(57)【要約】【課題】  Ｌ−ドーパなどの製造に適したチロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現が上昇した微生物を提供する。【解決手段】  チロシンリプレッサーに変異を導入し、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を誘導する活性にチロシンを必要としない変異型チロシンリプレッサーを得る。該変異型チロシンリプレッサーを微生物に導入してチロシン フェノールリアーゼを高発現する微生物を得る。    【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を誘導する活性にチロシンを必要としない変異型チロシンリプレッサー。
【請求項２】
野生型チロシンリプレッサーのアミノ酸配列において、以下の（イ）〜（ハ）のうちの２群又は３群のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する変異型チロシンリプレッサー、
（イ）６７位のバリン、７２位のチロシン及び２０１位のグルタミン酸、
（ロ）３２４位のアスパラギン
（ハ）５０３位のアラニン。
【請求項３】
（イ）６７位のバリンを置換するアミノ酸がアラニンであり、７２位のチロシンを置換するアミノ酸がシステインであり、２０１位のグルタミン酸を置換するアミノ酸がグリシンであり、（ロ）３２４位のアスパラギンを置換するアミノ酸がアスパラギン酸であり、（ハ）５０３位のアラニンを置換するアミノ酸がスレオニンである、請求項２に記載の変異型チロシンリプレッサー。
【請求項４】
前記変異以外の位置において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、かつ、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を誘導する活性にチロシンを必要としない、請求項２又は３に記載の変異型チロシンリプレッサー。
【請求項５】
野生型チロシンリプレッサーがパントエア・アグロメランスの野生型チロシンリプレッサーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異型チロシンリプレッサー。
【請求項６】
パントエア・アグロメランスの野生型チロシンリプレッサーが配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項５に記載の変異型チロシンリプレッサー。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異型チロシンリプレッサーをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡで形質転換されたエシェリヒア属細菌又はパントエア属細菌。
【請求項９】
さらにチロシンフェノールリアーゼ遺伝子のプロモーターに発現可能に連結された構造遺伝子を保持する請求項８に記載のエシェリヒア属細菌又はパントエア属細菌。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のエシェリヒア属細菌又はパントエア属細菌を培地中で培養してチロシンフェノールリアーゼを生成させる工程、及び該チロシンフェノールリアーゼを精製する工程を含む、チロシンフェノールリアーゼの製造法。
【請求項１１】
チロシン非存在下で前記微生物を培養することを特徴とする、請求項１０に記載のチロシンフェノールリアーゼの製造法。
【請求項１２】
請求項８又は９に記載のエシェリヒア属細菌又はパントエア属細菌をカテコール、ピルビン酸及びアンモニア、又はカテコール及びセリンに作用させてＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを生成させる工程、及び該Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを採取する工程を含む、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造法。
【請求項１３】
前記微生物がチロシン非存在下で増殖させた微生物である、請求項１２に記載のＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を誘導する活性にチロシンを必要としない変異型チロシンリプレッサー、それをコードする遺伝子及びそれらの利用に関する。これらは、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（以下、「Ｌ−ドーパ」ともいう）の製造等、醗酵工学分野において有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−ドーパは、神経伝達物質であるドーパミンの前駆体であり、パーキンソン病の治療薬等として有用である。Ｌ−ドーパは、従来化学合成法により製造されていたが、近年ではチロシン フェノールリアーゼ（ＴＰＬ）を用いて、カテコール及びセリン、又はカテコール、ピルビン酸及びアンモニアから酵素的に合成されている。
【０００３】
ＴＰＬは、エシェリヒア属、シュードモナス属、フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、キサントモナス属、アグロバクテリウム属、アクロモバクター属、エアロバクター属、エルビニア属、プロテウス属、サルモネラ属、シトロバクター属、エンテロバクター属、パントエア属など広範な微生物によって生産されることが知られており（特許文献１または２参照）、酵素学的諸性質についても明らかにされている（非特許文献１参照)。また、ＴＰＬを高発現することが知られているエルビニア属細菌においては、ＴＰＬ遺伝子の構造遺伝子と上流域の塩基配列が報告されている（非特許文献２参照）。
【０００４】
