(57)【要約】【課題】  ＨＣＶのタイプまたはサブタイプの決定に寄与する手段の提供。【解決手段】  ＨＣＶの５’非翻訳領域に特異的に結合する１０〜５０個のヌクレオチドからなる特定のオリゴヌクレオチドおよび該ヌクレオチドの使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１、配列番号：２もしくは配列番号：３に示されるヌクレオチド配列かまたはその相補的な配列であって、該配列中、ＷはＡもしくはＴを表し、ＲはＧもしくはＡを表し、そしてＹはＴもしくはＣを表すか、または該配列中、ＴがＵにより置換わった相当する配列であることを特徴とする配列のオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする１０〜５０ヌクレオチドからなる万能（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ＨＣＶオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
１０〜５０ヌクレオチドの少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含んでなる一組の万能ＨＣＶオリゴヌクレオチドにおいて、該オリゴヌクレオチドが配列番号：１、２、３、４、２０および２７に示されるヌクレオチド配列のいずれかまたはその相補的な配列であって、該配列中、ＷはＡもしくはＴを表し、ＲはＧもしくはＡを表し、そしてＹはＴもしくはＣを表すか、または該配列中、ＴがＵにより置換わった相当する配列である配列から選ばれる少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを、それぞれ独立して含むことを特徴とする一組の万能ＨＣＶオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載の万能ＨＣＶオリゴヌクレオチドの少なくとも一つを使用するＨＣＶ単離物の５’非翻訳領域の一般的増幅方法。
【請求項４】
増幅するためのさらなるオリゴヌクレオチドがヌクレオチド−６８から−１に伸長する領域から選ばれる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
増幅するためのさらなるオリゴヌクレオチドがヌクレオチド−５２から−１に伸長する領域から選ばれる請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
さらなるオリゴヌクレオチドが配列番号：４に示される配列またはその相補的な配列からなる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の万能ＨＣＶオリゴヌクレオチドの少なくとも一つを含んでなる生物学的試料中のＨＣＶを検出するための診断キット。
【請求項８】
請求項２に記載の一組の万能ＨＣＶオリゴヌクレオチドを含んでなる生物学的試料中のＨＣＶを検出するための診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＨＣＶ単離物の遺伝子型を決定するための、ＨＣＶの５’非翻訳領域由来の配列を標的とするプローブの使用に関する。
【０００２】
本発明はまた、ＨＣＶの５’非翻訳領域由来の配列の増幅方法およびそれに用いることのできるオリゴヌクレオチドに関する。
【０００３】
本発明はさらにかようなオリゴヌクレオチドを含有する生物学的試料中のＨＣＶを検出するための診断キットに関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、非Ａ、非Ｂ（ＮＡＮＢ）肝炎の大部分を引き起こす陽性鎖でエンベロープを持つＲＮＡウイルスの一族である。それらのゲノム組織はペスチウイルス科（Ｐｅｓｔｉｖｉｒｉｄａｅ）およびフラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）と親密な関連性を示す。幾つかの原型単離物の完全なゲノムを包含するｃＤＮＡクローン配列はすでに完璧に決定されている（非特許文献１、Ｋａｔｏら、１９９０；非特許文献２、Ｃｈｏｏら、１９９１；非特許文献３、Ｏｋａｍｏｔｏら，１９９１；非特許文献４、Ｔａｋａｍｉｚａｗａら，１９９１；非特許文献５Ｏｋａｍａｔｏら，１９９２ｂ）。これらのゲノムは約９５００塩基対の長さである。非特許文献１、非特許文献４および非特許文献２により報告された単離物は、３０１０または３０１１アミノ酸の塩基読み取り枠（ＯＲＦ）を含み、ならびに非特許文献３により報告された単離物は３０３３のアミノ酸をコードする。これらの単離物を比較すると、エンベロープ（Ｅ）および非構造領域（ＮＳ）はかなりの変異性を表すが、一方５’非翻訳領域（ＵＲ）、およびより程度が低いが、コア領域は高度に保存されていることが示されている。
【０００５】
ＮＳ３領域のクローン配列を使用して、非特許文献６Ｋｕｂｏら（１９８９）は日本と米国の単離物を比較し、ほぼ８０％のヌクレオチド、および９２％のアミノ酸相同性を見い出した。配列変異性の存在は、５’ＵＲ，コア、およびＥ１領域が入手できた時にさらに証明された（ＨＣ−Ｊ１およびＨＣ−Ｊ４；非特許文献７Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９０）。日本の研究所では幾つかのＮＳ５断片を単離した後、Ｋ１およびＫ２のふたつの群が記述された（非特許文献８Ｅｎｏｍｏｔｏら，１９９０）。“アメリカ様（Ａｍｅｒｉｃａｎ−ｌｉｋｅ）”単離物ＰＴ−１をＫ１（これは日本ではより一般的であった）と比較すると、それらは親密な関連性を示したが、群間のヌクレオチド同一性が約８０％の異なるサブタイプであった。Ｋ２配列は、Ｋ１およびＰＴ−１の両方によりわずかに関連しているだけである。なぜならばその相同性が核酸を基準としてわずか６７％、アミノ酸を基準として７２％観察されたからである。さらにＫ２はふたつの群（Ｋ２ａおよびＫ２ｂ）に分類でき、それらは約８０％の群間のヌクレオチド相同性を示した。５’ＵＲでのヌクレオチド配列分析では、Ｋ１とＰＴ−１との間で９９％の同一性を、ならびにＫ１とＫ２との間で最高９４％の同一性が示され、この分析は５’ＵＲを使用して制限断片鎖長多型（ＲＦＬＰ）、ならびにＨＣＶをＫ１およびＫ２群に分類すること可能にする（非特許文献９Ｎａｋａｏら１９９１）。さらにＨＣ−Ｊ６およびＨＣ−Ｊ８の完全な配列により、第二群に関する証拠が得られ、ふたつの配列はＫ２群と関連していた（非特許文献３および５）。４つの支脈（すなわちタイプＩ：ＨＣＶ−１およびＨＣＶ−Ｈ；タイプＩＩ：ＨＣＶ−Ｊ，−ＢＫ，ＨＣ−Ｊ４；タイプＩＩＩ：ＨＣ−Ｊ６；タイプＩＶ：ＨＣ−Ｊ８）を含むＨＣＶの系統発生系図がＯｋａｍｏｔｏらにより提案された（非特許文献５）。しかし、タイプＩとタイプＩＩとの間、ならびにタイプＩＩＩとタイプＩＶとの間に７９％の核酸配列相同性を観察することができる。第一群間（タイプＩおよびＩＩ）、ならびに第二群間（タイプＩＩＩおよびＩＶ）には程度の低い相関性が６７−６８％存在するだけである。さらに新たなＨＣＶタイプ、ＨＣＶ−ＴがＮＳ５領域を研究した後にタイ国で検出された（非特許文献１０Ｍｏｒｉら、１９９２）。ＨＣＶ−Ｔはすべての他の既知のＮＳ５配列と６５％の相同性を有し、ならびにふたつの群（ＨＣＶ−ＴａおよびＨＣＶ−Ｔｂ）が検出でき、これらはまた約８０％の核酸相同性を示した。英国の単離物に見出された同様な新規群と、タイプＩからＩＶの系統発生的関連の解明は、５’ＵＲ、コア、ＮＳ３およびＮＳ５領域の保存部分を分析することにより可能であった（非特許文献１１Ｃｈａｎら，１９９２ａ）。新たな系統発生系図が提案され、これによれば‘タイプ１’はタイプＩおよびＩＩ、‘タイプ２’はタイプＩＩＩおよびＩＶ、ならびに‘タイプ３’およびそれらの有する単離物Ｅ−ｂ１からＥ−ｂ８、ならびにＨＣＶ−Ｔに対応した。‘タイプ３’由来の単離物の５’ＵＲ配列の中には他者（非特許文献１２Ｂｕｋｈら、１９９２；非特許文献１３Ｃｈａら，１９９２；非特許文献１４Ｌｅｅら、１９９２）により報告されたものもあった。
【０００６】
幾つかの特許出願はタイプ１ＨＣＶ単離物のゲノム由来のプローブによりＨＣＶの存在を検出する問題点に取り組んだ（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４および特許文献５参照。）。さらに、ＨＣＶ単離物の５’ＵＲは一般的なＨＣＶ検出のためのプローブおよびプライマーを設計するためのよい候補になることが証明された（非特許文献１３；非特許文献１５Ｉｎｃｈａｕｐｓｅら、１９９１）。しかし、これらの特許出願のいずれも、分析すべき試料中に存在するＨＣＶのタイプおよび／またはサブタイプを同定するための方法を与えていない。  
【０００７】
種々のＨＣＶ遺伝子型感染は種々の血清学的反応性（非特許文献１６Ｃｈａｎら、１９９１）、ならびに種々のインターフェロンＩＦＮ−γ処置への応答（非特許文献１７Ｐｏｚａｔｔｏら、１９９１；非特許文献１８Ｋａｎａｉら、１９９２；非特許文献１９Ｙｏｓｈｉｏｋａら、１９９２）を生じることが実証され、ＨＣＶ遺伝子型決定の重要性が強調されている。現在まで、このことはコード領域、または５’ＵＲでの莫大な配列決定に関する努力により、あるいはコアープライマーのタイプ−特異的な組み合わせを使用するＨＣＶ  ｃＤＮＡ  についてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により（非特許文献２０Ｏｋａｍｏｔｏら，１９９２ａ）、あるいは５’ＵＲまたはＮＳ５領域内の（ＲＦＬＰ）分析により（非特許文献９Ｎａｋａｏら、１９９１；非特許文献２１Ｃｈａｎら、１９９２ｂ）達成されただけであった。しかしこれらのいずれの上記特許出願および公開も、分析すべき試料中に存在するＨＣＶのタイプまたはサブタイプを同定するための信頼しうる方法を提供していない。それはこれらの方法では特にタイピングが労働を要し、ならびにサブタイピングはさらに労働荷重であるか、あるいは不可能と思われるからである。この点で非特許文献１４Ｌｅｅら（１９９２）の、ＨＣＶ単離物であるＨＣＶ３２４とＨＣＶ３２４Ｘ間を、これら単離物のゲノムの５’ＵＲ由来のＰＣＲ断片により識別する試みは注目できる。その結果、これら５’ＵＲプローブは、それらが誘導されたそれぞれの単離物のゲノムとは特異的反応性を表さないことを実証している。
【特許文献１】国際公開第９２／０２６４２号パンフレット
【特許文献２】欧州特許第４１９  １８２号明細書
【特許文献３】欧州特許第３９８  ７４８号明細書
【特許文献４】欧州特許第４６９  ４３８号明細書
【特許文献５】欧州特許第４６１  ８６３号明細書
【非特許文献１】Ｋａｔｏ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７（１９９０）：９５２４−９５２８．
【非特許文献２】Ｃｈｏｏ  Ｑ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８（１９９１）：２４５１−２４５５．
【非特許文献３】Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７２（１９９１）：２６９７−２７０４．
【非特許文献４】Ｔａｋａｍｉｚａｗａ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５（１９９１）：１１０５−１１１３．
【非特許文献５】Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８８（１９９２ｂ）：３３１−３４１．
【非特許文献６】Ｋｕｂｏ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７  （１９８９）：１０３６８−１０３７２．
【非特許文献７】Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊａｐａｎ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ６０（１９９０）：１６７−１７７．
【非特許文献８】Ｅｎｏｍｏｔｏ  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  １７０（１９９０）：１０２１−１０２５．
【非特許文献９】Ｎａｋａｏ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７２（１９９１）：２１０５−２１１２．
【非特許文献１０】Ｍｏｒｉ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  １８３（１９９２）：３３４−３４２．
【非特許文献１１】Ｃｈａｎ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７３（１９９２ａ）：１１３１−１１４１．
【非特許文献１２】Ｂｕｋｈ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０（１９９３）：８２３４−８２３８．
【非特許文献１３】Ｃｈａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９（１９９２）：７１４４−７１４８．
【非特許文献１４】Ｌｅｅ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３０（１９９２）：１６０２−１６０４．
【非特許文献１５】Ｉｎｃｈａｕｐｓｅ  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１４（１９９１）：５９５−６００．
【非特許文献１６】Ｃｈａｎ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ３３８（１９９１）：１９９１．
【非特許文献１７】Ｐｏｚａｔｔｏ  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ３３８（１９９１）：５０９．
【非特許文献１８】Ｋａｎａｉ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ３３９（１９９２）：１５４３．
【非特許文献１９】Ｙｏｓｈｉｏｋａ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １６（１９９２）：２９３−２９９．
【非特許文献２０】Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７３（１９９２ａ）：６７３−６７９．
【非特許文献２１】Ｃｈａｎ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，イタリア  ベニスでの第一回定例総会、抄録Ｄ５，７３（１９９２ｂ）．
【発明の開示】
【０００８】
従って本発明の目的は、生物学的試料中に存在する１種の、または数種のＨＣＶ遺伝子型の存在を迅速かつ確実に決定する方法、および決定した単離物（または複数の単離物）を確実に分類する方法を提供することである。
【０００９】
もうひとつの本発明の目的は、未知のＨＣＶタイプまたはサブタイプを同定する方法を提供することである。
【００１０】
本発明のもうひとつの目的は、感染した生物学的流体を、ゲノムの水準で明白にタイプまたはサブタイプと関連した種々の血清学的群に分類できる方法を提供することである。
【００１１】
本発明のもうひとつの目的は、ＨＣＶの種々のタイプまたはサブタイプの存在、または不存在を迅速に検出するためのキットを提供することである。
【００１２】
さらなる本発明の目的は、配列番号：１、配列番号：２もしくは配列番号：３に示されるヌクレオチド配列かまたはその相補的な配列であって、該配列中、ＷはＡもしくはＴを表し、ＲはＧもしくはＡを表し、そしてＹはＴもしくはＣを表すか、または該配列中、ＴがＵにより置換わった相当する配列であることを特徴とする配列のオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする１０〜５０ヌクレオチドからなる万能（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ＨＣＶオリゴヌクレオチドを提供することである。
【００１３】
さらにまた本発明の目的は、１０〜５０ヌクレオチドの少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含んでなる一組の万能ＨＣＶオリゴヌクレオチドにおいて、該オリゴヌクレオチドが配列番号：１、２、３、４、２０および２７に示されるヌクレオチド配列のいずれかまたはその相補的な配列であって、該配列中、ＷはＡもしくはＴを表し、ＲはＧもしくはＡを表し、そしてＹはＴもしくはＣを表すか、または該配列中、ＴがＵにより置換わった相当する配列である配列から選ばれる少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを、それぞれ独立して含むことを特徴とする一組の万能ＨＣＶオリゴヌクレオチドを提供することである。
【００１４】
さらにまた、本発明の目的は、上記の万能ＨＣＶオリゴヌクレオチドの少なくとも一つを使用するＨＣＶ単離物の５’非翻訳領域の増幅方法を提供することである。
【００１５】
さらにまた、本発明の目的は、上記の万能ＨＣＶオリゴヌクレオチドの少なくとも一つを含んでなる生物学的試料中のＨＣＶを検出するための診断キットを提供することでもある。
【００１６】
本発明は少なくともひとつのプローブの使用に関し、生物学的試料中に存在するＨＣＶ単離物の遺伝子型を決定するために、該プローブは（ｉ）ひとつのＨＣＶ単離物の被検体鎖中に存在する、５’非翻訳領域（ＵＲ）のヌクレオチド−２９１位から−６６位に伸長するドメイン中の、遺伝子型に特異的な標的領域にハイブリダイズすることができ、または該プローブは（ｉｉ）任意の上記に定義したプローブに相補的である。
【００１７】
本発明は好ましくは、約５から約５０ヌクレオチド、より好ましくは約１０から約４０ヌクレオチド、ならびに最も好ましくは約１５から約３０ヌクレオチドを含有する少なくともひとつのプローブの使用に関し、該プローブは（ｉ）例えば図２のｃＤＮＡ配列により表されるようなｃＤＮＡ配列によって表されるひとつのＨＣＶ単離物のヌクレオチド−２９１位から−６６位に伸長するドメイン中にある、被検体鎖中に存在する遺伝子型に特異的な標的領域にハイブリダイズすることができ、ここでヌクレオチドの位置を示す負の番号は、ＨＣＶポリタンパク質をコードする塩基読み取り枠の初めのＡＴＧコドンより前にあるヌクレオチドから始まっている。あるいは該プローブは（ｉｉ）生物学的試料中に存在するＨＣＶの（インビトロ）遺伝子型決定のために上記に定義したプローブと相補的であり、該試料はＨＣＶ陽性であると事前に同定されていてもよい。
【００１８】
上記方法は他のＨＣＶ単離物との相同性の割合に従い、該単離物を分類するために使用することができ、単離物が同じタイプに属するという事実によれば：
完全ゲノム中の核酸水準で７４％より高い相同性を表す；
または、ヌクレオチド７９３５位と８２７４位との間にあるＮＳ５領域中の核酸水準で７４％より高い相同性を表す；
またはその完全なポリタンパク質はアミノ酸水準で７８％より高い相同性を表す；    またはアミノ酸２６４６位と２７５８位の間にあるそのＮＳ５領域は、アミノ酸水準で８０％より高い相同性を表す；
ならびにＨＣＶ単離物が同じサブタイプに属するという事実によれば、完全ゲノムにおいて核酸水準で９０％より高い相同性、かつ完全ポリタンパク質において、アミノ酸水準で９０％より高い相同性を表す。
【００１９】
より好ましくは上述の方法は、以下の事実に従うＨＣＶ単離物の分類に関する、
（１）ヌクレオチド７９３５と８２７４との間（Ｃｈｏｏら、１９９１）、または８２６１と８６００との間（Ｋａｔｏら、１９９０）、または８３４２と８６８１との間（Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９１）にあるＮＳ５ｂ領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じＨＣＶタイプに属する単離物は、０．３４より低いヌクレオチドディスタンスを表し、通常は０．３３より低く、より通常では０．３２より低く、および同じサブタイプに属する単離物は０．１３５より低く、通常は０．１３より低く、より通常では０．１２５より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果、同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は０．１３５から０．３４の範囲の通常では０．１４から０．３３の範囲、より通常では０．１５から０．３２の範囲を表す、ヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるＨＣＶタイプに属する単離物は０．３４より高く、通常は０．３５より高く、より通常では０．３６より高いヌクレオチドディスタンスを表し、
（２）ヌクレオチド３７８と９５７との間にあるコア／Ｅ１領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じＨＣＶタイプに属する単離物は、０．３８より低く、通常は０．３７より低く、より通常では０．３６より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は０．１７より低く、通常は０．１６より低く、より通常では０．１５より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は０．１５から０．３８の範囲の通常では０．１６から０．３７の範囲の、より通常では０．１７から０．３６の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるＨＣＶタイプに属する単離物は０．３６より高く、通常は０．３６５より高く、より通常では０．３７より高いヌクレオチドディスタンスを表し、
