(57)【要約】      （修正有）【課題】麻疹ウイルス属の遺伝子産物を発現する組換えポックスウイルスの提供。【解決手段】麻疹ウイルス属からの異種ＤＮＡを含有する、ワクチニアウイルスまたはカナリヤポックスウイルスのような組換えポックスウイルスを提供する。異種ＤＮＡは、麻疹ウイルス糖タンパク質の産生により宿主中に発現される。あるいは、異種ＤＮＡは少なくとも２つの麻疹ウイルス糖タンパク質の産生により宿主中に発現される。また、ワクチン接種した宿主動物中に免疫応答を誘発する組換えポックスウイルスを含有するワクチンにも関する。組換えポックスウイルスをイヌに接種することにより、イヌジステンパーに対してイヌの交差防御が得られる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポックスウイルスゲノムの可欠領域中に麻疹ウイルス属からのＤＮＡを含有する組換えポックスウイルスであって、前記ＤＮＡが、麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質、麻疹ウイルス融合糖タンパク質、および麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質と麻疹ウイルス融合糖タンパク質の組合せからなる群より選択される麻疹ウイルス糖タンパク質をコードし、かつ前記ポックスウイルスが、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主域遺伝子領域、および大ユニットリボヌクレオチド還元酵素が欠損したワクチニアウイルスであることを特徴とする組換えポックスウイルス。
【請求項２】
前記ポックスウイルスがＮＹＶＡＣであることを特徴とする請求項１記載の組換えポックスウイルス。
【請求項３】
前記ＤＮＡを発現させるプロモーターをさらに含有することを特徴とする請求項１または２記載の組換えポックスウイルス。
【請求項４】
ワクチンを接種した宿主動物において免疫応答を誘発するワクチンであって、担体および請求項１から３いずれか１項記載の組換えポックスウイルスを含むことを特徴とするワクチン。
【請求項５】
イヌジステンパーに対してイヌを防御する方法であって、請求項１から３いずれか１項記載の組換えポックスウイルスを前記イヌに接種する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡが麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質をコードすることを特徴とする請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願についての説明
本発明は1990年11月20日に出願した先願同時系属出願第07/621,614号の一部継続出願である。
【０００２】
産業上の利用分野
本発明は修飾ポックスウイルスおよびそれの製造方法並びに使用方法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、ウイルスが麻疹ウイルス属遺伝子の遺伝子産生物を発現する組換えポックスウイルス、および麻疹ウイルス属感染に対して防御免疫を提供するワクチンに関するものである。
【０００３】
本出願中において括弧内のアラビア数字によりいくつかの出版物が引用されている。これらの参照文献に関する全ての引用を請求の範囲の直前で明細書の終りに記載する。これらの参照文献は、本発明が属する従来技術を記載している。
【背景技術】
【０００４】
ワクチニアウイルスおよびより最近の他のポックスウイルスは異種遺伝子の挿入と発現に用いられてきた。異種遺伝子を生感染性ポックスウイルス中に挿入する基本技術は、供与体プラスミド中の異種遺伝子要素を側腹に有するポックスＤＮＡ配列とレスキューイング（ｒｅｓｃｕｉｎｇ）ポックスウイルス中に存在する同種配列との間の組換えを含む（ピッチーニら、1987）。
【０００５】
特に、組換えポックスウイルスは、従来技術において知られている２つの工程により構成され、特許文献１に記載されているワクチニアウイルスの合成組換え体を産生する方法と類似しており、その特許の開示をここに参照文献として含む。
【０００６】
第１に、ウイルス中に挿入されるＤＮＡ遺伝子配列、特に非ポックス源からの読み取り枠は、ポックスウイルスのＤＮＡの部分と相同なＤＮＡが挿入されるＥ．ｃｏｌｉプラスミド構成物中に配される。それとは別に、挿入されるＤＮＡ遺伝子配列はプロモーターに連結される。プロモーター遺伝子結合は、そのプロモーター遺伝子結合が可欠座を含有するポックスＤＮＡの領域を側腹に有するＤＮＡ配列と相同なＤＮＡにより両端の側腹にあるようにプラスミド構成物中に位置する。産生したプラスミド構成物は次いでＥ．ｃｏｌｉバクテリア内の成長により増幅され（クレウェル、1972）、単離される（クレウェルら、1969；マニアチスら、1982）。
【０００７】
第２に、挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離プラスミドは、ポックスウイルスとともに細胞培養、例えばひな胚胎繊維芽細胞中にトランスフェクションされる。プラスミド中の相同ポックスＤＮＡとウイルスゲノムとの間の組換え体はそれぞれ、そのゲノム中の可欠領域中に異種ＤＮＡ配列の存在により修飾されるポックスウイルスを与える。「異種」ＤＮＡという用語は、外因性ＤＮＡが配されるゲノムにより通常産生されない遺伝子産生物をコードする外因性ＤＮＡ、特に非ポックス源からのＤＮＡを称する。
【０００８】
遺伝子組換えは、一般的にＤＮＡの２本鎖間のＤＮＡの相同部分の交換である。あるウイルスにおいて、ＲＮＡはＤＮＡを置換する。核酸の相同部分は、同一のヌクレオチド塩基の配列を有する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の部分である。
【０００９】
遺伝子組換えは、感染宿主細胞内の新たなウイルスゲノムの複製または産生中に自然に生じる。それゆえ、ウイルス遺伝子間の遺伝子組換えは、２つ以上の異なるウイルスまたは他の遺伝子構成物に共感染した宿主細胞中で生じるウイルス複製サイクル中に生じる。第１のゲノムからのＤＮＡの部分は、ＤＮＡが第１のウイルスゲノムのＤＮＡと相同である第２の共感染ウイルスのゲノムの部分を構成するのに交換可能に用いられる。
【００１０】
しかしながら、組換えはまた、完全には相同ではない異なるゲノム中のＤＮＡの部分間にも生じ得る。そのような１つの部分が、例えば相同なＤＮＡの部分中に挿入される抗原決定基をコードする遺伝子または遺伝子マーカーの第１の部分内の存在を除いた別のゲノムと相同の第１のゲノムからのものである場合、組換えはまだ生じ、その組換えの産生物は次いで、組換えウイルスゲノム中の遺伝子または遺伝子マーカーの存在により検知可能である。
【００１１】
修飾感染ウイルスによる挿入ＤＮＡ遺伝子配列の発現を成功させるには２つの条件が必要である。第１に、修飾ウイルスが生存し続けるように、ウイルスの可欠領域中に挿入がなされなければならない。挿入ＤＮＡの発現の第２の条件は、挿入ＤＮＡへの適切な関係にあるプロモーターの存在である。発現されるＤＮＡ配列から上流に位置するようにプロモーターを配しなければならない。
【００１２】
イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）および麻疹ウイルス（ＭＶ）は、科パラミクソウイルス属の麻疹ウイルス属亜型の一員である（ジアロ、1990；キングスバリーら、1978）。ウイルスは負の極性の非分節１本鎖ＲＮＡゲノムを含有する。イヌジステンパーは非常に感染しやすい犬または他の肉食性動物の熱性病である。死亡率は高い；30から80パーセントの間の範囲に亘る。犬が生存してもしばしば永久の中枢神経系が損傷することがある（フェナーら、1987）。同様に、麻疹ウイルスも全身大丘疹性発疹により特徴付けられるひどく感染しやすい熱性病を生じる。その病気は主に子供を冒す。
【００１３】
麻疹ウイルス属の特徴が近年ノービーとオクスマン（1990）並びにジアロ（1990）により報告された。他のパラミクソウイルス属に報告されているように（アベリーおよびニベン、1979；マーツら、1980）、２つの構造タンパク質が防御免疫応答の誘発に重要である。これらのタンパク質は、血球凝集と宿主細胞へのウイルスの吸着の原因である膜糖タンパク質血球凝集素（ＨＡ）、およびウイルスと感染細胞との間または感染細胞と隣接した未感染細胞との間の膜融合を生じる融合糖タンパク質（Ｆ）である（グレーブスら、1978）。ＭＶゲノム中の遺伝子の順序はリチャードソンら（1985）およびドーリングら（1986）により推測された。ＭＶＨＡ遺伝子およびＭＶＦ遺伝子のヌクレオチド配列がアルクハチブとブリーディス（1986）およびリチャードソンら（1986）によりそれぞれ求められた。
【００１４】
ＣＤＶとＭＶは構造的に類似しており、類似した血清関係を共有している。イムノプレシピテーションの研究により、ＭＶに対する抗血清が全てのＣＤＶタンパク質（Ｐ、ＮＰ、Ｆ、ＨＡおよびＭ）を沈殿させることが示された。対称的に、ＣＤＶに対する抗血清は、ＨＡ糖タンパク質以外の全てのＭＶタンパク質を沈殿せしめる（ホールら、1980；オーベルら、1980；ステフェンソンら、1979）。この類似の血清関係に照らして、ＭＶによるワクチン接種は犬のＣＤＶ抗原投与に対する防御を引き出すことが以前から示されている（ギレスピーら、1960；モーラら、1961；ワレンら、1960）。ＣＤＶに対する中和抗体がヒト抗ＭＶ血清中に報告されているが（アダムスら、1957；イマガワら、1960；カーゾン、1955；カーゾン、1962）、ＭＶに対する中和抗体は犬からの抗ＣＤＶ血清中には発見されていない（ディレイら、1965；カーゾン、1962；ロバーツ、1965）。  ＭＶ  ＨＡおよびＦ遺伝子が、ワクチニアウイルス（ドリリアンら、1988；ウィルドら、1991）、鶏痘ウイルス（スフェナーら、1990；ウィルドら、1990）、アデノウイルス（アルハチブら、1990）およびバキュロウイルス（ブィアラードら、1990）を含むいくつかのウイルスベクター中に発現されている。これらの研究において、血球凝集（ブィアラードら、1990）溶血反応（アルハチブら、1990；ブィアラードら、1990）または細胞融合（アルハチブら、1990；ブィアラードら、1990；ウィルドら、1991）検定において機能した真正のＭＶタンパク質が発現された。ワクチニアウイルスベクター中に挿入されるときに、ＨＡまたはＦタンパク質のいずれかの発現は、ＭＶ脳炎に対するネズミ中の防御免疫応答を引き出すことができた（ドリリエンら、1988）。同様に、鶏痘ウイルスベクター中のＦタンパク質の発現は、ネズミ中のＭＶ脳炎に対する防御免疫を引き出した（ウィルドら、1990）。どの防御研究も他のベクターについては報告されなかった。
【００１５】
特許文献２は鶏痘中のＭＶ遺伝子の発現に関するものである。
【００１６】
パーカスらは近年（1990）、ワクチニアウイルス中の２つの独特な宿主域遺伝子の定義を記載した。これらの遺伝子は、生体外の様々な細胞基体上のワクチニアウイルスの複製を認める宿主域機能をコードする。その遺伝子は、ヒト細胞並びに家ウサギとブタの源の細胞上のワクチニアウイルス複製の宿主域機能をコードする。これら遺伝子の定義は、一方ではまだ興味のある異種遺伝子を発現し、定義された細胞中で複製する能力において厳しく制限されたワクチニアウイルスベクターの発達を提供する。これによりワクチニアウイルス組換え体の安全特性を大幅に高める。  弱毒化されたベクターは、ワクチニアウイルスのコペンハーゲン菌株からの６つの可欠領域の系列欠損により発達せしめられている。これらの領域はウイルスの毒性における役割を有するタンパク質をコードすることが知られている。欠損した領域は、ｔｋ遺伝子、出血性遺伝子、Ａ型含有遺伝子、血球凝集遺伝子、およびリボヌクレオチド還元酵素の大サブユニット並びに以前に定義したＣ７ＬからＫ１Ｌの配列をコードする遺伝子である（パーカスら、1990）。ワクチニアウイルスのコペンハーゲン菌株中のこれらの遺伝子の配列および遺伝子配置が以前に定義されている（ゲーベルら、1990ａ、ｂ）。産生した弱毒化ワクチニア菌株はＮＹＶＡＣと称する。
【００１７】
ワクチニアウイルス組換え体を産生する技術が、より制限された宿主域を有するポックスウイルス科の他のメンバーに最近広がっている。アビポックスウイルス、鶏痘は、狂犬病Ｇ遺伝子を発現する組換えウイルスとして設計されている（テイラーら、1988ｂ）。この組換えウイルスはまた特許文献３に記載されている。組換え体の多数の非鶏種への接種により、ネズミ、ネコおよびイヌにおいて致死量の狂犬病抗原投与に対して防御を示す狂犬病に対する免疫反応が引き出される。
【００１８】
イヌジステンパーと麻疹の両者は弱毒化ワクチンの使用により現在制御されている（フェンナーら、1987；プレブラッドら、1988）。生後８週間と生後12から16週間で生弱毒化ワクチンを使用する免疫化が、ＣＤＶの制御に推奨されている。ＣＤＶに対する免疫は一生のものであるが、病気の重大さと作用因子の高い感染特性のために、例年のワクチン再接種が通常推奨される。
【００１９】
継続的なワクチン再接種の現在の方針に関する１つの問題点は、ＣＤＶ免疫母体が初乳中の子孫に対する中和抗体を通過することである。子犬にワクチン接種を行なう、これらの抗体の水準が衰えるときを確かめることは困難である。これは子犬がＣＤＶ感染に対して感染しやすい場合に糸口を残す。麻疹ウイルス糖タンパク質のみを発現する組換えワクチンの使用により、母の抗体の抑制効果を克服し、新生児のワクチン接種を行なう方法が提供される。実際、ＣＤＶ免疫母体を哺乳した子犬中のＣＤＶ特異抗体は、ＭＶワクチンで接種したときにＭＶ特異抗体の発達を妨げなかったことが示されている（ベイカーら、1966）。
【００２０】
通常使用されている修飾生ＣＤＶワクチンの他の制限が以前に記載されており（チザード、1990）、ワクチン接種された動物内で複製するこれらのワクチン菌株の能力と関連付けられる。ＣＤＶワクチン菌株を、イヌアデノウイルス１および２とともに、免疫抑制、血小板減少、および脳炎となるイヌに接種した場合に、これらの欠損効果が最も著しい（ベステッティら、1987；ハートリー、1974；フィリップスら、1989）。修飾生ＣＤＶワクチンはまた、キツネ、キンカジョス（Ｋｉｎｋａｊｏｕｓ）、フェレットおよびパンダを含む他の動物種にジステンパーを誘発せしめることが示されている（ブッシュら、1976；カーペンターら、1976；カザコスら、1981）。それゆえ、組換えＣＤＶワクチン候補物の使用により、修飾生ＣＤＶの環境への継続的な導入と、従来のＣＤＶワクチンの使用により生じる潜在的なワクチン関連とワクチン誘発の併発が除去される。  ポックスウイルスの使用はまた、現在使用されているイヌの弱毒化ＣＤＶ菌株によるワクチン接種の際に母体抗体が有する文献に記載した抑制効果を克服する手段を提供する。若年にポックスウイル組換え体で免疫化した母体に生まれた子犬は、ＣＤＶ特異母体抗体の干渉を避ける。加えて、これらの反応および２つのポックスウイルスの間の血清の緊密な反応性の欠如を引き出すＭＶ  ＨＡ遺伝子とＦ遺伝子を含有するワクチニアウイルスとカナリヤポックスウイスルベクターの両者の能力は、１つのベクターが子犬の生涯の初期に用いられ、もう一方が後期に用いられてＣＤＶ特異免疫を高めるというさらなる利点を提供する。これは、弱毒化ＤＣＶ菌株の環境への放出と、ワクチン誘発およびワクチン関連の併発の発生に関連付けられるできごととを除去する（チザード、1990）。
