(57)【要約】【課題】  高効率かつ低コストのマイクロサテライトを用いたマッピング方法により関節リウマチ感受性遺伝子を同定する。【解決手段】  約１００ｋｂの間隔で設定したマイクロサテライト多型マーカーを用いて、関節リウマチに関するケース・コントロール相関解析を実施し、候補領域を絞り込んだ後、ＳＮＰをマーカーとする相関解析及び連鎖解析を実施することにより、ヒトゲノムＤＮＡ配列のＴＮＸＢ、ＮＯＴＣＨ４、ＲＡＢ６Ａ、ＭＰＲＬ４８、ＵＣＰ２又はＵＣＰ３遺伝子という新たな関節リウマチ感受性遺伝子を同定した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトゲノムＤＮＡ配列のＴＮＸＢ、ＮＯＴＣＨ４、ＲＡＢ６Ａ、ＭＰＲＬ４８、ＵＣＰ２又はＵＣＰ３遺伝子に存在する一塩基多型を示す少なくとも一つの塩基を含む連続したＤＮＡ部分配列、又は当該ＤＮＡ部分配列の相補鎖からなる、関節リウマチ検査用マーカー遺伝子。
【請求項２】
前記一塩基多型を示す塩基が、
配列番号：１の第６１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：２の第６１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：３の第６１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：４の第６１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：５の第４０１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：６の第４９５番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：７の第６１の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：８の第６１の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：９の第６１の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：１０の第６１の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：１１の第４０１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：１２の第４０１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：１３の第４０１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：１４の第５０３番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：１５の第２０１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：１６の第５１１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：１７の第２０１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：１８の第５１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：１９の第６１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：２０の第４９７番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：２１の第２０１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；及び
配列番号：２２の第２０１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のマーカー遺伝子。
【請求項３】
５０〜１５００ｂｐの長さを有する、請求項１又は２に記載のマーカー遺伝子。
【請求項４】
１００〜１０００ｂｐの長さを有する、請求項３に記載のマーカー遺伝子。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載のマーカー遺伝子に対応するＤＮＡ部分配列を被験者から採取し、当該ＤＮＡ部分配列の塩基配列を決定し、当該塩基配列を健常者から得た該当塩基配列と比較することを含む、関節リウマチの検査方法。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか一項に記載のマーカー遺伝子、あるいはそのプライマーを含む関節リウマチの検査キット。
【請求項７】
前記プライマーが、配列番号：２３〜６６のいずれかのＤＮＡ配列を有する、請求項６に記載の検査キット。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか一項に記載のマーカー遺伝子のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれか一項に記載のマーカー遺伝子によってコードされるポリペプチド。
【請求項１１】
請求項８に記載の宿主細胞を発現に適切な条件でインキュべートすることを含む、請求項１０に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載のポリペプチドを用いるスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載のスクリーニング方法で得られるアゴニスト及び／又はアンタゴニスト。
【請求項１４】
請求項に記載１３のアゴニスト及び／又はアンタゴニストを含む関節リウマチの診断、予防及び／又は治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロサテライト遺伝多型マーカを用いた遺伝子マッピング方法によって新たに同定された関節リウマチ感受性遺伝子、及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（ＲＡ：Rheumatoid Arthritis）は、自己免疫性の特徴を持つ慢性炎症性疾患である。ＲＡは病理学的に、関節における髄膜細胞の過剰増殖を伴う進行性の炎症を示し、関節組織疾患に分類されている。人口に対する罹患率は高く、様々な人種の約１％に達する。ＲＡの家系内集積及び一卵性双生児間の一致率が比較的高いことは以前から報告されており、病因における遺伝的素因の存在が示唆されていた。確かに、ＲＡを有する発端者からの家系において、発端者との関係が近いほど再発の危険性が増加することが知られており、例えば、兄弟姉妹 (λs) の危険率は２〜１０の範囲にあるとの報告がある。
【０００３】
これまでに発見されたＲＡ感受性遺伝子の中で、6p21.3のHLAクラスIII領域のHLA-DRB1座位は、ＲＡに最も強い寄与を有すると考えられており、全遺伝的危険率の30〜50%を占めると見積もられている。このことは逆に、HLA-DRB1と同程度の強い遺伝的寄与を持つ未発見の他の遺伝子が存在することも示唆している。そのような他の遺伝子の幾つかはHLA領域内にあり、HLA-DRB1と連鎖すると考えられている。多くの研究者が、同胞対解析等のゲノムワイドの連鎖解析（非特許文献１〜３）、及び候補遺伝子又は染色体領域に対するケース・コントロール解析（症例対照法）等の遺伝子相関解析（非特許文献４〜６）を含む様々な手法により、それら他の遺伝子を同定するべく研究を続けている。しかし、未だにＲＡ感受性遺伝子を全て同定するには至っておらず、その発症機序も十分に解明されていない。
