(57)【要約】【課題】  遺伝子発現等を指標とした統合失調症の客観的診断に資すために、統合失調症に関与する生物学的マーカー（例えば、遺伝子等）の発現量を判定する方法、およびその利用を提供する。【解決手段】  被験者におけるＶＬＤＬＲをコードする核酸及び／又は該タンパク質の発現量が、所定の範囲内にあるか否かを判定する方法であって、該被験者から採取した試料における、ＶＬＤＬＲをコードする核酸及び／又は該タンパク質の発現量を測定して定量値を求める測定工程と、上記測定工程によって得られた定量値が、上記所定の範囲内にあるか否かを判定する判定工程と、を含む判定方法によれば、統合失調症に関与する生物学的マーカーであるＶＬＤＬＲの発現量が所定の範囲内にあるか否かを客観的に判定できる。このため、統合失調症の客観的診断に利用可能である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験対象生物における統合失調症に関与する生物学的マーカーの発現量が、所定の範囲内にあるか否かを判定する方法であって、
被験対象生物から採取した試料における、統合失調症に関与する生物学的マーカーの発現量を測定して定量値を求める測定工程と、
上記測定工程によって得られた定量値が、上記所定の範囲内にあるか否かを判定する判定工程と、を含み、
上記生物学的マーカーには、以下の（ａ）〜（ｅ）のうちから選択される少なくとも１つの物質が含まれることを特徴とする判定方法。
（ａ）超低比重リポタンパク質受容体をコードする核酸
（ｂ）（ａ）の核酸と相補的な塩基配列を有する核酸
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の断片
（ｄ）超低比重リポタンパク質受容体
（ｅ）（ｄ）の断片
【請求項２】
上記所定の範囲が、健常生物における、上記統合失調症に関与する生物学的マーカーの発現量の範囲であることを特徴とする請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
上記試料が、末梢血液であることを特徴とする請求項１または２に記載の判定方法。
【請求項４】
上記生物学的マーカーが超低比重リポタンパク質受容体のｍＲＮＡであり、
上記測定工程には、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応工程が含まれることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項５】
上記逆転写ポリメラーゼ連鎖反応工程には、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸の塩基配列の少なくとも一部と相補的なオリゴヌクレオチドであって、５’末端が蛍光物質で修飾されており、かつ３’末端が該蛍光物質の蛍光を消光する物質で修飾されているオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応系に加える工程が含まれることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法を実施するための判定キット。
【請求項７】
以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちから選択される少なくとも１つの物質を含むことを特徴とする請求項６に記載の判定キット。
（ｉ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸の塩基配列の少なくとも一部と相補的なオリゴヌクレオチドであって、５’末端が蛍光物質で修飾されており、かつ３’末端が該蛍光物質の蛍光を消光する物質で修飾されているオリゴヌクレオチド
（ｉｉ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸の塩基配列を増幅させるためのプライマー
（ｉｉｉ）核酸増幅用の試薬類
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の判定方法または判定キットを用いて、被験対象生物が統合失調症であるか否か、または被験対象生物が統合失調症に罹患する可能性があるか否かを診断することを特徴とする診断方法。
【請求項９】
上記被験対象生物がヒトであることを特徴とする請求項８に記載の診断方法。
【請求項１０】
被験動物が統合失調症のモデル動物として有用であるか否かを判定するモデル動物の判定方法であって、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の判定方法または判定キットにより、上記被験動物が統合失調症に罹患しているか否かを診断する診断過程と、
上記診断過程において、被験動物が統合失調症に罹患していることを指標として、上記被験動物が統合失調症のモデル動物として有用であると判定する判定過程と、を備えることを特徴とするモデル動物の判定方法。
【請求項１１】
抗統合失調症薬の候補物質をスクリーニングするスクリーニング方法であって、
統合失調症のモデル動物に被験物質を与える過程と、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の判定方法または判定キットにより、上記モデル動物の統合失調症が治癒または改善されたか否かを診断する過程と、
上記モデル動物の統合失調症が治癒または改善していることを指標として、上記被検物質が抗統合失調症薬の候補物質であると判定する過程と、を備えることを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、統合失調症（精神分裂病）に関与する生物学的マーカーの判定方法およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
