(57)【要約】【課題】  血流中で遊離の形態で循環する場合には薬理学的因子として効果的であるが、腎クリアランスによって血流から迅速に遊離の形態で除去されるポリペプチドまたは多糖のエフェクターでの被験体の処置の提供。【解決手段】  遊離形態で腎クリアランスにより血流から迅速に除去されるポリペプチドまたは多糖エフェクターでの被験体の処置方法であって、ここで、改善点として、ポリエチレングリコール鎖の外表層および該鎖の末端と共有結合した該エフェクターを有するリポソームを含む、リポソーム組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遊離形態で腎クリアランスにより血流から迅速に除去されるポリペプチドまたは多糖エフェクターでの被験体の処置方法であって、ここで、改善点として、
ポリエチレングリコール鎖の外表層および該鎖の末端と共有結合した該エフェクターを有するリポソームを含む、リポソーム組成物を該被験体に投与する工程を包含する、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、増強循環エフェクター組成物、および通常血流から迅速な腎クリアランスを受ける小さいエフェクター分子を用いて被験体を処置する方法に関する。
【０００２】
（参考文献）
【０００３】
【数１】
2005097320.tif 000002
【０００４】
【数２】
2005097320.tif 000003
【０００５】
【数３】
2005097320.tif 000004
【背景技術】
【０００６】
（発明の背景）
多くの新しいまたは現在行われている治療は、小さい（50kDより小さい)タンパク質、ポリペプチド、または多糖エフェクターの静脈注射を包含する。このようなエフェクターは、活性免疫に用いるFab抗体フラグメント；免疫学的炎症反応を刺激するサイトカインおよび細胞成長因子；ホルモン；および多糖を包含する。これらは、内皮細胞レセプターと相互作用して、好中球が、血管を裏打ちしている活性化された内皮細胞に結合することを競合的に阻止し得る（Katre、Philips、Waldmann）。
【０００７】
他の小さなポリペプチドエフェクターは、血液中の標的細胞へのウイルス感染を阻止することに用いることが提案されている。例えば、CD4+糖ペプチドは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)がCD4+細胞に結合することを阻害するのに効果的である（Capon、Janeway）。
【０００８】
ポリミキシンＢ(polymyxinB)は、腎臓から迅速に排出される小さな塩基性のペプチドで、グラム陰性細菌のエンドトキシン、特にE.coli 0111:B4リポ多糖(LPS)と反応して中和することが知られている（Baldwin）。これは敗血症性ショック症候群の処置として非経口的に投与されることは稀である。なぜなら効果的な処置には高用量のポリミキシンＢが必要とされるからである。高用量は致死的となり得、腎毒性のため、進んだ段階の敗血症性ショックを処置することを困難にする。
【０００９】
ポリミキシンＢを用いる場合に観察される迅速な腎クリアランスの問題は、上記で議論されたような、疾病の非経口的治療に用いられている他の小ペプチドにも当てはまる。一般に、約50〜60kDより小さい循環タンパク質は、１〜２時間より短い寿命で腎臓により取り除かれる。
【００１０】
いくつかの場合では、ペプチドの分子量は、ポリエチレングリコール(polyethyleneglycol,PEG)のような生体適合性ポリマーを有するペプチドを誘導体化することにより限界値の50〜60kDより増大させ得る（例えば、米国特許第4,179,337号）。しかし、この方法(strategy)が、小さなエフェクター、例えば分子量が約５〜10kDより小さいエフェクター、にとって必ずしも効果的というわけではない。さらに、複数のPEG鎖を有するポリペプチドを誘導体化することは、ポリペプチドの活性を破壊または低減し、そして／またはポリペプチドの鍵となる活性部位を遮蔽し得る。
【００１１】
分子量の小さい薬理学的因子の採用時間を伸ばす別のアプローチとして、この因子は、選択された部位、例えば血流中または標的部分で粒子から薬剤を放出するために、リポソームのような巨大分子粒子にカプセル化され得る。小因子が粒子から放出されるまで、それは粒子自身の効果的な分子量および循環時間を有する。従来のリポソームの場合、細網内皮系（ＲＥＳ）による迅速な粒子の取り込みは肝臓のようなＲＥＳ組織への粒子の蓄積につながり、それはＲＥＳ組織からの因子の遅延放出メカニズムを提供し得る。
【００１２】
改善されたアプローチとして、血流中のリポソームの循環時間は、共有にかかる米国特許第５，０１３，５５６号（Ｗｏｏｄｌｅ）に記載されるように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような親水性ポリマーでリポソームを被覆することによって数倍い高められ得る。このポリマー被覆は、オプソニン（ｏｐｓｏｎｉｎ）のような血清タンパク質がリポソームに結合するのを低減することにより、特に、リポソーム表面の表面電荷および／または疎水性部位を血清タンパク質から保護することによって、循環時間を長くし得る。
【００１３】
抗体のような標的因子を、コーティングされたリポソームに付着させることのより、所望の標的部位にこのようなポリマー被覆リポソームの蓄積を高めることもまた提案されている（Ｋｌｉｂａｎｏｖ）。Ｋｌｉｂａｎｏｖは、抗体をリポソーム表面に直接付着させた場合、おそらくは立体障害によると思われる抗体結合の少しの損失は観察されるけれども、効果的なターゲッティングを示した。本明細書（ａｒｔｉｃｌｅ）はまた、抗体をポリマー重鎖の末端に付着させることも提案したが、このアプローチは、Ｋｌｉｂａｎｏｖ（ｐ．３２４）で議論されたような、リポソームを表面電荷および疎水性部位から保護することにおけるＰＥＧ鎖の提案されたメカニズムとは反対であるように思われる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の要旨
本発明は、一つの局面において、血流中で遊離の形態で循環する場合には薬理学的因子として効果的であるが、腎クリアランスによって血流から迅速に遊離の形態で除去されるポリペプチドまたは多糖のエフェクターでの被験体の処置における使用のためのリポソーム組成物を包含する。この方法は、ポリマー鎖の外層とその鎖の末端に共有結合しているエフェクターとを有するリポソームを含むリポソーム組成物の被験体への非経口的投与を包含する。好ましいポリマーは、約1,000ダルトンと10,000ダルトンとの間の鎖長の分子量を有するポリエチレングリコールである。
【００１５】
好ましいエフェクターは、以下を包含する：
(a)病原体に感染した被験体の処置に用いるための、血液循環病原体に対して特異的な抗体Fabフラグメント；
(b)ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に感染した被験体の処置に用いるためのCD4糖タンパク質；
(c)被験体の免疫応答の刺激に用いるための、サイトカインまたは細胞成長因子；
(d)炎症部位に好中球を補充して血管炎症を処置することに用いるための、内皮白血球接着分子(endothelialleukocyte adhesion molecule,ELAM)に結合するシアリルルイスx(sialyl Lewisx)のような単糖または多糖；
(e)被験体の免疫応答抑制を達成する処置のための、IL-1インヒビターまたはIL-1RA；
(f)敗血症性ショックの被験体を処置するための、ポリミキシンＢ、またはポリミキシンＢデカペプチド；
(g)ペプチドホルモン制御を受ける疾病を処置するための、ペプチドホルモン；および
(h)リガンド-レセプター細胞結合事象の阻止に用いるための、ペプチド。
【００１６】
一つの特定の実施態様では、本発明は、敗血症性ショックの被験体の処置におけるしようのためのリポソーム組成物を包含する。この実施形態では、リポソーム組成物は、ポリエチレングリコール鎖(PEG)の外層およびそのポリマー鎖の末端に付着したポリミキシンＢを含有する。
【００１７】
他の実態様では、このリポソーム組成物は、被検体の炎症の処置における使用のためのものである。この組成物は、親水性ポリマー鎖の外表層とその鎖の末端に共有結合しているシアリルルイスＸとを有するリポソームを含む。この親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidone）、ポリエチルオキサゾリン（polyethyloxazoline）、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド（polyhydroxypropylmethacrylamide）、ポリメタクリルアミド（polymethacrylamide）およびポリジメチルメタクリルアミド（polydimethylmethacrylamide）、ポリ乳酸（polylacticacid）、ポリグリコール酸（prlyglycolic acid）および誘導化されたセルロースであり得る。
【００１８】
本発明のこれらのおよび他の目的ならびに特徴は、以下の本発明の詳細な説明が添付の図面とともに読まれるならば、いっそう十分に明らかになる。
項目１．遊離形態で腎クリアランスにより血流から迅速に除去されるポリペプチドまたは多糖エフェクターでの被験体の処置方法であって、ここで、改善点として、
ポリエチレングリコール鎖の外表層および該鎖の末端と共有結合した該エフェクターを有するリポソームを含む、リポソーム組成物を該被験体に投与する工程を包含する、
方法。
項目２．前記ポリエチレングリコール鎖が約1,000ダルトンと10,000ダルトンとの間の分子量を有する、項目１に記載の方法。
項目３．前記エフェクターが以下：
(ａ)血流流中に存在する病原体に対して特異的な抗体Ｆabフラグメントであって、該病原体に感染している被験体の処置に用いるための抗体Fabフラグメント；
(ｂ)ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に感染している被験体の処置に用いるための、CD4糖タンパク質；
(ｃ)被験体の免疫応答の刺激に用いるための、サイトカインまたは細胞成長因子；
(ｄ)好中球補充および組織浸潤に関する炎症の処置に用いるための、内皮白血球接着分子(ELAM)に結合する多糖；
(ｅ)免疫応答抑制を達成するように被験体を処置するための、IL-1インヒビターまたはIL-1RA；
(ｆ)敗血症性ショックの被験体の処置のための、ポリミキシンＢまたはポリミキシンＢデカペプチド；
(ｇ)細胞成長を制御するように被験体を処置するための、ペプチドホルモン；および
(ｈ)リガンド-レセプター細胞結合事象を阻害するための、ペプチド
からなる群から選択される、項目２に記載の方法。
項目４．前記エフェクターがポリミキシンＢである、敗血症性ショックの被験体の処置に用いるための、項目３に記載の方法。
項目５．ポリペプチドまたは多糖エフェクターが腎クリアランスにより血流から迅速に除去されることを防ぐ用途のリポソーム組成物であって、該組成物は、リポソームを含み、その各々は、ポリエチレングリコール鎖の外表層を有しており、かつ該鎖の末端と共有結合しており、エフェクターが、以下：
(ａ)血流流中に存在する病原体に対して特異的な抗体Ｆabフラグメント；
(ｂ)CD4糖タンパク質；
(ｃ)サイトカイン；
(ｄ)内皮白血球接着分子(ELAM)に結合する多糖；
(ｅ)IL-1インヒビターまたはIL-1RA；
(ｆ)ポリミキシンＢ；
(ｇ)ペプチドホルモン；および
(ｈ)ペプチド
からなる群より選択される、リポソーム組成物。
項目６．前記ポリエチレングリコール鎖が約1,000ダルトンと10,000ダルトンとの間の分子量を有する、項目５に記載の方法。
項目７．被験体の敗血症性ショックの処置に用いるための、項目５に記載のリポソーム組成物であって、前記エフェクターが、ポリミキシンＢである、リポソーム組成物。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
I.  定義
指示のない限り、下記の用語は以下の意味を有する：
「小胞形成脂質(vesicle-forminglipid)」は、安定なミセルまたはリポソーム組成物の一部を形成し得るすべての脂質をいい、代表的には１つまたは２つの疎水性アシル炭化水素鎖またはステロイド基を含み、そしてアミン、酸、エステル、アルデヒド、またはアルコールのような化学的反応基をその頭部極性基の位置に含み得る。
