(57)【要約】【課題】ランダムプライマーを用いた二本鎖ＤＮＡの増幅反応を行い、二本鎖ＤＮＡを分画、分取する方法において、多くの時間と人的労力を必要とすることなく、サイズがほぼ均一な反応産物を取得することが可能な二本鎖ＤＮＡの取得方法を実現する。【解決手段】ランダムプライマー２０２による二本鎖ＤＮＡ２０４の増幅反応において、まず、均一なサイズ以下の反応産物が得られる様に増幅反応を１サイクル（処理（ａ））のみ行う。反応液中から反応産物を分子ふるい膜２０６により目的サイズのみ分画・分取する（処理（ｂ）、（ｃ））。反応液成分を補充する工程（処理ｄ）を加え、処理（ａ）〜（ｄ）を繰り返すことによって必要量の反応産物を取得し（処理（ｅ））、特定サイズへの鋳型ＤＮＡの増幅及び均一サイズな反応産物を分画・分取する。【選択図】      図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ランダムプライマーを用いた二本鎖ＤＮＡの増幅反応による反応産物取得方法において、
反応産物である二本鎖ＤＮＡを増幅し、分子ふるい膜にて特定サイズ領域に分離および分画、分取することを特徴とする二本鎖ＤＮＡの増幅反応による反応産物取得方法。
【請求項２】
請求項１記載の二本鎖ＤＮＡの増幅反応による反応産物取得方法において、二本鎖ＤＮＡ増幅反応のうち伸長反応時間を限定し、特定サイズ領域にある二本鎖ＤＮＡを増幅することを特徴とする二本鎖ＤＮＡの増幅反応による反応産物取得方法。
【請求項３】
請求項２記載の二本鎖ＤＮＡの増幅反応による反応産物取得方法において、
二本鎖ＤＮＡを一本鎖鋳型ＤＮＡとする工程と、
この一本鎖鋳型ＤＮＡとランダムプライマーをアニールし酵素反応にてプライマーの３’末端より一本鎖ＤＮＡを伸長する工程と、
一本鎖鋳型ＤＮＡより生成した一本鎖ＤＮＡを脱アニールした後に二本鎖ＤＮＡとする工程と、
反応産物である二本鎖ＤＮＡを分画・分取する工程と、
を備えることを特徴とする二本鎖ＤＮＡの増幅反応による反応産物取得方法。
【請求項４】
請求項２記載の二本鎖ＤＮＡの増幅反応による反応産物取得方法において、伸長反応により増幅した二本鎖ＤＮＡを分子ふるい膜により分離および分画、分取することを特徴とする二本鎖ＤＮＡの増幅反応による反応産物取得方法。
【請求項５】
請求項４記載の二本鎖ＤＮＡの増幅反応による反応産物取得方法において、分子ふるい膜により二本鎖ＤＮＡを分離および分画、分取した反応容器に、反応液成分のうちランダムプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、バッファー、及び滅菌蒸留水を再添加し二本鎖ＤＮＡの増幅反応を進行させ、ＤＮＡ増幅及び二本鎖ＤＮＡの分画、分取を複数回繰り返すことを特徴とする二本鎖ＤＮＡの増幅反応による反応産物取得方法。
【請求項６】
請求項５記載の二本鎖ＤＮＡの増幅反応による反応産物取得方法において、分画、分取された二本鎖ＤＮＡを含む分画液より分子ふるい膜により二本鎖ＤＮＡを濃縮することを特徴とする二本鎖ＤＮＡの増幅反応による反応産物取得方法。
【請求項７】
ランダムプライマーを用いた二本鎖ＤＮＡの増幅反応による反応産物取得装置であって、
液体試料を保温加熱する手段と、
液体試料吸引濾過又は遠心分離する手段と、
液体試料を吸引し、上記保温加熱手段又は吸引濾過遠心分離手段に分注する吸引分注手段と、
上記保温加熱手段、吸引濾過遠心分離手段、及び吸引分注手段の動作を制御する動作制御手段と、
