(57)【要約】【課題】精子の受精能を凍結融解後も有効に保つことができる凍結保存剤を提供する。【解決手段】有効成分として、氷核活性物質と細胞膜非透過型凍結保護物質とを含む精子凍結保存剤および該精子凍結保存剤を含む精子凍結保存用キット、ならびに、前記凍結保存剤または凍結保存用キットを用いて精子を凍結保存する方法、および該方法により凍結保存した精子を輸送する容器および方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、氷核活性物質と細胞膜非透過型凍結保護物質とを含む、精子凍結保存剤。
【請求項２】
氷核活性物質が１種または２種以上のアミノ酸である、請求項１に記載の凍結保存剤。
【請求項３】
細胞膜非透過型凍結保護物質が１種または２種以上の糖類である、請求項１または２に記載の凍結保存剤。
【請求項４】
アミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、アスパラギン、イソロイシン、グルタミン、プロリンおよびヒスチジンからなる群より選択される１種または２種以上である、請求項２または３に記載の凍結保存剤。
【請求項５】
糖類が、ラフィノース、ラクトースおよびトレハロースからなる群より選択される１種または２種以上である、請求項３または４に記載の凍結保存剤。
【請求項６】
アミノ酸が、アラニン、グルタミンおよびグリシンからなる群より選択され、、糖類がラフィノースである、請求項３〜５のいずれかに記載の凍結保存剤。
【請求項７】
氷核活性物質の含有量が５〜２００ｍＭ、および細胞膜非透過型凍結保護物質の含有量が１〜３０％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜６のいずれかに記載の凍結保存剤。
【請求項８】
精子が、マウス精子である、請求項１〜７のいずれかに記載の凍結保存剤。
【請求項９】
マウスが、Ｃ５７ＢＬ／６系統、ＢＡＬＢ／ｃ系統もしくはＤＢＡ／２系統のマウス、またはこれらの系統をバックグラウンドに持つ遺伝子改変マウスである、請求項８に記載の凍結保存剤。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の凍結保存剤、該凍結保存剤中に精子を採取するためのシャーレ、および該凍結保存剤中の精子を充填するストローを含む、精子凍結保存用キット。
【請求項１１】
精子を請求項１〜９のいずれかに記載の凍結保存剤中で凍結させることを含む、精子の凍結保存法。
【請求項１２】
精子を請求項１〜９のいずれかに記載の凍結保存剤と、その中で凍結させた精子とを含む、精子輸送容器。
【請求項１３】
請求項１２に記載の輸送容器を用いた精子の輸送方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精子、特にマウス精子を凍結保存するための凍結保存剤、および該凍結保存剤を含む精子凍結保存用キットに関する。本発明はまた、前記凍結保存剤または凍結保存用キットを用いて精子を凍結保存する方法、ならびに、該方法により凍結保存した精子を輸送するための容器および方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
自らの持つ遺伝情報に基づいて、新たな個体を発生させる能力を有する胚や生殖細胞を生存状態で長期保存する技術は、医学、薬学、生命工学などを含む広範囲な分野で今や必須の技術である。当該技術は、特に家畜の繁殖や、貴重な野生動物、遺伝子改変生物などの遺伝資源の保全に極めて重要である。さらに、所望の遺伝形質を有する個体を入手したい場合に、当該個体自体に代えてその胚や生殖細胞を輸送することで、取引上の手間や費用を大幅に削減できるなど、その有用性は多岐にわたる。
【０００３】
