(57)【要約】【課題】所望の細胞において、相同組換え率を顕著に促進させる新規方法を提供する。【解決手段】  真核生物細胞等の所望の細胞の相同組換え率を上昇させるために、非相同組換えに必要な因子、例えば、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０をコードする遺伝子に突然変異を導入し、または該遺伝子を破壊することにより、機能喪失を引き起こしたとき、細胞に外来性ＤＮＡを、電気ショック法等により導入して相同組換えを行わせ、細胞の相同組換え頻度を促進させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｂ）；
（ａ）非相同組換えに必要な遺伝子の機能低下もしくは機能喪失を誘導した細胞を作製する段階、
（ｂ）前記細胞に外来性ＤＮＡを導入し相同組換えを行わせる段階、
を含むことを特徴とする相同組換えを行わせる方法。
【請求項２】
前記非相同組換えに必要な遺伝子の機能低下もしくは機能喪失が、細胞内に内在する非相同組換えに必要な遺伝子中に突然変異または欠失を導入することで達成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非相同組換えに必要な遺伝子の機能低下もしくは機能喪失が、細胞内に内在する非相同組換えに必要な遺伝子の全体を破壊することで達成されることを特徴とする請求項１に記載の方法
【請求項４】
前記外来性ＤＮＡを導入する段階が、電気ショック法、スフェロプラスト法またはＴｉプラスミド法のいずれかの方法によって達成されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記非相同組換えに必要な遺伝子が、少なくともＫＵ７０、ＫＵ８０、ＬｉｇＩＶ、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、またはＸＲＣＣ４からなる群から選択される遺伝子であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が真核細胞であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記真核細胞が、少なくとも動物細胞、植物細胞、真菌細胞からなる群から選択される細胞であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記真菌細胞が、糸状菌であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記糸状菌が、ニューロスポラ属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、フザリウム属、トリコデルマ属またはムコール属のいずれか１つに属する糸状菌である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ニューロスポラ属に属する糸状菌が、少なくともニューロスポラ・クラッサ、ニューロスポラ・シトフィラ、ニューロスポラ・テトラスペルマ、ニューロスポラ・インターメディア、ニューロスポラ・ディスクレータからなる群から選択される１種である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記段階（ａ）で作製された請求項１に記載の細胞。
【請求項１２】
請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法によって取得された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、効率よく相同組換えを行わせる方法、およびその方法によって取得された相同組換え体細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに、真核生物細胞では、主な２つの組換え経路、相同組換え、および非相同組換えによる経路が同定されている。相同組換えは、ＤＮＡの相同な配列間における相互作用により誘起されるのに対し、非相同組換えは、ＤＮＡの相同性とは無関係に、切断された二重鎖端の直接的なライゲーションにより引き起こされると考えられている。出芽酵母では、組換えの機構として、主に相同組換えのシステムが使用されており、外来ＤＮＡがその両端に組込む相手のゲノム配列の一部を有していれば、その配列と相同なゲノム部位に外来ＤＮＡが組み込まれる（Takataら, 1997、Wachら、1994）。この過程において、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５４が必須であることが報告されている（NickoloffおよびHoekstra, 1998）。一方、ヒト、植物、昆虫および分裂酵母を含む他の多くの生物は、組換えの機能として非相同組換えのシステムを主として利用している。これらの生物においては、外来ＤＮＡがたとえゲノム上の特定領域と相同な長いＤＮＡ配列部分を有していたとしても、当該特定領域に組み込まれる頻度は低く、ゲノム上の不特定部分に組み込まれる場合が多い。
【０００３】
相同組換えは、既存の遺伝子を効率よく改変することが可能であり、新種株の作出や、細胞の機能低下を改善するなどの目的に利用することができるため、出芽酵母を除く真核生物細胞において、相同組換え率を上昇させる試みがこれまでに数多く行われてきた。
例えば、出芽酵母の相同組換えにおいて重要な役割を果たしている、ＲＡＤ５１遺伝子あるいはＲＡＤ５２遺伝子またはそのホモログ遺伝子の高発現系を構築する試みがなされているが、ＲＡＤ５１あるいはＲＡＤ５２を高発現させても相同組換え頻度は２〜３倍程度しか上昇せず、むしろ、細胞に対して悪影響を及ぼすことが知られている（Yanezおよび Porter, 2002、Reissら, 2000）。また、導入するベクターの相同組換え率を増大させるために多様なターゲティングベクターが開発されてきた。例えば、哺乳類細胞や植物細胞における、ネガティブ−ポジティブ選択法による相同組換え個体濃縮法（特許文献１、非特許文献１、２を参照のこと）は、代表的な例であるが、このような方法によっても依然として相同組換え頻度は極めて低く（１％以下）、かつ、このような方法を実施すること自体煩雑な操作が必要であることから、実用的な方法ではなかった。
【０００４】
出芽酵母以外の真核生物細胞における遺伝子組換えの研究は、遺伝学的アプローチが容易に行えることから、分裂酵母の他、真菌、例えば、糸状菌などを用いて行われている。糸状菌であるニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）も組換え研究に多く用いられる生物の一つである。ニューロスポラ・クラッサのｍｅｉ−３，ｍｕｓ−１１，ｍｕｓ−２５遺伝子は、出芽酵母の相同組換えにおいて機能するＲＡＤ５１，ＲＡＤ５２およびＲＡＤ５４とそれぞれ、相同であることが知られている。そこで、これらの遺伝子に欠損をもつ変異体の相同組換え率に関し、プラスミドｐＭＴＲ（Schroederら, 1995）に含まれるｍｔｒ遺伝子の、染色体ｍｔｒ遺伝子座への組換え頻度を指標にして、検討された（Handaら, 2000）。これらの遺伝子に欠損を持たない野生型株においては、形質転換体の３から５％のみが相同組換えを示したのに対し、ｍｅｉ−３およびｍｕｓ−２５変異体では、相同組換えはほとんど起こらなかった。これらのデータからも、ニューロスポラ・クラッサにおいては相同組換え率が非常に低く、遺伝子ターゲティングにより特定の遺伝子を破壊することは容易ではないことが示されていた。
【０００５】
