(57)【要約】      （修正有）【課題】可溶性発現量が大きく、高効率で結晶化が可能なJSP-1の部分からなるポリペプチド、及びX線結晶構造解析を可能にする高品質の結晶を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列のアミノ酸番号１から始まり、アミノ酸番号１５４〜１７４のいずれか一つで終わる配列を有するポリペプチド。特定のアミノ酸配において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列、又は特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列において、特定のアミノ酸配列のアミノ酸番号１に相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号１５４〜１７４に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列を有し、かつＪＳＰ−１活性を有するポリペプチドであって、全長蛋白質より高い可溶性発現量を示すポリペプチド。及び該ポリペプチドの結晶。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の単離精製されたＪＳＰ−１活性を有する蛋白質の部分からなるポリペプチド。
（ａ）配列番号１のアミノ酸番号１のアミノ酸から始まり、アミノ酸番号１５４〜１７４のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列を有するポリペプチド。
（ｂ）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列のアミノ酸番号１に相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号１５４〜１７４に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列を有し、かつＪＳＰ−１活性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドを発現させた場合に、全長蛋白質より高い可溶性発現量を示すポリペプチド。
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸番号１に相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号１５４〜１７４に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列を有し、かつＪＳＰ−１活性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドを発現させた場合に、全長蛋白質より高い可溶性発現量を示すポリペプチド。
【請求項２】
アミノ酸番号１５４のアミノ酸又はそれに相当するアミノ酸で終わる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
アミノ酸番号１６３のアミノ酸又はそれに相当するアミノ酸で終わる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドの結晶。
【請求項５】
空間群Ｃ２に属し、単位格子定数がａ＝８５±５Å、ｂ＝５０±５Å、ｃ＝４８±５Å、かつ、単位格子面角がα＝γ＝９０°、β＝１１９±１０°である、請求項４に記載の結晶。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、JSP-1活性を有する蛋白質の部分からなるポリペプチド及びその結晶に関する。
【背景技術】
【０００２】
JNK Stimulatory Phosphatase-1（以下、これを「JSP-1」と称することがある）は、ヒトにおいてJNKシグナルカスケードを制御する主要な脱リン酸化酵素の１種であることが知られている。この蛋白質は、ヒト胸腺・脾臓・前立腺・睾丸・末梢血リンパ球において広く特異的に発現しており、基質となる蛋白質内に存在するリン酸化チロシン残基およびリン酸化セリン残基両者を特異的に脱リン酸化する酵素群に属している。
【０００３】
JSP-1は、炎症性サイトカイン依存的JNKカスケードに起因する種々の症例（例えば、非特許文献1〜8参照）に該カスケードの一員として関与すると考えられている。Dual-specificityphosphatase-3（DSP-3）、及び、VHR（Vaccinia virus VH1-related)-related MKPX(mitogen-activated protein kinase phosphatase x)（VHX）は、JSP-1と同一の遺伝子によりコードされる蛋白質である。
【０００４】
また、JNK Pathway-Associated Phosphatase (以下、これを「JKAP」と称することがある)は、N末端から169残基まではJSP-1と同一のアミノ酸配列を有し、C末端付近15残基のアミノ酸配列を異にする蛋白質である。該蛋白質は、JSP-1と同様の脱リン酸化酵素群に属し、TNF-αやTGF-βなどの炎症性サイトカイン刺激によるJNKカスケードの活性化に必須であると考えられている（例えば、非特許文献2参照）。
【０００５】
さらに、JSP-1のマウスオルソログであるLow molecular weight-dual specificity phosphatase(以下、これを「LMW-DSP2」と称することがある)は、JSP-1とアミノ酸11個を異にする配列を有し、同じくJNKカスケードに関与していることが報告されている（例えば、非特許文献4、5参照）。
このように、JSP-1及び該蛋白質に関連する蛋白質がJNKカスケードに関与するとの多くの知見が得られている。該カスケードが各種疾患に関連する重要なカスケードであることから、該カスケードに関わる蛋白質であるJSP-1、JKAP、LMW-DSP2等を解析し、発症メカニズム等を解明することが望まれている。
【０００６】
このような分子生物学的な解析のためには、例えば、これらの蛋白質の立体構造を得ることが非常に重要であるが、そのためには、先ずX線結晶構造の解析を可能にするような優れた蛋白質分子の発現系構築、及び、高品質の結晶を得ることが必要である。しかし、JSP-1、JKAP、LMW-DSP2等については、これを遺伝子工学的手法により発現させて蛋白質を調製すると可溶性発現量が非常に低く、十分な量の蛋白質を得ることが困難であり、結晶化が行われていなかった。このため、十分な量の蛋白質を確実に取得し、高品質の結晶を調製することが望まれていた。
【非特許文献１】Shen, Y., Luche, R., Wei, B., Gordon, M. L., Diltz, C. D. and Tonks, N. K., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 98, 13613-13618 (2001)
【非特許文献２】Chen, A. J., Zhou, G., Juan, T., Colicos, S. M., Cannon, J. P., Cabriera-Hansen, M., Meyer, C. F., Furecie, R., Copeland, N. G., Gilbert, D. J., Jenkins, N. A., Fletcher, F., Tan, T.-H. and Belmont, J. W., J.Biol.Chem., 277, 36592-36601 (2002)
【非特許文献３】Alonso, A., Merlo, J. J., Na, S., Kholod, N., Jaroszewski, L., Kharitonenkov, A., Williams, S., Godzik, A. and Posada, J. D., J.Biol.Chem., 277, 5524-5528 (2002)
【非特許文献４】Aoki, N., Aoyama, K., Nagata, M. and Matsuda, T. (2001) J. Biochem. 130, 133-140.
