(57)【要約】【課題】  免疫原性を有するペプチド、又は生理活性ペプチド若しくはその前駆体を大量かつ迅速に得ることが容易な組換えプラスミド及びキメラウイルスを提供する。【解決手段】  組換えプラスミドは、クローバー葉脈黄化ウイルスのゲノムに由来する第１のポリヌクレオチドと、免疫原性を有するペプチド、又は生理活性ペプチド若しくはその前駆体をコードする第２のポリヌクレオチドとを備える。免疫原性を有するペプチドは、動物ウイルスの蛋白質若しくはその一部、又は微生物の蛋白質若しくはその一部であるのが好ましく、ノロウイルスのキャプシド蛋白質又はその一部であるのが特に好ましい。キメラウイルスは、前記組換えプラスミドを植物に感染させることにより生成される。【選択図】      図１
2005270032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クローバー葉脈黄化ウイルスのゲノムに由来する第１のポリヌクレオチドと、該第１のポリヌクレオチドに挿入された第２のポリヌクレオチドとを備え、前記ウイルスが感染する植物に感染性を有する組換えプラスミドであって、
前記第２のポリヌクレオチドは、免疫原性を有するペプチド、又は生理活性ペプチド若しくはその前駆体を構成するペプチドをコードし、該ペプチドは前記ウイルスが感染する植物の細胞内で発現するように構成されていることを特徴とする組換えプラスミド。
【請求項２】
前記第２のポリヌクレオチドは動物ウイルスの蛋白質若しくはその一部、又は微生物の蛋白質若しくはその一部をコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の組換えプラスミド。
【請求項３】
前記第２のポリヌクレオチドはノロウイルスのキャプシド蛋白質又はその一部をコードするポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の組換えプラスミド。
【請求項４】
キメラウイルスであって、
ゲノムと、免疫原性を有するペプチド、又は生理活性ペプチド若しくはその前駆体を構成するペプチドとを有し、
前記ゲノムは、クローバー葉脈黄化ウイルスのゲノムに由来する第１のポリヌクレオチドと、該第１のポリヌクレオチドに挿入された第２のポリヌクレオチドとを備え、
前記第２のポリヌクレオチドは前記ペプチドをコードしていることを特徴とするキメラウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、いわゆる「食べるワクチン」や生理活性ペプチドを製造するために用いられる組換えプラスミド及びキメラウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
将来、注射をしてもらう代わりに、日常食べたり飲んだりしていれば自然に各種の免疫や抵抗性が得られるようになるかもしれない。まさに医食同源であり、さらに重要なことは、従来の予防接種ができなかった国や地方、また特異な体質にあった子供たちも、食物ワクチンで感染症や原虫症、また過敏アレルギー等から救えるようになるであろう。これまでの従来ワクチンも感染性疾患を征服するのに奇跡ともいえる成果をあげ、天然痘は撲滅され歴史上の出来事になってしまった。やがて、小児麻痺（ポリオ）も撲滅されるようになるであろう。１９９０年代の末には、６種の主要な感染症に対する小児の予防接種キャンペーンが行われ、全世界の８０％の小児が接種を受けた（これは１９７０年代の５％に比べて目覚しい成果である）。その結果、年間死亡数が３００万人まで低下している。
【０００３】
しかし、未だ２０％の子供が接種を受けないことにより、ジフテリア、百日咳、小児麻痺、麻疹、破傷風及び結核によって年間２００万人も死亡しており、これらは遠隔かつ貧しい国々の子供達である。予防接種は高価で、実施不確実な国での乳児死亡は依然多く、それらの国々の発展の妨げにもなっている。このような事態は最貧国だけの問題ではなく、他の地域で消滅した感染症は動物や環境に温存されていて、それらが突然暴発し再興爆発寸前の事態にもなってきたともいえる。また、新興の感染症も近年数多く発生してきている。これまで発展整備が進められた社会の衛生システムが損傷を受けたとき、消滅したと考えられていた感染症が突然猛威をふるう。また、撲滅されたり激減した感染症病原体や毒素等も無差別テロや生物兵器に使われる可能性も否定できない。今や、国際的な交流や交易がますます盛んになってきているため、遠隔地域で発生した感染症が他の地域で即流行するようにもなりうる。
【０００４】
１９９０年代の初めに、開発途上国の子供にワクチンを行き渡らせる方法を考えていた研究者がいた。植物を遺伝子工学で改造し、食用部分にワクチンを作らせるようにして、必要なときに食べさせればいいのである。このワクチンのアイデアには利点がいろいろあった。植物は安価で、それぞれの地域にあった方法で栽培でき、しかも再生も可能なので種子を買わなくとも毎年同じように生育させることができると輸送の必要がなく食べることで接種効果が期待でき器具等も不要である。これらのアイデアの実現には、まだ初期的な段階にあるものの過去１０年間で、動物実験やわずかの臨床試験が行われたに過ぎないが、食べるワクチンが有効であるとの希望が生まれてきた。加えて、ある種の食物ワクチンは自己免疫抑制作用をも期待できるとの推測が得られるまでになってきた。
【０００５】
さて、食物ワクチンでは、病原体を形成しない抗原を含むサブユニットを作り出すことである。１０年前に前記研究者は、生成や保存の問題がない食物ワクチンは安くできると考えていた。しかし、臨床試験を始める前に、次のような課題を解決する必要があった。抗原遺伝子を組み込んだ植物は、特定の機能を持つ蛋白質をきちんとコピーでき、実験動物に食べさせたとき抗原が作用する前に消化されてしまうことはないか、抗原が保持されたとしても免疫系を活性化し十分な抗原刺激し食べるワクチンとして膜性免疫と呼ばれる賦活能を示すかどうか等であった。注射等で直接接種された抗原では液性免疫作用を主に直接起こさせるが、食べるワクチンでは細胞性と液性の免疫機構の両方を共に活性化することになる。
【０００６】
１９９５年までに研究者たちはこれらの疑問点に答えるべく、多数の実験を行った。例えば、タバコにＢ型肝炎由来の蛋白をコードする遺伝子を組み込み、この蛋白を合成する植物を作出した。それをマウスに注射したところ、ウイルス本体で誘起されると同じ免疫能が得られることを確認した。しかし、解決しなければならない点は多い。その一つは、ワクチンとしての抗原蛋白質濃度が低かったということである。これを解決する方法が多数試みられているが、どの植物や食品の一定量から一定濃度のワクチン抗原量が得られるかを証明しなければならない。また、食べるワクチンが、自己免疫疾患や感染症の予防に実際使われるようになるまでにはまだやらなければならないことが山積している。しかし、これらの技術的な障害は乗り越えられるであろう。世界中の何百万という乳幼児の健康を守ることができればそれは素晴らしいことである。（例えば非特許文献１参照）
