(57)【要約】【課題】  患者におけるＴ細胞仲介免疫システム疾患を防止または処置するために、または抗原特異的寛容を誘導するために使用され得る、リガンドの提供、および、Ｔ細胞アネルギーを生じさせるために、同種異系移植片移植物拒絶を処置するために、移植細胞対宿主病を処置するために、および慢性関節リュウマチを防止または処置するために使用され得る、。抗Ｂ７−１抗体の提供。【解決手段】  Ｂ７−１抗原に結合するがＢ７−２抗原にもＢ７−３抗原にも結合しないモノクローナル抗体またはそのフラグメント。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
B7-1抗原に結合するがB7-2抗原にもB7-3抗原にも結合しないモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項２】
B7-1抗原に結合するがB7-2抗原にもB7-3抗原にも結合しないモノクローナル抗体を産生し得る、ハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明はＴ細胞アネルギーの誘導のための方法および物質に関する。さらに詳細には、本発明は、移植物拒絶、移植細胞対宿主病、および特定の抗原を異物として認識することに起因する他の免疫学的状態を、防止または処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
移植後の移植片拒絶の防止のための現在のストラテジーは、シクロスポリンＡ(CsA)、FK506およびコルチコステロイドのような広く作用する免疫抑制剤の使用に基づいている。これらの薬物は、しばしば、長期間の時間に亘り使用されなくてはならず、それゆえ重篤な感染、腎毒性、およびガンの危険を増加する。さらに、全ての患者が、高用量のこれらの免疫抑制剤を寛容し得るわけではなく、しばしば移植片拒絶または移植細胞対宿主病(GVHD)を生じる。移植片拒絶の最適な防止は、ドナー組織に対する特定の寛容の誘導に基づくべきである。従って、移植物拒絶を防止するための理想的な薬物は、長期間の免疫抑制の必要なしに、ドナー反応性Ｔ細胞のクローン非応答性、またはアネルギーを誘導するべきである。アネルギーは、「共刺激(costimulatory)」シグナルの非存在下での、Ｔ細胞レセプター(TCR)とペプチド提示主要組織適合遺伝子複合体(MHC)抗原との間での相互作用の後の細胞内シグナリングの結果であると考えられている。Muellerら、Annu.Rev.Immunol.,7,445 (1989)。この共刺激シグナルは、通常、抗原提示細胞(APC)の細胞表面により提供される。Hawrylowiczら、J.Immunol.,141,4083 (1988)；およびSpringerら、Annu.Rev.Immunol.,5,223 (1987)。
【０００３】
Ｔ細胞は、通常のインビボにおける免疫応答の間に重要な役割を担う。Ｔ細胞は細胞障害性、遅延型過敏症、およびＢ細胞によるＴ細胞依存性抗体産生に関与している。さらに、Ｔ細胞は、多様なリンホカイン(例えば、インターロイキン-2(IL-2)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、リンホトキシン、γインターフェロン(IFN-γ)、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF))を産生する。
【０００４】
Ｔ細胞の活性化は、リガンド-レセプター相互作用の結果である。生理的条件下で、TCR/CD3複合体は、APCのMHC分子により提示される抗原性ペプチドに結合する。TCR/CD3複合体は抗原誘導性活性化において２つの役割を担う。第一に、これは抗原提示MHC分子との関係において特異的抗原を認識する、次いで、認識事象は、シグナリングメカニズムにより原形質膜を通って伝達される。しかし、TCRに対する抗原の結合のみではＴ細胞を最大に活性化するためには十分ではない。Ｔ細胞の表面上の多くの他のアクセサリー分子が、接着またはシグナリングまたはその両方において重要な役割を担う。例えば、Ｔ細胞上のCD2分子は、APC上のLFA-3に結合するが、CD2への抗体の結合がTCR/CD3複合体により提供されるシグナルを増大し得ることもまた示された。Ｔ細胞活性化に関与する他のリガンド対は、LFA-1/ICAM-1、CD4/MHCクラスII抗原、VLA-4/VCAM、および、最も重要には、CD28/B7である。
【０００５】
TCR刺激が完全なＴ細胞活性化またはＴ細胞アネルギーを導くかどうかを決定する共刺激シグナルの候補は、Ｔ細胞上のCD28とAPC上のB7細胞との相互作用により生成されるシグナルである。CD28分子のインビトロにおける架橋が、Ｔ細胞がアネルギーになることから救済し得ることが報告されている。Hardingら、Nature,356,607 (1992)。CD28は、44kDaの見かけの分子量を有するホモ二量体膜貫通糖タンパク質であり、そして免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである[Aruffoら、Proc.Nat'l.Acad.Sci. (USA),84,8573 (1987)]。CD28分子は約95%のCD4陽性Ｔ細胞上および50%のCD8陽性Ｔ細胞上で発現される。Ｔ細胞のTCR/CD3複合体に対するモノクローナル抗体およびCD28との共刺激は、非常に増強されたＴ細胞の活性化を生じる。Thompsonら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.(USA),86,1333-1337 (1989)；Juneら、J.Immunol.,143,153-161 (1989)；およびLindstenら、Science,244,339-343 (1989)。この効果は明らかにいくつかのリンホカイン(IL-2を含む)のmRNAの安定化に関与しており、これはこれらのリンホカインの産生の非常な増強を生じる。Juneら、前出；およびLindstenら、前出。さらに、CD28応答性エレメントがIL-2遺伝子のエンハンサーにおいて示され、転写レベルでの調節も存在することを示唆する。Fraserら、Science,251,313 (1991)およびVerweyら、J.Biol.Chem.,266, 14179-14182 (1991)。CD28により仲介されるＴ細胞活性化のあるモデルは、CsAでの阻害に相対的に耐性であることが報告されている。Juneら、Mol.Cell.Biol.,7,4472-4481 (1987)。
【０００６】
B7は、見かけの分子量45〜65kDaを有する単量体膜貫通糖タンパク質であり、CD28のように免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。Freemanら、J.Immunol.,143,2714-2722 (1989)。さらに、B7を発現するCHO細胞は、TCR刺激と相乗し得、それによりIL-2の分泌およびＴ細胞の増殖を生じる。Linsleyら、J.Exp.Med.,137,721-730 (1991)；およびGimmiら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.(USA),88,6575(1991)。B7はまた、CTLA-4分子の組換え融合タンパク質に結合することが報告されている。Linsleyら、J.Exp.Med.,174,561-569 (1991)。CTLA-4も、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、そしてCTLA-4およびCD28の細胞質領域は有意な相同性を示す。Harperら、J.Immunol.,147,1037 (1991)。B7分子は活性化Ｂ細胞上(Freemanら、前出)、IFN-γで刺激された単球上[Freedmanら、Cell.Immunol.,137,429-437 (1991)]および単離された末梢血樹状細胞上[Youngら、J.Clin.Invest.,90,229-237 (1992)]で発現される。免疫組織化学的研究は、B7分子が、インビボで、リンパ組織および非リンパ組織の両方において樹状細胞上で、構成的に発現されることを報告している。Vandenbergheら、International Immunology (1993)。
【０００７】
インビボにおいて、B7抗原は、移植物拒絶の間のＴ細胞活性化に関与している。Lenschowおよび共同研究者らは、マウスにおける、ヒトCTLA-4および免疫グロブリンG1 Fc領域の融合タンパク質(CTLA4Ig) (マウスB7およびヒトB7の両方に強く結合する)を使用して、移植後のヒトランゲルハンス島の拒絶を防止した [Lenschowら、Science,257,789-792 (1992)]。ここで、CTLA4Igが異種抗原(Ｔ細胞が由来する種に対して外来の抗原)の拒絶をブロックすることが報告されている。
【０００８】
B7とCD28抗原との間の相互作用を干渉するある分子が報告されている。可溶性CTLA4-Ig融合タンパク質が、部分的にこの相互作用をブロックすることが報告されている。Linsleyら、J.Exp.Med.74,561 (1991)。抗CD28抗体が、この相互作用をブロックすることもまた報告されている。さらに、抗B7抗体も公知である。Yokochiら、J.Immunol.,128,823 (1982)；Freedmanら、J.Immunol.,139,3260 (1987)；Valleら、Immunol.,69,531 (1990)。
【０００９】
アロ抗原特異的細胞障害性Ｔリンパ球前駆体のアネルギーが、いわゆる共刺激シグナルの非存在下で、TCR/MHC相互作用の後に細胞内シグナリングから生じることが報告されている[Jenkinsら、J.Exp.Med.,165,302 (1987)；Jenkinsら、Proc.Nat'l.Acad.Sci. (USA),54,5409 (1987)；Jenkinsら、J.Immunol.,140,3324 (1988)；Muellerら、Ann.Rev.Immunol.,7,445 (1989)；およびSchwartz,Science,248,1349 (1990)]。細胞表面APCにより提供されるこのような共刺激シグナルは、 APCおよびＴ細胞との間の接着を強化することによりTCRを介するシグナリングを補強するためにCD2-LFA-3およびLFA-1-ICAM-1/2/3相互作用を包含することが報告されている[Springer,Nature,346,425 (1990)；Weaverら、Immunol.Today,11,49 (1990)、およびvan Seventerら、Current Opinion In Immunology,3,294 (1991)]。
【００１０】
TCR刺激が完全なＴ細胞活性化またはＴ細胞アネルギーを導くかどうかを決定する共刺激シグナルの１つの候補は、Ｔ細胞CD28またはCTLA-4とAPC上のB7との相互作用である[Schwartz, Cell, 71, 1065 (1992)およびHardingら、Nature, 356, 607 (1992)]。また興味深いことに、CD28を介するＴ細胞の共刺激は、特定の基質のチロシンリン酸化を誘導し[Vandenbergheら、J.Exp.Med.,175, 951 (1992)]、これはカルシウム非依存性経路を包含する[Thompsonら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 86, 1333 (1989)；Juneら、J.Immunol., 143, 153 (1989)；Lindstenら、Science, 244, 339 (1989)；Juneら、Mol.Cell.Biol., 7, 4472 (1987)およびVan Goolら、J.Immunol., 150, 3254 (1993)]。IL-2を含むいくつかのサイトカインのmRNAの安定化もまた、関与し得る[Lindstenら、Science, 244, 339 (1989)]。IL-2遺伝子のエンハンサーにおけるCD28応答性エレメントが、報告されている[Fraserら、Science, 251, 313 (1991)およびVerweyら、J.Biol.Chem., 266, 14197 (1991)]。B7、すなわちCD28に対する天然のリガンド[Linsleyら、J.Exp.Med., 173, 721 (1991)およびGimmiらProc. Nat'l.Acad.Sci. (USA), 88, 6575 (1991)]は、45〜65kDaの分子量を有する単量体膜貫通糖タンパク質であることが報告されている。B7は、活性化Ｂ細胞上、活性化単球上、およびリンパ組織および非リンパ組織の両方において構成的に樹状細胞上で発現される[Vandenbergheら、Int.Immunol. 5, 317 (1993)]。 B7分子は、移植物拒絶の間、インビボにおいてＴ細胞の活性化に関与する。マウスB7およびヒトB7に強力に結合するヒトCTLA-4と免疫グロブリンとの可溶性融合タンパク質CTLA-4-Igは、マウスにおいて移植の後に、ヒトランゲルハンス島の拒絶を防止することが報告されている[Lenschowら、Science, 257, 789 (1992)]。 B7-CD28/CTLA-4のブロックおよびアロ抗原での活性化の後に、特異的な低応答性がヒトＴ細胞において誘導されることが報告されている[Tanら、J.Exp.Med. 177, 165 (1993)]。CD28により仲介されるＴ細胞活性化は、ある条件下でCsAでの阻害に耐性であることが報告されている[Juneら、Mol.Cell.Biol., 7, 4472 (1987)およびVan Goolら、J.Immunol., 150, 3254 (1993)]。 CsAおよびB7分子に対するmAbの存在が、ヒトCTL前駆体の持続する非応答性またはアネルギーを誘導するかどうかに関しては、Ｔ細胞アネルギーは細胞障害性エフェクターレベルで研究されており、これは移植物拒絶に最も適切であり、そして最も誘導されることが困難であるので選択された[Ottenら、Science, 251, 1228 (1991)およびGoら、J.Immunol, 150, 367 (1993)]。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
１．患者における移植物拒絶を防止するための方法であって、該方法は、このような処置を必要とする患者に、治療的に有効な量の(a)B7-1抗原に結合するがB7-2およびB7-3抗原には結合しない分子；および(b) 免疫抑制剤を、薬学的に受容可能な賦形剤中で投与する工程を包含する、方法。
２．患者における移植細胞対宿主病(GVHD)を防止または処置するための方法であって、該方法は、このような処置を必要とする患者に、治療的に有効な量の(a)B7-1抗原に結合するがB7-2およびB7-3抗原には結合しない分子；および(b) 免疫抑制剤を、薬学的に受容可能な賦形剤中で投与する工程を包含する、方法。
３．患者における慢性関節リュウマチを防止または処置するための方法であって、該方法は、このような処置を必要とする患者に、治療的に有効な量の(a)B7-1抗原に結合するがB7-2およびB7-3抗原には結合しない分子；および(b) 免疫抑制剤を、薬学的に受容可能な賦形剤中で投与する工程を包含する、方法。
４．B7-1抗原に結合する前記分子が抗B7-1抗体である、項目１、２または３に記載の方法。
