(57)【要約】    【課題】  非小細胞肺癌、膵癌、胃癌などの癌組織に対して選択的に作用する癌治療薬に用いることのできる、副作用の少ないモノクローナル抗体を提供する。    【解決手段】  癌患者の癌組織由来のリンパ球とマウスミエローマ細胞を融合させることによりハイブリドーマを作製し、癌細胞を特異的に認識する新規なヒトモノクローナル抗体を産生させる。該抗体を単独、または、毒素や抗癌剤を内包するリポソームの表面に担持して用いることにより、癌治療薬を得る。    【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域に配列番号８６、８８および９０のアミノ酸配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２】
重鎖可変領域に配列番号８２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
重鎖可変領域に配列番号１１５のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
軽鎖可変領域に配列番号９２、９４および９６のアミノ酸配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項５】
軽鎖可変領域に配列番号８４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
軽鎖可変領域に配列番号１１７のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
重鎖可変領域が、配列番号８６、８８および９０のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域が、配列番号９２、９４および９６の配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項８】
重鎖可変領域が配列番号８２のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域が配列番号８４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
重鎖可変領域が配列番号１１５のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域が配列番号１１７のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
ヒト抗体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
重鎖可変領域をコードする領域が、配列番号８５、８７および８９の塩基配列を含み、かつ軽鎖可変領域をコードする領域が、配列番号９１、９３および９５の塩基配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
重鎖可変領域をコードする領域が、配列番号８１の塩基配列を含み、かつ軽鎖可変領域をコードする領域が、配列番号８３の塩基配列を含むことを特徴とする、請求項１１または請求項１２に記載のＤＮＡ。
【請求項１４】
重鎖可変領域をコードする領域が、配列番号１１４の塩基配列を含み、かつ軽鎖可変領域をコードする領域が、配列番号１１６の塩基配列を含むことを特徴とする、請求項１１または請求項１２に記載のＤＮＡ。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む医薬組成物。
【請求項１９】
癌治療薬である請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
癌治療薬が、非小細胞肺癌、膵癌、および胃癌からなる群より選ばれる、一または二以上の癌に対する癌治療薬である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
モノクローナル抗体を、毒素または抗癌剤を内包するリポソームの表面に担持させたことを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む診断試薬。
【請求項２３】
下記（ａ）および／または（ｂ）の性質を有するポリペプチド：
（ａ）細胞骨格のフィラメントに反応性を有する、
（ｂ）正常細胞に対しては形態変化を引き起こさず、癌細胞に対しては形態変化を引き起こす。
【請求項２４】
下記（ａ）および／または（ｂ）の性質を有するポリペプチド：
（ａ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むヒト膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１由来の約５５ｋＤａのタンパク質を特異的に認識する、
（ｂ）正常細胞に対しては形態変化を引き起こさず、癌細胞に対しては形態変化を引き起こす。
【請求項２５】
前記約５５ｋＤａのタンパク質がビメンチンである請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
形態変化が、軸索状の形態、繊維芽細胞様の形態、および、神経細胞様の突起を有する形態からなる群より選ばれる、一または二以上の形態への形態変化である、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載のポリペプチド
【請求項２８】
請求項２３〜２６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療、診断に使用し得る新規なモノクローナル抗体、その抗体をコードするＤＮＡ、およびその抗体を産生するハイブリドーマ、並びに、その抗体を含む医薬組成物、診断試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の治療分野においては、充分な効果を示す治療薬のない固形癌に対して、特定の癌細胞を標的としたターゲティング療法の研究が従来よりなされてきた。かかるターゲティングには癌細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体が有効であるが、マウスモノクローナル抗体を用いると、免疫応答に起因するアナフィラキシーなどの副作用から、連続投与が難しい等の問題点があった（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
そして、かかる問題点を解決するために、副作用の少ないモノクローナル抗体の取得が試みられてきた。遺伝子組み換えによって抗体の定常領域をヒト由来のものとするキメラ抗体作成技術や、超可変領域以外をヒト由来とするヒト化抗体作成技術などがあるが、副作用低減の観点からは完全ヒトモノクローナル抗体がより望ましいとされてきた。かかる完全ヒトモノクローナル抗体を得る方法としてヒト由来のリンパ球を用いたハイブリドーマ法（例えば、非特許文献２参照。）があるが、完全ヒトモノクローナル抗体の作製はマウスモノクローナル抗体の作製法と比較し、目的とする抗体を産生するヒトＢ細胞を効率的に得るための能動的免疫法が困難であること、抗体産生細胞を無限増殖化させる効率的方法が確立されていないことなどから、充分に腫瘍細胞に反応するヒトモノクローナル抗体の取得はごくわずかしか報告されておらず（例えば、特許文献１参照。）、依然として困難な状況にあった。
【０００４】
かかる状況下においても、徐々にではあるが、ヒト化抗体技術等を利用して、特定の癌細胞に対し、単独、又は抗癌剤との併用によって、殺傷効果や、増殖抑制効果を有するモノクローナル抗体の開発がなされてきており、最近では、抗Ｈｅｒ２ヒト化抗体（ハーセプチン）の乳癌への適用（例えば、非特許文献３参照。）、抗ＥＧＦレセプター抗体（例えば、非特許文献４参照。）や抗ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）抗体（例えば、非特許文献５参照。）等を用いた治験が進められている。しかしながら、罹患者数の多い非小細胞肺癌や、特に難治性の癌種である膵癌等に対して特異的なターゲティング療法に用いることのできる抗体はいまだ存在せず、かかる癌種に対応するために、副作用が少なく、癌組織への特異性の高いモノクローナル抗体の取得が望まれていた。
【０００５】
ビメンチン（vimentin）は、間葉系細胞ないし非上皮細胞の細胞骨格のフィラメントタンパク質であり、細胞刺激によってその遺伝子発現が上昇することが知られている（非特許文献６参照）。また、通常の上皮細胞では発現が認められないのに対して、肺腺癌、胃癌、子宮内膜癌又は胎児性癌などの一部の低分化な腫瘍細胞の細胞質内にその発現傾向が高いことが知られている（非特許文献６参照）。しかし、ビメンチン自身が抗原タンパク質として機能するなどの現象は知られていなかった。
【特許文献１】特許第３２３６６６７号公報
【非特許文献１】Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. vol.86, p4220, 1989
【非特許文献２】Cancer Res. vol.45, p263, 1985
【非特許文献３】Oncology vol．63 Suppl 1，pp25−32, 2002
【非特許文献４】Semin Oncol. vol.29, No.5 Suppl 14, pp18-30, 2002
【非特許文献５】Semin Oncol. vol.29, No.6 Suppl 16, pp10-14, 2002
【非特許文献６】Mol Cell Biol. 1987, vol. 7, No. 11, p3908-15
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は癌、特に非小細胞肺癌、膵癌、胃癌の診断、治療に有用であり、かつ、副作用の少ないモノクローナル抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、癌組織に対するターゲティング療法に用いるためのモノクローナル抗体を提供すべく鋭意検討した結果、ＨＬＣ−１、ＰＡＮＣ−１およびＭＫＮ４５等の癌細胞を特異的に認識する新規なヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製し、本抗体を用いることによりターゲティング療法に有用な癌治療薬が得られることを見いだして、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）  重鎖可変領域に配列番号８６、８８および９０のアミノ酸配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
（２）  重鎖可変領域に配列番号８２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、（１）に記載のモノクローナル抗体。
（３）  重鎖可変領域に配列番号１１５のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、（１）のモノクローナル抗体。
（４）  軽鎖可変領域に配列番号９２、９４および９６のアミノ酸配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
（５）  軽鎖可変領域に配列番号８４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、（４）のモノクローナル抗体。
（６）  軽鎖可変領域に配列番号１１７のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、（４）のモノクローナル抗体。
（７）  重鎖可変領域が、配列番号８６、８８および９０のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域が、配列番号９２、９４および９６のアミノ酸配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
