(57)【要約】【課題】  ポリペプチド成分の安定性を促進する、生理学的に適合性の安定化剤を含むさらなる薬学的組成物を提供すること。それにより、その治療有効性が維持される。【解決手段】  安定化された液体の薬学的組成物であって、以下：  治療上活性な成分としてのインターロイキン−２(ＩＬ−２)またはその改変体であって、ＩＬ−２またはその改変体は、液体処方物中での貯蔵の間に凝集体形成を示す、ＩＬ−２またはその改変体；  組成物の貯蔵の間のＩＬ−２またはその改変体の凝集体形成を減少するために十分な量のアミノ酸塩基であって、該アミノ酸塩基は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む、アミノ酸塩基；ならびに  緩衝剤であって、緩衝剤は、その塩形態を実質的に含まない酸、その塩形態にある酸、ならびに酸およびその塩形態の混合物からなる群より選択される、緩衝剤を含む、組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化された液体の薬学的組成物であって、以下：
治療上活性な成分としてのインターロイキン−２（ＩＬ−２）またはその改変体であって、該ＩＬ−２またはその改変体は、液体処方物中での貯蔵の間に凝集体形成を示す、ＩＬ−２またはその改変体；
該組成物の貯蔵の間の該ＩＬ−２またはその改変体の凝集体形成を減少するために十分な量のアミノ酸塩基であって、該アミノ酸塩基は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む、アミノ酸塩基；ならびに
緩衝剤であって、該緩衝剤は、その塩形態を実質的に含まない酸、その塩形態にある酸、ならびに酸およびその塩形態の混合物からなる群より選択される、緩衝剤
を含む、組成物。
【請求項２】
約２４０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３６０ｍｍｏｌ／ｋｇの容量オスモル濃度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
約ｐＨ４．０〜約ｐＨ９．０の範囲内のｐＨを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記酸が、酢酸、コハク酸、クエン酸、リン酸、およびグルタミン酸からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記酸がコハク酸である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の組成物であって、前記アミノ酸塩基が、約１００ｍＭ〜約４００ｍＭの濃度で存在する遊離塩基形態のアルギニンであり、前記コハク酸が、約８０ｍＭ〜約１９０ｍＭの濃度範囲内で該組成物中に存在する、組成物。
【請求項７】
前記遊離塩基形態にあるアルギニンが、約１５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度で存在する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記遊離塩基形態にあるアルギニンが、約２３０ｍＭの濃度で存在し、前記コハク酸が、約１２８ｍＭの濃度で存在する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＩＬ−２が、組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）またはその改変体である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
約５．０〜約６．５のｐＨおよび約２５０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３３０ｍｍｏｌ／ｋｇの容量オスモル濃度を有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記酸がクエン酸である、請求項５に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物であって、前記アミノ酸塩基が、約１７５ｍＭ〜約４００ｍＭの濃度で存在する遊離塩基形態のアルギニンであり、前記クエン酸が、約４０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度範囲内で該組成物中に存在する、組成物。
【請求項１３】
前記ＩＬ−２またはその改変体が、液体処方物中での貯蔵の間に酸化される、少なくとも１つのメチオニン残基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組成物であって、該組成物の貯蔵の間の前記ＩＬ−２中の前記少なくとも１つのメチオニン残基の酸化を防止するために十分な量のメチオニンをさらに含む、組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載の組成物であって、該組成物の貯蔵の間の凍結融解または機械的剪断に応答する、前記ＩＬ−２またはその改変体の凝集を防止するために十分な量の非イオン性界面活性剤をさらに含む、組成物。
【請求項１６】
前記非イオン性界面活性剤がポリソルベート８０である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
安定化された液体の薬学的組成物であって、該組成物は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはその改変体、遊離塩基形態にあるアルギニン、およびその塩形態を実質的に含まないコハク酸を含み、該遊離塩基形態にあるアルギニンは、約１５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度で該組成物中に存在し、該コハク酸は、約８０ｍＭ〜約１９０ｍＭの濃度で該組成物中に存在する、組成物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の組成物であって、前記遊離塩基形態にあるアルギニンが、約２３０ｍＭの濃度で該組成物中に存在し、前記コハク酸が約１２８ｍＭの濃度で存在し、ここで、該組成物は、約５．０〜約６．５のｐＨおよび約２５０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３３０ｍｍｏｌ／ｋｇの容量オスモル濃度を有する、組成物。
【請求項１９】
液体の薬学的組成物中のインターロイキン−２（ＩＬ−２）またはその改変体の安定性を増加するための方法であって、該ＩＬ−２またはその改変体は、液体処方物中での貯蔵の間に凝集体形成を示し、該方法は、該ＩＬ−２またはその改変体の該凝集体形成を減少するために十分な量のアミノ酸塩基、および緩衝剤を該組成物に組み込む工程を包含し、該緩衝剤は、その塩形態を実質的に含まない酸、その塩形態にある酸、ならびに酸およびその塩形態の混合物からなる群より選択され、該アミノ酸塩基は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む、方法。
【請求項２０】
前記組成物が、約２４０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３６０ｍｍｏｌ／ｋｇの容量オスモル濃度を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が、約ｐＨ４．０〜約ｐＨ９．０の範囲内のｐＨを有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記酸が、酢酸、コハク酸、クエン酸、リン酸、およびグルタミン酸からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記酸がコハク酸である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはその改変体を含む薬学的組成物の貯蔵安定性を増加するための方法であって、該ＩＬ−２またはその改変体は、液体処方物中での貯蔵の間、凝集体形成を示し、該方法は、該ＩＬ−２またはその改変体の該凝集体形成を減少するために十分な量のアミノ酸塩基、および緩衝剤を該組成物に組み込む工程を包含し、該緩衝剤は、その塩形態を実質的に含まない酸、その塩形態にある酸、ならびに酸およびその塩形態の混合物からなる群より選択され、該アミノ酸塩基は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む、方法。
【請求項２５】
前記酸がコハク酸である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
凍結乾燥形態およびスプレー乾燥形態からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物の乾燥形態。
【請求項２７】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）での治療に応答性の疾患の診断、予防、または処置のための処方物であって、該処方物は、請求項１に記載の薬学的組成物を含む、処方物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、薬学的組成物に関し、より詳細には、代表的には、液体の薬学的処方物においては不安定であるポリペプチドを含む薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
遺伝子操作技術の発展における最近の進歩は、薬物として使用するための十分に大量な、広範な種々の生物学的に活性なポリペプチドを提供してきた。しかし、ポリペプチドは、物理的不安定性（変性、ならびに可溶性および不溶性凝集物の形成を含む）および種々の化学的不安定性（例えば、加水分解、酸化、および脱アミド化）の結果として、生物学的活性を失い得る。液体の薬学的処方物におけるポリペプチドの安定性は、例えば、ｐＨ、イオン強度、温度、凍結融解の反復サイクル、および機械的剪断力（例えば、処理の間に生じるような）への曝露のような因子により影響を及ぼされ得る。凝集物の形成および生物学的活性の喪失はまた、保存バイアル内の溶液中および液体−空気界面におけるポリペプチド分子の物理的攪拌および相互作用の結果として生じ得る。さらなるコンホメーション変化は、運搬または他の方法の間の攪拌から生じる、界面の圧縮−拡張の間に、液体−空気界面および固体−液体界面に吸着するポリペプチドで生じ得る。このような攪拌は、タンパク質がもつれ（ｅｎｔａｎｇｌｅ）、凝集し、粒子を形成し、そして最終的には他の吸着したタンパク質とともに沈殿することを引き起こし得る。タンパク質医薬品の安定性についての一般的な総説については、例えば、Ｍａｎｎｉｎｇら（１９８９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．６：９０３−９１８、およびＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｏｎ（１９８８）Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．４２：Ｓ１４を参照のこと。
【０００３】
ポリペプチドを含有する液体の薬学的処方物の不安定性は、再構成するための適切な液体媒体とともに凍結乾燥形態でこれらの処方物を適切なパッケージングすることを引き起こした。凍結乾燥は、組成物の保存安定性を改善したが、多くのポリペプチドは、乾燥した状態での保存の間（Ｐｉｋａｌ（１９９０）Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２７：２６−３０）または液体処方物として再構成する際の凝集物形成もしくは触媒活性の喪失の結果として（例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら（１９９１）Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ  ７４：２２５−２３９；Ｂｒｏａｄｈｅａｄら（１９９２）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．１８：１１６９−１２０６；Ｍｕｍｅｎｔｈａｌｅｒら（１９９４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１１：１２−２０；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｃｒｏｗｅ（１９８８）Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２５：４５９−４７０；およびＲｏｓｅｒ（１９９１）Ｂｉｏｐｈａｒｍ．４：４７−５３）のいずれかで、活性の低下を示す。添加物の使用は、乾燥タンパク質の安定性を改善したが、多くの再水和処方物は、受け入れられない量または所望でない量の不活性な、凝集したタンパク質を有し続けた（例えば、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  ａｎｄ  ＤｅＬｕｃａ（１９８３）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８０：６３−６６；Ｈｏｒａら（１９９２）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９：３３−３６；Ｙｏｓｈｉａｋａら（１９９３）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ，１０：６８７−６９１を参照のこと）。また、再構成の必要性は、不便であり、そして不正確な投薬の可能性をもたらす。
【０００４】
多くの液体の薬学的組成物は、そこに含まれるポリペプチドの生物学的活性を安定化するために処方されてきた一方、液体処方物におけるポリペプチドの分解は、医師に問題を与え続けてきた。結論として、ポリペプチド成分の安定性を促進する、生理学的に適合性の安定化剤を含むさらなる薬学的組成物が必要であり、それにより、これらの治療有効性が維持される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
治療活性成分としてポリペプチドを含む組成物およびこれらの調製に有用な方法が提供される。この組成物は、通常、液体処方物中での保存の間に、ポリペプチドの凝集の結果として、治療活性成分としての有効性が損なわれるポリペプチドを含む、安定化された液体の薬学的組成物である。本発明の安定化された液体の薬学的組成物は、液体処方物中での保存の間に凝集物形成を示すポリペプチドに加えて、保存の間にこのポリペプチドの凝集物形成を低下させるに十分な量のアミノ酸塩基を含み、ここで、このアミノ酸塩基は、アミノ酸またはアミノ酸の組み合わせであり、ここで、任意の所定のアミノ酸がそのフリーな塩基形態またはその塩形態のいずれかで存在する。この組成物は、このポリペプチドの安定性のために、受容可能な範囲内で液体組成物のｐＨを維持するために緩衝化剤をさらに含む。ここで、この緩衝化剤は、塩形態を実質的に含まない酸、塩形態の酸、または酸およびその塩形態の混合物である。
【０００６】
このアミノ酸塩基は、液体の薬学的組成物の保存の間の凝集物形成に対してポリペプチドを安定化するように働く一方、緩衝化剤として、塩形態を実質的に含まない酸、塩形態の酸、または酸およびその塩形態の混合物の使用により、等張性に近い容量オスモル濃度を有する液体組成物が生じる。この液体の薬学的組成物は、このポリペプチドの安定性をさらに増すために、さらに他の安定化剤、より詳細には、メチオニン、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）およびＥＤＴＡを組み込み得る。このような液体の薬学的組成物は、安定化されているといわれ、塩形態を実質的に含まない酸、塩形態の酸、または酸とその塩形態の混合物と組み合わせてアミノ酸塩基の付加として、これら２つの成分の組み合わせがない場合に処方された液体の薬学的組成物に対して増加した保存安定性を有する組成物を生じる。
【０００７】
液体の薬学的組成物におけるポリペプチドの安定性を増大する方法およびこのような薬学的組成物の保存安定性を増大する方法もまた、提供される。これらの方法は、液体の薬学的組成物中に、この組成物の保存の間にポリペプチドの凝集物形成を低減するに十分な量のアミノ酸塩基、および緩衝化剤（ここで、この緩衝化剤は、塩形態を実質的に含まない酸、塩形態の酸、または酸およびその塩形態の混合物である）を組み込む工程を包含する。この方法は、本発明の液体の薬学的組成物の調製における使用が見出される。
【０００８】
上記に加えて、本発明は、以下を提供する。
【０００９】
項目１  安定化された液体の薬学的組成物であって、以下：
治療上活性な成分としてのポリペプチドまたはその改変体であって、該ポリペプチドまたはその改変体は、液体処方物中での貯蔵の間に凝集体形成を示す、ポリペプチドまたはその改変体；
該組成物の貯蔵の間の該ポリペプチドまたはその改変体の凝集体形成を減少するために十分な量のアミノ酸塩基であって、該アミノ酸塩基は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む、アミノ酸塩基；ならびに
緩衝剤であって、該緩衝剤は、その塩形態を実質的に含まない酸、その塩形態にある酸、ならびに酸およびその塩形態の混合物からなる群より選択される、緩衝剤
を含む、組成物。
【００１０】
項目２  前記ポリペプチドが、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）、およびβ−インターフェロン（ＩＦＮ−β）からなる群より選択される、項目１に記載の組成物。
【００１１】
項目３  約２４０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３６０ｍｍｏｌ／ｋｇの容量オスモル濃度を有する、項目１に記載の組成物。
【００１２】
項目４  約ｐＨ４．０〜約ｐＨ９．０の範囲内のｐＨを有する、項目１に記載の組成物。
【００１３】
項目５  前記酸が、酢酸、コハク酸、クエン酸、リン酸、およびグルタミン酸からなる群より選択される、項目１に記載の組成物。
【００１４】
項目６  前記酸がコハク酸である、項目５に記載の組成物。
【００１５】
項目７  項目６に記載の組成物であって、前記アミノ酸塩基が、約１００ｍＭ〜約４００ｍＭの濃度で存在する遊離塩基形態のアルギニンであり、前記コハク酸が、約８０ｍＭ〜約１９０ｍＭの濃度範囲内で該組成物中に存在する、組成物。
【００１６】
項目８  前記ポリペプチドが、インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはその改変体であり、前記遊離塩基形態にあるアルギニンが、約１５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度で存在する、項目７に記載の組成物。
【００１７】
項目９  前記遊離塩基形態にあるアルギニンが、約２３０ｍＭの濃度で存在し、前記コハク酸が、約１２８ｍＭの濃度で存在する、項目８に記載の組成物。
【００１８】
項目１０  前記ＩＬ−２が、組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）またはその改変体である、項目９に記載の組成物。
【００１９】
項目１１  約５．０〜約６．５のｐＨおよび約２５０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３３０ｍｍｏｌ／ｋｇの容量オスモル濃度を有する、項目９に記載の組成物。
【００２０】
項目１２  前記ポリペプチドが、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）またはその改変体であり、前記遊離塩基形態にあるアルギニンが、約１７５ｍＭ〜約３２５ｍＭの濃度で存在する、項目７に記載の組成物。
【００２１】
項目１３  前記遊離塩基形態にあるアルギニンが、約２００ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度で存在し、前記コハク酸が、約１２０ｍＭ〜約１８０ｍＭの濃度で存在する、項目１２に記載の組成物。
【００２２】
項目１４  前記ＴＦＰＩが、組換えヒトＴＦＰＩまたはその改変体である、項目１３に記載の組成物。
【００２３】
項目１５  約５．０〜約６．５のｐＨおよび約２４０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３６０ｍｍｏｌ／ｋｇの容量オスモル濃度を有する、項目１３に記載の組成物。
【００２４】
項目１６  前記酸がクエン酸である、項目５に記載の組成物。
【００２５】
項目１７  項目１６に記載の組成物であって、前記アミノ酸塩基が、約１７５ｍＭ〜約４００ｍＭの濃度で存在する遊離塩基形態のアルギニンであり、前記クエン酸が、約４０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度範囲内で該組成物中に存在する、組成物。
【００２６】
項目１８  前記ポリペプチドがＴＦＰＩまたはその改変体である、項目１７に記載の組成物。
【００２７】
項目１９  前記ＴＦＰＩが組換えヒトＴＦＰＩ（ｒｈＴＦＰＩ）である、項目１８に記載の組成物。
【００２８】
項目２０  前記遊離塩基形態にあるアルギニンが、約２５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度で存在し、前記クエン酸が、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度で存在する、項目１８に記載の組成物。
【００２９】
項目２１  約５．０〜約６．５のｐＨおよび約２４０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３６０ｍｍｏｌ／ｋｇの容量オスモル濃度を有する、項目２０に記載の組成物。
【００３０】
項目２２  前記ポリペプチドまたはその改変体が、液体処方物中での貯蔵の間に酸化される、少なくとも１つのメチオニン残基を含む、項目１に記載の組成物。
【００３１】
項目２３  項目２２に記載の組成物であって、該組成物の貯蔵の間の前記ポリペプチド中の前記少なくとも１つのメチオニン残基の酸化を防止するために十分な量のメチオニンをさらに含む、組成物。
