(57)【要約】      （修正有）【課題】電子スピン共鳴法（ＥＳＲ）のスピントラップ剤として用いられる５，５−ジメチルピロリン−Ｎ−オキサイド（ＤＭＰＯ）を一連の操作を室温以下で行うことにより、熱による影響を少なくし効率よく高純度化する精製方法を提供する。【解決手段】粗ＤＭＰＯを３５℃以下で有機溶媒に溶解する工程と、得られた溶液から６℃以下でＤＭＰＯを再結晶化する工程を含む。溶媒は、酢酸エチル、酢酸エチル混合溶媒等で、粗ＤＭＰＯの１〜３倍量使用され、無色柱状結晶を得る。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
粗５，５−ジメチルピロリン−Ｎ−オキサイドを３５℃以下の温度で有機溶媒に溶解する工程と、得られた溶液からＤＭＰＯを６℃以下の温度で再結晶化する工程を含むことを特徴とする５，５−ジメチルピロリン−Ｎ−オキサイドの精製方法。
【請求項２】
前記溶液に固体状の５，５−ジメチルピロリン−Ｎ−オキサイドを添加する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、不純物を含む粗５，５−ジメチルピロリン−Ｎ−オキサイド（以下、５，５−ジメチルピロリン−Ｎ−オキサイドをＤＭＰＯという）からＤＭＰＯを精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内でさまざまな生理活性を示す物質として、フリーラジカルが知られている。フリーラジカルは、虚血性疾患、消化器疾患、癌、神経変性を伴う脳神経疾患、炎症、薬物による臓器障害など数多くの疾患と関係していることから、医学、薬学、生物学の分野で注目され、研究が進められている。
【０００３】
このようなフリーラジカルの検出法として、分子内不対電子を直接検出する電子スピン共鳴法（ＥＳＲ）がある。しかし、フリーラジカルは通常寿命が極めて短く、ＥＳＲ法を用いても生理条件下で直接検出することは困難である。そのため、その短寿命フリーラジカルをラジカル補足剤（スピントラップ剤）を用いて化学的に補足し、安定なラジカル体（スピンアダクト）として検出するスピントラップ法が一般的に用いられている。このスピントラップ剤の一種としてＤＭＰＯが用いられており、ヒドロキシラジカル、スーパーオキシド等の分析に多く使われている。
【０００４】
ところで、ＥＳＲ法は高感度の分析法であるため、高純度のＤＭＰＯを使用しないと不純物由来のＥＳＲスペクトルを示し、目的とするフリーラジカルの計測に支障をきたしてしまう。そこで、高純度のＤＭＰＯを得るために、粗ＤＭＰＯを減圧蒸留や精密蒸留によって精製することが行われている。
【０００５】
ＤＭＰＯの精製方法として、特許文献１には、粗ＤＭＰＯ水溶液を無極性有機溶媒を用いて洗浄してから有極性有機溶剤を用いて抽出し、蒸留精製することを特徴とする精製方法が開示されている（特許文献１）。また、特許文献２には、粗ＤＭＰＯの精製において酸化過程を含むことを特徴とする精製方法が開示されている（特許文献２）。
【０００６】
【特許文献１】特開平１−１５３６７５号公報
【特許文献２】特開平１−３０５０６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、これらの方法を用いても完全に不純物を取り除くことは困難である。また、高純度品が得られるとしても、得られるのは全体から比するとごく少量であったり、繰り返し蒸留を行うことが必要であったりと、精製効率的が悪い。さらに、ＤＭＰＯは熱に対して安定な化合物ではないため、蒸留を行う場合、可能な限り高真空状態にして外部から加える温度を下げる必要がある。
【０００８】
さらに、ＤＭＰＯ水溶液に活性炭を添加することで不純物を吸着させた後に濾過して分析に用いる手法もあるが、正確な濃度が分からなくなるために定量分析に用いるには不向きである。
【０００９】