（３）ヌクレオチド４６６４と５２９２との間（Ｃｈｏｏら、１９９１）、または４９９３と５６２１との間（Ｋａｔｏら、１９９０）、または５０１７と５６４５との間（Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９１）にあるＮＳ３／ＮＳ４領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じＨＣＶタイプに属する単離物は、０．３５より低く、通常は０．３４より低く、より通常では０．３３より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は０．１９より低く、通常は０．１８より低く、より通常では０．１７より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は０．１７から０．３５の範囲、通常では０．１８から０．３４の範囲、より通常では０．１９から０．３３の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるＨＣＶタイプに属する単離物は０．３３より高く、通常は０．３４より高く、より通常では０．３５より高いヌクレオチドディスタンスを表す。
【００２０】
「遺伝子型決定」という用語は、タイピングおよび／またはサブタイピングのいずれかを言う。ＨＣＶ単離物を‘遺伝子型決定’するための方法とは、少なくとも部分的にはＨＣＶ単離物を遺伝子型に分類することと考えられている。ＨＣＶ‘遺伝子型’は関連した配列を持つＨＣＶ単離物の群である。そのような関連配列は上記および実施例９に説明したようなヌクレオチドディスタンスを示すものとして定義される。より大きな群（ＨＣＶタイプ）、とより小さい群（ＨＣＶサブタイプ）とは関連していることが示された。ＨＣＶタイプはいつでもひとつ以上のＨＣＶサブタイプを含んでいる。したがって、遺伝子型決定法は、サブタイピング（ＨＣＶサブタイプへの分類）の不必要なＨＣＶ単離物のタイピング（ＨＣＶタイプへの分類）を目的とすることができ、または好ましい態様においてはサブタイピングを目的とすることができる。サブタイプへの分類は、本質的にタイプへ分類するためのデータを提供することが理解されるべきである。
【００２１】
「遺伝子型に特異的な標的領域」という表現は、図２および４からすぐに導き出すことができる５’非翻訳領域（ＵＲ）中の種々のＨＣＶ遺伝子型間で観察される少なくともひとつのヌクレオチド変異を言う。
【００２２】
「ＨＣＶポリタンパク質」という用語はサブタイプ１ｂに属するＨＣＶ−Ｊ単離物のＨＣＶポリタンパク質を言う（Ｋａｔｏら、１９９０）。
【００２３】
「プローブ」という表現は、相補性に基づいて特定のＨＣＶ単離物中に存在する標的配列とハイブリッドを形成する任意のポリヌクレオチドに対応する。そのようなプローブにはＤＮＡ，ＲＮＡ、または合成ヌクレオチド類似体を含む。本発明のプローブは、固体支持体に固定された被検鎖と共にインキュベートすることができる。本発明の好ましい態様においては、プローブそれ自体を固体支持体に固定することができる。これらのプローブはさらに捕獲プローブを含むことができ、このプローブは次に直接的、または間接的に固体支持体に結合する結合分子にカップルされることを特徴とするか、あるいは標識プローブを含んでもよく、この標識プローブは検出しうる標識を持っているのが特徴である。
【００２４】
本発明は生物学的試料中に存在するＨＣＶ単離物の遺伝子型決定法に関し、その方法は以下の工程を含んで成る：
試料中のリボヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチドが接近できるように作られた試料を、必要に応じて適当な変性条件下で少なくともひとつのプローブと接近させ、該プローブは（ｉ）ひとつのＨＣＶ単離物の５’非翻訳領域のヌクレオチド−２９１位から−６６位に伸長するドメイン中の領域とハイブリダイズすることができ、または該プローブは（ｉｉ）任意の上記に定義したプローブに相補的であり、ならびに
該プローブと同定すべきＨＣＶ単離物のヌクレオチド配列との間にあるいは形成された複合体を検出する。
【００２５】
本発明はまた生物学的試料中に存在するＨＣＶ単離物の遺伝子型決定法に関し、その方法は以下の工程を含んで成る：
試料中のリボヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチドが接近できるように作られた試料を、必要に応じて適当な変性条件下で、好ましくは約５から５０の、より好ましくは約１０から約４０ヌクレオチドの、最も好ましくは約１５から約３０ヌクレオチドの少なくともひとつの該プローブと接触させ、該プローブは（ｉ）例えば図２中のｃＤＮＡ配列により表されるｃＤＮＡ配列により表されるひとつのＨＣＶ単離物の５’ＵＲのヌクレオチド−２９１位から−６６位に伸長するドメイン中の領域とハイブリダイズすることができ、ここでその位置の負の番号はＨＣＶポリタンパク質をコードする塩基読み取り枠の初めのＡＴＧコドンより前にあるヌクレオチドから始まっており、あるいは該プローブは上記に定義したプローブに相補的であり、
該プローブと同定すべきＨＣＶ単離物のヌクレオチド配列との間にあるいは形成された複合体を検出し、およびハイブリダイゼーションパターンから存在するＨＣＶ単離物のタイプ（または複数のタイプ）を判断する。
【００２６】
上述の方法は、他のＨＣＶ単離物との相同性の割合に従って該単離物を分類する方法と考えることができ、単離物が同じタイプに属するという事実によれば：
完全ゲノム中の核酸水準で７４％より高い相同性を表す；
または、ヌクレオチド７９３５位と８２７４位との間にあるＮＳ５領域中の核酸水準で７４％より高い相同性を表す；
またはその完全なポリタンパク質はアミノ酸水準で７８％より高い相同性を表す；
またはアミノ酸２６４６位と２７５８位の間にあるＮＳ５領域は、アミノ酸水準で８０％より高い相同性を表す；
ならびに同じサブタイプに属するＨＣＶ単離物は、完全ゲノム中の核酸水準で９０％より高い相同性、かつ完全ポリタンパク質中のアミノ酸水準で９０％より高い相同性を表す。
【００２７】
より好ましくは、上記方法は以下の事実によるＨＣＶ単離物の分類に関し、
（１）ヌクレオチド７９３５と８２７４位との間（Ｃｈｏｏら、１９９１）、または８２６１と８６００との間（Ｋａｔｏら、１９９０）、または８３４２と８６８１との間（Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９１）にあるＮＳ５ｂ領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じＨＣＶタイプに属する単離物は、０．３４より低く、通常は０．３３より低く、より通常では０．３２より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は０．１３５より低く、通常は０．１３より低く、より通常では０．１２５より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は０．１３５から０．３４の範囲、通常では０．１４から０．３３の範囲、より通常では０．１５から０．３２の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるＨＣＶタイプに属する単離物は０．３４より高く、通常は０．３５より高く、より通常では０．３６より高いヌクレオチドディスタンスを表し、
（２）ヌクレオチド３７８と９５７との間にあるコア／Ｅ１領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じＨＣＶタイプに属する単離物は、０．３８より低く、通常は０．３７より低く、より通常では０．３６より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は０．１７より低く、通常は０．１６より低く、より通常では０．１５より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は０．１５から０．３８の範囲、通常では０．１６から０．３７の範囲、より通常では０．１７から０．３６の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるＨＣＶタイプに属する単離物は０．３６より高く、通常は０．３６５より高く、より通常では０．３７より高いヌクレオチドディスタンスを表し、
（３）ヌクレオチド４６６４と５２９２との間（Ｃｈｏｏら、１９９１）、またはヌクレオチド４９９３と５６２１との間（Ｋａｔｏら、１９９０）、またはヌクレオチド５０１７と５６４５との間（Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９１）にあるＮＳ３／ＮＳ４領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じＨＣＶタイプに属する単離物は、０．３５より低く、通常は０．３４より低く、より通常では０．３３より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は０．１９より低く、通常は０．１８より低く、より通常では０．１７より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は０．１７から０．３５の範囲、通常では０．１８から０．３４の範囲、より通常では０．１９から０．３３の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるＨＣＶタイプに属する単離物は０．３３より高く、通常は０．３４より高く、より通常では０．３５より高いヌクレオチドディスタンスを表す。
【００２８】
「被検体鎖」という用語は、生物学的試料中に存在するかもしれない配列を含有すると疑われる一本の、または二本鎖の核酸分子に対応し、該被検体鎖は直接的に検出されるか、または増幅後に検出される。この被検体鎖は好ましくは陽性の、または陰性鎖のＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは増幅されたｃＤＮＡである。
【００２９】
「生物学的試料」という表現は、ＨＣＶ配列を含有する任意の生物学的試料（組織または流体）を言い、より具体的には血液、血清または血漿試料を言う。
【００３０】
タイプまたはサブタイプ特異的標的領域間（あるとすれば）と、上述のプローブ間に形成されたハイブリッドの検出は、使用するレポーター分子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の性質（プローブ上、または標的とする被検体鎖上のいずれかに存在する）に依存し、ならびに比色、蛍光、放射検出、または従来技術を含む任意の他の方法による手段によって測定することができる。
【００３１】
「（ＨＣＶ）単離物」という用語は自然に感染したヒト、または実験的に感染させた動物から得たＣ型肝炎ウイルスの遺伝物質を含有する任意の生物学的流体をも言い、ならびにインビトロの実験で得たＣ型肝炎ウイルス遺伝物質を含有する流体を言う。例えば、インビトロ培養実験由来の細胞および生育培地の両方をＨＣＶ遺伝物質の源として使用することができる。
【００３２】
「ハイブリダイズ」、または「標的」という表現は、任意の周知技術に従い行われるハイブリダイゼーション実験を言い、ならびに相同的標的（ひとつまたは２〜３のミスマッチを含む）、または好ましくは完全な相同的標的（ミスマッチは認められない）の検出を可能とする。
【００３３】
本発明において、感受性のあるＰＣＲ法が、ネスト万能プライマーの組み合わせ（ｓｅｔ  ｏｆ  ｎｅｓｔｅｄ，ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒ）を用いて、高度に保存された５’ＵＲのために使用された。これらプライマーの位置および配列は、すでに報告されているタイプ１および２配列、ならびにタイプ３配列ＢＲ５６（図２）から誘導された。得られた増幅生成物を、５’ＵＲの可変領域に対して定位の、膜片上に平行線として固定された（逆−ハイブリダイゼーション法：ｒｅｖｅｒｓｅ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｉｃｉｐｌｅ）オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーションアッセイは、ライン  プローブ  アッセイ（ｌｉｎｅ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓｅｙ：ＬｉＰＡ）と呼ばれるが、迅速なアッセイであり、この方法により以前は不完全に記載されたＺ４、Ｚ６およびＺ７（Ｂｕｋｈら１９９２）と同様の単離物が検出された。これらＨＣＶ株に関する新しいタイプ４の分類が提案されている。ＢＥ９５およびＢＥ９６、ならびにＳＡ１（Ｃｈａら、１９９２）と同様な他の単離物が識別でき、タイプ５ａのような単離物を分類することが提案されている。ＨＫ２（Ｂｕｋｈら、１９９２）と同様な単離物を区別することができ、新たなタイプ６ａの分類が提案されている。単離物ＢＥ９８中に新たな遺伝子型が検出され、この単離物をＨＣＶタイプ３、サブタイプ３ｃに分類することが提案されている。別の新たな配列がＧＢ４３８中に検出され、これは４ｆに分類することができた。このＬｉＰＡ法は、患者血清中に存在するＨＣＶタイプおよびそれらのサブタイプを容易かつ早く決定することを可能にする。
【００３４】
本発明の好適な態様によれば、少なくともふたつのプローブを含むプローブの組が使用される。
【００３５】
好適な態様によれば、本発明の方法において、使用するプローブは以下のひとつのドメイン中の少なくとも５ヌクレオチドの領域を標的とする：
ａ）第２図のヌクレオチド−２９３位からヌクレオチド−２７８位に伸長するもの、
ｂ）第２図のヌクレオチド−２７５位からヌクレオチド−２６０位に伸長するもの、
ｃ）第２図のヌクレオチド−２５３位からヌクレオチド−２３８位に伸長するもの、
ｄ）第２図のヌクレオチド−２４４位からヌクレオチド−２２９位に伸長するもの、  ｅ）第２図のヌクレオチド−２３８位からヌクレオチド−２２３位に伸長するもの、
ｆ）第２図のヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に伸長するもの、
ｇ）第２図のヌクレオチド−１４１位からヌクレオチド−１１７位に伸長するもの、  ｈ）第２図のヌクレオチド−８３位からヌクレオチド−６８位に伸長するもの、
ｉ）第２図のヌクレオチド−１０３位からヌクレオチド−８８位に伸長するもの、
ｊ）  ヌクレオチド−１４６位からヌクレオチド−１３０位に伸長するもの。
【００３６】
領域−１７０から−１５５、および−１４１から−１１７はウイルスＲＮＡ中の同じステム（ｓｔｅｍ）の部分となることができる直線配列中の可変領域を表す。したがってひとつの領域中での突然変異は、もうひとつの領域のもうひとつの突然変異により補われ、ＲＮＡ二重鎖の形成が可能となるか、またはならない。変異は他の新しいタイプのＨＣＶにも同じ位置で同様に起こると思われ、それゆえにこれらの可変領域は現在の、および未だ発見されていないが、今後発見されるであろうすべてのＨＣＶタイプを識別するための道具となるであろう。
【００３７】
もうひとつの態様によれば、本発明は少なくとも以下のひとつの配列を標的とするような配列を含んで成るプローブに関する：
【００３８】
【表１】
2005040145.tif 000002
【００３９】
【表２】
2005040145.tif 000003
【００４０】
配列中ＹはＴまたはＣを表し、
ＫはＧまたはＴを表し、
ならびにＲはＧまたはＡを表し、
またはＴがＵに置換された対応する配列、
または上記に定義した配列に相補的な配列。
【００４１】
本発明のもうひとつの有利な態様によれば、少なくとも２種の上記プローブ、またはこれら２種のプローブの混合物が、以下に定義する種々のＨＣＶタイプまたはサブタイプを識別するために使用される。
【００４２】
本発明の方法の好適な態様によれば、ＨＣＶのそれぞれのタイプまたはサブタイプを決定するために、２種の異なるプローブの組、または２種の異なるプローブの混合物が使用され、その組の、または混合物の各プローブは、上記に定義した領域の中から選ばれた異なる領域をそれぞれ標的とし、より具体的には上記組または混合物中の２種のプローブは１０から４０個の連続したヌクレオチドから成り、以下のドメインの対の中からそれぞれ選ばれた２種の領域をそれぞれ標的とする：
＊第２図のヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に伸長するもの、および第２図のヌクレオチド−１４１位からヌクレオチド−１１７位に伸長するもの、
＊第２図のヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に伸長するもの、および第２図のヌクレオチド−１０３位からヌクレオチド−８８位に伸長するもの、
＊第２図のヌクレオチド−１４１位からヌクレオチド−１１７位に伸長するもの、および第２図のヌクレオチド−１０３位からヌクレオチド−８８位に伸長するもの、
＊第２図のヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に伸長するもの、および第２図のヌクレオチド−８３位からヌクレオチド−６８位に伸長するもの、
＊第２図のヌクレオチド−１４１位からヌクレオチド−１１７位に伸長するもの、および第２図のヌクレオチド−８３位からヌクレオチド−６８位に伸長するもの、
＊第２図のヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に伸長するもの、および第２図のヌクレオチド−１４６位からヌクレオチド−１３０位に伸長するもの、
＊第２図のヌクレオチド−１３２位からヌクレオチド−１１７位に伸長するもの、および第２図のヌクレオチド−１４６位からヌクレオチド−１３０位に伸長するもの、
＊第２図のヌクレオチド−１４６位からヌクレオチド−１３０位に伸長するもの、および第２図のヌクレオチド−１０３位からヌクレオチド−８８位に伸長するもの。
【００４３】
本発明はまた：
次の配列：ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＧＡＡ  ＣＴＡ  ＡＣＣ  Ｃ，
またはＴがＵに置換された対応する配列
または上記に定義した配列に相補的な配列
を標的とするような配列を有するプローブに関する。
【００４４】
本発明はまた、２種のプローブの組、または２種のプローブの混合物に関し、ここで各２種のプローブは１０から４０の連続的ヌクレオチドから成り、およびここで２種のプローブは以下のドメインの対の中からそれぞれ選ばれた二つの領域をそれぞれ標的とする：
＊第２図のヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に伸長するもの、および第２図のヌクレオチド−１４１位からヌクレオチド−１１７位に伸長するもの、
＊第２図のヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に伸長するもの、および第２図のヌクレオチド−１０３位からヌクレオチド−８８位に伸長するもの、
＊第２図のヌクレオチド−１４１位からヌクレオチド−１１７位に伸長するもの、および第２図のヌクレオチド−１０３位からヌクレオチド−８８位に伸長するもの、
＊第２図のヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に伸長するもの、および第２図のヌクレオチド−８３位からヌクレオチド−６８位に伸長するもの、
＊第２図のヌクレオチド−１４１位からヌクレオチド−１１７位に伸長するもの、および第２図のヌクレオチド−８３位からヌクレオチド−６８位に伸長するもの、
＊第２図のヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に伸長するもの、および第２図のヌクレオチド−１４６位からヌクレオチド−１３０位に伸長するもの、
＊第２図のヌクレオチド−１３２位からヌクレオチド−１１７位に伸長するもの、および第２図のヌクレオチド−１４６位からヌクレオチド−１３０位に伸長するもの、
＊第２図のヌクレオチド−１４６位からヌクレオチド−１３０位に伸長するもの、および第２図のヌクレオチド−１０３位からヌクレオチド−８８位に伸長するもの。
【００４５】
好適な態様によれば、本発明は少なくとも一つの次のＨＣＶタイプ：ＨＣＶタイプ１、ＨＣＶタイプ２、ＨＣＶタイプ３、ＨＣＶタイプ４、ＨＣＶタイプ５、およびＨＣＶタイプ６に属するＨＣＶ単離物を、それらが含まれると思われる生物学的試料中からタイピングする法に関し、以下の工程を含んで成る：
試料中のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドがすで  に接近できるようにされている上記試料を、必要に応じて適当な変性条件下で、図２および第４図中のｃＤＮＡ配列により表されるＨＣＶ単離物の５’ＵＲのヌクレオチド−２９１位からヌクレオチド−６６位に伸長するドメイン中の領域とハイブリダイズすることができる少なくとも一つのプローブと接触させ、ここでヌクレオチド位置の負の番号はＨＣＶポリタンパク質をコードする塩基読み取り枠の初めのコドンよりも前にあるヌクレオチドから始まっており、あるいは該プローブは上記に定義したプローブに相補的であり；
該プローブと標的領域間にあるいは形成された複合体を検出し；
観察されたハイブリダイゼーションパターンから存在するＨＣＶタイプを判断する。
【００４６】
好適な態様によれば、本発明は少なくとも一つの次のＨＣＶタイプ：ＨＣＶタイプ１、ＨＣＶタイプ２、ＨＣＶタイプ３、ＨＣＶタイプ４、ＨＣＶタイプ５、およびＨＣＶタイプ６に属するＨＣＶ単離物のタイピング法に関し、ならびに使用するプローブは以下の標的領域、またはＴがＵに置換された該領域、あるいはそのように定義した領域に相補的な領域の一つを標的とすることができるようになっている：
【００４７】
【表３】
2005040145.tif 000004
【００４８】
【表４】
2005040145.tif 000005
【００４９】
配列中、ＹはＣまたはＴを表し、そしてＫはＧまたはＴを表すが、あるいは使用するプローブは上記に定義したプローブの中から選択された二つのプローブの組である。
【００５０】
本発明はまた生物学的試料中に存在するＨＣＶ単離物のタイプ（および複数のタイプ）を決定する上記方法の使用に関する。
【００５１】
