(57)【要約】【課題】  古紙から糖化工程を経てグルコン酸を製造するグルコン酸製造方法であって、アスペルギルス属菌の菌体の分離と鉄イオンの添加を行うことなく、かつ菌体再利用を繰り返しても高い生産性を維持できるグルコン酸製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】  古紙を酵素糖化し、その糖をグルコン酸発酵してグルコン酸を製造する方法であって、古紙を糖化して糖化液とする工程と、その糖化液をアスペルギルス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)属に属する菌を用いてグルコン酸発酵する工程とを有し、前記グルコン酸発酵が、グルコン酸発酵液の一部を新しい糖化液と入れ換えてなされる。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
古紙を酵素糖化し、その糖をグルコン酸発酵してグルコン酸を製造する方法であって、
古紙を糖化して糖化液とする工程と、
その糖化液をアスペルギルス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)属に属する菌を用いてグルコン酸発酵する工程とを有し、
前記グルコン酸発酵が、グルコン酸発酵液の一部を新しい糖化液と入れ換えてなされることを特徴とするグルコン酸の製造方法。
【請求項２】
前記グルコン酸発酵が、糖化液の殺菌を行わずになされることを特徴とする請求項１記載のグルコン酸の製造方法。
【請求項３】
グルコン酸発酵を行う発酵槽内に、メッシュ状の担体からなる内筒を設け、
この担体表面に前記菌の菌体を付着させてグルコン酸発酵を行うことを特徴とする請求項１又は２に記載のグルコン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、古紙資源を糖化し、次いでグルコン酸発酵してグルコン酸を製造するグルコン酸製造方法に関するものであり、特に、グルコン酸発酵工程で、グルコン酸発酵液の一部を新しい糖化液と入れ換えてグルコン酸発酵を行うグルコン酸製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、グルコースの酸化発酵法により、グルコン酸を得る方法は公知である。この方法は、主として、アスペルギルス・ニガー(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ)に属する糸状菌やペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属菌を用いて製造されている。
このアスペルギルス属菌の菌体がグルコースを消費すると、その回の発酵は終了するが、発酵終了後の菌体はなおグルコースをグルコン酸にする活性を保持している。そこで、この菌体を分離・回収して、再び発酵に利用するのが有効である。
【０００３】
しかしながら、菌体の再利用を繰り返すと、グルコースに対するグルコン酸の収率が低下する傾向があった。
そこで、菌体再利用を繰り返して、かつ高収率でグルコン酸を得る方法として、１〜４０ｐｐｍの鉄イオンを培地に添加する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特公平３−３７９１７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１に係るグルコン酸製造方法にあっては、培地にわざわざ鉄イオンを添加しなければならないことと、グルコン酸発酵を行った発酵液から菌体を分離して、新しく調製した菌体再利用培地にこれを添加しなければならないという問題があった。
【０００５】
本発明は、上記従来技術の問題点に鑑み、古紙から糖化工程を経てグルコン酸を製造するグルコン酸製造方法であって、アスペルギルス属菌の菌体の分離と鉄イオンの添加を行うことなく、かつ菌体再利用を繰り返しても高い生産性を維持できるグルコン酸製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる課題を解決するため、
