(57)【要約】      （修正有）【課題】酢酸耐性を増強するタンパク質を遺伝子レベルにおいて解明するとともに、高度な酢酸耐性を有し、高濃度の酢酸を効率良く生産することが可能な微生物を取得し、さらに、当該微生物を用いて高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供すること。【解決手段】下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質ＧＡＤＨ、該タンパク質ＧＡＤＨをコードする遺伝子のＤＮＡ（Ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｂ）特定のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質並びに微生物細胞内における前記ＤＮＡのコピー数が増幅されてなる、高度な酢酸耐性を有する微生物；前記微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質ＧＡＤＨ。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【請求項２】
下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質ＧＡＤＨをコードする遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【請求項３】
下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項２に記載の遺伝子のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４６８〜２２４０からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４６８〜２２４０からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
微生物細胞内における請求項２又は３に記載のＤＮＡのコピー数が増幅されてなる、高度な酢酸耐性を有する微生物。
【請求項５】
微生物がアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質ＧＡＤＨ、その遺伝子、高度な酢酸耐性を有する微生物、及び該微生物を用いた食酢の製造方法に関し、詳しくは酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質ＧＡＤＨ、該タンパク質ＧＡＤＨをコードする遺伝子のＤＮＡ、該ＤＮＡを含むプラスミド、高度な酢酸耐性を有し、高濃度の酢酸を効率良く生産することが可能な微生物、及び該微生物を用いて高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
工業的な食酢製造においては、微生物による酢酸発酵が利用されている。このような微生物はアルコール酸化能を有し、一般に酢酸菌と呼ばれる。酢酸菌の中でも特に、アセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌は、工業的な酢酸発酵に広く利用されている。
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換されるが、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになる。蓄積した酢酸は、酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
そのため、工業的な食酢製造においては、より高い酢酸濃度においても増殖能力や発酵能力が低下しない酢酸菌、すなわち高度な酢酸耐性を有する酢酸菌を開発することが求められている。その一手段として、酢酸耐性に関与し、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質の遺伝子（酢酸耐性遺伝子）のクローニングや、その酢酸耐性遺伝子を用いた酢酸菌の育種並びに改良が試みられている。
【０００３】
酢酸耐性遺伝子に関するこれまでの知見としては、アセトバクター属の酢酸菌の酢酸耐性を変異させて酢酸感受性にした株を元の耐性に回復させることのできる相補遺伝子、すなわちクラスターを形成する３つの遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）のクローニングに関するものがある（例えば、非特許文献１参照）。３つの遺伝子のうち、ａａｒＡ遺伝子はクエン酸合成酵素をコードする遺伝子であり、又、ａａｒＣ遺伝子は酢酸の資化に関係する酵素をコードする遺伝子であると推定されたが、ａａｒＢ遺伝子については機能が不明であった（例えば、非特許文献２参照）。
これらの３つの遺伝子を含む遺伝子断片を、マルチコピープラスミドにクローニングし、アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO3288）株に形質転換して得られた形質転換株は、酢酸耐性が僅かしか向上せず、また実際の酢酸発酵における酢酸耐性能力については不明であった（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
一方、酢酸菌からクローニングされた膜結合型アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）をコードする遺伝子を、酢酸菌に導入することによって、酢酸発酵における最終到達酢酸濃度の向上が認められた例が開示されている（例えば、特許文献２参照）。
しかし、ＡＬＤＨはアルデヒドを酸化する機能を有する酵素であって、酢酸耐性に直接関係する酵素ではないことから、ＡＬＤＨをコードする遺伝子が真に酢酸耐性遺伝子であるとは断定できないものであった。
【０００５】
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）」、１７２巻，２０９６-２１０４，１９９０年」
【非特許文献２】「ジャーナル・オブ・ファーメンテイション・アンド・バイオエンジニアリング（Journal of Fermentation and Bioengineering）、７６巻、２７０-２７５, １９９３年」
【特許文献１】特開平３−２１９８７８号公報
【特許文献２】特開平２−２３６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上のように、酢酸菌の酢酸耐性を遺伝子レベルで解明し、高い酢酸耐性を有する実用性のある酢酸菌の開発に成功した例は、未だ報告されていない。
そこで、本発明の目的は、第一に酢酸菌の酢酸耐性の向上を図るため、酢酸耐性を増強するタンパク質を遺伝子レベルにおいて解明することである。さらに、本発明の別の目的は、当該タンパク質をコードする酢酸耐性増強遺伝子を取得するとともに、この遺伝子を用いて高度な酢酸耐性を有し、高濃度の酢酸を効率良く生産することが可能な微生物を取得すること、並びに当該微生物を用いて高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ね、その過程において、酢酸存在下でも増殖し、発酵することができる酢酸菌には、他の微生物には存在しない特異的な酢酸耐性に関与する遺伝子が存在するとの仮説を立てた。そして、こうした遺伝子を用いれば、従来以上に微生物の酢酸耐性を付与し、増強させることができ、さらにはそのような微生物を用いて、従来得ることができなかったような高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を開発することも可能になるとの新規着想を得た。
