(57)【要約】      （修正有）【課題】耐分解性および強度、使用者の取り扱い性に優れ、さらに従来臨床の現場では治療を断念せざるを得なかった重度の歯周組織損傷にも対応可能な歯周組織再生能を有する歯周組織再生用材料開発が求められている。【解決手段】本発明は、コラーゲン糸状物と、該コラーゲン糸状物の表面に形成した生分解性高分子のコーティング層とを有する複合糸状物からなる歯周組織再生用材料を提供する。該歯周組織再生用材料は、歯周組織再生の良好な足場材料となり、従来臨床の現場では治療を断念せざるを得なかった重度の歯周組織損傷にも適応可能な歯周組織再生能を有し、分解吸収性に非常にも優れている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン糸状物と、該コラーゲン糸状物の表面に形成した生分解性高分子のコーティング層とを有する複合糸状物からなる歯周組織再生用材料。
【請求項２】
複合糸状物を多孔体に成型した請求項１に記載の歯周組織再生用材料。
【請求項３】
連通多孔体が、厚さ約０．０５〜７０ｍｍの膜状である請求項２に記載の歯周組織再生用材料。
【請求項４】
コラーゲン糸状物の外径が約５〜７０μｍである請求項１に記載の歯周組織再生用材料。
【請求項５】
生分解性高分子がポリ乳酸、コラーゲン、ポリグリコール酸、多糖類、生分解性ポリエステルまたはポリペプチドである請求項１に記載の歯周組織再生用材料。
【請求項６】
生分解性高分子がポリ乳酸である請求項１に記載の歯周組織再生用材料。
【請求項７】
コラーゲン糸状物と、生分解性高分子溶液とを混合し、そのまま乾燥して得られた複合糸状物からなる歯周組織再生用材料。
【請求項８】
コラーゲン糸状物と、該コラーゲン糸状物の表面に形成した生分解性高分子のコーティング層とを有する複合糸状物からなる歯周組織再生用材料に、細胞を播種し、培養して得られた歯周組織再生用材料。
【請求項９】
細胞が、間葉系幹細胞、上皮幹細胞、造血幹細胞、血管内皮幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、内耳幹細胞、膵臓幹細胞、骨芽細胞、骨膜由来細胞、線維芽細胞、胚性幹細胞または体性幹細胞である請求項８に記載の歯周組織再生用材料。
【請求項１０】
コラーゲン糸状物と、生分解性高分子溶液とを混合し、そのまま乾燥させることを特徴とする歯周組織再生用材料の製造方法。
【請求項１１】
コラーゲン糸状物と、該コラーゲン糸状物の表面に形成した生分解性高分子のコーティング層とを有する複合糸状物からなる歯周組織再生用材料に、細胞を播種し、培養することを特徴とする歯周組織再生用材料の製造方法。
【請求項１２】
コラーゲン糸状物と、該コラーゲン糸状物の表面に形成した生分解性高分子のコーティング層とを有する複合糸状物からなる歯周組織再生用材料を、歯周組織欠損部に適応させ、歯周組織欠損部周囲の歯肉弁を被せて縫合固定することを特徴とする歯周組織再生方法。
【請求項１３】
コラーゲン糸状物と、該コラーゲン糸状物の表面に形成した生分解性高分子のコーティング層とを有する複合糸状物からなる歯周組織再生用材料に、細胞を播種し、培養して得られた歯周組織再生用材料を、歯周組織欠損部に適応させ、歯周組織欠損部周囲の歯肉弁で被せて縫合固定することを特徴とする歯周組織再生方法。
【請求項１４】
コラーゲン糸状物と、該コラーゲン糸状物の表面に形成した生分解性高分子のコーティング層とを有する複合糸状物を、厚さ約０．０５〜２ｍｍの平面膜状である連通多孔体に成型した歯周組織再生用材料を、歯周組織が再生する空間を保持するための遮断手段として用いることを特徴とする歯周組織再生方法。
【請求項１５】
コラーゲン糸状物および生分解性高分子溶液を含んでなる歯周組織再生用材料調製キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン糸状物と、該コラーゲン糸状物の表面に設けた生分解性高分子のコーティング層からなる歯周組織再生用材料、製造方法、使用方法ならびに調製キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