（８）  重鎖可変領域が配列番号８２のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域が配列番号８４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、（７）のモノクローナル抗体。
（９）  重鎖可変領域が配列番号１１５のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域が配列番号１１７のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、（７）のモノクローナル抗体。
（１０）  ヒト抗体である、（１）〜（９）のいずれかのモノクローナル抗体。
（１１）  （１）〜（１０）のいずれかのモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ。
（１２）  重鎖可変領域をコードする領域が、配列番号８５、８７および８９の塩基配列を含み、かつ軽鎖可変領域をコードする領域が、配列番号９１、９３および９５の塩基配列を含むことを特徴とする、（１１）のＤＮＡ。
（１３）  重鎖可変領域をコードする領域が、配列番号８１の塩基配列を含み、かつ軽鎖可変領域をコードする領域が、配列番号８３の塩基配列を含むことを特徴とする、（１１）または（１２）のＤＮＡ。
（１４）  重鎖可変領域をコードする領域が、配列番号１１４の塩基配列を含み、かつ軽鎖可変領域をコードする領域が、配列番号１１６の塩基配列を含むことを特徴とする、（１１）または（１２）のＤＮＡ。
（１５）  （１１）〜（１４）のいずれかのＤＮＡを含む組換えベクター。
（１６）  （１５）の組換えベクターを含む形質転換体。
（１７）  （１）〜（１０）のいずれかのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（１８）  （１）〜（１０）のいずれかのモノクローナル抗体を含む医薬組成物。
（１９）  癌治療薬である（１８）の医薬組成物。
（２０）  癌治療薬が、非小細胞肺癌、膵癌、および胃癌からなる群より選ばれる、一または二以上の癌に対する癌治療薬である、（１９）の医薬組成物。
（２１）  モノクローナル抗体を、毒素または抗癌剤を内包するリポソームの表面に担持させたことを特徴とする、（１８）〜（２０）のいずれかの医薬組成物。
（２２）  （１）〜（１０）のいずれかのモノクローナル抗体を含む診断試薬。
（２３）  下記（ａ）および／または（ｂ）の性質を有するポリペプチド：
（ａ）細胞骨格のフィラメントに反応性を有する、
（ｂ）正常細胞に対しては形態変化を引き起こさず、癌細胞に対しては形態変化を引き起こす。
（２４）  下記（ａ）および／または（ｂ）の性質を有するポリペプチド：
（ａ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むヒト膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１由来の約５５ｋＤａのタンパク質を特異的に認識する、
（ｂ）正常細胞に対しては形態変化を引き起こさず、癌細胞に対しては形態変化を引き起こす。
（２５）  前記約５５ｋＤａのタンパク質がビメンチンである（２４）のポリペプチド。（２６）  形態変化が、軸索状の形態、繊維芽細胞様の形態、および、神経細胞様の突起を有する形態からなる群より選ばれる、一または二以上の形態への形態変化である、（２３）〜（２５）のいずれかのポリペプチド。
（２７）  （１）〜（１０）のいずれかのモノクローナル抗体であることを特徴とする、（２３）〜（２６）のいずれかのポリペプチド
（２８）  （２３）〜（２６）のいずれかのポリペプチドを含む医薬組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明で得られたモノクローナル抗体を用いることにより、癌組織、特に、非小細胞肺癌、膵癌または胃癌を選択的に攻撃する癌治療薬を提供することができる。さらに、本発明のヒトモノクローナル抗体を用いた場合、副作用が少なく連続投与可能な癌治療薬を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明のモノクローナル抗体
本発明のモノクローナル抗体は、図５に示すヒト膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１４６９）由来の約５５ｋＤａの抗原タンパク質（配列番号１０７のアミノ酸配列を含むタンパク質）を特異的に認識するモノクローナル抗体である。また、正常細胞に対しては形態変化を引き起こさず、癌細胞に対しては形態変化を引き起こす、モノクローナル抗体である。さらに、図５に示すヒト膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１由来の約５５ｋＤａのタンパク質（配列番号１０７のアミノ酸配列を含むタンパク質）を特異的に認識し、かつ、正常細胞に対しては形態変化を引き起こさず、癌細胞に対しては形態変化を引き起こすモノクローナル抗体である。前記約５５ｋＤａの抗原タンパク質としては、ビメンチンを例示することができる。また、形態変化とは、例えば、図１のＢおよびＤに示すような軸索状の形態、繊維芽細胞様の形態、および、神経細胞様の突起を有する形態への正常細胞の形態変化が挙げられる。
【００１１】
本発明のモノクローナル抗体として具体的には、重鎖可変領域に配列番号８６、８８および９０のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域に配列番号９２、９４および９６のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。ここで、配列番号８８のアミノ酸配列において、１０番目のアミノ酸はＣｙｓであってもＴｙｒであってもよい。すなわち、重鎖可変領域としては１０Ｃｙｓのものと１０Ｔｙｒのものの２種類が挙げられる。なお、ヒト膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１由来の約５５ｋＤａの抗原タンパク質（配列番号１０７のアミノ酸配列を含む
タンパク質）を特異的に認識するという上記の特異性を有する限り、本発明の抗体は、上記６種類の配列のうちの一、または、複数において、一または数個のアミノ酸の置換、欠失、または付加があってもよい。ここで、数個とは好ましくは、２〜５個、より好ましくは、２個または３個、特に好ましくは、２個を意味する。
【００１２】
上記６種類の配列は、重鎖および軽鎖の可変領域の中で『超可変領域』と呼ばれる領域の配列である。抗体は重鎖と軽鎖からなり、さらに、それぞれの鎖は定常領域と可変領域からなる。可変領域にはさらに超可変領域が存在し、かかる領域が免疫グロブリンの抗体としての特異性、抗原決定基と抗体の結合親和性を決定している。したがって、本発明の抗体は、超可変領域に上記それぞれの配列を含むものであるが、かかる超可変領域以外の領域は他の抗体由来であっても構わない。ここで、他の抗体とはヒト以外の生物由来の抗体も含むが、副作用低減の観点からはヒト由来のものが好ましい。
【００１３】
本発明において特に好適なモノクローナル抗体としては、重鎖可変領域に配列番号８２のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域に配列番号８４のアミノ酸配列を含む抗体、または重鎖可変領域に配列番号１１５のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域に配列番号１１７のアミノ酸配列を含む抗体が挙げられる。ここで、配列番号８２または１１５の配列において、１４番目と５１番目のアミノ酸の組み合わせは（Ｃｙｓ、Ｔｙｒ）または（Ｔｙｒ、Ｃｙｓ）のいずれであってもよい。すなわち、重鎖可変領域の配列として、１４Ｃｙｓ、５１Ｔｙｒのものと１４Ｔｙｒ、５１Ｃｙｓのものの２種類が挙げられる。また、配列番号８４または１１７の配列において、１３番目のアミノ酸はＶａｌであってもＩｌｅであってもよい。すなわち、軽鎖可変領域の配列として、１３Ｖａｌのものと１３Ｉｌｅのものの２種類が挙げられる。
【００１４】
本発明において、モノクローナル抗体とは、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメント、Ｆ（ａｂ'）2化抗体、Ｆ（ａｂ'）化抗体、短鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）およびミニボディ（Ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）を含むものとする。定常領域を含む場合においては、重鎖および軽鎖の定常領域のアミノ酸配列は、Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986、The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982 およびCell vol.22, p197, 1980 に記載のものが好ましい。定常領域及び可変領域を含む本発明の抗体としては、例えば、配列番号１３０（重鎖）、又は配列番号１３２（軽鎖）のアミノ酸配列を有する抗体を挙げることができる。
【００１５】
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、本抗体を産生するハイブリドーマをウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培養液等を用いて培養するか、または、配列番号８１および８３の塩基配列を有する可変領域をコードするＤＮＡに、重鎖および軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡをそれぞれ連結した遺伝子（例えば、配列番号１２９（重鎖）又は１３１（軽鎖）の遺伝子）をＰＣＲ法、または、化学合成により合成し、従来法により、その遺伝子の発現を可能とする公知の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等）に組み込んでＣＨＯ細胞（チャイニーズハイスター卵巣細胞）や大腸菌等の宿主中で発現させることによって抗体を産生し、これらの培養液から、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム等を用いて抗体を精製することによって得ることができる。
【００１６】
本発明のモノクローナル抗体はまた、配列番号１０７のアミノ酸配列を含むヒト膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１由来の約５５ｋＤａのタンパク質、好ましくは、ビメンチン（GenBank Accession No. M14144）で免疫した動物からハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養し、得られたモノクローナル抗体の中から生癌細胞表面への結合活性を有するものを選択することによって得ることができる。このようなモノクローナル抗体としては、後述の実施例にて示されるハイブリドーマ２Ｆ６−１株、および３Ｆ９−１株より産生されるモノクローナル抗体を挙げることができる。
【００１７】
＜２＞本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡであるが、例として、重鎖可変領域をコードする領域が、配列番号８６、８８および９０のアミノ酸配列をコードする配列をそれぞれ含み、かつ、軽鎖可変領域をコードする領域が配列番号９２、９４および９６のアミノ酸配列をコードする配列をそれぞれ含むＤＮＡが挙げられる。その中でも、重鎖可変領域をコードする領域が配列番号８５、８７および８９の塩基配列をそれぞれ含み、かつ軽鎖可変領域をコードする領域が、配列番号９１、９３および９５の塩基配列をそれぞれ含むＤＮＡが好ましい。ここで、配列番号８７の配列は、２９番目の塩基がaであってもｇであってもよい。すなわち、重鎖可変領域をコードする配列として、２９ａのものと２９ｇのものの２種類が挙げられる。また、配列番号９５の配列は、１８番目の塩基がｃであってもｔであってもよい。すなわち、軽鎖可変領域をコードする配列として、１８ｃのものと１８ｔのものの２種類が挙げられる。
