(57)【要約】      （修正有）【課題】75℃でも生育可能なメタン資化菌の提供。【解決手段】メチロサーマス属に属し、75℃で生育可能なメタン資化菌；メチロサーマス・サマリスに属し、75℃で生育可能なメタン資化菌；寄託番号FERM P-19714であるメチロサーマス・サマリス。【効果】これらのメタン資化菌は、従来のメタン資化菌よりも、高温で生育可能であるため、培養温度をより高温とすることが可能である。培養温度を高温にすることにより、メタン資化菌の関与する反応の速度が増加すること、雑菌によるコンタミネーションが減少すること、設定温度を高くできるため冷却による負担が軽減されること、などの長所を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチロサーマス属に属し、75℃で生育可能なメタン資化菌。
【請求項２】
メチロサーマス・サマリスに属し、75℃で生育可能なメタン資化菌。
【請求項３】
寄託番号FERM P-19714である請求項１又は２に記載のメタン資化菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高温条件でも生育可能な新規なメタン資化菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球人口の増加に伴い、21世紀における食糧不足が深刻となることが予測されている。穀物類は、その栽培に太陽光、土地、時間を要するため、食糧が不足したとしても、直ちに増産することはできない。そのような場合、家畜等の飼料用として利用されていた穀物類が人間の食糧として使用されることとなり、家畜や養殖魚等の飼育や養殖に必要な飼料の不足が懸念される。
【０００３】
1970年代、太陽に依存しない炭素源として、石油や天然ガスが注目された。これを炭素源として微生物を生産し、その微生物をそのまま飼料とする技術（Single Cell Protein、以下SCPと称する）が開発された。石油系のSCPとしてパラフィンを炭素源として用いて生産した微生物を飼料として利用することが実用化されている。しかしながら、今後食糧が不足する時期と、石油が不足する時期はほぼ同時期であると予測されるため、石油系SCPが世界の食糧事情を改善するとは考えがたい。
【０００４】
ところで、石油より豊富に存在する天然ガスであるメタンを炭素源として用いてSCPを製造できれば、飼料として、より有用である。しかしながら、これまでに報告されているメタン資化菌は生育温度が中温（30-35℃）のものがほとんどであり（例えば、非特許文献１参照。）、しかもメタン資化菌は、メタン資化の際、メタン1mol当たり101kcalという大量の熱を発生するため、常温で生育するメタン資化菌を用いると、高温によるメタン資化菌の生育阻害を防止するため、大規模な冷却設備が必要となり、実用化は困難であった。
【０００５】
一方、今後のエネルギー開発においては、エネルギーの安定供給と地球環境保全との双方を確保することが重要な課題である。環境保全の観点からは、よりクリーンなエネルギーへのシフト及びこのようなクリーンエネルギーを用いた動力技術の開発が求められる。現在、石油が主なエネルギー源として用いられているが、石油は燃焼に伴い二酸化炭素排出量が多く、硫黄酸化物などの有害物を排出するという難点がある。また、石油の産出量は２０２０年以降減少すると予測されている。これに対し、石油よりクリーンなエネルギー源であり、かつ安定供給可能な石油代替エネルギーとして、メタンが注目されている。メタンは、メタノールひいてはジメチルエーテル等の液体燃料の製造原料として用いられる。メタンからのメタノール、ジメチルエーテル等の製造は、工業的には、COガス及びH2ガスの製造及びその後の高温・高圧下での多段階プロセスにより行われている。しかし、この方法は、高温・高圧を維持するために大規模な設備が必要であり、小規模のガス田では行い難い。また、高温・高圧を維持するためにコスト高になる。
【０００６】
一方、常温・常圧でメタンからメタノールを合成する方法として、メタンをエネルギー源として利用できるメタン資化菌を利用する方法が知られている。図１に示すように、メタン資化菌は、メタンモノオキシゲナーゼ（以下、MMOと称する）によりメタンを酸化してメタノールとし、メタノールデヒドロゲナーゼ（以下、MDHと称する）によりメタノールを酸化してフォルムアルデヒドとする。さらにメタン資化菌は、一方ではフォルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（以下、FADHと称する）によりフォルムアルデヒドを酸化して蟻酸とし、フォルミックアシッドデヒドロゲナーゼ（以下、FDHと称する）により蟻酸を酸化して二酸化炭素とする課程で、エネルギー源である還元力を生み出す。メタン資化菌は、他方では、フォルムアルデヒドを炭素源として用い、幾つかの段階を経て最終的に細胞構築物とする。
【０００７】