【００２０】
「エフェクター」は、ポリペプチド、単糖または多糖、および糖ペプチドをいう。ポリペプチド、多糖、または糖ペプチドは、約50〜60kDまでの大きさを有し得る。
【００２１】
II.  エフェクター組成物
本発明は、一つの局面において、それ自身が遊離の形態をとって血流から迅速に腎クリアランスにより除去される小さなポリペプチドまたは多糖エフェクター分子による被験体の処置に用いるためのリポソーム組成物を包含する。この組成物は、親水性ポリマー鎖、例えばPEGで形成される外層を有するリポソームからなるリポソームキャリアを含む。エフェクターは、誘導体化された小胞形成脂質の一部のポリマーの末端に付着する。このエフェクターは、ポリマー鎖の末端に付着して、リガンド-レセプター結合対のメンバーとしての作用のようなエフェクターの生物学的活性を保護する。組成物の調製は、下記の一般的手順に従う。
【００２２】
Ａ．脂質成分
組成物のリポソームキャリアは、３つの一般的なタイプの小胞形成脂質成分からなる。第１のタイプは、リポソームの小胞構造の大部分を形成する小胞形成脂質を包含する。
【００２３】
一般に、これらの小胞形成脂質は、疎水性部分および頭部極性基部分を有するいかなる両親媒性脂質も含み、それらは、(a)リン脂質によって例証されているように、水中では自発的に二層小胞を形成し得るか、あるいは(b)脂質二層に安定に組み込まれており、その疎水性部分を内側に接触させ（二層膜の疎水性領域）、その頭部極性基部分を外側に向けている（膜の極性表面）。
【００２４】
このタイプの小胞形成脂質は、好ましくは２つの炭化水素鎖、代表的にはアシル鎖、および１つの頭部極性基を有する小胞形成脂質である。このクラスに含まれるのは、ホスファチジルコリン(PC)、PE、ホスファチジル酸(phosphatidic acid,PA)、ホスファチジルイノシトール(phosphatidylinositol,PI)、およびスフィンゴミエリン(sphingomyelin, SM)のようなリン脂質であり、ここでは２つの炭化水素鎖は、代表的には約14〜22個の炭素原子の長さであり、そして種々の不飽和度を有している。種々の飽和度を有する上記の脂質およびリン脂質は商業的に入手し得るかまたは公開されている方法により調製し得る。本発明に含まれ得るその他の脂質には、糖脂質およびコレステロールのようなステロールがある。
【００２５】
第２の一般的な成分は、組成物内でポリマー層を形成するポリマー鎖によって誘導体化される小胞形成脂質を含む。第２の一般的な小胞形成脂質成分として用いられ得るこの小胞形成脂質は、第１の一般的な小胞形成脂質成分に関して記載された全ての成分である。リン脂質のようなジアシル(diacyl)鎖を有する小胞形成脂質が好まれる。１つの例示的なリン脂質はホスファチジルエタノールアミン(phosphatidylethanolamine,PE)であり、これは、活性化されたポリマーとカップリングするのに都合がよい反応性のアミノ基を提供する。模範的なPEは、ジステアリルPE(distearylPE, DSPE)である。
【００２６】
誘導体化された脂質において好ましいポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG)であり、好ましくは、1,000〜10,000ダルトンとの間、より好ましくは2,000ダルトンと5,000ダルトンとの間の分子量を有するPEG鎖である。適切であり得るその他の親水性ポリマーは、ポリビニルピロリドン(polyvinylpyrrolidone)、ポリメチルオキサゾリン(polymethyloxazoline)、ポリエチルオキサゾリン(polyethyloxazoline)、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド(polyhydroxypropylmethacrylamide)、ポリメタクリルアミド(polymethacrylamide)およびポリジメチルアクリルアミド(polydimethylacrylamide)、ポリ乳酸(polylacticacid)、ポリグリコール酸(polyglycolic acid)、ならびに、ヒドロキシメチルセルロース(hydroxymethylcellulose)またはヒドロキシエチルセルロース(hydroxyethylcellulose)のような誘導体化されたセルロースを含む。
【００２７】
さらに、これらのポリマーの阻止コポリマーまたはランダムコポリマー、特にPEGセグメントを含んでいるもの、が適切であり得る。PEGのような親水性ポリマーによって誘導体化される脂質を調製する方法は、例えば、共有の米国特許第5,013,556号に記載されているように、周知である。
【００２８】
第３の一般的な小胞形成脂質成分は、脂質アンカーであり、それによってアンカー内のポリマー鎖を介してエフェクターがリポソームに固定される。さらに、エフェクターの生物学的活性が失われないように、エフェクターはそのような方法でポリマー鎖の末端に位置する。脂質アンカーは、リポソーム二重層の外層表面の脂質の固定を提供する疎水性部分、ポリマーの内側の末端によって共有結合される頭部極性基、およびエフェクターへの共有結合のために活性化されるまたはされ得る遊離の（外側の）ポリマー末端を有する。このタイプの脂質アンカー分子を調製する方法を、下記で述べる。
【００２９】
Ｂ．リポソーム調製
リポソームは、Szokaら、1980に詳細に述べられているように種々の技法により調製され得る。多重ラメラ小胞(MLV)は、単一脂質フィルム水和技術により形成され得る。この手順では、上記に詳細に述べられているタイプのリポソーム形成脂質混合物を適切な有機溶媒に溶解して容器の中で蒸発させ、薄いフィルムを形成させる。これは後で水性の媒質によって覆われる。脂質フィルムを水和してMLVを形成し、代表的にはそれらの大きさは約0.1〜10ミクロンの間である。
【００３０】
リポソーム形成に用いられる脂質成分は、好ましくはそのモル比が約70〜90％の小胞形成脂質、１〜25％のポリマー誘導体化脂質、および0.1〜５％の脂質アンカーである。一つの模範的な処方は、50〜70モル％の非誘導体化PE、20〜40モル％のコレステロール、エフェクターカップリングのためにその遊離末端に化学反応基を有するPE-PEG(3500)ポリマー0.1〜１モル％、PEG3500ポリマー鎖で誘導体化されたPE５〜10モル％、および１モル％のα−トコフェロール(α-tocopherol)を含む。好ましくはリポソームは、選択した範囲の大きさ、代表的には約0.03〜0.5ミクロンの間の実質的に均一な大きさを有するように調製される。REVおよびMLVを効果的に大きさで分類する方法は、0.03〜0.2ミクロンの範囲の選択された一様な細孔サイズ、代表的には0.05、0.08、0.1、または0.2ミクロン、を有する一連のポリカーボネート膜からリポソームの水性懸濁液を押し出すことを包含する。膜の細孔サイズは、特にこの調製物が同じ膜を２度以上通される場合、その膜から押し出されることによって生成されるリポソームの最大サイズにほぼ相当する。均質化方法もまた、リポソームの大きさを100nm以下にまで小さくするためには有用である(Martin)。
【００３１】
Ｃ．エフェクター成分
組成物中のエフェクターは、遊離の形態で静脈投与された場合の血流からの迅速な（代表的には１〜２時間内の）クリアランスによって特徴づけられる治療用ポリペプチド、単糖または多糖、あるいは糖ペプチドである。以下に本発明に用いる好ましいエフェクターを記載する。
【００３２】
１．Ｆabフラグメント。Ｆabフラグメントは、与えられた病原体に対する中和活性を有するフラグメントである。この組成物は、種々の選択された病原体抗原の一つに対して体液性免疫を提供するのに効果的な受動ワクチンとして用いられる。
【００３３】
中和抗体のＦabフラグメントは、従来の方法(Harlow)によって調製され得る。このフラグメントは好ましくはヒト化(humanized)モノクローナル抗体(Mab)由来である。このような抗体は、公開された組換えDNA法(Larrick)により調製され得る。この抗体は、好ましくは上記のようにスルフヒドリル結合を介してリポソームの親水性ポリマー基にカップリングされる。
【００３４】
２．CD4糖タンパク質エフェクター。CD4糖ペプチドは、CD4+Ｔ細胞のCD4レセプター領域である(Capon)。このエフェクターは、gp120が媒介するHIVのCD4レセプターへの結合を阻止することにより、CD4+Ｔ細胞にHIVが感染することを阻止するように働く。このエフェクターは既知の組換え法(Maniatis)により生成され得る。
【００３５】
３．サイトカイン。下記の表１に示されるサイトカインは本発明に有用なサイトカインの例である。このサイトカインは、公開された手順に従って組換え生成方法により入手され得る。個々のサイトカインの治療的用途は文献に記載されている（例えば、Abbas参照）。いくつかのサイトカインエフェクターは、弱い免疫原性応答または弱い殺菌性応答(microbicidalresponse)を高めるために、短期間を基礎として投与される。このエフェクターはガンまたはAIDSの治療処置の一部として、長期間を基礎として投与され得る(Waldmann)。
【００３６】
【表１】
2005097320.tif 000005
【００３７】
４．ELAM-1結合インヒビター。炎症は、ポリペプチド、即ち内皮白血球接着分子-1(ELAM-1)、を炎症部位に近接した血管の内皮細胞表面上で発現させる。次にELAM-1は、好中球表面上で多糖部分、即ちシアリルルイスxを認識して結合し、そして好中球を炎症部位に補充する。ELAM-1による好中球の認識および結合を妨げることにより、再灌流損傷(reperfusioninjury)、敗血症性ショック、慢性炎症疾患のような状態のような過剰な炎症反応が避けられ得る。
【００３８】
この実施態様では、エフェクターは、ELAM-1により認識される四糖、即ちシアリルルイスxであり(Phillips)、血流中で炎症部位に過剰の好中球を補充することを妨げる治療に用いられる。エフェクターは、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞のグリコシル化変異体によって産生され、そして培養細胞から精製形態で入手され得る(Phillips)。あるいは、このエフェクターは、化学的および／または酵素的合成により生成される(Borman、Ichikawa)。
【００３９】
５．IL-1活性のインヒビター。この実施態様におけるエフェクターは、IL-1インヒビター、またはIL-1レセプターアンタゴニスト(IL1RA)であり、IL-1がリンパ球細胞表面上のレセプターに結合するのを阻止する(Stylianou)。
【００４０】
IL-1産生は、敗血症性ショックを引き起こす内毒素および毒性ショック症候群を引き起こす外毒素の両方によって刺激される(Dinarello)。敗血症性ショックまたは毒性ショックの間のIL-1産生は、患者に観察される臨床的症状を悪化させ得る。従って、毒性ショックまたは敗血症性ショックのどちらかに関係した臨床的症状を緩和させるためにIL-1インヒビターエフェクターを用いることは有益であり得る。
【００４１】
IL-1インヒビターは、52〜66Kdのポリペプチドであり、IL-1に特異的に結合してその免疫刺激応答を阻害する。IL1RAは、23〜25KDのポリペプチドであり、IL-1のその細胞表面レセプターへの結合と競合してIL-1の免疫刺激応答を阻害する。
【００４２】
６．ポリミキシンＢ。このエフェクターは、疎水性部分（６−メチルオクタノイル、(6-methyloctanoyl)）および短い塩基性デカペプチド部分を有する陽イオン界面活性剤である。ポリミキシンＢは、グラム陰性細菌の内毒素、特にE.coli0111:B4リポ糖(liposaccharide,LPS)と反応し、中和する(Baldwin)。ポリミキシンＢは、グラム陰性細菌の感染の治療に用いられる。ポリミキシンＢは、血流から迅速に浄化されるため頻繁にしかも高用量で投与されなければならないので、重篤な回復不能の腎臓障害を引き起こす。ポリミキシンＢは、化学的に合成され得るか、またはBacilluspolymyxaのような胞子形成グラム陰性桿菌から単離され得る。
【００４３】
あるいは、このエフェクターは、Limulus polyphemusの遊走細胞から単離された11.8kDのペプチド、即ちlimulus抗リポ多糖因子(LALF)である。LALFは、meningococcalリポオリゴ糖およびその他のグラム陰性内毒素を中和し、そしてグラム陰性敗血症を処置するために用いられ得る(Wainwright)。