【０００４】
新たな疾患関連遺伝子等を同定する方法としては、ヒトゲノムＤＮＡ配列に存在する一塩基多型（ＳＮＰs）を示す塩基と疾患との相関を調べる手法が注目されている。しかしながら、ＳＮＰsはゲノム上の一塩基置換であることから対立遺伝子数は一般に２個のみであり、マッピングすべき疾患関連遺伝子から約５kb以内に存在する一部のＳＮＰsしか相関を示さないため、ＳＮＰsを遺伝多型マーカーとしてゲノムマッピングを行うには膨大な数のＳＮＰsをマーカーとして設定して解析する必要がある。従って、ある程度絞られた狭い領域にしか適用されていないのが現状である。一方、マイクロサテライトの遺伝多型マーカーは対立遺伝子数が多く、マッピングすべき遺伝子からある程度離れた位置にあっても相関を示すという特徴があるが、該遺伝多型マーカーの設定数を多くしすぎると、ＳＮＰsの場合と同様に時間及び労力の点で解析が困難であり、設定数が少なすぎるとマーカー間隔が大きくなりすぎ、疾患関連遺伝子を見落とす危険性があるという問題があった。
【０００５】
本発明者等は、平均で約５０kb〜１５０kbの間隔で設定されたマイクロサテライトの遺伝多型マーカーを用いる遺伝子マッピング方法を開発し、その方法を用いることにより、疾患関連遺伝子又は遺伝的要因を持つヒト表現型の関連遺伝子の存在領域を高効率かつ低コストで同定できることを見出した（特許文献１）。
【０００６】
【非特許文献１】Conelis, F.等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95, 10746 (1998)
【非特許文献２】Shiozawa, S.等, Int.Immunol., 10, 1891 (1998)
【非特許文献３】Jawaheer, D.等, Am.J.Hum.Genet., 68, 927 (2001)
【非特許文献４】Okamoto, K.,等, Am.J.Him.Genet., 72, 303 (2003)
【非特許文献５】Suzuki, A.等, Nat.Genet., 34, 395 (2003)
【非特許文献６】Tokuhiro, S.等, Nat. Genet., 35, 341 (2003)
【特許文献１】WO０１／７９４８２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
よって、本発明は、従来のＳＮＰs相関解析の手法に比較してコスト効率が良く、なおかつ疾患感受性遺伝子を漏れなく同定できるマイクロサテライトマーカーによる精密なマッピング方法を多因子疾患であるＲＡに初めて適用することにより、新たなＲＡ感受性遺伝子を同定することを目的とする。さらに本発明は、同定されたＲＡ感受性遺伝子や当該遺伝子の発現産物であるＲＡ関連タンパク質等の情報に基づいて、ＲＡの病因や発症機序に関するデータを収集し、適切なスクリーニングを実施することにより、最終的にはＲＡの有効な予防／治療に結びつけることを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明では、マイクロサテライト（以下「ＭＳ」とする）を用いた遺伝子マッピング方法を用いることにより、従来はＲＡとの関連性が知られていなかった新たなＲＡ感受性遺伝子を同定した。
本発明によって新たに同定されたＲＡ感受性遺伝子は、ヒトゲノムＤＮＡ配列におけるＴＮＸＢ遺伝子、ＮＯＴＣＨ４遺伝子（以上、第６染色体）、ＲＡＢ６Ａ遺伝子、ＭＰＲＬ４８遺伝子、ＦＬＪ１１８４８遺伝子、ＵＣＰ２遺伝子及びＵＣＰ３遺伝子（以上、第１１染色体）である。本発明者等は、これらの新たに同定された遺伝子のゲノムＤＮＡ配列内に存在するＳＮＰsとＲＡとの相関解析を実施し、統計的に有意な相関を初めて見出した。
【０００９】
従って、第１の態様として、本発明は、ヒトゲノムＤＮＡ配列のＴＮＸＢ、ＮＯＴＣＨ４、ＲＡＢ６Ａ、ＭＰＲＬ４８、ＵＣＰ２又はＵＣＰ３遺伝子に存在する一塩基多型を示す少なくとも一つの塩基を含む連続したＤＮＡ部分配列、又は当該ＤＮＡ部分配列の相補鎖からなる、関節リウマチ検査用マーカー遺伝子を提供する。
第２の態様として、本発明は、前記マーカー遺伝子を用いたＲＡの検査方法及び検査キットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明で使用する遺伝子マッピング方法は、前記特許文献１に記載された方法である。具体的には、ヒトゲノム上に、所定の間隔、好ましくは約１００ｋｂの間隔で設定されたＭＳ遺伝多型マーカーを含有する連続ＤＮＡ配列の各ＤＮＡ配列に対応する、フォワードプライマー及びリバースプライマーを用い、該ＤＮＡ配列試料をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅し、ＤＮＡシークエンサーなどの分解能が高いゲルで電気泳動を行い、増幅産物であるマイクロサテライト遺伝多型マーカー含有ＤＮＡ配列断片を測定、解析することを含む。
【００１１】
ゲノムワイドに設定したＭＳ遺伝多型マーカーに対応するフォワードプライマーとリバースプライマーを使用して1次（第１相）スクリーニングを行い、該1次スクリーニングによって陽性を示したＭＳ遺伝多型マーカー対して、異なったサンプル集団を用いた２次（第２相）スクリーニングを行うという多相スクリーニングを採用することにより、偽陽性を示すＭＳ遺伝多型マーカーを無理な補正無しに劇的に減らすことが出来る。
【００１２】
ＭＳを用いた多相スクリーニングにより標的遺伝子の位置を絞り込んだ後、別の遺伝子マッピング法を用いて、さらに詳細に侯補領域又は遺伝子座を特定することができる。このためには、例えば、ＳＮＰを用いる解析が有効である。具体的には、標的遺伝子が存在すると思われる候補領域のＳＮＰsの多型頻度を、例えば、相関解析等により患者集団と健常者集団等で比較し、ハプロタイプ解析により検出された連鎖不平衡にあるＳＮＰマーカーを連鎖不平衡解析により検出することができる。
【００１３】
本発明においては、ＲＡ感受性遺伝子を同定するために、新たに設定した20,755座位を含む27,158のＭＳマーカーを使用し、コスト効率の良いスクリーニング方法として既に報告されているプールドＤＮＡ法を採用した。実施したゲノム相関解析は、上記したように３つの主要な工程を含む３相スクリーニング法により実施した。即ち、（１）第１種誤差率を減少させるための３相ゲノムスクリーニング、（２）陽性ＭＳ座位に関する個別のジェノタイピングによるプールした相関の確認、（３）スクリーニングした集団及び付加的集団における、候補領域周辺での緻密なＳＮＰsマーカーに関する個別のジェノタイピングによる同定である。
【００１４】
全ゲノム相関解析により、従来からＲＡとの相関が知られているHLA-DRB1遺伝子において最も強い相関が確認された (P=9.7×10-20)。さらに、HLA-DRB1と同じ第６染色体上において、HLA-DRB1から独立して、NOTCH4 (P=1.1×10-11) 及びTNXB (P=7.6×10-7)遺伝子に強い相関が観察された。また、ミトコンドリアリボゾームタンパク質L48 (MRPL48)及び非結合タンパク質と呼ばれる２つのミトコンドリアタンパク質(UCP2 及びUCP3)を含む11q13.4上のミトコンドリア関連遺伝子クラスターにおける新たな相関が見出された。また、10p13 及び14q23.1上でも弱い相関が見られた。これらの新たな相関に加えて、HLA-DRB1と同様にＲＡとの関連が既に報告されているIkBL (非特許文献４) 及びPADI4 (非特許文献５) 遺伝子における相関も確認された。