この過程を通じて、メタンはエネルギー源及び炭素源として利用されてしまい、通常、中間生成物であるメタノールを効率よく得ることは困難である。このため、メタノールを酸化するMDHをシクロプロパノールを用いて阻害することにより、メタノールを効率よく回収することも提案されている。しかし、シクロプロパノールは高価かつ不安定な化合物であるため、工業的には使用し難い。また、メタン資化菌を用いてメタンからメタノールを製造する方法では、合成されたメタノールによりメタン資化菌が被毒されるために合成メタノール濃度を一定以上に高くすることができないという難点もある。
【０００８】
しかしながら、メタノールの沸点（64.1℃）付近で生育するメタン資化菌を該沸点以上の温度条件下で利用してメタノールを合成すると、合成されたメタノールは気化して系外へ排出されるため、MDHによるメタノールの酸化やメタノールによるメタン資化菌の被毒をおさえることができる。このため、メタノールの沸点付近で生育可能なメタン資化菌の供給は重要である。
【非特許文献１】Hanson R.S., Hanson T.E. (1996), Methanotrophic Bacteria, Microbiol Rev 60, 439-471
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、より高温領域でも生育可能なメタン資化菌を提供することを目的とする    
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、全国の温泉地の土壌から、空気体積：メタン体積＝4：1の雰囲気下で液体培養し、培地に濁りが確認されたことを指標としてメタン資化菌をスクリーニングすることによって、75℃まで生育可能なメタン資化菌を見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
即ち、本発明は下記のメタン資化菌を提供する
項１．メチロサーマス属に属し、75℃で生育可能なメタン資化菌。
項２．メチロサーマス・サマリスに属し、75℃で生育可能なメタン資化菌。
項３．寄託番号FERM P-19714である項１又は２に記載のメタン資化菌。
【００１２】
本発明のメタン資化菌は、メチロサーマス属に属し、75℃で生育可能であることを特徴とするものである。本発明者は、実施例に記載のスクリーニング方法により本発明の菌を選択した。当該微生物の性質を下記に示す。
(a) 形態的性質
1. 細胞の形：球菌（液体培地）、桿菌（固体培地）
2. 細胞の多形性の有無：有り
3. 運動性：無し
4. 細胞の大きさ：0.6〜0.8μm×1.0〜1.2μm
5. 胞子の有無：無し
(b) 培養的性質
1. ANMS培地：コロニーの性状：直径1〜2mm、白色、全円、表面なめらか
2. 生育テスト
＋：メタン
−：メチルアミン、ギ酸、フォルムアルデヒド、酢酸、ピルビン酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、D-グルコース、D-キシロース、D-アラビノース、マルトース、スクロース、マンニトール、エタノール、グリセロール、イーストイクストラクト
(c) 生理学的性質
1. グラム染色性：陰性
2. 硝酸塩の還元：＋
3. 脱窒反応：−
4. MRテスト：−
5. VPテスト：−
6. インドールの生成：−
7. 硫化水素の生成：−
8. デンプンの加水分解：−
9. クエン酸の利用：−
10. 無機窒素源（硝酸塩及びアンモニウム塩）の利用：
＋：硝酸、アンモニア
−：窒素
11. 色素の生成：無し
12. 生育の範囲
生育温度：37〜75℃
最適温度：57〜60℃
塩濃度：最大1％、最適0.125〜0.25％
生育pH：6.5〜7.5
最適pH：6.5〜7.5
13. 酸素に対する態度：好気性
(d) 化学分類学的性質
1. DNAの塩基組成（GC含量）：58.5mol％
2. 16S rRNAの塩基配列：配列番号１に示す。メタン資化菌であるメチロサーマス sp. HBの16S rRNAの337bp-881bpとの相同性は74.1％
3. 菌体脂質：ホスファチジルエタノールアミン、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジルメチルエタノールアミン
4. キノン：メチレンユビキノンQ-8
5. pmoA塩基配列：X型メタン資化菌であるγ-プロテオバクテリア（Proteobacteria）に近接
6. 系統的に最も近い菌：メタン資化菌であるメチロサーマス sp. HB（pmoA塩基配列相同性97％、HB株の16SrDNA塩基配列及びpmoA配列のDDBJ登録番号U89299及びU89302）
これらの菌学的性質に基づいて、バージェズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bergeys Manual of Systematic Bacteriology）第1巻（以下、マニュアルと称する）に従って本菌株を分類したところ、本菌株は、60℃以上の高温でのメタン資化性を有することからメチロサーマス属に分類され、さらに、公知メチロサーマス属の16SrRNAの塩基配列と本菌株の16SrRNAの塩基配列との比較から新種であると判断し、メチロサーマス・サマリスMYHT株（Methylothermus thermalis MYHT）（以下、MYHT株と称する）と命名し、特許性物寄託センターに寄託した（寄託番号FERM P-19714）。本発明のメタン資化菌はこれと同様なスクリーニング方法によって入手することができる。本発明のメタン資化菌としては、このMYHT株が好適である。
