(57)【要約】【課題】  安価にヘテロオリゴ糖を提供する。【解決手段】  澱粉及び／又は澱粉加水分解物と、糖アルコール、グルコース以外の単糖、あるいは澱粉の酵素加水分解物であってグルコースがα−１，４結合及び／又はα−１，６結合したオリゴ糖以外のオリゴ糖とを含む混合糖液にα−アミラーゼを作用させることを特徴とするオリゴ糖組成物の製造方法；前記方法で製造したオリゴ糖組成物に、β−アミラーゼ又はグルコアミラーゼを作用させることを特徴とするオリゴ糖組成物の製造方法；前記方法で製造されるオリゴ糖組成物；前記オリゴ糖組成物から得られるヘテロオリゴ糖；前記オリゴ糖組成物又はヘテロオリゴ糖を含む糖組成物；並びに前記オリゴ糖組成物、ヘテロオリゴ糖又は糖組成物を含有する食品、飲料、調味料、味質改善剤、口腔衛生用組成物、化粧品、飼料又は洗髪用組成物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
澱粉及び／又は澱粉加水分解物と少なくとも１種の糖アルコールとを含む混合糖液にα−アミラーゼを作用させて、グルコースに糖アルコールが結合したグルコシル・ヘテロオリゴ糖、及びマルトオリゴ糖の還元末端側グルコースに糖アルコールが結合したマルトオリゴシル・ヘテロオリゴ糖を含むオリゴ糖組成物を得ることを特徴とするオリゴ糖組成物の製造方法。
【請求項２】
澱粉及び／又は澱粉加水分解物と、グルコース以外の少なくとも１種の単糖とを含む混合糖液にα−アミラーゼを作用させて、グルコースにグルコース以外の単糖が結合したグルコシル・ヘテロオリゴ糖、及びマルトオリゴ糖の還元末端側グルコースにグルコース以外の単糖が結合したマルトオリゴシル・ヘテロオリゴ糖を含むオリゴ糖組成物を得ることを特徴とするオリゴ糖組成物の製造方法。
【請求項３】
澱粉及び／又は澱粉加水分解物と、澱粉の酵素加水分解物であってグルコースがα−１，４結合及び／又はα−１，６結合したオリゴ糖以外の少なくとも１種のオリゴ糖とを含む混合糖液にα−アミラーゼを作用させて、グルコースに、澱粉の酵素加水分解物であってグルコースがα−１，４結合及び／又はα−１，６結合したオリゴ糖以外のオリゴ糖が結合したグルコシル・ヘテロオリゴ糖、及びマルトオリゴ糖の還元末端側グルコースに、澱粉の酵素加水分解物であってグルコースがα−１，４結合及び／又はα−１，６結合したオリゴ糖以外のオリゴ糖が結合したマルトオリゴシル・ヘテロオリゴ糖を含むオリゴ糖組成物を得ることを特徴とするオリゴ糖組成物の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法で製造したオリゴ糖組成物に、β−アミラーゼを作用させて、マルトシル・ヘテロオリゴ糖を含むオリゴ糖組成物を得ることを特徴とするオリゴ糖組成物の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法で製造したオリゴ糖組成物に、グルコアミラーゼを作用させて、グルコシル・ヘテロオリゴ糖を含むオリゴ糖組成物を得ることを特徴とするオリゴ糖組成物の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法で製造されるヘテロオリゴ糖を含むオリゴ糖組成物。
【請求項７】
請求項６記載のオリゴ糖組成物から得られるヘテロオリゴ糖。
【請求項８】
請求項６記載のオリゴ糖組成物又は請求項７記載のヘテロオリゴ糖を含む糖組成物。
【請求項９】
次式（Ｉ）：
【化１】
2005278457.tif 000004
（式中、Ｒは糖アルコール、グルコース以外の単糖、又は澱粉の酵素加水分解物であってグルコースがα−１，４結合及び／又はα−１，６結合したオリゴ糖以外のオリゴ糖を表す。）
で示されるマルトシル・ヘテロオリゴ糖。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法で製造されるオリゴ糖組成物から得られる請求項９記載のマルトシル・ヘテロオリゴ糖。
【請求項１１】
次式（II）：
【化２】
2005278457.tif 000005
（式中、Ｒは糖アルコール、グルコース以外の単糖、又は澱粉の酵素加水分解物であってグルコースがα−１，４結合及び／又はα−１，６結合したオリゴ糖以外のオリゴ糖を表す。）
で示されるグルコシル・ヘテロオリゴ糖。
【請求項１２】
