(57)【要約】【課題】  動脈硬化の進行の可能性や、動脈硬化に起因する心筋梗塞などの虚血性疾患の発症リスクを正確に予測し、さらには虚血性疾患に対する治療成績や予後の予測を可能にする診断方法を提供する。【解決手段】  動脈硬化の進行及び／又は動脈硬化に起因する疾患の発症リスクを予測する方法であって、ヒトを含む哺乳類動物から分離された生体試料を用いてKLF5遺伝子の多型を測定する工程を含み、該多型が、(1)KLF5遺伝子5'隣接領域に存在しており、かつKLF5プロモーター活性に作用し、及びアンジオテンシンIIに対する応答に必要な一塩基多型、又は(2)KLF5遺伝子のエクソン又はイントロンに存在しており、かつKLF5の機能又は遺伝子発現に影響する一塩基多型である場合に、該動物では動脈硬化の進行が早く、及び／又は動脈硬化に起因する疾患の発症リスクが高いと判定する工程を含む方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動脈硬化の進行及び／又は動脈硬化に起因する疾患の発症リスクを予測する方法であって、ヒトを含む哺乳類動物から分離された生体試料を用いてKLF5遺伝子の多型を測定する工程を含み、該多型が、
(1)KLF5遺伝子5'隣接領域に存在しており、かつKLF5プロモーター活性に作用し、及びアンジオテンシンIIに対する応答に必要な一塩基多型、又は
(2)KLF5遺伝子のエクソン又はイントロンに存在しており、かつKLF5の機能又は遺伝子発現に影響する一塩基多型
である場合に、該動物では動脈硬化の進行が早く、及び／又は動脈硬化に起因する疾患の発症リスクが高いと判定する工程を含む方法。
【請求項２】
動脈硬化に起因する疾患が虚血性疾患である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
動脈硬化に起因する疾患が、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、又は下肢閉塞性動脈硬化症である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
動脈硬化に起因する疾患が心筋梗塞又は脳梗塞である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
虚血性疾患の予後及び／又は虚血性疾患に対する治療成績を予測する方法であって、ヒトを含む哺乳類動物から分離された生体試料を用いてKLF5遺伝子の多型を測定する工程を含み、該多型が、
(1)KLF5遺伝子5'隣接領域に存在しており、かつKLF5プロモーター活性に作用し、及びアンジオテンシンIIに対する応答に必要な一塩基多型、又は
(2)KLF5遺伝子のエクソン又はイントロンに存在しており、かつKLF5の機能又は遺伝子発現に影響する一塩基多型
である場合に、該動物では虚血性疾患の予後が悪く、及び／又は虚血性疾患に対する治療成績が低いと判定する工程を含む方法。
【請求項６】
虚血性疾患が、虚血性心疾患又は虚血性脳疾患である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
虚血性疾患が心筋梗塞又は脳梗塞である請求項５に記載の方法。
【請求項８】
虚血性疾患が心筋梗塞であり、該心筋梗塞に対する治療が経皮的冠動脈形成術である請求項５に記載の方法。
【請求項９】
治療成績が経皮的冠動脈形成術後の再狭窄の発症を指標とした治療成績である請求項５ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該多型が-3451位におけるC/G変異、-7568位におけるG/A変異、又は-1593位におけるA/G変異である請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該多型を増幅可能なプライマーセットを用いて測定を行なう請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
