(57)【要約】      （修正有）【課題】ウイルスタンパク質を提供する。【解決手段】特定の配列または免疫原性を有するその断片を含む単離ポリペプチド。同ポリペプチドをコードする、または特定のＤＮＡ配列に少なくとも７０％同一な配列を含む単離核酸も開示される。関連する発現ベクター、宿主細胞、ならびに抗体も本発明の範囲内にある。前記ポリペプチドを製造する方法、コロナウイルス感染を診断する方法、ならびにコロナウイルス感染を治療するための試験化合物を同定する方法も開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または免疫原性を有するその断片からなる単離ポリペプチドであって、免疫原性を有する断片の長さが少なくとも１０アミノ酸残基であることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
免疫原性を有する断片が配列番号２または５を含む請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
免疫原性を有する断片が配列番号２または５である請求項２に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１である請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号３に少なくとも７０％同一な配列または同配列の相補物からなる単離核酸。
【請求項６】
前記配列は配列番号３に少なくとも８０％同一である請求項５に記載の単離核酸。
【請求項７】
前記配列は配列番号３に少なくとも９０％同一である請求項７に記載の単離核酸。
【請求項８】
前記配列は配列番号３に少なくとも９５％同一である請求項７に記載の単離核酸。
【請求項９】
前記配列は配列番号３である請求項８に記載の単離核酸。
【請求項１０】
請求項１のポリペプチドをコードする配列または同配列の相補物からなる単離核酸。
【請求項１１】
前記配列は配列番号４または６を含む請求項１０に記載の単離核酸。
【請求項１２】
請求項５に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１０に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項１４】
請求項５に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１０に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１４に記載の宿主細胞を、前記核酸によってコードされるポリペプチドの発現が可能な条件下で培地中で培養する工程と、培養した細胞または同細胞の培地からポリペプチドを精製する工程とを含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の宿主細胞を、前記核酸によってコードされるポリペプチドの発現が可能な条件下で培地中で培養する工程と、培養した細胞または同細胞の培地からポリペプチドを精製する工程とを含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１８】
請求項１に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸と、医薬として許容可能な担体とを含んでなる組成物。
【請求項１９】
ポリペプチドに対する抗体を生成させる方法であって、請求項１に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸をヒト以外の動物に投与する工程を含む方法。
【請求項２０】
対象者においてコロナウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項１に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸を、該対象者に投与する工程を含む方法。
【請求項２１】
請求項１に記載のポリペプチドまたはその断片に対して特異的に結合する精製抗体。
【請求項２２】
対象者におけるコロナウイルス感染を診断する方法であって、
対象者由来の試験サンプルを提供する工程と、
試験サンプル中の、請求項１に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドに対する抗体の存在を調べる工程と
からなり、
試験サンプル中に前記ポリペプチドまたは前記抗体が存在する場合、該対象者がコロナウイルスに感染していることを表すことを特徴とする方法。
【請求項２３】
コロナウイルスはＳＡＲＳ‐ＣｏＶである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
コロナウイルス感染を治療するための試験化合物を同定するスクリーニング方法であって、
試験化合物を請求項１に記載のポリペプチドと接触させる工程と、
試験化合物とポリペプチドとの間の結合を調べる工程と
からなり、
結合が認められるということは、コロナウイルス感染の治療に該試験化合物を使用可能であることを示していることを特徴とする方法。
【請求項２５】
コロナウイルスはＳＡＲＳ‐ＣｏＶである、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルスタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
ウイルスは様々な感染症の原因となる。例えば、コロナウイルス科のウイルスは、マウスの肝炎、ブタの胃腸炎、トリおよびヒトの呼吸器感染症を引き起こす。これまでに単離された３０を超えるコロナウイルスの中では、３、４種のウイルスがヒトに感染する。新たに発見された感染症である重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）は、新規なコロナウイルスに関連がある。生命を脅かすこの呼吸器コロナウイルスは、２００３年に世界規模の拡がりをみせた。ＳＡＲＳコロナウイルスに対するワクチンと薬とが精力的に探索されているにもかかわらず、安全上の問題から進展はいくぶん遅いものとなっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、ウイルスタンパク質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（要約）
本発明は、少なくとも部分的には、ＳＡＲＳの機構を解明しワクチンおよび治療薬を開発するための、標的としての役割を果たす可能性のあるＳＡＲＳ  ＣｏＶプロテイン３ａの発見に基づいている。
【０００５】
以下に示すのは該タンパク質の核酸およびアミノ酸の配列である。
【０００６】
【化１】
2005270102.tif 000002
本発明の一態様は、配列番号１を含む単離ポリペプチドまたは配列番号１に由来する免疫原性の断片を特徴とする。免疫原性の断片の長さは少なくとも１０アミノ酸残基、すなわち１０から２７４（配列番号１の長さ）の間の任意のアミノ酸数を含む。そのような免疫原性の断片の例には、ＤＰＩＹＤＥＰＴＴＴＴＳＶＰＬ（配列番号２）およびＰＩＹＤＥＰＴＴＴＴＳＶＰＬ（配列番号５）が挙げられる。該ポリペプチドは、プロテイン３ａに結合する抗体を生成させるために使用することができる。単離ポリペプチドとは、天然の状態で結合している分子を実質的に含まないポリペプチド、すなわち乾燥重量で純度が少なくとも７５％（すなわち７５％〜１００％の間の任意の数値を含む）のポリペプチドを意味する。純度は、任意の適切な標準的方法、例えば、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析により測定可能である。本発明の単離ポリペプチドは、天然の供給源から精製することも、組換えＤＮＡ技術もしくは化学的手法により作製することも可能である。
【０００７】
本発明の別の態様は、配列番号２をコードする配列（例えば、ｇａｔ  ｃｃａ  ａｔｔ
ｔａｔ  ｇａｔ  ｇａｇ  ｃｃｇ  ａｃｇ  ａｃｇ  ａｃｔ  ａｃｔ  ａｇｃ  ｇｔｇ
ｃｃｔ  ｔｔｇ；すなわち配列番号４）、配列番号５をコードする配列（例えば、ｃｃａ  ａｔｔ  ｔａｔ  ｇａｔ  ｇａｇ  ｃｃｇ  ａｃｇ  ａｃｇ  ａｃｔ  ａｃｔ  ａｇｃ  ｇｔｇ  ｃｃｔ  ｔｔｇ；すなわち配列番号８）、または配列番号１をコードする配列（例えば、上記の配列番号３）を含む単離核酸を特徴とする。本発明は、配列番号３と少なくとも７０％（例えば、９０％、９５％、または１００％、あるいは７０％から１００％の間の他の任意の数値を含む）同一な配列を含む単離核酸も特徴とする。
【０００８】
