(57)【要約】    【課題】  一酸化窒素に対する優れた結合活性を有しており、医薬としても使用可能である毒性の低い分子、およびそのような分子の製造方法を提供すること。    【解決手段】  ヘム核を有するシトクロムｃの部分ペプチドまたはその塩を含有する一酸化窒素捕捉剤、配列番号：１〜３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩を含有する一酸化窒素捕捉剤、および放射線照射したシトクロムｃまたはその塩を含有する一酸化窒素捕捉剤。【選択図】    図１
2005068109.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘム核を有するシトクロムｃの部分ペプチドまたはその塩を含有する一酸化窒素捕捉剤。
【請求項２】
配列番号：１から３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩を含有する一酸化窒素捕捉剤。
【請求項３】
放射線照射したシトクロムｃまたはその塩を含有する一酸化窒素捕捉剤。
【請求項４】
シトクロムｃ水溶液を調製する工程と、前記シトクロムｃ水溶液に、酸素をバブリングしながら、放射線を照射する工程と、を含む一酸化窒素捕捉剤の製造方法。
【請求項５】
前記放射線がガンマ線である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ガンマ線を０．１ｋＧｙから１．５ｋＧｙ照射する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１から３のいずれか１項に記載の一酸化窒素捕捉剤を、溶液中で一酸化窒素と接触させることを含む、一酸化窒素捕捉方法。
【請求項８】
請求項１から３のいずれか１項に記載の一酸化窒素捕捉剤を用いることを特徴とする、一酸化窒素の定量方法。
【請求項９】
請求項１から３のいずれか１項に記載の一酸化窒素捕捉剤を含む医薬組成物。
【請求項１０】
細胞呼吸賦活剤である、請求項９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はシトクロムｃを改変することにより得られる一酸化窒素捕捉剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の一酸化窒素（ＮＯ）は、その産生異常が様々な生理機能や疾患に関与することが報告されており、医学の分野で非常に注目される分子となっている。例えば、高血圧、高脂血、動脈硬化、心不全、冠動脈攣縮などにＮＯの不足が関与し、脳卒中、ハンチントン病、パーキンソン病、各種臓器障害などがＮＯの過多により起こると予想されている。
ＮＯは、常温で気体であり、不安定な短寿命のラジカル種であるという物理化学的性質のために、取扱いや定量法の確立が困難である。従来、ＮＯの定量法としては、化学発光法（非特許文献１参照）、オキシヘモグロビン法（非特許文献２参照）、電極法（非特許文献３参照）、ＥＰＲ法（非特許文献４参照）などがある。しかしながら、これらの定量法は、気体のＮＯにしか用いることができない、試薬が他の化合物とも反応するため細胞のような多成分系に用いることができない、試薬の調製が困難である、信頼性・再現性に乏しい、そして試薬に毒性がある等の問題があった。
ＮＯと特異的に結合することができる分子があれば、試料中に含まれるＮＯの検出や定量に用いることができるとともに、ＮＯスカベンジャーとして、ＮＯ過多により生じる疾患の予防や治療に、またそのための薬剤の開発にも利用できるものと期待される。
【非特許文献１】Kikuchi, K. et al.; J. Biol. Chem., 268, 23106-23110 (1993)
【非特許文献２】Ignarro, J. et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9265-9269 (1987)
【非特許文献３】Malimski T. et al.; Nature, 358, 676-677 (1992)
【非特許文献４】Kon H. et al.; Biochemistry, 8, 4757-4762 (1969)
【非特許文献５】Yamada, S. et al.; Biosci. Biotechnol. Biochem., 64(3), 628-632 (2000)
