(57)【要約】【課題】  無菌培養を利用して、アマモ類の一部細胞からアマモ類の植物体の大量増殖を可能とするアマモ類の無菌培養法および該方法により得られたアマモ類を提供する。【解決手段】  無菌化したアマモ類の生長点を含む組織を培養してその植物体を再生させる。ここで上記組織は、アマモ類の生長点を含む茎組織であり、アマモ類より該茎組織を切り出した後、除菌洗浄を行なったものである、または、上記組織は、アマモ類の種子を除菌洗浄後、該種子を無菌状態で発芽、生育させて得られたアマモ幼苗の生長点を含む胚軸を切り出したものである。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
無菌化したアマモ類の生長点を含む組織を培養して該アマモ類の植物体を再生させることを特徴とするアマモ類の無菌培養法。
【請求項２】
前記組織は、アマモ類の生長点を含む茎組織であり、アマモ類より該茎組織を切り出した後、除菌洗浄を行なったものであることを特徴とする請求項１記載のアマモ類の無菌培養法。
【請求項３】
前記組織は、アマモ類の種子を除菌洗浄後、該種子を無菌状態で発芽、生育させて得られたアマモ幼苗の生長点を含む胚軸を切り出したものであることを特徴とする請求項１記載のアマモ類の無菌培養法。
【請求項４】
前記培養は、活性炭を含んだ人工海水培地で行なうことを特徴とする請求項１、請求項２または請求項３記載のアマモ類の無菌培養法。
【請求項５】
前記培養は、抗菌物質を添加して行なうことを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれか一項記載のアマモ類の無菌培養法。
【請求項６】
アマモ類の採取から培養までの工程を、４℃〜１５℃の温度で行なうことを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれか一項記載のアマモ類の無菌培養法。
【請求項７】
請求項１ないし請求項６のいずれか一項記載の方法により作出されることを特徴とするアマモ類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アマモ類の無菌培養法および該方法により作出されるアマモ類に関する。
【背景技術】
【０００２】
アマモ類はオモダカ目アマモ科に属し、北半球の温帯域から寒帯域に分布し、流れの少ない内湾の浅底に生息する海産顕花植物である。アマモ類は、茎、葉、根が明確に分化していて花を咲かせて種子を作るため、他の水中顕花植物とともに、「海藻」と区別して、「海草」と呼ばれている。
アマモ類が群落状に生育している場所をアマモ場といい、該アマモ場はその周囲の生物環境および水質環境に大きな影響を与えている。例えば、潮流を和らげる、外敵からの隠れ場になる、夏季にアマモが減少する時には、枯死した葉が有機栄養分となり、多くのエサが提供されることなどにより、アミメハギ、ヨウジウオ、メバル、マダイなどの幼稚魚やヨコエビ、ワレカラなど小型動物の成育場またはこれらの産卵場となっている。また一方で、アマモ場を含む藻場は、地球の温暖化の原因となっている二酸化炭素を吸収する、または、富栄養化の原因物質であるリンを吸収することで海洋環境の浄化も担っている。
【０００３】
近年、沿岸域の埋め立て、流入河川の水質悪化などに起因する海洋環境の悪化によりアマモ場が減少傾向にあることに鑑み、全国的にアマモ場を造成回復させる試みがなされている。このアマモ場の造成は、天然のアマモより採取した種子を浅海域に直接播種する、または、採取した種子を苗まで育てた後に、このアマモ種苗を浅海域に播種、移植することで主に行なわれている。また、広範囲のアマモ場を形成するには、大量の種苗が必要となるため、アマモ種苗を人工的に増殖する技術の研究が行なわれている。従来、藻類などの人工増殖方法として、藻体の一部組織をプロトプラスト（単細胞）化などし、これを濃度勾配を調整した抗菌物資の存在下で培養する無菌培養法（特許文献１参照）などが開示されている。
【０００４】
