(57)【要約】【目的】  ヘアピン型のプローブを利用し、核酸検出能を向上させることができる核酸検出方法、及び、核酸単離効率を向上させることができる核酸単離方法を提供すること。【構成】  核酸検出方法は、標的核酸、標識されてなるヘアピン型のプローブ、RecA様タンパク質、並びに、一本鎖分解ヌクレアーゼを反応させて、核酸−タンパク質複合体を形成する工程と、この核酸−タンパク質複合体とライゲースを反応させて、標的核酸のうち一方の端部領域の末端と、プローブの第１ヌクレオチド部の末端とを結合させる工程と、反応液中のタンパク質を失活させ、プローブと標的核酸とからなる核酸結合体を得る工程と、プローブの標識を検出することで、核酸結合体を検出する検出工程とを備える。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
直鎖状の二本鎖をなす標的核酸、
自己相補的なステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部、及び、この第１ヌクレオチド部の一端から延出し、前記標的核酸の一方の端部領域に対して相補的な一本鎖の第２ヌクレオチド部を有し、標識されてなるヘアピン型のプローブ、
RecA様タンパク質、並びに、
一本鎖構造をなす核酸を分解可能な一本鎖分解ヌクレアーゼ、
を反応させて、前記標的核酸の前記一方の端部領域に、前記プローブの前記第２ヌクレオチド部が、前記RecA様タンパク質が関与した状態で結合し、この標的核酸のうち、このプローブの第２ヌクレオチド部が結合することで解離状態となった一本鎖領域の少なくとも一部が分解されてなる核酸−タンパク質複合体を形成する核酸−タンパク質複合体形成工程と、
前記核酸−タンパク質複合体とライゲースを反応させて、前記標的核酸のうち前記一方の端部領域の末端と、前記プローブの前記第１ヌクレオチド部の末端とを結合させるライゲーション工程と、
前記ライゲーション工程後、反応液中のタンパク質を失活させ、前記プローブと前記標的核酸とからなる核酸結合体を得るタンパク質失活工程と、
前記プローブの標識を検出することで、前記核酸結合体を検出する検出工程と、
を備える核酸検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸検出方法であって、
前記タンパク質失活工程後、前記検出工程前に、前記プローブのうち、前記標的核酸に結合していない未反応プローブを除去する未反応プローブ除去工程
を備える核酸検出方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の核酸検出方法であって、
前記一本鎖分解ヌクレアーゼは、一本鎖構造をなす核酸を分解可能な一本鎖分解エキソヌクレアーゼである
核酸検出方法。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の核酸検出方法であって、
前記RecA様タンパク質は、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質、及び、このRecAタンパク質を改変したタンパク質であってRecAタンパク質と類似する機能を有するRecA改変タンパク質、の少なくともいずれかである
核酸検出方法。
【請求項５】
直鎖状の二本鎖をなす標的核酸、
自己相補的なステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部、及び、この第１ヌクレオチド部の一端から延出し、前記標的核酸の一方の端部領域に対して相補的な一本鎖の第２ヌクレオチド部を有し、タグ物質が付加されてなるヘアピン型のプローブ、
RecA様タンパク質、並びに、
一本鎖構造をなす核酸を分解可能な一本鎖分解ヌクレアーゼ、
を反応させて、前記標的核酸の前記一方の端部領域に、前記プローブの前記第２ヌクレオチド部が、前記RecA様タンパク質が関与した状態で結合し、この標的核酸のうち、このプローブの第２ヌクレオチド部が結合することで解離状態となった一本鎖領域の少なくとも一部が分解されてなる核酸−タンパク質複合体を形成する核酸−タンパク質複合体形成工程と、
前記核酸−タンパク質複合体とライゲースを反応させて、前記標的核酸のうち前記一方の端部領域の末端と、前記プローブの前記第１ヌクレオチド部の末端とを結合させるライゲーション工程と、
前記ライゲーション工程後、反応液中のタンパク質を失活させ、前記プローブと前記標的核酸とからなる核酸結合体を得るタンパク質失活工程と、
前記タグ物質に高親和性を有する高親和性物質を用いて、前記核酸結合体を回収する核酸結合体回収工程と、
を備える核酸単離方法。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸単離方法であって、
前記タンパク質失活工程後、核酸結合体回収工程前に、前記核酸結合体とポリメラーゼを反応させて、前記核酸結合体に存在するステム・ループ構造部分をフィルインするフィルイン工程
を備える核酸単離方法。
【請求項７】
請求項５または請求項６に記載の核酸単離方法であって、
前記核酸結合体回収工程後、回収した前記核酸結合体の少なくとも一部をベクターに組み込み組換え体を形成する組換え体形成工程と、
前記組換え体を宿主細胞に導入する導入工程と、
を備える核酸単離方法。
【請求項８】
請求項５〜請求項７のいずれか一項に記載の核酸単離方法であって、
前記一本鎖分解ヌクレアーゼは、一本鎖構造をなす核酸を分解可能な一本鎖分解エキソヌクレアーゼである
核酸単離方法。
【請求項９】
請求項５〜請求項８のいずれか一項に記載の核酸単離方法であって、
前記RecA様タンパク質は、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質、及び、このRecAタンパク質を改変したタンパク質であってRecAタンパク質と類似する機能を有するRecA改変タンパク質、の少なくともいずれかである
核酸単離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸を検出する核酸検出方法、及び、標的核酸を単離する核酸単離方法に関し、特に、標識されたヘアピン型のプローブを利用して標的核酸を検出する核酸検出方法、及び、タグ物質が付加されたヘアピン型プローブを利用して標的核酸を単離する核酸単離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、ヘアピン型のプローブを利用して、標的核酸を検出したり、単離する方法が知られている。例えば、特許文献１には、ヘアピン型プローブを利用して標的核酸を検出する方法が開示されている。また、特許文献２には、ヘアピン型プローブを利用して標的核酸を単離する方法が開示されている。
これらの方法について図１１を参照しつつ説明すると、まず、自己相補的なステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部９０２と、この第１ヌクレオチド部９０２の一端９０２Ｓから延出し一本鎖構造をなす第２ヌクレオチド部９０３とからなるヘアピン型のプローブ９０１を用意する。第２ヌクレオチド部９０３は、標的核酸９２１の一方の端部領域に対して相補的な塩基配列とする。また、このプローブ９０１には、検出可能な標識（標的核酸を検出する場合）、或いは、分離用の標識（標的核酸を単離する場合）を付しておく。
【０００３】
次に、ヘアピン型のプローブ９０１とRecAタンパク質９１１とを反応させて、RecA−プローブ複合体９１３を形成する。
続いて、このRecA−プローブ複合体９１３と標的核酸９２１との間で相同組換え反応を起こさせ、プローブ９０１と標的核酸９２１とRecAタンパク質９１１とからなる核酸−タンパク質複合体９３１を形成する。
次に、リガーゼを作用させて、核酸−タンパク質複合体９３１のうち、標的核酸９２１の端部領域の末端９２１Ｔと、プローブ９０１の第１ヌクレオチド部９０２の末端９０２Ｔとを共有結合（連結）させる。
次に、この核酸−タンパク質複合体９３１からRecAタンパク質９１１を除去し、標的核酸９２１とプローブ９０１とからなる核酸結合体９４１を得る。
【０００４】
その後は、標的核酸９２１を検出する場合、標的核酸９２１に結合しなかった未反応のプローブ９０１を除去する。そして、プローブ９０１の標識を検出することによって、プローブ９０１と結合した標的核酸９２１（核酸結合体９４１）を検出する。かくして、標的核酸９２１が検出できる。
【０００５】
一方、標的核酸９２１を単離する場合、核酸結合体９４１のうち、ステム・ループ構造をなす部分にポリメラーゼを作用させることにより、フィルインを行って、核酸結合体９４１を直鎖状の２本鎖とする。その後、フィルイン生成物に含まれる分離用標識を固相担体に特異的に結合させ、固相担体に結合しなかった核酸は除去することにより、このフィルイン生成物を分離した後、適当な制限酵素で切断して、フィルイン生成物（核酸結合体９４１）を回収する。更に、必要に応じて、回収したフィルイン生成物（核酸結合体９４１）をベクターに組み込み、これを適切な宿主細胞に形質転換する。かくして、標的核酸９２１が単離できる。
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−１４６１９０号公報
【特許文献２】特開平１１−２０６３８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来の方法では、標的核酸９２１の末端９２１Ｔとプローブ９０１の末端９０２Ｔとを共有結合（連結）させる際に、プローブ９０１が標的核酸９２１から解離してしまい、この共有結合（連結）が効率よくできない場合がある。特に、この共有結合（連結）を高温（例えば55℃〜70℃）で行う場合には、熱によりRecAタンパク質９１１の活性が低下して、プローブ９０１が標的核酸９２１から解離しやすくなり、結合効率（連結効率）が低下する。そうすると、核酸結合体９４１の収量が減るので、標的核酸９２１（核酸結合体９４１）を十分に検出できなかったり（核酸検出能が低下したり）、標的核酸９２１（核酸結合体９４１）の単離効率（例えばクローニング効率）が低下するという問題が生じる。
【０００８】
本発明は、かかる現状に鑑みてなされたものであって、ヘアピン型のプローブを利用して標的核酸を検出する方法において、核酸検出能を向上させることができる核酸検出方法、及び、ヘアピン型のプローブを利用して標的核酸を単離する方法において、核酸単離効率を向上させることができる核酸単離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
その解決手段は、直鎖状の二本鎖をなす標的核酸、自己相補的なステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部、及び、この第１ヌクレオチド部の一端から延出し、前記標的核酸の一方の端部領域に対して相補的な一本鎖の第２ヌクレオチド部を有し、標識されてなるヘアピン型のプローブ、RecA様タンパク質、並びに、一本鎖構造をなす核酸を分解可能な一本鎖分解ヌクレアーゼ、を反応させて、前記標的核酸の前記一方の端部領域に、前記プローブの前記第２ヌクレオチド部が、前記RecA様タンパク質が関与した状態で結合し、この標的核酸のうち、このプローブの第２ヌクレオチド部が結合することで解離状態となった一本鎖領域の少なくとも一部が分解されてなる核酸−タンパク質複合体を形成する核酸−タンパク質複合体形成工程と、前記核酸−タンパク質複合体とライゲースを反応させて、前記標的核酸のうち前記一方の端部領域の末端と、前記プローブの前記第１ヌクレオチド部の末端とを結合させるライゲーション工程と、前記ライゲーション工程後、反応液中のタンパク質を失活させ、前記プローブと前記標的核酸とからなる核酸結合体を得るタンパク質失活工程と、前記プローブの標識を検出することで、前記核酸結合体を検出する検出工程と、を備える核酸検出方法である。
【００１０】
本発明の核酸検出方法によれば、まず、直鎖状の二本鎖をなす標的核酸と、標識されてなるヘアピン型のプローブと、RecA様タンパク質と、一本鎖分解ヌクレアーゼとを反応させて、プローブと標的核酸とRecA様タンパク質とからなる核酸−タンパク質複合体を形成する。この核酸−タンパク質複合体は、標的核酸の一方の端部領域に、プローブの第２ヌクレオチド部が、RecA様タンパク質が関与した状態で結合している。また、標的核酸のうち、プローブの第２ヌクレオチド部が結合することで解離状態となった一本鎖領域の少なくとも一部が分解されている。次に、核酸−タンパク質複合体とライゲースを反応させて、標的核酸の一方の端部領域の末端と、プローブの第１ヌクレオチド部の末端とを共有結合（連結）させる。次に、反応液中のタンパク質を失活させ、標的核酸とプローブとからなる核酸結合体を得る。その後は、プローブの標識を検出することで、核酸結合体を検出する。
【００１１】
このような方法では、核酸−タンパク質複合体を形成する際、一本鎖分解ヌクレアーゼの作用により、標的核酸のうち、プローブの第２ヌクレオチド部が結合することで解離状態となった一本鎖領域の少なくとも一部が分解される。このように一本鎖領域が分解されると、プローブが標的核酸から解離して巻き戻し（標的核酸が元の状態に戻ること）が起こりにくくなるため、標的核酸の末端とプローブの末端との結合（連結）が、より確実に行われる。その結果、標的核酸とプローブとが結合した核酸結合体の収量が増えるので、標的核酸（核酸結合体）をより確実に検出できる。即ち、核酸検出能を向上させることができる。
【００１２】
なお、本発明の核酸検出方法には、１セット（２種類）のヘアピン型プローブを同時に使用して、標的核酸を検出する方法も含まれる。即ち、標的核酸の一方の端部領域に対して相補的な第２ヌクレオチド部を有する第１ヘアピン型プローブと、標的核酸のもう一方の端部領域に対して相補的な第２ヌクレオチド部を有する第２ヘアピン型プローブとを同時に使用して、標的核酸を検出する方法である。この場合、核酸−タンパク質複合体は、RecAタンパク質が関与した状態で、標的核酸の一方の端部領域に第１ヘアピン型プローブが結合すると共に、標的核酸のもう一方の端部領域に第２ヘアピン型プローブが結合したものとなる。また、核酸結合体は、標的核酸の一方の端部領域に第１ヘアピン型プローブが結合すると共に、標的核酸のもう一方の端部領域に第２ヘアピン型プローブが結合したものとなる。なお、このような方法では、第１ヘアピン型プローブ及び第２ヘアピン型プローブの何れか一方が標識されていれば足りる。但し、核酸検出能をより向上させるためには、双方のヘアピン型プローブが標識されていることが好ましい。
また、本発明の核酸検出方法には、複数のヘアピン型プローブを使用して、複数の標的核酸を同時に検出する方法も含まれる。標的核酸を含む試料の量に限りがある場合に、特に効果的である。このような場合においても、一の標的核酸に対して、１セット（２種類）のヘアピン型プローブを同時に使用してもよい。
