(57)【要約】【課題】  １本鎖ＲＮＡ合成活性を有するトバモウイルスのＲＮＡ複製複合体を安定的かつ効率的に取得する技術と、その代表的な利用方法とを提供する。【解決手段】  本発明にかかるウイルスＲＮＡ複製液は、トバモウイルスに感染した植物細胞のプロトプラストを脱液胞化し、得られる脱液胞化プロトプラストから抽出した細胞抽出成分を含むものであり、ウイルスの２本鎖ＲＮＡ合成活性だけでなく、ウイルスの１本鎖ＲＮＡ合成活性も有している。これにより、ＲＮＡ複製複合体やＲＮＡ複製タンパク質を効率的かつ安定的に生産することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスの１本鎖ＲＮＡ合成活性を少なくとも有しており、
トバモウイルスに感染した植物細胞のプロトプラストを脱液胞化し、得られる脱液胞化プロトプラストから抽出した細胞抽出成分を含むことを特徴とするウイルスＲＮＡ複製液。
【請求項２】
上記細胞抽出成分が、細胞抽出液および当該細胞抽出液の膜画分の少なくとも何れかであることを特徴とする請求項１に記載のウイルスＲＮＡ複製液。
【請求項３】
上記植物細胞が培養細胞であることを特徴とする請求項１または２に記載のウイルスＲＮＡ複製液。
【請求項４】
上記脱液胞化プロトプラストは、密度勾配液を用いて遠心分画することにより得られたものであることを特徴とする請求項１、２または３に記載のウイルスＲＮＡ複製液。
【請求項５】
上記密度勾配液として、コロイド状シリカ製密度勾配液を用いることを特徴とする請求の範囲４に記載のウイルスＲＮＡ複製液。
【請求項６】
密度勾配液としてパーコール（商品名）を用いることを特徴とする請求項５に記載のウイルスＲＮＡ複製液。
【請求項７】
植物がNicotiana tabacumであることを特徴とする請求項１ないし６の何れか１項に記載のウイルスＲＮＡ複製液。
【請求項８】
上記培養細胞がＢＹ−２細胞であることを特徴とする請求項７に記載のウイルスＲＮＡ複製液。
【請求項９】
ウイルスの１本鎖ＲＮＡ合成活性を少なくとも有するウイルスＲＮＡ複製液の製造方法であって、
植物細胞にトバモウイルスを感染させるウイルス感染工程と、
トバモウイルスが感染した植物細胞からプロトプラストを調製するプロトプラスト調製工程と、
ウイルスに感染した植物細胞のプロトプラストを脱液胞化する脱液胞化プロトプラスト調製工程と、
得られる脱液胞化プロトプラストから細胞抽出液を調製する細胞抽出液調製工程とを含むことを特徴とするウイルスＲＮＡ複製液の製造方法。
【請求項１０】
ウイルス感染工程には、上記トバモウイルスの１３０ｋタンパク質および１８０ｋタンパク質をコードする遺伝子を含み、植物細胞内の転写によりトバモウイルスＲＮＡ様の分子を生じ、キメラトバモウイルスの感染を誘導可能な遺伝子カセットを、植物細胞に導入する場合を含むことを特徴とする請求項９に記載のウイルスＲＮＡ複製液の製造方法。
【請求項１１】
上記ウイルス感染工程では、アグロバクテリウムを用いることを特徴とする請求項９または１０に記載のウイルスＲＮＡ複製液の製造方法。
【請求項１２】
上記脱液胞化プロトプラスト調製工程には、脱液胞化プロトプラストを取得するために密度勾配遠心法を用いる密度勾配遠心工程が含まれることを特徴とする請求項９、１０または１１に記載のウイルスＲＮＡ複製液の製造方法。
【請求項１３】
上記密度勾配遠心工程に用いる密度勾配液として、２種類以上の密度の異なる密度勾配液を重層して用いることを特徴とする請求項１２に記載のウイルスＲＮＡ複製液の製造方法。
【請求項１４】
上記密度勾配遠心工程に用いる密度勾配液には、連続密度勾配液が含まれることを特徴とする請求項１２または１３に記載のウイルスＲＮＡ複製液の製造方法。
【請求項１５】
上記密度勾配液として、コロイド状シリカ製密度勾配液を用いることを特徴とする請求項１３または１４に記載のウイルスＲＮＡ複製液の製造方法。
【請求項１６】
上記コロイド状シリカ製密度勾配液はパーコール（商品名）であることを特徴とする請求項１５に記載のウイルスＲＮＡ複製液の製造方法。
【請求項１７】
上記植物細胞が植物の培養細胞であることを特徴とする請求項９ないし１６の何れか１項に記載のウイルスＲＮＡ複製液の製造方法。
【請求項１８】
上記植物がNicotiana tabacumであることを特徴とする請求項９ないし１７の何れか１項に記載のウイルスＲＮＡ複製液の製造方法。
【請求項１９】
請求項９ないし１８の何れか１項に記載の製造方法によって得られるウイルスＲＮＡ複製液。
【請求項２０】
請求項１ないし８、または１９の何れか１項に記載のウイルスＲＮＡ複製液を用いることを特徴とするウイルスＲＮＡの複製方法。
【請求項２１】
請求項１ないし８、または１９の何れか１項に記載のウイルスＲＮＡ複製液から調製されることを特徴とするウイルスＲＮＡ複製酵素。
【請求項２２】
請求項９ないし１８の何れか１項に記載のウイルスＲＮＡ複製液の製造方法を用いてウイルスＲＮＡを複製するための、ウイルスＲＮＡ複製キット。
【請求項２３】
請求項９ないし１８の何れか１項に記載のウイルスＲＮＡ複製液の製造方法を用いる、ウイルスＲＮＡ複製複合体の生産方法。
【請求項２４】
請求項１ないし８、または１９の何れか１項に記載のウイルスＲＮＡ複製液、あるいは請求項２１に記載のウイルスＲＮＡ複製酵素によるＲＮＡの合成を阻害する作用を有する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスＲＮＡ複製液およびその製造方法、並びにその利用に関するものであり、特に、ウイルスの１本鎖ＲＮＡ合成活性を少なくとも有しており、安定的かつ効率的に製造することができるウイルスＲＮＡ複製液と、その製造方法と、これらの代表的な利用とに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プラス鎖ＲＮＡウイルスは、ｍＲＮＡとして機能し得る極性のＲＮＡをゲノムとして有するウイルスであり、植物ウイルスの大部分を占めている。このプラス鎖ＲＮＡウイルスは、宿主細胞に感染すると、当該宿主細胞のオルガネラ膜表面の細胞質側にＲＮＡ複製複合体を形成することが知られている。このＲＮＡ複製複合体はウイルスにコードされた複製タンパク質を含み、相補鎖（マイナス鎖）を介してゲノムＲＮＡを複製する。
【０００３】
従来、多くのプラス鎖ＲＮＡウイルスについて、そのＲＮＡ複製複合体や当該ＲＮＡ複製複合体を含む標品を取得することが試みられている。一般に、プラス鎖ＲＮＡウイルスに感染した感染細胞から細胞抽出液を調製すると、当該細胞抽出液では、ＲＮＡ合成活性を検出することが困難であり、また、ほとんどの場合、１本鎖ＲＮＡ合成活性は検出されず、ＲＮＡ複製中間体である２本鎖ＲＮＡ合成活性のみが検出される（非特許文献１・２参照）。この原因としては、細胞破砕時に液胞が破壊され、タンパク質分解酵素および核酸分解酵素が細胞抽出液に混入する可能性が考えられる。したがって、ＲＮＡ複製複合体を取得するには、細胞抽出液そのままを用いるのではなく細胞抽出液を精製する必要がある。
【０００４】
トバモウイルスの１種であるトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）についてもＲＮＡ複製複合体を精製して取得する試みは行われている。具体的には、非特許文献１に開示されているように、まず、ＴｏＭＶに感染したトマトの葉を破砕し、破砕液を30,000×ｇで遠心して膜画分（沈殿）を得る。次に、当該膜画分をショ糖密度勾配遠心法により精製しＲＮＡ複製活性を有する画分を得る。30,000×ｇで得られた沈殿、すなわち精製前の膜画分においては、２本鎖ＲＮＡ合成活性のみが検出されるが、精製後の膜画分からは、２本鎖ＲＮＡ合成活性に加え、１本鎖ＲＮＡ合成活性が検出される。したがって、この技術により、１本鎖ＲＮＡ合成活性を有する標品を得ることが可能となる。
【０００５】
なお、非特許文献３には、界面活性剤であるタウロデオキシコール酸を用いて、ＴｏＭＶの膜結合ＲＮＡ複製複合体の可溶化および精製を行っている。この技術では、ＴｏＭＶの１本鎖ゲノミックＲＮＡ合成活性を有する標品を得ることが可能となっている。
【０００６】
