(57)【要約】【課題】  本発明は、正確にコレステロールを定量することができ、かつ製造が容易な酵素機能電極を得ることを目的とする。【解決手段】  試料溶液３中のコレステロール濃度を定量する酵素機能電極であって、固体電極１と、前記固体電極１に固定された酵素層２とを含み、前記酵素層２は、コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、前記ペルオキシダーゼとの反応に応じて前記固体電極と反応する電子伝達メディエータとを有する酵素機能電極を提供する。この酵素機能電極では、界面活性剤が固体電極１に浸透せず、固体電極部において電気化学反応が生じない。そのため、電極反応により生じる電流値が電気化学反応により影響を受けず、正確にコレステロールを定量することができる。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液中のコレステロール濃度を定量する酵素機能電極であって、
固体電極と、
前記固体電極に固定された酵素層とを含み、
前記酵素層は、コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、前記ペルオキシダーゼとの反応に応じて前記固体電極と反応する電子伝達メディエータとを有する酵素機能電極。
【請求項２】
前記酵素層は、前記固体電極と前記電子伝達メディエータとの間の電極反応により生じる電流の電流値に誤差を与える妨害物質を阻害する隔膜をさらに有する、請求項１に記載の酵素機能電極。
【請求項３】
前記酵素層は、前記電子伝達メディエータ、ペルオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼを前記固体電極に固定するポリマーをさらに有する、請求項１に記載の酵素機能電極。
【請求項４】
前記電子伝達メディエータはフェロセン誘導体であり、
前記ポリマーはポリアリルアミンまたはポリ−Ｌ−リジンである、請求項３に記載の酵素機能電極。
【請求項５】
前記酵素層は、前記ポリマーを架橋する架橋剤をさらに含み、
前記架橋剤は、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、スベリン酸（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、及びジメチルスベリミデートからなる群から選ばれる、請求項３に記載の酵素機能電極。
【請求項６】
前記酵素層において、前記固体電極を覆うように前記電子伝達メディエータ及びペルオキシダーゼからなる第１層が形成され、前記第１層を覆うようにコレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼからなる第２層が形成されている、請求項１に記載の酵素機能電極。
【請求項７】
前記第１層と前記第２層との間に、前記固体電極と前記電子伝達メディエータとの間の電極反応により生じる電流の電流値に誤差を与える妨害物質を阻害する隔膜がさらに形成されている、請求項６に記載の酵素機能電極。
【請求項８】
請求項１〜７に記載の酵素機能電極を有するコレステロールセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素機能電極及びコレステロールセンサに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血清などの試料溶液中のコレステロール濃度は、一般に酵素反応を用いた比色法によって測定されている。しかし、比色法は溶液の濁度の影響による誤差を生じ易い。そのため、比色法の代わりに電気的にコレステロールを定量する方法が提案されている。電気的にコレステロールを定量する方法として、例えばカーボンペースト電極を利用した過酸化水素電極によるコレステロールの定量法が非特許文献１に開示されている。非特許文献１に記載のコレステロールの定量法では、カーボンペースト電極に電子伝達メディエータであるフェロセンが練り込まれており、さらにカーボンペースト電極の表面にペルオキシダーゼが固定されている。診断指針として用いられるコレステロール値は、コレステロール濃度とコレステロールエステル濃度とを合計することにより得られる。よって、コレステロールセンサによりコレステロール濃度を定量する際には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾したコレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＤ）及びコレステロールエステラーゼ（ＣＨＥＲ）を、測定対象である試料溶液に添加する。このとき、コレステロールエステラーゼは、コレステロールエステルを特異的に認識し、コレステロールエステルのコレステロールへの反応を触媒する。また、コレステロールオキシダーゼは、コレステロールを特異的に認識しコレステロールのコレステノンへの反応を触媒する。ここで、一般的にPEG修飾されていないCHODおよびCHERを使用する場合、試料溶液中にさらに界面活性剤を添加する必要がある。これは、次のような理由からである。試料溶液中のコレステロールエステルは、偽性ミセルの一種であるリポ蛋白中に包摂されているため、コレステロールエステラーゼとの接触確率が低い。よって、コレステロールエステルからコレステロールへ変化する反応の進行が非常に遅い。そこで、試料溶液中にさらに界面活性剤を添加することで、コレステロールエステラーゼとコレステロールエステルとの接触確率を向上し、酵素の活性を向上させる。
【０００３】
この非特許文献１に記載の過酸化水素センサを用いたコレステロールの検知を、電極を試料溶液中に浸漬し、次のように定量を行う。コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼは、試料溶液中のコレステロールエステル及びコレステロールのコレステノンへの反応を触媒する。この反応で、試料溶液中の溶存酸素が過酸化水素に還元される。そして、ペルオキシダーゼは、還元型フェロセンによる過酸化水素の還元反応を触媒する。さらに、酸化されたフェロセンが電極で再還元される。このときの還元電流を測定することによりコレステロール濃度を定量する。
