(57)【要約】【課題】  微小流路中でも酵素による増幅効果が得られる、酵素反応による増幅効果を用いる蛍光・吸光・発光法・基質そのもの屈折率測定法に代わる酵素反応生成物の検出方法を提供すること。【解決手段】  生体分子の特異的結合に関与する分子を検出するバイオセンサーであって、(i)a)特異的結合反応と、b)酵素反応とを行う反応部と、(ii)反応a)およびb)によって生じた酸化還元性反応生成物と酸化還元物質膜が反応する検出部と、(iii)酸化還元反応生成物との反応による酸化還元物質膜の状態の変化を測定し、誘電率の変化を求める測定部とを含むことを特徴とするバイオセンサー。【選択図】        図１
2005024483.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子の特異的結合に関与する分子を検出するバイオセンサーであって、
(i)a)特異的結合反応と、b)酵素反応とを行う反応部と、
(ii)反応a)およびb)によって生じた酸化還元性反応生成物と酸化還元物質膜が反応する検出部と、
(iii)酸化還元反応生成物との反応による酸化還元物質膜の状態の変化を測定し、誘電率の変化を求める測定部と
を含むことを特徴とするバイオセンサー。
【請求項２】
生体分子の特異的結合に関与する分子を検出する際に用いられる微小流路であって、
(i)a)特異的結合反応と、b)酵素反応とを行う反応部、および
(ii)反応a)およびb)によって生じた酸化還元性反応生成物と酸化還元物質膜が反応する検出部
を含むことを特徴とする微小流路。
【請求項３】
生体分子の特異的結合に関与する分子を検出するバイオセンサーであって、
(i)a)特異的結合反応と、b)酵素反応とを行う反応部、および
(ii)反応a)およびb)によって生じた酸化還元性反応生成物と酸化還元物質膜が反応する検出部
を含む微小流路と、
(iii)  酸化還元反応生成物との反応による酸化還元物質膜の状態の変化を測定し、誘電率の変化を求める測定部と
を含むことを特徴とするバイオセンサー。
【請求項４】
誘電率の変化の測定方法が表面プラズモン共鳴を用いる測定方法であることを特徴とする請求項１または３に記載のバイオセンサー。
【請求項５】
特異的結合が抗原と抗体との結合であることを特徴とする請求項１、３または４に記載のバイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療診断や環境分析を行う装置において、抗原抗体反応を用いる抗原、ホルモンを検出するセンサー、ＤＮＡの配列を識別するセンサー、および酵素と基質の結合を利用するバイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体の抗原分子認識機能を使った免疫測定法は、複雑な生体分子を分離操作することなく検出できるため、臨床検査、環境汚染物質の測定、生化学分野での測定で広く使われている。比較的感度の低い測定では、簡便な測定法が開発され、例えば、個人で行うことのできる妊娠検査などに使われている。また特に低濃度の抗原が測定できることから、高感度測定が必要なインシュリン、ＢＮＰなどの疾病関連物質、環境ホルモンの測定に利用される。測定対象の分子に対する抗体は安価に人工的に産生することができるので、多くの天然分子や、環境ホルモンなど生体に影響のある非天然分子を測定できる対象分子の広い測定法である。抗体と抗原の結合が極めて特異的で結合定数も大きいことから、測定対象が低濃度である場合にも抗体は抗原に高い割合で結合し、またより高い濃度で存在する夾雑分子の影響を受けにくい。このような特徴から、免疫測定法は液体クロマトグラフィーなどの分離操作を必要としない、特定の分子を測定する方法である。このような特異的結合は、抗原抗体反応のほかに、相補する配列を持つＤＮＡ、酵素と基質、レセプター分子とリガンド分子があり、結合する組み合わせも、１対１だけではなく、３種以上の分子が結合する場合もある。
