(57)【要約】【課題】  感作性物質の新規は評価方法の提供。【解決手段】  本発明は、MIP-1を発現する細胞と、感作性物質を含有すると予想される被験試料とをインキュベートし、該細胞から放出されたMIP-1分子を検出することを特徴とする感作性物質のインビトロ評価方法またはスクリーニング方法を提供する。本発明はさらに、MIP-1を発現する細胞と、感作性物質と被験物質とを一緒にインキュベートし、該細胞から放出されたMIP-1分子を検出することを特徴とする、該被験物質が該感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤であるか否かを評価する方法又はスクリーニング方法を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
MIP-1を発現する細胞と、感作性物質を含有すると予想される被験試料とをインキュベートし、該細胞から放出されたMIP-1(マクロファージ由来炎症性タンパク質1)分子を検出することを特徴とする感作性物質のインビトロ 評価方法またはスクリーニング方法。
【請求項２】
前記被験試料とインキュベートされた前記細胞から発現されたCD86分子を検出する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記MIP-1がMIP-1α(マクロファージ由来炎症性タンパク質1α)及び／又はMIP-1β(マクロファージ由来炎症性タンパク質1β)である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が単核球細胞である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記単核球細胞がヒト単核球細胞である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト単核球細胞がTHP-1細胞である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
MIP-1を発現する細胞と、感作性物質と被験物質とを一緒にインキュベートし、該細胞から放出されたMIP-1分子を検出することを特徴とする、該被験物質が該感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤であるか否かを評価する方法又はスクリーニング方法。
【請求項８】
前記感作性物質及び被験物質とインキュベートされた前記細胞から発現されたCD86分子を検出する工程をさらに含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記MIP-1がMIP-1α(マクロファージ由来炎症性タンパク質1α)及び／又はMIP-1β(マクロファージ由来炎症性タンパク質1β)である、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が単核球細胞である、請求項７〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記単核球細胞がヒト単核球細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒト単核球細胞がTHP-1細胞である、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感作性物質のインビトロ評価法、及び感作性物質を活性化又は抑制する物質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体においてアレルギー等を誘発する物質（感作性物質）を評価する方法としては、実験動物に被験物質を適用し、そして該実験動物の皮膚などに生ずる反応を視察しる方法が行われている。しかしながら、この方法は動物愛護等の見地から見直しがせまられている。
【０００３】
外来物質によりアレルギー反応が惹起される最初の段階では、抗原提示細胞が感作性物質に暴露されると、抗原は該細胞により従属リンパ節に運ばれる。そこで、該細胞は、その細胞表面に抗原を担持したMHCクラスIIタンパク質や、CD86分子などを発現し、T細胞に抗原提示を行う。これにより、抗原特異的な獲得性免疫応答が成立する。この一連の過程では、該細胞は多くのサイトカイン（IL-1β、IL-6、IL-12など）やケモカイン（MIP-1αやMIP-1β、RANTESなど）を産生することで、活性化し、従属リンパ節への遊走が可能になる。このような抗原提示細胞としては樹状細胞やヒト単核球細胞株が知られている。しかしながら、樹状細胞の性質には個人差があり、また再現性に問題があり、一定の特性を有する樹状細胞を安定的に入手することが困難である。また、樹状細胞はその調製に困難さが伴う。
