(57)【要約】【課題】本発明はオーロラタンパク質の発現又は過剰発現により特徴付けられる疾患、特に癌の治療に使用を提供することを目的とする。【解決手段】本発明により、オーロラタンパクＣの新規選択的スプライスバリアントポリペプチド、そのコード化核酸、及び該ポリペプチドの変異体、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体が提供される。また、本発明により、該ポリペプチドの変異体、該ポリペプチドの変異体の発現ベクター、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含有する医薬組成物が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含むポリペプチド又はその塩。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２で示される配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＩＮＣＥＮＰポリペプチド（配列番号７）との結合活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
ヒストンＨ３をリン酸化することができない請求項１に記載のポリペプチド
【請求項３】
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの相補鎖。
【請求項５】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＩＮＣＥＮＰポリペプチド（配列番号７）との結合活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドの相補鎖
【請求項６】
請求項４又は５に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物から請求項１乃至３のいずれか１項に記載のポリペプチド又はその塩を取得することを特徴とする該ポリペプチド又はその塩の製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法によって製造される組換えタンパク質又はその塩。
【請求項１０】
請求項１、２、３又は９に記載のポリペプチド又はタンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の抗体を有効成分として含有する、オーロラＣの発現又は過剰発現により特徴付けられる疾患の治療用医薬組成物。
【請求項１２】
請求項２又は３に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、オーロラタンパク質の発現又は過剰発現により特徴付けられる疾患の治療用医薬組成物。
【請求項１３】
請求項２又は３に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換ベクターを有効成分として含有する、オーロラタンパク質の発現又は過剰発現により特徴付けられる疾患の治療用医薬組成物。
【請求項１４】
前記疾患が、悪性腫瘍（癌）である請求項１１乃至１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記悪性腫瘍が、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、脳腫瘍、咽頭癌、喉頭癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎盂・尿管癌、腎細胞癌、精巣（睾丸）腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、乳癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、悪性黒色腫、菌状息肉症、皮膚癌、軟部肉腫、悪性リンパ腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、慢性骨髄増殖性疾患及び膵内分泌腫瘍からなる群から選択されるものである請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトオーロラＣの選択的スプライシング変異体（以下、オーロラＣ＿ＡＳＶと記載する）ポリペプチドペプチド及び該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
また、本発明は新規オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド、該ポリペプチドをコードするベクター、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体、及びこれらを有効成分として含有する医薬組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
オーロラ（Aurora）キナーゼファミリーは、酵母からヒトに至るまでそのアミノ酸配列が保存されている細胞周期依存的なセリン−スレオニンキナーゼである。出芽酵母ではＩｐｌ１ｐ、分裂酵母ではＡｒｋ１のそれぞれ１種類が存在し、ショウジョウバエではａｕｒｏｒａとＩＡＬ、線虫ではＡＩＲ−１とＡＩＲ−２の各２種類が存在することが知られている。一方、哺乳動物では、オーロラＡ（オーロラ２ともいう）、オーロラＢ（オーロラ１ともいう）及びオーロラＣ（オーロラ３ともいう）の少なくとも３種類のアイソフォームが存在する（２，５，６）。
【０００３】
ヒトオーロラＡは、ヒトの乳癌において高頻度に遺伝子増幅が起こっている第２０番染色体の長腕１３の領域に存在する遺伝子として同定された（Senら, 1997）。ヒトオーロラＡ遺伝子の増幅とｍＲＮＡの発現上昇は乳癌以外にも大腸癌等の他の細胞株でも確認されている。さらに、繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３やＲａｔ−１においてオーロラＡのｍＲＮＡを過剰発現させるとこれらの細胞が癌細胞としての特徴を示すようにトランスフォームすることから、オーロラＡは癌遺伝子として位置付けられている（例えば、非特許文献２参照）。オーロラＡ蛋白質の発現量を細胞周期の点から見た場合、オーロラＡ蛋白質の発現量はＧ２／Ｍ期に上昇し、Ｇ１期になると急速に分解される（例えば、非特許文献２参照）。それに伴い、オーロラＡのキナーゼ活性もまたＧ２／Ｍ期に上昇し、Ｇ１期になると急速に低下する。オーロラＡ蛋白質はそのＮ末端領域にＫＥＮボックスとＣ末端領域に破壊ボックス（destruction box）の２つのユビキチン依存的な蛋白質分解ドメインを保有していることから、オーロラＡ蛋白質の分解はユビキチン化分解によるものと考えられる。実際、オーロラＡがＧ１期以降にＡＰＣ／Ｆｉｚｚｙ−ｒｅｌａｔｅｄ（Ｃｄｈ１）複合体によりユビキチン化分解を受けることが報告されている（Hondaら, 2000；Taguchiら, 2002）。
【０００４】
ヒトオーロラＢは腫瘍において過剰発現されるキナーゼとして同定された（非特許文献１）因子で、細胞分裂期の数多くのプロセスにおいて必要とされる染色体パッセンジャータンパク質である。オーロラＢの発現およびそのキナーゼ活性は細胞周期に依存して制御されており、発現のピークはＧ２／Ｍで、一方、キナーゼ活性は分裂期に最も高くなる（非特許文献１）。オーロラＢの不活性型を過剰発現すると、多くの細胞株において、細胞質分裂の最終段階が阻害されることが報告されている（Teradaら, 1998）。また、オーロラＢは、ヒストンＨ３をリン酸化することで、クロマチン凝縮を制御していると考えられているほか、染色体の構造の構築などにも関与することが予想されているが（非特許文献２）、その詳細は明らかにされていない。
【０００５】
オーロラＣに関しては、現在までのところ、その機能等に関しほとんど解明が進んでいない。オーロラＣは、哺乳動物においてのみ見出されており、特に、精巣において高いレベルで発現し、その発現レベルは、ある種の癌細胞株において上昇が認められている（非特許文献１〜３を参照のこと）。従って、細胞周期の進行、特に、細胞分裂期において重要な役割を担っていると考えられるオーロラＣの正常な機能性が失われることにより、重篤な癌へと細胞が変貌していく可能性が示唆されている。
従って、オーロラＣの活性を特異的に抑制する物質、例えば、オーロラＣに特異的に抗体、又は、活性型のオーロラＣと競合するドミナントネガティブな変異体などは、オーロラＣの過剰発現に起因する癌の抗癌剤としての用途に使用可能であると考えられる。しかしながら、現在のところ、オーロラＣの細胞内における作用機序がほとんど明らかにされていないことから、有効なオーロラＣの阻害剤の取得が困難となっているのが現状である。
【非特許文献１】Ｋｉｍｕｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７４：７３３４−７３４０，１９９９
【非特許文献２】Ｂｅｒｎａｒｄら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５３：４０６−４０９，１９９８
【非特許文献３】Ｔｓｅｎｇら，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７：８２３−８３３，  １９９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、ヒトオーロラＣの新規選択的スプライスバリアント（オーロラＣ＿ＡＳＶ）ポリペプチド及び該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
