(57)【要約】【課題】  敗血症、電撃性紫斑病、髄膜炎菌敗血症、骨髄または他の移殖、重度の火傷、妊娠、生命の危険を伴う手術、重度の外傷、または、ＡＲＤＳ等と関連する後天性凝固亢進状態または後天性プロテインＣ欠乏症のヒト患者を処置する薬剤を提供する【解決手段】  出血合併症を引き起こす力価の低い、高度に選択的な治療剤となる活性化プロテインＣにより上記課題は解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
約24時間〜約144時間かけて、約20μｇ/ｋｇ/時間〜約50μｇ/ｋｇ/時間の用量のヒト活性化プロテインＣを連続注入により投与することによりヒトの患者における後天性凝固亢進状態、または、後天性プロテインＣ欠乏症のヒト患者を処置するための薬剤の製造における活性化プロテインＣの使用。
【請求項２】
凝固亢進状態またはプロテインＣ欠乏症が敗血症、播種性血管内凝固、電撃性紫斑病、静脈血栓塞栓合併症、または大人の呼吸困難症候群と関連している、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
凝固亢進状態、または、プロテインＣ欠乏症が播種性血管内凝固と関連している、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
該薬剤が、ヒト活性化プロテインＣの約22μｇ/ｋｇ/時間〜約30μｇ/ｋｇ/時間の用量を与えるための投与のためである、請求項１〜３に記載の使用。
【請求項５】
該薬剤が、ヒト活性化プロテインＣの約24μｇ/ｋｇ/時間の容量を与えるための投与のためである、請求項４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、医学、特に後天性凝固亢進状態または後天性プロテインＣ欠乏症の処置に関する。
【０００２】
プロテインＣはセリンプロテアーゼ、そして、天然に存在する抗凝固物質であり、凝固カスケード中の第Va因子及び第VIIIa因子を不活性化することによりトロンビンの産出を妨げる能力を介して止血の調節に役割を果たす。ヒトプロテインＣは、イン・ビボでは主として肝臓において、461アミノ酸残基からなる一本鎖ポリペプチドとして作られる。この前駆体分子は、
1)42アミノ酸からなるシグナル配列の切断；
2)分子の2本鎖形を形成するための、一本鎖酵素前駆体からの155位のリジン残基及び156位のアルギニン残基のタンパク質分解性除去(即ち、155アミノ酸残基からなる軽鎖がジスルフィド結合を介して、262アミノ酸残基のセリンプロテアーゼを含む重鎖に結合)；
3)軽鎖の最初の42アミノ酸中に集中する9つのグルタミン酸残基のビタミンＫ依存性カルボキシル化(それにより9つのγ-カルボキシグルタミン酸残基が生じる)；そして
4)4つの部位での炭水化物付加(1つは軽鎖中、3つは重鎖へ）；
を含む複数の翻訳後修飾を受ける。重鎖は、よく特徴付けられたセリンプロテアーゼ3つ組残基である257位のＡｓｐ、211位のＨｉｓ及び360位のＳｅｒを含む。最終的に、循環される2本鎖酵素前駆体は、イン・ビボでカルシウムイオンの存在下、トロンビンによりリン脂質表面で活性化される。重鎖のＮ-末端からのドデカペプチドの除去により活性化され、それにより酵素活性を有する活性化プロテインＣ(ａＰＣ)が製造される。
【０００３】
他のタンパク質と共に、ａＰＣは血液凝固の恐らく最も重要なダウンレギュレーターとして機能し、それにより血栓症に対する防護となる。さらに、その抗凝固機能に加えて、サイトカイン産生(例えば、ＴＮＦ及びＩＬ-１)を阻害することにより、ａＰＣは抗炎症作用を有し、そしてさらに、血餅溶解を容易にする前繊溶特性を発揮する。従って、プロテインＣ酵素系は、抗凝固、抗炎症及び繊溶の主要な生理的機能を表す。
【０００４】
敗血症
敗血症は、サイトカインネットワーク、白血球、並びに、補体及び凝固/繊溶系を含む多数の宿主防護機構の活性化と関連、及び、活性化により媒介される感染に対する全身性の炎症性反応として定義される。(Mestersら、Blood、第88巻、第881〜886頁(1996年))。種々の臓器の微小血管系中で繊維素が広範囲にわたって沈着した播種性血管内凝固(ＤＩＣ)は、敗血症/敗血症性ショックの初期の現れである。ＤＩＣは、多臓器不全症候群の進展における重要なメディエーターであり、敗血症性ショックの患者の不十分な予後の一因である。(Fourrierら、Chest、第101巻、第816〜823頁(1992年))。
【０００５】
敗血症の種々の動物モデルにおけるプロテインＣを用いる、いくつかの有望な前臨床試験が報告されている。Taylorらによる、ヒヒの敗血症モデルを用いた研究(J.Clin.Invest.、第79巻、第918〜925頁(1987年))では、血漿由来ヒト活性化プロテインＣが用いられた。動物は予防的に処置した(すなわち、ａＰＣをＬＤ100大腸菌の2時間の点滴の始めに与えた)。5匹中5匹の動物が7日間生き残り、この実験プロトコルに関しては、永久に生存するとみなされた。同様の大腸菌の点滴を受けたコントロール動物では、5匹中5匹が24〜32時間以内に死んだ。有効な用量は7〜8ｍｇ/ｋｇであった。
【０００６】
ラットのリポ多糖類(ＬＰＳ；大腸菌)敗血症モデル(Murakamiら、Blood、第87巻、第642〜647頁(1996年))では、ＬＰＳにより誘導された肺血管傷害は、100μｇ/ｋｇの用量のヒト血漿由来活性プロテインＣにより阻害された。そのうえ、ウサギの結紮及び穿刺敗血症モデルでは、Okamotoら(Gastroenterology、第106巻、第A747頁(1994年))は、血漿由来ヒト活性化プロテインＣが12μｇ/ｋｇ/時間の用量で9時間与えられることにより、動物を凝固傷害及び臓器機能不全から効果的に防護することを示した。ａＰＣの種特異性のため、これらの動物で得られた結果は、ヒトにおける処置を必ずしも予見させるものではない。ヒト活性化プロテインＣの有効用量レベルは、選択される動物モデルに依存し、非常に多様で予見できないものである。例えば、ヒトにおけるヒト活性化プロテインＣの血清半減時間は30〜40分であるのに対し、ヒヒでは8〜10分、そして、ウサギでは90分の半減時間である。
【０００７】