統合失調症（精神分裂病）は、その易傷性（脆弱性）に遺伝的要因が関与しているとされる内因性精神病ないし機能（性）精神病の１つであり、罹患危険率はおおよそ０．８％とその頻度が極めて高い精神疾患である。この統合失調症の症状としては、幻覚、妄想などの陽性症状、感情鈍麻、意欲減退、社会的引きこもりなどの陰性症状、及び認知機能障害などがあるが、病歴も長期にわたるために、この精神疾患による社会的損失は計り知れないものとなっている。
【０００３】
このため、これまでに、世界中の多くの研究室で、統合失調症の治療法及び診断法が盛んに研究されており、薬物治療として、フェノチアジン系化合物、ブチロフェノン系化合物、ベンズアミド系化合物、イミノジベンジル系化合物、チエピン系化合物、インドール系化合物及びセロトニン・ドーパミン受容体遮断薬などが開発されている。これに対して、統合失調症の診断法は、最新のアメリカでの診断基準であるDSM-IV（米国精神医学会診断マニュアル第４版）においても、妄想型、解体型、緊張型、鑑別不能型といった心理症候学でのみ規定されているため、最終的な診断は担当医の主観に依存する症状診断のみとならざるを得ず、診断の精度は十全とはいえない。
【０００４】
このような現状の下、現在、統合失調症の原因遺伝子の染色体マッピング、及びその同定が盛んに繰り広げられており、統合失調症の診断に利用可能な生物学的マーカーがいくつか報告されている（例えば、特許文献１〜３参照）。
【０００５】
例えば、特許文献１には、被験者が統合失調症（精神分裂病）に罹患しているか否かを診断する方法として、核酸及び／又はタンパク質を含有する試料を被験者から採取し、ＤＮＡトポイソメラーゼＩ等の所定のタンパク質、及び／又は上記タンパク質をコードする核酸等を定量し、そのタンパク質若しくは核酸の定量値を指標として、上記被験者が統合失調症に罹患しているか否かを診断する方法を開示している。
【０００６】
また、特許文献２には、被験者から採取した試料において、統合失調症により発現量が変化する遺伝子（例えば、血管内皮成長因子前駆体等）を規定する核酸及び／又は上記統合失調症により発現量が変化する遺伝子を規定する核酸がコードするタンパク質の発現量を定量する工程を含む統合失調症により発現量が変化する遺伝子を規定する核酸の発現量を統計学的に評価する方法について開示されている。
【０００７】
また、特許文献３には、抗塩基性繊維芽増殖因子抗体を有効成分とする精神分裂病診断薬について記載されており、該診断薬を用いて血清中の塩基性繊維芽増殖因子を測定することによって、統合失調症を診断できるとしている。
【特許文献１】特開２００１−２４５６６１公報（公開日：２００１年  ９月１１日）
【特許文献２】特開２００３−３８１９８公報（公開日：２００３年  ２月１２日）
【特許文献３】特開２００３−２１２７９５公報（公開日：２００１年  ７月３０日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、統合失調症は、その病態の特殊性から、うつ病や躁うつ病との区別も困難であり、診断が正確でなければ適切な治療法を施せない。また、早期診断、治療、社会復帰活動、再発防止といった包括的な治療体系の確立が望まれている。特に、近年、副作用の少ない新世代の抗精神病薬が開発され、適切な診断と治療法により統合失調症を治療できるようになってきている。
【０００９】
このため、上述の特許文献１〜３に開示されている統合失調症の診断法だけでは、十分とはいえず、より簡便に、そして正確に統合失調症を診断できる生物学的マーカーを開発するとともに、遺伝子発現等を指標とした統合失調症の客観的診断に資すために、統合失調症に関与する生物学的マーカーを統計学的に評価する方法が強く求められていた。
【００１０】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、遺伝子発現等を指標とした統合失調症の客観的診断に資すために、統合失調症に関与する生物学的マーカー（例えば、遺伝子等）の発現量を判定する方法、およびその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、統合失調症患者および健常者のそれぞれから、末梢血を採血し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、統合失調症患者の血中ＶＬＤＬＲ（Very Low Density Lipoprotein Receptor）の発現量が健常者に比べ有意に低下していることを見出し、かかる現象に基づき、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は産業上有用な方法または物質として、下記１）〜１１）の発明を含むものである。
【００１３】
１）被験対象生物における統合失調症に関与する生物学的マーカーの発現量が、所定の範囲内にあるか否かを判定する方法であって、被験対象生物から採取した試料における、統合失調症に関与する生物学的マーカーの発現量を測定して定量値を求める測定工程と、上記測定工程によって得られた定量値が、上記所定の範囲内にあるか否かを判定する判定工程と、を含み、上記生物学的マーカーには、以下の（ａ）〜（ｅ）のうちから選択される少なくとも１つの物質が含まれる判定方法。
（ａ）超低比重リポタンパク質受容体をコードする核酸
（ｂ）（ａ）の核酸と相補的な塩基配列を有する核酸
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の断片
（ｄ）超低比重リポタンパク質受容体
（ｅ）（ｄ）の断片
２）上記１）における所定の範囲が、健常生物における、上記統合失調症に関与する生物学的マーカーの発現量の範囲である判定方法。
【００１４】
３）上記１）または２）における試料が、末梢血液である判定方法。
【００１５】
