(57)【要約】【課題】  本発明は、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰａｓｅ）、デンプン合成酵素（ＳＳ）、デンプン枝作り酵素（ＢＥ）、及びデンプン枝切り酵素（ＤＢＥ）からなるデンプン合成関連酵素における個々の酵素の機能を解析するための新規なスクリーニング系を提供する。また、本発明は、これらの酵素をコードする遺伝子が欠損したシアノバクテリア、及びこれらの酵素をコードする遺伝子で形質転換されたシアノバクテリアの変異株を提供するものである。【解決手段】  本発明は、シアノバクテリアにデンプン合成関連酵素をコードする遺伝子を導入して、当該遺伝子が導入されたシアノバクテリアが産生するデンプンの構造を解析することからなる、シアノバクテリアを宿主としたデンプン合成関連酵素の機能をスクリーニングする方法に関する。また、本発明は、前記した本発明の方法に使用するためのシアノバクテリアにデンプン合成関連酵素をコードする遺伝子を導入したシアノバクテリアの形質転換体に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアノバクテリアにデンプン合成関連酵素をコードする遺伝子を導入したシアノバクテリアの形質転換体。
【請求項２】
シアノバクテリアが、シネココッカス（Synechococcus）属のシアノバクテリアである請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
シアノバクテリアが、シネココッカスＰＣＣ７９４２（Synechococcus sp. PCC 7942）株である請求項１又は２に記載の形質転換体。
【請求項４】
シアノバクテリアが、内在性の枝作り酵素（ＢＥ）又は枝切り酵素（ＤＢＥ）をコードする遺伝子の欠損株である請求項１〜３のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項５】
デンプン合成関連酵素をコードする遺伝子が、デンプンの枝作り酵素（ＢＥ）又は枝切り酵素（ＤＢＥ）をコードする遺伝子である請求項１〜４のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項６】
デンプン合成関連酵素をコードする遺伝子が、高等植物由来のデンプン合成関連酵素をコードする遺伝子である請求項１〜５のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項７】
デンプン合成関連酵素をコードする遺伝子が、イネ由来のものである請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
枝作り酵素をコードする遺伝子が、イネ由来のＢＥIIｂをコードする遺伝子である請求項６又は７に記載の形質転換体。
【請求項９】
枝切り酵素をコードする遺伝子が、イネ由来のイソアミラーゼをコードする遺伝子である請求項６又は７に記載の形質転換体。
【請求項１０】
デンプン合成関連酵素をコードする遺伝子が、宿主となるシアノバクテリアとは異なる属のシアノバクテリア由来のデンプン合成関連酵素をコードする遺伝子である請求項１〜５のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項１１】
デンプン合成関連酵素をコードする遺伝子が、シアノバクテリアのシネコシスティス（Synechocystis）属由来のイソアミラーゼである請求項１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
シアノバクテリアにデンプン合成関連酵素をコードする遺伝子を導入して、当該遺伝子が導入されたシアノバクテリアが産生するデンプンの構造を解析することからなる、シアノバクテリアを宿主としたデンプン合成関連酵素の機能をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
シアノバクテリアが、導入されるデンプン合成関連酵素をコードする遺伝子に対応する内在性の遺伝子を欠損されたものである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
デンプン合成関連酵素をコードする遺伝子が、デンプンの枝作り酵素（ＢＥ）又は枝切り酵素（ＤＢＥ）をコードする遺伝子である請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
デンプン合成関連酵素をコードする遺伝子が、高等植物由来のデンプン合成関連酵素をコードする遺伝子である請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物のデンプンの合成に関連している酵素の機能を解析するための新規なスクリーニング系を提供をするものである。即ち、本発明は、シアノバクテリアにデンプン合成関連酵素をコードする遺伝子を導入したシアノバクテリアの形質転換体、及びこれを用いたデンプン合成関連酵素の機能をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
デンプンは植物のエネルギー貯蔵物質であり、α−ポリグルコースからなる多糖類の１種で、アミロースとアミロペクチンからなっている。グリコーゲンもデンプンと同様にα−ポリグルコースからなる多糖類であるが、これは主として動物のエネルギー貯蔵物質として利用されている。
デンプンは穀物の主成分として食品や飼料として使用されるだけでなく、デキストリン、オリゴ糖、異性化糖などに加工されて加工食品などにも利用され、また、糊や添加剤などとして工業製品やその原材料としても利用されている。
【０００３】
デンプンと一言でいっても、稲のデンプン、じゃがいものデンプン、小麦のデンプン、とうもろこしのデンプンなど、その由来によりデンプンの形、味、糊化したときの物性などが微妙に異なり、我々はその用途に応じて各種の植物由来のデンプンを使い分けてきている。このようなデンプンの性質の違いはデンプンの化学構造による違いから来ていると説明されてきている。
デンプンは主としてアミロースとアミロペクチンからできているものであり、その化学構造の相違は主として枝分かれ構造を有するアミロペクチンに由来するところが大きいとされている。
デンプン(Starch)は高等植物の貯蔵器官に蓄積するα‐ポリグルカンである。その貯蔵組織中でデンプン粒は「アミロプラスト」と呼ばれるプラスチドの中に含まれている。デンプンは２種類のグルコース・ホモポリマー、アミロペクチン（Amylopectin）とアミロース（Amylose）の混合物である。アミロースは、貯蔵デンプン中の２０〜３０％を占めているが、デンプン粒の形成には必須ではない。グルコース・ユニットがα−１，４グルコシド結合で繋がっており、少量のα‐１，６グルコシド結合の枝を含む線状のらせん状の分子である。一方、アミロペクチンはデンプン粒中の７０‐８０％を占め、グルコース・ユニットがα‐１，４グルコシド結合で伸び、主鎖と平行にα‐１，６グルコシド結合で枝が繋がった構造をとっている。特徴的なこの構造は”クラスター”構造と呼ばれている。
動物やバクテリアの貯蔵炭素源であるグリコーゲン(Glycogen)もアミロペクチンと同じくグルコース・ホモポリマーで構成されているが、クラスター構造は持っていない。グリコーゲンは”tree like”や”bush like”構造を持つと報告されている。
【０００４】
図１にアミロース、アミロペクチン、及びグリコーゲンの構造を示す。図１に示される線はα−グルコースの連鎖であり、アミロース（図１の（Ｃ））は枝分かれがほとんど無くα−１，４−グルコースのほぼ１本鎖の構造をしている。アミロペクチン（図１の（Ｂ））は規則正しい枝分かれ構造を有し、α−１，４−グルコースの連鎖とα−１，６−グルコースの枝分かれ構造（クラスター）を一定の間隔で規則正しく有している。また、動物などのエネルギー貯蔵物質であるグリコーゲン（図１の（Ａ））は、全く不規則な枝分かれ構造からなるものである。グリコーゲンはアミロペクチンに比べて分子も小さく、枝も短く、その多くは水溶性の物質である。これに対してアミロペクチンは、枝も長く、かつグルコースが高密度で充填されており、一般に水不溶性の物質である。
