(57)【要約】【課題】  淋菌（N.gonorrhoeae）を迅速、特異的かつ高感度に検出する一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーとその使用方法を提供すること。【解決手段】  淋菌（N.gonorrhoeae）のＯＲＦ1遺伝子配列中の淋菌特異的な配列に対するオリゴヌクレオチドを設計し、このオリゴヌクレオチドをＬＡＭＰ反応プライマーとしてＬＡＭＰ反応を行う。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２９の塩基配列を５’側に、配列番号３０の塩基配列を３’側に有し、全長が３２から４８塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号３１の塩基配列を５’側に、配列番号３２の塩基配列を３’側に有し、全長が３２から４８塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号３３の塩基配列を５’側に、配列番号３４の塩基配列を３’側に有し、全長が３１から４７塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号３５の塩基配列を５’側に、配列番号３６の塩基配列を３’側に有し、全長が３１から４７塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１から９の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１４から２８の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして請求項１から４の何れかに記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅する方法。
【請求項８】
ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして請求項５記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅する方法。
【請求項９】
ＬＡＭＰ法におけるアウタープライマーとして配列番号１０から１３に記載の塩基配列を有する少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを用いる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅する方法。
【請求項１０】
ＬＡＭＰ法におけるループプライマーとして請求項６記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅する方法。
【請求項１１】
試料中の淋菌を検出するために行う、請求項７から１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
配列番号１または２の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号４または５の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅するためのインナープライマーとして使用するプライマーセット。
【請求項１３】
配列番号３に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号６から９の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅するためのインナープライマーとして使用するプライマーセット。
【請求項１４】
配列番号１０に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１２に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅するためのアウタープライマーとして使用するプライマーセット。
【請求項１５】
配列番号１１に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１３に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅するためのアウタープライマーとして使用するプライマーセット。
【請求項１６】
配列番号１４から１６の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２１から２３の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅するためのループプライマーとして使用するプライマーセット。
【請求項１７】
配列番号１７から２０の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２４から２８の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅するためのループプライマーとして使用するプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療・診断分野において淋菌の核酸を検出・同定するためのオリゴヌクレオチド、及び該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＬＡＭＰ法による淋菌の核酸を検出・同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）が原因とされる淋菌感染症は、日本国内おいても一般的に報告されるＳＴＤ（Ｓｅｘｕａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）のひとつである。「性感染症／ＨＩＶ感染  その現状と検査・診断・治療（財団法人性の健康医学財団）」にその詳細が記載されている。
【０００３】
