(57)【要約】【課題】本発明は、Glyt1トランスジェニックマウスを提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、GLYT1をコードするトランスジェニックDNAをゲノム内に含むトランスジェニック非ヒト動物を作製するための遺伝学的構築物及び方法を提供する。これらのトランスジェニック動物は、さらに、より多くの活性GLYT1を産生するトランスジェニック動物を生成するために使用され得る。さらに、より多くのGLYT1タンパク質を産生するトランスジェニック動物、及びそれらを作製する方法も、提供される。本発明は、シナプスNMDA受容体機能の抑制の効果を分析するため、そして精神病性行動の症状を減少させる化合物の能力を研究するためのモデルとしての、これらの動物の使用にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターと機能的に連結されたGLYT1をコードするDNA配列を含む遺伝学的構築物。
【請求項２】
DNA配列がGLYT1のアイソフォームをコードする、請求項1記載の遺伝学的構築物。
【請求項３】
DNA配列がGLYT1bをコードする、請求項1記載の遺伝学的構築物。
【請求項４】
コード配列がヒト配列である、請求項1〜3のいずれか一項記載の遺伝学的構築物。
【請求項５】
プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項1〜4のいずれか一項記載の遺伝学的構築物。
【請求項６】
プロモーターが前脳特異的プロモーターである、請求項1〜4のいずれか一項記載の遺伝学的構築物。
【請求項７】
プロモーターが調節可能プロモーターである、請求項1〜4のいずれか一項記載の遺伝学的構築物。
【請求項８】
GLYT1をコードするトランスジェニックDNAを含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物を作製する方法であって、
a）請求項1〜7のいずれか一項記載の遺伝学的構築物を非ヒト接合体又は非ヒト胚性幹細胞に導入する段階、
b）該接合体又は胚性幹細胞からトランスジェニック非ヒト動物を作製する段階、及びそれにより
c）GLYT1をコードするトランスジェニックDNAを含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物を作製する段階
を含む、方法。
【請求項９】
トランスジェニックGLYT1を発現する非ヒトトランスジェニック動物を作製する方法であって、
a）請求項1〜7のいずれか一項記載の遺伝学的構築物を非ヒト接合体又は非ヒト胚性幹細胞に導入する段階、
b）該接合体又は胚性幹細胞からトランスジェニック非ヒト動物を作製する段階、及びそれにより
c）トランスジェニックGLYT1を発現するトランスジェニック非ヒト動物を作製する段階
を含む、方法。
【請求項１０】
請求項8または9記載の方法により作製されたトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１１】
請求項1〜7のいずれか一項記載の遺伝学的構築物を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１２】
齧歯類である、請求項10または11記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１３】
マウスである、請求項10または11記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１４】
GLYT1タンパク質を過剰発現する、請求項10〜13のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１５】
組織特異的にGLYT1タンパク質を過剰発現する、請求項10〜13のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１６】
請求項10〜15のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物の子孫。
【請求項１７】
請求項10〜16のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物またはその子孫に由来する細胞株または初代細胞培養物。
【請求項１８】
請求項10〜16のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物またはその子孫に由来する組織又は器官型脳切片培養物。
【請求項１９】
精神病性行動に対する化合物の効果を研究するためのモデルとしての、請求項10〜16のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物、請求項17記載の細胞株もしくは初代細胞培養物、または請求項18記載の組織もしくは器官型脳切片培養物の使用。
【請求項２０】
GLYT1特異的阻害効果に関して化合物を試験するための、請求項10〜16のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物、請求項17記載の細胞株もしくは初代細胞培養物、または請求項18記載の組織もしくは器官型脳切片培養物の使用。
【請求項２１】
シナプスNMDA受容体機能の抑制の効果を研究するためのモデルとしての、請求項10〜16のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物、請求項17記載の細胞株もしくは初代細胞培養物、または請求項18記載の組織もしくは器官型脳切片培養物の使用。
【請求項２２】
NMDA受容体活性化に対するGLYT1機能のインビボ効果を評価するための方法であって、請求項10〜16のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物においてNMDA受容体活性、シナプス可塑性、及び学習及び記憶を含む行動を決定する段階、並びに該NMDA受容体活性、シナプス可塑性、及び行動を対照におけるものと比較する段階を含む、方法。
【請求項２３】
NMDA受容体活性を増強する能力に関してGLYT1阻害化合物を試験する方法であって、GLYT1阻害化合物を、請求項10〜16のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物、請求項17記載の細胞株もしくは初代細胞培養物、または請求項18記載の組織もしくは器官型脳切片培養物に投与する段階、行動、電気生理学、及び組織学を評価することを含む化合物の効果を決定する段階、並びに該行動、電気生理学、及び組織学を対照のものと比較する段階を含む、方法。
【請求項２４】
NMDA受容体活性を増強する能力に関してGLYT1阻害化合物を試験するためのキットであって、請求項10〜16のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物、請求項17記載の細胞株もしくは初代細胞培養物、又は請求項18記載の組織もしくは器官型脳切片培養物もしくは組織、及び化合物がNMDA受容体活性を増強する能力を示すか否かを判定するための手段を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、GLYT1をコードするトランスジェニックDNAをゲノム内に含むトランスジェニック非ヒト動物を作製するための遺伝学的構築物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリシンは、脊髄及び脳幹における主要な阻害性神経伝達物質であり、NMDA受容体に対するコアゴニストでもある。グリシンの細胞外濃度は、少なくとも2個のNa+/Cl-依存性グリシン・トランスポーター（GLYT1及びGLYT2）により制御されており、これらは、シナプス前神経終末及び周囲の微細なグリア突起へのグリシンの再取り込みにより、シナプス後グリシン作動性作用の終結及び低い細胞外グリシン濃度の維持において重要な役割を果たしている。GLYT2は、齧歯類の脊髄、脳幹、及び前脳に高レベルに発現しており、その発現は、ストリキニーネ感受性グリシン受容体の存在と極めてよく相関している（非特許文献1〜3参照）。免疫組織化学的分析は、推定グリシン作動性シナプスのシナプス前に主として局在していることを示唆しており（非特許文献1および4参照）、このことから、グリシン作動性阻害性シナプス伝達の終結における役割が強く示唆される。ヒトGLYT2は、クローニングされており、類似の発現パターンを示すようである（非特許文献5参照）。GLYT2は、ある程度の不均一性を有している。実際、2個のGLYT2アイソフォーム（2a及び2b）が、齧歯類脳において同定されている。
