(57)【要約】【課題】より高速な分析を実現することが可能なだけでなく、より高感度の分析の可能性を見出すことのできる酸性多糖類の分析方法および当該方法の実施に使用するキットを提供する。【解決手段】酸性多糖類が４級アンモニウム塩（例えば、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム等）と複合体を形成し発蛍光することを利用し、さらに４級アンモニウム塩を含んだ電気泳動用緩衝液を用いて電気泳動することにより、従来蛍光標識するために要した前処理を省略することができる。また、近年ＤＮＡの高速分析を目的として開発されたマイクロチップ電気泳動法を応用することにより、従来法と比較して分析時間を約６０倍短縮することができる。【選択図】  図２
2005024336.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性多糖類と４級アンモニウム塩との複合体を形成させ、この複合体形成に基づく４級アンモニウム塩の発蛍光を利用することを特徴とする酸性多糖類の分析方法。
【請求項２】
上記４級アンモニウム塩として、窒素原子を含む複素環式芳香環を主構造とする４級アンモニウム塩が用いられることを特徴とする請求項１に記載の酸性多糖類の分析方法。
【請求項３】
上記４級アンモニウム塩として、臭化エチジウムまたはヨウ化プロピジウムが用いられることを特徴とする請求項１または２に記載の酸性多糖類の分析方法。
【請求項４】
上記複合体の分析に電気泳動法を用いることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の酸性多糖類の分析方法。
【請求項５】
電気泳動用緩衝液に４級アンモニウム塩を添加して電気泳動を行うことを特徴とする請求項４に記載の酸性多糖類の分析方法。
【請求項６】
キャピラリー電気泳動法またはマイクロチップ電気泳動法を用いることを特徴とする請求項４または５に記載の分析方法。
【請求項７】
４級アンモニウム塩を含む電気泳動用緩衝液と酸性多糖類標準試料とを含むことを特徴とする酸性多糖類分析用キット。
【請求項８】
上記４級アンモニウム塩として、窒素原子を含む複素環式芳香環を主構造とする４級アンモニウム塩が用いられることを特徴とする請求項７に記載の酸性多糖類分析用キット。
【請求項９】
上記４級アンモニウム塩として、臭化エチジウムまたはヨウ化プロピジウムが用いられることを特徴とする請求項７または８に記載の酸性多糖類分析用キット。
【請求項１０】
上記酸性多糖類標準試料は、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、コンドロイチン硫酸Ｃ、デキストラン硫酸、コロミン酸のうち、いずれか１種以上の酸性多糖類の標準試料であることを特徴とする、請求項７ないし９のいずれか１項に記載の酸性多糖類分析用キット。
【請求項１１】
さらにマイクロ電気泳動用チップを含む請求項７ないし１０のいずれか１項に記載の酸性多糖類分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酸性多糖類の分析方法および酸性多糖類の分析に使用するキットに関するものであり、特に、より高速な分析を実現することが可能なだけでなく、より高感度の分析の可能性を見出すことのできる酸性多糖類の分析方法および酸性多糖類分析用キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体内で、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリンあるいはヘパラン硫酸などの酸性多糖類はグリコサミノグリカン類といわれ、細胞間マトリックスを構成する主要な成分として生体の恒常性維持に重要な働きを担っている。これらの酸性多糖類はヒアルロン酸を除いては生体内ではタンパク質と結合してプロテオグリカンとして存在している。ヒアルロン酸はタンパク質と結合した形では存在せず、遊離の形で存在するがその分子量は数百万に達するといわれその生理作用に大きな興味が寄せられている。
【０００３】
これらのグリコサミノグリカン類は古くから医薬品や食品添加物あるいは健康食品として親しまれている。
【０００４】
例えばヒアルロン酸は関節炎の治療薬として非常に大きい市場を持つ。また、眼科における手術後の点眼薬としても有用である。さらに、その水溶液が高い粘度を有し著しく高い保水性を有することから化粧品の成分として利用されている。コンドロイチン硫酸は医療用あるいは一般用医薬品（点眼薬）の成分として重要である。また、サメ軟骨に多く含まれることから健康食品や食品添加物としても極めて市場性の高い物質である。ヘパリンは抗血液凝固作用を持つために、古くから医薬品として使用されている。硫酸エステル化したデキストランやデキストリンなどは、高脂血症薬として使用される。また一時期デキストラン硫酸が抗ＨＩＶ活性を有するということで新聞紙上を賑わわせたこともある。
【０００５】
生体中に存在する酸性多糖類は生合成に関わる遺伝子異常に基づく遺伝性疾患が次々と見出され、生体内における重要性が次第に明らかにされてきた。また、これらの酸性多糖類は加齢、老化あるいは細胞のガン化などと密接な関係を示すことが明らかにされつつある。
【０００６】
酸性多糖類は、通常セルロースアセテート膜電気泳動により分析される。この方法では、検出感度は０．１−１μｇであり、電気泳動とその後の染色時間を含めると約２時間を要し、さらに各スポットをデンシトメーターで定量する必要がある。また、より高感度な分析を達成するために、酸性多糖類を酵素消化後蛍光標識し、高速液体クロマトグラフィーにより分析する方法も採用されているが、通常分析に１日以上を要する（非特許文献１）。
【０００７】
一方、プロテオグリカン類やグリコサミノグリカン類あるいはムチン型糖タンパク質などの酸性複合糖質は塩化セチルピリジニウムや臭化セチルトリメチルアンモニウムなどの４級アンモニウム塩と複合体を形成し沈殿を生成することが古くから知られている（非特許文献２）。４級アンモニウム塩を用いて沈殿した酸性多糖類はアルコールにより４級アンモニウム塩を可溶化して除くと同時に酸性多糖類を沈殿として回収できる酸性多糖類の優れた調製法である。グリコサミノグリカン類の４級アンモニウム塩との複合体形成のメカニズムについては一般にイオン性複合体形成に基づくと考えられている。
【０００８】
核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）はらせん構造や独特な立体構造をとることにより、臭化エチジウムなどのいわゆるインターカレーター試薬と複合体を形成する。試薬自身は蛍光性を示さないにもかかわらず、この複合体形成により、強く発蛍光するためＤＮＡ配列解析法の基盤技術の一つとなっている。ＤＮＡとのイオン性相互作用により生成する複合体中で、これらのインターカレーター試薬は運動が固定された環境にあるため、光により励起された運動エネルギーは、分子運動ではなく蛍光として放出されると考えられる。
