(57)【要約】【課題】  核酸分離精製カートリッジに貯留した液体が飛散することなく、周辺の汚染や他のサンプルへのコンタミネーションが無く、分離性能良く、簡便で、迅速に、自動化可能に、核酸を含む検体から核酸を高い信頼性で分離精製する。【解決手段】  少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔質体を収容した核酸分離精製カートリッジ１１と、該核酸分離精製カートリッジ１１にエアを送り出す圧力発生装置４３とを備え、この核酸分離精製カートリッジ１１に注入される核酸を含む検体から核酸を分離精製する自動核酸分離精製装置であって、圧力発生装置４３が、核酸分離精製カートリッジ１１に注入した液体１６を、核酸吸着性多孔質体１１ｂを通過させてカートリッジ１１外へ排出する際に、カートリッジ１１に注入した液体１６の体積に応じた体積のエアを送り出すようにした。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性の固相を収容した核酸分離精製カートリッジと、該核酸分離精製カートリッジにエアを送り出す圧力発生装置とを備え、この核酸分離精製カートリッジに注入される核酸を含む検体から核酸を分離精製する自動核酸分離精製装置であって、
前記圧力発生装置が、前記核酸分離精製カートリッジに注入した液体を、前記核酸吸着性の固相を通過させてカートリッジ外へ排出する際に、前記カートリッジに注入した液体の体積に応じた体積のエアを送り出すことを特徴とする自動核酸分離精製装置。
【請求項２】
前記核酸分離精製カートリッジを装着したときの前記圧力発生装置から前記核酸分離精製カートリッジまでの該カートリッジ内容積を含む連通された全空間体積をＶ、前記核酸分離精製カートリッジに注入する液体の体積をＶLとしたとき、前記圧力発生装置から送り出すエア体積ＶPを、大気圧下で、
ＶP = a×Ｖ + ＶL  (０．０１≦ a ≦１．７) 
で表される範囲に設定する制御部を備えたことを特徴とする請求項１記載の自動核酸分離精製装置。
【請求項３】
少なくとも、
（１）核酸を含む検体を前記核酸分離精製カートリッジに注入し加圧によりカートリッジ外に排出する工程、
（２）洗浄液を前記核酸分離精製カートリッジに注入し加圧によりカートリッジ外に排出する工程、
（３）回収液を前記核酸分離精製カートリッジに注入し加圧によりカートリッジ外に排出する工程、
の各工程に対して予め求めた前記エア体積ＶPをそれぞれ記憶する記憶部を備え、
前記制御部が、前記工程毎に前記記憶部から予め求めたエア体積ＶPを参照して設定することを特徴とする請求項２記載の自動核酸分離精製装置。
【請求項４】
前記核酸吸着性の固相が、イオン結合が関与しない弱い相互作用で核酸が吸着する、有機高分子からなる多孔質体であることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１項記載の自動核酸分離精製装置。
【請求項５】
前記有機高分子からなる多孔質体が、水酸基を有する有機高分子からなることを特徴とする請求項４記載の自動核酸分離精製装置。
【請求項６】
前記核酸吸着性の固相が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料からなることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれか１項記載の自動核酸分離精製装置。
【請求項７】
前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物の鹸化率が、５％以上であることを特徴とする請求項６記載の自動核酸分離精製装置。
【請求項８】
前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の鹸化物である、請求項６又は請求項７記載の自動核酸分離精製装置。
【請求項９】
前記核酸吸着性の固相が、表裏非対称性の多孔性膜であることを特徴とする請求項１〜請求項８のいずれか１項記載の自動核酸分離精製装置。
【請求項１０】
容器内に核酸吸着性多孔質体を収容した核酸分離精製カートリッジと、該核酸分離精製カートリッジにエアを送り出す圧力発生装置とを用い、この核酸分離精製カートリッジに注入される核酸を含む検体から核酸を分離精製する核酸分離精製方法であって、
前記圧力発生装置から前記核酸分離精製カートリッジまでの該カートリッジ内容積を含む連通された全空間体積をＶ、前記各工程における核酸分離精製カートリッジに注入する液体の体積をＶLとしたとき、前記圧力発生装置から送り出すエア体積ＶPを、大気圧下で、
ＶP = a×Ｖ + ＶL  (０．０１≦ a ≦１．７) 
で表される範囲に設定することを特徴とする自動核酸分離精製方法。
【請求項１１】
少なくとも、
（１）核酸を含む検体を前記核酸分離精製カートリッジに注入し加圧によりカートリッジ外に排出する工程、
（２）洗浄液を前記核酸分離精製カートリッジに注入し加圧によりカートリッジ外に排出する工程、
（３）回収液を前記核酸分離精製カートリッジに注入し加圧によりカートリッジ外に排出する工程、
をこの順で含み、
前記各工程に対する前記エア体積ＶPをそれぞれ予め求めておき、各工程にて設定する前記エア体積ＶPを、この予め求めたエア体積ＶPを参照することで設定することを特徴とする請求項１０記載の自動核酸分離精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を分離精製する自動核酸分離精製装置及び方法に関し、より詳細には、圧力発生装置を用いた加圧により、核酸を含む検体から核酸を分離精製する改良技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸は、様々な分野で種々の形態で使用されている。例えば、組換え核酸技術の領域においては、核酸をプローブ、ゲノム核酸、及びプラスミド核酸の形状で用いることを要求する。
診断分野においても、核酸は種々の方法で用いられている。例えば、核酸プローブは、ヒトの病原体の検出及び診断に日常的に用いられている。同様に核酸は遺伝障害の検出に用いられている。核酸はまた食品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は遺伝地図の作製からクローニング及び組換え発現におよぶ種々の理由により、興味ある核酸の位置確認、同定及び単離において日常的に用いられている。
多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手できず、そして単離及び精製操作が煩雑で時間を要する。このしばしば時間を消費する煩雑な操作は核酸の損失に結びつきやすい。血清、尿及びバクテリアのカルチャーから得られた試料の核酸の精製においては、コンタミネーション及び疑陽性の結果が生じるという危険性も加わる。
広く知られた分離精製方法の一つに、核酸を二酸化珪素、シリカポリマー、珪酸マグネシウム等の固相に吸着させ、引き続く洗浄、脱着等の操作によって分離精製する方法がある（例えば、特許文献１）。この方法は、分離性能としては優れているが、簡便性、迅速性、自動化及び小型化適性においては十分でなく、同一性能の吸着媒体の工業的大量生産が困難であり、かつ取扱いが不便で、種々の形状に加工しがたい等の問題点がある。
【０００３】
上記問題を解決し、簡便かつ効率よく核酸を分離精製する方法の一つとして、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する自動核酸分離精製装置によって、核酸を分離精製する方法が記載されている（特許文献２）。
【特許文献１】特公平７−５１０６５号公報
