(57)【要約】  【課題】動的光散乱法を用いて、血液中の低密度リボ蛋白ＬＤＬの粒径を、簡単な装置構成により、かつ短時間で測定し、動脈硬化度の評価を行う。  【解決手段】人体から採取された血清又は血漿の中に含まれるＬＤＬの粒径分布を動的光散乱法で測定し、分布の５０％平均値が１０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲に入る粒径分布を特定し、その特定された粒径分布の広がりの度合いを示す指標である分散値を定量的に算出し、この算出された分散値を評価因子として、当該個体の動脈硬化度を評価する。さらに精度の高い評価を行うため、当該個体の年齢、性別を考慮する。【選択図】        図４
2005134205.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人体から採取された血清又は血漿の中に含まれる低密度リボ蛋白の粒径分布を動的光散乱法で測定し、
分布の５０％平均値が１０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲に入る粒径分布を特定し、
その特定された粒径分布の広がりの度合いを示す指標を定量的に算出し、
この算出された粒径分布の広がりの度合いを示す指標を評価因子として、当該個体の動脈硬化度を評価することを特徴とする動脈硬化評価方法。
【請求項２】
粒径分布の広がり度合いを示す指標が、分布の分散、又は分布のピークから任意の割合低下した幅のいずれかである請求項１記載の動脈硬化評価方法。
【請求項３】
前記粒径分布の広がりと、当該個体の年齢との２つを変数とする関数を定義して、この関数に基づいて動脈硬化度を評価する請求項１記載の動脈硬化評価方法。
【請求項４】
前記粒径分布の広がりと、当該個体の性別と、年齢との３つを変数とする関数を定義して、この関数に基づいて動脈硬化度を評価する請求項１記載の動脈硬化評価方法。
【請求項５】
人体から採取された血清又は血漿の中に含まれる低密度リボ蛋白の粒径分布を測定するための動的光散乱光度計と、
１０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲に入る粒径分布の広がりの度合いを示す指標を定量的に算出する、粒径分布の広がり算出手段と、
この算出手段により算出された粒径分布の広がりの度合いを示す指標を評価因子として、当該個体の動脈硬化度を評価する評価手段とを備えることを特徴とする動脈硬化評価装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動的光散乱法を用いて、人体から採取された血清又は血漿の中のＬＤＬ粒径分布を求め、動脈硬化の評価を行うことができる動脈硬化評価方法及び装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化度の定量的な評価方法として、頸動脈の内膜中膜複合体厚（ＩＭＴ;Intima-Media Thickness）の測定が有効な方法として認められている。頸動脈は動脈硬化の好発部位でその内膜中膜複合体の厚さは、動脈硬化の進行に比例して厚くなることが知られており、頸動脈のＩＭＴの計測が動脈硬化の指標として注目されている。特に、頸動脈のＩＭＴが1.1mmを超えると、脳血管障害や虚血性心疾患の発症率が高くなると報告されている。
【０００３】
また、前記ＩＭＴの計測以外に動脈硬化の診断方法として、従来の抗原抗体法で、血液中の低密度リボ蛋白ＬＤＬ(Low-Density Lipoprotein)の濃度測定も行われている。
【非特許文献１】Pignoli P, et al "Internal plus medical thickness of the arterial wall - a direct measurement with ultrasound imaging" Circulation 1986, 74, No.6, pp1399-1406
