(57)【要約】      （修正有）【課題】ＰＣＲ法で酸性食品変敗原因乳酸菌を包括的に迅速に検出できるようにする。【解決手段】酸性食品変敗原因乳酸菌検出用プライマー混合物が、乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の一部と相補的となるように化学合成された一対のオリゴヌクレオチドからなるプライマーを複数種含有する。このプライマー混合物は、一対のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方が、特定の塩基配列を有するプライマーから選ばれる２種以上のプライマーを含有する。このプライマー混合物を使用して、ＰＣＲ法により酸性食品変敗原因乳酸菌を検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の一部と相補的となるように化学合成された一対のオリゴヌクレオチドからなるプライマーを複数種含有する酸性食品変敗原因乳酸菌検出用プライマー混合物であって、一対のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方が、配列番号１又は２に示される塩基配列を有するプライマー、配列番号３又は４の塩基配列を有するプライマー、及び配列番号５又は６の塩基配列を有するプライマーから選ばれる２種以上のプライマーを含有することを特徴とする酸性食品変敗原因乳酸菌検出用プライマー混合物。
(5´)AGCTGCGCCTAATGATAGTTG(3´)           （配列番号1）
(5´)CATGTGGTTTTCGTTGTTATACG(3´)         （配列番号2）
(5´)GAACGAACTCTGGTATTGGATTG(3´)         （配列番号3）
(5´)GCGGTCCAAGTTGTTATGC(3´)             （配列番号4）
(5´)CGTCTCCGTTGATGATTTTAG(3´)           （配列番号5）
(5´)GGTGGTTTTGGTTGTTATACG(3´)           （配列番号6）
【請求項２】
一対のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方が、配列番号１又は２に示される塩基配列を有するプライマー、配列番号３又は４に示される塩基配列を有するプライマー、及び配列番号５又は６に示される塩基配列を有するプライマーを含有する請求項１記載の酸性食品変敗原因乳酸菌検出用プライマー混合物。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドと配列番号２に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドとからなるプライマー、配列番号３に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドと配列番号４に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドとからなるプライマー、配列番号５に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドと配列番号６に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドとからなるプライマーを含有する請求項１記載の酸性食品変敗原因乳酸菌検出用プライマー混合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のプライマー混合物を検体に加え、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法によりプライマーの伸長反応と標的とするヌクレオチド配列の増幅を行い、そのヌクレオチド配列の検出を行うことを特徴とする酸性食品変敗原因乳酸菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸性食品変敗原因乳酸菌の検出方法に関する。さらに詳しくは、複数の特定の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応法（Polymerase Chain Reaction、以下ＰＣＲ法と省略する）を行い、増幅されたプライマーの伸長物を検出することにより酸性食品変敗原因乳酸菌群の主な酸性食品変敗原因乳酸菌を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マヨネーズ、ドレッシング等の酸性食品では、含有する酢酸等の有機酸の制菌作用により、一般的な汚染微生物の増殖による食品変敗は制御されている。しかし、このような低ｐＨ環境下でも、稀に細菌により食品が変敗する場合があり、細菌的事故を散発させている。本発明者らは、この酸性食品を変敗する原因菌について長年にわたり調査したところ、変敗原因菌が耐酸性及び耐塩性を合わせ持つ乳酸桿菌であり、そのほとんどがラクトバチルス属の特定種であるラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）及びラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）であることが分かった。
