(57)【要約】  【解決手段】  アワビ内臓抽出物、特にアワビ内臓抽出物を原料とし２次元薄層クロマトグラフィーにより単離・精製される分子量約６６０の脂溶性物質、およびその用途。  【効果】  本発明のアワビ内臓抽出物由来の新規な生理活性物質は、細胞増殖阻害活性、多核化活性及び／またはアポトーシス誘導活性を有し、異常な細胞増殖に起因する各種の疾患、病態の治療に有用であり、また、細胞の機能を解析する効果的なツールとなる。  【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の理化学的性質を有する細胞増殖阻害活性物質：
ａ）分子量：約６６０
ｂ）紫外可視吸収波長スペクトル：図１に示す  λｍａｘ（クロロホルム中）：２５６ｎｍ
ｃ）溶解性：クロロホルムに易溶
ｄ）物質の色：薄褐色（液状）。
【請求項２】
長時間の室温での減圧乾固により以下の理化学的性質を有する物質に変性することを特徴とする請求項１記載の物質：
ｅ）溶解性：クロロホルム、メタノール、エチルエーテル及びベンゼンに不溶性で超純水に溶解する
ｆ）物質の色：薄褐色（粘稠物質）、メタノール中では白色に変色。
【請求項３】
糖、リン酸基、アミノ基及びステロールをその構造中に有さない、請求項１記載の物質。
【請求項４】
アワビ内臓由来である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の物質。
【請求項５】
アワビ内臓抽出物の総脂溶性画分を薄層クロマトグラフィーにより精製することによって得られる請求項１〜３のいずれか１項に記載の物質であって、薄層クロマトグラフィーによる精製が以下の工程を含むものである物質；
（１）アワビ内臓抽出物の総脂溶性画分を１次元薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム−アセトニトリル−酢酸（７０：３０：１）混液）に付し、展開溶媒による展開後のプレートに紫外線照射を行って得られる９個のスポットのうち、原点から２番目の白色のスポット（Ｒｆ＝０．０２９）から活性物質を回収する工程、および
（２）上記工程（１）で回収した活性物質を２次元薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：エチルエーテル−メタノール−ピリジン（８０：２０：４）混液）に付し、展開溶媒による展開後のプレートに紫外線照射を行って得られる４個のスポットのうち、原点から３番目の水色のスポットから活性物質を回収する工程。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の物質を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の物質を有効成分として含有する細胞増殖阻害剤。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の物質を有効成分として含有する細胞の多核化誘導剤。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の物質を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤。
【請求項１０】
アワビ内臓抽出物を有効成分として含有する、細胞増殖阻害剤。
【請求項１１】
アワビ内臓抽出物を有効成分として含有する、アポトーシス誘導剤。
【請求項１２】
アワビ内臓抽出物の総脂溶性画分を薄層クロマトグラフィーにより精製することによって得られる物質であって、薄層クロマトグラフィーによる精製が以下の工程を含むものである細胞増殖阻害活性物質；
（１）アワビ内臓抽出物の総脂溶性画分を１次元薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム−アセトニトリル−酢酸（７０：３０：１）混液）に付し、展開溶媒による展開後のプレートに紫外線照射を行って得られる９個のスポットのうち、原点から２番目の白色のスポット（Ｒｆ＝０．０２９）から活性物質を回収する工程、および
（２）上記工程（１）で回収した活性物質を２次元薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：エチルエーテル−メタノール−ピリジン（８０：２０：４）混液）に付し、展開溶媒による展開後のプレートに紫外線照射を行って得られる４個のスポットのうち、原点から３番目の水色のスポットから活性物質を回収する工程。
【請求項１３】
請求項１２に記載の物質を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１２に記載の物質を有効成分として含有する細胞増殖阻害剤。
【請求項１５】
請求項１２に記載の物質を有効成分として含有する細胞の多核化誘導剤。
【請求項１６】
請求項１２に記載の物質を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海産物由来の生理活性物質に関する。より詳しくは、アワビ内臓より得られる細胞増殖阻害活性を有する生理活性物質、およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の最小構成単位である細胞の構造と機能の解析は、生命現象を理解する上で最も基本的かつ必要不可欠な作業である。生きた細胞に生理活性物質を作用させ、それに対する細胞側の反応を解析する手法は、細胞の構造と機能を解析する上で最も有効な方法の一つである。
【０００３】
生理活性物質、特に天然の活性物質の資源としては種々報告されている。例えば動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもの等が挙げられ、またその活性も種々のものが報告されている。中でも海産物は天然の生理活性物質の資源としてその豊富な供給能力が期待されるが、どのような物質が単離し得るのか、またかかる物質がどのような作用を有しているのか等未解明な部分が依然多い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、天然物由来の生理活性物質、特に海産物由来の生理活性物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、未だ、天然の生理活性物質の資源として未知の部分が多い海産物に注目し、生理活性物質を得ることを試みた。その一環として種々の海産物由来の抽出物について培養細胞への影響を検討している過程で、アワビ内臓抽出物由来の脂溶性物質が種々の培養細胞の増殖を抑制することを見出し、さらに本物質の作用機構を調べたところ、細胞の核を断片化し細胞を多核化すること、この多核化が細胞増殖抑制活性の一因であることを確認して本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち本発明は下記の通りである。
