(57)【要約】【課題】  青枯病菌を効果的に防除する手段を提供する。【解決手段】  青枯病菌に対して溶菌性を示すバクテリオファージを植物又は土壌に散布する青枯病菌の防除方法、及び前記バクテリオファージを土壌に添加する土壌の改良方法。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
青枯病菌に対して溶菌性を示すバクテリオファージタイプ１、バクテリオファージタイプ２、又はバクテリオファージタイプ３。
【請求項２】
請求項１記載のバクテリオファージを有効成分として含有する青枯病菌の防除剤。
【請求項３】
請求項１記載のバクテリオファージを有効成分として含有する土壌改良剤。
【請求項４】
請求項１記載のバクテリオファージを植物又は土壌に散布することを特徴とする青枯病菌の防除方法。
【請求項５】
請求項１記載のバクテリオファージを土壌に添加することを特徴とする土壌の改良方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、青枯病菌（Ralstonia solanacearum）に対して溶菌性を示すバクテリオファージ、並びにそれを利用した青枯病菌の防除剤、土壌改良剤、青枯病菌の防除方法、及び土壌の改良方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
青枯病菌は、トマト、ナス、タバコなどに青枯病（立枯病）を引き起こす土壌細菌である。比較的温暖な地域の土壌を中心に世界中に分布し、ナス科やマメ科の他経済的に重要な農作物多種を含む３３科２００種以上の植物に感染し、甚大な被害をもたらす。一度汚染された土壌から病原菌を除去することは極めて困難である。本病に対する防除法としては、これまでに間作、輪作、土壌改良、土壌消毒法などが考案されているが、その発生を安定的に抑えることはほとんどできていない。青枯病菌には、宿主範囲、地理的分布、病原性、疫学的特徴、生理・生化学的性質が異なる系統、レース(race)、生理型(biovar)等が知られており、その個々に対応した防除法の開発が強く望まれている。
【特許文献１】特開平10-139610号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、青枯病菌を効果的に防除する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、自然界より新たに発見されたバクテリオファージが、青枯病菌の防除に有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（５）を提供するものである。
（１）青枯病菌に対して溶菌性を示すバクテリオファージタイプ１、バクテリオファージタイプ２、又はバクテリオファージタイプ３。
（２）（１）記載のバクテリオファージを有効成分として含有する青枯病菌の防除剤。
（３）（１）記載のバクテリオファージを有効成分として含有する土壌改良剤。
（４）（１）記載のバクテリオファージを植物又は土壌に散布することを特徴とする青枯病菌の防除方法。
（５）（１）記載のバクテリオファージを土壌に添加することを特徴とする土壌の改良方法。
【発明の効果】
【０００６】
新たに発見したバクテリオファージは、病原性、疫学的特徴、生理・生化学的性質が異なる青枯病菌６株（C-319, M4S, Ps29, Ps65, Ps72, Ps74）に対して有効に働き、増殖阻害、溶菌を引き起こす。異なる３タイプのファージの混合により、自然界に分布する種々の青枯病菌レース、biovarに対応することができる。また、一定頻度で自然発生するファージ耐性細胞の生育も抑えることができる。ファージは安価に大量生産できるので、フィールドレベルで細菌感染土壌に散布して土壌の殺菌、土壌改良に利用できる。また、植物体に散布して細菌の感染を予防することも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明のバクテリオファージには、タイプ１、タイプ２及びタイプ３の３種が含まれる。
【０００９】
