(57)【要約】【課題】従来とは異なる機構により効率よく矮化植物を生産する方法と、その利用の一例を提供する。【解決手段】ペクチンのメチル基をランダムに加水分解することができるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来ペクチンメチルエステラーゼ（ＰＭＥ）遺伝子（ｐｍｅＡ）をタバコ植物体Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．  ｃｖ  ＳＲ−１に導入することにより、細胞壁代謝異常を誘導し、矮小化した形質転換植物体を生産する。必要に応じて、植物体が成熟する前に、ペクチンメチルエステラーゼの発現に伴い生ずる測定可能な化合物の量または活性を基準として、矮化植物体を選抜すればよい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物由来のペクチンメチルエステラーゼ遺伝子を植物体に導入するＰＭＥ遺伝子導入工程を含み、
当該植物内でペクチンメチルエステラーゼを過剰発現させることを特徴とする矮化植物の生産方法。
【請求項２】
上記微生物由来のペクチンメチルエステラーゼとして、糸状菌類由来のものが用いられることを特徴とする請求項１記載の矮化植物の生産方法。
【請求項３】
上記糸状菌類由来のペクチンメチルエステラーゼとして、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌類由来のものが用いられることを特徴とする請求項２記載の矮化植物の生産方法。
【請求項４】
上記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌類由来のペクチンメチルエステラーゼとして、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のものが用いられることを特徴とする請求項３記載の矮化植物の生産方法。
【請求項５】
上記ペクチンメチルエステラーゼ遺伝子は、植物細胞内でペクチンメチルエステラーゼが安定的に発現するプロモーターと当該遺伝子を連結した過剰発現ベクターとして、植物体に導入されることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の矮化植物の生産方法。
【請求項６】
上記プロモーターとして、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターが用いられることを特徴とする請求項５記載の矮化植物の生産方法。
【請求項７】
上記過剰発現ベクターの植物体への導入は、アグロバクテリウムを用いた形質転換によりなされることを特徴とする請求項５または６記載の矮化植物の生産方法。
【請求項８】
矮化の対象となる植物としてタバコが用いられることを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の矮化植物の生産方法。
【請求項９】
上記ＰＭＥ遺伝子導入工程の後に得られた植物体の集団から、植物体が成熟する前に矮化植物体を選抜するために、
各植物体について、ペクチンメチルエステラーゼの発現に伴い生ずる測定可能な化合物の量または活性を基準として、矮化を判定する矮化植物体選抜工程を含むことを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載の矮化植物の生産方法。
【請求項１０】
上記ペクチンメチルエステラーゼの発現に伴い生ずる化合物の量または活性として、ペクチンメチルエステラーゼｍＲＮＡの発現量、ペクチンメチルエステラーゼ活性、またはメタノール濃度の少なくとも何れかが用いられることを特徴とする請求項９記載の矮化植物の生産方法。
【請求項１１】
上記ペクチンメチルエステラーゼ活性またはメタノール濃度を測定する対象となる植物個体の部位として、葉組織を用いることを特徴とする請求項１０記載の矮化植物の生産方法。
【請求項１２】
上記ペクチンメチルエステラーゼｍＲＮＡの発現量を測定する場合、ペクチンメチルエステラーゼ遺伝子を増幅するためのプライマーとして、配列番号３〜６の塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いることを特徴とする請求項１０記載の矮化植物の生産方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の矮化植物の生産方法を実施するために用いられる植物の矮化キット。
【請求項１４】
植物体内でペクチンメチルエステラーゼが安定的に発現するプロモーターと当該遺伝子を連結した過剰発現ベクターを含むことを特徴とする請求項１３に記載の植物の矮化キット。
【請求項１５】
さらに、植物細胞から、ペクチンメチルエステラーゼｍＲＮＡの発現量、ペクチンメチルエステラーゼ活性、またはメタノール濃度を測定するための試薬が含まれていることを特徴とする請求項１３または１４記載の植物の矮化キット。
【請求項１６】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の矮化植物の生産方法によって得られた矮化植物体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、矮化植物の生産方法およびその利用の一例に関するものであり、特に、効率的に矮化植物を得ることができる矮化植物の生産方法と、植物の矮化キットや得られる矮化植物体等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
植物の矮化は、高収性作物の作出技術として重要な育種改良技術であるばかりでなく、花卉園芸産業における新品種作出ため、また商業農業用の幼苗の保管および流通コスト削減による農業改良化上の重要技術である。
【０００３】
従来矮化植物体は、矮化変異株を交雑して得ることが最も一般的であり、その他、植物の成長調整剤の添加や、栽培環境の調製による方法も存在する（例えば特許文献１〜１０参照）。
【０００４】
ところで、ペクチン性多糖類は、植物の一次細胞壁を構成するマトリクス高分子で、セルロースミクロフィブリルの間隙を満たしている。細胞壁ペクチンは、ホモポリガラクツロナン主鎖とラムノガラクツロナンＩ／ＩＩ側鎖とからなり、ホモポリガラクツロナンは、ガラクツロン酸残基が連なった領域でＣａ２＋を介した分子間架橋を形成することにより非常に多数の分子から成る大きな会合体を作り、細胞壁強度や細胞間隙の大きさの調節に重要な役割を担っていると考えられている。
【０００５】
一方、ペクチンメチルエステラーゼ（以下適宜ＰＭＥと略す）は、全ての植物と植物病原性細菌・菌類に存在する酵素で、ホモポリガラクツロナンのメチルエステル部分を特異的に加水分解することによりメタノールとペクチン酸を生成する（非特許文献１参照）。ポリガラクツロナンのカルボキシル基の大部分は、細胞外に分泌された時点でメチルエステル化されているため、Ｃａ２＋架橋による会合体を形成できない。したがって、ＰＭＥによるメチルエステル部分の加水分解反応は、Ｃａ２＋架橋の形成には必須である。また、ペクチン酸の生成は、細胞壁中のｐＨやイオンバランスを変化させ、細胞壁内の酵素反応速度に影響を及ぼすと考えられている。このようにＰＭＥは、一次細胞壁の構築制御において重要な役割を果たし、細胞の成長や老化だけでなく、果実のライプニング（非特許文献２および３参照）、病原菌との相互作用（非特許文献４参照）等とも関連することが知られている。
【０００６】
そこで、これまでに形質転換植物体を用いたＰＭＥの過剰発現や発現誘導に関する試みがなされてきた。例えばアンチセンス法により内性のＰＭＥの発現を抑制した形質転換トマトを作出し、可溶性果肉の増大した表現型を得た（非特許文献５参照）
また、これまでに、他種植物（ペチュニア）由来ＰＭＥを過剰発現させた形質転換ジャガイモが作出されているが、ＰＭＥの効果はそれ程大きく現れなかった（非特許文献６参照）。この技術では、ペチュニア由来ＰＭＥ遺伝子をバイナリーベクターのＣａＭＶ３５Ｓプロモーター下流に連結してジャガイモＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌ．にて過剰発現させたところ、ＰＭＥ活性の上昇に伴って発生初期の茎伸張と塊茎肥大の表現型が見られたというものがある。しかしながら、ＰＭＥ過剰発現に伴うペクチンのメチルエステル化度の変化は見られず、大きなＰＭＥ効果は得られなかった。
【０００７】
なお、植物由来のＰＭＥ以外のＰＭＥ、例えば、微生物由来のＰＭＥとしては、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（以下適宜Ａ．ｎｉｇｅｒと略す））由来ＰＭＥが知られている。このＡ．ｎｉｇｅｒ  由来ＰＭＥは、至適ｐＨや等電点の他、作用機構も植物由来のＰＭＥと異なり（非特許文献１および７参照）、植物由来ＰＭＥが非還元末端やフリーのカルボシル基に隣接したメチル基を加水分解するのに対し、Ａ．ｎｉｇｅｒ  由来ＰＭＥはメチル基をランダムに加水分解する活性を持つ。ホモガラクツロナン主鎖を脱重合するポリガラクツロナーゼ（以下適宜ＰＧと略す）は、ペクチン分解反応においてＰＭＥとシナジー効果を示すことが知られている。Ａ．ｎｉｇｅｒ  由来ＰＭＥとオレンジ由来ＰＭＥの活性を比較するために、アップルペクチンを基質としてＰＧとのコンビネーションでペクチン分解反応を行ったところ、Ａ．ｎｉｇｅｒ  由来ＰＭＥを用いたときに効果的に脱重合反応が進むことが明らかとなっている（非特許文献８）。
【０００８】
【特許文献１】
特開２００３−０１８９１９号公報（公開日：平成１５（２００３）年１月２１日）
【０００９】
【特許文献２】
特開２００１−３３５４０６号公報（公開日：平成１３（２００１）年１２月４日）
【００１０】
【特許文献３】
特開２００１−００００６０号公報（公開日：平成１３（２００１）年１月９日）
【００１１】
【特許文献４】
特開平１０−２８７５２０号公報（公開日：平成１０（１９９８）年１０月２７日）
【００１２】
【特許文献５】
特開平０９−１３１１３３号公報（公開日：平成９年（１９９７）年５月２０日）
【００１３】
【特許文献６】
特開平０７−１５５０８１号公報（公開日：平成７（１９９５）年６月２０日）
【００１４】
【特許文献７】
特開平０６−０８０５１５号公報（公開日：平成６（１９９４）年３月２２日）
【００１５】
【特許文献８】
特開平０６−０３０６６９号公報（公開日：平成６（１９９４）年２月８日）
【００１６】
【特許文献９】
特開平０６−０３０６６８号公報（公開日：平成６（１９９４）年２月８日）
【００１７】
【特許文献１０】
特開平０５−１１５２２９号公報（公開日：平成５（１９９３）年５月１４日）
【００１８】
【非特許文献１】
Ｍｉｃｈｅｌｉ，  Ｆ．  （２００１）．  ”Ｐｅｃｔｉｎ  ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ：  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．”  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ６（９）：  ４１４−１９．
【００１９】
【非特許文献２】