請求項１にかかる発明は、古紙を酵素糖化し、その糖をグルコン酸発酵してグルコン酸を製造する方法であって、古紙を糖化して糖化液とする工程と、その糖化液をアスペルギルス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)属に属する菌を用いてグルコン酸発酵する工程とを有し、前記グルコン酸発酵が、グルコン酸発酵液の一部を新しい糖化液と入れ換えてなされることを特徴とするグルコン酸の製造方法である。
【０００７】
請求項２にかかる発明は、前記グルコン酸発酵が、糖化液の殺菌を行わずになされることを特徴とする請求項１記載のグルコン酸の製造方法である。
【０００８】
請求項３にかかる発明は、グルコン酸発酵を行う発酵槽内に、メッシュ状の担体からなる内筒を設け、この担体表面に前記菌の菌体を付着させてグルコン酸発酵を行うことを特徴とする請求項１又は２に記載のグルコン酸の製造方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のグルコン酸の製造方法によれば、アスペルギルス属菌の菌体の分離と鉄イオンの添加を行うことなく、菌体再利用を繰り返しても、グルコン酸の高い生産性を維持することができる。
【００１０】
また、本発明のグルコン酸の製造方法によれば、グルコン酸発酵に用いる菌として、栄養要求性の低いアスペルギルス属菌を用いるため、グルコン酸発酵液の一部を新しい糖化液と入れ換える回数が３回以下の場合には、全く栄養源を添加しなくとも発酵を良好に行うことができる。
【００１１】
さらに、本発明のグルコン酸の製造方法によれば、古紙の糖化液に含まれる不純物を精製しなくても、良好なグルコン酸発酵を行うことができる。
【００１２】
そして、本発明のグルコン酸の製造方法によれば、アスペルギルス属菌は菌糸が絡まり合ってペレットを形成するため、濾過等の分離手段を用いることなく、グルコン酸発酵液の一部のみを抜き取って、新しい糖化液を投入することができる。
【００１３】
また、本発明のグルコン酸の製造方法によれば、糖化液の殺菌工程、糖化液中の不純物分離精製工程、アスペルギルス属菌の菌体分離工程を省略することができるため、製造コストを低減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のグルコン酸の製造方法は、古紙を糖化して糖化液とする工程と、その糖化液をアスペルギルス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)属に属する菌を用いてグルコン酸発酵する工程とから構成されている。
【００１５】
本発明において、原料となる古紙は、新聞紙、雑誌、オフィス紙、段ボール紙等の多種類があり、通常はそれらの混合物として回収された古紙が用いられる。この古紙は、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンを含み、その他に印刷インキやトナーなどの着色剤、充填料などを含んでいてもよい。
【００１６】
糖化工程は、まず、シュレッディングした古紙、あるいは離解した古紙を、原料濃度５〜５０質量％、好ましくは２５〜３０質量％で水に分散させ、酵素によって糖化反応させる。この糖化反応は、連続式、回分式、半回分式など、いずれの方式でも良く、４０〜６０℃、好ましくは４０〜５０℃で、ｐＨ４〜７、好ましくはｐＨ４〜５に保持して、攪拌下で２０〜８０時間、好ましくは６５〜７５時間行う。
【００１７】
本発明において、古紙を糖化するために使用する酵素は、セルラーゼを含むものであれば生産菌は問わない。セルラーゼは、セルロースのβ-１，４-グルコシド結合をエンド型で切断し、最終的にグルコースを生成する。そのなかでも、アクレモニウム(Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ)属菌、トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)属菌の産出する酵素であることが望ましい。なお、セルラーゼの品質改良手段として、例えば遺伝子組み替えや細胞融合などの手法を用い、より強力なセルラーゼを効率よく生産できる菌を創製し、それを用いてセルラーゼを生産することも可能である。
【００１８】
