(57)【要約】  【課題】  形質転換微生物を用いた、高分子量のポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を簡便に効率よく製造する方法、並びに該製造方法に用いる形質転換微生物及び該形質転換微生物を作製するためのポリ−３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子群の発現を誘導することが可能な発現ベクターを提供する。  【解決手段】  ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子群を誘導性プロモーターにより制御可能宿主微生物に導入して得られた形質転換微生物を培養し、誘導条件下で誘導性プロモーターを誘導し、形質転換微生物を炭素源存在下で培養し、形質転換微生物からポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を単離・精製することを特徴とするポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の製造方法。  【選択図】  図２
2005278559.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子群と、誘導性プロモーターを含む発現ベクターであって、前記ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子群が前記誘導性プロモーターにより制御可能に導入されている発現ベクター。
【請求項２】
前記発現ベクターがpJRDTrcphaCABReである、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記発現ベクターがpTrcphaCABReである、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項４】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子群を誘導性プロモーターにより制御可能に宿主微生物に導入して得られる形質転換微生物。
【請求項５】
前記形質転換微生物が大腸菌である請求項４に記載の形質転換微生物。
【請求項６】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子群を誘導性プロモーターにより制御可能に宿主微生物に導入して得られる形質転換微生物を培養し、誘導条件下で誘導性プロモーターを誘導し、形質転換微生物を炭素源存在下で培養し、形質転換微生物からポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を単離・精製することを特徴とするポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の製造に関し、詳しくは、形質転換微生物を用いたポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の製造方法、並びに該製造方法に用いる形質転換微生物及び該形質転換微生物の作製に用いる発現ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物によって合成されるポリ−３−ヒドロキシアルカン酸（以下、「Ｐ（３ＨＡ）」と記載することがある）（例えば、ポリ−３−ヒドロキシブタン酸、ポリ−３−ヒドロキシヘキサン酸等）は、近年、代替プラスチック等への利用が有望視されている。しかしながら、微生物によって合成されるＰ（３ＨＡ）は、固くてもろいため加工・成形が困難である。
【０００３】
一般に、微生物によって合成されるＰ（３ＨＡ）は、重量平均分子量１０万〜１００万程度である。先に、本発明者らは、数平均分子量５０万（重量平均分子量１００万）以上の高分子量のＰ（３ＨＡ）を用いることによりＰ（３ＨＡ）の加工性が向上すること、また、大腸菌にラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）由来のＰ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群を導入した形質転換体を培養することにより、数平均分子量５０万以上の高分子量のＰ（３ＨＡ）を製造する方法を報告している（特許文献１）。
【０００４】
また、より高分子量のＰ（３ＨＡ）、例えば重量平均分子量３００万以上の超高分子量ポリマーにおいては、加工性がさらに向上するため、さらに高分子量のＰ（３ＨＡ）を製造する方法が求められていた。また、生産性に関しても、さらなる向上が求められていた。
【０００５】
重量平均分子量３００万以上の超高分子量ポリマーを製造する技術としては、酵素を用いた試験管内製造方法（非特許文献１）及び遺伝子組換え微生物を用いた製造方法が報告されている。
【０００６】
一般に、酵素を用いた試験管内製造方法の方が、遺伝子組換え微生物を用いた製造方法よりも高い分子量のポリマーを製造することができる。しかしながら、試験管内製造方法は、酵素や原料の調製に手間と時間がかかり、製造コストという観点から考えると現段階では実用的ではない。
【０００７】