「タイプ」という用語は、その群の他の単離物のゲノムに対して、ＨＣＶ単離物の完全なゲノムが核酸水準で７４％より高い相同性を表す、またはＨＣＶ単離物のヌクレオチド７９３５位と８２７４位間にあるＮＳ５領域が核酸水準で７４％より高い相同性を表す、またはＨＣＶ単離物の完全なポリタンパク質がアミノ酸水準で７８％より高い相同性を表す、またはそのアミノ酸２６４６位と２７５８位間にあるＮＳ５領域がアミノ酸水準で８０％より高い相同性を表すＨＣＶ単離物の群に対応し、ここで上記番号は、ＨＣＶ−Ｊ単離物のＨＣＶポリタンパク質の最初のＡＴＧコドンまたはメチオニンから始まる（Ｋａｔｏら、１９９０）。異なるタイプのＨＣＶに属する単離物は核酸水準で７４％より低く、かつアミノ酸水準で７８％より低い相同性を表す。同じタイプに属する単離物が、同じサブタイプに属する時、核酸水準で通常約９２から９５％、かつアミノ酸水準で９５から９６％の相同性を表し、ならびに同じタイプに属するが異なるサブタイプに属するものは核酸水準で約７９％、かつアミノ酸水準で８５−８６％の相同性を表す。より好ましくはＨＣＶ単離物の分類は以下の事実に従い行われるべきである、
（１）ヌクレオチド７９３５と８２７４との間（Ｃｈｏｏら、１９９１）、または８２６１と８６００との間（Ｋａｔｏら、１９９０）、または８３４２と８６８１との間（Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９１）にあるＮＳ５ｂ領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じＨＣＶタイプに属する単離物は、０．３４より低く、通常は０．３３より低く、より通常では０．３２より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は０．１３５より低く、通常は０．１３より低く、より通常では０．１２５より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は０．１３５から０．３４の範囲、通常は０．１４から０．３３の範囲、より通常では０．１５から０．３２の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、および異なるＨＣＶタイプに属する単離物は０．３４より高く、通常は０．３５より高く、より通常では０．３６より高いヌクレオチドディスタンスを表し、
（２）ヌクレオチド３７８と９５７との間にあるコア／Ｅ１領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じＨＣＶタイプに属する単離物は、０．３８より低く、通常は０．３７より低く、より通常では０．３６より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は０．１７より低く、通常は０．１６より低く、より通常では０．１５より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は０．１５から０．３８の範囲、通常では０．１６から０．３７の範囲、より通常では０．１７から０．３６の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるＨＣＶタイプに属する単離物は０．３６より高く、通常は０．３６５より高く、より通常では０．３７より高いヌクレオチドディスタンスを表し、
（３）ヌクレオチド４６６４と５２９２との間（Ｃｈｏｏら、１９９１）、またはヌクレオチド４９９３と５６２１との間（Ｋａｔｏら、１９９０）、またはヌクレオチド５０１７と５６４５との間（Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９１）にあるＮＳ３／ＮＳ４領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じＨＣＶタイプに属する単離物は、０．３５より低く、通常は０．３４より低く、より通常では０．３３より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は０．１９より低く、通常は０．１８より低く、より通常では０．１７より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は０．１７から０．３５の範囲、通常では０．１８から０．３４の範囲、より通常では０．１９から０．３３の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるＨＣＶタイプに属する単離物は０．３３より高く、通常は０．３４より高く、より通常では０．３５より高いヌクレオチドディスタンスを表す。
【００５２】
本発明の好適な態様によれば、タイプ１を同定するために、配列番号５、２８および６を用いて設計された任意のプローブを使用することができる；タイプ２を同定するために、配列番号８から１２、または２２から２６、および３２から３４を用いた任意のプローブを使用することができる；ならびにタイプ３を同定するために、配列番号１３、１４、３６、２１、または５４を用いた任意のプローブを使用することができる；ならびにタイプ４を同定するために、配列番号１７、１８、または１９および３７から４３、および配列番号４９、５０および５３を用いた任意のプローブを使用することができる。
【００５３】
プローブ４４から４７はタイプ５を、プローブ４８はタイプ６を同定するために使用できる。
【００５４】
以下の領域は特定のタイプを識別するために使用できる：タイプ２について−２３８位から−２２３位間にある領域、タイプ４について−２４４から−２２９位間にある領域、タイプ３について−２５３位から−２３８位間、または−２７５位から−２６０位間、または−２９３位から−２７８位間にある領域。
【００５５】
−２位のヌクレオチドはさらに特定のタイプまたはサブタイプ間を識別するためにも使用できる。
【００５６】
本発明の方法はまたＨＣＶのサブタイプを識別および分類することを含んで成り、ここで上述のプローブに加えて、以下の標的領域とハイブリダイズするプローブ、あるいはＴがＵに置換されている該領域、またはこのように定義した領域に相補的な領域も使用される、
【００５７】
【表５】
2005040145.tif 000006
【００５８】
【表６】
2005040145.tif 000007
【００５９】
【表７】
2005040145.tif 000008
【００６０】
または使用するプローブは定義したプローブの中から選択されたふたつのプローブの組である。
【００６１】
本発明はまた分析すべき生物学的試料中に存在するＨＣＶサブタイプ（および複数のサブタイプ）の上記決定方法の使用に関する。
【００６２】
「サブタイプ」という用語は、同じ群の他の単離物のゲノムの対応部分に対して、ＨＣＶ単離物の完全なゲノムまたは完全なポリタンパク質が、核酸水準およびアミノ酸水準の両方で９０％より高い相同性を表す、またはＨＣＶ単離物のヌクレオチド７９３５位と８２７４位間にあるＮＳ５領域が核酸水準で８８％より高い相同性を表すＨＣＶ単離物の群を言う。ここで上記番号は、長ＯＬＲの開始コドンのアデニン残基から始まる。異なるＨＣＶサブタイプに属し、かつ同じＨＣＶタイプに属する単離物は、核酸水準で７４％より高く、かつアミノ酸水準で７８％より高い相同性を表す。
【００６３】
より好ましくはＨＣＶ単離物のタイプまたはサブタイプへの分類に関する上記方法は以下の事実に従い行われるべきである、
（１）ヌクレオチド７９３５と８２７４との間（Ｃｈｏｏら、１９９１）、または８２６１と８６００との間（Ｋａｔｏら、１９９０）、または８３４２と８６８１との間（Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９１）にあるＮＳ５ｂ領域中にある核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じＨＣＶタイプに属する単離物は、０．３４より低く、通常は０．３３より低く、より通常では０．３２より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は０．１３５より低く、通常は０．１３より低く、より通常では０．１２５より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は０．１３５から０．３４の範囲、通常では０．１４から０．３３の範囲、より通常では０．１５から０．３２の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるＨＣＶタイプに属する単離物は０．３４より高く、通常は０．３５より高く、より通常では０．３６より高いヌクレオチドディスタンスを表し、
（２）ヌクレオチド３７８と９５７との間にあるコア／Ｅ１領域中にあるの核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じＨＣＶタイプに属する単離物は、０．３８より低く、通常は０．３７より低く、より通常では０．３６より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は０．１７より低く、通常は０．１６より低く、より通常では０．１５より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は０．１５から０．３８の範囲、通常では０．１６から０．３７の範囲、より通常では０．１７から０．３６の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるＨＣＶタイプに属する単離物は０．３６より高く、通常は０．３６５より高く、より通常では０．３７より高いヌクレオチドディスタンスを表し、
（３）ヌクレオチド４６６４と５２９２との間（Ｃｈｏｏら、１９９１）、またはヌクレオチド４９９３と５６２１との間（Ｋａｔｏら、１９９０）、またはヌクレオチド５０１７と５６４５との間（Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９１）にあるＮＳ３／ＮＳ４領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じＨＣＶタイプに属する単離物は、０．３５より低く、通常は０．３４より低く、より通常では０．３３より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は０．１９より低く、通常は０．１８より低く、より通常では０．１７より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は０．１７から０．３５の範囲、通常では０．１８から０．３４の範囲、より通常では０．１９から０．３３の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるＨＣＶタイプに属する単離物は０．３３より高く、通常は０．３４より高く、より通常では０．３５より高いヌクレオチドディスタンスを表す。
【００６４】
これらの基準を使用してＨＣＶ単離物は少なくとも６つのタイプに分類することができる。
【００６５】
数種のサブタイプは、５’ＵＲ、および７９３５位と８２７４位の間にあるＮＳ５の部分を含むコード領域、およびヌクレオチド３１７と９５７の間にあるＣ／Ｅ１領域の相同性に基づき、ならびにＢｕｋｈらにより記載された（１９９３）単離物Ｚ１とＤＫ１３との比較に基づき、確実にタイプ１、２、３および４に識別できる（１ａ，１ｂ，２ａ，２ｂ，２ｃ，３ａ，３ｂ，３ｃ，４ａ，４ｂ，４ｃ，４ｄ，４ｅおよび４ｆ）。
【００６６】
さらにタイプ４のサブタイプ４ｇおよび４ｈへの細分は試案であり、５’ＵＲ中の差異に基づくだけである。報告されたほとんどの単離物、および本発明のタイピング系により提案された分類の総覧を表１に与える。
【００６７】
本発明の好適な態様によれば、配列番号３１を使用したプローブはサブタイプ１ａを同定するために使用でき；配列番号７および３０を使用したプローブはサブタイプ１ｂを同定するために使用でき；配列番号９、１０、２２、または２４を使用した任意のプローブはサブタイプ２ａを同定するために使用でき；配列番号１１、１２、２３、または２５を使用した任意のプローブはサブタイプ２ｂを同定するために使用でき；配列番号３３、または３４を使用した任意のプローブはサブタイプ２ｃを同定するために使用でき；配列番号１３、１４または３５を使用した任意のプローブはサブタイプ３ａを同定するために使用でき；配列番号３８、１９および２１を使用した任意のプローブはサブタイプ３ｂ、４ａまたは４ｄを同定するために使用でき；配列番号３８、または４１を使用した任意のプローブはサブタイプ４ｂを同定するために使用でき；配列番号４２、または４３を使用した任意のプローブはサブタイプ４ｃを同定するために使用でき；配列番号３９、４０または４１を使用した任意のプローブは同定するために使用でき：４ｅ，５１，３８，１９または７；４ｆ；配列番号４９、または５０を使用した任意のプローブは推定上のサブタイプ４ｈを同定するために使用でき；配列番号５０、または５３を使用した任意のプローブは推定上のサブタイプ４ｇを同定するために使用できる。
【００６８】
本発明の方法の好適な態様によれば、識別すべきＨＣＶタイプまたはサブタイプはＨＣＶのための万能プローブにより同定することができ、それは以下のひとつの領域を標的とするようなものである。
【００６９】
ＴＴＧ  ＧＧＣ  ＧＹＧ  ＣＣＣ  ＣＣＧ  Ｃ（Ｎｏ．２０）
ＴＣＴ  ＧＣＧ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＧＴＧ  Ａ（Ｎｏ．２７）
本発明の方法のもうひとつの有利な態様によれば、ハイブリダイゼーションの工程は標的する領域を含有するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの増幅工程によって進められ、有利に以下の工程を含んで成る：
タイプまたはサブタイプを決定すべき単離物を含有すると思われる生物学的試料を、標的する領域を含むプライマーの組と接触させ、ここで該プライマーはＨＣＶゲノムの保存領域と相補的であり、そして好ましくは、プライマーはＨＣＶゲノムの５’非翻訳保存領域に相補的であり、該プライマーは好ましくは少なくとも８個の連続的ヌクレオチド、より好ましくは約１５個の、さらにより好ましくは１５個より多くの連続的ヌクレオチドを有し、該連続的ヌクレオチドはそれぞれ第２図および第４図のヌクレオチド−３４１からヌクレオチド−１７１に伸長する領域、およびヌクレオチド−６７からヌクレオチド−１に伸長する領域から選ばれた配列に相補的である。
【００７０】
あるいは、アンチセンスプライマーもコア領域に伸長することができ、あるいはプライマーの組は５’ＵＲおよびコア領域の両方（ＰＣＲの１断片中にか、またはそれぞれふたつの領域のためのプライマーの組）を増幅することを目的としてもよいか、または目的とする。したがって、コア領域からのプローブは、コアＰＣＲ生成物中の（サブ）タイプに特異的な領域にハイブリダイズすることができ、タイプおよび／またはサブタイプをさらに識別するためのプローブアッセイ工程に含めることができ、
例えば上述のプライマーの組によるポリメラーゼ連鎖反応を介し標的領域を増幅させ、あるいはジゴキシゲニンまたはビオチンのような標識を増幅標的配列に取り込み、ここで該増幅は２０から８０回繰り返され、有利には３０から５０回繰り返される。
【００７１】
本発明の好適な態様によれば、被検体鎖は酵素的または化学的に、インビボまたはインビトロのいずれかでハイブリダイゼーションの前に修飾される。核酸化合物にレポーター群をカップリングさせるための多くの系が記載され、それらはビオチンまたはジゴキシゲニンのような標識の使用に基づいている。本発明のさらなる別の態様によれば、サンドイッチハイブリダイゼーションを使用できる。好適な態様において、被検体鎖に存在する標的配列はｃＤＮＡに転換され、ここで該ｃＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Ｓａｉｋｉら、１９８８）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、１９８８；Ｗｕ  ＆  Ｗａｌｌａｃｅ，１９８９；Ｂａｒａｎｙ，１９９１）、核酸配列を基本とした増幅（ＮＡＳＢＡ；Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０；Ｃｏｍｐｔｏｎ，１９９１）、転写を基本とした増幅系（ＴＡＳ；Ｋｗｏｈら、１９８９）、鎖置換増幅（ＳＡＤ；Ｄｕｃｋ，１９９０；Ｗａｌｋｅｒら、１９９２）またはＱｂレプリカーゼによる増幅（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８；Ｌｏｍｅｌｉら、１９８９）のような任意の周知技術によって増幅される。
【００７２】
ｃＤＮＡ増幅工程は好ましくはＰＣＲ法の手段により行われ、次の工程から成ることができる：
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応法のために、検出すべき標的配列を含むプライマーの組を提供し；
（ｂ）標的領域を、ポリメラーゼ連鎖反応を介して（ａ）のプライマーの手段により増幅させ；ならびに同工程中に、適当な標識分子を増幅標的中に取り込むことができ、該標識分子は好ましくはジゴキシゲニンまたはビオチンである。
【００７３】
「プライマー」と言う用語は、ＨＣＶゲノム由来のｃＤＮＡまたはＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の保存領域に相補的なオリゴヌクレオチド配列に対応し；好ましくはＨＣＶゲノムの５’非翻訳保存領域、ならびにより好ましくは−３４１位から−１７１位および−６７位から−１位を含むＨＣＶゲノムの５’非翻訳領域の保存、またはコア領域の保存領域から選択される。
【００７４】
本発明の有利な態様において、本方法は増幅が二重のＰＣＲ段階から成り、各段階に特別なプライマーの組が関与し、該第一段階はヌクレオチド−３４１から−ヌクレオチド−１８６に伸長する領域、およびヌクレオチド−５２からヌクレオチド−１に伸長する領域から選ばれた外側のプライマー、ならびに特に以下の組：
ＣＣＣ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＣＴＷ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＣＧＣ（Ｎｏ．１）
ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＧ  ＴＣＴ  ＡＣＧ  ＡＧＡ  ＣＣＴ  （Ｎｏ．２）
あるいはこれらの相補鎖が関与し、
配列中、ＷはＡまたはＴを表し、ならびに該第二段階はヌクレオチド−３２６からヌクレオチド−１７１に伸長する領域、およびヌクレオチド−６８からヌクレオチド−１に伸長する領域から選ばれたネストプライマー、ならびに特に以下の組：
ＴＣＴ  ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＧＴＴ  ＡＧＴ  ＲＹＧ  ＡＧＴ  ＧＴ  （Ｎｏ．３）
ＣＡＣ  ＴＣＧ  ＣＡＡ  ＧＣＡ  ＣＣＣ  ＴＡＴ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＧＴ  （Ｎｏ．４）
配列中ＲはＡまたはＧ、およびＹはＴまたはＣを表し、
あるいはこれらの相補鎖が関与するものである。
【００７５】
本発明のこの態様によれば、二重ＰＣＲは第一回目では配列番号１および２に表される、またはそれらの相補的配列を含む外側プライマーを使用して行われ、ならびに第二回目では配列番号３および４に表される、またはそれらの相補的配列を含むネストプライマーを使用して行われる。
【００７６】
「適当な標識分子」という用語は、増幅のポリメラーゼ段階中に取り込まれる標識ヌクレオチドの使用を含むことができ、Ｓａｋａｉら（１９８８）およびＢｅｊら（１９９０）、ならびに当業者に周知の任意技術によって説明されるようなものである。
【００７７】
本発明で記載されているアッセイは当業者にとって明らかないくつかの方法によって改良することができる。例えばｃＰＣＲ反応は、ＲＮＡ−捕獲工程により進めることができる。
【００７８】
さらに別の態様によれば、本発明は少なくともひとつのオリゴヌクレオチドプライマーを含んで成る組成物に関し、該プライマーは好ましくは少なくとも１５個の連続的ヌクレオチドを有し、該連続的ヌクレオチドは、それぞれヌクレオチド−３４１位からヌクレオチド−１７１位に伸長する領域、およびヌクレオチド−６７位からヌクレオチド−１位に伸長する領域（第２図の）から選ばれた配列に相補的であるか、またはそれらの相補鎖である。
【００７９】
さらに別の態様によれば、本発明は好ましくは少なくとも１５個の連続的ヌクレオチドを有する少なくともひとつのオリゴヌクレオチドプライマーを含んで成る組成物に関し、該連続的ヌクレオチドは以下の任意の配列から選ばれる：
ＣＣＣ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＣＴＷ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＣＧＣ（Ｎｏ．１）
ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＧ  ＴＣＴ  ＡＣＧ  ＡＧＡ  ＣＣＴ  （Ｎｏ．２）
ＴＣＴ  ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＧＴＴ  ＡＧＴ  ＲＹＧ  ＡＧＴ  ＧＴ  （Ｎｏ．３）
ＣＡＣ  ＴＣＧ  ＣＡＡ  ＧＣＡ  ＣＣＣ  ＴＡＴ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＧＴ  （Ｎｏ．４）
配列中、ＷはＡまたはＴを表し、ＲはＡまたはＧを表し、およびＹはＴまたはＣを表し、
あるいはこれらの相補鎖である。
【００８０】
有利な態様によれば、生物学的試料に含有されるすべてのＨＣＶ単離物の同時タイピングに関する本発明の方法は、以下の要素のひとつを、上記に定義したプローブがすでに固定化されている固体支持体と接触させる工程を含んで成る：