一方、非相同組換えの過程は、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）、Ｋｕ７０−Ｋｕ８０ヘテロダイマー、ＤＮＡリガーゼＩＶ−Ｘｒｃｃ４複合体を介して進行することが報告されている（非特許文献３、４、５を参照のこと）。そこで、発明者は、非相同組換え機構を阻害することによって、相同組換え率が増大するのではないかとの作業仮説に基づき研究を進めた。
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−０４６０５３号公報
【非特許文献１】Ｔｅｒａｄａら，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２０，  １０３０−１０３４.  ２００２
【非特許文献２】Ｊｅａｎｎｏｔｔｅら，ＥＪ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１，５５７８−５５８５．１９９１
【非特許文献３】Ｇａｌｌｅｇｏら，  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ３５，  ５５７−５６５  ２００３
【非特許文献４】Ｗａｌｋｅｒら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１２，  ６０７−６１４．  ２００１
【非特許文献５】ＣｒｉｔｃｈｌｏｗおよびＪａｃｋｓｏｎ，  ＴＩＢＳ，  ２３，  ３９４−３９８．  １９９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は、上記事情に鑑み、真核細胞における相同組換え率を上昇させる方法がないかについて鋭意研究を行った結果、意外にも非相同組換えに必要な遺伝子であるＫＵ７０、ＫＵ８０の機能を喪失もしくは機能低下させることで、真核細胞における相同組換え頻度を上昇させることができることを見出した。
よって、本発明は、相同組換え率を上昇させる方法を提供することを目的とする。
さらに、上記方法を用いて作出された高効率相同組換え細胞を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
しかして、本発明において、相同組換え率を上昇させるために、非相同組換えに必要であることが知られている遺伝子に、突然変異導入、遺伝子破壊などの手法により機能低下、機能喪失を引き起こし、次いで、相同組換えを起こさせたい所望の外来ＤＮＡを該細胞に導入することで、効率よく相同組換えを行わせる方法が提供される。
本発明の方法を用いて実現される相同組換えの効率は、例えば、７０％以上、より好ましくは８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上であり、最も好ましくは１００％の相同組換え頻度が実現される。
本発明で用いられる細胞は、一般に、真核細胞であれば組織由来の細胞であっても、株化培養細胞であってもよく、限定はしないが、相同組換え率の低い、動物細胞、植物細胞、真菌細胞などが適している。
動物細胞としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ヒツジ、ネコ、イヌなどの哺乳類細胞の他、鳥類、は虫類、両生類などの細胞であっても使用可能である。
また、植物細胞としては、例えば、イネ、ダイズ、コムギ、オオムギ、ライムギ、綿花、トウモロコシ、イモ、ピーナッツ、アラビドプシスが適している。
さらに、遺伝子操作が比較的容易な真菌細胞なども使用可能であり、糸状菌細胞などが好ましい。使用可能な糸状菌としては、ニューロスポラ属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、フザリウム属、トリコデルマ属またはムコール属などを挙げることができる。中でも好適な糸状菌としては、ニューロスポラ属に含まれるニューロスポラ・クラッサ、ニューロスポラ・シトフィーラ、ニューロスポラ・テトラスペルマ、ニューロスポラ・インターメヂアなど、また、アスペルギルス属に含まれるアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・パラシティク、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・ノミウス、アスペルギルス・フミガタス、アスペルギルス・ニジュランスなどが好適に使用可能である。
【０００９】
本発明に使用される非相同組換えに必要な遺伝子は、当該技術分野において知られているものであれば使用可能であり、限定はしないが、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）、Ｋｕ７０−Ｋｕ８０ヘテロダイマー、ＤＮＡリガーゼＩＶ−Ｘｒｃｃ４複合体などをコードする遺伝子が好ましく、特に、ＫＵ７０遺伝子および／またはＫＵ８０遺伝子が最も好ましい。
本発明で用いられるＫＵ７０、ＫＵ８０には、任意の真核生物のＫＵ７０およびＫＵ８０ホモログが含まれる。例えば、ヒトＫＵ７０（P１２９５６）（配列番号１）、ヒトＫＵ８０（P１３０１０）（配列番号２）、ニューロスポラ・クラッサのＫＵ７０（NCU08290.1）（配列番号３）、ＫＵ８０（NCU00077.1）（配列番号４）などを含む遺伝子、およびこれらの遺伝子産物の一または数個のアミノ酸に欠失、付加もしくは置換を含むアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、その産物が非相同組換えに必要な活性を有するものが本発明のＫＵ７０ホモログ、ＫＵ８０ホモログとして使用可能である。
【００１０】
本発明で使用される細胞へのＤＮＡの導入方法は、当該技術分野において周知の方法であれば使用可能であるが、例えば、スフェロプラスト法、電気ショック法（エレクトロポレーション法）、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質による方法などが利用可能であるが、電気ショック法（エレクトロポレーション法）がもっとも好ましい。
【００１１】
また、本発明による方法によって作製された、相同組換え率が顕著に上昇した細胞も、本発明により提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、対象の細胞において、ほぼ１００％の相同組換え頻度を達成することができるため、目的の遺伝子の破壊、置換等を効率よく行うことができる。さらに、異種生物の遺伝子を対象の細胞のゲノムの特定域に挿入し、発現させることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
１．対象の細胞における非相同組換えに必要な因子をコードする遺伝子の同定
本発明においては、非相同組換えに必要な因子をコードする遺伝子に機能低下または機能喪失を導入するために、対象とする細胞に由来する非相同組換えに必要な因子をコードする遺伝子を同定する必要がある。例えば、ＫＵ７０またはＫＵ８０のホモログを同定する場合、対象とする細胞由来のＫＵ７０またはＫＵ８０のホモログの遺伝子配列が公知でない場合は、公知の他の種、例えば、ヒトなどのＫＵ７０（配列番号１）またはＫＵ８０（配列番号２）のホモログ遺伝子配列を基にして、対象細胞のｃＤＮＡライブラリーなどに対してスクリーニングを行う。スクリーニングの方法としては、核酸ハイブリダイゼーション及びクローニングに関する技術分野において周知の方法を用いて、低い、中程度又は高い緊縮性のハイブリダイゼーションにより得ることができる。ハイブリダイゼーションの「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な条件である。当業者であれば、ホモログを同定するためのハイブリダイゼーションスクリーニングを行うにあたり、プローブの長さなどを考慮して、温度、イオン強度等を如何に調節するか容易に理解することができる。