２つのアミノ酸配列の同一性（％）は、カーリン（Karlin）およびアルチュール（Altschul）のアルゴリズム（プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー．エス．エイ．誌（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、１９９０年、第８７巻、ｐ．２２６４−２２６８）の、カーリンおよびアルチュールによる変法（プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー．エス．エイ．誌、１９９３年、第９０巻、ｐ．５８７３−５８７７）を用いて決定する。そのようなアルゴリズムは、アルチュールらのＸＢＬＡＳＴプログラム（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー誌（J. Mol. Biol. ）、１９９０年、第２１５巻、ｐ．４０３−４１０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、文字長＝３を用いて実施される。２つの配列の間にギャップが存在する場合は、アルチュールらの報告（ヌクレイック・アシッド・リサーチ誌（Nucleic Acids Res.）、１９９７年、第２５巻、ｐ．３３８９−３４０２）に記載されているようにしてギャップ対応のＢＬＡＳＴ（Gapped BLAST）を利用する。ＢＬＡＳＴプログラムおよびギャップ対応のＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、有利な点としては初期設定パラメータを利用可能である（例えば、ＸＢＬＡＳＴ）。ncbi.nlm.nih.gov. を参照されたい。
【０００９】
核酸とは、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、またはＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体（アナログ）を指す。ＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体は、ヌクレオチドの類似体から合成することができる。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、二本鎖ＤＮＡが好ましい。「単離核酸」とは、天然に存在するいかなる核酸の構造または天然に存在するゲノム核酸のいかなる断片の構造とも同一でない構造を有する核酸を指す。従ってこの用語「単離核酸」には、例えば、（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部分の配列を有してはいるが、天然の状態で同ゲノム分子を含む生物体のゲノムにおいて同分子の前記一部分の両側に隣接するコード配列とは隣接してはいないＤＮＡ；（ｂ）ベクターまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた核酸であって、その結果得られる分子が天然に存在するいかなるベクターまたはゲノムＤＮＡとも同一でないように組み込まれている核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製された断片、または制限酵素処理により作製された断片などの個々の分子；ならびに（ｄ）ハイブリッド遺伝子（すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子）の一部分である組換えヌクレオチド配列；が含まれる。上述の核酸を、本発明のポリペプチドを発現するために使用することができる。この目的のために、該核酸を適切な制御配列に作動可能なように連結して発現ベクターを作製することができる。
【００１０】
ベクターとは、同ベクターに連結された別の核酸を運搬することができる核酸分子を指す。ベクターは、自律的に複製可能であるか、または宿主のＤＮＡに組み込まれて一体化することが可能である。ベクターの例としては、プラスミド、コスミド、またはウイルスベクターが挙げられる。本発明のベクターには、宿主細胞内で該核酸を発現するのに適した形態の核酸が含まれる。ベクターは、発現させようとする核酸配列に作動可能なように連結された１以上の制御配列を含むことが好ましい。「制御配列」には、プロモーター、
エンハンサー、およびその他の発現を制御する要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）がある。制御配列には、ヌクレオチド配列を構成的に発現させるものや、組織特異的に制御するもの、および／または誘導可能なものがある。発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因によって変わりうる。発現ベクターを宿主細胞に導入して本発明のポリペプチドを作製することができる。上述の核酸を含む宿主細胞もまた本発明の範囲内にある。例としては、大腸菌の細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞、または哺乳類の細胞がある。例えば、ゲッデル（Goeddel ）、１９９０年、「遺伝子発現技術（Gene Expression Technology）」、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology ）、第１８５巻、米国カリフォルニア州サンディエゴ所在のアカデミック・プレスを参照されたい。本発明のポリペプチドを作製するためには、本発明の核酸によりコードされるポリペプチドを発現させることのできる条件下で、宿主細胞を培地中で培養すればよい。別例として、例えばＴ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、本発明の核酸を生体外（in vitro）で転写および翻訳することもできる。
【００１１】
本発明のポリペプチドおよび核酸を用いて、対象者に対して有効な量の本発明のポリペプチドまたは同ポリペプチドをコードする核酸を投与することによって、同対象者の体内でコロナウイルスに対する免疫応答（すなわち、特異抗体の産生）を誘導することができる。また、配列番号１、２、もしくは５の配列を有するポリペプチドに、または免疫原性を有する同ポリペプチドの断片に特異的に結合する特異抗体を作製するために使用することも可能である。より具体的には、ヒト以外の動物に本発明のポリペプチドおよび核酸を投与することによって、抗体を作製することができる。従って、上記のポリペプチドまたは核酸と、医薬として許容可能な担体とを含む免疫原性の組成物も、本発明の範囲内にある。該組成物は抗体を生成させるために使用することができる。対象者またはヒト以外の動物由来の抗体から不純物を除くこと、標準的な技法を用いてモノクローナル抗体を作製することも可能である。
【００１２】
上述した抗体を使用して、ある対象者由来の試験サンプル中における、配列番号１の配列を含むポリペプチドまたは免疫原性を有する同ポリペプチドの断片（例えば、配列番号２または５）の存在について調べることによって、該対象者におけるコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ‐ＣｏＶへの感染を診断することができる。試験サンプル中に該ポリペプチドが存在するということは、その対象者がそのコロナウイルスに感染していることを示している。同様に、試験サンプル中における、配列番号１の配列を有するポリペプチドまたは免疫原性を有する同ポリペプチドの断片に対する特異抗体の存在について調べることによって、対象者のコロナウイルス感染を診断することもできる。試験サンプル中に抗体が存在するということもまた、その対象者がそのコロナウイルスに感染していることを示している。
【００１３】
本発明のポリペプチドを、コロナウイルス、例えばＳＡＲＳウイルスへの感染を治療するための化合物を同定するスクリーニング方法に使用することが可能である。該方法は、（１）試験化合物を上述のポリペプチドと接触させる工程と、（２）該試験化合物とポリペプチドとの間の結合について調べる工程とを含む。結合が認められるということは、該試験化合物がコロナウイルス感染の治療に使用可能であることを示している。
【００１４】
コロナウイルス感染の治療方法も本発明の範囲内にある。該方法は、投与を必要とする患者に、有効な量の１以上の上記ポリペプチドまたは抗体を投与する工程を含む。「治療する」という用語は、疾患、疾患の徴候、疾患に伴う病状、または疾患にかかりやすい素因を、癒し、軽減し、緩和し、改善し、予防し、または和らげる目的で対象者に組成物を投与することとして定義する。「有効な量」とは、治療を施された対象者において医学的に望ましい結果、例えば前述のような結果をもたらしうる組成物の量である。
【００１５】
本発明の１以上の実施形態の詳細については、添付の図面および以降の詳細な説明において述べる。本発明のその他の特徴、目的、および有利な点については、該説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（詳細な説明）
本発明は、ＳＡＲＳウイルスのプロテイン３ａおよび同タンパク質の断片に関する。これらのポリペプチドはＳＡＲＳを診断または治療するための標的となりうる。
【００１７】
ＳＡＲＳ‐ＣｏＶのゲノムは、長さ２９．７ｋｂであり、特徴的な遺伝子の順序［５’‐レプリカーゼ（ｒｅｐ）、スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）、ヌクレオキャプシド（Ｎ）‐３’］と両端の短い非翻訳領域とを有する典型的なコロナウイルスのゲノム構成を備えている。（ロタ（Rota）ら、２００３年、サイエンス誌（Science ）、第３００巻、ｐ．１３９４‐１３９９を参照のこと）。ＳＡＲＳ‐ＣｏＶゲノムは、６つの既知タンパク質および８つの未知タンパク質をコードする１４個の推定オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいる（スニジャ（Snijder ）ら、２００３年、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー誌、第３３１巻、ｐ．９９１‐１００４、およびシール（Thiel ）ら、２００３年、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ヴァイラロジー誌（J. Gen. Virol.）、第８４巻、ｐ．２３０５‐２３１５）。ＳＡＲＳ‐ＣｏＶゲノムのＯＲＦ３ａは、Ｓタンパク質およびＥタンパク質をコードする遺伝子の間に位置し、機能未知のプロテイン３ａをコードしている。