５．前記免疫抑制剤が、シクロスポリンＡ、FK506、ラパマイシンおよびコルチコステロイドからなる群より選択される、項目１、２または３に記載の方法。
６．ATCC HB11341と命名されたハイブリドーマ細胞株により産生される、モノクローナル抗体B7-24。
７．前記抗B7-1抗体がモノクローナル抗体である、項目４に記載の方法。
８．前記モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、項目７に記載の方法。
９．前記分子が、抗B7-1抗体の抗原結合機能を保有する該B7-1抗体のフラグメントである、項目１、２または３に記載の方法。
１０．前記モノクローナル抗体がMab B7-24である、項目７に記載の方法。
１１．モノクローナル抗体Mab B7-24を産生し得る、ハイブリドーマ細胞株。
１２．Ｔ細胞アネルギーを誘導するための組成物であって、以下の組み合わせを含み：
a)モノクローナル抗体またはその抗原に結合するフラグメントであって、抗原提示細胞の表面上のB7-1抗原に特異的に結合し得るがB7-2およびB7-3抗原には結合しない、抗体またはフラグメント；および
b)免疫抑制剤、
該抗体またはフラグメントおよび該免疫抑制剤のそれぞれが、同量の各組成物単独により誘導されるＴ細胞アネルギーの合計より大きいＴ細胞アネルギーを組み合わせにより誘導するために有効な量で存在する、組成物。
１３．前記モノクローナル抗体がB7-24である、項目１２に記載の組成物。
１４．前記免疫抑制剤が、シクロスポリンＡ、FK506、ラパマイシンおよびコルチコステロイドからなる群より選択されるメンバーである、項目１２に記載の組成物。
１５．前記モノクロール抗体がヒト化モノクローナル抗体である、項目１２に記載の組成物。
１６．前記抗原に結合するフラグメントおよび前記免疫抑制剤との組み合わせを含む、項目１２に記載の組成物。
１７．前記抗原に結合するフラグメントがヒト化成分を有する、項目１６に記載の組成物。
【００１２】
発明の要旨
本発明はまた、B7-1抗原に結合する分子および免疫抑制剤の患者への同時投与が、アロ抗原(Ｔ細胞と同じ種に対して天然の抗原)に対する持続的なＴ細胞アネルギーを誘導するという発見に基づいている。
【００１３】
従って、本発明は患者における移植物拒絶を防止する方法を提供する。この方法は、このような処置が必要な患者に、治療的に有効な量の(１)B7-1抗原に結合する分子および(２)免疫抑制剤(例えは、シクロスポリンA、FK506、またはコルチコステロイド)を、薬学的に受容可能な賦形剤中で投与する工程を包含する。本発明の好ましい実施態様において、B7-1抗原に結合する分子は、抗B7-1抗体である。
【００１４】
さらに、本発明は、患者における移植細胞対宿主病(GVHD)を防止または処置する方法を提供する。この方法は、このような処置が必要な患者に、治療的に有効な量の(１)B7-1抗原に結合する分子、および(２)免疫抑制剤(例えは、シクロスポリンA、FK506、またはコルチコステロイド)を、薬学的に受容可能な賦形剤中で投与する工程を包含する。本発明の好ましい実施態様において、B7-1抗原に結合する分子は、抗B7-1抗体である。
【００１５】
また、本発明は、患者における慢性関節リュウマチを防止または処置する方法を提供する。この方法は、このような処置が必要な患者に、治療的に有効な量の(１)B7抗原に結合する分子、および(２)免疫抑制剤(例えは、シクロスポリンA、FK506、またはコルチコステロイド)を、薬学的に受容可能な賦形剤中で投与する工程を包含する。本発明の好ましい実施態様において、B7-1抗原に結合する分子は、抗B7-1抗体である。
【００１６】
上記方法のより好ましい実施態様において、抗B7-1抗体は、モノクローナル抗体であり、最も好ましくは、本明細書に記載されるように作製されるB7-24モノクローナル抗体である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本明細書において記載される本発明は、以前に公開された研究および係属特許出願を引用する。例えば、このような研究は、科学論文、特許または係属特許出願からなる。以前または以後に引用されるこれらの全ての刊行物および出願は、これゆえ参考として援用される。
【００１８】
移植片拒絶を防止する最適な治療は、ドナーの組織に対する特異的な寛容の誘導に基づくべきである。免疫学的寛容における現在の概念は、アネルギーが、いわゆる共刺激シグナルの非存在下での、TCR/MHCペプチド相互作用の後の細胞間シグナリングの結果であるとされている(Jenkinsら、J,Exp.Med., 165,302 (1987))。この共刺激シグナルは、抗原提示細胞(APC)の細胞表面により提供される。現在では、TCR-刺激が、完全なＴ細胞活性化またはＴ細胞寛容を導くかどうかを決定する最も良い候補となる共刺激シグナルは、Ｔ細胞上のCD28分子の連結により生成される(Hardingら、Nature, 356, 607)。プロフェッショナルAPC上にCD28分子についての少なくとも２つのリガンド(B7-1およびB7-2と呼ばれる)があることが示された(Freemanら、Science, 262, 909 (1993))。これらの分子の両方が、Ｔ細胞の活性化のための共刺激シグナルを提供することが知られている。
【００１９】
モノクローナル抗体B7-24は、B7-1分子には特異的に結合するがB7-2には結合しない無比のモノクローナル抗体である。これは、B7-1およびB7-2の両方に結合するCTLA-4分子の組換え融合タンパク質と対照的である(Linsley、J.Exp.Med., 174, 561 (1991))。モノクローナル抗体B7-24は、B7ー1およびそれに加えて第３の形態のB7分子であるB7-3に結合する抗B7モノクローナル抗体BB-1とも異なる(Boussiotisら、Proc.Nat'l.Acad.Sci. (USA, 90, 11059 (1993)))。B7-1およびB7-2の両方が、CD28分子に結合することによりＴ細胞を共刺激し得ることが知られているが、シクロスポリンAの様な免疫抑制薬物を組み合わせた場合、B7-24のような特異的モノクローナル抗体を用いるB7-1のみのブロックが、Ｔ細胞寛容またはアネルギーを誘導し得ることは知られていない。CsAがマウスにおいてアネルギーの誘導を防止し得ることが文献中に示唆されているので、このことは予想外である[Schwartz, Science, 248, 425 (1990)]。
【００２０】
提案されるメカニズムに限定されることなく、mAb B7-24およびCsAによる寛容の誘導は、以下の様に説明され得る。寛容の誘導は能動的なプロセスであり、このことは寛容の誘導が、Ｔ細胞による特定の遺伝子の活性化および対応するタンパク質の産生の活性化を要求することを意味する。これらの遺伝子(「アネルギー遺伝子」)は、Ｔ細胞上のTCR/CD3複合体が特定の抗原で刺激されるときに活性化される。移植の間、これはアロ抗原であり、そしてこれはシグナル１として考えられ得る。(アロ)抗原によるＴ細胞の活性化は、APCとの相互作用で生じ、これは同時に、B7分子のような分子を介した共刺激シグナルを提供する。これはシグナル２と考えられ得る。Ｔ細胞がシグナル１およびシグナル２の両方を受けると、アネルギー遺伝子のみが活性化されるのではなく、IL-2のようなＴ細胞の増殖因子の遺伝子も活性化される。次いで、これらのＴ細胞増殖因子がＴ細胞上の特定のレセプター(IL-2レセプター)に結合し得、その結果Ｔ細胞の完全な活性化を生じ、アネルギー遺伝子が見かけ上無効にされるかまたは不活性化される。
【００２１】
CsAのような免疫抑制薬物は、IL-2遺伝子の活性化を部分的に阻害し得るが、ヒトにおいては、アネルギー遺伝子の活性化を妨げない。しかし、CsAが単独で使用される場合、CsAは完全にはIL-2の産生を阻害せず、そして小量のIL-2の産生は、アネルギー遺伝子を不活性化する。
【００２２】
B7-1およびB7-2の両方がＴ細胞にIL-2の産生の共刺激シグナルを提供し得るとすれば、CsAとの組み合わせでのB7-1のみのブロックがＴ細胞寛容を生じることは驚くべきことである。このことは、CD28の架橋後のシグナル伝達の結果、２つの独立したシグナル経路(１つはCsA感受性であり、１つはCsA非感受性である)を生じることが知られている事実により説明され得る。CD28とB7-2との相互作用の後のシグナル伝達がCsA感受性経路により仲介されるのかもしれない。さらに、最近の実験の見識により[Linら、J.Exp.Med., 178, 1801 (1983)]、B7-2とCD28との相互作用の後のシグナル伝達がアネルギー遺伝子の誘導に要求されることが提案され得る。それゆえ、B7-1分子には特異的に結合するがB7-2またはB7-3には結合しない分子と、Ｔ細胞によるIL-2の産生を阻害する免疫抑制剤の患者への同時投与が、持続的Ｔ細胞寛容またはアネルギーを誘導し得る。
【００２３】
持続的移植寛容を誘導するために、移植を受ける患者は、標準的な免疫抑制治療および抗B7-1モノクローナル抗体B7-24を用いる短い処置コースからなる予防（profylactic）処置を受け得る。標準的な免疫抑制治療は、通常、6mg/kg/日の開始用量で与えられるシクロスポリンAからなり、これは150ng/mlと250ng/mlとの間の全血レベルを維持するように調整される。ジピリダモールおよびアセチルサリチル酸が、CsAと共に与えられ得る。さらに、患者はアザチオプリンおよびステロイドを受け得る。最初の高用量のステロイドが、低維持用量に加減される。モノクローナル抗体B7-24の第一の用量は、手術の１時間前から６時間前の間に、患者に投与される。他の用量は、移植後１〜10日間、毎日与えられる。10日目の後、患者は標準的な免疫抑制治療を受け、それにより、免疫抑制薬物の用量を徐々に低維持レベルに加減するかまたは免疫抑制薬物処置を完全に中止する。
【００２４】
I.  定義：
本明細書で使用される用語、「膜結合抗原」、「細胞表面分子」および「細胞表面抗原」は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをいい、このタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの少なくとも１つの抗原性部分が生物学的膜の表面に曝露され、そして共有結合的に付着される以下の部分の１つ以上を有し得る：１つ以上の単純糖部分または複合糖部分(糖タンパク質におけるような)、脂質部分(脂質タンパク質におけるような)、脂質部分および糖部分の組合わせ、または他の転写後修飾。
【００２５】
代表的に「タンパク質」は、アミノ酸に基礎を置く重合体の長鎖である(「ポリぺプチド」)。タンパク質は１つ、２つまたはより多くのポリペプチド鎖からなり得、そしてさらにポリぺプチド鎖(単数または複数)に結合するある他の型の物質(例えば、炭水化物)を含み得る。タンパク質の大きさは（任意の数字の）5,000〜数十万g/moleのどちらかといえば広い範囲に及ぶ。5,000の数字はおおまかに40〜45アミノ酸の存在に相当する。代表的に、約5,000g/moleよりも小さいタンパク質は、ポリペプチドまたは単にぺプチドという(Bohinski)。
【００２６】
本明細書で使用される用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、およびそのフラグメント(例えば、Fab、F(ab')2、Fv)、ならびに親抗体の抗原結合機能を保有する他のフラグメントをいう。
【００２７】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、均質の抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、抗体の種または供給源に関して限定されず、またその作製方法によって限定される事も意図しない。この用語は、免疫グロブリン全体およびFab、F(ab')2、Fvのようなフラグメント及び抗体の抗原結合機能を保有する他のものを含有する。任意の哺乳動物種のモノクローナル抗体が、本発明において使用され得る。しかし特に、モノクローナル抗体を産生するために必要とされるハイブリッド細胞株またはハイブリドーマの作製において使用されるラットまたはマウスの細胞株の利用可能性故に、抗体は代表的にラットまたはマウス起源である。
【００２８】
本明細書で使用される用語「ヒト化抗体」は、免疫グロブリンの骨格領域の少なくとも一部分が、ヒト免疫グロブリン配列に由来することを意味する。
【００２９】
本明細書で使用される用語「単鎖抗体」は、結合する抗体の結合ドメインＨ鎖およびＬ鎖）を決定し、そして結合機能の保存を可能にする連結部分を供給する事により調製される抗体をいう。本質的にこれは、抗原への結合に必要な可変ドメインの部分のみを有する徹底的に短縮された抗体を形成する。単鎖抗体の決定および構築は、Ladnerの米国特許第4,946,778号に記載されている。
【００３０】
本明細書で使用される用語「B7-1抗原に結合する分子」は、同じ環境における他の物質がB7-1抗原に複合化されない環境において、B7-1抗原と複合体を形成し得る分子をいう。この複合体は、CD28抗原またはCTLA4抗原を介したB7-1の正常なシグナル伝達経路をブロックする方法で形成される。B7抗原に結合する分子は、CD28、CTLA4、CTLA4Igおよび抗B7抗体を含有する。
【００３１】
II.  膜結合抗原分子に対する抗体の生成
この節は、トランスフェクトされた昆虫細胞を免疫原として使用し、細胞表面分子に対する抗体を生成および選択する方法を記載する。この方法は以下の工程を包含する：免疫工程、これは(i)目的の抗原をコードする核酸コード配列を選択および単離する工程、(ii) コード配列の効率的な発現を得るようにコード配列をバキュロウイルス発現ベクターへ挿入する工程、(iii)発現ベクターを昆虫細胞株へトランスフェクトして選択された抗原を発現する組換え昆虫細胞を得る工程、そして(iv)宿主動物を膜結合抗原を発現する昆虫細胞で免疫する工程。
【００３２】
免疫の後、宿主細胞の血清を、昆虫細胞以外の、目的の抗原を発現する細胞に対してスクリーニングする。あるいは、目的の抗原を含む膜画分、またはいくつかの場合において、精製された組換え産生された抗原自体を、血清をスクリーニングするために使用し得る。代表的に、(a)採血前（pre-bleed）の血清、(b)目的の抗原を発現しない昆虫細胞で免疫した宿主動物の血清、および(c)組換え昆虫細胞で免疫した宿主動物の血清がスクリーニングされる。目的の抗原に対して特異的な抗体の存在は、血清(a)および血清(b)との陰性の反応および血清および(c)との陽性の反応により示される。
【００３３】
細胞表面タンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマもまた、生成され得る。方法は上記の(i)〜(iv)工程を包含する。宿主細胞を組換え昆虫細胞で免疫した後、抗体産生細胞を動物から単離する。このような抗体産生細胞は、モノクローナル抗体の産生のためにクローン化されそして使用されるハイブリドーマ細胞を生成するために使用され得る。このようなハイブリドーマ細胞からの上清を、例えば、下記の細胞に基づくスクリーニングアッセイを使用して、特異的な抗体産生についてスクリーニングする。
【００３４】
Ａ．膜分子のコード配列の単離