【０００３】
抗原抗体反応を使って抗原または、抗体分子を高感度に検出する方法では、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）や、Enzyme Linked Immunosorbent assay （ＥＬＩＳＡ法）が一般的である（例えば非特許文献１および２参照）。ＤＮＡでも、レセプターでも、抗原や抗体の代わりに使うことができる。ＥＩＡやＥＬＩＳＡでは標識酵素が必要である。これらの方法は、特異的反応によって、固定化された分子と酵素が複合体をつくり、固定化された酵素の活性により、大量の基質を加えると、標識酵素の分子数よりも多い酵素反応生成物が得られる。したがって容易に低分子の数少ない被検出分子を測定できる。
【０００４】
生成した物質の検出には、蛍光法が感度の高い方法として用いられている。例えば、標識酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの場合には、非蛍光性の4-methylumbelliferyl-β-D-galactosideを基質として加えると、固定化された酵素の反応によって蛍光性の分子に変換され、時間と共に蛍光強度が強くなる。
【０００５】
したがって、酵素の反応時間を十分にとると、極めて高い感度を実現できる。
【０００６】
一方、生体分子の検出では、高い感度が必要とされると共に、微量サンプルでの測定が重要である。近年サンプル体積の微量化、測定の自動化、測定装置の小型化を図るために、ガラスやプラスティック基板に半導体加工技術を使って微小な流路を形成し、この中で化学反応を行わせる技術が開発されている。
【０００７】
この方法を使うと、１μｌ以下の体積のサンプルで測定ができる。例えば、非特許文献３では、ポリスチレンビーズに抗原を固定化し、微小流路に閉じ込め、金微粒子を標識に使い、特殊な装置で抗体と共にビーズに固定化された金微粒子を測定している。微小流路を使うと、酵素増幅免疫測定で必要になる複雑な溶液交換や洗浄を自動化できる利点がある。非特許文献４では、複数の流路からの送液を制御することで、ＥＬＩＳＡを微小流路で実現し、最終的には微小流路内の蛍光強度で検出している。
【０００８】
ところで、特異的反応を標識分子を使って検出する方法は、高感度化を図れるが、複雑な操作を必要とする。そこで、特異的反応を直接検出する方法が開発されている。特に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使った屈折率の変化から特異的結合を検出する方法が実用化され（非特許文献５）、広く使われている（非特許文献２）。ＳＰＲ法では、金や銀などの基板表面から数百ｎｍの範囲の屈折率変化を検出でき、微小流路中でもバルク測定と同じ感度で測定できる利点がある。ＳＰＲを使う免疫センサーにおいては、抗原または抗体を金属薄膜に固定し、これと被測定分子が特異結合すると、金属薄膜表面の屈折率が大きくなるのを利用して検出する。このため、被測定分子の分子量が大きい場合には屈折率変化が大きく高感度に測定できるが、分子量が小さい場合には感度が低く測定が困難であった。しかし、金属薄膜表面に屈折率変化を増幅する膜を設けることにより過酸化水素のように低分子量分子でも特異的に検出することができるようになった（特許文献１）。
【０００９】
【特許文献１】特開２００１−１９４２９８号公報
【非特許文献１】「超高感度酵素免疫測定法」、石川  栄治著、学会出版センタ、  １９９３年１２月１９日発行、ｐ．１３１〜１３２
【非特許文献２】独立行政法人工業所有権総合情報館、インターネットURL ：www.ryutu.ncipi.go.jp/chart/kagaku2/1/1-1.htm
【非特許文献３】Sato, K:Tokeshi, M:Odake, T:Kimura, H:Ooi, T:Nakao, M:Kitamori, T, Anal.Chem. 2000, 72, 1144-1147.