請求項１〜３、５のいずれか１項に記載の方法で製造されるオリゴ糖組成物から得られる請求項１１記載のグルコシル・ヘテロオリゴ糖。
【請求項１３】
請求項６記載のオリゴ糖組成物、請求項７記載のヘテロオリゴ糖、請求項８記載の糖組成物、請求項９又は１０記載のマルトシル・ヘテロオリゴ糖、及び請求項１１又は１２記載のグルコシル・ヘテロオリゴ糖から選ばれる少なくとも１種を含有する食品、飲料、調味料、味質改善剤、口腔衛生用組成物、化粧品、飼料又は洗髪用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マルトオリゴ糖の還元末端側グルコースに糖アルコールが結合したヘテロオリゴ糖、又はグルコース以外の単糖が結合したヘテロオリゴ糖、更に澱粉の酵素加水分解物であってグルコースがα−１，４結合及び／又はα−１，６結合したオリゴ糖以外のオリゴ糖が結合したヘテロオリゴ糖など、ヘテロオリゴ糖組成物の製造法に関し、並びにそれらのヘテロオリゴ糖類に関する。また、本発明は前記のヘテロオリゴ糖類にβ−アミラーゼを作用させて生成するマルトシル・ヘテロオリゴ糖の製造法、グルコアミラーゼを作用させて生成するグルコシル・ヘテロオリゴ糖の製造法、並びにそれらのマルトシル・ヘテロオリゴ糖類及びグルコシル・ヘテロオリゴ糖類に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、酵素の転移反応を利用して種々のオリゴ糖が開発されてきた。カップリングシュガー、フラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖などである。カップリングシュガーは、澱粉を原料とし受容体としてショ糖を共存させシクロデキストリン合成酵素（以下、CGTaseと称する）の転移反応により製造されている。フラクトオリゴ糖はショ糖を原料及び受容体としてβ−フルクトフラノシダーゼ（以下、β-FFaseと称する）の転移反応により製造されている。乳果オリゴ糖は原料をショ糖とし受容体のラクトースを共存させβ-FFaseの転移反応により製造されている。ガラクトオリゴ糖は、乳糖を原料及び受容体としてβ−ガラクトシダーゼの転移反応により製造されている。ゲンチオオリゴ糖はグルコースを原料にして、β−グルコシダーゼの縮合・転移反応により製造されている。このように種々の酵素の転移反応を利用して、様々なオリゴ糖が製造されている。
【０００３】
これらのオリゴ糖についてはその生理機能が調べられており、カップリングシュガーは低ウ蝕性、ゲンチオオリゴ糖は整腸作用が認められている。また、フラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖、ガラクトオリゴ糖は整腸作用が認められ、厚生省から特定保健用食品として認可されているほかに、便性状の改善や免疫賦活効果、大腸癌抑制、ミネラル吸収促進などの生理機能も知られている。
【０００４】
本発明者らは、原料（供与体）としてプルランを用い、受容体として糖アルコール類などを共存させた混合糖液に、α−アミラーゼを作用させて、パノースの還元末端側のグルコース残基に糖アルコール類などが結合したヘテロオリゴ糖組成物を製造する方法について特許出願をしている（特許文献１）。
【０００５】
しかし、特許文献１に記載した方法では原料であるプルランが高価であるため、得られるヘテロオリゴ糖も高価となる。
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−２１５８９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、より安価にヘテロオリゴ糖を提供するため、鋭意研究を進めた結果、澱粉及び／又は澱粉加水分解物に糖アルコール、又はグルコース以外の単糖、更に澱粉の酵素加水分解物であってグルコースがα−１，４結合及び／又はα−１，６結合したオリゴ糖以外のオリゴ糖を受容体として共存させた状態で、α−アミラーゼ（EC 3.2.1.1）を作用させると、従来知られていない新規なヘテロオリゴ糖が生成することを見出した。更に、生成したヘテロオリゴ糖にβ−アミラーゼ（EC 3.2.1.2）を作用させると新規なマルトシル・ヘテロオリゴ糖が、又グルコアミラーゼ（EC 3.2.1.3）を作用させると新規なグルコシル・ヘテロオリゴ糖が効率よく得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