しかしながら、上記天然の種子を採取・保存・播種することによる造成では、造成の一方で種子を海域から採取するという矛盾を内包し、大量の天然種子を必要とするため、天然アマモの増殖を阻害する原因になるという問題がある。また、人工的に増殖させる場合では、元となるアマモが雑菌が蔓延する海に生息していたことから無菌状態での培養が困難であるという問題がある。上記特許文献１は、藻類、主に海藻についての培養法であり、繁殖方法などの生育性質の異なる海草（アマモ類）の培養法については具体的に開示されていない。また、特許文献１を含め、従来の研究では、カルス形成程度までの培養は成功しているものはあるが植物体の再生には至っていないのが現状である。
【特許文献１】特開平５−６８４４２号公報（段落［０００６］〜段落［０００７］）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はこのような問題に対処するためになされたもので、無菌培養を利用して、アマモ類の一部細胞からアマモ類の植物体の大量増殖を可能とするアマモ類の無菌培養法および該方法により得られたアマモ類を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のアマモ類の無菌培養法は、無菌化したアマモ類の生長点を含む組織を培養してその植物体を再生させることを特徴とする。
上記組織は、アマモ類の生長点を含む茎組織であり、アマモ類より該茎組織を切り出した後、除菌洗浄を行なったものであることを特徴とする。または、上記組織は、アマモ類の種子を除菌洗浄後、該種子を無菌状態で発芽、生育させて得られたアマモ幼苗の生長点を含む胚軸を切り出したものであることを特徴とする。
【０００７】
本発明におけるアマモ類の植物体とは、茎、葉、根が分化したアマモ類の個体をいう。また、本発明におけるアマモ幼苗とは、種子の発芽後の経過期間が、０ヶ月〜４ヶ月のアマモ類の植物体をいう。
無菌化したアマモ類の生長点を含む組織とは、アマモ類の茎組織を用いる場合では、アマモ類より生長点を含み切り出された後、直接除菌洗浄されることで無菌化された該茎組織をいい、アマモ幼苗の胚軸を用いる場合では、種子の段階で除菌洗浄された後、無菌状態で発芽、生育されることで無菌状態を維持された該胚軸組織をいう。
【０００８】
上記培養は、活性炭を含んだ人工海水培地で行なうことを特徴とする。また、上記培養は、抗菌物質を添加して行なうことを特徴とする。
また、アマモ類の採取から上記培養までの工程を、４℃〜１５℃の温度で行なうことを特徴とする。
【０００９】
本発明のアマモ類は、上記アマモ類の無菌培養法により作出されることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の無菌培養法により、生物工学的手法によるアマモ類の大量増殖法開発のために必須となる無菌培養苗を効率的に作出できる。また、本発明により作出される無菌培養苗を用いたクローン苗は、均一性、発芽斉一性が高く、アマモ場造成用の優良品種として利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
国内で繁殖するアマモ類としては、アマモ、オオアマモ、コアマモ、エビアマモ、リュウキュウアマモ、リュウキュウスガモなどがある。
本発明のアマモ類の無菌培養法は、無菌化したアマモ類の生長点を含む組織を培養して、該組織をアマモ類の植物体まで再生させる方法である。生長点を含む組織として茎組織を用いるか、または胚軸を用いるかで２通りの工程があり、以下でそれぞれを説明する。
本発明の無菌培養法の手順を図１を参照して説明する。図１は、生長点を含む組織として茎組織を用いた場合の工程図を示す。
海浅底より天然のアマモ類を採取する（Ｓ１）。採取したアマモ類の外皮を剥ぎ生長点を含む茎組織を所定の大きさに切り出す（Ｓ２）。生長点は、アマモが伸長する部位であり節状である。切り出す大きさは茎の長径５ｍｍ〜８ｍｍ程度とする。該大きさとすることにより、雑菌汚染率を低く抑えながら、活着率が向上する。
【００１２】
切り出した生長点を含む茎組織を、除菌洗浄剤などに浸漬して除菌洗浄する（Ｓ３）。除菌洗浄は、付着した細菌などが十分に落ち、該組織を無菌化できるまで行なう。また、アマモ類より数cmの小片で切りだし除菌洗浄した後に、該小片からさらに上記大きさで組織を切り出してもよい。
無菌化した茎組織を、試験管または瓶内に人工培地、養分、浸透圧調節剤、抗菌物質、活性炭などと合せて入れて初期培養する（Ｓ４）。培養は、４℃〜１５℃、弱光下（２００lux〜１０００lux）の人工気象器内で行なう。また初期培養は、該茎組織より根、葉、茎が再生し植物体となるまで行なう。