-3451位におけるC/G変異を有する多型について下記のプライマーセット forward: ccctagagaagagtgtgct及びreverse: ggtaagcatagaagcagtgtg；-7568位におけるG/A変異を有する多型について下記のプライマーセット forward: tcaggcgatgcttacagtgc及びreverse: ttctaaggacccgttcccac；及び(C)-1593位におけるA/G変異を有する多型について下記のプライマーセット forward: gtcaacaggaagagaaggaa及びreverse: aacatagacacagagcagcからなる群から選ばれる１以上のプライマーセットを用いる請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
動脈硬化の進行及び／又は動脈硬化に起因する疾患の発症リスクを予測するための診断試薬であって、KLF5遺伝子の多型を測定することができるプライマーセットを含み、該多型が
(1)KLF5遺伝子5'隣接領域に存在しており、かつKLF5プロモーター活性に作用し、及びアンジオテンシンIIに対する応答に必要な一塩基多型、又は
(2)KLF5遺伝子のエクソン又はイントロンに存在しており、かつKLF5の機能又は遺伝子発現に影響する一塩基多型
である診断試薬。
【請求項１４】
虚血性疾患の予後及び／又は虚血性疾患に対する治療成績を予測するための診断試薬であって、KLF5遺伝子の多型を測定することができるプライマーセットを含み、該多型が、
(1)KLF5遺伝子5'隣接領域に存在しており、かつKLF5プロモーター活性に作用し、及びアンジオテンシンIIに対する応答に必要な一塩基多型、又は
(2)KLF5遺伝子のエクソン又はイントロンに存在しており、かつKLF5の機能又は遺伝子発現に影響する一塩基多型
である診断試薬。
【請求項１５】
該多型が-3451位におけるC/G変異、-7568位におけるG/A変異、又は-1593位におけるA/G変異である請求項１３又は１４に記載の診断試薬。
【請求項１６】
-3451位におけるC/G変異を有する多型について下記のプライマーセット forward: ccctagagaagagtgtgct及びreverse: ggtaagcatagaagcagtgtg；-7568位におけるG/A変異を有する多型について下記のプライマーセット forward: tcaggcgatgcttacagtgc及びreverse: ttctaaggacccgttcccac；及び(C)-1593位におけるA/G変異を有する多型について下記のプライマーセット forward: gtcaacaggaagagaaggaa及びreverse: aacatagacacagagcagcからなる群から選ばれる１以上のプライマーセットを含む請求項１５に記載の診断試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈硬化の進行の可能性や、動脈硬化に起因する心筋梗塞などの虚血性疾患の発症リスクを正確に予測し、さらには虚血性疾患に対する治療成績や予後の予測を可能にする診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満、耐糖能障害、高脂血症などのメタボリック症候群や生活習慣病は全身および血管の慢性炎症を引き起こし、血管においては動脈硬化発症の原因となる。メタボリック症候群や生活習慣病は多数の遺伝的要因と環境的要因の相互作用によって発症する。そのため、遺伝的素因を明らかにすることは診断、予後判定、治療に重要な情報を与える。
【０００３】
遺伝子多型性common variantが冠動脈疾患のようなありふれた病気common diseaseの発症と関連するとする仮説(CV-CD仮説)に基づき、心臓血管病の病態への関与が期待される遺伝子の多型性につき国内外で精力的に解析が行われてきた。虚血性心疾患との関連から最初に注目されたのはアンジオテンシン変換酵素（ACE）遺伝子の第16イントロンに存在するAlu反復配列の挿入(I)または欠失(D)からなるI/D 多型である。1992年フランスのCambienらは心筋梗塞患者群において、対照群に比べてDD遺伝子型の頻度が有意に高く、特に低リスク患者群においてそれが顕著であることを報告した。その後、このレニン・アンギオテンシン系については、アンジオテンシノーゲン遺伝子、AT1受容体遺伝子と冠動脈疾患との関連が報告された。そのほか血栓形成に関与する凝固因子、血小板膜蛋白をコードする遺伝子多型と血栓性動脈硬化性疾患との関連、血管拡張因子である一酸化窒素(NO)の合成に関与するeNOSにも遺伝子多型と冠攣縮性狭心症・心筋梗塞発症との関連、血管リモデリングにおいて重要な組織改変因子マトリクスメタロプロテアーゼ(MMPs)の遺伝子多型と虚血性心疾患・冠動脈形成術後再狭窄との関連など、多数の遺伝子多型について疾患との関連性が証明されてきた。しかしながら、従来検討された遺伝子群は動脈硬化形成に直接作用するエフェクターであり、それらのエフェクターの発現制御を統御する上流の転写因子・転写調節因子についての多型性の報告はほとんどない。