これまでに、オリゴ糖あるいは配糖体の製造法として糖転移酵素又は加水分解酵素による糖転移反応や脱水縮合反応を利用する方法が開発されている。本発明では、加水分解酵素であるα−アミラーゼ（EC 3.2.1.1）の糖転移反応を利用し、従来知られていないヘテロオリゴ糖を製造できる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）澱粉及び／又は澱粉加水分解物と少なくとも１種の糖アルコールとを含む混合糖液にα−アミラーゼを作用させて、グルコースに糖アルコールが結合したグルコシル・ヘテロオリゴ糖、及びマルトオリゴ糖の還元末端側グルコースに糖アルコールが結合したマルトオリゴシル・ヘテロオリゴ糖を含むオリゴ糖組成物を得ることを特徴とするオリゴ糖組成物の製造方法。
【００１０】
（２）澱粉及び／又は澱粉加水分解物と、グルコース以外の少なくとも１種の単糖とを含む混合糖液にα−アミラーゼを作用させて、グルコースにグルコース以外の単糖が結合したグルコシル・ヘテロオリゴ糖、及びマルトオリゴ糖の還元末端側グルコースにグルコース以外の単糖が結合したマルトオリゴシル・ヘテロオリゴ糖を含むオリゴ糖組成物を得ることを特徴とするオリゴ糖組成物の製造方法。
【００１１】
（３）澱粉及び／又は澱粉加水分解物と、澱粉の酵素加水分解物であってグルコースがα−１，４結合及び／又はα−１，６結合したオリゴ糖以外の少なくとも１種のオリゴ糖とを含む混合糖液にα−アミラーゼを作用させて、グルコースに、澱粉の酵素加水分解物であってグルコースがα−１，４結合及び／又はα−１，６結合したオリゴ糖以外のオリゴ糖が結合したグルコシル・ヘテロオリゴ糖、及びマルトオリゴ糖の還元末端側グルコースに、澱粉の酵素加水分解物であってグルコースがα−１，４結合及び／又はα−１，６結合したオリゴ糖以外のオリゴ糖が結合したマルトオリゴシル・ヘテロオリゴ糖を含むオリゴ糖組成物を得ることを特徴とするオリゴ糖組成物の製造方法。
【００１２】
（４）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法で製造したオリゴ糖組成物に、β−アミラーゼを作用させて、マルトシル・ヘテロオリゴ糖を含むオリゴ糖組成物を得ることを特徴とするオリゴ糖組成物の製造方法。
（５）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法で製造したオリゴ糖組成物に、グルコアミラーゼを作用させて、グルコシル・ヘテロオリゴ糖を含むオリゴ糖組成物を得ることを特徴とするオリゴ糖組成物の製造方法。
【００１３】
（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法で製造されるヘテロオリゴ糖を含むオリゴ糖組成物。
（７）前記（６）に記載のオリゴ糖組成物から得られるヘテロオリゴ糖。
（８）前記（６）に記載のオリゴ糖組成物又は前記（７）に記載のヘテロオリゴ糖を含む糖組成物。
【００１４】
（９）次式（Ｉ）：
【化１】
2005278457.tif 000002
（式中、Ｒは糖アルコール、グルコース以外の単糖、又は澱粉の酵素加水分解物であってグルコースがα−１，４結合及び／又はα−１，６結合したオリゴ糖以外のオリゴ糖を表す。）
で示されるマルトシル・ヘテロオリゴ糖。
【００１５】
（１０）前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法で製造されるオリゴ糖組成物から得られる前記（９）に記載のマルトシル・ヘテロオリゴ糖。
【００１６】
（１１）次式（II）：
【化２】
2005278457.tif 000003
（式中、Ｒは糖アルコール、グルコース以外の単糖、又は澱粉の酵素加水分解物であってグルコースがα−１，４結合及び／又はα−１，６結合したオリゴ糖以外のオリゴ糖を表す。）
で示されるグルコシル・ヘテロオリゴ糖。
【００１７】
（１２）前記（１）〜（３）及び（５）のいずれかに記載の方法で製造されるオリゴ糖組成物から得られる前記（１１）に記載のグルコシル・ヘテロオリゴ糖。