【００１３】
ここで、「標的核酸」は、直鎖状で二本鎖をなすものであれば、如何なるものを用いてもよい。即ち、如何なる塩基配列からなるものであってもよく、また、理論上それらの鎖長に上限は存在しない。従って、例えば、3000Mbpといわれるヒトゲノムの全長を持つような巨大なDNAであっても構わない。勿論、標的核酸の由来も問われない。従って、ウィルスや微生物、動植物のゲノム由来の核酸やそれらを改変した核酸であっても、微生物等のもつプラスミド等やプラスミド等に異種の核酸断片を挿入したキメラ等であっても、或いは、人工的に合成したオリゴヌクレオチドなどであっても構わない。
【００１４】
ヘアピン型の「プローブ」は、自己相補的なステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部と、この第１ヌクレオチド部の一端から延出し、標的核酸の一方の端部領域の塩基配列に対して相補的な一本鎖の第２ヌクレオチド部を有し、標識されてなるものであれば、如何なるものを用いてもよい。即ち、この条件を満たす限り、如何なる塩基配列からなるものであってもよい。
但し、第１ヌクレオチド部は、安定なステム・ループ構造を形成するために、13b以上の長さであることが好ましい。
また、第２ヌクレオチド部は、プローブと標的核酸との結合をより確実なものとするため、15b以上の長さであることが好ましい。また、標的核酸の一方の端部領域の塩基配列に対する、第２ヌクレオチド部の相補的な程度は、核酸−タンパク質複合体を形成できる程度に実質的に相補的であればよい。一般的には、およそ70〜80％以上の相補性を有することが必要とされ、より好ましくは、ほぼ100％の相補性を有することである。相補性が高いほど、より安定な核酸−タンパク質複合体を形成できるからである。但し、必要とされる相補性の程度は、第２ヌクレオチド部の長さによっても若干変動する。また、第２ヌクレオチド部全体の相補性は同じ（例えば70％）であっても、第２ヌクレオチド部全体でほぼ等しい相補性（70％）を有する場合と、第２ヌクレオチド部内に相補性が高い領域（例えば90％）と低い領域（例えば50％）が偏在する場合とによっても、若干変動する。
また、プローブの「標識」は、検出工程で検出可能なものであればよく、放射性元素を用いた標識であっても、蛍光物質等の化学物質を用いた標識であってもよい。放射性元素を用いて標識すれば、核酸検出能をより向上させることができる。一方、化学物質を用いて標識すれば、核酸検出の各工程をより安全に行うことができる。また、ロボット等により各工程を自動化することも可能である。
【００１５】
「RecA様タンパク質」は、それが関与した状態で標的核酸とプローブとが安定な複合体を形成できるものであれば、如何なるものを用いてもよい。具体的には、大腸菌（Escherichia coli）に由来するRecAタンパク質の他、耐熱性細菌（Thermus thermophilus）やその他の腸内細菌においてRecA様遺伝子によりコードされている多機能タンパク質、或いは、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、枯草菌（Bacillus subtilis）、メチロフィルス メチロトローファス（Methylophilus methylotrophus）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ウスティラゴ メイディス（Ustilago maydis）等に由来するRecA様タンパク質などが挙げられる。また、酵母（Saccharomyces cerevisiae）やヒトなど真核生物に由来するRecA様タンパク質もこれに含まれる。
また、これらのタンパク質と類似する機能を有するものであれば、これらのタンパク質を改変した改変タンパク質であってもよい。改変タンパク質としては、例えば、RecA様タンパク質をコードする遺伝子から、部位特異的変異誘発等により作出された遺伝子の産物であって、１または数個のアミノ酸が欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、RecA様タンパク質と類似する機能を有するものが挙げられる。また、RecA様タンパク質をコードする遺伝子を改変した遺伝子の産物であって、RecA様タンパク質と類似する機能を有するタンパク質断片（RecA様フラグメント）であってもよい。
【００１６】
「一本鎖分解ヌクレアーゼ」は、ヌクレアーゼのうち、一本鎖構造をなす核酸を分解可能なものであれば、如何なるものを用いてもよい。一本鎖を端部から分解する一本鎖分解エキソヌクレアーゼを利用しても、一本鎖の鎖内部を分解する一本鎖分解エンドヌクレアーゼを利用してもよい。
【００１７】
「核酸−タンパク質複合体形成工程」は、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体の存在下において、緩衝液中で行うのが好ましい。効率よく、安定な核酸−タンパク質複合体を形成できるからである。
緩衝液は、使用するRecA様タンパク質及び一本鎖分解ヌクレアーゼにより、反応の最適条件を得るため適宜変更することできる。例えば、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）と酢酸や塩酸等の適当な酸とにより、pHを約4.0〜9.0、より好ましくは、約7.0〜8.0に調節したトリス系の緩衝液を使用すればよい。
【００１８】
ヌクレオシド三リン酸またはその類似体としては、例えば、アデノシン5'−三リン酸（ATP）、グアノシン5'−三リン酸（GTP）、UTP、CTPや、アデノシン（γ−チオ）−三リン酸（ATP-γS）、グアノシン（γ−チオ）−三リン酸（GTP-γS）、dATP、dUTP、dCTPなどを挙げることができる。これらは、更にヌクレオシド二リン酸（例えば、ADP）と組み合わせて使用することもできる。なお、特に核酸−タンパク質複合体を形成する系において、ATP等ヌクレオシド三リン酸が生化学的な分解を伴う場合には、ヌクレオシド三リン酸の類似体（例えば、ATP-γS）を使用するのが好ましい。
また、クレアチンリン酸とクレアチンリン酸キナーゼを反応液に加えるのが望ましい。
【００１９】
反応液中の核酸（標的核酸を含む試料及びプローブ）の濃度は、核酸が十分に溶解できる濃度であればよく、適宜変更できる。標的核酸を含む試料に対するプローブの割合は、モル比で約1〜100倍とするのが好ましい。また、RecA様タンパク質は、プローブの第２ヌクレオチド部の3塩基当たり1分子に相当するように加えるのが好ましい。但し、使用するRecA様タンパク質によってその最適量は若干変動する。このように調製した反応液は、4〜60℃、好ましくは約37℃において、5分間以上保温することにより、核酸−タンパク質複合体を形成できる。
【００２０】
なお、この核酸−タンパク質複合体形成工程では、上記のように反応液中に全てのもの加えて一定時間保温する方法の他、次のような方法を採ることもできる。即ち、まず、反応液中に標的核酸とプローブとRecA様タンパク質とを加えて一定時間保温し、その後、一本鎖分解ヌクレアーゼを加えて、更に一定時間保温する方法である。或いは、まず、反応液中にプローブとRecA様タンパク質とを加えて一定時間保温し、その後、標的核酸と一本鎖分解ヌクレアーゼを加えて、更に一定時間保温する方法である。
このような方法で反応させると、特に安定なDNA−タンパク質複合体を形成できる。その理由としては、一本鎖分解ヌクレアーゼは、一本鎖構造をなす核酸を分解するものであるから、最初から反応液に加えると、プローブの一本鎖部分が分解されてしまうことがある。しかし、一本鎖分解分解ヌクレアーゼを後から加えると、プローブにはRecA様タンパク質が結合して、一本鎖分解ヌクレアーゼから保護されるため、プローブが分解されにくくなり、安定な核酸−タンパク質複合体を形成できると考えられるからである。
【００２１】
「ライゲース」（リガーゼ）は、標的核酸のうち一方の端部領域の末端と、プローブの第１ヌクレオチド部の末端とを共有結合させるものであれば、如何なるものを用いてもよい。但し、標的核酸の末端とプローブの末端との連結させるだけでなく、試料中の核酸同士を高頻度で連結させるものは、結果的に核酸検出能が劣ることにもなりかねないため、標的核酸の末端とプローブの末端との連結だけを効率よく行えるライゲースを適宜選択することが好ましい。このようなライゲースとして、例えば、Ampligase DNA ligase（ エピセンターテクノロジー社）が挙げられる。
【００２２】
「ライゲーション工程」は、ライゲースの作用により、標的核酸のうち一方の端部領域の末端と、プローブの第１ヌクレオチド部の末端とを結合させればよい。但し、試料中の核酸同士が連結することを抑制するため、上記のようにライゲースを適宜選択したり、その反応条件を適宜選択することが好ましい。
【００２３】
「タンパク質失活工程」でタンパク質を失活させるには、反応液にキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）を加えるか、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を加えるか、タンパク質分解酵素（例えば、プロティナーゼK）を加えるか、または、タンパク質変性液（例えば、PB Buffer（キアゲン社））などを加え、或いは、これらの処理を組み合わせて行った後、例えば、約37℃で10分間以上保温すればよい。
こうして得られた反応液から核酸結合体だけを回収したい場合には、フェノール、クロロホルム等の溶媒抽出により除タンパク質処理を行った後、適当なカラムクロマトグラフィーで回収する方法を利用したり、或いは、エタノール沈殿で一旦DNAを析出させる方法を利用すればよい。
【００２４】
「検出工程」では、プローブの標識を検出することで、核酸結合体（標的核酸）を検出するものであれば、如何なる方法を利用してもよい。例えば、核酸結合体をゲル電気泳動して、ゲル中の標識を検出し、核酸結合体を検出すればよい。
【００２５】
更に、上記の核酸検出方法であって、前記タンパク質失活工程後、前記検出工程前に、前記プローブのうち、前記標的核酸に結合していない未反応プローブを除去する未反応プローブ除去工程を備える核酸検出方法とすると良い。
【００２６】
サンプル中に未反応プローブが多量に存在すると、検出工程において、それがバックグラウンドとなり、標的核酸（核酸結合体）が検出しにくくなる場合がある。これに対し、本発明では、検出工程前に、標的核酸に結合していない未反応プローブを除去するので、検出工程において、より確実に標的核酸（核酸結合体）を検出できる。
【００２７】
更に、上記のいずれかに核酸検出方法であって、前記一本鎖分解ヌクレアーゼは、一本鎖構造をなす核酸を分解可能な一本鎖分解エキソヌクレアーゼである核酸検出方法とすると良い。
【００２８】
一本鎖分解ヌクレアーゼとして、一本鎖構造をなす核酸を分解可能な一本鎖分解エキソヌクレアーゼを利用することにより、プローブが標的核酸に結合することで解離状体となった一本鎖領域をより確実に分解できる。このため、プローブが標的核酸から解離しにくくなる。その結果、標的核酸の末端とプローブの末端との結合（連結）がより確実に行われ、核酸結合体の収量が増えるので、核酸検出能をより向上させることができる。
【００２９】
更に、上記のいずれか一項に記載の核酸検出方法であって、前記RecA様タンパク質は、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質、及び、このRecAタンパク質を改変したタンパク質であってRecAタンパク質と類似する機能を有するRecA改変タンパク質、の少なくともいずれかである核酸検出方法とすると良い。
【００３０】
前述したように、RecA様タンパク質には、様々なものを適宜選択できる。これらのうち、入手容易性、安全性、機能性を考えると、大腸菌に由来するRecAタンパク質を用いるのが好ましい。また、このRecAタンパク質を改変したタンパク質であり、且つ、RecAタンパク質と類似する機能を有する改変タンパク質でもよい。このような改変タンパク質としては、例えば、RecA遺伝子から部位特異的変異誘発等により作出されたRecA遺伝子の産物であって、１または数個のアミノ酸が欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、RecAタンパク質と類似する機能を有するものが挙げられる。また、RecA遺伝子を改変した遺伝子の産物であって、RecAタンパク質と類似する機能を有するタンパク質断片（RecAフラグメント）であってもよい。
【００３１】
また、他の解決手段は、直鎖状の二本鎖をなす標的核酸、自己相補的なステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部、及び、この第１ヌクレオチド部の一端から延出し、前記標的核酸の一方の端部領域に対して相補的な一本鎖の第２ヌクレオチド部を有し、タグ物質が付加されてなるヘアピン型のプローブ、RecA様タンパク質、並びに、一本鎖構造をなす核酸を分解可能な一本鎖分解ヌクレアーゼ、を反応させて、前記標的核酸の前記一方の端部領域に、前記プローブの前記第２ヌクレオチド部が、前記RecA様タンパク質が関与した状態で結合し、この標的核酸のうち、このプローブの第２ヌクレオチド部が結合することで解離状態となった一本鎖領域の少なくとも一部が分解されてなる核酸−タンパク質複合体を形成する核酸−タンパク質複合体形成工程と、前記核酸−タンパク質複合体とライゲースを反応させて、前記標的核酸のうち前記一方の端部領域の末端と、前記プローブの前記第１ヌクレオチド部の末端とを結合させるライゲーション工程と、前記ライゲーション工程後、反応液中のタンパク質を失活させ、前記プローブと前記標的核酸とからなる核酸結合体を得るタンパク質失活工程と、前記タグ物質に高親和性を有する高親和性物質を用いて、前記核酸結合体を回収する核酸結合体回収工程と、を備える核酸単離方法である。
【００３２】
本発明の核酸単離方法によれば、直鎖状の二本鎖をなす標的核酸と、タグ物質が付加されてなるヘアピン型のプローブと、RecA様タンパク質と、一本鎖分解ヌクレアーゼとを反応させて、プローブと標的核酸とRecA様タンパク質とからなる核酸−タンパク質複合体を形成する。この核酸−タンパク質複合体は、標的核酸の一方の端部領域に、プローブの第２ヌクレオチド部が、RecA様タンパク質が関与した状態で結合している。また、標的核酸のうち、プローブの第２ヌクレオチド部が結合することで解離状態となった一本鎖領域の少なくとも一部が分解されている。次に、核酸−タンパク質複合体とライゲースを反応させて、標的核酸の一方の端部領域の末端と、プローブの第１ヌクレオチド部の末端とを共有結合（連結）させる。次に、反応液中のタンパク質を失活させ、標的核酸とプローブとからなる核酸結合体を得る。その後は、高親和性物質を利用して、核酸結合体（標的核酸）を回収する。