【００４４】
７．ペプチドホルモン。このエフェクターは、種々の疾患の処置に用いられ得る。一つの実施態様においては、このエフェクターは、84アミノ酸長を有し、骨芽細胞分裂を阻害し得る副甲状腺ホルモン(PTH)である。いくつかの骨のガンは、制御されていない骨芽細胞分裂により特徴づけられる(Kano)。あるいは、このペプチドホルモンは、特定のペプチドホルモンに対するレセプターを含む細胞をリポソームの標的とするために用いられ得る。
【００４５】
８．ペプチド。多くの病状は、リガンド特異的細胞結合事象を包含し、ここでは、分子がリガンドを介して細胞表面に接着する。例えば、リガンドラミニンは、悪性細胞の基底膜への結合、即ち転移性の腫瘍の形成の初期段階を媒介する。Pseudomonasのようないくつかの細菌の宿主上皮細胞への付着は、ウイルス粒子の宿主細胞への結合のように、リガンド結合事象により媒介される。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)による細胞の感染もまた感染プロセスの一部として特異的細胞結合事象を必要とする。これらのプロセスにおける細胞結合事象は、特異的であり、従って、多くの場合、レセプター部位に対してリガンドと競合する小ペプチドに細胞を曝すことにより細胞結合事象を阻害することが可能である。細胞結合事象の阻害は、潜在的に感染プロセスを阻止する結果となる。
【００４６】
この実施態様においては、エフェクターは、リガンド−レセプター細胞結合事象を阻止するのに有効なペプチドである。このペプチドは、Ｔ細胞へのウイルス−粒子付着を阻害することにより、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)による感染を阻害するのに効果的なペプチドであり得る。ここで、このペプチドは、次のアミノ酸組成物の一つである（図１３）：配列番号１(Nehete)；配列番号２(Nehete)；配列番号３(Nehete)；配列番号４(Nehete)；または配列番号５(Nehete)。
【００４７】
このペプチドは、遊離の腫瘍細胞が基底膜細胞に結合するのを阻害することにより腫瘍の転移を遅らせるのに効果的であり得る。ここで、このペプチドは、次のアミノ酸配列の一つである：配列番号６(Iwamoto)；配列番号７(Iwamoto)；配列番号８(Humphries)；配列番号９(Iwamoto)；または配列番号10(Kawasaki)。
【００４８】
上皮細胞に細菌が付着するのを阻害する（例えば、Sastry、Lee）ことによって、Pseudomonas感染を阻害するのに有用なペプチドのような、その他の結合関連ペプチドは、用いられ得る。
【００４９】
Ｄ．リポソームキャリアへのエフェクターの付着
エフェクターのリポソームキャリアへの付着のために、エフェクターのカップリング前に、脂質アンカーの遊離ポリマー端部が活性化される。以下の特定の実施例において、脂質アンカー形成反応および活性化反応の両方が記載される。この反応は、遊離の脂質、即ちジステアリルホスファチジルエタノールアミン(distearylphosphatidylethanolamine, DSPE)に関して示される。次いで、活性化された脂質アンカーは、上記のように、リポソームキャリアに組み込まれる。
【００５０】
リポソーム形成前に、脂質アンカーのPEG末端基を活性化する利点は、より広い範囲の反応溶媒および反応条件が用いられ得ることである。しかも、リポソーム自身は、活性化試薬に曝されない。従って、リポソームから試薬の混入を除く必要が排除される。
【００５１】
脂質アンカーがリポソームキャリアに組み込まれた後に活性化反応が行われ得ることもまた評価される。いくつかのカップリング反応においては、予備形成(preformed)されたリポソーム上の末端PEG基を活性化することがより所望され得る。このアプローチの１つの利点は、活性化反応が、外側の、表面接近性(surface-accessible)脂質に制限され、従って、活性化された基が、治療にその組成物を用いる前に完全にクエンチされ得ることである。このアプローチはまた、活性化されたPEG末端が水中では不安定である反応にも好ましい。
【００５２】
図１は、PEG鎖で誘導体化されそして鎖の遊離端部に活性化された化学基を有するDSPEの合成を示す。始めに、PEGビス（アミン）（化合物I）は、２−ニトロベンゼンスルホニルクロライド(2-nitrobenzenesulfonyl chloride)と反応してモノプロテクトされた生成物（化合物II）を生じる。化合物IIはトリエチルアミン(triethylamine,TEA)中でカルボニルジイミダゾール(carbonyl diimidazole)と反応してモノ２−ニトロベンゼン−スルホンアミドのイミダゾールカルバメート（化合物III）を形成する。
【００５３】
化合物IIIは、TEA中でDSPEと反応して一方の端部が２−ニトロベンジルスルホニルクロライド(2-nitrobenzylsulfonyl chloride)で保護された誘導体化されたPE脂質を形成する。保護基は酸処理により除去され、PEG鎖上に末端アミンを有するDSPE-PEG生成物（化合物IX）を得る。無水マレイン酸との反応により対応するマレアミン生成物（化合物V）を得、それにより、無水酢酸との反応で所望のPE-PEGマレイミド生成物（化合物VI）が得られる。反応の詳細は実施例１に示す。
【００５４】
この化合物はスルフヒドリル基と反応性であり、図８に示すように、ポリペプチドをチオエーテル結合を介してカップリングする。
【００５５】
図２は、スルフヒドリル含有ポリペプチドを誘導体化された脂質のポリマー末端にカップリングするのに有用な別の誘導体化された脂質を示す。ここでは、上記からのPE-PEG（化合物IV）は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionamide)（化合物VII）を用いて処理されアンカー脂質PE-PEG（化合物VIII）を形成する。この化合物は、ペプチドのスルフヒドリル基と反応して、図９に示すように、ペプチドをジスルフィド結合を介して脂質とカップリングさせ得る。
【００５６】
保護されたポリアルキルエーテル(polyalkylether)を脂質アミンにカップリングする他の反応方法は、図３に示される。この反応スキームでは、図５の最上部に示すように、PEG（化合物IX）は、始めにトリメチルシラン(trimethylsilane)基によってその１つの末端OHの場所で保護される。保護されたPEG（化合物X）はトリフルオロメチルスルホネート(trifluoromethylsulfonate)の無水物と反応して、トリフルオロメチルスルホネートを有する遊離のPEG末端を活性化する（化合物XI）。トリエチルアミン存在下での活性化された化合物と脂質アミン（例えば、PE）との反応、および酸処理によるトリメチルシリル(trimethylsilyl)保護基の解離は、末端アルコール基を含むPE-PEG誘導体（化合物XII）を与える。この末端アルコール基は、ジメチルスルホキシド（dimethylsulfoxide,DMSO）および無水酢酸存在下で酸化され末端OHをアルデヒド基に変換する（化合物XIII）。このアルデヒド基は、図１０に示されるように、還元的アミノ化を介してペプチドにカップリングされ得る。反応の詳細は実施例２に示される。
【００５７】
より一般的には、誘導体化された脂質成分は、ペプチド結合、エステル結合、またはジスルフィド結合のような脂質−ポリマー結合を含むように調製され、それらの結合は、ペプチダーゼまたはエステラーゼ酵素、またはグルタチオンのような還元剤が細胞内に存在するというような選択された物理的条件下で開裂され得る。
【００５８】
エフェクター分子にカップリングするのに適したPEGの脂質誘導体の調製のための別の一般的な方法は、出発物質として（化合物XIVのような）PEGのω−アミノカルボン酸(omega-aminocarboxylic acid)を含み、図４および５に示される。そのようなヘテロ二官能性PEG誘導体の調製方法は、Zalipskyら(1986;1990)によって記載されている。図４の反応スキームにおいて、PEGのω−アミノカルボン酸（Zalipskyら、1986）を、マレイミドプロピオネートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（maleimidopropionate N-hydroxysuccinimide ester, MPS、Pierce）と、過剰のMPSを用いて反応させる。次いで、得られたマレイミド−PEG（化合物XV）のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(N-hydroxysuccinimide)の存在下で、PEのような脂質アミンと反応させ、アミド結合を介してPEGを脂質に結合させる（化合物XVI）。ポリマーの「遊離の」末端にあるマレイミド基は、チオール含有リガンド、例えば免疫グロブリンおよびそれらのフラグメントのようなタンパク質と反応性である。
【００５９】
関連するスキームが図５に示され、それは、PEGのω−アミンカルボン酸（化合物XIV）とブロモアセチルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(bromoacetylN-hydroxysuccinimide ester)とを反応させることによって、PEGカルボン酸上の末端ブロモアセトアミド基の初期形成を示す（化合物XVII）。このPEGは、次いで、PEのような適切な脂質アミンと上記のようにカップリングされ、誘導体化された脂質を形成する（化合物XVIII）。このブロモアセトアミド基は、マレイミド基よりいっそう選択的であり、いっそう安定である。このブロモアセトアミド基は、リポソーム形成および負荷(loading)に用いられる方法においてより一層フレキシビリティーを持たせる。
【００６０】
図６に示される反応スキームは、フリーのPEG末端がOH基（ωOH基）である誘導体化された脂質の調製に関する。図６に示される反応において、PEGのω−ヒドロキシカルボン酸（化合物XIX）（Zalipsky、1990）は、メタノールによってエステル化され、末端の酸基を保護する（化合物XX）。末端ヒドロキシル基は、次いで、例えば、スクシンイミジルカーボネート(succinimidylcarbonate, SC)誘導体のような第１級アミンと反応性の官能基に変換される（Zalipsky、1992a）（化合物XXI）。この化合物は、化合物XXがホスゲン(phosgene)と反応し、次いでＮ−ヒドロキシスクシンイミド(N-hydroxysuccinimide)と反応することにより形成される（Zalipsky、1992b）。得られたSC-PEG-CO2-Me(XXI)は、DSPEのような脂質アミンと反応してDSPE-PEG-CO2-Me(化合物XXII)を形成する。このメチルエステルは、すっかりヒドラジン化され、示されるようにPE-PEG-CO-N2H3(化合物XXIII)を生じる。このヒドラジド含有PEG脂質は、従来の方法によりリポソームに組み込まれる。このヒドラジド基は、エフェクター分子を含有するアルデヒドまたはケトンの付着に用いられ得る。
【００６１】
このようなカルボニル基は、例えばオリゴ糖、ヌクレオチド、低分子量グリコシド、レクチン、免疫グロブリン、および他の糖タンパク質のような多くの炭水化物含有分子上に、化学的反応（過ヨウ素酸酸化）または酵素的反応（ガラクトースオキシダーゼ(galactose oxidase)）によって、存在するかまたは容易に生成され得る。形成された結合、即ち、ヒドラゾン(hydrazone)は、ｐＨ≧7.5で適度に安定であるが、より低いｐＨ値では酸触媒による加水分解により開裂し得る。これらの結合は、例えばナトリウムシアノボロハイドライド(sodiumcyanoborohydride)を用いて、還元により安定化され得る。このアプローチの利点は、ヒドラジド基の安定性である。この安定性により、リポソーム処方物および負荷プロトコルに広範に使用され得る。
【００６２】