【０００８】
前記従来技術における酢酸耐性遺伝子の取得方法は、酢酸菌の酢酸感受性の変異株を相補する遺伝子をクローニングする方法などが一般的であった。
しかし、本発明者らは、この方法では産業上有用な酢酸耐性遺伝子を見出すことは困難であると考え、他の取得方法を検討した。その結果、酢酸菌の染色体ＤＮＡライブラリーを構築し、この染色体ＤＮＡライブラリーを酢酸菌に形質転換することにより、通常は１％程度の酢酸の存在下でしか生育できない酢酸菌を２％の酢酸の存在下でも生育可能にする遺伝子をスクリーニングすることによって取得する方法を開発した。
この取得方法によって、実際に食酢製造に用いられているアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌から、酢酸耐性を実用レベルで増強する機能を有する新規なタンパク質ＧＡＤＨの遺伝子（酢酸耐性増強遺伝子）をコードするＤＮＡをクローニングすることにはじめて成功した。
【０００９】
得られた酢酸耐性増強遺伝子のコーディング領域は、微生物に見出されるグルコン酸脱水素酵素と称されるタンパク質とある程度の相同性を有するが、その相同性の程度は低いことから、酢酸菌に特異的なタンパク質遺伝子であって、酢酸菌のグルコン酸脱水素酵素タンパク質とある程度似ている新規なタンパク質をコードするＤＮＡであると推定された。
【００１０】
また、酢酸耐性増強遺伝子をコードするＤＮＡのコピー数を増幅させてなる微生物は、酢酸耐性が顕著に増強するので、高酢酸濃度の食酢を効率良く製造することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、請求項１記載の本発明は、下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質ＧＡＤＨを提供するものである。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【００１２】
請求項２記載の本発明は、前記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質ＧＡＤＨをコードする遺伝子のＤＮＡを提供するものである。
請求項３記載の本発明は、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項２に記載の遺伝子のＤＮＡを提供するものである。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４６８〜２２４０からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４６８〜２２４０からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１３】
請求項４記載の本発明は、微生物細胞内における請求項２又は３に記載のＤＮＡのコピー数が増幅されてなる、高度な酢酸耐性を有する微生物を提供するものである。
請求項５記載の本発明は、微生物がアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする請求項４に記載の微生物を提供するものである。
【００１４】
請求項６記載の本発明は、請求項４又は５に記載の微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、酢酸耐性を増強する機能を有する新規なタンパク質及びその遺伝子のＤＮＡが提供され、該ＤＮＡを用いて、より高濃度の酢酸を効率良く生産可能な微生物を取得することができる。さらに、該微生物を使用した高酢酸濃度の食酢を高効率で製造する方法の提供が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
(１)本発明のタンパク質ＧＡＤＨ
本発明のタンパク質ＧＡＤＨは、請求項１に記載するように、下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質である。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【００１７】
ここで、（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、種々の微生物のグルコン酸脱水素酵素のアミノ酸配列とある程度の相同性を有するが、その相同性の程度は５０％程度と低いことから、酢酸菌に特異的なグルコン酸脱水素酵素タンパク質であると推定された。
すなわち、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいてアミノ酸配列レベルでホモロジー検索すると、ペクトバクテリウム・シプリペディ（Pectobacterium cypripedii）あるいはシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）のグルコン酸脱水素酵素複合体を構成するタンパク質のうち、触媒鎖をコードする遺伝子と４３〜４４％の相同性を有する。
【００１８】
本発明のタンパク質ＧＡＤＨは、上述のように、（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよいが、（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質、（Ａ）のタンパク質と実質的に同一のタンパク質であっても良い。
【００１９】
このような、タンパク質（Ｂ）は、例えば部位特異的変異法によって、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列となるように改変することによっても取得され得る。また、従来知られている突然変異処理によっても取得することができるし、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。取得方法の詳細については、酢酸耐性を増強する機能を有することの確認のための手段を含めて、後述の（２）本発明のＤＮＡについての説明において詳細に説明する。
【００２０】
このような本発明のタンパク質ＧＡＤＨは、微生物、例えばアセトバクター（Acetobacter）属又はグルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）属に属する酢酸菌、具体的には例えば、アセトバクター・アセチＮo.１０２３株（Acetobacter aceti No.1023）（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託）、アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO3288）株、アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８３（Acetobacter aceti IFO3283）株、グルコンアセトバクター・ユウロパエウスＤＳＭ６１６０（Gluconacetobacter europaeus DSM6160）、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）に存在し、特にアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託）に存在する。
