(57)【要約】【課題】  多種多様の遺伝子検出を簡便、高効率、高精度に行うことを可能とし、遺伝子検出をベースとした分野で広範囲に利用されうる核酸の検出方法を提供する。【解決手段】  核酸アレイを用いた、固相ユニバーサルＰＣＲ、固相マルチプレックスＰＣＲ、さらにユニバーサルでありかつマルチプレックスである固相ＰＣＲを可能とする核酸の検出方法を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を有する核酸の検出方法。
（１）検出対象としての部分的で且つ連続な塩基配列の複数を有する一本鎖核酸(Ａ鎖)と、該Ａ鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸(Ｂ鎖)とを用意する工程。
（２）前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
（３）前記Ａ鎖の３’末端と、該３’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をＢ鎖伸長用プライマーとして用意する工程。
（４）前記Ａ鎖および前記Ｂ鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記Ｂ鎖伸長用プライマーと、を用いてＰＣＲ反応を行う工程。
（５）ＰＣＲ反応の結果、伸長増幅され、基板に結合したＡ鎖に相当する核酸と、伸長増幅され、基板に結合していないＢ鎖に相当する核酸と、のハイブリッド体を形成させる工程。
（６）前記ハイブリッド体を前記アレイの各々のプライマー固定領域において検出することにより、前記検出対象としての塩基配列を検出する工程。
【請求項２】
下記工程を有する核酸の検出方法。
（１）検出対象としての部分的で且つ連続な塩基配列の複数を有する一本鎖核酸(Ａ鎖)と、該Ａ鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸(Ｂ鎖)とを用意する工程。
（２）前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
（３）前記Ａ鎖の５’末端と、該５’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列を有する核酸をＡ鎖伸長用プライマーとして用意し、前記Ａ鎖の３’末端と、該３’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をＢ鎖伸長用プライマーとして用意する工程。
（４）前記Ａ鎖および前記Ｂ鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記Ａ鎖伸長用プライマー及びＢ鎖伸長用プライマーと、を用いてＰＣＲ反応を行う工程。
（５）ＰＣＲ反応の結果、伸長増幅され、基板に結合したＡ鎖に相当する核酸と、伸長増幅され、基板に結合していないＢ鎖に相当する核酸と、のハイブリッド体を形成させる工程。
（６）前記ハイブリッド体を前記アレイの各々のプライマー固定領域において検出することにより、前記検出対象としての塩基配列を検出する工程。
【請求項３】
下記工程を有する核酸の検出方法。
（１）検出対象としての部分的且つ連続な塩基配列を有する複数種の一本鎖核酸(Ａ鎖群：Ａ１鎖〜Ａｎ鎖：ｎ≧２)と、該Ａ鎖群の各鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸群(Ｂ鎖群：Ｂ１鎖〜Ｂｎ鎖：ｎ≧２)とを用意する工程。
（２）前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
（３）前記Ａ鎖群の各鎖ごとに、３’末端と、該３’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をＢ鎖伸長用プライマー(ＰＢ鎖群：ＰＢ１鎖〜ＰＢｎ鎖：ｎ≧２)として用意する工程。
（４）前記Ａ鎖群および前記Ｂ鎖群の各鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記ＰＢ鎖群の複数のＢ鎖伸長用プライマーと、を用いてＰＣＲ反応を行う工程。
（５）ＰＣＲ反応の結果、伸長増幅され、基板に結合したＡ鎖群に相当する核酸と、伸長増幅され、基板に結合していないＢ鎖群に相当する核酸と、のハイブリッド体を形成させる工程。
（６）前記ハイブリッド体を前記アレイの各々のプライマー固定領域において検出することにより、前記検出対象としての塩基配列を検出する工程。
【請求項４】
下記工程を有する核酸の検出方法。
（１）検出対象としての部分的且つ連続な塩基配列を有する複数種の一本鎖核酸(Ａ鎖群：Ａ１鎖〜Ａｎ鎖：ｎ≧２)と、該Ａ鎖群の各鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸群(Ｂ鎖群：Ｂ１鎖〜Ｂｎ鎖：ｎ≧２)とを用意する工程。
（２）前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
（３）前記Ａ鎖群の各鎖ごとに、５’末端と、該５’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列を有する核酸をＡ鎖伸長用プライマー(ＰＡ鎖群：ＰＡ１鎖〜ＰＡｎ鎖：ｎ≧２)として用意し、前記Ａ鎖群の各鎖ごとに、３’末端と、該３’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をＢ鎖伸長用プライマー(ＰＢ鎖群：ＰＢ１鎖〜ＰＢｎ鎖：ｎ≧２)として用意する工程。
（４）前記Ａ鎖群および前記Ｂ鎖群の各鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記ＰＡ鎖群および前記ＰＢ鎖群の各伸長用プライマーと、を用いてＰＣＲ反応を行う工程。
（５）ＰＣＲ反応の結果、伸長増幅され、基板に結合したＡ鎖群に相当する核酸と、伸長増幅され、基板に結合していないＢ鎖群に相当する核酸と、のハイブリッド体を形成させる工程。
（６）前記ハイブリッド体を前記アレイの各々のプライマーの固定領域において検出することにより、前記検出対象としての塩基配列を検出する工程。
【請求項５】
前記Ｂ鎖伸長用プライマーが標識されており、前記ハイブリッド体の検出が該標識を用いて行われるものである請求項１〜４のいずれかに記載の核酸の検出方法。
【請求項６】
前記標識が蛍光色素である請求項５に記載の核酸の検出方法。
【請求項７】
前記ハイブリッド体の検出が二本鎖核酸に作用するインターカレーターあるいはグルーブバインダーとしての蛍光色素を用いて行われるものである請求項１〜４のいずれかに記載の核酸の検出方法。
【請求項８】
前記ハイブリッド体の検出において、該蛍光色素を共焦点蛍光顕微鏡を用いて観察する工程をさらに有する請求項６または７に記載の核酸の検出方法。
【請求項９】
下記工程を有する核酸の検出方法。
（１）検出対象としての部分的で且つ連続な塩基配列の複数を有する一本鎖核酸(Ａ鎖)と、該Ａ鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸(Ｂ鎖)とを用意する工程。