【００２１】
それゆえ、麻疹ウイルス属組換えポックスウイルス、および麻疹ウイルス属感染に対する防御免疫を提供するワクチンを提供することは、技術の現在の状況よりも非常に望ましい利点であることが理解されよう。
【特許文献１】米国特許第4,603,112 号明細書
【特許文献２】欧州特許第0 314 569 号明細書
【特許文献３】国際公開第89/03429号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
それゆえ、本発明の目的は、麻疹ウイルス属の遺伝子産生物を発現する組換えポックスウイルスを提供すること、およびそのような組換えポックスウイルスを産生する方法を提供することにある。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、ポックスベクター、特にワクチニアウイルスベクターまたはカナリヤポックスウイルスベクター中の麻疹ウイルス属暗号配列、特に麻疹ウイルス暗号配列のクローニングおよび発現を提供することにある。
【００２４】
本発明の別の目的は、麻疹ウイルス属中和抗体、血球凝集抑制抗体および麻疹ウイルス属感染と致死量の麻疹ウイルス属抗原投与に対する防御免疫を引き出すことのできるワクチンを提供することにあり、特に麻疹ウイルス組換えポックスウイルスワクチンを用いてイヌジステンパーに対するイヌの緊密な防御を提供することにある。
【００２５】
本発明のこれらと他の目的および利点は、以下の検討の後に容易に明確となる。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
一面において、本発明はポックスウイルスゲノムの可欠領域の麻疹ウイルス属からのＤＮＡ配列を含有する組換えポックスウイルスに関するものである。ポックスウイルスは好ましくは、カナリヤポックスウイルスのようなアビポックスウイルスまたはワクチニアウイルスである。麻疹ウイルス属は好ましくは麻疹ウイルスである。
【００２７】
本発明によると、組換えポックスウイルスは異種の麻疹ウイルス属遺伝子の遺伝子産生物を発現する。特に、異種ＤＮＡは、麻疹ウイルス糖タンパク質、好ましくは麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質および麻疹ウイルス融合糖タンパク質をコードする。好ましくは、複数の麻疹ウイルス糖タンパク質が組換えポックスウイルスにより宿主中にともに発現される。
【００２８】
別の面において、本発明は、ワクチン接種した宿主動物中の免疫応答を誘発するワクチンに関し、ここでそのワクチンは、可欠領域中に麻疹ウイルス属からのＤＮＡ、特に麻疹ウイルスを含有する組換えポックスウイルスおよび担体を含む。好ましくは、ＤＮＡは、麻疹ウイルス糖タンパク質、特に麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質および麻疹ウイルス融合糖タンパク質をコードして発現する。複数の麻疹ウイルス糖タンパク質は好ましくは宿主中でともに発現される。本発明によるワクチン中に用いられるポックスウイルスは、好ましくはワクチニアウイルスまたはカナリヤポックスウイルスのようなアビポックスウイルスである。
【実施例】
【００２９】
本発明をより深く理解するために添付した図面を参照して説明する。
【００３０】
説明のために示した以下の実施例を参照して、本発明と本発明の多くの利点を詳細に説明する。
【００３１】
実施例１−麻疹血球凝集素遺伝子を含有するワクチニアウイルス組換え体の産生
両者の組換え体の産生に用いたレスキューイング（ｒｅｓｃｕｉｎｇ）ウイルスは、チミジンキナーゼ遺伝子が欠損せしめられたワクチニアウイルスのコペンハーゲン菌株であった。全てのウイルスが成長せしめられ、ベロ細胞単層上に滴定した。
【００３２】
初期／後期ワクチニアウイルスＨ６プロモーター（ロセルら、1986；テイラーら、1988ａ、ｂ）を、４つの重複オリゴヌクレオチド、Ｈ６ＳＹＮ  Ａ−Ｄをアニールすることにより構成した。生成したＨ６配列は以下のとおりである。
【００３３】
ワクチニアウイルスＨ６プロモーター（配列番号１／配列番号２）：
ＨｉｎｄＩＩＩ
５′ＡＧＣＴＴＣＴＴＴＡＴＴＣＴＡＴＡＣＴＴＡＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＡＧＧＴＴＣＴＴＧＡＧＧＧＴＴＧＴ
ＡＧＡＡＡＴＡＡＧＡＴＡＴＧＡＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＴＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＡＡＣＡ
ＧＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＧＣＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡＴＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＧＣＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴ
ＣＡＡＴＴＴＡＡＣＴＴＴＣＧＣＴＣＴＴＴＡＴＴＡＧＴＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＧＴＡＡＴＡＧＣＧＣＴＡＴＡＧＧＣＡＡＴＴＣＡＡ
ＴＧＴＡＴＣＧＴＡＣ−３′
ＡＣＡＴＡＧＣＡＴＧＡＧＣＴ−５′
ＸｈｏＩ
ここで第１図を参照する。アニールしたＨ６ＳＹＮオリゴヌクレオチドを、ＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＭＰ２ＬＶＣ中に連結してプラスミドｐＳＰ１３１を産生した。プラスミドｐＭＰ２ＬＶＣは、ｐＵＣ８内のワクチニアウイルス（コペンハーゲン菌株）ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ領域の一番左の０．４ｋｂｐを含有する。ｐＭＰ２ＬＶＣの構成は以下のようにして行なった：ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ領域からの０．４ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ断片を単離して、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で鈍端とした。この断片を、ＰｖｕＩＩで切断したｐＵＣ１８中に挿入した。産生したプラスミドをｐＭＰ２ＶＣと称した。プラスミドｐＭＰ２ＶＣをＳｓｐＩで線状にした。合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ５２（配列番号３）（５′−ＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣＣＣＣＣＧＧＧＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＴ−３′）およびＭＰＳＹＮ５３（配列番号４）（５′−ＡＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＣＣＧＧＧＧＧＴＡＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴ−３′）をアニールしてワクチニアウイルス配列内に位置する２つのＳｓｐＩ部位の一番左に挿入した。生成したプラスミドｐＭＰ２ＬＶＣは、Ｋ１ＬおよびＫ２Ｌ読み取り枠の間の遺伝子間領域中に多重クローニング領域を含む。
【００３４】
アニールしたオリゴヌクレオチド３Ｐ１（配列番号５）（５′−ＧＧＧＡＡＧ−ＡＴＧＧＡＡＣＣＡＡＴＣＧＣＡＧＡＴＡＧ−３′）およびＨＡ遺伝子の先端の３′配列と粘着末端ＥｃｏＲＩを含有する３Ｐ２（配列番号６）（５′−ＡＡＴＴＣＴＡＴＣＴＧ−ＣＧＡＴＴＧＧＧＧＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＣ−３′）を、ＨＡ遺伝子の残留基とＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで切断したｐＳＰ１３１とを含有するｐＭＨ２２からの１．８ｋｂｐのＸｈｏＩ／ＳｍａＩ断片に連結した。生成したプラスミドをｐＳＰＭＨＡ１１と称した。プラスミドｐＭＨ２２は、ＡＴＧ開始コードンにＸｈｏＩ部位を生成することにより麻疹ＨＡ遺伝子の全長のｃＤＮＡクローンから誘導した（アルハチブら、1986）。
【００３５】
麻疹ＨＡ遺伝子を含有する、ｐＳＰＭＨＡ１１からの１．９ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片を単離して、２ｍＭのｄｎｔｐの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で鈍端とした。単離した断片をＢｇｌＩＩで切断したｐＭＰ４０９ＤＶＣ（グオら、1989）中に挿入して、ムンビーン（ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ）ヌクレアーゼの処理により鈍端とした。このベクター中への挿入によりプラスミドｐＳＰＭＨＡ４１を産生した。Ｈ６プロモーターとＨＡ遺伝子の開始コードンとの間のＸｈｏＩ部位を、オリゴヌクレオチドＨＡＸＨＯＤ（配列番号７）（５′−ＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＴＣＡＣＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＣＣＧＧＡＴ−３′）を用いたオリゴヌクレオチド定方向２本鎖開裂突然変異（マンデック、1982）により除去した。プラスミドｐＳＰＭ２ＬＨＡＶＣをこの方法により産生した。レスキューイングウイルスとしてのワクチニアウイルスｖＰ４５８による生体外組換え実験において、プラスミドｐＳＰＭ２ＬＨＡＶＣの挿入を用いて組換え体ｖＰ５５７を産生した。ｖＰ４５８はｖＰ４１０のＭ２Ｌ挿入部位にＥ．ｃｏｌｉ乳Ｚ遺伝子を含有する。このワクチニアウイルス組換え体は、乳Ｚ遺伝子を置換する、ゲノムのＭ２Ｌ座中に麻疹ＨＡ遺伝子を含有する。
【００３６】
実施例２−麻疹融合遺伝子を含有するワクチニアウイルス組換え体の産生
第２図を参照する。アニールしたオリゴヌクレオチド３ＰＡ（配列番号８）（５′−ＣＣＴＡＡＡＧＴＴＴＧＡＴＣＴＴＡＣＧＧＧＡＡＣＡＴＣＡＡＡＡＴＣＣＴＡＴＧＴＡＡＧＧＴＣＧＣＴＣＴＧＡＴＴＴＴＴＡＴＣＧＧＣＣＧＡ−３′）および麻疹融合遺伝子の３′末端、ワクチニアウイルス初期転写終止信号（ユエンら、1987）およびＥａｇＩ末端並びにＨｉｎｄＩＩＩ末端を含有する３ＰＢ（配列番号９）（５′−ＡＧＣＴＴＣＧＧＣＣＧＡＴＡＡＡＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＡＣＣＴＴＡＣＡＴＡＧＧＡＴＴＴＴＧＡＴＧＴＴＣＣＣＧＴＡＡＧＡＴＣＡＧＧＣＴＴＴＡＧＧ−３′）を、ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＵＣ８およびｐＣＲＦ２からの１ｋｂｐのＳａｌＩ／ＨａｅＩＩＩ断片（カナダＨ３Ａ  １Ａ１、モントリオール、Ｃ．リチャードソン、カナダの国立研究議会（生物工学研究所）から得られる）に連結した。生成したプラスミドｐＭＦ３ＰＲ１４は麻疹融合遺伝子の１ｋｂｐの断片の３′末端を含有した。
【００３７】
５′ＳｍａＩ部位と３′ＢｓｔＸＩ部位を含有する、アニールしたオリゴヌクレオチド５ＰＡ（配列番号１０）（５′−ＧＧＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＴＣＴＧＣＣＡＴＡＴＴＣ−３′）および５ＰＢ（配列番号１１）（５′−ＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＣＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＧＡＣＣＣＡＴＣＣＣ−３′）を、ｐＣＲＦ２からの８２０ｂｐのＢｓｔＸＩ／ＳａｌＩ断片およびＳｍａＩとＳａｌＩで切断したｐＵＰ８に連結した。生成したプラスミドｐＳＰＭＦ５Ｐ１６は麻疹融合遺伝子の５′部分を含有した。ｐＳＰＭＦ５Ｐ１６からの８２０ｂｐのＳｍａＩ／ＳａｌＩ断片およびｐＭＦ３ＰＲ１４からの１ｋｂｐのＳａｌＩ／ＥａｇＩ断片を、ＳｍａＩとＥａｇＩで切断したｐＴＰ１５中に連結した。プラスミドｐＴＰ１５（グオら、1989）は、ワクチニアウイルス（コペンハーゲン菌株）ゲノムのＨＡ座からの配列により側腹に連結したワクチニアウイルス初期／後期Ｈ６プロモーターを含有する。ＨＡ挿入プラスミド内のＨ６プロモーターに並列した３′の麻疹融合遺伝子を含有する生成プラスミドをｐＳＰＨＭＦ７と称した。
【００３８】
オリゴヌクレオチド定方向突然変異をｐＳＰＨＭＦ７に行なった。最初に生体外突然変異反応（マンデック、1982）を行なって、オリゴヌクレオチドＰＳＭＡＤ（配列番号１２）（５′−ＴＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴ−ＴＴＧＴＡＴＧＧＴＡＡＴＧＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＴ−３′）を用いたＳｍａＩ部位の除去によりＨ６プロモーターと麻疹融合遺伝子との正確なＡＴＧ：ＡＴＧ連結を生成した。これによりｐＳＰＭＦ７５Ｍ２０が生成した。続いて、既知の方法（マンデック、1982）にしたがってオリゴヌクレオチドＳＰＢＧＬＤ（配列番号１３）（５′−ＡＡＴＡＡＡＴＣＡＣＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡＴＴＣＴＴＴＡＴＴＣＴＡＴＡＣＴＴＡＡＡＡＡＧＴ−３′）を用いてＨ６プロモーターの５′末端のＢｇｌＩＩ部位を除去した。生成したプラスミドをｐＳＰＭＦＶＣと称した。レスキューイングウイルスとしてのワクチニアウイルスｖＰ４１０により生体外組換え実験においてこのプラスミドを用いてｖＰ４５５を産生した。
【００３９】
実施例３−イムノプレシピテーション分析