歯の表面に付着したデンタルプラーク（歯垢）は実にその７０％以上が虫歯菌や歯周病菌などによって占められている、いわば細菌の塊である。歯垢中の細菌により歯周組織は炎症性反応を起こし、歯根との結合組織性付着を喪失する。この結合組織性付着を喪失した箇所は、歯肉上皮（上皮細胞）の再生速度が、歯槽骨（骨芽細胞）に代表される他の歯周組織の再生速度よりも早いため、歯肉上皮のダウングロースにより接合上皮性付着の形で治癒され、歯の周囲に歯周ポケットと呼ばれる溝が形成される。この歯周ポケットのために、さらに歯垢がたまりやすくなり、再び炎症性反応を起こす、という悪循環が繰り返され、歯を支えるべき歯周組織が失われていく。これが歯周病の症状であり、最終的には歯が抜け落ちてしまう恐れがある。更に、脱落してしまった歯の代替物として義歯の装着やインプラントを行うにしても、このように歯の土台たる歯周組織が失われた状態では実施することは困難である。
【０００３】
近年、歯周病学領域においてＧＴＲ（Ｇｕｉｄｉｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）法が注目されている。これは、外科的に歯肉と歯根の間に所期の歯周組織が再生するためのスペースを設け、新付着の形での治癒反応を生じさせる一方で、その空隙を遮断する膜により蓋をし、歯肉上皮の侵入、すなわちダウングロースを阻害するという方法である。ＧＴＲ法とは、遮断膜（ＧＴＲ膜）を用いて歯肉上皮のダウングロースを阻止しつつ、歯周組織が再生するスペースを確保することにより、歯周組織の再生を促す方法である。従来、ＧＴＲ膜としてテトラフルオロエチレン多孔性材料やポリエステルフィルターなどの半透膜を用いていた。しかし、これらのＧＴＲ膜は生体内で分解吸収されないので、術後に取り除く必要がある上に、全層歯肉弁と癒着しないため、縫合部から開裂が起きてしまうという欠点があった。
【０００４】
一方、ＧＴＲ膜の材料として、コラーゲン、ポリ乳酸、酸化セルロースなどの生分解性材料を用いた場合は、歯周組織が完全に再生する時間よりも、ＧＴＲ膜の分解する時間が早いこと、強度的に弱いなどの問題があった。
【０００５】
また、これまでのＧＴＲ膜は、前述したように歯周組織が再生する「スペース」を確保するためだけのものであり、組織の再生自体は自己治癒力任せであった。そのため、例えば重度な歯槽骨の欠損である、水平的骨欠損などを現在のＧＴＲ膜で修復することは不可能であった。
【０００６】
さらに、現在のＧＴＲ法は、手術時のＧＴＲ膜の取り扱いが難しいという、手術手技上の問題点があった。術式自体は有効な方法であるだけに、術者の練度が手術の正否を分ける要因となる傾向があり、取り扱いの簡便なＧＴＲ膜が求められていた。
【０００７】
係る問題を解決するために、耐分解性および強度に優れたＧＴＲ膜が開発されている（特許文献１）。さらに、損傷部が大きい場合は、生分解性材料で形成された固定具を併用することにより組織の再生を図る技術も開発されている（特許文献２）。しかし、これらの遮断膜を使用したときの歯周組織再生についての結果は一切開示されていない。
【０００８】
【特許文献１】特開平７−２６５３３７号公報
【特許文献２】特開平８−１９１８４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、耐分解性および強度、使用者の取り扱い性に優れ、さらに従来臨床の現場では治療を断念せざるを得なかった重度の歯周組織損傷にも対応可能な歯周組織再生能を有する歯周組織再生用材料の開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、
（１）  コラーゲン糸状物と、該コラーゲン糸状物の表面に形成した生分解性高分子のコーティング層とを有する複合糸状物からなる歯周組織再生用材料、
（２）  複合糸状物を多孔体に成型した（１）に記載の歯周組織再生用材料、
（３）  連通多孔体が、厚さ約０．０５〜７０ｍｍの膜状である（２）に記載の歯周組織再生用材料、
（４）  コラーゲン糸状物の外径が約５〜７０μｍである（１）に記載の歯周組織再生用材料、
（５）  生分解性高分子がポリ乳酸、コラーゲン、ポリグリコール酸、多糖類、生分解性ポリエステルまたはポリペプチドである（１）に記載の歯周組織再生用材料、