ＴＰＬはチロシンリプレッサーによる発現調節を受けることが知られている。すなわち、チロシンがチロシンリプレッサーに結合することにより、チロシンリプレッサーが活性化され、ＴＰＬ遺伝子の発現が活性化する。チロシンリプレッサー遺伝子の構造は既にエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）では明らかになっている（非特許文献３参照）。さらに、本発明者等は、エルビニア（Erwinia）属細菌のチロシンリプレッサーをコードする遺伝子を単離することに成功し、チロシンリプレッサーがＴＰＬ遺伝子の発現を正に調節する活性を有することを開示している（特許文献３参照）。
【０００５】
また、微生物菌体を用いたＬ−ドーパの生産も検討されていた。この場合、Ｌ−ドーパを効率よく得るためには、ＴＰＬの発現量の多い微生物を用いることが重要であるが、上記のようにチロシンがＴＰＬの発現を活性化することから、ＴＰＬ高発現株を取得するためには、培地への多量のチロシンの添加が不可欠であった。しかしながら、チロシンの溶解度はきわめて低いため、培養後に菌体を回収してＬ−ドーパの反応槽に移す際にチロシンが多量に混入し、最終産物のＬ−ドーパとの精製分離が困難になるという問題点があった。これに対し、チロシンの添加量が少ない状態でＴＰＬを高発現させることのできるチロシンリプレッサーの変異体が知られていた（特許文献４参照）。しかしながら、この変異体においてもチロシン添加時の方がＴＰＬの発現量が多く、チロシン非添加時においてもＴＰＬを高発現させることのできる微生物の開発が望まれていた。なお、特許文献３，４などにおいてエルビニア・ヘルビコーラ（Erwinia herbicola）として開示されている微生物は、現在はパントエア・アグロメランス(Pantoea agglomelans)に分類されているものである。したがって、上記エルビニア・ヘルビコーラについては、以下、パントエア・アグロメランスと呼ぶことにする。
【特許文献１】特許第２５２１９４５号公報
【特許文献２】特公平６−９８００３号公報
【特許文献３】特開平１１−３１３６７２号公報
【特許文献４】特開２００１−２３８６７８号公報
【非特許文献１】Biochem.Biophys. Res. Commun.,33,10(1963)
【非特許文献２】H.Suzuki et al., J, Ferment. Bioeng., 75, No.2, 145-148 (1993)
【非特許文献３】E. C. Cornishet al., J. Biol. Chem., 261, 403-410 (1986)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記チロシンリプレッサー遺伝子を利用した新規な技術を開発すること、具体的には、チロシン非存在下においてチロシンフェノールリアーゼ（ＴＰＬ）遺伝子を十分量発現させることのできる変異型チロシンリプレッサー及びそれをコードする遺伝子、並びにそれらの利用法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、チロシンリプレッサー遺伝子に種々の変異を導入し、得られた変異型チロシンリプレッサーについて活性を解析したところ、チロシン非存在下では野生型チロシンリプレッサーによるＴＰＬ遺伝子の発現量が少ないのに対し、６７位のバリン、７２位のチロシン、２０１位のグルタミン酸、及び３２４位のアスパラギン等が置換された変異型チロシンリプレッサーではチロシン非存在下でも十分量のＴＰＬを発現させることができることを見出した。さらに、このような変異型チロシンリプレッサーを保持する微生物を使用することによりＬ−ドーパを効率よく製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）  チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を誘導する活性にチロシンを必要としない変異型チロシンリプレッサー。
（２）  野生型チロシンリプレッサーのアミノ酸配列において、以下の（イ）〜（ハ）のうちの２群又は３群のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する変異型チロシンリプレッサー、
（イ）６７位のバリン、７２位のチロシン及び２０１位のグルタミン酸、
（ロ）３２４位のアスパラギン
（ハ）５０３位のアラニン
（３）  （イ）６７位のバリンを置換するアミノ酸がアラニンであり、７２位のチロシンを置換するアミノ酸がシステインであり、２０１位のグルタミン酸を置換するアミノ酸がグリシンであり、（ロ）３２４位のアスパラギンを置換するアミノ酸がアスパラギン酸であり、（ハ）５０３位のアラニンを置換するアミノ酸がスレオニンである、（２）の変異型チロシンリプレッサー。
（４）  前記変異以外の位置において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、かつ、チロシンフェノールリアーゼ遺伝子の発現を誘導する活性にチロシンを必要としない（２）又は（３）の変異型チロシンリプレッサー。
（５）  野生型チロシンリプレッサーがパントエア・アグロメランスの野生型チロシンリプレッサーである、（１）〜（４）のいずれかの変異型チロシンリプレッサー。
（６）  パントエア・アグロメランスの野生型チロシンリプレッサーが配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質である、（５）の変異型チロシンリプレッサー。
（７）  （１）〜（６）のいずれかの変異型チロシンリプレッサーをコードするＤＮＡ。
（８）  （７）のＤＮＡで形質転換されたエシェリヒア属細菌又はパントエア属細菌。
（９）  さらにチロシンフェノールリアーゼ遺伝子のプロモーターに発現可能に連結された構造遺伝子を保持する（８）のエシェリヒア属細菌又はパントエア属細菌。
（１０）  （８）又は（９）のエシェリヒア属細菌又はパントエア属細菌を培地中で培養してチロシンフェノールリアーゼを生成させる工程、及び該チロシンフェノールリアーゼを精製する工程を含む、チロシンフェノールリアーゼの製造法。
（１１）  チロシン非存在下で前記微生物を培養することを特徴とする、（１０）のチ