（２）前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
（３）前記Ａ鎖の３’末端と、該３’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をＢ鎖伸長用プライマーとして用意する工程。
（４）前記Ａ鎖および前記Ｂ鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記Ｂ鎖伸長用プライマーと、を用い、ヌクレオチドモノマーの少なくとも１種の一部、もしくは、全部を標識してＰＣＲ反応を行う工程。
（５）前記基板に結合したプローブから伸長増幅したＡ鎖に相当する核酸を、該核酸に取り込まれた標識を介して検出する工程。
【請求項１０】
下記工程を有する核酸の検出方法。
（１）検出対象としての部分的で且つ連続な塩基配列の複数を有する一本鎖核酸(Ａ鎖)と、該Ａ鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸(Ｂ鎖)とを用意する工程。
（２）前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
（３）前記Ａ鎖の５’末端と、該５’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列を有する核酸をＡ鎖伸長用プライマーとして用意し、前記Ａ鎖の３’末端と、該３’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をＢ鎖伸長用プライマーとして用意する工程。
（４）前記Ａ鎖および前記Ｂ鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記Ａ鎖伸長用プライマー及びＢ鎖伸長用プライマーと、を用い、ヌクレオチドモノマーの少なくとも１種の一部、もしくは、全部を標識してＰＣＲ反応を行う工程。
（５）前記基板に結合したプローブから伸長増幅したＡ鎖に相当する核酸を、該核酸に取り込まれた標識を介して検出する工程。
【請求項１１】
下記工程を有する核酸の検出方法。
（１）検出対象としての部分的且つ連続な塩基配列を有する複数種の一本鎖核酸(Ａ鎖群：Ａ１鎖〜Ａｎ鎖：ｎ≧２)と、該Ａ鎖群の各鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸群(Ｂ鎖群：Ｂ１鎖〜Ｂｎ鎖：ｎ≧２)とを用意する工程。
（２）前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
（３）前記Ａ鎖群の各鎖ごとに、３’末端と、該３’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をＢ鎖伸長用プライマー(ＰＢ鎖群：ＰＢ１鎖〜ＰＢｎ鎖：ｎ≧２)として用意する工程。
（４）前記Ａ鎖群および前記Ｂ鎖群の各鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記ＰＢ鎖群の複数のＢ鎖伸長用プライマーと、を用い、ヌクレオチドモノマーの少なくとも１種の一部、もしくは、全部を標識してＰＣＲ反応を行う工程。
（５）前記基板に結合したプローブから伸長増幅したＡ鎖に相当する核酸を、該核酸に取り込まれた標識を介して検出する工程。
【請求項１２】
下記工程を有する核酸の検出方法。
（１）検出対象としての部分的且つ連続な塩基配列を有する複数種の一本鎖核酸(Ａ鎖群：Ａ１鎖〜Ａｎ鎖：ｎ≧２)と、該Ａ鎖群の各鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸群(Ｂ鎖群：Ｂ１鎖〜Ｂｎ鎖：ｎ≧２)とを用意する工程。
（２）前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
（３）前記Ａ鎖群の各鎖ごとに、５’末端と、該５’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列を有する核酸をＡ鎖伸長用プライマー(ＰＡ鎖群：ＰＡ１鎖〜ＰＡｎ鎖：ｎ≧２)として用意し、前記Ａ鎖群の各鎖ごとに、３’末端と、該３’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をＢ鎖伸長用プライマー(ＰＢ鎖群：ＰＢ１鎖〜ＰＢｎ鎖：ｎ≧２)として用意する工程。
（４）前記Ａ鎖群および前記Ｂ鎖群の各鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記ＰＡ鎖群およびＰＢ鎖群の各プライマーと、を用い、ヌクレオチドモノマーの少なくとも１種の一部、もしくは、全部を標識してＰＣＲ反応を行う工程。
（５）前記基板に結合したプローブから伸長増幅したＡ鎖に相当する核酸を、該核酸に取り込まれた標識を介して検出する工程。
【請求項１３】
前記ＰＣＲ反応後に、前記基板上の反応液を洗浄除去する工程を更に有する請求項９〜１２のいずれかに記載の核酸の検出方法。
【請求項１４】
前記標識が蛍光色素である請求項９〜１３のいずれかに記載の核酸の検出方法。
【請求項１５】
前記標識の検出において、該蛍光色素を共焦点蛍光顕微鏡を用いて観察する工程を更に有する請求項１４に記載の核酸の検出方法。
【請求項１６】
少なくともＰＣＲ反応および核酸の検出を、プライマーアレイが同一の容器中に存在する形態でおこなう請求項１〜１５のいずれかに記載の核酸の検出方法。
【請求項１７】
ＰＣＲ反応および核酸の検出を、それぞれ同一の手段を用いて継続的に観察しながらおこなう請求項１６に記載の核酸の検出方法。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の核酸の検出方法を可能とする少なくともＰＣＲ反応容器および検出手段を具備する核酸の検出装置。
【請求項１９】
請求項1〜１７のいずれかに記載のプライマーアレイ、ＰＣＲ反応試薬、および核酸検出用試薬を有する、核酸検出キット。
【請求項２０】
検出する核酸が二本鎖核酸を形成する場合において、前記核酸検出用試薬が、二本鎖核酸に作用するインターカレーターまたはグルーブバインダーとしての蛍光色素である請求項１９に記載の核酸検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸検出方法、特にプライマーアレイ及びＰＣＲ法を用いた核酸検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトをはじめとするさまざまな生物のゲノム等の塩基配列解析が精力的に進められ、その結果として、遺伝子を解析して、遺伝病、癌、感染症、生活習慣病等の診断、治療方針の決定、治療後の管理、予後予想等が行われるようになってきた。また、別の分野では、同様に遺伝子を解析することにより、食肉、穀物等の食品の流通管理も行われようとしてきている。
【０００３】