【００１５】
即ち、新たに相関が見出されたＴＮＸＢ、ＮＯＴＣＨ４、ＲＡＢ６Ａ、ＭＰＲＬ４８、ＵＣＰ２又はＵＣＰ３遺伝子に存在するＳＮＰsでは、ＲＡ罹患者及び健常者との間で、アレル頻度に統計的に有意な相違が認められた。従って、これらの遺伝子領域に存在する一塩基多型を示す少なくとも一つの塩基を含む連続したＤＮＡ部分配列、又は当該ＤＮＡ部分配列の相補鎖は、関節リウマチ検査用マーカー遺伝子として利用できる。
【００１６】
具体的には、前記一塩基多型を示す塩基は、以下からなる群から選択するのが好ましい。
配列番号：１の第６１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：２の第６１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：３の第６１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：４の第６１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：５の第４０１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：６の第４９５番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：７の第６１の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：８の第６１の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：９の第６１の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：１０の第６１の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：１１の第４０１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：１２の第４０１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：１３の第４０１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：１４の第５０３番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：１５の第２０１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：１６の第５１１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：１７の第２０１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：１８の第５１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：１９の第６１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：２０の第４９７番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；
配列番号：２１の第２０１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基；及び
配列番号：２２の第２０１番目の塩基、又はその相補鎖上の対応する塩基。
【００１７】
上記の配列番号：１〜５はＴＮＸＢ遺伝子の部分配列、配列番号：６〜１３はＮＯＴＣＨ４遺伝子の部分配列、配列番号：１４はＲＡＢ６Ａ遺伝子の部分配列、配列番号：１５〜１８はＭＰＲＬ４８遺伝子の部分配列、配列番号：１９及び２０はＦＬＪ１１８４８遺伝子の部分配列、配列番号：２１はＵＣＰ２遺伝子の部分配列、及び配列番号：２２はＵＣＰ３の部分配列に相当する。
【００１８】
これらのマーカー遺伝子は、ＲＡに関する遺伝子検査に使用することができる。
例えば、一塩基多型を示す塩基を挟むように設定したフォワードプライマー及びリバースプライマーにより、一塩基多型を示す塩基を含む連続ＤＮＡ配列を、例えばＰＣＲ法を用いて増幅し、得られたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を決定し、同様に決定した健常者のヌクレオチド配列と比較することにより、ＲＡに対する遺伝子的素因の有無を検査することができる。
【００１９】
検査に使用されるフォワードプライマーとしては、ヒトゲノム上にマッピングされた上記一塩基多型を示す塩基を含むマーカー遺伝子のＤＮＡ配列の5’末端部から3’末端方向に延びる配列と同じ塩基配列を有するプライマーであって、15〜100塩基、好ましくは15〜25塩基、さらに好ましくは18〜22塩基の長さのものが挙げられる。リバースプライマーとしては、マーカー遺伝子のＤＮＡ配列の3’末端部から5’末端方向に延びる配列と相補的な塩基配列を有するプライマーであって、15〜100塩基、好ましくは15〜25塩基、さらに好ましくは18〜22塩基の長さのものが使用できる。
【００２０】
例えば、配列番号：１〜２２のＤＮＡ配列を有するマーカー遺伝子を増幅するためのプライマーとして配列番号：２３〜６６に記載したＤＮＡ配列を有するものが挙げられる。それらの対応関係は以下の通りである。
マーカー遺伝子    フォワードプライマー    リバースプライマー
配列番号：１        配列番号：２３          配列番号：２４
配列番号：２        配列番号：２５          配列番号：２６
配列番号：３        配列番号：２７          配列番号：２８
配列番号：４        配列番号：２９          配列番号：３０
配列番号：５        配列番号：３１          配列番号：３２
配列番号：６        配列番号：３３          配列番号：３４
配列番号：７        配列番号：３５          配列番号：３６
配列番号：８        配列番号：３７          配列番号：３８
配列番号：９        配列番号：３９          配列番号：４０
配列番号：１０      配列番号：４１          配列番号：４２
配列番号：１１      配列番号：４３          配列番号：４４
配列番号：１２      配列番号：４５          配列番号：４６
配列番号：１３      配列番号：４７          配列番号：４８
配列番号：１４      配列番号：４９          配列番号：５０
配列番号：１５      配列番号：５１          配列番号：５２
配列番号：１６      配列番号：５３          配列番号：５４
配列番号：１７      配列番号：５５          配列番号：５６
配列番号：１８      配列番号：５７          配列番号：５８
配列番号：１９      配列番号：５９          配列番号：６０