【００１８】
以下の実施例に示すように、プロテイン３ａは確かにＳＡＲＳ‐ＣｏＶにより発現される。本発明のポリペプチドは、配列番号１または免疫原性を有するその断片を含む。配列番号１の機能的等価物も本発明の範囲内にある。配列番号の機能的等価物とは、コロナウイルスのプロテイン３ａ由来のポリペプチド、例えば、融合ポリペプチド、または１以上の点突然変異、挿入、欠失、切断（truncation）、もしくはこれらの組合せを有するポリペプチドを意味する。具体的には、そのような機能的等価物には、１もしくは複数の保存的アミノ酸置換により、または１もしくは複数の非保存的なアミノ酸の置換、欠失、もしくは挿入によりプロテイン３ａと異なる配列を有するポリペプチドが挙げられる。そのような機能的等価物は、高度にストリンジェントな条件下で配列番号３、４、または６の配列のプローブにハイブリダイズする核酸によりコードされうる。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、約４５℃の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でハイブリダイゼーションし、次に５０‐６５℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回以上洗浄する条件を意味する。上述の機能的等価物は全てプロテイン３ａの細胞内ターゲティング活性、すなわち実施例５において後述するようにポリペプチドを特定の細胞内コンパートメントへと導く能力をほぼ維持している。この活性は、免疫蛍光法を用いた顕微鏡観察により、または実施例で述べるように細胞分画法により調べることができる。
【００１９】
プロテイン３ａのポリペプチドまたは免疫原性を有するその断片を、合成ポリペプチドまたは組換えポリペプチドとして得ることができる。組換えポリペプチドを調製する場合は、同ポリペプチドをコードする核酸を、融合パートナー、例えば、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓエピトープタグ、またはＭ１３のＧｅｎｅ３タンパク質などをコードする別の核酸に連結させればよい。その結果得られる融合核酸は適切な宿主細胞内で融合タンパク質を発現するが、このタンパク質は当技術分野で周知の方法により単離することができる。単離した融合タンパク質を、例えば酵素消化によりさらに処理し、融合パートナーを取り除いて本発明の組換えポリペプチドを得ることができる。
【００２０】
本発明のポリペプチドは、動物（抗体製造用）またはヒト（疾患治療のため）において抗体を生成させるために使用することができる。動物においてモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびにこれらの断片を作製する方法は当技術分野において周知である。例えば、ハーロウ（Harlow）およびレーン（Lane）、１９８８年、「抗体：実験の手引き（Antibodies: A Laboratory Manual ）」、米国ニューヨーク所在のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズを参照されたい。「抗体」という用語には、抗体分子そのものならびにその断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖抗体）、およびｄＡｂ（ドメイン抗体；ウォード（W ard）ら、１９８９年、ネイチャー誌
（Nature）、第３４１巻、ｐ．５４４）などが含まれる。これらの抗体を、例えば対象者由来の試験サンプルがＳＡＲＳウイルスを含んでいるかどうかを調べる場合、あるいは該ポリペプチドに結合する化合物を同定する場合の、プロテイン３ａの検出に使用することができる。これらの抗体は、ＳＡＲＳの治療のためにも有用である。
【００２１】
通常、本発明のポリペプチドをＫＬＨなどの担体タンパク質に結合させ、アジュバントと混合し、宿主動物に注射すればよい。次いで該動物において生産された抗体をペプチドアフィニティクロマトグラフィにより精製すればよい。よく使用される宿主動物には、ウサギ、マウス、モルモット、およびラットが挙げられる。免疫応答を増強するために使用可能な種々のアジュバントは宿主動物種によって変わるが、フロイントのアジュバント（完全アジュバントおよび不完全アジュバント）、水酸化アルミニウムゲルなどの鉱物のゲル、リゾレシチンなどの界面活性剤、ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性の乳化物、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールなどが挙げられる。有用なヒトアジュバントには、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム  パルバムが挙げられる。
【００２２】
ポリクローナル抗体、すなわち不均一な抗体分子の集団は、免疫化された対象者の血清中に存在している。モノクローナル抗体、すなわち本発明のポリペプチドに対する抗体の均一な集団は、標準的なハイブリドーマ技術を用いて調製することができる（例えば、コーラー（Kohler）ら、１９７５年、ネイチャー誌、第２５６巻、ｐ．４９５；コーラー（Kohler）ら、１９７６年、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー誌（Eur. J. Immunol.）、第６巻、ｐ．５１１；コーラー（Kohler）ら、１９７６年、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー誌、第６巻、ｐ．２９２；およびハンマーリング（Hammerling）ら、１９８１年、「モノクローナル抗体とＴ細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas ）」、米国ニューヨーク所在のエルゼビア（Elsevier）を参照されたい）。具体的には、モノクローナル抗体は、例えばコーラー（Kohler）ら、１９７５年、ネイチャー誌、第２５６巻、ｐ．４９５および米国特許第４，３７６，１１０号に記載の継続的な培養細胞株による抗体分子の産生をもたらす任意の技法；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（コスボール（Kosbor）ら、１９８３年、イムノロジー・トゥデイ誌（Immunol Today ）、第４巻、ｐ．７２；コール（Cole）ら、１９８３年、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー．エス．エイ．誌、第８０巻、ｐ．２０２６）、ならびにＥＢＶ‐ハイブリドーマ技法（コール（Cole）ら、「モノクローナル抗体と癌治療法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）」、アラン・アール．リス・インコーポレイテッド（Alan R. Liss, Inc.）、ｐ．７７−９６）により得ることができる。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ならびにこれらの任意のサブクラスを含む、任意の免疫グロブリンクラスでありうる。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、生体外（in vitro）で培養してもよいし、生体内（in vivo ）で培養してもよい。生体内（i n vivo ）で高力
価のモノクローナル抗体を産生する能力を有するハイブリドーマは、特に有用な生産法となる。
【００２３】
加えて、「キメラ抗体」の生産のために開発された技法を用いることができる。例えば、モリソン（Morrison）ら、１９８４年、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー．エス．エイ．誌、第８１巻、ｐ．６８５１；ノイベルガー（Neuberger ）ら、１９８４年、ネイチャー誌、第３１２巻、ｐ．６０４；およびタケダら、１９８４年、ネイチャー誌、第３１４巻、ｐ．４５２を参照されたい。キメラ抗体とは、例えばマウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域とを有する抗体のように、様々な部分が異なる動物種に由来している分子である。別例として、一本鎖抗体の生産について報告された技法（米国特許第４，９４６，７７８号および第４，７０４，６９２号）を、一本鎖Ｆｖ抗体のファージライブラリの作製に合わせて使用することもできる。一本鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖断片と軽鎖断片とをアミノ酸の架橋を介して連結することにより形成される。さらに、抗体断片は周知の技法により生成させることもできる。例えば、そのような断片として、抗体分子のペプシン消化により生じるＦ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生じるＦａｂ断片が挙げられるが、これらに限定はされない。当技術分野に周知の方法で抗体をヒト化することもできる。例えば、所望の結合特異性を備えたモノクローナル抗体を商業的にヒト化することも可能である（スコットランド国所在のスコットジーン（Scotgene）；米国カリフォルニア州パロアルト所在のオックスフォード・モレキュラー（Oxford Molecular）。完全なヒト型抗体、例えばトランスジェニック動物において発現されたヒト型抗体も、本発明の特徴である（例えば、グリーン（Green ）ら、１９９４年、ネイチャー・ジェネティクス誌（Nature Genetics ）、第７巻、ｐ．１３；ならびに米国特許第５，５４５，８０６号および同第５，５６９，８２５号を参照されたい）。