ところで、通常、植物ウイルス複製複合体を含む標品を取得する場合には、出発材料としてはウイルス感染植物体が用いられており、非特許文献１の技術でもＴｏＭＶが感染したトマト葉を用いている。これにより、原料としてのウイルス感染細胞を大量に得ることができるので、上記標品も十分な量取得することが可能となる。
【非特許文献１】Osman, T.A.M., and Buck, K.W. J. virol. 70, 6277-6234 (1996)
【非特許文献２】Schaad, M.C., Jensen, P.E., and Carrington, J.C. EMBOJ. 16. 4049-4059 (1997)
【非特許文献３】Osman, T.A.M., and Buck, K.W. J. virol. 71, 6075-6082 (1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記従来の技術では、１本鎖ＲＮＡ合成活性を有する標品を安定的かつ効率的に調製することは困難となっている。
【０００８】
具体的には、精製後の標品は、確かにＴｏＭＶの１本鎖ＲＮＡの合成活性を有しているが、１本鎖ゲノミックＲＮＡの合成活性は低く、１本鎖サブゲノミックＲＮＡの合成活性も極めてわずかとなっている。また、本発明者らは非特許文献１の技術により１本鎖ＲＮＡ合成活性を有する標品を調製しようと試みたが、再現することができなかった。また、非特許文献３の技術で得られる標品は、ＴｏＭＶの１本鎖ゲノミックＲＮＡ合成活性を有するが、１本鎖サブゲノミックＲＮＡ合成活性はほとんど有していない。
【０００９】
さらに、出発材料としてウイルス感染植物体を用いる場合、ウイルス感染細胞を大量に得ることができるという長所がある反面、（１）生育に時間がかかる、（２）細胞集団が均一ではない、（３）多くの夾雑物を含む、（４）感染が同調的ではない、（５）細胞集団の多くが感染後期の段階にある、等の多くの短所がある。それゆえ、１本鎖ＲＮＡ合成活性を有する標品を効率的に得ることは困難となっている。
【００１０】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、１本鎖ＲＮＡ合成活性を有するトバモウイルスのＲＮＡ複製複合体を安定的かつ効率的に取得する技術と、その代表的な利用方法とを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は上記課題を鑑み鋭意検討した結果、トバモウイルス感染ＢＹ−２細胞をプロトプラスト化し、液胞をパーコール遠心法により除去し、細胞質を抽出して得られる標品が、安定的かつ効率的にＴｏＭＶのＲＮＡを複製できることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明にかかるウイルスＲＮＡ複製液は、上記の課題を解決するために、ウイルスの１本鎖ＲＮＡ合成活性を少なくとも有しており、トバモウイルスに感染した植物細胞のプロトプラストを脱液胞化し、得られる脱液胞化プロトプラストから抽出した細胞抽出成分を含むことを特徴としている。
【００１３】
上記ウイルスＲＮＡ複製液においては、上記細胞抽出成分が、細胞抽出液および当該細胞抽出液の膜画分の少なくとも何れかであればよい。また、上記植物細胞が培養細胞であることが好ましく、上記脱液胞化プロトプラストは、密度勾配液を用いて遠心分画することにより得られたものであることが好ましい。ここで、上記密度勾配液として、コロイド状シリカ製密度勾配液を用いることが好ましく、密度勾配液としてパーコール（商品名）を用いることがより好ましい。また、上記植物としては、特に限定されるものではないが、タバコ（Nicotiana tabacum）を一例として挙げることができ、その培養細胞であるＢＹ−２細胞を、上記植物細胞のより好ましい一例として挙げることができる。
【００１４】
本発明にかかるウイルスＲＮＡ複製液の製造方法は、ウイルスの１本鎖ＲＮＡ合成活性を少なくとも有するウイルスＲＮＡ複製液の製造方法であって、植物細胞にトバモウイルスを感染させるウイルス感染工程と、トバモウイルスが感染した植物細胞からプロトプラストを調製するプロトプラスト調製工程と、ウイルスに感染した植物細胞のプロトプラストを脱液胞化する脱液胞化プロトプラスト調製工程と、得られる脱液胞化プロトプラストから細胞抽出液を調製する細胞抽出液調製工程とを含むことを特徴としている。
【００１５】
上記製造方法においては、ウイルス感染工程には、上記トバモウイルスの１３０ｋタンパク質および１８０ｋタンパク質をコードする遺伝子を含み、植物細胞内の転写によりトバモウイルスＲＮＡ様の分子を生じ、キメラトバモウイルスの感染を誘導可能な遺伝子カセットを、植物細胞に導入する場合を含むことが好ましく、上記ウイルス感染工程では、アグロバクテリウムを用いることが好ましい。
【００１６】
また、上記脱液胞化プロトプラスト調製工程には、脱液胞化プロトプラストを取得するために密度勾配遠心法を用いる密度勾配遠心工程が含まれることが好ましい。このとき、上記密度勾配遠心工程に用いる密度勾配液として、２種類以上の密度の異なる密度勾配液を重層して用いてもよいし、上記密度勾配遠心工程に用いる密度勾配液には、連続密度勾配液が含まれてもよい。さらに、上記密度勾配液として、コロイド状シリカ製密度勾配液を用いることがより好ましく、上記コロイド状シリカ製密度勾配液はパーコール（商品名）であることが特に好ましい。
【００１７】
上記製造方法においては、上記植物細胞が植物の培養細胞であることが好ましく、上記植物がNicotiana tabacumであることが好ましい。したがって、より好ましい一例としては、上記ＢＹ−２細胞を挙げることができる。なお、本発明には、上記製造方法によって得られるウイルスＲＮＡ複製液も含まれる。
【００１８】
本発明の利用方法は特に限定されるものではないが、例えば、上記ウイルスＲＮＡ複製液を用いるウイルスＲＮＡの複製方法、上記ウイルスＲＮＡ複製液から調製されるウイルスＲＮＡ複製酵素、上記ウイルスＲＮＡ複製液の製造方法を用いてウイルスＲＮＡを複製するためのウイルスＲＮＡ複製キット、上記ウイルスＲＮＡ複製液の製造方法を用いるウイルスＲＮＡ複製複合体の生産方法等を挙げることができる。
【００１９】
さらに、本発明のより応用的な利用方法は、特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、上記ウイルスＲＮＡ複製液、あるいは請求項２１に記載のウイルスＲＮＡ複製酵素によるＲＮＡの合成を阻害する作用を有する物質のスクリーニング方法を挙げることができる。
【発明の効果】
【００２０】
以上のように、本発明によれば、トバモウイルスに感染した植物細胞のプロトプラストを脱液胞化し、得られる脱液胞化プロトプラストから抽出した細胞抽出成分をＲＮＡ複製液として用いるため、１本鎖ＲＮＡ合成活性を有するＲＮＡ複製液を安定的かつ効率的に取得することができる。しかも、培養細胞を用いれば、当該ＲＮＡ複製液を大量に取得することができるだけでなく、これを精製することで、ＲＮＡ複製複合体やＲＮＡ複製タンパク質を効率的に取得することができる。
【００２１】
それゆえ、本発明によれば、トバモウイルスの２本鎖ＲＮＡだけでなく、１本鎖ゲノミックＲＮＡ，サブゲノミックＲＮＡを安定的かつ効率的に複製することができる上に、トバモウイルスのＲＮＡ複製複合体やＲＮＡ複製タンパク質そのものの大量調製にも用いることができるという効果を奏する。さらには、トバモウイルスだけでなく類縁ウイルスへの応用等も期待されるという効果も奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。本実施の形態では、本発明にかかるウイルスＲＮＡ複製液、その製造方法、並びに、その利用の順で、本発明を詳細に説明する。
【００２３】
（Ｉ）本発明にかかるウイルスＲＮＡ複製液
本発明にかかるウイルスＲＮＡ複製液（説明の便宜上、以下、単にＲＮＡ複製液と称する）は、トバモウイルスに感染した植物細胞のプロトプラストを脱液胞化し、得られる脱液胞化プロトプラストから抽出した細胞抽出成分を含むものである。本発明にかかるＲＮＡ複製液を用いることにより、少なくともトバモウイルスのＲＮＡを安定的かつ効率的に複製することができる。
【００２４】
〔ＲＮＡ合成活性〕
