(57)【要約】      （修正有）【課題】環境試料中の蛋白質分解能を評価する方法を提供する。【解決手段】以下のプライマーセットを用いて定量的ＰＣＲ法を行い、蛋白質分解菌を測定することによって、環境試料中の蛋白質分解能を評価する方法である：（ａ）特定の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、第二の特定の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；又は（ｂ）第三の特定の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、第二の特定の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；又は（ｃ）第四の特定の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、第五の特定の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境試料中に存在する蛋白質分解菌の１６S  ｒRNA遺伝子を標的として、以下の（Ａ）または（Ｂ）または（Ｃ）に記載の一組の塩基配列からなるプライマー対を使用して定量的ＰＣＲ法を行い、該ＰＣＲ法により増幅された核酸の量を測定し、該測定値に基づいて環境試料中の蛋白質分解細菌の菌数を定量する方法：
（Ａ）配列番号５の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号６の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列；
（Ｂ）配列番号７の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号６の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列；
（Ｃ）配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号９の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により環境試料中に存在する蛋白質分解細菌の菌数を定量し、  該定量値に基づいて該環境試料の蛋白質分解能を評価する方法。
【請求項３】
菌数を測定する前記環境試料中に存在する蛋白質分解細菌が、配列番号１〜４のいずれかを有する蛋白質分解細菌である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド：
（ａ）配列番号５の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；
（ｂ）配列番号６の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；
（ｃ）配列番号７の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；
（ｄ）配列番号８の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；
（ｅ）配列番号９の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列。
【請求項５】
16S rRNA遺伝子の塩基配列が配列番号１〜４記載の配列と99%以上の相同性を示す、Coprothermobacter属に属する菌株を用いて、４５〜７０℃において嫌気性条件下で有機性廃棄物の分解を行う、有機性廃棄物の処理方法。
【請求項６】
以下の（Ａ）または（Ｂ）または（Ｃ）に記載のプライマー対：
（Ａ）配列番号５の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号６の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列；
（Ｂ）配列番号７の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号６の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列；
（Ｃ）配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号９の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質分解菌を検出する方法およびそれに用いるプライマーに関する。また、本発明は、環境試料中の蛋白質分解菌を検出し、その検出結果に基づいて該環境試料の蛋白質分解能を評価する方法に関する。
【０００２】
より詳しくは、本発明は、高温嫌気性条件下で蛋白質の分解に有効なＰ株に関し、また、該株の菌数測定法およびそれに使用できるオリゴヌクレオチドに関する。また、本発明は、メタン発酵汚泥等の環境試料から、一定の性質を有するCoprothermobacter属に属する蛋白質分解細菌の菌数を、遺伝子工学的手法を用いて検出、定量することにより、当該環境試料が有する蛋白質分解能を予測する方法等に関する。
【背景技術】
【０００３】
我々が日常生活を営む過程で大量に発生する代表的な有機性廃棄物として、生ごみ、紙ごみ、し尿・浄化槽汚泥を挙げることができる。これらの有機性廃棄物は水分を多く含むため、従来の焼却処分により処理すると、大量の化石燃料を消費してしまうと共に、二酸化炭素・NOx・SOx等が生成し、ダイオキシン等の有害物質が発生してしまう問題が生じる。さらに、焼却灰を含めた廃棄物の埋め立て処分地の確保も困難になりつつある。
【０００４】
一方、微生物分解を利用した各種有機性廃棄物の処理・減容化方法は、下記のような有用性を有する。すなわち、メタン発酵は、省・創エネルギーと言われ、それ故、近年、焼却や埋め立て処理より環境負荷が低い。また、この方法では、複数の細菌による連係的な分解反応により、有機物をエネルギーとしてのメタンガスにまで転換することができる。このような有用性のため、微生物を利用した処理法が、有機性廃棄物処理に多く適用されている。
【０００５】
微生物を利用した処理法に関しては、その連携的な分解反応において、有機物の可溶化、酸生成反応が律速反応になりやすいことが知られている(非特許文献１)。しかしながら、これらの反応を担う酸生成細菌群についての知見は乏しく、安定的な処理を維持する為の運転条件や処理状況が悪化した際の回復見込みの指標、更にはプロセスの高効率化につながるような最適な酸生成細菌群集の形成についての情報は得られていなかった。
