(57)【要約】【課題】ハイブリダイズ反応後の検出精度が高いＤＮＡ固定化装置を得る。【解決手段】本発明のＤＮＡ固定装置は、ＤＮＡを固定する基板１を挟んでそれぞれ対向配置した高電圧電極４及び接地電極２と、基板に滴下した緩衝液の温度調整を行う温調装置３と、バイアス電圧を印加する電源６とを備え、基板を所定の温度に調整し、ＤＮＡの一方の末端を修飾した試液を緩衝液に添加し、この緩衝液を基板上に滴下してＤＮＡを化学結合させ、基板に対向して配置した電極にバイアス電圧を印加し、ＤＮＡを電気的に伸張させた状態で保持するものである。また、基板は、その表面に固定化膜を設けてもよい。また、バイアス電圧は、両極性の電圧を用いてもよいし、パルス電圧を用いてもよい。【選択図】    図１
2005009985.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
予め調整されたＤＮＡを基板上に滴下して固定化するＤＮＡの固定化方法において、
前記基板を所定の温度に調整し、前記ＤＮＡの一方の末端を修飾した試液を緩衝液に添加し、この緩衝液を前記基板上に滴下して前記ＤＮＡを化学結合させ、前記基板に対向して配置した電極にバイアス電圧を印加し、前記ＤＮＡを電気的に伸張させた状態で保持することを特徴とするＤＮＡの固定化方法。
【請求項２】
前記基板は、表面に固定化膜を有することを特徴とする請求項１記載のＤＮＡの固定化方法。
【請求項３】
前記バイアス電圧は、両極性の電圧を用いることを特徴とする請求項１または２記載のＤＮＡの固定化方法。
【請求項４】
前記バイアス電圧は、パルス電圧を用いることを特徴とする請求項１から３のいずれ１項に記載のＤＮＡの固定化方法。
【請求項５】
前記緩衝液は、所定の温度に調整して前記基板上に滴下することを特徴とする請求項１から４のいずれ１項に記載のＤＮＡの固定化方法。
【請求項６】
前記緩衝液中のＤＮＡは、他方の末端に極性を有するイオン、分子または粒子を修飾することを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡの固定化方法。
【請求項７】
前記緩衝液は、前記高電圧電極の表面に設けた誘電体と接触していることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載のＤＮＡの固定化方法。
【請求項８】
ＤＮＡを固定する基板を挟んでそれぞれ対向配置した高電圧電極及び接地電極と、基板に滴下した緩衝液の温度調整を行う温調装置と、バイアス電圧を印加する電源とを備え、前記基板上に予め調整された前記ＤＮＡを含んだ緩衝液を滴下して固定することを特徴とするＤＮＡ固定化装置。
【請求項９】
前記高電圧電極は、表面に誘電体を配置していることを特徴とする請求項８記載のＤＮＡ固定化装置。
【請求項１０】
前記高電圧電極は、固定化させたいスポット径と同等の面積を有する凹凸表面であることを特徴とする請求項８または９記載のＤＮＡ固定化装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子解析を行うために標識または検体となるＤＮＡを固定化した基板において、ＤＮＡを伸張させた状態で基板上に保持する固定化方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
極めて多数の遺伝子の総合的・系統的解析を行うために、多数遺伝子の一括発現解析を可能とする方法として、予め調整したＤＮＡを基板に固定化するＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）が提唱され、それに関する新しい分析法や方法論が開発されてきた（例えば、非特許文献１参照）。
従来の固定化方法及び装置では、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）などで別途作成したプローブＤＮＡを含む溶液（緩衝液）をスポッターまたはアレイヤーという装置で数ｎｌから数ｐｌの微小体積でスライドガラスやシリコンなどの基板上に並べ、基板上の特定領域に固定化していた（例えば、非特許文献２参照）。最近では、基板表面にはＤＮＡの固定化を確実に行うために固定化膜をコーティングしたものが主流となっている。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．、Ｓｈａｌｏｎ，Ｄ．、Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｄ．、Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｏ．著「Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０」、１９９５年、ｐｐ．４６７〜４７０
