(57)【要約】      （修正有）【課題】新規第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）または第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドコンジュゲートを提供する。また、それらの製剤および治療、特に各種凝固関連障害の治療方法を提供する。【解決手段】  これら新規ポリペプチドコンジュゲートは、ポリペプチドに共有結合した少なくとも１つの非ポリペプチド部分を含み、この場合前記ポリペプチドのアミノ酸配列は野生型ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａのアミノ酸配列と、前記非ポリペプチド部分に関する結合基を含む少なくとも１アミノ酸残基が導入され、あるいは除去される点で異なっている。コンジュゲートは市販されているｒＦＶＩＩａと比較し、長い機能的インビボ半減期および／または長い血漿半減期、および／または高い生物利用度および／または低い蛋白質分解感受性を含む１またはそれ以上の改善された特性を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドに共有結合した少なくとも１つの非ポリペプチド部分を含んでなるコンジュゲートであって、該ポリペプチドのアミノ酸配列が、前記非ポリペプチド部分のための結合基を含む少なくとも１つのアミノ酸残基を導入または除去されている点で、配列番号１中に示される野生型ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａのアミノ酸配列と異なるコンジュゲート。
【請求項２】
該結合基が、リジン、システイン、アスパラギン酸およびグルタミン酸より成るグループから選択される、請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項３】
該結合基がリジンである、請求項２記載のコンジュゲート。
【請求項４】
該ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも１つのリジン残基を除去されている点で配列番号１の配列と異なる、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項５】
リジン残基が置換により除去されている、請求項４記載のコンジュゲート。
【請求項６】
除去されたリジン残基が、Ｋ１８、Ｋ３２、Ｋ３８、Ｋ６２、Ｋ８５、Ｋ１０９、Ｋ１３７、Ｋ１４３、Ｋ１４８、Ｋ１５７、Ｋ１６１、Ｋ１９７、Ｋ１９９、Ｋ３１６、Ｋ３３７、Ｋ３４１、Ｋ３８９およびそれらの組み合わせより成るグループから選択される、請求項４または５記載のコンジュゲート。
【請求項７】
リジン残基が、Ｋ１８、Ｋ６２、Ｋ８５、Ｋ１９７、Ｋ３４１およびそれらの組み合わせより成るグループから選択される、請求項６記載のコンジュゲート。
【請求項８】
リジン残基がＲ、Ｑ、ＮおよびＨより成るグループから選択されるアミノ酸残基で置換されている、請求項５−７の何れかに記載のコンジュゲート。
【請求項９】
リジン残基がＲで置換されている、請求項８記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも１つのリジン残基が導入されている点で配列番号１と異なる、請求項３−９の何れかに記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
リジン残基が置換により導入されている、請求項１０記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
置換がＩ４２Ｋ、Ｙ４４Ｋ、Ｌ２８８Ｋ、Ｄ２８９Ｋ、Ｒ２９０Ｋ、Ｇ２９１Ｋ、Ａ２９２Ｋ、Ｔ２９３Ｋ、Ｑ３１３Ｋ、Ｓ３１４Ｋ、Ｒ３１５Ｋ、Ｖ３１７Ｋ、Ｌ３９０Ｋ、Ｍ３９１Ｋ、Ｒ３９２Ｋ、Ｓ３９３Ｋ、Ｅ３９４Ｋ、Ｐ３９５Ｋ、Ｒ３９６Ｋ、Ｐ３９７Ｋ、Ｇ３９８Ｋ、Ｖ３９９Ｋ、Ｌ４００Ｋ、Ｌ４０１Ｋ、Ｒ４０２Ｋ、Ａ４０３Ｋ、Ｐ４０４Ｋ、Ｆ４０５Ｋおよびその組み合わせより成るグループから選択される、請求項１１記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
置換がＲ２９０Ｋ、Ｒ３１５Ｋ、Ｒ３９２Ｋ、Ｒ３９６Ｋ、Ｒ４０２Ｋおよびその組み合わせより成るグループから選択される、請求項１２記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
少なくとも１つのリジン残基が除去され、そして少なくとも１つのリジン残基が導入されている、請求項３−１３のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
結合基がシステインである、請求項２記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
システイン残基が置換により導入された、請求項１５記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
置換がＩ３０Ｃ、Ｋ３２Ｃ、Ｄ３３Ｃ、Ａ３４Ｃ、Ｔ３７Ｃ、Ｋ３８Ｃ、Ｗ４１Ｃ、Ｙ４４Ｃ、Ｓ４５Ｃ、Ｄ４６Ｃ、Ｌ１４１Ｃ、Ｅ１４２Ｃ、Ｋ１４３Ｃ、Ｒ１４４Ｃ、Ｌ２８８Ｃ、Ｄ２８９Ｃ、Ｒ２９０Ｃ、Ｇ２９１Ｃ、Ａ２９２Ｃ、Ｓ３１４Ｃ、Ｒ３１５Ｃ、Ｋ３１６Ｃ、Ｖ３１７Ｃ、Ｌ３９０Ｃ、Ｍ３９１Ｃ、Ｒ３９２Ｃ、Ｓ３９３Ｃ、Ｅ３９４Ｃ、Ｐ３９５Ｃ、Ｒ３９６Ｃ、Ｐ３９７Ｃ、Ｇ３９８Ｃ、Ｖ３９９Ｃ、Ｌ４０１Ｃ、Ｒ４０２Ｃ、Ａ４０３Ｃ、Ｐ４０４Ｃおよびその組み合わせより成るグループから選択される、請求項１６記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
置換がＫ３２Ｃ、Ｙ４４Ｃ、Ｋ１４３Ｃ、Ｒ２９０Ｃ、Ｒ３１５Ｃ、Ｋ３４１Ｃ、Ｒ３９２Ｃ、Ｒ３９６Ｃ、Ｒ４０２Ｃおよびその組み合わせより選択される、請求項１７記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
結合基がアスパラギン酸および／またはグルタミン酸である、請求項２記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも１つのアスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基が導入されている点で配列番号１と異なっている、請求項１９記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
アスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基が置換により導入された、請求項２０記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
置換がＩ３０Ｄ／Ｅ、Ｋ３２Ｄ／Ｅ、Ａ３４Ｄ／Ｅ、Ｔ３７Ｄ／Ｅ、Ｋ３８Ｄ／Ｅ、Ｗ４１Ｄ／Ｅ、Ｙ４４Ｄ／Ｅ、Ｓ４５Ｄ／Ｅ、Ｄ４６Ｃ、Ｌ１４１Ｄ／Ｅ、Ｅ１４２Ｄ／Ｅ、Ｋ１４３Ｄ／Ｅ、Ｒ１４４Ｄ／Ｅ、Ｌ２８８Ｄ／Ｅ、Ｒ２９０Ｄ／Ｅ、Ｇ２９１Ｄ／Ｅ、Ａ２９２Ｄ／Ｅ、Ｑ３１３Ｄ／Ｅ、Ｓ３１４Ｄ／Ｅ、Ｒ３１５Ｄ／Ｅ、Ｋ３１６Ｄ／ＥＶ３１７Ｄ／Ｅ、Ｌ３９０Ｄ／Ｅ、Ｍ３９１Ｄ／Ｅ、Ｒ３９２Ｄ／Ｅ、Ｓ３９３Ｄ／Ｅ、Ｐ３９５Ｄ／Ｅ、Ｒ３９６Ｄ／Ｅ、Ｅ３９７Ｄ／Ｅ、Ｇ３９８Ｄ／Ｅ、Ｖ３９９Ｄ／Ｅ、Ｌ４０１Ｄ／Ｅ、Ｒ４０２Ｄ／Ｅ、Ａ４０２Ｄ／Ｅ、Ａ４０３Ｄ／Ｅ、Ｐ４０４Ｄ／Ｅおよびその組み合わせより成るグループから選択される、請求項２１記載のコンジュゲート。
【請求項２３】
置換がＫ３２Ｄ／Ｅ、Ｙ４４Ｄ／Ｅ、Ｋ１４３Ｄ／Ｅ、Ｒ２９０Ｄ／Ｅ、Ｒ３１５Ｄ／Ｅ、Ｋ３４１Ｄ／Ｅ、Ｒ３９２Ｄ／Ｅ、Ｒ３９６Ｄ／Ｅ、Ｒ４０２Ｄ／Ｅおよびその組み合わせより成るグループから選択される、請求項２２記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも１つのアスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基が除去されている点で配列番号１と異なっている、請求項１９記載のコンジュゲート。
【請求項２５】
アスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基が置換により除去された、請求項２４記載のコンジュゲート。
【請求項２６】
置換がＤ３３、Ｄ４６、Ｄ４８、Ｅ７７、Ｅ８２、Ｄ８６、Ｄ８７、Ｅ９４、Ｅ９９、Ｄ１０４、Ｅ１１６、Ｄ１２３、Ｅ１３２、Ｅ１４２、Ｅ１６３、Ｄ１９６、Ｅ２１０、Ｄ２１２、Ｅ２１５、Ｄ２１７、Ｄ２１９、Ｅ２２０、Ｄ２５６、Ｅ２６５、Ｅ２７０、Ｄ２８９、Ｅ２９６、Ｄ３０９、Ｄ３１９、Ｅ３２５、Ｄ３３４、Ｄ３３８、Ｄ３４３、Ｅ３８５、Ｅ３９４およびその組み合わせより成るグループから選択される、請求項２５記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
少なくとも１つのアスパラギン酸および／またはグルタミン酸残基が導入され、そして少なくとも１つのアスパラギン酸および／またはグルタミン酸残基が除去された、請求項１９−２６の何れかに記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
非ポリペプチド部分がポリマー分子である、前記請求項の何れかに記載のコンジュゲート。
【請求項２９】
ポリマー分子が天然型または合成ホモポリマーおよびヘテロポリマーから成るグループより選択される、請求項２８記載のコンジュゲート。
【請求項３０】
ポリマー分子が、直鎖型または分岐型ポリエチレングリコール、ポリビニールアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸およびポリ（ビニルピロリドン）から成るグループより選択されるホモポリマーまたはヘテロポリマーである、請求項２９記載のコンジュゲート。
【請求項３１】
ポリマーが直鎖型または分岐型ポリエチレングリコールである、請求項３０記載のコンジュゲート。
【請求項３２】
ポリエチレングリコールが分子量約３００ないし１００，０００Ｄａである、請求項３１記載のコンジュゲート。
【請求項３３】
ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列と１−１５アミノ残基異なっている、前記請求項何れかに記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
前記非ポリペプチド部分が糖成分であり、そして前記結合基が糖成分に関する結合基である、  請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項３５】
前記結合基がグルコシル化部位である、請求項３４記載のコンジュゲート。
【請求項３６】
少なくとも１つの非天然に生ずるグリコシル化部位が導入された、請求項３５記載のコンジュゲート。
【請求項３７】
少なくとも１つの天然に生ずるグリコシル化部位が除去された、請求項３５記載のコンジュゲート。
【請求項３８】
少なくとも１つの非天然に生ずるグリコシル化部位が導入され、そして少なくとも１つの天然に生ずるグリコシル化部位が除去された、請求項３６−３７の何れかに記載のコンジュゲート。
【請求項３９】
導入されたグリコシル化部位がインビボグリコシル化部位である、請求項３６記載のコンジュゲート。
【請求項４０】
グリコシル化部位がインビボＯ−グリコシル化部位である、請求項３９記載のコンジュゲート。
【請求項４１】
グリコシル化部位がインビボＮ−グリコシル化部位である、請求項３９記載のコンジュゲート。
【請求項４２】
ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも１つの天然に生ずるＮ−Ｘ‘−Ｘ配列がＮ−Ｘ’−ＳまたはＮ−Ｘ‘−Ｔ配列である点で配列番号１と異なっており、前記Ｘ’がＰ以外のいずれかのアミノ酸であり、そしてＸがＳおよびＴ以外のいずれかのアミノ酸である、請求項４１記載のコンジュゲート。
【請求項４３】
ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも１つの天然に生ずるＸ−Ｘ‘−Ｓまたは配列番号１に天然に存在するＸ−Ｘ’−Ｔ配列配列がＮ−Ｘ’−ＳまたはＮ−Ｘ‘−Ｔ配列で弛緩されており、前記Ｘ’がＰ以外のいずれかのアミノ酸であり、そしてＸがＮ以外のいずれかのアミノ酸である、請求項４１記載のコンジュゲート。
【請求項４４】
該置換が、Ｆ４Ｓ／Ｔ、Ｐ１０Ｎ、Ｑ２１Ｎ、Ｗ４１Ｎ、Ｓ４３Ｎ、Ａ５１Ｎ、Ｇ５８Ｎ、Ｌ６５Ｎ、Ｇ５９Ｓ／Ｔ、Ｅ８２Ｓ／Ｔ、Ｎ９５Ｓ／Ｔ、Ｇ９７Ｓ／Ｔ、Ｙ１０１Ｎ、Ｄ１０４Ｎ、Ｔ１０６Ｎ、Ｋ１０９Ｎ、Ｇ１１７Ｎ、Ｇ１２４Ｎ、Ｓ１２６Ｎ、Ｔ１２８Ｎ、Ａ１７５Ｓ／Ｔ、Ｇ１７９Ｎ、Ｉ１８６Ｓ／Ｔ、Ｖ１８８Ｎ、Ｒ２０２Ｓ／Ｔ、Ｉ２０５Ｓ／Ｔ、Ｄ２１２Ｎ、Ｅ２２０Ｎ、Ｉ２３０Ｎ、Ｐ２３１Ｎ、Ｐ２３６Ｎ、Ｇ２３７Ｎ、Ｖ２５３Ｎ、Ｅ２６５Ｎ、Ｔ２６７Ｎ、Ｅ２７０Ｎ、Ｒ２７７Ｎ、Ｌ２８０Ｎ、Ｇ２９１Ｎ、Ｐ３０３Ｓ／Ｔ、Ｌ３０５Ｎ、Ｑ３１２Ｎ、Ｇ３１８Ｎ、Ｇ３３１Ｎ、Ｄ３３４Ｎ、Ｋ３３７Ｎ、Ｇ３４２Ｎ、Ｈ３４８Ｎ、Ｒ３５３Ｎ、Ｙ３５７Ｎ、Ｉ３６１Ｎ、Ｖ３７６Ｎ、Ｒ３７９Ｎ、Ｍ３９１Ｎおよびそれらの組み合わせより成るグループから選択される、請求項４２または４３記載のコンジュゲート。
【請求項４５】
該置換が、Ｆ４Ｓ／Ｔ、Ｐ１０Ｎ、Ｑ２１Ｎ、Ｗ４１Ｎ、Ａ５１Ｎ、Ｇ５８Ｎ、Ｇ５９Ｓ／Ｔ、Ｎ９５Ｓ／Ｔ、Ｇ９７Ｓ／Ｔ、Ｙ１０１Ｎ、Ｄ１０４Ｎ、Ｔ１０６Ｎ、Ｋ１０９Ｎ、Ｇ１１７Ｎ、Ｇ１２４Ｎ、Ｓ１２６Ｎ、Ｔ１２８Ｎ、Ａ１７５Ｓ／Ｔ、Ｉ１８６Ｓ／Ｔ、Ｖ１８８Ｎ、Ｒ２０２Ｓ／Ｔ、Ｉ２０５Ｓ／Ｔ、Ｄ２１２Ｎ、Ｅ２２０Ｎ、Ｖ２５３Ｎ、Ｅ２６５Ｎ、Ｔ２６７Ｎ、Ｅ２７０Ｎ、Ｌ２８０Ｎ、Ｇ２９１Ｎ、Ｐ３０３Ｓ／Ｔ、Ｇ３１８Ｎ、Ｇ３３１Ｎ、Ｄ３３４Ｎ、Ｋ３３７Ｎ、Ｒ３５３Ｎ、Ｙ３５７Ｎ、Ｍ３９１Ｎおよびそれらの組み合わせより成るグループから選択される、請求項４４記載のコンジュゲート。
【請求項４６】
ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも１つの配列番号１に天然に存在するＫ−Ｘ‘−Ｘ配列またはＲ−Ｘ‘−Ｘ配列がＮ−Ｘ‘−ＳまたはＮ−Ｘ’−Ｔ配列により置換されている点で異なっており、前記Ｘ‘がＰ以外のアミノ酸であり、ＸがＳおよびＴ以外のアミノ酸である、請求項４１記載のコンジュゲート。
【請求項４７】
置換がＫ３２Ｎ＋Ａ３４Ｓ／Ｔ、Ｋ３８Ｎ＋Ｆ４０Ｓ／Ｔ、Ｋ６２Ｎ＋Ｑ６４Ｓ／Ｔ、Ｋ８５Ｎ＋Ｄ８７Ｓ／Ｔ、Ｋ１３７Ｎ＋Ｐ１３９Ｓ／Ｔ、Ｋ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｓ／Ｔ、Ｋ１４８Ｎ＋Ｑ１４９Ｓ／Ｔ、Ｋ１６１Ｎ＋Ｅ１６３Ｓ／Ｔ、Ｋ１９７Ｎ＋Ｋ１９９Ｓ／Ｔ、Ｋ１９９Ｎ＋Ｗ２０１Ｓ／Ｔ、Ｋ３１６Ｎ＋Ｇ３１８Ｓ／Ｔ、Ｋ３３８Ｎ、Ｋ３４１Ｎ＋Ｄ３４３Ｓ／Ｔ、Ｋ３８９Ｎ＋Ｍ３９１Ｓ／Ｔおよびその組み合わせより成るグループから選択される、請求項４６記載のコンジュゲート。
【請求項４８】
非天然に生ずるインビボＮ−グリコシル化部位が、置換により２８−４８、１３９−１４７、２８６−２９４、３１１−３１９、３３８−３４５および３８８−４０６より成るグループから選択される位置に導入される、請求項４１記載のコンジュゲート。
【請求項４９】