【０００５】
このようなアミロペクチンのクラスター構造は、結晶構造を造る際に有利であり、結晶構造によるデンプン粒が形成される。アミロペクチンのクラスター構造は、ほぼ９ｎｍの規則正しい繰り返し構造であり、この９ｎｍのサイズは組織や種が異なっても余りばらつきが見られない。
アミロペクチンの構造をさらに詳細に見てゆくと、３タイプのα‐１，４−グルコシド鎖を持っている（図２参照）。Ａ鎖は最も外側の鎖で鎖の中に分岐結合を持たない鎖である。Ｂ鎖は一つの鎖あたり１つ以上の鎖が分岐結合している鎖であり、Ｂ鎖はさらに、１つのクラスターにとどまるＢ１鎖、２つのクラスターに及んでいるＢ２鎖、３つのクラスターに及ぶＢ３鎖などがある。Ｃ鎖は還元末端を持っている鎖であり、アミロペクチン１分子あたり１つのＣ鎖を持っている。
【０００６】
このように、アミロペクチンの構造はほぼ一定ではあるが、植物の種類によりアミロペクチンの構造も微妙に異なってきている。最近の研究によれば、ねっとりとしたデンプンを有するジャポニカの稲と、パサパサとしたデンプンを有するインディカの稲のアミロペクチンの構造上の相違が報告されている。図３の上段（図３の（ａ））はジャポニカ米のアミロペクチン、図３の下段（図３の（ｂ））はインディカ米のアミロペクチンの構造を模式的に示したものである。クラスターの枝の長さを比べるとインディカ米の方が比較的長く、その密度も比較的密になっている。このためにインディカ米のデンプンの方が糊化が難しくなっていると考えられている。
このようなアミロペクチンの微細な構造上の相違は、アミロペクチンを合成する際の合成方法の相違により生起してくると考えられている。
【０００７】
アミロペクチンは次の４種類の酵素の連続反応で合成されると考えられている。
（１）ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ADPglucose pyrophosphorylase                                                              （ＡＧＰａｓｅ））、
（２）デンプン合成酵素（Starch synthase（ＳＳ））、
（３）デンプン枝作り酵素（Starch  branching enzyme（ＢＥ））、
（４）デンプン枝切り酵素（Starch debranching enzyme（ＤＢＥ））
である。
【０００８】
ＡＧＰａｓｅは、デンプン・ポリマーの原材料であるＡＤＰグルコースを合成する酵素である。ＳＳは、アミロペクチンの非還元末端にＡＤＰグルコースをα‐１，４グルコシド結合で繋ぎ、鎖を伸ばす役割をする。ＳＳがアミロペクチンの鎖を伸ばすのに対し、ＢＥは、アミロペクチンのα‐１，６グルコシド結合を形成する酵素であり、枝分かれ構造の枝分かれ部分を形成させる酵素である。
従来、ＳＳとＢＥがアミロペクチンの枝の頻度を決め、クラスター構造を形成するのに重要な役割を果たしているのではないかと考えられてきた。即ち、前記（４）のデンプン枝切り酵素（ＤＢＥ）はクラスターの形成に必要ない酵素であると考えられていた。しかし、この分解酵素が欠損した植物ではアミロペクチンのクラスターを形成することができないことが明らかにされ、ＤＢＥがクラスター構造の形成に不可欠であることを示すことが報告されている（非特許文献１〜３参照）。
【０００９】
ＤＢＥについてのこれらの報告から、アミロペクチンにおけるクラスター構造の形成は、ＳＳとＢＥによる新たな結合の形成だけなく、ＢＥにより余分に形成された枝分かれを、ＤＢＥにより分解してクラスター構造が規則正しく維持されることが分かってきた。
α‐１，６グルコシド結合の枝を分解するＤＢＥは、基質の違いから２種類のものが知られている。そのひとつはイソアミラーゼ（Isoamylase）であり、他のひとつがプルラナーゼ（Pullulanase(また、R-enzymeやlimit dextrinaseと呼ばれることもある)）である。これらの２種類のＤＢＥのうちイソアミラーゼは、グリコーゲンやグリコーゲンよりもやや規則性をもつフィトグリコーゲン（phytoglycogen）のα‐１，６グルコシド結合の枝を分解することが出来るが、プルラン（pullulan）には作用しない。一方、プルラナーゼはプルランには作用するが、グリコーゲンやフィトグリコーゲンには作用しない。
【００１０】
図４にアミロース、アミロペクチン、及びグリコーゲンの合成過程をまとめた。図４の左側のグリコーゲンの合成は主として動物や細菌類の場合であり、ＵＧＰａｓｅはグリコーゲンの材料となるリン酸化グルコースの合成酵素であり、ＧＳはグリコーゲン合成酵素であり、ＧＢＥはグリコーゲン枝作り酵素である。
図４の中側は、高等植物の場合のアミロペクチンの合成過程を示すものであり、図中のＳＳＳは水溶性ＳＳのことである。図４の右側は高等植物におけるアミロースの合成過程を示すものであり、ＧＢＳＳは粒結合デンプン合成酵素Ｉ（granule‐bound starch synthaseＩ（ＧＢＳＳＩ））のことである。
このように、高等植物においては、前記した４種類の酵素群（デンプン合成関連酵素）により植物の種類に応じたアミロペクチンを産生している。そして、植物の種類によるアミロペクチンの構造の相違は、これらの酵素の種類の違いによるところが大きいと考えられる。例えば、クラスター構造を形成させるのに重要な存在であるイソアミラーゼは植物の種類により微妙に異なっているものと推測される。
【００１１】
一方、遺伝子操作手法は、既存のデンプンにはない特徴を持つ新素材を作出できる可能性を持っている。デンプン合成に関連する酵素の形質転換体を用いた研究が多くのグループで進められている。形質転換技術によるデンプン形質の改変は主にジャガイモで試みられており、サフォードら（Safford, et al.,）（1998）はジャガイモのＢＥ（イネＢＥＩに対応）をアンチセンスに導入することにより糊化特性の異なるデンプンを蓄積するジャガイモを作出し、ジョブリングら（Jobling, et al.,）（1999）はＢＥ  Ａ（イネのＢＥＩＩに対応）のアンチセンス形質転換体を作成し、側鎖長の長くなったアミロペクチンが蓄積することを明らかにした。また、エドワードら（Edwards, et al.,）（1999）はＳＳＩＩ、ＳＳＩＩＩ、ＳＳＩＩとＳＳＩＩＩのキメラアンチセンスＲＮＡを導入し、デンプン合成活性の低下した形質転換体を作成した。デンプン粒のサイズは小さくなり、側鎖長分布には大きな変化が見られた。また、本発明者らは、イソアミラーゼの機能ついて解析を行ってきた（特許文献１参照）。
【００１２】
このように、植物のデンプン合成は、デンプン合成酵素、枝作り酵素（ＢＥ）、枝切り酵素のそれぞれ複数のアイソザイムが関与する複雑なシステムであり、これらの酵素の関わりにより、植物毎に味や物性が微妙に異なるデンプンが産生されていると考えられているが、これらの個々の酵素が植物によりどのように相違しており、またこれらの個々の酵素がデンプンの微細構造にどのように関わっているのかということは未だ解明されていない。これらの個々の酵素の機能を解明することができれば、希望する味や物性を有するデンプンを自由に産生できることになる。
したがって、これらの個々の酵素のデンプンの産生における機能の解明が望まれているが、高等植物におけるデンプン合成の過程は極めて複雑であり、かつ高等植物を用いた実験では、植物の生育に時間がかかり個々の酵素の機能を解明することは極めて困難であった。しかしながら、デンプンの合成は高等植物における植物細胞内の色素体（葉では葉緑体、貯蔵組織ではアミロプラスト）において合成されるために、高等植物での実験が必要とされていた。
【００１３】
【特許文献１】特開２００３−７９３６７号
【非特許文献１】M.G.James, et al., Plant Physiol., (1995) 7, 417-429;
【非特許文献２】Y.Nakamura, et al., Plant J., (1997) 12(1), 143-153;
【非特許文献３】A.Kubo, et al., Plant Phys., (1999) 121, 399-409