【００３２】
項目２４  項目１に記載の組成物であって、該組成物の貯蔵の間の凍結融解または機械的剪断に応答する、前記ポリペプチドまたはその改変体の凝集を防止するために十分な量の非イオン性界面活性剤をさらに含む、組成物。
【００３３】
項目２５  前記非イオン性界面活性剤がポリソルベート８０である、項目２４に記載の組成物。
【００３４】
項目２６  安定化された液体の薬学的組成物であって、該組成物は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはその改変体、遊離塩基形態にあるアルギニン、およびその塩形態を実質的に含まないコハク酸を含み、該遊離塩基形態にあるアルギニンは、約１５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度で該組成物中に存在し、該コハク酸は、約８０ｍＭ〜約１９０ｍＭの濃度で該組成物中に存在する、組成物。
【００３５】
項目２７  項目２６に記載の組成物であって、前記遊離塩基形態にあるアルギニンが、約２３０ｍＭの濃度で該組成物中に存在し、前記コハク酸が約１２８ｍＭの濃度で存在し、ここで、該組成物は、約５．０〜約６．５のｐＨおよび約２５０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３３０ｍｍｏｌ／ｋｇの容量オスモル濃度を有する、組成物。
【００３６】
項目２８  安定化された液体の薬学的組成物であって、該組成物は、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）またはその改変体、遊離塩基形態にあるアルギニン、およびその塩形態を実質的に含まないコハク酸を含み、該遊離塩基形態にあるアルギニンは、約１７５ｍＭ〜約３２５ｍＭの濃度で該組成物中に存在し、該コハク酸は、約８０ｍＭ〜約１９０ｍＭの濃度で該組成物中に存在する、組成物。
【００３７】
項目２９  項目２８に記載の組成物であって、前記遊離塩基形態にあるアルギニンが、約２００ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度で該組成物中に存在し、前記コハク酸が約１２０ｍＭ〜約１８０ｍＭの濃度で存在し、ここで、該組成物は、約５．０〜約６．５のｐＨおよび約２４０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３６０ｍｍｏｌ／ｋｇの容量オスモル濃度を有する、組成物。
【００３８】
項目３０  安定化された液体の薬学的組成物であって、該組成物は、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）またはその改変体、遊離塩基形態にあるアルギニン、およびその塩形態を実質的に含まないクエン酸を含み、該遊離塩基形態にあるアルギニンは、約１７５ｍＭ〜約４００ｍＭの濃度で該組成物中に存在し、該クエン酸は、約４０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度で該組成物中に存在する、組成物。
【００３９】
項目３１  項目３０に記載の組成物であって、前記遊離塩基形態にあるアルギニンが、約２５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度で該組成物中に存在し、前記クエン酸が約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度で存在し、ここで、該組成物は、約５．０〜約６．５のｐＨおよび約２４０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３６０ｍｍｏｌ／ｋｇの容量オスモル濃度を有する、組成物。
【００４０】
項目３２  液体の薬学的組成物中のポリペプチドまたはその改変体の安定性を増加するための方法であって、該ポリペプチドまたはその改変体は、液体処方物中での貯蔵の間に凝集体形成を示し、該方法は、該ポリペプチドまたはその改変体の該凝集体形成を減少するために十分な量のアミノ酸塩基、および緩衝剤を該組成物に組み込む工程を包含し、該緩衝剤は、その塩形態を実質的に含まない酸、その塩形態にある酸、ならびに酸およびその塩形態の混合物からなる群より選択され、該アミノ酸塩基は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む、方法。
【００４１】
項目３３  前記組成物が、約２４０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３６０ｍｍｏｌ／ｋｇの容量オスモル濃度を有する、項目３２に記載の方法。
【００４２】
項目３４  前記組成物が、約ｐＨ４．０〜約ｐＨ９．０の範囲内のｐＨを有する、項目３２に記載の方法。
【００４３】
項目３５  前記酸が、酢酸、コハク酸、クエン酸、リン酸、およびグルタミン酸からなる群より選択される、項目３２に記載の方法。
【００４４】
項目３６  前記酸がコハク酸である、項目３５に記載の方法。
【００４５】
項目３７  ポリペプチドまたはその改変体を含む薬学的組成物の貯蔵安定性を増加するための方法であって、該ポリペプチドまたはその改変体は、液体処方物中での貯蔵の間、凝集体形成を示し、該方法は、該ポリペプチドまたはその改変体の該凝集体形成を減少するために十分な量のアミノ酸塩基、および緩衝剤を該組成物に組み込む工程を包含し、該緩衝剤は、その塩形態を実質的に含まない酸、その塩形態にある酸、ならびに酸およびその塩形態の混合物からなる群より選択され、該アミノ酸塩基は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む、方法。
【００４６】
項目３８  前記酸がコハク酸である、項目３７に記載の方法。
【００４７】
項目３９  凍結乾燥形態およびスプレー乾燥形態からなる群より選択される、項目１に記載の組成物の乾燥形態。
【００４８】
項目４０  インターロイキン−２（ＩＬ−２）、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）、またはβ−インターフェロン（ＩＦＮ−β）での治療に応答性の疾患の診断、予防、または処置のための処方物であって、該処方物は、項目１に記載の薬学的組成物を含み、ここで、前記ポリペプチドは、ＩＬ−２、ＴＦＰＩ、およびＩＦＮ−βからなる群より選択される、処方物。
【発明の効果】
【００４９】
本発明は、治療上活性な成分としてポリペプチドを含有する液体の薬学的組成物に関し、そしてその調製において有用な方法に関する。  より詳細には、本発明の組成物は、安定化された液体の薬学的組成物であり、この組成物の治療上活性な成分としては、液体の薬学的処方物中に保存されている間、通常、凝集体形成を示すポリペプチドが挙げられる。液体の薬学的組成物の貯蔵の間のポリペプチドによる凝集体形成は、そのポリペプチドの生物学的活性に有害に影響し得、この薬学的組成物の治療有効性の損失をもたらす。さらに、凝集体形成は、このポリペプチド含有薬学的組成物が融合システムを用いて投与される場合、配管、膜、またはポンプの詰まりのような他の問題を生じ得る。本発明の方法は、このようなポリペプチドを含む薬学的処方物の、貯蔵安定性をもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、治療上活性な成分としてポリペプチドを含有する液体の薬学的組成物に関し、そしてその調製において有用な方法に関する。本発明の目的について、用語「液体（流体）（ｌｉｑｕｉｄ）」は、薬学的組成物または処方物に関して、用語「水性（ａｑｕｅｏｕｓ）」を含むことを意図する。本明細書において用いられる場合、用語「ポリペプチド」は、本明細書のいずれか他の場所で規定されるように、天然に存在する（ネイティブ）、合成の、および組換えの、ポリペプチドおよびタンパク質、ならびにその生物学的に活性な改変体を包含する。「治療上活性な成分」とは、このポリペプチドがこの組成物に特異的に取りこまれて、この薬学的組成物が被験体に投与された場合、この被験体内の疾患または状態の処置、予防、または診断に関して、所望の治療的反応をもたらすことを意図する。
【００５１】
より詳細には、本発明の組成物は、安定化された液体の薬学的組成物であり、この組成物の治療上活性な成分としては、液体の薬学的処方物中に保存されている間、通常、凝集体形成を示すポリペプチドが挙げられる。「凝集体形成（ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、可溶性のまま保持され得るオリゴマーの形成、または溶液から沈殿する可視的な大きい凝集体を生じるポリペプチド分子の間の物理的相互作用を意図する。「貯蔵の間」とは、一旦調製された液体の薬学的組成物または処方物が、被験体に直ちに投与されないことを意図する。むしろ、調製後、液体形態で、凍結状態で、または液体形態もしくは被験体への投与に適切な他の形態中での後の再構成のための乾燥形態でのいずれかで、貯蔵のためにこれをパッケージングする。「乾燥形態」とは液体の薬学的組成物または処方物が、凍結乾燥（すなわち、凍結乾燥；例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌｉ（１９８４）Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３８：４８〜５９、を参照のこと）、噴霧乾燥（Ｍａｓｔｅｒｓ（１９９１）Ｓｐｒａｙ−Ｄｒｙｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（第５版；Ｌｏｎｇｍａｎ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ，Ｅｓｓｅｚ，Ｕ．Ｋ．）第４９１〜６７６頁；Ｂｒｏａｄｈｅａｄら（１９９２）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．１８：１１６９〜１２０６；およびＭｕｍｅｎｔｈａｌｅｒら（１９９４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１１：１２〜２０）、または風乾（ＣａｒｐｅｎｔｅｒおよびＣｒｏｗｅ（１９８８）Ｃｒｙｂｉｏｌｏｇｙ  ２５：４５９〜４７０；およびＲｏｓｅｒ（１９９１）Ｂｉｏｐｈａｒｍ．４：４７〜５３）のいずれかによって乾燥されることを意図する。液体の薬学的組成物の貯蔵の間、ポリペプチドによる凝集体形成は、そのポリペプチドの生物学的活性に有害に影響し得、この薬学的組成物の治療有効性の損失をもたらす。さらに、凝集体形成は、このポリペプチド含有薬学的組成物が融合システムを用いて投与される場合、配管、膜、またはポンプの詰まりのような他の問題を生じ得る。
【００５２】
本発明の安定化された液体の薬学的組成物は、この組成物の貯蔵の間のこのポリペプチドによる凝集体形成を低下するのに十分な量のアミノ酸塩基をさらに含む。「アミノ酸塩基（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｂａｓｅ）」とは、アミノ酸またはアミノ酸の組合せを意図し、ここで任意の所定のアミノ酸がその遊離の塩基型、またはその塩型のいずれかで存在する。アミノ酸の組合せを用いる場合、アミノ酸の全てがその遊離の塩基型で存在してもよく、全てがその塩型で存在してもよい、またはいくつかがその遊離の塩型で存在してもよいが、他のアミノ酸はその塩型で存在する。本発明の組成物を調製するのにおいて使用するために好ましいアミノ酸は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸のような荷電した側鎖を保有するアミノ酸である。特定のアミノ酸の任意の立体異性体（すなわち、Ｌ、Ｄ、またはＤＬ立体異性体）、またはこれらの立体異性体の組合せは、特定のアミノ酸がその遊離の塩基型またはその塩型のいずれかで存在する限り、本発明の薬学的組成物に存在し得る。このましくは、Ｌ立体異性体を用いる。本発明の組成物はまた、これらの好ましいアミノ酸のアナログを用いて処方され得る。「アミノ酸アナログ（類似体）」とは、本発明の液体の薬学的組成物の貯蔵の間、このポリペプチドによる凝集体形成を減弱する所望の効果をもたらす、天然に存在するアミノ酸の誘導体を意図する。適切なアルギニンアナログとしては、例えば、アミノグアニジンおよびＮ−モノエチルＬ−アルギニンが挙げられる。好ましいアミノ酸と同様、このアミノ酸アナログは、その遊離塩基型または塩型のいずれかでこの組成物中に組み込まれる。
【００５３】
本明細書において規定されるようにこのアミノ酸塩基と組合せて、本発明の安定化された液体の薬学的組成物は、溶液のｐＨを維持するため、その塩型を実質的に含まない酸、その塩型の酸、または酸とその塩型の混合物をさらに含む。好ましくは、実質的にその塩型を含まない酸と組合せて、アミノ酸塩基を用いることによって、ｐＨを維持する。このような組合せによって、酸およびその塩型をアミノ酸塩基と組合せて緩衝剤として用いて、安定化した薬学的組成物を処方する場合よりも、溶液の浸透圧を低くする。このような組合せの利点は、当業者がより高濃度の安定化剤（アミノ酸塩基）を、溶液の等張性を大きくすることなく、この薬学的組成物に組み込み得るということである。「その塩型を実質的に含まない酸」とは、液体の薬学的組成物内で緩衝剤として作用するこの酸が、その塩型の非存在下で存在することを意図する。代表的には、酸を含む緩衝液を液体の薬学的組成物中に用いる場合、この酸の塩型またはこの酸とこの酸の塩型の組合せを用いて、これを調製する。従って、例えば、この緩衝液は、酸をその対イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、またはマグネシウム）とともに用いて調製される。このように、スクシナート緩衝液は、一般に、コハク酸の塩（例えば、コハク酸ナトリウム）、またはコハク酸とコハク酸ナトリウムの混合物からなる。本発明の安定化された液体の薬学的組成物中で緩衝剤として用いられる酸は、この酸の塩型、またはこの酸とその塩型の混合物であり得、好ましくは緩衝剤として作用するこの酸は単にその酸型である。本発明の安定化液体ポリペプチド含有組成物を処方するにおける使用に適切な酸としては、コハク酸、クエン酸、リン酸、グルタミン酸、マレイン酸、リンゴ酸、酢酸、酒石酸、およびアスパラギン酸、より好ましくはコハク酸およびクエン酸、最も好ましくはコハク酸、が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５４】
本発明の液体のポリペプチド含有薬学的組成物は、「安定化された」組成物である。「安定化された」とは、この液体組成物が、本明細書において開示されるように、アミノ酸塩基と緩衝剤との組合せの非存在下で調製された組成物に比して貯蔵安定性が増大していることを意図する。この貯蔵安定性の増大は、液体処方物において、後の使用のためにその形態中に直接貯蔵されても、凍結状態で貯蔵されそして使用の前に融解されても、または液体形態もしくは使用前の他の形態中への後の再構成のために、乾燥形態（例えば、凍結乾燥されるか、風乾されるか、または噴霧乾燥された形態）で準備されても、観察される。好ましくは、本発明の組成物は、その液体形態における貯蔵安定性の増大の利便性、再構成なしの投与の容易さ、およびプレフィルド（事前充填）レディーツーユース（すぐ使える）シリンジ（注射器）中の処方物を供給する能力、を完全に利用するために、またはこの処方物が静菌剤と適合する場合、マルチドーズ（多回用量）調製物として、その液体形態中に直接貯蔵される。
【００５５】
本発明の組成物は、アミノ酸であるアルギニン、リジン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸を、その遊離の塩基型またはその塩型で、その塩型を実質的に含まない酸、その塩型の酸、または酸およびその塩型の混合物と組合せて、添加することが、これらの２つの成分の組合せなしに調製した液体のポリペプチド含有薬学的組成物に比して、貯蔵安定性が増大した、液体のポリペプチド含有薬学的組成物を生じる、という発見に関する。この組成物の貯蔵安定性の増大は、治療上活性なポリペプチドの安定性に対するアミノ酸の影響、より詳細には、液体処方物中の貯蔵の間のポリペプチド凝集に対するその影響を通じて達成される。さらに、本明細書において規定されるようなアミノ酸塩基、および液体のポリペプチド含有処方物内のその塩型を実質的に含まない酸の取り込みが、さらなる等張化剤（例えば、塩化ナトリウム）を含むことのない等張性に近い、液体の薬学的組成物を生じる。「等張性に近い（ｎｅａｒ  ｉｓｏｔｏｎｉｃ）」とは、この液体組成物が、約２４０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３６０ｍｍｏｌ／ｋｇの浸透圧、好ましくは、約２４０〜約３４０ｍｍｏｌ／ｋｇの浸透圧、より好ましくは約２５０〜約３３０ｍｍｏｌ／ｋｇの浸透圧、なおより好ましくは、約２６０〜約３２０ｍｍｏｌ／ｋｇ、最も好ましくは、約２７０〜約３１０ｍｍｏｌ／ｋｇの浸透圧を有することを意図する。
【００５６】
本発明の安定化された液体の薬学的組成物に組み込まれたアミノ酸塩基は、治療上活性なポリペプチドを凝集に対して保護し、これによってこの組成物の貯蔵中のポリペプチドの安定性を増加させる。「安定性を増加させる」とは、液体の薬学的組成物の貯蔵中にポリペプチドによる凝集物形成が、この特定の安定剤の非存在下での貯蔵中のポリペプチドの凝集物形成と比較して減少することを示す。アミノ酸塩基の添加による、減少した凝集物形成は、濃度依存性の様式で起こる。すなわち、アミノ酸塩基の濃度を増加させることは、このポリペプチドがアミノ酸塩基の非存在下では通常は液体処方物中での貯蔵中に凝集物形成を示す場合に、液体の薬学的組成物中のポリペプチドの増加した安定性をもたらす。凝集物形成を減少させ、これによってポリペプチドの安定性を増加させ、従って組成物の貯蔵安定性を増加させるために、液体の薬学的組成物に添加されるための特定のアミノ酸塩基の量の決定は、当業者に一般的に公知の方法を使用する過度の実験なしに、目的の特定の任意のポリペプチドに対して容易に決定され得る。
【００５７】
従って、例えば、特定のアミノ酸塩基の、液体組成物中での貯蔵中のポリペプチド凝集に対する効果は、溶液中の可溶性ポリペプチドの変化を経時的に測定することによって、容易に決定され得る。溶液中の可溶性ポリペプチドの量は、目的のポリペプチドの検出に適合される多数の分析アッセイによって、定量され得る。このようなアッセイとしては、例えば、以下の実施例に記載されるような、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ、サイズ排除（ＳＥＣ）−ＨＰＬＣ、およびＵＶ吸光度が挙げられる。目的のポリペプチドが、液体処方物中での貯蔵中に可溶性と不溶性との両方の凝集物を形成する場合には、以下の実施例１に記載するように、ＲＰ−ＨＰＬＣとＳＥＣ−ＨＰＬＣとの組み合わせを使用して、可溶性凝集物として存在する可溶性ポリペプチドの部分と、凝集していない生物学的に活性な分子形態で存在する部分との間を区別し得る。
【００５８】
凝集の場合には、液体のポリペプチド含有薬学的組成物に組み込まれて、本発明の安定化された薬学的組成物を得るための、効果的な量のアミノ酸塩基は、経時的な凝集物形成の減少、従って、溶液中での可溶性ポリペプチドの、その凝集していない、生物学的に活性な分子形態における、より大きな保持を生じる量と判断される。従って、例えば、ポリペプチドがモノマータンパク質（例えば、以下の実施例に記載されるインターロイキン−２（ＩＬ−２）または組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ））である場合には、本発明の安定化された組成物を調製する際に使用するための効果的な量の安定剤は、そのモノマー分子形態でのＩＬ−２またはＴＦＰＩのより大きな保持を生じる量である。
【００５９】
本発明の安定化された液体ポリペプチド含有組成物の増加した貯蔵安定性はまた、治療上活性なポリペプチドにおけるグルタミン残基および／またはアスパラギン残基の、貯蔵中の脱アミノ化に対する、アミノ酸塩基の阻害効果に関連し得る。特定のアミノ酸塩基の、液体組成物における貯蔵中のこれらの残基の脱アミノ化に対する効果は、その脱アミノ化形態において存在するポリペプチドの量を経時的にモニタリングすることによって、容易に決定され得る。溶液相に存在する分子種（すなわち、ネイティブまたは脱アミノ化された、特定のポリペプチド）を測定するための方法は、当該分野において一般的に公知である。このような方法としては、分子種のクロマトグラフィー分離およびポリペプチド分子量標準物質を使用して（例えば、以下の実施例に記載されるように、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて）の同定が挙げられる。
【００６０】
本発明の安定化された液体の薬学的組成物におけるポリペプチドの安定性を増加させるための、実質的に塩形態を含まない酸によって緩衝されたアミノ酸塩基の新規な組み合わせの使用は、例えば、コハク酸／コハク酸ナトリウム緩衝系中でのアミノ酸の使用より優れた利点を提供する。この新規な組み合わせは、その酸形態と塩形態との混合物である緩衝系の使用によって達成され得るより高い濃度の安定化アミノ酸を有する、ほぼ等張の処方物の調製を可能にする。より高い濃度の安定化アミノ酸は、ポリペプチドの安定性をさらに大きく増加させることを可能にし、従って、この処方物の増加した貯蔵安定性を可能にする。
【００６１】
例えば、タンパク質インターロイキン−２（ＩＬ−２）を含み、そしてこのタンパク質のために最適なｐＨ（ｐＨ５．８）を有する液体処方物に添加されたアルギニン塩基を緩衝化するために、コハク酸が使用される場合には、アルギニンの濃度は、２３０ｍＭまで増加され得、一方で依然として、この処方物の等張性を維持し得る。このことは、ＩＬ−２の５０℃における貯蔵寿命（これは、タンパク質の安定性の尺度である）を二倍にする。類似のＩＬ−２貯蔵寿命が、同じアルギニン濃度および緩衝剤としてコハク酸／コハク酸ナトリウムを使用して達成され得るが、アルギニンは、類似のｐＨを達成するためにはその酸形態で添加されなければならず、そして得られる処方物は、過緊張である（実施例１、表１を参照のこと）。
【００６２】