置換がＫ３２Ｎ＋Ａ３４Ｓ／Ｔ、Ｆ３１Ｎ＋Ｄ３３Ｓ／Ｔ、Ｉ３０Ｎ＋Ｋ３２Ｓ／Ｔ、Ａ３４Ｎ＋Ｒ３６Ｓ／Ｔ、Ｋ３８Ｎ＋Ｆ４０Ｓ／Ｔ、Ｔ３７Ｎ＋Ｌ３９Ｓ／Ｔ、Ｒ３６Ｎ＋Ｋ３８Ｓ／Ｔ、Ｌ３９Ｎ＋Ｗ４１Ｓ／Ｔ、Ｆ４０Ｎ＋Ｉ４２Ｓ／Ｔ、Ｗ４１Ｎ、Ｉ４２Ｎ＋Ｙ４４Ｓ／Ｔ、Ｓ４３Ｎ、Ｙ４４Ｎ＋Ｄ４６Ｓ／Ｔ、Ｓ４５Ｎ＋Ｇ４７Ｓ／Ｔ、Ｄ４６Ｎ＋Ｄ４８Ｓ／Ｔ、Ｇ４７Ｎ＋Ｑ４９Ｓ／Ｔ、Ｋ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｓ／Ｔ、Ｅ１４２Ｎ＋Ｒ１４４Ｓ／Ｔ、Ｌ１４１Ｎ＋Ｋ１４３Ｓ／Ｔ、Ｉ１４０Ｎ＋Ｅ１４２Ｓ／Ｔ、Ｒ１４４Ｎ＋Ａ１４６Ｓ／Ｔ、Ａ１４６Ｎ＋Ｋ１４８Ｓ／Ｔ、Ｓ１４７Ｎ＋Ｐ１４９Ｓ／Ｔ、Ｒ２９０Ｎ＋Ａ２９２Ｓ／Ｔ、Ｄ２８９Ｎ＋Ｇ２９１Ｓ／Ｔ、Ｌ２８８Ｎ＋Ｒ２９０Ｓ／Ｔ、Ｌ２８７Ｎ＋Ｄ２８９Ｓ／Ｔ、Ｇ２９１Ｎ、Ａ２９２Ｎ＋Ａ２９４Ｓ／Ｔ、Ｔ２９３Ｎ＋Ｌ２９５Ｓ／Ｔ、Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｓ／Ｔ、Ｓ３１４Ｎ＋Ｋ３１６Ｓ／Ｔ、Ｑ３１３Ｎ＋Ｒ３１５Ｓ／Ｔ、Ｑ３１２Ｎ、Ｋ３１６Ｎ＋Ｇ３１８Ｓ／Ｔ、Ｖ３１７Ｎ＋Ｄ３１９Ｓ／Ｔ、Ｇ３１８Ｎ、Ｋ３４１Ｎ＋Ｄ３４３Ｓ／Ｔ、Ｓ３３９Ｎ＋Ｋ３４１Ｓ／Ｔ、Ｇ３４２Ｎ、Ｄ３４３Ｎ＋Ｇ３４５Ｓ／Ｔ、Ｒ３９２Ｎ＋Ｅ３９４Ｓ／Ｔ、Ｍ３９１Ｎ、Ｌ３９０Ｎ＋Ｒ３９２Ｓ／Ｔ、Ｋ３８９Ｎ＋Ｍ３９１Ｓ／Ｔ、Ｓ３９３Ｎ＋Ｐ３９５Ｓ／Ｔ、Ｅ３９４Ｎ＋Ｒ３９６Ｓ／Ｔ、Ｐ３９５Ｎ＋Ｐ３９７Ｓ／Ｔ、Ｒ３９６Ｎ＋Ｇ３９８Ｓ／Ｔ、Ｐ３９７Ｎ＋Ｖ３９９Ｓ／Ｔ、Ｇ３９８Ｎ＋Ｌ４００Ｓ／Ｔ、Ｖ３９９Ｎ＋Ｌ４０１Ｓ／Ｔ、Ｌ４００Ｎ＋Ｒ４０２Ｓ／Ｔ、Ｌ４０１Ｎ＋Ａ４０３Ｓ／Ｔ、Ｒ４０２Ｎ＋Ｐ４０４Ｓ／Ｔ、Ａ４０３Ｎ＋Ｆ４０５Ｓ／Ｔ、Ｐ４０４Ｎ＋Ｐ４０６Ｓ／Ｔ、Ｋ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｓ／Ｔ＋Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｓ／Ｔおよびその組み合せより成るグループから選択される、請求項４８記載のコンジュゲート。
【請求項５０】
置換がＫ３２Ｎ＋Ａ３４Ｓ／Ｔ、Ｋ３８Ｎ＋Ｆ４０Ｓ／Ｔ、Ｙ４４Ｎ＋Ｄ４６Ｓ／Ｔ、Ｋ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｓ／Ｔ、Ｒ２９０Ｎ＋Ａ２９２Ｓ／Ｔ、Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｓ／Ｔ、Ｋ３４１Ｎ＋Ｄ３４３Ｓ／Ｔ、Ｒ３９２Ｎ＋Ｅ３９４Ｓ／Ｔ、Ｒ３９６Ｎ＋Ｇ３９８Ｓ／Ｔ、Ｒ４０２Ｎ＋Ｐ４０４Ｓ／Ｔ、Ｋ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｓ／Ｔ＋Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｓ／Ｔおよびそれらの組み合せより成るグループから選択される、請求項４９記載のコンジュゲート。
【請求項５１】
置換がＫ３２Ｎ＋Ａ３４Ｔ、Ｋ３８Ｎ＋Ｆ４０Ｔ、Ｙ４４Ｎ＋Ｄ４６Ｔ、Ｋ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｔ、Ｒ２９０Ｎ＋Ａ２９２Ｔ、Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｔ、Ｋ３４１Ｎ＋Ｄ３４３Ｔ、Ｒ３９２Ｎ＋Ｅ３９４Ｔ、Ｒ３９６Ｎ＋Ｇ３９８Ｔ、Ｒ４０２Ｎ＋Ｐ４０４Ｔ、Ｋ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｔ＋Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｔおよびそれらの組み合わせから成るグループより選択される、請求項５０記載のコンジュゲート。
【請求項５２】
ポリペプチドが配列番号１に示すアミノ酸配列と１−１５アミノ酸残基異なっている、請求項３４−５１の何れかに記載のコンジュゲート。
【請求項５３】
１またはそれ以上のインビボグリコシル化部位が導入された、請求項３９−５１のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項５４】
さらにポリペプチドのアミノ酸残基に共有結合した少なくとも１の非ポリペプチド部分を含み、前記非ポリペプチド部分が糖成分とは異なる、請求項３４−５３のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項５５】
非ポリペプチド部分が請求項２９−３２の何れかに規定されているポリマー分子である、請求項５４のコンジュゲート。
【請求項５６】
コンジュゲートが少なくとも６７ｋＤａの分子量を有する、前記請求項の何れかに記載のコンジュゲート。
【請求項５７】
コンジュゲートが不活性化されている、前記請求の何れかに記載のコンジュゲート。
【請求項５８】
請求項１−５６の何れかに規定されているアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項５９】
請求項５８の該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項６０】
請求項５９の該ヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクター。
【請求項６１】
請求項５９によるヌクレオチド配列または請求項６０による発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項６２】
宿主細胞がインビボグリコシル化の能力を有するガンマカルボキシル化細胞である、請求項６１記載の宿主細胞。
【請求項６３】
ポリペプチドの発現を誘導する条件下に請求項６１または６２に規定される宿主細胞を培養すること、およびポリペプチドを回収することを含む請求項１−５７の何れかに規定されるコンジュゲートの製造方法にあって、ａ）前記ポリペプチドが少なくとも１つのＮ−またはＯ−グリコシル化部位を含み、そして前記宿主細胞がインビボグリコシル化することができる真核生物宿主細胞であり、および／またはｂ）ポリペプチドがインビトロで非ポリペプチド部分へのコンジュゲートを受ける製造方法。
【請求項６４】
請求項１−５７の何れかに規定されるコンジュゲートと、薬学的に許容しうるキャリアーまたは賦形剤とを含んでなる組成物。
【請求項６５】
医薬品として使用されるための、請求項１−５７のいずれかに規定されるコンジュゲート。
【請求項６６】
哺乳動物におけるＦＶＩＩａ／ＴＦ関連疾患または障害の治療を目的とした医薬品の製造のための、請求項１−５６の何れかに規定されたコンジュゲートの使用。
【請求項６７】
ＦＶＩＩａ／ＴＦ関連疾患または障害が、凝固形成の増加が望ましい疾患より成るグループから選択される、請求項６６記載の使用。
【請求項６８】
哺乳動物におけるＦＶＩＩａ／ＴＦ関連疾患または障害の治療を目的とした、薬剤の製造に関する、請求項５７に規定された不活性型コンジュゲートの使用。
【請求項６９】
ＦＶＩＩａ／ＴＦ−関連疾患または障害が、凝固形成の増加が望ましい疾患より成るグループから選択される、請求項６８記載の使用。
【請求項７０】
ＦＶＩＩａ／ＴＦ−関連疾患または障害を有する哺乳動物を治療する方法にあって、それを必要とする哺乳動物に請求項１−５６のいずれかに規定されるコンジュゲートを有効量投与することを含む方法。
【請求項７１】
疾患または障害が、凝固形成の増加が望ましい疾患より成るグループから選択される、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
ＦＶＩＩａ／ＴＦ−関連疾患または障害を有する哺乳動物を治療する方法にあって、それを必要とする哺乳動物に請求項５７に規定されるコンジュゲートを有効量投与することを含む方法。
【請求項７３】
疾患または障害が、凝固形成の増加が望ましい疾患より成るグループから選択される、請求項７２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）または第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドコンジュゲート、それらの調製、および治療における使用、特に各種の血液凝固関連疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固は結果としてフィブリン凝塊を生じせしめる各種血液成分（または因子）の複雑な相互作用から成るプロセスである。一般に、凝固”カスケード”とよばれるプロセスに関与する血液成分は、プロ酵素または酵素原（チモーゲン）、即ち活性化因子の作用によって活性型に変換される酵素的に不活性な蛋白質である。これら凝固因子の一つがＦＶＩＩである。
ＦＶＩＩは肝臓で合成され、そして血液中に分子量５３ｋＤａの単鎖型糖蛋白質として分泌されるビタミンＫ依存型血漿蛋白質である（ＢｒｏｚｅとＭａｊｅｒｕｓ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９８０；  ２２５：１２４２−１２４７）。ＦＶＩＩ酵素原は単一部位Ｒ１５２−Ｉ１５３が蛋白質分解的に開裂されることで活性型に変換され、単一のジスルフィド架橋結合により結合された２本鎖体となる。組織因子と複合体を形成したＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ複合体）は、第ＩＸ因子および第Ｘ因子の両方をそれぞれ活性型に変換することができ、それに続いて急速なトロンビン生成およびフィブリン形成をもたらす反応が起こる（ＯｓｔｅｒｕｄとＲａｐａｐｏｒｔ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９７７；５２６０−５２６４）。
【０００３】
ＦＶＩＩは分子のＮ末端域に１０カ所のγ−カルボキシグルタミン酸残基を生成するビタミンＫ依存型カルボキシル化を含む翻訳後修飾を受ける。即ち、配列番号１の残基番号６、７、１４、１６、１９、２０、２５、２６、２９および３５が、ＦＶＩＩの活性にとって重要なＧｌａドメイン内のγ−カルボキシグルタミン酸残基である。その他の翻訳後修飾としては、それぞれ位置１４５および３２２に天然に生ずる２カ所のＮ−グリコシル化部位およびそれぞれ位置５２および６０に天然に生ずる２カ所のＯ−グリコシル化部位への糖成分の結合が挙げられる。
ヒトＦＶＩＩ（ｈＦＶＩＩ）をコードする遺伝子は第１３染色体のｑ３４−ｑｔｅｒ９にマッピングされている（ｄｅ  Ｇｒｏｕｃｈｙら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １９８４；６６：２３０−２３３）。それは９個のエクソンを含み、１２．８Ｋｂにまたがっている（Ｏ'Ｈａｒａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８７；８４：５１５８−５１６２）。ＦＶＩＩの遺伝子構成および蛋白質構造は他のビタミンＫ依存型プロ凝固蛋白質のそれらに類似しており、エクソン１ａおよび１ｂはシグナル配列を；エクソン２はプロペプチドとＧｌａドメインを；エクソン３は短い疎水性域を；エクソン４と５は上皮増殖因子様ドメインを；そしてエクソン６ないし８はセリンプロテアーゼ触媒ドメインをコードしている（Ｙｏｓｈｉｔａｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８５；２４：３７３６−３７５０）。
ｈＦＶＩＩａについて（Ｐｉｋｅら、ＰＮＡＳ．ＵＳＡ．，  １９９９；９６：８９２５−３０およびＫｅｍｂａｌｌ−Ｃｏｏｋら、Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ，  １９９９；１２７：２１３−２２３）、Ｘ線結晶学的方法による可溶性組織因子と複合体を形成しているｈＦＶＩＩａ（Ｂａｎｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６；３８０：４１およびＺｈａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ，１９９９；２８５：２０８９）に関する、そしてｈＦＶＩＩの小型断片（Ｍｕｒａｎｙｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９８；３７：１０６０５およびＫａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９；３８：７０９７）について、実験的三次元構造が報告されている。
【０００４】
比較的少数のＦＶＩＩの蛋白質工学変種が報告されている（ＤｉｃｋｉｎｓｏｎとＲｕｆ、Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ，  １９９７；２７２：１９８７５−１９８７９、Ｋｅｍｂａｌｌ−Ｃｏｏｋら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  １９９８；２７３：８５１６−８５２１、Ｂｈａｒａｄｗａｊら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  １９９６；２７１：３０６８５−３０６９１、Ｒｕｆら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９；３８：１９５７−１９６６）。
ＢＨＫまたはその他哺乳動物細胞でのＦＶＩＩ発現（第ＷＯ９２／１５６８６号、第ＷＯ９１／１１５１４号および第ＷＯ８８／１０２９５号）および真核生物細胞でのＦＶＩＩとｋｅｘ２エンドプロテアーゼの共発現（第ＷＯ００／２８０６５号）に関する報告がある。
ヒト組換え体ＦＶＩＩａの市販製剤はＮｏｖｏＳｅｖｅｎ(R)として販売されている。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ(R)は血友病ＡまたはＢ患者の出血症状の治療に適用される。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ(R)は、出血症状に対する有効かつ信頼性の高い治療を目的とした唯一の市販ｒＦＶＩＩａである。
アルギニン１５２および／またはイソロイシン１５３が修飾されている不活性型ＦＶＩＩが第ＷＯ９１／１１５４号に報告されている。これらのアミノ酸は活性化部位に局在している。第ＷＯ９６／１２８００号は、セリンプロテアーゼ阻害剤によるＦＶＩＩａの不活性化を記載しており、α−アミノ酸基Ｉ１５３位置でのＦＶＩＩａのカルバミル化による不活性化がＰｅｔｅｒｓｅｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  １９９９；２６１：１２４−１２９により記載されている。この不活性型は、組織因子の結合と凝固活性の阻害に関し、野生型ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａと競合することができる。不活性型ＦＶＩＩａは、敗血症、心筋梗塞または血栓発作のリスクが高い患者等、血液凝固能低下状態にある患者の治療への利用が提案されている。
【０００５】
血流中のｒＦＶＩＩａの半減期は２．３時間であるとＦＤＡ参照番号９６−０５９７である「ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ(R)承認の根拠の要約」に報告されている。所望の治療または予防効果を達成するには、比較的高い投与量と頻繁な投与が必要とされている。結果として投与量を適切に管理することが困難となっており、そして頻繁に静脈投与の必要性が患者の生活を制限している。
