(57)【要約】      （修正有）【課題】ＰＣＥ分解関連バクテリアの検出に使用できる新規なポリヌクレオチドの提供。【解決手段】ポリヌクレオチドは、１７種の嫌気性ＰＣＥ分解関連バクテリアの16S-23S Internal Transcribed Spacer (ＩＴＳ)領域に由来する、前記１７種のバクテリアに特異的なポリヌクレオチドであって、それぞれ特定の塩基配列に由来するポリヌクレオチドである。バクテリアの迅速な検出のため、この塩基配列をＤＮＡプローブとして、ＤＮＡチップ等の遺伝子検出技術に利用する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチド。
（１）配列番号１から１７のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）前記（１）のポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（３）前記（１）のポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドとの相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド。
（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
下記（５）から（８）のいずれかのポリヌクレオチド。
（５）配列番号１９から１０５のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（６）前記（５）のポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（５）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（７）前記（５）のポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドとの相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド。
（８）前記（５）から（７）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブであって、前記（１）の配列番号が配列番号１であり、前記（５）の配列番号が配列番号１９から２５のいずれかである、バクテリア  デハロスピリルム  マルチヴォボランス（Dehalospirillum multivorans）を検出するためのＤＮＡプローブ。
【請求項４】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブであって、前記（１）の配列番号が配列番号２であり、前記（５）の配列番号が配列番号２６から３０のいずれかである、バクテリア  デスルフィトバクテリウム  フラピエリ（Desulfitobacterium frappieri）を検出するためのＤＮＡプローブ。
【請求項５】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブであって、前記（１）の配列番号が配列番号３であり、前記（５）の配列番号が配列番号３１から３５のいずれかである、バクテリア  アクチノマイセタレス  Ｓｍ-１（ロドコッカス  sp.  Sm-1）（Actinomycetales Sm-1 (Rhodococcus sp. Sm-1)）を検出するためのＤＮＡプローブ。
【請求項６】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブであって、前記（１）の配列番号が配列番号４であり、前記（５）の配列番号が配列番号３６から４０のいずれかである、バクテリア  ロドコッカス  ロドコッカス（Rhodococcus rhodococcus）を検出するためのＤＮＡプローブ。
【請求項７】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブであって、前記（１）の配列番号が配列番号５であり、前記（５）の配列番号が配列番号４１から４５のいずれかである、バクテリア  キサントバクター  フラバス（Xanthobacter flavus）を検出するためのＤＮＡプローブであって、およびの塩基配列に由来する請求項１または２に記載のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブ。
【請求項８】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブであって、前記（１）の配列番号が配列番号６であり、前記（５）の配列番号が配列番号４６から４８のいずれかである、バクテリア  マイコバクテリウム  L1（Mycobacterium L1）を検出するためのＤＮＡプローブ。
【請求項９】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブであって、前記（１）の配列番号が配列番号７であり、前記（５）の配列番号が配列番号４９から５３のいずれかである、バクテリア  デスルフォミクロビウム  ノルベギカム（デスルフォヴィブリオ  バキュラタス）（Desulfomicrobium norvegicum (Desulfovibrio baculatus)）を検出するためのＤＮＡプローブ。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブであって、前記（１）の配列番号が配列番号８であり、前記（５）の配列番号が配列番号５４から５７のいずれかである、バクテリア  デスルフィトバクテリウム  デハロゲナンス（Desulfitobacterium dehalogenans）を検出するためのＤＮＡプローブ。
【請求項１１】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブであって、前記（１）の配列番号が配列番号９であり、前記（５）の配列番号が配列番号５８から６２のいずれかである、バクテリア  デスルフィトバクテリウム  ハフニエンス（Desulfitobacterium hafniense）を検出するためのＤＮＡプローブ。
