(57)【要約】【目的】  アダプタ付きcDNA断片の群を高純度に作成できるアダプタ付きcDNA断片群の作成方法及び所望のcDNA断片を効率よく取得できる遺伝子断片の取得方法を提供すること。【構成】  アダプタ付きcDNA断片群の作成方法は、cDNAの一端に第１タグ物質が付加されたcDNAの群を作成し、これを第１制限酵素により切断し、更に、第１高親和性物質を用いて、第１タグ物質を有するcDNA断片の群を回収する。その後、第２制限酵素により切断し、第１タグ物質を有しないcDNA断片の群を回収する。その後、第２タグ物質を有する第１アダプタ配列と第２アダプタ配列のライゲーションを行い、第２高親和性物質を用いて、第２タグ物質を有するcDNA断片の群を回収する。その後、第２タグ物質を除去し、アダプタ付きcDNA断片の群を回収する。【選択図】        図１
2005253394.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
cDNA断片の一端に既知の第１アダプタ配列を有し他端に既知の第２アダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片の群を作成するアダプタ付きcDNA断片群の作成方法であって、
cDNAの一方の端部に第１タグ物質が付加された第１タグ付きcDNAの群を作成する第１タグ付きcDNA群作成工程と、
前記第１タグ付きcDNAの群を第１制限酵素により切断して、第１cDNA断片の群を得る第１切断工程と、
前記第１タグ物質に高親和性を有する第１高親和性物質を用いて、前記第１cDNA断片の群の中から、前記第１タグ物質を有する第１タグ付き第１cDNA断片の群を回収する第１タグ付き第１cDNA断片群回収工程と、
前記第１タグ付き第１cDNA断片の群を第２制限酵素により切断し、第２cDNA断片の群を得て、更に、この第２cDNA断片の群の中から、前記第１タグ物質を有しないタグなし第２cDNA断片の群を回収する第２切断・タグなし第２cDNA断片群回収工程と、
前記タグなし第２cDNA断片の群に対して、第２タグ物質が付加され前記第１制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する前記第１アダプタ配列、及び、前記第２制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する前記第２アダプタ配列のライゲーションを行い、少なくとも前記第２アダプタ配列が結合したアダプタ付き第２cDNA断片の群を作成する第１，第２アダプタライゲーション工程と、
前記第２タグ物質に高親和性を有する第２高親和性物質を用いて、前記アダプタ付き第２cDNA断片の群の中から、前記第２タグ物質付きの前記第１アダプタ配列をも結合した第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片の群を回収する第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片群回収工程と、
前記第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片から前記第２タグ物質を除去し、一端に前記第１アダプタ配列を有し他端に前記第２アダプタ配列を有する前記アダプタ付きcDNA断片の群を回収するアダプタ付きcDNA断片群回収工程と、
を備えるアダプタ付きcDNA断片群の作成方法。
【請求項２】
cDNA断片の一端に既知の第１アダプタ配列を有し他端に既知の第２アダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片の群を作成するアダプタ付きcDNA断片群の作成方法であって、
cDNAの一方の端部に第１タグ物質が付加された第１タグ付きcDNAの群を作成する第１タグ付きcDNA群作成工程と、
前記第１タグ付きcDNAの群を第１制限酵素により切断して、第１cDNA断片の群を得る第１切断工程と、
前記第１タグ物質に高親和性を有する第１高親和性物質を用いて、前記第１cDNA断片の群の中から、前記第１タグ物質を有する第１タグ付き第１cDNA断片の群を回収する第１タグ付き第１cDNA断片群回収工程と、
前記第１タグ付き第１cDNA断片の群を第２制限酵素により切断し、第２cDNA断片の群を得て、更に、この第２cDNA断片の群の中から、前記第１タグ物質を有しないタグなし第２cDNA断片の群を回収する第２切断・タグなし第２cDNA断片群回収工程と、
前記タグなし第２cDNA断片の群に対して、第２タグ物質が付加され前記第１制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する前記第１アダプタ配列のライゲーションを行い、前記第１アダプタ配列が結合した第１アダプタ付き第２cDNA断片の群を作成する第１アダプタライゲーション工程と、
前記第２タグ物質に高親和性を有する第２高親和性物質を用いると共に、前記第２制限酵素により前記第１アダプタ付き第２cDNA断片を切断して、自身の内部に前記第２制限酵素切断部位を有しない第１アダプタ付き第２cDNA断片の群を回収する第２切断・第１アダプタ付き第２cDNA断片群回収工程と、
前記第２制限酵素切断部位を有しない第１アダプタ付き第２cDNA断片から前記第２タグ物質を除去すると共に、前記第２制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する前記第２アダプタ配列のライゲーションを行い、一端に前記第１アダプタ配列を有し他端に前記第２アダプタ配列を有する前記アダプタ付きcDNA断片の群を作成するアダプタ付きcDNA断片群作成工程と、
を備えるアダプタ付きcDNA断片群の作成方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のアダプタ付きcDNA断片群の作成方法であって、
前記第１タグ付きcDNA群作成工程は、
原核生物の細胞からmRNAを得るmRNA取得工程と、
前記mRNAの3'末端にポリAを付加し、ポリA付加mRNAを得るポリA付加工程と、
前記ポリA付加mRNAに前記第１タグ物質が付加されたポリTをハイブリダイズさせるポリTハイブリダイズ工程と、
前記ポリTがハイブリダイズしたmRNAから前記第１タグ付きcDNAを合成するcDNA合成工程と、
を含む
アダプタ付きcDNA断片群の作成方法。
【請求項４】
cDNA断片の一端に既知の第１アダプタ配列を有し他端に既知の第２アダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片の群を作成し、その中から所望のcDNA断片を取得する遺伝子断片の取得方法であって、
cDNAの一方の端部に第１タグ物質が付加された第１タグ付きcDNAの群を作成する第１タグ付きcDNA群作成工程と、
前記第１タグ付きcDNAの群を第１制限酵素により切断して、第１cDNA断片の群を得る第１切断工程と、
前記第１タグ物質に高親和性を有する第１高親和性物質を用いて、前記第１cDNA断片の群の中から、前記第１タグ物質を有する第１タグ付き第１cDNA断片の群を回収する第１タグ付き第１cDNA断片群回収工程と、
前記第１タグ付き第１cDNA断片の群を第２制限酵素により切断し、第２cDNA断片の群を得て、更に、この第２cDNA断片の群の中から、前記第１タグ物質を有しないタグなし第２cDNA断片の群を回収する第２切断・タグなし第２cDNA断片群回収工程と、
前記タグなし第２cDNA断片の群に対して、第２タグ物質が付加され前記第１制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する前記第１アダプタ配列、及び、前記第２制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する前記第２アダプタ配列のライゲーションを行い、少なくとも前記第２アダプタ配列が結合したアダプタ付き第２cDNA断片の群を作成する第１，第２アダプタライゲーション工程と、
前記第２タグ物質に高親和性を有する第２高親和性物質を用いて、前記アダプタ付き第２cDNA断片の群の中から、前記第２タグ物質付きの前記第１アダプタ配列をも結合した第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片の群を回収する第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片群回収工程と、
前記第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片から前記第２タグ物質を除去し、一端に前記第１アダプタ配列を有し他端に前記第２アダプタ配列を有する前記アダプタ付きcDNA断片の群を回収するアダプタ付きcDNA断片群回収工程と、
前記アダプタ付きcDNA断片の群に対し、前記第１アダプタ配列に相補的な配列を有する第１プライマーと、前記第２アダプタ配列に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、PCRを行う第１PCR工程と、
前記第１PCR工程で増幅されたcDNA断片の群についてゲル電気泳動を行う電気泳動工程と、
前記電気泳動工程の結果に基づいて、ゲルから所望のcDNA断片を含むゲルを切り出し、このcDNA断片を回収するcDNA断片回収工程と、
を備える遺伝子断片の取得方法。
【請求項５】
cDNA断片の一端に既知の第１アダプタ配列を有し他端に既知の第２アダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片の群を作成し、その中から所望のcDNA断片を取得する遺伝子断片の取得方法であって、
cDNAの一方の端部に第１タグ物質が付加された第１タグ付きcDNAの群を作成する第１タグ付きcDNA群作成工程と、
前記第１タグ付きcDNAの群を第１制限酵素により切断して、第１cDNA断片の群を得る第１切断工程と、
前記第１タグ物質に高親和性を有する第１高親和性物質を用いて、前記第１cDNA断片の群の中から、前記第１タグ物質を有する第１タグ付き第１cDNA断片の群を回収する第１タグ付き第１cDNA断片群回収工程と、
前記第１タグ付き第１cDNA断片の群を第２制限酵素により切断し、第２cDNA断片の群を得て、更に、この第２cDNA断片の群の中から、前記第１タグ物質を有しないタグなし第２cDNA断片の群を回収する第２切断・タグなし第２cDNA断片群回収工程と、
前記タグなし第２cDNA断片の群に対して、第２タグ物質が付加され前記第１制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する前記第１アダプタ配列のライゲーションを行い、前記第１アダプタ配列が結合した第１アダプタ付き第２cDNA断片の群を作成する第１アダプタライゲーション工程と、
前記第２タグ物質に高親和性を有する第２高親和性物質を用いると共に、前記第２制限酵素により前記第１アダプタ付き第２cDNA断片を切断して、自身の内部に前記第２制限酵素切断部位を有しない第１アダプタ付き第２cDNA断片の群を回収する第２切断・第１アダプタ付き第２cDNA断片群回収工程と、
前記第２制限酵素切断部位を有しない第１アダプタ付き第２cDNA断片から前記第２タグ物質を除去すると共に、前記第２制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する前記第２アダプタ配列のライゲーションを行い、一端に前記第１アダプタ配列を有し他端に前記第２アダプタ配列を有する前記アダプタ付きcDNA断片の群を作成するアダプタ付きcDNA断片群作成工程と、
前記アダプタ付きcDNA断片の群に対し、前記第１アダプタ配列に相補的な配列を有する第１プライマーと、前記第２アダプタ配列に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、PCRを行う第１PCR工程と、
前記第１PCR工程で増幅されたcDNA断片の群についてゲル電気泳動を行う電気泳動工程と、
前記電気泳動工程の結果に基づいて、ゲルから所望のcDNA断片を含むゲルを切り出し、このcDNA断片を回収するcDNA断片回収工程と、
を備える遺伝子断片の取得方法。
【請求項６】
請求項４または請求項５に記載の遺伝子断片の取得方法であって、
前記第１タグ付きcDNA群作成工程は、
原核生物の細胞からmRNAを得るmRNA取得工程と、
前記mRNAの3'末端にポリAを付加し、ポリA付加mRNAを得るポリA付加工程と、
前記ポリA付加mRNAに前記第１タグ物質が付加されたポリTをハイブリダイズさせるポリTハイブリダイズ工程と、
前記ポリTがハイブリダイズしたmRNAから前記第１タグ付きcDNAを合成するcDNA合成工程と、
を含む
遺伝子断片の取得方法。
【請求項７】
請求項４〜請求項６のいずれかに一項に記載の遺伝子断片の取得方法であって、
前記cDNA断片回収工程で回収した前記cDNA断片について、前記第１アダプタ配列に相補的な配列を有する第３プライマーと、前記第２アダプタ配列に相補的な配列を有する第４プライマーとを用いて、再度PCRを行う第２PCR工程を備える
遺伝子断片の取得方法。
【請求項８】
請求項７に記載の遺伝子断片の取得方法であって、
前記cDNA断片回収工程後、または、前記第２PCR工程を有する場合には第２PCR工程後、前記cDNA断片をプラスミドベクターに連結し、組換え体プラスミドを形成する連結工程と、
上記組換え体プラスミドを大腸菌に導入する導入工程と、
を備える遺伝子断片の取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、cDNA断片の一端に既知の第１アダプタ配列を有し他端に既知の第２アダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片の群を作成するアダプタ付きcDNA断片群の作成方法、及び、このようなアダプタ付きcDNA断片の群の中から、所望のcDNA断片を取得する遺伝子断片の取得方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、様々なcDNA断片が混在するcDNA断片の群から所望のcDNA断片（遺伝子断片）を取得する方法がいくつか知られている。
例えば、平板ゲルを利用して、cDNA断片の群から所望のcDNA断片を取得する方法がある（例えば非特許文献１参照）。即ち、cDNA断片の群について、例えばアクリルアミドゲル電気泳動を行う。その後、アクリルアミドゲル中のcDNA断片をエチジウムブロミドで染色し、ＵＶトランスイルミネータによりアクリルアミドゲルを照らしてcDNA断片を検出する。そして、分画されたcDNA断片の群から目的のcDNA断片を含むアクリルアミドゲルを切り出し、そのゲルから当該cDNA断片を回収する。
