(57)【要約】      （修正有）【課題】優れた神経細胞増殖促進作用及び神経軸索伸長作用を発揮し得、損傷、欠損などの生じた神経細胞及び神経組織の増殖を促して修復し、神経を再生させることができる、神経再生用材料及びその製造方法の提供。【解決手段】生体吸収性ポリマーと細胞を含んでなる神経再生用材料。ここで、該細胞が、（１）CD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞、及び／又は（２）前記（１）の細胞を分化誘導してなる細胞からなる、神経再生用材料及びその製造方法；細胞と共に使用され得る生体吸収性ポリマーが、多糖類、酸性多糖類エステル、タンパク質、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、シアノアクリレート系共重合体、あるいは酸性多糖類エステルと、天然アミノ酸に由来するα−アミノ基を２個以上有するポリアミノ化合物とから形成されたポリマーからなる、神経再生用材料。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体吸収性ポリマーと共に使用され得る細胞を含んでなる神経再生用材料であって、該細胞が、（１）CD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞、及び／又は（２）前記（１）の細胞を分化誘導してなる細胞からなる、神経再生用材料。
【請求項２】
前記（２）の細胞がシュワン（Schwann）細胞又は神経細胞である請求項１記載の神経再生用材料。
【請求項３】
細胞が哺乳類由来細胞である請求項１又は２記載の神経再生用材料。
【請求項４】
哺乳類由来細胞がヒト由来細胞である請求項３記載の神経再生用材料。
【請求項５】
細胞が他家又は自家由来細胞である請求項１〜４いずれか記載の神経再生用材料。
【請求項６】
細胞の一部又は全部が骨髄起源の細胞である請求項１〜５いずれか記載の神経再生用材料。
【請求項７】
細胞と共に使用され得る生体吸収性ポリマーを含んでなる神経再生用材料であって、該ポリマーが、多糖類とその塩、架橋多糖類とその塩、酸性多糖類エステル、架橋酸性多糖類エステル、タンパク質、ポリペプチド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコール酸／乳酸共重合体、グリコール／カーボネート共重合体、ポリジオキサノン、ポリε−カプロラクトン、乳酸／ε−カプロラクトン共重合体、及びシアノアクリレート系共重合体からなる群より選ばれる少なくとも１種からなる、神経再生用材料。
【請求項８】
生体吸収性ポリマーが多糖類及び／又はその塩からなる請求項７記載の神経再生用材料。
【請求項９】
多糖類及び／又はその塩が酸性多糖類及び／又はその塩である請求項８記載の神経再生用材料。
【請求項１０】
酸性多糖類及び／又はその塩がカルボキシル基を有する多糖類及び／又はその塩である請求項９記載の神経再生用材料。
【請求項１１】
カルボキシル基を有する多糖類及び／又はその塩が、アルギン酸とその塩、及びヒアルロン酸とその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１０記載の神経再生用材料。
【請求項１２】
生体吸収性ポリマーが架橋多糖類及び／又はその塩からなる請求項７記載の神経再生用材料。
【請求項１３】
架橋多糖類及び／又はその塩が、カルボキシル基を有する多糖類及び／又はその塩を、以下の一般式（Ｉ）：
【化１】
2005270237.tif 000004
で表される化合物及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種からなる架橋性試薬で共有結合的に架橋してなるものである、請求項１２記載の神経再生用材料。
【請求項１４】
架橋性試薬が前記一般式（Ｉ）で表される化合物のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド塩である請求項１３記載の神経再生用材料。
【請求項１５】
前記一般式（Ｉ）で表される化合物のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド塩が、ジアミノエタンの２Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、ジアミノヘキサンの２Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、Ｎ，Ｎ’−ジ（リジル）−ジアミノエタンの４Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、及びＮ−（リジル）−ジアミノヘキサンの３Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１４記載の神経再生用材料。
【請求項１６】
細胞と共に使用され得る生体吸収性ポリマーを含んでなる神経再生用材料であって、該ポリマーが、酸性多糖類エステルと、天然アミノ酸に由来するα−アミノ基を２個以上有するポリアミノ化合物とから形成されたポリマーからなる、神経再生用材料。
【請求項１７】
酸性多糖類エステルがアルギン酸プロピレングリコールエステル及び／又はヒアルロン酸プロピレングリコールエステルである請求項１６記載の神経再生用材料。
【請求項１８】
ポリアミノ化合物がε−ポリリジンである請求項１６又は１７記載の神経再生用材料。
【請求項１９】
請求項７〜１１いずれかに記載の生体吸収性ポリマー及び／又は請求項１２〜１８いずれかに記載の生体吸収性ポリマーが生体吸収性の材料からなるチューブに充填されてなるものである神経再生用材料。
【請求項２０】
細胞と生体吸収性ポリマーとを含んでなる神経再生材であって、該細胞が請求項１〜６いずれかに記載の細胞からなり、該生体吸収性ポリマーが請求項７〜１８いずれかに記載の生体吸収性ポリマーからなる、神経再生材。
【請求項２１】
細胞と生体吸収性ポリマーとが生体吸収性の材料からなるチューブに充填されてなるものである請求項２０記載の神経再生材。
【請求項２２】
（１）生物材料より細胞を採取する工程、及び
（２）得られた細胞からCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞を分取する工程、
を有する、生体吸収性ポリマーと共に使用され得る神経再生材用細胞の製造方法。
【請求項２３】
（２’）分取された細胞を分化誘導する工程をさらに有する請求項２２記載の製造方法。
【請求項２４】
工程（１）において細胞を生体の骨髄より採取する請求項２２又は２３記載の製造方法。
【請求項２５】
（１）生物材料より細胞を採取する工程、
（２）得られた細胞からCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞を分取する工程、及び
（３）分取された細胞と、多糖類とその塩、架橋多糖類とその塩、酸性多糖類エステル、架橋酸性多糖類エステル、タンパク質、ポリペプチド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコール酸／乳酸共重合体、グリコール／カーボネート共重合体、ポリジオキサノン、ポリε−カプロラクトン、乳酸／ε−カプロラクトン共重合体、及びシアノアクリレート系共重合体からなる群より選ばれる少なくとも１種からなる生体吸収性ポリマー、及び／又は酸性多糖類エステルと、天然アミノ酸に由来するα−アミノ基を２個以上有するポリアミノ化合物とから形成された生体吸収性ポリマーとを合わせる工程、を有する、神経再生材の製造方法。
【請求項２６】
工程（２）と（３）の間に、（２’）分取された細胞を分化誘導する工程をさらに有する請求項２５記載の製造方法。
【請求項２７】
工程（１）において細胞を生体の骨髄より採取する請求項２５又は２６記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経再生用材料、神経再生材、並びにそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
交通事故や労働災害などの各種の事故によって生じた末梢神経損傷の治療は、外科領域、特に整形外科領域で大きな位置を占めている。近年、切断した神経を繋ぐ外科手術の技術は顕微手術の導入によって著しい進歩を遂げてきた。しかし、神経の欠損部が何かで補わなければならないほど大きい場合に、その治療は外科医にとって難問となっている。臨床的に現在行われている方法は腓腹神経を用いる自家神経移植である。自家神経は最も理想的な神経再生用材料であるが、患者の負担や、手術の複雑化などによって、その採取には制限がある。しかも、腓腹神経の切除によって足首から足の甲にかけての小指側の感覚神経が消失するため患者の生活の質が低下し、できれば自家神経移植を避けるのが好ましい。このような状況下に、自家神経に代わる移植材料の開発が切望され、種々の研究がなされている。例えば、神経以外の組織を用いる自家移植として自家血管移植や自家筋膜移植などが行われているが、患者の生体組織を使用するという点ではやはり患者の負担を解消できず、しかも手術時の複雑さの点でも自家神経移植の場合と大差がない。また、末梢神経は回復可能な臓器とはいえ、ギャップが大きい場合には機能回復に長時間を必要とすることから、より短期に神経機能を回復させる神経再生用材料が求められてきた。
【０００３】
さらに、特に哺乳類の脳・脊髄に代表される中枢神経はひとたび交通外傷やスポーツ外傷に伴う障害を受けると不可逆的であり、最終的には神経変性という過程をたどると考えられている。神経変性を伴った脊髄障害部より遠位の感覚神経、運動神経、自律神経は著しく傷害され、内臓疾患、排泄機能障害も併発し、生涯機能が回復することはない。軽度の損傷の場合においても、車椅子での生活を余儀なくされるが、重度の場合には人工呼吸器を使用しなくてはならない場合もある。これらの患者の社会的復帰は大きな社会問題となっている。
【０００４】
中枢神経が再生しない理由として以下のものが提案されている。
【０００５】
１）オリゴデンドロサイトは神経再生において強力な阻害作用を持っている。具体的には、オリゴデンドロサイトから抽出されたＮｏｇｏという分子が阻害することが示されている（非特許文献１及び２）。培養系を使った実験では、神経突起が伸長しているときにオリゴデンドロサイト由来のミエリン鞘と接触すると突起は伸長を止めるだけでなく、突起を退縮させることがわかっている（contact inhibition）。またミエリン鞘のあるところには神経突起は伸長せず、培養においてはそれらを避けるように突起が進んでいくことが示されている。
【０００６】
２）次に、グリオーシスを起こしたアストロサイトはさまざまな阻害物質を産生することがわかっており、なかでもケラチン硫酸やコンドロイチン硫酸などのプロテオグリカンが挙げられている（非特許文献３）。これらの物質が再生軸索の物理的なバリアとして作用し、軸索が伸長することを阻害することが推定されている。
【０００７】
一方、末梢神経は再生可能な臓器である。中枢神経とは異なり、末梢神経組織中では、シュワン（Schwann）細胞が主要な構成細胞である。末梢神経の神経線維は有髄・無髄のいずれの形態をとっていても、シュワン細胞によって被覆されている。シュワン細胞は神経堤細胞（neural crest cell）に由来し、神経再生に阻害的に作用する中枢性グリア（オリゴデンドロサイト、アストロサイト）は神経管（neural tube）に由来するというように、それぞれ発生起源を異にしている。
【０００８】
末梢神経は以下のような機構で再生すると考えられる。
【０００９】
末梢神経では、切断などの損傷を受けると損傷部位よりも末梢側ではワーラー変性（Wallerian degeneration）が起きる。これはシュワン細胞が、髄鞘を形成し分化した形態から未分化な状態に逆戻りし、活性化され分裂増殖し、索状を呈することを指す。末梢神経では個々の神経線維は独立してシュワン細胞に包まれており、その外側は基底膜に覆われている。すなわち各神経が別々の基底膜のさやに入っている。したがって変性を起こしても基底膜のさやの中で活性化されたシュワン細胞が増殖し、索状構造を形成するのでこれを手がかりに元の神経回路を再建することができるのである。
【００１０】