現行のｒＦＶＩＩａ治療のかかえる別の問題は、蛋白質分解に関してこの分子が比較的不安定であることである。蛋白質分解は、凍結乾燥製剤とは異なり溶液製剤を調製する際に大きな障害となる。安定した溶解性製剤を得る利点は、患者治療が容易であること、そして緊急時に即時に対応でき、その結果救命につながる可能性があることである。主な蛋白質分解部位に部位指定型突然変異を誘導して蛋白質分解を防止する試みが第ＷＯ８８／１０２９５号に開示されている。
より長い血中半減期を持つ分子では、投与の必要回数は少なくなるだろう。現行ＦＶＩＩａの頻回投与の問題、および治療薬ＦＶＩＩａレベルをより最適化すること、さらに高い治療効果が得られる可能性を考えると、明らかに改良型ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａ様分子が望まれている。
蛋白質の血中半減期を延長する方法の一つは、蛋白質の腎臓クリアランスを減らすことである。これは蛋白質を、蛋白質に低腎臓クリアランス性を付与する化学成分にコンジュゲートさせることで達成される。
さらに蛋白質に化学成分を結合すること、または蛋白質分解に曝されるアミノ酸を置換することにより、蛋白質分解酵素を分解対象となる蛋白質と接触することを効果的に遮断してもよい。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は治療様蛋白質製剤の調製に使用されているこの様な化学成分の一つである。
第ＷＯ９８／３２４６６号は、多くの他蛋白質と共にＦＶＩＩがＰＥＧ化できることを示唆しているが、その観点に関してそれ以上の情報を含んでいない。
【発明の要旨】
【０００６】
本出願は、上記の１またはそれを越える望ましい利点を提供する改良されたＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａ分子、特に組換え体ｈＦＶＩＩおよびｈＦＶＩＩａ分子を開示する。即ち本発明のコンジュゲートは市販ｒＦＶＩＩａに比し、機能性インビボ半減期の延長および／または血漿半減期の延長、そして生物利用性の増加および／または蛋白質分解的崩壊に対する感受性の低下を含む１またはそれ以上の改良特性を有する。その結果発明のコンジュゲートによる医療処置は、現行のｒＦＶＩＩａ化合物よりも注射の間隔がより長くなる等、多く利点をもたらす。
従って第１の側面では、発明はポリペプチドに共有結合した少なくとも１種類の非ポリペプチド部分を含んでなるコンジュゲートであって、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、前記非ポリペプチド部分のための結合基を含む少なくとも１つのアミノ酸残基を導入されるかまたは除かれている点で、配列番号１に示される野生型ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａの配列と異なるコンジュゲートに関する。
別の側面では、本発明は、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、非ポリペプチド部分に関する連結基を含む少なくとも１つのアミノ酸残基が導入されているかまたは除かれている点で、配列番号１に示される野生型ＦＶＩＩまたはｈＦＶＩＩａと異なるポリペプチドに関する。この様な新規ＦＶＩＩポリペプチドは治療、診断またはその他目的等に有用であると考えられるが、本発明のコンジュゲートの調製のための中間生成物として特に興味深い。
別の側面では、本発明は、本発明のコンジュゲートのポリペプチドまたは本発明のコンジュゲートのポリペプチドの一部をコードするヌクレオチド配列；本発明のヌクレオチド配列を備えた発現ベクトル；本発明のヌクレオチド配列または本発明の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
さらに別の側面では、本発明は、本発明のコンジュゲートを含む医薬組成物、およびそのようなコンジュゲートの調製方法及び使用方法に関する。
【発明の詳細な記載】
【０００７】
定義
本出願および本発明の文脈では、以下の定義が適用される：
用語”コンジュゲート（コンジュゲート体）”（または”コンジュゲート化したポリペプチド”と言い換えることができる）は、ポリマー分子、脂肪親和性化合物、糖成分または有機誘導化物質（organic derivatizing agents）のような１またはそれ以上の非ポリペプチド部分に１またはそれ以上のポリペプチドが共有結合することで形成された異種（複合体またはキメラという意味における）分子を意味する。好ましくは、コンジュゲートは関連濃度および条件では可溶性であり、即ち血液等の生理学的液体中では可溶性である。本発明のコンジュゲート化ポリペプチド例はグリコシル化および／またはＰＥＧ化ポリペプチドを包含する。
用語”共有結合”は、ポリペプチドおよび非ポリペプチド部分が互いに直接共有結合しているか、または架橋体、スペーサーまたは単数あるいは複数の結合成分を介して間接的に相互に共有結合していることを意味する。
用語”非コンジュゲート化ポリペプチド”は、コンジュゲートのポリペプチド部分に関して用いられる。
ここで使用される場合、用語”非ポリペプチド部分”は、本発明のポリペプチドの結合基にコンジュゲートできる分子を意味する。この様な分子の好適例には、ポリマー分子、糖成分、脂肪親和性化合物または有機誘導化物質が含まれる。本発明のコンジュゲートとの関係で使用される場合、非ポリペプチド部分は、コンジュゲートのポリペプチド部分に、そのポリペプチドの結合基を介して結合されると理解されるだろう。上記の如く、非ポリペプチド部分は結合基に直接共有結合されても、または架橋体、スペーサー、または単数あるいは複数の結合成分といった介在成分を介し、結合基に間接的に共有結合されても良い。
【０００８】
”ポリマー分子”は、２またはそれ以上のモノマーの共有結合により形成される分子であって、ポリマーがヒトアルブミンまたはその他の豊富な漿蛋白質である場合を除いて、モノマーがアミノ酸残基ではない分子である。用語”ポリマー”は用語”ポリマー分子”と互換的である。この用語はインビトログリコシル化により結合された炭水化物分子、即ち、随意に架橋結合剤を使用して、ポリペプチドの結合基に炭水化物分子を共有結合させることを伴うインビトロで正常的に実施される合成的グリコシル化により結合された炭水化物分子を包含する。
Ｎ−またはＯ−グリコシル化（更に下で記載する様な）の様なインビボグリコシル化により結合された炭水化物分子は、ここでは”糖成分”と呼ばれる。コンジュゲート中のポリマー分子または糖成分といった非ポリペプチド部分の数が明示されている場合を除き、本発明で使用されるコンジュゲートまたはその他のものに含まれる”非ポリペプチド部分”と呼ばれるものはいずれも、１またはそれ以上のポリマー分子または糖成分等のような非ポリペプチド部分を参照すべきものである。
【０００９】
用語”結合基”は、ポリペプチドの官能基、特にポリマー分子、脂肪親和性分子、糖成分または有機誘導化物質の様な非ポリペプチド部分を結合することができる、そのアミノ酸残基または炭水化物を指す。有用な結合基およびそれらの適合非ポリペプチド部分を下表に示す。
【００１０】
【表１】
2005270110.tif 000002
2005270110.tif 000003
【００１１】
インビボのＮ−グリコシル化の場合、用語”結合基”は通例外の意味で用いられ、Ｎ−グリコシル化部位を含むアミノ酸残基を表している（配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ／Ｃ、ここでのＸはプロリン以外の何れかのアミノ酸残基であり、Ｎはアスパラギン、そしてＳ／Ｔ／Ｃはセリン、スレオニンまたはシステインのいずれかであり、好ましくはセリンまたはスレオニンであり、最適にはスレオニンである）。Ｎ−グリコシル化部位のアスパラギン残基は、グリコシル化の際に糖成分が結合される部位の一つであるが、この様な結合は他のアミノ酸残基のＮ−グリコシル化部位が存在しない限りは成立しない。
従って非ポリペプチド部分が糖成分であり且つそのコンジュゲーションがＮ−グリコシル化により行われる場合、目的のポリペプチドのアミノ酸配列の変更と関連づけて使用される”非ポリペプチド部分のための結合基を含んでなるアミノ酸残基”という用語は、Ｎ−グリコシル化部位を構成する１またはそれ以上のアミノ酸残基が、機能的なＮ−グリコシル化部位がアミノ酸配列内に導入されているかまたは前記配列より除かれている様式で変更されるものであることを意味する。
【００１２】
本出願では、アミノ酸名および原子名（例えばＣＡ、ＣＢ、ＣＤ、ＣＧ、ＳＧ、ＮＺ、Ｎ、Ｏ、Ｃ等）は、ＩＵＰＡＣ命名規約（アミノ酸およびペプチドに関するＩＵＰＡＣ  命名規約および符号（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｙｍｂｏｌｉｓｍ  ｆｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）（残基名、原子名等）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３８、９−３７（１９８４）およびそれらに関するＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５２、１（１９８５）記載の補正に基づく蛋白質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＤａｔａＢａｎｋ）（ＰＤＢ）（ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ））で定義された通りに用いられる。
用語”アミノ酸残基”はアラニン（ＡｌａまたはＡ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）およびチロシン（ＴｙｒまたはＹ）残基より成るグループに含まれるアミノ酸残基を示すものである。
【００１３】
アミノ酸位置を指定する際使用される命名方法を以下例示する：Ｇ１２４とは、配列番号１に示すアミノ酸配列において位置１２４がグリシン残基で占められていることを示す。Ｇ１２４Ｒとは、位置１２４のグリシン残基がアルギニン残基により置換されたことを意味する。あるいは置換は”／”を用い、例えばＫ３２Ｄ／Ｅのように表され、これは位置３２のリジンがアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかにより置換されたアミノ酸配列を意味する。複数の置換は”＋”を使い、例えばＫ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｓ／Ｔの様に表し、これは位置１４３のリジン残基のアスパラギンによる置換、および位置１４５のアスパラギン残基のセリンまたはスレオニン残基による置換を含むアミノ酸配列を意味している。Ｇ１２４の後にアラニン残基が挿入される様な、追加のアミノ酸残基の挿入はＧ１２４ＧＡで表される。アミノ酸残基の欠失は星印で表される。たとえば位置１２４のグリシンの欠失はＧ１２４＊で表される。特記ない限り、ここで行うアミノ酸の番号付けは、配列番号１に示す野生型ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａのアミノ酸配列に対するものである。
特定の突然変異体（mutant）と結びつけて使用される場合、用語”異なる”は、明記されたアミノ酸の違いとは別の追加的違いも含むことを意味する。例えば非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基を除去および/または導入することに加え、ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチドはこの様なアミノ酸残基の導入および／または除去とは関係のない別の置換を含んでもよい。即ち、ここに開示した非ポリペプチド部分に関する結合部位の除去および／または導入を目的とするアミノ酸の変更に加え、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、望まれる場合には結合部位の導入または除去に関連させる必要のない別の変更、即ち置換、挿入または欠失を含むことができる。例えば、これらは１またはそれ以上のアミノ酸残基によるＮ−および／またはＣ−末端の切断、またはＮ−および／またはＣ−末端への１またはそれ以上の余分な残基の付加、例えばＮ−末端へのメチオニン残基の付加、ならびに”保存的アミノ酸置換”、即ち同様の特性を持ったアミノ酸群内、例えば小型アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸および芳香族アミノ酸群内で行われる置換を含んでもよい。
【００１４】
【表２】
2005270110.tif 000004
【００１５】
用語”変異”および”置換”はここでは互換的に使用される。
用語”核酸配列”は、２またはそれ以上のヌクレオチド分子の連続ストレッチを示すものである。ヌクレオチド配列はゲノミック、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成由来、またはその組換え体である。
用語”ポリメラーゼチェインリアクション”または”ＰＣＲ”は一般的には米国特許第４，６８３，１９５号に記載されているインビトロでの所望ヌクレオチド配列増幅法を表す。一般にＰＣＲ法は、鋳型核酸に好ましくハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプライマーを使った、プライマー延長合成のサイクルの繰り返しを含む。
”細胞”、”宿主細胞”、”細胞株”および”細胞培養”は、ここでは互換的に用いられ、この様な用語は全て、細胞を増殖し、または培養した結果生じる子孫を含むと理解すべきである。”形質転換”および”トランスフェクション”は互換的に使用され、細胞内にＤＮＡを導入する工程を示す。
”機能的に連結した”とは、２またはそれ以上のヌクレオチド配列が、酵素的ライゲーションまたはその他方法により、配列の正常な機能が行われることができる形に相互に配置され、共有結合することを表している。例えば、もしポリペプチドがポリペプチドの分泌に関わる前駆蛋白質として発現される場合には、プレ配列または分泌リーダーをコードするヌクレオチド配列がポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列に機能的に連結される：プロモーターまたはエンハンサーが配列の転写に影響を及ぼす場合、それはコーディング配列に機能的に連結されている；リボソーム結合部位が翻訳を促進する位置に配置されている場合、それはコーディング配列に機能的に連結されている。一般に”機能的に連結した”とは、連結しているヌクレオチド配列が隣接していること、そして分泌リーダーの場合には隣接し且つ読み枠内に存在することを意味する。連結は通常の制限部位でのライゲーションにより行われる。そのような部位がない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、標準的な組換え体ＤＮＡ法と結びつけ使用される。
【００１６】
用語”導入する”は、非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基の導入すること、特に既存アミノ酸残基の置換、または追加のアミノ酸残基の挿入により導入することを意味する。