【０００４】
また、同様にカーボンペースト電極を利用したコレステロールセンサが特許文献１に開示されている。特許文献１に記載のコレステロールセンサは、カーボンペースト電極、親水性高分子層及び酵素類を含む層から形成されている。カーボンペースト電極は、基板上に銀ペースト及びカーボンペーストがスクリーン印刷されて形成されている。このカーボンペースト電極上に親水性高分子層が形成され、その上に酵素類を含む層が形成されている。酵素類を含む層には、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼ等の酵素類、界面活性剤及び電子伝達メディエータが含有されている。このコレステロールセンサの酵素類を含む層上にコレステロールを含む試料溶液を滴下すると、コレステロールがコレステロールオキシダーゼの存在下でコレステノンに酸化される。その反応で、電子伝達メディエータが還元される。還元型電子伝達メディエータは、電極で再酸化され、このときに生じる酸化電流を電極で測定することによりコレステロール濃度を定量する。特許文献１のコレステロールセンサでは、電極表面が親水性高分子によって覆われているため、界面活性剤がカーボンペースト電極表面に接触しない。よって、高精度のセンサ応答を有するセンサを得ることができる。
【０００５】
さらに、金電極上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を作製し、コレステロールオキシダーゼおよびコレステロールエステラーゼをグルタルアルデヒド架橋により固定したコレステロールセンサが非特許文献２に開示されている。非特許文献２のコレステロールセンサは、電極として金電極を用いているため、電極が有機溶媒や界面活性剤の影響を受け難く高精度のセンサ応答を得ることができる。
【特許文献１】特開平１０−２３２２１９号公報
【非特許文献１】H.Kinoshita et al. /Ann Clin Biochem 1998; 35: 739-744
【非特許文献２】T.Nakaminami et al. /Anal Chem 1999; 71: 1068-1076
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、非特許文献１に記載のコレステロールの定量法では、カーボンペースト電極を界面活性剤を含有する試料溶液中に浸漬するため、電流応答が不正確になってしまう。つまり、試料溶液中の界面活性剤がカーボンペースト電極に接触すると、界面活性剤がカーボン層に湿潤しカーボン層の下地層である銀電極に接触する。そして、銀電極が電気化学反応を生じることにより酸化電流が発生し、測定される酸化電流値が増加してコレステロール濃度の定量に誤差が生じてしまう。さらに、カーボンペースト電極に界面活性剤が浸潤すると、カーボン層自体の変成により、電極活性の低下、すなわち電極／溶液界面での電子伝達速度の低下が生じ、応答性の低下をもたらす。また、カーボンペースト電極上にコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ等の酵素が固定されておらず、検知可能な応答電流を得るためには大量の酵素が必要となってしまう。
【０００７】
特許文献１に記載のコレステロールセンサでは、界面活性剤のカーボンペースト電極への影響を防止するためカーボンペースト電極上に親水性高分子膜を設ける必要があり、製造工程が複雑になる。
また、非特許文献２に記載のコレステロールセンサでは、界面活性剤の影響を受けない材料を電極に用いる必要があるため、電極材料が金などに限定されてしまう。また、電極上に酵素を固定するために、電極の洗浄やＳＡＭを作製するなどの前処理が必要であり工程数が多い。さらに、酵素をＳＡＭにより電極表面上に固定した場合にも酵素がその作用を維持していることが必要であるため、電極表面とＳＡＭとの相互作用等を考慮したＳＡＭの作製が必要である。また、非特許文献２では、電子伝達メディエータが溶存酸素によって自動酸化されてしまうので、測定の際には酸素を除かなければならない。
【０００８】
そこで、本発明は、正確にコレステロールを定量することができ、かつ製造が容易な酵素機能電極を得ることを目的とする。
また、本発明は、正確にコレステロールを定量することができ、かつ製造が容易なコレステロールセンサを得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願第１発明は、上記の課題を解決するために、試料溶液中のコレステロール濃度を定量する酵素機能電極であって、固体電極と、前記固体電極に固定された酵素層とを含み、前記酵素層は、コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、前記ペルオキシダーゼとの反応に応じて前記固体電極と反応する電子伝達メディエータとを有する酵素機能電極を提供する。
コレステロールエステル、コレステロールを含む試料溶液中に上記の酵素機能電極を浸漬すると、コレステロールエステラーゼが、界面活性剤の存在下でコレステロールエステルをコレステロールに変化させる。一方、コレステロールオキシダーゼは、コレステロールエステラーゼにより生成されたコレステロール及び試料溶液中に既に存在するコレステロールの酸素による酸化反応を触媒する。この反応で、試料溶液中の溶存酸素が過酸化水素に還元される。そして、ペルオキシダーゼは、この反応により生じる過酸化水素の還元型電子伝達メディエータによる還元反応を触媒する。最後に、ペルオキシダーゼ反応で生成した酸化型電子伝達メディエータは、固体電極で再還元される。この還元電流値を測定することによりコレステロールを定量する。