【非特許文献５】Aoyama, K., Nagata, M., Oshima, K., Matsuda, T. and Aoki, N., J.Biol.Chem., 276, 27575-27583 (2001)
【非特許文献６】Park, H.-S., Kim, M.-S., Huh, S.-H., Park, J., Chung, J., Kang, S. S. and Choi, E.-J., J.Biol.Chem., 277, 2573-2578 (2002)
【非特許文献７】Tournier, C., Dong, C., Turner, T. K., Jones, S. N., Flavell, R. A. and Davis, R. J., Genes & Dev., 15, 1419-1426 (2001)
【非特許文献８】Scapin, G., Patel, S. B., Lisnock, J., Becker, J. W. and LoGrasso, P. V., Chem. & Biol., 10, 705-712 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、これまで蛋白質の可溶性発現量が低く、結晶化が困難なことが知られていたJSP-1活性を有する蛋白質の部分からなるポリペプチド、及び、該ポリペプチドの結晶を提供するためになされたものである。より詳しくは、本発明は、X線結晶構造解析を可能にする高品質の結晶を提供するためになされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を進めた結果、JSP-1の全長のアミノ酸配列中から特定領域の配列を欠損させたJSP-1の部分からなるポリペプチドは、可溶性発現量が高く、高純度に精製可能であり、また、精製ポリペプチドから高品質の結晶が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明によれば、
（１）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の単離精製されたＪＳＰ−１活性を有する蛋白質の部分からなるポリペプチド。
（ａ）配列番号１のアミノ酸番号１のアミノ酸から始まり、アミノ酸番号１５４〜１７４のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列を有するポリペプチド。
（ｂ）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列のアミノ酸番号１に相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号１５４〜１７４に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列を有し、かつＪＳＰ−１活性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドを発現させた場合に、全長蛋白質より高い可溶性発現量を示すポリペプチド。
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸番号１に相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号１５４〜１７４に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列を有し、かつＪＳＰ−１活性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドを発現させた場合に、全長蛋白質より高い可溶性発現量を示すポリペプチド。
（２）アミノ酸番号１５４のアミノ酸又はそれに相当するアミノ酸で終わる、上記（１）に記載のポリペプチド、
（３）アミノ酸番号１６３のアミノ酸又はそれに相当するアミノ酸で終わる、上記（１）に記載のポリペプチド
が提供される。
また、本発明の別の態様からは、
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のポリペプチドの結晶、
（５）空間群Ｃ２に属し、単位格子定数がａ＝８５±５Å、ｂ＝５０±５Å、ｃ＝４８±５Å、かつ、単位格子面角がα＝γ＝９０°、β＝１１９±１０°である、上記（４）に記載の結晶
が提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、可溶性が高く高効率で結晶化が可能なJSP-1活性を有する蛋白質の部分からなるポリペプチド、及び、X線結晶構造解析を可能にする高品質の結晶が提供される。また、該結晶を用いれば高精度の3次元構造座標を得ることができ、さらに該座標を用いれば、JSP-1活性を有する蛋白質の機能を調節する能力を有する化合物の同定、検索、評価、又は設計等を、コンピュータ等を利用した公知の手法によって行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を更に詳細に説明するが、以下の説明は本発明の実施態様の代表例であり、本発明はこれらの内容のみで特定されるものではない。
1. JSP-1活性を有する蛋白質の部分からなるポリペプチド
JNK Stimulatory Phosphatase-1（JSP-1）とは、ヒトにおいてJNKシグナルカスケードを制御する主要な脱リン酸化酵素の１種であり、基質となる蛋白質内に存在するリン酸化チロシン残基およびリン酸化セリン残基を特異的に脱リン酸化する能力を有するdual specificity phosphatase（DSP）の一群に属する蛋白質である。該蛋白質は、ヒト（Homo sapiens）においてはアミノ酸184個からなり、配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する。本明細書においてJSP-1の配列という場合には、このヒト配列を用いて説明することとし、アミノ酸番号についてもこの配列における番号を用いる。
【００１１】
本発明におけるJSP-1活性を有する蛋白質には、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するものだけでなく、配列番号1のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、上記した活性を有する蛋白質も含まれる。ここで、数個とは、例えば、20個以下、好ましくは15個以下、特に好ましくは11個以下である。
【００１２】
また、配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、上記した活性を有する蛋白質も含まれる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、例えば、配列番号1に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとの相同性が80％以上、好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上の塩基配列を有するポリヌクレオチド等が挙げられる。ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、それ自体公知の通常用いられる緩衝液中で、温度が40〜70℃、好ましくは60〜65℃等で反応を行い、塩濃度が15〜300mM、好ましくは15〜60mM等の洗浄液中で洗浄する方法等により行うことができる。
【００１３】