【請求項１２】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブであって、前記（１）の配列番号が配列番号１０であり、前記（５）の配列番号が配列番号６３から６８のいずれかである、バクテリア  クロストリジウム  フォルミコアセチカム（Clostridium formicoaceticum）を検出するためのＤＮＡプローブで。
【請求項１３】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブであって、前記（１）の配列番号が配列番号１１であり、前記（５）の配列番号が配列番号６９から７４のいずれかである、バクテリア  デスルフロノナス  クロロエテニカ（Desulfuromonas chloroethenica）を検出するためのＤＮＡプローブ。
【請求項１４】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブであって、前記（１）の配列番号が配列番号１２であり、前記（５）の配列番号が配列番号７５から７９のいずれかである、バクテリア  アセトバクテリウム  ウッディ  DSM 1030（Acetobacterium woodii DSM 1030）を検出するためのＤＮＡプローブ。
【請求項１５】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブであって、前記（１）の配列番号が配列番号１３であり、前記（５）の配列番号が配列番号８０から８６のいずれかである、バクテリア  デハロバクター  レストリクタス（Dehalobacter restrictus）を検出するためのＤＮＡプローブ。
【請求項１６】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブであって、前記（１）の配列番号が配列番号１４であり、前記（５）の配列番号が配列番号８７から９１のいずれかである、バクテリア  デスルフィトバクテリウム  sp.  PCE１（Desulfitobacterium sp. strain PCE1）を検出するためのＤＮＡプローブ。
【請求項１７】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブであって、前記（１）の配列番号が配列番号１５であり、前記（５）の配列番号が配列番号９２から９６のいずれかである、バクテリア  デスルフィトバクテリウム  フラピエリ  TCE１（Desulfitobacterium frappieri TCE1）を検出するためのＤＮＡプローブ。
【請求項１８】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブであって、前記（１）の配列番号が配列番号１６であり、前記（５）の配列番号が配列番号９７から９９のいずれかである、バクテリア  アセトバクテリウム  ウッディ  DSM 2396（Acetobacterium woodii DSM 2396）を検出するためのＤＮＡプローブ。
【請求項１９】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブであって、前記（１）の配列番号が配列番号１７であり、前記（５）の配列番号が配列番号１００から１０５である、バクテリア  デスルフォモニル  タイドジェイ  DCB-１（Desulfomonile tiedjei DCB-1）を検出するためのＤＮＡプローブ。
【請求項２０】
請求項３から１９のいずれかに記載のＤＮＡプローブが少なくとも１つ基板上に固定されたＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項２１】
請求項３から１９に記載のＤＮＡプローブが少なくとも２つ以上固定され、少なくとも２種類以上の前記バクテリアを同時に検出できる請求項２０に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項２２】
バクテリアを検出するためのキットであって、請求項３から１９に記載のＤＮＡプローブの少なくとも１つのＤＮＡプローブと、前記ＤＮＡプローブにハイブリダイズすることで検出されるターゲットを調製するための遺伝子増幅用プライマーおよび遺伝子増幅用試薬とを含むバクテリアの検出キット。
【請求項２３】
バクテリアを検出するためのキットであって、請求項２０または２１に記載のＤＮＡマイクロアレイと、前記ＤＮＡプローブにハイブリダイズすることで検出されるターゲットを調製するための遺伝子増幅用プライマーおよび遺伝子増幅用試薬とを含むバクテリアの検出キット。
【請求項２４】
バクテリアの検出方法であって、検出対象試料から調製した核酸から遺伝子増幅方法によりターゲットを調製し、前記ターゲットと請求項３から１９に記載のＤＮＡプローブに少なくとも１つとをハイブリダイズさせることにより前記試料中のバクテリアを検出する方法。
【請求項２５】
バクテリアの検出方法であって、検出対象試料から調製した核酸から遺伝子増幅方法によりターゲットを調製し、前記ターゲットと請求項２０または２１に記載のＤＮＡマイクロアレイとをハイブリダイズさせることにより前記試料中のバクテリアを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の検出用ポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）およびトリクロロエチレン（ＴＣＥ）をはじめ、各種の有機塩素化合物による地下水や土壌の汚染は、世界共通の深刻な問題であり、しばしば、新聞紙上等のマスコミでも詳細に取り上げられ、これらの物質による環境汚染を修復するための技術開発が社会的に強く要求されている。
【０００３】
汚染環境修復技術として、物理化学的方法と生物的方法とがあげられるが、低濃度汚染の修復には、微生物を用いる生物的環境修復方法（バイオレメディエーション）が特に適している。バイオレメディエーションは、土壌の掘削が必要なく、建造物下の環境修復も容易であること、低コストで環境負荷が少ないことから、その実用化への期待が大きい。
【０００４】
バイオレメディエーションの方式には、汚染された土壌や地下水に元来生息する微生物に、例えば、各種栄養物質等を供給し、微生物の持つ環境汚染物質の分解除去能力を増強させる方式（バイオスティミュレーション）と、環境汚染物質を分解除去する能力を持つ微生物を汚染環境に直接導入する方式（バイオオーギュメンテーション：例えば、特許文献１参照）とがある。ＴＣＥに汚染された地下水の環境修復を、バイオスティミュレーションとバイオオーギュメンテーションにより行い、優れた成果をあげた例もある。
