(57)【要約】【課題】急速な再閉塞のリスクなしに、血管組織の治癒を促進し、そして血管筋細胞の増殖(過形成)を制御し、血管形成術、血管バイパス、器官移植、または血管の病気後の血管の再狭窄を防ぐ手段および方法の提供。【解決手段】血管領域の処置を必要とする患者の血管領域中の血管組織に対する損傷後、平滑筋細胞増殖または血管の再狭窄を阻害するための方法であって、、該方法は、平滑筋細胞増殖を阻害するのに十分な量で、血管組織に対する損傷または遮断の外部および隣接する部位で、解離した内皮細胞をその中またはその上に接種されている生体適合性マトリックスを移植する工程を包含する、方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管領域の処置を必要とする患者の血管領域中の血管組織に対する損傷後、平滑筋細胞増殖または血管の再狭窄を阻害するための方法であって、
、該方法は、平滑筋細胞増殖を阻害するのに十分な量で、血管組織に対する損傷または遮断の外部および隣接する部位で、解離した内皮細胞をその中またはその上に接種されている生体適合性マトリックスを移植する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
合衆国政府は、Elazer R. Edelmanへの国立衛生研究所補助金GM/HL 49039およびAG00294のために本発明に権利を有している。
【０００２】
本発明は、血管形成術、血管バイパス手術、器官移植、またはその他の血管介入または操作のような血管介入または損傷後の、血管平滑筋細胞増殖、または再狭窄を阻害または防ぐ方法の領域に関する。
【背景技術】
【０００３】
血管形成術、手術およびその他の血管介入は、遠位にある器官への血流を危うくするに十分重篤である短期間内の管腔中への細胞の急速な増殖により特徴付けられる加速された血管形成により複雑である。
【０００４】
血管バイパス手術は、プラークがアテローム硬化症で血管の表面に進行するときのような、狭窄および閉塞された血管を矯正するために広く用いられている。バイパス手術では、１つまたはそれ以上の健康な血管が、閉塞のいずれかの端部で閉塞された血管中に移植され、狭窄または閉塞された血管のまわりを短絡し、血管供給が狭窄または閉塞により損傷を受けている組織への十分な血液供給を再確立する。この手術は、しばしば、首尾良く損傷を受けた組織を再血管化する。
【０００５】
近年、血管形成術が、血管の内皮壁上のプラークの異常に横たわることに起因して血管の狭窄または閉塞の進行が初期に診断された患者において特に、バイパス手術に対する代替処置として発展してきた。血管形成術は、代表的には、通常、バルーンまたは膨張可能な金属メッシュを備えたカテーテルを動脈を通じて、狭窄または閉塞の領域まで案内することを含み、そして１回またはそれ以上のバルーンまたは金属メッシュの短い膨張が、閉塞する血管内物質またはプラークを、血管の内皮壁に対して押し上げ、それによってプラークを圧縮および/または破壊して離し、そして血流を再確立する。しかし、血管形成術処置は、特にバルーンが過剰膨張し、またはメッシュが過剰に伸びるとき、血管を損傷し得、血管形成の領域中の内皮細胞層の表面剥脱(除去)、血管の閉塞を伴う血管の残りから内部血管壁の分裂、または血管の内膜層の破裂のような、種々の所望されない結果を生じる。
【０００６】
血管形成術、血管バイパス移植、および器官移植後の、急速に加速する外傷の特徴は、平滑筋細胞の増殖および内膜内のそれらの蓄積であるけれども、それはこれらの事象を予告する正常の内皮機能の損失であり、そしてそれらが生ずることを刺激し得る。動脈内皮は、輸送バリア、生化学的フィルターとして、および多くの血管現象の調節因子として作用する。平滑筋細胞の最も強力な血管拡張薬であるトロンボゲン抵抗性化合物、およびインヒビターは内皮由来である。内膜内の血管平滑筋細胞蓄積は、内皮の修復で止まり(Schwartzら、Am.J.Pathol.,81:15-42(1975)；Fishmanら、Lab.Invest.,32：339-51(1975))、そして内膜過形成の後退は、内皮修復が最大である場合に最大となる(Bjornssonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8651-8655)。集密な、かつ対数増殖していない内皮細胞は、最も強力な血管拡張剤、痙縮のインヒビター、および平滑筋細胞増殖のインヒビターである一連の化合物を生成する。内皮細胞により産生されるヘパラン硫酸プロテオグリカンは、平滑筋細胞の対しておびただしい数の影響を有し、これには、血管平滑筋生長を刺激することが知られている(Nugentら、Circulation Research,73:1051-1060(1993)；Castelloら、J.Cell Biol.,90：372-9(1981))、ヘパリン性結合生長因子の結合の妨害(Nugentら、Circulation Research,73:1051-1060(1993))が含まれる。従って、血管の内皮単層を修復することは、血管細胞増殖の生化学的制御に関与する薬剤または化合物をもとに戻すように見える。