また、本発明は、新規オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド、該ポリペプチドをコードポリヌクレオチドを含有するベクター、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクター、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を有効成分として含有し、オーロラＣの発現又は過剰発現により特徴付けられる疾患、特に癌の治療に使用することができる医薬組成物等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、オーロラＣがオーロラＢ及びＩＮＣＥＮＰと複合体を形成することを見出し、さらに、ＩＮＣＥＮＰがオーロラＣのヒストンＨ３リン酸化活性を活性化することを明らかにして、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１５）である。
（１）本発明の第１の実施態様に係る発明は、「以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含むポリペプチド又はその塩。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２で示される配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＩＮＣＥＮＰポリペプチド（配列番号７）との結合活性を有するポリペプチド。」である。
ここで、「ＩＮＣＥＮＰポリペプチド」とは、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号７で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、オーロラＢタンパク質（配列番号６）と結合する活性を持つポリペプチドのことである。
（２）本発明の第２の実施態様に係る発明は、「ヒストンＨ３をリン酸化することができない上記（１）に記載のポリペプチド。」である。本ポリペプチドはオーロラＢポリペプチドと結合することができるにもかかわらず、不活性型であるため、本ペプチドが活性型のポリペプチドとオーロラＢポリペプチドと結合に関し競合することで、活性型の活性を抑制し、活性型が関連する疾患等の治療に有効に作用する。
（３）本発明の第３の実施態様は、「配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む上記（２）に記載のポリペプチド。」である。
（４）本発明の第４の実施態様は、  「上記（１）乃至（３）のいずれか１に記載のポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの相補鎖。」である。
（５）本発明の第５の実施態様は、  「以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＩＮＣＥＮＰポリペプチド（配列番号７）との結合活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドの相補鎖。」である。
（６）本発明の第６の実施態様は、「上記（４）又は（５）に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。」である。
（７）本発明の第７の実施態様は、「上記（６）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。」である。
（８）本発明の第８の実施態様は、「上記（７）に記載の形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物から上記（１）乃至（３）のいずれか１に記載のポリペプチド又はその塩を取得することを特徴とする該ポリペプチド又はその塩の製造方法。」である。
（９）本発明の第９の実施態様は、「上記（８）に記載の方法によって製造される組換えタンパク質又はその塩。」である。
（１０）本発明の第１０の実施態様は、「上記（１）、（２）、（３）又は（９）に記載のポリペプチド又はタンパク質に特異的に結合する抗体。」である。本抗体はオーロラＣの活性を抑制することで、オーロラタンパク質が関連する疾患等の治療に有効に作用するものである。本抗体はポリペプチドクローナル抗体でも、モノクローナル抗体でもよく、また、ヒト抗体又はヒト化抗体が好ましい。また、本抗体はオーロラＣのキナーゼ活性を抑制するものであれば使用可能であり、例えば、ＩＮＣＥＮＰポリペプチドとの結合領域に結合しＩＮＣＥＮＰポリペプチドとの結合を阻害する抗体、オーロラＣのキナーゼ領域（例えば、６９番目のリジンを含む領域など）に対する抗体などであってもよい。
（１１）本発明の第１１の実施態様は、「上記（１０）に記載の抗体を有効成分として含有する、オーロラＣの発現又は過剰発現により特徴付けられる疾患の治療用医薬組成物。」である。
（１２）本発明の第１２の実施態様は、「上記（２）又は上記（３）に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、オーロラタンパク質の発現又は過剰発現により特徴付けられる疾患の治療用医薬組成物。」である。
（１３）本発明の第１３の実施態様は、「上記（２）又は（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換ベクターを有効成分として含有する、オーロラタンパク質の発現又は過剰発現により特徴付けられる疾患の治療用医薬組成物。」である。
（１４）本発明の第１４の実施態様は、「前記疾患が、悪性腫瘍（癌）である上記（１１）乃至（１３）のいずれか１に記載の医薬組成物。」である。
（１５）本発明の第１５の実施態様は、「前記悪性腫瘍が、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、脳腫瘍、咽頭癌、喉頭癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎盂・尿管癌、腎細胞癌、精巣（睾丸）腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、乳癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、悪性黒色腫、菌状息肉症、皮膚癌、軟部肉腫、悪性リンパ腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、慢性骨髄増殖性疾患及び膵内分泌腫瘍からなる群から選択されるものである上記（１４）に記載の医薬組成物。」である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により提供される医薬組成物を用いることにより、オーロラＣの過剰発現により発症する癌の予防および治療において、効果が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明における「オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド」とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒストンＨ３のリン酸化活性を有するポリペプチドのことである。さらに、これらのポリペプチドの部分ペプチド、断片も本発明の「オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド」に含まれる。なお、本明細書中においては、特に断らない限り、「ポリペプチド」と「タンパク質」を同義に用いることとする。
ここでは、当該ポリペプチドの取得方法、該ポリペプチドの組換体の調製方法、該ポリペプチド中オーロラＢの活性化を特異的に阻害する部分の同定方法、該ポリペプチドおよびその部分を含んでなるオーロラＢの活性化を阻害する医薬的組成物の調製方法等について順を追って説明していく。
【００１１】
１．新規オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチドをコードする遺伝子のクローニング
本発明におけるオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチドをコードする遺伝子は、公知のオーロラＣの配列情報に基づいて作製されたＰＣＲプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー等からクローニングすることができる。
ＰＣＲプライマーの設計は、primer3
（Whitehead
Institute for Biomedical Research.）等のプライマー設計ソフトを用いて行うことができる。また、ＰＣＲプライマー合成は、標準的な合成技術、例えば、自動ＤＮＡ合成装置などを用いて行うことができるが、商業的に入手してもよい。ＰＣＲ反応によって増幅が予想される増幅産物の長さは、増幅効率およびその後のアガロースゲルによる分離能および塩基配列解析が容易であるような長さが好ましく、例えば、８０〜２００塩基になるようにデザインするのがよい。作成したＰＣＲプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリー等を鋳型にしてＰＣＲ反応を行い、増幅産物が目的の産物であることを、配列決定を行うなどして確認する。
【００１２】
ここで用いられる、ｃＤＮＡライブラリーはヒトを含むあらゆる動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ウシ、サル、ヒツジ、イヌ、ネコなど）の細胞、限定はしないが、例えば、免疫系細胞、血球系細胞、線維芽細胞、脾細胞、肝細胞、骨髄細胞、すい臓細胞、ランゲルハンス細胞、上皮細胞、筋細胞、神経細胞、グリア細胞、脂肪細胞、若しくはこれらの株化細胞、若しくはこれらの前駆細胞などから調製したものでもよく、又は、あらゆる動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ウシ、サル、ヒツジ、イヌ、ネコなど）の組織、限定はしないが、例えば、脳、脊髄、下垂体、胸腺、抹消血、脾臓、リンパ組織、下垂体、胃、すい臓、腎臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などから調製したものでもよい。ｃＤＮＡライブラリーの調製は、当該技術分野における通常の技術を用いて行うことができる（例えば、Sambrookら, 1989などを参照のこと）。
【００１３】
