(57)【要約】【課題】比酵素活性及び不斉選択性に優れた、リパーゼを用いた光学活性体の製法を提供する。【解決手段】一般式［１］で表されるアルコキシシクロアルカンを含有する溶媒中で、リパーゼの存在下に、ラセミアルコールの一方をエステル化剤によってエステル化し、  生成した光学活性なエステルと、光学活性なアルコールとを分離することを含む光学活性体の製法。                    Ａ(ＯＲ)n                                ・・・［１］（ただし、式中、Ａは、シクロペンタン環、シクロヘキサン環又はシクロヘプタン環であり、Ｒは、炭素数１〜３のアルキル基であり、ｎは、１〜３であり、ｎが２又は３のとき、複数個のＲは、同一であっても、異なっていてもよい。）【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式［１］で表されるアルコキシシクロアルカンを含有する溶媒中で、リパーゼの存在下に、ラセミアルコールの一方をエステル化剤によってエステル化し、
生成した光学活性なエステルと、光学活性なアルコールとを分離することを含む光学活性体の製法。
Ａ(ＯＲ)n                                ・・・［１］
（ただし、式中、Ａは、シクロペンタン環、シクロヘキサン環又はシクロヘプタン環であり、Ｒは、炭素数１〜３のアルキル基であり、ｎは、１〜３であり、ｎが２又は３のとき、複数個のＲは、同一であっても、異なっていてもよい。）
【請求項２】
一般式［１］で表されるアルコキシシクロアルカンを含有する溶媒中で、リパーゼの存在下に、ラセミアルコールの一方をエステル化剤によってエステル化し、
生成した光学活性なエステルと、光学活性なアルコールとを分離し、
分離された光学活性なエステルを加水分解することを含む光学活性体の製法。
Ａ(ＯＲ)n                                ・・・［１］
（ただし、式中、Ａは、シクロペンタン環、シクロヘキサン環又はシクロヘプタン環であり、Ｒは、炭素数１〜３のアルキル基であり、ｎは、１〜３であり、ｎが２又は３のとき、複数個のＲは、同一であっても、異なっていてもよい。）
【請求項３】
一般式［１］で表されるアルコキシシクロアルカンが、メトキシシクロペンタンである請求項１または２記載の光学活性体の製法。
【請求項４】
ラセミアルコールが、ラセミ２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール又はラセミ６−メチル−５−ヘプテン−２−オールである請求項１または２記載の光学活性体の製法。
【請求項５】
エステル化剤が、エノールエステルである請求項１または２記載の光学活性体の製法。
【請求項６】
エステル化剤が、酢酸イソペニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、又は酪酸ビニルである請求項１または２記載の光学活性体の製法。
【請求項７】
リパーゼが、シュードモナス・セパチア（＝Pseudomonas cepacia)起源のリパーゼである請求項１または２記載の光学活性体の製法。
【請求項８】
リパーゼが、シクロデキストリン修飾、ポリエチレングリコール修飾、アンフィフィル修飾されたリパーゼである請求項１または２記載の光学活性体の製法。
【請求項９】
リパーゼが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、２，６−ジ−ｏ−メチル−α−シクロデキストリン、ポリ−β−シクロデキストリン、２，６−ジ−ｏ−メチル−β−シクロデキストリン、部分ジメチル化シクロデキストリン、又は２，３，６−トリ−ｏ−メチル−β−シクロデキストリンで修飾されたリパーゼである請求項１または２記載の光学活性体の製法。
【請求項１０】
エステル化反応の反応温度が４０〜６５℃である請求項１または２記載の光学活性体の製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性体の製法に関する。さらに詳しくは、本発明は、比酵素活性及び不斉選択性に優れた、リパーゼを用いた光学活性体の製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
