(57)【要約】【課題】  電気泳動終了後に分離された物質を抽出することができる電気泳動用担体及びこの電気泳動用担体を使用した試料の生産方法を提供すること。  【解決手段】  架橋剤によって架橋されているポリアクリルアミド系の電気泳動用担体であって、前記架橋剤は、所定の条件により分断される部位を有するメチレンビスアクリルアミドの誘導体を含むことを特徴とする。例えば、分断される部位は、ペプチド結合により結合している。【選択図】  図１
2005024497.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋剤によって架橋されているポリアクリルアミド系の電気泳動用担体であって、
前記架橋剤は、所定の条件により分断される部位を有するメチレンビスアクリルアミドの誘導体を含むことを特徴とする電気泳動用担体。
【請求項２】
請求項１に記載の電気泳動用担体であって、
前記分断される部位は、ペプチド結合により結合していることを特徴とする電気泳動用担体。
【請求項３】
請求項２に記載の電気泳動用担体であって、
前記ペプチド結合は、アミノ酸残基の数が１〜６であることを特徴とする電気泳動用担体。
【請求項４】
請求項２に記載の電気泳動用担体を使用して、対象試料を電気泳動により複数の物質に分離する工程と、
前記分離された物質を少なくとも１つ含む電気泳動用の一部分を刳り抜く工程と、
前記刳り抜かれた一部分に所定の酵素もしくは化学物質を加えて、前記物質を抽出する工程と
を具備することを特徴とする試料の生産方法。
【請求項５】
請求項４に記載の生産方法であって、
前記酵素を加える工程に使用される酵素は、トリプシン、キモトリプシン、サーモライシン、リシルエンドペプチダーゼ、エンドペプチダーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドペプチダーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドペプチダーゼＡｓｐ−Ｎ、メタロエンドプロテアーゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ、アルギニルエンドペプチダーゼ、クロストリパイン、トロンビン、カリクレイン及びプロリン特異的エンドペプチダーゼからなる群より選ばれた化合物の一つもしくは複数であることを特徴とする試料の生産方法。
【請求項６】
請求項４に記載の生産方法であって、
前記化学物質を加える工程に使用される化学物質は、臭化シアン、BNPS-スカトール、ヒドロキシルアミン、塩酸グアニジン、N-ブロモスクシンイミド、酸からなる群より選ばれた化合物の一つもしくは複数であることを特徴とする試料の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡやタンパク質、ペプチド、糖、脂質の解析に行う電気泳動用担体及びこの電気泳動用担体を使用した試料の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやタンパク質、ペプチド、糖、脂質など生体由来物質の分離分析において、電気泳動法は比較的容易かつ安価に行える方法として普及している。試料を電気泳動するための担体として、主に天然系担体としてアガロース（例えば、特許文献１参照）、人工系担体としてポリアクリルアミド（例えば、特許文献２参照）が利用されている。
【０００３】
天然系担体は、温度依存によりゾル−ゲル転移が可逆的に行われるので、対象となる試料から分離された純度の高い物質として取り出すことができる。しかしながら、欠点としては、分離能に限界があり、低分子のＤＮＡを分離することはできない。また、担体自体が白濁して透明度が高くないので、電気泳動後の塩基配列決定等の定性が困難なものとなる。
【０００４】
一方、人工系担体は、分離能が高く、担体のポアサイズを任意に調整できるので、対象となる試料に含まれる物質の分子量に最適な担体を製造することができる。しかしながら、欠点としては、従来のメチレンビスアクリルアミドのみを架橋部としたポリアクリルアミドを使用した担体は、重合開始剤により一度ゾルからゲルになった場合には、再びゾルに戻すことはできない。その結果、試料が各物質に分離されてもそれのみを抽出することができず、新規物質としての回収や他の分析に利用できない。
【特許文献１】特開平１０−４８１８１（段落番号[００１２]）。
【特許文献２】特開平８−１５２２２（段落番号[０００７]、図１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、このような問題を解決するために、電気泳動終了後に分離された物質を抽出することができる電気泳動用担体及びこの電気泳動用担体を使用した試料の生産方法を提供すること目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような課題を解決するため、本発明に係る電気泳動用担体は、架橋剤によって架橋されているポリアクリルアミド系の電気泳動用担体であって、前記架橋剤は、所定の条件により分断される部位を有するメチレンビスアクリルアミドの誘導体を含むことを特徴とする。
【０００７】
本発明によれば、電気泳動に使用された電気泳動用担体を所定の条件下におくことによりゲルからゾルに転移するので、電気泳動された物質は分解されずに、当該担体中に含まれた物質を取り出すことができる。ここで所定の条件とは、電気泳動用担体に含まれる架橋剤の一部が分断される環境にされるための条件をいい、当該担体の構成により例えば、プロテアーゼやペプチターゼ等の酵素やヒドロキシルアミンや臭化シアン等の化学物質を加えてもよい。また、熱、光、電磁波等の照射や、ｐＨを変化させる等の化学的条件を変化させてもよい。
【０００８】
本発明の一の形態によれば、前記分断される部位は、ペプチド結合により結合していることを特徴とする。これにより、当該ペプチド結合を分離する特異的な酵素を投入すれば、電気泳動用担体がゲルからゾルに転移して、当該物質を取り出すことができる。
【０００９】
本発明の一の形態によれば、前記ペプチド結合は、アミノ酸残基の数が２又は３であることを特徴とする。これにより、電気泳動に適した硬度を有する電気泳動用担体を得ることができる。
【００１０】
本発明に係る試料の生産方法は、前記電気泳動用担体を使用して、対象試料を電気泳動により複数の物質に分離する工程と、前記分離された物質を少なくとも１つ含む電気泳動用の一部分を刳り抜く工程と、前記刳り抜かれた一部分に所定の酵素を加える工程とを具備することを特徴とする。
【００１１】
本発明によれば、電気泳動用担体に含まれるペプチド結合が所定の酵素により特異的に分断されゲルからゾルとなるので、電気泳動で分離された物質を独立して生産及び分析することができる。
【００１２】
本発明の一の形態によれば、前記酵素を加える工程に使用される酵素は、トリプシン、キモトリプシン、サーモライシン、リシルエンドペプチダーゼ、エンドペプチダーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドペプチダーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドペプチダーゼＡｓｐ−Ｎ、メタロエンドプロテアーゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ、アルギニルエンドペプチダーゼ、クロストリパイン、トロンビン、カリクレイン、フリン、ファクターXa、エンテロキナーゼ、Genase及びプロリン特異的エンドペプチダーゼからなる群より選ばれた化合物の一つもしくは複数であることを特徴とする。
