の植物のＥＰＬとして、タバコのＥＰＬのみを含む場合、タバコＥＰＬに含まれる脱液胞化プロトプラストの容量は、被験植物のＥＰＬに含まれる脱液胞化プロトプラストの容量を１とした時に、０．６〜１．４であることが好ましく、０．８〜１．２であることがより好ましく、０．９〜１．１であることがさらに好ましい。タバコＥＰＬの量が、この範囲の下限より大きいことにより、ウイルスＲＮＡ翻訳・複製の活性を向上させることが可能となる。また、タバコＥＰＬの量が、この範囲の上限より小さいことにより、Ｔｍ−１による、ウイルスＲＮＡ翻訳・複製の抑制活性がより検出されやすくなる。
【００３３】
上記無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液は、被験植物のＥＰＬ及び必要に応じて上記「他の無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製液」以外に、「他の成分」を含んでいてもよい。かかる「他の成分」は特に限定されるものではない。通常、脱液胞化プロトプラストを回収後、脱液胞化プロトプラストを懸濁する緩衝液の成分等が含まれる。なお、当該緩衝液の組成、ｐH、温度などの諸条件は使用する植物細胞に応じて適宜設定可能であることはいうまでもない。
【００３４】
その他、上記「他の成分」としては、例えば、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、スペルミン、ＡＴＰ、ＧＴＰ、アミノ酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ及びＲＮＡ分解酵素阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の成分を挙げることができる。さらに「他の成分」は、これら以外の成分を含んでいてもよいことはいうまでもない。また、上記成分の濃度は、適宜適切な濃度を選択して使用すればよく、特に限定されるものではない。
【００３５】
上記組成の中で、スペルミン濃度を８０μＭ未満とし、クレアチンキナーゼ濃度を１００μｇ／ｍＬ超とすることにより翻訳活性を向上させることが可能となる。スペルミンの濃度を減少することにより、理由は不明であるが翻訳活性を向上させることができる。また、クレアチンキナーゼの濃度を増加することにより、反応持続時間を長くする効果を得ることができる。さらに、従来脱液胞化プロトプラストを破砕した後に加えていたベントナイトについては、効果が認められないことが判明したため添加しなくてもよい。
【００３６】
＜野生型トバモウイルス、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルス＞
本発明の判定方法においては、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡと、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのゲノムＲＮＡとが複製するＲＮＡの量を比較する。Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株とは、Ｔｍ−１様形質によるトバモウイルスに対する抵抗性を打破する能力を有する株、すなわち、Ｔｍ−１様形質を有する植物においても増幅することができる株をいう。かかるＴｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのゲノムＲＮＡは、Ｔｍ−１様形質を有する植物においても、確実に複製されるため、コントロールとして用いることができる。
【００３７】
Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスは、Ｔｍ−１様形質を有する植物においても増幅することができるように、ゲノムＲＮＡの塩基配列に変異が導入されているものであればよく、突然変異によるものであってもよいし、人工的に変異が導入されたものであってもよい。
【００３８】
上記Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスとしては、Ｔｍ−１様形質を有する植物においても増幅できることができる変異株であれば特に限定されるものではない。具体的には、例えば、ＴＭＶ又はＴｏＭＶの突然変異株である、Ｌｔａ１、ＴＭＶ−ＣＨ２等を挙げることができる。上記ＴＭＶの突然変異株のＲＮＡの塩基配列は、Ｔｍ−１形質によって増殖が抑制される株のＲＮＡと比較して、２箇所でアミノ酸配列に変異をもたらす塩基配列の変異が見られる。この変異は３００６番目の塩基（９７９番目のアミノ酸）及び３０２１番目の塩基（９８４番目のアミノ酸）に見られる（例えば、非特許文献２）。従って、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのゲノムＲＮＡとしては、上記３００６番目の塩基及び／又は３０２１番目の塩基に相当するトバモウイルスのＲＮＡの部位に、人工的に変異を導入したゲノムＲＮＡを用いてもよい。また上記Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株は、Ｌｔａ１のゲノムＲＮＡを用いることがより好ましい。
【００３９】
また、本明細書において、「野生型トバモウイルス」とは、ゲノムＲＮＡにＴｍ−１様抵抗性打破という遺伝的変異が導入されていない状態のトバモウイルス株を意味する。
【００４０】
ここで、トバモウイルスとは、トバモウイルス属に属するウイルスをいう。トバモウイルス属とは、アルファ様ウイルススーパーグループに分類される、プラス鎖の一本鎖ＲＮＡウイルスグループである。トバモウイルス属に属するウイルスとしては、例えば、Cucumber green mottle mosaic virus（ＣＧＭＭＶ）、Frangipani mosaic virus（ＦｒＭＶ）、Kyuri green mottle mosaic virus（ＫＧＭＭＶ）、Obuda pepper virus（ＯｂＰＶ、）、Odontoglossum ringspot virus（ＯＲＳＶ）、Paprika mild mottle virus（ＰａＭＭＶ）、Pepper mild mottle virus（ＰＭＭＶ）、Ribgrass mosaic virus（ＲＭＶ）、Sammons’s Opuntia virus（ＳＯＶ）、Sunn-hemp mosaic virus（ＳＨＭＶ）、Tobacco mild green mosaic virus（ＴＭＧＭＶ）、Tobacco mosaic virus（ＴＭＶ）、Tomato mosaic virus（ＴｏＭＶ）、Turnip vein-cleaning virus（ＴＶＣＶ）、Ullucus mild mottle virus（ＵＭＭＶ）、Yucari mosaic virus（ＹｏＭＶ）等が挙げられる。
【００４１】
この中でも、本発明の判定方法で用いられるトバモウイルスは、ＴｏＭＶ、ＴＭＶであることがより好ましい。
【００４２】
＜野生型トバモウイルス、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのゲノムＲＮＡ＞