この種の食べるワクチンは、例えば特許文献１に開示されているような組換え植物ウイルス核酸を用いて製造される。一方、特許文献２には、マメ科植物、ナス科ニコチアーナ属に属する植物及びアヤメ科グラジオラス属に属する植物における遺伝子発現ベクターが知られている。この遺伝子発現ベクターは、クローバー葉脈黄化ウイルス（Clover yellow vein virus：ＣｌＹＶＶ）のゲノムに対するｃＤＮＡを、その構成要素として含んでいる。また、この遺伝子発現ベクターは、外来遺伝子をマメ科植物等の植物において発現させることができるようになっている。前記外来遺伝子としては、その遺伝子を発現させる対象となる植物に由来する遺伝子以外のあらゆる遺伝子を含むことは勿論のこと、遺伝子発現対象となる植物が本来的に保有する遺伝子であってもよい。例えば、各種の耐冷性遺伝子、大気汚染物質耐性遺伝子、ウイルス耐性遺伝子、病害虫忌避遺伝子、農薬耐性遺伝子、富栄養化遺伝子、ＧＦＰ（green fluorescent protein）のような発光遺伝子等が挙げられる。
【非特許文献１】“食べるワクチン”、[online]、テラメックス株式会社、[平成１６年１月５日検索]、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.teramecs.com/reference/bionews/news2000/bio2000#11.htm＞
【特許文献１】特開２００１−５４３９４号公報
【特許文献２】特開２０００−２４５４６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記従来の組換え植物ウイルス核酸はトバモウイルス、スズメノチャヒキウイルス、イネ壊死ウイルス等の（＋）−センス一本鎖ＲＮＡ植物ウイルスに由来している。この発明は、本発明者らの鋭意研究の結果、食べるワクチンの製造に適した遺伝子をクローバー葉脈黄化ウイルス由来のベクター内に組込んで組換えプラスミドを作製した後、該プラスミドを植物に感染させて所望とする蛋白質を極めて大量かつ迅速に発現させることができたという知見に基づいてなされたものである。その目的とするところは、免疫原性を有するペプチド、又は生理活性ペプチド若しくはその前駆体を大量かつ迅速に得ることが容易な組換えプラスミド及びキメラウイルスを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の組換えプラスミドの発明は、クローバー葉脈黄化ウイルスのゲノムに由来する第１のポリヌクレオチドと、該第１のポリヌクレオチドに挿入された第２のポリヌクレオチドとを備え、前記ウイルスが感染する植物に感染性を有する組換えプラスミドであって、前記第２のポリヌクレオチドは、免疫原性を有するペプチド、又は生理活性ペプチド若しくはその前駆体を構成するペプチドをコードし、該ペプチドは前記ウイルスが感染する植物の細胞内で発現するように構成されていることを要旨とする。
【０００９】
この構成によれば、第１のポリヌクレオチドによって、天然のクローバー葉脈黄化ウイルスが持つ高い感染性及び増殖能力が有効に発揮されることから、植物に対する感染が容易かつ迅速に進行するとともに、免疫原性を有するペプチド、又は生理活性ペプチド若しくはその前駆体が大量に得られる。また、免疫原性を有するペプチドでは免疫原性を保持した状態で得られる。さらに、クローバー葉脈黄化ウイルスは、世界中で広範囲に栽培されている植物に感染させることが可能であることから、世界中の多くの地域で生理活性ペプチドを製造することが容易となる。また、クローバー葉脈黄化ウイルスのゲノムに由来する第１のポリヌクレオチドは、長大な外来遺伝子の挿入が容易であるうえ、取り扱い性及び発現されるペプチドの収量の点でも極めて良好である。
【００１０】
請求項２に記載の組換えプラスミドの発明は、請求項１に記載の発明において、前記第２のポリヌクレオチドは動物ウイルスの蛋白質若しくはその一部、又は微生物の蛋白質若しくはその一部をコードするポリヌクレオチドを含むことを要旨とする。この構成によれば、動物ウイルスや微生物に対して免疫反応を引き起こすペプチドが大量に得られ、感染症や食中毒のような疾患の予防に用いられるワクチン及び関連資材を容易かつ迅速に製造することが可能となる。
【００１１】
請求項３に記載の組換えプラスミドの発明は、請求項１又は請求項２に記載の発明において、前記第２のポリヌクレオチドはノロウイルスのキャプシド蛋白質又はその一部をコードするポリヌクレオチドからなることを要旨とする。
【００１２】
この構成によれば、ノロウイルスに対して免疫反応を引き起こすペプチドが大量に得られることから、ノロウイルスによって引き起こされる非細菌性食中毒や胃腸風邪に対する予防効果の高いワクチン及び関連資材を製造することが可能となる。さらに、キャプシド蛋白質又はその一部は、動物の腸管膜に対する高い付着性を有しており、ノロウイルスが感染した宿主に対して極めて迅速かつ有効な免疫応答を引き起こさせることが可能であることから、ワクチンとしての高い効果が期待される。
【００１３】
請求項４に記載のキメラウイルスの発明は、キメラウイルスであって、ゲノムと、免疫原性を有するペプチド、又は生理活性ペプチド若しくはその前駆体を構成するペプチドとを有し、前記ゲノムは、クローバー葉脈黄化ウイルスのゲノムに由来する第１のポリヌクレオチドと、該第１のポリヌクレオチドに挿入された第２のポリヌクレオチドとを備え、前記第２のポリヌクレオチドは前記ペプチドをコードしていることを要旨とする。
【００１４】
この構成によれば、免疫原性を有するペプチド、又は生理活性ペプチド若しくはその前駆体を大量かつ迅速に得ることが容易である。さらに、これらのキメラウイルスでは、前記免疫原性を有するペプチド、又は生理活性ペプチド若しくはその前駆体がキャプシド等の構造蛋白質等から切り離された状態で存在していることから、動物に経口摂取させる際には、そのままの状態で腸管膜を通して該動物の生体内に吸収されやすい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の組換えプラスミド及びキメラウイルスによれば、免疫原性を有するペプチド、生理活性ペプチド若しくはその前駆体を大量かつ迅速に得ることが容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を具体化した実施形態を詳細に説明する。
