(57)【要約】【課題】高分子化合物による微細パターン方法を提供する。特に従来困難であった、インクジェット技術を用いた高分子化合物による微細パターン方法を提供する。【解決手段】基板上において、目的とするパターン状にポリヒドロキシアルカノエート合成酵素及び３-ヒドロキシアシルＣoＡを共存させた後、該酵素により３-ヒドロキシアシルＣoＡを重合させてポリヒドロキシアルカノエートを合成することにより、基板上にポリヒドロキシアルカノエートからなるパターンを形成する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上にポリヒドロキシアルカノエートからなるパターンを形成するパターン形成方法であって、
前記基板上に、目的とするパターン状にポリヒドロキシアルカノエート合成酵素と３-ヒドロキシアシルＣoＡとを共存させる工程と、
前記酵素により３-ヒドロキシアシルＣoＡを重合させることにより、前記ポリヒドロキシアルカノエートを合成する工程とを有することを特徴とするパターン形成方法。
【請求項２】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素と前記３-ヒドロキシアシルＣoＡを含有する溶液を前記基板上の前記目的とするパターン状に供給する工程を更に有し、
前記溶液内でポリヒドロキシアルカノエート合成反応を行うことを特徴とする請求項１記載のパターン形成方法。
【請求項３】
前記溶液は、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を含有し３-ヒドロキシアシルＣoＡを含有しない第１の溶液と、３-ヒドロキシアシルＣoＡを含有しポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を含有しない第２の溶液とからなり、
どちらか一方の溶液を前記基板上に供給した後に、前記一方の溶液上に他方の溶液を供給することを特徴とする請求項２記載のパターン形成方法。
【請求項４】
前記合成工程後に、再度前記共存工程及び前記合成工程を繰り返すことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のパターン形成方法。
【請求項５】
前記合成工程後に、前記基板を乾燥させる工程を更に有することを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のパターン形成方法。
【請求項６】
前記合成工程後に、合成されたポリヒドロキシアルカノエートのガラス転移点以上の温度で前記基板を加熱する工程を更に有することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載のパターン形成方法。
【請求項７】
前記ポリヒドロキシアルカノエートからなるパターンの少なくとも一部分をポリヒドロキシアルカノエート分解酵素によって分解する工程を更に有することを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載のパターン形成方法。
【請求項８】
前記ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を含有する溶液を前記ポリヒドロキシアルカノエートからなるパターン上の分解を目的とする部分に供給する工程を更に有し、
前記溶液内でポリヒドロキシアルカノエート分解反応を行うことを特徴とする請求項７記載のパターン形成方法。
【請求項９】
前記ポリヒドロキシアルカノエートからなるパターンに核酸もしくはタンパク質を固定化する工程を更に有することを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載のパターン形成方法。
【請求項１０】
前記固定化工程が、前記ポリヒドロキシアルカノエートの有する反応活性基と前記核酸もしくは前記タンパク質の有する反応活性基との共有結合によることを特徴とする請求項９記載のパターン形成方法。
【請求項１１】
前記ポリヒドロキシアルカノエートの反応活性基がエポキシ基、ビニル基、ブロモ基、カルボキシル基から選択される少なくとも１つであり、前記核酸もしくは前記タンパク質が、アミノ基、チオール基の少なくともどちらかであることを特徴とする請求項10記載のパターン形成方法。
【請求項１２】
前記ポリヒドロキシアルカノエートからなるパターンの少なくとも一部分に化学修飾を施す工程を更に有することを特徴とする請求項１乃至11のいずれかに記載のパターン形成方法。
【請求項１３】
前記ポリヒドロキシアルカノエートが反応活性基を有するモノマーユニットを少なくとも含んでおり、前記化学修飾が、前記反応活性基を活性点とすることを特徴とする請求項12記載のパターン形成方法。
【請求項１４】
前記反応活性基が、エポキシ基、ビニル基、ブロモ基、カルボキシル基から選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項12または13記載のパターン形成方法。
【請求項１５】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を前記酵素の生産能を有する微生物を用いて生産する工程を更に有することを特徴とする請求項１乃至14のいずれかに記載のパターン形成方法。
【請求項１６】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を前記酵素の生産能に関与する遺伝子を導入した形質転換体により生産する工程を更に有することを特徴とする請求項15記載のパターン形成方法。
【請求項１７】
前記遺伝子がポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物から得られた遺伝子であることを特徴とする請求項16記載のパターン形成方法。
【請求項１８】
前記形質転換体の宿主微生物が、大腸菌(Ｅscheichia coli)であることを特徴とする請求項16または17に記載のパターン形成方法。
【請求項１９】
基板上にポリヒドロキシアルカノエートからなるパターンを有することを特徴とする基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は基板上にポリヒドロキシアルカノエートからなる微細パターンを形成する方法に関する。また、特にインクジェット法によってポリヒドロキシアルカノエートからなる任意の微細パターンを形成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
半導体集積回路の生産技術として発展したリソグラフィなどの微細パターニング技術は、液晶、電子部品などの製造に応用され、さらにＭＥＭＳなどの微細加工技術としても用いられるようになってきている。しかし一方ではこうした用途の拡大に伴い、簡便かつ低コストに微細パターンを製造する技術が求められている。
【０００３】
近年、インクジェット法を用いた微細パターニング技術が注目されている。インクジェット法は、用紙の任意の位置にインクを吐出し、印字・描画を行うプリンターの吐出機構として開発されたものである。微小な液体を高精度かつ任意の位置に吐出可能であるため、このインクジェット法を用いてパターニング材料を基板上に吐出し、μｍオーダーの線幅でパターンを形成することが行われている。
【０００４】
例えば、特開平11-340129号公報(特許文献１)では溶媒に溶解させたレジスト材料をインクジェットヘッドからパターン形成面に吐出することでレジストパターンを形成している。
【０００５】
また、特開2002-324966号公報(特許文献２)では、導電性金属ペーストをインクジェット法によって吐出することで配線基板の回路パターンを描画している。
【特許文献１】特開平11-340129号公報
【特許文献２】特開2002-324966号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
様々な化学構造を構築しうる高分子化合物は工業用、日用品用を問わず、極めて有用かつ不可欠な材料となっているが、微細パターニングにおける構成材料としても、その耐久性、遮蔽性、絶縁性、反応性その他数多くの特性ゆえに大きな期待を寄せられている。
【０００７】
こうした高分子化合物からなる微細パターンを作製するために、前述のインクジェット法を適用することが検討されている。具体的には、まず高分子化合物を溶媒に溶解させてインクジェット法における吐出液を製造し、この吐出液をインクジェットヘッドから基板上に吐出し、次いで吐出液の溶媒を乾燥することで高分子化合物からなるパターンを形成するというものである。この場合、高分子化合物を溶解し、吐出液として調製するためには、高分子化合物に対して溶解性のある有機溶媒を用いることが避けられない。
【０００８】
しかし、このような有機溶媒は表面張力が低く、基板とのぬれ性が高いものが多く、基板上に吐出した吐出液の液滴が基板表面を流れ出して必要以上にパターンが広がってしまい、微細なパターニングが困難になるという問題がある。また、インクジェット法による吐出の際に、吐出精度の低下も生じる。例えば、溶液の表面張力が３ｍＮ/ｍ(＝30dyn/cｍ)より低い場合はノズル穴周辺での濡れ性が増大し、液滴の飛行曲がりが生じてしまう。
【０００９】
このような基板上でのパターンの広がりや吐出精度の低下を防ぐために、吐出液中の高分子化合物の濃度を高くして吐出液の粘性を高めることも考えられるが、インクヘッドの吐出口から組成物を円滑に吐出できなくなる可能性があり、また、吐出口での吐出液の切れが悪くなり、基板上に着弾したドット間で吐出液が糸を引くといった現象が生じる。例えば、溶液の粘度が20cpより高いと円滑な吐出ができずノズル穴の目詰まり頻度が高くなり、ノズル先端でのメニスカス形状が安定しないため、吐出量や吐出タイミングの制御が困難になる。
【００１０】
さらに、有機溶媒を用いた場合には揮発性の高さが問題となる。例えば吐出口で組成物中の有機溶媒が揮発し、吐出口付近にポリマーが析出して吐出量や吐出方向が変化して吐出位置がずれたり、目詰まりを起こしたりするなどといったことも生じうる。
【００１１】
また、有機溶媒を用いる場合には、インクヘッドの耐溶剤性を考慮する必要があり、さらに有機溶媒を揮発させる際に排気装置などを必要とするなど、設備面での負担も発生する。
【００１２】
上記の問題を回避する方法として、例えば特開2003-7459号公報では水に可溶な分子数20以下の中分子化合物を構成材料とすることで吐出液を水溶液とする方法をとっているが、分子量の高い高分子化合物に関しては記載されていない。
【００１３】
本発明はこのような問題点に鑑みてなされたものであり、高分子化合物による微細パターンを簡便に作製する方法を提供することを目的とする。また、特にインクジェット法を用いて高分子化合物からなる微細パターンを形成する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、基板上において、目的とするパターン状にポリヒドロキシアルカノエート合成酵素及び３-ヒドロキシアシルＣoＡを共存させた後、該酵素により３-ヒドロキシアシルＣoＡを重合させてポリヒドロキシアルカノエートを合成することによって、基板上にポリヒドロキシアルカノエートからなるパターンを形成するものである。
【００１５】
本発明の方法によれば、基板に供給する溶液中に高分子化合物を含まず、有機溶媒も使用しないため、パターニング方法としてインクジェット法をきわめて有効に使用することができ、微細なパターンを簡便に作製することが可能となる。また、パターニングするポリヒドロキシアルカノエートの化学構造として様々な種類を選択することが可能であり、さらに反応性が高い活性基を有する構造も取り得るため、官能基の導入や化学的変換を施してポリヒドロキシアルカノエート・パターンの多機能化を図ることも可能である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、ポリヒドロキシアルカノエートからなる微細パターンを簡便に製造することが可能となる。特に、基板に供給する溶液中に高分子化合物を含まず、有機溶媒も使用しないため、パターニング方法としてインクジェット法をきわめて有効に使用することができ、微細なパターンを簡便に作製することが可能となる。また、パターニングするポリヒドロキシアルカノエートの化学構造として様々な種類を選択することが可能であり、さらに反応性が高い活性基を有する構造も取り得るため、官能基の導入や化学的変換を施してポリヒドロキシアルカノエート・パターンの多機能化を図ることも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の主要な形態としては、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素と３-ヒドロキシアシルＣoＡを同時または別個に含有する溶液を基板上に供給し、両者が共存する状態において目的とするパターン状に該溶液を付着させる第１の工程と、該パターン状に付着させた溶液内でポリヒドロキシアルカノエート合成反応を行わせる第２の工程から構成される。
【００１８】
＜ポリヒドロキシアルカノエート＞
本発明では、パターンを構成する高分子材料として、ポリヒドロキシアルカノエートが使用される。ポリヒドロキシアルカノエート(以後、ＰＨＡと省略して記述する場合がある)は、今日、生分解性プラスティックとして、また非石油由来ポリマーとしてたいへん注目されており、さらに様々な官能基を側鎖に付帯させることができるため、機能性高分子としても活発に開発が進められている。
【００１９】
本発明によって基板上にパターニングできるＰＨＡとしては、３-ヒドロキシアシルＣoＡを基質として用いてＰＨＡ合成酵素によって合成され得るＰＨＡであれば特に限定されない。
【００２０】
ここで、ＰＨＡ合成酵素によるＰＨＡの合成について以下に簡単に説明する。
【００２１】
ある種の微生物(ＰＨＡ生産菌)では、種々の炭素源や各種アルカン酸から、生体内の様々な代謝経路(例えば、β酸化系や脂肪酸合成経路)を経て(Ｒ)-３-ヒドロキシアシルＣoＡを合成し、それを基質として、ＰＨＡ合成酵素(ＰＨＡポリメラーゼ、ＰＨＡシンターゼともいう)による重合反応によってＰＨＡを合成し、菌体内に蓄積している。
【００２２】
生合成可能なＰＨＡの種類としては、炭素数が０から２までの短鎖長(short-chain-length)の３-ヒドロキシアルカン酸ユニットからなるＰＨＡ(以下、scl-ＰＨＡと略す場合がある)や炭素数が３から12程度までの中鎖長(ｍediuｍ-chain-length)の３-ヒドロキシアルカン酸ユニットからなるＰＨＡ(以下、ｍcl-ＰＨＡと略す場合がある)があり、さらにアルキル基以外の置換基、例えば、フェニル基,フェノキシ基、シクロヘキシル基、不飽和炭化水素,エステル基,アリル基,シアノ基,ハロゲン化炭化水素,エポキシドなどを側鎖に導入したＰＨＡ(以下、unusual-ＰＨＡと略す場合がある)も生合成することができる。
【００２３】
ここで、特にscl-ＰＨＡを合成する酵素はＰＨＢ合成酵素(ＰＨＢポリメラーゼ、ＰＨＢシンターゼともいう)と呼ばれるが、本発明においてはＰＨＡ合成酵素に含めて呼ぶこととする。
【００２４】
なお、ＣoＡとは補酵素Ａ(coenzyｍe Ａ)の略称である。
【００２５】
さらに上記のＰＨＡ合成酵素をＰＨＡ生産菌の菌体外に取り出し、このＰＨＡ合成酵素によって基質である３-ヒドロキシアシルＣoＡを重合し、無細胞系(in vitro)においてＰＨＡを合成することも可能である。
【００２６】