【０００９】
発明者は、ヒアルロン酸のオリゴマーの電気泳動挙動を詳細に観察し、ヒアルロン酸の重合度がある一定の大きさを持つとその電気泳動挙動が著しく変化するという現象を見出し、この現象はヒアルロン酸が一定の立体構造をとるために起こる現象であると考えられることを報告した（非特許文献３）。このような現象はその他のグリコサミノグリカンにも当然考えられることであり、コンドロイチン硫酸類においても同様の報告がなされている（非特許文献２）。また、グリコサミノグリカン類が形成する基本的な立体構造として構成単糖類が６個から１０個結合することによりらせん型のコンホメーションをとるに至ると考えられている。
【００１０】
【非特許文献１】
Ｉｏｚｚｏ，  Ｒ．  Ｖ．  ｅｄ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．，  １７１，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１，  ｐ．３．
【００１１】
【非特許文献２】
Ｉｏｚｚｏ，  Ｒ．  Ｖ．  ｅｄ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．，  １７１，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１，  ｐ．１１７．
【００１２】
【非特許文献３】
Ｋａｋｅｈｉ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃａｃｉｄ：  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｏｒｄｅｒ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．    Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９９，  ７１，  ｐ．１５９２．
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
ヒトゲノムの解析が終了し、タンパク質の解析（プロテオーム、プロテオミクス）に研究の軸足が移りつつある。同様に、生体内で極めて重要な役割を果たしている酸性多糖類についても次世代の研究あるいは医薬品標的として興味が寄せられているが、これらの酸性多糖類が構造上極めて多様性に富み、かつ分子内に紫外部吸収基や発蛍光基を持たないために高感度分析が難しくその研究は核酸やタンパク質に比べて著しく遅れている。
【００１４】
上述のように、現在酸性多糖類の分析に通常用いられているセルロースアセテート膜電気泳動法では、検出感度が０．１−１μｇと低く、分析に２時間以上を要する。また、より高感度な分析が可能な高速液体クロマトグラフィーを用いる方法も、あらかじめ酸性多糖類を酵素消化後蛍光標識する必要があるため、通常分析に１日以上を要する。
【００１５】
酸性多糖類の分析を、あらかじめ標識することなくそのまま行うことができ、さらに分析に要する時間を大幅に短縮して簡便に行うことができれば、臨床におけるプロテオグリカンおよびグリコサミノグリカン類の迅速な診断を行うことが可能となり、医療分野において大いに貢献することが期待される。また、医薬品開発においても有用であると考えられる。
【００１６】
本発明は、上記課題に鑑みなされたものであり、その目的は、より高速な分析を実現することが可能なだけでなく、より高感度の分析の可能性を見出すことのできる酸性多糖類の分析方法および当該方法の実施に使用するキットを提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、酸性多糖類が４級アンモニウム塩と複合体を形成し、核酸の場合と同様に強く発蛍光することを見出した。さらに、近年ＤＮＡの高速分析を目的として開発されたマイクロチップ電気泳動法が、上記４級アンモニウム塩と複合体を形成した酸性多糖類の分析に応用可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１８】
すなわち、本発明に係る酸性多糖類の分析方法は、酸性多糖類と４級アンモニウム塩との複合体を形成させ、この複合体形成に基づく４級アンモニウム塩の発蛍光を利用することを特徴としている。
【００１９】
従来、酸性多糖類を標識なしで分析する方法としては、セルロースアセテート膜電気泳動法が主に使用されている。しかし、セルロースアセテート膜電気泳動法の検出感度は０．１−１μｇであり、より感度の高い分析法の開発が望まれている。
【００２０】
本発明では、酸性多糖類と４級アンモニウム塩との複合体形成に基づく４級アンモニウム塩の発蛍光を利用し、この蛍光を検出することにより酸性多糖類を分析するので、非標識酸性多糖類の分析と比較して高感度の分析が可能となる。
【００２１】
上記４級アンモニウム塩としては、酸性多糖類と複合体を形成し発蛍光するものであれば特に限定されるものではないが、窒素原子を含む複素環式芳香環を主構造とする４級アンモニウム塩が用いられることが好ましく、次の式（１）に示す構造を有する臭化エチジウム
【００２２】
【化１】
2005024336.tif 000003
【００２３】
または次の式（２）に示す構造を有するヨウ化プロピジウム
【００２４】
【化２】
2005024336.tif 000004
【００２５】
が用いられることが特に好ましい。
【００２６】
本発明に係る分析方法においては、上記複合体の分析に電気泳動法を用いることが非常に好ましく、この場合、電気泳動用緩衝液に４級アンモニウム塩を添加して電気泳動を行うことが好ましい。
【００２７】
従来、検出に蛍光波長が必要な装置を用いて酸性多糖類を分析する場合には、あらかじめ試料を蛍光標識化する必要があった。しかし、分子量が数千から数百万の酸性多糖類であるグリコサミノグリカン類をそのまま蛍光標識化するのは困難であり、通常は酵素消化によりオリゴ糖まで分解した後蛍光標識化していた。そのため、高速液体クロマトグラフィー等を用いて分析を行うまでに煩雑な前処理を行う必要があり、この前処理に長時間を要していた。
【００２８】
本発明では、電気泳動用緩衝液に４級アンモニウム塩を添加して電気泳動を行うのみで、上記酸性多糖類と４級アンモニウム塩との複合体が形成されるので、電気泳動を行う前に酸性多糖類と４級アンモニウム塩との複合体を形成させるための前処理の必要がない。したがって、検出に蛍光波長が必要な装置を用いて分析を行う場合においても、所要時間を大幅に短縮することが可能となる。
【００２９】
本発明において用いる電気泳動法としては、具体的には、従来酸性多糖類の分析に使用されていたキャピラリー電気泳動法および近年ＤＮＡの高速分析を目的として開発されたマイクロチップ電気泳動法を挙げることができる。