前述のように、中枢性グリアのミエリン鞘は軸索伸長に阻害的な物質を再生するのに対して、同じミエリン鞘でもシュワン細胞のものであれば阻害作用は少なく、許容的であるらしい（非特許文献４）。また、シュワン細胞とオリゴデンドロサイトでは、ミエリンを構成するタンパク質の組成に違いがあることもわかっている。このように中枢のグリアは障害を受けても、末梢神経におけるシュワン細胞のように未分化な形に脱分化をして分裂増殖したり、形態を大きく変えていくようなことをせず、比較的分化したままの表現型を維持するのである。その点、末梢神経は受けた障害に対して柔軟性に富んだ素早い反応を示すのが特徴である。
【００１１】
神経再生におけるシュワン細胞は、以下の役割をもつと考えられている。シュワン細胞は多くの因子を産生し、拡散性に放出する。また自らの細胞膜表面には基底膜が被っており、ここには細胞外基質成分（extracellular matrix）が含まれる。さらにシュワン細胞膜には、細胞接着分子が発現されていることがわかっており、これらのファクターが総合的に働いて神経再生が誘導されていると考えられている。
【００１２】
また、シュワン細胞は多くの神経栄養因子を産生することがわかっているが、なかでも再生に関係ある主だったものを以下に挙げる：１）ニューロトロフィンファミリー、例えば、nerve growth factor、brain-derived neurotrophic factor、neurotrophin-3、neurotrophin-4/5；２）毛様体神経栄養因子（ciliary neurotrophic factor）；３）ＦＧＦファミリー、例えば、acidic and basic fibroblast growth factor；４）インスリンファミリー、例えば、insulin-like growth factor-Ｉ，II；５）腫瘍化促進因子（transforming growth factor-β２，β３）。上記ニューロトロフィンは神経細胞に対する生存のほか、突起伸長などの強力な作用がある。
【００１３】
さらに、シュワン細胞が提供する基底膜には、細胞外基質成分fibronectin、laminin、type IV collagen、tenascinなどが含まれる。なかでも培養系などの実験ではfibronectin やlaminin が神経再生において支持的に働くといわれている。
【００１４】
さらには、細胞接着分子は数多くのものが同定されてきている。シュワン細胞と神経再生において関連のあるものとして、１）免疫グロブリンスーパーファミリーＮＣＡＭ（neural cell adhesion molecule）やＬ１は特にシュワン細胞の膜上に発現され、神経線維がシュワン細胞上を足場とし接触しながら伸長していくときに接着分子として大きな役割を果たす。２）カドヘリンスーパーファミリーカドヘリン（ｃａｄｈｅｒｉｎ）はカルシウム依存性の細胞接着分子で多くの種類が同定されているが、神経再生において特に関与しているのがＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎである。これも免疫グロブリンスーパーファミリーであるＮＣＡＭやＬ１と同様、神経線維がシュワン細胞上を接触し、認識しながら伸長していくときに大きな役割を果たす。３）インテグリンスーパーファミリーインテグリンは上述の細胞外基質に対する細胞側の受容体である。α、βの２つのサブユニットからなるヘテロ二量体分子である。またカドヘリン同様細胞骨格と連結しており、細胞間の情報伝達においても直接的に働いていると考えられている。シュワン細胞においてはα６β４ というサブタイプが発現しており、再生中の再ミエリン化の過程において役割を果たしている。
【００１５】
中枢神経再生の試みは過去何十年にもわたり多くの研究者により試みられてきた。それらを総括すると、１）手や足などの末梢神経を一部切り出し、中枢神経に自家移植することによって再生が認められている。これは、上記のシュワン細胞の軸索再生に与える許容的な効果を利用し、中枢神経の再生を促す環境を整える目的がある。これらの研究は、１９８３年のカナダのＡｇｕａｇｏらによる研究が発端になっている（非特許文献５）。２）また、上記のように、中枢神経そのものに神経が再生することを抑える働きがあることが知られている。これは２０００年にNatureにより掲載されたNogo因子をはじめ、以前より知られているミエリン関連タンパク質などが、軸索再生に対して抑制的作用を有することが報告されている。そこでこれらに対する抗体を注入してこれらの因子を中和してしまうと多少なりとも中枢神経は再生するということが報告されている。３）細胞を移植することによって再生を促すことができる。これには以下の２タイプがある：
−ａ）中枢神経の障害により変性して失われた神経細胞を供給して、神経回路を再建する。神経幹細胞、胎児由来の神経細胞を用いたアプローチである。
−ｂ）神経そのものを供給するのではなく、神経の再生能力を誘導することができる細胞（グリア細胞）を移植し、再建する。このような細胞として、末梢神経由来のシュワン細胞、神経栄養因子を導入した中枢神経由来のグリア細胞、同じく中枢神経由来の上衣細胞、臭神経由来の支持細胞などが試みられている。しかしながら、上記いずれの方法も一長一短であり、未だ画期的な方法は開発されていない。
【００１６】
これまでにも、上記３）−ｂ）に記載した末梢神経の組織構成を担っているシュワン細胞を用いた方法により中枢神経の再生が試みられてきた（非特許文献６、７、８及び９）。シュワン細胞は末梢神経に存在するが、自らの組織である末梢神経はもとより中枢神経系も含めて再生誘導能を有し、損傷部位への移植によって再生線維の足場を提供して有効な神経再生を導くこと、また神経が正常に機能する上で不可欠な要素である神経跳躍伝導を担うミエリンもシュワン細胞の移植によって再建可能であることが明らかとなっている。
【００１７】
しかしながら、動物実験レベルでは比較的容易なシュワン細胞の採取・培養もヒトとなると、様々な困難がある。例えば、シュワン細胞は末梢神経に存在するため、手や足の神経片を採取し、そこから単離しなくてはならないので、採取後ドナーに障害が残ることになる。さらに成人由来のシュワン細胞の増殖能には限界があり、大量培養には時間がかかり難しいという点も挙げられる。また、シュワン細胞に分化すると考えられている神経堤細胞(neural crest cell)は、胎児の末梢神経からしか採取できない。したがって、神経再生治療に用いることができ、培養により多量に入手することができる天然シュワン細胞代替物を提供する必要性が存在する。
【００１８】
一方、多糖類をグルタルアルデヒドやグリオキザールのような多価アルデヒドで処理してヘミアセタール結合又はアセタール結合させた架橋多糖類及び該架橋多糖類よりなる神経再生用基材が提案されている（特許文献１）。しかしながら、多価アルデヒドで架橋した前記架橋多糖類は、そのヘミアセタール結合またはアセタール結合が加水分解し易く、長期安定性および耐熱水性に劣るため、高温下で湿熱滅菌処理（例えば１２１℃で２０分間）すると分解するという欠点を有する。しかも、長期間にわたる体内留置により、架橋多糖類中のヘミアセタール結合又はアセタール結合が加水分解されて多価アルデヒドが溶出し、強い細胞毒性を示す。
【００１９】
また、神経再生材として、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）のメッシュ状チューブにコラーゲンを塗布して付着させたものが知られている（非特許文献１０）。しかしながら、この神経再生材は、充分な神経再生効果を示さない。
【００２０】
さらに、神経組織を再生させることを目的として、神経幹細胞を培養する試みがなされている（特許文献２、特許文献３及び特許文献４）。しかしながら、いずれも、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養法に関するものであり、ｉｎ ｖｉｖｏでの神経再生効果は確認されていない。
【００２１】
一方、本発明者らは、エチレンジアミン又はその塩を用いて架橋した多糖類のゲルを神経欠損部に充填すると、神経組織が再生することを見いだして先に出願した（特許文献５）。また、エチレンジアミン又はその塩を用いて架橋した多糖類のゲル及び神経幹細胞からなる神経再生用材料を神経欠損部に充填すると、神経組織がより正常近くまで再生することを見いだして先に出願した（特許文献６）。さらに、骨髄間質細胞由来シュワン細胞の視神経あるいは坐骨神経欠損部への移植、並びに骨髄間質細胞由来の神経細胞のパーキンソンモデルラットの線状体への移植により神経再生が促進されることを見出して先に出願した（特許文献７及び特許文献８）。これらの技術により、神経組織の再生が可能になったと言えるが、より速やかでより有効な神経組織の再生手段の構築が望まれる。
【特許文献１】特開平８−３３３４０２号公報
【特許文献２】特表平８−５０２６５２号公報
【特許文献３】特表平１０−５０５７５４号公報
【特許文献４】特表平１０−５０９５９２号公報
【特許文献５】特開２０００−１９８７３８号公報
【特許文献６】特開２００２−７８７９２号公報
【特許文献７】特開２００３−６１６４７号公報
【特許文献８】特開２００３−１４４１５５号公報
【非特許文献１】Schwab, ME et al : Rat CNS myelin and a subtype of oligodendrocytes in culture represent a nonpermissive substrate for neurite growth and fibroblast spreading. J Neurosci 8 : 2381-2393, 1988.
【非特許文献２】Chen, M. S. et al. ; Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN-1. Nature 403 : 434-439, 2000.
【非特許文献３】Snow, DM et al : Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite out-growth in vitro. Exp Neurobiol 109 : 111-130, 1990.
【非特許文献４】Bastmeyer, M et al : Similarities and differences between fish oligodendrocytes and Schwann cells in vitro. Glia 11 : 300-314, 1994.
【非特許文献５】Aguago, A. J. et al. ; A potential for axonal regeneration in neurons of the adult manmalian nervous system. In Nervous System Regeneration, B. Haber, J. R. Perez-Polo, G. A. Hashim and A.M.G. Stella eds., pp.327-340, Alan R. Liss, New York, 1983.
【非特許文献６】Kromer, LF et al : Transplants of Schwann cell cultures promote axonal regeneration in the adult mammalian brain. Proc Natl Acad Sci USA 82 : 6330-6334, 1985.
【非特許文献７】Xu, XM et al : Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol 351 : 145-160, 1995.
【非特許文献８】Guest, JD et al : The ability of human Schwann cell grafts to promote regeneration in the transected nude rat spinal cord. Exp Neurol 148 : 502-522, 1997.
【非特許文献９】Weidner, N et al : Nerve growth factor-hypersecreting Schwann cell grafts augment and guide spinal cord axonal growth and remyelinate central nervous system axons in a phenotypically appropriate manner that correlates with expressin of L1. J Comp Neurol 413 : 495-506, 1999.