また、例えば、キャピラリー電気泳動を利用して、cDNA断片の群から所望のcDNA断片を取得する方法もある（例えば特許文献１〜３参照）。即ち、予め蛍光標識したcDNA断片の群をキャピラリーカラムに供試し電気泳動を行う。そして、検出されたピークに基づいて、目的のcDNA断片が泳動されて来る時間を推測する。次に、再びキャピラリーカラムで電気泳動を行い、その推定時間を基づいて目的のcDNA断片を回収する。
【０００３】
【非特許文献１】A new method for sequencing DNA.  Proc.Natl.Acad.Sci. 1977,74:560-564
【特許文献１】特開２０００−８８８０３号公報
【特許文献２】特開平７−１８１１６４号公報
【特許文献３】特開平６−１３８０３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、前者の方法では、目的とするcDNA断片が少量しか存在しない場合、ゲル電気泳動後、cDNA断片を染色しても、ＵＶトランスイルミネータ下でそれを検出することができないため、目的とするcDNA断片を回収できないという問題がある。
一方、後者の方法では、蛍光標識したcDNA断片を使用しているので、目的とするcDNA断片が少量であっても、これを検出することは可能である。しかしながら、この方法では、cDNA断片を目視しながら回収できないため、目的のcDNA断片がキャピラリーカラムの先端部分に現れる時間を予想して回収する。このため、回収したcDNA断片には、目的とするcDNA断片に加え、目的物とほぼ同じ程度の長さのcDNA断片が混在する可能性が高い。また、サイズ分画能が平板ゲルを使用した場合と比較すると良くないため、回収したcDNA断片の中に目的物以外のものが混在したり、また、目的とするcDNA断片の回収率の低下を招くこともある。
【０００５】
このような問題を解消できる方法として、cDNA断片の両端に既知のアダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片の群を作成し、この中から所望のcDNA断片を取得する方法が考えられる。図９を参照しつつ具体的に説明すると、まず、真核生物由来のmRNAを用意し、このmRNAのポリAテイルに、タグ物質（例えばビオチン）が付加されたポリTをハイブリダイズさせる。そして、cDNAの合成を行い、タグ物質９０３を有するタグ付きcDNA９０１の群を作成する。なお、図中の「Ａ」は後述する第１制限酵素の酵素認識部位を、「Ｂ」は後述する第２制限酵素の酵素認識部位を示す。
【０００６】
次に、このタグ付きcDNA９０１の群を第１制限酵素で切断し、第１cDNA断片９１１の群を得る。この第１cDNA断片９１１の群には、タグ物質９０３を有するタグ付き第１cDNA断片９１３の他、タグ物質９０３を持たないタグなし第１cDNA断片９１５が多数存在する。
その後、この第１cDNA断片９１１の群に対して、第１制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第１アダプタ配列９２３のライゲーションを行い、第１アダプタ配列９２３が少なくとも片側に結合した第１アダプタ付き第１cDNA断片９２１の群を得る。この第１アダプタ付き第１cDNA断片９２１の群には、タグ物質９０３を有し、片側に第１アダプタ配列９２３が結合したタグ付き第１アダプタ付き第１cDNA断片９２５の他、タグ物質９０３を持たず、片側あるいは両側に第１アダプタ配列９２３が結合したタグなし第１アダプタ付き第１cDNA断片９２７が多数存在する。
【０００７】
次に、タグ物質９０３に高親和性を有する高親和性物質９３３（例えばストレプトアビジン付きビーズ）に、タグ物質９０３を有し、片側に第１アダプタ配列９２３が結合したタグ付き第１アダプタ付き第１cDNA断片９２５を結合させて、このタグ付き第１アダプタ付き第１cDNA断片９２５のみを回収し、タグ物質９０３を持たないタグなし第１アダプタ付き第１cDNA断片９２７を全て除去する。
次に、回収したタグ付き第１アダプタ付き第１cDNA断片９２５を第２制限酵素で切断し、第２cDNA断片９４１の群を得る。この第２cDNA断片９４１の群には、タグ物質９０３を有し第１アダプタ配列９２３を持たないタグ付き第２cDNA断片９４３、タグ物質９０３も第１アダプタ配列９２３も持たないタグなし第２cDNA断片９４５、タグ物質９０３を持たず第１アダプタ配列９２３を有するタグなし第２cDNA断片９４７が存在する。
【０００８】
次に、高親和性物質９３３を用いて、今度は、タグ物質９０３を有し第１アダプタ配列９２３を持たないタグ付き第２cDNA断片９４３を除去し、タグ物質９０３を持たないタグなし第２cDNA断片９４５，９４７を回収する。
次に、回収したタグなし第２cDNA断片９４５，９４７の群に対して、第２制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第２アダプタ配列９５３のライゲーションを行い、第２アダプタ配列９５３が少なくとも片側に結合したアダプタ付き第２cDNA断片９５１の群を得る。このアダプタ付き第２cDNA断片９５１の群には、一端に第１アダプタ配列９２３が結合し他端に第２アダプタ配列９５３が結合した第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片９５５、及び、両端に第２アダプタ配列９５３が結合した第２アダプタ付き第２cDNA断片９５７が存在する。
かくして、一端に第１アダプタ配列９２３を有し他端に第２アダプタ配列９５３を有するアダプタ付きcDNA断片９５５の群を作成できる。
【０００９】
その後は、第１アダプタ配列９２３に相補的な第１プライマーと、第２アダプタ配列９５５に相補的な第２プライマーとを利用してPCRを行うことにより、cDNA断片を十分に増幅させる。その後、PCR産物についてゲル電気泳動を行い、ゲル中のcDNA断片を染色して、ＵＶトランスイルミネータにより検出する。更に、分画されたcDNA断片の群から目的のcDNA断片を含むゲルを切り出し、目的のcDNA断片を回収する。かくして、目的の遺伝子断片を取得できる。
【００１０】
しかしながら、この方法では、第１，第２アダプタ配列９２３，９５３を有するアダプタ付きcDNA断片９５５と共に、両端に第２アダプタ配列９５３が結合したアダプタ付きcDNA断片９５７も相当量できる。従って、第１，第２アダプタ配列９２３，９５３を有するアダプタ付きcDNA断片９５５の群を、高純度に作成できない。また、遺伝子断片の取得にあたってPCRを行う際、両端に第２アダプタ配列９５３が結合したアダプタ付きcDNA断片９５７の存在が、PCR反応の阻害要因となり得る。恐らく、プライマーの消費バランスが崩れることに起因するものと考えられる。その結果、所望のcDNA断片（遺伝子断片）を効率よく取得できないという問題が生じる。
【００１１】
本発明は、かかる現状に鑑みてなされたものであって、一端に既知の第１アダプタ配列を有し他端に既知の第２アダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片の群を、高純度に作成できるアダプタ付きcDNA断片群の作成方法、及び、所望のcDNA断片を効率よく取得できる遺伝子断片の取得方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
その解決手段は、cDNA断片の一端に既知の第１アダプタ配列を有し他端に既知の第２アダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片の群を作成するアダプタ付きcDNA断片群の作成方法であって、cDNAの一方の端部に第１タグ物質が付加された第１タグ付きcDNAの群を作成する第１タグ付きcDNA群作成工程と、前記第１タグ付きcDNAの群を第１制限酵素により切断して、第１cDNA断片の群を得る第１切断工程と、前記第１タグ物質に高親和性を有する第１高親和性物質を用いて、前記第１cDNA断片の群の中から、前記第１タグ物質を有する第１タグ付き第１cDNA断片の群を回収する第１タグ付き第１cDNA断片群回収工程と、前記第１タグ付き第１cDNA断片の群を第２制限酵素により切断し、第２cDNA断片の群を得て、更に、この第２cDNA断片の群の中から、前記第１タグ物質を有しないタグなし第２cDNA断片の群を回収する第２切断・タグなし第２cDNA断片群回収工程と、前記タグなし第２cDNA断片の群に対して、第２タグ物質が付加され前記第１制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する前記第１アダプタ配列、及び、前記第２制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する前記第２アダプタ配列のライゲーションを行い、少なくとも前記第２アダプタ配列が結合したアダプタ付き第２cDNA断片の群を作成する第１，第２アダプタライゲーション工程と、前記第２タグ物質に高親和性を有する第２高親和性物質を用いて、前記アダプタ付き第２cDNA断片の群の中から、前記第２タグ物質付きの前記第１アダプタ配列をも結合した第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片の群を回収する第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片群回収工程と、前記第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片から前記第２タグ物質を除去し、一端に前記第１アダプタ配列を有し他端に前記第２アダプタ配列を有する前記アダプタ付きcDNA断片の群を回収するアダプタ付きcDNA断片群回収工程と、を備えるアダプタ付きcDNA断片群の作成方法である。
【００１３】
本発明によれば、まず、cDNAの一端に第１タグ物質が付加されたcDNA（第１タグ付きcDNA）の群を作成する。
次に、このcDNAの群を第１制限酵素により切断して、cDNA断片（第１cDNA断片）の群を得る。このcDNA断片には、第１タグ物質を有するcDNA断片（第１タグ付き第１cDNA断片）の他、第１タグ物質を持たないcDNA断片（タグなし第１cDNA断片）（例えば、両端とも第１制限酵素で切断されたcDNA断片）も複数存在する。
次に、第１タグ物質に高親和性を有する第１高親和性物質を利用して、このcDNA断片の群の中から、第１タグ物質を有するcDNA断片（第１タグ付き第１cDNA断片）の群のみを回収する。その際、第１タグ物質を持たないcDNA断片（タグなし第１cDNA断片）は全て除去される。
その後、回収したcDNA断片の群を第２制限酵素により切断して、cDNA断片（第２cDNA断片）の群を得る。また、再び第１高親和性物質を利用して、このcDNA断片の群の中から、今度は、第１タグ物質を持たないcDNA断片（タグなし第２cDNA断片）の群を回収する。その際、第１タグ物質を有するcDNA断片（第１タグ付き第２cDNA断片）は全て除去される。回収したcDNA断片の群には、一端が第１制限酵素で切断され他端が第２制限酵素で切断されたcDNA断片の他、両端とも第２制限酵素で切断されたcDNA断片も含まれる。なお、両端とも第１制限酵素で切断されたcDNA断片は、前の工程で既に除去されているため、このcDNA断片の群には存在しない。
【００１４】
次に、回収したcDNA断片の群に対して、第２タグ物質を有すると共に第１制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する第１アダプタ配列と、第２制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する第２アダプタ配列のライゲーションを行い、少なくとも第２アダプタ配列が結合したcDNA断片（アダプタ付き第２cDNA断片）の群を作成する。このcDNA断片の群には、一端に第１アダプタ配列が結合し他端に第２アダプタ配列が結合したcDNA断片（第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片）の他、両端に第２アダプタ配列が結合したcDNA断片も複数含まれる。
その後、第２タグ物質に高親和性を有する第２高親和性物質を用いて、このcDNA断片の群の中から、第２タグ物質を有する第１アダプタ配列をも結合したcDNA断片（第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片）の群を回収する。その際、両端に第２アダプタ配列が結合したcDNA断片は全て除去される。従って、この工程で回収されるcDNA断片の群は、理論的には、一端にタグ付きの第１アダプタ配列を有し他端に第２アダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片のみとなる。
その後は、このcDNA断片から第２タグ物質を除去し、一端に第１アダプタ配列を有し他端に第２アダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片の群を回収する。
なお、このような方法を本明細書では、「１段階連結法」とも言う。
【００１５】
このような方法でアダプタ付きcDNA断片の群を作成すれば、理論的には、両端に第１アダプタ配列が結合したアダプタ付きcDNA断片や両端に第２アダプタ配列が結合したアダプタ付きcDNA断片は含まれなくなり、一端に第１アダプタ配列を有し他端に第２アダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片のみからなるアダプタ付きcDNA断片群を作成できる。従って、その後、所望のcDNA断片を取得するにあたって、第１アダプタ配列に相補的なプライマーと第２アダプタ配列に相補的なプライマーとを用いてPCRを行う際、PCRを効率よく行うことができ、その結果、所望のcDNA断片（遺伝子断片）を効率よく取得できる。
【００１６】
ここで、第１タグ付きcDNA群作成工程で作成する「第１タグ付きcDNA」は、一端に第１タグ物質が付加されたcDNAであればよく、「第１タグ付きcDNA」は原核生物由来ものでも真核生物由来のものでもよい。また、この「第１タグ付きcDNA」の群は、抽出に用いた細胞で発現された殆ど全ての遺伝子が含まれる群であっても、その発現された遺伝子の一部だけが含まれる群であってもよい。更に、この「第１タグ付きcDNA」は、全長cDNAからなるものでも、全長cDNAの一部分からなるものでもよい。