組換え体ｖＰ４５５およびｖＰ５５７が真正のタンパク質を発現したことを確認するために、記載した方法（テイラーら、1990）にしたがってイムノプレシピテーション実験を行なった。手短に言うと、ベロ細胞単層を３５Ｓ−メチオニンの存在下で細胞当り１０ｐｆｕで親ウイルスまたは組換えウイルスのいずれかで感染せしめた。カルボキシ末端融合ペプチドに対して直列した家ウサギ抗血清を用いて感染細胞溶解産物から融合タンパク質を特異的に沈殿せしめた。多クローン性単特異生抗血清を用いて感染細胞溶解産物から血球凝集素タンパク質を特異的に沈殿せしめた。融合特異血清を用いたイムノプレシピテーションに関して、未感染ベロ細胞、親感染ベロ細胞、またはＨＡ組換え体ｖＰ５５７に感染した細胞中には全く放射線標識産生物は検出されなかった。融合組換え体ｖＰ４５５に感染した細胞において、約６０ｋｄの分子量を有する融合前駆体Ｆ０および４４ｋｄと２３ｋｄの分子量を有する２つの開裂産生物Ｆ１とＦ２が検出された。同様に、約７５から７７ｋｄの分子量を有するＨＡタンパク質のグリコシル化形状のイムノプレシピテーションに関して、未感染ベロ細胞、親感染細胞、またはｖＰ４５５に感染したベロ細胞中には産生物は全く検出されなかった。
【００４０】
加えて、イムノフルオレセンス研究は、両者のタンパク質が感染細胞表面上に発現されたことを示した。
【００４１】
実施例４−細胞融合実験
麻疹ウイルス属細胞変性性の特徴は、感染細胞と周囲の未感染細胞との融合により生じる融合細胞の形成であり、続いてその融合細胞の中心に向かって核が移動する（ノービーら、1982）。これはウイルス拡散の重要な方法であることが示されており、その拡散はパラミクソウイルス属に関して、血球凝集素特異抗体の存在下で生じ得る（マーツら、1980）。この能力は、他のパラミクソウイルス属との相似によりＦ１ペプチドのアミノ末端にあるとされている（ショパンら、1981；ノビックら、1988；パターソンら、1987）。
【００４２】
ワクチニアウイルス中で発現された麻疹ウイルスタンパク質が機能的に活性であることを確認するために、ベロ細胞単層に、それぞれ細胞当り１ｐｆｕの、親のまたは組換えウイルスｖＰ４５５およびｖＰ５５７を接種した。37℃での１時間の吸収後、接種物を取り出し、オーバーレイ媒質を置き換えて、接種物の入ったプレートを37℃で一晩培養した。感染の18時間後、プレートを顕微鏡で観察し、写真を写した。親ウイルスであるｖＰ４５５またはｖＰ５５７を接種したベロ細胞には全く細胞融合活性が見られなかった。しかしながら、ｖＰ４５５およびｖＰ５５７をともに接種した場合に、十分な細胞融合活性が観察された。
【００４３】
この結果は、麻疹／ワクチニアウイルス組換え体に感染した様々な細胞系における融合細胞の形成には、融合および血球凝集素遺伝子の両者の発現が必要であることを確認したウィルドら（1991）により最近確認された。しかしながら、その結果は、麻疹融合タンパク質を発現する非常に多重なアデノウイルス組換え体に感染した293 の細胞中の細胞融合を記載した先の報告（アルハチブ、1990）とは著しく異なる。同様に、麻疹融合タンパク質を発現するバキュロウイルス組換え体に感染した昆虫細胞中で、ｐＨ５．８で培養したときにのみに細胞融合が観察されたことが報告されている（ブィアラードら、1990）。いずれの場合においても、融合活性は、麻疹血球凝集素タンパク質を発現する適切な組換え体による共感染（ｃｏ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）により高められなかった。融合工程に含まれる変化要因は、細胞の種類（ギロードンら、1984）、媒質のｐＨ（ブィアラードら、1990）および融合タンパク質の発現水準（ノービーら、1982）である。
【００４４】
実施例５−血清試験
ウイルス中和（ＶＮ）抗体試験の技術は先に詳細に記載している（アペルら、1973）。ＣＤＶ−ＶＮ抗体滴定試験を、ＣＤＶの適応オンダーステポート（Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ）菌株によりベロ細胞中で行なった。ＭＶ−ＶＮ抗体滴定の試験は、ＭＶの適応エドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）菌株によりベロ細胞中で行なった。血清試験の結果を表１に示す。
【００４５】
実施例６に記載したように、麻疹融合タンパク質を発現するｖＰ４５５またはワクチニア親ウイルスのいずれかで免疫化したイヌは、ＭＶに対する中和抗体を発生させなかった。ＨＡタンパク質を発現するｖＰ５７７で免疫化したか、または組換え体ｖＰ４５５およびｖＰ５５７の両者で共接種したイヌは、１回の接種後に中和抗体を発生された。抗体の水準は、ＭＶの弱毒化エドモンストン菌株の接種により誘発された水準と等しかった。
【表１】
2005040129.tif 000002
【００４６】
実施例６−動物防御研究
組換え体を接種したイヌ中の麻疹ウイルスタンパク質の発現がＣＤＶ抗原投与に対する防御免疫反応を誘発するのに十分であるかどうかを確認するために、14匹の生後10週間の、特定の病原体のないビーグル犬について研究した。血液試料を実験の最初と、その後に繰り返し集積した。各群２匹ずつの４つの群を、３週間間隔で２回の注射で免疫化した。第１の群にはワクチニアウイルスのみを注射した。第２の群には、麻疹ウイルスのＦタンパク質（ｖＰ４５５）の挿入物を有するワクチニアウイルスを注射した。第３の群には、ＭＶのＨＡ抗原（ｖＰ５５７）の注入物を有するワクチニアウイルスを注射し、第４の群には第２と第３の組合せを注射した。各イヌに、１ｍｌの量中約４×10８ｐｆｕ（皮下で0.6 ｍｌ、筋肉内で0.4 ｍｌ）のワクチニアウイルスを接種した。２匹の対照イヌには10５ 50％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）のＭＶの弱毒化エドモンストン菌株を筋肉内に注射し（１ｍｌの量）、２匹の対照イヌには、毒性ＣＤＶの抗原投与の前に10４ ＴＣＩＤ５０のＣＤＶの弱毒化ロックボーン菌株を皮下に注射した。２匹のイヌは、抗原投与の前には接種されない状態であった。
【００４７】
最後の接種の２週間後に、全てのイヌを、10４ ＴＣＩＤ５０の毒性ＣＤＶのスナイダーヒル菌株を含有する１ｍｌの細胞培養液体を鼻内接種することにより抗原投与した。イヌの臨床反応を、毎日の観察および体温の記録により、そして２週間に１回体重の増加または減少の記録により監視した。循環血液リンパ球を、抗原投与の前および抗原投与後の日数（ｄｐｃ）３、５、７および10で数えた。イヌの肺のマクロファージによる共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）による被膜形成細胞からのウイルスの単離（アペルら、1967）をｄｐｃ３、５、７および10で行なった。血清試験の血液試料は、ワクチン接種の前、抗原投与の時期までの１週間ごと、およびｄｐｃ７、10および20で集積した。
【００４８】
抗原投与の結果を表２に示す。
【表２】
2005040129.tif 000003
【００４９】
免疫化していない対照イヌおよび親ワクチニアウイルスでワクチン接種したイヌは重い病気の臨床的徴候を示し、脱水症状が明確になったときに安楽死させた。ｖＰ４５５で免疫化した療法のイヌは、対照のイヌに見られたのよりも短い期間であるけれども、体重損失、体温の上昇、およびリンパ球減少を含むＣＤＶに感染した徴候を示した。言うまでもなく、両方のイヌが致死量のＣＤＶの抗原投与にもかかわらず生き残った。ｖＰ５５７を接種したイヌまたは療法の組換え体を共接種したイヌは、感染の最小限の徴候を示し、抗原投与にも生き残った。ＭＶの弱毒化エドモンストン菌株またはＣＤＶの弱毒化ロックボーン菌株のいずれかで接種したイヌはまた、最小限の病気の徴候を示して抗原投与にも生き残った。
【００５０】
実施例７−追加のワクチニア／麻疹構成物
ここで第３図を参照する。プラスミドｐＲＷ８４３の挿入により、ｔｋ座内に麻疹ＨＡ遺伝子を含有する第２のワクチニアウイルス組換え体を産生した（ｖＰ７５６）。ｐＲＷ８４３を以下の方法に従って構成した。正確なＡＴＧ：ＡＴＧ配列中に３′−末端側の２６ｂｐを欠損したＨＡ遺伝子と融合したＨ６プロモーターの３′−末端側の２４ｂｐを含有する１．８ｋｂｐのＥｃｏＲＶ／ＳｍａＩ断片をｐＳＰＭ２ＬＨＡＶＣから単離した。この断片を用いてｐＳＰＭＨＡ１１の１．８ｋｂｐのＥｃｏＲＶ／ＳｍａＩ断片を置き換えてｐＲＷ８０３を産生した。プラスミドｐＲＷ８０３は、正確に完全な麻疹ＨＡ遺伝子と連結した完全なＨ６プロモーターを含有する。
【００５１】
麻疹ＨＡ遺伝子を有する先の構成物を確認すると、公表された配列と比較してコードン１８（ＣＣＣ）の配列が欠損したことに気付いた（アルハチブら、1986）。オリゴヌクレオチドＲＷ１１７（配列番号１４）（５′−ＧＡＣＴＡＴＣＣＴＡＣＴＴ−ＣＣＣＴＴＧＧＧＡＴＧＧＧＧＧＴＴＡＴＣＴＴＴＧＴＡ−３′）
Ｐｒｏ  １８
を使用するクンケル法（クンケル、1985）を用いてオリゴヌクレオチド突然変異誘発によりＣＣＣ配列を置き換えた。ｐＩＢＩ２５中のｐＲＷ８０３からのＨ６／ＨＡカセッテを含有するプラスミドｐＲＷ８１９から１本鎖のテンプレートを誘導した（ＩＢＩ、ニューハブン、ＣＴ．）。コードン１８でプロリン残基をコードする挿入物（ＣＣＣ）を含有する突然変異誘発プラスミドをｐＲＷ８２０と称した。ｐＲＷ８２０のＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ部位の間の配列を、ヌクレオチド配列分析により確認した。ＨｉｎｄＩＩＩ部位はＨ６プロモーターの５′縁に位置し、一方ＸｂａＩ部位はＨＡ遺伝子の開始コードンから２３０ｂｐ下流に位置する。ＸｂａＩから下流のＨＡ暗号配列を含有し、終止コードンを含有する、ｐＲＷ８０３からの１．６ｋｂｐのＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ断片を用いてｐＲＷ８２０の等量の断片を置き換え、ｐＲＷ８３７を産生した。ｐＲＷ８３７内に含有される突然変異誘発の発現カセッテは、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩでの切断により誘導し、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でのＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片を用いて鈍端としてｐＳＤ５７３ＶＣＱのＳｍａＩ部位に挿入してｐＲＷ８４３を産生した。レスキューイングウイルスとしてのｖＰ６１８による生体外組換え実験においてプラスミドｐＲＷ８４３を用いてｖＰ７５６を産生した。親ウイルスｖＰ６１８は、チミジンキナーゼ、出血性およびＡ型含有遺伝子が欠損せしめられたコペンハーゲン菌株ウイルスである。約７５ｋｄの血球凝集素糖タンパク質を正確に発現するイムノプレシピテーション分析により組換え体ｖＰ７５６が示されている。
【００５２】
ここで第４図を参照する。ゲノムのＡＴＩ座に麻疹融合遺伝子を含有する第２のワクチニアウイルス組換え体（ｖＰ８００）を、プラスミドｐＲＷ８５０の挿入により産生した。ｐＲＷ８５０を構成するために、以下の操作を行なった。正確にＡＴＧ：ＡＴＧ配列中にＨ６プロモーターと連結した麻疹融合遺伝子を含有するプラスミドｐＳＰＭＦ７５Ｍ２０をＮｒｕＩとＥａｇＩで切断した。Ｈ６プロモターターの３′−末端側の２８ｂｐおよび完全な融合遺伝子を含有する１．７ｋｂｐの鈍端の断片を単離して、ＮｒｕＩとＸｂａＩで切断し鈍端としたｐＲＷ８２３に挿入した。生成したプラスミドｐＲＷ８４１は、ｐＩＢＩ２５プラスミドベクター中に麻疹融合遺伝子に連結したＨ６プロモーターを含有する（ＩＢＩ、ニューハブン、ＣＴ．）。ＳｍａＩでの切断によりｐＲＷ８４１からＨ６／麻疹融合発現カセッテを誘導し、生成した１．８ｋｂｐ断片を、ＳｍａＩで切断したｐＳＤ４９４ＶＣに挿入してｐＲＷ８５０を産生した。レスキューイングウイルスとしてのｖＰ６１８により生体外組換え実験においてプラスミドｐＲＷ８５０を用いてｖＰ８００を産生した。確実に処理した融合糖タンパク質を発現するイムノプレシピテーション分析により組換え体ｖＰ８００が示された。
【００５３】
実施例８−ｖＰ４５５を接種した家ウサギとモルモット中の麻疹中和抗体の評価
２匹の家ウサギを、麻疹融合タンパク質を発現する合計１×10８ｐｆｕの組換え体ｖＰ４５５により５つの部位に皮内に接種した。両方の家ウサギに12週間後それぞれ接種により追加抗原投与した。追加抗原投与後２週間、すなわち14週間後に連続的な流血を集積し、家ウサギを血清中和抗体の存在について試験した。
【００５４】
４匹のモルモットをそれぞれ１×10８ｐｆｕの組換え体ｖＰ４５５で皮下に接種した。それぞれの抗原投与接種は21日後に行なった。連続的な出血を集積した。
【００５５】
麻疹ウイルス血清中和抗体の存在を、マイクロタイタウェル（ｗｅｌｌ）当り１０ＴＣＩＤ５０のウイルスを用いたマイクロタイタ試験（アペルら、1973）により評価した。その結果を表３に示す。
【表３】
2005040129.tif 000004
【００５６】
実施例９−麻疹ウイルス組換えカナリヤポックスウイルスの産生
鶏痘ウイルスについて先に記載したものと同様な方法を用いて、麻疹／カナリヤポックスウイルス組換え体を産生した（テイラーら、1988ａ、ｂ）。
【００５７】
麻疹ＦおよびＨＡ遺伝子をカナリヤポックスウイルス中に挿入するプラスミドを以下のようにして産生した。
【００５８】
ここで第５図を参照する。Ｈ６プロモートした麻疹Ｆ遺伝子を含有するｐＳＰＭＦ７５Ｍ２０からの１．８ｋｂｐの鈍端ＢｇｌＩＩ／ＥａｇＩ断片をｐＲＷ７６４．２の鈍端ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。プラスミドｐＲＷ７６４．２は、ウイルス複製に可欠であると確認された独特なＥｃｏＲＩ部位を有するカナリヤポックスゲノムからの３．４ｋｂｐのＰｖｕＩＩ断片を含有する。麻疹Ｆ遺伝子を含有する生成したプラスミドはｐＲＷ８００と称し、レスキューイングウイルスとしてのカナリヤポックスによる組換え実験に用いてｖＣＰ４０を産生した。
【００５９】
ここで第６図を参照する。正確なＡＴＧ：ＡＴＧ配列でＨＡと融合したＨ６プロモーターの３′−末端側の２８ｂｐを含有するｐＳＰＭ２ＬＨＡからの１．８ｋｂｐのＥｃｏＲＶ／ＳｍａＩ断片を、ｐＳＰＭＨＡ１１のＥｃｏＲＶおよびＳｍａＩ部位の間に挿入した。生成したプラスミドをｐＲＷ８０３と称した。Ｈ６プロモートした麻疹ＨＡ遺伝子を含有するｐＲＷ８０３の２ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片を鈍端として、プラスミドｐＲＷ７６４．５の鈍端ＢｇｌＩＩ部位に挿入した。プラスミドｐＲＷ７６４．５は、ウイルスの成長に可欠であると先に確認された独特なＢｇｌＩＩ部位を有するカナリヤポックスゲノムの８００ｂｐ  ＰｖｕＩＩ断片を含有する。この挿入により、組換え試験に用いたプラスミドｐＲＷ８１０を生成してｖＣＰ５０を産生した。
【００６０】
麻疹ＦおよびＨＡ配列の挿入により個別に、それぞれ組換え体ｖＣＰ４０およびｖＣＰ５０を発生せしめた。二重の組換え体を生成するために、ｐＲＷ８１０に含まれるＨＡ遺伝子を挿入するレスキューイングウイルスとして単一Ｆ組換えｖＣＰ４０を用いた。これにより二重の組換え体ｖＣＰ５７が発生した。
【００６１】
実施例１０−イムノプレシピテーション分析
