(57)【要約】【課題】本発明は、効率的に生物学的物質を細胞内へ導入することができる生物学的物質導入法、及び当該生物学的物質導入法を用いた形質転換法を提供することにある。【解決手段】本発明の生物学的物質の導入方法は、ビルレントタンパク質を担体として使用し、直接的に生物学的物質を細胞内へ導入することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的物質を細胞内へ導入するための担体としてビルレントタンパク質を使用し、前記生物学的物質を細胞内へ直接的に導入することを特徴とする生物学的物質の導入方法。
【請求項２】
ビルレントタンパク質が、土壌細菌由来のタンパク質である請求項1記載の方法。
【請求項３】
ビルレントタンパク質が、VirD2、又はVirE2である請求項2記載の方法。
【請求項４】
土壌細菌が、Agrobacterium tumefaciensに属する細菌である請求項2記載の方法。
【請求項５】
生物学的物質が、DNA、RNA、並びにビルレントタンパク質が認識するボーダー配列を化学的に結合させたタンパク質又はペプチドであることを特徴とする請求項1〜4項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
生物学的物質がDNAであり、当該DNAにボーダー配列を付加する請求項１〜５項に記載の方法。
【請求項７】
ボーダー配列が、配列表の配列番号1に示す塩基配列、及び/又は当該塩基配列に相補的な塩基配列からなることを特徴とする請求項6記載の方法。
【請求項８】
マイクロインジェクション法、PEG法、レーザー法、パーティクルガン法からなる群から選択される少なくとも1種を用いて、生物学的物質を直接的に導入する請求項１〜７項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８項のいずれか1項記載の生物学的物質導入法を用いて、外来遺伝子を導入した形質転換法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的物質の導入法、及び当該生物学的物質の導入法を用いた形質転換法であって、特に、ビルレントタンパク質を利用した生物学的物質導入法、及び当該生物学的物質導入法を用いた形質転換法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子等の生物学的物質を導入する方法として、現在、主としてアグロバクテリウム法などの間接導入法と、パーティクルガン法などを代表とする直接導入法が知られている。前者のアグロバクテリウム法は、生きたアグロバクテリウムの植物への感染力を利用するものである。例えば、アグロバクテリウム法としては、双子葉植物の染色体への外来性DNAの組込方法が知られている(特開昭６０−７００８０)。このようなアグロバクテリウム法は、導入されたDNAの核移行効率が高いという利点を有する。
【０００３】
また、後者のパーティクルガン法は、これは金等の金属粒子に有用遺伝子をまぶしてそれを細胞の中に圧縮した空気を使って打ちこむ方法である。例えば、パーティクルガン法としては、生きている細胞へ生物学的物質を導入するための改良された方法である(特表平5‐508316)。このようなパーティクルガン法は、特定の植物種、動物種に限定されずに広範囲にわたる植物種に適用されるという利点を有する。
【０００４】
【特許文献１】特開昭６０−７００８０号公報
【０００５】
【特許文献２】特表平５‐５０８３１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上述のアグロバクテリウム法(間接導入法)は、感染する宿主の種が制限されるため汎用性が乏しく、商業価値が低いという欠点を有する。
【０００７】
さらに、上述のパーティクルガン法は、導入されたDNAの核移行効率が低いという問題点を有する。このように、従来の形質転換法にはそれぞれが相補しない問題点が存在し、これらの問題が、細胞における形質転換効率を低下させる要因となっている。したがって、効率よく生物学的物資、たとえば、RNA、DNA等を細胞へ導入する方法が望まれていた。同時に、種を問わず導入が可能な生物学的物質導入法、及びこのような生物学的物質導入法を用いることにより、高効率な形質転換法の開発が望まれていた。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、効率的に生物学的物質を細胞内へ導入することができる生物学的物質導入法、及び当該生物学的物質導入法を用いた形質転換法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、発明者らは、植物病原菌(アグロバクテリウム)が本来有する外来DNAの核移行に関する分子生物学的メカニズムに着目し、新規且つ高効率な生物学的物質導入法及び形質転換法を見出すに至った。
【００１０】