【００１０】
上記の酵素機能電極の電極基板は、固体電極であり、固体電極に固定された電子伝達メディエータと固体電極とが電極反応を生じる構成である。よって、界面活性剤が固体電極に浸透せず、固体電極部において電気化学反応が生じない。そのため、電極反応により生じる電流値が電気化学反応により影響を受けず、正確にコレステロールを定量することができる。
さらに、上記の酵素機能電極では、電子伝達メディエータの還元電流を測定するため、電極電位が低電位である。そのため、その電位において酸化または還元される物質によるノイズが生じ難く正確に定量対象物質を定量することができる。例えば、高電位であると、血中に存在する尿酸、アスコルビン酸及びアセトアミノフェン等が酸化される可能性があるが、低電位であるとそれらの物質の酸化されず測定電流に誤差が生じない。
【００１１】
さらに、上記の酵素機能電極においては、ペルオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及び電子伝達メディエータが固体電極に固定され、固体電極表面または固体電極表面近傍に位置している。よって、酵素反応及び電極反応の反応性を高め、生じる電流を固体電極において即時に測定することができる。また、効率良く酵素反応及び電極反応が起こるため、ペルオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及び電子伝達メディエータの量が少なくても酵素反応及び電極反応の応答性を確保することができる。
【００１２】
本願第２発明は、前記第１発明において、前記酵素層は、前記固体電極と前記電子伝達メディエータとの間の電極反応により生じる電流の電流値に誤差を与える妨害物質を阻害する隔膜をさらに有する酵素機能電極を提供する。
固体電極及び電子伝達メディエータ間の電極反応において生じる電流の電流値に誤差を生じさせる妨害物質を隔膜により阻害することができるので、応答電流の誤差を低減することができる。よって、さらに正確にコレステロール濃度を定量することができる。
本願第３発明は、前記第１発明において、前記酵素層は、前記電子伝達メディエータ、ペルオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼを前記固体電極に固定するポリマーをさらに有する酵素機能電極を提供する。
【００１３】
電子伝達メディエータ及び各酵素をポリマーにより固体電極に固定するため、固体電極の材料が金属電極に限定されない。また、例えば固体電極の前処理や洗浄などの工程を省略できるため、容易に酵素機能電極を作製することができる。
本願第４発明は、前記第３発明において、前記電子伝達メディエータはフェロセン誘導体であり、前記ポリマーはポリアリルアミンまたはポリ−Ｌ−リジンである酵素機能電極を提供する。
電子伝達メディエータであるフェロセン誘導体は、ポリアリルアミンまたはポリ−Ｌ−リジンの側鎖に結合される。よって、ポリアリルアミンまたはポリ−Ｌ−リジンを固体電極に結合することにより、電子伝達メディエータであるフェロセン誘導体を固体電極表面又は固体電極近傍に固定することができる。また、これらのポリマーはアミノ基を有しているため、架橋剤を介してポリマー同士を結合して網目構造を形成することによりペルオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを固定することができる。あるいは、架橋剤を介してポリマー骨格と、ペルオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとを架橋させることで、これらの酵素をポリマーに固定することができる。
【００１４】
本願第５発明は、前記第３発明において、前記酵素層は、前記ポリマーを架橋する架橋剤をさらに含み、前記架橋剤は、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、スベリン酸（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、及びジメチルスベリミデートからなる群から選ばれる酵素機能電極を提供する。
上記の架橋剤を用いることにより、固体電極に特別な前処理をすることなく、電子伝達メディエータ、ペルオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびコレステロールエステラーゼを固体電極に固定することができる。
【００１５】
本願第６発明は、前記第１発明において、前記酵素層において、前記固体電極を覆うように前記電子伝達メディエータ及びペルオキシダーゼからなる第１層が形成され、前記第１層を覆うようにコレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼからなる第２層が形成されている酵素機能電極を提供する。
上記の酵素機能電極では、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼからなる第２層が酵素機能電極の最表面に形成されているため、試料溶液中のコレステロールまたはコレステロールエステルとの接触確率が高くなり反応が生じやすい。また、電子伝達メディエータ及びペルオキシダーゼからなる第１層を固体電極側の最表面に固定することで、電子伝達メディエータとペルオキシダーゼとが凝集する。よって、電子伝達メディエータとペルオキシダーゼとの間の反応性が高まり、かつ電子伝達メディエータと固体電極との電極反応が高まる。よって、固体電極において即時に電流を測定することができる。さらに、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼが同一層に位置するように固体電極に固定されているため、コレステロールエステラーゼにより分解されて生じたコレステロールが、コレステロールオキシダーゼにより即時に分解されやすい。