この無細胞系でのＰＨＡの合成を利用して、本発明者らは微粒子などの基材の被覆方法を提案している(特開2002-327046号公報、特開2003-011312号公報)。この方法は、まず基材をＰＨＡ合成酵素溶液に分散もしくは浸漬することによりＰＨＡ合成酵素を基材表面に固定化し、ここに３-ヒドロキシアシルＣoＡを加えてＰＨＡを合成することにより、基材表面をＰＨＡで被覆するものである。
【００２７】
本発明においてもこの無細胞系でのＰＨＡの合成を利用しているが、基板上においてパターン状にＰＨＡ合成酵素及び３-ヒドロキシアシルＣoＡを共存させた後、ＰＨＡをパターン状に合成するものであって、上記従来例とは方法を異にする。また、上記従来例においては本発明におけるような微細パターニング方法に関して開示していなかった。
【００２８】
なお、本発明のパターニングにおいて合成するＰＨＡの分子量は、パターンに対してある程度の強度を付与するため、数平均分子量で１万から1,000万程度程度とするのが望ましい。
【００２９】
＜３-ヒドロキシアシルＣoＡ＞
本発明に使用できる３-ヒドロキシアシルＣoＡとしては、ＰＨＡ合成酵素によって重合し得るものであればいかなるものでも良く、３-ヒドロキシアシルＣoＡを適宜選択することで、パターニングするＰＨＡの化学構造を任意に制御することができる。
【００３０】
３-ヒドロキシアシルＣoＡは、例えば、酵素を用いたin vitro合成法、微生物や植物などの生物体を用いたin vivo合成法、化学合成法等の中から適宜選択した方法で合成して用いることができる。特に、酵素合成法は該基質の合成に一般に用いられている方法であり、市販のアシルＣoＡシンセターゼ(アシルＣoＡリガーゼ、Ｅ.Ｃ.6.2.1.3)を用いて、３-ヒドロキシアルカン酸とＣoＡから３-ヒドロキシアシルＣoＡを合成する方法が知られている(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250,432-439(1997)、Ａppl.Ｍicrobiol.Ｂiotechnol.,54, 37-43(2000))。
【００３１】
＜ＰＨＡ合成酵素＞
本発明に用いるＰＨＡ合成酵素は、該酵素を生産する微生物、あるいはそれら微生物のＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体により生産されたものを用いることができる。
【００３２】
ＰＨＡ合成酵素を生産する微生物として、例えば、ｍcl-ＰＨＡやunusual-ＰＨＡを生産できる微生物として、シュードモナス属(Ｐseudoｍonas sp.)、バークホルデリア属(Ｂurkholderia sp.)、アエロモナス属(Ａeroｍonas sp.),コマモナス属(Ｃoｍaｍonas sp.)などの微生物を用いることができ、例えば、本発明者らにより分離された、シュードモナス・プチダ・Ｐ91株(Ｐseudoｍonas putida Ｐ91),シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株(Ｐseudoｍonas cichorii Ｈ45),シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株(Ｐseudoｍonas cichorii ＹＮ２),シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株(Ｐseudoｍonas jessenii Ｐ161)、バークホルデリア属・ＯＫ３株(Ｂurkholderia sp.ＯＫ３、ＦＥＲＭ Ｐ-17370),バークホルデリア属・ＯＫ４株(Ｂurkholderia sp.ＯＫ４、ＦＥＲＭ Ｐ-17371)などの微生物を用いることができる。
【００３３】
また、scl-ＰＨＡを生産できる微生物として、アエロモナス属(Ａeroｍonas sp.)、アルカリゲネス属(Ａlcaligenes sp.)、クロマチウム属(Ｃhroｍatiuｍ sp.)、コマモナス属(Ｃoｍaｍonas sp.)、メチロバクテリウム属(Ｍethylobacteriuｍ sp.)、パラコッカス属(Ｐaracoccus sp.)、シュードモナス属(Ｐseudoｍonas sp.)などの微生物を用いることができ、例えば、本発明者らにより分離された、バルクホルデリア・セパシア・ＫＫ01株(Ｂurkholderia cepacia ＫＫ01,ＦＥＲＭ ＢＰ-4235)、ラルストーニャ・ユートロファ・ＴＢ64株(Ｒalstonia eutropha ＴＢ64,ＦＥＲＭ ＢＰ-6933)、アルカリゲネス属・ＴＬ２株(Ａlcaligenes sp.ＴＬ２,ＦＥＲＭ ＢＰ-6913)などを用いることができる。
【００３４】
なお、Ｐ91株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-7373として、Ｈ45株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-7374として、ＹＮ２株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-7375として、Ｐ161株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-7376として、ＯＫ３株は寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ-17370として、ＯＫ４株は寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ-17371として、ＫＫ01株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-4235として、ＴＢ64株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-6933として、ＴＬ２株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-6913として、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(経済産業省産業技術総合研究所(旧通商産業省工業技術院)生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター)に国際寄託されている。
【００３５】
また、前述のＰＨＡ生産菌の持つＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体を用いて、ＰＨＡ合成酵素を生産することも可能である。ＰＨＡ合成酵素遺伝子のクローニング、発現ベクターの作製、および、形質転換体の作製は、定法に従って行うことができる。
【００３６】
本発明のＰＨＡ合成酵素の生産に用いる微生物の培養方法としては、微生物が増殖可能であり、ＰＨＡ合成酵素が菌体内において発現されるものであれば、いかなる方法を用いても良い。また同様に培地組成に関しても上記条件を備えればいかなる種類を用いても良い。
【００３７】
具体的には、例えばオクタン酸やノナン酸等のアルカン酸を含み、リン源や窒素源などを含むＭ９等の無機培地と、さらにミネラル等の微量成分を添加した培地を用いて通気培養を行うことでＰＨＡ生産菌を増殖させ、ＰＨＡ合成酵素を生産することができる。
【００３８】
また、特に形質転換体等、ＰＨＡ生産菌が抗生物質耐性を有する場合には、対応する抗生物質を添加した培地を用いることでコンタミネーションを防止しながら培養を行うことも可能である。
【００３９】
また、形質転換体の発現ベクターにおいて、誘導性のプロモーターを用いている場合は、該プロモーターに対応する誘導物質を培地に添加してＰＨＡ合成酵素の発現を促しても良い。例えば、イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ),テトラサイクリン,インドールアクリル酸(ＩＡＡ)等が誘導物質として挙げられる。
【００４０】
培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば15〜40℃、好ましくは20〜35℃程度が適当である。
【００４１】
ＰＨＡ合成酵素の調製方法としては、まず上記ＰＨＡ生産菌を培養し、菌濃度の増大とＰＨＡ合成酵素の菌体内での蓄積を図った後、遠心分離機や濾過等によって培養液中から菌を回収し、次いでフレンチプレス,超音波破砕機,凍結融解法、リゾチームや各種界面活性剤等を用いて菌体を破砕して菌体内に蓄積されたＰＨＡ合成酵素の回収を行う。
【００４２】
使用するＰＨＡ合成酵素の形態としては、菌体破砕液そのものや、硫酸アンモニウム等によりタンパク質成分を沈殿・回収した硫安塩析物などの粗酵素を用いても良く、また、各種方法で精製した精製酵素を用いても良い。
【００４３】
ＰＨＡ合成酵素の精製方法は、ＰＨＡ合成酵素の酵素活性が保持される方法であればいかなる方法をも用いることができる。例えば、粗酵素について、アフィニティクロマトグラフィー,陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー,ゲル濾過等の手段を単独または適宜組み合わせることによって精製酵素を得ることができる。特に、遺伝子組換えタンパク質としてＰＨＡ合成酵素を発現する場合には、Ｎ末端やＣ末端にヒスチジン残基等の「タグ」を結合した融合タンパク質の形で発現させ、このタグを介して親和性樹脂に結合させることによって、より簡便に精製することができる。このような融合タンパク質には、ヒスチジンタグの他にグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ),キチン結合ドメイン(ＣＢＤ),マルトース結合タンパク(ＭＢＰ),あるいはチオレドキシン(ＴＲＸ)等がある。
【００４４】
融合タンパク質から目的のタンパク質を分離するには、トロンビン,血液凝固因子Ｘa等のプロテアーゼで切断する、pＨを低下せしめる、結合競合剤として高濃度のイミダゾールを添加する等の方法を用いると良い。あるいは、発現ベクターとしてpＴＹＢ１(Ｎeｗ Ｅnglan Ｂiolab社製)を用いた場合のようにタグがインテインを含む場合はdithiothreitolなどで還元条件にすることで切断を行う。
【００４５】
ＰＨＡ合成酵素には必要に応じて、金属塩,グリセリン,ジチオスレイトール,ＥＤＴＡ,ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、分子シャペロンなどの安定化剤,付活剤を適宜添加して用いることができる。
【００４６】
ＰＨＡ合成酵素の活性測定は、既報の各種方法を用いることができるが、例えば、３-ヒドロキシアシルＣoＡがＰＨＡ合成酵素の触媒作用により重合してＰＨＡになる過程で放出されるＣoＡを、５,５’-ジチオビス-(２-ニトロ安息香酸)で発色させて測定することを測定原理とする、以下に示す方法によって測定することができる。試薬１:ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)を0.1ｍol/Lトリス塩酸バッファー(pＨ8.0)に3.0ｍg/ｍl溶解、試薬２:３-ヒドロキシオクタノイルＣoＡを0.1ｍol/Lトリス塩酸バッファー(pＨ8.0)に3.0ｍｍol/L溶解、試薬３:トリクロロ酢酸を0.1ｍol/Lトリス塩酸バッファー(pＨ8.0)に10ｍg/ｍl溶解、試薬４:５,５’-ジチオビス-(２-ニトロ安息香酸)を0.1ｍol/Lトリス塩酸バッファー(pＨ8.0)に2.0ｍｍol/L溶解。第１反応(ＰＨＡ合成反応):試料(酵素)溶液100μlに試薬１を100μl添加して混合し、30℃で１分間プレインキュベートする。ここに、試薬２を100μl添加して混合し、30℃で１〜30分間インキュベートしたのち、試薬３を添加して反応を停止させる。第２反応(遊離ＣoＡの発色反応):反応停止した第１反応液を遠心分離(147kｍ/s2 (＝15,000×g)、10分間)し、この上清500μlに試薬４を500μl添加し、30℃で10分間インキュベートしたのち、412nｍの吸光度を測定する。酵素活性の算出:１分間に１μｍolのＣoＡを放出させる酵素量を１単位(Ｕ)とする。
【００４７】
＜基板に供給する溶液＞
本発明の第１の工程として、ＰＨＡ合成酵素と３-ヒドロキシアシルＣoＡを同時または別個に含有する溶液をインクジェット法等、各種溶液供給方法によって基板上に供給し、両者が共存する状態において目的とするパターン状に該溶液を付着させる工程が挙げられる。
【００４８】
本工程で使用する該溶液(以後、パターニング溶液と略す場合がある)としては、ＰＨＡ合成酵素と３-ヒドロキシアシルＣoＡが１つのパターニング溶液に含有される場合と、ＰＨＡ合成酵素と３-ヒドロキシアシルＣoＡが別々のパターニング溶液に含有される場合の大きく２種類に分けることができる。さらに３-ヒドロキシアシルＣoＡの種類などの組成の異なる複数のパターニング溶液を使用することができる。
【００４９】
パターニング溶液として、ＰＨＡ合成酵素と３-ヒドロキシアシルＣoＡが１つのパターニング溶液に含有される場合は、少なくとも一度の供給動作によって基板上においてＰＨＡ合成酵素と３-ヒドロキシアシルＣoＡを共存させることができる。また、パターニング溶液として、ＰＨＡ合成酵素と３-ヒドロキシアシルＣoＡが別々のパターニング溶液に含有される場合には、両溶液を少なくとも基板上で混合する必要がある。これらパターニング溶液の基板上への供給方法について詳しくは後述する。
【００５０】
パターニング溶液中のＰＨＡ合成酵素濃度や３-ヒドロキシアシルＣoＡ濃度は、ＰＨＡを合成する時間やパターニングするＰＨＡの膜厚に応じて適宜選択すればよいが、あまり高濃度であるとパターニング溶液の粘度が上昇して基板への供給が困難になるなどの支障が生じる恐れがあるため、例えばＰＨＡ合成酵素として、パターニング溶液１ｍlあたり10単位(Ｕ)から1,000単位(Ｕ)、望ましくは100単位(Ｕ)から500単位(Ｕ)の範囲内に設定すると良い。また、３-ヒドロキシアシルＣoＡとしては、通常、0.1ｍol/Lから２ｍol/L、好ましくは0.5ｍol/Lから１ｍol/Lの範囲内で設定すると良い。
【００５１】
その他パターニング溶液に構成しうる成分として、ＰＨＡ合成酵素の活性を阻害せず、かつ基板へのパターニング溶液の供給を妨げないものであればいかなるものも含有し得るが、特にＰＨＡ合成酵素の活性を安定に保持し、またＰＨＡ合成反応を好適に行うために、無機塩類、有機塩類等を含有させて各種緩衝作用のある溶液組成とすることが好ましい。
【００５２】
緩衝作用のある溶液組成としては、使用するＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得るものであれば、設定するpＨ領域等に応じて適宜選択して用いることができるが、例えば一般的な緩衝液である酢酸バッファー,リン酸バッファー,リン酸カリウムバッファー,３-(Ｎ-モルフォリノ)プロパンスルフォン酸(ＭＯＰＳ)バッファー,Ｎ-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-３-アミノプロパンスルフォン酸(ＴＡＰＳ)バッファー,トリス塩酸バッファー,グリシンバッファー,２-(シクロヘキシルアミノ)エタンスルフォン酸(ＣＨＥＳ)バッファーなどを用いることができる。
【００５３】
緩衝液の濃度も、使用するＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得るものであれば特に限定はされないが、通常5.0ｍｍol/Lから1.0ｍol/L、好ましくは0.1ｍol/Lから0.2ｍol/Lの濃度のものを使用すると良い。
【００５４】