（６）  生分解性高分子がポリ乳酸である（１）に記載の歯周組織再生用材料、
（７）  コラーゲン糸状物と、生分解性高分子溶液とを混合し、そのまま乾燥して得られた複合糸状物からなる歯周組織再生用材料、
（８）  コラーゲン糸状物と、該コラーゲン糸状物の表面に形成した生分解性高分子のコーティング層とを有する複合糸状物からなる歯周組織再生用材料に、細胞を播種し、培養して得られた歯周組織再生用材料、
（９）  細胞が、間葉系幹細胞、上皮幹細胞、造血幹細胞、血管内皮幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、内耳幹細胞、膵臓幹細胞、骨芽細胞、骨膜細胞、線維芽細胞、胚性幹細胞または体性幹細胞である（８）に記載の歯周組織再生用材料、
（１０）  コラーゲン糸状物と、生分解性高分子溶液とを混合し、そのまま乾燥させることを特徴とする歯周組織再生用材料の製造方法、
（１１）  コラーゲン糸状物と、該コラーゲン糸状物の表面に形成した生分解性高分子のコーティング層とを有する複合糸状物からなる歯周組織再生用材料に、細胞を播種し、培養することを特徴とする歯周組織再生用材料の製造方法、
（１２）  コラーゲン糸状物と、該コラーゲン糸状物の表面に形成した生分解性高分子のコーティング層とを有する複合糸状物からなる歯周組織再生用材料を、歯周組織欠損部に適応させ、歯周組織欠損部周囲の歯肉弁を被せて縫合固定することを特徴とする歯周組織再生方法、
（１３）  コラーゲン糸状物と、該コラーゲン糸状物の表面に形成した生分解性高分子のコーティング層とを有する複合糸状物からなる歯周組織再生用材料に、細胞を播種し、培養して得られた歯周組織再生用材料を、歯周組織欠損部に適応させ、歯周組織欠損部周囲の歯肉弁で被せて縫合固定することを特徴とする歯周組織再生方法、
（１４）  コラーゲン糸状物と、該コラーゲン糸状物の表面に形成した生分解性高分子のコーティング層とを有する複合糸状物を、厚さ約０．０５〜２ｍｍの平面膜状である連通多孔体に成型した歯周組織再生用材料を、歯周組織が再生する空間を保持するための遮断手段として用いることを特徴とする歯周組織再生方法、および、
（１５）  コラーゲン糸状物および生分解性高分子溶液を含んでなる歯周組織再生用材料調製キットに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の歯周組織再生用材料は、歯周組織再生の良好な足場材料となり、従来臨床の現場では治療を断念せざるを得なかった重度の歯周組織損傷にも適応可能な歯周組織再生能を有し、耐分解吸収性にも非常に優れている。また、該歯周組織再生用材料は、従来のＧＴＲ法に用いてきた遮断膜（ＧＴＲ膜）として用いることができる上、強度に非常に優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の歯周組織再生用材料は、コラーゲン糸状物と、該コラーゲン糸状物の表面に形成した生分解性高分子のコーティング層とを有する複合糸状物からなることを特徴としている。歯周組織再生用材料の形態は、複合糸状物が平行に配列した束、三次元的に不規則的に配列した多孔体などが選択されるが、多孔体が好ましく、さらに好ましくは厚さ約０．０５〜７０ｍｍの平面膜状に成型した多孔体であり、特に好ましくは厚さ約０．１〜５０ｍｍの平面膜状に成型した多孔体である。ここで連通多孔体とは、目視下で観察した際に均一もしくは不均一な大きさの多数の空隙を有する区画が連続的に分散し、少なくとも１区画以上連通した構造体であることを意味する。
【００１３】
本発明のコラーゲン糸状物は柔軟性を有するものであればその外径は特に限定されるものではないが、細い径である方が繊維表面積は広くなるため、より良好な細胞の生着、成長が期待できるため好ましい。また、形状付与のし易さの点においても細い径である方が柔軟に患部形状に追従可能であるので好ましい。外径としては約５〜７０μｍ、好ましくは約５〜３０μｍであり、さらに好ましくは約１０〜１５μｍである。
【００１４】