４）上記１）〜３）のいずれかの判定方法において、上記生物学的マーカーが超低比重リポタンパク質受容体のｍＲＮＡであり、上記測定工程には、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応工程が含まれる判定方法。
【００１６】
５）上記１）〜４）のいずれかの判定方法において、上記逆転写ポリメラーゼ連鎖反応工程には、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸の塩基配列の少なくとも一部と相補的なオリゴヌクレオチドであって、５’末端が蛍光物質で修飾されており、かつ３’末端が該蛍光物質の蛍光を消光する物質で修飾されているオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応系に加える工程が含判定方法。
【００１７】
６）上記１）〜５）のいずれかに記載の判定方法を実施するための判定キット。
【００１８】
７）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちから選択される少なくとも１つの物質を含むことを特徴とする６）に記載の判定キット。
（ｉ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸の塩基配列の少なくとも一部と相補的なオリゴヌクレオチドであって、５’末端が蛍光物質で修飾されており、かつ３’末端が該蛍光物質の蛍光を消光する物質で修飾されているオリゴヌクレオチド
（ｉｉ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸の塩基配列を増幅させるためのプライマー
（ｉｉｉ）核酸増幅用の試薬類
８）上記１）〜７）のいずれかに記載の判定方法または判定キットを用いて、被験対象生物が統合失調症であるか否か、または被験対象生物が統合失調症に罹患する可能性があるか否かを診断する診断方法。
【００１９】
９）上記被験対象生物がヒトであることを特徴とする８）に記載の診断方法。
【００２０】
１０）被験動物が統合失調症のモデル動物として有用であるか否かを判定するモデル動物の判定方法であって、上記１）〜７）のいずれかに記載の判定方法または判定キットにより、上記被験動物が統合失調症に罹患しているか否かを診断する診断過程と、上記診断過程において、被験動物が統合失調症に罹患していることを指標として、上記被験動物が統合失調症のモデル動物として有用であると判定する判定過程と、を備えるモデル動物の判定方法。
【００２１】
１１）抗統合失調症薬の候補物質をスクリーニングするスクリーニング方法であって、統合失調症のモデル動物に被験物質を与える過程と、上記１）〜７）のいずれかに記載の判定方法または判定キットにより、上記モデル動物の統合失調症が治癒または改善されたか否かを診断する過程と、上記モデル動物の統合失調症が治癒または改善していることを指標として、上記被検物質が抗統合失調症薬の候補物質であると判定する過程と、を備えるスクリーニング方法。
【００２２】
なお、後述する実施例に示すように、本発明に利用する生物学的マーカー（ＶＬＤＬＲ）は、統合失調症のみならず、大うつ病に対する病因感受性遺伝子であると考えられるため、本発明に係る判定方法、判定キット、診断方法、モデル動物の判定方法、スクリーニング方法は、大うつ病に対しても同様に利用可能であるといえる。
【発明の効果】
【００２３】
以上のように、本発明に係る判定方法によれば、被験対象生物（例えば、ヒトや実験動物等）における統合失調症に関与する生物学的マーカーの発現量が健常生物のそれの範囲内に含まれるか否かについて、正確かつ簡便に判定することができる。このため、本発明に係る判定方法を用いることで、被験者が統合失調症を罹患しているか否か、あるいは罹患する可能性があるか否かを診断することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、被験対象生物の統合失調症に関与する生物学的マーカーの発現量が、健常生物のそれの範囲内にあるか否かを簡便かつ正確に判定する方法およびその利用方法等を提供するものである。このため、以下の説明では、まず本発明に係る生物学的マーカーの判定方法（以下、説明の便宜上、単に「判定方法」と称する場合もある）について説明し、続いてその利用法として、判定キット、診断方法、モデル動物の判定方法、およびスクリーニング方法について順に説明する。
【００２５】
〔１〕生物学的マーカーの判定方法
本発明に係る生物学的マーカーの判定方法は、被験対象生物における統合失調症に関与する生物学的マーカーの発現量が、所定の範囲内にあるか否かを判定する方法であって、少なくとも測定工程、判定工程を含んでいればよく、その他の具体的な工程、材料、条件等は特に限定されるものではない。以下、工程ごとに詳細に説明する。
【００２６】
〔１−１〕測定工程
「測定工程」は、被験対象生物から採取した試料における、統合失調症に関与する生物学的マーカーの発現量を測定して定量値を求める工程であればよい。本測定工程では、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかを定量するが、指標とすべき生物学的マーカーの発現量を定量するためには、まず、被験対象生物から、試料を採取する必要がある。このため、例えば、本測定工程の前段階に、被験対象生物から試料を採取する採取工程が含まれていてもよい。
【００２７】
ここで「被験対象生物」とは、統合失調症の症状を表す生物全般をいい、被験者および被験動物を含む概念である。なお、本明細書において、「被験者」とはヒトであり、特に本発明の方法等の対象である患者を意味する。本明細書において、「被験動物」とはヒト以外の動物であり、特に実験動物として好適なマウス、ラット、モルモット、イヌ、ウサギ、サル、チンパンジー等を意味する。
【００２８】