緩衝液によって調整するpＨとしては、pＨ5.5からpＨ9.0、好ましくはpＨ7.0からpＨ8.5とするのが好ましいが、使用するＰＨＡ合成酵素性質によっては、これ以外の範囲に設定してもかまわない。
【００５５】
また、パターニング溶液に微生物などが混入する恐れのある場合には防腐剤等の微生物の生育を阻害する成分を添加することも好ましい。
【００５６】
また、基板に添加したパターニング溶液が合成反応中に蒸発・乾燥してしまうことを防ぐため、保湿剤等の蒸発防止作用のある成分を含有させることも好ましい。
【００５７】
また、インクジェット法のうち、サーマルインクジェット法においては吐出時に温度上昇をともなうため、ＰＨＡ合成酵素やモノマーの熱変性を防止するために、グリセリンなどの多価アルコール、オリゴ糖などを含有させることも好ましい。
【００５８】
前述のように、本発明では基板に供給するパターニング溶液は水溶液であり、その溶液中の組成物として高分子化合物を含んでいないため、インクジェット法による溶液の吐出動作が非常に好適になされるが、さらにインクジェットヘッドの吐出性能を十分に発揮できるように溶液の物性を調製することもより好ましい。例えば、サーマルインクジェット法においては、水溶性であるエタノール、イソプロピルアルコール、多価アルコールの低級アルキルエーテル類を添加することによって、インクジェットヘッドの吐出口内の薄膜抵抗体上での溶液の発泡をより安定に行うことができる。また、溶液の粘度として１〜20ｍＰa・s(cps)、表面張力として３ｍＮ/ｍ(＝30dyn/cｍ)以上に調整されていることが好ましい。また、粘度を１〜５ｍＰa・s(cps)、表面張力を３〜５ｍＮ/ｍ(＝30〜50dyn/cｍ)とした場合、基板上への溶液の吐出位置が極めて正確なものとなり、また溶液を吐出させて基板上に付着させたときのスポットの形状が円形で、また吐出された範囲が広がることがなく、精密にパターンを描画することができるため特に好ましい。本発明はインクジェット法による吐出溶液が水溶液であるため、上記物性の範囲に調整することは比較的容易に行い得る。
【００５９】
以上はインクジェット法を用いる場合の好適な吐出性を発揮するための溶液物性であるが、基板へのパターニング溶液の供給をインクジェット法で行わない場合や、インクジェット法を用いる場合であってもそれほど厳密なパターン精度を必要としないなどの場合には、本発明のパターニング溶液の特性を上記に限定するものではない。
【００６０】
＜基板＞
本発明に使用可能な基板としては、本発明におけるパターニング溶液が供給可能であり、かつそのパターニング溶液を基板に供給した後に、基板上に付着した溶液のパターンを維持することができること、並びにＰＨＡ合成酵素の反応を阻害するような物質を含有していないなど、ＰＨＡ合成酵素によるＰＨＡ合成反応を行うことが可能であればいかなる形状・材質のものでも良い。例えば供給したパターニング溶液が基板上から移動しないような形状もしくは材質であれば、基板の形状として特に平面状に限定されず、曲面、凹凸状など、いかなる形状でも良い。また、材質としても一般的な高分子化合物や無機系固形物、例えば、ガラス、樹脂、金属など、いかなる材質でも良く、また供給した溶液が基板内に浸透するような材質、例えば紙などを用いても良い。さらに化学的処理や物理的処理、放射線処理などの各種表面処理を施したり、ポリマー材料やシランカップリング剤などを塗布しても良い。
【００６１】
撥水性の基板を用いる場合には、基板の形状としては平面状が好ましく、さらに本発明のＰＨＡ合成までの工程において、基板を水平に設置しておくことが好ましい。
【００６２】
また、本発明の工程に入る前に、必要に応じて基板に殺菌処理を施しても良い。殺菌処理を行うことにより、特に長時間ＰＨＡ合成反応を行う場合に、溶液中で所望でない微生物などによりＰＨＡ合成酵素が分解されたり、モノマーが消費されたり、ＰＨＡ合成反応の阻害物質が生成したりすることを防ぐことができる。殺菌方法としては、基板の性質が変化しないものであればいかなるものでも良く、紫外線等の放射線照射や、アルコール等の殺菌剤で洗浄するなどによって行うことができる。
【００６３】
＜基板への溶液供給方法＞
本発明は前述のようにインクジェット法の吐出性能を阻害しないため、基板へのパターニング溶液の供給手段としてインクジェット法を非常に好適に用いることができるが、特にインクジェット法に限定されるわけではない。むしろ、基板に供給するパターニング溶液として水溶液を用いること、溶液中に高分子化合物を含有しないことから、本発明は他の溶液供給手段に対しても好適に適用することができる。
【００６４】
インクジェット法以外の溶液供給手段としては、パターニング溶液を基板に供給できるものであればどのような方法を用いても良いが、微細なパターンを形成することを目的とする場合には、例えばマイクロピペット、マイクロディスペンサーや、ピン方式、キャピラリー方式など、微量の溶液を供給できる方法を用いることができる。
【００６５】
ピン方式は試料を含む溶液の液面にピン先端を接触させてこれを付着させてから、その先端を基板へ機械的に接触させることにより試料溶液を基板上に供給する方法である。
【００６６】
キャピラリー方式は毛細管に試料溶液を吸い上げ、毛細管の先端から基板に機械的に接触させることにより試料溶液を基板上に供給する方法である。
【００６７】
基板へのパターニング溶液の供給方法として上述のような各種方法が選択し得るが、装置が安価に作製、入手でき、微量のパターニング溶液を基板上の任意の位置に容易に供給できる点でインクジェット法を特に好適に用いることができる。さらにインクジェット法の中でも、サーマルインクジェット式とピエゾインクジェット式を好適に用いることができる。サーマルインクジェット式は、加熱発泡により気泡を発生し、それを駆動力として液滴の吐出を行うもので、ピエゾインクジェット式は、圧電素子の変位により液滴の吐出を行うものである。
【００６８】
このようなインクジェット法においては、インクジェットヘッドを基板上の任意の位置に移動可能な駆動装置と、インクジェットヘッドからの流動体の吐出条件および駆動装置によるインクジェットヘッドの移動を制御する制御装置を通常有しており、基板上のパターン形体や液滴の付着量、付着回数などの情報を制御装置に付与すれば基板上にパターン状にパターニング溶液を供給することができる。
【００６９】
基板に供給するパターニング溶液の液量としては、基板に付着させた液滴の広がりが目的とするパターン描線の幅の範囲内に収まればいかなるものでもよい。ちなみにインクジェット法によって吐出できる液滴量としては、100pl以下に調整することが可能であり、パターンを高精度に描画することが可能である。
【００７０】
パターンを構成するＰＨＡの膜厚は、ＰＨＡ合成酵素や３-ヒドロキシアシルＣoＡの濃度を調製したり、パターン形成面の単位面積当たりにおける液滴の付着量を調整したりすることによって制御することができる。液滴の付着量を調整するには、パターン形成面の単位面積当たりにおける液滴の付着回数により制御したり、パターン形成面に付着させる液滴間のピッチにより制御したり、一回に付着させる液滴の量により制御するなどの方法を用いることができる。
【００７１】
また、一定のパターン形成面に付着させられる溶液量としては限界があるため、基板上にパターン状にＰＨＡを合成してから、乾燥によって残ったパターニング溶液を除いた後、再び同一パターン面にパターニング溶液を供給してＰＨＡを合成させること、またさらにそれを繰り返すことで、ＰＨＡパターン被膜の膜厚を増加することが可能である。
【００７２】
前述したように、パターニング溶液としてＰＨＡ合成酵素と３-ヒドロキシアシルＣoＡが１つのパターニング溶液に含有される場合は、少なくとも一度の供給動作によって基板上においてＰＨＡ合成酵素と３-ヒドロキシアシルＣoＡを共存させることができる。
【００７３】
しかし、酵素・基質混合溶液を調製した後、ＰＨＡ合成反応が進行する温度条件が整ってしまうと、該溶液を基板に添加する前に溶液中でＰＨＡが合成してしまい、インクジェット法による吐出の際にノズルが目詰まりするなど、本発明の効果が損なわれてしまう恐れがある。そこで酵素・基質混合溶液の調製から基板への供給までの間、溶液をＰＨＡ合成反応が進行する温度以下に冷却しておくことが好ましい。このような冷却温度としては、例えば０℃〜10℃、特に２℃〜５℃が好ましい。
【００７４】
また、パターニング溶液としてＰＨＡ合成酵素と３-ヒドロキシアシルＣoＡが別々のパターニング溶液に含有される場合には、両溶液をそれぞれ独立に基板上のパターン面に供給し、パターン面上おいて両溶液を混合することでＰＨＡ合成酵素と３-ヒドロキシアシルＣoＡを共存させる。この方法によれば、たとえ溶液を調製した後にＰＨＡ合成反応が進行する条件が整っても、ＰＨＡが合成される心配はない。そのため特に冷却等の方法をとる必要はないが、ＰＨＡ合成酵素の失活や溶液の微生物による汚染を抑えるため、前述の方法と同様に溶液を冷却しても良い。
【００７５】
ＰＨＡ合成酵素と３-ヒドロキシアシルＣoＡが別々のパターニング溶液に含有される場合に、各溶液をそれぞれ独立して基板上に供給する方法としては、例えばインクジェット法を用いる場合、各溶液を別々のインクタンクに注入し、各々別々のノズルを用いてどちらか一方の溶液を基板に供給した後に他の溶液を先の溶液が付着しているパターン面に重層する方法を用いることができる。またこの他にも基板に各溶液を同時に供給する方法、基板に供給する直前に２つの溶液を混合する方法など、いずれの方法を用いても良い。
【００７６】
また、異なる３-ヒドロキシアシルＣoＡ組成からなる、複数のパターニング溶液を各々パターン面に供給し、パターンの場所に応じて異なるモノマーユニットからなるＰＨＡから構成されるパターンを作製することもできる。
【００７７】
ここで、３-ヒドロキシアシルＣoＡの組成とは、化学構造の違いによる３-ヒドロキシアシルＣoＡの種類や、複数の３-ヒドロキシアシルＣoＡの種類の組み合わせ、またそれらの濃度に関する。
【００７８】
上記の異なる組成のパターニング溶液は、各々異なるパターン面上に供給してもよいし、また少なくとも一部の同一パターン面上に重層して供給しても良い。重層した場合、各溶液を混合する効果を得ることができ、さらに複数のモノマーユニット組成からなるＰＨＡを構成することが可能となる。
【００７９】
また上記の異なる組成のパターニング溶液の基板上への供給方法としては、例えばインクジェット法であれば複数のヘッドから各々独立して基板上に供給する方法を用いることが可能である。
【００８０】
また、前述のＰＨＡ被膜の膜厚を制御する場合のように、同一のパターン面上に複数回パターニング溶液を供給して、ＰＨＡの合成を繰り返す方法を用いる場合、溶液中の３-ヒドロキシアシルＣoＡの種類や濃度などの組成を供給回数ごとに変化させることによって、基板上に形成するＰＨＡ被膜のモノマーユニット組成が垂直方向に変化した多層構造を形成させることも可能である。
【００８１】
これによって、例えば基板との親和性が低いＰＨＡでパターンを形成する場合、まず基板と親和性の高いＰＨＡの基質となる３-ヒドロキシアシルＣoＡを用いてＰＨＡを形成した後、新たに供給する３-ヒドロキシアシルＣoＡの組成を、基板と親和性の高いＰＨＡの基質となる３-ヒドロキシアシルＣoＡと、最終的にパターン表面に露出したいＰＨＡの基質となる３-ヒドロキシアシルＣoＡとの混合組成とし、供給回数ごとに段階的に後者の３-ヒドロキシアシルＣoＡ濃度を高くしていくことで、基板との結合が強固であり、かつ所望のモノマーユニット組成のＰＨＡ被膜を有するパターンを形成することが可能となる。
【００８２】
＜ＰＨＡ合成反応＞
本発明の第２の工程として、第１の工程によってパターン状に付着させた溶液内でＰＨＡ合成反応を行わせる工程が挙げられる。
【００８３】
上記ＰＨＡ合成反応は、基板を適当な温度環境に保持することによって行うことができる。
【００８４】
ＰＨＡ合成反応の反応温度は、使用するＰＨＡ合成酵素の活性や活性保持時間等に応じて適宜設定すればよいが、通常、15℃から40℃、好ましくは20℃から35℃に設定すると良い。
【００８５】
反応時間は、作製するＰＨＡパターン被膜の厚さや使用するＰＨＡ合成酵素の安定性等にもよるが、１分間から３日間、通常は30分間から12時間の範囲内で適宜選択して設定する。
【００８６】
ＰＨＡ合成反応中、基板上に付着したパターニング溶液が蒸発しないように、また逆に結露を生じないように適当に管理された湿度環境下に保持することが好ましい＜。
【００８７】
合成されるＰＨＡは直径数nｍから数μｍの粒子状で、場合によっては凝集して塊状もしくはフロック状をなしており、パターニング溶液中に分散もしくは基板上に沈殿・堆積する。
【００８８】
＜後処理工程＞
ＰＨＡを合成した後、さらに各種後処理工程を行うことで、より好適なパターンとすることができる。
【００８９】
まず、基板上のパターニング溶液中でＰＨＡを合成した後、不要となったパターニング溶液を乾燥によって除去する。乾燥方法としては、合成したＰＨＡ及び基板が所望とする性質及び形状を損なわないような方法であればいかなる方法によってもよいが、例えばスピン乾燥機等の遠心分離によって水分を除く、あるいは、加熱や減圧、低湿度雰囲気下への放置、乾燥気体の噴射、吸水性材料との接触などの方法によって行えばよい。またこれらの乾燥方法を組み合わせて使用しても良い。
【００９０】
また乾燥後、さらにパターニング溶液中に存在した溶質成分を除去するために洗浄を行っても良い。洗浄方法としては、基板上に付着しているＰＨＡが基板から脱離しない方法であればいかなる方法によってもよい。例えば、水・緩衝液・メタノール等、パターンを形成しているＰＨＡが不溶である洗浄剤を基板上に添加する、もしくは洗浄剤の中に基板を浸漬するなどの方法を用いることができる。また、洗浄後は再び乾燥を行うことが好ましい。
【００９１】
上記乾燥工程を終了することによって基板上にＰＨＡパターンが形成されるが、このときパターン面では多数のＰＨＡ粒子が基板上に積層した状態になっている。そのため、パターン面の被覆性・遮蔽性をさらに向上させるために、熱処理によって基板上に積層したＰＨＡ粒子を融合させ、一体の被膜を形成させてもよい。このときの熱処理温度はＰＨＡのＴgによって異なるが、Ｔgの低い化学構造を選択することによって、例えば60〜80℃程度の比較的低温で効率よく処理することが可能である。また、前記乾燥工程を熱処理によって行う場合には、乾燥と被膜形成を同兼用してもよい。
【００９２】
前記乾燥工程によってＰＨＡをある程度の強度基板上に固定することができる。特にＰＨＡ及び基板が共に疎水的である場合には、疎水結合によって比較的強固に両者が固定されるため、新たに固定化処理を行うことは必ずしも必要ではないが、ＰＨＡや基板の種類、構造や用途によっては固定化処理を行っても良く、またそのような固定化処理を行うためにＰＨＡの化学構造を選択しても良い。
【００９３】
例えばＰＨＡのＴgを低くした場合には熱処理を行うことによって基板表面に融着させることができる。基板表面が帯電している場合には、逆の荷電を発現する官能基が導入されたＰＨＡを選択することでイオン吸着によって基板に固定化することが可能である。また、基板に帯電性がない場合には金属や無機酸化物微粒子、カチオン性高分子やアニオン性高分子など帯電可能な物質を基板に結合させてもよい。
【００９４】
＜化学修飾＞
上記後処理工程の前後にさらに必要に応じて化学修飾等の処理を施すことができる。これによってさらに有用な機能・特性を備えたＰＨＡパターンを得ることができる。
【００９５】
例えば、ＰＨＡにグラフト鎖を導入することにより、グラフト鎖に起因する各種の特性を備えたＰＨＡパターンとすることができる。また、ＰＨＡを架橋化することにより、ＰＨＡパターンの機械的強度、耐薬品性、耐熱性などを付与することが可能である。
【００９６】