〔１〕以下の理化学的性質を有する細胞増殖阻害活性物質：
ａ）分子量：約６６０
ｂ）紫外可視吸収波長スペクトル：図１に示す  λｍａｘ（クロロホルム中）：２５６ｎｍ
ｃ）溶解性：クロロホルムに易溶
ｄ）物質の色：薄褐色（液状）。
〔２〕長時間の室温での減圧乾固により以下の理化学的性質を有する物質に変性することを特徴とする上記〔１〕記載の物質：
ｅ）溶解性：クロロホルム、メタノール、エチルエーテル及びベンゼンに不溶性で超純水に溶解する
ｆ）物質の色：薄褐色（粘稠物質）、メタノール中では白色に変色。
〔３〕糖、リン酸基、アミノ基及びステロールをその構造中に有さない、上記〔１〕記載の物質。
〔４〕アワビ内臓由来である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載の物質。
〔５〕アワビ内臓抽出物の総脂溶性画分を薄層クロマトグラフィーにより精製することによって得られる上記〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載の物質であって、薄層クロマトグラフィーによる精製が以下の工程を含むものである物質；
（１）アワビ内臓抽出物の総脂溶性画分を１次元薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム−アセトニトリル−酢酸（７０：３０：１）混液）に付し、展開溶媒による展開後のプレートに紫外線照射を行って得られる９個のスポットのうち、原点から２番目の白色のスポット（Ｒｆ＝０．０２９）から活性物質を回収する工程、および
（２）上記工程（１）で回収した活性物質を２次元薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：エチルエーテル−メタノール−ピリジン（８０：２０：４）混液）に付し、展開溶媒による展開後のプレートに紫外線照射を行って得られる４個のスポットのうち、原点から３番目の水色のスポットから活性物質を回収する工程。
〔６〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれか１つに記載の物質を有効成分として含有する医薬組成物。
〔７〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれか１つに記載の物質を有効成分として含有する細胞増殖阻害剤。
〔８〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれか１つに記載の物質を有効成分として含有する細胞の多核化誘導剤。
〔９〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれか１つに記載の物質を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤。
〔１０〕アワビ内臓抽出物を有効成分として含有する、細胞増殖阻害剤。
〔１１〕アワビ内臓抽出物を有効成分として含有する、アポトーシス誘導剤。
〔１２〕アワビ内臓抽出物の総脂溶性画分を薄層クロマトグラフィーにより精製することによって得られる物質であって、薄層クロマトグラフィーによる精製が以下の工程を含むものである細胞増殖阻害活性物質；
（１）アワビ内臓抽出物の総脂溶性画分を１次元薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム−アセトニトリル−酢酸（７０：３０：１）混液）に付し、展開溶媒による展開後のプレートに紫外線照射を行って得られる９個のスポットのうち、原点から２番目の白色のスポット（Ｒｆ＝０．０２９）から活性物質を回収する工程、および
（２）上記工程（１）で回収した活性物質を２次元薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：エチルエーテル−メタノール−ピリジン（８０：２０：４）混液）に付し、展開溶媒による展開後のプレートに紫外線照射を行って得られる４個のスポットのうち、原点から３番目の水色のスポットから活性物質を回収する工程。
〔１３〕上記〔１２〕に記載の物質を有効成分として含有する医薬組成物。
〔１４〕上記〔１２〕に記載の物質を有効成分として含有する細胞増殖阻害剤。
〔１５〕上記〔１２〕に記載の物質を有効成分として含有する細胞の多核化誘導剤。
〔１６〕上記〔１２〕に記載の物質を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の細胞増殖阻害活性物質ならびにアワビ内臓抽出物は、種々の細胞に対して細胞増殖阻害活性を有し、また細胞の多核化、ひいてはアポトーシスを誘導する作用を有する。本発明が提供するこのような作用により、異常な細胞増殖に起因する各種疾患（例えば癌）の治療剤としての用途が期待できる。また、細胞の機能を解析するための効果的なツールとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は細胞増殖阻害活性、多核化活性及び／またはアポトーシス誘導作用を有する新規な生理活性物質を提供する。また、後述するが、アワビ内臓抽出物にも同様な活性が認められ、当該抽出物も本発明に包含される。本発明において提供されるアワビ内臓抽出物としては、上記活性を有しているものであれば特に限定されず、その精製の程度も特に制限されるものではない。例えば硫安分画による精製ではいずれの分画も本発明のアワビ内臓抽出物に含まれる。
【０００９】
本発明において、本発明の細胞増殖阻害活性物質は簡便にはアワビ内臓抽出物、特にアワビ内臓抽出物の総脂溶性画分を薄層クロマトグラフィー、特に２次元薄層クロマトグラフィーを用いて精製することによって得られる。
【００１０】
本発明の細胞増殖阻害活性物質の理化学的特徴について以下に詳述する。
ａ）分子量約６６０である。
【００１１】