選択された膜結合抗原の核酸コード配列は、抗原のタンパク質成分の既知のアミノ酸配列および／またはDNAコード配列に基づいて単離され得る。コード配列は、標準的な手順[Ausubelら;Maniatisら;Sambrookら](例えば、ハイブリダイゼーション、ディファレンシャルハイブリダイゼーション、クローニングおよびプラークスクリーニングなど)により、生物学的供給源から単離され得る。あるいは、目的の抗原をコードする合成オリゴヌクレオチド配列が、市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機を用いて調製され得、または例えば、Synthetic Genetics (San Diego, CA)から購入され得る。大きなコード配列の場合には、オリゴヌクレオチドコード配列は、コード配列に対応する複数のオリゴヌクレオチドフラグメントの直列配列を含む一連のクローニング工程によって合成され得る[Crea；Yhoshioら；Eatonら]。オリゴヌクレオチドコード配列は標準的な組換え手順[Maniatisら；Ausubelら]またはポリメラーゼ連鎖反応[Mullis；Mullisら]により増幅および単離され得る。
【００３５】
膜結合抗原の配列が既知または部分的に既知である場合、特異的抗原コード配列が単離され得る。代表的には、抗原コード配列は、ベクターへ選択された供給源に由来するDNAフラグメントを挿入することにより生成されるcDNAライブラリーから単離される。膜抗原含有供給源に由来するDNAフラグメントを含有するcDNAライブラリーは、標的のRNA分子から生成されるランダムなフラグメントのcDNA分子を使用して構築し得る。一般的に、このようなcDNAライブラリーは細菌システム(例えば、λgt10(Promegea, Madison, Wisconsin)を使用して構築されるが、従来技術を使用する酵母または真核生物の発現システムにおいても構築され得る(Ausubel)。
【００３６】
ライブラリーは、膜結合抗原DNA配列の存在について、代表的には抗原コード領域とハイブリイダズ可能な既知の配列またはコンセンサス配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして使用することによりスクリーニングされる (通常は、ハイブリダイゼーションにより；Ausubelら；Maniatisら) 。プローブは放射性同位体、ビオチンおよびジゴキシゲニンを含む多くの検出部分を有し得る。あるいは、核酸プローブ配列が利用できない場合、目的のコード領域を有するクローンについてのスクリーニングは、例えば、免疫スクリーニングにより (「PROTOCLONE」λgt11システム、Promega；Youngら；Huynhらを用いて)行い得る。
【００３７】
コード領域は、陽性シグナルを与える組換え単離体から(ハイブリダイゼーションスクリーニングまたは免疫学的スクリーニングのいずれかにより)単離される。代表的に、コード領域を含有するDNAフラグメントは、制限消化およびそれに続くサイズ分画およびフラグメント精製により単離される。次いで、このような核酸コード配列は、バキュロウイルストランスファーベクター(例えば、以下のパートＢにおいて記載されるようなpAcC8(図１Ａ）)への挿入のために処理され得る。ベクターpVL1393(Luckowら)およびpAC3T3(Summersら)を含む別のバキュロウイルスベクターが利用可能である。
【００３８】
あるいは、コード配列は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅(Mullis；Mullisら)を使用してもまた単離され得る。PCRに有用なプライマーは、任意の既知の核酸配列に由来し得る。正確な配列が既知でない場合、縮重プライマーが使用され得る(Mullis；Mullisら)。代表的には、これらのプライマーは８以上の共直線性のヌクレオチドからなる２つの核酸配列であり、ここでは、標的配列を生成するために、２つの配列がある定義された間隔により分離されており(実施例１)、反対鎖に相補的である。
【００３９】
代表的なPCRサイクルは、以下の工程を包含した：上昇した温度での溶解工程、およびそれに続くアニーリング工程、ならびに伸長工程。反応は、25〜30サイクル反復される。PCR産物は制限酵素で消化され、そして調製用1.5%アガロースゲルを使用して電気泳動的に分離され得る。クローン特異的増幅フラグメントは、代表的に、電気泳動ゲルサイズ分画により同定される。次いで、クローン特異的DNAフラグメントは、例えば、「GENE CLEAN]システム(BIO 101, La Jolla CA)を使用してゲルから回収される。必要であれば、DNAはフェノールおよび／またはフェノール：クロロホルム(１：１）で抽出され得る。単離されたDNAは、エタノール沈殿される。沈殿の後、DNAはバキュロウイルス発現ベクターへの挿入に使用される。
【００４０】
ヒトB7-1抗原を発現するSf9細胞の生成は、概略的に図１Ｂにおいて示される。示されるように、RNAは標準的な手順を用いて(Chirgwinら)、Epstein-Barrウイルス(EBV)トランスフォームヒト脾臓細胞の集団から単離される。全RNAは、確立された方法に従って、そして実施例１に記載されるように、ランダムヘキサマープライミングを使用してcDNAに変換される。目的の膜結合抗原分子をコードするDNA分子は、5'末端にクローニングのための制限部位を有する正方向プライマーおよび逆方向プライマーを用いて、PCR増幅により生成される。ヒトB7-1抗原のコード領域の調製において使用されるこのようなcDNAプライマーを、図２に描く。これらのプライマーは、抗原B7の公開された完全なDNAコード配列に基づいて構築された(Freemanら、1989)。
【００４１】
続く図1Bを参照すると、cDNAは、正方向プライマーおよび逆方向プライマーと、耐熱性ポリメラーゼ(例えば、Thermus aquaticusから得られるポリメラーゼなど)、等モルのデオキシヌクレオチド、および緩衝系の存在下で混合される(実施例１)。混合液は、サーモサイクラー中で増幅され、そして得られるPCR産物をバキュロウイルストランスファーベクターのポリリンカーにサブクローン化する。このようなべクターの１つ、pAcC8を、図式的に図１Ａにおいて表わす。ポリヘドリンプロモーターの下流に唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する任意の多くのこのようなバキュロウイルスベクター(Miller)は、本発明の実施において利用され得る：Autographica californica核酸ポリへドロシスウイルス(AcNPV)(Wuら；Matsuuraら；Takeharaら)、またはBombyx mori核ポリへドロシスウイルス(pBmNPV)ポリヘドリン mRNA(Nyunoyaら；Sekineら)。
【００４２】
バキュロウイルスにおいて発現させる前に、代表的に、DNA挿入物はPCR誘導性変異について、配列決定分析により点検される。
【００４３】
Ｂ．バキュロウイルスベクターへの抗原コード配列の挿入
バキュロウイルスベクターへの膜結合抗原コード領域の挿入は、確立された手順[Ausubelら；Maniatisら；Sambrookら]に従って実施される。ヒトB7-1およびヒトCD40をコードする完全長のcDNAを、クローニングのための制限部位を有するプライマーを使用して、PCRにより生成した。PCR増幅のための鋳型は、EBVトランスフォームヒト脾臓Ｂ細胞RNAから生成されたcDNAであった。簡単に記載すると、単離されたDNAコード領域をpAcC8プラスミドのようなバキュロウイルストランスファーベクターまたはプラスミドへ連結し、膜結合コード領域がポリへドロンプロモーターの下流になるようにする。ポリヘドリン遺伝子のATGは、機能的ATGを有するコード配列を含有しない組換えクローン中での翻訳開始を防止するために、ATTに変異された(図１Ａ)。得られるプラスドDNAを野生型バキュロウイルス(AcNPV)とともに、Spodoptera frugiperda由来の昆虫細胞(Sf9細胞)へ同時トランスフェクトし、野生型ウイルスと膜結合抗原遺伝子を有する組換えベクターとの間でのインビボにおける組換えを介して、組換えウイルス粒子を作製する。
【００４４】
実施例１〜２は、DNAの異種セグメントを含有する組換えバキュロウイルスベクター(pAcB7(完全長B7分子をコードする)、およびpCcB7-ED/Glu(B7-1分子の細胞性ドメインをコードする)の単離を記載する。
【００４５】
Ｃ．バキュロウイルスベクターでの昆虫細胞の感染
次いで、上記の組換えウイルスを使用して、昆虫細胞を同時感染した(実施例２)。次いで、これらの細胞は、異種のDNA挿入物によりコードされる抗原を発現した。
【００４６】
Sf9細胞(Spodoptera frugiperda；Summersら)を、106細胞/mlの密度で、組換えウイルスで感染した。組換えバキュロウイルスで感染されたSf9細胞を同定し、そしてクローン精製した(Summersら)。
【００４７】
細胞表面抗原を発現する細胞を48時間後に採収し、そして宿主動物の免疫に使用した。分泌された組換えタンパク質の産生のために、細胞を72時間培養した後に採収した。
【００４８】
Sf9細胞の細胞表面上での組換え分子の発現(実施例3)を、ELISAシステム(Harlowら)を用いて試験した。図３は、ヒトCD26を発現するSf9細胞とは反応せず、AcB7ウイルスで感染されたSf9細胞とのみ反応する抗(B7)モノクローナル抗体BB-1を示す。
【００４９】
Ｄ．膜結合抗原を発現する昆虫細胞の宿主動物への注射
ポリクローナル抗体の産生のための適切な宿主動物は、例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、チンパンジーおよびイヌを包含する。本発明の１つの利点は、一般的に、免疫アジュバントが必要とされないことである。
【００５０】
モノクローナル抗体の産生における使用のために適切な宿主動物は、一般に、ラット、ハムスターおよびマウスを包含する。しかし、免疫学的にヒトに近縁である抗体の生成が所望される場合、このような抗体の供給源は、チンパンジーのような高等霊長類を包含し得る。ヘテロミエローマー融合パートナーとの融合が、モノクローナル抗体の生成のために使用され得る(Carroll；Perkins,1991)。このような融合は、ポリエチレングリコールへの混合細胞の曝露および強い電場ヘの細胞の曝露(電気融合)を包含する当該分野において公知の多くの方法(Harlowら)により達成され得る。ハイブリドーマは、選択培地における増殖により選択され、次いで、下記のように抗原特異性について試験される。
【００５１】
CD40およびB7-1に対するモノクローナル抗体の生成のために、マウスを、細胞表面上でこれらの分子を発現するSf9細胞で免疫した(実施例５)。２回目の免疫の１週間後、マウスを採血し、そして血清をEBVトランスフォームＢ細胞の蛍光細胞染色を使用して特定の抗体の存在について分析した(実施例３)。図４は、B7を発現するSf9細胞で免疫したマウスが、CD40およびB7の両方に陽性であるEBVトランスフォームＢ細胞株ARC(アメリカンタイプカルチャーコレクション(A.T.C.C.)、12301 Parklawn Dr.,Rockville MD 20852)に対する血清力価を有したことを示した細胞染色の結果である。対照的に、コントロールSf9細胞で免疫したマウスは、ARC細胞との反応性を示さなかった。結果は、宿主動物が選択した膜結合抗原を発現するSf9細胞で免疫され得そして、免疫の結果、組換え抗原に対する抗体を含む免疫応答を生じることを示す。免疫は、Sf9昆虫細胞中にクローン化された組換えヒトタンパク質以外のヒトタンパク質と交差反応する抗体を生じない。
【００５２】
一匹のマウスにはCD40を発現するSf9細胞での最終追加抗原刺激注射を与え、そして一匹のマウスにはB7-1を発現するSf9細胞での最終追加抗原刺激注射を与えた。追加抗原刺激注射の３日後に脾臓を取り出し、そして脾臓細胞をSP2/0マウスミエローマ細胞と融合した。
【００５３】
Ｅ．特異的抗体を産生するリンパ球の単離および不死化
モノクローナル抗体産生のための抗体産生リンパ球は、好ましくは、免疫性宿主動物の骨髄、脾臓またはリンパ節から単離され得るようなＢリンパ球である(Harlow)。
【００５４】
あるいは、Ｂリンパ球は、末梢循環から単離され得る。この場合、血液サンプルを遠心分離し、そして勾配分離技術に供し、粗末梢血リンパ球(PBL)混合液を生成する。単球およびＴリンパ球を確立された手順（Mishell）に従って、この細胞混合物から選択的に枯渇させる。このような残存細胞を、抗原に親和性を有するこれらの細胞が抗原を含有する親和性マトリックスによる選択捕獲により濃縮される「パンニング手順」のような選択手順に供し得る。本発明の情況において、このようなマトリックスは膜結合抗原を発現する細胞を包含し得る。
【００５５】
Ｂリンパ球が上記の循環から単離される場合、トランスフォーミングウイルス(例えば、Epstein-Barrウイルス)でのトランスフォーメーションは有利であり得る。トランスフォーム細胞(リンパ芽球)を、特異的抗体産生について試験する前に、継代培養ウェル中に分配し、培養物に数週間維持する。このような特異的抗体の産生を示す培養物を拡大し、そして上述のポリエチレングリコールまたは電気融合を包含する標準的な融合プロトコルの１つ以上を使用して、種に適切なミエローマパートナー細胞と融合する。種々の供給源からのＢリンパ球の単離および不死化の方法は当該分野において公知である。
【００５６】
本発明を支持して行われた実験において、免疫されたマウスに由来する脾臓細胞は、de Boerら(1988)により記載されるようにSP2/0マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールを用いて融合された。ハイブリドーマクローンを実施例６に記載のように処理した。
【００５７】
表１(実施例６)は、融合データの要約を与える。B7融合の後、細胞を960ウェルに分配し、そしてこの融合によりハイブリドーマ増殖を有する312ウェルが生じた。融合の14日後、12ウェルの上清をプールしそしてプールをARC細胞と反応性の抗体の存在について試験した。FACS分析は、B7-1融合に由来する１つのプールがARC細胞に反応性であったことを示した。陽性なプールに由来する個々の上清を再試験して、B7に反応性の１つのウェルを同定した。この陽性ウェルからの細胞を、限界希釈によりクローン化し、そして、３ラウンドの細胞増殖の後に１つの安定な抗(B7)ハイブリドーマクローン(B7-24)を樹立した。これらの結果は、選択された膜結合性抗体に対するモノクローナル抗体を分泌する安定なハイブリドーマクローンを達成する能力を示す。
【００５８】
ハイブリドーマ融合物をスクリーニングするための多くの方法が利用可能であり(Harlowら)、以下を包含する；抗体捕獲、(i)標識抗原(例えば、放射活性標識された部分精製または精製抗原)の使用、(ii)全細胞または浸透化細胞(例えば、組換え抗原を発現するSf9細胞：および抗原捕獲、(i)溶液中の抗体／抗原、(ii)抗体／抗原固相。
【００５９】
Ｆ．モノクローナル抗体の特異性の試験
EBVトランスフォーム細胞を、一次ハイブリドーマ上清のスクリーニングおよび限界希釈クローニングの結果として生じる産物のスクリーニングに使用した。以下に表わす証拠のいくつかの株は、抗(B7-1)モクローナル抗体が生成された事実を支持する。
【００６０】