遺伝子組換え微生物を用いた製造方法では、大腸菌を宿主として高分子量のＰ（３ＨＡ）を生産する微生物のＰ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群を導入した遺伝子組換え微生物により重量平均分子量が３００万を超える超高分子量ポリマーが製造されている（非特許文献２〜４）。大腸菌は本来Ｐ（３ＨＡ）を蓄積しない微生物であるが、Ｐ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群を導入することでＰ（３ＨＡ）を蓄積するようになる。
【０００８】
現在までのところ、超高分子量Ｐ（３ＨＡ）は、代表的なＰ（３ＨＡ）合成微生物であるラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）のＰ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群（phaオペロン）を用いて、グルコースを原料とした場合に製造できることがわかっている（非特許文献２〜４）。しかしながら、従来の製造方法では、大腸菌の菌体濃度が約１０ｇ／Ｌ程度（乾燥菌体）と低く、かつ、ポリマー含率も約６０質量％程度とあまり高くなく、大量製造方法としては適していない。
【０００９】
前述の通り、単にＰ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群を大腸菌内で構成的発現させても、菌
体濃度を高くすることができない。これは、Ｐ（３ＨＡ）を蓄積した大腸菌においては細胞分裂が正常に行なわれず、増殖が抑制されるためと考えられている。この問題を解決するために、ＷａｎｇとＬｅｅは、細胞分裂を促すタンパク質（ＦｔｓＺ）を大腸菌内で発現させ、ポリマーを蓄積している細胞においても正常に分裂が行われるようにした（非特許文献５）。その結果、高い菌体濃度（２０４ｇ／Ｌ）及びポリマー収量（１５７ｇ／Ｌ）を達成することに成功している。しかしながら、ポリマーの生産収率は０．２８ｇ−ポリマー／ｇ−グルコースであり、あまり高いとはいえない。
【００１０】
Ｐ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群の誘導発現によるＰ（３ＨＡ）製造方法に関しては、Ｋｉｄｗｅｌｌらの報告がある（非特許文献６）。しかし、大量製造には至っておらず、また、製造されたポリエステルの分子量は粘度平均分子量１２０万程度であり、超高分子量Ｐ（３ＨＡ）ではなかった。
【００１１】
以上の通り、これまでの高分子量Ｐ（３ＨＡ）の製造方法では、大腸菌の菌体濃度が低く、また、Ｐ（３ＨＡ）含率もあまり高くなかった。その為、高分子量Ｐ（３ＨＡ）の大量製造を行うためには、より簡便で効率のよい方法の開発が必要であった。
【００１２】
【特許文献１】特開平１０−１７６０７０号公報
【非特許文献１】Gerngross, T.U. and Martin, D.P.: Enzyme-catalyzed synthesis of poly[(R)-(-)-3-hydroxybutyrate]:Formation of macroscopic granules in vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6279-6283, 1995.
【非特許文献２】Kusaka,S., Abe, H., Lee, S.Y., Doi, Y.: Molecular mass of poly[(R)-3-hydroxyalkanoic acid] produced in a recombinant Escherichia coli, Appl. Microbiol. Biotechnol., 47, 140-143, 1997.
【非特許文献３】Sim, SJ, Hogan, S.C., Snell, K.D., Sinskey, A.J., Rha, C.K., Stubbe, J.: PHA synthase activity controls the molecular weight and poldispersity of polyhydroxybutyrate in vivo, Nat. Biotechnol., 15, 63-67, 1997.
【非特許文献４】Sim S.J., Snell, K.D., Kim, B.W., Rha, C.K., Sinskey, A.J.: Increased poly-β-hydroxybutyrate (PHB) chain length by the modulation of PHA synthase activity in recombinant Escherichia coli. Biotechnol. Lett., 23, 2057-2061, 2001.
【非特許文献５】Wang, F., Lee, S.Y.: Production of poly(3-hydroxybutyrate) by fed-batch culture of filamentation-suppressed recombinant Escherichia coli, Appl. Environ, Micromol., 63, 4765-4769, 1997.
