(57)【要約】【目的】小麦グルテンの蛋白質分解酵素の分解液から、免疫賦活作用を有する新規なヘクサペプチド及びヘプタペプチドを提供する。【構成】小麦グルテンを蛋白質分解酵素等で処理し、新規な免疫賦活作用を有する（１）Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ、（２）Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ及び（３）Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎであり、マクロファージ（ＡＭ）貪食能、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性、及びマイトジェン活性（幼若化能）等の免疫賦活作用を有し、毒性も極めて低い。【選択図】なし・【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式；Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なヘクサペプチド。
【請求項２】
次式；Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なヘクサペプチドを有効成分として含有することを特徴とする免疫賦活剤。
【請求項３】
次式；Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なヘプタペプチド。
【請求項４】
次式：Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なヘプタペプチドを有効成分として含有することを特徴とする免疫賦活剤。
【請求項５】
次式；Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なヘクサペプチド。
【請求項６】
次式；Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なヘクサペプチドを有効成分として含有することを特徴とする免疫賦活剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、新規なヘクサペプチド、ヘプタペプチドおよび免疫賦活剤に関する。
【背景技術】
【０００２】食品由来のペプチドおよびフコイダンは、免疫賦活剤としての利点を持つ。
【特許文献１】  特開平０６−２５６３８９
【特許文献２】  特開平０８−２２５５９４
【特許文献３】  特開平０８−２３１５８９
【特許文献４】  特開２００２−２６５３７０
【特許文献５】  特開２００２−２６５４９６
【非特許文献１】Ｊ．Ｌ．Ｄｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．：Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１０１，８１０−８２４（１９８４）．
【非特許文献２】Ｆ．Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４５，６７７−６８２（１９８４）．
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｅｒｔｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．：ＦＡＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２１８，５５−５８（１９８７）
【非特許文献４】Ｋ．Ｓｕｅｔｓｕｎａ  ｅｔ  ａｌ．：Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｒｅｓ．，８，２２７−２３０（２００２）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】摂取された食品は消化管の中で分解、吸収される過程で宿主免疫系への種々の影響を与えることが知られている〔非特許文献１〕。宿主の免疫反応は免疫担当細胞であるリンパ球及びマクロファージから分泌される生理活性物質によって調節、制御されていることが知られているが、かたや、食品成分中にも宿主免疫系を調節する物質の存在が知られている。その中には、食品蛋白質を酵素分解したペプチドとして、ヒトカゼイン由来Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、ウシカゼイン由来Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ、ヒトβカゼイン由来Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒのものが知られておりいずれもマクロファージの活性を上昇させることが見出されている〔非特許文献２，３〕。これらを例にとるまでもなく、生体内に摂取された食品成分はそのままの形かあるいは分解された形で免疫応答系細胞と接する。このような食品成分と免疫応答系細胞との相互作用は、これまで知られているところでは、たとえば免疫系の異常状態である食品アレルギーを引き起こす場合があり、免疫系の賦活あるいは抑制という形となって観察されている。免疫応答系を調節する本来の生体内物質としてインターロイキンをはじめとするサイトカイニンと呼ばれる一群のポリペプチドであり、その機能及び構造について多くの情報が集積しつつある中で、発明者らは多くの免疫賦活ペプチド及びフコイダン等［特許文献１，２，３，４］を報告してきた。一方、小麦グルテンの加水分解物は、乳化性や起泡性をもつことから、以前から物性改良剤として利用されてきたが、小麦グルテン由来の生理活性ペプチドが、食品素材及び健康補助食品としての免疫調節機能を持つとの報告は少なく、発明者らの抗酸化ペプチド  Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ  及びＬｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ［非特許文献４］以外に、未だ医薬品としての開発が進んでいるとの報告はない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】本発明者は、小麦グルテンの蛋白質分解酵素の分解液から薬理作用を有する物質を検索し、新規な３種類のペプチドが強い免疫賦活作用を有することを見出した。そして、これら３種類のペプチドを医薬として実用化するための研究を鋭意行った。その結果、これら３種類のペプチドが、免疫賦活作用を有し、天然物由来の免疫賦活剤としての有用性を見出した。本発明は係る知見に基づくものである。本発明に係る新規なペプチドは、次式（１）、（２）及び（３）、