初期培養後、必要に応じて継代を行ない、アマモ類の植物体の培養を行なう（Ｓ５）。培養条件などは初期培養と同様であるか、または培地などを適宜変更してもよい。
（Ｓ１）〜（Ｓ４）までの概ねの工程を、４℃〜１５℃の温度で処理することが好ましい。具体的には、海での採取から運搬、材料調達、クリーンベンチ内での操作、未使用材料の保管の間、氷冷するなどして高温に曝されることを回避する。該温度範囲とすることにより、アマモ類の細胞活性が維持され活着率が向上する。また、（Ｓ２）〜（Ｓ５）の工程では、無菌状態を維持して行なうことが好ましい。具体的には、グリーンベンチ、グリーンルームなどで作業を行ない、試験管などへ入れるときに外部より細菌などの微生物が混入することを防止する。
【００１３】
本発明の無菌培養法の他の手順を図２を参照して説明する。図２は、生長点を含む組織としてアマモ幼苗の胚軸を用いた場合の工程図を示す。
海浅底より天然のアマモ類の種子を採取する（Ｓ６）。採取した種子に混ざっている貝、石、腐敗した種子を取り除き、除菌洗浄剤などに浸漬して除菌洗浄する（Ｓ７）。除菌洗浄は、種子外表面に付着した細菌などが十分に落ち、該種子を無菌化できるまで行なう。
除菌洗浄した種子を、海砂（オートクレーブ済み）および海水、蒸留水を入れた試験びん内に播種し、発芽後、所定期間アマモ幼苗の育成を行なう（Ｓ８）。アマモ幼苗の育成は、胚軸が切り出すのに十分な大きさとなるまで行ない、通常２ヶ月程度である。
アマモ幼苗の基部から生長点を含む胚軸を所定の大きさに切り出す（Ｓ９）。胚軸を切り出す大きさは直径１ｍｍ〜２ｍｍ程度、長さ２０ｍｍ〜３０ｍｍ程度とする。該大きさとすることにより、活着率が向上する。
【００１４】
胚軸から切り出した組織を、試験管または瓶内に人工培地、養分、浸透圧調節剤、抗菌物質などと合せて入れて初期培養する（Ｓ１０）。培養は、４℃〜１５℃、弱光下（２００lux〜１０００lux）の人工気象器内で行なう。また初期培養は、該組織より根、葉、茎が再生し植物体となるまで行なう。
初期培養後、必要に応じて継代を行ない、アマモ類の植物体の培養を行なう（Ｓ１１）。培養条件などは初期培養と同様であるか、または培地などを適宜変更してもよい。
（Ｓ１）〜（Ｓ４）の工程と同様に、（Ｓ６）〜（Ｓ１０）までの概ねの工程を、４℃〜１５℃の温度で処理することが好ましい。また同様に、（Ｓ７）〜（Ｓ１１）の工程では、無菌状態を維持して行なうことが好ましい。
【００１５】
アマモ類の組織の除菌洗浄に用いる除菌洗浄剤としては、アマモ類の生育阻害となる細菌を滅菌することができ、かつ、アマモ類の生理状態に悪影響を与えない任意のものを使用できる。例えば、滅菌作用を有するものとして次亜塩素酸ナトリウムなどを含む塩素系洗剤を、その他イオン性または非イオン性界面活性剤などを適宜使用することができる。十分な滅菌能力を発揮させ、かつ、アマモ類への悪影響を最小限に抑えるため、使用する除菌洗浄剤の有効塩素濃度は０．５％〜２．５％とすることが好ましい。
また、汚染原因となる微細な付着物などを取り除くため、超音波洗浄も合せて行なうことが好ましい。
【００１６】
抗菌物質としては、アマモ類の生育阻害となる細菌の増殖を抑制でき、かつ、アマモ類の生理状態に悪影響を与えない任意のものを使用できる。例えば、細胞壁生合成阻害物質として、カルベニシリン、ペニシリン、メチシリン、アンピシリン、アモキシシリンなどのβ−ラクタム系、セファゾリン、セフォチアム、セフォペラゾン、セフジニル、フロモキセフなどのセフェム系、イミペネム、パニペネム、メロペネムなどのカルバペネム系、アズトレオナム、カルモナムなどのモノバクタム系、バンコマイシンなどのグリコペプチド系などが挙げられ、蛋白質合成阻害物質として、ストレプトマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、アルベカシンなどのアミノグリコシド系、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、ジョサマイシンなどのマクロライド系、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンなどのテトラサイクリン系、クロラムフェニコールなどが挙げられ、核酸合成阻害物質として、ナリジクス酸、ノフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシンなどのキノロン系、リファンピシンなどが挙げられ、葉酸合成阻害として、スルファメトキサゾール、スルファミン、スルファモノメトキシンなどのサルファ薬、パラアミノサリチル酸、ジアフェニルスルホン、トリメトプリルなどが挙げられる。