【非特許文献１０】Suzuki, K. et al., Jpn. J. Artif., Organs, 27, 490-494, 1998.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の目的は、優れた神経細胞増殖促進作用及び神経軸索伸長作用を発揮し得、損傷、欠損などの生じた神経細胞及び神経組織の増殖を促して修復し、神経を再生させることができる、感染の恐れがなく、生体に対する安全性及び適合性にも優れた神経再生用材料及び該材料を含む神経再生材、並びに工業的生産過程において効率的にそれらを生産可能な神経再生用材料及び神経再生材の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、所定の生体吸収性ポリマーに所定の細胞〔CD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞及び／又はそれらの細胞を分化誘導させた細胞〕を組み合わせて神経再生材として用いるのが神経再生に有効であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２４】
すなわち、本発明は、
〔１〕  生体吸収性ポリマーと共に使用され得る細胞を含んでなる神経再生用材料であって、該細胞が、（１）CD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞、及び／又は（２）前記（１）の細胞を分化誘導してなる細胞からなる、神経再生用材料、
〔２〕  前記（２）の細胞がシュワン（Schwann）細胞又は神経細胞である前記〔１〕記載の神経再生用材料、
〔３〕  細胞が哺乳類由来細胞である前記〔１〕又は〔２〕記載の神経再生用材料、
〔４〕  哺乳類由来細胞がヒト由来細胞である前記〔３〕記載の神経再生用材料、
〔５〕  細胞が他家又は自家由来細胞である前記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の神経再生用材料、
〔６〕  細胞の一部又は全部が骨髄起源の細胞である前記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の神経再生用材料、
〔７〕  細胞と共に使用され得る生体吸収性ポリマーを含んでなる神経再生用材料であって、該ポリマーが、多糖類とその塩、架橋多糖類とその塩、酸性多糖類エステル、架橋酸性多糖類エステル、タンパク質、ポリペプチド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコール酸／乳酸共重合体、グリコール／カーボネート共重合体、ポリジオキサノン、ポリε−カプロラクトン、乳酸／ε−カプロラクトン共重合体、及びシアノアクリレート系共重合体からなる群より選ばれる少なくとも１種からなる、神経再生用材料、
〔８〕  生体吸収性ポリマーが多糖類及び／又はその塩からなる前記〔７〕記載の神経再生用材料、
〔９〕  多糖類及び／又はその塩が酸性多糖類及び／又はその塩である前記〔８〕記載の神経再生用材料、
〔１０〕  酸性多糖類及び／又はその塩がカルボキシル基を有する多糖類及び／又はその塩である前記〔９〕記載の神経再生用材料、
〔１１〕  カルボキシル基を有する多糖類及び／又はその塩が、アルギン酸とその塩、及びヒアルロン酸とその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記〔１０〕記載の神経再生用材料、
〔１２〕  生体吸収性ポリマーが架橋多糖類及び／又はその塩からなる前記〔７〕記載の神経再生用材料、
〔１３〕  架橋多糖類及び／又はその塩が、カルボキシル基を有する多糖類及び／又はその塩を、以下の一般式（Ｉ）：
【００２５】
【化１】
2005270237.tif 000002
【００２６】
で表される化合物及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種からなる架橋性試薬で共有結合的に架橋してなるものである、前記〔１２〕記載の神経再生用材料、
〔１４〕  架橋性試薬が前記一般式（Ｉ）で表される化合物のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド塩である前記〔１３〕記載の神経再生用材料、
〔１５〕  前記一般式（Ｉ）で表される化合物のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド塩が、ジアミノエタンの２Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、ジアミノヘキサンの２Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、Ｎ，Ｎ’−ジ（リジル）−ジアミノエタンの４Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、及びＮ−（リジル）−ジアミノヘキサンの３Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記〔１４〕記載の神経再生用材料、
〔１６〕  細胞と共に使用され得る生体吸収性ポリマーを含んでなる神経再生用材料であって、該ポリマーが、酸性多糖類エステルと、天然アミノ酸に由来するα−アミノ基を２個以上有するポリアミノ化合物とから形成されたポリマーからなる、神経再生用材料、
〔１７〕  酸性多糖類エステルがアルギン酸プロピレングリコールエステル及び／又はヒアルロン酸プロピレングリコールエステルである前記〔１６〕記載の神経再生用材料、
〔１８〕  ポリアミノ化合物がε−ポリリジンである前記〔１６〕又は〔１７〕記載の神経再生用材料、
〔１９〕  前記〔７〕〜〔１１〕いずれかに記載の生体吸収性ポリマー及び／又は前記〔１２〕〜〔１８〕いずれかに記載の生体吸収性ポリマーが生体吸収性の材料からなるチューブに充填されてなるものである神経再生用材料、
〔２０〕  細胞と生体吸収性ポリマーとを含んでなる神経再生材であって、該細胞が前記〔１〕〜〔６〕いずれかに記載の細胞からなり、該生体吸収性ポリマーが前記〔７〕〜〔１８〕いずれかに記載の生体吸収性ポリマーからなる、神経再生材、
〔２１〕  細胞と生体吸収性ポリマーとが生体吸収性の材料からなるチューブに充填されてなるものである前記〔２０〕記載の神経再生材、
〔２２〕  （１）生物材料より細胞を採取する工程、及び
（２）得られた細胞からCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞を分取する工程、
を有する、生体吸収性ポリマーと共に使用され得る神経再生材用細胞の製造方法、
〔２３〕  （２’）分取された細胞を分化誘導する工程をさらに有する前記〔２２〕記載の製造方法、
〔２４〕  工程（１）において細胞を生体の骨髄より採取する前記〔２２〕又は〔２３〕記載の製造方法、
〔２５〕  （１）生物材料より細胞を採取する工程、
（２）得られた細胞からCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞を分取する工程、及び
（３）分取された細胞と、多糖類とその塩、架橋多糖類とその塩、酸性多糖類エステル、架橋酸性多糖類エステル、タンパク質、ポリペプチド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコール酸／乳酸共重合体、グリコール／カーボネート共重合体、ポリジオキサノン、ポリε−カプロラクトン、乳酸／ε−カプロラクトン共重合体、及びシアノアクリレート系共重合体からなる群より選ばれる少なくとも１種からなる生体吸収性ポリマー、及び／又は酸性多糖類エステルと、天然アミノ酸に由来するα−アミノ基を２個以上有するポリアミノ化合物とから形成された生体吸収性ポリマーとを合わせる工程、を有する、神経再生材の製造方法、
〔２６〕  工程（２）と（３）の間に、（２’）分取された細胞を分化誘導する工程をさらに有する前記〔２５〕記載の製造方法、並びに
〔２７〕  工程（１）において細胞を生体の骨髄より採取する前記〔２５〕又は〔２６〕記載の製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明により、従来のものと比較して採取が容易であり、実質的に細胞の採取対象（例えば、ヒト）に障害を残すことがなく、また、増殖速度が速く、大量にしかも迅速に供給することができる前記所定の細胞を含んでなる神経再生用材料が提供される。該細胞は自家移植が可能であり、これは大変大きな利点である。従って、ある個体から前記細胞を採取し、所望により分化誘導をかけ、得られた細胞を用いて該材料を製造でき、該材料を同一個体の障害神経に移植するのであれば拒絶反応が起きないので免疫抑制剤等の投与が不要であり、該材料を所定の生体吸収性ポリマーと併用することで、安定した神経の再生が可能となる。骨髄バンクからも該細胞の原料細胞を得ることができるため供給面からも現実的な対応が可能となる。
【００２８】
また、本発明により、前記細胞と共に使用され得る所定の生体吸収性ポリマーを含んでなる神経再生用材料が提供される。該ポリマーは生体に対する安全性及び適合性に優れており、該材料と前記所定の細胞とを併用することで、安定した神経の再生が可能となる。
【００２９】
さらに、本発明の前記神経再生用材料を含む神経再生材によれば、安全かつ良好に神経を再生させることができる。従って、該神経再生材は、神経細胞や神経組織の損傷、欠損などによる中枢神経や末梢神経系の疾患、例えば、末梢神経障害、末梢ニューロパシーおよび局在化ニューロパシーなどの末梢神経系の疾患、アルツハイマー症、パーキンソン症、ハンチントン症、筋萎縮性側索硬化症、シャイ−ドレーガー（Ｓｈｙ−Ｄｒａｇｅｒ）症候群などの疾患の治療、脊椎疾患、頭部外傷、卒中などの脳血管疾患のような外傷性疾患などの治療に有効に使用され得る。また、神経組織修復のための外科手術などに用いる神経再生材として好適に使用され得る。
【００３０】
また、本発明によれば、前記の通りの優れた性能を有する神経再生用材料及び神経再生材を効率的に生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本明細書において、用語「神経再生用材料」は、損傷、欠損などの障害を負った神経の治癒、接着、補強及び／又は再生用の材料（神経再生材の材料）の意味で用いられる。本発明の神経再生材料には、細胞を含んでなるものと生体吸収性ポリマーを含んでなるものとがあるが、かかる材料はそれぞれ単独で神経再生に使用されるのではなく同時若しくは逐次に併用して使用される。同時に併用する形態としては、用語「神経再生材」と記載される、細胞と生体吸収性ポリマーとが合わされ一体となったものの使用が含まれる。
【００３２】
用語「天然シュワン細胞」は、生物の体内に存在する末梢神経から採取したシュワン細胞の意味で用いられる。当該細胞はＳ−１００＋（カルシウム結合タンパク質陽性）である。
【００３３】
用語「天然神経細胞」とは、生物の体内に存在する末梢神経、中枢神経から採取した神経細胞の意味で用いられる。当該細胞はｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ陽性（＋）である。
【００３４】
用語「CD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞」は、（ｉ）形態学的に天然シュワン細胞に酷似し、かつ継代培養によって未分化な状態に復帰することがなく、（ii）免疫染色でＰ７５（nerve growth factor (NGF) receptor、神経成長因子受容体、低親和性）、Ｓ−１００、ＧＦＡＰ（glial fibrillary acidic protein、中間径フィラメントの一種）、Ｎｅｓｔｉｎ（中間径フィラメントの一種）、及びＯ４（シュワン細胞やオリゴデンドロサイトなどミエリンを作る細胞のマーカー）との反応において天然シュワン細胞と同様の反応を示し、そして（iii）神経再生能力に関して天然シュワン細胞と同様の形質を有するが、分化誘導履歴の違いにより、天然シュワン細胞と区別され得るシュワン細胞の意味で用いられる。
【００３５】
用語「CD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来神経細胞」は、（ｉ）形態学的に、細胞体と神経突起を有することを特徴とし、（ii）生化学的には、ＭＡＰ−２、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ、ｂｅｔａ３−ｔｕｂｕｌｉｎ、及びＴｕｊ１に対して陽性であり、天然神経細胞と同様の反応を示し、そして（iii）神経再生能力に関して神経細胞と同様の形質を有するが、分化誘導履歴の違いにより、天然神経細胞と区別され得る神経細胞の意味で用いられる。
【００３６】
なお、本明細書においては、「CD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞」をまとめて本発明の細胞という場合がある。また、それに伴い、「CD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞」を本発明の細胞由来シュワン細胞と、「CD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来神経細胞」を本発明の細胞由来神経細胞という場合がある。
【００３７】