これらの遺伝子解析に用いられる技術として、1990年代の後半から特に注目されてきている技術の一つとして、固相の基板に複数の例えばＤＮＡプローブ、オリゴヌクレオチドプローブ、ｃＤＮＡ等の核酸を搭載した核酸アレイがあげられる。核酸アレイはまた、ＤＮＡアレイ、オリゴヌクレオチドアレイ、ｃＤＮＡアレイ等とも呼ばれることもあり、場合によっては、核酸チップ、ＤＮＡチップのようにも呼ばれる。核酸アレイそのもの、あるいは核酸アレイを用いた遺伝子解析技術は、近年ではかなり一般的に知られてきているのでここで詳細は説明しないが、基本的には多数多種の固相ハイブリダイゼーションを同時に行うことが可能であるという利点がある。
【０００４】
一方、遺伝子解析に関する重要技術として位置付けされてきたＰＣＲ(ポリメレースチェインリアクション)法は、現在でも色褪せることなく、遺伝子解析の際に最も一般的に用いられる技術の一つとなっている。
【０００５】
ＰＣＲ法は発明以来、幾つかの進歩進化を遂げている。例えば、旧来は一種類の遺伝子、もしくは一種類の塩基配列に対して、増幅を必要とする塩基配列を挟む形で二種類のプライマーを用いてＰＣＲを行っていたが、近年では、複数の遺伝子、もしくは複数の塩基配列の異なる塩基配列を含む増幅を必要とする塩基配列を挟んだ二種類のプライマーを用いてＰＣＲが行われるようになった。すなわち、たかだか二種類の(共通の)プライマーで複数の遺伝子等の増幅が可能となるのである。このようなＰＣＲ法は一般的にユニバーサルＰＣＲと呼ばれ、例えば、感染症の引き起こす複数の起炎菌を同定する場合に、特定のrRNA、例えば16s rRNA遺伝子の各起炎菌にユニークな塩基配列部分を含む塩基配列を挟み、且つ、各起炎菌に共通な塩基配列を有するプライマーでＰＣＲを行った後に、上記ユニークな塩基配列を検出することにより各起炎菌を特定、検出可能となる。この方法の利点は複数の遺伝子等それぞれにＰＣＲを行う必要がないところにある。
【０００６】
他方、マルチプレックスＰＣＲという手法も開発されている。これは、ひとつのバッチで複数の遺伝子等を、それぞれ異なるプライマーセットで増幅しようとするものである。この手法には、プライマーの鎖長、塩基配列、及びＰＣＲ条件の設計、設定等に難しさはあるものの、基本的に複数、多種のＰＣＲを同時に行うことが可能であり、また、同一のバッチで反応を行うことにより場合によっては検出の定量性の向上が期待できる。
【０００７】
さらに以上述べてきたチップ技術とＰＣＲ法を組み合わせた手法も提案されている。
【０００８】
二種のオリゴヌクレオチドからなるＰＣＲプライマーの一セットを核酸アレイの一つのマトリクスに固定して、複数のＰＣＲを一枚の固相上で行う、いわゆる固相ＰＣＲの一手法が開示されている(特許文献１参照)。この手法によれば、ＰＣＲ後の核酸アレイとハイブリダイゼーション条件におくことによって、マトリクス上で増幅した二種の増幅産物が互いに逆Ｕ字型にハイブリッドを形成する。このハイブリッドを例えば蛍光インターカレーター色素を用いて検出することにより、検出対象の例えば遺伝子を同定、検出することが可能となる。
【０００９】
また、複数のウェルを有するマイクロプレートでの固相ＰＣＲ法が示されている(非特許文献１参照）。すなわち、マイクロプレートのウェルの表面にＰＣＲのプライマーセットのうち、一方を共有結合で固定し、ウェル内において鋳型核酸および双方のプライマーを用いてＰＣＲを行う方法である。検出はウェル表面に固定化したプライマーから伸長したＰＣＲ増幅産物を別途検出プローブを用いて行う。
【特許文献１】特開２００１−２９９３４６号公報
【非特許文献１】Nalge Nunc Interntional社発行  TECH NOTE Vol.3 No.16
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上、本発明に関わる従来技術、すなわち、遺伝子検出技術、核酸アレイ技術、ＰＣＲ法、固相ＰＣＲ法について概説した。
【００１１】
上記固相ＰＣＲ法は、基本的にひとつのＰＣＲ反応を、ひとつのマトリクス、またはひとつのウェルにおいて行うものであって、すでに述べたユニバーサルＰＣＲあるいはマルチプレックスＰＣＲに適用することは難しい。また、特許文献１に記載の方法では最終的なハイブリッドの形成が微小領域で逆Ｕ字型に行われるためにハイブリッド形成に立体的な制限がある。また、非特許文献１に記載の方法は、マイクロプレートのウェル中での反応であるために、核酸アレイでの反応に比較して反応数に制限があり、反応液量も多量に必要となり、検出の効率も改良する余地がありうる。さらにこれらの技術の検出は蛍光インターカレーターを用いたり、別の検出プローブを用いるなど、増幅後に別途のステップを必要とするものであった。
【００１２】
以上のような状況に鑑み、本発明は多種多量の遺伝子検出を簡便、高効率、高精度に行うことを可能とする固相ＰＣＲ法に関するものであり、医療分野における診断、治療、予後予想、あるいは食品分野の流通管理など、遺伝子検出をベースとした分野で広範囲に利用されうる核酸の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の目的は以下の本発明によって達成される。
【００１４】
すなわち、本発明にかかる核酸検出方法の第１態様は、以下の工程を有することを特徴とする。
（１）検出対象としての部分的で且つ連続な塩基配列の複数を有する一本鎖核酸(Ａ鎖)と、該Ａ鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸(Ｂ鎖)とを用意する工程。
（２）前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
（３）前記Ａ鎖の３’末端と、該３’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をＢ鎖伸長用プライマーとして用意する工程。
（４）前記Ａ鎖および前記Ｂ鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記Ｂ鎖伸長用プライマーと、を用いてＰＣＲ反応を行う工程。
（５）ＰＣＲ反応の結果、伸長増幅され、基板に結合したＡ鎖に相当する核酸と、伸長増幅され、基板に結合していないＢ鎖に相当する核酸と、のハイブリッド体を形成させる工程。
（６）前記ハイブリッド体を前記アレイの各々のプライマー固定領域において検出することにより、前記検出対象としての塩基配列を検出する工程。
上記手法により核酸アレイ上でのユニバーサルＰＣＲが可能となる。
【００１５】
本発明の核酸の検出方法の第２の態様は、以下の工程を有することを特徴とする。
（１）検出対象としての部分的且つ連続な塩基配列を有する複数種の一本鎖核酸(Ａ鎖群：Ａ１鎖〜Ａｎ鎖：ｎ≧２)と、該Ａ鎖群の各鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸群(Ｂ鎖群：Ｂ１鎖〜Ｂｎ鎖：ｎ≧２)とを用意する工程。
（２）前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
（３）前記Ａ鎖群の各鎖ごとに、３’末端と、該３’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をＢ鎖伸長用プライマー(ＰＢ鎖群：ＰＢ１鎖〜ＰＢｎ鎖：ｎ≧２)として用意する工程。