【非特許文献４】J. Cooper McDonald, Steven J. Metallo, and George M. Whitesides, Anal, Chem. 2001, 73, 5645-5650
【非特許文献５】ビアコア株式会社、インターネットURL ：www.biacore.co.jp/2_0.html
【非特許文献６】酵素ハンドブック  １９８２年  朝倉書店
【非特許文献７】Enzyme Handbook 10, Class 1.1.1.150-1.1.99.26 Oxidoreductases (Eds.: D. Schomburg, D. Stephan, Springer-Verlag 1995)
【非特許文献８】Yuzuru Iwasaki, Tsutomu Horiuchi, and Osamu Niwa, Anal Chem. 2001, 73, 1595-1593
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＥＩＡを微小流路を用いて行えば、簡便な測定と高感度検出を両立することができる。ところが、酵素反応を行わせるときには流れを静止させるか、線流速が遅くなる体積の大きなインキュベーション部分を作る必要があり、微量高感度測定を行うのに不利であった。また、微小流路では従来の大きさの反応体積に比べて流路内の体積が小さいために、たとえすべての酵素の基質が反応したとしても、生成物の量は、酵素が固定化された部分に反応時間内に拡散可能な距離にあった基質の量に制限される。また、酵素の基質が抗原抗体反応を阻害する場合には、基質濃度が制限される。したがって、酵素による増幅効果が十分に得られない。
【００１１】
そこで、微小流路中でも酵素による増幅効果が得られる、検出手段が必要である。本発明の目的は、免疫、ＤＮＡバイブリダイゼーション、レセプター・リガンドの特異的結合反応を用いるセンサーにおいて、微小流路中で、酵素反応による増幅効果を用いる蛍光・吸光・発光法・基質そのもの屈折率測定法に代わる酵素反応生成物の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、生体分子の特異的結合に関与する分子を検出するバイオセンサーであって、(i)a)特異的結合反応と、b)酵素反応とを行う反応部と、(ii)反応a)および b)によって生じた酸化還元性反応生成物と酸化還元物質膜が反応する検出部と、(iii)酸化還元反応生成物との反応による酸化還元物質膜の状態の変化を測定し、誘電率の変化を求める測定部とを含むバイオセンサーである。
【００１３】
好ましくは、本発明は、(i)a)特異的結合反応と、b)酵素反応とを行う反応部、および(ii)反応a)およびb)によって生じた酸化還元性反応生成物と酸化還元物質膜が反応する検出部を含む微小流路を用い、微小流路と、(iii)酸化還元反応生成物との反応による酸化還元物質膜の状態の変化を測定し、誘電率の変化を求める測定部とを含むバイオセンサーである。
【００１４】
これらのバイオセンサーは、誘電率の変化の測定方法が表面プラズモン共鳴を用いる測定方法であることが好ましく、また、特異的結合が抗原と抗体との結合であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のバイオセンサーは、特異的結合反応と酵素増幅を使った高感度測定法において、酵素反応の生成物を微小流路の下流で捕捉する膜を設け、この膜の誘電率測定からこの捕捉の進行状態を測定することにより、微小流路中で連続して基質を流す場合にも、流路体積の制限を受けずに酵素増幅の効果が得られ、低い検出限界濃度を達成できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、生体分子の特異的結合に関与する分子を検出するバイオセンサーであって、(i)反応部、(ii)検出部および(iii)測定部を含む。以下各部分について説明する。
【００１７】
(i)反応部は、a)特異的結合反応と、b)酵素反応が行われる部分である。a)特異的結合反応は、好ましくは抗原抗体反応である。
【００１８】
(ii)検出部は、反応a)およびb)によって生じた酸化還元性反応生成物と酸化還元物質膜が反応する部分であり、高分子膜等が用いられる。