第一に、５つのハイブリドーマクローン全てに由来する上清はARC細胞および他のEBVトランスフォームＢ細胞株と反応性であったが、Ｔ細胞株HSB(A.T.C.C.)およびCEMM(A.T.C.C.)とは反応性ではなかった。
【００６１】
第二に、競合結合実験を、本発明のモノクローナル抗体および標的抗原の可溶性形態を使用して実施した(実施例７)。ハイブリドーマの上清を可溶性形態のB7-1とプレインキュベートした(実施例７)。次いで、混合物を蛍光細胞染色のためにARC細胞に添加した。競合実験の結果を図６に示す。データは、可溶性B7-1が、ARC細胞への抗(B7-1)モノクローナル抗体B7-24の結合をブロックすることを示す。さらに、抗（B7-1)モノクローナル抗体への可溶性B7-1の効果は、濃度依存性であった。可溶性タンパク質の量の減少の結果、ARC細胞に対する抗体の結合のブロックが減少した。
【００６２】
さらなる分析のために、抗(B7-1)モノクローナル抗体を扁桃Ｂ細胞に対する結合能力について試験した(実施例８)。表２は、12〜17%の新鮮に単離された扁桃Ｂ細胞が、抗(B7-1)モノクローナル抗体B7-24で陽性に染色されたことを示す。しかし、扁桃Ｂ細胞を固定化抗(IgM)抗体およびIL-2の存在下で５日間培養した場合、B7-24に陽性な細胞の百分率は約25%に増加した。
【００６３】
さらに、扁桃Ｂ細胞を抗(IgM)抗体およびIL-2で刺激した場合、B7-24に陽性なＢ細胞の数が増加したのみならず、細胞当たりの蛍光染色の量が顕著に増加した。このことはB7-1の発現が刺激の後に増加されたことを示す。
【００６４】
本発明の方法により得られるモノクローナル抗体は、以前に記載された(Harlowら)ようにタイピングされ得る。
【００６５】
モノクローナル抗体の生成のために、マウスを精製物質と免疫することが最適である。しかし、膜抗原の精製は専門化された複雑な技術を必要とし、そしてさらに、膜からの抽出は分子の構造を変化させ得る。さらに、タンパク質の可溶化は、しばしばそれらの免疫原性を減少する。それゆえ、細胞表面抗原に対する大部分のモノクローナル抗体は、全細胞または膜画分を用いてマウスを免疫した後に得られる。多くの場合、特定のリンパ球サブセットを、マウスに注射し、モノクローナル抗体のパネルを生じる。これらの抗体は、それらが結合する抗原を単離および特徴づけするために使用されている。マウスを全細胞で免疫する場合、多くの異なる分子に対する抗体が生成される。それゆえ、ハイブリドーマクローンによる特異的抗体産生のスクリーニングのために同じ細胞を使用することは困難である。
【００６６】
上記の問題を回避するために、上記の方法は昆虫細胞における膜結合抗原の発現および宿主動物を免疫するためのこれらの昆虫細胞の使用を包含する。PCR技術(Saikiら、1985；Saikiら、1988；Mullis；Mullisら)の導入以来、それをコードする核酸コード配列が公開されているタンパク質のcDNAを比較的簡単にクローン化できるようになった。完全なコード領域のみにわたるPCRプライマーを使用し得、そして発現ベクターへのクローニングを容易にするためにこれらのプライマー中に制限部位を導入し得る。
【００６７】
本発明の方法により得られる抗体は、膜結合抗原に対しており、膜結合抗原の検出のための診断剤としての使用に有利である。例えば、抗体は細胞表面マーカータンパク質または細胞表面から突き出るウイルスタンパク質に対する。
【００６８】
抗体を使用する組成物
本発明は、上記の方法により作製されるような抗体の使用を意図する。本発明の抗体は、B7抗原に結合する。しかし、これらの抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、およびそのフラグメントであり得る。抗B7-1抗体は、免疫抑制剤もまた含有する組成物において使用され得る。
【００６９】
Ａ．抗体調製
モノクローナル抗体B7-24は、本明細書の発明の詳細な説明の第II節および実施例のようにして調製される。
【００７０】
１．ポリクローナル血清
ポリクローナル血清は従来の方法により調製され得る。一般に、B7抗原を含有する溶液を、まず第一に使用して、適切な動物(好ましくはマウス、ラット、ウサギ、またはヤギ)を免疫する。ウサギおよびヤギは、得られ得る血清の容量のためにポリクローナル血清の調製に好ましく、そして標識抗ウサギ抗体および標識抗ヤギ抗体が入手可能である。一般的に免疫は、生理食塩水、好ましくはFreund’s完全アジュバントのようなアジュバント中で混合または乳化し、そして混合物または乳化物を非経口的(一般的には皮下または筋肉内に)に注射することにより実施される。代表的に、注射当り50〜200μgの用量が十分である。免疫は、生理食塩水中、好ましくはFreund’s不完全アジュバントを使用して、タンパク質の１回以上の注射で、２週間から６週間後に追加抗原刺激される。あるいは、当該分野で公知の方法を使用するインビトロにおける免疫によっても抗体を生成し得、これは本発明の目的のために、インビボにおける免疫に等価であると考えられる。
【００７１】
ポリクローナル抗血清は、免疫された動物をガラス容器またはプラスチック容器に採血し、血液を25℃で１時間インキュベートした後、４℃で２〜18時間インキュベートすることにより得られる。血清を遠心分離(例えば、1,000×gで10分間)により回収する。採血当り約20〜50mlが、ウサギから得られ得る。
【００７２】
２．モノクローナル抗体
KohlerおよびMilsteinの方法(Nature, 256, 495-96 (1975))またはその改変方法を使用してモノクローナル抗体が調製される。代表的に、マウスまたはラットを、上記のように免疫する。しかし、血清を抽出するために動物を採血するのではなく、脾臓(および随意にいくつかの大きなリンパ節)が取り出され、そして単一細胞に分離される。所望の場合、脾臓細胞は(非特異的壁着細胞を除去した後に)細胞懸濁物をタンパク質抗原でコートされたプレートまたはウェルにのせることにより、スクリーニングし得る。抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞はプレートに結合し、そして残りの懸濁物と共にはリンスされない。次いで、得られたＢ細胞または全ての分離脾臓細胞を、ミエローマ細胞と融合するために誘導してハイブリドーマを形成し、そして選択培地(例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「HAT」)中で培養する。得られたハイブリドーマを限界希釈によりプレートし、そして所望の免疫細胞性表面抗原に特異的に結合する(そして非関連抗原には結合しない)抗体の産生についてアッセイする。次いで、選択されたmAbを分泌するハイブリドーマを、インビトロ(例えば、組織培養ボトルまたは中空繊維リアクター)、またはインビボ(例えば、マウス中の腹水）のいずれかにおいて培養する。
【００７３】
所望な場合、抗体(ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれか)は、従来の技術を用いて標識され得る。適切な標識は蛍光団、発色団、放射性原子(特に32Pおよび125I)、高電子密度試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンドを包含する。代表的に、酵素はそれらの活性により検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、通常、3,3,5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)を青色色素に変換するその能力により検出され、分光光度計により定量可能である。「特異的結合パートナー」は、(例えば、抗原およびそれに特異的なモノクローナル抗体の場合のように)高い特異性でリガンド分子を結合し得るタンパク質をいう。他の特異的結合パートナーは、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、IgGおよびプロテインＡ、および当該分野において公知の多くのレセプター-リガンドの組を含有する。同じ標識がいくつかの異なる様式で作用し得るので、上記の記載が種々の標識を異なるクラスに類別することを意味しないことが理解されるべきである。例えば、125Iは、放射性標識または高電子密度試薬として作用し得る。HRPは、酵素またはmAbに対する抗原として作用し得る。さらに所望の効果のために種々の標識を組合わせ得る。例えば、mAbおよびアビジンはまた、本発明の実施において標識を必要とする：従って、mAbをビオチンで標識し、そして125Iで標識されたアビジンまたはHRPで標識した抗ビオチンmAbを用いてその存在を検出し得る。他の置換および可能性は、容易に当業者に明白であり、そして本発明の範囲内の等価物であると考慮される。
【００７４】
IV．免疫抑制剤を含有する組成物
本発明の組成物は、移植片拒絶、GVHD、または慢性関節リュウマチの防止または処置において、ともに治療的に有効である２つの成分を含有する。２つの成分は：(1)MAb B7-24のようなB7-1抗原に結合する分子；および(2)免疫抑制剤である。B7-1抗原に結合する分子は、CD28、CTLA4、CTLA4Igおよび上記第III節において記載されるような抗B7抗体を含有する。
【００７５】
本発明の抗B7-1抗体(またはB7-1抗原に結合する他の分子)は、１つ以上の免疫抑制剤と組合わせて与えられる。免疫抑制剤は、Ｔ細胞の活性化または増殖をブロックまたは阻害する薬剤である。本発明による免疫抑制剤は、シクロスポリンＡ(CsA)、コルチコステロイド(メトトレキセート、プレドニゾロン、デキサメタゾン)、FK506、およびラパマイシンを包含する。好ましくは、免疫抑制剤は、シクロスポリンＡ、FK506またはコルチコステロイドであり、最も好ましくはシクロスポリンＡである。
【００７６】
VI．処方および投与の方法
本発明の抗体および組成物は、移植物拒絶を停止するため、または(１)GVHDまたは慢性関節リュウマチ、または(２)アレルギー、SLE、PBCおよびITPのような抗体仲介性疾患を防止または処置するために、治療的に有効な濃度で投与される。この目的を達成するために、抗体または組成物は、当該分野で公知の種々の受容可能な賦形剤を使用して処方され得る。代表的に、抗体または組成物は注射により、静脈内にまたは腹腔内に投与される。この投与を達成するための方法は、当業者に公知である。局所的にまたは経口で投与され得る組成物、または粘膜を通って伝達され得る組成物を得ることもまた可能であり得る。
【００７７】
患者への投与の前に、処方物が抗体に添加され得る。液体処方が好ましい。例えば、これらの処方物は、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝液、アルブミン、界面活性剤、または増量剤を包含し得る。好ましい炭水化物は、単糖類、二糖類、または多糖類、あるいは水溶性グルカンのような糖または糖アルコールを包含する。糖またはグルカンは、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、αおよびβシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプンおよびカルボキシメチルセルロース、またはその混合物を包含し得る。スクロースが最も好ましい。「糖アルコール」は、OH基を有するC4〜C8の炭化水素として定義され、そしてガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、およびアラビトールを包含する。マンニトールが最も好ましい。上記のこれらの糖または糖アルコールは、個々にまたは組合わせて使用され得る。糖または糖アルコールが水性調製物において可溶性である限り、使用される量に固定した制限はない。好ましくは、糖または糖アルコールの濃度は、1.0w/v%と7.0w/v%との間であり、より好ましくは2.0w/v%と6.0w/v%との間である。好ましくは、アミノ酸はカルニチン、アルギニン、およびベタインの左偏性(L)形態を包含する；しかし他のアミノ酸も添加され得る。好ましいポリマーは、2,000と3,000との間の平均分子量を有するポリビニルピロリドン(PVP)、または3,000と5,000との間の平均分子量を有するポリエチレングリコール(PEG)を包含する。凍結乾燥の前または再構成の後の溶液中のpH変化を最少にするために、組成物中に緩衝液を使用することもまた好ましい。大部分の任意の生理学的緩衝液が使用され得るが、クエン酸、リン酸、コハク酸、およびグルタミン酸緩衝液またはその混合物が好ましい。最も好ましいのはクエン酸緩衝液である。好ましくは、濃度は、0.01〜0.3モル濃度の間である。処方に添加され得る界面活性剤は、欧州特許第270,799号、および同第268,110号に示される。
【００７８】
さらに抗体は、例えば、それらの循環半減期を増加するために、ポリマーへの共有結合により化学的に改変され得る。好ましいポリマー、およびそれらをペプチドに接着させる方法は、米国特許第4,766,106号；同第4,179,337号；同第4,495,285号；および同第4,609,546号において示され、これらは全てそのまま本明細書中で参考として援用される。好ましいポリマーは、ポリオキシエチル化されたポリオールおよびポリエチレングリコール(PEG)である。PEGは、室温で水溶性であり、そして一般式：R(O-CH2-CH2)nO-Rを有する。ここでRは水素、またはアルキル基またはアルカノール基のような保護基であり得る。好ましくは、保護基は１個と８個との間の炭素を有し、より好ましくは、メチルである。記号ｎは、正の整数であり、好ましくは１と1,000との間であり、より好ましくは２と500との間である。PEGは、1000と40,000との間の好ましい平均分子量を有し、より好ましくは2000と20,000との間の好ましい平均分子量を有し、最も好ましくは3,000と12,000との間の好ましい平均分子量を有する。好ましくは、PEGは少なくとも１つの水酸基を有し、より好ましくはこれは末端水酸基である。優先的に活性化されインヒビター上の遊離アミノ基と反応するのはこの水酸基である。しかし、反応基の型および量は、本発明の共有的に結合されるPEG/抗体を達成するために変化し得ることが理解される。
【００７９】
水溶性ポリオキシエチル化ポリオールもまた、本発明において有用である。それらはポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール(POG)などを包含する。POGが好ましい。１つの理由は、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格が、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド中の（例えば、動物およびヒトにおいて）天然に生じる骨格と同じであるからである。それゆえ、この分枝は体内において必ずしも異物剤として見られない。POGは、PEGと同じ範囲の好ましい分子量を有する。POGの構造は、Knaufら、J.Bio.Chem., 263, 15064-15070 (1988)に示され、そしてPOG/IL-2結合体の考察は、米国特許第4,766,106号において見出され、これらの両方はそのまま本明細書において参考として援用される。
【００８０】