【０００４】
他方、ヒト単核球細胞株は細胞の取扱いは、比較的容易であり、現時点ではヒト単核球細胞株に感作性物質を作用させた場合、該細胞表面に感作性物質の量や特性を反映してCD86分子が発現されることが明らかとなっている。特開特開２００１−２２１７９６号公報はCD86の発現を指標とする感作性物質のインビトロ評価方法を開示する。しかしながら、アレルギー物質の中には、例えば金属ニッケルやコバルトのように、ヒト単核球細胞株に作用させてもCD86の発現を亢進させないものもあり、CD86の発現を指標とするインビトロ評価方法による判定結果は、インビボ評価法の結果と必ずしも一致しない場合がある。
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−２２１７９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明は、取扱いが容易であり、安定して入手可能な培養細胞を用いて感作性物質をインビトロで評価する方法であって、CD86分子以外の分子の発現を指標とし、任意的にCD86分子を用いたインビトロ感作性物質評価方法と併用して用いることで、インビトロにおける感作性物質評価方法の精度を向上させる手段を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の目的を達成するため、種々検討した結果、ヒト単核球細胞株に感作性物質を作用させた場合、該細胞から培養液に、多数の炎症性サイトカイン・ケモカインのうちで、感作性物質の量や特性に反映してMIP-1分子が特に放出されることを見出し、本発明を完成させた。MIP-1(マクロファージ由来炎症性タンパク質1)は、刺激を受けた白血球や他の組織細胞、腫瘍細胞で生産されるペプチドであり、CCケモカインの一つである。MIP-1βは、Ｔ細胞活性化のための情報を提供して、増殖促進、IL-2分泌、細胞表面IL-2レセプターの発現を誘導することで知られる。また、MIP-1βは、様々な炎症疾患に関与していると考えられており、CD8＋Ｔ細胞によるHIV抑制に関わることも報告されている。MIP-1αは単球、Ｔ細胞の遊走活性、好中球、マクロファージの活性化、造血幹細胞の増殖抑制を示すことで知られる。また、プロテオグリカンと複合体を形成することで、HIV増殖抑制活性も示す。
【０００８】
従って、本発明は第一の観点において、MIP-1を発現する細胞と、感作性物質を含有すると予想される被験試料とをインキュベートし、該細胞から放出されたMIP-1分子、好ましくはMIP-1α及び／又はβを検出することを特徴とする感作性物質のインビトロ評価方法またはスクリーニング方法を提供する。好適な態様において、かかる感作性物質のインビトロ評価方法またはスクリーニング方法は、上記被験試料とインキュベートされた前記細胞から発現されたCD86分子を検出する工程をさらに含む。MIP-1を発現する細胞としては、単核球細胞、好ましくはヒト単核球細胞を使用してよい。より好適な態様において、ヒト単核球細胞はTHP-1細胞である。
【０００９】
本発明は第二の観点において、MIP-1を発現する細胞と、感作性物質と被験物質とを一緒にインキュベートし、該細胞から放出されたMIP-1分子、好ましくはMIP-1α及び／又はβを検出することを特徴とする、該被験物質が該感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤であるか否かを評価する方法又はスクリーニング方法を提供する。好適な態様において、かかる被験物質が該感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤であるか否かを評価する方法又はスクリーニング方法は、該感作性物質及び被験物質とインキュベートされた上記細胞から発現されたCD86分子を検出する工程をさらに含む。MIP-1を発現する細胞としては、単核球細胞、好ましくはヒト単核球細胞を使用してよい。より好適な態様において、ヒト単核球細胞はTHP-1細胞である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、インビトロによる感作性物質評価方法の精度を一層向上させることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において用いるMIP-1を発現する細胞としては、感作性物質の特性を反映して該細胞から培養液にMIP-1分子、即ち、MIP-1α及び／又はMIP-1βを放出するものであれば特に限定されず、哺乳動物の単核球細胞、特にヒト単核球細胞等であってよく、具体例としてTHP-1細胞が挙げられる。THP-1細胞は樹立された培養細胞であって、当業界の研究者により広く用いられており、容易に入手することができる。具体的には、THP-1細胞は公的な細胞バンクまたは民間企業より入手することができる。より好適な態様において、本発明に係る細胞は感作性物質の特性を反映して該細胞から培養液にMIP-1分子（MIP-1α及び／又はMIP-1β）を放出し、しかもその表面にCD86分子を発現する細胞を使用する。
