(57)【要約】      （修正有）【課題】労力および時間が必要な圃場での特性調査に代わる迅速、簡便、且つ正確なギニアグラスの品種識別法を開発すること。【解決手段】ギニアグラス由来の特定な塩基配列からなり、ギニアグラス品種の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチド；試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、前記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、前記オリゴヌクレオチドに対応して、該試料中に特定のギニアグラス品種が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在または消失を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種の識別方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツカゼ」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項１記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツカゼ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツカゼ」の識別方法。
【請求項３】
配列表の配列番号２記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツカゼ」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項３記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツカゼ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツカゼ」の識別方法。
【請求項５】
配列表の配列番号３記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツカゼ」および／または「ナツユタカ」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項５記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツカゼ」および／または「ナツユタカ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツカゼ」および／または「ナツユタカ」の識別方法。
【請求項７】
配列表の配列番号４記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツユタカ」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項７記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツユタカ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツユタカ」の識別方法。
【請求項９】
配列表の配列番号５記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツユタカ」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項９記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツユタカ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツユタカ」の識別方法。
【請求項１１】
配列表の配列番号６記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツユタカ」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項１１記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツユタカ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツユタカ」の識別方法。
【請求項１３】
配列表の配列番号７記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツコマキ」および／または「ナツサカリ」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項１３記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツコマキ」および「ナツサカリ」が存在しない場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの消失を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツコマキ」および／または「ナツサカリ」の識別方法。
【請求項１５】
配列表の配列番号８記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツコマキ」および／または「ナツサカリ」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項１５記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツサカリ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在、該試料中にギニアグラス品種「ナツサカリ」が存在しない場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの消失、並びに「ナツコマキ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツサカリ」および／または「ナツコマキ」の識別方法。
【請求項１７】
配列表の配列番号９記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツサカリ」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項１７記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツサカリ」が存在しない場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの消失を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツサカリ」の識別方法。
【請求項１９】
配列表の配列番号１０記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツサカリ」および／または「グリーンパニック」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項１９記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツサカリ」および／または「グリーンパニック」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツサカリ」および／または「グリーンパニック」の識別方法。
【請求項２１】
配列表の配列番号１１記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ガットン」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項２１記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ガットン」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ガットン」の識別方法。
【請求項２３】
