(57)【要約】【課題】本発明は、免疫細胞において、内分泌撹乱物質によって発現量が変化するポリペプチドおよびヌクレオチドを指標とする、被験物質の免疫毒性を検出するための手法および検出装置を提供することを目的とする。【解決手段】被検物質の免疫系に及ぼす影響を検出する免疫影響検出方法であって、前記被検物質と免疫細胞を接触させる工程と、前記免疫細胞に発現したバニロイド受容体ファミリーのタンパク質をコードする遺伝子から転写されたmRNAを検出する工程とを含むことを特徴とする免疫影響検出方法を提供する。また、被検物質の免疫系に及ぼす影響を検出する免疫影響検出方法であって、前記被検物質と免疫細胞を接触させる工程と、前記免疫細胞に発現したバニロイド受容体ファミリーのタンパク質を検出する工程とを含む免疫影響検出方法を提供する。【選択図】図１
2005270069.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質の免疫系に及ぼす影響を検出する免疫影響検出方法であって、
前記被検物質と免疫細胞を接触させる工程と、
前記免疫細胞に発現したバニロイド受容体ファミリーのタンパク質をコードする遺伝子から転写されたmRNAを検出する工程と、
を含むことを特徴とする免疫影響検出方法。
【請求項２】
被検物質の免疫系に及ぼす影響を検出する免疫影響検出方法であって、
前記被検物質と免疫細胞を接触させる工程と、
前記免疫細胞に発現したバニロイド受容体ファミリーのタンパク質を検出する工程と、
を含む免疫影響検出方法。
【請求項３】
前記被検物質は、内分泌攪乱物質PAHであることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の免疫影響検出方法。
【請求項４】
前記被検物質は、ダイオキシンまたはダイオキシン異性体であることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の免疫影響検出方法。
【請求項５】
前記バニロイド受容体ファミリーのタンパク質は、TRPV2であることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の免疫影響検出方法。
【請求項６】
前記バニロイド受容体ファミリーのタンパク質は、VR-1であることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の免疫影響検出方法。
【請求項７】
前記バニロイド受容体ファミリーのタンパク質は、配列番号1で表されるヌクレオチドによってコードされるタンパク質であることを特徴とする請求項１記載の免疫影響検出方法。
【請求項８】
前記バニロイド受容体ファミリーのタンパク質は、配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質であることを特徴とする請求項1または2記載の免疫影響検出方法。
【請求項９】
前記免疫細胞は、Jurkat細胞であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の免疫影響検出方法。
【請求項１０】
バニロイド受容体ファミリーのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを検出するためのプローブを支持体表面に配列してなることを特徴とする免疫影響検出用アレイ。
【請求項１１】
バニロイド受容体ファミリーのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを検出するためのプローブとバニロイド受容体ファミリーのタンパク質に対する抗体とを支持体表面に配列してなることを特徴とする免疫影響検出用μＴＡＳ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質が免疫系に及ぼす影響を検出するための方法およびキットに関する。より詳細には、ヒトバニロイド受容体タンパク質（vanilloid receptor-like protein;TRPV-2,VRL-1）ポリペプチド、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドプライマーまたはプローブを使用して、被験物質が免疫細胞に与える毒性を検出するための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、内分泌撹乱物質をはじめとする化学物質が、低濃度でも生体に悪影響を惹起することが問題になっている。それらの影響の範囲は、生殖系にとどまらず、神経系や免疫系にも及んでいる。なかでも、建築物（建材）に含まれる化学物質が原因で頭痛や喘息、時には呼吸困難から死に至るほどの過剰反応を引き起こしてしまう「化学物質過敏症」（シックハウスまたはシックスクール）、環境ホルモンと呼ばれる物質による健康障害など、国内での化学物質による免疫障害の人の割合は11.6％に達している。このような現状から、化学物質の免疫系に及ぼす影響の評価方法の構築が進められている。化学物質によるアレルギー反応の惹起に関するインビトロでの評価方法については、いくつかの試験方法が確立されており、即時型アレルギー応答に基づくHRT（ヒスタミン遊離試験）や、遅延型アレルギー応答に基づくリンパ球増殖反応試験などがある。しかし、いずれの試験にも反応しない場合もあり、また、内分泌撹乱物質については、インビトロで免疫影響を評価するための有効な試験方法は確立されていない。