【０００６】
一般的に、高温(約５５℃)メタン発酵は、中温(約３５℃)メタン発酵よりも、処理時間が短縮できる事が知られている（非特許文献２）。これは、高温性の微生物が中温性の微生物より数段高い代謝活性を有すること、および高温条件下では高級脂肪酸等を始めとする難分解性有機物の分散性が高くなるため、難分解性有機物と微生物との接触性が上がり、分解が進み易くなることによるものである。
【０００７】
これまでにメタン発酵処理リアクタから分離された高温性の蛋白質分解細菌としては、Coprothermobacter proteolyticus(ATCC35242)（特許文献１、非特許文献３)、 Coprothermobacter platensis (DSM11748) (非特許文献４)、Caloramator proteoclasticus (DSM10124) (非特許文献５)、Caloramator coolhaasii st.Z (非特許文献６)等の報告がある。しかしながら、これらの細菌が、実際の個々の処理系にどの程度存在し、また処理状況の変動と共にどのように変化するか等に関する知見はなかった。
このように、有機性廃棄物の主要な構成成分である蛋白質の分解、酸生成に関わる細菌についての情報はいまだ不十分であるのが現状である。
【０００８】
【特許文献１】Lasseu, et.al., Organic waste processing method, and uses thereof., US  Patent 6077548, 2000
【非特許文献１】Wiegant,W.M., Cleassen , J.A., and Lettinga,G., Thermophilic anaerobic digestion of high strength wastewaters., 27: 1374-1381, 1985
【非特許文献２】Eastman, J.A., Ferguson, J.F., Solubilization of particulate organic carbon during the acid phase of anaerobic digestion., J. Water.Pollut.Control.Fed., 53:352-366,1981
【非特許文献３】Ollivier B.M., Emendation of the genus Thermobacteroides: Thermobacteroides proteolyticus sp. Nov.,a proteolyticus acetogen from a methanogenic enrichment., Int.J.Syst.Bacteriol., 35:425-428,1985
【非特許文献４】Etchebehere, C., Pavan, M.E., Zorzopulos, J., Soubes, M., Muxi, L., Coprothermobacter platensis sp. nov., a new anaerobic proteolytic thermophilic bacterium isolated from an anaerobic mesophilic sludge., Int.J.Syst.Bacteriol., 48:1297-1304,1998
【非特許文献５】Tarlera, S., Muxi, L., Soubes, M., Stams, A.J.M., Caloramator proteoclasticus sp. nov., a New Moderately Thermophilic Anaerobic Proteolyticus Bacterium., Int.J.Syst.Bacteriol., 47(3):651-656,1997
【非特許文献６】Plugge, C.M., Zoetendal, E.G., Stams, A.J.M., Caloramator coolhaasii sp. nov., a glutamete-degrading, moderately thermophilic anaerobe., Int.J.Syst.Evolute.Microbiol., 50:1155-1162,2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような状況の中、本発明者等は、高温メタン発酵処理系において主に蛋白質を分解する酸生成細菌を見出した。具体的には、蛋白粉末(大豆製、和光純薬（株））を単一基質に用いた集積培養実験を行い、その細菌相の解析と基質代謝特性の調査を行った結果、Coprothermobacter属に属する或る一群の細菌群が優占化することを見出した。この蛋白質基質による集積培養体において優占化した細菌をP株とした。更に、蛋白質を含有する有機性廃棄物のメタン発酵処理汚泥の細菌群集構造を調査したところ、調査した全ての高温メタン発酵汚泥においてP株が優占的に存在することを確認した。
【００１０】
また、本発明者等はP株の単離に成功し、さらに、P株の生理特性の調査から、P株が動物性蛋白質(ペプトン、アルブミン、カゼイン、ゼラチン、酵母エキス)、植物性蛋白質(大豆製蛋白質)のいずれについてもその分解能を有すること、広いpH領域において高い蛋白質分解能を有する事などを明らかにした。すなわち、P株が蛋白質系有機物の高温メタン発酵処理系において主要な役割を担う細菌であると考えられる。
【００１１】
その結果、環境試料中に存在する上記P株のような蛋白質分解細菌数に関する情報に基づき、メタン発酵処理系における蛋白質の分解処理状況をモニタリングすることで、安定的な運転管理を可能にすると考えられる。
【００１２】
そこで、環境試料中の蛋白質分解細菌数に関する情報を評価する方法を確立する必要があるが、そのためには、先ず、環境試料中のP株及びこれと同等の性質を有する蛋白質分解細菌を効率よく検出し、菌数を計測するための技術開発が必須である。
【００１３】
分子系統学的検出に関する最新の技術動向によれば、細菌遺伝子を標的とした検出定量方法として、例えばポリメラーゼ連鎖反応（以下「PCR法」とも記述する）、in situ（生体内原位置）ハイブリダイゼーション法（以下「FISH法」とも記述する）等を利用する技術が開発されている（例えば、Amann, R., Ludwig, W., Schleifer, K., Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation, Microbiological reviews, vol.59, (1)143-169, 1995を参照）。