本工程において、被験植物の脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製液の中で、翻訳及び複製させる、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡ及びＴｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのゲノムＲＮＡは、ウイルス粒子の形で、又はＲＮＡの形で上記無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液に加えることができる。
【００４３】
＜Ｔｍ−１様形質＞
上記Ｔｍ−１様形質とは、植物が有する形質であって、トバモウイルスの増殖を抑制することができる形質という。かかるＴｍ−１様形質としては、例えば、トマトにおけるＴｍ−１形質を挙げることができる。
【００４４】
＜被験植物＞
本発明の判定方法を用いて、被検植物として判定できる植物は、トバモウイルスが感染する植物であれば特に限定されるものではない。トバモウイルスは、非常に広い宿主域をもつことで知られている。従って、トバモウイルスが感染する、広範囲の植物について、Ｔｍ−１形質の有無を判定することができる。
【００４５】
＜翻訳複製の条件＞
本工程において、被験植物の脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液と野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡとの割合、被験植物の脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液とＴｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのゲノムＲＮＡとの割合は、トバモウイルスのゲノムＲＮＡの翻訳及び合成が安定して行われるものであれば特に限定されるものではないが、インプットのゲノムＲＮＡの量と、複製産物であるゲノムＲＮＡの量とが比例するような範囲であることがより好ましい。
【００４６】
また、温度、時間等の翻訳複製の条件についても適宜選択することができ、特に限定されるものではない。翻訳複製の温度としては、１３℃〜３３℃であることがより好ましく、１８℃〜２８℃であることがさらに好ましく、２１℃〜２５℃であることが特に好ましい。かかる温度条件を選ぶことにより、より安定した結果を得ることが可能となる。また、翻訳複製の時間としては、０．５時間〜５時間であることがより好ましく、０．５時間〜３時間であることがさらに好ましく、０．５時間〜２時間であることが特に好ましい。かかる時間条件を選ぶことにより、より安定した結果を得ることが可能となる。例えば、後述する実施例では、２３℃、１時間という条件を用い、最も安定した結果を得ている。
【００４７】
また、翻訳複製の方法についても、公知のバッチ法であってもよいし、連続式無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製系（Science, 242, 1162-1164 (1988)）であってもよい。バッチ法は、予め翻訳反応に必要な要素をすべて加え、反応液を均一混合して合成反応を行う方法である。連続式無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製系は、透析膜により反応液と反応基質溶液とを仕切ること（透析法）、あるいは密度の異なる反応基質溶液の上層あるいは下層に反応液を重層すること（重層法）により、基質分解産物の蓄積を防止しつつ基質の供給を連続して行い、合成反応を長時間持続させる方法である。このなかでも、バッチ法を用いることがより好ましい。バッチ法では、連続式無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製系のように、過剰量の１３０ｋタンパク質及び１８０ｋタンパク質が合成されて、トバモウイルス増殖の阻害に影響を及ぼしうることがないからである。
【００４８】
ウイルスＲＮＡ翻訳・複製に利用するエネルギー源としては、ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸等が挙げられ、アミノ酸としては２０種類のＬ型アミノ酸が挙げられる。
【００４９】
（１−２）ＲＮＡ検出工程及びＲＮＡ量比較工程
ＲＮＡ検出工程は、上記ゲノム複製試行工程において複製されたＴｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのＲＮＡ及び野性型トバモウイルスのＲＮＡを検出する工程である。なお、ここで上記ＲＮＡには、ゲノムＲＮＡ（プラス鎖ＲＮＡ）のみならず、マイナス鎖ＲＮＡ及びサブゲノミックＲＮＡが含まれる。すなわち、検出され比較されるＲＮＡは、ゲノムＲＮＡであってもよいし、マイナス鎖ＲＮＡであってもよいし、サブゲノミックＲＮＡであってもよい。またこれらのうちの複数を検出、比較してもよい。マイナス鎖ＲＮＡとは、ゲノムＲＮＡと相補的なＲＮＡをいい、ゲノムＲＮＡの複製はマイナス鎖ＲＮＡを介して起こると考えられている。また、サブゲノミックＲＮＡとは、ウイルスゲノムＲＮＡの一部の配列をもった非完全長ＲＮＡを指す。トバモウイルスの場合、ゲノムＲＮＡと同一の３’末端配列をもつ２種のサブゲノミックＲＮＡが、ＲＮＡ複製の過程でゲノム長マイナス鎖ＲＮＡを鋳型として合成される。これら２種のサブゲノミックＲＮＡは、それぞれ３０ｋタンパク質と外被タンパク質合成のための鋳型として機能する。
【００５０】
上記ＲＮＡを検出する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を好適に用いることができる。かかる方法としては、例えば、複製反応時に放射性同位元素で標識したＲＮＡ合成基質を取り込ませ、産物をゲル電気泳動で分画後オートラジオグラフィーで検出する方法、複製反応液中のマイナス鎖ＲＮＡをノザンハイブリダイゼーションあるいは RNase protection 法で検出する方法、またはサブゲノミックＲＮＡ上にルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子をもつキメラウイルスを用いて、複製に伴い産生されるサブゲノミック ＲＮＡ をレポーター活性で測る方法等を挙げることができる。
【００５１】
また、ＲＮＡ量比較工程は、上記ＲＮＡ検出工程によって検出された、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのＲＮＡ量と、野性型トバモウイルスのＲＮＡ量とを比較する工程である。ＲＮＡ量を比較する方法も、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を好適に用いることができる。例えば、複製されたＲＮＡを電気泳動で分画後、３２Ｐのシグナルを検出する場合、ＲＮＡ量は、得られたバンドを見比べることで比較することができる。
【００５２】
上記ＲＮＡ検出工程において検出された野性型トバモウイルスのＲＮＡ量が、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのＲＮＡ量と比較して減少していれば、被験植物はＴｍ−１様形質を有していると判定することができる。これに対して、上記ＲＮＡ検出工程において検出された野性型トバモウイルスのＲＮＡ量が、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのＲＮＡ量と比較して略同量であれば、被験植物はＴｍ−１様形質を有していないと判定することができる。
【００５３】