配列番号：２０      配列番号：６１          配列番号：６２
配列番号：２１      配列番号：６３          配列番号：６４
配列番号：２２      配列番号：６５          配列番号：６６
【００２１】
また、本発明のマーカー遺伝子をプローブとして被験者からのＤＮＡサンプルをスクリーニングし、得られた被験者ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定した後、当該配列を健常者の配列と比較することによっても、ＲＡに対する遺伝的素因の有無を調べることができる。
【００２２】
ここで使用するプローブは、本発明のマーカー遺伝子そのものでもよいが、当該マーカー遺伝子に存在する一塩基多型を示す塩基を含む連続ＤＮＡ配列又はその相補鎖、あるいはそれらのハイブリダイズする配列であってもよい。好ましくは、15〜100塩基、好ましくは15〜25塩基、さらに好ましくは18〜22塩基の長さのプローブが使用できる。
【００２３】
一方、本発明で新たに相関が見出されたＴＮＸＢ、ＮＯＴＣＨ４、ＲＡＢ６Ａ、ＭＰＲＬ４８、ＵＣＰ２又はＵＣＰ３遺伝子に基づいて、ＲＡ感受性遺伝子の全長塩基配列を決定することにより、それらがコードする翻訳領域を決定でき、該遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列を特定することができる。それらのアミノ酸配列を持つ蛋白質は、ＲＡの病因又発症機序に関与している可能性が高いため、それらの蛋白質の機能を促進又は阻害することにより、ＲＡを予防又は治療することができる。
従って、本発明は、当該蛋白質を用いたスクリーニング方法にも関し、当該スクリーニング方法により、当該蛋白質の機能を促進又は阻害する物質、即ちアゴニスト又はアンタゴニストを同定することができる。ここでいうアンタゴニストとは、化学的小分子のみではなく、抗体又はその断片、アンチセンスオリゴヌクレオチドといった生体関連物質も包含する。これらのアゴニスト又はアンタゴニストは、ＲＡの診断、予防及び／又は治療薬として有効である。
【００２４】
上記の蛋白質は、本発明で同定されたマーカー遺伝子の少なくとも翻訳領域を含有するＤＮＡ配列を含むベクターを調製し、当該ベクターにより適当な宿主細胞を形質転換することにより、当該形質転換細胞に生産させることも可能である。
【実施例】
【００２５】
マイクロサテライト（ＭＳ）検出及びＰＣＲプライマーデザイン：
２、３、４、５又は６塩基の反復単位を有するＭＳ配列を、Sputnikに適用可能なアポロプログラム(Apollo program)を用いて、golden Path Oct. 2000からNCBI build 30までのヒトゲノムのドラフト配列のバージョン４で検出した。これらの反復を単一の反応条件下で増幅するためのＰＣＲプライマーは、PrimerExpressに適用可能なDiscover programにより自動的に設計した。また、ディファレンシャル増幅を防止するために、これらのＰＣＲプライマーが配列中にＳＮＰを含まないようにした(Sham et al, 2002)。
【００２６】
日本人プールにおけるＭＳマーカーの多型性を示す多数のピークを有するパターン(Barcellos. L.F.等, Am.J.Hum.Genet., 61, 734 (1997))を、欧州人のプールと比較し、その結果、日本人プールにおける個々の多型性ＭＳマーカーは、２つの欧州人プールと異なるパターンを示した（データは示さず）。人種間比較の結果から、日本人プールにおける多数ピークを有するパターンは、ＭＳの長さにおける多型性を反映しており、実験的誤差ではないことを示した。
【００２７】
本発明では、27,158の多型性ＭＳマーカーを設定し、それらをヒトドラフト配列(NCBI build 30)上にマッピングした(図１)。これらのマーカーの中で、20,755 は、本発明者等が新たに設定したものであり、6,403 はGenethon及びCHLCマーカー等の既知のマーカーである。Ｙ遺伝子上にマッピングされた119マーカーを除いた27,039のマーカの平均ヘテロ接合性は0.67±0.16 であり、対立遺伝子の平均数は6.4±3.1であった。平均のマーカー間隔は108.1kbであった (SD=64.5kb; max=930.1kb) (表１参照)。これらのマーカーは、粗く見積もって、疾患座位から約50kbまでの連鎖不平衡を検出できる。よって、これらのマーカーを用いてＲＡのケース・コントロール相関解析を実施した。なお、27,039のマイクロサテライト及びそれらの増幅に使用したプライマー配列は、Genbankに寄託し、図５に列挙した登録番号を付与されている。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
本発明では、940名のＲＡを有する被験者（ケース集団）及び同数の健常被験者（コントロール集団）を採用した。本発明に関係する各団体の倫理委員会の認可を得て、この分析に使用するケース及びコントロール集団の各被験者からインフォームドコンセントを得た。ＲＡフェノタイプは、米国リウマチ学会の診断基準に従って決定した。医学情報及び血液サンプルに関連する全ての個人特定情報は、募集した団体において注意深く廃棄した。
ケース集団における発症の平均年齢は47.7±13.1 であり、性別比は1:4 (男性：女性)であった。ケース集団及びコントロール集団における平均年齢及び性別比は、できるだけ等しくなるようにした。含まれる全てのサンプルについて、アメロゲニン(エナメル質タンパク質)ジェノタイピング(Akane, A.,等, Forensic Sci.Int., 49, 81(1991))により性別の確認をし、以前の報告(Voorter, C.E.等, Tissue Antigens, 49, 471 (1997))に従ってPCR 直接配列決定により、DNA量をチェックするための予備的なPCRテストをするとともに、HLA-DRB1遺伝子型も検査した。
【００３０】
ＤＮＡ試料の調製及びタイピング：
集団の各被験者のサンプルから、QIAamp DNA blood kit (QIAGEN) によりDNA抽出を行ったが、DNA量の変動を防止するために標準化された条件下で実施した。次いで、DNA分解及びRNA汚染をチェックするために0.8%アガロースゲル電気泳動を実施した。タンパク質汚染をチェックするために光学密度を測定した後、既に記載されているような(Collins, H.E.等, Hum.Genet., 106, 218 (2000)) PicoGreen蛍光アッセイ(Molecular Probes) による３回の測定によりDNA濃度を決定した。DNAサンプルの標準化されたピペッティング及び分取は、Biomek 2000及びMultimek 96 (Beckman)などのロボットを用いて実施した。
【００３１】
2組の約30,000のＭＳマーカーをタイピングするためのプール化DNAテンプレートは、DNAの定量化と同時又は直後に調製した。さらに、プール化DNA量を、被験者個体間のアレル分布及び３つのＭＳマーカーを用いたプール化タイピングの結果を比較することにより試験した。この試験の後、PCRプライマーを除く全ての成分を含む約30,000のPCR反応混合物を調製し、次いで96 PCR反応プレートに分取し、使用まで保存した。
【００３２】