【非特許文献２】
君塚房夫、加藤郁之進著「蛋白質  核酸  酵素  ４３（１３）」共立出版、１９９８年、ｐｐ．２００４〜２０１１
【０００４】
図５において１は基板、１１は縮小ＤＮＡ、１３は非固定化ＤＮＡ、１４は固定化膜、１５は官能基、１７は不純物であり、予め調整されたＤＮＡを含んだ緩衝液１０を固定化膜１４でコーティングされた基板１上にスポッターによってスポッティング（滴下）を行い、縮小ＤＮＡ１１の末端基を固定化膜１４の官能基１５と化学結合させ、自然乾燥を行うことで固定化する。
このように、従来の固定化方法及び装置では、基板表面に固定化膜を配置することで基板上に単にスポッティングするよりも固定化率を大幅に改善させるのである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の固定化方法及び装置は、緩衝液中のＤＮＡ数を基板表面の固定化膜にある官能基数よりもはるかに多くしているため、固定化されていないＤＮＡが官能基間や固定化されたＤＮＡの間に潜り込んだまま固定化処理が終了し、検出段階で相補結合させるＤＮＡとのハイブリダイズ（混成）反応後の検出時にばらつきが大きくなるという問題があった。また、緩衝液中の不純物が基板表面に残り、同様に検出感度を下げるという問題があった。さらに、緩衝液中のＤＮＡは通常の状態ではまっすぐに伸びた状態にはなっておらず、特有な糸が丸まったような屈曲した立体的形状になっているため、固定化反応やハイブリダイズ反応を阻害し、検出結果の均一性を損なうというような問題も抱えていた。
そこで、本発明はこのような問題点に鑑みてなされたものであり、ハイブリダイズ反応後の検出精度が高いＤＮＡ固定化装置を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記問題を解決するため、本発明は、次のように構成したのである。
請求項１に記載の発明は、予め調整されたＤＮＡを基板上に滴下して固定化するＤＮＡの固定化方法において、前記基板を所定の温度に調整し、前記ＤＮＡの一方の末端を修飾した試液を緩衝液に添加し、この緩衝液を前記基板上に滴下して前記ＤＮＡを化学結合させ、前記基板に対向して配置した電極にバイアス電圧を印加し、前記ＤＮＡを電気的に伸張させた状態で保持するものである。
このようになっているため、温度調整をすることで全ＤＮＡを変形しやすい状態にでき、電極間にバイアス電圧を印加することで、基板上の固定化ＤＮＡに固定化されていない他末端部を中心にして静電気的に高電圧電極側に向かって直線状に保持して固定化を行うことができる。また、基板面と化学結合していない緩衝液中の非固定化ＤＮＡや不純物を高電圧電極側へ移動させることができるため、固定化ＤＮＡ間等に挟まれた状態の非固定化ＤＮＡや不純物を基板表面より排除することができ、固定化処理の後段であるハイブリダイズ反応後の検出精度を向上することができる。
請求項２に記載の発明は、基板表面に固定化膜を有するものである。
このようになっているため、予め調整したＤＮＡを容易かつ確実に基板面と化学結合を行うことができ、バイアス電圧印加による静電力によって基板上の固定化ＤＮＡが剥離するのを防ぐことができる。また、基板材質に関係なく固定化膜を利用する事で固定化ＤＮＡを容易に化学結合させることができる。
請求項３に記載の発明は、バイアス電圧に両極性の電圧を用いるものである。
このようになっているため、緩衝液内部に振動電界を付与することができ、緩衝液中の非固定化ＤＮＡや不純物を基板面上から容易に排除することができる。また、基板面上の固定化ＤＮＡ間等での絡まりを抑制することができる。
請求項４に記載の発明は、バイアス電圧にパルス電圧を用いるものである。
このようになっているため、パルスの衝撃により緩衝液中の非固定化ＤＮＡや不純物を基板面上から容易に排除することができる。また、小刻みなパルス電圧を印加することでバイアス電圧を低く抑えることができ、熱エネルギー損失を抑制することができる。
請求項５に記載の発明は、緩衝液が所定の温度に調整されたものを基板上に滴下するものである。
このようになっているため、予め全ＤＮＡを変形しやすい状態にしておくことで、緩衝液の基板上への滴下からＤＮＡの固定化までの時間を大幅に削減することができる。また、温調装置による基板温度の所定温度までの温度上昇期間に緩衝液の気化が発生し、不完全な状態でＤＮＡが固定化されることを抑制することができる。
