(57)【要約】【課題】  シンドロームＸまたは内臓脂肪症候群，並びに糖尿病，高血圧，肥満，高脂血症の予防と治療に応用できるマイタケ由来の抽出物およびグリコプロテイン並びにその製造方法であって、実用性があり、生理活性物質を安定的に生産できる方法を提供することにある。【解決手段】  マイタケ子実体から、人体に悪影響を与え得るアセトンやエーテルを使用せず、また、健康食品等として不適な免疫抑制作用を示す物質を実質的に除去することができる抽出方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイタケ由来の抽出物を製造する方法であって、
（１）マイタケ子実体を９０％以上のエタノールで処理し、エタノール可溶性の低分子成分を除去する工程、
（２）その後、熱水抽出を行ない、得られた熱水抽出液に最終容量濃度が５０〜７５％になるまでエタノールを加え、生成した不溶成分を除去する工程、
（３）得られた上澄液から、透析または限外濾過により分子量１４，０００以上の画分を収集する工程を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の製造方法によって得られたマイタケ抽出物であって、グリコプロテインを主成分とする抽出物。
【請求項３】
請求項２に記載のマイタケ由来の抽出物を含むことを特徴とする組成物。
【請求項４】
マイタケ由来のグリコプロテインを製造する方法であって、
（１）マイタケ子実体を９０％以上のエタノールで処理し、エタノール可溶性の低分子成分を除去する工程、
（２）その後、熱水抽出を行ない、得られた熱水抽出液に最終容量濃度が５０〜７５％になるまでエタノールを加え、生成した不溶成分を除去する工程、
（３）得られた上澄液から、透析または限外濾過により分子量１４，０００以上の画分を収集する工程、
（４）当該画分を精製する工程を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項５】
請求項４に記載の製造方法によって得られたグリコプロテインであって、褐色であり、水溶性および熱安定性を示し、単純タンパク質部分と糖質部分との質量比率が７５：２５〜９０：１０、分子量分布が１８，０００〜２２，０００であり、且つビウレット反応とフェーリング反応に陽性であることを特徴とするマイタケ由来のグリコプロテイン。
【請求項６】
請求項５に記載のマイタケ由来のグリコプロテインを含むことを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイタケ由来の抽出物およびグリコプロテインの製造方法に関するものである。また、本発明は、当該方法により製造されるマイタケ由来の抽出物およびグリコプロテイン、並びに当該抽出物またはグリコプロテインを含む組成物に関するものであって、抗高血糖，抗高血圧，肥満軽減および抗高脂血症作用を有するものに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、冠動脈疾患の危険因子等としてシンドロームＸが話題になっている。この「シンドロームＸ」は、体細胞のインスリンに対する感受性が低下することにより、その機能が充分に発揮されなくなることに起因する高インスリン血症，耐糖能異常，高血圧，脂質代謝異常（高トリグリセリド血症や低ＨＤＬコレステロール血症など），肥満などを合併する症候群であり、欧米では「インスリン抵抗性症候群」とも呼ばれている。一方、日本では、その原因が内臓肥満にあるとの学説もあるので、「内臓脂肪症候群」と呼ぶことが提唱されている。
【０００３】
これまで、斯かるインスリン抵抗性の改善を目的とする化学薬品が販売されてきたが、いずれも何等かの副作用や耐薬性などの問題を抱えており、中には販売を中止せざるを得なかったものもある。
【０００４】
そこで、「シンドロームＸ」に対しては、食事制限や適度な運動を含む生活習慣の改善が有効であるとの認識があると共に、従来の合成化学薬品とは異なり、体に優しい上に有効な、天然由来の生理活性物質の開発が期待されている。
【０００５】
