(57)【要約】【課題】  導電性高分子化合物の新しい利用分野を提供することと共に、微生物又は細胞の活性を効率よく且つ確実に高める。【解決手段】  ポリアニリン、ポリ（２，６−ピリジンビニレン−コ−アゾベンゼン）などの導電性高分子化合物を、ＮＮ培地などの培地に配合して、シュードモナス属などの微生物又は細胞を培養する。これにより、同一微生物であっても脱窒素反応などの生物反応が効率よく進行する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
導電性高分子化合物の存在下で微生物又は細胞を成育・維持することを特徴とする生物活性化方法。
【請求項２】
導電性高分子化合物及び担体を含む生物活性化組成物の存在下で微生物又は細胞を成育・維持することを特徴とする請求項１記載の生物活性化方法。
【請求項３】
前記生物活性化組成物が、導電性高分子化合物を含む成育培地で構成されていることを特徴とする請求項２記載の生物活性化方法。
【請求項４】
前記導電性高分子化合物が、前記組成物に対して０．００１〜５００ｍｇ／ｍｌの最終濃度で含まれることを特徴とする請求項３記載の生物活性化方法。
【請求項５】
前記導電性高分子化合物で構成された活性化部材を、微生物又は細胞の成育・維持環境下に配置することを特徴とする請求項１に記載の生物活性化方法。
【請求項６】
前記微生物が、物質分解菌であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項記載の生物活性化方法。
【請求項７】
前記導電性高分子化合物が、下記のものであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項記載の生物活性化方法。
【化１】
2005270036.tif 000011
【請求項８】
導電性高分子化合物及び担体を含む生物活性化組成物。
【請求項９】
前記導電性高分子化合物が、下記のものであることを特徴とする請求項８記載の生物活性化組成物。
【化２】
2005270036.tif 000012
【請求項１０】
前記担体が成育培地であることを特徴とする請求項８又は９記載の生物活性化組成物。
【請求項１１】
前記導電性高分子化合物が、前記組成物に対して０．００１〜５００ｍｇ／ｍｌの最終濃度で含まれることを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか１項記載の生物活性化組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物活性化方法及び生物活性化組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
導電性高分子は、化学ドーピングによりホールあるいは電子による伝導キャリヤーを生成し、電気伝導性を発現する。導電性高分子はこのように外部環境と電子をやり取り（酸化−還元反応）を行い、電導度を変貌させると共に自身の発色も変化させることができ、この性質を応用したものにセンサー、電極材料やエレクトロクロミック素子がある。このように導電性高分子化合物の利用分野は多岐にわたっている。また有用な導電性高分子についても種々開発が進められている（例えば、特許文献１）。
一方、微生物は、水中及び土中の成分を有機的に分解するために利用されている。このうち特に、廃水処理施設では、古くから微生物の脱窒活性を廃水処理に利用している（例えば、特許文献２及び３）。
【特許文献１】特公平７−７２２５１号公報
【特許文献２】特開平７−１０８２９４号公報
【特許文献３】特開２００１−２５９６８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、微生物による化合物の分解活性は、微生物種の能力に依るところが大きく、処理能力を向上させるに、有用な微生物の新種を探索することが行われているが、新種の探索には限界がある。また処理能力活性を高めるために遺伝子組換え技術を利用することもあるが、工業的な要請に応える程度まで能力を向上させることは困難である。
また動物細胞や植物細胞に対しても遺伝子組換えなどによって特定の活性を高めて工業的に利用することが行われているが、人為的に変異を起こさせた遺伝子組換え体では、利用に向かない分野もあり、生物のもつ活性を効果的にまた確実に高めて広く利用するという観点から、万能とはいえない。
更に導電性高分子のドーピングには、ヨウ素や五フッ化ヒ素などの無機系のドーパントが用いられてきたが、自然環境の中では直接の使用に難しいという問題がある。
従って、本発明の目的は、導電性高分子化合物の新しい利用分野を提供することである。