配列表の配列番号１２記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「グリーンパニック」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項２３記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「グリーンパニック」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「グリーンパニック」の識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ギニアグラスの品種識別用オリゴヌクレオチド、および該ヌクレオチドを用いたギニアグラス品種の識別方法に関し、詳しくは、ギニアグラスの１または２品種が特異的に有しているもしくは消失しているＤＮＡに相補的であり、識別プライマーとして有用なオリゴヌクレオチド、および、ギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、前記オリゴヌクレオチドを識別プライマーとして用いて、そのプライマー間のゲノム領域をＰＣＲ増幅させて安定的に検出されるＤＮＡ断片のうち、ギニアグラスの１または２品種において特異的に存在または消失する特定のＤＮＡ断片の存在を確認することにより、ギニアグラス品種を効率的に識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ギニアグラスは、家畜の飼料として用いられるイネ科牧草である。ギニアグラスのうち、特に「ナツカゼ」、「ナツユタカ」、「ナツコマキ」、「ナツサカリ」、「ガットン」および「グリーンパニック」は家畜の飼料用としての需要が高いため、品種識別の必要性が高い。
なお、本明細書においては、ギニアグラス品種の名称を括弧（「  」）内に示して表している（例えば、「ナツカゼ」）。
【０００３】
一般的な品種識別法としては、それぞれの個体の遺伝子についてＤＮＡマーカーの有無を調査することによるＤＮＡマーカーによる品種識別法が挙げられる。ＤＮＡマーカーとは、一般的な植物（自殖性作物等）の場合は、ある品種の遺伝子中には１００％の頻度で存在し、もう一方の品種では０％の頻度で存在する塩基配列である。
ギニアグラスは、アポミクシス（無配合生殖）という特性を有していることから、品種内の遺伝子的な変異が小さいことが知られている（非特許文献１参照）。従って、前記のようなＤＮＡマーカーを発見できる可能性が高いが、これまでのところギニアグラスにおいては、ＤＮＡマーカーによる品種識別法は開発されていない。
このため、ギニアグラスの品種識別は、これまでは圃場での特性調査により行われてきた。
【０００４】
圃場での特性調査とは、例えば一検体につき１０個体６反復計６０個体を栽培し、草丈、出穂月日等からなる重要形質７形質、調査形質３形質について調査を行い、共に栽培した標準種子の集団と比較して同品種かどうか判定を行う方法である。
しかしながら、このような圃場での特性調査は、１）検定のための圃場が必要、２）調査に多くの労力が必要、３）検査結果が判明するまでに多くの時間が必要、等の問題点がある。
【０００５】
【非特許文献１】作物育種の理論と方法、第２４０頁〜第２４４頁、村上  寛一監修（１９８３）、株式会社  養賢堂発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の目的は、労力および時間が必要な圃場での特性調査に代わる迅速、簡便、且つ正確なギニアグラスの品種識別法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、各種ギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、ある種のランダムプライマーを用いて、そのプライマー間のゲノム領域をＰＣＲ増幅させて安定的に検出されるＤＮＡ断片のうちに、ギニアグラスのうちの１または２品種において特異的に存在するもしくは消失するＤＮＡ断片があり、これらのＤＮＡ断片はＤＮＡマーカーとして有用であることを見出した。
さらに、本発明者らは、これらのＤＮＡ断片を、いわゆるＤＮＡマーカーとして利用して、ギニアグラスの一種であり、特に家畜の飼料用として需要の高い「ナツカゼ」、「ナツユタカ」、「ナツコマキ」、「ナツサカリ」、「ガットン」および「グリーンパニック」の６品種を、ＤＮＡマーカーの存在または消失により、迅速、簡便且つ正確に識別できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
請求項１記載の本発明は、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツカゼ」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供するものである。
請求項２記載の本発明は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項１記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツカゼ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツカゼ」の識別方法を提供するものである。
【０００９】
請求項３記載の本発明は、配列表の配列番号２記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツカゼ」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供するものである。
請求項４記載の本発明は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項３記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツカゼ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツカゼ」の識別方法を提供するものである。
【００１０】
請求項５記載の本発明は、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツカゼ」および／または「ナツユタカ」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供するものである。
請求項６記載の本発明は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項５記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツカゼ」および／または「ナツユタカ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツカゼ」および／または「ナツユタカ」の識別方法を提供するものである。
【００１１】
請求項７記載の本発明は、配列表の配列番号４記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツユタカ」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供するものである。
請求項８記載の本発明は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項７記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツユタカ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツユタカ」の識別方法を提供するものである。
【００１２】
請求項９記載の本発明は、配列表の配列番号５記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツユタカ」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供するものである。
請求項１０記載の本発明は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項９記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツユタカ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツユタカ」の識別方法を提供するものである。
【００１３】
請求項１１記載の本発明は、配列表の配列番号６記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツユタカ」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供するものである。
請求項１２記載の本発明は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項１１記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツユタカ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツユタカ」の識別方法を提供するものである。
【００１４】