使用するコラーゲンは、例えば酵素可溶化コラーゲン、酸可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲンまたは中性可溶化コラーゲンなどが挙げられる。これらの可溶化コラーゲンとは、溶媒に溶解できるよう処理が施されたコラーゲンである。例えば、酸可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲン、酵素可溶化コラーゲンもしくは中性可溶化コラーゲンなどの可溶化コラーゲンが挙げられる。特に可溶化処理と同時にコラーゲンの抗原決定基であるテロペプチドの除去処理が施されているアテロコラーゲンが好適である。また、コラーゲンの由来については、ウシ、ブタ、鳥類、魚類、ウサギ、ヒツジ、ネズミまたはヒトなどの動物種の皮膚、腱、骨、軟骨もしくは臓器などから抽出されるものである。コラーゲンのタイプとしてはＩ型またはIII型などの分類可能なタイプのうちいずれかに限定されるものではない。
【００１５】
上記糸状物の製造方法は常法に従って成型することができる。例えば、コラーゲン溶液から連続紡糸して製造することができる。この際、コラーゲン溶液の溶媒としては、コラーゲンを可溶化できるものであれば特に限定されない。代表的なものとしては、塩酸、酢酸、硝酸などの希酸溶液や、エタノール、メタノールもしくはアセトンなどの親水性有機溶媒と水との混合液または水などが挙げられる。これらを単独または２種以上任意の割合で混合して用いても良い。このうち最も好ましくは水である。コラーゲン溶液の濃度は、使用するコラーゲンの種類により任意であり、紡糸可能であればどの様な濃度でも構わないが、通常は約０．１〜２０重量％、このうち湿式紡糸では約１〜１０重量％程度が好適で、約５〜７重量％程度が更に好適である。また、紡糸時のコラーゲンの吐出速度は、紡糸可能である範囲であれば任意である。紡糸の際、コラーゲン溶液の吐出に用いる装置は、汎用のギアポンプ、ディスペンサーまたは「各種押し出し装置など、何を用いても良いが、均一な紡糸を行うためには脈動が少なく安定してコラーゲン溶液を定量吐出できる装置が良い。また、紡糸を行う際の口金の孔径サイズは紡糸さえ可能であれば、特に限定はされず、目的の糸状物の外径に合わせて用いることができる。さらに口金の孔数は単数でも複数でも良い。口金の形状も特に限定はされず、紡糸可能であれば、例えばスリット状、各種形状などの物を用いても良い。
【００１６】
湿式紡糸で用いられる凝固浴としては、一般的にコラーゲンを凝固させうる溶媒、懸濁液、乳濁液もしくは溶液であれば特に限定はされないが、無機塩類水溶液、無機塩類含有有機溶媒、アルコール類、ケトン類またはこれらの任意の組み合わせが用いられる。無機塩類水溶液としては、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなどの水溶液、特に塩化ナトリウム、硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムなどの水溶液が好ましい。これらの無機塩類をアルコールまたはアセトンに溶解もしくは分散させた無機塩類含有有機溶媒などを用いてもよく、この場合特に塩化ナトリウムのエタノール溶解もしくは分散溶液が好ましい。アルコール類としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アミルアルコール、ペンタノールもしくはヘキサノールなどの炭素数１から６のアルコール類やエチレングリコールなどのグリコール類、好ましくはエタノールが挙げられる。ケトン類としてはアセトンまたはメチルエチルケトンなどが挙げられる。
【００１７】
上記凝固浴はコラーゲンの凝固のためだけではなく、後述する各種架橋剤との組み合わせにより、コラーゲンの凝固と架橋処理を同時に実施できる加工方法も有効である。たとえば、エタノールとグルタルアルデヒドを混和した溶液を、凝固処理と架橋処理を兼ね備えた凝固浴として使用した場合、両者の工程を一度に行うことができ、紡糸されたコラーゲン糸はそのまま架橋処理される。これらの同時処理は、工程の合理化だけではなく、希薄なコラーゲン溶液による紡糸や細径の糸を紡糸する際に非常に有効である。
【００１８】