【０００７】
血管内皮の所望されない増殖および病気状態を制限するその他の努力は、内皮化合物のアナログの単離された投与に焦点をあてている。ヘパリンのような特定の薬物は、組織培養および動脈病気の動物モデル中の血管平滑筋細胞増殖の特に有効なインヒビターである。まさにそれらは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンのような天然の内皮由来の化合物の活性を模倣しているからである。Edelman,E.R. & Karnovskv,M. J.Circ.89:770-776(1994)。しかし、ヘパリン様化合物の調節役割を支持する細胞培養および小動物データに関わらず、外因性のヘパリン調製物は、ヒトの試みにおいては利点を示さなかった。例えば、患者を、血管形成術後最初の18〜24時間にわたって、ヘパリンまたはデキストロース注入に対して無作為化したとき、ヘパリン処理した患者の41.2%、およびデキストロース注入患者のほんの36.7%が、再狭窄の証拠を有していた(Ellisら、Am.Heart.J.,117:777-782(1989))。さらに、出血合併症は、ヘパリン処理群で２倍の頻度であった。別の試みでは、10,000 IU/日でヘパリンを皮下注射した血管形成術患者は、標準的様式で処置された患者に比べ2.5倍のより多い再狭窄および有意により多い虚血合併症を有していた(Lehmannら、J.Am.Coll.Cardiol.,17:181A(要約)(1991))。酸化窒素およびプロスタグランジンのような非ヘパリン内皮化合物は、平滑筋細胞を含む所定範囲の生物学的効果の強力な調節剤である。これら化合物のインヒビターは、実験的血管損傷後の内膜過形成を制御することが示されている(Cookeら、Curr.Opin.Cardiol.,7:799-804(1992)；Moncadaら、N.Engl.J.Med.,329：2002-2012(1993)；McNamaraら、Biochem.Biophys.Res.Comm., 193:291-296(1993))。これは、血管内皮が血管壁の強力な調節剤であり、１つの化合物単独の産生および分泌のためではなく、無傷の単位としてのその存在のためであることを示す。動物における利点を可能にするプロトコールとヒトにおける病気を悪化するプロトコールの差違について関心が示されたが(Edelmanら、Circulation,89：770-776(1994))、ヘパリンのような単一の内皮産物が、複雑なヒト血管損傷の制御における全内皮を置換し得ないようである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、急速な再閉塞のリスクなしに、血管組織の治癒を促進し、そして血管筋細胞の増殖(過形成)を制御し、血管形成術、血管バイパス、器官移植、または血管の病気後の血管の再狭窄を防ぐ手段および方法の必要性が存在する。
【０００９】
従って、本発明の目的は、血管介入後の閉塞を防ぐ手段を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、再狭窄および血管閉塞の機構を理解および制御するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
血管内介入または損傷後の過剰の内膜生長(過形成)および/または血管平滑筋細胞増殖(過形成)を阻害する組成物および方法が開示される。好ましい実施態様では、内皮細胞は、生体適合性の生分解性または非生分解性マトリックス中またはその上に存在し、これは、細胞を居住させそして周辺組織中またはマトリックス中に産物を分泌させ、そこから、それらは周辺組織中に拡散し得る。この内皮細胞-マトリックス組成物は、例えば、血管形成術、手術、移植またはアテローム性硬化症由来の損傷された標的血管と並置され、血管の次の再狭窄または閉塞を防ぐ。
（項目１）血管領域の処置を必要とする患者の血管領域中の血管組織に対する損傷後、平滑筋細胞増殖または血管の再狭窄を阻害するための方法であって、
、該方法は、平滑筋細胞増殖を阻害するのに十分な量で、血管組織に対する損傷または遮断の外部および隣接する部位で、解離した内皮細胞をその中またはその上に接種されている生体適合性マトリックスを移植する工程を包含する、方法。
（項目２）前記損傷が、血管形成術、冠状動脈バイパス手術、抹消バイパス手術、または器官移植から生じる、項目１に記載の方法。
（項目３）前記マリックスが、ゲルまたは泡、懸濁液、マイクロカプセル、固体ポリマー基体、または繊維構造からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目４）前記細胞が、前記マトリックスが移植される患者の生検により得られる、項目１に記載の方法。