【非特許文献６】Yamada, S. et al.; Biosci. Biotechnol. Biochem., 66(10), 2044-2051 (2002)
【非特許文献７】駿河ら；  食品照射  第35号  第1、2号（2000）
【非特許文献８】Tappel et al. (1961)  Radiation Research, 15, 709-719 (1961)
【非特許文献９】Hoshino, M. et al.; J. Am. Chem. Soc., 118, 5702-5707 (1996)
【非特許文献１０】Beckman, J. S. et al.; Methods in nitric oxide rsearch (eds. Feelish M., Stamler J. S.) pp.61-70 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、ヘモグロビンがＮＯトラップ能を示すことから、種々の金属タンパク質を調製し、高ＮＯ捕捉能分子の検索を行ってきた。これまでに、本来電子伝達体として機能しているシトクロムｃやＣ型シトクロムが、亜硝酸還元能を有すること（非特許文献５参照）、また熱変性（非特許文献６参照）や放射線照射（非特許文献７参照）によりこの還元活性が亢進することを見出した。しかしながら、天然シトクロムｃや熱変性シトクロムｃは、ＮＯ検出試薬やＮＯ捕捉剤として用いるためには活性が不十分であった。そこで、本発明は、優れたＮＯ結合活性を有し、医薬としても使用可能な毒性の低い分子を調製すること、およびそのような分子の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題に鑑み、優れたＮＯ捕捉剤を求めて鋭意研究を行った。その結果予想外にも、断片化したシトクロムｃおよび放射線照射したシトクロムｃが、天然のシトクロムｃと比較して顕著に優れたＮＯ結合能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、
［１］ヘム核を有するシトクロムｃの部分ペプチドまたはその塩を含有する一酸化窒素捕捉剤；
［２］配列番号：１から３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩を含有する一酸化窒素捕捉剤；
［３］放射線照射したシトクロムｃまたはその塩を含有する一酸化窒素捕捉剤；
［４］シトクロムｃ水溶液を調製する工程と、前記シトクロムｃ水溶液に、酸素をバブリングしながら、放射線を照射する工程と、を含む一酸化窒素捕捉剤の製造方法；
［５］前記放射線がガンマ線である、前記［４］に記載の方法；
［６］前記ガンマ線を０．１ｋＧｙから１．５ｋＧｙ照射する、前記［５］に記載の方法；
［７］前記［１］から［３］のいずれか１項に記載の一酸化窒素捕捉剤を、溶液中で一酸化窒素と接触させることを含む、一酸化窒素捕捉方法；
［８］前記［１］から［３］のいずれか１項に記載の一酸化窒素捕捉剤を用いることを特徴とする、一酸化窒素の定量方法；
［９］前記［１］から［３］のいずれか１項に記載の一酸化窒素捕捉剤を含む医薬組成物；
［１０］細胞呼吸賦活剤である、前記［９］に記載の医薬組成物、に関する。
【０００５】
以下に本発明において記載する記号、用語等の意義等を明示して、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いる「シトクロムｃ」は、ヘムｃを補欠分子族とするシトクロムのうち、生理的にシトクロムｃオキシダーゼに対する電子供与体となっているものをいい、哺乳動物および植物のミトコンドリアや核に含まれるシトクロムｃのほか、細菌類や藻類に存在するシトクロムｃやＣ型シトクロムも本発明のシトクロムｃに含まれる。様々な原核生物および真核生物のシトクロムｃの一次構造や立体構造が研究されているが、異種間においても互いによく似た構造を有することが解明されつつあり、本発明に係る一酸化窒素捕捉剤には、これらのシトクロムｃやＣ型シトクロムのいずれを用いることもできる。また、生体から抽出した天然型シトクロムｃに限らず、遺伝子工学的手法により発現させたシトクロムｃを用いてもよい。
【０００６】