具体的には当該分子量は質量分析によって測定することができる。アワビ内臓抽出物の総脂溶性画分を薄層クロマトグラフィー、特に２次元薄層クロマトグラフィーを用いて精製することによって得られる試料の質量スペクトル解析の結果を図５に示す。
【００１２】
ここで質量分析は当分野で通常実施される手法、設備、機器を利用して行うことができ、例えばアワビ内臓抽出物の総脂溶性画分を薄層クロマトグラフィー、特に２次元薄層クロマトグラフィーを用いて精製することによって得られる試料をクロロホルムに溶解し化学イオン化でイオン化した後、JEOL JMS-SX-102AQQ hybrid mass spectrometer（日本電子社製）及びJMS-Gcmate（日本電子社製）を用いて実施し得る。
ｂ）紫外可視吸収波長スペクトル（クロロホルム中）：図１に示す。
【００１３】
クロロホルム中での吸収極大波長は、２５６ｎｍであり、可視領域には目立った吸収は見られない。当該知見より、本発明の細胞増殖阻害活性物質はその分子中に、何らかの環状構造を有する可能性が示唆される。
【００１４】
ここで紫外可視吸収波長スペクトル解析は当分野で通常実施される手法、設備、機器を利用して行うことができ、例えばアワビ内臓抽出物の総脂溶性画分を薄層クロマトグラフィー、特に２次元薄層クロマトグラフィーを用いて精製することによって得られる試料をクロロホルムに溶解し、Beckman DU640 spectrophotometer (Beckman社製)を用いて実施し得る。
ｃ）溶解性：クロロホルムに易溶。
ｄ）物質の色：薄褐色（液状）。
【００１５】
さらに、本発明の細胞増殖阻害活性物質は長時間の室温での減圧乾固により以下の理化学的性質を有する物質に変性することを特徴とする。ここで「長時間」とは、５時間以上が例示される。具体的には、減圧下、５時間以上放置する。減圧乾固するための手段としては通常当分野で実施されている方法が利用できるが、例えばロータリーエバポレーターや真空ポンプ等の手段が用いられる。
ｅ）変性することにより、溶解性が変化する。当該変性により、クロロホルム、メタノール、エチルエーテル及びベンゼンに不溶性であり、且つ超純水（例えばミリポア社製のろ過器によりろ過されたミリＱ水）に溶解性の物質となる。
ｆ）変性することにより薄褐色の液状物質であったものが、薄褐色の粘稠物質となる。
【００１６】
また、本発明の細胞増殖阻害活性物質は、モリブデン試薬反応を用いた確認試験結果からリン酸基を含有しないこと、ナフトール法およびアンスロン法を用いた確認試験結果から糖を含有しないこと、ニンヒドリン試薬反応を用いた確認試験結果からアミノ基を含有しないこと、硫酸−酢酸法を用いた確認試験結果からステロールを含有しないことが明らかとなっている。
【００１７】
各呈色反応用の試薬は公知の方法（生物化学実験法９、脂質分析法入門、藤野安彦著、学会出版センター）に基づいて調製した。
【００１８】
本発明の細胞増殖阻害活性物質は、例えばアワビ内臓の抽出物から分離精製することによって得ることができる。
【００１９】
アワビ内臓抽出物からの分離精製は、本発明の細胞増殖阻害活性物質の理化学的な性質を利用して各種分離手段の組合せにより精製することにより得られるが、好適には薄層クロマトグラフィーを利用した分離方法が用いられる。本発明において「アワビ」とは、本発明の活性物質（細胞増殖阻害活性、多核化活性及び／またはアポトーシス誘導作用を有する物質であり、アワビ内臓抽出物の総脂溶性画分を薄層クロマトグラフィー、特に２次元薄層クロマトグラフィーを用いて精製することによって得られる活性スポットから回収される物質ならびに後述するアワビ内臓抽出物の両方を意図している）を含有するものであれば、その種類や産地や齢（大きさ）等は特に限定されず、軟体動物腹足綱ミミガイ科に属する巻き貝のうち、とくに食用に供されるような大形種を意図している。日本以外に、北アメリカ西岸、アフリカ南部及びオーストラリアで採れる。本発明の細胞増殖阻害活性物質の出発原料となるのは好ましくはオーストラリア産のアワビである。本発明においては特にアワビの内臓を原料とする。「内臓」とは、一般に食用に用いる主に筋肉からなる部分以外の全てであって、一般的にアワビの内臓と認知され得る部分である。アワビ内臓抽出物は、生きたアワビから内臓を摘出し、適当な緩衝液（例えばリン酸緩衝液、好ましくはプロテアーゼインヒビターを含有する）中でホモジナイズすることによって得ることができる。得られた抽出物はろ過や遠心分離等、当分野で通常実施する適当な手段により不溶物を除去することが好ましい。そのまま分離・精製工程といった一連の過程（後述）を連続して行ってもよいが、調製した抽出物を凍結乾燥により保存可能な粉末とすることもできる。また、生きたアワビから内臓を摘出した時点で一旦冷凍し、使用時まで冷凍保存し、用時解凍し抽出材料とすることもできる。さらに、硫安沈殿処理（硫安分画）を組み合わせて抽出物を調製することもできる。
【００２０】
薄層クロマトグラフィーを利用した分離方法としては具体的には以下の工程を含む。
（１）アワビ内臓抽出物の総脂溶性画分を１次元薄層クロマトグラフィーに付し、活性物質を分離、回収する工程。
【００２１】
アワビ内臓抽出物（上述）から総脂溶性画分の抽出はＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法（Can. J. Biochem. Physiol., 37, 911-917,1959）に従って行う（詳細な抽出方法は実施例参照のこと）。得られた総脂溶性画分は、窒素置換した後、使用時まで−２０℃で遮光保存する。
【００２２】
１次元薄層クロマトグラフィーは、通常当分野で実施される手段に準じて実施することができる。展開溶媒にはクロロホルム−アセトニトリル−酢酸（７０：３０：１）を用いる。展開後、薄層プレートを風乾し、紫外線（３０２ｎｍ）照射することにより９個のスポットが検出される。本発明の細胞増殖阻害活性物質は、原点から２番目の白色のスポット（Ｒｆ＝０．０２９）に含まれるので、当該スポットから活性物質を抽出する。スポットからの活性物質の精製も通常実施されている手法に準じて実施することができる。薄層プレートとしてシリカゲルを塗布したガラスプレートを用いた場合を例にとって説明する。薄層プレートから該当するスポットをシリカゲルごとかき取った後、クロロホルム−メタノール（１：２）に溶解し、ガラスろ過器によりシリカゲルを除去し、クロロホルム−メタノール−水（６：５：１）にて再抽出した後、溶媒を除去する。クロロホルム−メタノール（１：１）及び水を添加し分液した後、クロロホルム層を回収する。活性物質はこのクロロホルム層に含まれるので、当該クロロホルム層を窒素置換し使用時まで−２０℃で遮光保存する。
