(57)【要約】      （修正有）【課題】糖尿病性網膜症の予防又は治療用医薬組成物の提供。【解決手段】毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）を含有する医薬組成物であり、これを点眼剤として、網膜の損傷や変性、緑内障、眼神経疾患、網膜神経損傷等の糖尿病性網膜症の予防又は治療するために使用することができる。ヒトＣＮＴＦ遺伝子の塩基配列は明らかとなっており、ヒトＣＮＴＦは２００アミノ酸、分子量約２２ｋＤのタンパク質である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛様体神経栄養因子を含有する医薬組成物。
【請求項２】
糖尿病性網膜症を予防又は治療するための請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
点眼剤である請求項１又は２記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛様体神経栄養因子（CNTF）を有効成分として含有する医薬組成物、特に糖尿病性網膜症の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病性網膜症は、高血糖値が長期間持続して網膜毛細血管が損傷あるいはその透過性が亢進することにより発症する疾患であり、ヒトに失明を起こす、現在最も頻度の高い病気である。糖尿病性網膜症はその経過から、単純網膜症、増殖前網膜症及び増殖網膜症の三期に分類される。増殖網膜症は、上記病期のうち最も重症の期に属し、網膜や虹彩における血管新生に起因する硝子体出血、牽引性網膜剥離又は血管新生緑内障を誘発する。その結果、重篤な視力障害を引き起こす。上記増殖網膜症の治療法として、異常増殖した血管を除去するためにレーザー光凝固法又は硝子体手術などが採用される。しかしながら、これらの治療法は対症療法的な外科的処置にすぎず、糖尿病性網膜症の根本的治療法ではない。
【０００３】
一方、網膜の神経細胞やその突起には、様々な神経栄養因子とその受容体が存在しており（非特許文献1、2、3）、その中でも、毛様体神経栄養因子（Ciliary Neurotrophic Factor：以下「CNTF」という）は網膜内に多量に存在することが知られている（非特許文献4、5）。また、眼球内への栄養因子の注射が網膜変性を阻止する報告例もある（非特許文献6、7）。
【０００４】
CNTFは、ニワトリ胚の毛様体神経節副交感神経細胞の生存を促進する因子として単離同定されたタンパク質であり、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ等において、CNTF遺伝子の塩基配列が明らかとなっている。例えば、ヒトCNTF遺伝子についてはGenBank Accession number X60542を参照のこと。そして、神経成長因子（Nerve Growth Factor：NGF）の遺伝子ファミリーとは相同性をもたないことが分かっている。
【０００５】
CNTFは、ヒト、ラットでは200アミノ酸、マウス、ウサギでは199アミノ酸からなり、分子量は約22ｋDである。そして、in vitroでは種々の神経細胞やある種のグリア細胞の生存又は分化を促進し、in vivoでは運動ニューロンの生存維持を促進する機能を有する（非特許文献8、9）。また、CNTFは、(i)網膜のニューロンの生存維持、(ii)光刺激による網膜の損傷の抑制、あるいは(iii)遺伝的に網膜ニューロンが変性するマウスにおけるその変性遅延及び視細胞突起の調節など、網膜の生存に関する重要な役割を果たしている。一方、CNTFの医療用途については、例えば、網膜の損傷及び変性の防止、緑内障の治療、眼神経疾患又は脳疾患の処置方、網膜神経損傷治療などがある。しかし、これらは網膜の生存に関する報告ではあるが、糖尿病による網膜の変性抑制に関するものではない。
【非特許文献１】Gupta, S.K. et. al. Biochem. Cell Biol. 75: 119-125, 1997
【非特許文献２】King, G.L. and Suzuma, K. N. Engl. J. Med. 342: 349-351, 2000
【非特許文献３】Beltran, W.A. et. al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44: 3642-3649, 2003
【非特許文献４】Kirsch, M. et. al. J. Neurochem. 68: 979-990, 1997
【非特許文献５】Walsh, N. et. al. Exp. Eye. Res. 72: 495-501, 2001