また「試料」とは、上記被験対象生物から採取される試料であればよく、例えば、被験対象生物から取り出した組織、細胞、体液を含む任意の試料が本発明でいう「試料」になり得る。好ましい試料として、例えば、血液、特に末梢血液が挙げられるが、本発明でいう生物学的マーカーは、血液以外でも発現しているため、生検脳、剖検脳、脳脊髄液、等のその他の種々の組織を用いる方法もまた、本発明の範囲内であると解されるべきである。
【００２９】
「統合失調症に関与する生物学的マーカー」とは、統合失調症を罹患することにより、その発現量が変動する（増加または減少する）生物学的マーカーであって、上述の（ａ）〜（ｅ）のうちから選択される少なくとも１つの物質が含まれていればよい。
【００３０】
（ａ）は、超低比重リポタンパク質受容体（以下、ＶＬＤＬＲと称する場合もある）をコードする核酸であればよい。また（ｂ）は、（ａ）の核酸と相補的な塩基配列を有する核酸であればよい。すなわち、（ａ）または（ｂ）の典型例としては、ＶＬＤＬＲのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡが挙げられる。また、これらのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの翻訳領域の末端及び／又は内部に調節配列やポリアデニル配列等の任意のポリヌクレオチドが含まれていてもよい。また、ＶＬＤＬＲが複数の対立遺伝子によってコードされ得る場合には、全ての対立遺伝子、それらの転写産物、およびｃＤＮＡがかかる核酸に含まれる。なお、本明細書において、「核酸」なる語には、任意の単純ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド、例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、等が含まれる。「修飾ヌクレオチド」には、イノシン、アセチルシチジン、メチルシチジン、メチルアデノシン、メチルグアノシンを含むリン酸エステルの他、紫外線や化学物質の作用で後天的に発生し得るヌクレオチドも含まれる。
【００３１】
また、（ｃ）は、（ａ）または（ｂ）の核酸の断片であればよい。「核酸の断片」とは、ＶＬＤＬＲをコードする遺伝子を規定する核酸または該核酸の一部を含むポリヌクレオチドを意味し、典型的には、ＶＬＤＬＲのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの断片が挙げられる。
【００３２】
なお、このような核酸の具体例としては、例えば、ヒトのＶＬＤＬＲをコードする遺伝子（accession #：Genomic  NT_008413、mRNA  NM_003383）やその断片などが挙げられる。ＮＣＢＩのサイトは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/LocRpt.cgi?l=7436である。なお、本発明に利用可能なＶＬＤＬＲをコードする遺伝子としては、上記ヒトのＶＬＤＬＲをコードする遺伝子に限られず、各種実験動物におけるＶＬＤＬＲをコードする遺伝子を好適に用いることができる。また、どの動物のＶＬＤＬＲ遺伝子を用いるかは、被験対象生物にあわせて適宜選択可能であることはいうまでもない。
【００３３】
また（ｄ）は、超低比重リポタンパク質受容体、すなわちＶＬＤＬＲのタンパク質である。また（ｅ）は、（ｄ）のタンパク質の断片であればよく、部分タンパク質やポリペプチド、オリゴペプチドを含む。このようなタンパク質の具体例として、例えば、ヒトのＶＬＤＬＲタンパク質（accession #：NP_003374）やその断片が挙げられる。
【００３４】
また「統合失調症」とは、従前は精神分裂病と称されていた精神疾患であり、妄想型精神分裂病、解体型精神分裂病、緊張型精神分裂病、および鑑別不能型精神分裂病を含む任意の型の精神分裂病（統合失調症）が含まれる。
【００３５】
また、本測定工程において、上記（ａ）〜（ｃ）の核酸を定量する場合、被験対象生物から試料を採取した後、通常は、該試料から核酸を抽出する操作を行う。この試料（生体成分）から核酸を抽出する方法としては、例えばフェノール抽出、エタノール沈殿の他、任意の抽出方法を使用することができる。また、ｍＲＮＡを抽出する場合には、オリゴｄＴカラムにかけてもよい。核酸の量が少ないときには、必要に応じて、核酸を増幅する操作を行ってもよい。増幅操作は、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などのポリメラーゼ連鎖反応（以下、単にＰＣＲと略記する）によって行うことができる。また、以下に記載するように、増幅操作は、定量操作として、又は定量操作を兼ねて行ってもよい。
【００３６】
必要に応じて、抽出操作及び／又は増幅操作を行った後には、上記（ａ）〜（ｃ）の核酸からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を定量する。核酸を定量するためには、定量的ＰＣＲ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮＡ消化酵素保護マッピング法、およびそれらの組み合わせを含む本分野で周知の任意の手法を使用することができる。
【００３７】
定量的ＰＣＲとしては、典型的には、放射性物質（例えば、３２Ｐ等）や蛍光物質等でラベルされたヌクレオチドを用いて増幅産物を内部標識する方法を使用することができる。また、放射性物質や蛍光物質でラベルされたプライマーを用いて増幅産物をエンドラベルする方法も使用し得る。標識された増幅産物は、ゲル濾過、アルコール沈澱、トリクロロ酢酸沈澱、グラスフィルター等への物理的吸着を含む周知の方法を用いて、遊離の放射性（または蛍光物質を付加した）ヌクレオチドまたはプライマーと分離することができる。
【００３８】
