(57)【要約】      （修正有）【課題】食品中のラクトバチルス・フラクチボランスを特異的に、簡便且つ迅速に検出できるオリゴヌクレオチド及びこれを用いたラクトバチルス・フラクチボランスの検出法を提供する。【解決手段】下記の（ａ）及び（ｂ）で示されるラクトバチルス・フラクチボランス検出用オリゴヌクレオチド。（ａ）特定の塩基配列を有する塩基配列の一部であって、当該塩基配列の２０番目から３６番目を含む１７〜３６の連続した塩基配列、若しくはその相補配列、又は当該塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、（ｂ）特定の塩基配列を有する塩基配列の一部であって、当該塩基配列の３６番目から２０番目を含む１７〜３６の連続した塩基配列、若しくはその相補配列、又は当該塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド下記の（ａ）及び（ｂ）で示されるラクトバチルス・フラクチボランス検出用オリゴヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）及び（ｂ）で示されるラクトバチルス・フラクチボランス検出用オリゴヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列の一部であって、当該塩基配列の２０番目から３６番目を含む１７〜３６の連続した塩基配列、若しくはその相補配列、又は当該塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列の一部であって、当該塩基配列の３６番目から２０番目を含む１７〜３６の連続した塩基配列、若しくはその相補配列、又は当該塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項２】
核酸プローブ又は核酸プライマーである請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１記載のオリゴヌクレオチドを標識化し、得られた標識核酸プローブを試料中のＤＮＡ又はＲＮＡと交雑させ、交雑した結合体の標識を測定することを特徴とする試料中のラクトバチルス・フラクチボランスの検出法。
【請求項４】
請求項１記載のオリゴヌクレオチドである核酸プライマー又は該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライマーを試料中のＤＮＡ又はＲＮＡと交雑させ、プライマー伸長させ、得られたプライマー伸長物を測定することを特徴とする試料中のラクトバチルス・フラクチボランスの検出法。
【請求項５】
請求項１記載のオリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）からなるプライマーセットを使用して、ＰＣＲ反応によりプライマー伸長を行うものである請求項４記載のラクトバチルス・フラクチボランスの検出法。
【請求項６】
請求項１記載のオリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プローブを含有する試料中のラクトバチルス・フラクチボランスの検出キット。
【請求項７】
請求項１記載のオリゴヌクレオチドである核酸プライマー又は該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライマーを含有する試料中のラクトバチルス・フラクチボランスの検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酢酸性食品の腐敗原因菌である酢酸耐性乳酸菌を簡易、迅速に検出するためのオリゴヌクレオチド及びこれを用いた当該菌の検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品の微生物事故は、製品や製造ライン殺菌不良・容器のシール不良が原因となる微生物混入やラインシール性不良などが事故発生件数の主を占めている。その為、これらの要因を排除・検品するにはハイレベルな検査技術が要求される。
【０００３】
マヨネーズ又はドレッシング等の酢酸性調味料や酢酸性食品においては、腐敗原因菌として酵母、カビ、乳酸菌等が知られている。加熱殺菌・特数値において酵母・カビは容易に殺菌が可能であるが、酢酸耐性の乳酸菌であるラクトバチルス・フラクチボランス（Lactobacillus fructivorans）は、ある程度の耐熱・好酢酸性の性質を持っているので酢酸性調味料業界においては重要危害菌として警戒されている。
【０００４】
従来、食品中のラクトバチルス・フラクチボランスの検査方法は、選択培地（ＭＲＳ＋０．５％塩酸）での生育及び顕微鏡での目視による形状観察により行われていた（非特許文献１〜３参照）。
【０００５】
しかしながら、この検査法では、菌の培養に非常に時間がかかること、また倍率の高い高価な顕微鏡装置が必要である等、問題点が多い。また、この検査は検査員の経験と主観に大きく左右される為、客観性を妥当とする評価検査に適するとはいえなかった。
【非特許文献１】醸協1985  Vol  80  No,10  710〜714
【非特許文献２】醸協2000  Vol  95  No,1  39〜45
【非特許文献３】食品工業  1998  Vol  41  No,20  25〜34