本発明にかかるＲＮＡ複製液はトバモウイルスのＲＮＡ合成活性を有しているが、特に本発明では、少なくとも１本鎖ＲＮＡ合成活性を有している。１本鎖ＲＮＡには、ｍＲＮＡとして機能し得る極性の１本鎖ＲＮＡ（プラス鎖ＲＮＡ）としてゲノミックＲＮＡおよびサブゲノミックＲＮＡが存在するが、本発明にかかるＲＮＡ複製液は何れの１本鎖ＲＮＡについても合成活性を有している。さらに、本発明にかかるＲＮＡ複製液は、２本鎖ＲＮＡの合成活性を有する。
【００２５】
なお、本発明では、実質的に２本鎖ＲＮＡの合成活性のみを有する場合には、「基本ＲＮＡ合成活性」を有すると定義し、２本鎖ＲＮＡだけでなく１本鎖ＲＮＡ合成活性も有する場合には、「完全ＲＮＡ合成活性」を有すると定義する。単に「ＲＮＡ合成活性」を有すると表現する場合には、上記少なくとも何れかのＲＮＡ合成活性を有する場合を示すものとする。
【００２６】
本発明において、ＲＮＡの複製対象となるトバモウイルス（Tobamovirus）は、αウイルス様スーパーファミリーに属するプラス鎖の１本鎖ＲＮＡウイルスであればとくに限定されるものではない。トバモウイルスとしては、具体的には、例えば、Cucumber green mottle mosaic virus（ＣＧＭＭＶ）、Frangipani mosaic virus（ＦｒＭＶ）、Kyuri green mottle mosaic virus（ＫＧＭＭＶ）、Obuda pepper virus（ＯｂＰＶ）、Odontoglossum ringspot virus（ＯＲＳＶ）、Paprika mild mottle virus（ＰａＭＭＶ）、Pepper mild mottle virus（ＰＭＭＶ）、Ribgrass mosaic virus（ＲＭＶ）、Sammons’s Opuntia virus（ＳＯＶ）、Sunn-hemp mosaic virus（ＳＨＭＶ）、Tobacco mild green mosaic virus（ＴＭＧＭＶ）、Tobacco mosaic virus（ＴＭＶ）、Tomato mosaic virus（ＴｏＭＶ）、Turnip vein-cleaning virus（ＴＶＣＶ）、Ullucus mild mottle virus（ＵＭＭＶ）、Yucari mosaic virus（ＹｏＭＶ）等が挙げられる。例えば、実施例では、ＴｏＭＶを例に挙げて本発明をより詳細に説明している。
【００２７】
本発明にかかるＲＮＡ合成液は、トバモウイルスに感染した植物細胞のプロトプラストより調製した、脱液胞化プロトプラストから得られる細胞抽出成分を含んでいればよい。ここで細胞抽出成分としては、特に限定されるものではないが、細胞抽出液および当該細胞抽出液の膜画分の少なくとも何れかであればよい。これは、ＲＮＡ複製複合体が膜画分に含まれるためである。
【００２８】
ＴｏＭＶを例に挙げてＲＮＡ複製複合体について説明する。ＴｏＭＶのゲノミックＲＮＡは、５’末端にキャップ構造を、３’末端にｔＲＮＡ様構造を有し、１３０ｋタンパク質、１８０ｋタンパク質、１３０ｋタンパク質、外皮タンパク質の４つのタンパク質をコードしている。ＴｏＭＶゲノミックＲＮＡから直接翻訳される１３０ｋタンパク質、およびその終止コドンのリードスルーにより合成される１８０ｋタンパク質は、ＴｏＭＶ ＲＮＡの複製に関与することが知られている。
【００２９】
上記１３０ｋタンパク質は、グアニン−７−メチルトランスフェラーゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、およびヘリカーゼ活性を有している。また、上記１８０ｋタンパク質は、１３０ｋタンパク質の有するドメインに加えてＲＮＡポリメラーゼドメインをＣ末端に有しており、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとして機能する。これら１３０ｋタンパク質および１８０ｋタンパク質をまとめて、便宜上、ＴｏＭＶ複製タンパク質と称する。
【００３０】
これらＴｏＭＶタンパク質は、そのアミノ酸配列からは膜タンパク質とは予測されないが、細胞分画法を用いた解析から、大部分が可溶性画分に存在すること、一部は膜画分に存在することが明らかとなっている。また、ＲＮＡ合成活性は膜画分において検出されている。したがって、ＴｏＭＶの複製はオルガネラ膜上で行われること、ＲＮＡ複製には膜が必要であることが明らかとなっている（何れも後述する実施例参照）。
【００３１】
このように、本発明にかかるＲＮＡ複製液は、細胞抽出液の膜画分が少なくとも含まれていればＲＮＡ合成活性を発揮することができる。したがって、本発明では、ＲＮＡ複製液には、細胞抽出液の膜画分が含まれていればよく、膜画分および可溶性画分、すなわち細胞抽出液全体が含まれていてもよい。しかしながら、細胞内小器官（オルガネラ）の膜成分を後から添加することにより可溶性画分にＲＮＡ合成活性を付与することが可能であるため、本発明にかかるＲＮＡ複製液は、細胞抽出液の可溶性画分のみであってもよい。
【００３２】
〔添加可能な成分〕
本発明にかかるＲＮＡ複製液は、上述したように、細胞抽出液、当該細胞抽出液の可溶性画分、および当該細胞抽出液の膜画分の少なくとも何れかが含まれていればよいが、それ以外の成分を添加してもよい。添加可能な他の成分としては、例えば、各種緩衝液、膜成分、翻訳反応の基質等を挙げることができる。
【００３３】
具体的には、得られた細胞抽出液をそのままＲＮＡ複製液として用いるのではなく、希釈して用いる場合には、細胞抽出液を各種緩衝液で希釈すればよい。また、細胞抽出液の膜画分のみを用いる場合には、この膜画分を緩衝液で希釈すればよい。緩衝液の具体的な種類は特に限定されるものではなく、使用条件等に応じてその成分を適宜選択し、ｐＨ等も適宜規定すればよい。なお、当該緩衝液の組成、ｐH、温度などの諸条件は使用する植物細胞に応じて適宜設定可能であることはいうまでもない。後述する実施例では、ＴＲバッファーを用いている。
【００３４】
また、上述したように、細胞抽出液の可溶性成分のみをＲＮＡ複製液として用いる場合や、分画しない細胞抽出液を用いるときに可溶性成分に含まれるＲＮＡ複合体も利用しようとする場合には、膜成分を添加すればよい。このときの添加の仕方は特に限定されるものではなく、固体のまま添加してから懸濁させてもよいし、緩衝液に予め懸濁させてから加えてもよい。添加する膜成分の種類も特に限定されるものではなく、各種細胞内小器官の膜成分を公知の方法で調製して用いればよい。
【００３５】
さらに、後述する実施例に示すように、脱液胞化プロトプラストから得られる細胞抽出液をそのままＲＮＡ複製液として用いてもＲＮＡ合成活性を示す。しかしながら、このときのＲＮＡ合成活性は、前記「基本ＲＮＡ合成活性」のみに近い状態で、１本鎖ＲＮＡ合成活性はわずかしか検出できない。これに対して、翻訳反応の基質を加えることで１本鎖ＲＮＡ合成活性を上昇させ、「完全ＲＮＡ合成活性」を実現することができる。したがって、本発明にかかるＲＮＡ複製液には、翻訳反応の基質を加えることが好ましい。
【００３６】
ここでいう翻訳反応の基質とは、タンパク質合成に利用するエネルギー源、およびアミノ酸を挙げることができる。エネルギー源としては、ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸等が挙げられ、アミノ酸としては２０種類のＬ型アミノ酸が挙げられる。このうちＡＴＰ再生系（ＡＴＰ、クレアチンリン酸、およびクレアチンキナーゼ）の添加が特に重要である。
【００３７】
他にも、本発明にかかるＲＮＡ複製液には、例えば、ＲＮＡ合成を容易に追跡できるように標識したＲＮＡ合成基質（ＮＴＰ）等を添加することが可能である。なお、このような標識したＮＴＰにおいて、標識の手法は特に限定されるものではなく、蛍光、ビオチン、ジゴキシゲニン等の公知の手法を挙げることができる。
【００３８】
（II）本発明にかかるウイルスＲＮＡ複製液の製造方法
本発明にかかるＲＮＡ複製液の製造方法は、特に限定されるものではないが、具体的には、（１）植物細胞にトバモウイルスを感染させるウイルス感染工程、（２）トバモウイルスが感染した植物細胞からプロトプラストを調製するプロトプラスト調製工程、（３）ウイルスに感染した植物細胞のプロトプラストを脱液胞化する脱液胞化プロトプラスト調製工程、（４）得られる脱液胞化プロトプラストから細胞抽出液を調製する細胞抽出液調製工程の各工程を含む製造方法を好ましく挙げることができる。