【０００４】
一方、KLF5はZn finger型転写因子で主として消化管、血管に発現することが知られている(Biochem. Biophys. Res. Commun., 239, pp.598-605, 1997; Circ. Res., 85, pp.182-191, 1999. 総説として、細胞工学, 23, pp.174-178, 2004)。本遺伝子は特に心臓・血管領域では障害時に誘導され、炎症・増殖因子の発現増強をもたらすと考えられており、本遺伝子の発現誘導は心臓血管病の病態を大きく左右する。KLF5遺伝子欠損マウスは動脈硬化や心臓肥大・線維化が抑制されており、この遺伝子がこれらの病態の発生に必須の役割をすることが明らかにされている(Nat. Med., 8, pp.856-863, 2002)。また、KLF5遺伝子欠損マウスでは脂肪組織の発達も著明に傷害されており、リンパ球やマクロファージ機能の障害も認められる。KLF5は、アンジオテンシンIIやbFGF(basic fibroblast growth factor)などの刺激によってMAPキナーゼを解した経路によって発現誘導される(Cir. Res., 91, pp.1103-1113, 2002; Circ. Res., 85, pp.787-795, 1999)。また、KLF5のいくつかの遺伝子多型の存在が知られている。しかしながら、従来、KLF5の遺伝子多型と動脈硬化の進行あるいは虚血性心疾患の発症リスクや予後などとの関連性については何ら報告がない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、動脈硬化の進行の可能性や、動脈硬化に起因する心筋梗塞などの虚血性疾患の発症リスクを正確に予測し、さらには虚血性疾患に対する治療成績や予後の予測を可能にする診断方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の課題を解決すべくKLF5について鋭意研究を行い、KLF5について遺伝子全長約20kbの長さにわたり遺伝子配列を20名の患者由来のDNA検体を用いて解析した。その結果、KLF5遺伝子座の複数の一塩基多型が動脈硬化の進行、並びに虚血性心疾患の発症及び重症度と相関しており、かつ経皮的冠動脈形成術後の再狭窄の発症頻度とも関連することが見いだされた。また、その関連性は、古典的な動脈硬化及び虚血性心疾患の危険因子とされる高血圧、高脂血症、糖尿病、及び喫煙歴とは独立していることから、この遺伝子多型の有無を確認することにより、動脈硬化の進行、並びに虚血性心疾患の発症及び発症後の重症度などを正確に予測できることが見いだされた。本発明はこれらの知見を基にして完成された。
【０００７】
すなわち、本発明により、動脈硬化の進行及び／又は動脈硬化に起因する疾患の発症リスクを予測する方法であって、ヒトを含む哺乳類動物から分離された生体試料を用いてKLF5遺伝子の多型を測定する工程を含み、該多型が、
(1)KLF5遺伝子5'隣接領域に存在しており、かつKLF5プロモーター活性に作用し、及びアンジオテンシンIIに対する応答に必要な一塩基多型、又は
(2)KLF5遺伝子のエクソン又はイントロンに存在しており、かつKLF5の機能又は遺伝子発現に影響する一塩基多型
である場合に、該動物では動脈硬化の進行が早く、及び／又は動脈硬化に起因する疾患の発症リスクが高いと判定する工程を含む方法が提供される。この発明の好ましい態様によれば、動脈硬化に起因する疾患が虚血性疾患である上記の方法；動脈硬化に起因する疾患が、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、又は下肢閉塞性動脈硬化症である上記の方法；及び動脈硬化に起因する疾患が心筋梗塞又は脳梗塞である上記の方法が提供される。
【０００８】
別の観点からは、虚血性疾患の予後及び／又は虚血性疾患に対する治療成績を予測する方法であって、ヒトを含む哺乳類動物から分離された生体試料を用いてKLF5遺伝子の多型を測定する工程を含み、該多型が、