試料中の遺伝物質がハイブリダイゼーションできるようにされている該生物学的試料、
または該生物学的試料中に含有された精製された遺伝物質、
または精製された遺伝物質に由来する単一のコピー、
または精製された遺伝物質に由来する増幅されたコピー。  
【００８１】
本発明の好適な態様によれば、上記に定義したプローブは固体支持体に固定化されている。
【００８２】
「固体支持体」という用語は、オリゴヌクレオチドプローブがカップルできる任意の支持体について言うことができ、ただしオリゴヌクレオチドはそのハイブリダイゼーション特性を保持しており、かつハイブリダイゼーションのバックグラウンドは低く保持されている。通常固体支持体はマイクロタイタープレートまたは膜（例えばナイロンまたはニトロセルロース）である。
【００８３】
膜への適用または固定化に先立ち、核酸プローブを修飾することは固定化を容易にするため、またはハイブリダイゼーション効率を向上させるために便利である。そのような修飾は、例えばホモポリマー  テイリング、脂肪族基、ＮＨ２基、ＳＨ基、カルボキシル基のような種々の反応性基のカップリング、またはビオチンまたはハプテンのカップリングを包含することができる。
【００８４】
本発明の有利な態様によれば、本方法は上記に定義した任意のプローブを以下の要素いずれかと接触させることから成る：
試料中の遺伝物質がハイブリダイゼーションできるようにされている該生物学的試料、
または該生物学的試料中に含有された精製された遺伝物質、
または精製された遺伝物質に由来する単一のコピー、
または精製された遺伝物質に由来する増幅されたコピー、ここで該要素は予め支持体上に固定化されている。
【００８５】
本発明はまた新規単離物のタイピングに関する。  より具体的には、本発明は既知のタイプまたはサブタイプとは異なる新規ＨＣＶタイプまたはサブタイプの検出法および識別法に関し、該方法は以下の工程を含んで成る：
生物学的試料中のＨＣＶ単離物が既知のどのタイプまたはサブタイプに属するかを上記に定義した方法により決定し、ここで該生物学的試料はあるいはＨＣＶ抗原または抗体アッセイ、または上記に定義したようなＨＣＶについての万能プライマーを使用することにより予めＨＣＶ含有であると決定されていてもよく、
上記に定義したふたつの任意のドメインから選ばれた領域を標的にすることができる少なくともひとつのプローブと陽性的にハイブリダイズしない試料が観察された場合には、その試料中に存在するＨＣＶタイプの完全なゲノムを配列決定するか、あるいは決定すべき新規タイプおよび／またはサブタイプの相当する５’非翻訳領域の部分（または複数の部分）を配列決定する。
【００８６】
生物学的試料中に存在する新規ＨＣＶタイプおよび／またはサブタイプの検出法および識別法は、有利には以下の工程を含んで成る（ここで新規タイプを同定する場合にはタイプ１、タイプ２、タイプ３、タイプ４、タイプ５、タイプ６とは異なるものであり；新規サブタイプを同定する場合にはタイプ１ＨＣＶ単離物についてはサブタイプ１ａおよび１ｂ、タイプ２単離物についてはサブタイプ２ａ、２ｂおよび２ｃ、タイプ３単離物についてはサブタイプ３ａ、３ｂおよび３ｃ、タイプ４単離物についてはサブタイプ４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇおよび４ｈ；タイプ５単離物についてはサブタイプ５ａ；タイプ６単離物についてはサブタイプ６ａとは異なるものである）。
【００８７】
分析すべき生物学的試料中のＨＣＶ単離物（複数のＨＣＶ単離物）が既知のどのタイプ（複数のタイプ）またはサブタイプ（複数のサブタイプ）に属するかを上記に定義した本発明の方法により決定し、ここで該生物学的試料はあるいはＨＣＶ抗原または抗体アッセイ、または上記に定義したようなＨＣＶについての万能プライマーを使用する手段により予めＨＣＶ含有であると決定されていてもよく、
上記に定義した任意のタイプ特異的またはサブタイプ特異的ドメインから選ばれた領域を標的にすることができる少なくともひとつのプローブとハイブリダイズしない試料が観察された場合には、より具体的にはタイプ１について配列番号５、２８および６と、タイプ２について配列番号８から１２または２２から２６および３２から３４と、タイプ３について配列番号１３、１４、３６、２１、または５４と、ならびにタイプ４について配列番号１７、１８、１９、３７から４３、４９、５０および５３と；ならびにサブタイプ１ｂについて配列番号７および３０と、サブタイプ１ａについて配列番号３１と、サブタイプ２ａについて配列番号９  １０  ２２または２４と、サブタイプ２ｂについて１１、１２、２３または２５と、サブタイプ２ｃについて配列番号３３または３４と、あるいはサブタイプ３ａについて配列番号１３、１４または３５と、サブタイプ３ｂ、４ａまたは４ｄについて配列番号３８、２１、および１９と、サブタイプ４ｂについて配列番号３８または４１と、サブタイプ４ｃについて配列番号４２または４３と；サブタイプ４ｅについて配列番号３９、４０または４１と、サブタイプ４ｆについて；配列番号５１、３８、１９または７と；推定のサブタイプ４ｈについては配列番号４９または５０と；推定のサブタイプ４ｇについては配列番号５０または５３とハイブリダイズしない試料が観察された場合には、試料中に存在するＨＣＶタイプの完全なゲノムを配列決定するか、あるいは決定すべき新規タイプおよび／またはサブタイプの相当する５’非翻訳領域の部分（または複数の部分）を配列決定する。
【００８８】
「新規単離物」とは、上述した９つの領域のいずれともハイブリダイズできないか、または現在知られているＨＣＶのタイプまたはサブタイプのひとつに適合すると正しく判断できる反応性を示すことができない単離物に対応する。本発明のこの特別な態様も以下の工程により行うことができる；
（ａ）ＨＣＶ抗体−陽性血清、または臨床的なＮＡＮＢ肝炎試料、または無作為な試料群をｃＰＣＲ（ｃＤＮＡ  ＰＣＲ）により調査し、
（ｂ）すでにｃＰＣＲ生成物を得た、これらの試料を使用してＨＣＶ  ＬｉＰＡを行い、ならびに
（ｃ）異常な反応性を表すＰＣＲ断片をクローニングおよび配列決定する。
【００８９】
本発明はまた生物学的試料中に存在するＨＣＶ、および／またはＨＩＶ、および／またはＨＢＶ、および／またはＨＴＬＶのタイプ（複数のタイプ）ならびにサブタイプ（複数のサブタイプ）の決定法に関し、この方法は以下の工程を含んで成る：
以下のプローブを提供し、
＊上記に定義した少なくともひとつのプローブ、好ましくは、プローブは上記に定義したものであり、ＨＣＶの遺伝子型決定（タイピングおよび／またはサブタイピング）が可能であり、ならびに以下の少なくともひとつのプローブ：
＊上記生物学的試料中に存在しうるＨＩＶタイプ１および／またはタイプ２のオリゴヌクレオチドを検出できるプローブ、ならびに／または
＊上記生物学的試料中に存在しうるＨＢＶサブタイプ、および／またはｓＡｇ突然変異体および／またはｃＡｇ突然変異体のオリゴヌクレオチドを検出できるプローブ、ならびに／または
＊生物学的試料中に存在すると疑われるＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−ＩＩのオリゴヌクレオチドを検出できるプローブ、
あるいは上記に定義したプライマーの組に加えて、少なくともひとつの次のプライマーを提供してもよく：ＰＣＲ反応の手段により、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、および／またはＨＢＶ、および／またはヒトＴ細胞リンフォトロピック（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）ウイルス（ＨＴＬＶ）オリゴヌクレオチドのそれぞれを増幅させるためのプライマーの組、ならびに生物学的試料中に存在するかもしれないＨＣＶ、およびＨＢＶおよび／またはＨＩＶおよび／またはＨＴＬＶのいずれかを増幅させ、
上述した上記定義のプローブと
＊試料中の遺伝物質がすでにハイブリダイゼーションできるようにされている生物学的試料、
＊または上記生物学的試料中に含有された精製された遺伝物質、
＊または精製された遺伝物質由来の単一コピー
＊または精製された遺伝物質由来の増幅コピー
とを、プローブとＨＣＶならびに少なくともひとつの次のウイルス、ＨＢＶ、および／またはＨＩＶ、および／またはＨＴＬＶの単離物の標的配列とがハイブリダイゼーションできる条件下で接触させ、
使用したプローブと生物学的試料に存在するかもしれない標的領域との間に形成した可能性のある複合体を検出する。
【００９０】
本態様によれば、生物学的試料中に存在するＨＣＶのタイプまたはサブタイプに加えて、本発明はまたＨＴＬＶ，ＨＩＶ，ＨＢＶのような任意の他の親から伝播したウイルスの単離物のタイプまたはサブタイプを決定する方法に関し、ひとつの同一ストリップにプローブを包含することを特徴とし、かつ該プローブは：
上記ＨＣＶの種々のタイプおよび／またはサブタイプ、
ヒト免疫不全症ウイルスＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２、
ヒトＴ細胞リンフォトロピックウイルスＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２、
種々のＨＢ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）変異体またはＨＢコア抗原（ＨＢｃＡｇ）またはＨＢプレコアＡｇ変異体、に特異的にハイブリダイズすることを特徴とする。
【００９１】
いくつかの試験試料において、種々の標的配列の特異的検出が臨床的な関連性を同時に提供する。これらのそれぞれの標的配列について、別個のハイブリダイゼーション試験が対応するプローブを使用して行われるべきである。（従来）技術を構成する種々のタイプ／サブタイプに特異的なプローブの組み合わせは、本発明により説明されるような新規かつ創意あるＨＣＶタイプ／サブタイプ−特異的プローブと組合わさり、ひとつの膜ストリップ上で、親から伝播したヒトのウイルス性疾患のための容易かつ信頼性のある一般的タイピングシステムを提供することができた。もし被検鎖の増幅が必要な場合には、プライマーの組を分別および分類すべきウイルス生体自体について提供できる。
【００９２】
本発明はまた固体支持体に関し、具体的には膜ストリップに関し、その表面の既知の位置には以下のプローブ、またはそれらの相補鎖、または上述したプローブであってＴがＵに置き換えられたものから選択されたものを含む：
上記の配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８から５４および９３から９６、ならびにこれらのプローブと、ＨＣＶ単離物が、区別されるべき生物学的試料中に含まれると思われるＨＣＶのリボまたはデオキシリボヌクレオチド鎖との間に、ハイブリダイゼーションがあるかどうかを決定するための対照を含む。
【００９３】
本発明の特に好適な態様によれば、プローブは膜ストリップに対して（横）線を引く様式（ｌｉｎｅ−ｗｉｓｅ  ｆａｓｈｉｏｎ）で固定化されている。
【００９４】
本発明のこの好適な態様において、各プローブの組は膜ストリップの定められた位置に適用され、配列番号５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７、配列番号２８から５４、および配列番号９３から９６から選択されたプローブ、ならびに結合体が結合するための対照線を含む。
【００９５】
本発明の好適態様の方法は、ＨＣＶ感染のタイプを素早く決定することを可能にする。このアッセイは少なくとも６つの異なるＨＣＶタイプ間を識別し、および少なくとも１８サブタイプ間を識別する能力を提供し、ならびにＨＣＶの新規タイプまたは（サブ）タイプを調査する良い道具である。例えば新規サブタイプ１ｃ，１ｄおよびタイプ７、ならびに他の新規（サブ）タイプは上述した領域中に特別な突然変異を含んでも良く、これは新規配列由来のタイプ−特異的プローブの手段によって特異的検出のために使用できる。
【００９６】
本発明はまたＨＣＶ単離物を含有すると思われる生物学的試料から少なくともひとつのＨＣＶ単離物をインビトロで識別するための、ならびにＨＣＶタイプサブタイプに従い分類するためのキットに関するものであり、該キットは以下のものを含む：
上記に定義された任意のプローブから選択された少なくともひとつのプローブ；
これらプローブとＨＣＶ単離物のｃＤＮＡおよび／またはＲＮＡとの間で行われるべきハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を作成するために必要な緩衝液または成分、
適当である時には、ハイブリダイゼーションの進行から生成するハイブリッドを検出するための手段。
【００９７】
本発明はまたＨＣＶ単離物を含有すると思われる生物学的試料から少なくともひとつのＨＣＶ単離物をタイピングするための、ならびにＨＣＶタイプおよびサブタイプに従い分類するためのキットに関するものであり、該キットは以下のものを含む：
場合によって、上記に定義されたひとつの万能プローブ；
本発明の任意のプローブから選択される少なくともひとつのプローブ、
これらのプローブとＨＣＶ単離物のｃＤＮＡおよび／またはＲＮＡとの間で行われるべきハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を作成するために必要な緩衝液または成分、
適当である時には、ハイブリダイゼーションの進行から生成するハイブリッドを検出するための手段。    
【００９８】
この態様によれば、本発明はまたＨＣＶ単離物の遺伝子型決定（タイピングおよび／またはサブタイピング）のためのキットに関し：
上記に定義したプローブの組、優先的に固体支持体に固定化されており、より優先的にはひとつの同一の膜に固定化されており、
場合によって上記に定義したプライマーの組、
ハイブリダイゼーション行うために、および形成したハイブリッドを検出するのに必要な緩衝液の組、を含む。
【００９９】
本発明はまた少なくとも以下のひとつのＨＣＶタイプ（ＨＣＶタイプ１、ＨＣＶタイプ２、ＨＣＶタイプ３、ＨＣＶタイプ４、ＨＣＶタイプ５、ＨＣＶタイプ６）に属するＨＣＶ単離物のタイピングのためのキットに関し、該キットは少なくともひとつの上記に定義したプローブ、
これらプローブと上記ＨＣＶ単離物のｃＤＮＡｓおよび／またはＲＮＡｓとの間で行われるべきハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を作成するために必要な緩衝液または成分；
適当な場合にはハイブリダイゼーションの進行から生成するハイブリッドを検出するための手段、を含む。
【０１００】
本発明は有利には、ＨＣＶタイプおよびサブタイプを識別ならびに分類するためのキットに関し、該キットは：
少なくともひとつの上記に定義したプローブ、
これらプローブと上記ＨＣＶ単離物のｃＤＮＡｓおよび／またはＲＮＡｓとの間で行われるべきハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を作成するために必要な緩衝液または成分；
適当な場合にはハイブリダイゼーションの進行から生成するハイブリッドを検出するための手段、を含む。
【０１０１】
配列番号１から５４および９３から９６由来のすべてのプローブは新規である。
【０１０２】
さらに配列番号１８、２９、３３、３４、３５、４０、４２、４３、４７、４９および５４のプローブは新規配列に由来する。
なお、各表について簡単な説明をしておく。
【０１０３】
表１
種々の分類系の概観。
【０１０４】
表２
第３図に示される結果の解説。
【０１０５】
表３
ＨＣＶ  ＬｉＰＡタイピングおよびＨＣＶ抗体アッセイの最終結果。
【０１０６】
血清学と関連したタイピングの要約が与えられている。ＩＮＮＯ−ＬＩＡ  ＨＣＶ  ＡｂアッセイはＮＳ４エピトープを使用したひとつの系列、ＮＳ５エピトープを使用したひとつの系列、およびコアエピトープを使用した４つの系列を含む。コア系列について最高点が与えられただけである。信号の強さは数で与えられる：０＝陰性；９＝不確定；１−３＝陽性。抗体試験の最終的解釈はＬＩＡ欄に与えられる：１＝陽性；０＝陰性；９＝不確定。
【０１０７】
Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＨＣＶ  Ａｂで試験した血清の信号対ノイズの比が与えられている血清もある。
【０１０８】
表４
プライマーおよびプローブのヌクレオチド配列、位置および方向。
【０１０９】
表５
ＨＣＶの新タイプおよびサブタイプから設計された新プローブの概観。分類が可能な、または向上したタイプおよびサブタイプ、配列、および配列番号を示す。
【０１１０】
＊はすべての単離物をタイピングまたはサブタイピングしていないプローブを表し、該タイプまたはサブタイプを表すことが見いだされた。下線の文字は暫定的なサブタイプへの分割を表す。
【０１１１】
表６
ＢＥ９０，ＢＥ９１，ＢＥ９２，ＢＥ９３，ＢＥ９５，ＧＢ３５８，ＧＢ５４９，およびＧＢ８０９と、公表されているヌクレオチド７９３５から８２７４（本発明中で使用した番号に従う）由来のＨＣＶ  ＮＳ５領域中の配列との間の配列相同性。同一サブタイプ内の相同性得点は際立っている。相同性を計算するために使用した公表配列はＥＭＢＬのデーターベースから取り、以下の受け入れ番号を持つ：１Ｍ６２３２１、２Ｄ１０７４９、３Ｍ６７４６３、４Ｄ９０２０８、５Ｘ６１５９６、６Ｌ０２８３６、７Ｍ８４７５４、８Ｄ１０７５０、９Ｄ１１１６８；Ｄ０１１７１、１０Ｓ３８２０４、１１Ｍ５８３３５、１２Ｄ１００７８、１３Ｄ１００７９、１４Ｄ１００８０、１５Ｄ１００８１、１６Ｄ００９４４、および１７Ｄ０１２２１。これらすべてが完全ゲノムを表すが、ＮＳ５配列が公表されている１２、１３、１４、１５および１８は除く。１８はＣｈｉｒｏｎの特許（国際特許第９２／１９７４３）、配列番号１８に公開されている。
【０１１２】
＜実施例＞
世界の各地から得たＨＣＶ単離物の天然変異体を研究するために、ＨＣＶ単離物のタイピングおよびサブタイピングに関する迅速な手段をラインプローブアッセイ（ＬｉＰＡ）の様式で開発した。
【０１１３】
本質的に、取り込まれたビオチン化ｄＵＴＰを含有するｃＰＣＲ断片を、ニトロセルロース膜上に固定化したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。安定なハイブリダイゼーション二重鎖を次にストレプトアビジン−標識アルカリホスファターゼにさらし、続いてＮＢＴ（ニトロ４２ブルー  テトラゾリウム）およびＢＣＩＰ（ブロモクロロ−インドリル  リン酸）で発色させる。ｃＰＣＲ断片は任意のＨＣＶ  ＲＮＡの５’ＵＲから、高度に保存されたプライマーの組を使用して合成される。タイピングに使用されるオリゴヌクレオチドは、ｃＰＣＲ断片の内部のタイプ−特異的可変部に対して向けられている。事実、直線配列中の−１７０と−１５５位との間、および−１３２と−１１７位との間の可変領域が、折りたたまれたウイルスＲＮＡ中のステムの部分となることができ、第一領域の突然変異が第二領域のもうひとつの突然変異により補足され、ＲＮＡの二重鎖形成ができるか、またはできない。変異および保存はＨＣＶの他の新タイプにも同一位置で同様に起こると思われ、それゆえにこの可変領域は現在の、および未だ発見されていないが今後発見されるであろうすべてのＨＣＶタイプを識別するための道具として残るかもしれない。さらに、５’ＵＲと比較してより高い可変性がコア、ＮＳ３およびＮＳ５領域中で観察され、これらの領域中で、万能プライマーの組を採用するタイピングはもはや理にかなったものではないだろう。
【０１１４】
本発明で提案した命名は暫定的なものであり、国際委員会により提出されるかもしれない新しいガイドラインに従いさらに補正に供されることにもなろう。例えばサブタイプ４ａはもうひとつのタイプ４サブタイプ（４ｃまたは４ｅのような）に変更されるかもしれないし、ならびにタイプ４はタイプ５または６に変更されるかもしれない。そのような場合にはタイプ４ａは例えば６ｃになるかも知れない。しかし新しい分類が、本発明で提案されたプローブの手段によりタイプまたはサブタイプに分類された単離物の特定群の分類を妨害するものではないだろう。
【０１１５】
実施例１．タイピングおよびサブタイピングのために使用した血清試料
６１のブラジル人試料（ＢＲ１からＢＲ６１）を、ＨＣＶ  抗体  ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｉｎｎｏｔｅｓｔ  ＨＣＶ  Ａｂ，  イノジェネティックス：Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）およびＩｎｎｏＬＩＡ  ＨＣＶ  Ａｂ  試験（イノジェネティックス）で試験した。初めの２３の血清試料は（ＢＲ１からＢＲ２３）は、ＡＬＴレベルが高い、またはＩｎｎｏ−ＬＩＡの結果が陽性である血液透析者、あるいは受容者がＮＡＮＢ肝炎疾患を発病している供与者の血液、のいずれかから採取した。他の１４（ＢＲ２４からＢＲ３７）の血清試料は無作為に選択した；残りの２４の血清は（ＢＲ３８からＢＲ６１）は、それらのＬＩＡパターンに基づき選択した。後者のほとんどがＬＩＡのＮＳ４およびＮＳ５合成ペプチドと僅かに陽性、不確定、または陰性の反応性を示した。以下の血清もこのタイピング試験に含まれた：日本人の２種のプール血清（ＪＰ６２および６３）、ベルギー人の６種の血清（ＢＥ６４からＢＥ６９）、オランダからの４種の血清（ＮＥ７０からＮＥ７３）、ブルンディーからの６種の血清（ＢＵ７４からＢＵ７９）およびガボンからの２種の血清（ＧＢ８０およびＧＢ８１）。これらはすべてＩｎｎｏ−ＬＩＡ  ＨＣＶ  Ａｂアッセイ系で試験された。血清ＢＵ７４からＢＵ７８は抗−コア抗体について陽性であるだけだったが、一方血清ＢＵ７９はＮＳ５系にのみ反応した。２種のガホン人から血清はＬＩＡ  ＨＣＶ陰性（Ｉｎｎｏ−ＬＩＡ  ＨＣＶ）、  ＨＩＶ陰性（ＩｎｎｏｔｅｓｔＨＩＶ）であったが、ＨＴＬＶ陽性（ＩｎｎｏｔｅｓｔＨＴＬＶ）であった。ベルギーからの１種の血清（ＢＥ６９）およびオランダからの１種の血清（ＮＥ７３）は完全に陰性であった。ＮＥ−血清の３種（ＮＥ７１からＮＥ７３）が第二世代の  ＲＩＢＡ  試験（オルソ  ダイアグノスティックス  社：Ｏｒｔｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）に陰性であったので選択した。