続いて、放射性物質を用いた場合は、電気泳動やハイブリダイゼーションを行って、又は行わずに、液体シンチレーション、オートラジオグラフィー、イメージングプレート（バイオイメージングアナライザー（ＢＡＳ；富士写真フィルム）等）等の操作によって、増幅産物を定量する。放射性物質の代わりに、蛍光物質や発光物質を標識物質として使用する場合は、分光蛍光光度計、蛍光用マイクロプレートリーダー、ＣＣＤカメラ等を用いて増幅産物を定量してもよい。
【００３９】
また、上記生物学的マーカーがＶＬＤＬＲのｍＲＮＡである場合、本測定工程には、定量的ＲＴ−ＰＣＲ工程が含まれていてもよい。また、定量的ＰＣＲ、定量的ＲＴ−ＰＣＲとして、いわゆるリアルタイムＰＣＲを行うことも可能である。リアルタイムＰＣＲとしては、インカレーター法、TaqMan プローブ法、サイクリングプローブ法等の従来公知の手法を用いることができる。
【００４０】
「インカレーター法」とは、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する試薬（インターカレーター：SYBRR Green I 、EtBr など）をＰＣＲ反応系に加える方法である。インターカレーターはＰＣＲ反応によって合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発するため、この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターできる。
【００４１】
また、「TaqMan プローブ法」とは、５’末端を蛍光物質（ＦＡＭなど）で、３’末端をクエンチャー物質（ＴＡＭＲＡなど）で修飾したオリゴヌクレオチド（TaqMan プローブ）をＰＣＲ反応系に加える方法である。TaqMan プローブは、アニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。そして、伸長反応ステップのときに、TaqDNA ポリメラーゼのもつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたTaqMan プローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光が発せられる。
【００４２】
また「サイクリングプローブ法」とは、ＲＮＡ（あるいはＲＮＡとＤＮＡのキメラ）プローブとRNase Hの組み合わせによる高感度な検出方法で、増幅中や増幅後の遺伝子断片の特定配列を効率良く検出することができる。プローブは５’端が蛍光物質（リポーター）で、３’端が蛍光を消光する物質（クエンチャー物質）で標識されている。このプローブは、インタクトな状態ではクエンチングにより強い蛍光を発することはないが、配列が相補的な増幅産物とハイブリッドを形成した後にRNaseH によりＲＮＡ部分が切断されると、強い蛍光を発するようになる。この蛍光強度を測定することで、増幅産物の量をモニターすることができる。
【００４３】
なかでも、後述する実施例に示すように、「TaqMan プローブ法」を利用することが好ましい。すなわち、本測定工程には、ＲＴ−ＰＣＲ工程が含まれ、かつ該ＲＴ−ＰＣＲ工程には、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸の塩基配列の少なくとも一部と相補的なオリゴヌクレオチドであって、５’末端が蛍光物質で修飾されており、かつ３’末端がクエンチャー物質で修飾されているオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応系に加える工程が含まれることが好ましい。上記の構成によれば、ＶＬＤＬＲに特異的なTaqMan プローブを準備するだけで、正確かつ簡便に本発明を実施することができる。なお、TaqMan プローブやＰＣＲ用のプライマーは、従来公知の方法にて、好適な領域を選択して任意に作製することができ、特に限定されるものではない。
【００４４】
また、定量的ＰＣＲ等を行わない場合、最も一般的には、核酸を含む試料を電気泳動にかけ、サザンブロットやノーザンブロットを行った後、検出可能な標識物質でラベルされたプローブを用いて定量することも可能である。また、多種類の核酸を同時に定量する場合には、これらの手法と共に、又はこれらの手法に代えて、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイを用いてもよい。核酸の定量に代えて、又は核酸の定量と共に、ｍＲＮＡ（遺伝子）から産生されるタンパク質を定量することにより、遺伝子の発現量を間接的に推定してもよい。本発明の方法によって、統合失調症を診断するには、核酸よりも、核酸がコードするタンパク質を定量することが有用である場合もあろう。
【００４５】
一方、本測定工程において、上記（ｂ）、（ｅ）のタンパク質またはその断片（以下、単にタンパク質等と称する）を定量する場合、被験対象生物から試料を採取した後、通常は、該試料からタンパク質等を抽出する操作を行う。このタンパク質等を試料（例えば、組織など）から抽出する方法、およびタンパク質を定量する方法としては、本分野において周知である任意の方法を使用することができる。例えば、タンパク質を定量する場合には、ウエスタンブロット法、固相酵素免疫検定法を含む酵素免疫検定法、免疫細胞化学法、免疫組織化学法を使用し得る。なお、本明細書では、最も一般的な操作の概略を例示したにすぎないので、上記方法の様々な変法や全く異なる方法も使用できる。現在、電気泳動装置やＰＣＲ装置等を組み合わせて、核酸の抽出、増幅、分離、定量を全自動で行う装置が市販されているので、このような装置を用いることも好ましい。このような装置を用いれば、通常の臨床検査と同じように、統合失調症の診断を行うことが可能となる。
【００４６】
〔１−２〕判定工程