【００１４】
しかしながら、メタン発酵汚泥等のような複雑な微生物群構造を対象として、本発明において着目される新規蛋白質分解細菌群を特異的に検出する方法について、分子系統学的又は遺伝子工学的な側面からの検討はなされていない。
【００１５】
上述の課題及び技術背景に鑑み、本発明は、環境試料に存在する一定の性質を有する蛋白質分解細菌の菌数をより正確に把握するための評価法を提供することを目的とする。さらに、本発明の目的は、一定の性質を有する蛋白質分解細菌の分子系統学的側面に着目し、遺伝子工学的手法を用いることによって迅速に、特異的に且つ／又は一定の性質を有する蛋白質分解細菌を定量的に検出できる方法、特に、環境試料中の蛋白質分解細菌数を定量的に検出することにより、試料の蛋白質分解能を把握する方法を提供する事である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、高温嫌気性条件下で優占化するP株の発見に続き、生理特性の調査よりP株は蛋白質を分解し、メタン発酵汚泥中の優占細菌になりうることを突き止めた。この結果より、汚泥中のP株の菌数を測定する事でメタン発酵汚泥の蛋白質分解能のモニタリングをすることができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１７】
より詳しくは、本発明者等は、P株の菌学的性質とその系統学的側面に着目し、この種の細菌の16S rRNA遺伝子を標的とすることによって、環境試料中の蛋白質分解細菌の菌数を効率的、定量的且つ／又は特異的に測定できる菌数測定法、及びそのためのオリゴヌクレオチドプライマー等を見出した。
【００１８】
すなわち、本発明は、環境試料中に存在する下記の性質を有する蛋白質分解細菌の菌数を測定することによって、該環境試料の蛋白質分解能を予測および評価する方法である：
（１）蛋白質の分解性を有する；および
（２）配列番号１〜４のいずれか1つの塩基配列に対して少なくとも99％以上の相同性を示す16S rRNA遺伝子を保持する。
【００１９】
本発明の評価法は、配列番号５〜９のいずれか１つの塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を含む核酸を使用することによって、前記環境試料から、該配列番号１〜４の塩基配列の少なくとも一部分の存在を検出することを含むことが好ましい。
【００２０】
本発明の好ましい態様の評価法は、環境試料に由来する蛋白質分解細菌P株の16S rRNA遺伝子を標的として、下記（Ａ）又は（Ｂ）又は（Ｃ）に記載の一組の塩基配列からなるプライマー対を使用して定量的ＰＣＲ法を行い、それにより増幅された核酸の量を測定し、そして、該測定値に基づいて、該環境試料中に存在する配列番号１〜４と99％以上の相同性を示す16S rRNA遺伝子を保有する蛋白質分解細菌P株の菌数を求める方法である：
（Ａ）配列番号５の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号６の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列；或いは
（Ｂ）配列番号７の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号６の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列；或いは
（Ｃ）配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号９の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列。
【００２１】
本評価法が適用される好適な環境試料は、蛋白質成分を含む有機性廃棄物の浄化作用が期待される汚泥試料である。
【００２２】
また、本発明は、下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号５の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；
（ｂ）配列番号６の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；
（ｃ）配列番号７の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；
（ｄ）配列番号８の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；
（ｅ）配列番号９の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の実施態様を詳細に説明する。
本発明は、環境試料中に存在する蛋白質分解菌を測定し、測定された菌数に基づいて該環境試料の蛋白質分解能を評価する方法に関する。
【００２４】
他の態様において、本発明は、P株を、該分解細菌がもつ16S rRNA遺伝子配列に特異的なPCRプライマー対を用いて、種々の細菌が混在する環境試料中から特異的に且つ網羅的に検出する方法および該分解細菌の数を定量する方法に関する。
【００２５】
本明細書で使用する用語
まず、本発明において使用する用語について説明する。
本明細書で使用される「環境試料」とは、環境から採取した試料をいう。本発明においては、「環境試料」としては、蛋白質分解細菌が生息することによる処理作用が期待される有機物含有試料が好ましい。例えば、蛋白質分解細菌が関与する加水分解・酸生成作用が期待される高温嫌気性条件下の蛋白質含有有機性廃棄物の処理汚泥試料等である。
【００２６】
本明細書で使用される「蛋白質分解微生物」および「蛋白質分解菌（細菌）」とは、蛋白質を分解する能力を有するすべての微生物および菌（細菌）を意味する。したがって、「蛋白質分解菌」には、高温嫌気性条件下や中温嫌気性条件下において活性の高い菌が含まれる。具体的には、本発明者らによって見出されたＰ株も蛋白質分解菌の一種であり、高温嫌気性条件下で効率良く、蛋白質を分解する。
【００２７】
本明細書で使用される「高温嫌気性条件」という語における「高温」とは、４５〜７０℃、好ましくは５０〜６５℃、より好ましくは５５〜６５℃の範囲を意味する。また、本明細書で使用される「中温嫌気性条件」という語における「中温」とは、３０〜４０℃の範囲を意味する。