1960年代のサリドマイド事件以来、光学活性な医薬品においてはその光学異性体の間でしばしば生理活性作用が異なることから純粋な光学活性体を用いる必要性が認識され、環境に対する負荷が少ない素材や新しい物性を有するものを創成する観点からも、光学活性体を利用する傾向は医薬・農薬のみならずコモディティケミカル（汎用化成品）の分野においても高まっている。生体触媒の酵素はそれ自身光学活性であり、立体特異性、反応形式の特異性及び反応位置を認識する特異性が厳密であるため、酵素反応は不斉合成や光学分割により光学活性体を製造する強力な手段である。中でもリパーゼ類の反応は有機溶媒中での研究が最も進んでいる酵素であり、加水分解反応、エステル交換反応のどちらを利用してもプロキラルなエステル、アルコールまたはカルボン酸から高光学純度の光学活性体を得ることができる。
【０００３】
例えば、特許文献１には、芳香剤や医薬品の製造中間体である不斉点を多く含むゼルボン誘導体の製法が開示され、具体的には、このゼルンボン誘導体を還元してラセミ体ゼルンボンオールを得、これをリパーゼの存在下でトランスエステル化して光学活性エステルと光学活性ゼルンボンオールを得る方法が提案されている。
特許文献２には、血中コレステロール降下剤若しくは機能性食品成分の製造中間体として重要なステロール類及びスタノール類の製法が開示され、具体的には、ステロール類及びステノール類を含有する混合物からステロール類を分離する方法において、リパーゼを接触させて、スタノール類を選択的にトランスエステル化する方法が提案されている。
また特許文献３には、抗ＨＩＶ薬等の製造中間体として重要な化合物であるトランス−２−ブロモインダン−１−オールなどを製造する方法が開示され、具体的には、カンディダ  アンタルティカ由来のリパーゼ又はその組換体が固定化されている固定化リパーゼを用いて光学活性なエステル体とアルコール体とを得、これらを分離する方法が提案されている。
【０００４】
さらに、特許文献４〜６には、強誘電性液晶、有機非線形材料などの機能性材料の製造中間体である、アセテート類やアルコール類を製造する方法が開示され、具体的には、ラセミアルコールを、リパーゼの存在下に不斉トランスエステル化して、Ｒ体とＳ体とに分割して光学活性アルコールを得る方法が提案されている。
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−６４０１０号公報
【特許文献２】特開２００３−７９３９１号公報
【特許文献３】特開平９−５６３９５号公報
【特許文献４】特開平１０−８７５４１号公報
【特許文献５】特開平１１−８００５４号公報
【特許文献６】特開２０００−６３３１２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、比酵素活性及び不斉選択性に優れた、リパーゼを用いた光学活性体の製法を提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、有機溶媒中での酵素、特にリパーゼの酵素反応速度を増大させるための修飾リパーゼの研究を行ってきたが、今までの成果によるとアンフィフィル修飾、ポリエチレングリコール修飾及びシクロデキストリン修飾のPseudomonas cepacia起源のリパーゼ（PCL）ではエーテル類のジイソプロピルエーテル（IPE）、Candida rugosa起源のリパーゼ（CRL）では環状炭化水素のシクロヘキサン（CH）が酵素活性の増大効果に優れている知見が得られている。また、テトラヒドロフラン（THF）、メチル-t-ブチルエーテル、ジオキサンなどエーテル系溶剤中における、シクロデキストリン修飾PCL触媒による不可逆トランスエステル化反応の研究を行ってきた。