同様に、タンパク質組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）を含み、そしてこのタンパク質のために適切なｐＨ（ｐＨ５．５）を有する液体処方物に添加されるアルギニン塩基を緩衝化するために、クエン酸が使用される場合には、アルギニンの濃度は、３００ｍＭに増加され得、一方で依然として、この処方物の等張性を維持し得る。このことは、５０℃でのＴＦＰＩの貯蔵寿命に、ほぼ５０％の増加を生じる。類似のＴＦＰＩ貯蔵寿命が、同じアルギニン濃度および緩衝剤としてクエン酸／クエン酸ナトリウムを使用して、達成され得るが、アルギニンは再度、類似のｐＨを達成するために、その酸形態で添加されなければならず、そして得られる処方物は、過緊張である（実施例８、表１８を参照のこと）。より高い濃度のアミノ酸を主要な安定剤として使用する能力は、より伝統的なポリペプチド安定剤（例えば、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン）の必要性を排除する。これらは、その潜在的なウイルス汚染に起因して、さほど所望されない安定剤である。
【００６３】
さらに、液体の薬学的組成物の等張性は望ましい。なぜなら、これは、投与の際の減少された疼痛を生じ、そして過緊張または低張性の組成物に関連する潜在的な溶血効果を最小にするからである。従って、本発明の安定化された組成物は、増加された貯蔵安定性を有するのみでなく、酸とその酸の塩形態からなる他のより伝統的な緩衝系を使用する処方物と比較した場合に、投与の際の実質的に減少した疼痛のさらなる利点を有する。例えば、本発明の１つの実施形態において、安定化された液体の薬学的組成物は、注射される場合に、通常の生理食塩水の注射と比較して、火傷および刺傷に関連する疼痛の減少を示す（実施例７を参照のこと）。
【００６４】
主要な安定剤としてアミノ酸塩基を含み、そして緩衝剤としての酸がその塩形態を実質的に含まない、本発明の液体ポリペプチド組成物の調製の利点が確認されたので、この組成物の貯蔵中のポリペプチドの増加した安定性を達成するために、本明細書中に記載されるような凝集物形成を示す治療上活性な目的のポリペプチドを含む液体の薬学的組成物に組み込むための、これらの成分の各々の好ましい濃度を、過度な実験なしに決定することは、当該分野の技術の範囲内である。例えば以下の実施例１において開示されるプロトコルに従って、当業者は、本明細書中に記載される液体の薬学的組成物において使用するためのアミノ酸塩基および種々の緩衝酸の所望の濃度の範囲を、評価し得る。好ましくは、この組成物に組み込まれるアミノ酸塩基の量は、この組成物中に存在するタンパク質に依存して、約１００ｍＭ〜約４００ｍＭ、好ましくは、約１３０ｍＭ〜約３７５ｍＭ、より好ましくは、約１５０ｍＭ〜約３５０ｍＭ、なおより好ましくは、約１７５ｍＭ〜約３２５ｍＭ、さらにより好ましくは、約１８０ｍＭ〜約３００ｍＭ、なおより好ましくは、約１９０ｍＭ〜約２８０ｍＭ、最も好ましくは、約２００ｍＭ〜約２６０ｍＭの濃度範囲内である。緩衝剤は、塩形態の酸、または酸とその塩形態の混合物であり得るが、本明細書中に開示される有利な理由により、好ましくは、緩衝剤は、実質的に塩形態を含まない酸である。緩衝剤として使用される酸は、好ましくは、緩衝剤として使用される酸およびポリペプチドが凝集物形成に対して安定化されるために最適なｐＨに依存して、約４０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２４０ｍＭ、約６０ｍＭ〜約２３０ｍＭ、約７０ｍＭ〜約２２０ｍＭ、より好ましくは、約８０ｍＭ〜約２１０ｍＭ、最も好ましくは、約９０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度範囲内で添加される。
【００６５】
１つの実施形態において、アミノ酸塩基は、約２３０ｍＭの濃度で存在するアルギニン塩基であり、そして緩衝剤として使用される酸は、約１２８ｍＭの濃度のコハク酸である。これは、ほぼ等張の容量オスモル濃度および約５．８のｐＨを有する液体ポリペプチド含有薬学的組成物の調製を可能にする。別の実施形態において、アミノ酸塩基は、約３００ｍＭの濃度で存在するアルギニン塩基であり、そして緩衝剤として使用される酸は、約１２０ｍＭの濃度のクエン酸である。これは、ほぼ等張の容量オスモル濃度および約５．５のｐＨを有する液体ポリペプチド含有薬学的組成物の調製を可能にする。なお別の実施形態において、アミノ酸塩基は、約２００ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度で存在するアルギニン塩基であり、そして緩衝剤として使用される酸は、約１２０ｍＭ〜約１８０ｍＭの濃度のコハク酸である。これは、約２５６ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３６３ｍｍｏｌ／ｋｇの容量オスモル濃度および約５．５のｐＨを有する液体ポリペプチド含有薬学的組成物の調製を可能にする。
【００６６】
従って、本発明の別の実施形態において、安定化された液体の薬学的組成物は、ポリペプチドとしてのＩＬ−２またはその改変体、約１５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度のアルギニン塩基、および約８０ｍＭ〜約１９０ｍＭの濃度のコハク酸を含む。好ましい実施形態において、アルギニン塩基は、約２３０ｍＭの濃度でこのＩＬ−２液体の薬学的組成物中に存在し、そしてコハク酸は約１２８ｍＭの濃度で存在する。この好ましいＩＬ−２組成物は、約５．８のｐＨ、および約２５０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３３０ｍｍｏｌ／ｋｇの浸透圧モル濃度を有する。これらの組成物中のＩＬ−２またはその改変体の濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約２．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０２ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．０３ｍｇ／ｍｌ〜約０．８ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．０３ｍｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌである。
【００６７】
本発明のさらに別の実施形態において、安定化された液体の薬学的組成物は、ポリペプチドとしてのＴＦＰＩまたはその改変体、約１００ｍＭ〜約４００ｍＭの濃度のアルギニン塩基、および約８０ｍＭ〜約１９０ｍＭの濃度のコハク酸を含む。好ましい実施形態において、アルギニン塩基は、ＴＦＰＩの液体の薬学的組成物中に、約２００ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度で存在し、そしてコハク酸は約１２０ｍＭ〜約１８０ｍＭの濃度で存在する。この好ましいＴＦＰＩ組成物は、５．５のｐＨ、および約２４０ｍｇ／ｋｇ〜約３６０ｍｇ／ｋｇの浸透圧モル濃度を有する。これらの組成物中のＴＦＰＩまたはその改変体の濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約２．０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１０ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．１０ｍｇ／ｍｌ〜約０．６０ｍｇ／ｍｌである。
【００６８】
本発明の別の実施形態において、安定化された液体の薬学的組成物は、ポリペプチドとしてのＴＦＰＩまたはその改変体、約１７５ｍＭ〜約４００ｍＭの濃度のアルギニン塩基、および約４０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度のクエン酸を含む。好ましい実施形態において、アルギニン塩基は、このＴＦＰＩの液体の薬学的組成物中に、約２５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度で存在し、そしてクエン酸は約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度で存在する。この好ましいＴＦＰＩ組成物は、約５．０〜６．５のｐＨ、および約２４０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３６０ｍｍｏｌ／ｋｇの浸透圧モル濃度を有する。さらに別の実施形態において、このアルギニン塩基は、約３００ｍＭの濃度で存在し、そしてクエン酸は約１２０ｍＭの濃度で存在する。このＴＦＰＩ組成物は、約５．５のｐＨ、および約２４０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３６０ｍｍｏｌ／ｋｇの浸透圧モル濃度を有する。これらの組成物中のＴＦＰＩまたはその改変体の濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約２．０、より好ましくは約０．１０ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．１０ｍｇ／ｍｌ〜約０．６０ｍｇ／ｍｌである。
【００６９】
以下の実施例に示されるように、液体ポリペプチド含有薬学的組成物のｐＨは、その中に含まれるポリペプチドの安定性、主にポリペプチド凝集体の形成に対するその影響に影響を与える。従って、本発明の薬学的組成物中に存在するする緩衝酸の量は、目的の特定のポリペプチドの安定性に最適なｐＨに依存して変わる。この最適なｐＨの決定は、当該分野で一般的に利用可能であり、そして本明細書中に記載される実施例にさらに例示される方法を使用して達成され得る。本発明の組成物に好ましいｐＨ範囲は、ポリペプチドに依存して、約ｐＨ４．０〜約ｐＨ９．０、より好ましくは約ｐＨ５．０〜約６．５である。従って、一実施形態において、より詳細には、ポリペプチドがＩＬ−２またはその改変体である場合、ｐＨは、約５．８である。別の実施形態において、より詳細には、ポリペプチドがＴＦＰＩまたはその改変体である場合、５．５である。
【００７０】
実質的に塩形態を含まない酸で緩衝化されたアミノ酸塩基、その酸の塩形態、または酸およびその酸形態の混合物を含む安定化された薬学的組成物はまた、さらなる安定化剤を含み得、この安定化剤は、組成物中の治療上活性なポリペプチドの安定性をさらに増大する。本発明に対して特に目的とされる安定化剤としては、メチオニンおよびＥＤＴＡ（これらはポリペプチドをメチオニン酸化から保護する）；ならびに非イオン性界面活性剤（これはポリペプチドを凍結解凍または機械的剪断に関連する凝集化から保護する）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
この様式において、治療剤として作用するポリペプチドが、メチオニン残基からメチオニンスルホキシドへの酸化に対して感受性の少なくとも１つのメチオニン残基を含むポリペプチドである場合、アミノ酸のメチオニンは、メチオニン残基からメチオニンスルホキシドへの酸化を阻害するために添加され得る。「阻害」により、経時的なメチオニン酸化種の最小の蓄積が意図される。メチオニン酸化を阻害することによって、適切な分子形態のポリペプチドがより多く保持される。任意の立体異性体のメチオニン（Ｌ、ＤまたはＤＬ異性体）、またはその組み合わせが使用され得る。添加される量は、メチオニンスルホキシドの量が調節因子に対して受容可能であるようにメチオニン残基の酸化を阻害するのに十分な量でなければならない。典型的に、これは、この組成物が約１０％〜約３０％以下のメチオニンスルホキシドを含むことを意味する。一般的に、これは、添加されるメチオニン対メチオニン残基の比が約１：１〜約１０００：１、最も好ましくは１０：１〜約１００：１の範囲であるようにメチオニンを添加することによって達成され得る。
【００７２】
添加されるメチオニンの好ましい量は、異なる濃度のメチオニンと共に目的のポリペプチドを含む組成物を調製し、そして以下の実施例２に記載されるように、ポリペプチドの酸化種の形成に対する相対的な影響を決定する（例えば、分子種のクロマトグラフィー分離、およびポリペプチドの分子量標準を使用する同定（例えば，ＲＰ−ＨＰＬＣを用いる）を使用する）ことによって、経験的に容易に決定され得る。ポリペプチドの凝集化のアミノ酸関連性阻害に対する悪影響を有することなく、メチオニン残基の酸化の阻害を最小にするメチオニンの濃度は、ポリペプチドの安定性をさらに改善するためにこの組成物に添加されるべきメチオニンの好ましい量を表す。
【００７３】
本発明の液体組成物の処理の間の凍結解凍または機械的剪断に起因するポリペプチドの分解は、本発明の液体ポリペプチド含有組成物に界面活性剤を組み込み、液体−空気界面における表面張力を小さくすることによって阻害され得る。用いられる典型的に界面活性剤は、非イオン性界面活性剤であり、これにはポリオキシエチレンソルビトールエステル（例えば、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ
８０）およびポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０））；ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンエステル（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８）；ポリオキシエチレンアルコール（例えば、Ｂｒｉｊ  ３５）；シメチコン；ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ  ４００）；リゾホスファチジルコリン；およびポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００）が挙げられる。界面活性剤または乳化剤による医薬の伝統的な安定化は、例えば、Ｌｅｖｉｎｅら（１９９１）、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４５（３）：１６０〜１６５（本明細書中で参考として援用される）に記載される。本発明の実施の際に用いられる好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０である。
【００７４】
上記のこれらの薬剤に加えて、他の安定化剤（例えば、アルブミン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、またはＥＤＴＡナトリウムのようなその塩）は、液体の薬学的組成物の安定性をさらに増大するために添加され得る。約１．０％
ｗ／ｖ未満の濃度の量のアルブミンが添加され得る。ＥＤＴＡは、多くの酸化反応を触媒することが知られている金属イオンのスカベンジャーとして作用し、従ってさらなる安定化剤を提供する。
【００７５】
本発明の一実施形態において、安定化された液体の薬学的組成物は、ポリペプチドとしてのＩＬ−２またはその改変体、約１５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度のアルギニン塩基、約８０ｍＭ〜約１９０ｍＭの濃度のコハク酸、約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度のメチオニン、約０．１〜約５．０ｍＭのＥＤＴＡ、および約０．００１％〜約０．２％のポリソルベート８０を含む。好ましい実施形態において、アルギニン塩基は、このＩＬ−２液体の薬学的組成物中に、約２３０ｍＭの濃度で存在し、そしてコハク酸は約１２８ｍＭの濃度で存在する。この好ましいＩＬ−２組成物は、約５．８のｐＨ、および約２５０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３３０ｍｍｏｌ／ｋｇの浸透圧モル濃度を有する。これらの組成物中のＩＬ−２またはその改変体の濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約２．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０２ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．０３ｍｇ／ｍｌ〜約０．８ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．０３ｍｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌである。
【００７６】
望ましい場合、糖または糖アルコールもまた、本発明の安定化された液体ポリペプチド含有薬学的組成物中に含有され得る。任意の糖（例えば、単糖類、二糖類、または多糖類）、または水溶性グルカン（例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、およびカルボキシメチルセルロース−Ｎａ）を含む）が使用され得る。スクロースは最も好ましい糖添加剤である。糖アルコールは、−ＯＨ基を有するＣ４〜Ｃ８炭化水素として定義され、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ダルシトール、キシリトール、およびアラビトールが挙げられ、マンニトールが最も好ましい糖アルコール添加剤である。上記の糖または糖アルコールは、個々にまたは組み合わせて使用され得る。この糖または糖アルコールが液体調製物に可溶性であり、かつ本発明の方法を使用して達成される安定化効果に悪影響を与えない限り、使用される量の固定された制限はない。好ましくは、糖または糖アルコールの濃度は、約１．０  ｗ／ｖ％と約１５．０  ｗ／ｖ％との間、より好ましくは約２．０  ｗ／ｖ％と約１０．０  ｗ／ｖ％との間である。
【００７７】
本発明の安定化された液体の薬学的組成物は、アミノ酸塩基を用いて達成される主要安定化効果が不利に影響されない限り、治療上活性な成分として役立つ目的のポリペプチドの有効性を増加するかまたはこのポリペプチドの望ましい質を促進する他の組成物を含み得る。この組成物は、選択される経路を介した投与について安全でなければならず、滅菌されていなければならず、そしてその望ましい治療上活性を保持しなければならない。
【００７８】
本発明の組成物は、好ましくは、目的のポリペプチドの組み込みの前に安定化剤および緩衝化剤、ならびに任意の他の賦形剤を予備混合することによって調製される。本発明の組成物をさらに安定化するために加えられ得る任意のさらなる賦形剤は、主要安定化剤の安定化効果に不利に影響してはならない（すなわち、アミノ酸塩基、緩衝化剤との組み合わせ、すなわち、その塩形態を実質的に含まない酸、酸の塩形態、酸およびその塩形態の混合物（本明細書中に開示される新規な組成物を得るために使用される））。目的のポリペプチドの凝集形成の減少を達成するための好ましい量のアミノ酸塩基の添加に続いて、液体組成物のｐＨが、緩衝化剤を、好ましくは本明細書中で開示される範囲で、より好ましくは、目的のポリペプチドに最適なｐＨを使用して調節される。目的のポリペプチドを組成物に添加することに続いてｐＨが調節され得るが、好ましくは、本発明のポリペプチドの添加の前に調節される。なぜなら、これは、ポリペプチドの変性の危険性を減少し得るからである。このとき、適切な機械的デバイスは、構成物の適切な混合を達成するために使用される。
【００７９】
本発明の特定の実施形態が、インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはその改変体、あるいは組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）またはその改変体（凝集形成による分解に特に感受性であるタンパク質の例）を含む安定化された組成物に関するが、本発明の有用性は、一般的に、液体処方物中での保存の間に凝集形成を示すポリペプチドまたはその改変体を含む任意の薬学的組成物に及ぶ。従って、本発明の実施における使用に適切なポリペプチドとしては、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２）、インターフェロン（β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）およびそのムテイン（例えば、ＩＦＮ−βser17）（欧州特許出願番号１８５４５９Ｂ１および米国特許第４，５８８，５８５号に記載される（本明細書中で参考として援用される）））、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インシュリン、および液体処方物中で凝集形成を示す他の同様なポリペプチド、ならびにその任意の生物学的に活性な改変体が挙げられる。
【００８０】
本発明の安定化された液体の薬学的組成物に存在するポリペプチドは、ネイティブであるか、または組換え技術によって得られ得、そして任意の供給源（例えば、マウス、ラット、ウサギ、霊長類動物、ブタ、およびヒトのような哺乳動物供給源を含む）からであり得るが、但し、それらは、本明細書中で詳細される基準に適合する（すなわち、それらは、液体処方物中での保存の間に凝集を形成する）。好ましくは、このようなポリペプチドは、ヒト供給源から誘導され、そしてより好ましくは、微生物宿主からの組換えヒトタンパク質である。
【００８１】
本発明の薬学的組成物中の治療上活性成分として役立つ目的のポリペプチドの生物学的に活性な改変体はまた、本明細書中で使用される、用語「ポリペプチド」によって包含される。このような改変体は、改変体のポリペプチドを含む薬学的組成物が、被験体に投与される場合、ネイティブなポリペプチドを含む薬学的組成物と同じ治療効果を有するように、ネイティブなポリペプチドの望ましい生物学的活性を保持すべきである。すなわち、改変体ポリペプチドは、ネイティブなポリペプチドについて観測されるのと類似の様式で薬学的組成物中の治療上活性な成分として役立つ。改変体ポリペプチドが望ましい生物学的活性を保持するかいなか、従って、薬学的組成物中の治療上活性な成分として役立つか否かを決定するための方法は、当該分野において利用可能である。生物学的活性は、ネイティブなポリペプチドまたはタンパク質の活性を測定するための特に設計されたアッセイ（本発明に記載されるアッセイを含む）を使用して測定され得る。さらに、生物学的に活性なネイティブなポリペプチドに対して惹起される抗体は、改変体ポリペプチドに結合するそれらの能力について試験され得、ここで、有効な結合は、ネイティブなポリペプチドのコンホメーションと類似のコンホメーションを有するポリペプチドを示す。