【００２８】
本明細書で使用される「Ｐ株」とは、系統学的にP１株（配列番号１）と同じグループに属するあらゆる蛋白質分解菌を含み、より具体的には、P２株（配列番号２）、P３株（配列番号３）、P４株（配列番号４）の少なくともいずれかの16S rRNA遺伝子の塩基配列と99％以上の相同性を示す16S rRNA遺伝子を有する嫌気性酸生成細菌群として定義される。
【００２９】
本明細書でプライマーに関して使用される「塩基配列が実質的に相同である」或いは「塩基配列が実質的に相補的である」という表現は、当該核酸がPCRプライマー等として機能し得る程度の断片長と相同性を有していることを意味する。
【００３０】
本明細書内で言及される「菌数の計測」又は「菌数の測定」とは、試料内のコロニー形成等の生菌数計測によるような直接的な計測に限らず、上述したように試料中の菌数によって変動する核酸量を定量することによる間接的な菌数の推定をも含む概念である。
【００３１】
本明細書において「ｒＲＮＡ遺伝子を標的とする」とは、染色体上に存在するｒＤＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ反応による増幅であってもよいし、ｒＤＮＡの転写産物であるｒＲＮＡに相補的なポリヌクレオチドプローブを用いたＦＩＳＨ法により検出してもよい、またｒＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡに相補的なポリヌクレオチドプライマーによるＰＣＲ反応による増幅を行ってもよい。
本明細書において使用される「ｒＲＮＡ遺伝子」は、「ｒＤＮＡ」と称されることもある。
【００３２】
測定対象となる蛋白質分解菌
本発明において、測定対象となる蛋白質分解菌としては、あらゆる蛋白質分解菌が含まれる。上述したように、高温嫌気性条件下であると蛋白質の分解が促進されることから、本発明の測定対象となる蛋白質分解菌としては、高温嫌気性条件において蛋白質分解活性の高い菌が好ましい。また、測定対象となる蛋白質分解菌としては、一定の性質を有するCoprothermobacter属に属する蛋白質分解細菌が好ましい。
【００３３】
具体的には、本発明の測定対象となる蛋白質分解菌として、本発明者らによって見出されたＰ株を挙げることができる。「Ｐ株」の例としては、P１株（配列番号１）、P２株（配列番号２）、P３株（配列番号３）、P４株（配列番号４）を挙げることができる。後述するようにＰ株は、高温嫌気性条件下で蛋白質分解活性があり、メタン発酵汚泥中で優占化しうることから、Ｐ株を本発明の測定対象とすることが好ましい。
【００３４】
また、本発明においては、蛋白質分解菌を測定する際に、ＰＣＲ法による遺伝子の増幅を利用してもよく、その場合、蛋白質分解菌を測定するために設計されたＰＣＲプライマーによって増幅される蛋白質分解菌は、すべて本発明における測定対象に含まれる。したがって、後述する本発明の測定法によって検出される蛋白質分解菌は、公知の菌であろうと、未知の菌であろうと、すべて本発明の測定対象に含まれる。
【００３５】
Ｐ株の単離
上述した「P株」の１つであるＰ１株は、具体的に、以下のようにして単離した。
し尿、浄化槽汚泥、生ごみを処理しているメタン発酵槽より採取したメタン発酵汚泥100 mL（乾燥重量約15 g）をセルムバイアル瓶に入れ、大豆製蛋白粉末を0.4 g、アンモニア性窒素（130 mg-N/L）、リン酸カリウム（50 mg-P/L）、酵母エキス（50 mg）を加えて、嫌気的条件下（溶存酸素濃度0 mg/L, 酸化還元電位 -200 mV以下）、55℃、pH 6.8〜7.0で振とう培養した。セルムバイアル瓶内の汚泥中の細菌叢の変化と蛋白質分解能を測定し、系内で優占化し、蛋白質分解能を有する菌株を発見、単離した。
【００３６】
P１株以外の本発明の細菌群P株として配列番号２（P２株）、配列番号３（P３株）、配列番号４（P４株）の16S rRNA遺伝子を有する菌株が挙げられるが、いずれもP１株と同様にメタン発酵汚泥などから蛋白質に対する分解能を指標として選択することができ、16S rRNA遺伝子を解析することによって同定できる。
【００３７】
Ｐ株の菌学的性質および分類上の位置
P株の菌学的性質及び分類上の位置は以下の通りである。
（ａ）形態学的特徴
形態的には桿菌、大きさは０．４〜０．５×１．５〜６．８（μｍ）、運動性は無く、グラム染色陰性、芽胞形成能は認められなかった。
【００３８】
（ｂ）生理学的性質
・酸素に対する耐性は認められない。
・生育可能温度は少なくとも35℃〜70℃であり、至適生育温度は60〜65℃である。
・生育可能pHは少なくとも5.3〜8.5であり、至適pHは6.2である(図１)。P株は少なくともpH5.3〜8.5において、pHの影響を受けにくく、蛋白質分解活性を保持できる性質を持つ（図２）。
・基質特異性は表１に示すとおりであった。P株は、植物性及び動物性蛋白質のいずれに対しても分解能を持つことが確認された。また、ペプトン、血清アルブミン、カゼイン、酵母エキス、ゼラチン、大豆性蛋白質の分解代謝物として、水素、アンモニア、酢酸、プロピオン酸、i-酪酸、i-吉草酸、乳酸を生成する。
・55℃、pH７の条件で表２に示す培養液（Balch, W.E., Fox, G.E., Magrum, L.J., Woese, C.R., Wolfe, R.S., Methanogens:Reevaluation of a Unique Biological Group., Microbiol.Rev., 43,265,1979を参照）を用いた場合のP株の酵母エキスからの生成物量の経時変化及びP株の増殖の経時変化を図３に示した。P株は、対数増殖期の後期以降からプロピオン酸の生成率が高くなる性質を持つ。
・倍加時間は、55℃、pH7の条件で酵母エキスを基質とした場合に約8時間である。
【００３９】
【表１】
2005253429.tif 000002
【００４０】
【表２】
2005253429.tif 000003
【００４１】
（ｃ）分子系統学的分類
Ｐ株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、配列番号１〜４に示す通りである。
