(57)【要約】【課題】  本発明は、マウスを用いて効率よく、有効に動脈硬化治療法を検索できる技術を提供することを課題とする。【解決手段】  本発明は、脂肪組織に由来する因子による動脈硬化およびメタボリックシンドロームの治療効果を判定ならびにスクリーニングするための方法であって：Ａ）アディポネクチンノックアウトマウスとアポＥノックアウトマウスを交配して得られる動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスを提供する工程；およびＢ）該マウスを、薬剤や食品成分などによって治療効果を判定する工程、を包含する、方法を提供する。本発明はまた、そのような方法において使用する動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウス、システムなども提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アディポネクチンノックアウトマウスとアポＥノックアウトマウスを交配して得ることを特徴とした動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウス。
【請求項２】
請求項１の動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスを利用したアディポネクチン依存性抗動脈硬化評価方法。
【請求項３】
請求項１の動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスを利用したアディポネクチン依存性メタボリックシンドローム評価方法。
【請求項４】
請求項１の動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスを利用した骨髄造血幹細胞へのアディポネクチンの作用の評価方法。
【請求項５】
請求項１の動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスを利用したアディポネクチンの感受性・抵抗性の評価方法。
【請求項６】
請求項２〜５いずれか１項記載の評価方法を利用した医薬品のスクリーニング方法。
【請求項７】
医薬品が抗動脈硬化治療薬、メタボリックシンドローム治療薬、アディポネクチン増加促進剤、アディポネクチン抵抗性改善薬のいずれか一つである、請求項６記載の医薬品のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、生物学、医学等の分野における動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウス、及びその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  狭心症や心筋梗塞などの冠動脈疾患患者で、いわゆる動脈硬化の危険因子とされている血圧やコレステロール、血糖値、体重などが単独で著しい異常値をとる患者は少ない。逆に軽度の肥満に軽度の高脂血症や糖尿病、軽症高血圧を合わせ持つ症例が一般的に観察され、実際これら冠危険因子の合併は冠動脈疾患の危険度を著しく増加させている（前田和久  中村正：日本医師会雑誌  １３０巻  第一号（平成１５年７月１日）ｐ３１−ｐ３６）。わが国で生活習慣病とも呼ばれている、高脂血症、糖尿病、高血圧はそれぞれ非常に頻度が高いため、偶然同一個人に合併することもあり得るが、個々人に別々に発症するよりもお互いに重なり合って、肥満に伴って発症することの多い疾患群であることが明らかにされている（前田和久：内分泌・糖尿病内科Ｍａｒ．２００４（Ｖｏｌ１８  Ｎｏ．３）ｐ２３４−２４０）。こうした一連の症候群をＷＨＯは「メタボリックシンドローム（代謝異常症候群）」と提唱し、世界的に診断および治療に当たるようになってきた。【０００３】  肥満すなわち、脂肪蓄積により動脈硬化が起こる。これは、肥満により合併した、糖尿病、高脂血症、高血圧がクラスターされた結果、動脈硬化を引き起こすというのが一般に受け入れられてきた病態発症機構である。しかし、最近脂肪組織中心説と呼ばれるメカニズムが注目されている。これはアディポサイトカイン（脂肪組織由来内分泌因子の総称）が、脂肪蓄積状態においては、その産生・分泌が過剰あるいは過小となり、このバランスの破綻が直接動脈硬化の進展に深く関わるというものである。アディポサイトカインの中で現在、最も直接動脈硬化に関与しているとされているのが、アディポネクチンである。アディポネクチンは、大阪大学細胞工学センターにおいて発明者によりクローニングされた脂肪組織特異的内分泌因子である（Ｍａｅｄａ  Ｋ、ｅｔ  ａｌ，：Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２２１（２）：２８６−９，１９９６）。
１）その血中濃度は肥満者において低下し、さらに、肥満度が同じでも、心筋梗塞や狭心症といった動脈硬化性疾患、および糖尿病で血中アディポネクチンが低下していることを明らかにされている。つまり、アディポネクチンはメタボリックシンドロームの鍵となる分子と考えられている。