【００１３】
本発明のメタン資化菌を培養するための培地は、炭素源、窒素源、無機塩を含有する通常の水性培地であり、炭素源としてメタンを必須とする。また、窒素源としては、カゼイン水解物、酵母抽出物、酵母自己消化物、酵母加水分解物、大豆粉、コーンスチープリカー、肉エキスなどが使用でき、無機塩としてはナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、カルシウム、マンガン、亜鉛、鉄、コバルト、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、塩化物、炭酸塩等のイオンを放出しうる通常の塩が挙げられる。培養雰囲気は、メタンが通常1〜50容量％程度、好適には10〜50容量％程度含まれる。メタン資化菌は編性好気性菌であるため、通常生育雰囲気にはメタンの他に酸素を含ませればよい。酸素は、通常1〜50容量％程度、好適には10〜50容量％程度含まれる。雰囲気中には、このほか、メタン資化菌の生育を妨げない範囲で、窒素、二酸化炭素などが含まれていても良い。
【００１４】
培地条件は特に制限されないが、好ましくはpH6.5〜7.5、培養温度は37〜75℃、好ましくは57〜60℃で24〜96時間振盪又は通気培養することができる。しかしながら、上記の培地構成成分、培養条件などは、メタン資化菌の用途に応じて好適な範囲が変化しうる。
【００１５】
メタン資化菌は、様々な用途（例えばSCP、メタンを原料とするメタノール合成（例えば特開2003-235546号公報、特開2000-166553号公報）、フォルムアルデヒド合成、ギ酸合成、メタン除去による地球温暖化抑制、ハロゲン化有機物（トリクロロエチレンなど）の分解など）において利用されている。本発明のメタン資化菌はこれらの用途に使用でき、その際、本発明のメタン資化菌特有の性質（培養条件等）を考慮するのは当然であるが、それ以外はこれらの用途において従来使用されているメタン資化菌と同様にして使用することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のメタン資化菌は、従来のメタン資化菌よりも、高温で生育可能であるため、培養温度をより高温とすることが可能である。培養温度を高温にすることにより、メタン資化菌の関与する反応の速度が増加すること、雑菌によるコンタミネーションが減少すること、設定温度を高くできるため冷却による負担が軽減されること、などの長所を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００１８】
実施例１（MYHT株の分離）
国内各所の温泉地から採取した温泉水1mlを下記表1に示す組成を有するANMS（ammonium nitrate mineral salts）培地10mlに接種した後、70ml容バイアルに密封し、上部気体を空気：メタン＝4：1（体積）に置換後，60℃で1ヶ月振盪培養した。培地の濁りが確認されたものについて、2週間の間隔で継代培養を繰り返し、4代培養できたものを、1.5％寒天を含むANMS培地に塗布し、空気：メタン＝4：1（体積）の環境下で培養し、コロニーの形成が確認された菌を採取した。
【００１９】
【表１】
2005270015.tif 000002
【００２０】
試験例１（14CH4 消費試験）
15mlの血清瓶に1mlの菌体培養液（OD600＝0.2〜0.4）をいれ密栓した。0.2mlの14CH4を血清瓶に注射器で投入し、37℃、55℃、60℃、65℃、75℃の各温度で振盪しながら1日間培養した。血清瓶の0.2mlを採取し、グラスフィルターで濾過後、乾燥させたフィルターの14Cをシンチレーションスペクトロメーターで測定した結果を、菌体取り込み量＋二酸化炭素転換量とした。またグラスフィルターで濾過したものを6N HClで洗浄後、乾燥させたフィルターの14Cを測定した結果を菌体取り込み量とした。結果を表２に示す。
【００２１】
【表２】
2005270015.tif 000003
【００２２】
この結果から、菌体への14CH4の取り込み、CO2への14CH4の取り込みともに60℃で最も量が多いこと、75℃でも生育可能なことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】メタン資化菌によるメタンの代謝を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００２４】
配列番号１は、メチロサーマス・サマリス MYHTの16S rRNAの塩基配列を示す。
【図１】
2005270015.tif 000004
【配列表】
2005270015000001.app