を備え、反応産物である二本鎖ＤＮＡを増幅し、特定サイズ領域に分離および分画、分取することを特徴とする二本鎖ＤＮＡの増幅反応による反応産物取得装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼの酵素反応により増幅した二本鎖ＤＮＡの分画、分取方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＢＡＣクローンやＣｏｓｍｉｄクローンといった数十〜数百ｋｂ（ｋｂ：１，０００塩基対）の塩基配列解析には、主にショットガン法が用いられる。このショットガン法では、一般に鋳型ＤＮＡを均一なサイズ（１．５〜２ｋｂ）に断片化した後、クローンを調製し、得られたクローンのライブラリを解析に利用している。
【０００３】
また、クローン調製の際、断片化した鋳型ＤＮＡから１．５〜２ｋｂサイズの断片のみを分画、分取する必要がある。
【０００４】
従来のショットガン法では、まず鋳型ＤＮＡを超音波、フレンチプレス細胞破砕機、あるいはホモジナイザー等により、せん断し断片化する。断片化した鋳型ＤＮＡはアガロースゲル電気泳動を用いて分離し、アガロースゲル中より一般的には１．５〜２ｋｂのサイズに分画、分取する。
【０００５】
次に、得られた断片をクローン化した後、プラスミドＤＮＡとして回収してシーケンシングすることで、鋳型ＤＮＡの塩基配列を解析する。
【０００６】
なお、特許文献１には、生体要素及び細胞を固体表面との相互作用を、温度によって制御し、分離あるいは精製することができるクロマトグラフィー用充填剤を使用するクロマトグラフィー方法が記載されている。
【０００７】
【特許文献１】特開平７−３１８５５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、上記従来技術にあっては、以下に述べるような問題点があった。  
（１）鋳型ＤＮＡを断片化すると、理論上その断片サイズは１塩基対から断片化前のサイズまで分布する。その中から特定サイズの、例えば１．５〜２ｋｂサイズの断片をクローン調製に必要な量だけ分取するには多量の鋳型ＤＮＡを必要とする。この鋳型ＤＮＡの調製には多くの時間と人的労力が必要となる。
【０００９】
（２）断片化した鋳型ＤＮＡをアガロースゲル中より分画、分取するにあたり、該当個所のアガロースゲルを切り出し、そしてサイズ検定をするなど操作が煩雑で時間がかかる。
【００１０】
上記問題点については、ランダムプライマーによる二本鎖ＤＮＡの増幅反応を用いる方法が考えられる。塩基配列のランダムネスにおいて、この方法で得られる反応産物は上記従来技術で得られる断片と同様なサイズ分布をもつが、従来技術に比べ、時間および人的労力を必要とせずに反応産物を得ることができる。
【００１１】
しかしながら、得られた反応産物サイズの分布は、理論上、従来技術と同様であり、サイズが均一な反応産物を取得するためには、反応産物をアガロースゲル中より分画、分取しなければならない。このため、やはり、サイズが均一な反応産物を取得するためには、多くの時間と人的労力が必要であった。
【００１２】
本発明の目的は、ランダムプライマーを用いた二本鎖ＤＮＡの増幅反応を行い、二本鎖ＤＮＡを分画、分取する方法において、多くの時間と人的労力を必要とすることなく、サイズがほぼ均一な反応産物を取得することが可能な二本鎖ＤＮＡの取得方法を実現することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するため、本発明は次のように構成される。  
（１）ランダムプライマーを用いた二本鎖ＤＮＡの増幅反応による反応産物取得方法において、反応産物である二本鎖ＤＮＡを増幅し、分子ふるい膜にて特定サイズ領域に分離および分画、分取する。
【００１４】
（２）好ましくは、上記（１）において、二本鎖ＤＮＡ増幅反応のうち伸長反応時間を限定し、特定サイズ領域にある二本鎖ＤＮＡを増幅する。
【００１５】
（３）また、好ましくは、上記（２）において、二本鎖ＤＮＡを一本鎖鋳型ＤＮＡとする工程と、この一本鎖鋳型ＤＮＡとランダムプライマーをアニールし酵素反応にてプライマーの３’末端より一本鎖ＤＮＡを伸長する工程と、一本鎖鋳型ＤＮＡより生成した一本鎖ＤＮＡを脱アニールした後に二本鎖ＤＮＡとする工程と、反応産物である二本鎖ＤＮＡを分画、分取する工程とを備える。