本発明者らは、比酵素活性及び不斉選択性に優れた、リパーゼを用いた光学活性体の製法を得るべく鋭意研究を重ねた結果、炭素数１〜３のアルコキシル基を有するシクロペンタン、シクロヘキサン及びシクロヘプタンを含む溶媒中で、リパーゼの存在下に、ラセミアルコールの一方をエステル化剤によってエステル化することによって、比酵素活性及び不斉選択性が向上することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、「（１）一般式［１］で表されるアルコキシシクロアルカンを含有する溶媒中で、リパーゼの存在下に、ラセミアルコールの一方をエステル化剤によってエステル化し、
生成した光学活性なエステルと、光学活性なアルコールとを分離することを含む光学活性体の製法。
Ａ(ＯＲ)n                                ・・・［１］
（ただし、式中、Ａは、シクロペンタン環、シクロヘキサン環又はシクロヘプタン環であり、Ｒは、炭素数１〜３のアルキル基であり、ｎは、１〜３であり、ｎが２又は３のとき、複数個のＲは、同一であっても、異なっていてもよい。）
（２）一般式［１］で表されるアルコキシシクロアルカンを含有する溶媒中で、リパーゼの存在下に、ラセミアルコールの一方をエステル化剤によってエステル化し、
生成した光学活性なエステルと、光学活性なアルコールとを分離し、
分離された光学活性なエステルを加水分解することを含む光学活性体の製法。
Ａ(ＯＲ)n                                ・・・［１］
（ただし、式中、Ａは、シクロペンタン環、シクロヘキサン環又はシクロヘプタン環であり、Ｒは、炭素数１〜３のアルキル基であり、ｎは、１〜３であり、ｎが２又は３のとき、複数個のＲは、同一であっても、異なっていてもよい。）
（３）一般式［１］で表されるアルコキシシクロアルカンが、メトキシシクロペンタンである（１）または（２）記載の光学活性体の製法。
（４）ラセミアルコールが、ラセミ２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール又はラセミ６−メチル−５−ヘプテン−２−オールである（１）または（２）記載の光学活性体の製法。
（５）エステル化剤が、エノールエステルである（１）または（２）記載の光学活性体の製法。
（６）エステル化剤が、酢酸イソペニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、又は酪酸ビニルである（１）または（２）記載の光学活性体の製法。
（７）リパーゼが、シュードモナス・セパチア（＝Pseudomonas cepacia)起源のリパーゼである（１）または（２）記載の光学活性体の製法。
（８）リパーゼが、シクロデキストリン修飾、ポリエチレングリコール修飾、アンフィフィル修飾されたリパーゼである（１）又は（２）記載の光学活性体の製法。
（９）リパーゼが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、２，６−ジ−ｏ−メチル−α−シクロデキストリン、ポリ−β−シクロデキストリン、２，６−ジ−ｏ−メチル−β−シクロデキストリン、部分ジメチル化シクロデキストリン、又は２，３，６−トリ−ｏ−メチル−β−シクロデキストリンで修飾されたリパーゼである（１）又は（２）記載の光学活性体の製法。
（１０）エステル化反応の反応温度が３５〜７０℃である（１）または（２）記載の光学活性体の製法。」を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の製法は、比酵素活性が高く、不斉選択性に優れているので、光学活性の高い、ステロール類、スタノール類のごときアルコール類などを効率的に得ることができる。本発明の製法によって得られる光学活性体は、製薬用、食品用、強誘電性液晶用、有機非線形材料用などの材料として使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の光学活性体の製法は、一般式［１］で表されるアルコキシシクロアルカンを含有する溶媒中で、リパーゼの存在下に、ラセミアルコールの一方をエステル化剤によってエステル化し、生成した光学活性なエステルと、光学活性なアルコールとを分離し、必要に応じて、分離された光学活性なエステルを加水分解することを含むものである。
本発明に用いる溶媒は、一般式［１］で表されるアルコキシシクロアルカンを含有する溶媒である。