本発明でいう判定工程とは、上記測定工程によって得られた定量値が、上記所定の範囲内にあるか否かを判定する工程であればよい。すなわち、上記測定工程において所定の生物学的マーカー（核酸の定量及び／又はタンパク質）の定量を行った後、その定量値が所定の範囲内にあるか否かを判定することになる。ここで「所定の範囲」とは、健常生物（統合失調症を罹患していない生物、非統合失調症生物）における、上記統合失調症に関与する生物学的マーカーの発現量の範囲、つまり正常値の範囲である。また「所定の範囲」として、上記正常値に基づき設定された閾値の範囲を用いてもよい。すなわち、本判定工程では、生物学的マーカーの発現量の正常値、もしくは正常値を参考にして適切な閾値の範囲を設定し、該正常値または閾値を上回っているか、あるいは下回っているかを判定することになるといえる。
【００４７】
また、上記閾値は、以下のように、所望の判定精度に応じて選定すればよい。例えば、非統合失調症の健常生物群（以下、正常群と称する）と統合失調症生物群（以下、単に患者群と称する）における遺伝子発現量の分布が何れも明らかになっているときには、例えば、定量すべき核酸又はタンパク質等を採取した個体が正常群に属する確率が１０％、５％、または１％であるように閾値を設定する。正常群の遺伝子発現量の分布のみが明らかになっているときには、定量すべき核酸又はタンパク質を採取した個体が正常群に属するという仮定の下で、該核酸又はタンパク質についてそのような定量値が得られる確率（以下ｐ値という、典型的には両側確率であるが、片側確率でもよい）が、１０％、または５％、または１％であるような核酸またはタンパク質の量または濃度を閾値として設定し得る。また、患者群の遺伝子発現量の分布のみが明らかなときにも、同様の統計手法によって解析し得る。
【００４８】
なお、ｐ値の計算は、例えば、ｔ検定やノンパラメトリック検定等の従来公知の検定手法によって算出することができる。正常群及び／又は患者群における遺伝子の発現量の統計学的分布を明らかにするには、典型的には、少なくとも５個体、好ましくは１０個体、より好ましくは２０個体、さらに好ましくは５０個体、最も好ましくは１００個体の発現量を測定すべきである。また、必要に応じて、任意の様々な統計学的手法を用いて、被験対象生物における上記生物学的マーカーが所定の範囲内にあるか否かをさらに正確に判定することも可能であるが、そのような手法を用いた判定方法も、当然、本発明の方法の範囲に属する。
【００４９】
また、本願明細書において、「測定工程によって得られた定量値が、所定の範囲内にあるか否かを判定する判定工程」とは、例えば、「測定工程によって得られた定量値が正常群の範囲内であるかを統計学的に解析する解析工程」と換言することができる。この「解析工程」とは、以下に具体的に記載する様な統計学的な工程を意味する。
【００５０】
まず、単一の核酸及び／又はタンパク質等の定量値を指標として判定する場合には、患者群の発現量が多く（例えば、シグナルが１０以上）、両者の絶対遺伝子発現変化率（「患者群の平均発現量／正常群の平均発現量」と「正常群の平均発現量／患者群の平均発現量」のうち何れか大きい方）が１．５倍以上で、かつ平均の差の検定におけるｐ値が５％以下である核酸及び／又はタンパク質等を指標とすることが好ましい。また、複数の核酸及び／又はタンパク質等の定量値を指標として判定する場合には、それぞれの核酸及び／又はタンパク質等について適切な閾値を設定し、単一の核酸及び／又はタンパク質等を指標とする場合と同様に、各遺伝子の発現量が閾値を上回っているか、又は下回っているかを調べる。所望の判定精度に応じて、１つの核酸及び／又はタンパク質等の定量値が閾値を上回っているか、又は下回っているかを判定することができる。その結果、患者が統合失調症の可能性があると判定し得る。また、２以上の核酸及び／又はタンパク質等の定量値が閾値を上回っているか、又は下回っているかを判定でき、その場合、統合失調症の可能性がさらに高いと判定し得る。確定的な判定を下したい場合には、より多くの核酸及び／又はタンパク質等の定量値が閾値を上回っているか、下回っているかを判定することにより、統合失調症であるか否かを判定できる。さらに、本発明の判定方法は、従来の主観的診断方法と併用することもできる。
【００５１】
また、何らかの方法によって、確定的に統合失調症であることが明らかな患者から、本発明の判定方法において指標として使用し得る生物学的マーカー（核酸及び／又はタンパク質等）の定量値についてのデータを収集することができれば、本発明の判定方法のみによって確定的な判定を下すことも可能となる。つまり、本発明の測定工程によって得られた生物学的マーカーの発現量の定量値が、確定的な統合失調症患者における生物学的マーカーの発現量の定量値の範囲内であるか否かを、本発明の判定工程において判定することも可能であろう。
【００５２】
なお、本発明の主題は、統合失調症の客観的判定（診断）方法を提供することに存するのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の抽出操作、増幅操作、および解析操作に存するのではない。したがって、上記各操作以外の操作を用いた判定方法も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【００５３】
以上のごとく、本発明に係る判定方法を用いれば、被験対象生物における統合失調症に関与する生物学的マーカーの発現量（核酸（遺伝子）の発現量及び／又は核酸（遺伝子）に由来する生物学的産物（タンパク質）の発現量）が、所定の範囲内にあるか否かを簡便かつ正確に判定することができる。そして、その判定結果を指標とすることにより、被験対象生物が統合失調症に罹患しているか否かを客観的に診断することができる。それゆえ、本発明には、以下の利用法が含まれる。
【００５４】
〔２〕利用法
本発明に係る判定方法は、上述の利点を有するため、種々の利用法が本発明には含まれる。以下、本発明に係る判定方法の利用法として、判定キット、診断方法、モデル動物の判定方法、スクリーニング方法について順に説明する。