（１３）前記（６）に記載のオリゴ糖組成物、前記（７）に記載のヘテロオリゴ糖、前記（８）に記載の糖組成物、前記（９）又は（１０）に記載のマルトシル・ヘテロオリゴ糖、及び前記（１１）又は（１２）に記載のグルコシル・ヘテロオリゴ糖から選ばれる少なくとも１種を含有する食品、飲料、調味料、味質改善剤、口腔衛生用組成物、化粧品、飼料又は洗髪用組成物。
【発明の効果】
【００１８】
本発明で得られるヘテロオリゴ糖は、澱粉及び／又は澱粉加水分解物と受容体を原料として、糖転移反応により生成するグルコース及びマルトオリゴ糖に糖アルコールが結合したヘテロオリゴ糖類、及び同じくグルコース以外の単糖が結合したヘテロオリゴ糖類、更に同じく澱粉の酵素加水分解物であってグルコースがα−１，４結合及び／又はα−１，６結合したオリゴ糖以外のオリゴ糖が結合したヘテロオリゴ糖類であり、又得られた各種ヘテロオリゴ糖類をβ−アミラーゼ処理して調製されたマルトシル・ヘテロオリゴ糖やグルコアミラーゼ処理して調製されたグルコシル・ヘテロオリゴ糖であって、今までに知られていない新規な構造を有した糖質である。従って、使用する受容体を選択すれば、製造されたヘテロオリゴ糖類は難消化性であり、低カロリーであると同時に整腸作用などの生理作用の機能性も期待できるし、食品、飲料、調味料として、また味質改善剤や口腔衛生用組成物としても期待できる。更に、これら糖質の保湿作用により化粧品やシャンプー、リンスなどの洗髪用組成物へも有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のヘテロオリゴ糖とは、受容体が共存した澱粉及び／又は澱粉加水分解物にα−アミラーゼ（EC 3.2.1.1）を作用させた後に得られるグルコース及びα−１，４結合からなるマルトオリゴ糖の還元末端側のグルコシル残基に、糖アルコール、又はグルコース以外の単糖、あるいは澱粉の酵素加水分解物であってグルコースがα−１，４結合及び／又はα−１，６結合したオリゴ糖以外のオリゴ糖が結合した糖質のことをいう。
【００２０】
α−アミラーゼの糖転移反応における原料（供与体）としては、少なくともマルトトリオースを含むα−１，４結合からなるマルトオリゴ糖を用いることができるが、通常澱粉及び／又は澱粉加水分解物を用いる。澱粉加水分解物としては、酵素処理あるいは酸処理により澱粉を可溶化した糖液が使用できる。受容体である糖アルコール、又はグルコース以外の単糖、あるいは澱粉の酵素加水分解物であってグルコースがα−１，４結合及び／又はα−１，６結合したオリゴ糖以外のオリゴ糖は、市販品を用いることができる。もちろん、それぞれの物質を含む天然物から、酸分解や酵素分解、酵素合成などで調製される糖類も使用できる。供与体と受容体の混合物は、澱粉及び／又は澱粉加水分解物と、前記の受容体のうち、１種あるいは２種以上とを適当な比率に混合して利用できる。しかしながら、本発明は供与体と受容体の数、比率は限定されるものではない。
【００２１】
澱粉加水分解物は酵素や酸処理で得られるが、工業的には酵素液化法が多く採用されている。酵素液化法の一例を示すと、澱粉に水酸化カルシウム及び／又は水酸化ナトリウムを加えてｐＨ６．３に調整した後、α−アミラーゼ（商品名：ターマミル１２０Ｌ、ノボザイム  ジャパン）を対澱粉０．０５％（ｗ／ｗ）加えて、ジェットクッカーでクッキング（１０５℃、５分間）し、更に９５℃で１時間反応させて得られる液化液〔DE（Dextrose Equivalent）＝７〕にシュウ酸を加えて反応を停止したものがある。しかしながら、本発明において、澱粉加水分解物の製造方法、澱粉加水分解物のDEは限定されるものではない。
【００２２】
受容体である糖アルコールとしては、ソルビトール、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ガラクチトール、アラビニトール、ラクチトール、パラチニット、リビトール、トレイトール、アリトール、イソマルチトール、イノシトール、クエルシトール、イノソース、マルチトール、還元澱粉糖化物等が挙げられる。