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰａｓｅ）、デンプン合成酵素（ＳＳ）、デンプン枝作り酵素（ＢＥ）、及びデンプン枝切り酵素（ＤＢＥ）からなるデンプン合成関連酵素における個々の酵素の機能を解析するための新規なスクリーニング系を提供する。また、本発明は、これらの酵素をコードする遺伝子が欠損したシアノバクテリア、及びこれらの酵素をコードする遺伝子で形質転換されたシアノバクテリアの変異株を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
デンプンの合成は高等植物における植物細胞内の色素体（葉では葉緑体、貯蔵組織ではアミロプラスト）において合成される。現在の地球上の植物の色素体は、植物の進化の歴史において、シアノバクテリアの祖先が細胞内共生を起こすことにより成立したと考えられている。即ち、シアノバクテリアとの共生により、色素体が形成され、デンプンの合成が始まったと考えられている。このことから、シアノバクテリアは最も原始的なデンプン合成機構を有している生物であると考えられている。
本発明者らは、より簡素なポリグルカン代謝系を持つシアノバクテリアを宿主とした遺伝子発現系によりデンプン合成の再構成を検討した。このために、シアノバクテリア Synechococcus sp. PCC 7942 株の変異株を作成し、イネ・デンプンの特異的な構造の形成に関与するデンプン枝作り酵素（ＢＥＩＩｂ）およびイソアミラーゼ（ＩＳＡ１）の遺伝子、並びに異種シアノバクテリアである Synechocystis sp. PCC 6803 株の２つのイソアミラーゼ遺伝子を、シアノバクテリア シネココッカスＰＣＣ７９４２（Synechococcus sp. PCC 7942）株において発現させる系を構築した。そして、これらの酵素の遺伝子発現の効果を解析したところ、シアノバクテリアにおいても、これらの酵素の機能により産生されるデンプンのクラスター構造における糖鎖の鎖長の分布が大きく変化することを見出した。
【００１６】
即ち、本発明は、シアノバクテリアにデンプン合成関連酵素をコードする遺伝子を導入して、当該遺伝子が導入されたシアノバクテリアが産生するデンプンの構造を解析することからなる、シアノバクテリアを宿主としたデンプン合成関連酵素の機能をスクリーニングする方法に関する。
また、本発明は、前記した本発明の方法に使用するためのシアノバクテリアにデンプン合成関連酵素をコードする遺伝子を導入したシアノバクテリアの形質転換体に関する。
【００１７】
本発明におけるシアノバクテリアとしては、デンプン又はデンプン様のグリコーゲンを産生できるものであればよく、好ましいシアノバクテリアとしては、シネココッカス（Synechococcus）属のシアノバクテリアが挙げられる。このようなシアノバクテリアとしては、例えば、シネココッカスＰＣＣ７９４２（Synechococcus sp. PCC 7942）株が挙げられる。本発明において宿主として使用されるシアノバクテリアは野生型のものをそのまま使用することもできるが、シアノバクテリアが導入しようとしているデンプン合成関連酵素をコードする遺伝子に対応する遺伝子を内在性の遺伝子として有している場合には、当該遺伝子を欠損させておくことが好ましい。例えば、デンプン合成関連酵素をコードする遺伝子として枝作り酵素（ＢＥ）を導入しようとする場合には、宿主のシアノバクテリアにおける枝作り酵素（ＢＥ）をコードしている遺伝子を欠損させた変異株を使用するのが、外来遺伝子の導入による機能相補の効果を検討するためにも好ましい。このような遺伝子の欠損株を得る方法としては、ジーンターゲッティング法などの公知の手法を用いることができる。
本発明におけるデンプン合成関連酵素としては、高等植物におけるデンプンの産生に関連している酵素であれば特に制限はないが、例えば、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰａｓｅ）、デンプン合成酵素（ＳＳ）、デンプン枝作り酵素（ＢＥ）、及びデンプン枝切り酵素（ＤＢＥ）からなる群から選ばれる酵素が挙げられる。好ましいデンプン合成関連酵素としては、例えば、デンプンの枝作り酵素（ＢＥ）若しくは枝切り酵素（ＤＢＥ）、又はこれらのサブタイプの酵素が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの酵素は、宿主として使用されるシアノバクテリアの内在性のものでなければ特に制限はないが、好ましい酵素としては、イネ、ムギ、トウモロコシ、ジャガイモなどの高等植物由来の酵素が挙げられる。より具体的には、例えば、イネのＢＥIIｂ、ＳＳIIａ、イソアミラーゼ、また、コムギのイソアミラーゼなどが挙げられる。また、宿主となるシアノバクテリアとは異なる属のシアノバクテリア由来のデンプン合成関連酵素をコードする遺伝子、例えば、シネコシスティス（Synechocystis）属由来のイソアミラーゼをコードする遺伝子であってもよい。
また、導入される遺伝子は１種であってもよいし、２種以上を同じ株に導入してもよい。例えば、イネのデンプン合成酵素（ＳＳ）の１種と、コムギのデンプン枝切り酵素（ＤＢＥ）の１種の２種の外来遺伝子を同時に導入することもできるが、通常は個々の酵素の機能を解析できるようにするために、１種の外来遺伝子を導入ことが好ましい。
【００１８】
本発明のデンプン合成関連酵素をコードする遺伝子としては、前記してきたデンプン合成関連酵素をコードするものであって、当該酵素の機能を損なわない範囲であれば必ずしも全長をコードする遺伝子でなくてもよい。また、適当な部分長の遺伝子を用いて、当該酵素の活性の有無を検討することにより、活性発現に必須の部分を本発明の方法により解析することも可能である。
遺伝子の発現用のプロモーターとしては、シアノバクテリアにおいて発現可能なものであれば特に制限はなく、シアノバクテリアのプロモーター領域を使用してもよいし、シアノバクテリアで発現可能であれば外来遺伝子のものをそのまま使用してもよいし、ｌａｃプロモーターのようなものを使用してもよい。
宿主のシアノバクテリアへの遺伝子の導入方法としては、プラスミドベクターを使用する方法、ウイルスを使用する方法、パーティクルガンによる方法などの公知の各種の手法を使用することができる。
このようにして外来遺伝子が導入されたシアノバクテリアは、抗生物質による培地を用いた公知の手法により選別することができる。そして、外来遺伝子が導入されたことや、シアノバクテリアにおいて発現していることを、ネイティブＰＡＧＥや各種のブロッティング法などの公知の手法により確認することができる。
【００１９】
本発明のスクリーニング法は、前記した外来のデンプン合成関連酵素をコードする遺伝子が導入されたシアノバクテリアを用いて、当該形質転換体が産生するデンプンの構造を解析することからなるものである。この方法におけるデンプンの構造の解析には、デンプンを産生するか否かということも包含されており、必ずしもデンプンを産生することができる遺伝子を導入しなければならないということに限定されるものではない。導入された遺伝子によってデンプンを産生することができない場合には、外来遺伝子がコードする酵素には目的の活性が無かったということになる。
また、本発明のスクリーニング法におけるデンプンの構造を解析する手法としては、特に制限はないが、シアノバクテリア形質転換株からアルコール抽出した多糖についてα−１，６−結合切断後、キャピラリー電気泳動法により分画を行って、クラスター中の糖鎖の重合度（糖の数）を測定する方法が好ましい。測定された重合度は、同じ重合度の糖鎖を有するものをそれぞれ定量し、糖鎖の全量に対する各重合度を有する糖鎖の比率（％）を計算して糖鎖の重合度の分布を示すグラフにする手法（図７〜図１０参照）が好ましい。
これにより、当該デンプンを形成しているクラスター中の糖鎖の重合度の分布がわかり、デンプンの構造的な特徴を把握することができる。
【００２０】
次に、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例示に限定されるものではない。
本発明者らは、各種の枝作り酵素（ＢＥ）及び枝切り酵素（ＩＳＡ）の遺伝子を調製し、この遺伝子を用いてシアノバクテリア シネココッカスＰＣＣ７９４２（Synechococcus sp. PCC 7942）株を形質転換して、これらの遺伝子がコードする酵素の機能を解析した。