また本発明の目的は、微生物又は細胞の活性を効率よく且つ確実に高めることである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、微生物や細胞における電子の受け渡し作用に着目し、これらの生物と導電性高分子との電子的相互作用から、導電性高分子化合物によって微生物又は細胞の活性を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。
【０００５】
すなわち、本発明の生物活性化方法は、導電性高分子化合物の存在下で微生物又は細胞を成育・維持することを特徴としている。
ここで、生物活性化方法は、導電性高分子化合物及び担体を含む生物活性化組成物の存在下で微生物又は細胞を成育・維持することを特徴としてもよく、前記導電性高分子化合物で構成された活性化部材を、微生物又は細胞の成育・維持環境下に配置することを特徴としてもよい。
また本発明の生物活性化組成物は、導電性高分子化合物及び担体を含むことを特徴としている。
前記導電性高分子化合物は、下記のものであることが好ましい。
【０００６】
【化１】
2005270036.tif 000002
【０００７】
これを詳細に説明すれば、本発明は、微生物又は細胞（以下、本発明において適宜単に「生物」という）を導電性高分子化合物の存在下で培養することによって、導電性高分子化合物の酸化−還元特性を、微生物における酸化−還元現象に利用すること、即ち、生物学的ドーピング現象を発見したことに基づく。
生物の活動において酸化−還元の現象は、成育のためのエネルギー生産（ＡＴＰ合成）、酸素による生体物質の酸化とこれを還元する生体の作用や、Ｆｅ（III）からＦｅ（II）への還元に基づく生体内の反応などに見られ、多くの微生物が、酸化−還元現象を生命維持に利用していることが知られている。このとき導電性高分子化合物が存在すると、導電性高分子化合物から電子が生物に受け渡され、生物における酸化−還元反応が効率よく進行することが見出された。
【０００８】
これを微生物による窒素呼吸系で説明すれば、以下の脱窒素反応が微生物によって行われている。
ＮＯ3-→ＮＯ2-→ＮＯ→Ｎ2Ｏ
導電性高分子化合物は、微生物における脱窒酵素の電子の受け渡しを活発化して、脱窒素反応を促進すると考えられる。生物内における反応は、種々の酵素反応の活性化に基づくものであるので、導電性高分子化合物による活性化は、微生物における脱窒素反応に限られない。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、導電性高分子化合物が生物における電子の受け渡しに寄与して、電子の受け渡し作用に基づく生物の活性を効率よく高めることができる。これにより、導電性高分子化合物の新しい利用分野を提供することができると共に、生物を効率よく且つ確実に活性化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の生物活性化方法は、導電性高分子化合物の存在下で微生物又は細胞を成育・維持するものである。
【００１１】
本発明により活性化される微生物としては、電子の受け渡しによって生物活性を向上させることができるものであれば特に限定されないが、工業的な利用性の観点から物質分解能を有する微生物が好ましく、脱窒菌が特に好ましい。このような微生物には、アルカリゲネス・キシロゾキシダンス・キシロゾキシダンス（Alcaligenes xylosoxidans subsp. xylosoxidans）、アルカリゲネシス・キシロゾキシダン・デニトリフィカンス（Alcaligenes xylosoxidans subsp. Denitrificans）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、マグネトスピリラム・マグネトタクチカム（Magnetospirillum magnetotacticum）、アクロバクター・クリアロフィラス（Arcobacter cryaerophilus）、ロゼオバクター・デニトリフィカンス（Roseobacter denitrificans）、ハロモナス・ハロデニトリフィカンス（Halomonas halodenitrificans）、アシドボラクス・アベネア・アベネア（Acidovorax avenae subsp. Avenae）、ザバルジニア・コンプランゾリス（Zavarzinia compransoris）、ブルクホルデリア属（Burkholderia sp.）、シュードモナス・スツトゼリ（Pseudomonas stutzeri）、シュードモナス・エアロジノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、ハイドロゲノモナス・シュードフラバ（Hydrogenomonas pseudoflava）、シェワネラ属（Shewanella sp.）