ヒトにおける敗血症を処置する無数の試みがなされてきたが、大部分は、この病気の病態生理に関連する炎症のメディエーターを妨げる薬剤を用いたものである。しかしながら、炎症のメディエーターを妨げる種々の薬剤を用いた臨床試験は不成功に終わっている(Natansonらによるレビュー、Ann.Intern.Med.、第120巻、第771〜783頁(1994年)；Gibaldi、Pharmacotherapy、第13巻、第302〜308頁(1993年))。炎症に関与するメディエーターの多くは、代償的な反応であるため有益な効果を持つので、それらの反応を妨げることは適切ではないかも知れないと、研究者の中には示唆する者もいる(例えば、Parrilloら、N.Engl.J.Med.、第328巻、第1471〜1477頁(1993年))。
【０００８】
最近、敗血症における臨床試験においてＤＩＣを妨げることが新しい標的として提案されている(例えば、Leviら、JAMA、第270巻、第975〜979頁(1993年))。しかしながら、敗血症における凝固欠陥を単に妨げるのでは十分でないかも知れない。Esmonによりレビューされたように(Arteriosclerosis&Thromb.、第12巻、第135〜145頁(1992年))、活性部位がブロックされた第Xa因子(Taylorら、Blood、第78巻、第364〜368頁(1991年))、ヒルジン及びHirulog(ヒルジン誘導体)(Maraganore、Perspective in Drug Discovery and Design、第1巻、第461〜478頁(1994年))を含む、いくつかの抗血栓剤はヒヒの敗血症モデルにおいて効力を示さなかった。これらの各抗血栓剤は、動物の消費性凝固障害を妨げることができたが、生存を向上させることはできなかった。さらに、日本の研究者ら(特開平7-97335号公報)は、ＤＩＣ様症状を示す可能性のある肝不全に関連した凝固障害を、血漿由来活性化プロテインＣで処置することを提案している。
【０００９】
現在までのところ、血漿由来ヒトプロテインＣ酵素前駆体が、細菌性敗血症の電撃性紫斑病の25人の患者の処置における攻撃的な従来の治療の有効な補助剤として使用されており、22人が生き延びた(Gersonら、Pediatrics、第91巻、第418〜422頁(1993年)；Smithら、Thromb.Haemost、第PS1709巻、第419頁(1997年)；Rintalaら、Lancet、第347巻、第1767頁(1996年)；Rivardら、J.Pediatr.、第126巻、第646〜652頁(1995年))。Gersonら(1993年)は、攻撃的な従来の治療に対して反応しなかった、グラム陽性菌血症及び電撃性紫斑病を患うことが示された子供の処置の事例研究について記載している。患者は、血漿由来ヒトプロテインＣ酵素前駆体(280μｇ/ｋｇボーラス＋40μｇ/ｋｇ/時間点滴)で処置され、凝固障害及びＤＩＣが一緒に治癒され、敗血症性ショック関連電撃性紫斑病の発生の臨床的徴候を阻止した。Rintalaら(1996年)は、電撃性紫斑病と共に髄膜炎菌敗血症を呈する2成人の処置を報告している。患者は、血漿由来プロテインＣ酵素前駆体、400μｇ/ｋｇボーラスで8〜10日間、6時間毎に処置された。1人は亡くなり、1人は生き残った。Rivardら(1995年)は、髄膜炎に加えて電撃性紫斑病を呈する4人の患者の処置を報告しており、ヒトプロテインＣ酵素前駆体治療により全員が生き残った。これらの患者は、6時間毎に400μｇ/ｋｇボーラスの用量で処置された。これらの試験の実例数は少ないものの、電撃性紫斑病を共に呈する髄膜炎に関する死亡率は50％より大きい(Powarsら、Clin.Infectious Diseases、第17巻、第254〜261頁(1993年))。しかしながら、これらの試験はヒトプロテインＣ酵素前駆体で行われているので、活性化プロテインＣを用いた治療における用量及び連続時間を確立するのに、あまり示唆を与えない。
【００１０】
髄膜炎菌に加えて、これらに限定されるわけではないが、リケッチア属(ロッキー山紅斑熱、ダニ熱、発疹チフス等)(Graybillら、Southern Medical Journal、第66巻第4号、第410〜413頁(1973年)；Loubserら、Annals of Tropical Paediatrics、第13巻、第277〜280頁(1993年))、サルモネラ属(腸チフス、鼡咬症)(Koulら、Acta Haematol.、第93巻、第13〜19頁(1995年))、肺炎双球菌属(Carpenterら、Scand.J.Infect.Dis.、第29巻、第479〜483頁(1997年))、Yersina pestis(腺ペスト)(Butlerら、The Journal of Infections Disease、第129巻、第578〜584頁(1974年))、Legionella pneumophilia(在郷軍人病)、Plasmodium falciparum(脳マラリア)(Lercariら、Journal of Clinical Apheresis、第7巻、第93〜96頁(1992年))、Burkholderia pseudomallei(類鼻疽)、Pseudomonas pseudomallei(類鼻疽)(Puthuchearyら、Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene、第86巻、第683〜685頁(1992年))、連鎖球菌属(歯原性感染)(Ota,Y.、J.Japanese Assoc.Infect.Dis.、第68巻、第157〜161頁)、帯状疱疹ウイルス(Nguyenら、Eur.J.Pediatr.、第153巻、第646〜649頁(1994年))、Bacillus anthracis (炭疽)(Franzら、Journal of the American Medical Assoc.、第278巻第5号、第399〜411頁(1997年)、Leptospira interrogans(レプトスピラ症)(Hillら、Seminars in Respiratory Infections、第12巻第1号、第44〜49頁(1997年))、ブドウ状球菌属(Levin,M.、Pediatric Nephrology、第8巻、第223〜229頁)、Haemophilus aegyptius(ブラジル紫斑熱)、ナイセリア属(淋菌血、髄膜炎)、及び、Mycobacterium tuberculosis(粟粒結核)により引き起こされる多数の細菌性、ウイルス性または原生動物性感染と、電撃性紫斑病及び/またはＤＩＣは関連する。