（項目５）前記マトリックスが生分解性である、項目１に記載の方法。
（項目６）前記マトリックスが、ポリヒドロキシ酸、ポリオルトエステル、ポリアンハイドライド、タンパク質、炭水化物またはポリサッカライド、ポリホスファゼン、ポリアルキレンオキシドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される物質から形成される、項目５に記載の方法。
（項目７）前記マトリックスが、エチレンビニルアセテート、ポリビニルアルコール、シリコーン、ポリウレタン、非生分解性ポリエステル、ポリエチレンオキシド-ポリプロピレンオキシド、テトラフルオロエレチンおよびそれらの混合物からないる群から選択される物質から形成される、項目１に記載の方法。
（項目８）前記マトリックスが、抗炎症剤、プロスタグランジン、プロスタノイド、アンギオテンシンおよび関連化合物、チロシンキナーゼインヒビター、免疫抑制剤、ビタミン、グルココルチコイド、抗酸化剤、フリーラジカルスカベンジャー、ペプチドホルモン、血管新生促進因子ならびに血管新生促進阻害因子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される生物学的活性化合物をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目９）前記細胞が最初にマトリックス中でインビトロ培養され、次いでインビボで移植される、項目１に記載の方法。
（項目１０）前記マトリックスが血管のまわりに手術により移植される、項目１に記載の方法。
（項目１１）血管の処置を必要とする患者における血管の血管組織に対する損傷の後、血管の内膜平滑筋細胞増殖または再狭窄を阻害する組成物であって、平滑筋細胞増殖を阻害するのに十分な量で、解離した内皮細胞をその中またはその上に接種されている生体適合性マトリックスを含む、組成物。
（項目１２）前記量が、血管形成術、冠状動脈バイパス手術、抹消バイパス手術、または器官移植から生じる損傷を処置するに有効である、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）前記マトリックスが、ゲルまたは泡、懸濁液、マイクロカプセル、固体ポリマー基体、または繊維構造からなる群から選択される、項目１１に記載の組成物。
（項目１４）前記細胞が、同種細胞、同種移植片細胞、異種移植片細胞、および遺伝子組換え細胞からなる群から選択される、項目１１に記載の組成物。
（項目１５）前記マトリックスが生分解性である、項目１１に記載の組成物。
（項目１６）前記マトリックスが、ポリヒドロキシ酸、ポリオルトエステル、ポリアンハイドライド、タンパク質、炭水化物またはポリサッカライド、ポリホスファゼン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される物質から形成される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）前記マトリックスが、エチレンビニルアセテート、ポリビニルアルコール、シリコーン、ポリウレタン、非生分解性ポリエステル、ポリエチレンオキシド-ポリプロピレンオキシド、テトラフルオロエレチンおよびそれらの混合物からなる群から選択される物質から形成される、項目１１に記載の組成物。
（項目１８）前記マトリックスが、抗炎症剤、プロスタグランジン、プロスタノイド、アンギオテンシンおよび関連化合物、チロシンキナーゼインヒビター、免疫抑制剤、ビタミン、グルココルチコイド、抗酸化剤、フリーラジカルスカベンジャー、ペプチドホルモン、血管新生促進因子ならびに血管新生促進阻害因子、からなる群から選択される生物学的活性化合物をさらに含む、項目１１に記載の組成物。
（項目１９）前記マトリックス表面が、細胞-マトリックス相互作用を改変するために修飾されている、項目１１に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、急速な再閉塞のリスクなしに、血管組織の治癒を促進し、そして血管筋細胞の増殖(過形成)を制御し、血管形成術、血管バイパス、器官移植、または血管の病気後の血管の再狭窄を防ぐ手段および方法が提供された。
【００１３】
本発明によって、血管介入後の閉塞を防ぐ手段が提供された。
【００１４】
本発明によって、再狭窄および血管閉塞の機構を理解および制御するための方法が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本明細書に記載される内膜過形成の阻害のための組成物は、異種移植片、同種移植片または自家移植片であり得る、内皮細胞が接種されたマトリックス(最も好ましくは、ヒドロゲルである)からなり、これは、過形成の領域の近くの部位でまたは過形成の領域で、血管介入のときに、または血管の再狭窄または他の閉塞の診断に際し移植される。