化学修飾の方法としては、合成したＰＨＡ及び基板が所望とする性質及び形状を損なわないような方法であればいかなる方法によってもよいが、例えば、反応性官能基を側鎖に有するＰＨＡを合成し、該官能基の化学反応を利用して化学修飾する方法などを用いることができる。
【００９７】
前記の反応性官能基の種類としては、例えばエポキシ基などを例示することができる。エポキシ基を側鎖に有するＰＨＡは、通常のエポキシ基を有するポリマーと同様の化学的変換を行うことができるため、例えば水酸基に変換したり、スルホン基を導入することが可能である。また、チオールやアミンを有する化合物を付加することもでき、例えば、末端に反応性官能基を有する化合物、具体的には、エポキシ基との反応性が高いアミノ基を末端に有する化合物などを添加して反応させることにより、ＰＨＡのグラフト鎖が形成される。
【００９８】
アミノ基を末端に有する化合物としては、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、アミノ変性ポリシロキサン(アミノ変性シリコーンオイル)などのアミノ変性ポリマーを例示することができる。このうち、アミノ変性ポリシロキサンとしては、市販の変性シリコーンオイルを使用しても良く、また、Ｊ.Ａｍer. Ｃheｍ. Ｓoc.,78, 2278(1956)などに記載の方法で合成して使用することもできる。
【００９９】
また、エポキシ基を有するＰＨＡの化学的変換の他の例として、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミン化合物,無水コハク酸,２-エチル-４-メチルイミダゾール,電子線照射などによる架橋反応が挙げられる。
【０１００】
また、エポキシ基以外の反応性官能基の例としては、ビニル基を挙げることが出来る。ビニル基もチオールを有する種々の化合物を付加することができる。また、過マンガン酸カリウム等の酸化剤を用いてビニル基をカルボキシル基に変換することも出来る。さらにクロロ過安息香酸等を用いてビニル基をエポキシ基に変換することも出来る。さらに分子内架橋反応を施すこともできる。
【０１０１】
その他の反応性官能基としては、ブロモ基を挙げることができ、これもチオールを有する種々の化合物を付加するのに用いることが出来る。
【０１０２】
＜ＰＨＡの分解によるパターンの加工＞
基板上に作製したＰＨＡパターンの一部もしくは全部を分解し、基板から除去することも可能である。ＰＨＡの分解方法としては、例えばＰＨＡ溶解性の有機溶媒を用いて溶出させる方法、酸やアルカリを添加後加熱によって加水分解する方法、ＰＨＡ分解酵素による酵素的分解方法などがあるが、特にＰＨＡ分解酵素を用いた場合には、インクジェット法等、本発明でパターニング溶液を基板に添加する際に用い得る微小溶液供給方法を使用することによって、微小な領域においてＰＨＡパターンの分解が可能となる。
【０１０３】
これによって、例えばＰＨＡパターンにさらにネガ型の加工を施すことや、ＰＨＡパターンの修正などが可能となる。また、後述するように本発明のＰＨＡパターンは核酸やタンパク質を結合させることも可能であるが、この核酸やタンパク質に試料中の標的物質を捕捉させ、その後核酸やタンパク質が結合しているＰＨＡを分解することによって、標的物質を回収することなども可能となる。
【０１０４】
ＰＨＡ分解酵素としては、リパーゼ、エステラーゼ、ＰＨＡデポリメラーゼ等のエステル加水分解酵素を挙げることができる。これらＰＨＡ分解酵素は市販されているもの、もしくはＰＨＡを分解可能な細菌やカビなどの微生物から取得することが可能である。そのような微生物としては、例えば、アルカリゲネス(Ａlcaligenes)属、シュードモナス(Ｐseudoｍonas)属、コマモナス(Ｃoｍaｍonas)属、ロドバクター(Ｒhodobacter)属、ロドスビリルム(Ｒhodospirilluｍ)属、ズーグレア(Ｚoogloea)属、ペニシリウム(Ｐenicilliuｍ)属、リゾプス(Ｒizopus deleｍer)などの微生物が挙げられ、特にアルカリゲネス・フェカーリス(Ａlcaligenes faecalis)、コマモナス・アシドボランス(Ｃoｍaｍonas acidovorans)、シュードモナス・ピケッティイ(Ｐseudoｍonas picketii)、シュードモナス・レモイグネイ(Ｐseudoｍonas leｍoignei)、シュードモナス・テストステロニ(Ｐseudoｍonas testosteroni)、ペニシリウム・ピノフィラム(Ｐenicilliuｍ pinophiluｍ)などの生産するＰＨＡデポリメラーゼやリゾプス・デレマー(Ｒizopus deleｍer)の生産するリパーゼが知られている。
【０１０５】
但し、これらの酵素は基質特異性を有するので、分解対象のＰＨＡの種類に応じて適宜選択することが好ましい。
【０１０６】
ＰＨＡ分解酵素の調製方法としては、前述のＰＨＡ合成酵素の調製と同様に行うことができるが、菌体外に分泌する場合は培養上清から酵素を回収する。
【０１０７】
上記ＰＨＡの分解処理は、前述したＰＨＡの化学修飾前に行うことが好ましいが、化学修飾後にもＰＨＡの分解が可能であればこの限りではない。
【０１０８】
＜ＰＨＡパターンの分析方法＞
基板上のＰＨＡパターンの形状やＰＨＡ組成を確認する方法として、例えばガスクロマトグラフィー等による組成分析と電子顕微鏡等による形態観察とを組み合わせた方法や、ＰＨＡパターンの被膜を多層構造とした場合には、飛行時間型二次イオン質量分析装置(ＴＯＦ-ＳＩＭＳ)とイオンスパッタリング技術を用いて、各構成層のマススペクトルから構造を判定する方法などを用いることができる。
【０１０９】
しかし、さらに直接的かつ簡便な確認方法として、本発明者らが開発したナイルブルーＡ染色と蛍光顕微鏡観察とを組み合わせた方法を用いることもできる(特開2002-328093号公報)。すなわち、パターン形成後の基板を上記方法によって蛍光染色し、蛍光顕微鏡で所定の励起光下に観察することによって、基板上のＰＨＡパターンを蛍光を発する形状として確認することができる。使用した基板が上記方法で蛍光を発する性質を有するものでない限り、上記方法を本発明のＰＨＡパターンの形状評価に用いることができる。
【０１１０】
＜本発明によるＰＨＡパターンの応用例＞
本発明のパターン形成方法は、酵素などのセンサー素子、触媒素子や核酸、タンパク質などのプローブを微細領域に効果的に配置することによって構成されるセンサーチップ、反応チップ、検出アレイなどの作製方法として効果的に用いることができる。具体的には、本発明のＰＨＡの化学構造として例えばエポキシ基、ビニル基、ブロモ基、カルボキシル基等の反応性官能基を有する構造を選択できるため、そうした官能基と共有結合できる官能基、例えばアミノ基、チオール基等の官能基を表面に露出している酵素やそれら官能基を末端に導入した核酸プローブなどをＰＨＡ上に選択的に固定化でき、基板上にパターン状に酵素や核酸プローブ等を配置することが可能となる。また、ＰＨＡパターンへの核酸やタンパク質の配置手段としても、インクジェット法を効果的に使用することができる。
【０１１１】
また本発明のパターン形成方法は、ディスプレイやカラーフィルター等のマトリクスパターンやＤＮＡチップやプロテインチップなどのアレイパターン形成用ウェル、コンビナトリアルケミストリー等における微小反応容器や微細流路に使用される隔壁を作製する方法としても効果的に用いることができる。すなわち、基板上にパターニングされたＰＨＡを凸部として隔壁を形成することができる。また、基板上にある程度の面積で形成したパターン上に前述のＰＨＡ分解酵素を供給し、付着したＰＨＡ分解酵素がＰＨＡを分解することで凹部を形成し、それを上記の用途に用いることもできる。
【０１１２】
ディスプレイやカラーフィルター等で使用されるブラックマトリクスを形成する場合には、パターニング溶液中に黒色の染料や黒色の顔料を含有させることで遮光性のある隔壁を作製することも可能である。
【０１１３】
また、特開平11-187900号公報ではプローブアレイの作製において、プローブを含んだ溶液を配置する撥水性ウェルを基板上に形成し、それによってプローブ溶液の分注及び分離を確実なものとする方法を提案しているが、本発明によって作製するＰＨＡパターンも撥水性を付与することができるため、アレイパターン形成用ウェルとして効果的に使用することができる。
【０１１４】
なお、本発明のＰＨＡパターン及びその形成方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【実施例】
【０１１５】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下に述べる実施例は本発明の最良の実施形態の一例ではあるが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。なお、以下における「％」は特に標記した以外は重量基準である。
【０１１６】
＜参考例１＞  ＰＨＡ合成酵素の生産１
ＹＮ２株から定法に従ってＰＨＡ合成酵素遺伝子(ＹＮ２-Ｃ１)を取得し、ＧＳＴとの融合タンパク質発現用のプラスミドであるpＧＥＸ-６Ｐ-１(アマシャムファルマシア・バイオテク(株)製)の対応する部位に挿入した。このベクターを用いて大腸菌(ＪＭ109)を形質転換し、発現用形質転換株を取得した。なお、この形質転換株の取得方法に関しては、特開2003-011312号公報に示される方法と同様であり、詳細は該特許に記載されている。
【０１１７】
次に、得られた形質転換株をＬＢ-Ａｍp培地10ｍlで一晩プレ・カルチャーした後、その0.1ｍlを、10ｍlのＬＢ-Ａｍp培地に添加し、37℃、170 rpｍで３時間振とう培養した。その後ＩＰＴＧを添加(終濃度 １ｍｍol/L)し、37℃で４から12時間培養を続けた。
【０１１８】
培養液から菌株を集菌(78kｍ/s2 (＝8,000×g),２分、４℃)し、１/10量の４℃リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ；８g ＮaＣl,1.44g Ｎa2ＨＰＯ4,0.24g ＫＨ2ＰＯ4,0.2g ＫＣl, 1,000ｍl精製水)に再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心(78kｍ/s2 (＝8,000×g),10分、４℃)して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ-ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロース４Ｂ(アマシャムファルマシア・バイオテク(株)製)で精製した。使用するグルタチオン・セファロースは、同量のＰＢＳで３回洗浄(78kｍ/s2 (＝8,000×g)、１分、４℃)した後、４％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、１/２量のＰＢＳに再懸濁した。このグルタチオン・セファロース 40μlを、無細胞抽出液１ｍlに添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質をグルタチオン・セファロースに吸着させた。吸着後、遠心(78kｍ/s2 (＝8,000×g)、１分、４℃)してグルタチオン・セファロースを回収し、400μlのＰＢＳで３回洗浄した。その後、10ｍｍol/Lグルタチオン40μlを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心(78kｍ/s2 (＝8,000×g)、２分、４℃)して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、シングルバンドを確認した。
【０１１９】
このＧＳＴ融合タンパク質500μgをＰreＳcissionプロテアーゼ(アマシャムファルマシア・バイオテク(株)製、５Ｕ)で消化した後、グルタチオン・セファロースに通してプロテアーゼとＧＳＴとを除去した。フロースルー分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ200カラムにかけ、ＰＨＡ合成酵素の最終精製物を得た。さらに該酵素を生体溶液試料濃縮剤(みずぶとりくんＡＢ-1100、アトー(株)製)を用いて濃縮し、10Ｕ/ｍlの精製酵素溶液を得た。
【０１２０】
＜参考例２＞  ＰＨＡ合成酵素の生産２
Ｐ91株、Ｈ45株、ＹＮ２株またはＰ161株を、酵母エキス(Ｄifco社製)0.5％、オクタン酸0.1％とを含むＭ９培地200ｍlに植菌して、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離(98kｍ/s2 (＝10,000×g)、４℃、10分間)によって回収し、0.1ｍol/Lトリス塩酸バッファー(pＨ8.0)200ｍlに再懸濁して再度遠心分離することによって洗浄した。菌体を0.1ｍol/Lトリス塩酸バッファー(pＨ8.0)2.0ｍlに再懸濁し、超音波破砕機にて破砕したのち、遠心分離(118kｍ/s2 (＝12,000×g)、４℃、10分間)して上清を回収して粗酵素を得た。
【０１２１】
さらに該酵素にライホゲルを添加して限外濾過濃縮し、10Ｕ/ｍlの粗酵素溶液を得た。
【０１２２】
＜参考例３＞ＰＨＢ合成酵素の生産
ＫＫ01、ＴＢ64株及びＴＬ２株を、酵母エキス0.5％、ミネラル溶液(下記参照)0.3％を含有したＭ９培地(下記組成)10リットルで30℃、24時間培養し、回収した培養液を４℃、78kｍ/s2 (＝8,000×g)で10分間遠心処理し、上清を取り除いた後、菌体ペレットを４℃のＰＢＳ溶液500ｍlに再懸濁した。この菌液をあらかじめ４℃に冷却しておいたベッセルに各回40ｍlずつ注入し、フレンチプレスによって216ＭＰa(＝2200kg/cｍ2)に加圧しながら少しずつノズルから菌液を解放することで菌体破砕処理を行った。得られた菌体破砕液を４℃、78kｍ/s2 (＝8,000×g)で10分間遠心処理した後、上清を回収した。この上清を0.45μｍのフィルターで濾過し、固形夾雑物を取り除いて粗酵素を得た。
【０１２３】
さらに該酵素にライホゲルを添加して限外濾過濃縮し、10Ｕ/ｍlの粗酵素溶液を得た。
【０１２４】
[Ｍ９培地]
Ｎa2ＨＰＯ4:6.2g、ＫＨ2ＨＰＯ4:3.0g、ＮaＣl:0.5g、ＮＨ4Ｃl:1.0g(培地１リットル中、pＨ7.0)。
【０１２５】
[ミネラル溶液]
ニトリロ三酢酸:1.5g、ＭgＳＯ4:3.0g、ＭnＳＯ4:0.5g、ＮaＣl:1.0g、ＦeＳＯ4:0.1g、ＣaＣl2:0.1g、ＣoＣl2:0.1g、ＺnＳＯ4:0.1g、ＣuＳＯ4:0.1g、ＡlＫ(ＳＯ4)2:0.1g、Ｈ3ＢＯ3:0.1g、Ｎa2ＭoＯ4:0.1g、ＮiＣl2:0.1g(１リットル中、pＨ7.0)。
【０１２６】
＜実施例１＞
本実施例において、本発明によるＰＨＡパターンの作製を検討した。
【０１２７】
0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)10ｍlに、参考例１で調製した形質転換株由来のＰＨＡ合成酵素(10Ｕ/ｍl)２ｍl、(Ｒ)-３-ヒドロキシオクタノイルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250, 432-439(1997)に記載の方法で調製)８g、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1gを添加・混合し、ただちに４℃に冷却した。この溶液の表面張力は３〜５ｍＮ/ｍ(＝30〜50dyn/cｍ)の範囲内であり、また粘度は２〜３ｍＰa・s(cps)の範囲内であった。
【０１２８】