実施形態の第一及び第二の組換えプラスミドは、クローバー葉脈黄化ウイルス（ＣｌＹＶＶ）のゲノムに由来する第１のポリヌクレオチドと、該第１のポリヌクレオチドの所定位置に挿入された第２のポリヌクレオチドとを備えている。第一の組換えプラスミドにおける第２のポリヌクレオチドは第２のペプチドとしての免疫原性を有するペプチドをコードしており、第二の組換えプラスミドにおける第２のポリヌクレオチドは第２のペプチドとしての生理活性ペプチド又はその前駆体を構成するペプチドをコードしている。これら第一及び第二の組換えプラスミドはいずれも、前記ＣｌＹＶＶが感染する植物に対し感染性を有するとともに、該植物の細胞（宿主細胞）内において宿主染色体とは別個に独立して自立的に複製されつつ安定に保持伝達される。さらに、これらの組換えプラスミドは、前記宿主細胞内で第２のペプチドを大量かつ迅速に発現させる。即ち、これらの組換えプラスミドは、非遺伝子組換え植物（Not Genetically Modified Plants）を作出して目的とするペプチドを製造するために用いられる。なお、これら第一及び第二の組換えプラスミドはＤＮＡ又はＲＮＡのいずれの物質により構成されていても構わない。
【００１７】
第１のポリヌクレオチドは、ＣｌＹＶＶのゲノム又はその一部により構成されており、ＣｌＹＶＶのゲノム又はその一部を含有するものであっても構わない。ＣｌＹＶＶは、ポティウイルス（Potyvirus）科に属する植物ウイルスであって、ひも状の形態をしており、約９５００塩基からなる（＋）一本鎖ＲＮＡをゲノムとして持っている。このゲノムＲＮＡには、約３０００アミノ酸からなるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、翻訳されたポリペプチドはそれ自身がコードするプロテアーゼによってプロセッシング（翻訳後修飾）を受け、１０種類の蛋白質を発現する（図２（ａ）及び（ｂ）参照）。
【００１８】
この第１のポリヌクレオチドは、プラスミドベクターとして機能し、パッセンジャーとしての第２のポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入する役割を果たす。この第１のポリヌクレオチドは、宿主細胞内における複製能を有しているうえ、第２のポリヌクレオチドを挿入するための制限酵素切断部位を備えている。なお、前記複製能としては、遺伝情報（塩基配列の情報）が複製されることを意味し、情報を担持する物質が複製段階でＤＮＡからＲＮＡに変化していても構わない。また、この第１のポリヌクレオチドは、前記複製能を発揮するためにＣｌＹＶＶを構成するキャプシド等の構造蛋白質を発現する。さらに、この第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドを途中に含む一つのポリヌクレオチドとして一つのポリプロテインを発現し、自身のプロテアーゼ活性による翻訳後修飾により、第２のペプチドを切り出すように構成されているのが好ましい。
【００１９】
ＣｌＹＶＶのゲノムに由来する第１のポリヌクレオチドとしては、例えば特許文献２に開示されている遺伝子発現ベクター（ｐＣｌＹＶＶ）又はその改良ベクターが用いられる。前記改良ベクターとしては、Ｍａｓｕｔａらの方法（Masuta,C., T.Yamana, Y.Tacahashi, I.Uyeda, M.Sato, S.Ueda, and T.Matsumura. 2000. Development of clover yellow vein virus as an efficient, stable gene-expression system for legume species. The Plant Journal 23:1-8）にて作製されるｐＣｌＹＶＶ／Ｐ１、又はＷａｎｇらの方法（Wang,Z-D., S.Ueda, I.Uyeda, H.Yagihashi, H.Sekiguchi, Y.Tacahashi, M.Sato, K.Ohya, C.Sugimoto, and T.Matsumura, 2003, Positional effect of gene insertion on genetic stability of a clover yellow vein virus-based expression vector. Journal of General Plant Pathology. J Gen Plant Pathol 69:327-334 ）にて作製されるｐＣｌＹＶＶ／ＣＰ／Ｗが挙げられる。
【００２０】
このＣｌＹＶＶのゲノムに由来する第１のポリヌクレオチドは、マメ科植物、ナス科ニコチアーナ属に属する植物又はアヤメ科グラジオラス属に属する植物に感染する。前記遺伝子発現ベクター及びその改良ベクターはいずれも、ＣｌＹＶＶのゲノムＲＮＡに対して作製されたｃＤＮＡをカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来３５Ｓプロモーターの下流に導入することによって得られ、環状二本鎖ＤＮＡの形態で存在する。遺伝子発現ベクター及びその改良ベクターは通常、大腸菌プラスミドに挿入されたＣａＭＶ由来３５Ｓプロモーターの下流に前記ｃＤＮＡを導入することによって得られる。これら遺伝子発現ベクター及びその改良ベクターはいずれも、前記植物の細胞内に感染した後、該ベクターの遺伝情報をゲノムＲＮＡ（ＲＮＡプロジェニー(RNA progeny)）として複製するとともに１０種類の蛋白質を発現し、キメラウイルスとしての新たな植物ウイルス（プロジェニーウイルス）を構築して子孫を増やす。
【００２１】
第一の組換えプラスミドにおける第２のポリヌクレオチドは、免疫原性を有するペプチド（ポリペプチド）をコードしている。前記免疫原性を有するとは、動物に対して免疫したときに特異的に結合する抗体が生産されることを意味し、例えば第２のポリヌクレオチドがコードする第２のペプチドを植物細胞内で発現させたとき、該ペプチドのエピトープにおける立体構造が第２のポリヌクレオチドが由来する生物において形成される天然型の立体構造と同じ構造を形成する。即ち、前記生物から抽出又は精製されたペプチドを抗原として作製されたモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体が、前記植物細胞内で発現される第２のペプチドと特異的に結合すればよい。前記特異的に結合するとは、エンザイム・イムノアッセイ等のイムノアッセイにより特異的な抗原抗体反応が検出可能であることを意味する。