、シノリゾビウム・メリロッティ（Sinorhizobium meliloti）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドバクター・カプシュラタス（Rhodobacter capsulatus）、パラコッカス・ベルスタス（Paracoccus versutus）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）、ウォリネラ・スクシノゲネス（Wolinella succinogenes）、ハロアルキュラ・デニトリフィカンス（Haloarcula denitrificans）、ハロアルキュラ・マリスモルタイ（Haloarcula marismortui）、ハロアルキュラ・バリスモルタイ（Haloarcula vallismortui）などを挙げることができる。
【００１２】
本発明における微生物には、上記の他に、種々の物質の分解菌を含むことができ、このような物質分解菌としては、多環芳香族、トリクロロエチレン等の種々環境汚染物質を分解するアルカリゲネス属（Alcaligenes sp.）、ラルストニア属（Ralstonia sp.）、アシドボラクス属（Acidovorax sp.）、ブルクホルデリア属（Burkholderia sp.）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）、シノリゾビウム属（Sinorhizobium sp.）、ゴルドニア属(Gordonia sp.）、さらにメタン酸化細菌群を挙げることができる。
なおこの他に、本発明における活性化組成物又は活性化方法の対象となりうる微生物には、所定の活性が利用可能となり得る如何なる微生物が包含され、特に制限されない。
【００１３】
また本発明における細胞には動物細胞及び植物細胞のいずれもが含まれ、特に細胞自体に活性を有するものや、特定のサイトカインを産生する細胞であることが好ましい。しかし、本発明においては特に制限されず、いずれの細胞に対しても活性化効果を得ることができる。
【００１４】
なお本発明において「微生物又は細胞の成育（生育）・維持」とは、対象となる微生物又は細胞が、活性化の対象となるその生物活性を維持した状態にあることを意味し、微生物又は細胞が増殖する場合及び増殖しない場合のいずれも含まれる。また微生物又は細胞が、それ自体の作用に基づいて物質分解活性などの特定の活性を行っていれば、如何なる場合も、本発明における「成育（生育）・維持」に含まれる。
【００１５】
本発明にかかる導電性高分子化合物としては、共役二重結合を有して電子の授受が可能であり、微生物における電子受け渡し（酸化−還元）作用に寄与することができるものであればいずれも用いてもよい。
このような導電性高分子化合物としては、ｎ型導電性高分子化合物及びｐ型導電性高分子化合物のいずれもを挙げることができる。このような導電性高分子化合物には、例えば、以下のものが挙げられる。
【００１６】
【化２】
2005270036.tif 000003
【００１７】
このうち、式ＩＩ及び式ＩＶの化合物はｎ型ｐ型ドープが可能であり、簡便に合成することができるという利点を有しており、式ＩＩＩの化合物は水溶性導電性高分子化合物であって両親媒性を有している。このため、これらの導電性高分子化合物はそれぞれの特性に応じた用途で好ましく使用することができる。また式Ｖの化合物はバンドキャップが低く光学活性部位を有しているため微生物への親和性をより高いものにすることができる。
【００１８】
また上記の他にも、以下のｎ型導電性高分子化合物を挙げることができ、このうち、ポリ（２，５−ピリジン）及びポリ（２，６−ピリジンビニレン）が、合成及び加工性の観点から好ましく、ポリ（２，６−ピリジンビニレン）がｎ型ｐ型ドープの両者が可能であるためにより広範な微生物又は細胞に適用することができるため、好ましい。
【００１９】
【化３】
2005270036.tif 000004
【００２０】
この他にも、本発明では以下の導電性高分子化合物を挙げることができる。
【００２１】
【化４】
2005270036.tif 000005
【００２２】
このうち、ポリアセチレンはｎ型及びｐ型ドーピングが可能でイオン化ポテンシャルが小さく、電子親和性が大きいため、微生物との相互作用が大きいという利点を有し、（ｂ）〜（ｊ）の化合物はｐ型ドープ可能で合成が容易であり、（ｋ）は電子導電性と共にイオン導電性を有するために微生物又は細胞との相互作用が特に大きいという利点を有する。また（ｌ）〜（ｍ）はバンドギャップが低く外部に電子を容易に供給することができ、（ｏ）及び（ｐ）は発光性高分子化合物であって、モノマーユニット上に比較的強く電子が局在するという特性を有し、（ｑ）は光導電性高分子化合物であって外部光によりポリマー内部でキャリアを発生することができるという特性を有する。またこれらの導電性高分子化合物のうち、発光性高分子化合物及び光導電性高分子化合物は、光エネルギーによってより多くの電子がポリマー上に発生するため、より多くの電子を生物に渡すことができるため、特に好ましい。