【０００５】
バイオレメディエーションを適用するにあたり、その汚染サイトがバイオスティミュレーション可能か、あるいは、系外から汚染物質分解能力を持つ微生物を導入するバイオオーギュメンテーションを適用しなければならないかの判定を迅速に行うことが望まれている（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特開2003-154332号公報
【特許文献２】特開2000-079000号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、バイオレメディエーションの適用において、どの方式を適用すべきか判定可能とするポリヌクレオチドの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明のポリヌクレオチドは、下記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドである。
（１）配列番号１から１７のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）前記（１）のポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（３）前記（１）のポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドとの相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド。
（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【０００８】
本発明者らは、ＰＣＥの分解に関連する嫌気性バクテリアの検出方法について鋭意研究を重ねた結果、前記バクテリアは、それぞれ、リボゾーマルＤＮＡの16S-23S Internal Transcribed Spacer (ＩＴＳ)領域に多様性に富む特有の塩基配列を有することを見出した。そして、この塩基配列をＤＮＡプローブとして、例えば、ＤＮＡチップ等の遺伝子検出技術に利用することによって、前記バクテリアの迅速な検出が可能であることを見出し、本発明に到達した。
【０００９】
なお、本発明のポリヌクレオチドにおける配列番号１から１７の塩基配列は、後述するＰＣＥ分解に関与する１７種類の嫌気性バクテリアのＩＴＳ配列であり、本発明者らが初めて決定した配列である。
【００１０】
本発明のポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチドをＤＮＡプローブとして使用すれば、例えば、汚染環境中の嫌気性ＰＣＥ分解関連バクテリアの少なくとも１７種を迅速に検出できる。また、現在報告のある嫌気性ＰＣＥ分解関連バクテリア１８種の残りの１種のバクテリアについても公知のＩＴＳ配列からＤＮＡプローブを作製でき、これ併用すれば、前記１８種すべてを一度に検出することが可能となる。また、前記ＤＮＡプローブを用いて、例えば、ＤＮＡマイクロアレイを作製すれば、前記検出がより一層簡便かつ迅速にすることができる。
【００１１】
したがって、本発明のポリヌクレオチドによれば、汚染環境中のＰＣＥ分解関連バクテリアを迅速に検出し、前記汚染環境が有するＰＣＥおよびその脱塩素化物を除去する能力を知ることができるから、例えば、バイオレメディエーションにおけるバイオスティミュレーションが可能か否かの判定が容易にできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のポリヌクレオチドは、上記（１）から（４）のポリヌクレオチドの一部であるポリヌクレオチドであってもよく、例えば、下記（５）から（８）のいずれかのポリヌクレオチドであってもよい。
（５）配列番号１９から１０５のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（６）前記（５）のポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（５）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（７）前記（５）のポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドとの相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド。
（８）前記（５）から（７）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００１３】
本発明のＤＮＡプローブは、下記ＡからＱのいずれかのバクテリアを検出するためのＤＮＡプローブであって、本発明のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである。
Ａ：デハロスピリルム  マルチヴォボランス（Dehalospirillum multivorans）
Ｂ：デスルフィトバクテリウム  フラピエリ（Desulfitobacterium frappieri）
Ｃ：アクチノマイセタレス  Ｓｍ-１（ロドコッカス  sp.  Sm-1）（Actinomycetales Sm-1 (Rhodococcus sp. Sm-1)）
Ｄ：ロドコッカス  ロドコッカス（Rhodococcus rhodococcus）
Ｅ：キサントバクター  フラバス（Xanthobacter flavus）
Ｆ：マイコバクテリウム  L1（Mycobacterium L1）
Ｇ：デスルフォミクロビウム  ノルベギカム（デスルフォヴィブリオ  バキュラタス）（Desulfomicrobium norvegicum (Desulfovibrio baculatus)）
Ｈ：デスルフィトバクテリウム  デハロゲナンス（Desulfitobacterium dehalogenans）
Ｉ：デスルフィトバクテリウム  ハフニエンス（Desulfitobacterium hafniense）
Ｊ：クロストリジウム  フォルミコアセチカム（Clostridium formicoaceticum）
Ｋ：デスルフロノナス  クロロエテニカ（Desulfuromonas chloroethenica）