PCR反応の後に、プール化ＭＳタイピング及び個別のジェノタイピングをABI3700 DNAアナライザー(Applied Biosystems)を用いて標準的なプロトコールに従って実施した。標準化した調製法を用いることにより、実験を通じて、プールしたDNAタイピングに一定の正確性を維持することができた。ピーク位置及び高さ等の様々な情報は、Applied Biosystems Japanによって開発されたPickPeak及び MultiPeaksプログラムにより、クロマトグラフファイル、即ちABI fsa ファイルの多重ピークパターンから自動的に読みとった。
【００３３】
プール化ＤＮＡ法による３相ゲノムスクリーニング
375人の個体を、RA罹患（ケース）及び非罹患（コントロール）について３つのケース・コントロール集団（各125人）に等分した。ピッチャード法(Pritchard's method) (Pritchard, J.K.及びRosenberg, N.A., Am.J.Hum.Genet., 65, 220 (1999))に従って、少なくとも集団層化に十分な無作為に選択した22のマイクロサテライトを用いて集団層化検定(population stratification test)を実施した。結果は、各々のケース・コントロール集団において有意な層化を示さなかった（表２）。集団層化検定により偽相関を防止することは、内部コントロールを収集することが困難なＲＡ等の遅発性疾患 (Risch 2000)にとって非常に重要である。
【００３４】
【表２】
2005278479.tif 000003
【００３５】
集団層化検定の後に、各ケース・コントロール集団からの３つのプール化DNAテンプレートを、３相ゲノムスクリーニングに使用した。このスクリーニング法は、単純に３つの独立したサンプル集団での再現を意味し、多数回試験による第１種誤差による多くの偽陽性を排除するために適することが知られている(Barcellos, L.等, Am.J.Hum.Genet., 61, 724 (1997))。一次（第１相）スクリーニングでは、2×2 又は2×m のいずれかの分割表（m=対立遺伝子の数）に関するフィッシャーの直接確率検定(Fisher's exact test) により、2,847 のＭＳマーカーが統計的に有意であることが示された(P<0.05)。続く二次（第２相）スクリーニングで、これら2,847マーカーのうち372のＭＳマーカーが有意であることが示された。さらに三次（第３相）スクリーニングの後、133の陽性ＭＳマーカーが得られた。これらの結果は、表３に示した。
【００３６】
【表３】
2005278479.tif 000004
【００３７】
陽性ＭＳマーカーの数は、統計的に推定されたものに比較して多く、既に指摘されているようにプール化ＤＮＡ法による実験的誤差を含んでいることが示唆された(Shaw, S.H.等, Genome Res., 8, 111 (1998); Sham, P.等, Nat.Rev.Genet., 3, 862 (2002))。従って、我々は、これらの陽性マーカーを、スクリーニングしたこれらの集団において個々のジェノタイピングにより注意深く確認したところ、47のマーカーが有意であった。これらのマーカーの内25は、陽性対立遺伝子の頻度の低さ(<0.05)により除外し、最終的に、２３の陽性ＭＳマーカーのリストを得た（表４）。
【００３８】
【表４】
2005278479.tif 000005
【００３９】
表４の基礎となる具体的なデータを表５に示す。一例として、この表では、各ＭＳマーカーで特定される領域が、関節リウマチ群(P)の方が健常者群(C)と比して有意に疾患相関性を有すると判断されたもの（陽性）を「＋」、非陽性を「−」として分類している。例えば、「＋／＋」は対立遺伝子がともに陽性であり、「＋／−」は対立遺伝子の一方が陽性という分類になる。この表を利用することにより、例えば、これらの数値に基づいて独自のアルゴリズムに従って各被験者を点数付けすることにより、関節リウマチの罹患可能性を数値化することも可能である。なお、表中の「o」はミスタイピングを示す。
【００４０】
【表５】
2005278479.tif 000006
【００４１】
前記表４のリストの上位７個のＭＳマーカーは、ボンフェローニ補正(Bonferroni's correction)の後でも有意であったので(Pc<0.05)、本実施例では、ＳＮＰsジェノタイピングはこれらの候補領域に焦点を絞った。
【００４２】
ＳＮＰジェノタイピング：
上位7個のＭＳマーカーの中の4個、即ち1番目、2番目、3番目及び5番目は、6p21.3のHLA領域に位置していた（図３）。一方、４番目の有意なマーカーは11q13.4、６番目は10p13、そして７番目は14q23.1に位置していた(cytobandsはNCBI build 30の呼称)。
これら候補領域周辺のSNPsは、NCBIホームページのdbSNPデータベース及び東京大学医科研ホームページのJSNPデータベースから選択した。これらのSNPsを、TaqManアッセイ又は直接配列決定を用いてジェノタイピングした。TaqManアッセイは、384-Well Block Module and Automation Accessory を具備するABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems)の標準的プロトコールを用いて実施した。PCR生成物の直接配列決定は、ABI3700 DNA analyzer (Applied Biosystems)を用いて標準的な手法に従って実施した。HLA領域において、HLAクラスIII領域のセントロメア末端周辺の、既に報告されているＲＡ相関を確認するために、IkBL〜C4B 遺伝子から更にSNPを選択した。選択したSNPsの詳細については表６を参照のこと。
【００４３】
ＭＳタイピングで使用したケース・コントロール集団中の165のSNPsをジェノタイピングした。これらのSNPsのうち41個は、多型性又はSTS（配列標識部位）ではなかったので（表６参照）、さらなる分析から除外した。124のSNPの中で、54個はケース・コントロール相関解析により統計的に有意であった(P<0.05)（表７）。これら124のSNPについて、EMアルゴリズムによってLDブロック構造を推定し（図２）、このアルゴリズムに従い各ブロックにおけるハプロタイプを用いてケース・コントロール相関解析を実施した（表８）。さらに、これらのSNPアレル相関を再現するために、各々565のケース及びコントロール個体からなる他の集団において、これら54個の陽性SNPを、ジェノタイピングした。最終的に、この実験に使用した全てのサンプルからなる混合集団（n=940）において、45の陽性SNPを得た。これら陽性SNPの中で、24個はボンフェローニ補正(Bonferroni's correction)の後でも有意(Pc<0.05)であった(表７)。
【００４４】
以下に、各染色体における解析結果について述べる。
6p21.3
6p21.3のHLA領域において、71の多型性SNPsのうち28個が、最初の試験で統計的に有意であった(Pc<0.05)。HLA-DRB1に対する予備的なジェノタイピングから、HLA-DRB1*0405アレルが最も有意であった(P=1.3×10-12)。結果は、期待したように、日本人集団における多くの従来報告(Wakitani, S.等, Br.J.Rheumatol., 36, 630 (1997); Shibue, T.等, Arthritis Rheum., 43, 753 (2000))と一致し、本発明で用いた方法が、感受性遺伝子とRAとの相関を検出するのに有効な方法であることを示している。HLA-DRB1に加えて、IkBL遺伝子(MIM*601022)上のプロモーターSNPであるrs3219185との相関も再現されたが(P=5.4´ 10-5)、マイナーなアレルの頻度は比較的低かった。また、NOTCH4 (MIM*164951)及びTNXB (MIM*600985) 遺伝子の周辺に強い相関が見られ、それらは、HLA-DRB1から各々約250 kb 及び 300 kb離間していた。