「タグ物質」と「高親和性物質」とは、互いに高親和性をもって特異的に結合する結合対を構成する物質であれば、いずれを利用することもできる。中でも、取り扱いの容易性や入手容易性などの理由から、タグ物質と高親和性物質の組合せとして、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、FIGTとFITC抗体、DIGとアンタイDIG、プロテインAとマウスIgG、ラテックス粒子等を利用するのが好ましい。なお、各組合せにおいて、可能であれば、いずれをタグ物質として使用しても、いずれを高親和性物質として使用してもよい。また、本発明において、「第１タグ物質」と「第２タグ物質」、及び、「第１高親和性物質」と「第２高親和性物質」はそれぞれ同じものでもよい。
【００１７】
「制限酵素」とは、一般的に、制限エンドヌクレアーゼとも称される酵素であり、特定の配列において二本鎖DNAを加水分解し切断する酵素である。使用する制限酵素は、cDNAあるいはcDNA断片を識別可能な長さを有するcDNA断片に切断可能なものが好ましい。また、cDNAの群やcDNA断片の群に含まれるcDNAあるいはcDNA断片のより多くを、好ましくは、殆ど全てを切断するような酵素が好ましい。
「第１アダプタ配列」は、第１制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有するものであればよく、また、「第２アダプタ配列」は、第２制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有するものであればよい。従って、それぞれいかなる塩基配列からなるものであっても構わないが、後にPCRを行う際の効率等を考慮して設計されたものであるのが好ましい。即ち、これらのアダプタ配列がそれぞれ15塩基程度以上であると、安定したPCR反応を行うことができ、効率よくcDNA断片を増幅できる。
【００１８】
また、他の解決手段は、cDNA断片の一端に既知の第１アダプタ配列を有し他端に既知の第２アダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片の群を作成するアダプタ付きcDNA断片群の作成方法であって、cDNAの一方の端部に第１タグ物質が付加された第１タグ付きcDNAの群を作成する第１タグ付きcDNA群作成工程と、前記第１タグ付きcDNAの群を第１制限酵素により切断して、第１cDNA断片の群を得る第１切断工程と、前記第１タグ物質に高親和性を有する第１高親和性物質を用いて、前記第１cDNA断片の群の中から、前記第１タグ物質を有する第１タグ付き第１cDNA断片の群を回収する第１タグ付き第１cDNA断片群回収工程と、前記第１タグ付き第１cDNA断片の群を第２制限酵素により切断し、第２cDNA断片の群を得て、更に、この第２cDNA断片の群の中から、前記第１タグ物質を有しないタグなし第２cDNA断片の群を回収する第２切断・タグなし第２cDNA断片群回収工程と、前記タグなし第２cDNA断片の群に対して、第２タグ物質が付加され前記第１制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する前記第１アダプタ配列のライゲーションを行い、前記第１アダプタ配列が結合した第１アダプタ付き第２cDNA断片の群を作成する第１アダプタライゲーション工程と、前記第２タグ物質に高親和性を有する第２高親和性物質を用いると共に、前記第２制限酵素により前記第１アダプタ付き第２cDNA断片を切断して、自身の内部に前記第２制限酵素切断部位を有しない第１アダプタ付き第２cDNA断片の群を回収する第２切断・第１アダプタ付き第２cDNA断片群回収工程と、前記第２制限酵素切断部位を有しない第１アダプタ付き第２cDNA断片から前記第２タグ物質を除去すると共に、前記第２制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する前記第２アダプタ配列のライゲーションを行い、一端に前記第１アダプタ配列を有し他端に前記第２アダプタ配列を有する前記アダプタ付きcDNA断片の群を作成するアダプタ付きcDNA断片群作成工程と、を備えるアダプタ付きcDNA断片群の作成方法である。
【００１９】
本発明によれば、まず、cDNAの一端に第１タグ物質が付加されたcDNA（第１タグ付きcDNA）の群を作成する。
次に、このcDNAの群を第１制限酵素により切断して、cDNA断片（第１cDNA断片）の群を得る。
その後、第１タグ物質に高親和性を有する第１高親和性物質を利用して、このcDNA断片の群の中から、第１タグ物質を有するcDNA断片（第１タグ付き第１cDNA断片）の群のみを回収する。
その後、回収したcDNA断片の群を第２制限酵素により切断して、cDNA断片（第２cDNA断片）の群を得る。また、再び第１高親和性物質を利用して、このcDNA断片の群の中から、今度は、第１タグ物質を持たないcDNA断片（タグなし第２cDNA断片）の群を回収する。
ここまでの工程は、前述の発明（１段階連結法）と同様である。
【００２０】
次に、回収したcDNA断片の群に対して、第２タグ物質を有すると共に第１制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する第１アダプタ配列のライゲーションを行い、第１アダプタ配列が結合したcDNA断片（第１アダプタ付き第２cDNA断片）の群を作成する。なお、このcDNA断片の群には、前記の工程において第２制限酵素で切断されたcDNA断片同士が再結合したものも含まれる。
その後、第２タグ物質に高親和性を有する第２高親和性物質を用いると共に、第２制限酵素によりこのcDNA断片を切断して、自身の内部に第２制限酵素切断部位を有しないcDNA断片（第１アダプタ付き第２cDNA断片）の群を回収する。これにより、再結合したcDNA断片が再び切断され、第２タグ物質を持たないcDNA断片は全て除去される。
その後、このcDNA断片から第２タグ物質を除去すると共に、第２制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する前記第２アダプタ配列のライゲーションを行い、一端に第１アダプタ配列を有し他端に第２アダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片の群を作成する。
なお、このような方法を本明細書では、「２段階連結法」とも言う。
【００２１】
このような方法でアダプタ付きcDNA断片の群を作成しても、理論的には、両端に第１アダプタ配列が結合したアダプタ付きcDNA断片や両端に第２アダプタ配列が結合したアダプタ付きcDNA断片は含まれなくなり、一端に第１アダプタ配列を有し他端に第２アダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片のみからなるアダプタ付きcDNA断片群を作成できる。従って、その後、所望のcDNA断片を取得するにあたって、第１アダプタ配列に相補的なプライマーと第２アダプタ配列に相補的なプライマーとを用いてPCRを行う際、PCRを効率よく行うことができ、その結果、所望のcDNA断片（遺伝子断片）を効率よく取得できる。
【００２２】
なお、「第１タグ付きcDNA」、「cDNA」、「タグ物質」、「高親和性物質」、「制限酵素」、「第１アダプタ配列」、「第２アダプタ配列」等は、前述の発明で説明した通りである。
また、「アダプタ付きcDNA断片群作成工程」では、前工程で回収したcDNA断片から第２タグ物質を除去した後に、第２アダプタ配列のライゲーションを行ってもよいし、先に、前工程で回収したcDNA断片に第２アダプタ配列のライゲーションを行い、その後、第２タグ物質を除去してもよい。いずれの順番で行っても、一端に第１アダプタ配列を有し他端に第２アダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片を作成できる。
【００２３】
更に、上記のいずれかに記載のアダプタ付きcDNA断片群の作成方法であって、前記第１タグ付きcDNA群作成工程は、原核生物の細胞からmRNAを得るmRNA取得工程と、前記mRNAの3'末端にポリAを付加し、ポリA付加mRNAを得るポリA付加工程と、前記ポリA付加mRNAに前記第１タグ物質が付加されたポリTをハイブリダイズさせるポリTハイブリダイズ工程と、前記ポリTがハイブリダイズしたmRNAから前記第１タグ付きcDNAを合成するcDNA合成工程と、を含むアダプタ付きcDNA断片群の作成方法とすると良い。
【００２４】
原核生物由来のmRNAはポリAテイルを持たないため、このままではcDNAを合成できない。
これに対し、本発明では、mRNAにポリAを付加し、これを利用するので、容易にcDNAを合成できる。従って、原核生物を試料にしているにも拘わらず、アダプタ付きcDNA断片群を容易に作成できる。
【００２５】
更に、上記のアダプタ付きcDNA断片群の作成方法であって、前記mRNA取得工程は、前記原核生物の細胞から全RNAを抽出する全RNA抽出工程と、16S rRNAの一部に相補的な配列を有する第１ヌクレオチドを前記16S rRNAにハイブリダイズさせると共に、23S rRNAの一部に相補的な配列を有する第２ヌクレオチドを23S rRNAにハイブリダイズさせる第１，第２ヌクレオチドハイブリダイズ工程と、前記第１ヌクレオチドのうち、前記16S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的である配列を有し、第３タグ物質が付加された第３ヌクレオチドを、前記16S rRNAと前記第１ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせると共に、前記第２ヌクレオチドのうち、前記23S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的である配列を有し、第４タグ物質が付加された第４ヌクレオチドを、前記23S rRNAと上記第２ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる第３，第４ヌクレオチドハイブリダイズ工程と、前記全RNAから、前記第３タグ物質に高親和性を有する第３高親和性物質を用いて、前記16S rRNAと前記第１ヌクレオチドと前記第３タグ物質を有する前記第３ヌクレオチドとの結合物を除去すると共に、前記第４タグ物質に高親和性を有する第４高親和性物質を用いて、前記23S rRNAと前記第２ヌクレオチドと前記第４タグ物質を有する前記第４ヌクレオチドとの結合物を除去する除去するrRNA除去工程と、を含むアダプタ付きcDNA断片群の作成方法とすると良い。
【００２６】
原核生物においては、mRNAにポリAテイルが存在しないため、真核生物の場合のように、ポリAテイルを利用して抽出した全RNAからmRNAを精製（濃縮）する方法を採ることができない。
これに対し、上記作成方法では、まず、原核生物の細胞から全RNAを抽出する。そして、抽出した全RNAに対し、16S rRNAの一部に相補的な配列を有する第１ヌクレオチドを16S rRNAにハイブリダイズさせると共に、23S rRNAの一部に相補的な配列を有する第２ヌクレオチドを23S rRNAにハイブリダイズさせる。その後、第１ヌクレオチドのうち、16S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的な配列を有し、第３タグ物質が付加された第３ヌクレオチドを、16S rRNAと第１ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる。また、第２ヌクレオチドのうち、23S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的な配列を有し、第２タグ物質が付加された第４ヌクレオチドを、23S rRNAと第２ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる。その後、全RNAから、16S rRNAと第１ヌクレオチドと第３タグ物質が付加された第３ヌクレオチドとの結合物を除去すると共に、23S rRNAと第２ヌクレオチドと第４タグ物質が付加された第４ヌクレオチドとの結合物を除去する。このような方法によれば、全RNAから、全RNAの中に多量に存在するrRNA（16S rRNA及び23S rRNA）の大部分を除去できる。従って、mRNAを容易に高純度に濃縮できる。
【００２７】
ここで、「第１ヌクレオチド」は、16S rRNAの一部に相補的な配列を有し、且つ、第３ヌクレオチドに相補的な配列を有するものであれば、いかなるものでもよい。従って、16S rRNAの一部に相補的な配列と第３ヌクレオチドに相補的な配列以外の配列を有していても構わない。ここでいう16S rRNAの一部に相補的な配列とは、16S rRNAの一部に対し100％相補的な配列に限られず、適当な条件下で16S rRNAにハイブリダイズできる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。また、第３ヌクレオチドに相補的な配列も、第３ヌクレオチドに対し100％相補的な配列に限られず、適当な条件下で第３ヌクレオチドにハイブリダイズできる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。また、第１ヌクレオチドのうち、第３ヌクレオチドに相補的な配列は、第３ヌクレオチド全体に対応するものに限られず、第３ヌクレオチドの一部に対応するものでもよい。
【００２８】
同様に、「第２ヌクレオチド」は、23S rRNAの一部に相補的な配列を有し、且つ、第４ヌクレオチドに相補的な配列を有するものであれば、いかなるものであってもよい。従って、23S rRNAの一部に相補的な配列と第４ヌクレオチドに相補的な配列以外の配列を有していても構わない。ここでいう23S rRNAの一部に相補的な配列も、23S rRNAの一部に対し100％相補的な配列に限られず、適当な条件下で23S rRNAにハイブリダイズできる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。また、第４ヌクレオチド相補的な配列も、第４ヌクレオチドに対し100％相補的な配列に限られず、適当な条件下で第４ヌクレオチドにハイブリダイズできる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。また、第２ヌクレオチドのうち、第４ヌクレオチドに相補的な配列は、第４ヌクレオチド全体に対応するものに限られず、第４ヌクレオチドの一部に対応するものでもよい。
