(57)【要約】【課題】  プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法および組成物を提供すること。【解決手段】  プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法。この方法は、  アミノ酸配列ＮＨ２−ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ−ＣＯＯＨを有するペプチドを得る工程、および  このペプチドを使用することによってか、またはこのペプチドのアミノ酸配列の知識から開発した組成物を使用することによって、ＪＮＫ経路を調節する工程、を包含する。別の方法は、  （ａ）ＪＮＫ経路内にある標的を選択する工程、および  （ｂ）このＪＮＫ経路をアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートするかのいずれかをする因子によって、この標的に干渉する工程、を包含する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法であって、該方法は、
アミノ酸配列ＮＨ２−ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ−ＣＯＯＨを有するペプチドを得る工程、および
該ペプチドを使用することによってか、または該ペプチドのアミノ酸配列の知識から開発した組成物を使用することによって、ＪＮＫ経路を調節する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法であって、該方法は、
（ａ）ＪＮＫ経路内にある標的を選択する工程、および
（ｂ）該ＪＮＫ経路をアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートするかのいずれかをする因子によって、該標的に干渉する工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
ＪＮＫ活性をインビボで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５βとは独立してＪＮＫＫ２と相互作用する候補因子を得る工程；
（ｂ）該因子を、非ヒト動物に投与する工程；および
（ｃ）該動物におけるＪＮＫ活性のレベルを、該因子を受けていない動物におけるＪＮＫ活性と比較して決定する工程
を包含する、方法。
【請求項４】
ＪＮＫ経路の調節因子についてスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）該ＪＮＫ経路の候補調節因子を得る工程であって、該候補調節因子は、アミノ酸配列ＮＨ２−ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ−ＣＯＯＨを有するペプチドに結合し得る、工程；
（ｂ）該候補調節因子を癌細胞に投与する工程；および
（ｃ）該ＪＮＫ経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを含む該候補調節因子の該ＪＮＫ経路調節能力を決定し、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのレベルをアッセイする工程
を包含する、方法。
【請求項５】
罹患した細胞におけるアポトーシスの影響により引き起こされる変性障害および他の状態を処置する方法であって、該方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５βとは独立してＪＮＫシグナル伝達の活性化に干渉する分子を得る工程；および
（ｂ）該罹患した細胞に該分子を接触させる工程
を包含する、方法。
【請求項６】
免疫系が癌細胞を殺傷させるのを、ＪＮＫシグナル伝達を増強することによって補助する方法であって、該方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５βとは独立してＪＮＫシグナル伝達をブロックするインヒビターを得る工程；および
（ｂ）該癌細胞を該インヒビターに接触させる工程
を包含する、方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、前記分子が、Ｇａｄｄ４５βとは独立してＪＮＮＫ２の活性化に干渉する、方法。
【請求項８】
ＪＮＫＫ２相互作用因子を同定する方法であって、該方法は、
（ａ）アミノ酸配列ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤを含むペプチドをベイトとして提供する工程；および
（ｂ）該ペプチドと相互作用する因子を同定する工程
を包含する、方法。
【請求項９】
全長ＪＮＫＫ２の１４２位〜１６６位（ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ）に結合し得る分子へのＪＮＫＫ２の結合に干渉する因子を決定するための方法であって、該方法は、
（ａ）全長ＪＮＫＫ２の１４２位〜１６６位（ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ）への該分子の結合に干渉する因子を得る工程；
（ｂ）一過性ＪＮＫ活性化を誘導する条件下で、細胞を該因子に接触させる工程；および
（ｃ）該因子に接触した細胞を該因子に接触しなかった細胞と比較して、ＪＮＫ経路が活性化されているか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
全長ＪＮＫＫ２の１３２位〜１５６位（ＧＰＶＷＫＭＲＦＲＫＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮ）由来のアミノ酸配列により特徴付けられるＪＮＫＫ２の結合領域を含む分子。
【請求項１１】
全長ＪＮＫＫ２の２２０位〜２３４位（ＧＫＭＴＶＡＩＶＫＡＬＹＹＬＫ）由来のアミノ酸配列により特徴付けられるＪＮＫＫ２の結合領域を含む分子。
【請求項１２】
全長ＪＮＫＫ２の１４２位〜１６６位（ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ）由来のアミノ酸配列により特徴付けられるＪＮＫＫ２の結合領域を含む分子。
【請求項１３】
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法であって、該方法は、
（ａ）ＪＮＫ経路内にある標的を選択する工程；および
（ｂ）該ＪＮＫ経路をアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートするかのいずれかをする因子によって、該標的に干渉する工程
を包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、該方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５タンパク質によるＪＮＫ活性化の抑制をブロックするために十分な因子を得る工程；および
（ｂ）前記細胞を該因子と接触させて、プログラム細胞死を経験する細胞の割合を増加させる工程
を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記因子が、ｇａｄｄ４５β遺伝子配列またはそのフラグメントに対する、アンチセンス分子である、方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、前記因子が、小干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）である、方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法であって、前記因子が、リボザイム分子である、方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法であって、前記因子が、Ｇａｄｄ４５βの結合部位と有効に競合するＪＮＫＫ２に融合した細胞透過性ペプチドである、方法。
【請求項１９】
請求項１４に記載の方法であって、前記因子が、低分子である、方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法であって、前記分子が、Ｇａｄｄ４５タンパク質の機能を模倣するペプチド模倣物である、方法。
【請求項２１】
請求項１３に記載の方法であって、前記方法が、
（ａ）ＪＮＫＫ２上のＧａｄｄ４５結合領域と相互作用することによってＪＮＫシグナル伝達を抑制する分子を得ることによって、前記標的に干渉する工程；および
（ｂ）細胞を該分子に接触させて、該細胞をプログラム細胞死から保護する工程
を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、
（ａ）Ｇａｄｄ４５タンパク質の全長または部分をコードするｃＤＮＡ分子を得る工程；
（ｂ）前記細胞を該ｃＤＮＡ分子でトランスフェクトする工程；および
（ｃ）該細胞における該ｃＤＮＡの発現のための条件を提供して、ＪＮＫＫ２を結合させ、ＪＮＫＫ２が、プログラム細胞死を誘導するＪＮＫ経路を活性化するために利用不能であるようにする、工程
を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記ｃＤＮＡ分子が、ＪＮＫシグナル伝達を抑制するために十分なＧａｄｄ４５タンパク質のフラグメントをコードする、方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法であって、前記ｃＤＮＡ分子が、Ｇａｄｄ４５βのアミノ酸６９〜１１３に対応するペプチドをコードする、方法。
【請求項２５】
請求項２２に記載の方法であって、前記プログラム細胞死が、ＴＮＦαによって誘導される、方法。
【請求項２６】
請求項２２に記載の方法であって、前記プログラム細胞死が、Ｆａｓによって誘導される、方法。
【請求項２７】
請求項２２に記載の方法であって、前記プログラム細胞死が、ＴＲＡＩＬによって誘導される、方法。
【請求項２８】
請求項２２に記載の方法であって、前記プログラム細胞死が、遺伝子毒性因子によって誘導される、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記因子が、ダウノルビシンおよびシスプラチナムからなる群より選択される、方法。
【請求項３０】
ＪＮＫシグナル伝達を調節する因子を同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）該因子がＧａｄｄ４５βに結合するか否かを決定する工程；および
（ｂ）該結合したＧａｄｄ４５βの活性についてアッセイして、ＪＮＫシグナル伝達に対する効果を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項３１】
ＪＮＫＫ２と相互作用することによってＪＮＫ活性化を抑制するために十分な模倣物を得るための方法であって、該方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５タンパク質の機能を模倣するように該模倣物を設計する工程；
（ｂ）該模倣物を、該ＪＮＫ経路を含む系に接触させる工程；および
（ｃ）ＪＮＫシグナル伝達の抑制が存在するか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項３２】
ＪＮＫ経路をインビトロで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）該ＪＮＫ経路の標的成分を得る工程；
（ｂ）細胞を該因子に曝露する工程；および
（ｃ）該因子が該ＪＮＫ経路を調節する能力を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の因子であって、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプチド様分子、変異体タンパク質、ｃＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンス構築物、脂質、糖質、および合成化合物または天然化合物からなる群より選択される、因子。
【請求項３４】
ＪＮＫ活性をインビボで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）候補因子を得る工程；
（ｂ）該因子を非ヒト動物に投与する工程；および
（ｃ）該動物におけるＪＮＫ活性のレベルを、該因子を受けていない動物におけるＪＮＫ活性と比較して決定する工程
を包含する、方法。
【請求項３５】
Ｇａｄｄ４５βがアポトーシスをブロックするのを防ぐ因子を同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）ＴＮＦα誘導性アポトーシスに対して保護されている高レベルのＧａｄｄ４５βを発現する細胞を、該因子およびＴＮＦαと接触させる工程；  
（ｂ）（ａ）における細胞におけるアポトーシスを、該因子に曝露されているがＴＮＦαには曝露されていないコントロール細胞と比較する工程；および  
（ｃ）コントロール細胞に対する処理細胞におけるアポトーシスの差異から、該因子はＧａｄｄ４５βがアポトーシスをブロックするのを妨げるか否かを推測する工程
を包含する、方法。
【請求項３６】
ＪＮＫ経路の調節因子についてスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）該ＪＮＫ経路の候補調節因子を得る工程であって、該候補は、該ＪＮＫ経路の成分を調節し得る潜在的に任意の因子であり、該因子は、ペプチド、変異体タンパク質、ｃＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス構築物、合成化合物または天然化合物を包含する、工程；
（ｂ）該候補因子を癌細胞に投与する工程；および
（ｃ）該ＪＮＫ経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを含む、該候補物質の該ＪＮＫ経路の調節能力を決定し、そしてアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのレベルをアッセイする工程
を包含する、方法。
【請求項３７】
罹患した細胞におけるアポトーシスの影響により引き起こされる変性障害および他の状態を処置する方法であって、該方法は、
（ａ）ＪＮＫ経路の活性化に干渉する分子を得る工程；および
（ｂ）該罹患した細胞を該分子に接触させる工程
を包含する、方法。
【請求項３８】
免疫系が癌細胞を殺傷させるのを、ＪＮＫシグナル伝達を増強することによって補助する方法であって、該方法は、  
（ａ）ＪＮＫシグナル伝達をブロックするためのインヒビターを得る工程；および
（ｂ）該癌細胞を該インヒビターに接触させる工程
を包含する、方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、前記インヒビターが、Ｇａｄｄ４５βによるＪＮＫＫ２の活性化をブロックする、方法。
【請求項４０】
ｇａｄｄ４５βプロモーターをトランスアクチベートするための方法であって、該方法は、
（ａ）ｇａｄｄ４５βのプロモーターエレメントにＮＦ−κＢ複合体を結合する工程；および
（ｂ）ｇａｄｄ４５β遺伝子発現についてアッセイする工程
を包含する、方法。
【請求項４１】
癌を処置するための方法であって、該方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５β機能を阻害することによってＪＮＫ活性を増加する工程；および
（ｂ）Ｇａｄｄ４５β機能に干渉するインヒビターを投与する工程
を包含する、方法。
【請求項４２】
Ｇａｄｄ４５タンパク質とＪＮＫＫ２との間の結合に干渉する因子を決定するための方法であって、該方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５タンパク質に結合する因子を得る工程；
（ｂ）一過性ＪＮＫ活性化を誘導する条件下で、細胞を該因子と接触させる工程；および
（ｃ）該因子と接触された細胞を、該因子に接触されていない細胞と比較して、ＪＮＫ経路が活性化されるか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項４３】
ｇａｄｄ４５βプロモーターとして機能する、ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号ＡＦ４４１８６０を有するヌクレオチド配列を有する分子。
【請求項４４】
図８に記載の−４４７位／−４３８位（κβ−１）、−４２６位／−４１７位（κβ−２）、−３７７位／−３６８位（κβ−３）からなる群より選択されるアミノ酸位置にあるプロモーターのエレメントであるヌクレオチド配列を有する、分子。
【請求項４５】
全長Ｇａｄｄ４５βタンパク質の６０位〜１１４位由来のアミノ酸配列により特徴付けられるＧａｄｄ４５β領域を含む、分子。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
アポトーシスを調節する方法および組成物は、細胞生存経路または細胞死経路の成分を、ＮＦ−κＢ／ＩκＢから遺伝子活性化を介してＪＮＫ経路の成分（例えば、ＭＫＫ７）と相互作用するＧａｄｄ４５βまでをブロックまたは刺激することに基づく。Ｇａｄｄ４５β非依存性ＪＮＫ調節は、特定の細胞型において存在して、アポトーシスまたは細胞生存を調節する。ＪＮＫ経路は、生存または死へ向かう細胞の進行の制御に関する焦点である。
【０００２】
アポトーシスまたはプログラム細胞死は、正常な発生および組織ホメオスタシスにおいて中心的役割を果す生理学的プロセスである。多くの因子が、複雑な経路において相互作用して、細胞死または細胞生存をもたらす。
【０００３】
（Ａ．ＮＦ−κＢ）
（１．免疫応答および炎症応答におけるＮＦ−κＢ）
ＮＦ−κＢ転写因子は、先天性免疫応答および適応性免疫応答の協調的調節因子である。ＮＦ−κＢの特徴は、多数の細胞外シグナル（その内には、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）がある）に応答した、細胞質から核への迅速なトランスロケーションである。ＮＦ−κＢダイマーは、一般的には、非刺激細胞の細胞質中に休眠状態で存在し、ＩκＢとして公知である阻害タンパク質によりそこに保持される。ＮＦ−κＢダイマーは、ＩκＢの連続的なリン酸化およびタンパク質分解を誘導するシグナルによって、迅速に活性化され得る。そのインヒビターを除去すると、ＮＦ−κＢが細胞核に移動して、防御関連遺伝子の協調的セット（例えば、多数のサイトカイン、増殖因子、ケモカイン、接着分子、および免疫レセプターをコードする遺伝子）を迅速に誘導することが可能になる。進化に関して、細胞防御遺伝子とＮＦ−κＢとの間の関係は、５億年前に始まる。なぜなら、この関係は、脊椎動物および無脊椎動物の両方において見出されるからである。後者の生物において、ＮＦ−κＢ因子は、Ｔｏｌｌレセプターにより主に活性化されて先天性防御機構を誘導する。脊椎動物において、これらの因子はまた、Ｂリンパ球およびＴリンパ球により広範に使用されて、抗原に対する細胞応答および腫瘍応答を開始する。
【０００４】
免疫応答および炎症応答におけるＮＦ−κＢの役割について、証拠が存在する。この転写因子はまた、広範なヒト疾患（自己免疫状態および慢性炎症状態（例えば、喘息、慢性関節リウマチ、および炎症性腸疾患）を含む）において役割を果す。実際、これらの状態を処置するために最も広範に使用される抗炎症剤および免疫抑制剤（例えば、グルココルチコイド、アスピリン、および金塩）は、ＮＦ−κＢを抑制することによって主に作用する。
【０００５】
ＴＮＦαは、最も強力な炎症促進サイトカインであり、そしてＮＦ−κＢの最も強力なアクチベーターのうちの１つであると論証できる。同様に、ＮＦ−κＢは、ＴＮＦαの強力な誘導因子であり、サイトカインとこの転写因子との間のこの相互調節は、ポジティブフィードバックループの確立のための基礎である。このポジティブフィードバックループは、敗血症性ショックおよび慢性炎症状態（例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）および炎症性腸疾患（ＩＢＤ））の病理において中心的な役割を果す。実際、これらの後者の障害の処置における標準的な治療アプローチは、高用量のＮＦ−κＢブロッカー（例えば、アスピリンおよびグルココルチコイド）の投与からなる。中和抗体の使用によるＴＮＦαの阻害は、これらの状態の処置における有効なツールを示す。しかし、ＮＦ−κＢインヒビターを用いる慢性的処置は、かなりの副作用を有する。この副作用としては、免疫抑制効果が挙げられる。そして、宿主免疫応答の発生に起因して、患者は、抗ＴＮＦα中和抗体の有益な効果に対して迅速に治療抵抗性になる。
【０００６】
（２．ＮＦ−κＢおよびアポトーシス制御）
協調的な免疫応答および炎症応答に加えて、ＮＦ−κＢ／Ｒｅｌ群の転写因子は、アポトーシスを制御する。アポトーシス（すなわち、プログラム細胞死（ＰＣＤ））は、正常な発生および組織ホメオスタシスにおいて中心的な役割を果す生理学的プロセスである。アポトーシスの特徴は、内因性自殺プログラムの実行を介するその細胞自体の破壊に、その細胞が積極的に関与することである。このプロセスにおける重要な事象は、進化的に保存されたプロテアーゼファミリーであるカスパーゼのタンパク質分解切断による活性化である。カスパーゼ活性の１つの経路、すなわち「内因性」経路は、発生上の合図または環境的な合図（例えば、遺伝子毒性因子）に応答して、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー（例えば、ＢａｘおよびＢａｋ）により誘発される。もう１つの経路は、「デスレセプター（ＤＲ）（例えば、ＴＮＦレセプター１（ＴＮＦ−Ｒ１）、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、ならびにＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２）の誘発により開始され、これは、アダプター分子（例えば、ＴＲＡＤＤおよびＦＡＤＤ）をこれらのレセプターにリガンド誘導性動員してカスパーゼ活性化を生じることに依存する。
【０００７】
細胞死を制御する精巧な機構の調節解除は、ヒトにおいて深刻な疾患（自己免疫障害および癌を含む）を引き起こし得る。実際、アポトーシスの妨害は、細胞周期の調節における異常とちょうど同じ程度に癌の病因に対して重要である。この生理学的アポトーシス機構の不活化はまた、腫瘍細胞が抗癌処置を回避するのを可能にする。このことは、化学療法剤および放射線が、癌細胞を殺傷させるためにアポトーシス経路を最終的には使用することが原因である。
【０００８】
種々のノックアウトモデルの分析を含む証拠は、ＮＦ−κＢの活性化が、多数のアポトーシス誘発因子（ＴＮＦαおよびＴＲＡＩＬを含む）による細胞殺傷に拮抗するためには必要とされることを示す。実際、ほとんど細胞は、ＮＦ−κＢ活性化またはタンパク質合成がブロックされない限り、ＴＮＦα細胞傷害性に対して完全に治療抵抗性である。顕著なことに、ＮＦ−κＢの強力な生存促進効果は、広範囲の生理学的プロセス（Ｂリンパ球産生、Ｂ細胞およびＴ細胞同時刺激、骨形成、およびマイトジェン応答を含む）を提供する。ＮＦ−κＢの抗アポトーシス機能はまた、癌における腫瘍形成および化学療法抵抗性および放射線療法抵抗性ならびに他のいくつかの病理学的状態にとって重要である。
【０００９】
ＪＮＫが、ＴＲＡＩＬに対するアポトーシス応答に関与することを示唆する証拠が存在する。第１に、ＴＲＡＩＬ−Ｒにより誘発されるアポトーシス機構は、ＴＮＦ−Ｒ１により活性化されるものと類似する。第２に、ＴＮＦ−Ｒ１を用いる場合と同様に、ＴＲＡＩＬ−Ｒのリガンド係合は、ＪＮＫおよびＮＦ−κＢの両方の強力な活性化をもたらす。第３に、ＴＲＡＩＬによる殺傷は、ＮＦ−κＢのこの活性化によりブロックされる。それにも関わらず、ＴＲＡＩＬによるアポトーシスにおけるＪＮＫの役割は、未だ公式には実証されていない。
【００１０】
ＴＲＡＩＬ−Ｒの誘発は、特定の癌の処置のための強力なツールとして広範な注目を受けた。ＴＲＡＩＬの投与を含む臨床試験が、存在する。このことは、正常細胞とは異なり、腫瘍細胞がＴＲＡＩＬ誘導性殺傷に対して非常に感受性であることに、主に起因する。腫瘍細胞についてのＴＲＡＩＬの細胞傷害性効果の選択性は、少なくとも部分的には、ＴＲＡＩＬと有効に会合する不活性レセプターであるいわゆる「デコイ（ｄｅｃｏｙ）レセプター」が正常細胞上に存在すること、そしてそれによって、そのレセプターがシグナル伝達ＤＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合するのが妨げられることに、起因する。デコイレセプターは、代わりに、ほとんどの癌細胞上に低レベルで発現される。さらに、ＦａｓＬおよびＴＮＦαとは異なり、ＴＲＡＩＬの全身投与は、ほんのわずかな副作用しか誘導せず、全体的には、患者によって十分に許容される。
【００１１】
ＮＦ−κＢの細胞防御は、生存促進遺伝子の活性化を包含する。しかし、調査にも関わらず、腫瘍形成形質転換の間、癌化学療法の間、およびＴＮＦα刺激の間のＮＦ−κＢ防御機能についての基礎は、ほとんど理解されていないままである。ＴＮＦ−Ｒに関して、ＮＦ−κＢによる防御は、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー、Ｂｃｌ−ＸＬおよびＡ１／Ｂｆｌ−１、ＸＩＡＰの誘導、ならびにＴＲＡＦ１／２およびｃ−ＩＡＰ１／２の刺激的アップレギュレーションに関係付けられている。しかし、ＴＲＡＦ２、ｃ−ＩＡＰ１、Ｂｃｌ−ＸＬおよびＸＩＡＰは、種々の細胞型においてＴＮＦαによって有意には誘導されず、いくつかのＮＦ−κＢ欠損細胞において、ほぼ正常なレベルで見出される。さらに、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー、ＸＩＡＰ、またはＴＲＡＦとｃ−ＩＡＰとの組み合わせは、ＮＦ−κＢヌル細胞においてＰＣＤを部分的にしか阻害し得ない。さらに、ＴＲＡＦ１およびＡ１／Ｂｆｌ−１の発現は、特定の組織に制限されており、そして多くの細胞型は、ＴＲＡＦ２（ＴＲＡＦ１をＴＮＦ−Ｒ１に動員するために必要な因子）の非存在下で、ＴＲＡＦ１を発現する。他の推定ＮＦ−κＢ標的（Ａ２０およびＩＥＸ−１Ｌを含む）は、ＮＦ−κＢ欠損細胞を保護できないか、またはそれらは、抗アポトーシス活性を有することが最近疑われている。従って、これらの遺伝子は、ＮＦ−κＢの防御活性を完全には説明できない。
【００１２】
（３．腫瘍形成および癌治療抵抗性におけるＮＦ−κＢ）
ＮＦ−κＢは、腫瘍形成において役割を果す。ＮＦ−κＢ群のメンバー（例えば、ｐ５２／ｐ１００、Ｒｅｌ、およびＲｅｌＡ、ならびにＩκＢ様タンパク質Ｂｃｌ−３）をコードする遺伝子は、ヒトリンパ腫および白血病において頻繁に再配列または増幅される。ＩκＢαの不活性化変異が、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）において見出される。ＮＦ−κＢはまた、変異または染色体転移事象とは無関係に、癌と関係がある。実際、ＮＦ−κＢは、ほとんどのウイルスオンコジーン産物および細胞オンコジーン産物（ＨＴＬＶ−Ｉ  Ｔａｘ、ＥＢＶ  ＥＢＶＡ２およびＬＭＰ−１、ＳＶ４０ラージＴ、アデノウイルスＥ１Ａ、Ｂｃｒ−Ａｂ１、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ、ならびにＲａｓのオンコジーン改変体を含む）により活性化される。ＮＦ−κＢは、腫瘍形成のいくつかの局面（癌細胞増殖、分化抑制、および腫瘍侵襲性を含む）に関与するが、インビボモデルおよびインビトロモデルの両方からの直接的証拠は、ＮＦ−κＢのアポトーシス制御が、癌発症にとって重要であることを示唆する。癌の初期段階において、ＮＦ−κＢは、オンコジーンによる形質転換に関連するアポトーシスを抑制する。例えば、Ｂｃｒ−Ａｂｌまたは、ヒト腫瘍における最も頻繁に変異したオンコジーンのうちの１つであるＲａｓのオンコジーン改変体の発現の際に、ＮＦ−κＢの阻害は、細胞形質転換をもたらすのではなく、アポトーシス応答をもたらす。ＥＢＶにより駆動される腫瘍形成はまた、ＩκＢαＭ（ＮＦ−κＢインヒビターであるＩκＢαの超活性形態）により阻害される。さらに、ＮＦ−κＢは、後期腫瘍の増加中のリスト（ＨＬ、びまん性ラージＢ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、多発性骨髄腫、および乳癌における非常に侵襲性のエストロゲンレセプター（ＥＲ）を含む）の生存を維持するために必須である。これらの悪性腫瘍の初代組織および細胞株モデルの両方が、高いＮＦ−κＢ活性を構成的に示す。ＩκＢαＭまたは他の種々の手段によるこの異常な活性の阻害は、これらの癌性細胞の死を誘導する。ＥＲ乳房腫瘍において、ＮＦ−κＢ活性は、しばしば、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕレセプターの過剰発現により活性化される、ＰＩ−３ＫおよびＡｋｔ１キナーゼによりしばしば維持される。このＨｅｒ−２／Ｎｅｕ／ＰＩ−３Ｋ／Ａｋｔ１／ＮＦ−κＢ経路の構成的活性化は、これらの腫瘍のホルモン非依存性増殖および生存、ならびに抗癌処置に対するその周知の抵抗性およびその乏しい予後に関係している。この経路の活性化に起因して、癌細胞はまた、ＴＮＦ−ＲおよびＦａｓ誘発に対して抵抗性になり、このことは、その癌細胞が免疫サーベイランスを回避するのを補助する。
【００１３】
実際、構成的に活性なＮＦ−κＢを含まない癌においてさえ、電離放射線または化学療法剤（例えば、ダウノルビシンおよびエトポシド）によるこの転写因子の活性化は、癌治療が腫瘍細胞を殺傷する能力を鈍くし得る。実際、特定の腫瘍が、ＣＰＴ−１１全身処置およびＩκＢαＭのアデノウイルス送達によって、マウスにおいて除去され得る。
【００１４】
（Ｂ．ＪＮＫ）
（１．アポトーシスにおけるＪＮＫの役割）
ｃ−Ｊｕｎ−Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ１／２／３）は、哺乳動物細胞において見出されるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードの３つの主要な群のうちの１つの下流成分である。他の２つは、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ１／２）およびｐ３８プロテインキナーゼ（ｐ３８α／β／γ／δ）からなる。各キナーゼ群は、ＭＡＰＫを含む３つのモジュールカスケード（ＪＮＫ、ＥＲＫ、およびｐ３８）の一部である。ＭＡＰＫは、ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）によるリン酸化により活性化され、次いで、ＭＡＰＫＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）によるリン酸化により活性化される。ＥＲＫの活性化は、細胞の増殖および生存に主に関係付けられているが、概して、ＪＮＫおよびｐ３８の活性化は、アポトーシスの誘導に関係付けられている。多くの細胞型を使用して、ＪＮＫの持続的活性化が細胞死を誘導すること、およびドミナントネガティブ（ＤＮ）インヒビターによるＪＮＫ活性化の遮断が、一群のアポトーシス刺激による殺傷を防ぐことが、示された。アポトーシスのおけるＪＮＫの役割はまた、ｊｎｋ遺伝子の標的化破壊を用いるマウス分析によって実証される。ＪＮＫ１およびＪＮＫ２の両方を欠くマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）は、種々のストレス刺激（遺伝子毒性因子、ＵＶ照射、およびアニソマイシンを含む）によるアポトーシスに対して、完全に抵抗性である。ｊｎｋ３−／−ニューロンは、興奮毒に対するアポトーシス応答の重篤な欠損を示す。さらに、ＪＮＫ２は、未成熟胸腺細胞における抗ＣＤ３誘導性アポトーシスのために必要であることが示された。
【００１５】
しかし、ストレス誘導性アポトーシスにおけるＪＮＫの役割は十分に確立されているが、ＤＲ（例えば、ＴＮＦ−Ｒ１、Ｆａｓ、およびＴＲＡＩＬ−Ｒ）による殺傷におけるその役割は、不明のままである。いくつかの初期研究は、ＪＮＫが、ＤＲ誘導性殺傷の重要な媒介因子ではないことを示唆した。このことは、ＴＮＦαを用いるチャレンジの間に、ＭＥＫＫ１（ＪＮＫの上流活性化因子）のＤＮ変異体によるＪＮＫ活性化の阻害は、細胞生存に対して何の影響も有さなかったという知見に主に基づいた。この知見を支持して、ストレス誘導性アポトーシスに対する抵抗性にも関わらず、ＪＮＫヌル線維芽細胞は、Ｆａｓによる殺傷に対して感受性のままであるということもまた、着目された。対照的に、ＪＮＫキナーゼＭＫＫ４／ＳＥＫ１のＤＮ改変体を使用する別の初期研究は、代わりに、ＴＮＦ−Ｒによるアポトーシス促進性シグナル伝達におけるＪＮＫの重要な役割を示した。
【００１６】
（２．癌におけるＪＮＫの役割）
ＪＮＫは、いくつかの化学療法剤およびオンコジーン産物（例えば、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ、ＳｒｃおよびオンコジーンＲａｓ）により、活性化可能である。従って、癌細胞は、これらの因子により誘導されるＪＮＫ媒介性アポトーシスを抑制するための機構を採用しなければならない。実際、ＪＮＫ経路の非重複（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）成分（例えば、ＪＮＫＫ１／ＭＫＫ４）は、候補腫瘍サプレッサーとして同定アクチベーター分に特徴付けられた腫瘍サプレッサーであるＢＲＣＡ１は、ＪＮＫの強力なアクチベーターであり、ＪＮＫに依存して死を誘導する。ＪＮＫの生物学的機能のうちのいくつかは、Ｓ６３およびＳ７３にて、ｃ−Ｊｕｎオンコプロテインのリン酸化により媒介され、このことは、ｃ−Ｊｕｎ転写活性を刺激する。しかし、細胞形質転換に対するｃ−Ｊｕｎの影響は、ＪＮＫによるその活性化とはほぼ無関係であるようである。実際、ノックイン（ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）研究によって、ｃ−ＪｕｎのＪＮＫリンアクセプター部位は、インビトロでオンコジーンによる形質転換のために不必要であることが示された。同様に、形質転換およびアポトーシスならびに細胞増殖におけるＪＮＫの活性のうちのいくつかは、ｃ−Ｊｕｎリン酸化によって媒介されない。例えば、ｃ−ＪｕｎのＪＮＫリン酸化部位の変異は、ニューロンアポトーシスにおけるＪＮＫ３消失の効果を再利用し得る（これは、転写事象に依存する）が、ＭＥＦにおけるＪＮＫ媒介性アポトーシスは、ｃ−Ｊｕｎによる新たな遺伝子誘導を必要としない。さらに、ＪＮＫはまた、ＪｕｎＢおよびＪｕｎＤを活性化し、これらは、腫瘍サプレッサーとして、インビトロおよびインビボの両方で作用する。他の研究は、Ｒａｓ形質転換細胞におけるＪＮＫの阻害は、固定非依存性増殖に対しても組織侵襲性に対しても、影響を有さないことを報告している。従って、ＪＮＫおよびｃ−Ｊｕｎは、アポトーシスおよび腫瘍形成において独立した機能を有する可能性があり、ＪＮＫは、いくつかの場合においてオンコジーンによる形質転換のためには必要ないが、代わりに、腫瘍形成を抑制することに寄与し得る。実際、ＪＮＫの阻害は、ＮＦ−κＢが腫瘍形成および癌化学療法抵抗性を促進する機構を示し得る。
【００１７】
（Ｃ．Ｇａｄｄ４５）
（１．Ｇａｄｄ４５タンパク質の生物学的機能）
ｇａｄｄ４５β（Ｍｙｄ１１８としても公知である）は、誘導性遺伝子のｇａｄｄ４５ファミリーの３つのメンバー（ｇａｄｄ４５α（ｇａｄｄ４５）およびｇａｄｄ４５γ（ｏｉｇ３７／ｃｒ６／ｇｒｐ１７）もまた含む）のうちの１つである。Ｇａｄｄ４５タンパク質は、転写レベルで主に調節され、いくつかの生物学的機能（Ｇ２／Ｍ細胞周期チェックポイントおよびＤＮＡ修復を含む）に関係付けられている。これらの機能は、Ｇａｄｄ４５αを用いて特徴付けられており、ＰＣＮＡ、コアヒストン、Ｃｄｃ２キナーゼ、およびｐ２１にこの因子が結合する能力に関連付けられている。Ｇａｄｄ４５αに対する配列類似性にも関わらず、Ｇａｄｄ４５βは、いくらか異なる生物学的活性を示す。なぜなら、例えば、Ｇａｄｄ４５βは、ほとんど細胞においてネガティブ増殖制御に関与しないようであるからである。Ｇａｄｄ４５タンパク質の過剰発現はまた、いくつかの系におけるアポトーシスに関係付けられている。しかし、これは、生理学的活性であることが明らかではない。なぜなら、他の多くの系において、内因性Ｇａｄｄ４５タンパク質の誘導は、細胞保護に関係付けられており、内因性ポリペプチドの発現は、死を誘導しないからである。最後に、Ｇａｄｄ４５タンパク質は、ＭＥＫＫ４／ＭＴＫ１と会合することが示されており、ＪＮＫおよびｐ３８シグナル伝達の開始因子であることが提唱されている。他の報告は、これらのタンパク質の発現が、種々の細胞株においてＪＮＫもｐ３８も誘導しないこと、および内因性産物が、ストレスによるこれらのキナーゼの活性化に何ら寄与しないことを、結論付けている。Ｇａｄｄ４５タンパク質がＭＥＫＫ４に結合する能力は、これらのタンパク質とＭＡＰＫ経路におけるキナーゼとの間の関係の存在を支持する。Ｔ細胞系を使用する研究は、ＪＮＫおよびｐ３８の両方の活性化にＧａｄｄ４５γを関係付けており、サイトカイン応答の間のｐ３８の調節にＧａｄｄ４５βを関係付けている。
【００１８】
以前の研究は、多くの重要な細胞プロセスを解明することを補助したが、特に、アポトーシスを制御することを担う細胞経路に関して、さらなる理解が必要なままである。例えば、ＮＦ−κＢがアポトーシスを制御する様式は、不明なままである。アポトーシスの調節を担う重要な経路の解明が、アポトーシスの異常なレベルに関係する種々の疾患を処置し得る新規な治療剤を開発するためには、必要である。
【００１９】
ＮＦ−κＢのインヒビターは、癌患者（例えば、ＨＬまたは多発性骨髄腫を有する患者）を処置するために、標準的な抗癌剤と組み合わせて、使用される。さらに、治療インヒビター（例えば、グルココルチコイド）は、ＮＦ−κＢの部分的阻害を達成するに過ぎず、かなりの副作用を示し、この副作用は、ヒトにおけるその使用を制限する。より良好な治療アプローチは、ＮＦ−κＢをブロックするのではなく、癌細胞におけるその下流抗アポトーシスエフェクターをブロックする、因子を使用することであり得る。しかし、集中的調査にも関わらず、これらのエフェクターは、未知のままである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法および組成物を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
（要旨）
ＪＮＫ経路は、プログラム細胞死をもたらす経路の制御についての焦点であることが見出された。１）ストレス誘導性アポトーシスにおいて役割を果すことに加えて、ＪＮＫ活性化は、ＴＮＦ−Ｒ１および他のＤＲ（例えば、ＦａｓおよびＴＲＡＩＬ−Ｒ）による効率的な殺傷のために必要である。２）ＪＮＫカスケードの阻害は、ＴＮＦα誘導性細胞傷害性に対するＮＦ−κＢによる防御機構を示す。３）ＪＮＫ活性化の抑制は、ＮＦ−κＢによる一般的防御機構を示し得、腫瘍形成および癌化学療法抵抗性の間にＮＦ−κＢの強力な効果を媒介する可能性がある。４）ＮＦ−κＢによるＪＮＫ活性化および細胞防御の阻害は、ｇａｄｄ４５βの転写活性化を包含する。５）Ｇａｄｄ４５βタンパク質は、ＪＮＫＫ２／ＭＫＫ７（ＪＮＫの特異的かつ非重複的なアクチベーター）への結合および阻害によって、ＪＮＫシグナル伝達をブロックする。この後者の知見に関して、ＪＮＫＫ２のＧａｄｄ４５β相互作用ドメインおよびＧａｄｄ４５βのＪＮＫＫ２結合表面が、同定された。このことは、Ｇａｄｄ４５βが（それゆえ、ＮＦ−κＢが）ＪＮＫ活性化をブロックしてアポトーシスを妨げる能力に干渉し得る、細胞透過性ペプチドおよび低分子の単離を容易にする。
【００２２】
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法は、
アミノ酸配列ＮＨ２−ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ−ＣＯＯＨを有するペプチドを得る工程、および
このペプチドを使用することによってか、またはこのペプチドの知識から開発した組成物を使用することによって、ＪＮＫ経路を調節する工程、
を包含する。
【００２３】
プログラム細胞死をもたらすＪＮＫ経路を調節する因子を同定するための方法は、
アミノ酸配列ＮＨ２−ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ−ＣＯＯＨを有するペプチドを得る工程、および
このペプチドと相互作用する因子を同定する工程、
を包含する。
【００２４】