【特許文献２】特開２００３−１２８６９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、核酸吸着性多孔膜に吸着した核酸を洗浄する工程、及び回収する工程において、核酸分離精製カートリッジに注入した液体を、加圧によりカートリッジ外に排出する際、液体排出終了時にカートリッジから加圧エアが排出され、カートリッジ下部に貯留した液体が飛散し、周辺の汚染や他のサンプルへのコンタミネーションを引き起こす懸念のない加圧方法については、これまでのところ知られていない。
少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔質体（核酸吸着性多孔性膜）を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する自動核酸分離精製装置においては、核酸分離精製カートリッジに注入した液体を、加圧によりカートリッジ外に排出する際、液体排出終了時にカートリッジから加圧エアが排出され、カートリッジ下部に貯留した液体が飛散し、周辺の汚染や他のサンプルへのコンタミネーションを引き起こす要因となっていた。
【０００５】
本発明は、上記状況に鑑みてなされたものであり、核酸分離精製カートリッジに貯留した液体が飛散することなく、周辺の汚染や他のサンプルへのコンタミネーションが無く、分離性能良く、簡便で、迅速に、自動化可能に、核酸を含む検体から核酸を高い信頼性で分離精製することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔質体（核酸吸着性多孔性膜）を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する自動核酸分離精製装置において、カートリッジにサンプル、洗浄液、回収液等の液体を所定量注入後、圧力発生装置により加圧しカートリッジ内部の液体をカートリッジ外に排出する工程で、カートリッジから液体が出終わったときのカートリッジ内部の圧力が液跳ねを起こさない範囲となるよう、注入した液体の体積に応じた体積のエアを圧力発生装置から送り出すことによって、上記課題を解決できることを見出した。
さらに本発明者らが鋭意検討した結果、液跳ねを起こさない範囲とは、上記核酸分離精製カートリッジを装着したときの圧力発生装置から核酸分離精製カートリッジまでのカートリッジ内容積を含む連通された全空間体積をＶとし、カートリッジに注入する液体の体積をＶLとしたとき、圧力発生装置から送り出すエア体積ＶPが、大気圧下で、ＶP = a×Ｖ + ＶL  (０．０１≦a≦１．７) で表される範囲であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
即ち、本発明は、下記の構成よりなるものである。
１．  少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性の固相を収容した核酸分離精製カートリッジと、該核酸分離精製カートリッジにエアを送り出す圧力発生装置とを備え、この核酸分離精製カートリッジに注入される核酸を含む検体から核酸を分離精製する自動核酸分離精製装置であって、前記圧力発生装置が、前記核酸分離精製カートリッジに注入した液体を、前記核酸吸着性の固相を通過させてカートリッジ外へ排出する際に、前記カートリッジに注入した液体の体積に応じた体積のエアを送り出すことを特徴とする自動核酸分離精製装置。
２．  前記核酸分離精製カートリッジを装着したときの前記圧力発生装置から前記核酸分離精製カートリッジまでの該カートリッジ内容積を含む連通された全空間体積をＶ、前記核酸分離精製カートリッジに注入する液体の体積をＶLとしたとき、前記圧力発生装置から送り出すエア体積ＶPを、大気圧下で、
ＶP = a×Ｖ + ＶL  (０．０１≦ a ≦１．７) 
で表される範囲に設定する制御部を備えたことを特徴とする第１項記載の自動核酸分離精製装置。
３．  少なくとも、
（１）核酸を含む検体を前記核酸分離精製カートリッジに注入し加圧によりカートリッジ外に排出する工程、
（２）洗浄液を前記核酸分離精製カートリッジに注入し加圧によりカートリッジ外に排出する工程、
（３）回収液を前記核酸分離精製カートリッジに注入し加圧によりカートリッジ外に排出する工程、
の各工程に対して予め求めた前記エア体積ＶPをそれぞれ記憶する記憶部を備え、前記制御部が、前記工程毎に前記記憶部から予め求めたエア体積ＶPを参照して設定することを特徴とする第２項記載の自動核酸分離精製装置。
４．  前記核酸吸着性の固相が、イオン結合が関与しない弱い相互作用で核酸が吸着する、有機高分子からなる多孔質体であることを特徴とする第１〜第３項のいずれか１項記載の自動核酸分離精製装置。
５．  前記有機高分子からなる多孔質体が、水酸基を有する有機高分子からなることを特徴とする第４項記載の自動核酸分離精製装置。
６．  前記核酸吸着性の固相が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料からなることを特徴とする第１〜第５項のいずれか１項記載の自動核酸分離精製装置。
７．  前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物の鹸化率が、５％以上であることを特徴とする第６項記載の自動核酸分離精製装置。
８．  前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の鹸化物である、第６項又は第７項記載の自動核酸分離精製装置。
９．  前記核酸吸着性の固相が、表裏非対称性の多孔性膜であることを特徴とする第１項〜第８項のいずれか１項記載の自動核酸分離精製装置。
１０．  容器内に核酸吸着性の固相を収容した核酸分離精製カートリッジと、該核酸分離精製カートリッジにエアを送り出す圧力発生装置とを用い、この核酸分離精製カートリッジに注入される核酸を含む検体から核酸を分離精製する核酸分離精製方法であって、前記圧力発生装置から前記核酸分離精製カートリッジまでの該カートリッジ内容積を含む連通された全空間体積をＶ、前記各工程における核酸分離精製カートリッジに注入する液体の体積をＶLとしたとき、前記圧力発生装置から送り出すエア体積ＶPを、大気圧下で、
ＶP = a×Ｖ + ＶL  (０．０１≦ a ≦１．７) 
で表される範囲に設定することを特徴とする自動核酸分離精製方法。
１１．  少なくとも、
（１）核酸を含む検体を前記核酸分離精製カートリッジに注入し加圧によりカートリッジ外に排出する工程、
（２）洗浄液を前記核酸分離精製カートリッジに注入し加圧によりカートリッジ外に排出する工程、
（３）回収液を前記核酸分離精製カートリッジに注入し加圧によりカートリッジ外に排出する工程、
をこの順で含み、前記各工程に対する前記エア体積ＶPをそれぞれ予め求めておき、各工程にて設定する前記エア体積ＶPを、この予め求めたエア体積ＶPを参照することで設定することを特徴とする第１０項記載の自動核酸分離精製方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性の固相を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する自動核酸分離精製装置において、核酸分離精製カートリッジに洗浄液、回収液等の液体を一定量吐出注入後、このカートリッジに注入した液体の体積に応じた体積のエアを圧力発生装置から送り出すことによって、カートリッジ下部に貯留した液体を飛散させることを防止する。従って、周辺の汚染や他のサンプルへのコンタミネーションが無く、分離性能良く、簡便で、迅速に、自動化可能に、核酸を含む検体から核酸を高い信頼性で分離精製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に本発明に係る自動核酸分離精製装置の好適な実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔質体（核酸吸着性多孔性膜）を収容した核酸分離精製カートリッジ（以降は単にカートリッジと称する）と圧力発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する自動核酸分離精製装置において、(1)核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(2)該核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で洗浄する工程、及び(3)回収液を、該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程の各工程を、カートリッジに注入する液体の体積に応じた体積のエアを加圧装置から送り出すことで行うものである。
