(57)【要約】【課題】生体リズム障害を的確に、且つ、簡便に評価する技術を提供すること、および、生体リズム障害患者の障害の診断ならびに治療方針を定めるための診断基準を提供すること。【解決手段】時計遺伝子ｈＰｅｒ２の発現量の時間的変化を指標とする、生体リズム障害の度合の判断方法。【選択図】なし。 【特許請求の範囲】
【請求項１】
時計遺伝子ｈＰｅｒ２の発現量の時間的変化を指標とする、生体リズム障害の度合の判断方法。
【請求項２】
ヒト時計遺伝子が、ヒトの体液から採取したものであることを特徴とする請求項１に記載の生体リズム障害の度合の判断方法。
【請求項３】
体液が、血液であることを特徴とする、請求項２に記載の生体リズム障害の度合の判断方法。
【請求項４】
遺伝子が、ｍＲＮＡであることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載の生体リズム障害の度合の判断方法。
【請求項５】
時計遺伝子の発現量の時間的変化が、午前４〜１０時を最高部、午後２〜８時を最低部とした、滑らかな曲線を形成していることを正常とし、それからの解離の度合で障害の度合を判断することを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載の生体リズム障害の度合の判断方法。
【請求項６】
生体リズム障害が、睡眠障害、不登校、うつ状態、及び慢性疲労からなる群から選択される１つ以上の症状であることを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載の生体リズム障害の度合の判断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体リズム障害の度合の判断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球上に生息する多くの生物は、地球の自転により創出される環境変化に適応するため、体内に２４時間周期で時を刻む生体時計を発達、保持してきた。このため生体には生物時計に支配されている内因性の生体リズムが多く存在する。これらは概日リズム（サーカディアンリズム）と呼ばれている。恒常環境下で現れる周期をフリ−ラン周期と呼び、ヒトではほぼ２５時間である。
【０００３】
最近、この生体リズムの不調による睡眠障害の患者が増加している。このような患者は、睡眠障害国際分類では、概日リズム睡眠障害（Circadian Rhythm Sleep Disorders：CRSD）として明記されている。この概日リズム障害は、夜勤や時差地域への急速な移動など、内因性生体リズムに逆らったスケジュールで生活することによって生じる睡眠障害と、内因性生体リズム自体の変調により睡眠・覚醒スケジュールが望ましい時間帯から慢性的にずれてしまう睡眠障害とに分けられる。後者の内因性生体リズム自体の変調による睡眠障害のうち、睡眠相後退症候群（ＤＳＰＳ）と、非２４時間睡眠・覚醒症候群（Ｎｏｎ−２４）は、特に社会的にも問題になっている。
【０００４】
生体リズムを検査する方法に関する文献としては、次のような文献がある。
【特許文献１】特開平６−２１７９４６号公報
【特許文献２】特開２０００−１６６８７７号公報
【非特許文献１】Ebisawa他,Alleicvariants of human melatonin 1a receptor:function and prevalence in subjectswith circadian rhythm sleep disorders,Biochem Biophys Res Commun,262,:832-837(1999)
【非特許文献２】岡村均、増渕悟、市川直征、山口瞬、時計遺伝子のフードバックループ、神経研究の進歩、４５：755-762（2001）
【非特許文献３】Bjamason他、Circadianexpression of clock genes in human oral mucosa and skin: association withspecific cell-cycle phases,AmJPathol,158:1793-1801(2001)
【０００５】
学習、記憶、認知、意欲の機能低下を伴う小児型慢性疲労症候群としての不登校状態にある学生・生徒は上記ＤＳＰＳかＮｏｎ−２４に起因すると考えられている。
【０００６】