ロシンフェノールリアーゼの製造法。
（１２）  （８）又は（９）のエシェリヒア属細菌又はパントエア属細菌をカテコール、ピルビン酸及びアンモニア、又はカテコール及びセリンに作用させてＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを生成させる工程、及び該Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを採取する工程を含む、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造法。
（１３）  前記微生物がチロシン非存在下で増殖させた微生物である、（１２）のＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造法。
【０００９】
なお、本明細書において、前記変異を有するチロシンリプレッサーを変異型チロシンリプレッサー、変異型チロシンリプレッサーをコードするＤＮＡを変異型チロシンリプレッサー遺伝子ということがある。また、前記変異を有しないチロシンリプレッサーを野生型チロシンリプレッサーということがある。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のチロシンリプレッサーを有する微生物は、チロシン非添加条件でチロシンフェノールリアーゼを高発現することができるため、この微生物を用いることにより、チロシンの分離操作をすることなく、純度の高いＬ−ドーパを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の変異型チロシンリプレッサー（TyrR）は、野生型チロシンリプレッサーのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換された配列を有する変異型チロシンリプレッサーであって、チロシンフェノールリアーゼ（ＴＰＬ）遺伝子の発現を誘導する活性にチロシンを必要としない変異型チロシンリプレッサーである。ここで、「数個」とは、２〜２０個が好ましく、２〜１０個がより好ましく、２〜５個が特に好ましい。また、「チロシンフェノールリアーゼ（ＴＰＬ）遺伝子の発現を誘導する活性にチロシンを必要としない」とは、例えば、チロシン濃度が０又は極小値のときのＴＰＬ遺伝子発現を誘導する活性が、チロシン濃度がＴＰＬ遺伝子発現誘導に通常要求される濃度（例えば、０．２％）のときの活性と同等以上であることを意味する。ここで、「極小値」とは、例えば、０．０１％以下、好ましくは３．０×１０−３％以下を意味する。また、「同等以上」とは、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは１００％以上を意味する。ＴＰＬ遺伝子発現を誘導する活性は、例えば、ＴＰＬ遺伝子を発現する細胞において、変異型チロシンリプレッサー遺伝子を発現させ、チロシン濃度が０もしくは極小値のとき、又はチロシン濃度が通常濃度のときのＴＰＬのｍＲＮＡを定量することによって調べることができる。また、ＴＰＬ活性を測定することによって間接的に調べることもできる。ＴＰＬ活性測定は、例えば、実施例に示すような合成基質を用いて370nmでの吸光度を測定する方法によって行うことができる。
【００１２】
本発明の変異型チロシンリプレッサーは、ＴＰＬ遺伝子の発現を誘導する活性にチロシンを必要としないものあれば特に制限されないが、例えば、次の（イ）〜（ハ）のうちの２群又は３群のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する変異型チロシンリプレッサーを挙げることができる。
（イ）６７位のバリン、７２位のチロシン及び２０１位のグルタミン酸、
（ロ）３２４位のアスパラギン
（ハ）５０３位のアラニン
【００１３】
すなわち、（１）（イ）６７位のバリン、７２位のチロシン及び２０１位のグルタミン酸、並びに（ロ）３２４位のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する変異型チロシンリプレッサー、（２）（イ）６７位のバリン、７２位のチロシン及び２０１位のグルタミン酸、並びに（ハ）５０３位のアラニンが他のアミノ酸に置換された
アミノ酸配列を有する変異型チロシンリプレッサー、（３）（イ）６７位のバリン、７２位のチロシン及び２０１位のグルタミン酸、（ロ）３２４位のアスパラギン、並びに（ハ）５０３位のアラニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する変異型チロシンリプレッサー、（４）（ロ）３２４位のアスパラギン、及び（ハ）５０３位のアラニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する変異型チロシンリプレッサーを挙げることができる。
【００１４】
上記部位のアミノ酸を置換するアミノ酸は、ＴＰＬ遺伝子の発現を誘導する活性にチロシンを必要としない変異型チロシンリプレッサーを生じるアミノ酸である限り特に制限されないが、（イ）６７位のバリンを置換するアミノ酸はアラニン、７２位のチロシンを置換するアミノ酸はシステイン、２０１位のグルタミン酸を置換するアミノ酸はグリシン、（ロ）３２４位のアスパラギンを置換するアミノ酸はアスパラギン酸、（ハ）５０３位のアラニンを置換するアミノ酸はスレオニンであることが好ましい。
【００１５】
本発明において、野生型チロシンリプレッサーとしては、例えば、パントエア・アグロメランス由来のチロシンリプレッサーが挙げられる。ここで、パントエア・アグロメランス由来のチロシンリプレッサーは、以前エルビニア・ヘルビコーラに分類されていた微生物由来のチロシンリプレッサーであってもよい。パントエア・アグロメランス由来のチロシンリプレッサーとしては、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が好ましい。
【００１６】
