(57)【要約】【課題】  酵素などの生体由来分子または生体分子を金属層や高分子層を介さずに炭素基材に固定したバイオセンサを提供する。【解決手段】  アモルファス炭素および結晶が一方向に配向した結晶性炭素とを含む炭素基材の端面に存在する多数のＯＨ基などの反応性残基を利用して、塩化シアヌルなどの結合分子を介して、または吸着により直接、蛋白質または電子メディエータなどを固定化する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液不透過性を有する炭素基材と、
該炭素基材に、該炭素基材の表面に存在する反応性残基を介し、金属層または高分子層を介さずに固定された生体由来分子または生体分子とを具備するバイオセンサ。
【請求項２】
前記炭素基材は、アモルファス炭素および該アモルファス炭素中に分散し結晶が実質的に一方向に配向した結晶性炭素とを含む請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記生体由来分子または生体分子は、前記炭素基材表面の反応性残基に化学的に結合した低分子量の結合分子を介して炭素基材に固定される請求項１または２記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記生体由来分子または生体分子は、前記炭素基材に直接固定される請求項１または２記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記生体由来分子または生体分子は、酵素及び／又は該酵素の電極反応を促進する電子移動メディエータである請求項１〜５のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素、抗体、電子移動メディエータ、糖タンパク質、細胞、微生物などの生体由来分子または生体分子を炭素基材に固定したバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
電気化学的測定に酵素センサを使用することは知られている。酵素センサのセンサ表面への酵素の固定化は、これまでは通常、重合体に結合させ、２官能性試薬によって架橋させて、膜の内側および膜の中に封入することによって、実施されてきた。これらの方法は、酵素分子が固相の厚い層の中に分布するという不都合がある。その結果、生成物が電極に拡散することが阻害され、センサの反応時間が長くなり、感度が低下する。
【０００３】
特開平８−２３３７７３公報には、貴金属表面を有する支持材上に吸着された結合分子を介して酵素を固定することが開示されている。
【０００４】
本願出願人による特願２００２−３２０２６１号には、炭素基材を貴金属層で海島状に覆って貴金属表面のみに選択的に結合分子を吸着させて酵素を固定したバイオセンサが開示されている。また本願出願人による特願２００３−０９６６２４号には、側鎖にマレイミド基を有する高分子化合物を介して酵素を炭素基材に固定したバイオセンサが開示されている。
【０００５】
【特許文献１】特開平８−２３３７７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、酵素、抗体、電子移動メディエータ、糖タンパク質、細胞、微生物などの生体由来分子または生体分子を金属層や高分子層を介さずに炭素基材に固定したバイオセンサを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のバイオセンサは、液不透過性を有する炭素基材と、該炭素基材に、該炭素基材の表面に存在する反応性残基を介し、金属層または高分子層を介さずに固定された生体由来分子または生体分子とを具備することを特徴とする。
【０００８】