【０００３】
GLYT1は、サルコシン及びグリシンのN-メチル化誘導体により遮断される感受性によってGLYT2から薬理学的に区別され得る（非特許文献6および7参照）。ヒトglyt1遺伝子はクローニングされており、4個のアイソフォームGLYT1a、1b、1c、及び1dをコードするが（非特許文献7参照）、ラット・アイソフォームはGLYT1a及び1bの2個しか同定されていない（非特許文献8〜10参照）。GLYT1は、ラットCNSにおいてグリア及びニューロンの両方に発現しているようであり（非特許文献1および9〜11参照）、GLYT1aは、灰白質及びいくつかの末梢組織に明らかに発現しているが、GLYT1bは、CNSの白質にのみ発現している（非特許文献10参照）。ヒトにおいて、全てのGLYT1アイソフォームに共通のプローブは、いくつかの末梢組織、最も注目すべきは腎臓における発現を明らかにしたが、GLYT1cは脳特異的であると思われる（非特許文献7参照）。GLYT1アイソフォームは、アミノ末端及び5'非コーディング領域のみが異なっている（非特許文献7および10参照）。GLYT1a及びGLYT1bは、オルタネート・プロモーターから指図された転写により生じるが、ヒトGLYT1cはGLYT1b転写物のスプライス・バリアントである（非特許文献7、12、および13参照）。GLYT1の末梢における発現及びアイソフォームのディファレンシャルなCNS発現パターンについては、いくぶん議論の余地があり、発表されている研究の間には重大な矛盾が明白に存在している。GLYT1は、脊髄、脳幹、及び間脳にGLYT2と共に発現している。興味深いことに、GLYT1は、機能性の阻害性グリシン作動性ニューロンが見出されない皮質、海馬、及び嗅球のような前脳野に発現しており（非特許文献1および8〜11参照）、従って、NMDA受容体により媒介される神経伝達の制御を含みうる、GLYT1の付加的な役割が示唆される（非特許文献9参照）。
【０００４】
NMDA受容体活性化には、グルタミン酸及びグリシンの両方の結合が必要である。グルタミン酸は、シナプス前終末から活性依存的に放出されるが、グリシンは明らかにより一定のレベルで存在しており、このことはより調整性の機能を示す。細胞外液及び脳脊髄液の中のグリシン濃度の測定は、それが低マイクロモーラー・レベルで存在していることを示唆している（非特許文献14参照）。しかしながら、グリシン・トランスポーターは、NMDA受容体の局所微小環境において著しくグリシン濃度を減少させ得る。実際、アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞におけるGLYT1の発現は、共発現されたNMDA受容体におけるグリシン濃度を減少させることが示されている（非特許文献15参照）。さらに、最近の研究により、グリシン取り込みメカニズムが、シナプスNMDA受容体活性を制御し得ることが示唆されている（非特許文献16および17参照）。NMDA受容体のグリシン親和性は、受容体NR2サブユニットの種類により影響を受け、組換え系において、NR2Aを含有している受容体は、NR2B、C、又はDを含有しているものと比べて著しく減少したグリシンに対する親和性を示す（非特許文献18〜20参照）。著しく低いグリシンに対する親和性を有するNMDA受容体の集団は、NR2Aの発現の発達的増加と平行して成熟の過程で出現し（非特許文献21参照）、このことから、正常な生理学的条件下でグリシンにより飽和されないNMDA受容体の集団が存在することが示唆される。
【０００５】
グルタミン酸による神経伝達、特に、NMDA受容体活性は、シナプス可塑性、学習、及び記憶において重大な役割を果たしており、例えば、NMDA受容体は、シナプス可塑性及び記憶形成の閾値のゲーティング（gating）のための等級付けされたスイッチ（graded switch）として機能すると考えられる（非特許文献22および23参照）。NMDA NR2Bサブユニットを過剰発現しているトランスジェニックマウスは、増強されたシナプス可塑性、並びに優れた学習及び記憶の能力を示す（非特許文献24参照）。
【０００６】
NMDA受容体の機能低下は、統合失調症の病態生理学に関連づけられている（非特許文献25および26参照）。PCP及びケタミンのような非競合性NMDA受容体アンタゴニストは、陽性及び陰性の症状、並びに認知機能障害が組み込まれており、従って、患者における統合失調症に類似している（非特許文献27参照）、統合失調症様の精神病を誘導することができる（非特許文献28〜30参照）。減少したレベルのNMDAR1サブユニットを発現しているトランスジェニックマウスは、薬理学的に誘導された統合失調症のモデルにおいて観察されるものと類似した行動異常を示し、このことから、減少したNMDA受容体活性が統合失調症様の症状をもたらすというモデルが支持される（非特許文献31参照）。さらに、NMDA受容体2Aサブユニットを欠くマウスは、海馬LTP及び空間学習の欠陥の他に、新規の環境における増加した自発運動活性及び水発見（water-finding）タスクにおける潜在学習の障害を示す（非特許文献32参照）。
【０００７】
GLYT1を過剰産生するマウスは、GLYT1の生理学的機能を評価するための貴重な道具を提供する。これらのマウスは、前脳における減少したグリシンのレベルを示すはずであり、それらは、NMDA受容体グリシン部位占有の活性な制御が、生理学的なNMDA受容体機能にとって重要であるか否かという疑問の解明において有用であり得る。
【０００８】
【非特許文献１】Zafra,F.ら著、J Neurosci、1995年、15(5 Pt 2)、p.3952-69
【非特許文献２】Luque,J.M.、N.Nelson、及びJ.G.Richards著、Neuroscience、1995年、64(2)、p.525-35
【非特許文献３】Jursky,F及びN.Nelson、J Neurochem著、1995年、64(3)、p.1026-33
【非特許文献４】Spike,R.C.ら著、Neuroscience、1997年、77(2)、p543-51
【非特許文献５】Morrow,J.A.ら著、FEBS Lett、1998年、439(3)、p.334-40
【非特許文献６】Liu,Q.R.ら著、J Biol Chem、1993年、268(39)、p.22802-8
【非特許文献７】Kim.K.M.ら著、Mol Pharmacol、1994年、45(4)、p.608-17
【非特許文献８】Guastella,J.ら著、Proc Natl Acad Sci USA、1992年、89(15)、p.7189-93
【非特許文献９】Smith,K.E.ら著、Neuron、1992年、8(5)、p.927-35
【非特許文献１０】Borowsky,B.、E.Mezey、及びB.J.Hoffman著、Neuron、1993年、10(5)、p.851-63
【非特許文献１１】Zafra,F.ら著、Eur J Neurosci、1995年、7(6)、p.1342-52
【非特許文献１２】Adams,R.H.ら著、J Neurosci、1995年、15(3 Pt 2)、p.2524-32
【非特許文献１３】Borowsky,B.及びB.J.Hoffman著、J Biol Chem、1998年、273(44)、p29077-85
【非特許文献１４】Westergren,I.ら著、J Neurochem、1994年、62(1)、p.159-65