【００４５】
NOCTH4遺伝子は、上皮成長因子(EGF)反復を有するプロトオンコジーンの一つである。NOTCH4は、細胞増殖、細胞分化及び血管形成のシグナル伝達に関与することが推定される大きな膜貫通レセプターをコードする (Yung Yu, C.等, Immunol.Today, 21, 320 (2000))。NOTCH4においては、9個のSNPsが統計的に有意であり、それらの中の2個はアミノ酸交換を生ずる。エキソン4のSNP：rs2071282 が、9個のSNPsの中で最も強い相関を示し(P=3.1×10-8)、NOTCH4細胞外ドメインの４番目のEGFにおいてLeu203Pro 交換を生ずる。一方、エキソン3のrs915894は中程度の有意性であり(P=0.044)、３番目のEGF反復でLys116Gln交換を生ずる。
【００４６】
TNXB遺伝子は、34のフィブロネクチン・タイプIII-様(FNIII)及び18のEGF反復を有する細胞外マトリクスタンパク質の一つをコードし、それは、結合組織におけるコラーゲン沈着の必須機能の少なくとも１つに関与する (Mao, J.R.等, Nat.Genet. 30, 421 (2002))。TNXBにおいて、5個のSNPsが統計的に有意であり、そのうち4個がアミノ酸交換を生ずる。これら5個のSNPの中で、エキソン10のrs185819が最も強い相関を示し(P=6.8×10-5)、7番目のFNIII反復において His1248Arg 交換を生じた。他のSNP, エキソン29のrs2075563 (Glu3260Lys)、エキソン21のrs2269428 (His2363Pro) 及びエキソン20のrs3749960 (Phe2300Tyr)も有意であり、各々26番目、18番目及び17番目のFNIII反復に位置する。
【００４７】
これら6個の陽性SNPsは、最終的に、混合集団(各n=940)において確認された（表６）。さらに、ハプロタイプ分析により、IkBL、NOTCH4及びTNXBについて、これらの結果が確認され（表７）、各遺伝子の全てのブロックに、各遺伝子内の単一のSNPより大きな危険性を持つ共通のハプロタイプが無いことが示された。IkBL、TNXB 及びNOTCH4において、これらのSNPsのHLA-DRB1との多重ロジスティック回帰分析を実施したところ、一部劣性モデルで、3個の遺伝子、DRB1*0405 (ORs=2.29-8.84)、IkBLのrs3219185 (ORs=1.16-2.67)、TNXBのrs185819 (ORs=1.00-1.62)が有意であった(P<0.05)。一部優性モデルでは、２つのSNPs：DRB1 (ORs=2.16-4.69) 及び TNXB (ORs=1.02-1.84)も有意であった。一方、DRB1のシェアードエピトープ(Shared Epitope (SE))に限定すると、一部劣性モデルでのみ、SE (ORs=1.79-3.85)、IkBL (ORs=1.11-2.54)及びNOTCH4のrs2071282 (ORs=1.13-7.14)が有意であった。これらの結果は、一部劣性モデルにおいて、これらの座位が独立にRAに寄与していることを示唆した。
【００４８】
11q13.4
11q13.4の候補領域には9個の遺伝子が存在し、３つのミトコンドリア関連遺伝子 MRPL48、UCP2 及び UCP3を含んでいた。MRPL48 は、哺乳類ミトコンドリアリボゾームタンパク質(MRP)と相同性を有する遺伝子として最近発見されたが (Zhang, Z.及びGerstein, M., Genomics, 81, 468 (2003))、MRPL48 の機能は未だに不明である。UCP2 (MIM*601693) 及びUCP3 (MIM*602044) は、内部ミトコンドリア膜のトランスポータータンパク質をコードし、エネルギー消費に関連している。また、UCP2 は、肥満及び糖尿病の感受性遺伝子であることも知られている。RAS-関連タンパク質であるRAB6A (MIM*179513) も、MRPL48のセントロメア側で見出された。さらに、３つの新たな遺伝子が、領域 FLJ11848、LOC374407 及び DKFZP586P0123に位置していた。FLJ11848 は WD40 反復を有し、細胞−細胞相互作用に広範に関与している(Smith, T.F.等, Trends Biochem.Sci., 24, 181 (1999))。LOC374407は、熱ショックタンパク質４０ホモログ (HSP40 homolog)との相同性、精子形成アポトーシス関連タンパク質との構造的類似性を有することが明らかになった。DKFZP586P0123 は、一つのプロテインキナーゼC保存領域を有する。
【００４９】
これらの遺伝子において、25の多型性SNPsの内16個が最初の試験で統計的に有意であった。これらのポジティブなSNPsは試験した領域に渡って点在していたが、最も有意な相関(P=0.00015)は、２つのSNPs：MRPL48の 5'UTRにあるrs1792174 及びイントロン3にあるrs1792160で観察された。MRPL48は、２つの他のポジティブSNPs：イントロン5のrs1792193 (P=0.003) 及び3’UTRのrs1051090 (P=0.007)も有していた。陽性SNPsは、他の全ての遺伝子UCP2、UCP3、RAB38 及び FLJ11848でも観察された。しかし、MRPL48及びFLJ11848を含むブロックb2における唯一の共通なハプロタイプがMRPL48における単一SNPと同等に強い有意な相関を示した。MRPL48におけるこれらの陽性SNPsは、最終的に、混合集団でのボンフェローニ補正(Bonferroni's correction)の後に確認された(表７)。一方、DKFZP586P0123 のrs1527302は、最初の試験でもハプロタイプ分析の後でも有意であった(P=0.00078)。しかし、SNPアレル相関は、混合集団において確認されなかった。これらの結果は、ブロックb2に他の原因SNPが存在する可能性を示唆している。
【００５０】
10q13, 14q23.1 及び PADI4
10p13上の候補領域は２つの遺伝子、DKFZP761F241 及びオプチネウリン(optineurin) (OPTN)を有する。DKFZP761F241 遺伝子の３つのSNPsは、最初の試験では統計的に有意であったが、混合集団における補正後では確認されなかった。各集団でのボンフェローニ補正の後に残った領域内に共通のハプロタイプは無かった。
【００５１】
一方、14q23.1上の候補領域には、レチクロン１(reticulon1)遺伝子(MIM*600865)のみが存在し、それは神経内分泌特異的タンパク質のグループをコードする。混合サンプルでのボンフェローニ補正の後でも、RTN1 イントロン3のrs2182138 は統計的に有意であった (P=0.0002)。補正後に残った両領域に共通のハプロタイプは無かった。
【００５２】