２．本発明のオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド
本発明のオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチドは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド」とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓癌細胞中に存在するポリペプチドのことである。
【００１４】
配列番号２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドとしては、配列番号２で表わされるアミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号２で表わされるアミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ならびに配列番号２で表わされるアミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含む、ポリペプチドが含まれる。上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチドをコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって、改変することによって行うことができる。例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット（例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｇ（TAKARA社）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（TAKARA社））等を使用し、Ｇｕｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法によって、塩基の置換を行うことによって達成することができる。
【００１５】
また、本発明のオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド及びその部分ペプチドのＣ末端は、通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）又はカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、当該カルボキシル基は、アミド（−ＣＯＮＨ２）やエステル（−ＣＯＯＲ）等に化学修飾されていてもよい。ここで、エステル中のＲとしては、Ｃ１−６アルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル）、Ｃ３−８シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル）、Ｃ１−６アリール基（例えば、フェニル、α−ナフチル）、フェニル−Ｃ１−２アルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル）、α−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基（例えば、α−ナフチルメチル）等が挙げられる。その他、経口用エステルとして汎用されているピバロイルオキシメチルエステルとすることも可能である。本発明のオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチドがＣ末端以外にもそのポリペプチド鎖中にカルボキシル基を有する場合には、当該カルボキシル基がアミド化又はエステル化されているものも、本発明のポリペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては上記の各エステルが挙げられる。同様に、本発明の新規オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチドのＮ末端は、通常アミノ基（−ＮＨ２）であるが、当該アミノ基は、ホルミル基、アセチル基等のＣ１−６アシル基等で化学修飾されていてもよい。その他、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したものや、分子内のアミノ酸側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な官能基（例えば、ホルミル基、アセチル等）で化学修飾されているものや糖鎖の結合しているものも本発明のポリペプチドに含まれる。
【００１６】
上記いずれかのオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド中の部分アミノ酸配列を含むペプチド（部分ペプチドともいう）も本発明の範囲に含まれる。すなわち、本発明の部分ペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一なアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を含むものである限り、いずれのものであってもよい。
【００１７】
本発明のオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドは、必要に応じて塩の形態、好ましくは生理学的に許容される酸付加塩の形態で提供され得る。そのような塩としては、無機酸、限定はしないが、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの塩、有機酸、限定はしないが、例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの塩等が挙げられる。また、無機塩基、限定はしないが、例えば、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属などとの塩、有機塩基、限定はしないが、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンなどとの塩が挙げられる。
本発明のオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその塩は、本発明の新規オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチドを発現しているヒトや動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ウシ、サル、ヒツジ、イヌ、ネコなど）の培養細胞又は組織から、当該分野における通常の技術により抽出・分離することができ、あるいは後述のように本発明の新規オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体を培養することにより、該培養物から抽出・分離することによっても製造することができる。ヒトや動物の組織又は細胞から製造する場合、ヒトや動物の組織又は細胞をホモジナイズ後、酸等で抽出を行い、得られた抽出液を疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーを組み合わせることにより単離精製することができる。
【００１８】
また、本発明の部分ペプチド又はその塩は、公知のペプチド合成法又は前記オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチドを適当なペプチダーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ）で切断することによって製造することができる。ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。すなわち、本発明の新規オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる（例えば、Bodanszkyら, 1996；Schroederら, 1965を参照のこと）。合成反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを単離精製することができる。
上記の方法で得られる新規オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができる、塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００１９】
３．本発明のオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明のオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、上記２のオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドをコードする塩基配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はその相補鎖を含有するものであれば如何なるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチドをコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡが挙げられ、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッドでもよい。
本発明のオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前述のｃＤＮＡライブラリーから調製したもの、あるいは合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、所望の細胞又は組織から調製した全ＲＮＡ又はｍＲＮＡ画分を用いて直接、ＲＴ−ＰＣＲ法（Reverse Transcriptase Polymerase