（１）Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
（２）Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
（３）Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表わされる新規なヘクサペプチド及びヘプタペプチドであり、常温における性状は白色の粉末である。【０００５】前記のヘクサペプチド及びヘプタペプチドは、化学的に合成する方法又は小麦グルテンの蛋白質分解酵素の分解液から分離精製する方法を挙げることができる。本発明に係る新規なこれらペプチドを化学的に合成する場合には、液相法または固相法等の通常のペプチド合成法によってポリマー性の固相支持体へペプチドのＣ末端（カルボキシル末端側）からそのアミノ酸残基に対応したＬ体のアミノ酸を順次ペプチド結合によって結合していくのがよい。そして、そのようにして得られた合成ペプチドは、トリフルオロメタンスルホン酸、フッ化水素等を用いてポリマー性の固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基を除去し、逆相系のカラムを用いた通常の方法で精製することができる。【０００６】上記したように、本発明に係る新規なヘクサペプチド及びヘプタペプチドは、小麦グルテンの蛋白質分解酵素の分解液から分離精製することができるが、その場合には、例えば、以下のようにして行うことができる。上記の新規なこれらペプチドを含有している小麦グルテン部分を取り出し加水分解する。加水分解は常法に従って行う。例えば、蛋白質分解酵素（例えば、ペプシン、モルシン、アクチナーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ等）で加水分解する場合は、小麦グルテンを必要とあれば更に加水分解した後、酵素の至適温度まで加温し、ｐＨを至適値に調整し、酵素を加えてインキュベートする。次いで必要に応じ中和した後、酵素を失活させて加水分解液を得る。その加水分解液を濾紙及び／又はセライト等を用いて濾過することによって不溶性成分を除去し、得られた濾液をセロファン等の半透膜を用いて適当な溶媒（例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液の中性の緩衝液等）中で充分に透析し、その濾液中の成分で半透膜を通過した成分を含む溶液を強酸性陽イオン交換樹脂（例えば、ダウケミカル社製のＤｏｗｅｘ５０Ｗ等）にかけ、その吸着画分から免疫賦活活性を有する成分を含有する画分を得、得られた免疫賦活活性画分を陽イオン交換ゲル濾過（例えば、ファルマシア社製のＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５等）によって分画し、得られた免疫賦活性画分を更に逆相ＨＰＬＣによって分画する。【０００７】本発明に係る新規なヘクサペプチド及びヘプタペプチドは、静脈内への繰り返し投与を行った場合、抗体産生を惹起せず、アナフィラキシーショックを起こさない。又、これらペプチドはＬ−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体内のプロテアーゼにより徐々に分解される為、毒性は極めて低く安全性は極めて高い（ＬＤ５０＞５０００ｍｇ／ｋｇ：ラット経口投与）。これらペプチドは、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等に調製することができる。投与法としては、通常は、免疫力が低下している哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射すること、あるいは経口投与することがあげられる。投与量は、例えば、動物体重１ｋｇ当たりペプチド０．０１−１０ｍｇの量である。投与回数は、通常、１日１回から４回程度であるが、投与経路によって、適宜、調製することができる。上記の各種製剤において用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等の種類は、特に限定されず、通常の注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤あるいはカプセル剤に用いられるものを使用することができる。【０００８】錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤に用いる添加剤としては、下記のものをあげることができる。賦形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール等の糖アルコール類、でんぷん類、無水リン酸カルシウム等；結合剤としては、でんぷん類、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等；崩壊剤としては、カルボキシメチルセルロース及びそのカリウム塩類；滑沢剤としては、ステアリン酸及びその塩類、タルク、ワックス類をあげることができる。又、製剤の調製にあたっては、必要に応じメントール、クエン酸及びその塩類、香料等の矯臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、常法により、本発明に係る新規なヘクサペプチド及びヘプタペプチドを、注射用水、生理食塩液及びキシリトールやマンニトールなどの糖アルコール注射液、プロピレングリコールやポリエチレングリコール等のグリコールに溶解又は懸濁させて注射剤とすることができる。この際、緩衝液、防腐剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加することができる。これらペプチドを含有する製剤は凍結乾燥品又は乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解剤、例えば水又は生理食塩液にて溶解して用いることもできる。
【発明の効果】
【０００９】本発明に係る新規なヘクサペプチド及びヘプタペプチドは優れた免疫賦活作用を有し、これら免疫賦活ペプチドは、マクロファージ（ＡＭ）貪食能、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性、及びマイトジェン活性（幼若化能）を示した。