【０００３】
Jurkat T細胞は、ヒトTリンパ球由来の培養細胞であり、容易にアポトーシスを引き起こすことが知られている。ダイオキシン（2,3,7,8-TCDD）は、インビボにおいて、胸腺退縮など免疫毒性を示す内分泌撹乱物質であることが知られている。また、2,3,7,8-TCDDは、Jurkat T細胞への暴露によってアポトーシスを引き起こすことや、生存率を低下させることが知られており（非特許文献1、5）、アレルギーなどの免疫応答に関わるHRF遺伝子の発現量が増大させることが知られている（非特許文献2）。このため、免疫毒性モデルのひとつとなっている。したがって、HRF以外にも、免疫毒性を有する内分泌撹乱物質を感作させることによって発現量が著しく増大する物質が同定できたとすれば、該物質を指標に内分泌撹乱物質の免疫毒性を検出することが可能であろう。
【０００４】
一方、バニロイド受容体またはバニロイド受容体様タンパク質は、イオンチャネルファミリーに属するポリペプチドであると考えられておる。これらのタンパク質は、バニロイド化合物（カプサイシンなど）や温度刺激などの有害な刺激に対する情報を中枢神経系に伝える機能を持つ感覚ニューロンを選択的に活性化することが明らかとなっており、痛覚の発生に関与することが示されている（非特許文献3、4）。バニロイド受容体またはバニロイド受容体様タンパク質をコードするいくつかのポリヌクレオチドが同定され、クローニングされている（非特許文献3）。バニロイド受容体ポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、開示されている（特許文献1および2）。これらの文献では、バニロイド受容体またはバニロイド受容体タンパク質は、痛覚の発生に関与しているという機能に基づいた知見を得ている。
【特許文献１】国際公開第99/37675号パンフレット
【特許文献２】米国特許第6,335,180号
【非特許文献１】Hossain A. et.al. J. Biol. Chem. 273 19853-19858 （1998）
【非特許文献２】Oikawa K. et.al. Biochem. Biophysica. Res. Commun. 290 984-987 （2002）
【非特許文献３】Caterina MJ. Et.al. Nature 389 816-824 （1997）
【非特許文献４】Caterina MJ. Etal Nature 398 436-441 （1999）
【非特許文献５】Myung-Ja Kwon et.al. Pharmacology and Toxicology 93 186-190 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、バニロイド受容体、バニロイド受容体様タンパク質およびそれらをコードするヌクレオチド、または、配列番号2で表されるポリペプチドおよび配列番号１で表されるポリヌクレオチドの発現量の増加を指標として、被検物質の免疫毒性の有無を判定することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記問題を解決すべく鋭意研究の結果、免疫細胞において、ダイオキシン（2,3,7,8-TCDD）刺激によってバニロイド受容体をコードするmRNAの転写量が変化するという知見を得ることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、被検物質の免疫系に及ぼす影響を検出する免疫影響検出方法であって、前記被検物質と免疫細胞を接触させる工程と、前記免疫細胞に発現したバニロイド受容体ファミリーのタンパク質をコードする遺伝子から転写されたmRNAを検出する工程とを含むことを特徴とする免疫影響検出方法を提供する。
【０００８】
また、被検物質の免疫系に及ぼす影響を検出する免疫影響検出方法であって、前記被検物質と免疫細胞を接触させる工程と、前記免疫細胞に発現したバニロイド受容体ファミリーのタンパク質を検出する工程とを含む方法を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、上記免疫影響検出方法であって、前記被検物質が、内分泌攪乱物質PAHまたはダイオキシンもしくはダイオキシン異性体である免疫影響検出方法を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、上記免疫影響検出方法であって、前記バニロイド受容体ファミリーのタンパク質がTRPV2またはVR-1である免疫影響検出方