【００２１】
（２）本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、請求項２に記載するように、上記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質ＧＡＤＨをコードする遺伝子のＤＮＡである。具体的には、請求項３に記載するように、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４６８〜２２４０からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４６８〜２２４０からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
なお、本発明のＤＮＡが、塩基配列の調整要素及び該遺伝子の構造部分を含んでも良いことは、言うまでもない。
【００２２】
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、具体的には（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４６８〜２２４０からなる塩基配列を含むＤＮＡは、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）から次のようにして取得することができる。
まず、グルコンアセトバクター・エンタニイ、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託）の染色体ＤＮＡを取得する。染色体ＤＮＡの取得は、例えば特開昭６０−９４８９号公報に開示された方法により行なうことができる。
【００２３】
次に、得られた染色体ＤＮＡから本発明の酢酸耐性を向上させる遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。
すなわち、まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々の染色体ＤＮＡ断片混合物を得る。制限酵素としては、幅広い種類の酵素が使用でき、使用する酵素に応じて切断反応時間などを調節し、切断の程度を調節する。例えば、Ｓａｕ３ＡＩを温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／ｍｌで様々な時間（１分〜２時間）、染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。なお、後記実施例ではＳａｕ３ＡＩを用いた。
【００２４】
次いで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、酢酸菌内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結する。
ベクターＤＮＡに染色体ＤＮＡ断片を連結させるためには、制限酵素等を用いてベクターＤＮＡを切断開裂させておく必要がある。制限酵素としては、上記ＤＮＡ断片混合物を得る際に用いた制限酵素（例えば、Ｓａｕ３ＡＩ）と相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素（例えば、ＢａｍＨＩ）を用いることができる。ＢａｍＨＩを用いた場合、温度３０℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で、１時間以上ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。
【００２５】
切断開裂されたベクターＤＮＡを、染色体ＤＮＡ断片混合物と混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させて、目的の組換えＤＮＡ（ＤＮＡライブラリー）を得ることができる。なお、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの作用条件としては、例えば、温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で１時間以上、好ましくは６〜２４時間とすることができる。
【００２６】
こうして得られた組換えＤＮＡ（ＤＮＡライブラリー）から、前記タンパク質（Ａ）をコードする遺伝子、具体的には前記ＤＮＡ（ａ）を選抜する。
選抜は、酢酸耐性の増強機能により行なうことができる。例えば、寒天培地上で１％よりも高濃度の酢酸の存在下では通常増殖することのできない酢酸菌、例えばアセトバクター・アセチＮｏ.１０２３株（Acetobacter aceti No.1023）（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託）を組換えＤＮＡを用いて形質転換し、その後２％酢酸含有寒天培地に塗布し、培養する。そこで生じたコロニーを液体培地に接種して培養し、得られる菌体からプラスミドを回収することで、目的のＤＮＡを得ることができる。
【００２７】
こうして（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、具体的には（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４６８〜２２４０からなる塩基配列を含むＤＮＡを得ることができる。ここで、配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、塩基番号４６８〜２２４０からなる塩基配列は、コーディング領域であり、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列は、コーディング領域に対応したものである。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、具体的には（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４６８〜２２４０からなる塩基配列を含むＤＮＡは、ペクトバクテリウム・シプリペディ（Pectobacterium cypripedii）あるいはシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）のグルコン酸脱水素酵素複合体を構成するタンパク質のうち、触媒鎖をコードする遺伝子と４３〜４４％の相同性を有することから、グルコン酸脱水素酵素とある程度似ている新規なタンパク質をコードする新規な遺伝子であることが推定されたものである。この点については、前記（１）本発明のタンパク質ＧＡＤＨの項で既に説明した通りである。
なお、グルコン酸脱水素酵素遺伝子が、酢酸耐性と関係していることは従来全く知られていなかったことであり、本発明者が初めて見出したものである。
【００２８】
さらに、タンパク質（Ａ）をコードする遺伝子、具体的にはＤＮＡ（ａ）は、すでに取得されている酢酸菌の酢酸耐性遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）や酢酸耐性を増強する機能を有するＡＤＨ遺伝子などとも異なる新規な酢酸耐性を増強する機能を有する遺伝子であると同定された。
【００２９】