Ａがシクロペンタン環の一般式［１］で表されるアルコキシシクロアルカンとしては、例えば、メトキシシクロペンタン、１,２−ジメトキシシクロペンタン、１,３−ジメトキシシクロペンタン、１,２,３−トリメトキシシクロペンタン、１,３,４−トリメトキシシクロペンタン、エトキシシクロペンタン、１−エトキシ−２−メトキシシクロペンタン、１−エトキシ−３−メトキシシクロペンタン、１−エトキシ−２,３−ジメトキシシクロペンタン、１−エトキシ−３,４−ジメトキシシクロペンタン、１,２−ジエトキシシクロペンタン、１,３−ジエトキシシクロペンタン、プロポキシシクロペンタン、１−プロポキシ−２−メトキシシクロペンタン、１−プロポキシ−３−メトキシシクロペンタン、１−プロポキシ−２,３−ジメトキシシクロペンタン、１−プロポキシ−３,４−ジメトキシシクロペンタン、１−プロポキシ−２−エトキシシクロペンタン、１−プロポキシ−３−エトキシシクロペンタン、１,２−ジプロポキシシクロペンタン、１,３−ジプロポキシシクロペンタン、イソプロポキシシクロペンタン、１−イソプロポキシ−２−メトキシシクロペンタン、１−イソプロポキシ−３−メトキシシクロペンタン、１−イソプロポキシ−２,３−ジメトキシシクロペンタン、１−イソプロポキシ−３,４−ジメトキシシクロペンタン、１−イソプロポキシ−２−エトキシシクロペンタン、１−イソプロポキシ−３−エトキシシクロペンタン、１,２−ジイソプロポキシシクロペンタン、１,３−ジイソプロポキシシクロペンタンなどを挙げることができる。
【００１０】
Ａがシクロヘキサン環の一般式［１］で表されるアルコキシシクロアルカンとしては、例えば、メトキシシクロヘキサン、１,２−ジメトキシシクロヘキサン、１,３−ジメトキシシクロヘキサン、１,４−ジメトキシシクロヘキサン、１,２,３−トリメトキシシクロヘキサン、１,３,４−トリメトキシシクロヘキサン、１,３,５−トリメトキシシクロヘキサン、エトキシシクロヘキサン、１−エトキシ−２−メトキシシクロヘキサン、１−エトキシ−３−メトキシシクロヘキサン、１−エトキシ−２,３−ジメトキシシクロヘキサン、１−エトキシ−３,４−ジメトキシシクロヘキサン、１,２−ジエトキシシクロヘキサン、１,３−ジエトキシシクロヘキサン、プロポキシシクロヘキサン、１,２−ジプロポキシシクロヘキサン、１,３−ジプロポキシシクロヘキサン、イソプロポキシシクロヘキサン、１,２−ジイソプロポキシシクロヘキサン、１,３−ジイソプロポキシシクロヘキサンなどを挙げることができる。
【００１１】
Ａがシクロヘプタン環の一般式［１］で表されるアルコキシシクロアルカンとしては、例えば、メトキシシクロヘプタン、１,２−ジメトキシシクロヘプタン、１,３−ジメトキシシクロヘプタン、１,４−ジメトキシシクロヘプタン、１,２,３−トリメトキシシクロヘプタン、１,３,４−トリメトキシシクロヘプタン、１,３,５−トリメトキシシクロヘプタン、１,３,６−トリメトキシシクロヘプタン、エトキシシクロヘプタン、１−エトキシ−２−メトキシシクロヘプタン、１−エトキシ−３−メトキシシクロヘプタン、１−エトキシ−２,３−ジメトキシシクロヘプタン、１−エトキシ−３,４−ジメトキシシクロヘプタン、１,２−ジエトキシシクロヘプタン、１,３−ジエトキシシクロヘプタン、プロポキシシクロヘプタン、１,２−ジプロポキシシクロヘプタン、１,３−ジプロポキシシクロヘプタン、イソプロポキシシクロヘプタン、１,２−ジイソプロポキシシクロヘプタン、１,３−ジイソプロポキシシクロヘプタンなどを挙げることができる。
【００１２】
本発明においては、上記のアルコキシシクロアルカンの中で、メトキシシクロペンタン、１,３−ジメトキシシクロペンタン、１,３,４−トリメトキシシクロペンタン、エトキシシクロペンタン、プロポキシシクロペンタン、メトキシシクロヘキサン及びメトキシシクロペンタンが好ましく、メトキシシクロペンタン及びエトキシシクロヘプタンがさらに好ましく、メトキシシクロペンタンが特に好ましい。
【００１３】
本発明においては、一般式［１］で表されるアルコキシシクロアルカンの１種を単独で用いることができ、一般式［１］で表されるアルコキシシクロアルカンの複数種を混合して用いることもでき、あるいは、一般式［１］で表されるアルコキシシクロアルカンと他の化合物を混合して用いることもできる。