【００１０】
以下に本発明の自動核酸抽出装置による加圧方法について、図１の模式図を用いて説明する。図１（ａ）は、二個の開口１１ｃ，１１ｆを有する核酸吸着性多孔膜１１ｂを収容したカートリッジ１１に、一の開口１１ｃよりサンプル液、洗浄液、回収液等の液体を注入した後、自動核酸抽出装置の加圧ヘッドをカートリッジ１１上部に装着し、カートリッジ１１と圧力発生装置であるエアポンプ４３とが連通した空間で結合した状態を示したものである。カートリッジ１１に加圧ヘッドを装着したときエアポンプ４３からカートリッジ１１までの吸気流路１４とカートリッジ１１の内容積を含む連通した全体積をＶとし、カートリッジ１１に注入する液体１６の体積をＶLとし、エアポンプ４３により送り込むべきエア１８の体積をＶP、圧力をＰ1とする。エアポンプ４３からカートリッジ１１内部の液面までの空間体積はＶ-ＶLとなり、その圧力はＰ1である。また、カートリッジ１１外部の圧力もＰ1である。
【００１１】
ここで、エアポンプ４３によりＰ1、ＶPのエアをカートリッジ１１内に送り込む（図1（ｂ）参照）。エアポンプ４３からエア１８を送り込むことで、カートリッジ１１内部の空間体積の圧力が上昇し、液体１６は核酸吸着性多孔膜１１ｂを通過し他の開口１１ｆよりカートリッジ１１外部に排出される。カートリッジ１１から液体１６が完全に排出された時点でのエアポンプ４３からカートリッジ１１底部までの空間体積はＶ、圧力はＰ2となるとする（図1（ｃ）参照）。
【００１２】
このとき、カートリッジ１１内部の圧力Ｐ2が大きいと、カートリッジ１１から液体１６が完全に排出された後にエアが核酸吸着性多孔膜１１ｂを通過し、他の開口１１ｆより勢いよく排出され、カートリッジ１１下部に貯留した液体が飛散し、他のサンプルへのコンタミネーションや周辺への汚染の原因となる。液跳ねを防止するためには、カートリッジ１１から液体１６の排出が終了した時点の圧力Ｐ2を適切な範囲となるよう、注入した液体１６の体積に応じた体積のエアをエアポンプ４３から送り出すことが好ましい。
【００１３】
そのようなエアポンプ４３から送り出すエアの体積ＶPは、以下に示す計算式により求めた範囲が好ましい。エアポンプ４３により加圧し、液体１６がカートリッジ１１より排出される工程は、断熱圧縮・断熱膨張の系であるが、温度変化を無視できる範囲であるため、近似的にボイルの法則が成り立つ。従ってボイルの法則「ＰＶ ＝ 一定」より、
Ｐ1｛(Ｖ-ＶL)＋ＶP｝ ≒ Ｐ2Ｖ             （１）
が成り立つ。ここで、
Ｐ2 ＝ (a＋1)Ｐ1                          （２）
と置くと（ただし、ａは係数）、
Ｐ1｛(Ｖ-ＶL)＋ＶP｝ ＝ (a＋1)Ｐ1Ｖ      （３）
となり、ポンプから注入すべき体積ＶPは、
ＶP ＝ a×Ｖ ＋ ＶL                       （４）
と計算できる。
そして、液跳ねを起こさない好ましい範囲を鋭意検討した結果、圧力発生装置から送り出すエア体積ＶPは、（４）式におけるａの範囲が大気圧下で、 ０．０１≦ a ≦１．７ で表される範囲であった。なお、全体積Ｖは、０．１〜５０ｍｌの範囲とすることが好ましい。
【００１４】
以下に本発明の自動核酸分離精製装置としての核酸抽出装置について、図面を参照して詳細に説明する。
図２は核酸抽出装置の一実施形態であってカバーを除去した状態を示す斜視図、図３は核酸抽出装置の概略ブロック構成図、図４は搭載機構におけるラックの斜視図、図５はラックの使用状態を示す斜視図、図６は抽出動作の工程図、図７は核酸分離精製カートリッジの斜視図である。
【００１５】
本実施形態の核酸抽出装置１の機構を説明する前に、この核酸抽出装置による核酸の抽出精製工程を説明する。
この核酸抽出装置１は、図７に示すような核酸分離精製カートリッジ１１（カートリッジ）を用いて試料液中の核酸を抽出するものである。このカートリッジ１１は、上端が開口した筒状本体１１ａの底部に核酸吸着性多孔膜１１ｂが保持され、筒状本体１１ａの核酸吸着性多孔膜１１ｂより下方部位はロート状に形成され、下端中心部に細管ノズル状の排出部１１ｃが所定長さに突出形成され、筒状本体１１ａの側部両側に縦方向の突起１１ｄが形成されてなる。カートリッジ１１の上部開口１１ｅより後述の試料液、洗浄液、回収液が分注された後、上部開口１１ｅより加圧エアが導入され、各液を核酸吸着性多孔膜１１ｂを通して排出部１１ｃより後述の廃液容器１２又は回収容器１３に流下排出する。  なお、図示の場合、筒状本体１１ａは上部と下部に分割され嵌着する構造となっている。
【００１６】
そして、核酸抽出装置１は基本的に図６(ａ)〜(ｇ)に示すような抽出工程によって核酸の抽出精製を行う。まず図６(ａ)工程で、廃液容器１２上に位置するカートリッジ１１に溶解処理された核酸を含む試料液Ｓを注入する。次に図６(ｂ)工程で、カートリッジ１１に加圧エアを導入して加圧し、核酸吸着性多孔膜１１ｂを通して試料液Ｓを通過させ、この核酸吸着性多孔膜１１ｂに核酸を吸着させ、通過した液状成分は廃液容器１２に排出する。
【００１７】
次に図６(ｃ)工程でカートリッジ１１に洗浄液Ｗを自動分注し、(ｄ)工程でカートリッジ１１に加圧エアを導入して加圧し、核酸吸着性多孔膜１１ｂに核酸を保持したままその他の不純物の洗浄除去を行い、通過した洗浄液Ｗは廃液容器１２に排出される。この(ｃ)工程及び(ｄ)工程は複数回繰り返してもよい。
【００１８】
その後、(ｅ)工程でカートリッジ１１の下方の廃液容器１２を回収容器１３に交換してから、(ｆ)工程でカートリッジ１１に回収液Ｒを自動分注し、(ｇ)工程でカートリッジ１１に加圧エアを導入して加圧し、核酸吸着性多孔膜１１ｂと核酸の結合力を弱め、吸着されている核酸を離脱させて、核酸を含む回収液Ｒを回収容器１３に排出し回収する。
【００１９】
上記カートリッジ１１における核酸吸着性多孔膜１１ｂは、基本的には核酸が通過可能な多孔質体であり、その表面は試料液中の核酸を化学的結合力で吸着する特性を有し、洗浄液による洗浄時にはその吸着を保持し、回収液による回収時に核酸の吸着力を弱めて離すように構成されてなる。その詳細は後述することにする。
【００２０】
前記核酸抽出装置１は、図２及び図３に示すように、装置本体２に、複数のカートリッジ１１、廃液容器１２及び回収容器１３を保持する搭載機構３と、核酸分離精製カートリッジ１１に加圧エアを導入する加圧エア供給機構４と、核酸分離精製カートリッジ１１に洗浄液Ｗ及び回収液Ｒを分注する分注機構５などを備えてなる。次に各機構３〜５を具体的に説明する。
【００２１】
＜搭載機構＞
搭載機構３は、装置本体２の前方下部に搭載台２１を備え、この搭載台２１上に複数の核酸分離精製カートリッジ１１、廃液容器１２及び回収容器１３を保持したラック６が載置される。ラック６は、図４にも示すように、スタンド６１とカートリッジホルダー６２と容器ホルダー６３とを備える。
スタンド６１は両側の柱状部６１ａに上下移動可能にカートリッジホルダー６２を保持し、柱状部６１ａの間の下部の底板６１ｂ上に前後移動可能に容器ホルダー６３を保持している。
【００２２】