【非特許文献６】LaVail, M. et. al. Invest. Ophthalmol. 39: 592-602, 1998,
【非特許文献７】Cayouette, M. et. al. J. Neurosci. 18: 9282-9293, 1998
【非特許文献８】Ishiyama, T. et. al. Exp. Neurol. 148: 247-255, 1997
【非特許文献９】Ikeda, K. et. al. Ann. Neurol. 37: 47-54, 1995
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、CNTFを含有する医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、CNTFを点眼することにより糖尿病性網膜症を予防又は治療し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、毛様体神経栄養因子を含有する医薬組成物である。本発明の医薬組成物は、糖尿病性網膜症を予防又は治療するために使用することができる。この場合、上記医薬組成物の剤形は、患者への侵襲が少なく、手軽に投薬できると言う点から点眼剤であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によりCNTFを含有する医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、糖尿病性網膜症を予防又は治療するために有用である。特に、CNTFの点眼により糖尿病性網膜症の網膜の変性を抑制する予防薬又は治療薬として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明は、糖尿病性網膜症を予防し、又は根本的に治療し、しかも侵襲が少なく簡便な予防又は治療法の開発を目的として完成されたものであり、CNTFを有効成分として含む医薬組成物に関する。
【００１２】
色素上皮細胞には血液-網膜関門が存在するため、従来、正常状態では高分子の治療薬は網膜内に入り込まないと言われていた。しかし、糖尿病患者では毛細血管の透過性亢進によって網膜に血清タンパク質が沈着していることから、網膜の変性を抑制する活性をもつ種々の因子は血管内から網膜へ入り込んでいると考えられる。そこで本発明者は、当該因子のうちCNTFに注目し、高分子物質であるCNTFも血液から網膜内へ進入していると考えた。そして、CNTFの点眼によって網膜症を抑制できるかを検討した。すなわち、ラットにストレプトゾトシンを静脈注射することによって膵臓のβ細胞を破壊し、作製した糖尿病モデルラットにCNTFを点眼投与した。その結果、網膜の変性が抑制されていることを見出した。
１．CNTF
本発明の医薬組成物に含有されるCNTFとして、例えばラット、マウス、ウサギ、ニワトリ等の動物又はヒトからCNTF遺伝子を単離し、これを適当な発現系を用いて発現させたタンパク質を用いることができる。本発明の医薬組成物は、大量のCNTFを必要とするため、適当な発現系から得られた組換えタンパク質、特にヒト由来の組換え型CNTFを使用することが好ましい。なお、ラット、マウス、ウサギ、ニワトリ等の動物からCNTFを直接単離精製してもよい。
【００１３】
本発明で用いられるCNTFを発現させるために、例えば細菌、酵母、昆虫若しくは昆虫細胞、又は動物若しくは動物細胞を宿主として用いることができる。これらの宿主は、本発明で用いられるCNTF遺伝子を有する発現ベクターで形質転換され、CNTFを産生することができる。
(1) 組換えベクターの作製
本発明において、組換えベクターは、適当なベクターにCNTF遺伝子を連結(挿入)することにより得ることができる。CNTF遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。
【００１４】
プラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなど、任意に選択することができる。また、ファージDNA、ウイルスベクターなどを用いることもできる。
【００１５】
ベクターへのCNTF遺伝子の挿入は、当分野で周知である。
(2) 形質転換体の作製
上記組換えベクターを、CNTF遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより、形質転換体を得る。宿主としては、例えば、エッシェリヒア属、バチルス属等の細菌、サッカロミセス、シゾサッカロミセス等の酵母、昆虫若しくは昆虫細胞、又は動物若しくは動物細胞が挙げられる。
【００１６】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、CNTF遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００１７】