その様な従来技術としては、マイタケ由来の抽出物が知られている。マイタケはサルノコシカケ科に属するキノコであり、その味や香りに加え、古来より健康にも良いとされ、珍重されてきた。しかし、近年では人工栽培が可能になるにつれ研究も進み、その有効成分が明らかにされつつある。
【０００６】
例えば非特許文献１には、マイタケ子実体をジエチルエーテル（以下、「エーテル」という）で抽出することにより得られる脂溶性成分が血圧降下作用を示すことが記載されており、また、非特許文献２には、同じくエーテル−エタノール（１：１）で処理した後に熱水抽出して得られた抽出液に、エタノールを最終容量濃度が５０％となるよう添加して生じた浮遊物が血糖降下作用を有する旨が記載されている。
【０００７】
しかし、これら抽出に用いられるエーテルには麻酔作用があり、また、揮発性が高く極めて引火し易い。その上、厚生労働省の規定によって、抽出物を健康食品の素材とする場合には、エーテルを抽出溶媒として用いることは禁止されていることから、工業化には著しい制約がある。
【０００８】
一方、特許文献１〜３に記載のマイタケ抽出物の製造方法では、熱水とアルコールを用いており、エーテルは使用されていない。詳しくは、これら特許文献に記載の製造方法はマイタケ粉末から熱水により抽出した物質にアルコールを添加し、生じた浮遊物を収集するものであり、それぞれ免疫抑制剤，糖尿病改善剤，育毛促進剤として利用され得る。しかしこれら抽出物はほぼ同じ方法により製造されているにも拘わらず、その収率はそれぞれ８〜１０％（特許文献１），１．６％（同２），１５％（同３）とかなり異なっており、当該物質は不安定であることが推測される。
【０００９】
また特許文献１によれば、当該物質は明確な免疫抑制作用（サプレッサーＴ細胞活性の抑制作用）を有することが記載されている。この様な物質は確かに免疫抑制剤としては応用可能かもしれないが、健康食品や他の疾病の治療剤として使用すれば免疫を抑制してしまうため、極めて好ましくない状況になることが想定される。
【００１０】
特許文献４にはマイタケまたはエノキタケの水抽出物が記載されており、高血圧，高脂血症，肥満に効果を示す旨が開示されている。しかし当該活性物質は熱に不安定なタンパク質であり、４０℃以上で失活していく。
【非特許文献１】「ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブラティン（Chem.Pharm.Bull.）」１９８８年，第３６巻３号，第１０００〜１００６頁
【非特許文献２】「バイオロジカル・アンド・ファーマシューティカル・ブラティン（Biol.Pharm.Bull.）」１９９４年，第１７巻８号，第１１０６〜１１１０頁
【特許文献１】特許２７５３９３５号明細書（請求項１等）
【特許文献２】特許２７５３９３６号明細書（請求項１等）
【特許文献３】特許２７３２００８号明細書（請求項１等）
【特許文献４】特公平７−７５５１８号公報（請求項１等）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述した様に、これまでにもシンドロームＸに対する活性物質であるマイタケ抽出物は種々知られているが、従来の製造方法やそれによって得られる活性物質には様々な欠点があり、医薬品や健康食品への応用は非常に難しいと思われる。
【００１２】
そこで、本発明が解決すべき課題は、シンドロームＸまたは内臓脂肪症候群に効果があるマイタケ由来の抽出物およびグリコプロテイン並びにその製造方法であって、実用性があり、生理活性物質を安定的に生産できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、マイタケの抽出方法につき鋭意研究を重ね、各方法の利便性や実用性を検討し、更に、得られるマイタケ抽出物の生理活性を確認した。その結果、本発明方法であれば従来方法が示す様な欠点はなく、得られるマイタケ抽出物はシンドロームＸ等に対して有効な活性を示すことを見出して、本発明を完成した。
【００１４】