(1)KLF5遺伝子5'隣接領域に存在しており、かつKLF5プロモーター活性に作用し、及びアンジオテンシンIIに対する応答に必要な一塩基多型、又は
(2)KLF5遺伝子のエクソン又はイントロンに存在しており、かつKLF5の機能又は遺伝子発現に影響する一塩基多型
である場合に、該動物では虚血性疾患の予後が悪く、及び／又は虚血性疾患に対する治療成績が低いと判定する工程を含む方法が提供される。この発明の好ましい態様によれば、虚血性疾患が、虚血性心疾患又は虚血性脳疾患である上記の方法；虚血性疾患が心筋梗塞又は脳梗塞である上記の方法；虚血性疾患が心筋梗塞であり、該心筋梗塞に対する治療が経皮的冠動脈形成術である上記の方法；治療成績が経皮的冠動脈形成術後の再狭窄の発症を指標としたものである上記の方法が提供される。
【０００９】
これらの発明の好ましい態様によれば、
(A)多型が-3451位におけるC/G変異（上記変異の位置はKLF5転写開始点からのものである。以下同様に記載する。)である上記の方法；該多型を増幅可能なプライマーセットを用いて測定を行なう上記の方法；及び下記のプライマー：forward: ccctagagaagagtgtgct及びreverse: ggtaagcatagaagcagtgtgを用いて測定を行う上記方法；
(B)該多型が-7568位におけるG/A変異である上記の方法；該多型を増幅可能なプライマーセットを用いて測定を行なう上記の方法；及び下記のプライマー：forward: tcaggcgatgcttacagtgc及びreverse: ttctaaggacccgttcccacを用いて測定を行う上記方法；並びに
(C)該多型が-1593位におけるA/G変異である上記の方法；該多型を増幅可能なプライマーセットを用いて測定を行なう上記の方法；及び下記のプライマー：forward: gtcaacaggaagagaaggaa及びreverse: aacatagacacagagcagcを用いて測定を行う上記方法が提供される。
【００１０】
別の観点からは、本発明により、動脈硬化の進行及び／又は動脈硬化に起因する疾患の発症リスクを予測するための診断試薬であって、KLF5遺伝子の多型を測定することができるプライマーセットを含み、該多型が、(1)KLF5遺伝子5'隣接領域に存在しており、かつKLF5プロモーター活性に作用し、及びアンジオテンシンIIに対する応答に必要な一塩基多型、又は(2)KLF5遺伝子のエクソン又はイントロンに存在しており、かつKLF5の機能又は遺伝子発現に影響する一塩基多型である診断試薬；及び虚血性疾患の予後及び／又は虚血性疾患に対する治療成績を予測するための診断試薬であって、KLF5遺伝子の多型を測定することができるプライマーセットを含み、該多型が、(1)KLF5遺伝子5'隣接領域に存在しており、かつKLF5プロモーター活性に作用し、及びアンジオテンシンIIに対する応答に必要な一塩基多型、又は(2)KLF5遺伝子のエクソン又はイントロンに存在しており、かつKLF5の機能又は遺伝子発現に影響する一塩基多型である診断試薬が提供される。
【００１１】
これらの発明の好ましい態様によれば、
(A)多型が-3451位におけるC/G変異である上記の試薬；-3451位におけるC/G変異である一塩基多型を増幅可能なプライマーセットを含む上記の試薬；及び下記のプライマーセット：forward: ccctagagaagagtgtgct及びreverse: ggtaagcatagaagcagtgtgを含む上記試薬；
(B)該多型が-7568位におけるG/A変異である上記の試薬；-7568位におけるG/A変異である一塩基多型を増幅可能なプライマーセットを含む上記の試薬；及び下記のプライマーセット：forward: tcaggcgatgcttacagtgc及びreverse: ttctaaggacccgttcccacを含む上記試薬；並びに
(C)該多型が-1593位におけるA/G変異である上記の試薬；-1593位におけるA/G変異である一塩基多型を増幅可能なプライマーセットを用いて測定を行なう上記の試薬；及び下記のプライマー：forward: gtcaacaggaagagaaggaa及びreverse: aacatagacacagagcagcを含む上記試薬が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、動脈硬化の進行程度や、動脈硬化に起因する心筋梗塞などの虚血性心疾患の発症リスクを正確に予測することができ、また、虚血性心疾患に対する治療成績や予後の予測が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の方法は、動脈硬化の進行及び／又は動脈硬化に起因する疾患の発症リスクを予測する方法であって、ヒトを含む哺乳類動物から分離された生体試料を用いてKLF5遺伝子の多型を測定する工程を含み、該多型が、