用語”除去する”とは、非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基を除去すること、特に除去対象となるアミノ酸残基を別のアミノ酸により置換すること、または追加のアミノ酸残基を欠失することにより除去することを意味する。
用語”ＦＶＩＩ”または”ＦＶＩＩポリペプチド”は単鎖型で提供されるＦＶＩＩ分子を意味する。
用語”ＦＶＩＩａ”または”ＦＶＩＩａポリペプチド”とは、活性化された２本鎖型で提供されるＦＶＩＩａ分子を意味し、この場合１本鎖型のＲ１５２−Ｉ１５３間のペプチド結合は切断される。ここでは配列番号１のアミノ酸配列を用いＦＶＩＩａのアミノ酸配列を記載するが、その場合は一方鎖のアミノ酸が残基１−１５２を含み、他方の鎖がアミノ酸残基１５３−４０６を含むと理解されるだろう。
用語”ｒＦＶＩＩ”または”ｒＦＶＩＩａ”は、それぞれ組換え体技術で生成されたＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａ分子を表す。
用語”ｈＦＶＩＩ”または”ｈＦＶＩＩａ”は野生型ヒトＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａをそれぞれ表す。
用語”触媒部位”は、ＦＶＩＩポリペプチドのＳ３４４、Ｄ２４２、およびＨ１９３より成る触媒性のトライアッド（３つ組構造）を意味する。
【００１７】
用語”活性ＦＶＩＩａ”、”活性ＦＶＩＩａポリペプチド”、”活性ＦＶＩＩａコンジュゲート”または”活性コンジュゲート”とは、野生型ｈＦＶＩＩａの触媒活性の少なくとも１０％を有するＦＶＩＩａポリペプチドまたはコンジュゲートを表すのに用いられる。ここで用いる場合、触媒活性は触媒活性測定法と題する節に記載のアッセイ、または低レベル触媒活性測定法と題したアッセイ（本明細書の材料と方法の節を参照）により、好ましく測定されるだろう。好ましくは上記アッセイで試験された時、活性コンジュゲートは野生型ｈＦＶＩＩａの触媒活性の少なくとも１５％、例えば少なくとも２０％、例えば少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％を、最適には例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％を有する。
好ましくは、活性コンジュゲートは組織因子に結合し、さらに血漿第Ｘ因子および／または第ＩＸ因子を活性化することができる。即ち好適実施態様では、活性ＦＶＩＩａポリペプチドまたはそのコンジュゲートは、野生型ＦＶＩＩａに比し少なくとも２５％の凝固活性、例えば野生型ＦＶＩＩａに比べ少なくとも５０％の凝固活性を、例えば野生型ＦＶＩＩに比較し少なくとも７５％の凝固活性を有する。即ち活性ＦＶＩＩａポリペプチドまたはそのコンジュゲートの凝固活性は、好ましくは野生型ＦＶＩＩａに比べ２５−２００％の範囲内にある。具体的には、ＦＶＩＩａポリペプチドまたはコンジュゲートは野生型ＦＶＩＩａと比較して３０−１５０％の範囲の凝固活性を、例えば野生型ＦＶＩＩａと比較して３０−１００％の範囲の凝固活性を持つ。凝固活性は以下材料と方法の節に詳細論ずる、当技術分野既知の方法により決定されるだろう。しかし特に好適には、凝固活性は”凝固活性測定法”と題する節記載の方法（材料と方法の節を参照）に従い決定される。
【００１８】
用語”免疫原性”は、特定物質と関連づけて使用される場合、免疫系からの反応を誘導する物質の能力を示している。免疫反応は細胞または抗体介在反応であり得る（免疫反応の詳細な定義については例えばＲｏｉｔｔ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第８版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）を参照）。一般に、抗体反応性の低下は、免疫原性の低下を表すだろう。免疫原性の低下は、例えばインビボまたはインビトロにて、当技術分野既知の好適方法を用い決定されるだろう。
用語”不活性ＦＶＩＩａ”、”不活性ＦＶＩＩａポリペプチド”、”不活性ＦＶＩＩａコンジュゲート”または”不活性コンジュゲート”は、野生型ｈＦＶＩＩａの触媒活性の１０％未満のＦＶＩＩａポリペプチドまたはコンジュゲートを意味するのに用いられる。ここで用いる場合、触媒活性は、触媒活性測定方法と題する節に記載のアッセイ、または低レベル触媒活性を測定する方法と題したアッセイ（本書材料と方法の節を参照）により好ましく決定されるだろう。好ましくは上記アッセイで試験された時、活性コンジュゲートは野生型ｈＦＶＩＩａ触媒活性の８％未満、例えば６％未満、例えば５％未満、より好ましくは４％未満、例えば３％未満、最適には例えば２％未満、例えば１％未満である。
【００１９】
典型的には、不活性コンジュゲートは野生型ｈＦＶＩＩａに比べ有意に低いインビトロまたはインビボ凝固活性を有する。不活性ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチドまたはコンジュゲートは、組織因子結合に関し野生型ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａと競合でき、それにより凝固活性を阻害することができるだろう。好ましくは不活性ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチドまたはコンジュゲートは野生型ｈＦＶＩＩまたはｈＦＶＩＩａに比べ１％未満の凝固活性を有する。より好ましくは不活性ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチドまたはコンジュゲートは、野生型ｈＦＶＩＩまたはｈＦＶＩＩａに比べ０．０５％未満の凝固活性を有する。最適には不活性ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチドまたはコンジュゲートは、野生型ｈＦＶＩＩまたはｈＦＶＩＩａに比べ０．０１％未満の凝固活性を有する。上記同様にして、凝固活性は以下の材料と方法の節で詳細論じられる様な当技術分野既知の方法により決定することができるが、好ましくは”凝固活性測定法”と題する節に記載の方法により決定される。
用語”機能的（functional）インビボ半減期”とは通常の意味で用いられており、即ちポリペプチドまたはコンジュゲートの生物活性の５０％が体内／標的器官内にまだ存在している時間、またはポリペプチドまたはコンジュゲートの活性が初期値の５０％である時間を意味する。機能的インビボ半減期を決定する代替として、”血清半減期”、即ち排除される前にポリペプチドまたはコンジュゲート分子の５０％が血漿または血流中を循環している時間を決定してもよい。血清半減期の決定は、機能的インビボ半減期を決定する場合よりも簡単であることが多く、血清半減期の大きさは機能的インビボ半減期の大きさを通常よく表す。あるいは血清半減期という語は”血漿半減期”、”血中半減期”、”血清クリアランス”、”血漿クリアランス”および”クリアランス半減期”を包含する。ポリペプチドまたはコンジュゲートは、細網内皮系（ＲＥＳ）、腎臓、脾臓または肝臓の作用により、組織因子、ＳＥＣ受容体またはその他受容体介在排除、または特異的あるいは非特異的蛋白質分解の１またはそれ以上により排除される。通常、クリアランスはサイズ（子球体濾過に関するカットオフに対する）、電荷、結合した炭水化物鎖、およびその蛋白質に対する細胞受容体の存在に依存する。保持する機能性は、一般には凝固前駆体、蛋白質分解または受容体結合活性より選択される。機能的インビボ半減期および血清半減期は、以下の材料と方法の節で詳細論ずる様に、当分野既知の好適方法により決定される。
【００２０】
機能的インビボ半減期または血漿半減期に関して使用される”増加した”という用語は、コンジュゲートまたはポリペプチドの関連半減期が、比較可能な条件下に於いて測定されて非コンジュゲート型ｒＦＶＩＩａ（例えばＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））の様な参照分子と比べて統計上有意に増加していることを表すのに用いられる。例えば、関連半減期は少なくとも約２５％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、５００％または１０００％増加するだろう。
用語”腎臓クリアランス”は、腎臓によって行われるクリアランス、例えば子球体濾過、尿細管排出、または尿細管細胞内での分解によるクリアランスを表す、一般的な意味に用いられる。腎臓クリアランスはサイズ（直径）、流体力学的容積、対称性、形状／硬度、および電荷を含むコンジュゲートの物理特性に依存する。一般的には、約６７ｋＤａの分子量が腎臓クリアランスのカットオフ値と考えられている。腎臓クリアランスは好適アッセイ、例えば確立されたインビボアッセイにより決定される。典型的には、腎臓クリアランスは標識（例えば放射線標識、または蛍光標識）ポリペプチドコンジュゲートを患者に投与し、患者より採集した尿中の標識活性を測定することで決定される。腎臓クリアランスの低下は、対応する参照ポリペプチド、例えば対応する非コンジュゲート化ポリペプチド、非コンジュゲート型の対応する野生型ポリペプチド、またはその他のコンジュゲート化ポリペプチド（例えば本発明によらないコンジュゲート化ポリペプチド）に対し、比較可能な条件下に決定される。好ましくは、コンジュゲートの腎臓クリアランス速度は関連参照ポリペプチドと比べ少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、そして最適には少なくとも９０％低下する。
本発明のコンジュゲートの蛋白質分解への感受性低下を示す能力は最も重要である；分解産物を含む組成物は、典型的には、コンジュゲートが全く分解されないか又はそのごく一部だけが分解される組成物に比べて、特異的活性が低いだろう。さらに、投与される組成物中に含まれる非生理学的分解産物は、患者の免疫系の引き金をひくことになるかもしれない。
【００２１】
用語”蛋白質分解への感受性低下”とは、主そして、コンジュゲートは、比較可能な条件の下に非コンジュゲート化野生型ＦＶＩＩａに比べた場合、蛋白質分解への低い感受性を有することを意味している。好ましくは、蛋白質分解は少なくとも１０％、例えば少なくとも２５％（例えば１０−２５％）、より好ましくは少なくとも３５％、例えば少なくとも５０％（例えば１０−５０％、例えば２５−５０％）、よりさらに好ましくは少なくとも６０％、例えば少なくとも７５％、さらには少なくとも９０％低下する。より好ましくは、蛋白質分解は１００％低下する。即ち、好ましくは、本発明のコンジュゲートは、野生型ＦＶＩＩａほどまでに蛋白質分解を被ることがなく、つまり、非コンジュゲート化野生型ＦＶＩＩａに比べて、本発明のコンジュゲートの蛋白質分解は、好ましくは１０−１００％、例えば２５−１００％、より好ましくは５０−１００％、最適には７５−１００％低下する。
本発明者は、コンジュゲートが蛋白質切断に対し低感受性であるか（低自己分解性）否かを評価するのに使用できる、好適な予備的インビトロ試験を開発した。即ち、本発明の好適実施態様では、本発明のコンジュゲートは、蛋白質分解感受性低下測定法と題する節に記載の方法で決定された時、触媒活性測定法と題する節に記載の方法で決定された時、または低レベル触媒活性を測定する方法と題する節記載の方法により決定された場合（本明細書の材料と方法の節を参照）、野生型ＦＶＩＩａに比べ蛋白質分解（上記定義による）への低い感受性を有する。
用語”親ＦＶＩＩ”または”親ポリペプチド”は、本発明により変更される元の分子を示している。典型的な親ＦＶＩＩは、配列番号１に示すアミノ酸配列を持つｈＦＶＩＩまたはｈＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ(R)を含む）である。
用語”変異体（variant）”は、親ポリペプチドと１またはそれ以上アミノ酸残基が異なる、一般的には１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸残基が異なっているポリペプチドである。
【００２２】
本発明のコンジュゲート
本発明のコンジュゲートは、改良されたＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａ分子の開発に関する一般的に新しいストラテジーの成果である。より具体的には、非ポリペプチド部分に関する結合基を含むアミノ酸残基を排除し且つ／または導入することによって、そのポリペプチドは、選択された非ポリペプチド部分へのコンジュゲーションに対しその分子がより感受性になり、そのコンジュゲーションパターンが最適化され（例えばＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａ分子表面上の非ポリペプチド部分の分布および数が確実に最適化され、コンジュゲート化が意図された結合基のみがその分子中に確実に存在するようにすること）、それによって、ＦＶＩＩ活性を有するか又は有さず、そして更には今日入手可能なＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａ分子に比べて１又はそれを越える改良された特性を有する新規なコンジュゲート分子を得ることに特異的に適合させることが可能になる。例えば、選択した非ポリペプチドに対する結合基を含むアミノ酸残基の総数が最適化レベルまで増加、または減少する場合、そのコンジュゲートの腎臓クリアランスは、典型的には、コンジュゲーションの結果生ずる分子の形、サイズ、および／又は電荷の変化に起因して大きく低下する。
本発明の好適な実施態様では、ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａの１を越えるアミノ酸残基が変更され、例えばこの変更は選択した非ポリペプチド部分に関する結合基を含むアミノ酸残基の排除および導入を包含する。ポリペプチドはこのアミノ酸残基の排除および／または導入に加えて、非ポリペプチド部分に関する結合基を含むアミノ酸残基の除去および／または導入に関係しないその他の置換またはグリコシレーションを含んでも良い。さらにポリペプチドは、ポリペプチドの触媒部位を阻害するために例えばセリンプロテアーゼ阻害剤に取り付けてもよい。
排除されるか又は導入される、非ポリペプチド部分に関する結合基を含むアミノ酸残基は、選択した非ポリペプチド部分の性質に基づき、そして多くの場合にはポリペプチドと非ポリペプチド部分間のコンジュゲーションが達成される方法に基づき選択される。例えば非ポリペプチド部分がポリエチレングリコールまたはポリアルキレンオキサイド誘導分子である場合、結合基を含むアミノ酸残基はリジン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンおよびチロシンより成るグループから選択され、好ましくはシステインおよびリジンであり、特にはリジンである。
【００２３】
