(57)【要約】【課題】尿蛋白質を電気泳動し、銀染色を行った電気泳動像を、腎糸球体障害を主とする群、腎尿細管障害を主とする群、ベンスジョーンズ蛋白質が現れる群、健常者群などに分類することを特長とする尿蛋白質分析病態解析を行うため、電気泳動像の型分類をするのではなく、健常とは異なる疾患特有の泳動像から特定の疾病の存在を予測しそれがおおよそどの臓器のどの部分に起因するかを特定し、それが診断と治療に最も重要だという課題を解決しようとした。【解決手段】従来型の濃度図(デンシトグラム)だけではなくその個別濃度の差異や健常者群との差異さらに特定の蛋白質バンドの有無等に基づいて疾患別に特有のアルゴリズムを用いることにより病態解析を行った。【選択図】    図１
2005134144.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿蛋白質を電気泳動し、銀染色を行った電気泳動像を、腎糸球体障害を主とする群、腎尿細管障害を主とする群、ベンスジョーンズ蛋白質が現れる群、健常者群などに分類することを特長とする尿蛋白質分析病態解析方法。
【請求項２】
アルブミン画分とβ画分の分画値がそれぞれその他の疾患群の分画値に較べて、有意に高く現れることを特長とした群を、腎糸球体障害群とした請求項1の尿蛋白質分析病態解析方法。
【請求項３】
アルブミン画分の分画値が腎糸球体障害を主とする群のアルブミン画分の分画値より有意に低くかつ、β画分の代わりにそれをはさんだ形に別の蛋白画分が有意に濃く現れることを特長とした群を、腎尿細管障害群とした請求項1の尿蛋白質分析病態解析方法。
【請求項４】
グロブリン領域に骨髄腫等の存在を示唆する明確な蛋白染色帯を検出することができる群を、ベンスジョーンズ蛋白質が現れる群とした請求項1の尿蛋白質分析病態解析方法。
【請求項５】
銀染色されたアルブミン画分の色調がその他の疾患群のアルブミン画分より有意に薄くかつ単一の染色帯を持ち、さらにグロブリン領域が薄く大きな団子状の染色帯になることを特長とする群を、健常者群とした請求項1の尿蛋白質分析病態解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ヒトや動物の尿の生化学的分析のうち、尿蛋白質を電気泳動しその分析結果の特長から、疾病の種類を特定しようという分野
【背景技術】
【０００２】
尿を用いる検査は、人体に苦痛を与えることなく採取できる被試験物質として受診時のスクリーニングや住民検診等で広く使われている。これらに使われている測定項目のうち尿蛋白質の分析について、試験紙による検査法では一般的に蛋白質が出現しないいわゆる陰性が健常とされている。しかし特許文献1のように感度の高い銀染色法を使うと、健常人でも極少量の蛋白質が排泄されていることがわかっている。この微量蛋白質の電気泳動法による分析法は、芝らにより非特許文献1および非特許文献2に詳しく述べられている。これによると銀染色法を用いる尿蛋白質の電気泳動像の分析から、糖尿病においては泳動像の形からおおよそ5群に分けられると述べている。
【特許文献１】特開2002-236127号公報
【非特許文献１】生物物理化学誌vol.41、1997年、頁25-27
【非特許文献２】臨床検査vol.42、1998年、頁1106-1109
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本願発明は、銀染色法を用いる高感度尿蛋白質分析法を使うことにより、従来から行われている電気泳動像の型分類をするのではなく、健常とは異なる疾患特有の泳動像から特定の疾病の存在を予測し、それがおおよそどの臓器のどの部分に起因するかを特定することが、診断と治療に最も重要だという課題を解決しようとした。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
課題を解決するため、多くの腎生検による臨床診断を根拠にそれぞれの泳動像の特長を明確にして専門医でなくとも、泳動像の特長より腎生検をしなくとも腎疾患の病態を把握できるようになる方法の開発を目指した。
【０００５】
一般的に、尿は腎臓で生成され必要な栄養素は再吸収され再利用されるという腎臓の機能から、尿蛋白質の出現そのものが腎機能の障害や腎疾患が予測される。その腎疾患のうち、腎糸球体障害としてはIgA腎症、膜性腎症、巣状糸球体硬化症などが知られている。また腎尿細管障害としてはファンコニー症候群、間質性腎炎などがある。
【０００６】
その腎疾患の確定診断をするため、腎生検が広く行われている。腎生検は針を腎臓に向かって穿刺し、腎組織を取り出し組織染色後専門医による病理診断をする方法であり、患者にかなりの苦痛を与えるばかりか、組織の採取や病理組織標本の作製、その標本の判定に相当の費用と時間と熟練を要していた。