(1)KLF5遺伝子5'隣接領域に存在しており、かつKLF5プロモーター活性に作用し、及びアンジオテンシンIIに対する応答に必要な一塩基多型、あるいは
(2)KLF5遺伝子のエクソン又はイントロンに存在しており、かつKLF5の機能又は遺伝子発現に影響する一塩基多型
である場合に、該動物では動脈硬化の進行が早く、及び／又は動脈硬化に起因する疾患の発症リスクが高いと判定する工程を含むことを特徴としている。
【００１４】
動脈硬化においては、物理化学的又は代謝的なストレス、あるいは様々な増殖因子によって血管壁において慢性炎症のような細胞の相互作用が引き起こされており、血管壁の三次元的構築の改変（リモデリング）が進行している。この過程で平滑筋細胞は脱分化（形質変換）し、リモデリングに主要な働きをしている。転写因子KLF5は平滑筋形質変換に重要な役割をはたしていると理解されている。KLF5にはすでに数種の多型の存在が報告されているが、本明細書の実施例に具体的に説明されているように、このKLF5の数種の多型のうち、特定の一塩基多型は、動脈硬化の進行を早め、動脈硬化に起因する疾患の発症リスクを高める性質を有している。本発明の方法では、その特定の多型を測定することにより、動脈硬化の進行及び／又は動脈硬化に起因する疾患の発症リスクを正確に予測できる。
【００１５】
本明細書において用いられる「動脈硬化の進行」という用語は、動脈硬化の病態の悪化が進行することを意味している。本明細書において用いられる「動脈硬化」の用語には、下肢動脈に生じるような筋型動脈の中膜に輪状の石灰化を伴う中膜硬化、脳内や腎臓の動脈などに生じるような細動脈壁の肥厚と内腔の狭窄をきたす細動脈硬化、及びコレステロールを主とする脂質沈着を認めるアテローム硬化などが含まれる。本発明の方法における好ましい対象は、アテローム硬化を伴う動脈硬化である。例えば、アテローム硬化の初期病変においては、多くの単球が血管内皮細胞に付着し、内皮下に進入後、マクロファージに変化する。このマクロファージは貪食能が亢進するとともにスカベンジャーレセプターが発現し、酸化LDLなどの変性LDLを取り込んで泡沫細胞化する。同時に平滑筋細胞も泡沫化する。泡沫細胞は最終的には細胞壊死を起こして死滅するが、この細胞死により細胞外に放出された脂質は、コレステリン結晶として沈着し、細胞の崩壊物とともにアテローム硬化巣の中心に堆積する。平滑筋細胞はアテローム硬化の形成過程で重要な働きをする。さらに肥厚した内膜が破綻して出血が生じたり、不安定プラークが剥離して血管内腔に流出して血栓を生じたりする。動脈硬化の進行という用語は、例えばこのような過程を経る病態の悪化を含む概念として理解されるべきであるが、いかなる意味においても限定的に解釈してはならず、最も広義に解釈する必要がある。
【００１６】
動脈硬化に起因する疾患としては、例えばアテローム性動脈硬化による血管狭窄が引き起こす虚血性疾患や、不安定な動脈硬化プラークの破壊又は剥離などによる血栓の生成や血管の塞栓が引き起こす虚血性疾患などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。代表的な疾患として、例えば、１又は２箇所以上の冠動脈における狭窄を伴う冠動脈硬化症、狭心症、若しくは急性心筋梗塞などの虚血性心疾患、脳塞栓若しくは脳梗塞などの虚血性脳疾患、又は下肢閉塞性動脈硬化症などを挙げることができる。本発明の方法の好ましい対象は冠動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、又は脳梗塞であり、特に好ましい対象は冠動脈硬化症又は心筋梗塞である。
【００１７】