本発明に従い非ポリペプチド部分の結合基がＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチド内に導入され、またはそれらより除去される場合、修飾されるポリペプチドの位置は常にポリペプチドの表面に好ましく配置され、好ましくは、２５％、より好ましくは５０％より多い側鎖が溶媒に露出するアミノ酸により占められる。この様な位置は本明細書の材料と方法に記した様に、ヒトＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａの３Ｄ構造の分析を基にして特定されている。さらにこの位置は組織因子結合部位領域および／または活性部位領域外に位置するＦＶＩＩ分子の一部より好ましく選択される。これら領域は以下記す材料と方法の節に特定されている。しかし、特定状況下で、例えば不活性コンジュゲートが望まれる場合には、その様な領域内または近傍に修飾が行うことが好都合であることを強調しなければならない。例えば、非ポリペプチド部分に関する１またはそれ以上の結合基、例えばインビボＮ−グリコシレーション部位のための結合基は、ＦＶＩＩ分子の活性部位領域内にまたは活性部位結合裂溝リッジで好都合に挿入される。活性部位領域および活性部位結合裂溝のリッジは本明細書の材料と方法の節に規定されており、そして以下の残基より構成される：
【００２４】
Ｉ１５３、Ｑ１６７、Ｖ１６８、Ｌ１６９、Ｌ１７０、Ｌ１７１、Ｑ１７６、Ｌ１７７、Ｃ１７８、Ｇ１７９、Ｇ１８０、Ｔ１８１、Ｖ１８８、Ｖ１８９、Ｓ１９０、Ａ１９１、Ａ１９２、Ｈ１９３、Ｃ１９４、Ｆ１９５、Ｄ１９６、Ｋ１９７、Ｉ１９８、Ｗ２０１、Ｖ２２８、Ｉ２２９、Ｉ２３０、Ｐ２３１、Ｓ２３２、Ｔ２３３、Ｙ２３４、Ｖ２３５、Ｐ２３６、Ｇ２３７、Ｔ２３８、Ｔ２３９、Ｎ２４０、Ｈ２４１、Ｄ２４２、Ｉ２４３、Ａ２４４、Ｌ２４５、Ｌ２４６、Ｖ２８１、Ｓ２８２、Ｇ２８３、Ｗ２８４、Ｇ２８５、Ｑ２８６、Ｔ２９３、Ｔ３２４、Ｅ３２５、Ｙ３２６、Ｍ３２７、Ｆ３２８、Ｄ３３８、Ｓ３３９、Ｃ３４０、Ｋ３４１、Ｇ３４２、Ｄ３４３、Ｓ３４４、Ｇ３４５、Ｇ３４６、Ｐ３４７、Ｈ３４８、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｇ３６０、Ｉ３６１、Ｖ３６２、Ｓ３６３、Ｗ３６４、Ｇ３６５、Ｃ３６８、Ｖ３７６、Ｙ３７７、Ｔ３７８、Ｒ３７９、Ｖ３８０、Ｑ３８２、Ｙ３８３、Ｗ３８６、Ｌ３８７、Ｌ４００およびＦ４０５（活性部位）；およびＮ１７３、Ａ１７５、Ｋ１９９、Ｎ２００、Ｎ２０３、Ｄ２８９、Ｒ２９０、Ｇ２９１、Ａ２９２、Ｐ３２１およびＴ３７０（活性部位結合裂溝のリッジ）。
【００２５】
結語基の最適分布を決定するために、ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａ分子の表面に位置するアミノ酸残基間の距離がポリペプチドの３Ｄ構造を基に計算される。より具体的には、この様な結合基を含むアミノ酸残基のＣＢ間の距離、または官能基の一つ（リジンのＮＺ、アスパラギン酸のＣＧ、グルタミン酸のＣＤ、システインのＳＧ）と結合基を含む他アミノ酸のＣＢとの間の距離が決定される。グリシンの場合、ＣＢの代わりにＣＡが用いられる。本発明のコンジュゲートのＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチド部分では、異種コンジュゲーションを避ける、または軽減するために前記距離は好ましくは８Åより大きく、特には１０Åより大きい。
結合基が除去される例では、その様な結合基を含み、そして上記位置を占めている関連アミノ酸残基は、問題の非ポリペプチド部分に関する結合基を含まない別のアミノ酸残基により好ましく置換される。通常除去されるアミノ酸残基は、コンジュゲーションが不都合であるアミノ酸残基、例えばポリペプチド機能部位またはその近傍に配置するアミノ酸残基である（この様な部位をコンジュゲート化すると、受容体認識が障害されるために、得られたコンジュゲートのＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａ活性の不活性化または低下が起こる）。この関係に於いて用語“機能部位”は、ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａの機能または性能に必須、あるいは別な形で関係している１またはそれ以上のアミノ酸残基を表す。この様なアミノ酸残基は機能部位の一部である。機能部位は当分野既知の方法により決定でき、ＦＶＩＩａ−組織因子複合体の構造分析により好ましく同定される（Ｂａｎｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６；３８０：４１−４６参照）。
結合基導入例では、この様な基を含むアミノ酸残基がこの位置に導入され、好ましくはこの位置を占めるアミノ酸残基の置換により導入される。
【００２６】
ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチド内に存在し、コンジュゲーションに利用できる結合基の正確な数は、コンジュゲーションにより得ることが望まれる効果に依存する。目的の効果は、例えばコンジュゲーションの性質および強さに依存する（例えば非ポリペプチド部分の個性、ポリペプチドにコンジュゲートすることが望まれる、または可能である非ポリペプチド部分にあって、コンジュゲーションすべきまたはコンジュゲーションを回避すべき成分の数）。
機能的インビボ半減期は、コンジュゲートの分子量に依存しており、従って半減期延長に必要とされる結合基の数は問題の非ポリペプチド部分の分子量に依存する。実施態様の一つでは、本発明のコンジュゲートは例えばＬａｅｍｍｌｉ、Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ２２７巻（１９７０）、ｐ６８０−８５によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したときに、少なくとも６７ｋＤａの分子量を有し、特には少なくとも７０ｋＤａの分子量を有している。ＦＶＩＩは約５３ｋＤａの分子量を有するため、所望効果を得るには更に１０−２０ｋＤａが必要とされる。これは、例えば２−４個の１０ｋＤａのＰＥＧ分子をコンジュゲートさせること、またはここに記載の別の方法により提供される。
親分死の構造および機能が大きく損なわれるのを回避するために、一般にコンジュゲートポリペプチド部分は配列番号１と９０％より高い同一性を有し、好ましくは９５％より高い、例えば９６％より高い同一性を揺する。具体的にはコンジュゲートのポリペプチド部分は典型的には配列番号１と９７％より高い、例えば９８％より高く、９９％より高い、９９．２５％より高い、９９．２５％より高い、または９９．５％より高い同一性を有するだろう。
【００２７】
アミノ酸配列相同性／同一性は、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラム、１．８バージョン、１９９９年６月をデフォルトパラメータで（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４、ＣｌｕｓｔｒａｌＷ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，  ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２２：４６７３−４６８０）利用するか、ＰＦＡＭファミリーデータベース４．０バージョン（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９９年７月１；２７（１）：２６０−２）よりＧＥＮＤＥＤＯＣ２．５バージョン（Ｎｉｃｈｏｌａｓ、Ｋ．Ｂ．，Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｈ．Ｂ．Ｊｒ．，およびＤｅｅｒｆｉｅｌｄ，Ｄ．Ｗ．ＩＩ．１９９７  ＧｅｎｅＤｏｃ：Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ、ＥＭＢＮＥＷ、ＮＥＷＳ  ４：１４；Ｎｉｃｈｏｌａｓ、Ｋ．Ｂ．およびＮｉｃｈｏｌａｓ  Ｈ．Ｂ．Ｊｒ．１９９７  ＧｅｎｅＤｏｃ：Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を使い、アラインメントした配列から簡便に決定される。
【００２８】
換言すれば、本発明により変更されるアミノ酸残基の総数（配列番号１に示すアミノ酸配列と比較した場合）は、典型的は１５を越えない。好ましくは、本発明のコンジュゲートのＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチド部分、または本発明のポリペプチドは配列番号１に示すアミノ酸配列と１−１５アミノ酸残基が異なり、典型的には配列番号１に示すアミノ酸配列とは１−１０または２−１０のアミノ酸残基が異なり、例えば１−８または２−８アミノ酸残基、例えば３−７または４−６アミノ酸残基が異なる。即ち、一般には本発明のコンジュゲートのポリペプチド部分またはポリペプチドは配列番号１に示すアミノ酸配列とは最大１５アミノ酸残基（例えば１５アミノ酸残基）、最大１４アミノ酸残基（例えば１４アミノ酸残基）、最大１３アミノ酸残基（例えば１３アミノ酸残基）、最大１２アミノ酸残基（例えば１２アミノ酸残基）、最大１１アミノ酸残基（例えば１１アミノ酸残基）、最大１０アミノ酸残基（例えば１０アミノ酸残基）、最大９アミノ酸残基（例えば９アミノ酸残基）、最大８アミノ酸残基（例えば８アミノ酸残基）、最大７アミノ酸残基（例えば７アミノ酸残基）、最大６アミノ酸残基（例えば６アミノ酸残基）、最大５アミノ酸残基（例えば５アミノ酸残基）、最大４アミノ酸残基（例えば４アミノ酸残基）、最大３アミノ酸残基（例えば３アミノ酸残基）、最大２アミノ酸残基（例えば２アミノ酸残基）異なるアミノ酸配列を含む。
【００２９】
同様に本発明のコンジュゲートは典型的には、例えば１−１５非ポリペプチド部分、典型的には１−１０非ポリペプチド部分または２−１０非ポリペプチド部分、例えば１−８または２−８非ポリペプチド部分、例えば１−６、１−４、３−７または４−６非ポリペプチド部分を含む。
好ましくは本発明のコンジュゲートは以下の改良された特性を１またはそれ以上有する：ｒＦＶＩＩａ（例えばＮｏｖｏＳｅｖｅｎ(R)）に比べ長い機能的インビボ半減期、長い血漿半減期、低い腎臓クリアランスおよび低い蛋白質分解に対する感受性。
たとえば第WO／１０２９５号よりＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの蛋白質分解は主に分子の各種蛋白質分解部位、即ち位置Ｋ３２、Ｋ３８、Ｉ４２、Ｙ４４、Ｋ１４３、Ｒ２９０、Ｒ３１５、Ｋ３４１、Ｒ３９２、Ｒ３９６およびＲ４０２（または位置Ｋ３２−Ｄ３３、Ｋ３８−Ｌ３９、Ｉ４２−Ｓ４３、Ｙ４４−Ｓ４５、Ｋ１４３−Ｒ１４４、Ｒ２９０−Ｇ２９１、Ｒ３１５−Ｋ３１６、Ｋ３４１−Ｋ３４２、Ｒ３９２−Ｒ３９３、Ｒ３９６−Ｒ３９７およびＲ４０２−Ａ４０３の間）で起こることが分かる。即ち、例えば機能的インビボ半減期を延長するための、長い血漿半減期を得る、あるいは蛋白質分解に対する感受性を低下させることに関する好適ストラテジーは、親蛋白質の蛋白質分解部位、および／またはその近傍の１またはそれ以上を、それら部位またはその近傍に非ポリペプチド部分を導入することによって、親蛋白質を修飾することである。即ち本発明の好適実施態様では、結合基は上記指定位置の１またはそれ以上に、または蛋白質分解に直接関係する位置に対する位置−４、−３、−２、−１、１、２、３、４に、好ましくは位置−２、−１、１、２、例えば−１、１に導入される。
【００３０】
より具体的には、非天然型のインビボグリコシル化部位、特には非天然型インビボＮ−グリコシル化部位（詳細以下参照）が２８−４８、１３９−１４７、２８６−２９４、３１１−３１９、３３８−３４５および３８８−４０６より成るグループから選択される位置に導入されることが好ましい。特には、インビボＮ−グリコシル化部位（詳細以下参照）の様なインビボグリコシル化部位が３０−３４、３６−４６、１４１−１４４、２８８−２９２、３１３−３１７、３４１−３４３、３９０−３９８および４００−４０４より成るグループから選択される位置に導入されることが好ましい。より好ましくは、インビボＮ−グリコシル化部位（詳細以下参照）の様なインビボグリコシル化部位が３１−３３（例えば３１、３２、または３３）、３７−３９（例えば位置３７、３８または３９）、４１−４６（例えば位置４１、４２、４３、４４、４５または４６）、１４２−１４４（例えば位置１４２、１４３または１４４）、２８９−２９１（例えば位置２８９、２９０または２９１）、３１４−３１６（例えば位置３１４、３１５または３１６）、３４１−３４２（例えば位置３４１、３４２または３４３）、３９１−３９３（例えば３９１、３９２または３９３）、３９５−３９７（例えば位置３９５、３９６または３９７）および４０１−４０３（例えば位置４０１、４０２または４０３）より成るグループから選択される位置に導入される。この導入は置換により好ましく行われる。
【００３１】
非ポリペプチド部分が結合基としてリジンを有する本発明のコンジュゲート
本発明の関心の実施態様では、非ポリペプチド部分は結合基としてリジンを有し、即ち本発明のコンジュゲートはポリペプチドに供給結合された非ポリペプチド部分を少なくとも１つ含むコンジュゲートであり、この場合ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１に示す野生型ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａの配列と、少なくとも１つのリジン残基が導入され、または除去されている点で異なっている。
ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａは１７個のリジン残基を含んでいる。３個のリジン残基（Ｋ１８、Ｋ６２およびＫ８５）は組織因子結合ドメイン内に位置しており、２個のリジン残基（Ｋ１９７およびＫ３４１）が活性部位領域内に位置している。
親ポリペプチド内のリジン残基量が比較的高いことから、非ポリペプチド部分への過剰なコンジュゲーションを避けるために、少なくとも１つのリジン残基が好ましく除去すべきであり、具体的にはリジン残基の非リジン残基による置換により除去すべきであると考えられる。
【００３２】
即ちコンジュゲートのＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチド部分のアミノ酸配列は、少なくとも１つのリジン残基、例えば１−１５個のリジン残基、具体的には１−１０個、１−６個、または２−４個のリジン残基が、好ましくは置換により除去されている点で配列番号１に示す配列と異なっている。例えば、好ましくは置換により除去されるリジン残基は、Ｋ１８、Ｋ３２、Ｋ３８、Ｋ６２、Ｋ８５、Ｋ１０９、Ｋ１３７、Ｋ１４３、Ｋ１４８、Ｋ１５７、Ｋ１６１、Ｋ１９７、Ｋ１９９、Ｋ３１６、Ｋ３３７、Ｋ３４１、Ｋ３８９およびその組み合わせより成るグループから選択される。具体的には、組織因子結合部位および／または活性部位領域の一部を構成する１またはそれ以上のリジン残基、即ちＫ１８、Ｋ６２、Ｋ８５、Ｋ１９７、Ｋ３４１またはその組み合わせの残基が除去されるのが好ましい。リジン残基は、他アミノ酸残基と置換することもできるが、好ましくはＲ、Ｑ、ＮまたはＨ，より好ましくはＲと置換される。
【００３３】
コンジュゲートのＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチド部分のアミノ酸配列は、少なくとも１つのリジン残基、例えば１−１５個のリジン残基、具体的には１−１０個、１−６個、または２−４個のリジン残基が、好ましくは置換により導入されている点で配列番号１に示す配列と異なっている。親分視内の所定位置に導入されるリジン残基の少なくとも１つは、上記リジン残基の除去の少なくとも１つと組み合わされることが特に好ましいことが理解されるだろう。即ち、本発明の好適実施態様では、コンジュゲートのＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチド部分のアミノ酸配列は、少なくとも１個のリジン残基が除去され、少なくとも１個のリジン残基が導入されている点で、配列番号１に示された配列と異なる。