【００２２】
この第一の組換えプラスミドにおける第２のポリヌクレオチドとしては、動物ウイルス又は微生物（病原菌）の蛋白質若しくはその一部をコードするものが用いられる。即ち、この第２のポリヌクレオチドは、感染症や食中毒のような疾患の予防に役立つペプチド又はポリペプチドをコードするものが用いられる。この第２のポリヌクレオチドがコードする第２のペプチドは、動物に経口摂取させることにより、該動物の免疫系（肥満細胞等）を活性化させて該ペプチドに対する特異的な免疫応答を引き起こさせて免疫記憶を形成させることにより、前記疾患に対する予防を行う。即ち、この第一の組換えプラスミドは「食べるワクチンを」製造するために利用される。
【００２３】
前記動物ウイルス又は微生物としては、ヒト又は動物に対し感染症や食中毒を引き起こすものが挙げられ、ノロウイルス（Norovirus）、ロタウイルス（Rotavirus）、ＳＡＲＳ（Severe Acute Respiratory Syndrome；重症急性呼吸器症候群）ウイルス、ＨＩＶウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、日本脳炎ウイルス、おたふく風邪ウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、痘そうウイルス、黄熱ウイルス、結核菌、溶連菌、コレラ菌、肺炎球菌、ジフテリア菌、破傷風菌、百日咳菌、ナイセリア菌、発疹チフス菌、ボツリヌス菌等が挙げられる。前記動物としては、ウシ、ブタ、ニワトリ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜、イヌ、ネコ、ネズミ、ウサギ等のペット、魚類や貝類等の海洋生物が挙げられ、特に前記植物を摂取する草食動物が適している。この第一の組換えプラスミドにおける第２のポリヌクレオチドとしては、前記動物ウイルスや微生物に存在するあらゆる蛋白質又はその一部をコードするものが用いられ得るが、それらウイルスや微生物の構造蛋白質又はその一部をコードするものが好適に用いられる。特に、この第２のポリヌクレオチドとしては、前記動物ウイルスの外殻又は微生物の外部に露出するポリペプチド（キャプシド蛋白質や細胞膜蛋白質等）をコードするものが好適に用いられる。
【００２４】
第二の組換えプラスミドにおける第２のポリヌクレオチドは、生理活性ペプチド又はその前駆体を構成するペプチド（ポリペプチド）をコードしている。前記生理活性ペプチドとしては、記憶学習改善ペプチド、摂食調節ペプチド、脂質代謝改善ペプチド、アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド等の血圧降下ペプチド、Soymetide-13やSoymetide-4等の免疫促進ペプチド、Soymetide-4等の抗脱毛ペプチド等が挙げられる。記憶学習改善ペプチドとしては、Gluten exorphin A、緑葉植物の葉に含まれるRibulose-bisphosphate carboxylase/oxygenaseから派生するモルヒネ様ペプチド、Casoxin C、Oryzatensin、補体Ｃ３ａのアゴニストペプチド、Albutensin A等が挙げられる。摂食調節ペプチドとしては、Leptin、Agouti-related protein、ＭＳＨ（Melanocyte-stimulating hormone）、ＣＲＦ（Corticotoropin releasing factor）、Urocortin、Cholecystokinin、Bombesin、Glucagon、Neurotensin、ＧＬＰ−１（Glucagon-like peptide）、ＧＬＰ−２、ＣＧＲＰ（Calcitonin gene related protein）、Adrenomedullin、Albutensin A、補体Ｃ３ａ、ＰＡＭＰ（Proadrenomedullin N-terminal 20 peptide）等の摂食抑制ペプチド、又はGhreln、Neuropeptide Y、ＭＣＨ（Melanin-concentrating hormone）、ＣＡＲＴ（Cocain- and amphetamine-regulated transcript）、Orexin、Opioid、補体Ｃ５ａ等の摂食促進ペプチドが挙げられる。
【００２５】
これら生理活性ペプチド及びその前駆体は、動物に経口摂取させることにより、該動物の生体内で特有の生理活性を引き起こさせて薬理作用を発揮する。即ち、この第二の組換えプラスミドは、経口摂取するための薬剤を製造するために利用される。前記薬剤は、動物に経口摂取させることにより、第２のポリヌクレオチドがコードする生理活性ペプチド又はその前駆体を該動物の消化器官を介して所定の組織に搬送するためのドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を構築するとともに、前記生理活性ペプチドによる所定の薬理作用を発揮する。前記生理活性ペプチドは、ペプチド（ポリペプチド）のみからなる単純蛋白質を用いるのが簡便であるが、第二の組換えプラスミドを前記植物に感染させることにより該植物の細胞内で適切な翻訳後修飾が可能であれば糖、脂質、金属等の非ペプチド性成分を備えたペプチド（ポリペプチド）からなる複合蛋白質であってもよい。また、前記生理活性ペプチドの前駆体は、動物の生体内におけるプロテアーゼ分解等により、前記生理活性ペプチドが生成されるように工夫されたものが用いられる。なお、前記第２のポリヌクレオチドは、単一のペプチドをコードしていてもよく、或いは複数のペプチドをコードしていても構わない。
【００２６】
これらの第一及び第二の組換えプラスミドによって発現される第２のペプチドは、第１のポリヌクレオチドがコードするキャプシド等の構造蛋白質等から完全に自動的に切り離され、独立した状態で存在する。また、前記第２のペプチドは、前記構造蛋白質等から切り離された状態で存在するとともにウイルスコート蛋白質（ＶＣＰ）中に包含された状態で存在する場合には、それら構造蛋白質等による保護作用によってプロテアーゼ抵抗性、耐酸性及び耐アルカリ性に優れている。このとき、第２のペプチドは、動物に経口摂取させたとき、前記保護作用によって動物の胃内での強酸条件下やプロテアーゼ分解等による分解及び変性が抑えられるとともに、吸収させる位置の腸管に到達した後、同構造蛋白質等が動物の腸管内で分解吸収される際にＶＣＰから該ペプチドが遊離され、腸管膜を通して動物の生体内に吸収される。
【００２７】
