(57)【要約】【課題】  サンプル中の巨核球の、迅速で、自動で簡単な検出方法を提供すること。【解決手段】  （ａ）細胞を含む試料を供給し、（ｂ）前記細胞から複数の形態学的情報を検出し、（ｃ）前記複数の形態学的情報からスキャッタグラムを作成し、（ｄ）前記スキャッタグラムの巨核球領域に集団が存在するか否かを決定することからなる巨核球の検出方法が開示される。【選択図】            なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）細胞を含む試料を供給し、
（ｂ）前記細胞から複数の形態学的情報を検出し、
（ｃ）前記複数の形態学的情報からスキャッタグラムを作成し、
（ｄ）前記スキャッタグラムの巨核球領域に集団が存在するか否かを決定することからなる巨核球の検出方法。
【請求項２】
前記試料と試薬を混合して測定用試料を調製することをさらに含む請求項１の検出方法。
【請求項３】
検出が自動血球分析装置を含む請求項１記載の検出方法。
【請求項４】
前記試薬が蛍光色素を含む請求項２記載の検出方法。
【請求項５】
測定用試料の調製が、免疫学的手法を含まない請求項２記載の検出方法。
【請求項６】
複数の形態学的情報が、細胞から発せられる側方散乱光及び側方蛍光からなる請求項１記載の検出方法。
【請求項７】
複数の形態学的情報が、細胞から発せられる前方散乱光及び側方散乱光からなる請求項１記載の検出方法。
【請求項８】
複数の形態学的情報が、細胞から発せられる前方散乱光及び蛍光からなる請求項１記載の検出方法。
【請求項９】
検出が、測定用試料を電気的に帯電した細孔を通して直流抵抗と高周波抵抗の変化を同定することからなる請求項２記載の検出方法。
【請求項１０】
さらに巨核球領域を同定することからなる請求項１記載の検出方法。
【請求項１１】
同定が、精製された巨核球から検出された複数の情報から第１の参照スキャッタグラムを作成し、末梢血試料及び骨髄試料のうちの少なくとも一つ中の細胞から検出された複数の情報から第２の参照スキャッタグラムを作成し（ここで、末梢血及び骨髄試料には、実質的に巨核球が存在しない）、第１の参照スキャッタグラムと第２のスキャッタグラムを比較し、それによって巨核球領域を同定することからなる請求項１０記載の検出方法。
【請求項１２】
精製された巨核球が、分化したDami細胞からなる請求項１１記載の検出方法。
【請求項１３】
精製された巨核球が、CD34陽性造血細胞から誘導された細胞からなる請求項１１記載の検出方法。
【請求項１４】
前記細胞が、トロンボポエチンを用いて誘導される請求項１３記載の検出方法。
【請求項１５】
（ａ）細胞を含む試料と試薬を混合して測定用試料を調製し、
（ｂ）前記細胞から複数の情報を検出し、ここで、前記情報は、細胞の大きさ情報、細胞内部情報、細胞の染色度合いの情報及びそれらの組み合わせからなる群より選択され、
（ｃ）複数の情報をプロットすることによりスキャッタグラムを作成し、
（ｄ）スキャッタグラムの巨核球領域内に集団が存在するか否かを決定することからなる巨核球の検出方法。
【請求項１６】
検出が自動血球分析装置を含む請求項１５記載の検出方法。
【請求項１７】
前記試薬が蛍光色素を含む請求項１５記載の検出方法。
【請求項１８】
測定用試料の調製が、免疫学的手法を含まない請求項１５記載の検出方法。
【請求項１９】
細胞内部情報が、細胞より発せられた側方散乱光に基づいて検出され、細胞の染色度合いの情報が、細胞より発せられた蛍光に基づいて検出される請求項１５記載の検出方法。
【請求項２０】
細胞の大きさ情報が、細胞より発せられる前方散乱光に基づいて検出され、細胞内部情報が、細胞より発せられた側方散乱光に基づいて検出される請求項１５記載の検出方法。
【請求項２１】
細胞の大きさ情報が、細胞より発せられる前方散乱光に基づいて検出され、細胞の染色度合いの情報が、細胞より発せられた蛍光に基づいて検出される請求項１５記載の検出方法。