【００１１】
敗血症/敗血症性ショックまたは他の感染における電撃性紫斑病、ＤＩＣまたは後天性プロテインＣ欠乏症症状は先に示したように詳細に文献に記載されているにも拘わらず、これらの患者をどのように活性化プロテインＣで処置するかのデータは少ない。動物モデルにおける活性化ヒトプロテインＣの処置から得られた臨床前薬理学データを用いてヒトにおける用量レベルを確立することは、プロテインＣの生物活性の種特異性のため困難である。
【００１２】
移殖
骨髄移殖(ＢＭＴ)、肝臓、腎臓、または、他の臓器移植に続いて、種々の移殖に伴う血栓塞栓症合併症が起こり得る(Haireら、JAMA、第274巻、第1289〜1295頁(1995年)；Harperら、Lancet、第924〜927頁(1988年)、及び、Sorensenら、J.Inter.Med.、第226巻、第101〜105頁(1989年)；Gordonら、Bone Marrow Transplan.、第11巻、第61〜65頁(1993年))。ＢＭＰ(Bazarbachiら、Nouv.Rev.Fr.Hematol.、第35巻、第135〜140頁(1993年)；Gordonら、Bone Marrow Trans.、第11巻、第61〜65頁(1993年))、腎移植(Sorensenら、J.Inter.Med.、第226巻、第101〜105頁(1989年))、及び、肝移植(Harperら、Lancet、第924〜927頁(1988年))後における循環性プロテインＣレベルの減少が報告されている。このプロテインＣ欠乏は凝固亢進状態の一因であり、患者が血栓塞栓症合併症を起こす危険に曝す。
【００１３】
例えば、肝臓の肝静脈閉塞疾患(hepatic venocclusive disease;ＶＯＤ)は、ＢＭＴの移殖前摂生の用量を制限させる主要な合併症である。ＶＯＤはおそらく、繊維素の血管内沈着による肝内小静脈閉塞の結果である(Faioniら、Blood、第81巻、第3458〜3462頁(1993年))。さらに、ＶＯＤはＢＭＴに次いで、かなりの罹患及び死を引き起こすものである(Collinsら、Throm.and Haemo.、第72巻、第28〜33頁(1994年))。ＶＯＤのピーク発病率と一致したプロテインＣの減少が報告されており(Harperら、Bone Marrow Trans.、第5巻、第39〜42頁(1990年))、この症状の起源に寄与する因子である可能性が高い。
【００１４】
肺、中央神経系、肝臓または腎臓を含む臓器のＢＭＴ後の機能不全は、移植患者において高い確率で起こる合併症である(Haireら、JAMA、第274巻、第1289〜1295頁(1995年))。ＢＭＴにおける単一の臓器の機能不全は、ＢＭＴ患者における死の主要原因である多臓器不全症候群(ＭＯＤＳ)を強く予期させるものである。凝固系の大規模な活性化、及び、種々の臓器の微小血管系中の繊維素の広範囲にわたる沈着による播種性血管内凝固(ＤＩＣ)は、ＭＯＤＳの進行の主要なメディエーターである(Fourrierら、Chest、第101巻、第816〜823頁(1992年))。従って、骨髄または他の臓器移植を受けた患者におけるプロテインＣレベルの欠乏は、患者を静脈血栓塞栓症合併症及び臓器の機能不全にかかりやすくする、凝固亢進状態を引き起こす。臓器移殖に伴う凝固亢進状態のヒトを、活性化プロテインＣを用いて処置する方法を確立する、要望が現在存在する。
【００１５】
火傷
重度の火傷の患者が、凝固亢進に関連する合併症を起こすことが昔から、認識されていた(Curreriら、Ann.Surg.、第181巻、第161〜163頁(1974年)）。火傷の患者は、非常に普通のイン・ヴィトロ凝固活性を有し、拡散性出血の突然の始まり、繊維素原、血小板及び第VIII因子活性の消費、血管内溶血、二次繊溶、及び、微血栓の生検証拠により特徴付けられるＤＩＣを頻繁に形成する(McManisら、J.of Trauma、第13巻、第416〜422頁(1973年))。最近、重度の火傷患者においてプロテインＣのレベルが劇的に減少すること、及び、この天然抗凝固物質の減少がＤＩＣの危険を増加させ得ることが報告された(Loら、Burns、第20巻、第186〜187頁(1994年))。さらに、Ueyamaらは、火傷障害の初期段階におけるＤＩＣの病因を論じる上で、大量トロンビン産生及び抗凝固物質活性の増加が火傷の度合いに比例して起こるかもしれないと推断している(Ueyamaら、日本外科学会雑誌、第92巻、第907〜912頁(1991年))。ＤＩＣは、重度の火傷障害を患う患者において一般的な合併症の1つである。
【００１６】
上述のようにプロテインＣ欠乏症が、重度の火傷患者について報告されてきたが、プロテインＣ補充治療が効果的であるかを考察した、または、これらの患者をどのように活性化プロテインＣで処置するべきかに注意したデータは少ない。
【００１７】
妊娠
凝固亢進状態となり得る複合的な変化が、妊娠により凝固系において引き起こされることはよく知られている。例えば、妊娠中及び分娩後における静脈血栓症になる危険性は、非妊娠状態に比べて5倍高い。さらに、凝固因子が増加し、凝固の天然阻害因子は減少し、繊溶系で変化が生じ、静脈鬱血が増加するのと同じく、胎盤分離、帝王切開、または感染によるお産での血管の損傷も増加する(Barbourら、Obstet.Gynecol.、第86巻、第621〜633頁(1995年))。
【００１８】
何の危険因子も持たない女性が、この凝固亢進状態によって合併症にかかる危険性は小さいが、血栓塞栓症に罹ったことのある女性が妊娠した場合には、再発する危険性が増加する。さらに、最近発見された活性化プロテインＣに対する遺伝的耐性を含む、潜在的に凝固亢進状態である女性もまた、再発する危険性がより高い(Dahlback、Blood、第85巻、第607〜614頁(1995年))。
【００１９】