【００２９】
また、「第３ヌクレオチド」は、第１ヌクレオチドのうち、16S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的な配列を有するものであれば、いかなるものであってもよい。従って、第１ヌクレオチドの一部に相補的な配列以外の配列を有していても構わない。ここでいう第１ヌクレオチドの一部に相補的な配列も、前述したように、第１ヌクレオチドに対し100％相補的な配列に限られず、適当な条件下で第１ヌクレオチドにハイブリダイズできる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。
【００３０】
同様に、「第４ヌクレオチド」は、第２ヌクレオチドのうち、23S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的な配列を有するものであれば、いかなるものであってもよい。従って、第２ヌクレオチドの一部に相補的な配列以外の配列を有していても構わない。ここでいう第２ヌクレオチドの一部に相補的な配列も、前述したように、第２ヌクレオチドに対し100％相補的な配列に限られず、適当な条件下で第２ヌクレオチドにハイブリダイズできる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。
なお、「タグ物質」については、前述の発明で説明した通りである。また、上記の第３タグ物質や第４タグ物質は、前述の第１タグ物質や第２タグ物質と同じものを利用してもよい。
【００３１】
また、他の解決手段は、cDNA断片の一端に既知の第１アダプタ配列を有し他端に既知の第２アダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片の群を作成し、その中から所望のcDNA断片を取得する遺伝子断片の取得方法であって、cDNAの一方の端部に第１タグ物質が付加された第１タグ付きcDNAの群を作成する第１タグ付きcDNA群作成工程と、前記第１タグ付きcDNAの群を第１制限酵素により切断して、第１cDNA断片の群を得る第１切断工程と、前記第１タグ物質に高親和性を有する第１高親和性物質を用いて、前記第１cDNA断片の群の中から、前記第１タグ物質を有する第１タグ付き第１cDNA断片の群を回収する第１タグ付き第１cDNA断片群回収工程と、前記第１タグ付き第１cDNA断片の群を第２制限酵素により切断し、第２cDNA断片の群を得て、更に、この第２cDNA断片の群の中から、前記第１タグ物質を有しないタグなし第２cDNA断片の群を回収する第２切断・タグなし第２cDNA断片群回収工程と、前記タグなし第２cDNA断片の群に対して、第２タグ物質が付加され前記第１制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する前記第１アダプタ配列、及び、前記第２制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する前記第２アダプタ配列のライゲーションを行い、少なくとも前記第２アダプタ配列が結合したアダプタ付き第２cDNA断片の群を作成する第１，第２アダプタライゲーション工程と、前記第２タグ物質に高親和性を有する第２高親和性物質を用いて、前記アダプタ付き第２cDNA断片の群の中から、前記第２タグ物質付きの前記第１アダプタ配列をも結合した第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片の群を回収する第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片群回収工程と、前記第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片から前記第２タグ物質を除去し、一端に前記第１アダプタ配列を有し他端に前記第２アダプタ配列を有する前記アダプタ付きcDNA断片の群を回収するアダプタ付きcDNA断片群回収工程と、前記アダプタ付きcDNA断片の群に対し、前記第１アダプタ配列に相補的な配列を有する第１プライマーと、前記第２アダプタ配列に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、PCRを行う第１PCR工程と、前記第１PCR工程で増幅されたcDNA断片の群についてゲル電気泳動を行う電気泳動工程と、前記電気泳動工程の結果に基づいて、ゲルから所望のcDNA断片を含むゲルを切り出し、このcDNA断片を回収するcDNA断片回収工程と、を備える遺伝子断片の取得方法である。
【００３２】
本発明では、遺伝子断片の取得にあたって、まず、前述した「１段階連結法」によってアダプタ付きcDNA断片群を作成する。即ち、まず、cDNAの一端に第１タグ物質が付加されたcDNA（第１タグ付きcDNA）の群を作成する。次に、このcDNAの群を第１制限酵素により切断して、cDNA断片（第１cDNA断片）の群を得る。その後、第１タグ物質に高親和性を有する第１高親和性物質を利用して、このcDNA断片の群の中から、第１タグ物質を有するcDNA断片（第１タグ付き第１cDNA断片）の群のみを回収する。その後、回収したcDNA断片の群を第２制限酵素により切断して、cDNA断片（第２cDNA断片）の群を得る。また、再び第１高親和性物質を利用して、このcDNA断片の群の中から、今度は、第１タグ物質を持たないcDNA断片（タグなし第２cDNA断片）の群を回収する。その後、回収したcDNA断片の群に対して、第２タグ物質を有すると共に第１制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する第１アダプタ配列と、第２制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する第２アダプタ配列のライゲーションを行い、少なくとも第２アダプタ配列が結合したcDNA断片（アダプタ付き第２cDNA断片）の群を作成する。その後、第２タグ物質に高親和性を有する第２高親和性物質を用いて、このcDNA断片の群の中から、第２タグ物質を有する第１アダプタ配列をも結合したcDNA断片（第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片）の群を回収する。その後は、このcDNA断片から第２タグ物質を除去し、一端に第１アダプタ配列を有し他端に第２アダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片の群を回収する。
【００３３】
アダプタ付きcDNA断片群を作成した後は、このアダプタ付きcDNA断片の群に対し、第１アダプタ配列に相補的な配列を有する第１プライマーと、第２アダプタ配列に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、PCRを行う。このようにPCRを行うことによって、cDNA断片を多量に増幅できる。従って、目的のcDNA断片が低濃度しかなくても、それを大幅に増幅できる。しかも、このアダプタ付きcDNA断片の群は、両端に同一アダプタ配列が結合したcDNA断片は含まれず、理論上、一端に第１アダプタ配列を有し他端に第２アダプタ配列を有するcDNA断片のみからなるので、PCRを効率よく行うことができる。
その後、PCR産物についてゲル電気泳動を行う。その際、第１PCR工程でcDNA断片が大幅に増幅されているので、目的のcDNA断片を容易に検出できる。
その後、この電気泳動の結果に基づいて、ゲルから所望のcDNA断片を含むゲルを切り出し、このcDNA断片（遺伝子断片）を回収する。
このような方法では、PCR工程でcDNA断片を効率よく増幅できるので、所望のcDNA断片（遺伝子断片）を効率よく取得できる。
【００３４】
なお、「第１タグ付きcDNA」、「cDNA」、「タグ物質」、「高親和性物質」、「制限酵素」、「第１アダプタ配列」、「第２アダプタ配列」等は、前述の発明で説明した通りである。
「第１プライマー」は、第１アダプタ配列に相補的な配列を有するものであれば、いかなるものであってもよい。ここでいう相補的な配列とは、第１アダプタに対し100％相補的な配列に限られず、PCR反応においてcDNA断片を増幅できる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。また、第１プライマーは、第１アダプタ配列に相補的な配列のみからなるものに限られず、第１アダプタ配列に相補的な配列に、更に他の配列が繋がったものであってもよい。また、第１プライマーは、第１アダプタ配列全体に対応するものに限られず、第１アダプタ配列の一部に対応するものでもよい。
【００３５】
同様に、「第２プライマー」は、第２アダプタ配列に相補的な配列を有するものであれば、いかなるものであってもよい。ここでいう相補的な配列も、第２アダプタに対し100％相補的な配列に限られず、PCR反応においてcDNA断片を増幅できる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。また、第２プライマーも、第２アダプタ配列に相補的な配列のみからなるものに限られず、第２アダプタ配列に相補的な配列に、更に他の配列が繋がったものであってもよい。また、第２プライマーは、第２アダプタ配列全体に対応するものに限られず、第２アダプタ配列の一部に対応するものでもよい。
【００３６】
なお、第１プライマー及び第２プライマーの少なくともいずれかに、標識物質を付与しておくのが好ましい。このような標識プライマーを利用すれば、PCR産物も標識物質を有することになる。従って、PCR反応を行っても依然として目的とするcDNA断片が比較的少ない場合であっても、電気泳動においてこの標識物質を認識することで、目的とするcDNA断片を容易に検出できる。
標識物質は、電気泳動において検出感度が高いものであれば、いずれのものを使用することもできる。例えば、6-カルボキシフルオレッセイン（以下、FAMと称す。）、4,7,2',4',5',7'-ヘキサクロロ-6-カルボキシフルオレッセイン（以下、HEXと称す。）、NED（アプライドバイオシステムズジャパン社）、6-カルボキシ-X-ローダミン（以下、Roxと称す。）等の蛍光物質などを使用できる。これらの標識物質は、例えば、プライマーDNAの末端（例えば5'末端）に結合させればよい。
【００３７】
ここで、PCR反応で用いる種々の試薬について説明する。
DNAポリメラーゼは、PCR反応においてDNA鎖を変性させる際の高温に短時間加熱されても永久的には不活性化されず、しかも、高温における活性を有するものが好適である。例えば、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、メタノサーマス・フェルビドゥス（Methanothermus fervidus）、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）、T.フラブス（T.flavus）、T.ラクテウス（T.lacteus）、T.ルベンス（T.rubens）、T.ルバー（T.ruber）などの高熱菌由来のDNAポリメラーゼや、デスルフロコッカス・モビリス（Desulfurococcus mobilis）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィルクム（Methanobacterium thermoautotrophilcum）、スルホロブス・ソルファタリクス（Sulfolobus solfataricus）、S.アシドカルダリウス（S.acidocaldarius）、サーモプラスマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）、ピロコッカス・コダカラエンシス（Pyrococcus kodakaraensis KOD1株）などの高熱性古細菌由来のDNAポリメラーゼなどが挙げられる。これらのうち、入手容易性等の理由から、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）由来のDNAポリメラーゼ（Taq DNAポリメラーゼ）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来のDNAポリメラーゼ、或いは、ピロコッカス・コダカラエンシス（Pyrococcus kodakaraensis KOD1株）由来のDNAポリメラーゼを利用するのが好ましい。
【００３８】
更に、PCR反応液には、DNAポリメラーゼによる核酸増幅前の活性を阻害するために、DNAポリメラーゼに特異的な抗体を混合してもよい。この抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え法により製造された抗体、化学的または組換え法により製造された抗体フラグメント（例えば、Fabフラグメント）が挙げられる。これらのうち、モノクローナル抗体を用いるのが特に好ましい。例えば、Taq DNAポリメラーゼに対する公知のモノクローナル抗体は、約20℃〜40℃においてTaq DNAポリメラーゼの酵素活性を阻害できると共に、PCRの熱的サイクルにおける高温によって不活性化される。
【００３９】
また、PCR反応は、一般に、4種類のdNTP、即ち、dATP、dCTP、dGTP及びdTTPの存在化において行う。
更に、PCR反応は、一般に、適当な緩衝剤を含む反応液中で行われる。効率よく核酸を増幅させるためである。緩衝液は、使用するDNAポリメラーゼ等により、反応の最適条件を得るため適宜変更できる。例えば、pHを適当に調整したトリス系の緩衝液に、塩化カリウムや塩化マグネシウムを加えた緩衝液を利用できる。
また、PCR反応液には、5％〜10％のDMSOと1％〜2％のベタインを添加してもよい。鋳型DNAとなるcDNA断片が二字構造を有する場合に産物が増幅されにくいという問題を、最小限に留める効果を有するものである。
【００４０】
「電気泳動工程」では、アクリルアミドゲル電気泳動やアガロースゲル電気泳動など、公知の平板ゲル電気泳動などにより、cDNA断片（PCR産物）を電気泳動し、cDNA断片を分画すればよい。また、これらの電気泳動には、公知の電気泳動装置を利用すればよい。なお、ゲル電気泳動は、キャピラリーカラムによる場合に比べ、サイズ分解能を向上させることができるため、目的とするcDNA断片のみをより特異的に回収できる利点がある。