【００３３】
このような方法では、核酸−タンパク質複合体を形成する際、一本鎖分解ヌクレアーゼの作用により、標的核酸のうち、プローブの第２ヌクレオチド部が結合することで解離状態となった一本鎖領域の少なくとも一部が分解される。このように一本鎖領域が分解されると、プローブが標的核酸から解離して巻き戻し（標的核酸が元の状態に戻ること）が起こりにくくなるため、標的核酸の末端とプローブの末端との結合（連結）が、より確実に行われる。その結果、標的核酸とプローブとが結合した核酸結合体の収量が増えるので、標的核酸（核酸結合体）の単離効率を向上させることができる。
【００３４】
なお、本発明の核酸単離方法には、１セット（２種類）のヘアピン型プローブを同時に使用して、標的核酸を単離する方法も含まれる。即ち、標的核酸の一方の端部領域に対して相補的な第２ヌクレオチド部を有する第１ヘアピン型プローブと、標的核酸のもう一方の端部領域に対して相補的な第２ヌクレオチド部を有する第２ヘアピン型プローブとを同時に使用して、標的核酸を単離する方法である。この場合、核酸−タンパク質複合体は、RecAタンパク質が関与した状態で、標的核酸の一方の端部領域に第１ヘアピン型プローブが結合すると共に、標的核酸のもう一方の端部領域に第２ヘアピン型プローブが結合したものとなる。また、核酸結合体は、標的核酸の一方の端部領域に第１ヘアピン型プローブが結合すると共に、標的核酸のもう一方の端部領域に第２ヘアピン型プローブが結合したものとなる。このように両端にプローブが結合された核酸結合体は、クローニングの際、ベクターへの組み込みが容易である。また、ベクターの調製を簡素化できる利点もある。
また、本発明の核酸単離方法には、複数のヘアピン型プローブを使用して、複数の標的核酸を同時に単離する方法も含まれる。標的核酸を含む試料の量に限りがある場合に、特に効果的である。このような場合においても、一の標的核酸に対して、１セット（２種類）のヘアピン型プローブを同時に使用してもよい。
【００３５】
ここで、「タグ物質」と「高親和性物質」とは、互いに高親和性をもって特異的に結合する結合対を構成する物質であれば、いずれを利用することもできる。中でも、取り扱いの容易性や入手容易性などの理由から、タグ物質と高親和性物質の組合せとして、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、FIGTとFITC抗体、DIGとDIG抗体、プロテインAとマウスIgG、ラテックス粒子等を利用するのが好ましい。なお、各組合せにおいて、可能であれば、いずれをタグ物質として使用しても、いずれを高親和性物質として使用してもよい。
なお、「標的核酸」、「プローブ」、「RecA様タンパク質」、「一本鎖分解ヌクレアーゼ」、「核酸−タンパク質複合体形成工程」、「ライゲース」、「ライゲーション工程」、「タンパク質失活工程」等については、前述の発明で説明した通りである。
【００３６】
更に、上記の核酸単離方法であって、前記タンパク質失活工程後、核酸結合体回収工程前に、前記核酸結合体とポリメラーゼを反応させて、前記核酸結合体に存在するステム・ループ構造部分をフィルインするフィルイン工程を備える核酸単離方法とすると良い。
【００３７】
本発明によれば、タンパク質失活工程後、核酸結合体回収工程前に、核酸結合体とポリメラーゼを反応させて、核酸結合体に存在するステム・ループ構造部分をフィルインする。フィルインとは、標的核酸に結合したヘアピン型プローブのステム・ループ部分を、ポリメラーゼにより伸張し、ステム・ループを持たない直鎖状の二本鎖にすることである。
このような工程を行うことにより、核酸結合体の全長が長くなるので、例えば、標的核酸をクローニングする際に、標的核酸を長い状態でベクターに組み込むことができる。特に、プローブ内に適当な制限酵素の認識配列を設けておけば、フィルイン生成物には、その制限酵素の切断部位が形成されるので、標的核酸を長い状態でクローニングすることが容易となる。
【００３８】
更に、上記のいずれかに記載の核酸単離方法であって、前記核酸結合体回収工程後、回収した前記核酸結合体の少なくとも一部をベクターに組み込み組換え体を形成する組換え体形成工程と、前記組換え体を宿主細胞に導入する導入工程と、を備える核酸単離方法とすると良い。
【００３９】
本発明によれば、核酸結合体回収工程後、回収した核酸結合体の少なくとも一部をベクターに組み込み組換え体を形成する。そして、この組換え体を宿主細胞に導入する。このようにすることで、単離した標的核酸の塩基配列を決定するなど、標的核酸についての解析が容易となる。
【００４０】
上記のいずれかに記載の核酸単離方法であって、前記一本鎖分解ヌクレアーゼは、一本鎖構造をなす核酸を分解可能な一本鎖分解エキソヌクレアーゼである核酸単離方法とすると良い。
【００４１】
一本鎖分解ヌクレアーゼとして、一本鎖構造をなす核酸を分解可能な一本鎖分解エキソヌクレアーゼを利用することにより、プローブが標的核酸に結合することで解離状体となった一本鎖領域をより確実に分解できる。このため、プローブが標的核酸から解離しにくくなる。その結果、標的核酸の末端とプローブの末端との結合（連結）がより確実に行われ、核酸結合体の収量が増えるので、核酸単離効率をより向上させることができる。
【００４２】
更に、上記のいずれかに記載の核酸単離方法であって、前記RecA様タンパク質は、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質、及び、このRecAタンパク質を改変したタンパク質であってRecAタンパク質と類似する機能を有するRecA改変タンパク質、の少なくともいずれかである核酸単離方法とすると良い。
【００４３】
前述したように、RecA様タンパク質には、様々なものを適宜選択できる。これらのうち、入手容易性、安全性、機能性を考えると、大腸菌に由来するRecAタンパク質を用いるのが好ましい。また、このRecAタンパク質を改変したタンパク質であり、且つ、RecAタンパク質と類似する機能を有する改変タンパク質でもよい。このような改変タンパク質としては、例えば、RecA遺伝子から部位特異的変異誘発等により作出されたRecA遺伝子の産物であって、１または数個のアミノ酸が欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、RecAタンパク質と類似する機能を有するものが挙げられる。また、RecA遺伝子を改変した遺伝子の産物であって、RecAタンパク質と類似する機能を有するタンパク質断片（RecAフラグメント）であってもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下、本発明の実施例を、図面を参照しつつ説明する。
（実施例１）
本実施例は、本発明に係る核酸検出方法を適用したものである。図１に、ヘアピン型のプローブ１０１と標的核酸１２１から、これらが結合（連結）してなる核酸結合体１６１を得るまでの過程を模式的に示す。
【００４５】
図１に示すように、まず、ヘアピン型のプローブ１０１を用意する。このプローブ１０１は、自己相補的なステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部１０２と、この第１ヌクレオチド部１０２の一端１０２Ｓから延出し、後述する標的核酸１２１の一方の端部領域１２３に対して相補的な一本鎖の第２ヌクレオチド部１０３を有し、標識されている。
【００４６】
本実施例では、下記に示す塩基配列を有する第１オリゴヌクレオチドからなり、その5'末端を32Ｐで標識したヘアピン型プローブを用意した。このヘアピン型プローブは、一本鎖をなす第２ヌクレオチド部が、ステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部の5'末端から延出している（図２参照）。従って、このヘアピン型プローブは、図２に示すように、第１ヌクレオチド部の3'末端が、標的核酸の一方の端部領域の5'末端に結合（連結）するものである（以下、このようなタイプのヘアピン型プローブを5'末端型プローブとも言う）。なお、この第１オリゴヌクレオチドのうち、5'-gcggccgcggtttccgcggccgc-3'の部分がステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部であり、5'-gtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagt-3'の部分が後述する標的核酸に相補的な第２ヌクレオチド部である。標的核酸に対する第２ヌクレオチド部の相補性は100％である。
【００４７】
第１オリゴヌクレオチド：
5'-gtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagt gcggccgcggtttccgcggccgc-3'
【００４８】
次に、図１に示すように、ヘアピン型のプローブ１０１とRecA様タンパク質１１１を反応させて、RecA−プローブ複合体１１３を形成する。
本実施例では、RecA様タンパク質として、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質（New England Biolabs社）を用意した。そして、下記の反応液Ａを37℃で15分間反応させて、RecA−プローブ複合体を形成した。なお、10×緩衝液Ａは、300mM トリス・酢酸（pＨ7.2）と 25mM 酢酸マグネシウムからなる。
【００４９】
【表１】
2005253427.tif 000003
【００５０】
次に、図１に示すように、直鎖状の二本鎖をなす標的核酸１２１を含む試料を用意する。また、一本鎖構造をなす核酸を分解可能な一本鎖分解ヌクレアーゼを用意する。そして、標的核酸１２１の一方の端部領域１２３に、プローブ１０１の第２ヌクレオチド部１０３が、RecA様タンパク質１１１が関与した状態で結合した核酸−タンパク質複合体１３１を形成する。更に、この核酸−タンパク質複合体１３１から、標的核酸１２１のうち、プローブ１０１の第２ヌクレオチド部１０３が結合することで解離状態となった一本鎖領域の少なくとも一部が分解された核酸−タンパク質複合体１４１を形成する（核酸−タンパク質複合体形成工程）。
【００５１】
本実施例では、標的核酸として、制限酵素ScaＩによる切断で直鎖状にされた pBluescript SK(-)（長さ2958bp）を用意した。また、一本鎖分解ヌクレアーゼとして、一本鎖分解エキソヌクレアーゼの１つである、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ（エピセンターテクノロジー社）を用意した。そして、下記の反応液Ｂを作成し、37℃で数分間加温した。その後、この反応液Ｂに上記反応液Ａを10μl加え、ピペッティングにより混ぜ、37℃で30分間反応させた。かくして、核酸−タンパク質複合体を得た。なお、10×緩衝液Ｂは、300mM トリス・酢酸（pＨ7.2）と 225mM 酢酸マグネシウムからなる。
【００５２】
【表２】
2005253427.tif 000004
【００５３】
次に、図１に示すように、核酸−タンパク質複合体１４１とライゲース（リガーゼ）を反応させて、標的核酸１２１のうち一方の端部領域１２３の末端１２１Ｔと、プローブ１０１の第１ヌクレオチド部１０２の末端１０２Ｔとを共有結合（連結）させる（ライゲーション工程）。
本実施例では、下記の連結反応液を作成し、37℃で数分間加温した。その後、この連結反応液 20μlを、核酸−タンパク質複合体の形成を行った上記反応液に加え、ピペッティングにより混ぜ、65℃で15分間、連結反応を行った。なお、ライゲースとして、エピセンターテクノロジー社の Ampligase DNA ligase を利用し、リアクションバッファーもこれに添付のものを利用した。
【００５４】
【表３】
2005253427.tif 000005
【００５５】
次に、図１及び図２に示すように、反応液中のタンパク質を失活させ、プローブ１０１と標的核酸１２１とからなる核酸結合体１６１を得る（タンパク質失活工程）。
本実施例では、ライゲーションを終えた反応液に、PB Buffer（キアゲン社）を10μl加えて酵素を失活させた。かくして、核酸結合体を得た。
【００５６】
次に、標的核酸１２１に結合していない未反応プローブを除去し（未反応プローブ除去工程）、核酸結合体１６１を精製する。
本実施例では、タンパク質を失活させた上記反応液を、Sephacryl S-400 スピンカラム（アマシャムバイオサイエンス社）に１回かけた。その後、このサンプルについてエタノール沈殿を行い、核酸結合体の乾燥ペレットを TE 緩衝液 20μlに溶かし、更に、BPB色素液4μlを混ぜた。なお、TE 緩衝液は、10mM トリス・塩酸（pＨ8.0）と 1mM EDTA からなる。また、BPB色素液は、0.25％ BPB（ブロモフェノールブルー）と 40％シュークロースからなる。
【００５７】
次に、プローブ１０１の標識を検出することで、核酸結合体１６１を検出する（検出工程）。
本実施例では、まず、上記サンプルについて電気泳動を行った。具体的には、24μlのサンプルのうち12μlを、0.8％アガロースゲルで電気泳動を行った。そして、臭化エチジウムでゲルを染色し、UVを照射して写真に撮った。その結果を図３（ｂ）に示す。
その後、電気泳動したゲルをゲルドライヤーにかけて、濾紙上でゲルを乾燥させた。そして、イメージアナライザー（BAS2000、フジ社）でバンドの定量を行った後、−80℃で2時間オートラジオグラフをとり、Ｘ線フィルムに写真を撮った。その結果を図３（ａ）に示す。
【００５８】
図３（ａ）及び（ｂ）において、レーンＭは、DNAサイズマーカーであり、λDNAを制限酵素HindIIIで切断し、その後、T4 Polynucleotide kinaseと［γ-32P］ATPを用いて、各DNA断片の5'末端を32Ｐでそれぞれ標識したものである。
レーン１は、コントロールであり、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、エキソヌクレアーゼＩを加えなかった結果である。
レーン２は、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、エキソヌクレアーゼＩを 1.25 units 加えた結果である。