このような蛋白質としては、例えば、N末端から169残基まではJSP-1と同一のアミノ酸配列を有し、C末端付近15残基のアミノ酸配列を異にする蛋白質であるJKAP（配列番号2）、JSP-1のマウスオルソログであってJSP-1とアミノ酸11個を異にする配列を有するLMW-DSP2（配列番号3）等の蛋白質が挙げられる。本明細書においては、これらの蛋白質を総称して「JSP-1活性を有する蛋白質」と言うことがある。
【００１４】
本発明のJSP-1活性を有する蛋白質の部分からなるポリペプチド（以下、これを「部分ポリペプチド」と称することがある）は、高い可溶性発現量を示すことを一つの特徴としている。JSP-1については、かねてよりこれを大量に発現させ、結晶化させて、X線結晶構造解析に供することが期待されていたが、全長の蛋白質の可溶性発現量が非常に少ないために結晶化が可能なだけの蛋白質量を得ることが困難であった。結晶を調製するためには、高純度の蛋白質を大量に取得することが必須である。
【００１５】
本発明者らは、この問題を解決するために鋭意検討を進めた結果、ある特定の配列を有するJSP-1の部分ポリペプチドを用いれば、これらの問題を解決できることを見出した。
かくして見出された本発明の部分ポリペプチドとは、配列番号1に記載のJSP-1のアミノ酸配列の、アミノ酸番号1のアミノ酸で始まり、アミノ酸番号154〜174のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列を有するポリペプチド、又は、配列番号1において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列のアミノ酸番号1に相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号154〜174に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列を有し、かつJSP-1活性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドを発現させた場合に、全長蛋白質より高い可溶性発現量を示すポリペプチドである。また、配列番号1のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列において、配列番号1のアミノ酸番号1に相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号154〜174に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列を有し、かつJSP-1活性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドを発現させた場合に、全長蛋白質より高い可溶性発現量を示すポリペプチドである。
【００１６】
例えば、前記したJKAPは、N末端から169残基まではJSP-1と同一のアミノ酸配列を有し、C末端付近のアミノ酸配列を異にする蛋白質であるので、配列番号1のアミノ酸番号1に相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号154〜169に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列においては、JSP-1と全く同等に取り扱うことができる。
以下、配列番号1の特定のアミノ酸番号を示して説明する場合、実施例を除いて、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するものだけではなく、配列番号1のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ上記した活性を有する蛋白質、又は、配列番号1のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ上記した活性を有する蛋白質も含まれる。
【００１７】
本発明の部分ポリペプチドは、JSP-1活性を有する蛋白質の全長蛋白質に比べて高い可溶性発現量を示すことを一つの特徴としているので、アミノ酸番号154〜174の中でもどのアミノ酸で終わるものがより好ましいかは、例えば、実際に該ポリペプチドを発現させて、可溶性発現量を指標として決定することができる。なお、ここで「全長蛋白質に比べて高い可溶性発現量を示す」とは、全長蛋白質に比べて部分ポリペプチドの可溶性発現量が有意に多いことが好ましいが、後述する結晶化等の利用目的に対して十分量の蛋白質が得られるものであれば、全長蛋白質に比べて若干低い可溶性発現量を示す部分ポリペプチドであっても用いることができる。また、例えば、本発明の部分ポリペプチドに後述するようなタグ等を付加して発現させる場合には、該タグを部分ポリペプチドのN末端に付加した場合でもC末端に付加した場合でも十分量の可溶性発現量が得られるものが好ましく用いられる。
【００１８】
また、例えば、活性又は比活性や、反応速度、温度、pHに対する至適値又は安定性等の一般的な生化学的分析を行って、発現された部分ポリペプチドが有する生物学的機能を利用した指標により選択することもできる。これらの手法はいずれも、それ自体既知であり、当業者が通常用い得るものである。
これらの中でも、本発明においては、可溶性発現量を指標とする方法、又は、活性もしくは比活性を測定する方法等が好ましく用いられるが、中でも、可溶性発現量を指標とすることが好ましい。また、前記の各手法のうちいくつかを適宜組み合わせて用いることもでき、複数の解析の結果が良好であるものを選択することが特に好ましい。
【００１９】
可溶性発現量を指標とする場合には、例えば、後述するような公知の方法を用いて目的の部分ポリペプチドを発現させ、遠心分離等の一般的手法により可溶性画分と不溶性画分に分画して、可溶性画分についてアフィニティー精製法等の簡易な精製を行い、精製して得られた部分ポリペプチドの量を解析すればよい。
上記したような各種の手法を用いれば、本発明の部分ポリペプチドの特に好ましい配列を選択することができる。すなわち、本発明の部分ポリペプチドとしては、前記した中でも、配列番号1に記載のJSP-1のアミノ酸配列のアミノ酸番号1のアミノ酸で始まり、アミノ酸番号154、163、又は174のアミノ酸で終わるポリペプチドが好ましい。中でも、アミノ酸番号154又は163のアミノ酸で終わるポリペプチドが特に好ましい。
【００２０】
なお、本発明の、配列番号1に記載のJSP-1のアミノ酸配列の、アミノ酸番号1のアミノ酸で始まり、アミノ酸番号154〜174のいずれか一つのアミノ酸で終わるポリペプチドには、JSP-1の全長蛋白質に比べて高い可溶性発現量を示すものであれば、上記のとおり、該部分配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものも含まれる。また、配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなるものも含まれる。
【００２１】
また、本発明の部分ポリペプチドは、例えば、精製等に用いるための適当なタグ（アミノ酸配列）等が付加されたものであっても良い。適当なタグとしては、例えば、ヒスチジン（His）が4〜12残基程度並んでいる配列を有するヒスチジンタグ（ポリヒスチジンタグ）、FLAGタグ（シグマ社製）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク（MBP）、チオレドキシン(Trx)、ProteinA由来Zドメイン、緑色蛍光タンパク（GFP）等が挙げられる。これらのタグは、通常JSP-1のN末端或いはC末端に付加して用いられる。
【００２２】
