(57)【要約】      （修正有）【課題】植物におけるＭｕｔＴ様タンパク質の機能を明らかにすることにより、植物におけるＭｕｔＴ様タンパク質の産業上有用な用途を開発する。【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子が導入され、かつ前記遺伝子が発現していることを特徴とするストレス耐性が向上した組換え植物：（ａ）特定の配列のアミノ酸からなるタンパク質；（ｂ）（ａ）において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡＤＰ−リボース及びＮＡＤＨを加水分解する酵素の活性を有するタンパク質。以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子の導入、発現により上記特徴を有する組換え植物：（ａ）特定の塩基配列からなるＤＮＡ；（ｂ）特定の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡＤＰ−リボ−ス及びＮＡＤＨを加水分解する酵素の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子が導入され、かつ前記遺伝子が発現していることを特徴とするストレス耐性が向上した組換え植物：
（ａ）配列番号２のアミノ酸からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡＤＰ−リボース及びＮＡＤＨを加水分解する酵素の活性を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子が導入され、かつ前記遺伝子が発現していることを特徴とするストレス耐性が向上した組換え植物：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡＤＰ−リボース及びＮＡＤＨを加水分解する酵素の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
ストレス耐性が活性酸素ストレス耐性であることを特徴とする請求項１又は２記載の組換え植物。
【請求項４】
遺伝子が植物中で過剰に発現していることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の組換え植物。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列で植物を形質転換する工程を含むことを特徴とするストレス耐性が向上した組換え植物の生産方法：
（ａ）配列番号２のアミノ酸からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡＤＰ−リボ−ス及びＮＡＤＨを加水分解する酵素の活性を有するタンパク質。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列で植物を形質転換する工程を含むことを特徴とするストレス耐性が向上した組換え植物の生産方法：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡＤＰ−リボ−ス及びＮＡＤＨを加水分解する酵素の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
ストレス耐性が活性酸素ストレス耐性であることを特徴とする請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
制御配列がカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター配列を含み、これにより遺伝子が植物中で過剰に発現されることを特徴とする請求項５〜７のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は外来遺伝子の導入によりストレス耐性が向上した組換え植物及びかかる組換え植物の生産方法に関する。具体的には本発明はＡＤＰ−リボース及びＮＡＤＨを加水分解する酵素タンパク質をコードする遺伝子の導入により活性酸素ストレス耐性が向上した組換え植物及びかかる組換え植物の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、光合成による酸素発生のため細胞内酸素濃度が他生物に比較して非常に高く、また光合成電子伝達系が共存するため活性酸素種（ＡＯＳ）の生成量が高い。従って、植物はＡＯＳに対する消去系として、多くの抗酸化剤や抗酸化酵素を細胞内コンパートメントに発達させ、生成したＡＯＳができるだけ周囲に拡散しないようにしている。しかし、過剰な環境ストレス下ではＡＯＳの生成量がさらに増加することになり、生成能と消去能のバランスが崩れ、タンパク質やＤＮＡの酸化傷害、細胞内レドックス状態の異常を引き起こし、最終的に細胞は死に至る。
【０００３】
これまで、植物におけるＡＯＳ消去系やＡＯＳの標的タンパク質の分子特性や発現調節機構については多くの研究が精力的になされている。しかし、細胞内の最も重要なオルガネラである核においては、ＡＯＳによるＤＮＡの酸化傷害及びその修復機構については全く明らかになっていない。
【０００４】
一方、大腸菌におけるＤＮＡ修復機構については比較的よく研究されており、ＭｕｔＴタンパク質と呼ばれるヌクレオシド二リン酸由来の物質を加水分解するＮｕｄｉｘ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｓｏｍｅ  ｍｏｉｅｔｙ  Ｘ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）が主要な役割を担うことが明らかになっている（非特許文献１，２）。すなわち、大腸菌のＭｕｔＴタンパク質はヌクレオシドニリン酸由来の物質の中でも突然変異の原因となるＤＮＡ基質（ｄＧＴＰ及びｄＡＴＰ）のＡＯＳによる酸化体（８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰ，８−ｏｘｏ−ｄＧＤＰ及び２−ＯＨ−ｄＡＴＰ）を特異的に加水分解することで、ＤＮＡの突然変異を防ぐ。このＭｕｔＴタンパク質のホモログは植物にも存在することが知られている。しかし、植物におけるＭｕｔＴ様タンパク質の機能や役割については現在に至るまで全く明らかになっていない。