【００１８】
これらの配列のＤＮＡによってコードされる超可変領域が、抗体の特異性を決定する領域であるため、他の領域をコードする配列は他の抗体由来の配列であってもよい。ここで、他の抗体とはヒト以外の生物由来の抗体も含むが、副作用低減の観点からはヒト由来のものが好ましい。
【００１９】
本発明において特に好適なＤＮＡは、重鎖可変領域をコードする領域が配列番号８２のアミノ酸配列をコードする配列を含み、かつ、軽鎖可変領域をコードする領域が配列番号８４のアミノ酸配列をコードする配列を含むＤＮＡ、または重鎖可変領域をコードする領域が配列番号１１５のアミノ酸配列をコードする配列を含み、かつ、軽鎖可変領域をコードする領域が配列番号１１７のアミノ酸配列をコードする配列を含むＤＮＡである。その中でも特に好ましいＤＮＡは、重鎖可変領域をコードする配列が配列番号８１の塩基配列を含み、かつ、軽鎖可変領域をコードする領域が、配列番号８３の塩基配列を含むＤＮＡ、または重鎖可変領域をコードする配列が配列番号１１４の塩基配列を含み、かつ、軽鎖可変領域をコードする領域が、配列番号１１６の塩基配列を含むＤＮＡである。ここで、配列番号８１または１１４の配列において、４１番目と１５２番目の塩基の組み合わせが、（ａ、ｇ）であっても（ｇ、ａ）であってもよい。すなわち、重鎖可変領域をコードする配列として、４１ａ、１５２ｇのものと４１ｇ、１５２ａのものの２種類が挙げられる。また、配列番号８３または１１６の配列において、３７番目、１８３番目、および２５８番目の塩基の組み合わせが、（ａ、ａ、ｔ）、（ａ、ａ、ｃ）および（ｇ、ｇ、ｔ）のいずれであってもよい。すなわち、軽鎖可変領域をコードする配列として、３７ａ、１８３ａ、２５８ｔのもの、３７ａ、１８３ａ、２５８ｃのもの、および、３７ｇ、１８３ｇ、２５８ｔのものの３種類が挙げられる。
【００２０】
なお、本発明のＤＮＡは、ヒト膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１由来の約５５ｋＤａの抗原タンパク質（配列番号１０７のアミノ酸配列を含むタンパク質）を特異的に認識するモノクローナル抗体をコードする限り、上記配列番号８１の塩基配列及び配列番号８３の塩基配列、または配列番号１１４の塩基配列及び配列番号１１６の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、サザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２１】
本発明のＤＮＡは重鎖と軽鎖の定常領域と可変領域の全てをコードするものであってもよいが、重鎖と軽鎖の可変領域のみをコードするものであってもよい。定常領域と可変領域の全てをコードする場合における重鎖および軽鎖の定常領域の塩基配列は、Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986、 The Journal of Biological Chemistry vol.257, 
p1516, 1982 および Cell vol.22, p197, 1980 に記載のものが好ましい。定常領域及び可変領域をコードする本発明のDNAとしては、例えば、配列番号１２９（重鎖）、又は配列番号１３１（軽鎖）の塩基配列を有するDNAを挙げることができる。
【００２２】
本発明のＤＮＡは例えば、以下の方法によって得ることができる。まず、本発明のハイブリドーマ等の細胞から、市販のＲＮＡ抽出キットを用いて全ＲＮＡを調製し、ランダムプライマー等を用い、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する。次いで、既知のヒト抗体重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の可変領域において、それぞれ保存されている配列のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ法によって、抗体をコードするｃＤＮＡを増幅させる。定常領域をコードする配列については、既知の配列をＰＣＲ法で増幅することによって得ることができる。ＤＮＡの塩基配列は、配列決定用プラスミドに組み込むなどして、常法により決定することができる。
【００２３】
本発明はまた、本発明のＤＮＡを含む組換えベクター及び該組換えベクターを含む形質転換体を提供する。組換えベクターとしては、大腸菌（Echerichia coli）のような原核細胞において発現可能なベクター（例えば、pBR322、pUC119、又はこれらの派生物）であってもよいが、真核細胞において発現可能なベクターが好ましく、哺乳動物由来の細胞において発現可能なベクターがより好ましい。哺乳動物由来の細胞において発現可能なベクターとしては、例えば、pcDNA3.1（Invitrogen社製）のようなプラスミドベクター、pDON-AI DNA（宝バイオ社製）などのウイルスベクターを挙げることができる。本発明の組換えベクターを導入する形質転換体は、大腸菌のような原核細胞であってもよいが、真核細胞が好ましく、哺乳動物由来の細胞がより好ましい。哺乳動物由来の細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）などを挙げることができる。
【００２４】
＜３＞本発明のハイブリドーマ
本発明のハイブリドーマは、上述したようなモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。本発明のハイブリドーマとしては、後述の実施例に示すハイブリドーマＨｏＡＫｓ−１株、２Ｆ６−１株、３Ｆ９−１株などを挙げることができる。本発明のハイブリドーマは以下の方法によって得ることができる。まず、Ａ．Ｉｍａｍらの方法（Cancer
Research vol.45,263 1985）に準じて、肺癌患者から摘出された癌組織から癌浸潤リンパ球を単離し、リンパ球を含む細胞をポリエチレングリコールを用いてマウスミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを得る。次に、得られたハイブリドーマの上清を用いてエンザイムイムノアッセイを行い、パラホルムアルデヒド固定した各種癌細胞株に対して陽性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択し、さらに該ハイブリドーマを限界希釈によりクローニングする。また、本発明のハイブリドーマは、図５のヒト膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１由来の約５５ｋＤａのタンパク質（配列番号１０７のアミノ酸配列を含むタンパク質）を用いてマウスを免疫し、得られたリンパ球とマウスミエローマ細胞とを融合させることによっても得ることができる。
【００２５】
＜４＞本発明の医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本発明のモノクローナル抗体を医薬上許容されうる担体とともに含んでなるものである。医薬上許容されうる担体の例としては、既知の生理学的に許容され得るバッファー（例えばリン酸バッファー）のような可溶性キャリアー、またはラテックスビーズのような固体状態のキャリアーが挙げられる。
【００２６】
本発明の医薬組成物は癌、特に非小細胞肺癌、膵癌または胃癌の治療薬として好適に用いられる。また、本発明の医薬組成物はモノクローナル抗体自身の細胞殺傷効果や増殖抑制効果を利用するものであってもよいし、アドリアマイシンなどの抗癌剤に本発明のモノクローナル抗体を結合させて抗癌剤を癌組織にターゲティングさせるものであってもよい。
【００２７】
本発明において特に好適な医薬組成物は、毒素や抗癌剤等を含んだリポソームに本発明の抗体を結合させたものである。抗体を担持するリポソームは、二重の脂質層からなるものであるが、該脂質層が多重層になったもの、あるいは一層のものいずれも使用することができる。リポソームの構成成分としては、フォスファチジルコリン、コレステロール、フォスファチジルエタノールアミン、さらに電荷をあたえる物質としてのフォスファチジン酸等が用いられる。構成成分の使用割合として、たとえば、フォスファチジルコリン１ｍｏｌに対しコレステロールは０．３〜１ｍｏｌ、好ましくは０．４〜０．６ｍｏｌ、フォスファチジルエタノールアミンは０．０１〜０．２ｍｏｌ好ましくは０．０２〜０．１ｍｏｌ、フォスファチジン酸は０〜０．４ｍｏｌ好ましくは０〜０．１５ｍｏｌの組成比を用いることができる。
【００２８】
リポソームの製造方法には公知の方法を用いることができる。たとえば、溶媒を除去した脂質混合物をホモジナイザー等で乳化し、凍結融解後、マルチラメラリポソームを得て、さらに適当な粒径に調整するために超音波処理、高速ホモジナイズ、あるいは均一ポアを持つメンブランで加圧ろ過する方法（Biochimica et Biophysica Acta vol. 812, p55,
1985）を用いることによって製造できる。リポソームのサイズは３０ｎｍから２００ｎｍが好ましい。
【００２９】
リポソームに内封させる薬剤としては、アドリアマイシン、ダウノマイシン、マイトマイシン、シスプラチン、ビンクリスチン、エピルビシン、メトトレキセート、５Ｆｕ（５−フルオロウラシル）、アクラシノマイシン等の抗癌剤、リシンＡ、ジフテリアトキシン等の毒素、アンチセンスＲＮＡ等を用いることができる。薬剤の封入は、脂質を薬剤水溶液で水和することでリポソームに封入することができる。またアドリアマイシン、ダウノマイシン、エピルビシンについては、ｐＨ勾配を利用したリモートローディング法（Cancer Res. vol.49, p5922, 1989）を用いて封入することもできる。
【００３０】
リポソーム表面上にモノクローナル抗体を結合させる方法としては、精製抗体に疎水性の物質をつけることでリポソームに挿入させる方法、ホスファチジルエタノールアミンと抗体をグルタールで架橋させる方法等もあるが、好適には、抗体をチオール化した後、マレイミド基を導入した脂質を含むリポソームを作製して抗癌剤または毒素を封入し、両者を反応させることによってリポソームの表面に抗体を結合させる方法を用いることができる。また、アミノ基との反応部位、および、チオール基または潜在的チオール基部分を有する水溶性高分子誘導体も好適に用いることができる（特開平１１−１５２２３４号）。一方、残存マレイミド基にチオール化したポリアルキレングリコール部分を含む化合物等を反応させることによって、リポソームの表面修飾を行うことも可能である。
【００３１】
抗体へのチオール基の付与は、抗体のアミノ基に対し、タンパク質のチオール化に通常用いられるＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）や、イミノチオラン、メルカプトアルキルイミデート等の化合物を用いて行う方法、または抗体の内在性ジチオール基を還元してチオール基とする方法が用いられるが、内在性チオール基を用いる方法が活性維持の点からより好ましい。また、抗体は、ペプシン等の酵素でＦ（ａｂ'）2化し、さらにジチオスレイトール（ＤＴＴ）等で還元し、Ｆ（ａｂ'）化して新たに生ずる１〜３個のチオール基をリポソームとの結合反応に供することもできる。マレイミド基含有リポソームとチオール化抗体の結合は中性の緩衝液（ｐＨ６．５−７．５）中、２〜１６時間反応させることで達成できる。
【００３２】
本発明の癌治療薬の製剤化には、公知の方法つまり、脱水法（特表平２−５０２３４８号公報）、安定化剤を加え液剤として用いる方法（特開昭６４−９３３１号公報）、凍結乾燥法（特開昭６４−９９３１号公報）等の製剤化法を用いることができる。本発明の癌