本発明の生物学的物質導入法は、生物学的物質を細胞内へ導入するための担体としてビルレントタンパク質を使用し、前記生物学的物質を細胞内へ直接的に導入することを特徴とする。
【００１１】
本発明の生物学的物質導入法の好ましい実施態様において、ビルレントタンパク質が、土壌細菌由来のタンパク質であることを特徴とする。
【００１２】
本発明の生物学的物質導入法の好ましい実施態様において、ビルレントタンパク質が、VirD2、又はVirE2であることを特徴とする。
【００１３】
本発明の生物学的物質導入法の好ましい実施態様において、土壌細菌が、Agrobacterium tumefaciensに属する細菌であることを特徴とする。
【００１４】
本発明の生物学的物質導入法の好ましい実施態様において、生物学的物質が、DNA、RNA、並びにビルレントタンパク質が認識するボーダー配列を化学的に結合させたタンパク質又はペプチドであることを特徴とする。
【００１５】
本発明の生物学的物質導入法の好ましい実施態様において、生物学的物質がDNAであり、当該DNAにボーダー配列を付加することを特徴とする。
【００１６】
本発明の生物学的物質導入法の好ましい実施態様において、ボーダー配列が、配列表の配列番号1に示す塩基配列からなることを特徴とする。
【００１７】
本発明の生物学的物質導入法の好ましい実施態様において、マイクロインジェクション法、PEG法、レーザ法、パーティクルガン法、からなる群から選択される少なくとも1種を用いて、生物学的物質を直接的に導入することを特徴とする。
【００１８】
本発明の形質転換法は、上述の生物学的物質導入法を用いて、外来遺伝子を導入することによって得られることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、生物学的物質を効率よく、細胞内に導入することが可能であるという有利な効果を奏する。また、本発明によれば、あらゆる植物種、動物種に適用可能な高効率の形質転換法を提供し得るという有利な効果を奏する。
【００２０】
また、本発明によれば、導入DNAの核移行効率を飛躍的に高めることが可能であるという有利な効果を奏する。
【００２１】
また、本発明によれば、用いる導入遺伝子が、１本鎖のみならず２本鎖でもよいことから、導入用の遺伝子の調製工程を著しく簡素化し得るという有利な効果を奏する。
【００２２】
また、核移行効率が高いことから、従来のアグロバクテリウム法、パーティクルガン法では、作出困難であった有用形質転換植物の分子育種分野や、本発明の応用開発（キット化）に関連した産業分野などに貢献し得るという有利な効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の生物学的物質の導入法は、ビルレントタンパク質を担体として使用し、直接的に生物学的物質を細胞内へ導入する。このように、ビルレントタンパク質を生物学的物質を運ぶ担体として使用すると、アグロバクテリウム法などの間接導入法で実証されているように、高効率で、生物学的物質を所望の細胞内へ導入することができる。直接的としたのは、純粋なアグロバクテリウム法などと区別するためのものであり、土壌細菌異種細胞への感染能力を使用せず、直接的に問いう意味である。
【００２４】
ここで、生物学的物質とは、DNA、RNA、並びにビルレントタンパク質が認識するボーダー配列を化学的に結合させたタンパク質又はペプチド等を挙げることができる。
【００２５】
本発明の生物学的物質導入法の好ましい実施態様において、生物学的物質がDNAであり、当該DNAにボーダー配列を付加する。
ここで、ボーダー配列とはAgrobacterium のTiプラスミド（tumor-inducing plasmid 腫瘍形成プラスミド）あるいはRiプラスミド（root-inducing plasmid根毛形成プラスミド）上に存在する1対の不完全なダイレクトリピート（同じ向きにほぼ同じ配列が25残基程度繰り返される）ものであり，5‘側の配列をRB（right border），３’側の配列をLB（left border）と呼ばれるものである。通常Agrobacterium では，RBとLBの間の配列（T-reagion:T領域）が感染植物細胞に移行される。すなわち,ボーダー配列とは感染の際，宿主（この場合植物細胞）に移行される領域を決定し,T配列にVirD2を結合して移行する遺伝子に荷札をつける働きをする。したがって，ボーダー配列は,核移行能力を有するVirD2に認識され結合される特異的な配列を意味する。このような機能を有するボーダー配列であれば、特に限定されることなしに、本発明の導入法に適用することができる。
このようなボーダー配列を核へ移行したい生物学的物質に付加することによって、外来遺伝子などの生物学的物質を、高効率で細胞内へ導入することが可能である。