コラーゲン糸状物は、必要によりさらに種々公知の物理的または化学的架橋処理を施してもよい。架橋処理を施す段階は問わない。すなわち各種架橋処理を施した糸状物で前記不織布を形成しても良いし、前記不織布を形成した後各種架橋処理を施しても良い。また、２種以上の架橋処理を併用しても良く、その際、処理の順序は問わない。この架橋処理により、生体内に移植された際に分解・吸収される時間を、未架橋の場合に比較して飛躍的に遅延させることが可能となり、また物理的強度も向上する。したがって生体内に移植後、歯周組織の再生を完了するまでの期間、体内で必要な耐分解性及び強度を維持することが可能となる。
【００１９】
物理的架橋方法の例としてはＸ線照射、紫外線照射、電子線照射、プラズマ照射、熱脱水反応による架橋処理などが挙げられ、化学的架橋方法の例としては、例えばジアルデヒドまたはポリアルデヒドなどのアルデヒド類、エポキシ類、カルボジイミド類またはイソシアネート類などとの反応、タンニン処理またはクロム処理などが挙げられる。中でも物理的架橋方法の一つである熱脱水架橋反応が好ましい。
【００２０】
さらに、本発明はコラーゲン糸状物の表面に生分解性高分子のコーティング層を形成することを特徴としている。生分解性高分子は生体内で分解吸収されうるものであれば特に限定されるものではなく、例えばポリ乳酸、コラーゲン、ポリグリコール酸、多糖類、ポリペプチドまたはこれらの共重合体などが挙げられ、中でもポリ乳酸が好ましい。これらの生分解性高分子は、これらは市販されているものを使用すればよく、重量平均分子量は約５０００〜２００００００、好ましくは約１０００００〜３０００００である。上記生分解性高分子のコーティング層は、厚さ約０．０１〜７０μｍ、好ましくは約０．１〜１５μｍである。
【００２１】
さらに、本発明の歯周組織再生用材料は、コラーゲン糸状物と、生分解性高分子溶液とを混合し、そのまま乾燥して得られた複合糸状物からなることを特徴としている。生分解性高分子水溶液の溶媒は、生分解性高分子を溶解できる良溶媒であり、コラーゲン糸状物が溶解しないものであれば特に限定されるものではない。例えば生分解性高分子がポリ乳酸である場合、ジクロロメタンまたはクロロホルムなどのハロゲン系の揮発性有機溶媒、トルエンまたはキシレンなどの芳香族系の揮発性有機溶媒などが挙げられるが、中でもジクロロメタンが好適である。一方、コラーゲンの場合は、水が好適であるが、この場合、コラーゲン糸状物に、水に対する不溶性を付与する必要がある。不溶性付与の方法としては前述した架橋処理が好適である。これらの生分解性高分子溶液の濃度は約０．５〜１００ｇ／ｌ、好ましくは約１０〜５０ｇ／ｌ、更に好ましくは約１５〜３０ｇ／ｌである。また、この場合の混合比はコラーゲン糸状物約１ｇに対して、生分解性高分子溶液が約１０〜２００ｍｌ、好ましくは約２０〜８０ｍｌである。乾燥する方法としては、例えば自然乾燥、真空乾燥、凍結乾燥、真空凍結乾燥などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００２２】
上記の方法を実施する際、成型鋳型を用いることで任意の形に容易に成型することができる。例えば、歯周組織再生用材料の形態として、複合糸状物が不規則的に配列した連通多孔体として使用する場合、目的の形の成型鋳型を用意し、コラーゲン糸状物を成型鋳型に不規則的に配列するように敷き詰める。敷き詰める割合は、成型鋳型の容積を１００％とした場合、敷き詰めるコラーゲン糸状物は約５０〜９９．９％、好ましくは約７５〜９５％である。次いで、上記生分解性高分子を成型鋳型に、上記混合比率に従って鋳型に満遍なく注いだ後、乾燥させて作成する。また、上記成型鋳型は、平面膜状の連通他抗体に成型可能であれば、成型された平面膜状の連通多孔体は、歯周組織損傷部に適応する際に取り扱いやすいために好ましい。
【００２３】
本発明の歯周組織再生用材料は、従来のＧＴＲ膜とは異なり、細胞の良好な接着、成長が可能であるので、歯周組織再生の足場材料として優れている。したがって、本発明は歯周組織再生用材料を歯周組織欠損部に適応させ、該歯周組織欠損部周囲の歯肉弁を被せて縫合固定するという新規な歯周組織再生方法を提案することができる。ここで適応とは、従来のＧＴＲ法において、ＧＴＲ膜が確保する歯周組織が自己再生する「スペース」に相当する部分を敷き詰める（ドリミングする）ことを意味する。適応の際に、患部形状に合わせてトリミングすることも可能である。このように適応された歯周組織再生用材料は、歯周組織欠損部周囲の歯肉弁を引き寄せた上で、被せて縫合固定する。縫合固定する手術糸は、市販のものを使用すればよい。
