(57)【要約】  【課題】  蛍光を発現する物質が測定対象であっても、励起光の波長を変えることなく、かつ、物性の変化も生じることなく、蛍光妨害を回避して所定のラマンスペクトルを得ることができるようにする。  【解決手段】  基板７の少なくともサンプルセット面７ａをラマン散乱光及び蛍光を発現しない材質から形成するとともに、このサンプルセット面７ａ上にセットするサンプルとして、原サンプルＳを焦点位置より下方部への蛍光が生じないように薄膜化処理した薄膜サンプルＳ１を使用し、この薄膜サンプルＳ１にレーザ光を照射してラマンスペクトルを測定する。  【選択図】      図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上にセットされたサンプルの焦点位置にレーザ光を照射して、その焦点位置から発散されるレイリー散乱光とラマン散乱光のエネルギー差でラマンスペクトルを求める共焦点顕微ラマン分光分析方法であって、
前記基板として、その少なくともサンプルセット面がラマン散乱光及び蛍光を発現しない材質から形成されたものを使用し、このサンプルセット面上に、原サンプルを前記焦点位置より下方部からの蛍光影響が生じないように薄膜化処理した薄膜サンプルをセットし、この薄膜サンプルにレーザ光を照射してラマンスペクトルを求めることを特徴とする共焦点顕微ラマン分光分析方法。
【請求項２】
前記原サンプルを薄膜化処理する方法が、ラマン散乱光及び蛍光を発現しない硬質材料から形成された基板の前記セット面上で原サンプルを押し潰す方法、原サンプルを溶媒に溶かして基板の前記セット面上に塗布したのちに溶媒を蒸発させる方法、蒸着作成可能な原サンプルにおいてその蒸着量をコントロールする方法、液相の原サンプルを薄く引き延ばして塗布する方法の中から選択された一つである請求項１に記載の共焦点顕微ラマン分光分析方法。
【請求項３】
前記薄膜サンプルは、一定波長のもとでの蛍光強度／ラマン散乱光強度が、１０／１以下となるように薄膜化処理されたものである請求項１又は２に記載の共焦点顕微ラマン分光分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、各種物質の組成や化学構造等を分析する場合に適用されるラマン分光分析方法の一つで、基板上にセットされたサンプルの焦点位置にレーザ光（励起光）を照射して、その焦点位置から発散されるレイリー散乱光とラマン散乱光（測定光）のエネルギー差（波数）でラマンスペクトルを求め、分子や結晶の化学的結合の振動エネルギー状態を測定する共焦点顕微ラマン分光分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
この種の汎用分析方法としては、赤外線吸収分光分析法（ＩＲ分光分析法）とラマン分光分析法が一般的であるが、ＩＲ分光分析法は水やガラス等の赤外線吸収による影響が強い一方、ラマン分光分析法は励起光及び測定光（ラマン散乱光）としてこれらの妨害が少ない可視光を使用できるため、バイオ分野の分析に有効である。
【０００３】
ところで、ラマン分光分析の場合は非常に微弱なラマン散乱光を捕らえねばならず、その微弱なラマン散乱光を捕らえやすくするために、励起光のエネルギーを強くすると、サンプルから発する蛍光も強くなるため、ラマンピークが隠蔽され認識しにくくなるという問題がある。特に、バイオ分野のサンプルでは、乾燥させることで蛍光の影響が顕著になる場合が少なくない。
【０００４】
上記のようなラマン分光分析法における問題の一つである蛍光妨害を回避する手段として、従来、（１）励起光の波長を変えて測定する方法、すなわち、励起光の波長をシフトさせ、これに伴ってラマン散乱光の波長もシフトさせて測定する方法、（２）サンプルを水中に入れる、あるいは、サンプルを十分な湿潤状態として測定する方法、が提案されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