（４）前記Ａ鎖群および前記Ｂ鎖群の各鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記ＰＢ鎖群の複数のＢ鎖伸長用プライマーと、を用いてＰＣＲ反応を行う工程。
（５）ＰＣＲ反応の結果、伸長増幅され、基板に結合したＡ鎖群に相当する核酸と、伸長増幅され、基板に結合していないＢ鎖群に相当する核酸と、のハイブリッド体を形成させる工程。
（６）前記ハイブリッド体を前記アレイの各々のプライマー固定領域において検出することにより、前記検出対象としての塩基配列を検出する工程。
【００１６】
上記の検出方法では、各Ａ鎖は複数の検出対象としての塩基配列を一ヶ所以上有することができる。
【００１７】
以上の方法により、従来技術では不可能であった、核酸アレイを用いた、固相ユニバーサルＰＣＲ、固相マルチプレックスＰＣＲ、さらに、ユニバーサルであり且つマルチプレックスである固相ＰＣＲが可能となる。
【００１８】
更に、本発明の核酸の検出方法の第３の態様は、以下の工程を有することを特徴とする。
（１）検出対象としての部分的で且つ連続な塩基配列の複数を有する一本鎖核酸(Ａ鎖)と、該Ａ鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸(Ｂ鎖)とを用意する工程。
（２）前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
（３）前記Ａ鎖の３’末端と、該３’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をＢ鎖伸長用プライマーとして用意する工程。
（４）前記Ａ鎖および前記Ｂ鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記Ｂ鎖伸長用プライマーと、を用い、ヌクレオチドモノマーの少なくとも１種の一部、もしくは、全部を標識してＰＣＲ反応を行う工程。
（５）前記基板に結合したプローブから伸長増幅したＡ鎖に相当する核酸を、該核酸に取り込まれた標識を介して検出する工程。
【００１９】
更に、本発明の核酸の検出方法の第４の態様は、以下の工程を有することを特徴とする。
（１）検出対象としての部分的且つ連続な塩基配列を有する複数種の一本鎖核酸(Ａ鎖群：Ａ１鎖〜Ａｎ鎖：ｎ≧２)と、該Ａ鎖群の各鎖に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸群(Ｂ鎖群：Ｂ１鎖〜Ｂｎ鎖：ｎ≧２)とを用意する工程。
（２）前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
（３）前記Ａ鎖群の各鎖ごとに、３’末端と、該３’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をＢ鎖伸長用プライマー(ＰＢ鎖群：ＰＢ１鎖〜ＰＢｎ鎖：ｎ≧２)として用意する工程。
（４）前記Ａ鎖群および前記Ｂ鎖群の各鎖を鋳型として、前記基板上に固定されたプライマーと、前記ＰＢ鎖群の複数のＢ鎖伸長用プライマーと、を用い、ヌクレオチドモノマーの少なくとも１種の一部、もしくは、全部を標識してＰＣＲ反応を行う工程。
（５）前記基板に結合したプローブから伸長増幅したＡ鎖に相当する核酸を、該核酸に取り込まれた標識を介して検出する工程。
【００２０】
上記の検出方法では、各Ａ鎖は複数の検出対象としての塩基配列を一ヶ所以上有することができる。
【００２１】
これらの第３及び第４の態様は、検出の工程をより簡便とするために、ＰＣＲ反応の際に用いられるヌクレオチドモノマーの少なくとも１つの一部もしくは全部に標識モノマーを利用することをその特徴の一つとする。これらの態様にかかる方法によって、ＰＣＲ後にハイブリッド形成を行うという二段階の工程を経ることなく、ＰＣＲ後に直ちに検出を行うことが可能な固相ＰＣＲ、あるいは、ＰＣＲ後に直ちに検出を行うことが可能な固相ユニバーサルＰＣＲ、固相マルチプレックスＰＣＲ、さらに、ユニバーサルであり且つマルチプレックスである固相ＰＣＲが可能となる。
【００２２】
更に、上記本発明の第１〜第４の態様は、基板に固定しないプライマーとしてＡ鎖の５’端側に最も近い検出対象としての塩基配列よりも５’端部側の領域から選択した塩基配列と同じ塩基配列を有する核酸(Ａ鎖伸長用プライマー)を上記のＢ鎖伸長用プライマーに付加して用いることで、ＰＣＲでの目的塩基配列の増幅効率を上げることができることを特徴とする。
【００２３】
また、上記本発明の第１〜第４のさらなる態様は、ＰＣＲ反応および検出を、プライマーアレイが同一の容器中に存在する形態で行うことを特徴とし、さらに、該ＰＣＲ反応および検出を、同一の手段を用いて継続的に観察しながら行うことができる。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、上記本発明の検出方法を可能とする、少なくともＰＣＲ反応容器および検出手段を具備する検出装置を特徴とする。
【００２５】
また、上記のプライマーアレイ、ＰＣＲ反応試薬、および核酸検出用試薬を有する、核酸検出キットとして提供することも本発明に含まれる。
【００２６】
なお、上記の各態様にかかる方法におけるｎは同数(整数)である。
【発明の効果】
【００２７】
本発明により核酸アレイを用いる、固相ユニバーサルＰＣＲ、固相マルチプレックスＰＣＲ、さらに、ユニバーサルであり且つマルチプレックスである固相ＰＣＲが可能となった。またＰＣＲ時に標識ヌクレオチドモノマーを用いることにより、ＰＣＲ後に直ちに検出を行うことが可能な固相ＰＣＲ、あるいは、ＰＣＲ後に直ちに検出を行うことが可能な固相ユニバーサルＰＣＲ、固相マルチプレックスＰＣＲ、さらにユニバーサルであり且つマルチプレックスである固相ＰＣＲが可能となった。
【００２８】
すなわち、本発明によれば、多種多量の遺伝子検出を簡便、高効率、高精度に行うことが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の核酸検出方法の第１の態様は、上記の(１)〜(６)の工程を有する。この方法によりプライマーアレイ上でのユニバーサルＰＣＲが可能となる。
【００３０】
この場合、検出対象としての塩基配列は、例えば二本鎖核酸からなる遺伝子であればセンス側の塩基配列でもアンチセンス側の塩基配列でも基本的には同じである。アンチセンス側の配列を知ることによってその相補的であるセンス側の塩基配列(すなわち遺伝子の塩基配列)を知ることができるのは自明である。
【００３１】