請求項６に記載の発明は、緩衝液中のＤＮＡの他方末端に極性を有するイオン、分子または粒子を修飾したものである。
このようになっているため、修飾した他末端部の極性に応じたバイアス電圧を印加することで容易かつ確実に固定化ＤＮＡを直線状に保持することができる。また、固定化に不要となった非固定化ＤＮＡや不純物を高電圧電極に容易に移動させることができる。
請求項７に記載の発明は、前記緩衝液を、前記高電圧電極の表面に設けた誘電体に接触させたものである。
このようになっているため、緩衝液に対して効率よく静電エネルギーを供給することができる。また、非固定化ＤＮＡや不純物を高電圧電極面上に凝集することができるため、基板上の不要なＤＮＡや不純物を取り除くことができる。
請求項８に記載の発明は、ＤＮＡを固定する基板を挟んでそれぞれ対向配置した高電圧電極及び接地電極と、基板に滴下した緩衝液の温度調整を行う温調装置と、バイアス電圧を印加する電源とを備え、前記基板上に予め調整された前記ＤＮＡを含んだ緩衝液を滴下して固定するものである。
このようになっているため、温度調整をすることで全ＤＮＡを変形しやすい状態にでき、電極間にバイアス電圧を印加することで、基板上の固定化ＤＮＡに固定化されていない他末端部を中心にして静電気的に高電圧電極側に向かって直線状に保持して固定化を行うことができる。また、基板面と化学結合していない緩衝液中の非固定化ＤＮＡや不純物を高電圧電極側へ移動させることができるため、固定化ＤＮＡ間等に挟まれた状態の非固定化ＤＮＡや不純物を基板表面より排除することができ、固定化処理の後段であるハイブリダイズ反応後の検出精度を向上することができる。
請求項９に記載の発明は、高電圧電極の表面に誘電体を配置した構造のものである。
このようになっているため、高電圧電極表面の微小な凹凸や緩衝液と気相との気液接面の不均一性による静電エネルギーの局所的印加を防ぐことができる。また、緩衝液中のスパーク（火花放電）への遷移を抑制することができる。
請求項１０に記載の発明は、高電圧電極が固定化させたいスポット径と同等の面積を有する凹凸表面としたものである。
このようになっているため、非固定化ＤＮＡや不純物を高電圧電極面上に凝集することができるため、基板上の不要な物質を取り除くことができる。また、高電圧電極と緩衝液が直接接することで効率よく静電エネルギーを供給することができる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の具体的実施例を図に基づいて説明する。
【０００８】
（第１実施例）
図１は、本発明の固定化装置におけるバイアス電圧印加前の部分断面図であり、図２は本発明の固定化装置におけるバイアス電圧印加後の部分断面図である。図において、共通する部分には同一符号を用いてあり、２は接地電極、３は温調装置、４は高電圧電極、５は誘電体、６は電源、７はバイアス電圧、１２は伸張ＤＮＡ，１８は気相、１９は気液接面となっている。
高密度アミノ基をコート剤とする固定化膜１４を塗布したスライドガラスを基板１として用い、弱アルカリ溶液に酵母菌より抽出したＤＮＡ断片に固定化末端基１５を修飾させたものを混入させたものを緩衝液１０として用いた。なお、温調装置３は６０〜９０℃の範囲で調整した。
次に、本実施例の動作について説明する。
緩衝液１０をスポッターを用いて２０〜２５μｍの大きさで基板１上にスポットする。基板１は予め温調装置３により所定の温度に暖められており、この状態で高電圧電極４を基板１の下面に配された接地電極２と平行に配置する。緩衝液１０中のＤＮＡは末端基と固定化膜１４の官能基１５で化学結合を始める。緩衝液１０中のＤＮＡの大半は温度調整により柔らかくなった縮小ＤＮＡ１１となっており、既に固定化された縮小ＤＮＡ１１間等に介在する非固定化ＤＮＡ１３や不純物１７が多数存在している。ここで図２に示すように、高電圧電極４に電源６よりバイアス電圧７を印加すると、両電極間に発生する静電力により柔らかくなった縮小ＤＮＡ１１が引き伸ばされほぼ直線状になる。また、緩衝液１０中の非固定化ＤＮＡ１３や不純物１７は静電力により気液接面１９近傍に集められる。この状態で温調装置３により基板１を冷却することで伸張ＤＮＡ１２は直線状に保持される。次に、緩衝液１０を乾燥させることで伸張ＤＮＡ１２を基板１上に固定化する。場合によっては、乾燥時に高電圧電極４の高さやバイアス電圧７を調整することで、不要となった非固定化ＤＮＡ１３や不純物１７を排除することができる。
例えば、固定化処理した基板１に蛍光色素を修飾した相補ＤＮＡとハイブリダイズ反応を行い、蛍光分析装置で発現量を測定したところ、検出強度のばらつきを大幅に抑制することができた。