レーン３は、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、エキソヌクレアーゼＩを 5 units 加えた結果である。
レーン４は、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、エキソヌクレアーゼＩを 20 units 加えた結果である。
レーン５は、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、エキソヌクレアーゼＩを 80 units加えた結果である。
【００５９】
また、各レーン１〜４について、標的核酸に対するプローブの付加効率、即ち、核酸結合体の形成率をそれぞれ求めた。その結果、図３（ａ）の下方に示すように、レーン１では20.7％、レーン２では36.9％、レーン３では41.9％、レーン４では56.9％、レーン５では31.5％であった。
【００６０】
図３（ａ）の結果から明らかなように、コントロールでは、標的核酸に対するプローブの付加効率（核酸結合体の形成率）が20.7％であったのに対し、本実施例では、36.9％、41.9％、56.9％、或いは、31.5％といずれも高い値を示した。
このことから、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、エキソヌクレアーゼＩを加えることで、核酸検出能が向上することが判る。
なお、エキソヌクレアーゼＩを多量に加えた場合（80 units 添加した場合）に、プローブの付加効率（核酸結合体の形成率）が低下するのは、この酵素液（Ampligase DNA ligase）に含まれるエキソヌクレアーゼＩ以外の微量成分が、プローブの付加効率に悪影響を及ぼすためであると推測される。
【００６１】
以上で説明したように、本実施例の核酸検出方法では、まず、直鎖状の二本鎖をなす標的核酸と、標識されてなるヘアピン型のプローブと、RecA様タンパク質と、一本鎖分解ヌクレアーゼとを反応させて、プローブと標的核酸とRecA様タンパク質とからなる核酸−タンパク質複合体を形成する。この核酸−タンパク質複合体は、標的核酸の一方の端部領域に、プローブの第２ヌクレオチド部が、RecA様タンパク質が関与した状態で結合している。また、標的核酸のうち、プローブの第２ヌクレオチド部が結合することで解離状態となった一本鎖領域の少なくとも一部が分解されている。次に、核酸−タンパク質複合体とライゲースを反応させて、標的核酸の一方の端部領域の末端と、プローブの第１ヌクレオチド部の末端とを共有結合（連結）させる。次に、反応液中のタンパク質を失活させ、標的核酸とプローブとからなる核酸結合体を得る。その後は、プローブの標識を検出することで、核酸結合体を検出する。
【００６２】
このような方法では、核酸−タンパク質複合体を形成する際、一本鎖分解ヌクレアーゼの作用により、標的核酸のうち、プローブの第２ヌクレオチド部が結合することで解離状態となった一本鎖領域の少なくとも一部が分解される。このように一本鎖領域が分解されると、プローブが標的核酸から解離して巻き戻し（標的核酸が元の状態に戻ること）が起こりにくくなるため、標的核酸の末端とプローブの末端との結合（連結）が、より確実に行われる。その結果、標的核酸とプローブとが結合した核酸結合体の収量が増えるので、標的核酸（核酸結合体）をより確実に検出できる。即ち、核酸検出能を向上させることができる。
【００６３】
更に、本実施例では、検出工程前に、標的核酸に結合していない未反応プローブを除去しているので、検出工程において、未反応プローブ由来のバックグラウンドが現れず、より確実に標的核酸（核酸結合体）を検出できる。
また、本実施例では、一本鎖分解ヌクレアーゼとして、一本鎖分解エキソヌクレアーゼを利用しているので、プローブが標的核酸に結合することで解離状体となった一本鎖領域をより確実に分解できる。このため、プローブが標的核酸から解離しにくくなる。その結果、標的核酸の末端とプローブの末端との結合（連結）がより確実に行われ、核酸結合体の収量が増えるので、核酸検出能をより向上させることができる。
また、本実施例では、RecA様タンパク質として、大腸菌のRecAタンパク質を用いているので、入手容易性、安全性、機能性に優れる。
【００６４】
（実施例２）
次いで、第２の実施例について説明する。なお、上記実施例１と同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例も、上記実施例１と同じく、本発明に係る核酸検出方法を適用したものであるが、ヘアピン型プローブが 5'末端型プローブではなく、後述する 3'末端型プローブである点が大きく異なるところである。
【００６５】
図１に示すように、まず、ヘアピン型のプローブ１０１を用意する。
本実施例では、下記に示す塩基配列を有する第２オリゴヌクレオチドからなり、その5'末端を32Ｐで標識したヘアピン型プローブを用意した。このヘアピン型プローブは、一本鎖をなす第２ヌクレオチド部が、ステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部の3'末端から延出している（図４参照）。従って、このヘアピン型プローブは、図４に示すように、第１ヌクレオチド部の5'末端が、標的核酸の一方の端部領域の3'末端に結合（連結）するものである（以下、このようなタイプのヘアピン型プローブを3'末端型プローブとも言う）。なお、この第２オリゴヌクレオチドのうち、5'-gcggccgcggtttccgcggccgc-3'の部分がステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部であり、5'-actcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgac-3'の部分が後述する標的核酸に相補的な第２ヌクレオチド部である。標的核酸に対する第２ヌクレオチド部の相補性は100％である。
【００６６】
第２オリゴヌクレオチド：
5'-gcggccgcggtttccgcggccgc actcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgac-3'
【００６７】
次に、図１に示すように、ヘアピン型のプローブ１０１とRecA様タンパク質１１１を反応させて、RecA−プローブ複合体１１３を形成する。
本実施例では、RecA様タンパク質として、上記実施例１と同様、大腸菌のRecAタンパク質を用意した。そして、下記の反応液Ａを37℃で15分間反応させて、RecA−プローブ複合体を形成した。
【００６８】
【表４】
2005253427.tif 000006
【００６９】
次に、図１に示すように、直鎖状の二本鎖をなす標的核酸１２１を含む試料を用意する。また、一本鎖構造をなす核酸を分解可能な一本鎖分解ヌクレアーゼを用意する。そして、標的核酸１２１の一方の端部領域１２３に、プローブ１０１の第２ヌクレオチド部１０３が、RecA様タンパク質１１１が関与した状態で結合した核酸−タンパク質複合体１３１を形成する。更に、この核酸−タンパク質複合体１３１から、標的核酸１２１のうち、プローブ１０１の第２ヌクレオチド部１０３が結合することで解離状態となった一本鎖領域の少なくとも一部が分解された核酸−タンパク質複合体１４１を形成する（核酸−タンパク質複合体形成工程）。
【００７０】
本実施例では、標的核酸として、上記実施例１と同様、制限酵素ScaＩによる切断で直鎖状にされた pBluescript SK(-)を用意した。一方、一本鎖分解ヌクレアーゼとして、一本鎖分解エキソヌクレアーゼの１つである、大腸菌（Escherichia coli）のrecJタンパク質（New England Biolabs社）を用意した。そして、下記の反応液Ｂを作成し、37℃で数分間加温した。その後、この反応液Ｂに上記反応液Ａを10μl加え、ピペッティングにより混ぜ、37℃で30分間反応させた。かくして、核酸−タンパク質複合体を得た。
【００７１】
【表５】
2005253427.tif 000007
【００７２】
次に、図１に示すように、核酸−タンパク質複合体１４１とライゲース（リガーゼ）を反応させて、標的核酸１２１のうち一方の端部領域１２３の末端１２１Ｔと、プローブ１０１の第１ヌクレオチド部１０２の末端１０２Ｔとを共有結合（連結）させる（ライゲーション工程）。
本実施例では、下記の連結反応液を作成し、37℃で数分間加温した。その後、この連結反応液 20μlを、核酸−タンパク質複合体の形成を行った上記反応液に加え、ピペッティングにより混ぜ、65℃で15分間、連結反応を行った。
【００７３】
【表６】
2005253427.tif 000008
【００７４】
次に、図１及び図４に示すように、反応液中のタンパク質を失活させ、プローブ１０１と標的核酸１２１とからなる核酸結合体１６１を得る（タンパク質失活工程）。
本実施例では、上記実施例１と同様、ライゲーションを終えた反応液に、PB Bufferを10μl加えて酵素を失活させた。かくして、核酸結合体を得た。
【００７５】
次に、標的核酸１２１に結合していない未反応プローブを除去し（未反応プローブ除去工程）、核酸結合体１６１を精製する。
本実施例では、上記実施例１と同様、タンパク質を失活させた上記反応液を、Sephacryl S-400 スピンカラムに１回かけた。その後、このサンプルについてエタノール沈殿を行い、核酸結合体の乾燥ペレットを TE 緩衝液 20μlに溶かし、更に、BPB色素液4μlを混ぜた。
【００７６】
次に、プローブ１０１の標識を検出することで、核酸結合体１６１を検出する（検出工程）。
本実施例では、上記実施例１と同様、まず上記サンプルについて電気泳動を行った。そして、臭化エチジウムでゲルを染色し、UVを照射して写真に撮った。その結果を図５（ｂ）に示す。その後、電気泳動したゲルをゲルドライヤーにかけて、濾紙上でゲルを乾燥させた。そして、イメージアナライザーでバンドの定量を行った後、−80℃で24時間オートラジオグラフをとり、Ｘ線フィルムに写真を撮った。その結果を図５（ａ）に示す。
【００７７】
図５（ａ）及び（ｂ）において、レーンＭは、上記実施例１と同様な、標識したDNAサイズマーカーである。
レーン１は、コントロールであり、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、recJタンパク質を加えなかった結果である。
レーン２は、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、recJタンパク質を 3.75 units 加えた結果である。
また、各レーン１，２について、標的核酸に対するプローブの付加効率、即ち、核酸結合体の形成率をそれぞれ求めた。その結果、図５（ａ）の下方に示すように、レーン１では20.3％、レーン２では24.6％であった。
【００７８】
図５（ａ）の結果から明らかなように、コントロールでは、標的核酸に対するプローブの付加効率（核酸結合体の形成率）が20.3％であったのに対し、本実施例では、24.6％まで向上した。
このことから、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、recJタンパク質を加えることで、核酸検出能が向上することが判る。
なお、上記実施例１に比して、プローブ付加効率（核酸結合体形成率）の向上が少なかったのは、recJタンパク質のヌクレアーゼ活性が、エキソヌクレアーゼＩのヌクレアーゼ活性に比して低いことに起因するものと考えられる。
その他、上記実施例１と同様な部分は、上記実施例１と同様な効果を奏する。
【００７９】
（実施例３）
次いで、第３の実施例について説明する。なお、上記各実施例１，２のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例も、上記各実施例１，２と同じく、本発明に係る核酸検出方法を適用したものであるが、標的核酸が大腸菌のrecG遺伝子断片であり、試料として大腸菌のゲノムDNAを用いる点が大きく異なるところである。
【００８０】
図１に示すように、まず、ヘアピン型のプローブ１０１を用意する。
本実施例では、下記に示す塩基配列を有する第３オリゴヌクレオチドからなり、その5'末端を32Ｐで標識したヘアピン型プローブを用意した。このヘアピン型プローブは、一本鎖をなす第２ヌクレオチド部が、ステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部の5'末端から延出している（図２参照）。従って、このヘアピン型プローブは、図２に示すように、第１ヌクレオチド部の3'末端が、標的核酸の一方の端部領域の5'末端に結合（連結）する 5'末端型プローブである。なお、この第３オリゴヌクレオチドのうち、5'-gcggccgcggtttccgcggccgc-3'の部分がステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部であり、5'-tcgctaagctgtagcgtcggtggcgggcggtgcaaagtgc-3'の部分が後述する標的核酸に相補的な第２ヌクレオチド部である。標的核酸に対する第２ヌクレオチド部の相補性は100％である。
【００８１】
第３オリゴヌクレオチド：
5'-tcgctaagctgtagcgtcggtggcgggcggtgcaaagtgc gcggccgcggtttccgcggccgc-3'
【００８２】
次に、図１に示すように、ヘアピン型のプローブ１０１とRecA様タンパク質１１１を反応させて、RecA−プローブ複合体１１３を形成する。
本実施例では、RecA様タンパク質として、エピセンターテクノロジー社の大腸菌のRecAタンパク質を用意した。そして、下記の反応液Ａを37℃で15分間反応させて、RecA−プローブ複合体を形成した。
【００８３】
【表７】
2005253427.tif 000009
【００８４】
次に、図１に示すように、直鎖状の二本鎖をなす標的核酸１２１を含む試料を用意する。また、一本鎖構造をなす核酸を分解可能な一本鎖分解ヌクレアーゼを用意する。そして、標的核酸１２１の一方の端部領域１２３に、プローブ１０１の第２ヌクレオチド部１０３が、RecA様タンパク質１１１が関与した状態で結合した核酸−タンパク質複合体１３１を形成する。更に、この核酸−タンパク質複合体１３１から、標的核酸１２１のうち、プローブ１０１の第２ヌクレオチド部１０３が結合することで解離状態となった一本鎖領域の少なくとも一部が分解された核酸−タンパク質複合体１４１を形成する（核酸−タンパク質複合体形成工程）。
【００８５】