（２）上記（１）で得られた活性物質を２次元薄層クロマトグラフィーに付し、活性物質を分離、回収する工程。
【００２３】
２次元薄層クロマトグラフィーは、通常当分野で実施される手段に準じて実施することができる。展開溶媒にはエチルエーテル−メタノール−ピリジン（８０：２０：４）を用いる。展開後、薄層プレートを風乾し、紫外線（３０２ｎｍ）照射することにより４個のスポットが検出される。本発明の細胞増殖阻害活性物質は原点から３番目の水色のスポットに含まれるので、当該スポットから活性物質を抽出する。スポットからの活性物質の精製は上記（１）で述べた方法と同様にして行う。
【００２４】
かくして薄層クロマトグラフィーを用いた分離・精製により、アワビ内臓抽出物から本発明の細胞増殖阻害活性物質を得ることができる。
【００２５】
本発明の細胞増殖阻害活性物質は、種々の細胞に対して細胞増殖阻害活性を有し、また細胞の多核化ならびにアポトーシスを誘導する作用を有する。従って本発明の細胞増殖阻害活性物質あるいは同様な作用を有するアワビ内臓抽出物を有効成分として含有する医薬組成物ならびに各種剤（細胞増殖阻害剤、アポトーシス誘導剤、多核化誘導剤）は、異常な細胞増殖に起因しているとされる各種疾患（例えば癌）の治療剤として有用である。特に本発明において使用する活性物質は天然物由来の為、安全に使用できることが期待される。
【００２６】
本発明の細胞増殖阻害活性物質あるいは同様な作用を有するアワビ内臓抽出物を有効成分とする医薬組成物および／または各剤は、経口あるいは非経口で投与され得る。その投与に際しては、それぞれの投与経路に応じて適宜の形態、例えば経口製剤、注射剤として製剤化されて投与される。経口製剤（例えば、錠剤、カプセル剤）および注射用製剤はそれぞれ常法によって製造される。それぞれの製剤には、通常それぞれの剤形に応じた製薬上許容される担体または添加物が配合される。また、経皮により投与する場合は、剤形として代表的なものに軟膏製剤が挙げられる。該製剤には、必要に応じて賦形剤、乳化剤、安定剤等の慣用の担体を用いて常套手段により調製することができる。
【００２７】
当該医薬組成物／または各剤における有効成分である本発明の細胞増殖阻害活性物質あるいは同様な作用を有するアワビ内臓抽出物の含量は、投与方法、剤形、適応疾患により適宜変更することが可能であるので特に限定されない。投与量は、適用疾患、疾患の程度、患者の年齢等により異なり、またそれらの要因に応じて設定される。
【００２８】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。また、用いる各化合物や試薬等は特に言及しない限り、商業的に入手可能であるか、また既知の報告等に基づいて調製することができる。
【実施例１】
【００２９】
（活性本体の精製）
１．アワビ内臓抽出物の調製
生きたアワビ（オーストラリア産）から内臓を摘出し、一旦冷凍保存後用時解凍し抽出材料とした。アワビ内臓重量（ｇ）に対し４倍量（ｍｌ）の緩衝液〔１ｍＭ  ＰＭＳＦ（phenylmethylsulfonyl fluoride），１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン，１μｇ／ｍｌ  ペプスタチン，０．１ｍＭ  ＤＴＴ（dithiothreitol），１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid）を添加したＰＢＳ（−）（phosphate buffered saline）（ＮａＣｌ  ８ｇ／Ｌ，ＫＣｌ  ０．２ｇ／Ｌ，Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ２．９ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４  ０．２ｇ／Ｌ）〕中で解凍後、ワーリングブレンダーで６，０００ｒｐｍ、２分間ホモジナイズを行い、４℃で１時間撹拌した。この抽出液をガーゼでろ過し、１０，０００×ｇで２０分間遠心した。上清を１００，０００×ｇで１時間遠心し、更にその上清をＮｏ．２ろ紙でろ過して不溶物を除去後、凍結乾燥を行い−２０℃で保存した。使用時にはＰＢＳ（−）で溶解、希釈して用いた。
２．総脂溶性画分の抽出
総脂溶性画分の抽出はＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法に従い行った。即ち、上記「１．アワビ内臓抽出」の項で得られたアワビ内臓抽出物の凍結乾燥粉末を５０ｍｇ／ｍｌになるよう超純水に溶解し、溶液５ｍｌに対しメタノール１２．５ｍｌとクロロホルム６．２５ｍｌを加え２分間激しく振盪した。続いてクロロホルム６．２５ｍｌを添加し２分間激しく振盪した後、更にＰＢＳ（−）６．２５ｍｌを加え２分間激しく振盪した。１，１００×ｇで５分間遠心を行いクロロホルム層を回収した。水層、及び蛋白質層をクロロホルム７．５ｍｌで洗浄後、再びクロロホルム層を回収した。回収したクロロホルム層を合わせた後、水溶性物質を除去するためクロロホルム−メタノール−水（３：４８：４７）を１０ｍｌ加え２分間激しく振盪後、１，１００×ｇで５分間遠心を行いクロロホルム層を回収した。この操作を再度行い、水溶性物質を除去した。得られたクロロホルム層はネジ付きガラス管中で窒素置換した後、使用時まで−２０℃で遮光保存した。
３．薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による精製
ガラスプレート（５ｃｍ×２０ｃｍ、２０ｃｍ×２０ｃｍ）に０．２５ｍｍの厚さでシリカゲルＨ（Kieselgel 60H, MERCK社製）を塗布し、使用直前に１２０℃で１時間加熱し活性化した。クロロホルム−アセトニトリル−酢酸（７０：３０：１）の展開溶媒で展開後、薄層プレート上に可視光下、肉眼で明らかに確認できる４個のスポットが検出された。全てのスポットを検出するため、展開後のプレートに紫外線（３０２ｎｍ）照射を行うと、９個のスポットが検出された。これらのスポットについてそれぞれ活性を調べたところ、原点から２番目のスポット（Ｒｆ＝０．０２９）に著しい細胞増殖抑制活性と多核化活性を認めた。このスポットは可視光下では検出できず、紫外線照射下で白色スポットとして認められた。
【００３０】
一方、溶媒先端から２番目のスポットには強い細胞毒性を認めた。