よって、アンチトロンビンIII、プロテインＣ、または、プロテインＳに欠損を有することが見つけられた、静脈血栓塞栓症に罹ったことのある女性では、血栓症が再発する相当の危険性があるので、予防的抗凝固治療を考慮するべきであることが提案されている(Conradら、Throm.Haemost、第63巻、第319〜320頁(1990年))。
【００２０】
繊維素形成の増加、繊溶系の活性化、血小板活性化及び血小板数の減少により示唆されるように、妊婦における子癇前症及び子癇は凝固障害の増加状態を示しているようである(Clin.Obstet.Gynecol.、第35巻、第338〜350頁(1992年))。子癇前症は、胎盤の「血管付着」が異形であることによる子宮胎盤虚血の結果と考えられている。子癇前症の結果起こる症状には、高血圧、同様に胎盤、腎臓、肝臓及び脳障害を引き起こすＤＩＣも含まれる(Rev.Fr.Gynecol.Obstet.、第86巻、第158〜163頁(1991年))。そのうえ、血小板減少、溶血、及び、肝臓機能障害の合併した子癇前症として定義されるＨＥＬＬＰ症候群として知られる重篤で、生命を脅かす症状にまで子癇前症は到り得る(Rathgeberら、Anasth.Intensivther Notfallmed.、第25巻、第206〜211頁(1990年))。さらに、重篤な子癇前症を患う妊婦では、正常な妊婦と比べるとプロテインＣレベルが減少していることが報告されている(De Stefanoら、Thromb.Haemost.、第74巻、第793〜794頁(1995年))。
【００２１】
従って、妊婦、特に血栓塞栓症を患ったことのある女性が静脈血栓塞栓症の合併症を起こす危険性は、主要な関心事である。子癇前症及びＤＩＣ等の重篤な合併症を起こす可能性は比較的低いものの、活性化凝固系の阻害が始まったと診断されたと同時に、ＤＩＣに対する治療を始めることが必須であると提案されている(Rathgeberら、Anasth.Intensivther Notfallmed.、第25巻、第206〜211頁(1990年))。子癇前症またはＤＩＣの合併症は、凝固亢進状態とプロテインＣレベルが減少する点で、敗血症で起こる状況と類似している。
【００２２】
生命の危険を伴う手術/外傷
生命の危険を伴う手術または事故による外傷から回復する患者は、誘導された凝固亢進状態の結果として頻繁に血液凝固合併症になる(Watkinsら、Klin.Wochenschr.、第63巻、第1019〜1027頁(1985年))。凝固亢進状態は、外科手術を受けた患者における静脈血栓塞栓症の原因としてますます認識されている(Thomasら、Am.J.Surg.、第158巻、第491〜494頁(1989年)；LeClerc,J.R.、Clin.Appl.Thrombosis/Hemostasis、第3巻第3号、第153〜156頁(1997年))。そのうえ、この凝固亢進状態は、まれにしか起こらないが、それにもかかわらず、破壊的であり、そして、起こればしばしば致命的であるＤＩＣ様症状を伴う合併症を導く(Collinsら、Am.J.Surg.、第124巻、第375〜380頁(1977年))。
【００２３】
さらに、冠動脈バイパス移殖(ＣＡＢＧ)(Mengesら、J.Cardiothor.Vasc.An,、第10巻、第482〜489頁(1996年))、生命の危険を伴う脊髄手術(Mayerら、Clin.Orthop.、第245巻、第83〜89頁(1989年))、生命の危険を伴う腹部手術(Blameyら、Thromb.Haemost.、第54巻、第622〜625頁(1985年))、下肢の生命の危険を伴う整形手術若しくは関節形成手術(LeClerc(1997年))、または、他の型の手術(Thomasら、Am.J.Surg.、第158巻、第491〜494頁(1989年))を受けた患者は、時折、静脈血栓塞栓症合併症を起こす。さらに、日本の研究者らは、脊髄障害を伴う微小血管血栓症を血漿由来プロテインＣで、成人で1〜10ｍｇ/日、若しくは、好ましくは2〜6ｍｇを1〜2回に分けてボーラスまたは静脈点滴によって投与することにより処置することを提案している(特開平8-325161号公報)。
【００２４】
抗凝固物質による治療が、生命の危険を伴う手術または外傷を受けた患者において静脈血栓塞栓症を予防するのに重要であることが示唆されてきた(Thomasら(1989年)；LeClerc(1997年))。例えば、肺塞栓症で亡くなる多くの患者は、血栓塞栓症の徴候の臨床的証拠を先立って示さず、診断がされ処置が成される前に亡くなる(LeClerc(1997年))。例えば、ワルファリン、低分子量ヘパリン等、現在存在する予防的法は、後遺基部血栓症または頻繁に用量調整する必要性がある等の限界を有する。
【００２５】
ＡＲＤＳ
成人呼吸窮迫症候群(ＡＲＤＳ)は、肺浮腫、微血栓、炎症性細胞浸潤、及び、遅延繊維症によって特徴付けられる。これらの多様な細胞性及び炎症性反応の中枢には、結果的に凝固亢進状態になる凝固の活性化がある。一般のＡＲＤＳ-随伴凝固疾患には、血管内凝固及び繊溶の阻害が含まれる。凝固系の活性化及び繊溶の阻害により形成された繊維素は、おそらく急性の肺障害の一因となるであろう。敗血症、外傷及び他の重篤な病気はＡＲＤＳを起こす重要な危険因子である(Hasegawaら、Chest、第105巻第1号、第268〜277頁(1994年))。
【００２６】
ＡＲＤＳは凝固の活性化及び繊溶の阻害に関連している。ＤＩＣで存在する凝固亢進に類似した、肺血管微塞栓が存在することを示す無視できない臨床的事実が存在する。よって、ＡＲＤＳに関連した凝固亢進状態の効果的な治療に対する要望が現在存在する。
【００２７】
一般文献及び特許文献に記載されたプロテインＣの用量レベルの比較を容易にするために、表１及び表２にヒトまたは非ヒト霊長類のいくつかの試験における標準化した用量レベルを示す。これらのデータには、本発明で提供する用量レベルよりも高いか、または、低い用量レベルを設定している。重要なことは、ヒトにおける試験は血漿由来プロテインＣ酵素前駆体を用いられたのに対し、非ヒト霊長類試験では組換えヒトａＰＣが用いたことである。
【表１】
2005097313.tif 000002
【表２】
2005097313.tif 000003
【００２８】