【００１４】
さらに、対象とする細胞由来のＯＲＦのデーターベースが存在する場合には、該データーベースに対してＢＬＡＳＴサーチ等を行い既知のＫＵ７０またはＫＵ８０に対するホモログを同定することも可能である。この場合、検索された配列に基づいて該当する遺伝子全体を増幅するために適当なＰＣＲ用のプライマーを作製し、得られたＰＣＲ産物を適当なクローニング用のベクターに挿入することによって、目的のＫＵ７０またはＫＵ８０をクローン化させることも可能である。
同定されたＫＵ７０またはＫＵ８０は適当なクローニング用ベクター（例えば、ｐＵＣ１９など）にサブクローニングして配列確認を行う。
【００１５】
２．非相同組換えに必要な遺伝子の機能低下または機能喪失
本発明は、細胞に内在する非相同組換えに必要な遺伝子の機能低下または機能喪失させることにより、染色体上における相同組換え頻度を上昇させる方法を提供するものである。そのために、細胞に内在する非相同組換えに必要な遺伝子の機能改変することができる。該機能を改変する方法としては、限定はしないが、例えば、内在する非相同組換えに必要な遺伝子に突然変異を導入する方法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用する方法、非相同組換えに必要な遺伝子全体を破壊する方法、非相同組換えに必要な遺伝子に対するアンチセンスを細胞内に導入する方法等、当業者にとって周知の方法が使用可能である。好ましくは、非相同組換えに必要な遺伝子に突然変異を導入する方法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用する方法、または非相同組換えに必要な遺伝子全体を破壊する方法であり、より好ましくは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用する方法、非相同組換えに必要な遺伝子全体を破壊する方法があり、最も好ましくは、非相同組換えに必要な遺伝子全体を破壊する方法である。
【００１６】
遺伝子全体を破壊する方法にはクローン化した標的遺伝子の必須領域にマーカー遺伝子を挿入したＤＮＡを細胞に形質転換する方法がある。細胞内に導入されたＤＮＡは標的遺伝子の両隣接配列を介した相同組換えを誘発し染色体上の標的遺伝子をマーカー遺伝子により破壊することができる（Alfaら, 1993）。
また、遺伝子機能の喪失の目的において、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用する。この場合、機能喪失を引き起こすべき目的の因子の機能ドメインに関する塩基配列をもとに、短いＲＮＡ二本鎖もしくは該ＲＮＡを産生するベクターを細胞内に導入することで、当該因子の機能低下または機能喪失をもたらすことができる。
また、インビトロおいて突然変異を導入する方法としては、部位特異的突然変異導入法、及びＰＣＲ突然変異導入法などの当該技術分野において既知の方法を用いて行うことができる。部位特異的突然変異導入法（Carter, 1986；ZollerおよびSmith, 1987）、カセット突然変異導入法、限定的選択突然変異導入法（Wellsら, 1985）または他の既知の技術は、目的の遺伝子に変異を導入するために調製され、クローン化されたＤＮＡ上で実施することができる（Ausbelら, 1987；Sambrook, 1989）。
ＫＵ７０またはＫＵ８０に突然変異を導入することで機能改変を行う場合、Ｋｕ７０タンパク質またはＫｕ８０タンパク質活性を欠失させるように変異を導入すること、またはＫｕ７０タンパク質とＫｕ８０タンパク質が相互作用を行うのに必要な部位に変異を導入し該相互作用を消失させるような変異を導入することなどが望ましい。
【００１７】
３．組換え活性の測定
相同組換えの程度は、細胞外から導入したＤＮＡにより形質転換された細胞のうち、相同配列部位での組換えによって形質転換をおこしているものの割合で測定する。
【００１８】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
ニューロスポラ・クラッサ
１．実験材料
表１に、本実験で用いたニューロスポラ株を示す。Ｃ１−Ｔ１０−３７ＡおよびＣ１−Ｔ１０−２８ａを野生型として用いた（TamuraおよびInoue, 1989）。大腸菌株ＤＨ１およびＸＬ−１Ｂｌｕｅはプラスミドの増幅に用いた（Sambrookら, 1989）。
プラスミドｐＢｌｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（Stratagene社）およびｐＧＥＭ（Promega社）は、通常、新しいベクターの構築に用いた。２つのプラスミドｐＢＡＲＧＥＭ７−１（PallおよびBrunelli, 1993）、ｐＣＳＮ４３（Stabenら, 1989）および２つのコスミドＧ７Ｈ３，Ｇ８Ｂ１２はFungal Genetics Stock Center, University of Kansas Medical School, Kansas City, KS 66160-7420から入手した。
【００２０】
表１．本発明において用いられるニューロスポラ・クラッサ株
【表１】
2005237316.tif 000002
【００２１】
２．方法
（１）ニューロスポラにおける遺伝子研究法
遺伝子解析はDavisおよびde Serres（1970）の記載に従って行った。
（２）ＰＣＲ法
ＰＣＲ増幅はExpandTM High-Fidelity PCR system（Roche Diagnositics Corp., Switzerland）を用いて指示書に従って行った。
【００２２】
（３）Ｈｙｇｒ遺伝子によるニューロスポラ・クラッサのＫＵホモログ遺伝子（以下、ｎｃＫＵ７０遺伝子およびｎｃＫＵ８０と記述する）の置換を行うためのプラスミド構築
ハイグロマイシン耐性遺伝子ＨｙｇｒによるｎｃＫＵ７０およびｎｃＫＵ８０の置換方法を図１Ａおよび１Ｂに示す。
（ａ）ｎｃＫＵ７０の置換のためのＤＮＡの調製
ニューロスポラＫＵ７０遺伝子の各２ｋｂｐの５’および３’フランキングＤＮＡを、コスミドＧ７Ｈ３をテンプレートに用いてＰＣＲにより増幅した（ＰＣＲの条件は：９４℃２分のあと９４℃１５秒、５８℃３０秒、７２℃２分のサイクルを１０回、さらに９４℃１５秒、５８℃１５秒、７２℃２分（サイクルごとに７２℃の時間を５秒づつ増やしていく）を２０サイクル, さらに７２℃７分、その後４℃で保存）。
５’フランキングＤＮＡのプライマー
（ｐ−１）５’ＧＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧＧＧＴＡＴＣＧＣ３’（配列番号５）
（ｐ−２）５’ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡ３’（配列番号６）
３’フランキングＤＮＡのプライマー
（ｐ−３）５’ＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＧＣＴＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣＧＴ３’（配列番号７）
（ｐ−４）５’ＴＴＧＧＡＣＧＣＣＧＣＡＣＡＣＣＴＣＴＣＧＣＴＣＴ３’（配列番号８）
【００２３】
次に、Ｈｙｇｒ遺伝子プラスミドｐＣＳＮ４３をテンプレートとして用いてＰＣＲ増幅を行った（条件は上記と同じ）。
（ｐ−５）５’ＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＡＴＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＣ３’（配列番号９）