【非特許文献１５】Supplisson,S.及びC.Bergman著、J Neurosci、1997年、17(12)、p.4580-90
【非特許文献１６】Berger,A.J.、S.Diendonne、及びP.Ascher著、J Neurophysiol、1998年、80(6)、p.3336-40
【非特許文献１７】Bergeron,R.ら著、Proc Natl Acad Sci USA、1998年、95(26)、p.15730-4
【非特許文献１８】Ikeda,K.ら著、FEBS Lett、1992年、313(1)、p.34-8
【非特許文献１９】Kutsuwada,T.ら著、Nature、1992年、358(6381)、p.36-41
【非特許文献２０】Priestley,T.ら著、Mol Pharmacol、1995年、48(5)、p.841-8
【非特許文献２１】Kew,J.N.ら著、J Neurosci、1998年、18(6)、p.1935-43
【非特許文献２２】Hebb,D.著、「The organization of behavior」、New York、Wiley出版、1949年
【非特許文献２３】Bliss,T.V.及びG.L.Collingridge著、Nature、1993年、361(6407)、p.31-9
【非特許文献２４】Tang,Y.P.ら著、Nature、1999年、401(6748)、p63-9
【非特許文献２５】Olney,J.W.及びN.B.Farber著、Arch Gen Psychiatry、1995年、52(12)、p.998-1007
【非特許文献２６】Hirsch,S.R.ら著、Pharmacol Biochem Behav.、1997年、56(4)、p.797-802
【非特許文献２７】Javitt,D.C.ら著、Biol Psychiatry、1999年、45(6)、p.668-79
【非特許文献２８】Allen,R.M.及びS.J.Young著、Am J Psychiatry、1978年、135(9)、p.1081-4
【非特許文献２９】Javitt,D.C.及びS.R.Zukin著、Am J Psychiatry、1991年、148(10)、p.1301-8
【非特許文献３０】Krystal,J.H.ら著、Arch Gen Psychiatry、1994年、51(3)、p.199-214
【非特許文献３１】Mohn,A.R.ら著、Cell、1999年、98(4)、p.427-36
【非特許文献３２】Miyamoto Y、Yamada K、Noda Y、Mori H、Mishima M、及びNabeshima T著、J.Neurosci、2001年、21(2)、p.750-757
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、GLYT1をコードするトランスジェニックDNAをゲノム内に含むトランスジェニック非ヒト動物を作製するための遺伝学的構築物及び方法を提供することを課題とする。これらのトランスジェニック動物は、さらに、活性GLYT1を過剰発現するトランスジェニック動物を生成するために使用され得る。さらに、GLYT1タンパク質を過剰発現するトランスジェニック動物、及びそれらを作製する方法も、提供される。本発明は、シナプスNMDA受容体機能の抑制の効果を分析するため、そして精神病性行動の症状を減少させる化合物の能力を研究するためのモデルとしての、これらの動物の使用にも関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る遺伝学的構築物においては、（１）プロモーターと機能的に連結されたGLYT1をコードするDNA配列を含む遺伝学的構築物であることを特徴とする。
【００１１】
本発明に係る遺伝学的構築物においては、（２）DNA配列がGLYT1のアイソフォームをコードする、上記(1)記載の遺伝学的構築物であることを特徴とする。
【００１２】
本発明に係る遺伝学的構築物においては、（３）DNA配列がGLYT1bをコードする、上記(1)記載の遺伝学的構築物であることを特徴とする。
【００１３】
本発明に係る遺伝学的構築物においては、（４）コード配列がヒト配列である、上記(1)〜(3)のいずれか一項記載の遺伝学的構築物であることを特徴とする。
【００１４】
本発明に係る遺伝学的構築物においては、（５）プロモーターが組織特異的プロモーターである、上記(1)〜(4)のいずれか一項記載の遺伝学的構築物であることを特徴とする。
【００１５】
本発明に係る遺伝学的構築物においては、（６）プロモーターが前脳特異的プロモーターである、上記(1)〜(4)のいずれか一項記載の遺伝学的構築物であることを特徴とする。
【００１６】
本発明に係る遺伝学的構築物においては、（７）プロモーターが調節可能プロモーターである、上記(1)〜(4)のいずれか一項記載の遺伝学的構築物であることを特徴とする。
【００１７】
本発明に係る方法においては、（８）GLYT1をコードするトランスジェニックDNAを含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物を作製する方法であって、
a）上記(1)〜(7)のいずれか一項記載の遺伝学的構築物を非ヒト接合体又は非ヒト胚性幹細胞に導入する段階、
b）該接合体又は胚性幹細胞からトランスジェニック非ヒト動物を作製する段階、及びそれにより
c）GLYT1をコードするトランスジェニックDNAを含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物を作製する段階
を含む方法であることを特徴とする。
【００１８】
本発明に係る方法においては、（９）トランスジェニックGLYT1を発現する非ヒトトランスジェニック動物を作製する方法であって、
a）上記(1)〜(7)のいずれか一項記載の遺伝学的構築物を非ヒト接合体又は非ヒト胚性幹細胞に導入する段階、
b）前記接合体又は胚性幹細胞からトランスジェニック非ヒト動物を作製する段階、及びそれにより
c）トランスジェニックGLYT1を発現するトランスジェニック非ヒト動物を作製する段階
を含む方法であることを特徴とする。
【００１９】
本発明に係る動物においては、（１０）上記(8)または(9)記載の方法により作製されたトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
【００２０】
本発明に係る動物においては、（１１）上記(1)〜(7)のいずれか一項記載の遺伝学的構築物を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
【００２１】
本発明に係る動物においては、（１２）齧歯類である、上記(10)または(11)記載のトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
【００２２】
本発明に係る動物においては、（１３）マウスである、上記(10)または(11)記載のトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
【００２３】
本発明に係る動物においては、（１４）GLYT1タンパク質を過剰発現する、上記(10)〜(13)のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
【００２４】
本発明に係る動物においては、（１５）組織特異的にGLYT1タンパク質を過剰発現する、上記(10)〜(13)のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
【００２５】
本発明に係る子孫においては、（１６）上記(10)〜(15)のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物の子孫であることを特徴とする。
【００２６】
本発明に係る細胞株または培養物においては、（１７）上記(10)〜(16)のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物またはその子孫に由来する細胞株または初代細胞培養物であることを特徴とする。