しかし生細胞は、一般に室温を含む高い温度条件下では代謝や変性により経時的に変化し、その機能や活性はやがて低下ないし消失してしまう。生細胞のかかる変化を抑制するために、通常は凍結保存法が用いられる。この方法は、−８０℃以下などの超低温で細胞の代謝や変性を抑えることにより細胞の劣化を防ぐものであるが、細胞は内部に水分を含んでおり、また、保存の際は、一般的に水を含む培地中に存在するため、冷却の過程で、細胞が、その内外に形成される氷晶により損害を受けるという問題があった。そこで、かかる弊害を改善する目的で、これまで畜産分野を中心に、胚や生殖細胞用の種々の凍結保存剤が開発されてきた（例えば、特許文献１〜３参照）。かかる細胞の保存技術は、バイオ系の基礎研究やヒトの不妊治療などを含む多くの分野で、最近ますますその重要性が高まっている（特許文献４参照）。
【０００４】
遺伝子関連分野では、ヒトゲノムの解読が終了したことを受け、次の段階である遺伝子機能の研究に注目が集まっている。当該分野においては、ヒトと遺伝子の相同性が高く、ゲノムの解読が既に終了している動物種であるマウスが主要な実験動物となっており、現在ノックアウトマウスやトランスジェニックマウスなどの遺伝子改変マウス系統が多数作製されている。従来これらの系統は、複数のマウス個体を飼育し、ブリーディングすることによって維持していたが、系統数の増加に伴い、飼育スペースの不足や人件費などのコスト増が近年大きな問題となっている（非特許文献１参照）。そこで、かかる状況を改善すべく、作製した系統の遺伝子資源を、凍結保存した胚や精子の形態で効率的に保全する試みが行われている。
【０００５】
胚と精子を比べた場合、１個体から得られる細胞数は精子の方が圧倒的に多く、しかも過排卵処置などの煩雑な前処置も必要としないなど、上記目的に関しては精子の方がはるかに優れている。ところが、マウスの精子は凍結に対し非常に脆弱であり、通常の凍結保存剤では融解後に十分な受精率を得ることができなかった。
【０００６】
かかる状況を打開すべく、近年ラフィノースと蛋白源とを含有する凍結保存液が開発され（非特許文献２および特許文献５参照）、マウス精子の凍結保存にある程度の結果を得ている。しかし、この凍結保存液を用いた場合、凍結融解後の精子の受精率は、ＤＢＡ／２系統では約９５％と高いにもかかわらず、Ｃ５７ＢＬ／６系統では約１０％、ＢＡＬＢ／ｃ系統では約２０％と低く、マウスの系統によっては十分な受精能を確保することができなかった。しかも、現在、遺伝子改変マウスとして基礎および応用研究に最も多く用いられているマウス系統はＣ５７ＢＬ／６系統であるので、上記凍結保存液は遺伝子改変マウスの凍結保存には十分に有効ではなかった。一方、受精率を改善する方法として、透明帯切開卵子を用いる方法や、卵細胞質内精子注入法が有効との報告もあるが、かかる方法は煩雑な上、高度な技術を要する。このため、遺伝子改変マウスの遺伝資源の保存に関しては、胚の凍結保存が未だ主流となっており、精子の凍結保存は副次的な役割を担っているに過ぎないのが現状である。
【０００７】
【特許文献１】特開平１０−７５０１号公報
【特許文献２】特開平１１−２２８３０１号公報
【特許文献３】特開平１１−９８９３５号公報
【特許文献４】特開２０００−２３９１０１号公報
【特許文献５】特開２００１−３２８９０１号公報
【特許文献６】特開２００１−２４７４０１号公報
【非特許文献１】ネイチャー（Nature）、２００２年６月２０日、４１７巻、p. ７８５−７８６
【非特許文献２】セリオジェノロジー（Theriogenology）、１９９２年、３７巻、p. １２８３−１２９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、精子、特にマウス精子の受精能を、凍結融解後も高いレベルに維持することができる凍結保存剤の提供を目的とする。
【０００９】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討を行う中で、凍結融解後のマウス精子の受精能低下の原因が、従来通説とされていた精子運動性の低下ではなく、精子頭部、特にアクロソームの著しい破損によるものであることを見出した。アクロソームには、卵子の透明帯を分解する酵素類が含まれており、当該部位の損傷により前記酵素類を失うと精子は卵子に侵入することができなくなる。このことは、透明帯切開卵子を用いると受精率が高くなるという事実とも符合する（URL:http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/japanese/sigen/h13/18.html  [平成１５年９月９日検索］参照）。