前記炭素基材は、アモルファス炭素および該アモルファス炭素中に分散し結晶が実質的に一方向に配向した結晶性炭素とを含むことが好ましい。
【０００９】
前記生体由来分子または生体分子は、例えば前記炭素基材表面の反応性残基に化学的に結合した低分子量の結合分子を介して炭素基材に固定される。
【００１０】
或いはまた、前記生体由来分子または生体分子は、前記炭素基材に直接固定される。
【００１１】
前記生体由来分子または生体分子は、例えば、酵素及び／又は該酵素の電極反応を促進する電子移動メディエータである。
【発明の効果】
【００１２】
液不透過性を有する炭素基材、とりわけその中でもアモルファス炭素およびアモルファス炭素中に分散し結晶が実質的に一方向に配向した結晶性炭素とを含む炭素基材は、その端面に反応性残基を多数有するので、それに化学的に結合した塩化シアヌルなどの低分子量の結合分子を介して、または吸着により直接、酵素などの生体由来分子または生体分子を固定することができる。
【実施例】
【００１３】
ＰＦＣ（Plastic Formed Carbon）の作製
(実施例１)
【００１４】
ＰＦＣ電極作製のための素材（アモルファス炭素源）として、塩素化塩化ビニル樹脂（日本カーバイド社製  Ｔ−７４２）３５質量％、フラン樹脂（日立化成社製  ヒタフランＶＦ−３０２）４５質量％、の混合樹脂系を用い、これに黒鉛微粉末（日本黒鉛社製  ＳＰ−３００Ｓ  平均粒度２μｍ）２０質量％を複合した組成物１００質量％に対し、可塑剤としてジアリルフタレートモノマー２０質量％を添加して、ヘンシェル・ミキサーを用いて分散した後、表面温度を１２０℃に保ったミキシング用二本ロールを用いて十分に混練を繰り返してシート状組成物を得、ペレタイザーによってペレット化し成形用組成物を得た。このペレットをスクリュー型押出機で直径３．６mmのダイスを用い脱気を行いつつ１３０℃で３ｍ／秒の速度で押し出し、これを枠に固定して、１８０℃に加熱されたエアー・オーブン中で１０時間処理してプリ・カーサー（炭素前駆体）線材とした。次に、これを窒素ガス中で５００℃までを１０℃／時、５００℃から１０００℃迄を５０℃／時の昇温速度で昇温し、その後１５００℃迄を１００℃／時で昇温し、１５００℃で３時間保持した後自然冷却して焼成を完了した。また、上記ペレットを１．２mm×６０mm角のダイスを用いシート成形し同様に１５００℃まで焼成し、得られた厚み１mmの板の水素ガス気体透過係数を差圧法で測定したところ、６．２×１０-13cm3・cm／cm2・sec・cmHgであった。これにより液不透過性が確認された。
（実施例２）
【００１５】
アモルファス炭素源として、塩素化塩化ビニル樹脂（日本カーバイド社製  Ｔ−７４２）３０質量％、フラン樹脂（日立化成社製  ヒタフランＶＦ−３０２）４０質量％、の混合樹脂系を用い、これに黒鉛微粉末（日本黒鉛社製  ＣＳＳＰ−Ｂ  平均粒度１μｍ）３０質量％を複合した組成物１００質量％に対し、可塑剤としてジアリルフタレートモノマー２０質量％を添加して、ヘンシェル・ミキサーを用いて分散した後、表面温度を１２０℃に保ったミキシング用二本ロールを用いて十分に混練を繰り返してシート状組成物を得、ペレタイザーによってペレット化し成形用組成物を得た。このペレットをスクリュー型押出機で直径３．６mmのダイスを用い脱気を行いつつ１３０℃で３ｍ／秒の速度で押し出し、これを枠に固定して、１８０℃に加熱されたエアー・オーブン中で１０時間処理してプリ・カーサー（炭素前駆体）線材とした。次に、これを窒素ガス中で５００℃までを１０℃／時、５００℃から１０００℃迄を５０℃／時の昇温速度で昇温し、その後１５００℃迄を１００℃／時で昇温し、１５００℃で３時間保持した後自然冷却して焼成を完了した。また、上記ペレットを１．２mm×６０mm角のダイスを用いシート成形し同様に１５００℃まで焼成し、得られた厚み１mmの板の水素ガス気体透過係数を差圧法で測定したところ、１．８×１０-12cm3・cm／cm2・sec・cmHgであった。