【０００７】
さらに患者側からすると腎生検後に、肉眼的血尿、血腫の形成など出血にまつわる合併症が起こり、出血の程度が多ければ血圧低下、ショックにまで発展することがあると言われている。
【０００８】
これら腎生検以外の検査法には、CTなどの画像診断や尿中蛋白質の定量および尿蛋白分画法がある。そのうち尿中蛋白質の定量検査には、アルブミン、トランスフェリンなどの糸球体性蛋白質の測定、レチノール結合蛋白、β2ミクログロブリン、NAGなどの尿細管性蛋白質の測定、免疫グロブリンL鎖(κ、λ)およびその他の臓器の疾患に起因する蛋白質の測定など種々の方法があるが、測定しなければならない蛋白質の種類が多すぎたり、免疫測定法など高価な抗体を使うなど欠点も多く実用的でなくあまり実施されていなかった。
【０００９】
従来の尿蛋白分画検査は、尿中蛋白質濃度がかなり低いため、尿を数十倍に濃縮して実施しておりその時間も10時間程度かかるばかりでなく、分離された電気泳動像も濃縮の影響による分画の不鮮明さで正確な診断が困難なことが多い。
【００１０】
本願発明は、前述特許文献1の銀染色法を用いて多数の腎疾患の尿蛋白質の電気泳動像の臨床例を詳しく精査した結果、疾患特有のアルゴリズムを特定することができた。
【００１１】
まず実施例に示すように尿蛋白質の銀染色による電気泳動像は、個人の腎機能の差異、疾病の状況により千差万別かつ種々雑多の印象を与える。この種々雑多の像をそのまま従来型の濃度図（デンシトグラム）にして専門医に回送してもそれがどの疾患群にあたるかを判定するにはあまりにも条件が多すぎ極めて困難であった。
【００１２】
本願発明では、デンシトグラムだけではなくその個別濃度の差異や健常者群との差異さらに特定の蛋白質バンドの有無等に基づいて疾患別に4群に分類しその群特有のアルゴリズムをコンピュータにより病態解析を行い、それが非常に有用という結論に至った。
【００１３】
図１に銀染色法による尿蛋白質4群の代表的電気泳動像の実際を示す。(1)(2)は腎糸球体障害群、(3)(4)は腎尿細管障害群、(5)(6)はベンスジョーンズ蛋白質出現群、(7)(8)は健常者群である。
【００１４】
排泄される尿蛋白質の濃度は患者の病状により異なるので、電気泳動する前に予め前述の特許文献1などの定量法で、その濃度を測定しておき、その濃度に従い電気泳動支持体へ患者尿の塗布量を一定にしているので、図1における色調の変化は濃度の差として認識できるようになっている。
【００１５】
病態解析の特定したアルゴリズムと関係する疾患名は下記のとおりである。
【００１６】
1. 銀染色した電気泳動像において、アルブミン画分とβ画分の分画値がそれぞれその他の疾患群の分画値に較べて、有意に高く現れる場合は腎糸球体障害群であり、主な疾患名はIgA腎症、膜性腎症、巣状糸球体硬化、糖尿病性腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、ループス腎炎などが含まれる。
【００１７】
2. アルブミン画分の分画値が腎糸球体障害とされる群のアルブミン画分の分画値より有意に低くかつ、β画分の代わりにそれをはさんだ形に別の蛋白画分が有意に濃く現れる場合は腎尿細管障害群であり、主な疾患名は、ファンコニー症候群、シスチン尿症、間質性腎炎、痛風腎、薬剤性尿細管壊死、尿細管アシドーシス、カドミウム中毒などが含まれる。
【００１８】
3. グロブリン領域に単一で、明確な蛋白染色帯を検出する場合はベンスジョーンズ蛋白質が現れる群であり、主な疾患名は多発性骨髄腫、オリゴクローナール、原発性アミロイドーシスなどが含まれる。ベンスジョーンズ蛋白質は形質細胞が腫瘍化いわゆるモノクローン化し、免疫グロブリンのL鎖が過剰生産されたものをいい、その血中濃度が上昇するため、再吸収出来きれなかった蛋白質が尿中に排泄される。
【００１９】
4. 銀染色されたアルブミン画分の色調がその他の疾患群のアルブミン画分より有意に薄くかつ単一の染色帯を持ち、さらにグロブリン領域全体が薄く帯状に染まったいわゆる大きな団子状の染色帯になる場合は健常者群である。健常者では腎糸球体でのアルブミンの透過性も低く、低分子量蛋白質もほとんどが尿細管で再吸収されるため、アルブミン以外では蛋白染色帯が出現するほどの蛋白質は排出されない。
【００２０】
また、上記アルゴリズムは特許文献、非特許文献には全く記載されていない。
【発明の効果】
【００２１】