「cDNA断片回収工程」は、電気泳動の結果に基づいて目的とするcDNA断片を回収する工程であれば、いかなる方法を利用することもできる。例えば、標識物質を検出できるDNAシークエンサーにcDNA断片を供試して電気泳動工程を行い、その解析結果から、回収するcDNA断片を決定する。次に、再度同一サンプルを電気泳動して、目的とするcDNA断片が検出されたときに、その部分のゲルを切り出し、そこから当該cDNA断片を回収する方法が挙げられる。また、ゲル電気泳動後、標識物質を検出できるスキャナー上にゲルを載置し、その解析結果から回収するcDNA断片を決定する。そして、その部分のゲルを切り出し、そこから当該cDNA断片を回収する方法が挙げられる。
【００４１】
また、他の解決手段は、cDNA断片の一端に既知の第１アダプタ配列を有し他端に既知の第２アダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片の群を作成し、その中から所望のcDNA断片を取得する遺伝子断片の取得方法であって、cDNAの一方の端部に第１タグ物質が付加された第１タグ付きcDNAの群を作成する第１タグ付きcDNA群作成工程と、前記第１タグ付きcDNAの群を第１制限酵素により切断して、第１cDNA断片の群を得る第１切断工程と、前記第１タグ物質に高親和性を有する第１高親和性物質を用いて、前記第１cDNA断片の群の中から、前記第１タグ物質を有する第１タグ付き第１cDNA断片の群を回収する第１タグ付き第１cDNA断片群回収工程と、前記第１タグ付き第１cDNA断片の群を第２制限酵素により切断し、第２cDNA断片の群を得て、更に、この第２cDNA断片の群の中から、前記第１タグ物質を有しないタグなし第２cDNA断片の群を回収する第２切断・タグなし第２cDNA断片群回収工程と、前記タグなし第２cDNA断片の群に対して、第２タグ物質が付加され前記第１制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する前記第１アダプタ配列のライゲーションを行い、前記第１アダプタ配列が結合した第１アダプタ付き第２cDNA断片の群を作成する第１アダプタライゲーション工程と、前記第２タグ物質に高親和性を有する第２高親和性物質を用いると共に、前記第２制限酵素により前記第１アダプタ付き第２cDNA断片を切断して、自身の内部に前記第２制限酵素切断部位を有しない第１アダプタ付き第２cDNA断片の群を回収する第２切断・第１アダプタ付き第２cDNA断片群回収工程と、前記第２制限酵素切断部位を有しない第１アダプタ付き第２cDNA断片から前記第２タグ物質を除去すると共に、前記第２制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する前記第２アダプタ配列のライゲーションを行い、一端に前記第１アダプタ配列を有し他端に前記第２アダプタ配列を有する前記アダプタ付きcDNA断片の群を作成するアダプタ付きcDNA断片群作成工程と、前記アダプタ付きcDNA断片の群に対し、前記第１アダプタ配列に相補的な配列を有する第１プライマーと、前記第２アダプタ配列に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、PCRを行う第１PCR工程と、前記第１PCR工程で増幅されたcDNA断片の群についてゲル電気泳動を行う電気泳動工程と、前記電気泳動工程の結果に基づいて、ゲルから所望のcDNA断片を含むゲルを切り出し、このcDNA断片を回収するcDNA断片回収工程と、を備える遺伝子断片の取得方法である。
【００４２】
本発明では、遺伝子断片の取得にあたって、まず、前述した「２段階連結法」によってアダプタ付きcDNA断片群を作成する。即ち、まず、cDNAの一端に第１タグ物質が付加されたcDNA（第１タグ付きcDNA）の群を作成する。次に、このcDNAの群を第１制限酵素により切断して、cDNA断片（第１cDNA断片）の群を得る。その後、第１タグ物質に高親和性を有する第１高親和性物質を利用して、このcDNA断片の群の中から、第１タグ物質を有するcDNA断片（第１タグ付き第１cDNA断片）の群のみを回収する。その後、回収したcDNA断片の群を第２制限酵素により切断して、cDNA断片（第２cDNA断片）の群を得る。また、再び第１高親和性物質を利用して、このcDNA断片の群の中から、今度は、第１タグ物質を持たないcDNA断片（タグなし第２cDNA断片）の群を回収する。その後、回収したcDNA断片の群に対して、第２タグ物質を有すると共に第１制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する第１アダプタ配列のライゲーションを行い、第１アダプタ配列が結合したcDNA断片（第１アダプタ付き第２cDNA断片）の群を作成する。その後、第２タグ物質に高親和性を有する第２高親和性物質を用いると共に、第２制限酵素によりこのcDNA断片を切断して、自身の内部に第２制限酵素切断部位を有しないcDNA断片（第１アダプタ付き第２cDNA断片）の群を回収する。その後、このcDNA断片から第２タグ物質を除去すると共に、第２制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する前記第２アダプタ配列のライゲーションを行い、一端に第１アダプタ配列を有し他端に第２アダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片の群を作成する。
【００４３】
アダプタ付きcDNA断片群を作成した後は、このアダプタ付きcDNA断片の群に対し、第１アダプタ配列に相補的な配列を有する第１プライマーと、第２アダプタ配列に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、PCRを行う。このようにPCRを行うことによって、cDNA断片を多量に増幅できる。従って、目的のcDNA断片が低濃度しかなくても、それを大幅に増幅できる。しかも、このアダプタ付きcDNA断片の群は、両端に同一アダプタ配列が結合したcDNA断片は含まれず、理論上、一端に第１アダプタ配列を有し他端に第２アダプタ配列を有するcDNA断片のみからなるので、PCRを効率よく行うことができる。
その後、PCR産物についてゲル電気泳動を行う。その際、第１PCR工程でcDNA断片が大幅に増幅されているので、目的のcDNA断片を容易に検出できる。
その後、この電気泳動の結果に基づいて、ゲルから所望のcDNA断片を含むゲルを切り出し、このcDNA断片（遺伝子断片）を回収する。
【００４４】
このような方法でも、PCR工程でcDNA断片を効率よく増幅できるので、所望のcDNA断片（遺伝子断片）を効率よく取得できる。
なお、「第１タグ付きcDNA」、「cDNA」、「タグ物質」、「高親和性物質」、「制限酵素」、「第１アダプタ配列」、「第２アダプタ配列」、「第１プライマー」、「第２プライマー」、「電気泳動工程」、「cDNA断片回収工程」等は、前述の発明で説明した通りである。
【００４５】
更に、上記のいずれかに記載の遺伝子断片の取得方法であって、前記第１タグ付きcDNA群作成工程は、原核生物の細胞からmRNAを得るmRNA取得工程と、前記mRNAの3'末端にポリAを付加し、ポリA付加mRNAを得るポリA付加工程と、前記ポリA付加mRNAに前記第１タグ物質が付加されたポリTをハイブリダイズさせるポリTハイブリダイズ工程と、前記ポリTがハイブリダイズしたmRNAから前記第１タグ付きcDNAを合成するcDNA合成工程と、を含む遺伝子断片の取得方法とすると良い。
【００４６】
原核生物由来のmRNAはポリAテイルを持たないため、このままではcDNAを合成できない。
これに対し、本発明では、原核生物の細胞から得たmRNAにポリAを付加するので、これを利用することで容易にcDNAを合成できる。従って、原核生物を試料にしているにも拘わらず、アダプタ付きcDNA断片群を容易に作成でき、目的とする遺伝子断片を容易に取得できる。
【００４７】
上記の遺伝子断片の取得方法であって、前記mRNA取得工程は、前記原核生物の細胞から全RNAを抽出する全RNA抽出工程と、16S rRNAの一部に相補的な配列を有する第１ヌクレオチドを前記16S rRNAにハイブリダイズさせると共に、23S rRNAの一部に相補的な配列を有する第２ヌクレオチドを23S rRNAにハイブリダイズさせる第１，第２ヌクレオチドハイブリダイズ工程と、前記第１ヌクレオチドのうち、前記16S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的である配列を有し、第３タグ物質が付加された第３ヌクレオチドを、前記16S rRNAと前記第１ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせると共に、前記第２ヌクレオチドのうち、前記23S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的である配列を有し、第４タグ物質が付加された第４ヌクレオチドを、前記23S rRNAと上記第２ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる第３，第４ヌクレオチドハイブリダイズ工程と、前記全RNAから、前記第３タグ物質に高親和性を有する第３高親和性物質を用いて、前記16S rRNAと前記第１ヌクレオチドと前記第３タグ物質を有する前記第３ヌクレオチドとの結合物を除去すると共に、前記第４タグ物質に高親和性を有する第４高親和性物質を用いて、前記23S rRNAと前記第２ヌクレオチドと前記第４タグ物質を有する前記第４ヌクレオチドとの結合物を除去する除去するrRNA除去工程と、を含む遺伝子断片の取得方法とすると良い。
【００４８】
原核生物においては、mRNAにポリAテイルが存在しないため、真核生物の場合のように、ポリAテイルを利用して抽出した全RNAからmRNAを精製（濃縮）する方法を採ることができない。
これに対し、上記取得方法では、まず、原核生物の細胞から全RNAを抽出する。そして、抽出した全RNAに対し、16S rRNAの一部に相補的な配列を有する第１ヌクレオチドを16S rRNAにハイブリダイズさせると共に、23S rRNAの一部に相補的な配列を有する第２ヌクレオチドを23S rRNAにハイブリダイズさせる。その後、第１ヌクレオチドのうち、16S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的な配列を有し、第３タグ物質が付加された第３ヌクレオチドを、16S rRNAと第１ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる。また、第２ヌクレオチドのうち、23S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的な配列を有し、第４タグ物質が付加された第４ヌクレオチドを、23S rRNAと第２ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる。その後、全RNAから、16S rRNAと第１ヌクレオチドと第３タグ物質が付加された第３ヌクレオチドとの結合物を除去すると共に、23S rRNAと第２ヌクレオチドと第４タグ物質が付加された第４ヌクレオチドとの結合物を除去する。
このような方法によれば、全RNAから、全RNAの中に多量に存在するrRNA（16S rRNA及び23S rRNA）の大部分を除去できる。従って、mRNAを容易により高純度に濃縮できる。
なお、「第１ヌクレオチド」、「第２ヌクレオチド」、「第３ヌクレオチド」、「第４ヌクレオチド」、「タグ物質」等については、前述の発明で説明した通りである。
【００４９】
更に、上記のいずれかに記載の遺伝子断片の取得方法であって、前記cDNA断片回収工程で回収した前記cDNA断片について、前記第１アダプタ配列に相補的な配列を有する第３プライマーと、前記第２アダプタ配列に相補的な配列を有する第４プライマーとを用いて、再度PCRを行う第２PCR工程を備える遺伝子断片の取得方法とすると良い。
【００５０】
本発明によれば、cDNA断片回収工程後、連結工程前に、回収したcDNA断片について、第１アダプタ配列に相補的な配列を有する第３プライマーと、第２アダプタ配列に相補的な配列を有する第４プライマーとを用いて、再度PCR反応を行う第２PCR工程を備える。
このような工程を行えば、cDNA断片回収工程で回収したcDNA断片が少量しかなくても、それを大幅に増幅できる。従って、効率よくcDNA断片を取得できる。
【００５１】
なお、このPCR工程で使用する「第３プライマー」は、第１アダプタ配列に相補的な配列を有するものであればよく、例えば、上記の第１プライマーを利用してもよい。但し、後の導入工程を考慮して、適当な制限酵素の認識配列を有する第３プライマーを利用すれば、導入工程を効率よく、また、確実に行うことができる。同様に、「第４プライマー」は、第２アダプタ配列に相補的な配列を有するものであればよく、例えば、上記の第２プライマーを利用してもよいが、適当な制限酵素の認識配列を有する第４プライマーを利用すれば、導入工程を効率よく、また、確実に行うことができる。なお、これら第３，第４プライマーには、標識物質は特に要しない。
【００５２】
上記の遺伝子断片の取得方法であって、前記cDNA断片回収工程後、または、前記第２PCR工程を有する場合には第２PCR工程後、前記cDNA断片をプラスミドベクターに連結し、組換え体プラスミドを形成する連結工程と、上記組換え体プラスミドを大腸菌に導入する導入工程と、を備える遺伝子断片の取得方法とすると良い。
【００５３】
本発明によれば、第２PCR工程を有しない場合には回収工程後、または、第２PCR工程を有する場合には第２PCR工程後、目的のcDNA断片をプラスミドベクターに連結し、組換え体プラスミドを形成する連結工程を備える。そして更に、この組換え体プラスミドを大腸菌に導入する導入工程を備える。
このように、回収したcDNA断片をプラスミドベクターに連結し、大腸菌に導入しておけば、cDNA断片の構造解析をする場合などに有効である。即ち、形質転換したその大腸菌を培養し、それからcDNA断片を有するプラスミドDNAを抽出すれば、これを例えば塩基配列の決定等の構造解析に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
以下、本発明の実施例を、図面を参照しつつ説明する。
（実施例１）