【００１６】
（４）また、好ましくは、上記（２）において、伸長反応により増幅した二本鎖ＤＮＡを分子ふるい膜により分離および分画、分取する。
【００１７】
（５）また、好ましくは、上記（４）において、分子ふるい膜により二本鎖ＤＮＡを分離および分画、分取した反応容器に、反応液成分のうちランダムプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、バッファー、及び滅菌蒸留水を再添加し二本鎖ＤＮＡの増幅反応を進行させ、ＤＮＡ増幅及び二本鎖ＤＮＡの分画・分取を複数回繰り返す。
【００１８】
（６）また、好ましくは、上記（５）において、分画、分取された二本鎖ＤＮＡを含む分画液より分子ふるい膜により二本鎖ＤＮＡを濃縮する。
【００１９】
（７）ランダムプライマーを用いた二本鎖ＤＮＡの増幅反応による反応産物取得装置であって、液体試料を保温加熱する手段と、液体試料吸引濾過又は遠心分離する手段と、液体試料を吸引し、上記保温加熱手段又は吸引濾過遠心分離手段に分注する吸引分注手段と、上記保温加熱手段、吸引濾過遠心分離手段、及び吸引分注手段の動作を制御する動作制御手段とを備え、反応産物である二本鎖ＤＮＡを増幅し、特定サイズ領域に分離および分画、分取する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ランダムプライマーを用いた二本鎖ＤＮＡの増幅反応を行い、二本鎖ＤＮＡを分画、分取する方法において、多くの時間と人的労力を必要とすることなく、サイズがほぼ均一な反応産物を取得することが可能な二本鎖ＤＮＡの取得方法を実現することができる。
【００２１】
つまり、ランダムプライマーを用いて二本鎖ＤＮＡの増幅反応を行うため、塩基配列のランダムネスにおいて、この方法で得られる反応産物と上記従来技術で得られる断片は同様であり、従来技術に比べ作業時間及び人的労力をかけずに必要量の反応産物を得ることが出来る。
【００２２】
また、二本鎖ＤＮＡの増幅反応においては１サイクル（熱変性、アニール、次いで伸長反応）毎に反応産物の分取を分子ふるい膜にて行うため、特定サイズの鋳型ＤＮＡを増幅しこれを分画、分取することができる。
【００２３】
これにより、作業時間及び人的労力のかかるアガロースゲル電気泳動を用いた分画、分取工程が不要となり、より簡便に均一なサイズのライブラリ作成が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
図１は、本発明の原理説明図である。図１に示す二本鎖ＤＮＡの形成方法は、ランダムプライマーによる二本鎖ＤＮＡの増幅反応を、任意の反応時間による１サイクル反応により行い、次いで、分子ふるい膜により目的サイズの増幅産物を分画、分取する方法である。
【００２５】
本発明の二本鎖ＤＮＡの分画、分取方法は、ランダムプライマーを用い、核酸伸長反応時間を制御する核酸増幅反応であり、後述するステップＡ、ステップＢ、ステップＣ、ステップＤ、ステップＥ、ステップＦ、ステップＧを含んでいる。
【００２６】
ステップＡは、図１に示す二本鎖ＤＮＡの増幅反応であり、以下の４つのステップに分けられる。  
図１のステップ１に示すように、９４〜９６℃の熱変性によって二本鎖になっている鋳型ＤＮＡ１０１を引き離す。ここで、鋳型ＤＮＡとは、ＤＮＡ増幅の際、複製の元になるＤＮＡをいう。
【００２７】
次に、図１のステップ２では、熱変性によって引き離されて一本鎖になった鋳型ＤＮＡ１０１の相補的な部分にプライマー１０２が二本鎖を形成（「アニールする」という）できる温度まで冷却し、アニーリングさせる。ここで、プライマーとは、数十塩基対の合成オリゴヌクレオチドからなる一本鎖ＤＮＡをいう。ＤＮＡ増幅の際、ＤＮＡ合成反応の起点となるものである。