カートリッジホルダー６２は、前後のプレート材の接合による２分割構造に構成され、横方向に延びる保持部６２ａの両端に上下方向に延びる支持脚６２ｂを備える。その支持脚６２ｂがスタンド６１の柱状部６１ａの上下方向の摺動溝６１ｃに上下移動可能に挿入され、この支持脚６２ｂがスタンド６１に内蔵された付勢部材（不図示）によって上方に付勢されている。保持部６２ａには複数の保持孔６２ｃが並設され、上方より核酸分離精製カートリッジ１１が挿入され、核酸分離精製カートリッジ１１の筒状本体１１ａの側部両側に形成された突起１１ｄ（図７参照）の下端がカートリッジホルダー６２内の係合部材（不図示）に係合保持される。係合部材は移動可能で、移動時には突起１１ｄとの係合を解除して核酸分離精製カートリッジ１１を全部同時に下方に落下廃棄するようになっている。
【００２３】
このカートリッジホルダー６２は上面の両側にピン孔６２ｄを備え、使用状態では後述の位置決め手段としての押えピン４９（図２参照）の先端４９ａが係合して下方に押し下げられる。図４のようにカートリッジホルダー６２が上昇した位置では、カートリッジホルダー６２に保持された核酸分離精製カートリッジ１１の排出部１１ｃの下端は容器ホルダー６３にセットされた廃液容器１２及び回収容器１３より上方に位置しているが、図５に示すように、カートリッジホルダー６２が下降した際には核酸分離精製カートリッジ１１の排出部１１ｃが廃液容器１２又は回収容器１３の内部に所定量挿入されるように設定されている。
【００２４】
容器ホルダー６３は、横方向に延びる廃液容器保持孔６３ａと回収容器保持孔６３ｂとを平行２列に備え、後側の廃液容器保持孔６３ａに複数の廃液容器１２が、前側の回収容器保持孔６３ｂに複数の回収容器１３がそれぞれ列状に保持される。廃液容器保持孔６３ａ及び回収容器保持孔６３ｂはカートリッジホルダー６２の保持孔６２ｃと等ピッチで等位置に配設され、保持された各核酸分離精製カートリッジ１１の下方にそれぞれ廃液容器１２及び回収容器１３が位置するように設定されている。この廃液容器１２と回収容器１３とは混同防止のためにサイズ、形状等が異なったものを使用するのが好ましい。
【００２５】
上記容器ホルダー６３はスタンド６１に内蔵された不図示の付勢部材によって前方に付勢されている。容器ホルダー６３の容器交換移動（前後動）は、搭載台２１に設置された作動部材３１（図３参照）が、スタンド６１の底板６１ｂに形成された開口を通して、容器ホルダー６３の底部の係合孔（不図示）に係合されて行われる。容器交換モータ３２（ＤＣモータ）の駆動に応じた作動部材３１の移動動作に応じて容器ホルダー６３が後退移動され、カートリッジホルダー６２の下方に回収容器１３が位置するように作動する。非作動時には廃液容器１２がカートリッジホルダー６２の下方に位置するように不図示の付勢部材で付勢されている。上記容器交換モータ３２の作動は位置センサ３３ａ，３３ｂの検出に応じて制御される。
【００２６】
＜加圧エア供給機構＞
加圧エア供給機構４は、図２及び図３に示すように、前記搭載機構３のラック６に対して昇降移動する加圧ヘッド４０と、該加圧ヘッド４０に１列に並んで設置された複数（図の場合８個）のエアノズル４１と、加圧エアを発生するエアポンプ４３と、リリーフバルブ４４と、各エアノズル４１に設置され個別に開閉する開閉バルブ４５と、各エアノズル４１に設置された圧力センサ４６を備え、順次核酸分離精製カートリッジ１１に加圧エアを送給する。そして、エアポンプ４３と、リリーフバルブ４４と、各エアノズル４１はそれぞれ制御部７０からの制御指令に基づいて動作する。
【００２７】
前記加圧ヘッド４０は、装置本体２の中間フレーム２２と上フレーム２３との間に上下方向に設置されたガイドロッド２４に上下移動可能に保持されている。同様に上下方向に設置されたボールネジ２５に加圧ヘッド４０に設置されたボールナット４０ａが螺合し、昇降モータ４７（パルスモータ）の駆動に伴うタイミングベルト、プーリを介したボールネジ２５の回転により加圧ヘッド４０が、フォトセンサ４８ａ〜４８ｃの検出に伴う制御により昇降移動される。加圧ヘッド４０の両側には押えピン４９を有し、この押えピン４９はスプリング４９ｂで下方に付勢されて上下移動可能で、先端４９ａがカートリッジホルダー６２の上面のピン孔６２ｄに係合して位置を規制して押えるようになっている。
【００２８】
上記押えピン４９は、カートリッジホルダー６２を押圧作動している状態で、後述の洗浄液分注ノズル５１ｗ及び回収液分注ノズル５１ｒの横方向移動と干渉しないように、カートリッジホルダー６２の前側位置を押えるように配設されている。
【００２９】
エアノズル４１は加圧ヘッド４０にそれぞれ上下移動可能にかつ下方に付勢されて設置され、その下方にはエアノズル４１に対応した連通孔４２ａ（図３参照）が開口されたシート状のシール材４２が配設され、加圧ヘッド４０が下降移動した際に、カートリッジホルダー６２にセットされた核酸分離精製カートリッジ１１の上端開口を、エアノズル４１先端でシール材４２を介して押圧して密閉し、連通孔４２ａを通して核酸分離精製カートリッジ１１内へ加圧エアが送給可能となる。
【００３０】
リリーフバルブ４４はエアポンプ４３と開閉バルブ４５との間の通路のエアを排出する際に大気開放作動される。開閉バルブ４５は選択的に開作動されて、エアポンプ４３からの加圧エアを対応するエアノズル４１を経て核酸分離精製カートリッジ１１内に導入するようにエア回路が構成されている。つまり、エアポンプ４３から核酸分離精製カートリッジ１１までの間に吸気流路１４が形成されている。加圧エアは、前述のＶP = a×Ｖ + ＶL  (０．０１≦a≦１．７) で表される式に従って制御部７０からの指令により供給される。圧力センサ４６は各エアノズル４１に設置され、核酸分離精製カートリッジ１１の内圧を個別に検出するものであり、圧力が所定値以下に低下したことの検出により液排出終了を判定する制御などが制御部７０と協働して行われる。
【００３１】
＜分注機構＞
分注機構５は、ラック６上を横方向に移動可能なノズル移動台５０に設置された洗浄液分注ノズル５１ｗ及び回収液分注ノズル５１ｒと、洗浄液ボトル５６ｗに収容された洗浄液Ｗを洗浄液分注ノズル５１ｗに給送する洗浄液供給ポンプ５２ｗと、回収液ボトル５６ｒに収容された回収液Ｒを回収液分注ノズル５１ｒに給送する回収液供給ポンプ５２ｒと、搭載台２１に載置された廃液ボトル５７などを備える。
【００３２】
ノズル移動台５０は、装置本体２の縦壁２６に水平方向に設置されたガイドレール２７に保持されて横方向に移動可能であり、その移動が不図示のノズル移動モータ（パルスモータ）によって各核酸分離精製カートリッジ１１上で順次停止し、復帰状態では廃液ボトル５７上に停止するように駆動制御される。洗浄液分注ノズル５１ｗ及び回収液分注ノズル５１ｒは先端が下方に向けて屈曲され、洗浄液分注ノズル５１ｗは切替弁５５ｗを介して洗浄液供給ポンプ５２ｗに接続され、洗浄液供給ポンプ５２ｗは切替弁５５ｗを介して洗浄液ボトル５６ｗに接続され、回収液分注ノズル５１ｒは切替弁５５ｒを介して回収液供給ポンプ５２ｒに接続され、回収液供給ポンプ５２ｒは切替弁５５ｒを介して回収液ボトル５６ｒに接続されている。洗浄液ボトル５６ｗ及び回収液ボトル５６ｒはそれぞれ装置本体２の側部に装着される。洗浄液供給ポンプ５２ｗ及び回収液供給ポンプ５２ｒはシリンジポンプで構成され、そのピストン部材がそれぞれポンプモータ５３ｗ，５３ｒ（パルスモータ）によってセンサ５４ｗ，５４ｒの位置検出に基づいて所定量の洗浄液Ｗ及び回収液Ｒを分注するように駆動制御される。これら、ポンプモータ５３ｗ，５３ｒ、及び切替弁５５ｗ，５５ｒは、制御部７０からの指令に基づいて動作する。
【００３３】