【００１２】
本発明のMIP-1を発現する細胞を培養するための培地としては、これらの細胞を培養することができる常用の任意の培地を使用することができるが、例えば具体例としてRPMI1640培地、DMEM培地、ダルベッコ改変イーグル培地等が挙げられる。これらの培地にはおよそ１０％程度のウシ胎児血清を添加することが必要である。
【００１３】
感作性物質の評価又はスクリーニングにおいては、培地中の上記MIP-1を発現する細胞に被験物質を加え、例えばCO2インキュベーター中で、３７℃にて２４〜７２時間培養（インキュベーション）を行う。MIP-1を発現する細胞の初期濃度は１×105〜1×106細胞／mLが好ましい。この場合、好ましくは、被験物質を加えないで、上記の同様の培養を行い、対照とする。また、感作性物質を阻害又は活性化する物質の評価又はスクリーニングにおいては、培地中のMIP-1を発現する細胞に、既知の感作性物質と被験物質とを加えて、上記条件で培養（インキュベーション）を行う。この場合も、好ましくは、被験物質を加えないで上記と同様の培養を行い、対照とする。
【００１４】
培養（インキュベーション）が終了した後、MIP-1分子を検出又は測定する。MIP-1の検出又は測定方法は、MIP-1を発現する細胞における遺伝発現を検出する定量的又は定性的RT-PCR法、マイクロアレイ、ノーザンブロッティング等の方法やMIP-1に対する抗体との反応性に基づくエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウスタンブロッティング等の方法を用いることができる。いずれの方法によってもMIP-1の測定が可能であるが、操作の簡便性、感度、設備等の点からヒト単核球細胞から培地中に放出されたMIP-1分子をエンザイムイムノアッセイ（ELISA法）で測定するのが好ましい。
【００１５】
培養（インキュベーション）が終了した後のMIP-1を発現する細胞の表面に発現されたCD86分子の検出又は測定を併用する本発明の好適な態様において、CD86の検出又は測定方法は特に限定されないが、抗−ヒトCD86抗体を用いた免疫測定が好ましく、フローサイトメトリー法が特に好ましい。抗−ヒトCD86抗体はモノクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、CD86を表面に発現している細胞を免疫原として用いた常法に従って調製することができる。フローサイトメトリー法も常法に従って行うことができる。
【実施例】
【００１６】
次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実験１：MIP-1βの放出を指標とした、感作性物質のインビトロ評価方法
THP-1細胞（ATCC (American Type Culture Collection)より供与）をRPMI1640（含10％FBS）培地を用いて5×105細胞/ｍLに調製し、6穴プレートに2mL/wellずつ播種した。被験物質は、滅菌水、RPMI1640（含10％FBS）培地あるいはDMSOを用いて適当な濃度に希釈した。被験物質で処理した細胞はCO2インキュベーター中で24時間培養し、培養後の培養液を遠心分離し、遠心分離後の培養上清に含まれるMIP-1βをELISA法にて測定した。MIP-1βの測定はMIP-1β測定用エンザイムイムノアッセイ（ELISA）キット（R&D Systems社製）を用い、下記のとおりにして行った。
【００１７】
Quantikine  human MIP-1β  プロトコール
（準備工程）
１）Wash buffer Concentrate  20mLをミリQ水で25倍に希釈する（総容量500mL）。
２）MIP-1β 標準品（結晶）のバイアルに Calibrator Diluent RD5K  5mL加えて溶解する（2ng/mL）。
３）MIP-1β 標準品/Calibrator Diluent RD5K  溶液（1mL）を希釈し，1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.2pg/mL，15.6pg/mLの溶液を調製（Calibrator Diluent RD5K  で希釈）する。0pg/mLはCalibrator Diluent RD5K  のみとする。
【００１８】