【非特許文献１】Ｍａｋｉ  Ｈｉｓａｊｉ  ａｎｄ  Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ  Ｍｕｔｓｕｏ（１９９２）  “ＭｕｔＴ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．”  Ｎａｔｕｒｅ．３５５：２７３−２７５
【非特許文献２】Ｔａｓｓｏｔｔｏ  Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｍａｔｈｅｗｓ  Ｃ．Ｋ．（２００２）  “Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭｕｔＴ  ８−ｏｘｏｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｏｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ．”  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１５８０７−１５８１２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はかかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は植物におけるＭｕｔＴ様タンパク質の機能を明らかにすることにより、植物におけるＭｕｔＴ様タンパク質の産業上有用な用途を開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者はかかる課題を解決するために植物シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）におけるＭｕｔＴ様タンパク質の分子特性及びかかるタンパク質をコードする遺伝子を組込んだ形質転換植物の特性について鋭意研究した結果、シロイヌナズナのＭｕｔＴ様タンパク質の一種を植物中で過剰発現させると前記植物のストレス耐性が著しく向上することを見出し、遂に本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明によれば以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子が導入され、かつ前記遺伝子が発現していることを特徴とするストレス耐性が向上した組換え植物が提供される：
（ａ）配列番号２のアミノ酸からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡＤＰ−リボース及びＮＡＤＨを加水分解する酵素の活性を有するタンパク質。
【０００８】
また、本発明によれば以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子が導入され、かつ前記遺伝子が発現していることを特徴とするストレス耐性が向上した組換え植物が提供される：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡＤＰ−リボ−ス及びＮＡＤＨを加水分解する酵素の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【０００９】
本発明のストレス耐性が向上した組換え植物の好ましい実施態様においては、ストレス耐性は活性酸素ストレス耐性であり、遺伝子は植物中で過剰に発現している。
【００１０】
また、本発明によれば以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列で植物を形質転換する工程を含むことを特徴とするストレス耐性が向上した組換え植物の生産方法が提供される：
（ａ）配列番号２のアミノ酸からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡＤＰ−リボ−ス及びＮＡＤＨを加水分解する酵素の活性を有するタンパク質。
【００１１】
また、本発明によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列で植物を形質転換する工程を含むことを特徴とするストレス耐性が向上した組換え植物の生産方法が提供される：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡＤＰ−リボ−ス及びＮＡＤＨを加水分解する酵素の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１２】
本発明のストレス耐性が向上した組換え植物の生産方法の好ましい実施態様においては、ストレス耐性は活性酸素ストレス耐性であり、制御配列はカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター配列を含み、これにより遺伝子が植物中で過剰に発現される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明のストレス耐性が向上した組換え植物及びかかる組換え植物の生産方法を具体的に説明するが、特許請求の範囲から逸脱しない限り、これらに限定されるものではない。
【００１４】
