(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞培養基材の処理法の提供。【解決手段】多糖類を基材とし、これに細胞を培養した後に酵素処理して多糖類を除去する細胞培養基材の処理法、並びに、多糖類とこれの細胞接着作用物質から成る基材に細胞を培養し、しかる後に酵素処理して多糖類を除去する細胞培養基材の処理法である。また、多糖類がキチンまたはキトサンであり、酵素がリゾチームである。【効果】基材を体内に埋入することにより、基材がもたらす分解産物による細胞毒性、分解残渣による異物反応等の誘起の懸念を取り除くことができる。また、安全性にも優れるものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖類を基材とし、これに細胞を培養し、しかる後に酵素処理して多糖類を除去することを特徴とする細胞培養基材の処理法。
【請求項２】
多糖類と細胞接着作用物質からなる基材に細胞を培養し、しかる後に酵素処理して多糖類を除去することを特徴とする細胞培養基材の処理法。
【請求項３】
多糖類がキチンまたはキトサンである請求項１または２記載の細胞培養基材の処理法。
【請求項４】
細胞接着作用物質がタンパク質、またはペプチドである請求項２記載の細胞培養基材の処理法。
【請求項５】
基材がシート状または、中空状の何れかである請求項１または２に記載の細胞培養基材の処理法。
【請求項６】
基材が三次元構造の多孔体である請求項１、2または5に記載の細胞培養基材の処理法。
【請求項７】
酵素がリゾチームである請求項１から6記載の細胞培養基材の処理法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養基材の処理法に関し、培養後において、基材を除去し、細胞集合体を得ることを可能としたものである。
【背景技術】
【０００２】
近時、欠損したり、切除した器官を再生するための再生医療にかかわる技術が多数報告されている。
例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸等の各種の生体吸収性素材を細胞培養のための基材として用い、これに各種の細胞を播種し、一定期間培養した後に生体に埋入して、組織の再生を行う方法が知られている。かかる生体吸収性素材は、一定期間経過すると基材自体が生体内で分解して消失するため、組織再生に対する基材の影響を抑えることができる。
しかしながら、基材がもたらす分解産物による細胞毒性、分解残渣による異物反応等の誘起が全くないわけではない。そこで、基材を体内に埋入しない方法、例えば、細胞と培養基材との間に存在する細胞接着タンパク質をタンパク分解酵素で消化分解することによって、基材から細胞をシート状で分離させる方法、具体的には、培養皮膚の場合、表皮細胞シートを培養基材からはがす場合にタンパク分解酵素であるディスパーゼが用いられている。
また、かかる酵素処理に係る他の例として、タンパク質またはペプチドをセルロースに固定化させた細胞培養基材上で細胞を培養した後、セルラーゼよって基材であるセルロースを除去する方法も提案されている。（特許文献１）
一方、表皮細胞シートを非酵素的に回収する方法としては、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド等の感温性高分子を表面グラフトした培養基材も知られており、かかる方法においては温度によって基材の細胞接着能をコントロールすることで基材から細胞を分離でき、優れた方法であるといえる。
【０００３】
【特許文献１】特開２００１−３２１１５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、細胞は極めて脆弱であり、従来の方法では細胞シートを得るための薬剤処理により細胞が損傷され、細胞に損傷を与えることなく細胞が付着している培養基材を除去することは困難である。    
本発明は、かかる点、酵素処理に関連するものであるが、より安全性に優れ、しかも前記課題も解決できる新規な技術を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
しかるに、本発明は、多糖類を基材とし、これに細胞を培養した後に酵素処理して多糖類を除去する細胞培養基材の処理法、並びに、多糖類とこれの細胞接着作用物質から成る基材に細胞を培養し、しかる後に酵素処理して多糖類を除去する細胞培養基材の処理法であり、多糖類がキチンまたはキトサンであること、細胞接着作用物質がタンパク質、またはペプチドであること、基材がシート状または、中空状の何れかであること、基材が三次元構造の多孔体であること、酵素がリゾチームであることを特徴とする細胞培養基材の処理法である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明においては、基材を体内に埋入することにより、基材がもたらす分解産物による細胞毒性、分解残渣による異物反応等の誘起の懸念を取り除くことができ、また、細胞が分泌した細胞外マトリックスを損傷することなく、細胞外マトリックスを含めた細胞の構造体を保持したまま細胞集合体を回収できる。
