(57)【要約】【課題】容易にプロラミン蛋白を高度に純化し、脱色度を高め、経済的にみてもツェインの安定生産が可能な、プロラミン蛋白の分離方法を提供すること。【解決手段】（１）プロラミン蛋白を含有するアセトン水溶液からプロラミン蛋白を採取するに際し、該水溶液にアセトンを加えて、アセトン濃度を８１〜９０重量％に高めることにより、不溶化したプロラミン蛋白を沈降物として分離回収することを特徴とするプロラミン蛋白の分離方法、（２）プロラミン蛋白を含有するエタノール水溶液からプロラミン蛋白を採取するに際し、該水溶液にエタノールを加えて、エタノール濃度を９６〜９９重量％に高めることにより、不溶化したプロラミン蛋白を沈降物として分離回収することを特徴とするプロラミン蛋白の分離方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロラミン蛋白を含有するアセトン水溶液からプロラミン蛋白を採取するに際し、該水溶液にアセトンを加えて、アセトン濃度を８１〜９０重量％に高めることにより、不溶化したプロラミン蛋白を沈降物として分離回収することを特徴とするプロラミン蛋白の分離方法。
【請求項２】
アセトン水溶液が、５０〜８０重量％のアセトン水溶液である請求項１記載のプロラミン蛋白の分離方法。
【請求項３】
プロラミン蛋白を含有するエタノール水溶液からプロラミン蛋白を採取するに際し、該水溶液にエタノールを加えて、エタノール濃度を９６〜９９重量％に高めることにより、不溶化したプロラミン蛋白を沈降物として分離回収することを特徴とするプロラミン蛋白の分離方法。
【請求項４】
エタノール水溶液が、５０〜９３重量％のエタノール水溶液である請求項３記載のプロラミン蛋白の分離方法。
【請求項５】
不溶物からのプロラミン蛋白の分離回収法が、不溶物をアセトン中に分散させてプロラミン蛋白を析出させる方法である請求項１、２、３又は４記載のプロラミン蛋白の分離方法。
【請求項６】
プロラミン蛋白が、ツェインである請求項１、２、３、４又は５記載のプロラミン蛋白の分離方法。
【請求項７】
請求項５記載の方法によって回収された析出物を乾燥して得られる、蛋白含量９５％以上（窒素１５．２％以上）のプロラミン蛋白素材。
【請求項８】
プロラミン蛋白が、ツェインである請求項７記載のプロラミン蛋白素材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロラミン蛋白の分離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プロラミン蛋白は含水アルコールに可溶な蛋白である。トウモロコシ由来のプロラミンはツェイン（ゼイン）と呼ばれている。ツェイン蛋白は、容易にフイルムを形成するという性質から食品用皮膜剤として汎用されており、サプリメント等のコーティングに幅広く利用されている。通常、ツェインはトウモロコシまたはコーングルテンミールから抽出・精製して得られる。抽出溶媒には含水アルコールや含水アセトンなどが使用される。
【０００３】
ツェインの分離精製に関するものとしては、例えば、穀類グルテンを６０〜９５重量％のアルコールやアセトン等の濃水溶液と混合し、得られた混合物を５０〜７５℃の温度に加熱し、ゼイン５〜１５％並びに抽出油及び上記溶媒に溶解した油溶性物質を含有する粗製ゼイン溶液から溶解されていない固形物を機械的に分離する穀類グルテンからゼインを分離する方法において、上記の粗製ゼイン溶液の凝固点以上の＋１０℃〜−２５℃に冷却して、２０〜４０％のゼイン及び少量の抽出油及び溶媒に溶解した油溶性物質を含有するタフィー状底部液体層及び油溶性物質及び少量の溶解したゼインを含有する表面に浮かんだ液体溶媒層とに分離し、表面の浮かんだ液体を冷却されたタフィー状ゼイン−溶媒層から分離することを特徴とする方法（特許文献１）、含水イソプロパノール、含水メタノール、又は含水アセトンを溶媒とするゼインの着色溶液から、色素含有量及び臭気の少ないゼインを取り出すための方法において、ゼインの着色溶液を冷却することにより、該着色溶液中に溶存するゼインを析出せしめ、該析出液から析出ゼインを分離、採取することを特徴とする色素含有量並びに臭気の少ないゼインの調製方法（特許文献２）、含水エタノールを溶媒とするゼインの着色溶液から、色素含有量及び臭気の少ないゼインを取り出すための方法において、ゼインの着色溶液を冷却することにより、該着色溶液中に溶存するゼインを析出せしめ、該析出液から析出ゼインを分離、採取することを特徴とする色素含有量並びに臭気の少ないゼインの調製方法（特許文献３）、ツェインを含む含水アセトンの水分濃度を４５〜５５重量％に調製した後、該溶液を冷却し（−１０〜−３０℃）、ツェインをを析出させることを特徴とするツェインの分離方法（特許文献４）等がある。
【０００４】
【特許文献１】特公昭５０−１６８００号公報
【特許文献２】特開平５−１３０８３５号公報
【特許文献３】特開平５−２２２０９７号公報
【特許文献４】特願２００２−２２３１２３号
【０００５】
しかし、これらの技術では、ツェイン蛋白を十分に回収するために、生産コストの点で不利なマイナス域の温度において長時間の冷却が必要であることに加えて、ツェイン溶液の水分が高いと蛋白変性し易いという問題点があり、工業的生産性の点では十分な技術とは言えない。
そのため、経済的にみても、ツェインの安定生産が可能な技術の開発が待たれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、容易にプロラミン蛋白を高度に純化し、脱色度を高め、経済的にみても安定生産が可能な、プロラミン蛋白の分離方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意研究を重ねたところ、アセトン水溶液又はエタノール水溶液に対するツェインの溶解度は、アセトン又はエタノールの濃度に影響を受け、該溶剤の濃度が一定以下であるとツェインの溶解度は高いが、該濃度が一定以上になるとツェインの溶解度は低くなることを知り、更に研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は、以下の発明から構成されるものである。
１．プロラミン蛋白を含有するアセトン水溶液からプロラミン蛋白を採取するに際し、該水溶液にアセトンを加えて、アセトン濃度を８１〜９０重量％に高めることにより、不溶化したプロラミン蛋白を沈降物として分離回収することを特徴とするプロラミン蛋白の分離方法。
２．含水アセトンが５０〜８０重量％のアセトン水溶液である上記１記載のプロラミン蛋白の分離方法。
３．プロラミン蛋白を含有するエタノール水溶液からプロラミン蛋白を採取するに際し、該水溶液にエタノールを加えて、エタノール濃度を９６〜９９重量％に高めることにより、不溶化したプロラミン蛋白を沈降物として分離回収することを特徴とするプロラミン蛋白の分離方法。
４．含水エタノールが、５０〜９３重量％のエタノール水溶液である上記３記載のプロラミン蛋白の分離方法。
５．沈澱物からのプロラミン蛋白の分離回収が、沈殿物をアセトン中に分散させてプロラミン蛋白を析出させるものである上記１、２、３又は４記載のプロラミン蛋白の分離方法。
６．プロラミン蛋白が、ツェインである上記１、２、３、４又は５記載のプロラミン蛋白の分離方法。
７．上記５記載の方法によって回収された析出物を乾燥して得られる、蛋白含量９５％以上（窒素１５．２％以上）のプロラミン蛋白素材。
８．プロラミン蛋白が、ツェインである上記７記載のプロラミン蛋白素材。
【０００９】
本発明は、プロラミン蛋白を含有するアセトン水溶液又はエタノール水溶液からプロラミン蛋白を採取するに際し、該水溶液にアセトン又はエタノールを加え、アセトン濃度を８１〜９０重量％に、又はエタノール濃度を９６〜９９重量％に高めて、プロラミン蛋白の不溶物を生成させる点に特徴を有する。