本発明における「ストレス」は植物が生育中に受ける任意のストレスであることができるが、本発明では特に活性酸素ストレスを取扱う。本発明において活性酸素ストレスとは植物細胞内に生成された酸素ラジカルや過酸化水素などの活性酸素によるストレスをいう。これらの活性酸素は例えば植物が強光、乾燥、塩、低温、高温、浸透圧、重金属、環境汚染物質などの物理化学的ストレスや植物病原菌感染などの生物学的ストレスを受けることにより生成されるものである（蛋白質核酸酵素１９９９年１１月号増刊第２１４７頁〜第２２５９頁に記載の論文「環境応答・適応の分子機構」を参照）。従って、本発明によれば植物に活性酸素ストレスに対する耐性を付与することにより、これらの物理化学的ストレスや生物学的ストレスに対する耐性も向上させることができる。
また、本発明において「遺伝子が過剰に発現している」とは遺伝子がその由来生物中において通常発現している量よりも有意に多量に発現している状態をいう。遺伝子の過剰発現は例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの如き過剰発現プロモーターを用いることにより行わせることができる。
【００１５】
本発明のストレス耐性が向上した組換え植物において植物に導入される遺伝子は配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又は配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子である。
【００１６】
配列番号１の遺伝子はシロイヌナズナのゲノム中に存在するＭｕｔＴ様タンパク質遺伝子の一つ、ＡｔＭｕｔＴ１に相当し、実施例で後述する通り、ＡＤＰ−リボース及びＮＡＤＨを加水分解する酵素タンパク質をコードする。この遺伝子はシロイヌナズナにおいて通常、ごく少量しか発現していない。また、強光などの種々のストレスによるこの遺伝子の発現誘導はシロイヌナズナにおいては認められない。
【００１７】
本発明の組換え植物に導入される遺伝子は配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡのみならず、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子であって、前記遺伝子によってコードされるタンパク質がＡＤＰ−リボース及びＮＡＤＨを加水分解する酵素の活性を有する遺伝子であることもできる。また、本発明の組換え植物に導入される遺伝子は配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子のみならず配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、前記アミノ酸配列からなるタンパク質がＡＤＰ−リボース及びＮＡＤＨを加水分解する酵素の活性を有する遺伝子であることもできる。これは遺伝子の塩基配列の一部に変異が生じたり、またその結果として遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列の一部に変異が生じても、機能的には同等のタンパク質を発現することが多いからである。
【００１８】
これらのいわゆる均等の範囲に含まれる遺伝子は、対象とする遺伝子源生物のゲノム配列が公知となっており、かつデータベースに登録されている場合、かかるデータベースを用いて配列検索することにより得ることができるであろう。
【００１９】
対象とする遺伝子源生物のゲノム配列が公知となっていない場合、いわゆる均等の範囲に含まれる遺伝子は以下の手順により得ることができるであろう。
【００２０】
即ち、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子であって、前記遺伝子によってコードされるタンパク質がＡＤＰ−リボース及びＮＡＤＨを加水分解する酵素の活性を有する遺伝子は、配列番号１の塩基配列又はその一部をプローブとしてコロニー又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより得ることができる。なお、本明細書において用いる用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えばある塩基配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡのみが特異的にハイブリダイズする条件であることができる。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより作り出すことができる。
【００２１】
ハイブリダイゼーションの手順としては、先ず目的の遺伝子源から得たＤＮＡ（染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ）のライブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー等をニトロセルロース等の膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡを膜に固定する。この膜を３２Ｐ等で標識したプローブ（配列番号１の塩基配列又はその一部）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下、例えば６×ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中で６５℃で２０時間行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的に吸着したプローブを洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成したクローンが単一になるまで繰り返す。こうして得られたクローンの中には目的の遺伝子が挿入されている。得られた遺伝子がＡＤＰ−リボース及びＮＡＤＨを加水分解する酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、例えば得られた遺伝子を大腸菌に導入し、形質転換体からタンパク質を回収してそのタンパク質の基質特異性を測定することにより確認することができる。