かくして選択された本発明の部分ポリペプチドの配列は、この配列を用いて実際に部分ポリペプチドを発現させると高い可溶性発現量を示す蛋白質を発現させることができ、高純度の蛋白質を大量に取得することができるという優れた効果を有している。また、取得された蛋白質を結晶化することにより、高品質の結晶を得ることができるという大きな効果をも奏する。該結晶は、X線結晶構造解析を可能にする高品質のものであり、該解析によって、例えば、JSP-1活性を有する蛋白質の関与する疾患の予防又は治療薬の開発等に有用な3次元構造座標を取得することができる。
【００２３】
2. JSP-1活性を有する蛋白質の部分からなるポリペプチドの結晶  
（1）結晶の調製方法
上記1に詳述した本発明の部分ポリペプチドを用いれば、高純度の蛋白質を大量に取得することができ、X線結晶構造解析が可能な高品質の結晶を調製することができる。
本発明の結晶は、上記1に詳述したようなJSP-1活性を有する蛋白質の部分からなるポリペプチドの結晶である。また、好ましくは、空間群C2に属し、単位格子定数がａ＝85±5Å、ｂ＝50±5Å、ｃ＝48±5Å、かつ、単位格子面角がα＝γ＝90°、β＝119±10°の結晶である。
【００２４】
本発明の結晶の調製方法を、具体例をあげて以下に説明する。
まず、目的とするJSP-1活性を有する蛋白質の部分ポリペプチドを調製し、それを高純度に精製する。具体的には、例えば、上記1に詳述した本発明の部分ポリペプチドのうちいずれかのものを選択して、該部分ポリペプチドの配列のN末端に、前記したようなタグ、例えばヒスチジンタグ等が結合した融合蛋白質を発現させる。このような融合蛋白質を発現させることによって、該タグの結合性を利用する精製カラム等を用いれば、目的蛋白質を高純度に精製することができる。発現に用いる遺伝子の調製、融合蛋白質の発現方法等は、それ自体既知の方法、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition（Sambrook and Russell著、Cold Spring Harbor Laboratory Press刊 (2001)）、The Journal of Biological Chemistry Vol.272, No.17, page 11402-11403等に記載されている方法により行うことができる。例えば、発現系は、大腸菌等の宿主微生物を用いるものでもよいし、無細胞蛋白質合成系等を用いてもよい。
【００２５】
その概要を、大腸菌等の宿主微生物を用いる場合を例に挙げて、以下にさらに詳述する。
まず、上記融合蛋白質をコードする目的遺伝子を適当な発現ベクター、例えばpET15b又はpET32a（Novagen社製）等に組み込む。ここで、目的遺伝子とは、少なくとも目的とする前記部分ポリペプチドのDNA配列を含むものであって、例えば、融合蛋白質を調製する場合には、目的とする前記部分ポリペプチドのDNA配列のN末端又はC末端にタグのDNA配列を適当な方法により連結させたもの等が用いられる。また、必要に応じて、タグを切断するために有用な酵素認識部位等も連結される。目的遺伝子が正確に組み込まれたことを確認するため、DNAシークエンサーにより配列を調べる。
【００２６】
目的遺伝子が正確に組み込まれた発現ベクターを、例えば、電子穿孔法等の公知の手法で発現用の適当な宿主、例えば、大腸菌等に導入して形質転換する。次に、得られた形質転換体を少量の液体培地（例えば、5mL程度）で培養し、該形質転換体中での目的蛋白質（JSP-1の部分ポリペプチド）の発現を調べ、所望の発現が確認できたら、大量の液体培地（例えば、200mLないし2L程度）で大量培養を行い、大量発現させる。続いて、菌体を遠心分離によりペレット状にして回収する。回収した菌体を適当な緩衝液等に懸濁し、菌体を超音波により破砕し、抽出液を遠心分離して上清を集める。得られた抽出液から、適当な蛋白質の精製方法、例えばアフィニティーカラム、陰イオン交換カラム及びゲル濾過カラム等のそれ自体既知の方法を組み合わせて蛋白質の精製を行う。ここで、前記のとおり適当なタグ、例えばヒスチジンのタグが付加した融合蛋白質を発現させている場合には、まずヒスチジンタグに選択的に結合するカラム、例えばTALON（クロンテック社製）、Ni-NTA（キアゲン社製）等を用い、その後、陰イオン交換、ゲル濾過の順にカラムを使用して精製する。精製の際に用いるこれらのカラムは、蛋白質の性質によって使い分ければ良い。
【００２７】
上記のような手順で得られる高純度に精製された蛋白質を用いて、Ｘ線結晶構造解析が可能な高品質の蛋白質結晶を調製することができる。結晶化は、目的の蛋白質溶液に沈殿剤を添加する、又は溶媒量を蒸発等により減少させる等の操作によって、蛋白質が溶液状態から非溶解状態になる場合において、ある特定の条件において、結晶として析出する性質を利用するものである。本発明のJSP-1活性を有する蛋白質の部分ポリペプチドの結晶化は、それ自体既知の方法、例えばバッチ法、透析法、蒸気拡散法などの手法（『蛋白質のＸ線結晶解析法』、J. ドレント著、 竹中ら訳(1998)、 シュプリンガー・フェアラーク東京）を用いて行うことができる。また、結晶化に際しては蛋白質濃度、塩濃度、水素イオン濃度(pH)、添加する沈殿剤の種類、温度等の物理的及び化学的な因子の決定が必要である。例えば、該ポリペプチドの結晶化においては、蒸気拡散法を用い、pH=6.0〜7.5、蛋白質濃度2.0〜3.5mg/mL、温度5℃又は20℃の条件下で、沈殿剤として15〜30%、より好ましくは26〜28%のポリエチレングリコール、例えばポリエチレングリコール4000を用いるのが特に好ましい。
【００２８】
かくして得られる結晶は、空間群C2に属し、単位格子定数がａ＝85±5Å、ｂ＝50±5Å、ｃ＝48±5Å、かつ、単位格子面角がα＝γ＝90°、β＝119±10°という高品質のものであって、高精度のX線結晶構造解析が可能な結晶である（図1）。
ただし、同一の蛋白質が、異なる条件でも結晶化し得ることは周知の事実であり、本発明のJSP-1活性を有する蛋白質の部分ポリペプチドの結晶は、これらの条件で調製されたものに限定されるものではなく、前記した定義に含まれるもの、また上記結晶学的定数と実質的に同一の結晶学的定数を与えるものを含む。
【００２９】
（2）結晶の利用
本発明の結晶は、高精度のX線結晶構造解析が可能な高品質の結晶である。本発明の結晶を用いれば、公知の手法により、JSP-1活性を有する蛋白質の部分ポリペプチドの3次元構造座標を取得することができる。
【００３０】
具体的には、例えば、上記（1）において詳述した方法により調製される本発明の結晶を、X線回折による結晶構造解析技術を用いて解析することができる。より具体的には、まず、上記（1）において調製された結晶を、多価アルコールを含有する結晶化溶液中で凍結させ、凍結状態でX線回折データを収集し、X線回折像を得る。ここで、多価アルコールとしては、ショ糖（スクロース）、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、2,4-メチルペンタンジオール（MPD）等が挙げられる。これらの中で、グリセロール又はMPDが好ましく用いられ、特にグリセロールが好ましく用いられる。結晶化溶液中の多価アルコールの濃度の下限は、通常5%、好ましくは10%であり、上限は通常25%、好ましくは20%である。具体的な濃度の範囲は、それぞれ濃度の下限と上限から組み合わせて決定すればよい。
【００３１】
この回折像を解析して得られる上記結晶の結晶学的定数として具体的には、単斜晶系の空間群対称C2に属し、結晶の単位格子長がａ＝85±5Å、ｂ＝50±5Å、ｃ＝48±5Å、かつ、単位格子面角がα＝γ＝90°、β＝119±10°の大きさを持つ。また、これらの結晶は、JSP-1活性を有する蛋白質の部分ポリペプチドの1分子が結晶学的な非対称単位中に存在しているものが特に好ましい。さらにこの結晶のX線回折による結晶構造解析を行うことにより、本発明の部分ポリペプチドの3次元構造座標を得ることができる。