１．腎生検により調べなければならい腎疾患の確定診断は、患者に余分な腎穿刺などの苦痛を強いたり、時間のかかる病理標本作成かつその標本の顕微鏡による専門医の診断を必要としている。実際腎生検が必要でもそれがされず放置されていた多数の患者に、本測定法によるスクリーニング的検査を実施し本当に腎生検をしなければならない患者を早く見つける等大きな効果が期待できる。
【００２２】
２．腎疾患やベンスジョーンズ蛋白の検出に本願尿蛋白質分析病態解析法を適用することで、腎生検に較べ飛躍的に診断が簡略化され、測定時間が短縮されかつ検査価格を低下させることが出来る。
【００２３】
３．腎疾患の早期診断による早期治療で人工透析開始時期を遅らせたり、病態の悪化を防ぐ事が出来るため、結果的に医療費の大幅な低減が図れる。
【００２４】
４．尿の電気泳動像は多種雑多なパターンを示すので、専門医でも判定に苦慮していたのを、本願尿蛋白質分析病態解析により腎臓専門医でなくとも疾病群を判断できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
尿蛋白質を電気泳動し、銀染色を行い、その電気泳動像を、腎糸球体障害を主とする群、腎尿細管障害を主とする群、ベンスジョーンズ蛋白質が現れる群、健常者群などに分類する。
【実施例１】
【００２６】
図2は健常血清蛋白の電気泳動像の模式図(9)と腎糸球体障害患者と診断された患者の尿の電気泳動像の模式図６種類を(10)〜(15)に示した。(16)はアルブミン画分で、(17)はβ画分である。(10)〜(15)の患者群は何れも図3と図4と図5のアルブミン画分およびβ画分の濃度より明らかに濃い。
【００２７】
α1画分、α2画分が多様に出現するため、(10)〜(15)の患者群を分類している。
【実施例２】
【００２８】
図3は健常血清蛋白の電気泳動像の模式図(9)と腎尿細管障害患者と診断された患者の尿の電気泳動像の模式図4種類を(18)〜(21)に示した。(16)はアルブミン画分で(17)はβ画分の位置であるがここでは見えない。(22)と(23)はβ画分(17)を挟む形にそれぞれ出現する。
【００２９】
α1画分、α2画分が多様に出現するため、(18)〜(20) の患者群を分類している。(21)に関しては、酸性尿であり、(23)の染色帯の蛋白質(β2ミクログロブリン)が分解したものである。
【実施例３】
【００３０】
図4は健常血清蛋白の電気泳動像の模式図(9)とベンスジョーンズ蛋白質が存在すると診断された患者の尿の電気泳動像の模式図6種類を(24)〜(29)に示した。(30)はγグロブリン領域である。(31)〜(36)はそれぞれ違った位置にそれぞれ明確な蛋白染色帯が認められた。
【実施例４】
【００３１】
図5は健常血清蛋白の電気泳動像の模式図(9)と健常者の尿の電気泳動像の模式図(37)を示した。(16)はアルブミン画分で、(38)はα1グロブリン〜γグロブリン領域である。(16)は単一の染色帯で現れるが、(38)のグロブリン領域は全体が薄く団子状に染まっている。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】尿蛋白質4群の代表的電気泳動像
【図２】健常血清蛋白と腎糸球体障害患者の尿の電気泳動像の模式図
【図３】健常血清蛋白と腎尿細管障害患者の尿の電気泳動像の模式図
【図４】健常血清蛋白とベンスジョーンズ蛋白質が存在する患者の尿の電気泳動像の模式図
【図５】健常血清蛋白と健常者の尿の電気泳動像の模式図
【符号の説明】
【００３３】
(1)(2) 腎糸球体障害群の代表的な電気泳動像
(3)(4) 腎尿細管障害群の代表的な電気泳動像
(5)(6) ベンスジョーンズ蛋白質出現群の代表的な電気泳動像
(7)(8) 健常者群の代表的な電気泳動像
(9) 正常血清蛋白の電気泳動像の模式図
(10)〜(15) 腎糸球体障害患者の尿の電気泳動像の模式図
(16) アルブミン画分
(17) β画分
(18)〜(21) 腎尿細管障害患者の尿の電気泳動像の模式図
(22) (17)を挟む形に出現するアルブミン側の蛋白染色帯(レチノール結合蛋白)
(23) (17)を挟む形に出現するγグロブリン側の蛋白染色帯(β2ミクログロブリン)
(24)〜(29) ベンスジョーンズ蛋白質が存在する患者の尿の電気泳動像の模式図
(30) γグロブリン領域
(31)〜(36) それぞれ異なった位置に明確な蛋白染色帯があるベンスジョーンズ蛋白質
(37) 健常者の尿の電気泳動像の模式図
(38) 全体が薄く帯状に染まっているα１グロブリン〜γグロブリン領域
【図１】
2005134144.tif 000003
【図２】
2005134144.tif 000004
【図３】
2005134144.tif 000005
【図４】
2005134144.tif 000006
【図５】
2005134144.tif 000007