【００１９】
(iii)測定部は、酸化還元反応生成物との反応による酸化還元物質膜の状態の変化を測定し、誘電率の変化を求める部分である。この誘電率の変化の測定方法において、好ましい測定方法は、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）である。表面プラズモン共鳴法とは、金属薄膜にｐ偏光の光を入射したとき、ある特定の角度（共鳴角）でその反射光強度が減少することを利用した手法である。この手法は感度が高く、金や銀などの基板表面から数ｎｍの範囲の屈折率変化を検出できる。実際の測定では、光を試料の反対面からある角度で入射し、そのエバネッセンス波と表面プラズモンとが共鳴する角度を測定する。この他にも、臨界角を測定することにより屈折率（誘電率の平方根）を測定する方法、エリプソメトリー、膜に交流またはパルス電位を印加して電気的インピーダンスから測定する方法等も使用可能である。
【００２０】
好ましい実施形態では、(i)反応部および(ii)検出部は微小流路において行われる。したがって、好ましい実施形態のバイオセンサーは、(i)反応部および(ii)検出部を有する微小流路と、(iii)酸化還元反応生成物との反応による酸化還元物質膜の状態の変化を測定し、誘電率の変化を求める測定部とを含むことを特徴とするバイオセンサーである。
【実施例】
【００２１】
以下に図面を参照して本発明を実施例により詳細に説明する。なお、以下の実施例は、例示であり、本発明はこれに限定されない。
【００２２】
図１は本発明のバイオセンサーの概略図である。本発明のバイオセンサーは、微小流路１と測定装置４を含んでおり、その間に金薄膜基板２を有し、測定装置４がＳＰＲ測定装置である場合は、微小流路１と測定装置４の間に、ＳＰＲ測定に用いるプリズム３が設置されている。
【００２３】
本発明の微小流路の一実施形態について、図面を参照して説明する。
【００２４】
微小流路１を、図２に示される微小流路マスクパターン６を用いてパターニングして作製した。この微小流路マスクパターン６に基づいて微小流路の各部分について説明する。符号８がサンプルを送液する送液ポートＡ、符号９が酵素結合コンジュゲートを送液する送液ポートＢ、および符号１０が基質および緩衝液を送液する送液ポートＣである。液の種類と位置はこれらに限定されないが、このように測定に用いる液ごとにポートを設けている。各送液ポートにシリンジからのチューブを接続し、シリンジポンプ等で送液する。これらの送液ポートから送られた液は、出液ポート１１から排出される。
【００２５】
このような微小流路マスクパターン６を用い、ＰＤＭＳ（polydimethyl siloxane 、ダウコーニング社製）を用いたレプリカ法によって作製した。レプリカ法は、まず、アクリル基板に耐酸素イオン反応性エッチングレジスト（ＮＴＴ−ＡＴ社製、ＳＰＰ）をスピンコートし、フォトマスクまたは、インクジェットプリンター（エプソン社製ＰＭ−９５０Ｃ）でパターンを印刷したＯＨＰシートを用いて露光・現像し、流路となる部分にＳＰＰが残るパターンを得ることにより行った。さらにこのアクリル基板を、酸素イオン反応性エッチング装置（アネルバ社製ＤＥＭ−４５１）を用いて進行波出力５０Ｗで４時間エッチングした。
【００２６】
以上の工程により、アクリル基板に２５μｍの段差を作製した。この基板をシャーレに入れ、硬化剤（ダウコーニング社製ＰＤＭＳカタリスト）と混合し、気泡を取り除いたＰＤＭＳを流し込んだ。これを６時間６０度に保ち、ＰＤＭＳを硬化させた。この後、硬化したＰＤＭＳをアクリル基板から剥離し、アクリル基板に作った流路パターンのレプリカを得た。レジストで作ったパターン部分は、深さ２５μｍのＰＤＭＳの溝になり、液体が流れる流路として機能する。
【００２７】