【非特許文献６】Kidwell, J., Valentin, H.E., Dennis, D.: Regulated expression of the Alcaligenes eutrophus pha biosynthesis genes in Escherichia coli, Appl. Environ, Micromol., 61, 1391-1398, 1995.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、形質転換微生物を用いた、高分子量のＰ（３ＨＡ）を簡便に効率よく製造する方法、並びに該製造方法に用いる形質転換微生物及び該形質転換微生物を作製するためのＰ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群の発現を誘導することが可能な発現ベクターを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するため、検討をおこなった結果、Ｐ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群を誘導性プロモーター下流に導入した発現ベクターを導入した形質転換微生物を、Ｐ（３ＨＡ）生産に十分な量まで増殖させた後、誘導条件下で誘導性プロモーターを誘導することにより、Ｐ（３ＨＡ）生産に十分な微生物量を得ることができ、また、この微生物により高分子量のＰ（３ＨＡ）を効率的に製造することができることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１５】
すなわち本発明は、以下の通りである。
（１）  ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子群と、誘導性プロモーターを含む発現ベクターであって、前記ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子群が前記誘導性プロモーターにより制御可能に導入されている発現ベクター。
（２）  前記発現ベクターがpJRDTrcphaCABReである、（１）に記載の発現ベクター。
（３）  前記発現ベクターがpTrcphaCABReである、（１）に記載の発現ベクター。
（４）  ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子群を誘導性プロモーターにより制御可能に宿主微生物に導入して得られる形質転換微生物。
（５）  前記形質転換微生物が大腸菌である（４）に記載の形質転換微生物。
（６）  ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子群を誘導性プロモーターにより制御可能に宿主微生物に導入して得られる形質転換微生物を培養し、誘導条件下で誘導性プロモーターを誘導し、形質転換微生物を炭素源存在下で培養し、形質転換微生物からポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を単離・精製することを特徴とするポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によって、形質転換微生物を用いたＰ（３ＨＡ）の製造方法、並びに該製造方法に用いる形質転換微生物及び該形質転換微生物の作製に用いる発現ベクターが提供される。
【００１７】
本発明においては、Ｐ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群を誘導性プロモーターにより制御可能に宿主微生物に導入して得られる形質転換微生物を、予め遺伝子を誘導発現せずに培養するため、Ｐ（３ＨＡ）が微生物内に蓄積することによる微生物の分裂の阻害を低減することができる。そのため、形質転換微生物をＰ（３ＨＡ）生産に十分な量を得るまで増殖させることができる。その後、Ｐ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群を誘導発現させることにより、微生物内に高分子量のＰ（３ＨＡ）を蓄積させることができる。
このため、本発明によって、高分子量のＰ（３ＨＡ）を簡便に効率よく製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（１）本発明の発現ベクター
本発明の発現ベクターに使用するＰ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群としては、Ｐ（３ＨＡ）重合酵素遺伝子と３-ヒドロキシアルカン酸（以下、「３ＨＡ」と記載することがある）モノマー供給遺伝子（群）とを含むものを用いることができる。
Ｐ（３ＨＡ）重合酵素遺伝子は、公知のＰ（３ＨＡ）重合酵素遺伝子を用いることができる。そのような遺伝子としては、例えば、ラルストニア・ユートロファ由来のＰ（３ＨＡ）重合酵素遺伝子phbC（Genbank アクセッション番号：M64341）（Steinbuchel A. and
Schlegel H. G., Mol. Microbiol., 5: 535-542(1991)）、デルフチア・アシドヴォランス（Delftia acidovorans）由来のＰ（３ＨＡ）重合酵素遺伝子phaC（Genbank アクセッション番号：M64341）（Sudesh,K., Fukui,T. and Doi,Y.,Appl. Environ. Microbiol. 64: 3437-3443 (1998)）等である。
【００１９】
また、本発明の発現ベクターにおける３ＨＡモノマー供給酵素遺伝子（群）(phaAもしくはphbA:β-ケトチオラーゼ遺伝子、phaBもしくはphbB:アセトアセチル-CoA（コーエイ:補酵素Ａ）遺伝子等）についても公知の遺伝子を用いることができる。そのような遺伝子としては、例えば、ラルストニア・ユートロファ由来のphbA、phbB（Genbank アクセッション番号：J04987）（Peoples,O.P. and Sinskey,A.J., J. Biol. Chem. 264: 15293-15297 (1989))等である。
【００２０】