【発明を実施するための最良の形態・実施例】
【００１０】本発明は、医薬品としての有用性を有する下記のアミノ酸の配列のペプチド構造を有するペプチド及びこれらペプチドを有効成分とする免疫賦活剤に関する。
（１）Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
（２）Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
（３）Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
（式中、アミノ酸残基を表わす各記号は、アミノ酸化学において慣用の表示法によるものである）
以下に実施例として、製造例及び試験例を記載し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１１】製造例１
小麦グルテン１０ｇに脱イオン水１０００ｍＬを加えてホモジナイズした。この小麦グルテンのホモジネイトにペプシン０．３ｇを加え、ｐＨ２．０に調整して、３７℃で２０時間インキュベートした。このようにして調製した小麦グルテンのペプシン分解液をＤｉａｆｌｏｗ膜（アミコン社製、ＹＭ−１０型膜、分画分子量１万）を用いて限外濾過した。得られた濾過液をＤｏｗｅｘ５０Ｗ×４（Ｈ＋）を充填したカラム（カラムサイズ；４．５×２０ｃｍ）を用いてクロマトグラフィーした。脱イオン水で十分水洗した後、２規定のアンモニア水５００ｍＬで溶出し溶出液を減圧濃縮した。この濃縮液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を充填したカラム（カラムサイズ；２．６×１４０ｃｍ）を用いてクロマトグラフィーした。その際のクロマトグラフィーの条件は、流速６０ｍＬ／ｈ、各画分７．２ｍＬで行った。ペプチド画分として分画番号２３から６０を集めて濃縮した。その結果を図１に示した。更に、この濃縮液をＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５（Ｈ＋）を充填したカラム（カラムサイズ；２×５０ｃｍ）を用いてクロマトグラフィーした。脱イオン水１Ｌから３％食塩水１Ｌでの濃度勾配法による溶出を、流速６０ｍＬ／ｈ、各画分７．２ｍＬのクロマトグラフィー条件で行った。各ペプチド画分としてＷＰ−１画分（分画番号１６〜３３）、ＷＰ−２画分（分画番号３４〜５３）及びＷＰ−３画分（分画番号５４〜８０）を分画し集めて減圧濃縮、凍結乾燥して、各ペプチド粉末（ＷＰ画分）を得た。その結果を図２に示した。このようにして分画したペプチド画分（ＷＰ画分）の中で、免疫賦活活性の高かったＷＰ−３画分の精製ペプチド粉末７ｍｇを脱イオン水２５μＬに溶解した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。ＨＰＬＣ条件は、カラムとして野村化学社製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−５（φ４．６ｍｍ  ＩＤ×２５ｃｍ  Ｌ）を使用し、移動相として０．０５％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略記する）から２５％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡでの濃度勾配法により、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長２２０ｎｍでクロマトグラフィー処理し、溶出時間３６分（１）、溶出時間５７分（２）及び溶出時間９３分に強い免疫賦活活性を有するペプチドフラグメントを得た。その結果を図３に示した。
このようにして得られた免疫賦活ペプチドのアミノ酸配列は、アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のプロテインシークエンサー４７７Ａ型を用いて決定された。その結果、次式（１）、（２）及び（３）、
（１）Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
（２）Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
（３）Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表わされる新規なヘクサペプチド及びヘプタペプチドであることが確認された。常温における性状は白色の粉末である。尚、本発明に係る新規なヘクサペプチド及びヘプタペプチドを免疫賦活剤として、例えば錠剤に製剤する場合には、常法に従って、例えば次のように処理すればよい：（１）ペプチド１３ｇ、（２）乳糖８７ｇ、（３）コーンスターチ２９ｇ、（４）ステアリン酸マグネシウム１ｇを原料とし、先ず（１）、（２）及び１７ｇのコーンスターチを混和し、７ｇのコーンスターチから作ったペーストとともに顆粒化し、この顆粒に５ｇのコーンスターチと（４）とを加え、得られた混合物を圧縮錠剤機で打錠し、錠剤１０００個を製造する。
【００１２】製造例２
本例は、合成法による製造例である。
Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎの合成法
アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のペプチド合成装置４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ヘクサペプチドを合成した。固相担体としては、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂を使用した。先ず、当該ヘクサペプチドのアミノ酸配列に従って、常法どおり、そのＣ末端側のグルタミンからクロロメチル樹脂に反応させ、ペプチド結合樹脂を得た。このときのアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下、ｔ−Ｂｏｃと略記する）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸を使用した。次に、このペプチド結合樹脂をエタンジオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加え、更に１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドは蒸留水に溶解した後、逆相系のカラムＣ１８（５μ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が２３分間で７６％−５２％の濃度勾配法により流速１．３ｍＬ／ｍｉｎでＨＰＬＣクロマトグラフィーした。紫外部波長２１６ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取、これを凍結乾燥することによって目的とする合成ヘクサペプチドを得た。
