(57)【要約】【課題】細胞を特定の形状に誘導すること、異なる種類の細胞を制御された状態で混在したまま培養することが容易な細胞培養足場およびこの細胞培養足場を用いた細胞培養方法を提供することを目的としている。【解決手段】レーザーアブレーション法等の気相法によって形成された生体親和性を備えた生体親和性材料からなる生体親和性薄膜層を基材の表面に備えていることを特徴としている。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、人工的に細胞増殖を制御し、意図した機能を持つ生体組織を再生するのに適した細胞培養足場およびこの細胞培養足場を用いた細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  従来の細胞培養は、均質・一様な培養床、もしくは培養足場上で行われており、集合として見た場合の細胞を特定の形状に誘導すること（選択的培養）、あるいは異なる種類の細胞を制御された状態で混在したまま培養（共培養）することは困難であった。
また、高分子材料中にハイドロキシアパタイト微粒子を分散させた細胞培養用基材も既に提案されている（特許文献１参照）が、この細胞培養用基材の場合もハイドロキシアパタイト微粒子が分散しているので、細胞を特定の形状に誘導すること（選択的培養）、あるいは異なる種類の細胞を制御された状態で混在したまま培養（共培養）することは自由に行えない。【０００３】
【特許文献１】    特開平７−２６５０５６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  本発明は、上記事情に鑑みて、細胞を特定の形状に誘導すること、異なる種類の細胞を制御された状態で混在したまま培養することが容易な細胞培養足場およびこの細胞培養足場を用いた細胞培養方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】  上記目的を達成するために、本発明の請求項１に記載の細胞培養足場（以下、「請求項１の細胞培養足場」と記す）は、細胞培養したい形状に形成した生体親和性を備えた生体親和性材料からなる生体親和部に隣接して非生体親和性または難生体親和性材料からなる生体非親和部が設けられていることを特徴としている。【０００６】  本発明の請求項２に記載の細胞培養足場（以下、「請求項２の細胞培養足場」と記す）は、基材の表面に気相法によって形成された生体親和性を備えた生体親和性材料からなる生体親和性薄膜層を備えていることを特徴としている。【０００７】  本発明の請求項３に記載の細胞培養足場（以下、「請求項３の細胞培養足場」と記す）は、請求項２の細胞培養足場において、生体親和性の異なる材料からなる複数の生体親和性薄膜層を備えていることを特徴としている。【０００８】  本発明の請求項４に記載の細胞培養足場（以下、「請求項４の細胞培養足場」と記す）は、請求項２または請求項３の細胞培養足場において、生体親和性材料がハイドロキシアパタイトであることを特徴としている。【０００９】  本発明の請求項５に記載の細胞培養足場（以下、「請求項５の細胞培養足場」と記す）は、請求項２〜請求項４のいずれかの細胞培養足場において、気相法が、レーザーアブレーション法であることを特徴としている。【００１０】  本発明の請求項６に記載の細胞培養足場（以下、「請求項６の細胞培養足場」と記す）は、請求項２〜請求項５のいずれかの細胞培養足場において、基材が、塑性変形可能な材料で形成されていることを特徴としている。【００１１】  本発明の請求項７に記載の細胞培養方法（以下、「請求項７の細胞培養方法」と記す）は、請求項２〜請求項６のいずれかの細胞培養足場の生体親和性薄膜層の細胞培養不要部分をエッチングにより除去する薄膜層除去工程と、薄膜層除去工程後、残った生体親和性薄膜層を用いて細胞培養する工程とを備えることを特徴としている。【００１２】  本発明の請求項８に記載の細胞培養方法（以下、「請求項８の細胞培養方法」と記す）は、複数の請求項２〜請求項６のいずれかの細胞培養足場の生体親和性薄膜層に、異なる種類の特定細胞誘導因子または細胞を吸着させたのち、複数の特定細胞誘導因子または細胞を定着させた定着済み細胞培養足場を培養組織に合ったパターンで組み合わせた状態で細胞培養することを特徴としている。【００１３】  本発明において、基材としては、特に限定されないが、たとえば、金属ワイヤ、有機系繊維、ポリＬ乳酸、ポリグリコール酸等の生体吸収性材料などの可撓性あるいは柔軟性に富むもの、あるいは、金属片、ガラス片、樹脂片等が
挙げられる。
気相法としては、特に限定されないが、たとえば、電子デバイスプロセスまたはマイクロマシンプロセスで用いる薄膜形成あるいは積層に用いられるスパッタリング法、反応性蒸着法、レーザーアブレーション法等が挙げられ、請求項４の細胞培養足場のように、レーザーアブレーション法が好ましい。【００１４】  また、生体親和性材料としては、特に限定されないが、たとえば、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）、チタン、ガラスなどが挙げられ、請求項３の細胞培養足場のように、ハイドロキシアパタイトが好ましい。
