(57)【要約】【課題】中空繊維の中空部に保持されたゲル状物と中空繊維内壁との界面に隙間がないマイクロアレイを提供する。【解決手段】以下の  （１）  〜  （４）  の工程を順次行う工程を含む生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法。（１）      複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を固定して、中空繊維束を製造する工程。（２）      中空繊維束に含まれる酸素を脱酸素剤により除去する工程。（３）      キャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を各中空繊維の中空部に導入し、重合反応を行い、キャプチャープローブが保持されたゲル状物を生成する工程。（４）      繊維の長手方向に交叉する方向で、切断して中空繊維束を薄片化する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の  （１）  〜  （４）  の工程を順次行う工程を含む生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法。
（１）      複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を固定して、中空繊維束を製造する工程。
（２）      中空繊維束に含まれる酸素を脱酸素剤により除去する工程。
（３）      キャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を各中空繊維の中空部に導入し、重合反応を行い、キャプチャープローブが保持されたゲル状物を生成する工程。
（４）      繊維の長手方向に交叉する方向で、切断して中空繊維束を薄片化する工程。
【請求項２】
以下の  （１）  〜  （４）  の工程を順次行う工程を含む生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法。
（１）      複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を固定して、中空繊維束を製造する工程。
（２）      中空繊維束に含まれる酸素濃度を脱酸素剤により０．５質量％以下とする工程。
（３）      キャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を各中空繊維の中空部に導入し、重合反応を行い、キャプチャープローブが保持されたゲル状物を生成する工程。
（４）      繊維の長手方向に交叉する方向で、切断して中空繊維束を薄片化する工程。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は核酸等の生体関連物質を検出するために用いられる生体関連物質検出用マイクロアレイ及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、多数遺伝子の一括発現解析を可能とするＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる分析法が開発されている。
【０００３】
このようなＤＮＡマイクロアレイの例として、複数の区画を有し、各区画が中空繊維により形成されており、各区画にはキャプチャープローブがゲル状物を介して保持されている生体関連物質検出用マイクロアレイが提案されている（特許文献１及び特許文献２参照）。
【０００４】
このマイクロアレイは、例えば以下の（１）〜（３）を順次行う方法により製造される。
【０００５】
（１）    複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列をポリウレタン樹脂等の接着剤を用いて固定し、中空繊維束を製造する工程。
【０００６】
（２）    キャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を各中空繊維の中空部に導入し、重合反応を行い、キャプチャープローブが保持されたゲル状物を生成する工程。
【０００７】
（３）    繊維の長手方向に交叉する方向で、切断して中空繊維束を薄片化する工程。
【０００８】
この製造方法は、フォトリソグラフィー法やスポッティング法と比較して高価な製造設備を必要とせず、製造工程が簡略化できるという利点を有する。
【０００９】
また、これにより製造されたマイクロアレイは、所定長の中空繊維の中空部にキャプチャープローブがゲル状物を介して保持されているため、単にシートの表面に保持させる場合と比較すると、一区画により多くの量のキャプチャープローブを保持することができる。さらには電気泳動によるハイブリダイゼーション反応を行うことができる。
【００１０】
【特許文献１】
国際公開第００／４０９４２号
【００１１】
【特許文献２】
国際公開第０１／９８７８１号
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記のマイクロアレイは、中空繊維内壁とその中空部に形成されているゲル状物との界面に隙間を生じている場合がある。そのようなマイクロアレイを検査に使用した場合、隙間に検体が優先的に流れ、ゲル状物に保持されているキャプチャープローブの一部しか検体との反応に利用されない。