Ｇａｆｆｅ，  Ｊ．，  Ｍ．  Ｅ．  Ｔｉｚｎａｄｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）．  ”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｔｏｍａｔｏ  ｐｅｃｔｉｎ  ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ．”  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １１４（４）：  １５４７−５６．
【００２０】
【非特許文献３】
Ｂｒｕｍｍｅｌｌ，  Ｄ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｍ．  Ｈ．  Ｈａｒｐｓｔｅｒ  （２００１）．  ”Ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｆｒｕｉｔ  ｓｏｆｔｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｑｕａｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ．”  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４７（１−２）：  ３１１−４０．
【００２１】
【非特許文献４】
Ｄｏｒｏｋｈｏｖ，  Ｙ．  Ｌ．，  Ｋ．  Ｍａｋｉｎｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）．  ”Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａ  ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ｐｌａｎｔ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｅｃｔｉｎ  ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ：  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．”  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４６１（３）：  ２２３−８．
【００２２】
【非特許文献５】
Ｔｉｅｍａｎ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｒ．  Ｗ．  Ｈａｒｒｉｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）．  ”Ａｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｅｃｔｉｎ  ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ  ａｌｔｅｒｓ  ｐｅｃｔｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｓｏｌｉｄ  ｉｎ  ｔｏｍａｔｏ  ｆｒｕｉｔｓ．”  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：  ６６７−６７９．
【００２３】
【非特許文献６】
Ｐｉｌｌｉｎｇ，  Ｊ．，  Ｌ．  Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）．  ”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｅｔｕｎｉａ  ｉｎｆｌａｔａ  ｐｅｃｔｉｎ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎ  Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌ．  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｓｔｅｍ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｓ  ｃａｔｉｏｎ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．”  Ｐｌａｎｔａ  ２１０（３）：  ３９１−９．
【００２４】
【非特許文献７】
Ｋｈａｎｈ，  Ｎ．  Ｑ．，  Ｅ．  Ｒｕｔｔｋｏｗｓｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）．  ”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｅｃｔｉｎ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒａｓｅ−  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ．”  Ｇｅｎｅ  １０６（１）：  ７１−７．
【００２５】
【非特許文献８】
Ｍａｓｓｉｏｔ，  Ｐ．，  Ｖ．  Ｐｅｒｒｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）．  ”Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｍｅｔｈａｎｏｌ  ａｎｄ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ  ａｐｐｌｅ  ｐｅｃｔｉｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｎｄｏｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ａｎｄ  ｐｅｃｔｉｎ  ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａ．  ｎｉｇｅｒ  ｏｒ  ｆｒｏｍ  Ｏｒａｎｇｅ．”  Ｌｅｂｅｎｓｍ．  −Ｗｉｓｓ．  ｕ．  −Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ３０：  ６９７−７０２．
【００２６】
【発明が解決しようとする課題】
上述した従来の技術では、効率的に植物体を矮化することは困難であるという課題を有している。
【００２７】
すなわち、前述した矮化変異株を交雑して矮化植物体を得る方法や、植物の成長調整剤の添加、および栽培環境の調製による方法は、偶然の産物という色彩が強く、効率的な方法といえるものではなかった。
【００２８】
ここで、上記のように、植物体においてＰＭＥ活性を上昇させると、発生初期の茎伸張と塊茎肥大の表現型が見られたという知見が得られている。それゆえ、植物体中でのＰＭＥ活性を制御すれば、植物の成長を制御できる可能性があるため、この技術を植物の矮化に応用できる可能性は見出される。しかしながら、上述したように、植物由来のＰＭＥを植物体内で過剰発現させても十分なＰＭＥ効果が得られないことから、これまでＰＭＥ活性の制御を植物の矮化に応用した技術は知られていない。
【００２９】
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、従来とは異なる機構により効率よく矮化植物を生産する方法と、その利用の一例を提供することにある。
【００３０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ペクチンにおける非還元末端やフリーのカルボキシル基に隣接したメチル基を加水分解する植物由来ＰＭＥとは異なり、メチル基をランダムに加水分解することができるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来ＰＭＥ遺伝子（ｐｍｅＡ）をタバコ植物体Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．  ｃｖ  ＳＲ−１に導入すれば、細胞壁代謝異常を誘導し、矮小化した形質転換植物体を作出可能であることを見出し、本発明を完成するにいたった。
【００３１】
すなわち本発明は、以下の発明を包含する。
【００３２】
（１）微生物由来のペクチンメチルエステラーゼ遺伝子を植物体に導入するＰＭＥ遺伝子導入工程を含み、当該植物内でペクチンメチルエステラーゼを過剰発現させる矮化植物の生産方法。
【００３３】
（２）上記微生物由来のペクチンメチルエステラーゼとして、糸状菌類由来のものが用いられる（１）記載の矮化植物の生産方法。
【００３４】
（３）上記糸状菌類由来のペクチンメチルエステラーゼとして、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌類由来のものが用いられる（２）記載の矮化植物の生産方法。
【００３５】
（４）上記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌類由来のペクチンメチルエステラーゼとして、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のものが用いられる（３）記載の矮化植物の生産方法。
【００３６】
（５）上記ペクチンメチルエステラーゼ遺伝子は、植物細胞内でペクチンメチルエステラーゼが安定的に発現するプロモーターと当該遺伝子を連結した過剰発現ベクターとして、植物体に導入される（１）〜（４）のいずれかに記載の矮化植物の生産方法。
【００３７】
（６）上記プロモーターとして、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターが用いられる（５）記載の矮化植物の生産方法。
【００３８】
（７）上記過剰発現ベクターの植物体への導入は、アグロバクテリウムを用いた形質転換によりなされる（５）または（６）記載の矮化植物の生産方法。
【００３９】
（８）矮化の対象となる植物としてタバコが用いられる（１）〜（７）のいずれかに記載の矮化植物の生産方法。
【００４０】
（９）上記ＰＭＥ遺伝子導入工程の後に得られた植物体の集団から、植物体が成熟する前に矮化植物体を選抜するために、各植物体について、ペクチンメチルエステラーゼの発現に伴い生ずる測定可能な化合物の量または活性を基準として、矮化を判定する矮化植物体選抜工程を含む（１）〜（８）のいずれかに記載の矮化植物の生産方法。
【００４１】
（１０）上記ペクチンメチルエステラーゼの発現に伴い生ずる化合物の量または活性として、ペクチンメチルエステラーゼｍＲＮＡの発現量、ペクチンメチルエステラーゼ活性、またはメタノール濃度の少なくとも何れかが用いられる（９）記載の矮化植物の生産方法。
【００４２】
（１１）上記ペクチンメチルエステラーゼ活性またはメタノール濃度を測定する対象となる植物個体の部位として、葉組織を用いる（１０）記載の矮化植物の生産方法。
【００４３】
（１２）上記ペクチンメチルエステラーゼｍＲＮＡの発現量を測定する場合、ペクチンメチルエステラーゼ遺伝子を増幅するためのプライマーとして、配列番号３〜６の塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いる（１０）記載の矮化植物の生産方法。