非親和性材料または難生体親和性材料としては、特に限定されないが、たとえば、シリコーン樹脂、４フッ化エチレン樹脂などが挙げられる。
請求項３の細胞培養足場において、複数の生体親和性薄膜層は、基材の表面に複層に積層されていても構わないし、基材の面方向に並設されていても構わない。【００１５】  特定細胞誘導因子としては、特に限定されないが、たとえば、インターロイキンのような細胞誘導因子、またはＢＭＰのような骨誘導因子に代表されるサイトカイン、ヘパリン，ヒアルロン酸のような生理活性分子などが挙げられる。
なお、本発明の細胞培養足場と同様な製造方法を用いれば、バイオセンサ、バイオチップ、ＤＮＡチップの作製を行うこともできる。【００１６】  請求項１の細胞培養足場の製造方法としては、特に限定されないが、たとえば、上記請求項２の細胞培養足場の生体親和性薄膜層をエッチングする方法や、生体親和性材料からなる板材等の表面に非生体親和性または難生体親和性材料からなる膜をフォトレジスト法などにより形成する方法が挙げられる。
請求項７の細胞培養方法において、エッチング方法は、物理エッチングおよび化学エッチングのいずれでも構わない。
【発明の効果】
【００１７】  請求項１の細胞培養足場は、細胞培養したい形状に形成した生体親和性を備えた生体親和性材料からなる生体親和部に隣接して非生体親和性または難生体親和性材料からなる非生体親和部が設けられているので、必要な形状に細胞増殖を人工的に行わせることができ、意図した機能を持つ生体組織を容易に再生することができる。【００１８】  請求項２の細胞培養足場は、基材表面に生体親和性を備えた生体親和性材料からなる生体親和性薄膜層を備えているので、生体親和性薄膜層を必要な部分以外をエッチング等で容易に除去できる。すなわち、請求項１の細胞培養足場を容易に製造することができる。したがって、必要な形状に細胞増殖を人工的に行わせることができ、意図した機能を持つ生体組織を容易に再生することができる。【００１９】  請求項３の細胞培養足場は、生体親和性の異なる材料からなる複数の生体親和性薄膜層を備えているので、複数の細胞を人工的に所望パターンで増殖できる。したがって、意図した機能を持つ生体組織をより容易に再生することができる。【００２０】  請求項４の細胞培養足場は、生体親和性材料がハイドロキシアパタイトであるので、蛋白質の持つアミノ基、カルボキシル基とアパタイトの持つＣａ２＋，ＰＯ４３−の結合による吸着性を利用して、より細胞増殖性に優れたものとなる。【００２１】  請求項５の細胞培養足場は、レーザーアブレーション法を用いて生体親和性薄膜層が形成されているので、生体親和性材料が、積層の際に分解したり、変質したりすることがなく、より均質な生体親和性薄膜層となる。したがって、より正確に細胞を人工的に所望パターンで増殖できる。【００２２】  請求項６の細胞培養足場は、基材が、塑性変形可能な材料で形成されているので、基材とともに生体親和性薄膜層の形状も変形させることができ、より容易に意図した形状に細胞を増殖させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】  以下に、本発明を、その実施の形態をあらわす図面を参照しつつ詳しく説明する。
図１は、本発明にかかる細胞培養足場の第１の実施の形態をあらわしている。【００２４】  図１に示すように、この細胞培養足場１は、金属片、ガラス片、樹脂片等からなる基材１１と、基材１１の表面にレーザーアブレーション法を用いて形成された生体親和性薄膜層１２とを備えている。
そして、この細胞培養足場１は、たとえば、図２（ａ）に示すように、まず、リソグラフィ技術およびエッチング技術を用いて、不要な部分の生体親和性薄膜層１２を取り除いて、不要な部分は基板１１を露出させる。【００２５】  つぎに、この不要な部分の生体親和性薄膜層１２を取り除いた細胞培養足場１ａに、特定細胞誘導因子を滴下したのち、洗浄を行い、図２（ｂ）に示すように、細胞培養足場１ａの生体親和性薄膜層１２部分のみに、特定細胞誘導因子を吸着させる。
そして、この特定細胞誘導因子を吸着させた細胞培養足場１ｂに図２（ｃ）に示すように、細胞Ｚを吸着させて培養すると、図２（ｄ）に示すように、生体親和性薄膜層１２に沿って細胞Ｚが増殖し、たとえば、神経回路網形成などを行うことができる。【００２６】  図３は、本発明にかかる細胞培養足場の第２の実施の形態をあらわしている。
図３に示すように、この細胞培養足場２は、上記第１の実施の形態と同様の基材２１表面に、生体親和性が異なる生体親和性薄膜層２２、２３がその厚み方向に積層されている。【００２７】  そして、この細胞培養足場２は、たとえば、図４（ａ）に示すように、まず、リソグラフィ技術およびエッチング技術を用いて、上層の生体親和性薄膜層２３の不要部分を取り除いて、下層の生体親和性薄膜層２２を所望パターンで露出させたのち、両生体親和性薄膜層２２、２３に特定細胞誘導因子を吸着させる。そして、図４（ｂ）に示すように、生体親和性薄膜層２２部分に細胞Ｘ、生体親和性薄膜層２３部分に細胞Ｙを吸着させれば、図４（ｃ）に示すように、生体親和性薄膜層２２部分に細胞Ｘのみが増殖し、生体親和性薄膜層２３部分に細胞Ｙのみが増殖した細胞組織を得ることができる。【００２８】  図５および図６は本発明にかかる細胞培養足場の第３の実施の形態をあらわしている。