【０００３】
一方、これら酸性食品変敗原因乳酸菌の中には通常の細菌試験で行われている平板培地での増殖が遅く、検出までに時間を要するものもある。そこで、以前より増殖培地の検討がなされてきたが、増殖が遅いことはこれらの菌の固有の性質であるために、抜本的な解決は困難であった。
【０００４】
このような状況下、例えば、特開平７−２８９２９５号公報（特許文献１）、特開平１０−２１０９８０号公報（特許文献２）には、ビールの有害菌であるラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、特開平１０−２３４３７７号公報（特許文献３）には、ビールの有害菌であるラクトバチルス・スピーシーズ(Lactobacillus sp.)の１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列(以下１６ＳｒＤＮＡと称する)を標的とするＰＣＲ法による迅速検出法が開示されている。また、特開平６−９０７９３号公報（特許文献４）には、日本酒の有害菌（火落ち菌）検出用として、１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と２３ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の間の領域を標的とするＰＣＲ法による迅速検出法が開示されている。これらの技術はラクトバチルス属の特定の株、種、グループ（幾つかの種の集合体）を検出する技術である。また、特開平１１−１５１０９７号公報（特許文献５）には、ラクトバチルス属の種を特定できるプライマーを複数種準備することにより、ラクトバチルス属の菌種の同定や解析が行なわれている。
【０００５】
【特許文献１】特開平７−２８９２９５号公報
【特許文献２】特開平１０−２１０９８０号公報
【特許文献３】特開平１０−２３４３７７号公報
【特許文献４】特開平６−９０７９３号公報
【特許文献５】特開平１１−１５１０９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一方、一般的な食品には多種の汚染微生物が見られ、酸性食品においてもその変敗原因乳酸菌としては、上述した通りほとんどの場合にラクトバチルス・フルクチボランス、ラクトバチルス・プランタラム及びラクトバチルス・ブレビスという複数種の菌が検出されるのが実状であり、これらを包括的に検出することのできる迅速な検出方法の開発が望まれている。
【０００７】
本発明は、このような従来技術の課題に対し、ＰＣＲ法で酸性食品変敗原因乳酸菌を包括的に迅速に検出できるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、酸性食品変敗原因乳酸菌の特定種であるラクトバチルス・フルクチボランス、ラクトバチルス・プランタラム及びラクトバチルス・ブレビスのそれぞれにおいて、１６ＳｒＤＮＡ配列が種のレベルで保存されており、他種の株の配列とは異なっている領域を探索し、当該領域の中の特定配列を標的とするプライマーを新規に開発し、さらにそれらを混合使用しても各酸性食品変敗原因乳酸菌の特定種を良好に検出できること、また、他のラクトバチルス属からも良好に識別できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の一部と相補的となるように化学合成された一対のオリゴヌクレオチドからなるプライマーを複数種含有する酸性食品変敗原因乳酸菌検出用プライマー混合物であって、一対のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方が、配列番号１又は２に示される塩基配列を有するプライマー、配列番号３又は４の塩基配列を有するプライマー、及び配列番号５又は６の塩基配列を有するプライマーから選ばれる２種以上のプライマーを含有することを特徴とする酸性食品変敗原因乳酸菌検出用プライマー混合物を提供する。
【００１０】
(5´)AGCTGCGCCTAATGATAGTTG(3´)           （配列番号1）
(5´)CATGTGGTTTTCGTTGTTATACG(3´)         （配列番号2）
(5´)GAACGAACTCTGGTATTGGATTG(3´)         （配列番号3）
(5´)GCGGTCCAAGTTGTTATGC(3´)             （配列番号4）
(5´)CGTCTCCGTTGATGATTTTAG(3´)           （配列番号5）
(5´)GGTGGTTTTGGTTGTTATACG(3´)           （配列番号6）
【００１１】
特に、上述のプライマー混合物として、配列番号１に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドと配列番号２に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドとからなるプライマー、配列番号３に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドと配列番号４に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドとからなるプライマー、配列番号５に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドと配列番号６に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドとからなるプライマーを含有する態様を提供する。