本発明の神経再生用材料は、生体吸収性ポリマー、又は本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞から構成され、それらは組み合わせて神経の再生のために用いられる。本発明の神経再生用材料では、生体吸収性ポリマーと本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞は必ずしも最初から一緒にされている必要はない。本発明の神経再生用材料では、生体吸収性ポリマーと本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞とは一緒にしてあっても、又は分離した状態であってもよい。本発明の神経再生用材料の使用に当たっては、生体吸収性ポリマーと本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞とを一緒にして神経の再生が必要な治療箇所に施しても（移植しても）よいし、或いは生体吸収性ポリマーと、本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞とを個別に、神経の再生が必要な治療箇所及び／又はそれ以外の場所（例えば脳脊髄液中）に同時又は逐次に施してもよい。逐次に施す場合は、神経の再生が必要な治療箇所に生体吸収性ポリマーを最初に施してから本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞を次に施しても、又は本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞を最初に施してから次に生体吸収性ポリマーを施してもよく、両者を施す時間的間隔としては短くてもよいし、又はある程度の期間（例えば７〜３０日程度）をおいてもよい。
【００３８】
ここで、生体吸収性ポリマーと本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞とが一緒になっているとは、本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞と生体吸収性ポリマーとが合わされている場合、例えば、細胞と生体吸収性ポリマーとが混合されている場合、細胞が生体吸収性ポリマーに担持されている場合、細胞が生体吸収性ポリマー中に埋設されている場合、細胞が生体吸収性ポリマーよりなる布帛やその他の形状物中に包含された状態にある場合、細胞を生体吸収性ポリマーに含浸させた場合
など、生体吸収性ポリマーと本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞とが互いに接触した状態になっていることをいう。また、生体吸収性ポリマーと本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞とが分離した状態にあるとは、各々が一緒になっておらず、非接触状態にあることをいう。
【００３９】
本発明は生体吸収性ポリマーと共に使用され得る細胞を含んでなる神経再生用材料（以下、細胞材料という場合がある）を提供するが、該細胞は本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞からなる。
【００４０】
本発明の細胞の入手方法や取得方法は特に制限されず、かかる細胞は生物材料、例えば、生体内の骨髄、末梢血、臍帯血、筋肉組織などから採取可能であるが、ヒトを含めた哺乳類から該細胞を得るには、骨髄より採取する方法が好ましく用いられる。体内の骨髄内であればどこからでも採取可能であるが、骨盤（腸骨）や手足の長管骨（大腿骨、脛骨）の骨髄及び／又は骨膜からより好ましく採取される。その他、歯槽骨の骨髄、口蓋又は歯槽骨の骨膜から採取してもよい。
【００４１】
骨髄より本発明の細胞を採取する場合には、公知の方法に従い、まず骨髄より骨髄間質細胞を分離する。骨髄以外の部位より細胞を採取する場合も、骨髄間質細胞を分離する場合に準じて、後述する本発明の細胞の分取に供するための細胞群を分離する。
【００４２】
本発明の細胞は、このように、その起源となる組織等由来の細胞群から分取される。これは以下の理由による。すなわち、従来、骨髄間質細胞由来シュワン細胞等により神経再生が生ずることは知られていた。しかしながら、骨髄間質細胞由来の細胞による神経再生において、そこに存在する細胞のバランスが重要であるのか、特定の細胞に神経再生能が集中しているのか、除去すべき細胞・成分等が存在するのか等、神経再生のカギとなる部分については不明であった。本発明者らは、本発明の所定の細胞以外の細胞を実質的に除去することこそが神経再生にとって重要であることを初めて見出した。また、本発明の細胞に相当する細胞であればどのような組織等に由来するものであっても有効に機能し得ることを見出した。そこで、以上の通りの細胞の分取が必要となる。
【００４３】
本発明の細胞は、前記のような組織等の起源より分離された細胞群から、例えば、以下のような細胞の分別方法により細胞表面マーカーがCD29＋、CD90＋、CD11−、CD34−である細胞を分取することによって得られる。
【００４４】
細胞の分別方法は、特に限定されないが、フローサイトメトリーによるものが好ましく、ＦＡＣＳcan又はＦＡＣＳcaliburの名称のベクトン−ディキンソン社製の蛍光−活性化セルソーター(ＦＡＣＳ)で分別することが最も好ましい。この技術によって、細胞上に、例えば、CD29マーカーを持っている細胞は、特定の蛍光染料などに結合している抗−CD29抗体によって特定の蛍光染料によって標識される。同様に、細胞のCD90マーカーは、別の染料に結合している抗−CD90抗体によって異なる蛍光染料によって標識される。染色された細胞を分析器にかけ、流動する細胞に蛍光色素を励起させ、光を放出させるアルゴンレーザービームに照射する。この発光を、１組の光学フィルターによって発光波長に特異的な蛍光色素の光電子増倍管(ＰＭＴ)によって検出する。ＰＭＴによって検出された信号はそれ自体のチャネルによって増幅され、コンピューターによって種々の異なる形態、例えば、柱状グラフ、点描表示または輪郭表示によって表現される。すなわち、１種類の波長で発光する蛍光細胞は特定の蛍光色素−標識試薬に反応するが、非蛍光細胞又は異なる波長で発光する蛍光細胞は、この分子を発現せず、他の波長で蛍光を発する蛍光色素−標識試薬に反応する分子を発現する。このフローサイトメトリーはまた、細胞によって表示される蛍光量(蛍光強度)を示す点で半定量的である。これは、相対的な意味で、細胞によって発現される分子の数に相関する。
【００４５】
フローサイトメトリーはまた、分子の大きさやレーザービームの照射時に細胞によって散乱される光などの非蛍光パラメーターを測定する機能もある。細胞の大きさは通常直接測定される。光散乱ＰＭＴ類は前方(前方散乱；ＦＳＣ)又は直角(側方散乱；ＳＳＣ)のいずれかでの細胞による光散乱を検出する。両方のパラメーターは他の要因によって影響を受ける。なお、ＦＳＣは細胞の大きさの指標であるが、ＳＳＣは細胞の複雑性の指標である。
【００４６】
フローサイトメトリーは１種類以上のＰＭＴ発光検出器を備えていることが好ましい。追加のＰＭＴは他の発光波長を検出し、個別のチャネルで１種類以上の蛍光色素をそれぞれ同時に検出することが可能である。コンピューターは各チャネルの分析又は各パラメーターと別のパラメーターとの相関関係の分析を可能にする。ＦＡＣＳに典型的に用いられる蛍光色素としては、５２５nm(緑色)に発光ピークのあるフルオレセインイソシアネート(ＦＩＴＣ)、５７５nm(橙赤色)に発光ピークのあるＲ−フィコエリスリン(ＰＥ)、６２０nm(赤色)に発光ピークのあるプロピジウムヨージド(ＰＩ)、６６０nm(緑色)に発光ピークのある７−アミノアクチオマイシンＤ(７−ＡＡＤ)、６７０nm(赤色)に発光ピークのあるＲ−フィコエリスリンＣy５(ＰＥ−Ｃy５)、６５５−７５０nm(暗赤色)に発光ピークのあるアロフィコシアニン(ＡＰＣ)が含まれる。
【００４７】
本発明の細胞材料中、本発明の細胞はCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞からなるが、本発明の細胞にそれらの細胞以外の細胞、すなわち、表面マーカーCD29とCD90を有し、かつCD11とCD34を有していない細胞以外の細胞が一部含まれることを排除するものではない。例えば、細胞材料中の全細胞に含まれる本発明の細胞の数の割合は、神経疾患の種類、様態によって選択可能である。当該割合としては、優れた神経再生効果を得る観点から９５％以上が好ましく、９９％以上がより好ましく、９９．５％以上が特に好ましい。
【００４８】
また、本発明の細胞としては、他の臓器（造血系、肝臓、腸管、骨格筋、乳腺、皮膚）由来の幹細胞を脱分化し、本発明の細胞へと分化させたものも使用することができる。例えば、全能性ヒト由来ＥＳ細胞（胚性幹細胞）を分化させたものも使用することができる。そのような脱分化および分化誘導は公知の方法に従って行うことができる。
【００４９】
本発明の細胞を分化誘導させた細胞（以下、分化誘導細胞という場合がある）としては、シュワン細胞又は神経細胞が好ましい。分化誘導細胞は、増殖し継代を繰り返すことが可能な自己複製能をもつ本発明の細胞を、増殖後に分化誘導することによって好適に入手することが可能である。
【００５０】
分化誘導の方法は特に制限されないが、例えば、本発明の細胞由来シュワン細胞を得る方法としては、本発明の細胞を標準的な基礎培地に血清を加えた培地中で培養し；還元剤を該培地中に添加し、そしてさらに培養し；分化誘導剤を該培地に添加し、そしてさらに培養し；並びにサイクリックAMP上昇作用性薬剤又はサイクリックAMPアナログ、及び／又はグリア細胞分化生存作用性因子を上記培地に添加し、さらに培養して本発明の細胞由来シュワン細胞を得る分化誘導方法（特開２００３−６１６４７号公報参照）が好適に用いられる。また、例えば、本発明の細胞由来神経細胞を得る方法としては、本発明の細胞を標準的な基礎培地に血清を加えた培地中で培養し；Notch遺伝子及び／又はNotchシグナリング関連遺伝子を導入し、そしてさらに培養し；並びにサイクリックAMP上昇作用性薬剤又はサイクリックAMPアナログ、及び／又は細胞分化生存作用性因子を上記培地に添加し、そしてさらに培養して神経細胞を得る分化誘導方法（特開２００３−１４４１５５号公報参照）が好適に用いられる。
【００５１】
本発明の分化誘導細胞としては、全ての細胞が単一の分化細胞の反応あるいは形質を示す細胞である必要はない。例えば、本発明の分化誘導細胞中における単一の分化細胞の反応あるいは形質を示す細胞の数の割合は、神経疾患の種類、様態によって任意に選択が可能である。当該割合としては、優れた神経再生効果を得る観点から４０％以上が好ましく、６０％以上がより好ましく、８０％以上が特に好ましい。
【００５２】
本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導した細胞は、神経欠損部で増殖、分化することが可能であればどのようなものでも用いることができるが、生物材料、中でも生体、例えば、哺乳類（ヒト、サル、チンパンジー、ヒツジなどの哺乳動物）に由来するものが好ましく、ヒト由来のものがより好ましい。また、当該細胞は他家（生体ドナー）由来細胞又は自家由来細胞のいずれであってもよく、他家由来のものが好ましく、自家由来のものがより好ましい。なお、他家とは、本発明の神経再生用材料を適用しようとする個体とは別の個体であることを、自家とは、本発明の神経再生用材料を適用しようとする個体と同一の個体であることを、それぞれ意味する。
【００５３】
また、本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導した細胞は骨髄起源であるのが好ましく、該細胞としては、その一部又は全部が骨髄起源の細胞であるのがよい。なお、一部とは厳密なものではなく、本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導した細胞の全てが骨髄起源のものではなく、部分的に骨髄起源の細胞が含まれていることを意味する。
【００５４】
本発明の細胞材料中の本発明の細胞及び／又は本発明の分化誘導細胞の含有濃度としては、特に限定はないが、好ましくは１０３〜１０１０細胞／ｍｌ、より好ましくは１０５〜１０９細胞／ｍｌである。本発明の細胞と本発明の分化誘導細胞とを両方使用する場合の両細胞の混合割合は特に限定されるものではない。本発明の細胞材料には、本発明の細胞及び／又は本発明の分化誘導細胞以外に、その他の成分として、例えば、水、塩類、成長因子、抗生物質、多糖類、タンパク質、ペプチド、脂質、アミノ酸、ビタミン、（重）金属イオン等が含まれていてもよい。本発明の細胞材料は、前記のようにして得られる本発明の細胞及び／又は分化誘導細胞そのものであってもよいが、前記その他の成分をさらに含ませる場合には、本発明の細胞及び／又は分化誘導細胞を得、それらと所望のその他の成分とを適宜混合することにより調製することができる。
【００５５】
以上により本発明の細胞材料が得られるが、本発明はその一態様として、
（１）生物材料より細胞を採取する工程、及び
（２）得られた細胞からCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞を分取する工程、
を有する、生体吸収性ポリマーと共に使用され得る神経再生材用細胞の製造方法をも提供する。当該製造方法は、（２’）分取された細胞を分化誘導する工程をさらに有していてもよい。工程（１）における細胞の採取は生体の骨髄より行うのが好ましい。なお、本明細書において、生物材料としては、生体由来のものであっても、非生体由来のものであってもよく、前記のものの他、例えば、皮下組織、毛包組織、肝臓、膵臓、小腸、大腸、（軟）骨組織、脂肪組織等を用いてもよい。