本発明は、従来のような温度コントロール、即ち、マイナス域の温度において長時間の冷却という方法ではなくて、溶媒の濃度コントロールという簡単な操作によって、プロラミン蛋白を取得し得るので経済的にも有利であるとともに、得られたプロラミン蛋白が高品質である点で優れている。
【００１０】
このような本発明は、以下の知見に基づいてなされたものである。
（１）ツェインは、通常濃度のアセトン水溶液又はエタノール水溶液等には溶解するので、該水溶液では、アセトン又はエタノールはツェインを溶解する機能を発揮しているといえる。
（２）ところが、上記のアセトン又はエタノール自身は、反対に、ツェインを含有するアセトン水溶液又はエタノール水溶液から、ツェインを不溶物として分離させるという、意外な特性のあること、しかも、分離されたツェインは脱色度の高いものであることをつきとめた。
（３）このようなアセトン又はエタノールのツェインに対する２つの特性は、次のことに起因するものと推察される。
「ツェインに対するアセトンやエタノールの溶剤特性は、水の存在量で全く逆になる。即ち、ツェインは、水の存在量が比較的多いアセトン又はエタノールには溶解するが、水の存在量が少ない（高濃度の）アセトン又はエタノールには溶解しない。」
【００１１】
本発明におけるプロラミン蛋白としては、トウモロコシ由来のツェイン、小麦由来のグリアジン、大麦由来のホルデインなどを挙げることができる。
本発明では、ツェイン蛋白等のプロラミン蛋白を含有するアセトン水溶液又はエタノール水溶液に、操作温度０〜５０℃において、エタノール又はアセトンを加えることによって、エタノール濃度又はアセトン濃度を９６〜９９重量％又は８１〜９０重量％にすることにより、不溶化したプロラミン蛋白を沈降物として分離回収することが出来る。
このようにエタノール濃度又はアセトン濃度を調整することによって、特別な冷却を必要とせずに、プロラミン蛋白を含有するエタノール溶液又はアセトン溶液から、高度に純化された色の少ないプロラミン蛋白を、極めて簡便に安定生産できる点で優れている。
また、本発明によれば、使用溶媒は、水とアセトン又は水とエタノールの混合溶媒であるので、複数溶剤の混合系よりも容易に、高濃度のアセトン又はエタノールを蒸留又は精留によって回収することができる。更に、沈澱としてプロラミン分離後に回収される析出用溶剤は、抽出用溶剤よりも水分濃度が低下しているので、蒸留や精留等による溶剤回収の効率が比較的高く、経済的なメリットが大きい。
【００１２】
以下、本発明について、更に詳細に説明する。
本発明のプロラミン蛋白の分離方法は、プロラミン蛋白を含有するアセトン水溶液又はエタノール水溶液からなるプロラミン蛋白溶液からプロラミン蛋白を採取するに際し、該水溶液にアセトン又はエタノールを加えて、アセトン濃度を８１〜９０重量％に、又はエタノール濃度を９８〜９６重量％に高めることにより、不溶化したプロラミン蛋白を沈降物として分離回収することを特徴とするものである。
【００１３】
そこで、上記の本発明の構成要件について、以下説明する。
（１）プロラミン蛋白溶液
本プロラミン蛋白溶液は、プロラミン蛋白を含有するエタノール水溶液又はアセトン水溶液であれば、如何なる状態でも使用することができる。プロラミン蛋白濃度の制限は特にない。
トウモロコシやコーングルテンミール、小麦、大麦などからエタノール水溶液又はアセトン水溶液を溶媒として得られたプロラミン蛋白抽出液が使用できることは勿輪、抽出液を減圧濃縮や限外濾過等に供して得られた濃縮液を使用することもできる。更には、プロラミン蛋白乾燥品をエタノール水溶液又はアセトン水溶液に溶解した溶液を使用することもできる。例えば、コーングルテンミールから溶剤抽出した後の乾燥しただけの未精製プロラミン蛋白を本発明の技術に供することで、色の少なくなった高純度プロラミン蛋白を得ることができる。
具体的には、５０〜９３重量％好ましくは７５〜９０重量％エタノールを溶媒として３０〜７８℃好ましくは５０〜７０℃にてプロラミン蛋白を抽出した抽出液、その抽出液から得られた濃縮液、または５０〜９３重量％好ましくは８０〜９０重量％エタノールを溶媒としてプロラミン蛋白を溶解した溶液を本発明に供することができる。