【請求項２２】
検出が、測定用試料を電気的に帯電した細孔を通して直流抵抗の変化に基づいて細胞の大きさ情報を同定し、高周波抵抗の変化に基づいて細胞内部情報を同定することからなる請求項１５記載の検出方法。
【請求項２３】
（ａ）細胞を含む試料と、蛍光色素と溶血剤からなる試薬を混合して測定用試料を調製し、
（ｂ）前記細胞から発せられる散乱光と蛍光を検出し、
（ｃ）前記散乱光と前記蛍光をプロットすることによりスキャッタグラムを作成し、
（ｄ）スキャッタグラムの巨核球領域内に集団が存在するか否かを決定することからなる巨核球の検出方法。
【請求項２４】
散乱光が側方散乱光からなる請求項２３記載の検出方法。
【請求項２５】
検出が自動血球分析装置を含む請求項２３記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液や骨髄のようなヒトサンプル中の巨核球を検出する方法に関する。より詳しくは、本発明は、自動血液分析装置を使って、正確に精度よく巨核球を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床的には、ヒトの造血（すなわち、種々のタイプの血球の生成及び成熟）は、血液及び骨髄サンプルを検査することによって研究されている。血球の計数・分類は、様々な疾患の診断において有用な情報を提供する。例えば、赤血球（RBC）カウントは、赤血球生成及び貧血に関する情報を提供する。白血球（WBC）カウントは、骨髄造血及び感染に関する情報を提供する。血小板カウントは、血小板生成及び血液凝固能に関する情報を提供する。
【０００３】
末梢血の分析から得られた情報に加えて、臨床的な診断に有用な情報が骨髄検査から得られる。例えば、巨核球の計数及び成熟段階の決定は、血液凝固疾患の診断に関して重要な臨床的情報を提供する。さらに、臨床的疾患の病理学上の分類を容易にする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来、巨核球（すなわち、血小板の前駆体）は、顕微鏡下で検出され計数されてきたが、非常に時間と労力のかかるアプローチである。巨核球カウントは、マニュアルで測定され顕微鏡スライドあたりの巨核球の総数として表される。用手法を実施する際特有の欠点に加えて、他の問題も存在する。例えば、骨髄異形成や巨核球性白血病のようないくつかの疾患に関しては、巨核球は、異なった形態で末梢血中に出現する。そのような細胞は、しばしば無視され、あるいは他のタイプの細胞として計数される。
【０００５】
別の分析方法は、フローサイトメトリと抗体の使用を含む。けれども、この方法には、多くの工程があり、染色、赤血球溶血、洗浄などといった免疫学的手順の複雑なプロトコールが必要である。
【０００６】
要するに、サンプル中の巨核球の、迅速で、自動で簡単な検出方法が、通常使用される技術に関連する欠点を克服するために必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の範囲は、添付された特許請求の範囲によってもっぱら定義されるものであり、この要約内の記述によっていかなる程度にも影響されない。
【０００８】
簡潔に言えば、本発明の特徴を具体化した第１の巨核球の検出方法は、（ａ）細胞を含む試料を供給し、（ｂ）前記細胞から複数の形態学的情報を検出し、（ｃ）前記複数の形態学的情報からスキャッタグラムを作成し、（ｄ）前記スキャッタグラムの巨核球領域に集団が存在するか否かを決定する、ことを含む。
【０００９】
本発明の特徴を具体化した第２の巨核球の検出方法は、（ａ）細胞を含む試料と試薬を混合して測定用試料を調製し、（ｂ）前記細胞から複数の情報を検出し、ここで前記情報は、細胞の大きさ情報、細胞の内部情報、細胞の染色度合いに関する情報及びそれらの組み合わせからなる群より選択され、（ｃ）前記複数の情報をプロットすることによりスキャッタグラムを作成し、（ｄ）前記スキャッタグラムの巨核球領域に集団が存在するか否かを決定する、ことを含む。