これは、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼ間の距離が短いため、コレステロールエステラーゼからコレステロールオキシダーゼへのコレステロールの移動距離が短いためである。また、物質移動速度の観点から、コレステロールの移動速度がＨ2Ｏ2の移動速度よりも小さい場合、前述のようにコレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼを酵素機能電極の最表面に固定すると、高い応答電流を得ることができる。これは、コレステロールが第１層及び第２層を移動するよりも、酵素機能電極の最表面に固定したコレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼによりコレステロールをＨ2Ｏ2に変えてから第１層及び第２層中を移動させたほうが、移動速度が速いためである。
【００１６】
本願第７発明は、前記第６発明において、前記第１層と前記第２層との間に、前記固体電極と前記電子伝達メディエータとの間の電極反応により生じる電流の電流値に誤差を与える妨害物質を阻害する隔膜がさらに形成されている酵素機能電極を提供する。
固体電極及び電子伝達メディエータ間の電極反応において生じる電流の電流値に誤差を生じさせる妨害物質を隔膜により阻害することができるので、応答電流の誤差を低減することができる。よって、さらに正確にコレステロール濃度を定量することができる。
本願第８発明は、前記第１発明〜第７発明のいずれかに記載の酵素機能電極を有するコレステロールセンサを提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明による酵素機能電極の電極基板は、固体電極であり、固体電極に固定された電子伝達メディエータと固体電極とが電極反応を生じる構成である。よって、界面活性剤が固体電極に浸透しないため、酵素反応に由来する電流が界面活性剤により影響を受けず、正確にコレステロールを定量することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
＜第１実施形態例＞
図１は、第１実施形態例に係る酵素機能電極が試料溶液に浸漬されている様子を示す概略図である。第１実施形態例に係る酵素機能電極では、酵素層２が固体電極１に固定されている。酵素層２は、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＤ）、コレステロールエステラーゼ（ＣＨＥＲ）、電子伝達メディエータ（Ｍ）、ポリマー１５及び架橋剤１７を有している。酵素層２内のＰＯＤ、ＣＨＯＤ、ＣＨＥＲ及び電子伝達メディエータは、ポリマー１５及び架橋剤１７を介して固体電極１に固定されている。図１の酵素機能電極では、ポリマー１５のポリマー分子同士が架橋剤１７により互いに架橋され、網目構造体を形成している。その網目構造体中にＣＨＯＤ、ＣＨＥＲ及びＰＯＤの酵素が包含され、包含された酵素は架橋剤１７を介して共有結合によりポリマー１５に結合されている。網目構造体を形成したポリマー１５は、主に疎水性相互作用により固体電極１表面に固定されている。この酵素機能電極が、酸素（Ｏ2）と、定量対象であるコレステロール及び／またはコレステロールエステルとを含む試料溶液３に浸漬される。そして、コレステロールの定量が行われる。また、コレステロールエステルとコレステロールエステラーゼとの接触確率を高めるために、界面活性剤が試料溶液３中に含まれている。界面活性剤を酵素機能電極に担持するようにしても良い。ここで、試料溶液３中のコレステロールエステルは、偽性ミセルの一種であるリポ蛋白中に包摂されているため、ＣＨＥＲとの接触確率が低い。そこで、試料溶液３中にさらに界面活性剤を添加することで、ＣＨＥＲとコレステロールエステルとの接触確率を向上し、酵素の活性を向上させる。そして、コレステロールエステルからコレステロールへの反応を促進させる。
【００１９】
固体電極材料としては、界面活性剤が染み込んだり、界面活性剤によって溶出したりしない材料が選択され、例えば、金属電極、およびグラッシーカーボンなどの炭素電極が挙げられる。
電子伝達メディエータ及びポリマーとしては、電子伝達メディエータが結合した電子伝達メディエータ結合ポリマーが挙げられる。電子伝達メディエータ結合ポリマーとしては、例えば電子伝達メディエータがフェロセン誘導体であるフェロセン結合ポリアリルアミンまたはフェロセン結合ポリ−Ｌ−リジンを用いる。これらのポリマーは、電子伝達メディエータであるフェロセン誘導体が、ポリアリルアミンまたはポリ−Ｌ−リジンの側鎖に結合されている。よって、電子伝達メディエータ結合ポリマーを固体電極１に結合することにより、電子伝達メディエータを固体電極１表面又は固体電極１表面近傍に固定することができる。ポリマーと固体電極１とは、例えば疎水性相互作用により結合されている。
【００２０】
また、ポリマーはアミノ基を有しているため、架橋剤１７を介してポリマー同士を結合して網目構造を形成することによりＰＯＤ、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲを固定することができる。また、架橋剤１７を介してポリマー骨格とＰＯＤ、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲとを架橋させることで、酵素をポリマーに固定することができる。フェロセン結合ポリアリルアミンの合成方法は、例えばE.J.Calvo et al, / Anal.Chem. 1996,68,4186-4193に記載されている。フェロセン結合ポリ−Ｌ−リジンの合成方法は、例えばS.Iijima et al, / Anal.Chem.Acta, 1993,281,438-487に記載されている。
【００２１】