【００３２】
X線結晶解析は、『蛋白質のX線結晶解析法（J.ドレント著、竹中ら訳(1998)、シュプリンガー・フェアラーク東京）』等の一般的実験書に記載の方法に従って行うことができる。蛋白質の結晶は、一般的にX線を照射されている間にX線のエネルギーによって損傷を受けることが知られている。この損傷を防ぐために、前記結晶化溶液中で凍結させ、凍結状態でX線回折データを収集する。具体的には、例えば、結晶を100K（-173℃）程度の低温の窒素気流中で凍結させ、この状態で直ちにX線回折データを収集することが好ましい。
【００３３】
蛋白質の3次元構造座標とは、蛋白質を構成する各原子の空間的な位置関係を示す値であって、3次元空間上で立体構造を記述するものである。各原子の座標として、空間上のある点を原点とする互いに垂直な3方向の相対的な距離が記述され、これにより蛋白質中に存在する水素原子を除く原子1つあたりに3個の数字からなるベクトル量が表現される。現在、様々な蛋白質について3次元構造座標が取得されているが、これらは必要に応じて、例えば、Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB)によって運営されているプロテイン・データ・バンク（PDB; URL: http://www.rcsb.org/pdb/）等の公開データベースに登録、公開されている。本発明の結晶を用いて取得されたJSP-1のアミノ酸番号１〜154からなる部分ポリペプチドの3次元構造座標も、PDBに登録されている（PDB accession code：1WRM）。
【００３４】
また、例えば、上記したような方法により本発明の結晶から得られたJSP-1の部分ポリペプチドの3次元構造座標を元に、蛋白質の構造を理解するのに一般的に用いられている表記方法であるリボンモデルでJSP-1の主鎖（配列番号1のアミノ酸番号1〜154で表されるJSP-1の部分ポリペプチド）を表記すると、図2に示すような構造が表記される。
かくして得られる本発明の部分ペプチドの3次元構造座標を用いれば、例えば、JSP-1活性を有する蛋白質の機能を調節する能力を有する化合物の同定、検索、評価、又は設計等を、コンピュータ等を利用した公知の手法によって行うことができる。該手法は、従来の生物学的機能等に基づいて行われる各手法を大幅に効率化するものであり、JSP-1活性を有する蛋白質の関与する疾患の予防又は治療薬等の開発を効率的に行うことができる。JSP-1活性を有する蛋白質の関与する疾患としては、例えば、慢性関節リウマチ、乾癬、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、クローン病、潰瘍性大腸炎等が挙げられる。
【００３５】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例において、JSP-1の「全長蛋白質」又は「部分ポリペプチド」の後の（  ）内に記載されている数字は、特に明記しない限り、配列番号1のアミノ酸番号を示すものである。
また、各種ベクターの作製、蛋白質の発現等は、特に記載のない限り、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition（Sambrook and Russell著、Cold Spring Harbor Laboratory Press刊 (2001)）等に記載の公知の手法に従って行うことができる。
【実施例１】
【００３６】
ヒトJSP-1の調製
（1）JSP-1発現系の構築
（1-1）JSP-1の全長蛋白質(アミノ酸番号1-184)をコードする遺伝子の大腸菌発現ベクター構築
Human Skeletal muscle cDNA（クロンテック社製）を鋳型とし、PCR法によりJSP-1遺伝子（JSP-1の全長蛋白質（1-184）をコードする遺伝子）を増幅させた。なお、PCR法では、合成プライマーJSP-1 forward（配列番号4）及びJSP-1 reverse（配列番号5）を使用した。
【００３７】
増幅されたPCR産物を、制限酵素NdeI（TAKARA社製）及びBamHI（TAKARA社製）で処理し、pET-15b（Novagen社製）のマルチクローニング部位に導入した（以下、これを「pET-15b JSP-1」と称することがある）。得られたプラスミドで大腸菌JM109株（TAKARA社製）を形質転換し、コロニーからプラスミドDNAを抽出・精製した後に、DNA配列を確認した。
ここで作製した発現ベクターは、T7プロモーター配列の下流に、SD配列・ポリヒスチジン(タグ付加用)・プロテアーゼ認識配列(Thrombin Protease用)・JSP-1遺伝子・T7ターミネーター配列を有するベクターである。これを発現させると、JSP-1の全長蛋白質のN末端側に、プロテアーゼ認識配列を介してポリヒスチジンタグが連結された融合蛋白質が発現される。
【００３８】
さらに、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク発現用大腸菌発現ベクターを構築した。まず、pET-32a（Novagen社製）のSD配列とT7ターミネーター配列の間に、pGEX-6P-3(アマシャム社製)由来のグルタチオン-S-トランスフェラーゼをコードする配列、プロテアーゼ認識配列(PSP; PreScission Protease（アマシャム社製）用) 、及び制限酵素SmaI及びSalI認識配列を含む遺伝子を順に導入したベクター（以下、これを「pET-32a GST psp」と称することがある）を作製した。次に、上記のベクターpET-15b JSP-1を制限酵素NdeIおよびSalI（TAKARA社製）で処理してJSP-1遺伝子を切り出し、pET-32a GST pspのクローニング部位に導入した。得られたプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換し、コロニーからプラスミドDNAを抽出・精製した後に、DNA配列を確認した。
【００３９】
ここで作製した発現ベクターは、T7プロモーター配列の下流にSD配列・GST(タグ付加用)・プロテアーゼ認識配列(PSP; PreScission Protease（アマシャム社製）用)・JSP-1遺伝子・T7ターミネーター配列を有するベクターである。これを発現させると、JSP-1の全長蛋白質のN末端側に、プロテアーゼ認識配列を介してGSTタグが連結された融合蛋白質が発現される。
【００４０】
（1-2) JSP-1の部分ポリペプチド（アミノ酸番号1-163及び1-174) をコードする遺伝子の大腸菌発現ベクター構築
次に、JSP-1の部分ポリペプチド（1-163及び1-174）の大腸菌発現ベクターを構築することとした。上記（1-1）で作製したJSP-1の全長蛋白質を発現させるためのベクター(pET-15b JSP-1)を鋳型とし、PCR法により上記JSP-1の部分ポリペプチド（アミノ酸番号1-163及び1-174）をコードする遺伝子を増幅させた。なお、PCR法を行うにあたっては、合成プライマーJSP-1Nter（配列番号6）、JSP-1 Cter163（配列番号7）、及びJSP-1 Cter174（配列番号8）を使用した。
【００４１】