アミノ酸配列ＮＨ２−ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ−ＣＯＯＨのペプチドをコードするために十分なｃＤＮＡ分子もまた、ＪＮＫ経路を調節する。
【００２５】
ＪＮＫシグナル伝達を調節する因子を同定するための方法は、
（ａ）この因子がアミノ酸配列ＮＨ２−ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ−ＣＯＯＨのペプチドに結合するか否かを決定する工程；および
（ｂ）この結合した因子の活性についてアッセイして、ＪＮＫシグナル伝達に対する効果を決定する工程
を包含する。
【００２６】
ＪＮＫＫ２と相互作用することによってＪＮＫ活性化を抑制するために十分な模倣物を得るための方法は、
（ａ）ペプチドＮＨ２−ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ−ＣＯＯＨの機能を模倣するようにこの模倣物を設計する工程；
（ｂ）この模倣物を、このＪＮＫ経路を含む系に接触させる工程；および
（ｃ）ＪＮＫシグナル伝達の抑制が存在するか否かを決定する工程
を包含する。
【００２７】
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法は、
（ａ）ＪＮＫ経路内にある標的を選択する工程、および
（ｂ）このＪＮＫ経路をアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートするかのいずれかをするように、この標的に干渉する工程、
を包含する。
【００２８】
干渉する方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５タンパク質によるＪＮＫ活性化の抑制をブロックするために十分な因子を得る工程；および
（ｂ）上記細胞をこの因子と接触させて、プログラム細胞死を経験する細胞の割合を増加させる工程
である。
【００２９】
この因子は、ｇａｄｄ４５β遺伝子配列もしくはそのフラグメントに対するアンチセンス分子、小干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）、リボザイム分子、Ｇａｄｄ４５βの結合部位と有効に競合するＪＮＫＫ２に融合した細胞透過性ペプチド、無機低分子、またはＧａｄｄ４５タンパク質の機能を模倣するペプチド模倣物であり得る。
【００３０】
干渉する別の方法は、
（ａ）ＪＮＫＫ２上のＧａｄｄ４５結合領域と相互作用することによってＪＮＫシグナル伝達を抑制する分子を得る工程；および
（ｂ）細胞をこの分子に接触させて、この細胞をプログラム細胞死から保護する工程
である。
【００３１】
干渉するためにｃＤＮＡを使用することは、
（ａ）Ｇａｄｄ４５タンパク質の全長または部分をコードするｃＤＮＡ分子を得る工程；
（ｂ）上記細胞をこのｃＤＮＡ分子でトランスフェクトする工程；および
（ｃ）この細胞におけるこのｃＤＮＡの発現のための条件を提供して、ＪＮＫＫ２を結合させ、ＪＮＫＫ２が、プログラム細胞死を誘導するＪＮＫ経路を活性化するために利用不能であるようにする、工程
を包含する。
【００３２】
このｃＤＮＡ分子は、ＪＮＫシグナル伝達を抑制するために十分なＧａｄｄ４５タンパク質フラグメント、Ｇａｄｄ４５βのアミノ酸６９〜１１３に対応するペプチドをコードし得る。
【００３３】
上記プログラム細胞死は、ＴＮＦα、Ｆａｓ、ＴＲＡＩＬ、または遺伝子毒性因子（例えば、ダウノルビシン（ｄｅｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）またはシスプラチナム（ｃｉｓｐｌａｔｉｎｕｍ））によって誘導され得る。
【００３４】
ＪＮＫシグナル伝達を調節する因子を同定するための方法は、
（ａ）この因子がＧａｄｄ４５βに結合するか否かを決定する工程；および
（ｂ）この結合したＧａｄｄ４５βの活性についてアッセイして、ＪＮＫシグナル伝達に対する効果を決定する工程
を包含する。
【００３５】
ＪＮＫＫ２と相互作用することによってＪＮＫ活性化を抑制するために十分な模倣物を得るための方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５タンパク質の機能を模倣するようにこの模倣物を設計する工程；
（ｂ）この模倣物を、このＪＮＫ経路を含む系に接触させる工程；および
（ｃ）ＪＮＫシグナル伝達の抑制が存在するか否かを決定する工程
を包含する。
【００３６】
ＪＮＫ経路をインビトロで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法は、
（ａ）この経路の標的成分を得る工程；
（ｂ）細胞をこの因子に曝露する工程；および
（ｃ）この因子がＪＮＫ経路を調節する能力を決定する工程
を包含する。
【００３７】
適切な因子としては、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプチド様分子、変異体タンパク質、ｃＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンス構築物、脂質、糖質、および合成化合物または天然化合物が挙げられる。
【００３８】
ＪＮＫ活性をインビボで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法は、
（ａ）候補因子を得る工程；
（ｂ）この因子を非ヒト動物に投与する工程；および
（ｃ）ＪＮＫ活性のレベルを、この因子を受けていない動物におけるＪＮＫ活性と比較して決定する工程
を包含する。
【００３９】
Ｇａｄｄ４５βがアポトーシスをブロックするのを防ぐ因子を同定するための方法は、
（ａ）ＴＮＦα誘導性アポトーシスに対して保護されている高レベルのＧａｄｄ４５βを発現する細胞を、ＴＮＦαと接触させる工程；  
（ｂ）（ａ）における細胞におけるアポトーシスを、この因子に曝露されているがＴＮＦαには曝露されていないコントロール細胞と比較する工程；および  
（ｃ）コントロール細胞に対する処理細胞におけるアポトーシスの差異から、この因子はＧａｄｄ４５βがアポトーシスをブロックするのを妨げるか否かを推測する工程
を包含する。
【００４０】
ＪＮＫ経路の調節因子についてスクリーニングするための方法は、
（ａ）このＪＮＫ経路の候補調節因子を得る工程であって、この候補は、このＪＮＫ経路の成分を調節し得る潜在的に任意の因子であり、この因子は、ペプチド、変異体タンパク質、ｃＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス構築物、合成化合物または天然化合物を包含する、工程；
（ｂ）この候補因子を癌細胞に投与する工程；および
（ｃ）このＪＮＫ経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを含む、この候補物質のこのＪＮＫ経路の調節能力を決定し、そしてアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのレベルをアッセイする工程
を包含する。
【００４１】
罹患した細胞におけるアポトーシスの影響により引き起こされる変性障害および他の状態を処置する方法は、
（ａ）ＪＮＫ経路の活性化に干渉する分子を得る工程；および
（ｂ）この罹患した細胞をこの分子に接触させる工程
を包含する。
【００４２】
免疫系が癌細胞を殺傷させるのを、ＪＮＫシグナル伝達を増強することによって補助する方法は、  
（ａ）ＪＮＫシグナル伝達をブロックするためのインヒビターを得る工程；および
（ｂ）この癌細胞をこのインヒビターに接触させる工程
を包含する。
【００４３】
このインヒビターは、Ｇａｄｄ４５βによってＪＮＫＫ２の活性化をブロックし得る。
【００４４】
ｇａｄｄ４５βプロモーターをトランスアクチベートするための方法は、
（ａ）ｇａｄｄ４５βのプロモーターエレメントにＮＦ−κＢ複合体を結合する工程；および
（ｂ）ｇａｄｄ４５β遺伝子発現についてアッセイする工程
を包含する。
【００４５】
癌を処置するための方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５β機能を阻害することによってＪＮＫ活性を増加する工程；および
（ｂ）Ｇａｄｄ４５β機能に干渉するインヒビターを投与する工程
を包含する。
【００４６】
化学療法剤もまた、使用され得る。
【００４７】
Ｇａｄｄ４５タンパク質とＪＮＫＫ２との間の結合に干渉する因子を決定するための方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５タンパク質に結合する因子を得る工程；
（ｂ）一過性ＪＮＫ活性化を誘導する条件下で、細胞をこの因子と接触させる工程；および
（ｃ）この因子と接触された細胞を、この因子に接触されていない細胞と比較して、ＪＮＫ経路が活性化されるか否かを決定する工程
を包含する。
【００４８】
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法は、
アミノ酸配列ＮＨ２−ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ−ＣＯＯＨを有するペプチドを得る工程、および
このペプチドを使用することによってか、またはこのペプチドのアミノ酸配列の知識から開発した組成物を使用することによって、ＪＮＫ経路を調節する工程、
を包含する。
【００４９】
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法は、
（ａ）ＪＮＫ経路内にある標的を選択する工程、および
（ｂ）このＪＮＫ経路をアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートするかのいずれかをする因子によって、この標的に干渉する工程、
を包含する。
【００５０】
ＪＮＫ活性をインビボで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５βとは独立してＪＮＫＫ２と相互作用する候補因子を得る工程；
（ｂ）この因子を、非ヒト動物に投与する工程；および
（ｃ）この動物におけるＪＮＫ活性のレベルを、この因子を受けていない動物におけるＪＮＫ活性と比較して決定する工程
を包含する。
【００５１】
ＪＮＫ経路の調節因子についてスクリーニングするための方法は、
（ａ）このＪＮＫ経路の候補調節因子を得る工程であって、この候補調節因子は、アミノ酸配列ＮＨ２−ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ−ＣＯＯＨを有するペプチドに結合し得る、工程；
（ｂ）この候補調節因子を癌細胞に投与する工程；および
（ｃ）このＪＮＫ経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを含むこの候補調節因子のＪＮＫ経路調節能力を決定し、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのレベルをアッセイする工程
を包含する。
【００５２】
罹患した細胞におけるアポトーシスの影響により引き起こされる変性障害および他の状態を処置する方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５βとは独立してＪＮＫシグナル伝達の活性化に干渉する分子を得る工程；および
（ｂ）この罹患した細胞にこの分子を接触させる工程
を包含する。
【００５３】
免疫系が癌細胞を殺傷させるのを、ＪＮＫシグナル伝達を増強することによって補助する方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５βとは独立してＪＮＫシグナル伝達をブロックするインヒビターを得る工程；および
（ｂ）この癌細胞を該インヒビターに接触させる工程
を包含する。
【００５４】
上記分子は、Ｇａｄｄ４５βとは独立してＪＮＫＫ２の活性化に干渉する。
【００５５】
ＪＮＫＫ２相互作用因子を同定する方法は、
（ａ）アミノ酸配列ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤを含むペプチドをベイト（ｂａｉｔ）として提供する工程；および
（ｂ）このペプチドと相互作用する因子を同定する工程
を包含する。
【００５６】
全長ＪＮＫＫ２の１４２位〜１６６位（ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ）に結合し得る分子へのＪＮＫＫ２の結合に干渉する因子を決定するための方法は、
（ａ）全長ＪＮＫＫ２の１４２位〜１６６位（ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ）へのこの分子の結合に干渉する因子を得る工程；
（ｂ）一過性ＪＮＫ活性化を誘導する条件下で、細胞をこの因子に接触させる工程；および
（ｃ）この因子に接触した細胞をこの因子に接触しなかった細胞と比較して、ＪＮＫ経路が活性化されているか否かを決定する工程
を包含する。
【００５７】
本発明の組成物としては、
ｇａｄｄ４５βプロモーターとして機能する、ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号ＡＦ４４１８６０を有する、ヌクレオチド配列；
図８に記載の−４４７位／−４３８位（κβ−１）、−４２６位／−４１７位（κβ−２）、−３７７位／−３６８位（κβ−３）からなる群より選択されるアミノ酸位置にあるプロモーターのエレメントである、ヌクレオチド配列；
全長Ｇａｄｄ４５βタンパク質の６０位〜１１４位由来のアミノ酸配列により特徴付けられるＧａｄｄ４５β領域を含む、分子；
全長ＪＮＫＫ２の１３２位〜１５６位（ＧＰＶＷＫＭＲＦＲＫＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮ）由来のアミノ酸配列により特徴付けられるＪＮＫＫ２の結合領域を含む、分子；および
全長ＪＮＫＫ２の２２０位〜２３４位（ＧＫＭＴＶＡＩＶＫＡＬＹＹＬＫ）由来のアミノ酸配列により特徴付けられるＪＮＫＫ２の結合領域を含む、分子；
全長ＪＮＫＫ２の１４２位〜１６６位（ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ）由来のアミノ酸配列により特徴付けられるＪＮＫＫ２の結合領域を含む、分子
が挙げられる。
【００５８】
ＪＮＫＫ２およびＭＫＫ７は、互換可能に使用される。
（項１）
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法であって、この方法は、
アミノ酸配列ＮＨ２−ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ−ＣＯＯＨを有するペプチドを得る工程、および
このペプチドを使用することによってか、またはこのペプチドのアミノ酸配列の知識から開発した組成物を使用することによって、ＪＮＫ経路を調節する工程、
を包含する、方法。
（項２）
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法であって、この方法は、
（ａ）ＪＮＫ経路内にある標的を選択する工程、および
（ｂ）このＪＮＫ経路をアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートするかのいずれかをする因子によって、この標的に干渉する工程、
を包含する、方法。
（項３）
ＪＮＫ活性をインビボで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法であって、この方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５βとは独立してＪＮＫＫ２と相互作用する候補因子を得る工程；
（ｂ）この因子を、非ヒト動物に投与する工程；および
（ｃ）この動物におけるＪＮＫ活性のレベルを、この因子を受けていない動物におけるＪＮＫ活性と比較して決定する工程
を包含する、方法。
（項４）
ＪＮＫ経路の調節因子についてスクリーニングするための方法であって、この方法は、
（ａ）このＪＮＫ経路の候補調節因子を得る工程であって、この候補調節因子は、アミノ酸配列ＮＨ２−ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ−ＣＯＯＨを有するペプチドに結合し得る、工程；
（ｂ）この候補調節因子を癌細胞に投与する工程；および
（ｃ）このＪＮＫ経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを含むこの候補調節因子のこのＪＮＫ経路調節能力を決定し、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのレベルをアッセイする工程
を包含する、方法。
（項５）
罹患した細胞におけるアポトーシスの影響により引き起こされる変性障害および他の状態を処置する方法であって、この方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５βとは独立してＪＮＫシグナル伝達の活性化に干渉する分子を得る工程；および
（ｂ）この罹患した細胞にこの分子を接触させる工程
を包含する、方法。
（項６）
免疫系が癌細胞を殺傷させるのを、ＪＮＫシグナル伝達を増強することによって補助する方法であって、この方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５βとは独立してＪＮＫシグナル伝達をブロックするインヒビターを得る工程；および
（ｂ）この癌細胞をこのインヒビターに接触させる工程
を包含する、方法。
（項７）
項５に記載の方法であって、上記分子が、Ｇａｄｄ４５βとは独立してＪＮＮＫ２の活性化に干渉する、方法。
（項８）
ＪＮＫＫ２相互作用因子を同定する方法であって、この方法は、
（ａ）アミノ酸配列ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤを含むペプチドをベイトとして提供する工程；および
（ｂ）このペプチドと相互作用する因子を同定する工程
を包含する、方法。
（項９）
全長ＪＮＫＫ２の１４２位〜１６６位（ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ）に結合し得る分子へのＪＮＫＫ２の結合に干渉する因子を決定するための方法であって、この方法は、
（ａ）全長ＪＮＫＫ２の１４２位〜１６６位（ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ）へのこの分子の結合に干渉する因子を得る工程；
（ｂ）一過性ＪＮＫ活性化を誘導する条件下で、細胞をこの因子に接触させる工程；および
（ｃ）この因子に接触した細胞をこの因子に接触しなかった細胞と比較して、ＪＮＫ経路が活性化されているか否かを決定する工程
を包含する、方法。
（項１０）
全長ＪＮＫＫ２の１３２位〜１５６位（ＧＰＶＷＫＭＲＦＲＫＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮ）由来のアミノ酸配列により特徴付けられるＪＮＫＫ２の結合領域を含む分子。
（項１１）
全長ＪＮＫＫ２の２２０位〜２３４位（ＧＫＭＴＶＡＩＶＫＡＬＹＹＬＫ）由来のアミノ酸配列により特徴付けられるＪＮＫＫ２の結合領域を含む分子。
（項１２）
全長ＪＮＫＫ２の１４２位〜１６６位（ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ）由来のアミノ酸配列により特徴付けられるＪＮＫＫ２の結合領域を含む分子。
（項１３）
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法であって、この方法は、
（ａ）ＪＮＫ経路内にある標的を選択する工程；および
（ｂ）このＪＮＫ経路をアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートするかのいずれかをする因子によって、この標的に干渉する工程
を包含する、方法。
（項１４）
項１３に記載の方法であって、この方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５タンパク質によるＪＮＫ活性化の抑制をブロックするために十分な因子を得る工程；および
（ｂ）上記細胞をこの因子と接触させて、プログラム細胞死を経験する細胞の割合を増加させる工程
を包含する、方法。
（項１５）
項１４に記載の方法であって、上記因子が、ｇａｄｄ４５β遺伝子配列またはそのフラグメントに対する、アンチセンス分子である、方法。
（項１６）
項１４に記載の方法であって、上記因子が、小干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）である、方法。
（項１７）
項１４に記載の方法であって、上記因子が、リボザイム分子である、方法。
（項１８）
項１４に記載の方法であって、上記因子が、Ｇａｄｄ４５βの結合部位と有効に競合するＪＮＫＫ２に融合した細胞透過性ペプチドである、方法。
（項１９）
項１４に記載の方法であって、上記因子が、低分子である、方法。
（項２０）
項１８に記載の方法であって、上記分子が、Ｇａｄｄ４５タンパク質の機能を模倣するペプチド模倣物である、方法。
（項２１）  項１３に記載の方法であって、上記方法が、
（ａ）ＪＮＫＫ２上のＧａｄｄ４５結合領域と相互作用することによってＪＮＫシグナル伝達を抑制する分子を得ることによって、上記標的に干渉する工程；および
（ｂ）細胞をこの分子に接触させて、この細胞をプログラム細胞死から保護する工程
を包含する、方法。
（項２２）  項２１に記載の方法であって、
（ａ）Ｇａｄｄ４５タンパク質の全長または部分をコードするｃＤＮＡ分子を得る工程；
（ｂ）上記細胞をこのｃＤＮＡ分子でトランスフェクトする工程；および
（ｃ）この細胞におけるこのｃＤＮＡの発現のための条件を提供して、ＪＮＫＫ２を結合させ、ＪＮＫＫ２が、プログラム細胞死を誘導するＪＮＫ経路を活性化するために利用不能であるようにする、工程
を包含する、方法。
（項２３）  項２２に記載の方法であって、上記ｃＤＮＡ分子が、ＪＮＫシグナル伝達を抑制するために十分なＧａｄｄ４５タンパク質のフラグメントをコードする、方法。
（項２４）  項２２に記載の方法であって、上記ｃＤＮＡ分子が、Ｇａｄｄ４５βのアミノ酸６９〜１１３に対応するペプチドをコードする、方法。
（項２５）  項２２に記載の方法であって、上記プログラム細胞死が、ＴＮＦαによって誘導される、方法。
（項２６）  項２２に記載の方法であって、上記プログラム細胞死が、Ｆａｓによって誘導される、方法。
（項２７）  項２２に記載の方法であって、上記プログラム細胞死が、ＴＲＡＩＬによって誘導される、方法。
（項２８）  項２２に記載の方法であって、上記プログラム細胞死が、遺伝子毒性因子によって誘導される、方法。
（項２９）  項２８に記載の方法であって、上記因子が、ダウノルビシンおよびシスプラチナムからなる群より選択される、方法。
（項３０）  ＪＮＫシグナル伝達を調節する因子を同定するための方法であって、この方法は、
（ａ）この因子がＧａｄｄ４５βに結合するか否かを決定する工程；および
（ｂ）この結合したＧａｄｄ４５βの活性についてアッセイして、ＪＮＫシグナル伝達に対する効果を決定する工程
を包含する、方法。
（項３１）  ＪＮＫＫ２と相互作用することによってＪＮＫ活性化を抑制するために十分な模倣物を得るための方法であって、この方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５タンパク質の機能を模倣するようにこの模倣物を設計する工程；
（ｂ）この模倣物を、このＪＮＫ経路を含む系に接触させる工程；および
（ｃ）ＪＮＫシグナル伝達の抑制が存在するか否かを決定する工程
を包含する、方法。
（項３２）  ＪＮＫ経路をインビトロで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法であって、この方法は、
（ａ）このＪＮＫ経路の標的成分を得る工程；
（ｂ）細胞をこの因子に曝露する工程；および
（ｃ）この因子がこのＪＮＫ経路を調節する能力を決定する工程
を包含する、方法。
（項３３）  項３２に記載の因子であって、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプチド様分子、変異体タンパク質、ｃＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンス構築物、脂質、糖質、および合成化合物または天然化合物からなる群より選択される、因子。
（項３４）  ＪＮＫ活性をインビボで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法であって、この方法は、
（ａ）候補因子を得る工程；
（ｂ）この因子を非ヒト動物に投与する工程；および
（ｃ）この動物におけるＪＮＫ活性のレベルを、この因子を受けていない動物におけるＪＮＫ活性と比較して決定する工程
を包含する、方法。
（項３５）  Ｇａｄｄ４５βがアポトーシスをブロックするのを防ぐ因子を同定するための方法であって、この方法は、
（ａ）ＴＮＦα誘導性アポトーシスに対して保護されている高レベルのＧａｄｄ４５βを発現する細胞を、この因子およびＴＮＦαと接触させる工程；  
（ｂ）（ａ）における細胞におけるアポトーシスを、この因子に曝露されているがＴＮＦαには曝露されていないコントロール細胞と比較する工程；および  
（ｃ）コントロール細胞に対する処理細胞におけるアポトーシスの差異から、この因子はＧａｄｄ４５βがアポトーシスをブロックするのを妨げるか否かを推測する工程
を包含する、方法。
（項３６）  ＪＮＫ経路の調節因子についてスクリーニングするための方法であって、この方法は、
（ａ）このＪＮＫ経路の候補調節因子を得る工程であって、この候補は、このＪＮＫ経路の成分を調節し得る潜在的に任意の因子であり、この因子は、ペプチド、変異体タンパク質、ｃＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス構築物、合成化合物または天然化合物を包含する、工程；
（ｂ）この候補因子を癌細胞に投与する工程；および
（ｃ）このＪＮＫ経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを含む、この候補物質のこのＪＮＫ経路の調節能力を決定し、そしてアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのレベルをアッセイする工程
を包含する、方法。
（項３７）  罹患した細胞におけるアポトーシスの影響により引き起こされる変性障害および他の状態を処置する方法であって、この方法は、
（ａ）ＪＮＫ経路の活性化に干渉する分子を得る工程；および
（ｂ）この罹患した細胞をこの分子に接触させる工程
を包含する、方法。
（項３８）  免疫系が癌細胞を殺傷させるのを、ＪＮＫシグナル伝達を増強することによって補助する方法であって、この方法は、  
（ａ）ＪＮＫシグナル伝達をブロックするためのインヒビターを得る工程；および
（ｂ）この癌細胞をこのインヒビターに接触させる工程
を包含する、方法。
（項３９）  項３８に記載の方法であって、上記インヒビターが、Ｇａｄｄ４５βによるＪＮＫＫ２の活性化をブロックする、方法。
（項４０）  ｇａｄｄ４５βプロモーターをトランスアクチベートするための方法であって、この方法は、
（ａ）ｇａｄｄ４５βのプロモーターエレメントにＮＦ−κＢ複合体を結合する工程；および
（ｂ）ｇａｄｄ４５β遺伝子発現についてアッセイする工程
を包含する、方法。
（項４１）  癌を処置するための方法であって、この方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５β機能を阻害することによってＪＮＫ活性を増加する工程；および
（ｂ）Ｇａｄｄ４５β機能に干渉するインヒビターを投与する工程
を包含する、方法。
（項４２）  Ｇａｄｄ４５タンパク質とＪＮＫＫ２との間の結合に干渉する因子を決定するための方法であって、この方法は、
（ａ）Ｇａｄｄ４５タンパク質に結合する因子を得る工程；
（ｂ）一過性ＪＮＫ活性化を誘導する条件下で、細胞をこの因子と接触させる工程；および
（ｃ）この因子と接触された細胞を、この因子に接触されていない細胞と比較して、ＪＮＫ経路が活性化されるか否かを決定する工程
を包含する、方法。
（項４３）  ｇａｄｄ４５βプロモーターとして機能する、ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号ＡＦ４４１８６０を有するヌクレオチド配列を有する分子。
（項４４）  図８に記載の−４４７位／−４３８位（κβ−１）、−４２６位／−４１７位（κβ−２）、−３７７位／−３６８位（κβ−３）からなる群より選択されるアミノ酸位置にあるプロモーターのエレメントであるヌクレオチド配列を有する、分子。
（項４５）  全長Ｇａｄｄ４５βタンパク質の６０位〜１１４位由来のアミノ酸配列により特徴付けられるＧａｄｄ４５β領域を含む、分子。
【発明の効果】
【００５９】
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法および組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
（詳細な説明）
ＪＮＫ経路は、プログラム細胞死にいたる経路の制御の中心である。
【００６１】
本発明は、疾患を改善するための新規の方法および組成物の開発を促進する。実際に、ＪＮＫの抑制がＮＦ−κＢによる保護機構を表すという観察は、炎症部位（ここでは、高レベルのＴＮＦαが存在する）における不必要な自己反応性リンパ球および他の炎症誘導性細胞（例えば、マクロファージ）のアポトーシスが、ＮＦ−κＢがＪＮＫの活性化を停止する能力を妨害することによって増大し得るということを示唆する。この妨害を達成するための強力な手段としては、例えば、Ｇａｄｄ４５βのブロッカーおよびＪＮＫＫ２相互作用因子を妨害する因子の使用が挙げられる。１つのこのような因子は、ペプチドＮＨ２−ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ−ＣＯＯＨである。
【００６２】
Ｆａｓと同様に、ＴＮＦ−Ｒ１もまた、宿主免疫監視機構に関与する。従って、本発明の別の局面において、これらの因子は、癌治療における強力な新規のアジュバントを提供し得る。
【００６３】
逆に、ＪＮＫのダウンレギュレーションによる細胞生存の増大は、変性障害および免疫不全、ならびに増大した細胞死によって一般的に特徴付けられる状態において有益な効果を有する。
【００６４】
本発明は、ＪＮＫ経路を調節する因子（例えば、ＪＮＫＫ２（これは、Ｇａｄｄ４５βと直接接触する）のアミノ酸領域を含む細胞透過性融合ペプチド（例えば、ＴＡＴ融合ペプチド））の設計を可能にする。これらのペプチドは、ＪＮＫＫ２への結合について、内在性Ｇａｄｄ４５βタンパク質と効率的に競合する。さらに、これらの知見は、低分子のライブラリーのスクリーニング、およびＧａｄｄ４５βがＪＮＫＫ２と会合する能力を妨害し得る化合物の同定のための生化学的アッセイの設計を可能にする。これらのペプチドとこれらの低分子の両方が、このＧａｄｄ４５βの能力を妨害し、それによりＮＦ−κＢがＪＮＫの活性化を停止し、最終的にはアポトーシスをブロックする能力を妨害し得ることが予測される。これらの化合物は、ヒトの疾患（慢性炎症および自己免疫状態、ならびに特定のタイプの癌が挙げられる）の処置において有用である。
【００６５】
ＮＦ−κＢの抗アポトーシス活性を調節するための新規の分子標的は、特定のヒト疾患の処置において有用である。これらの知見の適用は、以下の２つの広く規定されたクラスのヒト病理の処置に関連するようである：ａ）免疫学的障害（例えば、自己免疫状態および慢性炎症状態、ならびに免疫不全）；ｂ）特定の悪性腫瘍、特に、それらの生存についてＮＦ−κＢに依存する悪性腫瘍（例えば、乳癌、ＨＬ、多発性骨髄腫およびＤＬＢＣＬ）。
【００６６】
問題は、ＪＮＫがＴＮＦ−Ｒ誘導性アポトーシスにおいて役割を果たすか否かということであった。ＮＦ−κＢ欠損細胞における知見を確認すると、本明細書中に示された証拠は、終局的に、ＪＮＫの活性化が、ストレス誘導性アポトーシスにのみ必須なのではなく、ＴＮＦαによる有効な殺傷にも必須であることを証明した。ＡＳＫ１（ＪＮＫ（およびｐ３８）へシグナル伝達するＴＮＦ−Ｒ経路の必須成分）を欠く線維芽細胞は、ＴＮＦαによる殺傷に対して耐性であることが示された。さらに、ＪＮＫ１およびＪＮＫ２の二重ノックアウトＭＥＦは、絶対的ではないにも関わらず、ＴＮＦαおよびシクロへキシミドを用いる併用細胞傷害性処置に対するアポトーシス応答の著しい欠損を示す。さらに、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＴＮＦαホモログであるＥｉｇｅｒが、死を引き起こすのにＪＮＫに完全に依存し、一方で、このＥｉｇｅｒが、カスパーゼ−８ホモログのＤＲＥＤＤを必要としないことが示された。従って、ＪＮＫへの結合は、ＴＮＦαにより保証される原始アポトーシス機構の痕跡のようであり、これは、進化の後半にのみ、ＦＡＤＤ依存性経路を利用して、カスパーゼを活性化し始めた。
【００６７】
ＤＮ−ＭＥＫＫ１を用いた初期の観察は、これらのより最近の知見とどのように調和され得るのであろうか？おそらく、鍵は、ＴＮＦ−ＲによるＪＮＫ誘導の動態学にある。実際に、アポトーシスは、持続性であるが一過性ではないＪＮＫ活性と関連している。この見解は、ＪＮＫの活性化が、それ自体でアポトーシス原性（ａｐｏｐｔｏｇｅｎｉｃ）であるという最近の発見により支持され、このことは、外因性細胞刺激の非存在下において、構成的に活性なＪＮＫを生じるＭＫＫ７−ＪＮＫ融合タンパク質の使用によって簡潔に証明されている。ＵＶおよび他の形態のストレスと異なり、ＴＮＦαは、ＪＮＫの一過的な誘導しか引き起こさず、そして実際に、この誘導は、通常、有意な細胞死を伴うことなく生じ、このことは、ＤＮ−ＭＥＫＫ１変異体によるＪＮＫの阻害が細胞生存に対して影響を有さない理由を説明する。その代わり、ＪＮＫのアポトーシス促進活性は、キナーゼが、例えば、ＮＦ−κＢの阻害によって、慢性的にシグナル伝達し得る場合に現れる。
【００６８】
ＪＮＫがアポトーシスを促進する正確な機構は、知られていない。いくつかの場合において、ＪＮＫ媒介性殺傷は、ストレスまたはＴＮＦαのチャレンジの間に遺伝子発現の調節に関与するが、ＪＮＫアポトーシス促進シグナル伝達の標的は、すでに細胞中に存在するようである。ＭＫＫ７−ＪＮＫタンパク質による殺傷は、Ｂｃｌ−２群のＢａｘ様因子を必要とすることが示された；しかしながら、これらの因子が、ＪＮＫの直接標的であるのか、またはこれらがＴＮＦ−Ｒシグナル伝達の間のＪＮＫ細胞傷害性を媒介するのかは明らかではない。
【００６９】
（Ｉ．ＪＮＫカスケードの活性化は、ＤＲ（ＴＮＦ−Ｒ１、ＦａｓおよびＴＲＡＩＬ−Ｒ）による効率的な殺傷に必要であり、このカスケードの抑制は、ＮＦ−κＢの保護活性に重要である）
（Ａ．ＴＮＦ−Ｒ誘導性アポトーシス）
ＪＮＫ経路およびＮＦ−κＢ経路（サイトカインおよびストレスによって大抵常に同時活性化される）は、親密に関連している。ＮＦ−κＢサブユニットＲｅｌＡの除去またはＩκＢαＭスーパーインヒビターの発現のいずれかによるＮＦ−κＢ活性化のブロックは、ＴＮＦ−ＲによるＪＮＫ誘導の正常な停止を妨害する（図５Ａおよび５Ｂ）。実際、種々の手段によるＪＮＫシグナル伝達の阻害が、ＴＮＦα誘導性アポトーシスからＮＦ−κＢ欠損細胞をレスキューするという知見によって示されるように、ＮＦ−κＢによるＪＮＫカスケードの下方制御は、ＴＮＦα誘導性アポトーシスの抑制に必要である（図５Ｄおよび５Ｅ）。ＮＦ−κＢを欠く細胞において、ＪＮＫの活性化は、カスパーゼインヒビターでの保護的処置の後でさえ、持続したままであり、このことは、ＪＮＫ経路に対するＮＦ−κＢの効果が、カスパーゼ阻害の二次的結果ではないことを示している。従って、ＮＦ−κＢ複合体は、ＪＮＫ活性化の真のブロッカーである。これらの知見は、ＮＦ−κＢによる新規の保護機構を規定し、そしてＴＮＦαに対するアポトーシス応答における、ＪＮＫ（ｐ３８でもＥＲＫでもなく）に重要な役割を確立する（図１８を参照のこと）。
【００７０】
（Ｂ．Ｆａｓ誘導性アポトーシス）
ＡＳＫ１−／−およびＪＮＫヌル線維芽細胞は、ＴＮＦαの細胞傷害性効果に対して保護されるが、これらの細胞は、Ｆａｓ誘導性アポトーシスに対して正常な感受性を保持しており、このことが、ＦａｓおよびＴＮＦ−Ｒにより引き起こされるアポトーシス機構の間の基本的な差異を強調する。それにもかかわらず、特定の細胞（例えば、Ｂ細胞リンパ腫）において、ＪＮＫはまた、Ｆａｓ誘発に対するアポトーシス応答に関与する。実際、種々の手段（特定の薬理学的ブロッカーＳＰ６００１２５を含む）によるＪＮＫの抑制は、ＢＪＡＢ細胞をＦａｓ誘導性細胞傷害性から救う（図１４）。この観察と一致して、これらの細胞において、Ｆａｓによる殺傷はまた、Ｇａｄｄ４５βの過剰発現によってほとんど完全にブロックされる（図１３Ｂ）。共に、これらの知見は、ＪＮＫが、いくつかの場合（例えば、カスパーゼを活性化して死を引き起こすために、アポトーシスシグナルのミトコンドリア増幅を必要とする２型細胞（例えば、ＢＪＡＢ細胞））において、Ｆａｓ誘導性アポトーシスに必要であることを示す。
【００７１】
ＴＮＦ−Ｒと同様に、Ｆａｓは、癌細胞に対する宿主免疫監視機構において重要な役割を果たす。興味深いことに、構成的に高いＮＦ−κＢ活性の存在に起因して、特定の腫瘍細胞は、これらの免疫監視機構を逃れ得る。従って、ＪＮＫシグナル伝達の増強（Ｇａｄｄ４５β、またはより広範には、ＮＦ−κＢのＪＮＫ阻害活性をブロックすることによって達成される）は、免疫系が腫瘍細胞を効率的に処理するのを助ける。
【００７２】
Ｆａｓはまた、リンパ球ホメオスタシスにとって重要である。実際に、このレセプターまたはそのリガンドであるＦａｓＬにおける変異は、自己反応性リンパ球の排除を妨害し、自己免疫疾患の発症を生じる。従って、特定の自己免疫障害の処置について、ＪＮＫに対するＧａｄｄ４５βの阻害活性は、適切な標的として働き得る。
【００７３】
（Ｃ．ＴＲＡＩＬ−Ｒ誘導性アポトーシス）
Ｇａｄｄ４５βはまた、アポトーシスに関与するＴＲＡＩＬ−Ｒをブロックし（図１Ａ）、このことは、ＪＮＫが、このＤＲの誘発に対するアポトーシス応答において重要な役割を果たすことを示唆する。ＪＮＫがＤＲによるアポトーシスに必要であるという知見は、癌治療に利用され得る。例えば、アジュバント処置によるＴＲＡＩＬ誘導性殺傷に対する癌細胞の感受性は、ＪＮＫ活性化をアップレギュレートする因子を用いて増大される。このことは、Ｇａｄｄ４５βまたはＮＦ−κＢがＴＲＡＩＬ誘導性ＪＮＫ活性化をブロックする能力を妨害することによって達成され得る。この知見はまた、併用抗癌処置の相乗効果についての機構を提供し得る。なぜなら、遺伝子毒性化学治療薬によるＪＮＫの活性化は、ＤＲ誘導性殺傷の閾値を低下させ得るからである。
【００７４】
（ＩＩ．ＪＮＫの抑制は、ＮＦ−κＢが腫瘍形成および癌化学療法抵抗性を促進する機構を示す）
ＤＲ誘導性殺傷の拮抗に加えて、ＮＦ−κＢの保護活性は、腫瘍形成、ならびに癌における化学療法抵抗性および放射線療法抵抗性に重要である。しかし、この保護活性の基礎は、あまり理解されていない。ＪＮＫカスケードの標的化は、ＮＦ−κＢによる一般的な抗アポトーシス機構を示すことが可能であり、実際に、ＮＦ−κＢによるこの標的化の関連性が、腫瘍形成および抗癌治療に対する腫瘍細胞の抵抗性の両方におよぶという証拠がある。悪性転換の間、癌細胞は、癌遺伝子により誘導されるＪＮＫ媒介性アポトーシスを抑制する機構を採用するはずであり、少なくともいくつかの場合において、このアポトーシス性ＪＮＫシグナル伝達の抑制は、ＮＦ−κＢに関与し得る。実際に、ＮＦ−κＢの活性化は、転換関連アポトーシスをブロックために必要であるが、ＭＫＫ４およびＢＲＣＡ１のようなＪＮＫカスケードの非重複成分は、腫瘍サプレッサとして同定されている。
【００７５】
ＮＦ−κＢ依存性腫瘍形成の十分に特徴付けされたモデル系（例えば、乳癌細胞を含む）は、作用機構の識見を提供する。乳癌細胞株（例えば、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１およびＢＴ−２０（これらは、その生存のためにＮＦ−κＢに依存することが知られている））は、ＪＮＫブロッカーＳＰ６００１２５での保護的処置によって、ＮＦ−κＢ阻害によって引き起こされるアポトーシスから救われ得る（図１７）。従って、これらの腫瘍細胞において、ＪＮＫの除去は、ＮＦ−κＢについての要件を克服し得、このことは、ＮＦ−κＢ不活性化による細胞傷害性が、ＪＮＫ経路の過剰活性化に関連し、そして腫瘍抑制におけるこの経路の役割を示すことを示唆する。Ｇａｄｄ４５βは、腫瘍形成および癌化学両方抵抗性の間のＮＦ−κＢの保護効果を媒介し、抗癌治療のための新規の標的である。
【００７６】