【００２７】
本発明に係る組織または培養物においては、（１８）上記(10)〜(16)のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物またはその子孫に由来する組織又は器官型脳切片培養物であることを特徴とする。
【００２８】
本発明に係る使用においては、（１９）精神病性行動に対する化合物の効果を研究するためのモデルとしての、上記(10)〜(16)のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物、上記(17)記載の細胞株もしくは初代細胞培養物、または上記(18)記載の組織もしくは器官型脳切片培養物の使用であることを特徴とする。
【００２９】
本発明に係る使用においては、（２０）GLYT1特異的阻害効果に関して化合物を試験するための、上記(10)〜(16)のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物、上記(17)記載の細胞株もしくは初代細胞培養物、または上記(18)記載の組織もしくは器官型脳切片培養物の使用であることを特徴とする。
【００３０】
本発明に係る使用においては、（２１）シナプスNMDA受容体機能の抑制の効果を研究するためのモデルとしての、上記(10)〜(16)のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物、上記(17)記載の細胞株もしくは初代細胞培養物、または上記(18)記載の組織もしくは器官型脳切片培養物の使用であることを特徴とする。
【００３１】
本発明に係る方法においては、（２２）NMDA受容体活性化に対するGLYT1機能のインビボ効果を評価するための方法であって、上記(10)〜(16)のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物においてNMDA受容体活性、シナプス可塑性、及び学習及び記憶を含む行動を決定する段階、並びに該NMDA受容体活性、シナプス可塑性、及び行動を対照におけるものと比較する段階を含む方法であることを特徴とする。
【００３２】
本発明に係る方法においては、（２３）NMDA受容体活性を増強する能力に関してGLYT1阻害化合物を試験する方法であって、GLYT1阻害化合物を、上記(10)〜(16)のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物、上記(17)記載の細胞株もしくは初代細胞培養物、または上記(18)記載の組織もしくは器官型脳切片培養物に投与する段階、行動、電気生理学、及び組織学を評価することを含む化合物の効果を決定する段階、並びに該行動、電気生理学、及び組織学を対照のものと比較する段階を含む方法であることを特徴とする。
【００３３】
本発明に係るキットにおいては、（２４）NMDA受容体活性を増強する能力に関してGLYT1阻害化合物を試験するためのキットであって、上記(10)〜(16)のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物、上記(17)記載の細胞株もしくは初代細胞培養物、または上記(18)記載の組織もしくは器官型脳切片培養物もしくは組織、及び化合物がNMDA受容体活性を増強する能力を示すか否かを判定するための手段を含むキットであることを特徴とする。
【００３４】
本発明に係る遺伝学的構築物、方法、トランスジェニック動物、キット、及び使用においては、（２５）特に実施例を参照して本明細書に実質的に記載される、遺伝学的構築物、方法、トランスジェニック動物、キット、及び使用であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３５】
本発明により、GLYT1をコードするトランスジェニックDNAをゲノム内に含むトランスジェニック非ヒト動物を作製するための遺伝学的構築物及び方法が提供される。これらのトランスジェニック動物は、さらに、活性GLYT1を過剰発現するトランスジェニック動物を生成するために使用され得る。さらに、GLYT1タンパク質を過剰発現するトランスジェニック動物、及びそれらを作製する方法も提供される。本発明は、シナプスNMDA受容体機能の抑制の効果を分析するため、そして精神病性行動の症状を減少させる化合物の能力を研究するためのモデルとしての、これらの動物の使用にも関する。従って、本発明により、プロモーターと機能的に連結されたGLYT1をコードするDNA配列を含む遺伝学的構築物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明は、プロモーターと機能的に連結されたGLYT1をコードするDNA配列を含む遺伝学的構築物を提供する。glyt1遺伝子の配列は、GLYT1のアイソフォームをコードし得る。好ましくは、glyt1遺伝子の配列は、GLYT1bをコードする。
【００３７】
好ましくは、glyt1遺伝子の配列は、cDNA配列である。より好ましくは、cDNAには、少なくとも1個のイントロン配列が組み込まれている。最も好ましくは、少なくとも1個のイントロン配列は、ポリアデニル化部位を含む。
【００３８】
glyt1遺伝子の配列は、任意の動物に由来し得るが、好ましくは、glyt1遺伝子の配列は、哺乳動物に由来し、より好ましくは、glyt1遺伝子の配列は、ヒト配列である。
【００３９】
プロモーターは、ニューロン・プロモーターであり得る。一つの態様において、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。組織特異的プロモーターは、組織特異的に、例えば、脳組織、筋組織、肝組織、腎組織等において遺伝子の発現を調節し指図する任意のプロモーターであり得る。好ましくは、プロモーターは、前脳における特異的発現を提供する。最も好ましくは、プロモーターは、マウスCamKαII-プロモーターである。
【００４０】
プロモーターは、調節可能プロモーターであってもよい。調節可能プロモーターは、例えば、特異的な誘導物質又は抑制物質の添加により制御可能かつ／又は誘導可能な様式でトランスジーンの発現を調節する任意のプロモーターであり得る。いくつかの誘導可能細菌プロモーターが、当技術分野において既知である（Schultze N、Burki Y、Lang Y、Certa U、Bluethmann H；Nat Biotechnol 1996；14(4):499-503：van der Neut R；Targeted gene disruption:applications in neurobiology；J Neurosci Methods 1997；71(1):19-27；Liu HS、Lee CH、Lee CF、Su IJ、Chang TY；Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian cell lines.Biotechniques.1998:24(4):624-8,630-2）。
【００４１】
好ましくは、遺伝学的構築物は、図1に図示されたようなものである。
【００４２】
「トランスジェニックDNA」という用語は、本明細書において使用されるように、生物に人工的に導入され組み込まれるDNAをさす。
【００４３】
「glyt1遺伝子の配列」という用語は、本明細書において使用されるように、GLYT1をコードするDNA配列をさす。
【００４４】
本発明は、さらに、
a）前記のような遺伝学的構築物を非ヒト接合体又は非ヒト胚性幹細胞に導入する段階、
b）該接合体又は胚性幹細胞からトランスジェニック非ヒト動物を作製する段階、及びそれにより
c）GLYT1をコードするトランスジェニックDNAを含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物を作製する段階
を含む、GLYT1をコードするトランスジェニックDNAを含むゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を作製する方法を提供する。