本発明に係る「一酸化窒素捕捉剤」は、ヘム核を有するシトクロムｃの部分ペプチドまたはその塩を含有する。ヘム核とは、ポルフィリンの鉄錯体をいい、シトクロムｃが電子伝達体として機能する場合に補欠分子として作用する。シトクロムｃの部分ペプチドとしては、シトクロムｃの構成アミノ酸配列のうち例えば１〜７０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは５〜１０個のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
このような部分ペプチドは、例えば、シトクロムｃを自体公知の切断法により切断して得ることができる。切断法としては、プロテアーゼを用いる酵素法や化学的切断法などが挙げられる。プロテアーゼとしては、リシンおよびアルギニンを認識するトリプシン、リシンを認識するリジルエンドペプチダーゼ、芳香族アミノ酸を認識するキモトリプシン、グルタミン酸およびアスパラギン酸を認識するＶ８プロテアーゼなどが挙げられ、それぞれを用いることによって、認識するアミノ酸残基のカルボキシル末端側のペプチド結合を切断することができる。また、化学的切断法としては、臭化シアンによりメチオニン残基を切断する方法、ヒドロキシルアミンによってＡｓｎ−Ｇｌｙ間を切断する方法、ＢＮＰＳ−スカトールによってトリプトファン残基で切断する方法などが用いられる。切断されたペプチドは、例えば各種クロマトグラフィーによって、単離精製することができる。また、本発明に係る部分ペプチドは、自体公知の液相法または固相法により、人工的に合成して得たものも含む。
【０００７】
ヘム核を有するシトクロムｃの部分ペプチドの例として、配列番号１〜３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、それぞれポリペプチド（I）（II）（III）が挙げられる。ポリペプチド（I）（II）および（III）は、ウマ心筋シトクロムｃに、それぞれトリプシン、キモトリプシン、臭化シアンを作用させて得られるペプチドである。ポリペプチド（I）は、配列番号４に記載のウマ心筋シトクロムｃのアミノ酸配列における、Ｎ末端から１４番目のシステインから２２番目のリシンまでの９個のアミノ酸から、ポリペプチド（II）は１１番目のバリンから３２番目のロイシンまでの２２個のアミノ酸から、ポリペプチド（III）はＮ末端のグリシンから６５番目のメチオニンまでの６５個のアミノ酸からなるペプチドである。本発明で用いるポリペプチドは、シトクロムｃの部分ペプチドであって、ヘム核を有する限り、配列番号１〜３に記載されたアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が挿入、付加、欠失または置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドも含む。
【０００８】
本発明で用いられるペプチド、ポリペプチドまたはシトクロムｃの塩としては、薬理学的に許容される酸（例えば無機酸、有機酸等）や、塩基（例えばアルカリ金属塩等）などとの塩が用いられ、例えば無機酸（例えば、塩酸、硫酸、炭酸、重炭酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸等）の付加塩、有機カルボン酸（例えば、酢酸、マレイン酸、乳酸、酒石酸、トリフルオロ酢酸等）の付加塩、有機スルホン酸（例えばメタンスルホン酸、ヒドロキシメタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、タウリン等）の付加塩、アミンの付加塩（例えば、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、プロカイン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、トリス（ヒドロキシメチルアミン）メタン塩、フェネチルベンジルアミン塩等）、アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、セリン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸等）の塩などが好適である。
【０００９】