請求項１３記載の本発明は、配列表の配列番号７記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツコマキ」および／または「ナツサカリ」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供するものである。
請求項１４記載の本発明は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項１３記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツコマキ」および「ナツサカリ」が存在しない場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの消失を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツコマキ」および／または「ナツサカリ」の識別方法を提供するものである。
【００１５】
請求項１５記載の本発明は、配列表の配列番号８記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツコマキ」および／または「ナツサカリ」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供するものである。
請求項１６記載の本発明は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項１５記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツサカリ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在、該試料中にギニアグラス品種「ナツサカリ」が存在しない場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの消失、並びに「ナツコマキ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツサカリ」および／または「ナツコマキ」の識別方法を提供するものである。
【００１６】
請求項１７記載の本発明は、配列表の配列番号９記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツサカリ」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供するものである。
請求項１８記載の本発明は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項１７記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツサカリ」が存在しない場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの消失を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツサカリ」の識別方法を提供するものである。
【００１７】
請求項１９記載の本発明は、配列表の配列番号１０記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツサカリ」および／または「グリーンパニック」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供するものである。
請求項２０記載の本発明は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項１９記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツサカリ」および／または「グリーンパニック」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツサカリ」および／または「グリーンパニック」の識別方法を提供するものである。
【００１８】
請求項２１記載の本発明は、配列表の配列番号１１記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ガットン」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供するものである。
請求項２２記載の本発明は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項２１記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ガットン」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ガットン」の識別方法を提供するものである。
【００１９】
請求項２３記載の本発明は、配列表の配列番号１２記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「グリーンパニック」の識別に用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供するものである。
請求項２４記載の本発明は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項２３記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「グリーンパニック」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「グリーンパニック」の識別方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、特定のギニアグラスを識別できる識別マーカーが提供され、これを用いることにより、圃場での特性調査のような労力および時間を必要とせずに、ギニアグラス６品種の識別を迅速、簡便、且つ正確に行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
まず、本発明のオリゴヌクレオチドについて説明する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ギニアグラス品種の識別に用いられる、以下の１２種類のオリゴヌクレオチドである。
請求項１に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツカゼ」の識別に用いられることを特徴とする。
請求項３に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツカゼ」の識別に用いられることを特徴とする。
【００２２】
請求項５に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツカゼ」および／または「ナツユタカ」の識別に用いられることを特徴とする。
【００２３】
請求項７に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号４記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツユタカ」の識別に用いられることを特徴とする。
請求項９に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号５記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツユタカ」の識別に用いられることを特徴とする。
請求項１１に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号６記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツユタカ」の識別に用いられることを特徴とする。
【００２４】
請求項１３に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号７記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツコマキ」および／または「ナツサカリ」の識別に用いられることを特徴とする。
請求項１５に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号８記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツコマキ」および／または「ナツサカリ」の識別に用いられることを特徴とする。
【００２５】
請求項１７に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号９記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツサカリ」の識別に用いられることを特徴とする。