【００２３】
また光学活性を有する導電性高分子化合物では、Ｌ体及びＤ体のいずれであってもよいが、アミノ酸などの生体分子がＬ体の光学活性を有することからＬ体の導電性高分子化合物であることが特に好ましい。Ｌ体の導電性高分子化合物を用いた場合には、微生物又は細胞に対する親和性が高く、微生物又は細胞を引き付ける吸引性を持たせることができる。
このように、これらの導電性高分子化合物は、各特性を考慮して、対象となる種々の微生物及び細胞並びに活性化反応に応じて、適宜選択される。
【００２４】
なお、上記の構造式においてｎはいずれも２０〜３００の整数であり、好ましくは５０〜３００の整数であり、特に好ましくは８０〜１５０である。ｎが２０未満では導電性高分子化合物としての作用に期待できず、一方、３００を超えると合成及び加工をすることが難しくなるため、好ましくない。また式中Ｒは置換又は未置換アルキル基、好ましくは１〜１５の置換又は未置換のアルキル基であって、例えばメチル、エチル、ヘキシル、ドデシルや、両親媒性のデシルスルホン酸で置換されたアルキル基等が挙げられる。
【００２５】
導電性高分子化合物は、そのうちの１種類を単独で用いてもよく２種以上を組み合わせて使用してもよいが、異なる特性の各導電性高分子化合物を組み合わせて使用することが、微生物の活性をより効果的に高めることができるため、好ましい。特に、上記式Ｉの化合物と式ＩＩの化合物との組み合わせ、式ＩＩの化合物と式ＩＩＩの化合物との組み合わせ等が好ましい。
【００２６】
これらの導電性高分子化合物は、導電性高分子化合物の種類に応じた既知の方法に従って合成することができる。また導電性高分子化合物には市販品を含むことができ、このようなものには、例えばアルドリッチ社製のポリアセチレン、ポリアニリン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリフェニレンビニレン及びその誘導体、ポリフルオロエチニレン及びポリフェニレンスルフィドや、ＮＥＳＴＥ社製のポリアニリン、バイエル社製のポリ(３，４−エチレンジオキシチオフェン）−ポリスチレン（ＰＥＤＯＴ）ブレンド品（商品名バイトロンＰ（Baytron P)）を挙げることができる。
【００２７】
導電性高分子化合物は微生物又は細胞の成育・維持環境下に存在していればよく、導電性高分子化合物を単独で直接添加してもよい。導電性高分子化合物を直接添加する方法では、導電性高分子化合物を、例えば土中又は水中で物質分解中の微生物に対して直接又は肥料等と共に添加すればよい。
【００２８】
また導電性高分子化合物は、導電性高分子化合物と適当な担体とを含む生物活性化組成物として用いることができる。
ここで用いられる担体としては、例えば通常、微生物又は細胞の培養に用いられる成育培地を挙げることができる。この場合には、他の成分として、通常の培養に用いられる栄養源成分などを挙げることができる。これらの成分は、生物活性化組成物の利用形態に合わせて適宜選択される。
【００２９】
培養培地としては、培養対象となる生物の種類に応じて通常用いられる周知のものが含まれ、例えば、シュードモナス属などを含む多くの微生物の培養には、ＬＢ培地、ＮＮ培地、さらに最小培地（無機塩培地）などが好ましく用いられる。この培養培地は、液体に限らず、ゲル状などの半固体状のものも含むことができる。
栄養源成分しては、生物の成育・維持のために必要な一般的な栄養素を含むことができる。したがって、生物活性化組成物は、微生物の培養培地を基礎とすることが好ましい。
【００３０】
また生物の成育・維持環境下へ、散布などの適用形態で添加するためには水を担体としてもよい。この場合には、既に成育・維持している環境下へ水溶液又はコロイド形態として水と共に用いられる。或いは、マイクロカプセル化に必要な既知の賦形剤と組み合わせて用いてもよい。
【００３１】
導電性高分子化合物は、生物活性化組成物において、微生物が有効利用することができる量で配合することができる。使用時の最終濃度としては、生物種及び組成物の用途によって適宜変更することができるが、一般に、成育培地として用いる場合には、組成物全体の容量に対して０．００１〜５００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で配合される。導電性高分子化合物の量を多くすれば微生物による活性化効率は高くなるが、５００ｍｇ／ｍｌを超えると培地としての作用を損うことが予測されるため、好ましくない。