癌における化学療法抵抗性に関して、遺伝毒性ストレスによるアポトーシス（特定の抗癌剤（例えば、ダウノルビシン、エトポシド（ｅｔｏｐｏｐｓｉｄｅ）、およびシスプラチン）の所望の効果）は、ＪＮＫの活性化を必要とする一方で、これは、ＮＦ−κＢによって拮抗される。従って、ＪＮＫの阻害は、ＮＦ−κＢが腫瘍の化学療法抵抗性を促進する機構である。実際、ＮＦ−κＢのブロッカーは、癌患者（例えば、ＨＬを有する患者）を処置するために慣用的に使用され、そして他の困難な悪性腫瘍（例えば、多発性骨髄腫）を処置するために首尾良く使用されている。しかし、これらのブロッカー（例えば、グルココルチコイドおよびプロテオソームインヒビター）は、ＮＦ−κＢの部分的な阻害しか達成し得ず、そして慢性的に使用された場合、ヒトにおけるその使用を制限するかなりの副作用（免疫抑制効果を含む）を示す。従って、ＤＲと共に議論される場合、特定の悪性腫瘍の処置において、ＮＦ−κＢ標的化因子ではなく、ＮＦ−κＢの抗アポトーシス活性のブロックを目標とする治療因子を用いることが有益である。例えば、癌治療における非常に有効なアプローチは、ＮＦ−κＢがＪＮＫの活性化を抑制する能力を特異的に妨害する薬理学的化合物の使用であり得る。これらの化合物は、腫瘍細胞のＪＮＫ媒介性殺傷を促進するだけでなく、転写因子の抗アポトーシス機能および炎症誘発機能の脱共役を可能にする。従って、ＮＦ−κＢの全ブロッカーと異なり、このような化合物は、免疫抑制効果を有さず、それにより、癌治療における有望な新規の手段を示す。適切な治療標的は、Ｇａｄｄ４５β自体である。なぜなら、この因子は、化学療法剤によるアポトーシスを阻害し得（図３Ｄおよび３Ｅ）、これらの薬物によるその誘導が、ＮＦ−κＢに依存する（図２Ｄ）からである。これについて、Ｇａｄｄ４５βおよびＮＦ−κＢがＪＮＫカスケードをブロックする正確な機構の同定（すなわち、ＪＮＫＫ２の試験）は、特定のタイプの癌、特に、ＮＦ−κＢに依存する癌（癌形成Ｒａｓ、Ｂｃｒ−Ａｂ１またはＥＢＶがコードする癌遺伝子によって駆動される腫瘍、および後期腫瘍（例えば、ＨＬ、ＤＬＢＣＬ、多発性骨髄腫および乳癌）を含む）における治療的介入のための新たな手段を開拓する。
【００７７】
（ＩＩＩ．Ｇａｄｄ４５βは、ＮＦ−κＢによるＪＮＫカスケードの阻害を媒介する）
（Ａ．Ｇａｄｄ４５βは、ＤＲ誘導性アポトーシスに対するＮＦ−κＢの保護効果を媒介する）
ＮＦ−κＢによる細胞保護作用は、遺伝子発現のプログラムの活性化を含む。ＮＦ−κＢのこの重要な機能を媒介する生存促進（ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ）遺伝子を単離した。癌についての分子基礎のより良い理解を得ることに加え、これらの遺伝子の同定は癌治療のための新規標的を提供する。ＮＦ−κＢ／ＲｅｌＡヌル細胞の機能的スクリーニングを使用して、ＴＮＦ−α誘導性殺傷に対するＮＦ−κＢの保護活性の中心的メディエーターとして、Ｇａｄｄ４５βを同定した。ｇａｄｄ４５βは、ＮＦ−κＢを必要とするメカニズムを通して、サイトカインにより迅速にアップレギュレートされ（図２Ａおよび図２Ｂ）、ＴＮＦ−α誘導性殺傷に拮抗するのに必須であり（図１Ｆ）、そしてＮＦ−κＢヌル細胞におけるアポトーシスをブロックする（図１Ａ、図１Ｃ、図１Ｄ、図３Ａおよび図３Ｂ）。Ｇａｄｄ４５βによる細胞保護作用は、ＪＮＫ経路の阻害を含み（図４Ａ、図４Ｃおよび図４Ｄ）、そしてこの阻害はＮＦ−κＢによるアポトーシスの制御に対して中心的である（図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｄおよび図５Ｅ）。ＮＦ−κＢを欠失した細胞中でのＧａｄｄ４５βの発現は、ＴＮＦαに応答するＪＮＫ活性化を完全に抑止し、そしてアンチセンスｇａｄｄ４５βによる内因性タンパク質の阻害は、この応答の終結を妨げる（図４Ｄ）。Ｇａｄｄ４５βはまた、ＴＮＦαによるＪＮＫ誘導の、カスパーゼに非依存的な局面を抑制し、従って、ＪＮＫカスケードの真なるインヒビターである（図４Ａおよび図４Ｃ）。ＪＮＫシグナル伝達のさらなるＮＦ−κＢ誘導性ブロッカーが存在し得る。
【００７８】
ＮＦ−κＢによるｇａｄｄ４５βの活性化は、ｇａｄｄ４５βプロモーターの位置−４４７／−４３８（κＢ−１）、位置−４２６／−４１７（κＢ−２）および位置−３７７／−３６８（κＢ−３）に位置する、３つの保存されたκＢエレメントの機能であることが、示された（図８、図９Ａ、図９Ｂ、図１０Ａ、図１０Ｂおよび図１１）。これらの部位の各々は、インビトロでＮＦ−κＢ複合体に結合し、そして最適なプロモーターのトランス活性化のために必要とされる（図１２Ａ、図１２Ｂ、および図１２Ｃ）。併せると、これらのデータは、Ｇａｄｄ４５βが新規抗アポトーシス因子であること、ＪＮＫ活性化の生理学的インヒビターであること、そしてＮＦ−κＢの直接の転写の標的であることを、確立する。従って、Ｇａｄｄ４５βは、ＪＮＫカスケードの標的化、およびＮＦ−κＢによる細胞保護作用の標的化を媒介する。
【００７９】
Ｇａｄｄ４５βの保護活性は、ＴＮＦ−Ｒ以外のＤＲ（ＦａｓおよびＴＲＡＩＬ−Ｒを含む）へと広がる。Ｇａｄｄ４５βの発現は、これらのＤＲのいずれか１つの誘発により誘導されるアポトーシスから、ＢＪＡＢ細胞を劇的に保護し、一方、コントロール細胞における死滅を効率的に誘導した（それぞれ、図１３Ｂおよび１３Ａ）。注目すべきことに、Ｆａｓの場合において、Ｇａｄｄ４５βによる保護は、ほぼ完全であった。ＴＮＦ−Ｒ１と同様に、Ｆａｓによる殺傷に対するＧａｄｄ４５βの保護活性、およびおそらくはＴＲＡＩＬ−Ｒによる殺傷に対するＧａｄｄ４５βの保護活性は、ＪＮＫカスケードの阻害を含むようである（図１３Ａ、図１３Ｂおよび図１４）。従って、Ｇａｄｄ４５βは、種々のヒトの障害において、ＤＲ誘導性アポトーシスを調節するための新規ターゲットである。
【００８０】
（Ｂ．Ｇａｄｄ４５βは、腫瘍形成および癌の化学耐性（ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の間の、ＮＦ−κＢの保護活性の潜在的エフェクターである）
腫瘍形成および癌の化学耐性の間に、ＮＦ−κＢにより活性化される保護遺伝子は、未知である。Ｇａｄｄ４５βはＪＮＫ阻害およびＮＦ−κＢによる細胞保護を媒介するので、Ｇａｄｄ４５βは１つの候補である。実際、ＤＲ誘導性アポトーシスのコントロールを用いる場合、ｇａｄｄ４５βの誘導は、ＮＦ−κＢが癌細胞の生存を促進する手段を提供する。３ＤＯ腫瘍細胞において、Ｇａｄｄ４５βの発現は、シスプラチンおよびダウノルビシン（抗癌治療で広範に使用される２つの遺伝毒性薬物）による殺傷に拮抗した（図３Ｄおよび図３Ｅ）。従って、Ｇａｄｄ４５βは、ＤＲ、および哺乳動物細胞において見出されるカスパーゼ活性化の内在性経路の両方を、ブロックする。遺伝毒性薬剤によるアポトーシスはＪＮＫを必要とするので、Ｇａｄｄ４５βの後者の保護活性はまた、ＪＮＫカスケードの阻害により説明され得る。３ＤＯ細胞において、ｇａｄｄ４５βの発現は、ダウノルビシンまたはシスプラチンのいずれかの処理により強力に誘導され、そしてこの誘導は、ＩκＢαＭスーパーレプレッサーにより、ほぼ完全に排除された（図２Ｄ）。このことは、これらの薬物によるｇａｄｄ４５βの活性化が、ＮＦ−κＢに依存することを示す。従って、Ｇａｄｄ４５βは、抗腫瘍治療の効力をブロックし得、このことは、Ｇａｄｄ４５βが癌患者におけるＮＦ−κＢ依存性化学耐性に寄与すること、およびＧａｄｄ４５βが新規の治療標的を示すことを示唆する。
【００８１】
腫瘍抑制におけるＪＮＫの役割、およびＪＮＫ活性化をブロックするＧａｄｄ４５βの能力が示されると、Ｇａｄｄ４５βはまた、腫瘍形成においてＮＦ−κＢの機能を媒介する１つの候補である。実際、発現パターンは、Ｇａｄｄ４５βが、特定の後期の腫瘍（ＥＲ乳癌およびＨＬ細胞を含む）において、ＮＦ−κＢ依存性生存に寄与し得ることを示唆する。癌細胞において、ｇａｄｄ４５βは、構築的に高いレベルで発現されるが、より浸襲性でないＥＲ＋乳癌のようなコントロール細胞においてはそうでなく（図１６）、そしてこれらのレベルは、ＮＦ−κＢ活性と相関がある。
【００８２】
（Ｃ．Ｇａｄｄ４５βがＪＮＫ活性化をブロックするメカニズムの同定：ＪＮＫＫ２／ＭＫＫ７の標的化）
Ｇａｄｄ４５βもＮＦ−κＢもいずれも、ＥＲＫカスケードにもｐ３８カスケードにも影響しない（図４Ｃ）。このことは、これらの因子がＭＡＰＫＫＫモジュールの下流のＪＮＫシグナル伝達をブロックすることを示唆する。この注目と一致して、ＭＡＰＫＫ、ＪＮＫＫ２／ＭＫＫ７（ＪＮＫの特異的アクチベーターかつＪＮＫ活性化のＴＮＦ−Ｒ経路の必須成分）を、ＪＮＫカスケードにおけるＧａｄｄ４５βの分子標的として同定した。
【００８３】
Ｇａｄｄ４５βは、これまでに、ＭＥＫＫ４と会合することが示された。しかし、このＭＡＰＫＫＫはＤＲによっては活性化されなかったので、この相互作用の機能的結果は、それ以上は試験されなかった。従って、Ｇａｄｄ４５βがＴＮＦ−ＲによるＪＮＫ誘導を制御するメカニズムを調査するのを開始するために、ＴＮＦ−Ｒによって誘導されることが報告されている、ＭＡＰＫＫＫ、ＭＡＰＫＫおよびＭＡＰＫについて焦点を当て、さらなるキナーゼと物理的に相互作用する能力について、Ｇａｄｄ４５βを試験した。免疫共沈アッセイにより、Ｇａｄｄ４５βがＭＥＫＫ４に結合する能力が、確認された（図１９）。これらのアッセイはまた、Ｇａｄｄ４５βがＡＳＫ１と会合し得るが、他のＴＲＡＦ２相互作用性ＭＡＰＫＫＫ（例えば、ＭＥＫＫ１、ＧＣＫおよびＧＣＫＲ）とも、試験したさらなるＭＡＰＫＫＫ（例えば、ＭＥＫＫ３）とも会合し得ないことを示した（図１９）。注目すべきことに、Ｇａｄｄ４５βはまた、ＪＮＫＫ２／ＭＫＫ７と相互作用したが、他のＪＮＫキナーゼとも、ＪＮＫＫ１／ＭＥＫＫ４とも、試験した他のＭＡＰＫＫおよびＭＡＰＫのいずれ（２つのｐ３８特異的アクチベーターＭＫＫ３ｂおよびＭＫＫ６、ならびにＥＲＫキナーゼＭＥＫ１を含む）とも、相互作用しなかった（図１９）。インビトロにおけるＧＳＴプルダウン実験により、Ｇａｄｄ４５βとＪＮＫＫ２との間の強力かつ直接的相互作用、およびＡＳＫ１とのずっと弱い相互作用を、確認した（図２０）。これらはまた、Ｇａｄｄ４５βとＪＮＫＫ１との非常に弱い会合を明らかにした（図２０）。
【００８４】
Ｇａｄｄ４５βは、ＪＮＫＫ２活性の強力なインヒビターである。このことは、組換えＧａｄｄ４５βタンパク質を使用したインビトロアッセイ（図２２Ａ）および３ＤＯクローンのライセートを使用したインビボアッセイ（図２２Ａ）の両方において示された。ＪＮＫＫ２活性に対するＧａｄｄ４５βの作用は特異的である。なぜなら、これらの因子は、高濃度で使用した場合でさえ、ＪＮＫＫ１、ＭＫＫ３ｂ、ＡＳＫ１（この因子がＡＳＫ１に結合するにもかかわらず）のいずれも阻害し得なかったからである（図２１Ｂ、図２１Ｃ、図２２Ａおよび図２２Ｂ）。ＪＮＫＫ２のこの阻害は、ＭＡＰＫシグナル伝達に対するＧａｄｄ４５βの作用を説明するのに十分であり、そしてＪＮＫ経路に対するこれらの作用の特異性を説明するようである。併せると、これらのデータは、Ｇａｄｄ４５βが、ＴＮＦαにより誘導されるＪＮＫ活性化（これによるアポトーシス）、および直接的にＪＮＫＫ２を標的化することによるストレス刺激を阻害することを、示す（図２１Ａおよび２２Ａ）。Ｇａｄｄ４５βがＪＮＫカスケードに対するＮＦ−κＢの作用を媒介するという注目に一致して、Ｇａｄｄ４５βおよびＮＦ−κＢは、インビボで、ＴＮＦαによるＭＡＰＫ活性化に対して同様の作用を有する（図４Ｃ）。ＡＳＫ１は、ＪＮＫの持続的活性化、およびＴＮＦ−Ｒによるアポトーシスに必須であるので、Ｇａｄｄ４５βとこのＭＡＰＫＫＫとの間の相互作用はまた、これらのレセプターによるＪＮＫ誘導に関係することが、有り得る。
【００８５】
ＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５βまたはＧＳＴ−ＪＮＫＫ２のいずれか、ならびにＪＮＫＫ２およびＧａｄｄ４５βのいくつかのＮ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体をそれぞれ使用する、ＧＳＴプルダウン実験を実施することによって、Ｇａｄｄ４５βのキナーゼ結合表面（図２４Ａおよび図２４Ｂ）ならびにＪＮＫＫ２のＧａｄｄ４５β結合ドメイン（図２３Ａおよび図２３Ｂ）を、同定した。Ｇａｄｄ４５βは、ＪＮＫＫ２の触媒ドメイン内の２つの異なるアミノ酸領域に接触し（図２３Ａおよび図２３Ｂ）、この触媒ドメインは、ＪＮＫＫ２に対するＧａｄｄ４５βの阻害性作用のための根拠についての、重要な機能的洞察を提供する。ＪＮＫＫ２のこれらの領域は、ＭＥＫＫ４内では相同性を共有せず、このことは、Ｇａｄｄ４５βが異なる表面を介してこれらのキナーゼに接触することを示唆する。Ｇａｄｄ４５βは酵素活性（例えば、ホスファターゼ活性またはタンパク質分解活性）を有することは知られておらず、そしてＧａｄｄ４５βのＪＮＫＫ２に対する結合は、インビトロで、キナーゼ機能を阻害するのに十分であるので（図２１Ａ）、Ｇａｄｄ４５βは、キナーゼ活性または基質に対する接近を阻害する、構造的変化または立体的妨害のいずれかを原因とすることによって、触媒ドメインとの直接的な妨害を介してＪＮＫＫ２をブロックし得る。
【００８６】
変異体分析を実施することによって、ＴＮＦα誘導性殺傷のブロックを担うＧａｄｄ４５βのドメインを、マップ付けした（図２５）。ＲｅｌＡ−／−細胞における細胞保護作用アッセイにより、ＧＦＰ−Ｇａｄｄ４５β（６９−１６０）およびＧＦＰ−Ｇａｄｄ４５β（１−１１３）は、全長のＧＦＰ−Ｇａｄｄ４５βのＴＮＦαに対する抗アポトーシス活性に匹敵する、ＴＮＦαに対する抗アポトーシス活性を提示し、一方、Ｇａｄｄ４５β（８７−１６０）と融合したＧＦＰタンパク質またはＧａｄｄ４５β（１−８６）と融合したＧＦＰタンパク質は、緩やかな保護作用のみを有することが、示された。より短い短縮は、細胞生存に対して実質的に作用を有さず（図２５）、このことは、アミノ酸６９とアミノ酸１１３との間にまたがるＧａｄｄ４５βの領域が細胞保護作用に必須であり、そして隣接するアミノ酸６０−６８の領域が、この活性に緩やかに寄与することを、示唆する。
【００８７】
Ｇａｄｄ４５βドメイン（６９−１０４）を含むこの同じアミノ酸領域は、ＪＮＫＫ２とのＧａｄｄ４５βの相互作用のために必須である（図２４Ａおよび図２４Ｂ）。このことは、Ｇａｄｄ４５βの保護活性がＪＮＫＫ２に結合し、そしてＪＮＫ活性化を抑制するＧａｄｄ４５βの能力と関連するという注目と、一致する。興味深いことに、これらの発見は、ここで、Ｇａｄｄ４５βと直接的に接触するようになる、ＪＮＫＫ２のアミノ酸領域を包含する、細胞透過性のＴＡＴ融合ペプチドの設計を可能とする。これらのペプチドは、ＪＮＫＫ２に結合することに対して、内因性Ｇａｄｄ４５βタンパク質と効果的に競合し得ることが、期待される。さらに、これらの発見は、低分子のライブラリーをスクリーニングし、そしてＪＮＫＫ２と会合するＧａｄｄ４５βの能力を妨害し得る化合物を同定するための、生化学的アッセイを設計することを可能とする。これらのペプチドおよびこれらの低分子の両方は、ＪＮＫ活性化を閉鎖しそして最終的にアポトーシスをブロックする、Ｇａｄｄ４５βの能力（およびこれによるＮＦ−κＢの能力）を防止し得ることが、予測される。この要約全体を通して考察されるように、これらの化合物は、ヒトの疾患（慢性的炎症性状態および自己免疫状態、ならびに特定のタイプの癌を含む）の処置において、有用な適用を見出し得る。
【００８８】
（要約）
ｃ−Ｊｕｎ−Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）経路に対して作用することによりアポトーシスを調節するための方法および組成物、ならびにアポトーシスを調節し得る因子（ＪＮＫ経路の調節因子を含む）の単離のためのアッセイが、開示される。Ｇａｄｄ４５βとは独立してＪＮＫ経路を調節する方法が、開示される。アポトーシスの上昇または減少に関連する疾患および状態を調節するための新規な治療組成物の調製および使用のための、方法および組成物が提示される。
【００８９】
（引用文献）
以下の参考文献は、それが本明細書中に示されるものを補充する例示的手順または他の詳細を提供する程度に、本明細書中で参考として詳細に援用される。
【００９０】
【表１−１】
2005040137.tif 000002
【００９１】
【表１−２】
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【００９２】
【表１−３】
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【００９３】
【表１−４】
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【００９４】
【表１−５】
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【００９５】
【表１−６】
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【実施例】
【００９６】
以下の実施例は、本発明の実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術が、本発明の実行において十分機能するように、本発明者らによって発見された技術を表すということは、当業者により理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示を照会して、開示される特定の実施形態において多くの変更がなされ得、そして本発明の本質および範囲から逸脱することのなく、類似の結果または同等の結果を依然として得るべきであることを理解するべきである。
【００９７】
（実施例１：ＴＮＦＲ誘導性アポトーシスの新規アンタゴニストとしてのＧａｄｄ４５βの同定）
ＴＮＦαで処理した場合に急速にアポトーシスを受けるＲｅｌＡ−／−線維芽細胞の機能的補完（ＢｅｇおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、１９９６）を、ＴＮＦαで活性化した野生型線維芽細胞から誘導した、ｃＤＮＡ発現ライブラリーのトランスフェクションによって、達成した。４×１０６個より多くの独立したプラスミドから開始して、ライブラリーのトランスフェクション、ＴＮＦαでの細胞傷害性処理およびエピソームＤＮＡ抽出の継続的サイクルを全部で４回、完了した。
【００９８】
選択後、約２００個のランダムなクローンを、一過性トランスフェクションアッセイにおいて分析し、７１（３５％）が、ＲｅｌＡヌル細胞をＴＮＦα誘導性死から有意に保護することを見出した。これらの中には、マウスのＲｅｌＡ、ｃＦＬＩＰ、およびＦＡＤＤのドミナントネガティブ（ＤＮ）形態をコードするｃＤＮＡがあり、これらは、新規に単離されたライブラリーの３．６％を示すＲｅｌＡを用いて、選択プロセスの間に富化された。従って、このライブラリーは、ＴＮＦＲ誘発性アポトーシスの既知のレギュレーターに富んでいる（Ｂｕｄｉｈａｒｄｊｏら、１９９９）。
【００９９】
細胞保護作用アッセイにおいてポジティブを記録したｃＤＮＡのうちの１つは、全長Ｇａｄｄ４５βをコードしており、これは、ＴＮＦαに対する細胞性応答においてこれまで関係付けられていない因子である。Ｇａｄｄ４５βのインサートは、２回のサイクルの選択後８２倍に富化され、０．４１％の絶対的な頻度に達した。上記の実験は、Ｇａｄｄ４５βが新規の推定の抗アポトーシス因子であることを示す。
【０１００】
上記の発見を確認するために、ｐＥＧＦＰ−Ｇａｄｄ４５β構築物、ｐＥＧＦＰ−ＲｅｌＡ構築物、またはインサートのないｐＥＧＦＰ構築物を、ＲｅｌＡ−／−線維芽細胞中での一過性トランスフェクションアッセイにおいて、試験した。コントロールＧＦＰタンパク質を発現する細胞は、予想通り、ＴＮＦα誘導性死に高度に感受性であり、一方対照的に、ｐＥＧＦＰ−Ｇａｄｄ４５βを受容した細胞は、アポトーシスから劇的に保護された（８時間後、コントロール培養物中では生存率１３％に対して、ほぼ生存率６０％を示した）（図１Ａ）。以前に示されたように、ｐＥＧＦＰ−ＲｅｌＡを用いると、細胞のレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）は実際に完全であった（ＢｅｇおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、１９９６）。
【０１０１】
Ｇａｄｄ４５βの活性が細胞型特異的であるかどうかを決定するために、ＮＦ−κＢ欠損のさらなる細胞モデルを調製し、ここで、３ＤＯ  Ｔ細胞ハイブリドーマを、ＩκＢαＭ（ＮＦ−κＢの核移行を効果的に阻害する、ＩκＢαインヒビター改変体（Ｖａｎ  Ａｎｔｗｅｒｐら、１９９６））を安定に発現させた。
【０１０２】
レプレッサーの存在下で、３ＤＯ細胞は、核のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって示されるように、ＩκＢαＭタンパク質レベルに相関した毒性の程度に従って、ＴＮＦα誘導性殺傷に対して高度に感受性になった（図１Ｂ、下側パネル）。Ｎｅｏのコントロール細胞は、その代わりに、サイトカインに対して完全な耐性を維持した。次に、全長Ｇａｄｄ４５βを発現する構築物、または空のコントロールベクター（Ｈｙｇｒｏ）を、ＩκＢαＭを最も高レベルで提示した、３ＤＯ−ＩκＢαＭ−２５系列に安定に導入した（図１Ｂ）。試験した各々１１個のＩκＢαＭ−Ｈｙｇｒｏクローンは、ＴＮＦαに高度に感受性のままであったが、Ｇａｄｄ４５βを発現するクローンはアポトーシス耐性（Ｇａｄｄ４５βタンパク質レベルに相関した、３１個の独立したＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５βクローンの生存率）になった（図１Ｃおよび図１Ｄ、代表の線は、高レベルのＧａｄｄ４５βおよび低レベルのＩκＢαＭ−Ｈｙｇｒｏコントロールを表す）。Ｇａｄｄ４５βの保護作用は、いくつかのＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５β系列の生存率が、Ｎｅｏクローンの生存率と匹敵する場合、初期の時点で最も劇的であった（図１Ｃおよび図１Ｄ、８時間）。高量のＧａｄｄ４５βを発現するＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５β−３３系列において、細胞死の頻度は、２４時間でさえＮｅｏコントロールにおけるより、約１５％のみ高かった（図１Ｃ）。従って、Ｇａｄｄ４５βは、ＮＦ−κＢの欠失に対して一時的に代償するのに十分である。
【０１０３】
さらに、ＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５β細胞は、感受性のＩκＢαＭクローンにおいて検出されるＩκＢαＭタンパク質レベルと同等かまたはそれより高く（図１Ｄ、下側パネル）、そして、ＴＮＦαによるＮＦ−κＢの活性化を完全にブロックするのに十分である、ＩκＢαＭタンパク質レベル（電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ；図１Ｅ）によって判定する場合）を、維持した。従って、ＲｅｌＡ−／−細胞においても見られたように、Ｇａｄｄ４５βは、ＮＦ−κＢ複合体の下流で作用することによって、アポトーシス経路をブロックする。
【０１０４】
（実施例２：Ｇａｄｄ４５はＮＦ−κＢの生理学的標的である）
Ｇａｄｄ４５βは、ＩＬ−６、ＩＬ−１８およびＴＧＦβのようなサイトカイン、ならびに遺伝毒性ストレスによって、誘導され得る（Ｚｈａｎｇら、１９９９；Ｙａｎｇら、２００１；Ｗａｎｇら、１９９９ｂ）。ＮＦ−κＢの抗アポトーシス機能は遺伝子活性化と関係するので、Ｇａｄｄ４５βもまたＴＮＦαによって調節されるかどうかを決定した。図２Ａに示されるように、サイトカイン処理は、野生型マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）において、Ｇａｄｄ４５β転写物の強力かつ迅速なアップレギュレーションを決定した。対照的に、ＲｅｌＡを欠損する細胞において、特に初期の時点で遺伝子誘導は重篤に損なわれた（図２Ａ、０．５時間での＋／＋のレーンと−／−のレーンとを比較のこと）。これらの細胞において、誘導はまた、遅延され、そしてＮＨ−κＢの既知の標的であるＩκＢαＭの発現パターンを反映した（Ｇｈｏｓｈら、１９９８）。このことは、緩やかな誘導が、ＲｅｌＡ以外のＮＦ−κＢファミリーのメンバー（すなわち、Ｒｅｌ）に起因するようであることを示唆する。Ｇａｄｄ４５αは、ＴＮＦαによっては活性化されず、一方、Ｇａｄｄ４５γは両方の細胞型において緩やかにアップレギュレートされた。
【０１０５】
類似して、Ｇａｄｄ４５βは、親の３ＤＯ細胞およびＮｅｏ  ３ＤＯ細胞においてＴＮＦαによって、誘導されたが、ＩκＢαＭ系列においては誘導されなかった（図２Ｂ）。中程度の活性化がＩκＢαＭ−６細胞のみで見られ、この細胞は低レベルのレプレッサーを発現していた（図１Ｂを参照のこと）。Ｎｅｏクローンにおいて、Ｇａｄｄ４５βはまた、ＮＦ−κＢを活性化することが既知な処理である（Ｗａｎｇら、１９９６）、ダウノルビシン、またはＰＭＡ＋イオノマイシン（Ｐ／Ｉ；それぞれ図２Ｄおよび図２Ｃ）によって、誘導された。繰返すと、遺伝子誘導は、ＩκＢαＭによって実際に抑止された。Ｇａｄｄ４５αはＴＮＦα処理によっては影響されなかったが、ダウノルビシンまたはＰ／ＩによってＮＦ−κＢ非依存的であるがアップレギュレートされた（図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ）；一方、Ｇａｄｄ４５γは、いくつかの系列においてのみ、サイトカインによって僅かに誘導された（図２Ｂ）。ｎｆｋｂ１を、ＮＦ−κＢ依存的遺伝子発現のポジティブコントロールとして使用した（Ｇｈｏｓｈら、１９９８）。
【０１０６】
これらの結果は、ｇａｄｄ４５βが新規のＴＮＦα誘導性の遺伝子であり、そしてＮＦ−κＢの生理学的標的であることを、確立する。ｇａｄｄ４５βプロモーターの調査から、３つのκＢ結合部位の存在が明らかにされた。ＥＭＳＡおよび変異体分析により、これらの部位の各々が、最適な転写活性化のために必要とされることが確認され、このことは、Ｇａｄｄ４５βがまたＮＦ−κＢの直接的な標的であることを示す。これらの発見は、ＴＮＦαに対する細胞応答の生理学的調節因子としてのｇａｄｄ４５βの役割と一致する。
【０１０７】
（実施例３：内因性Ｇａｄｄ４５βは、ＴＮＦαの生存に必要とされる）
Ｇａｄｄ４５βは、ＮＦ−κＢの下流の標的であり、そして外因性Ｇａｄｄ４５βは、ＴＮＦαに対する応答の間、転写因子に対する部分的な代用となり得る。しかし、過剰発現の実験が実行されたので、細胞保護作用がＧａｄｄ４５βの生理学的機能を表し得ないということが論じられ得た。この問題を調査するために、Ｇａｄｄ４５βをアンチセンスの方向で安定に発現する３ＤＯクローンを調製した。これらのクローン中での構築的なＧａｄｄ４５β発現の阻害は、細胞周期における僅かな再配分を招き、Ｇ２にいる細胞の画分を低減させ、このことは、Ｇ２／ＭチェックポイントにおけるＧａｄｄ４５タンパク質の以前に提案された役割を強調する（Ｗａｎｇら、１９９９ｃ）。ＮＦ−κＢを活性化するそれらの能力にもかかわらず、高レベルのアンチセンスＧａｄｄ４５β（ＡＳ−Ｇａｄｄ４５β）を発現する細胞は、ＴＮＦα＋最適以下の濃度のＣＨＸによる殺傷に、著明な感受性を提示した（図１Ｆ）。対照的に、空ベクター（ＡＳ−Ｈｙｇｒｏ）を保持するコントロール系列は、この処理に対して耐性を維持した（図１Ｆ）。細胞周期の変化に関して、細胞毒性は、高レベルのアンチセンスｍＲＮＡと相関した。これらのデータは、正常な状況下では、内因性Ｇａｄｄ４５βがＴＮＦＲ誘導性アポトーシスに拮抗するのに必要とされることを示し、そしてＮＦ−κＢヌル細胞のサイトカイン殺傷に対する感受性が、少なくとも部分的に、これらの細胞がＧａｄｄ４５βの発現を活性化不能であることに起因することを、示唆する。
【０１０８】
（実施例４：Ｇａｄｄ４５βはＮＦ−κＢヌル細胞におけるアポトーシスを効果的にブロックする）
Ｇａｄｄ４５βの発現がカスパーゼの活性化に影響するかどうかという疑問が存在した。ＮＦ−κＢ欠損細胞において、３ＤＯ抽出物がカスパーゼ−８特異的基質をインビトロでタンパク質分解する能力によって評価した場合、カスパーゼ−８活性をＴＮＦα処理の４時間後ほどの早さで検出した（図３Ａ、ＩκＢαＭおよびＩκＢαＭ−Ｈｙｇｒｏ）。このことは、カスパーゼ−９、カスパーゼ−２、カスパーゼ−６およびカスパーゼ−３／７のような下流のカスパーゼの著明な活性化と一致する。以前に報告されたように、事象のこのカスケード（カスパーゼ−８前駆体の活性化を含む）は、ＮＦ−κＢによって完全にブロックされた（Ｎｅｏ；Ｗａｎｇら、１９９８）。イニシエーターカスパーゼおよび実行体（ｅｘｅｃｕｔｉｏｎｅｒ）カスパーゼの両方のサイトカイン誘導性活性化はまた、高レベルのＧａｄｄ４５βを発現するＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５β−１０において、抑制された（図３Ａ）。非常に低度のカスパーゼ−３／７の活性化は、６時間までにこれらの後者の細胞において検出されたが（下側パネル、中央パネル）、この発見の重要性は明らかでない。なぜなら、ウェスタンブロットにおいてカスパーゼ−３もカスパーゼ−７もいずれもプロセッシングの兆候が存在しなかったからである（図３Ｂ）。実際、ＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５β細胞およびＮｅｏ細胞において、他のカスパーゼ前駆体の切断、ならびにＢｉｄの切断もまた、これらの細胞中で正常レベルのタンパク質前駆形態で存在するにもかかわらず、完全に阻害された（図３Ｂ）。タンパク質分解は特異的であった。なぜなら、他のタンパク質（β−アクチンを含む）はこれらの細胞抽出物中では分解されなかったからである。従って、Ｇａｄｄ４５βは、ＮＦ−κＢヌル細胞において、カスパーゼ活性化のＴＮＦα誘導性経路を抑止する。
【０１０９】
アポトーシス経路のＧａｄｄ４５β依存性のブロックをさらに規定するために、ミトコンドリアの機能を分析した。ＩκＢαＭクローンおよびＩκＢαＭ−Ｈｙｇｒｏクローンにおいて、ＴＮＦαは、蛍光色素ＪＣ−１の使用によって測定した場合、ミトコンドリアのΔψｍの落ち込み（ｄｒｏｐ）を誘導した。ＪＣ−１＋細胞は、サイトカイン処理の４時間後、有意な数量で現れ始め、６時間までに約８０％に達した（図３Ｃ）。従って、ＮＦ−κＢヌル３ＤＯ細胞において、ミトコンドリアの事象の誘発、ならびにイニシエーターカスパーゼおよび実行体カスパーゼの活性化は、同様の動態で発生する。ＴＮＦα誘導殺傷に対するＩκＢαＭ細胞を保護するＢｃｌ−２の能力は、これらの細胞において、カスパーゼ活性化がミトコンドリアの増幅機構に依存することを示した（Ｂｕｄｉｈａｒｄｊｏら、１９９９）。ＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５β−１０細胞およびＮｅｏ細胞において、ミトコンドリアの脱分極化を完全に阻害した（図３Ａ）。低度のカスパーゼ活性を観察したＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５β−５細胞においてもまた、阻害はほぼ完全であった（図３Ａ）。これらの発見は、ミトコンドリアに対するＧａｄｄ４５βの保護活性を追従し、カスパーゼ活性化のブロックが、主に、Ｇａｄｄ４５βがミトコンドリアの増幅機構を完全に抑制する能力に依存することを示唆する。図３Ｄおよび図３Ｅに示されるように、Ｇａｄｄ４５βはシスプラチンおよびダウノルビシンに対して細胞を保護し得、このことはＧａｄｄ４５βがミトコンドリアにおけるアポトーシス経路をブロックし得ることを示唆する。この可能性と一致して、この因子の発現はまた、遺伝毒性薬剤のシスプラチンおよびダウノルビシンによるアポトーシスに対して細胞を保護した（それぞれ、図３Ｄおよび図３Ｅ）。Ｇａｄｄ４５βはミトコンドリアには局在しないようであるので、Ｇａｄｄ４５βは、概ね、オルガネラを標的化する経路を阻害することによって、間接的にミトコンドリアの事象を抑制するようである。
【０１１０】
（実施例５：Ｇａｄｄ４５βはＪＮＫ活性化の特異的インヒビターである）
調査した疑問は、Ｇａｄｄ４５βが、細胞死の制御において重要な役割を果たすＭＡＰＫ経路（ＣｈａｎｇおよびＫａｒｉｎ、２００１）に影響するかどうかである。ＩκＢαＭ−Ｈｙｇｒｏクローンにおいて、抗リン酸化ＪＮＫ抗体を用いたウェスタンブロットおよびＪＮＫキナーゼアッセイによって示されるように、ＴＮＦαはＪＮＫの強力かつ迅速な活性化を誘導した（図４Ａおよび図５Ａ、左パネル）。活性化は、５分でピークに達し、次いで減衰し、４０分までに持続性レベルで安定した。この特異的シグナルは、カスパーゼ活性化に起因して、１６０分で再度上昇した（図４Ａおよび図５Ａ）。初期の誘導とは異なり、カスパーゼインヒビターｚＶＡＤ−ｆｍｋで細胞を処理することによって、この作用を妨げ得る。ＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５β細胞において、これらの細胞中で正常なレベルのＪＮＫタンパク質が存在するにもかかわらず、各時点でＴＮＦαによるＪＮＫ活性化を劇的に抑止した（図４Ａ、右パネル）。Ｇａｄｄ４５βはまた、ソルビトールおよび過酸化水素を含む、ＴＮＦα以外の刺激によるＪＮＫ活性化を抑制した（図４Ｂ）。それにもかかわらず、このブロックは特異的である。なぜなら、Ｇａｄｄ４５βの存在はＥＲＫ活性化、ｐ３８活性化のいずれにも影響しなかったからである（図４Ｃ）。内因性Ｇａｄｄ４５βのアンチセンス阻害は、ＴＮＦＲ誘発後のＪＮＫの長期化した活性化を導いた（図４Ｄ、ＡＳ−Ｇａｄｄ４５βおよびＨｙｇｒｏ）。このことは、この因子および他の因子（ＡＳ−Ｇａｄｄ４５β細胞におけるダウンレギュレーションを参照のこと）がこの経路の効果的な終結のために必要とされることを示す。ＡＳ−Ｇａｄｄ４５β細胞において１０分に見られる、僅かに増強された誘導は、構築的に発現されたＧａｄｄ４５βがまたＪＮＫの阻害に寄与し得ることを示した（図２の、基底レベルのＧａｄｄ４５βを参照のこと）。Ｇａｄｄ４５βは、ＪＮＫ活性化の新規の生理学的インヒビターである。ＪＮＫがミトコンドリアにおいてアポトーシス経路を誘発する能力が示されると、これらの観察は、Ｇａｄｄ４５βの保護活性についての機構を提供し得る。
【０１１１】
（実施例６：ＮＦ−κＢによる新規の保護機構としてのＪＮＫ経路の阻害）
ＪＮＫのダウンレギュレーションは、ＮＦ−κＢの生理学的機能を表す。一方、Ｎｅｏ細胞において、ＪＮＫ活性化はサイトカイン処理の４０分後に基底レベル近くにまで戻り、一方、ＩκＢαＭ細胞およびＩκＢαＭ−Ｈｙｇｒｏ細胞においては、低度な調節（ｄｏｗｎ−ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）にもかかわらず、ＪＮＫシグナル伝達は、時間経過の全体を通して持続性のままであった（図７Ａ；図５Ａもまた参照のこと）。定量的に同様な結果が、ＲｅｌＡ欠損ＭＥＦを用いて得られ、この細胞では、野生型線維芽細胞において見られたものとは異なり、ＴＮＦα誘導性ＪＮＫを最終時点でさえ検出可能なレベルで堅持した（図５Ｂ）。従って、Ｇａｄｄ４５βに関して、ＮＦ−κＢ複合体は、ＴＮＦＲ誘発後のＪＮＫ経路の効果的な終結のために必要とされ、従ってＮＦ−κＢ経路とＪＮＫ経路との間の連結を確立する。
【０１１２】
ＣＨＸ処理もまた、ＴＮＦα誘導性ＪＮＫのダウンレギュレーションを妨げ（図５Ｃ）、このことは、３ＤＯ細胞において、このプロセスが新規に誘導された因子および／または迅速に代謝回転する因子を必要とすることを示す。いくつかの系において、ＣＨＸはＪＮＫの緩やかな活性化を誘導することが報告されているが（Ｌｉｕら、１９９６）、３ＤＯ細胞および他の細胞においてはこの薬剤は単独ではこの経路に対して全く影響しない（図５Ｃ；Ｇｕｏら、１９９８）。これらの発見は、ＪＮＫのＮＦ−κＢ依存的阻害が、概ね、転写的な事象でありそうであることを示す。この機能は、Ｇａｄｄ４５βの活性化の関与を示す。なぜなら、この因子は、その発現をＮＦ−κＢに依存するからであり（図２）、そしてＴＮＦＲ誘導性ＪＮＫのダウンレギュレーションにおいて必須の役割を果たすからである（図４Ｄ）。
【０１１３】
２つの異なるＮＦ−κＢヌル系を用いると、ＣＸＨ処理細胞およびＡＳ−Ｇａｄｄ４５β細胞は細胞毒性に相関してＪＮＫ活性化を堅持し、一方、ＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５β細胞を用いると、ＪＮＫ抑制が細胞保護作用と相関した。ＭＡＰＫカスケードが、ＮＦ−κＢヌル細胞のＴＮＦα誘導性アポトーシス応答において役割を果たすかどうかを直接的に測定するため、ＪＮＫＫ１（ＭＫＫ４；ＳＥＫ１）もしくはＪＮＫＫ２（ＭＫＫ７）の触媒的不活性化変異体（これらの各々がＪＮＫ活性化をブロックする（Ｌｉｎら、１９９５））またはＮＫＫ３ｂの酵素的不活性化変異体（これはｐ３８をブロックする（Ｈｕａｎｇら、１９９７））を発現するプラスミド、あるいは空ベクターを、ｐＥＧＦＰと一緒に、ＲｅｌＡ−１−細胞中に一過性にトランスフェクションした。明らかに、ｐ３８の阻害は細胞の生存に全く関渉せず、一方、ＤＮ−ＪＮＫＫ２によるＪＮＫの抑制は、ＴＮＦα誘導性殺傷からＲｅｌＡヌル細胞を劇的にレスキューした（図５Ｄ）。ＪＮＫＫ１は、炎症誘発性サイトカインによって主に活性化されるのではなく（Ｄａｖｉｓ、２０００）、このことは、なぜＪＮＫＫ１変異体がこの系において全く作用しないかを説明し得る。同様の発見は、ＭＡＰＫ経路が良好に特徴付けられた薬剤によって阻害された３ＤＯ−ＩκＢαＭ細胞において、得られた。ＰＤ９８０５９および低濃度のＳＢ２０２１９０（５μＭ以下）（それぞれ、ＥＲＫおよびｐ３８を特異的に阻害する）はＴＮＦα細胞傷害性に拮抗し得ないが、一方、高濃度のＳＢ２０２１９０（５０μＭ）（これはｐ３８およびＪＮＫの両方をブロックする（Ｊａｃｉｎｔｏら、１９９８））は、細胞生存を劇的に増強した（図５Ｅ）。これらのデータは、ＪＮＫがＴＮＦＲにより誘発される重要なアポトーシスシグナルを伝達するがｐ３８（またはＥＲＫ）は伝達せず、そして少なくとも部分的にＪＮＫ経路のダウンレギュレーションを促進することによってＮＦ−κＢ複合体が細胞を保護することを、示す。
【０１１４】
（実施例７：ｇａｄｄ４５βは、ＲｅｌＡの異所性発現により誘導されるが、Ｒｅｌでもｐ５０でも誘導されない）
サイトカインまたはストレスによるｇａｄｄ４５βの活性化は、本明細書中に開示されるように、ＮＦ−κＢを必要とする。なぜなら、ＲｅｌＡヌル変異体またはＩκＢαＭ（ＮＦ−κＢの核移行をブロックするＩκＢαインヒビターの改変体（Ｖａｎ  Ａｎｔｗｅｒｐら、１９９６））の発現のいずれかによって、廃止されるからである。ＮＦ−κＢがまたｇａｄｄ４５βのアップレギュレーションを行うのに十分であるかどうかを決定するため、そしてその場合、どのＮＦ−κＢファミリーのメンバーが遺伝子制御に最も関連するかを規定するため、ＨｅＬａ由来のＨｔＴＡ−ＲｅｌＡ細胞系列、ＨｔＴＡ−ＣＣＲ４３細胞系列およびＨｔＴＡ−ｐ５０細胞系列（それぞれ、ＲｅｌＡ、Ｒｅｌおよびｐ５０を発現する）を、テトラサイクリン調節性プロモーターの制御下で使用した（図６）。これらの細胞系を使用した。なぜなら、これらは、ＮＦ−κＢの転写因子を付随的に活性化し得る細胞外シグナルとは非依存的にＮＦ−κＢ複合体が核に局在することを可能にするからである。
【０１１５】
図６に示されるように、テトラサイクリンの除去は、ＨｔＴＡ−ＲｅｌＡ細胞においてｇａｄｄ４５β  ｍＲＮＡレベルの強力な増加を、ｒｅｌＡ、ならびにｉκｂαおよびｐ１０５（ＮＦ−κＢの２つの既知標的）の動態を反映する誘導動態で、促した。以前に報告されたように、これらの細胞中でのＲｅｌＡ発現により誘導される毒性（ｇａｄｐｈ  ｍＲＮＡレベル）は、ｇａｄｄ４５β誘導の範囲の過小評価を招く。逆に、ｇａｄｄ４５βは、高レベルのＲｅｌを条件付で発現するＨｔＴＡ−ＣＣＲ４３細胞において、ほんの僅かに誘導された。ｉκｂαおよびｐ１０５は、その代わり、これらの細胞において、ＨｔＴＡ−ＲｅｌＡ系列におけるよりも小さい範囲であるが、有意に活性化され、このことは、テトラサイクリンの除去が機能性のＲｅｌ含有複合体を生じたことを示す。ｐ５０の誘導および規定された活性化ドメインを欠失したＮＦ−κＢサブユニットの誘導は、ｇａｄｄ４５β、ｒｅｌ、ｐ１０５のいずれの内因性レベルにも影響しなかった。テトラサイクリンの除去は、ＨｔＴＡコントロール細胞においてｇａｄｄ４５β（またはｒｅｌＡ、ｉκｂαもしくはｐ１０５）のレベルに影響せず、このことは、ＨｔＴＡ−ＲｅｌＡ細胞におけるｇａｄｄ４５βの誘導が、ＮＦ−κＢ複合体の活性化に起因したことを示す。
【０１１６】
ＮＦ−κＢサブユニットの誘導動態を、ウェスタンブロット分析によって確認した。従って、ｇａｄｄ４５β発現は、転写活性なＮＦ−κＢサブユニットのＲｅｌＡの異所性発現の際に、劇的かつ特異的にアップレギュレートされるが、ｐ５０の異所性発現でもＲｅｌの異所性発現でもアップレギュレートされない（図６）。これらの発見は、上記のＲｅｌＡヌル線維芽細胞を用いた観察と一致し、そしてｇａｄｄ４５βの活性化におけるＲｅｌＡの重要性を強調する。