一方、物質を精製する方法として、再結晶化する方法が知られている。再結晶化は、通常、加熱した溶液に精製したい物質を含む組成物を飽和状態になるまで溶解し、その後その飽和溶液を冷却することにより、結晶を析出させる方法である。しかしながら、ＤＭＰＯは低融点有機化合物（融点：２５℃）であり、通常室温では油状物であるため、再結晶化は困難と考えられていた。
【００１０】
上記課題を鑑みたうえで、本願発明は一連の操作を室温以下で行うことにより、熱による影響を少なくし、ＤＭＰＯを効率よく高純度化する精製方法を提供することを目的とした。また、高純度のＤＭＰＯを含有する試薬を提供することによって、より精度の高いフリーラジカル計測等を可能にすることも目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、再結晶化の手法を特定の温度以下で行うことにより、上記課題を解決しうることを見出した。すなわち、ＤＭＰＯを常温若しくは常温より冷却した溶媒に溶解させた後、特定の温度以下に冷却して再結晶化させることにより、効率よく高純度のＤＭＰＯが得られることを見いだした。
【００１２】
具体的には、（１）粗５，５−ジメチルピロリン−Ｎ−オキサイドを３５℃以下の温度で有機溶媒に溶解する工程と、得られた溶液からＤＭＰＯを６℃以下の温度で再結晶化する工程を含むことを特徴とする５，５−ジメチルピロリン−Ｎ−オキサイドの精製方法；および、（２）上記（１）において、前記溶液に固体状の５，５−ジメチルピロリン−Ｎ−オキサイドを添加する工程をさらに含むことを特徴とするＤＭＰＯの精製方法を採用した。
【発明の効果】
【００１３】
本願発明の精製方法を採用することにより、簡便な手順で高純度のＤＭＰＯを取得することが可能となった。特に、本願発明の精製方法は、繰り返し行うことで更なるＤＭＰＯの高純度化を可能にするだけではなく、残った粗ＤＭＰＯを容易に効率良く回収できる利点を併せ持っている。さらに、ＤＭＰＯの高純度化はより精度の高いフリーラジカル計測等への助けとなり、高純度品の製造効率が上がることにより製造コストを下げることも可能になる。
【発明の実施の形態】
【００１４】
本願発明で言う粗ＤＭＰＯとは、ＤＭＰＯがそのほとんどを占める組成物をいう。例えば、公知の合成方法（例えば、E.G,Janzen, L.T.Jandrisits, R.V.Shetty, D.L.Haire, J.W.Hilborn, Synthesis and purification of 5,5-Dimethyl-1-pyrroline-N-oxide for biological applications, Chem. Biol., Interactions, 70, 167-172 (1989) に記載される方法）により得られたＤＭＰＯをクロマトグラフィー等によってさらに精製したもの等を挙げることができる。また、この場合の溶媒等は除去しておく方が好ましい。さらに、再結晶前に簡単な減圧蒸留を行い着色成分を取り除くことでより再結晶に適した粗ＤＭＰＯが得られる。
【００１５】
本願発明で採用する有機溶媒としては、ＤＭＰＯを溶解し再結晶化させるものを広く採用することができる。また、本願発明では、低い温度で再結晶化を試みるので、以下の要件を満たすことが好ましい。（１）溶媒の凝固点が再結晶温度より低いこと、好ましくは−４０℃以下、より好ましくは、−７０℃以下の融点を有する有機溶媒が好ましい。（２）室温と冷却した状態のＤＭＰＯの溶解度の差が大きい溶媒であること。具体的には酢酸エチル、酢酸エチル・ｎ−ヘキサン混合溶媒、ジエチルエーテル、アセトン、エタノール等を用いることができる。好ましくは、酢酸エチル、酢酸エチル・ｎ−ヘキサン混合溶媒を用いることができる。使用する溶媒の量は制限されないが、粗ＤＭＰＯの体積に対して、好ましくは１〜３倍量とする。
【００１６】