上記のような変異型チロシンリプレッサーは、野生型チロシンリプレッサーをコードするＤＮＡに、同ＤＮＡによってコードされるチロシンリプレッサーに上記アミノ酸置換が生じるような変異を導入することによって取得することができる。変異は、部位特異的変異法等によって計画的に導入することができる。野生型チロシンリプレッサーをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１に示す塩基配列を有するパントエア・アグロメランス由来の野生型チロシンリプレッサーをコードするＤＮＡを用いることができる。このＤＮＡは、例えば配列番号１に基づいてオリゴヌクレオチドを作製し、それを用いたＰＣＲ法又はハイブリダイゼーションによって、パントエア・アグロメランスの染色体ＤＮＡ又は染色体遺伝子ライブラリーからチロシンリプレッサー遺伝子を取得することができる。
【００１７】
上述したように、エルビニア・ヘルビコーラに分類されていた微生物は、現在ではパントエア・アグロメランスに分類されているものもある。このようにエルビニア属及びパントエア属は非常に近縁であるため、チロシンリプレッサー遺伝子は、エルビニア属及びパントエア属のいずれに属する微生物からも取得され得る。また、エルビニア属及びパントエア属以外の細菌、例えばエシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌からも、上記と同様にしてチロシンリプレッサー遺伝子を取得することができる。
【００１８】
本発明の変異型チロシンリプレッサーは、ＴＰＬ遺伝子の発現を誘導する活性にチロシンを必要としないものである限り、上記置換アミノ酸以外の位置において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、２〜２０個が好ましく、２〜１０個がより好ましく、２〜５個が特に好ましい。このように、本発明の変異型チロシンリプレッサーは、上述した置換アミノ酸以外の位置においてさらに改変されたものであってもよく、その場合、ＴＰＬ遺伝子の発現を誘導する活性にチロシンを必要としない限りにおいて、配列番号２のアミノ酸配列と全体として一定以上の相同性、すなわち、８０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する範囲で改変されたものであってもよい。
【００１９】
尚、本発明において、６７位のバリン、７２位のチロシン、２０１位のグルタミン酸、３２４位のアスパラギン、５０３位のアラニンとは、配列番号２に示す野生型チロシンリプレッサーのアミノ酸配列における位置である。上記のような活性に影響を与えないアミノ酸の欠失、挿入、付加、又は逆位によって位置が前後することがある。例えば、Ｎ末端部に１つのアミノ酸残基が挿入されれば本来６７位のバリンは６８位となるが、そのような６７位のバリンに相当するバリンを、本発明においては６７位のバリンと呼ぶこととする。
【００２０】
上記のような変異型チロシンリプレッサーと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、チロシンリプレッサーをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びチロシンリプレッサーをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばパントエア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。さらに、特開２００１−２３８６７８号公報に開示されているようなエラー・プローン（error-prone）PCR法によっても上記のようなＤＮＡを得ることができる。
【００２１】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、チロシンリプレッサーを保持する微生物の属、種、又は菌株の個体差に基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれる。
【００２２】
上記のような変異を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物のチロシンリプレッサー活性（ＴＰＬ遺伝子の発現を正に調節する活性）を調べることにより、変異型チロシンリプレッサーと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するチロシンリプレッサーをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４４２〜２００４からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＴＰＬ遺伝子の発現を誘導する活性にチロシンを必要としない変異型チロシンリプレッサーをコードするＤＮＡを単離することによっても、変異型チロシンリプレッサーと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、６５℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００２３】
このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性が低下又は消失したものも含まれるが、それらについては、市販の発現ベクターにつなぎチロシンリプレッサー活性を調べることによって容易に取り除くことができる。
【００２４】
本発明の変異型チロシンリプレッサーが導入された微生物は、組換えＴＰＬの生産に好適に使用することができる。変異型チロシンリプレッサーが導入される微生物としては、エシェリヒア属細菌又はパントエア属細菌などが挙げられる。また、エシェリヒア属細菌としてはエシェリヒア・コリが、パントエア属細菌としてはパントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティスが例示される。なお、上記パントエア属細菌は、以前エルビニア・へルビコーラなどのエルビニア属細菌に分類されていたものであって、現在パントエア属細菌に分類されている微生物も含む。
【００２５】