（実施例３）
【００１６】
チロシナーゼ固定化炭素電極によるカテコールの電気化学検出
３−１  チロシナーゼ固定化炭素基材の作製
Ａ：ＰＦＣへのチロシナーゼの固定化
ＰＦＣ電極の前処置（前処理１）
実施例１で得られた直径３mm、長さ５０mmの炭素基材（ＰＦＣ電極棒）の端面と両端面から長さ１０mmの範囲の側面をエメリーペーパー（６００番）で研磨し蒸留水中で５分間超音波洗浄し、１００℃のドライオーブンで５分間乾燥させた後、以下に示す５種類の方法でチロシナーゼを固定化した。
１）塩化シアヌル法
前処理１を行ったＰＦＣ棒をトルエン中で１０分間超音波洗浄した。次に５０mMの塩化シアヌル／トルエン溶液に所定時間、室温にて浸漬させることによりＰＦＣエッジ面のＯＨ基を活性化した。再びトルエン中で超音波洗浄を２分間行った後、窒素気流下室温で１０分間乾燥させた。このＰＦＣ棒を５mlのチロシナーゼ（ポリフェノールオキシダーゼ、ＥＣ．１．１４．１８．１，＞２５００units／mg、マッシュルーム由来）水溶液（０．２５mg／ml蒸留水）に室温にて２４時間浸漬することによりチロシナーゼ固定化ＰＦＣを得た。固定化の概略図を図１に示す。この方法は酵素（蛋白質）表面のリジン残基のε−アミノ基あるいは蛋白質表面に存在する糖鎖の水酸基を介して蛋白質を化学修飾するものである。
２）ＡＰＴＥＳ−グルタルアルデヒド法（ＡＰＴＥＳ−ＧＡ法−１）
前処理１を行ったＰＦＣ棒をγ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）原液５mlに室温で１ｈ浸漬させることによりＰＦＣ表面をアミノシリル化した。トルエンで５分間超音波洗浄し吸着種を除いた。窒素気流下で１０分間乾燥させた後、１％グルタルアルデヒド（ＧＡ）水溶液に所定時間浸した。蒸留水で洗浄し吸着種を除去した後、５mlのチロシナーゼ水溶液（０．２５mg／ml蒸留水）に室温にて２４時間浸漬することによりチロシナーゼ固定化ＰＦＣを得た。固定化の概略図を図２に示す。この方法は酵素（蛋白質）表面のリジン残基のε−アミノ基および電極表面に修飾したＡＰＴＥＳ末端のアミノ基同士をＧＡにより架橋することにより蛋白質を化学修飾するものである。
３）カルボジイミド脱水縮合法（ＷＳＣ脱水縮合法）
前処理１を行ったＰＦＣ棒を１５％の熱硝酸溶液で１５分間処理し電極表面官能基を酸化しＣＯＯＨ密度を増大させた。５０mMの水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）［正式名称：１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸］水溶液に所定時間浸漬し（ｏ−アシルイソ尿素中間体）を形成させた。ＷＳＣ活性化ＰＦＣを蒸留水で洗浄した後、５mlのチロシナーゼ水溶液（０．２５mg／ml蒸留水）に室温にて２４時間浸漬することによりチロシナーゼ固定化ＰＦＣを得た。固定化の概略図を図３に示す。この方法は酵素（蛋白質）表面のリジン残基のε−アミノ基と電極表面のＣＯＯＨ基から脱水縮合剤（ＷＳＣ）によりアミド結合を形成させ蛋白質を化学修飾するものである。
４）塩化チオニル法
前処理１を行ったＰＦＣ棒を１５％の熱硝酸溶液で１５分間処理し電極表面官能基を酸化しＣＯＯＨ密度を増大させた。５０mMの塩化チオニル／トルエン溶液に２４時間浸漬しＣＯＯＨ基を修飾した。トルエンで５分間超音波洗浄し吸着種を除いた後、窒素気流下で１０分間乾燥させた。５mlのチロシナーゼ０．２５mg／ml水溶液（蒸留水）に室温にて２４時間浸漬することによりチロシナーゼ固定化ＰＦＣを得た。固定化の概略図を図４に示す。この方法は炭素表面のＣＯＯＨから酸塩化物を形成させた後、酵素（蛋白質）表面のリジン残基と反応させ、アミド結合を介して蛋白質を化学修飾するものである。