【００３９】
〔使用植物〕
本発明にかかる製造方法に使用できる植物細胞としては、トバモウイルスに感染可能であり、かつ、脱液胞化プロトプラストを得ることができる植物細胞であれば、特に限定されるものではない。したがって、植物細胞に遺伝子組換え等の遺伝子操作を加えた、人工の植物細胞を使用することも可能である。例えば、形質転換植物由来の細胞、特定の因子を欠損させた細胞、特定の因子を過剰発現させた細胞等を用いることができる。
【００４０】
ここで、本発明では、株化された培養細胞を使用することが好ましい。株化された培養細胞は、均一な細胞集団を大量に得ることができるという利点がある。中でも、タバコ（Nicotiana tabacum）培養細胞またはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）培養細胞が好適である。これら培養細胞は、タバコ植物組織、あるいはシロイヌナズナ植物組織から、通常の植物組織培養方法（参考文献：植物バイオテクノロジー、S.H.Mantell, J.A.Matthews, R.A.McKee著、オーム社（1987））によって作製することができる。また、タバコ培養細胞としては、ＢＹ−２細胞が良く知られているので、このＢＹ−２細胞も好適に用いることができる。
【００４１】
ＢＹ−２細胞は極めて速い生育速度を有する細胞であり、プロトプラスト化が容易、アグロバクテリウムを用いた遺伝子導入も高い頻度で行うことができる。それゆえ、本発明では、ＢＹ−２細胞等の培養細胞を出発原料として用いることで、トバモウイルスに感染した感染細胞を大量に得ることができ、結果的にＲＮＡ複製液を十分な量得ることが可能となる。
【００４２】
〔ウイルス感染工程〕
ウイルス感染工程は、ホストとなる植物細胞にトバモウイルスを感染させる方法であれば特に限定されるものではなく、公知の方法を用いればよい。ここで、ウイルス感染とは、トバモウイルスそのものをホストとなる植物細胞に感染させること（狭義の「ウイルス感染」と定義する）だけでなく、ベクター化したＲＮＡを植物細胞に導入すること（「形質転換」と定義する）も含むものとする。
【００４３】
上記形質転換の場合、具体的には、少なくともトバモウイルスの１３０ｋタンパク質および１８０ｋタンパク質をコードする遺伝子（便宜上、１３０ｋ／１８０Ｋ遺伝子と称する）を含み、植物細胞内の転写によりトバモウイルスＲＮＡ様の分子を生じ、キメラトバモウイルスの感染を誘導可能な遺伝子カセットを、植物細胞に導入することになる。ここで、このような遺伝子カセットを導入する方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができるが、アグロバクテリウムを用いる方法を好適に用いることができる。
【００４４】
上記遺伝子カセットについては特に限定されるものではなく、上記１３０ｋ／１８０Ｋ遺伝子とそのプロモーターとを少なくとも含んでいればよい。上記プロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを挙げることができる。
【００４５】
また、上記以外のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。例えば、後述する実施例に示すように、ステロイドホルモンにより誘導がかけられるようなＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。あるいは、後述する実施例に示すように、３’末端側のポリ（Ａ）配列を切断する活性を有するリボザイム配列を含んでいてもよい。この場合、ポリ（Ａ）配列が除去されることにより、本来のトバモウイルスのゲノミックＲＮＡに近いｍＲＮＡを植物細胞内で発現させることができる。
【００４６】
〔プロトプラスト調製工程〕
プロトプラスト調製工程は、植物細胞からプロトプラストが得られる方法であれば特に限定されるものではなく、公知の方法を用いればよい。通常、酵素処理により植物細胞の細胞壁を消化する方法が一般的である。ただし、この方法に限定されるものではない。
【００４７】
細胞壁を消化する酵素としては、セルラーゼ、ペクトリアーゼ、ドリセラーゼを挙げることができるが、これに限定されるものではない。使用する酵素の種類、濃度等も、特に限定されるものではなく、用いる植物細胞の種類の応じて適宜選択すればよい。例えば、タバコ培養細胞を、１％セルラーゼ、０．１％ペクトリアーゼ、１％ドリセラーゼ存在下で処理することにより、タバコ培養細胞由来のプロトプラストを調製することができる。また、シロイヌナズナ培養細胞を、１％セルラーゼ、０．２％ペクトリアーゼ存在下で処理することにより、シロイヌナズナ培養細胞由来のプロトプラストを調製することができる。
【００４８】
〔脱液胞化プロトプラスト調製工程〕
脱液胞化プロトプラスト調製工程は、植物のプロトプラストから脱液胞化プロトプラストが得られる方法であれば特に限定されるものではないが、密度勾配遠心法を用いることが好ましい。すなわち、脱液胞化プロトプラスト調製工程は、密度勾配遠心工程を含むことが好ましい。ここで、「密度勾配遠心法」とは、遠心管内に溶質で濃度勾配、すなわち密度勾配をつけた溶液（密度勾配液）を作製し、試料を加えて遠心し、巨大分子や細胞内粒子などの成分を同じ密度の位置まで沈降あるいは浮遊させ、密度の異なる成分を分離、分画する方法である。使用する密度勾配液としては、特に限定されるものではなく、例えば、ショ糖、グリセロール、コロイド状シリカ製密度勾配液（シリカゾル）等が挙げられる。中でも、生体膜の保全性と遠心時間の短さの点でコロイド状シリカ製密度勾配液の使用が好ましい。
【００４９】
ここで、「コロイド状シリカ製密度勾配液」とは、表面処理されたコロイド状シリカを分散させて調製した密度勾配液をいう。コロイド状シリカ製密度勾配液として、具体的には、例えば、パーコール（商品名、アマシャムバイオサイエンス株式会社製）を挙げることができる。パーコールはポリビニルピロリドンの被膜を持つコロイド状シリカ製品で、密度1.13g/mLの溶液として販売されており、密度勾配遠心用媒体として、広く使用されている。パーコールは、植物のプロトプラストから脱液胞化プロトプラストを調製する場合の密度勾配液として、最も適しているものの１つである。ただし、コロイド状シリカ製密度勾配液はパーコールに限定されるものではなく、同等の性質を有するものであれば、好適に用いることができる。
【００５０】
密度勾配遠心法においては、２種類以上の密度の異なる密度勾配液を重層して用いることが好ましい。本製造方法において、密度の異なるパーコールの重層による密度勾配遠心法を適用する場合には、下層から順に４５〜７５％（v/v）、３５〜５０％（v/v）および１０〜３５％（v/v）の範囲から選択される濃度のパーコールを、最下層が最高濃度、最上層が最低濃度となるように用いることが好ましく、下層から順に７０％（v/v）、４０％（v/v）および３０％（v/v）の濃度のパーコールを重層して用いることが最も好ましい。この場合、タバコ培養細胞由来の脱液胞化プロトプラストは、７０％（v/v）パーコールと４０％（v/v）パーコールの境界面に濃縮して分画され、シロイヌナズナ由来の脱液胞化プロトプラストは４０％（v/v）パーコールと３０％（v/v）パーコールの境界面に濃縮して分画される。
【００５１】
また、密度勾配液に連続密度勾配液を用いることができる。「連続密度勾配液」とは、ある濃度から別の濃度まで連続した密度勾配を形成している状態にある密度勾配液を意味する。例えば、遠心管に３０％（v/v）パーコール溶液入れ、その上に等量の２０％（v/v）パーコール溶液を重層して、グラジエントメーカーを用いて回転させると、最上部の２０％（v/v）から最下部の３０％（v/v）まで滑らかに連続する密度勾配を形成した連続密度勾配液を作製することができる。連続密度勾配液を用いると、プロトプラストの最初の集束位置が分散するため、多量のプロトプラストを処理しても脱液胞化プロトプラストの収量が低下することがないという利点がある。
【００５２】