【００１０】
かかる知見を基にさらに研究を進めた結果、氷核活性物質と細胞膜非透過型凍結保護物質とを含む凍結保存剤を用いることで、凍結融解による精子頭部の破損を防ぎ、従来法では有効ではなかったマウス系統においても、凍結融解後の精子を用いて十分な受精率が得られることを見出し、本研究を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、有効成分として、氷核活性物質と細胞膜非透過型凍結保護物質とを含む精子凍結保存剤に関する。
本発明はまた、氷核活性物質が１種または２種以上のアミノ酸である、前記凍結保存剤に関する。
本発明はさらに、細胞膜非透過型凍結保護物質が１種または２種以上の糖類である、前記凍結保存剤に関する。
また、本発明は、アミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、アスパラギン、イソロイシン、グルタミン、プロリンおよびヒスチジンからなる群より選択される１種または２種以上である、前記凍結保存剤に関する。
【００１２】
さらに、本発明は、糖類が、ラフィノース、ラクトースおよびトレハロースからなる群より選択される、前記凍結保存剤に関する。
本発明は、さらにまた、アミノ酸がアラニン、グリシン及びグルタミンからなる群より選択され、糖類がラフィノースである、前記凍結保存剤に関する。
本発明はまた、氷核活性物質の含有量が５〜２００ｍＭ、および細胞膜非透過型凍結保護物質の含有量が１〜３０％（ｗ／ｖ）である、前記凍結保存剤に関する。
本発明はさらに、精子がマウス精子である、前記凍結保存剤に関する。
本発明はさらにまた、マウスが、Ｃ５７ＢＬ／６系統、ＤＢＡ／２系統もしくはＢＡＬＢ／ｃ系統のマウス、またはこれらをバックグラウンドに持つ遺伝子改変マウスである、前記凍結保存剤に関する。
【００１３】
また、本発明は、上記の凍結保存剤、該凍結保存剤中に精子を採取するためのシャーレ、および該凍結保存液中の精子を充填するストローを含む、精子凍結保存用キットに関する。
さらに、本発明は、精子を上記の凍結保存剤中で凍結させることを含む、精子の凍結保存方法に関する。
本発明はまた、上記の凍結保存剤と、その中で凍結させた精子とを含む、精子輸送容器に関する。
本発明は、さらに、上記の輸送容器を用いた精子の輸送方法にも関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の凍結保存剤においては、細胞膜非透過型凍結保護物質が細胞膜を保護するとともに、氷核活性物質の存在により凍結の過程で凍結保存剤中に氷晶が生じやすくなり、かかる氷晶が精子を取囲み、まだ凍結していない細胞内の水分を細胞外に汲み出すように作用することによって細胞が脱水し、凍結による細胞の損傷が抑制されると考えられる。
従来は、細胞内外の氷晶形成が凍結による細胞損傷の原因とされていたことから、凍結保存剤の開発に当たっては氷晶形成の抑制に力点が置かれており、有効成分としてはグリセロールやジメチルスルホキシドなどの氷晶形成抑制物質を配合したものが一般的であった（特許文献６参照）。これに対し本発明の凍結保存剤は、氷核活性物質の存在により逆に溶液中に積極的に氷晶を形成させることによって細胞内氷晶形成を抑え、凍結傷害を抑制するという、全く新しい発想に基づくものである。
【００１５】
本発明の凍結保存剤により、これまで凍結融解後に十分な受精率が得られなかったマウス系統、特に遺伝子解析などの研究で重要なＣ５７ＢＬ／６系統やＢＡＬＢ／ｃ系統などでも精子を有効に凍結保存することが可能となり、遺伝子改変マウスの遺伝資源の効率的な長期保存や輸送において多大な貢献が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の凍結保存剤の好適な態様について詳細に説明する。
本発明の凍結保存剤は、有効成分として氷核活性物質と細胞膜非透過型凍結保護物質とを含有することを特徴とするものである。