（ｐ−６）５’ＣＡＣＧＧＴＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴ３’（配列番号１０）
【００２４】
上記３つのＰＣＲ産物を混合して融合ＰＣＲテンプレートとして用い（Kuwayamaら, 2002）、また、プライマーとして、（ｐ−１）（配列番号５）及び（ｐ−４）（配列番号８）を用いて、融合ＰＣＲを以下の条件下で行った；
９４℃２分、９４℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃５分を１０サイクル、９４℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃５分（１サイクルごとに６８℃の時間を１分づつ延長する）を２０サイクル、７２℃７分、４℃で保持。
得られた融合ＰＣＲ産物を０．７％のアガロースゲルで電気泳動したのち、野生型のニューロスポラに形質転換した。
【００２５】
（ｂ）ｎｃＫＵ８０の置換のためのＤＮＡの調製
ニューロスポラＫＵ８０の各２ｋｂｐの５’および３’フランキングＤＮＡをコスミドＧ８Ｂ１２をテンプレートに用いてＰＣＲにより増幅した（条件はｎｃＫＵ７０の場合と同じ）。
５’フランキングＤＮＡのプライマー
（ｐ−７）５’ＧＣＧＣＣＧＧＧＡＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＡＡＧＣＴＧ３’（配列番号１１）
（ｐ−８）５’ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＧＧＣＴＴＴＴＣＧＧＣＴＴＴＧＣＴＧ３’（配列番号１２）
３’フランキングＤＮＡのプライマー
（ｐ−９）５’ＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＣＡＧＧＧＴＴＧＧＡＧＡＣＡＧＧＴ３’ （配列番号１３）
（ｐ−１０）５’ＡＡＧＧＣＧＧＡＧＴＴＧＴＴＧＧＣＴＧＣＧＡＡＧＧ３’ （配列番号１４）
【００２６】
次に、Ｈｙｇｒ遺伝子プラスミドｐＣＳＮ４３をテンプレートとして用いてＰＣＲ増幅を行った（条件はｎｃＫＵ７０の場合と同じ）。
（ｐ−１１）５’ＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＧＡＡＡＡＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＣ３’（配列番号１５）
（ｐ−１２）５’ＡＣＣＴＧＴＣＴＣＣＡＡＣＣＣＴＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴ３’（配列番号１６）
【００２７】
融合ＰＣＲは（ｐ−７）（配列番号１１）および（ｐ−１０）（配列番号１４）を用いて、上記条件下と同様に行った。
【００２８】
（４）電気ショック法（エレクトロポレーション法）
分生子懸濁液は１Ｍソルビトール中２．０ｘ１０９濃度で調製した。融合ＰＣＲ産物、３０μｌを分生子懸濁液５０μｌと混合し、氷上にて５分間インキュベートした。混合液４０μｌエレクトロポレーター（BTX Electro Cell Mnipulaion 600 Genetronics Inc.）上の細胞へ添加した。電気ショックの条件を以下のようにして行った；チャージ電圧１．５ｋＶ、最高電圧／計時モード２．５ｋＶ／抵抗、計時キャパシタンス５０μＦ、計時抵抗Ｒ６（１８６オーム）。
【００２９】
（５）ｎｃＫＵ７０およびｎｃＫＵ８０の置換
電気ショックの後、１．２％スクロースを含有するVogels’最小培地１ｍｌを加え、３０℃で２時間インキュベートした。この溶液２００μｌをハイグロマイシンＢ（５００μｇ／ｍｌ）を含む寒天培地に塗り広げた。ハイグロマイシン耐性のコロニーを単離し、標的遺伝子座において置換が生じているかどうかをＰＣＲを用いて検討した。さらに、余分なＨｙｇｒ遺伝子コピーを含んでいるかどうか、サザンブロット法により確認した。
（６）変異原感受性
ＵＶ及びメチルメタンスルホン酸塩（ＭＭＳ）に対する感受性について既刊の文献に記載の方法に従って行った（InoueおよびIshii, 1984）。
【００３０】
３．結果
（１）ｎｃＫＵ７０およびｎｃＫＵ８０の置換実験
ヒトＫＵ７０およびＫＵ８０に対するニューロスポラ・クラッサスのホモログを見つけるために、ニューロスポラゲノムデータベース（http://www-genome.wi.mit.edu/annotation/fungi/neurospora）に対してサーチを行った。検索された候補遺伝子を仮にｎｃＫＵ７０およびｎｃＫＵ８０と名づけた。ｎｃＫＵ７０およびｎｃＫＵ８０遺伝子は各々６４５および６６１アミノ酸をコードする。図２には、ヒトＫｕ７０のアミノ酸配列とｎｃＫｕ７０のアミノ酸配列の比較を示す。ヒトＫｕ７０とｎｃＫｕ７０は２３％の同一性、４２％の類似性を有していた。図３には、ヒトＫｕ８０とｎｃＫｕ８０の比較を示す。ヒトＫｕ８０とｎｃＫｕ８０は２３％の同一性、４１％の類似性を有していた。Orbach/Sachsコスミドライブラリー（Orbach, 1994）から得たＧ７Ｈ３及びＧ８Ｂ１２は、各々ｎｃＫＵ７０およびｎｃＫＵ８０を含んでいる。従って、これらのコスミドをテンプレートとして用い、ｎｃＫＵ７０およびｎｃＫＵ８０のＰＣＲ増幅を行った。材料および方法のところで記載したように、ｎｃｋｕ遺伝子に由来する２ｋｂｐの５’および３’フランキングＤＮＡを結合したＨｙｇｒ遺伝子を保持するＤＮＡ断片は、融合ＰＣＲによって調製した。融合ＰＣＲ産物を野生型ニューロスポラ・クラッサに中に導入し、ハイグロマイシン耐性コロニーを単離した。約２００の形質転換体をサブクローニングして、ゲノムＤＮＡを抽出し、ｎｃＫＵ遺伝子がＨｙｇｒ遺伝子によって置換されているかどうかをＰＣＲによって決定した。このＰＣＲのプライマーは、図１Ｂに示されるように、一方をｎｃＫＵ遺伝子の外側に、他方をＨｙｇｒ遺伝子の内側に設定した。ハイグロマイシン耐性コロニーの約１０％がｎｃＫＵ遺伝子の位置にＨｙｇｒ遺伝子を有していた。ｎｃＫＵ７０：：Ｈｙｇｒを保持する５４ｙｏ−７２８株およびｎｃｋｕ８０：：Ｈｙｇｒを保持する５４ｙｏ−８２８株を各々ｎｃｋｕ７０およびｎｃｋｕ８０変異体として用いた。これら株は、栄養生長およびホモ接合交雑増殖は正常であるが、僅かにＵＶに感受性であり、明らかにＭＭＳに感受性であった（図４）。
【００３１】
（２）野生型、ｎｃｋｕ７０，ｎｃｋｕ８０，ｍｅｉ−３，ｍｕｓ−１１変異株におけるｍｔｒ遺伝子およびａｄ−３Ａ遺伝子のターゲティング
染色体ＩＶおよびＩ上のｍｔｒ遺伝子およびａｄ−３Ａ遺伝子を、置換実験の標的に選んだ。ｍｔｒ遺伝子に欠損を持つ変異体は、アミノ酸アナログであるｐ−フルオロフェニルアラニン（ＰＦＰ）に耐性を示す。ａｄ−３Ａ遺伝子に欠損を持つ変異体は、紫色の色素の蓄積を示す（The Neurospora Conpendium, Academic Press 2001を参照のこと）。ｍｔｒＯＲＦまたはａｄ−３ＡＯＲＦをブラストサイジン耐性遺伝子ｂａｒに置換することによってターゲティングベクターを構築した。ｂａｒ遺伝子を含有する２．７ｋｂＤＮＡをｐＢＡＲＧＥＭ７−１から制限酵素ＳｃａＩおよびＳｍａＩで切り出した。
（２）−１