なお、上記連続密度勾配液は、上記脱液胞化プロトプラストが濃縮される密度勾配液の液−液界面より上層に重層されることが好ましい。このように連続密度勾配液を重層して密度勾配遠心法を実施する場合、脱液胞化プロトプラストは、連続密度勾配液中を通過して、所定の密度勾配液の液−液界面まで沈降することになる。この場合、プロトプラストの最初の集束位置が分散するため、段階的な密度勾配のみを形成して脱液胞化プロトプラストを取得する場合に比べて、脱液胞化プロトプラストをより高収率で取得することができる。
【００５３】
本製造方法において、連続密度勾配のパーコールを用いる場合には下層から順に４５〜７５％（v/v）、３５〜５０％（v/v）、（１０〜２０％（v/v））ないし（２５〜３５％（v/v））の連続密度勾配、および５〜１５％（v/v）の範囲から選択される濃度のパーコールを、最下層が最高濃度、最上層が最低濃度となるように濃度順に用いることが好ましく、下層から順に７０％（v/v）、４０％（v/v）、２０ないし３０％（v/v）の連続密度勾配、および１５％（v/v）の濃度のパーコールを重層して用いることが最も好ましい。連続密度勾配の密度勾配液を用いることにより、脱液胞化プロトプラストの回収効率を向上させることが可能となる。
【００５４】
脱液胞化プロトプラストが遠心管の底に沈殿すると、同じく底に沈殿する糖質等の固形成分により脱液胞化プロトプラストが破砕されてしまうため、密度の異なる密度勾配液の液−液界面に濃縮して遠心分画されるように密度勾配液の密度を設定することが重要である。液−液界面に分画されることにより、無傷の脱液胞化プロトプラストを回収することが可能となる。密度勾配液としてパーコールを用いる場合、脱液胞化プロトプラストを遠心管の底に沈殿させないために、４５〜７５％（v/v）の範囲内で選択される濃度のパーコール溶液を最下層とすることが好ましい。
【００５５】
〔細胞抽出液調製工程〕
細胞抽出液調製工程は、脱液胞化プロトプラストから細胞抽出液が得られる方法であれば特に限定されるものではなく、公知の方法を用いればよい。通常、脱液胞化プロトプラスト懸濁液を調製し、ホモジナイザーを用いて脱液胞化プロトプラストを破砕した後に遠心分離し、上清を回収する方法が一般的である。ただし、この方法に限定されるものではない。
【００５６】
本工程において、脱液胞化プロトプラストを懸濁する緩衝液の組成は特に限定されるものではないが、細胞質と同様の性質を有するものが好ましい。すなわち、ミリモル（ｍＭ）オーダーのマグネシウムイオンと１００ｍＭ程度のカリウムイオンを含み、中性に近いｐＨを有する緩衝液が好適である。また、還元剤、プロテアーゼ阻害剤等を含んでいてもよい。また、還元剤、プロテアーゼ阻害剤等は抽出液を調製した後に添加してもよい。
【００５７】
〔その他の工程〕
本発明にかかるＲＮＡ複製液の製造方法では、上記各工程以外の工程が含まれていてもよい。具体的には、例えば、細胞抽出液調製工程で得られた細胞抽出液を分画して膜画分と可溶性画分に分ける分画工程や、細胞抽出液、あるいは、膜画分および／または可溶性画分の少なくとも何れかに緩衝液等を混合して、最終製品としてのＲＮＡ複製液を調製するＲＮＡ複製液調製工程等を挙げることができる。これら工程の具体的な方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜用いることができる。
【００５８】
（III）本発明にかかるウイルスＲＮＡ複製液の利用
本発明にかかるウイルスＲＮＡ複製液およびその製造方法の利用方法は、特に限定されるものではなく、当業者の想定し得る範囲でさまざまな用途に利用することができる。
【００５９】
〔ウイルスＲＮＡの複製方法〕
本発明の代表的な利用方法としては、例えば、上述したウイルスＲＮＡ複製液を用いたウイルスＲＮＡの複製方法（または生産方法）が挙げられる。なお、当該ウイルスＲＮＡの複製方法には、後述するウイルスＲＮＡ複製液製造キット等を使用する場合も含まれる。本発明によれば、従来の技術では、十分に複製できなかったウイルスＲＮＡを効率よく複製することができる。
【００６０】
ここで、複製対象となるウイルスＲＮＡとしては、前述した各種トバモウイルスを含むプラス鎖ＲＮＡウイルスが挙げられる。プラス鎖ＲＮＡウイルスは、ｍＲＮＡとして機能し得る極性のＲＮＡをゲノムとして有するウイルスであり、植物ウイルスの大部分を占めている。さらに、Ｃ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ＳＡＲＳウイルス等の動物プラス鎖ＲＮＡウイルスは、トバモウイルスとＲＮＡ複製機構に関して共通項を有していることが知られている。
【００６１】
それゆえ、本発明を用いれば、少なくともトバモウイルス等の植物プラス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡを複製することが可能であるだけでなく、本発明を利用することで、動物プラス鎖ＲＮＡウイルスの複製の解明に大きく寄与することが可能となる。その結果、植物ウイルスによる植物病の研究だけでなく、上記各種疾患の研究、治療薬・予防薬の開発等にも広く応用することが可能となる。
【００６２】
ウイルスＲＮＡの複製方法における諸条件は特に限定されるものではなく、複製対象となるウイルスの種類等により、その条件を適宜設定すればよい。例えば、後述する実施例に示すような、ＴｏＭＶとＢＹ−２細胞とを用いてウイルスＲＮＡ複製液を製造し、これを用いて他の種のウイルスＲＮＡを複製してもよいが、用いるウイルスを他のウイルスとしてもよいし、用いるホスト細胞を他の植物としてもよい。
【００６３】
〔ＲＮＡ複製酵素、ＲＮＡ複製複合体、ＲＮＡ複製タンパク質〕
また、本発明には、上述したウイルスＲＮＡ複製液およびその製造方法を利用して得られるＲＮＡ複製酵素、並びにＲＮＡ複製複合体も含まれる。ここで言うＲＮＡ複製酵素は、少なくとも前記「基本ＲＮＡ合成活性」を発揮することができる程度に精製されているものであればよく、一種類の純度の高いタンパク質として精製されている必要はない。したがって、例えばザイモリアーゼ（zymolyase）のように複数の成分を含むものであってもよい。
【００６４】
逆に、本発明では、上述したウイルスＲＮＡ複製液や上記ＲＮＡ複製酵素を精製することにより、純度の高いＲＮＡ複製複合体を得てもよいし、１３０ｋタンパク質および／または８０ｋタンパク質、すなわちＲＮＡ複製タンパク質を得てもよい。本発明を用いれば、これら複合体やタンパク質単品を効率的に製造することができる。
【００６５】
なお、上記ＲＮＡ複製酵素、ＲＮＡ複製複合体、またはＲＮＡ複製タンパク質の状態は特に限定されるものではなく、固形状であってもよいし、適切な緩衝液に溶解または分散した溶液であってもよい。また、ウイルスＲＮＡ複製液から、上記ＲＮＡ複製酵素、ＲＮＡ複製複合体、またはＲＮＡ複製タンパク質を精製するときの精製法や精製条件も特に限定されるものではなく、公知の方法や条件を用いればよい。
【００６６】
〔ウイルスＲＮＡ複製キット〕
本発明の他の利用方法としては、ウイルスＲＮＡ複製キット、またはウイルスＲＮＡ複製液製造キットを挙げることができる。ウイルスＲＮＡ複製キットは、ウイルスＲＮＡを複製するためのキットであり、ウイルスＲＮＡ複製液製造キットは、上述したＲＮＡ複製液を製造するためのキットである。これらキットの構成は特に限定されるものではないが、例えば、植物にウイルスを感染させるために用いられる試薬（ウイルスＲＮＡ導入試薬）、植物のプロトプラストを調製するために用いられる試薬（プロトプラスト調製試薬）、プロトプラストから脱液胞化プロトプラストを調製するために用いられる試薬（脱液胞化試薬）、脱液胞化プロトプラストからＲＮＡ複製液を調製するために用いられる試薬（細胞抽出液調製試薬）を挙げることができる。ここで「試薬」には、酵素や塩類等の一般的な試薬の他に、一連の操作に使用される器具等を含んでもよいものとする。
【００６７】
ウイルスＲＮＡ導入試薬としては、ホストとなる植物細胞にトバモウイルスそのものをホストとなる植物細胞に感染させる「ウイルス感染」を行うか、または、前述した遺伝子カセットを植物細胞に導入する「形質転換」を行うための試薬であれば特に限定されるものではない。具体的には、例えば、アグロバクテリウムによる形質転換に用いられる各種試薬等を挙げることができる。
【００６８】