さて、これら第一及び第二の組換えプラスミドは、植物に接種することにより、該植物の細胞内で第２のポリヌクレオチドがコードする第２のペプチドを発現するとともに、複製されることによって新たな植物ウイルス（プロジェニーウイルス）のゲノムが生成される。さらに、同植物細胞内で第１のポリヌクレオチドがコードする蛋白質を発現し、前記生成されたゲノムとともにキメラウイルスとしての新たな植物ウイルス（プロジェニーウイルス）を構築して子孫を増やしながら感染を拡大させる。第一の組換えプラスミドを植物に感染させたときには、前記植物の細胞内で発現される第２のペプチドは、免疫原性を保持した状態のままで存在している。また、第二の組換えプラスミドを植物に感染させたときには、前記植物の細胞内では生理活性ペプチド又はその前駆体が発現される。このとき、第一及び第二の組換えプラスミドによって発現された第２のペプチドは、天然型又はそれに近い形の特異な立体構造を有しているため、宿主細胞の細胞質において該宿主細胞由来のプロテアーゼによる分解等の非特異的なプロセッシング（翻訳後修飾）が大幅に抑制されている。
【００２８】
実施形態のキメラウイルスは、前記第一又は第二の組換えプラスミドの塩基配列からなるポリヌクレオチドをゲノムとして備えているうえ、前記第１のポリヌクレオチドによってコードされるキャプシド等の構造蛋白質からなる外殻を備えている。このキメラウイルスは、植物に感染するウイルスであって、前記組換えプラスミドを前記植物に感染させることによって構築される前記プロジェニーウイルスからなる。即ち、このキメラウイルスの性質（ゲノムを構成する物質や構造蛋白質等）は、前記第１のポリヌクレオチドによって決定されている。このキメラウイルスは、前記各組換えプラスミドと同様に、前記植物に対し感染性を有しており、該植物の細胞内で前記第２のポリヌクレオチドがコードする第２のペプチドを発現するとともにゲノムを複製し、さらに前記第１のポリヌクレオチドがコードする蛋白質を発現して新たなキメラウイルス（プロジェニーウイルス）を構築する。このとき、前記植物の細胞内で発現される免疫原性を有するペプチドは天然型又はそれに近い形の特異な立体構造を有しているため免疫原性を保持した状態のままで存在しており、前記生理活性ペプチド及びその前駆体はＤＤＳを備えた薬理作用を発揮し得るようになっている。また、このキメラウイルスでは、前記第２のポリヌクレオチドによってコードされる第２のペプチドが構造蛋白質等から切り離された状態で存在しており、動物の腸管膜を通して該動物の生体内に効率的に吸収されるようになっている。
【００２９】
実施形態の植物体は、前記組換えプラスミド又はキメラウイルスが感染した植物個体からなり、前記第２のポリヌクレオチドがコードする第２のペプチドを含有している。このため、この植物個体に含まれる免疫原性を有するペプチドは、免疫原性を保持した状態のままで存在しており、食べるワクチンを製造するためのワクチン資材として利用される。また、この植物個体を構成する器官や組織についても、前記免疫原性を有するペプチドを含有している場合には、ワクチン資材として利用され得る。一方、この植物個体中に生理活性ペプチド又はその前駆体が含まれている場合には、腸管膜を介したＤＤＳを構築するとともに所定の薬理作用を発揮する薬剤として利用される。
【００３０】
実施形態の第一の薬剤としてのワクチンは、前記植物個体又はその器官や組織から得られる免疫原性を有するペプチドをワクチン資材として含有している。このワクチン資材は、免疫原性を保持しており、上記感染症や食中毒の予防に有効である。実施形態の第二の薬剤は、前記植物個体又はその器官や組織から得られる生理活性ペプチド若しくはその前駆体を有効成分として含有しているため、腸管膜を介したＤＤＳを構築するとともに所定の薬理作用を発揮する。なお、これら第一及び第二の薬剤中には、上記組換えプラスミドやキメラウイルスのゲノム等の核酸が含まれていても構わないが、含まれていないのが好ましい。前記ワクチン資材及び有効成分としては、いずれも前記植物個体又はその器官や組織をそのまま用いてもよく、それらを破砕、粉砕、搾汁、乾燥及び凍結から選ばれる少なくとも一種の加工処理を行ったものであってもよい。また、前記ペプチドが変性しない程度に加熱処理を行っても構わない。さらに、前記ワクチン資材及び有効成分としては、前記植物個体又はその器官や組織から前記免疫原性を有するペプチド、又は生理活性ペプチド若しくはその前駆体を公知の方法により抽出又は精製することにより得ることも可能である。これら第一及び第二の薬剤は、前記ワクチン資材又は有効成分をそのままの状態で経口摂取するように構成されていてもよく、或いは公知の医薬品素材と組合せることにより散剤、錠剤、カプセル剤等の所定形状に加工されていてもよい。
【００３１】
実施形態の飲食品は、前記植物個体又はその器官や組織から得られる免疫原性を有するペプチド、又は生理活性ペプチド若しくはその前駆体を含有している。なお、この飲食品中には、上記組換えプラスミドやキメラウイルスのゲノム等の核酸が含まれていても構わないが、含まれていないのが好ましい。この飲食品は、前記免疫原性を有するペプチドを含有している場合には上記感染症や食中毒の予防に有効であり、前記生理活性ペプチド又はその前駆体を含有している場合には所定の生理活性を発揮する健康食品分野に利用され得る。これらの飲食品中に含有される成分（第２のペプチド）は、前記植物個体又はその器官や組織をそのまま用いてもよく、それらを破砕、粉砕、搾汁、乾燥及び凍結から選ばれる少なくとも一種の加工処理を行ったものであってもよく、或いはペプチドが変性しない程度に加熱処理を行ったものであっても構わない。また、公知の方法により抽出又は精製することにより得たものであっても構わない。この飲食品は、前記成分をそのままの状態で経口摂取するように構成されていてもよく、或いは公知の飲食品素材と組合せることにより飲料品（ジュース）や加工食品等の所定形状に加工されていてもよい。
【００３２】
前記の実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・  実施形態の第一の組換えプラスミドは、ＣｌＹＶＶのゲノムに由来する第１のポリヌクレオチドと、免疫原性を有するペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドとを備えているうえ、該第２のポリヌクレオチドがコードする第２のペプチドはＣｌＹＶＶが感染する植物細胞内で免疫原性を保持しつつ発現するように構成されている。このため、この第一の組換えプラスミドは、第２のポリヌクレオチドがコードする第２のペプチドを、その免疫原性を保持した状態で得ることが容易であることから、食べるワクチン及びその関連資材の製造に適している。