淋菌の検査方法は、病原体を検出するグラム染色法や分離培養法、抗原を検出する酵素抗体法（ＥＩＡ法）、淋菌の遺伝子を増幅させて検出するＤＮＡプローブ法、Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:18 9-193）、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法（Science 230:1350 (1985)）などがある。特に遺伝子を増幅させて検出する方法は、検出感度に優れ、比較的単時間検査できることが特徴である。
【０００４】
特開平１０−８４９８２号公報には淋菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子特異的ヌクレオチド配列のプローブ、及び、プライマーを使った淋菌の検出方法が開示されている。また、日本特許第２５６１０５３号公報には、淋菌のシトシンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）遺伝子中の特異的配列をもって淋菌を検出する方法を報告している。特開平１１−１８７８５号公報においても淋菌のＮｇ−ＣＤＭＴ遺伝子（ＣＭＴと同一遺伝子）とハイブリダイズするプライマーにて、淋菌とナイセリア・サブフラバ又はナイセリア・シネレアとを判別するより淋菌に特異性の高いプライマーを使って淋菌検出する方法を示している。また、特表平１０−５００３１０号公報には淋菌またはトラコーマ・クラミジアの１６Ｓもしくは２３Ｓ  ｒＲＮＡまたは前記ｒＲＮＡをコードする領域からのＤＮＡにハイブリダイズし得るペプチド核酸(PNA)プローブについて報告している。
【０００５】
新しい核酸の増幅および検出方法として、Loop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP)法が、Ｎｏｔｏｍｉらによって開発され、日本特許第３３１３３５８号公報、Nucleic Acids Research, 28, e63, 2000、Biochemical and Biophysical Research Communications, 290, 1195-1198, 2002、Clinical Chemistry, 47, No.9, 1742-1743,2001に報告されている。これは通常、１対のインナープライマーと１対のアウタープライマーを併せた２対計４種のプライマー、あるいは、これに１対のループプライマーを加えた３対計６種のプライマーと、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとを使って通常１０分〜６０分程度で鋳型となる核酸を増幅する方法である。ＬＡＭＰ反応の検出は、ＬＡＭＰ増幅産物をアガロースゲル電気泳動にかけてＬＡＭＰ反応に特徴的なラダーのバンドを確認する方法や、ＬＡＭＰ反応産物にエチジウムブロマイドやＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ等の核酸インターカレーターを添加して検出する方法がある。また、ＬＡＭＰ反応時の生成物であるピロリン酸と反応バッファー中のマグネシウムイオンにて生じる沈殿物を検出する方法が国際公開ＷＯ０１／８３８１７号公報、およびBiochemical and Biophysical Research Communications, 289, 150-154, 2002に示されている。
【０００６】
ＬＡＭＰ法の検出感度は、一般的にＰＣＲとほぼ同等か、より優れているとされている。これはターゲットなる核酸配列の６領域を標的とするオリゴヌクレオチドプライマーを使用するため、非特異な増幅を防ぐことができるからである。また、最も大きな特徴のひとつは、増幅反応が一定温度で進み、かつ短時間でその反応を検出することが出来る点である。つまり反応温度を２なし３温度で変化させるためのサーマルサイクラーを必要としないことである。
【０００７】
【特許文献１】特開平１０−８４９８２号公報
【特許文献２】日本特許第２５６１０５３号公報
【特許文献３】特開平１１−１８７８５号公報
【特許文献４】特表平１０−５００３１０号公報
【特許文献５】日本特許第３３１３３５８号公報
【特許文献６】国際公開ＷＯ０１／８３８１７号公報
【非特許文献１】財団法人性の健康医学財団編集「性感染症／ＨＩＶ感染  その現状と検査・診断・治療」株式会社メジカルビュー社、２００１年３月２０日
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:18 9-193
【非特許文献３】Science 230:1350 (1985)
【非特許文献４】Nucleic Acids Research, 28, e63, 2000
【非特許文献５】Biochemical and Biophysical Research Communications, 290, 1195-1198, 2002
【非特許文献６】Clinical Chemistry, 47, No.9, 1742-1743, 2001
【非特許文献７】Biochemical and Biophysical Research Communications, 289, 150-154, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、高い検出感度、高い特異性、短時間での増幅・検出、を満たす淋菌検出用ＬＡＭＰ反応用のプライマー、およびそれを用いたＬＡＭＰ法による淋菌を迅速に検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく種々検討した結果、迅速・特異的・高感度に淋菌を検出するためのＬＡＭＰ反応用のオリゴヌクレオチドプライマーと、それを用いたＬＡＭＰ法による淋菌を特異的に検出する方法の開発に成功し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１）  配列番号２９の塩基配列を５’側に、配列番号３０の塩基配列を３’側に有し、全長が３２から４８塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド。
（２）  配列番号３１の塩基配列を５’側に、配列番号３２の塩基配列を３’側に有し、全長が３２から４８塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド。