組換え体ｖＣＰ４０、ｖＣＰ５０およびｖＣＰ５７が真正のタンパク質を発現したことを確認するために、ＨＡまたはＦタンパク質にいずれかに対して指向性のある単一特異性血清を用いたイムノプレシピテーション分析を行なった。ｖＣＰ４０とｖＣＰ５７に感染した細胞の溶解産物から、正確に処理した融合ポリペプチドを特異的に沈殿せしめた。約６０ｋｄの分子量を有する融合前駆体Ｆ０およびそれぞれ約４４ｋｄおよび２３ｋｄの分子量を有する２つの開裂産物Ｆ１およびＦ２を検出した。未感染ＣＥＦ細胞、親感染ＣＥＦ細胞またはＨＡ組換え体ｖＣＰ５０に感染したＣＥＦ細胞中にはどの融合特異産生物も検出不可能であった。同様に、単一ＨＡ組換え体ｖＣＰ５０および二重組換え体ｖＣＰ５７に感染したＣＥＦ細胞から、約７５ｋｄの糖タンパク質が特異的に沈殿せしめた。未感染細胞、親感染細胞または融合組換え体ｖＣＰ４０に感染した細胞中にはどのＨＡ特異産生物も検出されなかった。
【００６２】
実施例１１−細胞融合実験
麻疹ウイルス組換え体が機能的に活性であることを確認するために、細胞融合検定を行なった。ベロ細胞単層を、細胞当り１ｐｆｕのＣＰ親または組換えウイルスで感染せしめ、感染から18時間後に細胞変性効果を試験した。親、ｖＣＰ４０またはｖＣＰ５０ウイルスを接種したベロ細胞中には全く細胞融合活性は明確にはならなかった。しかしながら、ベロ細胞に二重組換え体ｖＣＰ５７を接種したときまたは細胞をｖＣＰ４０とｖＣＰ５０の両方で共接種したときに、十分な細胞融合活性が示された。
【００６３】
実施例１２−血清試験
実施例１３に記載するように、カナリヤポックス／ＨＡ組換え体ｖＣＰ５０、ワクチニア／ＨＡ組換え体ｖＰ５５７、カナリヤポックス／ＨＡ／Ｆ二重組換え体ｖＣＰ５７を接種したイヌまたはｖＰ４５５とｖＰ５５７で共接種したイヌは、１回の接種の後に麻疹ウイルスに対して著しい血清中和抗体を発生せしめた。カナリヤポックス／Ｆ組換え体ｖＣＰ４０を接種した２匹のイヌのいずれも、１または２回の接種の後に中和抗体を発生せしめなかった。血清試験の結果を表４に示す。
【００６４】
加えて、ｖＣＰ４０を接種したモルモットは再現できるが低い水準の血清中和抗体を発生した。
【表４】
2005040129.tif 000005
【００６５】
実施例１３−動物防御研究
麻疹ウイルスタンパク質を発現する非複製カナリヤポックスベクターがＣＤＶ抗原投与に対する防御免疫反応を誘発するかどうかを確認するために、生後10週間の特定の病原を有さないビーグル犬にカナリヤポックス親および組換えウイルスを接種した。２匹のイヌに１×10８ｐｆｕの各組換え体の皮下注射を３週間の間隔で２回、同時に接種した。比較するために、あるイヌは同一の摂生で、単一のワクチニアウイルス組換え体ｖＰ４５５およびｖＰ５５７並びにその両方の組合せのそれぞれを接種した。あるイヌはまた、ＭＶの弱毒化エドモンストンの10５ ＴＣＩＤ５０の１回の投与量を筋肉内に接種した。あるイヌは、ＣＤＶの弱毒化ロックボーン菌株の10４ ＴＣＩＤ５０の１回の投与量を皮下に接種した。それぞれのイヌに、鼻内の最終接種の２週間後、致死量のＣＤＶの毒性スナイダーヒル菌株の10４ ＴＣＩＤ５０を抗原投与した。イヌの臨床反応を毎日監視した。結果を表５に示す。
【表５】
2005040129.tif 000006
【００６６】
実験の過程中にどのイヌにもワクチン接種に反する反応は見られなかった。親カナリヤポックスウイルスで免疫化した２匹のイヌおよび２匹の非免疫化対照イヌは毒性ＣＤＶの抗原投与後重大な病気を示した。４匹のイヌ全てが上昇した体温、体重損失、リンパ球減少症およびひどい脱水症状を示した。ＣＤＶロックボーンで免疫化したイヌは、抗原投与の前にＭＶに対してではなくＣＤＶに対する血清中和抗体を発生し、抗原投与にも生き残り、症状は示さなかった。弱毒化ＭＶで免疫化したイヌは、抗原投与の前にＣＤＶではなくＭＶに対する血清中和抗体を発生し、穏やかな感染の徴候を見せたが抗原投与に生き残った。ｖＣＰ５０、ｖＣＰ５７、ｖＰ５５７を接種したイヌまたはｖＰ４４５およびｖＰ５５７を共接種したイヌは、１回の接種の後にＭＶに対する著しい血清中和抗体を発生し、ほとんど症状を示さず抗原投与に生き残った。
【００６７】
実施例１４−追加のカナリヤポックス／麻疹構成物
ここで第７図を参照する。ＭＶ  ＨＡ遺伝子を発現するカナリヤポックスウルイス組換え体を産生するために、以下の挿入プラスミドを生成した。正確に麻疹ＨＡに連結されたＨ６プロモーターの３′末端側の２６ｂｐを含有するｐＲＷ８３７から１．８ｋｂｐのＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ断片を、ｐＲＷ８３８からの３．２ｋｂｐのＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ断片に連結した。ｐＲＷ８３８誘導断片は、Ｈ６プロモーターの５′部分およびＣ５座側腹アームを含有する。プラスミドｐＲＷ８３８およびｐＲＷ８３１（下記以下参照）を以下に従って誘導した。
【００６８】
８８０ｂｐ  ＰｖｕＩＩカナリヤポックス遺伝子断片をｐＵＣ９のＰｖｕＩＩ部位の間に挿入した。生成したプラスミドはｐＲＷ７６４．５と称した。製造者の仕様書に従って改良Ｔ７酵素シーケナーゼＴＭキット（米国、バイオケミカル、クレブランド、ＯＨ）を用いて、８８０ｂｐカナリヤポックス断片のヌクレオチド配列を求めた。配列反応は、バイオサーチ8700（サンラファエル、ＣＡ）またはアプライドバイオシステムス3800（フォスターシティー、ＣＡ）により調製された注文合成プライマー（17−18mers）を用いた。これによりＣ５読み取り枠の規定が可能になった。
【００６９】
特異的にＣ５読み取り枠を欠損せしめるために、ＲｓａＩでｐＲＷ７６４．５を部分的に切断し、線状産生物を単離した。ＲｓａＩ線状断片をＢｇｌＩＩで再度切断し、位置１５６から位置４６２が欠損したＲｓａＩ−ＢｇｌＩＩを有するｐＲＷ７６４．５断片を単離して、以下の合成オリゴヌクレオチドのベクターとして用いた：ＲＷ１４５（配列番号１５）：（５′−ＡＣＴＣＴＣＡＡＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＡＡＡ−３′）ＲＷ１４６（配列番号１６）：（５′−ＧＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＡＡＡＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＴＧＡＧＡＧＴ−３′）。オリゴヌクレオチドＲＷ１４５およびＲＷ１４６をアニールし、上述したｐＲＷ７６４．５ＲｓａＩ−ＢｇｌＩＩベクター中に挿入した。生成したプラスミドはｐＲＷ８３１である。
【００７０】
このＣ５欠損プラスミドは、他のカナリヤポックスウイルス読み取り枠の妨害なく形成された。Ｃ５暗号配列を、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、およびＥｃｏＲＩの制限部位を含む上述アニールしたオリゴヌクレオチド（ＲＷ１４５およびＲＷ１４６）で置き換えた。
【００７１】
狂犬病Ｇ遺伝子（テイラーら、1988ｂ）並列３′を含有するＳｍａＩ断片をワクチニアウイルスＨ６プロモーターに挿入することによりｐＲＷ８３１からプラスミドｐＲＷ８３８を誘導した。ｐＲＷ８３７からの１．８ｋｂｐのＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ断片をｐＲＷ８３８からの３．２ｋｂｐのＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ断片に連結することによりプラスミドｐＲＷ８５２を構成した。プラスミドｐＲＷ８５２を、ＡＬＶＡＣと称するカナリヤポックス単離体による組換え実施例に用いてｖＣＰ８５を産生した。ＡＬＶＡＣは、カナリヤのワクチン接種に用いられるカナリヤポックスウイルス（ＣＰＶ）の非常に弱毒化した菌株である、レントシュラー菌株から誘導したＣＰＶのプラーククローン単離体である。ＡＬＶＡＣおよび誘導組換え体の複製は、鳥類種に制限されている。家ウサギ抗ＨＡ血清により認識される約７５ｋｄのタンパク質が組換え体ｖＣＰ８５に感染したＣＥＦ細胞中に発現されることがイムノプレシピテーション分析により確認された。
【００７２】
ここで第８図を参照する。ＭＶ  ＨＡおよびＦ遺伝子の両方を含有するカナリヤポックスウイルス組換え体を産生するために、以下の構成物を生成した。ＳｍａＩ制限部位をＨ６プローモートした麻疹融合遺伝子の末端に加えた。これを行なうために、ワクチニアウイルスＨ６プロモーターを含有するｐＩＢＩ２５であるｐＲＷ８２３をＸｂａＩ部位のプロモーター配列の下流で切断した。その末端を、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で鈍端とした。鈍端ＤＮＡを続いてＮｒｕＩで切断して、Ｈ６プロモーターの５′末端側の１００ｂｐを含有する３．０ｋｂｐ断片を離生した。この断片を単離して、ｐＳＰＭＦ７５からの１．７ｋｂｐの鈍端ＥａｇＩ／ＮｒｕＩ断片に連結した。生成したプラスミドをｐＲＷ８４１と称した。
【００７３】
ｐＲＷ８４１の切断により誘導された１．８ｋｂｐのＳｍａＩ断片をＣ５欠損ベクター、ｐＲＷ８３１中に挿入した。プラスミドｐＲＷ８５１を、３′末端を融合遺伝子に位置させたＥｃｏＲＩ部位で線状にして、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で鈍端とした。Ｈ６プロモーター配列に対して麻疹ＨＡ遺伝子並列３′末端を含有するプラスミドｐＲＷ８３７をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断して、クレノー断片で鈍端とした。生成した１．８ｋｂｐ断片を単離して、ＥｃｏＲＩで線状にされ鈍端となったｐＲＷ８５１中に挿入した。生成したプラスミドは尾から尾の配置に両方の遺伝子を含有し、これをｐＲＷ８５３Ａと称し、レスキューイングウイルスとしてのカナリヤポックス（ＡＬＶＡＣ）による生体外組換え実験において用い、ｖＣＰ８２を産生し、これをＡＬＶＡＣ−ＭＶと称した。イムノプレシピテーションおよびイムノフルオレセンスを用いた発現分析により、組換え体ｖＣＰ８２に感染した細胞中において、真正に処理したＨＡおよびＦタンパク質が発現されたことが確認された。組換え体は細胞融合活性について機能的であった。
【００７４】
ＡＬＶＡＣ−ＭＶ（ｖＣＰ８２）を接種したモルモットと家ウサギの血清の血清分析結果
４匹のモルモットにＡＬＶＡＣ−ＭＶ（ｖＣＰ８２）を皮下経路で接種した。２匹のモルモット（０２６および０２７）にそれぞれ１×10８ｐｆｕを接種し、もう２匹のモルモット（０２８および０２９）にはそれぞれ１×10７ｐｆｕを接種した。28日後に、モルモットに同一量を再接種した。２匹の家ウサギに、皮下経路で１×10８のＡＬＶＡＣ−ＭＶ（ｖＣＰ８２）を接種した。28日後に、家ウサギに同一量を再接種した。アペルとロビンソン（1973）により記載されたマイクロタイタ中和試験またはアルブレフトら（1981）により記載されたプラーク低減中和試験のいずれかを用いて、これらの動物の連続的な流血を、麻疹ウイルス中和活性について分析した。加えて、マーツら（1980）に記載されたように行なった抗融合検定において麻疹ウイルス誘導細胞−細胞融合を阻害できる抗体の存在について、血清を分析した。
【００７５】
麻疹ウイルス血清中和抗体の存在についての分析結果を表６および７に示す。１×10８のＡＬＶＡＣ−ＭＶを接種されたモルモット（０２６および０２７）の両方は１回の接種後に血清転化して、血清は追加抗原投与の接種後に抗体の上昇を示した。１×10７ｐｆｕを接種された１匹のモルモット（０２９）はまた、１回の接種後に血清転化した。４匹めのモルモットは、１回の接種後に検知可能な応答を示さなかったが、２回の接種後に等量の力価を達成した。
【００７６】
プラーク低減中和法を用いて家ウサギの血清もまた分析した。結果を表７に示す。両方の動物は１回の接種後に血清転化した。家ウサギ０６３の血清を、マイクロタイタ中和試験およびプラーク低減中和試験の両方により試験した。両方の方法を用いて得られた力価は同じであった。病気からの防御には、ワクチン接種した子供に1.2 から1.9 の最小限の血清中和力価が必要であることが報告されている（レノンおよびブラック、1986；ブラックら、1984）。この分類基準を用いて、２回の接種まで血清転化を示さなかった１匹のモルモットを除いて全ての動物が、１回の接種後に防御水準の抗体を示した。
【表６】
2005040129.tif 000007
【表７】
2005040129.tif 000008
【００７７】
不活性化したワクチンは、乏しい防御効能およびウイルスへの再露出で高められた麻疹病に関連することが以前に研究により示されている。不活性ワクチンの宿主は融合タンパク質に対する抗体がないことを示し、不活性化工程がタンパク質を非免疫遺伝にすることが提議されている（ノービーおよびゴルマー、1975；ノービーら、1975）。加えて、他のパラミクソウイルスに関して、Ｆタンパク質に対する抗体が組織培養中のウイルスの細胞から細胞への拡散を促成でき、一方血球凝集素成分に対する抗体はそのようにはできないことが示されている（マーツら、1980）。
【００７８】
それゆえ、ＡＬＶＡＣ−ＭＶ（ｖＣＰ８２）を接種した動物が、麻疹ウイルスの細胞から細胞への伝染を阻害できるＦタンパク質に対する抗体を誘発できたことを示すことは重大であった。この抗融合検定の結果を表８に示す。抗融合活性は、ＡＬＶＡＣ−ＭＶ（ｖＣＰ８２）を接種したモルモットと家ウサギの両方の血清において明白であった。分析した血清は、追加抗原投与の接種後２または３週間で採取した。ＡＬＶＡＣ親ウイルスを接種した家ウサギの血清中には、どの抗融合活性も検出できなかった。
【表８】
2005040129.tif 000009
【００７９】
ＡＬＶＡＣ−ＭＶを接種した動物の血清中のＭＶ血球凝集素およびＭＶ融合タンパク質の両方に対する抗体の存在を示すさらなる試験において、イムノプレシピテーション実験を行なった。ＡＬＶＡＣ−ＭＶを接種した家ウサギの血清は、エドモンストン菌株ＭＶを接種したベロ細胞の放射線標識した溶解産物からの血球凝集素および融合タンパク質の両方を特異的に沈殿せしめることが示された。
【００８０】
同様の研究において、モルモット、家ウサギおよびネズミの群を、筋肉内にＡＬＶＡＣ−ＭＶを接種し、麻疹ウイルスに対するそれらの血清反応について、血球凝集−阻害（ＨＩ）試験を用いてモニターした。カナリヤポックスウイルスに対する血清反応はＥＬＩＳＡ検定によりモニターした。この研究において、５匹のモルモットに5.5 ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０を接種し、30匹のネズミに4.8 ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０を接種し、５匹の家ウサギに5.8 ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０を接種した。全ての動物に、28日後に等量を再接種した。動物を規則的な間隔で出血させ、麻疹ウイルスに対するそれらの反応をＨＩ検定で評価した。ＨＩ検定における検出限界は、１のｌｏｇ１０力価に対応し、血清陽性（防御）の子供は1.6 から2.8 の範囲の血清力価を有すると考えられる。分析結果を表９、１０および１１に示す。