更に、単糖としては、果糖、マンノース、ガラクトース、タロース、ソルボース、タガトース、デオキシグルコース、プシコース、フコース、ラムノース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、キシロース、アラビノース、リボース、デオキシリボース、リキソース、N−アセチルグルコサミン、グルコサミンなどが挙げられ、オリゴ糖類としてセロビオース、キシロビオース、メリビオース、キトビオース、キチビオース、ラクチュロース、ゲンチオビオース、パラチノース、トレハロース、トレハルロース、コウジビオース、ニゲロース、ラミナリビオース、ビシアノース、プリメブロース、ロジメナビオース、ラクトース、ラフィノース、スタキオース、ツラノース、ソホロース、アロラクトース、カップリングシュガー、パラチノースオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、セロオリゴ糖、キシロオリゴ糖などが挙げられる。
【００２３】
本発明で使用するα−アミラーゼは本来加水分解酵素であるが、受容体を添加すると加水分解反応と競合して糖転移反応を触媒する。ヘテロオリゴ糖組成物を製造するには、受容体濃度が高い程よい。
【００２４】
糖転移反応に用いるα−アミラーゼ（EC 3.2.1.1）は、上述の受容体が共存した澱粉及び／又は澱粉加水分解物に作用させた場合、転移反応により還元末端側のグルコース残基に受容体が結合したヘテロオリゴ糖を生成するものであればよく、酵素の起源、種類は限定されない。使用できる酵素としては、好熱性放線菌であるサーモアクチノマイセス・ブルガリス（Thermoactinomyces vulgaris）のα−アミラーゼII（以下、ＴＶＡ IIと称する。）及び同じくα−アミラーゼＩ（ＴＶＡ Ｉ）が挙げられる。その他、使用できる酵素としてはバチラス（Bacillus）属由来のネオプルラナーゼ（EC 3.2.1.135）〔H. Takata et al., J. Biol. Chem., 267, 18447-52（1992） ： T. Kuriki et al., J. Biol. Chem., 271, 17321-9（1996）〕などのプルランからパノースを生成するアミラーゼも挙げられる。また、これら反応に使用する酵素は精製純化されたものである必要はなく、酵素を生産する菌体、もしくは菌体を超音波等で処理をした菌体破砕物を粗酵素として使用することができる。
【００２５】
糖転移反応により得られたヘテロオリゴ糖を更に分解してマルトシル・ヘテロオリゴ糖を製造するには、マルトトリオースを分解できない植物起源のβ−アミラーゼが好ましい。例えば、コムギ、大麦、ダイズ、サツマイモ、コメ由来のβ−アミラーゼが利用できる。しかし、酵素の起源は限定されるものではなく、バチラス（Bacillus）属のβ−アミラーゼなど、微生物起源の酵素を使用することもできる。
【００２６】
更にまた、ヘテロオリゴ糖を分解してグルコシル・ヘテロオリゴ糖を製造するには、アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）由来のグルコアミラーゼが好ましい。しかし、酵素の起源は限定されるものではなく、アスペルギルス（Aspergillus）属、リゾプス（Rhizopus）属、バチラス（Bacillus）属、エンドマイセス（Endomyces）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属などのグルコアミラーゼを使用することができる。
【００２７】
糖転移反応によるヘテロオリゴ糖類製造の反応条件としては、酵素の作用ｐＨ及び温度範囲であればいずれの条件でもよいが、反応液のｐＨは４〜７、温度は２０〜８０℃が望ましい。また、必要に応じて有機溶媒などの添加も可能である。使用される酵素量は反応時間と密接な関係にあるので、通常は１〜１００時間で反応が終了するような酵素量が望まれる。酵素濃度は、使用する酵素の種類や純度で大きく異なるが、通常、０．００００１重量％〜１重量％である。
【００２８】
糖転移反応により得られるヘテロオリゴ糖を含むオリゴ糖組成物、あるいはヘテロオリゴ糖のβ−アミラーゼ処理により製造したマルトシル・ヘテロオリゴ糖やグルコアミラーゼ処理により製造したグルコシル・ヘテロオリゴ糖などを含むオリゴ糖組成物は、常法に従い、活性炭による脱色及びイオン交換樹脂による脱塩などの精製工程を経て、そのままオリゴ糖組成物として利用できる。更に、必要に応じて各種クロマトグラフィーや膜分離により目的とするヘテロオリゴ糖を高純度に精製分離することができる。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明の詳細について実施例を挙げて説明するが、本発明は下記実施例により、その技術的範囲が限定されるものではない。