【００１０】
本発明の特徴を具体化した第３の巨核球の検出方法は、（ａ）細胞を含む試料と、蛍光色素と溶血剤を含む試薬を混合して測定用試料を調製し、（ｂ）前記細胞から放出される散乱光と蛍光を検出し、（ｃ）前記散乱光と前記蛍光プロットすることによりスキャッタグラムを作成し、（ｄ）前記スキャッタグラムの巨核球領域に集団が存在するか否かを決定する、ことを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本開示の全体及び添付された特許請求の範囲において、以下の定義が理解されるべきである。
【００１２】
「検出」及び「分析」という用語（例えば、「巨核球を検出する」など）は、一般には検体、とくには巨核球細胞を検出するための、いかなる定量法、半定量法、あるいは定性法をも意味する。例えば、サンプル中の巨核球の存在あるいは不存在を単に検出する方法は、データを提供してサンプル中の量あるいは濃度を出す方法を実施するのと同様に本発明の範囲内にある。
【００１３】
「スキャッタグラムの巨核球領域」という語句は、プロットの少なくとも約７５％が巨核球の集団由来であるスキャッタグラムの領域を意味する。
【００１４】
「未分化」という用語は、巨核球の前駆体あるいは成熟初期段階に対応する細胞を意味する。
【００１５】
「分化した」という用語は、成熟したあるいは成熟後期段階の巨核球を意味する。
【００１６】
今回見出されたのは、サンプル中の巨核球が、（１）サンプルより収集したデータからスキャッタグラムを作成し、（２）巨核球集団の存在を示すスキャッタグラムを検査することにより、容易にしかも免疫学的手法を使用することなく同定されることである。さらに見出されたのは、巨核球に対応するプロットがスキャッタグラムの特定の領域に出現することである。スキャッタグラム自体は、自動血液分析装置を用いて収集されたデータから作成される。比較目的のために、フローサイトメータが、並行して行われる対照試験においてデータを収集するために使用されてもよい。
【００１７】
日本の神戸のシスメックス株式会社から販売されている多項目分析装置XE-2100及びSE-9000のような自動血液分析装置が、現在、本発明に合致して好ましく使用される。自動血液分析装置の設定は、巨核球が、自動血液分析装置で通常使用される設定の外側に通常存在するので、巨核球の検出のために最適化される。
【００１８】
ここで述べた方法は、自動血液分析装置が、血液や巨核球を含む骨髄のようなヒトサンプルを検査し、細胞の特徴の変化だけでなく成熟段階を分析するために使用されることを可能にする。また、本発明の方法は、骨髄検査の自動化用に、あるいは造血の全体の状況を観察するために設計された自動化された装置に組み込まれてもよい。
【００１９】
従って、本発明の特徴を具体化した第１の巨核球の検出方法は、（ａ）細胞を含む試料を供給し、（ｂ）前記細胞から複数の形態学的情報を検出し、（ｃ）前記複数の形態学的情報からスキャッタグラムを作成し、（ｄ）前記スキャッタグラムの巨核球領域に集団が存在するか否かを決定する、ことを含む。
【００２０】
好ましくは、さらに前記方法は、前記細胞を含む試料と、蛍光色素（例えばポリメチン色素）のような試薬と混合して測定用試料を調製することを含む。前記試料を調製する手順及びそれと同時に使用される試薬の種類は、Sysmex XE-2100自動血液分析装置に関連して使用されているものと類似しており、Sysmex XE-2100取扱説明書に記載されている（特に第7章参照）。この取扱説明書の全内容は、本出願の開示あるいは定義に矛盾があった場合には、ここでの開示あるいは定義が優先されるものと見なされること以外は、ここに参照により組み入れられる。
【００２１】