これにより、複製されたＲＮＡの量の大小を比較することのみによって、植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定することができるため、簡便で迅速な判定が可能となる。
【００５４】
（１−３）タンパク質検出工程及びタンパク質生産量比較工程
上記タンパク質検出工程は、上記ゲノム複製試行工程において、野生型トバモウイルスゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質、並びに、トバモウイルスのＴｍ−１抵抗性打破変異株のゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質を検出する工程である。上記タンパク質を検出する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を好適に用いることができる。かかる方法としては、例えば、タンパク質を電気泳動で分画後、両タンパク質を認識する抗体を用いたウエスタンブロット法により検出する方法を挙げることができる。また、例えば、放射線標識したアミノ酸（例えば３５Ｓメチオニンあるいはシステインなど）を翻訳時に取り込ませ、免疫沈降して電気泳動で分離し、オートラジオグラフィー、フルオログラフィー等で検出する方法を用いてもよい。
【００５５】
上記タンパク質生産量比較工程は、上記タンパク質検出工程において検出された、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の量と、トバモウイルスのＴｍ−１抵抗性打破変異株のゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の量とをそれぞれ比較する工程である。上記比較する方法も、特に限定させものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、上記例示の方法を用いる場合には、一見してタンパク質の量を比較することができる。
【００５６】
上記タンパク質検出工程において検出された、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の量と、トバモウイルスのＴｍ−１抵抗性打破変異株のゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の量とがそれぞれ略同量であることを確認したうえで、上記ＲＮＡ検出工程において検出された野生型トバモウイルスのＲＮＡの量が、トバモウイルスのＴｍ−１抵抗性打破変異株のＲＮＡの量と比較して減少していれば、被験植物はＴｍ−１様形質を有していると判定することができる。これに対して、上記タンパク質検出工程において検出された、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の量と、トバモウイルスのＴｍ−１抵抗性打破変異株のゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の量とがそれぞれ略同量であることを確認したうえで、上記ＲＮＡ検出工程において検出された野生型トバモウイルスのＲＮＡの量が、トバモウイルスのＴｍ−１抵抗性打破変異株のＲＮＡの量と比較して略同量であれば、被験植物はＴｍ−１様形質を有していないと判定することができる。
【００５７】
上述したように、１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質は、トバモウイルスのゲノムＲＮＡの複製には必要である。従って、トバモウイルスのＲＮＡが複製される場合には必ず検出されなければならない。さらに、本発明者らは、Ｔｍ−１様形質を有する植物において、トバモウイルスのＲＮＡが複製されないときにも、１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質が翻訳されていることを見出した。これまで、Ｔｍ−１形質を有する植物にトバモウイルスを感染させた場合、生体内では、１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質が検出されるレベルに達するためには、感染したトバモウイルスが何サイクルも複製することが必要なため、投入されたゲノムＲＮＡが翻訳されたかどうかを検出することは不可能であった。しかし本発明において用いた無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製系では、投入したゲノムＲＮＡが翻訳されたかどうかを検出することが可能となった。これにより、初めてＴｍ−１形質はウイルスのＲＮＡ複製段階を阻害するのであろうこと、つまりＲＮＡの翻訳段階や１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の安定性には影響しないことが示唆された。また、Ｔｍ−１様形質を有すると有しないとにかかわらず、翻訳された１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の量は、野生型トバモウイルスとＴｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスとでそれぞれ略同量であることを見出した。従って、上記構成によれば、１３０ｋタンパク質及び１８０ｋの複製タンパク質が略同量生産されていることを確認するため、植物におけるＴｍ−１様形質の有無をより確定的に判定することが可能となる。
【００５８】
（１−４）脱液胞化プロトプラスト抽出液調製工程
本発明にかかる植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法は、さらに、被験植物のＥＰＬを調製する脱液胞化プロトプラスト抽出液調製工程を含んでいてもよい。
【００５９】
上記脱液胞化プロトプラスト抽出液調製工程は、植物細胞からプロトプラストを調製するプロトプラスト調製工程、植物のプロトプラストから脱液胞化プロトプラストを調製する、脱液胞化プロトプラスト調製工程と、該脱液胞化プロトプラストからＥＰＬを調製する、抽出液調製工程とを含むものである。もちろん、これら以外の工程を含んでいてもよい。例えば、脱液胞化プロトプラスト調製工程と無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製液調製工程との間に脱液胞化プロトプラストがどの程度調製されているかを確認する工程などを含んでいてもよいことはいうまでもない。
【００６０】
＜プロトプラスト調製工程＞
プロトプラスト調製工程は、植物細胞からプロトプラストを調製する工程である。本工程において用いる方法としては、植物細胞からプロトプラストが得られる方法であれば特に限定されるものではなく、公知の方法を用いればよい。通常、酵素処理により植物細胞の細胞壁を消化する方法が一般的である。ただし、この方法に限定されるものではない。
【００６１】
細胞壁を消化する酵素としては、セルラーゼ、ペクトリアーゼ、ドリセラーゼを挙げることができるが、これに限定されるものではない。使用する酵素の種類、濃度等も、特に限定されるものではなく、用いる植物細胞の種類の応じて適宜選択すればよい。例えば、タバコ培養細胞を、１％セルラーゼ、０．１％ペクトリアーゼ、１％ドリセラーゼ存在下で処理することにより、タバコ培養細胞由来のプロトプラストを調製することができる。また、シロイヌナズナ培養細胞を、１％セルラーゼ、０．２％ペクトリアーゼ存在下で処理することにより、シロイヌナズナ培養細胞由来のプロトプラストを調製することができる。また、トマト培養細胞を、１％セルラーゼ、０．２％ペクトリアーゼ存在下で処理することにより、トマト培養細胞由来のプロトプラストを調製することができる。