Chain Reaction）によって増幅することもできる。具体的には、本発明の新規オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられるが、これらのいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明のオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチドと実質的に同質の活性を有するオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであればいずれのものであってもよい。
【００２０】
配列番号１で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、配列番号１で表わされる塩基配列と好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％最も好ましくは約９９％のポリヌクレオチド配列相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ等が挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、核酸ハイブリダイゼーション及びクローニングに関する技術分野において周知の技術常識により決定され（例えば、Sambrook等, 1989などを参照のこと）、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な条件である。例えば、ナトリウム濃度が約２０〜４０ｍＭ、好ましくは約２０〜２５ｍＭ、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件などである。
本発明の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、上述の本発明の部分ペプチドをコードする核酸配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前述の細胞又は組織由来のｃＤＮＡ、前述の細胞又は組織由来のｃＤＮＡライブラリーより、当該技術分野において公知の方法により単離されたもの、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
【００２１】
４．組換えベクター及び形質転換体の作製
（１）組換えベクターの作製
本発明を行なうにあたり使用される組換えベクターは、適当なベクターに本発明のオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分をコードするＤＮＡを連結することにより得ることができる。本発明のオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分をコードするＤＮＡ配列を挿入するためのベクターは、クローニング用に供される場合には、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。また、本発明のオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分を発現するためのベクターとしては、宿主中で複製可能なものであって、該ポリペプチド又はその部分をコードするＤＮＡ断片を発現させることができるプロモーターを有するものが使用可能である。
使用可能なベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＣＢＤ−Ｃ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、ＹＩｐ３０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルス、トガウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００２２】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば特に限定されない。
例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター等が挙げられる。
宿主が大腸菌である場合には、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター等が、宿主が枯草菌である場合には、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が挙げられる。
宿主が酵母である場合には、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が挙げられる。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００２３】
本発明に使用される組換えベクターには新規オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分のコード配列、プロモーター以外にも、エンハンサー、選択マーカー、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ｏｒｉ）などを連結することができる。
選択マーカーとしては、限定はしないが、ハイグロマイシン耐性マーカー（Ｈｙｇｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，  Ｇ４１８）などが利用可能である。
また、組換えタンパク質の単離・精製を容易にするなどの目的で、本発明のオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分のＮ末端側に適当なシグナル配列を付加してもよい。
宿主が大腸菌である場合にはアルカリホスファターゼシグナル、ＯｍｐＡシグナルなどが利用可能であり、宿主が枯草菌である場合にはα−アミラーゼシグナル配列、ズブチリスシグナル配列などが利用可能であり、宿主が酵母である場合には、α因子シグナル配列、インベルターゼシグナル配列などが利用可能であり、宿主が動物細胞である場合には、例えば、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などが利用可能である。
【００２４】
上述のベクターに対して本発明の新規オーロラＣ＿ＡＳＶ遺伝子又はその断片を挿入するには、上記１においてクローニングされた新規オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチドをコードするＤＮＡ又はその断片をそのまま、又は所望により制限酵素で消化して、リンカーを付加し、ベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより行うことができる。連結するＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。連結するＤＮＡは、当該ＤＮＡ中にコードされている本発明の新規オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分が宿主細胞中で発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。
以上の方法により、本発明のオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むベクターを構築することができる。
【００２５】
（２）形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換え発現ベクターを、目的遺伝子又はその断片を発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の酵母、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、ヒトＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等の動物細胞、あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞が挙げられる。
【００２６】
大腸菌への組換えベクターの導入方法としては、カルシウムイオンを用いる方法（Cohenら, 1972）、エレクトロポレーション法（Shigekawa及びDower, 1988）等が利用可能である。酵母への組換えベクターの導入方法としては、エレクトロポレーション法（Beckerら, 1990）、スフェロプラスト法（Hinnenら, 1978）、酢酸リチウム法（Itohら,
1983）等が利用可能である。動物細胞又は動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Chen及びOkayama,
1988）、カチオン性脂質による方法（Elroy-Stein及びMoss, 1990）等が挙げられる。
以上のようにして、本発明のオーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドをコードＤＮＡが挿入された発現ベクターを含む形質転換体を得ることができる。
【００２７】
５．本発明の新規オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドの製造
本発明の新規オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドは、上記４において得られる形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより製造することができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００２８】
培養は、宿主細胞に適した条件下で行う。
例えば、大腸菌を培養する際の培地としては、ＬＢ培地、Ｍ９培地等が好ましい。所望によりプロモーターを効率よく働かせるために、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。大腸菌の場合、培養は通常約１５〜３７℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主が枯草菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