即ち、本発明の製造方法は、マイタケ由来の抽出物を製造する方法であって、（１）マイタケ子実体を９０％以上のエタノールで処理し、エタノール可溶性の低分子成分を除去する工程、（２）その後、熱水抽出を行ない、得られた熱水抽出液に最終容量濃度が５０〜７５％になるまでエタノールを加え、生成した不溶成分を除去する工程、（３）得られた上澄液から、透析または限外濾過により分子量１４，０００以上の画分を収集する工程を含むことを特徴とする。
【００１５】
上記製造方法により得られる抽出物は、グリコプロテインを主成分とするものであって、医薬組成物などの組成物の構成成分とすることができる。
【００１６】
また、本発明に係るマイタケ由来のグリコプロテインを製造する方法は、（１）マイタケ子実体を９０％以上のエタノールで処理し、エタノール可溶性の低分子成分を除去する工程、（２）その後、熱水抽出を行ない、得られた熱水抽出液に最終容量濃度が５０〜７５％になるまでエタノールを加え、生成した不溶成分を除去する工程、（３）得られた上澄液から、透析または限外濾過により分子量１４，０００以上の画分を収集する工程、（４）当該画分を精製する工程を含むことを特徴とする。
【００１７】
更に、本発明に係るマイタケ由来のグリコプロテインは、上記製造方法によって得られたマイタケ抽出物であって、褐色であり、水溶性および熱安定性を示し、単純タンパク質部分と糖質部分との質量比率が７５：２５〜９０：１０、分子量分布が１８，０００〜２２，０００であり、且つビウレット反応とフェーリング反応に陽性であることを特徴とする。
【００１８】
上記のマイタケ由来のグリコプロテインは、上記抽出物と同様に、組成物の構成成分とすることができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係るマイタケ由来のグリコプロテインおよびこれを主成分とする抽出物は、高血糖，高血圧，高脂血症および肥満に対して優れた抑制効果を示し、且つ毒性が極めて低いため、これら症状を恒常的に抑制できる。また、本発明に係る抽出物およびグリコプロテインは、シンドロームＸ或いは内臓脂肪症候群、並びに糖尿病，高血圧，肥満，高脂血症の予防と治療に応用できる。
【００２０】
従って、本発明の抽出物およびグリコプロテインは、医薬組成物や機能性食品等の組成物に添加される主成分として極めて有用であり、本発明の製造方法は、当該抽出物およびグリコプロテインを製造できるものとして、産業上有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明に係るマイタケ由来のグリコプロテインの製造方法が享有する最大の特徴は、極めて実用的である点にある。
【００２２】
即ち、従来のマイタケ抽出物に関係する技術は、何等かの点で実用上問題があったが、本発明の製造方法は、（ｉ）健康食品素材等の生産に禁止されているエーテルやアセトンなどの代わりに厚生労働省に認可されているエタノールを使用すること、（ii）免疫抑制作用がある物質を実質的に除去すること、（iii）限られた資源を効率よく利用すること、（iv）活性物質が安定して得られること、（v）当該活性物質が、シンドロームＸまたは内臓脂肪症候群，並びに糖尿病，高血圧，肥満，高脂血症の予防と治療に応用できることを特徴とするものである。
【００２３】
以下に、斯かる特徴を発揮する本発明の実施形態、及びその効果について説明する。
【００２４】
本発明に係るマイタケ由来の抽出物を製造する方法は、（１）マイタケ子実体を９０％以上のエタノールで処理し、エタノール可溶性の低分子成分を除去する工程、（２）その後、熱水抽出を行ない、得られた熱水抽出液に最終容量濃度が５０〜７５％になるまでエタノールを加え、生成した不溶成分を除去する工程、（３）得られた上澄液から、透析または限外濾過により分子量１４，０００以上の画分を収集する工程を含む。
【００２５】
（１）本発明方法では、先ず、「マイタケ子実体を９０％以上のエタノールで処理し、エタノール可溶性の低分子成分を除去する工程」を行なう。
【００２６】
使用する「マイタケ子実体」は、マイタケ子実体自体やその乾燥体を特に制限なく使用できるが、効率的な処理を行なうには粉末体を使用するのがよい。
【００２７】