あるいは、図７Ａに示されるように、PEGのω−ヒドロキシカルボン酸（化合物XIX）は、PE誘導体のアミノ基との反応に用いられ得、始めにアミン脂質、例えばDSPEとカップリングし、誘導体化された脂質（化合物XXIV）を形成し得る。この結合体の末端OH基は、例えば、ジスクシンイミジルカーボネート(disuccinimidylcarbonate, DSC)によって活性化され得、種々のアミノ基含有化合物と選択的に反応させるためにSC-PEG-DSPE（化合物XXV）を形成する。化学反応は、実施例４に記載される。これらのアミノ基含有化合物はまた、少なくとも１つの他の官能基を有し、その官能基には多くのエフェクター分子が付着され得る。エフェクター分子の付着は、リポソーム形成の前または後に起こり得る。
【００６３】
一つの場合、図７Ｂに示すように、SC-PEG-DSPEは、２−アミノエタンジチオピリジン(2-aminoethanedithiopyridine)と反応する。この形成された誘導体（化合物XXVI）は、２つの方法で用いられる。ジチオピリジン(dithiopyridine)基は、チオール含有分子に対して反応性であり、それは種々の条件において非常に安定である。例えばβ−メルカプトエタノール(β-mercaptoethanol)のような緩和な還元剤を用いるならば、リポソーム上のジチオピリジン基を遊離のチオールに変換することが可能であり、次いで、アルキル化しているマレイミドまたはブロモアセテート(bromoacetate)基、またはジチオピリジンのような反応性の混合ジスルフィド基を含有するリガンドを含む種々の結合手順において用いられ得る。
【００６４】
図７Ｃに示す反応において、SC-PEG-DSPEは、アミノプロパンジオール(aminopropanediol)と反応し、ジオールで末端化されたPEG-脂質（化合物XXVII）を生成する。リポソームへの組み込みの後、このジオールは緩和な条件（[IO4-]≦10mM、４℃）下で過ヨウ素酸塩(periodate)により酸化され得、反応性のアルデヒドを提供する。このアルデヒド含有PEG-リポソームは、ナトリウムシアノボロハイドライド存在下で、不可逆的に種々のアミノ含有エフェクター分子と反応する。
【００６５】
図７Ｄに示す反応において、SC-PEG-DSPEは、ガラクトサミン(galactosamine)とカップリングする。誘導体化された脂質上のガラクトース残基（化合物XXVIII）は、次いで、ガラクトースオキシダーゼによって酵素学的に酸化され得る。このプロセスにより得られるアルデヒド保有PEG-リポソームは、アミノ基含有エフェクター分子との結合のために用いられ得る。反応条件の緩やかさに加え、アルデヒド基はリポソームの外表面上でのみ生成される。
【００６６】
さらに、酸化されたガラクトース残基は、免疫系の刺激、特にＴ細胞活性化に有用であるという証拠がある。表面上に酸化されたガラクトース残基を有するリポソームは、アジュバントとして作用すると考えられ、そしてワクチン中で有用で有り得る（Zheng）。
【００６７】
図８に示され、実施例５に記載されている別の手順では、DSPE-PEG-ヒドラジドが調製される。始めにPEGはトリエチルアミン存在下でエチルイソシアネートアセテート(ethylisocyanatoacetate)と反応し、PEGのモノおよびジカルボキシル化種を生成する。モノカルボキシル化種はDEAE-Sephadex上でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製される（化合物XXIX、化合物XIXと同じ）。化合物XXIXは第３級ブチルカルバゼート(tert-butylcarbazate)と反応してPEGのヒドロキシBoc-ヒドラジド誘導体（化合物XXX）を生成する。遊離のヒドロキシル基はジスクシンイミジルカーボネートとの反応によって活性化され、DSPEと反応する前に末端ヒドロキシル基を活性化させ（化合物XXXI）、生成物（化合物XXXII）を生じる。化合物XXXIIは、ジオキサン(dioxane)中の4MHClにより脱保護され、遊離のヒドラジド基を曝すことになる。脂質−PEG−ヒドラジドは、リポソームに組み込まれる。これらのヒドラジド基は、アルデヒドに対して反応性であり、上記のように、生物学的に適切な多くの化合物上で生成され得る。
【００６８】
記載したばかりのこの方法は、PE、コレステリルアミン(cholesteryl amine)、および糖アミン基を有する糖脂質を含む種々の脂質アミンに適用され得る。記載したばかりのそれらの方法に加えて、種々の別のカップリング反応が、タンパク質カップリング反応において活性化されるかまたは反応性である末端基を有する、PEGのような親水性ポリマーによって誘導体化される小胞形成脂質の調製に適している。
【００６９】
１．マレイミドカップリング。マレイミドは広く用いられているタンパク質改変試薬であり、マレイミドがヘテロ二官能性架橋試薬中の２つの官能基の内の１つである場合は特に有用である。マレイミドとスルフヒドリル基との反応は、メルカプタン(mercaptane)基の活性化された二重結合へのマイケル付加を含む。アミノ基との反応は同じメカニズムによって起こるが、その確率は非常に低い。メルカプタンは、特に中性ｐＨでは最も反応性の種なので、マレイミド基は少数のスルフヒドリル基を標的にするために用いられ得、通常は良好な選択性が達成される。
【００７０】
１つの好ましい実施態様においては、PE-PEGのような誘導体化された脂質は、上記の図１および図４に示すように、末端マレイミド基によって形成される（化合物VIおよびXVI）。リポソームに組み込まれた後のこの脂質は、次いで、スルフヒドリル含有エフェクター（代表的にはポリペプチド）と、適切なカップリング条件下で反応する。このマレイミド脂質（化合物VIまたはXVI）とペプチドのスルフヒドリル基との反応は図９に示される。示されるように、この反応はタンパク質をチオエーテル結合を介して脂質ポリマーにカップリングさせ、誘導体化されたPE（化合物XXXIII）を与える。タンパク質をリポソームにカップリングさせる反応の使用は、実施例６に記載される。
【００７１】
この実施例では、PE-PEG3500の存在下または非存在下で、マレイミドカップリング剤を含むリポソームにβ−ガラクトシダーゼをカップリングさせる効率が比較される。この反応は、マレイミドカップリング剤として、(a)スクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート(succinimidyl4-(p-maleimidophenyl)butyrate, MPB)のDSPE誘導体、(b)N-(11-マレイミド−ウンデカノイル)(N-(11-maleimido-undecanoyl),C11）のDSPE誘導体、または(c)PE-PEG3500のマレイミドのいずれかを含むように調製されたリポソームを用いて行われる。
【００７２】
(a)〜(c)に関して上記に記載したように行われたカップリング反応の後、リポソーム結合酵素の量が定量された。リポソームの回収率をシンチレーションカウンターで測定し、そしてタンパク質の回収率をβ−ガラクトシダーゼアッセイおよびタンパク質量の直接定量により測定した。
【００７３】
PEG3500のDSPEカルバミドのマレイミドは、β−ガラクトシダーゼがリポソームに架橋するのに、PE-PEG3500鎖が存在してもしなくても、非常に効果的であった。表２に見られるように、２つの別々の実験においては、どちらのタイプのリポソームに架橋されたタンパク質の量も本質的に違いがなかった。さらに、PE-PEGマレイミドにカップリングされたタンパク質の量はMPBマレイミドまたはMPB-C11マレイミドのいずれにカップリングされた量よりもかなり高かった。リポソーム中に「活性化されていない」PE-PEG3500が存在することは、タンパク質とPE-PEG-マレイミドリポソームとのカップリングのレベルにほとんど影響しないが、MPB脂質またはMPB-C11脂質のいずれかを含有するリポソームへのタンパク質カップリングレベルを阻害した。
【００７４】
【表２】
2005097320.tif 000006
【００７５】
２．3-(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミド(3-(2-pyridyldithio)propionamide)によるカップリング。ジチオプロピオンアミド(dithiopropionamide)とスルフヒドリル基との反応はジスルフィド結合を介したスルフヒドリル含有分子へのカップリングを生じる。ジスルフィド交換は、非還元的環境においては、pH８で容易に起きる。この方法は、ペプチド内のチオール基と、PE-PEG(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミドを含むように調製されたリポソームとの反応を含む。この反応は、図１０に示すように、タンパク質をジスルフィド結合を介してリポソームにカップリングさせる（化合物XXXIV）。
【００７６】
３．還元的アミノ化。この方法では、PEG鎖の末端ヒドロキシル基は、その一端はPEに共有結合しており、緩やかな酸化によりアルデヒドに変換される。この酸化工程は、リポソームへの組み込みの前または後に行われ、誘導体化された脂質のアルデヒド型を生じる（化合物XIII、図３）。アルデヒドとエフェクター分子のアミン基との反応は、シフ塩基（化合物XXXV）を与え、それは次いでアミン基が結合したペプチドを有する所望の誘導体化された脂質に還元される(XXXVI)。
【００７７】
上記で示したように、このポリマーはまた、予備形成された脂質内で、即ち、既にリポソームに組み込まれているポリマー誘導体化脂質と、カップリングしているエフェクターのために活性化され得る。このアプローチの一つの利点は、リポソーム外表面上のポリマー部分のみが活性化されるということである。一つの一般的なアプローチでは、PEGポリマーを包含し、末端OH基は、最初に過ヨウ素酸ナトリウムによって暗所で20℃で２時間処理されることにより酸化される。酸化の後、過剰な試薬が除去され、そしてリポソームはエフェクター分子、例えば、Fabフラグメント、と共に２Mナトリウムシアノボロハイドライド存在下(10μl/ml)で20℃で14時間インキュベートされる。インキュベーションが終了した後、リポソームはSepharoseのクロマトグラフィーにかけられ、遊離の（結合していない）エフェクター分子が除去される。
【００７８】
III．末端官能化PEG-DSPEを含有するリポソームの血流および組織保持
末端官能化PEG-DSPEを含有するリポソームの血流および組織保持を決定するために、インビボでの研究が行われた。末端官能化PEG-DSPEは、種々の化合物をリポソームに付着させるために用いられ得る化学活性基を含有する。これらの研究から、末端官能化は、PEG-DSPE、モノメトキシPEG-DSPE、または他の同様に改変された小胞形成脂質を含有するリポソームの血流における寿命の長さに影響しないことが決定された。
【００７９】
本発明に基づいて行われた実験において、ヒドラジドにより末端官能化されたPEG-DSPEを含有するリポソームを調製した。PEG鎖の末端のヒドラジド基は、他の官能基の導入のために用いられ得るか、または多数のタイプの結合スキーム(Inman)において用いられ得る。特に有用なのは、イムノグロブリン(Wilchek)のような種々の糖タンパク質の分子をリポソームに付着させるための、これらの分子に対するヒドラジド反応基である。
【００８０】
ガリウム67標識したヒドラジド末端官能化PEGリポソームを約10〜20μMリン脂質/kg体重でラットの尾静脈に注射した。血液試料を所定の時間で後眼窩(retroobital)採血により得た。血流中に残存するガリウム標識リポソームのパーセントを0、15分、1、3、5、および24時間で決定し、そして表３に示す。注射したガリウム67標識リポソーム用量の異なった時間で血流中に残留するパーセントを図１２に時間に対する半対数プロット(halflog plot)で示す。
【００８１】
24時間後、動物を屠殺し、そして組織を標識定量のために取り出した。24時間での選択された組織に見られる注射用量のパーセントを表３に示す。
【００８２】
２つの異なった脂質組成物を有するGa標識ヒドラジド末端官能化リポソームの血液および組織保持もまた表３で比較した。流動性リポソーム組成物を部分水素化卵ホスファチジルコリン(HPEPC)から調製した。典型的なリポソーム組成物はヒドラジドPEG-DSPE脂質、部分水素化卵PC(PHEPC)、およびコレステロールを約0.15：1.85：１の脂質：脂質：脂質のモル比で含有する。硬化性リポソーム組成物を同じmol比でPHEPCを水素化血清ホスファチジルコリン(HSPC)に換えて調製した。
【００８３】