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、上記免疫影響検出方法であって、前記バニロイド受容体ファミリーのタンパク質が配列番号1で表されるヌクレオチドにいよってコードされるタンパク質、または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質である免疫影響検出方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、バニロイド受容体ファミリーのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを検出するためのプローブを支持体表面に配列してなることを特徴とする免疫影響検出用アレイを提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、バニロイド受容体ファミリーのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを検出するためのプローブとバニロイド受容体ファミリーのタンパク質に対する抗体とを支持体表面に配列してなることを特徴とする免疫影響検出用μＴＡＳを提供する。
【発明の効果】
【００１４】
上述のように、本発明によれば、被験物質の免疫毒性の有無を容易に検出することが可能になる。免疫細胞におけるバニロイド受容体またはバニロイド受容体様タンパク質、およびそれらをコードするヌクレオチドを検出することによって、被験物質の免疫毒性を検出することが可能になる。したがって、被験物質が、シックハウスなどのアレルギー症状の原因物質となる可能性があるかどうかの判定や、新規材料の毒性判定を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、上述のとおり、免疫細胞において、ダイオキシン（2,3,7,8-TCDD）刺激によってバニロイド受容体をコードするmRNAの転写量が変化するという知見に基づいている。すなわち、本発明は、被検物質が、免疫系に影響を及ぼす物質である場合には、該被検物質に暴露された免疫細胞においてバニロイド受容体をコードするmRNAの転写が促進されることを利用した方法である。
【００１６】
本発明の1つの態様において、バニロイド受容体ファミリーのタンパク質をコードするmRNAの検出を利用した方法について説明する。
【００１７】
ここで、バニロイド受容体ファミリーのタンパク質は、本明細書において使用されるものとして、TRPV-2、VR-1、配列番号2で表されるポリペプチドなどのバニロイド受容体もしくはバニロイド受容体様タンパク質、並びにこれらの断片を含む。また、バニロイド受容体ファミリーのタンパク質をコードするヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（たとえば、mRNAは、上記TRPV-2、VR-1、配列番号2で表されるポリペプチドなどのバニロイド受容体ファミリーのタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および配列番号1で表されるポリヌクレオチド、並びにこれらの断片を含む。さらに、バニロイド受容体ファミリーのタンパク質は、いずれの種に由来するものであってもよいが、ヒトに由来するものが好ましい。
【００１８】
a）免疫細胞への被験物質の暴露
本発明の方法では、まず被検物質と免疫系の細胞（免疫細胞、免疫担当細胞とも称する）を接触させる。このような接触は、たとえば以下のように行うことができる。まず、血清を含む培地中において、免疫細胞を培養しておく。免疫細胞としては、たとえば、ヒトの白血病T細胞株化細胞などのT細胞、B細胞、マクロファージ、およびその他当業者に既知の種々の免疫細胞を使用することができる。また、培養条件は、使用する細胞に適した培地において適切な条件下で培養することが好ましい。
【００１９】
免疫系に及ぼす影響を検出するための被検物質は、任意の物質であってよいが、たとえば、免疫系に影響を及ぼすことが明らかな被検物質として、ダイオキシン（2,3,7,8-TCDD；2,3,7,8-tetrachrolo dibenzo dioxon）およびダイオキシン異性体（たとえば1-MCDD (1-monochrolo dibenzo dioxin)、1,2,3,7,8-PeCDD (1,2,3,7,8-pentachrolo dibenzo dioxin)）が挙げられる。また、被検物質は、純粋なものである必要はなく、たとえば任意の組成物または混合物であってもよく、また精製されていない粗製物であってもよい。また、被検物質は、固体、液体、および気体などのいずれの形態であってもよい。
【００２０】
続いて、上記免疫細胞と、被験物質を接触させる。接触は、たとえば免疫細胞を含む培養液中に被検物質を添加することによって行うことができる。添加後、免疫系の細胞を被検物質と接触させるために十分な時間インキュベートする。さらに、バニロイド受容体ファミリーのタンパク質をコードする遺伝子を転写させるために十分な時間インキュベートすることが好ましい。たとえば、1時間、3時間、6時間、24時間程度培養すればよい。このような接触のために必要な時間、並びに転写および翻訳のために必要な時間は、当業者であれば容易に見出すことができるであろう。