Ｌ：アセトバクテリウム  ウッディ  DSM 1030（Acetobacterium woodii DSM 1030）
Ｍ：デハロバクター  レストリクタス（Dehalobacter restrictus）
Ｎ：デスルフィトバクテリウム  sp.  PCE１（Desulfitobacterium sp. strain PCE1）
Ｏ：デスルフィトバクテリウム  フラピエリ  TCE１（Desulfitobacterium frappieri TCE1）
Ｐ：アセトバクテリウム  ウッディ  DSM 2396（Acetobacterium woodii DSM 2396）
Ｑ：デスルフォモニル  タイドジェイ  DCB-１（Desulfomonile tiedjei DCB-1）
【００１４】
具体的には、本発明のＤＮＡプローブの一態様は、前記Ａのバクテリアを検出するためのＤＮＡプローブであって、配列番号１および配列番号１９から２５のいずれかに由来する本発明のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである。ここで、配列番号１に由来する本発明のポリヌクレオチドとは、前記（１）の配列番号が配列番号１である前記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドを意味する。
【００１５】
その他の態様として、本発明のＤＮＡプローブは、前記Ｂのバクテリアを検出するためのＤＮＡプローブであって、配列番号２および配列番号２６から３０のいずれかに由来する本発明のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである。
【００１６】
その他の態様として、本発明のＤＮＡプローブは、前記Ｃのバクテリアを検出するためのＤＮＡプローブであって、配列番号３および配列番号３１から３５のいずれかに由来する本発明のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである。
【００１７】
その他の態様として、本発明のＤＮＡプローブは、前記Ｄのバクテリアを検出するためのＤＮＡプローブであって、配列番号４および配列番号３６から４０のいずれかに由来する本発明のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである。
【００１８】
その他の態様として、本発明のＤＮＡプローブは、前記Ｅのバクテリアを検出するためのＤＮＡプローブであって、配列番号５および配列番号４１から４５のいずれかに由来する本発明のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである。
【００１９】
その他の態様として、本発明のＤＮＡプローブは、前記Ｆのバクテリアを検出するためのＤＮＡプローブであって、配列番号６および配列番号４６から４８のいずれかに由来する本発明のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである。
【００２０】
その他の態様として、本発明のＤＮＡプローブは、前記Ｇのバクテリアを検出するためのＤＮＡプローブであって、配列番号７および配列番号４９から５３のいずれかに由来する本発明のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである。
【００２１】
その他の態様として、本発明のＤＮＡプローブは、前記Ｈのバクテリアを検出するためのＤＮＡプローブであって、配列番号８および配列番号５４から５７のいずれかに由来する本発明のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである。
【００２２】
その他の態様として、本発明のＤＮＡプローブは、前記Ｉのバクテリアを検出するためのＤＮＡプローブであって、配列番号９および配列番号５８から６２のいずれかに由来する本発明のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである。
【００２３】
その他の態様として、本発明のＤＮＡプローブは、前記Ｊのバクテリアを検出するためのＤＮＡプローブであって、配列番号１０および配列番号６３から６８のいずれかに由来する本発明のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである。
【００２４】
その他の態様として、本発明のＤＮＡプローブは、前記Ｋのバクテリアを検出するためのＤＮＡプローブであって、配列番号１１および配列番号６９から７４のいずれかに由来する本発明のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである。
【００２５】
その他の態様として、本発明のＤＮＡプローブは、前記Ｌのバクテリアを検出するためのＤＮＡプローブであって、配列番号１２および配列番号７５から７９のいずれかに由来する本発明のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである。
【００２６】
その他の態様として、本発明のＤＮＡプローブは、前記Ｍのバクテリアを検出するためのＤＮＡプローブであって、配列番号１３および配列番号８０から８６のいずれかに由来する本発明のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである。
【００２７】
その他の態様として、本発明のＤＮＡプローブは、前記Ｎのバクテリアを検出するためのＤＮＡプローブであって、配列番号１４および配列番号８７から９１のいずれかに由来する本発明のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである。
【００２８】
その他の態様として、本発明のＤＮＡプローブは、前記Ｏのバクテリアを検出するためのＤＮＡプローブであって、配列番号１５および配列番号９２から９６のいずれかに由来する本発明のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである。
【００２９】
その他の態様として、本発明のＤＮＡプローブは、前記Ｐのバクテリアを検出するためのＤＮＡプローブであって、配列番号１６および配列番号９７から９９のいずれかに由来する本発明のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである。