２）さらに動脈硬化に対する作用としてアディポネクチンは正常血管内皮下では認められないが、バルーン障害数時間後のラット頚動脈血管内皮下に強く認められ、血流中のアディポネクチンが障害血管内皮下に侵入することがわかった。アディポネクチンは血管内皮細胞において、ＴＮＦ−α依存性に上昇する接着分子ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチンの発現を抑制し、血管内皮細胞と単球との接着を阻害する。またマクロファージの泡沫化を抑制する。さらに種々の増殖因子による血管平滑筋細胞の増殖を抑制する作用も有することがわかった。これらの細胞実験はアディポネクチンが抗動脈硬化ホルモンであることを示したのである。【０００４】  さらに野生型マウスに比較してアディポネクチンノックアウトマウスは、大腿動脈擦過後の血管内膜平滑筋の増殖、すなわち内膜肥厚が進んでいた。アディポネクチン補充は、この内膜肥厚を野生型のレベルにまで改善した。アディポネクチンノックアウトマウスの血管障害時の血管内膜肥厚の増強は、アディポネクチンの抗動脈硬化作用の欠乏によることが考えられ、またアディポネクチンの補充が、低アディポネクチン血症に付随した動脈硬化の治療につながることを示した。【０００５】  以上の理由により、アディポネクチンの補充により臨床的にはメタボリックシンドロームあるいは動脈硬化の抑制および治療を行うことのできる可能性がある。しかしアディポネクチンはヒト血中に大量に存在する蛋白質であるため直接投与による治療は困難である。そのため現在まで臨床応用法としては、以下の２つのメカニズムを介した開発が中心に行われてきた（前田和久  船橋徹：Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ２００４  内分泌、代謝ｐ１５−１９）。【０００６】１）アディポネクチン分泌促進薬
まず臨床的に低下した血中アディポネクチンを上昇させる薬剤の開発が重要となる。アディポネクチンは脂肪組織に特異的に発現するため、脂肪組識に直接作用する薬剤が注目された。最初にＰＰＡＲγ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒγ）アゴニストが血中アディポネクチン濃度を上昇させることが報告された。最近さらにその詳細なメカニズムとして、下村らはアディポネクチンのプロモーター領域にＰＰＡＲ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＰＰＲＥ）が存在し、さらにその近傍にｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒのひとつであるＬＲＨ−１（ｌｉｖｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ−１）の結合領域（ＬＲＨ−ＲＥ）が存在する。ＲＸＲ（ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）とＰＰＡＲγのヘテロダイマーとＬＲＨ−１が協調的に作用してアディポネクチンの転写活性を最大限に上昇させることを報告している。現在、ＰＰＡＲγを強く活性化するチアゾリジン誘導体がアディポネクチン不足を解消する臨床応用法として注目されている。【０００７】  しかし、これらチアゾリジン誘導体では脂肪細胞の小型化に伴うアディポネクチンの上昇が認められているが、前駆脂肪細胞から小型脂肪細胞への分化を促進することにより、食事や運動療法が不十分であるとむしろ肥満が憎悪してしまう。従って、生体にとってはアディポネクチンを増やすが、肥満に伴って耐糖能が悪化することも考えられ最終的に動脈硬化に寄与できるかは疑問視されており、実際にヒトを対象にした大規模試験ではこれらを支持する積極的なデータはない。【０００８】  同様に、レニンアンギオシステム系をはじめとする降圧剤などもアディポネクチンの濃度を増やす薬剤として注目されているが、最終的に血圧コントロールにより動脈硬化の抑制効果が存在するのか、アディポネクチンを増やすことによって動脈硬化を抑制するのか判然としない。従って降圧効果とは独立してアディポネクチンに依存した動脈硬化抑制の定量性が行えた場合、本薬剤の効能や適応が追加される可能性がある。【０００９】２）アディポネクチン受容体
一方、門脇らは最近、精製困難であるとされてきたアディポネクチン受容体の精製に成功した。主に骨格筋に存在するＡｄｉｐｏＲ１と肝臓に存在するＡｄｉｐｏＲ２であり、血管やマクロファージには両方が発現しているとされている。この受容体を介して、ＡＭＰキナーゼやＰＰＡＲαなどのシグナルが活性化され糖取り込みや脂肪酸の燃焼が起こる。さらにＡｄｉｐｏＲ１とＡｄｉｐｏＲ２の発現レベルは組織・細胞分化・病態特異的に制御を受けていることが明らかとなり、アディポネクチンの感受性・抵抗性といった概念が存在しうることが明らかになった。【００１０】  従って、アディポネクチン受容体の発現制御薬は新規の抗糖尿病薬、抗動脈硬化開発の道を切り開くものと期待されているが、本受容体は代謝に関与するメカニズムを十分に説明しうるものではではあるが、アディポネクチンの動脈硬化に対する直接効果について十分に説明しうるものとは言いがたい。またアディポネクチンの感受性や抵抗性といった概念を検討しうるシステムも明らかでない。