(57)【要約】【課題】  人工真皮と分層皮膚の移植を同時に行なうことができる人工真皮の調製方法を提供する。【解決手段】    凍結されている血管内皮細胞と線維芽細胞を解凍するステップと、コラーゲンスポンジにＰＤＷＨＦを含浸させるステップと、前記血管内皮細胞と前記線維芽細胞とを前記コラーゲンスポンジの表面に散布するステップとを含む方法により、細胞含有人工真皮を調整する。また、ＰＤＷＨＦを含浸させたコラーゲンスポンジ層と、前記コラーゲンスポンジ層の表面に散布された血管内皮細胞と線維芽細胞とを含む細胞含有人工真皮であって、前記血管内皮細胞と線維芽細胞が、凍結及び解凍処理を経たものであることを特徴とする細胞含有人工真皮を提供する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結されている血管内皮細胞と線維芽細胞を解凍するステップと、
コラーゲンスポンジにＰＤＷＨＦを含浸させるステップと、
前記血管内皮細胞と前記線維芽細胞とを前記コラーゲンスポンジの表面に散布するステップと
を含む、細胞含有人工真皮の調製方法。
【請求項２】
前記血管内皮細胞と前記線維芽細胞が同種細胞である、請求項１に記載の細胞含有人工真皮の調製方法。
【請求項３】
ＰＤＷＨＦを含浸させたコラーゲンスポンジ層と、
前記コラーゲンスポンジ層の表面に散布された血管内皮細胞および線維芽細胞と
を含む細胞含有人工真皮であって、前記血管内皮細胞と線維芽細胞は、凍結及び解凍処理を経たものであることを特徴とする細胞含有人工真皮。
【請求項４】
請求項１又は２の方法により調製された細胞含有人工真皮。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植用の人工真皮及びその調製方法に関する。具体的には、血管内皮細胞及び線維芽細胞を含む人工真皮とその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Yannas、Burkeらにより１９８０年に報告された人工皮膚を原型として、二層性人工真皮（IntegraR、USA）が開発され、世界的に臨床に供されている。わが国でも、Yannasらの人工皮膚を改良して開発された二種の人工真皮（PelnacR、TerudermisR）が臨床応用されている（例えば特許文献１）。熱傷や外傷等により生じた深い皮膚欠損創に対して、これらの人工真皮と自家分層植皮の併用による治療が行なわれ、その有効性に関する多くの報告がなされている。
【０００３】
熱傷、外傷、褥瘡などにより真皮が欠損した全層性皮膚欠損創に人工真皮を移植すると、移植床より自己の線維芽細胞や毛細血管が侵入して、単なる肉芽組織とは異なる真皮に類似した組織（真皮様組織）が構築される。この真皮様組織が構築された後、その上に薄い分層皮膚を移植して皮膚を再建する。このようにして再建した皮膚は、薄い分層植皮のみで再建した皮膚と比較して、弾性及び柔軟性などの質感の向上が得られる。皮膚の質感及び皮膚採取部の犠牲は、真皮の厚さに依存している。真皮を人工的に再建し得る人工真皮の存在意義は、皮膚採取部の犠牲を最小限として質感の高い皮膚の再建が可能である点である。
【０００４】
移植皮膚が生着するためには血漿により栄養が補給されるいわゆるplasmatic imbibitionの初期の過程を経て、移植床より植皮片内に新生毛細血管が侵入して血行が再開されなければならない。人工真皮の上に移植された分層皮膚の生着のためには、移植床よりの新生毛細血管が人工真皮を貫通して植皮片に到達しなければならず、真皮様組織の構築を経る前に分層皮膚を移植すると、分層皮膚に栄養が行き届かず、分層皮膚が脱離してしまう。このため、人工真皮を移植した２〜３週間後に、分層皮膚を再び植皮して安定した生着を得るのが一般的である。
【０００５】
人工真皮と分層皮膚とを２回に分けて移植する場合、人工真皮内に線維芽細胞や毛細血管が侵入して真皮様組織が構築されるまでの期間待機しなければならないが、乳幼児や重症広範囲熱傷患者などでは創部細菌感染を来さないように管理することが困難である場合がある。移植した人工真皮に細菌感染を来した場合、人工真皮移植による効果は全く期待されない。また、人工真皮移植後に再度の植皮が必要となるため、患者の精神的、肉体的および経済的負担も高くなる。
