(57)【要約】【課題】レジオネラ属菌以外の微生物の影響を受けにくく、より正確な検出が可能なレジオネラ属菌の検査方法を提供する。【解決手段】水中のレジオネラ属菌を平板培地による培養法によって検出するレジオネラ属菌の検査方法であって、検査対象サンプルを酸性リン酸緩衝液で処理する酸処理工程を有するレジオネラ属菌の検査方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中のレジオネラ属菌を平板培地による培養法によって検出するレジオネラ属菌の検査方法であって、検査対象サンプルを酸性リン酸緩衝液で処理する酸処理工程を有することを特徴とするレジオネラ属菌の検査方法。
【請求項２】
上記酸性リン酸緩衝液のｐＨが３以下であることを特徴とする請求項１に記載のレジオネラ属菌の検査方法。
【請求項３】
上記酸性リン酸緩衝液のリン酸イオンがすべて解離すると仮定したときのリン酸イオン濃度が０．０２ｍｏｌ／Ｌ以上であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のレジオネラ属菌の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸性緩衝液による前処理後に平板培養法等による培養を行うレジオネラ属菌の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レジオネラ属菌はレジオネラ症の原因微生物として知られており、自然界や人工の水環境に広く生息しているグラム陰性の細菌である。レジオネラ属菌に汚染された冷却塔水や温泉水、循環風呂水などのエアロゾルを吸い込むことによって、レジオネラ属菌に感染し、レジオネラ症を引き起こす場合がある。そのため、「新版  レジオネラ症防止指針」（非特許文献１）が定められ、これらの環境水中のレジオネラ属菌のコントロールを行うことが求められている。
【０００３】
これら環境水からレジオネラ属菌を検出する方法にはさまざまな方法があるが、そのなかでも平板培養法はレジオネラ属菌検出の標準的方法として主要な方法である。ここで上記「新版  レジオネラ症防止指針」に記載された冷却遠心濃縮法を用いた平板培養法のフローの大略について図１に示す。
【０００４】
レジオネラ属菌を培養して検出する場合、レジオネラ属菌以外の微生物の影響を除くために試料の前処理を行なう。前処理方法としては図１に示したような検査対象水あるいは検査対象水の冷却遠心沈渣に滅菌水を加えたものに対し、ＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液を加える酸処理を行って、レジオネラ属菌以外の菌を殺菌する方法が広く用いられている。
【０００５】
しかしながら、ＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液を用いる酸処理を行なった場合でも、共存する微生物の影響によりレジオネラ属菌を検出できないことが生じることがある。これでは精度良くレジオネラ属菌を検出することが出来ないので、大きな問題となっていた。
【非特許文献１】「新版レジオネラ症防止指針」  監修  厚生省生活衛生局企画課、発行者：（財団法人）ビル管理教育センター  平成１１年１１月  初版発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記した従来の問題点を改善する、すなわち、レジオネラ属菌以外の微生物の影響を受けにくく、より正確な検出が可能なレジオネラ属菌の検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等はＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液による酸処理では、検査対象水中にレジオネラ属菌と共に共存する他の微生物の除去に充分な効果が得られないのではないかと考えて、このＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液について基礎検討を行った。
【０００８】
まず、検査対象水の水質に着目し調査を行なったところ、検査対象水のアルカリ度が高い場合（温泉水等）にはＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液を検査対象水に等量添加しても検査対象水のｐＨは充分に低下しないことが判った。
【０００９】