本実施例では、試料として、制限酵素FspＩ及びEagIで切断した大腸菌のゲノムDNAを用意し、標的核酸をこの中に存在するrecG遺伝子断片とした。なお、recG遺伝子の塩基配列は、E.coli recG DNA.（ACCESSION X59550）を参照されたい。一方、一本鎖分解ヌクレアーゼは、上記実施例１と同様、大腸菌のエキソヌクレアーゼＩを用意した。そして、下記の反応液Ｂを作成し、37℃で数分間加温した。その後、この反応液Ｂに上記反応液Ａを20μl加え、ピペッティングにより混ぜ、37℃で30分間反応させた。かくして、核酸−タンパク質複合体を得た。
【００８６】
【表８】
2005253427.tif 000010
【００８７】
次に、図１に示すように、核酸−タンパク質複合体１４１とライゲース（リガーゼ）を反応させて、標的核酸１２１のうち一方の端部領域１２３の末端１２１Ｔと、プローブ１０１の第１ヌクレオチド部１０２の末端１０２Ｔとを共有結合（連結）させる（ライゲーション工程）。
本実施例では、下記の連結反応液を作成し、37℃で数分間加温した。その後、この連結反応液 40μlを、核酸−タンパク質複合体の形成を行った上記反応液に加え、ピペッティングにより混ぜ、65℃で30分間、連結反応を行った。
【００８８】
【表９】
2005253427.tif 000011
【００８９】
次に、図１及び図２に示すように、反応液中のタンパク質を失活させ、プローブ１０１と標的核酸１２１とからなる核酸結合体１６１を得る（タンパク質失活工程）。
本実施例では、ライゲーションを終えた反応液に、PB Bufferを20μl加えて酵素を失活させた。かくして、核酸結合体を得た。
【００９０】
次に、標的核酸１２１に結合していない未反応プローブを除去し（未反応プローブ除去工程）、核酸結合体１６１を精製する。
本実施例では、タンパク質を失活させた上記反応液を、Sephacryl S-400 スピンカラムに３回かけた。その後、このサンプルについてエタノール沈殿を行い、核酸結合体の乾燥ペレットを TE 緩衝液 12μlに溶かし、更に、BPB色素液3μlを混ぜた。
【００９１】
次に、プローブ１０１の標識を検出することで、核酸結合体１６１を検出する（検出工程）。
本実施例では、上記サンプル全量について電気泳動を行った。そして、臭化エチジウムでゲルを染色し、UVを照射して写真に撮った。その結果を図６（ｂ）に示す。その後、電気泳動したゲルをゲルドライヤーにかけて、濾紙上でゲルを乾燥させた。そして、イメージアナライザーでバンドの定量を行った後、−80℃で19時間オートラジオグラフをとり、Ｘ線フィルムに写真を撮った。その結果を図６（ａ）に示す。
【００９２】
図６（ａ）及び（ｂ）において、レーンＭは、上記実施例１等と同様な、標識したDNAサイズマーカーである。
レーン１は、コントロールであり、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、エキソヌクレアーゼＩを加えなかった結果である。
レーン２は、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、エキソヌクレアーゼＩを 5 units 加えた結果である。
レーン３は、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、エキソヌクレアーゼＩを 10 units 加えた結果である。
レーン４は、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、エキソヌクレアーゼＩを 20 units 加えた結果である。
レーン５は、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、エキソヌクレアーゼＩを 40 units 加えた結果である。
【００９３】
また、各レーン１〜５について、標的核酸に対するプローブの付加効率、即ち、核酸結合体の形成率をそれぞれ求めた。その結果、図６（ａ）の下方に示すように、レーン１では16.6％、レーン２では29.8％、レーン３では41.7％、レーン４では32.6％、レーン５では28.5％であった。
【００９４】
図６（ａ）の結果から明らかなように、コントロールでは、標的核酸に対するプローブの付加効率が16.6％であったのに対し、本実施例では、29.8％、41.7％、32.6％、或いは、28.5％といずれも高い値を示した。
このことから、大腸菌のゲノムDNAを試料として用い、その中に存在する標的核酸を検出する場合においても、核酸−タンパク質複合体を形成する際にエキソヌクレアーゼＩを加えることで、核酸検出能が向上することが判る。
その他、上記実施例１等と同様な部分は、上記実施例１等と同様な効果を奏する。
【００９５】
（実施例４）
次いで、第４の実施例について説明する。なお、上記各実施例１〜３のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例は、本発明に係る核酸単離方法を適用したものである。
図１に示すように、まず、ヘアピン型のプローブ１０１を用意する。
本実施例では、１セット（２種類）のプローブ、即ち、上記実施例３で示した第３オリゴヌクレオチドからなる第１ヘアピン型プローブと、下記に示す塩基配列を有する第４オリゴヌクレオチドからなり、その5'末端にビオチン（タグ物質）が付加された第２ヘアピン型プローブを用意した。これら第１，第２ヘアピン型プローブは、一本鎖をなす第２ヌクレオチド部が、ステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部の5'末端から延出している（図２参照）。第１ヘアピン型プローブは、その第１ヌクレオチド部の3'末端が、標的核酸の一方の端部領域の5'末端に結合（連結）する 5'末端型プローブであり、また、第２ヘアピン型プローブも、その第１ヌクレオチド部の3'末端が、標的核酸のもう一方の端部領域の5'末端に結合（連結）する 5'末端型プローブである。
【００９６】
なお、前述したように、第３オリゴヌクレオチドのうち、5'-gcggccgcggtttccgcggccgc-3'の部分がステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部であり、5'-tcgctaagctgtagcgtcggtggcgggcggtgcaaagtgc-3'の部分が後述する標的核酸の一方の端部に相補的な第２ヌクレオチド部である。標的核酸に対する第２ヌクレオチド部の相補性は100％である。
また、第４オリゴヌクレオチドのうち、5'-gcggccgcggtttccgcggccgc-3'の部分がステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部であり、5'-tgcaagtgctgcgcgacagtaacgacggttttgtgattgc-3'の部分が後述する標的核酸のもう一方の端部に相補的な第２ヌクレオチド部である。標的核酸に対する第２ヌクレオチド部の相補性は100％である。
【００９７】
第４オリゴヌクレオチド：
5'-tgcaagtgctgcgcgacagtaacgacggttttgtgattgc gcggccgcggtttccgcggccgc-3'
【００９８】
次に、２種類のヘアピン型のプローブ１０１とRecA様タンパク質１１１を反応させて、２種類のRecA−プローブ複合体１１３を形成する（図１参照）。
本実施例では、RecA様タンパク質として、大腸菌のRecAタンパク質（エピセンターテクノロジー社）を用意した。そして、下記の反応液Ａを37℃で15分間反応させて、２種類のRecA−プローブ複合体を形成した。
【００９９】
【表１０】
2005253427.tif 000012
【０１００】
次に、図１に示すように、直鎖状の二本鎖をなす標的核酸１２１を含む試料を用意する。また、一本鎖構造をなす核酸を分解可能な一本鎖分解ヌクレアーゼを用意する。そして、標的核酸１２１の一方の端部領域１２３に、プローブ１０１の第２ヌクレオチド部１０３が、RecA様タンパク質１１１が関与した状態で結合した核酸−タンパク質複合体１３１を形成する。更に、この核酸−タンパク質複合体１３１から、標的核酸１２１のうち、プローブ１０１の第２ヌクレオチド部１０３が結合することで解離状態となった一本鎖領域の少なくとも一部が分解された核酸−タンパク質複合体１４１を形成する（核酸−タンパク質複合体形成工程）。
【０１０１】
本実施例では、試料として、上記実施例３と同様、制限酵素FspＩ及びEagIで切断した大腸菌のゲノムDNAを用意し、標的核酸をrecG遺伝子断片とした。一方、一本鎖分解ヌクレアーゼは、上記実施例１等と同様、大腸菌のエキソヌクレアーゼＩを用意した。そして、下記の反応液Ｂを作成し、37℃で数分間加温した。その後、この反応液Ｂ20μlを上記反応液Ａに加え、ピペッティングにより混ぜ、37℃で30分間反応させた。かくして、核酸−タンパク質複合体を得た。この核酸−タンパク質複合体は、RecAタンパク質が関与した状態で、標的核酸の一方の端部に第１ヘアピン型プローブが結合すると共に、標的核酸のもう一方の端部に第２ペアピン型プローブが結合したものである。即ち、この核酸−タンパク質複合体は、標的核酸の両端にそれぞれヘアピン型プローブが結合している。
【０１０２】
【表１１】
2005253427.tif 000013
【０１０３】
次に、図１に示すように、核酸−タンパク質複合体１４１とライゲース（リガーゼ）を反応させて、標的核酸１２１のうち一方の端部領域１２３の末端１２１Ｔと、プローブ１０１の第１ヌクレオチド部１０２の末端１０２Ｔとを共有結合（連結）させる（ライゲーション工程）。
本実施例では、下記の連結反応液を作成し、37℃で数分間加温した。その後、この連結反応液 40μlを、核酸−タンパク質複合体の形成を行った上記反応液に加え、ピペッティングにより混ぜ、65℃で30分間、連結反応を行った。本実施例では、標的核酸の一方の端部に第１ヘアピン型プローブが、もう一方の端部に第２ヘアピン型プローブが結合している。従って、連結反応は、標的核酸と第１ヘアピン型プローブ、及び、標的核酸と第２ヘアピン型プローブでそれぞれ起こる。
【０１０４】
【表１２】
2005253427.tif 000014
【０１０５】
次に、図１及び図２に示すように、反応液中のタンパク質を失活させ、プローブ１０１と標的核酸１２１とからなる核酸結合体１６１を得る（タンパク質失活工程）。
本実施例では、ライゲーションを終えた反応液に、PB Bufferを20μl加えて酵素を失活させた。かくして、核酸結合体を得た。この核酸結合体は、標的核酸の一方の端部に第１ヘアピン型プローブが連結すると共に、標的核酸のもう一方の端部に第２ヘアピン型プローブが連結している。
【０１０６】
次に、標的核酸１２１に結合していない未反応プローブを除去し（未反応プローブ除去工程）、核酸結合体１６１を精製する。
本実施例では、タンパク質を失活させた上記反応液を、Sephacryl S-400 スピンカラムに３回かけた。その後、このサンプルについてエタノール沈殿を行った。
【０１０７】
次に、核酸結合体１６１とポリメラーゼを反応させて、核酸結合体１６１に存在するステム・ループ構造部分をフィルインする（フィルイン工程）。
本実施例では、上記のDNAのペレットを70％エタノールでリンスし乾燥させた後、蒸留水40μl、10×EcoPol Buffer（New England Biolabs社）5μl、dNTPs混合液（各2.5mM、タカラバイオ社）に溶かした。DNAが完全に溶けたら、Klenow（5unit/μl、New England Biolabs社）（ポリメラーゼ）を加えて混ぜ、37℃で30分間反応させて、第１，第２ヘアピン型プローブをそれぞれ直線状に伸ばすと共に、核酸結合体を直鎖状の二本鎖とした。なお、本実施例で利用した第１，第２ヘアピン型のプローブは、それぞれ制限酵素NotＩの認識配列を有するので、フィルイン生成物は、核酸結合体の両端に制限酵素NotＩの認識部位ができたものとなる。
【０１０８】
次に、タグ物質に高親和性を有する高親和性物質を用いて、核酸結合体を回収する（核酸結合体回収工程）。
本実施例では、予め100μlのTE緩衝液で2回洗浄しておいた50μl分のダイナビーズM-280ストレプトアビジン（ダイナル社）（高親和性物質）に、上記のサンプル液を加えて、磁気ビーズを懸濁し室温に40分間静置した。そのまま置いておくとビーズが沈殿するので、10分間毎にマイクロピペットで攪拌してビーズを懸濁し直した。次に、磁気スタンドを用いてビーズをサンプルチューブの1箇所に集め、サンプル液を廃棄した。続いて、100μlのTE 緩衝液で磁気ビーズを5回洗浄し、更に、200μlの TE 緩衝液に懸濁して新しいサンプルチューブに移した。
次に、磁気スタンドを用いてビーズをサンプルチューブの1箇所に集めてTE緩衝液を除き、下記に示す制限酵素NotＩ反応液 20μlに磁気ビーズを懸濁した。その後、37℃で60分間反応させて、核酸結合体をビーズから切り離した。このとき、10分間毎にマイクロピペットで攪拌してビーズを懸濁し直した。反応後、磁気スタンドを用いてビーズをサンプルチューブの1箇所に集め、サンプル液を回収した。
【０１０９】
【表１３】
2005253427.tif 000015
【０１１０】
次に、回収した核酸結合体をベクターに組み込み、組換え体を形成する（組換え体形成工程）。
本実施例では、上記のサンプル液に、ベクターDNAとして、NotIで切断され直鎖状にされた pZErO-1（25ng/μl、インビトロジェン社）を 1μl加えて、一緒にフェノール抽出、エタノール沈殿を行った。その後、DNAのペレットを70％エタノールでリンスした後に乾かし、下記に示す 1×ライゲーションバッファー 4.5μlに溶かした。DNAが溶けた後、T4 DNA ligase（400unit/μl、New England Biolabs社）を0.5μl加えて、16℃で２時間連結反応を行った。
【０１１１】
【表１４】
2005253427.tif 000016
【０１１２】
次に、組換え体を宿主細胞に導入する（導入工程）。
本実施例では、宿主細胞として大腸菌を用いた。そして、上記のサンプル全量について、Epicurian Coli XL-1-Blue Super Competent Cells（ストラタジーン社）100μlを用いて形質転換を行い、SOC培地を900μl加えて、37℃で1時間振盪した。
【０１１３】
その後、1mlの大腸菌液を100μlずつ3枚の減塩LBプレート（50μg/μlのゼオシン、1mMのIPTG入り）に接種し、37℃で一晩培養した。なお、本実施例で用いたベクター（pZErO-1）の薬剤耐性マーカーはゼオシン（zeocin）（gyraseの阻害剤）である。このベクターは、lacZとccdB（大腸菌致死遺伝子）の融合遺伝子の中に外来DNAを組み組むためのマルチクローニングサイドを有する。外来DNAを持たないベクターにより形質転換した大腸菌は、ccdBの作用で致死するのに対し、外来DNAが組み込まれたベクター（組換え体）は、組込みによってccdBが失活するので大腸菌が生育できる。これを利用してスクリーニングを行った。また、このときに、培地中にゼオシンを添加することで、ゼオシン耐性のないものについては生育できない条件とした。