【００３０】
特にマイクロチップ電気泳動法は、その分析が秒単位であるという高速性と小型であり操作が簡便であるという点からＤＮＡのみならずタンパク質や糖など、他の生体成分の分析にも応用されつつある。しかし、グリコサミノグリカン類の分析にはほとんど応用されていないことから、発明者はグリコサミノグリカン類の分析にマイクロチップ電気泳動法を応用することを試みた。その結果、マイクロチップ電気泳動法が酸性多糖類の分析に応用可能であることを見出し、超高速分析を実現することができた。
【００３１】
一方、従来用いられているキャピラリー電気泳動法では、マイクロチップ電気泳動法と比較して多少分析時間が長くなるが、感度的には同程度の分析が可能となる。それゆえ、分析の用途や条件等に応じて、マイクロチップ電気泳動法・キャピラリー電気泳動法を適宜使い分ければよい。
【００３２】
また、本発明に係る酸性多糖類分析用キットは、上記分析方法を実施するために用いられるものであって、４級アンモニウム塩を含む電気泳動用緩衝液と酸性多糖類標準試料とを含むことを特徴としている。このキットを用いることにより、上記酸性多糖類の分析方法を簡便に実施することが可能となる。
【００３３】
上記４級アンモニウム塩としては、上述したように、窒素原子を含む複素環式芳香環を主構造とする４級アンモニウム塩が用いられることが好ましく、次の式（１）に示す構造を有する臭化エチジウム
【００３４】
【化３】
2005024336.tif 000005
【００３５】
または次の式（２）に示す構造を有するヨウ化プロピジウム
【００３６】
【化４】
2005024336.tif 000006
【００３７】
が用いられることが特に好ましい。
【００３８】
４級アンモニウム塩を含む電気泳動用緩衝液を準備しておくことは、当該緩衝液を自製する時間を省略でき、分析時間の更なる短縮に貢献する。特に、マイクロチップ電気泳動法では、使用する緩衝液量が１試料あたり１０−２０μＬと微量であるので、臨床分析等のルーチン業務としてマイクロチップ電気泳動法を用いて本発明に係る分析方法を実施する場合には、上記緩衝液を準備しておくことは重要である。
【００３９】
また、試料として用いる酸性多糖類は、そのため、本発明に係るキットには酸性多糖類標準試料が含まれる。これにより、本キットの使用者は、標準試料を自製する必要がなくなり、簡便かつ短時間に酸性多糖類の分析を行うことが可能となる。
【００４０】
上記酸性多糖類標準試料としては、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、コンドロイチン硫酸Ｃ、デキストラン硫酸、コロミン酸のうち、いずれか１種以上の酸性多糖類の標準試料であればよい。
【００４１】
さらに、本キットにマイクロ電気泳動用チップを含めれば、使用者は別途マイクロ電気泳動用チップを準備する必要がなくなり、一層簡便かつ迅速に酸性多糖類の分析を行うことが可能となる。
【００４２】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
（１）本発明に係る酸性多糖類の分析方法
本発明に係る酸性多糖類の分析方法は、酸性多糖類の立体構造に４級アンモニウム塩をインターカレート（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅ）させることにより、複合体を形成し、この複合体形成に基づく４級アンモニウム塩の発蛍光を利用する方法である。
【００４３】
なお、本発明における「分析」には、上記４級アンモニウムの発蛍光による酸性多糖類の検出や、混合物からの各種酸性多糖類の分離だけでなく、発蛍光の測定から見出されるあらゆる知見を確認することも含まれる。
【００４４】
酸性多糖類が形成する基本的な立体構造として、構成単糖類が６個から１０個結合することによりらせん型のコンホメーションをとるに至ると考えられていることから、発明者はこのような一定のコンホメーションが蛍光性４級アンモニウム塩（以下、適宜「インターカレーター」と表す。）と複合体を形成し、核酸の場合と同様に強く発蛍光することを期待して検討を進めた。その結果、生体中に存在する酸性多糖類が予想通りインターカレーターと複合体を強く形成し、強く発蛍光することを見出した。
【００４５】
本発明で用いられる４級アンモニウム塩としては、酸性多糖類と複合体を形成し発蛍光するものであれば特に限定されるものではないが、具体的には、窒素原子を含む複素環式芳香環を主構造とする４級アンモニウム塩であることが好ましい。なお、ここでいう芳香環には、ベンゼン環構造だけでなく、ナフタレン環、アントラセン環、フェナントレン環等の多環式の芳香環構造も含まれる。また、上記主構造とは、４級アンモニウムとなる構造部位が複素環式芳香環であることを指し、当該複素環式芳香環の各原子が、それ以外の官能基や構造に置換されている場合を含む意味である。
【００４６】
具体的には、本発明において用いられる４級アンモニウム塩としては、臭化エチジウム（下記式（１）参照）、ヨウ化プロピジウム（下記式（２）参照）、ヨウ化ヘキシジウム（下記式（３）参照）、臭化エチジウム・モノアジド（下記式（４）参照）、塩化エチジウム・ジアジド（下記式（５）参照）等、フェナントレン環構造（厳密には、フェナントレン構造の９位の炭素が窒素原子に置換された複素環フェナントリジン構造）を有するとともに、１０位にフェニル基が置換されている構造を有する４級アンモニウム塩がより好ましく用いられる。中でも、核酸の検出に使用されている臭化エチジウム（下記式（１）参照）やヨウ化プロピジウム（下記式（２）参照）が好結果を与えるため好ましい。
【００４７】
【化５】
2005024336.tif 000007
【００４８】
【化６】
2005024336.tif 000008
【００４９】
【化７】
2005024336.tif 000009
【００５０】
【化８】
2005024336.tif 000010
【００５１】
【化９】
2005024336.tif 000011
【００５２】
なお、上記インターカレーターとしては、１種類の４級アンモニウム塩を用いればよいが、分析の目的等によっては、２種類以上の４級アンモニウム塩を適宜組み合わせて用いても構わない。
【００５３】
酸性多糖類とインターカレーターとの複合体形成は、あらかじめ前処理等を行う必要はなく、電気泳動用緩衝液に４級アンモニウム塩を添加して電気泳動を行うことで達成できる。そのため、従来酸性多糖類を蛍光標識して高速液体クロマトグラフィー等で分析する場合に必要であった、酵素消化とその後の蛍光標識という前処理が不要となり、分析時間を大幅に短縮することができる。
【００５４】