【００３４】
リジン残基が導入される位置の例には、上記蛋白質分解部位またはその近傍が包含されるが、これらに限定されるものではない。即ち、好適実施態様では、リジン残基による非リジン残基の置換は、Ｉ４２Ｋ、Ｙ４４Ｋ、Ｌ２８８Ｋ、Ｄ２８９Ｋ、Ｒ２９０Ｋ、Ｇ２９１Ｋ、Ａ２９２Ｋ、Ｔ２９３Ｋ、Ｑ３１３Ｋ、Ｓ３１４Ｋ、Ｒ３１５Ｋ、Ｖ３１７Ｋ、Ｌ３９０Ｋ、Ｍ３９１Ｋ、Ｒ３９２Ｋ、Ｓ３９３Ｋ、Ｅ３９４Ｋ、Ｐ３９５Ｋ、Ｒ３９６Ｋ、Ｐ３９７Ｋ、Ｇ３９８Ｋ、Ｖ３９９Ｋ、Ｌ４００Ｋ、Ｌ４０１Ｋ、Ｒ４０２Ｋ、Ａ４０３Ｋ、Ｐ４０４Ｋ、Ｆ４０５Ｋおよびその組み合わせより成るグループから選択され、好ましくはＲ２９０Ｋ、Ｒ３１５Ｋ、Ｒ３９２Ｋ、Ｒ３９６Ｋ、Ｒ４０２Ｋおよびその組み合わせより成るグループから選択される。
【００３５】
本発明のこの観点によるコンジュゲートの非ポリペプチド部分は、既知コンジュゲーション方法を利用する場合に結合基となるリジンを有する分子であるが、非ポリペプチド部分はポリマー分子であることが好ましい。このポリマー分子は”ポリマー分子へのコンジュゲーション”と題する節に記載されているいずれかの分子でよいが、好ましくは直鎖型、または分岐型ポリエチレングリコールまたはその他ポリアルキレンオキサイドより成るグループから選択される。好適ポリマー分子の例は、例えばシェアウォーターポリマーズ社（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｉｎｃ）のＳＳ−ＰＥＧ、ＮＰＣ−ＰＥＧ、アルデヒド−ＰＥＧ、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ｍＰＥＧ−ＳＣＭ、ｍＰＥＧ−ＢＴＣ、エンゾン社（Ｅｎｚｏｎ、Ｉｎｃ）のＳＣ−ＰＥＧ、米国特許第５、８８０、２５５号記載のトレシル化ｍＰＥＧ、またはオキシカルボニル−オキシ−Ｎ−ジカルボキシイミド−ＰＥＧ（米国特許第５、１２２、６１４号）である。
即ちリジン残基へのコンジュゲーションに関しては、非ポリペプチド部分は約５ないし約２０ｋＤａ、例えば約５ないし約１０ｋＤａ、例えば約５ｋＤａまたは約１０ｋＤａの分子量を有する。
本節に規定されるアミノ酸の変化、特に置換はいずれかのアミノ酸の変化、好ましくはグリコシル化部位の導入および／または除去を含む、具体的なアミノ酸修飾を開示している本書他節に規定されている置換と組み合わせることができることが理解されるだろう。
【００３６】
非ポリペプチド部分が結合基としてシステインを有する本発明のコンジュゲート
本発明の関心の実施態様では、非ポリペプチド部分は結合基としてシステインを有し、即ち本発明のコンジュゲートはポリペプチドに供給結合された非ポリペプチド部分を少なくとも１つ含むコンジュゲートであり、この場合ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１に示す野生型ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａの配列と、少なくとも１つのシステイン残基が導入され、または除去されている点で異なっている。
【００３７】
ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａは２４個のシステイン残基を有し、以下のシステイン暗記間にジスルフィド結合が確立されている：Ｃ１７とＣ２２、Ｃ５０とＣ６１，Ｃ５５とＣ７０、Ｃ７２とＣ８１、Ｃ９１とＣ１０２、Ｃ９８とＣ１１２、Ｃ１１４とＣ１２７、Ｃ１３５とＣ２６２、Ｃ１５９とＣ１６４、Ｃ１７８とＣ１９４、Ｃ３１０とＣ３２９およびＣ３４０とＣ３６８。
さらに関心の実施態様では、ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチドのアミノ酸配列は、すくなくとも１個のシステイン残基、例えば１−１５個のシステイン残基、具体的には１−１０個、１−６個または２−４個のシステイン残基が、好ましくは置換により、導入されている点で配列番号１に示す配列と異なっている。
【００３８】
システイン残基が導入される位置の例は、上記蛋白質分解部位またはその近傍の位置を含むが、これらに限定されない。
即ち、本発明の関心の実施態様では、好ましくは置換により導入されるリジン残基は、Ｉ３０Ｃ、Ｋ３２Ｃ、Ｄ３３Ｃ、Ａ３４Ｃ、Ｔ３７Ｃ、Ｋ３８Ｃ、Ｗ４１Ｃ、Ｙ４４Ｃ、Ｓ４５Ｃ、Ｄ４６Ｃ、Ｌ１４１Ｃ、Ｅ１４２Ｃ、Ｋ１４３Ｃ、Ｒ１４４Ｃ、Ｌ２８８Ｃ、Ｄ２８９Ｃ、Ｒ２９０Ｃ、Ｇ２９１Ｃ、Ａ２９２Ｃ、Ｓ３１４Ｃ、Ｒ３１５Ｃ、Ｋ３１６Ｃ、Ｖ３１７Ｃ、Ｌ３９０Ｃ、Ｍ３９１Ｃ、Ｒ３９２Ｃ、Ｓ３９３Ｃ、Ｅ３９４Ｃ、Ｐ３９５Ｃ、Ｒ３９６Ｃ、Ｐ３９７Ｃ、Ｇ３９８Ｃ、Ｖ３９９Ｃ、Ｌ４０１Ｃ、Ｒ４０２Ｃ、Ａ４０３Ｃ、Ｐ４０４Ｃおよびその組み合わせより成るグループから選択され、特にＫ３２Ｃ、Ｙ４４Ｃ、Ｋ１４３Ｃ、Ｒ２９０Ｃ、Ｒ３１５Ｃ、Ｋ３４１Ｃ、Ｒ３９２Ｃ、Ｒ３９６Ｃ、Ｒ４０２Ｃおよびその組み合わせより選択される。
【００３９】
本発明のさらに関心の実施態様では、システイン残基は、少なくともその側鎖の２５％が表面に露出しているスレオニンまたはセリン残基により占められている野生型ｈＦＶＩＩ中の位置に導入される。例えばＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチドではシステイン残基は、好ましくは置換によりＳ１２、Ｓ２３、Ｓ４３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｔ８３、Ｓ１０３、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｔ１２８、Ｔ１３０、Ｓ１４７、Ｔ１８５、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｓ２３２、Ｔ２３３、Ｔ２３８、Ｔ２３９、Ｔ２５５、Ｔ２６７、Ｔ２９３、Ｔ３０７、Ｓ３２０、Ｔ３２４、Ｓ３３３、Ｓ３３６、Ｔ３７０およびＴ３９３より成るグループより選択される少なくとも１つの位置に導入される。さらにより好ましくは、システイン残基は、その位置がＳ１２、Ｓ２３、Ｓ４３，Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｓ１０３、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｓ１４７、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｓ２３２、Ｓ３２０、Ｓ３３３、Ｓ３３６およびＳ３９３より成るグループから選択される、Ｓ残基を含むｈＦＶＩＩの少なくとも１つの位置に導入される。
【００４０】
別の実施態様では、システイン残基は、少なくともその側鎖の５０％が表面に露出しているスレオニンまたはセリン残基により占められている野生型ｈＦＶＩＩ中の位置に導入される。例えばＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチドではシステイン残基は、好ましくは置換によりＳ２３、Ｓ４３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７、Ｓ２１４、Ｔ２３８、Ｔ２６７およびＴ２９３より成るグループより選択される少なくとも１つの位置に導入され、より好ましくはＳ２３、Ｓ４３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７およびＳ２１４より成るグループから選択された位置に導入される。
【００４１】
さらに別の実施態様では、システイン残基は上記位置のいずれかより選択された少なくとも１つの位置にあって、活性部位領域内に配置されていない位置に導入される。好ましくは、その位置はＴまたはＳ残基により占められている。例えばＦＶＩＩポリペプチドは、Ｓ１２、Ｓ２３、Ｓ４３，Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｔ８３、Ｓ１０３、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｔ１２８、Ｔ１３０、Ｓ１４７、Ｔ１８５、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｔ２５５，Ｔ２６７、Ｔ３０７、Ｓ３２０、Ｓ３３３、Ｓ３３６、Ｔ３７０およびＳ３９３（その側鎖の２５％より多い部分が表面に露出している）より成るグループから選択された、特にはＳ１２、Ｓ２３、Ｓ４３，Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｓ１０３、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｓ１４７、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｓ３２０、Ｓ３３３、Ｓ３３６およびＳ３９３（Ｓ残基で占められている）より成るグループから選択される、そしてより好ましくはＳ２３、Ｓ４３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７、Ｓ２１４およびＴ２６７（その側鎖の５０％より多い部分が表面に露出している）より成るグループ、特にはＳ２３、Ｓ４３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｓ１１１、Ｓ１４７およびＳ２１４（Ｓ残基で占められている）より成るグループから選択される少なくとも１つの部位に導入されたシステインを含む。
【００４２】
さらに別の実施態様では、システインは上記の何れかより選択され、そして組織結合部位領域に位置しない少なくとも１つの位置に導入される。好ましくは、その位置はＴまたはＳ残基により占められている。例えばＦＶＩＩポリペプチドは、Ｓ１２、Ｓ２３、Ｓ４３，Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｔ８３、Ｓ１０３、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｔ１２８、Ｔ１３０、Ｓ１４７、Ｔ１８５、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｓ２３２、Ｔ２３３，Ｔ２３８、Ｔ２３９、Ｔ２５５，Ｔ２６７、Ｔ２９３、Ｓ３２９、Ｔ３２４、Ｓ３３３、Ｓ３３６、Ｔ３７０およびＳ３９３（その側鎖の２５％より多い部分が表面に露出している）より成るグループから選択された、特にはＳ１２、Ｓ２３、Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｓ１０３、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｓ１４７、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｓ２３２、Ｓ３２０、Ｓ３３３、Ｓ３３６およびＳ３９３（Ｓ残基で占められている）より成るグループから選択され、そしてより好ましくはＳ２３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７、Ｓ２１４、Ｔ２３８、Ｔ２６７およびＴ２９３（その側鎖の５０％より多い部分が表面に露出している）より成るグループ、特にはＳ２３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７およびＳ２１４（Ｓ残基で占められている）より成るグループから選択される少なくとも１つの部位に導入されたシステインを含む。
【００４３】
よりさらに別の実施態様では、システインは上記掲載の何れかより選択され、そして組織結合部位領域または活性部位領域に位置しない少なくとも１つの位置に導入される。好ましくは、その位置はＴまたはＳ残基により占められている。例えばＦＶＩＩポリペプチドは、Ｓ１２、Ｓ２３、Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｔ８３、Ｓ１０３、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｔ１２８、Ｔ１３０、Ｓ１４７、Ｔ１８５、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｔ２５５，Ｔ２６７、Ｓ３２０、Ｓ３３３、Ｓ３３６、Ｔ３７０およびＳ３９３（その側鎖の２５％より多い部分が表面に露出している）より成るグループから選択された、特にはＳ１２、Ｓ２３、Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｓ１０３、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｓ１４７、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｓ３２０、Ｓ３３３、Ｓ３３６およびＳ３９３（Ｓ残基で占められている）より成るグループから選択され、そしてより好ましくはＳ２３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７、Ｓ２１４およびＴ２６７（その側鎖の５０％より多い部分が表面に露出している）より成るグループ、特にはＳ２３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７およびＳ２１４（Ｓ残基で占められている）より成るグループから選択される少なくとも１つの部位に導入されたシステインを含む。
【００４４】
本発明のこの観点によるコンジュゲートの非ポリペプチド部分は、既知コンジュゲーション方法を利用する場合に結合基となるシステインを有する分子であるが、非ポリペプチド部分はポリマー分子であることが好ましい。このポリマー分子は”ポリマー分子へのコンジュゲーション”と題する節に記載されているいずれかの分子でよいが、好ましくは直鎖型、または分岐型ポリエチレングリコールまたはその他ポリアルキレンオキサイドより成るグループから選択される。特に関心の実施態様では、ポリマー分子はＶＳ−ＰＥＧの様なＰＥＧである。ポリペプチドとポリマー間のコンジュゲーションは、好適方法、例えば”ポリマー分子へのコンジュゲーション”と題する節に記載されている様に、例えば１段階法、または前記の節に参照されている段階的方法を用い達成されるだろう。ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチドがただ１個のコンジュゲート性システイン残基を含む場合、それは約５ないし約２０ｋＤａ、例えば約１０ｋＤａないし約２０ｋＤａ、例えば約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１５ｋＤａ、または約２０ｋＤａの分子量を有する非ポリペプチドと直接に、または低分子ポリマー（ＷＯ９９／５５３７７に開示の様な）を介し間接的に好ましくコンジュゲートされる。コンジュゲートが２またはそれより多いコンジュゲート性システイン残基を含む場合、一般的には各非ポリペプチド部分は約５ないし約１０ｋＤａの、例えば約５ｋＤａまたは約１０ｋＤａの分子量を持つ。
本節に規定されるアミノ酸の変化、特に置換は、いずれかのアミノ酸の変化、好ましくはグリコシル化部位の導入および／または除去を含む、具体的なアミノ酸修飾を開示している本書他節に規定されている置換と組み合わせることができることが理解されるだろう。