【特許文献１】特開2002-181820号公報
【特許文献２】特開2002-296118号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところが、前記ＩＭＴを計測する方法は、超音波を用いて血管画像を画面に映し出し、その画面に映し出されたＩＭＴを自動的に又は手動で計測しているため、高価で大がかりな診断装置が必要となる。
また、抗原抗体法を用いた測定方法では、血液中のＬＤＬを直接測定できるものの、測定結果が出るまでに多くのプロセス・時間を必要とする。
【０００５】
そこで、本発明は、動的光散乱法を用いて、血液中のＬＤＬの粒径を、簡単な装置構成により、かつ短時間で測定することのできる動脈硬化評価方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の動脈硬化評価方法は、人体から採取された血清又は血漿の中に含まれるＬＤＬの粒径分布を動的光散乱法で測定し、分布の左右を５０％ずつ分ける平均値が１０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲に入る粒径分布を特定し、その特定された粒径分布の広がりの度合いを示す指標を定量的に算出し、この算出された粒径分布の広がりの度合いを示す指標を評価因子として、当該個体の動脈硬化度を評価することを特徴とする。
【０００７】
前記の構成によれば、ＬＤＬの粒径分布を動的光散乱法で測定し、その粒径分布の広がりの度合いを示す指標を定量的に算出するところに特徴がある。後に[実施例]で示すように、この粒径分布の広がりの度合いを示す指標は、ＬＤＬ、酸化ＬＤＬ、その分解物、会合物に関連し、頸動脈のＩＭＴ値と強い相関が認められる。したがって、この指標を評価因子として、当該個体の動脈硬化度を評価することが可能となる。
【０００８】
粒径分布の広がり度合いを示す指標の例としては、分布の分散、又は分布のピークから任意の割合低下した幅のいずれかがあげられる。
また、前記粒径分布の広がりと、当該個体の年齢との２つを変数とする関数を定義して、この関数に基づいて動脈硬化度を評価することとすれば、精度の高い動脈硬化度の評価が行える。
【０００９】
さらに当該個体の性別を加えれば、さらに精度の高い動脈硬化度の評価が行える。
また、本発明の動脈硬化評価装置は、前記動脈硬化評価方法を実施するための装置である。
電磁波である光が分子に照射されると、分子内において双極子モーメントが誘起され、この誘起された双極子モーメントを二次光源として散乱光が放射される。
【００１０】
動的光散乱では、散乱媒質から散乱される散乱光強度の時間的ゆらぎを測定することにより、散乱媒質の粒径を求めることができる。
ある散乱体積（散乱光が発生している部分の中で、検出器によって観測される体積）の中に存在する２個の粒子からの散乱光を、散乱角度θにて観測する場合を例にとって、図２を参照しながら説明する。
【００１１】
混濁液中の２つの粒子から発せられた散乱光は、観測面ｐに置かれた光電子増倍管などの光検出器で測定される。その際に観測される散乱光強度は、各粒子からの散乱光の干渉、つまり各粒子からの散乱光の位相差によって決まる。入射光源にレーザを用いた場合、基準面Ｏの位置での入射光の位相は揃っているため、散乱光間の位相差は２個の粒子の位置関係のみに依存することとなる。混濁液中の粒子はブラウン運動をしており、その相互の位置関係は、時々刻々と変化している。その結果、観測される散乱光強度は時間的にゆらぐことになる。
【００１２】
実際の散乱体積の中には、数多くの粒子が含まれている。しかし、入射光のプロファイル（空間的な強度分布）が対称なガウス分布であり、溶液中に試料粒子が、巨視的に見て均一に分散している場合には、散乱光強度は、粒子が平均的な位置関係にある場合の値（平均散乱強度）を中心にゆらいでいると考えることができる。このゆらぎを、散乱光強度の時系列データとしてとらえ、（１）式のような自己相関関数Ｇ2（τ）を算出する。