【００３２】
本発明の生物活性化組成物を微生物又は細胞の培養方法に適用する場合には、通常の培養条件をそのまま適用することができる。培養対象となる微生物の数が充分でない場合には、生物活性化組成物による培養を開始する前に、前培養工程を設けてもよい。これにより、充分な数の微生物を効率よく活性化することができる。
【００３３】
導電性高分子化合物は、一般に、生物活性化組成物中に可溶化形態で含まれるが、コロイド（微粒子）状で分散させることが好ましい。この場合には、微生物との接触面積を増加させることができるため、より効率よく微生物を活性化することができる。導電性高分子化合物のコロイド化は、導電性高分子自体の特性に応じて適宜選択される。
例えば、ポリアニリン（上記式（Ｉ）の化合物）の場合には、界面活性剤、アニリン又はアニリン誘導体の塩酸塩を溶解し、これをペルオキソ二硫酸アンモニウムで化学酸化重合することによって、重合時にコロイド化する方法が挙げられる。また、得られた高分子化合物に界面活性剤を加えて強く攪拌することによって均一分散水溶液として、コロイド化することもできる。
また他の導電性高分子化合物では、溶媒に溶解させてポリマー溶液を作製し、強く攪拌した水溶液中にゆっくりと滴下することにより、容易にコロイド化することができる。この際に界面活性剤が存在すると、より効率よく微粒子を得ることができるため、好ましい。
【００３４】
更に、導電性高分子化合物のうち加工可能なものについては特定の形態の活性化部材に成形して、これを微生物の成育・維持環境下に配置することができる。これにより、培養組成や培養形態等に制限されずに、また繰り返し使用して、微生物の活性化に適用することができる。
【００３５】
導電性高分子化合物を活性化部材として用いる場合には、導電性高分子化合物の種類に応じて一般に行われている方法に従って加工すればよい。導電性高分子化合物の加工形態としては、層状、フィルム状、板状、ブロック状等、特に制限されない。また活性化部材の配置方法としては、塗布や貼り付けなど通常行われている方法をそのまま用いることができる。選択された導電性高分子化合物を活性化部材として用いる場合には、当業者であればどのような方法を用いて設置すればよいか容易に理解できる。例えば、導電性高分子化合物のフィルムを作製してその上で直接生物を培養したり、バイオリアクターの内壁、チューブ若しくはパイプの内壁を導電性高分子化合物でコートして、その内部で培養を行うことができる。
【００３６】
本発明による生物活性化の効果は、対象となる微生物の活性を通常の方法に従って測定することにより、容易に確認することができる。微生物の活性化の場合には、窒素分解活性や、生分解性プラスチックの残留試験等を挙げることができ、細胞による物質産生能の場合には、目的とする物質量の測定を挙げることができる。これらの測定方法については周知のものをそのまま用いることができ、当業者は容易に実施することができる。
【００３７】
本発明によれば、導電性高分子化合物を微生物又は細胞の成育・維持環境下に単に存在させることによって生物の活性を高めることができるので、生物の活性に基づくあらゆる分野に利用することができる。
【００３８】
例えば、土中の微生物による分解活性を高めるためには、導電性高分子化合物又は生物活性化組成物若しくは活性化部材を、微生物を含む対象の土に適当な濃度で散布又は埋設する。これにより、土中に浸透した導電性高分子化合物と微生物とが接触して微生物が活性化され、分解活性が高まって、散布領域の土中分解を促進することができる。
【００３９】
一方、廃水処理に本組成物を使用する場合には、廃水と微生物との混合液に、例えば、処理量に応じた導電性高分子化合物濃度となるように導電性高分子化合物又は生物活性化組成物若しくは活性化部材を添加又は配置する。或いは、予め生物を本組成物によって培養し、適切な数に到達又は適切な程度に活性化した後に、生物散布を行うこともできる。
【００４０】
また、導電性高分子化合物を他の生分解性プラスチックとブレンドして、高い生分解性が付与されたポリマーアロイを得ることができる。また、ポリマーの一部に高い生分解性部分を盛り込んで、導電性高分子化合物と生分解性高分子とのポリマーを得ることもできる。これらの高生分解性部分は、周囲の分解菌の分解活性を高める部分及び／又は分解菌に対する吸引性を有する部分となって、ポリマー全体の分解性を高めることができる。このように、生分解活性がより高められた新規の高生分解性プラスチックを開発することができる。
【００４１】