【００８１】
ネズミの血清を５つの動物の群に別けて分析した（表９）。全ての動物は、２回目の接種後に追加抗原投与したカナリヤポックスウイルスに対して初期の応答を示した。ネズミは１回の接種後にはＭＶに対する応答を示さなかった。６つの群のうち３つの群が、接種後８週間で防御範囲内の力価を示した。同様に、全てのモルモット（表１０）が、２回目の接種後に追加抗原投与した１回目の接種後のカナリヤポックスウイルスに対して応答を示した。５匹の動物のうち４匹が１回の接種後に抗ＨＩ力価を発生させ、これらのうち１つが防御範囲内にあった。２回目の接種の１週間後、全ての動物の力価が防御範囲内にあった。これらの力価は、実験を終了した接種後８週間まで保持された。ＡＬＶＡＣ−ＭＶ（ｖＣＰ８２）を接種した全ての家ウサギ（表１１）は、カナリヤポックス接種に対して血清学的に反応した。５匹の動物のうち４匹が１回の接種後に麻疹ウイルスに対して血清転化した（そのうち１つが防御範囲内にあった）。全ての動物の血清力価は、２回目の接種後１週間で防御範囲内にあった。
【表９】
2005040129.tif 000010
【表１０】
2005040129.tif 000011
【表１１】
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【００８２】
ＡＬＶＡＣ−ＭＶ（ｖＣＰ８２）を接種したリスサル（ｓｑｕｉｒｒｅｌ  ｍｏｎｋｅｙ）の血清の血清分析の結果：麻疹ウイルス特異免疫反応の誘発におけるポックスウイルスへの露出前の感染
９匹のリスサル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）にＡＬＶＡＣ−ＭＶ（ｖＣＰ８２）を接種した。全てのサルは麻疹ウイルスに対する経験がなかった。７匹のサルをワクチニアウイルスおよび／またはカナリヤポックスウイルスに先に露出した。先の免疫の経歴を表１２に示す。皮下経路により5.8 ｌｏｇ１０ｐｆｕの量を全てのサルに接種した。４匹のサル（39、42、53および58）に、最初の接種から15週間後に等量を再接種した。ＨＩ試験により抗麻疹抗体を測定した。その結果を表１２に示す。
【００８３】
最初の接種後、９匹のうち２匹のサルはＡＬＶＡＣ−ＭＶの接種に対して低い反応を示した。２回目の接種後、再接種した４匹のサルを防御免疫に必要な範囲の著しい抗体力価で血清転化した。達成された力価は、サルがワクチニウウイルスおよびＡＬＶＡＣへの先に露出されたかまたは全くポックスウイルスに露出しなかったかに対応する。
【表１２】
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【００８４】
実施例１５−弱毒化ワクチニアワクチン菌株ＮＹＶＡＣ
新たなワクチニアワクチン菌株を発生させるために、既知のまたは潜在的な毒性要因をコードするゲノムの６つの可欠領域を欠損せしめることによりワクチニアウルイスのコペンハーゲンワクチン菌株を変性した。配列欠損を以下詳細に示す。ワクチニア制限断片、読み取り枠およびヌクレオチド位置の全ての名称は、ゲーベルら（1990ａ、ｂ）に報告されている用語に基づく。
【００８５】
異種遺伝子の挿入の受容座として欠損座も生成した。
【００８６】
ＮＹＶＡＣ中に配列欠損した領域を以下に列記する。欠損領域の短縮形および読み取り枠の名称（ゲーベルら、1990ａ、ｂ）並びに以下に特定した欠損の全ての欠損を含有するワクチニア組換え体（ｖＰ）の名称もまた列記する：  
(1) チミジンキナーゼ（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）ｖＰ４１０；
(2) 出血性領域（ｕ；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）ｖＰ５５３；  
(3) 型封入体領域（ＡＴＩ；Ａ２６Ｌ）ｖＰ６１８；  
(4) 血球凝集素遺伝子（ＨＡ；Ａ５６Ｒ）ｖＰ７２３；  
(5) 宿主域遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）ｖＰ８０４；  および
(6) 大サブユニット、リボヌクレオチド還元酵素（Ｉ４Ｌ）
ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）。
【００８７】
ＤＮＡクローニングおよび合成
標準的な方法によりプラスミドを構成し、スクリーニングし、成長せしめた（マニアチスら、1986；パーカスら、1985；ピッチーニら、1987）。制限エンドグルカナーゼを、メリーランド州、ゲイサースブルク、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ；マサチューセッツ州、ビバーリー、ニューイングランドバイオラボ；およびインディアナ州、インディアナポリス、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルスから得た。ＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼおよびファージＴ４  ＤＮＡリガーゼはニューイングランドバイオラボから得た。試薬は様々な供給者により明示されたものとして用いた。合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを、前述したようにバイオサーチ８７５０またはアプライドバイオシステムス３８０Ｂ  ＤＮＡシンセサイザーにより調製した（パーカスら、1989）。ＤＮＡの塩基配列決定は、前述したように（グオら、1989）、シーケナーゼ（タバーら、1987）を用いたジデオキシ鎖終止法（サンガーら、1977）により行なった。配列を証明する（エンゲルケら、1988）ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅は、自動化パーキンエルマーセタスＤＮＡサーマルサイクラー中の注文合成オリゴヌクレオチドプライマーおよびジェネアンプＤＮＡ増幅試薬キット（パーキンエルマーセタス、ノルウォーク、ＣＴ）を用いて行なった。過剰のＤＮＡ配列は、制限エンドヌクレアーゼ切断によりプラスミドから欠損せしめ、それに続いてＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼによる制限切断並びに合成オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発（マンデックら、1986）を行なった。
【００８８】
細胞、ウイルス、およびトランスフェクション
ワクチニアウイルスのコペンハーゲン菌株の培養の条件と起源が以前に記載されている（グオら、1989）。組換えによる組換え体ウイルスの産生、ニトロセルロースフィルターの現場での雑種形成およびベータガラクトシダーゼ活性のスクリーニングは以前に記載している（パニカリら、1982；パーカスら、1989）。
【００８９】
チミジンキナーゼ遺伝子（Ｊ２Ｒ）の欠損したプラスミドｐＳＤ４６０の構成
ここで第９図を参照する。プラスミドｐＳＤ４０６はｐＵＣ８中にクローンされたワクチニアＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊ（位置８３３５９−８８３７７）を含有する。ｐＳＤ４０６まをＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｖｕＩＩで切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊの左側から１．７ｋｂの断片をＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで切断したｐＣＵ８中にクローンして、ｐＳＤ４４７を形成した。ｐＳＤ４４７はＪ２Ｒの完全な遺伝子（位置８３８５５−８４３８５）を含有する。開始コードンはＮｌａＩＩＩ部位内に含有され、終止コードンはＳｓｐＩ部位内に含有される。転写の方向は第９図中の矢印により示される。
【００９０】
左の側腹アームを得るために、０．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片をｐＳＤ４４７を単離し、次いでＮｌａＩＩＩで切断し、０．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｌａＩＩＩ断片を単離した。アニールした合成オリゴヌクレオチドＮＰＳＹＮ４３／ＭＰＳＹＮ４４（配列番号１７／配列番号１８）
【化１】
2005040129.tif 000014
【００９１】
を０．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｌａＩＩＩ断片と連結せしめ、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ１８ベクタープラスミド中に挿入し、プラスミドｐＳＤ４４９を産生した。
【００９２】
ワクチニア右側腹アームおよびｐＵＣベクター配列を含有する制限断片を得るために、ｐＳＤ４４７を、ワクチニア配列内のＳｓｐＩ（部分的）およびｐＵＣ／ワクチニア接合でのＨｉｎｄＩＩＩで切断し、２．９ｋｂのベクター断片を単離した。このベクター断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドＮＰＳＹＮ４５／ＭＰＳＹＮ４６（配列番号１９／配列番号２０）
【化２】
2005040129.tif 000015
【００９３】
と連結し、ｐＳＤ４５９を産生した。
【００９４】
左と右の側腹アームを１つのプラスミド中に結合せしめるために、０．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ断片をｐＳＤ４４９から単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで切断したｐＳＤ４５９ベクタープラスミドと連結し、プラスミドｐＳＤ４６０を産生した。野生型親ワクチニアウイルスコペンハーゲン菌株ＶＣ−２との組換えの供与体プラスミドとしてｐＳＤ４６０は用いられた。テンプレートとしてのＭＰＳＹＮ４５（配列番号１９）およびプライマーとしての相補的２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４７（配列番号２１）（５′−ＴＴＡＧＴＴＡＡＴＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣ−３′）を用いたプライマー・エクステンションにより３２Ｐ標識プローブを合成した。組換えウイルスｖＰ４１０を、プラーク雑種形成により同定した。
【００９５】
出血性領域（Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）が欠損したプラスミドｐＳＤ４８６の構成
ここで第１０図を参照する。プラスミドｐＳＤ４１９はｐＵＣ８中にクローンされたワクチニアＳａｌＩ  Ｇ（位置１６０，７４４−１７３，３５１）を含有する。ｐＳＤ４２２は、その右側に隣接ワクチニアＳａｌＩ断片、ｐＵＣ８中にクローンされたＳａｌＩ  Ｊ（位置１７３，３５１−１８２，７４６）を含有する。出血性領域、ｕ、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ（位置１７２，５４９−１７３，５５２）が欠損したプラスミドを構成するために、左側腹アームの供給源としてｐＳＤ４１９を用い、右側腹アームの供給源としてｐＳＤ４２２を用いた。ｕ領域の転写方向は第１０図中の矢印で示した。
【００９６】
不必要な配列をｐＳＤ４１９から除去するために、ｐＳＤ４１９をＮｃｏＩ／ＳｍａＩでの切断により、ＮｃｏＩ部位（位置１７２，２５３）の左側の配列を除去し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片で鈍端とし、連結してプラスミドｐＳＤ４７６を産生した。Ｂ１４Ｒの終止コードンでのｐＳＤ４２２のＨｐａＩによる切断および右側の０．３ｋｂのＮｒｕＩによる切断によってワクチニア右側腹アームを得た。この０．３ｋｂの断片を単離して、ｐＳＤ４７６から単離した３．４ｋｂのＨｉｎｃＩＩベクター断片と連結し、プラスミドｐＳＤ４７７を産生した。ｐＳＤ４７７におけるワクチニアｕ領域の部分的な欠損の位置を三角形により示す。ｐＳＤ４７７中の残りのＢ１３Ｒ暗号配列は、ＣｌａＩ／ＨｐａＩによる切断により除去し、生成したベクター断片を、アニールした合成オリゴヌクレオチドＳＤ２２ｍｅｒ／ＳＤ２０ｍｅｒ（配列番号２２／配列番号２３）
【化３】
2005040129.tif 000016
【００９７】
と連結し、ｐＳＤ４７９を産生した。ｐＳＤ４７９はＢｍａＨＩ部位により示された開始コードン（下線部）を含有する。ｕプロモーターの制御下でＥ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼをＢ１３−Ｂ１４（ｕ）欠損座に配するために、ベータガラクトシダーゼ遺伝子を含有する３．２ｋｂのＢａｍＨＩ断片（シャピラら、1983）をｐＳＤ４７９のＢａｍＨＩ部位中に挿入し、ｐＳＤ４７９ＢＧを産生した。ｐＳＤ４７９ＢＧは、ワクチニアウルイスｖＰ４１０による組換えの供与体プラスミドとして用いた。色素基体Ｘギャルの存在下でブループラークとして組換えワクチニアウイルスｖＰ５３３を単離した。ｖＰ５３３において、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ領域は欠損され、ベータガラクトシダーゼにより置き換えられている。
【００９８】
ｖＰ５３３からベータガラクトシダーゼ配列を除去するために、ポリリンカー領域を含有するがｕ欠損接合部には開始コードンを含有しないｐＳＤ４７７の誘導体であるプラスミドｐＳＤ４８６を用いた。最初に上述したｐＳＤ４７７からのＣｌａＩ／ＨｐａＩベクター断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドＳＤ４２ｍｅｒ／ＳＤ４０ｍｅｒ（配列番号２４／配列番号２５）
【化４】
2005040129.tif 000017
【００９９】
と連結し、プラスミドｐＳＤ４７８を産生した。次に、ｐＵＣ／ワクチニア接合部でのＥｃｏＲＩ部位をｐＳＤ４７８のＥｃｏＲＩによる切断により分断してＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片により鈍端とし、連結してプラスミドｐＳＤ４７８Ｅ−  を産生した。ｐＳＤ４７８Ｅ−  をＢａｍＨＩとＨｐａＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチドＨＥＭ５／ＨＥＭ６（配列番号２６／配列番号２７）
【化５】
2005040129.tif 000018