【００１４】
本発明に用いる溶媒には、老化防止剤、防錆剤、防腐剤などを添加することができる。これらの薬剤の添加量は、溶媒の１０重量％以下であることが好ましく、５重量％以下であることがより好ましい。
老化防止剤に特に制限はなく、例えば、４,４−チオビス(２−ｔ−ブチル−５−メチルフェノール)、２,２'−メチレンビス(６−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール)、１,３,５−トリメチル−２,４,６−トリス(３,５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシベンジル)ベンゼン、ペンタエリスリトールテトラキス(３−ドデシルチオプロピオネート)、ペンタエリスリトールテトラキス(３,５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシヒドロシンナメート)、トリス(４−ｔ−ブチル−２,６−ジメチル−３−ヒドロキシベンジル)−１,３,５−トリアジン−２,４,６(１Ｈ,３Ｈ,５Ｈ)、ジドデシルチオジプロピオネート、ジテトラデシルチオジプロピオネート、ジオクタデシルチオジプロピオネートなどを挙げることができる。
【００１５】
防錆剤に特に制限はなく、例えば、１Ｈ−ベンゾトリアゾール又はそのナトリウム塩、４−メチル−１Ｈ−ベンゾトリアゾール、５−メチル−１Ｈ−ベンゾトリアゾール又はそれらのカリウム塩などを挙げることができる。添加する防腐剤に特に制限はなく、例えば、２−(４−チアゾリル)ベンゾイミダゾール、２−ベンゾイミダゾールカルバミン酸メチル、ナトリウムピリチオン、ジンクピリチオン、ベンゾイソチアゾリン、トリスヒドロキシエチルトリアジン、オキシビスフェノキシアルシン、２,３,５,６−テトラクロロイソフタロニトリル、Ｎ−フルオロジクロロメチルチオフタルイミド、Ｎ,Ｎ−ジメチル−Ｎ'−フルオロジクロロメチルチオ−Ｎ'−フェニルスルファミド、２,３,５,６−テトラクロロ−４−メチルスルホニルピリジンなどを挙げることができる。
【００１６】
本発明において、一般式［１］で表されるアルコキシシクロアルカンの製造方法に特に制限はなく、例えば、モノアルコキシシクロアルカンは、シクロアルカノンの還元によりシクロアルカノールとし、さらにシクロアルカノールをアルキルエーテル化することにより、製造することができる。また、１,２−ジアルコキシシクロアルカンは、シクロアルケンの酸化により１,２−エポキシシクロアルカンとし、水との反応により１,２−ジヒドロキシシクロアルカンとし、さらにヒドロキシル基をアルキルエーテル化することにより、製造することができる。
【００１７】
本発明の製法に用いるリパーゼは、中性脂肪を加水分解して脂肪酸とグリセロールに分解する反応を可逆的に触媒する酵素である。リパーゼは、動物の胃液、膵液、腸液、血清、白血球、脳脊髄液、リンパ液、尿、乳などの体液；肺、腎臓、副腎、脂肪組織、胎盤などの臓器；ひまの種子、茎、葉、キンポウゲ科・ケシ科・アブラナ科・アオイ科植物の種子、エンバク、コムギ、ダイズなどの植物； Fusarium lini、Aspergillus flavus、Micotorula lipolyticaなどのかびや、ブドウ球菌、Pseudomonas fluorescens、Serratia marcescensなどの細菌、牛痘ウイルス；昆虫などから精製される。これらの中でもシュードモナス・セパチア（＝Pseudomonas cepacia）起源のリパーゼが好適に用いられる。なお、リパーゼは担体等に固定化したものであっても、固定化してないものであってもよい。
【００１８】
リパーゼは、各種修飾剤で修飾されたものであってもよい。修飾されたリパーゼとしてはシクロデキストリン修飾、ポリエチレングリコール修飾、アンフィフィル修飾されたリパーゼなどがあり、好ましくはシクロデキストリン修飾リパーゼであり、特に好ましくはシクロデキストリン修飾されたシュードモナス・セパチア（＝Pseudomonas cepacia)起源のリパーゼである。
【００１９】