洗浄液Ｗ又は回収液Ｒを分注する場合には、切替弁５５ｗ又は５５ｒを洗浄液ボトル５６ｗ又は回収液ボトル５６ｒ側に切り替え、ポンプモータ５３ｗ又は５３ｒを駆動して洗浄液供給ポンプ５２ｗ又は回収液供給ポンプ５２ｒのピストン部材を後退作動させる。  これにより、洗浄液Ｗ又は回収液Ｒを洗浄液供給ポンプ５２ｗ又は回収液供給ポンプ５２ｒの内部に吸引収容される。続いて切替弁５５ｗ又は５５ｒを洗浄液分注ノズル５１ｗ又は回収液分注ノズル５１ｒ側へ切り替え、ポンプモータ５３ｗ又は５３ｒを駆動して洗浄液供給ポンプ５２ｗ又は回収液供給ポンプ５２ｒのピストン部材を押込作動させる。  そして、廃液ボトル５７に対して通路内のエアを排出するまで洗浄液又は回収液を洗浄液分注ノズル５１ｗ又は回収液分注ノズル５１ｒより吐出させた後、洗浄液供給ポンプ５２ｗ又は回収液供給ポンプ５２ｒの駆動を停止させる。その後、洗浄液分注ノズル５１ｗ又は回収液分注ノズル５１ｒを核酸分離精製カートリッジ１１上に移動させてから、洗浄液供給ポンプ５２ｗ又は回収液供給ポンプ５２ｒの駆動量を制御して所定量の洗浄液Ｗ又は回収液Ｒを核酸分離精製カートリッジ１１へ分注する。
【００３４】
前記洗浄液ボトル５６ｗ及び回収液ボトル５６ｒは、容器本体５６ｗｂ，５６ｒｂとキャップ５６ｗｕ，５６ｒｕよりなり、両キャップ５６ｗｕ，５６ｒｕにはそれぞれ細パイプ状の吸引チューブ５８ｗ，５８ｒが設置され、該吸引チューブ５８ｗ，５８ｒの下端が容器本体５６ｗｂ，５６ｒｂの底部近傍に開口して、洗浄液供給ポンプ５２ｗ又は回収液供給ポンプ５２ｒの作動に応じて洗浄液Ｗ、回収液Ｒを吸い上げるようになっている。
【００３５】
次に、上記のような各機構３〜５は、装置本体２の上部に設置された操作パネル７の入力操作に対応して、連係された制御部７０によって、制御部７０に接続された記憶部７２に予め記憶されているプログラムに基づいて駆動制御される。
ここで、上記核酸抽出装置１による抽出動作を具体的に説明する。まず搭載機構３のラック６におけるカートリッジホルダー６２に核酸分離精製カートリッジ１１をセットし、容器ホルダー６３に廃液容器１２及び回収容器１３をそれぞれセットし、このラック６を装置本体２の搭載台２１に載置して準備を行う。次に、溶解処理された試料液Ｓをピペット等によって各核酸分離精製カートリッジ１１に順次注入する。なお、装置１に搭載する前のラック６にセットした後又はセットする前の核酸分離精製カートリッジ１１に試料液Ｓを先に注入するようにしてもよい。
その後、操作パネル７の操作によって装置を作動させると、加圧エア供給機構４の昇降モータ４７の駆動によって加圧ヘッド４０が下降移動し、押えピン４９の先端４９ａがカートリッジホルダー６２のピン孔６２ｄに係合して押さえつけて、このカートリッジホルダー６２を下降させて位置を規制すると共に、核酸分離精製カートリッジ１１の下端排出部１１ｃを図５のように廃液容器１２内に所定量挿入させて、排出液が飛散等によって外部に漏れてコンタミネーションの原因とならないようにする。さらに加圧ヘッド４０が下降移動してシール材４２を介して各エアノズル４１の下端部が核酸分離精製カートリッジ１１の上端開口に圧接して密閉する。このとき、前記押えピン４９がカートリッジホルダー６２の位置を規制していることで、各核酸分離精製カートリッジ１１に対し各エアノズル４１が正確に圧接して確実な密閉を確保することができる。
【００３６】
その後、加圧エアの供給が行われる。制御部７０の指令により、全部の開閉バルブ４５が閉状態でエアポンプ４３が駆動され、まず１番目の開閉バルブ４５が開作動される。そして、１番目のエアノズル４１を通して１番目の核酸分離精製カートリッジ１１にエアポンプ４３からの加圧エアが、前記ＶP = a×Ｖ + ＶL  (０．０１≦a≦１．７) で表される所定量供給される。このときのａの値、或いはＶPの値は、予め記憶部７２に登録されており、制御部７０は、記憶部７２に対して各値を問い合わせて最適なＶPの値を設定する。また、記憶部７２を参照する以外にも、ＶPの値を逐次算出して設定してもよい。
【００３７】
次いで、１番目の開閉バルブ４５を閉作動するのに続いて、２番目の開閉バルブ４５が開作動されて２番目のエアノズル４１を通して２番目の核酸分離精製カートリッジ１１に加圧エアが供給される。この動作を順に繰り返して全ての核酸分離精製カートリッジ１１に圧力を加える。圧力が作用した試料液Ｓは、核酸吸着性多孔膜１１ｂを通って核酸が吸着保持され、その他の液状成分は下端部の排出部１１ｃより廃液容器１２に排出される。  試料液Ｓが全て核酸吸着性多孔膜１１ｂを通過すると圧力が液排出完了圧力以下に低下し、各圧力センサ４６によって全部の核酸分離精製カートリッジ１１で抽出終了が検出されると、加圧ヘッド４０が上昇作動される。
【００３８】
次に、洗浄処理に移行するが、上記加圧エア供給後の加圧ヘッド４０の上昇は、エアノズル４１が核酸分離精製カートリッジ１１より離れ、ノズル移動台５０の移動が許容できる高さまで上昇した位置で停止し、押えピン４９がカートリッジホルダー６２を押さえつけ、核酸分離精製カートリッジ１１の下端が廃液容器１２内に挿入されている図５の状態を保持して行う。そして、ノズル移動台５０を移動させて洗浄液分注ノズル５１ｗを１番目の核酸分離精製カートリッジ１１上に停止させて洗浄液Ｗを所定量分注し、ノズル移動台５０を次の核酸分離精製カートリッジ１１に移動させて順次洗浄液Ｗを分注する。全部の核酸分離精製カートリッジ１１への洗浄液Ｗの分注が終了すると、加圧ヘッド４０が下降移動し、各エアノズル４１の下端部がシール材４２を介して核酸分離精製カートリッジ１１の上端開口に圧接して密閉してから、前述と同様に開閉バルブ４５が順次開作動されて各核酸分離精製カートリッジ１１に加圧エアが、前述同様に前記ＶP = a×Ｖ + ＶL(０．０１≦a≦１．７) で表される式に従って供給される。圧力が作用した洗浄液Ｗは、核酸吸着性多孔膜１１ｂを通って核酸以外の不純物の洗浄除去を行い、洗浄液Ｗは下端部の排出部１１ｃより廃液容器１２に排出される。全部の核酸分離精製カートリッジ１１における洗浄液Ｗが全て核酸吸着性多孔膜１１ｂを通過して排出されると、加圧ヘッド４０が初期の位置まで上昇作動される。洗浄処理を複数回行う場合には上記動作を繰り返す。
【００３９】
次に、回収処理に移行する。まず洗浄処理後の前記加圧ヘッド４０の上昇により、押えピン４９が上昇してラック６のカートリッジホルダー６２も上昇移動し、核酸分離精製カートリッジ１１の下端排出部１１ｃが廃液容器１２より上方へ移動した後、搭載機構３の作動部材３１を作動させて容器ホルダー６３を後退移動させ、核酸分離精製カートリッジ１１の下方に回収容器１３を位置させる容器交換を行う。
【００４０】
続いて、加圧ヘッド４０が下降移動し、押えピン４９の先端がカートリッジホルダー６２のピン孔６２ｄに係合して押さえつけ、核酸分離精製カートリッジ１１の下端が回収容器１３内に挿入されている状態を保持する。そして、ノズル移動台５０を移動させて回収液分注ノズル５１ｒを１番目の核酸分離精製カートリッジ１１上に停止させて回収液Ｒを所定量分注し、ノズル移動台５０を次の核酸分離精製カートリッジ１１に移動させて順次回収液Ｒの分注を行う。全部の核酸分離精製カートリッジ１１への回収液Ｒの分注が終了すると、前述と同様にさらに加圧ヘッド４０が下降し、各エアノズル４１の下端部をシール材４２を介して核酸分離精製カートリッジ１１の上端開口に圧接させて密閉してから、開閉バルブ４５が順次開作動されて各核酸分離精製カートリッジ１１に加圧エアが、前述同様に前記ＶP = a×Ｖ + ＶL  (０．０１≦a≦１．７) で表される式に従って供給される。圧力が作用した回収液Ｒは、核酸吸着性多孔膜１１ｂを通ってそれに吸着されている核酸を離脱させて、回収液Ｒとともに核酸が下端部の排出部１１ｃより回収容器１３に排出される。全部の核酸分離精製カートリッジ１１における回収液Ｒが全て回収容器１３に排出されると、加圧ヘッド４０が上昇作動され、一連の動作が終了する。
【００４１】
抽出動作が終了したラック６は搭載台２１より下ろされ、核酸分離精製カートリッジ１１及び廃液容器１２はカートリッジホルダー６２及び容器ホルダー６３より取り出されて廃棄され、一方、回収容器１３は容器ホルダー６３より取り出され、必要に応じて蓋がされて、次の核酸分析処理等が施される。
【００４２】
なお、本実施形態では、核酸分離精製カートリッジ１１を複数搭載しているが、これに限定されるものではなく、核酸分離精製カートリッジ１１を１本としても適用が可能である。