また、厚さ１ｍｍ、縦横30ｍｍ×30ｍｍのガラス基板を蒸留水で洗浄後乾燥し、ＵＶランプを用いて殺菌した。
【０１２９】
次に、サーマルインクジェット式によるインクジェットプリンターであるバブルジェットプリンター(商品名:ＢＪＣ-620；キヤノン(株)社製)のインクカートリッジを0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)で洗浄し、先に調製した溶液を充填し、同プリンターのバブルジェットヘッドに装着した。次いで温度４℃、湿度90％に調整された恒温恒湿器内にプリンターを設置し、このプリンターにガラス基板を装着し、溶液をガラス基板上に波線状に吐出した。描画パターンはプリンターを接続したパーソナルコンピューターにより制御した。なお、ここで用いたバブルジェットプリンターは平板への印刷が可能な様に改造を施したものである。１吐出動作あたりの溶液の吐出量は約20pl、描線の幅は約80μｍであった。
【０１３０】
吐出終了後、ただちにガラス基板を温度30℃、湿度90％に調整された恒温恒湿器内に移し、24時間静置してＰＨＡの合成を行った。
【０１３１】
この基板を室温で乾燥した後、蒸留水で洗浄し、スピン乾燥機で基板表面に付着した洗浄水を除去した後、再び室温で乾燥した。
【０１３２】
以上のようにしてガラス基板上にＰＨＡパターンを作製した。
【０１３３】
この基板表面に形成されたＰＨＡパターンを観察するため、基板表面に１％ナイルブルーＡ水溶液50μlを添加し、カバーグラスをかけて蛍光顕微鏡(330〜380nｍ励起フィルター、420nｍロングパス吸収フィルター、(株)ニコン製)により観察を行ったところ、線幅約70μｍのパターンが設計通り描かれていることが確認された。さらに高倍率で観察したところ、数μｍ程度の粒子がパターン面上に積層している様子が確認された。
【０１３４】
次に同様にパターニングした別の基板を60℃の乾熱器に１時間設置し、蒸留水で洗浄し、スピン乾燥機で基板表面に付着した洗浄水を除去した後、再び60℃で１時間乾燥した。
【０１３５】
この基板を前述と同様に１％ナイルブルーＡ水溶液で染色し、蛍光顕微鏡で観察したところ、パターン面のＰＨＡ粒子が融着し、一体化した被膜を形成している様子が確認できた。
【０１３６】
この基板上のＰＨＡパターンの膜厚を光干渉式膜厚計(Ｋ-ＭＡＣ社製)により測定したところ、平均約1.2μｍであった。
【０１３７】
次に、先に調製した溶液をこの基板の同じパターン上に供給し、同様にＰＨＡの合成を行った。60℃で１時間乾燥し、蒸留水で洗浄した後、スピン乾燥機で基板表面に付着した洗浄水を除去し、再び60℃で１時間乾燥した。
【０１３８】
乾燥後、上記各工程をさらに８回繰り返し、ガラス基板上にＰＨＡパターンを合計10回重層した。
【０１３９】
この基板を前述と同様に１％ナイルブルーＡ水溶液で染色し、蛍光顕微鏡で観察したところ、線幅約90μｍのパターンが設計通り描かれていることが確認された。
【０１４０】
この基板上のＰＨＡパターンの膜厚を同様に光干渉式膜厚計により測定したところ、平均約10.3μｍであった。
【０１４１】
さらに、同様にパターニングした別の基板を密閉容器内で一定容量のクロロホルムに浸漬し、35℃で20時間振とうして基板上のＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥＩ法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、３-ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。
【０１４２】
また、ＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬgel ＭＩＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒；クロロホルム、カラム温度；40℃、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝25,000であった。
【０１４３】
以上、本発明の方法により、サーマルインクジェット式によるインクジェットプリンターを用いて簡便かつ設計とおりにＰＨＡ微細パターンを作製できることが確認された。
【０１４４】
また、同一パターン面に繰り返しＰＨＡを重層することで、パターン面のＰＨＡ被膜の膜厚を制御できることがわかった。
【０１４５】
＜実施例２＞
本実施例では、異なる菌株由来のＰＨＡ合成酵素によるＰＨＡパターンの作製を検討した。
【０１４６】
参考例２で調製したＹＮ２株株由来のＰＨＡ合成酵素(10Ｕ/ｍl)２ｍlと(Ｒ)-３-ヒドロキシオクタノイルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250, 432-439(1997)に記載の方法で調製)８g、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1gを0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)10ｍlに添加・混合し、ただちに４℃に冷却した。
【０１４７】
また参考例２で調製したＰ91株、Ｈ45株、Ｐ161株由来の各ＰＨＡ合成酵素(10Ｕ/ｍl)についてもそれぞれ同様に調製し、４℃に冷却した。
【０１４８】
これら溶液の表面張力は３〜５ｍＮ/ｍ(＝30〜50dyn/cｍ)の範囲内であり、また粘度は２〜３ｍＰa・s(cps)の範囲内であった。
【０１４９】
次に実施例１と同様にバブルジェットプリンターによって上記各溶液をガラス基板上に波線状に吐出した。１吐出動作あたりの溶液の吐出量は約20pl、描線の幅は約80μｍであった。
【０１５０】
吐出終了後、ただちに各ガラス基板を温度30℃、湿度90％に調整された恒温恒湿器内に移し、24時間静置してＰＨＡの合成を行った。
【０１５１】
この基板を室温で乾燥した後、蒸留水で洗浄し、スピン乾燥機で基板表面に付着した洗浄水を除去した後、再び室温で乾燥した。
【０１５２】
以上のようにしてガラス基板上にＰＨＡパターンを作製した。
【０１５３】
この基板表面に形成されたＰＨＡパターンを観察するため、実施例１と同様に基板をナイルブルーＡ水溶液で染色し、蛍光顕微鏡により観察を行ったところ、線幅約70μｍのパターンが設計通り描かれていることが確認された。
【０１５４】
さらに、各々同様に作製した別の基板を用いて実施例１と同様に基板上のＰＨＡを抽出し、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、いずれも３-ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。
【０１５５】
さらに、ＰＨＡの分子量を実施例１と同様にゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより評価した結果、いずれもＭn＝22,000〜28,000の範囲内であった。
【０１５６】
以上、異なる菌株から取得したＰＨＡ合成酵素を用いても、本発明の方法により同様にしてＰＨＡの微細パターンが作製できることが確認された。
【０１５７】
＜実施例３＞
本実施例では、ＰＨＢ合成酵素によるＰＨＡパターンの作製を検討した。
【０１５８】
参考例３で調製したＫＫ01株由来のＰＨＢ合成酵素(10Ｕ/ｍl)２ｍlと(Ｒ)-３-ヒドロキシブチリルＣoＡ(Ｓigｍa社製)８g、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1gを0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)10ｍlに添加・混合し、ただちに４℃に冷却した。
【０１５９】
また参考例３で調製したＴＢ64株、ＴＬ２株由来のＰＨＢ合成酵素についてもそれぞれ同様に調製し、４℃に冷却した。
【０１６０】
これら溶液の表面張力は３〜５ｍＮ/ｍ(＝30〜50dyn/cｍ)の範囲内であり、また粘度は２〜３ｍＰa・s(cps)の範囲内であった。
【０１６１】
次に実施例１と同様にバブルジェットプリンターによって上記各溶液をガラス基板上に波線状に吐出した。１吐出動作あたりの溶液の吐出量は約20pl、描線の幅は約80μｍであった。
【０１６２】
吐出終了後、ただちに各ガラス基板を温度30℃、湿度90％に調整された恒温恒湿器内に移し、24時間静置してＰＨＡの合成を行った。
【０１６３】
この基板を室温で乾燥した後、蒸留水で洗浄し、スピン乾燥機で基板表面に付着した洗浄水を除去した後、再び室温で乾燥した。
【０１６４】
以上のようにしてガラス基板上にＰＨＡパターンを作製した。
【０１６５】
この基板表面に形成されたＰＨＡパターンを観察するため、実施例１と同様に基板をナイルブルーＡ水溶液で染色し、蛍光顕微鏡により観察を行ったところ、線幅約70μｍのパターンが設計通り描かれていることが確認された。
【０１６６】
さらに、各々同様に作製した別の基板を用いて実施例１と同様に基板上のＰＨＡを抽出し、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、３-ヒドロキシ酪酸ユニットからなるＰＨＢであることが確認された。
【０１６７】
さらに、このＰＨＢの分子量を実施例１と同様にゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより評価した結果、Ｍn＝69,000であった。
【０１６８】
以上、本発明によりＰＨＢの微細パターンが作製できることが確認された。
【０１６９】
また、異なる菌株から取得したＰＨＢ合成酵素を用いても、同様にＰＨＢパターンが作製できることが確認された。
【０１７０】
＜実施例４＞
本実施例では、ピエゾインクジェット式プリンターによるＰＨＡパターンの作製を検討した。
【０１７１】
実施例１と同様にして、0.1ｍol/Lリン酸緩衝液10ｍlにＰＨＡ合成酵素溶液(10Ｕ/ｍl)２ｍl、(Ｒ)-３-ヒドロキシオクタノイルＣoＡ ８g、ウシ血清アルブミン0.1gを添加・混合し、ただちに４℃に冷却した。この溶液の表面張力は３〜５ｍＮ/ｍ(＝30〜50dyn/cｍ)の範囲内であり、また粘度は２〜３ｍＰa・s(cps)の範囲内であった。
【０１７２】
次に、ピエゾインクジェット式インクジェットプリンター(商品名:ＰＭ-900Ｃ；セイコーエプソン社製)のインクカートリッジを0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)で洗浄し、調製した溶液を充填し、同プリンターのインクジェットヘッドに装着した。次いで温度４℃、湿度90％に調整された恒温恒湿器内にプリンターを設置し、このプリンターに紫外線照射によって滅菌した普通紙を装着し、溶液を波線状に吐出した。描画パターンはプリンターを接続したパーソナルコンピューターにより制御した。１吐出動作あたりの溶液の吐出量は約25pl、描線の幅は約100μｍであった。
【０１７３】
吐出終了後、ただちに溶液を吐出した紙を温度30℃、湿度90％に調整された恒温恒湿器内に移し、24時間静置してＰＨＡの合成を行い、60℃にて１時間乾燥した。
【０１７４】
以上のようにして紙上にＰＨＡパターンを作製した。
【０１７５】
この紙に形成されたＰＨＡパターンを観察するため、実施例１と同様にパターンを形成した部分をナイルブルーＡ水溶液で染色し、蛍光顕微鏡により観察を行ったところ、線幅約90μｍのパターンが設計通り描かれていることが確認された。
【０１７６】
さらに、同様に作製した別の紙を用いて実施例１と同様に紙上のＰＨＡを抽出し、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、３-ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。
【０１７７】
さらに、ＰＨＡの分子量を実施例１と同様にゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより評価した結果、Ｍn＝28,000であった。
【０１７８】
以上、ピエゾインクジェット式によるインクジェットプリンターを用いても、本発明の方法により同様にしてＰＨＡの微細パターンが作製できることが確認された。また、紙に対してもＰＨＡパターンを形成できることが確認された。
【０１７９】
＜実施例５＞
本実施例では、ＰＨＡ合成酵素と３-ヒドロキシアシルＣoＡを独立して供給する方法によるＰＨＡパターン作製を検討した。
【０１８０】
0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)10ｍlに参考例１で調製した形質転換株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10Ｕ/ｍl)２ｍlを添加・混合した溶液(1)、0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)10ｍlに(Ｒ)-３-ヒドロキシオクタノイルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250, 432-439(1997)に記載の方法で調製)８g、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1gを添加・混合した溶液(2)、0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)10ｍlに(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-フェニルバレリルＣoＡ(Ｒeforｍatsky反応により得られた３-ヒドロキシフェニル吉草酸エステルを加水分解して３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸を得たのち、Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250, 432-439(1997)に記載の方法で調製)８g、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1gを添加・混合した溶液(3)、0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)10ｍlに(Ｒ,Ｓ)-３-ヒドロキシ-５-フェノキシバレリルＣoＡ(３-フェノキシプロパナールとブロモ酢酸エチルとのＲeforｍatsky反応で得られた３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸エステルを加水分解して３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸を得たのち、Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250, 432-439(1997)に記載の方法で調製)８g、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1gを添加・混合した溶液(4)を各々調製し、それぞれ0.22μｍの滅菌フィルターで濾過した後、室温に保存した。なお、これらの溶液は24時間以内に使用した。また、これら４種類の溶液の表面張力は３〜５ｍＮ/ｍ(＝30〜50dyn/cｍ)の範囲内であり、粘度は１〜３ｍＰa・s(cps)の範囲内であった。
【０１８１】