酵母培養するための培地としては、ＳＤ培地、ＹＰＤ培地があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞又は昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、ウシ血清を含むグレース昆虫培地等が挙げられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。  
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地等が用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体の細胞膜等に本発明の新規オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドを生成させることができる。上記培養物から本発明の新規オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
【００２９】
本発明の新規オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により新規オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に新規オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清又は抽出液中に含まれる新規オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３０】
６．抗オーロラＣ＿ＡＳＶ抗体
本発明には係、オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチドと特異的に結合する抗オーロラＣ＿ＡＳＶ抗体も含まれる。
本発明において使用される「抗体」には、オーロラＣ＿ＡＳＶに対するモノエピトープ特異的抗オーロラＣ＿ＡＳＶ抗体、ポリエピトープ特異的抗オーロラＣ＿ＡＳＶ抗体、単一鎖抗体、及びこれらの断片が含まれる。これらの抗体には、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化又はヒト抗体などが含まれる。特に、ヒト化又はヒト抗体は、制癌化合物をコンジュゲートして、オーロラＣポリペプチドを過剰発現しているような標的癌病巣に該制癌化合物を送達する場合、又はオーロラＣのキナーゼ活性領域若しくはＩＮＣＥＮＰポリペプチドとの結合領域を特異的に標的するために使用する場合に好ましい。
（１）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、例えば、哺乳類宿主動物に対して、免疫原及びアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、免疫原及び／又はアジュバントを宿主動物の皮下又は腹腔内へ複数回インジェクトする。免疫原にはオーロラＣ＿ＡＳＶ及びその異種ポリペプチドとの融合体又はこれらの断片が含まれる。アジュバントの例には、完全フロイト及びモノホスホリル脂質Ａ合成−トレハロースジコリノミコレオート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）が含まれる。免疫応答を増強するために、免疫原は、キーホールインペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシチログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターなどの免疫原性を有するタンパク質に結合させたのち、インジェクトしてもよい。
免疫後、免疫動物から試験的に採取した抗血清を用いて力価をモニターしながら、所望の力価を示した段階で抗血清の採取を開始する。採取した抗血清から、定法に従って、目的の抗体を精製することができる。
あるいは、ＩｇＹ分子を産生するニワトリを用いて調製してもよい（Schadeら,
1996）。
抗体産生方法の詳細は、例えば、Ausubelら, 1987又はHarlow及びLane, 1988を参照のこと。
【００３１】
（２）モノクローナル抗体
抗オーロラＣ＿ＡＳＶモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を用いて調製される（Milstein及びCuello, 1983）。
この方法には以下に示す４つの工程が含まれる：（ｉ）宿主動物又は、宿主動物由来のリンパ球を免疫する、（ｉｉ）モノクローナル抗体分泌性（又は潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、（ｉｉｉ）リンパ球を不死化細胞に融合させる、（ｉｖ）所望のモノクローナル抗体（抗オーロラＣ＿ＡＳＶ）を分泌する細胞を選択する。
マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又は他の適当な宿主動物が、免疫動物として選択され免疫原がインジェクトされる。あるいは、免疫動物から取得したリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化してもよい。ヒト細胞が望ましい場合には、末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）が一般に使用される。しかしながら、他の哺乳類由来の脾臓細胞又はリンパ球がより一般的で好ましい。免疫原は典型的にはオーロラＣ＿ＡＳＶ及びその異種ポリペプチドとの融合体又はこれらの断片が含まれる。
免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて不死化細胞株と融合される（Goding, 1996）。トランスフォーメーションによって不死化された齧歯類、ウシ、又はヒトのミエローマ細胞が使用されるか、ラットもしくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球及び不死化細胞株の成長又は生存を阻害する一又は複数の基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンがＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（ＨＡＴ培地）に添加される。
【００３２】
モノクローナル抗体の調製にあたり、好ましい不死化細胞株はマウスミエローマ株で、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Manassas, VA）より入手可能である。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株による、ヒトモノクローナル抗体産生に関しては、Kozborら, 1984；Schook, 1987を参照のこと。
ハイブリドーマ細胞は細胞外に抗体を分泌するため、オーロラＣ＿ＡＳＶに対するモノクローナル抗体の産生の有無を培養液を用いて確認することができる。産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫沈降又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合アッセイにより評価することができる（Harlow及びLane, 1988；Harlow及びLane, 1999）。
抗オーロラＣ＿ＡＳＶモノクローナル抗体分泌性ハイブリドーマ細胞は、限界希釈法及びサブカルチャーにより単一クローンとして単離され得る（Goding, 1996）。適切な培地にはダルベッコ改変イーグル培地、ＲＰＭＩ−１６４０、場合によっては、タンパク質を含まない培地若しくは無血清培地などが含まれる（例えば、Ｕｌｔｒａ  ＤＯＭＡ  ＰＦ  又はＨＬ−１；Biowhittaker, Walkersville, MD）。あるいは、イブリドーマ細胞は、適切な宿主動物の腹水中で増殖させてもよい。
【００３３】
モノクローナル抗体は、培地又は腹水からプロテインＡセファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、硫安沈殿又はアフィニティークロマトグラフィー（Harlow及びLane, 1988；Harlow及びLane, 1999）などの当業者にとって周知の方法によって単離及び精製される。
また、モノクローナル抗体は遺伝子組換え技術によっても作製することができる（米国特許第4166452号）。抗オーロラＣ＿ＡＳＶ抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株から目的のモノクローム抗体ポリペプチドをコードする遺伝子を同定するに、例えば、マウスの重鎖及び軽鎖抗体遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを用いてもよい。その結果、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子が取得された場合は、その遺伝子の配列を決定することにより目的の抗体遺伝子を同定することができる。単離されたＤＮＡ断片は、モノクローナル抗体を発現させるために、適当な発現ベクターの抗体遺伝子を導入し、該ベクターを他のＩｇタンパク質を生産しないｓｉｍｉａｎ  ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はミエローマ細胞などのホスト細胞中へトランスフェクトさせる。単離されたＤＮＡ断片は、例えば、ヒト重及び軽鎖定常ドメインに対するコード化配列を相同なマウス配列の代わりに置換することにより（米国特許第4816567号；Morrisonら, 1987）、又は非Ｉｇポリペプチドをコードする配列の全て又は一部に対するＩｇコード化配列を融合することにより、修飾することができる。そのような非Ｉｇポリペプチドは、キメラ二価抗体を創作するために、抗体の定常ドメインと置換することが可能であり、又は一抗原結合部位の定常ドメインと置換することができる。