【００２６】
請求項１９に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１０記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ナツサカリ」および／または「グリーンパニック」の識別に用いられることを特徴とする。
【００２７】
請求項２１に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１１記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「ガットン」の識別に用いられることを特徴とする。
請求項２３に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１２記載の塩基配列からなり、ギニアグラス品種「グリーンパニック」の識別に用いられることを特徴とする。
【００２８】
本発明の各オリゴヌクレオチドは、上記各塩基配列からなるものであれば、天然の生物から抽出して得られるものでも良く、または合成されるものであっても良い。
例えば、品種識別用のプライマーとして用いる場合には、市販の合成プライマー（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより市販され得る）を購入し、利用することができる。
【００２９】
上記のように、本発明の各オリゴヌクレオチドは、それぞれギニアグラス品種の識別に用いることができる。
即ち、本発明の各オリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼ連鎖反応用のプライマーとして利用すると、ギニアグラスのうち、「ナツカゼ」、「ナツユタカ」、「ナツコマキ」、「ナツサカリ」、「ガットン」および「グリーンパニック」のうちの１または２種類以上の特定品種のゲノムＤＮＡを鋳型として、特定のＤＮＡ断片を増幅するので、反応後、増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、特定のバンドの存在または不存在を確認することにより、試料中のギニアグラスの品種を識別することが可能となる。
【００３０】
さらに、本発明は、このようなオリゴヌクレオチドを用いたギニアグラス品種の識別方法をも提供する。
即ち、請求項２に係る本発明は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項１記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツカゼ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツカゼ」の識別方法を提供するものである。
請求項４に係る本発明は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項３記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツカゼ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツカゼ」の識別方法を提供するものである。
【００３１】
請求項６に係る本発明は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項５記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツカゼ」および／または「ナツユタカ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツカゼ」および／または「ナツユタカ」の識別方法を提供するものである。
【００３２】
請求項８に係る本発明は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項７記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツユタカ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツユタカ」の識別方法を提供するものである。
請求項１０に係る本発明は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項９記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツユタカ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツユタカ」の識別方法を提供するものである。
請求項１２に係る本発明は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項１１記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツユタカ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツユタカ」の識別方法を提供するものである。
【００３３】
請求項１４に係る本発明は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項１３記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツコマキ」および「ナツサカリ」が存在しない場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの消失を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツコマキ」および／または「ナツサカリ」の識別方法を提供するものである。
【００３４】
請求項１６に係る本発明の方法は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項１５記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツサカリ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在、該試料中にギニアグラス品種「ナツサカリ」が存在しない場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの消失、並びに「ナツコマキ」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツサカリ」および／または「ナツコマキ」の識別方法を提供するものである。
【００３５】
請求項１８に係る本発明の方法は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項１７記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツサカリ」が存在しない場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの消失を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツサカリ」の識別方法を提供するものである。
【００３６】
請求項２０に係る本発明の方法は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項１９記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ナツサカリ」および／または「グリーンパニック」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ナツサカリ」および／または「グリーンパニック」の識別方法を提供するものである。
【００３７】
請求項２２に係る本発明の方法は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項２１記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「ガットン」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「ガットン」の識別方法を提供するものである。
【００３８】
請求項２４に係る本発明の方法は、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項２３記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、該試料中にギニアグラス品種「グリーンパニック」が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在を確認する工程を包含することを特徴とするギニアグラス品種「グリーンパニック」の識別方法を提供するものである。