【００４５】
本発明のさらなる態様は、
a）前記のような遺伝学的構築物を、非ヒト動物に由来する非ヒト接合体又は非ヒト胚性幹細胞に導入する段階、
b）該接合体又は胚性幹細胞からトランスジェニック動物を作製する段階、及びそれにより
c）トランスジェニックGLYT1を発現するトランスジェニック非ヒト動物を作製する段階
を含む、トランスジェニックGLYT1を発現する非ヒトトランスジェニックマウス動物を作製する方法を提供する。
【００４６】
好ましくは、前記の方法において使用される接合体は、C57BL/6J接合体である。本発明の方法においても使用され得る、当技術分野において使用されている接合体には、以下に限定はされないが、FVB/N接合体、BALB/c接合体、DBA/1接合体、及びDBA/2接合体が含まれる。
【００４７】
好ましくは、前記の方法において使用される胚性幹細胞は、C57BL/6J胚性幹細胞である。以下に制限はされないが、BALB/c胚性幹細胞、DBA/2J胚性幹細胞、DBA/J胚性幹細胞、及びマウス系統129の胚性幹細胞株を含む当技術分野において使用されている幹細胞も、本発明の方法において使用され得る。
【００４８】
接合体又は胚性幹細胞は、任意の非ヒト動物に由来し得る。好ましくは、接合体又は胚性幹細胞は、齧歯類に由来する。より好ましくは、接合体又は胚性幹細胞は、マウスに由来する。
【００４９】
遺伝学的構築物の接合体への導入は、DNAの微量注入によって行われ得る。遺伝学的構築物の胚性幹細胞への導入は、ウイルス感染によって行われ得る。
【００５０】
例えば、前記方法のトランスジェニック非ヒト動物は、微量注入後の接合体を培養すること、培養された接合体を偽妊娠非ヒト動物に移植すること、及びトランスジェニック非ヒト動物を繁殖させることにより生成され得る。
【００５１】
「トランスジェニックGLYT1」という用語は、本明細書において使用されるように、生物に人工的に導入され組み込まれたDNAより生じたGLYT1タンパク質をさす。
【００５２】
「トランスジェニック動物」という用語は、本明細書において使用されるように、ゲノム内にトランスジェニックDNAを含む動物をさす。このトランスジェニックDNAは、ゲノム内のある場所に組み込まれ得る。
【００５３】
本発明は、さらに、前記方法のいずれかによって作製されたトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【００５４】
本発明の一つの態様において、GLYT1をコードするトランスジェニックDNAを含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物が提供される。好ましい態様において、トランスジェニック非ヒト動物は、図1に図示されるような遺伝学的構築物を含む。
【００５５】
もう一つの態様において、トランスジェニックGLYT1を発現するトランスジェニック非ヒト動物が提供される。好ましい態様において、トランスジェニックGLYT1は、組織特異的に、即ち、脳において、発現される。より好ましい態様において、トランスジェニックGLYT1は、トランスジェニック非ヒト動物の前脳において特異的に発現される。もう一つの態様において、トランスジェニックGLYT1の発現は、例えば、特異的な誘導物質又は抑制物質の添加により、調節され得る。
【００５６】
GLYT1タンパク質を過剰産生する記載されたトランスジェニック非ヒト動物においては、外因性グリシン・レベルの改変によるインビボのNMDA受容体活性の調整が予想される。海馬領域及び脳皮質領域にはGLYT2受容体が存在しないため、これらの領域におけるGLYT1の過剰発現は、グルタミン酸作動性シナプスにおけるグリシンのレベルを減少させ、従って、NMDA受容体機能を抑制する。従って、GLYT1を過剰発現する変異マウスは、それぞれ、行動の改変及び異常、統合失調症及び認知障害を発症すると予想される。
【００５７】
トランスジェニック非ヒト動物は、本発明の方法のため使用され得る、当技術分野において既知の任意の非ヒト動物であり得る。好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物は、哺乳動物であり、より好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物は、齧歯類である。最も好ましくは、本発明のトランスジェニック動物は、マウスである。
【００５８】
前記のトランスジェニック非ヒト動物は、遺伝学的、分子的、及び行動的に分析され得る。
【００５９】
本発明は、同一又は別の遺伝子型との交配により入手される、本発明により提供されたようなトランスジェニック非ヒト動物の子孫にも関する。
【００６０】
本発明は、さらに、本発明により提供されたようなトランスジェニック非ヒト動物又はその子孫に由来する細胞株又は初代細胞培養物、組織、及び器官型脳切片培養物を提供する。
【００６１】
細胞培養物に基づくモデルは、二つの方法により調製され得る。細胞培養物は、非ヒトトランスジェニックマウス動物から単離されてもよいし、又は標準的な細胞トランスフェクション技術により同構築物を使用して確立された細胞培養物から調製されてもよい。
【００６２】
GLYT1をコードするトランスジェニックDNAを含む遺伝学的構築物の組み込みは、2〜3週齢マウスの尾生検材料から単離されたDNAを使用したゲノミック・サザンブロット及びPCR分析を含む様々な方法により検出され得る。
【００６３】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）又はノーザンブロットによるmRNA定量を含むRNAレベルの方法、インサイチュー・ハイブリダイゼーション、並びに組織化学、イムノブロット分析、及びインビトロ結合研究を含むタンパク質レベルの方法を含む、多数の分析手法が、トランスジェニックDNAの発現を検出するために使用され得ることは、当業者には明白であると思われる。ターゲティングされた遺伝子の発現レベルの定量は、さらに、当業者に周知のELISA技術によって決定され得る。
【００６４】
定量的測定は、多くの標準的なアッセイを使用して達成され得る。例えば、転写物レベルは、RT-PCR、並びにRNaseプロテクション、ノーザンブロット分析、及びRNAドット分析を含むハイブリダイゼーション法を使用して測定され得る。免疫組織化学的染色及びウェスタンブロット分析も、トランスジェニックGLYT1タンパク質の存在又は欠如を評価するために使用され得る。
【００６５】
本発明のトランスジェニック動物は、さらに、免疫組織化学、電子顕微鏡、磁気共鳴画像法（MRI）を含む当技術分野において既知の方法、並びに神経学的機能及び認知機能を解明する行動研究により、特徴決定され得る。行動テストの例は、自発行動、認知機能に関連した行動、薬理学的に妨害された行動、握力、ワイヤー・マヌーバー（wire manoeuvre）、水泳テスト、回転棒、運動活性、モリス型水迷路（Morris water maze）、Y字迷路、明暗嗜好（light-dark preference）、受動的及び能動的な回避テストである。
【００６６】
本発明のさらなる目的は、精神病性行動を減少させる化合物の能力を研究するためのモデルとしての、記載されたようなトランスジェニック非ヒト動物、又はそれらに由来するような細胞株もしくは組織もしくは器官型脳切片培養物の使用である。さらに、これらのトランスジェニック動物、それらに由来するような細胞又は組織又は器官型脳切片培養物は、シナプスNMDA受容体機能の抑制の効果を研究するためのモデルとして使用され得る。
【００６７】
さらなる態様において、活性GLYT1タンパク質が過剰発現されるようglyt1遺伝子のトランスジェニック配列を含有しているゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物においてNMDA受容体活性、シナプス可塑性、及び学習及び記憶を含む行動を決定する段階、並びにそのNMDA受容体活性、シナプス可塑性、及び行動を対照におけるものと比較する段階を含む、NMDA受容体活性化に対するGLYT1機能のインビボ効果を評価するための方法が提供される。