【００３４】
（３）ヒト化及びヒト抗体
抗オーロラＣ＿ＡＳＶ抗体には、ヒト化又はヒト抗体が含まれる。非ヒト抗体のヒト化型は、非ヒトＩｇ由来の最小配列を含むキメラＩｇｓ、Ｉｇ鎖又は断片（Ｆｖ，Ｆａｂ’，Ｆ(ａｂ’)２又は他の抗体の抗原結合領域など）である。
一般に、ヒト化抗体は、非ヒト由来のＩｇから導入された一又は複数のアミノ酸残基を持つ。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、可変ドメインから選ばれる。ヒト化抗体は、例えばマウスのＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列と対応するヒト抗体配列とを置換することにより作製することができる（Jonesら, 1986；Riechmannら, 1988；Verhoeyenら, 1988）。つまり、ヒト化抗体とは、典型的には、特定のＣＤＲ残基がマウス由来の抗体中の相当部位由来の残基と置換されているヒト抗体のことである。ヒト化抗体には、マウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種のＣＤＲであって、抗原に対する所望の特異的親和性を持つ残基により、レシピエント（ヒトＩｇ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が置換されるヒトＩｇｓ（レシピエント抗体）が含まれる。また、非ヒト由来の残基によって、ヒトＩｇのＦｖフレームワーク残基が置換される場合もある（Jonesら, 1986；Presta, 1992；Riechmannら, 1988）。
【００３５】
７．医薬組成物
オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチド、その部分ペプチド、又はそれらの発現ベクターなどは、薬学的に受容可能な担体と共に、生体に対して悪影響を及ぼさない医薬組成物の形態で治療剤として使用され得る。
「薬学的に受容可能な坦体」は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、アイソトニックに作用して吸着を遅らせる薬剤及びその類似物を含み、薬剤的投与に適するもののことである（Gennaroら, 2000）。該担体及び該担体を希釈するために好ましいものの例には、限定はしないが、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、及び５％のヒト血清アルブミンが含まれる。また、リポソーム及び不揮発性油などの非水溶性媒体も用いられる。さらに、本発明のオーロラＣポリペプチド、その部分ペプチド又はそれらの発現ベクターの活性を保護又は促進するような、特定の化合物が含有されてもよい。
【００３６】
（１）医薬組成物の調製
本発明の医薬組成物は、静脈内、経口への投与、胃への直接投与を含む、治療上適切な投与経路に適合するように製剤化される。静脈内への投与、又は胃への直接投与に使用される溶液又は懸濁液には、限定はしないが、注射用の水などの滅菌的希釈液、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒、ベンジルアルコール又は他のメチルパラベンなどの保存剤、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなどの無痛化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、塩化ナトリウム又はデキストロースなど浸透圧調製のための薬剤を含んでもよい。
ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整することができる。非径口的標品はアンプル、ガラスもしくはプラスチック製の使い捨てシリンジ又は複数回投与用バイアル中に収納される。
【００３７】
（２）注射可能な製剤
注射に適する医薬組成物には、滅菌された注射可能な溶液又は分散媒であって、使用時に調製するための滅菌水溶液（水溶性の）又は分散媒及び滅菌されたパウダー（凍結乾燥されたタンパク質、核酸などを含む）が含まれる。静脈内の投与に関し、適切な担体には生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬＴＭ（BASF, Parsippany, N.J.）、又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。注射剤として使用する場合、組成物は滅菌的でなくてはならず、また、シリンジを用いて投与されるために十分な流動性を保持していなくてはならない。該組成物は、調剤及び保存の間、化学変化及び腐食等に対して安定でなくてはならず、細菌及び真菌などの微生物由来のコンタミネーションなどが生じてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及び適切な混合物を含む溶媒又は分散媒培地を使用することができる。例えば、レクチンなどのコーティング剤を用い、分散媒においては必要とされる粒子サイズを維持し、界面活性剤を用いることにより適度な流動性が維持される。種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールなどは、微生物のコンタミネーションを防ぐために使用可能である。また、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムのような等張性を保つ薬剤が組成物中に含まれてもよい。吸着を遅らせることができる組成物には、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤が含まれる。
滅菌的な注射可能溶液は、必要な成分を単独で又は他の成分と組み合わせた後に、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を加え、滅菌することで調製される。一般に、分散媒は、基本的な分散培地及び上述したその他の必要成分を含む滅菌的媒体中に活性化合物を取り込むことにより調製される。滅菌的な注射可能な溶液の調製のための滅菌的なパウダーの調製方法には、活性な成分及び滅菌溶液に由来する何れかの所望な成分を含むパウダーを調製する真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。
【００３８】
（３）経口組成物
通常、経口組成物には、不活性な希釈剤又は体内に取り込んでも害を及ぼさない担体が含まれる。経口組成物には、例えば、ゼラチンのカプセル剤に包含されるか、加圧されて錠剤化される。経口的治療のためには、活性化合物は賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ又はカプセル剤の形態で使用される。また、経口組成物は、流動性担体を用いて調製することも可能であり、流動性担体中の該組成物は経口的に適用される。さらに、薬剤的に適合する結合剤、及び／又はアジュバント物質などが包含されてもよい。
錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチ剤及びその類似物は以下の成分又は類似の性質を持つ化合物の何れかを含み得る：微結晶性セルロースのような賦形剤、アラビアゴム、トラガント又はゼラチンなどの結合剤；スターチ又はラクトース、アルギン酸、ＰＲＩＭＯＧＥＬ、又はコーンスターチなどの膨化剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳＴＲＲＯＴＥＳなどの潤滑剤；コロイド性シリコン二酸化物などの滑剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、メチルサリシル酸又はオレンジフレイバーなどの香料添加剤。
【００３９】
（５）全身投与
また、全身投与は経粘膜的又は経皮的に行なうことができる。経粘膜的又は経皮的投与について、標的のバリアーを透過することができる浸透剤が選択される。経粘膜浸透剤は界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が含まれる。経鼻スプレー又は坐薬は経粘膜的な投与に対して使用することができる。経粘膜的投与に対して、活性化合物はオイントメント、軟膏、ジェル又はクリーム中に製剤化される。
また、化合物は、直腸への送達に対して、坐薬（例えば、ココアバター及び他のグリセリドなどの基剤と共に）又は滞留性の浣腸の形態で調製することもできる。
（６）担体
本発明のオーロラＣポリペプチド、その部分ポリペプチド、又はそれらの発現ベクターは、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの制御放出製剤として、体内から即時に除去されことを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。エチレンビニル酢酸塩、ポリエチレングリコール、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、ＡＬＺＡ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Mountain View, CA）およびＮＯＶＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．（Lake Elsinore, CA）から入手することが可能で、また、当該技術分野の専門家によって容易に調製することもできる。また、リポソームの懸濁液も薬学的に受容可能な坦体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。例えば、抗体のＦａｂ’断片などは、ジスルフィド交換反応を介して、リポソームに結合させてもよい（MartinおよびPapahadjopoulos, 1982）。詳細な調製方法は、例えば、Eppsteinら, 1985；Hwangら, 1980中の記載を参照のこと。