治療薬は、血管内投与法や、腹腔内等、局所投与法で用いることができ、その投与量は、リポソームに含有された薬剤によって、それぞれ最適な量とすることができる。アドリアマイシン封入体を例に取れば投与量はアドリアマイシン量として５０ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは５ｍｇ／ｋｇ以下で用いることができる。
【００３３】
＜５＞本発明の診断試薬
本発明の診断試薬としては、本発明の抗体の癌細胞特異性を利用する診断試薬が挙げられるが、具体的には、本発明の抗体、二次抗体および検出基質等からなる癌の診断試薬が挙げられる。
【００３４】
＜６＞本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドは、図５に示すヒト膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１由来の約５５ｋＤａのタンパク質（配列番号１０７のアミノ酸配列を含むタンパク質）を特異的に認識するポリペプチドである。また、正常細胞に対しては形態変化を引き起こさず、癌細胞に対しては形態変化を引き起こすポリペプチドである。さらに、図５に示すヒト膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１由来の約５５ｋＤａのタンパク質（配列番号１０７のアミノ酸配列を含むタンパク質）を特異的に認識し、かつ、正常細胞に対しては形態変化を引き起こさず、癌細胞に対しては形態変化を引き起こすポリペプチドである。前記約５５ｋＤａの抗原タンパク質としては、ビメンチンを例示することができる。ここで、形態変化とは、例えば、図１のＢおよびＤに示すような軸索状の形態、繊維芽細胞様の形態、および、神経細胞様の突起を有する形態への正常細胞の形態変化が挙げられる。
【００３５】
本発明のポリペプチドとして、具体的には、後述の実施例に示すプロセップＡに吸着されるポリペプチドが挙げられる。より好ましくは、本発明のモノクローナル抗体が挙げられる。本発明のポリペプチドは、癌細胞特異的に形態変化を引き起こすため、医薬組成物、特に、非小細胞肺癌、膵癌、胃癌などの癌の治療薬を製造するために用いることができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明についてより詳細に説明するが、その要旨を越えない限り以下に限定されるものではない。
【００３７】
（１）癌患者癌浸潤リンパ球とマウスミエローマとの細胞融合によるハイブリドーマの作製
（１）−１．リンパ球の調製
肺癌患者から摘出した癌組織をメスで小塊にし、培養液Ａ（ＲＰＭＩ１６４０＋５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン硫酸塩）中でよく振った後、その培養液（Ｉ）を回収した。さらに癌組織の小塊をカミソリ刃によって細かくほぐし、新たな培養液Ａ中でピペッティングを行い、細胞を分散させた。この細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清（ＩＩ）を回収した。ＩとＩＩを合わせ、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、最終的に癌浸潤リンパ球を含む約４×１０7個の細胞を得た。
【００３８】
（１）−２．細胞融合
癌浸潤リンパ球を含む細胞は、ポリエチレングリコール１５００（ロシュダイアグノスティックス）を用いて、マウスミエローマ細胞（約４×１０7個）と常法（Cancer Research vol.45, 263, 1985）に従い融合させた。融合させた細胞は、培養液Ｂ（培養液Ａに１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を加えたもの）に細胞数が５×１０5／ｍｌの密度になるよう懸濁し、１００μｌずつ９６ウェル−プレートに播種し、３７℃のＣＯ2インキュベーター中で培養を開始した。二日目に１０μＭヒポキサンチン、０．０４μＭアミノプテリン、１．６μＭチミジンを添加した培養液Ｂ（ＨＡＴ添加培養液）を各ウェルに１００μ
ｌずつ添加し、ハイブリドーマのコロニーが出現するまで培養を行った。その結果、ハイブリドーマのコロニーが、１０ウェル中に確認された。
【００３９】
（２）ヒトモノクローナル抗体の癌細胞株への反応性の検討
（２）−１．癌細胞株と維持
出現したハイブリドーマの培養上清を用いて、固定癌細胞株、即ち、肺癌株ＨＬＣ−１（癌 vol.67, No.4, pp483-492, 1976、慶應義塾大学医学部、鈴木氏より入手）、胃癌株ＭＫＮ４５（癌と化学療法，vol．5，p89，1978、免疫生物研究所から入手）および膵癌株ＳＵＩＴ２（国立病院九州ガンセンター、井口氏より入手）に対する反応性を測定し、目的のハイブリドーマを選択した。これらの癌細胞株は、培養液Ｃ（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２＋５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン硫酸塩）に５％ＦＣＳを添加した培養液Ｄで、３７℃、５％ＣＯ2の条件で維持、増殖させた。
【００４０】
（２）−２．癌細胞株に対する反応性の測定
上記癌細胞株は、９６ウェル−プレートで３日から４日間、一層になるまで培養を行い、上清を除去後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）（ＰＢＳ）で１回洗浄した後、２％パラホルムアルデヒド固定（室温、２０分）を行った。ＰＢＳで５回洗浄した後、５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）含有ＰＢＳ溶液を１５０μｌ／ウェルずつ入れ、ブロッキングを行った。このプレートをＰＢＳで５回洗浄し、５０μｌのハイブリドーマ培養上清を加えて３７℃、１時間半、反応させた。次に、ＰＢＳで５回洗浄し、５０μｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合させたヒト抗体に対するヤギ抗体（１０００培希釈、カペル社）を加え、３７℃、１時間の反応を行った。次に、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％を含んだＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）でプレートを洗浄し、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（５．２％）とＨ2Ｏ2（０．０１５％）を含有したりん酸クエン酸緩衝液を５０μｌ／ウェルずつ加え、室温で発色が確認できるまで反応させた後、４９０ｎｍにおける吸光度をマイクロフォトメーター（日本インターメッド）によって測定した。反応性が確認できたウェルから限界希釈によってクローニングを行い、ハイブリドーマ株ＨｏＡＫｓ−１を得た。
【００４１】
（３）モノクローナル抗体ＨｏＡＫｓ−１の精製と標識化
（３）−１．ハイブリドーマＨｏＡＫｓ−１の培養とモノクローナル抗体ＨｏＡＫｓ−１の精製
まず、ウシ胎児血清をプロテインＡ−ガラスビーズカラム（プロセップＡ）（ｂｉｏ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ）に素通りさせてプロセップＡに吸着する物質を除去した血清を作製し、この血清を７〜１０％添加した培養液Ａを用いてハイブリドーマＨｏＡＫｓ−１を培養した。次に、ハイブリドーマＨｏＡＫｓ−１を培養した培養液をプロセップＡにかけることにより、プロセップＡ吸着ポリペプチドを吸着させ、その後溶出させることによって、プロセップＡ吸着ポリペプチドを精製した。このプロセップＡ吸着ポリペプチドを以後、ＨｏＡＫｓ−１抗体として用いた。上記の血清を培養に用いることによって、血清由来の抗体等、プロセップＡに吸着する物質の混入がない精製ＨｏＡＫｓ−１抗体が得られたと考えられた。なお、図には示していないが、ＨｏＡＫｓ−１抗体は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で純粋なＩｇＭであることが確認された。
【００４２】
（３）−２．ＨｏＡＫｓ−１抗体のビオチン標識
プロセップＡで精製したＨｏＡＫｓ−１抗体をビオチニレーションリージェント（アマシャムファルマシアバイオテック）を用いて説明書に従いビオチン標識させた後、ゲルろ過法によって標識抗体と遊離のビオチンを分離した。
【００４３】
（４）生癌細胞株および血管内皮細胞への作用の検討
（４）−１．癌細胞株および血管内皮細胞と維持
ヒト癌細胞株として肺癌株ＨＬＣ−１、胃癌株ＭＫＮ４５、膵癌株ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１４６９）、正常ヒト細胞として血管内皮細胞ＨＵＶＥＣｓ（大日本製薬）を用いた。これらの癌細胞株は、培養液Ｄで３７℃、５％ＣＯ2の条件で維持、増殖させた。ヒト血管内皮細胞ＨＵＶＥＣｓは、培養液ＣＳ−Ｃ培養液（Ｃｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、維持、増殖させた。
【００４４】
（４）−２．癌細胞株および血管内皮細胞の形態に与える影響の検討
ＨｏＡＫｓ−１抗体をフィルター濾過して無菌化し、約１４０μｇ／ｍｌの濃度となるよう培養液ＣまたはＣＳ−Ｃ培養液で希釈し、９６−ウェルプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注した。次に、各培養癌細胞および血管内皮細胞ＨＵＶＥＣｓを、それぞれ１０％ヒト血清（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を含有した培養液Ｃ、またはＣＳＣ−培養液で３×１０4／ｍｌの密度に希釈し、その細胞含有溶液を１００μｌ／ウェルずつ播種し、ウェル中の細胞数が１．５×１０3／ウェル、ＨｏＡＫｓ−１抗体の濃度が約７０μｇ／ｍｌとなるよう調製した。このプレートを３７℃、５％ＣＯ2の条件で培養した。１日置きに３回、培養上清を上記と同様の条件となるよう交換し、６日目に細胞の形態変化を光学顕微鏡下で観察した。
【００４５】
観察結果を図１に示した。正常細胞である血管内皮細胞ＨＵＶＥＣｓでは抗体の添加によって細胞の形態変化が認められなかった（図１−Ｇ，Ｈ）のに対し、肺癌細胞株ＨＬＣ−１（図１−Ａ，Ｂ）、膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１（図１−Ｃ，Ｄ）では抗体の添加によって顕著な形態変化が認められた。これらの細胞は、軸索状の形態、繊維芽細胞様の形態、若しくは神経細胞様の突起を有する形態に変化した。特に膵癌株ＰＡＮＣ−１は、飢餓状態に陥った場合の形態に類似した変化を呈した。また、胃癌細胞株ＭＫＮ４５に対しても若干の形態変化が認められた（図１−Ｅ，Ｆ）。以上より、ＨｏＡＫｓ−１抗体は癌細胞株に対して、何らかの作用を与える可能性が示唆された。
【００４６】
（４）−３．癌細胞株に対する増殖抑制効果の検討
上記で形態変化の認められた肺癌細胞株ＨＬＣ−１、胃癌細胞株ＭＫＮ４５および形態変化の認められなかった正常細胞の血管内皮細胞ＨＵＶＥＣｓに対し、同様の条件下で９６ウェル−プレートに癌細胞を播種し、ＨｏＡＫｓ−１抗体の濃度が約７０μｇ／ｍｌとなる条件下、３７℃、５％ＣＯ2の環境で培養し、１日置きに３回、培養上清を上記と同様の条件となるよう交換し、６日目にＭＴＴアッセイ（Ｊ.Immunol.Methods vol.70， p257, 1984）によって生癌細胞数の比較を行った。比較として、ヒト抗体ＩｇＭ（ケミコン社製）を用い、同様の実験を行った。
【００４７】
結果を図２に示した。抗体を添加しなかったコントロール条件での細胞数を１００％とした場合、ＨｏＡＫｓ−１抗体を添加することによって、肺癌細胞株ＨＬＣ−１では約６０％、胃癌細胞株ＭＫＮ４５では約５０％の増殖抑制効果が認められた。一方、血管内皮細胞ＨＵＶＥＣｓにおいては差が認められなかった。また、比較として用いたヒトＩｇＭでは、その添加による癌細胞株の増殖抑制効果は認められなかった。