糖化反応終了後、この液は固液分離に供される。固形物残渣を除いた糖化液を、グルコン酸発酵用基質として用いる。固形物残渣を除く手段としては、濾過、遠心分離等が挙げられるが、そのなかでもエネルギー消費の小さい点から、濾過が好ましい。
【００１９】
本発明において、グルコン酸発酵に用いる菌は、アスペルギルス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)属に属する菌である。
そのなかでも、アスペルギルス・ニガー(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ)が好ましい。このアスペルギルス・ニガー(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ)は、グルコースだけでなく、セロビオース（グルコースの二量体）からもグルコン酸を生成できるため、糖化工程で古紙をすべてグルコースまで糖化しなくともよい。
【００２０】
グルコン酸発酵工程では、グルコン酸発酵用基質として用いる糖化液に対し、無機栄養源を添加した後、あらかじめ培養したアスペルギルス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)属に属する菌の培養液を５〜２０体積％、好ましくは５〜１０体積％添加し、２５〜３５℃、好ましくは２８〜３０℃で、ｐＨ５〜７、好ましくはｐＨ６〜７に保持し、１２〜４８時間、好ましくは２０〜２８時間、０．１〜１ｖｖｍの好気条件下で、発酵を行う。
【００２１】
無機栄養源としては、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、（ＮＨ４）２ＳＯ４等を必要に応じ用いることができる。本発明では、古紙からの糖化液であるため、古紙に元々含まれている成分は、添加を省略することができる。
また、古紙の糖化液を用いることによって、鉄イオンの添加を行うことなく菌体再利用を繰り返しても、グルコン酸の高い生産性を維持することができる。
【００２２】
さらに、アスペルギルス属菌は、栄養要求性が低いため、無機栄養源を全く添加しなくとも、グルコン酸発酵液の一部を新しい糖化液と入れ換える回数が３回までは、そのままグルコン酸の高い生産性を維持することができる。
【００２３】
また、糖化液の殺菌は、省略することができるが、一定期間保存する場合、微生物の繁殖による糖の減少を防ぐため、４℃以下に冷却することが望ましい。
本発明では、グルコン酸発酵に用いる菌として、アスペルギルス属菌を用いることで、栄養要求性が低いため、糖化液の殺菌を行わなくても、グルコン酸発酵工程で他の微生物の繁殖を防止することができる。
【００２４】
本発明によれば、１００〜１５０ｇ／Ｌのグルコースを含む糖化液から、２４〜４８時間の１回目の発酵で９０％以上の収率でグルコン酸を生産することができる。
【００２５】
本発明では、グルコン酸発酵が一旦終了したら、グルコン酸発酵液の一部を抜き取り、新しい糖化液を入れて、２回目の発酵を開始する。この入れ替え作業は、グルコン酸発酵が終了した時点で行う観点から、２０〜３０時間ごと、好ましくは２４時間ごとに行う。
また、入れ替える量は、最初のグルコン酸発酵液に対して、５０〜９５％、好ましくは８０〜９５％の容量である。入れ替える量を最初のグルコン酸発酵液に対して、５０〜９５％とすることで、２回目以降のグルコン酸発酵効率を高くすることができる。
さらに、入れ替えて菌体を再利用する回数は、３〜９回、好ましくは４〜５回である。菌体再利用の回数を３〜９回とすることで、この回数ではグルコン酸の収率が低下しないため、グルコン酸の高い生産性を維持することができる。
この時、一度使用したアスペルギルス属菌の菌体を分離して、これを回収をする必要はない。アスペルギルス属菌は菌糸が絡まり合ってペレットを形成するため、工業的には濾過等の菌体分離手段を用いることなく、グルコン酸発酵液の一部を抜き取ることが可能だからである。
【００２６】
本発明にあっては、このアスペルギルス属菌をメッシュ状の担体表面に付着させてグルコン酸発酵を行ってもよい。図１は、発酵槽内に、メッシュ状の担体からなる内筒を設けたグルコン酸発酵槽の断面図である。このグルコン酸発酵槽１は、ステンレスメッシュ状の担体からなる内筒３と、攪拌羽根４と、空気を供給するバブラー５から構成されている。そして、この発酵槽内には、菌体ペレット２と、糖化液６が収容されている。また、矢印は、糖化液６の流れ方向を示している。