【００１３】
隙間が生じる原因として、酸素による重合阻害が考えられる。例えば、電気泳動用のポリアクリルアミドのスラブゲルを製造する際、予めゲル前駆体重合性溶液を脱気することは通常行われる操作である。
【００１４】
しかし、上述のマイクロアレイを製造する際、ゲル前駆体重合性溶液中に溶解している酸素を除去するだけでは不十分であることが分かった。
【００１５】
具体的には中空繊維に溶解している酸素や中空繊維束を製造する際に使用したポリウレタン樹脂等の包埋剤に溶解している酸素が中空繊維の中空部へ移動し、重合反応を阻害することがわかった。
【００１６】
また、通常行われている窒素置換等の脱気操作は、長時間実施する必要がある。さらに脱気のための装置も必要であるため、操作が煩雑となる。
【００１７】
また、脱気操作のみで中空繊維に溶解している酸素やポリウレタン樹脂等に溶解している酸素を完全に除去することは非常に困難であることが分かった。
【００１８】
本発明は上記の問題点を解決したマイクロアレイ及びその製造方法を提供する。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討検討した結果、中空繊維束に含まれる酸素を脱酸素剤により除去することにより、上記問題が解決できることを見いだし、本発明を完成させた。
【００２０】
すなわち本発明は、以下の  （１）  〜  （４）  の工程を順次行う工程を含む生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法である。
【００２１】
（１）      複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を固定して、中空繊維束を製造する工程。
【００２２】
（２）      中空繊維束に含まれる酸素を脱酸素剤により除去する工程。
【００２３】
（３）      キャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を各中空繊維の中空部に導入し、重合反応を行い、キャプチャープローブが保持されたゲル状物を生成する工程。
【００２４】
（４）      繊維の長手方向に交叉する方向で、切断して中空繊維束を薄片化する工程。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明は、以下の  （１）  〜  （４）  の工程を順次行う工程を含む生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法である。
【００２６】
（１）    複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を固定して、中空繊維束を製造する工程。
【００２７】
（２）      中空繊維束に含まれる酸素を脱酸素剤により除去する工程。
【００２８】
（３）      キャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を各中空繊維の中空部に導入し、重合反応を行い、キャプチャープローブが保持されたゲル状物を生成する工程。
【００２９】
（４）      繊維の長手方向に交叉する方向で、切断して中空繊維束を薄片化する工程。
【００３０】
まず、第１の工程では、複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を固定して、中空繊維束を製造する。
【００３１】
中空繊維の材料としては、例えば、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系中空繊維、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカーボネート等のポリエステル系中空繊維、ポリアクリロニトリル等のアクリル系中空繊維、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系中空繊維、ポリメタクリル酸メチル等のポリメタクリレート系中空繊維、ポリビニルアルコール系中空繊維、ポリ塩化ビニリデン系中空繊維、ポリ塩化ビニル系中空繊維、ポリウレタン系中空繊維、フェノール系中空繊維、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系中空繊維、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系中空繊維等が挙げられる。
【００３２】
中空繊維の内径は任意に設定できる。好ましくは、１０〜２０００μｍである。また中空繊維にはカーボンブラック等の黒色顔料を適量含有させたものを用いることもできる。
【００３３】
上記中空繊維の複数本を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を固定して、中空繊維束を製造する。「集束」とは、複数本の中空繊維を互いに平行となるよう配置することをいう。集束体はその配置が乱れないように接着剤等で固定される。
【００３４】
中空繊維束を製造する方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法（特開平１１−１０８９２８号公報参照）が挙げられる。
【００３５】