また、５０〜８０重量％好ましくは６０〜７５重量％アセトンを溶媒として３０〜５７℃好ましくは４５〜５５℃にてプロラミン蛋白を抽出した抽出液、その抽出液から得られた濃縮液、または５０〜８０重量％好ましくは７０〜７８重量％アセトンを溶媒としてプロラミン蛋白を溶解した溶液を本発明に供することができる。
プロラミン蛋白溶液のエタノール濃度またはアセトン濃度は、出来るだけ高い方がエタノール又はアセトンの添加量が少なくなるので有利であるが、エタノール濃度又はアセトン濃度が極端に高くなるとプロラミン蛋白の抽出率や溶解度が顕著に低下するので好ましくない。
【００１４】
（２）プロラミン蛋白の分離回収法
１）プロラミン蛋白の不溶化
プロラミン蛋白溶液からのプロラミン蛋白の不溶物の生成は、該溶液のエタノール濃度又はアセトン濃度を調整することにより行うことができる。
上記の濃度調整法には、特に制限はなく、例えば、エタノール水溶液又はアセトン水溶液の抽出で得られたプロラミン蛋白溶液に、所定量のエタノール又はアセトンを加えることで、目的とするエタノール濃度又はアセトン濃度に調整すればよい。
エタノール水溶液の場合、エタノール濃度を９６〜９９重量％に調整することで、高度に純化されたプロラミン蛋白を不溶物として回収することができる。
また、アセトン水溶液の場合、アセトン濃度を８１〜９０重量％に調整することで、高度に純化されたプロラミン蛋白を不溶物として回収することができる．
この場合、溶剤濃度が低すぎると、回収量が著しく低下する（殆んど不溶物が形成されない）。また、溶剤濃度が高すぎても、使用する溶剤量が増えるだけで、精製度に顕著な差は認められないばかりか、付着し易い性状を呈するようになって、ハンドリングが非常に悪くなる。
エタノール又はアセトンの添加方法や添加速度にも、特に制限はない。エタノール又はアセトンを素早く添加して、溶媒濃度の局所的勾配が形成されたとしても、十分に混合することで均一な溶媒濃度とすることができる。
操作温度は０〜５０℃の範囲とするのが好ましい。操作温度を０℃以下としても回収量や精製度に顕著な差は見られない。操作温度が高くなると、溶剤の蒸発が顕著になって濃度調整の精度が低下する。
所定のエタノール濃度又はアセトン濃度に調整した後、撹拌を停止して静置状態とすることによって、不溶物は速やかに沈降する。その後、沈降した不溶物は凝集して均質な層を形成する。不溶物の下層形成に要する静置時間は１時間以内でよい。通常は、数分から数１０分程度で十分である。
【００１５】
２）プロラミン蛋白不溶物の回収
上記の操作によって生成したプロラミン蛋白不溶物は、上部に分離した上澄みを取り除いて、底部に沈降した不溶物を回収する。上澄みの除去は、分離缶上部からの吸引や分離缶側面からの抜液等によって実施することができる。また、上澄みを取り除かずに、底部に沈降凝集した不溶物を分離缶底部から抜き取っても構わない。
本方法によって得られるプロラミン蛋白の不溶物は、付着性が低いので、静置による不溶物の沈降操作を経ずに、遠心分離や液体サイクロン等によって、連続的に上澄みと沈降物に分離することもできる。
ここで得られる上澄みは、蒸留などの従来技術により、溶剤を回収して再利用することができる。
【００１６】
３）プロラミン蛋白
回収したプロラミン蛋白の不溶物は、ベルト乾燥やドラム乾燥などによって、プロラミン蛋白乾燥品とすることができる。また、エタノール水又はアセトン水の添加によって、不溶物の水分を調整することで、流動性の高いプロラミン蛋白溶液とすることもできる。この溶液を更に精製することも可能であるが、流動性が高くハンドリングし易くなった溶液を、ベルト乾燥や噴霧乾燥に供して、プロラミン蛋白乾燥物を得ることもできる。