【００１３】
本発明の一の形態によれば、前記化学物質を加える工程に使用される化学物質は、臭化シアン、BNPS-スカトール、ヒドロキシルアミン、塩酸グアニジン、N-ブロモスクシンイミド、酸からなる群より選ばれた化合物の一つもしくは複数であることを特徴とする。
【００１４】
これらにより、電気泳動用担体に含まれる特定のアミノ酸を有するペプチド結合を分断して、ゲルからゾルに転移もしくは重合体を小さくすることができる。
【００１５】
ここで、上記酵素が分解するアミノ酸としては以下の通りである。
【００１６】
トリプシン：リジン、アルギニン残基のC末端側
【００１７】
キモトリプシン：チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンの残基のC末端側
【００１８】
サーモライシン：ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンのN末端側
【００１９】
リシルエンドペプチダーゼ：リジン残基のC末端側
【００２０】
エンドペプチダーゼＬｙｓ−Ｃ：リジン残基のC末端側
【００２１】
エンドペプチダーゼＧｌｕ−Ｃ：グルタミン酸残基のC末端側
【００２２】
エンドペプチダーゼＡｓｐ−Ｎ：アスパラギン酸残基のN末端側
【００２３】
メタロエンドプロテアーゼ：リジン残基の残基のN末端側
【００２４】
マトリクスメタロプロテアーゼ：Gly-Lue/Ile間（他）
【００２５】
アルギニルエンドペプチダーゼ：アルギニン残基のC末端側
【００２６】
クロストリパイン：アルギニン残基のC末端側
【００２７】
トロンビン：アルギニン残基のC末端側
【００２８】
カリクレイン：アルギニン残基のC末端側
【００２９】
プロリン特異的エンドペプチダーゼ：プロリン残基のC末端側
【００３０】
フリン：Arg-X-X-Arg配列のC末端側
【００３１】
ファクターXa：Ile-Glu/Asp/Gly-ArgのＣ末端側
【００３２】
エンテロキナーゼ：Asp-Asp-Asp-Asp-LysのＣ末端側
【００３３】
Genase：His-TyrのＣ末端側またはTyr-His間
【００３４】
臭化シアン：メチオニン残基のＣ末端側
【００３５】
BNPS-スカトール：トリプトファン残基のＣ末端側
【００３６】
N-ブロモスクシンイミド：トリプトファン、チロシン、ヒスチジン残基のＣ末端側
【００３７】
ヒドロキシルアミン：Asn-Gly間
【００３８】
塩酸グアニジン：Asp-Pro間
【００３９】
酸：Asp-Pro間、X-Asp-Pro間
【発明の効果】
【００４０】
以上説明したように、本発明によれば、電気泳動終了後に分離された物質を抽出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
【００４２】
図１は、本発明に係る電気泳動用担体の製造過程の一実施形態を示す概念図である。図２は、本発明に係る電気泳動用担体を使用した試料の生産方法の一実施形態を示すフローチャート図である。
【００４３】
本発明に係る電気泳動用担体を製造するため、アクリルアミドとメチレンビスアクリルアミドの誘導体である架橋剤を混合した溶液を作成する（ａ）。アクリルアミドと架橋剤のそれぞれの分子は独立した状態であり、この溶液はゾルとして存在する。
【００４４】
アクリルアミドと架橋剤の混合溶液に重合剤が投入されると、アクリルアミドは２価のモノマーとして、メチレンビスアクリルアミドの誘導体は４価のモノマーとして重合が開始されて溶液はゲルとなる（ｂ）。
【００４５】
電気泳動後、電気泳動用担体に酵素を投入すると架橋部の一部が分断され、ゾルの状態になる（ｃ）。
【００４６】
次に、本発明に係る電気泳動用担体の製造について説明する。
【００４７】
合成法の一例を挙げる。ただし、本発明はこの合成法に限定されない。
【００４８】
骨格となるアミノ酸もしくはアミノ酸重合体（ペプチド鎖）のN末端側のアミノ基及びC末端側のカルボキシル基に、それぞれ重合に必要な官能基を導入することで製造する。ペプチドを用いる場合には、側鎖の保護基は完成まで外さないことが前提となる。まず、骨格となるアミノ酸もしくはアミノ酸重合体（ペプチド鎖）のN末端側のアミノ基に、acryloyl chlorideを反応させ、N-acryloyl amino acid (peptide)を得る。得られたN-acryloyl amino acid (peptide)のC末端側のカルボキシル基に、2(phenylseleno)ethanolを反応させ、bis-acrylol amino acid (peptide)を合成させる。ここで必要となる２つの素反応は文献として公知である。
【００４９】
アクリルアミドに、メチレンビスアクリルアミドと架橋剤となるメチレンビスアクリルアミドの誘導体を加えた混合液を調整する。アクリルアミドに対して、メチレンビスアクリルアミド及びメチレンビスアクリルアミドの誘導体を、重量比率をそれぞれ約０．１〜５％として混合溶液として調整する。この混合溶液に、重合剤として過硫酸アンモニウム（ammonium persulfate,ＡＰＳ）とＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチルエチレンジアミン（N,N,N,'N'-Tetramethylethylenediamine,ＴＥＭＥＤ）を加え、ラジカル重合させることによりゲル状の電気泳動用担体が得られる。ＡＰＳ及びＴＥＭＥＤは、上記混合液にそれぞれ約０．０３％〜０．１％の重量比率で加える。重合が開始したら、ガラス又はプラスチックからなる型枠に注入して成型する。
【００５０】
電気泳動用担体の濃度は、ＤＮＡの電気泳動易動度に影響を及し、アクリルアミドとメチレンビスアクリルアミド及びメチレンビスアクリルアミドの誘導体の比により、マトリックスのポアサイズを決定することができる。一般的に非変性ゲルには、アクリルアミドとメチレンビスアクリルアミドが２９:１の比率の電気泳動用担体が用いられる。ポリアクリルアミドゲル系の電気泳動は、５００ｂｐ以下の小さめのＤＮＡ断片の分離分析に用いられる場合が多い。その特徴は、（１）分解能に優れ、１０〜２０ｂｐの違いを容易に分離し、１ｂｐの差異をも分離可能である。（２）１０μｇ程度の大量のＤＮＡも、１ｃｍ幅のウェルにのせることができる。（３）ゲルからＤＮＡを回収する際、アガロースゲルに比べ、高純度のＤＮＡを得ることができることである。
【００５１】
ＤＮＡの電気泳動においてゲルマトリックスの種類、ゲル濃度は、電気泳動易動度にかかわる主要な因子で、一般的にポリアクリルアミド系の電気泳動用担体は、０．５ｋｂ以下のフラグメントの分離、アガロース系の電気泳動用担体は、０．２ｋｂ以上のフラグメントの分離に適している。また、数１０ｋｂ〜１００００ｋｂの大きなＤＮＡフラグメントの分離にはパルスフィールド電気泳動法が用いられる。
【００５２】
次に、本発明に係る電気泳動用担体を使用した試料の生産方法を図２に基づいて説明する。
【００５３】
まず、前記の工程によって作成された型枠中の電気泳動用担体が設置された泳動装置に分析の対象となる試料を加える（ＳＴ１０１）。
【００５４】
電気泳動装置に泳動用緩衝液を充填し、泳動装置に電圧を加えることで試料をクーロン力によって泳動させる（ＳＴ１０２）。
【００５５】
泳動完了後に、電源を切り泳動装置から型枠ごとに電気泳動用担体を外し、担体にタンパク質染色を行う（ＳＴ１０３）。
【００５６】
タンパク質染色を行った電気泳動用担体から、タンパク質を含む部分を刳り抜く。（ＳＴ１０４）。
【００５７】