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、食品中のラクトバチルス・フラクチボランスを特異的に、簡便且つ迅速に検出できるオリゴヌクレオチド及びこれを用いたラクトバチルス・フラクチボランスの検出法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、酢酸耐性乳酸菌（ラクトバチルス・フラクチボランス）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域に着目し、検討したところ、当該領域の上流に存在する約５００塩基対の塩基配列を特定のオリゴヌクレオチドを用いて検出することにより、ラクトバチルス・フラクチボランスのみを特異的に高感度で検出できることを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は、下記の（ａ）及び（ｂ）で示されるラクトバチルス・フラクチボランス検出用オリゴヌクレオチドを提供するものである。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列の一部であって、当該塩基配列の２０番目から３６番目を含む１７〜３６の連続した塩基配列、若しくはその相補配列、又は当該塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列の一部であって、当該塩基配列の３６番目から２０番目を含む１７〜３６の連続した塩基配列、若しくはその相補配列、又は当該塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【０００９】
また本発明は、当該オリゴヌクレオチドを標識化し、得られた標識核酸プローブを試料中のＤＮＡ又はＲＮＡと交雑させ、交雑した結合体の標識を測定することを特徴とする試料中のラクトバチルス・フラクチボランスの検出法を提供するものである。
【００１０】
また本発明は、当該オリゴヌクレオチドである核酸プライマー又は該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライマーを試料中のＤＮＡ又はＲＮＡと交雑させ、プライマー伸長させ、得られたプライマー伸長物を測定することを特徴とする試料中のラクトバチルス・フラクチボランスの検出法を提供するものである。
【００１１】
また本発明は、当該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プローブを含有する試料中のラクトバチルス・フラクチボランスの検出キットを提供するものである。
【００１２】
また本発明は、当該オリゴヌクレオチドである核酸プライマー又は該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライマーを含有する試料中のラクトバチルス・フラクチボランスの検出キットを提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、食品中の酢酸耐性乳酸菌（ラクトバチルス・フラクチボランス）を特異的に、簡便、迅速且つ高感度に検出できる。従って、従来法に比べ、酢酸性調味料や酢酸性食品の微生物的汚染に関する安全性管理を、簡便・迅速且つ確実に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のラクトバチルス・フラクチボランス検出用オリゴヌクレオチドは、下記の（ａ）及び（ｂ）で示されるものである。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列の一部であって、当該塩基配列の２０番目から３６番目を含む１７〜３６の連続した塩基配列、若しくはその相補配列、又は当該塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列の一部であって、当該塩基配列の３６番目から２０番目を含む１７〜３６の連続した塩基配列、若しくはその相補配列、又は当該塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【００１５】
上記オリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ自動合成機等を用いて化学合成することにより、又はラクトバチルス・フラクチボランスの遺伝子から酵素的に切り出すことにより調製できるが、大量且つ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得られる点から化学合成により調製するのが好ましい。
また、塩基配列の同一性については、Lipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, 1985) によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１６】
本発明の（ａ）で示される配列番号１で示される塩基配列の一部であって、当該塩基配列の２０番目から３６番目を含む１７〜３６の連続した塩基配列、若しくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１で示される塩基配列において２０番目から３６番目を含む１７〜３１の連続した塩基配列若しくはその相補配列が好ましく、より好ましくは１７〜２７、さらに好ましくは１７〜２４、特に好ましくは１７〜２３の連続した塩基配列若しくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。中でも１７番目の塩基から始まる１７番目以下の下流領域のオリゴヌクレオチドがより好ましく、更に、配列番号１で示される塩基配列において１７番目から３９番目を含む２３〜３１の連続した塩基配列若しくはその相補配列が好ましく、より好ましくは２３〜２７、さらに好ましくは２３〜２４の連続した塩基配列若しくはその相補配列が好ましく、特に１７番目から３９番目の連続した２３の塩基配列（配列番号３）若しくはその相補配列、１７番目から４３番目の連続した２７の塩基配列（配列番号４）若しくはその相補配列、１７番目から４７番目の連続した３１の塩基配列（配列番号５）若しくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとしては、その配列同一性が９５％以上であるのが好ましく、さらには９７％以上の配列同一性を有する塩基配列が好ましく、これらには、配列番号１で示される塩基配列において２０番目から３６番目を含む１７〜３６の連続した塩基配列若しくはその相補配列に１又は数個、好ましくは１又は２個、より好ましくは１個の塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドも包含される。