まず、核酵素の遺伝子の調製法について、具体例により説明するが、これらの実験例は本発明の例示であり、本発明は、これらの実験例に限定されるものではない。
【００２１】
（１）イネ デンプン枝作り酵素（ＢＥＩＩｂ）遺伝子発現のためのプラスミドの構築
イネのＢＥＩＩｂ ｃＤＮＡ （Mizuno et al. 1992）を含むプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、遺伝子を改変した。ＰＣＲプライマーとして以下の配列のものを用いた。
フォワードプライマー  783B：  5’- aaggaggccg tgatggcggc gggcgcgtca -3’
リバースプライマー  782B：    5’- ttcacagatt gctggcaact -3’
なお、ここで、フォワードプライマーとは、遺伝子の前端に、リバースプライマーとは遺伝子の後端にそれぞれ対合するものを指す。
フォワードプライマーは成熟タンパク質Ｎ末端の直前に開始コドン（３’側に示される下線部分）を付加し、更にその前にリボソーム結合配列（５’側に示される下線部分）が付加されるよう設計した。すなわち、イネにおいて、このタンパク質の遺伝子は細胞核にコードされ、細胞質で翻訳を受けた後、色素体内に輸送されて、その際、Ｎ末端のトランジットペプチドと呼ばれる領域が切断され、成熟型酵素に変換する。これに対し、本発明の実験において使用される遺伝子発現宿主であるシアノバクテリアは原核生物なので、オルガネラへの輸送過程を持たず、トランジットペプチドは不要である。そこで成熟型酵素部分のみが発現するよう、その直前に開始コドンを付加した。更に、シアノバクテリアでは翻訳開始のためにコード領域上流のリボソーム結合配列が必要となるため、これもＰＣＲプライマー中に組み入れた。
【００２２】
リバースプライマーは、終止コドンの下流６２−８１残基に対合する相補配列とした。
ＰＣＲ によって得られた増幅 ＤＮＡ 断片を、プラスミドベクター pGEM-T Easy (Promega) に連結し、これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、組換えプラスミドを得た。増幅されたＤＮＡに見出されたＰＣＲに起因する塩基置換は、鋳型ＤＮＡ由来の制限酵素処理断片と組換えることにより修復した。最終的に挿入断片全長の配列を決定することにより、変異が修復されたことを確認した。
なお、遺伝子増幅に用いた鋳型ＤＮＡは、Mizuno et al. (1992) が報告した配列と比較して１８４８残基目がＴ（チミン）でなくＣ（シトシン）であり、この変異は本研究で作成した遺伝子にも受け継がれた。ただし、翻訳アミノ酸配列は、両者で同じであったので（GGT → Gly、GGC → Gly）酵素機能に影響が生ずることはないと考えられた。
プラスミドベクター pGEM-T Easy に連結したことにより、遺伝子配列の両端に EcoRI 認識部位が導入された。これを利用して、組換えプラスミドから遺伝子を切り出し、シャトルプラスミド pECAN8 (Lau and Straus (1985)) の EcoRI 部位にクローン化した。このシャトルプラスミドには Synechococcus における複製開始に必要な配列が存在するので、シアノバクテリア細胞中で遺伝子を自律増殖させることができる。遺伝子をプラスミドに連結する際に、プラスミド中のlacプロモーターと遺伝子が順方向に配置したクローンを選抜し、ＢＥＩＩｂ 遺伝子がlacプロモーターに依存して転写されるようにした。
ここで作成した遺伝子は以後「ＢＥＩＩｂ−３５４」と呼ぶことにした。
【００２３】
（２）イネ イソアミラーゼ（ＩＳＡ１）遺伝子発現のためのプラスミドの構築
ＩＳＡ１ ｃＤＮＡ （Fujita et al. 1999）を含むプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、遺伝子を改変した。ＰＣＲ は以下に配列を示すプライマーを用いて２通り行った。
フォワードプライマー 1  741B：  5’- aaggaggtag gatgtcggtg gcctcggc -3’
リバースプライマー  743B：      5’- caaaattgaa ggaccgcaca act -3’
フォワードプライマー 2  742B：  5’- aggaggtggt gatgccggag aggta -3’
リバースプライマー  743B：      5’- caaaattgaa ggaccgcaca act -3’
フォワードプライマー１は、成熟タンパク質Ｎ末端の直前に開始コドン（３’側に示される下線部分）を付加し、更にその前にリボソーム結合配列（５’側に示される下線部分）が付加されるよう設計した。
一方、フォワードプライマー２は、成熟タンパク質中３０残基目のメチオニンコドン（３’側に示される下線部分）の前にリボソーム結合配列（５’側に示される下線部分）を付加し、この部分から翻訳が行われるように設計した。これは、ＩＳＡ１のＮ末端領域内にグルタミン酸に富む特異な配列が存在し、この部分を除去した場合の効果を検討する目的でデザインしたものである。
リバースプライマーは、終止コドンの下流７２−９４残基、ポリＡ付加部位の直前に対合する相補配列とし、２通りのＰＣＲにおいて共通のものを用いた。
ＰＣＲ によって得られた増幅ＤＮＡ断片を、プラスミドベクター pGEM-T Easy に連結し、これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、組換えプラスミドを得た。フォワードプライマー１を用いて得たクローンはいずれも遺伝子の後半部分を欠失したものだったので、フォワードプライマー２を用いて得たクローン由来の制限酵素処理断片と組換えることにより修復した。遺伝子の後半部分は両者において共通であるはずなので、この組換えにより目的の配列の遺伝子を得ることが出来た。最終的に挿入断片全長の配列を決定することにより、変異が修復されたことを確認した。
【００２４】
なお、増幅した遺伝子において、フォワードプライマー１を用いて得たクローンでは２１６７残基目、フォワードプライマー２を用いて得たクローンでは２０７７残基目にＣ（シトシン）の挿入が起こっており、フジタら（Fujita et al. (1999)）が報告した配列と異なっていた。この挿入は得られたＰＣＲ産物全てに共通に認められたことから、鋳型ＤＮＡに由来するものであると考えられた。この挿入変異により、翻訳アミノ酸配列にフレームシフトが生ずるが、他の植物種（トウモロコシ、ジャガイモ）における相同遺伝子との配列保存性は、むしろ高くなる（挿入塩基無しでは相同性は認められなかった）ことがわかった。
プラスミドベクター pGEM-T Easy に連結したことにより、遺伝子配列の両端にNotI認識部位が導入された。これを利用して、組換えプラスミドから遺伝子を切り出し、T4 ＤＮＡポリメラーゼにより末端を平滑化した後、シャトルプラスミド pECAN8 の SmaI 部位にクローン化した。遺伝子をプラスミドに連結する際に、プラスミド中の lac プロモーターと遺伝子が順方向に配置したクローンを選抜した。
フォワードプライマー１を用いて増幅した遺伝子由来のクローンを「ＩＳＡ１−１４４」、フォワードプライマー２を用いて増幅した遺伝子由来のクローンを「ＩＳＡ１−２４６」と呼ぶことにした。
【００２５】
（３）Synechocystis sp. PCC 6803 株のイソアミラーゼ（Slr0237）遺伝子発現のためのプラスミドの構築
Synechocystis sp. PCC 6803 株から調製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、イソアミラーゼ（Slr0237）遺伝子を増幅した。用いたＰＣＲプライマーは、カネコら（Kaneko et al.（1996））により公表された配列をもとに以下に示すように設計した。
フォワードプライマー  728B：  5’- ggaattgcct atgccacagt tga -3’