５）吸着法
前処理１を行ったＰＦＣ棒を５mlのチロシナーゼ水溶液（０．２５mg／ml蒸留水）に室温にて２４時間浸漬することによりチロシナーゼ吸着ＰＦＣを得た。
【００１７】
得られた酵素固定化ＰＦＣはすべて蒸留水で注意深く洗浄した後、０．１Ｍリン酸緩衝液（pH６．５）に浸し４℃で保存した。
Ｂ：ガラス状炭素（ＧＣ）へのチロシナーゼの固定化
ガラス状炭素（ＧＣ）電極（直径３mm）（ビー．エー．エス（株）製  ＣＶ用ＧＣＥグラッシーカーボン電極）は炭素の周りの絶縁性高分子をエッジングして炭素部分を２mm露出させたものを用いた。定法に従いＧＣ端面をアルミナ研磨し蒸留水中で超音波処理した後、窒素気流下で乾燥させた。
【００１８】
ＧＣの炭素部分を５０mMの塩化シアヌル／トルエン溶液に１ｈ浸漬させた後トルエンで洗浄した。窒素気流下で１０分乾燥させた後、５mlのチロシナーゼ水溶液（０．２５mg／ml蒸留水）に室温にて２４時間浸漬することによりチロシナーゼ固定化ＧＣ電極を得た。得られたチロシナーゼ固定化ＧＣ電極を蒸留水で注意深く洗浄した後、０．１Ｍリン酸緩衝液（pH６．５）に浸し４℃で保存した。固定化の概略図は基本的に図１と同様である。
１−２  カテコールの電気化学増幅検出
それぞれの固定化法の電気化学応答を比較する前に、測定に先立ち図５に示すようにＰＦＣ棒の端面と側面の上下１０mmを残して残りの側面（３０mm）をパラフィルムで覆い絶縁した。
【００１９】
ＰＦＣ電極とＧＣ電極との応答を比較する際には、みかけの電極表面積を統一するため、図６に示すように、ＰＦＣ電極の側面上１０mmのみを残し残り（４０mm）をパラフィルムで絶縁し、端面（直径３mm）のみを露出させて応答を比較した。ＧＣ電極は露出している炭素部分の端面（３mm）を残し側面（２mm）をパラフィルムで覆い絶縁した。
【００２０】
電気化学測定は、図７の電気化学セルで行った。電解液には酸素飽和した１０mlの０．１Ｍリン酸緩衝液（pH６．５）１０を用いた。チロシナーゼ固定化電極１２を作用極、白金線１４を対極、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極（内部液：飽和ＫＣｌ）１６を参照極とする３電極系で電解液１０をマグネチックスターラー１８により一定速度で攪拌した。作用極１２にはＡｇ／ＡｇＣｌ参照極１６の電位を基準として−０．０５０Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）をポテンショスタットで印加した。ベース電流が一定になったところで０．０２mM、０．１mM、１mMのカテコール標準溶液１００μｌをマイクロピペット２０で電解液（１０ml）に添加した。１回の添加で標準溶液中のカテコールは希釈され電解液中の濃度は添加前の約１／１００となる。カテコールは電極表面に拡散し固定化チロシナーゼの触媒作用によりｏ−キノンに酸化されるが、ｏ−キノンは炭素電極で−０．０５０Ｖにおいて電解還元されてカテコールが再生される。このカテコールが再び酵素反応を受けることにより図８に示すリサイクリング反応が生じ増幅された電流応答を得ることができる。定常値が得られたところで再びカテコールを加え同様の操作を繰り返すことにより図９に示すような階段状の応答曲線が得られた。試料を添加した後、定常値に達するまでの時間（応答時間）は１０秒〜１５秒以内と迅速である。
【００２１】