【０１１６】
実施例２．ｃＰＣＲ、ＰＣＲ生成物の分析、およびクローニング
ＰＣＲ反応に使用したプライマーは、種々のＨＣＶタイプの５’ＵＲの保存領域に相補的であった。タイプ１およびタイプ２配列（Ｋａｔｏら、１９９０；Ｎａｋａｎｏら、１９９１；Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９１）、ならびに我々のタイプ３クローン（ＢＲ５６；受け入れ番号Ｄ１３４４８、ＣＣＪＪＢ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ  ＤＮＡ  データベース、１９９２年１０月２１日寄託）をアニーリングさせるために、縮退が含まれた。外側ＰＣＲプライマー配列（ＨｃＰｒ９８、配列番号１およびＨｃＰｒ２９、配列番号２）、ならびにネストＰＣＲプライマー（ＨｃＰｒ９５、配列番号３およびＨｃＰｒ９６、配列番号４）を表４に表す。種々の血清タイプの検出のために使用したプローブも表４に掲示する。すべてのオリゴヌクレオチドは３９２ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（アプライド  バイオシステムズ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で合成した。
【０１１７】
ウイルスＲＮＡを、わずかに変更を加えたが本質的にＣｈｏｍｃｚｙｎｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（１９８７）に記載されたように抽出した。ＲＮＡを２０μｇのＤｅｘｔｒａｎ  Ｔ５００（ファルマシア；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と共沈させた。このＲＮＡペレットを簡単に乾燥し、１０μｌのＤＥＰＣ−処理Ｈ２Ｏ中に再懸濁した。２μｌの１５０ｎｇ／μｌの無作為プライマー（ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ：ファルマシア）を加え、６５℃で１０分間変性させた後、第一鎖のｃＤＮＡ合成を２０μｌについて２５ＵのＨＰＲＩ（アマシャム；Ａｍｅｒｓｈａｍ）、５００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ、１×ＡＭＶ緩衝液（ストラタジーン；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、および２．５ＵのＡＭＶ−ＲＴ（ストラタジーン）の存在下にて４２℃で行った。生成したｃＤＮＡの７μｌを外側ＰＣＲ中で４０サイクルにわたって増幅させ、各サイクルは全容量５０μｌにて９５℃で１分、５５℃で１分、および７２℃で１分から構成されていた。溶液を最終濃度２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ、１×Ｔａｑ緩衝液（ストラタジーン；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、０．２μＭの各プライマー、ならびに１ＵのＴａｑポリメラーゼ（ストラタジーン）に調整した。第一回の増幅生成物の１μｌを、ネストプライマーで再度、同一組成の緩衝液中で４０サイクル増幅させた。ＨＣＶタイピングについては、ネストＰＣＲは４０μＭのＢｉｏ−１１ｄＵＴＰ（シグマ；Ｓｉｇｕｍａ）および１６０μＭのｄＴＴＰを含有した。外側、およびネストＰＣＲ生成物の両方を次に２％の低融点（ニシーブ  ジーティージー、エフエムシー：ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧ  ＦＭＣ）／１％ウルトラプュア（Ｕｌｔｒａ  Ｐｕｒｅ：ギブコ  ビーアールエル：Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）アガロースゲルを使用した電気泳動に供した。エチジウムブロマイド染色後、ＰＣＲ断片をアガロースゲルから切り出し、ＤＮＡを０．４５μｍＨＶ膜（ミリポア；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通過させる遠心により回収して、２度のフェノール／クロロホルム抽出および２度のエーテル抽出を行うことにより精製し、沈殿させ、続いてＴ４ポリメラーゼ（ベーリンガー；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で処理し、Ｔ４キナーゼ（ベーリンガー）でリン酸化し、最終的にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（−）（ストラタジーン）の脱リン酸化Ｅｃｏ  ＲＶ部位に連結した。プラスミドＤＮＡの調製は、アルカリ溶解法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）に記載されているように行った。配列決定反応は、デアザ  Ｇ／Ａ  Ｔ７  シークエンシング  ミックス（Ｄｅａｚａ  Ｇ／Ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｉｘｅｓ；ファルマシア）を使用することにより、Ｔ７およびＴ３プライマーを用いて二重鎖プラスミドＤＮＡについて行った。
【０１１８】
これらの配列決定反応の結果を第２図に表す。以下の配列がＤＮＡデータベースに寄託された（ＢＲ５６：ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ジーンバンク受け入れ番号Ｄ１３４４８；ＢＵ７４：ＤＤＢＪ／ＥＭＬ／ジーンバンク受け入れ番号Ｄ１３４４９；ＢＵ７９：受け入れ番号Ｄ１３４５０；ＧＢ８０：受け入れ番号Ｄ１３４５１；ＧＥ８１：受け入れ番号Ｄ１３４５２；ＧＰ６２：受け入れ番号Ｄ１３４５３）。
【０１１９】
ＨＣＶ−感染患者からの血清ＲＮＡをｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用し、これを次にネストＰＣＲのための鋳型とした。ふたつのプライマーの組が、外側反応のためにはＨｃＰｒ９８（配列番号１）およびＨｃＰｒ２９（配列番号２）、ならびにネストＰＣＲ反応のためにはＨｃＰｒ９５（配列番号３）およびＨｃＰｒ９６（配列番号４）（表４）が設計された。これら４種のプライマーは公表された配列（Ｋａｔｏら、１９９０；Ｎａｋａｏら、１９９１；Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９１）、ならびに単離物ＢＲ５６（第２図参照）の非翻訳領域から得たクローンの配列に合うように選択された。入れ子状に重複したＰＣＲの結果の増幅生成物は２３５塩基対（ｂｐ）の長さである。Ｂｉｏ−１１−ｄＵＴＰの取り込みにより、アガロースゲル電気泳動後に視覚的に明らかな移動度の減少がある（第１図）。すべての異なるＨＣＶタイプについてＤＮＡ断片の大きさが同じであることは、制限酵素消化またはハイブリダイゼーションのような第二の実験が分類に必要であることを示唆している。それゆえに平行線として適用されているＨＣＶ−特異的オリゴヌクレオチドプローブを含有している膜片が開発された。これらの片は、合成中にビオチン化ヌクレオチドが中に取り込まれた５’ＵＲのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの後、アルカリフォスファターゼで標識したストレプトアビジンを加え、ハイブリダイゼーション中に形成されたビオチン化ハイブリッドに結合するようになる。ＮＢＴ／ＢＣＩＰとインキュベーションした後、紫色の沈殿が現れる。
【０１２０】
実施例  ３．ラインプローブアッセイ（ＬｉＰＡ）片の調製
１６−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（種々のタイプまたはサブタイプのＨＣＶに特異的である；表４、番号５から２７）の３’末端にｐｏｌｙ−（ｄＴ）尾を以下のように付けた：２０ｐｍｏｌのプライマーを２５μｌの緩衝液中（３．２ｍＭのｄＴＴ，２５ｍＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム、１ｍＭのＣｏＣｌ２、０．１ｍＭのジチオスレイトール、および６０Ｕのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ファルマシア）を含有する）にて３７℃で１時間インキュベーションした。反応を２．５μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加えて止め、ならびに２０×ＳＳＣ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）で最終濃度が６×ＳＳＣとなるまで希釈し、２．５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド／μｌを反応させた。
【０１２１】
この溶液の１ｐｍｏｌをニトロセルロース膜上に４ｍｍ離して適用した。結合体用の対照として、ビオチン化ＤＮＡを並べて適用した。オリゴヌクレオチドを８０℃に２時間焼いて膜に固定した。膜を次に４−ｍｍの片に切断した。  
【０１２２】
実施例４．ＬｉＰＡ試験ハイブリダイゼーションおよび発色
１０μｌのネストＰＣＲ増幅生成物（取り込まれたＢｉｏ−１１ｄＵＴＰ含有）を１０μｌの４００ｍＭ  ＮａＯＨ／１０ｍＭ  ＥＤＴＡと混合し、室温（ＲＴ）で１０分間インキュベーションする。次に１ｍｌの予め暖めた（３７℃）ハイブリダイゼーション緩衝液（３Ｍの塩化テトラメチルアンモニウム、（ＴＭＡＣｌ，メルク；Ｍｅｒｃｋ）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５×デンハーツ溶液（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）、０．６％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌの剪断サケ精子ＤＮＡを含む）を加え、ハイブリダイゼーションを水浴中にて振盪しながら４２℃で２時間行う（Ｊａｃｏｂｓら、１９８８）。ストリップを、ＲＴで５分間、１ｍｌの予め暖めた（３７℃）の洗浄緩衝液（３Ｍ  ＴＭＡＣｌ、０．２％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で２回洗浄し、次に５１℃で３０分間ストリンジェントな洗浄、ならびに簡単な洗浄工程をＲＴで行う。この時点で洗浄緩衝液をすすぎ溶液（Ｒｉｎｓｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＮａＣｌ、Ｔｒｉｔｏｎ、０．５％  ＮａＮ３を含むリン酸緩衝液；イノ−リパ（Ｉｎｎｏ−Ｌｉｐａ）、イノジェネティックス（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、アントワープ、ベルギー）に交換し、ストリップをＲＴで２回、１ｍｌですすぐ。最終的に、片を結合希釈物（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ：ＮａＣｌ、Ｔｒｉｔｏｎ、タンパク質安定化剤、０．１％  ＮａＮ３を含有するリン酸緩衝液：イノ−リア（Ｉｎｎｏ−Ｌｉａ）、イノジェネティックス、アントワープ、ベルギー）ですすぎ、４０００×に希釈したストレプトアビジンを含有する結合希釈物とインキュベーションし、アルカリフォスファターゼ（ギブコ  ＢＲＬ）でさらにＲＴで３０分間標識する。ストリップを再度すすぎ溶液で３回、基質希釈物（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ：ＮａＣｌおよびＭｇＣｌ２を含有するＴｒｉｓ緩衝液：イノ−リア、イノジェネティックス、アントワープ、ベルギー）で１回洗浄する。発色はＢＣＩＰおよびＮＢＴを基質希釈物に加えて、このストリップをＲＴで３０分間インキュベーションすることにより行う。発色は緩衝液を蒸留水と交換することにより停止する。
【０１２３】
実施例  ５．ＨＣＶタイプ１、２および３間を識別するためのＬｉＰＡ
タイプ３に対するプローブのための配列を血清ＢＲ５６（受け入れ番号Ｄ１３４４８）由来のｃＰＣＲクローンから得た。公表されたタイプ１配列をＢＲ５６と比較した時、４から６個の変異を含む１６ヌクレオチドのふたつの領域が、いつも観察された。驚くことには、タイプ２配列が入手できるようになった時、これらふたつの領域での変異が再び維持されていたことである。ゆえに、タイピング用プローブの位置はこれらの領域中から選ばれ、その領域はタイプ間で比較的低程度の相同性を有するが、ひとつのタイプの中ではよく保存されていた。第一ストリップは全部で８つの別個に固定化されたオリゴヌクレオチドが適用された。それらのふたつはＨＣＶタイプ１（ＨｃＰｒ１２４、配列番号５、およびＨｃＰｒ１２５、配列番号６）に、４つはＨＣＶタイプ２（ＨｃＰｒ１３６、（配列番号９）およびＨｃＰｒ１３７、（配列番号１０）はＨＣＶタイプ２ａに、ＨｃＰｒ１２６（配列番号１１）およびＨｃＰｒ１２７（配列番号１２）はタイプ２ｂに）に対し、ならびにふたつはＨＣＶタイプ３（ＨｃＰｒ１２８、配列番号１３、およびＨｃＰｒ１２９、配列番号１４）ＨＣＶに対するものであった（表４）。
【０１２４】
ｃＰＣＲ生成物を２３種のブラジル人血清（ＢＲ１からＢＲ２３）から合成し、ならびにハイブリダイゼーション後にその中の１７がタイプ１の１６ｍｅｒを認識した。４種のタイプ３血清がタイプ２ａ血清と共に見いだされた。血清ＢＲ２３をタイプ１およびタイプ３とコーインフェクションさせた。２種の日本人のプール血清を続いて試験した：ＪＰ６３はタイプ１およびタイプ２ａプローブと反応し、ＪＰ６２プールの大部分がタイプ２ａ配列を含有していた。プライマーＨｃＰｒ９５（配列番号３）とＨｃＰｒ９６（配列番号４）との間の領域のｃＰＣＲクローニングおよび配列決定後、ＪＰ６２（第２図）はタイプ２ａであると確定した。タイプ２ｂプローブであるＨｃＰｒ１２６（配列番号１１）およびＨｃＰｒ１２７（配列番号１２）は、ＪＰ６２がそれらとは反応しなかったが、それぞれたった１つか、および２つのヌクレオチドがＪＰ６２（受け入れ番号Ｄ１３４５３）の配列と異なっていた。それゆえに、選択したハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件はたいへんストリンジェントであり、このアッセイではわずかひとつの誤対合もハイブリダイゼーションを許さない。
【０１２５】
実施例  ６．サブタイプ間の識別
すべての入手可能なタイプ１コード配列を注意深く比較した後、ふたつのサブタイプ（１ａおよび１ｂ）を７９％の平均ゲノム相同性で明らかに区別できる。５’ＵＲ領域において、ＨＣＶ−ＪとＨＣＶ−１との間にたったふたつの変異が、ンフェストＰＣＲ生成物領域に観察されただけで、９８．８％の相同性を示した。ＨＣＶ−１（１ａ）とＨＣＶ−Ｊ（１ｂ）との間にはわずかふたつの変異が存在したが、−９９位で観察されるＡからＧへの転換はこれまでに調査したすべてのタイプ１ｂ単離物で起こることが観察された。それゆえに、プローブＨｃＰｒ１３８（配列番号７）へのハイブリダイゼーションは、Ｇへ置換した領域にも広がるが、タイプ１ｂ単離物であることを示している。
【０１２６】
すべての入手しうるタイプ３の５’ＵＲ配列（本発明：Ｂｕｋｈら、１９９２；Ｃｈａｎら，１９９２；Ｌｅｅら、１９９２）を比較する時、−１３９位での、共通なＧ（タイプ３ａ；ＨｃＰｒ１４０、配列番号１５）の存在、またはよりまれであるがＡ（タイプ３ｂ：ＨｃＰｒ１３９、配列番号１６）の存在により、単離物をふたつの群に分割できた。タイプ２ａとタイプ２ｂとの間（またはＫ２ａとＫ２ｂとの間）の識別は上記に報告したように可変領域中で行うことができた。
【０１２７】
タイプ１および３についてのこれらすべてのタイプ−およびサブタイプ−特異的プローブの組み合わせ（表４）は、１７種のブラジル人血清（すでにタイプ１を８つの１ａタイプ、および９つのタイプ１ｂ血清に特徴ずけられたもの）を分けることを可能にする。４つのタイプ３血清のうち３つがタイプ３ａ系とハイブリッドを形成した。コーインフェクションさせた血清ＢＲ２３のｃＰＣＲ断片中の異なる分子がタイプ１ｂおよびタイプ３ａの系とハイブリダイズした（第３図、第８ストリップ）。
【０１２８】
別の３８のブラジル人血清（ＢＲ２４からＢＲ６１）をこの新しいＬｉＰＡで試験した。これらの血清を選択するにあたっての最も有力な基準は、ＮＳ４およびＮＳ５エピトープに関する抗体の不存在であった。なぜならば以前の報告ではタイプ２およびタイプ３抗−ＮＳ４抗体と、タイプ１  ＮＳ４抗原との間に低度の交差反応があったからである（Ｃｈａｎら、１９９１）。３８のブラジル人血清のうちの１２がタイプ１ａと、１４がタイプ１ｂと、９がタイプ３ａと、２がタイプ３ｂと、ならびにひとつはタイプ１ｂおよびタイプ３ａとのコーインフェクションであると決定できた。すべての試験したブラジル人血清はタイプを決定できたと結論した。タイプ３サブタイプ間の識別に関連性があるかどうかを決定することが残る。ＴａおよびＴｂ単離物の５’ＵＲ由来の配列データ（Ｍｏｒｉら、１９９２）は公表されてないので、我々のタイプ３ａおよび３ｂの分割は未だ試験的なものである。血清学および塩基の読み取り枠についてのさらなるデータが、タイプ３およびタイプ４のサブタイプの決定を確立するためには必要である。
【０１２９】
実施例７．タイプ４単離物の同定およびタイプ４−特異的プローブのＬｉＰＡへの編入
６人のブルンディー人血清（ＢＵ７４からＢＵ７９）から増幅したＰＣＲ断片は、ストリップ上のいずれの１６−ｍｅｒとも反応できなかった。これらブルンディー人試料（ＢＵ７４：受け入れ番号Ｄ１３４４９（これはＢＵ７６と同一）、およびＢＵ７９：受け入れ番号Ｄ１３４５０；第２図）からの３つのＰＣＲ断片をクローン化し、配列決定した。以前記載されたほとんどのタイプとは明らかに異なる配列が得られた。ブルンディー人試料は互いに、およびＺ６（Ｂｕｋｈら、１９９２）と関連しており、タイプ３またはタイプ２よりもタイプ１により高い相同性を表す。しかしタイプ１とのほとんどの相違は、ここでも可変領域に位置していた。最も驚くべき発見は、ＢＵ７４およびＢＵ７６において、−１３９位と−１４０位の間にひとつの余分なヌクレオチドが存在することである。この結果は新規ＨＣＶタイプ（複数のタイプ）またはサブタイプ（複数のタイプ）が存在することに賛成の議論を支持し、これを暫定的にタイプ４と呼ぶ。これらアフリカ人から増幅できたウイルスの５’ＵＲ配列は、以前記載されたタイプとは、互いに大変異なった。それゆえにこれらの単離物は暫定的にタイプ４と命名した。アフリカから得られた同様な配列が、Ｂｕｋｈら（１９９２）の研究でも見られたが、ひとつはオランダからのものであった。第２図は、ヌクレオチド−２９１と−５５の間の領域において、この群内では最大８種の変異が可能であることを表す。タイプ４はさらにいくつかのサブタイプから構成されるようであり、すなわちこれらのサブタイプはタイプ１のサブタイプとは異なるようである。
【０１３０】
これらのデータを得た後、ＬｉＰＡは３つの点で改良された。第一にオリゴヌクレオチドＨｃＰｒ１４２（配列番号２０）（ひとつの縮退を持つ）が、ＰＣＲ生成物の存在を確認するための万能ＨＣＶプローブとして高度に保存された領域から選択された（表４）。第二に、３種のオリゴヌクレオチド（ＨｃＰｒ１４４、配列番号１７（ひとつの縮退をもつ）、ＨｃＰｒ１４５、配列番号１８およびＨｃＰｒ１４６、配列番号１９；表４）をタイプ４配列の同定のために合成した。第三に、万能タイプ２プローブを可変領域の外側から選択した（ＨｃＰｒ１４７、配列番号８、表４）、なぜならタイプ２の検出のための万能プローブを、−１７０位と−１５５位の間、および−１３２位と−１１７位との間の領域から選ぶことができなかったからである。
【０１３１】
この様式のＬｉＰＡで、ブルンディー人血清（表３）からの６ＰＣＲ断片を期待どおりタイプ４に分類した（第３図、第６および７ストリップ）。ふたつのガボン人血清、オランダからの４血清および６つのベルギー人血清も調査に含めた。ＧＢ８０からタイプ４ＨＣＶ５’ＵＲが増幅でき、これをクローン化し、および配列決定した（第２図）。他のガボン人血清ＧＢ８１はタイプ２（クローン化され、配列決定された、第２図）の変異体とタイプ４のコーインフェクションを表した。後者はＢＵ７９と同じタイピングパターン（第３図、第７ストリップ）を与えた。ＧＢ８１とタイプ２およびタイプ４プローブとの反応が、タイピングプローブ間の予期せぬ交差反応により起こるのか、または単にコーインフェクションの結果なのかを確かめるために、ｃＰＣＲ生成物をクローン化し、１７の別個のコロニーをＰＣＲおよびＨＣＶ  ＬｉＰＡに供した。１０（５９％）コロニーがタイプ４の挿入を含み、および７つがタイプ２を含み（４１％）、明らかに同一血清内で２つのタイプのＨＣＶのコーサーキュレーション（ｃｏ−ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）を示していた。３つのＮＥ−血清はＯｒｔｈｏ  ＲＩＢＡ試験に陰性、およびＩｎｎｏ−ＬＩＡ  ＨＣＶ  Ａｂ試験に陽性（ＮＥ７１）、不確定（ＮＥ７２）または陰性（ＮＥ７３）なので、タイプ３ａ単離物が存在することを示すことができた。第４のＮＥ血清は、Ｏｒｔｈｏ  ＲＩＢＡおよびＩＮＮＯ−ＬＩＡの両方によい反応性を示すが、タイプ１ａ単離物を含有した。最終的に、分析した６つのベルギー人血清から、ＢＥ６４からＢＥ６７がタイプ１ｂ株に感染していた。イタリアからの患者１人（ＢＥ６８）はタイプ２ａ感染であり、ならびにＢＥ６９はタイプ３ａ配列を含有した。後者は慢性の、ウイルス性−様のＮＡＮＢ肝炎の症例から得たものであったが、すべての第二世代アッセイ、ならびに抗−ＮＳ３、抗−Ｅ１および抗−Ｅ２リサーチアッセイに陰性であった。この血清はきわめて低いウイルス価を有し、および２年の間に採取された４つの別個の試料で、第二回のＰＣＲ後にわずかに陽性になり、ＨＣＶ診断ではネストＰＣＲの必要性を示した。ネストＰＣＲ断片の配列は、ＢＲ５６と同一であった。タイプ３株が示す変異は大変少ないので、このことは驚くことではなかった。
【０１３２】