前記変異型チロシンリプレッサー遺伝子をエシェリヒア属細菌又はパントエア属細菌等の微生物に導入するには、通常、これらの遺伝子を適当なベクターに連結して組換えＤＮＡを作製する。ベクターとしては、pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pACYC177、pACYC184、pMW219、pMW118等が挙げられる。
【００２６】
上記のように調製した組換えＤＮＡをエシェリヒア属細菌又はパントエア属細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、エレクトロポレーション法（Methods for general and molecular bacteriology, 1994, Philipp Gerhardt ed., ASM Press, 14.1.3.3 Electroporation procedure）も利用することができる。
【００２７】
前記変異型チロシンリプレッサー遺伝子は、宿主微生物のプラスミド上に存在させてもよく、相同組換え等によって宿主微生物の染色体ＤＮＡ上に存在させてもよい。導入される変異型チロシンリプレッサー遺伝子は、チロシンリプレッサー遺伝子固有のプロモーターによって発現制御されてもよく、プロモーターをｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰRプロモーター、ＰLプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｍｙＥプロモーター等の強力なプロモーターと置換し、これらのプロモーターによって発現制御されてもよい。
【００２８】
染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J.,Fritsch, E. F., and Maniatis, T.,
"Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
【００２９】
組換えＴＰＬの生産は、例えば、変異型チロシンリプレッサーをコードする遺伝子およびＴＰＬ遺伝子を保持する微生物を培地で培養し、培養物又は菌体からＴＰＬを精製することによって行うことができる。培地の種類は特に制限されないが、実施例で示すようなＴＰＬ高発現培地を用いることが好ましい。なお、組換え生産されるＴＰＬは精製用のペプチドタグを有するものであってもよい。また、組換えＴＰＬの生産はチロシン非添加条件下で行うことが好ましい。なお、本発明においてチロシン非存在下とは、チロシンが全く存在しない培養条件及び実質的にチロシンが存在しない培養条件を含む。実質的にチロシンが存在しない培養条件として具体的には、例えば、チロシン濃度が０．０１％以下、好ましくは３．０×１０−３％以下である条件が挙げられる。
【００３０】
このようにして生産された組換えＴＰＬは、酵素法によるＬ−ドーパの生産に利用することができる。すなわち、得られたＴＰＬを、カテコール、ピルビン酸及びアンモニア、又はカテコール及びセリンに作用させてＬ−ドーパを生成させ、Ｌ−ドーパを採取するこ
とにより、Ｌ−ドーパを製造することができる。Ｌ−ドーパ生成反応は、例えば、上記化合物を含有する反応液にＴＰＬを添加することによって行うことができる。ＴＰＬは粗酵素液として添加してもよい。また、ピルビン酸、アンモニア等は、ピルビン酸塩やアンモニウム塩などのように塩として反応液に含有させることもできる。
【００３１】
さらに、本発明の変異型チロシンリプレッサーをコードする遺伝子を保持する微生物の菌体を直接Ｌ−ドーパの製造に用いることもできる。すなわち、適当な培養条件下で増殖させた菌体を直接カテコール、ピルビン酸及びアンモニア、又はカテコール及びセリンに作用させ、生成したＬ−ドーパを採取することによりＬ−ドーパを製造することができる。なお、培地中で微生物を増殖させながら作用させることも可能である。エシェリヒア属細菌及びパントエア属細菌においては、通常、ＴＰＬ遺伝子の発現のインデューサーとしてチロシンが必要であるが、本発明の変異型チロシンリプレッサー遺伝子を保持するエシェリヒア属細菌又はパントエア属細菌は、チロシンを培地に添加しなくても、ＴＰＬ遺伝子の発現が誘導される。したがって、チロシンの混入を避けるため、菌体はチロシン非存在下で培養して得られた菌体を用いることが好ましい。なお、菌体は、菌体破砕物、菌体分画物又は固定化菌体であってもよい。
【００３２】
さらに、本発明の変異型チロシンリプレッサー及びそれをコードする遺伝子は、目的遺伝子の発現調節にも利用することができる。例えば、ＴＰＬ遺伝子のプロモーターに目的のタンパク質をコードする構造遺伝子を発現可能に連結し、得られる融合遺伝子を微生物に導入し、さらに、本発明の変異型チロシンリプレッサー遺伝子を同微生物に導入すると、変異型チロシンリプレッサーにより前記タンパク質の発現が正に制御される。したがって、ＴＰＬ遺伝子のプロモーターと目的のタンパク質の構造遺伝子との融合遺伝子と、変異型チロシンリプレッサー遺伝子が導入された微生物を培地に培養することにより、目的のタンパク質を効率よく産生させることができる。ＴＰＬ遺伝子のプロモーターの配列としては、例えば、配列番号３の塩基番号４８２〜８００の塩基配列を含む配列を挙げることができる。前記融合遺伝子及び変異型チロシンリプレッサー遺伝子の導入は、別々のベクターを用いて行ってもよく、単一のベクターを用いて同一ベクター上に両遺伝子を保持させてもよい。また、遺伝子の導入の順序は特に制限されない。なお、目的遺伝子としてＴＰＬ遺伝子を選択することもできる。この場合、宿主細胞のＴＰＬ発現量をさらに増加させることができるため、該細胞をＬ−ドーパの製造に使用することができる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３４】
＜１＞プラスミドの作製
（i）pAH175（N324D）