有機溶媒への粗ＤＭＰＯの溶解は、通常は室温で行う。例えば、０〜３５℃の温度範囲内、好ましくは４〜２５℃の温度範囲内で溶解を行う。溶解時には、攪拌や振とうを行ってもよい。また溶解時には、粗ＤＭＰＯの溶解状況を観察しながら、必要最低限の溶媒を徐々に添加しながら粗ＤＭＰＯを溶解させることが好ましい。粗ＤＭＰＯを溶解させた後は、溶解温度以上に温度を上げることなく次の工程に進むことが好ましい。
【００１７】
粗ＤＭＰＯの溶液を再結晶化する際の冷却温度は、ＤＭＰＯが再結晶化する温度であれば、特に定めるものではない。この条件を満たす温度は、６℃以下、より好ましくは、０℃以下、最も好ましくは、−５℃以下である。このような手段を採用すると、ＤＭＰＯが熱によって影響を受けるのをより効果的に防止しつつ、精製することが可能になる。
【００１８】
冷却時には、必要に応じて、固体状のＤＭＰＯを添加してもよい。固体状のＤＭＰＯは、ＤＭＰＯの再結晶化を促進するための核としての役割を果たすものである。従って、添加する固体状のＤＭＰＯは微粒子状であることが好ましい。ＤＭＰＯ微粒子は、上記粗ＤＭＰＯを溶解する溶媒の冷却時又は冷却中に添加する。このＤＭＰＯ微粒子は、その形状、大きさ等を含め、本願発明の目的を達成する限り広く公知のものを採用できる。従って、ＤＭＰＯ微粒子は特定の形状に限定されない。
【００１９】
ＤＭＰＯは冷却することにより、柱状や針状等の結晶として得られる。得られた結晶は、グラスフィルターを用いた吸引濾過やデカンテーションにより取り出し、デシケーターにて吸引減圧すること等により有機溶媒を完全に除去する。上記作業はコールドルームのような低温条件下で行うことが望ましい。
有機溶媒への粗ＤＭＰＯの溶解から結晶の取得までの一連の作業は、遮光下、不活性ガス雰囲気下で行うことが望ましい。また、一連の作業をすべてコールドルームのような低温条件下で行うことも望ましい。
【００２０】
結晶化せずに有機溶媒中に残った残留物は、溶媒を減圧下留去することにより回収することができる。本願発明の精製方法ではＤＭＰＯの化学変化を極力抑えることができるため、このとき回収される残留物の中には再結晶化しなかったＤＭＰＯが含まれている。したがって、残留物に対して本願発明の精製方法や公知の精製方法を適用することによって、純度が高いＤＭＰＯをさらに回収することが可能である。このため、本願発明の精製方法によれば、合成によって得られた粗ＤＭＰＯに含まれる高価なＤＭＰＯを分解させずに効率よく利用しうる。
【００２１】
本願発明の精製方法によれば、純度が高いＤＭＰＯを効率よく取得することができる。また、本願発明の精製方法を実施するために必要とされる試薬や設備は、従来のＤＭＰＯ精製法に比べて低コストで用意することができる。このため、本願発明の精製方法を利用すれば、高純度のＤＭＰＯを簡便かつ安価に取得することができる点で産業上の利用可能性が高い。
【００２２】
本願発明の精製方法により精製したＤＭＰＯは、様々な試薬として効果的に利用することができる。本願発明の精製方法により精製したＤＭＰＯを用いた試薬は、ＤＭＰＯの正確な濃度を認識することが容易であるので、特に定量分析用試薬として好ましく用いられる。例えば、フリーラジカル計測用の試薬として用いれば、より精度の高い定量分析が可能になる。また本願発明の精製方法により精製したＤＭＰＯは、ＤＭＰＯを出発物質とする合成反応にも効果的に用いることができる。
【００２３】
以下に実施例を記載して本発明の特徴をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
【００２４】
（実施例）
１．粗ＤＭＰＯの合成
１）  ４−メチル−４−ニトロペンタン−１−アールの合成