【００３１】
上記活性（細胞増殖抑制活性と多核化活性）を示したスポットをさらに２次元薄層クロマトグラフィーにより分離した。２次元用の展開溶媒としてエチルエーテル−メタノール−ピリジン（８０：２０：４）の混液を用いた。その結果、１次元ＴＬＣで分離された活性スポットは２次元ＴＬＣでさらに４個のスポットに分離した。この４個のスポットについてそれぞれ活性を調べたところ、原点から３個目の水色スポットに細胞増殖抑制活性と多核化活性を認めた。一方、他のスポットには活性は認められなかった。
【００３２】
ＴＬＣ後のプレートからの活性物質の精製は以下のようにして行った。プレートから活性スポットをシリカゲルごとかき取った後、クロロホルム−メタノール（１：２）に溶解し、ガラスろ過器によりシリカゲルを除去し、クロロホルム−メタノール−水（６：５：１）にて再抽出した後、３０℃の温浴にて溶媒を吸引蒸発させた。クロロホルム−メタノール（１：１）を１ｍｌ、及び水０．４５ｍｌをそれぞれ添加し２分間振盪後、１，１００×ｇで５分間遠心しクロロホルム層を回収した。得られたクロロホルム層は、ネジ付きガラス管中で窒素置換し使用時まで−２０℃で遮光保存した。
【００３３】
２次元ＴＬＣによる精製によって得られた本発明の細胞増殖阻害活性物質を便宜上精製活性物質と称することもある。
【００３４】
尚、本発明の生理活性物質の細胞増殖抑制活性と多核化活性については他の実施例で詳述する。
４．本発明の細胞増殖阻害活性物質の化学的特性
本発明の細胞増殖阻害活性物質の化学的な特性を調べるために、まず紫外可視吸収スペクトル解析を行った。その結果、本発明の細胞増殖阻害活性物質はクロロホルム中で２５６ｎｍの吸収極大波長を持ち、可視領域に目立った吸収は見られないことがわかった（図１参照）。続いて本発明の細胞増殖阻害活性物質の分子量を調べるため質量分析による解析を行った結果、分子量は約６６０であることが判明した（図５参照）。さらに精製活性物質について１Ｈ核磁気共鳴スペクトル解析、１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル解析及び赤外線吸収スペクトル解析を行った。結果をそれぞれ図３、図４及び図２に示す。得られた物質はクロロホルム易溶性の薄い褐色の液状物質であった。本物質は室温で長時間の減圧乾固を行うと、クロロホルムに対して不溶性となり薄い褐色の粘稠な物質に変性した。またこの物質はメタノールに対しても不溶であり、メタノール中では白色に変色した。更にエチルエーテル、ベンゼンにも不溶であったが超純水に溶解した。本発明の細胞増殖阻害活性物質について薄層プレート上で種々の検出試薬を用いて呈色反応を行ったところ、糖やリン酸基、アミノ基及びステロールを有していないことがわかった。
【００３５】
紫外可視吸収スペクトル解析は、精製活性物質をクロロホルムに溶解し、Beckman DU640 spectrophotometer (Beckman社製)を用いて実施した。また、分子量を測定するためには、当該物質をクロロホルムに溶解し化学イオン化でイオン化した後、JEOL JMS-SX-102AQQ hybrid mass spectrometer（日本電子社製）及びJMS-Gcmate（日本電子社製）を用いて実施した。さらに赤外線吸収スペクトル解析は、当該物質をクロロホルムに溶解し、FITR8100A Fourier Transform Infrared Spectrophotometer  (島津製作所製)を用いて実施した。１Ｈ核磁気共鳴スペクトルは当該物質をＣＤＣｌ３に溶解し、INOVA-500（Varian社製）を用いて実施した。１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル解析は当該物質をＣＤＣｌ３に溶解し、INOVA-500（Varian社製）を用いて実施した。
【実施例２】
【００３６】
（本発明の生理活性物質の細胞増殖抑制活性及び多核化活性）
実施例１で調製した、精製活性物質について、細胞増殖抑制活性及び多核化活性を確認した。
（１）材料及び方法
≪細胞≫
培養株化細胞であるヒト子宮頸部癌由来ＨｅＬａ細胞(商業的に入手可能)を用い、培地としてＭＥＭ（minimum essential medium）(GIBCO BRL社製)に１０％仔ウシ血清（bovine calf serum; CS）（Hyclone社製）、０．２％炭酸水素ナトリウム、１００単位／ｍｌペニシリンＧカリウム（萬有製薬株式会社製）、及び１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン（明治製菓株式会社製）を添加したものを用い、３７℃、５％ＣＯ２存在下で継代培養した。
≪本発明の精製活性物質による細胞の処理≫
細胞をＰＢＳ(−)で３回洗浄後、本発明の精製活性物質で処理した。本発明の精製活性物質によるＨｅＬａ細胞の処理は以下のようにして行った。まず、細胞を洗浄後、最終的な培養皿中の濃度が２．１μｇ／ｍｌあるいは４．２μｇ／ｍｌとなるように、ＰＢＳ（−）で希釈した本発明の精製活性物質を１００μｌ滴下し、培養皿を氷浴上に１５分間静置し、本発明の精製活性物質の希釈液が細胞に均一に分布するように時々皿を傾けた。続いて３７℃に加温した培養液を２．９ｍｌ添加し、さらに培養を続けた。
（２）結果
処理後１５時間と２４時間で細胞数と多核細胞の割合の測定を行った。細胞数と多核細胞の割合の測定は、顕微鏡下で行った。結果を図６に示す。濃度依存的に細胞増殖抑制活性及び多核化活性が見られ、４．２μｇ／ｍｌで細胞の増殖がほぼ完全に抑制された。
【実施例３】
【００３７】
（アワビ内臓抽出物の細胞増殖抑制活性及び多核化活性）
（１）材料及び方法
≪細胞≫
試験対象となる細胞として、次の３種の細胞を用いた。
・ＨｅＬａ細胞：実施例２で用いた細胞と同様に継代培養したものを用いた。
・ＸＡ６５３細胞：マウスプラズマサイトーマ由来の細胞(商業的に入手可能)であり、培地としてＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium）(GIBCO社製)に１５％ウシ胎児血清（fetal bovine serum；ＦＢＳ）(JRH Biosciences社製)、１００単位／ｍｌペニシリンＧカリウム及び１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを添加したものを用い、３７℃、５％ＣＯ２存在下で継代培養した。