表３に示されるように、リポソーム組成物の流動性はリポソームの血液保持時間に影響しない。しかし、リポソーム組成物の流動性は末端官能化リポソームの組織分布に影響するようである。例えば、硬化性リポソームは肝臓(live)、脾臓、および骨組織により優先的に保持される。流動性リポソームは腎臓、心臓、皮膚、および筋組織により好ましくは保持される。
【００８４】
【表３】
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【００８５】
IV．治療用エフェクター組成物  
以下に本発明のエフェクター組成物の特異的な実施態様および注射可能な治療剤として意図した使用を記載する。
【００８６】
Ａ．免疫応答増強のための組成物
１つの一般的な実施態様では、リポソーム組成物中のエフェクターは、非経口投与された場合、免疫応答増強可能な分子である。
【００８７】
１．Ｆabエフェクター。Ｆabエフェクター組成物は種々の選択された病原性抗原の１つに対して体液性免疫を提供する受動ワクチンとして用いられる。組成物は、与えられた抗原への弱められた免疫応答を補うために投与される。
【００８８】
ワクチンエフェクター組成物は、選択された病原体に曝された直後に、または曝されることが予期される直前に静脈内に投与される。組成物は、好ましくは、約0.1〜2mg抗体/kg体重の間に相当する量を注射され得る。静脈内(IV)投与後、組成物は、有効濃度で１〜２日間血流中を循環する。
【００８９】
２．CD4糖タンパク質エフェクター。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染および後天性免疫不全症候群(AIDS)の予防および処置に関する多くの治療法が提案されている。これらの治療は、ウイルス感染のプロセスの種々の工程を標的とする。頻繁に、治療は、AZTおよびDDIのような、ウイルス複製を妨げる薬物の投与を包含する。正常な細胞の複製プロセスもまた影響されるので、これらの薬物の投与は毒性の副作用をともなう。
【００９０】
治療法で標的にされるウイルス感染のプロセスでの他の工程は、細胞へのウイルス付着である。HIVはCD4＋Ｔ細胞のCD4レセプターに特異的に結合する。未だ十分には理解されていないメカニズムによって、CD4＋細胞は結局HIVにより感染され得る。可溶性CD4レセプターポリペプチドが、患者のCD4＋Ｔ細胞集団のさらなるHIV感染を防ぐために、HIV感染患者に静脈内に投与されてきた。これまで、CD4レセプターフラグメントは血流中の循環から迅速に取り除かれ、そして抑制性血漿濃度は維持され得ないので(Capon)、この治療法は効果的ではなかった。
【００９１】
この実施態様でのエフェクター分子はヒト免疫不全ウイルス(HIV)のgp120糖タンパク質に結合可能な可溶性CD4レセプターポリペプチドであり、HIVのCD4＋Ｔ細胞への結合を阻害する。好ましい実施態様では、CD4の共有結合は、ヒドラジド基含有リポソームと過ヨウ素酸酸化CD4とをカップリングすることにより完成する。
【００９２】
長循環リポソーム組成物として投与したCD4は血流でより長い時間残存し得る。CD4エフェクター組成物は、HIV感染の初期または後期の間に、AIDS治療で用いられるその他の薬物との組み合わせで最も有益に静脈内に投与される。これは、リポソームに結合したHIV粒子が、これらが感染可能な細胞により取り上げられる程度で、感染細胞へ用量の抗ウイルス剤を送達し得る。AZTおよびDDIは、リポソーム組成物中にカプセル化され得る抗HIV薬の例である。
【００９３】
リポソーム組成物は、１〜10μMの有効血流CD4濃度に等しい用量で静脈内に投与され得る。5〜40mg CD4/kg体重の用量が、典型的には処置の間2〜14日の間隔で、標準的なアッセイ法により処置の間モニターされる血流中に存在するHIVのレベルで投与され得る。
【００９４】
この組成物の主な利点は、血流中のCD4エフェクターの循環時間の増加およびリポソーム表面上のエフェクターの多価の提示である。多価のCD4提示の改良親和性が最近記載されている(Chen)。上記のとおり、CD4レセプターフラグメントは腎臓濾過により迅速に取り除かれる。リポソームキャリアへのCD4ポリペプチドの共有結合は、腎クリアランスを防ぎ、そして血流中での24〜48時間のポリペプチドエフェクター組成物の循環を可能にする。
【００９５】
さらに、多価のCD4を有しているリポソームは、CD4糖タンパク質がＴ細胞リンパ球の表面を模倣する疎水性表面に存在する点でCD4＋Ｔ細胞リンパ球に似ている。この提示は、健常なCD4＋リンパ球が侵されないように、HIV粒子およびgp120発現HIV感染細胞を結合するおとりとして働くと考えられる。
【００９６】
３．炎症性免疫応答を刺激するエフェクター。いくつかの医学的状態は、身体の天然免疫応答の刺激により間接的に処置される。このような状態は、AIDS、慢性感染、および特定のタイプの癌のような免疫不全症を包含し得る。１つの免疫刺激治療は、種々の様式でＢ細胞およびＴ細胞の免疫応答を刺激するために働き得るサイトカインの静脈内注射を包含する。
【００９７】
サイトカインエフェクター組成物は、弱い免疫原性応答または弱い殺菌性応答を高めるために、短期間を基礎にして投与され得る。あるいは、サイトカインエフェクター組成物はまた、癌またはAIDSの治療処置の一部として長期間を基礎にして投与され得る。エフェクター組成物は、免疫原性反応を高めるために約0.5〜5.0mg/kg体重の用量で静脈内に投与され得る。これらの用量は、血流中で約0.1〜1μMの有効サイトカイン濃度を生じる。
【００９８】
Ｂ．細胞レセプターへの結合を阻止する組成物  
他の一般的な実施態様では、リポソーム組成物中のエフェクターは細胞レセプターへの内因性因子の結合を阻止することが可能な分子であり、望ましい治療効果を成し遂げる。
【００９９】
１．ELAM-1結合インヒビター。１つの例として、炎症はポリペプチド、内皮白血球接着分子-1(ELAM-1)の発現を血管の内皮細胞の表面上で起こす。ELAM-1は、順番に好中球の表面上で多糖部位を認識および結合し、そして炎症部位に好中球を補充する。ELAM-1の好中球の認識および結合を阻害することにより、再灌流損傷、敗血症性ショック、および慢性炎症疾患のような状態による過剰な炎症反応が除去され得る。
【０１００】
この実施態様では、エフェクターを用いて、血流中での炎症部位への好中球の過剰な補充を防ぐ。エフェクターは、ELAM-1に認識されたシアリルルイスxである(Phillips)。この多糖エフェクターは上記の方法により長期循環リポソーム組成物に共有結合する。好ましい実施態様では、リポソームへのシアリルルイスxの付着はグルコサミン残基の還元末端を介して完了する。還元末端はDSPE-PEG調製物のヒドラジド基と容易に反応し得る。多糖とリポソームキャリア組成物とのカップリングは、腎臓による多糖の浄化を防ぎ、そして48時間にわたって有効濃度の多糖エフェクターを維持する。リポソームキャリア組成物を適時に静脈内および炎症部位付近に10〜50μg/kg体重の用量で投与する。
【０１０１】
２．IL-1活性のインヒビター。第２の例として、エフェクターは、IL-1免疫刺激活性を阻害するIL-1インヒビターまたはIL-1のリンパ球細胞表面への結合を阻止するIL-1レセプターアンタゴニスト(IL1RA)である。これらの分子は、敗血症性ショック、毒素性ショック、結腸炎症、または白血球細胞増殖の処置のために被験体に投与され得る。本発明のこの局面では、リポソームキャリア組成物は、敗血症、毒素性ショックまたは結腸炎症の処置のために、短期間を基礎にして、20〜50μg/kg体重の用量で投与され得る。リポソームキャリア組成物はまた、白血病の処置のために、長期間を基礎にして、1〜2日間隔で投与され得る。
【０１０２】
特定のサイトカインの特定のリンパ球集団への結合を阻止するのに効果的な他の分子もまた使用され得る。
【０１０３】
内因性因子の細胞レセプター部位への結合の阻止に用いるため、長期循環エフェクター組成物の使用は、遊離エフェクターの使用より２つの利点を提供する。第１に、エフェクターは、エフェクターの腎クリアランスの阻止により、長期間にわたり血流中で維持される。第２に、エフェクター分子は、リポソーム結合形態で、レセプターの細胞表面部位でより大きな立体障害を提供する。また、リポソーム構造は、そのより大きなサイズおよびレセプター部位の領域の阻止分子の数のためにゆっくりとした運動速度で置換されるので、レセプター部位でのエフェクターおよび内因性因子の競合的な結合または阻止は、阻止因子に向かって変化する。
【０１０４】
３．ペプチドホルモン。この実施態様では、エフェクター組成物は、ペプチドホルモンに応答する種々の病気の処置に有用である。１つの実施態様では、エフェクターは、非制御骨芽細胞分裂阻害に効果的な副甲状腺ホルモン(PTH)である。
【０１０５】
４．ペプチド。この実施態様では、エフェクターは細胞結合活性を有する短いペプチドであり、そしてレセプター部位に対してリガンドと競合することに効果的である。リガンド-レセプター細胞結合事象の阻害は、潜在的に感染プロセスを阻止する結果となる。
【０１０６】
一般に、有用なペプチドは、ペプチド末端以外の配列部分のために細胞結合活性を有し得る。このように、リポソーム上でポリマー鎖への付着後、ペプチドは活性を維持している。有用なペプチドの他の一般的な特徴は、それらの小さなサイズにある。約４〜20の間のアミノ酸からなるペプチドが好ましい。
【０１０７】
配列番号６(図１３)として本明細書中で同定した一例のペプチド、YIGSRは、腫瘍の転移を阻止するのに有用である。配列番号６は、糖タンパク質の接着性特性の原因であるラミニンのB1鎖のペプチド配列の１つであり、そしてラミニンレセプターに結合することで知られている。ラミニン(YIGSR配列が生じるタンパク質)は、基底膜の成分である。ラミニンレセプターを過剰発現する循環転移細胞は、それらが付着され、そして転移腫瘍を定着させ得る基底膜におけるラミニン分子にたどり着き得る。外因性YIGSRを導入することにより、循環転移細胞のラミニンレセプターは阻止され、それにより、腫瘍定着を阻害する。
【０１０８】
同様に、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸-セリン(RGDS)のペプチドは、腫瘍細胞のフィブロネクチンへの結合を妨げることにより、転移腫瘍の定着を阻害することが実験的に示されている(Humphries)。YIGSRと同様に、RGDSは、基底膜への腫瘍細胞接着に関わるペプチド配列である。
【０１０９】
HIVによるリンパ球の感染はまた、特異的なペプチド-レセプター相互作用を包含する(Nehete)。ここで、レセプターはCD4タンパク質であり、そしてペプチドはHIVエンベロープタンパク質gp120である。ペプチド結合配列は、gp120のV3ループに位置する。8〜15の間のアミノ酸からなるいくつかのペプチド配列が結合相互作用に関係している。これらの配列は配列番号１〜配列番号５を包含し、そして図１３に示される。
【０１１０】
Pseudomonascepacia感染はまた、これらが感染する細胞に特異的な結合を示す(Sajjan)。細菌細胞表面上にみられるシュードモナスピリンタンパク質は、ムチンと呼ばれる宿主タンパク質についてのレセプターとして働く。適切なペプチドは開示されている(例えば、Sastry,Lee)。
【０１１１】
Ｃ．抗菌性組成物
この実施態様では、エフェクターは敗血症性ショックの予防および処置に有用である化合物である。敗血症性ショックの原因となる因子は、全身性グラム陰性菌感染の間に蓄積する内毒素である(Jawetz)。重篤な敗血症の急速な攻撃のために、処置は、通常敗血症の危険な段階まで開始されない。
【０１１２】
敗血症性ショックの場合に対して敗血症性ショックの治療において最も首尾良く用いられてきた抗菌剤は、ポリミキシンＢである。化合物は迅速に排出されるので、高用量のポリミキシンＢが効果的な処置に必要とされる。高用量は、不運にも、重篤な腎毒性を導き得る。
【０１１３】
本発明では、血流中のポリミキシンＢ循環は、その長期循環リポソームへの付着により数倍延長される。化合物は、上記のカップリング方法により長期循環リポソーム組成物キャリアに付着する。
【０１１４】
リポソーム組成物は、急性敗血症性ショックの危険のあるまたは急性敗血性ショックで苦しむ個体のための予防薬として、短期間を基礎にして0.1〜0.5mg/kg体重の用量で投与される。既に論述したポリミキシンＢリポソーム組成物の特徴は、ポリミキシンＢの腎臓蓄積および腎毒性を最小にし得る。