本発明に係る一酸化窒素捕捉剤には、放射線照射したシトクロムｃまたはその塩を含有するものも含まれる。溶液中のシトクロムｃに放射線を照射すると、シトクロムｃ分子の深部にまで振動が与えられ、且つ溶媒の水分子が分解されてヒドロキシラジカル（ＯＨ・）が産生され、これがシトクロムｃを攻撃することで特定のアミノ酸が他のアミノ酸残基に変換されることが知られている。例えば、シトクロムｃにガンマ線を照射すると、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、シスチン、セリン、トレオニンなどのアミノ酸が減少することが報告されている（非特許文献８参照）。本発明者らは、シトクロムｃに放射線を照射することにより、ＮＯ結合能が顕著に上昇することを見出した。
【００１０】
放射線照射シトクロムｃは、例えば、シトクロムｃ水溶液を調製し、該水溶液中で酸素をバブリングしながら放射線を照射することにより得ることができる。ここで、酸素をバブリングするのは、より条件を過酷にすることで、放射線照射によるシトクロムｃの改変効果を高めるためである。
本発明で用いる放射線は、物質への透過力が強くシトクロムｃ分子の深部にまで影響を与えられるものであれば特に限定されないが、好ましくはガンマ線である。ガンマ線としてはコバルト６０ガンマ線やセシウム１３７ガンマ線などが挙げられるが、特にコバルト６０ガンマ線は半減期が短く、取扱いの点でも好ましい。
ガンマ線は、０．１〜１．５ｋＧｙ、好ましくは０．５〜１．０ｋＧｙ、最も好ましくは０．７５ｋＧｙ照射する。照射量の調節は、例えば、線量率を一定にし（例えば５．０ｋＧｙ／ｈ）、照射時間を変動させることによって行うことができる。
【００１１】
本発明に係る一酸化窒素捕捉方法は、上述した本発明に係る一酸化窒素捕捉剤のいずれかを、溶液中で一酸化窒素と接触させることにより行うことができる。
本発明に係る一酸化窒素捕捉剤がＮＯを捕捉する反応は、基質と特異的に結合する酵素反応であるため、生体試料のような多成分系の溶液中でもＮＯを特異的に捕捉することが可能である。
【００１２】
本発明に係る一酸化窒素の定量方法は、本発明に係る一酸化窒素捕捉剤を用いることを特徴とする。例えば、ＮＯを含む試料と本発明に係る一酸化窒素捕捉剤を接触させ、反応させることにより、ＮＨ３が産生されるため、このＮＨ３を測定することにより、元の溶液に含まれたＮＯの量を決定することができる。また、本発明に係る一酸化窒素捕捉剤がＮＯと反応したときのスペクトル変化から、結合量を求めることも可能である。上述のように、本発明に係る一酸化窒素捕捉剤がＮＯを捕捉する反応は、基質と特異的に結合する酵素反応であるため、生体試料のような多成分系の溶液中でもＮＯを特異的に捕捉し、定量することが可能である。
【００１３】
本発明は、新規な医薬組成物も提供する。本発明に係る医薬組成物は、有効成分として、（１）ヘム核を有するシトクロムｃの部分ペプチド若しくはその塩、（２）配列番号：１〜３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド若しくはその塩、または（３）放射線照射したシトクロムｃ若しくはその塩、のいずれかを含む。これらの成分には毒性もなく、長期保存でも安定であり、ＮＯ過多により起こる病気、例えば脳卒中、ハンチントン病、パーキンソン病、各種臓器障害などの予防や治療に有用である。
本発明にかかる医薬組成物は、上記（１）〜（３）の部分ペプチド、ポリペプチド若しくはシトクロムｃまたはその塩をそのまま用いるか、または必要に応じて散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤などとして経口的に、あるいは水若しくはそれ以外の薬学的に許容しうる液を用いた注射剤などとして非経口的に用いることができる。錠剤、カプセル剤などに混和する添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、膨化剤、矯味矯臭剤などが挙げられ、必要に応じて安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤など、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して通常の方法の従って製剤化することが可能である。また、注射剤とする場合も通常の製剤実施に従って処方することができ、注射用水性液若しくは油性液に本発明にかかる医薬組成物を溶解または懸濁し、必要に応じて緩衝剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、酸化防止剤などを適宜配合して得ることができる。