【０１１７】
（実施例８：ｇａｄｄ４５β発現は、Ｂ細胞系列におけるＮＦ−κＢ活性と相関する）
ＮＦ−κＢは、Ｂリンパ球産生において重要な役割を果たし、そして成熟Ｂ細胞の生存のために必要とされる。従って、ｇａｄｄ４５βの構築的かつ誘導性の発現を、ＮＦ−κＢの存在点（ｓｔａｎｄ  ｐｏｉｎｔ）から良好に特徴付けられたＢ細胞モデル系において、試験した。実際、ｇａｄｄ４５β  ｍＲＮＡレベルは、これらの細胞における核内ＮＦ−κＢ活性と相関した（図７）。ｇａｄｄ４５β転写物は、無刺激のＷＥＨＩ−２３１  Ｂ細胞（これは、構築的な核ＮＦ−κＢを提示する）において容易に見られ、一方、ｍＲＮＡレベルは、７０Ｚ／３  Ｂ細胞前駆体（これは、代わりに、転写因子の古典的誘導形態を含む）において検出未満であった。両方の細胞型において、発現は、ＬＰＳによって劇的に増大し（７０Ｚ／３細胞についてのより長期の曝露を参照のこと）、そしてＷＥＨ−２３１細胞においてもまたＰＭＡ（これらの細胞においてＮＦ−κＢを活性化することが既知の２つの薬剤）によって、劇的に増大した。従って、ｇａｄｄ４５βは、Ｂリンパ球においてＮＦ−κＢにより実行される重要な機能のいくつかを媒介し得る。
【０１１８】
（実施例９：いくつかの推定のκＢエレメントを含むｇａｄｄ４５βプロモーター）
ＮＦ−κＢによるｇａｄｄ４５β発現の調節を調査するために、マウス（ｍｕｒｉｎｇ）ｇａｄｄ４５βプロモーターをクローン化した。ｇａｄｄ４５β遺伝子を含むＢＡＣクローンを、ＸｈｏＩで消化した１２９ＳＶマウスゲノムライブラリーから単離し、そしてｐＢＳベクター中にサブクローン化した。ｇａｄｄ４５βを含む７３８４ｂｐのＸｈｏＩフラグメントを完全に配列決定し、そしていくつかの部分が先に寄託したＧｅｎｅＢａｎｋ配列に一致することを見出した（受託番号ＡＣ０７３８１６、ＡＣ０７３７０１、およびＡＣ０９１５１８）（図８もまた参照のこと）。このフラグメントは、転写開始部位の約５．４ｋｂｐ上流からｇａｄｄ４５βの第４番目のエキソン端部近傍までに亘るゲノムＤＮＡ領域を保有していた。次に、ＴＲＡＮＳＦＡＣデータベースを用いて、推定の転写因子結合エレメントを同定した。ＴＡＴＡＡボックスは、転写開始部位に対する位置−５６〜−６０に位置することが見出された（図１０）。このｇａｄｄ４５βプロモーターはまた、いくつかのκＢエレメントを示し、そのいくつかは、他者により最近報告された。３つの強いκＢ部位が、近位プロモーター領域に、位置−３７７／−３６８、−４２６／−４１７、および−４４７／−４３８で見出された（図８）；その一方、より弱い部位は、位置−４５１６、−４８９０／−４８８１、および−５２５１／−５２４２として位置決められた（図８）。３つのκＢコンセンサス部位もまた、ｇａｄｄ４５βの第１番目のエキソンとともに注目された（＋２７／＋３６、＋７１／＋８０、および＋１７１／＋１８０）。このプロモーターはまた、Ｓｐ１モチーフ（−８９０／−８８１）、および熱ショック因子（ＨＳＦ）１および２、Ｅｔｓ、Ｓｔａｔ、ＡＰ１、Ｎ−Ｍｙｃ、ＭｙｏＤ、ＣＲＥＢ、およびＣ／ＥＢＰを含む、その他の転写因子のためのいくつかの推定の結合部位を含んでいた（図８）。
【０１１９】
保存された調節エレメントを同定するために、ｇａｄｄ４５β転写開始部位のすぐ上流の５．４ｋｂｐのマウスＤＮＡ配列を、Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅにより先に寄託された対応するヒト配列（受託番号ＡＣ００５６２４）とアラインした。図８に示されるように、マウスｇａｄｄ４５βプロモーターの位置−１４７７〜−１１９７および−４６６〜−３００に亘るＤＮＡ領域は、ヒトプロモーターの部分と高度に類似し（灰色で強調したのは、相同性の領域内の同じヌクレオチドである）、これらの領域が、重要な調節エレメントを含むことを示唆した。より少ないが良好に保存された領域が、下流位置−１８３〜第１イントロンの始まりまでで同定された。相同性の、さらなるより短いストレッチもまた同定された（図８を参照のこと）。上流位置−２２８５には有意な類似性は見出されなかった。上記−４６６／−３００相同性領域は、３つのκＢ部位を含み（以後κＢ１、κＢ２、およびκＢ３と称する）、これらはその他のκＢ部位と異なり、ｇａｄｄ４５βプロモーター中いたるところに存在し、２つの種間で保存されていた。これらの知見は、これらのκＢ部位が、ｇａｄｄ４５βの調節で重要な役割を演じ、おそらく、ＮＦ−κＢによるｇａｄｄ４５βの誘導の原因であることを示唆している。
【０１２０】
（実施例１０：ＮＦ−κＢは、３つの近位κＢエレメントにより、ｇａｄｄ４５βプロモーターを調節している）
ｇａｄｄ４５βプロモーター中に存在するκＢ部位の機能的重要性を決定するために、一連のＣＡＴリポーター構築物を生成し、ここで、ＣＡＴ遺伝子発現は、このプロモーターの種々の部分によって駆動される（図９Ａ）。各ＣＡＴ構築物は、単独または増加する量のＲｅｌＡ発現プラスミドとともに、ＮＴｅｒａ−２胎児癌腫細胞中にトランスフェクトし、そして細胞溶解物中のＣＡＴ活性を、液体シンチレーション計数により測定した（図９Ｂ）。ＲｅｌＡを、その他のＮＦ−κＢサブユニットと比較したとき、ｇａｄｄ４５β発現の調節へのその関連度のために、これらの実験について選択した（図６を参照のこと）。図９Ｂに示されるように、上記−５４０７／＋２３−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴＴリポーターベクターは、用量依存様式で、ＲｅｌＡによって劇的にトランス活性化され、最も高い量のｐＭＴ２Ｔ−ＲｅｌＡでＲｅｌＡの不在下で観察された誘導に対し約３４０倍の誘導を示した。質的に同様のＲｅｌＡ依存性効果が、ｇａｄｄ４５βプロモーターの遠位の切断を含んだ、上記−３４６５／＋２３−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴ構築物および−５９２／＋２３−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴ構築物で観察された。相対的により低い構築物は、これらは、ｇａｄｄ４５βプロモーターの遠位の切断を含んでいた。相対的により低い基礎およびＲｅｌＡ依存性ＣＡＴ活性が、上記−５４０７／＋２３−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴで観察され、少なくとも部分的には、前記の構築物においてもＴＡＴＡボックスを含んでいた近位３２９ｂｐ調節領域の欠如に起因し得た（図９Ａおよび９Ｂ）。この領域の存在下でさえ、位置−５９２まで近位方向に延びる欠失は、ＣＡＴ遺伝子を活性化するＲｅｌＡの能力を完全になくした（図９Ｂ、−２６５／＋２３−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴ構築物および−１０３／＋２３−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴ構築物を参照のこと）。同様の知見が、位置＋２３の下流のさらなる１１６ｂプロモーターフラグメントを含む類似のリポーター構築物で得られた。その一方、−５９２／＋２３−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴと類似して、−５９２／＋１３９−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴは、ＲｅｌＡに高度に反応性であり、−２６５／＋１３９−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴは、最も高い量のｐＭＴ２Ｔ−ＲｅｌＡによってでさえトランス活性化されなかった。このリポーター構築物は、位置＋２７／＋３６および＋７１／＋８０（図８、配列番号３５を参照のこと）にある２つの推定のκＢ結合エレメントを保持するにもかかわらず、ＲｅｌＡに応答しなかったことに注目すべきである。ともに、これら知見は、マウスｇａｄｄ４５βプロモーター中の関係あるＮＦ−κＢ／ＲｅｌＡ応答性エレメントが、位置−５９２と＋２３との間に存在することを示す。それらはまた、第１番目のエキソンに含まれたκＢ部位、および遠位κＢ部位が、ＮＦ−κＢによるｇａｄｄ４５βの調節には有意に寄与し得ないことを意味している。同様の結論が、ＮＦ−κＢがＰＭＡプラスイオノマイシン処置によって活性化されたＪｕｒｋａｔ細胞またはＨｅＬａ細胞を採用する実験で得られた。
【０１２１】
図８に示されるように、ｇａｄｄ４５βプロモーターの上記−５９２／＋２３領域は、３つの保存されたκＢ結合部位、すなわち、κＢ１、κＢ２、およびκＢ３を含んでいる。これらκＢエレメントの機能的重要性を試験するために、これら部位の各々を、ＲｅｌＡによりトランス活性化され得る最小プロモーター領域を含んでいた−５９２／＋２３−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴ（図１０Ａ）の情況で変異させた。変異体リポーター構築物を、単独でかまたは増加する量のＰＭＴ２Ｔ−ＲｅｌＡとともに、ＮＴｅｒａ−２細胞中にトランスフェクトし、そしてＣＡＴ活性を、図９Ｂに関して記載したように測定した。図１０Ｂに示されるように、各κＢ部位の欠失は、ＲｅｌＡが−５９２／＋２３−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴ構築物をトランス活性化する能力を顕著にそこなわせ、最も劇的な影響は、κＢ１の変異で観察され、ＣＡＴ活性の約７０％阻害を生じた（−５９２／＋２３−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴおよびκＢ−１Ｍ−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴを比較のこと）。興味深いことに、κＢ１およびκＢ２の同時変異は、最高量のトランスフェクトされたＲｅｌＡプラスミドの存在下で、ＣＡＴ誘導を約９０％損なった（図１０Ｂ）（κＢ−１／２Ｍ−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴを参照のこと）。劇的な影響はまた、ＲｅｌＡのインプットレベルを１μｇまたは０．３μｇまで減少したときに観察された（野生型プロモーターに比較して、それぞれ、約８倍の減少および約５倍の減少）。後者の変異体構築物で観察された残存ＣＡＴ活性は、インタクトなκＢ３部位の存在に起因する可能性が高かった。質的に類似の結果が、ＲｅｌＡプラスｐ５０、またはＲｅｌ発現構築物のトランスフェクションで観察された。ｇａｄｄ４５βプロモーターは、３つの機能的κＢエレメントをその近位領域中に含み、しかも各々が、ＮＦ−κＢの最適転写活性化に必要であることが結論付けられた。
【０１２２】
これらの部位が、ＮＦ−κＢ依存性転写を駆動するに十分であったか否かを決定するために、ＣＡＴ遺伝子の発現を駆動するために、Δ５６−ＣＡＴ中に、１コピーのｇａｄｄ４５β−κＢ部位または変異した部位がそれぞれクローン化されたリポーター構築物、Δ５６−κＢ−１／２−ＣＡＴ、Δ５６−κＢ−３−ＣＡＴ、およびΔ５６−κＢ−Ｍ−ＣＡＴを構築した（図１１）。各Δ５６−ＣＡＴ構築物を、次に、単独または増加する量のＲｅｌＡ発現プラスミドと組合せＮｅｔｒａ２細胞中のトランスフェクトし、そして前のようにＣＡＴ活性を測定した。図１１に示されるように、κＢ−１プラスκＢ−２、またはκＢ−３いずれかの存在は、ＲｅｌＡに対するΔ５６−ＣＡＴの応答性を劇的に増大した。１つより、２つのκＢ部位を宿すという事実から予期され得たように、Δ５６−κＢ−１／２−ＣＡＴは、κＢ３より効率的に、特に最高量のｐＭＴ２Ｔ−ＲｅｌＡで誘導された。有意にもかかわらず、低いＲｅｌＡ−依存性ＣＡＴ活性もまた、Δ５６−κＢ−Ｍ−ＣＡＴ、および空のΔ５６−ＣＡＴベクターで注目され、Δ５６−ＣＡＴが潜在的なκＢ部位を含むことを示唆した（図１１）。これ故、κＢ−１プラスκＢ−２、またはκＢ−３いずれかのシスに作用するエレメントは、ＮＦ−κＢに対するプロモーター応答性を与えるに十分である。
【０１２３】
（実施例１１：κＢ−１、κＢ−２、およびκＢ−３エレメントは、インビトロでＮＦ−κＢに結合する）
ｇａｄｄ４５βプロモーター中のκＢエレメントのＮＦκＢ複合体と相互作用する能力を評価するために、ＥＭＳＡを実施した。κＢ−１、κＢ−２、またはκＢ−３の配列を含むオリゴヌクレオチドを、放射能標識し、そして操作前にｐＭＴ２Ｔ−ｐ５０、ｐＭＴ２Ｔ−ｐ５０プラスｐＭＴ２Ｔ−ＲｅｌＡ、または空のｐＭＴ２ＴプラスミドでトランスフェクトしたＮＴｅｒａ−２細胞の抽出物と独立にインキュベートし、そしてＤＮＡ結合複合体をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した（図１２Ａ）。各κＢプローブの、ｐ５０のみを発現する細胞からの種々の量の抽出物とのインキュベーションが、ｐ５０ホモダイマーと同時移動する単一のＤＮＡ結合複合体を生じた（図１２Ａ、レーン１〜３、５〜７、および９〜１１）。逆に、ｐ５０およびＲｅｌＡの両方を発現する細胞からの抽出物は、２つの特異的バンド：１つはｐ５０／ｐ５０ダイマーと同じ移動度を示し、そして他方はｐ５０／ＲｅｌＡヘテロダイマーと同時移動する（レーン４、８、および１２）を生じた。モックトランスフェクトＮＴｅｒａ２細胞からの抽出物は、ＥＭＳＡ中に任意の特異的シグナルを生じなかった（図１２Ｂ）。各複合体の特異性は競争アッセイによって確認し、そこでは、放射能標識プローブに加え、抽出物を、５０倍過剰の野生型または変異した冷κＢプローブとインキュベートした。従って、ｇａｄｄ４５βプロモーター中の機能的に関連するκＢエレメントの各々は、インビトロでＮＦ−κＢ複合体に結合し得る。
【０１２４】
ＤＮＡ結合複合体の組成を確認するために、スーパーシフトアッセイを、細胞抽出物を、ヒトｐ５０またはＲｅｌＡに対して惹起されたポリクローナル抗体とインキュベートすることにより実施した。抗ｐ５０抗体は、ｐ５０発現細胞の抽出物で観察された特異的複合体（図１２Ｂ、レーン５、１４、および２３）、ならびにｐ５０およびＲｅｌＡの両方を発現する細胞の抽出物で検出された２つの複合体（レーン８、１７、および２６）を完全にスーパーシフトした。逆に、ＲｅｌＡのみに対して惹起された抗体は、ｐ５０とＲｅｌＡの同時発現に際し観察されたより遅い複合体の移動を遅くし（レーン９、１８、２７）、そしてより速いＤＮＡ結合複合体の移動度に影響しなかった（レーン６、９、１５、１８、２４、および２７）。
【０１２５】
ｇａｄｄ４５β−κＢ部位は、ＮＦ−κＢ複合体に対して見かけ上別個の、インビトロ結合親和性を示した。実際、ｐ５０／ＲｅｌＡヘテロダイマーで、κＢ−２およびκＢ−３は、κＢ−１と比較したとき、有意により強いシグナルを生じた（図１２Ｂ）。逆に、κＢ−２は、ｐ５０ホモダイマーと最も強いシグナルを生じ、その一方、κＢ−３は、この複合体とインビトロで最も不十分に会合しているようであった（図１２Ｂ）。ゲル上で可視化されたｐ５０／ｐ５０複合体およびｐ５０／ＲｅｌＡ複合体の量から判断すると、抗体（得に抗ＲｅｌＡ抗体）の存在は、ＮＦ−κＢ−ＤＮＡ相互作用を安定化したようであった（図１２Ｂ）。いずれの抗体も、細胞抽出物の不在下で放射能標識プローブとインキュベートしたときバンドを生じなかった。スーパーシフトされたバンドの特異性は、非標識コンペティターオリゴヌクレオチドとの競合的結合反応によりさらに証明された。従って、移動度パターンと一致して（図１４Ａ）、より速い複合体は、主にｐ５０ホモダイマーから構成され、その一方、より遅い複合体は、主にｐ５０／ＲｅｌＡヘテロダイマーから構成されている。これらのデータは、ＣＡＴアッセイで得たデータと一致しており、そしてｇａｄｄ４５βプロモーターの関連するκＢエレメントの各々は、ｐ５０／ｐ５０およびｐ５０／ＲｅｌＡ、ＮＦκＢ複合体にインビトロで特異的に結合し得、それによってｇａｄｄ４５β発現のＮＦ−κＢに対する依存性の基礎を提供する。従って、ｇａｄｄ４５βは、ＮＦκＢの新たな直接標的である。
【０１２６】
（実施例１２：ＪＮＫＫ２（ＭＫＫ７としても知られる）−Ｇａｄｄ４５β相互作用ドメイン）
ＪＮＫ１／２／３は、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ１／２）およびｐ３８（α／β／γ／δ）カスケードをも含む、主要な分裂促進因子で活性化されるタンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードの１つの下流成分である。ＭＡＰＫは、ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）によって活性化され、これは、今度はＭＡＰＫＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）によって活性化される。ＪＮＫシグナル伝達のＧａｄｄ４５β制御の基礎を理解するために、Ｇａｄｄ４５βがこれらカスケード中のキナーゼと生理的に相互作用し得るか否かを決定した。ＨＡタグ化キナーゼを、２９３細胞において、単独またはＦＬＡＧ−Ｇａｄｄ４５βとともに一時的に発現させ、そして結合を、免疫沈降およびウェスタンブロットアッセイの組み合わせによって評価した。Ｇａｄｄ４５βは、ＡＳＫ１に結合したが、ＴＮＦαによるＪＮＫ活性化に必要な因子であるＴＲＡＦ２と相互作用し得るその他のＭＡＰＫＫＫには結合しなかった（図２６ａ、左）。それはまた、ＭＥＫＫ４／ＭＴＫ１−ＭＡＰＫＫＫ（それに代わりＴＮＦαによって誘導されない）と結合した。特に、Ｇａｄｄ４５βは、ＭＫＫ７／ＪＮＫＫ２と強く相互作用したが、その他のＪＮＫキナーゼ、ＭＫＫ４／ＪＮＫＫ１、ｐ３８特異的アクチベーターＭＫＫ３ｂおよびＭＫＫ６、またはＥＲＫキナーゼ、ＭＥＫ−１、およびＭＡＰＫとは相互作用しなかった（図２６ａ、中央および右、ならびに図２６ｂ）。Ｇａｄｄ４５β相互作用は、インビトロで確認された。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ではなく、ＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５βは、ＭＫＫ７インプットの大きな画分を沈殿させ（図２６ｃ）、その一方、それは、ＡＳＫ１またはＭＥＫＫ４の小さな画分のみを吸収した。これ故、Ｇａｄｄ４５βは、ＪＮＫ−誘導性キナーゼと、そして最も強くＭＫＫ７と相互作用する。
【０１２７】
別の疑問は、これらキナーゼとのＧａｄｄ４５β結合が、インビボで機能的結果を有したか否かであった。著しく、ＩκＢαＭ−Ｈｙｇｒｏ  ３ＤＯコントロールクローンではＴＮＦαはＭＫＫ７を強く活性化したが、Ｇａｄｄ４５βを発現するクローンでは、この活性化はなくなった（図２７ａ）。Ｇａｄｄ４５βが、ＴＮＦαまたはＰＭＡプラスアイオノマイシンのいずれによっても、その他のＭＡＰＫＫ（すなわち、ＭＫＫ４、ＭＫＫ３／６、およびＭＥＫ１／２）の誘導に対して影響を有さなかった（Ｐ／Ｉ；それぞれ、図２７ｂおよび図２７ｃ）ので、阻害は、特異的であった。ＡＳＫ１およびＭＥＫＫ１は、ＴＮＦαによって弱く活性化され、そしてこの活性化もまた、Ｇａｄｄ４５βによって影響されなかった（図２７ｂ）。従って、Ｇａｄｄ４５βは、ＴＮＦαによるＭＫＫ７リン酸化／活性の誘導を選択的にブロックした。
【０１２８】
Ｇａｄｄ４５βは、ＮＦ−κＢによるＪＮＫシグナル伝達の抑制を媒介する。実際、ＭＫＫ７は、ＮＦ−κＢによって阻害された（図２７ｄ）。その一方、コントロール３ＤＯクローン（Ｎｅｏ）では、ＴＮＦαによるＭＫＫ７活性化は、４０分で基底レベルに戻り−それによってＪＮＫ応答を映し−ＮＦ−κＢヌルクローン（ＩκＢαＭ）において、この活性化は持続されたままであった。ＭＫＫ７ダウンレギュレーションは、ＮＦ−κＢによるＧａｄｄ４５β誘導と関連した。さらに、ＮＦ−κＢは、ＭＫＫ４、ＭＫＫ３／６、またはＭＥＫ１／２に影響せず（図２７ｄおよび図２７ｅ）、それによってＭＡＰＫカスケードに対するＧａｄｄ４５βの影響を要約した。
【０１２９】
内因性Ｇａｄｄ４５βおよびＭＫＫ７の相互作用は、容易に検出された（図２８ａ）。抗Ｇａｄｄ４５βモノクローナル抗体は、Ｐ／Ｉ処理３ＤＯ細胞からＭＫＫ７を同時免疫沈澱し、これは、強いＧａｄｄ４５β発現を示したが（下の右）、非処理細胞ではそうではなく、検出可能なＧａｄｄ４５βを欠いていた。ＭＫＫ７は、刺激細胞および非刺激細胞で匹敵するレベルで存在し（下の左）、そしてアイソタイプ合致コントロール抗体によって同時沈殿されなかった。この相互作用は、免疫沈澱について抗ＭＫＫ７抗体、およびウェスタンブロットについて抗Ｇａｄｄ４５βモノクローナル抗体を用いて確認した（図２８ａ、上の右）。抗ＭＥＫＫ１抗体は、Ｇａｄｄ４５βを同時沈殿できず、ＭＫＫ７−Ｇａｄｄ４５β結合の特異性をさらに示した。Ｇａｄｄ４５βがＭＫＫ７に直接結合するか否かを決定するために、本発明者らは、精製されたタンパク質を用いた（図２８ｂ）。精製されたＧＳＴ−ＭＫＫ７またはＧＳＴを、インビトロで増加する量の精製Ｈｉｓ６−Ｇａｄｄ４５βまたはコントロールＨｉｓ６−ＪＩＰ１とインキュベートし、そしてＧＳＴタンパク質に結合したＨｉｓ６タグ化ポリペプチドの画分を、ウェスタンブロッティングにより可視化した。Ｈｉｓ６−Ｇａｄｄ４５βは、ＧＳＴ−ＭＫＫ７と特異的に結合し（図２８ｃ）、そしてこの結合は、生理学的なＭＫＫ７調節因子ＪＩＰ１の結合より強固で、最大半減結合（ＨＭＢ）値はＧａｄｄ４５βについて約３９０ｎＭであり、そしてＪＩＰ１について６５０ｎＭを超える（左；ＪＩＰ１は、非飽和条件下で用いた）。内因性Ｇａｄｄ４５βおよびＭＫＫ７は、直接的に、高親和性接触により結合するようである。
【０１３０】
疑問は、Ｇａｄｄ４５βがインビトロで活性ＭＫＫ７を阻害したか否かであった。ＦＬＡＧ−ＭＫＫ７を、ＴＮＦα−処置２９３細胞または非処置２９３細胞から免疫沈降し、そしてキナーゼアッセイを、精製Ｈｉｓ６−Ｇａｄｄ４５β、ＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５β、またはコントロールタンパク質（図２８ｄ；図２８ｇもまた参照のこと）の存在下で実施した。両方のＧａｄｄ４５βは、用量依存様式でＭＫＫ７によるＧＳＴ−ＪＮＫ１リン酸化をブロックしたが、ＧＳＴもＨｉｓ６−ＥＦ３のいずれもブロックしなかった（図２８ｄ）。インビボの知見（図２７）と一致して、Ｇａｄｄ４５βの阻害活性は特異的であった。事実、高濃度でさえ、この因子は、ＭＫＫ４、ＭＫＫ３ｂ、または−過剰発現でそれに結合するその能力にもかかわらず（図２６ａ）−ＡＳＫ１を妨害しなかった（図２８ｅ；図２８ｆ、総レベルもまた参照のこと）。これ故、Ｇａｄｄ４５βは、ＭＫＫ７の強力かつ特異的インヒビターであり、実際、Ｇａｄｄ４５βのＴＮＦαによるＭＫＫ７リン酸化に対する影響は、自動リン酸化するか、および／または上流キナーゼのための基質として供するＭＫＫ７の阻害に起因し得る。全体で、これら知見は、ＭＫＫ７能力を、Ｇａｄｄ４５βの標的として、およびＪＮＫカスケード中のＮＦ−κＢの標的として同定する。重要なことは、ＭＫＫ７は、ＪＮＫの選択的アクチベーターであり、そしてその消去はＴＮＦαによるＪＮＫ活性化を廃止する。従って、ＭＫＫ７のブロックは、ＪＮＫシグナル伝達に関するＧａｄｄ４５βの影響を説明するためにそれ自体−すなわち、このシグナル伝達のその特異的かつほぼ完全な抑制−で十分である。
【０１３１】
Ｇａｄｄ４５βのアミノ酸配列は、ホスファターゼの配列に類似ではなく、そして酵素活性を有することは知られていない。従って、キナーゼ不活性化の機構を理解するために、ＭＫＫ７のＧａｄｄ４５β結合領域を、Ｎ末端短縮型ＭＫＫ７ポリペプチドおよびＣ末端短縮型ＭＫＫ７ポリペプチドのセットを用いてマップした（それぞれ、図２９ａおよび図２９ｃ）ヒトおよびマウスのＭＫＫ７またはＪＮＫＫ２の完全長のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図３１に示す。本明細書で用いられるとき、アミノ酸位置は、ヒトＭＫＫ７またはＪＮＫＫ２のアミノ酸配列をいう。ＭＫＫ７／６３−４０１、ＭＫＫ７／９１−４０１、およびＭＫＫ７／１３２−４０１は、ＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５βに、特異的かつ完全長ＭＫＫ７の親和性に匹敵する親和性で結合し、その一方、アミノ酸１５７と２１３との間に存在する変異は、ＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５βと弱く相互作用した（図２９ｂ）。残基２３２までおよびそれを超えて延びる領域の切除は、結合を廃した。Ｃ末端短縮型の分析は、残基１４１と１６１との間のＧａｄｄ４５β相互作用ドメインの存在を確認したが（図２９ｄ；ＭＫＫ７／１−１４０とＭＫＫ７／１−１６１とを比較のこと）、上記で同定されたＣ末端結合領域を示すことはできず、Ｇａｄｄ４５βが、この後者の領域とより弱く相互作用することを示唆した。これ故、ＭＫＫ７は、残基１３２−１６１および２１３−２３１内に位置する２つの別個の領域（以後、それぞれ、領域ＡおよびＢと称する）によりＧａｄｄ４５βと接触する。
【０１３２】
相互作用領域を規定し、そしてそれらが結合のために十分であるかを決定するために、これら領域に亘る重複ペプチド（図２９ｅ）とのＧａｄｄ４５β結合を決定した。図２９ｆに示されるように、領域ＡおよびＢの両方は、ＭＫＫ７の情況から単離されたときでさえ、ＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５βに結合し−そしてペプチド１３２−１５６および２２０−２３４（すなわち、それぞれペプチド１および７）は、この結合を再利用するために十分であった。両方のペプチドは、ＭＫＫ７キナーゼドメイン内に存在し、そしてペプチド１は、触媒機能に必要なＡＴＰ結合部位Ｋ１４９に広がり−Ｇａｄｄ４５βが重要残基をマスクすることによりＭＫＫ７を不活性化することを示唆する。これは、ｐ２７ＫＩＰ１がサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）２を阻害する機構の暗示である。調査された疑問は、ＭＫＫ７、Ｇａｄｄ４５β結合性ペプチドが、キナーゼ活性を抑制するＧａｄｄ４５β能力を妨害するか否かであった。実際、ペプチド１は、Ｇａｄｄ４５βによるＭＫＫ７阻害を防いだが、その一方、ペプチド７またはコントロールペプチドは阻害しなかった（図３０ａ）。それ故、Ｇａｄｄ４５βによるキナーゼ不活性化は、領域Ｂではなく領域Ａとの接触を必要とする。
【０１３３】
これらのデータは、インビボのＧａｄｄ４５βによるＭＫＫ７不活性化を防ぐことが、ＴＮＦα誘導アポトーシスに対して細胞を感作することを予測する。この仮説を試験するために、ＭＫＫ７模倣ペプチドを、細胞透過性、ＨＩＶ−ＴＡＴペプチドに融合し、そして細胞中に形質導入した。著しく、ペプチド１は、ＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５β細胞のＴＮＦα誘導殺傷に対する感受性を顕著に増大し、その一方、予期されたように、ＤＭＳＯ処理細胞は、この殺傷に対して抵抗性であった（図３０ｂ）。重要なことには、ペプチド１は、最低限の基底毒性を示し、これは、その影響がＴＮＦα刺激に特異的であったことを示し、そしてペプチド７を含むその他のペプチドは、ＴＮＦαに対するアポトーシス応答に関して影響を有さなかった。ＭＫＫ７はＮＦ−κＢの標的であるという概念と一致して、ペプチド１は、ＮＦ−κＢ習得細胞−これは、通常、この殺傷に抵抗性である−のＴＮＦα誘導殺傷を促進した（Ｎｅｏ；図３０ｃ）。Ｇａｄｄ４５β発現クローンで観察されるように、このペプチドは、非処理細胞では最小の毒性を示した。ともに、これらの知見は、Ｇａｄｄ４５βが、ＭＫＫ７を阻害することによりＪＮＫカスケードを停止させ、そして原因として、Ｇａｄｄ４５β保護活性をこの阻害にリンクすることを支持する。さらに、ＭＫＫ７のブロックは、ＮＦ−κＢによるアポトーシスの抑制における因子であり、そしてこのブロックは、少なくとも一部、Ｇａｄｄ４５βの誘導により媒介される。
【０１３４】
Ｇａｄｄ４５βによるＪＮＫシグナル伝達の制御のための機構が同定された。ＭＫＫ７と強固に結合したＧａｄｄ４５βは、触媒ドメイン中の重要な残基と接触することによりその酵素活性を阻害し、そしてこの阻害は、ＴＮＦα誘導アポトーシスのその抑制
おける因子である。その他のキナーゼとの相互作用は、ＴＮＦαによるＪＮＫ活性化およびＰＣＤのＧａｄｄ４５β制御に関係あるようには見えない。なぜなら、ＭＥＫＫ４はＴＮＦ−Ｒシグナル伝達には関与せず、そしてＡＳＫ１は、Ｇａｄｄ４５βによって明らかに影響されないからである。実際、ＭＫＫ７へのＧａｄｄ４５β結合を妨害するペプチドは、ＴＮＦαに対するＧａｄｄ４５β保護活性を鈍くする（図３０ａおよび図３０ｂ）。ＭＫＫ７の標的化は、ＮＦ−κＢによるアポトーシスの抑制における因子である。ＮＦ−κＢ欠乏細胞は、ＴＮＦαによるＭＫＫ７誘導をダウンレギュレートできず、そしてＭＫＫ７模倣ペプチドは、ＮＦ−κＢのサイトカイン誘導殺傷をブロックする能力を妨げ得る（図３０ｃ）。これらの結果は、ＮＦ−κＢ活性化がＧａｄｄ４５βの転写を誘導し、これは次にＭＫＫ７を阻害し、ＪＮＫシグナル伝達の抑制し、そして最終的には、ＴＮＦαによって引き起こされるアポトーシスを導くというモデルと一致するように見える。
【０１３５】
慢性関節リウマチおよび炎症性腸疾患のような慢性の炎症性状態は、ＴＮＦαおよびＮＦ−κＢの相互活性化により生成されるポジティブフィードバックループによって駆動される。さらに、いくつかの悪性腫瘍は、それらの生存−ＪＮＫシグナル伝達の抑制を含み得るプロセス−のためにＮＦ−κＢに依存している。これらの結果は、ＮＦ−κＢのＭＫＫ７をシャットダウンする能力のブロックが、自己反応性／炎症促進性細胞（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌ）、そして、恐らく、癌細胞のアポトーシスを促進し得ることを示唆し、それによって、ＭＫＫ７−Ｇａｄｄ４５β相互作用を、潜在的な治療標的として同定する。興味深いことに、ＭＫＫ７へのＧａｄｄ４５β結合を中断する薬理学的化合物は、ＮＦ−κＢの抗アポトーシスおよび炎症促進性機能と連関せず、そして、それで、現在これらの病気を処置するために用いられている全体的なＮＦ−κＢブロッカーで観察される強力な免疫抑制副作用を回避する。ＮＦ−κＢ習得細胞におけるＭＫＫ７ペプチドのプロアポトーシス活性は、たとえ、ＮＦ−κＢがさらなるＭＫＫ７インヒビターを誘導したとしても、これらのインヒビターは、そのＧａｄｄ４５β−結合表面を通じてＭＫＫ７を標的にし得、それによって、原則的にこの治療アプローチの有効性を提供することを意味する。
【０１３６】
（実施例１３：インビボのＧａｄｄ４５βによるＭＫＫ７不活性化は、細胞をＴＮＦα誘導アポトーシス感受性にする）
ＮＦ−κＢ／Ｒｅｌ転写因子は、アポトーシスまたはプログラム細胞死（ＰＣＤ）を調節し、そしてこの調節は、発癌、癌の化学抵抗性、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α誘導殺傷と拮抗するという役割を演じている。ＴＮＦα誘導に際し、ＮＦ−κＢの抗アポトーシス活性は、ｃ−Ｊｕｎ−Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）カスケードを抑制することを含む。Ｇａｄｄ４５ファミリーの誘導性因子のメンバーであるＧａｄｄ４５β／Ｍｙｄ１１８は、ＮＦ−κＢのこの抑制性活性で重要な役割を演じている。しかし、Ｇａｄｄ４５βがＪＮＫシグナル伝達を鈍くする機構は、理解されていない。ＭＫＫ７／ＪＮＫＫ２は、ＪＮＫシグナル伝達の特異的かつ必須のアクチベーターとして、およびＧａｄｄ４５βそしてまたＮＦ−κＢそれ自体の標的として同定される。Ｇａｄｄ４５βは、ＭＫＫ７に直接結合し、そしてその触媒活性をブロックし、それによって、ＮＦ−κＢとＪＮＫ経路との間の分子リンクを提供する。Ｇａｄｄ４５βはＴＮＦα誘導細胞傷害性と拮抗するために必要であり、そしてＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７相互作用を中断するペプチドは、Ｇａｄｄ４５βおよびＮＦ−κＢの能力を-妨害し、この細胞傷害性を抑制する。これらの結果は、ＪＮＫ活性化のＮＦ−κＢ制御の基礎を確立し、そしてＭＫＫ７を、抗炎症治療および抗癌治療のための潜在的な標的として同定する。
【０１３７】
これらのデータは、Ｇａｄｄ４５βによりＭＫＫ７不活性化を防ぐことが、インビボでのＴＮＦα誘導性アポトーシスに細胞を感受性にすることを予見する。ＭＫＫ７模倣ペプチドを、細胞透過性ＨＩＶ−ＴＡＴペプチドに融合し、そして細胞中に形質導入した。フローサイトメトリー（ＦＣＭ）および共焦点顕微鏡によって示されるように、ペプチドは、相当する効率で細胞に侵入した（図３４ａ〜ｄ）。ペプチド１は、ＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５β細胞のＴＮＦα誘導殺傷に対する感受性を顕著に増加したが、予期されるように、ＤＭＳＯ処置細胞はこの殺傷に対して抵抗性であった（図３３ａ、左；）。ペプチド１は、最低限の基底細胞傷害性を示し、これはその影響が、ＴＮＦα刺激に特異的であったことを示し、そしてペプチド７を含むその他のペプチドは、ＴＮＦαに対するアポトーシス応答に関して影響を有さなかった。さらに、ペプチド１のインビボでの影響を、Ｇａｄｄ４５β、Ａｌａ変異体ペプチドのプロアポトーシス活性にリンクさせることは、インビトロでのＧａｄｄ４５βに対するそれらの見かけの結合親和性と関連していた（図３２ｄおよび３３ａ、右）。ＭＫＫ７はＮＦ−κＢの標的であるという概念と一致して、ペプチド１は、ＮＦ−κＢ習得細胞−これは、通常、この殺傷に抵抗性である−におけるＴＮＦα誘導殺傷を促進した（Ｎｅｏ；図３３ｂ）。Ｇａｄｄ４５β発現クローンで観察されたように、このペプチドは、非処理細胞で最小の細胞傷害性を示し、そしてＧａｄｄ４５βとの相互作用に必要な残基の変異は、ＴＮＦα細胞傷害性に対するその影響をなくした（図３３ｂ、右）。ともに、これらの知見は、Ｇａｄｄ４５βがＪＮＫカスケードを、ＭＫＫ７を阻害することにより停止し、そして原因であるＧａｄｄ４５β保護活性をこの阻害にリンクさせることを実証する。さらに、ＭＫＫ７のブロックは、ＮＦ−κＢによるアポトーシスの抑制にとって重要であり、そしてこのブロックは、少なくとも一部分Ｇａｄｄ４５βの誘導により媒介される。
【０１３８】
慢性関節リウマチおよび炎症性腸疾患のような慢性の炎症性状態は、ＴＮＦαおよびＮＦ−κＢの相互活性化により生成されるポジティブフィードバックループによって駆動される。さらに、いくつかの悪性腫瘍は、それらの生存−ＪＮＫシグナル伝達の抑制を含み得るプロセス−のためにＮＦ−κＢに依存している。これらの結果は、ＮＦ−κＢのＭＫＫ７をシャットダウンする能力のブロックが、自己反応性／炎症促進性細胞、そして、恐らく、癌細胞のアポトーシスを促進し得ることを示唆し、それによって、ＭＫＫ７−Ｇａｄｄ４５β相互作用を、潜在的な治療標的として同定する。ＭＫＫ７へのＧａｄｄ４５β結合を中断する薬理学的化合物は、ＮＦ−κＢの抗アポトーシスおよび炎症促進性機能と連関せず、そして、それで、現在これらの病気を処置するために用いられている全体的なＮＦ−κＢブロッカーで観察される強力な免疫抑制副作用を回避する。ＮＦ−κＢ習得細胞におけるＭＫＫ７ペプチドのプロアポトーシス活性は、重要なＮＦ−κＢ誘導性インヒビターが、そのＧａｄｄ４５β−結合表面またはその近傍を通じてＭＫＫ７を標的にし得、それによって、原則的にこの治療アプローチの有効性を提供することを示す。
【０１３９】
（実施例１４：ＪＮＫＫ２活性の細胞特異的調節）
マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）において、Ｇａｄｄ４５β切除は、ＴＮＦα誘導性ＰＣＤに影響を及ぼさないことが報告された。ＭＫＫ７由来ペプチドの効果を、これらの細胞において試験した。驚くべきことに、野生型線維芽細胞において、サイトカイン誘導性毒性は、ペプチド１およびペプチド２の両方によって劇的に増強されたのに対して、他のペプチドでの処置は、この毒性に影響なかった（図３３ｃ）。このことは、３ＤＯリンパ球細胞において見られることと一致し、ここでペプチド１のみが、ＴＮＦαによる殺傷を促進した（図３３ｂ）。ペプチド２は、Ｇａｄｄ４５βに結合しない（図３２ｂおよびｄ）ので、そのアポトーシス促進活性は、さらなる阻害性因子のＭＫＫ７からの置換に起因するようである。ペプチド２（ＭＫＫ７／ＪＮＫＫ２のａａ１４２〜１６６）は、アミノ酸配列ＮＨ２−ＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ−ＣＯＯＨを有し、そのＴＡＴ融合バージョンは、アミノ酸配列ＮＨ２−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＴＧＨＶＩＡＶＫＱＭＲＲＳＧＮＫＥＥＮＫＲＩＬＭＤ−ＣＯＯＨを有する。ＭＫＫ７由来ペプチド２は、（ａ）乳癌細胞（細胞死が、形態的基準によってスコア付けされる）における殺傷を誘導する、および（ｂ）細胞死がＥＬＩＳＡベースの方法によってスコア付けされる、Ｇａｄｄ４５βノックアウトマウスにおけるＴＮＦα誘導性アポトーシスを促進する。
【０１４０】
この考えと一致して、ペプチド２のアポトーシス促進活性は、ｇａｄｄ４５β−／−  ＭＥＦ（図３３ｄ）において保持される（および、実際に、増強される）。しかし、顕著には、Ｇａｄｄ４５β切除は、これらの細胞をペプチド１の細胞傷害性効果に対して完全に鈍感にした。このことは、野生型線維芽細胞において、これらの効果が、Ｇａｄｄ４５β不活性化に起因することを示す。まとめると、これらの結果は、ＴＮＦαに応答して活性化したＭＫＫ７阻害性機構が、組織特異的であること（３ＤＯ細胞および線維芽細胞におけるＭＫＫ７ペプチドの異なる効果によって示される；図３３ｂ〜ｄ）、および少なくともＭＥＦにおいて、この機構が、機能的に過剰であることを実証する。これらはまた、Ｇａｄｄ４５βが、ＴＮＦα誘導性殺傷をアンタゴナイズするために必要である（図３３ｃ）という説得力のある証拠を提供する。ｇａｄｄ４５β−／−線維芽細胞において以前に報告されたアポトーシス性表現型の明らかな欠如は、補完的機構（ペプチド１による急性Ｇａｄｄ４５β不活性化の間に上昇することができない機構）の活性化に起因するようである。
【０１４１】
従って、特定の細胞型（例えば、線維芽細胞）において、ＪＮＫキナーゼ、ＭＫＫ７／ＪＮＫＫ２を結合および阻害する、Ｇａｄｄ４５β以外の因子が存在する。Ｇａｄｄ４５βと同様に、これらの因子は、腫瘍壊死因子−レセプター（ＴＮＦ−Ｒ）ファミリー（例えば、ＴＮＦ−Ｒ１およびＦａｓ）のレセプターによって誘発される、プログラムされた細胞死またはアポトーシスの強力なインヒビターである。Ｇａｄｄ４５βと同様に、これらの因子の生存促進活性は、ＭＫＫ７の直接の標的化、およびＩＮＫカスケードの結果として生じる阻害によって媒介される。これらの因子の発現は、ＮＦ−κＢ（免疫および炎症性応答を調整し、そしておよび細胞生存を制御し、腫瘍形成および癌化学療法抵抗性において重要な役割を果たす転写因子のファミリー）によって調節され得る。ＮＦ−κＢインヒビターは、慢性炎症状態（例えば、慢性関節リウマチおよび炎症性腸疾患）ならびに特定の悪性疾患（例えば、ホジキンリンパ腫および多発性骨髄腫）を処置するために使用される。しかし、これらのインヒビター（例えば、グルココルチコイド）は、ＮＦ−κＢの部分的阻害を達成するのみであり得、ヒトにおけるそれらの使用を制限するかなりの副作用を示す。従って、これらの疾患の処置において、ＮＦ−κＢ標的化薬剤よりむしろ、ＮＦ−κＢの下流の抗アポトーシス性エフェクターをブロックする目的で治療剤を使用することは有益である。結果は、Ｇａｄｄ４５βに加えて、ＭＫＫ７を阻害することによって作用する他の治療標的が存在することを示す。
【０１４２】
（材料および方法）
（１．ライブラリー調製および富化）
ｃＤＮＡを、ＴＮＦα処理ＮＩＨ−３Ｔ３細胞から調製し、ｐＬＴＰベクター（Ｖｉｔｏら，１９９６）に特定の方向に導入した。富化するために、ＲｅｌＡ−／−細胞を、１００ｍｍプレート中に１．５×１０６／プレートにて播種し、２４時間後に、スフェロプラスト融合法によるトランスフェクションのために使用した。計４．５×１０６ライブラリークローンを、最初のサイクルでトランスフェクトした。ＴＮＦα（１００ユニット／ｍｌ）およびＣＨＸ（０．２５μｇ／ｍｌ）で２１時間処理した後、エピソームＤＮＡの抽出のために接着性細胞を採取し、増幅後のエピソームＤＮＡの抽出のために１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．６％  ＳＤＳ中に溶解し、ライブラリーを、次のサイクルの選択のために使用した。計４サイクルを行った。
【０１４３】