【００６８】
対照には、活性GLYT1タンパク質が過剰発現されるようGLYT1をコードするトランスジェニックDNAが導入されていない任意の非ヒト動物、又はネイティブglyt1遺伝子を排他的に含む任意の非ヒト動物が含まれ得る。行動の評価には、自発行動、空間的な短期及び長期の記憶、物体認識記憶、連合情動記憶、条件恐怖消去を含む認知機能に関連した行動、並びに薬物により誘導された運動亢進、薬物により誘導された社会的引きこもり（social withdrawal）、薬物により誘導されたプレパルス・インヒビション（prepulse inhibition）の欠陥、及び薬物により誘導された記憶喪失を含む薬理学的に妨害された行動が含まれ得る。
【００６９】
もう一つの態様において、活性GLYT1タンパク質が過剰発現されるようglyt1遺伝子のトランスジェニック配列を含有しているゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、又はそれらに由来する細胞株もしくは初代細胞培養物もしくは器官型脳切片培養物にGLYT1阻害化合物を投与する段階、並びに行動、電気生理学、及び組織学を評価することを含む化合物の効果を決定する段階、並びにその行動、電気生理学、及び組織学を対照のものと比較する段階を含む、NMDA受容体機能を増強する能力に関してGLYT1阻害化合物を試験する方法を提供する。
【００７０】
本発明の方法において使用され得るGLYT1阻害化合物は、以下に限定はされないが、ALX-5407（NPS Pharmaceuticals）及びORG-24598（Organon）を含む、当技術分野において既知の任意のGLYT1阻害化合物である。
【００７１】
対照には、活性GLYT1タンパク質が過剰発現されるようGLYT1をコードするトランスジェニックDNAが導入されていない任意の動物、細胞株もしくは初代細胞培養物もしくは器官型脳切片培養物もしくは組織、又はネイティブglyt1遺伝子を排他的に含む任意の動物、細胞株もしくは初代細胞培養物もしくは器官型脳切片培養物が含まれ得る。行動の評価には、自発行動、空間的な短期及び長期の記憶、物体認識記憶、連合情動記憶、条件恐怖消去を含む認知機能に関連した行動、並びに薬物により誘導された運動亢進、薬物により誘導された社会的引きこもり、薬物により誘導されたプレパルス・インヒビションの欠陥、及び薬物により誘導された記憶喪失を含む薬理学的に妨害された行動が含まれ得る。
【００７２】
本発明は、さらに、活性GLYT1タンパク質が過剰発現されるようglyt1遺伝子のトランスジェニック配列を含有しているゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、又はそれらに由来する細胞株もしくは初代細胞培養物もしくは組織もしくは器官型脳切片培養もしくは組織、及び化合物がNMDA受容体活性を増強する能力を示すか否かを決定するための手段を含む、NMDA受容体活性を増強する能力に関して化合物を試験するためのキットに関する。
【００７３】
さらに、精神病性行動に対する化合物の効果を研究するため、そしてGLYT1特異的阻害効果に関して化合物を試験するためのモデルとしての、活性GLYT1タンパク質が過剰発現されるようglyt1遺伝子のトランスジェニック配列を含有しているゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、又はそれらに由来する細胞株もしくは初代細胞培養物もしくは組織もしくは器官型脳切片培養物もしくは組織の使用。
【００７４】
本発明は、さらに、特に実施例を参照して本明細書に実質的に記載されるトランスジェニック動物、方法、組成物、キット、及び使用を提供する。
【００７５】
以上、本発明を一般的に記載したが、本発明は、例示のためにのみ本明細書に含まれ、本発明を制限するものではない特定の実施例を、以下の図面と併せて参照することにより、よりよく理解されると思われる。
【実施例】
【００７６】
実施例において言及された商業的に入手可能な試薬は、特記しない限り、製造業者の指示に従い使用された。
【００７７】
実施例1
マウスの生成
A）ヒトGLYT1b cDNAのクローニング
公開されているヒトglyt1b-cDNA配列（注：GLYT1b配列は1cの配列として公開されている；配列番号:1）からの配列情報に基づき、ネスティッドPCRによる全ヒト脳のpACT2-cDNAライブラリー（Clontech）からのglyt1b-cDNAのクローニングのためのプライマー（配列番号:3〜6）を導出した。増幅されたcDNAを、クローニング・ベクターpCIのNheI及びEcoRI制限部位（Promega；配列番号:10）へとサブクローニングした。
【００７８】
B）hGlyt1bトランスジーンのクローニング
プライマーhuGlyt1b-2147FLAG-PvuII-rev（配列番号:7）及びhuGlyt1b-234c（配列番号:8）を使用して、上記ベクターからヒトglyt1b cDNAを再増幅した。そのアンプリコンをPvuIIで切断し、精製し、イントロン及びポリA配列の付加のためベクターpNN265（M.Mayford、E.Kandel、Columbia University,New York,USA；Choi,T.ら、Mol Cell Biol,1991.11(6):p.3070-4）のEcoRV部位へとクローニングし、ベクターpNN265-hGlyt1b-FLAGを得た。cDNA部分を配列決定し、使用されたPwo-ポリメラーゼによる正確な増幅を確認するため、公開されている配列と比較した。変異は見出されなかった。
【００７９】
その後、トランスジーンの前脳特異的ニューロン発現パターンを生成するため、hGlyt1b-cDNAを、マウスCamKαII-プロモーター（Mayford,M.ら、Science,1996.274(5293):p.1678-83）を含有しているベクターへとクローニングした。このため、pBluescript II SK+プラスミド（Stratagene）のマルチクローニング・サイトを制限部位KpnI、HindIII、及びNotIのみを含有しているミニマル・クローニングサイトに置換した。その後、NotI及びHindIIIにより、ベクターpNN279（Mayford,M.ら、Science,1996.274(5293):p.1678-83）からプロモーター・カセット（配列番号:2）を除去し、修飾されたpBluescript II SK+ベクターへとクローニングした。NotI消化によりhGlyt1b-cDNAを周囲のイントロンと共にpNN265-hGlyt1b-FLAGから除去し、mCamKαII-プロモーターの後方の非反復NotI部位へとクローニングした（図1）。
【００８０】
C）トランスジェニックマウスの生成
BssHII消化によりベクター骨格からトランスジェニック・カセットを切り出し、精製した。そのDNAをC57BL/6J接合体（The Jackson Laboratory,600 Main Street,Bar Harbor,Maine 04609 USAより入手可能）へと3ng/μlの濃度で注入し、確立された手法（Hogan,B.C.、F；Lacy,E、1986,New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press）に従いトランスジェニックマウスを生成した。その後の出生仔のゲノミックDNAを、トランスジェニック・カセットの1600bp断片を増幅するプライマーpNN-279-7431c（配列番号:9）及びhuGlyt1b-786nc（配列番号:10）を用いたPCRにより、トランスジーンの存在に関してスクリーニングした（図2及び3）。このスクリーニングにおいて同定されたファウンダーを、系を確立するため、C57BL/6Jマウスと交配した。
【００８１】
実施例2
GLYT1bトランスジェニックマウスの分子的分析
A）GLYT1b変異マウスの組織学的分析