【００６２】
＜脱液胞化プロトプラスト調製工程＞
脱液胞化プロトプラスト調製工程は、植物のプロトプラストから脱液胞化プロトプラストを調製する工程である。本工程において用いる方法としては、植物のプロトプラストから脱液胞化プロトプラストが得られる方法であれば特に限定されるものではないが、密度勾配遠心法を用いることが好ましい。すなわち、脱液胞化プロトプラスト調製工程は、密度勾配遠心工程を含むことが好ましい。ここで、「密度勾配遠心法」とは、遠心管内に溶質で濃度勾配、すなわち密度勾配をつけた溶液（密度勾配液）を作製し、試料を加えて遠心し、巨大分子や細胞内粒子などの成分を同じ密度の位置まで沈降あるいは浮遊させ、密度の異なる成分を分離、分画する方法である。使用する密度勾配液としては、特に限定されるものではなく、例えば、ショ糖、グリセロール、コロイド状シリカ製密度勾配液（シリカゾル）等が挙げられる。中でも、生体膜の保全性と遠心時間の短さの点でコロイド状シリカ製密度勾配液の使用が好ましい。ここで、「コロイド状シリカ製密度勾配液」とは、表面処理されたコロイド状シリカを分散させて調製した密度勾配液をいう。コロイド状シリカ製密度勾配液として、具体的には、例えば、パーコール（商品名、アマシャムバイオサイエンス株式会社製）を挙げることができる。パーコールはポリビニルピロリドンの被膜を持つコロイド状シリカ製品で、密度１．１３ｇ／ｍＬの溶液として販売されており、密度勾配遠心用媒体として、広く使用されている。パーコールは、植物のプロトプラストから脱液胞化プロトプラストを調製する場合の密度勾配液として、最も適しているものの１つである。ただし、コロイド状シリカ製密度勾配液はパーコールに限定されるものではなく、同等の性質を有するものであれば、好適に用いることができる。
【００６３】
密度勾配遠心法においては、密度の異なる密度勾配液を重層して用いることが好ましい。本工程において、密度の異なるパーコールの重層による密度勾配遠心法を適用する場合には、下層から順に４５〜７５％（v/v）、３５〜５０％（v/v）および１０〜３５％（v/v）の範囲から選択される濃度のパーコールを、最下層が最高濃度、最上層が最低濃度となるように用いることが好ましく、下層から順に７０％（v/v）、４０％（v/v）および３０％（v/v）の濃度のパーコールを重層して用いることが最も好ましい。この場合、例えば、タバコ培養細胞由来の脱液胞化プロトプラストは、７０％（v/v）パーコールと４０％（v/v）パーコールの境界面に濃縮して分画され、シロイヌナズナ由来の脱液胞化プロトプラストは４０％（v/v）パーコールと３０％（v/v）パーコールの境界面に濃縮して分画される。また、トマト培養細胞由来の脱液胞化プロトプラストは、５０％（v/v）パーコールと３５％（v/v）パーコールの境界面、あるいは１０〜５０％(v/v)パーコール連続密度勾配の中間（３０％[v/v]）より下の部分に分画される。
【００６４】
また、密度勾配液に連続密度勾配液を用いることができる。「連続密度勾配液」とは、ある濃度から別の濃度まで連続した密度勾配を形成している状態にある密度勾配液を意味する。例えば、遠心管に３０％（v/v）パーコール溶液を入れ、その上に等量の２０％（v/v）パーコール溶液を重層して、グラジエントメーカーを用いて回転させると、最上部の２０％（v/v）から最下部の３０％（v/v）まで滑らかに連続する密度勾配を形成した連続密度勾配液を作製することができる。連続密度勾配液を用いると、プロトプラストの最初の集束位置が分散するため、多量のプロトプラストを処理しても脱液胞化プロトプラストの収量が低下することがないという利点がある。
【００６５】
なお、上記連続密度勾配液は、上記脱液胞化プロトプラストが濃縮される密度勾配液の液−液界面より上層に重層されることが好ましい。このように連続密度勾配液を重層して密度勾配遠心法を実施する場合、脱液胞化プロトプラストは、連続密度勾配液中を通過して、所定の密度勾配液の液−液界面まで沈降することになる。この場合、プロトプラストの最初の集束位置が分散するため、段階的な密度勾配のみを形成して脱液胞化プロトプラストを取得する場合に比べて、脱液胞化プロトプラストをより高収率で取得することができる。
【００６６】
本工程において、連続密度勾配のパーコールを用いる場合には下層から順に１０〜５０％（v/v）の連続密度勾配、および５〜１５％（v/v）の範囲から選択される濃度のパーコールを、最下層が最高濃度、最上層が最低濃度となるように濃度順に用いることが好ましい。連続密度勾配の密度勾配液を用いることにより、脱液胞化プロトプラストの回収効率を向上させることが可能となる。
【００６７】
脱液胞化プロトプラストが遠心管の底に沈殿すると、同じく底に沈殿する糖質等の固形成分により脱液胞化プロトプラストが破砕されてしまうため、密度の異なる密度勾配液の液−液界面に濃縮して遠心分画されるように密度勾配液の密度を設定することが重要である。液−液界面に分画されることにより、無傷の脱液胞化プロトプラストを回収することが可能となる。密度勾配液としてパーコールを用いる場合、脱液胞化プロトプラストを遠心管の底に沈殿させないために、４５〜７５％（v/v）の範囲内で選択される濃度のパーコール溶液を最下層とすることが好ましい。
【００６８】
＜抽出液調製工程＞
抽出液調製工程は、脱液胞化プロトプラストからＥＰＬを調製する工程である。本工程において用いる方法としては、ＥＰＬが得られる方法であれば特に限定されるものではなく、公知の方法を用いればよい。通常、脱液胞化プロトプラスト懸濁液を調製し、ホモジナイザーを用いて脱液胞化プロトプラストを破砕した後に遠心分離し、上清を回収する方法が一般的である。ただし、この方法に限定されるものではない。
【００６９】
本工程において、脱液胞化プロトプラストを懸濁する緩衝液の組成は特に限定されるものではないが、細胞質と同様の性質を有するものが好ましい。すなわち、ミリモル（ｍＭ）オーダーのマグネシウムイオンと１００ｍＭ程度のカリウムイオンを含み、中性に近いｐＨを有する緩衝液が好適である。また、還元剤、プロテアーゼ阻害剤等を含んでいてもよい。また、還元剤、プロテアーゼ阻害剤等は抽出液を調製した後に添加してもよい。
【００７０】
〔２〕植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定キット