さらに、候補遺伝子アプローチ(非特許文献５)によりRAの感受性遺伝子であると考えられるPADI4遺伝子において、本実施例の集団において、４つの陽性SNPs：padi89 (P=0.002)、padi90 (P=0.004)、rs874881 (P=0.002)及びrs2240340 (P=0.002)を複製した。PADI4遺伝子のイントロン6のＣＡマイクロサテライトマーカーであるD1S1144iが、ＲＡマーカーセットに含まれ、僅かに有意性を示すが (P=0.008)、相関するアレル頻度は低いことを確認した (コントロール集団においてP=0.037)。
【００５３】
【表６】
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【００５４】
【表７】
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【００５５】
【表８】
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【００５６】
発現分析
滑膜細胞を含む種々の組織の中でのこれらの遺伝子の発現パターンを研究するために、我々は、これらの組織からのRNAを用いた定量的逆転写PCR (QRT-PCR)を実施した。
ISOGEN (Nippon Gene) により、8人のRA及び4人の骨関節炎(OA)患者から手術により得た滑膜から、全RNAを単離した。また我々は、American Type Culture Collection (ATCC)から提供された滑膜細胞株(SW982)からも全RNAを単離した。様々な組織からの他のRNA類は、Clontech, Invitrogen, Origene 及びStratageneから市販されている。我々は、これらのRNAの質及び量Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent)を用いて評価し、RiboGreen RNA 蛍光アッセイ(MolecularProbes)により量を確認した。相補的DNAは、これら全RNAから、ランダムヘキサマー(random hexamers)を用いて、TaqMan 逆転写試薬キット(Applied Biosystems)で合成した。我々は、cDNA 特異的プライマー及びプローブを、各々Applied Biosystemsによって提供された'Assay-by-Design (AbD)'により試験した10の遺伝子に対して、'Assay-on-Demand (AoD)' によりハウスキーピングコントロール遺伝子としてのGAPD に対して得た。予備的実験の後、Applied Biosystemsからの標準的手法に従って、ABI PRISM 7900上の96-ウェル反応プレート中で、210nM プローブ、756nM プライマー 及び 0.48ng/ml in 50ml 反応容量という最終濃度を使用した。各プレートを３回プロセスし、各サンプルについて平均及びSDを計算した。見積量は、各ウェルの標準曲線を用いて各時点で計算した。GAPDに適合させることによる全ての規格化した量のデータは、5%の危険率を持つスミルノフテスト(Smirnov's test)により試験した。全ての規格化量のデータについての逆数変換の後、RA及びOA滑膜組織間の発現レベルについて Student's t-test を実行した。
【００５７】
肺におけるNOTCH4及び副腎におけるTNBXの一貫して高い発現が観察された (図３ａ)。我々の結果は、全ての遺伝子がRA滑膜細胞で発現されたことも示す。TNXB 及び NOTCH4 は、RA 滑膜細胞で有意に高い発現レベルを有していたが、RTN1 は最も低いレベルを有していた。また、我々は、RA及びOA滑膜細胞の間で、これらの遺伝子の発現レベルを比較した。スチューデントｔ試験により、MRPL48 (P=0.049) 及び DKFZP761F241 (P=0.027) 遺伝子の発現レベルは、RA及びOA滑膜細胞の間で、相対的に有意な相違を示した(表９及び図３ｂ)。RA滑膜組織におけるMRPL48の発現は、OA組織の約２倍であった。RA組織ドナーの3/4は、MRPL48座位のブロックｂ２におけるポジティブなハプロタイプについてホモ接合性であった。
【００５８】
【表９】
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【００５９】
統計解析：
P値を計算するために、各個体のアレルについての2×2分割表及び各座位についての2×m分割表に対して２種類のフィッシャー正確確率試験を使用した、ここで、mは集団で観察されたマーカーの数を意味する。2×m分割表に対してフィッシャー正確確率試験を実行するために、マルコフ・チェン／モンテカルロシミュレーション法(Markov chain/Monte Carlo simulation method)を採用した。我々は、ＭＳ、SNP及びハプロタイプについての2×2分割表に対するフェノタイプ相関ではなく、単純に「アレル」を提示した。これらのP値はボンフェローニ補正によって補正したが、その係数は、試験した分割表の合計数であった。これらの解析は、ソフトウェアパッケージ MCFishmanを用いて実行した。多重ロジスティック回帰分析及びMantel-Haenszel試験を含む他の基本的な統計解析は、SPSSプログラムパッケージ(SPSS) 及びMicrosoft Excel（商品名）を用いて実行した。我々は、これらのSNPについてのLDブロック構造を、LD測定としてのD’値の信頼区間を用いて推定した(Gabriel, S.B.等, Science, 296, 2225 (2002); Dawson, E.等, Nature, 418, 544 (2002))。また、各ブロックのハプロタイプ及びそれらの頻度を、EM及びClarkアルゴリズムによって見積もった。最後に、各ブロックのハプロタイプの信頼度を評価するために、Right プログラム(Mano. S.等, Ann.Hum.Genet., in press)で実行される、見積もられたハプロタイプ頻度に基づく2000回までのブートストラップ(bootstrap)再サンプリングにより与えられる各ハプロタイプ頻度からの95%信頼区間を計算した。
【００６０】
本実施例において、ＭＳマーカーによって絞り込まれた候補領域内で、HLA-DRB1から250kb離間した、TNXB 及び NOCTH4 遺伝子において強い相関が見出された。これらの遺伝子とHLD-DRB1 とは、明らかに異なるLDブロックに位置することが知られている(Cullen, M.等, Am.J.Hum.Genet., 71, 759 (2002); Walsh, E.C.等, Am.J.Hum.Genet., 73, 580 (2003))。多重回帰分析の結果と一致して、Mantel-Haenszel テストも、TNXB 及びNOTCH4の陽性ＳNPsは、一部優性及び一部劣性モデルの両方で、HLA-DRB1*0405 又はSEと独立していることを示した（データは示さず）。さらに、候補領域は、以前に予測された更なる感受性領域の一つと高度に一致していた (Jawaheer, D.等, Am.J.Hum.Genet., 71, 585 (2002))。TNXB は、関節を含む結合組織の機能不全を特徴とするEhlers-Danlos syndrome (MIM*600985) の一つの型の原因遺伝子であることが知られている。遺伝子産物は、結合組織機能及び種々の型のコラーゲンの析出を介する構造に関与し(Mao, J.R.等, Nat.Genet., 30, 421 (2002))、おそらく、ここに示す滑膜組織を含んでいる。マウスでは、タイプII コラーゲン誘発性関節炎は、関節リウマチに類似することが知られている(Moore. AR., Methods Mol. Biol., 225, 175 (2003))。