また、３ＨＡモノマー供給酵素遺伝子（群）に換えて、脂肪酸合成酵素遺伝子（群）等を用いることもできる。本発明に用いることができる脂肪酸合成酵素遺伝子は、真核生物や微生物由来の公知の遺伝子である。例えば、大腸菌（エシェリチア・コリ：Escherichia coli）由来の脂肪酸合成酵素遺伝子fab（Battner et al., Science 277:1453-1474, 1997 ）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）由来の脂肪酸合成酵素遺伝子fab（Kunst et al., Nature 390:249-256, 1997）等であり、これらを単独もしくは複数組み合わせて使用することができる。
【００２１】
例えば、Ｐ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群としては、ラルストニア・ユートロファH16株（ATCC 17699）からphaオペロン（phaCABRe）を、ＰＣＲ等の通常の遺伝子工学的手法（Sambrook et al., Molecular Cloning 2nd Edn.（Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989）等を参照）に基づいて単離することができる。
【００２２】
なお、ラルストニア・ユートロファの学名は、近年アルカリゲネス・ユートロファス（Alcaligenes eutrophus）より変更になったものである。さらに、最近ではオーテルシア・ユートロファ（Wautersia eutropha）と称されることもあるが、本発明においては、これらのいずれの学名の微生物も用いることができる。
【００２３】
Ｐ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群としては、上記公知遺伝子をプローブとして、任意生物種のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ等の通常の遺伝子工学的手法に基づいて単離したＰ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子を用いることもできる。
【００２４】
あるいは、Ｐ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子がコードするＰ（３ＨＡ）重合酵素及び３ＨＡモノマー供給酵素等の機能を損なわない範囲内において、同酵素の特定の部位のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転移を含むように、同Ｐ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子の塩基配列において置換、欠失、挿入又は転移を含むＰ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子を用いることもできる。
【００２５】
本発明の発現ベクターにおいては、Ｐ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群の発現を誘導するための誘導性プロモーターを、該Ｐ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群を制御可能に導入する。なお、「誘導性プロモーター」とは、誘導条件下にない場合に機能せず、誘導条件下で機能するプロモーターを意味する。誘導条件としては、例えば誘導性プロモーターを誘導しうる誘導物質、温度、ｐＨ等がある。誘導性プロモーターとしては、公知の誘導性プロモーターを用いることができ、例えば、ラクトース、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）等を誘導物質とするtrc、lac等のプロモーター等である。
【００２６】
これらのＰ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群及びプロモーターを、微生物用のベクターに組み込み、本発明の発現ベクターとすることができる。微生物用のベクターは、微生物中で複製可能なオリジン、リボソーム結合部位、遺伝子クローニング部位、ターミネーター等を有する公知の微生物用発現ベクター（例えば、大腸菌用発現ベクターとしては、pUC系、pBluescript II、pET発現システム、pGEX発現システム）などを用いることができる。そのようなベクターとしては、すでにtrcプロモーターが組み込まれた発現ベクターであ
る市販のpTrc99A、又はpJRDTrc1（特開２０００−１３５０８３号）等を用いることもできる。
【００２７】
ベクターとしては、ハイコピーベクター（例えば、コピー数１００〜６００程度）及びローコピーベクター（例えば、コピー数１〜２０程度）のいずれをも用いることが可能であるが、ハイコピーベクターを用いた場合、発現誘導をおこなわなくても遺伝子が若干発現する場合がある。また、得られるＰ（３ＨＡ）の分子量に関し、ローコピーベクターを用いた場合の方が、ハイコピーベクターを用いた場合に比べ、より高い分子量のものが得られる傾向にある。このような遺伝子発現制御及び得られるＰ（３ＨＡ）の物性の面から、本発明においては、ローコピーベクターを用いることが好ましい。
【００２８】
（２）形質転換微生物
以上のように構築したＰ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群発現ベクターをエレクトロポレーション法（電気穿孔法）、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法により宿主微生物に導入する。そして、発現ベクター中の耐性遺伝子による薬剤耐性等を用いて同遺伝子により形質転換した微生物を単離することができる。
【００２９】
なお、Ｐ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群の遺伝子は、同一の発現ベクター中に存在させてもよく、それぞれ２又は３以上の発現ベクター中に存在させてもよい。
【００３０】
あるいは、Ｐ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群の遺伝子は、誘導性プロモーターにより制御可能に宿主微生物の染色体ＤＮＡに導入してもよい。
【００３１】