このような、（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、具体的には（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４６８〜２２４０からなる塩基配列を含むＤＮＡの製造は、上述の方法に限定されず、例えば、鋳型として酢酸菌グルコンアセトバクター・エンタニイのゲノムＤＮＡを用い、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）によって、又は該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。
ここで、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）製のサーマルサイクラーGene Amp PCR System 9700を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して、定法に従って行なうことができる。
【００３０】
本発明のＤＮＡは、（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、具体的には（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４６８〜２２４０からなる塩基配列を含むＤＮＡであってもよいが、（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質、すなわち（Ａ）のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするものであっても良い。
このような、タンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするように、塩基配列を改変することによっても取得され得る。また、上記のようなタンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡは、既知の突然変異処理によっても取得することができる。
一般に、タンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡの塩基配列は、種間、株間、変異体間、変種間で僅かに異なることが知られているので、タンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から上記のようなタンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡを得ることが可能である。
【００３１】
このようなタンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡは、（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４６８〜２２４０からなる塩基配列又は前記塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡとして得ることができる。
例えば、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種、より具体的にはアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらを自然に、若しくは人工的に変異処理して得られる変異体（変異株或いは変種）から、配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４６８〜２２４０からなる塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることによって得ることができる。
【００３２】
ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１ＸＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度にて６０℃で洗浄が行なわれる条件などが挙げられる。
【００３３】
酢酸耐性を増強する機能を有することの確認は、例えば、後述の実施例で説明するように、通常は寒天培地上で酢酸濃度１％程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）に目的のＤＮＡを形質転換し、酢酸を２％含む培地で培養し、増殖可能かどうかを調べることにより行なうことができる。
【００３４】
（３）本発明の微生物
本発明の微生物は、請求項４に記載するように、微生物細胞内における請求項２又は３に記載のＤＮＡのコピー数が増幅されてなる、高度な酢酸耐性を有する微生物である。
【００３５】
このような微生物として、アルコール酸化能を有する酢酸菌が挙げられ、中でも、請求項５に記載のアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌は、酢酸の生産量及び生産効率を増大させることができる点で好ましい。
係る高度な酢酸耐性を有する微生物の取得に用いる酢酸菌は、アセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であり、アセトバクター属の酢酸菌としては、例えば、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）が挙げられ、具体的には例えば、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（Acetobacter aceti No.1023）（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託）、アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO3288）株、アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８３（Acetobacter aceti IFO3283）株を用いることができる。
また、グルコンアセトバクター属の酢酸菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・ユウロパエウスＤＳＭ６１６０（Gluconacetobacter europaeus DSM6160）、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）が挙げられ、具体的には例えば、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株（Acetobacter altoacetigenes MH-24）（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託）を用いることができる。
【００３６】
本発明の高度な酢酸耐性を有する微生物は、微生物細胞内における請求項２又は３に記載のＤＮＡのコピー数が、好ましくは２回以上、より好ましくは３〜２０回増幅されてなる微生物である。
微生物細胞内における請求項２又は３に記載のＤＮＡのコピー数を増幅する方法としては、例えば、該遺伝子の構造遺伝子（配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、４９８〜９５６番目）を含むＤＮＡ断片を、対象である微生物中で効率よく機能するプロモーター配列、例えば、酢酸菌のアルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）１７５巻、６８５７−６８６６、１９９３年」参照）、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＡＣＹＣ１７７のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなど対象微生物以外の微生物由来のプロモーター配列に置き換えて得られる組換えＤＮＡを用いて、微生物を形質転換する方法によっても良い。