次に金薄膜基板２を作製した。金薄膜基板２は、ＢＫ７基板（松浪硝子工業社製）上にスパッタ法（日本シード研究所社製スパッタ装置）とリフトオフ法により成膜および図２に示される金薄膜マスクパターン５を用いたパターニングを行い作製した。金薄膜マスクパターン５に基づいて微小流路の各部分について説明する。なお、図２の金薄膜マスクパターン５は、マスクパターンであるため、図１の金薄膜基板とは左右が反転している。符号１２、１４および１３は、それぞれ外部回路にリード線を取り出す電極パッドＡ、ＢおよびＣである。電極パッドＡは流路中の電気化学的参照極２０、電極パッドＢは対極２２、および電極パッドＣは作用極２１にそれぞれ接続されている。作用極では、酸化還元反応生成物との反応による酸化還元物質膜の状態の変化をＳＰＲで測定する際に、電気化学的に酸化還元状態を元に戻すために用いる。図２の符号１５に示す部分に３−メルカプトプロピオン酸（東京化成工業社製）の２ｍＭエタノール溶液を用いて自己組織化膜を形成し、この膜にＥＤＣ（同仁化学研究所製）とSulfo-NHS-Acetate （ピアス社製）を用いて、検出分子である生体分子に特異的に結合する分子（認識分子）を結合し、固定化した（反応部１５）。この分子は、抗原抗体反応を利用する場合に、抗原を検出分子として使用する場合には抗体、ホルモンを検出分子とする場合にはホルモンに特異的に結合する分子、ＤＮＡを検出分子とする場合は、検出するＤＮＡに特異的に結合する分子などを用いることができる。具体的には、後述の測定例１および２に用いられる抗ｈＩｇＧまたは抗ｈＩｇＧ−Ｆｃである。
【００２８】
次に、図２の１６に示す部位に、酸化還元物質膜として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含む酸化還元高分子膜であるＨＲＰ−ＯＳポリマー膜を、キャスト法により形成した（検出部１６）。酸化還元物質膜は、電極と酵素の両方と電気移動反応を起こすものであればよく、オスミウム化合物の他にもフェロセン化合物、有機酸化還元試薬、金属錯体、酸化還元酵素など、バイオセンサーにおいて一般的にメディエーターとなる物質が利用可能である。次に微小流路と金薄膜パターンを有するＢＫ７基板（金薄膜基板）とを合わせることにより、接着剤等を使用することなく自然に接着させ、微小流路を完成した。ＳＰＲ測定装置を測定部とする場合には、この微小流路の底面であるＢＫ７基板を、屈折率マッチングオイルを介してＳＰＲ測定装置のプリズムに設置した。
【００２９】
以上のように、本実施例では、流路幅１ｍｍ、流路の深さ２５μｍの微小流路を作製したが、使用可能な微小流路は、流路幅が５０μｍ〜２０００μｍ、好ましくは５０μｍ〜２００μｍの範囲、流路の深さが１０μｍ〜５０μｍ、好ましくは１８μｍ〜２５μｍの範囲である。
【００３０】
次に流路内部の各部分について、図３に基づいて説明する。図３は、図２の７の点線に沿った断面模式図である。微少流路は、基板１７と天井１８に囲まれており、符号２６は液が流れる方向を示す。流路上には４か所の金薄膜が成膜されている（符号１９、２０、２１、および２２）。金薄膜１９の上には、認識分子固定膜２３が設けられ、金薄膜１９と認識分子固定膜２３とを合わせて反応部を構成する。電極パッドＡにつながる金薄膜２０は、参照極として動作し、好ましくは金薄膜にごく薄く、銀または塩化銀がコートされる。電極パッドＢにつながる金薄膜２２は対極として動作する。電極パッドＢにつながる金薄膜２１の上には、酸化還元物質膜２４が設けられ、金薄膜２１と酸化還元物質膜２４を合わせて検出部（センサー部分）を構成する。金薄膜２１は電極パッドＣにつながっており、酸化還元物質膜２４の酸化還元状態を元に戻す。
【００３１】
以下に本発明のバイオセンサーを用いた測定例を示す。
【００３２】
測定例１  
（競合法ＥＩＡを用いた本発明のバイオセンサー（微小流路ＳＰＲ測定装置）によるｈＩｇＧの測定方法）
競合法によってｈＩｇＧを検出する場合の微小流路内部の一連の反応を本発明の一測定例として、図３および図４に従って説明する。図３は、図２の点線７で縦断した縦横の縮尺を考慮しない断面模式図である。検出分子３０として、抗原であるｈＩｇＧ（コスモバイ社製）、この認識分子２８として、抗体である抗ｈＩｇＧ（シグマ社製）を使って検出する競合法ＥＩＡを微小流路で行う測定例１の反応を示している。本測定例では、以上の抗原および抗体を用いて抗原抗体反応を利用することができるが、必ずしもこれに限る必要はなく、例えば生体分子としてＤＮＡおよびタンパク質、特異的に結合する分子としてこれらに特異的に結合する物質を用いることができる。