【００１７】
本発明の凍結保存剤に用いる氷核活性物質は、細胞内の水分が凍結するよりも高い温度で溶液中に氷核を形成させる物質であって、精子の生存性を損なわないものであればいずれであってもよい。かかる物質としては、アミノ酸、長鎖飽和アルコール（ＣｎＨ２ｎ+１ＯＨ、ここでｎは１０〜３１の範囲であることが好ましく、中でもｎが奇数のものが好ましい）、コレステロールなどのステロイド類、ヨウ化銀、シリカ等が上げられるが、好ましいのはアミノ酸であり、特に好ましいのはグリシン、アラニン、バリン、アスパラギン、イソロイシン、グルタミン、プロリンおよびヒスチジンである。中でも最も好ましい氷核活性物質はグリシン、アラニンおよびグルタミンである。
本発明の凍結保存剤は、上記氷核活性物質を１種または２種以上含むことができる
本発明の凍結保存剤における上記氷核活性物質の配合量は、精子の受精能を凍結融解後も有効に保つことができれば特に制限されないが、アミノ酸を用いる場合は、５〜２００ｍＭであればよく、好ましくは５０〜１５０ｍＭである。
本明細書中、精子の受精能が有効または十分であるとは、例えば、該精子を、透明帯切開法や、卵細胞質内精子注入法などの特別な技法を使わずに未受精卵に体外受精させた場合に、２０％以上、好ましくは２５％以上、より好ましくは３０％以上、特に好ましくは５０％以上の受精率が得られることをいう。
【００１８】
また、本発明の凍結保存剤に用いる細胞膜非透過型凍結保護物質は、原則として細胞膜を透過せず、凍結保護活性を有する物質であれば特に限定されないが、例えば、糖類、デキストラン、ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、フィコールなどを包含する。好ましい細胞膜非透過型凍結保護物質は糖類であり、中でも二糖以上のものが好ましい。特に好ましい細胞膜非透過型凍結保護物質は、ラフィノース、ラクトースおよびトレハロースであり、このうちラフィノースが最も好ましい。
本発明の凍結保存剤は、上記細胞膜非透過型凍結保護物質を１種または２種以上含むことができる。
本発明の凍結保存剤における上記細胞膜非透過型凍結保護物質の含有量は特に制限されないが、好ましくは１〜３０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１０〜２５ ％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは１５〜２１％（ｗ／ｖ）である。特に好ましい含有量は１８％（ｗ／ｖ）である。含有量が１％（ｗ／ｖ）未満の場合には精子の運動性が低下することがあり、また３０％（ｗ／ｖ）を超える場合には、凍結保存液中に細胞膜非透過型凍結保護物質が析出する傾向がある。
【００１９】
本発明の凍結保存剤は、細胞膜非透過型凍結保護物質の細胞膜保護効果をより高めるために、分散媒をさらに含有することができる。かかる分散媒としては、例えば、スキムミルク、牛乳、ホエー、卵黄、ウシ血清アルブミン、血清などが挙げられる。この場合、アルブミン、グロブリンなどの種々のタンパク質やミネラルを含み、それゆえ複合的保護効果が期待できることから、スキムミルクが好ましい。分散媒は単独で、または組み合わせて用いることができる。
前記分散媒の含有量は、好ましくは０.１〜２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは２〜４％（ｗ／ｖ）である。含有量が０.１重量％（ｗ／ｖ）の場合、細胞膜保護効果が低くなることがあり、また２０％（ｗ／ｖ）より多い場合、凍結保存剤の浸透圧が高くなることにより、精子の生存性が低下する傾向がある。
【００２０】
本発明の凍結保存剤の形態は特に限定されないが、溶液が好ましい。溶媒としては水が好ましい。水溶液とする場合は、溶媒として蒸留水、注射用蒸留水、細胞培養用蒸留水、胚操作用蒸留水などを用いるのが好ましい。
【００２１】