本発明にかかる植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定キットは、被験植物の脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液の中で、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡと、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのゲノムＲＮＡとを、それぞれ独立して、翻訳及び複製させ、複製された野性型トバモウイルスのＲＮＡとＴｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのＲＮＡとの量を比較することによって、植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定するために利用される判定キットであって、少なくとも、脱液胞化プロトプラスト抽出液を調製するための試薬、無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液を調製するための試薬、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡ、及びＴｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのゲノムＲＮＡを含むものである。なお、上記判定は、野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の量と、トバモウイルスのＴｍ−１抵抗性打破変異株のゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋ及び１３０ｋタンパク質の量とをそれぞれ比較する工程を含むものであってもよい。本キットを使用することにより、簡便、かつ、効率的に植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定することが可能となる。本キットの具体的な構成の一例について、以下に説明する。
【００７１】
（２−１）脱液胞化プロトプラスト抽出液を調製するための試薬
脱液胞化プロトプラスト抽出液を調製するための試薬としては、ＥＰＬを調製するために使用する試薬であれば特に限定されるものではない。具体的には、例えば、プロトプラストから脱液胞化プロトプラストを調製するために用いられる試薬（脱液胞化試薬）、脱液胞化プロトプラストからＥＰＬを調製するために用いられる試薬（抽出液調製試薬）、植物のプロトプラストを調製するために用いられる試薬（プロトプラスト調製試薬）を挙げることができる。ここで「試薬」には、酵素や塩類等の一般的な試薬の他に、一連の操作に使用される器具等を含んでもよいものとする。
【００７２】
＜脱液胞化試薬＞
脱液胞化試薬としては、上記脱液胞化プロトプラスト調製工程において使用する試薬であれば、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、密度勾配液、密度勾配液を希釈するための希釈液やプロトプラストを懸濁するための緩衝液、遠心管等を挙げることができる。
【００７３】
すなわち、脱液胞化試薬には、少なくとも密度勾配液が含まれていることが好ましい。密度勾配液としては、具体的には、上述のショ糖、グリセロール、コロイド状シリカ製密度勾配液（シリカゾル）等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。キットに含まれる密度勾配液は、密度勾配液の原液として一定密度の１種類の密度勾配液であってもよく、異なる密度に調製した複数の密度勾配液であってもよい。前者の場合は、キットの使用者が自由に使用密度を選択できるという利点があり、後者の場合は、そのまま密度勾配液を重層するだけで密度勾配遠心分離を実施でき、使用密度を選択して調製するという手間を省けるという利点がある。
【００７４】
＜抽出液調製試薬＞
抽出液調製試薬としては、上記抽出液調製工程において使用する試薬であれば、特に限定されるものではない。例えば、ＥＰＬの調製を、脱液胞化プロトプラストをホモジナイズしてその遠心上清を得るという方法により行う場合には、回収した脱液胞化プロトプラストを洗浄するための緩衝液、脱液胞化プロトプラストを懸濁してホモジナイズするための緩衝液、ホモジナイザー管、遠心管等を挙げることができる。
【００７５】
＜プロトプラスト調製試薬＞
プロトプラスト調製試薬としては、上記プロトプラスト調製工程において使用する試薬であれば、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、植物細胞の細胞壁を消化する酵素を含む酵素処理液、酵素処理後にプロトプラストを洗浄するための緩衝液、遠心管等を挙げることができる。
【００７６】
すなわち、プロトプラスト調製試薬には、少なくとも植物細胞の細胞壁を消化する酵素類が含まれていることが好ましい。当該酵素類としては、セルラーゼ、ペクトリアーゼ、ドリセラーゼ等を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００７７】
（２−２）無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液を調製するための試薬
本キットには、被験植物のＥＰＬ、及び必要に応じて上記「他の無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製液」に添加して無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液を調製するための反応液調製試薬が含まれることが好ましい。反応液調製試薬に含まれる成分として、具体的には、例えば、ウイルスＲＮＡ翻訳・複製に利用するエネルギー源としての、ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸等や、ウイルスＲＮＡ翻訳・複製に利用するアミノ酸（２０種類のＬ型アミノ酸）等が挙げられる。
【００７８】
（２−３）野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡ、及びＴｍ−１様形質抵抗性打破変異株トバモウイルスのゲノムＲＮＡ
本キットに含まれる野生型トバモウイルスのゲノムＲＮＡ、及びＴｍ−１様形質抵抗性打破変異株のゲノムＲＮＡトバモウイルスのゲノムＲＮＡについては、上記（１−１）で説明したので、ここでは説明を省略する。
【００７９】
（２−４）その他
その他に、本キットの構成として、無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応用プレートが含まれていることが好ましい。さらに、複製されたゲノムＲＮＡ及び必要に応じて合成されたタンパク質を検出するための、電気泳動用ゲル、緩衝液、試薬等が含まれていることが好ましい。これらが本キットに含まれていることにより、使用者はさらに簡便に本キットを用いて植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定を行うことが可能となる。
【００８０】
〔３〕トバモウイルスのＴｍ−１様形質抵抗性を打破する能力の有無を判定する方法
本発明にかかるトバモウイルスのＴｍ−１様形質抵抗性を打破する能力の有無を判定する判定方法は、Ｔｍ−１形質を有する植物の脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液の中で、被験トバモウイルスのゲノムＲＮＡと、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破という遺伝的変異が導入されていないトバモウイルスのゲノムＲＮＡとを、それぞれ独立して、翻訳及び複製させるゲノム複製試行工程と、上記ゲノム複製試行工程において複製された被験トバモウイルスのＲＮＡ及びＴｍ−１様形質抵抗性打破という遺伝的変異が導入されていないトバモウイルスのＲＮＡを検出するＲＮＡ検出工程と、上記ＲＮＡ検出工程によって検出された、被験トバモウイルスのＲＮＡ量と、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破という遺伝的変異が導入されていないトバモウイルスのＲＮＡ量とを比較するＲＮＡ量比較工程とを含んでいる。