【００２７】
図２は、攪拌開始後のグルコン酸発酵槽の断面図である。攪拌を始めると、糖化液６は矢印のように内筒３の外側から内側に流れる。この時、菌体ペレット２は内筒３のメッシュ状の担体表面に付着し、内筒３の外側に筒状に生育する。そのため、この菌体ペレット２の菌糸は、自由に糖化液６と接触することができる。また、バブラー５を用いることにより、発酵槽内に充分に酸素を供給することができるため、菌糸を活性の高い状態に保つことができる。
【００２８】
本発明のグルコン酸の製造方法によれば、グルコン酸発酵を行う発酵槽内で糖化液を、メッシュ状の担体からなる内筒の外側から内側に流れるように攪拌すると、この担体表面にアスペルギルス属菌の菌体ペレットが付着して内筒外側に筒状に生育することにより、アスペルギルス属菌の菌糸が自由に糖化液と接触でき、かつ酸素供給を良好に行うことができるため、菌糸を活性の高い状態に保つことができ、菌体再利用を繰り返しても、グルコン酸の高い生産性を維持することができる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により、本発明をさらに詳しく説明する。本発明は、下記実施例に何ら制限されるものではない。
【００３０】
［実施例１］
〈古紙から糖化液の生成〉
オフィス紙を離解後、２５質量％の濃度になるよう水に分散し、酵素としてアクレモニウムセルラーゼ（名糖製）を５質量％添加し、４５℃、ｐＨ４．５の条件で、７２時間糖化処理を行った。
糖化反応終了後、残渣を吸引濾過して除き、糖化液をロータリーエバポレーターを用いて所定の濃度まで濃縮した。
【００３１】
〈グルコン酸発酵〉
微生物には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＩＡＭ２０９４を使用した。この菌を前培養した後、本培養の培地に添加した。培地の条件と培養条件を、以下に示す。
【００３２】
［前培養培地］
糖化液  ５０ｇ／Ｌ（グルコースとして）、Ｎａ２ＨＰＯ４  ０．４ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１５ｇ／Ｌ
【００３３】
［本培養培地］
古紙糖化液  １５０ｇ／Ｌ（グルコースとして）、ＫＨ２ＰＯ４  ０．４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１５ｇ／Ｌ、ＣａＣＯ３（ｐＨ調整用）  ６０ｇ／Ｌ
【００３４】
［培養条件］
培養器の容量：５００ｍＬのフラスコに５０ｍＬの培養液を添加した。
培養温度：３０℃
振とう速度：１２０ｓｐｍ
前培養への植菌濃度：２×１０６個／ｍＬ
新しい糖化液との入れ換え：２４時間ごとに、培養済みの溶液を遠心処理または自然沈降させ、上清の培地２５〜４０ｍＬを取り除いた後、新鮮培地を添加した。
【００３５】
グルコースの消費量は、市販のグルコースアナライザー（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、型式：２７００）を用いて測定した。
また、生産されたグルコン酸量は、液体クロマトグラフィー（ＪＡＳＣＯ社製、カラム：ＲＳｐａｃｋ製、Ｓｈｏｄｅｘ  ＫＣ−８１１、溶媒：０．１％リン酸（流速０．７ｍＬ／分）、検出：ＵＶ（２１０ｎｍ））を用いて測定した。
２４時間ごとのグルコースの消費量（濃度  ｇ／Ｌ）を図３に●で、グルコン酸の生産量（濃度  ｇ／Ｌ）を図４に●で、各々示す。
【００３６】
［比較例１］
〈グルコン酸発酵〉
古紙糖化液に代えてグルコースを用いて、グルコン酸発酵を行った。使用した微生物、前培養の培地、培養条件は実施例１と同様である。以下に本培養の培地条件を示す。
【００３７】
［本培養培地］
グルコース  １５０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１５ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．３５ｇ／Ｌ、ＣａＣＯ３（ｐＨ調整用）  ６０ｇ／Ｌ
【００３８】
グルコース、グルコン酸の分析は、実施例１と同様の方法を用いた。