各固定化法で作製したチロシナーゼ固定化ＰＦＣでカテコール０．２μＭ（２×１０-6Ｍ）〜１００μＭ（１０-4Ｍ）までの検量線を作製した。５種類の固定化法の中では塩化シアヌル法が最も高感度かつ再現性に優れた応答を示した。表１に示すように各修飾法において反応時間などにより応答に差が生じるが、それぞれの方法における最良の検量線（図１０）からセンサの感度（検量線の傾き）および検出限界を比較すると、感度の大きな順に塩化シアヌル法＞ＷＳＣ脱水縮合法＞ＡＰＴＥＳ−ＧＡ法＞塩化チオニル＞吸着法となった。またベース電流の大きさや電位印加後ベース電流が安定するまでの時間は各方法で差があり、吸着法＜塩化シアヌル法＜ＡＰＴＥＳ−ＧＡ法＜ＷＳＣ脱水縮合法＜塩化チオニル法の順にベース電流が大きく安定時間が長くなった。
【００２２】
塩化シアヌル法により作製したチロシナーゼ固定化ＰＦＣの検量線の直線領域は０．０１μＭ〜３０μＭ、感度（直線領域の傾き：１０４．８nA／μＭ）であり出力限界電流を０．５nAとして見積もった検出限界は４．７μＭであった。同一条件で作製したＧＣ電極の応答と比較すると図１１に示すように（直線領域の傾き：１７．７nA／μＭ）でありＰＦＣのほうが感度で約６倍優れていることがわかった。キノン→カテコールの電子移動速度の違い、表面に存在する反応性残基の量の違いによる酵素固定化量の違いが要因として考えられる。
【００２３】
【表１】
2005083873.tif 000003
（実施例４）
【００２４】
グルコースオキシダーゼ固定化炭素電極によるグルコースの電気化学検出
２−１  グルコースオキシダーゼ固定化炭素基材の作製
Ａ：ＰＦＣへのグルコースオキシダーゼの固定化（ＡＰＴＥＳ−ＧＡ法−２）
前処理１を行ったＰＦＣ棒をγ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）原液５mlに室温で１ｈ浸漬させることによりＰＦＣ表面をアミノシリル化した。トルエンで５分間超音波洗浄し吸着種を除いた後、窒素気流下で１０分間乾燥させた。ＡＰＴＥＳ処理したＰＦＣ端面を上に向けて５μｌのグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ；ＥＣ１．１．３．４，from aspergillus niger，＞１８０units／mg）溶液（１０mg／ml）と５μｌの１％グルタルアルデヒド（ＧＡ）を混合した溶液（計１０μｌ）をＰＦＣ端面に載せ、５００mlのビーカーをかぶせ室温で８ｈ放置した。これによりＰＦＣ表面のアミノ基とＧＯＤおよびＧＯＤ同士を架橋させＰＦＣ表面に酵素層を形成させた。図１２に表面の模式図を示す。図２のＡＰＴＥＳ−ＧＡ法−１と異なる点は、酵素とＧＡ混合液をＡＰＴＥＳ処理したＰＦＣ上で架橋させることにより、酵素同士の架橋反応が生じ多層の酵素層が電極上に形成される点である。得られた酵素固定化ＰＦＣ電極を注意深く純水で洗浄した後、０．１Ｍリン酸緩衝液（pH６．０）に浸し４℃で保存した。
Ｂ：ＧＣへのグルコースオキシダーゼの固定化（ＡＰＴＥＳ−ＧＡ法−２）
ＧＣ電極（直径３mm）は炭素の周りの絶縁性高分子をエッジングして炭素部分を２mm露出させたものを用いた。定法に従いＧＣ端面をアルミナ研磨し蒸留水中で超音波処理した後、窒素気流下で乾燥させた。
【００２５】
ＧＣの炭素部分をＡＰＴＥＳ原液５mlに室温で１ｈ浸漬させることによりＧＣ表面をアミノシリル化した後、ＰＦＣと同様に処理してＧＯＤ固定化ＧＣ電極を得た。
２−２  電気化学測定
サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）測定は図７の電気化学セルで行った。作用極１２には炭素電極（ＰＦＣおよびＧＣ）を用いた。図６に示すようにＰＦＣ、ＧＣ共に炭素端面（直径３mm）のみを露出させ、それ以外の炭素側面はＰＦＣ棒の上部１０mm（端子として利用）を除きパラフィルムで絶縁した。電解液には１mMのハイドロキノン（ＨＱ）を含むpH６．０の０．１Ｍリン酸緩衝液１０mlを用いた。窒素ガスを２０分間電解液に吹き込み電解液中の溶存酸素を完全に除去した。ＣＶ測定条件は下記の通りである。