（２．構築物）
ＩκＢαＭを、ｐＣＭＸ−ＩκＢαＭ（Ｖａｎ  Ａｎｔｗｅｒｐら，１９９６）から切り出し、ｐｃＤＮＡ３−Ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ部位に連結した。全長ヒトＲｅｌＡを、ＢＳ−ＲｅｌＡ（Ｆｒａｎｚｏｓｏら，１９９２）からＰＣＲ増幅し、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＢａｍＨＩ部位に挿入した。Ｇａｄｄ４５β、Ｇａｄｄ４５αおよびＧａｄｄ４５γのｃＤＮＡを、ｐＬＴＰライブラリーに対してＰＣＲにより増幅し、両方の方向において、ＸｈｏＩ部位およびｐｃＤＮＡ  ３．１−Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ｐＥＧＦＰ−Ｇａｄｄ４５βを生成するために、Ｇａｄｄ４５βを、ｐＣＤＮＡ−ＨｙｇｒｏからＸｈｏＩ−ＸｂａＩで切り出し、リンカー５’−ＣＴＡＧＡＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＡ３’（配列番号１３）を用いて、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ部位に連結した。ｐｃＤＮＡ−Ｇａｄｄ４５αを、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩで消化し、ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩで開いたｐＥＧＦＰ−Ｃｌおよびリンカー５’−ＧＴＡＣＡＡＧＧＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＡＣＴＴＴＧＧＡＧＧ−３’（配列番号１４）に連結した。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−Ｇａｄｄ４５γを、ｐＣＤＮＡ−Ｈｙｇｒｏ−Ｇａｄｄ４５γのＢｓｐＥＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、アダプター５’−ＡＴＴＧＣＧＴＧＧＣＣＡＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴ−３’（配列番号１５）とともに、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１−Ｇａｄｄ４５αへと導入することによって生成した。ここでＧａｄｄ４５αを、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩによって切り出した。全ての構築物を、配列決定によりチェックした。ＤＮ−ＪＮＫＫ１（Ｓ２５７Ａ，Ｔ２６１Ａ）、ＤＮ−ＪＮＫＫ２（Ｋ１４９Ｍ、Ｓ２７１Ａ、Ｔ２７５Ａ）およびＭＫＫ３ｂＤＮ（Ｓ１２８Ａ、Ｔ２２２Ａ）を発現するｐＳＲα３プラスミドは、以前に記載した（Ｌｉｎら，１９９５；Ｈｕａｎｇら，１９９７）。
【０１４４】
（３．ｇａｄｄ４５βのアンチセンス構築物）
Ｇａｄｄ４５βのようなＪＮＫ経路の調節因子は、個々の機能的ポリペプチドをコードするＲＮＡ転写物に直接影響する分子によって調整され得る。アンチセンスおよびリボザイム分子は、このようなインヒビターの例であり、それは、Ｇａｄｄ４５配列またはそのフラグメント（配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１）のような特定のポリペプチドの減少、排除または阻害を達成するために特定の配列を標的にする。
【０１４５】
アンチセンスの方法論は、核酸が「相補的」配列と対合する傾向にあるという事実を利用している。アンチセンス構築物は、例えば、ＪＮＫ経路を調整するために本発明の一部分を特異的に形成する。本発明の１つの実施形態では、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号３５〜４１の核酸配列、ならびにそれらのフラグメントの部分をアンチセンス方向で含むアンチセンス構築物を含む、Ｇａｄｄ４５核酸を含むアンチセンス構築物が想定される。
【０１４６】
相補性によって、それは、ポリヌクレオチドが、標準的なワトソン−クリック相補性規則に従って、塩基対合し得るポリヌクレオチドであることを意味する。すなわち、より大きなプリンがより小さなピリミジンと塩基対合し、シトシンと対合したグアニン（Ｇ：Ｃ）、およびＤＮＡの場合、チミンと対合したアデニン（Ａ：Ｔ）、またはＲＮＡの場合ウラシルと対合したアデニン（Ａ：Ｕ）の組合せを形成する。イノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチンおよびその他のようなより一般的でない塩基をハイブリダイズ配列中に含むことは、対合を妨害しない。
【０１４７】
ポリヌクレオチドで二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを標的にすることは、三重鎖形成に至る：ＲＮＡを標的にすることは、二重らせん形成に至る。アンチセンスポリヌクレオチドは、標的細胞中に導入されるとき、それらの標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、そして転写、ＲＮＡプロセッシング、トランスポート、翻訳および／または安定性を妨害する。アンチセンスＲＮＡ構築物、またはこのようなアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡは、インビトロ、またはヒト被験体を含む宿主動物内のようなインビボいずれかで、宿主細胞内で、遺伝子転写または翻訳の両方を阻害するために採用され得る。
【０１４８】
合成のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス構築物は、プロモーターおよびその他の制御領域、遺伝子のエキソン、イントロンまたはエキソン−イントロン境界でさえに結合するように設計され得る。大部分の有効なアンチセンス構築物が、イントロン／エキソンスプライス接続部に相補的な領域を含み得ることが企図される。従って、イントロン−エキソンスプライス接続部の５０〜２００塩基内の領域に相補性をもつアンチセンス構築物が用いられ得る。いくつかのエキソン配列が、その標的選択性に重篤に影響することなくこの構築物中に含まれ得ることが観察されている。含まれるエキソン性物質の量は、用いられる特定のエキソン配列およびイントロン配列に依存して変動する。含まれるエキソンＤＮＡが多すぎるか否かは、インビトロで構築物を、正常な細胞機能が影響されるか否か、または相補的配列を有する関連する遺伝子の発現が影響されるか否かを決定することにより容易に試験し得る。
【０１４９】
ゲノムＤＮＡの部分を、ｃＤＮＡまたは合成配列と組合せ、特異的構築物を生成することは有利であり得る。例えば、最終的な構築物中にイントロンが望まれる場合、ゲノムクローンを用いる必要がある。ｃＤＮＡまたは合成ポリヌクレオチドは、構築物の残りの部分にためのより便利な制限部位を提供し得、そしてそれ故、残りの配列についても用いられ得る。
【０１５０】
（４．細胞株、トランスフェクションおよび処置）
ＭＥＦおよび３ＤＯ細胞を、１０％ウシ胎児血清を補填したＤＭＥＭおよびＲＰＭＩでそれぞれ培養した。ＲｅｌＡ−／−ＭＥＦ中の一時的トランスフェクションは、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ）の指示書に従ってＳｕｐｅｒｆｅｃｔにより実施した。ＣＨＸ（Ｓｉｇｍａ）プラスまたはマイナスＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）での細胞傷害性処置の後、接着性細胞を計数し、そしてＦＣＭ（ＦＡＣＳｏｒｔ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析し、生存ＧＦＰ＋細胞の数を評価した。３ＤＯ安定株を生成するために、トランスフェクションを、エレクトロポーレーション（ＢＴＸ）により実施し、そしてクローンをＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）および／またはＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む適切な選択培地で増殖させた。アポトーシスの評価のために、２ＤＯ細胞をＰＩ（Ｓｉｇｍａ）で染色し、そして先に記載のように（Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉら、１９９１）、ＦＣＭによって分析した。Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ、ＰＭＡ、Ｉｏｎｏｙｍｃｉｎ、過酸化水素、およびソルビトールはＳｉｇｍａから入手し；Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ（ｐｌａｔｉｎｏｌ  ＡＱ）はＶＨＡｐｌｕｓからであり、そしてＰＤ９８０５９およびＳＢ２０２１９０は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍからであった。
【０１５１】
（５．ノザンブロット、ウェスタンブロット、ＥＭＳＡ、およびキナーゼアッセイ）
ノザンブロットは、６μｇの総ＲＮＡを用いる標準的手順によって実施した。パリンドロームプローブを用いるＥＭＳＡおよび総細胞抽出物の調製は、先に記載のようであった（Ｆｒａｎｚｏｓｏら、１９９２）。ウェスタンブロットには、細胞抽出物は、改変溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＮａＢＯ４、３０ｍＭ  ピロリン酸、０．５％ＮＰ−４０、およびプロテアーゼインヒビター（図１Ｂ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００緩衝液中（図４Ａ；Ｍｅｄｅｍａら、１９９７）または１％ＮＰ−４０、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、２０％グリセロール、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、５０ｍＭ  ＮａＦおよびプロテアーゼインヒビターを含む溶解緩衝液中いずれかで調製した。各回で、等量のタンパク質（１５〜５０μｇの範囲）をロードし、そしてウェスタンブロットを、標準的な手順に従って調製した。反応は、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって可視化した。抗体は以下のようであった：ＩκＢα、Ｂｉｄ、およびβアクチンはＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙから；カスパーゼ６、カスパーゼ７およびカスパーゼ９、ホスホ−ｐ３８および総−ｐ３８、ホスホ−ＥＲＫおよび総−ＥＲＫ、ホスホ−ＪＮＫおよび総−ＪＮＫは、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから；カスパーゼ−８はＡｌｅｘｉｓから；カスパーゼ２およびカスパーゼ３はＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓからであった。Ｇａｄｄ４５β特異的抗体は、Ｎ末端ペプチドに対して生成された。キナーゼアッセイは、組換えＧＳＴ−ｃ−ｊｕｎ抗体および抗−ＪＮＫ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、（Ｌｉｎら、１９９５）で実施した。
【０１５２】
（６．カスパーゼ活性の測定およびミトコンドリア膜貫通電位）
カスパーゼインビトロアッセイには、細胞を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００緩衝液中で溶解し、そして溶解物を、以下のアミノ酸トリフルオロメチルクマリン（ＡＴＣ）標識カスパーゼ特異的ペプチド（Ｂａｃｈｅｍ）の４０μＭ中でインキュベートした：ｘＶＤＶＡＤ（カスパーゼ２）、ｚＤＥＶＤ（カスパーゼ３／７）、ｘＶＥＩＤ（カスパーゼ６）、ｘＩＥＴＤ（カスパーゼ８）、およびＡｃ−ＬＥＨＤ（カスパーゼ９）。アッセイは、先に記載のように実施され（Ｓｔｅｇｈら、２０００）、そして比活性は、蛍光プレートリーダーを用いて決定された。ミトコンドリア膜貫通電位は、先の記載のように（Ｓｃａｆｆｉｄｉら、１９９９）、蛍光色素ＪＣ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．）により測定した。ＴＮＦα処理後、細胞を、１．２５μｇ／ｍｌの色素と暗所中３７℃で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで一度洗浄し、そしてＦＣＭによって分析した。
【０１５３】
（７．本発明の治療適用）
本発明は、ＪＮＫ経路、そしてそれによってアポトーシスの調整のための方法および組成物を提供する。本発明の１つの実施形態では、この調整は、Ｇａｄｄ４５βおよびその他のＧａｄｄ４５タンパク質または遺伝子の調整によって実施され得る。あるいは、治療は、ＪＮＫ経路の別の成分、例えば、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３、ＭＡＰＫＫＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼキナーゼ）：ＧＣＫ、ＧＣＫＲ、ＡＳＫ１／ＭＡＰＫＫＫ５、ＡＳＫ２／ＭＡＰＫＫＫ６、ＤＬＫ／ＭＵＫ／ＺＰＫ、ＬＺＫ、ＭＥＫＫ１、ＭＥＫＫ２、ＭＥＫＫ３、ＭＥＫＫ４／ＭＴＫ１、ＭＬＫ１、ＭＬＫ２／ＭＳＴ、ＭＬＫ３／ＳＰＲＫ／ＰＴＫ１、ＴＡＫ１、Ｔｐｌ−２／Ｃｏｔ．ＭＡＰＫＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ）：ＭＫＫ４／ＳＥＫ１／ＳＥＲＫ１／ＳＫＫ１／ＪＮＫＫ１、ＭＫＫ７／ＳＥＫ２／ＳＫＫ４／ＪＮＫＫ２．ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化キナーゼ）：ＪＮＫ１／ＳＡＰＫγ／ＳＡＰＫ１ｃ、ＪＮＫ２／ＳＡＰＫα／ＳＡＰＫ１ａ、ＪＮＫ３／ＳＡＰＫβ／ＳＡＰＫ１ｂ／ｐ４９Ｆ１２に関し得る。
【０１５４】
さらに、多数のホスファターゼ、骨格タンパク質（ＪＩＰ１／ＩＢ１、ＪＩＰ２／ＩＢ２、ＪＩＰ３／ＪＳＡＰを含む）および他の活性化補因子および阻害補因子が存在し、これらもまた、ＪＮＫシグナル伝達の調節において重要であり、そして本発明に従って調節され得る。治療的使用が、アポトーシスの増加または減少により影響され得る潜在的にすべての状態のために適切である。本発明は、重要である。なぜなら、多くの疾患が、アポトーシスの阻害または増加に関係しているからである。アポトーシスの阻害に関係する状態としては、癌、自己免疫障害（例えば、全身性エリテマトーデスおよび免疫媒介性糸球体腎炎）、ならびにウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス属感染、ポックスウイルス属感染、およびアデノウイルス属感染）が挙げられる。従って、本発明は、アポトーシスの阻害に関係するこれらおよび他の状態を処置するための治療を提供し、この治療は、アポトーシスを増加するＪＮＫ経路調節因子の投与を包含する。Ｇａｄｄ４５のアップレギュレーションがアポトーシスをブロックするので、アポトーシスの阻害により引き起こされる疾患は、例えば、Ｇａｄｄ４５の阻害を介してＪＮＫ活性化を増加することを目的とする治療から、利益を受ける。そのような阻害が達成され得る方法の一例は、アンチセンスＧａｄｄ４５核酸の投与による。
【０１５５】
アポトーシスの調節のため、特にアポトーシスの増加のための、特定の使用は、癌の処置のためである。これらの場合、１つ以上の他の治療の組み合わせを含む処置が、望まれ得る。例えば、ＪＮＫ経路の調節因子は、従来の化学療法または放射線療法と組み合わせて使用した場合に、非常に有益であり得る。当業者に公知の広範な種類の癌治療が、個別にか、または本明細書中に提供されるＪＮＫ経路の調節因子と組み合わせて、使用され得る。併用療法は、ＪＮＫ経路に関与する遺伝子またはタンパク質を調節し得る因子を使用して治療の有効性を増加するために、使用され得る。ＪＮＫ経路のそのような調節因子は、センス核酸またはアンチセンス核酸を含み得る。
【０１５６】
併用療法の一例は、放射線治療、およびその後の、ＪＮＫ経路を調節し得るタンパク質の核酸配列（例えば、センスＧａｄｄ４５β核酸配列またはアンチセンスＧａｄｄ４５β核酸配列）を用いる遺伝子治療である。あるいは、当業者は、手術および／または化学療法、および／または免疫療法、および／または他の遺伝子治療、および／または局所熱治療と組み合わせて、ＪＮＫ調節因子ベースの抗癌治療を使用し得る。従って、当業者は、当該分野に存在する標準的癌治療のうちの１つまたはいくつかを本発明のＪＮＫ調節因子ベースの治療に加えて、使用し得る。
【０１５７】
他の癌治療は、数分間〜数日間〜数週間の範囲にわたる間隔で、ＪＮＫ経路調節因子ベースの治療の前に行われ得るか、または後に行われ得る。他の癌治療およびＧａｄｄ４５βインヒビターベースの治療が一緒に投与される実施形態において、当業者は、一般には、有意な時間が各送達時刻の間に満了しなかったことを確実にする。このような場合、当業者が、患者に、互いに約１２時間〜２４時間内に、より好ましくは互いに約６〜１２時間内に、両方の治療様式を投与すること、そしてほんの約１２時間の遅延時間が最も好ましいことが、企図される。しかし、いくつかの状況において、数日間（２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、または７日間）〜数週間（１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、または８週間）が、個々の投与の間で経過する場合に、処置のための時間を伸長することが有意に望ましくあり得る。
【０１５８】
別の癌治療およびＧａｄｄ４５βインヒビターベースの治療のいずれかの１回より多くの投与が、完全な癌治癒を達成するために必要とされることもまた、考えられる。種々の組み合わせが、使用され得る。ここで、他の癌治療が「Ａ」であり、ＪＮＫ経路調節因子ベースの治療処置（Ｇａｄｄ４５インヒビターを用いる処置を含む）が「Ｂ」であり、下記のように例証される：
【０１５９】
【化１】
2005040137.tif 000008
他の組み合わせもまた、企図される。いくつかの一般的治療剤の記載が、以下に提供される。
【０１６０】
（８．化学療法剤）
癌処置の場合、併用療法において使用するための他の種類の薬剤は、化学療法剤である。これらの薬剤は、腫瘍細胞に選択的かつ有害に影響を与え得る。ＤＮＡ損傷を引き起こす薬剤は、１つの型の化学療法剤を含む。例えば、直接ＤＮＡを架橋する薬剤、ＤＮＡ中にインターカレートする薬剤、および染色体異常および核酸合成に影響することによって有糸分裂異常をもたらす薬剤である。化学療法剤のいくつかの例としては、以下が挙げられる：抗生物質化学療法剤（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン（ムタマイシン（ｍｕｔａｍｙｃｉｎ）および／またはマイトマイシンＣとしても公知である）、アクチノマイシンＤ（ダクチノマイシン）、ブレオマイシン、プリコマイシン）；植物アルカロイド（例えば、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン）；種々の薬剤（例えば、シスプラチン、ＶＰ１６、腫瘍壊死因子、アルキル化剤（例えば、カルムスチン、メルファラン（アルケラン、Ｌ−フェニルアラニンマスタード、フェニルアラニンマスタード、Ｌ−ＰＡＭ、またはＬ−サルコリシンとしても公知であり、これは、ナイトロジェンマスタードのフェニルアラニン誘導体である）、シクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン（ミレラン（ｍｙｌｅｒａｎ）としても公知）、ロムスチン）；ならびに他の薬剤（例えば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、カンプトテシン、イフォスファミド（Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ニトロソ尿素、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲンレセプター結合因子、ゲンシタビエン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）、マベルビン（Ｍａｖｅｌｂｉｎｅ）、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビター、トランスプラチナ（Ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル、およびメトトレキサート、テマキソロミド（Ｔｅｍａｘｏｌｏｍｉｄｅ）（ＤＴＩＣの水性形態）、または上記の任意のアナログもしくは誘導改変体。
【０１６１】
（ａ．シスプラチナム（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎｕｍ））
核酸（特にＤＮＡ）に直接架橋する薬剤は、変異体腫瘍崩壊性ウイルスとの相乗的抗新形成組み合わせをもたらすＤＮＡ損傷を容易にすることが予期される。シスプラチナム（ｃｉｓｐｌａｔｉｎｕｍ）薬剤（例えば、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ））および他のＤＮＡアルキル化剤が、使用され得る。シスプラチナムは、癌を処置するために広範に使用されており、合計３回の治療単位の間に３週間毎に５日間の間に２０ｍｇ／ｍ２の有効用量が、臨床適用において使用される。シスプラチンは、経口吸収されず、従って、静脈内注射、皮下注射、腫瘍内注射、または腹腔内注射を介して送達されなければならない。
【０１６２】
（ｂ．ダウノルビシン）
ダウノルビシンハイドロクロライド、５，１２−ナフタセネジオン（ｎａｐｈｔｈａｃｅｎｅｄｉｏｎｅ）、（８Ｓ−ｃｉｓ）−８−アセチル−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−ａ−Ｌ−リクソ（ｌｙｘｏ）−ヘキサノピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−１０−メトキシ−，ハイドロクロライド；セルビジン（ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ）とも呼ばれ、そしてＷｙｅｔｈから入手可能である。ダウノルビシンは、ＤＮＡにインターカレートし、ＤＮＡを用いるＲＮＡポリメラーゼをブロックし、そしてＤＮＡ合成を阻害する。それは、核酸合成を妨げない用量によって、細胞分裂を阻害し得る。
【０１６３】
他の薬剤との組み合わせにおいて、成体における急性骨髄性白血病において（寛解の誘導のために）、急性リンパ性白血病、および慢性骨髄性白血病の急性段階の第１に選択される治療療法に含まれる。経口吸収は、乏しく、そして静脈内に投与されなければならない。分布の半減期は、４５分間であり、排泄半減期は、約１９時間である。その活性代謝物ダウノルビシノールの半減期は、約２７時間である。ダウノルビシンは、大部分が肝臓で代謝され、そして胆汁中に分泌される（約４０％）。投与用量は、肝不全または腎不全においては、減少されなければならない。
【０１６４】
適切な用量（塩基当量）は、６０歳未満の成人の静脈内の場合、４５ｍｇ／ｍ２／日（６０歳以上の患者については、３０ｍｇ／ｍ２）で、３週間または４週間ごとに、１，２または３日間、または０．８ｍｇ／ｋｇ／日で、３週間または４週間ごとに、３〜６日間であり；生涯において、５５０ｍｇ／ｍ２を超えない量である、ただし胸部の照射があった場合は、４５０ｍｇ／ｍ２である；小児の場合（２歳未満でも身体表面積が０．５ｍでもない場合）、週に一度２５ｍｇ／ｍ２、この場合、体重に基づく成人のスケジュールを使用する。それは、注入可能な投与形態（塩基当量）２０ｍｇ、（ハイドロクロライド２１．４ｍｇの塩基当量として）。例示的な用量は、１０ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、１７５ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、２２５ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、２７５ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、４２５ｍｇ／ｍ２、４５０ｍｇ／ｍ２、４７５ｍｇ／ｍ２、５００ｍｇ／ｍ２であり得る。当然のことながら、これら投与量の全てが例示的であり、そしてこれらの点の間の任意の投与量もまた、本発明において有用であることが予測される。
【０１６５】
（９．免疫治療）
本発明に従って、治療適用において、免疫治療を、ＪＮＫ経路の調節因子と組み合わせて、使用し得る。あるいは、免疫治療を使用して、ＪＮＫ経路を介するアポトーシスを調節し得る。例えば、抗Ｇａｄｄ４５β抗体またはＪＮＫ経路の他の成分に対する抗体を使用して、標的分子の機能を破壊して、それによってＧａｄｄ４５を阻害し、アポトーシスを増加し得る。あるいは、抗体を使用して、ＪＮＫ経路の調節因子を、それを必要とする細胞に標的送達し得る。例えば、免疫エフェクターは、腫瘍細胞表面の、あるマーカーに特異的な抗体であり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、癌胎児抗原、前立腺特異的抗原、尿腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシンセ（ｔｙｒｏｓｉｎｓｅ）（９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス（Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ）抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲンレセプター、ラミニンレセプター、ｅｒｂＢおよびｐ１５５が挙げられる。
【０１６６】
本発明の実施形態において、抗体は、抗Ｇａｄｄ４５β抗体であり得る。抗体単独で、治療のエフェクターとして作用し得るか、または他の細胞を補充して、実際に細胞の殺傷を起こし得る。抗体はまた、薬物または毒素（化学治療剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素、など）と結合体化して、単に標的化剤として作用し得る。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞中の標的（例えば、Ｇａｄｄ４５β）に対して、直接的かまたは間接的のいずれかで相互作用する表面分子を保有するリンパ球であってもよい。種々のエフェクター細胞としては、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が挙げられる。これらのエフェクターは、細胞死およびアポトーシスを引き起こす。アポトーシス癌細胞は、樹状細胞およびマクロファージを含む細網内皮細胞によって取り除かれ、そして、抗腫瘍免疫を生じるために免疫系に提示される（Ｒｏｖｅｒｅら、１９９９；Ｓｔｅｉｎｍａｎら、１９９９）。免疫刺激分子は、免疫治療として提供され得る：例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、γ−ＩＦＮのようなサイトカイン、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８のようなケモカイン、ならびにＦＬＴリガンドのような成長因子。Ｇａｄｄ４５インヒビターと組み合わせた、免疫刺激分子（タンパク質として、または遺伝子送達を用いるかのいずれかで）の組み合わせは、抗腫瘍効果を増強する。このことは、以下を含み得る：（ｉ）以下を含む受動免疫治療：抗体単独の注入；毒素または化学治療剤と結合した抗体の注入；放射性同位元素と結合した抗体の注入；抗イデオトープ抗体の注入；そして最後に、骨髄中の腫瘍細胞の除去；ならびに／あるいは（ｉｉ）抗原性ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、あるいは自己由来または同種異系の腫瘍細胞組成物、あるいは「ワクチン」を投与する能動免疫治療（一般的に、異なる細菌アジュバントを用いる）（ＲａｖｉｎｄｒａｎａｔｈおよびＭｏｒｔｏｎ、１９９１；ＭｏｒｔｏｎおよびＲａｖｉｎｄｒａｎａｔｈ、１９９６；Ｍｏｒｔｏｎら、１９９２；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、１９９０；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、１９９３）、ならびに／あるいは（ｉｉｉ）患者の循環リンパ球または腫瘍に浸潤したリンパ球がインビトロにおいて単離され、ＩＬ−２のようなリンホカインによって活性化されるか、または腫瘍壊死のための遺伝子を導入されて、再度投与される、養子免疫治療（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９９８；１９８９）。
【０１６７】
（１０．遺伝子治療）
本発明に従う治療は、１つ以上の治療用ポリヌクレオチドが、必要とする患者に投与される遺伝子治療を含み得る。この治療は、ＪＮＫ経路の調節因子である核酸の投与を含み得、そしてまた、ＪＮＫ経路の調節因子と組み合わされた任意の他の治療用ヌクレオチドの投与を含み得る。本発明に従う癌治療の１つの実施形態は、Ｇａｄｄ４５βのインヒビターである核酸配列（例えば、Ｇａｄｄ４５βインヒビターポリペプチドまたはアンチセンスＧａｄｄ４５β配列をコードする核酸）の投与を包含する。他の治療剤（遺伝子治療剤を含む）と組み合わせた、ＪＮＫインヒビターポリペプチドをコードするベクターまたはアンチセンスＪＮＫ経路調節因子を含むベクターの送達は、標的組織に対する、組み合わされた抗過剰増殖効果を有する。種々のタンパク質が、本発明者らによって、ＪＮＫ経路の調節因子と組み合わされた遺伝子治療のための標的として、想定され、そのいくつかが、以下に記載される。
【０１６８】
（１１．臨床プロトコール）
Ｇａｄｄ４５遺伝子によるその活性または発現を含む、ＪＮＫ経路の調節因子（例えば、Ｇａｄｄ４５タンパク質のインヒビター）を使用する癌の処置を促進するための臨床プロトコールが、本明細書中に記載される。このプロトコールは、同様に、アポトーシスの減少に関連する他の状態のために使用され得る。あるいは、このプロトコールは、Ｇａｄｄ４５のインヒビターを、Ｇａｄｄ４５のアクチベータで置換することによって、アポトーシスの増加と関連する処置を評価するために使用され得る。
【０１６９】
（１２．治療用キット）
ＪＮＫ経路の調節因子を含む治療用キットもまた、本明細書中に記載される。このようなキットは、一般に、適切な容器手段中に、ＪＮＫ経路の少なくとも１つの調節因子の薬学的に受容可能な処方物を含む。このキットはまた、他の薬学的に受容可能な処方物（例えば、ＪＮＫ経路の調節因子を、処置を必要とする患者または細胞型の異なる領域に標的化するための成分、あるいはＪＮＫ経路の調節因子と共に作用し得る範囲の薬物（例えば、化学療法剤）の任意の１つ以上を含む処方物）を含み得る。
【０１７０】
キットは、任意のさらなる成分を含むかまたは含まない、ＪＮＫ経路の調節因子を含む単一の容器手段を有し得るか、あるいは、これらのキットは、各々の所望の因子のための別個の容器手段を有し得る。キットの成分が１つ以上の液体溶液で提供される場合、液体溶液は、水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。しかし、キットの成分は、乾燥粉末として提供され得る。試薬または成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成され得る。溶媒がまた、別の容器手段で提供され得ることが想定される。キットの容器手段は、一般的に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器または他の容器手段を備え、これらの中に、モノテルペングリコシド／トルテルペングリコシド、および任意の他の所望の因子が、配置され得、そして好ましくは、適切に分割され得る。さらなる成分が含まれる場合、キットはまた、一般的に、これらが配置される第２のバイアルまたは他の容器を含み、これは、別々に設計された用量の投与を可能にする。キットはまた、滅菌の薬学的に受容可能な緩衝液または他の希釈液を含むための第２／第３の容器を備え得る。
【０１７１】
キットはまた、動物または患者にＪＮＫ経路の調節因子を投与するための手段（例えば、１つ以上の針もしくは注射器、または点眼器、ピペット、もしくは他のこのような類似の装置（これから、処方物が、動物に注射され得るか、または身体の疾患領域に適用され得る）さえ）を備え得る。本発明のキットはまた、代表的に、バイアルなどおよび他の成分を市販のために密閉して含むための手段（例えば、所望のバイアルおよび他の装置が配置および保持される射出成形プラスチック容器またはブロー成形プラスチック容器）を備える。
【０１７２】
（１３．Ｇａｄｄ４５組成物）
本発明の特定の局面は、Ｇａｄｄ４５の調節因子を含む。本発明の１つの実施形態において、調節因子は、Ｇａｄｄ４５または他の遺伝子またはタンパク質であり得る。本発明の特定の実施形態において、インヒビターは、アンチセンス構築物である。アンチセンス構築物は、アンチセンス方向の完全長コード配列を含み得、そしてまたコード配列の一部を含んでも良いしまたは含まなくても良い１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。ＪＮＫ経路の潜在的調節因子（Ｇａｄｄ４５β）の調節因子を含む）としては、例えば、生体膜を通る自由な移動を可能にするための、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ由来のペプチドまたはＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質に融合され得る合成ペプチド；ドミナントネガティブ作用変異タンパク質（これらのタンパク質をコードする構築物を含む）；ならびに天然および合成の化合物などが挙げられ得る。本発明に従う調節因子はまた、例えば、Ｇａｄｄ４５タンパク質の過剰発現を引き起こすことによって、Ｇａｄｄ４５をアップレギュレートし得る。同様に、Ｇａｄｄ４５をコードする核酸は、標的細胞に送達されて、Ｇａｄｄ４５を増加し得る。Ｇａｄｄ４５をコードする核酸配列は、Ｇａｄｄ４５の過剰発現を引き起こし得る異種プロモーターに作動可能に連結され得る。
【０１７３】
例示的なＧａｄｄ４５遺伝子は、ヒトｃＤＮＡについてのＧｅｎｂａｎｋ受け入れ番号ＮＭ−０１５６７５、ヒトタンパク質についてのＮＰ  ０５６４９０．１、マウスｃＤＮＡについてのＮＭ−００８６５５およびマウスタンパク質についてのＮＰ−０３２６８１．１から得られ得る。同様に、Ｇａｄｄ４５αヌクレオチド配列およびＧａｄｄ４５αタンパク質配列について、Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号は、以下である：ヒトｃＤＮＡについてＮＭ−００１９２４；ヒトタンパク質についてのＮＰ−００１９１５；マウスｃＤＮＡについてのＮＭ−００７８３６およびマウスタンパク質についてＮＰ−０３１８６２．１。Ｇａｄｄ４５γヌクレオチド配列およびＧａｄｄ４５γタンパク質配列について、Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号は、以下である：ヒトｃＤＮＡについてＮＭ−００６７０５；ヒトタンパク質についてのＮＰ−００６６９６．１；マウスｃＤＮＡについてのＮＭ−０１１８１７およびマウスタンパク質についてＮＰ−０３５９４７．１。核酸の連続したストレッチ（これらの配列の約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約３００、約４００、約５５、約５５０、約７５０、約１００、約１０００、約１２５０および約１５００またはそれ以上の連続した核酸を含む）がまた、本発明の一部を形成する。Ｇａｄｄ４５プロモーター配列の結合部位は、ｋＢ−１、ｋＢ−２およびｋＢ−３のコア結合部位を含み、これらの配列のいずれかによって与えられ、本明細書中に記載される方法および組成物において使用され得る。
【０１７４】
固体支持体に結合される上記配列のいずれかを含むアレイが、本発明者によってさらに具体的に企図される。Ｇａｄｄ４５およびＪＮＫ経路の他の成分のタンパク質はまた、アレイを作製するために使用され得、これは、これらの配列の約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０またはそれ以上の連続したアミノ酸を含むその一部を含む。
【０１７５】
（１４．リボザイム）
ＪＮＫ経路の成分に特異的なリボザイム（Ｇａｄｄ４５β特異的リボザイムを含む）の使用はまた、本発明の一部である。以下の情報は、先の段落を補い、そして、この試みにおける当業者を手助けするために提供される。
【０１７６】
リボザイムは、部位特異的様式で核酸を切断するＲＮＡタンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的触媒ドメインを有する（ＫｉｍおよびＣｅｃｈ、１９８７；Ｇｅｒｌａｃｋら、１９８７；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、１９８７）。例えば、多数のリボザイムは、高い程度の特異性を有するホスホエステル移動反応を加速し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質のいくつかのホスホエステルのうちの１つのみを切断する（Ｃｅｃｈら、１９８１；ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ、１９９０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ、１９９２）。この特異性は、化学反応の前に、基質が、リボザイムのインターナルガイド配列（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｇｕｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（「ＩＧＳ」）に対する特異的な塩基対形成相互作用によって結合する必要条件に帰している。
【０１７７】
（１５．タンパク質）
（ａ．コードされるタンパク質）
それぞれの遺伝子によってコードされるタンパク質は、多量のポリペプチド産物を作製するためにかなり多くの異なる組換えＤＮＡ発現系において発現され得、このポリペプチド産物は、次いで、精製され得、そしてさらなる研究が実施され得る抗血清を作製するために動物をワクチン接種するために使用され得る。本発明の１つの実施形態において、Ｇａｄｄ４５遺伝子産物またはその発現を阻害する核酸は、適切な発現系に挿入され得る。このような核酸は、Ｇａｄｄ４５のインヒビター（ドミナントネガティブ変異タンパク質を含む）をコードし得、そしてまた、アンチセンスＧａｄｄ４５核酸を含み得る。アンチセンス配列は、アンチセンス方向で全長コード配列を含み得、そしてまたコード配列の一部を含んでも良いし含まなくても良い１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。ＪＮＫ経路の潜在的調節因子（Ｇａｄｄ４５βの調節因子を含む）は、例えば、生体膜を通る自由な移動を可能にするための、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ由来のペプチドまたはＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質に融合され得る合成ペプチド；ドミナントネガティブ作用変異タンパク質（これらのタンパク質をコードする構築物を含む）；ならびに天然および合成の化合物などを含み得る。
【０１７８】
当業者に公知の他の発現系の例としては、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、バキュロウイスルが挙げられ、そしてポリペプチドの遺伝子コード部分の哺乳動物発現フラグメントが作製され得る。
【０１７９】
（ｂ．模倣物）