【００４５】
非ポリペプチド分子が結合基としてアスパラギン酸またはグルタミン酸を有する分子である本発明のコンジュゲート
本発明のさらに別の関心実施態様では、非ポリペプチド部分は結合基としてアスパラギン酸またはグルタミン酸を有し、即ち本発明のコンジュゲートはポリペプチドに共有結合した非ポリペプチド部分を少なくとも１種含むコンジュゲートであり、この場合ポリペプチドのアミノ酸配列は少なくとも１個のアスパラギン酸残基および／または少なくとも１個のグルタミン酸残基が導入されているか、または除去されている点で配列番号１に示す野生型ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａの配列と異なっている。
別関心実施態様では、ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも１個のアミノ酸残基および／またはグルタミン酸残基、例えば１−１５個のアスパラギン酸残基および／または少なくとも１個、特には１−１０個の、１−６個の、または２−４個のアスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基が、好ましくは置換により導入されている点で配列番号１に示すアミノ酸配列と異なっている。
アスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基が導入される位置の例としては、上記の蛋白質分解部位、またはその近傍が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
即ち、本発明の関心実施態様では、好ましくは置換により導入されるアスパラギン酸および／またはグルタミン酸残基は、Ｉ３０Ｄ／Ｅ、Ｋ３２Ｄ／Ｅ、Ａ３４Ｄ／Ｅ、Ｔ３７Ｄ／Ｅ、Ｋ３８Ｄ／Ｅ、Ｗ４１Ｄ／Ｅ、Ｙ４４Ｄ／Ｅ、Ｓ４５Ｄ／Ｅ、Ｄ４６Ｃ、Ｌ１４１Ｄ／Ｅ、Ｅ１４２Ｄ／Ｅ、Ｋ１４３Ｄ／Ｅ、Ｒ１４４Ｄ／Ｅ、Ｌ２８８Ｄ／Ｅ、Ｒ２９０Ｄ／Ｅ、Ｇ２９１Ｄ／Ｅ、Ａ２９２Ｄ／Ｅ、Ｑ３１３Ｄ／Ｅ、Ｓ３１４Ｄ／Ｅ、Ｒ３１５Ｄ／Ｅ、Ｋ３１６Ｄ／Ｅ、Ｖ３１７Ｄ／Ｅ、Ｌ３９０Ｄ／Ｅ、Ｍ３９１Ｄ／Ｅ、Ｒ３９２Ｄ／Ｅ、Ｓ３９３Ｄ／Ｅ、Ｐ３９５Ｄ／Ｅ、Ｒ３９６Ｄ／Ｅ、Ｅ３９７Ｄ／Ｅ、Ｇ３９８Ｄ／Ｅ、Ｖ３９９Ｄ／Ｅ、Ｌ４０１Ｄ／Ｅ、Ｒ４０２Ｄ／Ｅ、Ａ４０２Ｄ／Ｅ、Ａ４０３Ｄ／Ｅ、Ｐ４０４Ｄ／Ｅおよびその組み合わせより成るグループから選択され、特にはＫ３２Ｄ／Ｅ、Ｙ４４Ｄ／Ｅ、Ｋ１４３Ｄ／Ｅ、Ｒ２９０Ｄ／Ｅ、Ｒ３１５Ｄ／Ｅ、Ｋ３４１Ｄ／Ｅ、Ｒ３９２Ｄ／Ｅ、Ｒ３９６Ｄ／Ｅ、Ｒ４０２Ｄ／Ｅおよびその組み合わせより成るグループから選択される。
【００４７】
上記置換に加え、上記実施態様によるコンジュゲートのポリペプチドは、少なくとも１個のアスパラギン酸残基、および／または少なくとも１種類のグルタミン酸残基の、好ましくは置換による除去を含んでもよい。
親ポリペプチドのリジン残基量が比較的多いことから、非ポリペプチド部分への過剰なコンジュゲーションを回避するためには、少なくとも１個のアスパラギン酸またはグルタミン酸残基が、特には置換により好ましく排除されるべきである。
【００４８】
即ち実施態様の一つでは、本発明のコンジュゲートのＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチド部分のアミノ酸配列は、少なくとも１個のアミノ酸残基および／またはグルタミン酸残基、例えば１−１５個のアスパラギン酸残基および／または少なくとも１個、特には１−１０個の、１−６個の、または２−４個のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基が、好ましくは置換により導入されている点で配列番号１に示すアミノ酸配列と異なっている。例えば、好ましくは置換により除去されるアスパラギン酸およびグルタミン酸残基は、Ｄ３３、Ｄ４６、Ｄ４８、Ｅ７７、Ｅ８２、Ｄ８６、Ｄ８７、Ｅ９４、Ｅ９９、Ｄ１０４、Ｅ１１６、Ｄ１２３、Ｅ１３２、Ｅ１４２、Ｅ１６３、Ｄ１９６、Ｅ２１０、Ｄ２１２、Ｅ２１５、Ｄ２１７、Ｄ２１９、Ｅ２２０、Ｄ２５６、Ｅ２６５、Ｅ２７０、Ｄ２８９、Ｅ２９６、Ｄ３０９、Ｄ３１９、Ｅ３２５、Ｄ３３４、Ｄ３３８、Ｄ３４３、Ｅ３８５、Ｅ３９４およびその組み合わせより成るグループから選択される。
【００４９】
親分子の所定位置に導入されるアスパラギン酸またはグルタミン酸の少なくとも１つは、上記のアスパラギン酸またはグルタミン酸残基の除去の少なくとも１つと組み合わされと特に好ましいことが理解されるだろう。即ち、本発明の好適実施態様では、コンジュゲートのＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチド部分のアミノ酸配列は、少なくとも１個のアスパラギン酸またはグルタミン酸残基が、好ましくは置換により除去され、そして少なくとも１個のアスパラギン酸またはグルタミン酸残基が置換により導入される点で、配列番号１に示す配列と異なっている。
結合基としてアスパラギン酸またはグルタミン酸基を持つ、本発明のこの側面による標識体の非ポリペプチド部分は、この様な性質を有する非ポリペプチド部分であればよいが、ここでは非ポリペプチド部分はポリマー分子または有機誘導剤、特にポリマー分子であり、そしてコンジュゲートは例えばＳａｋａｎｅとＰａｒｄｒｉｄｇｅ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．１４、Ｎｏ．８、１９９７、ｐｐ１０８５−１０９１記載の様に調製されることが好ましい。
本節に規定されるアミノ酸の変化、特に置換は、いずれかのアミノ酸の変化、好ましくはグリコシル化部位の導入および／または除去を含む、具体的なアミノ酸修飾を開示している本書他節に規定される置換と組み合わせることができることが理解されるだろう。
【００５０】
非ポリペプチド分子が糖成分である本発明のコンジュゲート
本発明のさらに関心実施態様では、グリコシル化部位、特にインビボグリコシル化部位の様な糖成分に関する結合基が挿入および／または除去されている。
好ましくは、本発明のコンジュゲートは少なくとも１個のポリペプチドに共有結合した糖成分を含み、そのポリペプチドのアミノ酸配列が少なくとも１個の非天然型グリコシル化部位が導入されており、そして／または少なくとも１個の天然型グリコシル化部位が除去されている点で配列番号１に示す野生型ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａのアミノ酸配列と異なっているコンジュゲートである。具体的には、非天然型グリコシル化部位が導入されるか、または非天然型グリコシル化部位が天然型グリコシル化部位の除去と組み合わせ導入されている。導入されたグリコシル化部位は、Ｏ−グリコシル化部位またはＮ−グリコシル化部位であろう。好ましくは、グリコシル化部位はインビボＯ−グリコシル化部位、またはインビボＮ−グリコシル化部位であり、特にはインビボＮ−グリコシル化部位である。
この関係で使用される場合、用語“天然型グリコシル化部位”は位置Ｎ１４５、Ｎ３２２、Ｓ５２およびＳ６０のグリコシル化部位をカバーする。同様に、用語“天然型インビボＯ−グリコシル化部位”は、Ｎ１４５およびＮ３２２を含む。
【００５１】
典型的には、ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも１個の非天然型ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも１個の非天然型グリコシル化部位（例えば少なくとも１個の非天延型インビボＮ−グリコシル化部位）、例えば１−１５個の非天然型グリコシル化部位（例えば１−１５個の非天然型インビボＮ−グリコシル化部位）、具体的には１−１０個、１−６個、または２−４個の非天然型グリコシル化部位（例えば１−１０個、１−６個、または２−４個のインビボ非天然型グリコシル化部位）が、好ましくは置換により導入されている点で、配列番号１に示すアミノ酸配列と異なる。
コンジュゲートのポリペプチドが１または複数のグリコシル化部位を含んでいるコンジュゲートを調製するには、ポリペプチドはグリコシル化部位に糖成分（オリゴ糖）を結合できる宿主細胞内にて発現されるか、またはインビトログリコシル化にかけなければならない。グリコシル化宿主細胞の例は、“糖成分への結合”と題する以下の節に示されている。
【００５２】
この側面の関心実施態様では、インビボグリコシル化部位は分子表面に露出した、好ましくは側鎖の２５％より多くが溶媒に曝される、特に好ましくは側鎖の５０％より多くが溶媒に曝されるアミノ酸残基により占められている親ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａ分子の位置に導入される（これらの位置は本書方法の節に規定されている）。次に、Ｎ−グリコシル化部位は前記部位のＮ−残基が前記位置に配置される様に導入される。同様に、Ｏ−グリコシル化部位は、それら位置を形成するＳまたはＴ残基が前記位置に配置される用に導入される。この様な位置の例にはＫ３２Ｓ／Ｔ、１４２Ｓ／Ｔ、Ｙ４４Ｓ／Ｔ、Ｋ１４３Ｓ／Ｔ、Ｒ２９０Ｓ／Ｔ、Ｒ３１５Ｓ／Ｔ、Ｋ３４１Ｓ／Ｔ、Ｒ３９２Ｓ／Ｔ、Ｒ３９６Ｓ／Ｔ、Ｒ４０２Ｓ／Ｔおよびその組み合わせが含まれる。
【００５３】
Ｎ−グリコシル化部位に関しては、インビボグリコシル化部位は部位形成に１個の突然変異だけが必要とされる位置に導入される（即ち機能的グリコシル化部位の形成に必要な他アミノ酸残基は既に分子内に存在している）。
換言すれば本発明のコンジュゲートは、ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも１個の天然型Ｎ−Ｘ−Ｘ‘配列が、Ｎ−Ｘ’−ＳまたはＮ−Ｘ‘−Ｔ配列により置換され、前記Ｘ’がＰ以外のアミノ酸であり、ＸがＳおよびＴ以外のアミノ酸でる点で、配列番号１と異なっているコンジュゲートである。
同様に本発明のコンジュゲートは、好ましくはポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１にある少なくとも１個の天然型Ｘ−Ｘ‘−ＳまたはＸ−Ｘ’−Ｔ配列が、Ｎ−Ｘ’−ＳまたはＮ−Ｘ‘−Ｔ配列により置換され、前記Ｘ’がＰ以外のアミノ酸であり、ＸがＮ以外のアミノ酸でる点で、配列番号１と異なっているコンジュゲートである。
【００５４】
インビボＮ−グリコシル化部位を形成するこの様な置換の具体例としては、Ｆ４Ｓ／Ｔ、Ｐ１０Ｎ、Ｑ２１Ｎ、Ｗ４１Ｎ、Ｓ４３Ｎ、Ａ５１Ｎ、Ｇ５８Ｎ、Ｌ６５Ｎ、Ｇ５９Ｓ／Ｔ、Ｅ８２Ｓ／Ｔ、Ｎ９５Ｓ／Ｔ、Ｇ９７Ｓ／Ｔ、Ｙ１０１Ｎ、Ｄ１０４Ｎ、Ｔ１０６Ｎ、Ｋ１０９Ｎ、Ｇ１１７Ｎ、Ｇ１２４Ｎ、Ｓ１２６Ｎ、Ｔ１２８Ｎ、Ａ１７５Ｓ／Ｔ、Ｇ１７９Ｎ、Ｉ１８６Ｓ／Ｔ、Ｖ１８８Ｎ、Ｒ２０２Ｓ／Ｔ、Ｉ２０５Ｓ／Ｔ、Ｄ２１２Ｎ、Ｅ２２０Ｎ、Ｉ２３０Ｎ、Ｐ２３１Ｎ、Ｐ２３６Ｎ、Ｇ２３７Ｎ、Ｖ２５３Ｎ、Ｅ２６５Ｎ、Ｔ２６７Ｎ、Ｅ２７０Ｎ、Ｒ２７７Ｎ、Ｌ２８０Ｎ、Ｇ２９１Ｎ、Ｐ３０３Ｓ／Ｔ、Ｌ３０５Ｎ、Ｑ３１２Ｎ、Ｇ３１８Ｎ、Ｇ３３１Ｎ、Ｄ３３４Ｎ、Ｋ３３７Ｎ、Ｇ３４２Ｎ、Ｈ３４８Ｎ、Ｒ３５３Ｎ、Ｙ３５７Ｎ、Ｉ３６１Ｎ、Ｖ３７６Ｎ、Ｒ３７９Ｎ、Ｍ３９１Ｎおよびその組み合わせより成るグループから選択された置換が挙げられる。好ましくは、置換はＦ４Ｓ／Ｔ、Ｐ１０Ｎ、Ｑ２１Ｎ、Ｗ４１Ｎ、Ａ５１Ｎ、Ｇ５８Ｎ、Ｇ５９Ｓ／Ｔ、Ｎ９５Ｓ／Ｔ、Ｇ９７Ｓ／Ｔ、Ｙ１０１Ｎ、Ｄ１０４Ｎ、Ｔ１０６Ｎ、Ｋ１０９Ｎ、Ｇ１１７Ｎ、Ｇ１２４Ｎ、Ｓ１２６Ｎ、Ｔ１２８Ｎ、Ａ１７５Ｓ／Ｔ、Ｉ１８６Ｓ／Ｔ、Ｖ１８８Ｎ、Ｒ２０２Ｓ／Ｔ、Ｉ２０５Ｓ／Ｔ、Ｄ２１２Ｎ、Ｅ２２０Ｎ、Ｖ２５３Ｎ、Ｅ２６５Ｎ、Ｔ２６７Ｎ、Ｅ２７０Ｎ、Ｌ２８０Ｎ、Ｇ２９１Ｎ、Ｐ３０３Ｓ／Ｔ、Ｇ３１８Ｎ、Ｇ３３１Ｎ、Ｄ３３４Ｎ、Ｋ３３７Ｎ、Ｒ３５３Ｎ、Ｙ３５７Ｎ、Ｍ３９１Ｎおよびその組み合わせより成るグループから選択される。
【００５５】
あるいはインビボグリコシル化部位は、リジン残基またはアルギニン残基に占められている位置に、好ましくはリジン残基に占められている位置に、具体的にはＮ−グリコシル化部位のＮ−残基またはＯ−グリコシル化部位のＳまたはＴ残基がリジン残基と置換する形で導入される。
別の形で表現すれば、本発明のコンジュゲートは、好ましくは、ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１に天然に存在している、Ｋ−Ｘ‘−Ｘ配列またはＲ−Ｘ‘−Ｘ配列、好ましくはＫ−Ｘ’−Ｘ配列の少なくとも１個がＮ−Ｘ‘−ＳまたはＮ−Ｘ’−Ｔ配列により置換され、前記Ｘ‘がＰ以外のアミノ酸であり、ＸがＳおよびＴ以外のアミノ酸である点で配列番号１と異なっているコンジュゲートである。
【００５６】
インビボＮ−グリコシル化部位を作り出すこの様な置換例は、Ｋ３２Ｎ＋Ａ３４Ｓ／Ｔ、Ｋ３８Ｎ＋Ｆ４０Ｓ／Ｔ、Ｋ６２Ｎ＋Ｑ６４Ｓ／Ｔ、Ｋ８５Ｎ＋Ｄ８７Ｓ／Ｔ、Ｋ１３７Ｎ＋Ｐ１３９Ｓ／Ｔ、Ｋ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｓ／Ｔ、Ｋ１４８Ｎ＋Ｑ１４９Ｓ／Ｔ、Ｋ１６１Ｎ＋Ｅ１６３Ｓ／Ｔ、Ｋ１９７Ｎ＋Ｋ１９９Ｓ／Ｔ、Ｋ１９９Ｎ＋Ｗ２０１Ｓ／Ｔ、Ｋ３１６Ｎ＋Ｇ３１８Ｓ／Ｔ、Ｋ３３７Ｎ、Ｋ３４１Ｎ＋Ｄ３４３Ｓ／Ｔ、Ｋ３８９Ｎ＋Ｍ３９１Ｓ／Ｔおよびその組み合わせより成るグループから選択される例を含む。
上記グリコシル化の側面に関するさらに関心の実施態様では、グリコシル化部位、特にＮ−グリコシル化部位が上記蛋白質分解の位置、または近傍に導入されるだろう（“本発明のコンジュゲート”と題する節参照）。
【００５７】