・ＱＭ−ＲＳＶ細胞：形質転換ウズラ胚筋芽細胞。ＱＭ−ＲＳＶ細胞の調製及び培養はＫｉｍらの方法に従い行った（Cell Struct. Funct., 17, 237-247, 1992）。ＱＭ−ＲＳＶ細胞はウズラ胚筋芽細胞（quial myoblast;ＱＭ）をラウス肉腫ウイルス（Rous sarcoma virus;ＲＳＶ）の温度感受性変異株で形質転換させた細胞で、ＲＳＶの非許容温度である３５．５℃では未分化な筋芽細胞のまま増殖を続け癌細胞のようにふるまうが、ＲＳＶの非許容温度である４１℃では分化を始め、互いに融合して多核の筋管を形成する。
【００３８】
ＱＭ−ＲＳＶ細胞はコラーゲン（Cell Matrix Type I-P、新田ゼラチン社製）処理したプラスチック製培養皿に撒き込み、増殖培地としてＤＭＥＭに２０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン（日水製薬株式会社製）、１００単位／ｍｌペニシリンＧカリウム及び１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを添加したものを用い、３５．５℃、５％ＣＯ２存在下で継代培養した。
≪アワビ内臓抽出物の調製≫
実施例１の「１．アワビ内臓抽出物の調製」の項で得られた凍結乾燥する前の抽出物について硫安分画を行った。凍結乾燥前の抽出液に５０％飽和になるよう硫酸アンモニウムを添加し４℃で１時間放置後、１０，０００×ｇで１５分間遠心し、得られた沈殿物を５０％硫安沈殿物とした。続いてその上清に１００％飽和になるよう硫酸アンモニウムを添加し４℃で１時間放置後、１０，０００×ｇで１５分間遠心し、得られた沈殿物を１００％硫安沈殿物、上清を１００％硫安上清とした。５０％硫安沈殿物と１００％硫安沈殿物を少量のＰＢＳ（−）に溶解し、これら２つの画分と１００％硫安上清をＰＢＳ（−）に対し３日間透析した後凍結乾燥を行い−２０℃で保存し、使用時にはＰＢＳ（−）で希釈して用いた。
≪アワビ内臓抽出物による細胞の処理≫
上記で得られたアワビ内臓抽出物から得た３つの粗画分である５０％硫安沈殿物と１００％硫安沈殿物、及び１００％硫安上清について、それぞれ培養細胞の増殖に及ぼす影響を調べた。各細胞をＰＢＳ(−)で３回洗浄後、各アワビ内臓抽出物で処理した。細胞の処理は、各画分を１．０ｍｇ／ｍｌまたは２．０ｍｇ／ｍｌとなるように調製した希釈液を１００μｌ添加して処理する以外は実施例２と同様にして行った。また、いずれの細胞も処理後、継代培養時の温度と同じ温度で培養を続けた（ＱＭ−ＲＳＶ細胞は、未分化な筋芽細胞のまま増殖を続けさせるため、３５．５℃で培養を続けた）。
（２）結果
処理後４８時間で細胞数を測定した。その結果、未処理のコントロールでは、細胞数の増加が認められたが、５０％硫安沈殿物と１００％硫安沈殿物、及び１００％硫安上清の３つの画分全てにおいて、細胞増殖の抑制が認められた。
【００３９】
また、ＨｅＬａ細胞及びＸＡ６５３細胞については、細胞増殖抑制に伴いアワビ内臓抽出物の３つの粗画分全てにおいて処理後４８時間で、多くの細胞で通常の細胞よりも扁平で２倍以上の大きさを持つ多核細胞が認められた（ＨｅＬａ細胞での観察象を図７に示す）。
【００４０】
一方、ＱＭ−ＲＳＶ細胞については、このような多核細胞の形成は観察されなかった。
【００４１】
尚、細胞数と多核細胞の割合の測定は、実施例２同様、顕微鏡下で行った。
【実施例４】
【００４２】
（細胞周期に及ぼす本発明の活性物質の影響）
（１）材料及び方法
≪細胞≫
ＨｅＬａ細胞（実施例２で用いた細胞と同様）を用いた。
≪フローサイトメトリー（flow cytometry；ＦＣＭ）によるＤＮＡ量の測定≫
アワビ内臓から精製した本発明の精製活性物質（実施例１と同様にして調製）を４．２μｇ／ｍｌでＨｅＬａ細胞を処理した。本発明の精製活性物質での細胞の処理は実施例２で行った手順に準じて行った。処理後、１５時間、２４時間、及び３６時間で細胞を培養皿からトリプシンとＥＤＴＡを用いて回収し、１０％ＣＳ−ＭＥＭとＰＢＳ（−）でそれぞれ１回ずつ洗浄した。その後７０％エタノールで２４時間から７２時間、−２０℃で固定した。ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後ＰＢＳ（−）９０μｌに懸濁し、５０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡを１０μｌ添加、３７℃で３０分間放置した。その後、更に１ｍｇ／ｍｌのＰＩ（propidium Iodide）５μｌ、及びＰＢＳ（−）９８５μｌを添加し、ＦＡＣＳCalibur（Becton Dickinson社製）を用いて１個の細胞あたりのＤＮＡ量（相対ＤＮＡ量）を測定した。
≪ＤＮＡラダー形成の確認≫
６０ｍｍ径培養皿に４．５×１０５個になるようにＨｅＬａ細胞を撒き込んだ後、実施例３で行った方法と同様な方法によって５０％硫安沈殿物で処理した。一方、これとは別に細胞にアポトーシスを引き起こすため、撒き込んで２４時間後にエトポシド（SIGMA社製）２３５．４μｇ／ｍｌを溶解した培養液に交換した。それぞれ３７℃で２４時間、及び４８時間培養後細胞を回収し、４℃、４００×ｇで５分間遠心後沈殿を回収した。沈殿をlysis buffer〔１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％  sodium N-lauroylsarcosinateを添加した５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）〕２０μｌに懸濁し、１０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡを１μｌ添加後５０℃で３０分間加温した。更に１０ｍｇ／ｍｌ  Proteinase Kを１μｌ添加し５０℃で１時間加温後、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＵＶイルミネーター上で観察した。
（２）結果
本発明の精製活性物質の細胞周期へ及ぼす影響を調べた結果を図８に示す。
【００４３】