しかしながら、これらの報告にもかかわらず、敗血症、移殖、火傷、妊娠、生命の危険を伴う手術、外傷、若しくはＡＲＤＳに関連した後天性凝固亢進状態または後天性プロテインＣ欠乏症を患うヒトにおける安全で効果のある治療の用量レジメは知られないままである。これらの試験は、ヒトにおける凝固亢進状態または後天性プロテインＣ欠乏症において、本発明の組換え活性化プロテインＣを用いることを予測させるものではない。
【００２９】
本発明は、重篤な敗血症患者の臨床試験においてａＰＣを用いることを明らかにする。これらの患者において、プラシーボコントロールグループに比べて、ｒ-ａＰＣで処置されたグループは臓器機能の統計的改善、ＤＩＣマーカーの減少及び死亡率の減少を示した。重篤敗血症患者において用いられたａＰＣの用量は、48時間にわたる点滴で、12、18、24及び30μｇ/ｋｇ/時間であった。この試験では、12及び18μｇ/ｋｇ/時間の用量は有効でなかった。驚くべきことに、この試験で使用された24及び30μｇ/ｋｇ/時間の用量は効き目があり、公開されている前臨床的薬理学データと比べて相当に、そして、予想外に低いものである。
【００３０】
さらに、非ヒト霊長類における前臨床的毒理学試験から、ａＰＣの安全性は96時間にわたる点滴では、最高用量およそ50μｇ/ｋｇ/時間に限定されることを出願人は発見した。これらのデータも先行技術から予期されてないものであった。実際、従来の前臨床及び臨床試験に基づくヒトにおけるｒ-ａＰＣの用量レベルは、上述の毒理学試験により設定された毒素範囲以上であろう。
【００３１】
本発明は、後天性凝固亢進状態または後天性プロテインＣ欠乏症のヒト患者を処置する方法であって、該患者に約24〜約144時間にわたる連続点滴によって約20μｇ/ｋｇ/時間〜約50μｇ/ｋｇ/時間の用量で活性化プロテインＣを投与することを含む処置方法を提供する。
【００３２】
本発明はさらに、後天性凝固亢進状態または後天性プロテインＣ欠乏症のヒト患者を処置する方法であって、該患者に2ｎｇ/ｍｌ〜200ｎｇ/ｍｌの範囲の活性化プロテインＣ血漿レベルを達成するのに効果的な量の活性化プロテインＣを投与することを含む処置方法を提供する。
【００３３】
従って、本発明はヒト患者における敗血症、電撃性紫斑病、及び、骨髄炎に伴う凝固亢進状態またはプロテインＣ欠乏症の処置においてａＰＣを用いる方法を確立する。
【００３４】
本発明は重篤な火傷に伴う凝固亢進状態またはプロテインＣ欠乏症の処置においてａＰＣを用いる方法を確立する。
【００３５】
本発明は骨髄または他の臓器移植に伴う凝固亢進状態またはプロテインＣ欠乏症の処置においてａＰＣを用いる方法を確立する。
【００３６】
本発明は、生命の危険を伴う手術または重篤な外傷の回復期のヒト患者に伴う凝固亢進状態またはプロテインＣ欠乏症の処置においてａＰＣを用いる方法を確立する。
【００３７】
本発明は妊娠期の合併症に伴う凝固亢進状態またはプロテインＣ欠乏症の処置においてａＰＣを用いる方法を確立する。
【００３８】
本発明はＡＲＤＳに伴う後天性凝固亢進状態または後天性プロテインＣ欠乏症の処置においてａＰＣを用いる方法を提供する。
【００３９】
本明細書において開示し、特許請求する本発明の目的において、以下の用語は以下に定義される意味である。
【００４０】
ａＰＣまたは活性化プロテインＣは、組換え活性化プロテインＣを意味する。ａＰＣには、ヒトプロテインＣが含まれ、また、それであることが好ましいが、他の種またはプロテインＣの完全なタンパク質分解性、アミド分解性、エステル分解性、及び、生物学的(抗凝固若しくは前繊溶)活性を有する誘導体をさらに含み得る。プロテインＣ誘導体の例は、Gerlitzら(米国特許第5,453,373号)及びFosterら(米国特許第5,516,650号)に記載されている。これらの特許の全内容は本明細書の一部を構成する。組換え活性化プロテインＣは、組換えヒトプロテインＣ酵素前駆体をイン・ヴィトロで活性化することにより、または、プロテインＣの活性化形体を直接分泌させることにより製造することができる。プロテインＣは、例えば、ヒト腎臓２９３細胞からの分泌を含む細胞、真核細胞、トランスジェニック動物、またはトランスジェニック植物中での酵素前駆体としての産生に続いて、当業者に公知の技術により精製及び活性化することができる。
【００４１】
処置・・・・病気、症状または疾患と闘うことを目的とした患者の治療及び介護を表し、病気、症状または疾患の徴候または合併症の始まりを防ぐために予防的にａＰＣを投与すること、病気、症状または疾患を排除するためにａＰＣを投与することを含む。
【００４２】
連続点滴・・・・特定の期間にわたって静脈に、実質的に中断されることなく溶液の注入を続けること。
【００４３】
ボーラス注射・・・・規定された量の薬(ボーラスと呼ばれる)の最大約120分の期間にわたる注射。
【００４４】
投与に適する・・・・治療用薬剤として与えるのに適した凍結乾燥された製剤または溶液。
【００４５】
容器・・・・指定の材料、即ちａＰＣを受けるのに用いられるバイアルまたはボトル等の容器。
【００４６】
単位用量形・・・・ヒトを対象とした単位用量に適する物理的に分離された単位で、各単位は、所望の治療効果を生じるよう計算された、予め決定された量の活性材料を、適当な医薬的賦形剤と共に含む。
【００４７】
凝固亢進状態・・・・拡散性血管内凝固、前血栓症症状、凝固の活性化、またはａＰＣ等の凝固因子の先天的または後天的欠損に関連した過剰の凝固性。
【００４８】
酵素前駆体・・・・本明細書中において使用される、プロテインＣ酵素前駆体は、分泌された、不活性形体の、一本鎖または二本鎖のプロテインＣを意味する。
【００４９】
子供・・・・新生児、幼児、及び18歳以下の子供を含むが、それに限られないヒト患者。
【００５０】
有効量・・・・医薬的化合物の治療的有効量。
【００５１】
電撃性紫斑病・・・・細菌性敗血症、ウイルス性、細菌性または原生動物性感染に関連した斑状出血皮膚障害、熱、低血圧。通常、拡散性血管内凝固が存在する。
【００５２】