タンパク質を含む電気泳動用担体の一片を、タンパク質分解酵素を含む反応液に浸漬・保温する（ＳＴ１０５）。
【００５８】
タンパク質及び電気泳動用担体中の分解可能な部位を有するメチレンビスアクリルアミドの誘導体を加水分解させて、タンパク質を抽出する（ＳＴ１０６）。
【００５９】
次に、本発明に係る分析の対象となる試料の調整について説明する。
【００６０】
（１）組織の場合、例えば肝臓由来のタンパク質の１００μｇを１８ｃｍ×１８ｃｍ、厚さ１ｍｍの試料とする。
【００６１】
１．組織は氷冷したＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）で洗い、重量（ｇ）の５倍量のタンパク質溶解溶液（ｍｌ）を加えてホモジナイザーで可溶化する。可溶化が不十分な時は超音波破砕機を用いて可溶化させる。
【００６２】
２．可溶化後、４００００ｇで１時間遠心して上清をサンプルとする。サンプルは使用するまで−８０度で保存する。
【００６３】
（２）培養細胞の場合、例えば核酸ＤＮＡ１ｍｇを１８ｃｍ×１８ｃｍ、厚さ１ｍｍのと試料とする。
【００６４】
１．培養細胞は氷冷したＰＢＳで洗い、１０ｃｍシャーレ１枚につきタンパク質溶解溶液１ｍｌを加えて、セルスクレーパーでかき混ぜながら細胞を溶解する。
【００６５】
２．溶解した細胞をチューブに回収後、４００００ｇで１時間遠心して上清をサンプルとする。使用するまで−８０度で保存する。
【００６６】
次に、本発明に係る電気泳動用担体を使用した電気泳動の詳細について説明する。
【００６７】
１．タンパク質１００μｇを含むサンプルにタンパク質溶解溶液を加えて４００μｌにする。
【００６８】
２．膨潤用トレイに（１）の溶液を入れ、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐ（アマシャムバイオサイエンス製）溶液の上に被せる。さらに、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐ  Ｃｏｖｅｒ  Ｆｌｕｉｄ（アマシャムバイオサイエンス製）を被せて一晩静置する。
【００６９】
３．膨潤したＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐをＭｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｕｎｉｔにセットして、２０度に調整し、５００Ｖで１０分間、３５００Ｖで８時間、電気泳動を行う。
【００７０】
４．電気泳動後、平衡化トレイに入れて、平衡化バッファーＡ液で１５分間振盪し、平衡化バッファーＢ液に入れ替えて、さらに１５分間振盪する。
【００７１】
５．ＤＡＬＴ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｍａｋｅｒを使用して、本発明に係る電気泳動用担体を作成する。
【００７２】
６．平衡化したＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐを前記（５）で作成した電気泳動用担体に載せ、１％ＢＰＢ（bromphenol blue）入りアガロース溶液で固める。
【００７３】
７．ＤＡＬＴ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｕｎｉｔを使用して８０Ｖで１６時間、ＢＰＢバンドが電気泳動用担体の下端にみえるまで泳動させる。
【００７４】
８．電気泳動用担体中に存在する分離された物質（ＢＰＢバンドと観察される）を刳り抜いて他の容器に移し替える。
【００７５】
９．刳り抜かれた電気泳動用担体に酵素としてトリプシンを投入し、ゾル化させて中から物質を取り出す。
【００７６】
次に、本発明に係る電気泳動に使用した装置及び試薬等について説明する。
【００７７】
（１）装置
【００７８】
Ａ．Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｕｎｉｔ
【００７９】
（アマシャムバイオサイエンス製）
【００８０】
Ｂ．ＤＡＬＴ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｕｎｉｔ
【００８１】
（アマシャムバイオサイエンス製）
【００８２】
Ｃ．ＤＡＬＴ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｍａｋｅｒ
【００８３】
（アマシャムバイオサイエンス製）
【００８４】
（２）試薬
【００８５】
〈タンパク質溶解溶液〉
【００８６】
尿素（和光純薬製）                  ５Ｍ
【００８７】
チオ尿素（和光純薬製）              ２Ｍ
【００８８】
ＣＨＡＰＳ（和光純薬製）            ２％
【００８９】
ＳＢ３−１０（ＳＩＧＭＡ）          ２％
【００９０】
ＤＴＴ（和光純薬製）                １％（ｗ／ｖ）
【００９１】
Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ※（マシャムバイオサイエンス製）  ２％（ｗ／ｖ）
【００９２】
※Ａｍｐｈｏｌｉｎｅは等電点電気泳動の直前に添加する。
【００９３】
〈平衡化バッファー原液〉
【００９４】
尿素（和光純薬製）                  ５７．６ｇ
【００９５】
グリセロール                        ６０．５ｇ
【００９６】
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）      １６ｍｌ
【００９７】
（和光純薬製）
【００９８】
１０％ＳＤＳ                        １６ｍｌ
【００９９】
ＭｉｌｌｉＱ水で１６０ｍｌにする。
【０１００】
〈平衡化バッファーＡ液〉※※
【０１０１】
平衡化バッファー原液                ８０ｍｌ
【０１０２】
ＤＴＴ（和光純薬製）                ２００ｍｇ
【０１０３】
〈平衡化バッファーＢ液〉※※
【０１０４】
平衡化バッファー原液                ８０ｍｌ
【０１０５】
ヨードアセトアミド（和光純薬製）    ３．６ｇ
【０１０６】
ＢＰＢ（和光純薬製）                薬さじに少量
【０１０７】
※※平衡化バッファーＡ液及び平衡化バッファーＢ液は、平衡化バッファー原液を等分して作成する。
【０１０８】
本発明は上記に説明したいずれの実施形態にも限定されず、本発明の技術思想の範囲で適宜変更されて適用することができる。
【０１０９】
本発明は、二次元電気泳動に適用することができる。
【０１１０】
分子の種類が多数から構成される混合物を対象とする際、幾つかの種類が重なって分離しにくいことがあり、一次元電気泳動の場合、通常２０〜３０バンドの分離が限界である。そこで、本発明を二次元電気泳動に適用することにより、分解能を向上させ、数千のＤＮＡ断片の分離が可能となる。ＤＮＡの二次元電気泳動の方法として、一次元、二次元ともに分子量で分離する方法がある。ＤＮＡ断片に末端ＲＩ（Radio Isotope）標識を行い、一次元電気泳動を行った後、次にゲル中で制限酵素による消化の後に二次元電気泳動を行う。ゲル中、制限酵素で消化することより分子量が変化するので２回の分子量による分離ができることになる。ゲノム中に数千か所を切断する制限酵素、たとえば、切断端を末端ＲＩ標識して、この二次元電気泳動を行えば、一度にゲノム中の数千か所の情報を得ることができる。検出には、オートラジオグラフィーを用いる。