【００２８】
そして、図１のステップ３では、アニールしたプライマー１０２を起点としてＤＮＡポリメラーゼ１０３の酵素反応により５’末端から３’末端方向にＤＮＡ合成が起こり（「伸長反応」という）、伸長ＤＮＡは鋳型ＤＮＡ１０１とで二本鎖ＤＮＡの形で形成される。ここで、ＤＮＡポリメラーゼとは、ＤＮＡ増幅の際、ＤＮＡ合成反応を行う酵素であり、熱変性により一本鎖になった鋳型ＤＮＡと基質であるｄＮＴＰｓから、鋳型ＤＮＡに相補的な一本鎖ＤＮＡを合成する。
【００２９】
次に、図１のステップ４では、鋳型ＤＮＡ１０１よりプライマー１０２から伸長した目的のＤＮＡを脱アニールして、再度、一本鎖の伸長ＤＮＡを二本鎖にアニールする。
【００３０】
本発明では、ランダムプライマーによる二本鎖ＤＮＡの増幅反応において、反応を任意の反応時間で１サイクルのみ行い、反応産物を得る。
【００３１】
これにより、プライマー自身が鋳型になることも抑制できる。そして、反応産物のサイズ制御は１サイクルの反応時間を設定することで行う。例えば、ＤＮＡポリメラーゼでは一般的に伸長反応時間は１ｋｂ当たり４５秒であり、反応時間は、４５秒に増幅したいサイズ（ｋｂ）を掛け合わせた時間となる。
【００３２】
この条件は、使用するＤＮＡポリメラーゼの種類やその活性により変わるので、特に限定するものではなく、好ましくは予備的に該当ＤＮＡポリメラーゼにつき反応時間を変えて、その反応産物のサイズ分布を測定して、伸長反応時間を決めるとよい。
【００３３】
図２は、ステップＡ〜Ｇの説明図である。ステップＡは、図１を参照して説明したように、反応容器２０１中に鋳型ＤＮＡ１０１、ＤＮＡポリメラーゼ１０３、ランダムプライマー２０２、ｄＮＴＰｓ２０３を含む液体試料が収容され、二本鎖ＤＮＡが増幅される（処理（ａ））。ここで、ランダムプライマーとは、ランダムな配列と長さをもつプライマーをいう。
【００３４】
そして、ステップＢにおいて、反応容器２０１の反応液を分子ふるい膜２０６を有する濾過容器２０５に移し（処理（ｂ））、その中から目的のサイズを含む伸長反応産物である二本鎖ＤＮＡ２０４を分子ふるい膜２０６により目的のサイズに分画・分取する（処理（ｃ）、（ｅ））。このとき、分子ふるい膜２０６の孔径サイズを選択することで、目的サイズの反応産物を含む反応液を分取できる。ここで、二本鎖ＤＮＡ２０４は、ＤＮＡポリメラーゼ１０３の酵素反応により合成された、相補的な一本鎖ＤＮＡ同士が結合して得られた二本鎖のＤＮＡである。
【００３５】
ステップＡにおける、「二本鎖ＤＮＡの熱変性」、「鋳型ＤＮＡとプライマーのアニール」、「一本鎖ＤＮＡの伸長反応及び二本鎖ＤＮＡの形成」、「鋳型ＤＮＡからのプライマーの脱アニール及び一本鎖伸長ＤＮＡへの二本鎖ＤＮＡのアニール」の４ステップを１サイクルとする。この反応は一般には温調可能な装置、例えばサーマルサイクラーなどで行う。
【００３６】
１サイクルが終了した時点で、反応液中には反応液成分と反応産物が混在している。
【００３７】
次いで、ステップＣでは、分子ふるい膜（限外濾過膜）２０８を有する回収容器２０７に、目的サイズの二本鎖ＤＮＡを含む上記反応液を濾過容器２０５から吸引濾過又は遠心分離により分注する。そして、回収容器２０７に目的サイズ以下のＤＮＡを含む低分子分画を得る。
【００３８】
図２に示した例では限外濾過膜２０８がセットされた回収容器２０７を用いたが、分画、分取法として特に限定するものではなく、ゲル濾過法でもよい。また、高分子分画側、つまり、二本鎖ＤＮＡが分取された後の濾過容器２０５には、ＤＮＡポリメラーゼ及び鋳型ＤＮＡが回収される。
【００３９】
次に、ステップＤでは、上記高分子分画側にランダムプライマー、ｄＮＴＰｓ、バッファー及び滅菌蒸留水を必要量添加し、均一に攪拌した後、上記条件で反応工程（ステップＡ）を行う（処理（ｄ））。なお、場合によりＤＮＡポリメラーゼも添加することで伸長活性を保持することが必要になる。