このような生体リズム障害の研究は、病態の解明のみならず治療の開発に至るまで精力的に研究が進められている。しかし、今なおその本態は充分に解明されておらず、治療法も試行錯誤を重ねている。また、診断方法も開発段階であり、未だ確立されたものではない。
【０００７】
特許文献１には、心電計測データから生体リズムを測定する方法が開示されている。特許文献２には、繰り返しリズム運動の筋肉の動きを計測することにより生体リズムを検査する方法が開示されている。非特許文献１には、メラトニンが生体リズムに関与していることが記載されている。また、血中コルチゾールの発現量が生体リズムの指標になりうることが報告されている。しかしながら、本発明者らの検討によれば、コルチゾール発現量は、生体リズムの一応の指標とはなるものの、これにより生体リズムの異常を明確に判断することは困難であった。
【０００８】
非特許文献２には、サーカディアンリズムが時計遺伝子と呼ばれる一連の遺伝子群により駆動される、その時計発振機構について開示されている。しかし、時計遺伝子の発現と生体リズム疾患との関連については言及されていない。
【０００９】
非特許文献３には、健常者の皮膚と口腔粘膜で、時計遺伝子ｈPer１、ｈBmall及びｈCry1においてサーカディアンリズムの発現が認められたことが報告されている。しかし、これらの時計遺伝子の発現が生体リズム障害の定量の指標になることは全く知られていなかった。更に、体液、特に血液での挙動については、ヒトにおいてなんら調べられていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、この様な状況下行われたものであり、生体リズム障害を的確に、且つ、簡便に評価する技術を提供することを目的としている。本発明の他の目的は、生体リズム障害患者の障害の診断ならびに治療方針を定めるための診断基準を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち、本発明は、時計遺伝子ｈＰｅｒ２の発現量の時間的変化を指標とする、リズム障害の度合の判断方法である。
【００１２】
ヒト時計遺伝子は、ヒトの体液から採取したものであることが好ましい。
【００１３】
体液は、血液であることが好ましい。
【００１４】
遺伝子は、ｍＲＮＡであることが好ましい。
【００１５】
時計遺伝子として考えられているｈＰｅｒ２遺伝子の発現量の時間的変化が、午前４〜１０時を最高部、午後２〜８時を最低部とした、滑らかな曲線を形成していることを正常とし、それからの解離の度合で障害の度合を判断することが好ましい。
【００１６】
本発明では、リズム障害は、睡眠障害、不登校、うつ状態、及び慢性疲労からなる群から選択される１つ以上の症状を特に対象とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、他の生体リズムを表示しうる指標に比べて、生体リズム障害をより的確に、且つ、簡便に評価することができる。また本発明の評価方法によれば、生体リズム障害患者の治癒度合いを明確に判断することができる。この程度の障害の程度は既存の診断基準である、血圧、体温、生体内ホルモン類であるメラトニン、コルチゾールなどの評価では診断することは不可能であるが、本発明の時計遺伝子のモニタリングにより正確に生体リズム障害の程度を診断することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明について、実施の形態を中心に詳細に説明する。
本発明の生体リズム障害の度合いを判断する方法は、好ましくは、体液における、時計遺伝子ｈＰｅｒ２の発現量を指標とする事を特徴とする。
【００１９】
時計遺伝子とは、ヒトでは、生体リズムを調節する役割を担う遺伝子であり、これまでにｈＰｅｒ１、ｈＰｅｒ２、ｈＰｅｒ３、ｈＢｍａｌｌ，ｈＣｒｙ１、ｈＣｒｙ２、ｈＤｅｃ１、およびｈＤｅｃ２等が知られている。マウスにおいてもこれらの遺伝子は、類似の塩基配列をもつ。
【００２０】
ヒトにおける時計遺伝子ｈＰｅｒ２は、その塩基配列表がジーンバンクにＮｏ（NM_022817）として登録されている。時計振動体遺伝子であるｈＰｅｒ２は自身のコードするタンパクがネガティブ因子となり自分の転写を制御する。振動周期はネガティブ因子の産生から抑制までの過程で生じる時間的なずれの大きさによって決定される。また一方で、ネガティブ因子の転写を促進するポジティブ因子（Ｂmal１とｃｌｏｃｋのヘテロダイマー）が存在し、翻訳されたネガティブ因子が周期的にポジティブ因子に抑制をかけることによって継続する振動が成り立っている。