【００３０】
実施例１
コーンスターチを３０重量％の濃度で水に溶解してスラリーとし、酵素の安定剤としてＣａが５０ｐｐｍ以上になるように５重量％の水酸化カルシウムを添加後、更に４重量％の水酸化ナトリウムを加えてｐＨを６．３に調整した。次いで耐熱性α−アミラーゼ（商品名：ターマミル１２０Ｌ、ノボザイム  ジャパン）を対澱粉０．０５％（ｗ／ｗ）加えて、ジェットクッカーでクッキング（１０５℃、５分間）した後、９５℃に保持して１時間液化反応を進めた。反応終了後、２Ｎの塩酸でｐＨ４．０に調節して反応を停止してから、室温まで冷却した。得られた澱粉加水分解物１．５ｋｇに４重量％の水酸化ナトリウムを添加してｐＨ６．０に調整した後、エリスリトール（meso-Erythritol）を４８０ｇ、ＴＶＡ II（特開平７−２５８９１号公報に記載した方法で生産したものを使用した）３６０Unitsを添加して５０℃で９６時間反応させた。得られたヘテロオリゴ糖組成物を薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと称する）で分析すると、図１に示すように、糖転移反応物と思われる４つのスポット（Ｒｆ値＝０．８９、０．７１、０．５０、０．３２）が確認された。（Ｒｆ値＝０．８９、０．７１をそれぞれ糖転移物(1)、(2)と称する。）
【００３１】
薄層クロマトグラフィーはシリカゲル６０Ｆ２５４プレート（Merck）を使用し、展開はアセトニトリル：酢酸エチル：２−プロパノール：水＝８５：２０：５０：２０の溶媒（以下、展開溶媒(1)と称する。）で３回展開、若しくは１−ブタノール：エタノール：水＝２：２：１の溶媒（以下、展開溶媒(2)と称する。）で２回展開して行った。検出は５％硫酸／メタノールを噴霧した後にホットプレート上でＴＬＣプレートを加熱して行った。Ｒｆ（Rate of Flow）値はグルコースの移動度を１．００としたときの相対値で示した。図１のＴＬＣでは展開溶媒(1)を使用した。
【００３２】
エリスリトールが転移したヘテロオリゴ糖を含むオリゴ糖組成物  １０ｇ（固形分として）にシュウ酸を添加してｐＨ５．５に調整した。β−アミラーゼ（商品名：OPTIMALT BBA、Genencor International）を固形分に対して０．０２％（ｗ／ｗ）添加して６０℃で２４時間反応させた。エタノール沈殿で高分子物質を除去した後、ロータリーエバポレーターで濃縮しエタノールを除去した。濃縮した糖組成物を活性炭素カラム（φ６×７０ｃｍ）上に添加した。０〜５％（ｖ／ｖ）エタノールの直線濃度勾配により溶出させて、１０ｍｌ／tubeになるようにフラクションを集めた。各フラクションをＴＬＣで分析し、糖転移物(1)と(2)を含んでいたフラクションを別々に集めて３０重量％まで濃縮した。
【００３３】
糖転移物(1)と(2) ６０ｍｇ（固形分として）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）１．２ｍｌに溶解し、過剰量のグルコアミラーゼ（from Rhizopus sp.、生化学工業）１０００Unitsを添加して４０℃で反応させた。時間毎に、反応液を採取し１０分間煮沸することで反応を停止した。展開溶媒(1)を用いて反応生成物をTLCで分析した。糖転移物(1)は加水分解されなかったが、糖転移物(2)は加水分解されてグルコースと糖転移物(1)を生じた（図２）。この結果から糖転移物(1)はグルコシルエリスリトール、糖転移物(2)はマルトシルエリスリトールと推定した。
【００３４】
糖転移物(1)と(2)の核磁気共鳴スペクトル（以下、ＮＭＲスペクトルと称する。）を測定した。その結果、転移物(1)はグルコシルエリスリトール（図３、４）、糖転移物(2)はマルトシルエリスリトール（図５、６）と決定した。なお、ＮＭＲスペクトルはＪＥＯＬ  ＪＮＭ−ＡＬ４００（日本分光）を用い測定した。サンプルは少量のアセトンを加えた重水（Aldrich）に溶解した。基準ピークはアセトンのメチル基とし、１Ｈ−ＮＭＲで２．０４ｐｐｍ、１３Ｃ−ＮＭＲで２９．８ｐｐｍとした。
【００３５】