変異マウスの脳におけるGLYT1bの過剰発現を、ウサギ及びモルモットにおいて作製されたGLYT1特異抗体を使用した免疫組織化学及びウェスタンブロット分析により確認した。
【００８２】
B）GLYT1b変異マウスの電気生理学的分析
NMDA受容体活性化は、ある種の型の長期増強（LTP）の誘導のため必要とされる（Bliss,T.V.及びG.L.Collingridge、Nature,1993.361(6407)：p.31-9）。GLYT1bトランスジェニック体の海馬切片におけるシータ・バースト刺激により誘導される増強を、以前に記載されたようにして（Kew,J.N.ら、J Neurosci,2000.20(11):p.4037-49）、テタヌス後期間を通して、野生型対照と比較した。GLYT1bトランスジェニックマウスが、野生型対照と比較して異なるレベルのLTP増強を示すか否か、を決定した。
【００８３】
C）前脳及び脳幹のシナプトソームの調製
マウスを屠殺し、脳組織を氷上で解剖し、その後の手法は4℃で実施した。ガラス／テフロン・ホモジナイザーを使用して、0.32Mショ糖及び1mMペファブロック（Pefabloc）（プロテアーゼ阻害剤のカクテル）を含有している10vol(w/v)の10mMトリス-HCl（pH7.4）（緩衝液A）で組織をホモジナイズした（800rpm 10回）。ホモジネートを1300×gで5分間遠心分離した。上清を注意深くデカントし、氷上で維持し、ペレットは（最初の重量の）5volの緩衝液Aに懸濁させ、前記のようにしてホモジナイズし、遠心分離した。第二の上清を第一のものに添加し、17,000×gで20分間遠心分離した。得られたペレット（粗シナプトソーム画分）を、（最初の重量の）5volの10mMグルコースを含有しているクレブス・リンゲル（Krebs-Riner）溶液（pH7.4）（KRB）に懸濁させた。
【００８４】
D）グリシン取り込み
96穴プレートでアッセイを実施した。マウスの前脳（0.1mg）及び脳幹（0.05mg）のシナプトソーム調製物の一部を、250μlの全容量で、120nM［3H］グリシンと共に、KRB中で、22℃で30分間インキュベートした。96穴パッカード（Packard）GF/Bユニフィルター・プレートへの急速濾過によりインキュベーションを停止した後、氷冷KRBで3回洗浄した。シンチレーション溶液の添加の後、ウェルの放射能含有量を測定した。
【００８５】
E）MK801に関する飽和結合
96穴深型プレートでアッセイを実施した。マウスの前脳及び脳幹のシナプトソーム調製物の一部（0.07mg）を、0.5mlの全容量で、増加する濃度（0.03nM〜300nM）の［3H］MK801と共に、100μMグルタミン酸及び30μMグリシンを含有している20mMヘペス-KOH（pH7.4）の中で、22℃で1時間インキュベートした。10μM MK801を用いて非特異的結合を定義した。96穴パッカードGF/Bユニフィルター・プレートへの急速濾過によりインキュベーションを停止した後、氷冷20mMヘペス-KOH（pH7.4）で3回洗浄した。シンチレーション溶液の添加の後、ウェルの放射能含有量を測定した。
【００８６】
F）インビボの細胞外グリシンレベル
グリシンの細胞外レベルに対する増加したGLYT1b発現の影響を評価するため、微小透析研究を実施した。野生型及び変異型の成体マウスにイソフルラン麻酔を施し、微小透析頭頂プローブ（CMA7 4/2、キュプロファン膜（Cuprophane-membrane）特別注文）を線条体（CPu、ブレグマA：＋0.9；L：-1.8；V：-4.6）へと挿入した。動物を3〜4日間回復させた後に実験を行った。透析液中のグリシン・レベルを、わずかに修飾されたスミス（Smith）及びシャープ（Sharp）の方法に従い定量した。
【００８７】
実施例3
GLYT1変異マウスの行動分析
A）神経学的評価
神経学的評価には、屈曲反射、握力（g）、並びに16及び32rpmの回転棒上に留まっていられる時間（秒）のような多数の神経学的テスト、並びに体重が含まれる。
【００８８】
B）自発行動
姿勢、歩行、及び感覚応答を含む自然の探索行動の兆候に関して、GLYT1bトランスジェニックマウスを観察した（Irwin,S.、Psychopharmacologia,1968.13(3):p.222-57）。さらに、自発運動活性を分析した（アクティビティ・ボックス（activity box））。さらに、自然の嫌悪刺激に動物を曝すことにより、不安の状態を評価した（高架式十字迷路テスト及び明暗選択テスト）。
【００８９】
C）聴覚性驚愕及び音響驚愕反射のプレパルス・インヒビション（統合失調症に関連した行動）
全ての音響刺激を発生する高周波拡声器を用いて、換気された減音室（sound attenuated cubicle）において、プレキシグラス・プラットフォーム上に設置されたプレキシグラス・シリンダー（直径5cm）から各々なる8個の驚愕装置において、試験を実施した。各チャンバーの暗雑音は68dBであった。シリンダー内の動きは、プレキシグラス・ベースに取り付けられた圧電加速度計により検出され伝達され、コンピューターによりディジタル化され保存された。動物の驚愕の大きさを得るため、65×1msecの読み取りを、刺激開始時から記録し始めた。
【００９０】
5分間の順化期間の後、分析には含めない5回の連続的な110dBのトライアルから、各セクションを開始した。次いで、10種の異なるトライアル型を提示した：驚愕パルス単独（ST110、110dB／40msec）；20msec超の72、78、84、及び90dBの刺激が、単独で提示されるか（P72、P78、P84、P90）又は110dBパルスの100msec前に提示される（PP72、PP78、PP84、PP90）、8種の異なるプレパルス・トライアル；最後に、シリンダー内の基線の動きを測定するため暗雑音のみが提示される1種のトライアル。全てのトライアルが、擬似乱数的順序で提示され、平均トライアル間隔（ITI）は15msecであった。驚愕データ及びプレパルス・インヒビション（PPI）率を、二元配置ANOVAにより分析した。
【００９１】
D）巣作り
変異マウスの、ティッシュを裂くことにより巣を作成する能力を定量するため、折り畳まれた数枚のティッシュペーパーを各ケージに置き、24時間後、巣を評価した。
【００９２】
E）脳室内NMDA誘導痙攣
意識のあるマウスの側脳室へのNMDA（1μl中5nM）の注射により発作を誘導した。注射の直後、動物をプレキシグラス・ボックスに置き、5分間観察した。ワイルド・ランニング期（wild running phase）及び間代性痙攣を示すまでの各マウスの潜時（秒）を、変異マウスと比較して野生型マウスで記録した。
【００９３】
F）認知機能に関連した行動
空間的な短期及び長期の記憶
Durkin（Durkin,T.P.ら、Behav Brain Res,2000.116(1):p.39-53）により記載されたようにして、ディレイド・マッチング・スペイシャル・ワーキング・メモリー・タスク（delayed matching spatial working memory task）を実施した。5つのアームからなる迷路におけるディレイド・マッチング・ルール（delayed matching rules）の獲得に基づき、作業記憶を評価した。基本の学習タスクは、二つの期からなっていた。他の4つのアームを閉じ、準ランダムに選択されたあるアームに強制的に動物を向かわせ報酬を与える提示期から、各トライアルを開始した。報酬を与えた後、動物を待機ケージに置いた。様々な長さの保持間隔（作業記憶に関しては2秒、20秒、及び40秒の遅延；短期及び長期の記憶に関しては5分、1時間、4時間、24時間の遅延）の後、動物を5つの開放されたアームからの選択の情況に曝す想起テスト期を実施した。先に向かったアームを正確に選択した場合、報酬を与えた。10秒という固定されたトライアル間隔での連続的なトライアルにおける正確な選択の率の平均値により、保持間隔の関数として、作業記憶保持能を表した。記憶タスクは、自動化されたビデオ・トラッキング・システムによりモニタリングされた。
【００９４】