【００８２】
ネイティブまたは天然の目的のポリペプチドの適切な生物学的に活性な改変体は、そのポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体であり得る。「フラグメント」は、インタクトなポリペプチド配列および構造の一部のみからなるポリペプチドを意図し、ネイティブなポリペプチドのＣ末端欠失またはＮ末端欠失であり得る。「アナログ」は、ネイティブなポリペプチドまたはネイティブなポリペプチドのフラグメントのいずれかのアナログを意図し、ここで、アナログは、１つ以上のアミン酸置換、挿入または欠失を有するネイティブなポリペプチド配列および構造を含む。「ムテイン」（例えば、本明細書中に記載されるものおよび１つ以上のペプトイド（ペプチド模倣物）を有するペプチド）はまた、用語アナログによって包含される（国際公開番号ＷＯ９１／０４２８２を参照のこと）。「誘導体」は、目的のネイティブなポリペプチド、ネイティブなポリペプチドのフラグメント、またはそれらのそれぞれのアナログの任意の適切な改変（例えば、グリコシル化、リン酸化、または他の外来部分の付加）を、ネイティブなポリペプチドの望ましい生物学的な活性が保持される限り、意図する。ポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体を作製するための方法は、一般的に当該分野において利用可能である。
【００８３】
例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列改変は、目的のネイティブなポリペプチドをコードするクローン化されたＤＮＡ配列における変異によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列改変のための方法は、当該分野において周知である。例えば、ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；米国特許第４，８７３，１９２号；およびそれらに引用される参考文献を参照のこと；これらは、本明細書中において参考として援用される。目的のポリペプチドの生物学的活性に影響しない適切なアミノ酸置換についての手引きは、Ｄａｙｈｏｆｆ
ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出され得、これは本明細書において参考として援用される。保存的な置換（例えば、１つのアミノ酸を同じ性質を有する別のアミノ酸と交換すること）は、好ましくあり得る。保存的な置換の例としては、Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、Ａｓｎ⇔Ｇｌｎ、およびＰｈｅ⇔Ｔｒｐ⇔Ｔｙｒが挙げられるが、これらには限定されない。
【００８４】
目的のポリペプチドの改変体を構築する際に、改変体が望ましい活性を保有し続けるように改変がなされる。明らかに、改変体ポリペプチドをコードするＤＮＡにおいてなされる任意の変異は、読み取り枠からの配列を配置してはならず、そして好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を作り得る相補性領域を作らない。欧州特許出願公開番号第７５，４４４号を参照のこと。
【００８５】
目的のポリペプチドの生物学的に活性な改変体は、一般的に、参照ポリペプチド分子のアミノ酸配列（これは、比較のための基準として役立つ）に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは約９０％〜９５％以上、そして最も好ましくは約９８％以上のアミノ酸同一性を有する。目的のネイティブなポリペプチドの生物学的に活性な改変体は、１〜１５アミノ酸の少なさの、１〜１０の少なさの、例えば、６〜１０、５の少なさの、４の少なさの、３、２、または１のアミノ酸残基だけネイティブなポリペプチドと異なり得る。「配列同一性」は、同じアミノ酸残基が、改変体ポリペプチド、および改変体のアミノ酸配列の特定の連続的なセグメントが整列し、参照分子のアミノ酸配列と比較される場合、参照として役立つポリペプチド分子内に見出されることを意図する。２つのアミノ酸配列の間のパーセンテージ配列同一性は、同一のアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を参照分子との比較を受けるセグメント内の位置の全数で割り、そしてその結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【００８６】
２つの配列の最適な整列のために、改変体のアミノ酸配列の連続的なセグメントは、参照分子のアミノ酸配列に関してさらなるアミノ酸残基または欠失したアミノ酸残基を有し得る。参照アミノ酸配列との比較に使用される連続的なセグメントは、少なくとも２０の連続的なアミノ酸残基を含み、そして３０、４０、５０、１００以上の残基であり得る。改変体のアミノ酸配列におけるギャップを含むことに関連する増加した配列同一性の補正は、ギャップペナルティーを割り当てることによってなされ得る。配列整列の方法は、アミノ酸配列についてとアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列についての両方について当該分野において周知である。
【００８７】
従って、任意の２つの配列間の％同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの１つの好ましい非限定的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９９８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）において利用され、これは、ＧＣＧ配列整列ソフトウェアパッケージの一部である。アミノ酸配列を比較する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティが、ＡＬＩＧＮプログラムと共に使用され得る。２つの配列を比較する際に使用するための、数学的アルゴリズムの別の好ましい、非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４のアルゴリズムであり、これは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７のように改変された。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、文字長＝１２を用いて実施されて、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相同的なヌクレオチド配列が得られ得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５００、文字長＝３を用いて実施されて、目的のポリペプチドに相同的なアミノ酸配列が得られ得る。比較の目的のためのギャップのある整列を得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｅｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載されるように利用され得る。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔは、分子間の距離的関係を検出する反復検索を実施するために使用され得る。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）前出を参考のこと。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを使用する場合、各々のプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用され得る。ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。また、ＡＬＩＧＮプログラム（Ｄａｙｈｏｆｆ（１９７８）、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：補遺３（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）およびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから入手可能）のプログラム（例えば、ＧＡＰプログラム、ここで、プログラムのデフォルトパラメータが利用される）もまた参照のこと。
【００８８】
アミノ酸配列同一性の割合を考慮する場合、いくつかのアミノ酸残基位置が、タンパク質機能の特性に影響しない保存的アミノ酸置換の結果として異なり得る。これらの例において、％配列同一性は、保存的に置換されたアミノ酸における類似性をカウントするために上方調節される。このような調節は、当該分野で周知である。例えば、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１−１７を参照のこと。
【００８９】
ポリペプチドの正確な化学構造は、多くの因子に依存する。イオン化可能なアミノ基およびカルボキシル基が分子中に存在するために、特定のポリペプチドは、酸性塩または塩基性塩、あるいは中性の形態として得られ得る。適切な環境条件に配置された場合それらの生物学的活性を保持する全てのこのような調製物は、本明細書で使用されるようにポリペプチドの定義に含まれる。さらに、このポリペプチドの一次アミノ酸配列は、糖部分を使用する誘導体化（グリコシル化）によって、または脂質、ホスフェート、アセチル基などのような他の補足的な分子によって増強され得る。この配列はまた、糖類との結合によって、増強され得る。このような増強の特定の局面は、産生宿主の翻訳後プロセシング系を介して達成される；他のこのような改変は、インビトロで導入され得る。任意の事象において、このような改変は、ポリペプチドの活性が破壊されない限り、本明細書中で使用されるポリペプチドの定義に含まれる。このような改変は、種々のアッセイにおいて、このポリペプチドの活性を増加させるかまたは減少されるかのいずれかによって、その活性に定量的にまたは定性的に影響し得ることが期待される。さらに、鎖中の個々のアミノ酸残基は、酸化、還元、または他の誘導体化によって改変され得、そしてポリペプチドは、活性を保持するフラグメントを得るために切断され得る。活性を破壊しないこのような変更は、本明細書中で使用されるような目的のポリペプチドの定義からこのポリペプチド配列を排除しない。
【００９０】
先行技術は、ポリペプチド改変体の調製および使用に関する実質的なガイダンスを提供する。ポリペプチド改変体の調製において、当業者は、ネイティブなタンパク質ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対するどの改変が、本発明の薬学的組成物の治療上活性な成分としての使用に適し、そしてその凝集形態が、本明細書中に記載されるように、その塩形態、酸の塩形態、または酸およびその塩形態の混合物を実質的に含まないアミノ酸塩基および酸の存在によって減少される改変体を生じるかを容易に決定し得る。
【００９１】
本発明の１つの実施形態において、本発明の液体状の薬学的組成物中の治療上活性な成分として存在するポリペプチドは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはその誘導体、好ましくは組換えＩＬ−２である。インターロイキン−２は、正常な末梢血リンパ球によって生成され、そして低濃度で身体中に存在するリンホカインである。これは、植物レクチン、抗原、または他の刺激に曝露された後に、抗原刺激Ｔ細胞またはマイトジェン刺激Ｔ細胞の増殖を誘導する。ＩＬ−２は、最初に、Ｍｏｒｇａｎら（１９７６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９３：１００７−１００８によって記述され、そしてもともと刺激されたＴリンパ球の増殖を誘導するその能力のために、Ｔ細胞増殖因子と呼ばれた。それは、１３，０００〜１７，０００の範囲の報告された分子量を有するタンパク質であり（ＧｉｌｌｉｓおよびＷａｔｓｏｎ（１９８０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．４５９：１７０９）そして６〜８．５の範囲の等電点を有する。現在、その増殖因子の特性に加えて、それは、免疫系の種々のインビトロおよびインビボ機能を調節することが確認されている。ＩＬ−２は、細胞の相互作用および機能を媒介する、いくつかのリンパ球生成メッセンジャー−調節分子の１つである。この天然に存在するリンホカインは、単独でまたはリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞または腫瘍浸潤リンパ球と組合せた場合のいずれかで、種々の悪性腫瘍に対して抗腫瘍活性を有することが示されている（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８７）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６：８８９−８９７；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８８）Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２０８：１２１−１３５；Ｔｏｐａｌｉａｎら（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．６：８３９−８５３；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８８）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１９：１６７６−１６８０；およびＷｅｂｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０：３３−４０を参照のこと）。ＩＬ−２の抗腫瘍活性は、転移性メラノーマおよび腎細胞癌を有する患者について最もよく記述されているが、他の疾患、特に、リンパ腫もまた、ＩＬ−２での処置に応答するようである。
【００９２】
「組換えＩＬ−２」は、ネイティブ配列ＩＬ−２に匹敵する生物学的活性を有するインターロイキン−２を意図し、そしてこれは、例えば、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０２：３０５−３１０およびＤｅｖｏｓ（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：４３０７−４３２３に記述されるような組換えＤＮＡ技術によって調製されているか、またはＷａｎｇら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：１４３１−１４３３によって記載されるように、変異的に変化されたＩＬ−２である。一般に、ＩＬ−２をコードする遺伝子がクローニングされ、次いで、本明細書中に記載されるように、形質転換された生物、好ましくは微生物、および最も好ましくはＥ．Ｃｏｌｉにおいて発現される。宿主生物は、発現条件下でＩＬ−２を生成するための外来遺伝子を発現する。合成組換えＩＬ−２はまた、真核生物（例えば、酵母細胞またはヒト細胞など）において作製され得る。細胞からＩＬ−２を増殖、回収、分裂または抽出するためのプロセスは、例えば、米国特許第４，６０４，３７７号；同第４，７３８，９２７号；同第４，６５６，１３２号；同第４，５６９，７９０号；同第４，７４８，２３４号同第；４，５３０，７８７号；同第４，５７２，２９８号；および同第４，９３１，５４３号（これらは、本明細書中で、その全体が参考として援用される）に実質的に記載される。
【００９３】
改変体ＩＬ−２タンパク質の例として、欧州特許出願第１３６，４８９号；欧州特許出願第８３１０１０３５．０（１９８３年２月３日出願）（公開番号第９１５３９号のもとで１９８３年１０月１９日公開）；欧州特許出願第８２３０７０３６．２号（１９８２年１２月２２日出願）（第８８１９５号のもとで１９８３年９月１４日公開）；欧州特許出願第８３３０６２２１．９号（１９８３年１０月１３日出願）（第１０９７４８号のもとで１９８４年５月３０日公開）（ベルギー特許第８９３，０１６号、共有に係る米国特許第４，５１８，５８４号の等価物）に記載される組換えＩＬ−２ムテイン；米国特許第４，７５２，５８５号およびＷＯ  ９９／６０１２８号に記載のムテイン；ならびに本明細書中の実施例にて使用されそして米国特許第４，９３１，５４３号に記載されるＩＬ−２ムテイン（これらすべてが、本明細書において参考として援用される）を参照のこと。さらに、ＩＬ−２は、増加した可溶性および変化した薬物速度論プロフィールを提供するように、ポリエチレングリコールを用いて改変され得る（本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第４，７６６，１０６号を参照のこと）。
【００９４】
本発明の別の実施形態において、本発明の液体の薬学的組成物中に治療上活性な成分として存在するポリペプチドは、インターフェロンである、より詳細には、線維上皮β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）もしくはその改変体であり、好ましくは、当該分野にて記載される組換えＤＮＡ技術により調製される組換えＩＦＮ−βである。インターフェロンは、種々の誘導物質（例えば、マイトジェン、ポリペプチド、ウイルスなど）への曝露に応答して哺乳動物細胞により産生される。これらの比較的小さい、種特異的な単鎖ポリペプチドは、免疫調節特性、抗ウイルス特性、および抗増殖特性を示す。インターフェロンは、抗ウイルス疾患の処置および癌の制御のための、治療剤として興味深い。
【００９５】
ヒトＩＦＮ−β遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、当該分野で利用可能であり（Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７およびＴａｎｉｇｕｃｈｉら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｊａｐａｎ  ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５５：４６４を参照のこと）、そしてその遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら（１９８０）Ｇｅｎｅ  １０：１１〜１５）そしてチャイニーズハムスター卵巣細胞において発現される（例えば、米国特許４，９６６，８４３号および同５，３７６，５６７号を参照のこと）。ＩＦＮ−βの改変体は、欧州特許出願第１８５４５９Ｂ１に記載され、そして米国特許第４，５１８，５８４号、同４，５８８，５８５号および同４，７３７，４６２号は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されるＩＦＮ−βser17のようなムテインを記載する（これらすべてが、本明細書中で参考として援用される）。
【００９６】
なお別の実施形態において、本発明の液体の薬学的組成物中に治療上活性な成分として存在するポリペプチドは、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）もしくはその改変体であり、好ましくは組換えＴＦＰＩである。このポリペプチドは、凝固カスケードのインヒビターであり、リポタンパク質会合凝固インヒビター（ＬＡＣＩ）、組織因子インヒビター（ＴＦＩ）、および外因性経路インヒビター（ＥＰＩ）としても公知である。ＴＦＰＩは、ヒト肝細胞癌であるＨｅｐ  Ｇ２から最初に精製され（ＢｒｏｚｅおよびＭｉｌｅｔｉｃｈ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：１８８６〜１８９０）、その後ヒト血漿から精製され（Ｎｏｖｏｔｎｙら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１８８３２〜１８８３７）；そしてチャン肝細胞およびＳＫ肝細胞癌細胞から精製された（Ｗｕｎら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６０９６〜１６１０１）。ＴＦＰＩ  ｃＤＮＡが、胎盤ｃＤＮＡライブラリーおよび内皮ｃＤＮＡライブラリーから単離された（Ｗｕｎ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６００１〜６００４；Ｇｉｒａｒｄら（１９８９）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．５５：３７〜５０）。概説として、Ｒａｐａｐｏｒｔ（１９８９）Ｂｌｏｏｄ  ７３：３５９〜３６５（１９８９）；Ｂｒｏｚｅら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：７５３９〜７５４６を参照のこと。ＴＦＰＩ  ｃＤＮＡ（ＴＦＰＩの２７６アミノ酸残基タンパク質をコードする）のクローニングが、米国特許第４，９６６，８５２号にさらに記載されており；また、米国特許第５，７７３，２５１号および同第５，８４９，８７５号（これらすべてが本明細書中に参考として援用される）も参照のこと。
【００９７】
ＴＦＰＩの改変体は、当該分野で公知である。例えば、組換えＴＦＰＩの非グリコシル化形態がＥ．ｃｏｌｉ中で産生および単離された、米国特許第５，２１２，０９１号；アナログおよびフラグメントが開示されている、米国特許第５，１０６，８３３号；ならびに酵母におけるＴＦＰＩアナログの産生が記載されている、米国特許第５，３７８，６１４号（これらすべてが、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００９８】