（実験工程）
４）ウェルにRD1Xを50μL加える（結晶が析出している場合は，室温で溶かす）。
５）200μLのサンプル（培養上清）、標準溶液（1000pg/mLが最高濃度）をウェルに加える。
６）室温にて放置する（75分）。
７）Wash buffer  400μLで洗浄する（3回）。
８）200μLの MIP-1β conjugateを加える。
９）75分放置する（室温）。
１０）洗浄する（3回）。
１１）200μLのSubstrate Solutionを加え、20分室温放置(遮光)する。
１２）50μLのStop solutionを加え、混合する。
１３）450nm(λ correction 540 or 570nm)で30分以内に測定を行う。
【００１９】
その結果を表１に示す。
【表１】
2005278628.tif 000002
【００２０】
実験２：MIP-1αの放出を指標とした、感作性物質のインビトロ評価方法
THP-1細胞（ATCC (American Type Culture Collection)より供与）をRPMI1640（含10％FBS）培地を用いて5×105細胞/ｍLに調製し、6穴プレートに2mL/wellずつ播種した。被験物質は、滅菌水、RPMI1640（含10％FBS）培地あるいはDMSOを用いて適当な濃度に希釈した。被験物質で処理した細胞はCO2インキュベーター中で24時間培養し、培養後の培養液を遠心分離し、遠心分離後の培養上清に含まれるMIP-1αをELISA法にて測定した。MIP-1αの測定はMIP-1α測定用エンザイムイムノアッセイ（ELISA）キット（R&D Systems社製）を用い、下記のとおりにして行った。
【００２１】
Quantikine  human MIP-1α  プロトコール
（準備工程）
１）Wash buffer Concentrate  20mLをミリQ水で25倍に希釈する（総容量500mL）。
２）MIP-1α 標準品（結晶）のバイアルに Calibrator Diluent RD5B  6mL加えて溶解する（1ng/mL）。
３）MIP-1α 標準品/Calibrator Diluent RD5B  溶液（1mL）を希釈し，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.2pg/mLの溶液を調製（Calibrator Diluent RD5B  で希釈）する。0pg/mLはCalibrator Diluent RD5B  のみとする。
【００２２】
（実験工程）
４）ウェルにRD1Dを50μL加える。
５）200μLのサンプル（培養上清）、標準溶液（1000pg/mLが最高濃度）をウェルに加える。
６）室温にて放置する（120分）。
７）Wash buffer  400μLで洗浄する（3回）。
８）200μLの MIP-1α conjugateを加える。
９）90分放置する（室温）。
１０）Wash buffer 400μLで洗浄する（3回）。
１１）200μLのSubstrate Solutionを加え、20分室温放置(遮光)する。
１２）50μLのStop solutionを加え、混合する。
１３）450nm(λ correction 540 or 570nm)で30分以内に測定を行う。
【００２３】
その結果を表２に示す。
【表２】
2005278628.tif 000003
【００２４】
実験３：IL-1β（インターロイキン-1β）の放出を指標とした、感作性物質のインビトロ評価方法（比較例）
THP-1細胞（ATCC (American Type Culture Collection)より供与）をRPMI1640（含10％FBS）培地を用いて5×105細胞/ｍLに調製し、6穴プレートに2mL/wellずつ播種した。被験物質は、滅菌水、RPMI1640（含10％FBS）培地あるいはDMSOを用いて適当な濃度に希釈した。被験物質で処理した細胞はCO2インキュベーター中で24時間培養し、培養後の培養液を遠心分離し、遠心分離後の培養上清に含まれるIL-1βをELISA法にて測定した。IL-1βの測定はIL-1β測定用エンザイムイムノアッセイ（ELISA）キット（R&D Systems社製）を用いて行った。その結果を表３に示す。
【表３】
2005278628.tif 000004
【００２５】
本発明の方法と従来技術の方法との比較