【００２６】
初期電位：−０．６Ｖ  折り返し電位：＋０．８Ｖ  電位スキャン速度：５０mV／ｓ
図１３には表面状態の異なるＰＦＣ電極のサイクリックボルタモグラムを示す。ＡおよびＢは未処理（研磨のみ）およびＡＰＴＥＳ処理後のＰＦＣ電極のボルタモグラムである。ベンゾキノン／ＨＱの可逆な酸化還元波が０．１Ｖ近傍に観察される。ＡＰＴＥＳ処理により若干ピーク電流値が減少するもののピーク電位は変化していないことからＡＰＴＥＳ処理後もＰＦＣ電極本来の良好な電子移動特性が保たれていることがわかる。一方、ＣはＡＰＴＥＳ−ＧＡ−２法により酵素多重層を形成させた後のボルタモグラムである。Ｂに比べピーク電流がやや減少しピーク間電位差も広がり酸化還元波がやや不可逆な形状に変化している。図１２に示すように、ＧＯＤの蛋白質多重層が電極表面に形成されることによりヒドロキノンの電極表面への拡散が抑制されるためと考えられる。ＤはＣ測定後電解液にグルコース１２mMを添加し１０秒間溶液を攪拌した後に攪拌を止め測定したサイクリックボルタモグラムである。ベンゾキノン→ＨＱに由来する還元波がほぼ完全に消失し、ＨＱ→ベンゾキノンに伴う酸化波が著しく増大した。これは下記に示すＨＱ／ベンゾキノンを電子メディエーターとするグルコースオキシダーゼ反応が電極表面で生じたことを示している。すなわち電極反応で生じた１，４−ベンゾキノン（式１）が、グルコースオキシダーゼ反応で生じた還元型酵素（ＧＯＤ−ＦＡＤＨ2）（式２）と反応して酵素を酸化再生させ自身はＨＱに変化し（式３）、生じたＨＱが再び１，４−ベンゾキノンに酸化されることでこの酵素触媒サイクルが繰り返されることになる。
【００２７】
ＨＱ      →  １，４−ベンゾキノン  ＋  ２ｅ-   ＋  ２Ｈ+            （１）
グルコース＋ＧＯＤ−ＦＡＤ（酵素酸化型）→
グルコノラクトン＋ＧＯＤ−ＦＡＤＨ2（酵素還元型）                    （２）
ＧＯＤ−ＦＡＤＨ2（酵素還元型）＋１，４−ベンゾキノン→
ＧＯＤ−ＦＡＤ（酵素酸化型）＋ＨＱ                                    （３）
次にこの結果に基づき、＋０．３Ｖで定電位アンペロメトリーを行った。結果を図１４に示す。電解液０．１Ｍリン酸緩衝液（pH６．０）１０mlをマグネティックスターラーで一定速度で攪拌し電位を印加した後バックグランド電流が一定になったところで０．２mMのＨＱを添加すると式１に基づく酸化電流が生じた。定常値に達したところで１mMのグルコースを１０回添加すると階段状の電流応答が得られた。応答時間は３０秒から２分である。実施例３に比べ比較的長時間を要する理由は、図１１に示すようにＡＰＴＥＳ−ＧＡ法−２では酵素同士の架橋によりＡＰＴＥＳ層の上部に酵素多重層が形成されるため、実施例３の各方法に比べ酵素膜層が厚くなっているためである。グルコースに対する電流応答はＨＱ濃度に依存し、概してＨＱ濃度が高くなるほどグルコース応答も増大した。図１５には１mMのＨＱを電子メディエーターとするグルコースの検量線をＰＦＣとＧＣで比較して示す。この測定条件ではＧＣではほとんど応答を得ることができなかった。ＧＯＤ固定化ＧＣのＣＶ測定より、ＨＱ→ベンゾキノンへの酸化が＋０．３Ｖよりも高電位値（ピーク電位：＋０．５Ｖ）にシフトしていること、ＡＰＴＥＳはエッジ面のＯＨに対して結合するためＰＦＣとＧＣのエッジ官能基の違いにより酵素修飾量が異なることなどが要因として考えられる。以上の結果は、エッジ官能基を高密度に有するＰＦＣが化学修飾による高機能バイオセンサの作製に極めて有利であることを裏付ける結果である。