【０１１１】
また本発明は、キャピラリー電気泳動法（capillary electrophoresis：ＣＥ）に適用することができる。
【０１１２】
ＣＥ法は、内径５０μｍ程度のキャピラリー内にゲルやポリマーを含む緩衝液を充填し電気泳動を行い、自動化することで分析効率を上げることができるものである。キャピラリー電気泳動法よって、特に、調製が煩雑な電気泳動用担体を用いずに、短時間に再現性がよく、数１０〜数１０００ｂｐのＤＮＡを分析することが可能となる。電気泳動後のバンドの検出にはＵＶ（ultraviolet）が一般的であり、１ピーク当たりｎｇ〜ｐｇのＤＮＡを検出できる。レーザー蛍光法を用いることで検出感度は１０〜１０００倍向上する。ＣＥの装置は、高圧微弱電流型電源、オートサンプラー、キャピラリー、検出器からなる。ＤＮＡの分離には、内径５０〜１００μｍ位のキャピラリーを用いる。電気泳動用担体としてポリアクリルアミドを使用する場合は、コーティングしていないキャピラリーに直接行うが、ポリマー溶液を担体として用いたnon-gel sieving法では、内壁をコーティングし、電気浸透流を防止したキャピラリーを用いる。
【０１１３】
さらに、本発明は例えば、等電点電気泳動に適用することができる。
【０１１４】
本発明を等電点電気泳動に適用することにより、タンパク質の等電点（pI）の違いを利用して分離し、目的タンパク質の等電点測定や分析を行うことができる。タンパク質を構成しているアミノ酸側鎖やアミノ末端、カルボキシル末端の電荷はpH条件によって変化し、電荷の総和がゼロになるpHの値が等電点である。等電点電気泳動を行うには、泳動ゲル中にpH勾配を作る必要がある。サンプルを泳動ゲルに添加して電場をかけると、それぞれのタンパク質は固有のpIと同じpHに向かってpH勾配を形成したゲル中を移動します。pH勾配ゲルの作製には、両性担体（キャリアアンフォライト）をゲルに添加して電場をかけてpH勾配を形成する手法と、様々なpIの側鎖を持つアクリルアミド誘導体を用いてゲル作製と同時にpH勾配を形成する手法（IPG法： Immobilized pH gradient）とがある。キャリアアンフォライトを用いる等電点泳動の分離能は０．０１〜０．０２ｐＨ単位で、ＩＰＧ法では０．００１ ｐＨ単位の違いでも分離することができます。等電点電気泳動は、分子量が同じで等電点が異なるアイソザイムの検定や、タンパク質の分取に利用できる。また、二次元電気泳動の一次元目の泳動法としても利用される。
【０１１５】
さらに、本発明は例えば、パルスフィールドゲル電気泳動法に適用することができる。
【０１１６】
本発明をパルスフィールドゲル電気泳動法に適用すれば、二つの異なる方向に交互に電場をかけて、５０ｋｂ〜１０Ｍｂ程度のＤＮＡを分子量により分離できる。この方法によれば、電気泳動用担体のふるい効果によらず、電場の向きの変化に対応し負に帯電しているＤＮＡ分子が向きを変えるときに、大きなＤＮＡ分子は小さな分子に比べて向きがそろうまで、より多くの時間がかかる性質を利用するので、ＤＮＡが担体中を移動するときに電場の向きを繰返し変化させることで分子量の大きさに従って分離することができる。すなわち、分解能は、電場の方向転換の間隙であるパルスタイムに依存することになる。パルスフィールドゲル電気泳動法の操作は、サンプルの調製、電気泳動、分離後の解析に分けられるる。この方法では、解析の対象となるＤＮＡが大きいため、調製過程で剪断力によりＤＮＡがランダムに切断されないよう、細胞を低融である電気泳動担体に埋め込み、固化されたブロック中でＤＮＡを調製する方法をとることができる。電気泳動により試料を分離した後、０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド溶液でＤＮＡを染色し、検出を行う。次にナイロン膜等にトランスファーし、特定のプローブでサザンハイブリダイゼーション法等により解析することができる。
【０１１７】
さらに本発明は、ＲＬＧＳ（restriction landmark genome scanning）法に適用することができる。
【０１１８】
本発明をＲＬＧＳ法に適用すれば、ゲノム全体のある領域にランドマークを設けて、それを高速にスキャニングして特定の遺伝子を同定していくことができる。この方法は主に下記の工程から構成される。（１）ブロッキング：一般にゲノムＤＮＡは組織から精製する過程で、ニックやギャップが入る。ＲＩで標識する際には、そのような部位にも標識が入りバックグラウンドの原因となる。そこでゲノムＤＮＡの物理的切断末端にあらかじめヌクレオチドアナログを取り込ませることにより、非特異的な放射標識が生じることを防ぐ。（２）ランドマークの切断：ブロッキングしたＤＮＡをrare cutter酵素（１００ｋｂ以上のサイズを生じる制限酵素Ａ）で切断する。この制限酵素の認識部位がlandmarkとなる。（３）ラベリング：切断端をＲＩ標識する。制限酵素Ａに応じて必要な場合は、さらに平均鎖長の短い制限酵素Ｂで切断することでアガロース電気泳動により分離できる長さ（平均鎖長数ｋｂｐ〜数１０ｋｂｐ）に調製する。（４）一次元目電気泳動：薄層アガロースゲルを用いて一次元目の電気泳動を実施する。（５）ＤＮＡのゲル中での切断：一次元目の電気泳動で分離されたＤＮＡはゲル中でさらに平均鎖長の短い制限酵素Ｃ（１０ｋｂｐ以下）で切断する。（６）二次元目電気泳動：切断されたＤＮＡはアルリルアミドゲルで二次元目の電気泳動を行う。（７）オートラジオグラフィー：ゲルのオートラジオグラフィーをとる。また、この方法には次のような技術的効果を奏する。（Ｉ）一度に数千のlandmarkの情報が入手できるので高等生物の詳細なゲノム解析ができる。（ＩＩ）landmarkとして複数の制限酵素を用いて本法を複数行えば、さらに多くのlandmark情報を得ることができる。（ＩＩＩ）スポットの強度からゲノム中のコピー数の情報が得られる。（ＩＶ）プローブやプライマーが不要であるため適用できる生物種が多い。
【０１１９】
さらに本発明は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に適用することができる。
【０１２０】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ポリアクリルアミドゲルに界面活性剤ＳＤＳを加え、タンパク質を一本鎖状に変性して行う。この方法は次の技術的効果を奏する。（１）タンパク質の純度の分析（２）タンパク質の分子量の決定（３）タンパク質濃度の確認（４）タンパク質加水分解の検出（５）免疫沈殿をしたタンパク質の同定（６）タンパク質の変異の検出（７）抗体生成においてのタンパク質抗原の分離と凝縮（８）放射線標識タンパク質の分離がある。
【０１２１】
さらに本発明は、尿素添加ポリアクリルアミドゲル電気泳動に適用することができる。
【０１２２】
尿素添加ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ポリアクリルアミドゲルに変性剤の尿素を加え、一本鎖ＤＮＡやＲＮＡが二次構造を形成しないようにして行う。この方法により、対象となる試料の塩基数を推定することができ、シーケンス解析に用いることができる。
【０１２３】
さらに本発明は、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に適用することができる。
【０１２４】