【００４０】
１サイクル反応と分子ふるい膜２０６による反応産物（二本鎖ＤＮＡ）の分画、分取、反応液成分の添加で１サイクル反応に戻す工程を繰り返すことによって、反応産物の収量を上げることができる。また、反応容器２０１と分画容器２０６を同一で行えるもの、即ち限外濾過膜を底部に具備した容器を用いれば、効率的に作業を行える。
【００４１】
また、この限外濾過膜を底部に具備した容器はサーマルサイクラーより取り出し、吸引濾過、あるいは遠心分離による分画を行うが、サーマルサイクラーで該当反応容器に加圧、あるいは吸引する機器を設けることで、ＤＮＡの増幅反応と分画、分取を同一装置で行える。
【００４２】
次に、ステップＥでは、クローン調製はμｌ単位の液量にて行うため、上記反応産物分画液の液量を低減しておく必要があり、分子ふるい膜（限外濾過膜２０８）にて濃縮する（処理（ｆ））。
【００４３】
つまり、上記ステップＢにて分画・分取した反応産物を、分子ふるい膜（限外濾過膜２０８）の容器２０７に回収し、この容器２０７を吸引濾過、あるいは遠心分離して反応産物を濃縮し、膜上に残ったＤＮＡを滅菌蒸留水に溶解する。
【００４４】
ステップＦでは、上記により調製した反応産物を用いてクローン調製を行う。続いて、ステップＧでは、クローンをシーケンスすることにより塩基配列を決定する。
【００４５】
図３は、上述した二本鎖ＤＮＡの増幅反応における特定サイズの二本鎖ＤＮＡを分画、分取する方法の動作フローチャートである。
【００４６】
図３のステップＳ１〜Ｓ４が図１に示した動作に該当し、ステップＳ５〜Ｓ７、Ｓ９が図２に示した動作に該当する。ステップＳ８は、取得したの二本鎖ＤＮＡのクローン調整である。
【００４７】
図４は、本発明による、特定サイズの二本鎖ＤＮＡを分画、分取する方法を実施する装置の概略構成機能ブロック図である。  
図４において、入力手段１から操作者が、反応温度、保持時間、吸引濾過又は遠心分離の条件等を動作制御手段２に入力する。動作制御手段２は、液体吸引分注手段５を動作させて、試料液体を反応容器に収容させる。  そして、動作制御手段２は、入力された温度条件等に従って、反応容器中の液体試料を保温等するため、反応容器の温度時間調節手段４の動作を制御する。
【００４８】
そして、所定時間経過後、液体吸引分注手段５により、液体試料が反応容器から濾過容器に移動され、吸引濾過又は遠心分離手段６により低分子が、回収容器に分画、分取される。濾過容器に残留した高分子には、液体吸引分注手段によりランダムプライマー等が添加される。ランダムプライマー等が添加された液体は、液体吸引分注手段５により反応容器に移動され、再び、二本鎖ＤＮＡの増幅動作が行われる。
【００４９】
一方、回収容器に分画、分取された低分子は、吸引濾過又は遠心分離手段６により濃縮される。
【００５０】
上述した温度、時間、操作の繰り返し回数、動作処理過程等は、表示手段３に表示される。
【００５１】
次に、図１〜図４を用いて説明した二本鎖ＤＮＡの分画、分取方法の具体例を説明する。この例は、ショットガンクローン調製の一例である。反応容器２０１に鋳型ＤＮＡ１０１（０．２ｎｇ／μｌ）を０．５μｌ、ランダムプライマー２０２（５μＭ）を１．０μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ１０３（２．５Ｕ／μｌ）を０．１μｌ、ｄＮＴＰｓ２０３（２．５ｍＭ）を０．８μｌ、バッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５ｍＭ、ＫＣｌ、５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭの混合溶液）を１．０μｌ、及び滅菌蒸留水を６．６μｌ添加し、計１０μｌの反応液を調製した。