修飾のために使用する修飾剤は特に制限はないが、シクロデキストリン修飾のために使用する好適な修飾剤としては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、２，６−ジ−ｏ−メチル−α−シクロデキストリン、ポリ−β−シクロデキストリン、２，６−ジ−ｏ−メチル−β−シクロデキストリン、部分ジメチル化シクロデキストリン、及び２，３，６−トリ−ｏ−メチル−β−シクロデキストリンが挙げられる。これら修飾剤のうち、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、部分ジメチル化シクロデキストリン、及び２，３，６−トリ−ｏ−メチル−β−シクロデキストリンが好適に用いられ、部分ジメチル化シクロデキストリンが特に好適に用いられる。
【００２０】
本発明に用いるラセミアルコールは、不斉炭素を有するアルコールのラセミ体である。
ラセミアルコールの具体例としては、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール、６−メチル−５−ヘプテン−２−オール、ゼルンボンオール、トランス−２−ブロモインダン−１−オール、ステロイドアルコール類、４−イソプロピルオキシブタン−２−オール、２−ブタノール、２−オクタノール、２−メチル−１−ブタノール、アミノ酸誘導体、５−メチルヘキサン−２−オール、６−メチルヘプタン−２−オール、３−メチルブタン−２−オール、５−エチルヘプタン−２−オール、４−メチルペンタン−２−オール、４−エチルヘキサン−２−オール、５−エトキシ−ペンタン−２−オール、５−プロピルオキシ−ペンタン−２−オール、６−メトキシ−ヘキサン−２−オール、４−エトキシ−ブタン−２オールなどが挙げられる。これらのうち２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノールが好適に用いられる。
【００２１】
本発明に用いるエステル化剤は、特に制限されないが、エステル化反応と光学分割の容易さからエノールエステルが好適である。エステル化剤の具体例としては、酢酸イソペニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、酪酸ビニルなどが挙げられ、好ましくは酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、酪酸ビニルであり、特に好ましくは酪酸ビニルである。エステル化剤はアルキル鎖の長いもの、若しくは疎水性が高いものが好ましい。
【００２２】
本発明の製法においてトランスエステル化反応は、公知の手法によって行うことができる。例えば、前記溶媒中でリパーゼと、ラセミアルコールとエステル化剤との混合物を接触させることによって、若しくはリパーゼを含有する溶媒にエステル化剤を添加し次いでラセミアルコールを添加することによって、行うことができる。
【００２３】
本発明における反応温度は、リパーゼが酵素活性を示す温度であれば、特に制限はなく、通常０〜８０℃、好ましくは１０〜７０℃、より好ましくは１５〜６５℃である。一般にリパーゼによるエステル化反応は、３０℃前後において最も高い活性を示し、反応温度が高くなると、具体的には３５℃を超えると、酵素活性が低下し、選択性も低下することが知られていた。ところが、本発明の製法によれば、３５℃を超える温度、好ましくは４０〜６５℃の温度においても、酵素活性が低下せず、不斉選択性も高く維持される。また、本発明を４０〜６５℃の温度で行うと、反応速度が高いので、短時間でエステル化を行うことができる。
従来、リパーゼを用いたエステル反応では、反応後リパ−ゼを回収したり、固定化して、再利用することが行われていたが、高付加価値のある光学活性体の製造においては、エステル化反応を短時間で完了し、リパーゼを回収しない方がコスト的に有利な場合がある。本発明は高温反応によって短時間で高活性なエステル化反応を行うことができるので、高付加価値の光学活性体の製造に有用である。
【実施例】
【００２４】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
（試薬類）