【００３７】
その他、請求項２又は３に記載のＤＮＡを含むマルチコピーベクターを微生物の細胞に導入することによっても良い。
ここで、マルチコピーベクターとしては、プラスミド、トランスポゾン等が挙げられる。
プラスミドとしては、ｐＵＦ１０６（例えば、「セルロース（Cellulose）１５３−１５８, １９８９年」参照）、ｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）（例えば、特開昭６０−９４８８号公報参照）などが挙げられる。また、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistry），５２巻，ｐ．３１２５−３１２９，１９８８年」参照）も用いることができる。
トランスポゾンとしては、ＭｕやＩＳ１４５２などが挙げられる。
【００３８】
マルチコピーベクターの微生物の細胞への導入は、塩化カルシウム法（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistry），４９巻，p.２０９１−２０９７，１９８５年」参照）、エレクトロポレーション法（例えば、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Bioscience，Biotechnology and Biochemistry），５８巻，ｐ.９７４−９７５，１９９４年」参照）等によって行なうことができる。
【００３９】
（４）本発明の食酢の製造方法
本発明の食酢の製造方法は、請求項６に記載するように、請求項４又は５に記載の微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法である。
【００４０】
この方法は、従来の酢酸菌による発酵方法と同様に行なえば良い。アルコールを含有する培地とは、エタノール等のアルコールと、炭素源、窒素源、無機物等を含有する培地であり、いわゆる酢酸発酵の際に用いられる培地と同様の組成のものを使用することができる。必要に応じて、使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。
炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸等を用いることができる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
【００４１】
また、培養は、静置培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等の常法に従って、好気的条件下で行なうことができる。培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、通常は３０℃とすることができる。
培地のｐＨは通常２．５〜７．０の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種の酸、塩基、緩衝液等によって適宜調整することができる。
このように、本発明においては、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることができ、通常１〜２１日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸を生成蓄積せしめることができる。
【００４２】
以上、本発明のタンパク質ＧＡＤＨ又は酢酸耐性増強遺伝子は、それらの遺伝子源であるアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株が特許生物寄託センンターにＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託されているので、本発明に係る遺伝子のＤＮＡは容易に入手することができ、当業者であれば本発明の実施は容易である。そして、所望するのであれば、本発明のタンパク質ＧＡＤＨ又は酢酸耐性増強遺伝子を、酢酸菌で自律複製可能なベクターに乗せ換え、これを酢酸菌に導入し、該酢酸菌を培養することにより酢酸含量の高い食酢を容易に製造することができる。
【００４３】
さらに、上記したように本発明のタンパク質ＧＡＤＨ又は酢酸耐性増強遺伝子のクローン化やＰＣＲの態様、プラスミドベクター、組換えプラスミドの作製、宿主菌の寄託、その他が開示若しくは実施されており、いずれも入手ないし操作、処理が容易に行なえるので、実施例を参考にして各操作、処理を行なえば、目的とする酢酸耐性形質転換体を得ることができ、これを使用することにより高濃度の酢酸を製造することができる。
【実施例】
【００４４】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１（酢酸耐性増強遺伝子のクローニング）
染色体ＤＮＡライブラリーの作製
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）を、６％酢酸と４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン含有）中で、３０℃にて２４０〜３３６時間振盪培養を行なった。
培養終了後、培養液を遠心分離（７，５００Ｘｇ、１０分）し、菌体を得た。
得られた菌体より、特開昭６０−９４８９号公報に開示された方法により、染色体ＤＮＡを調製した。すなわち、該菌体をＴＥ緩衝液で洗浄後、ＴＥＳ緩衝液を加えて菌体を懸濁し、リゾチーム液を加えて静置し、ＥＤＴＡ液を加えて３７℃で２０分間反応させた。反応後、ラウリル硫酸ナトリウムを加え、３７℃で２０分間静置したのち、食塩水を加え、０℃で一夜静置した。次いで、遠心分離を行ない上清を得た。この上清にポリエチレングリコール６０００を加え、４℃で一夜静置した後、遠心分離を行ない沈殿物を得た。沈殿物をＵＣ緩衝液に溶解させ、エチジウムブロマイドを加え、さらに塩化セシウムを加えて密度を１．５７に合わせ、密度勾配遠心分離を行なった。その後、遠心チューブに３６５ｎｍの紫外線を照射し、染色体バンドの下に現れるバンドをプラスミド分画として分取した。分画液をイソプロパノールで処理し、エチジウムブロマイドを除き、ＴＥ緩衝液に対して透析した。これをプラスミド混在溶液とした。
【００４５】
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（タカラバイオ社製）で部分消化し、また大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＵＦ１０６を制限酵素ＢａｍＨＩで消化して、切断した。これらのＤＮＡを適量ずつ混合し、ライゲーションキット（TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2、タカラバイオ社製）を用いて連結してアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４の染色体ＤＮＡライブラリーを構築した。
【００４６】
（２）酢酸耐性増強遺伝子のクローニング