【００４０】
（７）投与量
本発明のオーロラＣポリペプチド、その部分ポリペプチド、又はそれらの発現ベクター等による特定の疾患の治療又は予防において、適切な投与量レベルは、投与される患者の状態、投与方法等に依存するが、当業者であれば、容易に最適化することが可能である。
注射投与の場合は、例えば、一日に患者の体重あたり約０．１μｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましく、一般に一回又は複数回に分けて投与され得るであろう。好ましくは、投与量レベルは、一日に約０．１μｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは一日に約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇである。
経口投与の場合は、組成物は、好ましくは１．０から１０００ｍｇの活性成分を含む錠剤の形態で提供され、好ましくは治療されるべき患者に対する投与量に含まれる有効活性成分は、１．０，５．０，１０．０，１５．０，２０．０，２５．０，５０．０，７５．０，１００．０，１５０．０，２００．０，２５０．０，３００．０，４００．０，５００．０，  ６００．０，７５０．０，８００．０，９００．０および１０００．０ｍｇである。化合物は１日に１〜４回の投与計画で、好ましくは１日に１回又は２回投与される。
【００４１】
（８）単位投与量
医薬組成物又は製剤は、一定の投与量を保障すべく、均一単位投与量により構成されなくてはならない。単位投与量とは、患者の治療に有効な一回の投与量を含み、薬学的に受容可能な担体と共に製剤化された一単位のことである。本発明の単位投与量を決定する場合には、製剤化される化合物（例えば、オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチドなど）の物理的、化学的特徴、期待される治療上の効果、及び該化合物に特有な製剤化における留意事項等により影響を受ける。
【００４２】
８．遺伝子治療組成物
本発明において開示される核酸分子（例えば、オーロラＣ＿ＡＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターなど）を患者の細胞に導入するために、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏという２つの主要な方法がある。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達においては、治療が必要とされる患者の部位に直接注入される。ｅｘ  ｖｉｖｏ処理では、治療が必要とされる患者の部位の細胞を単離し、単離された細胞に製剤化した核酸分子を導入し、導入された細胞を患者に直接、又は、例えば、患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与することができる（米国特許第4,892,538号および第5,283,187号参照）。核酸分子を生細胞に導入するために利用可能な技術は、培養細胞等にｉｎ  ｖｉｔｒｏで導入するか、又は患者にｉｎ  ｖｉｖｏで導入するかに依存して選択される。哺乳動物細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸分子を導入するのに適した技術としては、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスフェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム法などが挙げられる。トランスフェクションには、組換えウイルス（好ましくはレトロウイルス）粒子の細胞レセプターとの結合、次いで粒子に含まれる核酸分子の細胞への導入が含まれる。遺伝子のｅｘ  ｖｉｖｏ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。
【００４３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ核酸移入技術で好ましいのは、ウイルス又は非ウイルスベクター（アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ））、およびカチオン性脂質ベースの系（遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏ１である；例えば、Tonkinsonら, Cancer Investigation, 14(1): 54-65 (1996) 参照）を利用した系が含まれる。遺伝子治療で使用するために最も好ましいベクターはウイルスであり、その中でも、最も好ましくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス又はレトロウイルスである。レトロウイルスベクター等のウイルスベクターには、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー又は位置決定因子などが含まれる。さらに、レトロウイルスベクター等のウイルスベクターは、例えば、オーロラＣポリペプチドをコードする遺伝子を含んだ状態で転写される場合、該コード化遺伝子の翻訳を可能とするシスエレメント、即ち翻訳開始配列として機能する核酸配列を含む。このようなベクター構築物は、用いるウイルスに適したパッケージングシグナル、末端反復配列（ＬＴＲ）又はその一部を含む。場合によっては、ベクター構築物は、ポリアデニル化並びに翻訳終結配列も含む。例えば、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、ＤＮＡ合成の開始点、及び３’ＬＴＲ又はその一部を含む。非ウイルス性の他のベクターは、例えばカチオン性脂質、ポリリジン、及びデンドリマーを用いることもできる。
場合によっては、治療に用いる核酸を目的の細胞にターゲティングする試薬、例えば、細胞表面膜タンパク質を特異的な抗体などと共に提供するのが望ましい。現在知られている遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Andersonら, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。好適な遺伝子治療及びレトロウイルス粒子及び構造タンパク質の作成方法は、米国特許第5,681,746号を参照のこと。
【００４４】
９．医薬組成物に関するキット
医薬組成物はキット、容器、パック中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明に係る医薬組成物がキットとして供給される場合、該医薬組成物のうち異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装するのは、活性構成成分の機能を失うことなく、長期間の貯蔵を可能ならしめるためである。
（１）容器
キット中に含まれる試薬は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないような何れかの種類の容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性ガスの下において包装されたバッファーを含む。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料などから構成される。他の適切な容器の例には、アンプルなどの類似物質から作られる簡単なボトル、及び内部がアルミニウム又は合金などのホイルで裏打ちされた包装材が含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、又はその類似物が含まれる。容器は、皮下用注射針で貫通可能なストッパーを有するボトルなどの無菌のアクセスポートを有する。
（２）使用説明書
また、キットには使用説明書も添付される。当該医薬組成物からな成るキットの使用説明は、紙又は他の材質上に印刷され、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。詳細な使用説明は、キット内に実際に添付されていてもよく、あるいは、キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェッブサイトに掲載されていてもよい。
【００４５】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
結果
【実施例１】
【００４６】
オーロラＣ＿ＡＳＶのクローニング
本発明のオーロラＣ＿ＡＳＶをコードするＤＮＡは、当業者が容易に行い得る既存の技術を用いて取得することができる（例えば、Sambrookら, 1989を参照のこと）。
簡潔に説明すると、ヒトオーロラＣ＿ＡＳＶは、ヒト精巣のｃＤＮＡライブラリー（Clontech社）から、オーロラＢのｃＤＮＡ（配列番号５）（Niggら, 2001；Adamsら, 2001）を用いてハイブリダイゼーションを行い（４２℃で１２時間）スクリーニングした。すでに報告されているオーロラＣとはそのアミノ酸配列が相違することから、オーロラＣの新規選択的スプライスバリアントであると考えられる。得られたオーロラＣ＿ＡＳＶのｃＤＮＡ全長配列及びその予想されるアミノ酸配列を、各々、配列番号１及び配列番号２として示した。
【実施例２】
【００４７】
オーロラＣとオーロラＢの相互作用
オーロラＢに対するモノクローナル抗体を用いてＨｅＬａ細胞の抽出液に対して免疫沈降を行なったところ、その免疫沈降産物中にオーロラＣの存在が確認されが、オーロラＡの存在は確認されなかった（図１、レーン４）。
また、ｇｌｕタグ化オーロラＢ（Sugiyamaら, 2002）を単独、又はオーロラＣ（ｍｙｃタグ化）と共にＣＯＳ細胞（ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ、Sigma社）、１０％ＦＣＳ（Sigma社）中、５％ＣＯ２存在下で培養）中にトランスフェクトした後（ＤＥＡＥデキストラン法（Uranoら, 1996））、抗ｇｌｕモノクローナル抗体で免疫沈降を行った。ｇｌｕオーロラＣは、ｇｌｕ／ｐＭＴ３（Uranoら, 1996）により実施例１で取得したｃＤＮＡを発現可能に挿入して得られた発現ベクターを用いて以下の実験を行なった。