全部で１９の種々のオリゴヌクレオチドを第３図に示すようなＬｉＰＡ片様式に使用した。いくつかのオリゴヌクレオチドは同じＨＣＶサブタイプに対しているので、タイプ２ａのためにプローブＨｃＰｒ１５６（配列番号２２）をＨｃＰｒ１５８（配列番号２４）とともにプールした。タイプ４に対するオリゴヌクレオチドは別個に適用した、なぜならこの時点ではコード領域からの配列情報が極めて少なく、したがってサブタイプへの分割（あるとすれば）は未だできないからである。いくつかのタイプ４配列中の余分な塩基の存在により、この群をさらにサブタイピングする試みの基礎をつくることができる。いくつかの代表的血清で得られた結果を第３図に表す。これらのストリップの解釈は表２に与えられる。
【０１３３】
この調査で６１のＰＣＲ−陽性ブラジル人ＨＣＶ血清のタイプが決定された。２０（３３％）の血清はタイプ１ａＨＣＶ感染を有し、２３（３８％）はタイプ１ｂ、１（１．５％）はタイプ２ａ、１５（２４．５％）はタイプ３、および２（３％）の血清はコーインフェクションであることが分かった。コーインフェクションされた血清であることはＢＲ２３（第１図、レーン９；第３図、ストリップ８）により図示される。残る２０の血清を５つの異なる国から集めた；８つの血清がアフリカにあるふたつの国から得たものであった。
【０１３４】
症例ＢＥ６７のような少数の場合において、タイプ１ｂＰＣＲ断片は３ｂサブタイププローブＨｃＰｒ１３９（配列番号１６）を認識した。これは血清ＢＥ６７の１ｂ配列が−１３９位でＴの代わりにＡを有することを推定することにより説明できる。ＪＰ６２（受け入れ番号Ｄ１３４５３）配列で得た結果は、オリゴヌクレオチド中のひとつの誤対合がハイブリダイゼーション信号を認めない点から、この推定がさらに支持される。単離物−特異的変異は５’ＵＲ中に散在しているので、タイプが与えられた単離物が別のタイプのサブタイピングプローブとハイブリダイズすることも可能である（第３図、ストリップ６および７を参照）。そのような反応性は、調べた単離物中にサブタイピングプローブの配列が存在することを示すにすぎない。しかしＧＢ８１について調査したように、血清がコーインフェクションしていない限り、多くのタイピングプローブとの反応性は観察されなかった。
【０１３５】
一般的に、タイプ１ａ  ｃＰＣＲ生成物がＬｉＰＡでハイブリダイズする時、プローブＨｃＰｒ１２４（配列番号５）、ＨｃＰｒ１２５（配列番号６）およびＨｃＰｒ１４２（配列番号２０）の配列がネストｃＰＣＲ断片中に存在しなければならない。したがって１８４ｂｐ（第２図）のうちの４８ｂｐ（２６％）が、即座にわかる。同じ理由から、ＨＣＶ  Ｊタイプと同様な単離物は配列中の３３％、ＨＣ  Ｊ６タイプは３５％、ＢＲ５６タイプは３４％、Ｚ６およびＢＵ７７タイプは２６％、ＢＵ７４タイプは４１％、ならびにＢＵ７９タイプは３２％が知られていると計算することができる。しかし、１６−ｍｅｒのいくつかの縮退から情報が損失することを考慮しなければならず、したがってこれらの割合は最大値である。にもかかわらず、この研究法はハイブリダイゼーション法による配列決定の考え方を支持するものである（Ｓｔｒｅｚｏｓｋａら、１９９１）。
【０１３６】
ＬｉＰＡと、我々のＬｎｎｏ−ＬＩＡ  ＨＣＶ  Ａｂアッセイのこれら血清の抗体反応性とを比較する時（表３）、遺伝子型とそれらの表現型（血清型）との間のいくつかの相関が明らかになる。ベルギー、オランダ、ガボン、およびブレンディーからのタイプ３および４血清すべての第二世代の抗体アッセイとの反応は、わずかに陽性、不確定、または陰性である。わずかに陽性の反応はほとんどが抗−コア抗体により起こるが、ＬＩＡ  ＮＳ４およびＮＳ５エピトープに対する抗体は通常存在しない。これは免疫的交差反応を起こすわずかに異なるだけのエピトープをコードする、コア配列の高度な保存に合致する。ＮＳ４およびＮＳ５領域に対するエピトープは高可変領域に位置し、ほとんどの免疫的交差反応を起こすことはできない。現在の抗体アッセイはタイプ１エピトープを含んでいるので、タイプ２、タイプ３およびタイプ４感染血清の数％が陰性の結果を示すであろうことは可能である。しかし、タイプ３ブラジル人血清がタイプ１  ＮＳ４およびＮＳ５抗原と交差反応しないという結論を、我々の結果からは導くことができない（表３）。無作為に選択した１４の血清（ＢＲ２４から３７；表３）については、ＬＩＡ反応性と９つのタイプ１ウイルスとの間に１００％の相関があった。４つのタイプ３血清から２つ（ＢＲ３４およびＢＲ３６）がＮＳ４と反応し、３つが（ＢＲ３３，ＢＲ３４およびＢＲ３５）がＮＳ５と反応した。ＢＲ３７はコーインフェクションゆえに考慮されなかった。単一のタイプに感染した７７の血清のすべての血清学的データを分析した時、タイプ１血清の５８％および４４％がそれぞれＮＳ４およびＮＳ５エピトープを認識した。これらの割合はやや低く、それは選択基準のためである。タイプ３血清については、３７％および５３％がそれぞれＮＳ４およびＮＳ５と反応した。より高い交差反応性は高−危険群で観察することができ、それは例えばヨーロッパの血液提供者を対象とした結果と比較した場合のブラジルから得たこれら試料である（本発明およびＣｈａｎら、１９９２）。そのような交差反応する血清は多回感染によって誘導されることができ、その中には同時に生じるものもあるが、その他は続けて起こるだろう。前の抗−ＨＣＶ記憶は新たなＨＣＶ感染により二次免疫され、ひとつのタイプのウイルスのコーサーキュレーションを起こすことができ、別のタイプに対する抗体を生じた。このような説明は、血清ＢＲ５６に関してあてはまり、この血清はＨＣＶタイプ３と決定されたが、タイプ１コア、Ｅ１，Ｅ２，ＮＳ３，ＮＳ４およびＮＳ５に対する抗体を含んでいた（データは示さず）。抗−タイプ３抗体がこの血清に存在するかどうかを決定することが残る。
【０１３７】
免疫応答の差異に加えて、種々のＨＣＶタイプは長期肝臓疾患に対する種々の経過も表し、それらはすでに報告されている（Ｏｋａｍｏｔｏら，１９９２ａ）。
【０１３８】
結論として、ＬｉＰＡはＨＣＶ感染のタイプを迅速に決定できる。このアッセイは異なる４つのＨＣＶタイプおよび８つのサブタイプ間を識別する能力を有し、新らたなタイプを決定するための良い手段である。
【０１３９】
さらに、このアッセイはｃＰＣＲ反応をＲＮＡ−捕獲ＰＣＲと交換することによりさらに改良できる。最終的に、このアッセイは遺伝子型、将来的に血清型と、臨床状態または疾患の結果との関連を確立するさらなる道具となることが証明できた。
【０１４０】
実施例８．新規タイプおよびサブタイプの識別、およびそれらを分類するために有用なプローブ  
ベルギーから得た単離物ＢＥ８２、ＢＥ９０、ＢＥ９１、ＢＥ９２、ＢＥ９３、ＢＥ９４、ＢＥ９５、ＢＥ９６、ＢＥ９７、ＢＥ９８；ガボンから得たＧＢ４８、ＧＢ１１６、ＧＢ３５８、ＧＢ５６９、ＧＢ５４９、ＧＢ８０９、ＧＢ４８７、ＧＢ７２４およびＧＢ４３８；カメルーンから得たＣＡＭ６００およびＣＡＭ７３６；をさらに研究するために確保した。なぜなら実施例３および４に従い、プローブ５から２７を含むＬｉＰＡによる遺伝子型の決定後に、異常な反応性が観察されたからである。５’非翻訳領域の配列を、実施例２に記載されたように配列番号１，２，３および４を使用するネストプライマーによるＰＣＲ法、クローニングおよび配列決定後に得た。これらのほとんどの単離物に関するＮＳ５コード領域中の配列情報が得られ、既知の配列との整合配列を第５図に表す。各サブタイプに関する典型的単離物のＮＳ５核酸、およびアミノ酸配列の相同性を、公表された単離物の配列と共に表６に与える。この計算は第４図に与えるように、タイプおよびサブタイプへの分類を可能にする。いくつかの原型配列を持つこれら新規の単離物の５’非翻訳領域のヌクレオチド整合配列も第４に与えられる。ＨＣＶ−１と比較すると数個の変異が観察できる。５’非翻訳領域中の同一変異は、コード領域中の同様な配列と相関するので、そのような変異は本発明において、新規タイプおよびサブタイプ−特異的プローブを設計するために採用する。
【０１４１】
ＢＥ８２はサブタイプ１ｂの単離物であるが、−９４位でＣ変異を表し、それゆえにプローブ７とは反応できなかった。ＮＳ５領域を配列決定した後に、この単離物がサブタイプ１ｂに属するものと結論できた。ゆえにプローブ３０（−９４位でＴおよびＣの縮退を含む）はサブタイプ１ｂのより良い遺伝子型決定をすることができるはずである。
【０１４２】
ＢＥ９０は、別のサブタイプ１ｂ単離物であるが、−１５９位でＴ変異を、および−１２６位でＧ変異を表すので、万能プローブ２０および２７、ならびにサブタイピングプローブ７とのみ反応した。ＮＳ５領域の配列決定では、単離物がサブタイプ１ｂに属することが分かった。プローブ２８（Ｔおよび−１２６位でのＣの縮退を含む）はタイプ１および６のよい遺伝子型決定ができるはずである。
【０１４３】
単離物ＢＥ９２は万能プローブ２０および２７に加えて、プローブ８および２６とのみ反応した。すなわちこの単離物はタイプ２と分類できるが、サブタイプを決定することはできなかった。それはプローブ２３、２４、２５または２６との反応性が観察できなかったからである。配列決定した後に、ふたつの新らたなモティーフをまさに観察することができた：ＧＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧ（プローブ３３により包含される）、およびＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＴＴＴＧＧＧ（プローブ３４により包含される）。ＮＳ５領域の配列決定では、同一タイプ内の分類と矛盾しないタイプ２ａとタイプ２ｂ単離物との相同性が明らかになったが、別のサブタイプではサブタイプ２ｃが提案された。
【０１４４】
単離物ＢＥ９３およびＢＥ９４はサブタイピング用プローブ１４と、いかなる反応性を表さなかった。５’非翻訳領域およびＮＳ５領域を配列決定した後、これらの単離物は３ａサブタイプに属すると結論した。ゆえに、プローブ３５のように−１１８位でＣおよびＡの縮退を含むプローブはサブタイプ３ａのよりよい遺伝子型決定を可能にするはずである。
【０１４５】
単離物ＧＢ４８、ＧＢ１１６、ＧＢ３５８およびＧＢ５６９は、ＬｉＰＡにおいてプローブ１７および１９で陽性のハイブリダイゼーション信号を表し、すでに報告されているタイプ４単離物と同一であることを示すが、単離物ＧＢ５４９およびＧＢ８０９は万能プローブとしか反応しなかった。５’非翻訳領域、およびＮＳ５の一部分の配列が得られた。第５および６図、ならびに表６からＧＢ３５８により表される単離物はタイプ４の同じサブタイプに属すると結論でき、それはサブタイプ４ａと提案される。しかし、ＧＢ５４９およびＧＢ８０９のいずれもサブタイプ４ａ、４ｂおよび４ｄ単離物と、ならびに互いに低い相同性を表すが、ＧＢ８０９はＺ４と同じサブタイプに属すると思われる。これらの相同性は同じタイプ４への分類に対応するが、タイプ４の異なるサブタイプへの分類である：ＧＢ５４９はサブタイプ４ｅへ、およびＧＢ８０９はサブタイプ４ｃへ分類することが提案される。単離物ＧＢ１１６，ＧＢ３５８およびＧＢ５６９から得た配列すべては、プローブ３８で検出可能であるモティーフ  ＡＡＴＣＧＣＣＧＧＧＡＴＧＡＣＣ、ならびに、プローブ１９で検出可能であるモティーフＴＴＴＣＣＧＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣを表す。したがってプローブ３８および１９は、サブタイプ４ａの検出および分類に有用である。プローブ３８はサブタイプ４ａ，４ｂ，４ｄ，４ｆおよび３ｂに特異的であり、一方プローブ１９はサブタイプ３ｂ、４ａ，および４ｄを認識するが、新タイプ３ｃおよび４ｆともハイブリダイズする。興味深いことには、新タイプ３ｂ配列ＨＣＶ−ＴＲがこれらのプローブと交差反応する。しかしタイプ３−特異的プローブ２１との反応性から、３ｂは依然タイプ３と分類できる。    ＧＢ５４９も特徴的なモティーフを表す。モティーフＡＡＴＣＧＣＣＧＧＧＡＣＧＡＣＣはプローブ４０で検出でき、および配列ＡＡＴＧＣＣＣＧＧＣＡＡＴＴＴＧはプローブ４１で検出しうる。したがってプローブ４０および４１はサブタイプ４ｂのサブタイピングに有用である。
【０１４６】
ＧＢ８０９と同一の反応性は、ＬｉＰＡにおいてカメルーンから得たふたつの試料ＣＡＭ６００およびＣＡＭ７３６で得られた。ＮＳ５領域を配列決定した後、これらの試料はＧＢ８０９と同一のサブタイプに属すると結論でき、ならびに５’非翻訳領域を配列決定した後に、すでにＧＢ８０９に存在するふたつの同一モティーフが再び検出された。すなわちプローブ４２で検出しうるモティーフＡＡＴＣＧＣＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣ、およびプローブ４３で検出しうるＡＡＴＧＣＴＣＧＧＡＡＡＴＴＴＧがサブタイプ４ｃに特徴的であることが分かり、プローブ４２および４３はサブタイプ４ｃの検出および分類用に有用であると思われる。しかしＺ４は、同じサブタイプ４ｃへの分類に対応するＥ１領域中に相同性を示すが、ここでも独自な５’ＵＲ配列を表し、プローブ７、５０および５３で検出できる。
【０１４７】
単離物ＧＢ４８７，ＧＢ７２４およびＢＥ９７の５’非翻訳領域中の新規配列が検出された。これらの単離物に関して、コード領域の配列情報に基づくのではない新なサブタイプの分類が暫定的に提案された。すべて３種の単離物がプローブ５０で検出可能な配列、ＴＧＣＣＴＧＧＡＡＡＴＴＴＧＧＧを表す。ＧＢ４８７はプローブ４９で検出可能な独自の配列ＡＡＴＣＧＣＣＡＧＧＡＴＧＡＣＣを表し、暫定的にサブタイプ４ｈに分類される。ＧＢ７２４およびＢＥ９７は、両方ともプローブ５３で検出可能な配列、ＧＧＡＡＴＣＧＣＣＡＧＧＡＣＧＡを含有し、暫定的にサブタイプ４ｇに分類される。
【０１４８】
タイプ４単離物は、通常−２３８位にＴ、および−２３５位にＡを表す。それゆえに、プローブ３７、３８および５１はより良いタイプ４の遺伝子型決定を行うことができるはずである。
【０１４９】
別の例において、ＢＥ９５はＬｉＰＡにおいてプローブ７および１７とのみハイブリダイズするが、すべての他の単離物とコード領域における低い約６８％の相同性を表す。しかしＢＥ９５と同じサブタイプへの分類（サブタイプ５ａと提案される）で一致し、ＢＥ９５に対する相同性を表すＢＥ９６は除外する。ＢＥ９５，ＢＥ９６およびＳＡ１はすべてプローブ４４で検出可能な同じモティーフ、ＧＡＧＴＧＴＣＧＡＡＣＡＧＣＣＴ；プローブ４５および４７で検出可能なＡＡＴＴＧＣＣＧＧＧＡＹＧＡＣＣ；プローブ４６で検出可能なＴＣＴＣＣＧＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣを表す。したがってプローブ４４、４５、４６および４７はタイプ５ａの遺伝子型決定のために有用である。
【０１５０】
配列はＢｕｋｈら（１９９２）により公表され、それらは独自のＣＡ挿入を−１４４および−１４５位の間に含む。これらの単離物は暫定的にタイプ６と分類され、およびプローブ４８の手段によって検出できる。
【０１５１】
新たなＣ型肝炎ウイルスが単離物ＢＥ９８から発見され、これはＬｉＰＡでプローブ１９とのみ反応した。５’非翻訳領域の配列には、プローブ５４で検出しうる新たなモティーフ、ＧＡＡＴＣＧＣＣＧＧＧＴＴＧＡＣが含まれる。コア領域の配列決定により、遺伝子型３ａおよび３ｂに対しおよそ等しく相違する相同性を表す配列が明らかとなり、この原型配列には新たなタイプ３ｃが提案される。
【０１５２】
単離物ＧＢ４３８は、プローブ３８および１９で検出しうるサブタイプ４ａに典型的な配列モティーフを含有するが、Ｅ１領域ではやはり異なる配列を表し、タイプ４ａ内の新たなサブタイプを表し、これをサブタイプ４ｆと命名した。サブタイプ４ａからの識別は配列番号５１および７を用いたプローブの手段によって行うことができる。
【０１５３】
プローブ２９はＢＥ９０の配列から得たもので、プローブ５１および５２はＧＢ７２４の配列から得たものであるが、特定のＨＣＶタイプまたはサブタイプの遺伝子型決定を向上させるために有用でありうる。
【０１５４】
実施例９：ヌクレオチドディスタンスの計算
系統発生分析
すでに公表された配列はＥＭＢＬデータベース、公開３５から得た。他の配列は本発明者により分析され、およびＤＤＢＪデータベースに寄託した。配列は系統学推論パッケージ、３．５ｃバージョン（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．５ｃ）フェルセンステイン、１９９３年３月（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍａｒｃｈ  １９９３）に対する連続的様式中に与えられた。同一長の配列のみが同じ計算に含まれた。使用したプログラムはＤＮＡＤＩＳＴ，ＰＲＯＴＤＩＳＴ，ＤＮＡＰＡＲＳ，ＰＲＯＴＰＡＲＳ，ＮＥＩＧＨＢＯＲ，ＳＥＱＢＯＯＴ，ＣＯＮＳＥＮＳＥおよびＤＲＡＷＴＲＥＥであった。最大ＤＮＡディスタンスの見込マトリックスは、Ｋｉｍｕｒａ−２パラメーター設定を使用してＤＮＡＤＩＳＴにより作成された。ブートストラップ分析はＳＥＱＢＯＯＴを使用して、２０００反復で行った。これらすべてのマトリックスをさらにＮｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ設定を使用しＮＥＩＧＨＢＯＲで分析し、ならびにＣＯＮＳＥＮＳＥで分析してコンセンサス樹系を計算した。ＳＥＱＢＯＯＴデータ設定もＤＮＡＰＡＲＳプログラムで１１３０回の反復で分析された。推定のタンパク質配列は、ＰＲＯＴＤＩＳＴで分析され、続いてＮＥＩＧＨＢＯＲで分析された。最終的にプログラムＤＲＡＷＴＲＥＥは系統発生樹系図の図形的出力を創造するために使用された。すべての分析はＳＵＮ  ＳＰＡＲＣ  ＩＰＸコンピューターステーションで行われた。
【０１５５】
ＮＳ５領域
Ｅｎｏｍｏｔｏらにより記載されたプライマーの組（１９９０）を使用して、１３の種々の単離物由来の３４０ｂｐ長のＮＳ５ｂ  ＰＣＲ断片を増幅、クローン化および配列決定した。このヌクレオチド配列を、ＰＨＹＬＩＰ  ３．５ｃ  パッケージのＤＮＡＤＩＳＴプログラム（Ｆｅｌｅｓｅｎｔｓｔｅｉｎ，１９９３）を使用して系統発生樹系図を作るために使用した。６つの主な群または‘タイプ’の多様性はこの根無し木の証明である。各群はさらにふたつ以上の亜群または‘サブタイプ’に細分することができた。以下の集団（緊密に関連した単離物から成る群）が作られた：１ａ、１ｂ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ａおよび５ａ。この集団化は反復２０００のＳＥＱＢＯＯＴ／ＤＮＡＤＩＳＴ／ＮＥＩＧＨＢＯＲ／ＣＯＮＳＥＮＳＥプログラムを使用する１００％のブートストラップ様式の再サンプルデータに現れた。ブートストラップ様式のＤＮＡＰＡＲＳ分析も同様な集団化を生じた。ＤＮＡＤＩＳＴマトリックスから、単離物間、タイプ間およびサブタイプ間の分子の進化的ディスタンスを計算できた。上記に示した分割された集団のみをこれらの計算に含めた。ひとつのサブタイプの単離物間でこの範囲は０．０１４８から０．１０６４（平均  ０．０６２３；標準偏差  ０．０１８１）であった。サブタイプ間のディスタンスは０．１６５４から０．２６７５（平均  ０．２３１２；標準偏差  ０．０１８２）であり、タイプ間では０．３５８１から０．６５４９（平均  ０．４９４２；標準偏差０．０４８５）の範囲であった。しかし例外も現れた。
【０１５６】
ＨＣ−Ｊ６と単離物ＢＥ９２との間のディスタンスは０．１５３９であり、ディスタンス間としては低いディスタンス値であるが、しかし同一サブタイプ間に属する単離物間で得られたどのような値よりもはるかに高かった。  ＨＣ−Ｊ６とＢＥ９２との間のＮＳ５ヌクレオチド配列の相同性は８６．２％だった。ブートストラップ様式のＤＮＡデータベースは両方の配列をこの場合９８．８％にまとめ、これはサブタイプ２ａ分類に関しては異議のあるところであるが、しかし分子進化的ディスタンスおよびＢＥ９２の５’ＵＲの配列から暫定的にこの単離物をサブタイプ２ｃに分類した。
【０１５７】
ＧＢ８０９はタイプ４ａ集団から、０．１５０９（最小／最大＝０．１３８４／０．１５９７）の平均ディスタンスに位置した。８７．４％の最大相同性がＧＢ８０９とＧＢ３５８（タイプ４ａ）の間に存在する。しかし、これらのデータから、観察された５’ＵＲ中の変異性と共に新たなタイプ４サブタイプ４ｃを作ることが可能になる。ＧＢ５４９は新たなサブタイプ４ｅを表し、ヌクレオチド水準で４ａ集団から０．２４２６のディスタンスを；サブタイプ４ｃから０．２４０３のディスタンスを；およびＧＢ４３８から０．１７３８のディスタンスを有する。単離物ＧＢ４３８はおそらく別のタイプ４サブタイプを表すかもしれないが、暫定的に４ｆと命名する。
【０１５８】
コア／Ｅ１領域
ＤＮＡＳＤＩＳＴプログラムを使用するヌクレオチド３７８と９５７との間にあるコア／Ｅ１領域に関する系統発生樹系図は６つの主要支脈を生じ、６つの異なる遺伝子型を表す。２０００回の反復でブートストラップ様式のリサンプリング分析から、１００％の確実性で、以下の集団を明らかにできた；サブタイプ１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａおよび４ａ。サブタイプ４ｃ、４ｅ、４ｆおよび５ａはひとつの単離物により表されるだけなので、この集団化はこれらには不適当である。ＤＮＡＤＩＳＴマトリックスに基づき、同一サブタイプに属する単離物に関する分子の進化的ディスタンスは、０．０４０２から０．１１１（平均０．０７７２、標準偏差０．０１９７）、サブタイプ間は０．１８６４から０．３５３５（平均０．２８３３、標準偏差０．０３５０）、およびタイプ間は０．３８２４から０．６２３０（平均０．４８９４、標準偏差０．０５５４）の範囲にあった。
【０１５９】
ＤＮＡＤＩＳＴマトリックスからのディスタンスはさらに、タイプ４中に少なくとも４つの異なるサブタイプが存在する証明を提供した。タイプ４ａは０．００８３の平均相互ディスタンスを有する；一方タイプ４ｃ、４ｅおよび４ｆでの平均は０．２６０２であった。サブタイプ４ｃおよび４ｆは４ｅから、それぞれ０．２０４７および０．１８６４離れており、一方４ｃと４ｆとの間のディスタンスは０．２３１６であった。
【０１６０】
ＮＳ３／４領域
すでに記載したタイプ３ａエピトープ領域（Ｓｔｕｙｖｅｒら１９９３ａ）およびＥＭＢＬデータバンクの他の配列を含むＤＮＡ配列は、ＤＮＡＤＩＳＴおよびＮＥＩＧＨＢＯＲを使用してヌクレオチドディスタンスを計算するために使用された。ＤＮＡＤＩＳＴマトリックスから単離物間の分子的進化のディスタンスは０．０４０７から０．１１８１（平均  ０．０８５５、標準偏差  ０．０１９０）、サブタイプ間は０．２２８１から０．２６０３（平均  ０．２４１６、標準偏差０．００９８）およびタイプ間は０．４０５２から０．６２４７（平均  ０．４８８９、標準偏差０．０５３１）の範囲であった。