【００６１】
本発明者等は、TNXB遺伝子産物のアミノ酸交換が、コラーゲン代謝に関連する仮説的経路を介してRAの機能的素因になると考えている。近年、NOTCH4遺伝子産物は、滑膜細胞腫瘍懐死因子(TNF)を介する過剰増殖及びRA に関与しうることが報告された (Ando, K.等, Oncogene, 22, 7796 (2003))。しかし、NOTCH4の機能は未だ不明な部分が多い。
11q13.4においては、MRPL48 の機能は未だ全く知られていないが、発現パターンは、この遺伝子のRAとの関連性を示唆している。候補領域である11q13.4は、他の興味深い遺伝子 RAB6A, FLJ11848, UCP2 及びUCP3を含んでいる。この領域と同様に、10q13及び14q23.1における更なる相関分析は、より高い密度のSNPsマーカーの使用を必要とするが、他の染色体が本方法によって見出されたのは興味深い。これらの結果は、第１に、我々のマーカーセット及び方法が、他の複雑な疾患、少なくともRAにおけるHLA-DRB1のような主要な遺伝子を有する主働遺伝子（オリゴジーン）疾患に高度に実施可能かつ適用可能であることを示唆している。
【００６２】
興味深いことに、我々のデータは、上位７個のＭＳマーカーは、各々、特定のLDブロックに配置される傾向があることを示唆している（図３）。それは、「EMブロック」よりも「クラークブロック」上で観察された。多くの場合、陽性ＭＳアレルは、これらのブロックの陽性SNPハプロタイプと明らかに相関した。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本願実施例で使用したＭＳマーカーの染色体上のマッピング位置を示す図である。
【図２】第１相スクリーニングで使用したＭＳマーカーのマッピング及びＰ値を示す図である。有意であった１３３個のＭＳマーカーのＰ値を○印で示す。
【図３】本願実施例で選択したＭＳマーカー及びＳＮＰマーカーの染色体上のマッピング位置、ＥＭ及びクラークアルゴリズムで推定したブロック、アレル頻度に関するＰ値を示す図である。
【図４】本発明で同定されたＲＡ感受性遺伝子等の組織発現分布を示す図である。
【図５】図５−１から図５−４２は、本発明で使用したマイクロサテライトマーカー及びプライマーの名称（各列の左欄）及びGenbank登録番号（各列の右欄）に関する情報を示す表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図５−１０】
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【図５−１１】
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【図５−１２】
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【図５−１３】
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【図５−１４】
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【図５−１５】
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【図５−１６】
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【図５−１７】
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【図５−１８】
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【図５−１９】
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【図５−２０】
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【図５−２１】
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【図５−２２】
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【図５−２３】
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【図５−２４】
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【図５−２５】
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【図５−２６】
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【図５−２７】
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【図５−２８】
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【図５−２９】
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【図５−３０】
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【図５−３１】
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【図５−３２】
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【図５−３３】
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【図５−３４】
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【図５−３５】
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【図５−３６】
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【図５−３７】
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【図５−３８】
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【図５−３９】
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【図５−４０】
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【図５−４１】
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【図５−４２】
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【配列表】
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