これまで、コラーゲンからなる人工真皮を薄くしたり、人工真皮に小孔を多数あけるなどの工夫で、人工真皮と分層皮膚移植を同時に行なった報告はみられるが、人工真皮本来の目的を逸した使用方法である。そのため現状では、安定した植皮生着のために２〜３週間待機し、２次的に植皮を行なわざるを得ないのが実情である。
【０００６】
特許文献２には、表皮及び真皮組織を含む皮膚組織を入れる凹部もしくは孔部を有するコラーゲンスポンジ層の一方面にシリコーン層が積層されてなる人工真皮、該凹部内もしくは孔部内にシリコーン層側から表皮組織、真皮組織の順で表皮及び真皮組織を含む皮膚組織を含有してなる組織含有人工真皮を開示している。この組織含有人工真皮は表皮組織などを含むため、２回目の分層皮膚の移植を必要とすることがない利点がある。しかし、その表皮組織は患者の健常皮膚から採取するため、患者の負担もあり、普及するに至っていない。
【０００７】
本発明者らは、ラットによる実験モデルで人工真皮移植に際して大動脈由来培養血管内細胞、真皮由来線維芽細胞及び血小板由来の細胞増殖因子であるＰＤＷＨＦ（Platelet Derived Wound Healing Factor）を併用すると、移植後５日目に人工真皮内に血管侵入が起こることを明らかにし、さらに、同モデルで人工真皮上に分層植皮を同時に行なったところ生着が確認された（非特許文献１）。
このラットによるモデルでは、同種同系ラットから得た培養細胞を用いたが、臨床で応用する場合、自家細胞の培養を行っていたのでは、外傷、特に重症熱傷などでは培養に要する時間があり実用的ではない。従って、同種細胞によっても同様の効果が得られる必要がある。また、ラットモデルでは大動脈由来の培養血管内皮細胞を用いたが、臨床ではそれを採取することは困難であるので皮膚由来微小毛細血管の使用が必要である。
【特許文献１】特開２０００−２６２６１０号公報
【特許文献２】特開平１０−８０４３８号公報
【非特許文献１】日本形成外科学会会誌、第２３巻、第５号、ｐ．２９１〜２９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明は、凍結保存した同種培養皮膚微小毛細血管内皮細胞および培養真皮線維細胞を用いることができ、かつ、人工真皮と分層皮膚の移植を同時に行なうことができる人工真皮の調製方法を提供することを目的とする。また本発明は、同種細胞を用いることができ、かつ、人工真皮と分層皮膚の移植を同時に行なうことができる人工真皮を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、凍結及び解凍された血管内皮細胞及び線維芽細胞、及びＰＤＷＨＦを人工真皮移植に併用して皮膚欠損創への移植に用いることにより、人工真皮内に毛細血管の侵入が促進され、分層植皮と人工真皮を同時に移植しても植皮片が壊死することなく良好な生着が得られることがわかった。
【００１０】
すなわち、本発明は、凍結されている血管内皮細胞と線維芽細胞を解凍するステップと、コラーゲンスポンジにＰＤＷＨＦを含浸させるステップと、前記血管内皮細胞と前記線維芽細胞とを前記コラーゲンスポンジの表面に散布するステップとを含む、細胞含有人工真皮の調製方法を提供する。この方法において、細胞を解凍するステップ及びコラーゲンスポンジにＰＤＷＨＦを含浸させるステップは、順不同に行なうことができる。すなわち、凍結されている血管内皮細胞と線維芽細胞とを解凍した後に、コラーゲンスポンジにＰＤＷＨＦを含浸させてもよいし、あるいは、コラーゲンスポンジにＰＤＷＨＦを含浸させた後に、細胞を解凍してもよい。細胞を解凍するステップとコラーゲンスポンジにＰＤＷＨＦを含浸させるステップを同時並行してもよい。
さらに、この方法において、望ましくは、血管内皮細胞と線維芽細胞は、同種細胞、すなわち、他人から採取した細胞である。
【００１１】
さらに、本発明は、これらの方法により調製された細胞含有人工真皮を提供する。
【００１２】
また本発明は、ＰＤＷＨＦを含浸させたコラーゲンスポンジ層と、前記コラーゲンスポンジ層の表面に散布された血管内皮細胞と線維芽細胞とを含む細胞含有人工真皮であって、前記血管内皮細胞と線維芽細胞は、凍結及び解凍処理を経たものであることを特徴とする細胞含有人工真皮を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の細胞含有人工真皮は、真皮が欠損し再生が困難な全層皮膚欠損創に対して、従来行なっていた２回の移植手術ではなく、人工真皮と分層皮膚を用いて１回の移植手術により創傷部を治療でき、患者の負担を軽減でき、皮膚採取部の犠牲を最小限として質感の高い皮膚の再建が行い得る。特に手術が精神的及び肉体的な負担になる小児や高齢者など２回の手術を行うことを避けたい症例や、人工真皮移植後に真皮様組織が構築される期間を待機することが困難な重症広範囲熱傷や広範囲皮膚欠損の患者の治療に有用である。