本測定例のＥＩＡで増幅に用いる酵素はグルコース酸化酵素（ＧＯＤ）、その酵素反応生成物である酸化還元反応生成物は過酸化水素であり、過酸化水素を捕捉する膜（酸化還元物質膜）はＨＲＰ−ＯＳポリマー膜（ＢＡＳ社製）である。用いられる酵素は、従来から周知の酵素を用いてよく、例えば、ペルオキシダーゼ、グルコース酸化酵素、酪酸酸化酵素、グルタミン酸化酵素、ヒスタミン酸化酵素、コリン酸化酵素およびコレステロール酸化酵素を挙げることができる（非特許文献６、７を参照）。グルコース酸化酵素によるグルコースの酸化還元反応生成物である過酸化水素が検出部のＨＲＰ−ＯＳポリマーに捕捉される結果、ＯＳポリマーの酸化還元状態が変化する（図４（ｂ））。この酸化還元状態の変化を、金薄膜を通して光を照射してＳＰＲ測定装置（ＤＫＫ社製）で測定する。
【００３３】
まず、基板（ＢＫ７ガラスに金薄膜を形成したもの）上に金薄膜を設け（図３の符号１９および図４（ａ）の符号２７）、抗ｈＩｇＧを固定化して反応部（抗体膜）とし（図３の符号２３および図４（ａ）の符号２８）、この抗体膜に微小流路中でｈＩｇＧのγ鎖を認識する抗ｈＩｇＧ−Ｇにグルコース酸化酵素を結合したコンジュゲート（American Qualex Antibodies社製、抗ｈＩｇＧ−Ｇ−ＧＯＤ）をあらかじめ結合させる（図４（ａ）の符号２９）。次に、非特異吸着を防ぐために２％ＢＳＡを含むＰＢＳを、送液ポートから５分間送液した。送液は、各送液ポートにシリンジからのチューブを接続し、ＰＢＳ（ギフコ社製）に種々のサンプルまたはグルコースを溶解し、シリンジポンプ（ＣＭＳ社製）により送液した。流速はすべて１μｌ／ｍｉｎとした。これ以降、すべてのシリンジに２％ＢＳＡを含む溶液を用いる。この状態で基質のグルコースを送流すると、グルコース酸化酵素によってグルコースが反応し、酵素反応生成物として過酸化水素を生成する（図４（ｂ））。下流に金薄膜（図３の符号２１）と酸化還元物質膜であるＯＳポリマー複合体（図３の符号２４および図４（ａ）の符号３１）とを合わせた検出部（図４（ａ）の符号３２）を設置し、ＯＳポリマー複合体をあらかじめ還元しておくと、ＨＲＰと過酸化水素が反応してＯＳポリマーを酸化する（図４（ｂ））。この酸化速度をＳＰＲ測定機ＳＰＲ２０（ＤＫＫ社製）（非特許文献８）により測定すると、その変化速度は、固定された抗ｈＩｇＧの濃度に比例する。
【００３４】
次に検出分子（被測定分子）であるｈＩｇＧを含む試料を一定時間（Ｔ１）送液すると、ｈＩｇＧと抗ｈＩｇＧ−Ｇ−ＧＯＤが交換反応を起こし、ｈＩｇＧの濃度に応じて、特異的に結合していた抗ｈＩｇＧ−Ｇ−ＧＯＤの一部がｈＩｇＧに置き換わる（図４（ｃ））。この反応後、再び電極により電気化学的にＯＳポリマーを還元し、グルコースを送液すると、交換反応で抗ｈＩｇＧ−Ｇ−ＧＯＤが少なくなった分だけ、ＯＳポリマーの酸化速度が遅くなり、ｈＩｇＧの濃度を測定することができる（図４（ｄ））。
【００３５】
この微小流路で、１μｇ／ｍＬのｈＩｇＧを１μＬ／ｍｉｎの流速で５分間送液し測定した結果、ＳＰＲ角度変化で０．２度の信号を得た。用いたＳＰＲ測定装置の分解能は１／１００００度なので、十分な感度で測定できた。測定時間を長くした場合、標識酵素が無い場合には、２時間まで、ＳＰＲ測定値は変化しなかった。また、上流で発生した過酸化水素は下流のＨＲＰ−ＯＳポリマー膜で高さ２０μｍの微小流路を用いると、酵素反応を行う膜（反応部）と、酸化還元反応を行う膜（検出部）とを別々の場所に配置しても、微小流路を用いて検出に用いる生成物を反応部から下流の検出部に流すことにより、十分な感度で反応させることができた。
【００３６】
なお、ＳＰＲ角度と誘電率は、ほぼ比例関係にあり、図５はＳＰＲ角度と誘電率の関係を示す。ＳＰＲ角度を測定した際には、図５により誘電率を求めることができる。
【００３７】
被測定分子であるｈＩｇＧを流す時間Ｔ１を長くすると、低濃度の抗体を測定するのに適し、Ｔ１を短くすると高濃度の抗体を測定するのに適する。
【００３８】
測定例２  
（非競合法を用いた本発明のバイオセンサー（微小流路ＳＰＲ測定装置）によるｈＩｇＧ測定方法）