【００１３】この合成ヘクサペプチドをマススペクトルにより分析した結果、アミノ酸配列及びアミノ酸組成が前記で示したアミノ酸配列構造を有するヘクサペプチドであることが確認された。このマススペクトル及びアミノ酸分析の結果は表１に示す通りである。
Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ合成法
アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のペプチド合成装置４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ヘプタペプチドを合成した。固相担体としては、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂を使用した。先ず、当該ヘプタペプチドのアミノ酸配列に従って、常法どおり、そのＣ末端側のグルタミンからクロロメチル樹脂に反応させ、ペプチド結合樹脂を得た。このときのアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下、ｔ−Ｂｏｃと略記する）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸を使用した。次に、このペプチド結合樹脂をエタンジオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加え、更に１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドは蒸留水に溶解した後、逆相系のカラムＣ１８（５μ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が３４分間で９４％−７６％の濃度勾配法により流速１．４ｍＬ／ｍｉｎでＨＰＬＣクロマトグラフィーした。紫外部波長２１７ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とする合成ヘプタペプチドを得た。
【００１４】この合成ヘプタペプチドをマススペクトル及びアミノ酸分析により分析した結果、アミノ酸配列及びアミノ酸組成が前記で示したアミノ酸配列構造を有するヘプタペプチドであることが確認された。このマススペクトル及びアミノ酸分析の結果は表１に示す通りである。
Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ合成法
アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のペプチド合成装置４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ヘクサペプチドを合成した。固相担体としては、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂を使用した。先ず、当該ヘクサペプチドのアミノ酸配列に従って、常法どおり、そのＣ末端側のグルタミンからクロロメチル樹脂に反応させ、ペプチド結合樹脂を得た。このときのアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下、ｔ−Ｂｏｃと略記する）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸を使用した。次に、このペプチド結合樹脂をエタンジオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加え、更に１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドは蒸留水に溶解した後、逆相系のカラムＣ１８（５μ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が４５分間で８７％−６８％の濃度勾配法により流速１．５ｍＬ／ｍｉｎでＨＰＬＣクロマトグラフィーした。紫外部波長２１９ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とする合成ヘクサペプチドを得た。
この合成ヘクサペプチドをマススペクトル及びアミノ酸分析により分析した結果、アミノ酸配列及びアミノ酸組成が前記で示したアミノ酸配列構造を有するヘクサペプチドであることが確認された。このマススペクトル及びアミノ酸分析の結果は表１に示す通りである。
2005097223.tif 000002
上記の合成によって得られた本発明に係る新規なヘクサペプチド及びヘプタペプチドは、以下に示す試験によって、マクロファージ（ＡＭ）貪食能、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性、及びマイトジェン活性（幼若化能）等の免疫賦活作用が確認された。
【００１５】試験例１
（マクロファージ（ＡＭ）貪食能の測定）
肺胞マクロファージ（ＡＭ）の調製として、動物はネンブタール麻酔下で両腎動脈を切断して脱血後、開胸し、唾液腺及び結合組織を除去した後、気管を露出させたその後、翼静針付注入セットのチューブを用い、気管に挿入、留置し、３７℃に温めた生食水約４ｍＬにて肺を洗浄した。ラット１匹当たり５０ｍＬの洗浄液を得るまでこの操作を繰り返した。回収された洗浄液を１，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、培地にて適当に希釈後、血球計算盤でマクロファージ数を算定した。５％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ  １６４０培地にて２〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製後、各培養容器に１ｍＬずつ加えた。抗血清を用いてオプソニン化後、５１Ｃｒでラベルされた羊赤血球（ＳＲＢＣ）を肺胞マクロファージ（ＡＭ）と２時間、３７℃で培養することにより貪食を行わせた。肺胞マクロファージ（ＡＭ）に貪食されていない羊赤血球（ＳＲＢＣ）を蒸留水にて溶血、破壊後、除去した。その後、１規定のＮａＯＨを加え細胞を溶解後、γ−カウンターにて肺胞マクロファージ（ＡＭ）内に貪食された羊赤血球（ＳＲＢＣ）の放射活性を測定した。３種類の合成ペプチド（試料濃度；１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ）を用いて、肺胞マクロファージ（ＡＭ）のオプソニン化羊赤血球（ＳＲＢＣ）に対する貪食能をみた結果は図４に示すとおりである。