上記のようにして得られたアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４の染色体ＤＮＡライブラリーを、通常は寒天培地上で酢酸濃度１％程度までの条件下でしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）に形質転換した。
その後、形質転換されたアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を、２％酢酸、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＹＰＧ寒天培地で、３０℃にて４日間培養した。
【００４７】
次に、生じたコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ培地に接種して培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。その結果、図１の上段に示すような約５．０ｋｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片がクローン化されたプラスミドを回収できた。このプラスミドを、ｐＧＡＤＨ−１と命名した。
さらに、２％酢酸を含むＹＰＧ寒天培地でアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を生育可能にするＤＮＡ断片は、ｐＧＡＤＨ−１にクローン化された約５．０ｋｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片中の約２．４ｋｂｐのＮｏｔＩ断片であることが確認できた。
このようにして、通常は寒天培地上で酢酸濃度１％程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株から、２％酢酸含有寒天培地でも増殖可能にする酢酸耐性増強遺伝子断片を取得した。
【００４８】
（３）酢酸耐性増強遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の決定
上記のクローン化されたＳａｕ３ＡＩ断片中のＮｏｔＩ断片を、ｐＵＣ１９のＳｍａＩ切断部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法によって決定した。なお、塩基配列の決定は、ＤＮＡ２本鎖の両方の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
その結果、配列表の配列番号１記載の塩基配列が決定された。配列表の配列番号１記載の塩基配列中には、塩基番号４６８〜２２４０にかけて、配列表の配列番号２記載のアミノ酸１５３個からなるアミノ酸配列をコードするオープンリーディング・フレーム（ＯＲＦ）の存在が確認された。
【００４９】
実施例２（酢酸耐性増強遺伝子による形質転換）
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
上記実施例１のようにしてクローン化されたアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）由来の酢酸耐性増強遺伝子を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法によって増幅した。酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＵＦ１０６（例えば、「セルロース（Cellulose）１５３−１５８, １９８９年」参照）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化し、その部位に、増幅したＤＮＡ断片を挿入して、ｐＧＡＤＨを作製した。図１下段にｐＧＡＤＨに挿入された増幅断片の概略を示した。
【００５０】
ＰＣＲ法は次のようにして実施した。すなわち、鋳型として上記酢酸菌由来のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１及びプライマー２を用い、下記する条件にて、ＰＣＲ法を実施した。プライマー１及び２の塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号３及び４に示すとおりである。
ＰＣＲ法のサイクルは、９４℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃１５０秒を１サイクルとして、３０サイクルとした。
【００５１】
このｐＧＡＤＨを、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Bioscience, Biotechnology and Biochemistry），５８巻，ｐ.９７４−９７５，１９９４年」参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
【００５２】
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、酢酸耐性増強遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
【００５３】
（２）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＧＡＤＨを有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地で通気培養した場合の生育状態を、シャトルベクターｐＵＦ１０６のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株の生育と比較した。
具体的には、エタノール３％とアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ寒天培地と、エタノール３％、酢酸３％とアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する１００ｍｌのＹＰＧ培地のそれぞれに、ｐＧＡＤＨを有する形質転換株とシャトルベクターｐＵＦ１０６を有する元株を接種し、３０℃で振とう培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することにより比較した。酢酸を含む培地における元株及び形質転換株の増殖量の経時的変化を濁度（optical density：ＯＤ）で測定した結果を図２に示す。
【００５４】
その結果、酢酸を含有しない培地では形質転換株及び元株はほぼ同様の増殖が可能であった。しかし、図２から明らかな通り、酢酸を含む培地では、形質転換株は増殖が可能であるのに対して、元株であるアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株は増殖できないことが確認でき、酢酸耐性増強遺伝子の酢酸耐性増強機能が確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明の酢酸耐性増強遺伝子の制限酵素地図及びプラスミドｐＧＡＤＨへの挿入断片の概略を示した図である。
【図２】酢酸を含む培地における元株及び形質転換株の増殖量の経時的変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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