【００４８】
形態変化の認められた膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１を、ウェル中の細胞数が１ｘ１０3／ウェルとなるように９６ウェル−プレートに播種し、ＨｏＡＫｓ−１抗体の濃度が３００μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌの各濃度となる条件下、３７℃、５％ＣＯ2の環境で培養し、１日置きに３回、培養上清を上記と同様の条件となるよう交換し、６日目にブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）セルプロライフレーションアッセイキット（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ社製）によって生癌細胞数の比較を行った。６日目にキットの説明に従ってＢｒｄＵ溶液を各ウェルに添加し、オーバーナイトで培養を行い、その間に生癌細胞に取り込まれたＢｒｄＵ量を７日目に測定した。比較として、ヒト抗体ＩｇＭを用い、同
様の実験を行った。
【００４９】
結果を図３に示した。抗体を添加しなかったコントロール条件でのＢｒｄＵ取り込み量を１００％として表示した。ＨｏＡＫｓ−１抗体を添加することによって、膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１の増殖が濃度依存的に抑制されていることが確認された。比較として用いたヒトＩｇＭでは、その添加による癌細胞株の増殖抑制効果は認められなかった。
【００５０】
（５）各種組織切片に対する反応性の検討
（５）−１．各種組織切片の調製
ＨｏＡＫｓ−１産生ハイブリドーマの作製に用いたリンパ球が由来した肺癌組織片および同癌組織周辺の非癌部肺組織片を、常法に従ってホルマリン溶液で固定し、パラフィンに包埋させて切片を作製した。また、各種癌細胞株（肺癌細胞株：ＨＬＣ−１（慶應義塾大学）、Ａ５４９およびＰＣ−９（免疫生物研究所）、膵癌細胞株：ＳＵＩＴ２（九州ガンセンター），ＰＡＮＣ−１およびＰＫ８（東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センター）、胃癌細胞株：ＭＫＮ４５、ＭＫＮ７４、ＨＳＣ−３（いずれも免疫生物研究所）、大腸癌細胞株：ＨＴ２９（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３８）、ＤＬＤ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ２２１）、ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ２２９）、ＣＯＬＯ２０５（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ２２２））については、それぞれ培養液Ｄで３７℃、５％ＣＯ2の条件で増殖させ、それぞれ約１×１０6〜１×１０7個の細胞をヌードマウス（日本クレア）の皮下に移植し、腫瘍を形成させた。形成した腫瘍を摘出し、上記と同様に処理を行って腫瘍組織切片をそれぞれ作製した。
【００５１】
（５）−２．各種組織切片に対する反応性の検出
作製した各種組織切片を常法に従い脱パラフィン処理し、ブロッキング操作を行った後に、実施例（３）−２．に記載のビオチン標識したＨｏＡＫｓ−１抗体を反応させた。検出には、ＤＡＫＯ  Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｉｏｎ（ＣＳＡ）  Ｓｙｓｔｅｍ(ＤＡＫＯ)を用い、その反応性は、ジアミノベンチジンの赤褐色の染色として検出された。さらに上記免疫染色を行った組織切片は、組織像を確認するためにヘマトキシリンによって組織中の細胞の核を青染させた。
【００５２】
反応性が認められた各種癌組織切片および自家肺非癌部組織切片の染色像を図４に示した。ＨｏＡＫｓ−１抗体は、そのハイブリドーマが由来した自家肺癌組織切片中の癌細胞、および、ヌードマウスで形成された肺癌株腫瘍：ＨＬＣ−１およびＡ５４９、膵癌株腫瘍：ＳＵＩＴ２，ＰＡＮＣ−１およびＰＫ−８、胃癌株腫瘍：ＭＫＮ４５の腫瘍組織切片中の癌細胞に明確な反応性が認められた。一方、非癌部組織切片に対する反応は認められなかった。
【００５３】
また、図４には示していないが、コントロールとして、ヒト血清からＨｏＡＫｓ−１抗体と同様にプロセップＡカラムを用いて精製したヒト抗体、または、同様に取得したＨｏＡＫｓ−１抗体と同じサブタイプを有するＩｇＭ型ヒトモノクローナル抗体Ａを用いた染色も、上記と同様の手順で行った。これらの抗体は、後述の、ＰＡＮＣ−１細胞の不溶性画分に対する反応性を有しないが、上記各組織切片に対しても特異的な反応性を示さなかった。
【００５４】
（６）ＨｏＡＫｓ−１抗体が認識する抗原の解析
（６）−１．癌細胞株からの抗原サンプルの調製
細胞形態の著しい変化が引き起こされ、ヌードマウス移植腫瘍での抗体反応性が確認された膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１由来タンパク質を材料として、ウェスタンブロット法によってＨｏＡＫｓ−１抗体が反応する物質の同定を試みた。膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１をフラスコ中、培養液Ｄで３７℃、５％ＣＯ2の条件で増殖させた。フラスコ中の培養上清を除去
し、ＰＢＳで一回洗浄した後、少量のＰＢＳをフラスコに添加し、セルスクレーパーで細胞を剥がし、遠心管に移して１０００ｒｐｍ、５分間の遠心によって細胞を回収した。さらにＰＢＳで二回洗浄した後、ＴＮＥ−バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．６），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）＋プロテアーゼインヒビター（５μｇ／ｍｌロイペプチン、５μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、５μｇ／ｍｌキモスタチン（いずれもペプチド研究所））を回収した細胞の１０倍量（ｖ／ｖ）加え、氷冷中でガラス製ホモジナイザーを用いて細胞を破壊し、１００００ｇ、２０分間遠心を行い、可溶性の上清画分と不溶性の沈殿物を得た。沈殿物については、ＲＩＰＡ−バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．５％  デオキシコール酸、０．１％  ＳＤＳ）＋プロテアーゼインヒビター（５μｇ／ｍｌロイペプチン，５μｇ／ｍｌペプスタチンＡ，５μｇ／ｍｌキモスタチン）を、先に加えたＴＮＥ−バッファーと同量添加して懸濁させ、超音波破砕機に約３分間かけて沈殿を分散させた。
【００５５】
（６）−２．ウエスタンブロットによる解析
上記のＰＡＮＣ−１由来可溶性画分タンパク質およびＲＩＰＡバッファーで可溶化させた不溶性画分タンパク質をそれぞれ約２０μｇずつ用いて、２〜１５％アクリルアミドグラジエントゲルで電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルからＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写し、ＰＶＤＦ膜をブロッキングした後に、ＨｏＡＫｓ−１抗体を４℃、Ｏ／Ｎ、さらに３７℃で１時間、反応させた。ＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合したヒト抗体に対するヤギ抗体（１０００培希釈、カペル）を加え、さらに３７℃、１時間の反応を行った。次に、ＰＢＳ−ＴでＰＶＤＦ膜を洗浄し、ＨｏＡＫｓ−１の反応物質をウェスタンブロッティングルミノールリージェント（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で検出した。
【００５６】
ＰＡＮＣ−１細胞由来タンパク質の電気泳動パターン（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ染色）とウェスタンブロットの結果を図５に示した。ＨｏＡＫｓ−１抗体は、膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１細胞ホモジネートの不溶性画分（膜画分）中、約５５ｋＤａの単一タンパク質に対して反応性を示すことがわかった。
【００５７】
（６）−３．アミノ酸配列分析
上記のＲＩＰＡバッファーで可溶化させたＰＡＮＣ−１由来の不溶性画分約５６０μｇを、アマシャム社製ＰｌｕｓＯｎｅ ２−Ｄ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ ｋｉｔを用いて処理した後、約 ４０μｇずつ二次元電気泳動にかけた。一次元目の電気泳動では、ＺＯＯＭ ＳＴＲＩＰ（ｐＨ３−１０ＮＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサンプルを膨潤させて等電点電気泳動を行い、二次元目は１０％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−電気泳動を行った。上記ウェスタンブロット法と同様の方法を用い、二次元電気泳動パターン上でＨｏＡＫｓ−１の反応物質を検出した。同じサンプルについて１３回の二次元電気泳動を行い、電気泳動後のゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅで染色し、ウエスタンブロットの結果を参照して、ＨｏＡＫｓ−１抗体反応物質に相当するスポットを１３個分ゲルから切り出した。
【００５８】
切り出したゲル片を洗浄し、リジルエンドペプチダーゼを含むトリスバッファー（ｐＨ８．５）を加えて３５℃、オーバーナイトの処理を行った。その後、溶液を逆相ＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ）に供して断片ペプチドを分離した。分離されたペプチドのうち、フラクションＮｏ．５８についてアミノ酸配列分析装置（Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９４ ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）を行い、主に検出されたアミノ酸から、Ｎ末端がＶａｌで始まるペプチドの配列を１２残基目まで確定した。その配列は、ＶＥＬＱＥＬＮＤＲＦＡＮ（配列番号１０７）であり、ホモロジーリサーチの結果、各種ビメンチン（Mol. Cell. Biol. Vol. 6, p3614-3620, 1986, GenBank Acces
sion No. M14144）およびデスミン（Gene vol. 78, p243-254, 1989）の内部配列に一致していた。ビメンチンおよびデスミンは細胞骨格のフィラメントであることから、ＨｏＡＫｓ−１抗体は細胞骨格のフィラメントに反応性を有する抗体であることが考えられた。
【００５９】
ＨｏＡＫｓ−１抗体は、このアミノ酸配列ＶＥＬＱＥＬＮＤＲＦＡＮ（配列番号１０７）を含むタンパク質を介して癌細胞に形態変化（図１）や増殖抑制効果（図２または３）を及ぼしたと考えられたが、ＨｏＡＫｓ−１抗体を培養液中に添加することによって癌細胞が形態変化等を起こしたことから、この抗原タンパク質は癌細胞の膜表面に存在することが予想された。
【００６０】
（７）ヒトモノクローナル抗体ＨｏＡＫｓ−１遺伝子の取得と塩基配列の決定
ＨｏＡＫｓ−１抗体産生ハイブリドーマからＲＮｅａｓｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｍｉｎｉ
ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ)を用いて全ＲＮＡを調製した。逆転写反応は、ランダム９ｍｅｒをプライマーとして、ＲＮＡ  ＰＣＲ  ＫＩＴ（ＡＭＶ）（ＴａＫａＲａ）を用いて行い、ｃＤＮＡを合成した。
【００６１】
ＰＣＲ増幅用プライマーとしては、既知の抗体配列（J Mol Biol. Vol.222, pp581-597, 1991）に基づいて、重鎖可変領域の増幅用には、ヒト抗体重鎖可変領域のフレーム１で保存されているＮ末側アミノ酸配列（配列番号２、４、６、８、１０および１２）にそれぞれ対応するＰＣＲプライマーＶＨ１（配列番号１）、ＶＨ２（配列番号３）、ＶＨ３（配列番号５）、ＶＨ４（配列番号７）、ＶＨ５（配列番号９）、ＶＨ６（配列番号１１）の等量混合物を５'側に、ヒト抗体重鎖可変領域のフレーム４で保存されているＣ末側アミノ酸配列（配列番号１４、１６、１８および２０）にそれぞれ対応するＰＣＲプライマーＪＨ１（配列番号１３）、ＪＨ２（配列番号１５）、ＪＨ３（配列番号１７）、ＪＨ４（配列番号１９）の等量混合物を３'側に用いた。
【００６２】
κ鎖可変領域の増幅用プライマーには、ヒト抗体κ鎖可変領域のフレーム１で保存されているＮ末側アミノ酸配列（配列番号２２、２４、２６、２８、３０および３２）にそれぞれ対応するＰＣＲプライマーＶＫ１（配列番号２１）、ＶＫ２（配列番号２３）、ＶＫ３（配列番号２５）、ＶＫ４（配列番号２７）、ＶＫ５（配列番号２９）、ＶＫ６（配列番号３１）の等量混合物を５'側に、ヒト抗体κ鎖可変領域のフレーム４で保存されているＣ末側アミノ酸配列（配列番号３４、３６、３８、４０および４２）にそれぞれ対応するＰＣＲプライマーＪＫ１（配列番号３３）、ＪＫ２（配列番号３５）、ＪＫ３（配列番号３７）、ＪＫ４（配列番号３９）、ＪＫ５（配列番号４１）の等量混合物を３'側に用いた。
【００６３】
λ鎖可変領域の増幅用プライマーには、ヒト抗体λ鎖可変領域のフレーム１で保存されているＮ末側アミノ酸配列（配列番号４４、４６、４８、５０、５２，５４および５６）にそれぞれ対応するＰＣＲプライマーＶＬ１（配列番号４３）、ＶＬ２（配列番号４５）、ＶＬ３（配列番号４７）、ＶＬ４（配列番号４９）、ＶＬ５（配列番号５１）、ＶＬ６（配列番号５３）、ＶＬ７（配列番号５５）の等量混合物を５'末端に、ヒト抗体λ鎖可変領域のフレーム４で保存されているＣ末側アミノ酸配列（配列番号５８、６０および６２）にそれぞれ対応するＰＣＲプライマーＪＬ１（配列番号５７）、ＪＬ２（配列番号５９）、ＪＬ３（配列番号６１）の等量混合物を３'末端に用いた。
【００６４】
ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ
２４００を用い、ＲＮＡ  ＰＣＲ  ＫＩＴ（ＡＭＶ）（ＴａＫａＲａ）を用いて説明書に従って行った。その結果、軽鎖については、κ鎖用プライマーによるＰＣＲで増幅され、λ鎖用プライマーでは増幅されなかったため、ハイブリドーマより産生される抗体の軽鎖はκ鎖であることがわかった。
【００６５】
増幅された重鎖、軽鎖各々の可変領域ＤＮＡ断片は、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。次に、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ(インビトロジェン)を用いて、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯと上記の精製ＰＣＲ産物とを連結させ、大腸菌のトランスフォーメーションを行った。生じたコロニーをピックアップし、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ)を用いてプラスミドを精製し、ＥｃｏＲＩで３７℃１５分間消化して、２%アガロース電気泳動で目的ＤＮＡ断片が組み込まれていることを確認した。
【００６６】
塩基配列は、目的のＤＮＡ断片が組み込まれた複数のコロニーについて、Ｍ１３プライマーを用いて、ＣＥＱ  ２０００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ)により解析した。その結果、重鎖の解析からはＨ０９（配列番号６３）、Ｈ１２（配列番号６５）、Ｈ２７（配列番号６７）、Ｈ３０（配列番号６９）の４種類の配列が得られた。Ｋ鎖の解析からは、Ｋ３０（配列番号７１）、Ｋ３１（配列番号７３）、Ｋ３２（配列番号７５）、Ｋ３５（配列番号７７）、Ｋ３９（配列番号７９）、ＫＭＯ５（配列番号９７）、ＫＭＯ６（配列番号９９）、ＫＭＯ２６（配列番号１０１）、ＫＭＯ３６（配列番号１０３）、ＫＭＯ４０（配列番号１０５）の１０種類の配列が得られた。これらのうち、Ｈ０９、Ｈ１２、Ｈ２７、Ｈ３０、Ｋ３０、Ｋ３１、Ｋ３２、Ｋ３５、Ｋ３９がヒトの重鎖または軽鎖をコードしていると考えられた。これらの塩基配列、および対応するアミノ酸配列（重鎖：配列番号６４、６６、６８、Ｋ鎖：配列番号７０、７２、７４、７６、７８、８０）を比較することによって、重鎖および軽鎖それぞれについて、可変領域の塩基配列（重鎖：配列番号８１、軽鎖：配列番号８３）およびアミノ酸配列（重鎖：配列番号８２、軽鎖：配列番号８４）を決定した。
【００６７】
ＨｏＡＫｓ−１抗体遺伝子について、上記で決定した配列よりもさらに３’側の領域の配列を決定した。重鎖遺伝子の３’側領域の増幅は、ヒト抗体重鎖可変領域のフレーム１で保存されているＮ末側アミノ酸配列に対応するＰＣＲプライマーＶＨ３（配列番号５）を５’側プライマーに、ヒト抗体重鎖定常領域中のアミノ酸配列に対応するＰＣＲプライマーＩｇＭＦＯＲ（配列番号１０８）を３’側プライマーに用いたＰＣＲにより行った。得られたＰＣＲ産物を、上記と同様にしてプラスミドに組み込んで塩基配列を決定した。その結果、上記重鎖可変領域の塩基配列（配列番号８１）の３’側に続く５７塩基の配列（配列番号１１０）を新たに決定することができた。この塩基配列は１９アミノ酸（配列番号１１１）をコードしていると予想された。この５７塩基を加えたＨｏＡＫｓ−１抗体重鎖遺伝子の塩基配列と、予想されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１１８、配列番号１１９に示した。一方、この５７塩基には、定常領域をコードする配列も含まれるので、可変領域をコードしている部分（２４塩基）のみを加えたＨｏＡＫｓ−１抗体重鎖可変領域遺伝子の塩基配列と、予想されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１１４、配列番号１１５に示した。
【００６８】
ＨｏＡＫｓ−１抗体κ鎖遺伝子の増幅は、ヒト抗体κ鎖可変領域のフレーム１で保存されているＮ末側アミノ酸配列に対応するＰＣＲプライマーＶＫ４（配列番号２７）を５’側プライマーに、ヒト抗体κ鎖定常領域のＣ末側アミノ酸配列に対応するＰＣＲプライマーＧＫＦＯＲ（配列番号１０９）を３’側プライマーに用いたＰＣＲにより行った。得られたＰＣＲ産物を、上記と同様にしてプラスミドに組み込んで塩基配列を決定した。その結果、上記κ鎖可変領域の塩基配列（配列番号８３）の３’側に続く９９塩基の配列（配列番号１１２）を新たに決定することができた。この塩基配列は３３アミノ酸（配列番号１１３）をコードしていると予想された。この９９塩基を加えたＨｏＡＫｓ−１抗体κ鎖遺伝子の塩基配列と、予想されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１２０、配列番号１２１に示した。一方、この９９塩基には定常領域をコードする配列も含まれるので、可変領域をコードしている部分（２４塩基）のみを加えたＨｏＡＫｓ−１抗体κ鎖可変領域遺
伝子の塩基配列と、予想されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１１６、配列番号１１７に示した。
【００６９】
超可変領域（ＣＤＲ）とフレームワークの境目はＫａｂａｔらの文献（Sequences of Proteins of Immunological Interest, fifth edition National Institutes of Health, Bethesda, MD  1991年）を参考にして決定した。その結果、重鎖のＣＤＲはＨＣＤＲ１（塩基配列：配列番号８５、アミノ酸配列：配列番号８６）、ＨＣＤＲ２（塩基配列：配列番号８７、アミノ酸配列：配列番号８８）およびＨＣＤＲ３（塩基配列：配列番号８９、アミノ酸配列：配列番号９０）、軽鎖のＣＤＲはＬＣＤＲ１（塩基配列：配列番号９１、アミノ酸配列：配列番号９２）、ＬＣＤＲ２（塩基配列：配列番号９３、アミノ酸配列：配列番号９４）およびＬＣＤＲ３（塩基配列：配列番号９５、アミノ酸配列：配列番号９６）と決定することができた。
【００７０】
（８）形態変化の持続性
ＨｏＡＫｓ−１抗体の添加によって形態変化が認められた膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１を用い、その形態変化の持続性を検討した。ＨｏＡＫｓ−１抗体の濃度が約１００μｇ／ｍｌとなる条件下、３７℃、５％ＣＯ2の環境で膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１を５日間培養した後、ＨｏＡＫｓ−１抗体を含有しない培養液に交換し、さらに７日間培養を継続した。ＨｏＡＫｓ−１抗体を除去してから３日後、６日後、７日後の細胞の形態を顕微鏡で観察した結果を図６に示した。ＨｏＡＫｓ−１抗体によって引き起こされたＰＡＮＣ−１細胞の形態変化は、抗体を除去した後も長期間継続して認められた。
【００７１】
（９）ＨｏＡＫｓ−１抗体の生癌細胞表面への結合活性
膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１、肺癌細胞株ＨＬＣ−１および血管内皮細胞ＨＵＶＥＣｓを９６−ウェルプレート（３６０３、コーニング社製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ2の環境で培養を一日行った後、実施例（３）−２に記載のビオチン標識したＨｏＡＫｓ−１抗体を５０μｇ／ｍｌの濃度（０．０５％アジ化ナトリウム含有）で添加し、室温、６０分間反応させた。抗体溶液を除去した後、２０ｎＭ−ＱｄｏｔＴＭ５６５ストレプトアビジン標識（Ｑｕａｎｔｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）溶液（０．０５％アジ化ナトリウム含有）を加えて室温、３０分間反応を行い、本溶液を除去してＰＢＳ（０．０５％アジ化ナトリウム含有）を添加し、共焦点蛍光顕微鏡（ＣＳＵ１０、横河電機株式会社製）での観察を行った。各生細胞表面に対するＨｏＡＫｓ−１抗体の結合活性を図７に示した。ＨｏＡＫｓ−１抗体は、ＰＡＮＣ−１細胞およびＨＬＣ−１細胞の生細胞表面に結合活性を示した（図７−Ａ，Ｃ）が、ＨＵＶＥＣｓ細胞に対しては結合活性を示さなかった（図７−Ｅ）。コントロールとして用いたヒトＩｇＭ抗体は、いずれの細胞に対しても結合活性を示さなかった（図７−Ｂ，Ｄ，Ｆ）。
【００７２】
（１０）膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１由来の約５５ｋＤａタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体の作製
（１０）−１．マウスへの免疫および細胞融合
実施例（６）−１と同様の方法でＰＡＮＣ−１細胞のホモジネートからＲＩＰＡバッファーで可溶化させた不溶性画分タンパク質を調製し、約１８０μｇ分について１０％アクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅで染色し、ＨｏＡＫｓ−１抗体が反応性を示す約５５ｋＤａタンパク質に相当するバンドを切り出した。
【００７３】