【００４４】
（１３）上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の矮化植物の生産方法を実施するために用いられる植物の矮化キット。
【００４５】
（１４）植物体内でペクチンメチルエステラーゼが安定的に発現するプロモーターと当該遺伝子を連結した過剰発現ベクターを含む（１３）記載の植物の矮化キット。
【００４６】
（１５）さらに、植物細胞から、ペクチンメチルエステラーゼｍＲＮＡの発現量、ペクチンメチルエステラーゼ活性、またはメタノール濃度を測定するための試薬が含まれている（１３）または（１４）記載の植物の矮化キット。
【００４７】
（１６）上記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の矮化植物の生産方法によって得られた矮化植物体。
【００４８】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４９】
本発明に係る矮化植物の生産方法は、カビ等に代表される微生物由来のペクチンメチルエステラーゼ（ＰＭＥ）遺伝子を植物に導入することにより、植物を矮化させるものである。この生産方法により得られたＰＭＥ遺伝子の形質転換植物体は、細胞壁代謝異常により矮化したものとなる。
【００５０】
以下、本発明に用いられる微生物由来のＰＭＥ、本発明に係る矮化植物の生産方法、本発明の利用についてそれぞれ説明する。
【００５１】
（Ｉ）微生物由来のペクチンメチルエステラーゼ（ＰＭＥ）
＜ペクチンメチルエステラーゼ（ＰＭＥ）＞
ペクチンメチルエステラーゼは、ペクチンのメチルエステル基を加水分解してメタノールとペクチン酸に分解する酵素のことであり、別名ペクチダーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペクチンメトキシラーゼとも言う。ポリガラクツロナーゼ（ＰＧ）と共同で、果実の軟化に重要な役割を果たしている酵素であることが知られている。
【００５２】
リンゴやトマトなどでは、ペクチンが果実の細胞を結合する糊として働いている。果実を収穫すると、まずＰＭＥが発現誘導され、ペクチンをペクチン酸へと分解する。一方のＰＧは、ペクチンとペクチン酸の両方を分解し得るが、分解能はペクチン酸に対する方が高い。この二つの酵素の共同作用で、果実が収穫後速やかに軟化する。逆にこの酵素の作用を抑制することにより、果実の日持ちを向上することが可能となる。
【００５３】
一方ＰＭＥは、全ての植物と植物病原性細菌・菌類に存在する酵素で、ホモポリガラクツロナンのメチルエステル部分を特異的に加水分解することによりメタノールとペクチン酸を生成する（非特許文献１参照）。ポリガラクツロナンのカルボキシル基の大部分は、細胞外に分泌された時点でメチルエステル化されているため、Ｃａ２＋架橋による会合体を形成できない。したがって、ＰＭＥによるメチルエステル部分の加水分解反応は、Ｃａ２＋架橋の形成には必須である。また、ペクチン酸の生成は、細胞壁中のｐＨやイオンバランスを変化させ、細胞壁内の酵素反応速度に影響を及ぼすと考えられている。このようにＰＭＥは、一次細胞壁の構築制御において重要な役割を果たし、細胞の成長や老化に関連している。
【００５４】
＜ペクチン＞
ペクチン酸のうち、水溶性で有り種々のメチルエステル含量を持ち、砂糖と酸添加で種々のゲルを作ることができる一群のポリガラクツロン酸をペクチンと総称する。マツの形成層、ハリモミやトオヒなどの内部樹皮、レモンの皮、リンゴなどはペクチン含量が高い。Ｃａ２＋で硬いゲルとなり、食品工業や飲料加工、製菓領域で広く利用されている。生体内代謝の際には、メチルエステル含量や重合度が減少していく。良質の食物繊維である。
【００５５】
またペクチン性多糖類は、前述のごとく、植物の一次細胞壁を構成するマトリクス高分子で、セルロースミクロフィブリルの間隙を満たしている。細胞壁ペクチンは、ホモポリガラクツロナン主鎖とラムノガラクツロナンＩ／ＩＩ側鎖とからなり、ホモポリガラクツロナンは、ガラクツロン酸残基が連なった領域でＣａ２＋を介した分子間架橋を形成することにより非常に多数の分子から成る大きな会合体を作り、細胞壁強度や細胞間隙の大きさの調節に重要な役割を担っていると考えられている。
【００５６】
このように、ＰＭＥは、多くの植物や微生物において、生理的に重要な役割を果たしているが、ある種の植物由来のＰＭＥを他の種の植物に導入して過剰発現させても、ＰＭＥの過剰発現による効果を十分には得られないことが明らかとなっている（非特許文献５参照）。
【００５７】
そこで、本発明では、植物由来のＰＭＥではなく、微生物由来のＰＭＥを植物体に導入して過剰発現させることによって、ＰＭＥ過剰発現による効果を十分に発揮させる。このＰＭＥ過剰発現により、細胞壁代謝異常が誘導され、矮小化した形質転換植物体を作出することが可能となる。
【００５８】
＜ペクチンメチルエステラーゼ（ＰＭＥ）遺伝子＞
本発明で用いられるＰＭＥは、宿主となる植物において、ＰＭＥ過剰発現による効果が十分に得られるものであればよいが、好ましくは、微生物を由来（起源）とするＰＭＥを用いる。微生物由来のＰＭＥであれば、至適ｐＨ、等電点、および作用機構等から、植物体内で過剰発現されたＰＭＥによる効果を十分に得ることが可能となる。
【００５９】
ＰＭＥの由来となる微生物としては、具体的には、例えば、細菌類、糸状菌類（カビ類）を含む菌類、酵母等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。上記微生物の中でも、ＰＭＥの至適ｐＨ、等電点、および作用機構等の観点から、糸状菌由来のＰＭＥであることが好ましく、中でも、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の糸状菌をより好ましく用いることができる。
【００６０】
上記糸状菌類としては、具体的には、例えば、子のう菌類、担子菌類、接合菌類等が挙げられ、代表的なものとして、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｘａｎｔｏｍｏｎａｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属等を挙げることができる。
【００６１】
このうち、ＰＭＥの由来としてより好ましいＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の菌類としては、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（Ａ．  ｎｉｇｅｒ），  Ａ．  ｃａｒｂｏｎａｒｉｕｍ，  Ａ．  ｆｏｅｔｉｄｕｓ，  Ａ．  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ，  Ａ．  ｏｒｙｚａｅ等を挙げることができる。本発明では、後述する実施例に示すように、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のＰＭＥが特に好ましく用いられる。
【００６２】
植物由来ＰＭＥが、ペクチンの非還元末端やフリーのカルボシル基に隣接したメチル基を加水分解するのに対し、Ａ．ｎｉｇｅｒ  由来ＰＭＥはペクチンのメチル基をランダムに加水分解する活性を持つ。ホモガラクツロナン主鎖を脱重合するＰＧは、ペクチン分解反応においてＰＭＥとシナジー効果を示すことが知られている。Ａ．ｎｉｇｅｒ  由来ＰＭＥとオレンジ由来ＰＭＥの活性を比較するために、アップルペクチンを基質としてＰＧとのコンビネーションでペクチン分解反応を行ったところ、Ａ．ｎｉｇｅｒ  由来ＰＭＥを用いたときに効果的に脱重合反応が進むことが明らかとなっている（非特許文献８）。よってこのような観点からもＡ．ｎｉｇｅｒ  由来ＰＭＥが好ましい。なお、Ａ．ｎｉｇｅｒ  由来ＰＭＥ遺伝子の塩基配列は、例えば配列番号７に示されるとおりである。また、Ａ．ｎｉｇｅｒ  由来ＰＭＥのアミノ酸配列については、例えば配列番号８に示されるとおりである。
【００６３】
ただし、本発明で用いられるＰＭＥとしては、上述したように、Ａ．ｎｉｇｅｒ  由来ＰＭＥと同様に、ペクチンのメチル基をランダムに加水分解する活性を持つＰＭＥであれば、特に起源は限定されるものではない。
【００６４】
＜ＰＭＥ遺伝子の取得方法＞
本発明に係る遺伝子を取得する方法は、特に限定されるものではなく、例えば、公開された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記各遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。
【００６５】
例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ由来ＰＭＥを取得する場合は、後述する実施例において示すように、既知のＰＭＥ塩基配列をもとに化学合成したＰＭＥ遺伝子特異的プライマーセットＰＭＥ−Ｆ；５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＧＴＴＡＡＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＧＣＡＴＣＣＧ−３’（配列番号１）、およびＰＭＥ−Ｒ；５’−ＣＧＡＧＣＴＣＧＴＴＡＧＴＴＧＡＴＧＴＡＧＣＴＡＧＴＡＴＣＡＡＣＣＣ−３’（配列番号２）を用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、ＰＭＥ遺伝子を含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００６６】
その他ｃＤＮＡ配列の一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法が挙げられる。このようなプローブとしては、上記各ｃＤＮＡ配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
【００６７】
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成およびその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、目的の遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
【００６８】
（ＩＩ）矮化植物の生産方法
本発明に係る矮化植物の生産方法は、少なくとも、対象となる植物内でＰＭＥを過剰発現させるために、微生物由来のＰＭＥ遺伝子を植物体に導入するＰＭＥ遺伝子導入工程を含む方法であり、好ましくは、さらに、ＰＭＥ遺伝子導入工程の後に得られた植物体の集団から、植物体が成熟する前に矮化植物体を選抜する矮化植物体選抜工程を含む方法である。もちろん本発明はこれに限定されるものではなく、その他の工程を含んでもよいことは言うまでもない。
【００６９】
＜ＰＭＥ遺伝子導入工程＞