【００１７】
浸透圧調節剤としては、アマモ類の生育阻害となる細菌の増殖を助長しないものであれば任意のものを使用できる。例えば、マニトール、グルコース、ソルビトール、フルクトース、スクロースなどの糖類、塩化ナトリウムなどの塩類などが挙げられる。
【００１８】
初期培養および植物体の培養に用いる人工海水培地としては、アマモ類の生育に必要な栄養分を有し、かつ滅菌状態を維持できる任意のものを使用できる。例えば、市販の人工培地として、ＭＳ（Murashige and Skoog）培地、ダイゴ人工海水ＳＰ（日本製薬（株）製）、ダイゴＩＭＫ培地（日本製薬（株）製）、ダイゴＩＭＫ−ＳＰ培地（日本製薬（株）製）などが挙げられる。
【実施例】
【００１９】
実施例１〜実施例１０
池の浦（三重県：二見町）、松名瀬（三重県：松阪市）でアマモの植物体を採取した。腐敗を避けるため、採取したアマモは、ただちに海土のついた外皮を剥ぎ、生長点を含む茎組織を５〜６ｃｍの大きさに切断して、超音波洗浄を５分、５倍希釈台所用洗剤（有効塩素濃度１％）で１０分間処理した。
8 ｃｍ試験管に、10ml ＭＳ（Murashige and Skoog）、3 重量％ ショ糖、浸透圧調節剤として 0.2Ｍ マニトール、抗菌物質として 250mg/L カルベニシリンを入れ、茎組織からさらに外皮を剥ぎ、生長点の周辺組織を表１に示す大きさで摘出して１本ずつを植え込んだ。茎の長径を 5 mm 未満とした群を実施例１、5 mm 〜 8 mm とした群を実施例２とした。
また、上記マニトールに代えて、表２に示す浸透圧調節剤（0.2Ｍ）を添加した。それぞれの群を実施例３〜実施例７とした。
採取から培養まで一連の作業を、アマモを概ね１５℃より高温に曝さないように行なった。培養容器はすべて１５℃恒温、弱光下（1000lux）の人工気象器内に置いた。
また、抗菌物質の影響、および、除菌処理した生長点を含む茎組織の氷冷の影響を表３に示す条件で調べた。「氷冷せず」はクリーンベンチ内で常温（２５℃〜３０℃）で行ない、「氷冷」は、培養試験管、および除菌処理した生長点を含む茎組織を小分けして海水に漬けている容器を氷冷して行なった。なお、茎組織は、茎の長径 5 mm 〜 8 mm のものを使用した。それぞれの群を実施例８〜実施例１０とした。
各実施例および比較例について、初期生育数および雑菌汚染数とをカウントした。結果を表１〜表３に示す。なお初期生育数は、初期培養で枯死せず生長した個体数（雑菌汚染したのは除く）であり、雑菌汚染数は透明の培地が雑菌発生により白濁した個体数である。実施例８について培養開始から３週間後には、1 〜 2cmの鮮やかな緑色の茎組織に生長した。該再生した茎組織のグレースケール写真を図３に示す。
【００２０】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【００２１】
アマモの植物体を、農作物のように１回に培養する量だけを除菌し、残りを海水につけておくと、一晩で軟腐し、除菌不能となった。そのため、毎回採取した全株をただちに材料調整し、除菌処理する必要があった。
摘出する生長点は、農作物並みの 1 〜 2 mmでは枯死するため、5〜8mmとする必要があった。また、実施例１および実施例２に示すように、この大きさで摘出しても雑菌の発生は抑制できた。
実施例３〜７に示すように、浸透圧調節剤としてはソルビトールが不適である以外は大差がなかった。
実施例９に示すように、抗菌物質として 250mg/L カルベニシリンを添加することが雑菌汚染の抑制に有効であることが分かった。
【００２２】
実施例１１〜実施例１８
松名瀬（三重県：松阪市）、立神（三重県：阿児町）でアマモの種子を採取した。
種子に混じっている小さな貝や石、腐敗した種子を取り除き、超音波洗浄 30分、 70％エタノールで 30 秒、２倍希釈台所用洗剤（有効塩素濃度 2.5％）で１分間表面殺菌した。