また、本発明の人工真皮移植に用いる血管内皮細胞および線維芽細胞の供給源としては同種皮膚を用いているので、倫理面に注意を払う必要があるが、これらの血管内皮細胞や線維芽細胞は大量に培養凍結保存しておくことが可能である。ＰＤＷＨＦは患者本人より手術直前に採血して調整が可能であり、必要な時に必要な量の人工真皮にＰＤＷＨＦを含浸させ、細胞を解凍して散布するのみという簡便な方法であり、一般施設での熱傷治療等に広く応用できる実用的なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本明細書において、細胞含有人工真皮は、血管内皮細胞と線維芽細胞とをコラーゲンスポンジの表面に含むものをいう。血管内皮細胞と線維芽細胞は、コラーゲンスポンジの表面に散布される前に凍結及び解凍処理される。
【００１５】
血管内皮細胞とは、血管の内腔を被覆する一層の細胞であり、本発明において使用される血管内皮細胞としては、皮膚微小血管由来の細胞が挙げられる。採取しやすいだけでなく、真皮の生理的条件を再現するという目的を考慮しても皮膚微小血管内皮細胞を用いるのが好ましい。
線維芽細胞とは、支持組織の繊維成分を供給し、線維性結合組織の重要な成分をなす細胞である。本発明において使用される線維芽細胞は、真皮線維芽細胞が望ましく、どの部位の真皮に由来するものであっても使用することが可能である。
【００１６】
血管内皮細胞と真皮線維芽細胞は、ウイルス等の感染が無いことが確認されているものを用い、増殖等が正常に行なわれているものを用いる。感染防止のために抗菌剤などによる処理を行なってもよい。
【００１７】
皮膚微小血管内皮細胞と真皮線維芽細胞は、混合培養されたものでもよいが、培養の煩雑さを避けるため、それぞれ単独培養し、解凍時に血管内皮細胞と真皮線維芽細胞とを混合した後にコラーゲンスポンジに散布するのが好ましい。
【００１８】
血管内皮細胞と真皮線維芽細胞をＰＢＳのような緩衝液に懸濁し、予めＰＤＷＨＦを含浸させたコラーゲンスポンジの表面全体に均一に散布する。例えば、５×５ｃｍのコラーゲンスポンジに対して、血管内皮細胞及び線維芽細胞をそれぞれ約１×１０５細胞ずつ散布する。しかし、コラーゲンスポンジに散布する血管内皮細胞と線維芽細胞のそれぞれの細胞数は、患者の年齢、創傷の程度や部位などにより適宜変更可能である。通常は、コラーゲンスポンジの片側表面のみに細胞を散布し、その面が移植床に接するように移植する。
【００１９】
移植に際し、患者自身から採取した細胞を用いる場合、その細胞を自家細胞と呼び、他人から採取した細胞を用いる場合、その細胞を同種細胞と呼ぶ。
臨床で皮膚移植を行なう場合には、自家細胞を培養していたのでは時間がかかるうえ、外傷など急を要する場合には使用が困難であり、適用が制限される。そこで本発明者らは、凍結及び解凍処理を経た血管内皮細胞と真皮線維芽細胞を用いた場合には、他者の細胞を用いても拒絶反応を起こすことなく移植が可能となることを確認した。移植応答が起こらない理由としては、細胞の凍結及び解凍により細胞膜上の構造の一部が破壊されて抗原性が低減するためと考えられる。そのため、他者由来の細胞を用いても、拒絶反応に対する特別な処理をする必要がなくなる。血管内皮細胞及び線維芽細胞を凍結保存して、必要に応じて解凍して使用することができる。このように、本願発明では、自家細胞のみならず、患者の肉親または血縁関係が全くない他人から供給された同種細胞を用いることができるため、細胞の供給が不足したり、緊急の場合に対応できないという従来の問題が解消される。
【００２０】
血管内皮細胞と真皮線維芽細胞は、移植前一旦凍結し、後に解凍されたものを用いるが、拒絶反応等の問題が無い自家細胞を用いる場合には、採取して数回継代培養したものを凍結及び解凍処理を行なわずに用いてもよい。
【００２１】
血管内皮細胞及び線維芽細胞の凍結は、適当な量に小分けして凍結用容器に入れて、凍結保存液に懸濁させて通常−１５０℃前後で保存することによって行なう。