【００２１】
また、本方法において、対照試料として、被検物質を添加せずに同様の実験を同時に行った免疫細胞を準備することが好ましい。たとえば、同一条件で同時に培養を行い、一方には被検物質を添加し、他方を対照試料として被検物質を添加せずに培養しておく。
【００２２】
b）転写産物の分離
次いで、上記処理を行った免疫細胞において、バニロイド受容体ファミリーのタンパク質をコードする遺伝子から転写されたmRNAを検出する。mRNAを検出するためには、上記培養液から免疫細胞を回収し、RNAの単離をおこなう。RNAの単離は、当業者に既知のいずれの方法を使用して行ってもよく、たとえば、アルカリ法によって、またはグアニジンイソチオシアネートを用いた変性とセシウム溶液を用いた密度勾配超遠心によって総RNAを単離することができる。
【００２３】
c）被験物質物質の免疫細胞毒性の検出
上記b）で得られたRNAにおいて、バニロイド受容体もしくはバニロイド受容体様タンパク質をコードするmRNA、または配列番号１で表されるmRNAの転写量を検出する。転写量は、当業者に既知のいずれの方法を使用して検出してもよいが、たとえば得られたRNAからのRT-PCRによってバニロイド受容体ファミリーのタンパク質をコードするcDNAを増幅し、増幅産物を電気泳動することによって定量してもよく、またハイブリダイゼーションを利用して検出することもできる。また、バニロイド受容体ファミリーのタンパク質をコードするmRNAの検出は、その全長を検出してもよく、またはその一部のヌクレオチド断片を検出してもよい。ハイブリダイゼーションを利用して検出する場合、バニロイド受容体ファミリータンパク質をコードするポリヌクレオチドと相補的な配列を有するプローブを使用して検出することができる。このようなプローブは、当業者であれば容易に作成することができるであろう。また、このようなプローブを配置した装置を使用することによって容易に検出および定量することができる。このような装置としては、例えば、ガラス、石英、ポリマー、金属など、任意の材料からなる支持体上に複数のプローブのみを配列して固定したマイクロアレイ型デバイス、またはプローブのみならずバニロイド受容体ファミリーのタンパク質に対する抗体（免疫細胞）を前述したような支持体上に固定してなるμTAS型デバイスを具備する装置が想定される。
【００２４】
続いて、被検物質を添加した免疫細胞と被検物質を添加していない免疫細胞におけるバニロイド受容体ファミリーのタンパク質をコードするmRNA転写量を比較する。被験物質を添加した免疫細胞から得られたmRNAの発現量が、被験物質を添加していない細胞から得られたmRNAの発現量よりも多かった場合は、被検物質によってmRNAの転写が促進されていることが考えられ、従って該被験物質は、免疫系に影響を及ぼす物質であると判定される。
【００２５】
次に、本発明のもう1つの態様において、バニロイド受容体ファミリータンパク質の検出を利用した方法について説明する。
【００２６】
mRNAの検出と同様に、免疫細胞への被験物質の暴露を行う。上記a）と同様の処理を行えばよい。
【００２７】
d）タンパク質の分離
上記処理を行った後、免疫細胞において翻訳され、発現されたバニロイド受容体ファミリーのタンパク質を検出する。上記ａ）で得られた免疫細胞を含む培養液から培養した細胞を回収し、タンパク質の抽出を行う。タンパク質の抽出は、当業者に既知のいずれの方法を使用して行うこともできる。たとえば、遠心分離によって沈殿させた細胞を、ホモジナイザーまたは超音波破砕機によって破砕し、タンパク質抽出液を得る。あるいは、遠心分離によって沈殿させた細胞を変性剤、たとえばSDSもしくはメルカプトエタノールで処理することにより、または尿素を含む変性溶液で処理することにより、タンパク質抽出液を得る。
【００２８】
e）被験物質の免疫細胞毒性の検出
上記d）で得られたタンパク質抽出液において、バニロイド受容体ファミリーのタンパク質または配列番号2で表されるポリペプチドもしくはその一部を検出する。翻訳されたタンパク質の量および発現されたタンパク質の量は、当業者に既知のいずれの方法を使用して検出してもよいが、たとえばバニロイド受容体またはバニロイド受容体様タンパク質に対する抗体を使用した免疫学的方法を使用して定量することもできる。
【００２９】
以下、抗体を使用した方法の概要を説明する。
【００３０】
1）抗体の作製
本方法に使用する抗体は、ポリクロ-ナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよく、市販されていれば、それを使用することもできる。また、バニロイド受容体ファミリーのタンパク質または配列番号2で表されるペプチドの全長もしくは一部のペプチド断片に対する抗体を作製してもよい。
【００３１】