上記ＰＭＥ遺伝子導入工程は、ＰＭＥを過剰発現させるために、上記微生物由来のＰＭＥ遺伝子を植物体に導入する工程であれば特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、植物細胞内でＰＭＥが安定的に発現するプロモーターとＰＭＥ遺伝子を連結した過剰発現ベクターを構築し、これを宿主となる植物体へ導入する手法を好適に用いることができる。なお、ＰＭＥ遺伝子を導入した植物体は、適宜、形質転換植物体と称する。
【００７０】
上記過剰発現ベクターとしては、ＰＭＥ遺伝子を過剰発現できるベクターであれば特に限定されるものではなく、ベースとなるベクターとしては、プラスミド、ファージ、又はコスミド等公知のベクターを好適に用いることができる。また、上記プロモーターとしても、植物細胞内でＰＭＥを安定して発現させることができるものであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。中でも、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）を特に好ましく用いることができる。
【００７１】
さらに、上記過剰発現ベクターには、プロモーター以外の種々のＤＮＡセグメントが含まれていてもよい。ＤＮＡセグメントとしては、例えば、ターミネーターを挙げることができる。また、必要に応じて、キメラタンパク質を発現させるために、他のタンパク質をコードする遺伝子や、このような遺伝子を導入するための制限酵素認識部位（マルチクローニングサイト等）を含んでいてもよい。
【００７２】
上記過剰発現ベクターを構築する方法（作製方法）は具体的には特に限定されるものではなく、ＰＭＥ遺伝子およびプロモーター等のＤＮＡセグメントと、上述したベースとなるベクターとを、公知の組換えＤＮＡ技術を用いてつなげればよい。また、構築された過剰発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌細胞内で増殖させればよい。このときベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。
【００７３】
本発明で用いられる過剰発現ベクターの代表的な例としては、後述する実施例に示すように、ＰＭＥ遺伝子断片と、ｐＢＩ１２１のカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター下流に存在するＧＵＳ遺伝子とを置換することにより構築されたｐＡＮＰＭＥを挙げることができる。
【００７４】
構築された過剰発現ベクターを宿主（ホスト）となる植物体へ導入する具体的な手法は特に限定されるものではなく、宿主となる植物体の種類に応じた適切な形質転換方法を用いればよい。植物体への一般的な形質転換法としては、アグロバクテリウムを用いた形質転換法（アグロバクテリウム法）を挙げることができ、後述する実施例に示すように、本発明でもアグロバクテリウム法を好適に用いることができる。またその他パーティクルガンによる方法、プロトプラスト／スフェロプラスト法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００７５】
ＰＭＥ遺伝子（上記過剰発現ベクター）が宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認する方法は、特に限定されるものではなく、公知の各種の方法を用いることができる。具体的には、例えば、後述する実施例に示すように、宿主から調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＭＥ遺伝子全長を特異的に増幅するいわゆるジェノミックＰＣＲ法を挙げることができる。この方法によって、ＰＭＥ遺伝子が増幅されてくることを電気泳動法等によって確認できれば、ＰＭＥ遺伝子の導入を確認することができる。
【００７６】
また、その他の方法としては、例えば、各種マーカーを用いてもよい。例えば、宿主細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーとＰＭＥ遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとして宿主細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、ＰＭＥを融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、ＰＭＥをＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。さらに、発現ベクターには、形質転換植物体における発現部位を可視化してモニターするための遺伝子を導入することもできる。このような遺伝子の一例としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を挙げることができる。
【００７７】
＜矮化植物体選抜工程＞
上記矮化植物体選抜工程は、ＰＭＥ遺伝子導入工程の後に得られた植物体の集団から、植物体が成熟する前に矮化植物体を選抜する工程である。
【００７８】
本発明の目的から見れば、ＰＭＥ遺伝子導入工程の後に得られる植物体をそれぞれ栽培することによって、最終的にその茎長、幅等を基準に、矮化植物体を選抜すればよい。この手法によれば、確かに測定機器、測定技術等は必要としないという利点がある。しかしながら、矮化植物体の選抜には、植物が成熟するまで実際に栽培するため、（１）長期間を要すること、（２）栽培するために適当なスペースが必要なこと、（３）これらの理由によって多数の形質転換植物体を選抜（スクリーニング）するには不向きなこと等のデメリットがある。
【００７９】
そこで、本発明では、上記ＰＭＥ遺伝子導入工程の後に得られた植物体の集団から、植物体が成熟する前に矮化植物体を選抜するための矮化植物体選抜工程として、各植物体について、ＰＭＥの発現に伴い生ずる測定可能な化合物の量または活性を基準として、矮化を判定する工程を実施する。これによって、上記（１）〜（３）のデメリットを回避して効率的な矮化植物の生産が可能となる。
【００８０】
上記矮化植物体選抜工程では、ＰＭＥの発現に伴い生ずる化合物の量または活性としては特に限定されるものではないが、▲１▼ＰＭＥ  ｍＲＮＡの発現量、▲２▼ＰＭＥ活性、または▲３▼メタノール濃度の少なくとも何れかの指標を好適に用いることができる。以下、上記各指標を用いた矮化植物体選抜工程について説明する。
【００８１】
▲１▼形質転換植物体のＰＭＥ  ｍＲＮＡの発現量を基準とする選抜
後述する実施例に示すように、本発明者らは、ＰＭＥ遺伝子が導入されたタバコ植物体からＲＮＡを取得し、リアルタイム−ＰＣＲ（以下適宜ＲＴ−ＰＣＲと略す）によってｍＲＮＡの発現量を測定した。その結果、ＰＭＥ  ｍＲＮＡの発現量が多かった形質転換植物体を実際に栽培すると、茎長、幅等が矮化しており、またこの形質転換植物体の細胞長は、短小化していた。これは、形質転換植物体においてＰＭＥ遺伝子の転写量が増加し、ＰＭＥが過剰に発現したために、細胞壁代謝異常を誘導し、矮小化したものと考えられる。
【００８２】
つまり、細胞中のＰＭＥ  ｍＲＮＡの発現量が多い形質転換植物体は矮化植物体と判定することができる。したがって、ＰＭＥ遺伝子の導入が確認された形質転換植物体において、ＰＭＥ  ｍＲＮＡの発現量を測定し比較することで、矮化植物体であるか否かを判定することが可能となる。それゆえ、矮化度の高い植物体を、当該植物体が成熟する前に選抜することが可能となり、矮化植物体のスクリーニング（選抜）方法として有効に利用することができる。
【００８３】
上記ＰＭＥ  ｍＲＮＡの発現量を測定する方法については特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、上記のように、ＰＭＥ遺伝子が導入された植物体からＲＮＡを取得し、ＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡの発現量を測定する方法、ノザンハイブリダイゼーションにより解析する方法（ノザン解析法）等を挙げることができる。ノザン解析法では、目的とするサイズのバンドについて、シグナルの濃淡を基準にＰＭＥ  ｍＲＮＡの発現量を判断するので、濃いシグナルが得られた形質転換植物体を選抜すればよい。
【００８４】
なお、ＲＴ−ＰＣＲによりＰＭＥ  ｍＲＮＡの発現量を測定する場合、ペクチンメチルエステラーゼ遺伝子を増幅するためのプライマーとして、後述する実施例に示す配列番号３〜６の塩基配列を有するポリヌクレオチドを好適に用いることができる。
【００８５】
▲２▼形質転換植物体のＰＭＥ活性を基準とする選抜
後述する実施例に示すように、本発明者らは、ＰＭＥ遺伝子が導入されたタバコ植物体から組織抽出液を調製し、ＰＭＥ活性を蛍光測定法によって測定した。その結果、ＰＭＥ活性の高かった形質転換植物体を実際に栽培すると、茎長、幅等が矮化しており、またこの形質転換植物体の細胞長は、短小化していた。これは、上記▲１▼の説明にて記載した原理と同様に、ＰＭＥが過剰に発現したために、細胞壁代謝異常を誘導し、矮小化したものと考えられる。
【００８６】
つまり、細胞中のＰＭＥ活性の高い形質転換植物体は矮化植物体と判定することができる。したがって、ＰＭＥ遺伝子の導入が確認された形質転換植物体において、ＰＭＥ活性を測定し比較することでも、矮化植物体であるか否かを判定することが可能となる。それゆえ、矮化度の高い植物体を、当該植物体が成熟する前に選抜することが可能となり、矮化植物体のスクリーニング（選抜）方法として有効に利用することができる。
【００８７】
上記ＰＭＥ活性を測定する方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、上記のように、ＰＭＥ遺伝子が導入された植物体から組織抽出液を調製し、蛍光測定によりＰＭＥ活性を測定する方法、ペクチン酸滴定法、ペクチンゲル拡散法等を挙げることができる。
【００８８】
ここで、植物体から組織抽出液を調製する際にいずれの部位から抽出するかは、特に限定されるものではないが、葉から調製することが好ましく、若い葉から抽出液を調製することがより好ましい。これは、後述する実施例に示すように、ＰＭＥ遺伝子を導入したタバコ形質転換体において、ベクターコントロールと比べて若い葉では２〜３倍、古い葉では約１．７倍ＰＭＥ活性が増大していたのに対して、根ではあまり顕著な差は見られなかったという知見に基づくものである（図４参照）。
【００８９】
▲３▼形質転換植物体の葉中のメタノール濃度を基準とする選抜
後述する実施例に示すように、本発明者らは、ＰＭＥ遺伝子が導入されたタバコ植物体から組織抽出液を調製し、メタノール濃度をＧａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ法（以下適宜ＧＣ−ＭＳ法と略す）によって測定した。その結果、細胞中のメタノール濃度の高かった形質転換植物体を実際に栽培すると、茎長、幅等が矮化しており、またこの形質転換植物体の細胞長は、短小化していた。これは、細胞中のメタノール濃度が増加しているということは、細胞内のペクチンの分解が起こっているということを示している。よって、上記▲１▼の説明にて記載した原理と同様に、ＰＭＥが過剰に発現したために、細胞内ペクチンの分解が起こり、細胞壁代謝異常を誘導し、矮小化したものと考えられる。
【００９０】