各工程における各操作は公知の方法を用いて行うことができる。最終ステップの検出工程では、形成されたハイブリッド体を検出可能な手法であれば如何なる手法を用いることができる。例えば、二本鎖核酸に作用して蛍光を発光、あるいは、増強する蛍光インターカレーター色素、蛍光グルーブバインダー色素を用いる検出方法が利用できる。あるいは、工程(４)に記載のプライマーとして用いる、Ａ鎖の検出対象としての塩基配列の３’末端より、さらに３’側に位置する塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸(Ｂ鎖伸長用プライマーであり、Ａ鎖３’側に由来するプライマーである。ここで３’側に由来するとは３’末端に最も近い検出対象としての塩基配列よりも更に３’末端側に位置する部分に由来することを意味する)を、例えば、フルオロセイン、テトラメチルローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５等の蛍光色素、あるいはラジオアイソトープラベルする手法を採用することも可能である。なお、蛍光色素を用いた場合には、蛍光顕微鏡を用いて観察することができ、例えば共焦点蛍光顕微鏡を用いて観察する工程を更に有することができる。
【００３２】
この方法では、ＰＣＲ反応に用いるプライマーセットのうち、一方のプライマーを固相に固定し、他方(Ｂ鎖伸長用プライマー)を反応液中に溶解して使用する。このＢ鎖伸長用プライマーは各検出対象としての塩基配列の増幅に対して共通のプライマーとしての機能を有する。更に、第１の態様の(２)及び(３）の工程を以下のように変更することができる。
（２）前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
（３）前記Ａ鎖の５’末端と、該５’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列を有する核酸をＡ鎖伸長用プライマーとして用意し、前記Ａ鎖の３’末端と、該３’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をＢ鎖伸長用プライマーとして用意する工程。
【００３３】
すなわち、Ｂ鎖伸長用プライマーに加えて、Ａ鎖の検出対象としての塩基配列の５’末端より、さらに５’側に塩基配列の連続した一部と同じ塩基配列を有する核酸(Ａ鎖伸長用プライマーであり、Ａ鎖５’側に由来するプライマーである：ここで５’側由来とは５’末端に最も近い検出対象としての塩基配列よりも更に５’末端側に位置する部分に由来することを意味する)を反応溶液中に溶解して第２の共通プライマーとして併用することも可能である。場合によってはこちらの併用方法のほうが増幅の効率がよい。
【００３４】
なお、本方法において場合によっては、基板上の反応液を除去する洗浄操作によって、上記ハイブリッド体以外の、例えば鋳型核酸、ＰＣＲ反応に用いたヌクレオチドモノマー、酵素等を除去する工程を含むことができる。
【００３５】
これらの方法は上述のようにユニバーサルＰＣＲに関するものであるが、先に記載した第２の態様にかかる本発明の核酸の検出方法は先に記載した工程(１)〜(６)の工程を有する。この方法によりマルチプレックスＰＣＲが可能となる。
【００３６】
この場合、ハイブリッド体の検出には前述の方法と同様の検出方法を用いることができる。検出対象としての部分的かつ連続的な塩基配列を一ヶ所以上有する複数種の一本鎖核酸(Ａ鎖群：Ａ１鎖〜Ａｎ鎖：ｎ≧２)に対して上記検出方法を用いることができる。また、第２の態様の(２)及び(３)の工程を以下のように変更することもできる。
（２）前記複数の検出対象としての塩基配列ごとに該塩基配列を有する核酸をプライマーとして用意し、各プライマーを別々に基板上の独立した領域に固定して、前記検出対象としての塩基配列のそれぞれがこれらの固定領域に分配されたプライマーアレイを用意する工程。
（３）前記Ａ鎖群の各鎖ごとに、５’末端と、該５’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列を有する核酸をＡ鎖伸長用プライマー(ＰＡ鎖群：ＰＡ１鎖〜ＰＡｎ鎖：ｎ≧２)として用意し、前記Ａ鎖群の各鎖ごとに、３’末端と、該３’末端側に位置する検出対象としての塩基配列と、の間の領域内の部分的且つ連続的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸をＢ鎖伸長用プライマー(ＰＢ鎖群：ＰＢ１鎖〜ＰＢｎ鎖：ｎ≧２)として用意する工程。
【００３７】
すなわち、増幅反応時に、上記Ａ鎖群の検出を対象とする塩基配列の５’末端より、さらに５’側に塩基配列の連続した一部と同じ塩基配列を有する複数の核酸(ＰＡ鎖群：ＰＡ１鎖〜ＰＡｎ鎖：ｎ≧２)をＰＢ鎖群とともに反応液中に溶解して、ぞれぞれの共通プライマーとして使用することも可能である。場合によってはこちらの方法の方が増幅の効率がよい。
【００３８】
以上の方法により、核酸アレイを用いた、固相ユニバーサルＰＣＲ、固相マルチプレックスＰＣＲ、さらにユニバーサルであり且つマルチプレックスである固相ＰＣＲが可能となる。
【００３９】
図１として、上記の方法を、Ａ鎖が３つの検出対象としての塩基配列を有する場合について説明した模式図を示す。図１におけるＡ鎖には、primer 1〜primer 3が３’から５’方向に配置されており、Ａ鎖の相補鎖であるＢ鎖上に、Ａ鎖の３’末端に最も近いprimer 1の３’末端よりも更に３’末端側の領域から選択された部分に相補的な配列の部分として共通プライマー(univ. anti-sense primer)が設定されている。また、Ａ鎖の５’末端に最も近いprimer 3の５’末端よりも更に５’末端側の領域から選択された部分と同じ配列の部分として共通プライマー(univ. sense primer)が設定されている。基板にはprimer 1〜primer 3の部分と同じ配列からなるプライマーがそれぞれ固定された領域が設けられており、図１ではプライマーが固定された領域が示されている。基板上でＰＣＲ反応を行うと、基板上に固定されたプライマーから共通プライマーで規定された位置までの伸長増幅が起きる。図１に示されたプライマーの固定領域では、基板に５’末端で固定されたプライマーの３’末端が共通プライマー(univ. anti-sense primer)で規定される位置まで伸長増幅してＡ鎖に相当する固定鎖を形成し、Ｂ鎖から増幅したＢ鎖に相当する鎖とこの固定鎖で二本鎖を形成させることができる。この２本鎖を検出して検出対象としてのＡ鎖中の塩基配列を同定できる。共通プライマー(univ. sense primer)を更に追加することで、主に、Ａ鎖自体の増幅効果が期待でき、場合によって増幅効率の向上を図ることができる。
【００４０】
次に、先に挙げた第３及び第４の態様におけるように、検出の工程をより簡便とするために、ＰＣＲ反応の際に用いられるヌクレオチドモノマーに標識モノマーを利用することができる。この様子を図２の模式図で示す。すなわち、これまで述べてきた方法全てに適用でき、増幅時にアデニン、グアニン、シトシン、チミンを塩基とする伸長のためのヌクレオチドモノマーの少なくとも一種の一部もしくは全部に標識物質を結合することにより、増幅後、基板に結合したプライマーから伸長した核酸に、上記標識物質が導入される。その結果、前記の方法では起こってきたハイブリダイゼーション以降の工程を省いて検出を行うことが可能となる。本方法における標識物質は特に限定されるものではないが、上述の蛍光色素、ラジオアイソトープが例としてあげられる。第３及び第４の態様における検出工程においても、蛍光色素を用いて標識を行う場合には共焦点蛍光顕微鏡を用いて観察する工程を更に有することができる。