処理後１５時間では、未処理のコントロールと比較して本発明の精製活性物質で処理した細胞では相対ＤＮＡ量が４Ｎの細胞の割合の増加（図８，ｄ，矢印）が見られた。これは本発明の活性物質で処理した細胞が、処理後１５時間でＧ２期あるいはＭ期にて細胞周期を停止していることを示している。この時、Ｍ期の細胞に特徴的な培養皿への付着性の低下した丸い形態を示す細胞が多く観察された。このことから本発明の精製活性物質で処理することによりＭ期で細胞周期が停止しているものと思われた。しかし多くの多核細胞の出現が観察される処理後２４時間以降で、相対ＤＮＡ量が４Ｎの細胞の割合が低下し、それに伴い８Ｎの細胞の増加（図８，ｆ，白矢頭）が見られた。これらのことから本発明の精製活性物質で処理した細胞は、処理後１５時間において一旦Ｍ期で細胞周期を停止するが細胞周期は再び進行し、その後多核細胞が形成されるものと思われた。また、図８、ｄにて、処理後１５時間でアポトーシスを示すピーク（黒矢頭）が認められた。そこで５０％硫安沈殿物（実施例３で調製したもの）を１０ｍｇ／ｍｌでＨｅＬａ細胞に処理し、アポトーシスを起こしているかどうかをＤＮＡラダー形成の確認により行った。その結果、５０％硫安沈殿物を処理した細胞にアポトーシスを起こした細胞に典型的なＤＮＡラダーが認められた。
【実施例５】
【００４４】
（アワビ内臓抽出物によって誘導される多核化の機構）
（１）材料及び方法
≪細胞≫
ＨｅＬａ細胞（実施例２で用いた細胞と同様）を用いた。
≪間接蛍光抗体法≫
１３ｍｍ径カバースリップ（松浪硝子工業株式会社製）上に培養したＨｅＬａ細胞を本発明の細胞増殖阻害活性物質で処理後、経時的にカバースリップを取り出した。微小管染色のために、細胞を３．７％ホルマリン／ＰＢＳ（−）により室温で２０分間固定した。固定液を除きＰＢＳ（−）で洗浄した後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を４℃で１０分間処理し、１次抗体として抗β−tubulin抗体（SIGMA社製）を用い、氷浴上で１時間反応させた。中心体染色のためには、細胞をアセトン−メタノール混液（１：１）により−２０℃で１２分間固定した。固定液を除き細胞をＰＢＳ（−）で洗浄した後、抗体の非特異的な結合を避けるため、１０％ＮＧＳ（Normal Goat Serum）／ＰＢＳ（−）を用いて氷浴上で１５分間処理した。１次抗体として抗γ−tubulin抗体（SIGMA社製）を用い、氷浴上で１時間反応させた。未反応の１次抗体をＰＢＳ（−）で洗浄除去後、２次抗体としてＦＩＴＣ（fluorescein-isothiocyanate）標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（Cappel/ICN Pharmaceutical社製）、及び核の染色のためにヘキスト３３２５８（polysciences社製）の混液を加え、氷浴上で３０分間反応させた。２次抗体をＰＢＳ（−）で洗浄除去後、５０％グリセロール（退色防止の目的で１ｍｇ／ｍｌのｐ−フェニレンジアミンを含む）に封入し、蛍光顕微鏡Axiophoto（Carl Zeiss社製）により観察した。
（２）結果
アワビ内臓抽出物で処理することによって形成される多核細胞が、細胞融合によるものか細胞質分裂阻害によるものかを明らかにするため、５０％硫安沈殿物（実施例３で調製したもの）処理後のＨｅＬａ細胞を追跡観察した。当該処理は実施例３と同様にして行った。顕微鏡下で印を付けた３５ｍｍ径培養皿にＨｅＬａ細胞を撒き込み、５０％硫安沈殿物を処理後一定時間ごとに観察を行った。処理後２４時間で単核であった細胞は、２８時間で培養皿への付着性が低下して丸くなり、３２時間で再び培養皿へ接着した時には多核を示した。このことから細胞の多核化は細胞融合によるものではなく、１個の細胞内で起こるものと思われた。
【００４５】
また、このような多核化が、Ｍ期に特徴的な培養皿への付着性の低下による細胞の球形化後に認められることから、本発明の活性物質での処理によりＭ期に何らかの異常が起こっている可能性が考えられた。そこで本発明の精製活性物質で処理した細胞（ＨｅＬａ細胞；実施例２で用いたものと同じ）のＭ期での紡錘体形成を間接蛍光抗体法により詳しく観察した。その結果本発明の精製活性物質で処理した細胞では、Ｍ期に３極以上の紡錘体極から紡錘体が形成されているのを認めた。またこの時、染色体もそれぞれの紡錘体極に向かい牽引されているような分布を示した。紡錘体はＭ期の前期において中心体と呼ばれる不定形の蛋白質集合体から形成される。そこで、中心体を構成している蛋白質の１つであるγ−tubulin染色を行い、本発明の精製活性物質により紡錘体極が過剰に形成されているかどうかを確認した。その結果、本発明の精製活性物質で処理した細胞にＭ期で３個以上の中心体が認められ、その際染色体がそれぞれの中心体に向かい牽引されているように分布していることが判明した。
【００４６】
以上のことから、本発明の精製活性物質によりＭ期において過剰な中心体が形成された結果、紡錘体も過剰に形成され、染色体が異常に分離し多核化を引き起こすものと推察された。
【実施例６】
【００４７】
（サイクリンの発現に及ぼす本発明の精製活性物質の影響）
（１）材料及び方法
≪細胞≫
ＨｅＬａ細胞（実施例２で用いた細胞と同様）を用いた。
≪細胞の同調≫
３５ｍｍ径培養皿に２×１０５個になるようにＨｅＬａ細胞を撒き込んだ後２４時間培養し、アフィジコリン（和光純薬より入手）を５μｇ／ｍｌ含有した培養液に交換し、更に２４時間培養し細胞をＧ１／Ｓ期で同調させた。尚、３７℃、３０分間のＢｒｄＵ（5-bromo-2'-deoxyuridine）の取り込みから、この時の細胞同調率は約９６％であった。
≪ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び免疫ブロット≫