更に、プロラミン蛋白の不溶物又は不溶物にアセトン水等を添加した溶液を、アセトン中に分散させることにより、プロラミン蛋白を析出させて、高度に純化されたプロラミン蛋白画分を得ることができる。このプロラミン蛋白画分の蛋白含量は、乾物換算で９５％以上（ケルダール法：NX６．２５）となる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法に従えば、高度に純化された脱色度の高いプロラミン蛋白が極めて簡便に安定生産できる。この利点は、産業上の生産性や経済性の点から大きな意義を持つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
（実施例１〜４）
【００１９】
予め５５℃に加温した７２重量％アセトン水３２００ｍｌに、コーングルテンミール５００ｇを投入し、５５℃湯浴中にて時々撹拌しながら２時間抽出した。室温（２５℃）に１時間放冷した後、濾別によってコーングルテンミールを除去し、得られた回収液を助剤濾過して清澄な抽出液を得た。
抽出液およびアセトンを予め２０℃に冷却した。そして、ガラス瓶に採取した抽出液１００ｇに対して、アセトン６０ｇ（実施例１）、８０ｇ（実施例２）、１００ｇ（実施例３）、１５０ｇ（実施例４）を、撹拌しながら加えた。
所定量のアセトンを添加した後、直ちに撹拌を停止して３０分間静置した。次に、デカンテーションによって上澄み（上層）を取り除き、沈降凝集した不溶物（下層）を回収した。
回収した下層に、適量の６５％アセトンを添加し、撹拌混合することで清澄な溶液を得た。この溶液を加熱プレート（１２０〜１３０℃）上にて薄膜乾燥した。続いて、カッターミルを使用して粉砕することで乾燥粉砕物を得た（表１参照）。この乾燥粉砕物に含まれる蛋白質は、ケルダール法（窒素換算係数：６．２５）によって分析した。
尚、実施例１、２、３、４における蛋白回収率は、各々８１、８７、９４、９４％であった。
（比較例１）
【００２０】
実施例１〜4にて使用した抽出液を加熱プレート（１２０〜１３０℃）上にて薄膜乾燥した。続いて、カッターミルを使用して粉砕することで抽出液の乾燥粉砕物を得た。
実施例１〜４及び比較例１の結果は、表１に示す。
【００２１】
【表１】
2005068100.tif 000002
（実施例５〜７）
【００２２】
実施例1〜４にて使用した抽出液およびアセトンを、予め０℃（実施例５）、３０℃（実施例６）、または５０℃（実施例７）に加温した。そして、所定温度において、抽出液１００ｇに対して、アセトン１００gを撹拌しながら添加した。所定量のアセトンを添加した後、直ちに撹拌を停止して３０分静置した。次に、デカンテーションによって上澄み（上層）を取り除き、沈降凝集した不溶物（下層）を回収した。回収した下層に適量の６５％アセトンを添加し、撹拌混合することで清澄な溶液を得た。この溶液を加熱プレート（１２０〜１８０℃）上にて薄膜乾燥した。続いて、カッターミルを使用して粉砕することで乾燥粉砕物を得た。
尚、実施例５、６、７において蛋白回収率は、各々９２、９２、９１％であった。
実施例５〜７の結果は、表２に示す。
【００２３】
【表２】
2005068100.tif 000003
（実施例８〜９）
【００２４】
実施例１〜４にて使用した抽出液およびアセトンの液温を予め２５℃に調整した。そして、抽出液３００ｇに、アセトン３３０ｇを撹拌しながら投入した。投入後のアセトン濃度は８７重量％であった。所定量のアセトンを添加した後、撹拌を停止して３０分間静置した。次に、デカンテーションによって上澄み（上層）を取り除き、沈降凝集した不溶物（下層）を回収した。回収した下層に、適量の６０重量％アセトンを添加し、撹拌混合することで清澄な溶液を得た。この溶液の一部を加熱プレート（１２０〜１３０℃）上にて薄膜乾燥した。続いて、カッターミルを使用して粉砕することで乾燥粉砕物を得た（実施例８）。一方、回収した下層に６０重量％アセトンを添加して得られた溶液の一部を１０倍重量の冷アセトン（１０℃）中に強撹拌しながら滴下して分散させた。分散液から濾別して得られる析出物を真空乾燥（７０℃、２４時間）に供した。更に、カッターミルを使用して乾燥粉砕物を得た（実施例９）。