上記インターカレーターの使用方法は特に限定されるものではなく、酸性多糖類とインターカレーターとで複合体が形成できる方法であればよい。後述する実施例でも示すように、本発明者はマイクロチップ電気泳動法を用いることにより、分析時間を数分以内とすることができることを見出した。そこで、電気泳動法を用いる場合には、電気泳動用緩衝液にインターカレーター（４級アンモニウム塩）を添加して電気泳動を行う方法を採用すればよい。これにより、酸性多糖類とインターカレーターとで複合体が形成され、発蛍光を測定することができる。
【００５５】
本発明に係る分析方法において利用される具体的な分析方法は特に限定されるものではなく、酸性多糖類において分析したい物性や条件等に合わせて、公知の分析方法を適宜選択すればよい。本実施の形態では、代表的な分析方法として、上述した電気泳動法を挙げることができる。
【００５６】
本発明で利用可能な電気泳動法も特に限定されるものではなく、公知の各種方法を好適に用いることができるが、中でも、後述するマイクロチップ電気泳動法や、キャピラリー電気泳動法がより好ましく用いられる。これら方法を用いることにより、分析時間をより短くすることができるとともに、試料も微量とすることができる。特に、キャピラリー電気泳動法の場合、分解能が高いという利点もある。
【００５７】
本発明に係る酸性多糖類の分析方法は、グリコサミノグリカン含有医薬品の品質管理に応用可能である。後述の実施例で示すように、グリコサミノグリカン類を含有する医薬品は既に多数存在する。これらの医薬品を希釈あるいは濃縮、脱塩といった前処理を行わなくとも検出することが可能である。したがって、本発明に係る分析方法は、医薬品生産現場での品質管理業務の効率化に有用であると考えられる。
【００５８】
（２）電気泳動法を用いた分析方法の一例
次に、電気泳動法を用いた本発明に係る分析方法の代表的な一例について説明する。
【００５９】
前述したように、本発明者はマイクロチップ電気泳動法を用いることにより、分析時間を数分以内とすることができることを見出した。具体的には、後述する実施例に示すように、本発明者は、マイクロチップ電気泳動装置として株式会社日立ハイテクノロジーズ製の商品名：コスモアイＳＶ１１００を用いて検討したが、マイクロチップ電気泳動法に使用できる装置はこれに限定されるものではなく、公知のマイクロチップ電気泳動装置を用いることができる。例えば、コスモアイＳＶ１２１０（商品名、株式会社日立ハイテクノロジーズ製）、ＭＣＥ２０１０（商品名、株式会社島津製作所製）、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ（商品名、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  製）等が市販されており、本発明に係る酸性多糖類の分析方法はこれらの装置を用いても実施することができる。
【００６０】
本発明に係る分析方法に用いる電気泳動用緩衝液は特に限定されるものではない。マイクロチップ電気泳動法による酸性多糖類の分析において用いられる緩衝液としては特に限定されるものではなく、酸性多糖類およびインターカレーターにより形成された複合体の電気泳動と、発蛍光の検出を妨げないものであればよい。より具体的には、用いる装置およびチップの特性により最も適切な電気泳動用緩衝液を用いればよい。
【００６１】
例えば、上記コスモアイＳＶ１１００および専用チップであるｉ−チップＤＮＡ用（株式会社日立ハイテクノロジーズ製）を用いて酸性多糖類の分析を行う場合、緩衝液としては０．１Ｍトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．５）が好適である。また、分析対象の試料により、この緩衝液に他の物質を添加した方がよい場合もある。例えば、ヒアルロン酸を分析する場合には、ヒアルロン酸の粘度が高いために分離上好結果を得るため、ポリエチレングリコールを１％の濃度で添加することが好ましい。
【００６２】
電気泳動用緩衝液に添加するインターカレーターの濃度は、臭化エチジウムの場合０．０００１％〜０．０１％で検出可能であるが、好ましくは０．０００３％〜０．００３％である。臭化エチジウム以外のインターカレーターについても、適当な範囲の濃度で検出感度を検討することにより、至適濃度を決定することができる。また、使用する緩衝液が異なる場合には、適宜至適濃度を検討した後、当該至適濃度を用いることが好ましい。
【００６３】
以下の実施例で具体的に示すように、上記コスモアイＳＶ１１００および専用ｉ−チップＤＮＡ用、０．１Ｍトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いてヒアルロン酸を分析した場合、３０秒〜９０秒の短時間で分析が完了する。ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、およびコンドロイチン硫酸Ｃも６０秒以内に分析が可能である。さらに、神経細胞成長因子として最近注目を集めているＮＣＡＭ（神経細胞接着因子、Ｎｅｕｒａｌ  Ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）中のシアル酸ポリマー（例えば、コロミン酸）や合成品のデキストラン硫酸なども分析することができる。
【００６４】
本分析方法により分析を試みた酸性多糖類について、その検出限界を表１に示す。
【００６５】
【表１】
2005024336.tif 000012
【００６６】
また、酸性多糖類の混合試料の分離に関しては、従来法で分離が困難であった組み合わせの混合物から各酸性多糖類を分離することは、本発明に係る分析方法でも分離は困難である。例えばヘパリンとコンドロイチン硫酸の混合物は従来法でも本発明の分析方法でも分離することができない。しかし、従来、キャピラリー電気泳動法においても分離が困難であったブタ皮膚由来ヒアルロン酸（分子量１０万−２０万）と微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）由来ヒアルロン酸（分子量１００万−２００万）の混合物については本発明を用いて有効に分離することができる。
【００６７】
上記酸性多糖類の分析では、分析時間については従来のセルロースアセテート膜電気泳動法が前操作とデンシトメーターを用いる定量操作を加えるとおよそ３時間程度必要とされる。これに対し、本発明に係る分析方法では、マイクロチップ電気泳動装置を用いた場合、分析は約２分程度で完了し、少なくとも６０倍以上分析時間を短縮することができる。
【００６８】
また、本発明に係る分析方法では、マイクロチップ電気泳動装置を用いた場合、その検出感度や分離の程度については今のところ従来法と同等である。しかしながら、感度に関しては、実際には超高感度の検出が実現できているといえる。具体的には、マイクロチップの設計上、必要試料容量が１０μＬであるため従来法と同程度の量（約１μｇ）を用いる必要があるが、一回の分析で実際に分離・検出に使用している量は計算上約０．３ｎｇである。それゆえ、本発明では、事実上、超高感度分析がなされている。したがって、実際の必要試料量が検出に使用している量と同程度まで減少することができれば、本発明では、従来のセルロースアセテート膜電気泳動法と比べて１０００倍以上の高感度分析の実現が期待できる。