【００３０】
その他の態様として、本発明のＤＮＡプローブは、前記Ｑのバクテリアを検出するためのＤＮＡプローブであって、配列番号１７および配列番号１００から１０５のいずれかに由来する本発明のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブある。
【００３１】
本発明のＤＮＡマイクロアレイは、本発明のＤＮＡプローブが少なくとも１つ基板上に固定されたＤＮＡマイクロアレイである。本発明のＤＮＡマイクロアレイは、少なくとも２つ以上の本発明のＤＮＡプローブが固定され、前記ＡからＱのバクテリアの少なくとも２種以上を同時に検出できることが好ましい。
【００３２】
本発明のバクテリアの検出キットは、前記ＡからＱのバクテリアの少なくとも１種を検出するためのキットであって、少なくとも１つの本発明のＤＮＡプローブと、前記ＤＮＡプローブにハイブリダイズすることで検出されるターゲットを調製するための遺伝子増幅用プライマーおよび遺伝子増幅用試薬とを含むバクテリアの検出キットである。
【００３３】
本発明のバクテリアの検出キットは、その他の態様として、前記ＡからＱのバクテリアの少なくとも１種を検出するためのキットであって、本発明のＤＮＡマイクロアレイと、前記ＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズすることで検出されるターゲットを調製するための遺伝子増幅用プライマーおよび遺伝子増幅用試薬とを含むバクテリアの検出キットである。
【００３４】
本発明のバクテリアの検出方法は、検出対象試料から調製した核酸から遺伝子増幅方法によりターゲットを調製し、前記ターゲットと本発明のＤＮＡプローブに少なくとも１つとをハイブリダイズさせることにより前記試料中のバクテリアを検出する方法である。
【００３５】
本発明のバクテリアの検出方法は、その他の態様として、検出対象試料から調製した核酸から遺伝子増幅方法によりターゲットを調製し、前記ターゲットと本発明のＤＮＡマイクロアレイとをハイブリダイズさせることにより前記試料中のバクテリアを検出する方法である。
【００３６】
まず、本発明のポリヌクレオチドの一つを構成する配列番号１から１７の塩基配列について説明する。配列番号１から１７の塩基配列は、それぞれ、嫌気性ＰＣＥ分解関連バクテリアである前記ＡからＱのバクテリアのＩＴＳ配列に相当する配列である。前記ＩＴＳ配列は、原核生物の１６Ｓ-２３Ｓ ＩＴＳ配列を意味する。原核生物のリボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）である１６ＳｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡおよび５ＳｒＲＮＡは、通常、一つの転写単位（オペロン）として転写されるため、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子は隣り合ってゲノム上に配置されている。この１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子との間の領域が、１６Ｓ-２３Ｓ Internal Transcribed Spacer（ＩＴＳ）と呼ばれる領域である。本発明者らは、前記ＡからＱのバクテリアにおける前記ＩＴＳの配列を初めて決定し、このＩＴＳ配列であれば、前記ＡからＱのバクテリアのそれぞれに特有のＤＮＡプローブが作製できることを初めて見出したのである。
【００３７】
したがって、本発明のポリヌクレオチドとしては、下記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドがあげられる。
（１）配列番号１から１７のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）前記（１）のポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（３）前記（１）のポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドとの相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド。
（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００３８】
また、本発明者らは、前記ＩＴＳ配列（配列番号１から１７）の一部も、前記バクテリアＡからＱのＤＮＡプローブとして使用できることも見出した。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、前記（１）から（４）のポリヌクレオチドの一部であるポリヌクレオチドであってもよく、例えば、下記（５）から（８）のいずれかのポリヌクレオチドであってもよい。
（５）配列番号１９から１０５のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（６）前記（５）のポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（５）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（７）前記（５）のポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（５）のポリヌクレオチドとの相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド。
（８）前記（５）から（７）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００３９】
ここで、欠失、置換もしくは付加が可能な塩基数としては、例えば、４０塩基に対して、欠失・付加で、１個〜６個であり、１個〜３個が好ましく、より好ましくは１個〜２個であり、置換で、１個〜４個であり、１個〜２個が好ましく、より好ましくは１個である。ハイブリダイズする前記ストリンジェントな条件としては、例えば、配列番号で示された塩基配列のＴｍ値の±１０℃があげられる。また、前記相同性としては、例えば、９０％以上であり、９５％以上が好ましく、より好ましくは、９７．５％以上である。
【００４０】