（実施例５）
【００２８】
電子メディエーター吸着炭素電極の作製とＮＡＤＨの電気化学検出
１）電子メディエーター吸着炭素基材の作製
ＰＦＣ端面（直径３mm）をエメリーペーパー（２０００番）で研磨した後、純水中で５分間超音波洗浄した。１００℃のドライオーブンで５分間乾燥させた後、図１６に示す６種類の電子メディエーターの２mMエタノール溶液５μｌをＰＦＣ電極（直径３mm）の端面に載せ、５００mlビーカーをかぶせ室温で６ｈ乾燥させた後、蒸留水で洗浄した。ＧＣ電極を定法に従ってアルミナ研磨し、蒸留水中で超音波洗浄し室温で風乾した後、ＰＦＣと同様に処理して電子メディエーター吸着ＧＣ電極を作製した。
２）電気化学測定
２−１  電子メディエーター吸着ＰＦＣの電気化学特性
電気化学測定は図７に示す１室型セルで行った。電解液には０．１Ｍリン酸緩衝液（pH７．０）１０mlを用い、作製した電子メディエーター吸着電極を作用極、対極には白金線、参照極にはＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いた。測定の前に窒素ガスを２０分間バブリングして電解液中の溶存酸素を除去した。図１７にＤＣＰＩＰ吸着電極およびＭＰＭＳ吸着電極についてＰＦＣとＧＣのサイクリックボルタモグラムを比較して示す。
【００２９】
ＣＶ測定条件は下記の通りである。
【００３０】
ＤＣＩＰＣ  初期電位：−０．２Ｖ  折り返し電位：＋０．２５Ｖ
電位スキャン速度：２０mV／ｓ
ＭＰＭＳ  初期電位：−０．５Ｖ  折り返し電位：＋０．１Ｖ
電位スキャン速度：２０mV／ｓ
ＤＣＰＩＰ、ＭＰＭＳいずれもＰＦＣで明らかに可逆な電子移動反応に基づく酸化還元波が得られたのに対し、ＧＣでははっきりとした酸化還元波は得られなかった。これらの酸化還元波は電子スキャン５０回繰り返しても減衰せず、安定に固定化されていることがわかった。グラファイト結晶のベーサル面にメチレンブルーなどの多環芳香族化合物が吸着することが既に報告されている。ＰＦＣはグラファイトエッジの表面密度が高くそれが同一面に整列していることなどがこれらの色素（電子メディエーター）の強い吸着の要因と考えられる。図１８には電子スキャン速度を変えたときのチオニン吸着ＰＦＣ電極のサイクリックボルタモグラムを示し、図１９にはピーク電流とスキャン速度の関係を示す。ピーク電流は電位スキャン速度に比例して増大し、この応答が吸着電気活性種のものであることを支持している。表２に６種の電子メディエーター吸着ＰＦＣの電気化学特性をまとめて示す。ピーク間電位差はメルドラブルーを除き概ね２６mVから４２mV程度で表面密度は１．０８（×１０-10）mol／cm2〜２．９９（×１０-10）mol／cm2であった。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
２−２  ＮＡＤＨの電気化学検出
ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型）は３００種を超えるデヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）の基質型補酵素であり、迅速簡便なＮＡＤＨ定量法はデヒドロゲナーゼ基質測定の観点から食品分析・医療計測の分野で重要なテーマである。一般にＮＡＤＨを電解酸化する場合には比較的高い印加電圧を必要とする。例えばpH７のリン酸緩衝液中において１００mV／ｓで電位ｗをスキャンさせた場合、ＮＡＤＨの酸化ピーク電位はＧＣでは＋０．５Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）、ＰＦＣでは＋０．３Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）程度である。この電位領域では実試料に存在する被酸化性物質も酸化されるため、これらの妨害が問題となる。そこで各種電子メディエーターを電解触媒として用いることにより検出電位を低電位側にシフトさせる試みが行われている。今回作製した電子メディエーター吸着ＰＦＣ電極を用いてＮＡＤＨの電解触媒応答を測定した。