【００２４】
本発明のポリペプチドを、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ）に感染しやすい対象者において該コロナウイルスに対する抗体を生成させるための免疫原性組成物（例えばワクチン）を調製するために使用することもできる。そのような組成物は、例えば下記の実施例に記載の方法に従って、あるいは当技術分野で周知の他の任意の同等の方法によって調製することができる。該組成物は、有効な量の本発明のポリペプチドと、リン酸緩衝生理食塩水や重炭酸塩溶液などの医薬として許容可能な担体とを含む。担体は、投与形態および投与経路、ならびに標準的な薬務に基づいて選択される。適切な薬学的担体および希釈剤、ならびにこれらを使用するうえでの薬学上の必要事項については、レミントンの薬科学（Remington's Pharmaceuticals Sciences）に記載されている。アジュバント、例えばコレラ毒素、大腸菌易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）、リポソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、または免疫刺激性の配列を有するオリゴデオキシヌクレオチド（immunostimulatory sequences oligodeoxynucleotide：ＩＳＳ−ＯＤＮ）を、必要であれば本発明の組成物に含めることができる。プロテイン３ａまたはその断片もしくは類似体は、呼吸器疾患に対する多価ワクチン組成物の成分となりうる。この多価組成物には、少なくとも１種類の、上述の免疫原性を有するプロテイン３ａ断片が、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ブランハメラ（モラクセラ）ガタラリス、スタフィロコッカス・オーレウス、または呼吸器合胞体ウイルスから単離された少なくとも１種類の保護抗原とともに含まれており、アジュバントは含まれていても含まれていなくてもよい。
【００２５】
ワクチンを調製する方法は当技術分野で一般に知られており、米国特許第４，６０１，９０３号、同第４，５９９，２３１号、同第４，５９９，２３０号、および同第４，５９６，７９２号に例証されている。ワクチンを、液状の溶液または乳化物として、注射物質として調製することができる。プロテイン３ａまたはその断片もしくは類似体を、生理学的に許容可能かつ適合性のある賦形剤と混合してもよい。賦形剤としては、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せが挙げられる。ワクチンは、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはワクチンの効力を増強するためのアジュバントなど、微量の補助剤をさらに含んでいてもよい。ワクチンにアジュバント
効果をもたらす方法には、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウム（ミョウバン）などの薬剤を、通常０．０５〜０．１％のリン酸緩衝生理食塩水溶液として使用することが挙げられる。ワクチンは、皮下注射または筋肉内注射により非経口投与することができる。別例として、座剤および経口用製剤などの他の投与形態も望ましい。座剤については、結合剤および担体に、例えばポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドが含まれていてもよい。経口用製剤は、例えば医薬品等級のサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤を含んでいてもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル剤、カプセル剤、徐放製剤または散剤の形態をとり、１０〜９５％のプロテイン３ａ、断片類似体、またはペプチドを含有する。
【００２６】
ワクチンを、剤形に適合した方法で、治療上有効で保護的かつ免疫原性を有する量を投与する。投与すべき量は、治療しようとする対象者によって、例えば、個人の免疫系が抗体を合成する能力や（必要であれば）細胞性免疫応答を生じる能力などによって変わる。投与に必要な活性成分の正確な量は、医師の判断によって決まる。しかしながら、当業者には適切な用量の範囲を容易に決定することが可能であり、適切な用量の範囲はマイクログラム単位の本発明のポリペプチドであろう。初回投与およびブースター投与の用量についての適切な投与計画も可変的であるが、初回投与とその後の投与とが含まれるであろう。ワクチンの用量は投与経路によっても変わり、宿主の大きさによっても変わる。
【００２７】
生体内（in vivo ）においてポリペプチドを使用するには、まずペプチドの化学修飾が必要になるであろう。というのも、ペプチドの半減期は十分には長くないからである。化学修飾ペプチドまたはペプチド類似体には、本発明の実施に関して生体内（in vivo ）または試験管内（in vitro）で安定性および有効性の少なくともいずれかが増大していることを特徴とする、該ペプチドの機能上等価な任意の化学的等価物が挙げられる。ペプチド類似体という用語は、本明細書において述べるペプチドの任意のアミノ酸誘導体も意味する。ペプチド類似体は、側鎖の修飾、ペプチド合成時の非天然型アミノ酸および／またはその誘導体の取り込み、ならびに架橋剤の使用およびペプチドもしくはその類似体に構造上の制約を与える他の方法の使用など（これらに限定されない）の手法によって製造可能である。側鎖修飾の例には、アルデヒドと反応させてからＮａＢＨ４で還元することによる還元的アルキル化、メチルアセトイミデート（methylacetimidate ）によるアミド化；無水酢酸によるアセチル化；シアン酸によるアミノ基のカルバミル化；２，４，６トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアルキル化などのアミノ基の修飾、ならびにピリドキサール５’‐ホスファート処理後にＮａＢＨ４で還元するリジンのピリドキシル化などが挙げられる。アルギニン残基のグアニジノ基を、２，３‐ブタンジエン、フェニルグリオキサール、およびグリオキサールなどの試薬でヘテロ環縮合産物を形成させることにより修飾することが可能である。カルボキシル基を、ｏ‐アシルイソウレア形成後に続いて誘導体化して例えば対応するアミドにすることによるカルボジイミド活性化により、修飾することが可能である。スルフヒドリル基を、例えばヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；過ギ酸酸化によるシステイン酸形成；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応；４‐クロロマーキュリベンゾエート（4-chloromercuribenzoate ）、４‐クロロマーキュリフェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、２‐クロロマーキュリック‐４‐ニトロフェノールおよびその他の水銀剤による水銀誘導体の形成；アルカリ性ｐＨにおけるシアン酸塩によるカルバミル化などの方法により修飾することが可能である。トリプトファン残基を、例えばＮ‐ブロモスクシンイミドによる酸化または２‐ヒドロキシ‐５‐ニトロベンジルブロマイドもしくはスルフォニルハライドによるインドール環のアルキル化により修飾することができる。チロシン残基を、テトラニトロメタンでニトロ化して３‐ニトロチロシン誘導体を形成させることにより変化させることができる。ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化または
ピロ炭酸ジエチルによるＮ‐カルベトキシル化（N-carbethoxylation）により実施することができる。ペプチド合成時に非天然型のアミノ酸および誘導体を取り込む例には、ノルロイシン、４‐アミノブチル酸、４‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐５‐フェニルペンタン酸、６‐アミノヘキサン酸、ｔ‐ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐６‐メチルヘプタン酸、２‐チエニルアラニン、および／またはアミノ酸のＤ‐異性体の使用が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００２８】