【００２１】
本発明の生体リズム障害の度合の判断方法では、時計遺伝子を細胞組織または体液から採取する。これらのうちでは、採取の容易な体液から採取するのが好ましい。体液としては、全血液、血漿液、血清液、リンパ液、脳髄液、精液、唾又は乳液等を挙げることができる。これらの体液のうちでは、全血液が、ｍＲＮＡの採取が容易なため好ましい。
【００２２】
体液、とりわけ血液から時計遺伝子ｈＰｅｒ２を採取、定量するには、まず血液からｍＲＮＡを採取する。血液からのｍＲＮＡの分離は、通常検討される種々の手法により行えばよい。例えば、下記の実施例で示した全ＲＮＡキット等を用いて採取することができる。
【００２３】
次いで、採取した全ＲＮＡに対してＤＮＡの混入を防ぐために、ＤＮaseによりＤＮＡを分解し、時計遺伝子の部分のｍＲＮＡのみを採取・精製する。この採取・精製は、市販されているＲＮＡ抽出キット等を用いて行なうことができる。
【００２４】
上記方法で精製した時計遺伝子のｍＲＮＡに逆転写酵素を用いて、ｃＤＮＡを作成する。この方法も公知の方法であり、試薬会社などより逆転写酵素も容易に入手することができる。
【００２５】
上記方法で採取した時計遺伝子のｃＤＮＡは、次いで、ＰＣＲ反応によりクロ−ニングする。ＰＣＲ反応法自体も公知の方法であり、ｃＤＮＡを鋳型とし、プライマーを用いて複製することによりｃＤＮＡを増殖させる。ＰＣＲは通常、高温、例えば９５℃−１５秒の条件下でＤＮＡを一本鎖とし、次いで低温、例えば６０℃で１分間反応させることによりＤＮＡ鎖が複製される。このサイクルを通常５０回程度繰り返してＤＮＡを増殖させる。  
【００２６】
ＰＣＲ法によりクローニングされた時計遺伝子ｈＰｅｒ２の定量は、例えば、内部標準としてβ―アクチンを使用し、検量線法により各遺伝子の発現量を算出し、内部標準と対比することにより求めることができる。データはコサイナー解析ソフト（コサイナー社）を用いて、２４時間単一周期のシングル  コサイナー法により、リズム解析を行ない、振幅（amplitude）、頂点位相（acrophase）を求めてもよい。また、図式的に最高濃度と最低濃度を評価するものでも良い。
【００２７】
時計遺伝子ｈＰｅｒ２の発現量は、生体リズムが正常の場合は、実施例の図１のように、発現量の時間的変化が、午前４〜１０時を最高部、午後２〜８時を最低部とした、滑らかな曲線を形成している。すなわち、その曲線は約２４時間周期のサインカーブを示すものである。
【００２８】
生体リズムに障害の有無を判断する場合、時計遺伝子の発現量の曲線の周期が２４時間から外れる場合、最高部と最低部を示す時間が外れる場合、高低が認められない場合は、正常でなく生体リズム障害を持つと考えて良い。更に、何らかの治療を施しても時計遺伝子ｈＰｅｒ２の発現量の曲線が、上記正常時の曲線を外れる傾向を示す場合、生体リズム障害は完全には治癒されていないと考えられる。このように正常曲線からの解離の度合で障害の度合を判断することができる。
【実施例１】
【００２９】
以下に、実施例を挙げて本発明について更に詳細に説明するが、本発明がこれら実施例になんら限定されるものではない。なお、測定は次の方法で行なった。
【００３０】
（メラトニン濃度の測定）
血中メラトニン濃度は、ＲＩＡ２抗体法により測定した。
（コルチゾール濃度の測定）
血中コルチゾール濃度は、公知の測定方法であるＲＩＡ固相法により測定した。
【００３１】
被験者から４時間おきに採取した静脈血２．５ｍｌを、PAXgene ブラッド ＲＮＡ チューブ(Qiagen社)に保存した。
【００３２】
PAXgene ブラッドＲＮＡキット(Qiagen社)を用いて、プロトコルに従い、総血液から総ＲＮＡを精製した。この際、総ＲＮＡはＲＮase-フリーＤＮaseセット(Qiagen社)を用いて、ＤＮase処理を行なった。
【００３３】
精製した総ＲＮＡから、レーバー トラ エース-α-（東洋紡社製）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを作成した。逆転写反応は、２４μｌ総ＲＮＡ、２μｌランダムプライマー、８μｌ５ｘ室温緩衝液、２μｌｄＮＴＰ混合物、および２μｌレーバートラエースを含む全量４０μｌを反応液とし、２５℃−１０分、４２℃−５０分、９５℃―５分で行なった。