【００４１】
なお、本方法において場合によっては、ＰＣＲ反応の結果、伸長増幅され、基板に結合したＡ鎖に相当する核酸以外の、例えば伸長増幅したＢ鎖に相当する核酸、鋳型核酸、ＰＣＲ反応に用いたヌクレオチドモノマー、酵素等の除去を行ってもよい。
【００４２】
本方法によって、前記従来技術の要改良点の一つであったＰＣＲ後にハイブリッド形成を行うという二段階の工程を経ることなく、ＰＣＲ後に直ちに検出を行うことが可能な固相ＰＣＲ、あるいは、ＰＣＲ後に直ちに検出を行うことが可能な固相ユニバーサルＰＣＲ、固相マルチプレックスＰＣＲ、さらに、ユニバーサルであり且つマルチプレックスである固相ＰＣＲが可能となる。
【００４３】
(その他の実施形態)
上記で説明した検出方法を実現するための装置は、本発明の範囲に含まれうる。
【００４４】
上記の示した方法において、少なくともＰＣＲ反応および検出をプライマーアレイが同一の容器中に存在する形態で行うと、装置等の簡略化が可能となる点、また、以下に述べるように、ＰＣＲ反応及び検出を同一の検出手段を用いて継続的に観察しながら行うことが可能となる点で好ましい。ここで、ＰＣＲ反応および検出を同一の検出手段を用いて継続的に観察しながら行うことは、ＰＣＲ増幅の過程をモニターできることから、いわゆるリアルタイムＰＣＲを可能とする、すなわち、定量性の高い検出を行うことができる点で好ましい様態である。このような検出方法を可能とするＰＣＲ反応容器および検出手段を具備した装置は、本発明を実現する上で好適な形態である。
【００４５】
また、上記のプライマーアレイ、ＰＣＲ反応試薬、検出用試薬を有する核酸検出キットとして提供することも本発明に含まれる。さらに、上述のＰＣＲ反応容器を具備させても良く、ＰＣＲ反応容器をカートリッジ形状にしても良い。また、検出する核酸が２本鎖核酸を形成する場合においては、上記核酸検出キットの検出用試薬が２本鎖核酸に作用するインターカレーターまたはグルーブバインダーとしての蛍光色素であると良い。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例をあげて本発明を具体的に説明する。
【００４７】
実施例１（固相ユニバーサルPCRI）
（１）プライマーの準備
固相ユニバーサルＰＣＲの検出対象を大腸菌(Escherichia coli：ATCC♯11775)の16ｓ リボゾーマルＲＮＡ(ｒＲＮＡ)のゲノムＤＮＡの以下に示す７部分(Ec１〜Ec７)のセンス側塩基配列とし、固相固定プライマーとして選択した。
Ec1  5' CTCTTGCCATCGGATGTGCCCA 3'            (配列番号：１)
Ec2  5' ATACCTTTGCTCATTGACGTTACCCG 3'    (配列番号：２)
Ec3  5' TTTGCTCATTGACGTTACCCGCAG 3'        (配列番号：３)
Ec4  5' ACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGA 3'        (配列番号：４)
Ec5  5' ATACAAAGAGAAGCGACCTCGCG 3'          (配列番号：５)
Ec6  5' CGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGT 3'      (配列番号：６)
Ec7  5' GCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAAT 3'    (配列番号：７)。
【００４８】
これらのプライマーは合成業者(株式会社ベックス)に依頼して合成した。Ec１〜Ec７は後述するように固相基板に結合させるために５'側にリンカーを介してチオール(SH)基を結合した。チオール基を結合した構造をEc１を例として以下に示した。
HS(CH2)6OP(O2)O-dCTCTTGCCATCGGATGTGCCCA
また、アンチセンス側配列の共通プライマーの塩基配列として下記塩基配列(EcAP)を選択した：
EcAP  5' ATCCAACCGCAGGTTCCCCTAC 3'              (配列番号：８)
EcAPは通常どおり合成した。全てのプライマーの脱保護、精製は定法の基づいて行った。
【００４９】
（２）大腸菌ゲノムＤＮＡの抽出
まず、大腸菌標準株を定法に従って培養した。微生物培養液を1.5 ml容量のマイクロチューブに1.0 ml(OD600=0.7)採取し、遠心分離で菌体を回収した(8500rpm、５分間、４℃)。上精を捨てた後、Enzyme Buffer(50mM Tris-HCl：p.H. 8.0、25mM EDTA) 300μlを加え、ミキサーを用いて再縣濁した。再縣濁した菌液は再度遠心分離で菌体を回収した（8500rpm、５分間、4℃）。上精を捨てた後回収された菌体に以下の酵素溶液を加えミキサーを用いて再縣濁した：
Lysozyme                      50 μl （20 mg/ml in Enzyme Buffer）
N-Acetylmuramidase SG         50 μl （0.2 mg/ml in Enzyme Buffer）。
【００５０】
次に、酵素溶液を加え再縣濁した菌液を、37℃のインキュベーター内で30分間静置し、細胞壁の溶解処理を行った。次いで、核酸精製キット(MagExtractor.Genome-：TOYOBO社製)を用いてゲノムＤＮＡの抽出を行った。
【００５１】
具体的には、まず、前処理した微生物縣濁液に溶解・吸着液750μlと磁性ビーズ40μlを加え、チューブミキサーを用いて10分間激しく攪拌した(ステップ１)。
【００５２】
分離用スタンド(Magical Trapper)にそのマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま上精を捨てた(ステップ２)。
【００５３】
次に洗浄液900μlを加えミキサーで５秒間程度攪拌して再縣濁を行った(ステップ３)。
【００５４】
次に、分離用スタンド(Magical Trapper)にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま上精を捨てた(ステップ４)。
【００５５】
ステップ３、４を繰り返して２度目の洗浄(ステップ５)を行った後、70％エタノール900μlを加え、ミキサーで５秒間程度攪拌して再縣濁した(ステップ６)。
【００５６】
次に、分離用スタンド(Magical Trapper)にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた(ステップ７)。
【００５７】
ステップ６、７を繰り返して70％エタノールによる２度目の洗浄(ステップ８)を行った後、回収された磁性粒子に純水100μlを加え、チューブミキサーで10分間攪拌を行った。
【００５８】