本発明の特徴を具体化した検出方法は、２つの選択しうる巨核球源に合わせて発明された。すなわち、（１）患者から得られた巨核球細胞あるいは細胞株、（２）インビトロで培養された幹細胞あるいは前駆細胞である。巨核球性白血病患者からの巨核球細胞あるいは細胞株、および／またはトロンボポエチンを用いて造血幹細胞及び前駆細胞から誘導された巨核球が、現在本発明に合致して好適に使用される。
【００２２】
上述の第1の巨核球源によれば、巨核球性白血病患者から得られたDami細胞（Dami cell）が、現在本発明において使用するのに好ましい巨核球である。図１のフローチャートで概要を示したように、未分化のDami細胞（すなわち、巨核芽球あるいは幼若巨核球）が巨核球性白血病患者から採取される。未分化のDami細胞は、１０％ウシ胎児性血清（FBS）含有RPMI 1640中で成長因子なしで培養される。図2にRPMI 1640およびウシ胎児性血清中で培養された未分化のDami細胞の形態を示す。このようにして培養された未分化のDami細胞は、以下の表１に示した通常の設定で、および以下の表１で示した巨核球測定に最適化された設定で、Sysmex XE-2100で測定される。この段階の測定は、自動血液分析装置上での未分化の巨核球のバックグラウンドを決めるために、分析装置上での細胞の挙動の観察を可能にする。他の巨核球は同じように振る舞う。
【００２３】
【表１】
2005024557.tif 000002
【００２４】
異なったウインドウの最適化された調整値は、未分化のDami細胞を用いて得られた。ウインドウのパラメータの感度は、低下した。なぜならば、Dami細胞の細胞サイズと核酸が通常の血球とは異なるせいである。図３に、（ａ）通常の設定、および（ｂ）調整された設定で測定された未分化のDami細胞のスキャッタグラムを示す。
【００２５】
次に、上で得られた未分化のDami細胞は、血清を含まない（すなわち、タンパクを含まない）細胞培養系で培養され、分化したDami細胞（すなわち、巨核球）が得られる。図４には、（ａ）未分化のDami細胞と（ｂ）分化したDami細胞の形態を示す。互いに異なるDami細胞の細胞形態は、サイトスピンとライト−ギムザ染色を用いて観察され、未分化のDami細胞が、規則的な丸い核とダークグレーブルーの細胞質を有して丸く、一方、分化したDami細胞は、不規則な核と豊富なピンクの細胞質を有して約２−５倍大きく、成熟したあるいは成熟後期段階の巨核球の典型的な形態であることが示された。
【００２６】
このようにして得られた分化したDami細胞は、上の表１に示した調整値を用いてSysmex XE-2100で測定される。自動血液分析装置による分化したDami細胞の測定は、自動血液分析装置あるいは類似の細胞分析装置での成熟／分化した巨核球の細胞集団の測定を容易にする役目を果たす。図５に、（a）未分化Dami細胞、（ｂ）分化したDami細胞のスキャッタグラムを示す。比較検討したところ、分化したDami細胞は、ディファレンシャルウインドウの側方散乱（SSC）／側方蛍光（SFL）、好塩基球ウインドウのSSC/前方散乱（FSC）、NRBC（有核赤血球）ウインドウ及びRBCウインドウのSFL/FSCを含む異なるスキャッターウインドウにおいて、特別な細胞集団を有していた。細胞形態が示したのは、未分化細胞には、規則的な丸い核とダークグレーブルーの細胞質と小さな偽足があることである。分化した細胞は、不規則な核形状と豊富なピンクの細胞質を有して約２−５倍大きく、巨核球の典型的な成熟した形態であることを示した。
【００２７】
上で述べたDami細胞株は、通常幼若巨核球の特徴を有する。しかしながら、上で述べたように、その細胞は、異なった条件下で処理して、細胞形態において成熟したあるいは分化した巨核球になりうる。この研究においては、Dami細胞は、未分化細胞のための成長因子処理なしで１０％ウシ胎児性血清（FBS）含有RPMI 1640中で培養された。そして成熟した／分化した巨核球は、タンパク不含の培養系で得られた。しかしながら、この誘導は、違った成長因子を使って、違った条件下で実現することもできる。さらに、本発明によるDami細胞の代わりに他の巨核球細胞株も使用できることが重視されるべきである。