つまり、細胞中のメタノール濃度の高い形質転換植物体は矮化植物体と判定することができる。したがって、ＰＭＥ遺伝子の導入が確認された形質転換植物体において、メタノール濃度を測定し比較することでも、矮化植物体であるか否かを判定することが可能となる。それゆえ、矮化度の高い植物体を、当該植物体が成熟する前に選抜することが可能となり、矮化植物体のスクリーニング（選抜）方法として有効に利用することができる。
【００９１】
上記メタノール濃度を測定する方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、上記のようにメタノール濃度をＧＣ−ＭＳ法によって測定する方法、酵素法、あるいは蛍光測定法、吸光測定法等を挙げることができる。
【００９２】
ここで、植物体から組織抽出液を調製する条件は特に限定されるものではないが、無菌的に育種した植物体から抽出することが好ましい。これは、土壌で育種した植物体では、組織表面に微生物が付着し、微生物由来のメタノールが検出される可能性があるためである。
【００９３】
また植物体から組織抽出液を調製する際にいずれの細胞から抽出するかは、特に限定されるものではないが、葉から調製することが好ましく、また若い葉から抽出液を調製することがより好ましい。その理由については上記▲２▼の説明と同様に、葉（できれば若い葉）の方がＰＭＥ活性に差が現れやすいという知見に因るものである。
【００９４】
このように、矮化植物体選抜工程において、▲１▼ＰＭＥ  ｍＲＮＡの発現量、▲２▼ＰＭＥ活性、または▲３▼メタノール濃度の少なくとも何れかの指標を用いれば、選抜対象の植物体を成熟するまで培養する必要がなく、簡単な試験設備があれば、比較的短期間に多数の形質転換植物体のスクリーニングに利用することができる。もちろん、矮化植物体選抜工程では、ＰＭＥの発現に伴い生ずる測定可能な化合物の量または活性であれば、上記以外の指標を用いてもよいことは言うまでもない。
【００９５】
（ＩＩＩ）本発明の利用
本発明に係る矮化植物の生産方法の利用範囲は特に限定されるものではなく、本発明が利用可能な様々な分野に利用することができる。
【００９６】
＜本発明の対象となる植物＞
後述する実施例に示すように、本発明者らは、矮化の対象となる植物としてタバコを用いているが、本発明が利用可能な植物は、タバコに限定されるものではなく、広く植物一般に適用することができる。したがって、本発明には、上記矮化植物の生産方法によって得られた矮化植物体が含まれてもよい。
【００９７】
本発明では、ＰＭＥ遺伝子導入工程により植物体に遺伝子を導入するが、ここでいう「遺伝子の導入」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、ＰＭＥ遺伝子が導入された植物体は、上述したように形質転換体（形質転換植物体）となるが、この「形質転換体」には、細胞のみならず、各種生物の組織・器官、さらには植物の個体も含まれる。
【００９８】
本発明の対象となる植物としては、例えば、実験用の対象としては、シロイヌナズナ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、メロン等を挙げることができる。また、植物を用いた産業分野に本発明を適用する場合、各種作物（農林水産業で生産される植物、農作物）を挙げることができる。具体的には、例えば、イネ、コムギ、トウモロコシ等の穀物；トマト、ナス等の各種野菜・花卉類；ミカン、リンゴ等の果樹類；マツ、スギ、ヒノキ等の材木類等を挙げることができる。
【００９９】
＜植物の矮化キット＞
本発明の利用の一例としては、具体的には、例えば、上記矮化植物の生産方法を実施するために用いられる植物の矮化キットを挙げることができる。
【０１００】
植物の矮化キットの具体的な構成は特に限定されるものではないが、少なくとも、上記ＰＭＥ遺伝子導入工程が実施できるキットであればよく、好ましくは、矮化植物体選抜工程が実施できるキットであればよい。
【０１０１】
ＰＭＥ遺伝子導入工程が実施できるキットの具体的構成は特に限定されるものではないが、例えば、植物体内でＰＭＥが安定的に発現するプロモーターと当該遺伝子を連結した上記過剰発現ベクターを含む構成を挙げることができる。より具体的には、前述の発現ベクターｐＡＮＰＭＥを用いることができる。また、形質転換用の試薬等が含まれているとより好ましい。試薬としては、例えば、形質転換用のバッファー等を挙げることができる。また、必要に応じて、形質転換に好適なマイクロ遠心チューブ等が含まれていてもよい。
【０１０２】
上記矮化植物体選抜工程が実施できるキットの具体的構成は特に限定されるものではないが、例えば、植物細胞から、▲１▼ＰＭＥ  ｍＲＮＡの発現量、▲２▼ＰＭＥ活性、または▲３▼メタノール濃度を測定するための試薬を含む構成を挙げることができる。
【０１０３】
より具体的には、植物細胞から▲１▼ＰＭＥ  ｍＲＮＡの発現量を測定する場合で、ＲＴ−ＰＣＲを用いる場合には、キットの構成として、例えば、ＲＮＡ抽出バッファー、ＰＭＥ遺伝子を増幅するためのプライマーセット（例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド）等を挙げることができる。またノザン解析を用いる場合には、キットの構成として、例えば、全長ＰＭＥ  ｃＤＮＡを酵素またはラジオアイソトープ等で標識したプローブ等を挙げることができる。
【０１０４】
また、植物細胞から▲２▼ＰＭＥ活性を測定する場合には、キットの構成として、例えば、組織抽出用のバッファー類、酵素反応に用いる最適なバッファー類、タンパク質量測定に用いる試薬類、標準タンパク質（例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等）および蛍光標識した基質等を挙げることができる。
【０１０５】
さらに、植物細胞から▲３▼メタノール濃度を測定する場合には、キットの構成として、例えば、メタノールおよび内部標準としてのメタノール−ｄ３、組織抽出用のバッファー類等を挙げることができる。
【０１０６】
このようなキットを用いることにより、より簡便に矮化植物体を生産することができる。特に、上記キットが、矮化植物体選抜工程を実施できるキットであれば、ＰＭＥ遺伝子導入工程後の植物体を成熟するまで培養する必要がなくなり、簡単な試験設備があれば、比較的短期間に多数の形質転換植物体の選抜に利用することができる。
【０１０７】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１０８】
【実施例】
以下本発明を実施例および図１〜８に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１０９】
〔実施例１：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来ＰＭＥ遺伝子（ｐｍｅＡ）のタバコ植物体Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．  ｃｖ  ＳＲ−１への導入〕
〔材料及び培養条件〕
クロカビＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｖａｎ  Ｔｉｅｇｈｅｍ  ＫＦ−２６７は、大阪府立大学農学部、川口剛司先生より贈与された。カビはＣｚａｐｅｋ寒天培地にて３０℃で継代培養した。タバコ植物体Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．  ｃｖ  ＳＲ−１は、ＭＳ無機塩（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，  １９６２，  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ，  １８，  ４７３−４９７参照）に３％スクロース、０．３％ゲランガム（和光純薬工業株式会社製）を添加したＭＳ培地で栽培した。タバコ植物体は特に断らない限り、２５℃で１６時間明期および８時間暗期で栽培した。融合遺伝子構築の大腸菌宿主として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  （Ｆ−，  φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５，  Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９，  ｄｅｏＲ，  ｒｅｃＡ１，  ｅｎｄＡ１，  ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−ｍｋ＋），  ｐｈｏＡ，  ｓｕｐＥ４４，  λ−，  ｔｈｉ−１，  ｇｙｒＡ９６，  ｒｅｌＡ１）  （Ｈａｎａｈａｎ，  Ｄ．  （１９８３）．  ”Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍｉｄｓ．”  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １６６（４）：  ５５７−８０．参照）を使用した。
【０１１０】
タバコへの遺伝子導入に用いるアグロバクテリウムは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＥＨＡ１０５  株（Ｈｏｏｄ，  Ｅ．  Ｅ．，  Ｇ．  Ｌ．  Ｈｅｌｍｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）．  ”Ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ａ２８１  ｉｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｉｎ  ａ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｐＴｉＢｏ５４２  ｏｕｔｓｉｄｅ  ｏｆ  Ｔ−ＤＮＡ．”  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １６８（３）：  １２９１−３０１．参照）を使用した。アグロバクテリウムの培養は、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地を使用し、２８℃で行った。融合遺伝子の構築を行うためのベクターとして、ｐＵＣ１８（Ｍｅｓｓｉｎｇ，  Ｊ．  （１９８３）．  ”Ｎｅｗ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ．”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １０１：  ２０−７８参照）を使用した。形質転換タバコ作出のためのバイナリーベクターとして、ｐＢＩ１２１（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，  Ｒ．  Ａ．，  Ｔ．  Ａ．  Ｋａｖａｎａｇｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）．  ”ＧＵＳ  ｆｕｓｉｏｎｓ：  ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ａｓ  ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｈｉｇｈｅｒ  ｐｌａｎｔｓ．”  Ｅｍｂｏ  Ｊ  ６（１３）：  ３９０１−７．参照）を使用した。必要に応じて抗生物質（カナマイシン１００ｍｇ／ｌ）を添加した。