このようにして、本発明の形質転換微生物である、Ｐ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群を誘導性プロモーターにより誘導発現することが可能な形質転換微生物を得ることができる。
宿主としては、例えばエシェリチア属に属する菌種、具体的には、大腸菌（エシェリチア・コリ：Escherichia coli）の菌株が用いられる。具体的には、Escherichia coli XL1-Blue、JM109、DH5α、B,W等が挙げられる。
【００３２】
（３）本発明のＰ（３ＨＡ）の製造方法
本発明のＰ（３ＨＡ）の製造方法においては、まず、上記のようにして作製した形質転換微生物を、Ｐ（３ＨＡ）生産に十分な菌体量を得るまで増殖させる。この際、炭素源は培地中に加えても加えなくてもよい。炭素源を予め培地中に加えておいても、本発明の形質転換微生物のＰ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群の発現は、誘導性プロモーターにより制御されているため、非誘導条件下であるこの段階において、同遺伝子の発現はほぼ抑制されており、菌体内にＰ（３ＨＡ）が蓄積することにより、菌体の増殖が抑制されることが少ないからである。
【００３３】
Ｐ（３ＨＡ）生産に十分な菌体量が得られたら、誘導条件下、例えばＩＰＴＧ等の誘導物質を培地中に添加することにより、誘導性プロモーターを誘導させ、Ｐ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群の発現を誘導する。なお、遺伝子の発現誘導は菌体の培養を継続しつつ行ってもよく、菌体の培養を停止して行い、その後Ｐ（３ＨＡ）生産のための培養を開始してもよい。発現誘導後、炭素源存在下で十分な量のＰ（３ＨＡ）が微生物内に蓄積されるまで培養をおこなう。
【００３４】
培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン並びに必要に応じその他の有機成分及び抗生物質を含有する通常の培地を用いることができる。このような培地としては、例えば、ＬＢ培地（イーストエキストラクト  ５．０ｇ／Ｌ、トリプトン  １０．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０．０ｇ／Ｌ）、Ｒ培地（培地（／Ｌ）：ＫＨ2ＰＯ4  １３．５ｇ、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4  ４．０ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １．４ｇ、クエン酸  １．７ｇ、チアミン  
０．０１ｇ、トレースエレメント  １０ｍｌ、グルコース、２０．０ｇ、トレースエレメント（／Ｌ、５Ｎ  ＨＣｌ中）：ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １０．０ｇ、ＣａＣｌ2  ２．０ｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ２．２ｇ、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ  ０．５ｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  １．０ｇ、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ  ０．１ｇ、Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ  ０．０２ｇ）等の培地を用いることができる。
【００３５】
炭素源は、グルコースやフルクトース等の糖類、又は脂肪酸類を制限なく用いることができる。
【００３６】
培養は、通常の微生物の培養条件を用いることができ、例えば、大腸菌の場合には、誘導発現前に好気的条件下で２５〜４０℃で、１２〜３６時間程度培養することが好ましく、誘導発現後に好気条件下で２５〜４０℃で、１２〜３６時間程度培養することが好ましい。また、培養中のｐＨは６．０〜８．０に制御することが好ましい。
【００３７】
なお、本発明のＰ（３ＨＡ）の製造方法においては、Ｐ（３ＨＡ）合成酵素遺伝子群の誘導発現の効果に加え、より低温で培養をおこなうことによって、菌体内にポリマーが蓄積することによる菌体のフィラメント化がさらに低減される傾向にあるため、さらに高密度な培養が可能になる。
また、より低温で培養をおこなうことによって、発現誘導をより効果的に制御することができる傾向にある。
したがって、Ｐ（３ＨＡ）の生産性及び遺伝子発現制御という面から、培養温度は３０℃以下が好ましい。
【００３８】
また、本発明のＰ（３ＨＡ）の製造方法においては、より低いｐＨで培養をおこなうことによって、蓄積するポリマーの分子量が高くなる傾向がある。その一方、より低いｐＨで培養をおこなうと生産性が低くなる傾向がある。したがって、目的に応じて適宜ｐＨを調整するのがよい。
【００３９】
蓄積されたＰ（３ＨＡ）は公知の方法により単離・精製することができる。例えば、大腸菌の場合には、培養液から遠心分離等により菌体を集め、これを凍結乾燥し、乾燥菌体からクロロホルム抽出によってＰ（３ＨＡ）を単離することができる。そして、各種クロマトグラフィー等により精製することができる。
【実施例１】
【００４０】
以下に、本発明の実施例を説明する。
＜実施例１＞
（１）形質転換株Escherichia coli XL1-Blue(pTrcphaCABRe)及びEscherichia coli XL1-Blue(pJRDTrcphaCABRe)の調製
（i）プラスミドpTrcphaCABRe（ハイコピーベクター）の調製
ラルストニア・ユートロファH16株（ATCC 17699）由来のポリ−３−ヒドロキシブタン酸（以下、「Ｐ（３ＨＢ）」と記載することがある）生合成オペロンphaCABRe及びTrcプロモーターを含むpTrcphaCABReを、次のようにして調製した。
【００４１】
pTrc99A（アマシャム・バイオサイエンス社製）のマルチクローニングサイトに、ヌクレオチド合成機にて人工合成したEcoRI-BglII-Csp45I-NheI-NdeI-BamHIリンカーを挿入し、pTrcEBCNNBとした。
【００４２】
pTrcEBCNNBのマルチクローニングサイトに、pGEM'phbCABRe（Matsusaki et al., Appl.