得られた沈降物に対して抗ｍｙｃ抗体でイムノブロットを行ったところオーロラＣが検出された（図２、レーン７）。さらに、オーロラＣのキナーゼ活性を欠いた変異体（ＫＮ、配列番号３、定法に従い、二重ＰＣＲ突然変異導入法にて点突然変異を導入し、６９番目のリジンをアルギニンに置換した変異体）も野生型（配列番号２）と同様に沈降物中に存在することが確認された（図２、レーン８）。従って、細胞内において、オーロラＣはオーロラＢと直接又は間接的な相互作用を介して複合体を形成しているものと考えられる。また、キナーゼ活性を欠いた変異体のオーロラＣ（ＫＮ）も複合体を形成する能力を有することが示唆された。
【実施例３】
【００４８】
オーロラＣの生化学的な解析
ヒトオーロラＢの活性制御に関しては、プロテインホスファターゼがキナーゼ活性化のネガティブレギュレーターとして機能することが既に報告されている（Sugiyamaら, 2002）。そこで、プロテインホスファターゼ阻害剤であるオカダ酸がヒトオーロラＣの活性に影響を及ぼすか否か検討した。
ＣＯＳ細胞にｇｌｕタグ化オーロラＣ、又はその変異体を導入し、抗ｇｌｕタグ抗体を用いて免疫沈降を行ない、沈降産物中に存在するオーロラＣ又はその変異体のヒストンＨ３リン酸化活性を調べた（図３）。オーロラＣのキナーゼ活性は、以下の組成を有する反応液中（３０μｌ）で、３０℃、２０分間インキュベートして行った（以下、インビトロにおけるキナーゼ活性は同様な方法で行なった）；２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭＤＴＴ、０．１ｍＭＥＤＴＡの組成に、５０μＭ  ＡＴＰ、０．３μＣｉの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及び酵素、基質を含んだもの。
ヒトオーロラＣはヒストンＨ３（１０番目と２８番目のセリン残基）をリン酸化し、その活性はオカダ酸（０．４μＭ）によって増強されることが明らかとなった（図３の上図、レーン１と３、レーン７と９を比較のこと）。これに対し、細胞を分裂期に停止させるノコダゾールで処理（４００ｎｇ／ｍｌ）しても、オーロラＣのヒストンＨ３リン酸化活性は増強されない（図３、レーン２及びレーン８を参照）ことから、分裂前中期への移行だけでは、オーロラＣを活性化するには充分でないことが示唆された。また、不活性型の変異体であるＫＮおよびＴ１９５Ａ（活性化ループ領域に存在する１９５番目のスレオニンをアラニンに置換した変異体（配列番号４））は活性化されなかった。
【実施例４】
【００４９】
ＩＮＣＥＮＰによるオーロラＣの活性化
次に、ＩＮＣＥＮＰがオーロラＣと結合するかどうか検討を行なった。ＣＯＳ細胞中でｇｌｕタグ化オーロラＣをｍｙｃタグ化ＩＮＣＥＮＰと共発現させ、抗ｇｌｕタグ抗体で免疫沈降を行い、沈降産物中のオーロラＣのＩＮＣＥＮＰの存否を確認したところ、ＩＮＣＥＮＰの存在が検出されたことから、オーロラＣとＩＮＣＥＮＰが結合してＣＯＳ細胞中に存在することが示唆された（図４下から２番目の図、レーン３）。また、ＩＮＣＥＮＰと結合したオーロラＣのヒストンＨ３キナーゼ活性は、オカダ酸によって誘導される活性化レベルを超える程度にまで強く活性化された（図４上図、レーン２〜４を参照）。これに対し、キナーゼ活性を欠くオーロラＣの変異体（ＫＮ）は、ＩＮＣＥＮＰと結合はするものの（図４下から２番目の図、レーン６）、そのキナーゼ活性は検出されなかった（図４上図、レーン５〜７を参照）。
さらに、オーロラＣ、オーロラＢ及びＩＮＣＥＮＰが同じ複合体内に存在するかどうか検討した。ＨｅＬａ細胞（ノコダゾールの存在下又は非存在下で培養）の抽出液から抗オーロラＢ抗体を用いて免疫沈降を行い、その沈降物に対して、抗ＩＮＣＥＮＰ抗体及び抗オーロラ抗体でイムノブロットを行った。その結果、オーロラＢはＩＮＣＥＮＰ及びオーロラＣと複合体を形成しており、この複合体中にオーロラＡは存在しないことが明らかとなった（図５、レーン３、４）。また、抗ＩＮＣＥＮＰ抗体を用いて免疫沈降を行なった場合も、同様の結果を得ることができた（図５、レーン５、６）。以上のことから、オーロラＣは、細胞内においてＩＮＣＥＮＰ及びオーロラＢと複合体を形成していることが示唆された。
また、オーロラＣの活性化に必要なＩＮＣＥＮＰの領域に関し、ｆｌａｇ−ＩＮＢｏｘ（ＩＮＣＥＮＰの７８３番目から９１８番目までのアミノ酸領域）をオーロラＣとインビトロにおいて共発現させて、オーロラＣとの結合の有無及びオーロラＣのヒストンＨ３キナーゼ活性の活性化を誘導するかどうか検討した。
オーロラＣをｍｙｃ抗体で免疫沈降したところ、沈降物中にＩＮＣＥＮＰのＩＮＢｏｘ部分が存在することが確認され（図６の下から２番目の図、レーン３）、さらに、ヒストンＨ３キナーゼ活性も検出された（図６上図、レーン３）。従って、ＩＮＢｏｘのオーロラＣへの直接的な結合が、オーロラＣの活性化において必要十分であることが明らかとなった（図６、レーン２及び３）。
【実施例５】
【００５０】
オーロラＣ＿ＡＳＶのドミナントネガティブ変異体
ｍｙｃタグ化オーロラＣ単独、又はＥＧＦＰ−ＩＮＣＥＮＰと共にＣＯＳ細胞へトランスフェクトした後、リン酸化活性について検討した。トランスフェクト後、抗リン酸化ヒストンＨ３（１０番目のセリン残基）抗体を用いて蛍光染色を行なった結果、オーロラＣ及びＩＮＣＥＮＰの両方を発現している細胞の９０％以上が、抗リン酸化ヒストンＨ３抗体により染色された（図７、左から７番目のレーン）。一方、オーロラＣの変異体（ＫＮ）をＩＮＣＥＮＰと共発現した場合には、トランスフェクトされた細胞の１％未満しか抗リン酸化ヒストンＨ３抗体により染色されたかった（図７、左から８番目のレーン）従って、オーロラＣの変異体（ＫＮ）は、細胞内においてＩＮＣＥＮＰと結合はするものの（図４、レーン６も参照のこと）、キナーゼ活性の活性化が誘導されないドミナントネガティブ変異体として機能することが示唆された。
【００５１】
参考文献
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【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、オーロラＣの過剰発現により発症する癌の予防および治療、並びに、その予防および治療に効果的な製剤の開発において、産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】抗オーロラＢ抗体（αＡｕｒｏｒａ−Ｂ）を用いてＨｅＬａ細胞抽出液から免疫沈降を行い、抗オーロラ抗体（αｐａｎ−Ａｕｒｏｒａ）を用いてオーロラＣとオーロラＢとの相互作用について検討した結果を示す（ＩＢ：イムノブロッティング、ＩＰ：免疫沈降、を各々意味する。本明細書中において同じ）。
【図２】タグ化したオーロラＢ及びＣをＣＯＳ細胞中で発現させ、その相互作用を検討した結果を示す（ｇｌｕ−Ａｕｒｏｒａ−Ｂは、ｇｌｕタグ化オーロラＢを、ｍｙｃ−Ａｕｒｏｒａ−Ｃ及びＣ（ＫＮ）は、各々、ｍｙｃタグ化オーロラＣおよびオーロラＣの変異体（ＫＮ）を示す）。
【図３】ｇｌｕタグ化オーロラＣの野生型（ｗｔ）又は不活性型（ＫＮ）、（Ｔ１９５Ａ；１９５番目のスレオニンをアラニンに置換した変異体）をＣＯＳ細胞中で一過的に発現させ、オーロラＣのキナーゼ活性に対するオカダ酸の影響を示す（ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈ：オートラジオグラフィー、ｃｏｏｍａｓｓｉｅ：クマジー染色、ＧＳＴ−Ｈ３（５−１５）：ヒストンＨ３の５番目から１５番目までのアミノ酸のＧＳＴタグ化ペプチド、ｇｌｕ−Ａｕｒｏｒａ−Ｃ：ｇｌｕタグ化オーロラＣ、Ｎ：ノコダゾール添加、ＯＡ：オカダ酸）。
【図４】ｍｙｃタグ化ＩＮＣＥＮＰ、ｇｌｕタグ化オーロラＣの野生型（ｗｔ）又は不活性型（ＫＮ）をＣＯＳ細胞中で一過的に発現させ、オーロラＣのキナーゼ活性化に対するＩＮＣＥＮＰの影響を検討した結果を示す（ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈ：オートラジオグラフィー、ＧＳＴ−Ｈ３（５−１５）：ヒストンＨ３の５番目から１５番目までのアミノ酸のＧＳＴタグ化ペプチド、ｇｌｕ−Ａｕｒｏｒａ−Ｃ：ｇｌｕタグ化オーロラＣ、ｍｙｃ−ＩＮＣＥＮＰ：ｍｙｃタグ化ＩＮＣＥＮＰ）。
【図５】細胞内においてＩＮＣＥＮＰがオーロラＢ及びオーロラＣと相互作用していることを示す。抗オーロラＢ抗体（αＡＢ）及び抗ＩＮＣＥＮＰ抗体（αＩＮＣＥＮＰ）を用いて、対数増殖期（−）又はノコダゾール処理（＋）のＨｅＬａ細胞抽出液から免疫沈降を行い、沈降物に対し、抗ＩＮＣＥＮＰ抗体（αＩＮＣＥＮＰ）、抗オーロラ抗体（αｐａｎ−Ａｕｒｏｒａ）でイムノブロットを行なった。
【図６】ＩＮＣＥＮＰのＩＮＢｏｘ領域がオーロラＣと直接結合しオーロラＣの活性化に必要十分であることを示す結果である。インビトロでトランスレートしたｍｙｃタグ化オーロラＣを抗ｍｙｃ抗体（αｍｙｃ）で免疫沈降し、その沈降物をインビトロキナーゼアッセイにより解析した（ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈ：オートラジオグラフィー、ｃｏｏｍａｓｓｉｅ：クマジー染色、ＧＳＴ−Ｈ３（５−１５）：ヒストンＨ３の５番目から１５番目までのアミノ酸のＧＳＴタグ化ペプチド、ｍｙｃ−Ａｕｒｏｒａ−Ｃ：ｍｙｃタグ化オーロラＣ、ｆｌａｇ−ＩＮＢｏｘ：ｆｌａｇタグ化ＩＮＢｏｘ）。
【図７】抗リン酸化ヒストンＨ３（１０番目のセリンがリン酸化されたもの）抗体を用いてＣＯＳ細胞を蛍光染色した後、染色像が得られた細胞の割合を示す。縦軸は、ポジティブな染色像が得られた細胞の割合を％で示した。結果は、２００以上の細胞に対して少なくとも３回行なった実験から得られた値を、値±標準誤差として示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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