更には、微生物又は細胞に対する吸引性の高い導電性高分子化合物を選択した場合には、体内において浮遊又は浸潤細胞を効果的に引き付けることができるので、既存のシステムと組み合わせて又は新規に、効果的なドラッグ・デリバリー・システムを構築することができる。
【実施例】
【００４２】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量基準である。
【００４３】
（１）導電性高分子化合物の合成
１．ポリアニリン（式Ｉの化合物）の合成
A. G. MacDiarmid, C. J. Chiang, M. Halpern, W. S. Huang, S. L. Mu, M. L. D. Somasiri, W. Wu, and S. I. Yaniger, Molecular Crystals and Liquid Crystals, 121, 467 (1985)及びAndretta, Y. Cao, J. Chiang, A.J. Heeger, P. Smith, Synthetic Metals, 26, 383-389 (1988) の方法により合成した。これを簡単に説明すれば、１３．３ｍｌの蒸留したアニリンを、１．３３Ｍに調製した１５０ｍｌの塩酸に溶かし、これを−５℃に冷やした。別に２６．７ｍｌの蒸留水に１５．３３ｇの（ＮＨ4）2Ｓ2Ｏ8 (ペルオキソ二硫酸アンモニウム)を溶かした。この溶液を、攪拌したアニリン塩酸溶液に１時間かけてゆっくり滴下した。滴下終了後さらに一晩攪拌した。得られた沈殿物をろ過した後、これをｐＨが６〜７になるまで蒸留水で洗浄し、さらにメタノールで洗浄し、真空乾燥して中性ポリアニリンを得た（収率３６%）。これをヒドラジンで処理し、還元型のポリアニリンを合成した。
【００４４】
２．ポリ（２，６−ピリジンビニレン−コ−アゾベンゼン）（式ＩＩの化合物）の合成
アルゴン雰囲下中、５ｍｌのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）、２２ｍｇのＰｄ2（ｄｂａ）3（０．０２４ｍｍｏｌ）及び２４ｍｇのトリ（２−フリル）ホスフィン［Ｐ（フリル）3］（０．１ｍｍｏｌ）を加え、室温にて攪拌した。反応溶液は速やかに赤褐色から黄色へと変化した。ここに、１ｍｌのＴＨＦに溶かした２，５−ジブロモピリジン０．３ｇ（１．２８ｍｍｏｌ）を加え、さらに１時間後に、１ｍｌのＴＨＦに溶かしたトリブチルビニルスタナン０．８ｇ（２．５ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、これを５０℃で１時間攪拌した。反応液は黒褐色に変化した。８０℃に加熱して攪拌を続けＴＨＦを除去した。ここにジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）を１０ｍｌ加えた後、５６ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）のパラジウム（ＩＩ）アセテート［Ｐｄ（ＯＡｃ）2］と０．４ｇ（１．３ｍｍｏｌ）のトリ（ｏ−トリル）ホスフィン及びジブロモアゾベンゼン（合成法はO. H.Wheeler, D. Gonzalez, Tetrahedron, 20, 189, (1964) による）０．４３ｇ（１．２８ｍｍｏｌ）を加えた。これにトリエチルアミン［ＮＥｔ3］を５ｍｌ加え、１００℃で５日間攪拌した。トリエチルアミンは蒸発するので２４ｈ時間ごとに２ｍｌ加えた。その後攪拌を停止し、メタノール／塩酸混合溶液にて洗浄を２回行なった。沈殿物をガラスフィルターで回収し、オレンジ色のポリマーを得た（収量０．２９ｇ、収率７５％）。
【００４５】
【化５】
2005270036.tif 000006
【００４６】
３．ポリ（ピリジンビニレン）（式ＩＶの化合物）の合成
アルゴン雰囲気下、３ｍｌのＤＭＦに、１１ｍｇのＰｄ2（ｄｂａ）3（０．０１２ｍｍｏｌ）及び１１ｍｇのＰ（フリル）3（０．０４８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて攪拌した。ここに０．３ｇの２，５−ジブロモピリジン（１．３ｍｍｏｌ）を加え、さらに１時間後に、１ｍｌのＴＨＦに溶かした１，２−ビス（トリブチルスタニルエチレン）０．７３ｇ（１．２ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、これを５０℃で１時間攪拌した。反応液は黒褐色に変化した。８０℃に加熱して３日間攪拌した。メタノール／塩酸の混合溶液で２回洗浄し、ガラスフィルターで回収し、黄土色のポリマーを得た（収量：８１．８ｍｇ、収率６１％）。
【００４７】
【化６】
2005270036.tif 000007
【００４８】
４．式Ｖの化合物の合成