・溶媒として、メトキシシクロペンタン（CPME）及びジイソプロピルエーテル（IPE）を用いた。IPEはリパーゼ酵素反応の活性を増大させる効果に最も優れた溶媒として知られている（Journal of Bioscience and Bioengineering Vol.95, No.5, P441-447. 2003 参照）。
・リパーゼとして、Pseudomonas cepacia起源のリパーゼ（PCL）（アマノエンザイム(株)製）の原末からケイソウ土などの添加物を除去したものを用いた。
・ラセミアルコールとして、ラセミ2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-メタノール（ラセミソルケタール: SOL）（東京化成工業(株)試薬）、及びラセミ6-メチル-5-ヘプテン-2-オール（ラセミスルカトール: SUL）（Sigma-Aldrich試薬）を用いた。
・エノールエステル（エーテル化剤）として、酢酸イソプロペニル（IPA: 東京化成工業(株)試薬）、酢酸ビニル（＝VAC: 東京化成工業(株)試薬）、プロピオン酸ビニル（VPP: 日本酢ビ・ポバール(株)製）、及び酪酸ビニル（VBR: 日本酢ビ・ポバール(株)製）を用いた。
・修飾剤として、α-シクロデキストリン(αCyD)、β-シクロデキストリン(βCyD)、γ−シクロデキストリン（γCyD）、部分ジメチル化シクロデキストリン (Me1.78βCyD)、及び2,3,6-トリ-O-メチル-β-シクロデキストリン(Me3βCyD)を用いた。αCyD、βCyD及びγCyDは和光純薬工業(株)製、Me3βCyDはナカライテスク(株)製、Me1.78βCyDはメルシャン(株)製である。なお、括弧内の英記号は各物質の略号である。
【００２５】
製造例１（無修飾PCLの調整）
リパーゼ濃度が2.0mg/mlになるように25mlの丸底フラスコ中でリパーゼを5mlのリパーゼ緩衝液（10mM; pH7.0）に溶解した。この溶液をホモゲナイザーUltra-Turrax T8.01(IKA Labortechnik, Stanfen)で2分間、氷浴中でホモゲナイスした（20,000rpm）。得られた懸濁液を液体窒素で凍結して、フラスコを凍結乾燥機（タイテック(株)VD-16型）に連結し、5時間、凍結乾燥して無修飾PCLを調製した。
【００２６】
製造例２（修飾PCLの調製）
リパーゼ濃度が2.0mg/mlになるように25mlの丸底フラスコ中でリパーゼを5mlのリパーゼ緩衝液（10mM; pH7.0）に溶解した。この溶液に100モル倍量の修飾剤を添加し、ホモゲナイザーUltra-Turrax T8.01(IKA Labortechnik, Stanfen)で2分間、氷浴中でホモゲナイスした（20,000rpm）。得られた懸濁液を液体窒素で凍結して、フラスコを凍結乾燥機（タイテック(株)VD-16型）に連結し、5時間、凍結乾燥して修飾PCLを調製した。
【００２７】
実験方法
製造例２で得られた修飾PCLの全量に反応有機溶媒4mlを加え、得られた懸濁液に30℃で磁気撹拌しながらエノールエステル2mmol、次いでラセミアルコール2mmolを添加することにより反応を開始した。反応の進行は所定時間内毎に反応液を0.2μl抜き出して、FID検出器とキラルキャピラリーカラム（Supelco β-DEX120; 60m; Sigma-Aldrich Japan）を備えたガスクロマトグラフ（島津GC-18A型）で窒素ガスをキャリヤーガスに用いて、表１に示す測定条件下で分析した。
【００２８】
【表１】
2005278426.tif 000002
【００２９】
転化率30%までの反応速度から比酵素活性（mmol h-1(g-lipase)-1）を評価した。
一方、不斉選択性は転化率30%付近で測定した光学純度から算出した。
転化率は反応して(R)-及び(S)-アシルオキシ生成物に変化したアルコール基質の[%]として定義した。
不斉選択性は式（２）で示されるエナンチオマー比（E値）を転化率（c）とその時の生成物のエナンチオマー過剰率（eep）の実測値を用いて評価した。
E = [ ln { 1 - c ( 1 + eep ) } ] / [ ln { 1 - c ( 1 - eep ) } ]              （２）