Microbiol. Biothechol., 53, 401-409, 2000）のＰ（３ＨＢ）生合成オペロンを含むCsp45I-BamHI断片を挿入し、pTrcphaCABReとした。本プラスミドは、アンピシリン耐性遺伝
子（Ampr）を有しており、trcプロモーターの発現を制御するLacIタンパク質の遺伝子（lacIq）を有している。得られたプラスミドの構造を図１に示す。
【００４３】
（ii）プラスミドpJRDTrcphaCABRe（ローコピーベクター）の調製
ラルストニア・ユートロファH16株（ATCC 17699）由来のＰ（３ＨＢ）生合成オペロンphaCABRe及びTrcプロモーターを含むpJRDTrcphaCABReを、次のようにして調製した。
【００４４】
特開２０００−１３５０８３号に記載のpJRDTrc1は、pTrc99AとpJRD215（ATCC 37533）を組み合わせて構築した。pJRDTrc1のマルチクローニングサイトに、上記のように調製したpTrcphaCABReのEcoRI-HindIII断片を挿入し、pJRDTrcphaCABReとした。本プラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子（Kmr）を有しており、trcプロモーターの発現を制御するLacIタンパク質の遺伝子（lacIq）を有している。得られたプラスミドの構造を図２に示す。
【００４５】
（iii）形質転換株Escherichia coli XL1-Blue(pTrcphaCABRe)及びEscherichia coli XL1-Blue(pJRDTrcphaCABRe)の調製
Escherichia coli XL1-Blueへの各プラスミドpTrcphaCABRe及びpJRDTrcphaCABReの導入を塩化カルシウム法によりコンピテント細胞を作製し、これをプラスミド溶液と混ぜ熱ショックを与えることで行った。形質転換体の取得は、50mg/Lのアンピシリン又はカナマイシンを含むＬＢ培地（イーストエキストラクト  ５.０ｇ／Ｌ、トリプトン  １０．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）寒天プレート上で行った。以上のようにして、形質転換株Escherichia coli XL1-Blue(pTrcphaCABRe) 及びEscherichia coli XL1-Blue(pJRDTrcphaCABRe)を調製した。尚、Escherichia coli XL1-Blueは、東洋紡績（株）社から入手した。
【００４６】
（２）Ｐ（３ＨＢ）合成
（i）シード培養
ＬＢ培地（イーストエキストラクト  ５．０ｇ／Ｌ、トリプトン  １０．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）３．５ｍＬを入れた２０ｍＬ容試験管に、−８０℃で保存しておいたEscherichia coli XL1-Blue（pTrcphaCABRe）及びEscherichia coli XL1-Blue（pJRDTrcphaCABRe）の１０ｖ／ｖ％のグリセロールストック１ｍＬを各々接種し、３０℃で１２時間好気的に培養した。これを、グルコースを２０ｇ／Ｌとなるように添加した、ＬＢ培地１００ｍＬを入れた５００ｍＬ容坂口フラスコに接種し、３０℃で１８時間好気的に培養した。
【００４７】
（ii）生産培養
丸菱バイオエンジＭｏｄｅｌ２５０（容量１０Ｌ）にＲ培地（培地（／Ｌ）：ＫＨ2ＰＯ4  １３．５ｇ、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4  ４．０ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １．４ｇ、クエン酸  １．７ｇ、チアミン  ０．０１ｇ、トレースエレメント  １０ｍｌ、グルコース、２０．０ｇ、トレースエレメント（／Ｌ、５Ｎ  ＨＣｌ中）：ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １０．０ｇ、ＣａＣｌ2  ２．０ｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ２．