【０１００】
と連結し、プラスミドｐＳＤ４８６を産生した。組換えワクチニアウイルスｖＰ５３３の組換えの供与体プラスミドとしてｐＳＤ４８６を用いてｖＰ５５３を産生し、このｖＰ５３３をＸ−ギャルの存在下で透明プラークとして単離した。
【０１０１】
ＡＴＩ領域（Ａ２６Ｌ）の欠損したプラスミドｐＭＰ４９４Δの構成
ここで第１１図を参照する。ｐＳＤ４１４はｐＵＣ８中にクローンされたＳａｌＩ  Ｂを含有している。Ａ２６Ｌ領域の左側の不必要なＤＮＡ配列を除去するために、ｐＳＤ４１４を、ワクチニア配列内のＸｂａＩ（位置１３７，０７９）およびｐＵＣ／ワクチニア接合部でのＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片により鈍端とし、連結してプラスミドｐＳＤ４８３を産生した。Ａ２６Ｌ領域の右側の不必要なＤＮＡ配列を除去するために、ｐＳＤ４８３をＥｃｏＲＩ（位置１４０，６６５およびｐＵＣ／ワクチニア接合部）で切断して連結し、プラスミドｐＳＤ４８４を産生した。Ａ２６Ｌ暗号領域を除去するために、ｐＳＤ４８４を、Ａ２６Ｌ  ＯＲＦのやや上流のＮｄｅＩ（位置１３９，００４）（部分的）およびＡ２６Ｌ  ＯＲＦのやや下流のＨｐａＩ（位置１３７，８８９）で切断した。５．２ｋｂのベクター断片を単離して、アニールした合成オリゴヌクレオチドＡＴＩ３／ＡＴＩ４（配列番号２８／配列番号２９）
【化６】
2005040129.tif 000019
【０１０２】
と連結し、Ａ２６Ｌから上流の領域を再構成して上述したように制限部位ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩを含有する短いポリリンカー領域でＡ２６Ｌ  ＯＲＦで置換した。生成したプラスミドをｐＳＤ４８５と称した。ｐＳＤ４８５のポリリンカー領域におけるＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位は特異ではないので、ＢｇｌＩＩ（位置１４０，１３６）およびｐＵＣ／ワクチニア接合部でのＥｃｏＲＩでの切断によって不必要なＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位をプラスミドｐＳＤ４８３から除去し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片により鈍端とし、連結した。生成したプラスミドをｐＳＤ４８９と称した。Ａ２６Ｌ  ＯＲＦを含有するｐＳＤ４８９からの１．８ｋｂのＣｌａＩ（位置１３７，１９８）／ＥｃｏＲＶ（位置１３９，０４８）断片を、ｐＳＤ４８５からの対応する０．７ｋｂのポリリンカー含有ＣｌａＩ／ＥｃｏＲＶ断片と置換して、ｐＳＤ４９２を産生した。ｐＳＤ４９２のポリリンカー領域のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位は特異である。
【０１０３】
ワクチニア１１  ｋＤａプロモーター（バートレットら、1985；パーカスら、1990）の制御下でＥｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子を含有する３．３ｋｂのＢｇｌＩＩカセッテ（シャピラら、1983）をｐＳＤ４９２のＢｇｌＩＩ部位に挿入して、ｐＳＤ４９３ＫＢＧを産生した。レスキューイングウイルスｖＰ５５３による組換えにプラスミドｐＳＤ４９３ＫＢＧを用いた。Ａ２６Ｌ欠損領域にベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクチニアウイルスｖＰ５８１をＸ−ギャルの存在下でブループラークとして単離した。
【０１０４】
ワクチニア組換えウイルスｖＰ５８１からベータガラクトシダーゼ配列が除去されたプラスミドを産生するために、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ１７７（配列番号３０）（５′−ＡＡＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＴＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡＴＡＴＡ−ＡＣＴＴＡＴＴＴＴＴＴＧＡＡＴＡＴＡＣ−３′）を用いた突然変異誘発（マンデック、1986）により、プラスミドｐＳＤ４９２のポリリンカー領域を欠損せしめた。生成したプラスミドであるｐＭＰ４９４Δにおいて、完全なＡ２６Ｌ  ＯＲＦを含有するワクチニアＤＮＡ包含位置［１３７，８８９−１３８，９３７］は欠損せしめられる。ｐＭＰ４９４Δと、ワクチニア組換え体であるｖＰ５８１を含有するベータガラクトシダーゼとの間の組換えによりワクチニア欠損突然変異体ｖＰ６１８が産生され、このｖＰ６１８はＸ−ギャルの存在下で透明プラークとして単離される。
【０１０５】
血球凝集素遺伝子（Ａ５６Ｒ）が欠損したプラスミドｐＳＤ４６７の構成
ここで第１２図を参照する。ワクチニアＳａｌＩ  Ｇ制限断片（位置１６０，７４４−１７３，３５１）はＨｉｎｄＩＩＩ  Ａ／Ｂ接合部（位置１６２，５３９）を交雑する。ｐＳＤ４１９はｐＵＣ８中にクローンされたワクチニアＳａｌＩ  Ｇを含有している。血球凝集素（ＨＡ）遺伝子の転写方向は、第１２図中の矢印により示されている。ワクチニア配列内のおよびｐＵＣ／ワクチニア接合部でのＨｉｎｄＩＩＩによりｐＳＤ４１９の切断によりＨｉｎｄＩＩＩ  Ｂから誘導されたワクチニア配列を除去し、次いで連結した。生成したプラスミドであるｐＳＤ４５６は、ＨＡ遺伝子、Ａ５６Ｒを含有し、左側に０．４ｋｂのワクチニア配列並びに右側に０．４ｋｂのワクチニア配列をその側腹に有する。Ａ５６Ｒ暗号配列から上流のＲｓａＩ（部分的；位置１６１，０９０）、および遺伝子の近傍のＥａｇＩ（位置１６２，０５４）でｐＳＤ４５６を切断することによりＡ５６Ｒ暗号配列を除去した。ｐＳＤ４５６からの３．６ｋｂのＲｓａＩ／ＥａｇＩベクター断片を単離し、アニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ５９（配列番号３１）、ＭＰＳＹ６２（配列番号３２）、ＭＰＳＹＮ６０（配列番号３３）、およびＭＰＳＹＮ６１（配列番号３４）
【化７】
2005040129.tif 000020
【０１０６】
と連結し、Ａ５６Ｒ  ＯＲＦから上流のＤＮＡ配列を再構成し、上述したようにＡ５６Ｒ  ＯＲＦをポリリンカー領域で置換した。生成したプラスミドはｐＳＤ４６６である。ｐＳＤ４６６の欠損したワクチニアは、位置［１６１，１８５−１６２，０５３］を包含する。ｐＳＤ４６６の欠損
した部位は第１２図中の三角形により示されている。
【０１０７】
ワクチニア１１  ｋＤａプロモーター（バートレットら、1985；グオら、1989）の制御下でＥ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子を含有する３．２ｋｂのＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩカセッテ（部分的）（シャピラら、1983）をｐＳＤ４６６のＢｇｌＩＩ部位に挿入して、ｐＳＤ４６６ＫＢＧを産生した。プラスミドｐＳＤ４６６ＫＢＧをレスキューイングウイルスｖＰ６１８による組換えに用いた。Ａ５６Ｒ欠損部にベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクチニアウイルスであるｖＰ７０８をＸ−ギャルの存在下でブループラークとして単離した。
【０１０８】
供与体プラスミドｐＳＤ４６７を用いてベータガラクトシダーゼ配列をｖＰ７０８から欠損せしめた。ｐＳＤ４６６のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩによる切断によりｐＵＣ／ワクチニア接合部からＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ部位が除去されて、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクルノー断片で鈍端とされて連結されたことを除いては、ｐＳＤ４６７はｐＳＤ４６６と等しい。ｖＰ７０８とｐＳＤ４６７との間の組換えにより、組換えワクチニア欠損変異体、ｖＰ７２３が産生され、そのｖＰ７２３はＸ−ギャルの存在下で透明プラークとして単離された。
【０１０９】
読み取り枠［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］が欠損したプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δの構成
ここで第１３図を参照する。ｐＭＰＣＳＫ１Δの構成に以下のワクチニアクローンを用いた。ｐＳＤ４２０はｐＵＣ８中にクローンされたＳａｌＩ  Ｈである。ｐＳＤ４３５はｐＵＣ１８中にクローンされたＫｐｎＩ  Ｆである。ｐＳＤ４３５をＳｐｈＩで切断して再連結し、ｐＳＤ４５１を産生した。ｐＳＤ４５１において、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ中のＳｐｈＩ部位（位置２７，４１６）の左側のＤＮＡ配列は除去される（パーカスら、1990）。ｐＳＤ４０９はｐＵＣ８中にクローンされたＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍである。  ワクチニアからの［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］遺伝子クラスターの欠損した基質を提供するために、Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼを以下のようにワクチニアＭ２Ｌ欠損座中に挿入した（グオら、1990）。ｐＳＤ４０９中のＢｇｌＩＩ部位を除去するために、ワクチニア配列中のＢｇｌＩＩ（位置２８，２１２）およびｐＵＣ／ワクチニア接合部でのＢａｍＨＩでプラスミドを切断し、次いで連結してプラスミドｐＭＰ４０９Ｂを産生した。ｐＭＰ４０９Ｂを特異ＳｐｈＩ部位で切断した（位置２７，４１６）。合成オリゴヌクレオチド
【化８】
2005040129.tif 000021
【０１１０】
を用いた突然変異誘発（グオら、1990；マンデック、1986）によりＭ２Ｌ暗号配列を除去した。
【０１１１】
生成したプラスミド、ｐＭＰ４０９Ｄは、上述したようにＭ２Ｌ欠損座に挿入された特異ＢｇｌＩＩ部位を含有する。１１  ｋＤａプロモーターの制御下（バートレットら、1985）でＥ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子を含有する３．２ｋｂのＢａｍＨＩ（部分的）／ＢｇｌＩＩカセッテ（シャピラら、1985）を、ＢｇｌＩＩで切断したｐＭＰ４０９Ｄ中に挿入した。生成したプラスミドｐＭＰ４０９ＤＢＧ（グオら、1990）は、レスキューイングワクチニアウイルスｖＰ７２３による組換えの供与体プラスミドとして用いた。Ｍ２Ｌ欠損座中に挿入されたベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクチニアウイルス、ｖＰ７８４を、Ｘ−ギャルの存在下でブループラークとして単離した。
【０１１２】
ワクチニア遺伝子［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］が欠損したプラスミドをＳｍａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＵＣ８中に組み立て、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片で鈍端とした。ワクチニアＨｉｎｄＩＩＩ  Ｃ配列からなる左側腹アームは、ｐＳＤ４２０のＸｂａＩ（位置１８，６２８）での切断により得て、次いでＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片で鈍端とし、ＢｇｌＩＩ（位置１９，７０６）で切断した。ワクチニアＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ配列からなる右側腹アームをＢｇｌＩＩ（位置２９，０６２）およびＥｃｏＲＶ（位置２９，７７８）でのｐＳＤ４５１の切断により得た。生成したｐＭＰ５８１ＣＫは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｃ中のＢｇｌＩＩ部位（位置１９，７０６）とＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ中のＢｇｌＩＩ部位（位置２９，０６２）との間のワクチニア配列が欠損している。プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫ中のワクチニア配列の欠損した部位を、第１３図中に三角形で示す。
【０１１３】
ワクチニア欠損接合部での過剰のＤＮＡを除去するために、プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫをワクチニア配列内のＮｃｏＩ部位（位置１８，８１１；１９，６５５）で切断し、Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼで処理し、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２３３（配列番号３６）５′−ＴＧＴＣＡＴＴＴＡＡＣＡＣＴＡ−ＴＡＣＴＣＡＴＡＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＴＴＴＡＴＴ−３′を用いた突然変異誘発（マンデック、1986）を施した。生成したプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δは、１２ワクチニア読み取り枠［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を包含するワクチニア配列位置１８，８０５−２９，１０８が欠損している。ｐＭＰＣＳＫ１Δと、ワクチニア組換え体ｖＰ７８４を含有するベータガラクトシダーゼとの間の組換えにより、ワクチニア欠損変異体ｖＰ８０４が産生され、そのｖＰ８０４は、Ｘ−ギャルの存在下で透明プラークとして単離された。
【０１１４】
大ユニットのリボヌクレオチド還元酵素（Ｉ４Ｌ）が欠損したプラスミドｐＳＤ５４８の構成
ここで第１４図を参照する。プラスミドｐＳＤ４０５はｐＵＣ８内にクローンされたワクチニアＨｉｎｄＩＩＩＩ（位置６３，８７５−７０，３６７）を含有している。ｐＳＤ４０５をワクチニア配列内のＥｃｏＲＶ（位置６７，９３３）およびｐＵＣ／ワクチニア接合部でのＳｍａＩで切断して連結し、プラスミドｐＳＤ５１８を産生した。ｐＳＤ５４８の構成に用いた全てのワクチニア制限断片の供給源としてｐＳＤ５１８を用いた。
【０１１５】