【００２４】
さらに、本発明の歯周組織再生用材料は、該歯周組織再生用材料に歯周組織に誘導可能な幹細胞を播種し、培養して得られた材料は、さらに優れた歯周組織再生を可能とする。したがって、本発明は、コラーゲン糸状物と、該コラーゲン糸状物の表面に形成した生分解性高分子のコーティング層とを有する複合糸状物からなる歯周組織再生用材料に、幹細胞を播種し、培養して得られる歯周組織再生用材料を含む。
【００２５】
上記細胞の細胞種は特に限定されるものではないが、特に再生を意図する組織を構成する細胞を使用するのが良く、汎用性の高さから各種幹細胞の使用が好適であり、間葉系幹細胞、上皮幹細胞、造血幹細胞、血管内皮幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、内耳幹細胞、膵臓幹細胞、骨芽細胞、骨膜細胞、線維芽細胞、胚性幹細胞または体性幹細胞などが挙げられ、中でも間葉系幹細胞が好ましい。また、自家細胞、同種細胞、異種細胞何れを用いても構わないが、自家細胞であることが好ましい。
【００２６】
上記幹細胞は、常法に従って精製される。例えば、イヌ由来の間葉系幹細胞の場合下記の方法によって精製することが可能である。腸骨骨髄（約１０ｍｌ）を約１５〜２５ｋｇの任意のイヌより一般的な麻酔下で採取し、血液凝固を防ぐために約５０００〜１００００ｕｎｉｔのヘパリン約５〜２０ｍｌを充填したシリンジに、上記骨髄を吸い取り、ＤＭＥＭなどの培地に混合する。この培地には添加物として、１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリンＧ（濃度約７５〜１２５Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（濃度約７５〜１２５μｇ／ｍｌ）またはアンフォテリシンＢ（濃度約０．１０〜０．５０μｇ／ｍｌ）などの抗生物質を含んでもよい。上記骨髄の有核細胞画分を１．０６３ｇ／ｃｃのパーコール緩衝液を用いた密度勾配遠心により間葉系幹細胞を濃縮する。約５ｍｌの培地中の有核細胞を、約１０〜３０ｍｌのパーコール試薬上に注意深く層状に積み重ね、遠心分離を行う。遠心分離は３００〜５００ｇで約２０分間行う。培地−パーコール試薬界面の細胞を回収・洗浄後に、培養皿に約５〜１０ｍｌの上記培地を用いて細胞濃度約１．０〜２．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種する。上記手法により得た細胞を、３７℃、加湿雰囲気下、５％ＣＯ２存在下で培養を行う。培養２日目において、培養容器に付着していない非接着細胞を培養培地とともに除去し、培養中は、一週間に２回の割合で培地交換を行い、培養約１０〜１３日の間で０．０５％トリプシン含有のＥＤＴＡ溶液（濃度約０．２５〜０．７５ｍＭ）に約５分間曝露することで、細胞を培養容器より剥離して回収する。その後の継代培養は、約１．０×１０３〜２．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度で再播種することで行い、コンフルエントに近づいた細胞、標準的には播種してから約５〜７日後の細胞を回収する。
【００２７】
上記の方法で精製された肝細胞を培養する方法は、細胞を培養する容器上で、上記の方法などで作製された歯周組織再生用材料に幹細胞を播種させる。細胞を培養する容器は、シャーレ、フラスコ、バッグなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。播種の方法は、細胞を懸濁した培地を歯周組織再生用材料に直接塗布させる方法などが挙げられる。懸濁液中における細胞の量としては、細胞密度にして約０．１×１０3〜２．０×１０6ｃｅｌｌｓ／１００μｌ、好ましくは約０．１×１０４〜２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌでる。これらの細胞懸濁液に用いる培地は、培養する細胞及び分化・増殖など、目的に応じて適当な培地を用いることが好ましく、例えば、αMEM培地、DME培地またはDMEM培地などが挙げられる。こうして細胞支持体上に滴下された液滴中の細胞は、細胞支持体の上で接着するまで約３７℃、湿度１００％、５容量％炭酸ガスの培養条件で約０．５〜５時間インキュベートする。播種された幹細胞は、常法の手段によって培養される。例えば、室温約３７℃、加湿雰囲気下、５％ＣＯ２存在下で培養することができる。培養する日数は、通常約７〜３０日である。