図1にしたがって、N324D変異を有するtyrR遺伝子を含むプラスミドpAH175を作製した。pMW118（ニッポンジーン社）の3.9 kb PvuIIの断片と、pTK#20（特開2001-238678号公報）の2.4 kb SalI(blunt)-SspIの断片（パントエア・アグロメランスATCC21434株由来野生型TyrR遺伝子）を連結してpTK672を作製した。また、パントエア・アグロメランスATCC21434株由来野生型TyrR遺伝子を含むpTK775（Appl. Environ. Microbiol., 66, 4764-4771 (2000)）に、Stratagene社のQuikChange kitを用いた部位特異的変異によってN324D変異を導入し、pTK1108を作製した。次に、上記pTK672を EcoRI で切断した4.7 kbの断片と、上記pTK1108を EcoRI で切断した 1.6 kbの断片を連結し、pAH160とした。パントエア・アグロメランスはアンピシリン耐性であるため、選択マーカーとしてアンピシリンを利用できない。そこで、pAH160のScaIサイトにpBR322由来のテトラサイクリン耐性遺伝子 ( 1.6 kb SspI-PpuMI断片を平滑末端化処理したもの)を挿入し、pAH175とした。
【００３５】
（ii）pAH176（V67A，Y72C,E201G,N324D）
図２にしたがって、V67A，Y72C,E201G及びN324D変異を有するtyrR遺伝子を含むプラスミドpAH176を作製した。pTK775のPstI-EcoRI断片(2.3  kb)と、同じくpTK775 のPstI-EcoRV断片(2.6 kb)と、pYG5（特開2001-238678号公報に開示されているtyrR5（V67A，Y72C,E201G）を含むpACYC177）のEcoRI-EcoRV断片(1.1 kb)の３つの断片をligationし、pTK856を作製した。次に、（i）で得たpAH160をNruIで切断した 5.6 kbの断片と、上記pTK856をNruIで切断した 0.7 kbの断片を連結し、pAH163とした。さらに、(i)と同様にテトラサイクリン耐性遺伝子を挿入し、pAH176とした。
【００３６】
（iii）pAH178（V67A，Y72C,E201G,N324D,A503T）
図３にしたがって、V67A，Y72C,E201G,N324D及びA503T変異を有するtyrR遺伝子を含むプラスミドpAH178を作製した。pTK775にsite-directed mutagenesisでE275Q変異を導入しpTK815を作製した。これをtemplateとしてエラー・プローン（error-prone）PCRにより増幅したtyrR遺伝子断片をpTK774に挿入し、その中からＴＰＬ活性化能の高いクローンを選択した。得られたものの一つが、A503T変異を有するpTK1060であった。なお、pTK774では、error-prone PCRで増幅させた断片を挿入するため、tyrR遺伝子の開始コドンがNdeIになっている。pTK774を使用したライブラリーの作製法は、前述のAppl. Environ. Microbiol., 66, 4764-4771 (2000)のMaterials and Methodsのrandom mutagenesis of the tyrR
gene using error-prone PCRの項に記載されている。また、error-prone PCRの方法については特開２００１−２３８６７８号公報に開示されている。次に、上記(ii)で得たpAH163をPvuIIで切断した 5.9 kbの断片と、pTK1060をPvuIIで切断した 0.4 kbの断片を連結し、pAH164とした。さらに、(i)と同様にテトラサイクリン耐性遺伝子を挿入し、pAH178とした。
【００３７】
（iv）pAH170（A503T）
図４にしたがって、A503T変異を有するtyrR遺伝子を含むプラスミドpAH170を作製した。pTK919（特開２００１−２３８６７８号公報）をPvuIIで切断した 7.3 kbの断片と、上記（iii）で得たpTK1060をPvuIIで切断した 0.4 kbの断片を連結し、pAH170とした。
【００３８】
（V）pAH172（V67A，Y72C,E201G,A503T）
図５にしたがって、V67A，Y72C,E201G及びA503T変異を有するtyrR遺伝子を含むプラスミドpAH172を作製した。pTK922（特開２００１−２３８６７８号公報）をPvuIIで切断した 7.3 kbの断片と、上記（iii）で得たpTK1060をPvuIIで切断した 0.4 kbの断片を連結し、pAH172とした。
【００３９】
（vi）pAH177（N324D,A503T）
図６にしたがって、N324D及びA503T変異を有するtyrR遺伝子を含むプラスミドpAH177を作製した。上記（i）で得たpAH160をPvuIIで切断した 7.3 kbの断片と、上記（iii）で得たpTK1060をPvuIIで切断した 0.4 kbの断片を連結し、pAH177とした。
【００４０】
＜２＞野生型又は変異型tyrRのパントエア・アグロメランスへの導入
上記（i）〜（vi）のプラスミド及びV67A，Y72C,E201G 変異を有するtyrR遺伝子を含むpTK922、野生型tyrR遺伝子を含むpTK919を、それぞれ熱ショック法により、tyrR欠失株パントエア・アグロメランス（エルビニア・ヘルビコーラ） YG17株（特開2001-238678）に導入した。すなわち、別途調製したコンピテントセル２００μLに上記プラスミドを含む溶液２０μLを加え、氷上に３０分置いた後、４２℃で３０秒間熱ショックを与えた。８００μLのSOB培地を加えて３７℃で１時間インキュベートした後、菌体をプレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。これによって得られた株を表１に示す。なお、表１の略記号は、V67A，Y72C,E201G 変異をNT、N324DをCen、A503T変異をCTとしている。
【００４１】
【表１】
2005278453.tif 000003
【００４２】
＜３＞変異型tyrR導入株のＴＰＬ活性の評価