【００５６】
また、本発明は細胞と共に使用され得る生体吸収性ポリマーを含んでなる神経再生用材料を提供するが、該ポリマーは、（ａ）多糖類とその塩、架橋多糖類とその塩、酸性多糖類エステル、架橋酸性多糖類エステル、タンパク質、ポリペプチド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコール酸／乳酸共重合体、グリコール／カーボネート共重合体、ポリジオキサノン、ポリε−カプロラクトン、乳酸／ε−カプロラクトン共重合体、及びシアノアクリレート系共重合体からなる群より選ばれる少なくとも１種、又は（ｂ）酸性多糖類エステルと、天然アミノ酸に由来するα−アミノ基を２個以上有するポリアミノ化合物とから形成されたポリマーからなる。以下、生体吸収性ポリマーが（ａ）からなる神経再生用材料をポリマー材料ａと、（ｂ）からなる神経再生用材料をポリマー材料ｂという。なお、（ａ）のポリマーと（ｂ）のポリマーとは混合して用いることもできる。
【００５７】
本発明の神経再生用材料を構成する生体吸収性ポリマーは上記のようなポリマーからなるが、それらのポリマーは生体に対して安全で、かつ生体内で分解して吸収され得るものであるので、神経組織の再生と共に体内で分解吸収され、神経再生が完了した時点で消失し得る。また、生物学的安全性が高く、体内に埋め込んで使用しても安全である。
【００５８】
ポリマー材料ａを構成する生体吸収性ポリマーである多糖類とその塩、架橋多糖類とその塩、酸性多糖類エステルとしては、例えば、アルギン酸、架橋アルギン酸、キチン、ヒアルロン酸、架橋ヒアルロン酸、セルロース、デンプン、架橋デンプン、ペクチン、カルボキシメチルセルロール、カルボキシメチルデキストラン、これらの誘導体（例えば、エステル）などが挙げられる。タンパク質としては、例えば、ゼラチン、架橋ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、フィブリン、アルブミンなどが挙げられる。ポリペプチドとは、通常、１０〜１００個のアミノ酸がペプチド結合により連結してなるペプチドをいうが、例えば、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリジンなどが挙げられる。なお、多糖類の分子量としては、通常、５万〜５００万Ｄａ程度である。
【００５９】
ポリマー材料ａを構成する生体吸収性ポリマーとしては、多糖類及び／又はその塩が好ましく用いられ、酸性多糖類及び／又はその塩がより好ましく用いられ、アルギン酸、ヒアルロン酸、ペクチン、カルボキシメチルセルロール、カルボキシメチルデキストランなどのカルボキシル基を有する多糖類及び／又はその塩が更に好ましく用いられ、アルギン酸、ヒアルロン酸及びそれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種が一層好ましく用いられる。中でも、アルギン酸の水溶性塩及び／又はヒアルロン酸の水溶性塩が、生体に対する安全性が高い点から、特に好ましく用いられる。カルボキシル基を有する多糖類の水溶性塩、例えば、前記アルギン酸の水溶性塩やヒアルロン酸の水溶性塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などが好ましく用いられ、ナトリウム塩がより好ましく用いられる。カルボキシル基を有する多糖類の水溶性塩としては、得られるポリマー材料ａの良好な強度を確保する観点から、濃度１重量％の水溶液にしたときに、該水溶液の２０℃での粘度が１００センチポイズ（ｃｐ）以上であるものが好ましく用いられ、３００ｃｐ以上であるものがより好ましく用いられる。なお、粘度は、ＢＬ型粘度計により測定することができる。
【００６０】
また、ポリマー材料ａを構成する生体吸収性ポリマーとしては、多糖類及び／又はその塩を架橋してなる架橋多糖類及び／又はその塩も好ましく用いられ、特に前記したカルボキシル基を有する多糖類及び／又はその塩を、上記の一般式（Ｉ）で表される化合物及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種からなる架橋性試薬で共有結合的に架橋してなる架橋多糖類及び／又はその塩がより好ましく用いられる。
【００６１】
前記架橋性試薬としては、上記の一般式（Ｉ）で表される化合物（以下、アミン系化合物（Ｉ）という）に包含されるアミン系化合物及び／又はその塩であればいずれでもよい。アミン系化合物（Ｉ）及び／又はその塩としては、上記の一般式（Ｉ）においてｎが２〜８である化合物及び／又はその塩が好ましく用いられる。
【００６２】
アミン系化合物（Ｉ）の具体例としては、ジアミノエタン、ジアミノプロパン、ジアミノブタン、ジアミノペンタン、ジアミノヘキサン、ジアミノヘプタン、ジアミノオクタン、ジアミノノナン、ジアミノデカン、ジアミノドデカン、ジアミノオクタデカンなどのジアミノアルカン類及びそれらの塩、Ｎ−（リジル）−ジアミノエタン、Ｎ，Ｎ’−ジ（リジル）−ジアミノエタン、Ｎ−（リジル）−ジアミノヘキサン、Ｎ，Ｎ’−ジ（リジル）−ジアミノヘキサンなどのモノ又はジ（リジル）ジアミノアルカン類及びそれらの塩などを挙げることができる。
【００６３】
架橋性試薬がアミン系化合物（Ｉ）の塩からなる場合は、塩を形成する成分としては、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドが好ましく用いられる。特に好適なアミン系化合物（Ｉ）のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド塩としては、ジアミノエタンの２Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、ジアミノヘキサンの２Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、Ｎ，Ｎ’−ジ（リジル）−ジアミノエタンの４Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、及びＮ−（リジル）−ジアミノヘキサンの３Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。これらの化合物は安全性、生体適合性などが一層高く、かつそれらの化合物を架橋性試薬として用いて得られる架橋多糖類は、一層優れた神経再生作用を発揮し得る。
【００６４】
カルボキシル基を有する多糖類及び／又はその塩をアミン系化合物（Ｉ）及び／又はその塩からなる架橋性試薬で共有結合的に架橋した多糖類は、一般にゲル状を呈する（かかる点から共有結合的に架橋した多糖類を「架橋多糖類ゲル」という場合がある）。架橋性試薬によるカルボキシル基を有する多糖類及び／又はその塩の共有結合架橋率（カルボキシル基を有する多糖類及び／又はその塩に対する架橋性試薬の反応率）は、カルボキシル基を有する多糖類及び／又はその塩に対する架橋性試薬の使用モル比で制御することができる。架橋性試薬のモル比を低くすると、柔軟で含水率の高い共有結合的に架橋された架橋多糖類ゲルが得られ、架橋性試薬のモル比を高くすると強固で含水率の低い共有結合的に架橋された架橋多糖類ゲルが得られる。
【００６５】
共有結合架橋率は所望により適宜選択されるが、共有結合架橋率が低すぎると架橋多糖類ゲルの強度が低くなり、共有結合架橋率を高めるため架橋性試薬を多く使用すると架橋性試薬が未反応のまま架橋多糖類ゲル中に残る可能性があることから、架橋率としては、カルボキシル基を有する多糖類及び／又はその塩が有するカルボキシル基の内１〜５０モル％のカルボキシル基が架橋性試薬と反応していることが好ましく、５〜３０モル％のカルボキシル基が架橋性試薬と反応していることがより好ましい。架橋率は、核磁気共鳴装置を用いた分析（ＮＭＲ法）により求めることができる。
【００６６】
カルボキシル基を有する多糖類及び／又はその塩とアミン系化合物（Ｉ）及び／又はその塩からなる架橋性試薬との共有結合架橋反応は、水溶性カルボジイミドなどの脱水縮合剤を用いて行うことができる。
【００６７】
アミン系化合物（Ｉ）及び／又はその塩からなる架橋性試薬によるカルボキシル基を有する多糖類及び／又はその塩の共有結合架橋反応は、一般にカルボキシル基を有する多糖類及び／又はその塩を水に溶解して濃度が０．１〜２重量％程度で粘度（２０℃）が１００〜１２００ｃｐ程度の水溶液を調製し、これにアミン系化合物（Ｉ）及び／又はその塩からなる架橋性試薬と脱水縮合剤とを好ましくは上記したような所定の共有結合架橋率が得られ得る量で均一に混合し、４〜５０℃の温度で１〜１００時間程度反応させることにより行うのが望ましい。
【００６８】
上記により得られる架橋多糖類ゲルは、それ自体で実用的な強度と安定性を示すが、所望により、アミン系化合物（Ｉ）及び／又はその塩による共有結合架橋と共にイオン結合架橋、疎水結合架橋などの他の架橋を施してもよい。
【００６９】
また、ポリマー材料ｂを構成する生体吸収性ポリマーに使用される酸性多糖類エステルとしては、カルボキシル基を有する多糖類においてその２つ以上のカルボキシル基がアルコール類によってエステル化されているものが好ましく用いられる。酸性多糖類エステルのベースをなす前記したカルボキシル基を有する酸性多糖類の具体例としては、アルギン酸、キサンタンガム、ジェランガム、ヒアルロン酸などのカルボキシル基含有多糖類、生理学的に許容されるこれらの人工的な誘導体、カルボキシメチル化セルロース、カルボキシメチル化デキストラン、カルボキシメチル化プルラン、部分スクシニル化キトサン、カルボキシメチル化キトサン、カルボキシメチル化キチンなどの本来カルボキシル基を含有しない多糖類にカルボキシル基を人工的に導入したものなどを挙げることができる。
【００７０】
酸性多糖類における酸性基、特にカルボキシル基をエステル化している前記アルコール類としては、脂肪族アルコール、芳香族アルコール、環状脂肪族アルコール、複素環式アルコールなどが好適な例として挙げられる。中でも、炭素原子数が１〜１６の脂肪族１価又は多価アルコールが好ましく、具体例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどを挙げることができる。多価アルコールである場合は、その複数の水酸基のうち、１個の水酸基のみがカルボキシル基含有酸性多糖類中のカルボキシル基とエステル結合（-COO-）しているのが好ましい。
【００７１】
酸性多糖類エステルの種類は特に制限されず、上記の酸性多糖類と上記のアルコール類との間で形成され得る酸性多糖類エステルであればいずれでもよく、例えば、酸性多糖類としてアルギン酸又はヒアルロン酸を例にとると、アルギン酸のプロピレングリコールエステル、エチレングリコールエステル、トリメチレングリコールエステル、ブチレングリコールエステル、ペンチレングリコールエステル、ヒアルロン酸のプロピレングリコールエステル、エチレングリコールエステル、トリメチレングリコールエステル、ブチレングリコールエステル、ペンチレングリコールエステルなどを挙げることができる。これらは単独で若しくは２種以上を混合して用いることができる。中でも、アルギン酸のプロピレングリコールエステル及び／又はヒアルロン酸のプロピレングリコールエステルが生物学的安全性が高いことから好ましく用いられる。
【００７２】
酸性多糖類エステルの製造方法は特に制限されず、例えば、特開昭５２−３６１７７号公報に記載されている方法、日本化学会編「実験化学講座２２ 有機合成ＩＶ−酸・アミノ酸・ペプチド」第４版、第２４〜８３頁（１９９２年、丸善発行）に記載されている一般的な方法、Ｍ．ヤルパニ、「テトラヘドロン」（Ｍ．Ｙａｌｐａｎｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、第４１巻、２９５７頁（１９８５）に記載されている方法などにより製造することができる。中でも、特開昭５２−３６１７７号公報に記載されているような、エチレンオキサイドやプロピレンオキサイドなどの１，２−エポキシド、トリメチレンオキサイドなどの１，３−エポキシド類をカルボキシル基を有する酸性多糖類に反応させる方法が好ましく採用される。
【００７３】
一方、ポリマー材料ｂを構成する生体吸収性ポリマーに使用される「天然アミノ酸に由来するα−アミノ基を２個以上有するポリアミノ化合物」とは、天然に見出されるアミノ酸（アラニン、グリシン、フェニルアラニン、セリン、バリン、リジン、グルタミン酸など）のα−アミノ基に由来する第１級アミノ基を２個以上有する化合物をいう。ポリアミノ化合物は、前記α−アミノ基を２個以上有する水溶性高分子であることが好ましい。なお、ポリアミノ化合物の分子量は、通常、５００〜１００００Ｄａ程度である。また、ポリアミノ化合物中のα−アミノ基の個数の上限としては、通常、１００個程度である。
【００７４】
ポリアミノ化合物は、天然アミノ酸に由来するα−アミノ基を２個以上有する化合物であればいずれでもよいが、中でも、天然アミノ酸の重合物であるポリアミノ酸、α−アミノ基を有するアミノ酸で変性した多糖類などが好ましく用いられ、これらのポリアミノ化合物は、最適に官能基を保護された天然アミノ酸誘導体を多糖類、ポリアミノ酸などに化学修飾により導入した後、脱保護することにより製造することができる。本発明では、ポリアミノ化合物として、特にε−ポリリジンが好ましく用いられる。ε−ポリリジンは、下記の化学式に示すように、リジンのε位のアミノ基とα位のカルボキシル基とがアミド結合により縮合した水溶性高分子であり、その側鎖にはリジンのα−アミノ基が存在している。
【００７５】
【化２】
2005270237.tif 000003
【００７６】