【００１１】  よって、いずれのアプローチ法もメタボリックシンドロームあるいは動脈硬化進展に関与する、アディポネクチンの持つ作用を生体内で正確かつ十分に再現しうるシステムとは言えない。以上の理由によりアディポネクチン依存性の抗動脈硬化作用を迅速かつ、正確に評価できる生体システムを構築が強く望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】  本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、従来技術と全く異なった発想からの新規な動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスを提供することを目的とする。また、本発明は、それを利用したアディポネクチンを介した動脈硬化に対する改善効果を評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】  本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、アディポネクチンノックアウトマウスとアポＥノックアウトマウスを交配することで動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスが得られること、並びにその動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスを利用すればアディポネクチン依存性抗動脈硬化を評価するシステムとして最適なものであることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。【００１４】  本発明は、脂肪組織に由来する因子による動脈硬化およびメタボリックシンドロームの治療効果を判定ならびにスクリーニングするための方法であって：Ａ）アディポネクチンノックアウトマウスとアポＥノックアウトマウスを交配して得られる動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスを提供する工程；およびＢ）該マウスを、薬剤や食品成分などによって治療効果を判定する工程、を包含する、方法を提供する。本発明はまた、そのような方法において使用する動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウス、システムなども提供する。【００１５】  すなわち、本発明は、アディポネクチンノックアウトマウスとアポＥノックアウトマウスを交配した動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスを提供する。
また、本発明は、その動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスを利用したアディポネクチン依存性抗動脈硬化評価方法を提供する。
さらに、本発明は、その方法を利用した医薬品のスクリーニング方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】  本発明に記載される動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスを利用すれば、効率良くアディポネクチン依存性の抗動脈硬化を評価できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】  アディポネクチンは大阪大学で発明者により発見された抗動脈硬化ホルモンである。現在、このホルモンを増加させる方法、或いは受容体に対するアゴニスト、或いはアディポネクチン作用の感受性を高める方法の開発が世界中で活発に行われている。本発明において、アディポネクチンのノックアウトマウスと動脈硬化発症モデルマウスであるアポＥノックアウトマウスを交配することにより動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスを得ることができた。そして、その動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスを利用することでアディポネクチンの持つ抗動脈硬化現象を最も正確かつ迅速に生体内で検討することに成功することができた。その結果、アディポネクチンを介した抗動脈硬化薬、抗糖尿病薬、を効率良く、機能的に解析する手段を得ることができた。【００１８】  従来の細胞実験による方法ではヒト或いはマウス脂肪細胞から分泌されるアディポネクチンを増加させる薬の開発を行うことが出来る。しかし、細胞のみによる評価では、生体内で同様な機能が期待できるかどうかは明らかでない。一方、臨床的な検討から患者に薬剤を投与した結果、アディポネクチンの濃度上昇をみる方法は極めて効率の悪いものであり、特に動脈硬化への効果を判定するためには十年単位の年月を要する。
従って両者ともアディポネクチン依存性抗動脈硬化メカニズムを解析する方法として再現性の低く、効率の悪いものであった。一方、アディポネクチン受容体に対する作動薬は受容体制御薬と同様に抗糖尿病、抗動脈硬化薬開発の道を切り開くものと期待されるが、特に動脈硬化に関してアディポネクチンの感受性や抵抗性といった概念を十分に再現することは困難である。