【非特許文献１】横山政昭，田村典洋著、”顕微レーザラマン分光分析装置 LabRamによるバイオサンプル分析”、「Readout No.24 」、平成１４年３月  株式会社堀場製作所発行、ｐ５４−５７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上記した従来の蛍光妨害回避手段のうち、（１）の方法では、励起光の波長をシフトさせても蛍光の波長は変化しないので、蛍光の発現しない波長域にラマン散乱光が生じるように励起波長を設定できれば蛍光妨害を回避することが可能であるが、そのような効果的な励起波長の選択は技術的に非常に難しい。また、励起光の波長変化によってラマンスペクトルに変化が発生する可能性がある。特に、蛍光発現の少ない長波長の励起ではラマンスペクトルの多くのピークが発現しにくくなるため、高感度かつ高性能な分析を実現することができないという問題がある。
【０００７】
また、（２）の方法では、蛍光発現が減少するものもあるが、適応可能な物質が少ないとともに、水分の浸漬により測定対象物質そのものの物性が変化する可能性が高く、物性の変化に伴い所定どおりのラマンスペクトルが得られず、その結果、蛍光発現の減少は図れても（１）と同様に、高感度かつ高性能な分析を実現することができないという問題がある。
【０００８】
本発明は上述の諸事情に鑑みてなされたもので、その目的は、測定対象物質が蛍光を発現するものであっても、励起光の波長を変えることなく、かつ、物性の変化も生じることなく、蛍光妨害を回避して所定のラマンスペクトルを得ることができ、高感度かつ高性能な分析を実現できる共焦点顕微ラマン分光分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明に係る共焦点顕微ラマン分光分析方法は、基板上にセットされたサンプルの焦点位置にレーザ光を照射して、その焦点位置から発散されるレイリー散乱光とラマン散乱光のエネルギー差でラマンスペクトルを求める共焦点顕微ラマン分光分析方法であって、前記基板として、その少なくともサンプルセット面がラマン散乱光及び蛍光を発現しない材質から形成されたものを使用し、このサンプルセット面上に、原サンプルを前記焦点位置より下方部からの蛍光影響が生じないように薄膜化処理した薄膜サンプルをセットし、この薄膜サンプルにレーザ光を照射してラマンスペクトルを求めることを特徴としている。
【００１０】
ここで、前記原サンプルを薄膜化処理する方法としては、測定対象となる物質に対応して、ラマン散乱光及び蛍光を発現しない硬質材料から形成された基板の前記セット面上で原サンプルを押し潰す方法、原サンプルを溶媒に溶かして基板の前記セット面上に塗布したのちに溶媒を蒸発させる方法、蒸着作成可能な原サンプルにおいてその蒸着量をコントロールする方法、液相の原サンプルを薄く引き延ばして塗布する方法の中から選択された一つを採用すればよい。
【発明の効果】
【００１１】
上記のごとき構成を有する本発明に係る共焦点顕微ラマン分光分析方法によれば、次のような効果を奏する。すなわち、共焦点顕微ラマン分光分析の場合、焦点位置から発散されるレイリー散乱光は励起光の波長と同じ波長であるから、ラマン散乱光のみを測定すればよいが、このラマン散乱光の測定において妨害となる蛍光は励起光の焦点位置だけでなく、基板を含めて焦点位置より下方部の広い範囲に亘って発現し、これがラマン散乱光に重畳して測定されることでラマンピークが隠蔽され認識しにくくなるわけである。このような蛍光妨害の発生メカニズムに着目して鋭意研究の結果、サンプルの厚さ並びに基板のサンプルセット面の材質が蛍光の発現及びその発現範囲に大きく関与していることを知見するに至り、この知見に基づき本発明では、原サンプルをそのまま用いるのではなく、薄膜化処理した薄膜サンプルを用い、かつ、この薄膜サンプルをセットする基板のサンプルセット面をラマン散乱光及び蛍光を発現しない材質から形成することによって、焦点位置より下方部の広い範囲からの蛍光及びラマン散乱光の影響を防いでサンプル自体の焦点位置から上方へのみのラマン散乱光の測定に成功したのである。これによって、蛍光を発現する物質を測定対象とする場合でも、励起光の波長を変えなくても、また、物性変化の可能性がある水分浸漬しなくても、蛍光による妨害を著しく軽減して所定のラマンスペクトルを正確に得ることができ、高感度かつ高性能な分析を実現できるという効果を奏するに至ったのである。