本発明の凍結保存剤は、氷核活性物質および細胞膜非透過型凍結保存物質を含む成分を、例えば水に溶解することにより調製することができる。該凍結保存剤は、さらに、例えば、ろ過滅菌などにより滅菌し、容器（例えば、アンプル、バイアルなど）に注入し、そして封入することができる。また、氷核活性物質および細胞膜非透過型凍結保存物質を、一緒に、また両者を別個に容器（例えば、アンプル、バイアルなど）に保存してもよい。その際、少なくとも一方を水溶液としてもよく、また両者を水溶液としてもよく、さらには下記に説明するキットの構成として水のみを容器、例えばアンプル等に充填して保存し、用時に水溶液としてもよい。
【００２２】
本発明の凍結保存剤により凍結保存される精子はいずれの動物のものであってもよいが、マウスの精子が好ましい。中でも、Ｃ５７ＢＬ／６系統、ＢＡＬＢ／ｃ系統もしくはＤＢＡ／２系統のマウス、またはこれらの系統をバックグラウンドに持つ遺伝子改変マウスの精子が特に好ましい。
【００２３】
本発明の精子凍結保存用キットは、上記精子凍結保存剤、該凍結保存剤中に精子を採取するためのシャーレ、および該凍結保存剤中の精子を充填するストローを含む。
ストローは、精子凍結保存剤中に懸濁させた精子を充填し、凍結保存するための凍結保存容器として機能する。ストローの内径および長さは特に限定されないが、精子凍結時の温度における均一性の理由から、内径０.５ｍｍ〜３ｍｍのものが好ましい。
【００２４】
シャーレは、凍結保存剤中の精子懸濁液を調製するための容器として使用される。本発明の精子凍結保存用キットに用いられるシャーレの上面には、複数のウェルが設けられている。ウェルの数は特に限定されないが、摘出した精巣上体尾部上の血液や脂肪を取り除くために凍結保存剤で洗浄することを考慮すると、ウェルの数は複数であることが望ましく、好ましくは４〜９６程度である。また、ウェルは、その中で精巣上体尾部の洗浄および細切を容易に行うことができる大きさを有する必要がある。したがって、ウェルの数は４〜１２程度であることが特に好ましい。
上記ストローおよびシャーレは、滅菌後、包装することができる。
本発明の精子凍結保存用キットはまた、必要に応じて外箱、取扱説明書、ストローケースなどを適宜含むことができる。
【００２５】
次に、本発明の精子凍結保存用キットを用いて精子を凍結保存する手順を、マウスを例に説明する。ただし、これは本発明を限定するものではない。
まず、成熟雄マウス（８週齢以上）の精巣上体尾部をシャーレ上のウェル内の凍結保存剤中に移し、精巣上体管を細切後、シャーレをゆるやかに振盪させ、精子を凍結保存剤中に懸濁させ、精子懸濁液とする。
【００２６】
次に、ストローをシリンジに装着し、ＨＴＦ培地などの培養液を充填した後、シャーレのフタなどに精子懸濁液を取り、充填した培養液との間に空気相を挟んで精子懸濁液をストローに充填する。ストローの両端部に空気相を設け、シーラーで封止する。次いで、凍結用フロートに精子を充填したストローを入れ、液体窒素保管器内の液体窒素表面に５分〜１５分静置後、フロートを液体窒素中に浸漬し、精子を凍結保存する。
【００２７】
上記のようにして凍結保存された精子は、用時に融解し、未受精卵との体外受精などに用いることができる。
凍結精子の融解の１例を示すと、次の通りである。
まず、凍結保存してあるストローを液体窒素から取り出し、温水中に浸漬する。その後、温水からストローを引き上げ、精子懸濁液のみを、予め作製しておいた前培養用培地（主としてＨＴＦ培地だが、ＴＹＨ培地やＣＺＢ培地等でもよい）に移し、前培養を行う。前培養後の精子懸濁液は、体外受精などに供することができる
【００２８】
本発明の凍結保存液で凍結保存した精子は、輸送容器に収納し、輸送することができる。
輸送容器としては、凍結精子を−１２０℃以下、好ましくは−１９６℃以下に、３日以上安定して保持できる任意の容器を用いることができる。かかる容器としては、例えばドライシッパーなどが挙げられるが、これに限定されるわけではない。輸送の際には、例えば上記のように凍結させた精子を含むストローを、直接、またはストローケースなどに収納してから、輸送容器に収納する。輸送手段は特に限定されないが、輸送中、輸送容器が低温雰囲気下に保たれることが好ましい。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３０】