本発明は、敗血症、移殖、火傷、妊娠、生命の危険を伴う手術、外傷、若しくは、ＡＲＤＳに関連した凝固亢進状態または後天性プロテインＣ欠乏症を活性化プロテインＣを用いて処置する方法に関する。ａＰＣは、真核セルライン、トランスジェニック動物、またはトランスジェニック植物を用いて、当分野における周知の技術により作成し得る。これらに限定されるわけではないが、ＨＥＰＧ-２、ＬＬＣ-ＭＫ2、ＣＨＯ-Ｋ１、２９３、またはＡＶ１２細胞等、Grinnellにより米国特許第5,681,932号(該特許は本明細書の一部を構成する)に記載される例が、適当な宿主真核セルラインに含まれることが当業者には理解される。さらに、トランスジェニックな組換えタンパク質の産生は、Drohanら(米国特許第5,589,604号)及びArchibaldら(米国特許第5,650,503号)に記載される。これらの特許は本明細書の一部を構成する。
【００５３】
本発明の方法において完全に活性で作用可能であるためには、これらの方法の何れかにより産生されるａＰＣは、9個のγ-カルボキシ-グルタミン酸の付加(γ-カルボキシ化、即ちＧｌａ含量)、1個のエリスロ-β-ヒドロキシ-Ａｓｐの付加(β-ヒドロキシル化)、4個のＡｓｎ-結合オリゴ糖類の付加(グリコシル化)、リーダー配列(42アミノ酸残基)の除去、及び、ジペプチドＬｙｓ156-Ａｒｇ157の除去等の翻訳後修飾を受けなければならない。このような翻訳後修飾がないと、ａＰＣは完全には機能しないか、または、全く機能しない。
【００５４】
医薬的に有用な組成物を製造するためにａＰＣは、公知の方法に従って製剤し得る。ａＰＣは、血流中に有効な形体で運び込まれるように、約24〜約144時間にわたる連続点滴として、適当な用量を注入することにより、非経口的に投与されるであろう。投与されるａＰＣ量は、約20μｇ/ｋｇ/時間〜約50μｇ/ｋｇ/時間であろう。より好ましくは、投与されるａＰＣ量は約22μｇ/ｋｇ/時間〜約40μｇ/ｋｇ/時間であろう。最も好ましいａＰＣの投与量は、約24μｇ/ｋｇ/時間〜約30μｇ/ｋｇ/時間であろう。
【００５５】
他の選択肢として、時間毎の適当な用量の一部(1/3〜1/2)を、ボーラス注射として約5分〜約120分かけて注射し、続いて適当な用量を約23時間〜約144時間かけて連続点滴することにより、結果として適当な用量を24〜144時間かけて投与することによりａＰＣは投与される得る。
【００５６】
注意深く調整された臨床試験及び徹底的な実験的研究後に初めて、出願人は約24時間〜約144時間にわたって連続点滴された約20μｇ/ｋｇ/時間〜約50μｇ/ｋｇ/時間の用量レベルが効果的な治療に帰着することを見出した。後天性凝固亢進状態または後天性プロテインＣ欠乏症のヒト患者を処置するのに投与する最も好ましいａＰＣの用量レベルは、本明細書において記載されるように24μｇ/ｋｇ/時間である。
【００５７】
製造例１
ヒトプロテインＣの製造
組換えヒトプロテインＣ(ｒ-ｈＰＣ)をヒト腎臓２９３細胞中で、例えばYanにより米国特許第4,981,952号に述べられるような当業者に周知の技術によって製造した。該特許文献の全内容は本明細書の一部を構成する。ヒトプロテインＣをコードする遺伝子は、Bangらの米国特許第4,775,624号に開示され、クレームされている。該特許文献の全内容は本明細書の一部を構成する。ヒトプロテインＣを２９３細胞において発現するのに用いたプラスミドは、Bangらの米国特許第4,992,373号に開示されているプラスミドｐＬＰＣである。該特許文献の全内容は本明細書の一部を構成する。プラスミドｐＬＰＣの構築はまた欧州特許公開第0445939号、及び、Grinnellら(1987年)Bio/Technology、第5巻、第1189〜1192頁にも記載され、これらの全内容も本明細書の一部を構成する。簡単に言うと、該プラスミドを２９３細胞にトランスフェクトし、その後、安定な形質転換体を同定し、無血清培地において二次培養及び生育させた。培養後、細胞を含有しない培地をミクロフィルター濾過により得た。
【００５８】
ヒトプロテインＣは、Yan(米国特許第4,981,952号、その全内容は本明細書の一部を構成する)の技術を適用することにより培養液より分離した。清澄化した培地は、ＥＤＴＡ中で4ｍＭとした後、陰イオン交換樹脂(Fast-FlowQ,Pharmacia)に吸着させた。4カラム容量の20ｍＭ Ｔｒｉｓ、200ｍＭ ＮａＣｌ(ｐＨ7.4)、及び、2カラム容量の20ｍＭ Ｔｒｉｓ、150ｍＭ ＮａＣｌ(ｐＨ7.4)で洗浄した後、結合した組換えヒトプロテインＣ酵素前駆体を20ｍＭ Ｔｒｉｓ、150ｍＭ ＮａＣｌ、10ｍＭ ＣａＣｌ2(ｐＨ7.4)で溶出した。溶出されたタンパク質の、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による溶出後の純度は95％より大きかった。
【００５９】
さらなるタンパク質の精製は、タンパク質をＮａＣｌ中に3Ｍにした後、20ｍＭ Ｔｒｉｓ、3Ｍ ＮａＣｌ、10ｍＭ ＣａＣｌ2(ｐＨ7.4)で平衡化した疎水性相互作用樹脂(Toyopearlフェニル650Ｍ,TosoHaas)に吸着させることにより達成された。2カラム容量のＣａＣｌ2を含まない平衡化バッファーで洗浄した後、組換えヒトプロテインＣを20ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ7.4)で溶出した。
【００６０】
溶出したタンパク質から残存カルシウムを除くことにより活性化に備えた。組換えヒトプロテインＣを、カルシウムを除くため金属アフィニティーカラム(Chelex-100,Bio-Rad)に通し、再び陰イオン交換体(Fast FlowQ,Pharmacia)に吸着させた。これら両方のカラムは連続して配置され、20ｍＭ Ｔｒｉｓ、150ｍＭ ＮａＣｌ、5ｍＭ ＥＤＴＡ(ｐＨ6.5)で平衡化した。タンパク質を載せた後、Chelex−100カラムを系から外す前に、1カラム容量の同じバッファーで洗浄した。陰イオン交換カラムを3カラム容量の平衡バッファーで洗浄した後、0.4Ｍ ＮａＣｌ、20ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸(ｐＨ6.5)で溶出した。組換えヒトプロテインＣ及び組換え活性化プロテインＣ溶液のタンパク質濃度をＵＶ280ｎｍ吸光度Ｅ0.1%＝各々1.85または1.95で測定した。
【００６１】
製造例２
組換えヒトプロテインＣの活性化