「１段階連結法」によって、cDNA断片の一端に既知の第１アダプタ配列を有し他端に既知の第２アダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片の群を作成する方法について、図１〜図４を参照しつつ説明する。図１は、アダプタ付きcDNA断片１６１の群を作成する方法のうち、第２切断・タグなし第２cDNA断片群回収工程までを示す説明図である。図２は、アダプタ付きcDNA断片１６１の群を作成する方法のうち、第２切断・タグなし第２cDNA断片群回収工程後の工程を示す説明図である。図３は、原核生物由来の全RNAからmRNAを濃縮するためにrRNAを除去する方法を示す説明図である。図４は、第１アダプタ配列及び第２アダプタ配列を示す説明図である。
【００５５】
アダプタ付きcDNA断片群１６１の作成にあたって、まず、図１に模式的に示すように、一端に第１タグ物質１０３が付加されたcDNA（第１タグ付きcDNA）１０１の群を作成する（第１タグ付きcDNA群作成工程）。
この工程では、まず、原核生物の細胞から高純度のmRNAを得る（mRNA取得工程）。図３に全RNAからmRNAを濃縮するために、16S rRNAを除去する方法を模式的に示す。23S rRNAの除去についても基本的に同じである。
詳細には、原核生物の細胞から全RNAを抽出する（全RNA抽出工程）。その後、16S rRNAの一部に相補的な配列を有する第１ヌクレオチド２０１を16S rRNAにハイブリダイズさせると共に、23S rRNAの一部に相補的な配列を有する第２ヌクレオチドを23S rRNAにハイブリダイズさせる（第１，第２ヌクレオチドハイブリダイズ工程）。更に、第１ヌクレオチド２０１のうち、16S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的である配列を有し、第３タグ物質２０５が付加された第３ヌクレオチド２０３を、16S rRNAと第１ヌクレオチド２０１の結合物にハイブリダイズさせる。また、第２ヌクレオチドのうち、23S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的である配列を有し、第４タグ物質が付加された第４ヌクレオチドを、23S rRNAと上記第２ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる（第３，第４ヌクレオチドハイブリダイズ工程）。その後、全RNAから、第３タグ物質２０５に高親和性を有する第３高親和性物質を用いて、16S rRNAと第１ヌクレオチド２０１と第３タグ物質２０５を有する第３ヌクレオチド２０３との結合物を除去する。また、第４タグ物質に高親和性を有する第４高親和性物質を用いて、23S rRNAと第２ヌクレオチドと第４タグ物質を有する第４ヌクレオチドとの結合物を除去し、mRNAを濃縮する（rRNA除去工程）。
【００５６】
本実施例では、試験対象として、原核生物であるバチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）を用意した。そして、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）を、イノシトールを添加した培地で培養し、この細胞から全RNAを抽出した。なお、イノシトールを添加することにより、イノシトール分解遺伝子郡の一遺伝子である iolJ の mRNAが転写されているはずである。この全RNAの抽出は、RNA抽出キット（Rneasy Protect Bacterial Mini Kit）を用いて、添付のマニュアルに従って行った。その後、抽出した全RNA10μgを用いて、rRNAを除去しmRNAを濃縮した。この精製（濃縮）には、MICROB Express Bacterial mRNA Isolation Kit（Ambion社製）を使用した。精製法は、添付のマニュアルに従った。かくして、バチルス・サブティリスのmRNAを得た（濃縮した）。
【００５７】
次に、抽出・精製したmRNAの3'末端にポリAを付加し、ポリA付加mRNAを得る（ポリA付加工程）。
本実施例では、インビトロジェン社製のPolyA化キットを使用して、mRNAのポリA化を行った。mRNAは1000ng使用した。ポリA化反応の終了後、反応液に TE buffer 100μlとフェノール・クロロフォルム溶液 200μlを加えて混合した。続いて、この混合液を15,000rpmで5分間、室温で遠心分離した。そして、上澄み溶液を185μl（92.5μl×2）吸い取った。続いて、この上澄み溶液に 3M 酢酸ナトリウムを18.5μl加えて混合した。更に、この溶液に520μlの99.5％エタノールを加えてよく混合した。その後、この溶液を−80℃で10分間保冷した。その後、これを15,000rpmで15分間、4℃で遠心分離した後、70％エタノールで沈殿をリンスした。続いて、これを15,000rpmで3分間、4℃で遠心分離し、上澄みを除去した。その後、沈殿を風乾させ、DEPC処理水7μlに溶解した。かくして、3'末端にポリAテイルが付加したmRNAを得た。
【００５８】
次に、このポリA付加mRNAに、第１タグ物質が付加されたポリTをハイブリダイズさせる（ポリTハイブリダイズ工程）。続いて、このポリTがハイブリダイズしたmRNAからcDNA（第１タグ付きcDNA）を合成する（cDNA合成工程）（図１参照）。
本実施例では、mRNAの3'末端側のポリAテイルに相補的なオリゴdTプライマーをビオチン（第１タグ物質）１０３で標識化したものをプライマーとして用いて、cDNA（第１タグ付きcDNA）１０１を合成した。
【表１】
2005253394.tif 000003
まず、上記の混合物を65℃で5分間加温後、氷中で1分間以上放置した。
【００５９】
一方で、下記の混合物を作成した。なお、この混合物の作成には、インビトロジェン社製のキットを使用した。
【表２】
2005253394.tif 000004
そして、この混合物を氷中で保冷しておいた上記混合物に加えて穏やかに混合した後、42℃で1時間インキュベートした。この反応液を1st Strand Mixとする。
【００６０】
また一方で、下記の混合物（これを2nd Strand Mixとする）を作成した。この混合物も、インビトロジェン社製のものを利用した。
【表３】
2005253394.tif 000005
そして、この混合物を上記の1st strand合成反応が終了するまで氷中に保存した。
【００６１】
次に、冷却した2nd Strand Mix 130μlを、上記の1st Strand Mixに加えて穏やかに混合した後、16℃で2時間反応させた。その後、MinElute Reaction kit を使用して、反応液を精製濃縮した。このとき、１本のチューブで１サンプルを処理した。最終溶出量は、10μlの溶出を２回繰り返し、18μlとした。かくして、タグ物質１０３が付加されたcDNA（第１タグ付きcDNA）１０１の群を得た。
【００６２】
次に、図１に示すように、cDNA（第１タグ付きcDNA）１０１の群を第１制限酵素により切断して、cDNA断片（第１cDNA断片）１１１の群を得る（第１切断工程）。このcDNA断片１１１の群には、第１タグ物質１０３を有するcDNA断片（第１タグ付き第１cDNA断片）１１３の他、例えば、両端とも第１制限酵素で切断されたcDNA断片など、第１タグ物質１０３を持たないcDNA断片（タグなし第１cDNA断片）１１５も多数存在する。
本実施例では、下記の混合物を作成し、37℃で２時間反応させた。なお、第１制限酵素として、４塩基認識制限酵素の１つであるHhaＩを用いた。
【表４】
2005253394.tif 000006
【００６３】
次に、図１に示すように、第１タグ物質１０３に高親和性を有する第１高親和性物質１２３を利用して、cDNA断片（第１cDNA断片）１１１の群の中から、第１タグ物質１０３を有するcDNA断片（第１タグ付き第１cDNA断片）１１３の群を回収する（第１タグ付き第１cDNA断片群回収工程）。その際、第１タグ物質１０３を持たないcDNA断片（タグなし第１cDNA断片）１１５は除去される。
本実施例では、ストレプトアビジンが固定されたマグネットビーズ（第１高親和性物質）１２３を用いて、ビオチン（第１タグ物質）１０３を捕捉し、ビオチン１０３を有するcDNA断片１１３のみを回収した。
具体的には、まず、マグネットビーズ１２３の洗浄を行った。即ち、400μlのマグネットビーズ１２３をマイクロチューブに移し、スタンドにマイクロチューブを立てた。そして、マグネットビーズ１２３がスタンド側に引きつけられた後、上澄みを除去した。その後、スタンドからマイクロチューブをはずし、洗浄buffer（5mM Tris、0.5mM EDTA、1M NaCl：pＨ＝7.5）を700μl加え、ピペッティングにより懸濁した。そして、再度マイクロチューブをスタンドに立てて、マグネットビーズ１２３をスタンド側に引きつけ、上澄みを除去した。その後、再度この洗浄操作を行った。その後、スタンドからマイクロチューブをはずし、洗浄bufferを300μl加え、ピペッティングにより懸濁した。そして、マイクロチューブを再びスタンドに立てて、上澄みを除去した後、2×洗浄bufferを195μl加えて懸濁し、ビーズ懸濁液とした。
【００６４】
次に、上記の制限酵素の反応液30μlに TE bufferを70μl加え、更に、上記のビーズ懸濁液を100μl添加した。そして、TOMY mixer(MT-360) を用いて、目盛り4〜5で15分間混合した。混合後、マイクロチューブをスタンドに立てて、マグネットビーズ１２３をスタンド側に引きつけ、上澄みを除去した。なお、この上澄み液には、第１タグ物質１０３を持たないcDNA断片（タグなし第１cDNA断片）１１５が含まれている。その後、洗浄bufferを用いて上述したように洗浄を行った（500μl×2回、200μl×1回）。この洗浄後、スタンドからマイクロチューブをはずし、0.1×TE bufferを200μl加え、ピペッティングにより懸濁洗浄した。その後、マイクロチューブをスタンドに戻し、上澄みを除去した後、水を50μl加えた。その後、再度スタンドからマイクロチューブをはずし、ピペッティングにより懸濁した。かくして、第１タグ物質１０３を有するcDNA断片（第１タグ付き第１cDNA断片）１１３の群を得た。
【００６５】
次に、図１に示すように、第１タグ付き第１cDNA断片１１３の群を第２制限酵素により切断して、新たなcDNA断片（第２cDNA断片）１３１の群を得る。このcDNA断片１３１の群には、一端が第１制限酵素で切断され他端が第２制限酵素で切断され、タグ物質１０３を持たないcDNA断片（タグなし第２cDNA断片）１３７の他、両端とも第２制限酵素で切断され、タグ物質１０３を持たないcDNA断片（タグなしcDNA断片）１３５や、一端が第２制限酵素で切断され、第１タグ物質１０３を有するcDNA断片１３３が含まれる。なお、両端とも第１制限酵素で切断されたcDNA断片は、前の工程で既に除去されているため、このcDNA断片１３１の群には存在しない。新たなcDNA断片（第２cDNA断片）１３１の群を得た後は、この中から第１タグ物質１０３を持たないcDNA断片（タグなし第２cDNA断片）１３５，１３７の群を回収する（第２切断・タグなし第２cDNA断片群回収工程）。
【００６６】
本実施例では、下記の混合物を作成した。なお、第２制限酵素として、４塩基認識制限酵素の１つであるSau3AIを用いた。
【表５】
2005253394.tif 000007
そして、この混合液を上記のビーズ入りマイクロチューブに100μl添加し穏やかに混合した。そして、37℃で2時間、穏やかに振盪しながら反応させた。
【００６７】
反応終了後、スタンドにマイクロチューブを立ててマグネットビーズ１２３を引きつけ、上澄み140μｌを新しいマイクロチューブに移した。そして、再度、TE buffer 60μlをビーズ入りマイクロチューブに入れ、スタンドからはずしてピペッティングにより穏やかに混合した。その後、再びスタンドにマイクロチューブを立ててマグネットビーズ１２３を引きつけ、上澄み60μlを新しいマイクロチューブに移した。その後、MinElute Reaction kit（QIAGEN）を使用して、サンプルを精製濃縮した。このとき、溶出操作は１回のみとした（溶出量は9μl）。かくして、タグなし第２cDNA断片１３５，１３７の群を得た。
【００６８】
次に、図２に示すように、このタグなし第２cDNA断片１３５，１３７の群に対して、第２タグ物質１４４を有すると共に第１制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する第１アダプタ配列１４３、及び、第２制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する第２アダプタ配列１４５のライゲーションを行い、少なくとも第２アダプタ配列１４５が結合したアダプタ付きcDNA断片（アダプタ付き第２cDNA断片）１４１の群を作成する（第１，第２アダプタライゲーション工程）。このアダプタ付きcDNA断片１４１の群には、一端に第１アダプタ配列１４３が結合し他端に第２アダプタ配列１４５が結合したアダプタ付きcDNA断片（第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片）１４９の他、両端に第２アダプタ配列１４５が結合したアダプタ付きcDNA断片（第２アダプタ付き第２cDNA断片）１４７も多数含まれる。
【００６９】
本実施例では、第２タグ物質１４４を有する第１アダプタ配列１４３として、ビオチン（第２タグ物質）１４４を有し、図４（ａ）に示す配列からなる第１アダプタ配列１４３を用意した（以下、これをタグ付きHhaIアダプタとも言う）。また、第２アダプタ配列１４５として、図４（ｂ）に示す配列からなる第２アダプタ配列１４５を用意した（以下、これをSau3AIアダプタとも言う）。そして、0.4μlのタグ付きHhaIアダプタ溶液（5pmol/μl）及び0.8μlのSau3AIアダプタ溶液（5pmol/μl）を上記の溶出液に加え、それに ligation kit ver.2（タカラバイオ）のＩ液を10μl添加し、穏やかに混合した。その後、16℃で一晩反応させた。かくして、アダプタ付きcDNA断片１４１の群を得た。
【００７０】