【００１７】
本発明の（ｂ）で示される配列番号２で示される塩基配列の一部であって、当該塩基配列の３６番目から２０番目を含む１７〜３６の連続した塩基配列、若しくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドとしては、配列番号２で示される塩基配列において３６番目から２０番目を含む１７〜３１の連続した塩基配列若しくはその相補配列が好ましく、より好ましくは１７〜２７、さらに好ましくは１７〜２４、特に好ましくは１７〜２３の連続した塩基配列若しくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。中でも３９番目の塩基から始まる３９番目以上の上流領域のオリゴヌクレオチドがより好ましく、更に、配列番号２で示される塩基配列において３９番目から１７番目を含む２３〜３１の連続した塩基配列若しくはその相補配列が好ましく、より好ましくは２３〜２７、さらに好ましくは２３〜２４の連続した塩基配列若しくはその相補配列が好ましく、特に３９番目から１７番目の連続した２３の塩基配列若しくはその相補配列（配列番号６）、３９番目から１３番目の連続した２７の塩基配列若しくはその相補配列（配列番号７）、３９番目から９番目の連続した３１の塩基配列若しくはその相補配列（配列番号８）からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとしては、その配列同一性が９５％以上であるのが好ましく、さらには９７％以上の配列同一性を有する塩基配列が好ましく、これらには、配列番号２で示される塩基配列において３６番目から２０番目を含む１７〜３６の連続した塩基配列若しくはその相補配列に１又は数個、好ましくは１又は２個、より好ましくは１個の塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドも包含される。
【００１８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ラクトバチルス・フラクチボランスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域に存在し、当該ラクトバチルス・フラクチボランスに特異的な核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチドであることから、ラクトバチルス・フラクチボランスを特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとなり得る。
すなわち、本発明オリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用い、公知の方法（ＦＩＳＨ法、ドットプロット法、サザンプロット法、ノーザンプロット法等）により、ラクトバチルス・フラクチボランスを検出すること、或いは、本発明オリゴヌクレオチドを核酸プライマーとしてＤＮＡポリメラーゼ等により伸長反応させてラクトバチルス・フラクチボランスを検出すること、により試料中のラクトバチルス・フラクチボランスを検出・同定、定量することができる。
【００１９】
本発明のオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用いる場合は、本発明のオリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プローブを試料中のＤＮＡ又はＲＮＡと交雑させ、交雑した結合体の標識を適当な検出法で検出すればよい。
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行ってもよいし、標的核酸を標識して捕捉することでもよい。
【００２０】
一方、本発明のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いる場合は、当該オリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライマーとするか、又は該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライマーを試料中のＤＮＡ又はＲＮＡと交雑させ、ＤＮＡポリメラーゼ等によりプライマーを伸長させ、得られたプライマー伸長物を直接測定するか、標識プローブを用いて測定する。尚、この場合、ＤＮＡポリメラーゼ等を使用する遺伝子増幅（ＰＣＲ等）を行うことにより、ラクトバチルス・フラクチボランス遺伝子のみを特異的に増幅することができる。増幅反応に際しては反応時に放射性物質などの標識の結合したヌクレオチドを取り込ませる方法や、増幅産物を電気泳動により分画して特異なバンドを検出することにより、容易にラクトバチルス・フラクチボランスを検出・同定、定量することができる。
【００２１】
ＰＣＲ反応を用いて遺伝子増幅を行う場合には、核酸プライマーは、上記（ａ）で示されるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、（ｂ）で示されるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとするプライマーセットを用いるのが好ましい。例えば、フォワードプライマーとして、（ａ）配列番号１で示される塩基配列の一部であって、当該塩基配列の２０番目から３６番目を含む１７〜３６の連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）を使用し、リバースプライマーとしては、（ｂ）配列番号２で示される塩基配列の一部であって、当該塩基配列の３６番目から２０番目を含む１７〜３６の連続した塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）を使用すればよい。