非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、変性剤を加えず、そのままのポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行う。この方法により、タンパク質は高次構造を保ったまま、一本鎖ＤＮＡやＲＮＡは二次・三次構造を維持したまま行われるので、試料を複合体の状態として電気泳動を行うことができる。
【０１２５】
このように本発明は、図１に示すように、架橋剤によって架橋されているポリアクリルアミド系の電気泳動用担体であって、前記架橋剤は、所定の条件により分断される部位を有するメチレンビスアクリルアミドの誘導体であり、電気泳動に使用された電気泳動用担体を所定の条件下におくことによりゲルからゾルに転移するので、電気泳動された物質は分解されずに当該担体中に含まれた物質を取り出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】本発明に係る電気泳動用担体の製造過程の一実施形態を示す概念図。
【図２】本発明に係る電気泳動用担体を使用した試料の生産方法の一実施形態を示すフローチャート図。
【符号の説明】
【０１２７】
１  アクリルアミド
２  メチレンビスアクリルアミド
３  メチレンビスアクリルアミドの誘導体
【図１】
2005024497.tif 000003
【図２】
2005024497.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月7日(2004.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡやタンパク質、ペプチド、糖、脂質の解析に行う電気泳動用担体及びこの電気泳動用担体を使用した試料の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやタンパク質、ペプチド、糖、脂質など生体由来物質の分離分析において、電気泳動法は比較的容易かつ安価に行える方法として普及している。試料を電気泳動するための担体として、主に天然系担体としてアガロース（例えば、特許文献１参照）、人工系担体としてポリアクリルアミド（例えば、特許文献２参照）が利用されている。
【０００３】
天然系担体は、温度依存によりゾル−ゲル転移が可逆的に行われるので、対象となる試料から分離された純度の高い物質として取り出すことができる。しかしながら、欠点としては、分離能に限界があり、低分子のＤＮＡを分離することはできない。また、担体自体が白濁して透明度が高くないので、電気泳動後の塩基配列決定等の定性が困難なものとなる。
【０００４】
一方、人工系担体は、分離能が高く、担体のポアサイズを任意に調整できるので、対象となる試料に含まれる物質の分子量に最適な担体を製造することができる。しかしながら、欠点としては、従来のメチレンビスアクリルアミドのみを架橋部としたポリアクリルアミドを使用した担体は、重合開始剤により一度ゾルからゲルになった場合には、再びゾルに戻すことはできない。その結果、試料が各物質に分離されてもそれのみを抽出することができず、新規物質としての回収や他の分析に利用できない。  
【特許文献１】特開平１０−４８１８１（段落番号[００１２]）。
【特許文献２】特開平８−１５２２２（段落番号[０００７]、図１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、このような問題を解決するために、電気泳動終了後に分離された物質を抽出することができる電気泳動用担体及びこの電気泳動用担体を使用した試料の生産方法を提供すること目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような課題を解決するため、本発明に係る電気泳動用担体は、架橋剤によって架橋されているポリアクリルアミド系の電気泳動用担体であって、前記架橋剤は、所定の条件により分断される部位を有するメチレンビスアクリルアミドの誘導体を含むことを特徴とする。
【０００７】
本発明によれば、電気泳動に使用された電気泳動用担体を所定の条件下におくことによりゲルからゾルに転移するので、電気泳動された物質は分解されずに、当該担体中に含まれた物質を取り出すことができる。ここで所定の条件とは、電気泳動用担体に含まれる架橋剤の一部が分断される環境にされるための条件をいい、当該担体の構成により例えば、プロテアーゼやペプチターゼ等の酵素やヒドロキシルアミンや臭化シアン等の化学物質を加えてもよい。また、熱、光、電磁波等の照射や、ｐＨを変化させる等の化学的条件を変化させてもよい。
【０００８】
本発明の一の形態によれば、前記分断される部位は、ペプチド結合により結合していることを特徴とする。これにより、当該ペプチド結合を分離する特異的な酵素を投入すれば、電気泳動用担体がゲルからゾルに転移して、当該物質を取り出すことができる。
【０００９】
本発明の一の形態によれば、前記ペプチド結合は、アミノ酸残基の数が２又は３であることを特徴とする。これにより、電気泳動に適した硬度を有する電気泳動用担体を得ることができる。
【００１０】
本発明に係る試料の生産方法は、前記電気泳動用担体を使用して、対象試料を電気泳動により複数の物質に分離する工程と、前記分離された物質を少なくとも１つ含む電気泳動用の一部分を刳り抜く工程と、前記刳り抜かれた一部分に所定の酵素を加える工程とを具備することを特徴とする。
【００１１】
本発明によれば、電気泳動用担体に含まれるペプチド結合が所定の酵素により特異的に分断されゲルからゾルとなるので、電気泳動で分離された物質を独立して生産及び分析することができる。
【００１２】
本発明の一の形態によれば、前記酵素を加える工程に使用される酵素は、トリプシン、キモトリプシン、サーモライシン、リシルエンドペプチダーゼ、エンドペプチダーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドペプチダーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドペプチダーゼＡｓｐ−Ｎ、メタロエンドプロテアーゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ、アルギニルエンドペプチダーゼ、クロストリパイン、トロンビン、カリクレイン、フリン、ファクターXa、エンテロキナーゼ、Genase及びプロリン特異的エンドペプチダーゼからなる群より選ばれた化合物の一つもしくは複数であることを特徴とする。
【００１３】
本発明の一の形態によれば、前記化学物質を加える工程に使用される化学物質は、臭化シアン、BNPS-スカトール、ヒドロキシルアミン、塩酸グアニジン、N-ブロモスクシンイミド、酸からなる群より選ばれた化合物の一つもしくは複数であることを特徴とする。
【００１４】
これらにより、電気泳動用担体に含まれる特定のアミノ酸を有するペプチド結合を分断して、ゲルからゾルに転移もしくは重合体を小さくすることができる。
【００１５】
ここで、上記酵素が分解するアミノ酸としては以下の通りである。
【００１６】
トリプシン：リジン、アルギニン残基のC末端側
【００１７】
キモトリプシン：チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンの残基のC末端側
【００１８】
サーモライシン：ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンのN末端側
【００１９】
リシルエンドペプチダーゼ：リジン残基のC末端側
【００２０】
エンドペプチダーゼＬｙｓ−Ｃ：リジン残基のC末端側
【００２１】
エンドペプチダーゼＧｌｕ−Ｃ：グルタミン酸残基のC末端側
【００２２】
エンドペプチダーゼＡｓｐ−Ｎ：アスパラギン酸残基のN末端側