【００１３】
Ｇ2（τ）＝＜Ｉ(t)Ｉ(t+τ)＞／＜Ｉ(t)＞2                        （１）
ここでＩ(t)は、時刻ｔでの散乱光強度、τは遅延時間である。この自己相関関数Ｇ2（τ）は、散乱光電場の一次相関関数ｇ1（τ）と、（２）式のように関係づけられる。
Ｇ2（τ）＝［ｇ1（τ）］2＋１                           （２）
単分散試料（単一粒径の試料）では、一次相関関数ｇ1は、粒子の拡散係数Ｄに依存する単一減衰の指数関数となる。
【００１４】
ｇ1（τ）＝Ｂexp[−ｑ2Ｄτ]                             （３）
ここでＢは、装置に依存する定数である。ｑは散乱ベクトルで、
ｑ＝４πｎsin(θ/2)／λ
で表される。ここでｎは溶媒の屈折率、θは散乱角度、λは真空中の光源の波長である。
粒子の半径（ストークス径）ｄは、Stokes-Einstein の式
ｄ＝ｋＴ／３πηＤ                                              （４）
により求められる。ここでｋはボルツマン定数、Ｔは絶対温度、ηは溶媒の粘度である。
【００１５】
以上をまとめると、散乱光強度Ｉ(t)を測定することによって、自己相関関数Ｇ2（τ）、一次相関関数ｇ1（τ）が求まり、一次相関関数ｇ1（τ）の形から粒子の拡散係数Ｄが求まり、粒子の半径ｄが求められる。
多分散試料（粒径に分布がある試料）では、それぞれの粒子からの全散乱光への寄与の和として、
ｇ1（τ）＝ＢΣ｛Ａi exp[−ｑ2Ｄiτ]｝                  （５）
と表せる。ここでＡiは、拡散係数Ｄiの粒子からの相対散乱強度である。総和Σは、粒子の種類ｉについてとる。
【００１６】
したがって、求められた相関関数の成分分析を行うことにより、それぞれの散乱強度比からの粒径分布を求めることができる。
【発明の効果】
【００１７】
以上のように本発明によれば、ＬＤＬの粒径分布の広がりの度合いを示す指標は、頸動脈のＩＭＴ値と強い相関が認められ、この指標を評価因子として、当該個体の動脈硬化度を精度良く評価できる動脈硬化評価方法を確立することができる。
また、測定にあたっては、血液への操作は血清血漿分離、抗凝固剤、リン酸バッファでの希釈、冷却又は冷凍保存だけなので、従来の方法と違って血液の変性は最小限に抑えられるので、より精度の高い測定が可能である。また通常の血液検査と同様に扱えるので、大量、かつ迅速に動脈硬化度の評価ができる。
【００１８】
さらに動脈硬化の結果である血管内壁の状態でなく、動脈硬化の原因となる血液中の酸化ＬＤＬの測定を基本にしているため、予防や治療のモニターとして、ＩＭＴより有効な評価ができることになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態を、添付図面を参照しながら詳細に説明する。
図１は、動的光散乱光度計の概略図である。動的光散乱光度計は、透明な試料セルにレーザ光を照射する入射光路系と、散乱光を測定する散乱光路系に分かれる。
入射光路系は、レーザ光源１、レーザ光の光路を曲げるミラー２，５、光路を一時的に遮断するシャッター３、入射光を減衰させるＮＤフィルター４、入射光を試料セルに集光するレンズ６、入射光から一定の偏光成分のみを透過させる偏光プリズム７を備えている。
【００２０】
試料セル８は、一定温度の液浸バス９の中に漬けられている。
散乱光路系は、試料からの散乱光を反射させる全反射プリズム１０、散乱光の一定の偏光成分のみを通す検光子１１、散乱光を光検出器１４に結像させる集光レンズ１２、余分な迷光をカットするピンホール１３、フォトマルチプライヤなどの光検出器１４を備えている。散乱光路系の全体は、紙面に垂直な軸を中心として回転するゴニオメータ１５に搭載され、散乱角度の設定が可能となっている。
【００２１】