【００６９】
また、近年ＤＮＡの高速分析を目的として開発されたマイクロチップ電気泳動法の応用により、従来少なくとも２時間以上要した分析時間を２〜３分に短縮することを実現した。特に、マルチ分析流路（例えば１０本の分析流路）を有するマイクロチップ電気泳動装置を使用すれば、多数の試料を数分で分析できる。
【００７０】
なお、上記の例では、本発明にマイクロチップ電気泳動法を適用した例を挙げたが、本発明ではこれに限定されるものではなく、キャピラリー電気泳動法も好適に適用することができる。キャピラリー電気泳動法を適用した場合、多少分析時間が長くなるが、感度的にはマイクロチップ電気泳動法に匹敵した分析を実施できる。
【００７１】
（３）本発明に係る酸性多糖類分析用キット
次に、本発明に係る酸性多糖類分析用キットについて説明する。
【００７２】
本キットは、本発明に係る酸性多糖類の分析方法を簡便に実施できることを目的とするもので、４級アンモニウム塩を含む電気泳動用緩衝液と酸性多糖類標準試料とを含む。さらに、マイクロチップ電気泳動法に特化したキットとする場合には、マイクロ電気泳動用チップを含むものとすることが好ましい。
【００７３】
上記４級アンモニウム塩は、前述したように、酸性多糖類と複合体を形成し発蛍光するものであれば特に限定されるものではないが、具体的には、複素環式芳香環構造を含むものであることが好ましく、特に、臭化エチジウム（前記式（１）参照）やヨウ化プロピジウム（前記式（２）参照）が好ましく用いられる。
【００７４】
４級アンモニウム塩を含む電気泳動用緩衝液としては、例えば臭化エチジウムを０．００１％含む０．１Ｍトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．５）を挙げることができる。また、ヨウ化プロピジウムを含むものでもよく、酸性多糖類と複合体を形成し発蛍光するその他の４級アンモニウム塩を含むものでもよい。緩衝液についても０．１Ｍトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．５）に限定されるものではなく、装置やチップの特性に応じた適当な緩衝液を選択すればよい。
【００７５】
さらに、緩衝液に添加する試薬等を別途含ませてもよい。例えば、ヒアルロン酸を分析する場合に添加するポリエチレングリコールを別の容器に入れてキットの構成に含ませ、用時緩衝液に規定量を添加するものとすればよい。
【００７６】
酸性多糖類は起源により分子量や糖鎖の組成に変動がみられるため、標準試料を同時に分析する必要がある。そのため酸性多糖類の標準試料をキットに含ませることはキット使用者の利便性および分析精度を向上させるために重要である。
【００７７】
標準試料とする酸性多糖類としては、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、コンドロイチン硫酸Ｃ、デキストラン硫酸、コロミン酸等を挙げることができるが、これに限定されるものではない。さらに、同一の酸性多糖類であっても起源や分子量等により分析結果が異なることがあらかじめ知られているものについては、その起源ごと、分子量ごと等複数の標準試料をキットに含ませることが好ましい。
【００７８】
なお、本発明に係る酸性多糖類分析用キットにおいては、上記４級アンモニウム塩を含む電気泳動用緩衝液、酸性多糖類標準試料、好ましくはさらにマイクロ電気泳動用チップが含まれていればよいが、使用目的に応じてこれら以外の試薬等が含まれていてもよい。
【００７９】
本キットを使用することにより、本発明に係る酸性多糖類の分析方法を簡便かつ短時間で実施することが可能となり、例えば、臨床現場等での利用が大いに期待できる。
【００８０】
【実施例】
実施例では、本発明にかかる酸性多糖類の分析方法をマイクロチップ電気泳動法により実施した場合について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、各実施例に用いたマイクロチップ電気泳動法について先に説明する。
【００８１】
〔マイクロチップ電気泳動法〕
装置：コスモアイＳＶ１１００（株式会社日立ハイテクノロジーズ製）
マイクロチップ：ｉ−チップＤＮＡ用（幅１００μｍ、深さ３０μｍ、株式会社日立ハイテクノロジーズ製）
泳動緩衝液：０．１Ｍトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．５）／０．００１％臭化エチジウム（ヒアルロン酸の分析の場合のみ１％ポリエチレングリコールを含む。）
試料導入時間：６０秒
導入電圧：３００Ｖ（導入）、０Ｖ（分離）
分離電圧：１３０Ｖ（導入）、７５０Ｖ（分離）
試料容量：１０μＬ
〔実施例１：蛍光性４級アンモニウム塩（インターカレーター）の選択〕
臭化エチジウム（下記式（１）参照）、ヨウ化プロピジウム（下記式（２）参照）、エチジウム・ホモ二量体（下記式（６）参照）、アクリジンオレンジ（下記式（７）参照）およびヘキスト３３２５８（商品名、一般名：ビス−ベンズイミド）（下記式（８）参照）の５種類のインターカレーターを用い、検出能の有無について検討した。
【００８２】
【化１０】
2005024336.tif 000013
【００８３】
【化１１】
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【００８４】
【化１２】
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【００８５】
【化１３】
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【００８６】
【化１４】
2005024336.tif 000017
【００８７】
試料にヘパリン（１ｍｇ／ｍＬ）およびコンドロイチン硫酸（１ｍｇ／ｍＬ）を用い、それぞれ臭化エチジウムまたはヨウ化プロピジウムを０．１Ｍトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加した泳動用緩衝液を用いてマイクロチップ電気泳動法により検出した結果を図１（ａ）、（ｂ）に示した。図中の            ＥＢは臭化エチジウムを、ＰＩはヨウ化プロピジウムを表す。また、図の横軸は分離時間を示し、単位は秒である。
【００８８】
図１（ａ）、（ｂ）から明らかなように、いずれの試料についても臭化エチジウムおよびヨウ化プロピジウムに同程度の発蛍光が観察された。この結果を踏まえて、以後の実施例ではインターカレーターとして臭化エチジウムのみを用いた。
【００８９】
〔実施例２：ヒアルロン酸の検出〕