また、使用する「９０％以上のエタノール」は、９０％以上のエタノール水であればよいが、エタノール可溶成分を効率的に除去するためには、９５％以上のエタノール水が好適であり、更にエタノール自体が好ましい。
【００２８】
当該工程における処理は、一般的にはマイタケ子実体にエタノールまたはエタノール水を加え、攪拌することにより行なう。この際のマイタケ子実体の濃度は、１０〜２５質量％とし、温度は２０〜７０℃とするが、室温でよい。また処理時間は、用いるマイタケ子実体の状態等にもよるが、１〜１０時間とする。
【００２９】
当該処理で得られるエタノール可溶性成分は、濾過や遠心分離により除去できるが、大量処理等のためには遠心分離を用いるのがよい。こうして得られるエタノール抽出残渣を、次工程で用いる。
【００３０】
（２）次に、「上記（１）の抽出残渣を熱水抽出し、得られた熱水抽出液に最終容量濃度が５０〜７５％になるまでエタノールを加え、生成した不溶成分を除去する工程」を行なう。
【００３１】
当該工程では、先ず、前工程で得られたエタノール抽出残渣に水を加え、加熱することにより抽出する。この際のエタノール抽出残渣濃度は１０〜２５質量％とし、温度は８０〜１３０℃として、好適には加圧下１００〜１３０℃で行なう。また、抽出時間は１〜５時間が適当である。
【００３２】
次いで、不溶成分を濾別し、得られた濾液にエタノールを最終容量濃度が５０〜７５％になるまでエタノールを加える。但し、エタノール添加前に濾液を濃縮すると効率的である。エタノール添加後は、低温下（０℃から室温、好ましくは４℃以上，１０℃以下）で５〜２４時間（好適には、８〜１２時間）静置し、不溶成分である沈殿物や浮遊物の生成を促すとよい。当該不溶成分は、遠心分離や濾過により除去する。得られた上澄液（濾液等を含む）を次工程で用いる。
【００３３】
（３）次いで、「得られた上澄液から、透析または限外濾過により分子量１４，０００以上の画分を収集する工程」を行なう。
【００３４】
当該工程における「透析または限外濾過」で用いられる透析膜は、分画分子量１４，０００のものであれば特に制限は無く、セロファン膜やコロジオン膜など一般的なものを使用できる。
【００３５】
以上の手順により本発明に係るマイタケ由来の抽出物を製造することができるが、更に精製することによって、その主成分であるグリコプロテインを製造することができる。
【００３６】
（４）当該画分を精製する工程は、上記工程（３）で得られた分子量１４，０００以上の画分を、更に精製するものである。当該精製方法は、例えばゲル濾過クロマトグラフィー等、グリコプロテインの精製によく用いられている方法を特に制限無く使用することができる。
【００３７】
上記方法により得られたマイタケ抽出物は、褐色であり、水溶性および熱安定性を示し、単純タンパク質部分と糖質部分との質量比率が７５：２５〜９０：１０、分子量分布が１８，０００〜２２，０００であり、且つビウレット反応とフェーリング反応に陽性であることを特徴とする。
【００３８】
当該抽出物は、ビウレット反応とフェーリング反応に陽性であることから、タンパク質であり且つ糖質部分を持つグリコプロテインであることが分かる。
【００３９】
また、水溶性であり且つ熱安定性を示すことは、上記製造方法の条件（例えば、上記工程（２）における熱水抽出）から明確である。
【００４０】
その他の「単純タンパク質部分と糖質部分との質量比率」および「分子量分布」に関する特徴は、後述する実施例から導き出されたものである。ここで「単純タンパク質部分」とは、複合タンパク質であるグリコプロテインのうちポリペプチド鎖のみからなる部分をいう。因みに、当該グリコプロテインの平均分子量としては、約２０，０００が好ましい。
【００４１】
本発明の組成物は、上記の抽出物またはグリコプロテインを含むことを特徴とする。後述の実施例で実証されている通り、上記グリコプロテインは、血糖降下作用，血圧低下作用，抗肥満作用および抗高脂血症作用を示すので、当該組成物は、糖尿病治療，高血圧治療，抗肥満，抗高脂血症等を目的とする医薬組成物として有用である。
【００４２】