実施例１ (精子凍結保存液の調製)
アラニン０.０８９１ｇに蒸留水１０ｍｌを加え、攪拌混和し、１００ｍＭのアラニン溶液を作製した。該溶液を、ラフィノース１.８０ｇおよびスキムミルク０.３０ｇの入った容器に加え、攪拌混和後、６０℃の湯浴中で溶解した。溶解物を遠心分離し、その上清を回収した。こうして、アラニン１００ｍＭ、ラフィノース１８％ (ｗ／ｖ) およびスキムミルク３％ (ｗ／ｖ)を含む、本発明の精子凍結保存剤を得た。
【００３１】
実施例２ (精子凍結保存用キットの作製)
上記実施例１で調製した凍結保存剤をろ過滅菌し、アンプルに注入後、封入した。次いで、γ線滅菌された内径１.２ｍｍの０.２５ｍｌプラスチック製カスー式精子凍結用ストロー、および４ウェルシャーレを、それぞれ別個に包装した。これらアンプル、ストローおよびシャーレを組み合わせ、本発明の精子凍結保存用キットを得た。
【００３２】
実施例３ (精子の凍結保存)
実施例２で得た精子凍結保存用キットを用いて、以下に示すとおりに精子を凍結保存した。
性成熟した８〜４０週齢のＣ５７ＢＬ／６系統の雄マウスから、安楽死の直後に左右両精巣の精巣上体尾部を取り出した。シャーレ上の各ウェルには、あらかじめ凍結保存剤を１００μｌずつ入れておき、上記２個の精巣上体尾部をいずれかのウェル内の１００μｌの凍結保存剤中で軽く揺すり、未使用の別のウェルに移すことにより不要な血液などを除去した。この洗浄操作を３回繰り返し、精巣上体尾部を４つ目のウェルに移してから、眼科用剪刀あるいはウェッケル剪刀で５箇所程度細切し、そのまま３分静置することで凍結保存剤中に精子を採取した。その後、組織片を除去し、凍結保存剤中に精子を充分に拡散させて精子懸濁液とした。
次に、ストローを１ｍｌのシリンジに装着し、ＨＴＦ培地を約１００μｌ充填した後、シャーレのフタに１２〜１５μｌの精子懸濁液を取り、充填した培養液との間に１０ｍｍの空気相を挟んでストローに充填し、さらにストローの両端部に１０ｍｍの空気相を設け、シーラーで封止した。次いで、ストロー内で精子が均一に分布するように、該ストローを３７℃で１分加温した。
【００３３】
市販のディスポーザブル５０ｍｌシリンジの外筒内に、先端に向けて厚さ２〜３センチの発泡スチロール片を充填したものを、アクリル棒の一端に針金で固定した精子凍結用フロートに、上記ストローを、精子を充填した方の端を下にして乗せた。この状態で、フロートを液体窒素上に浮かべ、１０分静置した。これにより、精子の温度を、約−２０℃／分の冷却速度で、約−１２０℃まで下降させる。次に、精子凍結用フロートを液体窒素内に導き、ストローを液体窒素液相中に曝露した。該ストローを液体窒素中で２日〜６ヶ月保存した。
【００３４】
実施例４ (凍結精子の輸送)
上記実施例２の凍結保存用キットを用いて凍結したマウス精子を、以下に示すような方法で輸送した。
凍結精子を含むストローは、ストローケースに収納した状態で凍結保存しておいた。予め液体窒素を充填しておいたドライシッパーに、凍結精子をストローケースごと、空気相中で凍結精子が融解しないように素早く移した。該ドライシッパーを、宅配便にて輸送した。この輸送に要した時間は、２日〜３日であった。輸送された該ドライシッパーより、凍結精子を取り出し、体外受精に供した。
【００３５】
実験例１ (氷核形成物質の濃度による凍結融解精子の受精能の変化)
本発明の凍結保存剤が精子受精能に及ぼす影響を検討するため、種々の濃度の氷核形成物質を含む凍結保存剤中で凍結融解した精子を用いて、体外受精を行った。
【００３６】
ａ) 精子の凍結および融解
実施例１と同様にして、アラニンの濃度がそれぞれ５、１０、５０、１００、１５０および２００ｍＭとなるように、６種類の凍結保存剤１〜６を調製した。また、従来の凍結保存剤との比較のために、アラニンを含まない以外は実施例１と同様にして調製した凍結保存剤Ａも用意した（特許文献６参照）。