ブタ皮膚由来ヒアルロン酸（分子量１０万−２０万）および微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）由来ヒアルロン酸（分子量１００万−２００万）の分析を試みた。泳動緩衝液は１％ポリエチレングリコールを含む０．１Ｍトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．５）に０．００１％の臭化エチジウムを溶解したものを用いた。両試料の濃度はいずれも１ｍｇ／ｍＬとした。その結果を図２に示す。図中のＨＡ（ｐｉｇ  ｓｋｉｎ）はブタ皮膚由来ヒアルロン酸、ＨＡ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）は微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）由来ヒアルロン酸を表す。また、図の横軸は分離時間を示し、単位は秒である。
【００９０】
図２から明らかなように、ブタ皮膚由来ヒアルロン酸は４０秒付近にピークが観察され、微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）由来ヒアルロン酸は１００秒付近にピークが観察された。すなわち、本検出法により２種類の分子量の異なるヒアルロン酸をいずれも検出することができた。
【００９１】
〔実施例３：臭化エチジウムの濃度の影響〕
グリコサミノグリカン類の検出における臭化エチジウムの濃度の影響を検討した。上記ブタ皮膚由来ヒアルロン酸および微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）由来ヒアルロン酸（ともに１ｍｇ／ｍＬ）を試料とし、臭化エチジウムを０．００２％から段階希釈した泳動緩衝液を用いた。結果を図３（ａ）、（ｂ）に示す。図中のＨＡ（ｐｉｇ  ｓｋｉｎ）はブタ皮膚由来ヒアルロン酸、ＨＡ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）は微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）由来ヒアルロン酸を表す。ＥｔＢｒは臭化エチジウムを表す。また、図の横軸は分離時間を示し、単位は秒である。
【００９２】
図３（ａ）、（ｂ）から明らかなように、両ヒアルロン酸とも、臭化エチジウム濃度が０．００５％まで検出することが可能であったが、最も感度がよい臭化エチジウム濃度は０．００１％であった。また、０．００２％ではベースラインの振り切れが生じ、検出不可能であった。この結果を踏まえて、以後の実施例では０．００１％の臭化エチジウムを含む泳動緩衝液を用いることとした。
【００９３】
〔実施例４：グリコサミノグリカン類の検出および検出限界の検討〕
ブタ皮膚由来ヒアルロン酸および微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）由来ヒアルロン酸の検出限界について検討した。ブタ皮膚由来ヒアルロン酸は０．５および１ｍｇ／ｍＬの試料を用い、微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）由来ヒアルロン酸は０．０５、０．１および１ｍｇ／ｍＬの試料を用いた。結果を図４（ａ）、（ｂ）に示した。図中のＨＡ（ｐｉｇ  ｓｋｉｎ）はブタ皮膚由来ヒアルロン酸、ＨＡ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）は微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）由来ヒアルロン酸を表す。また、図の横軸は分離時間を示し、単位は秒である。
【００９４】
図４（ａ）、（ｂ）から明らかなように、ブタ皮膚由来ヒアルロン酸の検出限界は１ｍｇ／ｍＬ、微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）由来ヒアルロン酸の検出限界は０．１ｍｇ／ｍＬであった。
【００９５】
ヘパリン（ブタ腸粘膜由来、分子量６０００）の検出および検出限界について検討した。濃度が０．２５、０．５および１ｍｇ／ｍＬの試料を用いた。結果を図５（ａ）に示した。
【００９６】
図５（ａ）から明らかなように、ヘパリン（分子量６０００）は本検出法で検出可能であり、検出限界は０．２５ｍｇ／ｍＬであった。
【００９７】
また、図５（ｂ）に示したように、ヘパリン（分子量３０００）も本検出法で検出可能であったが、ヘパリン（分子量６０００）より検出感度は低く、検出限界は１ｍｇ／ｍＬであった。
【００９８】
ヘパラン硫酸（ウシ腎臓由来）の検出および検出限界について検討した。濃度が０．２５、０．５および１ｍｇ／ｍＬの試料を用いた。結果を図６に示した。
【００９９】
図６から明らかなように、ヘパラン硫酸は本検出法で検出可能であり、検出限界は０．５ｍｇ／ｍＬであった。
【０１００】
コンドロイチン硫酸Ａ（クジラ軟骨由来）、コンドロイチン硫酸Ｂ（ブタ皮膚由来）およびコンドロイチン硫酸Ｃ（サメ軟骨由来）の検出および検出限界について検討した。コンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳ−Ａ）およびコンドロイチン硫酸Ｃ（ＣＳ−Ｃ）は０．０５、０．１および１ｍｇ／ｍＬの試料を用いた。コンドロイチン硫酸Ｂ（ＣＳ−Ｂ）は０．１、０．２および１ｍｇ／ｍＬの試料を用いた。結果を図７（ａ）〜（ｃ）に示す。
【０１０１】
図７（ａ）〜（ｃ）から明らかなように、いずれの種類のコンドロイチン硫酸も本検出法で検出可能であった。コンドロイチン硫酸Ａおよびコンドロイチン硫酸Ｃの検出限界は０．１ｍｇ／ｍＬ、コンドロイチン硫酸Ｂの検出限界は０．２ｍｇ／ｍＬであった。
【０１０２】
デキストラン硫酸（分子量５０万）の検出および検出限界について検討した。濃度が０．０５、０．１および１ｍｇ／ｍＬの試料を用いた。結果を図８（ａ）に示した。
【０１０３】
図８（ａ）から明らかなように、デキストラン硫酸（分子量５０万）は本検出法で検出可能であり、検出限界は０．１ｍｇ／ｍＬであった。
【０１０４】
また、図８（ｂ）に示したように、デキストラン硫酸（分子量１万）も本検出法で検出可能であり、検出感度はデキストラン硫酸（分子量５０万）と同程度で、検出限界は０．１ｍｇ／ｍＬであった。
【０１０５】
コロミン酸の検出および検出限界について検討した。濃度が０．１、０．２および１ｍｇ／ｍＬの試料を用いた。結果を図９に示した。
【０１０６】
図９から明らかなように、コロミン酸は本検出法で検出可能であり、検出限界は０．２ｍｇ／ｍＬであった。
【０１０７】
ヒアルロン酸過硫酸塩（ＨＡＰＳ、ＨＡ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅｄ）の検出結果を図１０に示した。図１０から明らかなように、ヒアルロン酸過硫酸塩は本検出法で検出可能であった。また、図には示していないが、ヒアルロン酸過硫酸塩の検出限界は０．１ｍｇ／ｍＬであった。