循環半減期を増加するための別のドラッグデリバリーシステムは、リポソームである。リポソームデリバリーシステムを調製する方法は、Gabizonら、Cancer Research, 42, 4734 (1982)；Cafiso, Biochem.Biophys.Acta, 649, 129 (1981)；およびSzoka, Ann.Rev.Biophys.Eng., 9, 467 (1980)において考察されている。他のドラッグデリバリーシステムは当該分野において公知であり、そして例えば、Poznanskyら、DRUG DELIVERY SYSTEMS (R.L.Juliano編Oxford, N.Y. 1980), pp.253-315；M.L.Poznansky, Pharm.Revs., 36, 277 (1984)において考察されている。
【００８１】
液体の薬学的組成物が調製された後、これは好ましくは分解を防止しそして無菌性を保つために凍結乾燥される。液体組成物を凍結乾燥する方法は当業者に公知である。使用する直前に、組成物は追加の成分を含み得る滅菌希釈物(例えば、リンガー溶液、滅菌水、または滅菌生理食塩水)を用いて再構成される。再構成したら、組成物は好ましくは、当業者に公知の方法を使用して被験体に投与される。
【００８２】
本発明の抗B7抗体は、好ましくは、移植物拒絶、GVHDまたは慢性関節リュウマチを防止または処置するために使用される。これらの抗体の投与の好ましい経路は、非経口である。非経口投与において、本発明の組成物は薬学的に受容可能な非経口賦形剤とともに溶液、懸濁液または乳化液のような単位投与注射可能形態に処方される。このような賦形剤は本来非毒性および非治療的である。このような賦形剤の例は、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。固定化オイルおよびエチルオレイン酸のような非水性賦形剤もまた使用され得る。好ましい賦形剤は、生理食塩水中の５%のデキストロースである。賦形剤は、等張性および化学的安定性を増強する物質のような少量の添加物を含有し得、これは緩衝液および防腐剤を包含する。
【００８３】
投薬および投与の様式は、個体に依存する。一般的に、組成物は抗体が１μg/kgと20mg/kgとの間の用量で、より好ましくは20μg/kgと10mg/kgとの間の用量で、最も好ましくは１mg/kgと７mg/kgとの間の用量で与えられるように投与される。好ましくは、組成物はボーラス用量として与えられ、ボーラス用量の後４時間〜６時間に、循環レベルを10〜20倍増加する。ボーラス用量の後に、継続的な注入もまた使用され得る。そうであれば、抗体は５μg/kg/分と20μg/kg/分との間の用量で、より好ましくは７μg/kg/分と15μg/kg/分との間の用量で、注入され得る。
【００８４】
以下の実施例は本発明を説明するが、いかなる方法においても本発明を限定することを意図しない。
【００８５】
材料および方法
Iscove’s改変Dulbecco’sEagle培地(IMDM)およびウシ胎児血清をJR Biosciences(Lenexa, KS)から得た；ペニシリンおよびストレプトマイシンはIrvine(Santa Ana, CA)から得た；そしてポリエチレングリコール(分子量1500)をBoehringer Mannheim(Indianapolis, IN)から得た。
【００８６】
培養培地  SP2/0マウスミエローマ細胞、ハイブリドーマ細胞、精製Ｔ細胞、EBVトランスフォームＢ細胞、および細胞株は、ストレプトマイシン(200μg/ml)、ペニシリン(200U/ml)および10%の熱不活性化ウシ胎児血清を補充したIMDM(完全IMDM)中で培養した。Sf9昆虫細胞を、0.5%ウシ胎児血清を補充したMaiorellaら(1989)に記載の培地中、撹拌(125〜150rpm)して振とうフラスコ中で培養した。3T6-FcγRII細胞を、アミノプテリン(0.2μg/ml)、チミジン(５μg/ml)、キサンチン(10μg/ml)、ヒポキサンチン(15μg/ml)、ミコフェノール酸(20μg/ml)、デオキシシチジン(2.3μg/ml)、および10%の熱不活性化ウシ胎児血清を補充した50%のDulbecco’s改変Eagle’s培地および50%のHAM-F10培地からなる培地(完全DME/HAM-F10)中で培養した。3T6-FcγRII/B7細胞を、400μg/ml G418 (Gibco)を含有する完全DME/HAM-F10培地中で培養した。
【００８７】
細胞および細胞株  末梢血単核細胞を、Ficoll-Hypaque密度遠心分離により、ヘパリン処理した血液(健康なボランティアから得た）から単離した。Ｔ細胞を、Lymphokwik(Lambda, California)(１λ）を用いて単球およびＢ細胞を枯渇させることにより濃縮した。EBVトランスフォームＢ細胞株ARCおよびP815細胞株（FcγRIIおよびFcγRIIIを発現するNK耐性マウス肥満細胞腫細胞株[Raら、Nature, 341, 752 (1989)]）を、ATCC(Rockville, Maryland)から得た。3T6-FcγRII（ヒトFcγRIIの高応答性対立遺伝子であるCD32を発現するマウス繊維芽細胞株、Warmerdam, P.A.M.ら、J.Exp.Med., 172, 19 (1990)に記載される）をDr.J.van de Winkel(University Hospital, Utrecht, The Netherlands)の好意により得た。変異マウス胸腺腫EL-4サブクローンEL4B5は、Dr.R.H.Zubler、Hopital Cantonal Universitaire, Genevaから贈与された。ヒトFcγRIIaのHR(高応答性)対立遺伝子形態のハイブリッド分子を発現するマウス3T6トランスフェクタント細胞は、Dr.P.A.M.Warmerdam, Department of Experimental Immunology, University Hospital Utrecht, Utrecht, The Netherlandsから贈与された。Warmerdamら、J.Immunol., 147, 1338 (1991)。細胞株は両方ともゲンタマイシン(80μg/ml)および10%の熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)(Hyclone, Logan, Utah)を補充したIscove’s改変Dulbecco’s培地(IMDM)中で培養した。Ｂ細胞活性化能力の考えられ得る消失を避けるために、４週間〜８週間ごとにEL4B5細胞の新しいバッチを解凍した。細胞株を定期的に、マイコプラズマのリボソームRNAについての3H標識DNAプローブ(GenProbe, San Diego, CA)の使用により、マイコプラズマ混入について試験し、実験課程の間、マイコプラズマはなかった。
【００８８】
ヒトＢリンパ球  Ｂリンパ球を扁桃炎を患う小児より得られた扁桃から、本質的にDe Grootら、Lymphokine Reserch, 9, 321 (1990)に記載されるようにして単離した。簡単に述べると、組織を外科用ナイフを用いて分散し、食細胞およびNK細胞を５mML-ロイシンメチルエステルで処理することにより枯渇させ、そしてＴ細胞を、2-アミノエチルイソチオウロニウムブロミドで処理したヒツジ赤血球(SRBC)を用いる１サイクルのロゼット化（rosetting）により除去した。得られたＢリンパ球調製物の純度を、抗(CD20)mAb B1(Coulter Clone, Hialeah, FA)または抗(CD3)mAb OKT3(Ortho, Raritan,NJ)およびFITC結合したウサギ抗(マウスIg)のF(ab‘)2フラグメント(Zymed, San Francisco, CA) を用いる間接的な免疫蛍光標識およびFACS分析により点検した。Ｂ細胞調製物は95±４%CD20陽性細胞および２±１%CD3陽性細胞を含有していた(６つの単離物の平均値±SD)。
【００８９】
抗体  抗(ヒトB7)モノクローナル抗体BB-1(Yokochiら、1982)をDr.E.A.Clark(Uniresity of Washington, Seattle, WA)から得、そして精製抗体として使用した。抗(ヒトCD26)モノクローナル抗体Ta-1および抗(CD20)モノクローナル抗体B1をCoulter(Hialeah, FL)から得た。抗(CD3)モノクローナル抗体OKT3をOrtho(Raritan, NJ)から得、そして抗(LeuM3)モノクローナル抗体をBecton-Dickinson(San Jose, CA)から得た。ビーズ(Immunobeads)に結合した抗(IgM)抗体をBio-Rad(Richmond, CA)から得た。
【００９０】
抗B7Mab B7-24(IgG2a, χ)を上記第II節に記載のようにして得、そして精製抗体として使用した。抗CD3 Mab CLB-T3/4.1(IgG1, κ)を希釈した組織培養物上清として使用し、そしてDr.L.Aarden(Central Laboratory of the Red Cross Blood Transfusion Service, Amsterdam, The Netherlands)の好意により得た。抗CD3 Mab UCHT1 (IgG, κ)を精製抗体として使用し、そしてDr.P.Beverley(Imperial Research Cancer Fund, London, UK)から贈与された。抗CD72 Mab WL225 (IgG2a, κ)を精製抗体として使用し、Dr.K.Thielemans(Vrije Universiteit Brussel, Beligum)から贈与された。抗ICAM-1 Mab 84H10を希釈腹水液として使用した。コントロール抗体は：抗(β-グルコセレブロシダーゼ)mAb 8E4(IgG1)(Barneveldら、Eur.J.Biochem.,134,585 (1983))、およびミエローマ免疫グロブリンMOPC-21 (IgG1)およびMOPC-141 (IgG2b)(Sigma, St.Louis, MO)であった。全てのmAbは精製抗体調製物として使用した。
【００９１】
本発明のモノクローナル抗体は、多くのレポーター部分を使用して標準的な方法により標識し得、レポーター部分は以下を含有する：蛍光標識物(フルオレセイン(FITC)、R-フィコエリトリン、ローダミン(TMRITC)、ローダミン600(XRITC)、「TEXAS RED」など、一般にアビジン結合される；放射性部分(125Iなど)；光放射物(light-emitting)(ルシフェラーゼなど)；酵素(西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼなど)。さらに、レポーター抗体(本発明のモノクローナル抗体に結合特異性を有する抗体、例えば、ヤギ抗マウスIgG)もまた上に列挙する標識部分を使用し得る。
【００９２】
酵素およびオリゴヌクレオチド。  E.coli DNAポリメラーゼI(Klenowフラグメント)をBoehringer Mannheim Biochemicals (BMB)(Indianapolis, IN)から得た。T4DNAリガーゼおよびT4DNAポリメラーゼをNew England Biolabs (Beverly, MA)から得た；ニトロセルローズフィルターをSchleicher and Schuell(Keene, NH)から得る。合成オリゴヌクレオチドリンカーおよびプライマーを、市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機を使用して調製した。あるいは、注文設計の合成オリゴヌクレオチドを、例えばSynthetic Genetics (San Diego, CA)から購入し得る。cDNA合成キットおよびランダムプライミング標識キットを、Boehringer-Mannheim Biochemical(BMB, Indianapolis, Indiana)から得る。ペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列は、上記のようにも合成され得る、あるいは、ペプチドを標準的なインビトロ技術により、直接合成し得る(Applied Biosystems, Foster City CA)。
【００９３】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の研究に関与する一般の操作（抗体精製を含む）は、標準的な手順により実施される(Harlowら)。
【００９４】
蛍光細胞染色(FACS) アッセイ  細胞(106/サンプル)を、10μlの一次抗体(PBS-BSAまたは１% BSAおよび0.05% アジ化ナトリウムを補充したHBSS(Hanks' Balanced Salt Solution, Gibco/BRL)中10μl/ml)を４℃で20分間インキュベートした。PBS-BSAまたはHBSS-BSAで３回洗浄した後、細胞を100μLのFITC標識したヤギ抗（マウスIgG）抗体のFab'2フラグメント（Jackson, West Grove, PA）中で４℃で20分間インキュベートした。PBS-BSAまたはHBSS-BSAで３回洗浄し、そしてPBSで１回洗浄した後、細胞を0.5mlのPBS中に再懸濁した。分析をFACSSCAN V(Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いて実施した。
【００９５】
B7仲介Ｔ細胞増殖アッセイ  精製Ｔ細胞を、FcγRIIa高応答性対立遺伝子およびB7-1分子でトランスフェクトした3T6[de Boerら、Eur.J.Immunol., 22, 3071-3075 (1992)]繊維芽細胞とともに培養した。増殖を3Hチミジン取り込みにより測定した。簡単に述べると、４×104個のＴ細胞を、96ウェルの平底組織培養プレート中で、１ウェル当たり200μlの完全IMDM(抗CD3 Mab CLB-T3/4.1を含むかまたは含まない)中で、104個の照射(2500ラド)3T6-FcγRII/B7-1細胞とともに培養した。72時間の培養期間の最後の16時間の間、細胞を１ウェル当たり１μCiの3Hチミジンでパルスした。Ｔ細胞の増殖を、３つのウェルの平均cpmとして表す。
【００９６】
細胞障害性Ｔ細胞アッセイ   精製Ｔ細胞を、FcγRIIa高応答性対立遺伝子およびB7-1分子でトランスフェクトした3T6繊維芽細胞とともに培養した。簡単に述べると、106個のＴ細胞を、24ウェルの平底組織培養プレート中で、１ウェル当たり１mlの完全IMDM中で、抗CD3 Mab UCHT1の存在下で、３日間〜４日間、0.2×106個の照射(2500ラド)3T6-FcγRII/B7-1細胞とともに培養した。リンパ球の細胞傷害活性を、下記の抗CD3再方向付け(redirected)細胞障害性アッセイにおいて分析した。
【００９７】
混合リンパ球培養物(MLC)アッセイ  精製Ｔ細胞の増殖を、EBVトランスフォームＢ細胞株ARCを刺激細胞(stimulator cell)として使用して、混合リンパ球培養(MLC)において測定した。５×104個のＴ細胞を、96ウェルの丸底組織培養プレート(Corning)中で、１ウェル当たり200μlの完全IMDM培地中で、５×104個の照射(5000ラド)刺激細胞とともに培養した。72時間の培養期間の最後の16時間の間、細胞を１ウェル当たり１μCiの3Hチミジンでパルスした。Ｔ細胞の増殖を、３つのウェルの平均cpmとして表す。二次MLCのために、細胞を一次MLCについて上述したように刺激した。二次MLCのためのＴ芽細胞を、５日目〜７日目のMLCにおいて、その後刺激細胞の非存在下で２〜４日間培養して、生成した。一次MLCまたは二次MLCにおいて生成されたＴ細胞の細胞障害活性を、抗CD3再方向付け細胞障害アッセイにおいて、マウスP815細胞を使用して下記のように分析した。あるいは、CTL活性を誘導するために使用したEBVトランスフォームＢ細胞を、標的細胞として使用した。