また、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ねあわせ、それらの孔部に、中空繊維を通過させ、２枚の多孔板の間隔を開き、２枚の多孔板間の、中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させ硬化させる方法（特開２００１−１３３４５３号公報参照）が挙げられる。
【００３６】
接着剤としては、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂等を用いることができる。また、隣接する中空繊維の外表面を相互に融着することによって中空繊維の集束物を固定することもできる。
【００３７】
中空繊維束の固定は、集束した中空繊維の全長又は所定部分に対して行う。集束した中空繊維の少なくとも一方の端部から適当な長さの部分は固定しない状態とすることもできる。
【００３８】
第２の工程では、中空繊維束に含まれる酸素を脱酸素剤により除去する。脱酸素剤としては、食品や医薬品等の酸化を防止するために使用されている鉄系脱酸素剤、有機系脱酸素剤等が挙げられる。
【００３９】
除去は、例えば中空繊維束と脱酸素剤をガスバリア性の高いパックに封入し密閉系とすることにより行う。その際、市販の酸素インジケーターを同封することにより、パック内の酸素の有無が確認できる。酸素インジケーターとしては、タブレット状で酸素濃度によりタブレットの色が変化するものが使用される。
【００４０】
酸素除去は、酸素インジケーターが示す酸素濃度が０．５質量％以下、好ましくは０．３％以下、さらに好ましくは０．１質量％以下となるまで行う。
【００４１】
中空繊維束は、次の工程を実施する直前でパックから取り出せばよい。本方法によれば、特別な装置を必要とせず酸素除去を確実に実施することができる。さらに製造した中空繊維束をパックのまま保存することができる。
【００４２】
第３の工程では、キャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を各中空繊維の中空部に導入し、重合反応を行い、キャプチャープローブが保持されたゲル状物を生成する。
【００４３】
「キャプチャープローブ」とは、核酸、アミノ酸、ペプチド、糖、脂質、抗体、さらには化学結合、物理結合などの相互作用により生体関連物質を検出しうる有機化合物、無機化合物等をいう。
【００４４】
例えば、核酸を用いる場合、生細胞からのＤＮＡの調製は、Ｂｌｉｎらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３．２３０３（１９７６））等により行うことができ、また、ＲＮＡの抽出については、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５．７１８（１９８０））等により行うことができる。
【００４５】
「ゲル前駆体重合性溶液」とは、キャプチャープローブの他に前述の単量体、多官能性単量体、重合開始剤、及び水等を含むものである。
【００４６】
単量体とは、例えばアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸及びアリルデキストリン等である。
【００４７】
多官能性単量体とは、例えばメチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等である。
【００４８】
ゲル前駆体重合性溶液は、真空吸引法等によって中空繊維の中空部へ導入される。例えば、まず中空繊維束とゲル前駆体重合性溶液をデシゲーター内に設置する。次いで、中空繊維束の中空繊維が固定されていない端部を、この溶液中に浸し、デシゲーター内を減圧状態し、中空繊維の中空部内にこの溶液を導入する。
【００４９】
ゲル前駆体重合性溶液は予め脱気しておくことが好ましい。
【００５０】
導入後、ゲル前駆体重合性溶液を含む中空繊維束を加熱することにより重合反応を開始する。重合温度は使用する単量体等により適宜選択される。
【００５１】
重合反応後、中空繊維の中空部にはキャプチャープローブが保持されたゲル状物が充填されている。
【００５２】
「保持」とは、上述のゲル状物にキャプチャープローブが化学的に又は物理的に固定されている状態をいう。
【００５３】
「化学的に固定する」とは、上述の単量体成分に生体関連物質を直接結合することをいう。例えば、核酸の末端にビニル基を導入し、アクリルアミド等の単量体と共重合させる方法が挙げられる（ＷＯ  ９８／３９３５１号公報参照）。
【００５４】
また、「物理的に固定する」とは、ゲル状物中に生体関連物質が包括固定することをいう。例えば、ビオチン化した核酸とアビジン化したアガロースビーズ（シグマ社製  アビジン化アガロース等）を反応させ、核酸が固定化されたアガロースビーズを得、この核酸固定化アガロースビーズをアクリルアミドゲル等に包括固定化する方法が挙げられる。
【００５５】
キャプチャープローブは目的に応じて必要な種類（数）が準備される。例えば、中空繊維の本数と同一の数のキャプチャープローブを準備し、各中空繊維に互いに異なる１種類のキャプチャープローブを導入することができる。また、複数本の中空繊維に同じキャプチャープローブを導入することもできる。
【００５６】
第４の工程において、重合反応終了後の中空繊維束を繊維の長手方向に交叉する方向で、通常は直交する方向で、切断して薄片化を行う。
【００５７】