切り出したゲルを破砕し、０．２ｍｌのコンプリートフロイントアジュバント（ＤＩＦＣＯ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）と混合してマウス（Ｂａｌｂ／ｃＡ  Ｊｃｌ、６週令、♀、日本クレア）の腹腔に注入し、初回免疫を行った。さらに２週間後、インコンプリートアジュバントとゲルを混合し、上記同様に調製をして同マウスに再度免疫を施し
た。その４日後、同マウスの脾臓を摘出してリンパ球を調製（２．４ｘ１０8個）し、定法（単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティッフィク出版）に従いマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１と融合させた。融合させた細胞は、培養液Ｄ（ｅＲＤＦ＋５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン硫酸塩＋１０％ＦＣＳ）に通常使用濃度のＨＡＴを添加した培養液に懸濁し、９６ウェル−プレートに播種し、３７℃、ＣＯ2インキュベーターで培養を開始した。融合から約２週間後、ハイブリドーマの出現を確認し、その培養上清を用いて約５５ｋＤａタンパク質に対する反応性をウェスタンブロッティング法によって検出し、目的のハイブリドーマを選択した。
【００７４】
（１０）−２．約５５ｋＤａタンパク質に対する反応性の検出
ＰＡＮＣ−１細胞のホモジネートからＲＩＰＡバッファーで可溶化させた不溶性画分タンパク質、約４ｍｇ分について１０％アクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、ゲルからＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写してブロッキングした。（１０）−１の９６ウェル−プレートの各ウェルについてその培養上清を回収し、転写したＰＶＤＦ膜と３７℃、１時間反応させた。ＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＨＲＰを結合したマウス抗体に対するヤギ抗体（１０００倍希釈、カペル）を加え、さらに３７℃、１時間の反応を行った。次に、ＰＢＳ−ＴでＰＶＤＦ膜を洗浄し、培養上清の約５５ｋＤａのタンパク質に対する反応性をコニカイミュノステインＨＲＰ−１０００（コニカ株式会社製）を用いて検出した。反応性が検出されたウェルから限界希釈法によってクローニングを行い、ハイブリドーマ株２Ｆ６−１および３Ｆ９−１を樹立した。
【００７５】
（１１）抗５５ｋＤａマウスモノクローナル抗体の生癌細胞表面への結合活性
（１１）−１．抗５５ｋＤａマウスモノクローナル抗体の精製と標識化
（１０）−２で樹立したハイブリドーマ株２Ｆ６−１、および３Ｆ９−１を培養し、それぞれの培養上清を回収してプロセップＡにかけ、抗体を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってそれぞれのモノクローナル抗体は、いずれもＩｇＭであることが確認された。精製した各抗体をビオチニレーションリージェントを用いて説明書に従いビオチン標識させた後、ゲルろ過法によって標識抗体と遊離のビオチンを分離した。
【００７６】
（１１）−２．生癌細胞表面への結合活性
（９）と同様に膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１、肺癌細胞株ＨＬＣ−１および血管内皮細胞ＨＵＶＥＣｓを９６−ウェルプレート（３６０３、コーニング社製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ2の環境で培養を一日行った後、（１１）−１に記載のビオチン標識した抗５５ｋＤａマウスモノクローナル抗体を５０μｇ／ｍｌの濃度（０．０５％アジ化ナトリウム含有）で添加し、室温、６０分間反応させた。抗体溶液を除去した後、２０ｎＭ−ＱｄｏｔＴＭ５６５ストレプトアビジン標識（Ｑｕａｎｔｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）溶液（０．０５％アジ化ナトリウム含有）を加えて室温、３０分間反応を行い、本溶液を除去してＰＢＳ（０．０５％アジ化ナトリウム含有）を添加し、共焦点蛍光顕微鏡（ＣＳＵ１０、横河電機株式会社製）での観察を行った。各生細胞表面に対する抗体の結合活性を図８に示した。２Ｆ６−１および３Ｆ９−１由来の抗体は、（９）に記載のＨｏＡＫｓ−１と同様、ＰＡＮＣ−１細胞とＨＬＣ−１細胞に対してその生細胞表面に結合活性を示した（図８−Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）が、ＨＵＶＥＣｓ細胞に対する結合活性は示されなかった（図8−Ｇ、Ｈ）。
【００７７】
（１２）ウェルタンブロッティングによる抗ビメンチン抗体および抗デスミン抗体の約５５ｋDaタンパク質に対する反応性
ＰＡＮＣ−１細胞のホモジネートからＲＩＰＡバッファーで可溶化させた不溶性画分タンパク質を１０％アクリルアミドゲルの各レーンにつき、約１０μｇのせ、電気泳動を行い、ゲルからＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写してブロッキングを行った。抗ビメンチンマウスモノクローナル抗体（ｓｃ−６２６０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ社製）およびヤギ抗デスミン抗体（ｓｃ−７５５９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）をＰＶＤＦ膜と３７℃、１時間反応させた後、ＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＨＲＰを結合したマウス抗体に対するヤギ抗体（１０００倍希釈、カペル）またはヤギ抗体に対するマウス抗体（１０００倍希釈）を加え、さらに３７℃、１時間の反応を行った。次に、ＰＢＳ−ＴでＰＶＤＦ膜を洗浄し、抗体の反応物質をウェルタンブロッティングルミノールリージェントで検出した。抗ビメンチン抗体は、約５５ｋＤａのタンパク質に対して反応性を示したが、抗デスミン抗体の反応性は検出されなかった。
【００７８】
これらの結果から、ＨｏＡＫｓ−１抗体が認識するＰＡＮＣ−１由来の約５５ｋＤａタンパク質はビメンチンであると判断され、該タンパク質に反応性を有する抗体には生癌細胞表面へ結合活性を有するものも存在するということが証明された。
【００７９】
（１３）γ−ＨｏＡ．（組換えＨｏＡＫｓ−１抗体）の作製
（１３−１）ｃＤＮＡの作製およびＨｏＡＫｓ−１可変領域ＤＮＡ断片の取得
全ＲＮＡ（実施例（７）に記載）からのｃＤＮＡの調整およびＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００を用い、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｐｌｕｓ  ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｇ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて説明書に従って行った。重鎖のｃＤＮＡを調製するためのプライマーには、キットに付属のｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒｓを用いた。κ鎖のｃＤＮＡを調製するためのプライマーには、Ｐ１（配列番号１２２）を用いた。
【００８０】
重鎖およびκ鎖の可変領域の増幅には、発現プラスミドと連結するための制限酵素サイトを導入したプライマーを用いた。重鎖可変領域の増幅には、５’末端側にＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびシグナル配列を含むＰ２（配列番号１２３）、３’末端側にＮｈｅＩサイトを含むＰ３（配列番号１２４）を用いた。κ鎖可変領域の増幅には、５’末端側にＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびシグナル配列を含むＰ４（配列番号１２５）、３’末端側にＢｓｉＷＩサイトを含むＰ５（配列番号１２６）を用いた。
【００８１】
増幅された重鎖、κ鎖各々の可変領域ＤＮＡ断片は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。次に、発現ベクターと連結するため、ＤＮＡ断片を制限酵素で消化した。重鎖ＤＮＡ断片はＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩで３７℃、２時間消化した。κ鎖ＤＮＡ断片ははじめにＢｓｉＷＩで３７℃、２時間消化した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、さらにＨｉｎｄＩＩＩで３７℃、２時間消化した。消化したＤＮＡ断片は１．５％アガロース電気泳動し、目的のＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
【００８２】
（１３−２）発現プラスミドの切断およびプラスミド断片の取得
ＨｏＡＫｓ−１のヒトＩｇＧ１型組換え抗体を発現させるため、重鎖発現用プラスミドとして重鎖定常領域の配列を含むｐＥＸ−Ｇ１―ＷＬｐＨｙ、κ鎖発現用プラスミドとしてκ鎖定常領域の配列を含むｐＫＳ−κ‘−Ｈｉｎｄ−５を用いた。ｐＥＸ−Ｇ１―ＷＬｐＨｙはＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩで３７℃、２時間消化した。ｐＫＳ−κ‘−Ｈｉｎｄ−５はＡｓｐ７１８で３７℃、２時間消化した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、さらにＨｉｎｄＩＩＩで３７℃、２時間消化した。消化した断片は０．８％アガロース電気泳動し、目的の断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
【００８３】
（１３−３）ＨｏＡＫｓ−１可変領域の発現プラスミドへの連結
上記の方法により得られたＨｏＡＫｓ−１の重鎖可変領域を含むＤＮＡ断片と切断した発現プラスミドｐＥＸ−Ｇ１―ＷＬｐＨｙは、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、説明書に従って連結させ、大腸菌ＤＨ５α−Ｔ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を説明書に従い形質転換した。生じたコロニーをピックアップし、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。重鎖塩基配列を含むプラスミドはＮｄｅＩで３７℃、１時間消化し、１．５％アガロース電気泳動を行い所望のプラスミドｐＥＸ−ＨｏＡＫｓ−Ｈを得た。得られたプラスミドは、５’末端側にＰ６（配列番号１２７）、３’末端側にＰ７（配列番号１２８）を用いて塩基配列を確認した。ＨｏＡＫｓ−１組換え抗体の重鎖構造遺伝子の塩基配列を配列番号１２９に示す。
【００８４】
一方、ＨｏＡＫｓ−１のκ鎖可変領域を含むＤＮＡ断片と切断した発現プラスミドｐＫＳ−κ‘−Ｈｉｎｄ−５は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、説明書に従って連結させ、大腸菌ＤＨ５α−Ｔ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。生じたコロニーをピックアップし、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。κ鎖塩基配列を含むプラスミドはＢｓｉＷＩで３７℃、１時間消化し、１．５％アガロース電気泳動を行い所望のプラスミドｐＫＳ−ＨｏＡＫｓ−Ｋを得た。得られたプラスミドは、５’末端側にＰ６、３’末端側にＰ１を用いて塩基配列を確認した。ＨｏＡＫｓ−１組換え抗体のκ鎖構造遺伝子の塩基配列を配列番号１３１に示す。
【００８５】
（１３−３）ＨｏＡＫｓ−１重鎖とＨｏＡＫｓ−１κ鎖を含むプラスミドの連結