たとえば、組換えタンパク質を使用して、当業者に既知の方法によって抗体を得ることができる。簡単には、バニロイド受容体もしくはバニロイド受容体様タンパク質をコードするヌクレオチド、または配列番号１で表されるポリヌクレオチドの全長もしくは一部のヌクレオチド断片を組み込んだ発現ベクターを作製する。組み込んだ断片の末端には、たとえばV5などのタグをつけておいてもよい。作製した発現ベクターを大腸菌などの細菌細胞または動物細胞などに形質転換し、細胞内に組換えタンパク質を発現させて、バニロイド受容体もしくはバニロイド受容体様タンパク質、または配列番号2で表されるペプチドの全長もしくは一部のペプチド断片を生産させこれらを回収する。回収は、たとえばタグによるカラム処理によって行うことができる。回収した組換えタンパク質等を、常法に従って、マウス、ラット、およびウサギなどの動物に免疫し、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を作製することができる。
【００３２】
2）発現されたタンパク質量の定量
次いで、上記d）で得られたタンパク質抽出液において、バニロイド受容体ファミリータンパク質に特異的な抗体を使用して、該タンパク質の発現量を検出する。たとえば、ELISA法またはイムノブロット法などの当業者に既知のいずれの方法によって検出することもできるが、これらに限定されない。たとえば、イムノブロット法では、上記d）で得られたタンパク質抽出液をSDS-PAGEで分離し、これらをPVDF膜などに転写して、対応するタンパク質に特異的な抗体、たとえば、上記1）のように作製した抗体を使用して検出し、さらにデンシトメトリーなどによって定量することができる。
【００３３】
タンパク質およびポリペプチドの検出には、上記1）で得られた抗体などのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を配置した装置を使用することによって容易に検出および定量することができる。このような装置としては、上記抗体類のみが固定されたマイクロアレイ型デバイス、または抗体類のみならず免疫細胞も含むμTAS型デバイスを具備する装置が想定される。
【００３４】
続いて、被検物質を添加した免疫細胞と被検物質を添加していない免疫細胞におけるバニロイド受容体ファミリーのタンパク質の量を比較する。被験物質を添加した免疫細胞から得られたタンパク質の発現量が、被験物質を添加していない細胞から得られたタンパク質の発現量よりも多かった場合は、被検物質によってタンパク質の翻訳が促進されていることが考えられ、従って該被験物質は、免疫系に影響を及ぼす物質であると判定される。
【００３５】
さらに、本発明のもう1つの態様において、上記方法を実施するためのキットが提供される。
【００３６】
本キットは、上記バニロイド受容体ファミリーのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを検出するためのプローブを含むことを特徴とする。また、該プローブは、プローブのみを含むマイクロアレイ型デバイス、またはプローブのみならず免疫細胞も含むμTAS型デバイスとして提供されてもよい。さらに、キットには、バニロイド受容体ファミリーのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーおよび適切なバッファーなどが含まれていてもよい。
【００３７】
本発明のキットを使用すれば、上記被検物質の免疫系に及ぼす影響を検出する方法を容易に実施することが可能となる。
【実施例１】
【００３８】
＜ダイオキシンの免疫影響の検出＞
（1）Jurkat T細胞の培養
Jurkat T細胞は、10％牛胎児血清(FCS)を含むRPMI 1640にて、通常の培養操作によって培養をおこなった。継代は2日ごとに行い、5％CO2雰囲気下において37℃で培養を行った
（2）ダイオキシン暴露
Jurkat T細胞を遠心にて回収し懸濁後、5x105細胞相当分を1.5mlの10％ FCS-RPMI 1640培地に希釈した。1.5mlの10％ FCS-RPMI 1640培地に、DMSOに溶解した2,3,7,8−TCDDを20nMの最終濃度になるように添加し、激しくボルテックスで攪拌する。この溶液をJurkatT細胞の希釈液とあわせて軽く混合し、全量を6穴マイクロタイタープレートにまいた。対象試料として、2,3,7,8−TCDDを含まないDMSOのみを添加して、同様の操作をおこなった。
【００３９】
（3）RNAの抽出
（2）にてダイオキシンを暴露した細胞を24時間培養したのち、1800rpmの遠心にて回収して、それぞれの細胞からRNAを抽出した。RNAの抽出には、RN easy（QIAGEN社製）をもちいて行った。すなわち、回収した細胞全量にメルカプトエタノールを含むRLT液350μｌを加え、激しくボルテックスを掛けた。その後、18ゲージのニードルを5回通過させることによって、ホモジナイズした。ホモジネートに350μｌの70％エタノールを加え、全量をRN easy mini columnに移した。10000rpmで15秒遠心後、ろ過液を除去し、700μｌのRW１液でカラムの洗浄を行った。続いて500μlのRPE液で2度洗浄を行った。洗浄液を遠心にて完全に除去した後、40μｌのRN aseフリー水で10000rpmの遠心によって溶出した。この溶出液をRNA溶液とした。