次に、本発明のＤＮＡプローブについて説明する。本発明のＤＮＡプローブは、前記ＡからＱのバクテリアのいずれかを検出できるＤＮＡプローブであって、本発明のポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである。本発明のＤＮＡプローブとしては、前記バクテリアＡからＱのＩＴＳ配列全体（配列番号１から１７）よりもその一部の塩基配列に由来するものが好ましい。ＤＮＡプローブは、通常、その長さが短くなるほど配列特異性が増し、信頼度が向上するからである。一方、配列自体が前記バクテリアそれぞれに対して特有である必要がある。したがって、ＤＮＡプローブの長さとしては、特に制限されないが、例えば、１０塩基から前記ＩＴＳ配列全体であり、４０〜８０塩基が好ましい。
【００４１】
前記バクテリアＡからＱのＩＴＳ配列全体（配列番号１から１７）の一部である４０塩基の塩基配列の具体例が、配列番号１９から１０５の塩基配列であって、配列番号１９から２５が配列番号１の一部に該当し、配列番号２６から３０が配列番号２の一部に該当し、配列番号３１から３５が配列番号３の一部に該当し、配列番号３６から４０が配列番号４の一部に該当し、配列番号４１から４５が配列番号５の一部に該当し、配列番号４６から４８が配列番号６の一部に該当し、配列番号４９から５３が配列番号７の一部に該当し、配列番号５４から５７が配列番号８の一部に該当し、配列番号５８から６２が配列番号９の一部に該当し、配列番号６３から６８が配列番号１０の一部に該当し、配列番号６９から７４が配列番号１１の一部に該当し、配列番号７５から７９が配列番号１２の一部に該当し、配列番号８０から８６が配列番号１３の一部に該当し、配列番号８７から９１の配列番号１４の一部に該当し、配列番号９２から９６が配列番号１５の一部に該当し、配列番号９７から９９が配列番号１６の一部に該当し、配列番号１００から１０５が配列番号１７の一部に該当する。
【００４２】
現在、ＰＣＥの分解に関連する嫌気性バクテリアとして報告されている嫌気性バクテリアは１８種であり、前記ＡからＱの１７種のバクテリアと下記Ｒのバクテリアである。なお、前記ＡからＱのバクテリアは、以下に示す生物資源保存機関ＡＴＣＣまたはＤＳＭＺの寄託番号が付されている。
Ｒ：Dehalococcoides ethenogenes 195
Ａ：DSM 12446  Ｂ：DSM 13498  Ｃ：ATCC 51239  Ｄ：ATCC 21197  Ｅ：DSM 10330
Ｆ：DSM 6695   Ｇ：DSM 1741   Ｈ：DSM 9161    Ｉ：DSM 10644   Ｊ：ATCC 27076
Ｋ：DSM 12431  Ｌ：DSM 1030   Ｍ：DSM 9455    Ｎ：DSM 10344   Ｏ：DSM 12704
Ｐ：DSM 2396   Ｑ：ATCC 49306
前記バクテリアＲのゲノム配列は、コーネル大のDr. Zinder氏により配列決定されたものであるが、本発明者らは、前記バクテリアＲのＩＴＳ配列（配列番号１８）およびその一部からなるポリヌクレオチドのＤＮＡプローブが前記バクテリアＲに特異的であり、本発明のＤＮＡプローブと併用すれば、前記１８種のバクテリアの全てを検出できるＤＮＡプローブとすることができることを、初めて見出したのである。
【００４３】
前記バクテリアＲ用のＤＮＡプローブとしては、下記（９）から（１２）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブがあげられる。
（９）前記バクテリアＲのＩＴＳ配列である配列番号１８の塩基配列またはその一部である配列番号１０６から１１５のいずれかの４０塩基の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（１０）前記（９）のポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（９）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（１１）前記（９）のポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（９）のポリヌクレオチドとの相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド。
（１２）前記（９）から（１１）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００４４】
次に、本発明のＤＮＡマイクロアレイについて説明する。本発明のＤＮＡマイクロアレイは、本発明のＤＮＡプローブが少なくとも一つ基板上に固定されたものであり、好ましくは、２種類以上の本発明のＤＮＡプローブが固定され、２種以上の前記バクテリアが検出できるＤＮＡマイクロアレイであって、より好ましくは、前記バクテリアＡからＲのそれぞれに対応するＤＮＡプローブが固定されたＤＮＡマイクロアレイである。前記１８種に対応する本発明のＤＮＡプローブが固定されたＤＮＡマイクロアレイであれば、一度に１８種類の前記バクテリアの検出ができる。本発明のＤＮＡマイクロアレイに固定するＤＮＡプローブは、ノイズを抑えるため長さが短いほうが好ましく、また、Ｔｍ値を一定にすることでクロスハイブリを抑制するためにそれぞれの長さをそろえることが好ましい。前記バクテリアＡからＱを検出するための本発明のＤＮＡプローブとしては、例えば、配列番号１９から１０５の塩基配列に由来するＤＮＡプローブを使用でき、前記バクテリアＲを検出するためのＤＮＡプローブとしては、例えば、配列番号１０６から１１５の塩基配列に由来するＤＮＡプローブが使用できる。前記基板としては、特に制限されず、市販のＤＮＡマイクロアレイ用基板等が使用でき、前記基板上へのＤＮＡプローブの固定方法は、特に制限されず、従来公知の方法を適用できる。
【００４５】
次に、本発明のバクテリアの検出キットは、前記ＡからＲのバクテリアを検出するためのキットであって、少なくとも１つの本発明のＤＮＡプローブと、前記ＤＮＡプローブにハイブリダイズすることで検出されるターゲットを調製するための遺伝子増幅用プライマーおよび遺伝子増幅用試薬とを含むバクテリアの検出キットである。
【００４６】