次に、実施例１で用いたバブルジェットプリンターの４つのインクカートリッジを0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)で洗浄し、調製した４種類の溶液を充填し、同プリンターのバブルジェットヘッドに装着した。次いで温度30℃、湿度90％に調整された恒温恒湿器内にプリンターを設置し、このプリンターに実施例１と同様に調製したガラス基板を装着し、まず(2)(3)(4)の３種類の溶液を波線状に吐出した。
【０１８２】
続いて(2)(3)(4)の溶液で描画した各パターン上に(1)の溶液を供給し、(2)と(1)、(3)と(1)、(4)と(1)の溶液を混合した。
【０１８３】
ここで、各溶液の１吐出動作あたりの溶液の吐出量は約20pl、描線の幅は約80μｍであった。
【０１８４】
吐出終了後、そのまま24時間静置してＰＨＡの合成を行った。
【０１８５】
この基板を60℃で１時間乾燥した後、蒸留水で洗浄し、スピン乾燥機で基板表面に付着した洗浄水を除去した後、再び60℃で１時間乾燥した。
【０１８６】
以上のようにしてガラス基板上にＰＨＡパターンを作製した。
【０１８７】
各基板に形成されたＰＨＡパターンを観察するため、実施例１と同様に基板をナイルブルーＡ水溶液で染色し、蛍光顕微鏡により観察を行ったところ、各基板ともパターンが設計通り描かれていることが確認された。
【０１８８】
さらに、各々同様にパターニングした別の基板を用いて実施例１と同様に基板上のＰＨＡを抽出し、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、(2)と(1)の溶液を用いて作製されたパターンのＰＨＡは３-ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡであることが、(3)と(1)の溶液を用いて作製されたパターンのＰＨＡは３-ヒドロキシフェニル吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることが、(4)と(1)の溶液を用いて作製されたパターンのＰＨＡは３-ヒドロキシフェノキシ吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。
【０１８９】
さらに、各ＰＨＡの分子量を実施例１と同様にゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより評価した結果、３-ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡはＭn＝25,000、３-ヒドロキシフェニル吉草酸ユニットからなるＰＨＡはＭn＝72,000、３-ヒドロキシフェノキシ吉草酸ユニットからなるＰＨＡはＭn＝46,000であった。
【０１９０】
以上、３-ヒドロキシアシルＣoＡの組成を変えることによって、異なるモノマーユニット組成からなるＰＨＡパターンを同一基板上に同時に作製できることが確認された。
【０１９１】
また、ＰＨＡ合成酵素と３-ヒドロキシアシルＣoＡを別々に含有する溶液を用いることで、室温でもＰＨＡパターンを製造できることが確認された。
【０１９２】
＜実施例６＞
本実施例では、本発明のパターン形成方法によるマトリクスの作製を検討した。
【０１９３】
0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)10ｍlに参考例１で調製した形質転換株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10Ｕ/ｍl)２ｍl、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-フェニルバレリルＣoＡ(Ｒeforｍatsky反応により得られた３-ヒドロキシフェニル吉草酸エステルを加水分解して３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸を得たのち、Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250, 432-439(1997)に記載の方法で調製)８g、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1g、黒色の水溶性インク(Ｃ.I.フードブラック２)１ｍlを添加・混合し、ただちに４℃に冷却した。
【０１９４】
この溶液の表面張力は３〜５ｍＮ/ｍ(＝30〜50dyn/cｍ)の範囲内であり、また粘度は２〜３ｍＰa・s(cps)の範囲内であった。
【０１９５】
次に実施例１と同様にバブルジェットプリンターによって上記各溶液をガラス基板上に、縦横の描線の間隔が240μｍの格子状のパターンとして吐出した。１吐出動作あたりの溶液の吐出量は約20pl、描線の幅は約80μｍであった。
【０１９６】
吐出終了後、ただちにガラス基板を温度30℃、湿度90％に調整された恒温恒湿器内に移し、24時間静置してＰＨＡの合成を行った。
【０１９７】
この基板を60℃で１時間乾燥した後、蒸留水で洗浄し、スピン乾燥機で基板表面に付着した洗浄水を除去した後、再び60℃で１時間乾燥した。
【０１９８】
乾燥後、再び先に調製した溶液を同じガラス基板の同じパターン上に供給し、同様にＰＨＡの合成を行った後、乾燥と洗浄を行った。
【０１９９】
乾燥後、上記各工程をさらに５回繰り返し、ガラス基板上にＰＨＡパターンを作製した。
【０２００】
この基板表面に形成されたＰＨＡパターンを観察するため、光学顕微鏡で観察を行ったところ、線幅約70μｍの黒色のマトリクスが設計通り作製されていることが確認された。また、実施例１と同様に基板をナイルブルーＡ水溶液で染色し、蛍光顕微鏡により観察を行ったところ、マトリクス部分が蛍光を発することが確認された。
【０２０１】
さらに、同様にパターニングした別の基板を用いて実施例１と同様に基板上のＰＨＡを抽出し、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、３-ヒドロキシフェニル吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。
【０２０２】
さらに、ＰＨＡの分子量を実施例１と同様にゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより評価した結果、Ｍn＝74,000であった。
【０２０３】
次にバブルジェットプリンター(商品名:ＢＪＣ-620:キヤノン(株)社製)を用いて、同様にパターニングした別の基板のマトリクス内(ウェル)に10μｍol/LのローダミンＢ水溶液をひとつおきに供給した。１ウェルあたりの供給量は約60plとした。またこのプリンターの吐出位置決め精度は±2.5μｍであった。
【０２０４】
この基板を蛍光顕微鏡を用いて観察したところ、一つおきのウェルに蛍光が確認され、また隣接する格子内及び格子上には蛍光は観察されなかった。
【０２０５】
以上、本発明の方法により、マトリクスを作製できることが確認された。また、該マトリクスを、水溶液を分離して貯留できるウェルとして使用できることがわかった。
【０２０６】
＜実施例７＞
本実施例では、本発明により作製したマトリクスにＤＮＡプローブを配置し、ＤＮＡアレイを作製することを検討した。
【０２０７】
0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)10ｍlに参考例１で調製した形質転換株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10Ｕ/ｍl)２ｍl、(Ｒ,Ｓ)-３-ヒドロキシ-７,８-エポキシオクタノイルＣoＡ(Int.Ｊ.Ｂiol.Ｍacroｍol.,12, 85-91(1990)に記載の方法で合成した３-ヒドロキシ-７-オクテン酸の不飽和部分を３-クロロ安息香酸でエポキシ化したのち、Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250, 432-439(1997)に記載の方法で調製)８g、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1gを添加・混合し、ただちに４℃に冷却した。
【０２０８】
この溶液の表面張力は３〜５ｍＮ/ｍ(＝30〜50dyn/cｍ)の範囲内であり、また粘度は２〜３ｍＰa・s(cps)の範囲内であった。
【０２０９】
次に実施例１と同様にバブルジェットプリンターによって上記各溶液を実施例１と同様に調製したガラス基板上の縦横10ｍｍ×10ｍｍの領域に吐出した。
【０２１０】
吐出終了後、ただちにガラス基板を温度30℃、湿度90％に調整された恒温恒湿器内に移し、24時間静置してＰＨＡの合成を行った。
【０２１１】
この基板を60℃で１時間乾燥した後、蒸留水で洗浄し、スピン乾燥機で基板表面に付着した洗浄水を除去した後、再び60℃で１時間乾燥した。
【０２１２】
乾燥後、再び先に調製した溶液を同じガラス基板の同じ領域に供給し、同様にＰＨＡの合成を行った後、乾燥と洗浄を行った。
【０２１３】
乾燥後、上記各工程をさらに３回繰り返し、ガラス基板上にＰＨＡ被膜を作製した。
【０２１４】
次にこの基板を密閉容器内で一定容量のクロロホルムに浸漬し、35℃で20時間振とうして基板上のＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過した後、真空乾燥によってＰＨＡを回収した。回収したＰＨＡの1Ｈ-ＮＭＲ分析を実施例１と同様に行った結果、３-ヒドロキシ-７,８-エポキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。
【０２１５】
さらに、該ＰＨＡの分子量を実施例１と同様にゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより評価した結果、Ｍn＝27,000であった。
【０２１６】
次に同様に作製した別のガラス基板のＰＨＡパターン上に、実施例６で作製した吐出溶液を、実施例６と同様に縦横の描線の間隔が240μｍの格子状のパターンとして吐出した。１吐出動作あたりの溶液の吐出量は約20pl、描線の幅は約80μｍであった。
【０２１７】
吐出終了後、ただちにガラス基板を温度30℃、湿度90％に調整された恒温恒湿器内に移し、24時間静置してＰＨＡの合成を行った。
【０２１８】
この基板を60℃で１時間乾燥した後、蒸留水で洗浄し、スピン乾燥機で基板表面に付着した洗浄水を除去した後、再び60℃で１時間乾燥した。
【０２１９】
乾燥後、再び先に調製した溶液を同じガラス基板の同じパターン上に供給し、同様にＰＨＡの合成を行った後、乾燥と洗浄を行った。
【０２２０】
乾燥後、上記各工程をさらに５回繰り返し、ガラス基板上にＰＨＡパターンを作製した。
【０２２１】
この基板表面に形成されたＰＨＡパターンを観察するため、光学顕微鏡で観察を行ったところ、線幅約70μｍの黒色のマトリクスパターンが設計通り描かれていることが確認された。
【０２２２】
以上により、ウェル底部がエポキシ基を提示したＰＨＡからなるマトリクスを作製できた。
【０２２３】
次にＤＮＡプローブとして５’末端の水酸基にリン酸基とヘキサメチレンを介してアミノ基を結合した下記に示す18量体のオリゴマー(日本製粉株式会社製)を用意した。
【０２２４】
５'ＮＨ2-(ＣＨ2)６-Ｏ-ＰＯ2-Ｏ-ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３'
また、上記ＤＮＡプローブに対して完全相補的な一本鎖ＤＮＡを合成した。次に50ｍｍol/LのＮaＣlを含むＴＥ溶液(pＨ８)に、ＤＮＡプローブ及び一本鎖ＤＮＡを終濃度100μｍol/Lとなるように溶解し、90℃から25℃まで２時間かけて降温し、ＤＮＡプローブと一本鎖核酸とのハイブリッドを形成させた。次にグリセリン7.5％、尿素7.5％、チオジグリコール7.5％、アセチレンアルコール１％を含む水溶液に上記ハイブリッドを終濃度８μｍol/Lとなるように加えた。
【０２２５】
この溶液の表面張力は３〜５ｍＮ/ｍ(＝30〜50dyn/cｍ)の範囲内であり、また粘度は２〜３ｍＰa・s(cps)の範囲内であった。
【０２２６】
次にバブルジェットプリンター(商品名:ＢＪＣ-620:キヤノン(株)社製)を用いて、先に作製したマトリクスのウェル内に上記ハイブリッド溶液をひとつおきに供給した。１ウェルあたりの供給量は約60plとした。またこのプリンターの吐出位置決め精度は±2.5μｍであった。
【０２２７】
この基板を25℃、湿度90％の恒温恒湿器内に12時間置き、プローブのアミノ基とウェル底部のエポキシ基とを反応させた後、この基板を80℃の純水で洗浄し、プローブとハイブリッドを形成している相補鎖をプローブから解離させ、洗い流した。次いで基板を１％エタノールアミン水溶液で室温下で１時間処理した。これによって各ウェル内の未反応のエポキシ基は開環して水酸基となり、ウェルの底部は親水性となった。最後に基板を純水で洗浄し、スピン乾燥機で表面の洗浄液を除去した。以上により、ＤＮＡプローブをウェルに固定化した。
【０２２８】
次にこのＤＮＡプローブに対する完全相補性の一本鎖ＤＮＡを50ｍｍol/LのＮaＣlを含むＴＥ溶液(pＨ８)に終濃度10μｍol/Lとなるように溶解し、この溶液にガラス基板を浸漬し、80℃から25℃まで２時間かけて降温しハイブリタイゼーション反応を行なった。次いで20℃で10ｍｍol/LのＮaＣlを含むＴＥ緩衝液(pＨ８)で基板を洗浄したのちスピン乾燥機で表面の洗浄液を除去した。
【０２２９】
さらに50ｍｍol/LのＮaＣlを含むＴＥ溶液(pＨ8.0)に、二本鎖核酸にインターカレートして蛍光を発する２-メチル-４、６-ビス(４-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノフェニル)ピリリウムアイオタイドを終濃度10μｍol/Lとなるように調製した。
【０２３０】
この溶液をバブルジェットプリンター(商品名:ＢＪＣ-620:キヤノン(株)社製)を用いて、先の基板の全てのウェルに約60plずつ供給したのち、湿度90％の恒温恒湿器内に５分間静置後、蛍光顕微鏡によって観察した。その結果、ＤＮＡプローブを固定したウェルのみ蛍光が確認された。
【０２３１】
以上より、本発明によって作製したマトリクスパターンにＤＮＡプローブを配置できることが確認された。
【０２３２】
＜実施例８＞タンパク質アレイ作製
本実施例では、本発明により作製したマトリクスにタンパク質を配置することを検討した。
【０２３３】
緑色蛍光タンパク質であるＧＦＰ(コスモ・バイオ社製)１gをリン酸緩衝液(pＨ7.4)100ｍlに溶解し、ＧＦＰ溶液を調製した。
【０２３４】
実施例７と同様にしてウェルを形成した基板をこのＧＦＰ溶液に浸漬し、25℃にて12時間置き、ＧＦＰ表面に提示されているアミノ基とウェル底部のエポキシ基とを反応させ、ＧＦＰをウェルに固定した。
【０２３５】
この基板を溶液から取り出し、スピン乾燥機で脱水した後、１％エタノールアミン水溶液で室温下で１時間処理し、各ウェルの未反応のエポキシ基を開環させた。次に基板を純水で洗浄、乾燥した。これによってウェル内のＧＦＰと反応しなかったエポキシ基は開環して水酸基となり、ウェルの底面は親水性が高くなった。
【０２３６】
この基板を蛍光顕微鏡によって観察したところ、全てのウェル内にＧＦＰによる蛍光が確認され、また格子上に蛍光は観察されなかった。
【０２３７】
以上より、本発明によって作製したマトリクスパターンにタンパク質を配置できることがわかった。
【０２３８】
＜実施例９＞
本実施例では、ＰＨＡ分解酵素を用いたウェルの作製を検討した。
【０２３９】