増幅したPCR産物は、制限酵素NdeIで切断した後、Klenow酵素（TAKARA社製）で平滑化し、さらに制限酵素HindIII（TAKARA社製）で処理した。次に、pET-32a（Novagen社製）のSD配列とT7ターミネーター配列の間に、ヒスチジン10個（ポリヒスチジンタグ）をコードする配列、プロテアーゼ認識配列(PSP; PreScission Protease（アマシャム社製）用)、及び制限酵素SmaIとHindIII認識配列を含む遺伝子を順に導入したベクター（以下、これを「pET-32a Nhis psp」と称することがある）を作製した。このpET-32a Nhis psp、もしくは上記（1-1）で作製したpET-32a GST pspのクローニング部位に、先に処理しておいたPCR産物をぞれぞれ導入した。得られたプラスミドにより大腸菌JM109株を形質転換し、コロニーから各プラスミドDNAを抽出・精製した後に、DNA配列を確認した。
【００４２】
ここで作成した4種類の発現ベクターは、T7プロモーター配列の下流にSD配列・ポリヒスチジンもしくはGST(タグ付加用)・プロテアーゼ認識配列(PSP用)・JSP-1（1-163もしくは1-174）・T7ターミネーター配列を有するベクターである。これらを発現させると、JSP-1の部分ポリペプチド（1-163もしくは1-174）のN末端側に、プロテアーゼ認識配列を介してポリヒスチジン又はGSTタグが連結された融合蛋白質が発現される。
【００４３】
（2）大腸菌発現系によるJSP-1の発現
上記（1-1）及び（1-2）で作製した発現ベクター6種類について、それぞれを大腸菌BL21(DE3)-RP株（Novagen社製）に形質転換し、それぞれコロニーを選択した。選択したコロニーを、2×YT液体培地(20mL)に植菌し、培地の濁度（600nM近傍の吸光度）が0.6程度になるまで37℃にて振とう培養した。その後、終濃度1.0mMとなるようイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加し、さらに培地の濁度が1.0程度になるまで25℃にて振とう培養した。培養後、培養液を遠心操作することで、菌体を回収した。
【００４４】
GST融合蛋白質の場合には、回収した菌体を、緩衝液1(150mM NaCl, 10% glycerol, 10mM DTT, 50mM Tris-HCl (pH8.0))  2mlに懸濁した。氷上にて超音波により菌体を破砕し、遠心分離により菌体中に可溶性画分として存在しているJSP-1の全長蛋白質又は部分ポリペプチドを含有する上清を抽出した。得られた上清を、予め同じ緩衝液1で平衡化しておいたアフィニティーカラム(グルタチオン 4B；アマシャム社製) 200μlに供し、発現させた融合蛋白質を特異的に吸着させ、カラム洗浄後、PSPを含む同緩衝液200μlで溶出した。溶出された蛋白質のN末端には、タグの切断に伴いPreScission Protease認識配列内C末端側2残基のGly-Proが付加されて回収される。回収したサンプルを、SDS-PAGE(SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動)に10μlずつ供して、発現の確認を行った。
【００４５】
また、ポリヒスチジン融合蛋白質の場合には、回収した菌体を緩衝液2(150mM NaCl, 10% glycerol, 2mMβ-mercaptoethanol, 50mM Tris-HCl (pH8.0))  2mlに懸濁した。氷上にて超音波により菌体を破砕し、遠心分離により菌体中に可溶性画分として存在しているJSP-1の全長蛋白質又は部分ポリペプチドを含有する上清を抽出した。得られた上清を、予め同じ緩衝液2で平衡化しておいたアフィニティーカラム(TALON；クロンテック社製) 200μlに供し、発現させた融合蛋白質を特異的に吸着させ、カラム洗浄後に、200mM imidazoleを含む同緩衝液200μlで溶出を行った。続いて、目的蛋白質のN末端に付加されているポリヒスチジンタグを切断するために、JSP-1の部分ポリペプチド（1-163及び1-174）に関しては溶出したサンプルにPSPを反応させ、JSP-1の全長蛋白質に関してはbiotin-conjugated-Thrombin protease(Novagen社製)を反応させた。タグの切断に伴い、蛋白質のN末端には、JSP-1の部分ポリペプチド（1-163及び1-174）についてはPreScission Protease認識配列内C末端側2残基のGly-Proが付加され、JSP-1の全長蛋白質についてはThrombin protease認識配列内C末端側3残基のGly-Ser-Hisが付加される。反応後、遠心分離した上清サンプルをSDS-PAGE(SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動)に10μlずつ供して、発現の確認を行った。
【００４６】
以上の各蛋白質の発現確認の結果を表1に示す。
ただし、表1において、GST融合蛋白質として発現させた蛋白質については、発現後、アフィニティー精製とGSTの切断を行った後に回収された蛋白質量を示している。ポリヒスチジン融合蛋白質として発現させた蛋白質についても、発現させた後、アフィニティー精製とポリヒスチジンの切断を行った後に回収された蛋白質量を示している。
【００４７】
【表１】
2005278642.tif 000002
【００４８】
さらに、これらの発現された蛋白質を用いて、リン酸エステル加水分解酵素活性を測定した。活性測定には、基質としてp-ニトロフェニルリン酸（pNPP）を用いた。測定バッファ（50mM Hepes-NaOH(pH 7.6), 5mM DTT）中に基質（pNPP；20mM）と上記で精製した各蛋白質とを混合して、37℃で10分間反応させる。反応中、405nmの吸光度上昇の経時変化を既存のマイクロプレートリーダーなどで測定した後に、分解産物であるp-ニトロフェノール（pNP）の標準曲線から比活性(nmol/min/mg)を求めた。
【００４９】
なお、ここで、GST融合蛋白質については、GST切断後の蛋白質を用いて活性測定を行ったが、ポリヒスチジン融合蛋白質については、ポリヒスチジンタグがついた状態で活性測定を行った。
活性測定の結果を表2に示す。
【００５０】
【表２】
2005278642.tif 000003
【００５１】
これらの結果より、N末端に各種タグを連結させた融合蛋白質では、JSP-1の全長蛋白質(1-184)と、JSP-1の部分ポリペプチド（1-163及び1-174）の間で可溶性発現量に大きな差はなかった。しかし、活性測定では、特にアミノ酸番号1-163からなるJSP-1の部分ポリペプチドの比活性が高い値を示し、全長蛋白質の1.5倍以上であった。
【実施例２】
【００５２】
JSP-1の部分ポリペプチドの詳細な解析
（1）JSP-1の部分ポリペプチド(アミノ酸番号1-146, 1-148, 1-150, 1-152, 1-154, 1-156,1-158, 1-160, 1-163, 1-184) をコードする遺伝子の大腸菌発現ベクター構築
上記実施例（1-1）で作製したJSP-1の全長蛋白質を発現させるためのベクター(pET-15b JSP-1)を鋳型とし、PCR法により、JSP-1の部分ポリペプチド(1-146, 1-148, 1-150, 1-152, 1-154, 1-156,1-158, 1-160, 1-163, 1-184)をコードする遺伝子を増幅させた。なお、PCR法には、合成プライマーJSP-1Nter（配列番号9）と、それぞれの部分ポリペプチドに応じて、JSP-1 Cter146(stop-)（配列番号10）、JSP-1 Cter148(stop-)（配列番号11）、JSP-1 Cter150(stop-)（配列番号12）、JSP-1 Cter152(stop-)（配列番号13）、JSP-1 Cter154(stop-)（配列番号14）、JSP-1 Cter156(stop-)（配列番号15）、JSP-1 Cter158(stop-)（配列番号16）、JSP-1 Cter160(stop-)（配列番号17）、JSP-1 Cter163(stop-)（配列番号18）、又はJSP-1 Cter184(stop-)（配列番号19）を用いた。各プライマーの名称中の番号は、部分ポリペプチドのC末端の配列番号と対応している。