【００３０】
実施例１及び比較例１
溶媒として、CPME（実施例）及びIPE（比較例）を用い、リパーゼとしてMe1.78βCyD修飾PCLを用い、ラセミアルコールとしてSUL及びSOLを用い、エノールエステルとしてIPA、VAC、VPP、VBRを用い、30℃で反応させた。その結果を表２に示した。
【００３１】
【表２】
2005278426.tif 000003
【００３２】
表２の結果から、ラセミアルコールがスルカトール（SUL）の場合、どのエノールエステルでも酵素活性はIPEよりも劣るが、反応の不斉選択性が高くなっている。特にエノールエステルのアルキル鎖が長くなる、すなわち疎水性が増すと、選択性が大きくなる傾向になることがわかる。興味深いのはエノールエステルがVBRの時に100%の不斉選択性を示すことである。一方、ラセミアルコールがソルケタール（SOL）の場合はどのエステル化剤（アシルソース）でも不斉選択性はほぼ同じか若干大きいのであるが、酵素活性はIPEよりも1.6〜9.8倍大きくなることがわかる。
【００３３】
実施例２、比較例２
修飾剤の種類を変えて製造例２に従って、種々の修飾PCLを得、反応溶媒にそれぞれCMPEまたはIPEを用いてSOL-VBR系での酵素比活性と不斉選択性を測定した。結果を表３に示した。
【００３４】
【表３】
2005278426.tif 000004
【００３５】
表３の結果から、CPME溶媒はIPE溶媒よりも、修飾PCLに対し、不斉選択性はほぼ同等で酵素活性を増大させることが分かった。中でもγCyD修飾PCL、及びMe1.78βCyD修飾PCLでは２倍以上の酵素活性増大をもたらした。
【００３６】
実施例３、比較例３
IPE及びCPME溶媒中でのソルケタールと酪酸ビニルの反応系におけるMe1.78βCyD修飾PCL触媒不可逆トランスブチリル化に対する反応温度効果
一般にリパーゼによるエステル化反応では反応温度が高くなると、具体的には３５℃を超えると、酵素活性が低下し、選択性も低下することが知られている。Me1.78βCyD修飾PCLのIPE及びCPME溶媒中でのSOL-VBRトランスエステル化反応における不斉選択性と酵素活性を、種々の温度（20〜60℃）で反応を行って測定し、温度による変化を調べた。実験結果を表４に示した。
【００３７】
【表４】
2005278426.tif 000005
＊表中、転化率の欄の括弧内は反応開始後からの経過時間（単位：分）を示した。
【００３８】
表４の結果から、CPMEを溶媒として用いた反応では、３５℃を超える温度領域においても比酵素活性が高く、不斉選択性も高い値を維持していることがわかる。また、転化率のデータから、IPEでは高温度になると反応速度が急激に低下するのに対して、CPMEでは高温度になると反応速度が高くなることがわかる。本発明によれば、リパーゼによるエステル化反応を、高温度で行うことで、短時間で、高選択率で光学活性体を得ることができることがわかる。
【００３９】
リパーゼ反応メカニズム（図１）は明らかにされており、最初の段階は中間体のアシル化リパーゼの生成で、まず、アシルドナーがリパーゼと反応するが、ここが総括反応における律速段階で、次の段階がアルコールとアシル中間体が反応するところで、ここでリパーゼの活性サイトに共有結合したアシル部やリパーゼ自身のキラル結合サイトがアルコールの不斉選択的トランスアシル化に大きな役割を果たしている。
一般式（１）で表されるアルコキシシクロアルカンを含有する溶媒を使用することによって反応速度、酵素活性、及び不斉選択性が大きくなる理由は詳細には不明であるが、リパーゼ反応の酵素活性及び不斉選択性が、第１段階におけるアルコラートイオンの脱離基の大きさ、第２段階におけるコンホメーションの影響、リパーゼの活性ホールの収容割合などが関係していることが知られており、これらの因子が、一般式（１）で表されるアルコキシシクロアルカンを含有する溶媒を用いることによって助長されていると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】リパーゼ反応のメカニズムを示す図。
【図１】
2005278426.tif 000006