【００８１】
上記ＲＮＡ検出工程において検出された被験トバモウイルスのＲＮＡ量が、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破という遺伝的変異が導入されていないトバモウイルスのＲＮＡ量と比較して増加していれば、被験トバモウイルスはＴｍ−１様形質抵抗性を打破する能力を有していると判定することができる。
【００８２】
また、本判定方法は、さらに、上記ゲノム複製試行工程において、被験トバモウイルスのゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質、並びに、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破という遺伝的変異が導入されていないトバモウイルスのゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質を検出するタンパク質検出工程と、上記タンパク質検出工程において検出された、被験トバモウイルスのゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の量と、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破という遺伝的変異が導入されていないトバモウイルスのゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋ及び１３０ｋタンパク質の量とをそれぞれ比較するタンパク質生産量比較工程とを含んでいることが好ましい。上記タンパク質検出工程において検出された、被験トバモウイルスのゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の量と、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破という遺伝的変異が導入されていないトバモウイルスのゲノムＲＮＡから得られたタンパク質である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の量とがそれぞれ略同量であることを確認したうえで、上記ＲＮＡ検出工程において検出された被験トバモウイルスのＲＮＡ量が、Ｔｍ−１様形質抵抗性打破という遺伝的変異が導入されていないトバモウイルスのＲＮＡ量と比較して増加していれば、被験トバモウイルスはＴｍ−１様形質抵抗性を打破する能力を有していると判定することができる。タンパク質量を比較することにより、判定の信頼性をより向上させることができる。
【００８３】
上記、被験トバモウイルスとしては、例えば、トバモウイルスのゲノムＲＮＡに様々な人工的に変異を加えた変異株を挙げることができる。かかるトバモウイルスが、Ｔｍ−１様形質抵抗性を打破する能力の有無を、簡便に、比較的短時間で判定することができるため、加えた変異と、判定結果より、Ｔｍ−１様形質を有する植物において、トバモウイルスの増殖が抑制される機構の解析に好適に用いることができる。
【００８４】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００８５】
〔実施例１：Ｔｍ−１形質による in vitro でのＴｏＭＶのＲＮＡ複製の阻害〕
Ｔｍ−１形質を有するトマトの脱液胞化プロトプラスト抽出液及びタバコの脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液の中で、野生型ＴｏＭＶのＲＮＡと、Ｔｍ−１形質抵抗性打破変異株ＴｏＭＶのＲＮＡとを、それぞれ独立して、翻訳及び複製させた。複製された野性型ＴｏＭＶのＲＮＡ量及びタンパク質生産量とＴｍ−１形質抵抗性打破変異株ＴｏＭＶのＲＮＡ量及びタンパク質生産量とをそれぞれ比較した。
【００８６】
（１）トマトの培養細胞の作製
トマトセルラインＧＣＲ２６（＋／＋）及びＧＣＲ２３７（Ｔｍ−１／Ｔｍ−１）について、過去に培養細胞の確立について過去に例があったが、該培養細胞は絶えていたため自作した。過去の培養細胞の確立についての論文（Watanabe,Y., Kishibayashi,N., Motoyoshi,F., Okada,Y.,(1987)Virology161:527-532)に従って、培養細胞の樹立を試みたが、得られたセルラインはすぐに褐変し、増殖効率も低かった。そこで、新たな培地条件として、ゼアチン，α-ナフタレン酢酸，２，４−ジクロロフェノキシ酢酸(２，４−Ｄ)，スクロースを添加したムラシゲ＆スグーグ培地で培養した、トマトセルラインＧＣＲ２６（＋／＋）及びＧＣＲ２３７（Ｔｍ−１／Ｔｍ−１）を得た。得られたセルラインは、いずれも、褐変せず安定であり、増殖効率も高いものであった。ＧＣＲ２６はＴｏＭＶ感受性を有するトマトの品種Craigella、ＧＣＲ２３７はCraigellaと共通する遺伝的背景を有する（Ｔｍ−１／Ｔｍ−１）ホモ接合体である。
【００８７】
（２）トマト培養細胞からのプロトプラストの調製
上記ＧＣＲ２３７（Ｔｍ−１／Ｔｍ−１）培養細胞を、ＮＤＺ培地で２３℃、７０〜８０ｒｐｍ（往復；ふれ幅７ｃｍ）、暗黒下で、7日間、フラスコを用いて培養した。これにより、定常状態にある細胞を取得した。この細胞を更に新鮮な培地に継代し、同一条件で３日間培養した。遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、１分間）して上清を除去し、細胞を集めた。得られた細胞に０．７Ｍマンニトール（３０℃）を加えて、１０分間、室温に静置した。これを再び遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、１分間）して上清を除去した後、プロトプラスト調製液（1% セルラーゼ “ONOZUKA” RS （ヤクルト社製）、0.2% ペクトリアーゼ、5 mM CaCl2、0.6 M マンニトールをＮＤＺ培地に溶解し、pH を 5.8 に合わせた。）を添加し、３０℃、２時間反応させ、プロトプラストを調製した。
【００８８】
（３）トマトの脱液胞化プロトプラストの調製
上記プロトプラスト調製液中のプロトプラストを、遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、５分間）して上清を除くことにより回収した。これに０．７Ｍマンニトールを加えて洗浄し、遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、５分間）して上清を除いた。この洗浄操作を４回繰り返した後、２倍容の１０％パーコール溶液（5mM PIPES-KOH（pH7.4）、20mM MgCl2、10%パーコール（v/v）、0.7Mマンニトール）にプロトプラストを懸濁した。この細胞懸濁液を１０−５０％パーコール連続密度勾配溶液の上に重層した。これを遠心分離（ベックマン社製ＪＳ２４．１５、10,000×ｇ、６０分間、２５℃）し、遠心後、浮き上がった画分（液胞を主に含む）と底に沈んだ画分（死んだ細胞など）以外の画分を回収した。この細胞を顕微鏡観察したところ、液胞がなく、細胞小器官が保持された目的の脱液胞化プロトプラストが大多数を占めていた。
【００８９】
（４）トマトの脱液胞化プロトプラスト抽出液の調製