本発明の技術によればアディポネクチンのノックアウトマウスと動脈硬化発症モデルマウスであるアポＥノックアウトマウスを交配することにより得られた動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスが動脈硬化を発症、進行する２ヶ月の間に種々の薬剤、或いは食品の投与を行えば、アディポネクチン依存性の抗動脈硬化を検証することができるようになる。【００１９】  さらに、本発明を用い、複数の医薬品のデータベース化により、多くの候補から容易にしかも的確に判定できるようになる。【００２０】  本発明に用いられるアディポネクチンノックアウトマウスは製造上特に限定されるものでないが、例えば１２９マウス系統に由来しているＥＳ細胞株を使用してトランスジェニックマウスを作製し、Ｃ５７ＢＬ／６に数回バッククロスする方法等が挙げられる。この方法に従えば本発明に必要なアディポネクチンノックアウトマウスを得ることができる。通常のアディポネクチンのみのノックアウトマウスとコントロールマウスを用いた系ではアディポネクチン欠損による種々の効果が検定できるが、動脈硬化は起こしにくく有用なモデルとは言いがたい。【００２１】  また、動脈硬化発症モデルマウスであるアポＥノックアウトマウスにおいても製造上特に限定されるものでないが、例えば１２９マウス系統に由来しているＥＳ細胞株を使用してトランスジェニックマウスを作製し、Ｃ５７ＢＬ／６に数回バッククロスする方法等が挙げられる。この方法に従えば本発明に必要な動脈硬化発症型アポＥノックアウトマウスを得ることができる。【００２２】  アポＥノックアウトマウスは普通食或いは動脈硬化誘発食下で容易に動脈硬化を進展する。しかし、本モデルに上記のアディポネクチン増加促進剤や受容体アゴニストを投与しても実際にアディポネクチンを介するメカニズムの検討はできない。例えば山田らは（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖｓａｃ  Ｂｉｏｌ．  ２００１；２１：３７２−３７７）アポＥノックアウトマウスにＰＰＡＲγアゴニストを投与して動脈硬化が抑制されることを報告しているがその作用メカニズムとして、全身性の代謝作用と動脈壁への直接効果と推測しているため作用機序が明らかであるとはいえない。【００２３】  また、例えばアポＥノックアウトマウスは通常の同系統マウスに比べて、糖代謝異常を来たしにくいので、アディポネクチン依存性と非依存性の動脈硬化抑制メカニズムを検討した場合、非依存性つまり薬剤の持つ直接効果や糖代謝の改善による動脈硬化改善作用は生理的なヒトに近い作用機序であるとは言いがたい。【００２４】  さらに、糖尿病治療薬として、低下したインスリン作用を補うために、インスリンの直接補充やインスリンを増やす薬に加えて最近、インスリンの抵抗性を改善する薬が出現したが、こうした抵抗性を改善する薬を開発する場合、単純に血中インスリンが上昇するとは限らない。アディポネクチンについても同様のことが言え、必ずしもアディポネクチンを増やすのみではなく、その感受性や抵抗性を評価検討する必要がある。【００２５】  本発明では、これら２種のノックアウトマウスを交配し動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスを得るものである。その交配方法は、常法に従えば良く、たとえばＣ５７ＢＬ／６に数回バッククロスして作製されたアディポネクチンノックアウトマウスとアポＥノックアウトマウスを交配してアディポネクチン・アポＥダブルヘテロノックアウトマウスを得る。得られたアディポネクチン・アポＥダブルヘテロノックアウトマウス同士を掛け合わせて作製する方法などが挙げられる。この方法に従えば、本発明に必要なアディポネクチン・アポＥダブルノックアウトマウスおよび、コントロールとして同腹のアポＥノックアウトマウスが得られる。それぞれをコロニー化して大量に作成することができるが特に限定されるものではない。【００２６】  上記方法で得られたダブルノックアウトマウスであれば、アディポネクチン依存症の抗動脈硬化を検証することのできるマウスを得ることとなる。その検証方法は特に制約されるものではないが、例えば対象とする医薬品を血中投与する方法、経口投与する方法、また対象とする食品、或いはその抽出物を経口投与する方法が挙げられる。それら投与の結果、ダブルノックアウトマウスに対する薬剤や食品の抗動脈硬化作用と、アポＥノックアウトマウスに対する薬剤や食品の抗動脈硬化作用を比較検討すれば、すなわちその差異がアディポネクチンの存在することにより見られた薬剤もしくは食品の動脈硬化に対する効能になる。【００２７】  また、本発明の動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスであればアディポネクチン依存性メタボリックシンドロームの評価もできるようになる。従来技術で、例えばチアゾリジン誘導体では脂肪細胞の小型化に伴うアディポネクチンの上昇が認められているが、前駆脂肪細胞から小型脂肪細胞への分化を促進することにより、食事や運動療法が不十分であるとむしろ肥満が憎悪してしまう。