この動的光散乱光度計で血漿中の散乱光強度Ｉ(t)を求め、前述した解析法を使って、低密度リボ蛋白ＬＤＬ(Low-Density Lipoprotein)の粒径分布を求めることができる。
なお、血漿に限らず、血清にもＬＤＬが含まれているので、試料として血清を用いても良い。
【実施例】
【００２２】
６４人の男女集団に対して、血液を取得し、その血漿中の粒子の粒径分布、特にＬＤＬの粒径である２５ｎｍ付近（１０ｎｍから４５ｎｍまで）の粒径分布を測定した。一検体への測定時間は５分ほどである。
測定条件は次のとおりである。
測定波長：４８８ｎｍ（７５ｍＷ；Ａｒレーザ）
測定散乱角度：９０度
サンプリングタイム：８．０μsec
積算回数：１００回
コリレーションチャネル数：２５６
ＮＤフィルター：１０％減衰
ピンホール：＃１，＃２とも  ０．２（単位ｍｍ）
試料の物性値：屈折率1.3365，粘度      0.877
粒径分布のデータに基づいて、個体試料ごとに粒径分布の平均粒径（分布の左右の面積が５０％になる粒径。「ＬＤＬ平均」という。）、粒径分布の分散（以下「ＬＤＬ分散」という。この明細書では「分散」を「標準偏差」と同じ意味で用いている。）を算出した。そして、同じ個体について［背景技術］に述べた方法でＩＭＴを測定した。
【００２３】
【表１Ａ】
2005134205.tif 000003
【００２４】
【表１Ｂ】
2005134205.tif 000004
【００２５】
表１Ａと表１Ｂは、測定結果を示す。表の第１列は個体番号、第２列は性別（男性のみＭで示している）、第３列は測定したＩＭＴ値（単位ｍｍ）、第４列は年齢、第５列はＬＤＬ分散値（単位ｎｍ）、第６列はＬＤＬ平均値（単位ｎｍ）、第７列〜第９列はそれぞれ関数Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３の値（後述）を示している。
図３は、個体番号97174の３６歳女性について粒径分布を測定した結果を示すグラフである。連続する実線は累積度数である。この女性のＩＭＴは０．５ｍｍである。測定結果によれば、粒径の分布は３カ所にみられる。５．６ｎｍから３１．６ｎｍの間の分布がＬＤＬに相当する。そのＬＤＬ平均値は１３．８ｎｍ、ＬＤＬ分散値は３．９ｎｍである。
【００２６】
図４は、個体番号６７の７７歳女性について、粒径分布を測定した結果を示すグラフである。この女性のＩＭＴは１．２ｍｍである。測定結果によれば、５．６ｎｍから１７８ｎｍの間にＬＤＬの分布がある。そのＬＤＬ平均値は３７．５ｎｍ、ＬＤＬ分散値は２１．１ｎｍである。
表１Ａと表１Ｂに掲げたすべての個体について、ＬＤＬ分散値とＩＭＴとの関係をグラフにプロットしたところ、図５のようになった。相関係数は、0.511であった。
【００２７】
ＬＤＬ平均値とＩＭＴとの相関関係は、図６のようになった。相関係数は、0.351であった。
年齢とＩＭＴとの相関関係は、図７のようになった。相関係数は、0.489であった。
このように、３つの中ではＬＤＬ分散が最も高い相関を示している。これは、ＬＤＬの酸化によってＬＤＬが分解・会合して、ＬＤＬの変成物ができているという知見と一致している。
【００２８】
ＬＤＬ分散値をＳ（単位はｎｍ）と書き、年齢をＡと書き、３種類の関数Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３を選択した。
Ｙ１＝Ａ＋２．３Ｓ，
Ｙ２＝Ａ＋０．０８５Ｓ2，
Ｙ３＝Ａ＋０．１６Ｓ1.63
すべての個体についてＹ１，Ｙ２，Ｙ３の各関数値を求め、ＩＭＴとの相関関係をプロットしたところ、図８から図１０に示すようになった。ＩＭＴとの相関係数を求めたところ、Ｙ１については0.716、Ｙ２については0.726、Ｙ３については0.726と、いずれも高い値が得られた。
【００２９】
このように、ＬＤＬ分散の他に、既知の年齢を考慮すると、さらに相関の高い評価方法が得られることがわかる。
以上のように、ＬＤＬ分散値と年齢との組み合わせ関数を用いるほうが、ＬＤＬ分散値単独で用いるよりも高い相関が得られることが分かる。