プロトプラスト調製試薬としては、上記プロトプラスト調製工程において使用する試薬であれば、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、植物細胞の細胞壁を消化する酵素を含む酵素処理液、酵素処理後にプロトプラストを洗浄するための緩衝液、遠心管等を挙げることができる。
【００６９】
すなわち、プロトプラスト調製試薬には、少なくとも植物細胞の細胞壁を消化する酵素類が含まれていることが好ましい。当該酵素類としては、セルラーゼ、ペクトリアーゼ、ドリセラーゼ等を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００７０】
脱液胞化試薬としては、上記脱液胞化プロトプラスト調製工程において使用する試薬であれば、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、密度勾配液、密度勾配液を希釈するための希釈液やプロトプラストを懸濁するための緩衝液、遠心管等を挙げることができる。
【００７１】
すなわち、脱液胞化試薬には、少なくとも密度勾配液が含まれていることが好ましい。密度勾配液としては、具体的には、上述のショ糖、グリセロール、コロイド状シリカ製密度勾配液（シリカゾル）等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。キットに含まれる密度勾配液は、密度勾配液の原液として一定密度の１種類の密度勾配液であってもよく、異なる密度に調製した複数の密度勾配液であってもよい。前者の場合は、キットの使用者が自由に使用密度を選択できるという利点があり、後者の場合は、そのまま密度勾配液を重層するだけで密度勾配遠心分離を実施でき、使用密度を選択して調製するという手間を省けるという利点がある。
【００７２】
細胞抽出液調製試薬としては、上記細胞抽出液調製工程において使用する試薬であれば、特に限定されるものではない。例えば、ＲＮＡ複製液の調製を、脱液胞化プロトプラストをホモジナイズしてその遠心上清を得るという方法により行う場合には、回収した脱液胞化プロトプラストを洗浄するための緩衝液、脱液胞化プロトプラストを懸濁してホモジナイズするための緩衝液、ホモジナイザー管、遠心管等を挙げることができる。
【００７３】
ＲＮＡ複製液製造キットの場合は、上記プロトプラスト調製試薬、脱液胞化試薬、細胞抽出液調製試薬を含んでいればよいが、ＲＮＡ複製キットの場合には、ＲＮＡ複製液を用いて複製されたＲＮＡを精製するための試薬（ＲＮＡ精製試薬）を含んでいることが好ましい。ＲＮＡ精製試薬としては、具体的には、例えば、フェノール、クロロホルム、グアニジウム塩等を挙げることができる。また、公知のＲＮＡ精製用キット試薬と組み合わせてもよい。
【００７４】
また、上記何れのキットにおいても、「完全ＲＮＡ合成活性」を十分なものとするために、ＲＮＡ合成活性向上試薬を含んでいることが好ましい。具体的には、例えば、前述した翻訳反応の基質類や、細胞内小器官の膜成分等を挙げることができる。なお、翻訳反応の基質類に含まれる成分として、具体的には、例えば、タンパク質合成に利用するエネルギー源としての、ＡＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ等が挙げられる。これらは一種類のみが個別にキットに含まれていてもよいし、予め２種類以上を混合した混合物としてキットに含まれていてもよい。
【００７５】
その他に、上記何れのキットにおいても、ＲＮＡ複製複合体、あるいは１３０ｋタンパク質または１８０ｋタンパク質を確認するための電気泳動用ゲル、緩衝液、試薬等が含まれていることが好ましい。これらが本キットに含まれていることにより、使用者はさらに簡便に本キットを用いて無細胞タンパク質合成反応を行うことが可能となる。
【００７６】
〔ＲＮＡの合成を阻害する作用を有する物質のスクリーニング方法〕
上述した各利用方法は、本発明を実用化する上での代表的な利用技術の一例であるが、本発明の応用面での利用方法も本発明には含まれる。本発明の応用面での利用方法としては、具体的には、例えば、上記ＲＮＡ複製液やＲＮＡ複製酵素等によるＲＮＡの合成を阻害する作用を有する物質のスクリーニング方法を挙げることができる。
【００７７】
これらＲＮＡの合成を阻害する物質は、トバモウイルスによる各種植物病の治療薬や予防薬となり得る。また、このようにして得られたＲＮＡの合成を阻害する物質は、ヒトや動物の疾患の治療薬や予防薬としても有効である可能性がある。
【００７８】
本発明にかかるスクリーニング方法は、本発明にかかるＲＮＡ複製液、またはＲＮＡ複製酵素等を含むＲＮＡ複製（合成）系に候補物質を添加し、ＲＮＡが複製されているか否かを確認すればよい。このとき、「完全ＲＮＡ合成活性」が確実に検出されることを確認することで、ＲＮＡの合成を阻害する作用を有する物質をより確実にスクリーニングすることが可能となる。
【実施例】
【００７９】
本発明について実施例および図１ないし図６に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
【００８０】
〔用いたベクター〕
ＴｏＭＶのゲノムは、図１Ａに示すように、５’末端から順に、１３０Ｋ／１８０ｋタンパク質をコードする遺伝子（図中ＴｏＭＶ １３０ｋ／１８０ｋ）、移行タンパク質をコードする遺伝子（図中ＭＰ）、外被タンパク質をコードする遺伝子（図中ＣＰ）からなる構造を有している。
【００８１】
以下の実施例では、図１Ｂ〜Ｄに示す各遺伝子カセット（ベクター）を、ステロイドホルモンによるＴｏＭＶ感染誘導に用いた。具体的には、図１Ｂに示すベクターであるＤＥＸ−ＴｏＭＶは、５’末端から順に、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（図中３５Ｓ）、キメラ転写因子ＧＶＧ、Ｔｅｒ１はｒｂｃＳ（ribulose bisphosphate carboxylase small subunit）Ｅ９のポリ（Ａ）付加シグナル（図中Ｔｅｒ１）、誘導プロモーター、ＴｏＭＶ １３０ｋ／１８０ｋ、ＥＲ膜内局在シグナル（図中ER-targeteing signal）を有するＧ３ＧＦＰ配列（ｅｒＧ３ＧＦＰと記載）、ｂｃＳ−３Ａのポリ（Ａ）付加シグナル（図中Ｔｅｒ２）からなる構成を有している。
【００８２】
キメラ転写因子ＧＶＧは、５’末端から順に、出芽酵母の転写因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（図中ＧＡＬ４）、ヘルペスウイルスの転写因子ＶＰ１６の転写活性化ドメイン（図中ＶＰ１６）、グルココルチコイド受容体のホルモン結合ドメイン（図中ＧＲ−ＨＢＤ）からなる構造を有している。このキメラ転写因子ＧＶＧは、上記３５Ｓプロモーターにより制御される。また、上記誘導プロモーターは、６回反復ＧＡＬ４−ＤＮＡ結合配列（図中６×ＧＡＬ４ ＵＡＳ）と３５Ｓプロモーターのコア配列（ＴＡＴＡ）より構成され、ＴｏＭＶ ＲＮＡは、この誘導プロモーターにより制御される。なお、ｅｒＧ３ＧＦＰは、感染の有無を確認するために導入されている。
【００８３】
図１Ｃに示すベクターであるＤＥＸ−ＴｏＭＶ−ｒｉｂｏ３４は、基本的に上記ＤＥＸ−ＴｏＭＶと基本的に同じ構造を有しているが、ＴｏＭＶ配列の直下に、ＨＤＶ（Hepatitis delta virus）のリボザイム配列（ＲＺ）を挿入している。ＴｏＭＶ由来の配列はＣＣＡまたはＣＣＡＧである。また、リボザイムにより切断される個所を矢印で示す。
【００８４】
図１Ｄに示すベクターであるＤＥＸ−ＴｏＭＶ−ｒｉｂｏ１２も、基本的に上記上記ＤＥＸ−ＴｏＭＶと基本的に同じ構造を有しているが、ＴｏＭＶ配列の直下に、ＳＴＲＶ（Satellite tobacco ringspot virus）のリボザイム配列（ＲＺ）を挿入している。ＴｏＭＶ由来の配列はＣＣＡであり、付加される配列はＧＵＧである。また、リボザイムにより切断される個所を矢印で示す。
【００８５】
〔用いた形質転換体〕
以下の実施例では、ＴｏＭＶ感染誘導細胞３４Ｈ２４株、または１２Ｈ１６株より調製した細胞抽出液を用いた。形質転換体の作製に用いたベクターは上記ＤＥＸ−ＴｏＭＶ、ＤＥＸ−ＴｏＭＶ−ｒｉｂｏ１２またはＤＥＸ−ＴｏＭＶ−ｒｉｂｏ３４である。これらベクターを用いて、ステロイドホルモン添加によるＴｏＭＶ感染誘導の原理を、図２に基づいて具体的に説明する。
【００８６】