また、エアポンプ４３から核酸分離精製カートリッジ１１に供給するエアは、液体１６の性状に影響を及ぼさなければ、他のいかなる気体であってもよい。
【００４３】
次に、上記の核酸分離精製カートリッジ１１に内有する核酸吸着性多孔膜（核酸吸着性多孔質体）１１ｂについて詳細に説明する。
上記核酸分離精製カートリッジ１１に内有する核酸吸着性多孔膜１１ｂは、基本的には核酸が通過可能な多孔性であり、その表面は試料液中の核酸を化学的結合力で吸着する特性を有し、洗浄液による洗浄時にはその吸着を保持し、回収液による回収時に核酸の吸着力を弱めて離すように構成されてなる。
【００４４】
上記核酸分離精製カートリッジ１１に内有する核酸吸着性多孔膜１１ｂは、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であることを特徴とする。これは、多孔性膜側の使用条件で「イオン化」していないことを意味し、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜が引き合うようになると推定される。これにより分離性能に優れ、しかも洗浄効率よく、核酸を単離精製することができる。好ましくは、核酸吸着性多孔性膜は、親水基を有する多孔性膜であり、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜の親水基同士が引きあるようになると推定される。
【００４５】
親水基とは、水との相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用の強さが中程度のもの（化学大事典、共立出版株式会社発行、「親水基」の項の「あまり親水性の強くない基」参照）が良く、例えば、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、オキシエチレン基などを挙げることができる。好ましくは水酸基である。
【００４６】
ここで、親水基を有する多孔性膜とは、多孔性膜を形成する材料自体が、親水性基を有する多孔性膜、または多孔性膜を形成する材料を処理またはコーティングすることによって親水基を導入した多孔性膜を意味する。多孔性膜を形成する材料は有機物、無機物のいずれでも良い。例えば、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する有機材料である多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜などを、使用することができるが、加工の容易性から、多孔性膜を形成する材料は有機高分子などの有機材料を用いることが好ましい。
【００４７】
親水基を有する材料の多孔性膜としては、水酸基を有する有機材料の多孔性膜を挙げることができる。水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などで、形成された多孔性膜を挙げることができるが、特に多糖構造を有する有機材料の多孔性膜を好ましく使用することができる。
【００４８】
水酸基を有する有機材料の多孔性膜として、好ましくは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物から成る有機高分子の多孔性膜を使用することができる。アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物として、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物を好ましく使用する事ができる。
特にトリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物を好ましく使用することができる。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９である事が好ましく、９０：１０〜５０：５０である事がより好ましい。
【００４９】
更に好ましい、水酸基を有する有機材料としては、特開２００３−１２８６９１号公報に記載の、アセチルセルロースの表面鹸化物が挙げられる。アセチルセルロースの表面鹸化物とは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理したものであり、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物も好ましく使用することができる。より好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物を使用することである。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９であることが好ましい。更に好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の混合比は、９０：１０〜５０：５０であることである。この場合、鹸化処理の程度（鹸化率）で固相表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。核酸の分離効率をあげるためには、水酸基の量（密度）が多い方が好ましい。例えば、トリアセチルセルロースなどのアセチルセルロースの場合には、鹸化率（表面鹸化率）が約５％以上であることが好ましく、１０％以上であることが更に好ましい。また、水酸基を有する有機高分子の表面積を大きくするために、アセチルセルロースの多孔性膜を鹸化処理することが好ましい。この場合、多孔性膜は、表裏対称性の多孔性膜であってもよいが、裏非対称性の多孔性膜を好ましく使用することができる。
【００５０】
鹸化処理とは、アセチルセルロースを鹸化処理液(例えば水酸化ナトリウム水溶液)に接触させることを言う。これにより、鹸化処理液に接触したアセチルセルロースの部分に、再生セルロースとなり水酸基が導入される。こうして作成された再生セルロースは、本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている。
又、鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度を変えて鹸化処理を行えば良い。鹸化率は、ＮＭＲ、ＩＲ又はＸＰＳにより、容易に測定することができる（例えば、カルボニル基のピーク減少の程度で定めることができる）。
【００５１】
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法として、ポリマー鎖内または側鎖に親水基を有すグラフトポリマー鎖を多孔性膜に結合することができる。
有機材料の多孔性膜にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする２つの方法がある。
【００５２】
まず、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる方法においては、ポリマーの末端または側鎖に多孔性膜と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と、多孔性膜の官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。多孔性膜と反応する官能基としては、多孔性膜の官能基と反応し得るものであれば特に限定はないが、例えば、アルコキシシランのようなシランカップリング基、イソシアネート基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、アリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基等を挙げることができる。
【００５３】