また、本発明の方法は、虚血性疾患の予後及び／又は虚血性疾患に対する治療成績を予測するために用いることもできる。本明細書において用いられる「予後」という用語は、治療の終了後又は継続的治療を行なっている場合において、疾患の軽快又は治癒、あるいは疾患の悪化や変化が認められない場合などを含めて、治療に結果の満足度を意味している。また、治療成績とは、治療により達成しようとした所望の改善効果がどの程度得られたかを示す指標を意味する。この発明では、好ましくは、虚血性疾患として虚血性心疾患又は虚血性脳疾患を適用対象とすることができ、より好ましい対象は狭心症、心筋梗塞又は脳梗塞であり、特に好ましい適用対象は狭心症又は心筋梗塞である。治療成績の予測は、好ましくは、狭心症又は心筋梗塞に対する経皮的冠動脈形成術について行なうことができる。もっとも、虚血性疾患及び治療の種類は上記に例示したものに限定されることはない。本発明の方法により治療成績及び予後を予測することが可能になり、治療対象の個々の個体に対して、より適した治療方法を選択することが可能になる。例えば、心筋梗塞を発症したある個体について本発明の方法を適用し、経皮的冠動脈形成術を行なっても再狭窄の可能性が高いと予測された場合には、この治療方法の選択を見送り、他の治療方法（例えば血栓溶解剤の投与など）を選択するあるいは薬剤溶出性ステントなどを用いることが望ましい。
【００１８】
本発明の方法で測定の対象となるKLF5遺伝子の多型は、(1)KLF5遺伝子5'隣接領域に存在しており、かつKLF5プロモーター活性に作用し、アンジオテンシンIIに対する応答に必要な一塩基多型である。また、本発明の方法で測定の対象となる別な多型は、(2)KLF5遺伝子のエクソン又はイントロンに存在しており、かつKLF5の機能又は遺伝子発現に影響する一塩基多型である。ヒトKLF5遺伝子についてはGenBank (Accession NT_024524)に記載されており、当業者は容易にこの遺伝子を利用できる。また、ヒトKLF5遺伝子の5'隣接領域の核酸配列はGenBank (Accession NT_024524)に記載されており、当業者はこの核酸配列を容易に利用できる。KLF5遺伝子の多型がKLF5プロモーター活性に作用し、かつアンジオテンシンIIに対する応答に必要であるか否かについては、本明細書の実施例に具体的に説明した方法により当業者が確認できる。KLF5プロモーター活性に作用するという用語は、KLF5プロモーター活性を変化させるという意味に解釈すべきであり、プロモーター活性の増強及び減弱のいずれの場合であってもよい。このような性質を有するヒトKLF5の遺伝子多型としては、例えば、-1593位におけるA/G変異（位置はKLF5転写開始点からのものであり、野生型遺伝子のAがGに変異した多型を意味する)、-3451位におけるC/G変異、及び-7568位におけるG/A変異をそれぞれ有する多型を挙げることができるが、この特定の多型に限定されることはない。
【００１９】
本発明の方法は、例えば、ヒトを含む哺乳類動物（例えばイヌやネコなどを含む）から血液などの生体試料を採取し、該生体試料を必要に応じて前処理した後、上記のKLF5遺伝子多型を増幅可能なプライマーセットを用いて該多型部分を含むDNAを増幅して、上記のKLF5遺伝子の多型の存在を証明することにより行なわれる。該多型を増幅可能なプライマーセットの種類は特に限定されないが、本発明の方法で測定対象となる特定のKLF5遺伝子多型を増幅可能で、かつその他のKLF5遺伝子多型を増幅できないプライマーセットを選択する必要がある。そのようなプライマーセットは、上記の公知のKLF5の核酸配列情報に基づいて、当業者が適宜設計可能である。例えば、(A)-3451位におけるC/G変異を有する多型については、下記のプライマー：forward: ccctagagaagagtgtgct及びreverse: ggtaagcatagaagcagtgtg；-7568位におけるG/A変異を有する多型については下記のプライマー：forward: tcaggcgatgcttacagtgc及びreverse: ttctaaggacccgttcccac；並びに(C)-1593位におけるA/G変異を有する多型については下記のプライマー：forward: gtcaacaggaagagaaggaa及びreverse: aacatagacacagagcagcを用いることにより、ヒトKLF5の遺伝子多型のうち、特定の一塩基多型のみを増幅することができ、これにより該多型の存在を容易に証明することができる。
【００２０】