【０１０８】
上記以外にアルギン酸についても検討したが、多糖でもアルギン酸は検出することができず、臭化エチジウムによるグリコサミノグリカン類の発色はその多糖の構造に相関があると考えられた。
【０１０９】
上記の結果を表１にまとめた。
【０１１０】
〔実施例５：グリコサミノグリカン類混合物の分離の検討〕
従来法（アセテートセルロース膜電気泳動法、キャピラリー電気泳動法等）において分離が可能である組み合わせ、および分離が困難である組み合わせについて検討した。従来法において分離が可能である組み合わせとしては、ヒアルロン酸（ＨＡ）とヘパリン（ＨＰ）とヘパラン硫酸（ＨＳ）との組み合わせがある。これらは電気泳動の移動度が異なるため分離が可能である。一方、従来法において分離が困難である組み合わせとしては、ヘパリン（ＨＰ）とコンドロイチン硫酸（ＣＳ）や、コンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）とコンドロイチン硫酸Ｃ（ＣＳＣ）がある。これらは電気泳動の移動度が類似するため分離が困難である。
【０１１１】
本実施例では、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパリン（ＨＰ）、コンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）およびヘパラン硫酸（ＨＳ）の混合物（ヒアルロン酸のみ２ｍｇ／ｍＬ、他は１ｍｇ／ｍＬ）、コンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）とコンドロイチン硫酸Ｃ（ＣＳＣ）の混合物（各１ｍｇ／ｍＬ）、ヘパリン（ＨＰ）とヘパラン硫酸（ＨＳ）の混合物（ヘパリン１ｍｇ／ｍＬ、ヘパラン硫酸２ｍｇ／ｍＬ）について、本発明に係る分析方法を用いて分離の可否を検討した。なお、ヒアルロン酸を含む混合物を分離する場合のみ、１％ポリエチレングリコールを含む泳動緩衝液を用いた。結果を図１１に示した。
【０１１２】
ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパリン（ＨＰ）、コンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）およびヘパラン硫酸（ＨＳ）の混合物では、ヒアルロン酸（ＨＡ）とヘパラン硫酸（ＨＳ）はそれぞれ単独のピークとして分離できたが、ヘパリン（ＨＰ）とコンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）はピークが重なり分離することができなかった（図１１上段）。
【０１１３】
コンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）とコンドロイチン硫酸Ｃ（ＣＳＣ）の混合物ではピークが重なり、分離することができなかった（図１１中段）。
【０１１４】
ヘパリン（ＨＰ）とヘパラン硫酸（ＨＳ）の混合物ではそれぞれ単独のピークとして分離することができた（図１１下段）。
【０１１５】
以上の結果より、本発明に係る分析方法を用いても従来法と同様に、分離が困難な組み合わせについては分離することができなかった。
【０１１６】
次に、キャピラリー電気泳動法においても分離が困難とされている、ブタ皮膚由来ヒアルロン酸と微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）由来ヒアルロン酸との混合物の分離を試みた。ブタ皮膚由来ヒアルロン酸（１ｍｇ／ｍＬ）と微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）由来ヒアルロン酸（０．５ｍｇ／ｍＬ）との混合物の分析結果をブタ皮膚由来ヒアルロン酸（１ｍｇ／ｍＬ）単独、および微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）由来ヒアルロン酸（１ｍｇ／ｍＬ）単独の分析結果と比較した。結果を図１２に示した。
【０１１７】
図１２上段はブタ皮膚由来ヒアルロン酸（１ｍｇ／ｍＬ）単独の分析結果である。図１２中段は微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）由来ヒアルロン酸（１ｍｇ／ｍＬ）単独の分析結果である。図１２下段は混合物の分析結果である。３試料の分析結果から明らかなように、混合物の２つのピークはそれぞれ単独のピークと近似する位置にあり、２種類のヒアルロン酸を分離できることが示された。したがって、本発明に係る分析方法ではキャピラリー電気泳動法においても分離が困難とされているブタ皮膚由来ヒアルロン酸と微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）由来ヒアルロン酸との混合物を分離することが可能であった。
【０１１８】
〔実施例６：グリコサミノグリカン含有医薬品の品質管理への応用〕
（１）使用医薬品
ヒアルロン酸ナトリウム点眼液（商品名：ヒアレイン（登録商標）０．１、製造販売元：参天製薬株式会社）、コンドロイチン硫酸ナトリウム点眼液（商品名：コンドロン（登録商標）点眼液３％、製造販売元：科研製薬株式会社）、ヒアルロン酸ナトリウム関節内注射液（商品名：アルツ（登録商標）、製造元：生化学工業株式会社、販売元：科研製薬株式会社）、ヒアルロン酸ナトリウム（眼科手術補助剤、商品名：オペガン（登録商標）、製造元：生化学工業株式会社、販売元：参天製薬株式会社）、ヘパリンナトリウム（商品名：パンヘプリン、製造販売元：大日本製薬株式会社）
（２）分析結果
ヒアルロン酸ナトリウム点眼液（ヒアレイン０．１）およびコンドロイチン硫酸ナトリウム点眼液（コンドロン点眼液）の分析結果を図１３に示した。ヒアルロン酸ナトリウム点眼液はブタ皮膚由来ヒアルロン酸と泳動時間の一致が認められた（図１３および図２）。コンドロイチン硫酸ナトリウム点眼液についても同様にコンドロイチン硫酸標準品と泳動時間がほぼ一致した（図１３および図７（ａ）〜（ｃ））。なお、両医薬品とも希釈あるいは濃縮、脱塩といった前処理をする必要がなく、製品をそのまま分析することが可能であった。
【０１１９】
ヒアルロン酸ナトリウム関節内注射液およびヒアルロン酸ナトリウム（眼科手術補助剤）の分析結果を図１４に示した。ブタ皮膚由来ヒアルロン酸標準品（ＨＡ（ｐｉｇ  ｓｋｉｎ））および微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）由来ヒアルロン酸標準品（ＨＡ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ））の分析結果を同時に示した。両医薬品は原液を前処理なく分析した結果である。
【０１２０】