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００１８】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。
【００１９】
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００２０】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞、Sf21細胞などが用いられる。
【００２１】
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００２２】
昆虫を宿主とする場合は、カイコが用いられる。昆虫への組換えベクターの導入方法としては、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法などが用いられる。
【００２３】
動物細胞を宿主とする場合は、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞などが用いられる。
【００２４】
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００２５】
動物を宿主とする場合は、ヤギ、マウス、ラットなどが用いられる。動物への組換えベクターの導入方法としては、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法などが用いられる。
(3)CNTFの精製
上記CNTFは、前記形質転換体を培養又は飼育し、その培養物又は動物体から採取することにより得ることができる。
【００２６】
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。培養後、CNTFが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりCNTFを抽出する。
【００２７】
また、CNTFが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。昆虫又は動物を用いた場合は、例えばカイコについては噴出される生糸から、ヤギについては乳汁を採取する。
【００２８】
その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中又は採取物中からCNTFを単離精製することができる。
【００２９】
大腸菌を宿主としてCNTFを発現させる場合、(i) CNTFをネイティブな形で発現させるか、(ii)タグのついた融合タンパク質として発現させるかを選択することができる。後者の場合、アフィニティークロマトグラフィーにより容易に精製できることから、融合タンパク質として発現させることが望ましい。
【００３０】
CNTFに融合させるタグとしては、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、ヒスチジン−タグ（His-Tag）等が挙げられる。本発明においては、タグとしての長さが短く、融合タンパクの精製がし易いという点でGSTが好ましい。
【００３１】
GSTとの融合タンパク質は、グルタチオン−セファロースカラムを用いて精製することができる。また、得られた融合タンパク質は、トロンビン又はファクターXで処理することにより、GST部分と本発明で用いられるCNTFとを切断分離した後、再度、アフィニティーカラムに通し、カラムに結合せずに通過した画分をCNTFとして回収する。さらに、その回収画分をベンズアミドセファロース６Ｂカラムに通すことにより、トロンビン等を除去し、純品のCNTFを得ることができる。
２．医薬組成物
上記のようにして得られたCNTFは、後述する実施例で明らかなように、糖尿病モデルラットにおいて網膜の変性を抑制するため、糖尿病性網膜症の予防又は治療薬として使用することができる。CNTFが製剤学的に許容できる塩を形成できるときは、そのような塩を形成してもよい。塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、特に生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。上記塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００３２】