【０１１１】
〔Ａ．  ｎｉｇｅｒ由来ＰＭＥ  ｃＤＮＡ発現用バイナリープラスミドの構築〕
Ｃｚａｐｅｋ培地に植菌して３から７日間、３０℃で培養したＡ．  ｎｉｇｅｒから菌糸をサンプリングし、液体窒素存在下で細胞を破砕した。得られた粉末は、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （キアゲン社製）に供してトータルＲＮＡをスピンカラム精製した。トータルＲＮＡは、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  （タカラバイオ株式会社製）処理後、ｏｌｉｇｏ  （ｄＴ）１２−１８  ｐｒｉｍｅｒ  （Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）およびＭＭＬＶ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  （東洋紡株式会社製）による逆転写反応に供し、ｃＤＮＡプールを合成した。融合遺伝子構築のための基本操作は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  らの方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｅ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）．  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｎ．”  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ＮＹ，  ＵＳＡ．参照）に従った。
【０１１２】
ＰＭＥ  ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅は、既知配列（Ｋｈａｎｈ，  Ｎ．  Ｑ．，  Ｈ．  Ａｌｂｒｅｃｈｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）．  ”Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｐｅｃｔｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｃＤＮＡ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｓｔｒａｉｎ  ＲＨ  ５３４４．”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８（１４）：  ４２６２．参照）から化学合成したＰＭＥ遺伝子特異的プライマーセットＰＭＥ−Ｆ；５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＧＴＴＡＡＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＧＣＡＴＣＣＧ−３’（配列番号１）、およびＰＭＥ−Ｒ；５’−ＣＧＡＧＣＴＣＧＴＴＡＧＴＴＧＡＴＧＴＡＧＣＴＡＧＴＡＴＣＡＡＣＣＣ−３’（配列番号２）を用いて３０サイクル（９４℃，３０秒；５５℃，３０秒；７２℃，１分３０秒）の１次反応と２０サイクル（９４℃，３０秒；５５℃，３０秒；７２℃，１分３０秒）の２次反応により行った。
【０１１３】
精製したＰＣＲ断片は、ｐＵＣ１８のＳａｃＩ／ＸｂａＩ部位に挿入した。ＰＭＥ遺伝子配列はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ＵＳＡ）を用いたダイターミネーター法により解析し、既知配列と同じアミノ酸配列であることを確認した。図１に示すごとく、クローニングベクターより切断した約１ｋｂのＳａｃＩ／ＸｂａＩ  ＰＭＥ遺伝子断片と、ｐＢＩ１２１のカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター下流に存在するＧＵＳ遺伝子とを置換することにより、新規ベクターｐＡＮＰＭＥを構築した。
【０１１４】
〔アグロバクテリウムの形質転換〕
アグロバクテリウム単一コロニーを５ｍｌのＬＢ培地に植菌し、２８℃で一晩振盪培養した。この培養液を、５００ｍｌのＬＢ培地に植菌し、６００ｎｍにおける濁度が０．５になるまで２８℃で振盪培養した。培養液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により集菌して上清を捨て、菌体を洗浄するため５００ｍｌの滅菌水を加えて懸濁し、再度遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により集菌して上清を捨てた。この操作を２回繰り返した後、沈殿に２０ｍｌの冷却した滅菌１０％グリセロール溶液を加えて懸濁し、遠心分離  （５０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により集菌して上清を捨てた。沈殿に３ｍｌの冷却した滅菌１０％グリセロール溶液を加えて懸濁し、４０μｌづつ１．５ｍｌ遠心管に分注して、液体窒素で凍結させてから−８０℃で保存した。
【０１１５】
コンピテントセルを氷中で解凍した後、２μｌのＤＮＡ溶液を加え、氷冷しておいた１ｍｍキュベット  （Ｇｅｎｅ  ＰｕｌｓｅｒＲ／Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＴＭ  Ｃｕｖｅｔｔｅ；  ＢＩＯ−ＲＡＤ社）に移した。エレクトロポレーター  （Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ；  ＢＩＯ−ＲＡＤ社）  により電気パルス  （１．８ＫＶ，２５μＦ，２００Ｗ）を与え、ＤＮＡを導入した。１ｍｌのＳＯＣ培地を加えて混合し、１．５ｍｌ遠心管に移した。そのまま２８℃で１時間振盪培養した後、スピンダウンして上清を大部分除き、残った培地に菌体を懸濁して５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上に塗布し、２８℃で二晩培養した。
【０１１６】
〔タバコ植物体の形質転換〕
無菌的に生育させたタバコの葉片をシャーレ上で滅菌水に浸し、カナマイシン１００ｍｇ／ｌを含む５ｍｌのＬＢ培地で２８℃、二晩培養したアグロバテリウム培養液（ｐＢＩ１２１を持つＥＨＡ  １０５株）を加えた。３分後、リーフディスクを取り出し、２ｍｇ／ｌナフタレン酢酸（以下ＮＡＡと略す）と０．２ｍｇ／ｍｌベンジルアデニンを含むＭＳ培地に置床した。２５℃で二晩、明所下で静置して共存培養した。
【０１１７】
リーフディスクからアグロバクテリウムを除くため、滅菌水による洗浄を４回繰り返した後、２５０ｍｇ／ｌクラフォランを含む滅菌水で洗浄した。リーフディスクを２ｍｇ／ｌＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌベンジルアデニン、２５０ｍｇ／ｌクラフォランを含むＭＳ培地に置床し、２５℃、明所下で１週間培養した。リーフディスクを０．０２ｍｇ／ｌＮＡＡ、１ｍｇ／ｌベンジルアデニン、１００ｍｇ／ｌカナマイシンを含むＭＳ培地に移し、２５℃、明所下で培養することによりシュートを誘導した。シュートをリーフディスクから切り取って、１００ｍｇ／ｌカナマイシンを含むＭＳ培地に移し、２５℃、明所下で培養することによりルートを誘導した。
【０１１８】
発根した植物体は、ピートモス／バーミキュライト（３／１）を含む５号鉢（１５０ｍｍ×１６０ｍｍ）に移植した。自家受粉により得られた雑種第一世代の種子を１００ｍｇ／ｌカナマイシンを含むＭＳ培地に移し、２５℃、１６時間明所／８時間暗所の条件で無菌的に培養することにより、外来遺伝子の導入された形質転換植物体を選抜した。
【０１１９】
〔ジェノミックＰＣＲによる遺伝子導入の確認〕
タバコ植物体のゲノムＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ  （キアゲン社製）を用いて調製した。形質転換植物体の遺伝子導入の確認は、調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＭＥ遺伝子全長を特異的に増幅するＰＭＥ−ＦおよびＰＭＥ−Ｒのプライマーセットを用いたＰＣＲによって行った。ＰＣＲは、変性反応を９４℃で１分間行った後、変性反応を９４℃で３０秒間、アニーリング反応を５５℃で３０秒間、伸長反応を７２℃で１分３０秒間、の条件で３０サイクル繰り返して行い、最後に伸長反応を７２℃で５分間行った。
【０１２０】
〔タバコ植物体からのＲＮＡ単離〕
タバコ植物体からのＲＮＡ単離は、ＡＴＡ（ａｕｒｉｎｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）法に従った（Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９，  ４２９９−４３０３参照）。タバコ植物体組織（０．１ｇＦＷ程度）をあらかじめ液体窒素を入れておいた乳鉢に入れ、乳棒で粉末状になるまで細胞をすりつぶした。粉砕した細胞を使用直前に１／１０００容の２−メルカプトエタノールを加えたＲＮＡ抽出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，２％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ，２ｍＭ  ＡＴＡ，２％  ＴＩＮＳ（ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ））が１ｍｌ入った１．５ｍｌ遠心管に入れ、緩やかに撹拌し、溶液が均一になったら３Ｍ  ＫＣｌを１４０μｌ加え混合した。これを氷中で１５分間以上冷やし、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，５分間，４℃）した。上清の約１．１ｍｌを新しい１．５ｍｌ遠心管に移し、そこへ１０Ｍ  ＬｉＣｌを４４０μｌ加え混合した。これを氷中で３０分間以上放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）した。上清を取り除き、沈殿を３００μｌの滅菌水に溶解して、フェノール・クロロホルム抽出を２回、クロロホルム抽出を１回行った。抽出後の上清に５Ｍ  ＮａＣｌ  ４０μｌ、エタノールを８５０μｌ加えて混合し、−２０℃で１時間以上放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，１５分間，４℃）した。上清を取り除き、沈殿を７０％エタノールでリンスし、３０μｌの滅菌水に溶解した。
【０１２１】
〔ノザン解析〕