図１４から明らかなように、両医薬品は３０秒付近と１２０秒付近にヒアルロン酸であると思われるピークを示した。標準品とのピークのずれは、製品中に存在する高濃度の塩が影響を与えていると思われる。また、製品を１０倍希釈した試料（ヒアルロン酸１ｍｇ／ｍＬ）についても同様のエレクトロフェログラムを与えたことから、高濃度ヒアルロン酸の粘度は分析に影響を与えないことが示された。
【０１２１】
ヘパリンナトリウム製剤の分析結果を図１５に示した。図１５から明らかなように、ヘパリンナトリウム製剤のピークはヘパリン標準品（Ｈｅｐａｒｉｎと表示）のピークと泳動時間がほぼ一致した。
【０１２２】
〔比較例：セルロースアセテート膜電気泳動法によるグリコサミノグリカン類の分析〕
現在、グリコサミノグリカン類を標識せずに分析する場合には、セルロースアセテート膜電気泳動法が主に用いられている。そこで、比較例としてセルロースアセテート膜電気泳動法によりヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ヘパリン（ＨＰ）、デキストラン硫酸（ＤＳ）およびコンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）を分析した。
【０１２３】
〈実験方法〉
泳動用緩衝液：０．１Ｍピリジン／０．４７Ｍ蟻酸（ｐＨ３．０）
泳動電流：０．５ｍＡ／ｃｍ
染色：０．１％アルシャンブルー／０．１％酢酸
試料導入量：１μｇ（全試料）
〈所要時間〉
セルロースアセテート膜を２５％メタノールに浸す。（数分）
セルロースアセテート膜を泳動用緩衝液に浸す。（３０分）
膜状に試料をスポットする。（数分）
電気泳動する。（１時間）
アルシャンブルーで染色する。（１０分）
０．１％酢酸で脱色する。（１分）
〈結果〉
結果を図１６に示す。図１６から明らかなように、各グリコサミノグリカンが検出できた。分析に必要な時間は約２時間であり、さらにデンシトメーターで定量することが必要である。
【０１２４】
本発明に係るマイクロチップ電気泳動法を用いた分析方法では、分析時間は２〜３分であるので、約６０倍の高速化が得られたことになる。
【０１２５】
【発明の効果】
本発明は、酸性多糖類と４級アンモニウム塩との複合体形成に基づく４級アンモニウム塩の発蛍光を利用する酸性多糖類の分析方法であり、電気泳動用緩衝液に４級アンモニウム塩を添加して電気泳動を行うことで酸性多糖類を分析することが可能である。そのため、従来酸性多糖類を蛍光標識して高速液体クロマトグラフィー等で分析する場合に必要であった、酵素消化とその後の蛍光標識という前処理が不要となり、分析時間を大幅に短縮することができるという効果を奏する。
【０１２６】
さらに、本発明に係る分析方法を実施するめの緩衝液、標準試料、チップ等をキット化することにより、簡便に本発明を実施することができるという効果を奏する。
【０１２７】
近年、生体内における酸性多糖類の重要な意義が次々と明らかにされつつあり、酸性多糖類のハイスループット分析法の開発が望まれている。本発明者は、本発明を完成させることにより、酸性多糖類をあらかじめ標識することなくそのまま分析できること、およびマイクロチップ電気泳動を利用して超高速分析を可能とすることを実現した。
【０１２８】
したがって、本発明は、医薬品の開発や医薬品の品質管理、分析装置の開発、臨床での診断等に応用でき、医薬品産業、医療機器産業、試薬産業のみならす、広く医療全般の利益に貢献でき、これらを通じて人類の福祉に果たす貢献は極めて高いと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）はヘパリンを、臭化エチジウムまたはヨウ化プロピジウムを含む電気泳動用緩衝液を用いてマイクロチップ電気泳動法により検出した結果を示すエレクトロフェログラムであり、（ｂ）はコンドロイチン硫酸Ａを、臭化エチジウムまたはヨウ化プロピジウムを含む電気泳動用緩衝液を用いてマイクロチップ電気泳動法により検出した結果を示すエレクトロフェログラムである。
【図２】ヒアルロン酸を、臭化エチジウムを含む電気泳動用緩衝液を用いてマイクロチップ電気泳動法により検出した結果を示すエレクトロフェログラムである。
【図３】（ａ）はブタ皮膚由来ヒアルロン酸の検出における臭化エチジウム濃度の影響を検討した結果を示すエレクトロフェログラムであり、（ｂ）は微生物由来ヒアルロン酸の検出における臭化エチジウム濃度の影響を検討した結果を示すエレクトロフェログラムである。
【図４】（ａ）はブタ皮膚由来ヒアルロン酸の検出限界を検討した結果を示すエレクトロフェログラムであり、（ｂ）は微生物由来ヒアルロン酸の検出限界を検討した結果を示すエレクトロフェログラムである。
【図５】（ａ）はヘパリン（分子量６０００）の検出限界を検討した結果を示すエレクトロフェログラムであり、（ｂ）はヘパリン（分子量６０００および３０００）の検出結果を示すエレクトロフェログラムである。
【図６】ヘパラン硫酸の検出限界を検討した結果を示すエレクトロフェログラムである。
【図７】（ａ）はコンドロイチン硫酸Ａの検出限界を検討した結果を示すエレクトロフェログラムであり、（ｂ）はコンドロイチン硫酸Ｂの検出限界を検討した結果を示すエレクトロフェログラムであり、（ｃ）はコンドロイチン硫酸Ｃの検出限界を検討した結果を示すエレクトロフェログラムである。
【図８】（ａ）はデキストラン硫酸（分子量５０万）の検出限界を検討した結果を示すエレクトロフェログラムであり、（ｂ）はデキストラン硫酸（分子量５０万および１万）の検出結果を示すエレクトロフェログラムである。
【図９】コロミン酸の検出限界を検討した結果を示すエレクトロフェログラムである。
【図１０】ヒアルロン酸過硫酸塩の検出結果を示すエレクトロフェログラムである。
【図１１】マイクロチップ電気泳動法によりグリコサミノグリカン類の分離を検討した結果を示すエレクトロフェログラムである。
【図１２】マイクロチップ電気泳動法によりブタ皮膚由来ヒアルロン酸と微生物由来ヒアルロン酸の分離を検討した結果を示すエレクトロフェログラムである。
【図１３】マイクロチップ電気泳動法によりヒアルロン酸ナトリウム点眼液およびコンドロイチン硫酸ナトリウム点眼液の分析を検討した結果を示すエレクトロフェログラムである。
【図１４】マイクロチップ電気泳動法によりヒアルロン酸ナトリウム関節内注射液およびヒアルロン酸ナトリウム（眼科手術補助剤）の分析を検討した結果を示すエレクトロフェログラムである。
【図１５】マイクロチップ電気泳動法によりヘパリンナトリウム製剤の分析を検討した結果を示すエレクトロフェログラムである。
【図１６】セルロ−スアセテート膜電気泳動法によるグリコサミノグリカン類の分析手順および分析結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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