本発明に従うポリペプチドの調製のため別の方法は、ペプチド模倣物の使用である。模倣物は、タンパク質２次構造のエレメントを模倣するペプチド含有分子である。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎら、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｕｒｎ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ」、ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ、Ｐｅｚｚｕｔｏら編、ＣｈａｐｍａｎおよびＨａｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照のこと。ペプチド模倣物の使用の後ろにある基礎になる原理は、タンパク質のペプチド骨格が、分子相互作用（例えば、抗体および抗原の相互作用）を促進するような方法で、アミノ酸側鎖を方向付けるように主に存在することである。ペプチド模倣物は、天然の分子に類似の分子相互作用を可能にするように期待される。
【０１８０】
（１６．薬学的処方物および送達）
本発明の実施形態において、Ｇａｄｄ４５インヒビター核酸を含む発現構築物の送達による癌の処置のための方法が意図される。「Ｇａｄｄ４５インヒビター核酸」は、Ｇａｄｄ４５インヒビター（ポリペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびドミナントネガティブ変異体を含む）のコード配列を含み得る。同様に、他の型のインヒビター（天然または合成の化合物および他の型の因子を含む）が投与され得る。薬学的処方物は、異常なアポトーシスレベルと関連する任意の疾患を処置するために使用され得る。
【０１８１】
有効量の薬学的組成物は、一般的に、疾患またはその症状の程度を検出可能かつ反復的に改善するか、減少するか、最小化するかまたは制限するのに十分なその量として規定される。より厳密な定義は、疾患の排除、根絶または治癒を含んで、適用され得る。
【０１８２】
（１７．ＪＮＫ経路の調節因子を発見する方法）
本発明の１つの局面は、ＪＮＫまたはアポトーシスの阻害を含む、Ｇａｄｄ４５の任意の１つ以上の特性をスクリーニングする方法を包含する。調節因子は、例えば、ＪＮＫ経路に関連するポリペプチドを阻害することによってタンパク質レベルで作用し得るか、またはこのようなポリペプチドの発現を調節することによって核酸レベルで作用し得る。あるいは、このような調節因子は、ＪＮＫ経路における分子の化学的改変（例えば、分子のリン酸化）に影響し得る。スクリーニングアッセイは、アポトーシスを増加するようにＪＮＫ経路を調節する因子およびアポトーシスを減少するように作用する因子の両方であり得る。ポリペプチド活性のスクリーニングアッセイにおいて、候補物質は、最初に、基礎的生化学活性（例えば、標的分子への結合）をスクリーニングされ得、次いで、細胞、組織または動物全体のレベルにおける発現を調節する能力について試験され得る。アッセイは、Ｇａｄｄ４５タンパク質またはＧａｄｄ４５  ｍＲＮＡのレベルを検出するため、あるいはＪＮＫ経路における別の関与物（ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔ）のタンパク質または核酸のレベルを検出するために使用され得る。
【０１８３】
このようなスクリーニングのための例示的な手順は、以下に記載される。以下に提示される方法の全てにおいて、試験される薬剤は、低分子（すなわち、化合物）、ペプチド（例えば、ファージディスプレイ）、または他の型の分子のいずれかのライブラリーであり得る。
【０１８４】
（ａ．インビトロでのＧａｄｄ４５に結合する因子のスクリーニング）
９６ウェルプレートは、標準的な手順に従って、試験される因子でコーティングされる。非結合因子は、組換えＧａｄｄ４５βタンパク質とともにプレートをインキュベートする前に、洗浄される。さらなる洗浄後、プレートへのＧａｄｄ４５βの結合は、例えば、免疫検出（例えば、ＥＬＩＳＡ）のために慣用的に使用される抗Ｇａｄｄ４５β抗体および方法論を使用して、結合されたＧａｄｄ４５の検出によって評価される。
【０１８５】
（ｂ．Ｇａｄｄ４５βの、ＪＮＫ経路におけるその分子標的への結合を阻害する因子のスクリーニング）
特定の実施形態において、例えば、Ｇａｄｄ４５βを阻害またはアップレギュレートする、ＪＮＫ経路を調節する因子をスクリーニングおよび同定する方法が開示される。Ｇａｄｄ４５を阻害する化合物は、アポトーシスの阻害を有効に妨げ得、従って、細胞をアポトーシスにより感受性にする。これは、代表的に、標的ポリペプチド（例えば、Ｇａｄｄ４５タンパク質）を得ること、およびこのタンパク質を候補因子と接触させ、続いて、活性における任意の変化についてのアッセイすることによって、達成される。
【０１８６】
候補化合物は、天然に存在する化合物のフラグメントまたは一部を含み得るか、あるいは、公知の化合物の活性の組み合わせ（これは、そうでなければ、不活性である）として見出され得るのみである。好ましい実施形態において、候補化合物は、低分子である。あるいは、天然の供給源（例えば、動物供給源、細菌供給源、真菌供給源、植物供給源（葉および樹皮を含む）および海洋サンプル）から単離された化合物が、潜在的に有用な薬学的因子の存在についての候補としてアッセイされ得ることが提供される。スクリーニングされる薬学的因子がまた、化学的組成物または人工の化合物由来であるかまたはこれらから合成され得ることが理解される。
【０１８７】
組換えＧａｄｄ４５βタンパク質を、９６ウェルプレートにコートし、そして非結合タンパク質を、徹底的に洗浄することによって除去される。次いで、試験される因子は、組換えＧａｄｄ４５β相互作用タンパク質とともに、プレートに添加される。あるいは、因子は、第２のタンパク質の添加の前または後のいずれかで添加される。徹底的な洗浄後、Ｇａｄｄ４５β相互作用タンパク質へのＧａｄｄ４５βの結合は、例えば、後者のポリペプチドに対する抗体および免疫検出（ＥＬＩＳＡなど）に慣用的に使用される方法論を使用することによって評価される。いくつかの場合において、プレートを組換えＧａｄｄ４５β相互作用タンパク質でコートし、そして抗Ｇａｄｄ４５β抗体を使用することによってＧａｄｄ４５βとの相互作用を評価することが好ましくあり得る。目的は、Ｇａｄｄ４５βとそのパートナーポリペプチドとの間の会合を破壊する因子を同定することである。
【０１８８】
（ｃ．Ｇａｄｄ４５βのアポトーシスを妨げる能力を阻害する因子のスクリーニング）
高レベルのＧａｄｄ４５βを発現するＮＦ−κＢ欠損細胞株は、ＴＮＦα誘導アポトーシスに対して保護される。細胞（例えば、３ＤＯ−ＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５βクローン）は、９６ウェルプレートにおいて増殖され、試験される因子に暴露され、次いで、ＴＮＦαで処理される。アポトーシスは、標準的な方法論（例えば、比色ＭＴＳアッセイ、ＰＩ染色など）を使用して測定される。コントロールは、ＴＮＦαの非存在下で、因子で処理される。さらなるコントロールにおいて、ＴＮＦα感受性ＮＦ−κＢヌル細胞株（例えば、３ＤＯ−ＩκＢαＭ細胞）、ならびにＴＮＦα耐性ＮＦ−κＢコンピテント細胞（例えば、３ＤＯ−Ｎｅｏ）は、ＴＮＦαの存在下または非存在下で試験される因子に暴露される。目的は、未処理細胞での動物毒性および３ＤＯ−ＩκＢαＭ細胞または３ＤＯ−Ｎｅｏ細胞でのＴＮＦα誘導アポトーシスに対する効果がないことを用いて、ＴＮＦα処理３ＤＯ−ＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５βでのアポトーシスを誘導する因子を同定することである。これらの基準を満たす因子は、直接的または間接的のいずれかで、Ｇａｄｄ４５β機能に影響するようである。
【０１８９】
（ｄ．ＪＮＫ活性を妨げるＧａｄｄ４５βの能力を阻害する因子のスクリーニング）
細胞株、処理および因子は、ｃ．の通りである。しかし、アポトーシスよりも、ＴＮＦαによるＪＮＫ活性が評価される。このアプローチの潜在的な複雑化は、かなり多くの細胞および試薬を必要とし得ることである。従って、この型のスクリーニングは、例えば、他の方法を用いて単離される因子についての第２のスクリーニングとして最も有用ではなくてもよい。
【０１９０】
（ｅ．インビトロアッセイ）
本発明の本実施形態は、ＪＮＫ経路を調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法の使用を企図する。実施される迅速、安価かつ容易なアッセイは、結合アッセイである。標的への分子の結合は、立体的相互作用、アロステリック相互作用または荷電−荷電相互作用に起因して、本来それ自体で、阻害性であり得る。これは、溶液中または固相上で実施され得、そして最初の回のスクリーニングとして、使用されて、より洗練されたスクリーニングアッセイに移動する前に特定の化合物を迅速に排除し得る。標的は、溶液において遊離し得るか、支持体に固定され得るか、細胞の表面の中でまたは表面上において発現し得る。支持体の例としては、ニトロセルロース、カラムまたはゲルが挙げられる。標的または化合物のいずれかは、標識され得、それによって、結合の決定を可能にする。別の実施形態において、アッセイは、天然または人工の基質または結合パートナーへの標的の結合の増強を測定し得る。通常、標的は、標識された種であり、標識が結合部分の機能を妨害する可能性を減少させる。結合または結合の阻害を決定するために、遊離標識対結合標識の量が測定され得る。
【０１９１】
化合物のハイスループットスクリーニングのための技術は、ＷＯ８４／０３５６４に記載される。ハイスループットスクリーニングにおいて、多数の候補阻害性試験化合物（低分子、天然基質およびリガンドであり得るか、あるいはそのフラグメント、または構造的模倣物もしくは機能的模倣物であり得る）は、固体基質（例えば、プラスチックピンまたはいくつかの他の表面）で合成される。あるいは、精製された標的分子は、薬剤スクリーニング技術における使用のために、プレートまたは支持体上に直接的にコーティングされ得る。また、反応性領域（好ましくは、末端領域）を含む融合タンパク質は、酵素の活性領域を、固相、または支持体に連結するために使用され得る。試験化合物は、標的分子（例えば、Ｇａｄｄ４５β）と反応し、そして結合された試験化合物は、種々の方法によって検出される（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １（２）：第５章、１９９１を参照のこと）。
【０１９２】
スクリーニングされ得る低分子の例としては、有機低分子、ペプチドおよびペプチド様分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質または他の有機分子（炭素含有）もしくは無機分子が挙げられる。多くの製薬会社は、化学的混合物および／または生物学的混合物（しばしば、真菌、細菌、または藻類抽出物）の広範囲なライブラリーを有し、これは、ＪＮＫ経路を調節する化合物を同定するために、本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る。さらに、薬物発見において、例えば、タンパク質は、ハイスループットスクリーニングアッセイのために、抗体Ｆｃ部分と融合されて、新規なポリペプチド標的の潜在的調節因子を同定する。Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，８：５２−５８（１９９５）およびＫ．Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７０，（１６）：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと。
【０１９３】
本発明の特定の実施形態において、アッセイは、Ｇａｄｄ４５タンパク質、コード配列またはプロモーター核酸配列を支持体に結合する工程、Ｇａｄｄ４５βを、Ｇａｄｄ４５β核酸に結合し得る候補阻害性因子に暴露する工程を包含する。結合は、当該分野において任意の標準的手段（例えば、放射能、免疫学的検出、蛍光、ゲル電気泳動または比色手段を使用すること）によってアッセイされ得る。さおさらに、アッセイは、アポトーシスのＧａｄｄ４５β依存性遮断を開始し得る化合物の同定により、Ｇａｄｄ４５βのインヒビターについて、細胞全体を使用して実施され得る（例えば、以下の実施例８〜１１を参照のこと）。
【０１９４】
（ｆ．インビボアッセイ）
種々のトランスジェニック動物（例えば、マウス）は、調節因子の使用が、アポトーシスを導くシグナル伝達経路を調節し得る構築物を用いて作製され得る。
【０１９５】
試験化合物によるこれらの動物の処置は、動物への適切な形態の化合物の投与を含む。投与は、経口、鼻腔内、頬、または局所でさえを含む、臨床的目的または非臨床的目的のために使用され得る任意の経路による。あるいは、投与は、気管内点滴、気管支点滴、皮内注射、皮下注射、筋内注射、腹腔内注射、または静脈内注射により得る。全身静脈内注射、血液供給またはリンパ供給による局所投与が具体的に企図される。
【０１９６】
（ｇ．細胞内（ｉｎ  ｃｙｔｏ）アッセイ）
本発明はまた、細胞においてＪＮＫ経路を調節する能力について化合物をスクリーニングすることを企図する。種々の細胞株は、このようなスクリーニングアッセイのために使用され得る（この目的のために特に操作される細胞を含む）。アッセイに依存して、培養が必要とされ得る。細胞は、細胞におけるアポトーシスまたはＪＮＫ活性化をスクリーニングするための多くの異なるアッセイのいずれかを使用して試験される。
【０１９７】
本発明の特定の実施形態において、スクリーニングは、一般的に、以下の工程を包含し得る：
（ａ）ＪＮＫ経路の候補調節因子を得る工程であって、ここで、この候補は、潜在的に、ＪＮＫ経路の成分を調節し得る任意の因子（ペプチド、変異タンパク質、ｃＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは構築物、合成または天然の化合物などを含む）である、工程；
（ｂ）候補薬剤を癌細胞と混合する工程；
（ｃ）ＪＮＫ経路を調節する（ＪＮＫ経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを含む）候補物質の能力を決定し、そしてレベルアップまたはダウンレギュレーションをアッセイする工程。
【０１９８】
レベルアップまたはダウンレギュレーションは、アポトーシスが細胞において生じる程度、および細胞が例えば、癌治療に受容性である程度を決定する。調節のレベルを検出するために、免疫検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）が、考慮され得る。
【０１９９】
（１８．インビトロおよびインビボで、Ｇａｄｄ４５βを含むアポトーシス経路の調節因子を評価する方法）
Ｇａｄｄ４５βの適切な調節因子が同定された後、これらの因子は、インビトロおよび／またはインビボでＧａｄｄ４５β活性を増加または減少するために、本発明に従って使用され得る。
【０２００】
ＪＮＫ経路におけるＧａｄｄ４５βの分子標的の同定において、因子は、Ｇａｄｄ４５βとＧａｄｄ４５β相互作用タンパク質との間の物理的相互作用を破壊する能力について試験される。これは、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための当該分野で一般に使用される方法論（免疫沈降、ＧＳＴプルダウン（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）、酵母または哺乳動物ツーハイブリッド系などを含む）を使用することによって評価され得る。これらの研究について、タンパク質は、種々の系（インビトロ転写翻訳、細菌または真核生物の発現系、および類似の系を含む）を用いて作製され得る。
【０２０１】
候補因子はまた、ＪＮＫまたはアポトーシスのＧａｄｄ４５β依存性阻害に影響を及ぼす能力について評価される。これは、Ｇａｄｄ４５β（例えば、３ＤＣ−ＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５β）を安定に発現する細胞株、またはＧａｄｄ４５β発現構築物を一過性トランスフェクトされた細胞株（例えば、ＨｅＬａ、２９３、および他のもの）のいずれかを使用することによって試験され得る。細胞は、これらの因子で処理され、そして種々の誘因物質（ｔｒｉｇｇｅｒ）（例えば、ＴＮＦα）によって誘導されるアポトーシスまたはＪＮＫ活性化を阻害するＧａｄｄ４５βの能力が、標準的な方法論を使用することによって試験される。並行して、コントロール実験は、Ｇａｄｄ４５βを発現しない細胞株を使用して実施される。
【０２０２】
Ｇａｄｄ４５βを発現するトランスジェニックマウスまたは高レベルのＧａｄｄ４５βを発現する細胞株（例えば、癌細胞）を注射されたマウスが使用される。なぜなら、それらが、高レベルのＧａｄｄ４５βを天然に発現するか、またはそれらが、そうするように操作されている（例えば、トランスフェクトされた細胞）かのいずれかであるからである。次いで、動物は、試験される因子で処理され、そして種々の誘因物質によって誘導されるアポトーシスおよび／またはＪＮＫ活性化は、標準的な方法論を使用して分析される。これらの研究はまた、これらの因子の潜在的な毒性の評価を可能にする。
【０２０３】
（１９．Ｇａｄｄ４５βを含む、アポトーシス経路の調節因子を用いて癌を処置する方法）
この方法は、Ｇａｄｄ４５βタンパク質の機能、または細胞におけるタンパク質の発現のいずれかを妨害することによって、Ｇａｄｄ４５βを阻害し得る任意の因子を潜在的に得るための手段を提供する。インヒビターは、天然に存在するかまたは合成の化合物（特に、本明細書中に記載されるように単離されたもの）、アンチセンス構築物またはオリゴヌクレオチド、Ｇａｄｄ４５β変異タンパク質（すなわち、ドミナントネガティブ変異体）、Ｇａｄｄ４５βの発現または機能を妨害する変異または野生型形態のタンパク質、抗Ｇａｄｄ４５β抗体、上記タンパク質のいずれかをコードするｃＤＮＡ、リボザイム、合成ペプチドなどが挙げられ得る。
【０２０４】
（ａ．インビトロ方法）
ｉ）高レベルのＧａｄｄ４５βを発現する癌細胞（例えば、種々の乳癌細胞株）は、候補因子で処理され、そして、アポトーシスは、従来の方法（例えば、ＭＴＳアッセイ、ＰＩ染色、カスパーゼ活性化など）によって測定される。目的は、これらの因子による構成性Ｇａｄｄ４５βの発現または機能の阻害が、癌細胞におけるアポトーシスを誘導し得るか否かを決定することである。ｉｉ）別の研究において、試験される因子とともに、細胞は、ＴＮＦαまたは他の「死レセプター」（ＤＲ）のリガンド（例えば、Ｆａｓに結合するＦａｓリガンド、またはＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２の両方に結合するＴＲＡＩＬ）で処理され得る。これらの研究の目的は、Ｇａｄｄ４５βの阻害が、癌細胞を、ＤＲ誘導性アポトーシスに対してより感受性にさせるか否かを評価することである。ｉｉｉ）他の研究において、癌細胞は、従来の化学療法剤または放射線と組み合わせて、Ｇａｄｄ４５βの発現または機能を阻害する因子を用いて処理される。ＤＮＡ損傷因子は、これらの研究の重要な候補である。しかし、任意の化学療法剤が使用され得る。目的は、Ｇａｄｄ４５βの阻害が、癌細胞を、化学療法または放射線によって誘導されるアポトーシスに対してより感受性にするか否かを決定することである。
【０２０５】
（ｂ．インビボ方法）
上記方法は、動物モデルで使用される。試験される因子は、例えば、Ｇａｄｄ４５βを発現するトランスジェニックマウスまたは高レベルのＧａｄｄ４５βを発現する腫瘍細胞を注射されたマウスにおいて使用される。なぜなら、これらは、高レベルのＧａｄｄ４５βを天然に発現するか、またはこれらが、そうするように操作されている（例えば、トランスフェクトされた細胞）かのいずれかであるからである。マウスにおいて腫瘍を形成し得る細胞株が、これらの研究について特に興味がある。Ｇａｄｄ４５βインヒビターの効果は、腫瘍生存度に対して、単独で、あるいはＤＲのリガンド（例えば、ＴＮＦαおよびＴＲＡＩＬ）、化学療法剤、または放射線と組み合わせて、のいずれかで評価される。これらのアッセイはまた、動物におけるＧａｄｄ４５β阻害またはコンビナトリアル治療の特定の手段の潜在的な毒性の決定を可能にする。
【０２０６】
（２０．ＮＦ−κＢによるｇａｄｄ４５βプロモーターの調節）
κＢ結合部位を、Ｇａｄｄ４５βプロモーターにおいて同定した。ｇａｄｄ４５βプロモーターにおける機能的κＢ部位の存在は、Ｇａｄｄ４５βの調節におけるＮＦ−κＢ複合体の直接的な関係を示し、それによって、ＮＦ−κＢによって重要な保護機構を提供する。
【０２０７】
（２１．ｇａｄｄ４５βプロモーターの単離および分析）
マウスｇａｄｄ４５β遺伝子を含むＢＡＣクローンを、１２９ＳＢマウスゲノムライブラリー（マウスＥＳ  Ｉライブラリー；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）から単離し、ＸｈｏＩで消化し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ−（ｐＢＳ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＸｈｏＩ部位に連結した。ｇａｄｄ４５βの７３８４ｂｐのＸｈｏ  Ｉフラグメントを保有するｐＢＳプラスミド（ｐＢＳ−０１４Ｄ）をその後単離し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏの配列決定施設にて自動配列決定によって完全に配列決定した。ＴＲＡＮＳＦＡＣデータベース（Ｈｅｉｎｅｍｅｙｅｒら、１９９９）を使用して、推定転写因子結合ＤＮＡエレメントを同定し、一方で、ＢＬＡＳＴエンジン（Ｔａｔｕｓｏｖａら、１９９９）を、ヒトプロモーターとの比較分析のために使用した。
【０２０８】
（２２．プラスミド）
ｐＭＴ２Ｔ発現プラスミド、ｐＭＴ２Ｔ−ｐ５０発現プラスミドおよびｐＭＴ２Ｔ−ＲｅｌＡ発現プラスミドが、以前に記載された（Ｆｒａｎｚｏｓｏら、１９９２）。ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴレポーター構築物を作製するために、ｇａｄｄ４５βプロモーターの部分を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって、ｐＢＳ−０１４Ｄから増幅した。このＰＣＲは、以下のプライマーを使用した：
【０２０９】
【化２】
2005040137.tif 000009
（−５９２／＋２３−ｇａｄｄ４５β、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーにそれぞれ組み込まれたＭｌｕＩ部位およびＥｃｏＲＶ部位に、下線を付している）；
【０２１０】
【化３】
2005040137.tif 000010
。ＰＣＲ産物をＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、プロモーターを含まないｐＣＡＴ３−Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＭｌｕＩ部位およびＳｍａＩ部位に連結して、プロモーターを含まないｐＣＡＴ２−Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＭｌｕＩ部位およびＳｍａＩ部位への連結を駆動して、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の発現を駆動した。すべてのインサートを、配列決定によって確認した。−５４０７／＋２３−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴおよび−３４６５／＋２３−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴを作製するために、ｐＢＳ−０１４Ｄを、それぞれ、ＸｈｏＩまたはＥｃｏＮＩで消化し、クレノー充填（Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｉｌｉｎｇ）に供し、ＢｓｓＨＩＩでさらに消化した。生じた５０３９ｂｐのＸｈｏＩ−ＢｓｓＨＩＩフラグメントおよび３０９７ｂｐのＥｃｏＮＩ−ＢｓｓＨ  ＩＩフラグメントを、その後、−５９２／＋２３−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴの充填したＭｌｕＩ部位とＢｓｓＨＩＩ部位との間に独立して挿入した。これらの２つの後者の構築物は、−３８＋２３フラグメントに直接結合した−５４０７もしくは−３４６５のいずれかから−３６８まで広がるｇａｄｄ４５βプロモーターフラグメントを含んだ。両方のレポータープラスミドは、インタクトなκＢ−１部位、κＢ−２部位、およびκＢ−３部位を含んだ（図１０を参照のこと）。
【０２１１】
κＢ−１Ｍ−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴ、κＢ−２Ｍ−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴ、およびκＢ−３Ｍ−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴを、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造業者の指示書に従って使用して、−５９２／＋２３−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴプラスミドの部位特異的変異誘発によって得た。以下の塩基置換を導入した。
【０２１２】
【化４】
2005040137.tif 000011
を
【０２１３】
【化５】
2005040137.tif 000012
へ導入した（κＢ−１Ｍ−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴ；κＢ部位およびその変異対応物に下線を付している；変異ヌクレオチドを太字で示している）；
【０２１４】
【化６】
2005040137.tif 000013
を
【０２１５】
【化７】
2005040137.tif 000014
へ導入した。そして
【０２１６】
【化８】
2005040137.tif 000015
を
【０２１７】
【化９】
2005040137.tif 000016
へ導入した。変異したκＢ−１部位および変異したκＢ−２部位を含むκＢ−１／２−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴは、上記のようなκＢ−１の部位特異的変異誘発によって、κＢ−２Ｍ−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴから誘導した。すべての構築物について、変異κＢエレメントを含む−５９２／＋２３プロモーターフラグメントと、ＳｍａＩクローニング部位からＣＡＴポリアデニル化シグナルの終わりまで広がるｐＣＡＴ−３−Ｂａｓｉｃ領域とを、配列決定によって確認した。
【０２１８】
Δ５６−κＢ−１／２−ＣＡＴレポータープラスミド、Δ５６−κＢ−３−ＣＡＴレポータープラスミド、およびΔ５６−κＢ−Ｍ−ＣＡＴレポータープラスミドを、マウスｇａｄｄ４５βプロモーター由来の野生型オリゴヌクレオチドまたは変異型オリゴヌクレオチドを、最小マウスｃ−ｆｏｓプロモーターのすぐ上流に位置するＢｇｌＩＩ部位とＸｈｏＩ部位との間のΔ５６−ＣＡＴ中に挿入することによって、構築した。使用したオリゴヌクレオチドは、
【０２１９】
【化１０】
2005040137.tif 000017
（κＢ−１／２−ＣＡＴ；κＢ−１部位およびκＢ−２部位にそれぞれ下線を付している）；
【０２２０】
【化１１】
2005040137.tif 000018
であった。
【０２２１】
（２３．トランスフェクション、ＣＡＴアッセイ、および電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ））
ＮＴｅｒａ−２細胞のリン酸カルシウム媒介性の一過性トランスフェクションおよびＣＡＴアッセイ（シンチレーションバイアル計測を含む）を、以前に報告された（Ｆｒａｎｚｏｓｏら，１９９２，１９９３）ように実行した。ＥＭＳＡ、過剰シフト分析、ならびにヒトｐ５０およびＲｅｌＡのＮ末端ペプチドに対する抗体は、以前に記載された（Ｆｒａｎｚｏｓｏら，１９９２）とおりであった。以前に記載されたように、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、０．２ＭＭ  ＥＤＴＡ；０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２５％グリセロール、およびプロテアーゼインヒビターのカクテル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中での凍結融解の繰り返し、引き続く超遠心分離によって、トランスフェクトされたＮＴｅｒａ−２細胞からの全細胞抽出物を調製した。
【０２２２】
（２４．ＢＪＡＢクローンの生成および処理ならびにヨウ化オロピジウム（Ｏｒｏｐｉｄｉｕｍ）染色アッセイ）
安定なクローンを生成するために、ＢＪＡＢ細胞をｐｃＤＮＡ−ＨＡ−Ｇａｄｄ４５βまたは空のｐｃＤＮＡ−ＨＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトし、そして２４時間後、Ｇ４１８における選択（セルグロ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）；４ｍｇ／ｍｌ）に供した。伸長し、そしてＨＡーＧａｄｄ４５βが発現した耐性クローンを、抗ＨＡ抗体、または充填を制御するための抗βアクチン抗体を使用するウェスタンブロッティングによって評価した。
【０２２３】
次いで、高レベルのＨＡ−Ｇａｄｄ４５βを発現するクローンおよびコントロールＨＡクローン（新生クローンとも称される）を１２ウェルプレート中に供与し、そして未処理のままか、またはアゴニスト性の抗Ｆａｓ抗体ＡＰＯ−１（１μｇ／ｍｌ；Ａｌｅｘｉｓ）または組換えＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍｌ；Ａｌｅｘｉｓ）で処理した。示された時間で、細胞を回収し、２回ＰＢＳ中で洗浄し、そして０．１％クエン酸Ｎａ（ｐＨ７．４）、５０μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（ＰＩ；Ｓｉｇｍａ）、および０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む溶液中で一昼夜４°Ｃでインキュベートした。次いで、細胞を、ＦＬ−２チャネルおよびＦＬ−３チャネルの両方においてフローサイトメトリー（ＦＣＭ）によって試験し、そして２Ｎ未満のＤＮＡ含量を有する細胞（サブ−Ｇ１区分）を、アポトーシスとしてスコアリングした。
【０２２４】
ＪＮＫブロッカーＳＰ６００１２５（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）での保護処理のためにＢＪＡＢ細胞を未処理のままにしておくか、または示されるように３０分間種々の濃度のブロッカーで前処理し、次いで、さらに１６時間アゴニスト性の抗Ｆａｓ抗体ＡＰＯ−１（１μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。アポトーシスを、本明細書中で記載されるようにＰＩアッセイにおいてスコアリングした。
【０２２５】
（２５．処理、ウイルス形質導入（ｔｒａｎｄｕｃｔｉｏｎ）、およびＪＮＫヌル繊維芽細胞でのＪＮＫキナーゼアッセイ）
適切なコントロール繊維芽細胞とともに、ｊｎｋ１およびｊｎｋ２遺伝子の同時欠損を含むＪＮＫヌル繊維芽細胞を、Ｄｒ．Ｒｏｇｅｒ  Ｄａｖｉｓ（マサチューセッツ大学）から得た。細胞傷害実験のために、ノックアウト細胞および野生型細胞を、１０，０００細胞／ウェルの密度で４８ウェルプレート中に播種し、そして２４時間後、ＴＮＦα単独（１，０００Ｕ／ｍｌ）または増加濃度のシクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処理した。アポトーシスを、メーカーの指示に従って細胞死検出ＥＬＩＳＡキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｒｏｃｈｅ）を使用する処理から８時間後にモニタリングした。簡単に言えば、細胞をウェル中で直接溶解した後、細胞溶解物中の遊離ヌクレオソームを、ビオチン化抗ヒストン抗体を使用するＥＬＩＳＡによって定量した。実験は３回実行した。
【０２２６】
ＭＩＧＲ１レトロウイルスベクターを、Ｄｒ．Ｈａｒｉｎｄｅｒ  Ｓｉｎｇｈ（シカゴ大学）から得た。活性ＪＮＫ１を構成的に発現するＭＩＧＲ１−ＪＮＫＫ２−ＪＮＫ１を、ｐＳＲα−ＪＮＫＫ２−ＪＮＫ１（Ｄｒ．Ａｎｎｉｎｇ  Ｌｉｎ、シカゴ大学）から得たＪＮＫＫ２−ＪＮＫ１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを切除することによって生成し、そしてクレノー反応によってこのフラグメントを埋めた後、ＭＩＧＲ１の埋められたＸｈｏＩ部位に挿入した。高力価のレトロウイルス調製物を、ＭＩＧＲ１またはＭＩＧＲ１−ＪＮＫＫ２−ＪＮＫ１をトランスフェクトしたＰｈｏｅｎｉｘ細胞から得た。ウイルスの形質転換のために、突然変異繊維芽細胞を１００，０００／ウェルで６ウェルプレート中に播種し、そして一昼夜４ｍｌのウイルス調製物および１ｍｌの完全ＤＭＥＭ培地とともに５μｇ／ｍｌのポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）中でインキュベートした。次いで、細胞を完全培地で洗浄し、そして４８時間後、細胞傷害アッセイのために使用した。
【０２２７】
ＪＮＫキナーゼアッセイのために、細胞を未処理のままにしておくか、またはＴＮＦα（１，０００Ｕ／ｍｌ）で１０分間処理し、そして溶解物を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、５０ｍＭ  ＮａＦ、およびプロテアーゼインヒビターを含む緩衝液中で調製した。ＪＮＫを細胞溶解物から市販の抗ＪＮＫ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して免疫沈降し、そしてキナーゼアッセイを図６および７で示されるようにＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ基質を使用して実行した。
【０２２８】
（２６．ＷＥＨＩ−２３１細胞の処理および電気泳動移動度シフトアッセイ）
ＷＥＨＩ−２３１細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）の推奨に従って１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地中で培養した。電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）について、細胞を４０μｇ／ｍｌのリポ多糖類（ＬＰＳ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ血清型０１１１：Ｂ４）で処理し、そして示された時間で回収した。細胞溶解物を、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４２Ｍ  ＮａＣｌ、２５％グリセロール、およびプロテアーゼインヒビター）中での凍結融解の繰り返し、引き続く超遠心分離によって調製した。インビトロでのＤＮＡ結合アッセイについて、２μｌの細胞抽出物を、マウスｇａｄｄ４５βプロモーターにおける見出される３つのκＢ部位のそれぞれに由来する放射性標識したプローブとともに２０分間インキュベートした。インキュベーションを、１μｇ／ｍｌのポリｄＩ−ｄＣおよび０．１μｇ／ｍｌのＢＳＡを含む緩衝液Ｄ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、２０％グリセロール、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ）中で実行し、そしてＤＮＡ結合複合体をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。過剰シフトのために、抽出物を１０分間、１μｌの個々のＮＦ−κＢサブユニットと反応する抗体と共にプレインキュベートした。
【０２２９】
（２７．ＢＴ−２０細胞およびＭＤＡ−ＭＤ−２３１細胞の処理）
乳癌細胞株を、１０％ＦＣＳを補充した完全ＤＭＥＭ培地中で培養し、そして１００，０００／ウェルで１２ウェルプレート中に播種した。２４時間後、培養物を未処理のままにしておくか、または１時間示された濃度のＳＰ６００１２５インヒビター（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で前処理し、その後ＮＦ−κＢインヒビターであるプロスタグランジンＡ１、ＣＡＰＥ、またはパルセノリド（ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄｅ）（Ｂｉｏｍｏｌ）を図２０で示されるように添加した。示された時間で、細胞死を光学顕微鏡によって形態学的にスコアリングした。
【０２３０】
（２８．２９３細胞溶解物との共免疫沈降）
全長（ＦＬ）ヒトＭＥＫＫ１、ＭＥＫＫ３、ＧＣＫ、ＧＣＫＲ、ＡＳＫ１、ＭＫＫ７／ＪＮＫＫ２、およびＪＮＫ３またはマウスＭＥＫＫ４およびＭＫＫ４／ＪＮＫＫ１のいずれかを発現する１５μｇのｐｃＤＮＡ−ＨＡプラスミドで、１５μｇのＦＬマウスＧａｄｄ４５βを発現するｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−Ｇａｄｄ４５βまたは空のｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧベクター（ｐｃＤＮＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））とともに用いる、リン酸カルシウム法によって、２９３細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、細胞を回収し、そして細胞溶解物を、ＣＯ−ＩＰ緩衝液（４０ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、２０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、およびプロテアーゼインヒビター）中で細胞ペレットを再懸濁し、そしてそれらを超遠心分離に供することで調製した。
【０２３１】
共免疫沈降（ｃｏ−ＩＰ）について、２００μｇの細胞溶解物を抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）でコートしたビーズ（Ｓｉｇｍａ）とともにＣＯ−ＩＰ緩衝液中で４時間４°Ｃでインキュベートした。インキュベーション後、ビーズを４回洗浄し、そしてＳＤＳ−ポリアクリアミドゲル上に充填し、そしてウェスタンブロットを、抗ＨＡ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を使用して実行した。
【０２３２】
（２９．ＧＳＴ融合タンパク質構築およびＧＳＴプルダウンアッセイ）
マウスＧａｄｄ４５βおよびヒトＪＮＫＫ２を、それぞれ、ｐＧＥＸ−３ＸおよびｐＧＥＸ−２Ｔ細菌性発現ベクター（両方ともＡｍｅｒｓｈａｍから）のＥｃｏＲｉおよびＢａｍＨＩ部位でクローニングした。これらの構築物および挿入のないｐＧＥＸ−３Ｘベクターを、ＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５βタンパク質、ＧＳＴ−ＪＮＫＫ２タンパク質、およびＧＳＴタンパク質を発現させるためにＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１細胞に導入した。１ｍＭ  ＩＰＴＧでの誘導後、細胞をＰＢＳ中で超音波破砕によって溶解し、そしてグルタチオン−セファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）とともに１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下で沈殿させ、そして４回同じ緩衝液中で洗浄した。
【０２３３】