薬学的に有効な量の、本発明の安定化された液体のポリペプチド含有薬学的組成物が、被験体に投与される。「薬学的に有効な量」により、疾患もしくは状態の、処置、予防または診断において有用である量が意図される。代表的な投与経路としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：経口投与および非経口投与（静脈内、筋肉内、皮下、動脈内および腹腔内の注射または注入を含む）。１つのこのような実施形態において、その投与は、注射により、好ましくは皮下注射による。本発明の組成物の注射可能な形態としては、溶液、懸濁物および乳濁液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
目的のポリペプチドを含む安定化された液体の薬学的組成物は、単位用量にて処方されるべきであり、そして溶液、懸濁物、または乳濁液のような、注射可能な形態または注入可能な形態であり得る。さらに、これは、乾燥形態（例えば、凍結乾燥粉末）で凍結貯蔵または調製され得、それは、経口投与経路または非経口投与経路を含む種々の方法のいずれかによって投与前に液体溶液、懸濁物または乳濁液中に再構成され得る。好ましくは、それは、下記に概説されるように、本発明の方法に従って達成される、増加した貯蔵安定性を利用して、液体処方物にて貯蔵される。この安定化された薬学的組成物は、好ましくは、膜濾過により滅菌され、そして密封されたバイアルもしくはアンプルのような、単位用量または複数用量の容器中で貯蔵される。当該分野で一般的に公知の薬学的組成物を処方するためのさらなる方法が、本明細書中に開示される液体の薬学的組成物の貯蔵安定性をさらに増強するための使用され得るが、ただしそれは、それらの方法が、本発明の方法に開示される好ましい安定化剤および緩衝剤の有益な効果に不利には影響しない場合である。薬学的に受容可能なキャリア、安定化剤などの処方および選択の徹底的な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）（第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｅａｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
【０１００】
「被験体」によって、任意の動物が意図される。好ましくは、その被験体は哺乳動物であり、より好ましくはその被験体はヒトである。ヒト以外の特に重要な哺乳動物としては、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、およびブタが挙げられるが、こられに限定されない。
【０１０１】
投与が処置目的である場合、投与は、予防目的または治療目的のいずれかのためであり得る。予防的に提供される場合、その物質は、すべての症状の前に提供される。その物質の予防的投与は、その後のいかなる症状をも予防または減弱するように作用する。治療的に提供される場合、その物質は、症状の開始時（またはすぐ後）に提供される。その物質の治療的投与は、実際のいかなる症状をも減弱するように作用する。
【０１０２】
従って、例えば、ネイティブ配列ＩＬ−２またはその改変体を含む、本発明の有効量の薬学的組成物を含む処方物を、このポリペプチドでの治療に応答する複数の診療徴候の処置、予防、および診断の目的のために使用し得る。ネイティブ配列ＩＬ−２の生物学的活性改変体（例えば、ＩＬ−２活性を保持するＩＬ−２のムテイン、特にムテインＩＬ−２．ｓｕｂ．ｓｅｒ１２５および他のムテイン、ここで、位置１２５のシステインは、別のアミノ酸で置換される）を、ネイティブ配列ＩＬ−２と同一の様式で処方および使用され得る。従って、ネイティブ配列ＩＬ−２またはその改変体を含む本発明の処方物は、細菌、ウイルス、寄生虫、原虫および真菌感染の診断、予防、および処置（局所的または全身的）のため；細胞媒介細胞傷害を増強するため；リンフォカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の活性を刺激するため；リンパ球の免疫機能の回復を媒介するため；同種抗原の応答を増強するため；後天的免疫不全状態における免疫機能の回復を促進するため；加齢のヒトおよび動物における正常な免疫機能の再構成のため；疾患状態におけるＩＬ−２レベルのモニタリングのために、酵素増幅の使用、放射線標識、放射線画像化、および他の当該分野で公知の方法のような診断アッセイの展開において；治療および診断目的のためにインビトロでＴ細胞増殖を促進するために；リンフォカインの対するレセプター部位を遮断するため；ならびに種々の他の治療、診断および調査適用において有用である。ヒトＩＬ−２またはその改変体（例えば、ＩＬ−２ムテイン）の種々の治療適用および診断適用を、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８７）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６：８８９−８９７；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８８）Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２０８：１２１−１３５；Ｔｏｐａｌｉａｎら（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．６：８３９−８５３；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８８）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１９：１６７６−１６８０；Ｗｅｂｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０：３３−４０；Ｇｒｉｍｍら（１９８２）Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７０（２）２４８−２５９；Ｍａｚｕｍｄｅｒ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｓｃｉ．Ａｍ．３（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ３７−４２；ＭａｚｕｍｄｅｒおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５９（２）：４９５−５０７；およびＭａｚｕｍｄｅｒら（１９８３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１５（１）：１−１０において研究および報告されている。ＩＬ−２またはその改変体を含む本発明の処方物は、単一治療活性剤として使用され得るか、または他の免疫学的に関連するＢもしくはＴ細胞または他の治療剤と組合せて使用され得る。関連細胞の例としては、ＢまたはＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、ＬＡＫ細胞などであり、そしてＩＬ−２またはその改変体と組合せて使用され得る例示的治療剤は、種々のインターフェロン、特にγ−インターフェロン、Ｂ細胞増殖因子、ＩＬ−１、および抗体（例えば、抗−ＨＥＲ２または抗−ＣＤ抗体）である。ＩＬ−２またはその改変体を含む本発明の処方物は、内科医によって適切であるとみなされた場合、経口、腹腔内、筋肉内、皮下、静脈内、鼻腔内、または肺送達によって、ヒトまたは動物に投与され得る。投与され得るＩＬ−２の量（ＩＬ−２生物学的活性を保持するネイティブ配列またはその改変体（例えば、本明細書中で開示されるムテイン）のいずれか）は、約０．１ｍｌＵ／ｍ2と約１５ｍｌＵ／ｍ2との間の範囲であり得る。腎細胞癌および転移性黒色腫のような徴候のために、ＩＬ−２またはその生物学的活性改変体を、３００，０００〜８００，０００ＩＵ／ｋｇ／８時間の高い用量の静脈内ボーラスとして投与し得る。
【０１０３】
ネイティブ配列組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）またはその改変体を含む本発明の有効量の薬学的組成物を含む処方物を、このポリペプチドでの治療に応答する複数の診療徴候の診断、予防、および処置（局所的または全身的）の目的のために使用し得る。このような診断徴候としては、例えば、好中球エラスターゼの増加した合成および放出に関連する徴候（このような免疫疾患には、重篤急性膵炎、気腫、慢性関節リウマチ、多発性器官不全、嚢胞性線維症、成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）、および敗血症が挙げられる）；ならびに疾患の診断および処置のために、ＩＬ−８の増加した合成および放出に関連する徴候（このような免疫疾患には、ＡＲＤＳ、再灌流障害（肺再灌流障害を含む）、敗血症、および関節炎が挙げられる）を含む。本明細書中で参考として援用されるＷＯ９６／４０２２４を参照のこと。ＩＦＮ−βまたはムテインのヒトまたは動物への投与は、内科医によって適切であるとみなされた場合、経口、腹腔内、筋肉内、皮下、静脈内、鼻腔内、または肺送達によって投与され得る。
【０１０４】
β−インターロイキン（ＩＮＦ−β）またはその改変体（例えば、ＩＮＦ−βser17）を含む、本発明の有効量の薬学的組成物を含む処方物を、このポリペプチドでの治療に応答する複数の診療徴候の診断、予防、および処置（局所的または全身的）の目的のために使用し得る。例えば、このような診断徴候は、以下が挙げられる：中枢神経系（ＣＮＳ）、脳、および／または脊髄の障害または疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、レーヴィ体痴呆、多発性硬化症、癲癇、小脳性運動失調、進行性核上性麻痺、筋萎縮側索硬化症、情動障害、不安障害、強迫性障害、人格障害、注意欠陥障害、注意欠陥過活動性障害、ツレット症候群、テイサックス病、ニーマン‐ピック、および精神分裂病；神経損傷（脳血管疾患（例えば、脳または脊髄での発作）、ＣＮＳ感染（髄膜炎およびＨＩＶを含む）、脳および脊髄の腫瘍、またはプリオン疾患）；自己免疫疾患（後天免疫欠損、慢性関節リウマチ、乾癬、クローン病、シェーグレン症候群、筋萎縮性側索硬化症、および狼瘡）；ならびに癌（脳癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌および結腸癌を含む））。ＩＮＦ−βまたはそのムテインのヒトまたは動物への投与は、内科医によって適切であるとみなされた場合、経口、腹腔内、筋肉内、皮下、静脈内、鼻腔内、または肺送達によって投与され得る。
【０１０５】
本発明はまた、液体の薬学的組成物中におけるポリペプチドの安定性を増加させるための方法を提供し、ここで、治療活性成分として有用であるポリペプチドは、液体処方物中での保存の間に、凝集形成を示す。この方法は、液体の薬学的組成物の保存の間のポリペプチドの凝集形成を減少させるために、十分な量でアミノ酸塩、ならびに実質的に塩形態でない酸、その塩形態の酸、または酸およびその塩形態の混合物を液体の薬学的組成物に取り込む工程を包含し、ここで、この酸は、本明細書中で先に記載されるように、受容可能な範囲内で液体組成物のｐＨを維持するために緩衝剤として有用である。
【０１０６】
アミノ酸塩、またはアミノ酸塩基の塩および本明細書中に記載されるような１以上のさらなる安定剤を、本明細書中に記載されるような緩衝剤と組合せて（すなわち、実質的に塩形態でない酸、酸の塩形態、または酸およびその塩形態の混合物）取り込むことによって、ポリペプチドまたはその改変体の安定性を上げることによって、保存中の液体ポリペプチド含有薬学的組成物の安定性の増加に導く。従って、本発明はまた、この組成物が液体処方物中での保存の間に凝集を形成するポリペプチドを含む場合、液体の薬学的組成物の保存安定性を上げるための方法を提供する。「保存安定性を上げる」とは、保存中に適切な、凝集しない、生物学的活性コンフォメーションでポリペプチドまたはその改変体のより長い保持を示し、従って、アミノ酸塩を含まないか、またはアミノ酸塩および１以上の明細書中に記載されるさらなる安定化剤を含まないように、本明細書中で開示される緩衝剤と組合せて調製された液体の薬学的組成物よりも治療効果が衰退しない薬学的組成物を意図する。
【０１０７】
本発明の方法に従って達成されたポリペプチド含有薬学的組成物の保存安定性は、当該分野で標準の手順を使用して評価され得る。代表的に、このような組成物の保存安定性は、保存安定性プロフィールを使用して評価される。これらのプロフィールは、以下の実施例に示されるように、凝集しない生物学的活性分子形態で存在するポリペプチドの量、および目的の変量（例えば、ｐＨ濃度、安定剤、安定剤の濃度など）に応答する経時的効力をモニタリングすることによって得られる。これらの安定性プロフィールは、可能な保存条件（例えば、凍結温度、冷蔵温度、室温、または高温（例えば、４０〜５０℃））のそれぞれの個々の温度で作製され得る。次いで、保存安定性を、例えば、目的のポリペプチドの凝集しない生物学的活性分子形態の半減期を決定することによってプロフィール間で比較する。「半減期」とは、目的のポリペプチドの凝集しない生物学的活性分子形態において５０％の減少に必要とされる時間が意図される。アルギニン塩および本発明の方法に従って調製された、実質的に塩形態でない酸を含む組成物は、アミノ酸塩基の塩を含まないか、またはアミノ酸塩および１以上の明細書中に記載されるさらなる安定化剤を含まないように、実質的に塩形態でない酸、その酸の塩形態、または酸およびその塩形態の混合物と組合せて調製された液体組成物の半減期よりも約２倍〜約１０倍長い半減期、好ましくは、少なくとも約３倍〜約１０倍長い半減期、より好ましくは、少なくとも約４倍〜約１０倍長い半減期、最も好ましくは、少なくとも約５倍〜約１０倍長い半減期を有する。本発明の目的のために、本発明に従って調製される結果として、増加した保存安定性を有する薬学的組成物は、「安定化」薬学的組成物とみなされる。このような安定化組成物は、好ましくは、２〜８℃で保存した場合、少なくとも約１８ヶ月、より好ましくは、少なくとも約２０ヶ月、さらにより好ましくは、少なくとも２２ヶ月、最も好ましくは、少なくとも２４ヶ月の有効期間を有する。
【実施例】
【０１０８】
以下の実施例は、例示の目的で提供され、制限する目的で提供するものではない。
【０１０９】
（実験）
ＩＬ−２は、Ｔ細胞増殖を刺激する強力なマイトジェンである。これは、癌転移の処置として、癌治療のためのアジュバントとして、および感染性疾患の組み合わせ薬剤としての、広範な治療適用を有する。
【０１１０】
ＩＬ−２治療を使用する種々の臨床試験の進行に伴い、このタンパク質についての安定な液体処方物の開発が、非常に望ましいことが明らかになった。このような処方物は、従来の凍結乾燥化処方物よりも汎用性がある。なぜなら、これは、種々の投薬レジメンに従って異なる強度で供給され得るからである。液体処方物はまた、再構成を必要としないので、投与により簡便である。このような処方物は、予め充填された既製シリンジにおいて供給され得るか、または静菌剤と適合性であることが見い出された場合は、複数回用量の調製物として供給され得る。
【０１１１】
液体処方物中のＩＬ−２は、貯蔵中に少なくとも以下の３つの経路：凝集、メチオニン酸化および脱アミノ化、を介して分解することが報告されている（Ｋｕｎｉｔａｎｉら（１９８６）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ３５９：３９１−４０１；Ｋｅｎｎｅｙら（１９８６）Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．５：５２３−５２７）。さらに、ＩＬ−２は、凍結および機械的剪断ストレスによって引き起こされる急性のダメージに対して感受性である。従って、ＩＬ−２処方物の開発は、急性のダメージおよび慢性的分解の両方に取り組みことを必要とする。
【０１１２】
従って、新規な安定なモノマーｒｈＩＬ−２処方物を開発した。この処方物において、タンパク質分子は、そのモノマー形態で溶液中に存在し、凝集形態では存在しない。それゆえ、ｒｈＩＬ−２の共有結合オリゴマーまたは疎水性オリゴマーあるいは凝集体は存在しない。処方物は、いくつかの安定剤（最も重要には、アルギニンおよびメチオニン）を含み、長期間の貯蔵の間の凝集、メチオニン酸化および脱アミノ化のような物理的および化学的なダメージに対して、このタンパク質を安定化する。さらに、非イオン性界面活性剤、ポリソルベート−８０を、処方物に含め、凍結融解および機械的剪断ストレスによって生じる急性のダメージからタンパク質を防止する。以下の実施例に示されるように、ｒｈＩＬ−２処方物への本発明の安定剤の添加は、その貯蔵安定性を増加する。
【０１１３】
これらの実施例において使用されるＩＬ−２分子は、組換えヒトＩＬ−２ムテインである、アルデスロイキン（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）（デス−アラニル−１，セリン−１２５ヒトインターロイキン−２）であり、これは、システイン−１２５がセリンで置換されている。米国特許第４，９３１，５４３号に記載のように、これは、Ｅ．ｃｏｌｉから発現され、その後、ダイアフィルトレーションおよびカチオン交換クロマトグラフィーによって精製される。開発用途のための精製バルクは、約３ｍｇ／ｍｌのＩＬ−２であり、そして１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ  ６）、２００〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ＣＭプール緩衝液）中または１０ｍＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ  ６）および１５０ｍＭ  Ｌ−アルギニンを含有する緩衝液中のいずれかにおいて処方した。
【０１１４】
組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）は、液体の薬学的処方物における貯蔵の間の凝集による分解を示す別のタンパク質である（Ｃｈｅｎら（１９９９）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８８：８８１−８８８）。以下の実施例８は、凝集形態を減少するためのその遊離塩基形態にある酸、およびその塩形態を実質的に含まない酸によって供給される緩衝液系の使用の効果を示す、液体処方物に関する。
【０１１５】
以下のプロトコルを実施例において使用し、ＩＬ−２またはＴＦＰＩの分解に対する特定の安定剤の効果、およびそれゆえ、液体処方物中の貯蔵の間のこのタンパク質の安定性を測定した。
【０１１６】
（ＵＶ吸光度測定）
タンパク質溶液のＵＶ吸光度を、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙスペクトロメーター（Ｍｏｄｅｌ  ８４５２）を使用して行った。この装置は、適切な処方物緩衝液でブランクを取った。２８０ｎｍでの吸光度を、１．０ｃｍの経路長の石英キュベットを使用して記録した。０．７０（ｍｇ／ｍｌ）-1ｃｍ-1の吸光率を使用して、吸光度データをＩＬ−２濃度（ｍｇ／ｍｌ）に変換した。
【０１１７】
（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
ＲＰ−ＨＰＬＣを、７１７自動サンプラーを備えたＷａｔｅｒｓ  ６２６  ＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｉｎｅ）上で、Ｖｙｄａｃ  ２１４ＢＴＰ５４Ｃ4カラムおよびＶｙｄａｃ  ２１４ＧＣＣ５４プレカラム（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ，Ｈｅｓｐａｒｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して行った。カラムを、最初に、移動相Ａ（１０％  アセトニトリル、０．１％  ＴＦＡ）で平衡化した。次いで、２０μｇのＩＬ−２サンプルをロードし、そしてタンパク質を、流速１．０ｍｌ／分で５０分間にわたる、０〜１００％の移動相Ｂ（１００％  アセトニトリル、０．１％  ＴＦＡ）を適用して溶出した。主要な可溶性ＩＬ−２種は、約３２分で溶出され、そしてＷａｔｅｒｓ  ４８６検出器を使用してＵＶ  ２１４ｎｍによって検出した。データの取得および処理を、Ｐｅｒｋｉｎｓ−Ｅｌｍｅｒ  Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍシステム（ＰＥ  Ｎｅｌｓｏｎ，，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）上で行った。
【０１１８】
このＲＰ−ＨＰＬＣ方法は、主要なモノマーＩＬ−２種をピークＢとして、メチオニン酸化種（主に、Ｍｅｔ104が酸化されている）をピークＡとして、脱アミノ化種（おそらく、Ａｓｎ88）をピークＢ’として、そしてこれらのピークの前後のいずれかで溶出された他の未知の種を検出した。
【０１１９】
（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
サイズ排除ＨＰＬＣを、ＴＯＳＯＨＡＡＳ  Ｇ２０００ＳＷｘ１カラムおよびＴＳＫ  ＳＷｘ１ガードカラム（ＴＯＳＯＨＡＡＳ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）上で行った。１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ  ７）および２００ｍＭ  硫酸アンモニウムを含む単一の移動相を、１．０ｍｌ／分の流速で適用した。モノマーＩＬ−２種は、約１４分で溶出され、そしてＷａｔｅｒｓ  ４８６検出器を使用してＵＶ  ２１４ｎｍによって検出された。データの取得および処理を、Ｐｅｒｋｉｎｓ−Ｅｌｍｅｒ  Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍシステム上で行った。
【０１２０】
ＩＬ−２をモニターするために特別に開発したネイティブＳＥＣ−ＨＰＬＣプロトコルを使用して、ｒｈＩＬ−２は、主に、単一の種として溶出し、凝集解離剤（例えば、ＳＤＳ、尿素およびＤＴＴ）の添加は、この種の溶出に影響を与えなかったことから、この種は、おそらくモノマー形態である。
【０１２１】
（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）