【００５３】
まず、pET-32a（Novagen社製）のSD配列とT7ターミネーター配列の間に、NdeI及びXhoI認識配列、プロテアーゼ認識配列(PSP; PreScission Protease（アマシャム社製）用)、ヒスチジン10個（ポリヒスチジンタグ）をコードする配列を含む遺伝子を順に導入したベクター（以下、これを「pET-32a Chis psp」と称することがある）を作製した。次に、増幅された前記PCR産物を、制限酵素NdeI及びXhoI（TAKARA社製）で処理し、作製したベクターpET-32a Chis pspのクローニング部位にそれぞれ導入した。得られたプラスミドにより大腸菌JM109株を形質転換し、コロニーから各プラスミドDNAを抽出・精製した後、DNA配列を確認した。
【００５４】
ここで作製した発現ベクターは、T7プロモーター配列の下流に、SD配列・JSP-1（1-146, 1-148, 1-150, 1-152, 1-154, 1-156, 1-158, 1-160, 1-163, 1-184）・プロテアーゼ認識配列(EK; Entero kinaseとPSP; PreScission Protease用)・ポリヒスチジン (タグ付加用)・T7ターミネーター配列を有するベクターである。これらを発現させると、JSP-1の全長蛋白質又は各部分ポリペプチドのC末端側に、プロテアーゼ認識配列を介してポリヒスチジンタグが連結された融合蛋白質が発現される。
【００５５】
（2）大腸菌発現系によるJSP-1の発現
上記（1）で作製した発現ベクター10種類について、上記実施例1の（2）に記載の方法と同様にして蛋白質の発現を行った。ただし、上記の実験との相違点として、PSPを反応させた部分ポリペプチド（1-146, 1-148, 1-150, 1-152, 1-154, 1-156, 1-158, 1-160, 1-163）とJSP-1の全長蛋白質（1-184）のC末端には、タグの切断に伴い、ベクター構築時に導入したエンテロカイネース認識アミノ酸5個(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)とPSP認識配列内N末端側6残基（Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln）が付加される。
【００５６】
発現確認の結果を表3に示す。
ここで、表3においては、ポリヒスチジン融合蛋白質として発現させた蛋白質について、アフィニティー精製及びポリヒスチジンの切断を行った後に回収された蛋白質量を示している。
【００５７】
【表３】
2005278642.tif 000004
【００５８】
さらに、発現されたこれらの蛋白質を用いて、上記実施例1の（3）記載の方法と同様にして、加水分解酵素活性を測定した。
活性測定の結果を表4に示す。
部分ポリペプチド（1-152）については、活性は若干見られたが、蛋白質量が定量するに十分な量が得られていなかったので、ブランクとした。部分ポリペプチド（1-146, 1-148, 1-150）については、活性は検出されなかった。
【００５９】
【表４】
2005278642.tif 000005
【００６０】
これらの結果より、C末端側に各種タグを連結させた融合蛋白質として発現させた場合、JSP-1の部分ポリペプチドの可溶性発現量は、部分ポリペプチドのC末端のアミノ酸番号が154から急激に上昇し、少なくとも163までは上昇していく傾向にあることが明らかになった。その値は、JSP-1の全長蛋白質（1-184）と比較して明らかに大きくなることがわかった。特に部分ポリペプチド（1-160）及び（1-163）については、全長蛋白質（1-184）に比べて数倍以上という非常に高い可溶性発現量を示すことがわかった。すなわち、本発明によれば、適切な部分ポリペプチドの配列を選択することによって、全長蛋白質に比べて簡便に十分量の蛋白質を取得できることが示された。
【００６１】
一方、活性については、部分ポリペプチドのC末端のアミノ酸番号が154以降であれば全長蛋白質（1-184）と同等の比活性が得られることがわかり、特に部分ポリペプチド（1-160）及び（1-163）では全長蛋白質（1-184）以上の比活性が検出された。
上記実施例1及び2で行った可溶性発現量と比活性の解析結果から、N末端にタグを連結させた場合でもC末端にタグを連結させた場合でも可溶性発現量が十分であり、かつ、高い活性を示したアミノ酸番号1-163からなる部分ポリペプチド（以下、これを「JSP-1△163」と称することがある）を発現させるためのベクターが有用であると推測された。これより先の実験には、このJSP-1△163をN末端ポリヒスチジン融合蛋白質として発現させ、使用することとした。
【実施例３】
【００６２】
JSP-1△163の発現及び精製
上記実施例1において構築したJSP-1△163を発現させるためのベクター（N末端ポリヒスチジン融合蛋白質として発現させる）により大腸菌JM109株を形質転換し、抗生物質アンピシリン100μg/mLを含む2×YT培地に植菌し、37℃で振とう培養した。その後、終濃度1.0mMとなるようイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加し、25℃で5時間の発現誘導を行った。
【００６３】
その培養液から、遠心沈降法により集菌を行い、得られた菌体を緩衝液(150mM NaCl, 10% glycerol, 2mM β-mercaptoethanol, 50mM Tris-HCl (pH8.0))に懸濁した。超音波により菌体を破砕し、遠心分離により菌体中に可溶性画分として存在しているJSP-1△163を含有する上清を抽出した。得られた上清を、同じ緩衝液で予め平衡化しておいたアフィニティーカラム(TALON；クロンテック社製)に供し、JSP-1△163を特異的に吸着させ、カラム洗浄後、200mM imidazoleを含む同緩衝液で溶出した。溶出後、溶出された画分をSDS-PAGEに供して、目的とする蛋白質の含まれる画分を回収した。続いて、回収したJSP-1△163にPreScission Proteaseを添加し、4℃にて12時間処理し、N末端に結合しているヒスチジンタグの切断・除去を行った。タグの切断に伴い、JSP-1△163のN末端には、PreScission Protease認識配列内C末端側2残基のGly-Proが付加される。
【００６４】
次に、上清を緩衝液(10% glycerol, 5mM DTT, 20mM HEPES-NaOH (pH7.4))で希釈し、同緩衝液で予め平衡化しておいた陰イオン交換カラム(Resource Q；アマシャムバイオサイエンス社製)に供した。カラムに吸着したJSP-1△163を1M NaClを含む同緩衝液の直線濃度勾配により溶出させ、溶出画分をSDS-PAGEに供して目的の画分を回収した。回収したJSP-1△163を、限外濾過膜(centricon-10；ミリポア社製)で濃縮し、緩衝液(150mM NaCl, 10% glycerol, 5mM DTT, 10mM HEPES-NaOH (pH7.4))により平衡化されたゲル濾過カラム(Superdex75pg；アマシャムバイオサイエンス社製)に供した。カラムから溶出した目的の画分をSDS-PAGE及びIEF-PAGE(等電点電気泳動) に供して純度検定を行い、さらにDLS(動的光散乱法；DynaProMTSC800, Protein Solutions Inc.) に供して分散性検定を行い、精製試料とした。