図５に示すように、この細胞培養足場３は、金属ワイヤ、有機系繊維、生体吸収性材料などの可撓性あるいは柔軟性に富む線状をした基材３１の周面の生体親和性薄膜層３２が形成され、図６（ａ）に示すように、線状あるいは紐状になっている。【００２９】  そして、この細胞培養足場３は、図６（ｂ）に示すように、細胞誘導因子Ａを吸着させた細胞培養足場３ａを作製するとともに、図６（ｃ）に示すように、細胞誘導因子Ｂを吸着させた細胞培養足場３ｂを作製したのち、図６（ｄ）に示すように、細胞培養足場３ａおよび細胞培養足場３ｂを細胞培養したいパターンに組み合わせ、図６（ｅ）に示すように、意図する細胞組織４を得ることができる。即ち、複数の細胞を共培養することができる。【００３０】  本発明は、上記の実施の形態に限定されない。たとえば、上記の実施の形態では線状の可撓性あるいは柔軟性に富む細胞培養足場を用いて複数の細胞を共培養するようにしていたが、板状やブロック状の細胞培養足場を異なる細胞誘導因子を吸着させた状態で、モザイク状に並べたり、積み重ねたりして共培養を行うこともできる。
【実施例１】
【００３１】  以下の方法によって細胞培養足場を作製し、生体物質の選択性吸着を確認した。
基材としてのガラス基板上、及びシリコン基板上へ生体親和性としてのハイドロキシアパタイトをレーザーアブレーション法により厚さ３００ｎｍ堆積させたのち、結晶性を高める目的で熱処理を施しで生体親和性薄膜層薄膜を作製した。これに、フォトリソグラフィーとウエットエッチングを用い、図２（ａ）のようなパターンを形成した。この試料を、蛋白質（ミオグロビン１ｍｇ／リットル）を溶かした純水に浸し、その前後で光学顕微鏡、蛍光顕微鏡による観察を行った。その結果、純水で洗浄、乾燥した試料の光学顕微鏡観察によりハイドロキシアパタイト配線上でミオグロビンの赤い色素が確認された。また、蛍光顕微鏡観察においてもハイドロキシアパタイトパターン部と基板部でハイドロキシアパタイトの蛋白質吸着を示唆するコントラストが確認された。また、ミオグロビン以外にも、予め蛍光マーカーを添加したタンパク質を用いた実験においても同様な結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】  本発明にかかる細胞培養足場の第１の実施の形態を模式的にあらわす断面図である。
【図２】  図１の細胞培養足場の細胞培養方法の１例を工程順に説明する説明図である。
【図３】  本発明にかかる細胞培養足場の第２の実施の形態を模式的にあらわす断面図である。
【図４】  図３の細胞培養足場の細胞培養方法の１例を工程順に説明する説明図である。
【図５】  本発明にかかる細胞培養足場の第３の実施の形態を模式的にあらわす断面図である。
【図６】  図５の細胞培養足場の細胞培養方法の１例を工程順に説明する説明図である。
【符号の説明】
【００３２】１，２，３  細胞培養足場
１１，２１，３１  基材
１２，２２，２３，３２  生体親和性薄膜層
Ｘ，Ｙ，Ｚ  細胞
【図１】
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【図２】
2005278609.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年6月11日(2004.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養したい形状に形成した生体親和性を備えた生体親和性材料からなる生体親和部に隣接して非生体親和性または難生体親和性材料からなる非生体親和部が設けられていることを特徴とする細胞培養足場。
【請求項２】
基材の表面に気相法によって形成された生体親和性を備えた生体親和材料からなる生体親和性薄膜層を備えていることを特徴とする細胞培養足場。
【請求項３】
生体親和性の異なる材料からなる複数の生体親和性薄膜層を備えている請求項２に記載の細胞培養足場。
【請求項４】
生体親和性材料がハイドロキシアパタイトである請求項２または請求項３に記載の細胞培養足場。
【請求項５】
気相法が、レーザーアブレーション法である請求項２〜請求項４のいずれかに記載の細胞培養足場。
【請求項６】
基材が、塑性変形可能な材料で形成されている請求項２〜請求項５のいずれかに記載の細胞培養足場。
【請求項７】
請求項２〜請求項６のいずれかに記載の細胞培養足場の生体親和性薄膜層の細胞培養不要部分をエッチングにより除去する薄膜除去工程と、
薄膜層除去工程後、残った生体親和性薄膜層を用いて細胞を培養する工程とを備えることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項８】
複数の請求項２〜請求項６のいずれかに記載の細胞培養足場の生体親和性薄膜層に、異なる種類の特定細胞誘導因子または細胞を吸着させたのち、複数の特定細胞誘導因子または細胞を吸着させたのち、複数の特定細胞誘導因子または細胞を定着させた定着済み細胞培養足場を培養組織に合ったパターンで組み合わせた状態で細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法。