２ｇ、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ  ０．５ｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  １．０ｇ、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ  ０．１ｇ、Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ  ０．０２ｇ）４Ｌを加え、１２１℃で１５分滅菌した。なお、トレースエレメントはフィルター滅菌しておき、ファーメンターに加えた。なお、グルコース２０ｇ／水１００ｍＬ溶液は培地と同条件で滅菌しておき、ファーメンターに加えた。
【００４８】
ファーメンターは、温度３０℃に調整し、４〜５Ｌ／ｍｉｎでフィルター滅菌した酸素を供給し、溶存酸素濃度４０％を維持するように撹拌速度を調節した。グルコースの添加はpH-stat法により行った。すなわち、培地のグルコース濃度をモニターしながら、培地のｐＨが７．１を上回った場合に、自動的に２０ｇ／Ｌ×培養液量（Ｌ）のグルコースが
供給されるようにフィーデングソリューション（（／Ｌ）：グルコース  ７００ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １５ｇ、チアミン  ０．２５ｇ）を添加した。一方、培地のｐＨが低下した場合は、２８vol%アンモニア水を添加して、自動的に７．０に制御した。ここに、前培養で得られた培養液４００ｍＬを接種した。培養開始２４時間後にＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭとなるように添加した。ＯＤ780の勾配にしたがって溶存酸素濃度１０％以下になるように撹拌速度を調節した。培養開始から５４時間経過したのち、培養液を回収した。
【００４９】
（３）結果
回収した培養液を４℃で、１５０００ｇ、１０分間遠心分離機にかけ、上清を取り除いた。回収した菌体は蒸留水とよく混ぜ合わせて洗浄し、洗浄液は再び遠心分離機にかけて分離した。集めた菌体を、次いで凍結乾燥した。
【００５０】
このようにして得られた乾燥菌体５ｇに対し、常温のクロロホルム５０ｍＬを加え、よく撹拌した。Ｐ（３ＨＢ）が完全にクロロホルム中に溶けだした後、フィルターで菌体を除去した。溶液はロータリーエバポレーターで約１０分の１に濃縮した。これを、１０倍量のヘキサンにゆっくり注ぎ、白いＰ（３ＨＢ）の沈殿を得た。濾過によりヘキサンを除去し、よく乾燥させてＰ（３ＨＢ）の収量を測定した。
【００５１】
得られたポリマーの組成は、菌体内のＰ（３ＨＢ）を高温下で硫酸−メタノール混合溶液と反応させメタノリシスを行い、メチルエステル化されたモノマー成分をガスクロマトグラフィー分析し、定量した。メタノリシスの反応を以下に示す。
ガスクロマトグラフィー分析を用いることにより、１度にＰ（３ＨＢ）蓄積率（含量）とその組成比が定量分析できる。Ｐ（３ＨＡ）蓄積条件下で培養した培養液を、５０ｍＬ
ＦＡＬＣＯＮチューブに２回に分けて移し、室温にて８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除くことで集菌した。純水を各２５ｍＬ加え懸濁し、遠心し、上清を除くことで洗浄した。最後に２ｍＬの純水に懸濁して、あらかじめ質量を測定したマルエムサンプル容器に移した。サンプルを−８０℃にて５時間凍結した後、２４時間真空乾燥を行い、得られた乾燥菌体質量を測定した。耐圧スクリュー管に各サンプルを３０ｍｇ移し、１５：８５％（ｖ／ｖ）  硫酸−メタノール混合溶液を２ｍＬ及びクロロホルムを２ｍＬ加え厳封した。それをヒートブロックにて１００℃、１４０分間加熱し、メタノリシスを行った。加熱の間、数回ボルテックスを用いて激しく撹拌した。反応後放冷し、反応液に１ｍＬの純水を加え、ボルテックスにて激しく撹拌した。静置により３相に分離させ、最下層のみをパスツールピペットを用いて採取し、孔径０．４５ｍｍのＭｉｌｌｅｘ−ＦＨ（ミリポア社製）フィルターを通した後、マルエムサンプル管に移した。さらにその５００ｍＬをAutosample Vials & Accessories（National Scientific Company製）に移し、内部標準として０．１％カプリル酸メチルを加えたクロロホルム溶液５００ｍＬと混合し、測定サンプルとした。ガスクロマトグラフィーへの注入量は１ｍＬとした。