窒素雰囲気下、２−ニトロプロパン（２１１．５ｇ）に７％ナトリウムメトキシドメタノール溶液（２５０ｍＬ）を攪拌しながら−１０℃〜−１５℃に保つように滴下した。次いでをアクロレイン（２１．０ｇ）と２−ニトロプロパン（４９．１ｇ）の混合溶液を攪拌しながら−１０℃〜−１５℃に保つように滴下した。滴下終了後、更に３０分間攪拌し、反応溶液を室温に戻した。次いで濃塩酸を加えることにより反応溶液を酸性とした後、吸引濾過し、濾液をエバポレートした。残留物をエーテル抽出、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去した後、減圧蒸留（沸点９０〜９３℃／６ｍｍＨｇ）にて目的物を得た（３８．４ｇ，８２％）。
【００２５】
２）  ２−（３−メチル−３−ニトロブチル）−１，３−ジオキソランの合成
４−メチル−４−ニトロペンタン−１−アール（３２．７ｇ）及びエチレングリコール（１６．０ｇ）を３５０ｍＬの脱水ベンゼンに溶解し、更にｐ−トルエンスルホン酸（０．５ｇ）を加え、水を除きながら７時間加熱還流した。放冷後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び水で反応溶液を洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去した後、減圧蒸留（沸点８５〜９０℃／４ｍｍＨｇ）にて目的物を得た（３１．３ｇ，７４％）。
【００２６】
３）  ５，５−ジメチルピロリン−Ｎ−オキサイド（ＤＭＰＯ）の合成
２−（３−メチル−３−ニトロブチル）−１，３−ジオキソラン（７．０ｇ）の５％塩化アンモニウム水溶液（４２ｍＬ）の混合溶液を窒素雰囲気下、遮光、攪拌し１０℃〜１５℃に保つように塩酸で表面を洗浄活性化した亜鉛粉末（９．８ｇ）を加えた。更に３０分間攪拌した後、吸引濾過、６０℃の温水で洗浄した後、濾液を濃塩酸にて酸性とし、１２時間放置した。次いで溶液を４０分間７０℃に加熱、放冷後に炭酸ナトリウムにてアルカリ性とし、減圧下溶媒を留去、クロロホルム抽出した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下溶媒を留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２０：１）により精製し、減圧下溶媒を留去することにより目的物を得た（３．５ｇ，８４％）。
【００２７】
２．ＤＭＰＯの再結晶
５ｇの上記粗ＤＭＰＯを、２５℃で２．５ｍＬの酢酸エチルに溶解した。さらに、２．５ｍｌのｎ−ヘキサンを加え、−１２℃の冷凍庫内に静置した。この冷却されたＤＭＰＯ溶液に、固体状のＤＭＰＯを微量加え、更に冷凍庫内に静置した。固体状のＤＭＰＯが核となることで結晶化が始まった。そして、結晶の成長が止まった段階で、デカンテーションにて結晶と溶液を分け、結晶はデシケーターにて吸引減圧することにより有機溶媒を完全に除去した。得られた結晶は無色柱状結晶（２．５ｇ）であった。溶液側は溶媒を減圧下留去することにより粗ＤＭＰＯの回収を行った。
【００２８】
３．不純物由来ＥＳＲ信号の測定：
上記１の再結晶前の粗ＤＭＰＯ及び上記２の再結晶により得られたＤＭＰＯをそれぞれ超純水にて２０倍希釈した。この溶液をフラットセル（ラボテック製）に吸引し、ＥＳＲスペクトルを計測した（日本電子製、品番：ＪＥＳ−ＦＲ８０）。その結果を図１に示す。それぞれのＥＳＲスペクトルに存在する両端の信号はＥＳＲ計測において基準として用いているマンガンマーカー由来の信号である。ここで、（ａ）は上記１の粗ＤＭＰＯのＥＳＲスペクトルを、（ｂ）は上記２の再結晶により得られたＤＭＰＯのＥＳＲスペクトルを、それぞれ示している。ここで、（ａ）では多量の不純物由来のＥＳＲ信号が存在しているが、（ｂ）では不純物が無くなっているのが認められた。この結果から本願発明の方法を用いたＤＭＰＯの精製法が有効であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】精製前のＤＭＰＯのＥＳＲスペクトル（ａ）と精製後のＤＭＰＯのＥＳＲスペクトル（ｂ）を示す。
【図１】
2005068067.tif 000002