【０１６１】
実施例１０
実施例の導入部、および前述の実施例中に記載したように、５’ＵＲの可変領域は遺伝子型に特異的な配列を、実施例８に記載したように新たに発見された遺伝子型中にも含むと期待され、従ってそのような新たな遺伝子型−特異的モティーフは、実施例８に記載したような遺伝子型−特異的プローブの手段によって再度検出されるべきである。それゆえに、プローブ３２および実施例８に記載したプローブ３１、３３、３４、３７、３８、４４、４５および４６を合成し、ニトロセルロース膜に適用し、実施例３および４に記載したようなビオチン−標識ＰＣＲ断片を用いたラインプローブアッセイを行った。ただしＰＣＲ断片の合成中に、ｂｉｏ−１１−ｄＵＴＰから取り込まれたものではなく、配列番号３および４を用いた５’−ビオチン化プライマー、または配列番号１および２を用いた５’−ビオチン化プライマーから取り込まれたビオチンを用いたＰＣＲ生成物の標識は除外した。
【０１６２】
第６図は、ＨＣＶのタイプ１ではないＨＣＶタイプ２の５’ＵＲ断片の、配列番号３２を用いたプローブへのタイプ−特異的ハイブリダイゼーションを表す。サブタイプ２ａおよび２ｂ単離物の両方が特異的にプローブ３２とハイブリダイズした。
【０１６３】
第７図において、配列番号３３および３４のプローブは、血清ＢＥ９２由来の遺伝子型２ｃ  ＰＣＲ生成物と特異的にハイブリダイズすることを表すことができた。一方遺伝子型２ａおよび２ｂ血清は、それぞれ２ａおよび２ｂ遺伝子型−特異的プローブとの特異的ハイブリダイゼーションを観察することができたが、これらのプローブ  （配列番号３３および３４）に対しては反応しなかった。新しい遺伝子型２ｃは、最近発見された他の遺伝子型２ｃとは異なるかもしれないと思われたので、このサブタイプの種類のための別の名前が提案できる。
【０１６４】
第８図は、タイプ４血清を用いて行ったラインプローブアッセイを表し、最も共通なタイプ４血清のプローブ３７および３８への特異的ハイブリダイゼーションを表す。
【０１６５】
第９図は、タイプ５ａ血清のプローブ４４、４５、４６およびプローブ７に対する特異的ハイブリダイゼーションを図解し、一方タイプ４血清の反応性は通常プローブ３１に限られ、プローブ４４から４６に対しては存在しない。それゆえに、配列番号１８のプローブのタイプ４およびタイプ５単離物の両方に対する混乱は、今では配列番号１９のプローブに加えて配列番号３７、３８、４４、４５、４６、７、３０、おび３１のプローブを遺伝子型４および５を識別するために採用することにより、便利に克服できる。
【０１６６】
実施例１１
実施例３および４で概説したような他のハイブリダイゼーション条件（温度および緩衝液）を使用することが好ましいかもしれない。それゆえに、配列番号９３、９４、９５および９６のプローブをニトロセルロース膜に適用した。第１０図は実施例４に記載されたようなタイプ４血清ＧＢ１１６およびタイプ５ａ血清ＢＥ９５を用いたラインプローブアッセイを表すが、以下が異なる：ＰＣＲ断片をＮａＯＨ／ＳＤＳ中で変性させた後、３×ＳＳＣ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８２））および１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）から成る１．０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（５０℃に予め暖めた）を変性ＰＣＲ生成物に加え、ハイブリダイゼーションを振盪湯浴中で５０℃、２時間行った。片を同じハイブリダイゼーション緩衝液で５０℃で３０分間洗浄し、その後実施例４に記載されたように洗浄および発色を行った。第１０図では、明らかなタイプ−特異的反応を観察できる。それゆえに、タイプ−特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションプローブにわずかに変更を加えた後に実施例４および１０中に記載されたような他のハイブリダイゼーション条件でも得られた。例えば特定のハイブリダイゼーション条件で、より特異的なハイブリダイゼーションを行うために、プローブの位置を変更することができ、例えばタイプ−特異的ヌクレオチドがプローブの中央部に位置するようにプローブを配置することができる。特定のプローブについて、他のハイブリダイゼーション条件中でも特異性を保持するために、連続的ＨＣＶ配列を長くし、または短くし、かつ／またはプローブのセンスを逆にして、特定の好ましい温度または塩濃度条件で遺伝子型−特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることも好ましいかもしれない。しかし場合によっては、イノシン類または誤対合ヌクレオチドを含めて、遺伝子型−特異的ハイブリダイゼーションが特定の温度または塩濃度条件で起こるようにすることが好ましいかもしれない。例えば配列番号３７のプローブは、タイプ４と５単離物間を実施例１０に記載したようなテトラメチルアンモニウムクロライド緩衝液中で識別できたが、いまでは連続的ＨＣＶ配列の３’末端を２ヌクレオチド延長することにより配列番号９３（５’−ＧＡＧＴＧＴＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＣ−３’）に変更され、プローブ９３はＳＳＣ／ＳＤＳハイブリダイゼーション緩衝液中で特異活性を表した（第１０図）。配列番号４４のプローブはタイプ４と５単離物間を実施例１０に記載したようなテトラメチルアンモニウムクロライド緩衝液中で識別できたが、いまでは連続的ＨＣＶ配列の３’末端を１ヌクレオチド延長することにより配列番号９６（５’−ＧＡＧＴＧＴＣＧＡＡＣＡＧＣＣＴＣ−３’）に変更され、プローブ９６はＳＳＣ／ＳＤＳハイブリダイゼーション緩衝液中で特異活性を表した（第１０図）。配列番号４６のアンチセンスプローブは、−１３２から−１１７の位置を標的とし、タイプ４と５の単離物間を実施例１０に記載したようなテトラメチルアンモニウムクロライド緩衝液中で識別できたが、今では配列ＩＳ番号９５（５’−ＴＧＣＣＣＧＧＡＧＡＴＴＴＧＧＧ−３’）に変更され、これは−１２６から−１１１の位置を標的とするセンスプロ���ブであり、プローブ９５はＳＳＣ／ＳＤＳハイブリダイゼーション緩衝液中で特異活性を表した（第１０図）。
【０１６７】
実施例では当業者に対して、実施例４に与えたような遺伝子型−特異的変異、または他の新たな、または今後発見される遺伝子型中に存在する遺伝子型−特異的変異を標的とするためのプローブを開発する多くの可能性を説明した。
【０１６８】
【表８】
2005040145.tif 000009
【０１６９】
【表９】
2005040145.tif 000010
【０１７０】
【表１０】
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【０１７１】
【表１１】
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【０１７２】
【表１２】
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【表１７】
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【０１７８】
引  用  文  献
Ｂａｒａｎｙ  Ｆ（１９９１），クローン化耐熱性リガーゼを使用する遺伝子疾患の検出およびＤＮＡ増幅（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｃｌｏｎｅｄ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ｌｉｇａｓｅ．）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：１８９−１９３．
Ｂｅｊ  Ａ，  Ｍａｈｂｕｂａｎｉ  Ｍ，  Ｍｉｌｌｅｒ  Ｒ，  Ｄｉ  Ｃｅｓａｒｅ  Ｊ，  Ｈａｆｆ  Ｌ，  Ａｔｌａｓ  Ｒ（１９９０）水中の病原細菌および指標を検出するための多重ＰＣＲ増幅および固定化捕獲プローブ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｉｎ  ｗａｔｅｒ．）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ４：３５３−３６５．  
Ｂｕｋｈ  Ｊ，  Ｐｕｒｃｅｌｌ  Ｒ，  Ｍｉｌｌｅｒ  Ｒ（１９９２）  Ｃ型肝炎ウイルスの５’非コード領域の配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５’ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ．）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４９４２−４９４６．  
Ｂｕｋｈ  Ｊ，  Ｐｕｒｃｅｌｌ  Ｒ，  Ｍｉｌｌｅｒ  Ｒ（１９９３）  世界中から集められた単離物の推定上のＥ１遺伝子の配列分析により予想されたＣ型肝炎ウイルスの少なくとも１２遺伝子型  （Ａｔ  ｌｅａｓｔ  １２  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ  ｂｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ｅ１  ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ．）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：８２３４−８２３８
Ｃｈａ  Ｔ，  Ｂｅａｌ  Ｅ，  Ｉｒｖｉｎｅ  Ｂ，  Ｋｏｌｂｅｒｇ  Ｊ，  Ｃｈｉｅｎ  Ｄ，  Ｋｕｇｏ  Ｇ，  Ｕｒｄｅａ  Ｍ（１９９２），少なくとも５つの関連した、しかし別個のＣ型肝炎ウイルス遺伝子型が存在する（Ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｆｉｖｅ  ｒｅｌａｔｅｄ，  ｂｕｔ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ，  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｅｘｉｓｔ．）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：７１４４−７１４８
Ｃｈａｎ  Ｓ，  Ｓｉｍｍｏｎｄｓ  Ｐ，  ＭｃＯｍｉｓｈ  Ｆ，  Ｙａｐ  Ｐ，  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｒ，  Ｄｏｗ  Ｂ，  Ｆｏｌｌｅｔｔ  Ｅ，（１９９１）  異なる３種のＣ型肝炎ウイルスによる感染に対する血清学的応答（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ．）Ｌａｎｃｅｔ  ３３８：１９９１．
Ｃｈａｎ  Ｓ，  ＭｃＯｍｉｓｈ  Ｆ，  Ｈｏｌｍｅｓ  Ｅ，  Ｄｏｗ  Ｂ，  Ｐｅｕｔｈｅｒｅｒ  Ｊ，  Ｆｏｌｌｅｔｔ  Ｅ，  Ｙａｐ  Ｐ，Ｓｉｍｍｏｎｄｓ  Ｐ（１９９２ａ）新規Ｃ型肝炎ウイルスタイプの分析、およびその現存する変異体に対する系統発生的関係（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｅｘｉｓｔｉｎｇ  ｖａｒｉａｎｔｓ．）  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：１１３１−１１４１．
Ｃｈａｎ  Ｓ，  Ｈｏｌｍｅｓ  Ｅ，  ＭｃＯｍｉｓｈ  Ｆ，  Ｆｏｌｌｅｔｔ  Ｅ，  Ｙａｐ  Ｐ，  Ｓｉｍｍｏｎｄｓ  Ｐ（１９９２ｂ）新規で高度に異なるＨＣＶタイプ（タイプ３）の系統発生的分析：感染に関する配列変異性の血清学的応答に対する効果。Ｃ型肝炎ウイルスおよび関連ウイルスを対象としたウイルス分子学および病原論（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｈｉｇｈｌｙ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ＨＣＶ  ｔｙｐｅ（ｔｙｐｅ３）：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｎ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｃｅｓ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．）  イタリア  ベニスでの第一回定例総会、抄録Ｄ５，７３．
Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  Ｐ，  Ｓａｃｃｈｉ  Ｎ  （１９８７）  グアニジニウム酸  チオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出による単回ＲＮＡ単離法（Ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｅｐ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １６２：１５６−１５９．
Ｃｈｏｏ  Ｑ，  Ｒｉｃｈｍａｎ  Ｋ，  Ｈａｎ  Ｊ，  Ｂｅｒｇｅｒ  Ｋ，  Ｌｅｅ  Ｃ，  Ｄｏｎｇ  Ｃ，  Ｇａｌｌｅｇｏｓ  Ｃ，  Ｃｏｉｔ  Ｄ，  Ｍｅｄｉｎａ−Ｓｅｌｂｙ  Ａ，  Ｂａｒｒ  Ｐ，  Ｗｅｉｎｅｒ  Ａ，  Ｂｒａｄｌｅｙ  Ｄ，  Ｋｕｏ  Ｇ，  Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  Ｍ  （１９９１）Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝的組織および多様性（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ．）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５．
Ｃｏｍｐｔｏｎ  Ｊ（１９９１）．核酸配列を基本とした増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．）  Ｎａｔｕｒｅ、３５０：９１−９２．
Ｄｕｃｋ  Ｐ（１９９０）キメラ環化オリゴヌクレオチドに基づくプローブ増幅系（Ｐｒｏｂｅ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ９，１４２−１４７．
Ｅｎｏｍｏｔｏ  Ｎ，  Ｔａｋａｄａ  Ａ，  Ｎａｋａｏ  Ｔ，  Ｄａｔｅ  Ｔ（１９９０）日本にはふたつのタイプのＣ型肝炎ウイルスが存在する（Ｔｈｅｒｅ  ａｒｅ  ｔｗｏ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  Ｊａｐａｎ．）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  １７０：１０２１−１０２５．
Ｇｕａｔｅｌｌｉ  Ｊ，  Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ  Ｋ，  Ｋｗｏｈ  Ｄ，  Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ  Ｋ，  Ｒｉｃｈｍａｎ  Ｄ，Ｇｅｎｇｅｒａ  Ｔ（１９９０）レトロウイルスによる複製後に模擬実験された多重酵素反応による核酸の等温のインビトロ  増幅（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ，ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ａ  ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌｅｄ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８．
Ｉｎｃｈａｕｐｓｅ  Ｇ，  Ａｂｅ  Ｋ，  Ｚｅｂｅｄｅｅ  Ｓ，  Ｎａｓｏｆｆ  Ｍ，  Ｐｒｉｎｃｅ  Ａ（１９９１）ポリメラーゼ連鎖反応による感染血清中のウイルスＲＮＡの検出のためのＣ型肝炎ウイルス由来保存領域の使用（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｓｅｒａ  ｂｙ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．）  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１４：５９５−６００．
Ｊａｃｏｂｓ  Ｋ，  Ｒｕｄｅｒｄｏｒｆ  Ｒ，  Ｎｅｉｌｌ  Ｓ，  Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  Ｊ，  Ｂｒｏｗｎ  Ｅ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ（１９８８）テドラアルキルアンモニウム塩溶液中ではオリゴヌクレオチド二重鎖の熱安定性は配列非依存的である：組み替えＤＮＡクローンの同定への応用（Ｔｈｅ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｉｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎ  ｔｅｄｒａａｌｋｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｅｓ）．Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １６：４６３７−４６５０．
Ｋａｎａｉ  Ｋ，  Ｋａｋｏ  Ｍ，  Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｈ（１９９２）慢性Ｃ型肝炎のＨＣＶ遺伝子型およびインターフェロンへの応答（ＨＣＶ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ．）  Ｌａｎｃｅｔ  ３３９：１５４３．
Ｋａｔｏ  Ｋ，  Ｈｉｊｉｋａｔａ  Ｍ，  Ｏｏｔｓｕｙａｍａ  Ｙ，  Ｎａｋａｇａｗａ  Ｍ，  Ｏｈｋｏｓｈｉ  Ｓ，  Ｓｕｇｉｍｕｒａ  Ｔ，  Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ  Ｋ（１９９０）非Ａ非Ｂ肝炎の日本人患者由来ヒトＣ型肝炎ウイルスゲノムの分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅｆｒｏｍ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎ−Ａ，ｎｏｎ−Ｂ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：９５２４−９５２８．
Ｋｕｂｏ  Ｙ，  Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｋ，  Ｂｏｏｎｍａｒ  Ｓ，  Ｋａｔａｙａｍａ  Ｔ，  Ｃｈｏｏ  Ｑ，  Ｋｕｏ  Ｇ，  Ｗｅｉｎｅｒ  Ａ，Ｂｒａｄｌｙ  Ｄ，  Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  Ｍ，  Ｓａｉｔｏ  Ｉ，  Ｍｉｙａｍｕｒａ  Ｔ（１９８９）日本にて輸血後の非Ａ非Ｂ肝炎に関わる供与者から単離したＣ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡ断片（Ａ  ｃＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ｄｏｎｏｒ  ｏｆ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｎｏｎ−Ａ，ｎｏｎ−Ｂ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｊａｐａｎ．）  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７：１０３６８−１０３７２．  
Ｋｗｏｈ  Ｄ，  Ｄａｖｉｓ  Ｇ，  Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ  Ｋ，  Ｃｈａｐｐｅｌｌｅ  Ｈ，  Ｄｉｍｉｃｈｅｌｅ  Ｌ，  Ｇｉｎｇｅｒａｓ  Ｔ（１９８９）転写に基づく増幅系、およびビーズ−を基本としたサンドイッチハイブリダイゼーション様式を用いた増幅ヒト免疫不全ウイルスタイプ１の検出（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ１  ｗｉｔｈ  ａ  ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔ．）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７．
Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  Ｕ，  Ｋａｉｓｅｒ  Ｒ，  Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｊ，  Ｈｏｏｄ  Ｌ（１９８８）リガーゼを仲介した遺伝子検出法（Ｌｉｇａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０．  