【００９８】
細胞障害アッセイ  CTL活性を、標的としてP815マウス肥満細胞腫細胞、またはARC EBVトランスフォームＢ細胞を使用して４時間の標的細胞溶解アッセイにおいて測定した。P815標的細胞の場合、CTLを、抗CD3 Mab OKT3を２μg/mlで使用して、標的細胞に非特異的に架橋した。ARC細胞を標的細胞として使用した場合、アロ抗原特異的CTLのみが、障害プロセスに関係した。106の標的細胞を200μCiの51Crクロム酸ナトリウム(Amersham International)とともに１時間インキュベートし、その後洗浄した。CTLアッセイを、96ウェルV底マイクロタイタープレート中で、ウエル当たり200μlの総容量中で、5000個の51Cr標識標的細胞を異なる量のエフェクター細胞とともに使用して実施した。４つのウェルを200μlの培地のみの中の５×103個の標的細胞で満たし、そして４つのウェルを100μlの培地および100μlのサポニン中の５×103個の標的細胞で満たした(それぞれ、自然放出の評価および最大放出の評価のために)。P815細胞の場合、３つのウェルを、抗CD3 Mabの非存在下で、エファクター細胞および標的細胞で満たした(バックグランドの実験溶解のを測定するために)。３つの他のウェルはまた、抗CD3の存在下での全溶解を測定するために、抗CD3 Mabを２μg/mlで含有した。プレートを10分間、200×gで遠心分離し、そして４時間37℃でインキュベートした。その後、100μlの各ウェルの上清をγカウンターでカウントした。結果を、P815標的細胞での抗CD3依存性特異的放出の百分率として、またはARC標的細胞でのアロ抗原特異的放出の百分率として表す。
【００９９】
フローサイトメロリーアッセイ  ARC細胞(10６細胞／サンプル)を、100μlの一次抗体(PBS-BSAまたは１%BSAおよび0.05%アジ化ナトリウムを補充したHank's平衡化塩溶液(HBSS)中の10μg/ml)中で20分間４℃でインキュベートした。PBS-BSAまたはHBSS-BSAで３回洗浄した後、細胞を、100μlのFITC標識ヤギ抗(マウスIgG)抗体のF(ab')2フラグメント(Jackson, West Grove, PA)中、20分間４℃でインキュベートした。PBS-BSAまたはHBSS-BSAで３回洗浄し、そしてPBSで１回洗浄した後、細胞を0.5mlのPBS中に再懸濁した。分析をFACSCAN V(Becton Dickinson, San Jose, California)を用いて実施した。
【実施例】
【０１００】
実施例１
B7のPCRクローニング
RNAをEBVトランスフォームヒト脾臓細胞の集団から、本質的にはChirgwinら(1979)により記載されるように単離した。簡単に述べると、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で２回洗浄し、そして0.7M 2-メルカプトエタノールの存在下で５Mのチオシアン酸グアニジニウム中で溶解した。細胞溶解物を不連続なCsCl勾配上に重層し(Chirgwinら)、そしてBeckman SW28ローターで、16時間26,000rpmで遠心分離した。RNAをDEPC処理水中に沈殿を溶解して回収した。このRNAを、１回、エタノール沈澱し、DEPC処理水に再懸濁して、そして-70℃で保存した。
【０１０１】
全RNA(１反応当たり10μg)を、500ユニットのLMV-RT(Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD)、５μMのランダムヘキサマー(Pharmacia, Piscataway, NJ)、１mM DTT、dNTP混合物(各0.5mM)、10mM Tris-HCL pH8.3、50mM KCl、2.5mM MgCl2および0.1mg/ml BSA(ウシ血清アルブミン)を含有する50μlの反応液中、ランダムヘキサマープライミングを使用して、cDNAに転換した。37℃で１時間インキュベーションした後、サンプルを３分間煮沸し、そして-70℃で保存した。B7-1分子をコードするDNAを、B7配列に相同性を有する配列を含有するプライマーを使用して、PCRにより生成した。ここでこのプライマーは、クローニングに有用な制限部位もコードした(図２)。これらのプライマーはB7-1の公表されたcDNAコード配列(Freemanら、1989)に基づいた。全てのプライマーは、5'末端のC-Gクランプで開始し、その次にクローニングのための制限部位を含んだ(図２に太字で示す)。逆方向プライマーの下線を付した配列は、可溶性形態のB7ー1のクローニングのためのものであり、アフィニティ精製に使用されるモノクローナル抗体により認識されるエピトープを表す。括弧内の数字は公開されたB7-1のcDNAに関するプライマーの位置を表している。
【０１０２】
PCR増幅のために、１μlのcDNAを、１μl(10ピコモル)の正方向プライマー、１μl(10ピコモル)の逆方向プライマー、および47μlのPCR混合物と混合した。PCR混合物は、1.25ユニットのTaqポリメラーゼ(Perkin-Elmer/Cetus, NorwalK, CT)、dNTP混合物(各0.2mM)、10mM Tris-HCl pH8.3、50mM KCl、2.5mM MgCl2および0.1mg/ml BSAからなった。PCR混合物の50μlを70μlの鉱油で覆い、そしてPerkin-Elmer/Cetusサーモサイクラー中で25サイクルの増幅にかけた(変性:95℃で30秒間、プライマーのアニーリング：55℃で30秒間および伸長:72℃で1.5分間)。PCR産物を25増幅サイクルの後に得た。
【０１０３】
増幅産物をBglIIおよびKpnI(図1B)で消化し、そしてサイズ分画により単離した。バキュロウイルスでの発現の前に、各フラグメントのDNA配列を配列決定分析により確認して、PCRで誘導される変異の導入を防止した。バキュロウイルストランスファーベクターpAcC8もまた、BglIIおよびKpnIで消化した(図1B)。
【０１０４】
増幅したフラグメントを、直鎖状ベクターpAcC8に連結した(挿入物とベクターとの比率は３：１)。連結産物を細菌株DH5α(Gibco/BRL, Gaithersburg MD)へ形質転換し、そして組換えpAcC8ベクターを、アンピシリン耐性に基づいて選択した。組換えプラスミドを細菌クローンから単離し(Maniatisら；Ausubelら) 、そして目的の挿入物の存在を、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して証明した(上を参照のこと)。大規模なプラスミド調製を、標準的な手順(Ausubelら；Maniatisら；Sambrookら)により実施した。
【０１０５】
実施例２
ヒトB7のバキュロウイルス発現
ヒトB7をコードする配列を、トランスファーベクターpAcB7(完全長のB7-1分子をコードする)およびpCcB7-ED/Glu(B7分子の細胞ドメインをコードする)を使用して、Autographa californoica baculovirus(AcNPV)へ組換えた。
【０１０６】
プラスミドを野生型バキュロウイルスDNA(２〜10pfu)(AcNPV；Summersら)とともに、SF9(Spodoptera frugiperda)細胞へ、106細胞/mlの密度で同時トランスフェクトした(Summersら)。組換えバキュロウイルスで感染されたSf9細胞を同定し、クローン精製した(Summersら)。
【０１０７】
組換えタンパク質の細胞表面発現のために、細胞を培養48時間後に回収した；分泌組換えタンパク質産生のために、細胞を培養の72時間後に回収した。
【０１０８】
実施例３
Sf9細胞ELISA
組換えウイルスで感染されたSf9昆虫細胞を、24ウエルプレートにおいて48時間培養した。組織培養培地を除去した後、プレートを１%BSAを有するPBS（PBS-BSA）中で0.25mlの抗体とともに、45分間室温(RT)でインキュベートした。PBS-BSAで三回洗浄した後、プレートを、250μlのPBS-BSA中の1/250希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されたヤギ抗(マウス全Ig)免疫グロブリン(Zymed, South San Francisco, CA)とともに、35分間室温でインキュベートした。非結合のペルオキシダーゼ活性を、PBS-BSAでの５回の洗浄により除去した。結合したペルオキシダーゼ活性は、エタノール中の２mg/mlの3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンの0.5mlを、10mM 酢酸ナトリウム、10mM EDTA緩衝液(pH5.0)を用いて10mlに希釈し、そして0.03%(v/v)のH2O2を添加することにより調製したアッセイ混合物の添加によって、示された。反応は100μlの１M H2SO4を添加することにより10分後に停止した。
【０１０９】
上記のELISAアッセイを生存Sf9細胞において実施し、以下の結果を得た。図３は、pAcB7およびpAcCD26で感染され、24ウェルプレートにおいて48時間培養されたSf9細胞についてのデータを表す。ELISAにおいて使用した抗体は：BB-1 抗
-(B7)(白棒)、Ta-1、抗(CD26)(斜線棒)および一次抗体なし(黒棒)。
【０１１０】
実施例４
蛍光細胞染色
Ａ．蛍光細胞染色
細胞(106/サンプル)を、10μlの一次抗体(PBS-BSAまたは１% BSAおよび0.05% アジ化ナトリウムを補充したHBSS(Hanks' Balanced Salt Solution, Gibco/RBL)中の10μl/ml)を20分間、４℃でインキュベートした。PBS-BSAまたはHBSS-BSAで３回洗浄した後、細胞を100μlのFITC標識ヤギ抗(マウスIgG)抗体のFab'2フラグメント(Jackson, West Grove, PA)中で、20分間、４℃でインキュベートした。 PBS-BSAまたはHBSS-BSAで３回洗浄し、そしてPBSで１回洗浄した後、細胞を0.5mlのPBS中に再懸濁した。分析をFACSSCAN V(Becton Dickinson, San Jose, California)を用いて実施した。
【０１１１】
フローサイトメトリー分析についての一般的プロトコル、およびフローサイトメトリーについての臨床データ分析は、KerenらおよびCoonらに詳述されている。一般的な血液細胞カウント技術およびDNA定量は、Powers, KerenらおよびCoonらにより記載されている。
【０１１２】
ARC EBVトランスフォームＢ細胞の蛍光細胞染色についてのデータを、図４に表す。図４において；B7を発現するSf9細胞で免疫したマウスに由来する血清の1:100希釈での染色についての結果(実線)、または正常マウス血清の1:100希釈での染色についての結果(点線)を示す。
【０１１３】
Ｂ．可溶性抗原の競争アッセイ
ARC EBVトランスフォームＢ細胞を、可溶性B7-1の存在下および非存在下において、抗(B7-1)モノクローナル抗体を用いて染色した。 抗体および可溶性B7またはコントロールを、ARC細胞を添加する前に室温で20分間プレインキュベートした。
【０１１４】
図６Ａは、B7-24(点線)または二次抗体単独(実線)を用いた染色の結果を示す。図６Ｂは、B7-24単独(点線)または可溶性B7でプレインキュベートしたB7-24(実線)を用いた染色の結果を示す。
【０１１５】
実施例５
宿主動物免疫
雌BALB/cマウスを、０日目および14日目に、AcB7ウイルスまたはAcCd3ウイルス(コントロールウイルス)で感染させた５×106個のSf9細胞を用いて腹腔内注射した。21日目に、100μlの血清を得て、特異的抗体の存在について試験した。少なくとも２週間の残りの期間の後、マウスにAcB7ウイルスで感染させた５×106個の細胞を用いて最終注射した。この最後の注射の３日後、脾臓細胞を細胞融合のために使用した。
【０１１６】
実施例６
ハイブリドーマクローンの生成
免疫されたBALB/cマウス由来の脾臓細胞を、de Boerら(1988)により先に記載されるように、50%のポリエチレングリコールを使用して、SP2/0マウスミエローマ細胞と10：１の比率で融合した。融合した細胞をヒポキサンチン(0.1mM)、アミノプテリン(0.01mM)、チミジン(0.016mM)および0.5ng/ml hIL-6(Genzyme, Cambridge, MA)を補充した完全IMDM培地中に再懸濁した。次いで、これらの融合細胞を96ウェル組織培養プレートのウェル間に分配し、各ウェルが平均１つの増殖ハイブリッドを含有するようにした。
【０１１７】
10〜14日後、ハイブリドーマ集団の上清を特異的抗体の産生についてスクリーニングした。ハイブリドーマクローンによる特異的抗体の産生のスクリーニングのために、12ウェルの上清をプールし、そして実施例４に記載のようにEBVトランスフォームＢ細胞の蛍光細胞染色に使用した。次いで、陽性プールの上清を個別に試験した。陽性ハイブリドーマ細胞を、0.5ng/ml hIL-6を含有するIMDM/FBS中の限界希釈により、３回クローン化した。分析の結果を表１に表す。
【０１１８】
【表１】
2005097315.tif 000002
【０１１９】
表１において、融合後得られた細胞の半数のみを分析した。陽性ウェルの数を、実施例４において記載されたFACS分析により測定した。陽性ウェルの頻度を、陽性ウェルの数をハイブリドーマ増殖を有したウェルの総数で割り、100を掛けたものとして定義する。
【０１２０】
実施例７
扁桃Ｂ細胞の試験
扁桃Ｂリンパ球を、扁桃摘出を受けた小児から得た扁桃から、deGrootら(1990)に記載されるようにして単離した。簡単に述べると、組織を外科用ナイフを用いて分散し、食細胞およびNK細胞を５mM L-ロイシンメチルエステルを用いた処理により枯渇させ、そしてＴ細胞を2-アミノエチルイソチオウロニウムブロミドで処理したヒツジ赤血球を用いる１サイクルのロゼット化により除去した。
【０１２１】
抗(B7-1)モノクローナル抗体を、上記の実施例４において記載した蛍光細胞染色アッセイを使用して、扁桃Ｂ細胞に結合するそれらの能力について試験した。培養された扁桃Ｂ細胞の蛍光染色分析のために、ヨウ化プロピジウムを死細胞を排除するために使用した。
【０１２２】
【表２】
2005097315.tif 000003
【０１２３】
表２において、陽性扁桃細胞の百分率を、実施例４に記載した蛍光細胞染色により測定した。
【０１２４】
これらのデータは、新たに単離した扁桃Ｂ細胞の12%〜17%が抗(B7)モノクローナル抗体B7-24で陽性に染色されたことを示す。
【０１２５】
実施例８
Mab B7-24でのＴ細胞増殖のブロック
Ｔ細胞活性化におけるB7-1分子の役割を、上記のＴ細胞増殖およびMLCアッセイを使用して研究した。B7-24 Fabフラグメントの非存在下での増殖は、20,000cpm〜60,000cpmの範囲であった。図６は、このMabがB7-1分子の機能的に重要なドメインに結合することを示す。なぜなら、Mabが、抗CD3で誘導され、B7-1に仲介されるＴ細胞増殖の誘導を完全にブロックし得るからである。示すデータは、異なるドナーのＴ細胞を使用した４回の独立した実験の±S.D.である。