【０１１５】
以下の実施例は、本発明に従って、誘導体化された脂質およびタンパク質被覆リポソームを調製する方法を示す。
【実施例】
【０１１６】
実施例１
DSPE-PEG-マレイミドの調製
I．PEGビス(アミン)のモノ2-ニトロベンゼンスルホンアミドの調製(化合物II)
1.7g(0.5mmol)の市販されているポリエチレングリコールビス(アミン)および104mg(0.55mmol)の2-ニトロベンゼンスルホニルクロライドの混合物を丸底フラスコに添加した。溶液とするのに最小量のジオキサン(約15ml)および280μlのトリエチルアミン(2mmol)を添加した。反応フラスコに栓をし、そして室温で４日間静置した。
シリカ被覆プレート上で以下の組成の混合溶媒(CHCl3/CH3OH/H2O/NH4OH;130/70/8/0.5;v/v/v/v)を用いた薄層クロマトグラフィー(TLC)は、Ｒf＝0.87〜0.95およびＲf＝0.68〜0.75で蛍光クエンチングスポットを示す。2-ニトロベンゼンスルホニルクロライドは、Ｒf＝0.85でさらに小型なスポットであった。Ｒf＝0.87〜0.95のＵＶ吸収物質は、おそらくビス-2-ニトロ-ベンゼンスルフェンアミド(bis-2-nitro-benzenesulfenamide)を示した。Ｒf＝0.68〜0.75の物質は、おそらく開始ジアミンの所望のモノ-2-ニトロベンゼンスルホンアミド(mono-2-nitrobenzenesulfonamide)を示した。
【０１１７】
溶媒を真空下で蒸発し、2.135gの黄色シロップを得た。それを5mlクロロホルムに溶かし、そしてクロロホルムで湿らせたSiO2の21mm×270mmカラムの上部に載せた。生成物を順番にカラムに通すことにより精製した：
100ml  100％クロロホルム  0％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
200ml   90％クロロホルム  10％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
100ml   80％クロロホルム  20％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
100ml   70％クロロホルム  30％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
50mlアリコートを別々に収集し、上記のとおりTLCによりアッセイした。黄色のニンヒドリン陽性反応物質のほとんどが、20％(濃度1％NH4OHMeOH溶液)画分に溶出された。画分を乾燥し、そして397mgの明黄色固体を生じた。純粋なサンプルの収率は約20％であった。
【０１１８】
II．PEGビス(アミン)のモノ2-ニトロベンゼンスルホンアミドのイミダゾールカルバメートの調製(化合物III)
PEGビス(アミン)の550mg(0.15mmol)の2-ニトロベンゼンスルホンアミドを無水ベンゼンに溶解する。これに、49mgのカルボニルジイミダゾール(0.3mmol)および28μl(0.20mmol)のトリエチルアミンを添加した。反応器中の空気を窒素で置換し、フラスコに栓をし、そして80℃のオイルバスで４時間加熱した。上記と同じ溶媒系を用いたシリカ被覆プレート上のTLCは、全ての開始スルホンアミド(Ｒf＝0.72)が消費され、そしてＲf＝0.92のヨウ素吸収物質により置換されることを示した。溶媒を真空下で除去した。残渣を、約2.5mlクロロホルムに溶解し、そしてクロロホルムで湿らせた21×280mmカラムのシリカの上部に移した。以下の溶媒を順番にカラムに通した：
100ml  100％クロロホルム    0％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
100ml   90％クロロホルム   10％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
200ml   80％クロロホルム   20％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
50ml画分を収集し、そしてTLCによりアッセイし、所望の生成物は、20％(濃度1％NH4OHMeOH溶液)中に優勢的に見られた。プールした画分を蒸発させて乾燥し、475mgのレモンイエローの固体を得た。これを4.75mlベンゼンに溶解した。
【０１１９】
III．PEGビス(アミン)の2-ニトロベンゼンスルホンアミドのDSPEカルバミドの調製
4.5mlベンゼンに溶解したPEGビス(アミン)のイミダゾールカルバミドの2-ニトロベンゼンスルホンアミドの450mg(0.125mmol)に、93mgDSPE(0.125mmol)および70μl(0.50mmol)のトリエチルアミンを添加した。空気を窒素で置換し、フラスコに栓をし、そして80℃のオイルバスで６時間加熱した。フラスコを室温まで冷却した。DSPEは、上記のTLC系において0.54のＲfで移動する。TLCは、全てのDSPEが消費されたことを示した。溶媒を真空下で蒸発させた。残渣を、2.5mlクロロホルムに溶解し、そしてクロロホルムで湿らせたシリカの21×260mmカラムの上部に置いた。試料を順番にカラムに通し精製した：
100ml  100％クロロホルム    0％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
200ml   90％クロロホルム   10％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
100ml   80％クロロホルム   20％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
100ml   70％クロロホルム   30％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
20％(濃度1％NH4OHMeOH溶液)で溶出した所望の生成物を蒸発し、そしてＲf＝0.95の358mgの明黄色固体を得た。イミダゾールを含有する画分を用いず、そして生成物(0.0837mmol)の最終収率は65％であった。
【０１２０】
IV．PEGビス(アミン)のDSPEカルバミドの調製(化合物IV)
ポリエチレングリコールビス(アミン)のDSPEカルバメートのニトロベンゼンスルフェンアミドの約358mgを10mlエタノールに溶解した。溶液に2.4ml水および1.2ml酢酸を添加した。混合物を室温で18時間静置した。TLC分析は部分的な脱保護のみを示した。別に2.3mlの水、および別に1.2mlの酢酸を添加し、そして反応物を一晩静置した。シリケート被覆プレート上で、展開剤として上記と同様な溶媒系を用いた場合、蛍光クエンチング物質は、Ｒf＝0.86およびＲf＝0.74で現れた。所望されるニンヒドリン反応性のリン酸含有物質は、0.637のＲf値で移動した。このスポットは、蛍光クエンチングを示さなかった。
【０１２１】
溶媒を真空下で除去した。残渣を15mlクロロホルムに再溶解し、そして15mlの５％炭酸ナトリウムで抽出した。混合物を遠心分離し、分離を効果的に行い、そして炭酸ナトリウム相を15mlクロロホルムで２回再抽出した。組合せたクロロホルム抽出物を減圧下で蒸発させ、386mgのろうを得た。TLCはろうが主としてＲf＝0.72のニンヒドリン陽性のリン酸含有脂質であることを示した。
【０１２２】
ろうを2.5mlクロロホルムに溶かし、そしてクロロホルムで湿らせたシリケートカラムの上に載せた。以下の溶媒を順番にカラムに通した：
100mlの  100％クロロホルム  0％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
100ml     90％クロロホルム  10％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
100ml     80％クロロホルム  20％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
100ml     70％クロロホルム  30％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
100ml     50％クロロホルム  50％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
100ml       0％クロロホルム100％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
試料をTLCによりアッセイした。所望される生成物を30％および50％(濃度1％NH4OHMeOH溶液)の画分(faction)に見出した。これらの試料を合わせ、そして真空下で蒸発させて乾燥し、91mg(22μmol)の粘性シロップを得た。
【０１２３】
Ｖ．PEGビス(アミン)のDSPEカルバミドのマレイン酸誘導体の調製(化合物Ｖ)
1.8mlクロロホルムに溶解した上記のPEGビス(アミン)のDSPEカルバミドの18μmolに、3.5mg(36μmol)無水マレイン酸および５μl(36μmol)トリエチルアミンを添加した。栓をしたフラスコを室温で24時間静置した。溶媒を蒸発させた。シリカプレート上のTLCは、全ての出発物質が、Ｒf＝0.79〜1.00のニンヒドリン陰性のリン酸含有物質により置換されたことを示した。
【０１２４】
VI．PEGビス(アミン)のDSPEカルバミドのマレイミドの調製(化合物VI)
シロップを無水酢酸ナトリウムで飽和された２ml無水酢酸に溶解した。溶液を50℃のオイルバスで２時間加熱した。10mlエタノールを添加し、そして真空下で蒸発させた。この工程を２回繰り返し、過剰な無水酢酸および酢酸を除去した。残渣を１mlクロロホルムに溶解し、そして以下の溶媒で順番にシリカカラムに通した：
100ml  100％クロロホルム    0％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
200ml   90％クロロホルム   10％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
100ml   80％クロロホルム   20％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
100ml   70％クロロホルム   30％(濃度1％NH4OH MeOH溶液)
50ml試料を集め、そして主要な生成物を10％の濃度1％NH4OHMeOH溶液で溶出した画分に見出した。画分を合わせ、そして次いで、真空下で蒸発させて乾燥し、52mgの薄黄色の粘性オイルを得た。これはTLCにより0.98のRfで移動し、そしてリン酸を含有していた。12.3μmolの生成物を得た。これは、約34％の収率に一致する。
【０１２５】
実施例２
DSPE-PEG3-(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミドの調製 
PEGビス(アミン)のDSPEカルバミド(50μmol)を50μmolのトリエチルアミンおよび25mgのN-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(N-succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP)を含有する３mlの無水メタノールに溶解する。反応をアルゴン雰囲気下で５時間室温で行う。メタノールを減圧下で除去し、そして生成物を、クロロホルムに再溶解し、そして150℃で一晩活性化して前洗浄した10mlシリカゲルカラムに供した。実施例１で用いたのと同様の溶媒系を用いて生成物を精製した。TLCプレート上の分析は、ニンヒドリンと陰性に反応し、リン酸を含みそして遊離スルフヒドリル基を有さないＲf＝0.98の生成物を示す。生成物を過剰なジチオトレイトールで処理する場合、2-チオピリジノン(2-thiopyridinone)が解離される。
【０１２６】
実施例３
エチレン結合PEG-DSPEのアルデヒドの調製
I．I-トリメチルシリルオキシ-PEGの調製(化合物Ｘ)