ウシトロンビンを、50ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ7.5)の存在下、4℃で活性化ＣＨ-セファロース４Ｂ(Pharmacia)に結合した。結合反応は、前もってカラムに詰められた樹脂に対して、およそ5000ユニットトロンビン/ｍＬ樹脂を使用して行った。トロンビン溶液をおよそ3時間カラムに循環させた後、ＭＥＡを0.6ｍｌ/ｌの濃度で循環溶液に添加した。樹脂上の未反応アミンの完全なブロックを保証するため、ＭＥＡ含有溶液をさらに10〜12時間循環させた。ブロックに続いて、トロンビン結合樹脂を10カラム容量の1Ｍ ＮａＣｌ、20ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ6.5)で、全ての非特異的結合タンパク質を除くため洗浄し、活性化バッファーで平衡化した後、活性化反応において使用した。
【００６２】
精製ｒ-ｈＰＣをＥＤＴＡ中に5ｍＭとし(残存するカルシウムを全てキレート化するため)、20ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ7.4)または20ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸(ｐＨ6.5)で2ｍｇ/ｍｌの濃度に希釈した。この材料を、37℃で50ｍＭ ＮａＣｌ、及び、20ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ7.4)または20ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸(ｐＨ6.5)の一方で平衡化したトロンビンカラムに通した。流速は、ｒ-ｈＰＣとトロンビン樹脂の間の接触時間がおよそ20分となるように設定した。流出物を集め、即座にアミド分解性について分析した。もし材料が、確立された標準ａＰＣに匹敵する特異的活性(アミド分解性)を有していなければ、完全にｒ-ｈＰＣを活性化するため、それを再度トロンビンカラムに循環させた。これに続いて、次の製造工程に進むまでの間、ａＰＣをより低い濃度に保つため上述のように7.4〜6.0の間のいずれかの値のｐＨを有する(自己消化を防ぐため、低いｐＨの方が好ましい)20ｍＭバッファーによる材料の1：1溶出を行った。
【００６３】
浸出したトロンビンをａＰＣ材料から除くことは、ａＰＣを150ｍＭ ＮａＣｌを含む活性化バッファー(20ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ7.4)または好ましくは20ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸(ｐＨ6.5)のどちらか一方)で平衡化した陰イオン交換樹脂(Fast-FlowQ,Pharmacia)に結合することにより達成した。トロンビンはカラムを通過し、2〜6カラム容量の20ｍＭ平衡化バッファーよりなる洗浄の間に溶出する。結合したａＰＣは、5ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸(ｐＨ6.5)または20ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ7.4)のどちらか中における、0.4Ｍ ＮａＣｌを用いたステップ勾配で溶出される。より多い容量によるカラムの洗浄によって、より完全なドデカペプチドの除去が促進された。このカラムより溶出された材料を凍結溶液(−20℃)または凍結乾燥粉末のどちらかにより保存した。
【００６４】
ａＰＣのアミド分解性活性(ＡＵ)は、Beckman DU-7400ダイオードアレイ分光光度計を用いた、Kabi Vitrumより購入した合成基質Ｈ-Ｄ-Ｐｈｅ-Ｐｉｐ-Ａｒｇ-ｐ-ニトロアニリド(Ｓ-２２３８)からのｐ-ニトロアニリンの解離により測定した。1ユニットの活性化プロテインＣは、ｐ-ニトロアニリンの405ｎｍにおける吸光係数として9620Ｍ-1ｃｍ-1を用いて、25℃、ｐＨ7.4において1分間で1μｍｏｌのｐ-ニトロアニリンを解離するのに必要とされる酵素量として定義した。
【００６５】
活性化プロテインＣの抗凝固活性は、活性化部分トロンボプラスチン時間(ＡＰＴＴ)凝固分析における凝固時間の延長を測定することにより決定した。プロテインＣ濃度が125〜1000ｎｇ/ｍｌの範囲の希釈溶液(1ｍｇ/ｍｌ放射免疫検定グレードＢＳＡ、20ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ7.4、150ｍＭ ＮａＣｌ、0.02％ＮａＮ3)で標準曲線を作成し、試料をこの濃度範囲のいくつかの希釈度で用意した。各試料を含むキュベットに、50μｌの冷ウマ血清及び50μｌの再構成活性化部分トロンボプラスチン時間試薬(ＡＰＴＴ試薬、Sigma)を添加し、37℃で5分間インキュベートした。インキュベーション後、50μｌの適当な試料またはスタンダートを各キュベットに添加した。基礎凝固時間を決定するため、試料またはスタンダートに代えて希釈バッファーを使用した。fibrometer(CoA Screener Hemostasis Analyzer,American Labor)のタイマーは、各試料またはスタンダートに37℃で、50μｌの30ｍＭ ＣａＣｌ2を添加すると同時にスタートさせた。試料中の活性化プロテインＣ濃度は、標準曲線の線形回帰方程式(linear regression equation)より計算した。ここで報告される凝固時間は、標準曲線の試料も含めて、最低3回の実験の平均である。
【００６６】
上記の記述は、当業者にａＰＣの製造、並びに、これらに限定されるわけではないが、敗血症、移殖、火傷、妊娠、生命の危険を伴う手術/外傷、及び、ＡＲＤＳに関連する凝固亢進状態または後天性プロテインＣ欠乏症における使用を可能にするものである。
【００６７】
実施例１
ａＰＣのヒト血漿レベル
6人のヒト患者に、24時間以上の期間にわたって1ｍｇ/ｍ2/時間または約0.024ｍｇ/ｋｇ/時間でａＰＣの静脈内点滴を与えた。投与されたａＰＣは、10ｍｇ ａＰＣ、5ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸バッファー及び100ｍＭ塩化ナトリウムを含む、2ｍｌの水で再構成されｐＨ6.5に調整された凍結乾燥製剤であった。