塩基配列は、遺伝子解析ソフトClustalW（例えば、Thompson,J.D., Higgins,D.G. and Gibson,T.J. 「CLUSTAL W: Inproving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice.」 Nuceleic. Acid. Res. 22, 4673-4680, 1994を参照）を用いて系統解析に供した。その系統解析の結果に基づき系統樹を作成した（図４)。また、MBIC BLAST search（http://seasquirt.mbio.co.jp/mbic  /index.php?page=blast）により相同性検索をしたところ、P株は最も近縁とみられる公知株Coprothermobacter proteolyticus  BT株(以下単に「BT株」と記述する)との間では16S rDNAについて1523塩基中98％の相同性を持つ。その反面、P１株に代表されるP２株、P３株、P４株を含む一群の菌株は、ClustalWを用いた多重アライメントの結果、16S rDNAについて99％以上の相同性を持つグループを構成する事が示された。
【００４２】
かくして本発明は、上記のようなP株の一定の菌学的特徴と分子系統学的特徴とを特定することによって、環境試料からP株をほぼ網羅的に且つほぼ特異的に検出するものである。
【００４３】
Ｐ株検出用オリゴヌクレオチドの設計
このようにＰ株は、蛋白質分解活性を有し、メタン発酵汚泥中で優占化しうることから、環境試料中の蛋白質分解菌としてＰ株を検出することによって、環境試料の蛋白質分解活性を評価することができると考えられる。
【００４４】
そこで、Ｐ株検出用のオリゴヌクレオチドについて、以下のように設計した。
P株の遺伝子系統学的側面によれば、P株に普遍的に存在し且つ保存性の高いコンセンサス配列を見出し得る遺伝子配列としては、16S rRNA遺伝子の核酸配列が挙げられる。
【００４５】
本評価法の一特徴として、P株の16S rRNA遺伝子の塩基配列（配列番号１〜４）に対し少なくとも99%の相同性を有する核酸群が規定されるので、それら核酸群はP株を検出するための指標ないし標的となる。
【００４６】
従って、P株を検出するためには、配列番号１〜４の塩基配列と少なくとも99%の相同性を有する核酸とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを設計し、使用するとよい。具体的には、P株を検出するための標的とされる核酸配列間で実質的に相同な塩基（その特異性に求められる包括的範囲を考慮して選択する）であるが、他の区別したい微生物とは異なっている塩基（その特異性に求められる排他的範囲を考慮して選択する）を基にPCRプライマー等を設計する。それらプライマー又はプローブは合成オリゴヌクレオチドであってもよいし、また長鎖のプローブならば、配列番号１〜４の塩基配列を有する単離核酸から調製されるcDNAプローブ等であってもよい。
【００４７】
特に好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜４の塩基配列の少なくとも一部を有する核酸の存在を検出するために、配列番号１〜４の塩基配列の少なくとも一部、好ましくは少なくとも２０塩基、より好ましくは少なくとも１５塩基程度からなる部分配列と完全に相補的であるか又はそれと実質的に相補的な核酸として設計される。
【００４８】
上記のような好ましいオリゴヌクレオチドの例には、（ａ）配列番号５の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；（ｂ）配列番号６の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列；（ｃ）配列番号７の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列、（ｄ）配列番号８の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列（ｅ）配列番号9の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列、又はそれらと実質的に相同な塩基配列が挙げられる。
【００４９】
上記オリゴヌクレオチド群のうち、PCR用プライマー対に好適なオリゴヌクレオチドの組み合わせは（ａ）と（ｂ）、（ｃ）と（ｂ）、（ｄ）と（ｅ）である。
上記のようにして、P株の16S rRNA遺伝子を特異的に検出するために、本明細書に開示された配列番号１〜４の各塩基配列情報に基づいてP株に特徴的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド部分を選択するか、又は当該技術分野に関する常法ないし当業者が容易に知り得る経験則に従い、そのような特異的配列をデザインすることができる。
【００５０】
上記態様の本評価法によれば、それら有用なオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブを使用してP株の標的核酸の少なくとも一部分の存在を特異的に検出できるので、環境試料に存在するP株を迅速かつ正確に検出し、定量することができる。
【００５１】
プライマーは、使用目的や条件によっては必ずしも100％の相同性を有している部位から設計する必要はない。例えば、目的とする領域のプライマーの５’末端付近で数塩基が異なっていても、アニーリング温度やマグネシウム濃度を検討することによって標的領域のDNAを増幅させることが可能である。完全に相同な部位を使用し且つ特異性が高くなる条件を選択すれば、特異性の高い検出・定量が可能となり、特異性の低い条件でよければ数塩基が異なっている配列も許容される。したがって、本発明においては、上記（ａ）〜（ｅ）に示したオリゴヌクレオチドと「塩基配列が実質的に相同である」或いは「塩基配列が実質的に相補的である」オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することが可能である。
【００５２】
なお、プライマーとして実質的に相同或いは相補的であるか否かは、例えば、インターネット上に公開されている上記のプローブチェックプログラム（The RDP-II、例えば、Ribosomal Database Project, Maidak BL, Cole JR, Lilburn TG, Parker CT Jr, Saxman PR, Farris RJ, Garrity GM, Olsen GJ, Schmidt TM, Tiedje JM., Nucleic Acids Res. 29(1):173-174, 2001を参照）によって行うことができる。