【００２８】
歯周組織再生用材料が、上記した肝細胞の培養工程を経て得られたものである場合であっても、上記の新規な歯周組織再生方法に用いることができる。再生方法は上記と同様の方法で実施することができ、特に限定されるものではない。
【００２９】
さらに、本発明の歯周組織再生用材料が厚さ約０．０５〜２ｍｍ、好ましくは約０．１〜１ｍｍの平面膜状の連通多孔体である場合、従来のＧＴＲ法における遮断膜として使用することができる。外科的に歯肉と歯根の間に所期の歯周組織が再生するための空隙を設け、新付着の形での治癒反応を生じさせる一方で、その空隙は遮断膜により蓋をし、歯肉上皮の侵入、すなわちダウングロースを阻害するという方法である。遮断膜を用いて歯肉上皮のダウングロースを阻止しつつ、歯周組織が再生するスペースを確保することにより、歯周組織の再生を促すことができる。
【００３０】
また、本発明の歯周組織再生用材料は、患部形状に適した形状に成形出来るという有用性に鑑み、使用者の手によって作成することができる形態選択をしてもよい。したがって、使用者の手によって該歯周組織再生用材料を調製するために、コラーゲン糸状物と、生分解高分子水溶液を含んでなるキットしての形態を含む。また、場合によっては成型鋳型を含んでもよい。
【実施例】
【００３１】
以下に本発明を、実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１：コラーゲン糸状物の製造
７重量％コラーゲン水溶液を充填したシリンジに、空気圧をかけてシリンジに装着したノズルより該コラーゲン水溶液を吐出した。吐出した７重量％コラーゲン水溶液は、９９.５容量％エタノール３Ｌを収容したエタノール槽で直ちに糸状に脱水・凝固した。エタノール槽から引き上げられた糸状コラーゲンを、直径１００ｍｍ、全長２００ｍｍのロール状巻き取り具で回転させ、ドライエアーで乾燥しつつ巻き取った。尚、巻き取りの際、ロール状巻き取り具を軸方向に１.５ｍｍ／ｓの速度で往復させた。巻き取り終了後、コラーゲン糸状物をロール状巻き取り具から取り外し、バキュームドライオーブン（ＥＹＥＬＡ社製：ＶＯＳ―３００ＶＤ型）を用いて１３５℃、減圧下（１Ｔｏｒｒ以下）で２４時間熱脱水架橋反応処理を行い、熱架橋処理が施されたコラーゲン糸状物（外径約１０〜１５μｍ）を得た。
次に、この熱架橋処理が施されたコラーゲン糸状物を７．５重量％炭酸水素ナトリウム水溶液に約５分間浸漬して中和処理を施し、その後直ちに十分量の７０容量％エタノールで洗浄した。続いて十分量の９９．５容量％エタノールに浸漬し、自然乾燥させ、前述のバキュームドライオーブンを用いて１３５℃、減圧下（１Ｔｏｒｒ以下）で２４時間熱脱水架橋反応処理を行った。
【００３３】
実施例２：歯周組織再生用材料の調製
実施例１で得られたコラーゲン糸状物約０．０２ｇを空隙約０．６ｃｍ３（底面積約１.５ｃｍ２、厚さ約０．４ｃｍ）の鋳型（雌型）に入れ、０．１５ｇ／ｌの濃度に調製したポリ乳酸（分子量１０００００）ジクロロメタン溶液を注入した。この際の比率はコラーゲン糸状物約１ｇに対しポリ乳酸メチレンクロライド溶液約４０ｍｌとした。鋳型（雄型）で蓋をし、均一に混合した後メチレンクロライドを自然乾燥させて、歯周組織再生用材料を作製した。
【００３４】
実施例３：間葉系幹細胞の培養
イヌの腸骨骨髄から間葉系幹細胞を採取し、ＭＳＣＢ培地（ＢＩＯ ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ， ＣＡ， ＵＳＡ）中で１週間培養した。次いで、その間葉系幹細胞を、アスコルビン酸、デキサメタゾン、βグリセロリン酸を添加したＭＳＣＢ培地中で１週間培養した後、実施例２で作製した歯周組織再生誘導基材に播種して更に１週間培養して間葉系細胞を培養した歯周組織再生用材料を得た。