本発明にかかる医薬組成物を医薬として使用する場合は、投与形態は特に限定されず、経口でも非経口的投与でもよい。例えばヒトに投与する場合の投与量は、疾患、患者、投与方法、調剤の種類等によって異なり特に限定されないが、経口投与の場合、１日あたり約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、さらに好ましくは約１．０〜２０ｍｇとし、非経口的に投与する場合は、例えば１日あたり０．０１〜３０ｍｇ、０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度とすることができ、１日１回または数回に分けて投与することができる。
本発明にかかる医薬の、ＮＯ過多により起こる疾患に対する有効性は、公知の手法に準じて容易に試験可能である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、優れたＮＯ結合能を有する一酸化窒素捕捉剤を提供することができた。本発明に係る一酸化窒素捕捉剤は、調製が容易で、低コストで作製することができる。また、毒性がなく長期保存しても安定であるので、医薬組成物としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に示す本発明の参考例、実施例および試験例は例示的なものであり、本発明は以下の具体例に制限されるものではない。当業者は以下に示す実施例に様々を加えて本発明を最大限に実施することができ、かかる変更は本願特許請求の範囲に包含される。
【実施例１】
【００１６】
＜ヘム核を有するシトクロムｃの部分ペプチドの調製＞
ウマ心筋シトクロムｃにトリプシン、キモトリプシン、臭化シアン（和光純薬社製）をそれぞれ通常の方法に従って作用させ、配列番号１〜３に記載のアミノ酸からなる断片を得た。以下、トリプシンによるアミノ酸９個の断片をＨＰ９と、キモトリプシンによるアミノ酸２２個の断片をＨＰ２２と、臭化シアンによるアミノ酸６５個の断片をＨＰ６５という。
ＨＰ９、２２および６５の物理化学的性質を表１に示す。
【表１】
2005068109.tif 000003
＜ＮＯ結合能の確認＞
ＨＰ９、ＨＰ２２およびＨＰ６５のＮＯ捕捉能をHoshino, M．らの方法（非特許文献９参照）に従って測定した。
スクリューキャップ付きマイクロ石英セル（GL Sciences社製）に、酸化型（Ｆｅ（III））に調製した各断片を、最終濃度が１０μＭになるように加え、セル内をアルゴン置換し、一酸化窒素捕捉剤とした。
次に、Beckmanらの方法（非特許文献１０参照）に従って、飽和ＮＯ溶液（２５℃で１．９ｍＭ）を用意し、これを用いて、１．９×１０−４、３．８×１０−４、５．７×１０−４、７．６×１０−４、９．５×１０−４Ｍの各濃度のＮＯ溶液を調製してセルに添加した。このセルの可視吸収スペクトルを、HITACHI U3310 Spectrophotometerにより測定した。シトクロムｃやヘムペプチドは、ＮＯと反応することで５３０ｎｍと５６０ｎｍに吸収極大を示す。この吸収極大の数値を用いて、Hosinoらの方法（非特許文献９参照）により、ＨＰ９、２２および６５の結合平衡定数(equilibrium constants: Ｋｅｑ (Ｍ−１)を算出した。
計算式を下記に示す。
【化１】
2005068109.tif 000004
ここで、
Ｄ(λ)=各濃度のＮＯとシトクロムｃを反応させた場合の５６０ｎｍの吸収
Ｄ０(λ)=シトクロムｃの５６０ｎｍの吸収（ＮＯ非添加）
Ｄ∞(λ)=最も高濃度のＮＯとシトクロムｃを反応させた場合の５６０ｎｍの吸収
である。上記の式によりＫ[ＮＯ]を算出し、ＮＯ濃度に対しプロットする。その後、その直線の傾きを求める。この傾きが結合平衡定数（Ｋｅｑ (Ｍ-1)）となる。
計算結果を表２に示す。
【表２】
2005068109.tif 000005
ヘム核を有するシトクロムｃはいずれもＮＯとの結合能を有し、小さい断片ほどＮＯ結合能の優れ、ＨＰ９の結合平衡定数は、天然シトクロムｃ（１０４残基）の約７倍にも及んだ。
＜ＨＰ９を用いたＮＯの検出限界の決定＞