本発明において、「バクテリオファージタイプ１」とは、青枯病菌のC-319、M4S、Ps29、Ps65、Ps72、Ps74の６株すべてに溶菌性を示すバクテリオファージである。この「バクテリオファージタイプ１」は、約250 kbpのdsDNAをゲノムとし制限酵素PstI, KpnI等によって特徴的なバンドパターンを示す（図１）。
【００１０】
この「バクテリオファージタイプ１」に含まれるファージの一つである安芸津Aは、本出願人によって保存維持されており、特許法施行規則２７条の３の規定に準ずる分譲は本出願人が保証する。
【００１１】
本発明において、「バクテリオファージタイプ２」とは、青枯病菌のC-319に溶菌性を示し、M4S、Ps29、Ps65、Ps72、Ps74には溶菌性を示さないバクテリオファージである。この「バクテリオファージタイプ２」は、約4.5 kbの環状ssDNAをゲノムとし制限酵素では切断されないことを特徴とする（図２）。この「バクテリオファージタイプ２」に含まれるファージの一つである西条農高(1)Aは、本出願人によって保存維持されており、特許法施行規則２７条の３の規定に準ずる分譲は本出願人が保証する。
【００１２】
本発明において、「バクテリオファージタイプ３」とは、青枯病菌のM4S、Ps29、Ps65、Ps72の４株に溶菌性を示し、C-319、Ps74の２株には溶菌性を示さないバクテリオファージである。この「バクテリオファージタイプ３」は、約6.0 kbの環状ssDNAをゲノムとし制限酵素では切断されないことを特徴とする（図３）。この「バクテリオファージタイプ３」に含まれるファージの一つである島根dAは、本出願人によって保存維持されており、特許法施行規則２７条の３の規定に準ずる分譲は本出願人が保証する。
【００１３】
タイプ１〜３のファージ（以下、「本発明のファージ」という場合がある）の増殖は、一般的なバクテリオファージと同様の方法で増殖させることができる。例えば、青枯病菌を培養し、十分に増殖させた後、本発明のファージを接種し、培養を継続することにより、大量のファージ溶液を得ることができる。青枯病菌の培養は、常法に従って行うことができ、例えば、CPZ液体培地などを用い、温度27〜37℃で旋回又は振とう培養すればよい。ファージを接種する時期は、青枯病菌が十分増殖している時期であれば特に限定されないが、菌体濃度が1x107〜1x108cfu/ml程度まで増殖した時期に接種するのが好ましい。ファージ接種から6〜8時間の培養で、ほぼすべての青枯病菌が溶菌し、ファージ溶液を得ることができる。
【００１４】
本発明のファージは、青枯病菌の防除剤や防除方法に利用することができ、土壌改良剤や土壌改良方法にも利用できる。なお、ここでいう「防除」とは、感染した青枯病菌の「駆除」と青枯病菌感染の「予防」の双方を含む意味である。
【００１５】
本発明のファージは、タイプ１、タイプ２、タイプ３のファージをそれぞれ単独で使用してもよいが、２種以上のファージを組み合わせて使用するのが好ましい。
【００１６】
本発明のファージを青枯病の防除剤又は土壌改良剤として利用する場合、上述した増殖方法によって得られるファージ溶液、あるいはファージ溶液を遠心分離等によって培養残渣と分離したものを使用してもよく、微生物製剤において一般的に使用される方法によって製剤化したものを使用してもよい。ファージ溶液を防除剤又は土壌改良剤として用いる場合、溶液中のファージ濃度は、106〜1010pfu/mlとするのが好ましく、108〜109pfu/mlとするのが更に好ましい。
【００１７】
防除の対象とする植物としては、ジャガイモ、ナス、トマト、トウガラシ、ピーマン、タバコ、シソ、ダイコン、イチゴ、バナナ、マーガレット、キク、ヒマワリ、などを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。また、防除対象とする病害は、青枯病菌（Ralstonia solanacearum）によって引き起こされる病害であれば限定されず、例えば、ナス科植物の青枯病、タバコ立枯病などを挙げることができる。
【００１８】
本発明の防除剤を圃場に散布する場合、その散布量は青枯病菌を防除できる範囲内であれば特に限定されないが、通常、圃場1 m2当り1010〜1011 pfuのファージを散布するのが好適である。