ｍｔｒ遺伝子の場合、ターゲティングベクターの構築および導入は以下のように行った。ｍｔｒ遺伝子を含有するｐＭＴＲをＭｓｃＩで消化し、ｍｔｒ遺伝子のプロモーターとＯＲＦの一部を含んだ約１ｋｂｐを除去した。次いで、２．７ｋｂｐのｂａｒ断片をその部分に挿入して、プラスミドｐＧＳ１（９．５ｋｂｐ）を作製した。ｐＧＳ１をＮｏｔＩで消化し、その結果得られたｂａｒ遺伝子の両サイドにｍｔｒ遺伝子の１．８ｋｂｐ５’および１．９ｋｂｐ３’フランキングＤＮＡを保持した６．７ｋｂｐの直鎖状断片を異なる遺伝的バックグラウンドを持つ株にエレクトロポローション法により導入した。ブラストサイジン（２００μｇ／ｍｌ）に耐性をもつ形質転換体を単離し、それらがＰＦＰ（２０μｇ／ｍｌ）に耐性であるかどうか検討した。ｂａｒ−ＤＮＡがｍｔｒ遺伝子座に組換えられていれば、ＰＦＰに対して耐性を示すはずである。そこで、組換えが相同的置換によって行われたかどうかをさらに検討した。表２は、野生型株においてブラストサイジン耐性形質転換体のうち１０から３０％が相同組換えにより生じたことを示す。これに対し、ｎｃｋｕ７０およびｎｃｋｕ８０株の形質転換体全てが相同的組換えによって生じた。相同組換え修復に欠損を持つｍｅｉ−３およびｍｕｓ１１株では、相同的組み込みがほとんど起こらなかった。
【００３２】
【表２】
2005237316.tif 000003
【００３３】
（２）−２
ａｄ−３Ａの１．６ｋｂｐ５’および２ｋｂｐ３’フランキングＤＮＡをｂａｒ遺伝子の両サイドに保持するａｄ−３Ａターゲティングベクターの構築は、上述のｍｔｒ遺伝子の場合と同様に行い、種々の株に導入した。ブラストサイジン耐性の形質転換体を単離し、アデニンを添加した最小培地中１０日間サブカルチャーを行った。ａｄ−３Ａの機能を喪失したことを示す、紫色の菌糸体のコロニー数をカウントした。表３に示すように、野生型のブラストサイジン耐性形質転換体の約５０％が紫色の菌糸体であり、これに対し、ｎｃｋｕ７０およびｎｃｋｕ８０株の形質転換体では１００％が紫色を呈していた。これらの形質転換体が相同的置換による破壊株であることをＰＣＲにより確認した（表３）。
【００３４】
【表３】
2005237316.tif 000004
【００３５】
４．ターゲティング率と相同配列の長さとの関係
ターゲティング率と相同配列の長さとの関係を調べるために、ｍｔｒ遺伝子の５’および３’フランキングＤＮＡと相同な５０，１００，５００，１０００ｂｐｓをＰＣＲで増幅し、ｂａｒ遺伝子の両サイドに結合させた。ブラストサイジン耐性形質転換体について、ＰＦＰに対し耐性であるかどうか調べた（表４）。５０ｂｐおよび１００ｂｐ長の相同ＤＮＡを導入されたブラストサイジン耐性形質転換体は、ｎｃｋｕ７０、ｎｃｋｕ８０ならびに野生型株においてＰＦＰ耐性をほとんど示さなかった。５００ｂｐ長の相同性の場合、野生型株においてＰＦＰ耐性を示したブラストサイジン耐性形質転換体が１０％未満であるのに対し、ｎｃｋｕ７０およびｎｃｋｕ８０株においては９０％以上がＰＦＰ耐性を示した。１０００ｂｐ長の相同性の場合、野生型株においてＰＦＰ耐性を示したブラストサイジン耐性形質転換体が２０％未満であるのに対し、ｎｃｋｕ７０およびｎｃｋｕ８０株においては全てがＰＦＰ耐性を示した。従って、相同部分が少なくとも１０００ｂｐ長あれば標的遺伝子を完全に置換することができる。
【００３６】
【表４】
2005237316.tif 000005
【実施例２】
【００３７】
アスペルギルス
１．アスペルギルス・ニジュランスのＫＵ７０遺伝子のクローニング
アスペルギルス・ニジュランス のゲノムデータベース(http://www-genome.wi.mit.edu/annotation/fungi/aspergillus/index.html) に対して  ＢＬＡＳＴ  ネットワークサービスを用いて、ニューロスポラ・クラッサのＫＵ７０遺伝子と相同性の高いクローン情報を検索した。その結果、Contig 1.132 は アスペルギルス・ニジュランスのＫＵ７０遺伝子全長を含んでいると考えられた。アスペルギルス・ニジュランスの推定Ｋｕタンパク質は、ニューロスポラ・クラッサのＫｕ７０タンパク質と約 ５０％の相同性を示した。A. nidulans FGCS A89 株のゲノムＤＮＡを鋳型に以下のプライマーを用いてＰＣＲにより、ＫＵ７０遺伝子全長を含む４０４５ｂｐの断片を増幅した。
ＫＵ７０／Ｆｏｒ  ５’ＧＡＧＡＡＣＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＡＴＧＣＧＴＧＧＣ  ３’（配列番号１７）
ＫＵ７０／Ｒｅｖ  ５’ＣＡＴＴＣＧＣＴＴＧＡＴＣＧＡＣＡＴＧＧＴＴＧＧＣ  ３’（配列番号１８）
【００３８】
ゲノムＤＮＡ             １（５０ｎｇ）
プライマーＦｏｒｗａｒｄ １（１００ｐｍｏｌ）
プライマーＲｅｖｅｒｓｅ １（１００ｐｍｏｌ）
１０×反応用バッファー   ５
ｄＮＴＰ混合物           ４
Ｅｘ  Ｔａｑ             １
ＤＤＷ（蒸留水）       ３７
総量                   ５０μｌ
上記のような反応系を作製し、TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL（宝酒造  （株））にてＰＣＲ反応を行った。反応条件は、９６℃２分、１サイクル；９６℃  ３０秒、５８℃３０秒、７２℃７分、３０サイクルとした。ＰＣＲ反応後、アガロースゲル電気泳動に供し、目的断片をゲルから回収した。これをｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ベクター（Promega 社）にＴＡクローニング法によりライゲーションを行い、ｐＧＥＭｋｕ７０  を得た。
【００３９】
２．アスペルギルス・ニジュランスのＫＵ７０遺伝子破壊−ｏｌｉＣ３１−
ｐＧＥＭｋｕ７０を鋳型に以下のプライマーを用いてQuikChange site-directed mutagenesis（部位特異的突然変異導入法）法によりＨｉｎｄＩＩＩサイトを導入した。下線部はＨｉｎｄＩＩＩサイトを示す。
ＫＵ７０（ＨｉｎｄＩＩＩ）／Ｆｏｒ  ５’ＣＡＣＡＴＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＧＴＧＧＣＴＡＣＣＣ  ３’（配列番号１９）
ＫＵ７０（ＨｉｎｄＩＩＩ）／Ｒｅｖ  ５’ＧＧＧＴＡＧＣＣＡＣＡＧＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＣＡＡＴＧＴＧ  ３’（配列番号２０）  
【００４０】
ｐＧＥＭｋｕ７０           ２（２０ｎｇ）
プライマーＦｏｒｗａｒｄ   ２（２００ｎｇ）
プライマーＲｅｖｅｒｓｅ   ２（２００ｎｇ）
１０×反応用バッファー     ５
ｄＮＴＰ混合物             ４
Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ         １
ＤＤＷ （蒸留水）        ３４
総量                     ５０μｌ
TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL を用いて、９５℃２分、１サイクル；９５℃３０秒、５４℃３０秒、７０℃１５分、１８サイクルとした。得られた変異プラスミドを  ｐＧＥＭｋｕ７０（Ｈ）とし、このプラスミドをＢｌｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アスペルギルス・ニジュランス由来オリゴマイシン耐性遺伝子ｏｌｉＣ３１をＢｌｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した断片を挿入し、ｐＧＥＭｋｕ７０：：ｏｌｉＣ３１とした。このプラスミドをＡｐａＩ消化によって直鎖状にした後、A. nidulans FGSC A89 株にプロトプラストＰＥＧ法を用いて導入した。形質転換体の選択は、オリゴマイシン（３μｇ／ｍｌ）を含むポテトデキストロース培地で行った。得られた形質転換体について、ＰＣＲ及びサザンブロット解析によりＫＵ７０遺伝子破壊株を選抜した。
【００４１】
３．アスペルギルス・ニジュランスのＫＵ７０遺伝子破壊−ｐｔｒＡ−