（３）  配列番号３３の塩基配列を５’側に、配列番号３４の塩基配列を３’側に有し、全長が３１から４７塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド。
（４）  配列番号３５の塩基配列を５’側に、配列番号３６の塩基配列を３’側に有し、全長が３１から４７塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド。
【００１１】
（５）  配列番号１から９の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
（６）  配列番号１４から２８の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【００１２】
（７）  ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして（１）から（４）の何れかに記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅する方法。
（８）  ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして（５）記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅する方法。
【００１３】
（９）  ＬＡＭＰ法におけるアウタープライマーとして配列番号１０から１３に記載の塩基配列を有する少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを用いる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅する方法。
（１０）  ＬＡＭＰ法におけるループプライマーとして（６）記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅する方法。
（１１）  試料中の淋菌を検出するために行う、（７）から（１０）の何れかに記載の方法。
【００１４】
（１２）  配列番号１または２の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号４または５の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅するためのインナープライマーとして使用するプライマーセット。
（１３）  配列番号３に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号６から９の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅するためのインナープライマーとして使用するプライマーセット。
【００１５】
（１４）  配列番号１０に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１２に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅するためのアウタープライマーとして使用するプライマーセット。
（１５）  配列番号１１に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１３に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅するためのアウタープライマーとして使用するプライマーセット。
【００１６】
（１６）  配列番号１４から１６の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２１から２３の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅するためのループプライマーとして使用するプライマーセット。
（１７）  配列番号１７から２０の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２４から２８の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて淋菌の核酸を増幅するためのループプライマーとして使用するプライマーセット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、医療・診断分野において、従来の淋菌検査方法と比較して、より迅速・より簡便・より高感度な方法として利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について更に詳しく述べる。
本明細書中において、核酸の塩基配列中のＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃは、デオキシリボヌクレオチド中のアデニン塩基、グアニン塩基、チミン塩基、シトシン塩基を示す。
【００１９】
ＬＡＭＰ反応に用いるインナープライマーとはＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーとを示す。ＦＩＰプライマーは、５’側にターゲット核酸配列の表鎖に相同的なＦ１ｃと呼ばれる配列、３’側にターゲット核酸配列の裏鎖に相補的なＦ２と呼ばれる配列、とを有するオリゴヌクレオチドであり、ＢＩＰプライマーは、５’側にターゲット核酸配列の裏鎖に相同的なＢ１ｃと呼ばれる配列、３’側にターゲット核酸配列の表鎖に相補的なＢ２と呼ばれる配列、とを有するオリゴヌクレオチドである。アウタープライマーとは、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーを示し、Ｆ３プライマーはターゲット核酸配列の裏鎖に相補的なオリゴヌクレオチド、Ｂ３プライマーはターゲット核酸の表鎖に相補的なオリゴヌクレオチドである。ループプライマーは、ＦＬプライマーとＢＬプライマーを示し、ＬＡＭＰによる核酸の増幅反応を促進する。ＦＬプライマーはＦ２配列に相補的なＦ２ｃ配列とＦ１ｃ配列の間の配列に相補的な配列、ＢＬプライマーはＢ２配列に相補的なＢ２ｃ配列とＢ１ｃ配列の間の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。これらインナープライマー、アウタープライマー、および、ループプライマーの設計方法は、先の特許文献１、文献１〜３、および、Ｗｅｂサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／に公開されている。