【００１２】
さらに本発明は、上述のプライマー混合物を検体に加え、ＰＣＲ法によりプライマーの伸長反応と標的とするヌクレオチド配列の増幅を行い、そのヌクレオチド配列の検出を行う酸性食品変敗原因乳酸菌の検出方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＰＣＲ法で、酸性食品変敗の主要な原因菌であるラクトバチルス・フルクチボランス、ラクトバチルス・ブレビス又はラクトバチルス・プランタラムを高い検出感度と選択性で検出することができる。したがって、酸性食品変敗原因乳酸菌を包括的に検出することが可能となる。
【００１４】
また試料中に存在する異属及び同属異種の細菌の増殖を考慮する必要がなくなり、熟練を必要とすることなく、簡易に酸性食品変敗原因乳酸菌を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明が酸性食品変敗原因乳酸菌群の検出のために行うＰＣＲ法は、Saikiが開発したPolymerase Chain Reaction法（Science,230,1350(1985)）に基づくものである。
【００１６】
本発明において、酸性食品変敗原因乳酸菌の特定は、標準菌株を用いた場合は、その標準菌株の属名及び種名による。また標準菌株でないものを用いた場合は、常法に則り、ラクトバチルス属に特有の形態（グラム陽性桿菌）及び性状（カタラーゼ陰性、芽胞非形成若しくは嫌気性）を確認した後、市販の同定キットである「アピ５０CHL（日本ビオメリュー（株）販売）」を用いた同定による。
【００１７】
具体的同定方法としては、前記同定キットに従い細菌液を調製し、この細菌液を「アピ５０CHL培地（日本ビオメリュー（株）販売）」に添加して接種菌液を調製する。次に、この接種菌液を「アピ５０CHLプレート（日本ビオメリュー（株）販売）」のチューブ部分に接種した後、ミネラルオイルを重層する。プレートに蓋をし、３５℃で４８時間培養する。培養後、培地の色の変化により各生化学性状を判定し、解析ソフトであるAPILAB Plus（日本ビオメリュー（株）販売）で同定する。
【００１８】
なお、「アピ５０CHL（日本ビオメリュー（株）販売）」同定キットを用いて同定した種名と、相同性検索ソフト：ブラスト（BLAST）を用いた１６ＳｒＤＮＡ解析より推定した群が異なる場合は、本発明では、「アピ５０CHL（日本ビオメリュー（株）販売）」同定キットを用いて同定した種名を基準とする。
【００１９】
相同性検索ソフト：ブラスト（BLAST）を用いた１６ＳｒＤＮＡ解析による群の具体的な推定方法は、まず、単一コロニーの分離と純粋培養を行った後、ＤＮＡの熱水抽出を行うため、滅菌精製水にコロニーを懸濁し、１００℃で１０分間の湯せんで加熱する。次に、１６ＳｒＲＮＡをコードする全領域に対する共通のプライマーである下記に示す２種のオリゴヌクレオチド[Journal of Bacteriology, 173 (2), p697-703 (1991)]を用い、
(5´)AGAGTTTGATCATGGCTCAG(3´)         （配列番号7）
(5´)GGTTACCTTGTTACGACTT(3´)          （配列番号8）
前記熱水抽出物をＤＮＡの鋳型としてＰＣＲを行った後（細菌で保存性が高い配列部分をプライマーとしているので、未知の細菌であっても１６ＳｒＲＮＡをコードする約１４００塩基対のＤＮＡが増幅される。）、ＰＣＲ産物を電気泳動し、１６ＳｒＲＮＡをコードする約１４００塩基対のＤＮＡの増幅を確認する。次に、ＰＣＲ産物の塩基配列を「DNA Sequencer ABI PRISM 16キャピラリー（ABI社）」で解読する。日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）の相同性検索ソフト：ブラスト（BLAST）により、当該塩基配列と相同性の高い塩基配列を検索し、群を推定する。
【００２０】
本発明では、ＰＣＲ法により酸性食品変敗原因乳酸菌を検出する際に使用するプライマーとして、特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーの混合物を使用する。このプライマー混合物は、一対のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方が配列番号１又は２に示される塩基配列を有するるプライマー、一対のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方が配列番号３又は４に示される塩基配列を有するプライマー、及び一対のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方が配列番号５又は６に示される塩基配列を有するプライマーの３種のプライマーから選ばれる任意の２種以上を含有している。
【００２１】
(5´)AGCTGCGCCTAATGATAGTTG(3´)           （配列番号1）
(5´)CATGTGGTTTTCGTTGTTATACG(3´)         （配列番号2）