【００２２】
また、配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、前記アミノ酸配列からなるタンパク質がＡＤＰ−リボース及びＮＡＤＨを加水分解する酵素の活性を有する遺伝子は、例えばサイトダイレクテドミュータジェネシスキット（タカラバイオ製）や、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）等の市販キットを用いてＤＮＡ塩基配列を置換することにより得ることができる。得られた遺伝子がＡＤＰ−リボース及びＮＡＤＨを加水分解する酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、例えば得られた遺伝子を大腸菌に導入し、形質転換体からタンパク質を回収してそのタンパク質の基質特異性を測定することにより確認することができる。
【００２３】
配列番号１の遺伝子がコードするタンパク質又は配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質はＡＤＰ−リボース及びＮＡＤＨを加水分解する酵素の活性を有する。実施例で後述する通り、この酵素タンパク質の基質であるＡＤＰ−リボース及びＮＡＤＨは「ヌクレオシドニリン酸由来物質」の一種であるが、「突然変異の原因となるＤＮＡ基質のＡＯＳによる酸化体」ではない。従って、この酵素タンパク質を植物体内で発現させても、ＡＯＳにより酸化傷害を受けたＤＮＡの修復能力が特に向上するわけではなく、本発明の組換え植物においてストレス耐性が向上する理由は今だ明らかになっていない。
【００２４】
本発明の組換え植物の生産方法においては植物の形質転換に用いる塩基配列は上述の遺伝子に加えて前記遺伝子の発現を制御する制御配列も含む。かかる制御配列は前記遺伝子を植物細胞内で効果的に発現させる役割を有するものであり、例えば前記遺伝子の５′末端側に連結されるプロモーターであることができる。プロモーターとしてはカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーター、ＯＣＳプロモーターなどの構成的に発現するプロモーターを用いることができるが、対象植物中で遺伝子を過剰発現させるためにはカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターを用いることが好ましい。制御配列は前記遺伝子の３´末端側に連結されるターミネーターも含むことが効果的な発現のため好ましい。ターミネーターとしてはＮＯＳターミネーター、３５Ｓターミネーターなどを用いることができる。
【００２５】
本発明の組換え植物の生産方法においては、前記遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列を用いた植物の形質転換は従来公知の外来遺伝子導入方法により行うことができる。これらの方法にはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌を用いる方法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法などがあるが、双子葉植物細胞を対象とする場合はアグロバクテリウム属細菌を用いる方法が確実さの点で好ましい。アグロバクテリウム属細菌を用いた形質転換法としては、リーフディスク法及びプロトプラスト法（大野哮司（１９８６）ベクターの開発−Ｔｉプラスミド、現代化学増刊５「植物バイオテクノロジー」、山田泰之、岡田吉美編、ｐ．１９７−２１３の第２０７〜２１２頁：内宮博文（１９８９）トランスジェニック植物、「植物遺伝情報の交換」、秀潤社、岡田吉美ら編ｐ２６１−２７６）が周知である。このようにして得られた形質転換植物が前記遺伝子を発現しているかどうかは例えば形質転換植物からタンパク質を回収してそのタンパク質の基質特異性を測定することにより確認することができる。
【００２６】
以上の手順により、活性酵素等のストレスに対する耐性が向上した組換え植物を生産することができる。かかる植物はストレスに対して強い耐性を有するので、厳しいストレスの下でも生育できる農作物としてまたは環境改善用植物として極めて有用である。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、実施例の記載は純粋に発明の理解のためのみに挙げるものであり、本発明はこれによって何ら限定されるものではない。
【００２８】
（１）シロイヌナズナにおけるＭｕｔＴ様タンパク質の検索
ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のＰＲＯＴＥＩＮ  ＢＬＡＳＴで大腸菌のＭｕｔＴのＮｕｄｉｘモチーフ配列を用いて相同性検索したところ、シロイヌナズナにおいて八つのＭｕｔＴ様タンパク質コード配列（ＡｔＭｕｔＴ１〜ＡｔＭｕｔＴ８）が発見された。
【００２９】
（２）シロイヌナズナのＭｕｔＴ様タンパク質の基質特異性の調査
（１）で得られた八つのＭｕｔＴ様タンパク質コード配列のうち、ＡｔＭｕｔＴ１〜ＡｔＭｕｔＴ４について、以下の手順で基質特異性を調査した。コントロールとして、大腸菌のＭｕｔＴタンパク質を用いた。ＡｔＭｕｔＴ１〜ＡｔＭｕｔＴ４の塩基配列は配列表の配列番号１，３，５及び７にそれぞれ示される通りであり、アミノ酸配列は配列番号２，４，６及び８にそれぞれ示される通りであった。また、大腸菌のＭｕｔＴの塩基配列は配列表の配列番号９に示される通りであり、アミノ酸配列は配列番号１０に示される通りであった。