スクリューキャップ付きマイクロ石英セル（GL Sciences社製）に、酸化型（Ｆｅ（III））に調製したＨＰ９を、最終濃度が１０μＭになるように加え、セル内をアルゴン置換し、一酸化窒素捕捉剤とした。
次に、Beckmanらの方法（非特許文献１０参照）に従って、飽和ＮＯ溶液（２５℃で１．９ｍＭ）を用意し、これを用いて、０．０１０、０．０１５、０．０２０、０．０２５、０．０３０、０．０３５、０．０４０、０．０５０ｍＭの各濃度になるよう、ＮＯ溶液をセルに添加した。このセルの可視吸収スペクトルを、HITACHI U3310 Spectrophotometerにより測定した。
５６０ｎｍの吸収と各ＮＯ濃度について検量線を作成し、直線関係が得られる最も低いＮＯ濃度をＮＯの検出限界とした。
この結果、ＨＰ９を用いてＮＯを定量する場合の検出限界は、２５μＭであることがわかった。
【実施例２】
【００１７】
＜放射線照射したシトクロムｃの調製＞
３０μＭシトクロムｃ溶液に、線量率５．０ｋＧｙ／ｈのコバルト６０ガンマ線を０分（０ｋＧｙ）、３分（０．２５ｋＧｙ）、６分（０．５ｋＧｙ）、９分（０．７５ｋＧｙ）、１２分（１．０ｋＧｙ）、１８分（１．５ｋＧｙ）、２４分（２．０ｋＧｙ）、３６分（３．０ｋＧｙ）照射したものを用意し、これを一酸化窒素捕捉剤とした。照射中温度は２５℃とし、流速１０ｍｌ／分で酸素をバブリングした。
＜ＮＯ結合能の確認＞
各シトクロムｃ溶液を用いて、実施例１と同様の方法でＮＯ捕捉能を測定した。０．７５ｋＧｙ照射した試料の可視吸収スペクトルを図１（ａ）に、比較例として非照射試料（０ｋＧｙ）のスペクトルを図１（ｂ）に示す。ＮＯ濃度の上昇に従い、シトクロムｃとＮＯの結合に由来する４１６．５ｎｍ（Soret peak）、５３０ｎｍ（β peak）、５５０ｎｍ（α peak）の吸収極大の増加が見られた。
それぞれの試料について、スペクトル変化からＮＯ結合平衡定数(equilibrium constants: Ｋｅｑ (Ｍ−１)を算出し、ＮＯ結合平衡定数と線量との関係を図２に示す。約０．１ｋＧｙから約１．５ｋＧｙの間で、ＮＯ結合平衡定数Ｋｅｑ(Ｍ−１)は非照射シトクロムｃより高くなり、０．７５ｋＧｙで極大となった。このときのＫｅｑ (Ｍ−１)は、非照射シトクロムｃの約１．５倍であった。
＜放射線照射シトクロムｃを用いたＮＯの検出限界の決定＞
スクリューキャップ付きマイクロ石英セル（GL Sciences社製）に、酸化型（Ｆｅ（III））に調製した放射線照射シトクロムｃを、最終濃度が１０μＭになるように加え、セル内をアルゴン置換し、一酸化窒素捕捉剤とした。
次に、Beckmanらの方法（非特許文献１０参照）に従って、飽和ＮＯ溶液（２５℃で１．９ｍＭ）を用意し、これを用いて、０．０１０、０．０１５、０．０２０、０．０２５、０．０３０、０．０３５、０．０４０、０．０５０ｍＭの各濃度になるよう、ＮＯ溶液をセルに添加した。このセルの可視吸収スペクトルを、HITACHI U3310 Spectrophotometerにより測定した。
５６０ｎｍの吸収と各ＮＯ濃度について検量線を作成し、直線関係が得られる最も低いＮＯ濃度をＮＯの検出限界とした。
この結果、放射線照射シトクロムｃを用いてＮＯを定量する場合の検出限界は、３０μＭであることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】放射線（０．７５ｋＧｙ）照射シトクロムｃと非照射シトクロムｃの可視吸収スペクトルを示す。
【図２】ＮＯ結合平衡定数と線量との関係を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００１９】
配列番号１は、配列番号４に記載のウマシトクロムｃのアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から１４番目（システイン）〜２２番目（リシン）までの９個のポリペプチドである。配列番号２は、同様に１１番目（バリン）〜３２番目（ロイシン）までの２２個のアミノ酸から、配列番号３は１番目（グリシン）〜６５番目（メチオニン）までの６５個のアミノ酸からなるペプチドである。
【図１】
2005068109.tif 000006
【図２】
2005068109.tif 000007
【配列表】
2005068109000001.app