上記、回収した脱液胞化プロトプラストを氷冷した０．７Ｍマンニトールで３回洗浄した。洗浄後の脱液胞化プロトプラストに、細胞量の４倍容の氷冷ＴＲバッファー（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、８０ｍＭ ＫＯＡｃ、１．８ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、２ｍＭ ＤＴＴ、Protease inhibitor cocktail（Roche社製、Complete Mini EDTA-free（商品名）、１粒／１０ｍＬ））を添加し、氷冷したダウンス型ホモジナイザー（tight）で５０回ストロークして、脱液胞化プロトプラストを破砕した。ベントナイト溶液は添加せず、遠心分離（トミー精工製ＴＭＳ−２１、８００×ｇ、１０分間、４℃）した。この上清を回収し、−８０℃で凍結保存した。
【００９０】
（５）タバコ培養細胞の作製
Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2 種子を次亜塩素酸ナトリウム溶液（有効塩素濃度２％）で滅菌後、滅菌水を含んだ脱脂綿に播種し、暗黒下、２５℃で培養した。２週間後、展開した下胚軸を切取り、更に０．２ｍｇ／Ｌの2,4-Dおよび30g/Lのsucroseを含むムラシゲ・スクーグ培地に置床し、２５℃、暗黒下でカルス誘導を行った。得られたカルスを１週間毎に継代培養し、増殖旺盛なタバコ培養細胞株を確立した。
【００９１】
（６）タバコ培養細胞からのプロトプラストの調製
上記タバコ培養細胞を、0.2mg/Lの2,4-Dおよび30g/Lのsucroseを含むムラシゲ・スクーグ培地に継代し、２６〜２７℃、１３０ｒｐｍ、暗黒下で、7日間、フラスコを用いて培養した。これにより、定常状態にある細胞を取得した。この細胞を更に新鮮な培地に継代し、同一条件で３日間培養した。遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、１分間）して上清を除去し、細胞を集めた。得られた細胞に０．４Ｍマンニトール（３０℃）を加えて、１０分間、室温に静置した。これを再び遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、１分間）して上清を除去した後、プロトプラスト調製液（１％セルラーゼ“ONOZUKA”RS（ヤクルト社製）、０．１％ペクトリアーゼＹ２３（キッコーマン社製）、１％ドリセラーゼ（協和発酵社製）、０．４Ｍマンニトール、ｐＨ５．５）を添加し、３０℃、２時間反応させ、プロトプラストを調製した。
【００９２】
（７）タバコの脱液胞化プロトプラストの調製
上記プロトプラスト調製液中のプロトプラストを、遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、５分間）して上清を除くことにより回収した。これに０．４Ｍマンニトールを加えて洗浄し、遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、５分間）して上清を除いた。この洗浄操作を４回繰り返した後、３０％パーコール溶液（5mM PIPES-KOH（pH7.4）、20mM MgCl2、30%パーコール（v/v）、0.7Mマンニトール）にプロトプラストを懸濁した。この細胞懸濁液を遠心チューブに移し、その下層に４０％パーコール溶液（5mM PIPES-KOH（pH7.4）、20mM MgCl2、40%パーコール（v/v）、0.7Mマンニトール）、さらにその下層に７０％パーコール溶液（5mM PIPES-KOH（pH7.4）、20mM MgCl2、70%パーコール（v/v）、0.7Mマンニトール）を、注射器を用いて注入した。これを遠心分離（ベックマン社製ＪＳ２４．１５、10,000×ｇ、６０分間、２５℃）し、４０％パーコール溶液の層と７０％パーコール溶液の層との界面に位置している細胞を回収した。この細胞を顕微鏡観察したところ、液胞がなく、細胞小器官が保持された目的の脱液胞化プロトプラストが大多数を占めていた。
【００９３】
（８）タバコの脱液胞化プロトプラスト抽出液の調製
上記、回収した脱液胞化プロトプラストを氷冷した０．７Ｍマンニトールで３回洗浄した。洗浄後の脱液胞化プロトプラストに、細胞量の４倍容の氷冷ＴＲバッファー（30mM HEPES-KOH（pH7.4）、80mM KOAc、1.8mM Mg(OAc)2、2mM DTT、Protease inhibitor cocktail（Roche社製、Complete Mini EDTA-free（商品名）、１粒/10mL））を添加し、氷冷したダウンス型ホモジナイザー（tight）で５０回ストロークして、脱液胞化プロトプラストを破砕した。ベントナイト溶液を添加せず、遠心分離（トミー精工製ＴＭＳ−２１、８００×ｇ、１０分間、４℃）した。この上清を回収し、−８０℃で凍結保存した。
【００９４】
（９）無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液の中でのＴｏＭＶの翻訳複製
上記ＧＣＲ２３７（Ｔｍ−１／Ｔｍ−１）脱液胞化プロトプラスト抽出液及び上記タバコの脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液の中で、野生型ＴｏＭＶのＲＮＡと、Ｔｍ−１形質抵抗性打破変異株ＴｏＭＶのＲＮＡとを、それぞれ独立して、翻訳及び複製させた。Ｔｍ−１形質抵抗性打破変異株ＴｏＭＶとしては、Ｌｔａ１を用いた。
【００９５】
すなわち、上記ＧＣＲ２３７（Ｔｍ−１／Ｔｍ−１）脱液胞化プロトプラスト抽出液（１２．５μＬ）と上記タバコの脱液胞化プロトプラスト抽出液（１２．５μＬ）とを混合し、調製した無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液をそれぞれ用いて、野生型ＴｏＭＶのＲＮＡと、Ｔｍ−１形質抵抗性打破変異株Ｌｔａ１のＲＮＡとを、それぞれ独立して、翻訳及び複製させた。上記無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液（総量５３μＬ）の組成を以下の表１に示す。
【００９６】
【表１】
2005237302.tif 000002
【００９７】
ウイルス粒子は、ポリエチレングリコールによる選択的沈殿と分画遠心法を用いて感染タバコ葉から精製し、ウイルス RNA は、精製ウイルスからフェノール抽出とエタノール沈殿により調製した。
【００９８】
ウイルスＲＮＡの量は、野生型及びＴｍ−１形質抵抗性打破変異株Ｌｔａ１とも１００ｎｇとした。２３℃、１時間インキュベートして翻訳を行った。２３℃で１時間翻訳反応を行なった反応液４０μＬに５×ＲｄＲＰアッセイ液１０μＬ（ＡＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰ各５ｍＭ；２０μCi [α-３２Ｐ] ＣＴＰを含む１２５μＭ ＣＴＰ；５０ｍＭ ＤＴＴ；５００μｇ／ｍＬアクチノマイシンＤ（和光純薬製、大阪）；１７ｍＭ酢酸マグネシウム；１５０ｍＭクレアチンリン酸）を加え、２３℃で更に1時間インキュベートした。
【００９９】
（１０）複製された野性型ＴｏＭＶ及びＴｍ−１形質抵抗性打破変異株Ｌｔａ１のＲＮＡの検出及び比較