【００１６】試験例２
（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性の測定）
脾細胞の調製として、各ラットをネンブタール麻酔下で右腎動脈を切断して脱血後、無菌的に脾臓を摘出した。摘出された脾臓をＲＰＭＩ  １６４０培地を含むシャーレ内で、滅菌したステンレススチールのスクリーンに通すことにより、脾細胞を単離し、０．２％酢酸液で希釈後、細胞数を血球計算盤上で算定した。脾細胞（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）と５１Ｃｒでラベルした腫瘍細胞（Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ；ＹＡＣ−１）を標的細胞とし、エフェクター細胞と標的細胞の比をＥ：Ｔ＝１００：１の割合で、４時間、３７℃のＣＯ２インキュベータ内で培養後、上清を採取、γ−カウンターでその放射活性を測定し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性を算出した。３種類の合成ペプチド（試料濃度；１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ）を用いて、脾細胞のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性をみた結果は、図５に示すとおりである。
【００１７】試験例３
（脾細胞のマイトジェン活性の測定）
９６ウエルのマイクロプレートに脾細胞をウエル当たり１×１０５ｃｅｌｌｓの濃度で加え、更にＴ細胞マイトジェンであるフォトヘマトグルチニン（ＰＨＡ，２０μｇ／ｍＬ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、２０μｇ／ｍＬ）あるいはＢ細胞のマイトジェンである細菌リポポリサッカライド（ＬＰＳ、１００μｇ／ｍＬ）と３７°Ｃ、７２時間培養後、１．０μＣｉの３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを各ウエルに加えた。２４時間後、３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを取り込んだ脾細胞を自動細胞ハーベスターによってフィルター上に採取し、その放射活性を液体シンチレーションカウンターにより測定した。得られた結果は、培地のみと、培養した脾細胞の増殖能とを比較して刺激指数（ＳＩ）で表した。３種類の合成ペプチド（試料濃度；１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ）を用いて、脾細胞のマイトジェン（幼若化能）活性をみた結果は、図６〜８に示すとおりである。
【００１８】以上の試験の結果、本発明に係る新規なヘクサペプチド及びヘプタペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて有意に免疫機能に影響を及ぼすことが確認され、免疫賦活剤として有用である。尚、本発明に係る新規なヘクサペプチド及びヘプタペプチドは、構造的にそのアミノ酸配列を部分構造とするペプチドにおいて、構造中に採用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る３種のペプチドに関する、製造例１におけるＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムクロマトグラフィーによる、免疫賦活ペプチドの分離精製の結果を示す図である。
【図２】本発明に係る３種のペプチドに関する、製造例１におけるＳＰ  ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５カラムクロマトグラフィーによる、免疫賦活ペプチドの分離精製の結果を示す図である。
【図３】本発明に係る３種のペプチドに関する、製造例１における逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による、免疫賦活ペプチドの分離精製の結果を示す図である。
【図４】本発明に係る３種のペプチドに関する、製造例２で得られた合成ペプチド（試料濃度；１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ）の、肺胞マクロファージ（ＡＭ）貪食能を示す図である。
【図５】本発明に係る３種のペプチドに関する、製造例２で得られた合成ペプチド（試料濃度；１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ）の、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性を示す図である。
【図６】本発明に係る３種のペプチドに関する、製造例２で得られた合成ペプチド（試料濃度；１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ）の、フォトヘマトグルチニン（ＰＨＡ，２０μｇ／ｍＬ）に対するマイトジェン活性（幼若化能）を示す図である。
【図７】本発明に係る３種のペプチドに関する、製造例２で得られた合成ペプチド（試料濃度；１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ）の、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、２０μｇ／ｍＬ）に対するマイトジェン活性（幼若化能）を示す図である。
【図８】本発明に係る３種のペプチドに関する、製造例２で得られた合成ペプチド（試料濃度；１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ）の、細菌リポポリサッカライド（ＬＰＳ、１００μｇ／ｍＬ）に対するマイトジェン活性（幼若化能）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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