次に、分離用スタンド(Magical Trapper)にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブ壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま上精を新しいチューブに回収した。
【００５９】
回収された大腸菌のゲノムＤＮＡは、定法に従って、アガロース電気泳動と260／280 nmの吸光度測定を行い、その品質(低分子核酸の混入量、分解の程度)と回収量を検定した。本実施例では約９μgのゲノムＤＮＡが回収され、ゲノムＤＮＡのデグラデーションやｒＲＮＡの混入は認められなかった。回収したゲノムＤＮＡは、最終濃度50 ng/μlとなるようにＴＥ緩衝液に溶解し、以下の実施例に使用した。
【００６０】
（３）ＤＮＡアレイの作製
［３-１］ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板(サイズ：25mm×75mm×う１mm、飯山特殊ガラス社製)を耐熱、耐アルカリのラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、20分間超音波洗浄を行った。続いて基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水中で20分超音波洗浄を行った。次に80℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に10分間基板を浸した。再び純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡアレイ用の石英ガラス基板を用意した。
【００６１】
［３−２］表面処理
シランカップリング剤KBM-603(信越シリコーン社製)を、１％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、20分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に乾燥した基板を120℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで同仁化学研究所社製のN-マレイミドカプロイロキシスクシイミド(N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido)(以下EMCSと略す)を、ジメチルスルホキシドとエタノールの1:1混合溶媒中に最終濃度が0.3mg/mlとなるように溶解しEMCS溶液を用意した。ベークの終了したガラス基板を放冷し、調製したEMCS溶液中に室温で２時間浸した。この処理により、シランカップリング剤によって表面に導入されたアミノ基とEMCSのスクシイミド基が反応し、ガラス基板表面にマレイミド基が導入された。EMCS溶液から引き上げたガラス基板を、先述のEMCSを溶解した混合溶媒を用いて洗浄し、さらにエタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００６２】
［３-３］プライマー
(１)で述べた固相固定用プライマー(Ec1〜Ec7)をそれぞれ純水に溶解し、最終濃度(後記溶解時)10μMとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
【００６３】
［３-４］ＢＪプリンターによるプライマーＤＮＡ吐出、および基板への結合
グリセリン7.5wt%、チオジグリコール7.5wt%、尿素7.5wt%、アセチレノールEH(川研ファインケミカル社製)1.0wt%を含む水溶液(混合溶媒)を用意した。続いて、先に用意した7種のプライマーを上記混合溶媒に規定濃度なるようにそれぞれ溶解した。得られたＤＮＡ溶液をバブルジェットプリンター(商品名：BJF-850 キヤノン(株)製)用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【００６４】
なお、ここで用いたバブルジェットプリンターは平板への印刷が可能なように改造を施したものである。またこのバブルジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ピコリットルのＤＮＡ溶液を約120マイクロメートルピッチでスポッティングすることが可能となっている。
【００６５】
続いて、この改造バブルジェットプリンターを用いて、１枚のガラス基板に対して、印字操作を行い、ＤＮＡアレイを作製した。印字が確実に行われていることを確認した後、30分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基と核酸プライマー末端のチオール基とを反応させた。
【００６６】
［３-５］洗浄
30分間の反応後、100mMのNaClを含む10mMのリン酸緩衝液(pH 7.0)により表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流し、ガラス基板表面に一本鎖ＤＮＡが固定したＤＮＡアレイを得た。
【００６７】
（４）固相ＰＣＲ
大腸菌ゲノムＤＮＡの増幅方法を以下に示す。
【００６８】
【表１】
2005253389.tif 000003
【００６９】
前述のプライマーアレイのプライマー結合部位をカバーし、且つ温度コントロールが可能なマイクロチャンバーを作製し、上記組成の反応液を該チャンバー内に封止して、以下のプロトコールに従って、増幅反応を行った。即ち、95℃／10分の保持の後、92℃(変性)／45秒、55℃(アニーリング)／45秒および72℃(伸長)／45秒を１サイクルとして35サイクル、最後に72℃／10分保持した。
【００７０】
【表２】
2005253389.tif 000004
【００７１】
反応終了後、チャンバー内に、二本鎖核酸共存下で蛍光が増強する色素SYBR(登録商標) GreenI(モレキュラープローブ社：商品名SYBR(登録商標) Green I nucleic acid gel s
tain 10,000×concentrate in DMSO)をあらかじめ純水で200倍に希釈した溶液１μlを加えて、プライマーアレイを65℃／３分間→92℃／２分間→45℃／３時間の条件下におき、ハイブリダイゼーションを行った。
【００７２】
次に、プライマーアレイを２×SSC／0.1% SDS(25℃)２分間→２×SSC (20℃)２分間→純水(10℃)２分間の条件で洗浄し、チャンバーから取り出して乾燥した。
【００７３】
（５）蛍光測定
ハイブリダイゼーション反応終了後のＤＮＡアレイをＤＮＡアレイ用蛍光検出装置(Axon社製、GenePix 4000B)を用いで蛍光測定を行った(励起波長532 nm、フォトマル電圧400V)。測定結果を表１に示す。なお本実施例では、全ての操作を２回実施したのでそれぞれの結果を表１に示した。
【００７４】
【表３】
2005253389.tif 000005
【００７５】
表１中の蛍光輝度の数値は、ピクセル平均輝度(解像度５μm)を示した。表１で明らかなように、大腸菌から抽出したゲノムＤＮＡを固相ユニバーサルＰＣＲで増幅した結果を再現性よく検出することが可能であった。
【００７６】