【００４０】
（4）TRPV2の検出
RT-PCR法を使用して、（3）で得られたRNAに対して、TRPV2  RNAの検出をおこなった。まず、（3）で得られたRNAに対して、Super scriptII（Invitrogen社製）を使用して逆転写反応を行った。すなわち、以下のように試薬を調製し、65℃において5分間の加熱変性後、氷上に1分間放置した
【表１】
2005270069.tif 000003
【００４１】
さらに、以下の試薬を混合し、25℃で2分間インキュベートした。
【表２】
2005270069.tif 000004
【００４２】
さらに、逆転写酵素（Super script II）を1μl（50 unit）添加して、以下のプログラムで反応を行った。
【表３】
2005270069.tif 000005
【００４３】
この溶液をcDNA溶液とし、以下のPCR反応に用いた。
【００４４】
PCR反応は、EX-Taq（宝酒造製）を使用して行った。すなわち、以下のように試薬を調製し、サーマルサイクラーでPCR反応を行った。
【表４】
2005270069.tif 000006
【００４５】
プライマーには、以下の配列のものを用いた。
【表５】
2005270069.tif 000007
【００４６】
アニール温度は、49℃で行った。
【００４７】
PCR産物を3.0％  Nuseive3:1アガロース/TBE電気泳動によって分離し、バイオラッド社製のフルオロイメージャーによって検出した。その結果、図1のような結果が得られた。図中、y軸は任意単位を示し、x軸は添加した被検物質を示す。この結果は、ダイオキシンの影響を検出することを示す。
【実施例２】
【００４８】
＜ダイオキシンの免疫影響の検出2＞
(1)Jurkat T細胞の培養
Jurkat T細胞は、10％牛胎児血清を含むRPMI1640にて、通常の培養操作によって培養をおこなった。継代は2日ごとに行い、5％CO2雰囲気下において37℃で培養を行った。
【００４９】
(2)ダイオキシン暴露
Jurkat T細胞を遠心にて回収し懸濁後、5x105細胞相当分を1.5mlの10％ FCS-RPMI 1640培地に希釈した。1.5mlの10％FCS-RPMI 1640培地に、DMSOに溶解した2,3,7,8−TCDDを20nMの最終濃度になるように添加し、激しくボルテックスで攪拌した。この溶液をJurkat T細胞の希釈液とあわせて軽く混合し、全量を6穴マイクロタイタープレートにまいた。対象試料として、2,3,7,8−TCDDを含まないDMSOのみを添加して、同様の操作をおこなった。
【００５０】
（3）RNAの抽出
（2）にてダイオキシンを暴露した細胞を24時間培養したのち、1800rpmの遠心にて回収して、それぞれの細胞からRNAを抽出した。RNAの抽出には、RN easy（QIAGEN社製）をもちいて行った。すなわち、回収した細胞全量にメルカプトエタノールを含むRLT液350μｌを加え、激しくボルテックスを掛けた。その後、18ゲージのニードルを5回通過させることによって、ホモジナイズした。ホモジネートに350μｌの70％エタノールを加え、全量をRN easy mini columnに移した。10000rpmで15秒遠心後、ろ過液を除去し、700μｌのRW１液でカラムの洗浄を行った。続いて500μlのRPE液で2度洗浄を行った。洗浄液を遠心にて完全に除去した後、40μｌのRN aseフリー水で10000rpmの遠心によって溶出した。この溶出液をRNA溶液とした。
【００５１】
(4)VR-1の検出
RT-PCR法を使用して、（3）で得られたRNAに対して、VR-1  RNAの検出をおこなった。まず、（3）で得られたRNAに対して、Super scriptII（Invitrogen社製）を使用して逆転写反応を行った。すなわち、以下のように試薬を調製し、65℃において5分間の加熱変性後、氷上に1分間放置した
【表６】
2005270069.tif 000008
【００５２】
さらに、以下の試薬を混合し、25℃で2分間インキュベートした。
【表７】
2005270069.tif 000009
【００５３】
さらに、逆転写酵素（Super script II）を1μl（50 unit）添加して、以下のプログラムで反応を行った。
【表８】
2005270069.tif 000010
【００５４】
この溶液をcDNA溶液とし、以下のPCR反応に用いた。
【００５５】
PCR反応は、EX-Taq（宝酒造製）を使用して行った。すなわち、以下のように試薬を調製し、サーマルサイクラーでPCR反応を行った。
【表９】
2005270069.tif 000011
【００５６】
プライマーには、以下の配列のものを用いた。