(5´)GAACGAACTCTGGTATTGGATTG(3´)         （配列番号3）
(5´)GCGGTCCAAGTTGTTATGC(3´)             （配列番号4）
(5´)CGTCTCCGTTGATGATTTTAG(3´)           （配列番号5）
(5´)GGTGGTTTTGGTTGTTATACG(3´)           （配列番号6）
【００２２】
これら配列番号１又は２で示されるオリゴヌクレオチドの配列は、ラクトバチルス・フルクチボランス、及び異属並びに異種の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を詳細に解析した結果、ラクトバチルス・フルクチボランスの異株間に保存され、異属並びに異種と完全に識別される領域を見出すことにより決定されたものであり、配列番号３又は４で示されるオリゴヌクレオチドの配列は、ラクトバチルス・プランタラム、及び異属並びに異種の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を詳細に解析した結果、ラクトバチルス・プランタラムの異株間に保存され、異属並びに異種と完全に識別される領域を見出すことにより決定されたものであり、配列番号５又は６で示されるオリゴヌクレオチドの配列は、ラクトバチルス・ブレビス、及び異属並びに異種の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を詳細に解析した結果、ラクトバチルス・ブレビスの異株間に保存され、異属並びに異種と完全に識別される領域を見出すことにより決定されたものである。
【００２３】
したがって、本発明のプライマー混合物に含有させる２種以上のプライマーを前述の３種のプライマーのいずれとするかは、検体あるいは検出目的に応じて適宜定めることができるが、酸性食品変敗の原因菌をより包括的に検出するためには３種とも含有させることが好ましい。
【００２４】
なお、本発明では上述のように特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するが、このオリゴヌクレオチドには、それを構成するデオキシリボースや塩基について、一部に他の分子が付加したり、その一部が他の分子で置換されるなどにより修飾されているものも含まれる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドには、ラクトバチルス・ブレビスの１６ＳｒＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドをＰＣＲ法で増幅した後、そのオリゴヌクレオチドの検出を簡略化するため、プライマーとするオリゴヌクレオチドの5´末端を蛍光色素であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したものが含まれる。この他、5´末端にビオチンを結合し、アビジンと共有結合させたペルオキシダーゼを結合させ得るものや、デオキシリボース骨格間を結合しているリン酸の中の酸素をイオウ原子に置き換えることによりアンチセンス化したもの等が含まれる。
【００２５】
また、前述の配列番号１〜６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち、配列番号１、配列番号３及び配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは正規鎖側プライマーであり、配列番号２、配列番号４及び配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは逆鎖側プライマーである。
【００２６】
したがって、本発明のプライマー混合物中、一対のオリゴヌクレオチドからなるプライマーの一方として配列番号１、配列番号３又は配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用する場合に、これと組み合わせて使用するもう一方のオリゴヌクレオチドとしては、公知の逆鎖側プライマーを使用することができ、また、配列番号２、配列番号４又は配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用する場合に、これと組み合わせて使用するもう一方のオリゴヌクレオチドとしては、公知の正規鎖側プライマーを使用することができるが、配列番号１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれ一対のプライマーとして使用することが好ましい。
【００２７】
本発明のプライマー混合物を用いて各プライマーに対応するラクトバチルス・フルクチボランス、ラクトバチルス・プランタラム又はラクトバチルス・ブレビスに特異的なオリゴヌクレオチドを増幅するＰＣＲ法自体は公知の方法に従うことができる。即ち、まず、検体を熱処理することにより検体中の二本鎖ＤＮＡを一本鎖に分離し、これに上述した少なくとも２種、好ましくは３種のプライマーを含有した本発明のプライマー混合物を添加し、各プライマーを、相補的な検体のオリゴヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズさせ、次に、ＤＮＡポリメラーゼと４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）との存在下でプライマーの下流の領域を選択的に合成する。そしてこの操作を２０〜４０サイクル程度繰り返すことにより、検体中の特異的なオリゴヌクレオチドをプライマーの伸長物として増幅することができる。また、この増幅は、電気泳動、クロマトグラフィー等により確認することができ、これにより検体中の酸性食品変敗原因乳酸菌の存在を容易にかつ確実に検出することが可能となる。