【０００９】
（第２実施例）
図３は第２実施例の構成を示す図である。図において、共通する部分には同一符号を用いてあり、１６は誘導末端基となっている。
第１実施例と同様な基板１を用い、酵母菌より抽出したＤＮＡ断片に固定化末端基１５を修飾させ、他端に誘導末端基１６を修飾させたものを弱アルカリ溶液に混入し緩衝液１０として用いた。なお、温調装置３は６０〜９０℃の範囲で調整した。
次に、本実施例の動作について説明する。
緩衝液１０をスポッターを用いて２０〜２５μｍの大きさで基板１上にスポットする。基板１は予め温調装置３により所定の温度に暖められており、この状態で高電圧電極４を基板１の下面に配された接地電極２と平行に配置する。緩衝液１０中のＤＮＡは末端基と固定化膜１４の官能基１５で化学結合を始める。緩衝液１０中のＤＮＡの大半は温度調整により柔らかくなったＤＮＡとなっており、既に固定化されたＤＮＡ間等に介在する非固定化ＤＮＡ１３や不純物１７が多数存在している。ここで高電圧電極４に電源６よりバイアス電圧７を印加すると、官能基１５と化学結合したＤＮＡに修飾された誘導末端基１６が両電極間に発生する静電力により引っ張られることで直線状の伸張ＤＮＡ１２となる。また、非固定化ＤＮＡ１３及び不純物１７は静電力により気液接面１８近傍に集められる。この状態で温調装置３により基板１を冷却することで伸張ＤＮＡ１２は直線状に保持される。次に、緩衝液１０を乾燥させることで伸張ＤＮＡ１２を基板１上に固定化する。場合によっては、乾燥時に高電圧電極４の高さやバイアス電圧７を調整することで、不要となった非固定化ＤＮＡ１３や不純物１７を排除する。例えば、固定化処理した基板１に蛍光色素を修飾した相補ＤＮＡとハイブリダイズ反応を行い、蛍光分析装置で発現量を測定したところ、検出強度のばらつきを大幅に抑制することができた。
【００１０】
（第３実施例）
図４は、第３実施例の構成を示す図である。図において、共通する部分には同一符号を用いている。
第２実施例と同様な基板１、緩衝液１０及び温調装置３による温度調節を用いた。
次に、本実施例の動作について説明する。
緩衝液１０をスポッターを用いて２０〜２５μｍの大きさで基板１上にスポットする。基板１は予め温調装置３により所定の温度に暖められており、この状態で高電圧電極４を基板１の下面に配された接地電極２と平行に配置する。緩衝液１０中のＤＮＡは固定化膜１４の官能基１５と化学結合を始める。緩衝液１０中のＤＮＡの大半は温度調整により柔らかくなったＤＮＡとなっており、既に固定化されたＤＮＡ間等に介在する非固定化ＤＮＡ１３や不純物１７が多数存在している。ここで高電圧電極４に電源６よりバイアス電圧７を印加すると、官能基１５と化学結合したＤＮＡに修飾された誘導末端基１６が両電極間に発生する静電力により引っ張られることで直線状の伸張ＤＮＡ１２となる。また、非固定化ＤＮＡ１３及び不純物１７は静電力により高電圧電極４表面近傍に集められる。この状態で温調装置３により基板１を冷却することで伸張ＤＮＡ１２は直線状に保持される。次に、緩衝液１０を乾燥させることで伸張ＤＮＡ１２を基板１上に固定化し、不要となった非固定化ＤＮＡ１３及び不純物１７は高電圧電極４にトラップした状態で基板１上から排除する。
例えば、固定化処理した基板１に蛍光色素を修飾した相補ＤＮＡとハイブリダイズ反応を行い、蛍光分析装置で発現量を測定したところ、検出強度のばらつきを大幅に抑制することができた。
なお、本実施例ではバイアス電圧７として直流電圧を印加したが、両極性電圧及びパルス電圧を用いることで、緩衝液内部に振動電界やパルス電界を付与することができるため、非固定化ＤＮＡを基板面上から容易に排除することができる。また、特異的な形状を持つＤＮＡや隣接するＤＮＡ間との絡まりから非固定化ＤＮＡを排除することも可能となり固定化後の検出精度を向上することができる。
緩衝液１０中のＤＮＡを予め所定の温度に調整し、ＤＮＡを変形しやすい状態に予めしておくことで、バイアス電圧印加までの時間を短く、かつ固定化膜１４との化学結合時間を大幅に削減することができる。
高電圧電極は平板形状にする必要は無く、例えば固定化させたいスポット径と同等の面積を有する凹凸表面など緩衝液へ効率よく静電エネルギーを供給できる形状であれば同様の効果を得ることができる。
なお、本発明の固定化方法及び装置は、前述の実施例のみに限定するものではなく、例えば緩衝液１０の組成及び基板１上に固定化する物質や他の分野においても本発明の要旨を逸脱しない範囲の固定化方法及び装置に適用できることは無論である。