これらの株及び野生株AJ2985（ATCC21434）を0.2%チロシン含有又は非含有ＴＰＬ高発現培地100mlで、２８℃で２８、３２、３６時間振とう培養した。用いたＴＰＬ高発現培地の組成を表２に示す。
【００４３】
【表２】
2005278453.tif 000004
【００４４】
大豆タンパク質加水分解物としては、COMPOUND-F（味の素株式会社製）を使用した。本製品中のチロシン含量は、１．５％プラスマイナス０．１５％と原料のアミノ酸組成及びその製法から推定される。したがって、チロシン非添加条件においても、培地中には２．２５×１０−３％の微量のチロシンが含まれている計算になる。ただし、この程度の量はＬ−ドーパの発酵生産において混入がほとんど問題にならない量である。
【００４５】
培養終了後、菌体を10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）、0.2mM PLP（ピリドキサール5'リン酸）、5mM 2-メルカプトエタノール、4mM EDTA(pH7.0)に懸濁し、超音波処理により破砕した。菌体破砕液を、前記緩衝液に対して一夜透析した。こうして得られた酵素液について、タンパク質定量及びＴＰＬの活性測定を行った。
【００４６】
タンパク質の定量は、ウシ血清アルブミンを標準として、ローリー法（Lowry,O.H.et al., J. Biol. Chem. 193, 265 (1951)により行った。ＴＰＬ活性測定は、下記に従って化学合成したS-o-nitrophenyl-L-cystein（SOPC）を基質に使用して行った。すなわち、0.2mM SOPC、0.1 mM PLP、5mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM PLP、100mMリン酸カリウム緩衝液（pH8.0）からなる反応液を30℃の水浴で 4 分間プレインキュベートした後、この反応液 1 mlと前記酵素液 50 μlを混合した。SOPC は 368 nmで吸収極大を示す。そこで、本実施例では 370 nmの吸光度の減少を測定した (ε＝ 1,860) 。なお、酵素単位の定義は、 1 分間に 1 μmole の SOPC を消費する酵素の量を 1 unitとした。チロシン添加培地で36時間培養した野生株の菌体重量あたりのＴＰＬ活性の値を100としたときの、各株の菌体重量あたりのＴＰＬ活性の相対値を表３及び図７に示す。
【００４７】
【表３】
2005278453.tif 000005
【００４８】
チロシン添加時においては、AH181株（NT Cen）、AH182株(Cen CT)、AH183株(NT CT)及びAH184株(NT Cen CT)は、野生株（AJ2985）と同等かそれ以上のＴＰＬ活性を示した。一方、チロシン非添加時においては、野生株がほとんどＴＰＬを活性化できないのに対し、AH181株（NT Cen）、AH182株(Cen CT)、AH183株(NT CT)及びAH184株(NT Cen CT)は、野生株の10倍以上のＴＰＬ活性を示した。このことから、上記の変異型tyrRが導入されたパントエア・アグロメランスは、培地にチロシンを添加しなくても、大量のＴＰＬを発現させることができることがわかった。
【００４９】
なお、ＴＰＬ活性測定に使用したSOPC の化学合成及び精製は、以下の方法で行った。
（１）10 mM システイン100 ml (in water) と 10 mM o-DNB  100 ml (in EtOH) を混合。
（２）28％アンモニア水を 3 滴加え、50℃で一晩インキュベートした。
（３）50℃でエバポレーションを行い、o-DNBの結晶を得た。
（４）室温において、3,500 rpmで 3 分間遠心分離を行い、結晶を取り除いた。
（５）ペーパークロマトグラフィーを一晩行った。(展開溶液は、1 -ブタノール：水：酢酸＝4：1：1)
（６）紙を乾かした後、UV吸収が見られた部分のみ細かく切り、水に浸して一晩抽出を行った。
（７）その溶液をニトロセルロースのフィルター (pore size 5.0 μm) を用いてろ過した。
（８）再び50℃でエバポレーションを行った。
（９）凍結乾燥によって粉状のSOPCを得た。
【００５０】
＜４＞変異型TyrR導入株を用いたＬ−ドーパの製造
評価菌株としては、以下の５株を用いた。
control株（pTK631/AJ2985ΔtyrR::kan+）
YG38株（tyrR+/AJ2985ΔtyrR::kan+）
YG40株（tyrR+NT/AJ2985ΔtyrR::kan+）
AH181株（tyrR+NT+Cen/AJ2985ΔtyrR::kan+）
AH184株（tyrR+NT+Cen+CT/AJ2985ΔtyrR::kan+）
Control株に使用したベクターpTK631は、Applied and Environmental Microbiologyの第66巻、p4764−4771（2000年）に記載されている。
【００５１】
まず、上記菌株をリフレッシュスラント（Basal培地にAgar2%添加し、ｐH7.5に調整したもの）上、31.5℃で24時間培養した。リフレッシュスラント上に生育してきた菌体を、500ml坂口フラスコに100ml入れたチロシン非添加又は0.2％チロシン添加ＴＰＬ高発現用培地に1エーゼ植菌し、140rpmで攪拌しながら、28℃で17時間培養した。なお、スラントでの生育は、いずれの株も同程度であった。
【００５２】
培養終了後、5mlの培養物を遠心分離（3000rpm、15分）して集菌を行った。得られた菌体を、下記に示す基質溶液5mlに懸濁し、15℃で1時間反応させた。
TPL活性測定用基質溶液
ヒ゜ルヒ゛ン酸Na  1.55g/dl、カテコール  1.0g/dl、塩化アンモニウム  4.7g/dl
硝酸アンモニウム  0.13g/dl、亜硫酸ソータ゛  0.27g/dl、EDTA-2Na  0.4g/dl
ｐH  8.0（反応直前にアンモニア水で調整）
【００５３】
反応終了後、反応液を塩酸でｐH1以下にし、さらに100倍希釈した後に、HPLCにてＬ−ドーパ生成量を分析した。培養によって得られた菌体量及びL-ドーパ生成量を表４に示す。チロシン＋はチロシン０．２％添加、チロシン−はチロシン無添加を示している。