【００３３】
・  実施形態の第二の組換えプラスミドは、ＣｌＹＶＶのゲノムに由来する第１のポリヌクレオチドと、該第１のポリヌクレオチドに挿入された第２のポリヌクレオチドとを備えているうえ、該第２のポリヌクレオチドは生理活性ペプチド又はその前駆体をコードしている。このため、この第二の組換えプラスミドは、動物の消化器官を介して生理活性ペプチドを所定の組織に搬送するためのＤＤＳを構築するとともに、前記生理活性ペプチドによる薬理作用を発揮する経口薬の製造に適している。
【００３４】
・  第１のポリヌクレオチドがＣｌＹＶＶのゲノムに由来していることから、組換えプラスミドを世界中の多くの地域で常時栽培されているマメ科植物等に感染させることができる。このため、組換えプラスミドは、世界中の多くの地域で食べるワクチンや生理活性ペプチドを安価にかつ常時製造することが容易となる。さらに、ＣｌＹＶＶはひも状であるため、長大な外来遺伝子を挿入させることが容易である。また、取り扱い性が良好であるうえ発現蛋白質の量も多い。
【００３５】
・  第一及び第二の組換えプラスミドは、第１のポリヌクレオチドを備えていることから、天然のＣｌＹＶＶが持つ高い感染能力を有効に発揮し、植物に対する感染が極めて容易かつ迅速に進行する。このため、これらの組換えプラスミドは、植物ゲノムの改変を必須とする遺伝子組換え植物（ＧＭ植物）とは異なり、目的とするペプチドを得るまでの期間が大幅に短縮される。即ち、例えば形質転換にてＧＭ植物を作出して食べるワクチンを製造する際には、無菌状態でのカルス誘導や目的遺伝子が導入されたカルスのスクリーニング等の作業が極めて煩雑であるうえ、無菌培養植物への感染に数日、カルス誘導に数週間、ポット栽培及び大量栽培に数ヶ月といった極めて長い期間をかける必要があった。さらに、これらの組換えプラスミドでは、天然のＣｌＹＶＶが持つ高い増殖能力が有効に発揮されることから、第２のペプチドを極めて大量に得ることが可能である。特に、既に大きく成長している植物に対して組換えプラスミドを感染させることから、１週間程で十分な量のワクチン資材が得られることは、公衆衛生上極めて有用である。また、これらの組換えプラスミドは、極めて安価に食べるワクチンや生理活性ペプチドを提供できるという利点があるうえ、非遺伝子組換え植物が作出されるという利点もある。
【００３６】
・  本実施形態のキメラウイルスでは、第２のペプチドがＣｌＹＶＶの構造蛋白質等とは切り離された状態で得られるようになっている。一方、タバコモザイクウイルス等の他のウイルスでは、導入遺伝子の産物が構造蛋白質等と融合された状態で発現されるようになっており、腸管膜を通して動物の生体内に吸収される効率が格段に低い。従って、本実施形態のキメラウイルスでは、第２のペプチドの吸収効率を極めて効果的に高めることができて有用である。また、このＣｌＹＶＶのゲノムを利用して作製されたキメラウイルスでは、第２のポリヌクレオチドが欠失することなくプロジェニーウイルスに安定的に伝達されるとともに、繰り返し感染においても極めて安定的に遺伝情報が伝達されるようになっている。つまり、ＣｌＹＶＶのゲノムを利用して作製された本実施形態のキメラウイルスでは、欠失等の変異が引き起こされやすい領域が保存されるようになっていることから産業上極めて有用である。
【実施例１】
【００３７】
＜組換えプラスミドの調製＞
クローバー葉脈黄化ウイルス（ＣｌＹＶＶ）のゲノムに由来する第１のポリヌクレオチドとして、Ｍａｓｕｔａらの方法（図１（ａ）の論文参照）及びＷａｎｇらの方法（図１（ｂ）の論文参照）にてそれぞれｐＣｌＹＶＶ／Ｐ１及びｐＣｌＹＶＶ／ＣＰ／Ｗの２種類の感染性ｃＤＮＡプラスミドベクター（改良ベクター）を作製した。
【００３８】
ｐＣｌＹＶＶ／Ｐ１は、図２（ａ）に示されるｐＣｌＹＶＶにおいて、Ｐ１（first protein）とＨＣ−ｐｒｏ（helper component protease）との間に、Ｐ１認識ペプチド配列及びＮＩａ−ｐｒｏ認識ペプチド配列をコードするポリヌクレオチドが挿入されたものである。前記Ｐ１認識ペプチド（P1 recognition peptide）配列は配列番号６（配列番号７であってもよい）で表され、ＮＩａ−ｐｒｏ認識ペプチド（small nuclear inclusion protein-protease recognition peptide）配列は配列番号８（配列番号９であってもよい）で表される。一方、ｐＣｌＹＶＶ／ＣＰ／Ｗは、図２（ａ）に示されるｐＣｌＹＶＶにおいて、ＮＩｂ（large nuclear inclusion protein）とＣＰ（coat protein）との間に、配列番号１０（配列番号１１であってもよい）で表されるＮＩａ−ｐｒｏ認識ペプチド配列をコードするポリヌクレオチドが挿入されたものである。
【００３９】
次に、図１（ａ）に示すように、組換えプラスミドとしてのｐＣｌＹＶＶ−ＮＶ６６６を作製した。この組換えプラスミドは、ｐＣｌＹＶＶ／Ｐ１のＰ１とＨＣ−ｐｒｏとの間の制限酵素サイトを利用して、ノロウイルスのギフ株（Norwalk virus, genogroup 2 (G2), Hu/NV/Gifu9601/JP）ゲノムにおけるキャプシド遺伝子ＯＲＦ２の５’末端側の６６６ｂｐ（第２のポリヌクレオチド）を挿入することにより作製された。前記ノロウイルス（Norwalk virus）は、Caliciviridae科Norovirus属に属し、世界中で散発的又は流行性の胃腸炎を発症させる最大の原因ウイルスである。
【００４０】
この６６６ｂｐは以下のように作製した。まず、ノロウイルスのギフ株（Hu/NV/Gifu9601/JP）のゲノムの塩基配列を決定した（Accession number: AB045603）。このノロウイルスのギフ株のゲノムは、配列番号１で表される塩基配列からなり、３つのＯＲＦが存在している。ＯＲＦ１は配列番号１で表される配列の５〜５１０４番目からなる。ＯＲＦ２は、配列番号１で表される配列の５０８５〜６６９２番目からなり、５８ｋＤａのキャプシド蛋白質をコードしている。ＯＲＦ３は配列番号１で表される配列の６６９２〜７４７１番目からなる。
【００４１】