【００１６】
内膜過形成を阻害するための組成物
本明細書で記載される組成物を用いて、血管損傷に対する所望されない応答を阻害し、これには、例えば、狭窄または閉塞された血管を開口するために用いられた血管形成術、冠状動脈バイパスの結果として、血管の内皮組織に対する応答で生じる平滑筋血管細胞の過形成が含まれる。損傷された内皮が引き金となる血管平滑筋細胞過形成は、血管平滑筋細胞の過剰増殖に起因して血管の再狭窄を生じ得る。
【００１７】
細胞
内皮細胞は、標準的方法により、例えば、Gimbrone,M. 血管内皮の培養。Progress Hemostasis and Thrombosis 3:1-28(1976)により記載されるように単離される。細胞は、標準的な生検技法を用いる手順のときに得られ得る。この手順は、血管形成術、開放領域手術または診断目的のためであるか否かを問わない。細胞は、コラゲナーゼまたはトリプシンを用いて解離され得、そして即座に移植するために以下に記載のようにマトリックス中に直接接種され、または移植される細胞の数を生成するために必要なときインビトロで培養される。代表的には、細胞は、約103〜1012細胞/cm3の間の密度でマトリックス中またはマトリックス上に接種される。細胞密度は、肉眼による方法またはCoultercounterを用いて測定され得る。投与されるべき細胞およびマトリックスの有効量は、血管損傷の部位で過形成を防ぎまたは阻害する量である。
【００１８】
標的遺伝子または調節要素のリボザイム介在切断で得られるオリゴヌクレオチド、または標的された遺伝子の転写をブロックするアンチセンス、または不完全な、欠失または不十分な遺伝子をコードする配列を用いて遺伝子操作されているその他の細胞もまた用いられ得る。例えば、ヘパラン硫酸合成遺伝子、ヘパラン硫酸の調節因子、酸化窒素シンターゼ、生長因子、サイトカインおよびその他の血管調節因子産物の遺伝子でトランスフェクトされた細胞をマトリックス中に接種し得、そして移植され得る。ウイルスベクター、マイクロインジェクションおよびリン酸カルシウム沈殿のような標準的な方法を用いて細胞中に遺伝子をトランスフェクトし得る。
【００１９】
その他の物質もまた、マトリックスを経由して投与され得、これには、抗炎症剤、プロスタグランジン、プロスタノイド、アンギオテンシンおよび関連化合物、チロシンキナーゼインヒビター、免疫抑制剤、ビタミン、グルココルチコイド、抗酸化剤、フリーラジカルスカベンジャー、ペプチドホルモン、血管新生促進因子および血管新生促進阻害因子を含む。
【００２０】
マトリックス
内皮細胞は、血管損傷に接触隣接してまたは血管損傷の部位で、例えば、血管のまわりを覆うことによって移植するために適切である生体適合性マトリックス上またはその中に接種され得る。マトリックスは、ゲル、泡、懸濁液、マイクロカプセル、固体ポリマー基体、または繊維状構造の形態であり得る。マトリックスはまた、物理的に支持する役割で供し得る。厚さ、サイズまたは形状に関しては特別な要求はない。細胞がマトリックス内に接種されるとき、マトリックスは、栄養源およびガスのマトリックス中への自由な拡散を可能にし、細胞生存率を維持するに十分多孔性であり、その一方細胞の分泌産物をマトリックスからほぼ生理学的量で周辺組織中に拡散させることが好ましい。マトリックスはまた、免疫攻撃から非自己細胞を保護するために供し得る。
【００２１】
好ましくは、マトリックスは、加水分解により分解する合成ポリマーのような生分解性物質、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびそれらのコポリマーのようなポリヒドロキシ酸、ポリオルトエステル、ポリアンハイドライド、ゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質、またはセルロースおよび誘導体化セルロース、キトサン、アルギネート、またはそれらの組み合わせのような炭水化物またはポリサッカライドであり、その結果、マトリックス物質の移植後、数日または数週間の間に経時的にマトリックスは次第になくなる。好ましい実施態様では、マトリックスは、代表的にはマトリックスの約90重量%が吸収された水であるマトリックスとして規定されたヒドロゲルである。ヒドロゲルは、ポリフォスファゼン、アルギネートのようなポリサッカライド、およびゼラチンのようなタンパク質などの種々の水溶性ポリマーのイオン架橋または共有架橋により形成され得る。以下の実施例で示されるように、現在好ましいマトリックス物質は、精製されたゼラチンを基礎にしたGelfoamTM(The UpjohnCo.,Kalamazoo,MI)手術用スポンジである。
【００２２】