【００２２】
ＰＤＷＨＦ（血小板由来創傷治癒因子）は、創傷初期に創部に集まった血小板から放出される創傷治癒機構に重要な役割を果たす、血小板由来の増殖因子である。ＰＤＷＨＦは、感染等の防止のために移植される患者本人の血液から調製されるのが望ましい。通常、採取した血液にＡＣＤ液（anticoagulant citrate dextrose）のような凝固防止剤を加え、遠心分離により血小板を得て、得られた血小板を活性化してＰＤＷＨＦを放出させることによって調製できる。ＰＤＷＨＦ以外にも必要に応じて他の増殖因子を添加することが可能である。
【００２３】
コラーゲンスポンジは、真皮の主な構成成分であるコラーゲンをウシなどの動物から抽出し、スポンジ状に合成したものである。コラーゲンスポンジに含まれるコラーゲンは、抗原性を低下させる処理がされているものが望ましい。抗原性が低下されたコラーゲンとしては、例えば、アテロコラーゲンが挙げられる。
コラーゲンスポンジは、移植用として市販されているものを使用することが可能である。例えば、Plelnac、Terudermis、Integraなどを用いることができる。コラーゲンスポンジの大きさや厚みは、全層欠損部の大きさや部位により適宜変更可能である。
【００２４】
本発明の細胞含有人工真皮は、熱傷、外傷、糖尿病性下肢潰瘍、静脈潰瘍の治療、形成外科手術後の瘢痕治療などに広く適用可能である。皮膚全層にわたるIII度熱傷のように、真皮全層に欠損を生じた創傷に対しても有効である。特に、重症広範囲熱傷症例などの頸部・大関節などの瘢痕拘縮好発部位、顔面・手など露出部の整容的・機能的再建の重要な部位の皮膚再建に有用である。本発明の細胞含有人工真皮の適応除外症例は創部感染のある症例である。従って、広範囲熱傷症例は創部感染が必ず発生するので、１回目の早期切除術施行時に適用するのが望ましい。さらに本発明の人工真皮は、単に創傷面を被覆するだけでなく、人工真皮に含有される創傷治癒に必要な成長因子などを分泌あるいは供給して、肉芽組織の形成を向上させる点でも有効である。
【００２５】
本発明の人工真皮は、分層皮膚と同時に創傷部に移植することができる。具体的には、細胞を散布した面を下面（創傷面）にして本願の人工真皮を移植し、その上に分層皮膚を移植する。従来では人工真皮と分層皮膚を通常２回に分けて手術していたが、本発明の細胞含有人工真皮では、人工真皮と分層皮膚を１回の手術により創傷部を治療でき、患者の負担を軽減できる。特に手術が負担になる小児や高齢者など２回の手術を行うことを避けたい症例などの広範囲皮膚欠損創の再建に有用である。
【００２６】
本発明の人工真皮の上に移植する分層皮膚は、他人由来の分層皮膚を用いたのでは拒絶反応により局所破壊を起こして脱落するため、患者の皮膚健常部から採取するのが望ましい。また、分層皮膚の代わりにスキンバンクや本人または他人の表皮から培養して得られるシート状の表皮を用いることができるが、培養表皮は基底膜が欠如しているため、生着が困難であり、後に患者本人の分層植皮が必要となるため望ましくない。しかしながら、本願発明の人工真皮は、培養表皮と共に移植する使用の適用を除外するものではない。
【００２７】
分層皮膚は、そのまま人工真皮と共に移植することができるが、広範囲熱傷などにより創傷面の面積に比べて採皮部の面積が足りない場合などには、分層皮膚をメッシュ状に切れ込みを入れることにより広げて植皮する、いわゆる網状植皮を行なうのが好ましい。
【実施例１】
【００２８】
以下に実施例をあげて、本発明をさらに詳細に説明するが、これらにより本発明を制限することを意図するものではない。
対象症例
対象症例は６３歳の男性であった。電気作業中にアーク放電し、作業服に引火してIII度の熱傷を体表面の４９％に受傷した。直ちに熱傷ショックに対する治療を行った後、受傷後２０時間目に早期焼痂切除術を施行した。その際に左下腿の約１％の創面に対して本法による人工真皮と分層皮膚移植を行った。同意は本人の意識が無かったため家族より得た。
【００２９】
１．培養細胞の調製
東京女子医科大学形成外科で手術時に余剰となった正常皮膚を、患者の同意のもと培養に供した。皮膚提供者はウイルス感染（ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ）について検査を施行し陰性であることを確認した。また、使用したウシ血清はプリオン感染陰性であることを製造元(Gibco, USA)より証明されているもののみを用いた。