上記CNTF（その塩も含む）は、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る溶液との混合物、又は懸濁剤との混合物とし、非経口的に使用できる。例えば、上記CNTFを生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、特に点眼剤の形態で投与されることが望ましい。
【００３４】
本発明の医薬組成物には、上記有効成分に加え、公知の賦形剤、他の有効成分等をさらに含有することができる。これらの例として、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、L-アスパラギン酸ナトリウム、アミノエチルスルホン酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、塩酸ナファゾリン、レチノール等が挙げられる。
【００３５】
また、通常点眼剤に使用される添加剤、例えば、カンフル、ボルネオール等の清涼化剤、水酸化ナトリウム、塩酸等のpH調節剤、グリセリン、プロピレングリコール等の等張化剤、ヒドロキシエチルセルロース等の粘稠剤、エタノール、ポリソルベート80、ポリエチレングリコール等の溶解補助剤、亜硫酸水素ナトリウム等の安定化剤、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム等の防腐剤、及び滅菌水を通常使用する量で含有することができる。
【００３６】
本発明の医薬組成物は、通常の製造方法を用いて製造することができる。例えば、有効成分及び添加剤を滅菌水に溶解後、メンブランフィルターにて除菌濾過し、滅菌容器に充填することにより得ることができる。
【００３７】
糖尿病性網膜症を治療するために上記医薬組成物をヒトに使用する場合、点眼剤１滴（およそ50μl）に含まれるCNTFの含有量は、およそ10μg、好ましくは15μg、さらに好ましくは20μgである。投与期間は、3カ月以上は必要と考えられ、好ましくは6カ月程度と考えられる。１日あたりの有効投与量は1眼当たりおよそ100μl、好ましくは200μl、さらに好ましくは300μlであり、１日の投与回数は、好ましくは3回（１回の点眼滴数： 2滴、CNTF20μg）である。
【００３８】
以下、実施例を示すことにより、本発明を具体的に説明する。但し、実施例により、本発明が限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
CNTFの調製
ヒトCNTFのcDNAは、採取された座骨神経からmRNAを抽出し、逆転写酵素でFirst DNAを作製、そのDNAを鋳型にしてPCRで増幅することにより調製した。このcDNAを、大腸菌の発現ベクター（pGEX-2T：Pharmacia）に組み込んだ後、これを大腸菌（JM109：TOYOBO）に導入して、IPTG（isopropyl-beta-D-thiogalactopyraanoside）で誘導することによりヒトCNTFタンパク質［glutathione S-transferase（GST）との融合タンパク質］を発現させた。この融合タンパク質をグルタチオン−セファロースカラム（Amersham Biosciences）を用いて精製し、次に得られた融合タンパク質をトロンビンで処理し、GST部分とヒトCNTF部分とを切断分離した後、再度、グルタチオン−セファロースカラムに通し、カラムに結合せずに通過した画分を集めた。続いて、その画分をベンズアミドセファロース6Bカラムに通すことにより、トロンビンを除去し、純品のヒトCNTFを得た。SDS-PAGEによりヒトCNTFを単一バンドとして確認した（図１）。
【実施例２】
【００４０】
糖尿病モデルラットの作出及びヒトCNTFの点眼
8週齡雄SDラットの尾静脈にストレプトゾトシン（STZ）（50 mg/Kg体重）を投与し、24時間後、血糖値が300 mg/ml以上になったラットを糖尿病モデルラットとした。糖尿病モデルラットが網膜症を発症していることの確認は、網膜電位のa波、b波の振幅（amplitude）の減少を確認することによって行った。統計処理は分散分析によって行った。STZ投与24時間後の糖尿病モデルラット（n=20）の両眼にヒトCNTF（2 μg/10 μl生理食塩水）を、朝夕2回、1ヶ月連続点眼した。コントロール群として、糖尿病モデルラット（n=20）及び健常ラット（n=20）に生理食塩水10 μlを点眼した。それぞれのラット群の1ヶ月後の体重及び血糖値を表１に示す。
【００４１】
【表１】
2005097137.tif 000002
【実施例３】
【００４２】
網膜電位の計測
ラットを24時間、暗室で飼育後、赤色ランプ下でketamine（32 mg/kg）及びxylazine（20 mg/kg）で麻酔し、1% atropine sulfate及び1% phenylephrine hydrochlorideで散瞳させ、網膜電位（PE-2000、TOMEY）を測定した。