リバースプライマー  729B：    5’- atttgtttaa ttaatctcat ggt -3’
フォワードプライマーはコード領域上流の非翻訳配列１０残基および開始コドン（３’側に示される下線部分）からの１３残基を含むよう設計した。なお、開始コドンとした位置における本来の配列は gtg であったが、これを atg に改変した。
リバースプライマーは、終止コドンの下流４７−６９残基に対合する相補配列とした。
ＰＣＲ によって得られた増幅 ＤＮＡ 断片を、プラスミドベクター pGEM-T Easy に連結し、これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、組換えプラスミドを得た。挿入断片全長の配列を決定することにより、ＰＣＲでの増幅にともなう変異が無いことを確認した。
プラスミドベクター pGEM-T Easy に連結したことにより、遺伝子配列の両端に EcoRI 認識部位が導入された。これを利用して、組換えプラスミドから遺伝子を切り出し、シャトルプラスミド pECAN8 の EcoRI 部位にクローン化した。遺伝子をプラスミドに連結する際に、プラスミド中の lac プロモーターと遺伝子が順方向に配置したクローンを選抜した。
【００２６】
（４）Synechocystis sp. PCC 6803 株イソアミラーゼ（Slr1857）遺伝子発現のためのプラスミドの構築
Synechocystis sp. PCC 6803 株から調製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、イソアミラーゼ（Slr1857）遺伝子を増幅した。用いたＰＣＲプライマーは、カネコら（Kaneko et al.（1996））により公表された配列をもとに以下に示すように設計した。
フォワードプライマー  734B：  5’- gcaggacacc atggaacgca ta -3’
リバースプライマー  735B：    5’- gcgttattaa taatttccga tt -3’
フォワードプライマーはコード領域上流の非翻訳配列１０残基および開始コドン（３’側に示される下線部分）からの１２残基を含むよう設計した。
リバースプライマーは、終止コドンの下流７６−９７残基に対合する相補配列とした。
ＰＣＲによって得られた増幅ＤＮＡ断片を、プラスミドベクター pGEM-T Easy に連結し、これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、組換えプラスミドを得た。挿入断片全長の配列を決定することにより、ＰＣＲでの増幅にともなう変異が無いことを確認した。
プラスミドベクター pGEM-T Easy に連結したことにより、遺伝子配列の両端に EcoRI 認識部位が導入された。これを利用して、組換えプラスミドから遺伝子を切り出し、シャトルプラスミド pECAN8 の EcoRI 部位にクローン化した。遺伝子をプラスミドに連結する際に、プラスミド中の lac プロモーターと遺伝子が順方向に配置したクローンを選抜した。
【００２７】
以上の方法で調製された各遺伝子の塩基配列、及びそのアミノ酸配列を配列表のそれぞれ以下のとおり記載しておく。
配列番号１：  イネＢＥIIｂ−３５４の塩基配列。
配列番号２：  イネＢＥIIｂ−３５４のアミノ酸配列。
配列番号３：  イネイソアミラーゼ（ＩＳＡ１−１４４）の塩基配列。
配列番号４：  イネイソアミラーゼ（ＩＳＡ１−１４４）のアミノ酸配列。
配列番号５：  イネイソアミラーゼ（ＩＳＡ１−２４６）の塩基配列。
配列番号６：  イネイソアミラーゼ（ＩＳＡ１−２４６）のアミノ酸配列。
配列番号７：  Synechocystis sp. 6803株由来のイソアミラーゼ(slr0237)の塩基配列。
配列番号８：  Synechocystis sp. 6803株由来のイソアミラーゼ(slr0237)のアミノ酸配列。
配列番号９：  Synechocystis sp. 6803株由来のイソアミラーゼ(slr1857)の塩基配列。
配列番号１０：  Synechocystis sp. 6803株由来のイソアミラーゼ(slr1857)のアミノ酸配列。
【００２８】
以上のように、本発明者らは、デンプン合成に関わる枝作り酵素（ＢＥ）として、イネのＢＥＩＩｂを一部変性させた遺伝子としてＢＥＩＩｂ−３５４と命名した遺伝子、並びに枝切り酵素としてイネのイソアミラーゼの変性した遺伝子としてＩＳＡ−１及びＩＳＡ−２と命名した遺伝子、並びにシアノバクテリア  Synechocystis sp. PCC 6803 株から得られたslr0237およびslr1857と命名された２種のイソアミラーゼ遺伝子を調製し、これらを用いて、これらの酵素の機能解析を行った。
宿主としては、シアノバクテリア Synechococcus sp. PCC 7942 株の野生株（ＷＴ）、枝作り酵素（ＢＥ）欠損株（ΔＢＥ）、及びイソアミラーゼ（ＩＳＡ）欠損株（ΔＩＳＡ）を使用した。前記した遺伝子を用いて組換えプラスミドを構築し、これを用いてゴールドマンらの方法（Golden et al. (1987)）に準じSynechococcus 野生株および変異株の形質転換を行い、各種外来遺伝子をシアノバクテリア細胞内に導入した。アンピシリン耐性を指標として、外来遺伝子を含む形質転換株を選抜した。
【００２９】
本発明の実験に使用された形質転換株は次のとおりである。
（Ａ）野生株（ＷＴ）を宿主とする形質転換体。
１．ＢＥＩＩｂ−３５４を導入したもの（以下、ＷＴ＋ＢＥＩＩｂ−３５４）、
２．ＩＳＡ１−１４４を導入したもの（以下、ＷＴ＋ＩＳＡ１−１４４）、
３．ＩＳＡ１−２４６を導入したもの（以下、ＷＴ＋ＩＳＡ１−２４６）、
４．pECAN8（遺伝子を含まない対照）を導入したもの（以下、ＷＴ＋ベクター）、
（Ｂ）枝作り酵素（ＢＥ）欠損株（ΔＢＥ）を宿主とする形質転換体。
１．ＢＥＩＩｂ−３５４を導入したもの（以下、ΔＢＥ＋ＢＥＩＩｂ−３５４）、
２．pECAN8（遺伝子を含まない対照）を導入したもの（以下、ΔＢＥ＋ベクター）、
（Ｃ）イソアミラーゼ（ＩＳＡ）欠損株（ΔＩＳＡ）を宿主とする形質転換体。
１．ＩＳＡ１−１４４を導入したもの（以下、ΔＩＳＡ＋ＩＳＡ１−１４４）、
２．ＩＳＡ１−２４６を導入したもの（以下、ΔＩＳＡ＋ＩＳＡ１−２４６）、
３．Slr0237を導入したもの（以下、ΔＩＳＡ＋Slr0237）、
４．Slr1857を導入したもの（以下、ΔＩＳＡ＋Slr1857）、
５．pECAN8（遺伝子を含まない対照）を導入したもの（以下、ΔＩＳＡ＋ベクター）、
本発明において、内在遺伝子欠損株を宿主として用いたのは、外来遺伝子の導入による機能相補の効果を検討するためである。
【００３０】
このようにして得られた形質転換株における外来遺伝子の発現の検出を行った。
即ち、アンピシリンを含む液体培地で形質転換株を培養し、細胞を収穫した。遠心により集めた細胞をバッファーで懸濁し、フレンチプレスを用いて１３８ＭＰａで破砕した。２００００ｘｇで遠心した上清について酵素活性の検出を行った。
デンプン枝作り酵素活性について、非変性条件でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（Native-PAGE）後の活性染色の結果を図５に図面に代わる写真で示す。図５中のレーン１は、対照として泳動したイネ胚乳抽出液についての結果であり、レーン２、３、及び４は、それぞれ Synechococcus 野生株（ＷＴ）、ＢＥ欠損株（ΔＢＥ）、及びＢＥ欠損株にＢＥＩＩｂ−３５４を導入した形質転換株（ΔＢＥ＋ＢＥＩＩｂ−３５４）の抽出液（５０μｇタンパク質）を示す。イネ胚乳抽出液には図５に示されるように、ＢＥＩ、ＢＥＩＩａ、ＢＥＩＩｂ といった複数の酵素活性が認められた。Synechococcus 野生株（ＷＴ）では、内在性のＢＥによる濃い染色バンドが検出されるのに対し、ＢＥ欠損株（ΔＢＥ）では活性が完全に消失していた。これと比較してＢＥＩＩｂ形質転換株（ΔＢＥ＋ＢＥＩＩｂ−３５４）では特異的なバンドが認められ（図５中のレーン４の右側の三角印参照）、これが導入した遺伝子に起因するものであることが示された。
【００３１】