【００２３】
メタロエンドプロテアーゼ：リジン残基の残基のN末端側
【００２４】
マトリクスメタロプロテアーゼ：Gly-Lue/Ile間（他）
【００２５】
アルギニルエンドペプチダーゼ：アルギニン残基のC末端側
【００２６】
クロストリパイン：アルギニン残基のC末端側
【００２７】
トロンビン：アルギニン残基のC末端側
【００２８】
カリクレイン：アルギニン残基のC末端側
【００２９】
プロリン特異的エンドペプチダーゼ：プロリン残基のC末端側
【００３０】
フリン：Arg-X-X-Arg配列のC末端側
【００３１】
ファクターXa：Ile-Glu/Asp/Gly-ArgのＣ末端側
【００３２】
エンテロキナーゼ：Asp-Asp-Asp-Asp-LysのＣ末端側
【００３３】
Genase：His-TyrのＣ末端側またはTyr-His間
【００３４】
臭化シアン：メチオニン残基のＣ末端側
【００３５】
BNPS-スカトール：トリプトファン残基のＣ末端側
【００３６】
N-ブロモスクシンイミド：トリプトファン、チロシン、ヒスチジン残基のＣ末端側
【００３７】
ヒドロキシルアミン：Asn-Gly間
【００３８】
塩酸グアニジン：Asp-Pro間
【００３９】
酸：Asp-Pro間、X-Asp-Pro間
【発明の効果】
【００４０】
以上説明したように、本発明によれば、電気泳動終了後に分離された物質を抽出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
【００４２】
図１は、本発明に係る電気泳動用担体の製造過程の一実施形態を示す概念図である。図２は、本発明に係る電気泳動用担体を使用した試料の生産方法の一実施形態を示すフローチャート図である。
【００４３】
本発明に係る電気泳動用担体を製造するため、アクリルアミドとメチレンビスアクリルアミドの誘導体である架橋剤を混合した溶液を作成する（ａ）。アクリルアミドと架橋剤のそれぞれの分子は独立した状態であり、この溶液はゾルとして存在する。
【００４４】
アクリルアミドと架橋剤の混合溶液に重合剤が投入されると、アクリルアミドは２価のモノマーとして、メチレンビスアクリルアミドの誘導体は４価のモノマーとして重合が開始されて溶液はゲルとなる（ｂ）。
【００４５】
電気泳動後、電気泳動用担体に酵素を投入すると架橋部の一部が分断され、ゾルの状態になる（ｃ）。
【００４６】
次に、本発明に係る電気泳動用担体の製造について説明する。
【００４７】
合成法の一例を挙げる。ただし、本発明はこの合成法に限定されない。
【００４８】
骨格となるアミノ酸もしくはアミノ酸重合体（ペプチド鎖）のN末端側のアミノ基及びC末端側のカルボキシル基に、それぞれ重合に必要な官能基を導入することで製造する。ペプチドを用いる場合には、側鎖の保護基は完成まで外さないことが前提となる。まず、骨格となるアミノ酸もしくはアミノ酸重合体（ペプチド鎖）のN末端側のアミノ基に、acryloyl chlorideを反応させ、N-acryloyl amino acid (peptide)を得る。得られたN-acryloyl amino acid (peptide)のC末端側のカルボキシル基に、2(phenylseleno)ethanolを反応させ、bis-acrylol amino acid (peptide)を合成させる。ここで必要となる２つの素反応は文献として公知である。
【００４９】
アクリルアミドに、メチレンビスアクリルアミドと架橋剤となるメチレンビスアクリルアミドの誘導体を加えた混合液を調整する。アクリルアミドに対して、メチレンビスアクリルアミド及びメチレンビスアクリルアミドの誘導体を、重量比率をそれぞれ約０．１〜５％として混合溶液として調整する。この混合溶液に、重合剤として過硫酸アンモニウム（ammonium persulfate,ＡＰＳ）とＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチルエチレンジアミン（N,N,N,'N'-Tetramethylethylenediamine,ＴＥＭＥＤ）を加え、ラジカル重合させることによりゲル状の電気泳動用担体が得られる。ＡＰＳ及びＴＥＭＥＤは、上記混合液にそれぞれ約０．０３％〜０．１％の重量比率で加える。重合が開始したら、ガラス又はプラスチックからなる型枠に注入して成型する。
【００５０】
電気泳動用担体の濃度は、ＤＮＡの電気泳動易動度に影響を及し、アクリルアミドとメチレンビスアクリルアミド及びメチレンビスアクリルアミドの誘導体の比により、マトリックスのポアサイズを決定することができる。一般的に非変性ゲルには、アクリルアミドとメチレンビスアクリルアミドが２９:１の比率の電気泳動用担体が用いられる。ポリアクリルアミドゲル系の電気泳動は、５００ｂｐ以下の小さめのＤＮＡ断片の分離分析に用いられる場合が多い。その特徴は、（１）分解能に優れ、１０〜２０ｂｐの違いを容易に分離し、１ｂｐの差異をも分離可能である。（２）１０μｇ程度の大量のＤＮＡも、１ｃｍ幅のウェルにのせることができる。（３）ゲルからＤＮＡを回収する際、アガロースゲルに比べ、高純度のＤＮＡを得ることができることである。
【００５１】
ＤＮＡの電気泳動においてゲルマトリックスの種類、ゲル濃度は、電気泳動易動度にかかわる主要な因子で、一般的にポリアクリルアミド系の電気泳動用担体は、０．５ｋｂ以下のフラグメントの分離、アガロース系の電気泳動用担体は、０．２ｋｂ以上のフラグメントの分離に適している。また、数１０ｋｂ〜１００００ｋｂの大きなＤＮＡフラグメントの分離にはパルスフィールド電気泳動法が用いられる。
【００５２】
次に、本発明に係る電気泳動用担体を使用した試料の生産方法を図２に基づいて説明する。
【００５３】
まず、前記の工程によって作成された型枠中の電気泳動用担体が設置された泳動装置に分析の対象となる試料を加える（ＳＴ１０１）。
【００５４】
電気泳動装置に泳動用緩衝液を充填し、泳動装置に電圧を加えることで試料をクーロン力によって泳動させる（ＳＴ１０２）。
【００５５】
泳動完了後に、電源を切り泳動装置から型枠ごとに電気泳動用担体を外し、担体にタンパク質染色を行う（ＳＴ１０３）。
【００５６】
タンパク質染色を行った電気泳動用担体から、タンパク質を含む部分を刳り抜く。（ＳＴ１０４）。
【００５７】
タンパク質を含む電気泳動用担体の一片を、タンパク質分解酵素を含む反応液に浸漬・保温する（ＳＴ１０５）。
【００５８】
タンパク質及び電気泳動用担体中の分解可能な部位を有するメチレンビスアクリルアミドの誘導体を加水分解させて、タンパク質を抽出する（ＳＴ１０６）。
【００５９】
次に、本発明に係る分析の対象となる試料の調整について説明する。
【００６０】
（１）組織の場合、例えば肝臓由来のタンパク質の１００μｇを１８ｃｍ×１８ｃｍ、厚さ１ｍｍの試料とする。
【００６１】
１．組織は氷冷したＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）で洗い、重量（ｇ）の５倍量のタンパク質溶解溶液（ｍｌ）を加えてホモジナイザーで可溶化する。可溶化が不十分な時は超音波破砕機を用いて可溶化させる。
【００６２】
２．可溶化後、４００００ｇで１時間遠心して上清をサンプルとする。サンプルは使用するまで−８０度で保存する。
【００６３】
（２）培養細胞の場合、例えば核酸ＤＮＡ１ｍｇを１８ｃｍ×１８ｃｍ、厚さ１ｍｍのと試料とする。
【００６４】
１．培養細胞は氷冷したＰＢＳで洗い、１０ｃｍシャーレ１枚につきタンパク質溶解溶液１ｍｌを加えて、セルスクレーパーでかき混ぜながら細胞を溶解する。
【００６５】