【００４３】
その結果を図２に示した。a波は視細胞の突起に存在する光受容体、b波はミューラー細胞の働きを示す。糖尿病ラット群では健常ラット群と比較して、a、b波ともに低下した（*：p<0.05）。一方ヒトCNTF点眼糖尿病ラット群のb波は糖尿病ラット群と比較して、有意に高い振幅を示した（*：p<0.05）。
【実施例４】
【００４４】
組織分析
(1)組織の処理及び薄切
ラットを2.5%グルタルアルデヒド及び1%パラホルムアルデヒドを含むカコジル緩衝液で心臓から還流させ、固定した。その後、眼組織を取り出し同固定液に1晩置き、さらに1%オスミウムで後固定し、Epon 812で包埋した。包埋後の組織を1μmに薄切し、トルイジン・ブルーで染色した。それぞれのラットの網膜の像の写真を図３に示した。糖尿病ラットでは網膜色素上皮細胞に多数の空胞（色素上皮細胞の足突起（＝網膜−血管関門をなす）の陥凹部分が拡大して細胞内に食い込んだことによって生じた空胞。細胞変性所見。）が見られた（図３の矢印）。一方ヒトCNTF点眼糖尿病ラットではその空胞の数及び大きさには、対照と有意な差は無かった。
(2)網膜の各層の厚さ測定
網膜の各層の厚さはocular micrometerを用い計測した。網膜各層の区分を図４に示した。内網状層（IPL）の厚さは視神経節細胞層の中心から内顆粒層の一番内側まで、内顆粒層（INL）の厚さは内顆粒層の一番内側から外側まで、外網状層（OPL）の厚さはINLの一番外側から外顆粒層（ONL）の一番内側まで、外顆粒層（ONL）はONLの一番外側から内側まで、視細胞突起層（PSL）は外顆粒層（ONL）の一番外側から色素上皮細胞層のapical面まで、網膜層（RL）は視神経節細胞層の中心からから色素上皮細胞層のapical面までとした。それぞれの各層の領域を図４に、厚さの比較を図５に示した。分散分析によって統計処理を行ったところ、糖尿病ラット群ではIPLの厚さが有意に減少した（図５、IPL：p<0.05）。
【００４５】
しかしヒトCNTF点眼糖尿病ラット群ではIPLの厚さは糖尿病ラット群と比較して有意に厚く、対照と差がなかった（p<0.05）。
(3)網膜の電子顕微鏡（電顕）所見
健常ラット、糖尿病ラット、CNTF点眼糖尿病ラットの網膜を電子顕微鏡で観察し、所見を解析した。糖尿病ラットで最も顕著な所見は、網膜色素上皮細胞で観察された。糖尿病ラットでは、色素上皮細胞の足突起（basal infoldings）の陥凹部分が細胞内に食い込んでできる空胞（細胞変性所見）が多数見られた（図６の星印）。これに対し、CNTF点眼糖尿病ラット群では、この空胞の数には、正常対照と差が認められなかった（図6、図7）。
(4)網膜色素上皮細胞で認められた空胞の数の検討
健常ラット群、糖尿病ラット群、CNTF点眼糖尿病ラット群の網膜色素上皮細胞で認められた、直径2.5 μm以上の空胞の、色素上皮250 μm長さ当たりで認められた数をクラスカル−ワーリスH-テストで統計処理した。その結果、糖尿病ラットの網膜色素上皮では空胞が多数生じていたが、それはCNTF点眼によって完全に抑えられていた（p＜0.05）（図7）。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】CNTFのSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真。
【図２】健常ラット群、糖尿病ラット群及びヒトCNTF点眼糖尿病ラット群の網膜電位a波及びb波を示した図。一方ヒトCNTF点眼糖尿病ラット群のb波は糖尿病ラット群と比較して、有意に高い振幅を示した。*：p<0.05。
【図３】健常ラット、糖尿病ラット及びヒトCNTF点眼糖尿病ラットの網膜切片をトルイジン・ブルーで染色し解析した結果を示した写真。ヒトCNTF投与群では、網膜の厚さの減少（萎縮）と、糖尿病群でみられる色素上皮細胞の空洞（矢印）が見られない。バー：40μm
【図４】網膜各層の測定範囲を示す写真。バー：40μm
【図５】健常ラット群、糖尿病ラット群及びヒトCNTF点眼糖尿病ラット群の網膜各層の厚さを示す図。ヒトCNTF投与群では、IPL（内顆粒層）の厚さの減少（萎縮）が見られない。*：p<0.05。
【図６】網膜色素上皮細胞の電子顕微鏡写真。糖尿病ラットでは、多数の空胞が見られるが、CNTF点眼糖尿病ラットでは、それが完全に抑えられている。
【図７】網膜色素上皮細胞の空胞の数を示す図。糖尿病ラットで認められる多数の空胞は、CNTF点眼糖尿病ラットでは完全に抑えられている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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