【００２２】
また、ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分加熱した後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で４５秒のサイクルを２０〜３０回繰り返した後、７２℃で１０分放置後、４℃に冷却する条件がプライマーダイマーの発生を防ぐ点から、好ましい。
【００２３】
ここで用いられる、標識オリゴヌクレオチドにおける標識物としては、放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体などの公知の標識物が挙げられる。標識方法は、末端標識でも、配列の途中に標識してもよく、また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。
尚、かかる標識の検出手段としては、検出プローブが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フィルムを用いた解析やＣＣＤカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。
【００２４】
本発明の検出キットは、試薬として、本発明のオリゴヌクレオチド又はこのオリゴヌクレオチドを適当な標識物で標識化した標識オリゴヌクレオチドを含有するものである。核酸プライマーを含有するキットには標識プローブを含んでいてもよい。当該キットには、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酵素基質（ｄＮＴＰ，ｒＮＴＰ等）等を含有させることができる。
【実施例】
【００２５】
実施例１  FISH法
15mL用の無菌チューブに4%PFA9mL・菌液（×106以上）3mLを添加した。3H以上4℃で保存した後、遠心機（HITACHI CF16RX）で4000rpmで10分間遠心を行った。上澄み液を廃棄後、1×PBSで再懸濁してもう一度4000rpmで10分間遠心した。上澄み廃棄後に1×PBS：エタノール＝１：１にしたものを添加したものをサンプルとした。疎水性コートスライドガラスに１ウェルに付きサンプル3μLを添加した。46℃で乾燥させた後、50・80・98％（v/v）各3分間エタノール脱水して自然乾燥した。各ウェルに50μg/mLリゾチーム20μL添加して30℃20minで反応させた。その後、自然乾燥し、ハイブリダイゼーションバッファー（0.9M塩化ナトリウム・0.01％w/vSDS・20mMトリス塩酸・20 w/vホルムアミド）8μL・本発明プローブ（Ｃｙ３）（配列番号３及び６）30ngを添加し、46℃で2H保存した。ウォシングバッファー（塩化ナトリウム180mM・0.01％w/vSDS・20mMトリス塩酸・5mM EDTA）で20分間洗浄して自然乾燥した。DAPIを含んだ褪色防止剤を加え、カバーグラスをかぶせてコーティングして蛍光顕微鏡（オリンパスＡＸ−７０・フィルター Ｕ−ＤＭｃｙ３）で観察した。その結果、Lactobacillus fructivoransを検出できた。
【００２６】
実施例２  ＰＣＲ反応による検出
MRS+0.5％塩酸及び酢酸の寒天培地・30℃で定常期まで培養し、集菌後、Dneasy TissueKit(qiagen)でそれぞれの菌体より全ＤＮＡを取得した。ＤＮＡ量０．０５μｇ/μL、このＤＮＡ １μLとし、本発明プライマー（20pg/μL）ペアー１μL(フォワードプライマー（配列番号３）:0.5μL＋リバースプライマー（配列番号６）:0.5μL)・Pre Mix Taq(Ex Taq Version)（宝バイオ）を13μLと無菌蒸留水（DNA/RNA Free）10μLを0.2mL用チューブ（エッペンドルフ社）に接種、25μLのＰＣＲ反応溶液に調整した後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーDICE（宝バイオ）で増幅反応を行った。反応条件は、２ステップPCR条件では９５℃、10分間後→９５℃・３０秒間→６８℃・４５秒間のサイクルを３０サイクル行なった後、６８℃１０分間反応させた。３ステップのPCR条件では９５℃、10分間後→９５℃・３０秒間→５５℃・３０秒間→７２℃・４５秒間の合成反応のサイクルを３０サイクル→７２℃１０分間反応させた。対照実験として、ゲノムＤＮＡを含まない反応系と他種の乳酸菌（5種類）Lactobacillus.paracasei、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus breves、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus fermentamでもＰＣＲを同様に行った。ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応液から１０μLを分取し、３ ％アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイドでＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡを確認した。Lactobacillus fructivoransの遺伝子を含む反応では400〜500bp程度の塩基の増幅が確認されターゲット細菌を含んだサンプルを選抜できた。対照実験からはＤＮＡ断片の増幅は認められなかった。
【配列表】
2005253345000001.app