【表１０】
2005270069.tif 000012
【００５７】
アニール温度は、49℃で行った。
【００５８】
PCR産物を3.0％  Nuseive3:1アガロース/TBE電気泳動によって分離し、バイオラッド社製のフルオロイメージャーによって検出した。その結果、図2のような結果が得られた。図は、それぞれ左：DMSO添加コントロール、右：2 0nM TCDD添加試料を示す。図中、y軸は任意単位を示す。この結果は、ダイオキシンの影響を検出することを示す。
【実施例３】
【００５９】
＜ダイオキシン異性体の免疫影響の検出＞
(1)Jurkat T細胞の培養
Jurkat T細胞は、10％牛胎児血清を含むRPMI 1640にて、通常の培養操作によって培養をおこなった。継代は2日ごとに行い、5％CO2雰囲気下において37℃で培養を行った
(2)ダイオキシン暴露
Jurkat T細胞を遠心にて回収し懸濁後、5x105細胞相当分を1.5mlの10％FCS-RPMI1640培地に希釈した。1.5mlの10％ FCS-RPMI 1640培地に、DMSOに溶解した1-MCDD、2,3,7,8−TCDD、12378-PeCDDを20nMの最終濃度になるように添加し、激しくボルテックスで攪拌した。この溶液をJurkat細胞の希釈液とあわせて軽く混合し、全量を6穴マイクロタイタープレートにまいた。対象試料として、2,3,7,8−TCDDを含まないDMSOのみを添加して、同様の操作をおこなった。
【００６０】
（3）RNAの抽出
（2）にてダイオキシンを暴露した細胞を24時間培養したのち、1800rpmの遠心にて回収して、それぞれの細胞からRNAを抽出した。RNAの抽出には、RN easy（QIAGEN社製）をもちいて行った。すなわち、回収した細胞全量にメルカプトエタノールを含むRLT液350μｌを加え、激しくボルテックスを掛けた。その後、18ゲージのニードルを5回通過させることによって、ホモジナイズした。ホモジネートに350μｌの70％エタノールを加え、全量をRN easy mini columnに移した。10000rpmで15秒遠心後、ろ過液を除去し、700μｌのRW１液でカラムの洗浄を行った。続いて500μlのRPE液で2度洗浄を行った。洗浄液を遠心にて完全に除去した後、40μｌのRN aseフリー水で10000rpmの遠心によって溶出した。この溶出液をRNA溶液とした。
【００６１】
（4）TRPV2の検出
RT-PCR法を使用して、（3）で得られたRNAに対して、TRPV2  RNAの検出をおこなった。まず、（3）で得られたRNAに対して、Super scriptII（Invitrogen社製）を使用して逆転写反応を行った。すなわち、以下のように試薬を調製し、65℃において5分間の加熱変性後、氷上に1分間放置した
【表１１】
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【００６２】
さらに、以下の試薬を混合し、25℃で2分間インキュベートした。
【表１２】
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【００６３】
さらに、逆転写酵素（Super script II）を1μl（50 unit）添加して、以下のプログラムで反応を行った。
【表１３】
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【００６４】
この溶液をcDNA溶液とし、以下のPCR反応に用いた。
【００６５】
PCR反応は、EX-Taq（宝酒造製）を使用して行った。すなわち、以下のように試薬を調製し、サーマルサイクラーでPCR反応を行った。
【表１４】
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【００６６】
プライマーには、以下の配列のものを用いた。
【表１５】
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【００６７】
アニール温度は、49℃で行った。
【００６８】
PCR産物を3.0％  Nuseive3:1アガロース/TBE電気泳動によって分離し、バイオラッド社製のフルオロイメージャーによって検出した。その結果、図3のような結果が得られた。図中、y軸は任意単位を示し、x軸は添加した被検物質を示す。この結果は、ダイオキシンの影響を検出することを示す。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明の一態様に係る方法を使用して、ダイオキシンを検出した結果を示すグラフ。
【図２】本発明の一態様に係る方法を使用して、ダイオキシンを検出した結果を示すグラフ。
【図３】本発明の一態様に係る方法を使用して、ダイオキシン異性体を検出した結果を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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