イオン交換（ＩＥＸ）−ＨＰＬＣを、Ｃｈｅｎら（１９９９）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８８：８８１−８８８に記載されるように、７１７加熱器／冷却器自動サンプラーを備えるＷａｔｅｒｓ  ６２６  ＬＣシステムを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｍｏｎｏ−Ｓ  ＨＲ  ５／５ガラスカラム上で行った。このカラムは、８０％の移動相Ａ（７０：３０ｖ／ｖ、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム：アセトニトリル（ｐＨ  ５．４））および２０％の移動相Ｂ（７０：３０ｖ／ｖ、２０ｍＭ  酢酸ナトリウムおよび１Ｍ  塩化アンモニウム：アセトニトリル（ｐＨ
５．４））で平衡化した。注入後、組換えヒト（ｒｈ）ＴＦＰＩを、流速０．７ｍｌ／分で２１分間にわたり、移動相Ｂを８５％に増加させることによって溶出した。ｒｈＴＦＰＩは、約１６．５分で単一のピークとして溶出され、そしてＷａｔｅｒｓ  ４８６吸光度検出器を用いて２８０ｎｍのＵＶ吸光度によって検出した。データの取得および処理を、Ｐｅｒｋｉｎｓ−Ｅｌｍｅｒ  Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍシステム上で行った。タンパク質濃度を、ピーク面積を積分しそして既知の濃度のサンプルから作成した標準曲線での面積と比較することによって、推測した。
【０１２２】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Ｌａｅｍｍｌｉのプロトコルに従って行った。約５μｇのＩＬ−２を、プレキャスト１８％  Ｎｏｒｖｅｘ  Ｔｒｉｓ−グリシンゲルの各レーンにロードし、そして電気泳動を１００Ｖで行った。タンパクバンドを、クーマシーブルー染色によって染色し、そしてＩｍａｇｅｑｕａｎ  Ｔシステムを備えるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ濃度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって分析した。
【０１２３】
（ＩＬ−２生物活性についてのＨＴ−２細胞増殖およびＭＴＴ染色）
ＩＬ−２の効力を、ＨＴ−２細胞増殖およびＭＴＴ染色を使用するインビトロバイオアッセイ（Ｇｉｌｌｉｓら（１９７８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２０：２０２７−２０３２；Ｗａｔｓｏｎ（１９７９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５０（６）：１５１０）によって測定した。手短には、１×１０4のマウスＨＴ−２細胞（これは、増殖についてＩＬ−２依存性である）を、標準、コントロールまたはサンプルを含む、組織培養プレートのウェルにロードした。３７℃で２２〜２６時間のインキュベーション後、ＭＴＴ染色をウェルに添加し、そしてインキュベーションを３７℃で３〜４時間継続した。次いで、２０％  ＳＤＳを添加し、室温で一晩脱色した。ウェルの吸光度を、５７０ｎｍで読み取り、そしてＷＨＯ国際標準に基づいてＩＬ−２の生物活性に変換した。
【０１２４】
（ｐＨおよび容量オスモル濃度測定）
種々の処方物の溶液のｐＨを、Ｏｒｉｏｎ製のｐＨメーター（Ｍｏｄｅｌ  ６１１、Ｏｒｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｇｒｏｕｐ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）によって測定した。このｐＨメーターは、ｐＨ  ４標準（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号ＳＢ１０１−５００）およびｐＨ  ７標準（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＳＢ１０７−５００）を使用して、製造業者に示された２緩衝液較正手順によって較正した。
【０１２５】
これらの処方物の溶液の容量オスモル濃度を、Ｗｅｓｃｏｒ製のＶａｐｏｒ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  ５５００、Ｗｅｓｃｏｒ
Ｉｎｃ．，Ｌｏｇａｎ．Ｕｔａｈ）によって測定した。この浸透圧計は、この製造業者によって供給される以下の２つの標準：２９０ｍｍｏｌ／ｋｇ標準（Ｗｅｓｃｏｒ，発注番号ＯＡ−０１０）および１，０００ｍｍｏｌ／ｋｇ標準（Ｗｅｓｃｏｒ，発注番号ＯＡ−０２９）、によって較正した。
【０１２６】
これらのプロトコルを使用して、タンパク質の凝集、メチオニン酸化および脱アミノ化によるｒｈＩＬ−２分解に対する、種々の安定剤の効果を定量化した。
【０１２７】
（実施例１：タンパク質凝集およびｒｈＩＬ−２の貯蔵安定性に対する種々の可溶化剤の影響）
タンパク質凝集は、マイルドな酸性からアルカリ性のｐＨ条件の範囲の液体媒体中のｒｈＩＬ−２についての主な分解経路である。これらのｐＨ条件で処方された溶液中のｒｈＩＬ−２は、高温で貯蔵される場合、迅速にタンパク質凝集し、これによって、可視の沈澱が生じる。可視の沈澱したタンパク質は、０．２μｍフィルターを通した濾過によって除去され得る。溶液中の残りの可溶性タンパク質は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＵＶ吸光度のような多数の分析アッセイによって定量され得る。凝集はまた、生物活性の減少を生じ、これは、本明細書中に記載されるインビトロでのバイオアッセイによって決定され得る。
【０１２８】
本明細書中に記載される分析手順を用いて、いくつかの条件下でのｒｈＩＬ−２の貯蔵安定性を、高温でのインキュベーション時間の関数として可溶性ｒｈＩＬ−２の量の変化をモニタリングすることによって追跡した。
【０１２９】
（１．Ａ．糖およびアミノ酸の影響）
ｒｈＩＬ−２の貯蔵安定性に対する糖の影響を、ソルビトール、スクロースおよびマンニトールについて、０．２ｍｇ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−２、１０ｍＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ６）およびこれらの糖のうちの１つ２７０ｍＭを含む処方物中で調べた。安定性サンプル中に残っている可溶性ｒｈＩＬ−２の量を、図１に示すようにインキュベーション時間に対してプロットした。互いに重ねたスクロースおよびマンニトールの曲線は、ＩＬ−２貯蔵安定性に対するそれらの影響が類似することを示す。ソルビトールについての曲線は、他の２つの糖よりもわずかに高く、このことは、ソルビトールが他の２つの糖よりもわずかに大きな安定性効果を有することを示唆する。
【０１３０】
貯蔵安定性に対するアミノ酸の影響を図２に示す。処方物は、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２、１０ｍＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ６）および選択された９つのアミノ酸のうちの１つ１５０ｍＭを含んでいた。図２に示すように、安定性のランクは、Ａｒｇ＞Ａｓｐ＞Ｌｙｓ＞Ｍｅｔ＞Ａｓｎ＞Ｌｅｕ＝Ｓｅｒ＝Ｐｒｏ＝Ｇｌｙである。
【０１３１】
ソルビトールおよびアルギニンの安定化効果を、さらなる研究において確認した。この研究は、ｒｈＩＬ−２貯蔵安定性が濃度依存性様式で影響を受けることを示した。従って、ｒｈＩＬ−２貯蔵安定性は、ソルビトール濃度が５０ｍＭから１５０ｍＭに、そして最終的に２７０ｍＭまで増大した場合に増強される（図３）。同様に、ｒｈＩＬ−２貯蔵安定性は、処方物中のアルギニンの濃度が増大するにつれて増大する（図４）。
【０１３２】
（１．Ｂ．処方物のｐＨの影響）
ＮａＣｌ、ソルビトールおよびアルギニンを含む処方物中のｒｈＩＬ−２のｐＨ貯蔵安定性プロフィールを調べた。５０℃での残りの可溶性ＩＬ−２についての半減期を、図５中のｐＨに対してプロットする。半減期（ｔ1/2）を、安定性サンプル中の可溶性タンパク質の５０％減少に必要な時間として本明細書で定義した。より大きな半減期は、より大きな貯蔵安定性を示す。
【０１３３】
図５に示すように、タンパク質凝集に対してｒｈＩＬ−２を安定化するために最適なｐＨは、溶液中に存在する安定化剤に依存する。ＮａＣｌ中のｒｈＩＬ−２の最大の貯蔵安定性には、ｐＨ４で到達し、ここで、ｒｈＩＬ−２は、５０℃で約２３日間の半減期を有する。ソルビトール処方物中のｒｈＩＬ−２は、ｐＨが減少するにつれて増大した安定性を示し、最大の安定性は、ｐＨ５で生じ、ここで、５０℃での半減期は約２６日間である。最大の安定性（すなわち、最長の半減期）は、約６．０のｐＨを有する処方物中で安定化剤としてアルギニンを用いて達成され得、ここで、このタンパク質の５０℃での半減期は約３２日間である。これらの結果は、アルギニンが、ソルビトールまたはＮａＣｌと比較して好ましい安定化剤であることを示唆する。なぜなら、タンパク質安定化についての最適ｐＨが、より生理学的に受容可能なｐＨで生じるからである。
【０１３４】
（１．Ｃ．緩衝液系の影響）
処方物中で１０ｍＭ緩衝液系を用いて、適切なｐＨを提供し、そして特定の量の緩衝化能力を維持することが極めて習慣的である。例えば、５．８の処方物ｐＨは、コハク酸およびその塩形態（例えば、コハク酸ナトリウム）の１０ｍＭの混合物を用いることによって達成され得る。このような緩衝液系が選択される場合、１５０ｍＭアルギニンＨＣｌは、処方物において一次安定化剤として用いられ得るが、１５０ｍＭアルギニン塩基はそうではない。なぜなら、１５０ｍＭアルギニン塩基は、ｐＨが１０ｍＭ緩衝液によって下げて５．８に調整されるのを妨げるからである。
【０１３５】
しかし、アルギニンＨＣｌは、アルギニン塩基が生じるよりも高い容量オスモル濃度を生じる。従って、１０ｍＭコハク酸およびコハク酸ナトリウム緩衝液を用いてｐＨ５．８に調整された１５０ｍＭアルギニンＨＣｌを含む処方物は、既に等張性に近く、約２５３ｍｍｏｌ／ｋｇの容量オスモル濃度および５０℃での約８日間の半減期を有する（表１）。貯蔵安定性は、この安定化剤の増大に伴って増大するので、処方物中のなおより高い濃度のアルギニンが望ましい。アルギニンＨＣｌの添加によってアルギニンの濃度が２３０ｍＭに増大し、そして１０ｍＭコハク酸およびコハク酸ナトリウム緩衝液を用いてｐＨが５．８に調整された場合、５０℃での半減期は二倍（約１７日間）であり、なお、この溶液は高張性であり、約３７２ｍｍｏｌ／ｋｇの容量オスモル濃度を有する。
【０１３６】
溶液のｐＨを５．８に調整するための緩衝化系として供されるコハク酸およびアルギニンは、アルギニン塩基として存在し、２３０ｍＭまでアルギニン塩基の濃度が増大すると、５０℃での半減期が同様に二倍になり、これは、約１６日間まで増大した。しかし、貯蔵安定性におけるこの増大は、溶液をほぼ等張にしつつ達成され、この処方物は、約２７１ｍｍｏｌ／ｋｇの容量オスモル濃度を有していた（表１を参照のこと）。このようにして、２３０ｍＭアルギニン塩基は処方物中で用いられて、この処方物の等張性を越えることなく、ｒｈＩＬ−２の貯蔵安定性を増大させ得る。
【０１３７】
（表１：ｒｈＩＬ−２処方物の溶液の容量オスモル濃度および貯蔵安定性）貯蔵安定性を、５０℃で貯蔵した後、ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定した残りの可溶性ｒｈＩＬ−２についての半減期（ｔ1/2）で表す。アルギニンＨＣｌ処方物は、０．５ｍｇ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−２、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１５０ｍＭまたは２３０ｍＭ  Ｌ−アルギニンＨＣｌならびに１０ｍＭコハク酸およびコハク酸ナトリウムを含み、ｐＨが５．８に調整される。アルギニン塩基処方物は、０．５ｍｇ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−２、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１５０ｍＭまたは２３０ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基、ならびに８１ｍＭまたは１２８ｍＭコハク酸を含み、ｐＨが５．８に調整された。
【０１３８】
【表１】
2005068158.tif 000002
【０１３９】
これらの２つのｐＨ調整方法を、他の緩衝液系について調べた（表２）。１５０ｍＭアルギニンＨＣｌを処方物中で用い、そして１０ｍＭの酸およびそのナトリウム塩によってｐＨを５．８に調整した場合、全ての処方物は、等張未満であり、等張は約２９０ｍｍｏｌ／ｋｇであった。これらの処方物中でのｒｈＩＬ−２についての５０℃での半減期は、約１５日間〜約２０日間の範囲であった。２３０ｍＭアルギニン塩基をこの処方物中で用い、そして緩衝液系としてその塩の形態を実質的に含まない酸を用いてｐＨを５．８になるまで滴定した場合、クエン酸またはコハク酸で調整されたｐＨを有する処方物は、依然として等張よりも低い溶液容量オスモル濃度を示し、一方、他の処方物は、リン酸の場合のように等張よりもわずかに高いか、またはグルタミン酸もしくは酢酸の場合のように高張であるかのいずれかであった。しかし、全ての処方物についての５０℃での半減期は、３０日を越えるまで増大した。従って、いずれもその塩形態を実質的に含まないクエン酸またはコハク酸を緩衝化系として用いることによって、アルギニンの濃度は、アルギニン塩基を用いて２３０ｍＭへと増大され得、ｒｈＩＬ−２の貯蔵安定性が増大する。
【０１４０】
（表２：ｒｈＩＬ−２処方物の溶液容量オスモル濃度および貯蔵安定性）５０℃での貯蔵後にＲＰ−ＨＰＬＣによって測定した残りの可溶性ｒｈＩＬ−２についての貯蔵安定性を半減期（ｔ1/2）で表す。全ての処方物は、０．２ｍｇ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−２、５ｍＭメチオニン、１ｍＭ  二ナトリウムＥＤＴＡ、０．１％ポリソルベート８０および１５０ｍＭ  Ｌ−アルギニンＨＣｌを含んでおり、１０ｍＭの酸およびそのナトリウム塩または２３０ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基によってｐＨを５．８に調整し、その塩形態を実質的に含まない酸を用いて滴定することによってｐＨを５．８に調整した。
【０１４１】
【表２】
2005068158.tif 000003
【０１４２】
（１．Ｄ．タンパク質濃度の効果）
貯蔵安定性に対するタンパク質濃度の効果を、１０ｍＭ  コハク酸ナトリウム（ｐＨ６）および１５０ｍＭ  アルギニンを含有する処方物において試験した。図６に示されるように（ここで、可溶性ｒｈＩＬ−２に関する５０℃における半減期を、最初のタンパク質濃度に対してプロットした）、ｒｈＩＬ−２貯蔵安定性はタンパク質濃度が減少するにつれて増加する。この知見は、凝集体が処方物中のｒｈＩＬ−２に関する主要な分解経路であるという実験的な観測と合致する。
【０１４３】
（１．Ｅ．非イオン性界面活性剤ポリソルベート８０の効果）
ｒｈＩＬ−２貯蔵安定性に対するポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０またはＴｗ  ８０）の効果を、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２、２３０ｍＭ  アルギニン塩基、ｐＨ５．８に調整された１２８ｍＭ  コハク酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡならびに０、０．０２、および０．１％のポリソルベート８０を含有する処方物中試験した。表３に示されるように、ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定された場合、ポリソルベート８０を含有する両方の処方物は、５０℃において可溶性ＩＬ−２の半減期に減少（１６日から約９日へ）を示す。従って、処方物中にポリソルベート８０を含有することは、タンパク質凝集に対するその効果に単独で基づいて望ましくないとして認識される。しかし、この因子は、以下の実施例に開示されるように、このタンパク質を含有する液体処方物の加工の間に有利である、凍結融解および機械剪断に関連する激しいタンパク質損傷に対して安定化する効果を有する。
【０１４４】
２つのソルビトールベースの処方物の貯蔵安定性をまた、試験した。ＲＰ−ＨＰＬＣおよび生物活性によるこれらの半減期はアルギニン処方物に対して比較可能であったが、ＳＥＣ−ＨＰＬＣから概算された半減期は大いに小さく、これは、これらの処方物中のｒｈＩＬ−２タンパク質のより大きい部分が、おそらく可溶性凝集形態中に存在することを示唆する。
【０１４５】
（表３：ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定された半減期（ｔ1/2）  または残存する可溶性ｒｈＩＬ−２（ピークＢ）、および５０℃で所蔵されたｒｈＩＬ−２処方物中のインビトロバイオアッセイ）
【０１４６】
【表３】
2005068158.tif 000004
【０１４７】
表３において、ＲＰ−ＨＰＬＣ方法によって決定された場合のアルギニン塩基のコハク酸ｒｈＩＬ−２処方物に関する半減期は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ方法によって決定されたものよりもわずかにより小さく、そしてインビトロバイオアッセイ方法によって決定されたものよりも大いにより小さい。ＳＥＣ−ＨＰＬＣに対する主要なｒｈＩＬ−２種の溶出を、これらの差異をさらに調べるために評価した。ＳＤＳ、尿素、およびＤＴＴの処置が有りおよび無しでのサンプルは、主要な種に関して溶出時間に変化を示さず、これらの処方物中のｒｈＩＬ−２が単量体種として存在したことを示す。しかし、ＳＥＣ−ＨＰＬＣプロトコールは、他の単量体種（例えば、ピークＡのメチオニン酸化種）を主要な単量体のインタクト種（ピークＢの種）と区別し得なかったのかもしれない。従って、半減期の決定において小さな差異が予想される。
【０１４８】
表３に提示されるデータにおいて生物活性を決定するために使用されるインビトロバイオアッセイは、アッセイ希釈物中に０．１％のＳＤＳを用いて実行した。従って、マウスＨＴ−２細胞と相互作用させるために組織培養プレートへサンプルを適用する前に、このサンプルを０．１％  ＳＤＳを含有するアッセイ希釈物を用いて希釈した。ＳＤＳを用いた希釈が、これらのサンプル中のいくらかのｒｈＩＬ−２凝集体をもとの単量体形態へ解離させ、所定の処方物の生物活性の過大評価を生じ得た可能性はあった。従って、安定性のサンプルを、ＳＤＳの添加有り（＋Ｓ）および無し（−Ｓ）のアッセイ希釈物を用いてアッセイした。サンプルをまた、０．２μｍのろ過処理が有り（＋Ｆ）および無し（−Ｆ）でアッセイした。なぜなら、ろ過は、視覚検査によって判定されるように大きなタンパク質凝縮物を除去することが可能だからである。これらの処置を用いたサンプルに関して測定された生物活性値を、比較のためのＲＰ−ＨＰＬＣプロトコールを用いて得られた貯蔵安定性の結果と共に、表４に示す。値は、−７０℃で貯蔵された類似のサンプルにおいて得られた生物活性値の百分率として示す。
【０１４９】
一般的に、ＨＴ−２細胞と接触される前にＳＤＳを用いて希釈されろ過されていない処方物は、このアッセイを動かす前にアッセイ希釈中ＳＤＳ無しで希釈されてろ過された処方物よりも、より高い生物活性値を示す。これらの生物活性結果の間で、ろ過およびＳＤＳ無しでの希釈を用いて得られたものは、ＲＰ−ＨＰＬＣの結果に全く匹敵した。従って、この方法は、単量体ｒｈＩＬ−２に関する真の生物活性測定に推奨される。
【０１５０】
（表４：可溶性ｒｈＩＬ−２に関するＲＰ−ＨＰＬＣ分析と４０℃または５０℃で２週間貯蔵された安定性サンプルに関するインビトロ生物活性分析との間の結果の比較）
全ての結果は、これらそれぞれの−７０℃サンプルに関して得られた結果のパーセンテージとして表す。処方物は、０．５ｍｇ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−２、２３０ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基、１２８ｍＭ  コハク酸（ｐＨ５．８）、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ポリソルベート８０（有り（＃１）および無し（＃２））を含んだ。バイオアッセイに関するサンプルを、０．１％  ＳＤＳが有りおよび無しの希釈物を用いた希釈の前に、０．２２μｍのろ過が有りおよび無しで処置した。
【０１５１】
【表４】
2005068158.tif 000005
【０１５２】
（ｌ．Ｆ．保存料適合性）
保存料適合性を、複用量処方物の開発を要して調査した。ＩＬ−２安定性に対する保存料の効果を、２つの促進された研究において評価した。研究１は、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２、１０ｍＭ  コハク酸ナトリウム（ｐＨ６）および１６０ｍＭ  アルギニンを含有する処方物中、ベンジルアルコール、ｍ−クレゾール、およびフェノールをスクリーニングした。研究２は、０．２ｍｇ／ｍｌ  Ｉｌ−２、２３０ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基、１２８ｍＭ  コハク酸（ｐＨ５．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム、０．１％  ポリソルベート８０を含有する処方物中、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、メチルパラゲン（ｐａｒａｇｅｎ）／プロピルパルベン（ｐａｒｂｅｎ）、およびクロロブタノールをスクリーニングした。４０℃で貯蔵されたこれらの処方物に関してＲＰ−ＨＰＬＣによって測定された可溶性ｒｈＩＬ−２に関する半減期を、表５に示す。
【０１５３】