【００５２】
二本鎖ＤＮＡの増幅反応における各ステップの反応条件は以下に示す通りである。  
図１のステップ１では二本鎖ＤＮＡの熱変性（９６℃、３０秒）、図１のステップ２では鋳型ＤＮＡとプライマーのアニール（５０℃、１５秒）、ステップ３では一本鎖ＤＮＡの伸長反応（６８℃、９０秒）、ステップ４では伸長ＤＮＡの二本鎖化（６０℃、１５秒）とした。
【００５３】
本発明の一実施形態で使用したＤＮＡポリメラーゼでは、一本鎖ＤＮＡ伸長反応における反応時間については、４５秒に増幅したい鎖長（ｋｂ）を掛け合わせた時間として計算することができる。
【００５４】
したがって、鎖長を２ｋｂへの増幅を目的としているので、上記伸長反応時間は４５×２＝９０（秒）で行った。
【００５５】
また、図５に示すように、ランダムプライマー２０２はそのランダムネスにより鋳型ＤＮＡ１０１の不特定部位にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼ１０３の酵素反応によりプライマーの３’末端（図１）から一本鎖ＤＮＡを伸長反応する。
【００５６】
ステップ３において、伸長反応時間を９０秒に設定しているため、一本鎖ＤＮＡのサイズは理論上、約２ｋｂとなる。生成した一本鎖ＤＮＡは鋳型ＤＮＡ１０１より脱アニールした後、相補的な一本鎖ＤＮＡ同士でアニールし、反応産物として約２ｋｂの二本鎖ＤＮＡが得られる。
【００５７】
ＤＮＡポリメラーゼ１０３による二本鎖ＤＮＡ２０４の増幅反応における反応産物を含む反応液を、ポリプロピレン製の濾過容器２０５に分注した。濾過容器２０５の底部には、分子ふるい膜（限外濾過膜２０６）がセットしてあり、この限外濾過膜２０６は、再生セルロース製で孔径が０．０１μｍのものを用いた。
【００５８】
濾過容器２０５の底部（濾過膜２０６が取り付けられている部分）に回収容器２０７を接続し、遠心分離機を用いて遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２１８００ｘｇ、３分）による分画・分取を行った。
【００５９】
回収容器２０７には目的サイズ以下のＤＮＡを含む低分子分画が得られ、上記操作１回につき目的サイズの反応産物０．８ｎｇが８μｌの分画に得られた。
【００６０】
目的サイズの反応産物を分画、分取した反応容器２０１に、反応液成分のランダムプライマー２０２（５μＭ）１．０μｌ、ｄＮＴＰｓ２０３（２．５ｍＭ）０．８μｌ、バッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２５ｍＭ、ＫＣｌ  ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭの混合溶液）１．０μｌ、及び滅菌蒸留水７．２μｌを各々再添加し、計１０μｌの反応液を調製し、再度ＤＮＡポリメラーゼ１０３による二本鎖ＤＮＡ増幅反応を行った。
【００６１】
クローンの調製には反応産物１００ｎｇ以上を要するため、上記操作を複数回繰り返す必要があり、この操作を１６０回分（８ウェル容器を２個使用して１０回の繰り返し）行い、目的サイズの反応産物１０２ｎｇを計１ｍｌの分画に得た。
【００６２】
クローン調製はμｌ単位の液量にて行うため、上記反応産物分画液の液量を低減しておく必要があり、分子ふるい膜（限外濾過膜２０８）による濃縮を行った。この限外濾過膜２０８は再生セルロース製で孔径は０．００１μｍのものを用いた。
【００６３】
そして、遠心分離機を用いて遠心分離（７０００ｒｐｍ、９４２０ｘｇ、５分）し、限外濾過膜２０８上に残ったＤＮＡを滅菌蒸留水１μｌにより溶解した。
【００６４】
以上により調製した反応産物を用いてクローンの調製を行った。  
クローン調製においては、二本鎖ＤＮＡの増幅反応によって得られた反応産物とベクターの連結（ライゲーション）を行った。