試験びんに 40ｇ海砂を入れオートクレーブし、フィルターろ過 20％海水（20重量％海水：80重量％蒸留水）75 ml を加えた。これに２５粒ずつ種子を植え込んだ。２週間後、発芽した種子の数、および雑菌汚染数をカウントした。結果を表４に示す。なお、松名瀬（３回採取）で得られた種子を用いた群を実施例１１〜１３、立神（２回採取）で得られた種子を用いた群を実施例１４、１５とした。
発芽したアマモ幼苗に等量（75ml）のフィルターろ過 100％海水を追加した。２ヶ月後、生長したアマモ幼苗の基部から生長点を含む胚軸（直径 1 mm〜 2 mm、長さ 20 mm 〜30 mm）を切り出し、ダイゴ人工海水ＳＰ（日本製薬（株）製）、ダイゴＩＭＫ−ＳＰ培地（日本製薬（株）製）、50％ろ過海水（50重量％海水：50重量％蒸留水）、各１５本ずつ 70ml/びん に移植した。50％ろ過海水に移植したものを実施例１６、ダイゴ人工海水ＳＰに移植したものを実施例１７、ダイゴＩＭＫ−ＳＰ培地に移植したものを実施例１８とした。
再生した根は 0.2重量％活性炭を含むＩＭＫ−ＳＰ固体培地（70ml/びん）に植え込み、茎葉はＩＭＫ−ＳＰ液体培地（150ml/びん）に浸漬した。
培養作業は、アマモを概ね１５℃より高温に曝さないように行なった。培養容器はすべて１５℃恒温、弱光下（1000lux）の人工気象器内に置いた。
各実施例について、発芽数（または茎・根再生数）および雑菌汚染数とをカウントした。結果を表５に示す。また、実施例１８について培養開始から３ヶ月後には、10 cmの植物体に生長した。該植物体のグレースケール写真を図４に示す。なお、図中上左が実施例１６、図中上右が実施例１７、図中下が実施例１８である。
【００２３】
【表４】
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【表５】
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【００２４】
種子の段階で、汚染原因となる混入物や腐敗種子を取り除くことにより、その発芽後の雑菌の発生も概ね抑制できた。また、種子には地域間差があり、松名瀬で採取した種子では雑菌の発生が少なく、実施例１１〜１３に示すように、20％海水を用いることで発芽率が極めて高かった。アマモ種子は１週間ほどで葉鞘を出し、約２週間で緑色の葉身を出し伸長した。10％海水を等量追加すると、その後１〜２週間は生長を続けた。しかし、その後は１個体でも根から雑菌を出すと、急激に汚染が広まり、そのびん全体の幼苗は急激に枯死するケースが多かった。
枯死せず残った幼苗から切り出した生長点を含む胚軸を移植したもののうち、ダイゴＩＭＫ−ＳＰ培地に移植した実施例１８では、根および茎葉が再生し、約 10cmまでの植物体に生長した（図４）。これらは、継代なしに３ヶ月間生存していた。これは、胚軸を完全に無菌化できたことによって可能となったと考えられる。
実施例１８の植物体を、活性炭を含むＩＭＫ−ＳＰ固体培地とＩＭＫ−ＳＰ液体培地に継代したところ、さらに根の伸長が良くなり、胚軸培養後、４ヶ月経過しても生育を続けた。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明により作出される無菌培養苗は、均一性、発芽斉一性が高く、アマモ場造成用の優良品種として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】茎組織を用いた場合の本発明の無菌培養法の手順を示す図である。
【図２】胚軸を用いた場合の本発明の無菌培養法の手順を示す図である。
【図３】再生した茎組織のグレースケール写真図である。
【図４】再生した植物体のグレースケール写真図である。
【符号の説明】
【００２７】
Ｓ１    アマモ類の採取工程
Ｓ２    茎組織の切り出し工程
Ｓ３    除菌洗浄工程
Ｓ４    初期培養工程
Ｓ５    植物体の培養工程
Ｓ６    アマモ類の種子の採取工程
Ｓ７    除菌洗浄工程
Ｓ８    播種および幼苗育成工程
Ｓ９    胚軸の切り出し工程
Ｓ１０  初期培養工程
Ｓ１１  植物体の培養工程
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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