ｐＧＥＭｋｕ７０を鋳型に以下のプライマーを用いてQuikChange site-directed mutagenesis法によりＨｉｎｄＩＩＩサイトを導入した。下線部はＨｉｎｄＩＩＩサイトを示す。
ＫＵ７０（ＨｉｎｄＩＩＩ）／Ｆｏｒ ５’ＣＡＣＡＴＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＧＴＧＧＣＴＡＣＣＣ  ３’（配列番号２１）
ＫＵ７０（ＨｉｎｄＩＩＩ）／Ｒｅｖ ５’ＧＧＧＴＡＧＣＣＡＣＡＧＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＣＡＡＴＧＴＧ  ３’（配列番号２２）
【００４２】
ｐＧＥＭｋｕ７０          ２（２０ｎｇ）
プライマーＦｏｒｗａｒｄ  ２（２００ｎｇ）
プライマーＲｅｖｅｒｓｅ  ２（２００ｎｇ）
１０×反応用バッファー    ５
ｄＮＴＰ混合物            ４
Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ        １
ＤＤＷ（蒸留水）        ３４
総量                    ５０μｌ
TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL を用いて、９５℃２分、１サイクル；９５℃３０秒、５４℃３０秒、７０℃１５分、１８サイクルとした。得られた変異プラスミドを  ｐＧＥＭｋｕ７０（Ｈ）とし、このプラスミドをＢｌｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アスペルギルス・オリゼ由来ピリチアミン耐性遺伝子ｐｔｒＡをＢｌｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した断片を挿入し、ｐＧＥＭｋｕ７０：：ｐｔｒＡとした。このプラスミドをＳｐｅＩ消化によって直鎖状にした後、A. nidulans FGSC A89株にプロトプラストＰＥＧ法を用いて導入した。形質転換体の選択は、ピリチアミン  （１００μｇ／ｍｌ）  を含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地で行った。得られた形質転換体について、ＰＣＲ及びサザンブロット解析によりｋｕ７０遺伝子破壊株を選抜した。
【００４３】
４．任意遺伝子の破壊効率  −ｋｅｘＢ−
野生株あるいはｋｕ７０破壊株を宿主にした遺伝子破壊効率を調べるにあたり、ｋｅｘＢ遺伝子破壊によって効率を求めた。ｋｅｘＢ遺伝子はプロセッシングプロテアーゼ  ＫｅｘＢをコードしており、ｋｅｘＢ遺伝子破壊株は野生株と比較してコンパクトなコロニーを形成することが分かっている。野生株とｋｕ７０破壊株にｋｅｘＢ遺伝子破壊用プラスミドを導入し、得られた形質転換体がどのくらいの割合でｋｅｘＢ遺伝子破壊株の表現型を示すかどうか調べた結果を以下に示した。
ｋｅｘＢ遺伝子破壊効率
野生株 (FGSC A89)宿主 ６／８３  形質転換体（７．２％）
ｋｕ７０遺伝子破壊株宿主      ９０／１００形質転換体（９０％）
このように非常に高い効率でｋｅｘＢ遺伝子を破壊することに成功したことから、ｋｕ７０ 遺伝子破壊株は遺伝子破壊などの遺伝学的解析において非常に有用株であることが示された。
【実施例３】
【００４４】
アラビドプシス
１．実験材料
表５に本実験で用いるアラビドプシス株を示す。
標的遺伝子はどのようなものでもよいが、今回は、ＡＧ(At4G18960) 及びＬＦＹ（At5g61850）とする。形質転換マーカーとして、プラスミドCａＭＶ３５Ｓ−ｓＧＦＰ(Ｓ６５Ｔ)−ＮＯＳ３’由来のＧＦＰ遺伝子を用いる。プラスミドから、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩでＧＦＰ遺伝子を切り出し、平滑末端化してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ+のＥｃｏＲＶ部位に挿入する（ｐＳＫＧＦＰ）。制限酵素部位をつけたプライマーでＡＧ遺伝子の読み出しコドン上流約２ｋｂを増幅し、ｐＳＫＧＦＰのＧＦＰ上流に挿入する。同様にＡＧ遺伝子読み出しコドンの下流約２ｋｂもＧＦＰ下流に挿入する。このようにして得られたｐＳＫＡＧ：：ＧＦＰからＡＧ：：ＧＦＰ部分を切り出して形質転換に使用する。ＬＦＹ遺伝子についても同様の操作を行う。
【００４５】
【表５】
2005237316.tif 000006
【００４６】
２．遺伝子ホモ破壊株の確認
（１）各系統の種子を５％次亜塩素酸で滅菌し、ハイポネックスとショ糖を加えた寒天培地に播種する。
（２）１０日後、子葉を一枚切り取りトミー精工社マイクロスマッシュにてＤＮＡを分離する。そのＤＮＡを鋳型にし、Ｔ−ＤＮＡ挿入部位前後のゲノムＤＮＡ５００ベースに合わせたプライマーでＰＣＲを行う。ゲノムＤＮＡの増幅が見られなかった個体をとりあえず遺伝子破壊ホモ個体として以後の実験に使用する。
【００４７】
３．ＫＵ及びＬｉｇ４破壊株の維持
ホモ破壊株と確認された個体は定法に従って栽培し、系統維持する。
【００４８】
４．細胞培養系の確立と形質転換
（１）播種後２週間の幼植物（前述の方法で育てた無菌のもの）から胚軸と葉を切り取り、１ｍｍ程度の幅に切り刻む。
（２）カルス誘導培地（ＣＩＭ培地：Ｂ５培地にＭＥＳ、糖、固化剤、植物ホルモンを加えたもの）に置床する。
（３）カルスが十分に成長したら、液体培地（ＭＳ培地：ＭＳ基本培地に糖、植物ホルモンを加えたもの）に移し振とう培養する。
（４）一週間ごとに植え替える。
（５）細かいカルスを直接形質転換に使用する。（塊が大きい場合はプロトプラスト化して後述の５．に記載の手法を用いる。）
（６）カルスを遠心で集め、EPバッファー（７０ｍＭＫＣＬ，０．３Ｍマニトール，５ｍＭ  ２−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｐＨ５．８）に懸濁する。濃度を１．５ｘ１０６／ｍｌに調整する。８００μｌを電気穿孔用キュベット（４ｍｍギャップ）に入れる。ＢＴＸ社  ＥＣＭ  ６００を使用し、モード：ＬＶ、キャパシタンス：１２５μＦ、抵抗：０、チャージ電圧：３００ボルト、フィールド強度：７５０Ｖ／ｃｍ、パルス長：２２−２６ｍｓｅｃの条件で電気穿孔を行う。ＤＮＡは一度の穿孔に１０μｇを使用する。
（７）穿孔後、０．５Ｍマニトールを加えた液体培地５ｍｌに懸濁し、１時間静置する。
（８）液体培地に寒天を入れ固化したシャーレ培地に播く。
【００４９】
５．プロトプラストの作製と形質転換
（１）種後２週間の幼植物（前述の方法で育てた無菌のもの）から胚軸と葉を切り取り、１mm程度の幅に切り刻む。
（２）０．５Ｍマニトール溶液に１時間浸潤した後、酵素溶液（１％セルラーゼ  Ｏｎｏｚｕｋａ  ＲＳ、０．２５％マセロザイム  Ｒ−１０、０．５Ｍマニトール、８ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ５．５  ）で５−１０時間処理し、０．５Ｍマニトールで３回洗浄する。
（３）細胞数を２ｘ１０６  ／ｍｌに調整し、４００μｌを電気穿孔用キュベット（２ｍｍギャップ）に入れる。導入するＤＮＡを５−１０μｇ／ｍｌとなるよう加える。ＢＴＸ社  ＥＣＭ６００を使用し、モード：ＬＶ、キャパシタンス：５００μＦ、抵抗：Ｒ３（４８オーム）、チャージ電圧：１０６ボルト、フィールド強度：５３０Ｖ／ｃｍ、パルス長：２２−２６  ｍｓｅｃの条件で電気穿孔を行う。
（４）穿孔後、修正８ｐ培地３ｍｌに懸濁し、１時間静置する。
（５）修正８ｐ培地をアガロースで固めた培地に広げ、培養する。
【００５０】
６．形質転換体の確認
（１）形質転換実験後に生育したカルスに紫外線を照射する。