まず、ＧＶＧ転写因子は構成的に発現するが、ＤＥＸが無いときはＨＳＰ９０と結合して細胞質に局在し、不活性な状態にある（ステップ１）。次に、デキサメタゾンとの結合により、ＧＶＧが活性化される（ステップ２）。活性化ＧＶＧは核に移行し、ＧＶＧ制御プロモーターに結合する（ステップ３）。そして、ＴｏＭＶゲノミックＲＮＡがＲＮＡポリメラーゼIIにより転写される（ステップ４）。このとき、リボザイムによりＲＮＡが切断される（ステップ４ａ）。次に、１３０ｋおよび１８０ｋ複製タンパク質が翻訳される（ステップ５）。翻訳された複製タンパク質および宿主因子によりウイルスＲＮＡが複製され（ステップ６）、サブゲノミックＲＮＡが合成される（ステップ７）。その後、サブゲノミックＲＮＡが翻訳され、ＧＦＰが発現する（ステップ８）。
【００８７】
アグロバクテリウムを用いて図１Ｂ〜Ｄに示すベクターの遺伝子導入を行い、抗生物質耐性を有する形質転換ＢＹ−２細胞を得た。抗生物質耐性を有するカルスを全て液体培養し、ステロイドホルモンであるデキサメタゾン（ＤＥＸ）の添加により特異的にＧＦＰ蛍光を発する形質転換体を選別した。ＧＦＰ蛍光を観察することにより誘導発現率を解析した。ＧＦＰ蛍光の解析には、ＮＩＫＯＮ製倒立落射蛍光顕微鏡ＴＭＤ−ＥＦＱ（Ｍ）を用いた。ＧＦＰ蛍光観察には、ＦＩＴＣフィルターを用いた。
【００８８】
図１Ｃ・Ｄに示すベクター、すなわちリボザイム配列を挿入したベクターを用いた結果、誘導特異的にＧＦＰ蛍光を発する形質転換体の割合が上昇し、誘導感染率も上昇した。スクリーニングの結果、ＲＮＡ複製タンパク質およびＧＦＰを誘導特異的に発現する形質転換体として、３４Ｈ２４株および１２Ｈ１６株を得た。
【００８９】
これら各株の誘導は次のようにして行った。まず、３４Ｈ２４株は、図３Ａに示すように、定常期の細胞を植え継ぎ後７日目に１／２５倍希釈し、２日間培養した。その後、ＤＥＸ０．５μＭを添加し、２日間培養し、ＧＦＰ蛍光を観察した。次に、１２Ｈ１６株は、図３Ｂに示すように、定常期の細胞を植え継ぎ後７日目に１／１０倍希釈し、３日間培養した。その後、ＤＥＸ０．５μＭを含む培地に１／２０倍に希釈した。その後、２日間培養し、ＧＦＰ蛍光を観察した。
【００９０】
蛍光顕微鏡による３４Ｈ２４株の観察率（誘導発現率）は１０〜２０％であり、１２Ｈ１６株の観察率（誘導発現率）は図４Ａに示すように５０％であった。また、１２Ｈ１６株について、共焦点レーザー顕微鏡によるｅｒＧ３ＧＦＰの発現解析を行った結果、図４Ｂに示すように、ステロイドホルモン添加時に全細胞中の約５０％の細胞にＧＦＰ蛍光が観察された。
〔ＢＹ−２細胞のプロトプラスト化および脱液胞化〕
ＢＹ−２細胞のプロトプラスト化および脱液胞化は、基本的に次の方法にしたがった。まず、ＢＹ−２細胞を、０．２ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄおよび３０ｇ／Ｌのスクロースを含むムラシゲ・スクーグ培地に継代し、２６〜２７℃、１３０ｒｐｍ、暗黒下で、７日間、フラスコを用いて培養した。これにより、定常状態にある細胞を取得した。この細胞を更に新鮮な培地に継代し、同一条件で３日間培養した。遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、１分間）して上清を除去し、細胞を集めた。得られた細胞に０．４Ｍマンニトール（３０℃）を加えて、１０分間、室温に静置した。これを再び遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、１分間）して上清を除去した後、プロトプラスト調製液（１％セルラーゼ“ONOZUKA”RS（ヤクルト社製）、０．１％ペクトリアーゼＹ２３（キッコーマン社製）、１％ドリセラーゼ（協和発酵社製）、０．４Ｍマンニトール、ｐＨ５．５）を添加し、３０℃、２時間反応させ、プロトプラストを調製した。
【００９１】
上記プロトプラスト調製液中のプロトプラストを、遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、５分間）して上清を除くことにより回収した。これに０．４Ｍマンニトールを加えて洗浄し、遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、５分間）して上清を除いた。この洗浄操作を４回繰り返した後、３０％パーコール溶液（５ｍＭ PIPES−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、３０％パーコール（ｖ／ｖ）、０．７Ｍマンニトール）にプロトプラストを懸濁した。この細胞懸濁液を遠心チューブに移し、その下層に４０％パーコール溶液（５ｍＭPIPES−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ ＭＧＣｌ2、４０％パーコール（ｖ/ｖ）、０．７Ｍマンニトール）、さらにその下層に７０％パーコール溶液（５ｍＭ PIPES−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、７０％パーコール（ｖ/ｖ）、０．７Ｍマンニトール）を、注射器を用いて注入した。これを遠心分離（ベックマン社製ＪＳ２４．１５、12,000×ｇ、６０分間、２５℃）し、４０％パーコール溶液の層と７０％パーコール溶液の層との界面に位置している細胞を回収した。この細胞を顕微鏡観察したところ、液胞がなく、細胞小器官が保持された目的の脱液胞化プロトプラストが大多数を占めていた。
〔ＢＹ−２脱液胞化プロトプラストの大量調製〕
各形質転換体について、前記〔用いた形質転換体〕で述べたようにして２日間誘導を行った後、プロトプラストおよび脱液胞化プロトプラスト細胞質抽出液（ＢＹＬ）の調製を行った。基本的には、上記〔ＢＹ−２細胞のプロトプラスト化および脱液胞化〕にしたがったが、大量調製のために、（１）感染細胞の大量調製を目的として形質転換体を、前述した誘導条件の下で、５００ｍｌの液体培地を含む２Ｌフラスコを用いて２日間誘導を行った点、（２）ナイロンメッシュ（共進理工；ＰＰ−４５Ｎ，孔径４５μＭ）により液体培地を除き、細胞を回収した点、（３）ナイロンメッシュに包んだままの細胞を４００ｍｌの０．４Ｍのマンニトール溶液に浸し、細胞を洗浄した点を変更した。
【００９２】
遠心による脱液胞化処理には、遠心ローターとしてBeckman製 JS24.15・JS13.1を使用した。遠心条件は、12,000×ｇ、６５分、２８℃、スローアクセル・ノーブレーキとした。Beckman製 JS13.1の遠心チューブには、下から７０％パーコール１０ｍｌ、４０％パーコール１０ｍｌ、３０％パーコール１０ｍｌ、２０％パーコール１０ｍｌを重層し、さらにその上に１５％パーコールに懸濁したプロトプラストを１０ｍｌ重層した。３０％と４０％との界面に含まれる細胞、および４０％と７０％との界面に含まれる細胞は脱液胞化プロトプラストであった。以下の実験には、４０％と７０％との界面にある細胞画分から調製したＢＹＬをＲＮＡ複製液として使用した。
〔ＲＮＡ複製液の調製およびＲＮＡ複製液中に含まれる複製活性の検出〕
ＲＮＡ複製タンパク質およびＧＦＰを誘導特異的に発現する形質転換体として、１２Ｈ１６株を選択し、３Ｌの培地を用いて１２Ｈ１６株の誘導を行ったところ（感染率５０％）、８ｍｌの脱液胞化プロトプラストおよび３２ｍｌのＢＹＬが得られた。このＢＹＬを本発明にかかるＲＮＡ複製液とした。そして、ＲＮＡ複製液において、ＴｏＭＶ ＲＮＡ複製活性を検出した。
【００９３】
ＲＮＡ複製液またはコントロールのＢＹＬにＴＲバッファーを２０μｌと５×ＲｄＲｐミクスチャーを１０μｌ加え、２８℃で６０分間インキュベートした。これにより、ＲＮＡ複製液について、［α-32Ｐ］ＣＴＰ存在下で複製反応を行い、ウイルスＲＮＡへの32Ｐ−ＣＴＰの取り込みを解析した。なお、ＲＮＡ抽出ＲＮＡ電気泳動法は、Komoda et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(7)：1863-1867に従った。ＴＲバッファーの組成を表１に、５×ＲｄＲｐミクスチャーの組成を表２に示す。
【００９４】
【表１】
2005237301.tif 000002
【００９５】
【表２】
2005237301.tif 000003