ホルマリンアガロースＲＮＡ変性ゲル電気泳動を行うため、無菌水７７ｍｌに、アガロース１．５ｇ、２０×ＭＯＰＳバッファー（４００ｍＭ  ＭＯＰＳ、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）５ｍｌを加え、ゲルを溶解した後、１８ｍｌのホルマリンを加えて混合し、６ｍｍ厚のサブマリン型電気泳動ゲルを作製した。泳動用緩衝液は、１×ＭＯＰＳバッファー（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ、５  ｍＭ  酢酸ナトリウム、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）を用いた。ＲＮＡ溶液（４０μｇのＲＮＡを含む）３．４μｌ、２０×ＭＯＰＳバッファー  ０．５μｌ、ホルマリン  ２μｌ、ホルムアミド  ５μｌ、０．２５％ブロモフェノールブルー−５０％グリセロール  １μｌを混合し、４ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイドを０．１μｌ加えた後、７０℃で１０分間加熱後、氷中で急冷し、泳動用色素液を２μｌ加え、５０Ｖで１．５時間電気泳動を行なった。
【０１２２】
電気泳動で分離したＲＮＡをナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋；  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｂｕｃｋｓ．，  ＵＫ）にトランスファーした。トランスファーバッファーは、２０×ＳＳＣ（３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  クエン酸ナトリウム）を用い、１２時間以上行った。ブロットしたメンブレンを、２×ＳＳＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３Ｍ  クエン酸ナトリウム）で洗浄し、８０℃にて１０分間乾燥させた後、２分間ＵＶクロスリンクした。ＤＮＡプローブには、ｐＡＮＰＭＥを鋳型としてＰＭＥ−ＦおよびＰＭＥ−ＲのプライマーセットによるＰＣＲで増幅した全長ＰＭＥ  ｃＤＮＡを用いた。プローブのラベリング及びバイブリダイゼーションは、Ａｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて行い、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてシグナルを検出した。
【０１２３】
〔リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）解析〕
ＲＴ−ＰＣＲに用いるためのＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて調製した。ＲＮＡの逆転写反応（ｃＤＮＡ合成）は、上記と同様の方法で行った。ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ  ５７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎケミストリにより検出を行った。反応液は，１×ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｔ、０．２μＭプライマーセット（ｆｏｒ  Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＰＭＥ：  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ，  ５’−ＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＧＣＡＴＣＣＧＴＴＣＴＣＴＴＴＧ−３’（配列番号３）；  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ，  ５’−ＣＡＧＣＧＣＴＧＡＴＣＧＴＧＴＣＧＴＡＧＴＣＡ−３（配列番号４）；  ｆｏｒ  ａｃｔｉｎ：  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ，  ５’−ＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＡＴＣＡＣＡ−３’（配列番号５）；  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ，  ５’−ＴＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＡ−３’（配列番号６））、１ｎｇ鋳型ｃＤＮＡを含む。ＰＣＲパラメーターは、５０℃で２分間，９５℃で１０分間処理後、９５℃で１５秒間，６０℃で１分間を４０サイクル繰り返すこととした。ＰＭＥ遺伝子の相対的発現量をノーマライズするためのハウスキーピング遺伝子としてアクチン遺伝子を用いた。
【０１２４】
遺伝子発現量のデータ解析は、Ｗｉｎｅｒらの方法（Ｗｉｎｅｒ，  Ｊ．，  Ｃ．  Ｋ．  Ｊｕｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）．  ”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．”  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７０（１）：  ４１−９．）を用いて行った。簡単には、それぞれのラインについてアクチンｍＲＮＡ発現量との差を求め、その差を相対的に評価することにより行った。
【０１２５】
図２には、ＰＭＥ遺伝子が導入されたタバコ形質転換植物体（以下適宜タバコＰＭＥ遺伝子導入株と称す）（２２−３、２２−４、２２−５、２２−６、２２−２４、２２−２５、２２−２６、２２−２７、２２−２８、２２−２９、２２−３０、２２−３１、２２−３２、２２−３３、２２−３４、２２−３５、２２−３６、２２−３７、２２−３８、２２−３９、２２−４０、２２−４１、２２−４２、２２−４３、２２−４４、２２−４５、および２２−４６）およびベクターコントロール（Ｐ−１）についてのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
【０１２６】
その結果、ＲＴ−ＰＣＲに供した２７株全てにおいてＰＭＥ遺伝子の発現を確認したが、発現量にはばらつきが見られた。
【０１２７】
そこで次に、ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果ＰＭＥ遺伝子の発現量が多かった株について、全長Ａ．  ｎｉｇｅｒ  ＰＭＥ  ｃＤＮＡをプローブとしてノザン解析を行った。図３に、タバコＰＭＥ遺伝子導入株（２２−３、２２−４、２２−３５、２２−３６、２２−３７、および２２−４６）およびベクターコントロール（Ｐ−１）についてのノザン解析の結果を示す。その結果、１．０ｋｂ付近にバンドが検出され、ＰＭＥ遺伝子の発現が示唆された。これらのＰＭＥ  ｍＲＮＡ発現量の多い株については、後述するＦ１世代の解析を行った。
【０１２８】
〔ＰＭＥ粗抽出液及び活性測定〕
タバコ組織を液体窒素存在下で破砕し、等量（ｗ／ｖ）の抽出バッファー（２０ｍＭ  酢酸ナトリウム，２Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ５．０）を加え、４℃で２時間インキュベートした。ＰＭＥ粗抽出液は、１０分間、１５，０００ｒｐｍで遠心後、上清から回収し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，  Ｍ．  Ｍ．  （１９７６）．  ”Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．”  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７２：  ２４８−５４．参照）を用いてタンパク質濃度を定量した。
【０１２９】
次にＰＭＥ粗抽出液をＡ．  ｎｉｇｅｒ  由来ＰＭＥの至適ｐＨであるｐＨ５．０に合わせた０．１Ｍリン酸カリウムバッファーにアプライしＰＭＥ活性を測定した。なお、ＰＭＥ活性は、蛍光測定法（Ｗｏｊｃｉｅｃｈｏｗｓｋｉ，  Ｃ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｒ．  Ｆａｌｌ  （１９９６）．  ”Ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｐｅｃｔｉｎ  ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ．”  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３７（１）：  １０３−８．参照）により測定した。本方法を簡単に説示すると、１ｍｇ／ｍｌ  Ｆｌｕｏｒａｌ−ｐ（株式会社同仁科学研究所製），２．０２５ｍｇ／ｍｌ  ｃｉｔｒｕｓ  ｐｅｃｔｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製、５９％  ｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ），０．６Ｕ／ｍｌ  Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐ．  Ａｌｃｏｈｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅを含む０．２Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４バッファー（ｐＨ５．０）に組織抽出液を加えた後、４０５ｎｍの励起光により生じる５００ｎｍの蛍光を測定することにより、単位時間当たりのメタノール生成量を求めた。
【０１３０】
図４にタバコＰＭＥ遺伝子導入株（図中黒塗りおよび白抜き棒グラフ）およびベクターコントロール（図中斜線棒グラフ）の若い葉（図中左）、古い葉（図中真中）、根（図中右）から調製したそれぞれの粗抽出液の、ＰＭＥ活性を測定した結果を示す。
【０１３１】
その結果、図４に示すごとく、タバコＰＭＥ遺伝子導入株では、ベクターコントロールと比べて若い葉では２〜３倍、古い葉では約１．７倍ＰＭＥ活性が増大していた。一方、根ではあまり顕著な差は見られなかった。
【０１３２】
〔ＧＣ−ＭＳを用いたメタノール分析〕
メタノールおよび内部標準としてのメタノール−ｄ３は、和光純薬工業株式会社より購入した。ガスクロマトグラフィはＳｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣ−１７Ａ  ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ  （島津製作所製）を使用し、サンプルはヘリウムをキャリアガスとしてＣＰ−ＰｏｒａＢＯＮＤ  Ｑ  ｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ  ＰＬＯＴ  カラム（２５  ｍ×０．２５  ｍｍ  ｉ．ｄ．，  ｄｆ  ＝  ３  μｍ  ｆｉｌｍ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ；  Ｃｈｒｏｍｐａｋ）に供した。ＧＣの条件は、カラム温度６０℃〜１００℃（６０℃で２分間保持し、毎分１０℃昇温）、気化室温度２７０℃で行った。サンプルはスプリットレスで注入し、カラムヘッド圧力は５０ｋＰａであった。