【００３０】
（ｉ）組換えタンパク質の調製
ＡｔＭｕｔＴ１〜ＡｔＭｕｔＴ４のｃＤＮＡをヒスチジンタグ融合タンパク質発現ベクターｐＥＴ３ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の制限酵素Ｎｄｅ  Ｉ部位に導入し、大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３（ｐＬｙｓＳ）株へ形質転換した。得られた形質転換大腸菌をアンピシリンとクロラムフェニコールを含むＬＢ培地でＯＤ６００＝０．５（濁度）になるまで培養し、０．４ｍＭ  ＩＰＴＧ添加によって組換えタンパク質の発現を誘導した。菌体を遠心分離により回収後、精製用緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  イミダゾール、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）で懸濁し、超音波破砕した。遠心分離によって得られた上澄み画分を、ニッケルを結合させたＨｉＴｒａｐＣｈｅｌａｔｉｎｇＨＰカラムによって精製し、活性測定用緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ，ｐＨ８．０）で一晩透析を行い、ＭｕｔＴ活性の測定に用いた。
【００３１】
（ｉｉ）基質特異性の調査
基質特異性の調査は、基質のヌクレオシドニリン酸由来物質として８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰ，ＡＤＰ−リボース及びＮＡＤＨの三種類を用いて行われた。
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０），５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２５μＭ基質（８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰ、ＡＤＰ−リボース、ＮＡＤＨ）、０．２〜１．０μｇ組換えタンパク質を混合し、３７℃、１０分間反応させた後、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ１０μｌを添加して反応を停止させた。ＨＰＬＣのＣＯＳＭＯＳＩＬ  Ｃ１８  カラム（４．６  Ｘ  ２５０ｍｍ，Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）を用いて、５ｍＭ  ｔｅｔｒａｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ、２０％メタノール、７３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６）流速０．６ｍｌ／ｍｉｎで分離し、基質の加水分解物をＡＤＰ−リボース、ＮＡＤＨについては２６７ｎｍ、８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰについては２９３ｎｍの波長で測定した。
【００３２】
結果を図１に示す。図１から理解される通り、シロイヌナズナのＭｕｔＴ様タンパク質ＡｔＭｕｔＴ１〜ＡｔＭｕｔＴ４のうち、ＡｔＭｕｔＴ２〜ＡｔＭｕｔＴ４はいずれの基質とも反応しなかった。また、ＡｔＭｕｔＴ１は８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰとは反応しなかったがＡＤＰ−リボース及びＮＡＤＨとは反応し、これらの基質を加水分解した。一方、大腸菌のＭｕｔＴは８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰを加水分解したが、ＡＤＰ−リボース及びＮＡＤＨは加水分解しなかった。
【００３３】
（３）ＡｔＭｕｔＴ１をコードする遺伝子を導入した組換えシロイヌナズナの作成
（２）でＡＤＰ−リボース及びＮＡＤＨに対する基質特異性が確認されたＡｔＭｕｔＴ１を用いて組換えシロイヌナズナを作成した。
（ｉ）植物材料の調製
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ，ｅｃｏｔｙｐｅ  Ｃｏｌｏｍｂｉａ）の種子をＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地に播種し、種子発芽から約１ｃｍに生長するまで培養した。培養条件は光照度：１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、明期１２時間、暗期１２時間、２２℃であった。その後、ＭＳ培地より根を切らないように注意しながら植物体を取り、土壌栽培に移行した。土壌に移した後は、グロスチャンバー内で、光照度１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、明期１２時間、暗期１２時間、２２℃の条件下で培養した。なお、土壌栽培は、市販土及びバーミキュライトを混合したものを用いて行った。
【００３４】
（ｉｉ）導入プラスミドの構築
ＡｔＭｕｔＴ１  ｃＤＮＡからＯＲＦを含む８３７  ｂｐ（配列番号１）をＰＣＲにより増幅し、植物細胞導入用ベクターｐＤＨ１２３（ＣＬＯＮＴＥＣ製）のカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターとノパリンシンターゼターミネーター間に導入し、ＡｔＭｕｔＴ１導入プラスミドを構築した（図２）。  
【００３５】
（ｉｉｉ）シロイヌナズナへの遺伝子導入
シロイヌナズナへのＡｔＭｕｔＴ１をコードする遺伝子の導入は、目的プラスミドで形質転換したアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いた減圧浸潤法より行った。