本発明の組成物には、上記グリコプロテインの他に、防腐剤，安定剤，賦形剤，結合剤，崩壊剤，甘味料など、一般的な組成物の添加成分を加えてもよい。
【００４３】
本発明の組成物は、健康食品，機能性食品或いは一般食品などの食品とすることもできる。本発明のグリコプロテインは、マイタケ抽出物であることから安全性に優れており、この安全性は後述の実施例によって証明されている。従って、当該食品は恒常的に摂取することができ、且つ糖尿病，高血圧症，肥満，高脂血症等を予防し得ることから、平素より血糖値や血圧，体重などを安定化する健康食品等とすることができる。
【００４４】
本発明の組成物には、上記添加成分の他、ビタミン類，ミネラル類，ハーブ類，キノコ類やその他の栄養素材などを添加してもよい。尚、これらビタミン類等は、当然に上記組成物に添加してもよいものである。また、本発明の抽出物またはグリコプロテインを、そのまま食品等にすることもできる。
【００４５】
以下に、実施例および試験例を示すことにより本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４６】
（実施例１）マイタケ抽出物の製造
乾燥マイタケ子実体粉末１０００ｇに９５％エタノール水５Ｌを加え、室温で攪拌しながら２〜３時間処理し、濾過によりエタノール可溶性の低分子成分を除去した。
【００４７】
次いで、残渣に脱イオン水５Ｌを加え１００〜１２０℃で攪拌しながら約２時間抽出を行ない、得られた熱水抽出物を容量の約２分の１まで濃縮してから、エタノールを最終容量濃度が５０〜７５％になるまで添加した。４〜１０℃の低温室で８〜１２時間放置後、沈殿物や浮遊物などの固形物質を遠心分離により除去し、上澄液から透析によって分子量１４，０００以上の画分を収集した。
【００４８】
当該画分をゲル濾過クロマトグラフィーで精製し、約２１ｇの褐色物質を得た。当該抽出物はビューレット反応とフェーリング反応において陽性であったことから、タンパク質であり且つ糖を含むことが確認できた。また、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法でタンパク質定量を、フェノール硫酸法により糖の定量を行なうことによって、当該抽出物はグリコプロテインであることが明らかにされた。
【００４９】
（実施例２）分析結果
実施例１で得られた抽出物の分析結果を、以下に示す。尚、グリコプロテイン中の単純タンパク質部分の定量はＢｒａｄｆｏｒｄ法で、単純タンパク質部分の構成アミノ酸は自動アミノ酸分析装置（Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer）で、糖質部分の定量はフェノール硫酸法で、糖質部分の組成は高速液体クロマトグラフィーで、分子量の測定はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により行ない、１Ｈ-ＮＭＲ測定も行なった。
【００５０】
外観  ：  褐色，吸湿性粉末
溶解性  ：  水およびアルカリ性溶液に可溶
安定性  ：  高温に安定，エタノールにも安定
化学構成  ：  単純タンパク質部分：糖質部分＝７５：２５〜９０：１０（質量比率，表１を参照）
【００５１】
【表１】
2005068112.tif 000002
【００５２】
単純タンパク質部分のアミノ酸組成  ：  アスパラギン，グルタミン，セリン，スレオニン，グリシン，アラニン，バリン，システイン，メチオニン，イソロイシン，ロイシン，チロシン，フェニルアラニン，リシン，ヒスチジン，アルギニン，プロリン
糖質部分の組成  ：  ガラクトース，マンノース，グルコース，Ｎ-アセチルグルコサミン，フコース
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル  ：  3.0473, 3.8983, 6.8500, 7.3150
平均分子量  ：  ２０，０００。
【００５３】
（試験例１）