【００１２】
特に、前記薄膜サンプルとして、一定波長のもとでの蛍光強度／ラマン散乱光強度が、１０／１以下となるように薄膜化処理されたものを用いることによって、蛍光妨害を最小限に抑えることができ、同じ測定条件下で比較物質のラマンスペクトルを対比して一層高性能な分析結果を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態を、図面を参照しながら説明する。
図１は本発明に係る共焦点顕微ラマン分光分析方法の実施に用いられる共焦点顕微ラマン分光分析装置の原理構成図であり、同図において、１はレーザ、２は共焦点顕微鏡であり、この共焦点顕微鏡２はノッチフィルタ３、対物レンズ４、ＣＣＤ検出器５、回折格子６Ａ，６Ｂ等の光学系を備えており、レーザ１から発せられたレーザ光Ｘをノッチフィルタ３で反射させるとともに、その反射されたレーザ光Ｘを対物レンズ４を通して基板７上にセットされたサンプルＳ１の焦点位置に照射させ、かつ、そのサンプルＳ１の焦点位置から発散されるレイリー散乱光Ｌ及びラマン散乱光Ｒのうちレーザ光Ｘと波長が異なる微弱なラマン散乱光Ｒのみノッチフィルタ３を透過させるように構成されている。
【００１４】
８は前記共焦点顕微鏡２のノッチフィルタ３を通過したラマン散乱光Ｒを分光させる分光器、９は分光されたラマン散乱光Ｒとレイリー散乱光Ｌ（レーザ光Ｘと同じ波長）とのエネルギー差でラマンスペクトルを測定する検出器であり、この検出器９で測定されたラマンスペクトルをパソコン１０に入力して解析することにより、サンプルＳの組成や化学構造等の分析を行うように構成されている。
【００１５】
上記のような測定原理の共焦点顕微ラマン分光分析方法おいて、本発明では、前記基板７として、ラマン散乱光Ｒ及び蛍光を発現しない硬質材料、例えばステンレス等の金属材料を用い、図２に示すように、その頭部が微小径かつ平坦なサンプルセット面７ａとなる円錐台形状に作製された基板を使用し、この円錐台形状の基板７のサンプルセット面７ａ上に原サンプルＳを薄膜化処理した薄膜サンプルＳ１をセットし、上述したとおりレーザ光Ｘを照射してラマンスペクトルを測定する。
【００１６】
ここで、前記薄膜サンプルＳ１の作成方法としては、図２に示すように、前記基板７のサンプルセット面７ａの径ｄより少し小径ｄ１の突出軸部１１ａと基板７の最大径部Ｄと略同径Ｄ１の握り操作部１１ｂとを有し、基板７と同一の金属材料からなり、同一高さＨを有するＴ字形に作製されたプレスピン１１を基板７と共にセット準備した上、図３に示すように、前記基板７のサンプルセット面７ａ上に原サンプルＳを載せ、この原サンプルＳにプレスピン１１の突出軸部１１ａを押し当てて押圧力を加えることにより原サンプルＳを押し潰して薄膜サンプルＳ１を作成する方法が採られる。そして、サンプルセット面７ａ上に作成された薄膜サンプルＳ１を基板７ごと上記した共焦点顕微ラマン分光分析装置に設置してラマンスペクトルの測定に供する。
【００１７】
なお、原サンプルＳの押し潰しに伴いプレスピン１１の突出軸部１１ａの先端面にも薄膜サンプルが付着残存していることがあり、この場合、プレスピン１１を基板７と同様に取り扱うことで突出軸部１１ａの先端面をサンプルセット面として同様にラマンスペクトルを測定することが可能である。また、円錐台形状の基板７とプレスピン１１のセットを使用する場合は、サンプルセット面７ａ及び突出軸部１１ａの先端面が共に微小径かつ平坦面であるため、測定使用後には、その面を紙ヤスリ等で簡単、容易に清掃することが可能で、これらを測定に繰り返し使用することができる。しかし、基板７としては、それ以外に、図４に示すように、ガラス製基台７Ａの表面にチタン層７Ｂを付着してなるものを用いてもよい。この場合は、足の長いプレスピン１１Ａを用い原サンプルの押し潰しによって薄膜サンプルを作成するとき、そのサンプルセット面７ａが硬度の高いチタン層７Ｂから形成されているため、傷が付くことがなく、繰り返し測定に使用することができる。  