イソアミラーゼ（枝切り酵素）についてのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ Native-PAGE）、活性染色の結果を図６に図面に代わる写真で示す。図６中のレーン１は、対照として泳動したイネ胚乳抽出液についての結果であり、レーン２、及び４は Synechococcus ＩＳＡ欠損株（ΔＩＳＡ）、レーン３、及び５はＩＳＡ欠損株にＩＳＡ１−１４４を導入した形質転換株（ΔＩＳＡ＋ＩＳＡ１−１４４）の抽出液（２、３は２０μｇ、４、５は５０μｇタンパク質）を示す。イネ胚乳抽出液には図に示すように、ＩＳＡ１ による複数の染色バンドに加え、アミラーゼやプルラナーゼの活性を示すバンドが認められた。Synechococcus ＩＳＡ１ 形質転換株（ΔＩＳＡ＋ＩＳＡ１−１４４）では、親株であるＩＳＡ欠損株（ΔＩＳＡ）には見られない薄い染色バンド（図６の右側の矢印部分、明瞭な白いバンドの直下）が認められた。
以上述べたように、シアノバクテリア細胞内に導入したイネ遺伝子由来の酵素を発現させ、その活性を検出することに成功した。ＩＳＡ−２４６ および Synechocystis Slr0237、Slr1857 の酵素活性検出についても同様である。
【００３２】
次にこれらの形質転換株における貯蔵多糖の構造解析を行った。
５００ｍｌの液体培養で得られた形質転換株の細胞からアルコール抽出により貯蔵多糖を調製し、市販のイソアミラーゼによって枝切り処理を行った後、キャピラリー電気泳動にかけてグルカン鎖の鎖長分布を調べた。
図７〜１０はキャピラリー電気泳動の結果をグラフ化したものである。これらの各図の上段は鎖長分布を示し、横軸は鎖の長さを示し、縦軸は頻度（％）を示す。これらの各図の下段は、各図の上段に記載した種の２種を比較した場合の差分を示す。
図７は、野生株（ＷＴ）（図７中の灰色白抜き）、ＢＥ欠損株に対照として遺伝子を含まないプラスミドベクターを導入した株（ΔＢＥ＋vector）（図７中の灰色塗りつぶし）、とＢＥ欠損株にイネ ＢＥＩＩｂ 遺伝子を導入した形質転換株（ΔＢＥ＋ＢＥＩＩｂ−３５４）（図７中の黒色塗りつぶし）におけるポリグルカンの鎖長分布（図７上段）、および形質転換株とその親株である欠損株での各鎖長の存在比率の差（(ΔＢＥ＋ＢＥＩＩｂ−３５４)−(ΔＢＥ＋vector)）（図７中の黒色塗りつぶし）（図７下段）を示したものである。
イネ ＢＥＩＩｂ 遺伝子の導入実験に親株として使用した内在性遺伝子ＢＥ欠損株は、野生株と比較してグルコース重合度（ＤＰ）１０以上の糖鎖の割合が増加するという特徴を示したが、イネ ＢＥＩＩｂ 遺伝子を導入した形質転換株ではＤＰ７−８の鎖が減少し、代わって短鎖（ＤＰ４−５）の割合が増大した。この結果から、Synechococcus においてはＢＥＩＩｂはＤＰ＝８以下の短いグルカン鎖に作用して、転移反応を行うことが示された。
【００３３】
図８は、野生株（ＷＴ）（図８中の灰色白抜き）、ＩＳＡ欠損株に対照として遺伝子を含まないプラスミドベクターを導入した株（ΔＩＳＡ＋vector）（図８中の灰色塗りつぶし）、とＩＳＡ欠損株にイネＩＳＡ１遺伝子を導入した形質転換株（ΔＩＳＡ＋ＩＳＡ１−１４４）（図８中の黒色塗りつぶし）におけるポリグルカンの鎖長分布（図８上段）、および形質転換株とその親株である欠損株での各鎖長の存在比率の差（(ΔＩＳＡ＋ＩＳＡ１−１４４)−(ΔＩＳＡ＋vector)）（図８中の黒色塗りつぶし）（図８下段）を示したものである。
図９は、野生株（ＷＴ）（図９中の灰色白抜き）、ＩＳＡ欠損株に対照として遺伝子を含まないプラスミドベクターを導入した株（ΔＩＳＡ＋vector）（図９中の灰色塗りつぶし）、とＩＳＡ欠損株に異種シアノバクテリア Synechocystis sp. PCC 6803 株ＩＳＡ（Slr0237）遺伝子を導入した形質転換株（ΔＩＳＡ＋Slr0237）（図９中の黒色塗りつぶし）におけるポリグルカンの鎖長分布（図９上段）、および形質転換株とその親株である欠損株での各鎖長の存在比率の差（(ΔＩＳＡ＋Slr0237)−(ΔＩＳＡ＋vector)）（図９中の黒色塗りつぶし）（図５下段）を示したものである。
図１０は、野生株（ＷＴ）（図１０中の灰色白抜き）、ＩＳＡ欠損株に対照として遺伝子を含まないプラスミドベクターを導入した株（ΔＩＳＡ＋vector）（図１０中の灰色塗りつぶし）、とＩＳＡ欠損株に異種シアノバクテリア Synechocystis sp. PCC 6803 株ＩＳＡ（Slr1857）遺伝子を導入した形質転換株（ΔＩＳＡ＋Slr1857）（図１０中の黒色塗りつぶし）におけるポリグルカンの鎖長分布（図１０上段）、および形質転換株とその親株である欠損株での各鎖長の存在比率の差（(ΔＩＳＡ＋Slr1857)−(ΔＩＳＡ＋vector)）（図１０中の黒色塗りつぶし）（図１０下段）を示したものである。
【００３４】
これらの結果から、イネ ＩＳＡ１、異種シアノバクテリア Synechocystis の２種のイソアミラーゼ（Slr0237、Slr1857）を導入した場合は、いずれも同様な効果が現れることが明らかとなった。すなわち、親株として使用した内在性遺伝子ＩＳＡ欠損株は、野生株と比較して短鎖（ＤＰ２−３）の含量が増加するという特徴を示したが、ＩＳＡ遺伝子を導入した形質転換株では、いずれもこの短鎖の比率が低下することが認められた。従って、シアノバクテリアにおいてＩＳＡはグリコーゲン分子中の短い枝鎖に作用してこれを除去し、分子構造の成形に関与することが示された。
【００３５】
以上のように、本発明の方法によれば、植物の生育を待たずにデンプン合成の結果を得ることができ、極めて短時間でデンプン合成関連酵素のそれぞれの活性、機能を解析することが可能となる。
【発明の効果】
【００３６】
本発明は、植物、好ましくは高等植物におけるデンプン合成関連酵素の個々の酵素の活性や機能を極めて短時間でかつ簡便の手法で解析することができる新規な実験系及びそのための形質転換体を提供するものである。本発明の方法により、各種の植物におけるデンプン合成関連酵素の機能を短時間で解析することが可能となり、それぞれの酵素の有する特徴を生かしたデンプンの構造をデザインし、それを宿主植物に産生させることも可能となり、新規なクラスター構造を有するデンプンの創生が可能となる。
【００３７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
イネ デンプン枝作り酵素（ＢＥＩＩｂ）遺伝子発現のためのプラスミドの構築
ＢＥＩＩｂ ｃＤＮＡ （Mizuno et al. 1992）を含むプラスミドを鋳型としてＰＣＲ を行い、シアノバクテリアに適した遺伝子に改変したＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲプライマーとして以下の配列のものを用いた。
フォワードプライマー  783B：  5’- aaggaggccg tgatggcggc gggcgcgtca -3’
リバースプライマー  782B：    5’- ttcacagatt gctggcaact -3’
ＰＣＲ によって得られた増幅 ＤＮＡ 断片を、プラスミドベクター pGEM-T Easy (Promega) に連結し、これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、組換えプラスミドを得た。増幅されたＤＮＡに見出されたＰＣＲに起因する塩基置換は、鋳型ＤＮＡ由来の制限酵素処理断片と組換えることにより修復した。最終的に挿入断片全長の配列を決定することにより、変異が修復されたことを確認した。
プラスミドベクター pGEM-T Easy に連結したことにより、遺伝子配列の両端に EcoRI 認識部位が導入された。これを利用して、組換えプラスミドから遺伝子を切り出し、シャトルプラスミド pECAN8 (Lau and Straus 1985) の EcoRI 部位にクローン化した。このシャトルプラスミドには Synechococcus における複製開始に必要な配列が存在するので、シアノバクテリア細胞中で遺伝子を自律増殖させることができる。遺伝子をプラスミドに連結する際に、プラスミド中の lac プロモーターと遺伝子が順方向に配置したクローンを選抜し、ＢＥＩＩｂ 遺伝子が lac プロモーターに依存して転写されるようにした。