【００２０】
具体的には、まず、標的核酸について、5'側からF3、F2、F1、B1c、B2c、B3cの６つの領域を規定し、この６つの領域の相補的な領域をF3c、F2c、F1c、B1、B2、B3と規定し、次の通り4種類のプライマーを設計する。
【００２１】
（１）FIPプライマー：標的核酸のF2領域を3'端に持ち、5'末端側に標的核酸のF1cと同じ配列を持つように設計する。
（２）F3プライマー：標的核酸のF3領域を持つように設計する。
（３）BIPプライマー：標的核酸のB2領域を3'端に持ち、5'末端側に標的核酸のB1cと同じ配列を持つように設計する。
（４）B3プライマー：標的核酸のB3領域を持つように設計する。
【００２２】
LAMP法においては、ダンベル構造の5’末端側のループの1本鎖部分（B1領域とB2領域の間、あるいは F1領域とF2領域の間）に相補的な配列を持つループプライマー（それぞれループプライマーB（本発明においてはＢＬプライマー）、ループプライマーF（本発明においてはＦＬプライマー））を用いることによりDNA合成の起点を増やすことが可能となる。ループプライマーを用いることにより、増幅時間は、ループプライマーを使用しない場合の1/3〜1/2となることが期待される。
【００２３】
ＬＡＭＰ反応の反応時間とはＬＡＭＰ反応産物がある一定に達する時間を言い、ここではＬＡＭＰ反応の濁度が０．１に達する時間を指標とした。よって、ＬＡＭＰ反応速度が速いとは濁度が０．１に達する時間が短いことを示す。ＬＡＭＰ反応産物の濁度が０．１の時、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等の蛍光インターカレーターや電気泳動後のエチジウムブロマイド染色にて十分に検出できる量のＬＡＭＰ産物が形成されていることが判っている。
【００２４】
本発明では、核酸を増幅するＬＡＭＰ反応のターゲット配列として、淋菌のＯＲＦ１（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｓ８６１１３）遺伝子を選択した。ＯＲＦ1遺伝子は淋菌に極めて特異的な遺伝子とされており、淋菌の検出に有用であることが、先の特開平１１−１８７８５号公報に報告されており、この遺伝子にＬＡＭＰの増幅領域を設定し、プライマーの設計・改変を進めた。ＯＲＦ１遺伝子と、Ｍ．ＮｇｏＶＩＩ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｓｅ  （ｄｃｍＧ）  ａｎｄ  Ｒ．ＮｇｏＶＩＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ｄｃｒＧ）遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ４３７３６）、および特開平１１−１８７８５号公報に記載されているＮｇ−ＣＤＭＴ遺伝子は同一遺伝子と思われるが、それぞれ若干配列が異なっている。まず、配列番号３７および３８に記載の１対のＰＣＲ用プライマーにて、淋菌ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ７００８２５ＤをテンプレートしてＰＣＲを行い、その塩基配列を明らかにした（配列番号３９）。この配列を使い、ＬＡＭＰ反応用のプライマーの設計を進めた。
【００２５】
フォワード側のインナープライマーＦＩＰとして１４種、リバース側のインナープライマーＢＩＰとして１９種、フォワード側のアウタープライマーＦ３として４種、リバース側のアウタープライマーＢ３として４種オリゴヌクレオチドを設計し、淋菌のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＬＡＭＰ反応を行い反応の早いプライマーセットを選択した。その結果、増幅速度の速いＦＩＰプライマーとして配列番号１、２、３のオリゴヌクレオチドプライマー、ＢＩＰプライマーとして配列番号４〜９のオリゴヌクレオチドプライマー、およびこれらの組み合わせを含むプライマーミックスとして、表１記載のプライマーミックスＮＧ＃００５、ＮＧ＃０３１、ＮＧ＃０３３、ＮＧ＃０３５、表２記載のＮＧ＃１００、ＮＧ＃１０１、ＮＧ＃１０２、ＮＧ＃１０３のプライマーミックスを得た。次に、ＬＡＭＰ反応の反応速度を早めるため、インナープライマーおよびアウタープライマーに加えて最適なループプライマーを加えるべく、その検討を進めた。フォワード側のループプライマーとして配列番号１４〜２０のオリゴヌクレオチド、リバース側のループプライマーとして配列番号２１〜２８のオリゴヌクレオチドを組み合わせて表１および表２記載のプライマーミックスを添加してＬＡＭＰ反応を行い、反応速度の速いループプライマーを複数得ることができた。表１に記載したループプライマーを含む８種のプライマーミックスＮＧ＃００５−３３、ＮＧ＃０３１−３３、ＮＧ＃０３３−３３、ＮＧ＃０３５−３３、ＮＧ＃１００−３３、ＮＧ＃１０１−３３、ＮＧ＃１０２−３３、ＮＧ＃１０３−３３について検出感度および検出の特異性を検定した。その結果、ＮＧ＃００５−３３においては淋菌ゲノムＤＮＡ  １ｐｇ（４３０菌体相当）であったが、ＮＧ＃０３１−３３、ＮＧ＃０３３−３３、ＮＧ＃０３５−３３、ＮＧ＃１００−３３、ＮＧ＃１０１−３３、ＮＧ＃１０２−３３、ＮＧ＃１０３−３３においては淋菌ゲノムＤＮＡ  ０．１ｐｇ（４３菌体相当）を検出することができた。ＮＧ＃０３５−３３は、テンプレート量が１００ｐｇの際にはおよそ１３分で濁度が０．１に達しており、かつ、テンプレート量が０．１ｐｇのときでもおよそ３０分で濁度が０．１に達し、高感度かつ短時間に淋菌のゲノムＤＮＡを検出することができた。またこれら８種のプライマーミックスでは、テンプレートが２種の淋菌ゲノム（ＡＴＣＣ７００８２５およびＡＴＣＣ４３０７０）の時に増幅が起こるが、淋菌と同属のＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａ（ＡＴＣＣ２３９７０）やＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１３０９０）では増幅が起こらず、特異性が高いことが示された。これらの知見に基づいて、感度・特異性が高く、短時間に淋菌を検出することが可能なＬＡＭＰ反応用オリゴヌクレオチドプライマーとこれを用いた淋菌の検出法を完成するに至った。