従って、メタボリックシンドロームの治療効果は未解明であったが、本発明によりアディポネクチン濃度、糖尿病、高脂血症に加えて動脈硬化も検討できるためメタボリックシンドローム発症のメカニズム検討が明確となり、極めて有効な技術である。【００２８】  また、本発明の動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスであればアディポネクチンの感受性や抵抗性の評価もできるようになる。従来技術で、例えば血中のアディポネクチン濃度のみでは感受性や抵抗性の定量は出来ない。しかし、本発明により明らかにされたアディポネクチン依存性の抗動脈硬化などとアディポネクチン血中濃度を組み合わせることにより、アディポネクチンの感受性や抵抗性も定量できることになる。【００２９】  本発明により、上記のようにアディポネクチン依存性の抗動脈硬化、メタボリックシンドローム治療効果、アディポネクチンの感受性や抵抗性を検証することができるようになる。従って、本発明により抗動脈硬化治療薬、メタボリックシンドローム治療薬、アディポネクチン増加促進剤、アディポネクチン抵抗性改善薬（或いは感受性増進薬）等のような医薬品を開発できるようになる。また、本発明の技術により多種薬剤のスクリーニングが同時に行えるようになる。
【実施例】
【００３０】  以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。【００３１】  以下に示した実施例において使用した試薬は、特に言及しない限り和光純薬、Ｓｉｇｍａ、Ｏｔｓｕｋａから得た。動物の飼育は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈｇ作成した「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ」およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅが作成、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈが公表した「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（ＨＩＮ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．８６−２３，１９８５，改訂）に遵って、大阪大学医学部において規定される基準に遵い、動物愛護精神に則って行った。ヒトを対象とする場合は、厚生労働省の基準に従い、事前に同意を得た上で実験を行う。
【実施例１】
【００３２】（動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスとそのコントロールマウスの作製）
本実施例ではＣ５７ＢＬ／６に数回バッククロスして作製したアディポネクチンノックアウトマウスとアポＥノックアウトマウスを交配してアディポネクチン・アポＥダブルヘテロノックアウトマウスを得た。さらに、得られたアディポネクチン・アポＥダブルヘテロノックアウトマウス同士を掛け合わせてアディポネクチン・アポＥダブルノックアウトマウスおよび、コントロールとして同腹のアポＥノックアウトマウスを得た。
【実施例２】
【００３３】（動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスとそのコントロールマウスの確認）
実施例１において作製したマウスの中にアディポネクチンおよびアポＥが欠損していることはＤＮＡおよび蛋白質により確認する。両ＤＮＡの欠損は、ジェノミックサザンブロッティング法およびＰＣＲ法にて同定することが出来る。作製した動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスとそのコントロールマウス、アポＥノックアウトマウスをそれぞれ、交配させコロニーを作製した。各コロニーから生産されるマウス群をアディポネクチン依存性の動脈硬化検討に用いた。
【実施例３】
【００３４】（動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスの特徴づけ）
次に実施例２において作製した動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスの血清中のアディポネクチンが欠損していることを、ＥＬＩＳＡを用いることによって確認した。コントロールとしてアポＥノックアウトマウスの血清アディポネクチンを測定した。さらに、両マウスの動脈硬化進展度合いを比較した。【００３５】  その結果、動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスは０μｇ／ｍｌ、アポＥノックアウトマウスは約５〜２０μｇ／ｍｌのアディポネクチンを分泌していた。また動脈硬化の進展度合いもダブルノックアウトマウスではコントロールマウスに比べて亢進していることが分かった。従って本発明のマウスはアディポネクチンが欠損していることによって、アポＥの欠損している状態で動脈硬化をより起こしやすくなっていることが分かった。
【実施例４】
【００３６】（マウスへの動脈硬化誘発食および薬剤の投与）