【０１２６】
図７は、抗CD3で誘導され、B7に仲介されるＴ細胞の増殖の、抗B7-1 Mabs  B7-24(四角)またはBB-1(三角)による阻害を示す。図８は、二次MLCの間のB7/CD28相互作用のブロックの効果を示す（白のシンボル）。精製Ｔ細胞を、異なる濃度のMab B7-24(図８Ａ)またはBB-1(図８Ｂ)の存在下または非存在下において、EBVトランスフォームＢ細胞株ARCで、３日間刺激した。抗体の非存在下における増殖は、一次MLCにおいては15,000〜30,000の範囲であり、二次MLCにおいては20,000〜60,000の範囲であった。示すデータは異なるドナーに由来するＴ細胞を用いた４回の独立した実験の平均値±S.D.である。
【０１２７】
この実験から、抗B7モノクローナル抗体が完全には一次MLCをブロックしないことが明らかである。しかし、同じ実験条件下において、CD3に対するMabは、一次MLCにおけるＴ細胞の活性化をほとんど完全にブロックした。興味深いことに、Mab B7-24を、前活性化（pre-activated）Ｔ細胞を用いた二次混合リンパ球培養においてその阻害能力について試験した場合、Mab B7-24はＴ細胞の活性化を阻害し得た。
【０１２８】
実施例９
シクロスポリンＡおよび／またはMab B7-24を用いたＴ細胞増殖のブロック
本発明者らは、 B7でのＴ細胞の共刺激も、CsAでの阻害に対して耐性であるかどうかを決定するために、上記のＴ細胞増殖アッセイを使用した。図９は、Ｔ細胞が抗CD3 Mabで増殖に誘導される場合、B7-1での共刺激が、用量依存性の様式でCsAにより阻害され得ることを示す。しかし、毒性でないCsAの濃度を用いてＴ細胞の活性化を完全にブロックすることは可能ではなかった。CsAを一次MLC(結果は示さず)または二次MLC(表３を参照のこと)をブロックするために使用した場合、同様の結果が得られた。これらの実験は、B7-1-CD28/CTLA-4仲介Ｔ細胞増殖が、CsAの阻害作用に部分的にのみ感受性であることを明らかに示唆している。インビトロにおいてＴ細胞がB7-1で共刺激される場合の、この完全な阻害の欠如は、CsAの処置にもかかわらず移植片拒絶または急性GVHDの間にインビボにおいて生じることを模倣し得る。
【０１２９】
【表３】
2005097315.tif 000004
【０１３０】
表３全体において、Ｔ細胞増殖をCPMで反映する。増殖を、上記のＴ細胞増殖アッセイを使用して測定した。データは４回の実験のうちの１回について表す。
【０１３１】
表３は、CsA単独またはmAb B7-24単独では、用量依存性であるが、不完全なＴ細胞活性化の阻害を生じたことを示す。しかし、CsAおよびB7-24とを組み合わせた場合、Ｔ細胞活性化は完全にブロックされた。興味深いことに、0.025μg/mlのB7-24の添加は、2.5μg/mlとほとんど同じ量のブロックを与えた。さらに、0.025μg/mlのB7-24の存在下では、CsA濃度を60倍減らしてもなお90%より大きいＴ細胞活性化の阻害を生じ、これは最も高いCsA濃度単独での最大の阻害よりも大きかった。
【０１３２】
Mab B7-24とCsAとのこの相乗性は、B7/CD28相互作用に特異的であった。なぜなら、これは表４に示すように、同じ増殖アッセイにおいて、ICAM-1またはCD72のいずれかに対する Mabを用いて観察されなかったからである。
【０１３３】
【表４】
2005097315.tif 000005
【０１３４】
表４全体において、コントロール(100%)の百分率として表されるＴ細胞増殖を反映する。増殖を上記のＴ細胞増殖アッセイを使用して測定した。
【０１３５】
実施例10
Mab B7-24および他の免疫抑制剤を用いたＴ細胞増殖のブロック
上記の実施例９のプロトコルを、他の免疫抑制剤とともにMab B7-24を使用するＴ細胞増殖のブロックを示すために使用する。CsAを(Ａ)FK506、(Ｂ)ラパマイシン、(Ｃ)メトトレキセート、(Ｄ)プレドニゾロン、または(Ｅ)デキサメタゾンに置き換えて、実施例９における増殖アッセイプロトコルに従う。
【０１３６】
実施例11
シクロスポリンＡおよび／またはMab B7-24を用いた
細胞障害性Ｔリンパ球活性のブロック
上記の細胞障害性アッセイを、CsAおよびB7-24がまた、Ｔ細胞のアロ抗原特異的活性化におけるCTL活性の誘導のブロックにおいても協同し得るかどうかを試験するために使用した。精製Ｔ細胞を、６日間、EBVトランスフォームＢ細胞株 ARCで刺激した後、２日間培地のみの中で培養した。Ｔ細胞のCTL活性を、EBVトランスフォームＢ細胞株ARCを用いて、図10に示すように、培地単独；400μg/ml CsA；10μg/ml Mab B7-24；または400μg/ml CsAおよび10μg/ml Mab B7-24の存在下で、３日間再刺激した後分析した。これらの培養物中でアロ抗原により活性化されたＴ細胞は、効率的に誘導されて細胞溶解性となった。というのは、約50%のARC標的細胞が４時間のアッセイで溶解され得たからである。二次MLCにおけるCTL活性のこの誘導は、400ng/mlのCsAで僅かに阻害され得たのみであった。二次MCLの間の10μg/mlのMab B7-24の添加で、約40%の阻害が生じた。しかし、CsAとMab B7-24とを組み合わせると、ほとんど完全にCTL活性化をブロックした。
【０１３７】
実施例12
Mab B7-24および他の免疫抑制剤を用いた細胞障害性Ｔリンパ球活性のブロック
上記の実施例11のプロトコルを、他の免疫抑制剤とともにMab B7-24を使用する細胞障害性Ｔリンパ球活性のブロックを示すために使用する。CsAを(Ａ)FK506、(Ｂ)ラパマイシン、(Ｃ)メトトレキセート、(Ｄ)プレドニゾロン、または(Ｅ)デキサメタゾンに置き換えて、実施例11における細胞障害性アッセイプロトコルに従う。
【０１３８】
実施例13
アロ抗原特異的Ｔ細胞活性化の間のCsAおよびMab B7-24の組み合わせ
CsAおよびMab B7-24の存在下で(上記のように)一次MLCアッセイにおいてアロ抗原で刺激されたＴ細胞が、二次抗原刺激に応答し得るかどうかを研究した。精製Ｔ細胞を、６日間、10μg/mlのMab B7-24および400μg/mlのCsAの存在下または非存在下においてEBVトランスフォームＢ細胞株 ARCで刺激した後、２日間培地のみの中で培養した。Ｔ細胞のCTL活性を、３日間EBVトランスフォームＢ細胞株ARCで再刺激した後に分析した。図５におけるデータは代表的な実験のデータであり、これはCsAおよびMab B7-24の両方の存在下でのアロ抗原への６日間の曝露で、二次MLCにおけるアロ抗原を用いる次のチャレンジに全体的に非応答性となったが、CsAまたはMab B7-24単独の存在下では非応答性にならなかったことを示す。この非応答性は、一次MLC後の細胞の生存性の欠如にはよらなかった。というのは、コントロール実験において、固定化された抗CD3 Mabまたは非関連性アロ抗原を発現する細胞で刺激した後に細胞集団が誘導されて細胞障害性になり得たからである(結果は示さず)。
【０１３９】
【表５】
2005097315.tif 000006
【０１４０】
表５中、上記の一次MLCの後の、ARC細胞を刺激細胞として使用した二次MLCにおける精製Ｔ細胞のCTL活性。上記のＴ細胞細胞障害性アッセイにおいて測定したCTL活性。
【０１４１】
実施例14
アロ抗原特異的Ｔ細胞活性の間の、Mab B7-24および免疫抑制剤の組み合わせ
上記の実施例13のプロトコルを、他の免疫抑制剤と共にMab B7-24が二次抗原刺激をブロックする能力を示すために使用する。CsAを(Ａ)FK506、(Ｂ)ラパマイシン、(Ｃ)メトトレキセート、(Ｄ)プレドニゾロン、または(Ｅ)デキサメタゾンに置き換えて、実施例13におけるCTLアッセイプロトコルに従う。
【０１４２】
培養物の寄託
上記実施例において使用したハイブリドーマを、ブダペスト条約の規約のもとにアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USAに寄託しそして受領された。この寄託は、これらのハイブリドーマが先に記載されるまたは以下に請求される本発明の実施に必要であることを示さない。
【０１４３】
【表６】
2005097315.tif 000007
【０１４４】
モノクローナル抗体B7-24は、BB-1モノクローナル抗体およびCTLA-4 Ig融合タンパク質とは異なるB7-1分子上の抗原性エピトープに結合する：B7-24はB7-2に結合しないが、一方、CTLA-4 Igは結合する；B7-24およびCTLA-4 Igは、B7-1陰性細胞に結合しないが、これらの細胞はBB-1モノクローナル抗体での染色に陽性である。[Boussiotisら、Proc.Nat'l.Acad.Sci. (USA), 90, 11059 (1993)；およびFreemanら、Science, 262, 909 (1993)]。
【０１４５】
少なくとも３つの異なるB7分子が存在することが結論づけられ、以下の表はB7-24、BB-1およびCTLA-4 IGの結合を要約する。
【０１４６】
【表７】
2005097315.tif 000008
【０１４７】
アロ抗原特異的アネルギーまたは寛容は、CsAおよびB7-24の併用から誘導され得る。寛容のこの誘導は、Ｔ細胞による細胞障害性の誘導およびＴ細胞増殖の両方について示された(データは示さず)。このことは明白ではない。なぜなら、十分に引用されている科学文献の発表が、CsAのＴ細胞への添加がアネルギーの誘導を防止することを示唆しているからである[Jenkinsら、J.Exp.Med., 165, 302 (1987)；Jenkinsら、Proc.Nat'l.Acad.Sci. (USA), 54, 5409 (1987)；Jenkinsら、J.Immunol., 140, 3324 (1988)；Muellerら、Ann.Rev.Immunol., 7, 445 (1989)およびSchwartz, Nature, 248, 1349 (1990)]。
【０１４８】
CTLA-4 Igを用いたラットにおける心臓移植のインビボモデルでの寛容の誘導は、組織移植の２日後に添加された場合にのみ作用することが報告されている。移植の同じ日での処置の開始は寛容を生じないことが報告されている。従って、Ｔ細胞とのB7-2相互作用によるシグナリングが寛容の誘導に必要であり、そして２日目でのブロック効果はB7-1のブロックに起因する。B7-24抗体を使用すればこれは問題ではない。なぜなら、CTLA-4 Igとは対照的に、B7-24抗体はB7-2をブロックしないからである。抑制に対する寛容誘導に関しては、抗B7-1とCsAとの組み合わせは、TcR/CD3複合体を介した明白なシグナル伝達ではなく抗B7-2が寛容の誘導に必要である。このことは、IL-2産生に必要とされるTcR/CD3およびB7-2によるシグナルがCsAに感受性であるが、寛容誘導のシグナルには感受性ではないことを意味する。
【０１４９】
実施例15は、細胞表面上にB7-1分子およびB7-2分子の両方を発現する細胞株を使用した寛容の誘導を記載する。これにより、B7-1およびCsAをブロックすることにより寛容を誘導することが可能であり、同時にB7-2分子はＴ細胞上のCD28および／またはCTLA-4と自由に相互作用する。再び記載するが、本文献においてこれは両方のB7分子の役割に関して示唆されていない。
【０１５０】
実施例15
細胞および細胞株
末梢血Ｔ細胞を健康なボランティアから上記のように単離した[Van Goolら、J.Immunol., 150, 3254 (1993)]。細胞を、２mM L-グルタミン、ペニシリン(1000U/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)および10%の鉄補充ウシ胎児血清を補充したRPMI 1640 (Gibco, Paisley, Scotland) (完全培地)中で培養した。２つのEBVトランスフォームＢ細胞株を、MLRのための刺激細胞として使用した:ARC(ATCC, Rockville, MDから得た(HLA-DR w8, w8)およびMM(Innogenetics, Gent, Belgiumで生成された(HLA-DR 1,2)) 。P815細胞株(ATCC, Rockville, MDから得た)は、FcγRIIおよびFcγRIIIを発現するDBA/2由来のNK耐性マウス肥満細胞株である。
【０１５１】
モノクローナル抗体および他の試薬
MAb B7-24 (IgG2a、κ)をヒトB7分子を発現するSf9昆虫細胞で免疫したマウスに由来する脾臓細胞との融合から得[de Boerら、Eur.J.Immunol., 22, 3071 (1922)およびde Boerら、J.Immunol.Methods, 152, 15 (1992)]、そして精製抗体として使用した。抗CD3 mAb OKT3(IgG2a, κ)を、ATCC, Rockville, Marylandから得たOKT-3クローンの上清から単離した精製抗体として使用した。CsA(Sandoz Pharmaceuticals, Basel, Switzerlandから購入した)をエタノール中で溶解し(10mg/ml)、リン酸緩衝化生理食塩水(pH7.4)を用いて希釈して、８μg/mlの保存溶液とした(-20℃で保存)。rIL-2はBiological Response Modifier Program(NCl, Frederick, Maryland)を通じて得そしてHoffman-La Rocheにより製造されたか、またはBoehringer Mannheimから購入した。rIL-4は、Innogenetics, Gent, Belgiumで製造された。
【０１５２】
混合リンパ球反応(MCR)
一次MLRのために、106個のＴ細胞を0.25×106個のARC細胞(2000ラドで照射した)とともに、５日間〜７日間、24ウェルの平底組織培養プレート中で１ml培地中で培養した。MAb B7-24(10μg/ml)および／またはCsA(400ng/ml)を培養期間の開始から添加した。５日間〜７日間後細胞を回収し、細胞障害性能力の分析のためにまたは刺激細胞の非存在下での１日〜２日間培地のみの中でのさらなる培養のために培地中に再懸濁した。Ｔ芽細胞を、CsAまたは抗B7を用いないで、Ｔ細胞；刺激細胞比４：１で、照射されたARC細胞またはMM細胞を用いて、二次MLRにおいて再刺激した。４日後細胞を回収し、そして細胞障害性能力の分析またはさらなる培養のために培地中に再懸濁した。三次MLRが実施される場合は、細胞をCsAまたは抗B7を用いないで、ARC細胞またはMM細胞(Ｔ細胞：刺激細胞比−４：１)で４〜５日間再び再刺激した。
【０１５３】
細胞障害性アッセイ