ワクチニアＩ４Ｌ遺伝子は位置６７，３７１−６５，０５９に亘る。Ｉ４Ｌの転写方向を第１４図中の矢印により示す。Ｉ４Ｌ暗号配列の部分が欠損したベクタープラスミド断片を得るために、ｐＳＤ５１８をＢａｍＨＩ（位置６５，３８１）およびＨｐａＩ（位置６７，００１）で切断し、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片を用いて鈍端とした。この４．８ｋｂのベクター断片を、ワクチニア１１ｋＤａプロモーター（バートレットら、1985；パーカスら、1990）の制御下でＥ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（シャピラら、1983）を含有する３．２ｋｂのＳｍａＩカセッテに連結して、プラスミドｐＳＤ５２４ＫＢＧを産生した。ｐＳＤ５２４ＫＢＧは、ワクチニアウイルスｖＰ８０４による組換えの供与体プラスミドとして用いた。Ｉ４Ｌ遺伝子が部分的に欠損したベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクチニアウイルス、ｖＰ８５５を、Ｘ−ギャルの存在下でブループラークとして単離した。
【０１１６】
ベータガラクトシダーゼおよびｖＰ８５５からのＩ４Ｌ  ＯＲＦの残留物を除去するために、欠損プラスミドｐＳＤ５４８を構成した。左右のワクチニア側腹アームを、前述したようにｐＵＣ８中に別々に組み立て、第１４図中に模式的に示した。
【０１１７】
左ワクチニア側腹アームを受容するベクタープラスミドを構成するために、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチド５１８Ａ１／５１８Ａ２（配列番号３７／配列番号３８）
【化９】
2005040129.tif 000022
【０１１８】
と連結し、プラスミドｐＳＤ５３１を産生した。ｐＳＤ５３１をＲｓａＩ（部分的）およびＢａｍＨＩで切断し、２．７ｋｂのベクター断片を単離した。ｐＳＤ５１８をＢｇｌＩＩ（位置６４，４５９）／ＲｓａＩ（位置６４，９９４）で切断し、０．５ｋｂの断片を単離した。２つの断片をともに連結し、ｐＳＤ５３７を産生し、このｐＳＤ５３７はＩ４Ｌ暗号配列の左側に完全なワクチニア側腹アーム含有する。
【０１１９】
右ワクチニア側腹アームを受容するベクタープラスミドを構成するために、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチド５１８Ｂ１／５１８Ｂ２（配列番号３９／配列番号４０）
【化１０】
2005040129.tif 000023
【０１２０】
と連結し、プラスミドｐＳＤ５３２を産生した。ｐＳＤ５３２をＲｓａＩ（部分的）／ＥｃｏＲＩで切断し、２．７ｋｂのベクター断片を単離した。ｐＳＤ５１８をワクチニア配列内のＲｓａＩ（位置６７，４３６）およびワクチニア／ｐＵＣ接合部のＥｃｏＲＩで切断し、０．６ｋｂの断片を単離した。２つの断片をともに連結し、ｐＳＤ５３８を産生し、このｐＳＤ５３８はＩ４Ｌ暗号配列の右側に完全なワクチニア側腹アーム含有する。
【０１２１】
右ワクチニア側腹アームをｐＳＤ５３８からの０．６ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ断片として単離し、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩで切断したｐＳＤ５３７ベクタープラスミドに連結した。生成したプラスミド、ｐＳＤ５３９において、Ｉ４Ｌ  ＯＲＦ（位置６５，０４７−６７，３８６）はポリリンカー領域と置き換えられ、その領域には、全てｐＵＣを背景として、左側に０．６ｋｂのワクチニアＤＮＡを、右側に０．６ｋｂのワクチニアＤＮＡをその側腹に有する。ワクチニア配列内の欠損部位を第１４図中の三角形で示す。ｐＳＤ５３９のｐＵＣ誘導部分中のベータガラクトシダーゼ配列と組換えワクチニアウイルスｖＰ８５５中のベータガラクトシダーゼ配列との起こり得る組換えを避けるために、ワクチニアＩ４Ｌ欠損カセッテをｐＳＤ５３９から取り出してｐＲＣ１１中に組み込み、このｐＲＣ１１は全てのベータガラクトシダーゼ配列が除去されたｐＵＣ誘導体であり、ポリリンカー領域により置き換えられる（コリナスら、1990）。ｐＳＤ５３９をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断し、１．２ｋｂの断片を単離した。この断片をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断したｐＲＣ１１（２．３５ｋｂ）に連結し、ｐＳＤ５４８を産生した。ｐＳＤ５４８とワクチニア組換え体、ｖＰ８５５を含有するベータガラクトシダーゼとの間の組換え体により、ワクチニア欠損変異体ｖＰ８６６が産生され、このｖＰ８６６はＸ−ギャルの存在下で透明プラークとして単離された。
【０１２２】
組換えワクチニアウイルスｖＰ８６６からのＤＮＡを、制限切断により分析し、次いでアガロースゲルの電気泳動を行なった。制限模様は予期したものであった。テンプレートとしてｖＰ８６６を用いたポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（エンゲルケら、1988）および上述した６つの欠損座を側腹に有するプライマーは、予期したサイズのＤＮＡ断片を産生した。欠損接合部の区域の辺りのＰＣＲ産生断片の配列分析により、接合部が予期したものであったことが確認された。譲受した６つの生成欠損を含有する組換えワクチニアウイルスｖＰ８６６をワクチニアワクチン菌株「ＮＹＶＡＣ」と称した。
【０１２３】
実施例１６−麻疹融合および血球凝集素糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣ−ＭＶ組換え体の構成
麻疹ウイルスＭＶのＨＡおよびＦタンパク質（エドモンストン菌株）をコードする配列のｃＤＮＡコピーを、ＮＹＶＡＣ中に挿入し、ＮＹＶＡＣ−ＭＶ（ｖＰ９１３）と称する二重組換え体を産生した。組換え体は真正に、感染細胞の表面上に両方の麻疹糖タンパク質を発現した。イムノプレシピテーション分析は、ＦおよびＨＡ糖タンパク質の両方の正確な処理方法を示した。組換え体はまた融合細胞形成を誘発することが分かった。
【０１２４】
細胞およびウイルス
ＮＹＶＡＣ−ＭＶの産生に用いたレスキューイングウイルスは、ＮＹＶＡＣと称するワクチニアウイルスの修飾コペンハーゲン菌株であった。全てのウイルスが成長し、ベロ細胞単層上で滴定された。
【０１２５】
プラスミドの構成
ここで第１５図およびテイラーらの文献（1991）を参照する。プラスミドｐＳＰＭ２ＬＨＡは、正確なＡＴＧ配列に対するＡＴＧの関係に、前述したワクチニアウイルスＨ６プロモーターと連結した完全麻疹ＨＡ遺伝子を含有している（テイラーら、1988ａ，ｂ；グオら、1989；パーカスら、1989）。１．８ｋｂｐのＥｃｏＲＶ／ＳｍａＩ断片は、正確なＡＴＧ：ＡＴＧ配列の関係に、３′末端側の２６ｂｐが欠損したＨＡ遺伝子と融合したＨ６プロモーターの３′末端側の２４ｂｐを含有する。この断片を、ｐＳＰＭＨＡ１１の１．８ｋｂｐのＥｃｏＲＶ／ＳｍａＩ断片（テイラーら、1991）を置き換えてｐＲＷ８０３を産生するのに用いた。プラスミドｐＲＷ８０３は、正確に完全な麻疹ＨＡ遺伝子に連結した完全なＨ６プロモーターを含有する。
【０１２６】
プラスミドｐＳＤ５１３ＶＣＶＱを、ポリリンカー配列の転化によりプラスミドｐＳＤ４６０から誘導した。ワクチニアウイルスからのチミジンキナーゼ遺伝子を欠損させるようにプラスミドｐＳＤ４６０を誘導した（図９）。
【０１２７】
麻疹ウイルスＦ遺伝子をＨＡ挿入プラスミド中に挿入するために、ｐＳＰＨＭＦ７に操作を行なった。プラスミドｐＳＰＨＭ７（テイラーら、1991）は、前述したワクチニアウイルスＨ６プロモーターを３′の近位に有する麻疹Ｆ遺伝子を含有している。完全なＡＴＧに対するＡＴＧ配列を達成し、プロモーターの３′末端と麻疹Ｆ遺伝子のＡＴＧとの間の介在配列を除去するために、オリゴヌクレオチドＳＰＭＡＤ（配列番号４１）を用いてオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を行なった。
【０１２８】
ＳＰＭＡＤ：５′−ＴＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＴ−３′
生成したプラスミドをｐＳＰＭＦ７５Ｍ２０と称した。
【０１２９】
正確なＡＴＧに対するＡＴＧの配列の関係でＨ６プロモーターと現在連結している麻疹Ｆ遺伝子を含有するプラスミドｐＳＰＭＦ７５Ｍ２０を、ＮｒｕＩとＥａｇＩで切断した。生成した、Ｈ６プロモーターの３′末端側の２７ｂｐおよび完全な融合細胞を含有する１．７ｋｂｐの鈍端断片を単離し、ＮｒｕＩとＸｂａＩで切断し、鈍端とした中間プラスミドｐＲＷ８２３中に挿入した。ＳｍａＩでの切断によりＨ６／麻疹ＦカセッテをｐＲＷ８４１から除去し、生成した１．８ｋｂ断片をｐＲＷ８４３（麻疹ＨＡ遺伝子を含有する）中に挿入した。最初にプラスミドｐＲＷ８４３をＮｏｔＩで切断し、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で鈍端とした。それゆえ、生成したプラスミドｐＲＷ８５７は、尾対尾の配列で連結した麻疹ウイルスＦおよびＨＡ遺伝子を含有する。両方の遺伝子はワクチニアウイルスＨ６プロモーターに連結される。
【０１３０】
ＮＹＶＡＣ−ＭＶの開発
前述したリン酸カルシウム沈殿法（パニカリら、1982；ピッチーニら、1987）を用いることにより、プラスミドｐＲＷ８５７をＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）感染ベロ細胞中にトランスフェクションした。特定のＭＶ  ＦおよびＨＡ放射線標識プローブに対する現場でのプラーク雑種形成に基づいて、陽性のプラークを選択し、選択したプラークについて、純粋な固体群が達成されるまで、６回連続でプラーク精製を行なった。次いで１つの代表のプラークを増幅し、生成した組換え体をＮＹＶＡＣ−ＭＶ（ｖＰ９１３）と称した。
【０１３１】
免疫蛍光法
前述したように間接免疫蛍光法を行なった（テイラーら、1990）。使用した単特異性試薬は、家ウサギに麻疹ＦまたはＨＡ遺伝子を発現するカナリヤポックス組換え体を接種することにより産生した血清であった。
【０１３２】
イムノプレシピテーション
前述したようにモルモット抗麻疹血清（ウィタッカーＭ．Ａ．バイオプロダクツ、ウォーカースビル、ＭＤ）を用いてイムノプレシピテーション反応を行なった。
【０１３３】
細胞融合実験
60ｍｍの皿中のベロ細胞単層を、多数の、細胞当たり１ｐｆｕの親または組換えウイルスで接種した。37℃での１時間の吸収後に接種物を除去し、重層媒質を置き換え、皿を37℃で１晩接種した。感染20時間後、皿を検査した。
【０１３４】
麻疹ウイルスＦおよびＨＡ遺伝子の両方の発現産生物が感染細胞表面上に存在することを確認するために、麻疹ＦまたはＨＡ遺伝子のいずれかを発現するカナリヤポックス組換え体に対する家ウサギ中に産生された単特異性血清を用いて間接免疫蛍光法分析を行なった。その結果、ＦおよびＨＡ遺伝子産生物が、両単特異性血清での強い表面蛍光により示されるように、感染細胞表面上に発現されたことが示された。親ＮＹＶＡＣ菌株を接種した細胞の血清のいずれかに関して明確である背景の染色はなく、単特異性血清がＨＡまたはＦ遺伝子のいずれかを発現するワクチニア単組換え体に対して試験された場合、交差反応染色はない。
【０１３５】
ＮＹＶＡＣ−ＭＶにより発現されたタンパク質が麻疹ウイルス特異血清で免疫反応性であり、感染細胞中で真正に処理されたことを示すために、イムノプレシピテーション分析を行なった。ベロ細胞単層に、多様な、１０ｐｆｕ／細胞３５Ｓ−メチオニンの存在下で親または組換え体ウイルスを接種した。イムノプレシピテーション分析は、それぞれ４４ｋＤａおよび２３ｋＤａの分子量を有する切断融合産生物Ｆ１およびＦ２並びに約７６ｋＤａのＨＡ糖タンパク質を示した。未感染ベロ細胞または親細胞ＮＹＶＡＣウイルスに感染した細胞中には、麻疹特異産生物が検出されなかった。
【０１３６】
ＭＶ細胞変異性の特性は、感染細胞の周囲の感染または未感染細胞による融合により生じる融合細胞の形成と続いての融合細胞の中心に向かう核の移行である（ノービーら、1982）。これは、パラミクソウイルスにとって、ＨＡ特異ウイルス中和抗体中で生じ得る重要なウイルス展着法であることが示されている（マーツら、1980）。ワクチニアウイルス中で発現されたＭＶタンパク質が機能的に活性であることを確認するために、ベロ細胞単層に、ＮＹＶＡＣおよびＮＹＶＡＣ−ＭＶを接種し、細胞変異性効果についてその単層を観察した。感染後約18時間後に、ＮＹＶＡＣ−ＭＶ感染ベロ細胞中で強い細胞融合活性が明白となった。親細胞ＮＹＶＡＣに感染した細胞中では細胞融合活性は全く明白にはならなかった。
【０１３７】
ＮＹＶＡＣ−ＭＶ（ｖＰ９１３）を接種した家ウサギの血清の血清分析の結果
この研究において、２匹の家ウサギを皮下経路により１×10８ｐｆｕのＮＹＶＡＣ−ＭＶ（ｖＰ９１３）を接種した。28日目にその動物に等量を追加抗原投与した。連続の出血を、プラーク還元法を用いてＭＶ中和活性について分析した。結果を表１３に示す。その結果は、いずれの家ウサギもＮＹＶＡＣ−ＭＶの最初の接種には反応しなかったことを示している。しかしながら、２回目の接種後の鋭く立ち上がる反応は、動物が感作されたことを示す。両方の動物が防御範囲の中和抗原力価を達成した。
【０１３８】
実施例１４に示したＡＬＶＡＣ−ＭＶ（ｖＣＰ８２）の免疫抗原性の体内分析は、ある範囲の種の接種において、組換え体は、標準血清試験で測定可能な血清反応を誘発できることを示している。達成された力価は、病気からの防御に必要とされる範囲内にある。ＮＹＶＡＣ−ＭＶ（ｖＰ９１３）の家ウサギへの接種は同様に、防御的である麻疹ウイルス中和抗体の水準を誘発する。
【表１３】
2005040129.tif 000024
【０１３９】
以下に、他の参考例を記載する。
【０１４０】
１．  ポックスウイルスゲノムの可欠領域中に麻疹ウイルス属からの少なくとも２つの抗原をコードするＤＮＡを含有する組換えポックスウイルス。
【０１４１】
２．  前記麻疹ウイルス属が麻疹ウイルスであることを特徴とする参考例１記載の組換えポックスウイルス。
【０１４２】
３．  前記ＤＮＡがコードする前記少なくとも２つの抗原のうちの１つが麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質であることを特徴とする参考例２記載の組換えポックスウイルス。
【０１４３】
４．  前記ＤＮＡがコードする前記少なくとも２つの抗原のうちの１つが麻疹ウイルス融合糖タンパク質であることを特徴とする参考例２記載の組換えポックスウイルス。
【０１４４】
５．  前記ＤＮＡが２つの麻疹ウイルス糖タンパク質をコードすることを特徴とする参考例２記載の組換えポックスウイルス。
【０１４５】
６．  前記麻疹ウイルス糖タンパク質が血球凝集素糖タンパク質および融合糖タンパク質であることを特徴とする参考例５記載の組換えポックスウイルス。
【０１４６】
７．  前記ＤＮＡが宿主中で発現され、その発現が麻疹ウイルス糖タンパク質の産生を含むことを特徴とする参考例２記載の組換えポックスウイルス。