中空繊維束の切断は、ミクロトーム、レーザー、等を使用することができる。得られる薄片の厚みは、５ｍｍ以下であり、好ましくは０．１ｍｍ〜１ｍｍである。
【００５８】
得られた薄片は、核酸等の生体関連物質を検出するために用いられる生体関連物質検出用マイクロアレイとして使用される。
【００５９】
【実施例】
以下、実施例により詳細に説明する。
【００６０】
＜実施例１＞
（１）キャプチャープローブの製造
合成機ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  （ｍｏｄｅｌ３９４）（ＰＥバイオシステムズ社製）を用いて、ＧＣＡＴのオリゴヌクレオチドを合成した。これらは、一般的手法によって脱保護及び精製して使用した。
【００６１】
得られたＧＣＡＴ（５００ｎｍｏｌ／ｍｌ）５０μｌ、グリシジルメタクリレート  ５μｌ及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５μｌを混合し、７０℃で２時間反応させ、水１９０μｌを加えて、１００ｎｍｏｌ／ｍｌのメタクリレート基を有するＧＣＡＴ（ＭＡ−ＧＣＡＴ）を得た。
（２）中空繊維束の製造
図１に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。
【００６２】
まず、直径０．３２ｍｍの孔が、孔の中心間距離を０．１２ｍｍとして、縦横各１６列で合計２５６個設けられた厚さ０．１ｍｍの多孔板２枚を準備した。これらの多孔板を重ね合わせて、そのすべての孔に、ポリカーボネート中空繊維（三菱エンジニアリングプラスチック社製  カーボンブラック１質量％添加）を１本づつ、通過させた。
【００６３】
Ｘ軸方向に各繊維に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を８０ｍｍとした。
【００６４】
次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。
【００６５】
次に、この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン４２７６、コロネート４４０３）の総重量に対し、２．５質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板と板状物を取り除き、中空繊維束を得た。
【００６６】
（３）脱酸素処理
ガスバリア性パック（ガスバリアナイロン／ＰＥ  ２０Ｘ２５ｃｍ）に（２）で製造した中空繊維束、脱酸素剤（三菱ガス化学社製  エージレスＴＭ）および酸素インジケーター（三菱ガス化学社製  エージレスアイＴＭ）を入れた後、密閉した。約２日間でパック内の酸素濃度は０．１％以下となった。
【００６７】
（４）重合反応
次に、表１示すの質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液を調製した。
【００６８】
【表１】
2005024322.tif 000002
次に、キャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液をデシケーター内に設置した。デシケーター内を減圧状態にしたのち、中空繊維束の繊維束が固定されていない一方の端部をこの溶液中に浸漬した。デシケーター内に窒素ガスを封入し、中空繊維の中空部にキャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入した。次いで、容器内を７０℃とし、３時間かけて重合反応を行った。
【００６９】
このようにしてキャプチャープローブがゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束を得た。
【００７０】
（５）薄片化
（４）で得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向でスライスし、厚さ０．５ｍｍの薄片シート５０枚を得た。スライス時に中空繊維からゲル状物は脱落しなかった。
【００７１】
得られた薄片シート５０枚について、ゲル状物の形態、中空繊維内壁とゲル状物との界面を実体顕微鏡で観察した。
【００７２】
その結果、すべてのシートで、中空繊維の中空部にゲル状物が保持されており、中空繊維内壁とゲル状物との界面には隙間がないことを確認した。
【００７３】
＜比較例１＞
実施例１の（３）の操作を行わない以外は実施例１と同様に操作を行った。
【００７４】
その結果、マイクロアレイ１枚あたり、２５６スポット中６０スポットで中空繊維内壁とゲル状物との界面に隙間が観察された。
【００７５】
＜比較例２＞
実施例１の（３）の代わりに中空繊維束を窒素雰囲気下に約１６時間、放置した以外は実施例１と同様に操作を行った。
【００７６】
その結果、マイクロアレイ１枚あたり、２５６スポット中９０スポットで中空繊維内壁とゲル状物との界面に隙間が観察された。
【００７７】
【発明の効果】
中空繊維束に含まれる酸素を脱酸素剤により除去することにより、中空繊維の中空部に保持されたゲル状物と中空繊維内壁との界面に隙間がないマイクロアレイを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】配列固定器具の概念図である。
【符号の説明】
１    配列固定器具
１１    孔部
２１    多孔板
３１    中空繊維
４１    板状物
【図１】
2005024322.tif 000003