これらの乾燥粉砕物０．３ｇを、７４重量％エタノール１０ｍｌに溶解し、遠心分離（５，０００ｇ、１０分）によって、微粒子を除去した後の４７０ｎｍにおける透過率を測定した。
尚、実施例８における蛋白回収率は９３％であった。
また、比較例１のものを用いて、４７０ｎｍにおける透過率を測定した。
（比較例２）
【００２５】
実施例１〜４にて使用した抽出液を、１０倍重量の冷アセトン（１０℃）中に強撹拌しながら滴下して分散させた。分散液から濾別して得られる析出物を真空乾燥（７０℃、２４時間）に供した。更に、カッターミルを使用して乾燥粉砕物を得た。
実施例８及び比較例１の結果は表３に、また、実施例９及び比較例２の結果は表４に、それぞれ示す。
【００２６】
【表３】
2005068100.tif 000004
【００２７】
【表４】
2005068100.tif 000005
【００２８】
表３に示したとおり、本発明の方法によって、極めて脱色度（４７０ｎｍＴ％）の向上した製品が得られることが分かる。更に、溶液を冷アセトン中に分散させて高度精製を図った場合でも、表４に示したとおり、本発明の分離方法に供した溶液の方が、蛋白純度及び脱色度ともに顕著に向上することが分かる。
（実施例１０）
【００２９】
コーングルテンミール５００gに、９３重量％エタノール２０００ｇを加え、２５℃に２４時間静置した（脱脂操作）。そして、濾別によってコーングルテンミールを回収して真空乾燥に供した。次に、得られた真空乾燥物に、予め５０℃に加温した８６重量％エタノール２０００ｇを加え、５０℃湯浴中に２４時間静置した（抽出操作）。濾別によってコーングルテンミールを除去し、得られた回収液を助剤濾過して清澄な抽出液を得た。抽出液およびエタノールを予め２５℃として、ガラス瓶に採取した抽出液１００gに対して、エタノール３６０gを撹拌しながら加えた。このときのエタノール濃度は９７重量％であった。
撹拌を停止して３０分間静置した後、上澄みをデカンテーションによって取り除き、沈澱した不溶物を回収した。得られた不溶物に、適量の７４重量％エタノールを添加し、撹拌混合することで清澄な溶液を得た。この溶液を加熱プレート上（１２０〜１３０℃）にて薄膜乾燥した。続いて、カッターミルを使用して粉砕することで乾燥粉砕物を得た。  尚、実施例１０における蛋白回収率は３１％であった。
（比較例３）
【００３０】
実施例１〜４にて使用した抽出液を、加熱プレート上（１２０〜１３０℃）にて薄膜乾燥した。続いて、カッターミルを使用して粉砕することで乾燥粉砕物を得た。
（実施例１１）
【００３１】
比較例３の乾燥粉砕物２５ｇを８６重量％エタノール７５ｇに溶解した。この溶液にエタノール９８０ｇを撹拌しながら加えた。このときのエタノール濃度は９９重量％であった。撹拌を停止して５分間静置した後、上澄みをデカンテーションによって取り除き、沈澱した不溶物を回収した。得られた不溶物に適量の７４重量％エタノールを添加し、撹拌混合することで清澄な溶液を得た。この溶液を加熱プレート上（１２０〜１３０℃）にて薄膜乾燥した。続いて、カッターミルを使用して粉砕することで乾燥粉砕物を得た。
尚、実施例１１における蛋白回収率は５８％であった。
実施例１０〜１１及び比較例３の結果は、表５に示す。
【００３２】
【表５】
2005068100.tif 000006
＊：カールフィッシャー法にて測定した溶液水分から計算した。
【００３３】
以上の表１〜表５の結果から、本発明によれば、高度に純化された脱色度の高いプロラミン蛋白が極めて簡便に得ることができることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明のプロラミン蛋白、特にツェイン蛋白は、容易にフイルムを形成するという性質から食品用皮膜剤として利用でき、サプリメントや錠菓等のコーティングに幅広く利用し得る。