本発明の核酸分子も、例えばサルモネラ、ＢＣＧ、アデノウイルス、ポックスウイルスまたはワクシニアなどの生のベクター（媒介物）を介して同核酸分子を対象者へ直接投与することにより、免疫化に直接使用することが可能である。核酸を用いる免疫化方法は当技術分野で周知である。
【００２９】
コロナウイルスに感染しやすい対象者を特定して、本発明のポリペプチド含有組成物を投与することができる。組成物の用量は、当業者であれば決定することができるように、例えば、個々のポリペプチドによって、ポリペプチドと共にアジュバントを投与するかどうかによって、一緒に投与するアジュバントの種類によって、投与形態および投与頻度によって決まる。当業者であれば決定することができるように、投与は必要に応じて反復してもよい。例えば、初回投与に続いて１週間おきに３回のブースター投与を実施してもよい。ブースター投与を初回の免疫化後４〜８週に実施し、同じ製剤を用いて第２のブースター投与を８〜１２週に実施してもよい。組成物によって誘発された、コロナウイルスのプロテイン３ａまたはコロナウイルス感染に対する免疫応答を調べるために、血清またはＴ細胞を対象者から採取すればよい。タンパク質または感染に対する抗体または細胞傷害性Ｔ細胞について調べる方法は、当技術分野において周知である。必要に応じて追加のブースター投与を実施してもよい。ポリペプチドの量、組成物の用量、および投与頻度を変化させることにより、最大の免疫応答を誘発するように免疫化プロトコールを最適化することができる。大規模に投与する前に、効力試験を実施することが望ましい。効力試験においては、ヒト以外の対象検体に経口または非経口経路で本発明の組成物を投与すればよい。初回投与後または任意実施のブースター投与後に、試験検体および対照検体（偽組成物投与）の双方にＬＤ９５用量のコロナウイルスを負荷投与する。致死率以外の評価項目も使用可能である。組成物を投与した検体の致死率が対照検体よりも低い場合に効力が確定する。致死率の違いは統計学的に有意でなければならない。
【００３０】
上述の抗体またはプロテイン３ａ断片を用いる診断方法も本発明の範囲内にある。プロテイン３ａ断片またはプロテイン３ａポリペプチド自体に対する抗体が対象者の体内に存在するということは、その対象者がコロナウイルスに感染していることを表している。該抗体またはポリペプチドを検出するために、対象者から試験サンプルを採取して、標準的な技法を用いて該抗体またはポリペプチドが存在するかどうかを検出する。検出技法の例としては、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、免疫蛍光法、ＥＩＡ、ＲＩＡ、およびウエスタンブロット分析などが挙げられる。サンプルは、滲出物、体液（例えば血清、羊水、中耳滲出液、唾液、気管支肺胞洗浄液）および組織などの臨床サンプルでよい。
【００３１】
本発明の核酸は、サンプル中のコロナウイルス（例えばＳＡＲＳ  ＣｏＶ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。様々なハイブリダイゼーション条件を用いて、標的配列に対するプローブの選択性の程度を変えることが可能である。選択性を高くするためには、ストリンジェントな条件、例えば［要約］の項において記載したような条件が必要である。
【００３２】
ハイブリダイゼーション反応は、溶液中においても固相上でも実施することができる。固相では、選択したマトリクスまたは表面にサンプル由来の試験配列を固定する。固定さ
れた該核酸を、次に、所望の条件下で、本発明の核酸からなる選択されたプローブとの特異的ハイブリダイゼーションに供する。選択される条件は、例えば、ＧＣ含量、標的核酸の種類、核酸の供給源、ハイブリダイゼーションプローブの長さなどに応じて必要とされる個々の基準に基づいた特定の状況によって決まるであろう。非特異的に結合したプローブ分子を取り除くためにハイブリダイゼーション表面を洗浄した後、標識を用いて特異的ハイブリダイゼーションを検出または定量する。選択されるプローブは少なくとも１８ｂｐでなければならず、３０ｂｐ〜９０ｂｐ長の範囲内にありうる。
【００３３】
本発明のポリペプチドに結合する新規な化合物（例えば抗体）は本発明の範囲内にある。そのような化合物を、例えばコンピュータ・モデリング・プログラムを用いて、該ポリペプチドの三次元構造に従って設計し、当技術分野において周知の技術により合成することが可能である。ライブラリをスクリーニングすることにより化合物を同定してもよい。そのような化合物をスクリーニングするためには、（１）候補化合物をプロテイン３ａ断片と接触させ、（２）該試験化合物と該ポリペプチドとの間の結合を測定すればよい。結合が認められるということは、その試験化合物がコロナウイルス感染を治療するために使用されうることを表している。
【００３４】
試験化合物は、当技術分野において周知のコンビナトリアル・ライブラリ法における数々の手法のうち任意のものを用いて入手可能である。そのようなライブラリとしては、ペプチドライブラリ、ペプトイドライブラリ（ペプチドの機能を備えているが、酵素分解に耐性を有する新規な非ペプチド性の骨格を有する分子のライブラリ）、空間的に位置指定可能な固相または溶液相の並列ライブラリ、デコンボルーションまたはアフィニティ・クロマトグラフィ選択により得られた合成ライブラリ、「１ビーズ１化合物（one-bead one-compound ）」ライブラリ、および抗体ライブラリなどが挙げられる。例えば、ズッカーマン（Zuckermann）ら、１９９４年、ジャーナル・オブ・メディカル・ケミストリー誌（J. Med. Chem. ）、第３７巻、ｐ．２６７８‐８５；ラム（Lam ）、１９９７年、アンタイキャンサー・ドラッグ・デザイン誌（Anticancer Drug Des.）、第１２巻、ｐ．１４５；ラム（Lam ）ら、１９９１年、ネイチャー誌、第３５４巻、ｐ．８２；ホーテン（Houghten）ら、１９９１年、ネイチャー誌、第３５４巻、ｐ．８４；ならびにソンヤン（Songyang）ら、１９９３年、セル誌（Cell）、第７２巻、ｐ．７６７を参照されたい。分子ライブラリの合成法の例は当技術分野において見出すことが可能である。例えば、デウィット（DeWitt）ら、１９９３年、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー．エス．エイ．誌、第９０巻、ｐ．６９０９；エルブ（Erb ）ら、１９９４年、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー．エス．エイ．誌、第９１巻、ｐ．１１４２２；ズッカーマン（Zuckermann）ら、１９９４年、ジャーナル・オブ・メディカル・ケミストリー誌（J. Med. Chem. ）、第３７巻、ｐ．２６７８；チョ（Cho ）ら、１９９３年、サイエンス誌、第２６１巻、ｐ．１３０３；キャレル（Carrell ）ら、１９９４年、アンゲヴァンテ・ヒェミー・インターナショナル・エディション・イン・イングリッシュ誌（Angew. Chem. Int. Ed. Engl. ）、第３３巻、ｐ．２０５９；キャレル（Carell）ら、１９９４年、アンゲヴァンテ・ヒェミー・インターナショナル・エディション・イン・イングリッシュ誌、第３３巻、ｐ．２０６１；ならびにギャロップ（Gallop）ら、１９９４年、ジャーナル・オブ・メディカル・ケミストリー誌、第３７巻、ｐ．１２３３に記載されている。化合物ライブラリは、溶液として提供されてもよいし（例えば、ホーテン（Houghten）、１９９２年、バイオテクニクス（Bi otechniques ）、第１３巻、ｐ．４１２‐４２１）、あるいはビーズ上
（ラム（Lam ）、１９９１年、ネイチャー誌、第３５４巻、ｐ．８２‐８４）、チップ上（フォドール（Fodor ）、１９９３年、ネイチャー誌、第３６４巻、ｐ．５５５‐５５６）、細菌上（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上（米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド上（カル（Cull）ら、１９９２年、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー．エス．エイ．誌、第８９巻、ｐ．１
８６５‐１８６９）、またはファージ上（スコット（Scott ）およびスミス（Smith ）、１９９０年、サイエンス誌、第２４９巻、ｐ．３８６‐３９０；デブリン（Devlin）、１９９０年、サイエンス誌、第２４９巻、ｐ．４０４‐４０６；クウィラ（Cwirla）ら、１９９０年、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー．エス．エイ．誌、第８７巻、ｐ．６３７８‐６３８２；フェリチ（Felici）、１９９１年、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー誌（J. Mol. Biol. ）、第２２２巻、ｐ．３０１‐３１０；および米国特許第５，２２３，４０９号）に提示されてもよい。
【００３５】