ガスクロマトグラフィー装置は、島津ＧＣ−１７Ａ（島津製作所製）を用いた。カラムは、ＮＥＵＴＲＡ−ＢＯＮＤ−１（３０ｍ×０．２５ｍｍ，Ｉ．Ｄ．０．４ｍｍ、ＧＬサイエンス社製）を用いた。キャリアガスとしてヘリウムを用い、成分検出は水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）により行った。ピーク面積の積分には島津クロマトパックＣ−Ｒ７Ａを用いた。
【００５２】
Ｐ（３ＨＢ）の数平均分子量（Ｍn）は、島津１０ＡＧＰＣシステムと、６Ａ示差屈折計、Shodex K802, K806Mカラムを直列接続したものを用い、４０℃で測定した。溶離液にはクロロホルムを用い、流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎとし、サンプル濃度は０．２５ｍｇ／ｍＬとした。数平均分子量1,200〜4,000,000の多分散度の狭いポリスチレンスタンダードを使用して検量線を作成し、ＧＰＣより得られたデータから島津クロマトパックＣ−Ｒ７Ａで、ＧＰＣプログラムを使って分子量及び多分散度（Ｍw／Ｍn）を計算した。起こりう
る分子量測定誤差は±２０％である。
【００５３】
なお、比較対照としてラルストニア・ユートロファH16株のＰ（３ＨＢ）生合成オペロンphaCABReをラルストニア・ユートロファH16株由来の恒常性プロモーター下流に含むプラスミドpSYL105を導入した形質転換体Escherichia coli XL1-Blue（pSYL105）（Lee, S.
Y., et al., Biotechnol. Bioeng., 44:1337-1374(1994)、Meynell, E. and Datta, N.,
Genet.Res. Camb., 7, 134-140(1966)、Rasmussen, P.B., et al., Mol. Gen. Genet.,209,122-128(1987)、Gerdes, K., Bio/Technology, 6, 1402-1405(1988)、Schubert, P. et al., J. Bacteriol., 173:168-175(1991)、Schubert, P., et al.,J. Bacteriol., 170:5837-5847(1988)）についても、同様に培養をおこなった。
結果を表１に示す。
【００５４】
【表１】
2005278559.tif 000003
【００５５】
本発明の形質転換体（Ｎｏ．１−１，１−２，１−３，１−４，２）、すなわち、誘導性プロモーターにより誘導発現されるＰ（３ＨＢ）合成酵素遺伝子群を導入した形質転換体は、菌体の増殖が良好で、かつ菌体内Ｐ（３ＨＢ）含量も高く、高い生産性が得られた。さらに、得られたＰ（３ＨＢ）は超高分子量かつＭw／Ｍnの低い非常に均質な分子量を
もつ高品質のＰ（３ＨＢ）であった。なお、得られたポリマーの組成に関しては、３-ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）が１００％であった。
これに対し、比較対照の形質転換体（Ｎｏ．３）、すなわち、恒常性プロモーターにより発現されるＰ（３ＨＢ）合成酵素遺伝子群を導入した形質転換体は、本発明の形質転換体に比べ、菌体の増殖が制限されており、また、菌体内Ｐ（３ＨＢ）含量も十分ではなく、したがって、生産性も十分なものではなかった。得られたＰ（３ＨＢ）の分子量についても本発明の形質転換体に比べ、低い分子量であった。また、Ｍw／Ｍnに関しても、比較的高いものであった。なお、得られたポリマーの組成に関しては、３ＨＢが１００％であった。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、プラスミドpTrcphaCABReの構造を示す。
【図２】図２は、プラスミドpJRDTrcphaCABReの構造を示す。
【図１】
2005278559.tif 000004
【図２】
2005278559.tif 000005