ポリマーの末端、または側鎖に反応性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシル基をポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシアネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーとしては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的には、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレンなどを挙げることができる。
【００５４】
多孔性膜を基点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させ、グラフトポリマー鎖を形成させる方法は、一般的には表面グラフト重合と呼ばれる。表面グラフト重合法とは、プラズマ照射、光照射、加熱などの方法で基材表面上に活性種を与え、多孔性膜と接するように配置された重合可能な二重結合を有する化合物を重合によって多孔性膜と結合させる方法を指す。
基材に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。
特に有用な親水基を有するモノマーの具体例としては、次のモノマーを挙げることができる。例えば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート等の水酸性基含有モノマーを特に好ましく用いることができる。また、アクリル酸、メタアクリル酸等のカルボキシル基含有モノマー、もしくはそのアルカリ金属塩及びアミン塩も好ましく用いることができる。
【００５５】
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができるが、多糖構造を有するポリマーが好ましい。
【００５６】
また、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。
【００５７】
親水基を有する無機材料である多孔性膜としては、シリカ化合物を含有する多孔性膜を挙げることができる。シリカ化合物を含有する多孔性膜としては、ガラスフィルターを挙げることができる。また、特許公報第３０５８３４２号に記載されているような、多孔質のシリカ薄膜を挙げることができる。この多孔質のシリカ薄膜とは、二分子膜形成能を有するカチオン型の両親媒性物質の展開液を基板上に展開した後、基板上の液膜から溶媒を除去することによって両親媒性物質の多層二分子膜薄膜を調整し、シリカ化合物を含有する溶液に多層二分子膜薄膜を接触させ、次いで前記多層二分子膜薄膜を抽出除去することで作製することができる。
【００５８】
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する２つの方法がある。
多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。
【００５９】
親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、上記、親水基を持たない有機材料の多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法において、記載した親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。
【００６０】
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができる。
【００６１】
また、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コ−ティングしたアセチルセルロ−スまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。
【００６２】
親水基を持たない無機材料の多孔性膜としては、アルミニウム等の金属、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、もしくはニューセラミックス、シリコン、活性炭等を加工して作製した多孔性膜を挙げることができる。
【００６３】
上記の核酸吸着性多孔性膜は、溶液が内部を通過可能であり、厚さが１０μｍ〜５００μｍである。さらに好ましくは、厚さが５０μｍ〜２５０μｍである。洗浄がし易い点で、厚さが薄いほど好ましい。
【００６４】
上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、最小孔径が０．２２μｍ以上である。さらに好ましくは、最小孔径が０．５μｍ以上である。また、最大孔径と最小孔径の比が２以上である多孔性膜を用いる事が好ましい。これにより、核酸が吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難い。さらに好ましくは、最大孔径と最小孔径の比が５以上である。
【００６５】
上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、空隙率が５０〜９５％である。さらに好ましくは、空隙率が６５〜８０％である。また、バブルポイントが、０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ２である事が好ましい。さらに好ましくは、バブルポイントが、０．２〜４ｋｇｆ／ｃｍ２である。
【００６６】
上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、圧力損失が、０．１〜１００ｋＰａである事が好ましい。これにより、過圧時に均一な圧力が得られる。さらに好ましくは、圧力損失が、０．５〜５０ｋＰａである。ここで、圧力損失とは、膜の厚さ１００μｍあたり、水を通過させるのに必要な最低圧力である。
【００６７】
上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ２の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ２あたり１分間で１〜５０００ｍＬであることが好ましい。さらに好ましくは、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ２の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ２あたり１分間で５〜１０００ｍＬである。
【００６８】
上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、多孔性膜1ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．１μｇ以上である事が好ましい。さらに好ましくは、多孔性膜1ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．９μｇ以上である。
【００６９】
上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、一辺が５ｍｍの正方形の多孔性膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに、１時間以内では溶解しないが４８時間以内に溶解するセルロース誘導体が、好ましい。また、一辺が５ｍｍの正方形の多孔質膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに１時間以内に溶解するが、ジクロロメタン５ｍＬに浸漬したときには２４時間以内に溶解しないセルロース誘導体がさらに好ましい。
【００７０】