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはLaemmliら（Nature, 227, 380-685, 1970）、免疫ブロットはSaiuchiら（Cell Struct. Funct., 18, 285-296, 1993）の方法にそれぞれ従い行った。即ち、本発明の細胞増殖阻害活性物質を処理した細胞に抽出液〔１ｍM  ＰＭＳＦ，１ｍＭ  iodoacetamide，１μｇ／ｍｌ  ペプスタチン，１０μｇ／ｍｌ  トリプシンインヒビター，１μｇ／ｍｌ  アンチパインを添加した０．５％ sodium dodecylsulfate （ＳＤＳ）〕を３５ｍｍ径培養皿あたり１５０μｌ加えラバーポリスマン（CMS社製）で細胞を回収し、細胞を壊すためにこれを２７Ｇの注射針に１０回通し、１８，０００×ｇで１５分間遠心を行い上清を総蛋白質抽出液とした。抽出液を１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、ニトロセルロース膜（Bio-Rad Laboratories社製）上に転写した。転写後のニトロセルロース膜をTris-buffered saline（ＴＢＳ；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に１０分間浸した後、抗体の非特異的な吸着を避けるために、サイクリンＡ、及びサイクリンＢの場合は５％スキムミルク／ＴＢＳを室温でそれぞれ３０分間、及び一晩、サイクリンＥの場合は３％スキムミルク／ＴＢＳを室温で一晩処理した。１次抗体として３％スキムミルク／Ｔ−ＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ）で希釈した抗サイクリンＡ抗体（SIGMA社製）、及び抗サイクリンＢ１抗体（SIGMA社製）をそれぞれ２μｇ／ｍｌ、及び１１．２μｇ／ｍｌ、２％スキムミルク／Ｔ−ＴＢＳで希釈した抗サイクリンＥ抗体（Santa Cruz Biotechnology社製）を０．４μｇ／ｍｌの濃度で処理し、続いてＨＲＰ（horseradish peroxidase）標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体（Bio-Rad Laboratories社製）を２次抗体として処理した。未反応の２次抗体をＴ−ＴＢＳで洗浄除去後、ケミルミネッセンス試薬（Perkin Elmer社製）を室温で１分間反応させ、Ｘ線フィルム（FUJI MEDICAL X-RAY FILM New RX）(FUJIFILM社製)に露光した。またバンドの濃さはNIH Imageにより測定した。尚、NIH ImageはMachintosh computer対応の画像処理用ソフトウェアで、National Institute of Health（USA）より無料で配布されている。
（２）結果
これまでに、中心体の複製にサイクリン−ＣＤＫ複合体が関与しているという報告が多数ある。その中に、サイクリンＥ−ＣＤＫ２が中心体複製の開始に必要であること（Cell, 103, 127-140, 2000）、ヒドロキシウレアにより細胞周期を停止させたＨｅＬａ細胞にサイクリンＡを過剰発現させると中心体が過剰に形成されるという報告（Chromosoma, 110, 381-392, 2001）がある。また非分解型サイクリンＢをＨｅＬａ細胞に発現させると細胞周期がＭ期で停止し、多極の紡錘体が形成される（J. Cell Biol., 117, 213-224, 1992）。そこで、本発明の細胞増殖阻害活性物質で処理することによりサイクリンの発現に影響が見られるかどうか調べた。サイクリンは細胞周期に依存して細胞内での発現が異なる。サイクリンＥはＧ１期からＳ期にかけて発現する核蛋白質で、ＣＤＫ２と結合してキナーゼ活性を促進し、ＤＮＡ複製開始因子や転写調節因子のリン酸化を介しＳ期開始をコントロールする。またサイクリンＡはＳ期から合成が始まり、Ｓ期ではＣＤＫ２と結合してＤＮＡ複製に促進的に関与し、Ｍ期ではＣＤＫ１と結合しＭ期中期で分解される。サイクリンＢはサイクリンＡと同じくＳ期から合成されるが、ＣＤＫ１と結合してＧ２期からＭ期の移行期において急激に活性化され、Ｍ期開始に関わる核膜崩壊などの一連の事象を引き起こす。またサイクリンＢの分解は、細胞がＭ期から離脱するために必須であることが知られている（細胞周期がわかる，中山敬一（編），pp.24-35，羊土社，2001）。ＨｅＬａ細胞にアフィジコリンを処理し約９６％の細胞をＳ期で同調させた後、本発明の精製活性物質で処理し、サイクリンＡ、サイクリンＢ１、及びサイクリンＥの発現量を未処理のコントロールと比較した。その結果、サイクリンＡは本発明の精製活性物質で処理しても未処理のコントロールと比較してその発現量に差は認められなかった。しかしサイクリンＢ１は多核細胞が出現する処理後１２時間において未処理のコントロールよりも発現量が増加していることが判明した。またサイクリンＥは、処理後１８時間において、本発明の精製活性物質で処理した細胞では未処理のコントロールよりも発現量が低下していた。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の細胞増殖阻害活性物質の紫外可視吸収波長スペクトルを示す図である。
【図２】アワビ内臓抽出物から２次元薄層クロマトグラフィーによって精製することによって得られる活性スポットから回収された試料の赤外吸収スペクトルを示す図である。
【図３】アワビ内臓抽出物から２次元薄層クロマトグラフィーによって精製することによって得られる活性スポットから回収された試料の１Ｈ核磁気共鳴スペクトルを示す図である。
【図４】アワビ内臓抽出物から２次元薄層クロマトグラフィーによって精製することによって得られる活性スポットから回収された試料の１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルを示す図である。
【図５】アワビ内臓抽出物から２次元薄層クロマトグラフィーによって精製することによって得られる活性スポットから回収された試料の質量スペクトルを示す図である。
【図６】ＨｅＬａ細胞に及ぼす本発明の生理活性物質の細胞増殖抑制活性及び多核化活性を示す図である。ａは細胞増殖抑制活性を示すグラフであり、処理後１５時間および２４時間の細胞数の変化を示している。ｂは多核細胞の割合を示すグラフであり、処理後１５時間及び２４時間の多核細胞の割合の変化を示している。
【図７】アワビ内臓抽出物処理によるＨｅＬａ細胞の形態変化示す顕微鏡写真である。ａはコントロールを、ｂは５０％硫安沈殿物を処理した細胞を示す。処理後４８時間における位相差像である。
【図８】細胞周期に及ぼす本発明の細胞増殖阻害活性物質の影響を調べた図である。処理後、経時的に細胞を回収しその相対ＤＮＡ量の分布をFACSCaliburを用いて測定した。ａ，ｄは処理後１５時間、ｂ，ｅは処理後２４時間、ｃ，ｆは処理後３６時間でのヒストグラムを示す。ａ〜ｃは未処理のコントロールを、ｄ〜ｆは本発明の細胞増殖阻害活性物質で処理した細胞の結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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