【００５５】
〔２−１〕判定キット
本発明に係る判定キットは、上記〔１〕欄で説明した判定方法を実施するためのものであればよく、これに含まれる具体的な構成、材料、機器等は、特に限定されるものではない。具体的には、上記判定方法の各工程を実施するための物が含まれていればよい。例えば、被験対象生物から試料を採取する採取工程の場合、採血するための機器として、注射器等が挙げられる。また、測定工程の場合は、上記測定を実施するために必要な物、例えば、各種試薬や実験器具が挙げられる。また、判定工程の場合は、上記判定を行うために必要な各種演算装置（例えば、コンピュータ等）が挙げられよう。
【００５６】
上記の構成によれば、簡便かつ確実に本発明に係る判定方法を実施することができる。このため、本判定方法を用いて、統合失調症の判定（診断）を行うことができる。
【００５７】
また、なかでも、測定工程にＰＣＲ工程が含まれる場合、上記〔１〕欄で説明した（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸を増幅させるためのＰＣＲ用プライマーや各種試薬類（ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、サーマルサイクラー等のＰＣＲ機器を含む）が挙げられる。また、生物学的マーカーがＲＮＡであり、ＲＴ−ＰＣＲ工程が含まれる場合は、ＲＴ−ＰＣＲ用の試薬（逆転写酵素等）が挙げられる。さらに、上述の「TaqMan プローブ法」を利用する場合、生物学的マーカー（ＶＬＤＬＲ遺伝子またはその断片等）に特異的なTaqMan プローブが必要になる。すなわち、上記〔１〕欄で説明した（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸の塩基配列の少なくとも一部と相補的なオリゴヌクレオチドであって、５’末端が蛍光物質で修飾されており、かつ３’末端が該蛍光物質の蛍光を消光する物質で修飾されているオリゴヌクレオチドが必要となる。
【００５８】
上記の構成によれば、生物学的マーカーであるＶＬＤＬＲをコードする核酸に特異的なTaqMan プローブを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ工程を含む測定工程を簡便に行うことができるという利点がある。
【００５９】
〔２−２〕診断方法
また、本発明には、被験対象生物が統合失調症であるか否か、または被験対象生物が統合失調症に罹患する可能性があるか否かを診断する方法も含まれる。本診断方法は、上記の判定方法または判定キットを用いていればよく、その他の具体的な構成、条件等は特に限定されない。例えば、統合失調症に罹患していない生物（健常生物）における上記生物学的マーカーの発現量を指標として、被験対象生物が統合失調症に罹患しているか否かを判定することになる。より具体的には、単一の核酸及び／又はタンパク質の定量値を指標として診断する場合、正常値を参考にして適切な閾値を設定し、該閾値を上回っているか、又は下回っていれば、統合失調症である可能性が高いと診断できる。すなわち、統合失調症患者内で上記生物学的マーカーの発現量が増加する場合には、設定した閾値を上回っていれば、統合失調症である可能性が高いと判定し得るであろう。
【００６０】
したがって、本診断方法によれば、簡便かつ正確に被験対象生物が統合失調症であるか否か、または被験対象生物が統合失調症に罹患する可能性があるか否かを診断することができる。また、本診断方法は、被験者（ヒト）に対する診断方法と、被験動物（実験動物等）に対する診断方法に分けることができる。ヒトに対する診断方法の有用性は述べるまでもないが、例えば、法的責任能力の有無を調べる目的で、またはその他の目的で行われる精神鑑定に適用することも可能である。また、被験動物に対する診断方法は、例えば、統合失調症の治療薬を開発する際などの動物実験の際などに非常に有用であろう。
【００６１】
〔２−３〕モデル動物の判定方法、スクリーニング方法
本発明の判定方法や判定キットは、ヒトを除く統合失調症のモデル動物の有用性を判定する方法、およびこのようなモデル動物を用いた薬物スクリーニングにおいて、薬物の有効性を判定する方法に応用し得る。すなわち、統合失調症のモデル動物の有用性を判定する場合には、前記判定方法や診断方法と同様に、上記生物学的マーカー（遺伝子）の発現量に基づいて、被験動物が統合失調症を発症しているか否かを判断し、該動物が統合失調症を発症していれば、統合失調症のモデル動物として有用であると判定することができる。
【００６２】
また、ここでいう「被験動物」には、マウス、ラット、及びサルが含まれるが、ヒト以外の動物であれば、任意の動物が「被験動物」になり得る。ヒト以外の動物では、統合失調症の判定（診断）は、さらに困難であったので、該方法は極めて有用であるといえる。さらに、このようなモデル動物に、抗統合失調症薬の候補物質を投与した後、上記のごとく生物学的マーカーの核酸及び／又はタンパク質等を定量し、統合失調症が治癒または改善されていれば、前記候補物質は抗統合失調症作用を有していると判断し得る。すなわち、本発明の判定方法を利用すれば、抗統合失調症薬の候補物質を容易かつ正確にスクリーニングすることができる。なお、ここでいう「抗統合失調症薬の候補物質」は、試験者が所望する任意の物質であり得る。
【００６３】
なお、後述する実施例に示すように、本発明に利用する生物学的マーカー（ＶＬＤＬＲ）は、統合失調症のみならず、大うつ病に対する病因感受性遺伝子であると考えられるため、上述の本発明に係る判定方法、判定キット、診断方法、モデル動物の判定方法、スクリーニング方法は、大うつ病に対しても同様に利用可能であるといえる。すなわち、上記各方法やキットにおける「統合失調症」を「大うつ病」と読み替えて、「大うつ病」に対する判定方法、判定キット等として利用することができる。