【００２８】
上で述べた第2の巨核球源によれば、トロンボポエチンを用いて培養された造血細胞、及びとくにトロンボポエチンを用いて培養された精製されたCD34陽性細胞が、現在本発明において好ましく使用される。図６のフローチャートに示したように、CD34陽性細胞（すなわち、ヒト造血前駆細胞、HPC）は、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）を用いて動員されたヒト末梢血を使って精製される。精製されたCD34陽性細胞は、種々のタイプの血球になるように誘導されうる造血細胞の初期段階に相当する。図７（ａ）は、精製されたCD34陽性造血細胞の形態を示す。次に、このようにして得られた精製されたCD34陽性細胞は、上記表１に示した調整値を用いてSysmex XE-2100で測定される。図７（ｂ）と図８は、1日目（つまり、トロンボポエチンを用いて培養する前）の精製されたCD34陽性造血細胞のスキャッタグラムを示す。次に、このようにして得られた精製されたCD34陽性細胞は、トロンボポエチンを用いて培養される。培養8日後、CD34陽性細胞は、本物の骨髄サンプル中で観察されるような、大きくなった大きさ、不規則な核、多葉核及びピンクブルーの細胞質を持った巨核球になるように誘導される。図９（ａ）は、CD34陽性造血細胞を培養することにより得られた巨核球の形態を示す。このようにして得られた巨核球は前記のSysmex XE-2100で測定される。前記の全ての細胞が、前処理や染色することなく前記の装置を用いて新たに培養系から検討された。図９（ｂ）と図10は、培養8日後の巨核球のスキャッタグラムを示す。
【００２９】
上で述べたように、分化したDami細胞、未分化Dami細胞、CD34陽性造血細胞、及びCD34陽性造血細胞から誘導された巨核球は、表１に示した調整値を用いて自動血液分析装置を用いて分析されうる。調整値自身は、使用される装置のタイプ及び／または状態とともに変動し、表１に示した数値は、ガイドラインとして与えられることが重視されるべきである。
【００３０】
スキャッタグラムの巨核球特有の領域の同定は、分化した及び未分化Dami細胞から得られたスキャッタグラムだけでなく、CD34陽性細胞及びそれらから誘導された巨核球のスキャッタグラムの比較を含む。例えば、精製された巨核球は、設定値の調整されたSysmex XE-2100を使って検出され、第１のスキャッタグラムが作成される。正常骨髄サンプルもまた、設定値の調整されたSysmex XE-2100を使って測定され、第2のスキャッタグラムが作成される。図１１と１２に正常骨髄のスキャッタグラムを示す。精製された巨核球のスキャッタグラムと正常骨髄のスキャッタグラムを比較することによって、2つのスキャッタグラム上での細胞集団の分布の違いが（例えば、DIFFチャンネルの高SFL領域）、巨核球のみが出現する領域の決定を可能にすることが明らかになるであろう。このようにして、大きくて高い蛍光特性を持った細胞によって占められた領域の位置を決めることが可能になる。なお、巨核球のみが出現する領域は、予め血液分析装置に記憶させておき、サンプルを測定したときに、その領域内にプロットが出現するか否かによって、巨核球が存在するかどうかを決定することができる。
【００３１】
本発明の特徴を具体化する第１の一連の好ましい方法において、細胞は、Sysmex XE-2100血液分析装置を用いて測定され、巨核球は、ディファレンシエーションチャンネルにおいて観察された。これらのスキャッタグラムにおいて、X軸は側方散乱（細胞の複雑さ）を表し、ｙ軸は側方蛍光を示す。
【００３２】