生分解性マトリックスの使用は、過形成の後退および内皮損傷の治癒の後、分解されない移植されたマトリックスを除去するための手術の必要性をなくする。しかし、合成の非生分解性物質もまた用いられ得る。有用な物質には、エレチンビニルアセテート、ポリビニルアルコール、シリコーン、ポリウレタン、非生分解性ポリエステル、およびポリエチレンオキシド-ポリプロピレンオキシド、およびテトラフルオロエチレンメッシュ(Teflon（登録商標）)が含まれる。
【００２３】
細胞のマトリックスへの付着は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、フィブリン、基底膜成分、および付着ペプチド(RGDおよび多くの他のものが公知でありそして文献中に記載されている)のような物質で、ポリマーを被覆または化学的に改変すること、付着または誘導体化することにより増大され得る。
【００２４】
マトリックスにおける細胞の培養
内皮細胞を接種したマトリックス材料は、インビトロで培養され、マトリックス全体を通じて細胞生長を促進し得る。培養培地における接種したマトリックスのインキュベーションの間の種々の時間で、接種されたマトリックスの試料を取り出し、そして、例えば、細胞染色および顕微鏡観察により検査し、マトリックス中の細胞生長および増殖の程度、および総硫酸化グリコサミノグリカン、そして特にヘパラン硫酸の産生を測定し得る。
【００２５】
細胞が、マトリックス中で所望の細胞密度に到達し、または培養されたマトリックスの大部分の間隙の上に集密に生育したとき、マトリックスを培養培地から取り出し、そして以下に記載の血管平滑筋細胞過形成を処置する手順で用いられるか、または次の移植のために貯蔵されるのいずれかである。
【００２６】
あるいは、マトリックス移植の直前に、マトリックスに細胞を接種する。
【００２７】
内膜過形成を処置する方法
患者を、血管内皮細胞損傷について、血管の特定領域を通じて流れる色素のＸ線蛍光透視法検査またはその他の視覚化技術、臨床的判定に基づく、痛みなどのような症状の存在、または物理的検査で証明される兆候のような公知の方法を用いて診断し得る。あるいは、損傷は、血管形成術、動脈バイパス移植、抹消バイパス手術、または器官移植のような手順の実施に起因して生じ、損傷または病気が必然的に生じるという仮定に基づいて患者が処置されることが仮定され得る。
【００２８】
好ましい実施態様では、内皮細胞-マトリックス細片は、開放領域手術の間に損傷の部位に付与される。この実施態様では、培養されたマトリックスの細片は、損傷の内部部位にわたって、損傷した血管の外面に、通常、血管のまわりをマトリックス細片を覆うことにより付与される。移植後、細胞は、生存したままで、そしてヘパラン硫酸を含む、硫酸化グリコサミノグリカンのような因子を産生する。
【００２９】
内膜過形成が、マトリックス細片の移植または被覆の前に観察された場合、過形成の後退は、代表的には、痛み、または減少した血流のその他の症状の減少、または造影技法の使用により確認される。過形成の減少または損傷した血管を通じる流速の増加は、血管内皮に対する損傷または血管の遮断をはじめに診断するために用いたのと同じ方法によりモニターされ得る。
【００３０】
以下の非限定的な実施例は、血管平滑筋細胞過形成および血管の再狭窄を処置するために用いられる組成物および方法の種々の局面のいくつかを例示する。
【００３１】
実施例１:接種されたマトリックス中の細胞移植および培養された細胞の特徴付け
ウシ大動脈内皮細胞(BAE)および変異体チャイニーズハムスター卵巣(CHO-745)細胞をGelfoamTMマトリックス上で培養した。変異体細胞は、J.Esko博士(Universityof Alabama, Birmingham, AB)から得、これらは示し得るヘパラン硫酸を産生しないので(Esko 1992)コントロール細胞として供し、そして、その結果、内皮細胞とは異なり、培養された血管平滑筋細胞へのbFGF結合またはその有糸分裂誘発を阻害しない(Nugentら、1993)。GelfoamTMは、移植可能な手術スポンジとして長く、そしてより最近細胞生長のための足場として用いられている(Centraら、1992)。ブタ皮膚のゼラチンから単離されるこの物質は、ブロックで供給され(UpJohnInc.)、2.5×１×0.3cm3の細片に切断し、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)中で10分間オートクレーブすることにより水和した。冷却に際し、ブロックを、17×100mmポリプロピレンチューブ中に置き、それに２mLの細胞懸濁液(0.6×105細胞/mL)を添加した。内皮細胞は、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)中に懸濁し、そしてCHO-745細胞はハムのF-12培地中に懸濁した。培地には、1g/Lグルコースおよび10%ウシ血清を補填した。
【００３２】