２４時間ごとのグルコースの消費量（濃度  ｇ／Ｌ）を図３に■で、グルコン酸の生産量（濃度  ｇ／Ｌ）を図４に■で、各々示す。
【００３９】
図３は、実施例１及び比較例１におけるグルコースの消費量を示したグラフである。図４は、実施例１及び比較例１におけるグルコン酸の生産量を示したグラフである。
これらの結果から、実施例１では、本培養の培地に硫酸アンモニウムを添加していないにもかかわらず、比較例１と同程度のグルコースの消費量及びグルコン酸の生産量が得られることがわかった。
【００４０】
また、実施例１及び比較例１とも、９６時間（４回目の新鮮培地を添加）以降は、グルコン酸の生産量が低下した。これは、菌体ペレットが成長し、巨大化して酸素供給性が低下したためと考えられる。
【００４１】
［実施例２］
図１のグルコン酸発酵槽を用いて、古紙からの糖化液を発酵させた。糖化液の生成は実施例１と同様に行った。
【００４２】
〈グルコン酸発酵〉
実施例１と同様に、微生物には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＩＡＭ２０９４を使用した。この菌を前培養した後、本培養の培地に添加した。培地の条件と培養条件を、以下に示す。
【００４３】
［前培養培地］
糖化液  ５０ｇ／Ｌ（グルコースとして）、酵母エキス  ３ｇ／Ｌ、麦芽エキス  ３ｇ／Ｌ、ポリペプトン  ３ｇ／Ｌ
【００４４】
［前培養条件］
培養器の容量：５００ｍＬのフラスコに８０ｍＬの培養液を添加した。
培養温度：３０℃
振とう速度：３００ｓｐｍ
前培養への植菌濃度：２×１０８個／ｍＬ
培養時間：２４時間
【００４５】
［本培養培地］
古紙糖化液  １００ｇ／Ｌ（グルコースとして）、Ｎａ２ＨＰＯ４  ０．４ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１５ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １．３５ｇ／Ｌ、ＣａＣＯ３（ｐＨ調整用）  ６０ｇ／Ｌ
【００４６】
［本培養条件］
培養器の容量：１．５Ｌのジャーファーメンターに８００ｍＬの培養液を添加した。
培養温度：３０℃
振とう速度：３００ｓｐｍ
植菌量：８０ｍＬ
新しい糖化液との入れ換え：約６日ごとに、培養済みの溶液を遠心処理させ、上清の培地６００ｍＬを取り除いた後、新鮮培地を添加した。
通気：１ｖｖｍ
【００４７】
グルコース、グルコン酸の分析は、実施例１と同様の方法を用いた。
２４時間ごとのグルコースの消費量（濃度  ｇ／Ｌ）を図５に○で、グルコン酸の生産量（濃度  ｇ／Ｌ）を図６に□で、各々示す。
【００４８】
図５は、実施例２におけるグルコースの消費量を示したグラフである。図６は、実施例２におけるグルコン酸の生産量を示したグラフである。
実施例２では、菌体ペレットは発酵槽内の内筒の外側に生育した。バブラーで空気を供給したため、新鮮培地の添加を約６日ごとに行ってもグルコン酸の生産性は低下しなかった。
【００４９】
以上の結果から、本発明のグルコン酸の製造方法によれば、アスペルギルス属菌の菌体の分離と鉄イオンの添加を行うことなく、菌体再利用を繰り返しても、グルコン酸の高い生産性を維持できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】発酵槽内に、メッシュ状の担体からなる内筒を設けたグルコン酸発酵槽の断面図である。
【図２】攪拌開始後のグルコン酸発酵槽の断面図である。
【図３】実施例１及び比較例１におけるグルコースの消費量を示したグラフである。
【図４】実施例１及び比較例１におけるグルコン酸の生産量を示したグラフである。
【図５】実施例２におけるグルコースの消費量を示したグラフである。
【図６】実施例２におけるグルコン酸の生産量を示したグラフである。
【符号の説明】
【００５１】
１  グルコン酸発酵槽
２  菌体ペレット
３  ステンレスメッシュ状の担体からなる内筒
６  糖化液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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