１）皮膚微小血管内皮細胞
皮膚を抗生物質で除菌処理を施した後、ディスパーゼ(Dispase)を用いて表皮を剥離して真皮を得た。得られた真皮を２〜３ｍｍ大の小片に細断して皮膚微小血管内皮細胞選択培地(MCDB 131 medium, Gibco, USA)に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した培地中で、３７℃にて５％ＣＯ2環境下で培養した。数回の継代培養後、トリプシンを用いて集密に達した細胞を培養ディッシュから回収し、凍結保存液(RPMI medium 1640＋１０％ＦＢＳ＋１０％グリセロール)に浮遊させ、cryo vialに１本当たり１．０×１０５個ずつに小分けして−１５０℃で凍結保存した。
２）真皮線維芽細胞
上記と同様の手技で真皮小片を得て、DME medium low glucose (Gibco, USA)+ 10% 子牛血清（ＣＳ）を培地中で、３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養した。数回の継代培養後、集密に達した細胞を上記と同様の手技で１．０×１０５個ずつに小分けして凍結保存した。
【００３０】
２．ＰＤＷＨＦの調製
手術前に、使用する人工真皮(１０×１０ｃｍ大)１枚あたり自己血２５ｍｌの血液を採取し、２５ｍｌの血液あたり２．５ｍｌのＡＣＤ液(anticoagulant citrate dextrose)を加えた。次に赤血球と白血球を１０００ｒｐｍ、２０分間、４℃の条件で遠心分離して多血小板血漿（platelet-rich plasma；ＰＲＰ）を得た。その血小板数を測定した後、２１００ｒｐｍ、２０分間、４℃で再度遠心分離して血小板の沈殿を得た。得られた血小板をＨＥＰＥＳで一度洗浄したのち、１×１０９／ｍｌとなるようにＨＥＰＥＳに再浮遊させたものにトロンビン（三共株式会社製）（１Ｕ／ｍｌ） を添加して血小板を活性化させてＰＤＷＨＦを放出させた。最後にＰＤＷＨＦを放出した血小板を２４００ｒｐｍ、１０分間、４℃の条件で遠心分離し、その上清をＰＤＷＨＦとした。
【００３１】
３．人工真皮の準備
人工真皮(TerudermisＲ、コラーゲンスポンジ単独タイプ、厚さ3mm、大きさ１０×１０ｃｍ、テルモ)に、先に調製したＰＤＷＨＦを含浸させた。次に予め凍結保存しておいた培養細胞を人工真皮５×５ｃｍあたり血管内皮細胞、線維芽細胞いずれもcrio vial １本分（１．０×１０５細胞）を目安として解凍した。解凍後、ＰＢＳを用いて洗浄した後、１本のcrio vialあたり０．５ｍｌのＰＢＳに再浮遊させた。ＰＤＷＨＦが人工真皮に十分に含浸した後、人工真皮の片側表面に細胞浮遊液を全体に均一に散布した。
【００３２】
４．移植方法
皮膚全層欠損創に対して準備した人工真皮を細胞を散布した面を下面（移植面）にして移植し、その上に１０／１，０００インチ厚の薄目分層皮膚を１:３の網状植皮として移植した。その上をソフラチュールＲで被覆し、ワセリン軟膏を塗布してタイオーバー(tie-over)固定した。
【００３３】
結果
術後１０日目に開創したところ植皮は完全に生着しており、すでに網状植皮の網の間にも上皮化が進行しつつあった。２０日目には植皮片は赤黒い色調を呈したが、３０日目には正常皮膚の色調に近くなり非常に柔軟で良好な質感が得られた。１０、２０、３０日目に組織を採取し組織学的検討を行ったが、２０日目には人工真皮の成分であるウシコラーゲンの残存が認められ、若干の炎症細胞の浸潤が観察された。しかしながら、３０日目にはウシコラーゲンは吸収消失しており、炎症反応も消退して正常皮膚と遜色のない皮膚が再建されていた。
【００３４】
本法は、従来人工真皮を移植してから２〜３週間待機しなければ行い得なかった分層皮膚移植を人工真皮移植と同時に行うことを可能とした画期的なものである。使用する細胞である血管内皮細胞、線維芽細胞はいずれもヒト真皮由来であり、真皮再生に生理的に望ましい細胞であると考えられる。また、非自己の同種由来の細胞を凍結保存しているものを用いるが、明らかな急性拒絶反応を来さず、外傷などの緊急症例でも使用可能である。
自己血を採取してＰＤＷＨＦを調製するのに約８０分を要するが、人工真皮の調製手技および移植手技は簡便である。