ここで、０．２ｍｏｌ／Ｌ−ＨＣｌ水溶液と０．２ｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ水溶液をｐＨが２．２になるように混合して調製したＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液１００ｍＬに対して、０．１ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＯＨ水溶液を添加したときのｐＨの変化を図２に示す。
【００１０】
図２により、ＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液の緩衝能が極めて低いことが判る。このようなｐＨ緩衝能の低いＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液では、検査対象水の水質によっては充分に酸性に保つことができず、その結果、レジオネラ属菌以外の細菌類の影響を排除すると云う酸処理の効果が得られないことを見いだした。
【００１１】
このため、本発明者等はＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液に代えて、酸性リン酸緩衝液、及び、クエン酸を用いるマッキルベイン緩衝液について検討した結果、本発明に至った。
【００１２】
すなわち、本発明のレジオネラ属菌の検査方法は上記課題を解決するため、請求項１に記載の通り、水中のレジオネラ属菌を平板培地による培養法によって検出するレジオネラ属菌の検査方法であって、検査対象サンプルを酸性リン酸緩衝液で処理する酸処理工程を有することを特徴とするレジオネラ属菌の検査方法である。
【発明の効果】
【００１３】
上記本発明の構成により、レジオネラ属菌以外の微生物の影響を受けにくく、より正確なレジオネラ属菌の検査方法が可能となり、また、このとき、培養に要する時間も従来と同等であった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明において、検査対象サンプルとは、検査対象水、および、検査操作の過程で得られる中間工程のサンプルを指し、液体状のサンプルであっても、あるいは、ろ過残渣のようなサンプルであっても良い。
【００１５】
本発明のレジオネラ属菌の検査方法において、酸性緩衝液としては酸性リン酸緩衝液を用いる必要がある。
【００１６】
上記酸性リン酸緩衝液は、リン酸水溶液にアルカリ剤を添加して目的のｐＨとすることにより得ることができるが、一般的には、目的の濃度のリン酸水溶液と、同濃度の第一リン酸塩水溶液との混合比を調整することで、容易に所定の濃度、所定のｐＨの緩衝液を得ることができる。ここで、第一リン酸塩としては、リン酸二水素一ナトリウム、リン酸二水素一カリウム、リン酸二水素一アンモニウム等を使用することができるが、これに限定されるものではない。
【００１７】
酸性リン酸緩衝液のｐＨは、３以下であることが好ましい。ｐＨが３より大きいと、レシオネラ属菌以外の微生物の影響を充分に排除することが困難となる。また、酸性リン酸緩衝液の濃度は、酸性リン酸緩衝液中のリン酸イオンがすべて解離すると仮定した場合のリン酸イオン濃度（本発明では、この濃度を「酸性リン酸緩衝液の濃度」とする）として、０．０２ｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましい。緩衝液の濃度が０．０２ｍｏｌ／Ｌ未満だと、充分なｐＨ緩衝能が得られない場合がある。ここで、ｐＨの下限値、濃度の上限値は、レジオネラ属菌の生菌数測定に影響を与えない範囲で適宜決定することができるが、ｐＨが１．８以上２．６以下、濃度０．１ｍｏｌ／Ｌ以上０．５ｍｏｌ／Ｌ以下の酸性リン酸緩衝液を用いるのが、レジオネラ属菌以外の微生物の影響を排除して、レジオネラ属菌の生菌数を正確に測定する上で最も好ましい範囲である。
【００１８】
なお、上記濃度値は、検査対象水ないし検査対象水から調製したサンプル水１ｍＬに対して緩衝液を１ｍＬ加える条件での濃度であって、例えば、容量の増加が望ましくない場合などでは、より濃度の高い液を調製して少量添加することでで、検査対象水ないし検査対象水から調製したサンプル水をｐＨが１．８以上２．６以下、酸性リン酸緩衝液成分が濃度０．０５ｍｏｌ／Ｌ以上０．２５ｍｏｌ／Ｌ以下とするようにしても良く、この場合も本発明に含まれる。
【実施例】
【００１９】