培養チューブを穏やかに攪拌し、細胞を分散させ、次いで、45゜の角度で、37℃、湿潤化した、５% CO2および95%空気中、15日までインキュベートした。生長培地は、３、７および12日に交換した。０、２、４、７、10および15日に、培地中の細胞数(非接着細胞)およびGelfoamTMに付着した細胞数を血球計数器を用いて測定した。付着した細胞を計数する前に、GelfoamTMブロックをHBSSで４回洗浄し、非付着細胞および血清を取り除いた。コラゲナーゼ(1mg/mL)を用いてGelfoamTMを消化し、マトリックスからすべての細胞を放出させた。80μLのアリコートを細胞計数のために取り出し、そして生存率をトリパンブルー排除によりチェックした。
【００３３】
結果を図１に示す。データ点の各々は、２回の測定の平均細胞数±標準誤差(SEM)を示す。
【００３４】
細胞は、この三次元のコラーゲン様マトリックス(Centraら、1992)の間隙を裏打ちし、そして外に移動することなくマトリックス内に残った。細胞生長は、組織培養ポリスチレンについて観察されたパターンに類似のパターンに従った。トリパンブルー排除により評価された細胞生存率は、培養の経過にわたって、BAEについて90±2.3%、およびCHO-745について93.1±1.7%で維持された。
【００３５】
組織培養中のまたはラット頸動脈周囲の配置14日後回収されたGelfoamTMブロック内の細胞の免疫的同一性の保存は、Edelmanら、J.Clin.Invest.89:465-471(1992)により記載されたように、内皮マーカーであるフォンウィレブランド因子を免疫染色することにより測定した。
【００３６】
GelfoamTM上で培養された細胞または組織培養ポリスチレンにより産生された馴化培地中のヘパラン硫酸の量を測定した。内皮細胞またはCHO-745細胞を含むGelfoamTMフィルムを、抗生物質を含まず、かつウシ血清を含まない培養培地中で、24時間37℃でインキュベートした。コントロールとして、細胞を含まない同一のGelfoamTMフィルムをそれぞれの培地でインキュベートした。培地を集め、遠心分離し(5,000×g)、水に対して徹底的に透析し、そして凍結乾燥により濃縮した。総硫酸化グリコサミノグリカンを、ジメチルメチレンブルーを用いて測定し(Farndaleら、Biochimicaet Biophysica Acta 883:173-177(1986))、そしてヘパラン硫酸の量を、試料をヘパリナーゼで処理した後評価した。GelfoamTM上で生育した内皮およびCHO-745細胞はまた、35SO4を用いて放射能標識(100μCi/mL、24時間)し、細胞によるヘパラン硫酸の代謝合成を可視化した。培地を集め、遠心分離し、そして35SO4プロテオグリカンを遊離の35SO4から、カチオン性ナイロン膜(RapraegerおよびYeaman,Anal.Biochem.179:361-365(1989))を通じる真空濾過により分離した。35SO4プロテオグリカンを含むフィルターを亜硝酸中でインキュベートし(3.6M酢酸と組み合わせた0.48M亜硝酸ナトリウム)、そしてヘパラン硫酸内に取り込まれた放射能活性の量を測定した。
【００３７】
移植された細胞は、生化学的分泌能力および生物学的能力ならびに免疫的同一性を完全に保持して生存を維持していた。GelfoamTM上で培養された細胞は、同じ細胞がポリスチレン皿上で生長したとき産生されるのとほぼ同一量の総硫酸化グリコサミノグリカンおよびヘパラン硫酸を産生した。さらに、５%SDS-PAGE上で分析したとき、プロテオグリカンのプロフィールにおける有意な差違は存在しなかった。GelfoamTMおよび組織培養ポリスチレン上で生育した両方の細胞について、大部分のプロテオグリカンは、タンパク質標準に対して600kDaより大きいバンドとして移動した。GelfoamTM上で生長したCHO-745細胞と比較したとき、移植された内皮細胞は、11.1倍より多い量グリコサミノグリカンを産生した(内皮細胞について4.1±0.3マイクログラム/106細胞/日、対、CHO-745細胞について0.37±0.02マイクログラム/106細胞/日)。内皮細胞により産生されたグリコサミノグリカンの29.1%がヘパラン硫酸であったが(1.2±0.05マイクログラム/106細胞/日)、CHO-745細胞は、検出可能なヘパラン硫酸を産生しなかった。GelfoamTM移植内皮細胞からの馴化培地はまた、図２に示されるように、125I-bFGFのヘパラン硫酸プロテオグリカンへの結合、および血管平滑筋細胞に対するbFGFの有糸分裂促進効果の両方を、用量依存様式で阻害した。対照的に、図２に示されるように、CHO-745細胞からの馴化培地は、結合に対して影響を有さず、同様に、成長因子で誘導される有糸分裂促進に対して影響を有さなかった。
【００３８】
実施例２：ラットにおける内膜過形成の阻害
BAE細胞を含むマトリックス細片のラット中への移植