【００６５】
最終的に得られた精製JSP-1△163は、収量1.0mg/1L培養液、かつ、純度99%以上、分散性15%以下であった。
【実施例４】
【００６６】
JSP-1△163の結晶の調製
上記実施例3において得られた高純度に精製されたJSP-1△163を、結晶化試料とするために、3.0mg/mL(UV280nmの吸光度から換算)まで限外濾過膜(centricon-10；ミリポア社製)を使用して濃縮・調製した後、孔径0.22μmの膜フィルターで滅菌濾過して、-80℃にて凍結保存した。
【００６７】
JSP-1△163の結晶は、蒸気拡散法（J. ドレント著、 竹中ら訳 (1998)、 蛋白質のＸ線結晶解析法、 シュプリンガー・フェアラーク東京）により得た。前記精製試料を4℃にて解凍し、結晶化に使用した。この蛋白質溶液1.0μLに、結晶化溶液として、20%〜30%(w/v)のポリエチレングリコール4000(PEG4000)と150mMの塩化マグネシウムを含む100mM MES-NaOH緩衝液(pH6.5〜pH7.0)を等量添加・混合し、結晶化ドロップとした。平衡化溶液として上記結晶化溶液を50μL注入し、気密性のある結晶化プレートに入れてシールした。プレートは5.0℃の恒温槽内に静置した。およそ5〜7日で、ドロップ内に大きさ0.2×0.2×0.1mm3程度の結晶が得られた。
得られたJSP-1△163結晶の顕微鏡写真を図1に示す。
【実施例５】
【００６８】
JSP-1△163の立体構造解析
（1）JSP-1△163の結晶の結晶形決定
上記実施例4で得られた結晶を、20%のglycerol又はMPDを抗凍結剤として添加した結晶化溶液に数秒間浸漬し、100Kの窒素ガス気流下にて急速凍結した。これを、リガク社製の高輝度X線発生器RA-Micro7、及び高輝度光科学研究所の放射光SPring-8のビームラインBL24XUを線源とし、イメージングプレートを装備したR-AXIS VII及びR-AXIS V（リガク社）をX線検出装置としてX線回折データを振動法にて測定した。次に、回折強度処理プログラムHKL2000(HKL Research製)を使用して、結晶より得られた回折強度を数値化し、結晶構造因子の振幅を求めた。
【００６９】
その結果、JSP-1△163の結晶は、空間群C2対称に属し、結晶の格子定数はa＝84.0Å、b=49.3Å、c=47.3Å、かつα＝γ＝90°、β＝119.5°であった。また、結晶の格子定数及び空間群と分子量から、結晶性非対称単位内には1分子のJSP-1△163が存在することが確認された。
【００７０】
（2）JSP-1△163の結晶の回折強度データ解析
上記（1）で得られた回折強度データを、CCP4（Collaborative Computational Project Number 4）というプログラム群のAMOREを使用して、分子置換法 (MR; Molecular Replacement)による解析を行った。MR法は蛋白質の立体構造解析手法の1つであり、目的蛋白質とのアミノ酸相同性が高く、かつ立体構造既知（PDB（Protein Data Bank）に登録されている）である類似蛋白質を目的蛋白質に見立て、得られた回折強度データから「解（回折強度データと立体構造がシミュレーション計算で整合性を持つか否か）」を導く方法である。
【００７１】
ここで、JSP-1△163と30-35%程度のアミノ酸相同性を持つ近縁蛋白質であるMKP（mitogen-activated protein kinase phosphatase, PDB code; 1MKP）、及びVHR（vaccinia H1-related phosphatase, PDB code; 1VHR）をMR法での初期構造として使用した。解析の結果、MKPを使用した計算よりJSP-1△163の有意と思われる「解」を得た。
次に、CNX（Crystallography & NMR Explor; アクセルリス社製）というプログラムで、電子密度の計算及び各原子位置の精密化を行い、得られた電子密度図に対してQuanta（アクセルリス社製）というプログラムでJSP-1△163構造の構築及び水分子の同定を行った。この操作を繰り返し行うことで、1.5Å分解能において精密化されたJSP-1△163の立体構造を得た。
JSP-1△163結晶から解析された立体構造を、リボンモデルを用いて図2に示す。
【００７２】
（3）JSP-1△163の3次元構造解析結果
上記（2）の解析の結果、構造座標の正確さの指標とされているR因子は、20Åから1.5Åのブラッグ反射角を持つ回折像から得られる構造因子を用いた場合、R=25.1%であった。更に精密化の段階で独立に精密化の計算に入れなかった構造因子から計算されるR因子（R-free 因子と呼ばれている因子）はR-free=28.2%であった。さらに、各原子間の結合距離及び結合角の理想状態からの2乗平均平方根誤差は、それぞれ0.0057Å及び1.3210°であった。
【００７３】
また、得られた立体構造は、JSP-1のアミノ酸番号1-154までのものであった。すなわち、計算された電子密度図に従ってJSP-1のアミノ酸を当てはめた結果、アミノ酸番号1-154まではアミノ酸の構造に対応する電子密度が得られたが、アミノ酸番号155-163までの電子密度は得られなかった。これは、アミノ酸番号155以降の領域が立体構造的にフレキシブルな状態になっているためと考えられた。先に、上記実施例2において、JSP-1の部分ポリペプチドの可溶性発現量がC末端のアミノ酸番号が154以降になると急激に上昇することが確認されたが、この構造解析の結果からも、JSP-1においてアミノ酸番号1-154で表される部分が重要な意義を有することが示唆された。
【００７４】
得られた構造座標は、一般的に用いられている表記法であるプロテイン・データ・バンク (PDB)の形式に従って表記し、PDBに登録した（PDB accession code：1WRM）。
以上のように、本発明のJSP-1の部分からなるポリペプチド、及び、該ポリペプチドの結晶を用いて、今まで結晶化が行われておらず、3次元結晶構造解析が行われていなかったJSP-1の3次元構造座標が取得された。これにより、本発明のポリペプチドが、結晶化を行うに足る十分量の可溶性発現量を示すものであり、また、本発明の結晶が、3次元結晶構造解析が可能な高品質のものであることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明によれば、可溶性が高く高効率で結晶化が可能なJSP-1活性を有する蛋白質の部分ポリペプチド、及び、X線結晶構造解析を可能にする高品質なJSP-1活性を有する蛋白質の部分ポリペプチドの結晶が提供される。該結晶を用いれば、高精度の3次元構造座標を得ることができ、さらに該座標を用いれば、JSP-1活性を有する蛋白質の機能を調節する能力を有する化合物の同定、検索、評価、又は設計等を、コンピュータ等を利用した公知の手法によって行うことができる。該手法は、従来の生物学的機能等に基づいて行われる各手法を大幅に効率化するものであり、JSP-1活性を有する蛋白質の関与する疾患の予防又は治療薬等の開発を効率的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明のJSP-1部分ポリペプチドの結晶の顕微鏡写真である。
【図２】JSP-1の部分ポリペプチドの立体構造を、リボンモデルで表したコンピューターディスプレイのプリントアウト（図）である。
【図１】
2005278642.tif 000006
【図２】
2005278642.tif 000007
【配列表】
2005278642000001.app