＜各緩衝液の緩衝能の比較＞
酸処理に用いる緩衝液として重要なのはｐＨ２．２付近で緩衝能が高く、かつ、レジオネラ属菌に対する悪影響がないものであることである。これらの条件を満たすものとして、リン酸とその塩からなる酸性リン酸緩衝液と、クエン酸とリン酸塩とからなるマッキルベイン緩衝液の２つを選んで、検討を行った。それに、従来から使用されているＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液を加えて３種類の緩衝液の緩衝能の比較を行った。
【００２０】
ＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液は０．２ｍｏｌ／Ｌ−ＨＣｌ水溶液と０．２ｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ水溶液とをｐＨが２．２になるように混合して調製し、酸性リン酸緩衝液は０．２ｍｏｌ／Ｌ−Ｈ3Ｐ０4水溶液と０．２ｍｏｌ／Ｌ−ＫＨ2Ｐ０4水溶液とをｐＨが２．２になるように混合して調製した。また、マッキルベイン緩衝液は０．２ｍｏｌ／Ｌ−クエン酸水溶液と０．２ｍｏｌ／Ｌ−Ｎａ2ＨＰＯ4水溶液とをｐＨが２．２となるように混合して調製した。
【００２１】
これら各緩衝液１００ｍＬに０．１ｍｏｌ／Ｌ−水酸化ナトリウム水溶液を添加していき、そのときのｐＨの変化について調べた。結果をＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液での結果と共に図３に示す。
【００２２】
図３より、ＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液は、酸性リン酸緩衝液およびマッキルベイン緩衝液に比較して明らかに緩衝能が低いことがわかる。また、０．１ｍｏｌ／Ｌ−水酸化ナトリウム水溶液の添加量が６５ｍＬまではリン酸緩衝液のほうがマッキルベイン緩衝液よりｐＨを低く保つことができることも読み取れる。また、ＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液の濃度が１／１０、すなわち０．０２ｍｏｌ／Ｌの濃度の酸性リン酸緩衝液あるいはマッキルベイン緩衝液で０．２ｍｏｌ／Ｌ−ＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液よりも高い緩衝作用が得られることも判る。
【００２３】
＜各緩衝液の緩衝能の確認＞
実際にレジオネラ属菌検査に供される冷却塔水（試料番号１〜６）および温泉水（試料番号７〜１２）について、検査対象水に、０．２ｍｏｌ／Ｌ−ＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液（記号「ＨＫ」、以下同じ）、０．２ｍｏｌ／Ｌ−酸性リン酸緩衝液（記号「ＰＢ」、以下同じ）あるいは０．２ｍｏｌ／Ｌ−マッキルベイン緩衝液（記号「ＭＢ」、以下同じ）（これら緩衝液のｐＨはすべて２．２）を等量混合した時のｐＨを測定した。このときの結果を、各検査対象水のｐＨおよび総アルカリ度（Ｍアルカリ度）の測定結果と共に表１に示す。
【００２４】
【表１】
2005237275.tif 000002
【００２５】
表１よりＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液では、他の２種類の緩衝液に比較して、ｐＨが上昇しやすいことが確認された。特に総アルカリ度の高い試料５、６、１１、１２ではｐＨを低く維持することが全くできず、酸処理の効果は得られないと思料される。これに対し、酸性リン酸緩衝液やマッキルベイン緩衝液では、どの試料でも低いｐＨに保つことができることが判る。また、リン酸緩衝液とマッキルベイン緩衝液を比較した場合には、リン酸緩衝液の方がより低いｐＨを維持できる。これは、図３で示した結果と一致した。
【００２６】
＜培地でのｐＨ緩衝作用の影響＞
レジオネラ属菌検査では、酸処理を行った検査対象水は中和されることなく培地に接種される。これは培地の緩衝能によりｐＨが中和されるのでレジオネラ属菌の培養に影響がないためである。しかし、ＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液と比較すると緩衝能が高い酸性リン酸緩衝液やマッキルベイン緩衝液を用いた場合、培地の緩衝能だけで充分に中和されることを確認する必要がある。
【００２７】