２．溶解した細胞をチューブに回収後、４００００ｇで１時間遠心して上清をサンプルとする。使用するまで−８０度で保存する。
【００６６】
次に、本発明に係る電気泳動用担体を使用した電気泳動の詳細について説明する。
【００６７】
１．タンパク質１００μｇを含むサンプルにタンパク質溶解溶液を加えて４００μｌにする。
【００６８】
２．膨潤用トレイに（１）の溶液を入れ、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐ（アマシャムバイオサイエンス製）溶液の上に被せる。さらに、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐ  Ｃｏｖｅｒ  Ｆｌｕｉｄ（アマシャムバイオサイエンス製）を被せて一晩静置する。
【００６９】
３．膨潤したＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐをＭｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｕｎｉｔにセットして、２０度に調整し、５００Ｖで１０分間、３５００Ｖで８時間、電気泳動を行う。
【００７０】
４．電気泳動後、平衡化トレイに入れて、平衡化バッファーＡ液で１５分間振盪し、平衡化バッファーＢ液に入れ替えて、さらに１５分間振盪する。
【００７１】
５．ＤＡＬＴ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｍａｋｅｒを使用して、本発明に係る電気泳動用担体を作成する。
【００７２】
６．平衡化したＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐを前記（５）で作成した電気泳動用担体に載せ、１％ＢＰＢ（bromphenol blue）入りアガロース溶液で固める。
【００７３】
７．ＤＡＬＴ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｕｎｉｔを使用して８０Ｖで１６時間、ＢＰＢバンドが電気泳動用担体の下端にみえるまで泳動させる。
【００７４】
８．電気泳動用担体中に存在する分離された物質（ＢＰＢバンドと観察される）を刳り抜いて他の容器に移し替える。
【００７５】
９．刳り抜かれた電気泳動用担体に酵素としてトリプシンを投入し、ゾル化させて中から物質を取り出す。
【００７６】
次に、本発明に係る電気泳動に使用した装置及び試薬等について説明する。
【００７７】
（１）装置
【００７８】
Ａ．Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｕｎｉｔ
【００７９】
（アマシャムバイオサイエンス製）
【００８０】
Ｂ．ＤＡＬＴ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｕｎｉｔ
【００８１】
（アマシャムバイオサイエンス製）
【００８２】
Ｃ．ＤＡＬＴ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｍａｋｅｒ
【００８３】
（アマシャムバイオサイエンス製）
【００８４】
（２）試薬
【００８５】
〈タンパク質溶解溶液〉
【００８６】
尿素（和光純薬製）                  ５Ｍ
【００８７】
チオ尿素（和光純薬製）              ２Ｍ
【００８８】
ＣＨＡＰＳ（和光純薬製）            ２％
【００８９】
ＳＢ３−１０（ＳＩＧＭＡ）          ２％
【００９０】
ＤＴＴ（和光純薬製）                １％（ｗ／ｖ）
【００９１】
Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ※（マシャムバイオサイエンス製）  ２％（ｗ／ｖ）
【００９２】
※Ａｍｐｈｏｌｉｎｅは等電点電気泳動の直前に添加する。
【００９３】
〈平衡化バッファー原液〉
【００９４】
尿素（和光純薬製）                  ５７．６ｇ
【００９５】
グリセロール                        ６０．５ｇ
【００９６】
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）      １６ｍｌ
【００９７】
（和光純薬製）
【００９８】
１０％ＳＤＳ                        １６ｍｌ
【００９９】
ＭｉｌｌｉＱ水で１６０ｍｌにする。
【０１００】
〈平衡化バッファーＡ液〉※※
【０１０１】
平衡化バッファー原液                ８０ｍｌ
【０１０２】
ＤＴＴ（和光純薬製）                ２００ｍｇ
【０１０３】
〈平衡化バッファーＢ液〉※※
【０１０４】
平衡化バッファー原液                ８０ｍｌ
【０１０５】
ヨードアセトアミド（和光純薬製）    ３．６ｇ
【０１０６】
ＢＰＢ（和光純薬製）                薬さじに少量
【０１０７】
※※平衡化バッファーＡ液及び平衡化バッファーＢ液は、平衡化バッファー原液を等分して作成する。
【０１０８】
本発明は上記に説明したいずれの実施形態にも限定されず、本発明の技術思想の範囲で適宜変更されて適用することができる。
【０１０９】
本発明は、二次元電気泳動に適用することができる。
【０１１０】
分子の種類が多数から構成される混合物を対象とする際、幾つかの種類が重なって分離しにくいことがあり、一次元電気泳動の場合、通常２０〜３０バンドの分離が限界である。そこで、本発明を二次元電気泳動に適用することにより、分解能を向上させ、数千のＤＮＡ断片の分離が可能となる。ＤＮＡの二次元電気泳動の方法として、一次元、二次元ともに分子量で分離する方法がある。ＤＮＡ断片に末端ＲＩ（Radio Isotope）標識を行い、一次元電気泳動を行った後、次にゲル中で制限酵素による消化の後に二次元電気泳動を行う。ゲル中、制限酵素で消化することより分子量が変化するので２回の分子量による分離ができることになる。ゲノム中に数千か所を切断する制限酵素、たとえば、切断端を末端ＲＩ標識して、この二次元電気泳動を行えば、一度にゲノム中の数千か所の情報を得ることができる。検出には、オートラジオグラフィーを用いる。
【０１１１】
また本発明は、キャピラリー電気泳動法（capillary electrophoresis：ＣＥ）に適用することができる。
【０１１２】
ＣＥ法は、内径５０μｍ程度のキャピラリー内にゲルやポリマーを含む緩衝液を充填し電気泳動を行い、自動化することで分析効率を上げることができるものである。キャピラリー電気泳動法よって、特に、調製が煩雑な電気泳動用担体を用いずに、短時間に再現性がよく、数１０〜数１０００ｂｐのＤＮＡを分析することが可能となる。電気泳動後のバンドの検出にはＵＶ（ultraviolet）が一般的であり、１ピーク当たりｎｇ〜ｐｇのＤＮＡを検出できる。レーザー蛍光法を用いることで検出感度は１０〜１０００倍向上する。ＣＥの装置は、高圧微弱電流型電源、オートサンプラー、キャピラリー、検出器からなる。ＤＮＡの分離には、内径５０〜１００μｍ位のキャピラリーを用いる。電気泳動用担体としてポリアクリルアミドを使用する場合は、コーティングしていないキャピラリーに直接行うが、ポリマー溶液を担体として用いたnon-gel sieving法では、内壁をコーティングし、電気浸透流を防止したキャピラリーを用いる。
【０１１３】
さらに、本発明は例えば、等電点電気泳動に適用することができる。
【０１１４】