【００３３】
今回作製した電子メディエーター吸着ＰＦＣの中では特にＭＰＭＳ吸着ＰＦＣ電極において最も検出電位を定電位側にシフトさせることに成功した。ＭＰＭＳ吸着ＰＦＣのＮＡＤＨ共存下および非共存下でのサイクリックボルタモグラムを図２０に示す。−０．１５Ｖ近傍の酸化還元波は１mMのＮＡＤＨ添加後図のように変化し還元波が消失して酸化波が増大した。これは下記の電解触媒反応の進行を示唆している。
【００３４】
ＮＡＤＨ ＋ ＭＰＭＳ（酸化型） → ＮＡＤ＋ ＋ ＭＰＭＳ（還元型）      （４）
ＭＰＭＳ（還元型） → ＭＰＭＳ（酸化型）＋２Ｈ+ ＋ ２ｅ-              （５）
同一の電解セルを用いて溶液を一定速度で攪拌し、−０．１Ｖで定電位アンペロメトリーを行い、ＮＡＤＨの検量線を作製した。ＮＡＤＨ標準溶液の所定量を電解液に添加するとほぼ１分程度で定常値に達した。図２１に示すように検量線はＮＡＤＨ濃度１０μＭから１２０μＭの範囲で直線性を示し、５nAを出力限界として見積もった検出限界は１．２２μＭであった。さらに実施例３および実施例４の方法を組み合わせて電子メディエーターと共にデヒドロゲナーゼを固定化すれば、各種デヒドロゲナーゼ基質計測用センサの作製も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】炭素基材上への塩化シアヌル法による蛋白質固定化の概念図である。
【図２】炭素基材上へのＡＰＴＥＳ−ＧＡ法による蛋白質固定化の概念図である。
【図３】炭素基材上へのｗｓｃ脱水縮合法による蛋白質固定化の概念図である。
【図４】炭素基材上への塩化チオニル法による蛋白質固定化の概念図である。
【図５】電気化学測定に用いたＰＦＣ電極を示す図である。
【図６】ＧＣ電極との応答の比較に用いたＰＦＣ電極を示す図である。
【図７】測定に用いた電気化学セルを示す図である。
【図８】カテコールのリサイクリング反応を示す概念図である。
【図９】チロシナーゼ固定化ＰＦＣによるカテコールの時間−電流曲線を示すグラフである。
【図１０】それぞれの固定化法により得られたカテコールの検量線を示すグラフである。
【図１１】チロシナーゼ固定化ＰＦＣとＧＣの検量線を示すグラフである。
【図１２】炭素基材へのＡＰＴＥＳ−ＧＡ法−２による蛋白質の固定化の概念図である。
【図１３】表面状態の異なるＰＦＣ電極のサイクリックボルタモグラムを示すグラフである。
【図１４】グルコースオキシダーゼ固定化ＰＦＣの時間−電流曲線を示すグラフである。
【図１５】グルコースオキシダーゼ固定化ＰＦＣ電極とＧＣ電極の検量線を示すグラフである。
【図１６】各種のメディエータの構造を示す図である。
【図１７】ＤＩＰＩＰおよびＭＰＭＳを吸着させたＰＦＣ電極とＧＣ電極のＣＶの比較を示すグラフである。
【図１８】電位スキャン速度を変えたときのチオニン吸着ＰＦＣ電極のＣＶを示すグラフである。
【図１９】ピーク電流とスキャン速度との関係を示すグラフである。
【図２０】ＭＰＭＳ吸着ＰＦＣ電極のＮＡＤＨ添加前後のＣＶを示すグラフである。
【図２１】ＭＰＭＳ吸着ＰＦＣによるＮＡＤＨの検量線を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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