(57)【要約】【課題】プロテインＳの熱処理において、できる限り検討要素の少ない条件下で、プロテインＳの活性を低下させることなくウイルスの不活化を図る。【解決手段】ヒト・プロテインＳ含有溶液に、２価以上の金属イオンとして例えばカルシウムイオンを１ｍＭ以上に存在させ、５５〜６５℃で１０〜２０時間程度加熱処理を施す。加熱処理に際し、必要に応じて、ショ糖などの二糖類やマンニトールなどの糖アルコール、グリセロールなどのポリオールを１０〜４０ｗ／ｖ％加えてもよい。【選択図】        図１
2005015444.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス夾雑の危険性のあるプロテインＳ含有溶液の加熱によるウイルス不活化方法であって、溶液中に２価以上の金属イオンを必須成分として存在させることを特徴とするウイルス不活化方法。
【請求項２】
金属イオンがカルシウムイオン、亜鉛イオン、アルミニウムイオンから選ばれる１種以上であることを特徴とする請求項１に記載のウイルス不活化方法。
【請求項３】
金属イオン濃度を１ｍＭ以上として加熱処理することを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載のウイルス不活化方法。
【請求項４】
糖類またはポリオールをさらに存在させることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のウイルス不活化方法。
【請求項５】
糖類またはポリオールの濃度を１０〜４０ｗ／ｖ％として加熱処理することを特徴とする請求項４に記載のウイルス不活化方法。
【請求項６】
糖類が二糖類または糖アルコールであることを特徴とする請求項４または５のいずれかに記載のウイルス不活化方法。
【請求項７】
前記二糖類または糖アルコールは、ショ糖、ソルビトール、マンニトールのいずれかであることを特徴とする請求項６に記載のウイルス不活化方法。
【請求項８】
ポリオールがグリセロールであることを特徴とする請求項４または５のいずれかに記載のウイルス不活化方法。
【請求項９】
プロテインＳは血漿由来または遺伝子組換えであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のウイルス不活化方法。
【請求項１０】
ウイルス不活化後の活性化プロテインＣコファクター活性についての比活性を、蛋白１ｍｇあたり４０国際単位以上維持することを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のウイルス不活化方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のウイルス不活化方法により、ウイルスが実質的に不活化されたプロテインＳ調製物。
【請求項１２】
請求項１１に記載されたプロテインＳ調製物を有効成分として含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明はウイルスの不活化方法、より具体的にはウイルスを含有するプロテインＳ含有溶液を熱処理してウイルスを不活化する際のプロテインＳ安定化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト・プロテインＳは人血漿中に約１０ｍｇ／リットル含まれているビタミンＫ依存性血漿糖蛋白質であり、その分子量は約８０，０００である。ヒト・プロテインＳのＮ末端領域はプロトロンビン、血液凝固第ＶＩＩ、ＩＸおよびＸ因子、プロテインＣおよびプロテインＺ等のビタミンＫ依存性糖蛋白質と極めてよく似た構造を有しているが、Ｃ末端領域はそれらとは全く異なる構造を有しており、その領域には性ホルモン結合グロブリン様領域や、Ｃ４ｂｐ結合領域が含まれている。
このような血液由来の蛋白は、エイズウイルス、各種肝炎ウイルス、ヒトパポバウイルスＢ１９などの種々のウイルスに汚染されている可能性がある。したがって、これらを原料とした治療剤の製造に関しては、ウイルスを十分に除去または不活化する工程を組み込むことが必須である。
【０００３】
血液由来の製剤、すなわち血液製剤に夾雑してくるウイルスを不活化する方法として、水溶液状態での加熱処理法（以下、液状加熱法という。）、蛋白を乾燥状態で加熱する乾燥加熱法（特開昭５８−２１３７２１号など参照）、特殊な溶媒と洗浄剤を用いるソルベントデタージェント（ＳＤ）法、紫外線を照射する方法などが提案されている。