インビトロでの転写反応および翻訳反応を、［３５Ｓ］メチオニン存在下で、メーカーの指示書に従ってＴＮＴ結合化網状赤血球溶解システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して実行した。インビトロ反応を開始するために、ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐＢＳ）ＳＫ−プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。ＦＬマウスＭＥＫＫ４を、ｐＢＳのＳｐｅＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、そしてＴ３ポリメラーゼで転写した；ＦＬヒトＪＮＫＫ２、ＦＬマウスＪＮＫＫ１、およびＦＬヒトＡＳＫ１を、それぞれ、ｐＢＳのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ部位、ＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ部位、およびＸｂａＩ−ＡｐａＩ部位にクローニングし、そしてＴ７ポリメラーゼの使用によって転写した。ｐＢＳ−Ｃ−ＡＳＫ１（ヒトＡＳＫ１のアミノ酸６４８〜１３７５をコードする）は、ＡＳＫ１のＥａｒＩおよびＸｂａＩフラグメントの切断ならびに以下のオリゴヌクレオチドリンカー：５’−ＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＣＣＡＴ−３’の挿入によってｐＢＳ−ＦＬ−ＡＳＫ１に由来した。Ｎ−ＡＳＫ１（ＡＳｋ１の１〜７５６アミノ酸フラグメントをコードする）を、ＰｐｕＭＩで消化したｐＢＳ−ＦＬ−ＡＳＫ１でインビトロでの転写／翻訳反応をプライムすることによって得た。
【０２３４】
Ｎ末端が欠損したヒトＪＮＫＫ２を発現するｐＢＳプラスミドを、ＢａｍＨＩおよびＪＮＫＫ２のコード配列内を切断する適切な制限酵素でのｐＢＳ−ＦＬ−ＪＮＫＫ２の消化、ならびに以下：ＢａｍＨＩ部位、Ｋｏｚａｋ配列、開始ＡＴＧ、およびＪＮＫＫ２の７残基と１３残基の間をコードするヌクレオチド配列を含む（５’→３’）オリゴヌクレオチドを有する切除フラグメントでの置換によって生成し、これは、図２８において示されるＪＮＫＫ２のカルボキシ末端のアミノ酸部分をコードするｐＢＳプラスミドを生じる。ＪＮＫＫ２Ｃ末端欠損を生成するために、インビトロでの転写／翻訳反応をプライムするために使用する前に、ｐＢＳ−ＦＬ−ＪＮＫＫ２をＳａｃＩＩ、ＰｐｕＭＩ、ＮｏｔＩ、ＸｃｍＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｐＨＩ、またはＰｆｌＭＩで直線化した。結果として生じたポリペプチド産物は、図２８において示されるＪＮＫＫ２のアミノ末端アミノ酸配列を含む。
【０２３５】
Ｇａｄｄ４５βポリペプチドを生成するために、インビトロ反応をｐＢＳ−ＧＦＰ−Ｇａｄｄ４５β（ＦＬまたは切断したＧａｄｄ４５βに直接融合された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする）でプライムした。これらのプラスミドを得るために、ｐＢＳ−Ｇａｄｄ４５β（ＦＬ）、ｐＢＳ−Ｇａｄｄ４５β（４１−１６０）、ｐＢＳ−Ｇａｄｄ４５β（６０−１６０）、ｐＢＳ−Ｇａｄｄ４５β（６９−１６０）、ｐＢＳ−Ｇａｄｄ４５β（８７−１６０）、およびｐＢＳ−Ｇａｄｄ４５β（１１３−１６０）（マウスＧａｄｄ４５βの対応するアミノ酸残基をコードする）を、適切なｇａｄｄ４５β  ｃＤＮＡフラグメントをｐＢＳ  ＳＫ−のＸｈｏＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることによって生成した。次いで、これらのプラスミド（ＦＬまたは切断したＧａｄｄ４５βのいずれかをコードする）をＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで開き、そして切断したＤＮＡフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドリンカー：５’―ＧＴＡＣＡＡＧＧＧＴＡＴＧＧＣＴＡＴＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＧＴＡＧ−３’に直接結合するｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；ＧＦＰをコードする配列を含む）のＫｐｎＩ−ＢｓｒＧＩフラグメントで置換した。これらの構築物を、ｐＢＳ−ＧＦＰ−Ｇａｄｄ４５βと称した。Ｇａｄｄ４５βのＣ末端欠損を、インビトロでのタンパク質合成にするためにＮｇｏＭＩ、ＳｐｈＩ、またはＥｃｏＲＶ制限酵素で消化したｐＢＳ−ＧＦＰ−Ｇａｄｄ４５β（ＦＬ）を使用することにより、ＪＮＫＫ２欠損について記載されるように得た。これらのプラスミドは、それぞれ、Ｇａｄｄ４５βの１〜１３４アミノ酸フラグメント、１〜９５アミノ酸フラグメント、および１〜６８アミノ酸フラグメントをコードした。全てのｐＢＳ−Ｇａｄｄ４５β構築物を、Ｔ７ポリメラーゼを使用して転写した。
【０２３６】
ＧＳＴプルダウン実験について、５μｌのインビトロで翻訳され、そして放射性標識したタンパク質を、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＪＮＫＫ２（Ｇａｄｄ４５β翻訳産物を有するのみ）、またはＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５β（ＡＳＫ１、ＭＥＫＫ４、ＪＮＫＫ１、およびＪＮＫＫ２翻訳産物を有するのみ）を有するグルタチオンビーズと混合し、そして１時間室温で、２０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣ、および０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む緩衝液中でインキュベートした。次いで、このビーズを沈殿し、そして４回同じ緩衝液で洗浄し、そしてこの物質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。ＧＳＴおよびＧＳＴ−ＪＮＫＫ２またはＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５βビーズの各対と一緒に、２μｌの粗製のインビトロ転写／翻訳反応物（投入量）を充填した。
【０２３７】
（３０．キナーゼアッセイ）
キナーゼ活性に対する組換えＧａｄｄ４５βタンパク質の阻害効果を試験するために、リン酸カルシウム方法を使用することによって、３０μｇの総ＤＮＡに対して１〜１０μｇのｐＣＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＪＮＫＫ２、ｐＣＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＪＮＫＫ１、ｐＣＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＭＫＫ３ｂまたはｐＣＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＡＳＫ１、および空のｐＣＤＮＡ−ＦＬＡＧによりＨＥＫ−２９３細胞をトランスフェクトした。２４時間後、細胞を２０分間ヒトＴＮＦα（１，０００Ｕ／ｍｌ）で処理するかまたは未処理のままにし、回収し、そして２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、５０ｍＭ  ＮａＦ、およびプロテアーゼインヒビターを含む緩衝液中で溶解し、そして超遠心分離に供した。抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）をコーティングしたビーズ（Ｓｉｇｍａ）および２００μｇの細胞溶解物を使用して免疫沈降を実行した。免疫沈降後、ビーズを溶解緩衝液中で２回およびさらにキナーゼ緩衝液中で２回洗浄した。免疫沈降のキナーゼ活性についてアッセイするために、ビーズを１０分間組換えＨｉｓ６−Ｇａｄｄ４５β、ＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５β、またはコントロールタンパク質の量を増加させて、１０Ｍ  ＡＴＰおよび１０μＣｉ［３２Ｐ］−γＡＴＰを含む３０μｌのキナーゼ緩衝液中でプレインキュベートし、そして示されるように、さらに１時間３０°Ｃで１μｇの適切なキナーゼ基質とともにインキュベートした。以下のキナーゼ緩衝液を使用した：ＪＮＫＫ２について、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  β−グリセロリン酸、１ｍＭ  ＤＴＴ、および５０μＭ  Ｎａ３ＶＯ４；ＪＮＫＫ１について、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  β−グリセロリン酸、および０．５ｍＭ  ＤＴＴ；ＭＫＫ３について、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  β−グリセロリン酸、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、および５０μＭ  Ｎａ３ＶＯ４；ＡＳＫ１について、２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  β−グリセロリン酸、１ｍＭ  ＤＴＴ、および５０μＭ  Ｎａ３ＶＯ４。
【０２３８】
内因性キナーゼの活性をアッセイするために、示されたように、各酵素に特異的な適切な市販の抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）およびＴＮＦα（１，０００Ｕ／ｍｌ）での刺激前および後に、３ＤＯ−ＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５βおよび３ＤＯ−ＩκＢαＭ−Ｈｙｇｒｏクローンから得た細胞溶解産物を使用して免疫沈降を実行した。組換えＧａｄｄ４５βタンパク質との免疫沈降物をプレインキュベートすることを除いて、キナーゼアッセイを上述されたように実行した。
【０２３９】
（３１．ＲｅｌＡノックアウト細胞およびｐＥＧＦＰ−Ｇａｄｄ４５β構築物における細胞保護アッセイ）
マウスＧａｄｄ４５βのＮ末端切断物およびＣ末端切断物を発現するプラスミドを、適切なｇａｄｄ４５β  ｃＤＮＡフラグメントをｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＸｈｏＩ部位およびＢａｍＨＩ部位でクローニングすることによって得た。これらの構築物は、ＧＦＰのＮ末端に直接融合したＧａｄｄ４５βの示されたアミノ酸を発現した。細胞保護アッセイについて、製造者の指示書に従いＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用することによって、ＧＦＰ−Ｇａｄｄ４５βをコードするプラスミドまたは空のｐＥＧＦＰをＲｅｌＡ−／−細胞にトランスフェクトし、そして２４時間後、培養をＣＨＸ単独（０．１μｇ／ｍｌ）またはＣＨＸ＋ＴＮＦα（１，０００Ｕ／ｍｌ）で処理した。１２時間の処理後、ＧＦＰ陽性を評価するために、組織培養プレートに接着した生存細胞をＦＣＭによって数え、そして試験した。ＣＨＸ単独で処理したものと比較してＣＨＸおよびＴＮＦαで処理した培養中に存在する生存ＧＦＰ＋細胞の総数を外挿することによって、パーセント生存値を計測した。
【０２４０】
（３２．実施例１２におけるプラスミド）
ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＧＣＫＲ、ｐＣＥＰ−ＨＡ−ＭＥＫＫ１、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＡＳＫ１、ｐＣＭＶ５−ＨＡ−ＭＥＫＫ３、ｐＣＭＶ５−ＨＡ−ＭＥＫＫ４、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＭＥＫ１、ｐＭＴ３−ＨＡ−ＭＫＫ４、ｐＳＲα−ＨＡ−ＪＮＫ１、ｐＭＴ２Ｔ−ＨＡ−ＪＮＫ３、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＥＲＫ１、ｐＳＲα−ＨＡ−ＥＲＫ２、ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ｐ３８α、ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ｐ３８β、ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ｐ３８γ、およびｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ｐ３８δは、Ａ．Ｌｅｏｎａｒｄｉ、Ｈ．Ｉｃｈｉｊｏ、Ｊ．Ｌａｎｄｒｙ、Ｒ．Ｖａｉｌｌａｎｃｏｕｒｔ、Ｐ．Ｖｉｔｏ、Ｔ．Ｈ．Ｗａｎｇ、Ｊ．Ｗｉｍａｌａｓｅｎａ、およびＨ．Ｇｒａｍによって提供された。ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−Ｇａｄｄ４５β、ｐＧＥＸ−ＪＮＫ１、ｐＥＴ２８−Ｈｉｓ６／Ｔ７−ＪＩＰＩ（ＪＩＰ１ｂのＭＫＫ７結合ドメインを発現する）、およびｐＰｒｏＥｘ−１．Ｈｉｓ６−ＥＦ３（浮腫因子３を発現する）。他のＦＬＡＧまたはＨＡをコードする構築物全てを、ｐｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して生成した。細菌性発現のために、以下のベクター内でサブクローニングした：ｐＥＴ−２８（Ｎｏｖａｇｅｎ）におけるＨｉｓ６／Ｔ７−Ｇａｄｄ４５β；ｐＰｒｏＥｘ−１．Ｈ６２０におけるＨｉｓ６−Ｇａｄｄ４５β；ｐＧＥＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）におけるＧＳＴ−ｐ３８α、ＧＳＴ−ＭＫＫ７、およびＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５β。インビトロでの転写／翻訳をプライムするために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＢＳ）−ＭＥＫＫ４、ｐＢＳ−ＡＳＫ１、およびｐＢＳ−ＭＫＫ７を生成した（図２６）；ヒトＭＫＫ７のＮ末端切断物およびポリペプチドフラグメントを発現するｐＢＳをベースにしたプラスミド。放射性標識を増強するために、後者のプラスミドを強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に融合して発現させた。ＡＳＫ１１−７５７（ＡＳＫ１のアミノ酸１〜７５７をコードする）およびＣ末端ＭＫＫ７切断物を、それぞれ適切な制限酵素でｐＢＳ−ＡＳＫ１およびｐＢＳ−ＭＫＫ７を直線化することによって得た。
【０２４１】
（３３．処理およびアポトーシスアッセイ）
処理は以下のとおりであった；マウスＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を１，０００Ｕ／ｍｌ（図２７）または１０Ｕ／ｍｌ（図３０）；ヒトＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を２，０００Ｕ／ｍｌ；ＰＭＡおよびイオノマイシン（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）をそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌおよび１μＭ。図３０において、ＨＩＶ−ＴＡＴペプチド（５μＭ）またはＤＭＳＯでの前処理は３０分間であり、ＴＮＦαとのインキュベーションは、それぞれさらに７時間および３．５時間であった。Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用することによって、アポトーシスを測定した。
【０２４２】
（３４．結合アッセイ、タンパク質精製、およびキナーゼアッセイ）
インビトロで翻訳したタンパク質または精製したタンパク質とのＧＳＴの沈降（図２６〜３０）およびキナーゼアッセイを実行した。Ｈｉｓ６／Ｔ７−Ｇａｄｄ４５β、Ｈｉｓ６／Ｔ７−ＪＩＰ１、Ｈｉｓ６−Ｇａｄｄ４５β、Ｈｉｓ６−ＥＦ３、およびＧＳＴタンパク質を、他で記載されたように細菌溶解物から精製し、そして緩衝液Ａ１９（図２８）または５ｍＭ  Ｎａ＋リン酸緩衝液（（ｐＨ７．６）図２８、３０）に対して透析した。組換えタンパクとのキナーゼプレインキュベーションは１０分間であり（図２８、３０）、そしてペプチドまたはＤＭＳＯ（−）とのＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５βプレインキュベーションは、さらに２０分間であった（図３０）。抗Ｐ−ＭＫＫ７抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇで開発した）との免疫沈降、引き続く抗総ＭＫＫ７抗体でのウェスタンブロットを実行することによって、ＭＫＫ７のリン酸化をモニタリングした。共免疫沈降のために、抽出物をＩＰ緩衝液中に調製した。
【０２４３】
（３５．抗体）
抗ＭＫＫ７抗体は、以下であった：図２７、キナーゼアッセイ（ヤギ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）；図２７、ウェスタンブロット、および図３ａ、右上、免疫沈降（ウサギ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）；図２８、左上、ウェスタンブロット、（マウスモノクローナル；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。他の抗体は：Ｓｉｇｍａからの抗ＦＬＡＧ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇからの抗Ｐ−ＭＫＫ４、抗Ｐ−ＭＫＫ３／６、抗Ｐ−ＭｅＫ１／２、抗総ＭＫＫ３、および抗総ＭＥＫ１／２；Ｎｏｖａｇｅｎからの抗Ｔ７；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚからの抗ＨＡ、抗総ＭＫＫ４、抗総ＡＳＫ１（キナーゼアッセイおよびウェスタンブロット）、および抗総ＭＥＫＫ１（キナーゼアッセイ、ウェスタンブロット、および共免疫沈降）であった。抗Ｇａｄｄ４５βモノクローナル抗体（５Ｄ２．２）が存在した。
【０２４４】
（３６．ペプチドの細胞内取り込みアッセイ、処理、およびアポトーシスアッセイ）
処理は以下のとおりであった：マウスＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を１，０００Ｕ／ｍｌ、１０Ｕ／ｍｌ、または１，０００Ｕ／ｍｌ＋０．３μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（ＣＨＸ；図３３）；ヒトＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を２，０００Ｕ／ｍｌ；ＰＭＡおよびイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）を、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌおよび１μＭ。Ｈ２Ｏ２およびソルビトールでの処理は、以前に記載されたとおりであった。図３３において、ＨＩＶ−ＴＡＴペプチド（５μＭ）またはＤＭＳＯでの前処理は３０分間であり、そしてＴＮＦαとのインキュベーションは、それぞれさらに４時間および３．５時間であった。図３３において、ペプチドを１０μＭで使用し、そしてＴＮＦαとのインキュベーションは４時間であった。Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用することによって、アポトーシスを測定した。細胞内取り込みを評価するために、ＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒ  ＦＩＴＣタンパク質標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用することで、ペプチドを合成の間またＨＰＬＣ精製後のいずれかでそのＮ末端にＦＩＴＣを標識した。次いで、細胞を５μＭのペプチドとともに２０分間インキュベートし、トリプシン化に供し、ＰＢＳで３回洗浄し、そしてＦＣＭまたは共焦点顕微鏡によって試験した。
【０２４５】
（３７．ｇａｄｄ４５β−／−繊維芽細胞の生成）
Ｇａｄｄ４５βがゼロのマウスを、シカゴ大学のトランスジェニックおよびノックアウト施設の助力をもって、ＥＳ細胞における標準的な相同組換えをベースにした技術を使用することによって生成した。ＭＥＦをｃｏｉｔｕｍから１４日目にマウスの胚から単離した。
【０２４６】
（３８．ペプチド２と相互作用する因子を同定するための方法）
ペプチド２と相互作用する因子を同定するための方法としては、ツーハイブリッド系、ファージディスプレイ、アフィニティー精製、およびＧＳＴプルダウンのような技術が挙げられる。
【０２４７】
ファージディスプレイは、ペプチドまたはタンパク質がバクテリオファージのコートタンパク質を有する融合物として発現される選択技術を記載し、これはファージビリオンの外表面上の融合タンパク質のディスプレイを生じる一方で、この融合をコードするＤＮＡがビリオン内に存在する。各配列をコードするＤＮＡに対するランダムペプチド配列の巨大ライブラリー間の物理的な連結を創るために、ファージディスプレイを使用し、これは、「パニング」と呼ばれるインビトロでの選択プロセスによって、種々の標的分子（抗体、酵素、細胞表面レセプター、シグナル伝達物質など）に対するペプチドリガンドの迅速な同定を可能にする。Ｐｈ．Ｄ．ＴＭ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔｓ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ）のような市販のシステムを使用し得る。
【０２４８】
相互作用するタンパク質を同定するために、アフィニティーカラムをベースにした精製システムもまた使用され得る。Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ融合タンパク質に対する操作されたストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎと呼ばれる）の高度な選択的結合をベースにしたＳｔｒｅｐ−ｔａｇＴＭ精製システムのような市販のアフィニティー精製システムが有用である（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。この技術は、生理学的条件下での組換えタンパク質の一工程精製を可能にし、従ってこれは、その生物活性を保存する。機能的なＳｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩタンパク質をバキュロウイルス、哺乳動物細胞、酵母、および細菌を含む任意の発現系から精製するために、このＳｔｒｅｐ−ｔａｇシステムを使用し得る。この目的のために独特のＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎアフィニティーカラムを開発し、そして対応する操作プロトコルを以下に記載する。その小さいサイズに起因して、一般的にＳｔｒｅｐ−ｔａｇは、融合パートナーの生物活性を妨げない。
【０２４９】
酵母ツーハイブリッドシステムは、タンパク質−タンパク質相互作用を研究するために使用される、広く行き渡った方法である。このシステムにおいて、１つのタンパク質（「バイト（ｂａｉｔ）」分子）をＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＬｅｘＡタンパク質）に融合し、そして他方のパートナー（「プレイ（ｐｒｅｙ）」分子）を活性化ドメイン（例えば、酵母ＧＡＬ４タンパク質）に融合する。これらのツーハイブリッドタンパク質が相互作用する場合、二部の転写因子が再構築され、そしてバイトタンパク質のＤＮＡ結合ドメインに対してＤＮＡ結合部位の下流であるレポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ（βガラクトシダーゼをコードする）またはｈｉｓ３（イミダゾールアセトールホスフェートトランスアミナーゼ酵素をコードする））を転写活性し得る。このシステムはまた、ＤＮＡ結合ドメインに融合する特定のタンパク質のための新規の結合パートナーを検出しそして特徴付けるのに非常に有用である。これは、活性化ドメインの配列に融合するｃＤＮＡのライブラリーをスクリーニングすることによって達成される。代表的なスクリーニングプロトコルにおいて、各酵母クローンからのプラスミドＤＮＡは、ｃＤＮＡを同定するために単離されなければならない。相互作用する因子を同定するために、ＣｈｅｃｋｍａｔｅＴＭ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のような市販のシステムを使用し得る。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１−１】図１は、Ｇａｄｄ４５βが、ＮＦ−κＢヌル細胞において、ＴＮＦＲ誘導性アポトーシスをアンタゴナイズすることを示す。図１Ａ：Ｇａｄｄ４５βならびにＧａｄｄ４５αおよびＧａｄｄ４５γ（左）は、ＲｅｌＡ−／−  ＭＥＦ、ＴＮＦα−誘導性殺傷をレスキューする。プラスミドを、示されたように使用した。細胞を、ＣＨＳ（０．１μｇ／ｍｌまたはＣＨＸ＋ＴＮＦα（１００単位／ｍｌ）で処理し、そして示された時点で回収した。各柱は、ＣＨＸ単独で処理した培養物と比較して、ＴＮＦα処理された培養物中のＧＨＰ＋生存細胞の％を示す。値は、３つの独立した実験の平均である。この図は、Ｇａｄｄ４５α、Ｇａｄｄ４５βおよびＧａｄｄ４５γが、ＴＮＦαに対する抗アポトーシス活性を有することを示す。図１Ｂ：ＮＦ−κＢヌル３ＤＯ細胞は、ＴＮＦαに対して感受性である。ＩκβαＭプラスミドまたはｎｅｏプラスミドを有する細胞株を、ＴＮＦα（３００単位／ｍｌ）で処理し、そして１４時間目に回収した。柱は、ＰＩ染色によって決定されるような生存細胞の％を示す。ウェスタンブロットは、ＩκβαＭタンパク質のレベルを示す（下のパネル）。図１Ｃ：３ＤＯ  ＩκβαＭ−Ｇａｄｄ４５β細胞は、ＴＮＦα殺傷から保護される。細胞が示される。細胞を、ＴＮＦα（２５単位／ｍｌ）で処理したか、または未処理のままにし、そして示された時点で回収した。各値は、３つの独立した実験の平均を示し、そしてコントロールに対して、処理された培養物中の生存細胞の％を示す（左）。ＴＮＦαを伴うかまたは伴わない８時間のインキュベーション後のそれぞれのクローンのＰＩ染色プロファイル（右パネル、それぞれ、ＴＮＦαおよびＵＳ）。
【図１−２】図１は、Ｇａｄｄ４５βが、ＮＦ−κＢヌル細胞において、ＴＮＦＲ誘導性アポトーシスをアンタゴナイズすることを示す。図１Ｄ：保護は、２つのＩκＢ−Ｇａｄｄ４５β株の添加で、（Ｃ）に示される８時間の時点の実験のＧａｄｄ４５βレベルと相関する。ウェスタンブロットは、示されたとおりである（下パネル）。図１Ｅ：Ｇａｄｄ４５βは、ＮＦ−κＢ複合体の下流で機能する。未処理またはＴＮＦα処理した３ＤＯ細胞の抽出物によるＥＭＳＡ。κＢ結合複合体の組成を、スーパーシフト抗体を使用して評価した。図１Ｆは、Ｇａｄｄ４５βが、ＴＮＦα誘導性アポトーシスをアンタゴナイズするために必須であることを示す。アンチセンスＧａｄｄ４５β（ＡＳ−Ｇａｄｄ４５β）プラスミドまたは空の（Ｈｙｇｒｏ）プラスミドを有する３ＤＯ株を、ＣＨＸ（０．１μｇ／ｍｌ）±ＴＮＦα（１０００単位／ｍｌ）で処理し、そして核ＰＩ染色によって、１４時間目に分析した。低濃度のＣＨＸを使用して、アポトーシスの閾値を低下させた。各柱の値は、３つの独立した実験の平均を示し、そして図１Ｃに記載されたように計算した。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、Ｇａｄｄ４５βが、ＮＦ−κＢの転写標的であることを示す。図２Ａ：未処理およびＴＮＦα（１０００ｕ／ｍｌ）処理したＲｅｌＡ−／−  ＭＥＦおよびＲｅｌＡ＋／＋  ＭＥＦ由来のＲＮＡでのノザンブロット。プローブは、示されたとおりである。図２Ｂ〜２Ｄ：３ＤＯ  ＩκβαＭ細胞およびコントロールを、ＴＮＦα（１０００ｕ／ｍｌ）で処理した。それぞれ、ＰＭＡ（５０ｇ／ｍｌ）＋イオノマイシン（１μＭ）またはダウノルビシン（０．５μＭ）であり、図２Ａのように分析した。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｅは、Ｇａｄｄ４５βが、ＮＦ−κＢヌル細胞においてカスパーゼの活性化を防止することを示す。図３Ａ：カスパーゼ活性のＧａｄｄ４５依存的ブロック。３ＤＯ株を、ＴＮＦα（５０単位／ｍｌ）で処理し、そしてインビトロの蛍光定量アッセイによって、カスパーゼ活性の測定のために、示された時点で回収した。値は、バックグラウンドを差し引いた後に得られた蛍光単位を示す。図３Ｂ：Ｇａｄｄ４５αは、Ｂｉｄおよびプロカスパーゼの、ＴＮＦα誘導性のプロセシングを阻害する。細胞を、図２Ａに記載したように処理した。黒および白の矢頭は、それぞれ、プロセシングされていないタンパク質およびプロセシングされたタンパク質を示す。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｅは、Ｇａｄｄ４５βが、ＮＦ−κＢヌル細胞においてカスパーゼの活性化を防止することを示す。図３Ｃ：Ｇａｄｄ４５βは、ＮＦκＢヌル細胞において、ＴＮＦα誘導性のミトコンドリア脱分極を、完全に抑制する。３ＤＯ株およびＴＮＦα処理は、図３Ａおよび３Ｂに記載されたとおりであった。各値は、３つの独立した実験の平均を示し、そして各培養物におけるＪＣ−１＋細胞の％を示す。図３Ｄ−＃：Ｇａｄｄ４５βは、シスプラチン誘導性およびダウノルビシン誘導性の毒性を阻害する。独立して生成されたＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５βクローンおよびＩκＢαＭ−Ｈｙｇｒｏクローンを、（濃度）０．０２５μＭ  シスプラチン（図３Ｄ）または０．０２５μＭ  ダウノルビシン（図３Ｅ）で２４時間、示されたように処理した。値は、核ＰＩ染色によって評価されるような生存細胞の％を示し、そして図１Ｃに記載されるように計算した。
【図４】図４は、Ｇａｄｄ４５βが、ＪＮＫシグナル伝達の生理学的インヒビターであることを示す。図４Ａ：ウェスタンブロットは、ＩκＢαＭＨｙｇｒｏクローンおよびＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５β  ３ＤＯクローンにおける、ＴＮＦα（１０００Ｕ／ｍｌ）によるＪＮＫ活性化の反応速度論を示す。類似の結果が、４つのさらなるＩκＢαＭ−−Ｇａｄｄ４５βクローンおよび３つのＩκＢαＭ−−Ｈｙｇｒｏクローンで得られた。図４Ｂ：ウェスタンブロットは、ＴＮＦαで５分間処理された３ＤＯクローンにおけるＥＲＫ、ｐ３８およびＪＮＫのリン酸化を示す。図４Ｄ：ウェスタンブロット（上および中）およびキナーゼアッセイ（下）は、（Ａ）のようにＴＮＦαで処理した、アンチセンスＧａｄｄ４５βクローンおよびＨｙｇｒｏクローンにおける、ＪＮＫ活性化を示す。図４Ｃ：ＩκＢαＭ−ＨｙｇｒｏクローンおよびＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５βクローンにおける、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、６００μＭ）およびソルビトール（０．３Ｍ）による、ＪＮＫの活性化を示す。処理は、３０分間に亘った。
【図５】図５Ａ〜Ｅは、ＪＮＫの阻害が、ＮＦ−κＢによる保護機構を示すことを示す。図５Ａ：３ＤＯ−ＩκＢαＭクローンおよび３ＤＯ−Ｎｅｏクローンにおける、ＴＮＫα（１０００Ｕ／ｍｌ）によるＪＮＫ活性化の反応速度論。リン酸化（Ｐ）ＪＮＫまたは総ＪＮＫに特異的な抗体を用いたウェスタンブロット（それぞれ、上および中）およびＪＮＫキナーゼアッセイ（下）。類似の結果が、２つのさらなるＩκＢαＭクローンおよび５つのＮｅｏクローンで観察された。図５Ｂ：ウェスタンブロット（上および中）およびキナーゼアッセイ（下）は、（Ａ）のように処理されたＲｅｌＡ−／−  ＭＥＦおよびＲｅｌＡ＋／＋  ＭＥＦにおけるＪＮＫ活性化を示す。図５Ｃ：  ウェスタンブロット（上および中）およびキナーゼアッセイ（下）は、ＴＮＦα（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＴＮＦα＋ＣＨＸ（１０μｇ／ｍｌ）またはＣＨＸ単独で処理した親３ＤＯ細胞における、ＪＮＫ活性化を示す。ＣＨＸ処理を、示された時間に加えて３０分間実施した。図５Ｄ：ＴＮＦα（１０００Ｕ／ｍｌ）＋ＣＨＸ（０．１μｇ／ｍｌ）で１０時間処理された後にトランスフェクトされたＲｅｌＡ−／−  ＭＥＦの生存。プラスミドを、ｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共に、示されたようにトランスフェクトした。図５Ｅ：ＭＡＰＫインヒビターで３０分間前処理し、次いで、ＴＮＦα（２５Ｕ／ｍｌ）またはＰＢＳのいずれかと共にさらに１２時間インキュベートした３ＤＯ−ＩκＢαＭ細胞の生存。インヒビター（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）および濃度は、示されたとおりである。（Ｄ）および（Ｅ）において、値は、３つの独立した実験の平均を示す。
【図６】図６は、ｇａｄｄ４５β発現が、ＲｅｌＡによって強力に誘導されるが、Ｒｅｌまたはｐ５０によっては誘導されないことを示す。ノザンブロットは、ＨｔＴＡ−１細胞、ならびに示された時間に亘ってテトラサイクリンの存在下（０時間）および非存在下で維持した、ＨｔＴＡ−ｐ５０細胞クローン、ＨｔＴＡ−ｐ５０細胞クローン、ＨｔＴＡ−ＲｅｌＡ細胞クローンおよびＨｔＴＡ−ＣＣＲ４３細胞クローンにおける、ｇａｄｄ４５β転写物の発現を示す。細胞株、テトラサイクリンの使用中止後の時間、およびｇａｄｄ４５β、ｉｋｂα、ｒｅｌＡ、ｐ５０、ｒｅｌまたはコントロールｇａｐｄｈのｃＤＮＡに特異的な３２Ｐ標識プローブは、示されたとおりである。テトラサイクリン誘導性ｎｆ−ｋｂ導入遺伝子を、四角で囲む。内因性ｐ１５０遺伝子およびｐ５０導入遺伝子由来の転写物が示される。
【図７】図７は、ｇａｄｄ４５β発現が、Ｂ細胞株におけるＮＦ−κＢ活性と相関することを示す。ノザンブロットは、７０Ｚ／３  前Ｂ細胞およびＷＥＨＩ−２３１  Ｂ細胞におけるｇａｄｄ４５βの構成的発現および誘導性発現を示す（それぞれ、レーン１−５および５−５）。細胞を、未処理のまま（レーン１、６および１１）にしたか、またはＬＰＳ（４０μｇ／ｍｌ）もしくはＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理し、そして  示された時点でＲＮＡ調製のために回収した。マウスｇａｄｄ４５β  ｃＤＮＡ（上のパネル、短時間の露出；中のパネル、長時間の露出）に特異的な３２Ｐ標識プローブとハイブリダイズした、２つの異なる露出のブロットが示される。充填コントロールとして、ブロットを、ｇａｐｄｈで再プローブした（下のパネル）。
【図８】図８は、マウスｇａｄｄ４５βプロモーターの近位領域の配列を示す。転写因子結合部位との強い一致に下線を付し、そして同族ＤＮＡ結合因子を示す。高い相同性のＤＮＡストレッチ内の、マウスおよびヒトの配列が同一である位置は、灰色で強調されている。これらのストレッチ内で、アラインメントのために導入されたギャップは、ダッシュで印をつける。ヒトプロモーター中の保存されたκＢ結合部位を、四角で囲む。以前に同定された転写物開始部位を、アスタリスクによって示し、そして転写されたヌクレオチドをイタリックにする。左側の数は、転写開始部位に対する塩基対位置を示す。これはまた、マウスｇａｄｄ４５βプロモーターの近位領域の配列も示す。ＮＦ−κＢによるＧａｄｄ４５βの調節を理解するために、マウスＧａｄｄ４５βプロモーターをクローニングした。ｇａｄｄ４５β遺伝子を含むＢＡＣライブラリークローンを単離し、ＸｈｏＩで消化し、そしてｐＢＳにサブクローニングした。ｇａｄｄ４５βを含む７３８４ｂのＸｈｏＩフラグメントを完全に配列決定し（登録番号：ＡＦ４４１８６０）、そしてその一部は、Ｇｅｎｂａｎｋに以前に登録された配列（登録番号：ＡＣ０７３８１６、ＡＣ０７３７０１およびＡＣ０９１５１８）と一致することが見出された。このフラグメントは、以前に同定された転写開始部位の約５．４ｋｂ上流からｇａｄｄ４５βの第四のエキソンの末端近傍までにわたる、ゲノムＤＮＡ領域を有した。ＴＡＴＡボックスは、転写開始部位に対して−５６〜−６０の位置に位置した。ｇａｄｄ４５βプロモーターはまた、いくつかのＮＦ−κＢ結合エレメントを示した。３つの強力なκＢ部位が、位置−３７７／−３６８、−４２６／−４１７および−４４７／−４３８において、近位プロモーター領域中に見出されたが；一方、より弱い部位が、位置−１１５９／−１１５０に位置し、そして４つの他の一致は、位置−２７５１／−２７４２、−４５２５／−４５１６、−４８９０／−４８８１および−５２５１／−５２４２にて、さらに上流にマップされた（ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ登録番号ＡＦ４４１８６０）。ｇａｄｄ４５βの第一エキソン内の３つのκＢコンセンサス部位（＋２７／＋３６、＋７１／＋８０および＋１７１／＋１８０）。このプロモーターはまた、Ｓｐ１モチーフ（−８９０／−８８１）および他の転写因子（熱ショック因子（ＨＳＦ）１および２、Ｅｔｓ、Ｓｔａｔ、ＡＰ１、Ｎ−Ｍｙｃ、ＭｙｏＤ、ＣＲＥＢならびにＣ／ＥＢＰを含む）についてのいくつかの推定結合部位を含んだ。保存された調節エレメントを同定するために、ｇａｄｄ４５β転写開始部位の直ぐ上流に位置する５．４ｋｂのマウスＤＮＡ配列を、対応するヒト配列（Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅによって以前に登録されている（登録番号：ＡＣ００５６２４））と整列した。マウスｇａｄｄ４５βの−１４７７／−１１９７領域および−４６６／−３００領域は、ヒトプロモーターの部分に高度に類似しており、このことは、これらの領域が、重要な調節エレメント（灰色で強調された部分は、高い相同性の領域内の同一のヌクレオチドを示す）を含むことを示唆する。あまり十分保存されていない領域が、第一イントロンの開始に対して位置−���８３の下流で同定された。さらに短い相同なストレッチもまた同定された。有意な類似性は、位置−２２８５の上流では見いだされなかった。−４６６／−３００での相同領域は、３つのκＢ部位（κＢ−１、κＢ−２およびκＢ−３と称する）を含み、これらは、ｇａｄｄ４５βプロモーター中に存在する他のκＢ部位とは異なり、２つの種間で保存されていた。これらの知見は、これらのκＢ部位が、おそらく、ＮＦ−κＢによるｇａｄｄ４５βの誘導を説明する、ｇａｄｄ４５βの調節において重要な役割を果たし得ることを示唆する。
【図９】図９は、マウスｇａｄｄ４５βプロモーターが、ＲｅｌＡによって強力にトランス活性化されることを示す。（Ａ）マウスｇａｄｄ４５βプロモーターの種々の部分によって駆動されるＣＡＴレポーター遺伝子構築物の模式図。数字は、各ＣＡＴ構築物中に含まれるプロモーターフラグメントの末端におけるヌクレオチド位置を示す。保存されたκＢ−１部位、κＢ−２部位およびκＢ−３部位は、白い四角として示され、一方で、ＴＡＴＡボックスおよびＣＡＴコード配列は、それぞれ、黒い四角および灰色の四角として示される。（Ｂ）ｇａｄｄ４５βプロモーターのＲｅｌ−Ａ依存的トランス活性化。ＮＴｅｒａ−２細胞を、示されるように、個々のｇａｄｄ４５β−ＣＡＴレポータープラスミド（６μｇ）単独でか、または０．３μｇ、１μｇもしくは３μｇのＰｍｔ２ｔ−ＲｅｌＡと一緒に、同時トランスフェクトした。各細胞抽出物中で検出された絶対的ＣＡＴ活性が示され、そして一分当たりの計数（ｃ．ｐ．ｍ．）として示されている。各柱は、細胞抽出物のタンパク質濃度に対して正規化された後の、３つの独立した実験の平均を示す。トランスフェクトされたＤＮＡの総量を、適切な量の、挿入物のないｐＭＴ２Ｔを添加することによって、ずっと一定に保った。各レポーター構築物は、１μｇのｐＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質；ＧＦＰをコードする；Ｃｏｎｔｅｃｈ）の同時トランスフェクションによって決定されるように、匹敵する効率でＮｔｅｒａ−２細胞中にトランスフェクトされ、そしてフローサイトメーター分析が、ＧＦＰ＋細胞の％およびＧＦＰ発現レベルを評価することを助けた。