Ｌｅｅ  Ｃ，  Ｃｈｅｎｇ  Ｃ，  Ｗａｎｇ  Ｊ，  Ｌｕｍｅｎｇ  Ｌ（１９９２）５’非翻訳領域の非保存配列を用いたＣ型肝炎ウイルスの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｎｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ．）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３０：１６０２−１６０４  
Ｌｉｚａｒｄｉ  Ｐ，  Ｇｕｅｒｒａ  Ｃ，  Ｌｏｍｅｌｉ  Ｈ，  Ｔｕｓｓｉｅ−Ｌｕｎａ  Ｉ，  Ｋｒａｍｅｒ  Ｆ（１９８８）組み替えＲＮＡハイブリダイゼーションプローブの指数関数的増幅（  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＲＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ．）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７−１２０２．
Ｌｏｍｅｌｉ  Ｈ，  Ｔｙａｇｉ  Ｓ，  Ｐｒｉｎｔｃｈａｒｄ  Ｃ，  Ｌｉｓａｒｄｉ  Ｐ，  Ｋｒａｍｅｒ  Ｆ（１９８９）複製しうるハイブリダイゼーションプローブの使用に基づく定量的アッセイ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓｅｙｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔａｂｌｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ．）  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ３５：１８２６−１８３１．
Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ（１９８２）モレキュラークローニング：実験マニュアル。コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ＮＹ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）
Ｍｏｒｉ  Ｓ，  Ｋａｔｏ  Ｎ，  Ｙａｇｙｕ  Ａ，  Ｔａｎａｋａ  Ｔ，  Ｉｋｅｄａ  Ｙ，  Ｐｅｔｃｈｃｌａｉ  Ｂ，  Ｃｈｉｅｗｓｉｌｐ  Ｐ，  Ｋｕｒｉｍｕｒａ  Ｔ，  Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ  Ｋ（１９９２）タイ国における患者のＣ型肝炎ウイルスの新タイプ（Ａ  ｎｅｗ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｔｈａｉｌａｎｄ．）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  １８３：３３４−３４２．
Ｎａｋａｏ  Ｔ，  Ｅｎｏｍｏｔｏ  Ｎ，  Ｔａｋａｄａ  Ｎ，  Ｔａｋａｄａ  Ａ，  Ｄａｔｅ  Ｔ（１９９１）制限長多形によるＣ型肝炎ウイルスゲノムのタイピング（  Ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｂｙ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ．）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：２１０５−２１１２．
Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｈ，  Ｏｋａｄａ  Ｓ，  Ｓｕｇｉｙａｍａ  Ｙ，  Ｙｏｔｓｕｍｏｔｏ  Ｓ，  Ｔａｎａｋａ  Ｔ，Ｙｏｓｈｉｚａｗａ  Ｈ，Ｔｕｄａ  Ｆ，  Ｍｉｙａｋａｗａ  Ｙ，  Ｍａｙｕｍｉ  Ｍ（１９９０）Ｃ型肝炎ウイルスゲノムの５’末端配列（Ｔｈｅ  ５’ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ．）  Ｊａｐａｎ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ６０：１６７−１７７．
Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｈ，  Ｏｋａｄａ  Ｓ，  Ｓｕｇｉｙａｍａ  Ｙ，  Ｋｕｒａｉ  Ｋ，Ｉｉｚｕｋａ  Ｈ，  Ｍａｃｈｉｄａ  Ａ，  Ｍｉｙａｋａｗａ  Ｙ，  Ｍａｙｕｍｉ  Ｍ（１９９１）ヒトキャリアーから単離したＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡのヌクレオチド配列：報告された単離物の保存および異種領域の比較（  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ    ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈｕｍａｎ    ｃａｒｒｉｅｒ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｐｏｒｔｅｄ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ．）  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：２６９７−２７０４．  
Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｈ，  Ｓｕｇｉｕａｍａ  Ｙ，  Ｏｋａｄａ  Ｓ，  Ｋｕｒａｉ  Ｋ，  Ａｋａｈａｎｅ  Ｙ，  Ｓｕｇａｉ  Ｙ，  Ｔａｎａｋａ  Ｔ，  Ｓａｔｏ  Ｋ，  Ｔｓｕｄａ  Ｆ，  Ｍｉｙａｋａｗａ  Ｙ，  Ｍａｙｕｍｉ  Ｍ（１９９２ａ）タイプ−特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＣ型肝炎ウイルスのタイピング：臨床的調査および感染源の追跡（Ｔｙｐｉｎｇ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｕｒｖｅｙｓ  ａｎｄ  ｔｒａｃｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｓｏｕｒｃｅｓ．）  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：６７３−６７９．
Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｈ，  Ｋｕｒａｉ  Ｋ，  Ｏｋａｄａ  Ｓ，  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ，  Ｌｉｚｕｋａ  Ｈ，  Ｔａｎａｋａ  Ｔ，  Ｆｕｋｕｄａ  Ｓ，  Ｔｓｕｄａ  Ｆ，  Ｍｉｓｈｉｒｏ  Ｓ（１９９２ｂ）報告された単離物に対して相同性が良くないＣ型肝炎ウイルスゲノムの完全長配列：４種の別個の遺伝子型の比較研究（Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ａ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｈａｖｉｎｇ  ｐｏｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｒｅｐｏｒｔｅｄ  ｉｓｏｌａｔｅｓ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ．）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８８：３３１−３４１．
Ｐｏｚａｔｔｏ  Ｇ，  Ｍｏｒｅｔｔｉ  Ｍ，  Ｆｒａｎｚｉｎ  Ｆ，  Ｃｒｏｃｅ  Ｌ，  Ｔｉｒｉｂｅｌｌｉ  Ｃ，  Ｍａｓａｙｕ  Ｔ，  Ｋａｎｅｋｏ  Ｓ，  Ｕｎｏｕｒａ  Ｍ，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｋ（１９９１）種々のＣ型肝炎ウイルスクローンでの肝臓疾患の重症度（Ｓｅｖｅｒｉｔｙ    ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒａｌ  ｃｌｏｎｅｓ．）  Ｌａｎｃｅｔ  ３３８：５０９．
Ｓａｉｋｉ  ｒ，  Ｇｅｌｆａｎｄ  Ｄ，  Ｓｔｏｆｆｅｌ  Ｓ，  Ｓｃｈａｒｆ  Ｓ，  Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｒ，  Ｈｏｒｎ  Ｇ，  Ｍｕｌｌｉｓ  Ｋ，Ｅｒｌｉｃｈ  Ｈ（１９８８）耐熱性ポリメラーゼを用いたＤＮＡのプライマー指令型酵素的増幅（Ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ    ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７−４９１．
Ｓｔｒｅｚｏｓｋａ  Ｚ，  Ｐａｕｎｅｓｋａ  Ｔ，  Ｒａｄｏｓａｖｌｊｅｖｉｃ  Ｄ，  Ｌａｂａｔ  Ｉ，Ｄｒｍａｎａｃ  Ｒ，  Ｃｒｋｖｅｎｊａｋｏｖ  Ｒ（１９９１）ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列決定：非−ゲル−に基づく方法による１００塩基の解読（ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：１００  ｂａｓｅｓ  ｒｅａｄ  ｂｙ  ａ  ｎｏｎ−ｇｅｌ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ．）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：１００８９−１００９３．
Ｔａｋａｍｉｚａｗａ  Ａ，  Ｍｏｒｉ  Ｃ，  Ｆｕｋｅ  Ｉ，  Ｍａｎａｂｅ  Ｓ，  Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｓ，  Ｆｕｊｉｔａ  Ｊ，  Ｏｎｉｓｈｉ  Ｅ，  Ａｎｄｏｈ  Ｔ，  Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｉ，  Ｏｋａｙａｍａ  Ｈ  （１９９１）ヒトキャリアーから単離したＣ型肝炎ウイルスの構造および組織（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｒｉｅｒｓ．）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５：１１０５−１１１３．
Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ，  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｍ，  Ｎａｄｅａｕ  Ｊ，  Ｓｈａｎｋ  Ｄ（１９９２）制限酵素／ＤＮＡポリメラーゼ系によるＤＮＡの等温インビトロ  増幅（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｉｎ ｖｉｔｒｏ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ／ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ．）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：３９２−３９６．  
Ｗｕ  Ｄ，  Ｗａｌｌａｃｅ  Ｂ，（１９８９）ライゲーション増幅反応（ＬＡＲ）−鋳型依存的ライゲーションの連続的循環を使用する特別なＤＮＡ配列の増幅（Ｔｈｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＡＲ）−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｒｏｕｎｄｓ  ｏｆ  ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｌｉｇａｔｉｏｎ．）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０−５６９．
Ｙｏｓｈｉｏｋａ  Ｋ，  Ｋａｋｕｍｕ  Ｓ，  Ｗａｋｉｔａ  Ｔ，  Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｔ，  Ｉｔｏｈ  Ｙ，  Ｔａｋａｙａｎａｇｉ  Ｍ，  Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｙ，  Ｓｈｉｂａｔａ  Ｍ，  Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ  Ｔ（１９９２）ポリメラーゼ連鎖反応によるＣ型肝炎ウイルスの検出およびインターフェロン治療への対応：Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型に対する関連性（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｔｈｅｒａｐｙ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ．）  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １６：２９３−２９９．
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】ネストＰＣＲ断片の長さを示すエチジウムブロマイドで染色したアガロースゲル電気泳動の図に代わる写真である。各対のレーンＡはＢｉｏ−１１−ｄＵＴＰを取り込んだＰＣＲ断片を表す。レーンＢはＢｉｏ−１１−ｄＵＴＰ無しのＰＣＲ断片である。１：血清ＢＲ２８、２：血清ＢＲ２４、３：血清ＢＲ２９、４：血清ＢＲ３３、５：血清ＢＲ３６、６および７：陰性対照血清、８：血清ＪＰ６２、９：血清ＢＲ２３、１０：鋳型無しのｃＰＣＲ対照、Ｍ：分子量マーカー。
【図２】４種の異なるＨＣＶタイプ由来の単離物の５’ＵＲヌクレオチド配列の整合配列を示す図である（第２図）。箱で囲ったヌクレオチドは４種の異なる群をタイピングするために使用したプローブの位置を示す。下線を引いたヌクレオチドは各群内をサブタイピングするために使用される。ほとんどの配列のヌクレオチド−１４０から−１３９間の間隔にはいくつかタイプ４単離物中の挿入が対応する。プローブの番号は表４に使用する番号と一致する。
【図３】第２図の続き（その１）である。
【図４】第２図の続き（その２）である。
【図５】いくつかの代表的な血清についてのＨＣＶ  ＬｉＰＡタイピングの結果を示す図に代わる薄層クロマトグラムの写真である（第３図）。ストリップは１９の平行した線を含む。
【０１８０】
Ａ：プローブ５（配列番号５）；Ｂ：プローブ６（配列番号６）；Ｃ：プローブ７（配列番号７）；Ｄ：プローブ８（配列番号８）；Ｅ：プローブ２６（配列番号２６）；Ｆ：プローブ２２（配列番号２２）およびプローブ２４（配列番号２４）；Ｇ：プローブ１０（配列番号１０）；Ｈ：プローブ１３（配列番号１３）；Ｉ：プローブ１４（配列番号１４）；Ｊ：プローブ２１（配列番号２１）；Ｋ：プローブ１５（配列番号１５）；Ｌ：プローブ１６（配列番号１６）；Ｍ：プローブ１７（配列番号１７）；Ｎ：プローブ１９（配列番号１９）；Ｏ：プローブ１８（配列番号１８）；Ｐ：プローブ１５５（アンチセンスプローブ：５’−ＧＧＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧ−３’）（配列番号９７）；Ｑ：プローブ２７（配列番号２７）；Ｒ：プローブ２０（配列番号２０）；Ｓ：結合体の結合のための対照ライン。
【０１８１】
ストリップを以下の血清のＰＣＲ生成物とハイブリダイズさせた：ストリップ１：血清ＢＲ５、片２：血清ＢＲ１２：片３：血清ＢＲ１８、片４：血清ＢＲ２２：片５：血清ＢＲ１９、片６：血清ＢＲ９５：片７：血清ＢＵ７９、片８：血清ＢＲ２３、片９：血清ＪＰ６３。
【図６】新規単離物（ＢＥ９０、ＢＥ９１、ＢＥ９２、ＢＥ９３、ＢＥ９４、ＢＥ９５、ＢＥ９６、ＢＥ９７、ＢＥ９８、ＢＥ９９、ＧＢ４８、ＧＢ１１６、ＧＢ３５８、ＧＢ５６９、ＧＢ５４９、ＧＢ８０９、ＣＡＭ６００、ＣＡＭ７３６、ＧＢ４７８、ＧＢ７２４、およびＧＢ４３８）、ならびにＨＣＶタイプ１ａ（ＨＣＶ−１）、１ｂ（ＨＣＶ−Ｊ）、２ａ（ＨＣ−Ｊ６）、２ｂ（ＨＣ−Ｊ８）、３ａ（ＢＲ５６）、３ｂ（ＨＣＶ−ＴＲ）、５（ＳＡ１）、６（ＨＫ１）のＨＣＶ５’非翻訳領域のヌクレオチド配列の整合配列を示す図である（第４−１〜２図）。この整合配列を構成するために使用した配列は、ＥＭＢＬデータベースから取り、以下の受け入れ番号を有する：１Ｍ６２３２１、２Ｄ１０７４９、３Ｄ００９４４、４Ｄ０１２２１、５Ｄ１３４４８、６Ｄ１１４４３、７Ｍ８４８３８、および８Ｌ０８１５６。ヌクレオチド−２２０から−１８０の間の配列は示されていないが、それらはすべての単離物中でＨＣＶ−１と同一である。‘−’ヌクレオチドはＨＣＶ−１中の対応するヌクレオチドと同一である；−１４５から−１４４の間に作られた空所‘．．’は、整合配列がＣＡ挿入を有するタイプ６配列を持つと認められる；ほとんどのヌクレオチド中の−１３８と−１３７の間に作られた空所‘．’は、整合配列がその位置で特別なヌクレオチドを有する配列を保存する。＊は第２図に表される−２２０と−１８０残基の間の保存ＨＣＶ配列を言う。
【図７】第４−１図の続きである。
【図８】第４−１図の続きである。
【図９】第４−２図である。
【図１０】第４−２図の続きである。
【図１１】単離物ＢＥ９０，ＢＥ９１，ＢＥ９２，ＢＥ９３，ＢＥ９５，ＧＢ３５８、ＧＢ５４９およびＧＢ８０９のＮＳ５配列のアミノ酸配列、ならびに表６に記載された既知の配列の整合配列を示す図である（第５図）。
【図１２】第５図の続きである。
【図１３】配列番号３２を使用したプローブを含むラインプローブアッセイ、タイプ１および２血清で試験した結果を表す図に代わるクロマトグラムの写真である（第６図）。１．タイプ１ｂ  血清ＢＥ８２、２．タイプ２ａ  血清ＪＰ６２、３．タイプ２ｂ  血清ＢＥ９１、Ａ．結合体対照、Ｂ．プローブ２０および２７、Ｃ．プローブ８、Ｄ．プローブ２６、Ｅ．プローブ３２（配列番号３２）。
【図１４】配列番号３３および３４を使用したプローブを含むラインプローブアッセイ、タイプ２ａ，２ｂ，および２ｃ血清で試験した結果を表す図に代わるクロマトグラムの写真である（第７図）。１．タイプ２ａ  血清ＪＰ６２、２．タイプ２ｂ  血清ＢＥ９１、３．タイプ２ｃ  血清ＢＥ９２、Ａ．結合体対照、Ｂ．プローブ２０および２７、Ｃ．プローブ８、Ｄ．プローブ２６、Ｅ．プローブ３２、Ｆ．プローブ２２、Ｇ．プローブ２４、Ｈ．プローブ２３、Ｉ．プローブ２５、Ｊ．プローブ３３（配列番号３３）、Ｋ．プローブ３４（配列番号３４）。
【図１５】配列番号３１、３７および３８を使用したプローブを含むラインプローブアッセイ、タイプ４血清で試験した結果を表す図に代わるクロマトグラムの写真である（第８図）。１．タイプ４ａ  血清ＧＢ１１６、２．  血清ＧＢ１１３、３．タイプ４ｆ  血清ＧＢ４３８、Ａ．結合体対照、Ｂ．プローブ２０および２７、Ｃ．プローブ３７（配列番号３７）、Ｄ．プローブ３８（配列番号３８）、Ｅ．プローブ１９、Ｆ．プローブ３１（配列番号３１）、Ｇ．プローブ７。
【図１６】配列番号４４、４５、９５および４６を使用したプローブを含むラインプローブアッセイ、タイプ４ａおよび５ａ血清で試験した結果を表す図に代わるクロマトグラムの写真である（第９図）。１．タイプ５ａ  血清ＢＥ９５、２．  タイプ４ａ  血清ＧＢ１１６、Ａ．結合体対照、Ｂ．プローブ２０および２７、Ｃ．プローブ４４（配列番号４４）、Ｄ．プローブ４５（配列番号４５）、Ｅ．プローブ４６（配列番号４６）、Ｆ．プローブ３１（配列番号３１）、Ｇ．プローブ７。
【図１７】配列番号９３、９４、９５および９６を使用したプローブを含むラインプローブアッセイ、タイプ４ａおよび５ａ血清で試験した結果を表す図に代わるクロマトグラムの写真である（第１０図）。１．タイプ４ａ  血清ＧＢ１１６、２．  タイプ５ａ  血清ＢＥ９５、Ａ．結合体対照、Ｂ．プローブ２０および２７、Ｃ．プローブ９３（配列番号９３）を濃度０．４ｐｍｏｌ／μｌで適用、Ｄ．プローブ９４（配列番号９４）を濃度２．５ｐｍｏｌ／μｌで適用、Ｅ．プローブ９４（配列番号９４）を濃度１．０ｐｍｏｌ／μｌで適用、Ｆ．プローブ９４（配列番号９４）を濃度０．４ｐｍｏｌ／μｌで適用、Ｇ．プローブ９５（配列番号９５）を濃度２．５ｐｍｏｌ／μｌで適用、Ｈ．プローブ９５（配列番号９５）を濃度１．０ｐｍｏｌ／μｌで適用、Ｉ．プローブ９５（配列番号９５）を濃度０．４ｐｍｏｌ／μｌで適用、Ｊ．プローブ９６（配列番号９６）を濃度０．４ｐｍｏｌ／μｌで適用。
【図２】
2005040145.tif 000019
【図３】
2005040145.tif 000020
【図４】
2005040145.tif 000021
【図６】
2005040145.tif 000022
【図７】
2005040145.tif 000023
【図８】
2005040145.tif 000024
【図９】
2005040145.tif 000025
【図１０】
2005040145.tif 000026
【図１１】
2005040145.tif 000027
【図１２】
2005040145.tif 000028
【図１】
2005040145.tif 000029
【図５】
2005040145.tif 000030
【図１３】
2005040145.tif 000031
【図１４】
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【図１５】
2005040145.tif 000033
【図１６】
2005040145.tif 000034
【図１７】
2005040145.tif 000035
【配列表】
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