【０００４】
これらのうち、液状加熱法は、ウイルスの不活化という点で非常に優れた方法の１つである。特開２００２−２７５０９０号公報には、１つまたはそれ以上の糖類と、アルギニン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン酸およびその塩、またはグルタミン酸およびその塩から選ばれる１つまたはそれ以上のアミノ酸を含ませて、４０〜９５℃で５〜５０時間の熱処理を行う方法が開示されている。そして、同号公報には、安定化をさらに高めるべく可溶性カルシウム塩（塩として１ｍＭ程度）を添加するのが有利である旨が記載されている。
【０００５】
【特許文献１】
特開昭５８−２１３７２１号公報
【特許文献２】
特開２００２−２７５０９０号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記公報に記載された方法では、少なくともアミノ酸と糖類を組み合わせる必要があり、その組み合わせの検討が非常に面倒である。特に、ヒト・プロテインＳは、上記構造上の特徴を有しているので、他のビタミンＫ依存性血液凝固因子とは異なり、血液凝固系以外にも多くの作用を有していると考えられている。このため、安定化剤の組み合わせによっては、ヒト・プロテインＳ特有の活性（例えば、活性化プロテインＣコファクター活性）を低下させる可能性も否定できない。
【０００７】
さらに、プロテインＳはその精製過程においてトロンビンなどにより限定分解を受けやすく、限定分解を受けたプロテインＳは活性化プロテインＣコファクター活性を失う。この限定分解を受けたプロテインＳの生成はプロテインＳの持つ活性化プロテインＣコファクター活性を低下させる要因となる。
【０００８】
本発明者らは、できる限り検討要素の少ない条件下で、プロテインＳ活性の低下を引き起こさず、熱処理によるウイルス不活化を行うことができないかどうか種々の条件を検討したところ、２価以上の金属イオンがヒト・プロテインＳ活性、特に活性化プロテインＣコファクター活性の低下を防ぐことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明のウイルスの不活化方法は、ウイルス夾雑の危険性のあるプロテインＳ含有溶液の加熱によるウイルス不活化方法であって、溶液中に２価以上の金属イオンを必須成分として存在させることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明は、上記方法において、金属イオンがカルシウムイオン、亜鉛イオン、アルミニウムイオンから選ばれる１種以上であることを特徴としている。
【００１１】
さらに、本発明は、上記方法において、金属イオン濃度を１ｍＭ以上として加熱処理することを特徴としている。
【００１２】
また、本発明は、上記方法において、糖類またはポリオールをさらに存在させることを特徴としている。そして、本発明は、当該方法において、糖類が二糖類または糖アルコールであることを特徴としている。さらに具体的に言えば、二糖類または糖アルコールとしてショ糖、ソルビトール、マンニトールのいずれかが望ましく、ポリオールとしてはグリセロールが望ましい。
【００１３】
さらに、本発明は、糖類またはポリオールを使用する場合において、それらの濃度を１０〜４０ｗ／ｖ％として加熱処理することを特徴としている。
【００１４】
本発明は、上記いずれの方法であって、プロテインＳは血漿由来または遺伝子組換えであることを特徴とし、さらに、ウイルス不活化後の活性化プロテインＣコファクター活性についての比活性を、蛋白１ｍｇあたり４０国際単位（ＩＵ）以上維持することを特徴とする。
【００１５】
本発明のプロテインＳ調製物は、上記本発明によるウイルス不活化方法により、ウイルスが実質的に不活化されたものである。
【００１６】
本発明の医薬組成物は、本発明のプロテインＳ調製物を有効成分として含有するものである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明のウイルス不活化方法の対象となる蛋白は、生体成分由来のものであれば特に限定されるものではないが、特に液状加熱に対して不安定なヒト・プロテインＳがその対象として最適である。本発明の方法は血漿由来のみならず、遺伝子組換えによるプロテインＳにも適用されうる。なお、ウイルスの不活化が、精製後に実施されるものであれば、特開２００３−９６０９４号に述べられているように、血液凝固第ＩＩ因子（プロトロンビン）の活性化などの悪影響を及ぼすことは考えられない。