【０１４７】
８．  前記麻疹ウイルス糖タンパク質が麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質であることを特徴とする参考例７記載の組換えポックスウイルス。
【０１４８】
９．  前記麻疹ウイルス糖タンパク質が麻疹ウイルス融合糖タンパク質であることを特徴とする参考例７記載の組換えポックスウイルス。
【０１４９】
１０．  前記ＤＮＡが２つの麻疹ウイルス糖タンパク質の産生により宿主中に発現されることを特徴とする参考例２記載の組換えポックスウイルス。
【０１５０】
１１．  前記麻疹ウイルス糖タンパク質が麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質および麻疹ウイルス融合糖タンパク質であることを特徴とする参考例１０記載の組換えポックスウイルス。
【０１５１】
１２．  前記ポックスウイルスがワクチニアウイルスであることを特徴とする参考例１記載の組換えポックスウイルス。
【０１５２】
１３．  前記ポックスウイルスがアビポックスウイルスであることを特徴とする参考例１記載の組換えポックスウイルス。
【０１５３】
１４．  前記アビポックスウイルスがカナリヤポックスウイルスであることを特徴とする参考例１３記載の組換えポックスウイルス。
【０１５４】
１５．  前記ＤＮＡが組換えにより前記ポックスウイルス中に導入されることを特徴とする参考例１記載の組換えポックスウイルス。
【０１５５】
１６．  麻疹ウイルス属からの少なくとも２つの抗原をコードするＤＮＡおよび該ＤＮＡを発現するプロモーターを含有する組換えポックスウイルス。
【０１５６】
１７．  ワクチンを接種した宿主動物中に免疫応答を誘発するワクチンであって、該ワクチンが、可欠領域中に麻疹ウイルス属からの少なくとも２つの抗原をコードするＤＮＡを含有する組換えポックスウイルスおよび担体からなることを特徴とするワクチン。
【０１５７】
１８．  前記麻疹ウイルス属が麻疹ウイルスであることを特徴とする参考例１７記載のワクチン。
【０１５８】
１９．  前記ＤＮＡがコードし発現する前記少なくとも２つの抗原のうちの１つが麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質であることを特徴とする参考例１８記載のワクチン。
【０１５９】
２０．  前記ＤＮＡがコードし発現する前記少なくとも２つの抗原のうちの１つが麻疹ウイルス融合糖タンパク質であることを特徴とする参考例１８記載のワクチン。
【０１６０】
２１．  前記ＤＮＡが２つの麻疹ウイルス糖タンパク質をコードし、発現することを特徴とする参考例１８記載のワクチン。
【０１６１】
２２．  前記麻疹ウイルス糖タンパク質が血球凝集素糖タンパク質および融合糖タンパク質であることを特徴とする参考例２１記載のワクチン。
【０１６２】
２３．  前記ポックスウイルスがワクチニアウイルスであることを特徴とする参考例１７記載のワクチン。
【０１６３】
２４．  前記ポックスウイルスがアビポックスウイルスであることを特徴とする参考例１７記載のワクチン。
【０１６４】
２５．  前記アビポックスウイルスがカナリヤポックスウイルスであることを特徴とする参考例２４記載のワクチン。
【０１６５】
２６．  前記ＤＮＡが組換えにより前記ポックスウイルス中に導入されることを特徴とする参考例１７記載のワクチン。
【０１６６】
２７．  イヌジステンパーに対してイヌを防御する方法であって、該方法が、ポックスウイルスゲノムの可欠領域中に麻疹ウイルス属からの抗原をコードするＤＮＡを含有する組換えポックスウイルスをイヌに接種することからなることを特徴とする方法。
【０１６７】
２８．  前記麻疹ウイルス属が麻疹ウイルスであることを特徴とする参考例２７記載の方法。
【０１６８】
２９．  前記ＤＮＡが麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質をコードすることを特徴とする参考例２８記載の方法。
【０１６９】
３０．  前記ＤＮＡが麻疹ウイルス融合糖タンパク質をコードすることを特徴とする参考例２８記載の方法。
【０１７０】
３１．  イヌジステンパーに対してイヌを防御する方法であって、該方法が、麻疹ウイルスである麻疹ウイルス属からのＤＮＡを含有する組換えワクチニアまたはアビポックスウイルスをイヌに接種することからなり、前記ＤＮＡが麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質をコードすることを特徴とする方法。
【０１７１】
３２．  カナリヤポックスウイルスゲノムの可欠領域中に麻疹ウイルスからのＤＮＡを含有する組換えカナリヤポックスウイルスであって、麻疹ウイルス糖タンパク質をコードする前記ＤＮＡが、麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質、麻疹ウイルス融合糖タンパク質、および麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質と麻疹ウイルス融合糖タンパク質の組合せからなる群より選択されることを特徴とする組換えカナリヤポックスウイルス。
【０１７２】
３３．  前記ＤＮＡが麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質をコードすることを特徴とする参考例３２記載の組換えカナリヤポックスウイルス。
【０１７３】
３４．  前記ＤＮＡが麻疹ウイルス融合糖タンパク質をコードすることを特徴とする参考例３２記載の組換えカナリヤポックスウイルス。
【０１７４】
３５．  前記ＤＮＡが麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質および麻疹ウイルス融合糖タンパク質をコードすることを特徴とする参考例３２記載の組換えカナリヤポックスウイルス。
【０１７５】
３６．  ｖＣＰ８２であることを特徴とする参考例３２記載の組換えカナリヤポックスウイルス。
【０１７６】
３７．  麻疹ウイルスからのＤＮＡおよび該ＤＮＡを発現するプロモーターを含有する組換えカナリヤポックスウイルスであって、麻疹ウイルス糖タンパク質をコードする前記ＤＮＡが、麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質、麻疹ウイルス融合糖タンパク質、および麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質と麻疹ウイルス融合糖タンパク質の組合せからなる群より選択されることを特徴とする組換えカナリヤポックスウイルス。
【０１７７】
３８．  ワクチンを接種した宿主動物中に免疫応答誘発するワクチンであって、該ワクチンが、可欠領域中に麻疹ウイルスからのＤＮＡを含有する組換えカナリヤポックスウイルスおよび担体からなり、麻疹ウイルス糖タンパク質をコードする前記ＤＮＡが、麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質、麻疹ウイルス融合糖タンパク質、および麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質と麻疹ウイルス融合糖タンパク質の組合せからなる群より選択されることを特徴とするワクチン。
【０１７８】
３９．  前記ＤＮＡが麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質をコードすることを特徴とする参考例３８記載のワクチン。
【０１７９】
４０．  前記ＤＮＡが麻疹ウイルス融合糖タンパク質をコードすることを特徴とする参考例３８記載のワクチン。
【０１８０】
４１．  前記ＤＮＡが麻疹ウイルス血球凝集素糖タンパク質および麻疹ウイルス融合糖タンパク質をコードすることを特徴とする参考例３８記載のワクチン。
【０１８１】
４２．  前記組換えカナリヤポックスウイルスがｖＣＰ８２であることを特徴とする参考例３８記載のワクチン。
【０１８２】
４３．  イヌジステンパーに対してイヌを防御する方法であって、該方法が、麻疹ウイルス融合糖タンパク質をコードする麻疹ウイルスからのＤＮＡを含有する組換えカナリヤポックスウイルスをイヌに接種することからなることを特徴とする方法。
【０１８３】
４４．  前記ポックスウイルスが、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主域遺伝子領域、および大ユニットリボヌクレオチド還元酵素が欠損したワクチニアウイルスであることを特徴とする参考例１から１２、１５または１６いずれか１記載の組換えポックスウイルス。
【０１８４】
４５．  前記ワクチニアウイルスがＮＹＶＡＣワクチニアウイルスであることを特徴とする参考例４４記載の組換えポックスウイルス。
【０１８５】
４６．  前記ポックスウイルスが、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主域遺伝子領域、および大ユニットリボヌクレオチド還元酵素が欠損したワクチニアウイルスであることを特徴とする参考例１７から２３、または２６いずれか１記載のワクチン。
【０１８６】
４７．  前記ワクチニアウイルスがＮＹＶＡＣワクチニアウイルスであることを特徴とする参考例４６記載のワクチン。
【０１８７】
４８．  前記ポックスウイルスが、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主域遺伝子領域、および大ユニットであるリボヌクレオチド還元酵素が欠損したワクチニアウイルスであることを特徴とする参考例２７から３０いずれか１記載の方法。
【０１８８】
４９．  前記ワクチニアウイルスがＮＹＶＡＣワクチニアウイルスであることを特徴とする参考例４８記載の方法。
【０１８９】
５０．  前記ワクチニアウイルスが、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主域遺伝子領域、および大ユニットであるリボヌクレオチド還元酵素が欠損したワクチニアウイルスであることを特徴とする参考例３１記載の方法。
【０１９０】
５１．  前記ワクチニアウイルスがＮＹＶＡＣワクチニアウイルスであることを特徴とする参考例５０記載の方法。
【０１９１】
５２．  前記ポックスウイルスまたはカナリヤポックスウイルスがＡＬＶＡＣカナリヤポックスウイルスであることを特徴とする参考例１から１１、１３から１６、３２から３５、または３７いずれか１記載の組換えポックスウイルスまたはカナリヤポックスウイルス。
【０１９２】
５３．  前記ポックスウイルスまたはカナリヤポックスウイルスがＡＬＶＡＣカナリヤポックスウイルスであることを特徴とする参考例１７から２２、２４から２６、３８から４１いずれか１記載のワクチン。
【０１９３】
５４．  前記ポックスウイルス、アビポックスウイルスまたはカナリヤポックスウイルスがＡＬＶＡＣカナリヤポックスウイルスであることを特徴とする参考例２７から３１、または４３いずれか１記載の方法。
【０１９４】
５５．  ｖＰ９１３であることを特徴とする参考例４５記載の組換えポックスウイルス。
【０１９５】
５６．  前記ＮＹＶＡＣワクチニアウイルスがｖＰ９１３であることを特徴とする参考例４７記載のワクチン。
【０１９６】
５７．  前記ＮＹＶＡＣワクチニアウイルスがｖＰ９１３であることを特徴とする参考例４９または５１記載の方法。
【参考文献】
【０１９７】
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【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】第１図（１Ａおよび１Ｂ）は、ＭＶ血球凝集素遺伝子を発現する組換えワクチニアウイルスｖＰ５５７を誘導するのに用いたプラスミドｐＳＰＭ２ＬＨＡＶＣを構成する方法を模式的に示す。
【図２】第２図（２Ａおよび２Ｂ）は、ＭＶ融合遺伝子を発現する組換えワクチニアウイルスｖＰ４５５を誘導するのに用いたプラスミドｐＳＰＭＦＶＣを構成する方法を模式的に示す。
【図３】第３図は、ＭＶ血球凝集素遺伝子を発現する組換えワクチニアウイルスｖＰ７５６を誘導するのに用いたプラスミドｐＲＷ８４３を構成する方法を模式的に示す。
【図４】第４図は、ＭＶ融合遺伝子を発現する組換えワクチニアウイルスｖＰ８００を誘導するのに用いたプラスミドｐＲＷ８５０を構成する方法を模式的に示す。
【図５】第５図は、ＭＶ融合遺伝子を発現する組換えカナリヤポックスウイルスｖＣＰ４０を誘導するのに用いたプラスミドｐＲＷ８００を構成する方法を模式的に示す。
【図６】第６図は、ＭＶ血球凝集素遺伝子を発現する組換えカナリヤポックスウイルスｖＣＰ５０およびＭＶ融合遺伝子とＭＶ血球凝集素遺伝子をともに発現するｖＣＰ５７を誘導するのに用いたプラスミドｐＲＷ８１０を構成する方法を模式的に示す。
【図７】第７図は、ＭＶ血球凝集素遺伝子を発現する組換えカナリヤポックスウイルスｖＣＰ８５を誘導するのに用いたプラスミドｐＲＷ８５２を構成する方法を模式的に示す。
【図８】第８図は、ＭＶ血球凝集素遺伝子とＭＶ融合遺伝子をともに発現するｖＣＰ８２を誘導するのに用いたプラスミドｐＲＷ８５３Ａを構成する方法を模式的に示す。
【図９】第９図は、チミジンキナーゼ遺伝子を欠損せしめ、組換えワクチニアウイルスｖＰ４１０を産生するプラスミドｐＳＤ４６０を構成する方法を模式的に示す。
【図１０】第１０図は、出血性領域を欠損せしめ、組換えワクチニアウイルスｖＰ５５３を産生するプラスミドｐＳＤ４８６を構成する方法を模式的に示す。
【図１１】第１１図は、ＡＴＩ領域を欠損せしめ、組換えワクチニアウイルスｖＰ６１８を産生するプラスミドｐＭＰ４９４Δを構成する方法を模式的に示す。
【図１２】第１２図は、血球凝集素遺伝子を欠損せしめ、組換えワクチニアウイルスｖＰ７２３を産生するプラスミドｐＳＤ４６７を構成する方法を模式的に示す。
【図１３】第１３図は、遺伝子クラスター［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を欠損せしめ、組換えワクチニアウイルスｖＰ８０４を産生するプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δを構成する方法を模式的に示す。
【図１４】第１４図は、大サブユニットリボヌクレオチド還元酵素を欠損せしめ、組換えワクチニアウイルスｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）を産生するプラスミドｐＳＤ５４８を構成する方法を模式的に示す。
【図１５】第１５図は、ＭＶ血球凝集素遺伝子およびＭＶ融合遺伝子をともに発現する組換えＮＹＶＡＣウイルスｖＰ９１３を誘導するのに用いたプラスミドｐＲＷ８５７を構成する方法を模式的に示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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