【００２６】
【表１】
2005278443.tif 000002
【００２７】
【表２】
2005278443.tif 000003
【００２８】
以上の通り、本発明で用いるインナープライマーとしては、
（１）配列番号２９の塩基配列を５’側に、配列番号３０の塩基配列を３’側に有し、全長が３２から４８塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド；
（２）配列番号３１の塩基配列を５’側に、配列番号３２の塩基配列を３’側に有し、全長が３２から４８塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド；
（３）配列番号３３の塩基配列を５’側に、配列番号３４の塩基配列を３’側に有し、全長が３１から４７塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド；及び
（４）配列番号３５の塩基配列を５’側に、配列番号３６の塩基配列を３’側に有し、全長が３１から４７塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド；
が挙げられる。上記オリゴヌクレオチドの具体例としては、配列番号１から９の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２９】
また、本発明で用いるアウタープライマーとしては、F3として配列番号１０又は１１に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、B3として配列番号１２又は１３に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３０】
さらに、本発明で用いるループプライマーとしては、配列番号１４から２８の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３１】
本発明においてインナープライマー、アウタープライマーまたはループプライマーとして用いる上記オリゴヌクレオチドは何れも、当業者に周知の方法である固相合成法により合成することができる。このような合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどの業者から販売されている。
【００３２】
また、本発明のオリゴヌクレオチドとしては、本明細書の配列表の配列番号で示される特定の塩基配列を含む限り、オリゴヌクレオチドを構成するデオキシリボースや塩基について、その一部に他の分子が付加したり、その一部が他の分子で置換されるなどにより修飾されているものでもよい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドとしては、ＬＡＭＰ法で淋菌のＤＮＡを増幅した後、そのオリゴヌクレオチドの検出を簡略化するため、プライマーとするオリゴヌクレオチドの5’末端を蛍光色素であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したオリゴヌクレオチドや、プライマーとするオリゴヌクレオチドの5’末端にビオチンを結合し、アビジンと共有結合させたペルオキシダーゼを結合させ得るものでもよい。
【００３３】
本発明におけるＬＡＭＰ法では、標的遺伝子を含む試料、プライマー（FIP, F3, BIP, B3）、鎖置換型DNA Polymerase、dNTPs、及び反応緩衝液を含む反応液を調製し、６４〜６５℃で１０分から１時間程度インキュベーションすることにより、増幅産物あるいは増幅の有無を検出することができる。増幅産物の検出は簡易検出及びリアルタイム検出が可能であり、増幅する時間は、ループプライマーを利用することで更に短縮することができる。
【００３４】
ＬＡＭＰ法は、具体的には以下の通り行なうことができる。即ち、インナープライマー（ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー）、ループプライマー（ＦＬプライマーおよびＢＬプライマー）及びアウタープライマー（Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマー）を含むプライマーセットを作製し、これを適当なマイクロチューブに添加し、氷上に置く。ＬＡＭＰ反応液としては、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ  Ｂｅｔａｉｎｅ、  ２．８ｍＭ  ｄＧＴＰ、２．８ｍＭ  ｄＣＴＰ、２．８ｍＭ  ｄＡＴＰ、２．８ｍＭ  ｄＴＴＰ、所定量の試料（即ち、淋菌ゲノムＤＮＡを含む試料）を添加し、全容量を適量に調整し、氷上に置く。これに、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ）を添加して全容量を調整し、混和した後、例えば、６４℃にて１５分から１時間反応させることによりＬＡＭＰ反応を行なう。
【００３５】
ＬＡＭＰ反応におけるインナープライマーの濃度は、ＬＡＭＰ反応が進む限り特に限定されないが、一般的にはプライマーの各々につき、１０〜７０ｐｍｏｌ／２５μｌ、好ましくは３０〜５０ｐｍｏｌ／２５μｌ、例えば４０ｐｍｏｌ／２５μｌとすることができる。
【００３６】
ＬＡＭＰ反応におけるループプライマーの量は、ＬＡＭＰ反応が進む限り特に限定されないが、一般的にはプライマーの各々につき、１０〜１５０ｐｍｏｌ／２５μｌ、好ましくは１０〜１００ｐｍｏｌ／２５μｌ、例えば２０、４０または６０ｐｍｏｌ／２５μｌとすることができる。
【００３７】