【００５３】
蛋白質分解菌の定量的測定
遺伝子工学的手法が使用される本評価法において、定量的検出が必要であれば、定量的PCR法を使用することができる。そのようなPCR法を使用してP株を検出、定量する方法としては、上述のとおりP株の16S rRNA遺伝子の塩基配列（典型的には配列番号１）の少なくとも一部を特異的に増幅できる一対のPCRプライマーを設計し、使用する。
【００５４】
そのような定量的PCR法として有用な技術は、競合PCR法（例えば、中山広樹、「細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッド3」、秀潤社、1996年を参照）、定量的PCR法（例えば、磯野一宏、「臨床病理」、45、p218、1997年を参照）等を挙げることができる。
【００５５】
定量的PCR法の一般的手順は、次の通りである。環境試料に由来する核酸試料を鋳型としてプライマーを接触させ、一連のポリメラーゼ連鎖反応条件下で断続的な増幅反応を繰り返す。このときの増幅反応条件は、当該技術分野において技術常識ないし経験則に従って適宜設定するとよい。その結果、使用した３’側プライマーと５’側プライマーとの間の、特定の断片長の核酸領域が特異的に増幅される。増幅された核酸は、例えば、その断片長を電気泳動法によって確認したり、その断片に特異的なプローブ等を用いるなどして、それが目的核酸であることを確認できる。増幅される核酸の量は、被検試料中の菌数とほぼ相関しているので、その増幅核酸の定量値に基づいて菌数を求めることができる。定量的ＰＣＲ法によれば、既知量の核酸の増幅度を指標にして目的核酸の量を知ることができる。本発明において、ＰＣＲ法を利用した蛋白質分解菌の測定は、プライマーで増幅しうる菌を網羅的かつ特異的に検出することが可能なため、特に好適である。
【００５６】
さらに、プローブを使用してＰ株を始めとする蛋白質分解菌を定量的に検出・測定する方法としては、ＦＩＳＨ法が挙げられる。
典型的なＦＩＳＨ法では、Ｐ株に特異的な蛍光ＦＩＳＨプローブを使用し、これを環境試料と混合し、細胞内の標的核酸とＦＩＳＨプローブの結合が行われる条件下でハイブリダイゼーション（結合）を行い、蛍光顕微鏡観察下でハイブリダイズした遺伝子プローブからの蛍光シグナルが得られるかどうかによって、検出対象菌の細胞を同定し、菌数計測を行うことができる。
【００５７】
ＦＩＳＨプローブの設計においても、特異性が高く、好適に使用できる遺伝子としては、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子が挙げられる。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を基にして設計された好適なＦＩＳＨプローブの例は、配列番号５〜９のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブが挙げられる。
【００５８】
ＦＩＳＨ法による具体的な検出・定量の一態様は、次の通りである。Ｐ株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に特異的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを調製し、このＤＮＡを蛍光色素あるいは放射性同位元素、またはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）等の化学発光物質で標識する。その標識プローブを、Ｐ株を検出および定量したい被検試料と混合し、適切な温度、塩濃度条件下でのハイブリダイゼーション処置を行い、標識プローブと標的核酸とのハイブリッドを形成させる。次いで、ハイブリッドを形成しなかった標識プローブ等を除去し、ハイブリッドを形成している標識プローブのみからのシグナルを検出する。ハイブリッド形成プローブの具体的な検出・定量方法としては、標識シグナルを蛍光顕微鏡で検出する方法や、フローサイトメトリーを用いる方法等が挙げられる。このとき、例えば、標識の化学発光等を可視的に捕らえて試料中の標的核酸の分布を見て菌数を計測できるし、定量的に評価可能なシグナルであれば、そのシグナルレベルを比較して標的核酸の量、つまり菌数を定量することができる。
【００５９】
このように上記ＦＩＳＨプローブは、一般的には微生物細胞を含むin situ試料と混合されるが（in situハイブリダイゼーション）、これに限らず、微生物試料から抽出した精製ＤＮＡ試料と混合してもよい（Dot blotハイブリダイゼーション）。
【００６０】
蛋白質分解菌の測定データに基づく、環境試料の蛋白質分解能の評価
本発明においては、環境試料の蛋白質分解菌を測定し、測定結果を基に環境試料の蛋白質分解能を評価することができる。
本発明の評価法の好ましい一態様では、嫌気的条件下のメタン発酵槽から採取された一定の試料から、配列番号１〜４と99％以上の相同性を示す16S rRNA遺伝子を保有する蛋白質分解細菌の菌数を定量的に検出し、その定量値をメタン発酵試料等の環境試料の蛋白質分解能に対応する基礎データとする。
【００６１】
本評価法は、特定遺伝子の分子系統学的特徴を要件とするので、種複雑な微生物群集構造をもつ生物処理環境試料の中からでも確実且つ効率的に目的のP株を検出することができる。
【００６２】
また、メタン発酵処理のように複雑なプロセスについては、その微生物群集構造の詳細は解明されておらず、その制御法も確立していないが、少なくとも本法によれば、この種の系に関する理想的な状態やその状態変化を示す指標データを提供できる。すなわち、当該菌数の基礎データを、その系の状態について実際に得られる他のパラメータ、例えば蛋白質分解能や蛋白質負荷、ガス発生量、pH、プロピオン酸等の有機酸濃度等と照らして経時的に記録することにより、系の状態変化を予測することができる。
【００６３】
高温嫌気性蛋白質分解細菌の添加による蛋白質分解の促進方法
上述のようにして得られた菌数定量値は、当該環境試料の蛋白質分解能と相関する基礎データとして位置づけることができ、この種の基礎データは、蛋白質含有廃棄物処理プロセスの管理や診断に使用できる。例えば、当該処理プロセスにおいて蛋白質分解能をモニタリングし、処理を安定的に維持するために、処理槽中の栄養源の増減処置や温度制御等の必要性についての目安を与えることができる。
【００６４】