15.0g(10mmol)のPEG分子量1500(AldrichChemical)を80mlベンゼンに溶解した。1.40ml(11mmol)のクロロトリメチルシラン(chlorotrimethylsilane)(Aldrich Chemical Co.)および1.53ml(1mmol)のトリエチルアミンを添加した。混合物を不活性雰囲気下、室温で５時間撹拌した。
【０１２７】
混合物を吸引濾過し、トリエチルアンモニウムクロライド(triethylammonium chloride)の結晶を分離し、そして結晶を5mlベンゼンで洗浄した。濾液およびベンゼン洗浄液を合わせた。この溶液を真空下で蒸発させて乾燥し、静置すると凝固する15.83gの無色のオイルを得た。
【０１２８】
Si-C18逆相プレートで、展開剤として４容量のエタノールと１容量の水との混合物、およびヨウ素蒸気可視化を用いた生成物のTLCは、全てのポリグリコール1500(Ｒf＝0.93)が消耗され、そして、Ｒf＝0.82の物質に置換されたことを明らかにした。赤外スペクトルは、ポリグリコールのみの吸光度ピーク特性を示した。
【０１２９】
I-トリメチルシリルオキシ(trimethylsilyloxy)PEG、分子量1500の収量はほぼ定量であった。
【０１３０】
II．トリメチルシリルオキシ-PEGのトリフルオロメタンスルホニルエステルの調製(化合物XI)
上記で得たI-トリメチルシリルオキシPEG結晶15.74g(10mmol)を40ml無水ベンゼンに溶解して、そして破砕した氷のバス中で冷却した。AldrichChemical Co.から入手した1.53ml(11mmol)トリエチルアミンおよび1.85ml(11mmol)のトリフルオロメタンスルホン酸無水物を添加し、そして混合物を反応混合物が茶色になるまで不活性雰囲気下で一晩撹拌した。
【０１３１】
次いで、溶媒を減圧下で蒸発させ、そして残りのシロップ状ペーストを塩化メチレンで100.0mlまで希釈した。トリフルオロメタンスルホン酸エステル(trifluoromethane sulfonic ester)の大きな反応性のために、I-トリメチルシリルオキシPEGのトリフルオロメタンスルホニルエステル(trifluoromethanesulfonyl ester)のさらなる精製はされなかった。
【０１３２】
III．N-1-トリメチルシリルオキシPEG1500PEの調製(化合物XII)  
1-トリメチルシリルオキシPEGのトリフルオロメタンスルホニルエステルの塩化メチレン貯蔵溶液10mlを真空下で蒸発させて乾燥し、約1.2gの残渣(約0.7mmol)を得た。この残渣に、372mg(0.5mmol)卵PEを含有するクロロホルム溶液3.72mlを添加した。生じた溶液に、139μl(1.0mmol)のトリエチルアミンを添加し、そして溶媒を真空下で蒸発させた。得られた残渣に、5ml乾燥ジメチルホルムアミドおよび70μl(0.50mmol)トリエチルアミン(VI)を添加した。反応容器の空気を窒素で置換した。容器を密閉し、そして砂バスで110℃で22時間加熱した。溶媒を真空下で蒸発させて、1.58gの茶色がかったオイルを得た。
【０１３３】
Kieselgel60シリカ70〜230メッシュで満たされた21×260mmクロマトグラフィー吸収カラムを調製し、そして40容量のブタノン、25容量酢酸および5容量の水で構成される溶媒で濯いだ。粗生成物を3mlの同じ溶媒に溶解し、クロマトグラフィーカラムの上部に移した。クロマトグラムを同じ溶媒で展開しそして一連の流出液の30ml部分を各々TLCによりアッセイした。
【０１３４】
TLCアッセイ系は、シリカゲル被覆ガラスプレートを、ブタノン／酢酸／水；40/25/5；v/v/vの溶媒の組み合わせと共に用いた。ヨウ素蒸気吸収を、可視化のために用いた。この溶媒系でN-1-トリメチルシリルオキシPEG1500PEはＲf＝0.78で現れた。不変PEはＲf＝0.68で現れた。
【０１３５】
所望されるN-1-トリメチルシリルオキシPEG1500PEはカラム流出液の170〜300ml部分の主成分であった。真空下で蒸発させて乾燥した場合、これらの部分は、111mgの薄黄色のオイル生成物を生じた。
【０１３６】
IV．N-ポリエチレングリコール1500：PEの調製(化合物XII)
一旦クロマトグラフィーし、PE化合物を2mlのテトラヒドロフランに溶解した。これに、6ml酢酸および2ml水を添加した。生じた溶液を3日間23℃で静置した。反応混合物からの溶媒を真空下で蒸発させ、そして一定重量まで乾燥し、75mgの薄黄色ろうを得た。Si-C18逆相プレート上で4容量エタノール、1容量水の混合物で展開したTLCは、遊離PEおよびポリグリコール様物質が加水分解の間に形成されることを示した。
【０１３７】
残渣を0.5mlテトラヒドロフランに溶解し、そして3mlのエタノール水；80：20；v：vの溶液で希釈した。混合物をオクタデシル結合したシリカゲル相で充填した10mm×250mmクロマトグラフィー吸収カラムの上部に付し、そしてカラムをエタノール水80：20容量％で展開し、流出液の20ml部分を順に集めた。流出液を逆相TLCによりアッセイした。Ｒｆ＝0.08〜0.15の生成物のみを含有する画分を合わせた。これは、典型的には20〜100ml部分の流出液であった。乾燥のために真空下で蒸発させると、これらの部分は、出発ホスファチジルエタノールアミンを基礎にして3％のみの収率に対応する33mgの無色ろうPEG-PEを生じた。
【０１３８】
NMR分析は、生成物がPE残渣およびPEG残渣の両方を取り込んでいることを示した。調製された生成物をPEG-PEリポソームの調製のために用いた。
【０１３９】
Ｖ．PEG-DSPEのアルデヒドの調製(化合物XIII)
DSPEにより誘導体化されたPEG上の遊離ヒドロキシル基は、リポソームへの直鎖状ポリマーの取り込み前に以下の方法で相当するアルデヒドに酸化され得る(Harris)。実施例３で調製されたように約2.7gのPEG1500-DSPE(1mmol)を15mlジメチルスルホキシド中の0.4g無水酢酸に添加し、室温で30時間撹拌する。この時点で、反応混合物を希釈水酸化ナトリウムで中和し、溶媒を減圧下で蒸発させる。
【０１４０】
残渣を10mlクロロホルムに溶解し、2回連続的に10ml部分の水で洗浄し、そして遠心分離してクロロホルム相と水相とを分離する。クロロホルム相を真空下で蒸発させ、ろうを得る。ろうを5mlクロロホルムに再溶解し、そしてクロロホルムで湿らせたシリカゲルの21×270mmカラムの上部に移す。カラムを100mlの溶媒をカラムに通すことで展開する。以下の溶媒を順番に用いた：
クロロホルム              濃度２％水酸化アンモニウム含有  
容積％              メタノール／メタノール容積％    
100％                             0％
95％                            5％
90％                           10％
85％                           15％
80％                           20％
70％                            30％
60％                           40％
50％                           50％
0％                                                    100％
カラム流出液の分離した50ml画分を蓄える。カラムの画分をSi-C18逆相プレート上のTLCにより分離する。TLCプレートを１容量の水と混合した4容量のエタノールで展開する。ヨウ素蒸気に曝すことにより可視化を行う。
【０１４１】
Ｒfが約0.20のヨウ素吸収脂質を含有するそれらの画分だけを合わせ、そして真空下で蒸発させて乾燥し、そして一定重量まで高真空で乾燥した。このようにして、分子量2226のろう結晶固体94mgを得た。末端アルコールのアルデヒドへの変換はIＲによりモニターされ得る。
【０１４２】
実施例４
α-ヒドロキシ-ω-(カルボキシメチルアミノ-カルボニル)オキシ-ポリ(オキシレン)のN-ヒドロキシスクシンイミドエステルの合成(化合物XXIV)およびDSPEとのカップリング
PEGのα-ヒドロキシ-ω-カルボキシ誘導体(XXIX)(2g、約1mmol)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(0.23g、2mmol)を塩化メチレン-酢酸エチル(4ml、1：1)に溶解した。溶液を氷水バス上で冷却し、そして酢酸エチル(1ml)に予め溶解されたジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(0.25g、1.2mmol)で処理した。2、3分以内で、溶液はジシクロヘキシルウレア(dicyclohexylurea,DCU)が現れるにつれて濁った。2時間後、反応混合物をDCUから濾過し、そして蒸発させて乾燥した。ポリマーをイソプロパノールから結晶化し、そして真空内P2O5で乾燥した。収率：1.5g(70％)。活性アシル含有量についての生成物の滴定(Zalipsky,1991)によって、4.8×10-5mol/g(理論値の104％)を得た。H-NMR(CDCl3)スペクトルは、特徴的なPEGのシングレット(δ＝3.64)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(δ＝2.84)に加えて、CH2-(C=O)-Gly(δ＝4.27)のトリプレットおよびグリシン残基のメチレン基(δ＝4.33)のダブレットもまた示し、そしてイソプロパノールもまたいくらか存在する(δ＝1.20、3、J＝6Hz)ことを示した。
【０１４３】
α-ヒドロキシ-ω-カルボキシPEGのN-ヒドロキシスクシンイミドエステル(0.52g、0.2mmol)をクロロホルム(2ml)中のDSPE(0.14g、0.185mmol)懸濁液に添加し、続いてトリエチルアミン(0.1ml、0.86mmol)を添加した。混合後、混合物をウォーターバスで55℃で5分間加熱した。この時間の間で溶液は透明になった。シリカゲルＧ上のTLC(クロロホルム-メタノール-水90：18：2)は、DSPEの新しい生成物への完全な変換を示した。その新しい生成物は、過剰なPEGがヨウ素蒸気により容易に可視化されるようには、ニンヒドリンで呈色されなかった。溶液を等量の酢酸で処理して、TEAを中和し、そして蒸発させて乾燥した。残渣を水に溶解し、そして4℃で300,000MWCOセルロースアセテート膜を介し充分に透析し、0.2μmを介し濾過し、そして凍結乾燥し、純粋な化合物XXIV(360mg、約70％)を得た。
【０１４４】
実施例５
DSPE-PEG-ヒドラジドの調製(化合物XXXII)
I．PEGのω-ヒドロキシ酸誘導体、α-(ヒドロキシエチル)-ω-(カルボキシメチルアミノカルボニル)オキシ-ポリ(オキシエチレン)の調製(化合物XIXおよびXXIX)
ポリエチレングリコール(Fluka,  PEG-2000、42g、42ミリ当量OH)をトルエン(200ml)に溶解し、そして共沸的に乾燥し(Zalipsky,1987)、そしてエチルイソシアノトアセテート(ethyl isocyanotoacetate)(2.3ml、21mmol)およびトリエチルアミン(1.5ml、10mmol)で処理する。25℃で一晩反応後、溶液を乾燥するまで蒸発させる。残渣を0.2MNaOH(100ml)に溶解し、そしていかなる微量のトルエンも蒸発させる。溶液を4M NaOHの定期的な滴下によりpH12で維持する。
【０１４５】
溶液のpHがpH12で安定化される場合、溶液をpH3.0まで酸性化し、そして生成物を塩化メチレン(100ml×2)で抽出する。シリカゲルＧ上のTLC(イソプロピルアルコール/H2O/濃アンモニア10：2：1)は、非反応PEG(Ｒf＝0.67)、モノカルボキシル化誘導体(Ｒf＝0.55)、およびポリマーのジカルボキシル化誘導体(Ｒf＝0.47)からなる部分カルボキシル化PEGの典型的なクロマトグラムを与える(Zalipsky,1990)。この溶液を乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして乾燥するまで蒸発させる。PEG混合物を水(50ml)に溶解する。この溶液の3分の1(30ml、約14gの誘導体化されたPEG)をDEAE-SephadexA-25(ホウ酸塩形態のゲル115ml)に加える。非誘導体化PEGを水でカラムから洗い流した後に(ネガティブポリメタクリル酸(PMA)テスト(Zalipsky,1990)により確認された)、炭酸水素アンモニウムの濃度勾配(2〜20mMで、200ml毎に1〜2mMの増加)をかけ、そして50ml画分を収集した。画分1〜25は、PMAおよびTLCテストにより決定されたようにPEGモノ酸のみを含有している。これらの画分を一緒にプールし、約70mlまで濃縮し、pH2まで酸性化し、そして塩化メチレン(50ml×2)で抽出する。CH2Cl2溶液を乾燥し(MgSO4)、濃縮し、そして撹拌している冷エーテルに注ぐ。沈澱した生成物を真空下で乾燥する。収率：7g。カルボキシ基の滴定により、4.6×10-4ミリ当量/g(理論値の97％)が得られる。