【００１１】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によればつぎの効果がある。
請求項１に記載のＤＮＡの固定化方法によれば、ＤＮＡの一方の末端を修飾した試液を緩衝液に添加し、この緩衝液を基板上に滴下してＤＮＡを化学結合させ、基板に対向して配置した電極にバイアス電圧を印加し、ＤＮＡを電気的に伸張させた状態で保持するので、ハイブリダイズ反応後の検出精度を向上することができるという効果がある。
請求項２に記載のＤＮＡの固定化方法によれば、基板表面に固定化膜を設けたので、予め調整したＤＮＡを容易かつ確実に基板と化学結合を行うことができる。また、基板材質に関係なく、固定化ＤＮＡを容易に化学結合させることができる。
請求項３に記載のＤＮＡの固定化方法によれば、バイアス電圧を両極性の電圧にしたので、非固定化ＤＮＡを基板面上から容易に排除でき、また、固定化ＤＮＡ間における非固定化ＤＮＡの絡まりを抑制することができる。
請求項４に記載のＤＮＡの固定化方法によれば、バイアス電圧をパルス電圧にしたので、パルスの衝撃により非固定化ＤＮＡを基板面上から容易に排除できる。また、小刻みなパルス電圧を印加することでバイアス電圧を低く抑えることができ、熱エネルギー損失を抑制することができる。
請求項５に記載のＤＮＡの固定化方法によれば、緩衝液を所定の温度に調整したものを基板上に滴下するので、スポッティングから固定化までの時間を大幅に削減することができる。また、緩衝液の気化による不完全な固定化を抑制することができる。
請求項６に記載のＤＮＡの固定化方法によれば、緩衝液中のＤＮＡを他方の末端に極性を有するイオン、分子または粒子を修飾させたので、容易かつ確実に固定化ＤＮＡを直線状に伸張させ、保持することができる。
請求項７に記載のＤＮＡの固定化方法によれば、緩衝液を高電圧電極の表面に設けた誘電体と接触させるようにしたので、緩衝液に対して効率よく静電エネルギーを供給することができる。また、非固定化ＤＮＡを高電圧電極面上に凝集することができ、基板上の不要なＤＮＡを取り除くことができる。
請求項８に記載のＤＮＡの固定化装置によれば、ＤＮＡを固定する基板を挟んでそれぞれ対向配置した高電圧電極及び接地電極と、基板に滴下した緩衝液の温度調整を行う温調装置と、バイアス電圧を印加する電源とを備え、基板上に予め調整されたＤＮＡを含んだ緩衝液を滴下して固定するので、全ＤＮＡを変形しやすい状態にでき、基板上の固定化ＤＮＡの固定化されていない他末端部を中心にして静電気的に高電圧電極側に向かって直線状に保持して固定化を行うことができる。また、基板面と化学結合していない非固定化ＤＮＡや不純物を高電圧電極側へ移動させることができ、固定化ＤＮＡ間等で引っ掛った状態の非固定化ＤＮＡを基板より排除することができるので、後段階であるハイブリダイズ反応後の検出精度を向上することができる。
請求項９に記載のＤＮＡの固定化装置によれば、表面に誘電体を配置した構造にしたので、高電圧電極表面の微小な凹凸や緩衝液と気相との気液接面の不均一性による静電エネルギーの局所的印加を防ぐことができる。また、スパーク（火花放電）への遷移を抑制することができるという効果がある。
請求項１０に記載のＤＮＡの固定化装置によれば、高電圧電極を固定化させたいスポット径と同等の面積を有する凹凸表面にしたので、緩衝液中の非固定化ＤＮＡや不純物を高電圧電極面上に凝集することができ、基板上から取り除くことができる。また、高電圧電極と緩衝液が直接接することができ、効率よく静電エネルギーを供給できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施例を示す固定化装置の電圧印加前の部分断面図
【図２】本発明の第１実施例を示す固定化装置の電圧印加後の部分断面図
【図３】本発明の第２実施例を示す固定化装置の部分断面図
【図４】本発明の第３実施例を示す固定化装置の部分断面図
【図５】従来の固定化装置の部分断面図
【符号の説明】
１  基板
２  接地電極
３  温調装置
４  高電圧電極
５  誘電体
６  電源
７  バイアス電圧
１０  緩衝液
１１  縮小ＤＮＡ
１２  伸張ＤＮＡ
１３  非固定化ＤＮＡ
１４  固定化膜
１５  官能基
１６  誘導末端基
１７  不純物
１８  気相
１９  気液接面
【図１】
2005009985.tif 000003
【図２】
2005009985.tif 000004
【図３】
2005009985.tif 000005
【図４】
2005009985.tif 000006
【図５】
2005009985.tif 000007