本発明の検出キットを用いれば、例えば、バクテリアを検出する試料から核酸を抽出し、前記核酸を前記遺伝子増幅用プライマーと前記遺伝子増幅用試薬を用いて遺伝子増幅を行いターゲットを調製し、前記ターゲットを本発明のＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションすることで、簡単かつ迅速に、前記試料中の前記ＡからＲのバクテリアを検出できる。前記核酸は、例えば、ＤＮＡでもよく、ＲＮＡでもよい。本発明のキットは、必要に応じて、核酸抽出用試薬およびフィルターもしくはチップ等を含んでいてもよい。前記ターゲットは、試料中のバクテリアの配列であって、前記ＤＮＡプローブの配列の相補配列であり、検出方法に応じた標識をされた前記ターゲットと前記ＤＮＡプローブとがハイブリダイズすることで検出可能となる。前記ターゲットの標識方法は、特に制限されず、例えば、前記遺伝子増幅用プライマーに予め標識しておく方法等があげられる。
【００４７】
前記遺伝子増幅の方法は、本発明のＤＮＡプローブであるＩＴＳを含む領域を増幅できるものであれば、特に制限されず、従来公知の遺伝子増幅方法を使用できる。前記遺伝子増幅方法として、例えば、ＰＣＲ法を用いる場合、前記遺伝子増幅用プライマーとしては、例えば、センスプライマーとして配列番号１１６の塩基配列からなるプライマーを使用でき、アンチセンスプライマーとして、前記バクテリアＲ以外には、配列番号１１７の塩基配列からなるプライマーを使用でき、前記バクテリアＲには、配列番号１１８の塩基配列からなるプライマーを使用できる。また、前記遺伝子増幅用試薬としては、従来公知の試薬が利用でき、例えば、バッファー、ポリメラーゼ、ヌクレオチド等があげられる。
【００４８】
前記ターゲットと本発明のＤＮＡプローブとをハイブリダイズさせる方法は、特に制限されず、例えば、サザンブロット、ＤＮＡアレイ、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ等、従来公知の遺伝子検出技術を利用できる。これらのなかでも、本発明のマイクロアレイを使用することが好ましく、前記１８種のバクテリアが検出可能な本発明のマイクロアレイを使用することがより好ましい。したがって、本発明のキットの好ましい態様としては、本発明のＤＮＡマイクロアレイと、前記ＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズすることで検出されるターゲットを調製するための遺伝子増幅用プライマーおよび遺伝子増幅用試薬とを含むバクテリアの検出キットである。
【００４９】
次に、本発明のバクテリアの検出方法は、検出対象試料から調製した核酸から遺伝子増幅方法によりターゲットを調製し、前記ターゲットと本発明のＤＮＡプローブとをハイブリダイズさせることにより前記試料中から前記ＡからＲのバクテリアを検出する方法である。ハイブリダイズの方法は、特に制限されず、例えば、サザンブロット、ＤＮＡアレイ、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ等、従来公知の遺伝子検出技術を利用できる。これらのなかでも、前記ＡからＲの全てのバクテリアを検出できる本発明のＤＮＡマイクロアレイを使用する方法が好ましい。本発明の検出方法は、例えば、前述した本発明のキットを用いて行うことができる。
【００５０】
一般に、ＰＣＥは、例えば、図３Ａに示すとおり、ＰＣＥから、ＴＣＥ、ジクロロエチレン（ＤＣＥ）、ビニルクロライド（ＶＣ）と、この順で脱塩素化され、前記ＶＣは、エテンまたは二酸化炭素に分解される。前記ＡからＲのバクテリアのＰＣＥおよびその脱塩素化物に対する分解活性を、図３Ｂに示す。図３Ｂに示すとおり、前記ＡからＲのバクテリアのＰＣＥおよびその脱塩素化物に対する分解活性は様々である。例えば、前記バクテリアＲは、ＰＣＥを、エテンまで一つずつ脱塩素化していくが、前記バクテリアＭ、ＡおよびＧは、ＰＣＥを、シス型のＤＣＥに分解する。
【００５１】
したがって、本発明のポリヌクレオチドを用いて、ＰＣＥやＴＣＥで汚染された環境中の前記ＡからＲのバクテリアを検出すれば、検出された前記バクテリアのＰＣＥおよびその脱塩素化物に対する脱塩化能力に基づき、前記環境のＰＣＥまたはＴＣＥの除去能力を判定することが可能となる。前記環境としては、特に制限されず、例えば、汚染れた土壌、地下水、池、海水等があげられる。
【００５２】
バイオレメディエーションを適用するにあたり、前述のように本発明のポリヌクレオチドを用いて汚染環境のＰＣＥおよびその脱塩素化物の除去能力を判定できれば、例えば、バイオスティミュレーションが可能か、または、バイオオーギュメンテーションが必要かの判定が容易となる。例えば、バクテリアＲが検出されれば、前記バクテリアＲでＰＣＥをエテンにできるから、前記バクテリアＲの増殖や活性を高める栄養素を環境に導入するバイオスティミュレーションを選択できる。また、例えば、バクテリアＫとＣとが検出された場合も、前記２種のバクテリアでＰＣＥを二酸化炭素に分解できるから、バイオスティミュレーションが選択できる。
【００５３】
さらに、ＰＣＥの分解は、好気性条件では困難であると考えられており、また、通常、地表より５０ｃｍ以下は嫌気性であると考えられるから、例えば、ＰＣＥ汚染環境や地表５０ｃｍ以下の汚染環境を、本来利用可能な嫌気性バクテリアではなく好気性バクテリアで修復することは、余分なコストの投入となる場合があるが、本発明のポリヌクレオチドによれば、前記嫌気性バクテリアを容易かつ迅速に検出できるから、例えば、ＰＣＥ汚染環境や、地表５０ｃｍ以下の汚染環境を修復する際に、好気性バクテリアを利用することによる余分なエネルギーの使用を回避することが可能となる。
【００５４】
以下に、本発明の実施例について説明する。
【実施例１】
【００５５】
（ＤＮＡプローブの作製）
前記バクテリアＡからＲのＩＴＳ配列（配列番号１から１８）から、４０塩基からなる配列をデザインし、ＤＮＡマイクロアレイのＤＮＡプローブとした。前記ＤＮＡプローブのデザインは、４０塩基、ＧＣ含有量４８-５０％の一本鎖であり、相補性がないかまたはほとんどなく、国際データベースＧｅｎＢａｎｋでヒットがない（あっても２以上のミスペア）ことを基準として行った。その結果、前記各バクテリアについてそれぞれ３から１０のＤＮＡプローブを作製した（配列番号１９から１１５）。
【００５６】