全ての試験された保存料は、上昇した温度においてｒｈＩＬ−２安定性を減少した。研究１において、可溶性ｒｈＩＬ−２に関する半減期は、いずれの保存剤も無しでは４０℃において約７４日間であった。ベンジルアルコールまたはｍ−クレゾールまたはフェノールの添加は、半減期を有意に５分の１倍〜１０分の１倍に減少した。研究２において、保存剤の効果は十分に低い強度であった。可溶性ｒｈＩＬ−２に関する半減期は、塩化ベンゼトニウムに関しては半分よりも小さく減少し、そして他の保存料に関して２分の１より大きく減少した。全てを考慮に入れて、塩化ベンゼトニウムは、試験された保存料の間でｒｈＩＬ−２安定性において最も少ない減少を有した。
【０１５４】
（表５．防腐剤を含有する処方物についての４０℃での可溶性ｒｈＩＬ−２の半減期（ｔ2/1））研究１：処方物は、０．２ｍｇ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−２、１０ｍＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ６）、１５０ｍＭ  Ｌ−アルギニンおよび防腐剤を含有した。研究２：処方物は、０．２ｍｇ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−２、２３０ｍＭ
Ｌ−アルギニン塩基、１２８ｍＭコハク酸（ｐＨ５．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡナトリウム、０．１％ポリソルベート８０および防腐剤を含有した。
【０１５５】
【表５】
2005068158.tif 000006
【０１５６】
防腐剤は、上昇した温度でのｒｈＩＬ−２に対する明白な不安定化効果を有したが、４℃または２５℃でのｒｈＩＬ−２の短時間貯蔵安定性に対するこれらの効果をも試験した。新たな研究を、０．２ｍｇ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−２、２３０ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基、１２８ｍＭコハク酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡナトリウム、５ｍＭメチオニンおよび０．１％ポリソルベート８０（ｐＨ５．８）を含む同じ処方物中において６つ防腐剤を試験した。表６は、１年貯蔵した後に残った可溶性ｒｈＩＬ−２の量の結果を報告する。全ての処方物は、コントロールと比較して、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびインビトロバイオアッセイの両方により可溶性ｒｈＩＬ−２の有意な損失を示さないが、ただし、０．２５％  ｍ−クレゾールを含む処方物（これは、検出可能な損失を示した）を除く。
【０１５７】
（表６．ＲＰ−ＨＰＬＣ積分ピーク面積およびインビトロ生物活性により決定される場合に残っている総可溶性ｒｈＩＬ−２の割合で表した、４℃または２５℃での防腐剤含有処方物の１年間の貯蔵の安定性）コントロール処方物は、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２、２３０ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基、１２８ｍＭコハク酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭメチオニンおよび０．１％ポリソルベート８０（ｐＨ５．８）を含有した。
【０１５８】
【表６】
2005068158.tif 000007
【０１５９】
（実施例２．ｒｈＩＬ−２のメチオニン酸化および貯蔵安定性に対する種々の因子の効果）
ＩＬ−２におけるメチオニン酸化は、以前に特徴付けられている（Ｋｕｎｉｔａｎｉら（１９８６）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ３５９：３９１−４０２；Ｓａｓａｏｋｉら（１９８９）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３７（８）：２１６０−２１６４）。Ｉｌ−２は、ペプチド鎖上の残基の位置２３、３９、３６および１０４位の４つのメチオニン残基を有する。これらの中でも、Ｍｅｔ104は、タンパク質表面上に存在し、そして最も酸化的である。このメチオニン酸化種は、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムからの初期の溶出種（ピークＡ）〜主要なＩＬ−２種（ピークＢ）として溶出され得る。Ｍｅｔ23およびＭｅｔ39は酸化されにくく、これは、おそらくタンパク質分子の内部のそれらの距離に起因して、極度な酸化条件下でしか生じない。これらのＭＥＴ残基の酸化種は、ＲＰ−ＨＰＬＣ上でＭｅｔ104よりも早い種として溶出され得る。Ｍｅｔ46は、タンパク質の内部深く埋められ、そしてタンパク質が完全に展開しない限り、簡単には酸化されない。
【０１６０】
ＩＬ−２におけるメチオニン酸化の研究は、Ｍｅｔ104（それ自体、酸化を最も受け易いメチオニン残基であり、そしてまた他のメチオニン残基の酸化を妨げる）の酸化に集中した。
【０１６１】
（２．Ａ．ｐＨの効果）
メチオニン酸化を、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭの種々の緩衝液種を含む処方物において、３〜９のｐＨ範囲において研究した。これらの処方物におけるメチオニン酸化を、ｔ＝０およびｔ＝３ヶ月で、ＩＬ−２サンプルにおけるピークＡ（すなわち、Ｍｅｔ104酸化種）の割合を定量化することにより試験した。表７に報告するように、ｐＨの効果は、シトレートにより緩衝化したサンプル（ｐＨ６）を除いて、ｔ＝０で認められた。他のサンプル（５％のピークＡ種を有するサンプル）と比較して、シトレートサンプルは、６％までのピークＡのレベルの増加を示した。
【０１６２】
ｔ＝３ヶ月では、ピークＡのレベルは、高いｐＨ条件で増加し、このことは、Ｍｅｔ104のメチオニン酸化のための塩基触媒機構を示唆する。ｐＨ６では、スクシネートは、低い値のピークＡがスクシネート処方物において観察される場合にメチオニン酸化を最少化する際、シトレートより良好な緩衝液である。
【０１６３】
（表７．ｔ＝０および３ヶ月でのｐＨ３〜ｐＨ９の処方物サンプルについてのメチオニン酸化ピークＡ種（総可溶性ＩＬ−２のピークＡ（％））として表される可溶性ＩＬ−２（ピークＡ＋ピークＢ）の総量の割合として表したメチオニン酸化のＲＰ−ＨＰＬＣ分析）処方物は、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含み、そしてｐＨは１０ｍＭの種々の緩衝液種により調製された。
【０１６４】
【表７】
2005068158.tif 000008
【０１６５】
（２．Ｂ．ＥＤＴＡ、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０およびＭｇＣｌ2の効果）
メチオニン酸化に対する金属イオンキレート剤、２種類の非イオン性界面活性剤、および二価金属イオンの効果を表８に報告する。処方物におけるポリソルベート２０またはポリソルベート８０の存在は、ｔ＝０およびｔ＝１ヶ月の両方でのメチオニン酸化種のレベルを増加させる。対照的に、ＥＤＴＡおよびＭｇＣｌ2は、４０および５０℃での１ヶ月貯蔵した後のメチオニン酸化種のレベルを減少させる。
【０１６６】
（表８．ｔ＝０およびｔ＝１ヶ月でのＩＬ−２サンプル中のメチオニン酸化ピークＡ種（ピークＡ（％））として存在する可溶性ＩＬ−２（ピークＡおよびピークＢ）の総量の割合）コントロールサンプルは、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２、１０ｍＭ  コハク酸ナトリウム（ｐＨ６）、および１５０ｍＭ  アルギニンを含有した。
【０１６７】
【表８】
2005068158.tif 000009
【０１６８】
（２．Ｃ．メチオニンの効果）
メチオニン酸化からＩＬ−２を保護するために、処方物におけるメチオニンの添加を実験した。表９は、５０℃での２週間貯蔵した後のメチオニンの種々の量を含む処方物についての、ピークＡの変化および可溶性ＩＬ−２（ピークＡ＋ピークＢ）の総量を報告する。処方物におけるメチオニン濃度の増加は、ｔ＝０および２週間でピークＡのレベルを減少させ、一方２週間貯蔵した後に残っている可溶性ＩＬ−２の量は、影響されない。５ｍＭメチオニンでは、ピークＡの３倍減少をｍｔ＝２週間において観察する。従って、メチオニンの添加は、タンパク質の有意なメチオニン酸化の減少を生じ、そしてＩＬ−２凝集に対してわずかしか影響しない。
【０１６９】
（表９．５０℃におけるｔ＝０およびｔ＝２週間でのＩｌ−２サンプルにおける、ピークＡの変化および総可溶性タンパク質の変化）処方物は、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２、２３０ｍＭアルギニン、１２８ｍＭコハク酸（ｐＨ５．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ポリソルベート８０および０〜１０ｍＭメチオニンを含有した。
【０１７０】
【表９】
2005068158.tif 000010
【０１７１】
高温の結果に加えて、５ｍＭメチオニンを有するかまたは有さない処方物について、３ヶ月貯蔵した後の４℃および２５℃でのメチオニン酸化のレベルも記録した。表１０に示されるように、処方物における５ｍＭメチオニンの存在は、４℃および２５℃の両方におけるピークＡのレベルの３倍の減少を生じる。従って、５ｍＭメチオニンの添加は、酸化からＭｅｔ104を有効に保護する。
【０１７２】
（表１０．メチオニンが酸化されたピークＡ種（総可溶性ＩＬ−２のピークＡ（％））として示される可溶性ＩＬ−２（ピークＡ＋ピークＢ）の総量の割合、および４℃または２５℃のいずれかでの３ヶ月間貯蔵したサンプルに残っている可溶性ＩＬ−２の割合として表される、メチオニン酸化のレベル）処方物は、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２、２３０ｍＭアルギニン、１２８ｍＭコハク酸（ｐＨ５．８）１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ポリソルベート８０および０〜５ｍＭメチオニンを含有した。
【０１７３】
【表１０】
2005068158.tif 000011
【０１７４】
（２．Ｄ．窒素パージングおよび脱気による酸素除去の効果）
メチオニン酸化を最少化するためにＩＬ−２サンプル中の酸素の除去を試験した。１ｍｌ  ＩＬ−２サンプルを満たした３ｃｃバイアル中のヘッドスペース中の空気を窒素でパージした。溶解した酸素分子を減圧脱気により除去した。表１１は、これらのサンプルについて、５０℃で１週間貯蔵した後の可溶性ＩＬ−２（ピークＡ＋ピークＢ）の総量の変化およびピークＡの変化を示す。窒素パージング単独では、メチオニン酸化種の割合をわずか（６．７％〜６．２％）しか減少しない。溶液脱気とヘッドスペースの窒素パージングとの組み合わせはさらにピークＡのレベルを約１パーセントポイント減少させる。一方、可溶性ＩＬ−２の総量の割合は、窒素パージまたは脱気のどちらを使用しても変化しないままである。
【０１７５】
（表１１：ｔ＝０およびｔ＝１週間にて５０℃で回収したサンプル中の、メチオニン酸化されたピークＡの種として表した可溶性ＩＬ−２の総量（ピークＡ＋ピークＢ）のパーセンテージ（％ピークＡ）における変化およびサンプル中に残っている可溶性ＩＬ−２の総量のパーセンテージにおける変化。処方物は、０．３ｍｇ／ｍｌのＩＬ−２、２３０ｍＭ  アルギニン、１２８ｍＭ  コハク酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１％  ポリソルベート８０を含有した。）
【０１７６】
【表１１】
2005068158.tif 000012
【０１７７】
（２．Ｅ．保存剤の効果）
メチオニン酸化に対する保存剤の効果を試験した。表１２は、６つの保存剤のうちの１つを有する処方物サンプルおよび保存剤を有さない処方物サンプルについての、４℃および２５℃で６ヶ月および１２ヶ月保存した後の、ピークＡにおける変化を示す。保存剤を含むすべての処方物は、コントロールと同様のピークＡのレベルを示した。このことは、この保存剤が、０．２５％  ｍ−クレゾールを含有する処方物（これは、ピークＡのレベルにおける有意な増加を示した）を除いて、メチオニン酸化に対する検出可能な効果を有さないことを示す。
【０１７８】
（表１２：４℃および２５℃で６ヶ月および１２ヶ月保存した種々の保存剤含有処方物における、メチオニン酸化されたピークＡの種として表した可溶性ＩＬ−２の総量（ピークＡ＋ピークＢ）のパーセンテージ（％ピークＡ）。コントロール処方物は、５．８のｐＨにおいて、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２、２３０ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基、１２８ｍＭ  コハク酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  メチオニン、０．１％  ポリソルベート８０を含有した。）
【０１７９】
【表１２】
2005068158.tif 000013
【０１８０】
（実施例３：ＩＬ−２の脱アミド化に対する種々の因子の効果）
ＩＬ−２の脱アミド化は、以前に報告されている（Ｋｕｎｉｔａｎｉら（１９８６）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ３５９：３９１−４０２）。Ａｓｐ88は、ＩＬ−２における脱アミド化のための主要な部位であることが発見された（Ｓａｓａｏｋｉら（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４０（４）：９７６−９８０）。脱アミド化された種は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって、主要な種（ピークＢ）に対するバックショルダーピーク（ピークＢ’）として検出され得る。ＩＬ−２脱アミド化を、アルギニン、ＮａＣｌおよびソルビトールを含有する処方物において研究した。表１３は、高温で２週間のインキュベーションの後、脱アミド化された種が、ソルビトールを含有する処方物およびＮａＣｌを含有する処方物においてのみ検出され得るが、アルギニンを含有する処方物においては検出され得ないことを示す。従って、アルギニンは、脱アミド化を介する分解に対してＩＬ−２を安定化させる。
【０１８１】
（表１３：ｐＨ６において、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２、１０ｍＭ  コハク酸ナトリウム、および１５０ｍＭ  アルギニン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、または２７０ｍＭ  ソルビトールを含有する処方物における、ＲＰ−ＨＰＬＣによって検出されたピークＢ’の種の脱アミド化）
【０１８２】
【表１３】
2005068158.tif 000014
【０１８３】
（実施例４：ＩＬ−２安定性に対する凍結融解の効果）
凍結により誘導されるタンパク質の損傷は、通常、３つの機構によって生じる：（１）タンパク質は、低温において立体配置的に不安定である（低温変性）；（２）タンパク質は、氷−水界面での変性に対して感受性である；（３）タンパク質は、凍結の際の塩濃度における変化またはｐＨシフトによって損傷される。
【０１８４】
ＩＬ−２の場合においては、凍結融解の間のタンパク質損失は、おそらく氷−水界面における変性および凝集より引き起こされる。なぜなら、非イオン性界面活性剤ポリソルベート８０は、凍結融解損傷から効率的にＩＬ−２を保護したからである。図７に示されるように、可溶性ＩＬ−２の量は、ｐＨ６において、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２、１０ｍＭ  コハク酸ナトリウム、および１５０ｍＭ
アルギニンを含有する処方物における凍結融解の各サイクルにおいて減少する。処方物へのポリソルベート８０の添加は、複数の凍結融解に対するＩＬ−２の安定性を増加させる。ポリソルベート８０の濃度が０．０５％以上に達するとき、ＩＬ−２は、完全に凍結融解損傷から保護される。
【０１８５】
（実施例５：ＩＬ−２の安定性に対する機械的剪断の効果）
（５．１．ポリソルベート８０、ＥＤＴＡ、タンパク質濃度、および充填容積の効果）
剪断−応力により誘導される可溶性ＩＬ−２の損失を試験するための研究を行った。２つの型の剪断応力を評価した：Ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ（ＶＷＲ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号５７０１８−７５４）での振とうおよびボルテキサー（ｖｏｒｔｅｘｅｒ）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｎｉｅ２モデル、スピードを４に設定）でのボルテックス。種々のＩＬ−２処方物を、３ｃｃバイアル中に１ｍｌ充填した。これらのバイアルを、冷蔵庫中に保存する（コントロールサンプル）か、ラボラトリーベンチ上に一晩置く（静置サンプル）か、２００ＲＰＭで一晩振とうする（振とうサンプル）か、または１分間ボルテックスした（ボルテックスサンプル）。表１４は、これらのサンプルについての可溶性ＩＬ−２の量における変化の結果を示す。
【０１８６】
冷蔵したコントロールサンプルと比較して、静置サンプルおよび振とうサンプルの両方は、ＩＬ−２の損失を示さない。従って、ＩＬ−２は、周囲温度において安定であり、そして振とう処理に対して安定である。一方、これらの処方物を１分間のボルテックスに供した場合、種々の量の損失が検出された。０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２または１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡまたは低濃度のポリソルベート８０（０．００５〜０．０５％）を含有する処方物はすべて、可溶性ＩＬ−２の２５〜５０％の損失を示す。従って、１分間のボルテックスは、一晩の振とうよりもＩＬ−２分子に対して有害である。ＩＬ−２の損失は、処方物中のポリソルベート８０の濃度を０．１％に等しい濃度およびそれより高い濃度まで増加させることによって防止され得る。さらに、ヘッドスペースに空気が残っていない完全に満たされたバイアルもまた、１分間のボルテックスの際に可溶性ＩＬ−２の最小の損失を示し、このことは、気−液界面が損傷を引き起こす主な因子であったことを示す。
【０１８７】
（表１４：４℃で保存したサンプルと比較した場合の、周囲温度で一晩保存したサンプル（静置）、２００ＲＰＭで一晩振とうしたサンプル（振とう）および１分間ボルテックスしたサンプル（ボルテックス）についての可溶性ＩＬ−２の量における変化。コントロール処方物は、ｐＨ６において、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２、１０ｍＭ  コハク酸ナトリウム、および１５０ｍＭ  アルギニンを含有した。この処方物を、完全に充填したサンプル（これは、ヘッドスペースに空気を残さずに、３ｃｃバイアルの頂部まで完全にコントロールサンプルを充填した）以外は、３ｃｃガラスバイアル中に１ｍｌ充填した。可溶性ＩＬ−２を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって定量した。
【０１８８】
【表１４】
2005068158.tif 000015
【０１８９】
（５．２  アルギニンの効果）
ボルテックス損傷に対するＩＬ−２の安定性に対するアルギニンの効果を、表１５に報告する。アルギニン濃度を１５０ｍＭから２３０ｍＭまで増加させることにより、１分間のボルテックスに供した後、可溶性ＩＬ−２の量における６５％から６９％までの３％の増加を生じる。従って、アルギニンは、剪断損傷に対してＩＬ−２に対する小さな効果を有するが、アルギニンは、以前に、凝集の形成に起因する変性に対してＩＬ−２に対する大きな安定化効果を示した。
【０１９０】
２３０ｍＭ  アルギニン処方物におけるポリソルベート８０の効果を試験した。低濃度のポリソルベート８０（０．０２％）の添加は、ＩＬ−２を不安定化し、そして高濃度のポリソルベート８０（０．１％）の添加は、ＩＬ−２をボルテックスの損傷に対して安定化する。
【０１９１】
（表１５：ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した場合の、１分間のボルテックスの際の種々の処方物中の可溶性ＩＬ−２の残留パーセント）
【０１９２】
【表１５】
2005068158.tif 000016
【０１９３】
（５．３．輸送研究）
製品の輸送の間のＩＬ−２に対する剪断損傷を、実際の輸送研究において調査した。ＩＬ−２を、アルギニン処方物およびＮａＣｌ処方物（いずれも、異なる量のポリソルベート８０を含む）中で調製した。これらのＩＬ−２サンプルを、航空機によってＥｍｅｒｙｖｉｌｌｅ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からＳｔ．Ｌｏｕｉｓ（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）まで氷上で輸送し、そしてＳｔ．ＬｏｕｉｓからＥｍｅｒｙｖｉｌｌｅまで戻った。図８は、これらのサンプル中の可溶性ＩＬ−２の量のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す。処方物中にポリソルベート８０が存在しないと、ＩＬ−２の約１０％の損失が、アルギニン処方サンプルおよびＮａＣｌ処方サンプルの両方において観察される。アルギニン処方物とＮａＣｌ処方物との間の安定性の差異は無視し得る（約１％）。処方物中にポリソルベート８０が存在するとＩＬ−２の損失は減少する。０．１％  ポリソルベート８０においては損失は観察されず、このことは、ＩＬ−２がこの界面活性剤濃度において完全に保護されたことを示す。従って、０．１％ポリソルベート８０は、輸送の間のＩＬ−２の急激な剪断損傷を防ぐために、処方物において有効である。
【０１９４】