【００３９】
本発明の各識別方法における特異的なバンド、即ち識別マーカーの存在または消失、とギニアグラス６品種との関係は、表１に示す通りである。尚、表１中の各バンド（識別マーカー）のサイズ（ｂｐ）に記載の数値は、サイズマーカー１００ｂｐ  ＤＮＡ  ＬａｄｄｅｒおよびλＨｉｎｄＩＩＩを用いて計測されたものであるが、厳密な値ではなく、サイズの大小により１００ｂｐ前後の変動が、電気泳動の条件に依存し得る。
【００４０】
【表１】
2005080520.tif 000002
＋：バンド存在、−：バンド消失
【００４１】
表１に示すように、請求項２に係る本発明の識別方法においては、試料中に「ナツカゼ」が存在する場合に８５０ｂｐのバンド（識別マーカーＮｏ．１）が特異的に増幅されるので、このバンドの存在を確認することにより「ナツカゼ」を識別することができる。
請求項４に係る本発明の識別方法においては、試料中に「ナツカゼ」が存在する場合に４７０ｂｐのバンド（識別マーカーＮｏ．２）が特異的に増幅されるので、このバンドの存在を確認することにより「ナツカゼ」を識別することができる。
【００４２】
請求項６に係る本発明の識別方法においては、試料中に、「ナツカゼ」および／または「ナツユタカ」が存在する場合に、８３０ｂｐのバンド（識別マーカーＮｏ．３）が特異的に増幅されると共に、「ナツカゼ」が存在する場合に、６００ｂｐのバンド（識別マーカーＮｏ．４）が特異的に増幅されるので、これらのバンドの存在を確認することにより「ナツカゼ」および／または「ナツユタカ」を識別することができる。
【００４３】
請求項８に係る本発明の識別方法においては、試料中に「ナツユタカ」が存在する場合に、２５０ｂｐのバンド（識別マーカーＮｏ．５）が特異的に増幅されるので、このバンドの存在を確認することにより「ナツユタカ」を識別することができる。
請求項１０に係る本発明の識別方法においては、試料中に「ナツユタカ」が存在する場合に、３１９０ｂｐのバンド（識別マーカーＮｏ．６）が特異的に増幅されるので、このバンドの存在を確認することにより「ナツユタカ」を識別することができる。
請求項１２に係る本発明の識別方法においては、試料中に「ナツユタカ」が存在する場合に、１１１０ｂｐのバンド（識別マーカーＮｏ．７）が特異的に増幅されるので、このバンドの存在を確認することにより「ナツユタカ」を識別することができる。
【００４４】
請求項１４に係る本発明の識別方法においては、試料中に「ナツコマキ」および「ナツサカリ」が存在しない場合に、８８０ｂｐのバンド（識別マーカーＮｏ．８）が特異的に増幅されるので、このバンドの消失を確認することにより「ナツコマキ」および／または「ナツサカリ」を識別することができる。
【００４５】
請求項１６に係る本発明の識別方法においては、試料中に「ナツサカリ」が存在する場合に、２つのバンド（識別マーカーＮｏ．９：３５３０ｂｐのバンド、識別マーカーＮｏ．１１：８２０ｂｐのバンド）が特異的に増幅されると共に、試料中に「ナツサカリ」が存在しない場合に、１６００ｂｐのバンド（識別マーカーＮｏ．１０）が特異的に増幅される。一方、試料中に「ナツコマキ」が存在する場合に、特異的な５００ｂｐのバンド（識別マーカーＮｏ．１２）が特異的に増幅されるので、これらのバンドの存在または消失を確認することにより「ナツサカリ」および／または「ナツコマキ」を識別することができる。
【００４６】
請求項１８に係る本発明の識別方法においては、試料中に「ナツサカリ」が存在しない場合に、４６０ｂｐのバンド（識別マーカーＮｏ．１３）が特異的に増幅されるので、このバンドの消失を確認することにより「ナツサカリ」を他のギニアグラスから識別することができる。
【００４７】
請求項２０に係る本発明の識別方法においては、試料中に「ナツサカリ」が存在する場合に、４３０ｂｐのバンド（識別マーカーＮｏ．１４）が特異的に増幅されると共に、試料中に「グリーンパニック」が存在する場合に、３２０ｂｐのバンド（識別マーカーＮｏ．１５）が特異的に増幅されるので、これらのバンドの存在を確認することにより「ナツサカリ」および／または「グリーンパニック」を識別することができる。
【００４８】
請求項２２に係る本発明の識別方法においては、試料中に「ガットン」が存在する場合に、２９５０ｂｐのバンド（識別マーカーＮｏ．１６）が特異的に増幅されるので、このバンドの存在を確認することにより「ガットン」を識別することができる。
【００４９】
請求項２４に係る本発明の識別方法においては、試料中に「グリーンパニック」が存在する場合に、６００ｂｐのバンド（識別マーカーＮｏ．１７）が特異的に増幅されるので、このバンドの存在を確認することにより「グリーンパニック」を識別することができる。
【００５０】
本発明の各識別方法は、第一に、試料中のギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、各オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅ＤＮＡ産物を得る工程を包含する。
ここで、試料としては、品種を識別したいギニアグラスを適宜用いることができるが、出穂前の、枯れていない、健康な葉が好ましい。
試料からのギニアグラスのゲノムＤＮＡの調製には、植物細胞からのＤＮＡの抽出に一般的に用いられる手段を用いることができる。このような手段としては、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）を抽出バッファーとして使用する方法（ＣＴＡＢ法とも称する）が好適に使用され得る。このようなプロトコルとしては、例えば、ＲｏｇｅｒｓｏｙおよびＢｅｎｄｉｃｈ、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ａ６：１−１０（１９８８）；および植物バイオテクノロジー実験マニュアル  クローニングとシークエンス、第２５２頁〜第２５６頁、１９８９年６月１５日発行、株式会社農村文化社出版に記載のようなプロトコルが挙げられる。
【００５１】
各オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるためには、例えば、市販の合成プライマー（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより市販され得る）を購入し、利用することができる。
【００５２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ギニアグラスのゲノムＤＮＡを鋳型に、各オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるのであれば、その他の条件は、通常の条件、例えば、Ｓａｉｋｉら、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９に記載の条件で実施され得る。具体的には例えば、下記の実施例と実質的に同等の条件下で実施され得る。
【００５３】
溶媒としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、核酸増幅反応で通常使用され得るいずれもの緩衝液（市販による入手可能なキット中の緩衝液を含む）等を適宜用いることができる。
ＤＮＡポリメラーゼとしては、市販により入手可能な、または当業者に調製可能な任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することができ、好ましくは、Ｔａｑポリメラーゼが使用され得る。デオキシヌクレオチドは、通常、ＤＮＡ合成の直接の前駆物質として使用され得る物質であり、各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰとも称される：デオキシシトシン三リン酸、デオキシグアニン三リン酸、デオキシアデニン三リン酸およびデオキシチミジン三リン酸を含む）を使用することができる。
【００５４】
ＰＣＲの熱変性、アニーリング、および伸長の条件は、用いるプライマーの長さおよび組成、ポリメラーゼの酵素性質などを考慮して、反応温度および反応時間が当業者によって適宜設定され得る。非特異的なバンドの生成を避けるためには、ストリンジェントな条件を設定することが好ましい。
このようなＰＣＲは、通常のＰＣＲ自動化機器（例えば、ＰＥ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより市販されている）を、製造業者によって提供される仕様書に従って使用することにより、好都合に実施され得る。
【００５５】
本発明の各識別方法は、第二に、増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、各識別方法において用いるオリゴヌクレオチドに対応して、該試料中に特定のギニアグラス品種が存在する場合に特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在または消失を確認する工程を包含する。