次に、図２に示すように、第２タグ物質１４４に高親和性を有する第２高親和性物質１５３を利用して、アダプタ付き第２cDNA断片１４１の群の中から、第２タグ物質１４４を有する第１アダプタ配列１４３をも結合した第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片１４９の群を回収する（第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片群回収工程）。その際、両端に第２アダプタ配列１４５が結合した第２アダプタ付き第２cDNA断片１４７は除去される。
本実施例では、ストレプトアビジンが固定されたマグネットビーズ（第２高親和性物質）１５３を用いて、ビオチン（第２タグ物質）１４４を捕捉し、ビオチン１４４を有するcDNA断片１４９のみを回収した。この工程のマグネットビーズ１５３の洗浄及び結合操作等は、基本的に、前述した第１タグ付き第１cDNA断片群回収工程と同様である。最終的には、マグネットビーズ１５３に nuclease free water 50μl加えて懸濁した。かくして、第２タグ物質１４４を有する第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片１４９の群を得た。
【００７１】
次に、図２に示すように、第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片１４９から第２タグ物質１４４を除去し、一端に第１アダプタ配列１４３を有し他端に第２アダプタ配列１４５を有するアダプタ付きcDNA断片１６１の群を回収する（アダプタ付きcDNA断片群回収工程）。
本実施例では、下記の混合物を作成した。なお、第３制限酵素として、８塩基認識制限酵素の１つであるNotIを用いた。
【表６】
2005253394.tif 000008
そして、この混合液を上記のビーズ入りマイクロチューブに100μl添加し穏やかに混合した。そして、37℃で3時間、穏やかに振盪しながら反応させた。
【００７２】
反応終了後、スタンドにマイクロチューブを装着し、マグネットビーズ１５３を引きつけ、上澄み140μｌを回収した。続いて、nuclease free water を60μl添加し、ビーズ懸濁後、再度マグネットビーズ１５３をスタンド側に引きつけ、上澄み液60μlを回収する。その後、MinElute Reaction kit を使用して、サンプルを精製濃縮した。このとき、溶出操作は３回とした（10μlの溶出bufferを３回カラムに通して、最終溶出量を27μlとした）。そして、この溶出液を数倍〜数十倍に希釈した。かくして、一端に第１アダプタ配列１４３を有し他端に第２アダプタ配列１４５を有するアダプタ付きcDNA断片１６１の群を得た。
【００７３】
次いで、このアダプタ付きcDNA断片１６１の群の中から、所望のcDNA断片を取得する遺伝子断片の取得方法について、図５〜図７を参照しつつ説明する。図５は、アダプタ付きcDNA断片１６１の群の中から、所望のcDNA断片（遺伝子断片）を取得する方法を示す説明図である。図６は、バチルス・サブティリスのイノシトール分解遺伝子郡の一遺伝子である iolJ の塩基配列と、その中に存在するHhaI切断部位及びSau3AI切断部位を示す説明図である。図７は、取得したcDNA断片（遺伝子断片）について電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。
【００７４】
まず、図５に示すように、アダプタ付きcDNA断片１６１の群に対し、第１アダプタ配列１４３に相補的な配列を有する第１プライマーと、第２アダプタ配列１４５に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、PCRを行う（第１PCR工程）。
本実施例では、このプライマーセットとして、第１アダプタ配列１４３に相補的な配列と、増幅させる方向に更に２塩基の配列（gg）を有し、且つ、近赤外蛍光色素IRD-800（標識物質）が結合された第１プライマー（オリゴヌクレオチド１）と、第２アダプタ配列１４５に相補的な配列を有する第２プライマー（オリゴヌクレオチド２）を使用した。なお、第１，第２プライマーは、それぞれ公知の手法により合成すればよい。
【００７５】
第１プライマー（オリゴヌクレオチド１）：
5'-catagaatcaaatcagttgcgc gg-3'
第２プライマー（オリゴヌクレオチド２）：
5'-gcactagtgcaatcgcacttgaacgatgatc-3'
【００７６】
PCR反応の反応組成は、次の通りである。
【表７】
2005253394.tif 000009
また、PCRは、BIO-RAD社製のI-Cysler を用いて行った。PCR条件は、Stepdown PCR（Biotechniques，1996，20：478-485を参照されたい。）により行った。
【００７７】
このようなPCRにより、第１，第２アダプタ配列１４３，１４５に囲まれたcDNA断片１６２が増幅される。本実施例では、イノシトール分解遺伝子郡の一遺伝子である iolJ の一部が回収されているはずである。第１，第２プライマーを考慮すると、図６に塩基配列とHhaIサイト及びSau3AIサイトを示すイノシトール遺伝子のうち、768-839 の断片を含む 117bp のcDNA断片が増幅されるはずである。
【００７８】
次に、図５に示すように、第１PCR工程で増幅されたcDNA断片１６２の群についてゲル電気泳動を行う（電気泳動工程）。
本実施例では、増幅したcDNA断片１６２の群を、蛍光色素の読み取れるDNAシークエンサー（LI-COR社製LIC-4200L(S)-1）に供試し、サイズ分画のためにアクリルアミドゲル電気泳動を行った。アクリルアミドゲル１６３の組成は、上記DNAシークエンサーに付属のマニュアルに従った。アクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、図７のレーン２に示すように、117bpの位置にシグナルが現れた。なお、図７はシークエンサのデータより取得した画像である。
なお、図７のレーン１は、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）を培養する際にイノシトールを添加しなかった場合のものである。それ以外は、本実施例と同様に試験を行った。イノシトールを添加しない場合には、イノシトール分解遺伝子が発現しないため、イノシトール分解遺伝子由来のcDNA断片は検出されない。
また、レーン３及び４については、実施例２で後述する。
【００７９】
次に、図５に示すように、電気泳動工程の結果に基づいて、ゲルから所望のcDNA断片１６４を含むゲルを切り出し、このcDNA断片１６４を回収する（cDNA断片回収工程）。
本実施例では、電気泳動を行ったゲルについて、濾紙を使用してゲルをゲル板から剥がした。続いて、濾紙にくっ付いたゲルを蛍光色素の検出できるスキャナー上に載置し、ゲル全体をイメージ化した。そして、目的のcDNA断片１６４がゲル中のどの位置にあるかを把握し、この目的のcDNA断片１６４を含むゲルを切り出した。なお、本実施例では、LI-COR社のゲルイメージングシステムオデッセイを使用した。
その後、切り出したアクリルアミドゲルから目的のcDNA断片１６４を回収した。このDNAの抽出は、Omega Bio-tek社の E.Z.N.A. Poly-Gel DNA Extraction kit を使用した。
【００８０】
次に、図５に示すように、cDNA断片回収工程で回収したcDNA断片１６４について、第１アダプタ配列１４３に相補的な配列を有する第３プライマーと、第２アダプタ配列１４５に相補的な配列を有する第４プライマーとを用いて、再度PCRを行う（第２PCR工程）。
本実施例では、フォワード側には、第１アダプタ配列１４３に相補的な配列を有すると共に制限酵素NotI部位の配列を有する第３プライマー（オリゴヌクレオチド３）を、リバース側には、第２アダプタ配列１４５に相補的な配列を有すると共に制限酵素SpeI部位の配列を有する第４プライマー（オリゴヌクレオチド４）を用いて、PCR反応を行った。
【００８１】
第３プライマー（オリゴヌクレオチド３）：
5'-cagcggccgct catagaatcaaatcagttgcgc gg-3'
第４プライマー（オリゴヌクレオチド４）：
5'-gcactagtgcaatcgcacttgaacgatgatccg-3'
【００８２】
また、この第２PCR工程においても、PCR反応は、パーキンエルマー社製の GeneAmp 2400 を用い、Stepdown PCR（Biotechniques，1996，20：478-485を参照されたい。）の条件により行った。
【００８３】
次に、図５に示すように、cDNA断片（PCR産物）１６４をプラスミドベクター１６５に連結し、組換え体プラスミド１６６を形成する（連結工程）。
本実施例では、増幅したcDNA断片１６４の産物を制限酵素NotIとSpeIで処理した上で、プラスミドベクター（pBluescriptII）１６５に連結し、組換え体プラスミド１６６を形成した。この連結は、宝酒造社製のライゲーションキットver.2 を使用し、その添付マニュアルに従って行った。
【００８４】
次に、この組換え体プラスミド１６６を大腸菌に導入する（導入工程）。
本実施例では、コンピテントセルとして E.coli DH5αを使用し、公知の手法により、組換え体プラスミド１６６を大腸菌に導入した。
【００８５】
次に、形質転換した大腸菌をプレート培養したところ、126個のコロニーが得られた。いくつかのコロニーからプラスミドDNAを抽出し、挿入されたcDNA断片１６４の塩基配列を調べたところ、確かに、本実施例の標的遺伝子である、iolJ の一部であった。一方、第２PCR工程で得られたcDNA断片１６４を制限酵素SpeIのみで処理し、プラスミドベクター１６５に連結した場合には、6個のコロニーが得られた。これは、cDNA断片の両端に同一アダプタが連結されたものであると考えられる。従って、本実施例によれば、同一アダプタが両端に結合したcDNA断片の存在割合は約５％しかなく、一端に第１アダプタ配列１４３、他端に第２アダプタ配列１４５が結合したcDNA断片１６１の割合は約９５％もある。
一方、図９を用いて説明した旧法を利用した場合、得られたcDNA断片を制限酵素NotIとSpeIで処理し、プラスミドベクターに連結すると、57個のコロニーが得られ、cDNA断片を制限酵素SpeIのみで処理し、プラスミドベクターに連結すると、36個のコロニーが得られた。従って、同一アダプタが両端に結合したcDNA断片の存在割合は約３９％もあり、一端に第１アダプタ配列、他端に第２アダプタ配列が結合したcDNAの割合は約６１％しかない。
このことから、本発明を適用することにより、一端に第１アダプタ配列１４３、他端に第２アダプタ配列１４５が結合したアダプタ付きcDNA断片１６１の群を高純度に作成でき、効率よく所望の遺伝子断片を取得できることが判る。
【００８６】
以上で説明したように、本実施例では、まず、一端に第１タグ物質１０３が付加されたcDNA（第１タグ付きcDNA）１０１の群を作成する。次に、このcDNA１０１の群を第１制限酵素により切断して、cDNA断片（第１cDNA断片）１１１の群を得る。その後、第１高親和性物質１２３を利用して、このcDNA断片１１１の群の中から、第１タグ物質１０３を有するcDNA断片（第１タグ付き第１cDNA断片）１１３の群を回収する。その後、回収したcDNA断片１１３の群を第２制限酵素により切断して、cDNA断片（第２cDNA断片）１３１の群を得る。また、このcDNA断片１３１の群の中から、第１タグ物質１０３を有しないcDNA断片（タグなし第２cDNA断片）１３５，１３７の群を回収する（図１参照）。
次に、回収したcDNA断片１３５，１３７の群に対して、第２タグ物質１４４を有する第１アダプタ配列１４３と第２アダプタ配列１４５のライゲーションを行い、少なくとも第２アダプタ配列１４５が結合したcDNA断片（アダプタ付き第２cDNA断片）１４１の群を作成する。その後、第２高親和性物質１５３を用いて、このcDNA断片１４１の群の中から、第１アダプタ配列１４３をも結合したcDNA断片（第１，第２アダプタ付き第２cDNA断片）１４９の群を回収する。その後は、このcDNA断片１４９から第２タグ物質１４４を除去し、一端に第１アダプタ配列１４３を有し他端に第２アダプタ配列１４５を有するアダプタ付きcDNA断片１６１の群を回収する（図２参照）。
【００８７】
このような方法でアダプタ付きcDNA断片１６１の群を作成すれば、理論的には、両端に第１アダプタ配列１４３が結合したアダプタ付きcDNA断片や、両端に第２アダプタ配列１４５が結合したアダプタ付きcDNA断片は含まれなくなり、一端に第１アダプタ配列１４３を有し他端に第２アダプタ配列１４５を有するアダプタ付きcDNA断片１６１のみからなる、高純度のアダプタ付きcDNA断片群を作成できる。
【００８８】
更に、本実施例では、原核生物の細胞から抽出・濃縮したmRNAにポリAを付加するので、これを利用することで、容易にcDNA１０１を合成するできる。従って、原核生物を試料にしているにも拘わらず、アダプタ付きcDNA断片群を容易に作成できる。
また、本実施例では、mRNA取得工程において、まず、原核生物の細胞から全RNAを抽出する。そして、抽出した全RNAに対し、16S rRNAの一部に相補的な配列を有する第１ヌクレオチドを16S rRNAにハイブリダイズさせると共に、23S rRNAの一部に相補的な配列を有する第２ヌクレオチドを23S rRNAにハイブリダイズさせる。その後、第１ヌクレオチドのうち、16S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的な配列を有し、第３タグ物質が付加された第３ヌクレオチドを、16S rRNAと第１ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる。また、第２ヌクレオチドのうち、23S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的な配列を有し、第４タグ物質が付加された第４ヌクレオチドが付加された第２タグ物質を、23S rRNAと第２ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる。その後、全RNAから、16S rRNAと第１ヌクレオチドと第３ヌクレオチドとの結合物を除去すると共に、23S rRNAと第２ヌクレオチドと第４ヌクレオチドとの結合物を除去する。
このような方法によれば、全RNAから、全RNAの中に多量に存在する16S rRNAと23S rRNAの大部分を除去できる。従って、mRNAを容易により高純度に濃縮できる。
【００８９】