【００１８】
蛋白溶液におけるプロテインＳの濃度は特に制限されないが、通常０．０１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは０．０３ｍｇ／ｍＬ以上である。
【００１９】
本発明において加えられる金属イオン濃度は、少なくとも１ｍＭ以上、好ましくは２ｍＭ以上、望ましくは５ｍＭ以上である。この金属イオンは、２価以上のイオンであり、好ましくは、カルシウムイオン、亜鉛イオン、アルミニウムイオン、より望ましくはカルシウムイオンである。これらの金属イオンの添加が、他の安定剤を必要とすることなく実用的なレベルの活性を維持する。具体的には、金属イオンが５ｍＭ程度存在すれば、処理前の比活性は５０％以上に維持される。これにより、通常のヒト・プロテインＳの精製法、例えば特開平９−２８６７９９号公報や特開２００３−９６０９４号に示された精製法から得られるヒト・プロテインＳの活性を、実用的な活性レベルである蛋白１ｍｇ当たり４０国際単位以上に維持できる。金属イオンは、通例、塩化カルシウムなどの水溶性の無機化合物あるいはアミノ酸塩を除く有機化合物として添加される。
【００２０】
蛋白溶液には、必要に応じて、糖類またはポリオールが、５〜５０ｗ／ｖ％、好ましくは１０〜４０ｗ／ｖ％添加される。この糖類またはポリオールは、蛋白の安定化を達成できるものであれば特に制限されるものではないが、本発明では、ショ糖などの二糖類あるいはソルビトールやマンニトールなどの糖アルコール、グリセロールが好適に用いられる。
【００２１】
その他緩衝液、例えば酢酸緩衝液を蛋白溶液に添加してもよい。蛋白溶液のｐＨは、通常、５．０〜１０．０、好ましくは６．０〜８．５である。加熱処理は常法に従えばよく、４０〜９５℃で５〜４０時間、好ましくは５５〜６５℃で１０〜２０時間程度施される。このような加熱処理は、夾雑したエイズウイルス、各種肝炎ウイルスなどの比較的熱感受性なウイルスを不活化し、さらに必要に応じてその他のウイルス不活化処理、ウイルス除去方法が組み合わされ、ウイルスが実質的に不活化されたヒト・プロテインＳ調製物が提供される。
【００２２】
【実施例】
以下に実施例、比較例を挙げて本発明についてさらに説明する。
〔実施例１  安定化剤による効果〕
ヒト・プロテインＳは、特開平９−２８６７９９号公報に記載の方法にてヒト血漿より精製を行った。得られたプロテインＳ含有溶液をプールし、以降の実験に使用した。加熱処理使用時の緩衝液組成は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．３Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０とした。得られた溶液中のプロテインＳの活性（活性化プロテインＣコファクター活性）は約７．１ＩＵ／ｍＬであった。
次に、表１に記載の安定化剤をそれぞれ１０ｍＭ酢酸ナトリウムに表記の２倍濃度となるように溶解し、ｐＨ７．０に調整した。この安定化剤溶液１ｍＬと前述のプロテインＳ含有溶液１ｍＬを混合し、６０℃、１５時間の加熱処理を行った。加熱処理後、処理液を速やかに冷却した。なお、Ｃａ２＋には塩化カルシウムを用いた。
【００２３】
得られたプロテインＳ含有加熱処理溶液および加熱未処理溶液のプロテインＳの活性を測定し、加熱処理後の残存活性を求めた。プロテインＳ活性は、スタクロットプロテインＳ測定キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて、活性化プロテインＣコファクター活性として測定した。その結果を表１に示す。カルシウムイオンの添加が実用化に値する安定化作用を示した。
【表１】
2005015444.tif 000003
【００２４】
〔実施例２  金属イオンによる安定化効果〕
プロテインＳ含有溶液および安定化剤溶液の調製は、実施例１と同様に行った。安定化剤として、塩化亜鉛（Ｚｎ２＋濃度１０ｍＭ）および塩化アルミニウム（Ａｌ３＋濃度５ｍＭ）を用いた。６０℃、１５時間の加熱処理後、実施例１と同様の方法にてプロテインＳ活性を測定した。その結果を表２に示した。カルシウムイオンの他に、亜鉛イオンやアルミニウムイオンが安定化作用を示した。
【表２】