また、KLF5は血管平滑筋細胞、線維芽細胞以外にも、血管内皮細胞、脂肪細胞、リンパ球、及びマクロファージの機能制御に重要であることが知られている。従って、上記の特定の一塩基多型が、メタボリック症候群の病態に関わる可能性が高いと予測できる。さらに、上記のKLF5遺伝子の多型を調べることによって、糖尿病、高脂血症、高血圧症を含む生活習慣病の発症リスクや、病態、予後、及び治療法の選択が可能になると予測される。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例により限定されることはない。
例１：冠動脈硬化重症度との関連
-3451位にC/G変異をもつ多型につき検討したところ、健常者(110名)ではCアレル頻度0.90、Gアレル頻度0.10であった。冠動脈疾患患者全体(380名)ではCアレル頻度0.88、Gアレル頻度0.12であり、健常者との比較において有意差を認めなかった。一方、冠動脈疾患患者につき、より重症の集団を抽出するために多枝病変のためにバイパス手術を受けた患者(70名)に限って解析を行ったところ、Cアレル頻度は0.80、Gアレル頻度は0.20であり、健常人と有意差(p=0.007)をもってGアレルの保有率が重症冠動脈疾患において高いことが判明した。
【００２２】
つぎに、-7568位にG/A変異を有する多型について検討を行った。冠動脈疾患のなかで初回冠動脈造影の症例に限定して解析(512名)を行った。Gensiniスコアは冠動脈主要部位の狭窄度をスコア化し、その合計値で冠動脈硬化の重症度を表す指標である。Gensiniのスコアでみた場合、二つのアレルの両者がGであるGG型では平均3.42、一つのアレルがGでもう一方のアレルがAのGA型4.68、二つのアレルがAであるAA型4.42であり、GG型とGAおよびAA型の間には統計学的有意差をもって差異を認めた。本遺伝子多型についてはGA型あるいはAA型（Aアレルの保有者）で冠動脈疾患が重症の傾向にあることが判明した。図１に結果を示す。
【００２３】
例２：冠動脈形成術後再狭窄との関連
-3451位にC/G変異を有する多型について検討を行った。経皮的経管的冠動脈形成術を施行されたのち、約6ヶ月後(300-420日)に確認カテーテル検査を実施された症例に限定し解析を行った。男性114名につき検討したところ、再狭窄群ではCGまたはGG型が14名、CC型が29名、非再狭窄群ではCGまたはGG型が8名、CC型が53名であり、統計的有意差をもって再狭窄群においてGアレルの保有者が多いことが判明した(p=0.02)。本遺伝子多型は実施例１において重症冠動脈疾患との発症に関与していることが示されているが、同時に冠動脈形成術術後再狭窄にも関与していることが明らかとなった。
【表１】
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【００２４】
例３：KLF5遺伝子5'隣接領域の一塩基置換がKLF5プロモーター活性に及ぼす影響
KLF5遺伝子5'隣接領域に認められた一塩基多型がプロモーター活性に及ぼす影響を検討するためにヒトKLF5遺伝子の5'隣接領域-2232 bpから-79 bp（KLF5遺伝子の翻訳開始部位を+1とした場合の位置を示す）までの領域をpGL3 basic プラスミド(プロメガ)のルシフェラーゼ遺伝子の上流に結合したコンストラクトを作成した。-1593位におけるA又はGの2種のコンストラクトを培養平滑筋細胞にトランスフェクトしてその活性を検討したところ、図２に示すように-1593Aでは認められたPMA（ホルボール12-ミリスチン酸エステル 13-酢酸塩）あるいはアンジオテンシンII刺激によるプロモーター活性の上昇が、-1593Gでは著明に抑制されていた。図２中、非刺激時のルシフェラーゼ活性を1とした相対的ルシフェラーゼ活性を示し、エラーバーは標準偏差を示す。実施例１及び２で疾患との関連性を認めている遺伝子多型とこの多型（-1593、A/G）との間では強い連鎖不均衡があり、実施例１及び２で認められた関連性を直接規定しているのはこの多型（-1593、A/G）であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】KLF5遺伝子の5'隣接領域の一塩基多型(-3451位におけるC/G変異)と冠動脈重症度との関連を示した図である。
【図２】KLF5遺伝子の5'隣接領域の一塩基置換(-1593位におけるA/G変異)がKLF5プロモーター活性に及ぼす影響を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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