又は、Morris（Morris,R.G.ら、Nature,1982.297(5868):p.681-3；Morris,R.G.ら、Nature,1986.319(6056):p.774-6）により記載された水迷路パラダイムにおいて、空間的な学習及び記憶を評価した。マウスを円形プール（直径120cm、高さ30cm）に置き、その中で、隠れたプラットフォームを探し当てることにより不透明な水（深さ20cm、20±1℃）から脱出することを学習させる。このターゲット・プラットフォーム（直径7cm、水面より1cm下）は、プールの特定の四分円の中央に置かれ、動物の航海を容易にするため、プールの周囲には外的な視覚的手がかりが位置づけられていた。4日間のテスト期間中、マウスは、4つの固定された出発位置からランダムに選択された一つにおいて、プールの壁に向かって水中に置かれた（各セッション3トライアル、1日3セッション）。マウスがターゲットを探し当てるまでに要する時間（脱出潜時）並びに泳路及び泳速が、自動化されたビデオ・モーティリティ・システムを使用して測定された。60秒以内にターゲットを見出すことができない場合には、その動物を手でプラットフォームに置き、トライアル間隔（10〜20秒）の間、そこに留まらせた。各セッション間の間隔は1.5〜2時間であった。4日目の最終トライアルの後、プラットフォームを除去し、マウスを60秒間自由に水泳させた。マウスが各四分円で過ごす時間及びそれらの泳路を記録した。
【００９５】
連合情動記憶
NMDA受容体依存性であった連合情動記憶を、2つの行動タスクにおいて評価した。
【００９６】
i．恐怖により増強される驚愕応答：マウスを、フットショック（嫌悪US）と対にされた光（CS）に応答するよう条件付けた。24時間の遅延の後、条件付けられた光刺激と共に又はそれなしで、異なる音響刺激（90〜110dB）により誘発された驚愕反射の大きさにより、情動記憶を評価した。条件付けられた光刺激の提示は、音響驚愕反射の増強をもたらす（Davis,M.、Psychopharmacology（Berl）,1979.62(1):p.1-7）。
【００９７】
ii．状況恐怖条件付け：状況恐怖条件付けとは、当初は中性であった状況が、無条件嫌悪刺激（US）との反復的な連合の後、嫌悪特性を獲得する、潜在的な嫌悪性連合学習過程であった。動物を新たなチャンバーに曝し、そこで、数分後、無条件恐怖応答（不動（freezing）行動）を誘発する連続的な電気フットショック（US）により処置した（Phillips,R.G.及びJ.E.LeDoux、Behav Neurosci,1992.106(2):p.274-85）。その状況への再曝露に応答して起こる不動の量により、状況恐怖条件付けを測定した。短期（1〜3時間）及び長期（1〜10日）の状況記憶を評価するため、訓練後の異なる時点で、条件不動応答を試験した。
【００９８】
条件恐怖消去
学習された恐怖応答の消去は、最初の学習された連合の末梢ではなく、新たな型の記憶の形成に依ると考えられた行動可塑性の一つの型を表す（Falls,W.A.、M.J.Miserendino及びM.Davis、J Neurosci,1992.12(3):p.854-63）。最近、条件恐怖の消去が、NMDA受容体依存性の過程を含むことが示された（Tang,Y.P.ら、Nature,1999.401(6748):p.63-9）。訓練後の24時間の遅延の後、5連続日にわたるその状況への反復曝露に応答して起こる不動の量の時間依存的減少により、条件不動の消去が評価され得る。
【００９９】
G）薬理学的に妨害された行動
運動亢進、プレパルス・インヒビション（PPI）の欠陥、及び記憶欠陥を含む統合失調症型症状の別個の範囲が、アポモルヒネ、D-アンフェタミン、又は非競合性NMDA受容体アンタゴニストPCPの投与により誘導され得る。野生型マウスにおいて行動を妨害するための最小有効用量を使用した。次いで、GLYT1bトランスジェニックマウスが、薬理学的な行動の妨害に対する異なる感受性を示すか否か、を試験した。
【０１００】
薬物により誘導される運動亢進
オープン・フィールド（アクティビティ・ボックス）において、水平運動活性、垂直活性、ステレオタイプ運動、及びオープン・フィールドの中心で過ごす時間を記録することにより、運動活性及びステレオタイプ行動に対するD-アンフェタミンの効果を評価した。
【０１０１】
薬物により誘導される社会的引きこもり
社会的行動におけるD-アンフェタミン又はPCPに対する行動応答に対するGLYT1b過剰発現の効果を評価するため、社会的探索テストを使用した（Crestani,F.、F.Seguy、及びR.Dantzer、Brain Res,1991.542(2):p.330-5）。個々に収容された雄マウスを、若年雌マウスに5分間曝した。肛門性器及び頸部のスニッフィング（sniffing）、ヘテログルーミング（heterogrooming）、及び追求（pursuits）を含む社会的相互作用を、薬物投与の前後に、ビデオ・トラッキング・システムにより記録した。薬物投与後の異なる時間間隔（30分、2時間、4時間、及び24時間）で、薬物により誘導される社会的探索の悪化を調査した。
【０１０２】
薬物により誘導されるプレパルス・インヒビションの欠陥
D-アンフェタミン又はPCPによるプレパルス・インヒビション（PPI）の妨害は、注意及び感覚運動ゲーティングが評価され得る、高頻度に使用されている感覚運動ゲーティング欠陥のモデルであった（Kretchmer,B.D.ら、Eur J Pharmacol,1997.331(2-3):p.109-16；Bakshi,V.P.及びM.A.Geyer、J Neurosci,1998.18(20):p.8394-401；Bakshi,V.P.ら、J Pharmacol Exp Ther,1999.288(2):p.643-52）。PPIとは、非驚愕誘導性プレパルス刺激の提示の後の音響性又は触覚性の驚愕応答の減弱であった。音響刺激後の動物の驚愕応答を評価した。
【０１０３】
薬物により誘導される記憶喪失
PCP又はアンフェタミンにより誘導される記憶機能の障害を、前記のディレイド・マッチング・スペイシャル・メモリー・タスク（delayed matching spatial memory task）において評価した。
【０１０４】
H）GLYT1b変異マウスにおける特異的GLYT1阻害剤によるインビトロ及びインビボの欠陥／障害の復帰
特異的GLYT1阻害剤がインビトロ（実施例2パラグラフB、D、及びE参照）又はインビボ（実施例2パラグラフF、実施例3パラグラフA〜F参照）で観察された障害／欠陥を復帰させ得るか否かを決定した。
【０１０５】
I）薬理学的にチャレンジされたGLYT1b変異マウスにおける特異的GLYT1阻害剤によるインビトロ及びインビボの欠陥／障害の復帰
特異的GLYT1阻害剤が、GLYT1b変異マウスにおいて、薬理学的な行動の妨害に対する改変された感受性（実施例3パラグラフG参照）を復帰させ得るか否かを決定した。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】組み込まれたイントロン（I）と共にマウスCamKαII-プロモーター、ヒトGLYT1bをコードするcDNA（hGlyt1b）を含む遺伝学的構築物の概略図である。ここで、1個のイントロンは、ポリアデニル化部位（pA）を含む。制限部位は図の上部に与えられている。
【図２】glyt1b-DNAのクローニング（配列番号:3〜8）及び組換えイベントの確認（配列番号:9及び10）のため使用されたプライマー対の概略図。
【図３】CamKaII-プロモーターの3'からglyt1b遺伝子の5'までのトランスジェニック・カセットについてのPCR（配列番号:9及び10）。遺伝学的構築物から生じたアンプリコンは、1600bpというサイズを有する。内因性遺伝子は、アンプリコンを与えない。17〜22：F1マウス、M：マーカー。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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