【００６４】
以下実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００６５】
〔方法と結果〕
対象者は、すべての未治療の者とした。(i)統合失調症群は、DSM-IV（米国精神医学会診断マニュアル第４版）により、Schizophrenia、Schizophreniform disorder、Schizoaffective disorderと診断される患者（ｎ＝２０）、およびDSM-IVにおける大うつ病性障害患者（ｎ＝２０）である。また、(ii)対照群は、性・年齢を一致させた両親・同胞に精神疾患のない健常者（ｎ＝２０）、および精神疾患の各々の治療群である。
【００６６】
上記対象者に書面にて研究内容を説明し、同意を得た。その後、具体的な実験を行った。具体的には、まず、ＥＤＴＡ採血管に静脈血２０ｍｌを採取し、Ficoll/Paque濃度勾配法によりリンパ球を含む単核球分画を抽出し、総ＲＮＡを調製する。神経幹細胞の機能を修飾することが知られているLipoprotein Receptor family、およびIL-6 receptor familyについて、各々のTaqMan プローブを作製し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ（Applied Biosystems Inc製）を用いたリアルタイムＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ法）により、ｍＲＮＡ発現量を定量し、各群間で比較した。なお、ＰＣＲにより増幅させる標的分子（生物学的マーカー）を以下に示す。
・Lipoprotein receptor family: Apolipoprotein E receptor type 2、Very low density lipoprotein receptor (VLDLR)、Megalin、Low density lipoprotein (LDL) receptor、LDL receptor-related protein
・LI-6 receptor family: Ciliary neurotrophic factor、Leukemia inhibitory factor (LIF)、LIF receptor
また、使用したプライマーおよびTaqMan プローブを以下に示す。なお、リアルタイムＰＣＲは、以下の条件で行った。なお、プライマーは、ＶＬＤＬＲのｍＲＮＡ配列、Genbank accession #：NM_003383に基づき、エクソン７の上にプライマーＡ：5’CTG CAG GGA CTG GAG TGA TGA 3’を、エクソン９の上にプライマーＢ：5’ GCA GAT TCC TGG ATT TTG GCA 3’と設計した。
【００６７】
また、TaqMan プローブは、エクソン８上に、5’ CGA GTG TGA CTG TGC AGC TGG GTT TGA 3’と設計した。
【００６８】
また、リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ（Applied Biosystems Inc製）Sequence Detection Systemを用い、条件は、９５℃で３０秒、６０℃で４５秒、７２℃で３０秒を５５サイクル行なった。
【００６９】
その結果、図１に示す。なお、図中、Healthyは健常者を表し、Schizophrenia (not medicated)は統合失調症（未治療群）、Schizophrenia (medicated)は統合失調症（治療群）、Depression (not medicated)はうつ病態（未治療群）、Major Depression (medicated)は大うつ病態（治療群）、Bipolar Disorder (medicated)は「そう」と「うつ」とを繰り返す病態（治療群）の患者を表す。
【００７０】
この図１に示すように、上記の標的分子の中で、本願発明者らは未治療の統合失調症患者と大うつ病患者において、Very low density lipoprotein receptor （ＶＬＤＬＲ）のｍＲＮＡの発現レベルが有意に低下していることを発見した。また、健常者および治療群患者では、ＶＬＤＬＲのｍＲＮＡ発現量の低下は認められなかった。
【００７１】
このため、本願発明者らは、ＶＬＤＬＲが統合失調症および大うつ病に共通する生物学的マーカーとして利用可能であると判断した。なお、ＶＬＤＬＲが上記両疾患に対する共通の病因感受性遺伝子であることの報告は未だなされておらず、本発見は世界ではじめてであるといえる。
【００７２】
したがって、この因子は統合失調症等の発症に関与しているといえ、統合失調症等の発症時の生物学的マーカーとして利用することができる。また、他の精神疾患等との鑑別や治療経過におけるトレートマーカー（trait marker）として使用することもできる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
上述したように、本発明に係る判定方法によれば、被験対象生物が統合失調症であるか否かについて簡便かつ確実に判定することができるため、統合失調症の予防、診断、治療等に非常に有用である。つまり、学術的な利用価値だけでなく、医薬品産業、医療機器、医療業など、非常に広範な用途に利用可能であるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本発明における実施例の結果を示す図である。
【図１】
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【配列表】
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