例えば、汚泥を経時的にサンプリングして当該菌数を監視し、その有意な変化から系の蛋白質分解能の変化を診断、予測することができ、このようにして系の理想的状態への制御或いはその悪化を避けるための処置が可能となる。
【００６５】
測定されたメタン発酵汚泥や余剰汚泥など、本発明のP株に類する菌株が存在する環境中には、P株に類する菌株以外の多種多様な微生物が数多く存在している。P株をこのような微生物の群集内で利用する場合、純粋培養系とは異なり、それぞれ異なった基質特異性や機能を持つ微生物群との増殖競合が生じ、必ずしもP株の微生物群集内での定着及び増殖を順調になしうるとは限らない。そこで、本発明により環境試料中のＰ株を測定した結果に基づいて、汚泥等にＰ株を添加する等の方法により、蛋白質分解を制御してもよい。
【００６６】
そのような場合には、対象とする微生物群集にP株の培養物又はその乾燥菌体を添加して、P株の定着及び増殖を促進する事ができる。また添加する際に、P株の生存及び生物活性を維持する為に生物学的に許容される公知の増殖剤などと混合した組成物として提供してもよい。その形態は液体でも固体でも良く、保存及び運搬等の条件に適したものであればよい。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
［実施例１］
P１株及びその近縁株P２株、P３株、P４株の16S rDNAを標的としたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、菌株から抽出したDNAを鋳型としPCRを行い、各プライマーの有効性を検証した。
【００６８】
使用した菌株は、P１株、P２株、P３株、P4株、BT株の５株である。使用したプライマー対は以下の通りである。
プライマー対（Ａ）
5’プライマー：P-F６(配列番号５；配列番号1〜４の塩基番号１９３〜２１２に相当する)及び
3’プライマー：P-B８(配列番号６；配列番号1〜４の塩基番号８１２〜７９７に相当する)
プライマー対（Ｂ）
5’プライマー：P8-F１(配列番号７；配列番号３及び配列番号４の塩基番号１９３〜２１２に相当する)及び
3’プライマー：P-B８(配列番号６；配列番号３及び配列番号４の塩基番号８１２〜７９７に相当する)
プライマー対（Ｃ）
5’プライマー：P-F７(配列番号８；配列番号１〜４の塩基番号７８０〜７９８に相当する)及び
3’プライマー：P-B７(配列番号９；配列番号１〜４の塩基番号１１３７〜１１１９に相当する)
プライマー対(Ａ)を使用すると、P１株、P２株、P３株、P４株の16S rDNAを含む試料からは、配列番号１、２、３及び４の塩基配列中の塩基番号193〜812に相当する「620塩基」の核酸断片が増幅される。
【００６９】
プライマー対(Ｂ)を使用すると、P３及びP４株の16S rDNAを含む試料からは、配列番号３及び４に記載の塩基配列中の塩基番号193〜812に相当する「620塩基」の核酸断片が増幅される。
【００７０】
プライマー対(Ｃ)を使用すると、P１株、P２株、P３株及びP４株の16S rDNAを含む試料からは、配列番号１、２、３及び４に記載の塩基配列中の塩基番号780〜1137に相当する「358塩基」の核酸断片が増幅される。
【００７１】
設計されたプライマーの特異性の評価は、上記プローブチェックプログラム（The RDP-II）によって行うことができる。その結果、上記各オリゴヌクレオチドプライマー対を使用すれば、各菌株以外の細菌の16S rDNA増幅産物以外の増幅は起こらない事が確認され、P１株、P２株、P３株、及びP４株の16S rDNAに特異的であり得ると評価された。
【００７２】
上記PCRプライマー対(Ａ)、プライマー対（Ｂ）、プライマー対（Ｃ）を用い、P１株、P２株、P３株、P４株、BT株の培溶液から抽出した各核酸試料を鋳型としてPCRを行った。PCR反応液組成には、鋳型DNA  50 ng/50 μL、1×PCR buffer (Perkin−Elmer)、1.5 mM ＭgCl2、0.01％ bovine serum albumin、200 μM each dNTP、400 μM プライマー対 、1.25 U /50 μL  AmpliTaq GoldTMが含まれる。
【００７３】
プライマー対(Ａ)についてのPCR条件は、94℃ 10分を1サイクル；94℃ 1分、55℃ 1分、及び72℃ 1分を35サイクル；そして72℃ 10分を1サイクルとした。
プライマー対(Ｂ) についてのPCR条件は、94℃ 10分を1サイクル；94℃ 1分、57℃ 1分、及び72℃ 1分を35サイクル；そして72℃ 10分を1サイクルとした。
【００７４】
プライマー対(Ｃ) についてのPCR条件は、94℃ 10分を1サイクル；94℃ 1分、53℃ 1分、及び72℃ 1分を35サイクル；そして72℃ 10分を1サイクルとした。
図５に上記PCRの結果を示す。電気泳動の各レーンは左から１〜１５まであり、各レーンで泳動したサンプルは以下の通りである：
レーン１、レーン６、レーン１１にP１株のDNAを鋳型としたPCR増幅試料；
レーン２、レーン７、レーン１２にP２株のDNAを鋳型としたPCR増幅試料；
レーン３、レーン８、レーン１３にP３株のDNAを鋳型としたPCR増幅試料；
レーン４、レーン９、レーン１４にP４株のDNAを鋳型としたPCR増幅試料；
レーン５、レーン１０、レーン１５にBT株のDNAを鋳型としたPCR増幅試料。
【００７５】
レーン１〜５にはプライマー対(Ａ)を用いた増幅試料、レーン６〜１０にはプライマー対(Ｂ)を用いた増幅試料、レーン１１〜１５にはプライマー対(Ｃ)を用いた増幅試料をそれぞれ泳動した。
【００７６】
図５の結果から、プライマー対(Ａ)を用いた場合、目的細菌ではないBT株では増幅断片が生じず、P１株、P２株、P３株、P４株の培養液からの抽出DNAに対してのみ「620塩基」のDNA断片が増幅された。すなわち、プライマー対(Ａ)（配列番号５と配列番号６の一組の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対）を用いたPCRによる増幅によって、P１株、P２株、P３株、P４株を特異的に検出することができる事が検証された。
【００７７】
また、プライマー対(Ｂ)を用いた場合、目的細菌ではないP１株、P ２株、BT株では増幅断片が生じず、P３株、P４株の培養液からの抽出DNAに対してのみ「620塩基」のDNA断片が増幅された。すなわち、プライマー対(Ｂ)（配列番号７と配列番号６の一組の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対）を用いたPCRによる増幅によって、P３株、P４株を特異的に検出することができる事が検証された。