８週齢のＺＦＲラット（Zucker Fatty Rat，先天性肥満糖尿病ラット）を無作為に２組に分け、実施例１で得た本発明物質を蒸留水に溶解し、これを１日当たり１５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与した群を「投与群」とし、これと同量の蒸留水を投与した群を「対照群」とした。
【００５４】
その後、ラットの血圧を週１回測定し、その変化を観察した。また、投与開始から３５日目において絶食後４時間で血液を採取し、血液化学検査を行なうことによって、ラット血液中の血糖，総コレステロールおよびトリグリセリドの変化を調べた。血圧測定の結果を図１に、血液化学検査の結果を表２に示す。
【００５５】
図１に示した様に、試験開始後の６週間にわたって、対照群のラットの血圧平均値は１１９ｍｍＨｇから１５０ｍｍＨｇまで上昇した。これに対して、本発明物質を投与した投与群の血圧平均値は１１９ｍｍＨｇから１２６ｍｍＨｇまで上昇したに過ぎない。従って、本発明物質は、血圧の上昇を抑制できることが実証された。
【００５６】
また、血液化学検査の結果（表２）によれば、本発明の抽出物を投与された投与群は、対照群と比較して、その血糖，総コレステロール，トリグリセリドの何れもが低減されていた。従って、本発明の抽出物は、糖尿病や高脂血症などの治療薬となり得ることが証明された。
【００５７】
【表２】
2005068112.tif 000003
【００５８】
（試験例２）
体重が急増し肥満が進行している１５週齢のＺＦＲラットに対し、本発明物質を１日当たり２４ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与した。その後３週間にわたって体重変化を観察した。結果を図２に示す。
【００５９】
当該結果より、本発明に係る抽出物を投与されたＺＦＲラットは、体重増加が抑制されていることが明らかになった。従って、本発明の抽出物は、糖尿病や肥満などに伴う体重増加を抑制し得ることが実証された。
【００６０】
（試験例３）
７０〜７５週齢（寿命の３分の２以上）という高齢のＺＦＲラットを用いて、本発明物質を１日当たり２４ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与し、高齢ラットの血圧および血糖値に対する本発明物質の効果を調べた。血圧測定の結果を図３に示す。
【００６１】
図３の結果によれば、本発明物質の投与群では、対照群に対して明らかな血圧の低下が見られた。また、試験開始後３５日目の血糖値測定の結果によれば、対照群の２１８±１８ｍｇ／ｄｌに対して、１５１±１１ｍｇ／ｄｌまでの血糖値の低下が観察された。
【００６２】
従って、本発明の抽出物は、年齢によらず血圧上昇および血糖値上昇を抑制できる薬剤となり得ることが実証された。
【００６３】
（試験例４）
健康な４週齢のＩＣＲ系マウスを、雌雄それぞれ１０匹を用いて安全性試験を行なった。これらマウスにつき絶食後４時間に体重を測定した後、試験群には、雌雄ともに本発明に係る抽出物を２，０００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で胃ゾンデを用いて強制単回投与した。対照群には、雄で０．７ｍＬ，雌で０．６ｍＬの純水を同様に投与した。観察期間は１４日間とし、観察期間終了後にすべて剖検した。
【００６４】
その結果、雌雄ともに観察期間中に死亡例はなく、一般状態と体重にも異常は見られなかった。剖検では、すべての試験マウスの主要臓器にも異常は見出せなかった。従って、本発明に係る抽出物のマウスに対する単回経口投与によるＬＤ５０値は、雌雄ともに２，０００ｍｇ／ｋｇ体重以上であると考えられ、本発明の抽出物は、安全性が高いことが明らかにされた。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】若年ＺＦＲラットにおける抗高血圧作用を示す図
【図２】ＺＦＲラットにおける体重増加の抑制作用を示す図
【図３】高齢ＺＦＲラットにおける抗高血圧作用を示す図
【図１】
2005068112.tif 000004
【図２】
2005068112.tif 000005
【図３】
2005068112.tif 000006