上述の抗体および化合物をＳＡＲＳの治療に用いることが可能である。従って、本発明は、例えば投与を必要とする対象者に有効な量の本発明の抗体または化合物を投与することによる、ＳＡＲＳの治療方法を特徴とする。治療すべき対象者を、ＳＡＲＳに特徴的な状態であるか、そのような状態に陥るリスクを負っているとして特定しうる。この方法は単独で実施してもよいし、他の薬物または治療法と一緒に実施してもよい。
【００３６】
生体内（in vivo ）における一手法においては、治療用組成物（例えば、本発明のポリペプチド、抗体、または化合物を含有する組成物）を対象者に投与する。一般に、抗体または化合物を、医薬として許容可能な担体（例えば、生理食塩水）に懸濁して、経口もしくは静脈内注入により投与するか、あるいは皮下、筋肉内、くも膜下、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内、もしくは肺内へ注射または移植する。
【００３７】
必要な用量は、投与経路の選択、製剤の性質、対象者の病気の性質、対象者の大きさ、体重、表面積および性別、投与される別の薬物、ならびに担当医の判断によって決まる。適切な用量は０．０１〜１００．０ｍｇ／ｋｇの範囲内にある。必要とされる用量が広範囲に変動することは、利用可能な組成物が様々であること、種々の投与経路により有効性に差異があることを考慮すれば予想されるべきことである。例えば、経口投与は静脈内注入による投与よりも高い用量が必要であると予想されよう。これらの用量レベルの変動は、当技術分野においてはよく理解されているように、最適化のための標準的な実証的手順を用いて調節することが可能である。適切な送達用ビヒクル（例えばポリマー微粒子または埋め込み可能なデバイス）に組成物を封入すると、送達（特に経口送達）の効率を高めることができる。
【００３８】
医薬として許容可能な担体と有効な量の本発明の抗体または化合物とを含む医薬組成物も、本発明の範囲内にある。該医薬組成物は、ＳＡＲＳの治療に使用することができる。医薬として許容可能な担体には、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、ならびに等張化剤および吸収遅延剤が挙げられる。
【００３９】
本発明の医薬組成物を、従来の方法を利用して様々な投与経路のための投与形態に製剤化することができる。例えば、本発明の医薬組成物を経口投与用のカプセル剤、ゲル封入剤（gel seal）、または錠剤に製剤化することができる。カプセル剤には、ゼラチンまたはセルロースなど医薬として許容可能な任意の標準的な材料を含めることができる。錠剤は、組成物と固体担体および潤滑剤との混合物を圧縮することにより、従来の手順に従って製剤化することができる。固体担体の例には、デンプンおよびシュガーベントナイトが挙げられる。組成物を、結合剤（例えば、ラクトースまたはマンニトール）、従来の充填剤、および錠剤化剤を含んだハードシェル錠剤またはカプセル剤の形態で投与してもよい。本発明の医薬組成物を、非経口経路により投与してもよい。非経口の投与形態の例には、活性物質の水溶液、等張生理食塩水溶液または５％グルコース溶液、あるいはその他のよく知られた医薬として許容可能な賦形剤が挙げられる。シクロデキストリンまたはその他の当業者によく知られた可溶化剤を、治療剤の送達のための薬学的賦形剤として利用してもよい。
【００４０】
本発明の組成物の有効性を、試験管内（in vitro）および生体内（in vivo ）のいずれにおいても評価することができる。生体内で評価する場合、組成物を動物（例えばマウスのモデル）に注射して、次いでその治療効果を調べることができる。その結果に基づいて、適切な用量範囲および投与経路を決定することができる。
【００４１】
以下の具体的な実施例は単に例示的なものとみなすべきであり、開示内容の残りの部分を如何様にも限定するものとみなすべきではない。さらに詳述しなくとも、当業者であれば、本明細書の記載に基づいて本発明をその最大限まで利用することができると思われる。本明細書において引用された全ての出版物はその全体が本願に援用される。
【実施例１】
【００４２】
ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ（ＴＷ１株）を感染させたＶｅｒｏＥ６細胞から、スウエー（H sueh
）ら、２００３年、エマージング・インフェクシャス・ディジーズ誌（Emerg. Infect. Dis. ）、第９巻、ｐ．１１６３‐１１６７またはチョムツィンスキー（Chomczynski ）
ら、１９８７年、アナリティカル・バイオケミストリー誌（Anal. Biochem.）、第１６２巻、ｐ．１５６‐１５９に記載されているような一段階抽出法を用いて全ＲＮＡを単離した。推定上のプロテイン３ａをコードする遺伝子（オープンリーディングフレーム３ａ、ＯＲＦ３ａ）を増幅して配列決定するために使用したプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＹ２９１４５１のヌクレオチド２５２６８‐２６０９２に基づいて設計した。この推定遺伝子（マーラ（Marra ）ら、２００３年５月３０日、サイエンス誌、第３００巻、ｐ．１３９９‐４０４）は、Ｓ糖タンパク質遺伝子（ＣＤＳ：２１４９２〜２５２５９）およびＥタンパク質遺伝子（ＣＤＳ：２６１１７〜２６３４７）の間に位置している。最小の転写調節配列（５’‐ＡＣＧＡＡＣ‐３’）がＯＲＦ３ａ（ＣＤＳ：２５２６０〜２５２６５）の上流に位置している。次の２つのオリゴヌクレオチド：
センス鎖：５’‐ＡＴＧＧＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴＡＣＴ‐３’
アンチセンス鎖：５’‐ＣＡＡＡＧＧＣＡＣＧＣＴＡＧＴＡＧＴＣＧＴＣＧＴ‐３’を使用した。これらの２種のプライマーはそれぞれＮ末端のＭＤＬＦＭＲＦＦＴ部分およびＣ末端のＴＴＴＴＳＶＰＬ部分に対応する。次いでオープンリーディングフレームをＰＣＲにより増幅させた。増幅産物を電気泳動により分析し、ｐＳＴＢｌｕｅベクター（米国ウィスコンシン州マディソン所在のノバジェン（Novagen ））にサブクローニングし、次いで大腸菌のＤＨ５α株を形質転換した。陽性クローン由来のプラスミドをＡＢＩ３１００型シーケンサ（米国カリフォルニア州フォスターシティ所在のアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems））により配列解析した。
【００４３】
このオープンリーディングフレームは、理論上の分子量が約３０．９ｋＤａである２７４アミノ酸のタンパク質（すなわちプロテイン３ａ）をコードすることが予測された。ＢＬＡＳＴ解析から、プロテイン３ａのＮ末端部分は、細菌（ラルストニア・ソラナセアルム：Ralstonia solanacearum）の推定シトクロムＢ‐５６１膜貫通タンパク質と〜２９％同一であり、かつスズメガ（タバコスズメガ：Manduca sexta ）由来のオプシン断片およびチョウ（メスグロトラフアゲハ：Popilio glaucus ）由来のロドプシンと２４％同一であった。Ｃ末端部分は、寄生虫（熱帯熱マラリア原虫：Plasmodium falciparum ）のカルシウム輸送ＡＴＰアーゼおよび細菌（シェワネラ・オネイデンシス：Shewanella oneidensis ）の外膜ポリンに中程度の類似性（それぞれ４１％および２７％）を有していた。プロテイン３ａ配列全長については、いかなる既知タンパク質とも有意な類似性はなかった。
【００４４】
プロテイン３ａの疎水性および極性について、標準的な技法（ホップ（Hopp）ら、１９８１年、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー．エス．エイ．誌、第７８巻、ｐ．３８２４‐３８２８ならびにグランサム（Granth
am）、１９７４年、サイエンス誌、第１８５巻、ｐ．８６２‐８６４）を用いて調べた。Ｎ末端部分に極性が低く疎水性の高い３つの領域が見出された。膜タンパク質構造予測ＤＡＳ（Dense Alignment Surface method：チェルゾ（Cserzo）ら、１９９７年、プロテイン・エンジニアリング誌（Prot. Eng.）、第１０巻、ｐ．６７３‐６７６）により予測された膜貫通領域は、次の３つの領域、すなわちアミノ酸４３‐５６位、７９‐９７位、および１０６‐１１６位に位置していた。これらの結果から、プロテイン３ａがＳＡＲＳ‐ＣｏＶと細胞膜との相互作用において役割を担っていることが示唆される。
【実施例２】
【００４５】