また、多糖類、特に、天然界に豊富に存在し安価で食品、化粧品、医薬品等に広く用いられて、安全性が保証されているキチン、キトサンを基材としたこと、これの除去にも安全性が保証され、医薬品に用いられてきたリゾチーム（Lysozym）を用いた点、従来にない特徴を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明に用いられる多糖類としては、キチン、キトサンが例示できる。特に好ましくは、例えば、カニ、エビなど甲殻類の殻を原料とし、脱タンパク質、脱灰分の加工によって得られるキチン、或いは、キチンを脱アセチル化することによって得られ、希薄な酸溶液に溶解し、成型加工も比較的容易であるキトサンが例示できる。              
かかるキチン、キトサンは、所望する組織の形状にあわせて例えば、シート状、チューブ状、中空状に、また、構造的に三次元の多孔体（スポンジ状）に加工される。
勿論、他の態様として公知の技術によって繊維化されたキチン、キトサンを編、織成したり、不織布化したり、組紐編機によって中空のブレード状としたものも適宜選択して用いることができる。
【０００８】
本発明は、以上の構成よりなる基材を適宜の形状、サイズとした後、細胞を播種し、培養するが、細胞接着作用を有するタンパク質、及びまたはペプチドを固定化した後、細胞を播種し、培養してもよい。
かかる固定化の方法は、多糖類が有する水酸基やアミノ基を利用して行うことができる。タンパク質、ペプチドを固定化するときに用いる薬剤としては、トレシルクライド、エピクロルヒドリン、ビスエポキシ化合物、２官能性チオイソシアネート化合物等を用いることができる。具体的には、先ず、トレシルクライドとピリジンを、アセトン、クロロホルム、または、ジオキサン等の極性有機溶媒に溶解させた溶液に３０分〜数時間浸漬し、多糖類を活性化させた後、細胞接着作用を有するタンパク質、ペプチドを固定化する。例えば、かかる操作は、細胞接着作用を有するタンパク質、ペプチドを加えた緩衝液に基材を浸漬することにより行う。
【０００９】
本発明における細胞接着作用を有するタンパク質としては、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ティネシン、トロンボスポンジン、エンタクチン、オステオポンチン、フォンビルブラント因子、フィブリノーゲン、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン等が例示でき、これを単独若しくは適宜混合して用いる。
また、細胞接着作用を有するペプチドとしては、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−セリン、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸、ロイシン−アスパラギン酸−バリン、アルギニン−グルタミン酸−アスパラギン酸−バリン、アスパラギン酸−グリシン−グルタミン酸−アラニン、グルタミン酸−イソロイシン−ロイシン−アスパラギン酸−バリン、グリシン−プロリン−アルギニン−プロリン、リジン−グルタミン−アラニン−グリシン−アスパラギン酸−バリン、グルタミン酸−イソロイシン−ロイシン−アスパラギン酸−バリン、チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン、バリン−グリシン−バリン−アラニン−プロリン−グリシンが例示でき、これを単独若しくは適宜混合して用いる。
以下、実施例を挙げて説明するが、本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００１０】
キチンを室温で蟻酸に浸漬し、−20°Cで24時間凍結した。凍結、融解を数回繰り返し、透明なゲルを得た。ゲルを蟻酸に分散させ、少量のジクロロ酢酸を添加した。この溶液をガラス板上で風乾させ、キチンフィルムを得た。
浮遊培養用シャーレに上記キチンフィルムを敷き、角化細胞を2×10↑4個/cm2の細胞密度で播種した。角化細胞用の無血清培地（Gibco社製、ケラチノサイトSFM）で、コンフルエントになるまで1週間培養した。
次いで、4mg/mlのリゾチーム水溶液（ｐH7.4、0.1M PBS）を添加し、37°Cでキチンフィルムを分解させ、角化細胞シートを得た。
得られた細胞シートは、シート自体の損傷、分解酵素による細胞傷害のないものであった。
【実施例２】
【００１１】
脱アセチル化度が、69％のキトサンを1％酢酸水溶液に1％濃度となるように溶解させ、ガラス板上で風乾させてキトサンフィルムを得た。得られたフィルムを更に3％のNaOHを含む50％エタノール溶液に2時間浸漬し、蒸留水で十分に洗浄し、乾燥させた。
浮遊培養用シャーレに上記キトサンフィルムを敷き、角化細胞を2×10↑4個/cm2の細胞密度で播種した。角化細胞用の無血清培地（Gibco社製、ケラチノサイトSFM）で、コンフルエントになるまで1週間培養した。
次いで、4mg/mlのリゾチーム水溶液（ｐH7.4）を添加し、37°Cでキトサンフィルムを分解させ、角化細胞シートを得た。
得られた細胞シートは、シート自体の損傷、分解酵素による細胞傷害のないものであった。
【産業上の利用可能性】
【００１２】
本発明においては、基材がもたらす分解産物による細胞毒性、分解残渣による異物反応等の誘起の懸念を取り除くことができる。また、細胞が分泌した細胞外マトリックスを損傷することなく、細胞外マトリックスを含めた細胞の構造体を保持したまま細胞集合体を回収できる。また、使用するリゾチームは医薬品としての使用実績があることから、安全性は保証される。即ち、細胞集合体を効率的に取り出すことができ、再生医療用途に好適に用いることができる。