核酸吸着性多孔性膜中を、核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を一方の面から他方の面へと通過させることが、液を多孔性膜へ均一に接触させることができる点で、好ましい。核酸吸着性多孔性膜中を、核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を核酸吸着性多孔性膜の孔径が大きい側から小さい側に通過させることが、目詰まりし難い点で好ましい。
【００７１】
核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜を通過させる場合の流速は、液の多孔性膜への適切な接触時間を得るために、膜の面積ｃｍ２あたり、２〜１５００μＬ/secである事が好ましい。液の多孔性膜への接触時間が短すぎると十分な分離精製効果が得られず、長すぎると操作性の点から好ましくない。さらに、上記流速は、膜の面積ｃｍ２あたり、５〜７００μＬ/secである事が好ましい。
【００７２】
また、使用する溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、１枚であってもよいが、複数枚を使用することもできる。複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。
【００７３】
複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸吸着性多孔性膜との組合せであっても良い。例えば、ガラスフィルターと再生セルロースの多孔性膜との組合せを挙げることができる。また、複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸非吸着性多孔性膜との組合せであってもよい、例えば、ガラスフィルターと、ナイロンまたはポリスルホンの多孔性膜との組合せを挙げることができる。
そして、以上に説明した核酸吸着性多孔性膜は、カートリッジの形状に応じて、膜状以外の形態にすることができる。例えば、チップ状やブロック状等とすることができる。
【実施例１】
【００７４】
以下に、核酸分離精製処理を実施して、圧力発生装置から核酸分離精製カートリッジへのエアの送り出し量を増減制御して比較確認した結果を説明する。
（１）核酸分離精製カートリッジの作製
内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔膜を収容する部分を持つ核酸分離精製カートリッジ用容器をハイインパクトポリスチレンで作製する。鹸化処理を行ったアセチルセルロース多孔膜（富士写真フイルム株式会社製  FR250）を、核酸分離精製カートリッジ用容器の核酸吸着性多孔膜を収容する部分に収容し、これを核酸分離精製カートリッジとした。
【００７５】
（２）核酸可溶化試薬及び洗浄液の調製
以下に示す処方の核酸可溶化試薬溶液を調製した。
（核酸可溶化試薬溶液）
塩酸グアニジン（ライフテクノロジー社製）      ３８２ｇ
Ｔｒｉｓ（ライフテクノロジー社製）          １２．１ｇ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＩＣＮ製）              １０ｇ
蒸留水                                    １０００ｍｌ
（洗浄液）
１００ｍＭ  ＮａＣｌ    
１０ｍＭ    Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
６５％  エタノ−ル
【００７６】
（３）核酸分離精製操作時における液跳ね有無の確認
人全血検体２００μｌに、（２）で作製した核酸可溶化試薬２００μlと、プロテアーゼ（ＳＩＧＭＡ社製、"Protease"  Type  XXIＶ  Bacterial）溶液２０μlを添加して、６０℃で１０分間インキュベートする。インキュベート後、エタノール２００μｌを加え攪拌することで、核酸を含む試料溶液を調製した。核酸を含む試料溶液を上記（１）で作製した核酸分離精製カートリッジの一方の開口に注入し、本発明による自動核酸分離精製装置を用い、上記一方の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した試料溶液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させ、核酸分離精製カートリッジの他方の開口より廃液容器に排出する。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一方の開口に、（２）で調製した洗浄液７００μlを注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一方の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させ、他方の開口より上記廃液容器に排出する。この操作を３回繰り返す。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一方の開口に回収液２００μlを注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一方の開口に圧力発生装置を結合して、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させ、他方の開口より回収容器に排出し、この液を回収する。この際、本発明の圧力発生装置から送り出すエア（ＶP= a×Ｖ + ＶL）のaの値を種々変化させ、加圧エアによる液跳ねの有無を目視で確認した。
表１に得られた結果を示す。
【００７７】
【表１】
2005278437.tif 000003
【００７８】
上記表１に示すように、aの値が０．０５〜１．７までの範囲（実施例１〜実施例５）では、液跳ねを生じることなく液を回収することができたが、ａの値が１．７を超える１．８〜２．０とした比較例１〜比較例３では、液跳ねが生じる結果となった。なお、ａの値が０の場合は、核酸分離精製カートリッジ内の液体が完全に抜けきらない場合が生じ得るが、ａの値を０から僅かに増加させた値（ａ＝０．０１）とすると、液跳ねを生じさせずに安定して液体を抜くことができることも実験により判明している。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】本発明の自動核酸抽出装置による加圧方法について説明する模式図で、（ａ）はエア供給前、（ｂ）はエア供給後の液体排出前、（ｃ）はエア供給後で液体排出後の状態を示す図である。
【図２】核酸抽出装置の一実施形態であってカバーを除去した状態を示す斜視図である。
【図３】核酸抽出装置の概略ブロック構成図である。
【図４】搭載機構におけるラックの斜視図である。
【図５】ラックの使用状態を示す斜視図である。
【図６】抽出動作の工程図である。
【図７】核酸分離精製カートリッジの斜視図である。
【符号の説明】
【００８０】
１    核酸抽出装置（核酸分離精製装置）
２    装置本体
３    搭載機構
４    加圧エア供給機構
５    分注機構
６    ラック
１１    核酸分離精製カートリッジ
１１ｂ  核酸吸着性多孔膜
１１ｃ  排出部（他方の開口）
１１ｅ  上部開口（一方の開口）
１２    廃液容器
１３    回収容器
１６    液体
１４    吸気流路
１８    エア
４０    加圧ヘッド
４１    エアノズル
４３    エアポンプ（圧力発生装置）
４５    開閉バルブ
４６    圧力センサ
５１ｗ，５１ｒ   分注ノズル
５２ｗ，５２ｒ   供給ポンプ
５６ｗ，５６ｒ   ボトル
７０    制御部
７２    記憶部
Ｓ    試料液
Ｗ    洗浄液
Ｒ    回収液
【図１】
2005278437.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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