組換えプロテイン３ａを作製した。上述のコード配列をｐＧＥＸ  ４Ｔ‐２ベクター（スウェーデン国所在のアマシャム・バイオサイエンシズ・インコーポレイテッド（Amersham Biosciences Inc. ））に挿入し、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードする配列にフレームを合わせて融合させた。得られたベクターで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（米国ウィスコンシン州マディソンに所在のノバジェン）を形質転換した。０．５ｍＭイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシドにより３７℃で３時間処理してＧＳＴ‐プロテイン３ａ融合体の発現を誘導した。純粋な組換えプロテイン３ａを得るために、トロンビンでプロテアーゼ消化してからグルタチオン‐Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂアフィニティ・クロマトグラフィ（アマシャム・バイオサイエンシズ・インコーポレイテッド）を製造業者の指示書に従って実施し、ＧＳＴタグを除去した。簡単に述べると、誘導処理したＢＬ２１細胞を１ｍＭのＰＭＳＦを含むＰＢＳ緩衝液に懸濁し、次いで氷浴中で１分間超音波処理した。溶解した細胞を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上清を、ＰＢＳ緩衝液で平衡化したグルタチオン‐Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂカラムに供し、次いでそのカラムを、カラム容量の１０倍の同じＰＢＳ緩衝液で洗浄した。ＧＳＴ‐プロテイン３ａ融合体を結合させた後、カラムを５０ユニットのトロンビンを含むＰＢＳとともに２５℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳを用いて、ＧＳＴを含まない組換えプロテイン３ａを溶出させて回収した。このタンパク質の純度を、１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびクーマシーブルーを用いた可視化により決定した。
【実施例３】
【００４６】
プロテイン３ａに対するポリクローナル抗体を作製した。標準的な技法を用いて２種のペプチドＣＰＩＹＤＥＰＴＴＴＴＳＶＰＬ（ペプチドＰ２、配列番号７）およびＳＤＮＧＰＱＳＮＱＲＳＡＣ（ペプチドＮ１、配列番号８）を合成したが、これらのペプチドはそれぞれプロテイン３ａの２６１‐２７４位の残基（すなわち配列番号５）およびヌクレオキャプシドタンパク質の１‐１２位の残基を含んでいる。２種のペプチドをそれぞれキーホールリンペットヘモシアニンと結合させ、０．５ｍｌのＰＢＳに溶解し、等容量のＴｉｔｅｒＭａｘ（商標）アジュバント（米国ジョージア州ノルクロス（Norcross）所在のシトルックス・インコーポレイテッド（CytRx Inc.））を用いて乳化してから、３ヶ月齢のニュージーランドホワイトウサギに投与した。３週間後、このウサギに、キーホールリンペットヘモシアニンと結合させた前記２種のペプチドをそれぞれフロイントの不完全アジュバント中に乳化したものを用いて皮内注射によりブースター投与を行った。さらに３週間後にも同じ方法で再度ウサギにブースター投与を行った。その後、最後のブースター投与時から１２日間隔で抗血清を回収した。ウエスタンブロット法により抗体の特異性を調べた。
【００４７】
より詳細には、タンパク質サンプルを１２．５％のＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルで分離した後に、ＰＶＤＦ膜上にエレクトロブロッティングで転写した。次にこの膜をスキムミルクでブロッキング処理し、抗Ｐ２ウサギ抗血清（１：２０００〜３０００希釈）またはＳＡＲＳ‐ＣｏＶ感染患者由来の血清を合わせたもの（１：１００希釈）とともに４℃で１６時間インキュベートした。結合した抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識し
たロバの抗ウサギＩｇＧ抗体（アマシャム・バイオサイエンシズ・インコーポレイテッド）またはヒツジの抗ヒトＩｇＧ抗体（アマシャム・バイオサイエンシズ・インコーポレイテッド）で検出した。標的タンパク質を、高感度ケミルミネッセンス（ＥＣＬ、アマシャム・バイオサイエンシズ・インコーポレイテッド）発色システムにより可視化した。
【００４８】
結果から、大腸菌から精製した組換えプロテイン３ａは、抗Ｐ２抗体およびＳＡＲＳ‐ＣｏＶ感染患者由来の血清を合わせたものにより認識されることが示された。これに対し、同タンパク質は免疫前の血清を用いても検出されず、このことはＳＡＲＳ‐ＣｏＶが確かにプロテイン３ａを発現していることを示している。
【実施例４】
【００４９】
ＶｅｒｏＥ６細胞において組換えプロテイン３ａを一過性発現させた。より具体的には、プロテイン３ａをコードする上述の配列をｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ‐Ｈｉｓベクター（米国カリフォルニア州サンディエゴ所在のインビトロジェン（Invitrogen））にサブクローニングした。ＶｅｒｏＥ６細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ‐１５８６）は、２ｍＭのＬ‐グルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、および１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ギブコ‐ビーアールエル（Gibco-BRL ））中で培養した。
【００５０】
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ‐Ｈｉｓ／プロテイン３ａプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）試薬（米国カリフォルニア州サンディエゴ所在のインビトロジェン）と混合し、製造業者の指示書に従って細胞をトランスフェクションした。４８時間後、細胞をハーベストしてＰＢＳで２回洗浄し、ウエスタンブロット法に供した。プロテイン３ａの発現は検出されなかった。その他数種の細胞株においてもＳＡＲＳのプロテイン３ａを発現させることを試みたが、すべて失敗に終わった。
【００５１】
プロテイン３ａはＳＡＲＳ‐ＣｏＶに感染した細胞においてのみ選択的に発現するのではないかという仮説が立てられた。従って、感染状態でトランスフェクションする（infected-transfection ）一過性発現システムを用いてＶｅｒｏＥ６細胞においてプロテイン３ａを発現させた（チョムツィンスキー（Chomczynski ）ら、１９８７年、アナリティカル・バイオケミストリー誌（Anal. Biochem.）、第１６２巻、ｐ．１５６‐１５９；ワイアット（Wyatt ）ら、１９９５年、ヴァイラロジー（Virology）、第２１０巻、ｐ．２０２‐２０５；フェルスト（Fuerst）ら、１９８６年、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー．エス．エイ．誌、第８３巻、ｐ．８１２２‐８１２６；およびレヴィス（Lewis ）ら、１９９６年、ジャーナル・オブ・ヴァイラロジー（J. Virol. ）、第７０巻、ｐ．２８６９‐２８７５）。最初に、ＶｅｒｏＥ６細胞（１×１０６）を１×１０５感染ユニットのワクシニアウイルス／バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼハイブリッドに感染させた。２時間後、約１５μｇのＤＮＡを用いて前記細胞をトランスフェクションし、ハーベストし、抗Ｐ２抗体を用いて上述の方法でウエスタンブロット解析した。細胞は、分子量〜３７ｋＤａと推測される組換えＭｙｓ‐Ｈｉｓタグ付きプロテイン３ａを発現していることがわかった。非感染状態でトランスフェクションした細胞由来の溶解物にはシグナルは検出されなかった。
【００５２】
ＳＡＲＳ‐ＣｏＶがプロテイン３ａを発現することをさらに確認するため、ＶｅｒｏＥ６細胞をＳＡＲＳ‐ＣｏＶ  ＴＷ１で４、８、１２、または２４時間感染させた。感染細胞ならびに対照の非感染細胞をハーベストし、ＳＤＳ‐サンプル用緩衝液で処理して細胞溶解物を作製した。該溶解物を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ／クーマシーブルー染色またはウエスタンブロット法により上述のようにして調べたが、ウエスタンブロット法については、抗Ｐ２抗体、５ｍＭのＰ２ペプチドとともにプレインキュベートした抗Ｐ２抗体、または抗ヌクレオキャプシド（抗Ｎ１）抗体を用いた。
【００５３】
プロテイン３ａの発現はヌクレオキャプシドタンパク質の発現と同様に感染後８〜１２時間で検出され、約２４時間後には一層高いレベルに達した。抗Ｐ２抗体を（Ｎ１ペプチドではなく）Ｐ２ペプチドとともにプレインキュベートすると、抗Ｐ２抗体のプロテイン３ａへの結合が抑制されることから、プロテイン３ａが特異的に検出されていることが示された。
【実施例５】
【００５４】
プロテイン３ａの細胞内局在について、免疫蛍光法を用いた顕微鏡観察ならびに細胞分画により調べた。