架橋剤１７としては、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、スベリン酸（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル)、及びジメチルスベリミデートなどが挙げられる。これらの架橋剤のアルデヒド基またはエポキシ基が、ポリアリルアミン、ポリ−Ｌ−リジンあるいは酵素のアミノ基とシッフ塩基を形成し結合する。
架橋する際に、ポリアリルアミン、ポリ−Ｌ−リジン等のポリマーまたは牛血アルブミン（ＢＳＡ）をさらに添加すると、ポリマーと架橋剤との反応により網目構造が形成され、酵素の固定が容易である。
【００２２】
図２は、第１実施形態例に係る酵素機能電極を有するコレステロールセンサを用いた場合の反応の様子を示す模式図である。血中総コレステロール濃度は、コレステロール濃度とコレステロールエステル濃度とを合計することにより得られるため、次の反応によりコレステロールを定量する。
コレステロールエステル及びコレステロールを含む試料溶液３中に上記の酵素機能電極を浸漬すると、ＣＨＥＲが、界面活性剤の存在下でコレステロールエステルがコレステロールと脂肪酸に分解される。一方、ＣＨＯＤは、ＣＨＥＲにより生成されたコレステロール及び試料溶液３中に既に存在するコレステロールのコレステノンへの酸化を触媒する。この反応で、試料溶液３中の溶存酸素（Ｏ2）が過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）に還元される。次に、ＰＯＤの存在下でＨ2Ｏ2が水（Ｈ2Ｏ）に還元され、この反応で還元型電子伝達メディエータ（Ｍｒｅｄ）は酸化型電子伝達メディエータ（Ｍｏｘ）に酸化される。最後にＭｏｘが、固体電極１から電子を受け取りＭｒｅｄに還元される。この電極反応により生じる還元電流値を測定することによりコレステロールを定量する。ここで、溶存酸素（Ｏ2）は、ＣＨＯＤとコレステロールとの反応で、ＣＨＯＤによりＨ2Ｏ2に還元される。
【００２３】
上記の酵素機能電極の電極基板は、固体電極１であり、固体電極１に固定された電子伝達メディエータと固体電極１とが電極反応を生じる構成である。よって、界面活性剤が固体電極１に浸透せず、固体電極部において電気化学反応が生じない。そのため、電極反応により生じる電流値が電気化学反応により影響を受けず、正確にコレステロールを定量することができる。
さらに、上記の酵素機能電極の固体電極では、電子伝達メディエータの還元電流を測定するため、電極電位が低電位である。そのため、その電位において酸化または還元される物質によるノイズが生じ難く正確に定量対象物質を定量することができる。例えば、高電位であると、血中に存在する尿酸、アスコルビン酸及びアセトアミノフェン等が酸化される可能性があるが、低電位であるとそれらの物質の酸化されず測定電流に誤差が生じない。また、電子伝達メディエータとしてフェロセンを用いると、フェロセンが溶存酸素により酸化されにくい性質を有しているため、低電位で測定する測定することができる。
【００２４】
上記の酵素機能電極においては、ＰＯＤ、ＣＨＯＤ、ＣＨＥＲ及び電子伝達メディエータが固体電極１に固定され、固体電極１表面または固体電極１表面近傍に位置している。よって、酵素反応及び電極反応の反応性を高め、生じる電流を固体電極１において即時に測定することができる。また、効率良く酵素反応及び電極反応が起こるため、ＰＯＤ、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲ及び電子伝達メディエータの量が少なくても酵素反応及び電極反応の応答性を確保することができる。
また、ＰＯＤ、ＣＨＯＤ、ＣＨＥＲ及び電子伝達メディエータの固体電極１への固定が、ポリマー１５や架橋剤１７により行われているため、固体電極１の材料が金属電極に限定されない。さらに、固体電極１の前処理や洗浄などの工程を省略できるため、容易に酵素機能電極を作製することができる。例えば、ＳＡＭを用いて酵素を電極に固定する場合には、共有結合を利用して金属電極に酵素を固定するため、電極が金などの金属電極に限定されてしまう。また、ＳＡＭを用いる場合には、固体電極の洗浄や前処理などの工程が必要である。さらに、電子伝達メディエータや酵素がポリマー１５や架橋剤１７により固体電極１に固定されているため、例えば強力な対流に曝されても固体電極１から脱難することがない。よって、酵素機能電極を繰り返し使用したり、酵素量や電子伝達メディエータ量を低減することが可能である。例えば、酵素が固定された酵素機能電極を試料溶液から引き上げ、軽く洗浄して再度測定することができる。
＜第２実施形態例＞
図３は、第２実施形態例に係る酵素機能電極を示す概略図である。固体電極１には、ＰＯＤと電子伝達メディエータからなる第１層２２が形成され、第１層２２を覆うようにＣＨＯＤ及びＣＨＥＲからなる第２層２４が形成されている。第１層２２のＰＯＤ及び電子伝達メディエータ間、第２層２４のＣＨＯＤ及びＣＨＥＲ間は、ポリマー１５及び架橋剤１７により結合されている。また、第１層２２及び第２層２４間は、主に架橋剤１７を介した共有結合により固定されている。ここで、第２層２４のＣＨＯＤ及びＣＨＥＲ間は、架橋剤１７のみにより結合されていても良い。この酵素機能電極を、第１実施形態例と同様に、定量対象であるコレステロール及び／またはコレステロールエステルとを含む試料溶液３に浸漬し、コレステロールの定量を行う。また同様に、コレステロールエステルとコレステロールエステラーゼとの接触確率を高めるために、界面活性剤が試料溶液３中に含まれている。界面活性剤を酵素機能電極に担持するようにしても良い。
【００２５】
第１層２２と第２層２４とを別々の層に固定することで、ＰＯＤ及び電子伝達メディエータを電極に固定するためのポリマーとＣＨＯＤ及びＣＨＥＲを電極に固定するためのポリマーとを別々のポリマーとすることができる。例えば、ＰＯＤ及び電子伝達メディエータを固定するために最適なポリマーとＣＨＯＤ及びＣＨＥＲを固定するために最適なポリマーとが異なる場合であっても、それぞれの酵素に対して最適なポリマーを用いてそれぞれの酵素を固定することができる。