本発明のポリマー材料ｂを構成する生体吸収性ポリマーは、前記酸性多糖類エステルとポリアミノ化合物とを用い、例えば、特開２００１−２７８９８４号公報に記載の方法に従って製造することができる。
【００７７】
本発明の神経再生用材料で用いる生体吸収性ポリマーは、水で膨潤した状態（含水ゲル）であっても、水で膨潤する前の乾燥した状態（含水性ゲル）であっても、又は水で完全には膨潤していないが水を多少含んだ状態であってもよい。
【００７８】
また、生体吸収性ポリマーの形態は特に制限されず、例えば、スポンジ状、フィルム状、シート状、マット状、不織布状、織布状、編布状、網状、繊維状、ペレット状、小塊状、大塊状、粉末状、粒子状、管状、線状などの任意の形態にしておくことができる。
【００７９】
本発明のポリマー材料ａとｂ各々の生体吸収性ポリマーの含有量としては、特に限定はないが、好ましくは１〜５０重量％、より好ましくは５〜２０重量％である。本発明のポリマー材料ａ及びｂには、生体吸収性ポリマー以外に、その他の成分として、例えば、含水率のコントロール、弾性率・強度の調整、分解速度のコントロール、細胞接着性を高めたり、細胞の分化状態を維持若しくは変更するなどの目的で、Na+、Ca++、Mg++などの無機イオン類、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸等の親水性高分子化合物などの添加物を添加することが可能である。さらに、薬理的に許容できるあらゆる薬剤を単独若しくは複数の種類添加することが可能である。また、化学反応によってこれらの薬剤を単独若しくは複数の種類で生体吸収性ポリマー上に固定化することも可能である。使用可能な薬剤の例としては、消毒剤、抗生物質、抗菌剤、アクトシン、PEG1などの血行改善薬、TGFβ、PDGF、b-FGF、血小板由来成長因子（PDNF-AA）、毛様体神経栄養因子（CNTF）、グリア由来神経栄養因子（GDNF）、神経成長因子（NGF）、ヘレグリン（Heregulin）などの増殖因子、ウリナスタチン、TIMP等の酵素阻害剤、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤などの抗炎症剤、フィブリン、コラーゲンなどの構造タンパク質、Eagle’sアルファ修飾最小必須培地等の培地、ウシ胎児血清等の血清、β−メルカプトエタノールなどのSH試薬、フォルスコリン（Forskolin）などのサイクリックAMP上昇作用性剤（又はサイクリックAMPアナログ）、５−アザシチジン（5-azacytidine）等の脱メチル化剤などが挙げられる。
【００８０】
本発明のポリマー材料ａ及びｂとして前記のような生体吸収性ポリマーをそのまま使用することもできるが、前記その他の成分をさらに含ませる場合には、例えば、生体吸収性ポリマーを得、それと所望のその他の成分とを適宜混合することにより調製することができる。
【００８１】
また、本発明の一態様として、本発明のポリマー材料ａを構成する生体吸収性ポリマー及び／又はポリマー材料ｂを構成する生体吸収性ポリマーが生体吸収性の材料からなるチューブに充填されてなるものである、手術操作性に優れた神経再生材料を提供する。かかる神経再生材料は後述する、生体吸収性ポリマーと本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞とを含む神経再生材に準じて製造することができる。ポリマー材料ａを構成する生体吸収性ポリマーとポリマー材料ｂを構成する生体吸収性ポリマーとを両方使用する場合の両者の混合割合は特に限定されるものではない。
【００８２】
本発明はまた、細胞と生体吸収性ポリマーとを含んでなる神経再生材であって、該細胞が本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞からなり、該生体吸収性ポリマーが本発明のポリマー材料ａを構成する生体吸収性ポリマー及び／又は本発明のポリマー材料ｂを構成する生体吸収性ポリマーからなる、神経再生材を提供する。かかる神経再生材は、前記した神経再生用材料に用いられる細胞と生体吸収性ポリマーとが一体となったものであり、神経組織の再生などを必要とする部分にそのまま移植することができ、外科手術などにおいて良好な操作性で便利に使用することができる。さらに、取り扱い性及び保存性等をも考慮すると、細胞と生体吸収性ポリマーとが生体吸収性の材料からなるチューブに充填されてなるものである神経再生材が好適である。
【００８３】
本発明の神経再生材における生体吸収性ポリマーと本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞との混合割合は特に制限されず、神経再生材を適用する生体損傷箇所の状況、損傷神経の種類などに応じて調整することができる。通常、生体吸収性ポリマーの乾燥重量１ｍｇに対して、本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞を好ましくは１×１０３〜１×１０９個、より好ましくは１×１０４〜１×１０８個の割合で両者を混合するのが良好な神経再生性能を発揮させる観点から望ましい。
【００８４】
本発明の神経再生材を形成するためのチューブとしては生体吸収性の材料からなり、しかも生理学的に許容され得る材料からなるものが好適に使用される。前記チューブの形成に用い得る材料の具体例としては、アルギン酸、架橋アルギン酸、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、架橋ヒアルロン酸、セルロース、デンプン、架橋デンプン及びこれらの誘導体などの多糖類；ゼラチン、架橋ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、フィブリン、アルブミンなどのタンパク質；ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリジンなどのポリペプチド；ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコール酸／乳酸共重合体、グリコール酸／カーボネート共重合体、ポリε−カプロラクトン、乳酸／ε−カプロラクトン共重合体、ポリジオキサノン、シアノアクリレート系重合体などの合成高分子材料；水酸アパタイト、リン酸三カルシウム、炭酸カルシウムなどの無機材料などを挙げることができる。中でも、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコール酸／乳酸共重合体、ポリε−カプロラクトン、乳酸／ε−カプロラクトン共重合体などの合成高分子材料からなるチューブが、安定性、柔軟性、透明性、耐熱性、耐湿熱性、強度などの点で優れていることから、好ましく用いられる。
【００８５】
かかるチューブとしては両方の端部が開口していることが好ましい。また、チューブの形態は特に制限されず、例えば、生体吸収性でかつ生理学的に許容され得る上記した物質からなる不織布、織布、編布、フェルト、網体、フィルム、シート、マット、スポンジなどを用いて管状に形成したもの、生体吸収性でかつ生理学的に許容され得る上記した物質を中空紡糸又は管状押出成形などによって直接多孔質又は非多孔質の管状に形成したもの等を挙げることができる。チューブの内径、厚さ、長さなどは特に制限されず、本発明に使用される生体吸収性ポリマーと細胞とを充填してなるチューブからなる神経再生材の用途、それが用いられる患部の状態、外科手術の方法などに応じて種々調節することができる。なお、チューブの内径としては、通常０．５〜２０ｍｍの範囲内であり、外科手術などにおける使用のしやすさなどの点から、１〜１０ｍｍの範囲内であるのが好ましく、２〜５ｍｍの範囲内であるのがより好ましい。チューブの厚さとしては、０．１〜１ｍｍの範囲内であるのが好ましく、０．１〜０．５ｍｍの範囲内であるのがより好ましい。
【００８６】
本発明の神経再生材は本発明の神経再生用材料を用いて好適に製造することができる。チューブへの細胞及び生体吸収性ポリマーの充填は公知の方法により適宜行うことができる。
【００８７】
以上により本発明の神経再生材が得られるが、本発明はその一態様として、
（１）生物材料より細胞を採取する工程、
（２）得られた細胞からCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞を分取する工程、及び
（３）分取された細胞と、本発明で使用される生体吸収性ポリマーとを合わせる工程、を有する、神経再生材の製造方法をも提供する。当該製造方法は、工程（２）と（３）の間に、（２’）分取された細胞を分化誘導する工程をさらに有していてもよい。工程（１）における細胞の採取は生体の骨髄より行うのが好ましい。
【００８８】
本発明の神経再生用材料においては、生体吸収性ポリマーと本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞の保存形態や生体への適用時の形態は特に制限されず、上記したように、本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞を生体吸収性ポリマーと混合したり、該細胞を生体吸収性ポリマーに担持、埋設、包含、含浸させたりするなどして一緒にして保存したり、患部に適用されてもよいし、生体の治療箇所に適用する前は分離した状態で存在したものを適用直前に合わせて併用してもよい。また、生体吸収性ポリマーと本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞を一緒にすることなく個別に神経の再生が必要な患部及び／又はその他の場所（例えば脳脊髄液中）に同時に適用してもよいし、生体吸収性ポリマーと本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞の一方を患部に適用した後に所定の期間を経てからもう一方を同じ患部及び／又はその他の場所に適用する逐次方式を採用してもよい。逐次方式を採用する場合は、神経の再生が必要な患部に生体吸収性ポリマーを最初に施してから本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞を次に施しても、又は本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞を最初に患部に施してから次に生体吸収性ポリマーを施してもよいが、生体吸収性ポリマーを最初に施すことが好ましい。また、両者を施す時間的間隔は短くてもよいし又はある程度の期間（例えば７〜３０日程度）をおいて施してもよく、患部の種類や状況などに応じて適当な方法を採用することができる。細胞と生体吸収性ポリマーとを神経の再生が必要な患部に施す量としては、特に限定されないが、神経再生材について記載した通りの細胞と生体吸収性ポリマーとの割合が好適である。なお、生体吸収性ポリマーを施す量は患部の状態に応じて決定され得る。
【００８９】
生体吸収性ポリマーと本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞を一緒にして患部に施す場合は、生体吸収性ポリマーの形態に応じて、本発明の細胞及び／又は本発明の細胞を分化誘導させた細胞を混合、担持、埋設、包含、含浸などにより生体吸収性ポリマーと一緒にすればよい。
【００９０】
本発明の神経再生用材料あるいは神経再生材を移植後は、薬理学的に許容できるあらゆる薬剤を任意の時期に、任意の個所、任意の方法で患者に適用することが可能である。適用可能な薬剤としては、消毒剤、抗生物質、抗菌剤、アクトシン、PEG1などの血行改善薬、TGFβ、PDGF、b-FGF、血小板由来成長因子（PDNF-AA）、毛様体神経栄養因子（CNTF）、グリア由来神経栄養因子（GDNF）、神経成長因子（NGF）、ヘレグリン（Heregulin）などの増殖因子、ウリナスタチン、TIMP等の酵素阻害剤、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤などの抗炎症剤、フィブリン、コラーゲンなどの構造タンパク質、Eagle’sアルファ修飾最小必須培地等の培地、ウシ胎児血清等の血清、β−メルカプトエタノールなどのSH試薬、フォルスコリン（Forskolin）などのサイクリックAMP上昇作用性剤（またはサイクリックAMPアナログ）、５−アザシチジン（5-azacytidine）等の脱メチル化剤などが単独若しくは複数を逐次もしくは混合した状態で適用可能である。
【実施例】
【００９１】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はかかる実施例のみに何ら限定されるものではない。
【００９２】
《実施例１〜９及び比較例１〜２》
（１）共有結合したアルギン酸架橋ゲルの製造
（ｉ） ２．３ｇ（２０ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（株式会社ペプチド研究所製）を酢酸エチル１５０ｍｌに溶解し、この溶液に、酢酸エチル１０ｍｌに溶解した０．６ｇ（１０ｍｍｏｌ）のエチレンジアミン（ジアミノエタン）（和光純薬株式会社製）を撹拌しながら室温下に滴下した。滴下終了後、さらに１時間撹拌を続けた。析出した結晶を濾取し、減圧下に乾燥してエチレンジアミン２Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩２．９ｇ（収率１００％）を得た。
【００９３】