ＬＡＭＰ反応におけるアウタープライマーの量は、ＬＡＭＰ反応が進む限り特に限定されないが、一般的にはプライマーの各々につき、２〜２０ｐｍｏｌ／２５μｌ、好ましくは２〜１０ｐｍｏｌ／２５μｌ、例えば５ｐｍｏｌ／２５μｌとすることができる。
【００３８】
ＬＡＭＰ反応による増幅反応の過程では、副産物としてピロリン酸マグネシウムが産生される。この副産物は、増幅産物と比例して産生されることから、増幅産物量が非常に多いLAMP法では白濁として観察することができる。即ち、ＬＡＭＰ法ではこの白濁の有無で標的遺伝子の有無を確認することができる。また、ＬＡＭＰ反応とその後の反応産物の検出は、ＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）などの市販の装置を用いて行なうことができる。
【００３９】
あるいは、蛍光インターカレーター（例えば、エチジウムブロマイド等）の存在下で増幅させた増幅産物の入ったチューブにＵＶランプを照射することにより、鋳型DNA（標的遺伝子）が存在する場合には、蛍光強度が上がり、肉眼でも増幅の有無、いわゆる標的遺伝子の有無を確認することができる。
【００４０】
上記以外としては、ＬＡＭＰ反応後、反応産物を電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドあるいはサイバーグリーンで核酸染色を行い、増幅されたヌクレオチド配列の塩基長が、上述の標的配列の塩基長と等しければ検体中に検出対象の淋菌が存在すると判定できる。増幅されたヌクレオチド配列の検出には、クロマトグラフィーを使用することもできる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
［実施例１］プライマーの検定
ＬＡＭＰ反応プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは化学的に合成した。インナープライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、アウタープライマーとして５ｐｍｏｌのＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ループプライマーとして２０ｐｍｏｌのＦＬプライマー、ＢＬプライマーを含むプライマーミックス（表１）を調製し、０．２ｍｌマイクロチューブ（栄研化学）に添加し、氷上に置いた。ＬＡＭＰ反応液として、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ  Ｂｅｔａｉｎｅ、  ２．８ｍＭ  ｄＧＴＰ、２．８ｍＭ  ｄＣＴＰ、２．８ｍＭ  ｄＡＴＰ、２．８ｍＭ  ｄＴＴＰ、１００ｐｇ  Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＡＴＣＣ７００８２５）ゲノムＤＮＡを添加し、全容量を２４μｌとし氷上に置いた。これに、８ｕｎｉｔｓ／μｌのＢｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ）１μｌを添加して全容量を２５μｌとし、ゆっくり混和した後、速やかにＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）にセットして６４℃にて６０分間反応させ、ＬＡＭＰ増幅反応液の濁度を測定した。ＬＡＭＰ反応の指標として濁度が０．１に達した時間を抽出し、その結果を表３に示した。ループプライマーの添加によって増幅に要する時間を大幅に短縮することができ、ＮＧ＃０３５−３３においては１５分にて濁度が０．１に達した。
【００４２】
【表３】
2005278443.tif 000004
【００４３】
［実施例２］プライマーの検定
表２記載のプライマーミックスについて実施例１と同様にプライマーの検定を行った。その結果を表４及び５に示す。
【００４４】
【表４】
2005278443.tif 000005
【００４５】
【表５】
2005278443.tif 000006
【００４６】
［実施例３］検出感度の検定
表１記載のプライマーミックスＮＧ＃００５−３３、ＮＧ＃０３１−３３、ＮＧ＃０３３−３３、ＮＧ＃０３５−３３、ＮＧ＃００５−３３、および、表２記載のプライマーミックスＮＧ＃１００−３３、ＮＧ＃１０１−３３、ＮＧ＃１０２−３３、ＮＧ＃１０３−３３の検出感度を調べた。テンプレートとして、１００ｐｇ〜０．１ｐｇのＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＡＴＣＣ７００８２５）ゲノムＤＮＡを用い、その他の条件は実施例１と同様にして行った。その結果を表６に示す。ＮＧ＃０３５−３３が最も反応速度が速く、淋菌ゲノムＤＮＡ  １００ｐｇ（４３０００分子相当）をテンプレートとした時は１３分で濁度が０．１に到達した。淋菌ゲノムＤＮＡ  ０．１ｐｇ（４３分子相当）をテンプレートとした時でも２１分で濁度が０．１に達し、検出限界が０．１また検出限界げゲノムＤＮＡ  ０．１ｐｇ（４３分子）であった。
【００４７】
【表６】
2005278443.tif 000007
【００４８】
［実施例４］特異性（交差性）の検定
表１記載のプライマーミックスＮＧ＃００５−３３、ＮＧ＃０３１−３３、ＮＧ＃０３３−３３、ＮＧ＃０３５−３３、ＮＧ＃００５−３３、および、表２記載のプライマーミックスＮＧ＃１００−３３、ＮＧ＃１０１−３３、ＮＧ＃１０２−３３、ＮＧ＃１０３−３３の淋菌特異性を調べた。ＬＡＭＰ反応液は実施例１と同様にして調製し、ＬＡＭＰ反応のテンプレートして、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ  （ＡＴＣＣ７００８２５）、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＡＴＣＣ４３０７０）、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ（ＡＴＣＣ２３９７０）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１３０９０）のゲノムＤＮＡ  各１００ｐｇを使いＬＡＭＰ反応を行った。その結果を図１から図８に示す。いずれのプライマーミックスとも、淋菌のゲノムＤＮＡ（ＮＧ１およびＮＧ２）をテンプレートした時のみ増幅が進み、特異性が高いことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】実施例４のプライマーミックスＮＧ＃００５−３３の交差性の検定。ＮＧ１、ＮＧ２、ＮＬ、ＮＭはそれぞれ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ  （ＡＴＣＣ７００８２５）、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＡＴＣＣ４３０７０）、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ（ＡＴＣＣ２３９７０）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１３０９０）のゲノムＤＮＡを示す。