また、本実施例では、アダプタ付きcDNA断片１６１の群を作成した後、これに対し、第１アダプタ配列１４３に相補的な配列を有する第１プライマーと、第２アダプタ配列１４５に相補的な配列を有する第２プライマーとからなるプライマーセットであって、少なくとも一方のプライマーに標識物質を有するプライマーセットを用いて、PCRを行う。このようにPCRを行うことによって、cDNA断片１６２を多量に増幅できる。従って、cDNA断片１６２の群の中に存在する目的のcDNA断片１６４が低濃度であっても、それを大幅に増幅できる。しかも、このPCRにおいては、このアダプタ付きcDNA断片１６１の群が、従来とは異なり、両端に同一アダプタ配列が結合したcDNA断片は含まれず、一端に第１アダプタ配列１４３を有し他端に第２アダプタ配列１４５を有するcDNA断片１６１のみからなるので、PCRを効率よく行うことができる。その後、PCR産物についてゲル電気泳動を行う。その際、cDNA断片１６２を容易に検出できる。そして、電気泳動の結果に基づいて、ゲルから所望のcDNA断片１６４を含むゲルを切り出し、このcDNA断片（遺伝子断片）１６４を回収する。
このような方法では、PCR工程で効率よくcDNA断片１６２を増幅できるので、所望のcDNA断片（遺伝子断片）１６４を効率よく取得できる。
【００９０】
また、本実施例では、cDNA断片回収工程後、連結工程前に、回収したcDNA断片１６４について、第１アダプタ配列１４３に相補的な配列を有する第３プライマーと、第２アダプタ配列１４５に相補的な配列を有する第４プライマーとを用いて、再度PCR反応を行う第２PCR工程を備える。
このような工程を行えば、cDNA断片回収工程で回収したcDNA断片１６４が少量しかなくても、それを大幅に増幅できる。
【００９１】
また、本実施例では、第２PCR工程後、目的のcDNA断片１６４をプラスミドベクター１６５に連結し、組換え体プラスミド１６６を形成する連結工程を備える。そして更に、この組換え体プラスミド１６６を大腸菌に導入する導入工程を備える。
このように、回収したcDNA断片１６４をプラスミドベクター１６５に連結し、大腸菌に導入しておけば、cDNA断片１６４の構造解析をする場合などに有効である。即ち、形質転換したその大腸菌を培養し、それからcDNA断片１６５を有するプラスミドDNA１６６を抽出すれば、これを例えば塩基配列の決定等の構造解析などに利用できる。
【００９２】
（実施例２）
次いで、第２の実施例について説明する。なお、上記実施例１と同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
まず、「２段階連結法」によって、一端に既知の第１アダプタ配列１４３を有し他端に既知の第２アダプタ配列１４５を有するアダプタ付きcDNA断片２７１の群を作成する方法について説明する。
アダプタ付きcDNA断片群２７１の作成にあたって、まず、上記実施形態１と同様にして、第１タグ付きcDNA群作成工程から第２切断・タグなし第２cDNA断片群回収工程までを行う（図１参照）。
【００９３】
次に、タグなし第２cDNA断片１３５，１３７の群に対して、図８に示すように、第２タグ物質１４４を有すると共に第１制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する第１アダプタ配列１４３のライゲーションを行い、第１アダプタ配列１４３が結合したcDNA断片（第１アダプタ付き第２cDNA断片）２４１の群を作成する（第１アダプタライゲーション工程）。その際、図中に示すように、第２cDNA断片同士が再結合することもある。
本実施例では、第２タグ物質１４４を有する第１アダプタ配列１４３は、上記実施例１と同様に、ビオチン（第２タグ物質）１４４を有し、図４（ａ）に示す配列からなる第１アダプタ配列１４３（タグ付きHhaIアダプタ）である。そして、0.4μlのHhaIアダプタ溶液（5pmol/μl）を溶出液に加え、それに ligation kit ver.2（タカラバイオ）のＩ液を10μl添加し、穏やかに混合した。その後、16℃で一晩反応させた。かくして、第１アダプタ付き第２cDNA断片２４１の群を得た。
【００９４】
次に、図８に示すように、第２制限酵素により第１アダプタ付き第２cDNA断片２４１を切断して、新たなcDNA断片２５１の群を得る。また、第２タグ物質１４４に高親和性を有する第２高親和性物質１５３を用いて、このcDNA断片２５１の中から、自身の内部に第２制限酵素切断部位を有しない第１アダプタ付き第２cDNA断片２５３の群を回収する（第２切断・第１アダプタ付き第２cDNA断片群回収工程）。その際、第２タグ物質１４４を持たないcDNA断片２５５は除去される。
本実施例では、上記実施例１と同様に、ストレプトアビジンが固定されたマグネットビーズ（第２高親和性物質）１５３を用いた。マグネットビーズ１５３の洗浄及び結合操作等は、基本的に、実施例１で前述した第１タグ付き第１cDNA断片群回収工程と同様にして行う。
また、下記の混合物を作成した。なお、第２制限酵素として、４塩基認識制限酵素の１つであるSau3AIを用いた。
【表８】
2005253394.tif 000010
そして、この混合液を上記のビーズ入りチューブに150μl添加して混合する。そして、37℃で2時間、穏やかに振盪しながら反応させた。
反応終了後、ビーズの洗浄操作を行い、続いて、ビーズを50μlの nuclease free water に懸濁した。かくして、自身の内部に第２制限酵素切断部位を有しない第１アダプタ付き第２cDNA断片２５３の群を得た。
【００９５】
次に、図８に示すように、第２制限酵素切断部位を有しない第１アダプタ付き第２cDNA断片２５３から第２タグ物質１４４を除去し、タグなし第１アダプタ付き第２cDNA断片２６１の群を回収する。
本実施例では、下記の混合物を作成した。なお、第３制限酵素として、６塩基認識制限酵素の１つであるNotIを用いた。
【表９】
2005253394.tif 000011
そして、この混合液を上記のビーズ入りチューブに100μl添加して混合する。そして、37℃で3時間、穏やかに振盪しながら反応させた。
【００９６】
反応終了後、スタンドにマイクロチューブを装着し、マグネットビーズ１５３を引きつけ、上澄み140μlを回収した。続いて、nuclease free water を60μl添加し、ビーズ懸濁後、再度マグネットビーズ１５３をスタンドに引きつけ、上澄み液60μlを回収する。その後、MinElute Reaction kit を使用して、サンプルを精製濃縮した。このとき、溶出操作は１回のみとした（溶出量は9μl）。
【００９７】
次に、図８に示すように、タグなし第１アダプタ付き第２cDNA断片２６１の群に対して、第２制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する第２アダプタ配列１４５のライゲーションを行い、一端に第１アダプタ配列１４３を有し他端に第２アダプタ配列１４５を有するアダプタ付きcDNA断片２７１の群を作成する（アダプタ付きcDNA断片群作成工程）。
本実施例では、第２アダプタ配列１４５は、上記実施例１と同様に、図４（ｂ）に示す配列からなる第２アダプタ配列１４５（Sau3AIアダプタ）である。そして、0.4μlのSau3AIアダプタ溶液（5pmol/μl）を溶出液に加え、それに ligation kit ver.2（タカラバイオ）のＩ液を10μl添加し、穏やかに混合した。その後、16℃で30分間反応させた。
その後、MinElute Reaction kit を使用して、サンプルを精製濃縮した。このとき、溶出操作は３回とした（最終溶出量は27μl）。そして、この溶出液を数倍〜数十倍に希釈した。かくして、一端に第１アダプタ配列１４３を有し他端に第２アダプタ配列１４５を有するアダプタ付きcDNA断片２７１の群を得た。
【００９８】
その後は、上記実施例１と同様にして、このアダプタ付きcDNA断片２７１の群の中から、所望のcDNA断片（遺伝子断片）１６４を取得する（図５〜図７参照）。
本実施例においても、アクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、図７のレーン４に示すように、117bpの位置にシグナルが現れた。
なお、図７のレーン３は、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）を培養する際にイノシトールを添加しなかった場合のものである。それ以外は、本実施例と同様に試験を行った。実施例１の場合と同様に、イノシトールを添加しない場合には、イノシトール分解遺伝子が発現しないため、イノシトール分解遺伝子由来のcDNA断片は検出されない。
【００９９】
また、実施例１と同様に、形質転換した大腸菌をプレート培養したところ、818個のコロニーが得られた。いくつかのコロニーからプラスミドDNAを抽出し、cDNA断片１６４の塩基配列を調べたところ、確かに、本実施例の標的遺伝子である、iolJ の一部であった。一方、第２PCR工程で得られたcDNA断片１６４を制限酵素SpeIのみで処理し、プラスミドベクター１６５に連結した場合には、65個のコロニーが得られた。これは、上記実施例１と同様に、cDNA断片の両端に同一アダプタが連結されたものであると考えられる。従って、本実施例によれば、同一アダプタが両端に結合したcDNA断片の存在割合は約７％しかなく、一端に第１アダプタ配列１４３、他端に第２アダプタ配列１４５が結合したcDNA断片２７１の割合は約９３％もある。
一方、前述したように、図９を用いて説明した旧法を利用した場合、同一アダプタが両端に結合したcDNA断片の存在割合は約３９％もあり、一端に第１アダプタ配列、他端に第２アダプタ配列が結合したcDNAの割合は約６１％しかない。
このことから、本発明を適用することにより、一端に第１アダプタ配列１４３、他端に第２アダプタ配列１４５が結合したアダプタ付きcDNA２７１の群を高純度に作成でき、効率よく所望の遺伝子断片を取得できることが判る。
【０１００】
以上で説明したように、本実施例では、まず、上記実施例１と同様に、タグなし第２cDNA断片）の群を回収するところまで行う。次に、回収したcDNA断片１３１の群に対して、第２タグ物質１４４を有する第１アダプタ配列１４３のライゲーションを行い、第１アダプタ配列が結合したcDNA断片（第１アダプタ付き第２cDNA断片）２４１の群を作成する。その後、第２高親和性物質１５３を用いると共に、第２制限酵素によりこのcDNA断片２４１を切断して、自身の内部に第２制限酵素切断部位を有しないcDNA断片（第１アダプタ付き第２cDNA断片）２５３の群を回収する。その後、このcDNA断片２５３から第２タグ物質１５３を除去し、第２タグ物質１５３を有しないcDNA断片（タグなし第１アダプタ付き第２cDNA断片）２６１の群を回収する。その後、回収したcDNA断片２６１の群に対して、第２制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する第２アダプタ配列１４５のライゲーションを行い、一端に第１アダプタ配列１４３を有し他端に第２アダプタ配列１４５を有するアダプタ付きcDNA断片２７１の群を作成する。
【０１０１】
このような方法でアダプタ付きcDNA断片２７１の群を作成しても、理論的には、両端に第１アダプタ配列１４３が結合したcDNA断片や、両端に第２アダプタ配列１４５が結合したcDNA断片は含まれなくなり、一端に第１アダプタ配列１４３を有し他端に第２アダプタ配列１４５を有するアダプタ付きcDNA断片２７１のみからなるアダプタ付きcDNA断片群を作成できる。
【０１０２】
その後は、上記実施形態１と同様にして、遺伝子断片を取得する。本実施例でも、PCR工程で効率よくcDNA断片１６２を増幅できるので、所望のcDNA断片（遺伝子断片）１６４を効率よく取得できる。
その他、上記実施例１と同様な部分は、上記実施例１と同様な効果を奏する。
【０１０３】
以上において、本発明を実施形態を実施例に即して説明したが、本発明は上述の実施例に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で、適宜変更して適用できることは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】実施例１に関し、両端に既知のアダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片の群を作成する方法のうち、第２切断・タグなし第２cDNA断片群回収工程までを示す説明図である。
【図２】実施例１に関し、両端に既知のアダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片の群を作成する方法のうち、第２切断・タグなし第２cDNA断片群回収工程後の工程を示す説明図である。
【図３】実施例１に関し、原核生物から抽出した全RNAからmRNAを濃縮するために、rRNAを除去する方法を示す説明図である。
【図４】実施例１に関し、（ａ）は第１アダプタ配列を示す説明図であり、（ｂ）は第２アダプタ配列を示す説明図である。
【図５】実施例１に関し、アダプタ付きcDNA断片の群の中から、所望のcDNA断片（遺伝子断片）を取得する方法を示す説明図である。
【図６】実施例１に関し、バチルス・サブティリスのイノシトール分解遺伝子の塩基配列と、その中に存在するHhaI切断部位及びSau3AI切断部位を示す説明図である。
【図７】実施例１に関し、取得したcDNA断片について電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。
【図８】実施例２に関し、両端に既知のアダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片の群を作成する方法のうち、第２切断・タグなし第２cDNA断片群回収工程後の工程を示す説明図である。
【図９】両端に既知のアダプタ配列を有するアダプタ付きcDNA断片の群を作成する方法を示す説明図である。
【図１】
2005253394.tif 000012
【図２】
2005253394.tif 000013
【図３】
2005253394.tif 000014
【図４】
2005253394.tif 000015
【図５】
2005253394.tif 000016
【図６】
2005253394.tif 000017
【図８】
2005253394.tif 000018
【図９】
2005253394.tif 000019
【図７】
2005253394.tif 000020
【配列表】
2005253394000001.app