【００３５】
実験例１：動物埋植実験
実施例３で間葉系幹細胞を採取したイヌの、３番下顎前臼歯及び４番下顎前臼歯の周囲の歯周組織を除去し、水平的骨欠損を作製した。歯肉弁をもとにもどし、３ヶ月間放置して口腔内細菌に曝した。その後再び歯肉弁を開いて感染した歯周組織を除去し、歯根分岐部を完全に露出させた（図１）。
次に実施例３で得られた、間葉系細胞を培養した歯周組織再生基材を、埋植部位の形状に合わせて適応（ドリミング）し（図２）、歯周組織の除去された歯根部周囲に移植し、移植周囲に歯肉弁を被せて縫合固定した（図３）。
【００３６】
４ヶ月後に目視観察およびＸ線撮影を行った結果、歯槽頂高は新生した骨により明らかに隆起しており、良好な骨形成が確認された。また、術後６ヶ月で摘出して組織学的評価を行った結果、歯根表面と歯槽骨の間に歯根膜、セメント質といった歯周組織の再生の徴候が見られた（図４、５）。
【００３７】
比較例１：動物実験コントロール例
実験例１とは別のイヌに対し、３番下顎前臼歯及び４番下顎前臼歯の周囲の歯周組織を除去し、水平的骨欠損を作製した。歯肉弁をもとにもどし、３ヶ月間放置して口腔内細菌に曝した。その後再び歯肉弁を開いて感染した歯周組織を除去し、歯根分岐部を完全に露出させた。
【００３８】
４ヶ月後に目視観察およびＸ線撮影を行った結果、比較例１では骨再生は欠損の基底部でのみ観察され、歯槽頂高は低いままであり、実験例１に比較して明らかに骨形成は劣っていた（図６、７）。また、術後６ヶ月で摘出して組織学的評価を行った結果、歯根膜、セメント質といった歯周組織の再生の徴候は認められなかった。
【００３９】
試験例１：ＧＴＲ膜としての使用
実施例１で得られたコラーゲン糸状物０．０５ｇを空隙１ｃｍ３（底面積２０ｃｍ２、厚さ０．５ｍｍ）の鋳型（雌型）に入れ、０．１５ｇ／ｌの濃度に調製したポリ乳酸（分子量１０００００）ジクロロメタン溶液を注入した。この際の比率はコラーゲン糸状物約１ｇに対しポリ乳酸メチレンクロライド溶液約２０ｍｌの比率とした。鋳型（雄型）で蓋をし、均一に混合した後メチレンクロライドを自然乾燥させて、ＧＴＲ膜用に使用する歯周組織再生用材料を作製した。
次に、実験例１および比較例１とは別のイヌに対し、３番下顎前臼歯及び４番下顎前臼歯の周囲の歯周組織の一部を除去し、垂直的骨欠損を作製し、上記で作製したＧＴＲ膜用に使用する歯周組織再生用材料を、歯周組織が再生するスペースを確保した状態で縫合した。その結果、ＧＴＲ膜用に使用した歯周組織再生用材料は破けることなく、十分に縫合できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の歯周組織再生用材料は、歯周組織再生の良好な足場材料となり、従来臨床の現場では治療を断念せざるを得なかった重度の歯周組織損傷にも適応可能な歯周組織再生能を有し、分解吸収性に非常にも優れている。また、該歯周組織再生用材料は、従来のＧＴＲ法に用いてきた遮断膜（ＧＴＲ膜）として用いることができる上、強度に非常に優れている。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】歯根分岐部を完全に露出させたイヌの３番下顎前臼歯及び４番下顎前臼歯の写真である。
【図２】歯根分岐部を完全に露出させたイヌの３番下顎前臼歯及び４番下顎前臼歯に、実施例３で得た歯周組織再生用材料を適応（ドリミング）させた写真である。
【図３】歯根分岐部を完全に露出させたイヌの３番下顎前臼歯及び４番下顎前臼歯に、実施例３で得た歯周組織再生用材料を適応（ドリミング）させた後、周囲の歯肉弁を被せて縫合固定した写真である。
【図４】実験例１の移植後４ヶ月後の写真である。
【図５】実験例１の移植後４ヶ月後のＸ線撮影の写真である。
【図６】比較例１の移植後４ヶ月後の写真である。
【図７】比較例１の移植後４ヶ月後のＸ線撮影の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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