【００１９】
また、本発明の土壌改良剤を土壌に添加する場合、その添加量は特に限定されないが、通常、土壌1 kg当り1010〜1011  pfuのファージを添加するのが好適である。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００２１】
〔実施例１〕  青枯病菌の培養
ポリペプトン10.0 g、カザミノ酸1.0 g、及びグルコース5.0 gを、蒸留水1,000mlに加え、CPG液体培地を調製した。このCPG液体培地を用いて、青枯病菌の各菌株を28〜32℃で旋回培養（120
rpm）した。
【００２２】
〔実施例２〕  バクテオリオファージのアッセイ・分離
まず、青枯病菌分離用のSM-1培地を調製した。ポリペプトン10.0 g、カザミノ酸1.0 g、グルコース5.0 g、及び寒天17.0 gを、蒸留水1,000mlに加えた。高圧滅菌後、約45℃に冷まし、その後、フィルター（0.2 μm）滅菌した1%テトラゾリウムクロライド水溶液5 mlと混合し、SM-1培地を得た。
【００２３】
上記SM-1培地2 mlに、日本各地から採取した土壌を懸濁し、30 分振とう後、遠心上清を0.2 μm孔のフィルターで濾過滅菌した。上清250 μlに実施例１で得た青枯病菌（C319株）の培養液(OD600＝0.1〜0.5) 250 μlを加え、28℃で1時間だけ保温後、2 mlのtop agarに混合してCPG寒天培地（上記CPG液体培地に17.0 gの寒天を添加した培地）上に広げた。28℃で1〜2日後、生じたプラークを検出し（図４）、プラーク中央部分を滅菌爪楊枝でつつき青枯病菌（C319株）の培養液（OD600＝0.1〜0.5）に添加してファージを増幅した。
【００２４】
このプラークアッセイ法により、広島、福島、島根から採取した土壌数種より多数のプラークを検出し、バクテリオファージを分離した。
【００２５】
〔実施例３〕  バクテリオファージの宿主特異性
広島から採取した土壌から分離したファージ14種（安芸津A〜L、西農A、B）、福島からの2種（福島bA、bB）、島根からの4種（島根dA、dB、i、l）の青枯病菌の各菌株に対する宿主特異性をプラークアッセイ法によって調べた。青枯病菌の検定菌として、病原性、疫学的特徴、生理・生化学的性質が異なるC-319、M4S、Ps29、Ps65、Ps72、Ps74を用いた。この結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
表に示すように、バクテリオファージは宿主パターンの異なる3タイプに分けることができる。タイプ１は、安芸津A〜J、安芸津L、福島bA、福島bBの13種で、調べた6種の株全てに感染性を示した。タイプ２は、安芸津Kと西条農高(1)Aの2種で、C-319のみに感染した。タイプ３は、島根dA、島根dB、島根i、西条農高(1)Bの4種で、C-319とPs72には感染しない。他の青枯れ病菌株に対する感染パターンもこれらタイプ間で大きく異なる可能性がある。なお、島根lは、タイプ３と類似した感染パターンを示したが、C-319に溶菌性を示した。
【００２８】
これら各タイプのバクテリオファージから核酸を抽出してその性状を調べたところ、タイプ１のファージは約250 kbpのdsDNAゲノムが検出され、制限酵素での切断パターンはファージ間でよく保存されていた。タイプ２のファージからは約4.5 kpの環状 ssDNAゲノムが検出された。タイプ３のファージからは約6 kbの環状 ssDNAゲノムが検出された。このように宿主特異性とゲノム性状には明らかな相関性が見られた。すなわち異なる３種のバクテリオファージがここに発見された。類似ファージの報告は文献等で見あたらない。
【００２９】
〔実施例４〕  バクテリオファージの大量生産
まず、ファージ調製用CPG培地を調製した。ポリペプトン10.0 g、カザミノ酸1.0 g、グルコース5.0 g、MgSO4・7H2O 1.97 g、及びゼラチン 0.1 gを、蒸留水1,000mlに加え、ファージ調製用CPG培地を得た。
【００３０】