次に、ＰＣＲ法を用いて前記ゲノムの塩基配列からＯＲＦ２をコードするｃＤＮＡを得た後、該ｃＤＮＡをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen社製）に挿入することによって、図１（ａ）、（ｂ）に示されるＮＶ／ＯＲＦ２／ｃＤＮＡ／ｐＣＲ２．１（5.5kb）を作製した。最後に、ＮＶ／ＯＲＦ２／ｃＤＮＡ／ｐＣＲ２．１（5.5kb）に対し、配列番号２，３で表される一対のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって前記６６６ｂｐを得た。なお、配列番号２で表されるプライマーは、配列番号１で表される塩基配列（前記ゲノム）の５０８５〜５０９９番目に相当する配列と、ＫｐｎＩサイトに相当する６塩基の配列とを含んでいる。配列番号３で表されるプライマーは、配列番号１で表される塩基配列（前記ゲノム）の５７５０〜５７３６番目に結合する配列と、ＳｐｅＩサイトに相当する６塩基の配列とを含んでいる。
【００４２】
同様に、図１（ｂ）に示すように、組換えプラスミドとしてのｐＣｌＹＶＶ−ＮＶ１６０５を作製した。この組換えプラスミドは、ｐＣｌＹＶＶ／ＣＰ／ＷのＮＩｂとＣＰとの間の制限酵素サイトを利用して、ノロウイルスのギフ株の（Hu/NV/Gifu9601/JP）ゲノムにおけるキャプシド遺伝子ＯＲＦ２の１６０５ｂｐ（第２のポリヌクレオチド）を挿入することにより作製した。この１６０５ｂｐは、前記ＮＶ／ＯＲＦ２／ｃＤＮＡ／ｐＣＲ２．１（5.5kb）に対し、配列番号４，５で表される一対のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって得た。なお、配列番号４で表されるプライマーは、配列番号１で表される塩基配列（前記ゲノム）の５０８５〜５１００番目に相当する配列と、ＳｐｅＩサイトに相当する６塩基の配列とを含んでいる。配列番号５で表されるプライマーは、配列番号１で表される塩基配列（前記ゲノム）の６６８９〜６６７４番目に結合する配列と、ＳｐｅＩサイトに相当する６塩基の配列とを含んでいる。
【実施例２】
【００４３】
＜組換えプラスミドの感染性評価＞
ｐＣｌＹＶＶ−ＮＶ６６６及びｐＣｌＹＶＶ−ＮＶ１６０５のそれぞれを、２３〜２５℃のＰ２レベル閉鎖型栽培室内で栽培された１０日齢のソラマメの苗木の葉に接種した。具体的には、ＴＥ緩衝液（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0）に対し、１０-2〜１０-3μｇ／μｌの濃度となるように組換えプラスミド溶液を作製した後、研削剤を擦り付けることによって傷付けられたソラマメの葉に対し、前記組換えプラスミド溶液を振りかけて接種した後、通常の栽培を行いながら観察した。なお、コントロールとしては、前記組換えプラスミドの代わりに改良ベクター（ｐＣｌＹＶＶ／Ｐ１又はｐＣｌＹＶＶ／ＣＰ／Ｗ）を接種したものと、ＴＥ緩衝液のみ（組換えプラスミド及び改良ベクターを含まない）を接種したものとを用いた。感染性の評価は、ソラマメの葉に対し典型的な感染性モザイク病徴発症である局部壊疽斑を引き起こすか否かで評価した。また、各サンプルはそれぞれ１０枚ずつのソラマメの葉に対して接種した。
【００４４】
その結果、組換えプラスミド及び改良ベクターを接種したものはいずれも７〜９日後に局部壊疽斑が引き起こされたのに対し、コントロールとしてのＴＥ緩衝液のみを接種したものでは局部壊疽斑は引き起こされなかった。さらに、組換えプラスミド及び改良ベクターのいずれにおいても局部壊疽斑の症状における有意差は認められなかったことから、感染性について遺伝子挿入による影響はないものと考えられる。また、組換えプラスミド及び改良ベクターを接種したものはいずれも１ヶ月以内に野生型ウイルス感染で見られるのと同様な致死的な壊死が引き起こされた。
【００４５】
＜繰り返し感染における第２のポリヌクレオチドの安定性評価＞
前記組換えプラスミドを感染させたソラマメの葉の抽出液を回収し、ウイルスに感染していない別のソラマメの葉に接種した。この操作を複数回繰り返すとともに、市販の遺伝子抽出試薬（TRIZOL(Molecular Research Center製)、RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN製)等）を用いて各抽出液からトータルＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲにより第２のポリヌクレオチドの存在を確認した。プライマーは配列番号２〜５で表されるものを適宜用いた。その結果、両組換えプラスミドはいずれも、ソラマメの葉に対し少なくとも４回の接種までは第２のポリヌクレオチドの欠失が全く見られず、安定であったことが確認された。５回目以降の接種は行っておらず、結果は得られていない。また、両組換えプラスミドともに、ソラマメの個体が死滅するまでの約１ヶ月間は第２のポリヌクレオチドの欠失が全く見られず、安定であったことも確認された。
【実施例３】
【００４６】
＜ウエスタンブロッティング＞
前記組換えプラスミド及び改良ベクターを感染させたソラマメの葉を回収し、リン酸緩衝液中でホモゲナイズした後、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動した。続いて、ハイボンドＰポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Amersham Life Science社製）に転写した。次に、前記ＰＶＤＦ膜について、ノロウイルス（Hu/NV/Gifu9601/JP）に対するモノクローナル抗体ＭＡｂ−１Ｃ６又はＭＡｂ−１Ｇ２と、アルカリフォスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（ICN Pharm.Inc.社製）とを用いてウエスタンブロッティングを行った。
【００４７】
前記ＭＡｂ−１Ｃ６及びＭＡｂ−１Ｇ２は、Ｙｏｄａらの論文（Yoda,T., Y.Terano, Y.Suzuki, K.Yamazaki, I.Oishi, T.Kuzuguchi, H.Kawamoto, E.Utagawa, K.Takino, H.Oda and T.Shibata, 2001, Characterization of Norwalk virus GI specific monoclonal antibodies generated against Escherichia coli expressed capsid protein and the reactivity of two broadly reactive monoclonal antibodies generated against GII capsid towards GI recombinant fragments. BMC microbiology 1:24/1471-2180. [online.] http://www.biomedcentral.com.）にて作製したものを用いた。ＭＡｂ−１Ｃ６は、ノロウイルスのギフ株（Hu/NV/Gifu9601/JP）のキャプシド蛋白質のＮ末端側を認識するため、前記６６６ｂｐに相当するポリペプチド（ｐＣｌＹＶＶ−ＮＶ６６６がコードするポリペプチド）及び前記１６０５ｂｐに相当する蛋白質（ｐＣｌＹＶＶ−ＮＶ１６０５がコードする蛋白質）に結合する。ＭＡｂ−１Ｇ２は、ノロウイルスのギフ株（Hu/NV/Gifu9601/JP）のキャプシド蛋白質のＣ末端側を認識するため、前記１６０５ｂｐに相当する蛋白質（ｐＣｌＹＶＶ−ＮＶ１６０５がコードする蛋白質）のみに結合する。