【００３６】
（ｉｖ）形質転換株の選抜
アグロバクテリウムを感染させたシロイヌナズナ（Ｔ０世代）は光照度１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、明期１２時間、暗期１２時間、２２℃で栽培し、Ｔ１種子を回収した。さらに、自家交配によりＴ３種子を回収し、実験に用いた。
【００３７】
（４）組換えシロイヌナズナのストレス耐性の評価
活性酸素ストレス
（３）で得られたＴ３種子を（３）の（ｉ）に記載した手順で播種し、パラコートを含まないＭＳ培地（通常培地）で一週間栽培（光照度：１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、明期１２時間、暗期１２時間、２２℃）後、パラコート（３μＭ）を含む培地へ移植し、一週間処理（光照度：１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、明期１２時間、暗期１２時間、２２℃）を行い、更に通常培地に移植して生育させた。
また、生育段階における影響を調べるため、通常培地で二週間栽培したものに対して同様のパラコート処理を行った。
なお、コントロールとしては空ベクターで形質転換したシロイヌナズナのＴ３種子を用いた。
【００３８】
結果を図３及び図４に示す。図３及び図４から明らかな通り、播種一週間後にパラコート処理した場合、コントロールではほとんどの株が枯死していたが（生存率約１３％）、ＡｔＭｕｔＴ１遺伝子を過剰発現させた形質転換体では多くの株が緑色を保っていた（生存率約６８％）。また、生育段階における影響を調べるために播種二週間後にパラコート処理した場合、その差は一層明確であった（コントロールの生存率約７％、ＡｔＭｕｔＴ１遺伝子を過剰発現させた形質転換体の生存率約８０％）。  
【００３９】
（５）ＡｔＭｕｔＴ１遺伝子の選択的スプライシング
図５(配列番号１１)及び図６に示す通り、ＡｔＭｕｔＴ１遺伝子は八つのエキソンと七つのイントロンで構成されており、イントロンのスプライシングによりＡｔＭｕｔＴ１ａ  ｍＲＮＡが生成する。一方、選択的スプライシングによりイントロン５及び６の代わりに、エキソン５の途中（図５の４８４番目の塩基）からエキソン７の途中（図５の５７２番目の塩基）までがイントロンとしてスプライシングされることにより、ＡｔＭｕｔＴ１ｂ  ｍＲＮＡが生成する。つまり、ＡｔＭｕｔＴ１遺伝子からは選択的スプライシングによって二つのｍＲＮＡ産物が生成する（図６）。そこで、どちらのｍＲＮＡ産物がストレス耐性に関与しているのかを明らかにするため、それぞれのｍＲＮＡのｃＤＮＡを用いて（３）と同様の手順で過剰発現体を作成し、（４）と同様の手順でストレス耐性を検討した。その結果、播種一週間後及び播種二週間後のパラコート処理のどちらにおいても、コントロール及びＡｔＭｕｔＴ１ｂと比較してＡｔＭｕｔＴ１ａの過剰発現体において多くの株が良好な生育を示した（図７及び図８）。これらの結果から、ＡｔＭｕｔＴ１ａ  ｍＲＮＡがコードするタンパク質がストレス耐性を向上させる機能を有することが示された。
【００４０】
考察
（４）及び（５）の結果から、ＡｔＭｕｔＴ１遺伝子を植物中で過剰に発現させると植物のストレス耐性が著しく向上すること、及び具体的にはＡｔＭｕｔＴ１遺伝子の二つのｍＲＮＡ産物のうち、ＡｔＭｕｔＴ１ａ  ｍＲＮＡがコードするタンパク質が植物のストレス耐性を向上させる機能を有することが明らかである。このＡｔＭｕｔＴ１ａ  ｍＲＮＡがコードするタンパク質の塩基配列及びアミノ酸配列は配列表の配列番号１及び２にそれぞれ記載される通りである。
【００４１】
（２）で示した通り、ＡｔＭｕｔＴ１タンパク質は調査した三つの基質のうち、ＡＤＰ−リボース及びＮＡＤＨのみを加水分解する。これらの基質はいずれも「突然変異の原因となるＤＮＡ基質のＡＯＳによる酸化体」には該当しない。
この結果は、「突然変異の原因となるＤＮＡ基質のＡＯＳによる酸化体」である８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰを加水分解するがＡＤＰ−リボース及びＮＡＤＨは加水分解しない大腸菌のＭｕｔＴタンパク質とは対照的である。このことから、ＡｔＭｕｔＴ１タンパク質は大腸菌のＭｕｔＴタンパク質とは異なり、突然変異を抑制する作用を有さず、ＡＯＳによるＤＮＡの酸化傷害の修復には関与していない可能性が高い。実際、本発明者がＡｔＭｕｔＴ１について大腸菌ＭｕｔＴ欠損株を用いて相補試験を行ったところ、ＡｔＭｕｔＴ１には突然変異の抑制作用は認められなかった（データは示さず）。従って、ＡｔＭｕｔＴ１によるストレス耐性の向上は突然変異の抑制作用によるものではなく、他の全く異なる未知の作用によるものであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】シロイヌナズナＭｕｔＴ様タンパク質の基質特異性を示す。
【図２】ＡｔＭｕｔＴ１導入プラスミドの構築を示す。
【図３】ＡｔＭｕｔＴ１遺伝子の過剰発現による活性酸素ストレス耐性の向上を示す。
【図４】ＡｔＭｕｔＴ１遺伝子の過剰発現による活性酸素ストレス耐性の向上を示す。
【図５】ＡｔＭｕｔＴ１遺伝子の配列を示す。
【図６】ＡｔＭｕｔＴ１遺伝子の選択的スプライシングパターンを示す。
【図７】ＡｔＭｕｔＴ１ａ  ｃＤＮＡの過剰発現による活性酸素ストレス耐性の向上を示す。
【図８】ＡｔＭｕｔＴ１ａ  ｃＤＮＡの過剰発現による活性酸素ストレス耐性の向上を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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