本発明を等電点電気泳動に適用することにより、タンパク質の等電点（pI）の違いを利用して分離し、目的タンパク質の等電点測定や分析を行うことができる。タンパク質を構成しているアミノ酸側鎖やアミノ末端、カルボキシル末端の電荷はpH条件によって変化し、電荷の総和がゼロになるpHの値が等電点である。等電点電気泳動を行うには、泳動ゲル中にpH勾配を作る必要がある。サンプルを泳動ゲルに添加して電場をかけると、それぞれのタンパク質は固有のpIと同じpHに向かってpH勾配を形成したゲル中を移動します。pH勾配ゲルの作製には、両性担体（キャリアアンフォライト）をゲルに添加して電場をかけてpH勾配を形成する手法と、様々なpIの側鎖を持つアクリルアミド誘導体を用いてゲル作製と同時にpH勾配を形成する手法（IPG法： Immobilized pH gradient）とがある。キャリアアンフォライトを用いる等電点泳動の分離能は０．０１〜０．０２ｐＨ単位で、ＩＰＧ法では０．００１ ｐＨ単位の違いでも分離することができます。等電点電気泳動は、分子量が同じで等電点が異なるアイソザイムの検定や、タンパク質の分取に利用できる。また、二次元電気泳動の一次元目の泳動法としても利用される。
【０１１５】
さらに、本発明は例えば、パルスフィールドゲル電気泳動法に適用することができる。
【０１１６】
本発明をパルスフィールドゲル電気泳動法に適用すれば、二つの異なる方向に交互に電場をかけて、５０ｋｂ〜１０Ｍｂ程度のＤＮＡを分子量により分離できる。この方法によれば、電気泳動用担体のふるい効果によらず、電場の向きの変化に対応し負に帯電しているＤＮＡ分子が向きを変えるときに、大きなＤＮＡ分子は小さな分子に比べて向きがそろうまで、より多くの時間がかかる性質を利用するので、ＤＮＡが担体中を移動するときに電場の向きを繰返し変化させることで分子量の大きさに従って分離することができる。すなわち、分解能は、電場の方向転換の間隙であるパルスタイムに依存することになる。パルスフィールドゲル電気泳動法の操作は、サンプルの調製、電気泳動、分離後の解析に分けられるる。この方法では、解析の対象となるＤＮＡが大きいため、調製過程で剪断力によりＤＮＡがランダムに切断されないよう、細胞を低融である電気泳動担体に埋め込み、固化されたブロック中でＤＮＡを調製する方法をとることができる。電気泳動により試料を分離した後、０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド溶液でＤＮＡを染色し、検出を行う。次にナイロン膜等にトランスファーし、特定のプローブでサザンハイブリダイゼーション法等により解析することができる。
【０１１７】
さらに本発明は、ＲＬＧＳ（restriction landmark genome scanning）法に適用することができる。
【０１１８】
本発明をＲＬＧＳ法に適用すれば、ゲノム全体のある領域にランドマークを設けて、それを高速にスキャニングして特定の遺伝子を同定していくことができる。この方法は主に下記の工程から構成される。（１）ブロッキング：一般にゲノムＤＮＡは組織から精製する過程で、ニックやギャップが入る。ＲＩで標識する際には、そのような部位にも標識が入りバックグラウンドの原因となる。そこでゲノムＤＮＡの物理的切断末端にあらかじめヌクレオチドアナログを取り込ませることにより、非特異的な放射標識が生じることを防ぐ。（２）ランドマークの切断：ブロッキングしたＤＮＡをrare cutter酵素（１００ｋｂ以上のサイズを生じる制限酵素Ａ）で切断する。この制限酵素の認識部位がlandmarkとなる。（３）ラベリング：切断端をＲＩ標識する。制限酵素Ａに応じて必要な場合は、さらに平均鎖長の短い制限酵素Ｂで切断することでアガロース電気泳動により分離できる長さ（平均鎖長数ｋｂｐ〜数１０ｋｂｐ）に調製する。（４）一次元目電気泳動：薄層アガロースゲルを用いて一次元目の電気泳動を実施する。（５）ＤＮＡのゲル中での切断：一次元目の電気泳動で分離されたＤＮＡはゲル中でさらに平均鎖長の短い制限酵素Ｃ（１０ｋｂｐ以下）で切断する。（６）二次元目電気泳動：切断されたＤＮＡはアルリルアミドゲルで二次元目の電気泳動を行う。（７）オートラジオグラフィー：ゲルのオートラジオグラフィーをとる。また、この方法には次のような技術的効果を奏する。（Ｉ）一度に数千のlandmarkの情報が入手できるので高等生物の詳細なゲノム解析ができる。（ＩＩ）landmarkとして複数の制限酵素を用いて本法を複数行えば、さらに多くのlandmark情報を得ることができる。（ＩＩＩ）スポットの強度からゲノム中のコピー数の情報が得られる。（ＩＶ）プローブやプライマーが不要であるため適用できる生物種が多い。
【０１１９】
さらに本発明は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に適用することができる。
【０１２０】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ポリアクリルアミドゲルに界面活性剤ＳＤＳを加え、タンパク質を一本鎖状に変性して行う。この方法は次の技術的効果を奏する。（１）タンパク質の純度の分析（２）タンパク質の分子量の決定（３）タンパク質濃度の確認（４）タンパク質加水分解の検出（５）免疫沈殿をしたタンパク質の同定（６）タンパク質の変異の検出（７）抗体生成においてのタンパク質抗原の分離と凝縮（８）放射線標識タンパク質の分離がある。
【０１２１】
さらに本発明は、尿素添加ポリアクリルアミドゲル電気泳動に適用することができる。
【０１２２】
尿素添加ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ポリアクリルアミドゲルに変性剤の尿素を加え、一本鎖ＤＮＡやＲＮＡが二次構造を形成しないようにして行う。この方法により、対象となる試料の塩基数を推定することができ、シーケンス解析に用いることができる。
【０１２３】
さらに本発明は、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に適用することができる。
【０１２４】
非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、変性剤を加えず、そのままのポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行う。この方法により、タンパク質は高次構造を保ったまま、一本鎖ＤＮＡやＲＮＡは二次・三次構造を維持したまま行われるので、試料を複合体の状態として電気泳動を行うことができる。
【０１２５】
このように本発明は、図１に示すように、架橋剤によって架橋されているポリアクリルアミド系の電気泳動用担体であって、前記架橋剤は、所定の条件により分断される部位を有するメチレンビスアクリルアミドの誘導体であり、電気泳動に使用された電気泳動用担体を所定の条件下におくことによりゲルからゾルに転移するので、電気泳動された物質は分解されずに当該担体中に含まれた物質を取り出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】本発明に係る電気泳動用担体の製造過程の一実施形態を示す概念図。
【図２】本発明に係る電気泳動用担体を使用した試料の生産方法の一実施形態を示すフローチャート図。
【符号の説明】
【０１２７】
１  アクリルアミド
２  メチレンビスアクリルアミド
３  メチレンビスアクリルアミドの誘導体
【配列表フリーテキスト】
【０１２８】
フリンが分解するアミノ酸の配列である。
ファクターＸａが分解するアミノ酸の配列である。
エンテロキナーゼが分解するアミノ酸の配列である。