【００３４】
作成したｃＤＮＡを鋳型として、標的遺伝子特異的なプライマー（インビトロゲン社製）と、タクマンプローブ(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて、ABIPRISM7700シーケンスディテクター(アプライドバイオシステムズ社製)により、リアルタイムＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応は、１μｌｃＤＮＡ、１μＭＰＣＲプライマー、１μＭタクマンプローブ(アプライドバイオシステムズ社製)および１２．５μｌタクマンユニバーサルマスターミックス(アプライドバイオシステムズ社製)を含む、全量２５μｌで行なった。ＰＣＲ条件は、５０℃−２分、９５℃−１０分でインキュベート後、９５℃−１５秒、６０℃−１分の反応を５０サイクル行なった。プライマーおよびプローブ設計は標的遺伝子の配列から設定した。その配列を表１に示す。内部標準としてヒトβ−アクチンを使用した。遺伝子の発現量は、検量線法により各遺伝子の発現量を算出し、内部標準に対する相対比を求めた。なお、今回示したプライマーの配列はここで提示したものに限定されるものでない。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
データはコサイナー解析ソフト（コサイナー社）を用いて、２４時間単一周期のシングル  コサイナー法により、リズム解析を行ない、振幅（amplitude）、頂点位相（acrophase）を求めた。
【実施例２】
【００３７】
（症例）
患者：１６歳  女性
診断名：非２４時間睡眠・覚醒症候群（ｎｏｎ−２４）
病歴：小学校５年生頃から朝起きができなくなり、週２〜３回は学校を休んだ。中学校１年生の夏休みに昼夜が完全に逆転した。日中の眠気、全身倦怠感、頭痛、胃痛およびうつ状態がひどくなった。
【００３８】
（治療）
入院し、起床後光を照射する光照射と、メラトニン、メチルＢ１２を１日３回食後に内服する時間治療を行なった。さらに、運動療法とフルボキサミンの投与も行なった。退院後も投与は継続して行った。
【００３９】
（治療結果）
治療の開始により睡眠相が前進し、その後も入院中は２４時間周期の睡眠・覚醒リズムを維持できた。しかし、退院後は投薬を継続したにもかかわらず、睡眠相が後退し、再びｎｏｎ−２４の睡眠・覚醒パターンに戻った。入院前後の睡眠時間帯を図２に示す。
【００４０】
（評価）
実施例２において、患者の血液を４時間毎に採取し、血液中のｈＰｅｒ２の量を定量した。治療前と治療後のｈＰｅｒ２の発現量を図３に示す。
【００４１】
（比較例１）
実施例２において、評価手段として、ｈＰｅｒ１に着目する以外は実施例２と同様に行なった。結果を図４に示す。
【００４２】
（比較例２）
実施例２において、評価手段として、ｈＰｅｒ３に着目する以外は実施例２と同様に行なった。結果を図５に示す。
【００４３】
（比較例３）
実施例２において、評価手段として、ｈＣｌｏｃｋに着目する以外は実施例２と同様に行なった。結果を図６に示す。
【００４４】
（比較例４）
実施例２において、評価手段として、ｈＢｍａｌ１に着目する以外は実施例２と同様に行なった。結果を図７に示す。
【００４５】
（比較例５）
実施例２において、評価手段として、メラトニンに着目する以外は実施例２と同様に行なった。結果を図８に示す。
【００４６】
（比較例６）
実施例２において、評価手段として、コルチゾールに着目する以外は実施例２と同様に行なった。結果を図９に示す。
【００４７】
ｈＰｅｒ２の発現パターンを治療開始時と入院治療後において比較したが、共に健常人パターンに類似したものでなく、前に述べたように、明らかにパターンが異なっていた。なお、既存の検査項目である、メラトニン、コルチゾールの治療後の値は健常人に類似しており、生体リズム障害を検出するには至っていない。
【実施例３】
【００４８】
（症例）
患者：１５歳  女性
診断名：睡眠相後退症候群（ＤＳＰＳ）
病歴：中学校２年生のときいじめを受け不登校状態になり、徐々に昼夜逆転状態になった。
【００４９】
（治療）
入院し、起床後光を照射する光照射と、メラトニン、メチルＢ１２を１日３回食後に内服する時間治療を行なった。さらに、運動療法パロキセチンの投与も行なった。退院後は投与は行なわなかった。入院前後の睡眠時間帯を図１０に示す。