翻訳及び複製反応後の上記無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液からフェノール抽出、エタノール沈殿によりRNA を精製し、３０μＬの水に沈殿を溶解した。そのうちの３μＬ（上記無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液４μＬ分：ＲＮＡ産物の１／１０）を２．４％ポリアクリルアミド−８Ｍ尿素ゲルを用いて電気泳動分画後、ゲルをメチレンブルーで染色し、水でよく脱染色した後、３ＭＭ紙（Whatman 社製）の上で乾燥させ、これにイメージングプレートをあててＢＡＳ１０００（富士写真フィルム製）を用いて３２Ｐのシグナルを検出した。
【０１００】
結果を図１（ａ）に示す。図中ＴｏＭＶは野生型ＴｏＭＶのＲＮＡ、Ｌｔａ１はＴｍ−１形質抵抗性打破変異株Ｌｔａ１のＲＮＡをそれぞれ複製したことを示し、ｎｏＲＮＡは無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製液にＲＮＡを加えていないことを示す。また、図中「Genomic」と示されているバンドはＴｏＭＶのゲノムＲＮＡ（６．４ｋｂ、１本鎖ＲＮＡ）、図中「RF」と示されているバンドは複製中間体（６．４ｋｂ、２本鎖ＲＮＡ）を示す。
【０１０１】
図１（ａ）から明らかなように、野生型ＴｏＭＶの複製は、Ｔｍ−１形質抵抗性打破変異株Ｌｔａ１の複製よりも低く抑えられていることが示された。
【０１０２】
（１１）翻訳された野性型ＴｏＭＶ及びＴｍ−１形質抵抗性打破変異株Ｌｔａ１の１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の検出及び比較
翻訳後の段階の無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液４μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、その後ウェスタンブロット法で解析した（ゲル：６％ポリアクリルアミドゲル（自製）、一次抗体：α−ＴｏＭＶヘリカーゼドメイン抗体（自製）、二次抗体：ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Amersham Pharmacia Biotech社製、Anti-rabbit IgG HRP-Linked whole Ab、コード：NA934）、分子量マーカー：Prestained Protein Marker, Broad Range（ＮＥＢ社製））。
【０１０３】
結果を図２（ａ）に示す。図中ＴｏＭＶは野生型ＴｏＭＶのＲＮＡ、Ｌｔａ１はＴｍ−１形質抵抗性打破変異株Ｌｔａ１のＲＮＡをそれぞれ翻訳したことを示し、ｎｏＲＮＡは無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製液にＲＮＡを加えていないことを示す。また、図中「１８０Ｋ」と示されているバンドは１８０ｋタンパク質、図中「１３０Ｋ」と示されているバンドは１３０ｋタンパク質を示す。
【０１０４】
図２（ａ）から明らかなように、野生型ＴｏＭＶと、Ｔｍ−１形質抵抗性打破変異株Ｌｔａ１とが翻訳する１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の蓄積量に差は見られなかった。
【０１０５】
この結果より、Ｔｍ−１形質形質抵抗性打破変異株Ｌｔａ１においては、複製の過程で、１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質が翻訳されていることが確認された。また、野生型株においては、１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質は翻訳されるが、複製が起こらないことが明らかになった。
【０１０６】
〔実施例２：Ｔｍ−１形質を有しないトマトＥＰＬを用いた場合の in vitro でのＴｏＭＶのＲＮＡ複製及び翻訳〕
Ｔｍ−１形質を有しないＧＣＲ２６（＋／＋）培養細胞ＥＰＬを用いた以外は上記実施例１と同様にして、トマトの脱液胞化プロトプラスト抽出液及びタバコの脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製反応液の中で、野生型ＴｏＭＶのＲＮＡと、Ｔｍ−１形質抵抗性打破変異株ＴｏＭＶのＲＮＡとを、それぞれ独立して、翻訳及び複製させた。複製された野性型ＴｏＭＶのＲＮＡ量及びタンパク質生産量とＴｍ−１形質抵抗性打破変異株ＴｏＭＶのＲＮＡ量及びタンパク質生産量とをそれぞれ比較した。
【０１０７】
複製された野性型ＴｏＭＶ及びＴｍ−１形質抵抗性打破変異株Ｌｔａ１のＲＮＡの検出結果を図１（ｂ）に示す。図中ＴｏＭＶは野生型ＴｏＭＶのＲＮＡ、Ｌｔａ１はＴｍ−１形質抵抗性打破変異株Ｌｔａ１のＲＮＡをそれぞれ複製したことを示す。また、図中「Genomic」と示されているバンドはＴｏＭＶのゲノムＲＮＡ（６．４ｋｂ、１本鎖ＲＮＡ）、図中「RF」と示されているバンドは複製中間体（６．４ｋｂ、２本鎖ＲＮＡ）を示す。
【０１０８】
図１（ｂ）から明らかなように、野生型ＴｏＭＶの複製は、Ｔｍ−１形質抵抗性打破変異株Ｌｔａ１の複製と差がないことが示された。
【０１０９】
翻訳された野性型ＴｏＭＶ及びＴｍ−１形質抵抗性打破変異株Ｌｔａ１の１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の検出結果を図２（ｂ）に示す。図中ＴｏＭＶは野生型ＴｏＭＶのＲＮＡ、Ｌｔａ１はＴｍ−１形質抵抗性打破変異株Ｌｔａ１のＲＮＡをそれぞれ翻訳したことを示す。また、図中「１８０Ｋ」と示されているバンドは１８０ｋタンパク質、図中「１３０Ｋ」と示されているバンドは１３０ｋタンパク質を示す。
【０１１０】
図２（ｂ）から明らかなように、野生型ＴｏＭＶと、Ｔｍ−１形質抵抗性打破変異株Ｌｔａ１とが翻訳する１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質の蓄積量に差は見られなかった。
【０１１１】
この結果より、複製の前提である１８０ｋタンパク質及び１３０ｋタンパク質が翻訳されたことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明は、トバモウイルスの増殖を抑制するＴｍ−１様形質の有無を、ＥＰＬを含む無細胞ウイルスＲＮＡ翻訳・複製系を用いて、簡便に、比較的短時間で判定することができる画期的な発明である。従って、トバモウイルスに対する植物の抵抗性の機構の解明に貢献できるのみならず、育種上も非常に有用であり、広く農薬産業や農業の発展に寄与するものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１（ａ）は、実施例１において、ＧＣＲ２３７培養細胞の脱液胞化プロトプラスト抽出液を用いて in vitro 翻訳及び複製を行い、得られたＲＮＡを解析した電気泳動図であり、図１（ｂ）は、実施例２において、ＧＣＲ２６培養細胞の脱液胞化プロトプラスト抽出液を用いて in vitro 翻訳及び複製を行い、得られたＲＮＡを解析した電気泳動図である。
【図２】図２（ａ）は、実施例１において、ＧＣＲ２３７培養細胞の脱液胞化プロトプラスト抽出液を用いて in vitro 翻訳及び複製を行い、翻訳後のサンプルをウエスタンブロット解析した図であり、図２（ｂ）は、実施例２において、ＧＣＲ２６培養細胞の脱液胞化プロトプラスト抽出液を用いて in vitro 翻訳及び複製を行い、翻訳後のサンプルをウエスタンブロット解析した図である。
【図１】
2005237302.tif 000003
【図２】
2005237302.tif 000004