免疫蛍光法を用いた顕微鏡観察には、６×１０４個のＶｅｒｏＥ６細胞を１２ウェルプレートに入ったカバー・スリップ上で増殖させ、次いで１μｇのｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ‐Ｈｉｓ／プロテイン３ａプラスミドを用いて上述のようにして感染状態でトランスフェクションした。４８時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド‐ＰＢＳ中で室温にて５分間固定し、氷冷メタノール中で５分間透過化処理した。間接的免疫蛍光染色を標準的な方法（リン（Lin ）ら、２０００年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー誌（J. Biol. Chem.）、第２７５巻、ｐ．３７８１５‐３７８２３）で実施した。細胞をＰＢＳに含めた０．２％のウシ血清アルブミン、０．１％サポニンでブロッキング処理し、続いて抗Ｐ２ペプチド特異的ウサギ抗血清（１：６００）または抗ＳＡＲＳ  Ｍタンパク質ウサギ抗血清とともに３０分間インキュベートした。細胞小器官を可視化するために、数多くの細胞小器官特異抗体（１：１０００希釈）をそれぞれ抗Ｐ２抗体とともにコインキュベートした。これらの抗体には、ゴルジ体の５８Ｋタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（シグマ（Sigma ））、β‐ＣＯＰタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（シグマ）、カルネキシンタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（アフィニティ・バイオリエージェンツ（Affinity BioReagents））、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＰＭ‐２）に対するマウスモノクローナル抗体（ビーディーバイオサイエンシズ（BD Biosciences））、ならびにシトクロムｃオキシダーゼサブユニット１（ＣＯＸ１）に対するマウスモノクローナル抗体（モレキュラープローブス（Molecular Probes））が含まれていた。
【００５５】
ＰＢＳで３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ４８８と結合させた抗ウサギＩｇＧ抗体（モレキュラープローブス）およびＡｌｅｘａ５９４と結合させた抗マウスＩｇＧ抗体などの二次抗体とともに細胞をインキュベートしてから、ＤＮＡ色素であるＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色した。最後に、細胞を再びＰＢＳで３回洗浄し、Ｍｏｗｉｏｌ（登録商標）でマウントし、ツァイス（Zeiss ）のエピ蛍光用顕微鏡Ａｘｉｏｐｈｏｔ（商品名）ならびにバイオラッド（Bio-Rad ）のＲａｄｉａｎｃｅ（商品名）２１００共焦点顕微鏡下で調べた。
【００５６】
結果から、ＶｅｒｏＥ６細胞において、組換えプロテイン３ａは、微細な断続的パターンで細胞質全体に分布しながら、一部はゴルジ装置に集中して染まったことがわかる。ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ感染後６時間のＶｅｒｏ細胞においても、同様のプロテイン３ａの免疫蛍光染色が観察された。しかしながら、発現レベルは感染後２４時間の発現レベルよりも低かった。さらに、市販のＳＡＲＳ‐ＣｏＶ感染細胞のスライド（ドイツ連邦共和国所在のユーロイミュン・インコーポレイテッド（Euroimmun Inc.）について同一の実験を実施した場合も、（１）プロテイン３ａは断続的パターンで検出され、一部はゴルジ装置に集中して染まるが、小胞体（ＥＲ）、リソソーム、またはミトコンドリアには検出されない；かつ（２）プロテイン３ａならびにＭタンパク質はゴルジ装置マーカータンパク質β‐ＣＯＰとともに局在する、ということが示された。
【００５７】
ＶｅｒｏＥ６細胞における組換えプロテイン３ａの細胞内分布をさらに評価するために
、細胞分画を実施した。ＶｅｒｏＥ６細胞の細胞基質画分（Ｃ）および膜画分（Ｍ）を、ＣＮＭコンパートメントタンパク質抽出キット（CNM compartment protein extraction kit、米国カリフォルニア州ヘイワード所在のバイオチェーン・インスティテュート・インコーポレイテッド（BioChain Institute Inc. ））を用いて製造業者の指示書に従って調製した。簡単に述べると、感染状態でトランスフェクションしたＶｅｒｏＥ６細胞（１×１０６個）をハーベストし、ＰＢＳで洗浄し、次いで１，０００×ｇで５分間遠心分離した。プロテアーゼ阻害剤の混合物を含んだ１００μｌのバッファＣで細胞のペレットをホモジナイズし、４℃で２０分間インキュベートし、４℃、１２，０００×ｇで２０分間遠心分離して可溶性の細胞基質画分（Ｃ）を得た。不溶性のペレットを２００μｌのバッファＷで洗浄し、５０μｌのバッファＮに４℃で２０分間再懸濁した。核タンパク質を抽出し、４℃、１２，０００×ｇで２０分間遠心分離した後に上清中に回収した。最後に、膜タンパク質を得るために、細胞の破片を含む細胞ペレットを５０μｌのバッファＭで抽出し、次いで４℃で２０分間インキュベートした。上清を４℃、１２，０００×ｇで２０分間遠心分離して可溶性の膜画分を得た。分画したタンパク質溶液は全て−７０℃で保管した。
【００５８】
ウエスタンブロット解析を用いて、上記細胞成分画分中のプロテイン３ａ、カルネキシン（ＥＲ膜のマーカー）、およびα‐チューブリン（細胞質のマーカー）の分布を調べた。プロテイン３ａは膜画分中に検出されることがわかった。この結果は、生体内（in vivo ）においてＳＡＲＳ‐ＣｏＶが実際に膜に結合したプロテイン３ａを発現していることを示している。Ｓタンパク質およびＭタンパク質などのウイルスの膜タンパク質は、小胞体‐ゴルジ中間コンパートメントに入り、一方で完全長の複製ＲＮＡ（＋鎖）はＮタンパク質と会合することが知られている（フィールズ（Fields）ら、２００１年、「フィールズ・ウイルス学（Fields Virology ）第４版」、フィラデルフィア所在のリッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Lippincott Williams & Wilkins ））。このＲＮＡとタンパク質との複合体が次にＥＲの膜に埋め込まれたＭタンパク質と結合し、そしてヌクレオキャプシド複合体がＥＲ内へと芽状に生成されるにつれてウイルス粒子が形成される。次にウイルスはゴルジ複合体を通り抜けて移動し、最終的にはおそらくエクソサイトーシスにより細胞から出る。興味深いことであるが、プロテイン３ａは一部がゴルジのマーカータンパク質ｐ５８とともに局在し、断続的なパターンはプロテイン３ａが膜に結合した分子である結果かもしれない。
【実施例６】
【００５９】
反復性の胸痛と呼吸困難により２００３年４月２３日に国立台湾大学付属病院に収容された７３歳の男性ＳＡＲＳ患者について、プロテイン３ａの発現を調べた。この患者は２年前に心筋梗塞の発作を起こしていた。入院後、微熱を発し、連続的な胸部Ｘ線による検証から進行性の肺浸潤が認められた。咽頭スワブからＳＡＲＳ‐ＣｏＶが単離され、さらにＲＴ‐ＰＣＲによりウイルスゲノムの存在が確認された。入院７日後にこの患者は急性心筋梗塞により死亡した。早急に限定的病理解剖を実施し、肺、心臓、腎臓、肝臓、小腸および膵臓を無作為にサンプリングした。肺組織のＨ‐エオシン染色から、鬱血および巣状の浮腫が示された。ＳＡＲＳ‐ＣｏＶに感染していない肺の生検標本３種も陰性対照として含めた。全ての組織標本を１０％の中性ホルマリン中で固定した。従来の方法によりパラフィンに包埋した塊と連続切片とを作製した。
【００６０】
免疫組織化学的な染色のために、Ｔｒｉｌｏｇｙ（商標）回収用バッファ（米国テキサス州オースティン所在のセル・マーク・コーオペレイション（Cell Marque Cooperation ））を用いてスチームヒート法（steam heat method ）により１０分間処理してスライドから抗原を回収した。内在性のペルオキシダーゼ活性を０．３％の過酸化水素で２０分間処理して抑制した。このスライドを抗Ｐ２抗体（１：５００）または予め免疫した血清とともに４℃で一晩インキュベートした。次いでこのスライドをＮｅｘｉｓ自動染色機（米
国アリゾナ州ツーソン所在のベンタナ（Ventana ））でベンタナ・ベーシック・アルカリホスファターゼ・レッド・ディテクション・キット（Ventana Basic Alkaline Phosphatase Red Detection Kit）を用いて連続的に染色し、ヘマトキシリンで対染色した。
【００６１】
プロテイン３ａは肺にのみ検出され、小腸、心臓、肝臓、膵臓、腎臓、またはリンパ節には検出されないことが判明した。ポジティブ染色により、肺胞を裏打ちする肺細胞および肺胞内の一部の細胞が主に染色された。肺胞腔に沿ったヒアリン膜はところどころポジティブに染色された。ポジティブ染色される領域は、肺の末梢部にパッチ様に分布して認められる傾向にあった。気管支上皮および肺血管内皮は陰性であった。これに対し、ＳＡＲＳではない患者の組織切片全てにおいてプロテイン３ａは検出されなかった。予め免疫した血清を用いると肺組織切片の染色は認められなかった。
【００６２】
（その他の実施形態）
本明細書に開示された全ての特徴を、任意の組合せに組み合わせることが可能である。本明細書に開示された各々の特徴を、同じ、等価、または類似の目的をはたす別の特徴に置き換えることが可能である。従って、別途特記しない限り、開示された各特徴は、包括的な一連の等価または類似の特徴についての一例にすぎない。
【００６３】
以上の説明から、当業者であれば本発明の本質的な特性を容易に確認することが可能であり、また本発明を様々な用途や条件に適合させるために、本発明の思想および範囲から逸脱することなく本発明に様々な変更および改変を施すことが可能である。従って、他の実施形態もまた特許請求の範囲の範囲内にある。
【配列表】
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【外国語明細書】
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