【００６５】
本発明の一実施形態で使用したＤＮＡポリメラーゼはα型であるため、二本鎖ＤＮＡは平滑末端となるので、リンカーライゲーションを採用した。
【００６６】
即ち、平滑末端である反応産物に対して、リンカーライゲーションを行った。この場合、リンカーと呼ばれる合成オリゴヌクレオチドから作製される、数十塩基対の二本鎖ＤＮＡを用いる。
【００６７】
リンカーＤＮＡは制限酵素であるＥｃｏＲＩの認識配列を有し、平滑末端へリンカーをライゲーションした後に、ＥｃｏＲＩで処理することにより、ＤＮＡポリメラーゼで増幅した反応産物の平滑末端を突出末端に変えた。これにＥｃｏＲＩの認識配列をもつベクターをライゲーションして、反応産物をクローン化した。
【００６８】
リンカーライゲーション法で得たクローンのライゲーション効率をβガラクトシダーゼ遺伝子のα−相補性によるブルー／ホワイトスクリーニングにより検定した。
【００６９】
以下、検定方法を説明する。  
まず、、各々のクローン（１ｎｇ／μｌ）１μｌに大腸菌ＤＨ５αを１０μｌ加え氷冷（４℃、３０分）した。
【００７０】
ヒートショック（４２℃、４５秒）によりクローンを大腸菌に導入し、再度氷冷（４℃、３分）した。これにＳＯＣ培地を９０μｌを加えた後、振とう培養（３７℃、１時間、１５０ｒｐｍ）した。
【００７１】
その培養菌液を抗生物質（アンピシリン）及びＸ−Ｇａｌを含む寒天培地に塗布し静置培養（３７℃、１５時間）した。培養により寒天培地上にコロニーが出現するが、二本鎖ＤＮＡとベクターがライゲーション即ち組換えのできたクローンが導入された大腸菌のコロニーは白色、クローンが導入されていない大腸菌のコロニーは青色を呈する。
【００７２】
ライゲーションにより得られた大腸菌のコロニーについて、白色・青色コロニーの個数を計測することにより、クローン化の効率を測定した。
【００７３】
その結果、白色コロニーの出現率は従来の方法で調製されたＤＮＡ産物によるものと同じであった。
【００７４】
このことより、本発明により得られたＤＮＡがショットガンクローンの調製で、従来技術と同等に使用できることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明による二本鎖ＤＮＡの分画、分取方法の説明図である。
【図２】本発明による二本鎖ＤＮＡの分画、分取方法の説明図である。
【図３】本発明による二本鎖ＤＮＡの分画、分取方法の動作フローチャートである。
【図４】本発明による二本鎖ＤＮＡの分画、分取方法を実施する装置の概略機能ブロック図である。
【図５】一本鎖ＤＮＡの伸長反応説明図である。
【符号の説明】
【００７６】
１              入力手段
２              動作制御手段
３              表示手段
４              反応容器の温度時間調節手段
５              液体吸引分注手段
６              吸引濾過又は遠心分離手段
１０１          鋳型ＤＮＡ
１０２          プライマー
１０３          ＤＮＡポリメラーゼ
２０１          反応容器
２０２          ランダムプライマー
２０３          ｄＮＴＰｓ
２０４          二本鎖ＤＮＡ
２０５          濾過容器
２０６          分子ふるい膜
２０７          回収容器
２０８          限外濾過膜
【図１】
2005278529.tif 000003
【図２】
2005278529.tif 000004
【図３】
2005278529.tif 000005
【図４】
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【図５】
2005278529.tif 000007