（ii） アルギン酸ナトリウム（和光純薬株式会社製）の１重量％水溶液（粘度５００〜６００ｃｐ）５５０ｍｌ(カルボキシル基；２７５ｍｍｏｌ)に、上記の（ｉ）で得られたエチレンジアミン２Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩２．４２ｇ（８．５ｍｍｏｌ）と、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（株式会社ペプチド研究所製）１７.６ｇ(９２ｍｍｏｌ)を添加して溶解し、それにより得られた溶液をテフロン被覆アルミ製トレイ（１５ｃｍ×２５ｃｍ）に流延し、室温下に静置した。約５１時間後に含水ゲル（架橋率：１５モル％）が得られた。
【００９４】
（iii） 上記（ii）で得られた含水ゲルを、カルシウムイオンとナトリウムイオンの濃度が細胞間質液におけるのと同じ濃度（カルシウムイオン５ｍｅｑ、ナトリウムイオン１４３ｍｅｑ）になるようにして塩化カルシウムと塩化ナトリウムを溶解した水溶液で十分に洗浄した後、純水で十分に洗浄し、次いで凍結乾燥して、共有結合架橋したアルギン酸ゲルよりなるアルギン酸架橋ゲルスポンジ約５ｇを得た。
【００９５】
（iv） 上記（iii）で得られたアルギン酸架橋ゲルスポンジをトリミングし、約１０×５×２ｍｍ大のアルギン酸架橋ゲル（約１０ｍｇ）を得た（実施例１）。
【００９６】
（２）骨髄間質細胞、及びCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞の入手、並びに分化誘導
（ｉ）GFP（緑色蛍光タンパク質）陽性の成体ラット(Ｗｉｓｔａｒ種)の骨髄より間質細胞を採取し培養する。培地は修飾Ｅａｇｌｅ’ｓ最小必須培地アルファ（Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modification）に２０（v/v）％のウシ胎児血清（fetus carf serum）を加えたものを用いた。４代まで継代培養した。
【００９７】
（ii）得られた細胞をベクトン−ディキンソン社製のＦＡＣＳcan（蛍光−活性化セルソーター）で分別し、CD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞を入手した。
【００９８】
（iii）（ii）で得られた細胞を再度培養し、５０％のコンフルエント（集密confluent）に達した時点で、β−メルカプトエタノール（β-mercaptoethanol） を１ｍＭの濃度で加え２４時間培養した。その後レチノイン酸 ３５ｎｇ／ｍｌを加えた培地に切り替えた。培地は修飾Ｅａｇｌｅ’ｓ最小必須培地アルファに２０（v/v）％のウシ胎児血清を加えたものを用いた。３日後、Forskolin ５μＭ、Platelet-derived growth factor-ＡＡ ５ｎｇ／ｍｌ、basic- Fibroblast growth factor １０ｎｇ／ｍｌ、Heregulin （登録商標）２００ｎｇ／ｍｌを培地に添加したものにさらに切り替えた。７日後に細胞の免疫染色を行った。P75、O4、S-100、GFAP、及びNestin抗体とで反応させたところ、天然シュワン細胞と同様の反応を示した。上記骨髄間質細胞は、天然シュワン細胞と形態学的に同様の形態に誘導された。
【００９９】
（iv）（ii）で得られた細胞を再度培養し、８０−９０％のコンフルエントに達した時点でＮｏｔｃｈ細胞内ドメインの遺伝子を導入した。これはＰｒｏｍｅｇａ社、ｐＣＩ−ｎｅｏ哺乳動物発現ベクター（＃Ｅ１８４１）のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩマルチクローニング部位に、３．１ｋｂのＮｏｔｃｈ細胞内ドメインのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を挿入し組み換えたものであった。導入には、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，１１６６８−０２７）のシステムを用いた。導入の翌日にＧ４１８ｓｕｌｆａｔｅ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，８３−５０２７）を２００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し導入細胞の選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を１０日間行った。細胞数が９０％集密を回復した後、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎｅ ５μＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，３４４２７３）、ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １０ｎｇ／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＥＣ，ＬＴＤ，１００−１８Ｂ）、ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ５０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，５５７−ＮＴ）を添加した。１０日程たって細胞を解析した結果、神経細胞に特徴的な形態が観察された。誘導された細胞は、ＭＡＰ−２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＭＡＢ３６４）、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，８１４３４２）、ｂｅｔａ３−ｔｕｂｕｌｉｎ、Ｔｕｊ１に対して陽性反応を示した。ＭＡＰ−２、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ、ｂｅｔａ３−ｔｕｂｕｌｉｎおよびＴｕｊ１は神経細胞のマーカーであるため、誘導された細胞は神経細胞としての性質を持つものと判断できる。
【０１００】
（v）上記（i）において得られた細胞をTrypsin処理によって回収し、ピペッティング、静置、上澄みの吸引の操作を繰り返して、精製単離した骨髄間質細胞を得た（比較例１）。
【０１０１】
（vi）上記（ii）において得られた細胞をピペッティング、静置、上澄みの吸引の操作を繰り返して、精製単離したCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞を得た（実施例２）。
【０１０２】
（vii）上記（iii）において得られた細胞をTrypsin処理によって回収し、ピペッティング、静置、上澄みの吸引の操作を繰り返して、精製単離したCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞を得た（実施例３）。
【０１０３】
（viii）上記（iv）において得られた細胞をTrypsin処理によって回収し、ピペッティング、静置、上澄みの吸引の操作を繰り返して、精製単離したCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来神経細胞を得た（実施例４）。
【０１０４】
（３）（i）神経再生材の調製：上記（１）で得られた約１０×５×２ｍｍ大のアルギン酸架橋ゲル（約１０ｍｇ）上に、上記（２）（v）で得られた骨髄間質細胞１０６個を含む培地を滴下・含浸させることで、神経再生材を調製した（比較例２）。操作は、全て滅菌条件下で行った。
【０１０５】
（ii）神経再生材の調製：上記（１）で得られたアルギン酸架橋ゲル約１０ｍｇ上に、上記（２）（vi）で得られたCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞１０６個を含む培地を滴下・含浸させることで、神経再生材を調製した（実施例５）。操作は、全て滅菌条件下で行った。
【０１０６】
（iii）神経再生材の調製：上記（１）で得られたアルギン酸架橋ゲル約１０ｍｇ上に、上記（２）（vii）で得られたCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞１０６個を含む培地を滴下・含浸させることで、神経再生材を調製した（実施例６）。操作は、全て滅菌条件下で行った。
【０１０７】
（iv）神経再生材の調製：上記（１）で得られたアルギン酸架橋ゲル約１０ｍｇ上に、上記（２）（viii）で得られたCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来神経細胞１０６個を含む培地を滴下・含浸させることで、神経再生材を調製した（実施例７）。操作は、全て滅菌条件下で行った。
【０１０８】
（４）末梢血由来のＣＤ２９陽性（ＣＤ２９+）、ＣＤ９０陽性（ＣＤ９０+）、ＣＤ１１陰性（ＣＤ１１-）及びＣＤ３４陰性（ＣＤ３４-）である細胞の入手、並びに分化誘導
(i)ＧＦＰ陽性の成体ラット（Ｗｉｓｔａｒ種）の心臓より血液を採取し、ベクトン−ディキンソン社製のＦＡＣＳｃａｎ（蛍光−活性化セルソーター）で分別し、ＣＤ２９陽性（ＣＤ２９+）、ＣＤ９０陽性（ＣＤ９０+）、ＣＤ１１陰性（ＣＤ１１-）及びＣＤ３４陰性（ＣＤ３４-）である細胞を入手した（実施例８）。
【０１０９】
（ii）(i)で得られた細胞を培養し、５０％のコンフルエント（集密confluent）に達した時点で、β−メルカプトエタノール（β−mercaptoethanol）を１ｍＭの濃度で加え、２４時間培養した。その後レチノイン酸３５ｎｇ／ｍｌを加えた培地に切り替えた。培地は修飾Eagle's最小必須培地アルファに２０（ｖ／ｖ）％のウシ胎児血清を加えたものを用いた。３日後、Forskolin  ５μＭ、Platelet-derived growth factor-AA  ５ｎｇ／ｍｌ、basic-Fibroblast growth factor  １０ｎｇ／ｍｌ、Heregulin（登録商標）２００ｎｇ／ｍｌを培地に添加したものにさらに切り替えた。７日後に細胞の免疫染色を行なった。Ｐ７５、Ｏ４、Ｓ−１００、ＧＦＡＰ及びＮｅｓｔｉｎ抗体とで反応させたところ、天然シュワン細胞と同様の反応を示した。上記末梢血由来のＣＤ２９陽性（ＣＤ２９+）、ＣＤ９０陽性（ＣＤ９０+）、ＣＤ１１陰性（ＣＤ１１-）及びＣＤ３４陰性（ＣＤ３４-）である細胞は、天然シュワン細胞と形態学的に同様の形態に誘導された。
【０１１０】
（iii）上記（ii）において得られた細胞をＴｒｙｐｓｉｎ処理によって回収し、ピペッティング、静置、上澄みの吸引の操作を繰り返して、末梢血より精製単離したＣＤ２９陽性（ＣＤ２９+）、ＣＤ９０陽性（ＣＤ９０+）、ＣＤ１１陰性（ＣＤ１１-）及びＣＤ３４陰性（ＣＤ３４-）である細胞由来のシュワン細胞を得た（実施例９）。
【０１１１】
《試験例１》
中枢神経再生手術：１０匹の生後３０日ラットを試験に用いた。各々のラットにエーテル麻酔後、顕微鏡下、胸椎のラミネクトミーを行い、脊髄を露出させた。鋭利なメスを用いて、第８〜１０胸椎レベルで脊髄に２ｍｍのギャップを形成し、上記（３）（iii）で得られた実施例６の神経再生材（アルギン酸架橋ゲルへCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞を含浸させたもの）を２×２×２ｍｍの大きさにトリミングしたものを直ちに充填した。移植後、骨を戻し、筋肉を数箇所、皮膚を数箇所縫合して手術を完了した。術後のラットには免疫抑制剤としてシクロスポリンを連日投与した。
【０１１２】
《試験例２》
（ｉ） １０匹の生後３０日ラットを試験に用い、試験例１と同じ方法により脊髄に２ｍｍのギャップを形成し、そこに生体吸収性ポリマーとして上記（１）で得られた実施例１のアルギン酸架橋ゲルを２×２×２ｍｍの大きさにトリミングしたもの（約１．５ｍｇ）を充填した後、骨を戻し、筋肉を数箇所、皮膚を数箇所縫合した。
【０１１３】
（ii） 上記（ｉ）の術後１０日目に、再度脊髄を露出させ、そこに上記（２）（vii）で得られた実施例３のCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞１０６個をマイクロシリンジを用いて注入した後、同様に骨を戻し、筋肉を数箇所、皮膚を数箇所縫合して手術を完了した。ラットには上記（ｉ）の術後からシクロスポリンを連日投与した。
【０１１４】
《試験例３》
１０匹の生後３０日ラットを試験に用い、試験例１と同じ方法により脊髄に２ｍｍのギャップを形成し、上記（３）（ii）で得られた実施例５の神経再生材（アルギン酸架橋ゲルへCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞を含浸させたもの）を２×２×２ｍｍの大きさにトリミングしたものを直ちに充填した。移植後、骨を戻し、筋肉を数箇所、皮膚を数箇所縫合して手術を完了した。術後のラットにはシクロスポリンを連日投与した。
【０１１５】
《試験例４》
１０匹の生後３０日ラットを試験に用い、試験例１と同じ方法により脊髄に２ｍｍのギャップを形成し、上記（３）（iv）で得られた実施例７の神経再生材（アルギン酸架橋ゲルへCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来神経細胞を含浸させたもの）を２×２×２ｍｍの大きさにトリミングしたものを直ちに充填した。移植後、骨を戻し、筋肉を数箇所、皮膚を数箇所縫合して手術を完了した。術後のラットにはシクロスポリンを連日投与した。
【０１１６】
《試験例５》