培養後、3枚のプレートで得られたコロニー数から、全体のコロニー数を推定した。その結果を図７に示す。
【０１１４】
次に、プレート上のコロニーを任意に100個採って、それぞれ1mlの減塩LB培地（50μg/μlゼオシン、1mMのIPTG入り）に接種し、37℃で一晩振盪培養した。培養後、プラスミド自動分離装置（PI-100Σ、クラボウ社）を用いてプラスミドを抽出し、電気泳動にかけた。その結果、標的核酸と思われるインサートを含むものについては、組換え体プラスミドをNotIで切断し、更に電気泳動を行って外来DNAの分子量を調べた。その得られた分子量から、標的核酸に類似した分子量の外来DNAを含有する組換え体プラスミドについては、NotI及び適切な制限酵素で切断し、これを電気泳動して、インサートが標的核酸が否かインサートチェックを行った。その結果も図７に示す。
【０１１５】
ここで、比較例として、従来の核酸単離方法を利用した場合について説明する。
この比較例では、本実施例と同様なプローブ（第１ヘアピン型プローブ及び第２ヘアピン型プローブ）を使用した。そして、下記の反応液Ａを37℃で15分間反応させて、RecA−プローブ複合体を形成した。
【０１１６】
【表１５】
2005253427.tif 000017
【０１１７】
次に、本実施例と同様に、標的核酸（recG遺伝子断片）を含む試料（制限酵素FspＩ及びEagIで切断した大腸菌のゲノムDNA）を用意した。そして、下記の反応液Ｂを作成し、37℃で数分間加温した。その後、この反応液Ｂ20μlを上記反応液Ａに加え、ピペッティングにより混ぜ、37℃で2時間反応させた。かくして、核酸−タンパク質複合体を形成した。なお、この反応液Ｂには、本実施例と異なり、エキソヌクレアーゼＩが含まれていない。
【０１１８】
【表１６】
2005253427.tif 000018
【０１１９】
次に、下記の連結反応液を37℃で数分間加温した。その後、連結反応液 40μlを、核酸−タンパク質複合体の形成を行った上記反応液に加え、ピペッティングにより混ぜ、55℃で一晩おいて連結反応を行った。
【０１２０】
【表１７】
2005253427.tif 000019
【０１２１】
次に、ライゲーションを終えた反応液に、PB Bufferを20μl加えて酵素を失活させた。
その後、Sephacryl S-400 スピンカラムに３回かけた。そして、このサンプルについてエタノール沈殿を行った。
その後は、本実施例と同様な操作を行った。即ち、本実施例と同様に、フィルイン工程、核酸結合体回収工程、組換え体形成工程、導入工程、培養、電気泳動、インサートの確認等を行った。その結果を図７に示す。
【０１２２】
図７の結果から明らかなように、本実施例（改良技術）では、使用したサンプルゲノム量（大腸菌ゲノム）が4μgであり、標的核酸をインサートに持つクローンが86個、非標的核酸をインサートに持つクローンが7個、インサートのないものが7個、総コロニー数が約7540個であった。一方、比較例（従来技術）では、使用したサンプルゲノム量（大腸菌ゲノム）が40μgであり、標的核酸をインサートに持つクローンが96個、非標的核酸をインサートに持つクローンが1個、インサートのないものが4個、総コロニー数が約3100個であった。
【０１２３】
このような結果から、本実施例では、比較例に比してサンプルゲノム量が１／１０にも拘わらず、標的核酸をインサートに持つクローンが同程度得られていることが判る。従って、本実施例では、比較例に比して、標的核酸の単離効率（クローニング効率）がおよそ１０倍に向上している。よって、本発明の核酸単離方法を適用することにより、標的核酸の単離効率が著しく向上することが判る。
【０１２４】
以上で説明したように、本実施例の核酸単離方法では、直鎖状の二本鎖をなす標的核酸と、タグ物質が付加されてなるヘアピン型のプローブと、RecA様タンパク質と、一本鎖分解ヌクレアーゼとを反応させて、プローブと標的核酸とRecA様タンパク質とからなる核酸−タンパク質複合体を形成する。この核酸−タンパク質複合体は、標的核酸の一方の端部領域に、プローブの第２ヌクレオチド部が、RecA様タンパク質が関与した状態で結合している。また、標的核酸のうち、プローブの第２ヌクレオチド部が結合することで解離状態となった一本鎖領域の少なくとも一部が分解されている。次に、核酸−タンパク質複合体とライゲースを反応させて、標的核酸の一方の端部領域の末端と、プローブの第１ヌクレオチド部の末端とを共有結合（連結）させる。次に、反応液中のタンパク質を失活させ、標的核酸とプローブとからなる核酸結合体を得る。その後は、高親和性物質を利用して、核酸結合体（標的核酸）を回収する。
【０１２５】
このような方法では、核酸−タンパク質複合体を形成する際、一本鎖分解ヌクレアーゼの作用により、標的核酸のうち、プローブの第２ヌクレオチド部が結合することで解離状態となった一本鎖領域の少なくとも一部が分解される。このように一本鎖領域が分解されると、プローブが標的核酸から解離して巻き戻し（標的核酸が元の状態に戻ること）が起こりにくくなるため、標的核酸の末端とプローブの末端との結合（連結）が、より確実に行われる。その結果、標的核酸とプローブとが結合した核酸結合体の収量が増えるので、標的核酸（核酸結合体）の単離効率を向上させることができる。
【０１２６】
更に、本実施例では、タンパク質失活工程後、核酸結合体回収工程前に、核酸結合体とポリメラーゼを反応させて、核酸結合体に存在するステム・ループ構造部分をフィルインする。このような工程を行うことにより、核酸結合体の全長が長くなるので、標的核酸をクローニングする際に、標的核酸を長い状態でベクターに組み込むことができる。特に、プローブ内に適当な制限酵素の認識配列を設けておくことで、フィルイン生成物には、その制限酵素の切断部位が形成されるので、標的核酸を長い状態でクローニングすることが容易となる。
【０１２７】
また、本実施例では、核酸結合体回収工程後、回収した核酸結合体の少なくとも一部をベクターに組み込み組換え体を形成する。そして、この組換え体を宿主細胞に導入する。このようにすることで、単離した標的核酸の塩基配列を決定するなど、標的核酸についての解析が容易となる。
また、本実施例では、一本鎖分解ヌクレアーゼとして、一本鎖分解エキソヌクレアーゼを利用しているので、プローブが標的核酸に結合することで解離状体となった一本鎖領域をより確実に分解できる。このため、プローブが標的核酸から解離しにくくなる。その結果、標的核酸の末端とプローブの末端との結合（連結）がより確実に行われ、核酸結合体の収量が増えるので、核酸単離効率をより向上させることができる。
また、本実施例では、RecA様タンパク質として、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質を利用しているので、入手容易性、安全性、機能性の点で優れる。
【０１２８】
（実施例５）
次いで、第５の実施例について説明する。なお、上記各実施例１〜４のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例は、上記実施例４と同じく、本発明に係る核酸単離方法を適用したものであるが、試料として、大腸菌ゲノムDNAよりも遙かに大きい（約660倍）、ヒトゲノムDNAを用いている点が大きく異なるところである。
【０１２９】
図１に示すように、まず、ヘアピン型のプローブ１０１を用意する。
本実施例では、１セット（２種類）のプローブ、即ち、下記に示す塩基配列を有する第５オリゴヌクレオチドからなり、その5'末端にビオチン（タグ物質）が付加された第１ヘアピン型プローブと、下記に示す塩基配列を有する第６オリゴヌクレオチドからなる第２ヘアピン型プローブを用意した。これら第１，第２ヘアピン型プローブは、一本鎖をなす第２ヌクレオチド部が、ステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部の5'末端から延出している（図２参照）。第１ヘアピン型プローブは、その第１ヌクレオチド部の3'末端が、標的核酸の一方の端部領域の5'末端に結合（連結）する 5'末端型プローブであり、また、第２ヘアピン型プローブも、その第１ヌクレオチド部の3'末端が、標的核酸のもう一方の端部領域の5'末端に結合（連結）する 5'末端型プローブである。
【０１３０】
なお、第５オリゴヌクレオチドのうち、5'-gcggccgcggtttccgcggccgc-3'の部分がステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部であり、5'-agttggactgggttcggtctgacggcgcccccagtgtgca-3'の部分が後述する標的核酸の一方の端部に相補的な第２ヌクレオチド部である。標的核酸に対する第２ヌクレオチド部の相補性は100％である。
また、第６オリゴヌクレオチドのうち、5'-gcggccgcggtttccgcggccgc-3'の部分がステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部であり、5'-agttggactgggttcggtctgacggcgcccccagtgtgca-3'の部分が後述する標的核酸のもう一方の端部に相補的な第２ヌクレオチド部である。標的核酸に対する第２ヌクレオチド部の相補性は100％である。
【０１３１】
第５オリゴヌクレオチド：
5'-agttggactgggttcggtctgacggcgcccccagtgtgca gcggccgcggtttccgcggccgc-3'
第６オリゴヌクレオチド：
5'-gcgctacccggctttgaaaagtcgcggtcactcactgagc gcggccgcggtttccgcggccgc-3'
【０１３２】
次に、２種類のヘアピン型のプローブ１０１とRecA様タンパク質１１１を反応させて、２種類のRecA−プローブ複合体１１３を形成する（図１参照）。
本実施例では、RecA様タンパク質として、大腸菌のRecAタンパク質（エピセンターテクノロジー社）を用意した。そして、下記の反応液Ａを37℃で15分間反応させて、２種類のRecA−プローブ複合体を形成した。
【０１３３】
【表１８】
2005253427.tif 000020
【０１３４】
次に、図１に示すように、直鎖状の二本鎖をなす標的核酸１２１を含む試料を用意する。また、一本鎖構造をなす核酸を分解可能な一本鎖分解ヌクレアーゼを用意する。そして、標的核酸１２１の一方の端部領域１２３に、プローブ１０１の第２ヌクレオチド部１０３が、RecA様タンパク質１１１が関与した状態で結合した核酸−タンパク質複合体１３１を形成する。更に、この核酸−タンパク質複合体１３１から、標的核酸１２１のうち、プローブ１０１の第２ヌクレオチド部１０３が結合することで解離状態となった一本鎖領域の少なくとも一部が分解された核酸−タンパク質複合体１４１を形成する（核酸−タンパク質複合体形成工程）。
【０１３５】
本実施例では、試料として、制限酵素Eco47III、ApaLI、及びNotIで切断したヒトゲノムDNAを用意し、標的核酸をその中に存在するDNA断片とした。このDNA断片の塩基配列は、Human c-jun proto oncogene（JUN），complete cds，clone hCJ-1.（ACCESSION J04111）を参照されたい。一方、一本鎖分解ヌクレアーゼは、上記実施例１等と同様、大腸菌のエキソヌクレアーゼＩとした。そして、下記の反応液Ｂを作成し、37℃で数分間加温した。その後、この反応液Ｂに上記反応液Ａを100μl加え、ピペッティングにより混ぜ、37℃で30分間反応させた。かくして、核酸−タンパク質複合体を得た。この核酸−タンパク質複合体は、RecAタンパク質が関与した状態で、標的核酸の一方の端部に第１ヘアピン型プローブが結合すると共に、標的核酸のもう一方の端部に第２ペアピン型プローブが結合したものである。即ち、核酸−タンパク質複合体は、標的核酸の両端にそれぞれヘアピン型プローブが結合している。
【０１３６】
【表１９】
2005253427.tif 000021
【０１３７】
次に、図１に示すように、核酸−タンパク質複合体１４１とライゲース（リガーゼ）を反応させて、標的核酸１２１のうち一方の端部領域１２３の末端１２１Ｔと、プローブ１０１の第１ヌクレオチド部１０２の末端１０２Ｔとを共有結合（連結）させる（ライゲーション工程）。
本実施例では、下記の連結反応液を作成し、37℃で数分間加温した。その後、この連結反応液 200μlを、核酸−タンパク質複合体の形成を行った上記反応液に加え、ピペッティングにより混ぜ、65℃で30分間、連結反応を行った。本実施例では、標的核酸の一方の端部に第１ヘアピン型プローブが、もう一方の端部に第２ヘアピン型プローブが結合している。従って、連結反応は、標的核酸と第１ヘアピン型プローブ、及び、標的核酸と第２ヘアピン型プローブでそれぞれ起こる。
【０１３８】
【表２０】
2005253427.tif 000022
【０１３９】
次に、図１及び図２に示すように、反応液中のタンパク質を失活させ、プローブ１０１と標的核酸１２１とからなる核酸結合体１６１を得る（タンパク質失活工程）。
本実施例では、ライゲーションを終えた反応液に、PB Bufferを100μl加えて酵素を失活させた。かくして、核酸結合体を得た。この核酸結合体は、標的核酸の一方の端部に第１ヘアピン型プローブが連結すると共に、標的核酸のもう一方の端部に第２ヘアピン型プローブが連結している。
【０１４０】
次に、標的核酸１２１に結合していない未反応プローブを除去し（未反応プローブ除去工程）、核酸結合体１６１を精製する。
本実施例では、５本のSephacryl S-400 スピンカラムに、上記のサンプルを100μlずつ分注して、余剰のプローブ、塩等を除き、溶出液をロータリーコセントレーターで液量を合計で200μlまで濃縮した。続いて、２本のSephacryl S-400 スピンカラムに100μlずつ分注して、更に余剰のプローブ、塩等を除き、溶出液をロータリーコセントレーターで液量を合計で30μlまで濃縮した。最後に、もう一度全量を１本のSephacryl S-400 スピンカラムに投入して精製し、エタノール沈殿を行った（15000rpm、4℃で10分間遠心）。
【０１４１】
次に、核酸結合体１６１とポリメラーゼを反応させて、核酸結合体１６１に存在するステム・ループ構造部分をフィルインする（フィルイン工程）。