ここで作成された遺伝子を「ＢＥＩＩｂ−３５４」と命名した。
【実施例２】
【００３９】
イネ イソアミラーゼ（ＩＳＡ１）遺伝子発現のためのプラスミドの構築
ＩＳＡ１ ｃＤＮＡ （Fujita et al. 1999）を含むプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、シアノバクテリアに適した遺伝子に改変されたＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ は以下に配列を示すプライマーを用いて２通り行った。
フォワードプライマー 1  741B：  5’- aaggaggtag gatgtcggtg gcctcggc -3’
リバースプライマー  743B：      5’- caaaattgaa ggaccgcaca act -3’
フォワードプライマー 2  742B：  5’- aggaggtggt gatgccggag aggta -3’
リバースプライマー  743B：      5’- caaaattgaa ggaccgcaca act -3’
ＰＣＲ によって得られた増幅ＤＮＡ断片を、プラスミドベクター pGEM-T Easy に連結し、これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、組換えプラスミドを得た。フォワードプライマー１を用いて得たクローンはいずれも遺伝子の後半部分を欠失したものだったので、フォワードプライマー２を用いて得たクローン由来の制限酵素処理断片と組換えることにより修復した。遺伝子の後半部分は両者において共通であるはずなので、この組換えにより目的の配列の遺伝子を得ることが出来た。最終的に挿入断片全長の配列を決定することにより、変異が修復されたことを確認した。
得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクター pGEM-T Easy に連結したことにより、遺伝子配列の両端に NotI 認識部位が導入された。これを利用して、組換えプラスミドから遺伝子を切り出し、T4 ＤＮＡ ポリメラーゼにより末端を平滑化した後、シャトルプラスミド pECAN8 の SmaI 部位にクローン化した。遺伝子をプラスミドに連結する際に、プラスミド中の lac プロモーターと遺伝子が順方向に配置したクローンを選抜した。
フォワードプライマー１を用いて増幅した遺伝子由来のクローンを「ＩＳＡ１−１４４」、フォワードプライマー２を用いて増幅した遺伝子由来のクローンを「ＩＳＡ１−２４６」とそれぞれ命名した。
【実施例３】
【００４０】
Synechocystis sp. PCC 6803 株イソアミラーゼ（Slr0237）遺伝子発現のためのプラスミドの構築
Synechocystis sp. PCC 6803 株から調製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、イソアミラーゼ（Slr0237）遺伝子を増幅した。用いたＰＣＲプライマーは、Kaneko et al.（1996）により公表された配列をもとに以下に示すように設計した。
フォワードプライマー  728B：  5’- ggaattgcct atgccacagt tga -3’
リバースプライマー  729B：    5’- atttgtttaa ttaatctcat ggt -3’
ＰＣＲ によって得られた増幅 ＤＮＡ 断片を、プラスミドベクター pGEM-T Easy に連結し、これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、組換えプラスミドを得た。挿入断片全長の配列を決定することにより、ＰＣＲでの増幅にともなう変異が無いことを確認した。
プラスミドベクター pGEM-T Easy に連結したことにより、遺伝子配列の両端に EcoRI 認識部位が導入された。これを利用して、組換えプラスミドから遺伝子を切り出し、シャトルプラスミド pECAN8 の EcoRI 部位にクローン化した。遺伝子をプラスミドに連結する際に、プラスミド中の lac プロモーターと遺伝子が順方向に配置したクローンを選抜した。
【実施例４】
【００４１】
Synechocystis sp. PCC 6803 株イソアミラーゼ（Slr1857）遺伝子発現のためのプラスミドの構築
Synechocystis sp. PCC 6803 株から調製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、イソアミラーゼ（Slr1857）遺伝子を増幅した。用いたＰＣＲプライマーは、Kaneko et al.（1996）により公表された配列をもとに以下に示すように設計した。
フォワードプライマー  734B：  5’- gcaggacacc atggaacgca ta -3’
リバースプライマー  735B：    5’- gcgttattaa taatttccga tt -3’
ＰＣＲによって得られた増幅ＤＮＡ断片を、プラスミドベクター pGEM-T Easy に連結し、これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、組換えプラスミドを得た。挿入断片全長の配列を決定することにより、ＰＣＲでの増幅にともなう変異が無いことを確認した。
プラスミドベクター pGEM-T Easy に連結したことにより、遺伝子配列の両端に EcoRI 認識部位が導入された。これを利用して、組換えプラスミドから遺伝子を切り出し、シャトルプラスミド pECAN8 の EcoRI 部位にクローン化した。遺伝子をプラスミドに連結する際に、プラスミド中の lac プロモーターと遺伝子が順方向に配置したクローンを選抜した。
【実施例５】
【００４２】
Synechococcus 形質転換株の作成
以上に述べた組換えプラスミドを使用して、Golden et al. (1987) の方法に準じSynechococcus 野生株および変異株の形質転換を行い、各種外来遺伝子をシアノバクテリア細胞内に導入した。アンピシリン耐性を指標として、外来遺伝子を含む形質転換株を選抜した。これまでに得られた形質転換株は次のとおりである。野生株を宿主として ＢＥＩＩｂ−３５４、ＩＳＡ１−１４４、ＩＳＡ１−２４６、pECAN8（遺伝子を含まない対照）による形質転換株を得た。枝作り酵素（ＢＥ）欠損株を宿主として ＢＥＩＩｂ−３５４、pECAN8 による形質転換株を得た。イソアミラーゼ（ＩＳＡ）欠損株を宿主として ＩＳＡ１−１４４、ＩＳＡ１−２４６、Slr0237、Slr1857、pECAN8 による形質転換株を得た。内在遺伝子欠損株を宿主として用いたのは、外来遺伝子の導入による機能相補の効果を検討するためである。
【実施例６】
【００４３】
形質転換株における外来遺伝子発現の検出
アンピシリンを含む５００ｍｌの液体培地で形質転換株を培養し、細胞を収穫した。遠心により集めた細胞を４ｍｌのバッファーで懸濁し、フレンチプレスを用いて１３８ＭＰａで破砕した。２００００ｘｇで遠心した上清について酵素活性の検出を行った。細胞の懸濁に用いたバッファーの組成を以下に示す。
デンプン枝作り酵素活性検出のためのバッファー組成
５０ｍＭ              イミダゾール (ｐＨ７．４)
８ｍＭ              ＭｇＣｌ２
５０ｍＭ              ２−メルカプトエタノール
１２．５％(ｖ／ｖ)    グリセロール
【００４４】
イソアミラーゼ活性検出のためのバッファー組成
５０ｍＭ              イミダゾール (ｐＨ７．４)
８ｍＭ              ＭｇＣｌ２
５００ｍＭ              ２−メルカプトエタノール
１２．５％(ｖ／ｖ)    グリセロール
デンプン枝作り酵素活性について、非変性条件でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（Native-PAGE）後の活性染色を行った。この結果を図５に示す。