凍結保存剤１〜６およびＡをそれぞれ用いて、実施例３に記載されたとおりに精子を凍結保存した。５日後、凍結したマウス精子を液体窒素から取り出し、室温(２５℃)にて５秒放置し、次いで３７℃の湯浴中にて１０分間加温した。その後、あらかじめ用意しておいた９０μｌのＨＴＦ培地中に精子を導き、３７℃、５％ ＣＯ２に制御されたＣＯ２インキュベーター内に１時間静置することによって精子の前培養を行った。前培養後、中央に集まった死滅精子や不動化精子を避けながら、運動精子を選別採取した。
【００３７】
ｂ) 体外受精
体外受精に供したマウス卵子は、８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスから定法に則して採取した。すなわち、ＰＭＳＧおよびｈＣＧを用いた過排卵誘起法にてマウス卵子を過排卵させ、排卵された卵子卵丘複合体をマウス卵管膨大部から採取した
雌１匹分の卵子卵丘複合体を、予め用意しておいた９０μｌのＨＴＦ培地中に導いた。１本の精子ストローから得られる凍結融解精子に対し、５匹分の卵子卵丘複合体（それぞれ９０μｌのＨＴＦ培地中に存在）を用意した。
上記ａ)で得られた精子を含む液１０μｌを、各１匹分の卵子卵丘複合体を含む培地中にそれぞれ導き、媒精した。
【００３８】
ｃ) 体外受精率の決定
体外受精の１０時間後に、受精卵および未受精卵を回収し、それらをスライドグラス上でグルタルアルデヒドによって固定し、固定標本を作製した。受精の判定は、前核が２つあるかどうかによって判定し、２つあるものを受精卵、１つもないものを未受精卵とし、それらを計数した。得られた数を以下の式に代入し、体外受精率を算出した。
体外受精率(％)={受精卵の数 ／ (受精卵の数+未受精卵の数)}×１００
【００３９】
ｄ) 結果
上記ｃ)で得られた体外受精率を表１に示す。
【表１】
2005270006.tif 000002
表１により、アラニンを従来の凍結保存剤に加えることで、マウス精子の凍結保存率が飛躍的に向上することがわかる。またその効果はアラニン濃度に依存的であり、至適濃度である１００ｍＭでの体外受精率は、アラニンを含まない従来の凍結保存剤を用いた場合の約５倍に達した。
【００４０】
実験例２ (氷核活性物質の種類による凍結融解精子の受精能の変化)
氷核活性物質として、アラニン１００ｍＭの代わりに、グリシン１００ｍＭ、バリン１００ｍＭ、イソロイシン１００ｍＭ、アスパラギン１００ｍＭ、グルタミン１００ｍＭ、アスパラギン酸１００ｍＭ、ヒスチジン１００ｍＭ、メチオニン１００ｍＭ、スレオニン１００ｍＭ、または、プロリン１００ｍＭ、を用いること以外は実施例１と同様にして凍結融解精子の受精能を評価した。得られた受精率を表２に示す。
【表２】
2005270006.tif 000003
表２により、氷核活性物質としてアラニン以外のアミノ酸を用いても、凍結融解精子の体外受精率が顕著に改善されることが分かる。また、生体内に存在するアミノ酸以外の修飾アミノ酸についても、同様な結果を得ている。例えば、氷核形成物質として修飾アミノ酸の一種であるベタイン１００ｍＭを用いること以外は実施例１と同様にして凍結融解精子の受精能を評価したところ、体外受精率は２４.９±１６.８％であった。
【００４１】
実験例３ (マウス系統による凍結融解精子の受精能の変化)
本発明の凍結保存剤のＣ５７ＢＬ／６系統以外の系統における有効性を評価するため、マウスがＢＡＬＢ／ｃ系統あるいはＤＢＡ／２系統であり、凍結保存剤として凍結保存剤４のみを用いた以外は実験例１と同様にして、凍結融解精子の受精能を評価した。その結果、体外受精率はＢＡＬＢ／ｃ系統で５５.４±２４.２％ (ｎ＝５)、ＤＢＡ／２系統で８８.９±１０.４％であった（ｎ＝５）。これに対し、凍結保存剤として、実験例１に記載の凍結保存剤Ａを用いた以外は上記と同様にして行った、凍結融解精子による体外受精率は、ＢＡＬＢ／ｃ系統で４１.２±２１.５％ (ｎ＝５)、ＤＢＡ／２系統で８２.２±１０.７％であった（ｎ＝５）。これは、本発明の凍結保存剤を用いることにより、実験に使用したすべての系統において、従来の凍結保存剤を用いた場合に比べ受精能が向上したことを示している。このことから、本発明は、従来困難であったＣ５７ＢＬ／６系統およびＢＡＬＢ／ｃ系統を含め、いかなる系統のマウスに対しても適応可能であることが分かる。