前述のように、ＴＬＣによる分析では４つの糖転移物と思われるスポットが検出されており、Ｒｆ値＝０．８９と０．７１のスポットはグルコシルエリスリトールとマルトシルエリスリトールであると確認された。従って、Ｒｆ値＝０．５０と０．３２のスポットはマルトトリオシルエリスリトールとマルトテトラオシルエリスリトールであると思われる。
【００３６】
更に、エリスリトールが転移したヘテロオリゴ糖を含むオリゴ糖組成物に、前述のグルコアミラーゼを作用させて得られるオリゴ糖組成物を高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと称する）で分析した。
ＨＰＬＣの分析条件は下記の通りである。
カラム：  SUGAR KS-802（φ8×300mm×2）（昭和電工）
移動相：  H2O
流  速：  1.0ml/min
温  度：  80℃
検出器：  RI Detector 504R （GL Science）
【００３７】
ＨＰＬＣのクロマトグラムから推算すると、グルコシルエリスリトールの面積比は、糖類全体の面積比に対して１５．６％であった。
【００３８】
実施例２
実施例１と同様に澱粉加水分解物１．５ｋｇを調製し、４重量％の水酸化ナトリウムを添加してｐＨ６．０とした後、キシリトールを４８０ｇ、ＴＶＡ II ３６０Unitsを添加して５０℃で９６時間反応した。得られたヘテロオリゴ糖組成物をＴＬＣで分析し、糖転移化合物(3)及び(4)（Ｒｆ値＝０．５５、０．２７）のスポットが確認された（図７）。（展開溶媒(1)を使用。）
【００３９】
糖転移物(3)と(4)を含むヘテロオリゴ糖組成物を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）０．０５ｍｌに溶解して終濃度が５重量％となるように希釈し、グルコアミラーゼ０．６Unitsを添加して４０℃で反応させた。時間毎に、反応液を採取し１０分間煮沸して反応を停止した。展開溶媒(1)を用いて反応生成物をＴＬＣで分析すると、糖転移物(3)（GlcXyli）は加水分解されなかったが、糖転移物(4)（MalXyli）は加水分解された（図８）。この結果から糖転移物(3)はグルコシルキシリトール、糖転移物(4)はマルトシルキシリトールと思われた。
【００４０】
更に、キシリトールが転移したヘテロオリゴ糖を含むオリゴ糖組成物に、前述のグルコアミラーゼを作用させて得られるオリゴ糖組成物をＨＰＬＣで分析すると、グルコシルキシリトールの面積比は、糖類全体の面積比に対して１５．０％であった。
【００４１】
実施例３
実施例１と同様に澱粉加水分解物１．５ｋｇを調製し、４重量％の水酸化ナトリウムを添加してｐＨ６．０とした後、単糖としてキシロース、ガラクトース、マンノースをそれぞれ４８０ｇ、ＴＶＡ II ３６０Unitsを添加して５０℃で９６時間反応した。マルトオリゴ糖にそれぞれ、キシロース、ガラクトース、マンノースが結合したヘテロオリゴ糖組成物を得た。得られたヘテロオリゴ糖組成物をＴＬＣで分析し、糖転移化合物を確認した。グルコース及びマルトオリゴ糖にキシロースが結合したヘテロオリゴ糖のスポットはＲｆ値＝０．８６、ガラクトースが結合したヘテロオリゴ糖のスポットはＲｆ値＝０．６８とＲｆ値＝０．５９、マンノースが結合したヘテロオリゴ糖のスポットはＲｆ値＝０．９２とＲｆ値＝０．８１であった（図９）。（展開溶媒(2)を使用。）
【００４２】
更に、キシロース、ガラクトース、マンノースが転移したヘテロオリゴ糖を含むオリゴ糖組成物に、前述のグルコアミラーゼを作用させて得られる各オリゴ糖組成物をＨＰＬＣで分析すると、グルコシルキシロース、グルコシルガラクトース、グルコシルマンノースの各面積比は各オリゴ糖組成物の糖類全体の面積比に対して、それぞれ１３．６％、１０．７％、１６．６％であった。
【００４３】
実施例４
実施例１と同様に澱粉加水分解物１．５ｋｇを調製し、４重量％の水酸化ナトリウムを添加してｐＨ６．０とした後、トレハロース、セロビオース、ラクトースを４８０ｇ、ＴＶＡ II ３６０Unitsを添加して５０℃で９６時間反応した。得られたヘテロオリゴ糖組成物をＴＬＣで分析し、糖転移化合物を確認した。グルコース及びマルトオリゴ糖にトレハロースが結合したヘテロオリゴ糖のスポットはＲｆ値＝０．７７とＲｆ値＝０．６６、セロビオースが結合したヘテロオリゴ糖のスポットはＲｆ値＝０．６０とＲｆ値＝０．５０、ラクトースが結合したヘテロオリゴ糖のスポットはＲｆ値＝０．５７とＲｆ値＝０．４８であった（図１０）。（展開溶媒(2)を使用。）