2005015444.tif 000004
【００２５】
〔実施例３  金属イオン濃度による影響〕
プロテインＳ含有溶液および安定化剤溶液の調製は、実施例１と同様に行った。加熱処理使用時の緩衝液組成は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．６Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０とした。安定化剤として塩化カルシウムを用いてＣａ２＋濃度を１、２、５、１０ｍＭとし、６０℃、１５時間の加熱処理を行った。その後、実施例１と同様の方法にてプロテインＳ活性を測定した。その結果を表３に示した。カルシウムイオン１ｍＭ程度の添加が安定化効果を発揮し、５ｍＭ程度の添加が最も効果的であった。
【表３】
2005015444.tif 000005
【００２６】
〔実施例４  カルシウムイオンと他の安定化剤との併用効果〕
プロテインＳ含有溶液および安定化剤溶液の調製は、実施例１と同様に行った。すべての溶液に終濃度５ｍＭのカルシウムイオンを添加した後、表４に記載したそれぞれの安定化剤を、表記載の終濃度となるように添加した。６０℃、１５時間の加熱処理を行った。その後、実施例１と同様の方法にてプロテインＳ活性を測定した。その結果を表４に示した。糖類の添加もしくはポリオールの添加が、プロテインＳの安定性を向上させた。
【表４】
2005015444.tif 000006
【００２７】
〔実施例５  ウイルス不活化効果〕
プロテインＳ含有溶液および安定化剤溶液は、実施例３と同様に行った。５ｍＭのカルシウムイオンを添加後、安定化剤として終濃度１０ｗ／ｖ％となるようにソルビトールを添加した。
次に、調製したプロテインＳ含有溶液に、ブタパルボウイルス液を１／１００容添加し、ウイルスの不活化試験を実施した。ウイルス液を添加したプロテインＳ含有溶液を、６０℃の加熱処理に処し、０、１０、１５、２０時間後サンプリングを行った。
ブタパルボウイルスの感染価は、３７℃、５％炭酸ガス培養器で培養したＥＳＫ（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｗｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ）細胞を用い、ブタパルボウイルスのＥＳＫ細胞に対する細胞変性効果をマイクロプレートにて確認する方法を用いた。細胞変性効果よりＴＣＩＤ５０を算出し、ウイルス不活化効果を次式によりＬＲＶ（Ｌｏｇ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｖａｌｕｅ）として示した。
【式１】
2005015444.tif 000007
【００２８】
それと同時に、実施例１に記載した方法と同様の方法にてプロテインＳ活性を測定した。それらの結果を図１に示した。
加熱処理時間に依存的にブタパポバウイルスの不活化効果が観察される一方、プロテインＳ活性の著しい低下は見られなかった。図中●印は加熱処理後におけるプロテインＳの残存活性率（％）を、▲印はウイルス不活化効果を示す。
【００２９】
〔実施例６  加熱処理後のプロテインＳ比活性の推移〕
プロテインＳ含有溶液および安定化剤溶液の調製は、実施例３と同様に行った。このプロテインＳ含有溶液を、塩化カルシウムを終濃度５ｍＭとなるように添加し、さらに安定化剤としてマンニトールを終濃度１０ｗ／ｖ％となるように調製を行った。続いて、６０℃、１５時間の加熱処理を施した。この系において、加熱処理前後のプロテインＳ活性を実施例１と同様の方法にて測定した。その結果を表５に示した。１５時間の加熱処理後においても、プロテインＳ含有溶液の比活性は４０ＩＵ／ｍｇを超え、比活性も高く維持された。
【表５】
2005015444.tif 000008
【００３０】
【発明の効果】
本発明の不活化方法では、安定化剤として金属イオンのみの使用が処理後の比活性を処理前の５０％以上に維持できるので、安定化剤の選択や安定化剤の調製が容易となる。そして、極めて高い比活性に精製するまでもなく、活性化プロテインＣコファクター比活性が蛋白１ｍｇ当たり４０国際単位以上に維持される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ウイルス不活化効果を示す図である。
【図１】
2005015444.tif 000009