ＨｏＡＫｓ−１の重鎖とκ鎖をひとつのプラスミドに連結するため、上記で得られたプラスミドを制限酵素で消化した。ｐＥＸ−ＨｏＡＫｓ−ＨはＮｈｅＩで３７℃、２時間消化し、ｐＫＳ−ＨｏＡＫｓ−ＫはＮｈｅＩおよびＳｐｅＩで３７℃、２時間消化した。得られた断片はＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。各々の断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて説明書に従い連結させ、大腸菌ＤＨ５α−Ｔ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。生じたコロニーをピックアップし、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。得られたプラスミドをＮｈｅＩで３７℃、３０分間消化し、０．８％アガロース電気泳動を行って所望のプラスミドｐＥＸ−ＨｏＡＫｓ−ＨＫを得た。
【００８６】
（１３−４）γ−ＨｏＡ．発現プラスミドの作製
上記で得られたｐＥＸ−ＨｏＡＫｓ−ＨＫとｄｈｆｒ遺伝子を含むプラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ‘’を連結させ、γ−ＨｏＡ．発現用のプラスミドを作製した。方法としては、まずｐＥＸ−ＨｏＡＫｓ−ＨＫをＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで３７℃、２時間消化した後０．８％アガロース電気泳動し、目的のＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。ｐＳＶ２ｄｈｆｒ‘’はＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで３７℃、２時間消化した後Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を添加して６５℃、１５分間処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。その後０．８％アガロース電気泳動し、目的のＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
【００８７】
各々の断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、説明書に従って連結させ、大腸菌ＤＨ５α−Ｔ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。生じたコロニーをピックアップし、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。得られたプラスミドをＮｄｅＩで
３７℃、１時間消化した後、１．５％アガロース電気泳動を行って組換え抗体を発現させるための所望のプラスミドｐＥＸ−ＨｏＡＫｓ−ＨＫ／ｐＳＶ２ｄｈｆｒ‘’を得た。
【００８８】
（１３−５）γ−ＨｏＡ．生産細胞の作製
γ−ＨｏＡ．産生のための細胞株として、無血清培地で培養可能なＣＨＯ（ＤＧ３２５）細胞株を用いた。ＣＨＯ（ＤＧ３２５）をＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（ＧＩＢＣＯ）にて１ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。２μｇのｐＥＸ−ＨｏＡＫｓ−ＨＫ／ｐＳＶ２ｄｈｆｒ‘’ＤＮＡ  と６μＬのＦｕＧＥＮＥ  ６（Ｒｏｃｈｅ）を混合し、説明書に従ってＣＨＯ（ＤＧ３２５）にトランスフェクションした。トランスフェクションして５時間後にＥＸ―ＣＥＬＬ３２５−ＰＦ（ニチレイ）を添加した。２日間培養後、Ｇ４１８  Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）４００μｇ／ｍｌおよびメトトレキセート（Ｓｉｇｍａ）０、もしくは２５、もしくは５０ｎＭを選択試薬として培地に添加して培養し、γ−ＨｏＡ．を生産する細胞を得た。
【００８９】
（１３−６）ＥＬＩＳＡ  Ａｓｓａｙを用いた抗体生産量の測定
細胞が生産するγ−ＨｏＡ．の生産量は、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。まず、ウサギ抗ヒトイムノグロブリン抗体（ＣＡＰＰＥＬ）を５０μｇ／ｍｌに溶液１（PBS）で希釈し、９６ｗｅｌｌフレキシブルプレート（ＦＡＬＣＯＮ）に５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、３７℃で２時間処理した。その後、ｗｅｌｌの溶液を捨て、各ｗｅｌｌに溶液２を２００μＬずつ添加し、４℃で１６時間以上処理した。各ｗｅｌｌの溶液を捨て、溶液２（０．１％Ｇｅｌａｔｉｎ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で希釈した培養上清を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、４℃で１６時間以上反応させた。反応後、各ｗｅｌｌの溶液を捨て、溶液３（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄した後、溶液２で１０００倍に希釈したＨＲＰ標識ウサギ抗ヒトイムノグロブリン抗体（ＣＡＰＰＥＬ）を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、３７℃で１時間反応させた。各ｗｅｌｌの溶液を捨て、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン錠（和光純薬）を５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で溶解し過酸化水素水を添加した基質液（遮光・用時調整）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。室温で３分間ほど反応させて発色させた後、１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4を５０μＬ／ｗｅｌｌを添加して反応を停止させ、マルチプレートリーダー  ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）でＬ１＝４９５ｎｍおよびＬ２＝６５０ｎｍの吸光度Ａ１およびＡ２を測定し、（Ａ１−Ａ２）を算出した。ヒトＩｇＧ１κ（ＣＡＰＰＥＬ）を希釈して標準溶液として検量線を作製し、培養上清中の抗体量を算出した。算出した結果より、抗体の生産量が最も高い細胞を選択し、γ−ＨｏＡ．の生産に用いた。
【００９０】
（１３−７）γ−ＨｏＡ．の精製
上記で得られたγ−ＨｏＡ．生産細胞株をＧ４１８  Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびメトトレキセート（Ｓｉｇｍａ）を添加したＥＸ−ＣＥＬＬ３２５−ＰＦ（ニチレイ）で培養し、γ−ＨｏＡ．を含む培養液を得た。次に、その培養液をプロセップＡにかけることにより、γ−ＨｏＡ．を吸着させ、その後溶出させることによってγ−ＨｏＡ．を精製した。なお、図には示していないが、γ−ＨｏＡ．は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純粋なＩｇＧであることが確認された。
【００９１】
（１４）膵癌細胞株PANC−１由来の約５５ｋＤａタンパク質に対するγ−ＨｏＡ．の反応性の検出
ＰＡＮＣ−１細胞のホモジネートからＲＩＰＡバッファーで可溶化させた不溶性画分タンパク質を各１０μｇ分について１０％アクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、ゲルからＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写してブロッキングした。転写したＰＶＤＦ膜を（１３−７）に記載の精製γ−ＨｏＡ．と３７℃、１時間反応させた。ＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＨＲＰを結合したヒト抗体に対するヤギ抗体（１０００倍希釈、カペル）を
加え、さらに３７℃、１時間の反応を行った。次に、ＰＢＳ−ＴでＰＶＤＦ膜を洗浄し、約５５ｋＤａのタンパク質に対するγ−ＨｏＡ．の反応性をウェスタンブロッティングルミノールリージェント（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で検出した結果、γ−ＨｏＡ．はＨｏＡＫｓ−１と同様、約５５ｋＤａのタンパク質に対して反応性を示すことがわかった。
【００９２】
（１５）γ−ＨｏＡ．の生癌細胞表面への結合活性
膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１、肺癌細胞株ＨＬＣ−１および血管内皮細胞ＨＵＶＥＣｓを９６−ウェルプレート（３６０３、コーニング社製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ2の環境で培養を一日行った後、（１３−７）に記載の精製γ−ＨｏＡ．（０．０５％アジ化ナトリウム含有）を添加し、室温で６０分間反応させた。γ−ＨｏＡ．溶液を除去した後、ＦＩＴＣを結合したヒト抗体に対するヤギ抗体（２０倍希釈、カペル）（０．０５％アジ化ナトリウム含有）を室温、３０分間反応させ、本溶液を除去してＰＢＳ（０．０５％アジ化ナトリウム含有）を添加し、共焦点蛍光顕微鏡（ＣＳＵ１０、横河電機株式会社製）での観察を行った。各生細胞表面に対する抗体の結合活性を図９に示した。γ−ＨｏＡ．は、（９）に記載のＨｏＡＫｓ−１と同様、ＰＡＮＣ−１細胞とＨＬＣ−１細胞に対してその生細胞表面に結合活性を示した（図９−Ａ、Ｃ）が、ＨＵＶＥＣｓ細胞に対する結合活性は示さなかった（図９−Ｅ）。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明の抗体は、癌、特に非小細胞肺癌、膵癌、胃癌などの治療薬又は診断薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ＨｏＡＫｓ−１抗体を培養癌細胞株に作用させたときの各細胞の形態変化を示す図（写真）。
【図２】ＨｏＡＫｓ−１抗体の培養癌細胞株ＨＬＣ−１、ＭＫＮ４５およびＨＵＶＥＣｓに対する増殖抑制効果を示すグラフ図。
【図３】ＨｏＡＫｓ−１抗体の膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１に対する増殖抑制効果を示すグラフ図。
【図４】ＨｏＡＫｓ−１抗体の各種組織切片に対する反応性を示す図（写真）。
【図５】ＨｏＡＫｓ−１抗体が反応する抗原タンパク質についての解析結果を示す図（写真）。レーン１〜４はSDS-PAGEのパターンを、レーン５〜８はSDS-PAGE後のＨｏＡＫｓ−１抗体によるウエスタンブロットのパターンを示す。また、レーン１及び５は分子量マーカー、レーン２及び６はPANC-1細胞ホモジネート、レーン３及び７はPANC-1細胞ホモジネート不溶性画分、レーン４及び８はPANC-1細胞ホモジネート可溶性画分を示す。
【図６】培養癌細胞株にＨｏＡＫｓ−１抗体を一定期間作用させ、その後、抗体を除去したときの各細胞の形態変化を示す図（写真）。
【図７】ＨｏＡＫｓ−１抗体の各生癌細胞表面に対する結合活性を示す図（写真）。
【図８】抗５５ｋＤａマウスモノクローナル抗体の各生癌細胞表面への結合活性を示す図（写真）。
【図９】γ−ＨｏＡ．抗体の各生癌細胞表面に対する結合活性を示す図（写真）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年3月4日(2004.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
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