さらに、第２実施形態例の酵素機能電極では、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲからなる第２層２４が酵素機能電極の最表面に形成されているため、試料溶液３中のコレステロールまたはコレステロールエステルとの接触確率が高くなり反応が生じやすい。また、電子伝達メディエータ及びＰＯＤからなる第１層２２を固体電極１側の最表面に固定することで、電子伝達メディエータとＰＯＤとが凝集する。よって、電子伝達メディエータとＰＯＤとの間の反応性が高まり、かつ電子伝達メディエータと固体電極１との電極反応が高まる。よって、固体電極１において即時に電流を測定することができる。さらに、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲが同一層に位置するように固体電極１に固定されているため、コレステロールエステラーゼにより分解されて生じたコレステロールが、コレステロールオキシダーゼにより即時に分解されやすい。これは、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼ間の距離が短いため、コレステロールエステラーゼからコレステロールオキシダーゼへのコレステロールの移動距離が短いためである。また、物質移動速度の観点から、コレステロールの移動速度がＨ2Ｏ2の移動速度よりも小さい場合、前述のようにＣＨＯＤ及びＣＨＥＲを酵素機能電極の最表面に固定すると、高い応答電流を得ることができる。これは、コレステロールが第１層２２及び第２層２４を移動するよりも、酵素機能電極の最表面に固定したＣＨＯＤ及びＣＨＥＲによりコレステロールをＨ2Ｏ2に変えてから第１層２２及び第２層２４中を移動させたほうが、移動速度が速いためである。
【００２６】
また、固体電極を覆うように層状に電子伝達メディエータ、各酵素を固定する方法としては、例えば図４〜図６の模式図に示すような固定方法もある。図４では、固体電極１上に電子伝達メディエータからなる第１層２６が結合され、第１層２６を覆うようにＰＯＤ、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲが混在した第２層２７が結合されている。図５では、固体電極１上に電子伝達メディエータからなる第１層３０が結合され、第１層３０を覆うようにＰＯＤからなる第２層３１が結合され、さらに第２層３１を覆うようにＣＨＯＤ及びＣＨＥＲが混在した第３層３２が結合されている。図６では、固体電極１上に電子伝達メディエータからなる第１層３３が結合され、第１層３３を覆うようにＰＯＤからなる第２層３４が結合され、第２層３４を覆うようにＣＨＯＤ第３層３５が結合され、さらに第３層３５を覆うようにＣＨＥＲからなる第４層３６が結合されている。
＜第３実施形態例＞
図７は、第２実施形態例に係る酵素機能電極を示す概略図である。固体電極１には、ＰＯＤと電子伝達メディエータからなる第１層３７が形成され、第１層３７を覆うように隔膜３８が設けられている。隔膜３８の上にはＣＨＯＤ及びＣＨＥＲからなる第２層３９が形成されている。第１層３７のＰＯＤ及び電子伝達メディエータ間は、ポリマー１５及び架橋剤１７により結合されている。第２層３９のＣＨＯＤ及びＣＨＥＲ間は、架橋剤１７により結合されている。また、第１層３７及び隔膜３８の間、第２層３９及び隔膜３８の間は、主に架橋剤１７を介した共有結合により固定されている。
【００２７】
ここで、隔膜３８は、固体電極１及び電子伝達メディエータ間の電極反応により生じる電流の電流値を増加または減少させる妨害物質が固体電極１に到達するのを防ぐ。つまり、コレステロール濃度に応じて電子伝達メディエータと固体電極１との間に生じる固体電極１における電流の電流値が、妨害物質が固体電極１で生じる酸化電流または還元電流により誤差を受けるのを隔膜３８が防ぐ。隔膜３８としては、妨害物質を固体電極１側へ通さないが、過酸化水素は固体電極１側に通す隔膜や、マイナスまたはプラスに帯電した妨害物質を静電気的に固体電極１に近づけない隔膜が挙げられる。妨害物質を通さない隔膜３８としては、例えばポリイオンコンプレックス膜がある。また、静電気的に妨害物質を固体電極１に近づけない隔膜３８としては、例えばアニオン性またはカチオン性の隔膜がある。また、このような電流値に誤差を生じさせる妨害物質としては、例えば尿酸、アスコルビン酸及びアセトアミノフェン等がある。
【００２８】
この酵素機能電極を、第１実施形態例と同様に、定量対象であるコレステロール及び／またはコレステロールエステルとを含む試料溶液に浸漬し、コレステロールの定量を行う。また同様に、コレステロールエステルとコレステロールエステラーゼとの接触確率を高めるために、界面活性剤が試料溶液中に含まれている。界面活性剤を酵素機能電極に担持するようにしても良い。
このような第２実施形態例に係る酵素機能電極は、例えば次のように作製される。直径３ｍｍのグラッシーカーボンからなる固体電極１上において、ＰＯＤ＝０．８ユニット及び電子伝達メディエータ結合ポリマーとしてＦｃ−ＰＡＡ＝０．８ｍｇを混合して乾燥する。その上に、隔膜３８として４０ｍｇ／ｍｌのポリアリルアミン５μｌを滴下して乾燥させることによりポリアリルアミンからなるカチオン性膜を形成する。さらに、隔膜３８上にＣＨＯＤ＝０．２ユニット、ＣＨＥＲ＝０．２ユニット及びＰＥＧＤＥ＝１０μｇを滴下して乾燥して、上記酵素機能電極を作製する。上記の隔膜３８としては、４０ｍｇ／ｍｌのポリビニルスルホン酸５μｌを滴下して乾燥させたポリビニルスルホン酸からなるアニオン性膜、あるいは４０ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジン５μｌ及び４０ｍｇ／ｍｌのポリビニルスルホン酸５μｌを滴下して乾燥したポリ−Ｌ−リジンとポリビニルスルホン酸のポリイオンコンプレックス膜を用いることができる。