【０１４６】
II．化合物XXXの調製
PEGのω-ヒドロキシ酸誘導体(5g、2.38mmol)および第三級-ブチルカルバゼート(0.91g、6.9mmol)をCH2Cl2-酢酸エチル(1:1、7ml)に溶解する。溶液を氷上で冷却し、そして同じ溶媒混合物に予め溶解したDCC(0.6g、2.9mmol)で処理する。30分後、アイスバスを取り除きそして反応をさらに3時間進行させる。反応混合物をジシクロヘキシルウレアから濾過し、そして蒸発させる。生成物を回収し、そして酢酸エチル-エーテル(1：1)から2回の沈澱により精製し、そして真空下P2O5で乾燥する。収率：5.2g、98％。生成物のTLCは、出発物質(Ｒf＝0.55)の代わりに1つのスポット(Ｒf＝0.68)を与えた。H-NMR(CDCl3):δ1.46(s, t-Bu, 9H); 3.64(s, PEG, 178H); 3.93(br. d, J=4.5, GlyのCH2, 2H);4.24(t, CH2-OCO-Gly, 2H)ppm。13C-NMR(CDCl3): δ28.1(t-Bu); 43.4(GlyのCH2);61.6(CH2OH); 64.3(CH2OCONH); 69.3(CH2CH2OCONH); 70.5(PEG); 72.4(CH2CH2OH);81.0(CMe3); 155.1(BocのC=O); 156.4(GlyウレタンのC=O; 168.7(GlyヒドラジドのC=O)ppm。
【０１４７】
III．化合物XXXIの調製
PEGのω-ヒドロキシBoc-ヒドラジド誘導体(5g、2.26mmol)をピリジン(1.1ml)、CH2Cl2(5ml)、およびCH3CN(2ml)に溶解し、ジスクシンイミジルカーボネート(1.4g、5.5mmol)で25℃にて一晩処理する。溶液を濾過し、冷エチルエーテル(100ml)を徐々に添加する。沈澱生成物を温酢酸エチル(45ml)に溶解し、凍結し、そして等量のエチルエーテルと混合する。沈澱物を濾過により収集し、そして真空下P2O5で乾燥する。収率：4.8g、90％。スクシンイミジルカーボネート基含有量4.15・10-4ミリ当量/g(理論値の98％)を滴定(Zalipsky,1991)によって決定した。H-NMR(CDCl3): δ1.46(s, t-Bu, 9H); 2.83(s, スクシンイミド); 3.64(s, PEG,178H); 3.79(t, CH2CH2OCO2-Su); 3.93(br. d, J=4.5, GlyのCH2, 2H); 4.24(t,CH2-OCO-Gly, 2H); 4.46(t, CH2OCO2-Su)ppm。
【０１４８】
IV．化合物XXXIIの調製
DSPE-PEG-ヒドラジドを調製するために、わずかに過剰なスクシンイミジルカーボネートBoc-保護PEG-グリシンヒドラジド(上記で調製)を、トリエチルアミンの存在下でクロロホルムに懸濁されたDSPEと反応させる。脂質誘導体をこの反応のプロセスにおいて急速に(5〜10分)可溶化させる。過剰なヘテロ二官能性PEGをSpectrumからの300,000MWCOセルロースエステル透析膜を用いる透析により除去する。回収した脂質結合体を従来のBoc-脱保護条件(4MHClのジオキサン溶液に30分間)に曝し、次いで再結晶によりさらに精製する。H-NMR(CDCl3): δ0.88(t, CH3, 6H); 1.59(t,CH2CH2CO, 4H); 2.84(t, CH2CO, 4H); 3.64(s, PEG, 180H); 4.0(t); 4.2(m,CH2OCO-NH2); 4.4-4.3(2つのダブレット);5.2(g, グリセリドのCH)。
【０１４９】
実施例６
共有結合β-ガラクトシダーゼをともなうリポソームの調製
ポリオキシエチレンビス(アミン)のDSPEカルバミドのマレイミド(3500-DSPE)を実施例１と同様に調製した。β-ガラクトシダーゼをPierce(Rockford、IL)から購入した。ο-ニトロフェニルガラクトース(o-nitrophenylgalactose)を用いた酵素アッセイを、本質的に0.1N水酸化ナトリウム中413ナノメーターで吸光係数4467を有する着色生成物の呈色をモニターすることにより行った。アッセイ混合物は、86mMリン酸ナトリウムpH7.3、1mM塩化マグネシウム、50mMβ-メルカプトエタノール、および2.3mMο-ニトロフェニルガラクトースからなり、そして生成物の形成をアッセイの線状範囲で10〜15分間モニターした。
【０１５０】
リポソーム(MLV's)を標準方法により調製し、そして表４に示した以下の組成物の1つの大きさに作った。リポソームを、200nmまでのポリカーボネート膜を押し出すことにより一定の大きさに作った。
【０１５１】
【表４】
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【０１５２】
ここで、α-T＝α-トコフェロール(抗酸化剤)、Ch＝コレステロール、PC＝部分水素化卵PC(IV40)、架橋剤＝PEG3500-DSPEのマレイミド誘導体、およびPG＝卵ホスファチジルグリセロール。さらに、全てのリポソーム調製物を、3H-DPPCトレーサーで「スパイク(spiked)」した。各調製物の全脂質濃度は、PBS(50mMリン酸ナトリウムpH7.2、50mM塩化ナトリウム)中での水和の後、2mMであった。
【０１５３】
架橋反応を、リポソームに酵素溶液を添加し(最終タンパク質濃度＝0.5mg/ml)、そして穏やかに振とうしながら周囲の温度で懸濁液を一晩インキュベートすることにより行った。次いで、未反応の架橋剤を10mM2-メルカプトエタノール(2-ME)で30〜60分間37℃でクエンチングした。リポソームをメトリザミド(metrizamide)濃度勾配を介する浮遊により非結合タンパク質から分離した：試料を30％(w/v)メトリザミドに入れ、そしてSW60Ti管に移し、20％メトリザミドを上に重層し、次いで、PBSを最上部に添加し、水性界面を提供した。濃度勾配を45,000rpmで60分間4℃で遠心分離し、次いで、PBS界面で容易に目視可能な各リポソームのバンドを収集し、そして透析チューブに移した。透析は2回交換したPBSに対して4℃で一晩行った。メトリザミドの除去は必要であり、それは1％(W/V)濃度でさえβ-ガラクトシダーゼ活性を顕著に阻害するためである。
【０１５４】
実施例６
ヒドラジド末端官能化PEGリポソームのリポソーム血液寿命測定
I．ヒドラジド末端官能化リポソームの調製
ヒドラジド基で末端官能化されたPEG、およびジステアリル-PEで構成されるヒドラジドPEG-DSPEを上記のとおり調製した。ヒドラジドPEG-DSPE脂質を、約0.15：1.85：1の脂質：脂質：脂質モル比で部分水素化卵PC(PHEPC)およびコレステロールと合わせ、そして脂質混合物を水和させた。一般に、脂質水和は、メシル酸デスフェラール(desferalmesylate)の存在下で生じ、続いて0.1ミクロンまでの大きさにし、そしてゲル濾過により非捕捉デスフェラールを除去し、続いてGa-オキシドをリポソームに加えた。非カプセル化GaをSephadexG-50ゲル排除カラムを通している間に除去した。両方の組成物は、0.15MNaCl、5mMデスフェラール中に10μmol／mlを含有していた。
【０１５５】
第２の脂質混合物を同様の方法で調製したが、PHEPCの代わりにHSPCを用いた。
【０１５６】
II．血液循環時間および組織レベルの測定
リポソームのインビボの研究を各200〜300gの実験用ラットで行った。これらの研究は約10〜20μMリン脂質/kg体重でのリポソーム試料の尾静脈注射を包含する。血液試料を所定の時間に後眼窩採血により得た。動物を24時間後に屠殺し、そして組織を標識定量のために取り出した。各組織中の注射用量の重量およびパーセントを決定した。研究を67Ga-デスフェラールを加えたリポソームを用いて行い、そして放射活性をガンマカウンターを用いて測定した。24時間までのいくつかの時点での血液中および24時間での選択した組織中に残留している注射用量のパーセントを決定した。
【０１５７】
Ａ．ヒドラジド-PEGリポソームの血漿運動
リポソーム組成物(0.4ml)を動物に静脈内(IV)注射した。注射後0、0.25、1、3、または5および24時間で、血液試料を取り出し、そして血液中に残留しているGa-デスフェラールの量についてアッセイし、注射後直ぐに測定した量のパーセントとして表現した。ヒドラジド-PEGリポソームは約15時間の血液半減期を有し、そして注射した物質のほぼ30％が24時間後血液中に存在する。
【０１５８】
Ｂ．24時間の組織レベル
静脈内リポソーム注射の24時間後の選択した組織中のガリウム標識リポソームの分布を決定する研究を行った。リポソーム組成物(0.4ml)を動物に静脈内(IV)注射した。静脈内投与の24時間後の組織に残留するパーセント用量を表３に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１−１】図１は、ポリエチレングリコール(PEG)ビス（アミン）のDSPEカルバメート(carbamate)のマレイミド(maleimide)の合成工程を示す。
【図１−２】図１−２は、図１−１のつづきである。
【図２】図２は、ポリエチレングリコール(PEG)ビス（アミン）のDSPEカルバミド(carbamide)のジスルフィド結合を含むプロピオンアミド(propionamide)の合成工程を示す。
【図３】図３は、DSPEのエチレン結合PEG誘導体のアルデヒドを調製するための合成スキームを示す。
【図４】図４は、ポリマーの末端にマレイミド基を有するPEG誘導体化PEの形成工程を例示する。
【図５】図５は、ポリマーの末端にブロモアセトアミド(bromoacetamide)基を有するPEG誘導体化PEの形成工程を例示する。
【図６】図６は、PEG末端ヒドラジド(hydrazide)基を有する誘導体化DSPE脂質の合成工程を示す。
【図７−１】図７Ａ〜７Ｄは、種々のアミン含有基(７Ｂ〜７Ｄ)をPEGポリマー末端にカップリングするために用いられ得るPEG末端活性基(７Ａ)を有する誘導体化DSPE脂質の合成工程を示す。
【図７−２】図７Ａ〜７Ｄは、種々のアミン含有基(７Ｂ〜７Ｄ)をPEGポリマー末端にカップリングするために用いられ得るPEG末端活性基(７Ａ)を有する誘導体化DSPE脂質の合成工程を示す。
【図８】図８は、ヒドラジド基を有するPEGスペーサー鎖によって誘導体化される他のPEの形成工程を示す。
【図９】図９は、図１に示したPEGビス（アミン）のDSPEカルバメートのマレイミドへのスルフヒドリル(sulfhydryl)基を介したペプチドの共有結合カップリングを示す。
【図１０】図１０は、図２に示したPEGビス（アミン）のDSPEカルバメートのPEGビス（アミン）マレイミドのDSPEカルバミドのジスルフィド結合を含むプロピオンアミド(propionamide)へのスルフヒドリル基を介したペプチドの共有結合カップリングを示す。
【図１１】図１１は、図３に示したPEG(PEG)のDSPEカルバミドのエチレン結合誘導体のアルデヒドの還元的アミノ化によるペプチドの共有結合を示す。
【図１２】図１２は、ヒドラジドPEG-DSPE、部分水素化卵ホスファチジルコリン(phosphatidylcholine,PHEPC)、およびコレステロール(cholesterol)(PEG-HZ流動性リポソーム)、あるいは、ヒドラジドPEG-DSPE、水素化血清ホスファチジルコリン(HSPC)、および血流中のコレステロール(PEG-HZ硬化性リポソーム）からなるガリウム-67で標識されたリポソームのタイムコースのプロットを示す。
【図１３】図１３は、従来の１文字アミノ酸コードの配列番号１〜10によって同定されるペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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