バクテリアＡのプローブＡ１からＡ７が、それぞれ、配列番号１９から２５の塩基配列であり、バクテリアＢのプローブＢ１からＢ５が、それぞれ、配列番号２６から３０の塩基配列であり、バクテリアＣのプローブＣ１からＣ５が、それぞれ、配列番号３１から３５の塩基配列であり、バクテリアＤのプローブＤ１からＤ５が、それぞれ、配列番号３６から４０の塩基配列であり、バクテリアＥのプローブＥ１からＥ５が、それぞれ、配列番号４１から４５の塩基配列であり、バクテリアＦのプローブＦ１からＦ３が、それぞれ、配列番号４６から４８の塩基配列であり、バクテリアＧのプローブＧ１からＧ５が、それぞれ、配列番号４９から５３の塩基配列であり、バクテリアＨのプローブＨ１からＨ４が、それぞれ、配列番号５４から５７の塩基配列であり、バクテリアＩのプローブＩ１からＩ５が、それぞれ、配列番号５８から６２の塩基配列であり、バクテリアＪのプローブＪ１からＪ６が、それぞれ、配列番号６３から６８の塩基配列であり、バクテリアＫのプローブＫ１からＫ６が、それぞれ、配列番号６９から７４の塩基配列であり、バクテリアＬのプローブＬ１からＬ５が、それぞれ、配列番号７５から７９の塩基配列であり、バクテリアＭのプローブＭ１からＭ７が、それぞれ、配列番号８０から８６の塩基配列であり、バクテリアＮのプローブＮ１からＮ５が、それぞれ、配列番号８７から９１の塩基配列であり、バクテリアＯのプローブＯ１からＯ５が、それぞれ、配列番号９２から９６の塩基配列であり、バクテリアＰのプローブＰ１からＰ３が、それぞれ、配列番号９７から９９の塩基配列であり、バクテリアＱのプローブＱ１からＱ６が、それぞれ、配列番号１００から１０５の塩基配列であり、バクテリアＲのプローブＲ１からＲ１０が、それぞれ、配列番号１０６から１１５の塩基配列である。
【００５７】
（ＤＮＡマイクロアレイの作製とＤＮＡプローブの特異性の確認）
次に、前記９７種類のＤＮＡプローブを、Affymetrix 417 Arrayerにより、Takara Hubble Slideにカスタムプリントし、ＤＮＡマイクロアレイを作製した。そして、ターゲットを前記ＡからＲのバクテリアからそれぞれ調製し、そのターゲットを前記ＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイズすることで、ＤＮＡプローブの特異性を確認した。
【００５８】
前記ターゲットは、前記バクテリアのＩＴＳ領域をＰＣＲ法で増幅して調製した。前記ＰＣＲにおいて、センスプライマーとして配列番号１１６の塩基配列からなる非標識プライマーを使用し、アンチセンスプライマーとして前記バクテリアＲ以外には配列番号１１７の塩基配列からなるＣｙ３標識プライマーを使用し、前記バクテリアＲには配列番号１１８の塩基配列からなるＣｙ３標識プライマーを使用した。ＰＣＲの反応条件は、標準的なプロトコールに従った。
【００５９】
ターゲットとなる前記ＰＣＲの増幅産物を、 Autoseq G-50（ファルマシア社製）を用いて脱塩し、SpeedVac（Savant社製）を用いて吸引乾燥し、最終濃度が５×ＳＳＣ、０.２％ＳＤＳ、５０％ホルムアミドであるバッファーに溶解させた。前記ターゲット溶解液を、９４℃で３分間ボイルして少なくとも２分間氷冷した後、前記ＤＮＡマイクロアレイ上にアプライした。その後、カバーグラスを前記ＤＮＡマイクロアレイ上にかぶせ、そのように準備したものを４２℃で設定されたハイブリダイゼーションチャンバー内に少なくとも４時間配置した。その後、前記ＤＮＡマイクロアレイを、０.２×ＳＳＣ、０.２％ＳＤＳで５分間、０.２×ＳＳＣで５分間、そして、０.０５×ＳＳＣで数秒間洗浄し、1,800ｒｐｍでスピンドライし、Scanarry version 5（パーキンエルマージャパン社製）でスキャンした。
【００６０】
その結果をまとめたものを図１に示す。図１は、縦軸に示された１８のバクテリアのＩＴＳ配列のターゲットと、横軸に示す９７のＤＮＡプローブとハイブリダイズしたかどうかを示すグラフであり、黒塗りの部分が、５００蛍光ユニット以上のシグナルを示してＤＮＡプローブとターゲットとがハイブリダイズしたことを示す。なお、横軸の系統樹は、ＩＴＳ配列のアライメントから作製したものである。図１に示すとおり、前記ＡからＲのバクテリアそれぞれから調製したターゲットは、クロスハイブリダイズすることなく、前記ＡからＲのバクテリアのＤＮＡプローブのみと有意にハイブリダイズすることが示された。
【実施例２】
【００６１】
T.H. Lee博士（韓国）の提供による嫌気的集積培養試料を用いて、下記９６種類のＤＮＡプローブを配置したＤＮＡマイクロアレイを用いて検出した。まず、前記嫌気性集積培養試料からFastPrep bead-beater and soil DNA extraction kit（Q Bionene社製）を用い、取扱い説明書に従って、ＤＮＡを抽出した。前記ＤＮＡから、実施例１と同様のプライマーを用いてＰＣＲ法によりターゲットを調製し、実施例１と同様の条件で前記ＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイズした。
【００６２】
その結果、バクテリアＡ、Ｊ、Ｍ、ＮおよびＯの一部のプローブに強いシグナルが検出され、バクテリアＢおよびＩのプローブからも弱いシグナルが検出された。その結果を図２に示す。図２および図３Ｂから前記試料には、ＰＣＥをcisＤＣＥに変換するバクテリアが存在することが示されるが、これは、T.H. Lee博士による前記集積培養のＰＣＥ／cisＤＣＥの分析データと一致する内容であった。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
以上、説明したとおり、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＥ分解関連バクテリアの検出に有用であり、例えば、汚染環境の修復方法、とりわけ、バイオレメディエーションの分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、本発明の一例におけるＤＮＡマイクロアレイによる検出結果を示す図である。
【図２】図２は、本発明のその他の例におけるＤＮＡマイクロアレイによる検出結果を示す図である。
【図３】図３は、本発明に関わる嫌気性ＰＣＥ分解関連バクテリアの分解活性を説明する図である。
【配列表フリーテキスト】
【００６５】
配列番号１１６  ＰＣＲ用センスプライマー２７Ｆ
配列番号１１７  ＰＣＲ用アンチセンスプライマー１３２Ｒ
配列番号１１８  ＰＣＲ用アンチセンスプライマー３４１Ｒ
【図１】
2005237250.tif 000003
【図２】
2005237250.tif 000004
【図３】
2005237250.tif 000005
【配列表】
2005237250000001.app