実施例２において作製したアポＥノックアウトマウスと動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスをそれぞれ５匹ずつ、６週齢より６週間にわたり、Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｔｙｐｅ  ｄｉｅｔ（２１％粗脂肪、０．１５％コレステロールを含む、オリエンタル酵母）にアディポネクチンの増加促進剤であるＰＰＡＲγアゴニストの一種であるトログリタゾンを混餌量０．１％で含むものと含まないものに群分け飼育した。
【実施例５】
【００３７】（マウス動脈硬化の評価）
次に、図１に示す方法にてマウスの動脈硬化進展度を観察した。大動脈３ヵ所を病理組織学的に検査したが大動脈の標本採取部位は近位、中位、遠位の３ヵ所を観察した。染色はヘマトキシリン−エオジン染色及びオイルレッド染色を施した。特徴的な変化は、ヘマトキシリン−エオジン染色では微細な泡沫状の大きい細胞質をもつ細胞で構成される限局性斑であった。オイルレッド染色では、この細胞の細胞質に諸種大きさの脂質滴が認められた（リポイド斑）。これらの斑は大動脈の管腔側に盛り上がった形でみられ、しばしば表面近くに軽度ながら結合織増生も観察された。【００３８】  大動脈の部位別に見ると、リポイド斑の形成は、近位で全例にみられ、かつ変化も他の部位に比べて明らかに高度であった。リポイド斑が高度な近位の大動脈壁では中膜筋細胞の配列異常を伴う中膜肥厚を伴っていた。これらの変化はリポイド斑の下に位置する中膜で明らかであり、オイル赤Ｏ染色では中膜筋細胞にも微細な脂質滴が観察された。【００３９】  病変の強さ：  ０；変化なし    １；ごく軽度    ２；軽度    ３；中等度    ４；高度、（リポイド斑の強さ：  ごく軽度，軽度；管腔に面した血管壁の１／３以下、中等度；管腔に面した血管壁の１／３を占めるが比較的薄い（細胞が３層程度）、高度；管腔に面した血管壁の１／３以上を占め、斑が厚い）としてスコア化し、各群での動脈硬化進展度合いを薬剤投与していない状態を基準にして比較検討した。得られた結果を図２に示す。
【実施例６】
【００４０】（アディポネクチン依存性抗動脈硬化の評価）
図２において、薬剤投与したアポＥノックアウトマウスと同じく薬剤投与した動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスの動脈硬化進展度合いの差がすなわち、アディポネクチンの存在下つまりアディポネクチン依存性の抗動脈硬化と考えられた。トログリタゾンを例に取ると、トログリタゾンのもつ抗動脈硬化（２５％改善）のうち約半分（１３％）がアディポネクチンの存在していない状態でも見られ、アディポネクチン非依存性の抗動脈硬化と考えられた。一方、残りの部分すなわちアディポネクチンの存在しているアポＥノックアウトマウスは認められているが、アディポネクチンの存在していない動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスでは認められていない部分は（１２％）はアディポネクチン依存性に動脈硬化が改善していると考えられた。
【実施例７】
【００４１】（アディポネクチン依存性抗メタボリックシンドロームの評価）
同様のマウスを用いて、血糖や血清インスリン値、中性脂肪やコレステロールなどの脂質成分を定量する。動脈硬化の結果とあわせてアディポネクチン依存性のメタボリックシンドロームの評価を行った。
【実施例８】
【００４２】（アディポネクチンの感受性の評価）
ヒトでは通常トログリタゾンにてアディポネクチン濃度は約２倍近くになるとされている（Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２００２  Ｏｃｔ；５１（１０）：２９６８−７４）。同様に本マウスに対してもトログリタゾン投与によりアディポネクチン血中濃度は約２倍近くになる。【００４３】  血中濃度が例えば、全く変化しない薬剤を使用して、同程度のアディポネクチン依存性の動脈硬化の改善度が認められた場合に比較して、トログリタゾンの抗動脈硬化は感受性が５０％である。
【産業上の利用可能性】
【００４４】  本発明に記載される方法であれば、極めて短期間にアディポネクチンの存在下および非存在下で生体に於ける動脈硬化進展度の定量が可能である。そのため実際の薬剤スクリーニングがきわめて容易にできるようになる。さらに、メタボリックシンドロームの検討も同じ条件で比較できるようになる。この方法は、たとえば抗動脈硬化薬、メタボリックシンドローム治療薬、アディポネクチン増加促進剤、アディポネクチン抵抗性改善薬スクリーニングへの応用が強く期待される。したがって、本発明は医学、生物学等の分野における極めて有用な発明である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】  実施例５に示す動脈硬化進展度を検討する方法を示す図である。
【図２】  実施例６に示すトログリタゾン投与下での動脈硬化発症型ダブルノックアウトマウスとそのコントロールマウスのアディポネクチン依存性抗動脈硬化評価方法を示す図である。
【図１】
2005278617.tif 000002
【図２】
2005278617.tif 000003