CPG寒天培地上で培養した青枯病菌C319株のシングルコロニーをCPG液体培地40 mlに植菌し、32℃にて一晩旋回培養（160 rpm）した。この培養液10 mlをバクテリオファージ調製用CPG培地2,000 mlに添加し、OD600＝0.1（約1×107 cfu/ml）程度まで25℃にて3〜4時間振とう培養（120 rpm）した。この培養液にm.o.i.＝2〜50になるよう、あらかじめ用意しておいたバクテリオファージ液を40〜100 ml添加し、25℃にて1時間静置後、25℃にて8時間以上振とうし（60 rpm）、溶菌させることで大量のバクテリオファージ液を調製した。この方法では、約1.5倍規模のスケールでも可能であることを確認している。
【００３１】
〔実施例５〕  バクテリオファージによる青枯病菌の増殖阻害効果
CPG液体培地100ml×5本（300ml三角フラスコ）を用いて青枯病菌C319株の前培養液（試験管 5ml  定常期）をOD600 = 0.01になるように加えた（0時間）。28℃で振とう培養し、2時間毎にサンプリング、OD測定をした。OD600 = 0.03、0.1、0.3、1.0 になったところで、ファージ（安芸津D）を 6.0×107 pfu/100ml (30 μl) を添加した。その後、2時間毎にサンプリングし、OD600測定を行った。結果を図５に示す。
【００３２】
図５に示すように、ファージの添加により青枯病菌の増殖が著しく阻害された。
【００３３】
〔実施例６〕  バクテリオファージによる葉たばこ立枯病防除
4種のバクテリオファージ（安芸津D、西条農高(1)A、福島bA、福島bB）を大量生産法により調製し、得られた溶菌液にクロロホルムを約1/300容加え、20分間振とうを続けたのち、12,000 gで15分間遠心分離し上清をとることで大量のファージ液を得た。この4種のファージ液の混合液を圃場に処理した。混合液中のファージ濃度はそれぞれ、安芸津Dが5.5×107 pfu/ml、西条農高(1)Aが3.7×107 pfu/ml、福島bAが3.4×107 pfu/ml、福島bBが3.6×107 pfu/mlである。
【００３４】
心止が終了したタバコ（第2黄色種エムシー1号）を栽培する圃場に、ファージ混合液を処理した。タバコの根元を中心に1株あたり2,000 mlのファージ混合液を畦面に灌水した。何も処理をしない株を無処理区とし、処理区と無処理区において、概観では立枯病の感染が見られない株をそれぞれ31株、20株を選択し、立枯病の発生状況を調査した。結果を表２に示す。
【００３５】
表２の通り、処理後1週間目の8月1日には若干ではあるが防除効果が認められた。
【００３６】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】バクテリオファージタイプ１のゲノムDNA制限酵素切断パターンを示す写真。１〜８はそれぞれ表１の安芸津A〜Hに対応する。M:サイズマーカー、上から19.33 kbp, 7.74 kbp, 6.22 kbp, 4.26 kbp, 3.47 kbp, 2.69 kbp, 1.98 kbp, 1.49 kbp。
【図２】バクテリオファージタイプ２のゲノムDNAのアガロースゲル電気泳動分離パターンを示す写真。西条農高(1)AのDNA（１）。一般の制限酵素によっては切断されないが（２）、一本鎖DNAを切断するnuclease S1によって切断される(３、４)。M:サイズマーカー、上から19.33 kbp, 7.74 kbp, 6.22 kbp, 4.26 kbp, 3.47 kbp, 2.69 kbp, 1.98 kbp, 1.49 kbp。
【図３】バクテリオファージタイプ３のゲノムDNAのアガロースゲル電気泳動分離パターンを示す写真。M:サイズマーカー、上から19.33 kbp, 7.74 kbp, 6.22 kbp, 4.26 kbp, 3.47 kbp, 2.69 kbp, 1.98 kbp, 1.49 kbp。
【図４】青枯病菌に対して生じたプラークを示す写真。
【図５】ファージの添加と青枯病菌の増殖との関係を示す図。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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