ボーダー配列の一例を挙げれば、配列表の配列番号1に示す塩基配列、及び/又は当該塩基配列に相補的な塩基配列からなる。配列表の配列番号1に示す塩基配列は、VirD2が直接共有結合する方のストランド（DNA鎖）の配列である。当該塩基配列に相補的な塩基配列でも可能としたのは、配列表の配列番号1に示す塩基配列に相補的な塩基配列、すなわち、いわゆる相補鎖(アンチセンス鎖)であっても、PCR等で増幅したときに結果的に2本鎖状態になれば、VirD2は結合することができるからである。
【００２６】
ビルレントタンパク質と、標的細胞へ導入すべき所望の生物学的物質との結合は、例えば、ボーダー配列を付加した所望の生物学的物質を用いれば、適当な親和性を利用することによって行なうことができる。
また、親和性とは、共有結合、イオン結合、水素結合、疎水性を利用したもの、ファンデルワールス力によるもの等を含むことができる。例えば、生物学的物質が、遺伝子である場合には、導入遺伝子のボーダー配列と、ビルレントタンパク質とが結合するが、両者の反応は、適当なバッファー中で混合することにより簡単に行なうことができる。
【００２７】
また、好ましい実施態様において、ビルレントタンパク質が、土壌細菌由来のタンパク質である。土壌細菌由来のタンパク質としては、導入する生物学的物質に結合するとともに宿主核への移行能を有し，宿主細胞への組み込みに関する機能を有するという観点から、VirD2、又はVirE2を挙げることができる。
【００２８】
また、土壌細菌としては、Agrobacterium tumefaciensに属する細菌が好ましい。これは、アグロバクテリウム法の高い導入率に着目し、その原理、すなわち、Tiプラスミドの情報を使いビルレントタンパク質その他の感染に必要なタンパク質群が作られ、これらの作用によってT領域が切り出され感染した植物にT領域が移行し、植物染色体に組み込まれることを利用したものだからである。
【００２９】
すなわち、本発明では、VirD2、VirE2などのビルレントタンパク質を別途人工的に調整し、さらに、導入する生物学的物質との反応も試験管内で行なうことにより、効率よく生物学的物質を細胞内へ導入するというものである。
【００３０】
特に、Virタンパク質を用いれば、生物種に無関係に、生物学的物質を導入することが可能となるという利点を有する。
【００３１】
好ましい実施態様において、マイクロインジェクション法、PEG法、レーザ法、パーティクルガン法からなる群から選択される少なくとも1種を用いて、生物学的物質を直接的に導入する。これらマイクロインジェクション法、PEG法、レーザー法、パーティクルガン法などのいわゆる直接導入法を用いて、生物学的物質を所望の標的細胞へ導入することができる。
【００３２】
マイクロインジャクション法では、核に微量のDNA溶液を直接注入する場合と、細胞質にDNAを注入しその一部の核への移行を行なう場合とがあるが、両者を含む。
【００３３】
PEG法(ポリエチレングリコール法)は、細胞壁を酵素処理などにより除いたいわゆるプロトプラストをPEGの存在下、高カルシウム濃度かつ、高pHで処理し、細胞外液の一部が細胞に取り込まれる現象を利用して生物学的物質を細胞内へ導入する方法である。当該PEG法には、リポソームなどに導入物質を封入して、PEG法を適用すると膜の融合が起こり、リポソーム内の物質を細胞内へ導入することができるが、このようなリポソーム等を利用した方法も、広く含まれる。    
【００３４】
また、レーザー法は、レーザーにより細胞壁又は細胞膜の一部又は全部を除いた細胞へ、細胞壁又は細胞質を除いた場所から外来の生物学的物質を導入する方法である。
【００３５】
パーティクルガン法は、細胞に対してDNAを吸着した微粒子を高速で打ち込む方法である。
【００３６】
これら直接導入法によれば、通常裸の遺伝子を直接的に導入するため、導入された遺伝子の核移行効率が低いことが指摘されているが、本発明によれば、上述のように、ビルレントタンパク質を生物学的物質の担体として用いて、当該ピルレントタンパク質とともに導入する生物学的物質を導入したので、高効率な導入を可能としたものである。
【００３７】
上述のマイクロインジェクション法、PEG法、レーザー法、パーティクルガン法は、裸の遺伝子を用いる代りに、担体が結合した生物学的物質を用いる以外、常法により行なうことができる。
【００３８】
次に、本発明の形質転換法について説明する。本発明の形質転換法は、上述した本発明の生物学的物質導入方法を用いて、外来遺伝子を導入することによって得られる。本発明の生物学的導入方法について、上述に説明しており、前記説明に記載された要領で、生物学的物質を細胞へ導入して、形質転換体を得ることが可能である。
【００３９】
本発明の生物学的物質の導入方法は、形質転換体を得るに際して導入する生物学的物質が細胞内に入った後、核に到達し、組み込まれることを効率化することが可能である。
【００４０】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される意図ではない。