本実施例では、上記のDNAのペレットを70％エタノールでリンスし乾燥させた後、蒸留水40μl、10×EcoPol Buffer 5μl、dDNTPs混合液に溶かした。DNAが完全に溶けたら、Klenow（5unit/μl、New England Biolabs社）（ポリメラーゼ）を加えて混ぜ、37℃で30分間反応させて、第１，第２ヘアピン型プローブをそれぞれ直線状に伸ばすと共に、核酸結合体を直鎖状の二本鎖とした。なお、本実施例で利用した第１，第２ヘアピン型のプローブは、それぞれ制限酵素NotＩの認識配列を有するので、フィルイン生成物は、核酸結合体の両端に制限酵素NotＩの認識部位ができたものとなる。
【０１４２】
次に、タグ物質に高親和性を有する高親和性物質を用いて、核酸結合体を回収する（核酸結合体回収工程）。
本実施例では、予め100μlのTE緩衝液で２回洗浄しておいた50μl分のダイナビーズM-280ストレプトアビジン（高親和性物質）にサンプルを加えて、磁気ビーズを懸濁し室温に40分間静置した。そのまま置いておくとビーズが沈殿するので、10分間毎にマイクロピペットで攪拌してビーズを懸濁し直した。次に、磁気スタンドを用いてビーズをサンプルチューブの１箇所に集め、サンプル液を廃棄した。続いて、100μlのTE緩衝液で磁気ビーズを5回洗浄し、更に、200μlのTE緩衝液に懸濁して新しいサンプルチューブに移した。
次に、磁気スタンドを用いてビーズをサンプルチューブの１箇所に集めてTE緩衝液を除き、下記に示す制限酵素NotＩ反応液 20μlに磁気ビーズを懸濁した。その後、37℃で60分間反応させて、核酸結合体をビーズから切り離した。このとき、10分間毎にマイクロピペットで攪拌してビーズを懸濁し直した。反応後、磁気スタンドを用いてビーズをサンプルチューブの１箇所に集め、サンプル液を回収した。
【０１４３】
【表２１】
2005253427.tif 000023
【０１４４】
次に、回収した核酸結合体をベクターに組み込み組換え体を形成する（組換え体形成工程）。
本実施例では、サンプル液に、ベクターDNAとして、NotIで切断され直鎖状にされた pZErO-1（25ng/μl）を 1μl加えて、一緒にフェノール抽出、エタノール沈殿を行った。その後、DNAのペレットを70％エタノールでリンスした後に乾かし、下記に示す１×ライゲーションバッファー 4.5μlに溶かした。DNAが溶けた後、T4 DNA ligase（400unit/μl）を0.5μl加えて、16℃で2時間連結反応を行った。
【０１４５】
【表２２】
2005253427.tif 000024
【０１４６】
次に、組換え体を宿主細胞に導入する（導入工程）。
本実施例では、宿主細胞として大腸菌を用いた。そして、上記のサンプル全量について、Epicurian Coli XL-1-Blue Super Competent Cells 80μlを用いて形質転換を行い、SOC培地を920μl加えて、37℃で1時間振盪した。
【０１４７】
その後、1mlの大腸菌液を100μlずつ10枚の減塩LBプレート（50μg/μlのゼオシン、1mMのIPTG入り）に接種し、37℃で一晩培養した。培養後、得られたコロニー数をカウントした。その結果を図８に示す。
【０１４８】
次に、プレート上の全てのコロニーを採って、それぞれ1mlの減塩LB培地（50μg/μlのゼオシン、1mMのIPTG入り）に接種し、37℃で一晩振盪培養した。培養後、プラスミド自動分離装置を用いてプラスミドを抽出し、電気泳動にかけた。その結果、標的核酸と思われるインサートを含むものについては、組換え体プラスミドをNotIで切断し、更に電気泳動を行って外来DNAの分子量を調べた。その得られた分子量から、標的核酸に類似した分子量の外来DNAを含有する組換え体プラスミドについては、NotI及び適切な制限酵素で切断し、これを電気泳動して、インサートが標的核酸が否かインサートチェックを行った。その結果も図８に示す。
【０１４９】
本実施例では、使用したサンプルゲノム量（ヒトゲノムDNA）が20μgであり、標的核酸をインサートに持つクローンが8個、非標的核酸をインサートに持つクローンが17個、インサートのないものが243個、総コロニー数が268個であった。つまり、標的核酸をインサートに持つ目的のクローンが8個得られた。これは、従来に比して、標的核酸の単離効率（クローニング効率）が大幅に向上していると言えるものである。よって、本発明の核酸単離方法を適用することにより、巨大なヒトゲノムDNAを試料とし、その中から標的核酸を単離する場合でも、標的核酸の単離効率が著しく向上することが判る。
その他、上記実施例４等と同様な部分は、上記実施例４等と同様な効果を奏する。
【０１５０】
（実施例６）
次いで、第６の実施例について説明する。なお、上記各実施例１〜５のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例は、上記実施例４等と同じく、本発明に係る核酸単離方法を適用したものであるが、試料から複数（２つ）の標的核酸を同時に単離する点が大きく異なるところである。
【０１５１】
図１に示すように、まず、ヘアピン型のプローブ１０１を用意する。
本実施例では、２セット（４種類）のプローブを用意した。即ち、上記実施例３で示した第３オリゴヌクレオチドからなり、ビオチン（タグ物質）が付加された第１ヘアピン型プローブと、上記実施例４で示した第４オリゴヌクレオチドからなり、ビオチン（タグ物質）が付加された第２ヘアピン型プローブのプローブセット、及び、下記に示す塩基配列を有する第７オリゴヌクレオチドからなり、ビオチン（タグ物質）が付加された第３ヘアピン型プローブと、下記に示す塩基配列を有する第８オリゴヌクレオチドからなり、ビオチン（タグ物質）が付加された第４ヘアピン型プローブのプローブセットを用意した。
【０１５２】
これら第１〜第４ヘアピン型プローブは、一本鎖をなす第２ヌクレオチド部が、ステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部の5'末端から延出している（図２参照）。第１ヘアピン型プローブは、その第１ヌクレオチド部の3'末端が、後述する第１標的核酸の一方の端部領域の5'末端に結合（連結）する 5'末端型プローブであり、また、第２ヘアピン型プローブも、その第１ヌクレオチド部の3'末端が、第１標的核酸のもう一方の端部領域の5'末端に結合（連結）する 5'末端型プローブである。また、第３ヘアピン型プローブは、その第１ヌクレオチド部の3'末端が、後述する第２標的核酸の一方の端部領域の5'末端に結合（連結）する 5'末端型プローブであり、また、第４ヘアピン型プローブも、その第１ヌクレオチド部の3'末端が、第２標的核酸のもう一方の端部領域の5'末端に結合（連結）する 5'末端型プローブである。
【０１５３】
なお、前述したように、第３オリゴヌクレオチドのうち、5'-gcggccgcggtttccgcggccgc-3'の部分がステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部であり、5'-tcgctaagctgtagcgtcggtggcgggcggtgcaaagtgc-3'の部分が後述する第１標的核酸の一方の端部に相補的な第２ヌクレオチド部である。第１標的核酸に対する第２ヌクレオチド部の相補性は100％である。
また、前述したように、第４オリゴヌクレオチドのうち、5'-gcggccgcggtttccgcggccgc-3'の部分がステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部であり、5'-tgcaagtgctgcgcgacagtaacgacggttttgtgattgc-3'の部分が後述する第１標的核酸のもう一方の端部に相補的な第２ヌクレオチド部である。第１標的核酸に対する第２ヌクレオチド部の相補性は100％である。
また、第７オリゴヌクレオチドのうち、5'-gcggccgcggtttccgcggccgc-3'の部分がステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部であり、5'-accgccagcgaaatgctcagcgttaacggcgttgggatgc-3'の部分が後述する第２標的核酸の一方の端部に相補的な第２ヌクレオチド部である。第２標的核酸に対する第２ヌクレオチド部の相補性は100％である。
また、第８オリゴヌクレオチドのうち、5'-gcggccgcggtttccgcggccgc-3'の部分がステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部であり、5'-ttccgccaccagtgggcatgacgacgaggcaatcgcgccc-3'の部分が後述する第２標的核酸のもう一方の端部に相補的な第２ヌクレオチド部である。第２標的核酸に対する第２ヌクレオチド部の相補性は100％である。
【０１５４】
第７オリゴヌクレオチド：
5'-accgccagcgaaatgctcagcgttaacggcgttgggatgc gcggccgcggtttccgcggccgc-3'
第８オリゴヌクレオチド：
5'-ttccgccaccagtgggcatgacgacgaggcaatcgcgccc gcggccgcggtttccgcggccgc-3'
【０１５５】
次に、２種類のヘアピン型のプローブ１０１とRecA様タンパク質１１１を反応させて、４種類のRecA−プローブ複合体１１３を形成する（図１参照）。
本実施例では、RecA様タンパク質として、大腸菌のRecAタンパク質（エピセンターテクノロジー社）を用意した。そして、下記の反応液Ａを37℃で15分間反応させて、４種類のRecA−プローブ複合体を形成した。
【０１５６】
【表２３】
2005253427.tif 000025
【０１５７】
次に、図１に示すように、直鎖状の二本鎖をなす標的核酸１２１を含む試料を用意する。また、一本鎖構造をなす核酸を分解可能な一本鎖分解ヌクレアーゼを用意する。そして、標的核酸１２１の一方の端部領域１２３に、プローブ１０１の第２ヌクレオチド部１０３が、RecA様タンパク質１１１が関与した状態で結合した核酸−タンパク質複合体１３１を形成する。更に、この核酸−タンパク質複合体１３１から、標的核酸１２１のうち、プローブ１０１の第２ヌクレオチド部１０３が結合することで解離状態となった一本鎖領域の少なくとも一部が分解された核酸−タンパク質複合体１４１を形成する（核酸−タンパク質複合体形成工程）。
【０１５８】
本実施例では、試料として、制限酵素FspＩ及びEagIで切断した大腸菌のゲノムDNAを用意し、第１標的核酸をその中に存在するrecG遺伝子断片、第２標的核酸をその中に存在するrecQ遺伝子断片とした。recG遺伝子の塩基配列は、前述したように、E.coli recG DNA.（ACCESSION X59550）を参照されたい。また、recQ遺伝子の塩基配列は、E.coli recQ gene complete cds，and pldA gene，3'end.（ACCESSION M30198）を参照されたい。一方、一本鎖分解ヌクレアーゼは、上記実施例１等と同様、大腸菌のエキソヌクレアーゼＩとした。そして、下記の反応液Ｂを作成し、37℃で数分間加温した。その後、この反応液Ｂ 20μlを上記反応液Ａに加え、ピペッティングにより混ぜ、37℃で30分間反応させた。かくして、２種類の核酸−タンパク質複合体を得た。このうち、一方の核酸−タンパク質複合体は、RecAタンパク質が関与した状態で、第１標的核酸の一方の端部に第１ヘアピン型プローブが結合すると共に、第１標的核酸のもう一方の端部に第２ペアピン型プローブが結合したものである。即ち、一方の核酸−タンパク質複合体は、第１標的核酸の両端に第１，第２ヘアピン型プローブが結合している。また、他方の核酸−タンパク質複合体は、RecAタンパク質が関与した状態で、第２標的核酸の一方の端部に第３ヘアピン型プローブが結合すると共に、第２標的核酸のもう一方の端部に第４ペアピン型プローブが結合したものである。即ち、他方の核酸−タンパク質複合体は、第２標的核酸の両端に第３，第４ヘアピン型プローブが結合している。
【０１５９】
【表２４】
2005253427.tif 000026
【０１６０】
次に、図１に示すように、核酸−タンパク質複合体１４１とライゲース（リガーゼ）を反応させて、標的核酸１２１のうち一方の端部領域１２３の末端１２１Ｔと、プローブ１０１の第１ヌクレオチド部１０２の末端１０２Ｔとを共有結合（連結）させる（ライゲーション工程）。
本実施例では、下記の連結反応液を作成し、37℃で数分間加温した。その後、この連結反応液 40μlを、核酸−タンパク質複合体の形成を行った上記反応液に加え、ピペッティングにより混ぜ、65℃で30分間、連結反応を行った。本実施例では、第１標的核酸の一方の端部に第１ヘアピン型プローブが、もう一方の端部に第２ヘアピン型プローブが結合している。また、第２標的核酸の一方の端部に第３ヘアピン型プローブが、もう一方の端部に第４ヘアピン型プローブが結合している。従って、連結反応は、第１標的核酸と第１ヘアピン型プローブ、第１標的核酸と第２ヘアピン型プローブ、第２標的核酸と第３ヘアピン型プローブ、及び、第２標的核酸と第４ヘアピン型プローブでそれぞれ起こる。
【０１６１】
【表２５】
2005253427.tif 000027
【０１６２】
次に、図１及び図２に示すように、反応液中のタンパク質を失活させ、プローブ１０１と標的核酸１２１とからなる核酸結合体１６１を得る（タンパク質失活工程）。
本実施例では、ライゲーションを終えた反応液に、PB Bufferを20μl加えて酵素を失活させた。かくして、２種類の核酸結合体を得た。このうち、一方の核酸結合体は、第１標的核酸の一方の端部に第１ヘアピン型プローブが連結すると共に、第１標的核酸のもう一方の端部に第２ヘアピン型プローブが連結している。また、他方の核酸結合体は、第２標的核酸の一方の端部に第３ヘアピン型プローブが連結すると共に、第２標的核酸のもう一方の端部に第４ヘアピン型プローブが連結している。
【０１６３】
次に、標的核酸１２１に結合していない未反応プローブを除去し（未反応プローブ除去工程）、核酸結合体１６１を精製する。
本実施例では、Sephacryl S-400 スピンカラムに３回かけた。その後、このサンプルについてエタノール沈殿を行った（15000rpm、４℃で10分間）。
【０１６４】
次に、核酸結合体１６１とポリメラーゼを反応させて、核酸結合体１６１に存在するステム・ループ構造部分をフィルインする（フィルイン工程）。
本実施例では、上記のDNAのペレットを70％エタノールでリンスし乾燥させた後、蒸留水35.62μl、5×Sequenase Buffer（USB社）10μl、dDNTPs混合液に溶かした。DNAが完全に溶けたら、Sequenase ver.2.0（13unit/μl、USB社）（ポリメラーゼ）を加えて混ぜ、37℃で30分間反応させて、第１〜第４ヘアピン型プローブをそれぞれ直線状に伸ばすと共に、２種類の核酸結合体をそれぞれ直鎖状の二本鎖とした。なお、本実施例で利用した第１〜第４ヘアピン型のプローブは、それぞれ制限酵素NotＩの認識配列を有するので、２種類のフィルイン生成物は、それぞれ核酸結合体の両端に制限酵素NotＩの認識部位ができたものとなる。