ここで、増幅ＤＮＡ産物とは、先に述べたＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ産物を意味する。
電気泳動としては、アガロースゲル電気泳動等のＤＮＡのバンドを検出するために通常使用される電気泳動が使用され得る。電気泳動の条件については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙなどの実験書に記載される条件に基づいて行うことができる。具体的には例えば、下記の実施例と実質的に同等の条件下で実施され得る。
【００５６】
増幅ＤＮＡ産物を電気泳動し、各識別方法において用いるオリゴヌクレオチドに対応して、該試料中に特定のギニアグラス品種が存在する場合に、特異的に増幅されるＤＮＡ断片に相当するバンドの存在または消失を確認するには、例えば、まず、増幅ＤＮＡ産物を、好ましくは当業者に周知の適切なサイズマーカーと一緒にゲルに載せ、適切な条件下で電気泳動する。ここで、サイズマーカーとしては、好ましくは、ＤＮＡサイズマーカー１００ｂｐ  ＤＮＡ  ＬａｄｄｅｒおよびλＨｉｎｄＩＩＩが使用され得る。
電気泳動の結果、特異的なバンドが検出されるか、または消失している場合には、対応するギニアグラスの品種であると判断される。サイズマーカーを用いた場合は、サイズマーカーの位置と照らし合わせてそのバンドの大きさを容易に推定することができるとともに、表１のサイズ（ｂｐ）に記載の数値との照合も可能であることから、正確な推定が可能である。
【００５７】
本発明の各識別方法によれば、ゲノムＤＮＡ情報において品種間の差異を反映するので、ギニアグラスの生育環境に影響されることなく、ギニアグラスの６品種である、「ナツカゼ」、「ナツユタカ」、「ナツコマキ」、「ナツサカリ」、「ガットン」および「グリーンパニック」を正確、かつ迅速に識別することができる。
また、本発明の各識別方法を組み合わせることにより、より正確な品種識別が可能である。特に、請求項１４に係る本発明の識別方法単独では、「ナツコマキ」および「ナツサカリ」のいずれが含まれているかが分からないので、請求項１６に係る本発明の識別方法、請求項１８に係る本発明の識別方法等と組み合わせることにより、「ナツコマキ」および「ナツサカリ」のいずれかまで判断することができる。
【００５８】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されない。本実施例で使用した材料、試薬、装置などは、他に特定のない限り、商業的な供給源から入手可能である。使用され得る試薬は、工業的に利用可能な等級の試薬である。
【実施例１】
【００５９】
ギニアグラスの１品種「ナツカゼ」を、他の５品種「ナツユタカ」、「ナツコマキ」、「ナツサカリ」、「ガットン」および「グリーンパニック」から識別した。
【００６０】
（ギニアグラスのゲノムＤＮＡの調製）
ギニアグラスの各品種のゲノムＤＮＡは、「植物バイオテクノロジー実験マニュアル  クローニングとシークエンス」、第２５２頁〜第２５６頁、１９８９年６月１５日発行、株式会社農村文化社出版に記載のＣＴＡＢバッファーを用いるゲノムＤＮＡの調製法に基づいて調製した。ゲノムＤＮＡは、枯れていない健康な葉から調製した。
【００６１】
ゲノムＤＮＡの調製は、以下の手順および条件で行った。
各品種において、枯れていない健康な葉５ｇを液体窒素下で細かく粉砕し、破砕組織を得た。この破砕組織を、１．５×ＣＴＡＢ液（２×ＣＴＡＢ液（２％ＣＴＡＢ；０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０；２０ｍＭ  ＥＤＴＡ；１．４Ｍ  ＮａＣｌ；１％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ））の１．５倍希釈液）７．５ｍｌと共に混合し、６５℃で６０分間静置した。
これに内容量が２０ｇになるように１×ＣＴＡＢ液（上記２×ＣＴＡＢ液２倍希釈液）を添加した後、７．５ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１；ｖ／ｖ）を添加した。室温で３０分間ゆっくりと振盪した。次いで、２８００ｒｐｍ、１０分、室温で遠心分離した。この上層に７．５ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１；ｖ／ｖ）を添加し、これを室温で６０分間ゆっくりと振盪した。次いで２８００ｒｐｍ、１０分、室温で遠心分離し、上清を得た。
一方、先の遠心分離の下層に５ｍｌの１×ＣＴＡＢ液を添加し、これを室温で６０分間、ゆっくりと振盪し、この上清もまた得た。
【００６２】
これらの上清を混和し、７．５ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１；ｖ／ｖ）を添加し、これを室温で３０分間ゆっくりと振盪した。次いで、２８００ｒｐｍ、１０分、室温で遠心分離し、さらに上清を分離した。
この上清に、７．５ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１；ｖ／ｖ）を添加し、これを室温で３０分間ゆっくりと振盪した。次いで、２８００ｒｐｍ、１０分、室温で遠心分離した。この上清に、１／１０容１０％ＣＴＡＢ液（１０％ＣＴＡＢ；０．７Ｍ  ＮａＣｌ）を添加し、混和した後、室温で２０〜３０分静置した。
次いでこれを２等分し、それぞれに１０ｍｌの１％ＣＴＡＢ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０；１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含むバッファーを添加し、１晩静置した。次いで、１６００ｒｐｍ、１０分、室温で遠心分離し、沈殿物を得た。
【００６３】
この沈殿物にそれぞれ２．５ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌ−ＴＥ（１Ｍ  ＮａＣｌ；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、５５℃とし、沈殿物が溶解した後、それぞれを混和し、５ｍｌのイソプロピルアルコールを添加した。次いで沈殿物に１ｍｌの７０％エタノールを添加した後、７０％エタノールを除去する工程を５回繰り返した。次いで沈殿物に１ｍｌのＴＥを添加し、５５℃とした。沈殿物が溶解した後、１μｌのＲＮａｓｅ液（１ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ）を添加し、３７℃で６０分間おいた。次いで、４℃下に保存した。
【００６４】
（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ断片の増幅）
反応に使用した耐熱性ポリメラーゼは、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ（寶酒造製）であった。
反応液の組成（１μｌあたりの濃度で示す）は、上述のようにして調製した、試験される各品種のギニアグラス由来のゲノムＤＮＡ（０．８ｎｇ）、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるプライマー（０．２ｐｍｏｌ）、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ）（各０．２ｍｍｏｌ）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．０２５ｕｎｉｔ）であった。
バッファーは、上記のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含むキットに備え付けのバッファーを使用した。
ＰＣＲは、１サイクルを、熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（４６℃、２分）、および伸長反応（７２℃、３分）とし、これを４５サイクル行った。
【００６５】
（電気泳動によるゲノムＤＮＡ断片の分画）
上記のようにして得られたＰＣＲ反応液に、１／１０容の泳動用色素（０．２５％ブロモフェノールブルー；０．２５％キシレンシアノールＦＦ；１５％フィコール；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を混合し、１０μｌを１．５％アガロースゲルのウェル部にのせた。また、ＤＮＡサイズマーカーとしての１００ｂｐ  ＤＮＡ  ＬａｄｄｅｒおよびλＨｉｎｄＩＩＩをゲルのウェル部にのせた。次いで、７５Ｖで約５時間（もしくは、７５Ｖで２０分、その後２５Ｖで約１５時間）泳動した。