結論として、アルギニンは、長期間の保存の間のＩＬ−２凝集および脱アミド化を減少させるために、液体ＩＬ−２薬学的処方物における初期安定化剤として役立ち得る。処方物中のアルギニン濃度をさらに増加させ、従ってより高いＩＬ−２安定性を達成するが、溶液の等張性をなお維持するために、好ましくは、コハク酸を、アルギニン塩基をｐＨ５．８まで滴定するように使用する。さらに、タンパク質のメチオニン酸化を防ぐために、メチオニンおよびＥＤＴＡを処方物中に含有し得る。最後に、ＩＬ−２が凍結融解および機械的剪断により損傷することを防ぐために、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）を処方物中に含有し得る。
【０１９５】
（実施例６：保存剤効力試験）
抗菌保存剤を含有するいくつかの処方物を、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（ＵＳＰ）保存剤効力試験に供した。結果を表１６に示す。保存剤を含まないコントロールサンプルは、試験に不合格であったが、保存剤を含有する処方物はすべて試験に合格した。
【０１９６】
（表１６：ｒｈＩＬ−２処方物についてのＵＳＰ保存剤効力試験。コントロール処方物は、５．８のｐＨにおいて、０．１ｍｇ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−２、２３０ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基、１２８ｍＭ  コハク酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ
メチオニン、０．１％  ポリソルベート８０を含有した。）
【０１９７】
【表１６】
2005068158.tif 000017
【０１９８】
（実施例７：疼痛産生性質）
フロリダ大学、歯科大学、神経科学のＯＭＳＤＳ部門において開発されたラットモデル使用して、疼痛産生性質、より具体的には、処方物によって産生された激しい疼痛および辛辣な疼痛を評価する。このモデルは、疼痛メッセージを運ぶ感覚細胞で誘導された電流のアッセイに基づく。このアッセイを行なうために、感覚細胞（ラット後根神経節）が、記録チャンバーにおいて単離される。記録は侵害性（疼痛誘導）基準に基づいて、あらかじめ選択された個々の細胞から作製される。激しい疼痛、辛辣な疼痛、および規準化された疼痛スコアが、試験された処方物について計算される。激しい疼痛スコアは、カプサイシン（５００ｎＭ）と比較した試験処方物に対する応答によって定義する。カプサイシンは、ヒトにおける激烈な激しい疼痛を産生するその能力が周知である（Ｃｏｏｐｅｒら（１９８６）Ｐａｉｎ  ２４：９３−１１６）。辛辣な疼痛スコアは、ｐＨ  ５．０に緩衝化された溶液によって産生されたスコアに対する試験処方物によって産生された電流の割合として計算される。基準化された疼痛スコアは、通常の生理食塩水（０．９％  ＮａＣｌ、非緩衝化）（辛辣な感覚を産生することが公知の一般的な病院の薬局の非経口的な処方物）と比較した処方物を評価する。
【０１９９】
液体Ｌ−アルギニン塩基のコハク酸処方物は、このモデルを介して疼痛分析に供される。これらの２つの試験溶液の結果を表１７に示す。激しい疼痛、辛辣な疼痛、および規準化された疼痛スコアについて計算されたスコアに基づいて、Ｌ−アルギニン−コハク酸処方物は、通常の生理食塩水と比較して優れた性質を示した。通常の生理食塩水を使用して減少しなかったが、処方物の適用の間に試験電流が減少することが観察された（時間依存性減少）。このことは、この処方物が、このアッセイによって評価されるように、生理食塩水より優れて耐性であることを実証する。
【０２００】
（表１７：液体処方物および０．９％塩化ナトリウムについての激しい疼痛、辛辣な疼痛、および基準化された疼痛スコア）液体処方物は、５．８のｐＨで、２３０ｍＭＬ−アルギニン塩基で、１２８ｍＭコハク酸、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭメチオニン、０．１％ポリソルベート８０を含んだ。
【０２０１】
【表１７】
2005068158.tif 000018
【０２０２】
（実施例８：ＴＦＰＩに関する安定性研究）
種々の処方物におけるＴＦＰＩの安定性および可溶性研究は、Ｌ−アルギニンがＴＦＰＩに対する安定剤（データは示されていない）であり、そしてクエン酸イオンのように荷電した緩衝液種類が、より著名な可溶効果を有することを実証する。この研究において、種々の処方物におけるＴＦＰＩ安定性に対するＬ−アルギニン濃度および緩衝化システムの影響を調べた。特に、酸およびその塩形態の混合物に対する、その塩形態を実質的に含まない酸の形態における緩衝化システムの影響を、前出の実施例におけるＩＬ−２処方物について以前に記載されるように試験した。
【０２０３】
（材料および方法）
ＴＦＰＩ溶液を、ｐＨ５．５で、２０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび３００ｍＭ  Ｌ−アルギニン中で０．６ｍｇ／ｍｌに処方した。この溶液を、クエン酸またはコハク酸緩衝化システムのいずれかによってｐＨ６．５に緩衝化された種々のアルギニン処方物に対するＳｐｅｃｔｒａｌ  Ｐｏｒ＃７膜（ＭＷＣＯ３，５００，ＩＤ＃１３２−１１０）を使用して、４℃での透析を介して緩衝液交換した。透析後、各溶液のＴＦＰＩ濃度をＵＶ／Ｖｉｓ分光法を使用して測定した。次いで、各溶液を適切な緩衝液を使用して、０．１５ｍｇ／ｍｌに希釈した。次いで、調製された溶液を、安定性貯蔵のために３ｃｃバイアルにアリコート（各１ｍｌ）した。バイアルは、Ｔ＝０の時点で取っておいた。残りのバイアルを、促進された安定性研究のために５０℃のインキュベーターで配置した。次いで、３、７、１４、および３０日の時点で採取した。各時点での分析について、各バイアルの含有量を１．７ｍｌの微小遠心分離チューブに移し、次いで、約２分間１０Ｋｒｐｍで遠心分離した。ＩＥＸ−ＨＰＬＣ（記載が必要）を使用する分析のために、サンプルの遠心分離された上清を、このチューブから取り出し、ＩＥＸ−ＨＰＬＣは、安定性指示アッセイであることが以前の研究から公知である。
【０２０４】
（結果および考察）
ＴＦＰＩをＬ−アルギニン塩基またはＬ−アルギニンＨＣｌのいずれかを含む種々の処方物における０．１５ｍｇ／ｍｌの最終濃度に処方した。Ｌ−アルギニンＨＣｌ処方物を、そのそれぞれの結合体ナトリウム塩と組み合わせて、１０ｍＭクエン酸またはコハク酸によって、ｐＨ５．５に緩衝化した。Ｌ−アルギニン塩基処方物をクエン酸またはコハク酸のいずれかによって、ｐＨ５．５に滴定した。全８回の研究を以下に列挙されるように実行した：
１）１０ｍＭクエン酸およびクエン酸ナトリウムによって、２０〜１５０ｍＭ
Ｌ−アルギニンＨＣｌをｐＨ５．５に緩衝化した；
２）クエン酸によって、２０〜１５０ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基をｐＨ５．５に滴定した；
３）１０ｍＭクエン酸およびクエン酸ナトリウムによって、１００〜３００ｍＭ  Ｌ−アルギニンＨＣｌをｐＨ５．５に緩衝化した；
４）クエン酸によって、１００〜３００ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基をｐＨ５．５に滴定した；
５）１０ｍＭコハク酸およびコハク酸ナトリウムによって、２０〜１５０ｍＭ
Ｌ−アルギニンＨＣｌをｐＨ５．５に緩衝化した；
６）コハク酸によって、２０〜１５０ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基をｐＨ５．５に滴定した；
７）１０ｍＭコハク酸およびコハク酸ナトリウムによって、１００〜３００ｍＭ  Ｌ−アルギニンＨＣｌをｐＨ５．５に緩衝化した；
８）コハク酸によって、１００〜３００ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基をｐＨ５．５に滴定した；
ＴＦＰＩについての主要な分解経路は、タンパク質凝集／沈殿であると以前に決定されている（Ｃｈｅｎら（１９９９）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８８：８８１−８８８）。ＴＦＰＩ分解後、安定性サンプルにおける残りの可溶性タンパク質のモニタリングが続く。異なったＬ−アルギニン濃度で、処方されたＴＦＰＩ溶液を、促進安定性研究のために、５０℃で貯蔵した。サンプルを、予定の時間間隔で採取した。サンプル中の可溶性タンパク質を、微小遠心分離チューブにおける遠心分離を介して凝集／沈殿したタンパク質から分離する。可溶性タンパク質の量をＩＥＸ−ＨＰＬＣ方法によって決定した（Ｃｈｅｎら（１９９９）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８８：８８１−８８８）。次いで、データをＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈグラフィックソフトウェアを使用して残りの可溶性タンパク質の半減期を計算するために、単一指数関数速度方程式（Ｙ＝ＹｏＥＸＰ（−ｋｌｔ））によって貯蔵時間の関数として適合させた（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｆｔｗａｒｅ，Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）。
【０２０５】
シトレートまたはクエン酸ナトリウム添加によって緩衝化した処方物に関する残存する可溶性ＴＦＰＩの半減期（ｔ1/2）値を、表１８に示す。コハク酸またはコハク酸ナトリウムによって緩衝化された処方物に関するこれらは、表１９に示す。これらのデータは、半減期値がこれらの処方物中の漸増するＬ−アルギニン濃度とともに増加することを示す。これらのデータはまた、シトレート緩衝化系およびスクシネート緩衝化系のそれぞれに関して、図９および図１０にプロットされる。半減期値を放射線状曲線としてプロットし、そしてアルギニン濃度の関数として増加させる。これは、Ｌ−アルギニンがＴＦＰＩのための安定剤であることを確立する。
【０２０６】
２つの緩衝化系の間で、ＴＦＰＩ安定性における差異は、無視できるようである。シトレート緩衝化系はより変動性を示したが（図９）、スクシネート緩衝化系に関する２つの半減期  対  アルギニン濃度の曲線は、本質的に重ね合わせ可能であった（図１０）。ＴＦＰＩは、これらの緩衝化系がｐＨ調整のために使用されたにかかわらず、類似のＬ−アルギニン濃度で類似の安定性を達成した。図１１はまた、コハク酸緩衝化系とクエン酸系との間の半減期  対  アルギニン濃度曲線を比較する。この図は、アルギニン濃度が処方物中で同じままである限り、ＴＦＰＩ安定性に主要な差異は存在しないことを示す。これらのデータは、安定化効果が主にアルギニンから寄与されたことを示す。
【０２０７】
しかし、コハク酸またはクエン酸のいずれかを用いた酸滴定は、等張性を維持しながら処方物中のより大きなアルギニン濃度を可能にする（これより増加した安定性を可能にする）。従って、例えば、表１８中の処方物３−３および３−４の両方は、処方物中３００ｍＭ  Ｌ−アルギニンを有し、そしてこれらの半減期値は類似している。しかし、３−３処方物は、１０ｍＭ  クエン酸およびクエン酸ナトリウムを使用して３００ｍＭ  Ｌ−アルギニン  ＨＣｌをｐＨ５．５に緩衝化し、そして４９７ｍＯｓｍ／ｋｇの溶液容量オスモル濃度を有した。これは高張性処方物であり、注射可能な処方物としては好ましくない。一方、４−３処方物は、３００ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基と組み合わせて１２１ｍＭ  クエン酸を使用してｐＨを５．５に調整し、そして２９５ｍＯｓｍ／ｋｇの溶液容量オスモル濃度を有した。この処方物は、等張性溶液（２９０ｍｍｏｌ／ｋｇ）に非常に近く、従ってより好ましい注射可能な処方物である。ｐＨ調整のための簡便な方法が使用された（例えば、１０ｍＭ  クエン酸およびクエン酸ナトリウムを用いる）場合、等張性を超えることなく、処方物にわずかに１５０ｍＭより大きいＬ−アルギニンを単に添加し得る。３００ｍＭ  Ｌ−アルギニン処方物（コード４−３）に対して２３日間を有するのに比較して、１５０ｍＭ  Ｌ−アルギニン処方物（コード１−６）の半減期は１６日間である。従って、ＴＦＰＩを、安定剤としての酸塩基（すなわち、アルギニン塩基）およびその塩形態を実質的に有さない酸を含む緩衝液（すなわち、コハク酸）と処方することは、ＴＦＰＩに対する安定化効果を最大化するためにより多くの安定剤（すなわち、アルギニン）を添加するための、効果的な手段を提供する。
【０２０８】
（結論）
本実施例は、Ｌ−アルギニンがＴＦＰＩを、その保存の貯蔵寿命を拡大することによって安定化することを実証する。酸滴定を使用することによって、より多くのアルギニンを処方物に添加して、等張性を超えることなく安定化効果を最大化し得、これは、注射可能な処方物に対して好ましい。
【０２０９】
（表１８：ＴＦＰＩアルギニン−シトレート（ｐＨ５．５）処方物に関する安定性データ）この半減期（ｔ1/2）は、単一指数運動方程式を用いて５０℃の安定性データを適合させることによって得た。
【０２１０】
【表１８】
2005068158.tif 000019
【０２１１】
（表１９：ＴＦＰＩアルギニン−スクシネート（ｐＨ５．５）処方物に関する安定性データ）この半減期（ｔ1/2）は、単一指数運動方程式を用いて５０℃の安定性データを適合させることによって得た。
【０２１２】
【表１９】
2005068158.tif 000020
【０２１３】
本明細書中に言及される全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する当業者のレベルの指標である。全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が詳細にそして個々に参考として援用されることが示されるかのように、同じ程度で本明細書中に参考として援用される。
【０２１４】
上記の本発明は、理解の明確化の目的で実例および実施例によっていくらか詳細に記載してきたが、特定の変化および改変が添付の特許請求の範囲の範囲内で実行され得ることは、明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０２１５】
【図１】図１は、４０℃で保存した安定性サンプルにおけるＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した可溶性ＩＬ−２の残存％を示す。処方物は、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ６）、および２７０ｍＭのソルビトールまたはスクロースまたはマンニトールを含んでいた。
【図２】図２は、５０℃で保存した安定性サンプルにおけるＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した可溶性ＩＬ−２の残存％を示す。処方物は、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ６）、および図に示されるように、１５０ｍＭの種々のアミノ酸を含んでいた。
【図３】図３は、４０℃で保存した安定性サンプルにおけるＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した可溶性ＩＬ−２の残存％を示す。処方物は、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２、１０ｍＭ  コハク酸ナトリウム（ｐＨ６）、および５０ｍＭ、１００ｍＭ、または２７０ｍＭのソルビトールを含んでいた。
【図４】図４は、５０℃で保存した安定性サンプルにおけるＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した可溶性ＩＬ−２の残存％を示す。処方物は、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２、１０ｍＭ  コハク酸ナトリウム（ｐＨ６）、および５０ｍＭ、１００ｍＭ、または１５０ｍＭのアルギニンを含んでいた。
【図５】図５は、５０℃でのｐＨの関数として、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した残存可溶性ＩＬ−２の半減期（ｔ1/2、日数）を示す。処方物は、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２、１０ｍＭ  緩衝液（グリシン、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム）、および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２７０ｍＭ  ソルビトールまたは１５０ｍＭ  アルギニンを含んでいた。
【図６】図６は、５０℃で保存した安定性サンプルに関する半減期（ｔ1/2）  対  初期タンパク質濃度のＬｎ−Ｌｎプロットを示す。処方物は、１０ｍＭ  コハク酸ナトリウム（ｐＨ６）および１５０ｍＭ  アルギニン中に、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、または０．５ｍｇ／ｍｌのＩＬ−２を含んでいた。
【図７】図７は、−７０℃から周囲温度までの凍結融解を１サイクル、３サイクル、および５サイクルで処理したサンプルにおけるＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した可溶性ＩＬ−２の残存％を示す。処方物は、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２、１０ｍＭ  コハク酸ナトリウム（ｐＨ６）、１５０ｍＭ  アルギニン、および０〜０．１％  ポリソルベート８０を含んでいた。
【図８】図８は、氷上でＥｍｅｒｙｖｉｌｌｅ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からＳｔ．Ｌｏｕｉｓ（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）まで、およびＳｔ．ＬｏｕｉｓからＥｍｅｒｙｖｉｌｌｅに戻す輸送で処理したサンプルにおけるＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した可溶性ＩＬ−２の残存％を示す。種々の量のポリソルベート８０を含む２つの処方物を用いた：アルギニン処方物（１０ｍＭ  コハク酸ナトリウム（ｐＨ６）および１５０ｍＭ  アルギニン中に０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２を含む）；およびＮａＣｌ処方物（１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）および２００ｍＭ  ＮａＣｌ中に０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ−２を含む）。
【図９】図９は、５０℃でのアルギニン濃度の関数として、ＩＥＸ−ＨＰＬＣにより分析した４つの処方物における残存可溶性ＴＦＰＩの半減期（ｔ1/2、日数）を示す。全ての処方物は、０．１５ｍｇ／ｍｌ  ＴＦＰＩ、およびＬ−アルギニン塩基またはＬ−アルギニンＨＣ１のいずれか（クエン酸、または１０ｍＭ  クエン酸およびクエン酸ナトリウムのいずれかでｐＨ５．５に緩衝化されている）を含んでいた。特定のＴＦＰＩ処方物は、以下を含んでいた：（ａ）緩衝液として２０〜１５０ｍＭ  Ｌ−アルギニンＨＣｌ、１０ｍＭ  クエン酸およびクエン酸ナトリウム；（ｂ）２０〜１５０ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基（クエン酸で滴定した）；（ｃ）緩衝液として１００〜３００ｍＭ  Ｌ−アルギニンＨＣｌ，１０ｍＭ  クエン酸およびクエン酸ナトリウム；（ｄ）１００〜３００ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基（クエン酸で滴定した）。
【図１０】図１０は、５０℃でのアルギニン濃度の関数として、ＩＥＸ−ＨＰＬＣにより分析した４つの処方物における残存可溶性ＴＦＰＩの半減期（ｔ1/2、日数）を示す。全ての処方物は、０．１５ｍｇ／ｍｌ  ＴＦＰＩ、およびＬ−アルギニン塩基またはＬ−アルギニンＨＣｌのいずれか（コハク酸、または１０ｍＭ  コハク酸およびコハク酸ナトリウムのいずれかでｐＨ５．５に緩衝化されている）を含んでいた。特定のＴＦＰＩ処方物は、以下を含んでいた：（ａ）緩衝液として２０〜１５０ｍＭ  Ｌ−アルギニンＨＣｌ、１０ｍＭ  コハク酸およびコハク酸ナトリウム；（ｂ）２０〜１５０ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基（コハク酸で滴定した）；（ｃ）緩衝液として１００〜３００ｍＭ  Ｌ−アルギニンＨＣｌ、１０ｍＭ  コハク酸およびコハク酸ナトリウム；（ｄ）１００〜３００ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基（コハク酸で滴定した）。
【図１１】図１１は、５０℃でのアルギニン濃度の関数として、ＩＥＸ−ＨＰＬＣにより分析した４つの処方物における残存可溶性ＴＦＰＩの半減期（ｔ1/2、日数）を示す。全ての処方物は、０．１５ｍｇ／ｍｌ  ＴＦＰＩ、およびＬ−アルギニン塩基（コハク酸またはクエン酸のいずれかでｐＨ５．５に滴定した）を含んでいた。特定のＴＦＰＩ処方物は、以下を含んでいた：（ａ）２０〜１５０ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基（クエン酸で滴定した）；（ｂ）２０〜１５０ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基（コハク酸で滴定した）；（ｃ）１００〜３００ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基（クエン酸で滴定した）；（ｄ）１００〜３００ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩基（コハク酸で滴定した）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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