本発明の特徴を具体化する第２の一連の好ましい方法において、細胞は、Sysmex XE-2100血液分析装置を用いて測定され、巨核球は、WBC/Basoチャンネルにおいて観察された。これらのスキャッタグラムにおいて、X軸は細胞の複雑さを表し、ｙ軸は細胞の大きさあるいは前方散乱（FSC）を表す。
【００３３】
本発明の特徴を具体化する第３の一連の好ましい方法において、細胞は、Sysmex XE-2100血液分析装置を用いて測定され、巨核球は、NRBCチャンネルにおいて観察された。これらのスキャッタグラムにおいて、X軸は細胞の複雑さあるいはSFLを表し、ｙ軸は細胞の大きさあるいは前方散乱（FSC）を表す。
【００３４】
上で開示したことから明らかなように、Dami細胞あるいはCD34細胞のいずれかから誘導された巨核球は、細胞系統の典型的な特徴を有し、Sysmex XE-2100に制限されない自動血液分析装置での細胞挙動を検出するのに使用されうる。
【００３５】
さらに、Sysmex XE-2100のような自動血液分析装置は、巨核球の検出に使用されうることがうまく示された。この知見は、造血の全体の状況を観察するためのプロトコールあるいは、ヒト試料を用いた骨髄検査自動化の開発において特に有用とわかるだろう。
【００３６】
上述の詳細な開示と例が、説明と図面によって与えられるが、添付された特許請求の範囲を制限することを意図するものではない。ここで説明された現在好ましい実施形態において、多くの変形形態は当業者においては明らかであり、添付された特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の特徴を具体化した第１の巨核球の検出法方法のフローチャートを示す。ここでは、巨核球は巨核球性白血病患者から採取した。
【図２】RPMI 1640及びウシ胎児性血清中で培養された未分化のDami細胞（Dami cell）のライト−ギムザ染色された細胞の写真であり、ヒト骨髄中の巨核球の前駆体あるいは成熟初期段階を表す。
【図３】XE-2100自動血液分析装置で測定された未分化Dami細胞のスキャッタグラムを示し、（ａ）通常の設定、及び（ｂ）変更した設定で使用したものである。
【図４】ライト−ギムザ染色された細胞の写真であり、（ａ）未分化Dami細胞、及び（ｂ）分化したDami細胞を示す。
【図５】自動血液分析装置で測定された（ａ）未分化Dami細胞、及び（ｂ）分化したDami細胞のスキャッタグラムを示し、ここでは、特別な細胞集団が、ディファレンシャル、Baso、NRBC及びRBCのような異なったウインドウ中に出現する。
【図６】本発明の特徴を具体化した第２の巨核球の検出法方法のフローチャートを示す。ここでは、巨核球は、トロンボポエチンを用いて培養された精製されたCD34陽性細胞から得られた。
【図７】（ａ）精製されたCD34陽性造血細胞の細胞形態を示したライト−ギムザ染色された細胞の写真、（ｂ）自動血液分析装置で測定された精製されたCD34陽性造血細胞のスキャッタグラムを示す。
【図８】トロンボポエチンを用いて培養する前に自動血液分析装置で測定された精製されたCD34陽性造血細胞のスキャッタグラムを示す。
【図９】（ａ）トロンボポエチンを用いて培養されたCD34陽性造血細胞から誘導された巨核球の細胞形態を示したライト−ギムザ染色された細胞の写真、（ｂ）自動血液分析装置で測定されたこれらの巨核球のスキャッタグラムを示す。
【図１０】トロンボポエチンを用いて8日間培養された後に、自動血液分析装置で測定されたCD34陽性造血細胞のスキャッタグラムを示す。
【図１１】正常骨髄のスキャッタグラムを示す。
【図１２】正常骨髄のスキャッタグラムを示す。
【図１】
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【図６】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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