アガロースは、ＴＡＥ緩衝液に溶解して調製した。なお、電気泳動用緩衝液としてＴＡＥ緩衝液を使用した。
電気泳動終了後、アガロースゲルをエチジウムブロマイド溶液（０．５μｇ／ｍｌ）に５分間浸した。ＤＮＡ断片の電気泳動パターンは、紫外線照射下でポラロイドカメラを用いて撮影した。
電気泳動パターンを図１に示す。
【００６６】
図１から明らかなように、矢印の位置のバンドは、「ナツカゼ」に存在するが、他の５品種からは消失していることから、本バンドの存在または消失を確認することにより、「ナツカゼ」と他の５品種を識別できることが明らかとなった。なお、本バンドの位置は、サイズマーカー１００ｂｐ  ＤＮＡ  ＬａｄｄｅｒおよびλＨｉｎｄＩＩＩを用いた結果、８５０ｂｐであることが示唆される。
【実施例２】
【００６７】
ギニアグラスの１品種「ナツカゼ」を、他の５品種「ナツユタカ」、「ナツコマキ」、「ナツサカリ」、「ガットン」および「グリーンパニック」から識別した。
【００６８】
ギニアグラスのゲノムＤＮＡの調製は、実施例１記載と同様の方法で行った。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ断片の増幅は、プライマーとして、配列表の配列番号２記載の塩基配列からなるプライマーを用いた他は、実施例１記載と同様の方法で行った。
電気泳動によるゲノムＤＮＡ断片の分画は、実施例１記載と同様の方法で行った。電気泳動パターンを図２に示す。
【００６９】
図２から明らかなように、本図の矢印の位置のバンドは、「ナツカゼ」には存在するが、他の５品種は消失していることから、本バンドの存在または消失を確認することにより、「ナツカゼ」と他の５品種を識別できることが明らかとなった。なお、本バンドの位置は、サイズマーカー１００ｂｐ  ＤＮＡ  ＬａｄｄｅｒおよびλＨｉｎｄＩＩＩを用いた結果、４７０ｂｐであることが示唆される。
【実施例３】
【００７０】
ギニアグラスの１品種「ナツカゼ」を、他の５品種「ナツユタカ」、「ナツコマキ」、「ナツサカリ」、「ガットン」および「グリーンパニック」から、ギニアグラスの１品種「ナツユタカ」を、他の５品種「ナツカゼ」、「ナツコマキ」、「ナツサカリ」、「ガットン」および「グリーンパニック」から、同時に識別した。
【００７１】
ギニアグラスのゲノムＤＮＡの調製は、実施例１記載と同様の方法で行った。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ断片の増幅は、プライマーとして、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるプライマーを用いた他は、実施例１記載と同様の方法で行った。
電気泳動によるゲノムＤＮＡ断片の分画は、実施例１記載と同様の方法で行った。電気泳動パターンを図３に示す。
【００７２】
図３から明らかなように、本図の上の矢印の位置のバンドは、「ナツカゼ」および「ナツユタカ」には存在するが、他の４品種は消失している。また、下の矢印の位置のバンドは、「ナツカゼ」には存在するが、他の５品種は消失している。
これらのことから、２つのバンドの存在または消失を確認することにより、「ナツカゼ」と他の５品種を、また、「ナツユタカ」と他の５品種を、同時に識別できることが明らかとなった。
なお、これらのバンドの位置は、サイズマーカー１００ｂｐ  ＤＮＡ  ＬａｄｄｅｒおよびλＨｉｎｄＩＩＩを用いた結果、上から順に、８３０ｂｐおよび６００ｂｐであることが示唆される。
【実施例４】
【００７３】
ギニアグラスの１品種「ナツユタカ」を、他の５品種「ナツカゼ」、「ナツコマキ」、「ナツサカリ」、「ガットン」および「グリーンパニック」から識別した。
ギニアグラスのゲノムＤＮＡの調製は、実施例１記載と同様の方法で行った。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ断片の増幅は、プライマーとして、配列表の配列番号４記載の塩基配列からなるプライマーを用いた他は、実施例１記載と同様の方法で行った。
電気泳動によるゲノムＤＮＡ断片の分画は、実施例１記載と同様の方法で行った。電気泳動パターンを図４に示す。
【００７４】
図４から明らかなように、本図の矢印の位置のバンドは、「ナツユタカ」には存在するが、他の５品種は消失していることから、本バンドの存在または消失を確認することにより、「ナツユタカ」と他の５品種を識別できることが明らかとなった。
なお、本バンドの位置は、サイズマーカー１００ｂｐ  ＤＮＡ  ＬａｄｄｅｒおよびλＨｉｎｄＩＩＩを用いた結果、２５０ｂｐであることが示唆される。
【実施例５】
【００７５】
ギニアグラスの１品種「ナツユタカ」を、他の５品種「ナツカゼ」、「ナツコマキ」、「ナツサカリ」、「ガットン」および「グリーンパニック」から識別した。
ギニアグラスのゲノムＤＮＡの調製は、実施例１記載と同様の方法で行った。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ断片の増幅は、プライマーとして、配列表の配列番号５記載の塩基配列からなるプライマーを用いた他は、実施例１記載と同様の方法で行った。
電気泳動によるゲノムＤＮＡ断片の分画は、実施例１記載と同様の方法で行った。電気泳動パターンを図５に示す。
【００７６】
図５から明らかなように、本図の矢印の位置のバンドは、「ナツユタカ」には存在するが、他の５品種は消失していることから、本バンドの存在または消失を確認することにより、「ナツユタカ」と他の５品種を識別できることが明らかとなった。
なお、本バンドの位置は、サイズマーカー１００ｂｐ  ＤＮＡ  ＬａｄｄｅｒおよびλＨｉｎｄＩＩＩを用いた結果、３１９０ｂｐであることが示唆される。
【実施例６】
【００７７】
ギニアグラスの１品種「ナツユタカ」を、他の５品種「ナツカゼ」、「ナツコマキ」、「ナツサカリ」、「ガットン」および「グリーンパニック」から識別した。
ギニアグラスのゲノムＤＮＡの調製は、実施例１記載と同様の方法で行った。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ断片の増幅は、プライマーとして、配列表の配列番号６記載の塩基配列からなるプライマーを用いた他は、実施例１記載と同様の方法で行った。
電気泳動によるゲノムＤＮＡ断片の分画は、実施例１記載と同様の方法で行った。  電気泳動パターンを図６に示す。
【００７８】
図６から明らかなように、本図の矢印の位置のバンドは、「ナツユタカ」には存在するが、他の５品種は消失していることから、本バンドの存在または消失を確認することにより、「ナツユタカ」と他の５品種を識別できることが明らかとなった。
なお、本バンドの位置は、サイズマーカー１００ｂｐ  ＤＮＡ  ＬａｄｄｅｒおよびλＨｉｎｄＩＩＩを用いた結果、１１１０ｂｐであることが示唆される。
【実施例７】
【００７９】
ギニアグラスの２品種「ナツコマキ」および「ナツサカリ」を、他の４品種「ナツカゼ」、「ナツユタカ」、「ガットン」および「グリーンパニック」から識別した。
ギニアグラスのゲノムＤＮＡの調製は、実施例１記載と同様の方法で行った。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ断片の増幅は、プライマーとして、配列表の配列番号７記載の塩基配列からなるプライマーを用いた他は、実施例１記載と同様の方法で行った。
電気泳動によるゲノムＤＮＡ断片の分画は、実施例１記載と同様の方法で行った。電気泳動パターンを図７に示す。
【００８０】
図７から明らかなように、本図の矢印の位置のバンドは、「ナツコマキ」および「ナツサカリ」は消失しているが、他の４品種には存在することから、本バンドの存在または消失を確認することにより、「ナツコマキ」および「ナツサカリ」と他の４品種を識別できることが明らかとなった。なお、本バンドの位置は、サイズマーカー１００ｂｐ  ＤＮＡ  ＬａｄｄｅｒおよびλＨｉｎｄＩＩＩを用いた結果、８８０ｂｐであることが示唆される。
【実施例８】
【００８１】
ギニアグラスの１品種「ナツコマキ」を、他の５品種「ナツカゼ」、「ナツユタカ」、「ナツサカリ」、「ガットン」および「グリーンパニック」から、ギニアグラスの１品種「ナツサカリ」を、他の５品種「ナツカゼ」、「ナツコマキ」、「ナツユタカ」、「ガットン」および「グリーンパニック」から同時に識別した。
【００８２】
ギニアグラスのゲノムＤＮＡの調製は、実施例１記載の方法と同様の方法で行った。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ断片の増幅は、プライマーとして、配列表の配列番号８記載の塩基配列からなるプライマーを用いた他は、実施例１記載と同様の方法で行った。
電気泳動によるゲノムＤＮＡ断片の分画は、実施例１記載と同様の方法で行った。
電気泳動パターンを図８に示す。
【００８３】