【００１８】
さらに、上記のような押し潰しによる薄膜化処理で薄膜サンプルＳ１を作成する方法以外にも、原サンプルを溶媒に溶かして基板７のサンプルセット面７ａ上に塗布したのち、溶媒を蒸発させて薄膜サンプルＳ１を作成する方法、蒸着により作成可能なサンプルについてはその蒸着量をコントロールして薄膜サンプルＳ１を作成する方法、液相サンプルについてはその液相原サンプルを基板７のサンプルセット面７ａ上に薄く引き延ばして塗布し薄膜サンプルＳ１を作成する方法などが考えられ、それら方法はサンプルの性状や物性に応じて選択される。
【００１９】
上記いずれの薄膜化処理で作成された薄膜サンプルＳ１であっても、その厚さは、一定波長のもとでの蛍光強度／ラマン散乱光強度が、１０／１以下、好ましくは、１／１以下であり、このような厚さの薄膜サンプルＳ１を使用し、かつ、基板７のサンプルセット面７ａがラマン散乱光Ｒ及び蛍光を発現しない材料から作製されているので、焦点位置より下方部の広い範囲に亘る蛍光及びラマン散乱光の発現は少ない。これによって、測定対象物質が蛍光を発現する物質である場合でも、励起光の波長を変えることなく、また、水分浸漬によって物性変化を生じることなく、蛍光による妨害を著しく軽減して所定のラマンスペクトルを正確に得ることができ、高感度かつ高性能な分析の実現が図れる。
【００２０】
因みに、図５は飲料水収納容器等に使用されているグリーンＰＥＴ（ポリエチレンテレフタート）を測定対象サンプルとし、厚さ９００μｍの原サンプルと厚さ１２μｍに薄膜化処理した薄膜サンプルそれぞれについて本発明者が行った測定実験の結果で得られたラマンスペクトルを示す。また、図６は超臨界海水処理に使用されているセルロースを測定対象サンプルとし、厚さ５００μｍの原サンプルと厚さ１０μｍに薄膜化処理した薄膜サンプルそれぞれについて本発明者が行った測定実験の結果で得られたラマンスペクトルを示す。
【００２１】
これら図５及び図６に示すラマンスペクトルからも明らかなように、厚さの大きい原サンプルの場合は、焦点位置の下方部に発現される蛍光により多くのラマンピークが隠蔽されてしまい、サンプル固有のラマンピークが確認しにくい。一方、厚さの小さい薄膜サンプルの場合は、焦点位置の下方部の広い範囲の蛍光及びラマン散乱光の発現が非常に少ないために、蛍光の影響がほとんどなくなり、サンプル固有のラマンスペクトルが得られること、つまり、薄膜化によって大きな蛍光妨害除去効果を奏することが確認できた。これによって、共焦点顕微ラマン分光分析の感度及び性能の著しい向上が図れるに至ったのである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明に係る共焦点顕微ラマン分光分析方法の実施に用いられる共焦点顕微ラマン分光分析装置の原理構成図である。
【図２】同上分析方法において使用される薄膜化処理用治具の一例を示す正面図である。
【図３】同上分析方法におけるサンプルの薄膜作成方法の説明図である。
【図４】同上分析方法において使用される薄膜化処理用治具の他の例を示す正面図である。
【図５】グリーンＰＥＴ（ポリエチレンテレフタート）を測定対象サンプルとする測定実験により得られたラマンスペクトル図である。
【図６】超臨海水処理用セルロースを測定対象サンプルとする測定実験により得られたラマンスペクトル図である。
【符号の説明】
【００２３】
１  レーザ
２  共焦点顕微鏡
３  ノッチフィルタ
７  基板
７ａ  サンプルセット面
Ｓ  原サンプル
Ｓ１  薄膜サンプル
Ｘ  レーザ光
Ｌ  レイリー散乱光
Ｒ  ラマン散乱光
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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