マトリックス細片中の移植された細胞のインビボ効果を、Sprague-Dawleyラット中の内皮表面剥脱動脈損傷モデルにおいて評価した。BAE細胞またはCHO-745細胞を含む、または細胞を含まないGelfoamTMゼラチンマトリックスの細片(各々2.5×１×0.3cm3)を、バルーンカテーテルで表面剥脱した頸動脈のまわりを覆い、そして平滑筋細胞増殖および内膜過形成に対するそれらの影響を、２週間後に測定した。
【００３９】
Sprague-Dawleyラット中の左総頸動脈の内皮表面剥脱を、外部頸動脈切開を通じて導入された２ French Fogartyバルーンカテーテルを用い、そして総頸動脈の内皮上をその膨張された状態で３回通過させることにより実施した(Edelmanら、1992、Clowesら、1983、Edelmanら、1990)。BAE細胞、CHO-745細胞を含む、または細胞を含まないGelfoamTMの細片(各々2.5×１×0.3cm3)で、表面剥脱した頸動脈のまわりを覆った。細片の端部を重複させ、動脈の完全な取り囲みを確実にした。筋膜面を閉鎖して縫合し、デバイスをさらに固定化した。
【００４０】
証明された内皮細胞アナログの薬理学的用量に対して、内皮細胞産物の予期される生理学的分泌の結果を比較するために、ヒドロゲルフィルムを処方し(Nathanら、1994)、ヘパリン単独を用量2.5±0.1マイクログラム/日で放出した。この用量および送達の様式は、新内膜過形成のヘパリンの阻害を最大にすることが先に示されている(Edelmanら、1990；Edelmanら、1993；EdelmanおよびKarnovsky 1994)。
【００４１】
手術後第14日後に、動物を安楽死させ、そしてリンガーの乳酸溶液を用い左心室を経由して清澄に灌流し、次いでCarnoyの固定液(60%メタノール、30%クロロホルム、10%氷酢酸)を用いて浸漬固定した。移植されたマトリックスの位置を記し、そしてマトリックスを無傷の動脈の完全長さを有して回収した。頸動脈を回収し、そしてGelfoamTMの被覆を含む３つと上下のセグメントの、５つの等しいセグメントに切断した。セグメントをパラフィン包埋し、そして６ミクロンのセクションを各セグメントの長さに沿って得た。
【００４２】
ヘマトキシリン/エオシンまたはverHoeffのエラスチン染色を用いて染色した後、内膜、中央および外膜領域、内膜：中膜流域領域比および管腔閉塞のパーセントを、専用のビデオ顕微鏡および特注のソフトウェアを用いたコンピューター化したデジタル面積測定法を用いて計算した。細胞増殖は、増殖細胞核抗原性(PCNA)の免疫細胞化学的同定、および手術後３日および７日、かつ屠殺の１時間前に、50mg/kg体重で、腹腔内に注射されたチミジンアナログである5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU、NewEngland Nuclear, Dupont Corp., Wilmington, DE)を用いてアッセイした。
【００４３】
覆われていないバルーン損傷動脈のセグメントを、GelfoamTMで覆ったセグメントと比較した。比較は、処置群を横切って、および処置群内で行い、各動物をそれ自身のコントロールとして供させた。統計的比較は、分散分析(ANOVA)を用いて実施し、そして次いで群間の差違はStudentのt検定を用いて実施した。データは、0.05より大きいp値が観察されたとき、有意に異なるものではないとして拒否した。データラインの適合性は、線形回帰および相関モデルを用いて確立された。
【００４４】
内皮細胞移植片のインビボ能力は、それらのインビトロ効果に加えて保持されていた。頸動脈内皮のバルーン表面剥脱は、図３に示されるように、内膜の領域対中膜の領域(I:M)の比における1.44±0.16までの増加に至った。内皮細胞を含むGelfoamTMに曝された動脈壁セグメントは、最小の過形成の疾患を示した。移植されたGelfoamTMの下の動脈セグメント中の内膜過形成は、0.17±0.07まで減少した。この調節効果は内皮細胞に特異的であった。コントロールのCHO-745細胞移植片は、図３により示されるように、バルーン損傷、単独またはからのGelfoamTMマトリックス(I:M 1.20±0.11)に比べて、内膜過形成に対して統計的に有意な影響は有さなかった(I:M 1.36±0.32)。
【００４５】
ヘパリンは、主要な部分で、平滑筋細胞増殖および内膜過形成の貴重な標準的インヒビターとして同定されている。何故なら、それは、内皮細胞由来のヘパラン硫酸プロテオグリカンに似ているからである。実際、ヒドロゲルフィルムからのヘパリン単独の血管周囲への放出は、増殖をI:M 0.55±0.11に減少させた。しかし、この結果は、内皮移植片からのヘパラン硫酸プロテオグリカンの放出速度の２倍のヘパリンのヒドロゲル放出にも関わらず、移植された内皮細胞により奏されるコントロールより3.2倍より効果的でなかった。
【００４６】