測定例１と同様に、図２の微小流路を用いて、サンドイッチイムノアセイを行った。測定例１の抗ｈＩｇＧ−Ｇ−ＧＯＤと同時にｈＩｇＧ結合可能なＦｃ部分を認識する抗ｈＩｇＧ−Ｆｃ（American Qualex Antibodies社製）でｈＩｇＧを検出する。抗ｈＩｇＧ−Ｆｃを図３の符号２３にＳＡＭ法で固定し、ポートＡ（図２の符号８）からサンプル（ｈＩｇＧ）を送液した。抗ｈＩｇＧ−Ｆｃの一部には、ｈＩｇＧが結合する。次に送液ポートＢ（図２の符号９）から抗ｈＩｇＧ−Ｇ−ＧＯＤを送液する。抗ｈＩｇＧ−Ｇ−ＧＯＤは、すでにｈＩｇＧが結合している部分に結合する。次に送液ポートＣ（図２の符号１０）から、グルコースを１００μＭ含む緩衝溶液を送液した。抗ｈＩｇＧ−Ｆｃ固定部分（図２の符号１５および図３の符号２３）に結合した抗ｈＩｇＧ−Ｇ−ＧＯＤのグルコース酸化酵素の活性によって、その場で過酸化水素が発生する。この過酸化水素を、酸化還元物質膜であるＨＲＰ−ＯＳポリマー膜部分（図３の符号２４）で、測定例１と同様に測定した。流路が薄層であるために、ほとんどの過酸化水素が、ＨＲＰ−ＯＳポリマー膜部分で反応し、さらにＨＲＰ−ＯＳポリマー膜の酸化反応として積算される。時間をかけて酸化還元物質膜の酸化状態をＳＰＲで測定すると、ＨＲＰ−ＯＳポリマー膜に結合したｈＩｇＧの濃度に比例した速度で、酸化速度が変化した。さらに、ｈＩｇＧの濃度が近くても微小流路を使った測定で、サンドイッチイムノアセイを使って効果的に酵素増幅することができた。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
以上説明したように、特異的結合反応と酵素増幅を使った高感度測定法において、酵素反応の生成物を微小流路の下流で捕捉する膜を設け、この膜の誘電率測定からこの捕捉の進行状態を測定することにより、微小流路中で連続して基質を流す場合にも、流路体積の制限を受けずに酵素増幅の効果が得られ、低い検出限界濃度を達成することができる。
【００４０】
したがって、本発明による抗原抗体反応を利用するセンサーは以下のような有利な効果を有する。
１．微小流路では効果が低かった、酵素抗体測定法による免疫センサーの感度を向上することができる。
２．酵素抗体法による増幅に加えて、酸化還元状態変化による酵素反応生成物の局所的蓄積により高感度化することができる。
３．酵素抗体法の最終的検出手段として、ＥＬＩＳＡや種々の高感度手法と組み合わせてセンサーの高機能化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明のバイオセンサーを示す図である。
【図２】微小流路の金薄膜マスクパターンおよび微小流路マスクパターンを示す図である。
【図３】図２の符号７の線に沿った断面模式図である。
【図４】本発明のバイオセンサー内の反応を示す図である。
【図５】ＳＰＲ角度と誘電率の関係を示す図である。
【符号の説明】
【００４２】
１    微小流路
２    金薄膜基板
３    ＳＰＲ測定装置のプリズム
４    ＳＰＲ測定装置本体
５    金薄膜マスクパターン
６    微小流路マスクパターン
７    図３で示す断面を表す補助線
８    送液ポートＡ
９    送液ポートＢ
１０    送液ポートＣ
１１    出液ポート
１２    電極パッドＡ
１３    電極パッドＢ
１４    電極パッドＣ
１５    反応部
１６    検出部
１７    基板
１８    微小流路の天井
１９    金薄膜
２０    電極パッドＡにつながる金薄膜（参照極）
２１    電極パッドＣにつながる金薄膜（作用極）
２２    電極パッドＢにつながる金薄膜（対極）
２３    認識分子固定膜
２４    検出部
２５    微小流路の深さ
２６    流れる方向
２７    金薄膜
２８    認識分子（抗ｈＩｇＧ）
２９    酵素結合コンジュゲート（抗ｈＩｇＧ−Ｇ−ＧＯＤ）
３０    検出分子（被認識分子・ｈＩｇＧ）
３１    酸化還元物質膜（ＨＲＰ−Ｏｓポリマー複合膜）
３２    センサー（検出部）
【図１】
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【図２】
2005024483.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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