イソアミラーゼ（枝切り酵素）について、同様にネイティブ−ＰＡＧＥ（Native-PAGE）を行った。この活性染色の結果を図６に示す。
【実施例７】
【００４５】
形質転換株における貯蔵多糖の構造解析
５００ｍｌの液体培養で得られた形質転換株の細胞からアルコール抽出により貯蔵多糖を調製し、市販のイソアミラーゼによって枝切り処理を行った後、キャピラリー電気泳動にかけてグルカン鎖の鎖長分布を調べた。
この結果をグラフ化して図７〜１０に示す。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、植物が産生するデンプン合成の関連している個々の酵素の活性や機能を解析するための新規な手法を提供するものであり、本発明の方法で各種の植物が有するデンプン合成関連酵素の活性や機能を短時間で簡便に解析することができようになり、これらの酵素の活性や機能を利用した新規なクラスター構造を有するデンプンの開発が可能となり、食糧問題の解決だけでなく、工業的なデンプンの利用へのあらたな発展を可能とするものであり、産業上極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、生物における貯蔵性ポリグルカンの構造を示す概念図である。
【図２】図２は、アミロペクチンのクラスター構造を示すものである。
【図３】図３は、イネ胚乳におけるジャポニカとインディカとのアミロペクチンのクラスター構造の相違を示すものである。
【図４】図４は、生物における貯蔵性ポリグルカンである、アミロース、アミロペクチン、及びグリコーゲンの生合成経路の概要を示すものである。
【図５】図５は、デンプン枝作り酵素活性について、非変性条件でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（Native-PAGE）後の活性染色の結果を示す図面に代わる写真である。図５中のレーン１は、対照として泳動したイネ胚乳抽出液についての結果であり、レーン２、３、及び４は、それぞれ Synechococcus 野生株（ＷＴ）、ＢＥ欠損株（ΔＢＥ）、及びＢＥ欠損株にＢＥＩＩｂ−３５４を導入した形質転換株（ΔＢＥ＋ＢＥＩＩｂ−３５４）の抽出液（５０μｇタンパク質）を示す。
【図６】図６は、イソアミラーゼ（枝切り酵素）についてのポリアクリルアミドゲル電気泳動（Native-PAGE）、活性染色の結果を示す図面に代わる写真である。図６中のレーン１は、対照として泳動したイネ胚乳抽出液についての結果であり、レーン２、及び４は Synechococcus ＩＳＡ欠損株（ΔＩＳＡ）、レーン３、及び５はＩＳＡ欠損株にＩＳＡ１−１４４を導入した形質転換株（ΔＩＳＡ＋ＩＳＡ１−１４４）の抽出液（２、３は２０μｇ、４、５は５０μｇタンパク質）を示す。
【図７】図７は、野生株（ＷＴ）、ＢＥ欠損株に対照として遺伝子を含まないプラスミドベクターを導入した株（ΔＢＥ＋vector）、とＢＥ欠損株にイネＢＥＩＩｂ遺伝子を導入した形質転換株（ΔＢＥ＋ＢＥＩＩｂ−３５４）におけるポリグルカンの鎖長分布（図７上段）、および形質転換株とその親株である欠損株での各鎖長の存在比率の差（(ΔＢＥ＋ＢＥＩＩｂ−３５４)−(ΔＢＥ＋vector)）（図７下段）を示したものである。図７の上下段のいずれにおいても、横軸は鎖長（グルコース重合度）を示し、縦軸は各鎖長の量の全鎖長の合計量に対する比率（％）を示す。
【図８】図８は、野生株（ＷＴ）、ＩＳＡ欠損株に対照として遺伝子を含まないプラスミドベクターを導入した株（ΔＩＳＡ＋vector）、とＩＳＡ欠損株にイネＩＳＡ１遺伝子を導入した形質転換株（ΔＩＳＡ＋ＩＳＡ１−１４４）におけるポリグルカンの鎖長分布（図８上段）、および形質転換株とその親株である欠損株での各鎖長の存在比率の差（(ΔＩＳＡ＋ＩＳＡ１−１４４)−(ΔＩＳＡ＋vector)）（図８下段）を示したものである。図８の上下段のいずれにおいても、横軸は鎖長（グルコース重合度）を示し、縦軸は各鎖長の量の全鎖長の合計量に対する比率（％）を示す。
【図９】図５は、野生株（ＷＴ）、ＩＳＡ欠損株に対照として遺伝子を含まないプラスミドベクターを導入した株（ΔＩＳＡ＋vector）、とＩＳＡ欠損株に異種シアノバクテリア Synechocystis sp. PCC 6803 株ＩＳＡ（Slr0237）遺伝子を導入した形質転換株（ΔＩＳＡ＋Slr0237）におけるポリグルカンの鎖長分布（図９上段）、および形質転換株とその親株である欠損株での各鎖長の存在比率の差（(ΔＩＳＡ＋Slr0237)−(ΔＩＳＡ＋vector)）（図９下段）を示したものである。図９の上下段のいずれにおいても、横軸は鎖長（グルコース重合度）を示し、縦軸は各鎖長の量の全鎖長の合計量に対する比率（％）を示す。
【図１０】図１０は、野生株（ＷＴ）、ＩＳＡ欠損株に対照として遺伝子を含まないプラスミドベクターを導入した株（ΔＩＳＡ＋vector）、とＩＳＡ欠損株に異種シアノバクテリア Synechocystis sp. PCC 6803 株ＩＳＡ（Slr1857）遺伝子を導入した形質転換株（ΔＩＳＡ＋Slr1857）におけるポリグルカンの鎖長分布（図１０上段）、および形質転換株とその親株である欠損株での各鎖長の存在比率の差（(ΔＩＳＡ＋Slr1857)−(ΔＩＳＡ＋vector)）（図１０下段）を示したものである。図１０の上下段のいずれにおいても、横軸は鎖長（グルコース重合度）を示し、縦軸は各鎖長の量の全鎖長の合計量に対する比率（％）を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００４８】
配列番号１：  イネＢＥIIｂ−３５４の塩基配列
配列番号２：  イネＢＥIIｂ−３５４のアミノ酸配列
配列番号３：  イネイソアミラーゼ（ＩＳＡ１−１４４）の塩基配列
配列番号４：  イネイソアミラーゼ（ＩＳＡ１−１４４）のアミノ酸配列
配列番号５：  イネイソアミラーゼ（ＩＳＡ１−２４６）の塩基配列
配列番号６：  イネイソアミラーゼ（ＩＳＡ１−２４６）のアミノ酸配列
配列番号７：  Synechocystis sp. 6803株由来のイソアミラーゼ(slr0237)の塩基配列
配列番号８：  Synechocystis sp. 6803株由来のイソアミラーゼ(slr0237)のアミノ酸配列
配列番号９：  Synechocystis sp. 6803株由来のイソアミラーゼ(slr1857)の塩基配列
配列番号１０：  Synechocystis sp. 6803株由来のイソアミラーゼ(slr1857)のアミノ酸配列
配列番号１１：  イネＢＥIIｂ−３５４の増幅用のフォーワードプライマ−
配列番号１２：  イネＢＥIIｂ−３５４の増幅用のリバースプライマ−
配列番号１３：  イネイソアミラーゼの増幅用のフォーワードプライマ−の１
配列番号１４：  イネイソアミラーゼの増幅用のフォーワードプライマ−の２
配列番号１５：  イネイソアミラーゼの増幅用のリバースプライマ−
配列番号１６：  Synechocystis sp. 6803株由来のイソアミラーゼ(slr0237)の増幅用のフォーワードプライマ−
配列番号１７：  Synechocystis sp. 6803株由来のイソアミラーゼ(slr0237)の増幅用のリバースプライマ−
配列番号１８：  Synechocystis sp. 6803株由来のイソアミラーゼ(slr1857)の増幅用のフォーワードプライマ−
配列番号１９：  Synechocystis sp. 6803株由来のイソアミラーゼ(slr1857)の増幅用のラバースプライマ−
【図１】
2005253401.tif 000002
【図２】
2005253401.tif 000003
【図３】
2005253401.tif 000004
【図４】
2005253401.tif 000005
【図７】
2005253401.tif 000006
【図８】
2005253401.tif 000007
【図９】
2005253401.tif 000008
【図１０】
2005253401.tif 000009
【図５】
2005253401.tif 000010
【図６】
2005253401.tif 000011
【配列表】
2005253401000001.app