【図１０】図１０は、ｇａｄｄ４５βプロモーターが、３つの機能的κＢエレメントを含むことを示す。（Ａ）野生型および変異した−５９２／＋２３−ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴレポーター構築物の模式図。κＢ−１結合部位、κＢ−２結合部位およびκＢ−３結合部位、ＴＡＴＡボックス、ならびにＣＡＴ遺伝子を、図９Ａのように示す。変異したκＢ部位に、×印を付ける。（Ｂ）κＢ−１、κＢ−２およびκＢ−３は、各々、ＲｅｌＡによるｇａｄｄ４５βプロモーターの効率的なトランス活性化に必要である。Ｎｔｅｒａ−２細胞を、示されるように、野生型または変異した−５９２／＋２３−  ｇａｄｄ４５β−ＣＡＴレポーター構築物単独でか、あるいは、０．３μｇ、１μｇまたは３μｇのｐＭＴ２Ｔ−ＲｅｌＡと一緒に、同時トランスフェクトした。レポータープラスミド単独のトランスフェクションで観察された活性を超える相対的ＣＡＴ活性が示される（〜倍の誘導）。各柱は、細胞抽出物のタンパク質濃度に対して正規化された後の、３つの独立した実験の平均を示す。空のｐＭＴ２Ｔベクターを、トランスフェクトされたＤＮＡの量をずっと一定に保つために使用した。ｐＥＧＦＰを、図９Ｂに記載されるように、ＣＡＴプラスミドのトランスフェクション効率を制御するために使用した。
【図１１】図１１は、ｇａｄｄ４５βプロモーター由来のκＢエレメントが、ＲｅｌＡ依存的トランス活性化に十分であることを示す。Ｎｔｅｒａ細胞を、示されるように、Δ５６−κＢ−１／２−ＣＡＴレポーター構築物、Δ５６−κＢ−３−ＣＡＴレポーター構築物またはΔ５６−κＢ−Ｍ−ＣＡＴレポーター構築物単独でか、あるいは、０．３μｇまたは１μｇのＲａｌＡ発現プラスミドと一緒に、同時トランスフェクトした。図１０Ｂのように、柱は、細胞抽出物のタンパク質濃度に対して正規化された後の、観察された相対的ＣＡＴ活性（〜倍の誘導）を示し、そして３つの独立した実験の平均を示す。挿入物のないｐＭＴ２Ｔプラスミドを、トランスフェクトされたＤＮＡの総量を調整するために使用した。
【図１２】図１２は、ｇａｄｄ４５βプロモーターのκＢ部位が、インビトロでＮＦ−κＢ複合体に結合することを示す。（Ａ）ｐ／５０ｐ５複合体およびｐ５０／ＲｅｌＡ複合体の、κＢ−１、κＢ−２およびκＢ−３に対する結合を示すＥＭＳＡ（それぞれ、レーン９−１２、５−８および１−４）。全細胞抽出物を、ｐＭＴ２Ｔ−ｐ５０（９μｇ；レーン１−３、５−７および１１−１２）またはｐＭＴ２Ｔ−ｐ５０（３μｇ）＋ｐＭＴ２Ｔ−ＲｅｌＡ（６μｇ；レーン４、８および１２）でトランスフェクトしたＮＴｅｒａ−２細胞から調製した。種々の量の細胞抽出物（０．１μｌ、レーン３、７および１１；０．３μｌ、レーン２、６および１０；または１μｌ、レーン１、４、５、８、９および１２）を、示されるように、３２Ｐ標識したκＢ−１プローブ、κＢ−２プローブまたはκＢ−３プローブと共にインビトロでインキュベートし、そしてタンパク質−ＤＮＡ複合体を、ＥＭＳＡによって分離した。ＮＦ−κＢ−ＤＮＡ結合複合体が示される。（Ｂ）ＤＮＡ結合ＮＦ−κＢ複合体のスーパーシフト分析。κＢ部位を、（Ａ）において使用した同じ抽出物１μｌ、または挿入物を含まないｐＭＴ２ＴでトランスフェクトしたＮＴｅｒａ−２細胞由来の抽出物と共にインキュベートした（レーン１−３、１０−１２および１９−２１）。サンプルを、示されるように、直接的にか、あるいは、ヒトｐ５０またはＲｅｌＡに対する抗体とのプレインキュベーション後のいずれかで、ゲルに充填した。トランスフェクトしたプラスミドおよび抗体は、示されたとおりであった。ＤＮＡ結合ＮＦ−κＢ複合体のバンド、スーパーシフトした複合体のバンドおよび非特異的（ｎ．ｓ．）バンドを、標識する。（Ｃ）は、ｇａｄｄ４５β  κＢ部位が、インビトロで内因性ＮＦ−κＢ複合体に結合することを示す。ｇａｄｄ４５β−κＢエレメントが、内因性ＮＦ−κＢ複合体に結合するか否かを決定するために、全細胞抽出物を、未処理およびリポポリサッカリド（ＬＳＰ）処理したＷＥＨＩ−２３１細胞から得た。細胞を、４０μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ血清型０１１１：Ｂ４）で２時間処理し、そして２μｌの全細胞抽出物を、インビトロで３２Ｐ標識したｇａｄｄ４５β−κＢプローブと共にインキュベートした。プローブのバンド、個々のＮＦ−κＢサブユニットに対する抗体のバンド、優勢なＤＮＡ結合複合体のバンド、スーパーシフトした複合体のバンド、および非特異的（ｎ．ｓ．）バンドを、同様に標識した。３つ全てのｇａｄｄ４５β−κＢ部位が、構成的に活性なＮＦ−κＢ複合体およびＬＳＰ誘導性ＮＦ−κＢ複合体の両方に結合した（レーン１−３、９−１１および１７−１９）。κＢ−３は、遅く移動するＮＦ−κＢ複合体に強力に結合し、この複合体は、抗Ｒｅｌ抗体によってのみ、スーパーシフトした（レーン４−８）。この抗体はまた、κＢ−２、およびより緩くκＢ−１に結合する、より遅いダイマーの移動を遅延するが、これらのプローブを用いて検出されたより速く移動する複合体に対しては影響を有さなかった（それぞれ、レーン１５および２３）。κＢ−１およびκＢ−２と相互作用する、より遅い複合体もまた、大量のｐ５０ならびに少量のｐ５２およびＲａｌＡを含んだ（��ーン１２−１４および２０−２２、ＲｅｌＡは、κＢ−１では僅かに検出可能であった）。その代わり、より速い複合体は、抗ｐ５０抗体によってほぼ完全にスーパーシフトし（レーン１２および２０）、そして残存ＤＮＡ結合活性は、抗ｐ５２抗体と反応した（レーン１３および２１；下のバンド）。各プローブを用いて、ＲＥｌＢダイマーは、僅かにのみ、κＢ結合活性に寄与した。ＤＮＡ結合複合体の特異性を、非標識競合オリゴヌクレオチドを使用する競合結合反応によって確認した。このように、κＢ−１およびκＢ−２に結合するより速い複合体は、ｐ５０ホモダイマーから主に構成され、そして有意な量のｐ５２／ｐ５２ダイマーを含んだが、一方、より遅い複合体は、ｐ５０／Ｒｅｌヘテロダイマーから形成され、そしてより低い程度まで、ｐ５２／Ｒｅｌ含有ダイマー、Ｒｅｌ／Ｒｅｌ含有ダイマーおよびＲｅｌＡ含有ダイマーから形成された。逆に、κＢ−３のみが、Ｒｅｌホモダイマーに結合した。トランスフェクトされたＮＴｅｒａ−２細胞での観察と一致して、κＢ−１は、ｐ５０ホモダイマーおよびｐ５２ホモダイマーについて明らかな優先性を示し、一方で、κＢ−２は、Ｒｅｌ含有複合体およびＲｅｌＡ含有複合体に対して優先的に結合した。全体として、κＢ−３は、最も強力なＮＦ−κＢ特異的シグナルを生じ、一方で、κＢ−１は、最も弱いシグナルを生じた。興味深いことに、ＤＮＡプローブのインビトロの結合特性は、インビボでのプロモータートランス活性化に対する、個々のκＢ部位の相対的重要性を反映しないようであった。それにもかかわらず、これらの知見は、ｇａｄｄ４５βプロモーターの機能的に適切なκＢエレメントの各々が、ＮＦ−κＢ複合体に結合し得、それによって、ＮＦ−κＢに対するｇａｄｄ４５β発現の依存性についての基礎を提供することを実証した。
【図１３】図１３は、Ｇａｄｄ４５β発現が、Ｆａｓ誘導性およびＴＲＡＩＬ−Ｒ依存性のアポトーシスに対して、ＢＪＡＢ細胞を保護することを示す。Ｇａｄｄ４５β活性が、ＴＮＦ−Ｒ以外のＤＲに及ぶか否かを決定するために、安定なＨＡ−Ｇａｄｄ４５βクローンおよびＮｅｏコントロールクローンを、ＢＪＡＢ  Ｂ細胞リンパ腫（これは、ＦａｓおよびＴＲＡＩＬ−Ｒの両方による殺傷に高度に感受性である）において生成した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色アッセイによって示されるように、Ｎｅｏクローンとは異なり、Ｇａｄｄ４５βを発現するＢＪＡＢクローンは、（Ｂ）アゴニスト性抗Ｆａｓ抗体（（ＡＰＯ−１；１μｇ／ｍｌ、１６時間）または（Ａ）組換え（ｒ）ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍｌ、１６時間）のいずれかによって誘導されるアポトーシスに対して、劇的に保護された。各場合において、細胞生存は、抗ＨＡ抗体を用いたウエスタンブロット（下パネル）によって示されるように、高レベルのＨＡ−Ｇａｄｄ４５βタンパク質と相関した。興味深いことに、Ｆａｓを用いると、Ｇａｄｄ４５βによる保護は、２４時間の時点でさえ、ほぼ完全であった。
【図１４】図１４は、ＪＮＫ活性化の阻害が、Ｆａｓ誘導性アポトーシスからＢＪＡＢ細胞を保護することを示す。親ＢＪＡＢ細胞を、抗ＡＰＯ１抗体（１μｇ／ｍｌ）で、１６時間に亘って、特異的ＪＮＫブロッカーＳＰ６００１２５（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の漸増濃度の存在下または非存在下で処理し、そしてアポトーシスを、ＰＩ染色アッセイによってモニタリングした。ＢＪＡＢ細胞は、Ｆａｓ誘発によって誘導されるアポトーシスに対して高度に感受性であったが、ＪＮＫ活性化の抑制は、これらの細胞を死から劇的にレスキューし、そして細胞保護の程度は、ＳＰ６００１２５の濃度と相関した。このデータは、ＭＥＦ（すなわち、ＡＳＫ１欠損ＭＥＦおよびＪＮＫ欠損ＭＥＦ）で以前に報告されたものとは異なり、Ｂ細胞リンパ腫において、そしておそらく他の細胞において、ＪＮＫシグナル伝達が、Ｆａｓ連結に対するアポトーシス応答において、中心的な役割を果たすことを示す。このことは、これらの細胞において、Ｆａｓによる殺傷が、Ｇａｄｄ４５βの発現によってもブロックされる（図１３Ｂ）という知見と一致する。従って、ＪＮＫは、２型細胞（例えば、ＢＪＡＢ細胞）（これは、１型細胞（例えば、ＭＥＦ）とは異なり、カスパーゼを活性化するために、アポトーシスシグナルのミトコンドリア増幅を必要とする）におけるＦａｓ誘導性のアポトーシスに必要であり得る。
【図１５】図１５は、ＪＮＫが、ＴＮＡＦαによる効率的な殺傷に必要であることを示す。図５Ｄおよび５Ｅにおいて、本発明者らは、ＤＮ−ＭＫＫ７の発現または高用量の薬理学的ブロッカーＳＢ２０２１９０によるＪＮＫの阻害が、ＴＮＦα誘導性殺傷から、ＮＦ−κＢヌル細胞をレスキューすることを示した。図５Ａ〜Ｃに示されるデータと合わせると、これらの知見は、ＪＮＫカスケードの阻害が、ＮＦ−κＢによる保護機構を示すことを示す。これらはまた、ＪＮＫカスケードが、サイトカインに対するアポトーシス応答において重要な役割を果たすことを示唆する。従って、ＪＮＫ活性化をＴＮＦ−Ｒ１による殺傷に直接関連付けるために、ＪＮＫ１およびＫＮＫ２の感受性を、ＴＮＦαによるアポトーシスに対する、二重ノックアウト線維芽細胞において試験した。実際、図１５Ａに示されるように、変異体細胞は、ＴＮＦα（１，０００Ｕ／ｍｌ）およびＣＨＸでの、１８時間にわたる組み合わせた細胞傷害性処理に対して劇的に保護され（黒の柱）、一方で、野生型線維芽細胞は、この処置に対して感受性のままであった（白の柱）。ＪＮＫキナーゼアッセイは、ノックアウト細胞が、ＴＮＦα刺激後にＪＮＫを活性化できないことを確認した（左のパネル）。ＴＮＦα＋ＣＨＸに対するＪＮＫヌル細胞のアポトーシス応答における欠損は、発達欠損ではなかった。なぜなら、サイトカイン感受性は、構成的に活性なＪＮＫ１を発現する、ＭＩＧＲ１−ＪＮＫＫ２−ＪＮＫ１のウイルス形質導入によって迅速に回復されたからである（図１５Ｂ；左のパネル、ＪＮＫキナーゼアッセイもまた参照のこと）。従って、図５Ａ〜Ｅに示されたデータと共に、ＪＮＫヌル細胞を用いたこれら後者の知見は、ＪＮＫ（ｐ３８でもＥＲＫでもなく）が、ＴＮＦ−ＲによるＰＣＤに必須であることを示し、そしてＮＦ−κＢが細胞を保護する機構が、Ｇａｄｄ４５βによるＪＮＫカスケードのダウンレギュレーションであることを確認する。
【図１６】図１６は、Ｇａｄｄ４５βが、腫瘍形成におけるＮＦ−κＢ機能の強力なエフェクターであることを示す。構成的なＮＦ−κＢの活性化は、特定の後期腫瘍（例えば、ＥＲ−乳癌）の生存率を維持するために重要である。顕著なことに、ノザンブロットによって示されるように、ｇａｄｄ４５βは、ＥＲ−乳癌細胞株（これは、その生存について、ＮＦ−κＢに依存する）において構成的に高レベルで発現されたが、コントロール株またはあまり侵襲性でないＥＲ＋乳癌細胞においては、発現されなかった。興味深いことに、これらの細胞において、ｇａｄｄ４５β発現は、ＮＦ−κＢ活性と相関した。従って、ＴＮＦα誘導性のアポトーシスの制御同様、ｇａｄｄ４５βの誘導は、ＮＦ−κＢが癌細胞の生存を促進し、それによって腫瘍形成を促進する機構を示し得る。従って、Ｇａｄｄ４５βは、抗癌治療の新規標的であり得る。
【図１７】図１７は、ＪＮＫの抑制が、ＮＦ−κＢが腫瘍形成を促進する機構を示すことを示す。ＥＲ−乳癌細胞株（ＢＴ−２０およびＭＤＡ−ＭＤ−２３１）は、ＮＦ−κＢ依存的腫瘍形成の十分特徴付けられたモデル系である。なぜなら、これらの株は、核ＮＦ−κＢ活性を構成的に含み、そしてその生存についてこの活性に依存するからである。これらの細胞において、十分特徴付けられた薬理学的ブロッカー（プロスタグランジンＡ１）（ＰＧＡ１、１００μＭ）、ＣＡＰＥ（５０μｇ／ｍｌ）、またはパルテノライド（ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄｅ）（２．５μｇ／ｍｌ））によるＮＦ−κＢ活性の阻害が、光学顕微鏡によって判断される場合、アポトーシスを迅速に誘導した。全てのＮＦ−κＢブロッカーは、Ｂｉｏｍｏｌから購入し、そして濃度は、示されたとおりであった。処理を、２０時間（ＰＧＡ１）、４時間（パルテノライド）または１７時間（ＣＡＰＥ）に亘って実施した。アポトーシスを、形態学的にスコアリングし、そして以下のように図式的に示した：＋＋＋＋、７６〜１００％の生存細胞；＋＋＋、５１〜７５％の生存細胞；＋＋、２６〜５０％の生存細胞；＋、１〜２５％の生存細胞；−、０％の生存細胞。顕著なことに、ＪＮＫインヒビターＳＰ６００１２５との組み合わせ処理は、ＮＦ−κＢの阻害によって誘導される細胞傷害性から、乳房腫瘍細胞を劇的にレスキューし、このことは、ＮＦ−κＢによるＪＮＫの抑制が、腫瘍形成において重要な役割を果たすことを示す。
【図１８】図１８は、アポトーシスを調節するＴＮＦ−Ｒ１誘導性経路の模式図である。ＲｅｌＡノックアウト変異、ＩκＢαＭタンパク質またはアンチセンスｇａｄｄ４５βプラスミドの発現、あるいはＣＨＸでの処理のいずれかによる、ＮＦ−κＢ依存的経路のブロックは、持続性のＪＮＫ活性化およびアポトーシスを導く。逆に、ＪＮＫヌル変異またはＡＳＫ１ヌル変異、ＤＮ−ＭＫＫ７タンパク質の発現、あるいは十分に特徴付けられた薬理学的ブロッカーのいずれかによるＴＮＦα誘導性のＪＮＫ活性化のブロックは、ＮＦ−κＢの非存在下でさえも、細胞の生存を促進する。ＮＦ−κＢによるＪＮＫカスケードのブロックは、ｇａｄｄ４５βの転写活性化を含む。Ｇａｄｄ４５βは、ＭＫＫ７／ＪＮＫＫ２（ＪＮＫの特異的かつ非重複のアクチベーター）に直接結合し、そしてこれを阻害することによって、このカスケードをブロックする。従って、ＭＫＫ７およびその生理学的インヒビターＧａｄｄ４５βは、ＪＮＫ活性化および引き続くアポトーシスを調節するための、重要な分子標的である。
【図１９】図１９は、インビボでのＧａｄｄ４５βとＪＮＫ経路中のキナーゼとの間の物理的相互作用を示す。Ｇａｄｄ４５βは、ＭＥＫＫ４と会合する。しかし、このＭＡＰＫＫＫは、ＤＲによって活性化されないので、さらなる試験は、この相互作用の機能的結果からなされなかった。従って、Ｇａｄｄ４５βがＴＮＦ−ＲによるＪＮＫ活性化を鈍化する機構を調査し始めるために、ＭＡＰＫＫＫ、ＭＡＰＫＫおよびＭＡＰＫ（これらは、ＴＮＦ−Ｒによって誘導されることが、以前に報告されている）に焦点を当てて、Ｇａｄｄ４５βが、ＪＮＫ経路中のさらなるキナーゼと物理的に相互作用する能力を試験した。ＨＡ標的化キナーゼを、２９３細胞中で、ＦＬＡＧ−Ｇａｄｄ４５βの存在下または非存在下で一過的に発現させ、そして細胞溶解物を、抗ＦＬＡＧ抗体被覆したビーズを用いる同時免疫沈降（ＩＰ）と、その後の抗ＨＡ抗体でのウェスタンブロットによって、分析した。これらのアッセイは、Ｇａｄｄ４５βがＭＥＫＫ４に結合する能力を確認した。これらの同時ＩＰアッセイは、Ｇａｄｄ４５βがまた、ＡＳＫ１と会合し得るが、他のＴＲＡＦ２相互作用ＭＡＰＫＫＫ（例えば、ＭＥＫＫ１、ＧＣＫおよびＧＣＫＲ）とも、試験したさらなるＭＡＰＫＫＫ（例えば、ＭＥＫＫ３）とも会合しないことを実証した。留意すべきことに、Ｇａｄｄ４５βはまた、ＪＮＫＫ２／ＭＫＫ７と相互作用したが、他のＪＮＫキナーゼ（ＪＮＫＫ１／ＭＫＫ４）とも、試験中の任意の他のＭＡＰＫＫおよびＭＡＰＫ（２つのｐ３８特異的アクチベーターであるＭＫＫ３ｂおよびＭＫＫ６、ならびにＥＲＫキナーゼであるＭＥＫ１を含む）とも相互作用しなかった。類似の知見が、ＩＰについて抗ＨＡ抗体を使用し、そしてウェスタンブロットについて抗ＦＬＡＧ抗体を使用して得られた。実際、ＪＮＫＫ２（ＴＮＦ−Ｒによって誘導される優性なＪＮＫキナーゼ）ならびにＡＳＫ１（ＴＮＦαによる持続性のＪＮＫ活性化およびアポトーシスに必要なキナーゼ）に結合する能力は、Ｇａｄｄ４５βによるＪＮＫシグナル伝達の制御についての基礎を示し得る。ＪＮＫＫ２との相互作用はまた、ＪＮＫ経路に対するＧａｄｄ４５βの阻害効果の特異性を説明し得る。
【図２０】図２０は、インビトロの、Ｇａｄｄ４５βとＪＮＫ経路中のキナーゼとの間の物理的相互作用を示す。上記インビトロの相互作用を確認するために、ＧＳＴプルダウン（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）試験を実施した。全長（ＦＬ）のヒトＡＳＫ１、ＭＥＫＫ４、ＪＮＫＫ１およびＪＮＫＫ２、またはＡＳＫ１のアミノ末端もしくはカルボキシ末端由来のポリペプチド（すなわち、アミノ酸１〜７５６に及ぶＮ−ＡＳＫ１、およびアミノ酸６４８〜１３７５にわたるＣ−ＡＳＫ１）をコードするｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐＢＳ）プラスミドを、３５Ｓメチオニンの存在下で、ＴＮＴ共役網状赤血球溶解物システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、インビトロで転写および翻訳した。５μｌの各翻訳ミックスを、インビトロで、精製グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ポリペプチドまたはＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５βタンパク質のいずでかで被覆されたセファロース−４Ｂビーズと共に、インキュベートした。後者のタンパク質は、ＧＳＴに直接融合されたＦＬマウスＧａｄｄ４５βを含んだ。結合アッセイを、標準的手順に従って実施し、次いで、ビーズに結合した３５Ｓ標識タンパク質、ならびに２μｌの各インビトロ翻訳ミックス（投入）を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分解した。アスタリスクは、インタクトな翻訳産物を示す。図２０に示されるように、ＦＬ−ＪＮＫＫ２は、ＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５βと強力に会合したが、ＧＳＴとは会合せず、このことは、ＪＮＫＫ２およびＧａｄｄ４５βがまた、インビトロで相互作用し、そしてそれらの相互作用が特異的であったことを示す。組換えＪＮＫＫ２およびＧａｄｄ４５βを使用するさらなる実験は、この相互作用が、直接的タンパク質−タンパク質接触によって媒介されることを実証した。インビボの知見と一致して、ＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５βはまた、（ＪＮＫＫ２との会合よりも強くないにもかかわらず）ＡＳＫ１、Ｎ−ＡＳＫ１、Ｃ−ＡＳＫ１およびＭＥＫＫ４と会合し、そしてＪＮＫＫ１と弱く会合した。従って、ＧＳＴプルダウン実験は、インビボで観察されたＧａｄｄ４５βとＪＮＫＫ２との間の強力な相互作用、ならびにＪＮＫ経路中の他のキナーゼとＧａｄｄ４５βとのより弱い相互作用を確認した。これらのアッセイはまた。Ｇａｄｄ４５βとＪＮＫＫ１との間の弱い会合を明らかにした。
【図２１】図２１は、Ｇａｄｄ４５βが、インビトロでＪＮＫＫ２活性を阻害することを示す。次に、ＪＮＫ経路における、Ｇａｄｄ４５βとキナーゼとの物理的相互作用のインビトロでの機能的結果を評価した。マウスおよびヒトの、全長Ｇａｄｄ４５βタンパク質を、それぞれ標準の技術に従って、ＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５βおよびＨｉｓ６タグ化Ｇａｄｄ４５βとしてＥ．ｃｏｌｉから精製した。インビトロアッセイでのこれらのタンパク質の使用の前に、全ての組換えポリペプチドの純度を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルのクーマシーブルー染色を実施することによって、９８％より高いことを確認した。次いで、これらのタンパク質、ならびにコントロールＧＳＴおよびＨｉｓ６−ＥＦ３タンパク質の、ＪＮＫ経路におけるキナーゼを阻害する能力をインビトロでモニタリングした。ＦＬＡＧタグ化ＪＮＫＫ２、ＦＬＡＧタグ化ＪＮＫＫ１、ＦＬＡＧタグ化ＭＫＫ３およびＦＬＡＧタグ化ＡＳＫ１を、抗ＦＬＡＧ抗体を使用して、一時的にトランスフェクトした２９３細胞から免疫沈降させ、組換えタンパク質の濃度を増加させながら１０分間プレインキュベートし、その後、特異的キナーゼ基質（すなわち、ＧＳＴ−ＪＮＫ１にはＪＮＫＫ１およびＪＮＫＫ２；ＧＳＴ−ｐ３８γにはＭＫＫ３；ＧＳＴ−ＪＮＫＫ１またはＧＳＴ−ＪＮＫＫ２にはＡＳＫ１）を添加した。特に、ＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５βおよびＨｉｓ６−Ｇａｄｄ４５βの両方は、試験した濃度の中でも最低の濃度でさえ、インビトロでＪＮＫＫ２活性を効率的に抑制し、一方、コントロールポリペプチドは、キナーゼ活性に対して何ら効果は有さなかった（図２１Ａ）。最高濃度のＧａｄｄ４５βタンパク質の存在下において、ＪＮＫＫ２活性は、実質的に完全にブロックされた。これらの知見は、Ｇａｄｄ４５βへの結合に際して、ＪＮＫＫ２が、効率的に不活性化されることを示す。逆に、ＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５βもＨｉｓ６−Ｇａｄｄ４５βも、他のキナーゼ（すなわち、ＪＮＫＫ１、ＭＫＫ３およびＡＳＫ１）がそれらの生理学的基質をインビトロでリン酸化する能力に対して有意な効果を有さず、このことは、Ｇａｄｄ４５βが、ＪＮＫＫ２の特異的インヒビターであることを示す。Ｇａｄｄ４５βはまた、ＪＮＫＫ２の自己リン酸化を阻害した。
【図２２】図２２Ａ〜Ｂは、Ｇａｄｄ４５βが、インビボでＪＮＫＫ２活性を阻害することを示す。Ｇａｄｄ４５βがＪＮＫＫ２を阻害する能力を、３ＤＯ細胞においてインビボで確認した。これらの細胞において、Ｇａｄｄ４５βの過剰発現は、種々の刺激によるＪＮＫ活性化をブロックし、この活性化のブロックは、特異的なものである。なぜなら、Ｇａｄｄ４５βは、ｐ３８経路にもＥＲＫ経路にも影響を及ぼさないからである。これらの知見は、Ｇａｄｄ４５βが、ＭＡＰＫＫＫモジュールの下流でＪＮＫシグナル伝達を阻害することを示唆する。キナーゼアッセイを、非刺激の３ＤＯ細胞およびＴＮＦα刺激した３ＤＯ細胞からの抽出物、内因性キナーゼを特異的に認識する市販の抗体、ならびにＧＳＴ−ＪＮＫ１（ＪＮＫＫ２について）基質またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ；ＡＳＫ１について）基質を使用して、当業者に公知の手順に従い実施した（図２２Ａ）。ＪＮＫＫ１およびＭＫＫ３／６の活性を、リン酸化（Ｐ）ＪＮＫＫ１またはＭＫＫ３／６（これらのキナーゼの活性形態）に特異的な抗体を使用して、代わりにアッセイした（図２２Ｂ）。インビトロデータと一致して、これらのアッセイは、３ＤＯ細胞において、Ｇａｄｄ４５β発現が、ＴＮＦαによるＪＮＫＫ２活性化を完全にブロックし得ることを示した（図２２Ａ）。この発現はまた、ＪＮＫＫ１活性化を部分的に抑制したが、ＭＫＫ３／６（ｐ３８の特異的アクチベーター）またはＡＳＫ１に対する有意な阻害効果を有さなかった（図２２Ａ〜Ｂ）。従って、Ｇａｄｄ４５βは、ＪＮＫＫ２（すなわちＪＮＫの特異的なアクチベーターであり、ＪＮＫ活性化のＴＮＦ−Ｒ経路の必須の構成要素）の強力なブロッカーである。このＪＮＫＫ２の阻害は、ＭＡＰＫシグナル伝達に対するＧａｄｄ４５βの効果を担い、ＪＮＫ経路に対するこれらの効果の特異性を説明するのに十分である。まとめると、このデータは、Ｇａｄｄ４５βが、ＴＮＦαおよびＪＮＫＫ２の直接標的化によるストレス刺激により誘導されるＪＮＫ活性化、それによる、アポトーシス、を抑制することを示す。Ｇａｄｄ４５βは、インビトロでＪＮＫＫ２に結合し得、かつＪＮＫＫ２活性を阻害し得るので（図２０および２１）、Ｇａｄｄ４５βは、キナーゼ活性を妨害するコンフォメーション変化または立体障害のいずれかを誘導することによって、このキナーゼを直接的にブロックする可能性がある。これらの知見は、ＪＮＫＫ２／ＭＫＫ７を、ＪＮＫカスケードにおけるＧａｄｄ４５βの重要な分子標的として同定する。特定の環境下において、Ｇａｄｄ４５βはまた、ＪＮＫＫ１を阻害し得るが、ＪＮＫＫ２より弱い。ＡＳＫ１は、ＪＮＫの持続的活性化およびＴＮＦ−Ｒによるアポトーシスに必須であるので、恐らくＧａｄｄ４５βとこのＭＡＰＫＫＫとの間の相互作用はまた、これらのレセプターによるＪＮＫ誘導に関連する。
【図２３】図２３Ａ〜Ｂは、ＪＮＫＫ２のキナーゼドメインにおける２つの別個のポリペプチド領域が、Ｇａｄｄ４５βとの相互作用に必須であることを示す。ＧＳＴ−コーティングビーズおよびＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５β−コーティングビーズによるＧＳＴプルダウンアッセイを実施することによって、Ｇａｄｄ４５βとの相互作用に関与するＪＮＫＫ２の領域を決定した。種々のＪＮＫＫ２のアミノ末端短縮をコードするｐＢＳプラスミドを、３５Ｓ−メチオニンの存在下でインビトロで翻訳し、そしてこれらのペプチドのＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５βへの結合を、本明細書に記載のようにアッセイし（図２３Ａ、一番上）、ＪＮＫＫ２（１〜４０１；ＦＬ）ポリペプチド、ＪＮＫＫ２（６３〜４０１）ポリペプチド、ＪＮＫＫ２（９１〜４０１）ポリペプチド、およびＪＮＫＫ２（１３２〜４０１）ポリペプチドは、インビトロでＧａｄｄ４５βと強く相互作用した。このことは、残基１と残基１３１との間にわたるアミノ酸領域が、Ｇａｄｄ４５βとのＪＮＫＫ２会合に必要でないことを示す。しかし、より短いＪＮＫＫ２短縮（すなわち、ＪＮＫＫ２（１５７〜４０１）、ＪＮＫＫ２（１７６〜４０１）、およびＪＮＫＫ２（２３１〜４０１））は、Ｇａｄｄ４５βとより弱く相互作用し、このことは、１３３と１５６との間のアミノ酸領域が、Ｇａｄｄ４５βへの強い結合に重要であることを示す。残基２４４を越えて延びるさらなる欠失は、キナーゼのＧａｄｄ４５βへの会合を阻害する能力を完全に抑制し、このことは、ＪＮＫＫ２の２３１〜２４４領域はまた、Ｇａｄｄ４５βへの結合の一因となることを示す。
【０２５１】
これらの知見へのさらなる支持を提供するために、適切な制限酵素により直線化されたｐＢＳ−ＪＮＫＫ２テンプレートとの網状溶解物（ｒｅｔｙｃｕｌｏ−ｌｙｓａｔｅ）反応をプログラムすることによって、ＪＮＫＫ２のカルボキシ末端欠失を作製した（図２３Ｂ、下側）。これらの短縮を用いた結合アッセイを、本明細書に記載のように実施した。ＳａｃＩＩ（ＦＬ）、ＰｐｕＭＩ、またはＮｏｔＩによるｐＢＳ−ＪＮＫＫ２（ＦＬ）の消化は、ＪＮＫＫ２のＧａｄｄ４５βと相互作用する能力に有意に影響を及ぼさず、このことは、アミノ酸２６６〜４０１が、この因子への結合に必要でないことを示す。逆に、ＸｃｍＩまたはＢｓｇＩによる消化（それぞれ、ＪＮＫＫ２（１〜１９７）ポリペプチドおよびＪＮＫＫ２（１〜１８６）ポリペプチドを生成する）は、Ｇａｄｄ４５βへの結合を部分的に阻害した。さらに、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｐＨＩ、またはＰｆ１ＭＩによる切断は、より短いアミノ末端ポリペプチドを生成し、この結合を完全に抑制した。まとめると、これらの知見は、アミノ酸１３９〜１８６およびアミノ酸１９８〜２６５にわたるポリペプチド領域は、両方、ＪＮＫＫ２とＧａｄｄ４５βとの強い会合を担うことを示す。ＪＮＫＫ２とＧａｄｄ４５βとの相互作用を、ＪＮＫＫ２残基１３２と１５６との間および残基２３１と２４４との間にわたる２つのポリペプチドに対して主にマッピングした。ＪＮＫＫ２はまた、さらなるアミノ酸領域を介してＧａｄｄ４５βと接触し得た。
【０２５２】
Ｇａｄｄ４５βは、ＪＮＫＫ２触媒ドメイン内の２つの別個のアミノ酸領域と直接接触するという知見は、Ｇａｄｄ４５βのＪＮＫＫ２に対する阻害的効果についての機械的基礎への洞察を提供する。ＪＮＫＫ２のこれらの領域は、ＭＥＫＫ４内で相同性を共有せず、このことは、Ｇａｄｄ４５βが、別個の表面を介してこれらのキナーゼと接触することを示唆する。Ｇａｄｄ４５βは、酵素的活性（例えば、ホスファターゼ活性またはタンパク質分解活性）を有することは知られておらず、そして、ＪＮＫＫ２へのその結合が、インビトロでキナーゼ機能を阻害するのに十分であるので、Ｇａｄｄ４５βは、キナーゼ活性または基質への接触を阻害するコンフォメーション変化または立体障害のいずれかを引き起こすことによって、触媒ドメインとの直接妨害を介してＪＮＫＫ２をブロックし得る。この点に関して、１３３〜１５６ペプチド領域は、アミノ酸Ｋ１４９（キナーゼ活性に重要な残基）を含み、それにより、Ｇａｄｄ４５βによるＪＮＫＫ２の強力な阻害についての可能性のある機構を提供する。
【図２４】図２４Ａ〜Ｂは、残基６９〜１０４にわたるＧａｄｄ４５βアミノ酸領域が、ＪＮＫＫ２との相互作用に必須であることを示す。ＪＮＫＫ２との会合を媒介するＧａｄｄ４５βの領域を同定するために、ＧＳＴプルダウン実験を実施した。標準プロトコルおよびＧＳＴ−ＪＮＫＫ２−コーティングビーズまたはＧＳＴ−コーティングビーズを使用して、アッセイを実施した。Ｇａｄｄ４５βの徐々に短くなるアミノ末端欠失をコードするｐＢＳプラスミドを、インビトロで翻訳し、３５Ｓ−メチオニンにより標識した（図２４Ａ）。マウスＧａｄｄ４５β（１〜１６０；ＦＬ）ポリペプチド、Ｇａｄｄ４５β（４１〜１６０）ポリペプチド、Ｇａｄｄ４５β（６０〜１６０）ポリペプチド、およびＧａｄｄ４５β（６９〜１６０）ポリペプチドは、ＪＮＫＫ２と強く相互作用し、一方、Ｇａｄｄ４５β（８７〜１６０）は、キナーゼのみに弱く結合した。対照的に、Ｇａｄｄ４５β（１１４〜１６０）は、ＪＮＫＫ２と会合することができなかった。これらの知見を確認するために、一連のカルボキシ末端Ｇａｄｄ４５β短縮を、適切に線状化したｐＢＳ−Ｇａｄｄ４５βプラスミドとのインビトロでの転写／翻訳反応をプログラムすることによって作製した（図２４Ｂ）。ｐＢＳ−Ｇａｄｄ４５βのＮｇｏＭＩによる消化は、ＪＮＫＫ２へのＧａｄｄ４５β結合に影響を及ぼさなかったが、ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＶによる消化（それぞれ、Ｇａｄｄ４５β（１〜９５）およびＧａｄｄ４５β（１〜６８）を生成する）は、ＪＮＫＫ２に対するＧａｄｄ４５β親和性を進行的に減失させた。実際に、後者のポリペプチドは、ＪＮＫＫ２と会合することができなかった。まとめると、このデータは、残基６９〜１０４にわたるＧａｄｄ４５βポリペプチドが、ＪＮＫＫ２との相互作用に関与していることを示す。
【図２５】図２５は、残基６９と１１３との間にわたるアミノ酸領域が、Ｇａｄｄ４５βがＴＮＦα誘導性アポトーシスを抑制する能力に必須であることを示す。突然変異分析を実施することによって、ＴＮＦα誘導性死滅のブロックに必要であるＧａｄｄ４５βのドメインを、６９〜１１３アミノ酸領域に対してマッピングした。ＲｅｌＡ−／−細胞における発現の際に、ＧＦＰ−Ｇａｄｄ４５β（６９〜１６０）およびＧＦＰ−Ｇａｄｄ４５β（１〜１１３）は、ＴＮＦαに対する抗アポトーシス活性を呈し、この活性は、全長ＧＦＰ−Ｇａｄｄ４５βに匹敵した。対照的に、これらのアッセイにおいて、Ｇａｄｄ４５β（８７〜１６０）またはＧａｄｄ４５β（１〜８６）と融合したＧＦＰタンパク質は、中程度の保護効果のみを有した。より短い短縮は、細胞生存に対して実質的な効果を有さず、このことは、アミノ酸６９と１１３との間にわたるＧａｄｄ４５β領域が、細胞保護を提供し、隣接する６０〜６８領域は、この活性に中程度でのみ寄与することを示す。
【０２５３】
このアミノ酸領域は、ＪＮＫＫ２との相互作用をも担うＧａｄｄのドメインを含む。このことは、Ｇａｄｄ４５βの保護活性が、そのＪＮＫＫ２への結合能力およびＪＮＫ活性化を抑制する能力に連関するという意見と一致する。
【図２６】図２６は、Ｇａｄｄ４５βが、ＪＮＫ経路におけるキナーゼと物理的に相互作用することを示す。ａ、ｂ、２９３細胞由来の抗ＦＬＡＧ免疫沈降物（上側）または全溶解産物（中および下側）によるウェスタンブロットであり、ＡＳＫ１、ＭＥＫＫ４、およびＭＫＫ７とのＧａｄｄ４５β会合を示す。ｃ、ＧＳＴ−コーティングビーズまたはＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５β−コーティングビーズおよび３５Ｓ標識した、インビトロで翻訳されたタンパク質を使用するプルダウンアッセイ。４０％の投入が示される。
【図２７】図２７は、Ｇａｄｄ４５βおよびＮＦ−κＢが、インビボでＭＫＫ７を特異的に阻害することを示す。ａ〜ｅ、リン酸化（Ｐ）キナーゼまたは全キナーゼおよびキナーゼアッセイ（Ｋ．Ａ．）に対する抗体を用いたウェスタンブロットであり、（ａ〜ｃ）ＩκＢαＭ−ＨｙｇｒｏクローンおよびＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５βクローンならびに（ｄ、ｅ）ＮｅｏクローンおよびＩκＢαＭ  ３ＤＯクローンにおけるＴＮＦαまたはＰ／ＩによるＭＡＰＫＫおよびＭＡＰＫＫＫの活性化を示す。ａ、ｄ、ＭＫＫ７リン酸化（Ｐ−ＭＫＫ７）を、組み合わせ免疫沈降（抗Ｐ−ＭＫＫ７抗体）およびウェスタンブロッティング（抗全ＭＫＫ７抗体）によってモニタリングした。
【図２８】図２８は、Ｇａｄｄ４５βが、ＭＫＫ７の直接的なインヒビターであることを示す。ａ、免疫沈降に続くウェスタンブロットであり、Ｐ／Ｉにより処理（２時間）した３ＤＯ細胞または未処理のまま（ＵＳ）の３ＤＯ細胞における、内因性Ｇａｄｄ４５βとＭＫＫ７との物理的会合（上側）を示す。タンパク質レベルを示す（下側）。ｂ、ｇ、クーマシーブリリアントブルー染色（ＣＳ）であり、それぞれ（ｃ）および（ｄ、ｅ）において使用されたタンパク質の純度を示す。ｃ、精製したタンパク質を用いたインビトロプルダウンアッセイであり、Ｈｉｓ６／Ｔ７−Ｇａｄｄ４５βとＧＳＴ−ＭＫＫ７との間の直接的な相互作用を示す。沈降したＧＳＴタンパク質および結合したＨｉｓ６／Ｔ７タグ化タンパク質を、それぞれ抗Ｔ７抗体を用いるＣＳおよびウェスタンブロッティング（ＷＢ）により視覚化した。Ｈｉｓ６／Ｔ７−タグ化タンパク質の投入を示す。Ｈｉｓ６／Ｔ７−Ｇａｄｄ４５βおよびＨｉｓ６／Ｔ７−ＪＩＰ１のＧＳＴ−ＭＫＫ７への結合の画分（任意の単位［ａ．ｕ．］で表す；左）を、公知のタンパク質濃度により作製された標準曲線に対して計算した１９。ｄ、ｅ、キナーゼアッセイであり、精製したＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５βおよびＨｉｓ６−Ｇａｄｄ４５βによるインビトロでの活性ＭＫＫ７の特異的阻害を示す。ＦＬＡＧタグ化キナーゼを、ＴＮＦαにより処理した（１０分）２９３細胞または未処理のままの２９３細胞から免疫沈降させ、示された濃度のＧａｄｄ４５βポリペプチドとともにプレインキュベートした。ｆ、２９３細胞における内因性キナーゼレベルを示すウェスタンブロット。
【図２９】図２９は、ＭＫＫ７が、その触媒ドメイン中の２つのペプチド（ｐｅｔｉｄｉｃ）領域を介してＧａｄｄ４５βに接触することを示す。ａ、ｃ、ｅ、は、結合アッセイに使用した、ＭＫＫ７  Ｎ末端短縮およびＭＫＫ７  Ｃ末端短縮ならびにペプチドそれぞれの模式図である。相互作用領域は、灰色で陰をつけてある。ｂ、ｄ、ｆ、ＧＳＴがプルダウンされており、示された３５Ｓ−標識されたインビトロで翻訳されたＭＫＫ７産物に結合するＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５βを示す。４０％投入を示す。ｇ、は、Ｇａｄｄ４５β相互作用ペプチド１および７のアミノ酸配列であり、Ｋ１４９を強調している。
【図３０】図３０は、ペプチド１が、Ｇａｄｄ４５β（およびＮＦ−κＢ）がＴＮＦαにより誘導されるＪＮＫ活性化およびアポトーシスを抑制する能力を減失させることを示す。ａ、ペプチド領域１への結合が、Ｇａｄｄ４５βによるＭＫＫ７不活性化に必要であることを示すキナーゼアッセイ（Ｋ．Ａ．）である。ＦＬＡＧ−ＭＫＫ７を、ＴＮＦα処理した（１０分間）２９３細胞から免疫沈降させた。ｂ、ｃ、は、ペプチド１が、それぞれＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５βクローンおよびＮｅｏクローンにおけるＴＮＦαによる殺傷を促進することを示すアポトーシスアッセイである。ＴＮＦα処理した細胞の値から未処理の細胞のバックグラウンド値を減算することによって値（任意の単位として表す）を得、この値は、３つの実験の平均（＋／−標準偏差）を表す。
【図３１−１】図３１（Ａ〜Ｄ）は、ヒトおよびマウスのＪＮＫＫ２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３１−２】図３１（Ａ〜Ｄ）は、ヒトおよびマウスのＪＮＫＫ２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３１−３】図３１（Ａ〜Ｄ）は、ヒトおよびマウスのＪＮＫＫ２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３２】図３２は、Ｇａｄｄ４５βが、その触媒ドメイン中のペプチド領域に接触することによってＭＫＫ７ブロックすることを示す。ａ、結合アッセイに使用したＭＫＫ７ペプチドの模式図である。相互作用領域は灰色である。ｂ、ｄ、ｅ、ＧＳＴプルダウンアッセイであり、示された３５Ｓ標識されたインビトロで翻訳されたＭＫＫ７産物のＧＳＴ−Ｇａｄｄ４５βへの結合を示す。４０％の投入を示す（ｂ、ｄ）。ｅ、ＡＴＰを示されるように使用した。ｃ、（ｄ）において使用したＧａｄｄ４５β相互作用ペプチド１および７、ならびにペプチド１変異体のアミノ酸配列である。Ｋ１４９をアスタリスクにより印す。Ｇａｄｄ４５βへの結合に関与するアミノ酸は、灰色であり、黒色は、この結合に対するそれらの明らかな関連と相関する。ｆ、ペプチド領域１への結合が、Ｇａｄｄ４５βによるＭＫＫ７不活性化に必要であることを示すキナーゼアッセイ（Ｋ．Ａ．）である。ＦＬＡＧ−ＭＫＫ７を、ＴＮＦα処理した（１０分間）２９３細胞から免疫沈降させた。ｃにおける下線および太字のアミノ酸は、元のｐ１（１３２〜１５６）には存在しなかった挿入されたアミノ酸を表す。
【図３３】図３３は、ＭＫＫ７のＧａｄｄ４５β媒介性抑制が、ＴＮＦα誘導性アポトーシスをブロックするのに必要であることを示す。ａ、ｂ、ペプチド１が、それぞれＩκＢαＭ−Ｇａｄｄ４５βクローンおよびＮｅｏ  ３ＤＯクローンにおけるＴＮＦαによる殺傷を効率的に促進することを示すアポトーシスアッセイである。ｃ、ｄ、ペプチド１およびペプチド２の両方が、野生型ＭＥＦにおけるＴＮＦα誘導性細胞傷害性を促進し得ること、およびペプチド２のみが、Ｇａｄｄ４５β  ヌル＿ＭＥＦにおけるこの傷害性を促進し得ることをそれぞれ示すアポトーシスアッセイである。ＭＥＦは双生児胚由来であり、継代（ｐ）４において使用した。ａ〜ｄ、ＴＮＦα処理した細胞の値から未処理の細胞のバックグラウンド値を減算することによって値（任意の単位として表す）を得、この値は、３つの実験の平均（＋／−標準偏差）を表す。
【図３４】図３４は、合成のＦＩＴＣ標識したＴＡＴペプチドが、匹敵する効率で細胞に進入することを示す。ａ〜ｄ、ＤＭＳＯ（Ｃｔｒ）または示されたペプチド（５μＭ）と２０分インキュベートした後の、３ＤＯ細胞のＦＣＭ（ａ、ｃ）および共焦点顕微鏡（ｂ、ｄ）分析である。ａ、ｃ、ＤＭＳＯ（灰色）およびペプチド（黒色）で処理した細胞の重なりプロフィールを、ヒストグラムに示す。ｅ、インビボ研究のためにＴＡＴに融合されたペプチド１変異体のアミノ酸配列である。Ａｌａ−ＩＩ＊は、Ａｌａ−ＩＩに存在しないＲ１４０変異体を含み、Ａｌａ−Ｖ＊において、変異は、Ａｌａ−Ｖと比較してＣ末端側に１アミノ酸だけシフトしていることに留意すること（図３２ｃを参照のこと）。Ａｌａ−ＩＶ＊は、Ａｌａ−ＩＶに対して、そのＭＫＫ７模倣部分において同一である。（配列表）
【０２５４】
【表２】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３１−３】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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