【００５０】
（治療結果）
治療の開始により睡眠相が前進し、本人が望む睡眠・覚醒パターンに改善できた。退院後もそのリズムを維持できた。
【００５１】
（評価）
実施例２と同様に、患者の血液を４時間毎に採取し、血液中のｈＰｅｒ２の量を定量した。治療前と治療後のｈＰｅｒ２の発現量を図１１に示す。
【００５２】
（比較例７）
実施例３において、評価手段として、ｈＰｅｒ１に着目する以外は実施例３と同様に行なった。結果を図１２に示す。
【００５３】
（比較例８）
実施例３において、評価手段として、ｈＰｅｒ３に着目する以外は実施例３と同様に行なった。結果を図１３に示す。
【００５４】
（比較例９）
実施例３において、評価手段として、ｈＣｌｏｃｋに着目する以外は実施例３と同様に行なった。結果を図１４に示す。
【００５５】
（比較例１０）
実施例３において、評価手段として、ｈＢｍａｌ１に着目する以外は実施例３と同様に行なった。結果を図１５に示す。
【００５６】
（比較例１１）
実施例３において、評価手段として、メラトニンに着目する以外は実施例３と同様に行なった。結果を図１６に示す。
【００５７】
（比較例１２）
実施例３において、評価手段として、コルチゾールに着目する以外は実施例３と同様に行なった。結果を図１７に示す。
【００５８】
以上の実施例で示したように、ｈＰｅｒ２の発現パターンを治療開始時と入院治療後において比較した結果、治療前に異常であったｈＰｅｒ２の発現パターンが、治療により健常人パターンに類似したものとなった。一方、既存の検査項目である、メラトニン、コルチゾールの値は、治療前であっても健常人に類似しており、生体リズム障害を検出するには至っていない。また、治療後においても健常人とほぼ同様であり、変化は認められていない。すなわち、既存の診断方法では、健常人と区別ができない生体リズム障害は時計遺伝子のパターンの検出により診断が可能であり、治療効果の変化を評価できる診断方法であることが示された。このことから、時計遺伝子のパターン検出は生体リズム障害患者の診断において有用であり、治療計画作成に十分な情報を与えるものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
生体リズム診断において既存の方法と組み合わせることで更に正確なリズム診断が可能となるため、生体リズム障害が原因と考えられる疾患に対して有用な診断方法を提供するものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、健常人のｈＰｅｒ２遺伝子の量の経時変化を示したグラフである。
【図２】図２は、実施例２における患者の睡眠時間帯の変化を示したグラフである。
【図３】図３は、実施例２におけるｈＰｅｒ２遺伝子の量の経時変化を示したグラフである。
【図４】図４は、比較例１におけるｈＰｅｒ１遺伝子の量の経時変化を示したグラフである。
【図５】図５は、比較例２におけるｈＰｅｒ３遺伝子の量の経時変化を        示したグラフである。
【図６】図６は、比較例３におけるｈＣｌｏｃｋ遺伝子の量の経時変化を示したグラフである。
【図７】図７は、比較例４におけるｈＢｍａｌｌ遺伝子の量の経時変化を示したグラフである。
【図８】図８は、比較例５におけるメラトニンの量の経時変化を示したグラフである。
【図９】図９は、比較例６におけるコルチゾールの量の経時変化を示したグラフである。
【図１０】図１０は、実施例３における患者の睡眠時間帯の変化を示したグラフである。
【図１１】図１１は、実施例３におけるｈＰｅｒ２遺伝子の量の経時変化を示したグラフである。
【図１２】図１２は、比較例７におけるｈＰｅｒ１遺伝子の量の経時変化を示したグラフである。
【図１３】図１３は、比較例８におけるｈＰｅｒ３遺伝子の量の経時変化を示したグラフである。
【図１４】図１４は、比較例９におけるｈＣｌｏｃｋ遺伝子の量の経時変化を示したグラフである。
【図１５】図１５は、比較例１０におけるｈＢｍａｌｌ遺伝子の量の経時変化を示したグラフである。
【図１６】図１６は、比較例１１におけるメラトニンの量の経時変化を示したグラフである。
【図１７】図１７は、比較例１２におけるコルチゾールの量の経時変化を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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