（２）ＧＦＰ発現が認められた細胞塊を一つずつ分けて、植え替える。
（３）細胞塊が５ｍｍぐらいに成長したら２つに分け、一方は再分化用培地（ＲＩＭ：Ｂ５培地にＭＥＳ、糖、植物ホルモンを加えたもの）に移し、もう一方からＤＮＡを分離する。ＤＮＡ分離の方法は実験１と同様である。得られたＤＮＡを鋳型として、ＧＦＰ遺伝子内部と標的遺伝子部位に設定したプライマーでＰＣＲを行う。予定サイズの断片が出現した細胞塊は、遺伝子が破壊されたものと数える。
【００５１】
７．アグロバクテリウムを利用した形質転換
（1)ＴｉベクターｐＢＩ２２１Ｈを制限酵素処理し、３５Ｓプロモーター：ＧＵＳ構造遺伝子：ＮＯＳターミネ−ター部分を切り出す。
（２）切り出した部分に上記の形質転換用ＤＮＡを挿入し、エレクトロポレーションでアグロバクテリウムに導入する。アンピシリン耐性で目的のプラスミドをもつアグロバクテリウムを選択する。
（３）形質転換用ＤＮＡを持つアグロバクテリウムを２８℃で一晩培養した後、浸潤用懸濁培地にＯＤ６００が０．８になるよう懸濁する。
（４）植物体を使用する場合は、鉢を逆さにし、花芽部分を１５分間浸す。その後約１ヶ月培養し、種子を集める。集めた種子を発芽させ、ＧＦＰによる発光が見られるものについてＰＣＲによる確認を行う。
（５）カルスを使用する場合は、菌懸濁液に２−３分浸した後共存培養培地（Ｎ６ＣＯ培地）で３日間培養する。カルベニシリンで滅菌した後ＧＦＰ発光の有無について調査する。発光部分のみを植物ホルモンを含むＭＳ培地で１ヶ月培養し、再度発光を確認した後、ＤＮＡを分離しＰＣＲによる確認を行う。
【００５２】
８．その他の形質転換実験
直鎖化された形質転換用DNAは、パーティクルガンによる形質転換及びプロ トプラストを利用する細胞融合形質転換にも使用される。
【実施例４】
【００５３】
ヒトＫＵ７０遺伝子の破壊について
１．ヒトＫＵ７０遺伝子情報の取得
Ｅｎｓｅｍｂｌプロジェクト（http://www.ensembl.org/）のヒトゲノムデータベースよりヒトＫＵ７０（Ｇ２２Ｐ１）遺伝子の塩基配列およびエキソン、イントロンなどの情報をhttp://www.ensembl.org/Homo_sapiens/geneview?gene=ENSG00000100419より取得した。
【００５４】
２．繰り返し配列位置の特定
得られた塩基配列情報をREPEATMASKER WEB SERVER（http://ftp.genome.washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker）に送り、繰り返し配列の検索を行い、ＫＵ７０遺伝子内に存在する繰り返し配列の位置を特定した。
【００５５】
３．ターゲッティングベクター用プライマーの設定
１および２の塩基配列情報をもとにターゲッティングベクターに用いるホモロジーアーム作製用ＰＣＲプライマーの設定を行った。以下にプライマー配列を示す。（下線部は、サブクローニング用の制限酵素認識配列）
（１）ポリAセレクション法ベクター構築の場合
５’側ホモロジーアーム用プライマー対
Ｋｕ７０  Ｐ２  ＡｓｃＩ  ５’−ＧＣＴＡＴＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＴＧＣＡＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＴＡＧＣＴＧＴＧ−３’（配列番号２３）
Ｋｕ７０  Ｐ３  ＮｏｔＩ  ５’−ＡＧＡＡＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＣＡＣＴＧＣＴＴＡＴＧＡＴＣ−３’（配列番号２４）
３’側ホモロジーアーム用プライマー対
Ｋｕ７０  Ｐ４  ＮｏｔＩ  ５’−ＣＴＴＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＣＡＡＧＡＴＧＡＧＴＣＡＴＡＡＧＡＧＧＡＴＣ−３’（配列番号２５）
Ｋｕ７０  Ｐ５  ＳａｌＩ  ５’−ＣＡＴＧＴＣＧＡＣＡＴＴＴＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＧ−３’（配列番号２６）
（２）プロモーターレス法ベクター構築の場合
５’側ホモロジーアーム用プライマー対
Ｋｕ７０  Ｐ２  ＳａｌＩ  ５’−ＧＣＴＡＴＡＧＴＣＧＡＣＴＣＴＧＣＡＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＴＡＧＣＴＧＴＧ−３´（配列番号２７）
Ｋｕ７０  Ｐ３  ＮｏｔＩ  ５’−ＡＧＡＡＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＣＡＣＴＧＣＴＴＡＴＧＡＴＣ−３’（配列番号２８）
３’側ホモロジーアーム用プライマー対
Ｋｕ７０  Ｐ４  ＮｏｔＩ  ５’−ＣＴＴＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＣＡＡＧＡＴＧＡＧＴＣＡＴＡＡＧＡＧＧＡＴＣ−３’（配列番号２９）
Ｋｕ７０  Ｐ５  ＳａｌＩ  ５’−ＡＴＣＧＣＡＧＧＣＧＣＧＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＧＡＴＡＣ−３’（配列番号３０）
【００５６】
４．ＰＣＲ法によるホモロジーアームの合成
（１）材料および使用機器
ヒト大腸癌由来ＨＣＴ１１６  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  （５００ｎｇ／μｌ）
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  （東洋紡績株式会社製の熱耐性ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）
ＰＣＲ用サーマルサイクラー（ＴａＫａＲａ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＭＰ，Ｍｏｄｅｌ  Ｎｏ．  ＴＰ−３０００  宝酒造株式会社）
それぞれのプライマー対を各々１０ｐｍｏｌに調整したＰｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ（上記３を参照）
ＰＣＲ反応液の組成
ＨＣＴ１１６  ゲノムＤＮＡ  （５００ｎｇ／μｌ  ）      １μｌ
１０ｘＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ    ５μｌ
２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                      ５μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４                                    ２μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ（１０ｐｍｏｌ各）              １．５μｌ
ＤＭＳＯ                                            ２．５μｌ
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ                    １μｌ
滅菌水                                                ３２μｌ
総量                                                  ５０μｌ
上記の反応系をＰＣＲ用サイクルサイクラーにてＰＣＲ反応を行った。
反応条件は、９４℃２分、１サイクル、９４℃１５秒；６０℃３０秒；６８℃５分、３０サイクルで行った。