【００２８】
なお、このＰＣＲ法を適用する本発明の酸性食品としては、例えば、マヨネーズ、ドレッシング等の酸性調味料等が挙げられ、これらは通常ｐＨ４．６以下である。
【実施例１】
【００２９】
（１）検体の調製
本発明の酸性食品変敗原因乳酸菌検出用プライマー混合物が酸性食品変敗原因乳酸菌であるラクトバチルス・フルクチボランス、ラクトバチルス・プランタラム及びラクトバチルス・ブレビスに対し特異的であることを確認するために、以下の試験を行なった。また、このプライマー混合物中の個々のプライマーが前記細菌のいずれに対して特異的であることを合わせて確認した。すなわち、［表１−Ａ］、［表１−Ｂ］中の縦の見出し欄に示した菌を用い、それぞれ増菌用の平板培地に接種し、培養した。菌体を掻き取り、０．８５％食塩水に懸濁し、沸騰水中で１０分間加熱することによりＤＮＡを抽出し、遠心分離した上澄液を検体とした。なお、この懸濁液中の菌濃度は１０7ｃｆｕ／ｍｌ程度であった。
【００３０】
（２）プライマーの合成
ラクトバチルス属の１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とする、正規鎖側プライマーとして配列番号１、３及び５、逆鎖側プライマーとして配列番号２、４及び６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをホスホアミダイト法によりそれぞれ合成した。
【００３１】
（３）反応液の調製とＰＣＲ反応
検体液５μｌに１０倍に濃縮されている反応用バッファー５μｌ（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑに付属のＢｕｆｆｅｒ）、４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合液（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑに付属のｄＮＴＰ混合液）４μｌ、［表１−Ａ］、［表１−Ｂ］に示すように、正規鎖側プライマーとして配列番号１、３及び／又は５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド２０ｐｍｏｌ、逆鎖側プライマーとして配列番号２、４及び／又は６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド２０ｐｍｏｌ、ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ）０．２５μｌを加え、水で５０μｌとした。
【００３２】
熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１分）、重合反応（７２℃、１分）からなる過程を１サイクルとし、これを３５サイクル繰り返し反応させた。
【００３３】
反応液中にヌクレオチド配列が増幅されたか否かを見るために、アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウムによる染色を行った。即ち、電気泳動は３％のアガロースゲルを使用し、ＴＢＥバッファー中、１００Ｖで３０分行った。次いでゲルを取り出し、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム水溶液中に３０分浸漬して染色後、トランスイルミネーターで発色させ、ポラロイドカメラで撮影した。この場合、電気泳動時に塩基対数が既知のＤＮＡ断片を一緒に流すことにより、相対比較によって、検出されたヌクレオチド配列断片の長さを算出した。
【００３４】
結果を［表１−Ａ］、［表１−Ｂ］に示す。表中の＋は、約１６０塩基対に相当する大きさの増幅物が観察されたことを示している。なお、菌株によっては１６ＳｒＤＮＡ配列の増幅され得る部分に塩基対の挿入または欠落が起こり、ＤＮＡ増幅物の大きさは変動し得る。
【００３５】
［表１−Ａ］
2005270095.tif 000002
【００３６】
［表１−Ｂ］
2005270095.tif 000003
【００３７】
表中のカッコは、相同性検索ソフト：ブラスト（BLAST）を用いた１６ＳｒＤＮＡ解析により推定した群である。
【００３８】
［表１−Ａ］、［表１−Ｂ］の結果から、本発明によれば、酸性食品変敗原因乳酸菌であるラクトバチルス・フルクチボランス、ラクトバチルス・プランタラム及びラクトバチルス・ブレビスの存在を検出できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の酸性食品変敗原因乳酸菌検出用プライマー及びこれを用いたＰＣＲ法による検出方法は、酸性食品において、当該変敗原因乳酸菌を検出するために有用となる。
【配列表】
2005270095000001.app