【００４４】
更に、トレハロース、セロビオース、ラクトースが転移したヘテロオリゴ糖を含むオリゴ糖組成物に、前述のグルコアミラーゼを作用させて得られる各オリゴ糖組成物をＨＰＬＣで分析すると、グルコシルトレハロース、グルコシルセロビオース、グルコシルラクトースの各面積比は各オリゴ糖組成物の糖類全体の面積比に対して、それぞれ２２．９％、２３．９％、１７．１％であった。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】実施例１における反応生成物をＴＬＣで分析した図である。レーン１は澱粉加水分解物、レーン２はエリスリトール（Ery）、レーン３はエリスリトールを共存させた澱粉加水分解物にＴＶＡ IIを作用させたもの、レーン４はレーン３のサンプルにグルコアミラーゼを作用させたもの、レーン５はレーン３のサンプルにβ−アミラーゼを作用させたものを表す。
【図２】活性炭素カラムで精製した糖転移物(1)と(2)をグルコアミラーゼ処理した図である。レーン１は糖転移物(1)にグルコアミラーゼを作用させないサンプル、レーン２はグルコアミラーゼを作用させて２０分後のサンプル、レーン３は同じく２４時間後のサンプル、レーン４は糖転移物(2)にグルコアミラーゼを作用させないサンプル、レーン５はグルコアミラーゼを作用させて２０分後のサンプル、レーン６は同じく２４時間後のサンプルを表す。
【図３】グルコシルエリスリトールの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの図である。
【図４】グルコシルエリスリトールの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの図である。
【図５】マルトシルエリスリトールの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの図である。
【図６】マルトシルエリスリトールの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの図である。
【図７】実施例２における反応生成物をＴＬＣで分析した図である。レーン１は澱粉加水分解物、レーン２はキシリトール（Xyli）、レーン3はキシリトールが共存した澱粉加水分解物にＴＶＡ IIを作用させたものを表す。
【図８】糖転移物(3)と(4)を含むヘテロオリゴ糖組成物にグルコアミラーゼ作用させた図である。レーン１はグルコアミラーゼを作用させないサンプル、レーン２はグルコアミラーゼを作用させて５分後のサンプル、レーン３は同じく２時間後のサンプル、レーン４はグルコシルエリスリトールを表す。
【図９】実施例３における反応生成物をＴＬＣで分析した図である。レーン１は澱粉加水分解物にＴＶＡ IIを作用させたもの、レーン２はキシロース、レーン３はキシロースが共存した澱粉加水分解物にＴＶＡ IIを作用させたもの、レーン４はガラクトース、レーン５はガラクトースが共存した澱粉加水分解物にＴＶＡ IIを作用させたもの、レーン６はマンノース、レーン７はマンノースが共存した澱粉加水分解物にＴＶＡ IIを作用させたものを表す。
【図１０】実施例４における反応生成物をＴＬＣで分析した図である。レーン１は澱粉加水分解物にＴＶＡ IIを作用させたもの、レーン２はトレハロース、レーン３はトレハロースが共存した澱粉加水分解物にＴＶＡ IIを作用させたもの、レーン４はセロビオース、レーン５はセロビオースが共存した澱粉加水分解物にＴＶＡ IIを作用させたもの、レーン６はラクトース、レーン７はラクトースが共存した澱粉加水分解物にＴＶＡ IIを作用させたものを表す。
【符号の説明】
【００４６】
Ｍ  マルトオリゴ糖（マーカーとして使用した。）
Ｇ１  グルコース
Ｇ２  マルトース
Ｇ３  マルトトリオース
Ｇ４  マルトテトラオース
Ｇ５  マルトペンタオース
Ｇ６  マルトヘキサオース
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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