【実施例１】
【００４１】
まず、ビルレントタンパク質としてVirD2及びVirE2を用いて、これらの共存下での一本鎖DNAの核移行効率について調べた。
【００４２】
大腸菌で大量発現させて精製及びリフォールディングしたVirD2とローダミン標識オリゴDNAの複合体を、タマネギ表皮細胞へインジェクションすることによってVirD2の核移行能を調べた結果、VirD２によってオリゴDNAが経時的に核へ移行していることを確認した。また、シロイヌナズナプロトプラストを用いたデュアルリシフェラーゼアッセイの結果より、VirD2の共存下でレポーター遺伝子の相対活性値が顕著に上昇していることを確認した。また、単独で用いた場合、VirD2の共存下でレポーター遺伝子の相対活性値の上昇が確認された。
図１は、ディアルルシフェラーゼ活性試験の結果を示す。この試験は、2つの異なるルシフェラーゼ遺伝子を用いて行なうもので、一つは、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子を、もう一つはウミシイタケ由来のルシフェラーゼ遺伝子である。これら2つの遺伝子を用いるのは、核移行以外のファクター(例えば、細胞内への遺伝子の導入効率など)を相殺するためである。
ルシフェラーゼが発現すると基質としてそれぞれに特異的なルシフェリンと反応し、それぞれ違う波長で発光する。
本実施例では、ホタル由来の遺伝子にボーダー配列を付加し、ウミシイタケ由来の遺伝子にはボーダー配列を付加しない状態とした。もし、ホタル及びウミシイタケ由来の遺伝子が双方同じ効率で核に移行し発現したならば、どちら(の波長の光)も同じだけ光を発する。(この場合、相対活性は１を示す。)。一方、もしボーダーを付加したホタルの遺伝子の方が他方より高い効率で核へ移行し発現したならば、ホタルの方が強い光を発することになる。
図１において、縦軸の相対活性は、ホタルルシフェラーゼ活性／ウミシイタケルシフェラーゼ活性である。
コントロールは、VirDタンパク質と複合体を形成させることなしに遺伝子のみを細胞内へ導入したものである。また、BSAは、VirD２タンパク質の代わりに全く無関係のタンパク質(牛の血清由来アルブミン)を添加したものである。熱変性VirD2タンパク質は、VirD2を熱処理し、添加したもので、結果として熱処理してもVirD2の活性にそれほど影響が見られなかった。
図1左から、ボーダ−配列を付加したホタルルシフェラーゼ遺伝子の方が３〜4倍強く発現しているのが分かる。
図1右から、VirD2タンパク質を付加した場合に、コントロールと比較してやはり、核移行効率が高いことが分かる。
【実施例２】
【００４３】
次に、VirD２共存下での二本鎖DNAの核移行効率について調べた。VirD２の核移行モデルでは、VirD2は一本鎖DNAの５‘末端ボーダー配列に付着するとされている。そこで、両末端にボーダー配列を有する二本鎖DNAではさらに核移行効率が上昇すると考えた。実験の結果、予想通りVirD２は二本鎖DNAを認識し、一本鎖DNAの場合よりも核移行効率が上昇した。また、VirD２の核移行にはボーダー配列の存在が有効であること、及び二本鎖DNAを用いる場合には、VirE2の存在は、必ずしも必要ではないことも判明した。
図２は、DNA核移行率に及ぼすVirD2とVirE２との相乗効果を示す図である。すなわち、この図から、VirD２単独で用いる場合よりもVirE2と併用した方が高い効率で核移行が可能であることが分かる。
【実施例３】
【００４４】
パーティクルガン法を用いてVirD2共存下での二本鎖DNAの核移行効率向上確認
実際の植物形質転換法として頻用されているパーティクルガン法を用いて、二本鎖DNAをタマネギ表皮細胞に導入した場合のVirD2の効果を調べた結果、二本鎖DNAの核移行効率はVirD2の共存量に比例して上昇することを明らかにした。
図３は、DNA核移行に及ぼすVir２Dの分量依存性効果を示す。図３から明らかなように、VirD2タンパク質の濃度の上昇に伴い、核移行効率が上昇しているのが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
アグロバクテリウム法、パーティクルガン法などの従来法では、作出困難であった有用形質転換植物の分子育種分野や、医薬品、アグリビジネス、食品、生物を原料とする工業や試薬工業などの分野に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、ディアルルシフェラーゼ活性試験の結果を示す。
【図２】図２は、DNA核移行率に及ぼすVirD2とVirE２との相乗効果を示す。
【図３】図３は、DNA核移行に及ぼすVir２Dの分量依存性効果を示す。
【図１】
2005080570.tif 000002
【図２】
2005080570.tif 000003
【図３】
2005080570.tif 000004
【配列表】
2005080570000001.xml