【０１６５】
次に、タグ物質に高親和性を有する高親和性物質を用いて、核酸結合体を回収する（核酸結合体回収工程）。
本実施例では、予め100μlのTE緩衝液で２回洗浄しておいた50μl分のダイナビーズM-280ストレプトアビジン（高親和性物質）にサンプル液を加えて、磁気ビーズを懸濁し室温に40分間静置した。そのまま置いておくとビーズが沈殿するので、10分間毎にマイクロピペットで攪拌してビーズを懸濁し直した。次に、磁気スタンドを用いてビーズをサンプルチューブの１箇所に集め、サンプル液を廃棄した。続いて、100μlのTE緩衝液で磁気ビーズを5回洗浄し、更に、200μlのTE緩衝液に懸濁して新しいサンプルチューブに移した。
次に、磁気スタンドを用いてビーズをサンプルチューブの１箇所に集めてTE緩衝液を除き、下記に示す制限酵素NotＩ反応液 20μlに磁気ビーズを懸濁した。その後、37℃で60分間反応させて、核酸結合体をビーズから切り離した。このとき、10分間毎にマイクロピペットで攪拌してビーズを懸濁し直した。反応後、磁気スタンドを用いてビーズをサンプルチューブの１箇所に集め、サンプル液を回収した。
【０１６６】
【表２６】
2005253427.tif 000028
【０１６７】
次に、回収した核酸結合体をベクターに組み込み組換え体を形成する（組換え体形成工程）。
本実施例では、サンプル液に、ベクターDNAとして、NotIで切断され直鎖状にされた pZErO-1（25ng/μl）を 1μl加えて、一緒にフェノール抽出、エタノール沈殿を行った。その後、DNAのペレットを70％エタノールでリンスした後に乾かし、下記に示す１×ライゲーションバッファー 4.5μlに溶かした。DNAが溶けた後、T4 DNA ligase（400unit/μl）を0.5μl加えて、16℃で2時間連結反応を行った。
【０１６８】
【表２７】
2005253427.tif 000029
【０１６９】
次に、組換え体を宿主細胞に導入する（導入工程）。
本実施例では、宿主細胞として大腸菌を用いた。そして、上記のサンプル全量について、Epicurian Coli XL-1-Blue Super Competent Cells 100μlを用いて形質転換を行い、SOC培地を900μl加えて、37℃で1時間振盪した。
【０１７０】
その後、1mlの大腸菌液を100μlずつ3枚の減塩LBプレート（50μg/μlのゼオシン、1mMのIPTG入り）に接種し、37℃で一晩培養した。培養後、3枚のプレートで得られたコロニー数から、全体のコロニー数を推定した。その結果を図９に示す。
【０１７１】
次に、プレート上のコロニーを任意に100個採って、それぞれ1mlの減塩LB培地（50μg/μlのゼオシン、1mMのIPTG入り）に接種し、37℃で一晩振盪培養した。培養後、プラスミド自動分離装置を用いてプラスミドを抽出し、電気泳動にかけた。その結果、第１標的核酸または第２標的核酸と思われるインサートを含むものについては、組換え体プラスミドをNotIで切断し、更に電気泳動を行って外来DNAの分子量を調べた。その得られた分子量から、第１標的核酸または第２標的核酸に類似した分子量の外来DNAを含有する組換え体プラスミドについては、NotI及び適切な制限酵素で切断し、これを電気泳動して、インサートが第１標的核酸や第２標的核酸であるか否かインサートチェックを行った。その結果も図９に示す。
【０１７２】
本実施例では、第１標的核酸（recG遺伝子断片）をインサートに持つクローンが74個、第２標的核酸（recQ遺伝子断片）をインサートに持つクローンが16個、非標的核酸をインサートに持つクローンが2個、インサートのないものが8個、総コロニー数が約2360個であった。つまり、第１標的核酸をインサートに持つ目的のクローンが74個、第２標的核酸をインサートに持つ目的のクローンが16個得られた。これは、従来に比して、標的核酸の単離効率（クローニング効率）が大幅に向上していると言えるものである。よって、本発明の核酸単離方法を適用することにより、複数の標的核酸を同時に単離する場合でも、標的核酸の単離効率が著しく向上することが判る。
その他、上記実施例４等と同様な部分は、上記実施例４等と同様な効果を奏する。
【０１７３】
（実施例７）
次いで、第７の実施例について説明する。なお、上記各実施例１〜６のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例は、上記実施例１等と同じく、本発明に係る核酸検出方法を適用したものであるが、ヌクレアーゼとして、エンドヌクレアーゼの１つであるマングビーンヌクレアーゼを用いる点が大きく異なるところである。
【０１７４】
図１に示すように、まず、ヘアピン型のプローブ１０１を用意する。
本実施例では、上記実施例１で示した第１オリゴヌクレオチドからなり、その5'末端を32Ｐで標識したヘアピン型プローブを用意した。このヘアピン型プローブは、一本鎖をなす第２ヌクレオチド部が、ステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部の5'末端から延出している（図２参照）。従って、このヘアピン型プローブは、図２に示すように、第１ヌクレオチド部の3'末端が、標的核酸の一方の端部領域の5'末端に結合（連結）する 5'末端型プローブである。なお、前述したように、第１オリゴヌクレオチドのうち、5'-gcggccgcggtttccgcggccgc-3'の部分がステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部であり、5'-gtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagt-3'の部分が標的核酸に相補的な第２ヌクレオチド部である。標的核酸に対する第２ヌクレオチド部の相補性は100％である。
【０１７５】
次に、図１に示すように、ヘアピン型のプローブ１０１とRecA様タンパク質１１１を反応させて、RecA−プローブ複合体１１３を形成する。
本実施例では、RecA様タンパク質として、上記実施例１等と同様、大腸菌のRecAタンパク質を用意した。そして、下記の反応液Ａを37℃で15分間反応させて、RecA−プローブ複合体を形成した。
【０１７６】
【表２８】
2005253427.tif 000030
【０１７７】
次に、図１に示すように、直鎖状の二本鎖をなす標的核酸１２１を含む試料を用意する。また、一本鎖構造をなす核酸を分解可能な一本鎖分解ヌクレアーゼを用意する。そして、標的核酸１２１の一方の端部領域１２３に、プローブ１０１の第２ヌクレオチド部１０３が、RecA様タンパク質１１１が関与した状態で結合した核酸−タンパク質複合体１３１を形成する。更に、この核酸−タンパク質複合体１３１から、標的核酸１２１のうち、プローブ１０１の第２ヌクレオチド部１０３が結合することで解離状態となった一本鎖領域の少なくとも一部が分解された核酸−タンパク質複合体１４１を形成する（核酸−タンパク質複合体形成工程）。
【０１７８】
本実施例では、標的核酸として、上記実施例１と同様、制限酵素ScaＩによる切断で直鎖状にされた pBluescript SK(-)を用意した。一方、一本鎖分解ヌクレアーゼとして、一本鎖分解エンドヌクレアーゼの１つである、マングビーンヌクレアーゼ（10unit/μl、New England Biolabs社）を用意した。そして、下記の反応液Ｂを作成し、37℃で数分間加温した。その後、この反応液Ｂに上記反応液Ａを10μl加え、ピペッティングにより混ぜ、37℃で30分間反応させた。かくして、核酸−タンパク質複合体を得た。
【０１７９】
【表２９】
2005253427.tif 000031
【０１８０】
次に、図１に示すように、核酸−タンパク質複合体１４１とライゲース（リガーゼ）を反応させて、標的核酸１２１のうち一方の端部領域１２３の末端１２１Ｔと、プローブ１０１の第１ヌクレオチド部１０２の末端１０２Ｔとを共有結合（連結）させる（ライゲーション工程）。
本実施例では、下記の連結反応液を作成し、37℃で数分間加温した。その後、この連結反応液 20μlを、核酸−タンパク質複合体の形成を行った上記反応液に加え、ピペッティングにより混ぜ、65℃で15分間、連結反応を行った。
【０１８１】
【表３０】
2005253427.tif 000032
【０１８２】
次に、図１及び図２に示すように、反応液中のタンパク質を失活させ、プローブ１０１と標的核酸１２１とからなる核酸結合体１６１を得る（タンパク質失活工程）。
本実施例では、ライゲーションを終えた反応液に、PB Bufferを10μl加えて酵素を失活させた。かくして、核酸結合体を得た。
【０１８３】
次に、標的核酸１２１に結合していない未反応プローブを除去し（未反応プローブ除去工程）、核酸結合体１６１を精製する。
本実施例では、タンパク質を失活させた上記反応液を、Sephacryl S-400 スピンカラムに１回かけた。その後、このサンプルについてエタノール沈殿を行い、核酸結合体の乾燥ペレットを TE 緩衝液 20μlに溶かし、更に、BPB色素液4μlを混ぜた。
【０１８４】
次に、プローブ１０１の標識を検出することで、核酸結合体１６１を検出する（検出工程）。
本実施例では、上記実施例１と同様、まず上記サンプルについて電気泳動を行った。そして、臭化エチジウムでゲルを染色し、UVを照射して写真に撮った。その結果を図１０（ｂ）に示す。その後、電気泳動したゲルをゲルドライヤーにかけて、濾紙上でゲルを乾燥させた。そして、イメージアナライザーでバンドの定量を行った後、−80℃で7.5時間オートラジオグラフをとり、Ｘ線フィルムに写真を撮った。その結果を図１０（ａ）に示す。
【０１８５】
図１０（ａ）及び（ｂ）において、レーンＭは、上記実施例１等と同様な、標識したDNAサイズマーカーである。
レーン１は、コントロールであり、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、マングビーンヌクレアーゼを加えなかった結果である。
レーン２は、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、マングビーンヌクレアーゼを 2.5 units 加えた結果である。
レーン３は、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、マングビーンヌクレアーゼを 5 units 加えた結果である。
レーン４は、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、マングビーンヌクレアーゼを 10 units 加えた結果である。
レーン５は、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、マングビーンヌクレアーゼを 20 units 加えた結果である。
レーン６は、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、マングビーンヌクレアーゼを 40 units 加えた結果である。
【０１８６】
また、各レーン１〜６について、標的核酸に対するプローブの付加効率、即ち、核酸結合体の形成率をそれぞれ求めた。その結果、図１０（ａ）の下方に示すように、レーン１では14.5％、レーン２では16.5％、レーン３では20.0％、レーン４では14.2％、レーン５では15.2％、レーン６では17.5％であった。
【０１８７】
図１０（ａ）の結果から明らかなように、コントロールでは、標的核酸に対するプローブの付加効率（核酸結合体の形成率）が14.5％であったのに対し、本実施例では、16.5％、20.0％、14.2％、15.2％、或いは、17.5％と同等以上の値を示した。
このことから、核酸−タンパク質複合体を形成する際に、マングビーンヌクレアーゼを加えることで、核酸検出能が向上することが判る。
なお、上記実施例１に比して、本実施例の方がプローブ付加効率（核酸結合体形成率）が低いのは、ヌクレアーゼとして、一本鎖分解エンドヌクレアーゼを使用しているためであると考えられる。従って、プローブ付加効率（核酸結合体形成率）を向上させるためには、一本鎖分解エキソヌクレアーゼを利用するのが好適であると考えられる。
その他、上記実施例１等と同様な部分は、上記実施例１等と同様な効果を奏する。
【０１８８】
以上において、本発明を実施形態を実施例に即して説明したが、本発明は上述の実施例に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で、適宜変更して適用できることはいうまでもない。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】実施例１に関し、標的核酸とヘアピン型プローブから、これらの核酸結合体を形成するまでの過程を示す説明図である。
【図２】実施例１に関し、標的核酸とヘアピン型プローブとからなる核酸結合体を示す説明図である。
【図３】実施例１に関し、標的核酸の検出結果を示す図面に代わる写真であり、（ａ）はオートラジオグラフの結果を示す写真であり、（ｂ）は電気泳動の結果を示す写真である。
【図４】実施例２に関し、標的核酸とヘアピン型プローブとからなる核酸結合体を示す説明図である。
【図５】実施例２に関し、標的核酸の検出結果を示す図面に代わる写真であり、（ａ）はオートラジオグラフの結果を示す写真であり、（ｂ）は電気泳動の結果を示す写真である。
【図６】実施例３に関し、標的核酸の検出結果を示す図面に代わる写真であり、（ａ）はオートラジオグラフの結果を示す写真であり、（ｂ）は電気泳動の結果を示す写真である。
【図７】実施例４に関し、単離したコロニーを解析した結果を示す説明図である。
【図８】実施例５に関し、単離したコロニーを解析した結果を示す説明図である。
【図９】実施例６に関し、単離したコロニーを解析した結果を示す説明図である。
【図１０】実施例７に関し、標的核酸の検出結果を示す図面に代わる写真であり、（ａ）はオートラジオグラフの結果を示す写真であり、（ｂ）は電気泳動の結果を示す写真である。
【図１１】従来技術に関し、標的核酸とヘアピン型プローブから、これらの核酸結合体を形成するまでの過程を示す説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【配列表】
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