細胞障害活性を、マウスP815細胞またはARC細胞を標的として使用する４時間の標的細胞溶解アッセイにおいて測定した。P815標的細胞の場合、CTLを抗CD3 mAb OKT3を２μg/mlで使用して標的細胞に非特異的に架橋した[Van Goolら、J.Immunol., 150, 3254 (1993)]。従って、この細胞障害アッセイは抗原特異性に関わりなく全てのＴ細胞障害活性を評価する。ARC細胞を標的細胞として使用した場合、アロ抗原特異的CTLのみが障害プロセスに関係した。百万個の標的細胞を200μCiの51Crクロム酸ナトリウム(Amersham International, Amersham, United Kingdom)で標識した。CTLアッセイを、96ウエルのＶ底マイクロタイタープレート中で、１ウェル当たり200μlの全容量中で、5000個の51Cr標識標的細胞を５×104個のＴ細胞とともに使用して(示さない限り、Ｅ：Ｔ比＝10) 実施した。それぞれ自然放出および最大放出の評価のために、４つのウェルを200μlの培地単独中の５×103個の標的細胞で満たし、そして４つのウェルを100μlの培地および100μlのサポニン中の５×103個の標的細胞で満たした。P815細胞の抗CD3依存性51Cr放出の百分率を記載されるように算定した[Van Goolら、J.Immunol., 150, 3254 (1993)] 。ARC細胞の溶解%を算定した：(Ｔ細胞による全放出−自然放出)／(サポニンによる最大放出−自然放出)×100。
【０１５４】
図11において、精製ヒトＴ細胞を一次MLR(7d、 図11ＡおよびＣ、左側パネル)および二次MLR(4d、図11ＢおよびＤ、右側パネル)において照射されたARC細胞で刺激した。CsA(400ng/ml)およびmAb B7-24(10μg/ml)を、一次MLRの間、示すように添加した。CTL活性を、P815肥満細胞に対する抗CD3再方向付け細胞障害性アッセイにおいて(図11ＡおよびＢ上側パネル)、および元の刺激細胞に対するアロ抗原特異的細胞障害性アッセイにおいて(図１１Ｃ−Ｄ、下側パネル)測定した。
【０１５５】
mAb B7-24でのB7−CD28/CTLA-4相互作用のブロックの、次の同じ細胞株での再刺激に及ぼす効果を、EBVトランスフォームヒトＢ細胞株(ARC)に対する新鮮に単離されたヒトＴ細胞の一次MLRの間、CsAと組み合わせて分析した。 ARCでプライムされたＴ細胞は、一次MLRの後およびより多く二次MLRの後に、細胞障害活性を示した(図11)。図11Ａ〜Ｄ中、mAbB7-24(10μg/ml)およびCsA(400ng/ml)を含むかまたは含まないで、ARCを刺激細胞として使用した、一次MLRの間に刺激されたＴ細胞の二次MLR(n＝10、上側パネル)または三次MLR(n＝３、図11ＣおよびＤ、パネル下側)後に測定した、細胞障害活性の組み合わせのデータ。細胞障害活性を、抗CD3再方向付け細胞障害性アッセイ(左側パネル)、または元のARC刺激細胞でのアロ抗原特異的細胞障性アッセイ(右側パネル)のいずれかにおいて測定した。P815に対する抗CD3再方向付け細胞障害性アッセイ(対のサンプルのt-検定（t-test of paired sample）：ｐ＜0.0001)またはARCに対する抗原特異的細胞障害性アッセイ(対のサンプルのｔ-検定：p＜0.005)を用いて測定すると、アネルギー細胞の全体的な細胞障害活性は、プライムされた細胞に比べて顕著に低かった。
【０１５６】
図11において示されるように、B7-24 mAbとCsAとの各々別々にではなく組み合わせは、一次MLRの間、CTLの生成をブロックし、そしてより重要なことに、これらのブロック剤の非存在下において実施される二次MLRにおいて次のCTL生成を阻害した。Tanら、J.Exp.Med., 177, 165 (1993)は、増殖で測定したところ、CTLA-4-Ig単独でヒトＴ細胞培養物におけるアロ抗原特異的な低応答性を誘導することを示した。本発明者らの実験において、アネルギー誘導についてのCTL評価[Ottenら、Science, 251, 1228 (1991)およびGoら、J.Immunol., 150, 367 (1993)]を使用し、mAb B7-24単独では、細胞はアネルギー状態に入らなかったが、本発明者らはまた時々、低応答性の状態を見出した(データは示さず)。しかし、一次MLRの間に添加したCsAとmAb B7-24との組み合わせは、二次MLRにおいてアロ抗原で誘導されるCTL生成を一貫して阻害した(図12)。200ng/ml〜1600ng/mlのCsA濃度の変化、または0.1μg/ml〜10μg/mlの抗B7濃度の変化は、非応答性と同一の状態を生じた(データは示さず)。ARCでの第二の再刺激後もまた、一次MLRの間にCsAおよびmAb B7-24でアネルギー化され、細胞は細胞障害活性を示さなかった(図12)。 CsAと抗CD58(LFA-3)mAbまたは抗CD54(ICAM-1)mAb、あるいはmAb B7-24とIL-2レセプターに対するmAbの組み合わせは、この非応答性の状態を誘導し得なかった(データは示さず)。アネルギー誘導のアロ抗原特異性を研究するために、ARCでプライムされた非応答性Ｔ細胞をARC細胞(HLA-DR w8、w8)または第三者のMM(HLA-DR 1、2)細胞で二度刺激した。
【０１５７】
表８において、アロ抗原でプライムされたまたはアネルギー化細胞は、抗B7-1(10μg/ml)およびCsA(400ng/ml)の非存在(プライムされた細胞)下、または存在(アネルギー化細胞)下、５日間の一次MLRにおいて単離ヒトＴ細胞が刺激されるかどうかに依存して生成された。ARC刺激細胞での一次MLRの後、そして培地のみの中での１日間の培養の後、細胞をARCまたはMMで再刺激した(Ｔ細胞：刺激細胞比−４：１)。二次MLRの５日後残存する細胞を回収し、そして培地のみの中で１日間培養した。三次MLRをARCまたはMMを示されるように用いて実施した(Ｔ細胞：刺激細胞比−４：１)。二次MLRまたは三次MLRの後細胞を回収し、そして抗CD3でコートしたP815に対して10：１のエフェクター：標的比で細胞障害アッセイを実施した。
【０１５８】
【表８】
2005097315.tif 000009
【０１５９】
一次MLRにおいてARCに対してCsAおよびB7-24 mAbで処理したＴ細胞は、 MM細胞で再刺激したときに細胞障害活性を示し、このことはARC特異的Ｔ細胞のみが不応答性であることを示す(表８)。mAb B7-24およびCsAの存在下でアロ抗原誘導性刺激により得られるアネルギー誘導は、いくつかの理由で能動的なプロセスであると考えられるべきである。第一に、刺激細胞との最少５日間の培養、およびその後の１日間または２日間の培地のみの中での培養が、アネルギー状態を生じるために必要であった(データは示さず)。活性化マーカHLA-DRが、MAb B7-24およびCsAの存在下でアロ抗原で刺激された細胞の一部で発現された(２回の実験において24%および33%の陽性細胞、出発集団における２%および４%、ならびにアロ抗原単独での刺激後の51%および31%と比較して）。しかし、アロ抗原刺激の間、mAb B7-24およびCsAとともに培養した細胞はCD25(IL-2レセプター)を発現せず、そしてCD45RA(処女)表現型からCD45RO(記憶)表現型に変化しなかった(データは示さず)。IL-2は、共刺激シグナルの非存在下で抗原刺激によりアネルギー化されたＴ細胞のアネルギー状態を防止し [Tanら、J.Exp.Med., 177, 165 (1993)] 、そして訂正する [JenkinsらProc.Nat'l.Acad.Sci. (USA), 54, 5409 (1987)；Muellerら、Ann Rev.Immunol., 7, 445 (1989)およびSchwartzら、Cell, 71, 1065 (1992)]ことが示された。
【０１６０】
図13において、精製ヒトＴ細胞を、CsA(400ng/ml)およびmAb B7-24(10μg/ml)を含むかまたは含まない一次MLR(5 d)において、照射ARC細胞で刺激した。IL-2(10 U/ml, Hoffman-La Roche)またはIL-4(200 U/ml)を、示すように一次MLRの間に添加した。二次MLR(4 d)後、CTL活性を、P815肥満細胞に対する抗CD3再方向付け細胞障害性アッセイにおいて測定した。
【０１６１】
図13は、ヒトＴ細胞におけるCsAおよびmAb B7-24によるアロ抗原特異的アネルギー誘導が、一次MLRの間のIL-2の添加によってもまた防止され得たことを示す。このIL-2の効果は、IL-2レセプターのp55鎖およびp70鎖に対するmAb抗Tacおよびmikβ1によりブロックされ得る(データは示さず)。
【０１６２】
IL-2を二次MLRの間に添加した場合、アネルギー化された細胞の培養物における抗原特異的CTL活性の生成が強力に回復した(図14Ａ)。図14Aにおいて、ARC細胞またはIL-2(10U/ml、Boehringer-Mannheim)を、CsA(400ng/ml)およびmAbB7-24(10μg/ml)のブロック組み合わせで、一次MLR(7d)の間にRCでプライムされたかまたはARCに対してアネルギー化されたＴ細胞に添加した。抗原特異的CTL活性を４日後に測定した(E:T＝20)。データは、３回の実験の代表である。LAK活性は排除され得た。図14b：プライムされたまたはアネルギー化されたＴ細胞を、４日間ARC細胞または固定化UCHT1＋IL-2(10U/ml、Boehringer-Mannheim)で再刺激した。CTL活性を、 P815肥満細胞に対して抗CD3再方向付け細胞障害性アッセイにおいて測定した(E:T＝20)。データーは二回の実験の代表である。
【０１６３】
三次MLRの間のIL-2の添加もまた、アネルギー細胞のCTL活性を回復し得た(データは示さず)。Ｔ細胞がアネルギーにされた場合、ポリクローナル細胞障害活性が、固定化抗CD3 mAb UCHT1およびIL-2での最適な再刺激後に測定され得た(図14Ｂ)。これらのデータは、アネルギー状態の誘導のためのIL-2産生の欠損の重要性を示している。CTLA-4-IgでのMLRのブロックの後の持続的なIL-4 mRNAの発現が、一次MLRまたは二次MLRにおける残りのＴ細胞増殖を担い得ることが報告されている[Tanら、J.Exp.Med.,177, 165 (1993)]。これは、抗B7-1単独の存在下での残りのCTLの生成も担い得る。しかし、データ(図13)は、この仮定を支持しない。というのは、mAb B7-24およびCsAの存在下でのIL-4の一次MLRへの添加は効果がないからである。
【０１６４】
実施例16
精製末梢血リンパ球(0.5×106/ml)を、表中に示す添加物の存在下において、マイトマイシンＡで処理した、アロ抗原を発現するEBVトランスフォームＢ細胞株 ARC(0.12×106/ml)とともに６日間培養した。添加物を加えずに３日間培養した後、 Ｔ細胞をさらなる添加物を加えずに４日間ARC細胞で再刺激した。増殖応答を[3H]-チミジン取り込みにより測定した。結果を表９に示す。
【０１６５】
【表９】
2005097315.tif 000010
【０１６６】
一次MLRにおけるＴ細胞のアロ抗原への曝露は、アロ抗原特異的Ｔ細胞のプライムを生じ、これは再刺激後に強力な増殖応答を生じる。抗B7 mAb B7-24、CTLA4-IgまたはCsA単独の添加は、二次刺激後の増殖応答に影響しなかった。アロ抗原とのＴ細胞の一次曝露の間のmAb B7-24とCsAとの組み合わせは、アロ抗原特異的寛容を生じた。というのは、Ｔ細胞は同じアロ抗原では再刺激され得なかったからである。対照的に、CTLA4-IgとCsAとの組み合わせは、二次刺激の間の応答の減少のみを生じたが、アロ抗原特異的寛容を生じなかった。
【０１６７】
この実験は、B7-1にのみ結合するmAb B7-24とB7-1およびB7-2に結合するCTLA4-Igとの間の差の別の例を提供する。さらに、この実験は再びB7-1およびB7-2の両方のブロックが、アロ抗原特異的寛容を生じないことを示している。
【０１６８】
本発明は、特定の実施態様を参照して記載した。しかし、本出願は、添付する請求項の精神および範囲から逸脱することなく当業者によってなされ得るそれらの改変および置換を覆うことを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１Ａ】図1Aは、バキュロウイルストランスファーベクターpAcC8の概略図、およびマルチクローニング部位の配列を示す。
【図１Ｂ】図1Bは、本発明によるヒトB7-1抗原を発現するSf9細胞の生成の概略図を示す。
【図２】図２は、ヒトB7-1抗原のコード領域の調製において使用したポリメラーゼ連鎖反応プライマーの配列を示す。これらのプライマーは、公開されたB7-1抗原の完全なDNAコード配列を基に構築された(Freemanら、1989)。
【図３】図３は、抗(B7)モノクローナル抗体BB-1と、AcB7ウイルスで感染したSf9細胞およびヒトCD26を発現するSf9細胞との反応を検討したELISAアッセイの結果を示す。
【図４】図４は、 B7-1を発現するEBVトランスフォームＢ細胞株ARC細胞の蛍光細胞染色の結果を示す。
【図５】図５ＡおよびＢは、CD40およびB7-1、ならびに可溶性B7-1抗原を発現するEBVトランスフォームＢ細胞株ARC細胞の蛍光細胞染色を使用したアッセイを示す。
【図６】図６は、抗CD3で誘導され、B7に仲介されるＴ細胞の増殖の抗B7-1 Mab B7-24のFabフラグメントによる阻害を示す。
【図７】図７は、抗CD3で誘導され、B7に仲介されるＴ細胞の増殖の抗B7 Mab B7-24(四角)またはBB-1(三角)よる阻害を示す。
【図８】図８は、３日間の二次MLCの間の、(A)MAb B7-24(白三角)または(B)MAb BB-1(白マル)を用いた、B7/CD28の相互作用をブロックする効果を示す。
【図９】図９は、抗CD3で誘導され、B7に仲介されるＴ細胞の増殖のCsAによる阻害を示す。データは、異なるドナーのＴ細胞を使用する３回の独立する実験の平均値±S.D.である。
【図１０】図10は、二次MLCの間の、アロ抗原誘導性のCTL活性のブロックにおける、抗B7-1 Mab B7-24およびCsAの相乗効果を示す。Ｔ細胞のCTL活性は、培地のみ；400μg/ml CsA；10μg/ml Mab B7-24；または400μg/ml CsAおよび10μg/ml Mab B7-24の存在下で、EBVトランスフォームＢ細胞株ARCで３日間再刺激した後に分析した。
【図１１】図11A〜Dにおいて、棒グラフは、一次MLRのブロックにおける、およびCTL前駆体の持続的アロ抗原非応答性の誘導における、mAb B7-24とCsAとの間の相乗性を示す。
【図１２】図12A〜Dにおいて、棒グラフは、一次MLRの間にCsAと抗B7-1との組み合わせが、二次MLRおよび三次MLRにおける再刺激への持続的アロ抗原非応答性を誘導することを示す。
【図１３】図13において、棒グラフはIL-2が一次MLRにおいてmAb B7-24およびCsAでのアネルギーの誘導を防止することを示す。
【図１４】図14A〜Bにおいて、棒グラフは、IL-2(図4a)または固定化抗CD-3(図4b)での再刺激が、アネルギーを逆転することを示す。
【０１７０】
（配列表）
【数１−１】
2005097315.tif 000011
【０１７１】
【数１−２】
2005097315.tif 000012
【０１７２】
【数１−３】
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【０１７３】
【数１−４】
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【図１Ａ】
2005097315.tif 000015
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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