GelfoamTMに移植された内皮細胞は、増殖および内膜過形成を減少させた。中膜および内膜における細胞総数に対する増殖する細胞の数を増殖の指標として用いた。移植された内皮細胞を有するGelfoamTM移植片は、図４に示されるように、からのGelfoamTM移植片に対して、内膜(20.4%減少)および中膜(26.3%減少)の両方において、細胞増殖における有意な減少を引き起こした。ヘパリン注入もまた、増殖を減少させたが、この効果は、調べた動物およびセクションの数では統計的に有意ではなかった。バルーン損傷単独に対して、ヘパリン注入は、図４に示されるように、BrdU免疫染色を、内膜において11.0%、そして中膜において12.2%減少させた。
【００４７】
移植片が細胞または全身拒絶を誘導したことの証拠はなかった。移植片を有する動物の全身健康および外観は、コントロールと変わらなかった。バルーン損傷単独を受けたラットは、14日の実験期間にわたって52.9±3.6gに達し、そしてDMEMまたはHAMS-F12のいずれかで水和された無細胞の移植片を受けた動物は、48.0±7.3gに達した。内皮接種移植片で移植された動物は、51.3±2.8gに達し、そしてCHO-745を積んだ移植片を有する動物は、53.4±6.5gに達した。血管周囲のヘパリンを受けたラットは、56.7±6.2gに達し、処置が副作用を有さなかったことを示した。
【００４８】
これらの結果は、三次元バイオポリマー足場上の、細胞生存率、正常生長特性、免疫学的マーカー、生化学的活性および生理学的効果を有する内皮細胞の移植を示す。
【００４９】
移植された内皮細胞の生物学効果は、細胞特異的であり、かつ、内皮産物の単一の薬理学的アナログであるヘパリンの注入に比べて優れていた。ヘパリン硫酸プロテオグリカン欠陥のCHO-745細胞ではなく、移植片移植内皮細胞からの馴化培地は、用量依存様式で、血管平滑筋細胞に対するbFGF結合および有糸分裂誘発を阻害した。同様に、内皮細胞移植片のみが内膜過形成を阻害した。移植片単独またはCHO-745細胞を接種した移植片は、細胞増殖または内膜過形成に対して統計的に有意な影響を有さなかった。ヘパリンは、内皮細胞によるヘパラン硫酸プロテオグリカン産生の２倍の速度で放出されたときでさえ、内皮過形成および平滑筋細胞増殖が、内皮細胞移植片を用いたときより3.2倍減少させたに過ぎなかったが、血管平滑筋細胞に対する最も有効な抗増殖性薬剤の１つである。
【００５０】
内皮細胞移植物により奏される制御は、移植された細胞の生化学的効果から単独に生ずるようである。内皮細胞-特異的マーカーを用いる免疫染色は、内因性内皮細胞の初期回復、または移植された細胞の、それらのバイオポリマー足場から、回復した動脈セグメントのいずれか中の動脈内層への移動に対する証拠を検出しなかった。移植片の影響は、他の化合物の血管周囲放出で観察された焦点効果と類似の様式で局在化された。全身的または局所的免疫応答または移植片拒絶の証拠はなかった。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、GelfoamTM(TheUpjohn Co.,Kalamazoo,MI)コラーゲンマトリックス上の、ウシ大動脈内皮細胞(BAE)細胞(白丸)、およびチャイニーズハムスター卵巣745細胞(平滑筋細胞増殖の調節剤を産生しないコントロール)(黒丸)の増殖(細胞数として測定した)の経時的(日)なグラフである。
【図２】図２は、CHO-745細胞Gelfoam（登録商標）馴化培地による血管平滑筋細胞に対するbFGF結合(白丸)および有糸分裂誘発(線影の四角)の阻害と比較した、内皮細胞-Gelfoam（登録商標）馴化培地による血管平滑筋細胞に対する強力な血管細胞生長プロモーターbFGFの結合(黒丸)および有糸分裂誘発(黒四角)の阻害(コントロールの%)のグラフである。
【図３】図３は、バルーンで損傷した動脈を、Gelfoam（登録商標）単独(Gel)、CHO-745細胞で移植したGelfoam（登録商標）(CHO)、ヘパリンを含むGelfoam（登録商標）(Hep)、および内皮細胞を含むGelfoam（登録商標）(EC)に曝したときの、内皮のバルーン表面剥脱後の中膜の領域に対する内膜の領域の比(BI)のグラフである。
【図４】図４は、バルーン血管形成術(BI)後、内皮細胞を移植したGelfoam（登録商標）(EC)、ヘパリンを含むGelfoam（登録商標）(Hep)、CHO-745細胞で移植したGelfoam（登録商標）(CHO)、Gelfoam（登録商標）コントロールのいずれかに曝したとき、または非処置の、内膜(白棒)および中膜(黒棒)について増殖細胞の%を比較する、内膜および中膜の両方における細胞増殖を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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