【００４８】
その結果、ｐＣｌＹＶＶ−ＮＶ６６６を感染させたソラマメの葉では２５ｋＤａの蛋白質の発現がウエスタンブロッティングにより確認され、ｐＣｌＹＶＶ−ＮＶ１６０５を感染させたソラマメの葉では６２ｋＤａの蛋白質の発現がウエスタンブロッティングにより確認された。これに対し、プラスミドを感染させていないソラマメの葉及び改良ベクターを感染させたソラマメの葉では、第２のポリヌクレオチドがコードする蛋白質の発現は確認されなかった。
【００４９】
＜サンドイッチＥＬＩＳＡによるポリペプチド発現量の定量＞
前記組換えプラスミド及びコントロールとしての改良ベクターを感染させてから２，４，６，９，１２日後のソラマメの葉を回収し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液にてホモゲナイズした後、前記ＭＡｂ−１Ｃ６及びＭＡｂ−１Ｇ２を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。このとき、図３に示すように、ＮＶ／ＯＲＦ２／ｃＤＮＡ／ｐＣＲ２．１（5.5kb）からＮｄｅＩ及びＸｈｏＩにて切り出したＤＮＡ断片（NV-ORF2）をｐＥＴ２０ｂにクローニングした後、大腸菌蛋白質発現系にて発現させた６２ｋＤａリコンビナントキャプシド蛋白質を用いて蛋白質発現量の定量を行った。なお、前記リコンビナントキャプシド蛋白質は、ＭＡｂ−１Ｃ６及びＭＡｂ−１Ｇ２によって認識されることが予備試験により確認されている。結果を図４に示す。
【００５０】
図４より、ｐＣｌＹＶＶ−ＮＶ６６６を感染させたソラマメの葉では、感染させてから２，４，６，９，１２日後の葉の組織１ｇ当たりそれぞれ９４．０，１０４．９，１１５．０，１２０．０，１００．７μｇの蛋白質が発現していたことが確認された。ｐＣｌＹＶＶ−ＮＶ１６０５を感染させたソラマメの葉では、感染させてから２，４，６，９，１２日後の葉の組織１ｇ当たりそれぞれ１１２．８，１２５．５，１４０．６，１６０．０，１１３．６μｇの蛋白質が発現していたことが確認された。いずれの組換えプラスミドにおいても、収量は非常に多いことが確認された。
【００５１】
＜プロテアーゼ耐性試験＞
前記リコンビナントキャプシド蛋白質をソラマメの葉の抽出液で３７℃、２時間処理した後、前記＜ウエスタンブロッティング＞と同様にウエスタンブロッティングを行った。前記抽出液としては、組換えプラスミドを感染させたソラマメの葉、又は感染させていないソラマメの葉から得たものを用いた。また、組換えプラスミドを感染させたソラマメの葉を回収し、リン酸緩衝液中でホモゲナイズした後、１μｇのトリプシン又はペプシンを添加して３７℃、１時間処理した後、前記＜ウエスタンブロッティング＞と同様にウエスタンブロッティングを行った。その結果、大腸菌発現リコンビナントキャプシド蛋白質は、組換えプラスミド及び改良ベクターの感染の有無に関わらず、ソラマメの葉の抽出液に含まれるプロテアーゼ作用によって分解されていたことが確認された。また、組換えプラスミドを感染させたソラマメから得られた２５ｋＤａのポリペプチドは、ソラマメの葉の抽出液に含まれるプロテアーゼ作用によって分解されず、トリプシンによって分解されたことが確認され、６２ｋＤａのポリペプチドはソラマメの葉の抽出液に含まれるプロテアーゼ、トリプシン及びペプシンによっても分解されなかった。
【００５２】
なお、本実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
・  第一の組換えプラスミドが接種された植物を経口摂取した動物、又はその動物から採取した血清やミルク等を、別の動物に対するワクチン資材や受動免疫資材として利用してもよい。
【００５３】
・  ワクチン資材をガンの予防や治療に用いてもよい。このとき、第２のポリヌクレオチドは、腫瘍抗原ペプチドをコードするように構成される。このように構成した場合、ガン細胞に対する特異的な免疫応答を引き起こさせてガンの免疫治療を行うことができるとともに、免疫記憶を形成させることによりガンの予防に役立てることができる。また、ワクチン資材をアレルギー性疾患の予防や治療に用いてもよい。このとき、第２のポリヌクレオチドは、乳酸菌等の細菌の蛋白質又はその一部をコードしているものを融合させるとよい。
【００５４】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・  請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の組換えプラスミドを植物に感染させることにより生成されることを特徴とするキメラウイルス。このように構成した場合、免疫原性を有するペプチド、又は生理活性ペプチド若しくはその前駆体を大量かつ迅速に得ることが容易である。
【００５５】
・  請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の組換えプラスミド又は請求項４に記載のキメラウイルスが感染していることを特徴とする植物体。このように構成した場合、免疫原性を有するペプチド、又は生理活性ペプチド若しくはその前駆体が大量かつ迅速に得られる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】（ａ）及び（ｂ）はいずれも、実施例１の組換えプラスミドｐＣｌＹＶＶ−ＮＶ６６６及びｐＣｌＹＶＶ−ＮＶ１６０５の作製方法を模式的に示す。
【図２】（ａ）は実施形態のＣｌＹＶＶのゲノムの構造を模式的に示す、（ｂ）は実施形態の植物内におけるポティウイルスの増殖様式を模式的に示す。
【図３】実施例３のリコンビナントキャプシド蛋白質を発現させるための方法を模式的に示す。
【図４】実施例３の組換えプラスミドをソラマメの葉に感染させたときの蛋白質発現量の定量結果を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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