0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)10ｍlに参考例１で調製した形質転換株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10Ｕ/ｍl)２ｍl、(Ｒ)-３-ヒドロキシピメリルＣoＡ(Ｊ.Ｂacteriol.,182, 2753-2760(2000)に記載の方法で調製)８g、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1gを添加・混合した溶液(溶液(5))、0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)10ｍlに同様のＰＨＡ合成酵素溶液(10Ｕ/ｍl)２ｍl、(Ｒ)-３-ヒドロキシオクタノイルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250, 432-439(1997)に記載の方法で調製)８g、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1gを添加・混合した溶液(溶液(6))をそれぞれ調製し、ただちに４℃に冷却した。
【０２４０】
各溶液の表面張力は３〜５ｍＮ/ｍ(＝30〜50dyn/cｍ)の範囲内であり、また粘度は２〜３ｍＰa・s(cps)の範囲内であった。
【０２４１】
次に実施例１と同様にバブルジェットプリンターによって上記溶液(5)を実施例１と同様に調製したガラス基板上に縦横300μｍ×3000μｍの短冊形の領域内に吐出した。
【０２４２】
吐出終了後、ただちに基板を温度30℃、湿度90％に調整された恒温恒湿器内に移し、24時間静置してＰＨＡの合成を行った。
【０２４３】
この基板を60℃で１時間乾燥した後、蒸留水で洗浄し、スピン乾燥機で基板表面に付着した洗浄水を除去した後、再び60℃で１時間乾燥した。
【０２４４】
乾燥後、再び先に調製した溶液を同じ基板の同じ領域に供給し、同様にＰＨＡの合成を行った後、乾燥と洗浄を行った。乾燥後、上記各工程をさらに５回繰り返した。
【０２４５】
さらに上記溶液(6)を同じ基板の同じ領域に供給し、同様にＰＨＡの合成を行った後、乾燥と洗浄を行った。この各工程をさらに２回繰り返した。
【０２４６】
以上により、ガラス基板上にＰＨＡ被膜を作製した。
【０２４７】
次に、このＰＨＡ被膜のＰＨＡの質量を、飛行時間型二次イオン質量分析装置(ＴＯＦ-ＳＩＭＳ IV、ＣＡＭＥＣＡ製)により測定した。得られたマススペクトルから、パターン表面は３-ヒドロキシオクタン酸のユニットからなるホモポリマーで構成されていることがわかった。また、実施例１で用いた光干渉式膜厚計によりＰＨＡ被膜の膜厚を測定しながらイオンスパッタリングによりパターン表面を少しずつ削り、同様にＴＯＦ-ＳＩＭＳによりマススペクトルを測定していったところ、基板表面から7.8μｍの膜厚部分から３-ヒドロキシピメリン酸のユニットからなるホモポリマーに変化することが確認された。
【０２４８】
次に、以下の方法によりＰＨＡ分解酵素を取得した。
【０２４９】
まず、ＹＮ２株をポリペプトン0.5％、オクタン酸0.1％を含むＭ９培地１Lを分注した坂口フラスコ10本に植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。72時間後、菌体を遠心分離(98kｍ/s2 (＝10,000×g)、４℃、10分間)によって回収し、メタノールで数回洗浄した後、真空乾燥により菌体を乾燥した。この乾燥菌体にクロロホルムを添加し、35℃で３日間攪拌してＰＨＡを抽出した後、0.45μｍのフィルターで濾過した。この濾液をエバポレーターで濃縮し、真空乾燥して約４gのＰＨＡポリマーを得た。このポリマーを実施例１と同様にガスクロマトグラフィー-質量分析装置で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行ったところ、３-ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。
【０２５０】
次にポリペプトン0.5％、寒天1.2％を含むＭ９培地をオートクレーブした後、シャーレに分注し、寒天培地を作製した。先のＰＨＡ ２gを10ｍlのアセトン溶液に溶解し、これを先に作製した寒天培地に0.5ｍl添加し、寒天表面に均一に広げ、ドラフト内で一晩放置した。寒天の表面は析出したＰＨＡによって白濁した。この寒天培地に野外から採集した土壌の懸濁液を塗布し、30℃で１週間培養し、出現したコロニーのうち、コロニー周辺のＰＨＡが分解してクリアゾーンができているコロニーから菌株を分離した。分離した菌株を同様の寒天培地に塗布し、短時間のうちに最も大きなクリアゾーンが形成される菌株をＰＨＡ分解酵素を取得する菌株として選択した。
【０２５１】
次に、滅菌水10ｍlに先のＰＨＡ １gとＴｗeen20 0.5ｍlを加え、ブレンダーで乳化し、これをポリペプトン0.5％を含むＭ９培地に添加し、これに分離した菌株を植菌して、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。72時間後、培養液を遠心分離(98kｍ/s2 (＝10,000×g)、４℃、10分間)によって菌体と上清に分離し、菌体を0.1ｍol/Lトリス塩酸バッファー(pＨ8.0)200ｍlに再懸濁し、再度遠心分離することによって洗浄した。菌体を0.1ｍol/Lトリス塩酸バッファー(pＨ8.0)２ｍlに再懸濁し、超音波破砕機にて破砕したのち、遠心分離(118kｍ/s2 (＝12,000×g)、４℃、10分間)して上清を回収した。この上清と先の培養上清を限外濾過膜によって濃縮し、0.1ｍol/Lトリス塩酸バッファー(pＨ8.0)に再懸濁しＰＨＡ分解酵素の粗酵素溶液を得た。
【０２５２】
この溶液をバブルジェットプリンター(商品名:ＢＪＣ-620:キヤノン(株)社製)を用いて、作製した短冊型ＰＨＡ被膜の長手方向に直径約100μｍのドットを約200μｍの間隔で吐出した。
【０２５３】
この基板をただちに30℃、湿度90％の恒温恒湿槽に移し、24時間静置した。次いで60℃で１時間乾燥し、蒸留水で基板表面を洗浄した後、さらに60℃で１時間乾燥した。
【０２５４】
ここで、基板上のＰＨＡ被膜の膜厚を実施例１と同様に光干渉式膜厚計により測定したところ、リパーゼを添加していない部分の膜厚は平均10.8μｍであり、リパーゼを添加した部分の膜厚は2.8〜6.2μｍであった。この部分を先と同様にＴＯＦ-ＳＩＭＳによりマススペクトルを測定していったところ、３-ヒドロキシピメリン酸のユニットからなるホモポリマーからなることが確認された。
【０２５５】
以上より、リパーゼを用いてＰＨＡ被膜にウェルが作製されたことがわかった。なお、３-ヒドロキシピメリン酸のユニットからなるＰＨＡは水酸基を提示しているため親水性であり、３-ヒドロキシオクタン酸のユニットからなるＰＨＡは疎水性である。
【０２５６】
次にバブルジェットプリンター(商品名:ＢＪＣ-620:キヤノン(株)社製)を用いて、基板上のウェル内に10μｍol/LのローダミンＢ水溶液をひとつおきに供給した。１ウェルあたりの供給量は約20plとした。またこのプリンターの吐出位置決め精度は±2.5μｍであった。
【０２５７】
この基板を蛍光顕微鏡を用いて観察したところ、約400μｍ間隔で直径約80μｍの円形の蛍光が確認された。またそれ以外の部分に蛍光は観察されなかった。
【０２５８】
以上、ＰＨＡ分解酵素を用いることによってウェルを作製できることが確認された。
【０２５９】
＜実施例10＞
本実施例では、本発明のパターン形成方法により微小流路を作製することを検討した。
【０２６０】
0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)10ｍlに参考例１で調製した形質転換株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10Ｕ/ｍl)２ｍl、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-フェニルバレリルＣoＡ(Ｒeforｍatsky反応により得られた３-ヒドロキシフェニル吉草酸エステルを加水分解して３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸を得たのち、Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250, 432-439(1997)に記載の方法で調製)８g、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1gを添加・混合し、ただちに４℃に冷却した。
【０２６１】
この溶液の表面張力は３〜５ｍＮ/ｍ(＝30〜50dyn/cｍ)の範囲内であり、また粘度は２〜３ｍＰa・s(cps)の範囲内であった。
【０２６２】
次にこの溶液を、実施例１と同様にバブルジェットプリンターによってガラス基板上に流路パターンを描画するように吐出した。パターンは、ガラス基板の一辺に２箇所の端面が接するように一辺20ｍｍのコの字型を描画した。またその200μｍ内側に同様のパターンを描画した。このとき、１吐出動作あたりの溶液の吐出量は約20pl、描線の幅は約80μｍであった。
【０２６３】
吐出終了後、ただちにガラス基板を温度30℃、湿度90％に調整された恒温恒湿器内に移し、24時間静置してＰＨＡの合成を行った。
【０２６４】
この基板を60℃で１時間乾燥した後、蒸留水で洗浄し、スピン乾燥機で基板表面に付着した洗浄水を除去した後、再び60℃で１時間乾燥した。
【０２６５】
乾燥後、再び先に調製した溶液を同じガラス基板の同じパターン上に供給し、同様にＰＨＡの合成を行った後、乾燥と洗浄を行った。
【０２６６】
乾燥後、上記各工程をさらに５回繰り返し、ガラス基板上にＰＨＡパターンを作製した。
【０２６７】
このガラス基板上に、５μｍのスペーサーをはさんで実施例１と同様に調製したガラス基板を重ね、60℃の乾熱器中に１時間静置し、パターン面をガラス基板に密着させた。
【０２６８】
この基板の間隙から実施例１のナイルブルー溶液を染み込ませて染色し、蛍光顕微鏡によって観察したところ、線幅約90μｍの２本の描線が、約100μｍ間隔でコの字型のパターンを形成していることが確認された。
【０２６９】
次に、同様にパターニングした別のガラス基板の流路の一方の開口部にあたる部分に、内径0.25ｍｍ、外径0.76ｍｍのタイゴンマイクロボアチューブ(Ｓ-54-ＨＬ；サンゴバン社製)を弾性接着剤(ＥＰ-001；セメダイン社製)で接着した。この基板を蛍光顕微鏡に設置し、蛍光観察を行いながらシリンジポンプ(ＣＦＶ-3200；日本光電社製)を用いて流路内に10μｍol/LのローダミンＢ水溶液を0.05μl/hrの流速で流入した。その結果、蛍光を発する溶液が流路に沿って流動する様子が確認された。このとき、流路からの蛍光溶液の漏出は認められなかった。
【０２７０】
以上、本発明により、溶液の流動が可能な微小流路を作製できることがわかった。
【０２７１】
＜実施例11＞
本実施例では、本発明の方法によって多層構造を有するＰＨＡパターンの作製を検討した。
【０２７２】
0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)10ｍlに参考例１で調製した形質転換株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10Ｕ/ｍl)２ｍl、(Ｒ)-３-ヒドロキシピメリルＣoＡ(Ｊ.Ｂacteriol.,182, 2753-2760(2000)に記載の方法で調製)８g、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1gを添加・混合した溶液(溶液(5))、0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)10ｍlに同様のＰＨＡ合成酵素溶液(10Ｕ/ｍl)２ｍl、(Ｒ)-３-ヒドロキシピメリルＣoＡ ６g、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-フェニルバレリルＣoＡ(Ｒeforｍatsky反応により得られた３-ヒドロキシフェニル吉草酸エステルを加水分解して３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸を得たのち、Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250, 432-439(1997)に記載の方法で調製)２g、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1gを添加・混合した溶液(溶液(6))、0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)10ｍlに同様のＰＨＡ合成酵素溶液(10Ｕ/ｍl)２ｍl、(Ｒ)-３-ヒドロキシピメリルＣoＡ ２g、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-フェニルバレリルＣoＡ ６g、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1gを添加・混合した溶液(溶液(7))、0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)10ｍlに同様のＰＨＡ合成酵素溶液(10Ｕ/ｍl)２ｍl、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-フェニルバレリルＣoＡ ８g、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1gを添加・混合した溶液(溶液(8))を各々調製し、ただちに４℃に冷却した。
【０２７３】
各溶液の表面張力は３〜５ｍＮ/ｍ(＝30〜50dyn/cｍ)の範囲内であり、また粘度は２〜３ｍＰa・s(cps)の範囲内であった。
【０２７４】
次に実施例１と同様にバブルジェットプリンターによってまず溶液(5)をガラス基板上に波線状に吐出した。１吐出動作あたりの溶液の吐出量は約20pl、描線の幅は約80μｍであった。
【０２７５】
吐出終了後、ただちにガラス基板を温度30℃、湿度90％に調整された恒温恒湿器内に移し、24時間静置してＰＨＡの合成を行った。
【０２７６】
この基板を60℃で１時間乾燥した後、蒸留水で洗浄し、スピン乾燥機で基板表面に付着した洗浄水を除去した後、再び60℃で１時間乾燥した。
【０２７７】
次に、溶液(6)を同じガラス基板の同じパターン上に供給し、同様にＰＨＡの合成を行った後、乾燥と洗浄を行った。溶液(7)、溶液(8)についても同様に順次ＰＨＡパターンを重層した。
【０２７８】
以上より、ガラス基板上にＰＨＡパターンを作製した。
【０２７９】
次に、基板上に形成されたパターン表面のＰＨＡの質量を、飛行時間型二次イオン質量分析装置(ＴＯＦ-ＳＩＭＳ IV、ＣＡＭＥＣＡ製)により測定した。得られたマススペクトルから、パターン表面は３-ヒドロキシフェニル吉草酸のユニットからなるホモポリマーで構成されていることがわかった。また、イオンスパッタリングによりパターン表面を少しずつ削りながら同様にＴＯＦ-ＳIＭＳによりマススペクトルを測定していったところ、３-ヒドロキシフェニル吉草酸と３-ヒドロキシピメリン酸の共重合体(モル比３:１)が現れ、次いで３-ヒドロキシフェニル吉草酸と３-ヒドロキシピメリン酸の共重合体(モル比１:３)が現れ、最後に３-ヒドロキシピメリン酸のユニットからなるホモポリマーに変化することが確認された。
【０２８０】
以上、本発明により多層構造のＰＨＡパターンを作製できることがわかった。
【０２８１】
＜実施例12＞