【０１３３】
マススペクトロメトリーは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＱＰ−５０００  ｍａｓｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  （島津製作所製）を用いて行った。検出器電圧は、１．８ｋＶで行った。メタノール（ｍ／Ｚ  ３２）およびメタノール−ｄ３（ｍ／Ｚ  ３５）のスペクトルは、ＳＩＭ（ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｅｒｉｎｇ）を用いて検出した。検量線は、２５μＭ〜２００μＭのメタノールと１００μＭのメタノール−ｄ３（内部標準）のｐｅａｋ  ｒａｔｉｏ（ｍ／ｚ３２／３５）から作成した。図５Ａに作成した検量線を示す。図５Ａに示すごとく、Ｒ２＝０．９８８８なる信頼できる検量線を得た。
【０１３４】
〔タバコ植物体組織中のメタノールアッセイ〕
無菌的に育種したタバコ葉を液体窒素中で粉砕した。なお、本実施例においては、無菌的に育種したフレッシュなタバコ葉から得た抽出液をサンプルとして用いた。その理由は、土壌で育種した植物では、組織表面に微生物が付着し、微生物由来のメタノールが検出される可能性があるからである。
【０１３５】
４０ｍｌバイアル（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｉｎｃ．，  ＵＳＡ）に、０．１ｇ〜０．２ｇのタバコサンプル、１０ｍｌの１２５μＭメタノール−ｄ３水溶液、ＰＴＦＥコーティング回転子を入れた。バイアルはテフロン（登録商標）／シリコンセプタム付フェノール製キャップ（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｉｎｃ．，  ＵＳＡ）により密閉し、８０℃にて１０分間攪拌しながら熱処理した。ヘッドスペースガスは、７５μｍ  Ｃａｒｂｏｘｅｎ／ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ  （ＰＤＭＳ）ファイバーを装着したｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｍｉｃｒｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  （ＳＰＭＥ）ユニット（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｉｎｃ．，  ＵＳＡ）を用いてサンプリングした。なお、ＳＰＭＥでは、目的化合物をファイバーに固定された抽出相に吸着させることにより抽出するため、適切な抽出相を選択することにより、目的化合物を効率よく抽出・濃縮できるという利点があるために採用した。
【０１３６】
ＳＰＭＥユニットの針部分をセプタムに突き刺し、ヘッドスペースにて８０℃で１０分間ファイバーを露出させることにより揮発性化合物を吸着させた。ファイバーは、針内に戻した後バイアルから引き抜き、直ちにＧＣ注入口（２７０℃）にインジェクトして３０秒間露出させた。ファイバーは、測定毎２７０℃で１０分間熱処理することによりコンディショニングした。
【０１３７】
図５Ｂに、左から順に野生株、ベクターコントロール（ｐ−１）およびタバコＰＭＥ遺伝子導入株の内ＰＭＥ活性が高かった株（以下適宜ＰＭＥ過剰発現株と称す）（２２−４）の葉組織中のメタノール濃度を示す。
【０１３８】
その結果、図５Ｂに示すごとく、ベクターコントロールでは、野生株とほとんど同程度だったのに対して、ＰＭＥ過剰発現株では、メタノール量の明らかな増加が認められた。
【０１３９】
〔タバコ形質転換体の表現型の比較〕
タバコ形質転換体をカナマイシン１００ｍｇ／ｌを含むＭＳ培地にて８週間培養後、土壌に移して培養し、そのときの表現型をベクターコントロールと比較した。
【０１４０】
図６には、ＰＭＥ過剰発現株（２２−３，２２−４）およびベクターコントロール（Ｐ−１）の土壌での培養後５週目（図６Ａ）の写真と、７週目の写真（図６Ｂ）を示す。その結果、ＰＭＥ過剰発現株（２２−３、２２−４）では、ベクターコントロール（Ｐ−１）と比べて明らかな矮化現象が見られた。
【０１４１】
また、図７Ａには、培養９週目、１０週目、１１週目、１２週目、および１３週目のＰＭＥ過剰発現株（２２−３、２２−４、２２−３６、および２２−４６）とベクターコントロール（Ｐ−１、Ｐ−７およびＰ−９）の茎長を示した。また図７Ｂには、培養９週目、１０週目、１１週目、１２週目、および１３週目のＰＭＥ過剰発現株（２２−３、２２−４、２２−３６、および２２−４６）とベクターコントロール（Ｐ−１、Ｐ−７およびＰ−９）の幅を示した。また図７Ｃには、培養９週目、１０週目、１１週目、１２週目、および１３週目のＰＭＥ過剰発現株（２２−３、２２−４、２２−３６、および２２−４６）とベクターコントロール（Ｐ−１、Ｐ−７およびＰ−９）の葉数を示した。
【０１４２】
図７の結果から、ＰＭＥ過剰発現株は、背丈が低く、幅が狭く、葉の枚数があまり変わらない。したがって、節間距離が短いフェノタイプといえる。特に、背丈の矮化は顕著で、播種してから１３週目の茎長がコントロールの平均と比べて６０〜７０％であった。また、ＰＭＥを発現する４株とベクターコントロールの３株では明らかに傾向が異なるため、矮化現象が導入遺伝子のｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔである可能性は排除できる。
【０１４３】
〔タバコ茎表皮細胞の顕微鏡観察〕
培養１３週目のタバコ第３節間を切り出して、デジタルＨＦマイクロスコープＶＨ８０００（Ｋｅｙｅｎｃｅ，  Ｊａｐａｎ）を用いて表皮細胞を観察した。
【０１４４】
図８Ａには、ＰＭＥ過剰発現株の第３節間表皮細胞の写真を示す。また図８Ｂには、ベクターコントロールの第３節間表皮細胞の写真を示す。また、図８Ｃには、ＰＭＥ過剰発現株（図中白抜き棒グラフ）と、ベクターコントロール（図中黒塗り棒グラフ）の第３節間表皮細胞について、任意に２０細胞選抜して細胞長を測定した結果を示す。
【０１４５】
図８の結果より、矮化した植物体では、細胞が短くなっていることが分かった。このことからＰＭＥの過剰発現は、細胞伸長に影響を及ぼし植物を矮化させることが示唆された。
【０１４６】
よって以上の結果より、Ａ．  ｎｉｇｅｒ由来ＰＭＥ遺伝子（ｐｍｅＡ）をタバコ植物体Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．  ｃｖ  ＳＲ−１に導入することにより、細胞壁代謝異常を誘導し、矮小化した形質転換植物体を作出することが可能であるとの知見が得らた。この知見を用いることによって、矮化植物体を容易に作出することが可能となる。
【０１４７】
またさらに、ＰＭＥ遺伝子を導入した植物体におけるＰＭＥのｍＲＮＡ発現量または、植物体中のＰＭＥ活性または、若い葉組織中のメタノール濃度を基準として判断すれば、矮化植物体のスクリーニングに用いることが可能となる。
【０１４８】
【発明の効果】
本発明にかかる矮化植物の生産方法は、以上のように、ＰＭＥ遺伝子（ｐｍｅＡ）を植物体に導入することにより、細胞壁代謝異常を誘導し、矮小化した形質転換植物体を作出する構成である。また本発明にかかる植物の矮化キットは上記生産方法を実施するための試薬等から構成されている。
【０１４９】
それゆえ、これらの構成によって、矮化植物体を容易に作出することが可能となるという効果を奏する。背丈が短縮した植物体は、雨風による倒伏を免れる耐倒伏性を獲得するとともに、施肥による徒長にも強いという耐肥性を獲得することができるため、ガーデニング等の観賞用としても求められているだけでなく、農業的に高収量作物として期待されている。また、花卉園芸および商業農業用の幼苗の保管流通コスト削減が可能となる。
【０１５０】
よって本発明は、花卉園芸産業および商業農業上極めて有用であると考えられる。
【０１５１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る矮化植物の生産方法で用いられる過剰発現ベクターの一例であるｐＡＮＰＭＥの構造を示す模式図である。
【図２】タバコＰＭＥ遺伝子導入株（２２−３、２２−４、２２−５、２２−６、２２−２４、２２−２５、２２−２６、２２−２７、２２−２８、２２−２９、２２−３０、２２−３１、２２−３２、２２−３３、２２−３４、２２−３５、２２−３６、２２−３７、２２−３８、２２−３９、２２−４０、２２−４１、２２−４２、２２−４３、２２−４４、２２−４５、および２２−４６）およびベクターコントロール（Ｐ−１）についてＲＴ−ＰＣＲを行ない、ＰＭＥのｍＲＮＡの発現量を調べた結果を示すグラフである。
【図３】タバコＰＭＥ遺伝子導入株（２２−３、２２−４、２２−３５、２２−３６、２２−３７、および２２−４６）およびベクターコントロール（Ｐ−１）について、全長Ａ．  ｎｉｇｅｒ  ＰＭＥ  ｃＤＮＡをプローブとしてノザン解析を行った結果を示す図である。
【図４】タバコＰＭＥ遺伝子導入株（図中黒塗りおよび白抜き棒グラフ）およびベクターコントロール（図中斜線棒グラフ）の若い葉（図中左）、古い葉（図中真中）、根（図中右）から調製したそれぞれの粗抽出液の、ＰＭＥ活性を測定した結果を示すヒストグラムである。
【図５】図５Ａは、メタノールの検量線を示すグラフであり、図５Ｂは、左から順に野生株、ベクターコントロール（Ｐ−１）およびＰＭＥ過剰発現株（２２−４）の葉細胞におけるメタノール濃度を示すヒストグラムである。
【図６】図６Ａは、ＰＭＥ過剰発現株（２２−３，２２−４）およびベクターコントロール（Ｐ−１）の土壌での培養後５週目の状態を示す図であり、図６Ｂは、ＰＭＥ過剰発現株（２２−３，２２−４）およびベクターコントロール（Ｐ−１）の土壌での培養後７週目の状態を示す図である。
【図７】図７Ａは、培養９週目、１０週目、１１週目、１２週目、および１３週目のＰＭＥ過剰発現株（２２−３、２２−４、２２−３６、および２２−４６）とベクターコントロール（Ｐ−１、Ｐ−７およびＰ−９）の茎長を示すヒストグラムであり、図７Ｂは、培養９週目、１０週目、１１週目、１２週目、および１３週目のＰＭＥ過剰発現株（２２−３、２２−４、２２−３６、および２２−４６）とベクターコントロール（Ｐ−１、Ｐ−７およびＰ−９）の幅を示すの状態を示す図であり、図７Ｃは、培養９週目、１０週目、１１週目、１２週目、および１３週目のＰＭＥ過剰発現株（２２−３、２２−４、２２−３６、および２２−４６）とベクターコントロール（Ｐ−１、Ｐ−７およびＰ−９）の葉数を示すの状態を示す図である。
【図８】図８Ａは、ＰＭＥ過剰発現株の第３節間表皮細胞の状態を示す図であり、図８Ｂは、ベクターコントロールの第３節間表皮細胞の状態を示す図であり、図８Ｃは、ＰＭＥ過剰発現株（図中白抜き棒グラフ）と、ベクターコントロール（図中黒塗り棒グラフ）の第３節間表皮細胞について、任意に２０細胞選抜して細胞長を測定した結果を示すヒストグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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