【００９６】
その結果、ＲＮＡ複製液においては、ＴｏＭＶ ＲＮＡ複製中間体である２本鎖（ｄｓ）ＲＮＡに相当する32Ｐ標識されたＲＮＡバンドが検出された。図５のレーン１に示すように、１本鎖ＴｏＭＶゲノミックＲＮＡおよびサブゲノミックＲＮＡに相当するバンドもわずかに検出された。一方、ＲＮＡ複製液ではないコントロールのＢＹＬにおいては、図７Ｂに示すように、32Ｐ標識されたＲＮＡバンドは検出されなかった。
〔ＡＴＰ再生系添加による１本鎖ＲＮＡ合成活性の上昇〕
上記のように、ＲＮＡ複製液には、わずかながら１本鎖ＲＮＡの合成活性が検出されるが、このＲＮＡ合成活性を上昇させるために、翻訳反応の基質を添加した。具体的には、ＲＮＡ複製液２０μｌに、２×基質ミクスチャーおよび上記５×ＲｄＲｐミクスチャーを１０μｌ加えた。２×基質ミクスチャーの組成を表３に示す。
【００９７】
【表３】
2005237301.tif 000004
【００９８】
その結果、図５のレーン５に示すように、ＴｏＭＶゲノミックおよびサブゲノミックＲＮＡ相当するバンドが強く検出された。
【００９９】
さらに、翻訳反応の基質の構成成分であるＡＴＰ、ＧＴＰ、各種アミノ酸、スペルミン、クレアチンリン酸、クレアチンリン酸キナーゼを除去する場合（ＡＴＰ再生系を除去する場合）と、除去しない場合とを比較した。除去しない場合は、ＲＮＡ複製液に対して、ＴＲバッファーを２０μｌと、ＡＴＰ再生系を含む５×ＲｄＲｐミクスチャー（５×ＲｄＲｐミクスチャー（＋）と称する）とを１０μｌ加えた。５×ＲｄＲｐミクスチャー（＋）の組成を表４に示す。
【０１００】
【表４】
2005237301.tif 000005
【０１０１】
その結果、図５のレーン２〜４に示す場合（ＡＴＰ再生系を除去する場合）と、レーン６〜７に示す場合（ＡＴＰ再生系を除去しない場合）との比較から明らかなように、ＡＴＰ再生系が１本鎖ＲＮＡの検出に必要であることが示された。
【０１０２】
〔ＴｏＭＶ ＲＮＡ複製活性を有する膜画分の単離〕
ＲＮＡ複製複合体の存在する膜画分を得るために、10,000×ｇの遠心によりＲＮＡ複製液を粗分画した。上清画分をＳ１０と称し、沈殿画分をＰ１０と称する。図６Ｃに示すように、Ｐ１０には、小胞体局在シグナルを有するＧＦＰ（ｅｒＧ３ＧＦＰ）が多く存在した。この結果から、Ｐ１０は小胞体膜等の細胞内小器官の膜を含むことが示された。
【０１０３】
このＰ１０とＲＮＡ複製液の原液（ＢＹＬ）とについて、Bradford法によりタンパク質濃度を定量した結果、原液の濃度は約６ｍｇ／ｍｌであるのに対して、原液と等量のＴＲバッファーに懸濁したＰ１０の濃度は約０．６ｍｇ／ｍｌであった。ＲＮＡ複製タンパク質の存在量を調べたところ、図６Ｂに示すように、大半がＳ１０に存在していた。一方、ＲＮＡ合成活性を調べた結果、図６Ａに示すように、Ｐ１０には原液と同等のＲＮＡ合成活性が検出されたが、Ｓ１０にはほとんどＲＮＡ合成活性が検出されなかった。また、図６Ｄに示すように、Ｓ１０およびＰ１０の各画分に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＣＢＢ染色により検出したところ、やはり大半のタンパク質がＳ１０画分に分画されることがわかった。
【０１０４】
また、ＲＮＡ複製タンパク質およびＧＦＰを誘導特異的に発現する形質転換体として、３４Ｈ２４株を選択し、３Ｌの培地を用いて３４Ｈ２４株の誘導を行ったところ（感染率２０％）、８ｍｌの脱液胞化プロトプラストおよび３２ｍｌのＢＹＬが得られた。このＢＹＬを本発明にかかるＲＮＡ複製液とした。このＲＮＡ複製液に含まれるＲＮＡ複製タンパク質の定量を行った。
【０１０５】
ＲＮＡ複製複合体の存在する膜画分に含まれるＲＮＡ複製タンパク質をより厳密に定量するため、図７Ａに示すように、細胞抽出液をイオディキサノール不連続密度勾配の底に重層し、超遠心により膜を浮遊させた。具体的には、０％と３０％とからなるイオディキサノール不連続密度勾配の底に終濃度３５％イオディキサノールを含むＲＮＡ複製液（ＢＹＬ）を重層した。110,000×ｇ、６０分、４℃の条件でＴＬＳ−５５ローター（Beckman製）を用いて超遠心を行った。
【０１０６】
細胞内小器官を含む画分（Top画分）は十倍希釈した後、超遠心により膜を沈殿させて回収した。この沈殿は実験に用いたＲＮＡ複製液と等量の緩衝液に懸濁することにより希釈した。なお、図７Ａに示すように、上記Top画分に対して、ＲＮＡ複製液（ＢＹＬ）をTotalとし、可溶性画分をBottom画分とし、Bottom画分とTop画分の中間層をMiddleとした。
【０１０７】
図７Ｂに示すように、定量スタンダードと比較した結果、Total中に含まれるＲＮＡ複製タンパク質の濃度は約４．３ｎｇ／μｌ、Top画分に含まれるＲＮＡ複製タンパク質濃度は０．２ｎｇ／μｌであった。なお、上記定量スタンダードは、コムギ胚芽抽出液によりＴｏＭＶ ＲＮＡ翻訳産物の量をスタンダードとして用いた。
【０１０８】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
このように、本発明は、１本鎖ＲＮＡ合成活性を有するトバモウイルスのＲＮＡ複製複合体を安定的かつ効率的に取得することができるとともに、トバモウイルスに代表されるウイルスＲＮＡを効率的に複製（合成・生産）することができる。それゆえ、本発明は、ウイルスＲＮＡの研究等の試薬類を生産する産業に広く利用することができるだけでなく、植物ウイルスによる植物病の予防薬や治療薬、さらにはヒトを含む動物におけるＲＮＡウイルスによる疾患の予防薬や治療薬の開発に応用することが期待でき、広く医薬品産業や医療産業に利用できる可能性が期待される。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】Ａは、本発明の一実施例において、ベクター化したＲＮＡとして用いられた遺伝子カセットに用いられたＴｏＭＶゲノムの構造を示す模式図であり、Ｂは、上記遺伝子カセットとして用いられたＤＥＸ−ＴｏＭＶの構造を示す模式図であり、Ｃは、上記遺伝子カセットとして用いられたＤＥＸ−ＴｏＭＶ−ｒｉｂｏ１２の構造を示す模式図であり、Ｄは、上記遺伝子カセットとして用いられたＤＥＸ−ＴｏＭＶ−ｒｉｂｏ３４の構造を示す模式図である。
【図２】本発明の一実施例において用いられた、ステロイドホルモン添加によるＴｏＭＶ感染誘導の原理を示すステップ図である。
【図３】Ａは、３４Ｈ１２株を用いた場合のデキサメタゾン誘導によるＴｏＭＶ感染ＢＹ−２細胞の誘導条件を示すステップ図であり、Ｂは、１２Ｈ１６株を用いた場合のデキサメタゾン誘導によるＴｏＭＶ感染ＢＹ−２細胞の誘導条件を示すステップ図である。
【図４】Ａは、デキサメタゾン誘導を行ったＴｏＭＶ誘導感染ＢＹ−２細胞の蛍光顕微鏡像を示す図であり、Ｂは、同感染ＢＹ−２細胞の共焦点レーザー顕微鏡によるｅｒＧ３ＧＦＰの発現を示す図である。
【図５】ＴｏＭＶ感染誘導ＢＹ−２細胞から得られたＲＮＡ複製液に含まれるＲＮＡ合成活性の検出を示す電気泳動図であり、図中ｓｓＲＮＡはＴｏＭＶゲノミックＲＮＡを、ｄｓＲＮＡは複製中間体である２本鎖ＲＮＡを、ｓｇＲＮＡはサブゲノミックＲＮＡを、ＡＴＰはＡＴＰ再生系を、ａ．ａ．は各種アミノ酸を、sper．はスペルミンを示す。
【図６】Ａは、ＴｏＭＶ誘導感染ＢＹ−２細胞から得られたＲＮＡ複製液におけるＲＮＡ合成活性を、［α-32Ｐ］ＣＴＰの取り込みから測定した結果を示す電気泳動図であり、ＢおよびＣは、ＲＮＡ複製タンパク質とｅｒＧ３ＧＦＰとをウエスタン解析により検出した結果を示す図であり、Ｄは、各画分に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＣＢＢ染色により検出した結果を示す図である。
【図７】Ａは、ＴｏＭＶ誘導感染ＢＹ−２細胞から得られたＲＮＡ複製液を、イオディキサノール不連続密度勾配遠心により分画した概略工程を示す工程図であり、Ｂは、分画した膜画分（Top）、可溶性画分（Bottom）、ＲＮＡ複製液全体（Total）に含まれる複製タンパク質の定量の結果を示す電気泳動図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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