本実施例では、本発明によって作成したパターンのＰＨＡを化学修飾によって架橋することを検討した。
【０２８２】
0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)10ｍlに参考例１で調製した形質転換株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10Ｕ/ｍl)２ｍl、(Ｒ,Ｓ)-３-ヒドロキシ-５-フェノキシバレリルＣoＡ(３-フェノキシプロパナールとブロモ酢酸エチルとのＲeforｍatsky反応で得られた３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸エステルを加水分解して３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸を得たのち、Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250, 432-439(1997)に記載の方法で調製)６g、(Ｒ,Ｓ)-３-ヒドロキシ-７,８-エポキシオクタノイルＣoＡ(Int.Ｊ.Ｂiol.Ｍacroｍol.,12, 85-91(1990)に記載の方法で合成した３-ヒドロキシ-７-オクテン酸の不飽和部分を３-クロロ安息香酸でエポキシ化したのち、Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250, 432-439(1997)に記載の方法で調製)２g、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1gを添加・混合し、ただちに４℃に冷却した。
【０２８３】
この溶液の表面張力は３〜５ｍＮ/ｍ(＝30〜50dyn/cｍ)の範囲内であり、また粘度は２〜３ｍＰa・s(cps)の範囲内であった。
【０２８４】
次に実施例１と同様にバブルジェットプリンターによって上記各溶液をガラス基板上に波線状に吐出した。１吐出動作あたりの溶液の吐出量は約20pl、描線の幅は約80μｍであった。
【０２８５】
吐出終了後、ただちにガラス基板を温度30℃、湿度90％に調整された恒温恒湿器内に移し、24時間静置してＰＨＡの合成を行った。
【０２８６】
この基板を室温で乾燥した後、蒸留水で洗浄し、スピン乾燥機で基板表面に付着した洗浄水を除去した後、再び室温で乾燥した。
【０２８７】
この基板を実施例１と同様にナイルブルーＡ水溶液で染色し、蛍光顕微鏡により観察を行ったところ、目的とするパターンが形成されていることが確認された。
【０２８８】
また、同様にパターニングした基板を密閉容器内で一定容量のクロロホルムに浸漬し、35℃で20時間振とうして基板上のＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、この抽出液について実施例７と同様に1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った。その結果、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸74％、３-ヒドロキシ-７,８-エポキシオクタン酸26％からなるＰＨＡであることがわかった。
【０２８９】
次に、同様にしてパターニングした基板を水50ｍlに浸漬後、架橋剤としてヘキサメチレンジアミン0.5gを溶解させた。溶解を確認後、凍結乾燥により水を除去した(これを基板Ａとする)。さらに基板Ａを70℃で12時間反応させた(ここれを基板Ｂとする)。
【０２９０】
次に基板Ａ、Ｂを、密閉容器内で一定容量のクロロホルムに浸漬し、35℃で20時間振とうして基板上のＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、真空乾燥によりクロロホルムを除去し、示差走査熱量計(ＤＳＣ；パーキンエルマー社製、Ｐyris １、昇温:10℃/分)装置で測定を行った。その結果、基板Ａでは90℃付近に明確な発熱ピークがみられ、ポリマー中のエポキシ基とヘキサメチレンジアミンとの反応が起こり、ポリマー同士の架橋が進行していることが示された。一方、基板Ｂでは明確なヒートフローは見られず、架橋反応がほぼ完了していることが示された。
【０２９１】
さらに、同様に作製した別の基板について赤外吸収を測定した(ＦＴ-ＩＲ；パーキンエルマー社製、1720Ｘ)。その結果、基板Ａで見られたアミン(3340cｍ-1付近)及びエポキシ(822cｍ-1付近)のピークが基板Ｂでは消失していた。
【０２９２】
次に、架橋後のＰＨＡパターンを観察するため、実施例１と同様に基板ＢをナイルブルーＡ水溶液で染色し、蛍光顕微鏡により観察を行ったところ、線幅約90μｍのパターンが設計通り描かれていることが確認された。
【０２９３】
以上、化学修飾を行うことにより、本発明のＰＨＡパターンのポリマーを架橋できることがわかった。
【０２９４】
＜実施例13＞
本実施例では、本発明によって作成したパターンのＰＨＡに化学修飾によってグラフト鎖付与した。
【０２９５】
実施例12と同様のＰＨＡパターンをガラス基板上に作製した。
【０２９６】
この基板を末端アミノ変性ポリシロキサン(変性シリコーンオイルＴＳＦ4700、ＧＥ東芝シリコーン(株)製)に浸漬し、70℃で２時間反応させた。これをメタノール洗浄したのち、乾燥することで、ＰＨＡパターンにポリシロキサンのグラフト鎖を付与した。
【０２９７】
次に、グラフト鎖付与後のＰＨＡパターンを観察するため、実施例１と同様に基板ＢをナイルブルーＡ水溶液で染色し、蛍光顕微鏡により観察を行ったところ、線幅約90μｍのパターンが設計通り描かれていることが確認された。
【０２９８】
＜実施例14＞
本実施例では、本発明によって作成したＰＨＡパターンの官能基を化学修飾によって他の官能基に変換することを検討した。
【０２９９】
0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)10ｍlに参考例１で調製した形質転換株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10Ｕ/ｍl)２ｍl、(Ｒ,Ｓ)-３-ヒドロキシ-ω-(４-ビニルフェニル)バレリルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250, 432-439(1997)に記載の方法と同様に調製)８g、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1gを添加・混合し、ただちに４℃に冷却した。
【０３００】
この溶液の表面張力は３〜５ｍＮ/ｍ(＝30〜50dyn/cｍ)の範囲内であり、また粘度は２〜３ｍＰa・s(cps)の範囲内であった。
【０３０１】
次に実施例１と同様にバブルジェットプリンターによって上記各溶液をガラス基板上に波線状に吐出した。１吐出動作あたりの溶液の吐出量は約20pl、描線の幅は約80μｍであった。
【０３０２】
吐出終了後、ただちにガラス基板を温度30℃、湿度90％に調整された恒温恒湿器内に移し、24時間静置してＰＨＡの合成を行った。
【０３０３】
この基板を室温で乾燥した後、蒸留水で洗浄し、スピン乾燥機で基板表面に付着した洗浄水を除去した後、再び室温で乾燥した。
【０３０４】
この基板を実施例１と同様にナイルブルーＡ水溶液で染色し、蛍光顕微鏡により観察を行ったところ、目的とするパターンが形成されていることが確認された。
【０３０５】
また、同様にパターニングした基板を密閉容器内で一定容量のクロロホルムに浸漬し、35℃で20時間振とうして基板上のＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、この抽出液について実施例１と同様に1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った。その結果、３-ヒドロキシ-ω-(４-ビニルフェニル)吉草酸からなるＰＨＡであることがわかった。
【０３０６】
次に、同様にしてパターニングした基板をヘキサン50ｍlに浸漬後、ｍ-クロロ過安息香酸２gを20ｍlのヘキサンに溶解した溶液を滴下して５℃で12時間、20℃で12時間攪拌し、反応を行った。
【０３０７】
この基板を実施例１と同様にナイルブルーＡ水溶液で染色し、蛍光顕微鏡により観察を行ったところ、目的とするパターンが形成されていることが確認された。
【０３０８】
また、同様に化学修飾した基板上に形成されたパターン表面のＰＨＡの質量を、飛行時間型二次イオン質量分析装置(ＴＯＦ-ＳＩＭＳ IV、ＣＡＭＥＣＡ製)により測定した。得られたマススペクトルから、パターン表面は３-ヒドロキシ-ω-(４-エポキシフェニル)吉草酸ユニットからなるＰＨＡで構成されていることが推定された。
【０３０９】
以上、化学修飾を行うことにより、本発明のＰＨＡパターンの官能基を他の官能基に変換できることがわかった。
【０３１０】
＜実施例15＞
本実施例では、本発明によって作成したＰＨＡパターンに化学修飾によって化合物を付加することを検討した。
【０３１１】
0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)10ｍlに参考例１で調製した形質転換株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10Ｕ/ｍl)２ｍl、(Ｒ,Ｓ)-３-ヒドロキシ-８-ブロモオクタノイルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250, 432-439(1997)に記載の方法と同様に調製)８g、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1gを添加・混合し、ただちに４℃に冷却した。
【０３１２】
この溶液の表面張力は３〜５ｍＮ/ｍ(＝30〜50dyn/cｍ)の範囲内であり、また粘度は２〜３ｍＰa・s(cps)の範囲内であった。
【０３１３】
次に実施例１と同様にバブルジェットプリンターによって上記各溶液をガラス基板上に波線状に吐出した。１吐出動作あたりの溶液の吐出量は約20pl、描線の幅は約80μｍであった。
【０３１４】
吐出終了後、ただちにガラス基板を温度30℃、湿度90％に調整された恒温恒湿器内に移し、24時間静置してＰＨＡの合成を行った。
【０３１５】
この基板を室温で乾燥した後、蒸留水で洗浄し、スピン乾燥機で基板表面に付着した洗浄水を除去した後、再び室温で乾燥した。
【０３１６】
この基板を実施例１と同様にナイルブルーＡ水溶液で染色し、蛍光顕微鏡により観察を行ったところ、目的とするパターンが形成されていることが確認された。
【０３１７】
また、同様にパターニングした基板を密閉容器内で一定容量のクロロホルムに浸漬し、35℃で20時間振とうして基板上のＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、この抽出液について実施例７と同様に1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った。その結果、３-ヒドロキシ-８-ブロモオクタン酸からなるＰＨＡであることがわかった。
【０３１８】
次に、同様にしてパターニングした基板をヘキサン12ｍlに浸漬後、系内を窒素置換した。ついで系内を室温に保ちながら、ヘキサン18ｍlに溶解した化学式(１)で示される２-(２'-メルカプトエチル)アミド-２-メチルプロパンスルホン酸ナトリウム825ｍg加え、更に、ジエチルアミン330μlを加え、24時間ゆるやかに攪拌し、反応を行った。
【０３１９】
この基板を実施例１と同様にナイルブルーＡ水溶液で染色し、蛍光顕微鏡により観察を行ったところ、目的とするパターンが形成されていることが確認された。
【０３２０】
また、同様に化学修飾した基板上に形成されたパターン表面のＰＨＡの質量を、飛行時間型二次イオン質量分析装置(ＴＯＦ-ＳＩＭＳ IV、ＣＡＭＥＣＡ製)により測定した。得られたマススペクトルから、パターン表面は下記化学式(２)に示されるユニットからなるＰＨＡで構成されていることが推定された。
【０３２１】
以上、化学修飾を行うことにより、本発明のＰＨＡパターンに化合物を付加できることがわかった。
【０３２２】
【化１】
2005237208.tif 000002
【０３２３】
【化２】
2005237208.tif 000003
【０３２４】
＜実施例16＞
本実施例では、本発明によって作成したＰＨＡパターンに化学修飾によって化合物を付加することを検討した。
【０３２５】
0.1ｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ7.0)10ｍlに参考例１で調製した形質転換株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10Ｕ/ｍl)２ｍl、(Ｒ)-３-ヒドロキシピメリルＣoＡ(Ｊ.Ｂacteriol.,182, 2753-2760(2000)に記載の方法で調製)８g、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1gを添加・混合し、ただちに４℃に冷却した。
【０３２６】
この溶液の表面張力は３〜５ｍＮ/ｍ(＝30〜50dyn/cｍ)の範囲内であり、また粘度は２〜３ｍＰa・s(cps)の範囲内であった。
【０３２７】
次に実施例１と同様にバブルジェットプリンターによって上記各溶液をガラス基板上に波線状に吐出した。１吐出動作あたりの溶液の吐出量は約20pl、描線の幅は約80μｍであった。
【０３２８】
吐出終了後、ただちにガラス基板を温度30℃、湿度90％に調整された恒温恒湿器内に移し、24時間静置してＰＨＡの合成を行った。
【０３２９】
この基板を100℃の乾熱器に１時間設置した後、蒸留水で洗浄し、スピン乾燥機で基板表面に付着した洗浄水を除去した後、室温で乾燥した。
【０３３０】
この基板を実施例１と同様にナイルブルーＡ水溶液で染色し、蛍光顕微鏡により観察を行ったところ、目的とするパターンが形成されていることが確認された。
【０３３１】
また、同様にパターニングした基板を密閉容器内で一定容量のクロロホルムに浸漬し、35℃で20時間振とうして基板上のＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、この抽出液について実施例７と同様に1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った。その結果、(Ｒ)-３-ヒドロキシピメリン酸からなるＰＨＡであることがわかった。
【０３３２】
次に窒素雰囲気下でp-トルイジン-２-スルホン酸547ｍg、ピリジン100ｍlを200ｍl二口フラスコに入れ攪拌した後、同様にしてパターニングした基板をフラスコ内に入れて溶液に浸漬させ、次いで亜リン酸トリフェニル0.8ｍlを加え、100℃で６時間加熱した。反応終了後、この基板を実施例１と同様にナイルブルーＡ水溶液で染色し、蛍光顕微鏡により観察を行ったところ、目的とするパターンが形成されていることが確認された。
【０３３３】
また、同様に化学修飾した基板上に形成されたパターン表面のＰＨＡの質量を、飛行時間型二次イオン質量分析装置(ＴＯＦ-ＳＩＭＳ IV、ＣＡＭＥＣＡ製)により測定した。得られたマススペクトルから、パターン表面は下記化学式(３)に示されるユニットからなるＰＨＡで構成されていることが推定された。
【０３３４】
以上、化学修飾を行うことにより、本発明のＰＨＡパターンに化合物を付加できることがわかった。
【０３３５】
【化３】
2005237208.tif 000004
【配列表】
2005237208000001.app