【００５４】
【表４】
2005278453.tif 000006
【００５５】
特開２００１−２３８６７８記載の変異型チロシンリプレッサー遺伝子（NT）に、本発明のCen、CTの変異を導入することにより、Ｌ−ドーパ生成量も菌体当たりのＬ−ドーパ生成活性のいずれもが飛躍的に増加した。これまで知られていた変異型チロシンリプレッサーの場合（NT）は、チロシンを添加する方が、Ｌ−ドーパ生成量、菌体当たりのＬ−ドーパ生成活性が高く、チロシンによる誘導が完全になくなっているわけではなかった。これに対して、本発明のCen及び／又はCTの変異を導入した場合（NT＋Cen、NT＋Cen+CT）では、チロシンをいれても入れなくても同等、むしろ無添加の方がＬ−ドーパ生成量、菌体当たりの活性が高いことが明らかになった。すなわち、本来、Ｌ−ドーパ生産に必要なＴＰＬはよく知られているようにチロシンによる誘導が必要であったが、本発明により誘導が完全に不要となった。
【００５６】
＜５＞変異型tyrRのエシェリヒア・コリ内での評価
本発明の変異型チロシンリプレッサー（TyrR）がエシェリヒア・コリ内においてもパントエア・アグロメランスのＴＰＬ遺伝子プロモーターを活性化できるかどうかを調べるために、以下の実験を行った。まず、変異型TyrR の転写活性化能を観察するために β- ga
lactosidase 活性を指標にしようと考え、パントエア・アグロメランスのtpl プロモーターにβ- galactosidase をコードする lacZ 遺伝子をつないだ遺伝子（Φ(tpl ’-‘lacZ) 遺伝子）を有するレポータープラスミドの構築を行った。Φ(tpl ’-‘lacZ) 遺伝子を保持するプラスミドについては、kan+ および bla+ 遺伝子を保持したpTK1004より HindIII - SalI 断片 5.9 kb を切り出し、これを同じく HindIII, SalI で処理した pBR322 の断片とライゲーションさせて図８に示すΦ(tpl ’-‘lacZ) 遺伝子を保持するプラスミド pAH276 を作製した。
なお、上記pTK1004の作製法は以下のとおりである。すなわち、まず、pTK312（特開2001-238678）から切り出した8.6 kb のSacI-SacII(blunt-ended)断片と、pMC1871 (Pharmacia)から切り出した1.1 kb のSacI-BamHI(blunt-ended)断片を連結し、pTK1003を得た。次に、pTrc99A (Pharmacia)から切り出した0.5 kb のXmnI断片を pTK1003のNcoI (blunt-ended)に挿入して、pTK1004とした。
【００５７】
コントロールとなる空のプラスミドpTK631、野生型 tyrR遺伝子をもつpTK919、tyrR（V67A Y72C E201G）遺伝子をもつpTK922、tyrR（V67A Y72C E201G N324D A503T）遺伝子をもつpAH178の計 4 種類のプラスミドで、内因性tyrR遺伝子及びlacZ遺伝子を欠損したエシェリヒア・コリDtyrR、Dlac株 TK743 を形質転換した。これらの形質転換株を、さらに前記 F(tpl’-‘lacZ) レポータープラスミド pAH276 で形質転換した。得られた株を LB
培地、1 mM チロシンを添加した LB 培地、1 mM フェニルアラニンを添加した LB 培地、それぞれにおいて 37℃ で一晩前培養したのち、本培養培地の100 分の 1 量に相当する量を採取し、新たな各培地において 37℃ で本培養を行い、OD600 = 0.5 になった時点で b - galactosidase 活性の測定を行った。
【００５８】
結果は図９に示したように、チロシン非添加LB 培地において、TyrR（V67A Y72C E201G）をもつ株で野生型 TyrR 保持株の約 7 倍、TyrR（V67A Y72C E201G N324D A503T）をもつ株で野生型 TyrR 保持株の約 22 倍の発現がみられた。また、1 mM チロシンを添加した LB 培地においては、それぞれ野生型の約 8 倍、10 倍の発現、1 mM フェニルアラニンを添加した LB 培地においては、それぞれ野生型の約 4.5 倍、17倍の発現がみられた。なお、野生型 TyrR 保持株において、チロシンやフェニルアラニンによる誘導がほとんど観察されないのは、LB 培地にもともとそれらの芳香族アミノ酸が多量に含まれているためであると考えられた。以上のことから、エシェリヒア・コリ内においても、変異型 TyrR は チロシン非添加時にtpl プロモーターからの転写を大きく上昇させることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明の変異型チロシンリプレッサーを用いて得られる組換えＴＰＬ又はＴＰＬ高発現微生物を用いることにより、パーキンソン病などの治療に有用なＬ−ドーパを効率よく生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】プラスミドpAH175の構築を示す図。
【図２】プラスミドpAH176の構築を示す図。
【図３】プラスミドpAH178の構築を示す図。
【図４】プラスミドpAH170の構築を示す図。
【図５】プラスミドpAH172の構築を示す図。
【図６】プラスミドpAH177の構築を示す図。
【図７】チロシン添加時（A）、非添加時（B）における野生型又は変異型tyrR導入株の菌体重量あたりのＴＰＬ活性を示す図。
【図８】Φ(tpl’-‘lacZ) レポータープラスミドの構築を示す図。
【図９】変異型TyrR によるΦ(tpl’-‘lacZ) の転写活性化能を示す図。LB+Yはチロシン添加LB培地を、LB+Fはフェニルアラニン添加LB培地を示す。
【図１】
2005278453.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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