図８から明らかなように、図中の４つの矢印のうち、１番上の矢印および上から３番目の矢印の位置のバンドは、「ナツサカリ」には存在するが、他の５品種は消失している。また、上から２番目の矢印の位置のバンドは、「ナツサカリ」は消失しているが、他の５品種には存在する。さらに、１番下の矢印の位置のバンドは、「ナツコマキ」には存在するが、他の５品種からは消失している。
これらのことから、４つのバンドの存在または消失を確認することにより、「ナツコマキ」と他の５品種を、また「ナツサカリ」と他の５品種を同時に識別できることが明らかとなった。
なお、これらのバンドの位置は、サイズマーカー１００ｂｐ  ＤＮＡ  ＬａｄｄｅｒおよびλＨｉｎｄＩＩＩを用いた結果、上から順に、３５３０ｂｐ、１６００ｂｐ、８２０ｂｐおよび５００ｂｐであることが示唆される。
【実施例９】
【００８４】
ギニアグラスの１品種「ナツサカリ」を、他の５品種「ナツカゼ」、「ナツユタカ」、「ナツコマキ」、「ガットン」および「グリーンパニック」から識別した。
ギニアグラスのゲノムＤＮＡの調製は、実施例１記載と同様の方法で行った。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ断片の増幅は、プライマーとして、配列表の配列番号９記載の塩基配列からなるプライマーを用いた他は、実施例１記載と同様の方法で行った。
電気泳動によるゲノムＤＮＡ断片の分画は、実施例１記載と同様の方法で行った。電気泳動パターンを図９に示す。
【００８５】
図９から明らかなように、本図の矢印の位置のバンドは、「ナツサカリ」は消失しているが、他の５品種には存在することから、本バンドの存在または消失を確認することにより、「ナツサカリ」と他の５品種を識別できることが明らかとなった。
なお、本バンドの位置は、サイズマーカー１００ｂｐ  ＤＮＡ  ＬａｄｄｅｒおよびλＨｉｎｄＩＩＩを用いた結果、４６０ｂｐであることが示唆される。
【実施例１０】
【００８６】
ギニアグラスの１品種「ナツサカリ」を、他の５品種「ナツカゼ」、「ナツユタカ」、「ナツコマキ」、「ガットン」および「グリーンパニック」から、ギニアグラスの１品種「グリーンパニック」を、他の５品種「ナツカゼ」、「ナツユタカ」、「ナツコマキ」、「ナツサカリ」および「ガットン」から、同時に識別した。
【００８７】
ギニアグラスのゲノムＤＮＡの調製は、実施例１記載と同様の方法で行った。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ断片の増幅は、プライマーとして、配列表の配列番号１０記載の塩基配列からなるプライマーを用いた他は、実施例１記載と同様の方法で行った。
電気泳動によるゲノムＤＮＡ断片の分画は、実施例１記載と同様の方法で行った。電気泳動パターンを図１０に示す。
【００８８】
図１０から明らかなように、本図の上の矢印の位置のバンドは、「ナツサカリ」には存在するが、他の５品種は消失している。また、下の矢印の位置のバンドは、「グリーンパニック」には存在するが、他の５品種は消失している。
このことから、これら２つのバンドの存在または消失を確認することにより、「ナツサカリ」と他の５品種を、また、「グリーンパニック」と他の５品種を、同時に識別できることが明らかとなった。
なお、これらのバンドの位置は、サイズマーカー１００ｂｐ  ＤＮＡ  ＬａｄｄｅｒおよびλＨｉｎｄＩＩＩを用いた結果、上から順に、４３０ｂｐおよび３２０ｂｐであることが示唆される。
【実施例１１】
【００８９】
ギニアグラスの１品種「ガットン」を、他の５品種「ナツカゼ」、「ナツユタカ」、「ナツコマキ」、「ナツサカリ」および「グリーンパニック」から識別した。
ギニアグラスのゲノムＤＮＡの調製は、実施例１記載と同様の方法で行った。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ断片の増幅は、プライマーとして、配列表の配列番号１１記載の塩基配列からなるプライマーを用いた他は、実施例１記載と同様の方法で行った。
電気泳動によるゲノムＤＮＡ断片の分画は、実施例１記載と同様の方法で行った。電気泳動パターンを図１１に示す。
【００９０】
図１１から明らかなように、本図の矢印の位置のバンドは、「ガットン」には存在するが、他の５品種は消失していることから、本バンドの存在または消失を確認することにより、「ガットン」と他の５品種を識別できることが明らかとなった。
なお、本バンドの位置は、サイズマーカー１００ｂｐ  ＤＮＡ  ＬａｄｄｅｒおよびλＨｉｎｄＩＩＩを用いた結果、２９５０ｂｐであることが示唆される。
【実施例１２】
【００９１】
ギニアグラスの１品種「グリーンパニック」を、他の５品種「ナツカゼ」、「ナツユタカ」、「ナツコマキ」、「ナツサカリ」および「ガットン」から識別した。
【００９２】
ギニアグラスのゲノムＤＮＡの調製は、実施例１記載と同様の方法で行った。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ断片の増幅は、プライマーとして、配列表の配列番号１２記載の塩基配列からなるプライマーを用いた他は、実施例１記載と同様の方法で行った。
電気泳動によるゲノムＤＮＡ断片の分画は、実施例１記載と同様の方法で行った。電気泳動パターンを図１２に示す。
【００９３】
図１２から明らかなように、本図の矢印の位置のバンドは、「グリーンパニック」には存在するが、他の５品種は消失していることから、本バンドの存在または消失を確認することにより、「グリーンパニック」と他の５品種を識別できることが明らかとなった。
なお、本バンドの位置は、サイズマーカー１００ｂｐ  ＤＮＡ  ＬａｄｄｅｒおよびλＨｉｎｄＩＩＩを用いた結果、６００ｂｐであることが示唆される。
【実施例１３】
【００９４】
ギニアグラスの品種「ナツカゼ」について、育種家種子から２世代増殖した種子である原種子を用いて、増殖された原種子が「ナツカゼ」であるかどうか、育種家種子と比較して確認を行った。なお、今回用いた原種子は、圃場での特性調査で「ナツカゼ」として品種の確認が行われているものである。
ギニアグラスのゲノムＤＮＡの調製は、実施例１記載の方法と同様の方法で行った。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ断片の増幅は、プライマーとして、配列表の配列番号２記載の塩基配列からなるプライマーを用いたこと以外は、実施例１記載の方法と同様の方法で行った。
また、電気泳動によるゲノムＤＮＡ断片の分画は、実施例１記載の方法と同様の方法で行った。
電気泳動パターンを図１３に示す。
【００９５】
図１３から明らかなように、矢印の位置のバンド（４７０ｂｐであることが示唆される）は、「ナツカゼ」には存在するが、他の５品種は消失している。「ナツカゼ」育種家種子５個体すべてにバンドが存在しているのと同様に、２世代増殖した原種子２０個体についても、すべてにバンドが存在している。
これらのことから、増殖された原種子は「ナツカゼ」であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明により、特定のギニアグラスを識別できる識別マーカーが提供され、これを用いることにより、圃場での特性調査のように労力および時間を必要とせずに、ギニアグラス６品種の識別を迅速、簡便且つ正確に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】実施例１により得られたギニアグラス品種の電気泳動パターンを示す電気泳動写真である。
【図２】実施例２により得られたギニアグラス品種の電気泳動パターンを示す電気泳動写真である。
【図３】実施例３により得られたギニアグラス品種の電気泳動パターンを示す電気泳動写真である。
【図４】実施例４により得られたギニアグラス品種の電気泳動パターンを示す電気泳動写真である。
【図５】実施例５により得られたギニアグラス品種の電気泳動パターンを示す電気泳動写真である。
【図６】実施例６により得られたギニアグラス品種の電気泳動パターンを示す電気泳動写真である。
【図７】実施例７により得られたギニアグラス品種の電気泳動パターンを示す電気泳動写真である。
【図８】実施例８により得られたギニアグラス品種の電気泳動パターンを示す電気泳動写真である。
【図９】実施例９により得られたギニアグラス品種の電気泳動パターンを示す電気泳動写真である。
【図１０】実施例１０により得られたギニアグラス品種の電気泳動パターンを示す電気泳動写真である。
【図１１】実施例１２により得られたギニアグラス品種の電気泳動パターンを示す電気泳動写真である。
【図１２】実施例１３により得られたギニアグラス品種の電気泳動パターンを示す電気泳動写真である。
【図１３】実施例１３により得られたギニアグラス品種の電気泳動パターンを示す電気泳動写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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