【図２】実施例４のプライマーミックスＮＧ＃０３１−３３の交差性の検定。ＮＧ１、ＮＧ２、ＮＬ、ＮＭはそれぞれ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ  （ＡＴＣＣ７００８２５）、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＡＴＣＣ４３０７０）、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ（ＡＴＣＣ２３９７０）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１３０９０）のゲノムＤＮＡを示す。
【図３】実施例４のプライマーミックスＮＧ＃０３３−３３の交差性の検定。ＮＧ１、ＮＧ２、ＮＬ、ＮＭはそれぞれ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ  （ＡＴＣＣ７００８２５）、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＡＴＣＣ４３０７０）、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ（ＡＴＣＣ２３９７０）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１３０９０）のゲノムＤＮＡを示す。
【図４】実施例４のプライマーミックスＮＧ＃０３５−３３の交差性の検定。ＮＧ１、ＮＧ２、ＮＬ、ＮＭはそれぞれ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ  （ＡＴＣＣ７００８２５）、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＡＴＣＣ４３０７０）、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ（ＡＴＣＣ２３９７０）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１３０９０）のゲノムＤＮＡを示す。
【図５】実施例４のプライマーミックスＮＧ＃１００−３３の交差性の検定。ＮＧ１、ＮＧ２、ＮＬ、ＮＭはそれぞれ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ  （ＡＴＣＣ７００８２５）、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＡＴＣＣ４３０７０）、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ（ＡＴＣＣ２３９７０）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１３０９０）のゲノムＤＮＡを示す。
【図６】実施例４のプライマーミックスＮＧ＃１０１−３３の交差性の検定。ＮＧ１、ＮＧ２、ＮＬ、ＮＭはそれぞれ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ  （ＡＴＣＣ７００８２５）、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＡＴＣＣ４３０７０）、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ（ＡＴＣＣ２３９７０）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１３０９０）のゲノムＤＮＡを示す。
【図７】実施例４のプライマーミックスＮＧ＃１０２−３３の交差性の検定。ＮＧ１、ＮＧ２、ＮＬ、ＮＭはそれぞれ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ  （ＡＴＣＣ７００８２５）、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＡＴＣＣ４３０７０）、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ（ＡＴＣＣ２３９７０）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１３０９０）のゲノムＤＮＡを示す。
【図８】実施例４のプライマーミックスＮＧ＃１０３−３３の交差性の検定。ＮＧ１、ＮＧ２、ＮＬ、ＮＭはそれぞれ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ  （ＡＴＣＣ７００８２５）、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＡＴＣＣ４３０７０）、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ（ＡＴＣＣ２３９７０）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１３０９０）のゲノムＤＮＡを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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