反応後、ＰＣＲ産物ＤＮＡ  断片を精製し、それぞれのプライマーに付加してある制限酵素認識配列の制限酵素で消化を行った。
【００５７】
（２）ポリAセレクション法ベクター構築の場合
５’側ホモロジーアーム用プライマー対（Ｋｕ７０  Ｐ２  ＡｓｃＩ／Ｋｕ７０  Ｐ３  ＮｏｔＩ）のＰＣＲ産物ＤＮＡ断片では、ＡｓｃＩとＮｏｔＩの両制限酵素で消化を行った。このＤＮＡ断片名をＫｕ７０  Ｆ２とした。
３’側ホモロジーアーム用プライマー対（Ｋｕ７０  Ｐ４  ＮｏｔＩ／  Ｋｕ７０  Ｐ５  ＳａｌＩ）のＰＣＲ産物ＤＮＡ断片では、ＳａｌＩとＮｏｔＩの両制限酵素で消化を行った。このＤＮＡ断片名をＫｕ７０  Ｆ３とした。
（３）プロモーターレス法ベクター構築の場合
５’側ホモロジーアーム用プライマー対（Ｋｕ７０  Ｐ２  ＳａｌＩ／  Ｋｕ７０  Ｐ３  ＮｏｔＩ）のＰＣＲ産物ＤＮＡ断片では、ＳａｌＩとＮｏｔＩの両制限酵素で消化を行った。このＤＮＡ断片名をＫｕ７０  Ｆ２Ｂとした。
３’側ホモロジーアーム用プライマー対（Ｋｕ７０  Ｐ４  ＮｏｔＩ／  Ｋｕ７０  Ｐ５  ＡｓｃＩ）のＰＣＲ産物ＤＮＡ断片では、ＮｏｔＩとＡｓｃＩの両制限酵素で消化を行った。このＤＮＡ断片名をＫｕ７０  Ｆ３Ｂとした。
それぞれのＤＮＡ断片をｐＢＣサブクローニング用ベクターにサブクローニングし、ＤＮＡ断片の両端部分のシークエンスを行ってＫＵ７０遺伝子を含むＤＮＡ断片であることを確認した。
【００５８】
５．ターゲッティングベクタープラスミドの構築
（１）ポリＡセレクション法ベクター構築の場合
クローニングサイト改良ｐＭＣ１ＤＴ−３上にＫｕ７０  Ｆ２、プロモーター付ピューロマイシン耐性遺伝子、Ｋｕ７０  Ｆ３の順になるようにＤＮＡ断片を挿入してポリＡセレクション用ベクターを構築した。プラスミド名を  ｐＰＡＳ−Ｋｕ７０  Ｐｕｒｏとした。
（２）プロモーターレス法ベクタープラスミド構築の場合
クローニングサイト改良ｐＭＣ１ＤＴ−ＡｐＡ上にＫｕ７０  Ｆ２Ｂ、プロモーター無しポリＡシグナル付ネオマイシン耐性遺伝子、Ｋｕ７０  Ｆ３Ｂの順になるようにＤＮＡ断片を挿入してポリＡセレクション用ベクターを構築した。プラスミド名をｐＢＤＴＡ−Ｋｕ７０  ｎｅｏとした。
両ターゲッティングベクタープラスミドともに制限酵素ＡｓｃＩで消化することによってプラスミドＤＮＡの直線化を行った。
【００５９】
６．ＫＵ７０遺伝子破壊細胞の選抜
（１）ポリＡセレクション法ベクターでの遺伝子破壊
上記５で作製した直線化ｐＰＡＳ−Ｋｕ７０  Ｐｕｒｏ  ＤＮＡをＨＣＴ１１６細胞にエレクトロポーレーション法にて細胞に導入した。相同組換えによってＫＵ７０遺伝子が破壊された細胞を選抜するために、ピューロマイシン（最終濃度０．３μｇ／ｍｌ）添加マッコイ５Ａ培地で培養をおこないコロニーを形成させた。得られた形質転換細胞コロニーをピックアップし、ＰＣＲ法およびサザンブロット解析により二つあるＫＵ７０遺伝子座のうち一方の遺伝子座を破壊した細胞の選抜を行った。  
（２）プロモーターレス法ベクタープラスミドでの遺伝子破壊
次に、一方の遺伝子座を破壊するために、直線化ｐＢＤＴＡ−Ｋｕ７０  ｎｅｏを同様の方法で導入し、Ｇ４１８（最終濃度３００μｇ／ｍｌ）添加マッコイ５Ａ培地で培養を行いコロニーを形成させ、先の（１）と同様の方法で形質転換細胞の解析を行い２つ目の遺伝子座も破壊された細胞株の選抜を行った。
【００６０】
７．任意遺伝子の破壊効率−ＨＰＲＴ−
ヒト細胞株ＨＣＴ１１６あるいは由来のｋｕ７０破壊細胞を用いて遺伝子破壊効率を調べるためＨＰＲＴ（hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase）遺伝子破壊により効率を求めた。
ＨＰＲＴは核酸前駆体合成のサルベージ経路で働く酵素なので、ＨＰＲＴ遺伝子が破壊されても細胞の増殖に影響しないため、正確に遺伝子破壊効率を測定することができる。ＨＣＴ１１６および由来のｋｕ７０破壊細胞にハイグロマイシン抵抗性遺伝子を有するＨＰＲＴ遺伝子破壊用のプラスミドＤＮＡを導入し、得られたハイグロマイシン抵抗性クローンがどれくらいの割合でＨＰＲＴ遺伝子が破壊されているかを、ＰＣＲ法およびサザンブロッティング法で調べた。
ＨＰＲＴ遺伝子破壊効率（遺伝子破壊細胞数／ハイグロマイシン抵抗性細胞数）
親株ＨＣＴ１１６  ：  ６／１２０  （５  ％）
ｋｕ７０破壊細胞株：  ３０／１２０（２５  ％）
このように非常に高い効率でＨＰＲＴ遺伝子を破壊することができることから、ｋｕ７０遺伝子破壊細胞株は、遺伝子破壊などの遺伝学的解析においてきわめて有用な細胞株であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明により、自由にデザインしたＤＮＡを所望の細胞のゲノムの特定の位置に高い確率で組み込むことが可能となるため、精度の高い遺伝子改変技術を提供することができる。また、組み換え時に生じ得る不要な組み込みに対し、例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘを利用した切り出し系を開発が可能となることから、不要な組み込みを排除することもできる。その結果、特定の遺伝子を確実に導入し、該遺伝子を所望の細胞の中で安定に発現させることができる。また、特定の遺伝子を確実に破壊することも可能となる。従って、本発明に係る方法を用いることで、微生物を用いて食料等を生産する分野においては、容易に新品種の改良を実施することができるようになる。
また、本発明により、物質生産を阻害する遺伝子や、細胞毒素生産系に関与する遺伝子など、産業上利用可能な生物にとって不利益を及ぼす遺伝子の除去を容易に行うことができる。
さらに、本発明により提供される方法を高等動植物に応用することにより、動植物の品種改良はもとより、医療分野における創薬および遺伝子治療においても新たな技術の提供が期待できる。
【００６２】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ＨｙｇｒでｎｃＫＵ７０およびｎｃＫＵ８０を置換する方法を示す。ＡはｎｃＫＵターゲットベクターの構築法を示す。ｎｃＫＵ遺伝子の５’領域を（ｐ−１）（配列番号５）および（ｐ−２）（配列番号６）で増幅し、３’領域を（ｐ−３）（配列番号７）および（ｐ−４）（配列番号８）で増幅した。Ｈｙｇｒ遺伝子は（ｐ−５）（配列番号９）および（ｐ−６）（配列番号１０）で増幅した。Ｂは融合ＰＣＲ産物の標的遺伝子への相同組込みを示す。
【図２】ｎｃＫｕ７０タンパク質の予想アミノ酸配列とヒトＫｕ７０タンパク質の予想アミノ酸配列との比較を示す。実線による枠内は、ＫＵ７０／８０のＤＮＡ結合ドメインを、破線による枠内はＫＵ８０結合領域を、点線による枠内はＳＡＰドメインを示す。また、各種生物のＫｕにおいて特に保存されている領域ＰＨＲは斜字体に下線を付して示した。
【図３】ｎｃＫｕ８０タンパク質の予想アミノ酸配列とヒトＫｕ８０タンパク質の予想アミノ酸配列との比較を示す。実線による枠内は、ＫＵ７０／８０のＤＮＡ結合ドメインを、破線による枠内はＫＵ８０結合領域を、点線による枠内はＤＮＡ−ＰＫｃｓ結合領域を示す。また、各種生物のＫｕにおいて特に保存されている領域ＰＨＲは斜字体に下線を付して示した。
【図４】野生型およびｎｃｋｕ７０およびｎｃｋｕ８０株のＵＶおよびＭＭＳ感受性を示す。白抜きの三角は野生型、黒丸はｎｃｋｕ７０、黒四角はｎｃｋｕ８０を示す。実験は少なくとも３回行い、各点はこれらのデータの平均値である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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