ここで、ＢＣＹＥα培地から寒天と活性炭粉末を除いた、ＢＹＥα液体培地１００ｍＬにそれぞれの各緩衝液を添加していき、それぞれのｐＨの変化を調べた。結果を図４に示す。
【００２８】
図４より、マッキルベイン緩衝液が最もＢＹＥα液体培地のｐＨを低下させ、ＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液はほとんどｐＨを変化させないことが判る。
【００２９】
一方、リン酸緩衝液はマッキルベイン緩衝液と比較すると培地のｐＨをあまり低下させない。１００ｍＬのＢＹＥα液体培地に２ｍＬのリン酸緩衝液を添加しても培地のｐＨは６．８前後に保たれ、この範囲であればレジオネラ属菌の発育に影響がないと考えられる。
【００３０】
このことからＢＣＹＥα培地やＧＶＰＣα培地の平板（培地の量は１枚あたり１５〜２０ｍＬ）に対して、０．２ｍｏｌ／Ｌ−酸性リン酸緩衝液を３００〜４００μＬ接種したとしても、培地の緩衝能によりｐＨの変化は充分に低いレベルであると思料される。
【００３１】
一方、マッキルベイン緩衝液ではレジオネラ属菌培養への培地ｐＨ低下の影響について調査する必要があると思料された。
【００３２】
＜酸処理の効果について検討  その１（一般細菌による検討）＞
これら緩衝液による酸処理により、レジオネラ属菌以外の細菌によるレジオネラ属菌検査への影響を排除できるかについて検討を行った。
【００３３】
温泉水及び冷却塔水から選ばれた９つの検査対象水、それぞれ１ｍＬに対して、０．２ｍｏｌ／Ｌ−ＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液、あるいは、０．２ｍｏｌ／Ｌ−酸性リン酸緩衝液（ｐＨはどちらも２．２）をそれぞれ１ｍＬずつ混合し、１０分間接触させた後、これらの細菌数およびｐＨを測定した。なお、細菌数を測る際には、各酸処理緩衝液と１０分間接触させた後、ただちに１ｍＬを採り、４ｍＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ−中性リン酸緩衝液に添加して希釈を行ない、ｐＨを中性域に戻すことによりｐＨの影響の除去を行い、その後、標準寒天培地で混釈し、３７℃で６日間培養を行った。培養後、形成された細菌類の集落数を測定した。結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
2005237275.tif 000003
【００３５】
表２より、酸性リン酸緩衝液の方がＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液に比べて、明らかに酸処理の効果が高いことが判る。特に検査対象水２での差は大きい。この結果からも、酸性リン酸緩衝液を用いることにより、酸処理の効果を最大限に引き出すことが可能であることが明らかとなった。
【００３６】
＜酸処理の効果について検討  その２（緑膿菌による検討）＞
緑膿菌（Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＩＡＭ１５１４株）を脱イオン水に懸濁させ、菌数を１０4ＣＦＵ／ｍＬに調整し、検査対象水とした。この検査対象水を１ｍＬずつ５本の滅菌済み試験管に分注した。
【００３７】
これらに対して、０．２ｍｏｌ／Ｌ−Ｈ3Ｐ０4水溶液と０．２ｍｏｌ／Ｌ−ＫＨ2Ｐ０4水溶液との混合比を変えて調製したｐＨが２．２、２．５、３．０、４．０あるいは５．０の５種類の０．２ｍｏｌ／Ｌ−酸性リン酸緩衝液１ｍＬを加えた後の、５、１０、１５あるいは２０分後の緑膿菌の残存数について調べた。
【００３８】
このとき所定の時間が経過した後、ただちに１ｍＬを採取し、４ｍＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌの中性リン酸緩衝液に添加して希釈を行ない、ｐＨを中性域に戻すことによりｐＨの影響の除去を行い、その後、標準寒天培地で混釈し、３７℃で２日間培養を行った。培養後、形成された緑膿菌の集落数を測定した。結果を以下の図５に示す。
【００３９】
図５よりｐＨ２．２の酸性リン酸緩衝液を用いることにより緑膿菌を比較的短時間で処理できることが明らかになった．またｐＨが３．０超の酸性リン酸緩衝液を用いた場合には酸処理の効果はほとんど期待できない。この結果から、比較的抗生物質が効きにくい緑膿菌に対しても、ｐＨが３．０以下の酸性リン酸緩衝液を用いた酸処理は極めて有効であることが示された。