【００６８】
ａＰＣの血清濃度は免疫捕捉-アミド分解分析を用いて測定した。クエン酸抗凝固物質、及び、ａＰＣの可逆的阻害剤であるベンズアミジンの存在下で血液を集めた。酵素は血漿から、マイクロタイタープレートに固定したａＰＣの特異的マウスモノクローナル抗体Ｃ３により捕捉した。洗浄により阻害剤を除去し、アミド分解活性またはａＰＣは、オリゴペプチド色原体基質を用いて測定した。37℃で16〜20時間インキュベーションした後、405ｎｍにおける吸光度を測定し、加重線状曲線-適合アルゴリズム(Weighted linear curve-fitting algorithm)によりデータを分析した。ａＰＣの濃度は、0〜100ｎｇ/ｍｌの濃度範囲の標準曲線から推定した。分析の定量限界は1.0ｎｇ/ｍｌであった。ａＰＣの用量レベル及び血漿濃度は約24時間の時点で測定した。0.024ｍｇ/ｋｇ/時間の用量は24時間で約50ｎｇ/ｍｌの血漿濃度を与える。
【００６９】
実施例２
敗血症ヒト患者における2重盲プラシーボコントロール試験、第1期
このプロトコルは、2期にわたる、重度の敗血症ヒト患者における2重盲プラシーボコントロール試験である。第1期では、総数72人の患者に48時間にわたって組換えヒト活性化プロテインＣ(ｒ-ａＰＣ)を点滴した。
【００７０】
参加基準は、一般に受け入れられている敗血症の基準(心拍数、呼吸運動、体温の上昇/降下、白血球数の増加/減少)のうち3つを含むことであった。患者はまた、冠血栓、尿素排出の減少または低酸素血症のどれかとして定義される臓器不全を示していることが求められた。4つの異なる用量を使用した；12、18、24、30μｇ/ｋｇ/時間。ｒ-ａＰＣを48時間かけて連続点滴法により点滴した。この試験の第1の終了点は；用量及び用量の継続時間の関数としての安全性、及び、用量及び用量の継続時間の関数としての凝固障害を正すｒ-ａＰＣの能力を示すことであった。
【００７１】
死亡率情報には、全ての用量が、他に特に指定がない限り含まれる。我々の示したプラシーボ死亡率が予想されるプラシーボ死亡率と一致していることは重要である。全てにおいて死亡率が求めれた28日目が、プラシーボを与えられた患者対ｒ-ａＰＣを与えられた患者における終了点であった。
【００７２】
全体で観察されたプラシーボ死亡率は38％(10/26)であり、全体で観察されたｒ-ａＰＣ死亡率は20％(9/46)であった。ｒ-ａＰＣの用量が多い方からの2つのみ(24及び30μｇ/ｋｇ/時間)を含むサブグループ対プラシーボ患者では、観察された死亡率は13％(3/24)であった。
【００７３】
第2のサブグループ分析には、60％よりも低い基準プロテインＣ活性として定義される後天性プロテインＣ欠乏症の患者を含んでいた。基準プロテインＣ活性のデータが入手可能であった64患者のうち61患者、すなわち95％は、試験段階に入る時点で後天性プロテインＣ欠乏症を患っていた。プロテインＣ欠乏症患者におけるプラシーボで観察される死亡率は41％(9/22)であり、プロテインＣ欠乏症患者におけるｒ-ａＰＣで観察される死亡率は18％(7/39)であった。
【００７４】
ｒ-ａＰＣの低用量の治療が重度の敗血症患者で有利であることを示唆する明瞭なデータとしては、プラシーボ患者と処置患者が死亡する平均時間がある。プラシーボグループで死亡した10人の患者における死亡した平均時間は6日間であった。ｒ-ａＰＣ処置患者では、死亡した平均時間は14日間であった。さらに、ｒ-ａＰＣ闘病処置で死亡した9人の患者のうち4人は21日、あるいはそれよりも長く生き残り、その後、最初の敗血症の症状とは無関係な症状で死亡した。遅れて死亡した4人のうちの2人は、低用量のグループ(12μｇ/ｋｇ/時間)で起こった。これら両方の患者はＩＣＵに残り、死亡するまでの全試験の間(27日間)、機械的肺換気を行っていた。遅れて死亡した他の2人は、高用量のグループ(30μｇ/ｋｇ/時間)に属した。これら両方の患者は最初改善が見られた。2週間内に、両方が機械的肺換気を外されＩＣＵから移された。1人は1週間後、敗血症により誘導された呼吸障害により、受け入れられた「蘇生術を希望せず(ＤＮＲ)」との希望を表明した後、亡くなった。第2の患者は、敗血症の第2の症状に関連した肺不全の症状を患って28日後に亡くなった。この患者もまたＤＮＲを希望しており、そのため再挿管しなかった。重度の敗血症の第2の症状を示した患者を再度ｒ-ａＰＣで処置することは28日間の試験中、治療プロトコル下では認められていなかったことに留意すべきである。
【００７５】
この試験における死亡に関する情報は驚くべきもので、そして予想されないものであった。28日間にわたる全死亡率のこのような顕著な減少のデータを示した2重盲プラシーボコントロール敗血症試験は他にない。
【００７６】
実施例３
活性化プロテインＣ製剤
活性化プロテインＣの安定な凍結乾燥製剤を、約2.5ｍｇ/ｍＬ活性化プロテインＣ、約15ｍｇ/ｍＬショ糖、約20ｍｇ/ｍＬ ＮａＣｌ及び5.5より大きく、6.5より小さいｐＨのクエン酸ナトリウムバッファーを含む溶液を凍結乾燥することを含む工程により製造した。さらに、活性化プロテインＣの安定な凍結乾燥製剤は、約５ｍｇ/ｍＬ活性化プロテインＣ、約30ｍｇ/ｍＬショ糖、約38ｍｇ/ｍＬ ＮａＣｌ、及び5.5より大きく、6.5より小さいｐＨのクエン酸バッファーを含む溶液を凍結乾燥することを含む。
【００７７】
凍結乾燥工程に適する製剤において、ａＰＣ:塩:増量剤(重量：重量：重量)の比率は重要な因子である。比率はａＰＣの濃度、塩の選択及び濃度、並びに、増量剤の選択及び濃度に依存して異なる。特に、約1部の活性化プロテインＣに対して、約7.6部の塩、約6部の増量剤の比率が好ましい。
【００７８】
連続点滴による投与に適する活性化プロテインＣの単位用量製剤を、活性化プロテインＣ、ＮａＣｌ、ショ糖、及びクエン酸ナトリウムバッファーを混合することにより製造した。混合後、4ｍＬの溶液を単位用量容器に移し、凍結乾燥した。それを必要とする患者に約0.02ｍｇ/ｋｇ/時間〜約0.05ｍｇ/ｋｇ/時間の用量で投与するのに適した約5ｍｇ〜約20ｍｇの活性化プロテインＣを含む、この単位用量容器に封をし、使用まで貯蔵した。