本発明の方法（「THP-1/MIP-1β法」及び「THP-1/MIP-1α法」：実験1及び2に記載の方法）と、以下に示す従来技術の方法との比較をいくつかの被験物質について行い、それを表４にまとめる。従来技術の方法は、特開２００１−２２１７９６号公報に記載のCD86分子の発現を指標とするインビトロ評価方法（「THP-1/CD86法」）、並びにGuinea Pig Maximization法（「GPMT法」）及びLocal Lymph Node Assay法（「LLNA法」）である。THP-1/CD86法の結果は以下に記載の通りに実験を行って得たものであり、GPMT法及びLLNA法のデータは参考文献に記載のものである。さらに、ヒトアレルギーに関する文献データとの比較も行った。
【００２６】
THP-1/CD86法
THP-1細胞（ATCC (American Type Culture Collection)より供与）をRPMI1640（含10％FBS）培地を用いて5×105細胞/ｍLに調製し、24穴プレートに1mL/wellずつ播種する。被験物質は、滅菌水、RPMI1640（含10％FBS）培地あるいはDMSOを用いて適当な濃度に希釈する。被験物質で処理した細胞はCO2インキュベーター中で24時間培養する。培養後の細胞をPBSを用いて洗浄し、FITCで蛍光標識した抗ヒトCD86抗体を用いて氷水中で30分間染色する。染色した細胞をPBSを用いて洗浄し、洗浄後の細胞を0.1％BSAを含むPBSに浮遊させる。その細胞浮遊液を用いてフローサイトメトリーにより生細胞1×106細胞の蛍光強度を測定し、被験物質無処理のコントロールを比較する。生細胞の検出はPI染色により行う。
【表４】
2005278628.tif 000005
比較結果を表4に示す。
【００２７】
考察
表４にまとめた本発明に係るTHP-1/ MIP-1βの結果（「MIP-1β」）、THP-1/ MIP-1αの結果（「MIP-1α」）、従来技術であるTHP-1/CD86法の結果（「CD86」）、及びTHP-1/MIP-1β法の結果とTHP-1/CD86法の結果の組合せ（「CD86+ MIP-1β」）について、ヒトアレルギーに関する文献データ（「インビボ「ヒト」）との相関についてそれぞれ検討し、その相関結果をさらに表４にまとめた。尚、THP-1/MIP-1β法とTHP-1/CD86法を組合せた結果（「CD86+ MIP-1β」）は、どちらか一方が陽性となれば(「++」又は「+-」）陽性と判断した。表中、インビトロ結果とインビボデータとが一致しているものを○で囲った。
【表５】
2005278628.tif 000006
【００２８】
CD86に関しては、試験した１８種の化合物のうち、１２種がインビボデータと一致した。詳しくは、CD86 インビトロ評価法によれば、インビボデータで陽性とされた化合物のうち５種（Ni、Co、ペニシリンＧ、イソユゲノール、シンナムアルデヒド）を除く８種の化合物が同様に陽性と判定され、またインビボデータで陰性であるとされた化合物のうち１種（塩化ベンズアルコニウム）を除く４種の化合物が同様に陰性と判定された。
MIP-1βに関しては、試験した１８種の化合物のうち、１４種がインビボデータと一致した。詳しくは、MIP-1β インビトロ評価法によれば、インビボデータで陽性とされた化合物のうち４種（pPD、HgCl2、ペニシリンＧ、ヒドロキノン）を除く９種の化合物が同様に陽性と判定され、またインビボデータで陰性とされた化合物については相反する結果は示されず、５種の化合物全てが同様に陰性と判定された。MIP-1αに関しても、試験した９種の化合物のうち、2-MBTを除き、MIP-1βの結果と一致した。従って、MIP-1β及びMIP-1αのいずれか一方または両者を指標とすることで、CD86を指標とするインビトロ評価方法とほぼ同程度のレベルで、感作性物質を評価・スクリーニングできることが明らかとなった。
【００２９】
MIP-1βとCD86の結果の組合せによる判定に関しては、試験した１８種の化合物のうち、１６種がインビボデータと一致した。詳しくは、組合せインビトロ評価法によれば、インビボデータで陽性とされた化合物のうちペニシリンＧを除く１２種の化合物が同様に陽性と判定され、またインビボデータで陰性であるとされた塩化ベンズアルコニウムを除く４種の化合物が同様に陰性と判定された。従って、CD86を指標とするインビトロ評価法にMIP-1β及び／又はMIP-1αを指標とする評価法を組合せることで、精度の一層向上された感作性物質の評価・スクリーニングができることが明らかとなった。
【００３０】
尚、表２に示すように、IL-1βを指標とするインビトロ評価法では、試験した１７種の化合物のうち、インビボ評価法と一致した結果を示す化合物はわずか６種であり（感作性物質：pPD、Ni、イソユゲノール、ヒドロキノン；非感作性物質：DMSO、塩化ベンズアルコニウム）非感作性物質であるSDS、Triton X-100、サリチル酸メチルにあっては発現亢進が確認された。従って、サイトカインやケモカインであっても、感作性物質の評価・スクリーニングの指標とすることができないものが存在することが明らかである。