【００４０】
＜レジオネラ属菌に対する酸性リン酸緩衝液による酸処理の影響＞
レジオネラ属菌（Ｌ．ｐｎｅｕｏｐｈｉｌａ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ−１（ＡＴＣＣ３３１５２）株）を脱イオン水に懸濁させ、菌数を１０3ＣＦＵ／ｍＬに調整し、１ｍＬずつ５本の滅菌済み試験管に検査対象水として分注した。
【００４１】
これらに０．２ｍｏｌ／Ｌ−リン酸緩衝液（ｐＨ２．２）をそれぞれ１ｍＬずつ混合し、５、１０あるはい２０分間接触後にそれぞれをＢＣＹＥα培地に２００μＬずつ接種した。３７℃で６日間培養し、形成されたレジオネラ属菌の集落数を測定した（ｎ＝５で行った）。結果を図６に示す。
【００４２】
図６より、０．２ｍｏｌ／Ｌ−リン酸緩衝液（ｐＨ２．２）を用いた酸処理はレジオネラ属菌の発育に対してほとんど影響を与えないことが判る。
【００４３】
＜実際の試料での確認＞
日本全国から集めた冷却水、浴槽水等のレジオネラ属菌検査試料１０００検体について、０．２ｍｏｌ／Ｌ−ＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液（ｐＨ２．２）を用いた酸処理を行ってレジオネラ属菌の生菌数の検査を行った。レジオネラ属菌の検査は、図１に示す、「新版  レジオネラ症防止指針」Ｐ８９図１８記載の方法に準じて、ただし、酸処理の時間は１０分間、培地はＧＶＰＣα培地、培養は５日問とした。
【００４４】
その結果、４７検体（４．７％）が雑菌（レジオネラ属菌以外の微生物）の増殖が激しく、レジオネラ属菌の陽性あるいは陰性を判定することができなかった。
【００４５】
上記と同様な日本全国から集めた冷却水、浴槽水等のレジオネラ属菌検査試料１０００検体について、０．２ｍｏｌ／Ｌ−酸性リン酸バッファー（ｐＨ２．２）を用いた前処理法を用いてレジオネラ属菌の生菌数の検査を行った。検査方法としてはパッファーの種類を変えた以外は上記の０．２ｍｏｌ／Ｌ−ＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液（ｐＨ２．２）を用いた場合と同様の条件で行った。
【００４６】
その結果、雑菌の増殖が激しく、レジオネラ属菌の陽性、陰性を判定することができなかった検体は８検体（０．８％）に過ぎなかった。
【００４７】
一方、マッキルベイン緩衝液を用いたレジオネラ属菌菌数の検査に関しては、１０検体について検査を試みたが、レジオネラ属菌の増殖遠度が遅く、コロニーの判別が可能になるまでに７〜８日を要することが判った。これはクエン酸がレジオネラ属菌の繁殖に対して何らかの阻害を引き起こすためと思料された。このようにマッキルベイン緩衝液を用いた場合、求められる迅速な検査に対応できず、また、培養器の稼働効率が悪くなるので同一設備での可能な検査能力も低下を来すため、実用的でないと判断された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明はレジオネラ属菌以外の微生物の影響を受けにくく、正確な検出が可能なレジオネラ属菌の検査方法として、冷却塔水や温泉水、循環風呂水等、レジオネラ属菌の検査が求められる分野で好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】「新版  レジオネラ症防止指針」に記載された冷却遠心濃縮法を用いた平板培養法のフローチャート（抜粋）である（ただし、原図には齟齬があるのでその部分については修正済み）。
【図２】従来用いられてきたＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液の緩衝能について調べた結果を示す図である。
【図３】酸性リン酸緩衝液及びマッキルベイン緩衝液の緩衝能について調べた結果を示す図である。
【図４】各緩衝液の培地のｐＨに対する影響について調べた結果を示す図である。
【図５】さまざまなｐＨに設定した酸性リン酸緩衝液の、緑膿菌への影響を調べた結果を示す図である。
【図６】０．２ｍｏｌ／Ｌ−リン酸緩衝液（ｐＨ２．２）を用いた酸処理のレジオネラ属菌の発育への影響を調べた結果を示す図である。
【図１】
2005237275.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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