イソチアナフテン及び（Ｒ）−（−）−４−（３，７−ジメチル）オクチルオキシベンズアルデヒドの０．１Ｍ１，４−ジオキサン溶液に２０ｖｏｌ％のオキシ塩化リンをゆっくり加え、これを８０℃で２４時間還流させた。沈殿物をガラスフィルターで回収し、ソックスレー抽出器を用いてメタノールで洗浄し、さらにアンモニアで洗浄した後、ろ別することにより真空乾燥してポリマーを得た。
【００４９】
（２）脱窒活性測定
シュードモナス・エアロジノーザ（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１株をＬＢ培地（ＬＢ培地；nacalai tesque社製、表１参照）４ｍｌ入り中試験管に植菌した。これを、３７℃、１６５ｒｐｍで１２時間培養し、前培養とした。得られた前培養液２００μｌを、ＮＮ培地（ＫＮＯ3-１００ｍＭ）（表１参照）２ｍｌ入りハンゲートチューブ（１６ｍｌ容）へ植菌した。ハンゲートチューブ中には、上記のようにして作製された導電性高分子化合物のうちポリアニリン（式Ｉ）及びポリ(２，６−ピリジンビニレン−コ−アゾベンゼン）（式ＩＩ）を予め添加した。導電性高分子化合物の種類及び添加条件は表２に示す。ハンゲートチユーブをゴム栓及び、スクリューキャップにより密封し、３７℃，１６５ｒｐｍで７時間培養した。その後、生育量、培地中の硝酸濃度、及びヘッドスペースのＮ2Ｏ濃度を定量し、脱窒活性とした。
生育は、BECKMAN COULTER社製 DU640の吸光光度計を用いて、吸光度６６０ｎｍにより測定した。
【００５０】
硝酸はブルシン・スルファニル酸法により測定した。検水１００μｌに、ブルシン・スルファニル酸溶液（１％ブルシン、０．１％スルファニル酸、３％（ｖ／ｖ）ＨＣｌ）５０μｌを加えて室温で５分放置した。その後、硫酸溶液（８０％Ｈ2ＳＯ4）を５００μｌを加えて室温で１０分放置した。蒸留水後、５００μｌを加えて室温で３０分放置した後、吸光度４１０ｎｍで測定した。
Ｎ2Ｏ濃度はガスクロマトグラフィー（SHIMADZU社製 GC-8A ）により測定した。
結果を表３に示す（実施例１〜３）。
一方、導電性高分子化合物をいずれも含まない以外は同様にして培養したものを、比較例とした。結果を表３に示す。
【００５１】
【表１】
2005270036.tif 000008
【００５２】
【表２】
2005270036.tif 000009
【００５３】
【表３】
2005270036.tif 000010
【００５４】
表３に示されるように、導電性高分子化合物を含まないＮＮ培地で生育させた場合（比較例）と比較して、導電性高分子化合物を含むＮＮ培地で生育させた場合（実施例１〜３）では、増殖の程度には差がないにも拘らず、Ｎ2Ｏの排出量が増加していた。特に、導電性高分子化合物を組み合わせて使用した場合には、Ｎ2Ｏは約２割上昇しており、残存硝酸量も１割程度低かった。
【００５５】
このことから、本発明によれば、導電性高分子化合物を微生物の成育・維持環境下に単に存在させることによって、導電性高分子化合物が微生物と電子的な相互作用から、同一種類の微生物であっても且つ特別な処理を行うことなく脱窒素反応を顕著に高めることができることが明らかである。このような電子的な相互作用は、微生物以外の細胞であっても、また窒素呼吸に限らない反応においても生じるため、あらゆる生物活性に対しても、導電性高分子化合物によって同様に高まることが示された。
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月5日(2005.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７】
前記導電性高分子化合物が、下記のものから選択された少なくとも１つであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項記載の生物活性化方法。
【化１】
2005270036.tif 000013
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項９】
前記導電性高分子化合物が、下記のものから選択された少なくとも１つであることを特徴とする請求項８記載の生物活性化組成物。
【化２】
2005270036.tif 000014
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
【化１】
2005270036.tif 000015
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
【化２】
2005270036.tif 000016
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
【化５】
2005270036.tif 000017