さらに、男性女性別に、前記と同じ処理を行った。
【００３０】
男性では、ＬＤＬ分散値とＩＭＴとの相関係数を求めたところ、0.625であった。ＬＤＬ平均値とＩＭＴとの相関係数は、0.405であった。年齢とＩＭＴとの相関係数は、0.606であった。
ＬＤＬ分散値（Ｓ）と年齢（Ａ）との組み合わせとして関数Ｙ４＝Ａ＋３Ｓを選択した。
【００３１】
Ｙ４とＩＭＴとの相関関係を図示すると、図１１のようになった。Ｙ４とＩＭＴとの相関係数を求めたところ、0.867となった。このように性別と年齢とを組み合わせることにより、高い相関係数が得られた。
女性では、ＬＤＬ分散値とＩＭＴとの相関係数を求めたところ、0.471であった。ＬＤＬ平均値とＩＭＴとの相関係数は、0.332であった。年齢とＩＭＴとの相関係数は、0.431であった。
【００３２】
そこでＬＤＬ分散値（Ｓ）と年齢（Ａ）との組み合わせとして、関数Ｙ１＝Ａ＋２．３Ｓ，Ｙ５＝Ａ＋２Ｓを選択した。
Ｙ１とＩＭＴとの相関係数を求めたところ、0.650となった。Ｙ５とＩＭＴとの相関関係を図示すると、図１２のようになった。Ｙ５とＩＭＴとの相関係数は、0.650となった。このように性別と年齢とを組み合わせることにより、高い相関係数が得られた。
【００３３】
以上で、本発明の実施の形態を説明したが、本発明の実施は、前記の形態に限定されるものではない。例えば、今までの実施携帯ではＬＤＬ分散値をＬＤＬ分布の広がりを示す指標として用いたが、分布のピークから５０％低下した幅である「半値幅」や、より一般的にいって分布のピークから任意の割合低下した幅を用いてもよい。その他、本発明の範囲内で種々の変更を施すことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】動的光散乱光度計の概略図である。
【図２】ある散乱体積の中に存在する２個の粒子からの散乱光を、散乱角度θにて観測する様子を説明する図である。
【図３】ある３６歳女性について粒径分布を測定した結果を示すグラフである。
【図４】ある７７歳女性について、粒径分布を測定した結果を示すグラフである。
【図５】ＬＤＬ分散値とＩＭＴとの関係をプロットしたグラフである。
【図６】ＬＤＬ平均値とＩＭＴとの関係をプロットしたグラフである。
【図７】年齢とＩＭＴとの関係をプロットしたグラフである。
【図８】Ｙ１（Ｙ１＝Ａ＋２．３Ｓ）の関数値と、ＩＭＴとの関係をプロットしたグラフである。ＳはＬＤＬ分散値、Ａは年齢である。
【図９】Ｙ２（Ｙ２＝Ａ＋０．０８５Ｓ2）の関数値と、ＩＭＴとの関係をプロットしたグラフである。
【図１０】Ｙ３（Ｙ３＝Ａ＋０．１６Ｓ1.63）の関数値と、ＩＭＴとの関係をプロットしたグラフである。
【図１１】男性集団について、Ｙ４（Ｙ４＝Ａ＋３Ｓ）の関数値と、ＩＭＴとの関係をプロットしたグラフである。
【図１２】女性集団について、Ｙ５（Ｙ５＝Ａ＋２Ｓ）の関数値と、ＩＭＴとの関係をプロットしたグラフである。
【符号の説明】
【００３５】
１  レーザ光源
２，５  ミラー
３  シャッター
４  ＮＤフィルター
６  レンズ
７  偏光プリズム
８  試料セル
９  液浸バス
１０  全反射プリズム
１１  検光子
１４  光検出器
１２  集光レンズ
１３  ピンホール
１４  光検出器
１５  ゴニオメータ
【図１】
2005134205.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005134205.tif 000009
【図６】
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【図７】
2005134205.tif 000011
【図８】
2005134205.tif 000012
【図９】
2005134205.tif 000013
【図１０】
2005134205.tif 000014
【図１１】
2005134205.tif 000015
【図１２】
2005134205.tif 000016