実施例２(固相ユニバーサルPCR II)
固相ＰＣＲ時に実施例１で用いたプライマーに加えて、下記塩基配列を有するセンス側配列の共通プライマーの(EcSP)をアンチセンス側共通プライマーと同濃度で用いた以外は、実施例1と同様の方法で、固相ＰＣＲおよび蛍光検出を行った。
EcSP  5' GCGGCAGGCCTAACACATGCAAG 3'      (配列番号：９)。
【００７７】
実施例２では、固相ＰＣＲのサイクル数が31回で、実施例1とほぼ同様の結果を得た。これにより、センス側、アンチセンス側双方の共通プライマーを溶液中に共存させることで、固相ＰＣＲの効率の向上を図ることが可能であることが示された。
【００７８】
実施例３(固相マルチプレックスユニバーサルPCR I)
（１）プライマーの準備
本実施例では実施例１で検出した大腸菌と同時に緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa：ATCC♯10145)のrRNAのゲノムＤＮＡを検出する。そのために最初に緑膿菌用のチオール化センス側配列プライマー８種(Pa１〜Pa８)を実施例１と同様に合成した。該プライマーの塩基配列を以下に示した。
Pa１  5' TGAGGGAGAAAGTGGGGGATCTTC 3'    (配列番号：１０)
Pa2  5' TCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGC 3'        (配列番号：１１)
Pa３  5' GAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGG 3'          (配列番号：１２) 
Pa４  5' GTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTC 3'        (配列番号：１３)
Pa５  5' GACCACCTGGACTGATACTGACAC 3'          (配列番号：１４)
Pa６  5' TGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTC 3'        (配列番号：１５)
Pa７  5' TTAGTTACCAGCACCTCGGGTGG 3'            (配列番号：１６)
Pa８  5' TAGTCTAACCGCAAGGGGGACG 3'              (配列番号：１７)。
【００７９】
また、アンチセンス側配列の共通プライマーの塩基配列として下記塩基配列(PaAP)を選択した：
PaAP  5' ATCCAGCCGCAGGTTCCCCTAC 3'            (配列番号：１８)。
【００８０】
（２）蛍光検出
緑膿菌ゲノム抽出、大腸菌プライマーおよび緑膿菌プライマーを搭載したDNAマイクロアレイの作製、固相ＰＣＲ(大腸菌ゲノムＤＮＡおよび緑膿菌ゲノムＤＮＡ：それぞれ10 ng、EcAPおよびPaAP：それぞれ20 pmole）、ハイブリダイゼーション、洗浄等を実施例１と同様に行い、蛍光による検出を行った。その結果を表２に示す。
【００８１】
【表４】
2005253389.tif 000006
【００８２】
表２から固相マルチプレックスユニバーサルＰＣＲによって大腸菌と緑膿菌との双方のｒRNAゲノムの設定したプライマー配列が全て同時に検出されたことが示された。
【００８３】
実施例４（固相マルチプレックスユニバーサルPCR II）
固相ＰＣＲ時に実施例２で用いたプライマーに加えて、大腸菌と緑膿菌とのそれぞれのセンス側配列の共通プライマー(EcSPおよびPaSP)を同濃度で用いた以外は、実施例３と同様の方法で固相ＰＣＲおよび蛍光検出を行った。以下にPaSPの塩基配列を示す。
PaSP  5' GCGGCAGGCTTAACACATGCAAG 3'            (配列番号:１９)。
【００８４】
実施例４では、固相ＰＣＲのサイクル数が数回程度少ない条件で、実施例３とほぼ同様の結果を得た。これにより、固相マルチプレックスユニバーサルＰＣＲにおいてもセンス側、アンチセンス側双方の共通プライマーを溶液中に共存させることで、固相ＰＣＲの効率の向上を図ることが可能であることが示された。
【００８５】
実施例５(取り込み標識固相ユニバーサルPCR)
実施例１と全く同様の方法により大腸菌ゲノム抽出、プライマーの合成、プライマーアレイの作製を行った後、下記の組成のＰＣＲ溶液を用いて固相ＰＣＲを遂行した。
【００８６】
【表５】
2005253389.tif 000007
【００８７】
次いで、プライマーアレイをハイブリダイゼーション条件におくことなく、２×SSC／0.1% SDS(92℃)２分間→  ２×SSC／0.1% SDS(92℃)２分間→  ２×SSC／0.1% SDS(25℃)２分間→  ２×SSC (20℃)２分間→ 純水(20℃)２分間の条件で洗浄し、チャンバーから取り出して乾燥した。
【００８８】
次いで実施例１と同様に蛍光検出を行った。結果を表３に示す。
【００８９】
【表６】
2005253389.tif 000008
【００９０】
本発明における検出方法に従い、固相ユニバーサルＰＣＲ時に取り込み標識を採用し蛍光検出を行ったところ、表３に示すように簡便に蛍光検出がされた。従ってハイブリダイゼーション工程を必要としない蛍光検出が可能であることが示された。
【００９１】
実施例６
実施例５の取り込み標識を用いて、実施例２から４の固相ユニバーサルＰＣＲ、あるいは固相マルチプレックスユニバーサルＰＣＲを行い、蛍光強度はそれぞれ実施例２から４とは異なるものの、結果として大腸菌のｒＲＮＡゲノムＤＮＡ、あるいは大腸菌と緑膿菌との双方のｒＲＮＡゲノムＤＮＡの同時検出が可能であることが示された。
【００９２】
実施例７(共通プライマー標識固相ユニバーサルPCR)
共通プライマーEcAPをテトラメチルローダミン標識し、ハイブリダイゼーションをSYBR green等の蛍光色素を共存させずに行い、蛍光検出を上記テトラメチルローダミンを用いて行うこと以外は実施例１と全く同様の方法により固相ユニバーサル法による大腸菌ゲノムDNAの検出をおこなった。以下にテトラメチルローダミン標識EcAPの構造を示す。
5' Rho-CONH(CH2)6OP(O2)O-d ATCCAACCGCAGGTTCCCCTAC 3'      (配列番号：２０)
（Rho=テトラメチルローダミン）。
【００９３】
結果、蛍光強度に差は観察されるものの実施例１とほぼ同様の結果が得られた。
【００９４】
アンチセンス側配列の共通プライマーを標識する方法、実施例２〜４の方法においても実施を試みたが、いずれも有効であるとの結果を得ることができた。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】本発明における固相ユニバーサルＰＣＲを説明するための模式図である。
【図２】本発明における固相ユニバーサルＰＣＲおよび取り込み標識を説明するための模式図である。
【図１】
2005253389.tif 000009
【図２】
2005253389.tif 000010