【００２９】
第３実施形態例に係る酵素機能電極では、第１及び第２実施形態例の酵素機能電極にさらに隔膜３８が設けられている。この隔膜３８により、固体電極１及び電子伝達メディエータ間の電極反応において生じる電流の電流値に誤差を生じさせる妨害物質を阻害することができるので、応答電流の誤差を低減することができる。よって、さらに正確にコレステロール濃度を定量することができる。
また、隔膜３８は、前記図４〜図６に示す各層の間、例えば固体電極１と第１層２６との間、第１層２６と第２層２７との間のいずれにも設けることができる。ただし、図７に示すように、図７の第１層３７と第２層３９との間に設けるようにすると好ましい。これは、妨害物質の影響を防止できる上に、分子集合体であるミセルとして存在するコレステロールが隔膜３８を通過せずにＣＨＯＤに接触できるからである。また、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲからなる第２層３９が酵素機能電極の最表面に形成されているため、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲと試料溶液３中のコレステロールまたはコレステロールエステルとの接触確率が向上するからである。また、電子伝達メディエータは、固体電極１と電子の授受を行うため、固体電極１の近傍にいることが望ましいからである。さらに、物質移動速度の観点からコレステロールをＨ2Ｏ2変えてから第１層３７及び第２層３９を移動させた方が良いからである。
＜実験例１＞
再び図１を用いて実験例１を説明する。実験例１に係るコレステロールセンサの固体電極部は以下の構成から成る。固体電極１は直径３ｍｍのグラッシーカーボンであり、固体電極１にＰＯＤ、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲが固定されている。ＰＯＤ、ＣＨＯＤ、ＣＨＥＲが、電子伝達メディエータがフェロセンであり、ポリマー１５がポリアリルアミンであるフェロセン結合ポリアリルアミン（Ｆｃ−ＰＡＡ）及び架橋剤１７であるPoly（ethylene  glycol）diglycidyl  ether（ＰＥＧＤＥ）により架橋されて固定されている。それぞれ以下の最適の濃度により固体電極１に固定されている。
【００３０】
ＰＯＤ＝０．８ユニット、ＣＨＯＤ＝０．２ユニット、Ｆｃ−ＰＡＡ＝１６μｇ、ＰＥＧＤＥ＝１０μｇで調整されている。
図８は、実験例１に係るコレステロールセンサの系の一例を示す。攪拌子４０が入れられた恒温ガラスセル４２がスターラマシン４４上に載置されている。恒温ガラスセル４２には、電子伝達メディエータ、ＰＯＤ、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲが固体電極に固定された酵素機能電極４６、対極４８及び参照極５０が電極固定部５２により固定されている。酵素機能電極４６は、グラッシーカーボン電極、対極は白金線、参照極は銀／塩化銀電極で構成されている。これらの電極は、それぞれ定電位設定装置５４を介して測定された電流等を記録する記録装置５６に接続されている。恒温ガラスセル４２には、試料溶液６０を満たし、３７℃で攪拌子４０により２０００ｒｐｍで攪拌した。試料溶液６０としては、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）および所定濃度のコレステロールまたはコレステロールエステルを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩酸塩の緩衝水溶液（ｐＨ７．０）を用いた。
【００３１】
前述のコレステロールセンサを用いて次のように定量を行った。酵素機能電極４６には、参照極５０に対して０ｍＶの電位を印加した。このとき、ＣＨＥＲは、試料溶液６０中のコレステロールエステルがコレステロールに分解される反応を触媒する。分解後のコレステロール及び既に試料溶液６０中に存在するコレステロールは、ＣＨＯＤの触媒反応によりコレステノンに酸化される。この反応で、Ｏ2がＨ2Ｏ2に還元される。次に、ペルオキシダーゼが、生成されたＨ2Ｏ2の水への還元反応を触媒する。この反応で電子伝達メディエータであるフェロセンが酸化され、フェリシニウムイオンが生成される。酵素機能電極４６には、参照極５０に対して０ｍＶの電位が印加されているため、フェリシニウムイオンは、酵素機能電極４６から電子を受け取りフェロセンに還元される。酵素機能電極４６での還元電流を測定することにより、試料溶液中のコレステロール濃度を測定した。
【００３２】
実験例１における測定結果を図９及び図１０に示す。図９は、酵素機能電極４６において測定された還元電流の変化量とコレステロール濃度との関係図、図１０は、酵素機能電極４６において測定された還元電流の変化量とコレステロールエステル濃度との関係図である。図９及び図１０より、還元電流の変化量とコレステロール濃度及びコレステロールエステル濃度は、良好な比例関係を示した。よって、実験例１のコレステロールセンサでは、コレステロール及びコレステロールエステルを正確に定量できた。
＜実験例２＞
実験例２では、以下の３種類の酵素機能電極を有するコレステロールセンサを作製し、各コレステロールセンサの応答電流を測定した。以下に、３種類の酵素機能電極Ａ〜Ｃを示す。
１）酵素機能電極Ａ
前記図１に示す、フェロセン、ＰＯＤ、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲが混在した層を固体電極１に固定した酵素機能電極を作製した。それぞれ以下の最適の濃度により固体電極１に固定されている。
【００３３】
ＰＯＤ＝０．８ユニット、ＣＨＯＤ＝０．２ユニット、ＣＨＥＲ＝０．２ユニット、Ｆｃ−ＰＡＡ＝０．４ｍｇ、ＰＥＧＤＥ＝２０μｇを混合・乾燥して作製。
２）酵素機能電極Ｂ