【００７８】
また、プライマー対(Ｃ)を用いた場合、目的細菌ではないBT株では増幅断片が生じず、P１株、P２株、P３株、P４株の培養液からの抽出DNAに対してのみ「358塩基」のDNA断片が増幅された。すなわち、プライマー対（Ｃ）（配列番号８と配列番号９の一組の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対）を用いたPCRによる増幅によって、P１株、P２株、P３株、P４株を特異的に検出することができる事が検証された。
【００７９】
［実施例２］
試料中のP株菌数を定量するために、実施例１に記載される配列番号５と配列番号６の一組の塩基配列からなるPCRプライマー対（Ａ）を使用し、定量PCR法によりP株16S  rDNAコピー数の定量を行った。
【００８０】
PCRプライマー対（Ａ）を使用して、蛋白質負荷の異なる高温（55℃）メタン発酵汚泥から抽出したDNAを鋳型とし定量PCRを行い、各試料中のP株菌数を定量した。
定量PCRはLightCycler system(Roche)を使用し、LightCycler−FastStart DNA SYBR GreenＩ(Roche)試薬を用いて行った。PCR反応液20 μＬの最終濃度液組成は以下のように調整した。1×Mastermix (FastStart enzyme, FastStart Taq DNA polymerase, reaction buffer, dNTP mixuture, MgCl2, and SYBR Green I dyeを含む)、500 μM プライマー対（Ａ）を含む。なおMgCl2濃度は、最終濃度3.5 mM MgCl2に調整した。
【００８１】
定量PCRの条件は、95℃ 10分を1サイクル；95℃ 15秒、55℃ 10秒、及び72℃ 20秒を40サイクル；そして70℃  15秒を1サイクルである。溶解曲線作成条件は、0.1℃/秒速で温度幅は70℃から95℃である。
【００８２】
定量PCRの外部標準の調製は以下のように行った。
pGEM（登録商標）−T  Easy  Vectorの３７４bp〜１１４６bp増幅産物をMicrocon YM-100（Millipore）フィルターで精製し、最終容量３０ μLの滅菌蒸留水(DNase free, RNase free; Nippon Gene)に溶解した。回収増幅産物濃度を分光光度計(Pharmacia,２６０ nm)を用いて測定し、順次109〜104 コピー/μＬになるよう希釈し、これを外部標準とした。尚、外部標準増幅用プライマーは標的増幅産物用のプライマーとTm値、ヌクレオチド長を増幅効率に支障がない程度同一に設定した。また、外部標準増幅産物の増幅長は、標的増幅産物の増幅産物長の85％〜115％に設定し、外部標準と標的のPCR増幅効率が支障のない程度に同一であるように設定した。
【００８３】
また、定量ＰＣＲの外部標準としては、Ｐ株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの全長領域の増幅産物を用いても良い。つまり、配列番号１〜４に記載の１ｂｐ〜１５２８ｂｐを増幅し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターで精製、最終容量３０μＬの滅菌蒸留水（ＤＮａｓｅ  ｆｒｅｅ、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ；Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）に溶解し、回収増幅産物濃度を分光光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２６０ｎｍ）を用いて測定し、順次１０９〜１０４コピー／μＬになるよう希釈したものを外部標準とすることも可能である。この場合、外部標準と標的ＤＮＡは同一の標的増幅産物用プライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことができる。
【００８４】
16S rDNAのゲノム上でのコピー数は1以上であるが各細菌株により一定と考えられるので、試料中のP株菌数と16S rDNAコピー数は比例関係にある。従って、試料中のP株濃度は、一定量汚泥（2.5 mgVSS）試料から抽出回収したDNA重量あたりのP株16S rDNAコピー数として算定した。
【００８５】
リアクタに投入される原水中の蛋白質濃度は、常法に則りケルダール窒素（社団法人日本下水道協会、「下水試験方法」、上巻、184-185ページ、1997年）とアンモニア性窒素（社団法人日本下水道協会、「下水試験方法」、上巻、160-162ページ、1997年）を測定し、以下の数式にあてはめ算定した。
【００８６】
蛋白質濃度＝（ケルダール窒素−アンモニア性窒素）×6.25
図６に、蛋白質系有機物を処理するメタン発酵汚泥中のP株菌濃度と蛋白質負荷測定結果の関係を示す。この結果より、蛋白質負荷とP株菌濃度の間には相関がみられ、試料中のP株菌濃度は汚泥が許容しうる蛋白質負荷の定量化に有効であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、各pHにおける培養開始から7日目のP株の増殖能を示すグラフである。
【図２】図２は、各ｐHにおける培養開始から7日目のP株による酵母エキスからの代謝産物を示すグラフである。
【図３】図３は、P株の酵母エキスからの代謝物の生成量経時変化及び増殖を示すグラフである。
【図４】図４は、P株の分子系統学的位置（16S rDNA，NJ法）を示す図である。
【図５】図５は、実施例１において16S rDNAを標的とするPCR増幅産物についての電気泳動結果を示す図である。
【図６】図６は、実施例２において16S rDNAを標的とするPCR増幅産物について定量されたP株菌濃度と汚泥の蛋白質負荷との関係を示すグラフである。
【図１】
2005253429.tif 000004
【図３】
2005253429.tif 000005
【図４】
2005253429.tif 000006
【図６】
2005253429.tif 000007
【図２】
2005253429.tif 000008
【図５】
2005253429.tif 000009
【配列表】
2005253429000001.app