末梢神経再生手術：１０匹の６週令ラットを試験に用いた。各々のラットにケタラールを腹腔内注射することで全身麻酔を施した後、鋭利なメスを用いて右下腿中央部の坐骨神経に７ｍｍのギャップを形成し、上記（３）（ii）で得られた実施例５の神経再生材（アルギン酸ゲルへCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞を含浸させたもの）を２枚移植した。各断端は２枚のアルギン酸ゲルでサンドイッチされた状態とした。移植後、筋肉を数箇所、皮膚を数箇所縫合し、神経再生材料の移植および創の閉鎖を行った。術後のラットにはシクロスポリンを連日投与した。
【０１１７】
《試験例６》
１０匹の６週令ラットを試験に用い、試験例５と同じ方法により右下腿中央部の坐骨神経に７ｍｍのギャップを形成し、上記（３）（iii）で得られた実施例６の神経再生材（アルギン酸ゲルへCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞を含浸させたもの）を２枚移植した。各断端は２枚のアルギン酸ゲルでサンドイッチされた状態とした。移植後、筋肉を数箇所、皮膚を数箇所縫合し、神経再生材料の移植および創の閉鎖を行った。術後のラットにはシクロスポリンを連日投与した。
【０１１８】
《試験例７》
(i)１０匹の生後３０日ラットを試験に用い、試験例１と同じ方法により脊髄に２ｍｍのギャップを形成し、そこに生体吸収性ポリマーとして上記（１）で得られた実施例１のアルギン酸架橋ゲルを２×２×２ｍｍの大きさにトリミングしたもの（約１．５ｍｇ）を充填した後、骨を戻し、筋肉を数箇所、皮膚を数箇所縫合した。
【０１１９】
（ii）上記(i)の術後１０日目に、再度脊髄を露出させ、そこに実施例１の（４）（iii）で得られた実施例９のCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来のシュワン細胞１０６個を、マイクロシリンジを用いて注入した後、同様に骨を戻し、筋肉を数箇所、皮膚を数箇所縫合して手術を完了した。ラットには上記(i)の術後からシクロスポリンを連続投与した。
【０１２０】
《比較試験例１》
１０匹の生後３０日ラットを試験に用い、試験例１と同じ方法により脊髄に２ｍｍのギャップを形成し、そこに神経再生用材料として上記（１）（iv）で得られた実施例１のアルギン酸架橋ゲルを２×２×２ｍｍの大きさにトリミングしたものを充填した後、骨を戻し、筋肉を数箇所、皮膚を数箇所縫合して、手術を完了した。術後のラットには実験条件を同等とするためシクロスポリンを連日投与した。
【０１２１】
《比較試験例２》
１０匹の生後３０日ラットを試験に用い、試験例１と同じ方法により脊髄に２ｍｍのギャップを形成し、上記（３）（i）で得られた比較例２の神経再生材（アルギン酸架橋ゲルへ骨髄間質細胞を含浸させたもの）を２×２×２ｍｍの大きさにトリミングしたものを直ちに充填した。移植後、骨を戻し、筋肉を数箇所、皮膚を数箇所縫合して手術を完了した。術後のラットにはシクロスポリンを連日投与した。
【０１２２】
《比較試験例３》
１０匹の生後３０日ラットを試験に用い、試験例１と同じ方法により脊髄に２ｍｍのギャップを形成し、そこに神経再生用材料として上記（１）（iv）で得られた実施例１のアルギン酸架橋ゲルに予め他のWistar系ラットより採取・培養した神経幹細胞１０６個を含浸させた神経再生材を２×２×２ｍｍの大きさにトリミングしたものを充填した後、骨を戻し、筋肉を数箇所、皮膚を数箇所縫合して、手術を完了した。術後のラットにはシクロスポリンを連日投与した。
【０１２３】
《比較試験例４》
１０匹の生後３０日ラットを試験に用い、試験例１と同じ方法により脊髄に２ｍｍのギャップを形成し、そこに神経再生用材料として上記（１）（iv）で得られた実施例１のアルギン酸架橋ゲルに自家末梢神経より予め採取・培養した天然シュワン細胞１０６個を含浸させてなる神経再生材を２×２×２ｍｍの大きさにトリミングしたものを充填した後、骨を戻し、筋肉を数箇所、皮膚を数箇所縫合して、手術を完了した。術後のラットには実験条件を同等とするためシクロスポリンを連日投与した。
【０１２４】
《比較試験例５》
１０匹の生後３０日ラットを試験に用い、試験例１と同じ方法により脊髄に２ｍｍのギャップを形成し、そこに上記（２）（vii）で得られた実施例３のCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞１０６個をマイクロシリンジを用いて注入した後、骨を戻し、筋肉を数箇所、皮膚を数箇所縫合して、手術を完了した。術後のラットにはシクロスポリンを連日投与した。
【０１２５】
《比較試験例６》
１０匹の６週令ラットを試験に用い、試験例５と同じ方法により右下腿中央部の坐骨神経に７ｍｍのギャップを形成し、上記（１）（iv）で得られた実施例１の神経再生用材料（アルギン酸架橋ゲル）を２枚移植した。各断端は２枚のアルギン酸架橋ゲルでサンドイッチされた状態とした。移植後、筋肉を数箇所、皮膚を数箇所縫合し、神経再生材料の移植および創の閉鎖を行った。術後のラットには実験条件を同等とするためシクロスポリンを連日投与した。
【０１２６】
《試験結果》
Ｉ．術後初期の形態観察
（１）中枢神経再生試験：上記の試験例１、２及び比較試験例５において、CD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞移植後の６日目及び１４日目に、免疫組織化学手法を用いて形態観察を行った。
【０１２７】
（i）術後６日目：試験例１及び２のギャップ部は多数のGFP（移植した細胞であることを示すマーカー）陽性であり、かつS100抗体、Nestin抗体、P0抗体、P75抗体、およびO4抗体陽性のCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞が観察された。CD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞は残存しているアルギン酸ゲルに良好に接着していた。また、GAP43（growth associated protein-43、再生軸索が成長・伸長するときに発現するタンパク質）陽性のニューロンが頭側断端及び尾側断端近傍で観察された。再生軸索はCD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞と同位置に観察され、これらのシュワン細胞は再生軸索に接着し、ミエリン形成も起きていることが確認された。また、試験例１と２とで、CD29陽性（CD29＋）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞の観察数、形態に大きな差異は観察されなかった。一方、比較試験例５では、移植したGFP陽性のCD29陽性（CD29+）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞が移植部位より流出しており、ギャップ内には該細胞は観察されなかった。
【０１２８】
（ii）術後１４日目：試験例１及び２のギャップ部からは多くのCD29陽性（CD29+）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞が観察され、試験例２の方がさらに多くの細胞が観察された。CD29陽性（CD29+）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞は残存アルギン酸ゲルに良好に接着していた。また、GAP43陽性で厚いミエリンで取り巻かれた再生軸索がギャップ中央部で観察された。観察軸索数は試験例１及び２の間に有意差は観察されなかった。比較試験例５では、ギャップ内にGFP陽性のCD29陽性（CD29+）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞、再生軸索ともに観察されなった。
【０１２９】
（２）末梢神経再生試験：上記の試験例５、６及び比較試験例６において、神経再生材料若しくは神経再生材移植後の６日目及び１４日目に、免疫組織化学手法を用いて形態観察を行った。試験例５と６では、術後６日目でGFP陽性、かつS100抗体、Nestin抗体、P0抗体、P75抗体、およびO4抗体陽性のCD29陽性（CD29+）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞が観察され、これらのシュワン細胞は残存アルギン酸ゲルに良好に接着していた。また、これらのシュワン細胞にミエリン化された多数のneurofilament抗体陽性の再生軸索が観察され、どちらの試験例においても多数の軸索がギャップ中央部に観察された。術後14日目には、再生軸索はギャップを超え遠位段端まで到達していた。両試験例間に形態学的に有意な差異は観察されなかった。一方、比較試験例６では、術後6日目には近位断端近傍にGFP陰性のシュワン細胞に取り囲まれた少数の再生軸索が観察された。術後14日目では、再生軸索の先端はギャップの中央付近までしか到達していなかった。
【０１３０】
II．術後慢性期での中枢神経の再生
（１）中枢神経の再生の評価方法：上記の手術後５週目で、筋電図計（Nicolet Biomedical Instruments社製「The Nicolet Viking」）を使用して、体性運動誘発電位（ＭＥＰ）及び体性感覚誘発電位（ＳＥＰ）を記録した。その際に、ＭＥＰは大脳運動皮質に電気刺激を加えて、それにより生じた誘発電位を末梢の腓腹筋で記録した。また、ＳＥＰは下肢に電気刺激を加えて、それにより生じた誘発電位をpostcruciate sensory cortex で記録した。さらに、１２週目に光学顕微鏡及び電子顕微鏡を用いて組織の形態学的評価を行った。
【０１３１】
（２）中枢神経再生の評価結果：（ｉ） 試験例１、２、３、４及び７、比較試験例２及び３では、手術後５週目にすでにＭＥＰ及びＳＥＰが記録され、神経の再生されていると評価された。中でも、試験例１、２、３、４及び７では、ＭＥＰ及びＳＥＰ共に、その潜時は短く且つ電位が高くて、より正常に近い評価が得られた。さらに、試験例２及び７では、その潜時はより短く且つ電位がより高く、良好な機能回復がなされていた。
【０１３２】
（ii） 一方、比較試験例１、４及び５では、手術後５週目にＭＥＰ及びＳＥＰは記録されず、神経の再生が円滑に行われていなかった。
【０１３３】
（iii） １２週目の光学顕微鏡標本では、試験例１、２、３、４及び７、比較試験例２及び３では、ギャップ中央部で有髄軸索、無髄軸索が数多く観察された。中でも、試験例１、２、３、４及び７では、より多くの有髄軸索が観察され、軸索はシュワン様細胞と１対１の関係を持ち、厚いミエリン髄鞘を持っていた。さらに、試験例２及び７では、より多くの有髄軸索が観察され、厚いミエリン髄鞘を持っていた。
【０１３４】
（iv） 一方、１２週目の標本において、比較試験例１、４及び５では、ギャップ中央部で有髄軸索は殆ど観察されなかった。
【０１３５】
（ｖ） また、１２週目の透過型電子顕微鏡観察において、試験例１〜７、比較試験例１〜４及び６では、神経再生用材料若しくは神経再生材を埋植した部分でマクロファージ、リンパ球が殆ど観察されず、異物反応及び慢性炎症反応が殆ど起こっていなかった。
【０１３６】
（vi） 上記の結果から、生体吸収性ポリマーである共有結合架橋したアルギン酸架橋ゲルと、特にCD29陽性（CD29+）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞との併用により、高度な神経機能再生が得られることがわかる。これは、共有結合架橋したアルギン酸架橋ゲルの有する優れた生体適合性とCD29陽性（CD29+）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞による神経細胞増殖促進作用や神経軸索伸長作用との相乗効果によるものと推定される。また、生体吸収性ポリマー（共有結合架橋したアルギン酸架橋ゲル）とCD29陽性（CD29+）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞は、一体として神経再生材として用いるよりも、試験例２及び７におけるように、共有結合架橋したアルギン酸架橋ゲルを最初に患部に施した後に、CD29陽性（CD29+）、CD90陽性（CD90＋）、CD11陰性（CD11−）及びCD34陰性（CD34−）である細胞由来シュワン細胞を施して逐次的に併用すると、より高度な神経再生がなされ得ることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１３７】
所定の生体吸収性ポリマーと、所定の細胞及び／又は該細胞を分化誘導させた細胞からなる本発明の神経再生用材料若しくは神経再生材、特に生体吸収性ポリマーとしてカルボキシル基を有する多糖類及び／又はその塩をアミン系化合物（Ｉ）及び／又はその塩からなる架橋性試薬で共有結合的に架橋してなる架橋多糖類からなる生体吸収性ポリマーと、所定の細胞及び／又は該細胞を分化誘導させた細胞からなる神経再生用材料若しくは神経再生材は、神経細胞増殖促進作用及び神経軸索伸長作用を発揮し得、安全性、生体適合性などの点でも優れているため、神経細胞や神経組織の損傷、欠損などによる中枢神経や末梢神経系の疾患の治療、脊椎疾患、頭部外傷、卒中などの脳血管疾患のような外傷性疾患などの治療に有効に用いることができる。
【０１３８】
本発明の神経再生用材料及び神経再生材は、感染症の発生する恐れがなく、生体に対する安全性及び適合性に優れ、しかも工業的に容易にかつ生産性よく製造することができる。また、本発明の神経再生用材料を構成する細胞と生体吸収性ポリマーとを生体吸収性の材料からなるチューブに充填した本発明の神経再生材は、取り扱い性に優れ、神経組織修復のための外科手術などで便利に操作性良く使用することができる。