フェロセン、ＰＯＤ及びＣＨＯＤが混在した第１層を固体電極１上に形成し、第１層の上にＣＨＥＲからなる第２層を固定して酵素機能電極を作製した。それぞれ以下の最適の濃度により固体電極１に固定されている。
ＰＯＤ＝０．８ユニット、ＣＨＯＤ＝０．２ユニット、Ｆｃ−ＰＡＡ＝０．４ｍｇを混合・乾燥した後、ＣＨＥＲ＝０．２ユニット、ＰＥＧＤＥ＝２０μｇを混合・乾燥して作製。
３）酵素機能電極Ｃ
前記図３に示す、フェロセン及びＰＯＤが混在した第１層を固体電極１上に形成し、第１層の上にＣＨＯＤ及びＣＨＥＲからなる第２層を固定して酵素機能電極を作製した。それぞれ以下の最適の濃度により固体電極１に固定されている。
【００３４】
ＰＯＤ＝０．８ユニット、Ｆｃ−ＰＡＡ＝０．４ｍｇを混合・乾燥した後、ＣＨＯＤ＝０．２ユニット、ＣＨＥＲ＝０．２ユニット、ＰＥＧＤＥ＝２０μｇを混合・乾燥して作製。
酵素機能電極Ａ〜Ｃを有するコレステロールセンサを用い、実験例１と同様に前記図８の系により応答電流を測定した。試料溶液６０としては、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）、２％イソプロパノール及び１４ｍＭコール酸ナトリウムを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩酸塩の緩衝水溶液（ｐＨ７．０）を用いた。この試料溶液６０に、前述の酵素機能電極４６を有するコレステロールセンサを浸漬し、攪拌子４０で攪拌しながら定常電流が得られたところでコレステロールエステル溶液を添加して反応を開始した。そして、反応前の定常電流値と反応後の定常電流値との差を応答電流として読みとった。酵素機能電極４６には、参照極５０に対して０ｍＶの電位を印加した。
【００３５】
図１１は、コレステロールエステル濃度に対する応答電流の測定結果である。コレステロールエステル濃度に対する応答電流の大きさは、酵素機能電極Ｃ＞酵素機能電極Ａ＞酵素機能電極Ｂであった。よって、酵素機能電極としては、フェロセン及びＰＯＤが混在した第１層を固体電極１上に形成し、第１層の上にＣＨＯＤ及びＣＨＥＲからなる第２層を固定した酵素機能電極Ｃが最適であることが分かった。
これは、物質移動速度の観点から説明できる。すなわち、コレステロールエステルおよびコレステロールは分子の大きさが比較的大きいため、固体電極上に固定された酵素を含む層の中における移動速度が遅い。また、酸素が還元された過酸化水素の分子は比較的小さく移動速度が速いことを考慮すると、コレステロールの移動距離が小さい、つまり、ＣＨＥＲとＣＨＯＤとの間の距離が小さいほど応答電流は大きくなる。各酵素機能電極について考察すると次のようになる。酵素機能電極Ｃでは、ＣＨＥＲ及びＣＨＯＤがコレステロールセンサの最表面、つまり試料溶液６０からの距離が近い位置に固定されており、かつ同一層に固定されているため、ＣＨＥＲとＣＨＯＤとの間の距離が小さい。また、酵素機能電極Ａでは、ＣＨＥＲ及びＣＨＯＤとが同一層に固定されているので距離は小さいが、固体電極１の表面に固定されたＣＨＥＲまでコレステロールエステルが移動し難い。つまり、試料溶液６０に接しているコレステロールセンサの最表面からコレステロールセンサの深層にまでコレステロールエステルが移動しにくい。酵素機能電極ＢではＣＨＥＲ及びＣＨＯＤとが異なる層に位置しているため、ＣＨＥＲとＣＨＯＤとの間の距離が大きい。以上から、ＣＨＥＲ及びＣＨＯＤが試料溶液に近い位置に固定されており、かつＣＨＥＲ及びＣＨＯＤ間の距離が短い酵素機能電極Ｃが一番応答電流が大きいと分かった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明を用いれば、正確にコレステロールが定量可能なコレステロールセンサを容易に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】第１実施形態例に係る酵素機能電極が試料溶液に浸漬されている様子を示す概略図。
【図２】第１実施形態例に係る酵素機能電極を有するコレステロールセンサを用いた場合の反応の様子を示す模式図。
【図３】第２実施形態例に係る酵素機能電極を示す概略図。
【図４】第２実施形態例に係る別の酵素機能電極を示す概略図（１）。
【図５】第２実施形態例に係る別の酵素機能電極を示す概略図（２）。
【図６】第２実施形態例に係る別の酵素機能電極を示す概略図（３）。
【図７】第２実施形態例に係る酵素機能電極を示す概略図。
【図８】実験例１に係るコレステロールセンサの系の一例。
【図９】酵素機能電極において測定された還元電流の変化量とコレステロール濃度との関係図。
【図１０】酵素機能電極において測定された還元電流の変化量とコレステロールエステル濃度との関係図。
【図１１】コレステロールエステル濃度に対する応答電流の測定結果。
【符号の説明】
【００３８】
１：固体電極    
２：酵素層    
３、６０：試料溶液    
１５：ポリマー  
１７：架橋剤  
２２、２６、３０、３３、３７：第１層  
２４、２７、３１、３４、３９：第２層  
３２、３５：第３層  
３６：第４層  
３８：隔膜  
４０：攪拌子  
４２：恒温ガラスセル  
４６：酵素機能電極  
４８：対極  
５０：参照極  
【図１】
2005083965.tif 000003
【図２】
2005083965.tif 000004
【図３】
2005083965.tif 000005
【図４】
2005083965.tif 000006
【図５】
2005083965.tif 000007
【図６】
2005083965.tif 000008
【図７】
2005083965.tif 000009
【図８】
2005083965.tif 000010
【図９】
2005083965.tif 000011
【図１０】
2005083965.tif 000012
【図１１】
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