即ち、インビボＮ−グリコシル化部位を作り出すこの様な置換の具体例としては、Ｋ３２Ｎ＋Ａ３４Ｓ／Ｔ、Ｆ３１Ｎ＋Ｄ３３Ｓ／Ｔ、Ｉ３０Ｎ＋Ｋ３２Ｓ／Ｔ、Ａ３４Ｎ＋Ｒ３６Ｓ／Ｔ、Ｋ３８Ｎ＋Ｆ４０Ｓ／Ｔ、Ｔ３７Ｎ＋Ｌ３９Ｓ／Ｔ、Ｒ３６Ｎ＋Ｋ３８Ｓ／Ｔ、Ｌ３９Ｎ＋Ｗ４１Ｓ／Ｔ、Ｆ４０Ｎ＋Ｉ４２Ｓ／Ｔ、Ｗ４１Ｎ、Ｉ４２Ｎ＋Ｙ４４Ｓ／Ｔ、Ｓ４３Ｎ、Ｙ４４Ｎ＋Ｄ４６Ｓ／Ｔ、Ｓ４５Ｎ＋Ｇ４７Ｓ／Ｔ、Ｄ４６Ｎ＋Ｄ４８Ｓ／Ｔ、Ｇ４７Ｎ＋Ｑ４９Ｓ／Ｔ、Ｋ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｓ／Ｔ、Ｅ１４２Ｎ＋Ｒ１４４Ｓ／Ｔ、Ｌ１４１Ｎ＋Ｋ１４３Ｓ／Ｔ、Ｉ１４０Ｎ＋Ｅ１４２Ｓ／Ｔ、Ｒ１４４Ｎ＋Ａ１４６Ｓ／Ｔ、Ａ１４６Ｎ＋Ｋ１４８Ｓ／Ｔ、Ｓ１４７Ｎ＋Ｐ１４９Ｓ／Ｔ、Ｒ２９０Ｎ＋Ａ２９２Ｓ／Ｔ、Ｄ２８９Ｎ＋Ｇ２９１Ｓ／Ｔ、Ｌ２８８Ｎ＋Ｒ２９０Ｓ／Ｔ、Ｌ２８７Ｎ＋Ｄ２８９Ｓ／Ｔ、Ｇ２９１Ｎ、Ａ２９２Ｎ＋Ａ２９４Ｓ／Ｔ、Ｔ２９３Ｎ＋Ｌ２９５Ｓ／Ｔ、Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｓ／Ｔ、Ｓ３１４Ｎ＋Ｋ３１６Ｓ／Ｔ、Ｑ３１３Ｎ＋Ｒ３１５Ｓ／Ｔ、Ｑ３１２Ｎ、Ｋ３１６Ｎ＋Ｇ３１８Ｓ／Ｔ、Ｖ３１７Ｎ＋Ｄ３１９Ｓ／Ｔ、Ｇ３１８Ｎ、Ｋ３４１Ｎ＋Ｄ３４３Ｓ／Ｔ、Ｓ３３９Ｎ＋Ｋ３４１Ｓ／Ｔ、Ｇ３４２Ｎ、Ｄ３４３Ｎ＋Ｇ３４５Ｓ／Ｔ、Ｒ３９２Ｎ＋Ｅ３９４Ｓ／Ｔ、Ｍ３９１Ｎ、Ｌ３９０Ｎ＋Ｒ３９２Ｓ／Ｔ、Ｋ３８９Ｎ＋Ｍ３９１Ｓ／Ｔ、Ｓ３９３Ｎ＋Ｐ３９５Ｓ／Ｔ、Ｅ３９４Ｎ＋Ｒ３９６Ｓ／Ｔ、Ｐ３９５Ｎ＋Ｐ３９７Ｓ／Ｔ、Ｒ３９６Ｎ＋Ｇ３９８Ｓ／Ｔ、Ｐ３９７Ｎ＋Ｖ３９９Ｓ／Ｔ、Ｇ３９８Ｎ＋Ｌ４００Ｓ／Ｔ、Ｖ３９９Ｎ＋Ｌ４０１Ｓ／Ｔ、Ｌ４００Ｎ＋Ｒ４０２Ｓ／Ｔ、Ｌ４０１Ｎ＋Ａ４０３Ｓ／Ｔ、Ｒ４０２Ｎ＋Ｐ４０４Ｓ／Ｔ、Ａ４０３Ｎ＋Ｆ４０５Ｓ／Ｔ、Ｐ４０４Ｎ＋Ｐ４０６Ｓ／Ｔおよび例えばＫ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｓ／Ｔ＋Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｓ／Ｔの様なその組み合わせより成るグループから選択される置換を含む。好ましくは、置換はＫ３２Ｎ＋Ａ３４Ｓ／Ｔ、Ｋ３８Ｎ＋Ｆ４０Ｓ／Ｔ、Ｙ４４Ｎ＋Ｄ４６Ｓ／Ｔ、Ｋ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｓ／Ｔ、Ｒ２９０Ｎ＋Ａ２９２Ｓ／Ｔ、Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｓ／Ｔ、Ｋ３４１Ｎ＋Ｄ３４３Ｓ／Ｔ、Ｒ３９２Ｎ＋Ｅ３９４Ｓ／Ｔ、Ｒ３９６Ｎ＋Ｇ３９８Ｓ／Ｔ、Ｒ４０２Ｎ＋Ｐ４０４Ｓ／Ｔおよび、例えばＫ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｓ／Ｔ＋Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｓ／Ｔの様なそれらの組み合わせより成るグループから選択される。より好ましくは、置換はＫ３２Ｎ＋Ａ３４Ｔ、Ｋ３８Ｎ＋Ｆ４０Ｔ、Ｙ４４Ｎ＋Ｄ４６Ｔ、Ｋ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｔ、Ｒ２９０Ｎ＋Ａ２９２Ｔ、Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｔ、３４１Ｎ＋Ｄ３４３Ｔ、Ｒ３９２Ｎ＋Ｅ３９４Ｔ、Ｒ３９６Ｎ＋Ｇ３９８Ｔ、Ｒ４０２Ｎ＋Ｐ４０４ＴおよびＫ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｔ＋Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｔの様な、それらの組み合わせから成るグループより選択される。
【００５８】
本発明のよりさらに関心の実施態様では、インビボグリコシル化部位は、ここに規定される組織因子結合部分を形成しない、または活性部位領域と活性部位結合裂溝のリッジを形成しない位置に導入されるのが好ましい。この様なグリコシル化変異体は一次的には前記規定の活性コンジュゲートに分類されると考えられる。
即ちこの様なインビボＮ−グリコシル化部位を形成する具体的置換例は、Ｋ３２Ｎ＋Ａ３４Ｓ／Ｔ、Ｉ３０Ｎ＋Ｋ３２Ｓ／Ｔ、Ａ３４Ｎ＋Ｒ３６Ｓ／Ｔ、Ｋ３８Ｎ＋Ｆ４０Ｓ／Ｔ、Ｔ３７Ｎ＋Ｌ３９Ｓ／Ｔ、Ｗ４１Ｎ、Ｙ４４Ｎ＋Ｄ４６Ｓ／Ｔ、Ｓ４５Ｎ＋Ｇ４７Ｓ／Ｔ、Ｄ４６Ｎ＋Ｄ４８Ｓ／Ｔ、Ｇ４７Ｎ＋Ｑ４９Ｓ／Ｔ、Ｋ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｓ／Ｔ、Ｅ１４２Ｎ＋Ｒ１４４Ｓ／Ｔ、Ｌ１４１Ｎ＋Ｋ１４３Ｓ／Ｔ、Ｉ１４０Ｎ＋Ｅ１４２Ｓ／Ｔ、Ｒ１４４Ｎ＋Ａ１４６Ｓ／Ｔ、Ａ１４６Ｎ＋Ｋ１４８Ｓ／Ｔ、Ｓ１４７Ｎ＋Ｐ１４９Ｓ／Ｔ、Ｌ２８８Ｎ＋Ｒ２９０Ｓ／Ｔ、Ｌ２８７Ｎ＋Ｄ２８９Ｓ／Ｔ、Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｓ／Ｔ、Ｓ３１４Ｎ＋Ｋ３１６Ｓ／Ｔ、Ｋ３１６Ｎ＋Ｇ３１８Ｓ／Ｔ、Ｖ３１７Ｎ＋Ｄ３１９Ｓ／Ｔ、Ｇ３１８Ｎ、Ｒ３９２Ｎ＋Ｅ３９４Ｓ／Ｔ、Ｍ３９１Ｎ、Ｌ３９０Ｎ＋Ｒ３９２Ｓ／Ｔ、Ｋ３８９Ｎ＋Ｍ３９１Ｓ／Ｔ、Ｓ３９３Ｎ＋Ｐ３９５Ｓ／Ｔ、Ｅ３９４Ｎ＋Ｒ３９６Ｓ／Ｔ、Ｐ３９５Ｎ＋Ｐ３９７Ｓ／Ｔ、Ｒ３９６Ｎ＋Ｇ３９８Ｓ／Ｔ、Ｐ３９７Ｎ＋Ｖ３９９Ｓ／Ｔ、Ｇ３９８Ｎ＋Ｌ４００Ｓ／Ｔ、Ｖ３９９Ｎ＋Ｌ４０１Ｓ／Ｔ、Ｌ４０１Ｎ＋Ａ４０３Ｓ／Ｔ、Ｒ４０２Ｎ＋Ｐ４０４Ｓ／Ｔ、Ａ４０３Ｎ＋Ｆ４０５Ｓ／Ｔ、Ｐ４０４Ｎ＋Ｐ４０６Ｓ／Ｔおよび例えばＫ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｓ／Ｔ＋Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｓ／Ｔの様なその組み合わせより成るグループから選択される置換を含む。好ましくは、置換はＫ３２Ｎ＋Ａ３４Ｓ／Ｔ、Ｋ３８Ｎ＋Ｆ４０Ｓ／Ｔ、Ｙ４４Ｎ＋Ｄ４６Ｓ／Ｔ、Ｋ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｓ／Ｔ、Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｓ／Ｔ、Ｒ３９２Ｎ＋Ｅ３９４Ｓ／Ｔ、Ｒ３９６Ｎ＋Ｇ３９８Ｓ／Ｔ、Ｒ４０２Ｎ＋Ｐ４０４Ｓ／Ｔおよび、例えばＫ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｓ／Ｔ＋Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｓ／Ｔの様なそれらの組み合わせより成るグループから選択される。より好ましくは、置換はＫ３２Ｎ＋Ａ３４Ｔ、Ｋ３８Ｎ＋Ｆ４０Ｔ、Ｙ４４Ｎ＋Ｄ４６Ｔ、Ｋ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｔ、Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｔ、Ｒ３９２Ｎ＋Ｅ３９４Ｔ、Ｒ３９６Ｎ＋Ｇ３９８Ｔ、Ｒ４０２Ｎ＋Ｐ４０４ＴおよびＫ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｔ＋Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｔの様な、それらの組み合わせから成るグループより選択される。
【００５９】
本発明のよりさらに関心の実施態様では、インビボグリコシル化部位は、ここに規定される組織因子結合部分を形成しないが、活性部位領域と活性部位結合裂溝のリッジを形成する位置に導入されるのが好ましい。この様なグリコシル化変異体は一次的には前記規定の不活性コンジュゲートに分類されると考えられる。
即ちこの様なインビボＮ−グリコシル化部位を形成する具体的置換例は、Ｉ１５３Ｎ＋Ｇ１５５Ｓ／Ｔ、Ｑ１６７Ｎ＋Ｌ１６９Ｓ／Ｔ、Ｖ１６８Ｎ＋Ｌ１７０Ｓ／Ｔ、Ｌ１６９Ｎ＋Ｌ１７１Ｓ／Ｔ、Ｌ１７０Ｎ＋Ｖ１７２Ｓ／Ｔ、Ｌ１７１Ｎ＋Ｎ１７３Ｓ／Ｔ、Ａ１７５Ｓ／Ｔ、Ａ１７５Ｎ＋Ｌ１７０Ｓ／Ｔ、Ｌ１７７Ｎ＋Ｇ１７９Ｓ／Ｔ、Ｇ１７９Ｎ、Ｇ１８０Ｎ＋Ｌ１８２Ｓ／Ｔ、Ｔ１８１Ｎ＋Ｉ１８３Ｓ／Ｔ、Ｖ１８８Ｎ、Ｖ１８９Ｎ＋Ａ１９１Ｓ／Ｔ、Ｓ１９０Ｎ＋Ａ１９２Ｓ／Ｔ、Ａ１９１Ｎ＋Ｈ１９３Ｓ／Ｔ、Ｈ１９３Ｎ＋Ｆ１９５Ｓ／Ｔ、Ｆ１９５Ｎ＋Ｋ１９７Ｓ／Ｔ、Ｄ１９６Ｎ＋Ｉ１９８Ｓ／Ｔ、Ｋ１９７Ｎ＋Ｋ１９９Ｓ／Ｔ、Ｉ１９８Ｎ＋Ｎ２００Ｓ／Ｔ、Ｋ１９９Ｎ＋Ｗ２０１Ｓ／Ｔ、Ｗ２０１Ｎ＋Ｎ２０３Ｓ／Ｔ、Ｒ２０２Ｓ／Ｔ、Ｉ２０５Ｓ／Ｔ、Ｖ２２８Ｎ＋Ｉ２３０Ｓ／Ｔ、Ｉ２２９Ｎ＋Ｐ２３１Ｓ／Ｔ、Ｉ２３０Ｎ、Ｐ２３１Ｎ、Ｓ２３２Ｎ＋Ｙ２３４Ｓ／Ｔ、Ｔ２３３Ｎ＋Ｖ２３５Ｓ／Ｔ、Ｙ２３４Ｎ＋Ｐ２３６Ｓ／Ｔ、Ｖ２３５Ｎ＋Ｇ２３７Ｓ／Ｔ、Ｐ２３６Ｎ、Ｇ２３７Ｎ、Ｔ２３８Ｎ＋Ｎ２４０Ｓ／Ｔ、Ｔ２３９Ｎ＋Ｈ２４１Ｓ／Ｔ、Ｈ２４１Ｎ＋Ｉ２４３Ｓ／Ｔ、Ｄ２４２Ｓ／Ｔ、Ｉ２４３Ｎ＋Ｌ２４５Ｓ／Ｔ、Ａ２４４Ｎ＋Ｌ２４６Ｓ／Ｔ、Ｌ２４５Ｎ＋Ｒ２４７Ｓ／Ｔ、Ｌ２４６Ｎ＋Ｌ２４６Ｓ／Ｔ、Ｖ２８１Ｎ＋Ｇ２８３Ｓ／Ｔ、Ｓ２８２Ｎ＋Ｗ２８４Ｓ／Ｔ、Ｇ２８３Ｎ＋Ｇ２８５Ｓ／Ｔ、Ｗ２８４Ｎ＋Ｑ２８６Ｓ／Ｔ、Ｇ２８５Ｎ＋Ｌ２８７Ｓ／Ｔ、Ｑ２８６Ｎ＋Ｌ２８８Ｓ／Ｔ、Ｄ２８９Ｎ＋Ｇ２９１Ｓ／Ｔ、Ｒ２９０Ｎ＋Ａ２９２Ｓ／Ｔ、Ｇ２９１Ｎ、Ａ２９２Ｎ＋Ａ２９４Ｓ／Ｔ、Ｔ２９３Ｎ＋Ｌ２９５Ｓ／Ｔ、Ｔ３２１Ｎ＋Ｉ３２３Ｓ／Ｔ、Ｔ３２４Ｎ＋Ｙ３２６Ｓ／Ｔ、Ｅ３２５Ｎ＋Ｍ３２７Ｓ／Ｔ、Ｙ３２６Ｎ＋Ｆ３２７Ｓ／Ｔ、Ｆ３２８Ｎ＋Ａ３３０Ｓ／Ｔ、Ｓ３３９Ｎ＋Ｋ３４１Ｓ／Ｔ、Ｋ３４１Ｎ＋Ｄ３４３Ｓ／Ｔ、Ｇ３４２Ｎ＋Ｓ３４４Ｓ／Ｔ、Ｄ３４３Ｎ＋Ｇ３４５Ｓ／Ｔ、Ｓ３４４Ｎ＋Ｇ３４６Ｓ／Ｔ、Ｇ３４５Ｎ＋Ｐ３４７Ｓ／Ｔ、Ｐ３４７Ｎ＋Ａ３４９Ｓ／Ｔ、Ｈ３４８Ｎ、Ｌ３５８Ｎ＋Ｇ３６０Ｓ／Ｔ、Ｔ３５９Ｎ＋Ｉ３６１Ｓ／Ｔ、Ｇ３６０Ｎ＋Ｖ３６２Ｓ／Ｔ、Ｉ３６１Ｎ、Ｖ３６２Ｎ＋Ｗ３６４Ｓ／Ｔ、Ｓ３６３Ｎ＋Ｇ３６５Ｓ／Ｔ、Ｗ３６４Ｎ＋Ｑ３６６Ｓ／Ｔ、Ｇ３６５Ｎ＋Ｇ３６７Ｓ／Ｔ、Ｔ３７０Ｎ＋Ｇ３７２Ｓ／Ｔ、Ｖ３７６Ｎ、Ｙ３７７Ｎ＋Ｒ３７９Ｓ／Ｔ、Ｔ３７８Ｎ＋Ｖ３８０Ｓ／Ｔ、Ｒ３７９Ｎ、Ｖ３８０Ｎ＋Ｑ３８２Ｓ／Ｔ、Ｑ３８２Ｎ＋Ｉ３８４Ｓ／Ｔ、Ｙ３８３Ｎ＋Ｅ３８５Ｓ／Ｔ、Ｗ３８６Ｎ＋Ｑ３８８Ｓ／Ｔ、Ｌ３８７Ｎ＋Ｋ３８９Ｓ／Ｔ、Ｌ４００Ｎ＋Ｒ４０２Ｓ／Ｔおよびその組み合わせより成るグループから選択される置換を含む。好ましくは、置換はＤ２８９Ｎ＋Ｇ２９１Ｓ／Ｔ、Ｒ２９０Ｎ＋Ａ２９２Ｓ／Ｔ、Ｇ２９１Ｎ、Ａ２９２Ｎ＋Ａ２９４Ｓ／Ｔ、Ｔ２９３Ｎ＋Ｌ２９５Ｓ／Ｔ、Ｓ３３９Ｎ＋Ｋ３４１Ｓ／Ｔ、Ｋ３４１Ｎ＋Ｄ３４３Ｓ／Ｔ、Ｇ３４２Ｎ＋Ｓ３４４Ｓ／Ｔ、Ｄ３４３Ｎ＋Ｇ３４５Ｓ／Ｔおよびその組み合わせより成るグループから選択される。より好ましくは、置換はＤ２８９Ｎ＋Ｇ２９１Ｔ、Ｒ２９０Ｎ＋Ａ２９２Ｔ、Ｇ２９１Ｎ、Ａ２９２Ｎ＋Ａ２９４Ｔ、Ｔ２９３Ｎ＋Ｌ２９５Ｔ、Ｓ３３９Ｎ＋Ｋ３４１Ｔ、Ｋ３４１Ｎ＋Ｄ３４３Ｔ、Ｇ３４２Ｎ＋Ｓ３４４Ｔ、Ｄ３４３Ｎ＋Ｇ３４５Ｔおよびその組み合わせより成るグループから選択される。
【００６０】
糖成分に加え、本節記載の本発明の側面によるコンジュゲートは、本出願書記載の如く、コンジュゲートのポリペプチド部分に存在する１またそれ以上の結合基にコンジュゲートする追加の非ポリペプチド部分、特にポリマーを含んでも良い。
本節に規定されるアミノ酸の変化、特に置換は、具体的なアミノ酸の変化を開示している本書他節規定のアミノ酸の変化、特に置換と組み合わせることができることが理解されるだろう。
例えば、置換Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｔおよび／またはＫ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｔを含む変異の様な、少なくとも１カ所のグリコシル化部位が導入され、そして／または除去された本節開示のグリコシル化変異体は、さらにＰＥＧの様なポリマー分子、またはその他非ポリペプチド部分とコンジュゲートさせてもよい。この目的に関しては、コンジュゲーションはＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチドに存在している結合基を利用し達成するか、または結合基を具体的には合計１−６個、特には３−４個、または１、２、３、４、５あるいは６個の結合基がコンジュゲーションに利用できる様に導入および／または除去してもよい。
好ましくはＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチドが２カ所のグリコシル化部位を含んでいる本発明のコンジュゲートでは、非ポリペプチド部分の数および分子量は、非ポリペプチド部分により加えられる合計分子量が５−２５ｋＤａの範囲、例えば１０−２５ｋＤａ、特には約５ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１５ｋＤａまたは約２０ｋＤａである用に選ばれる。
【００６１】
不活性コンジュゲート
本発明のコンジュゲートは、配列番号１のＲ１５２、Ｉ１５３、Ｓ３４４、Ｄ２４２およびＨ１９３より成るグループから選択された位置を占める少なくとも１つのアミノ酸残基を除去することで不活性化される。この除去は、上記アミノ酸残基の１またはそれ以上を置換、または欠失することで実行される。好ましくは、この除去は置換、特には保存的置換により実施される。従ってここで使用される不活性型ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチドは、以下の置換を１またはそれ以上含む：Ｘがいずれかのアミノ酸残基、好ましくは保存的置換を生ずるいずれかのアミノ酸残基であるＲ１５２Ｘ、Ｉ１５３Ｘ、Ｓ３４４Ｘ、Ｄ２４２ＸまたはＨ１９３Ｘ。例えば不活性型ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチドは、Ｘがリジン以外のいずれかのアミノ酸残基である（リジンはプロテアーゼ切断部位を形成する）突然変異Ｒ１５２Ｘを含む。その他具体的置換例としてはＩ１５３Ａ／Ｖ／Ｌ；Ｓ３４４Ｔ／Ａ／Ｇ／Ｙ；Ｄ２４２Ｅ／Ａおよび／またはＨ１９３Ｒ／Ａが挙げられる。
【００６２】
あるいは、活性型ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチドは、α−アミノ基Ｉ１５３をカルバミル化すること、またはポリペプチドをセリンプロテアーゼ阻害剤と複合体化することで不活性化することができる。好適セリンプロテアーゼ阻害剤は、例えば有機リン酸化合物、スルファニルフルオリド、ペプチドハロメチルケトンより成るグループから選択され、好ましくはダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロルメチルケトン、デンシル−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇクロルメチルケトン、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−ＡｒｇクロルメチルケトンまたはＰｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロルメチルケトンまたはアザペプチドである。
コンジュゲートはまた、続くグリコシル化がコンジュゲートを不活性化する用に選択された位置に少なくとも１カ所のグリコシル化部位を導入することで、不活性化してもよい。
上記“非ポリペプチド部分が糖成分である本発明のコンジュゲート”と題する節の最終部分に説明されている様に、この様なグリコシル化部位はここに規定される組織因子の一部を形成しないが、活性部位領域および活性部位結合裂溝のリッジ部分を形成する位置に導入されることが好ましい。好適置換の具体例は、上記“非ポリペプチド部分が糖成分である本発明のコンジュゲート”と題する節“に示されている。
【００６３】
本発明コンジュゲートの非ポリペプチド部分
上記詳細示した通り、本発明のコンジュゲートの非ポリペプチド部分は、ポリマー分子、親油性化合物、糖成分（インビボグリコシレーションを経て）および有機誘導化作用物質より成るグループから好ましく選択される。これら作用物質は全て、コンジュゲートのポリペプチド部分に望まれる特性を付与し、特に長い機能的インビボ半減期および／または長い血漿半減期を与える。コンジュゲートのポリペプチド部分は一般的には１種類の非ポリペプチド部分とのみコンジュゲートされるが、２またはそれ以上の種類の非ポリペプチド部分、例えばポリマー分子と糖成分、親油基と糖成分、有機誘導化作用物質と糖成分、親油基とポリマー分子等とコンジュゲートしてもよい。２またはそれ以上の種類の非ポリペプチド部分へのコンジュゲートは同時または連続的に実施されるだろう。
【００６４】
本発明のコンジュゲートの調製方法
次節“親油性化合物へのコンジュゲート”、“ポリマー分子へのコンジュゲート”、“糖成分へのコンジュゲート”および“有機誘導化作用物質へのコンジュゲート”では、具体的種類の非ポリペプチド部分へのコンジュゲートが記載されている。一般的には、本発明のポリペプチドコンジュゲートは、ポリペプチドの発生を誘導する条件の下に適当な宿主細胞を培養すること、およびポリペプチドを回収することにより生成されるが、この場合ａ）ポリペプチドは少なくとも１カ所のＮ−またはＯ−グリコシル化部位を有し、そして宿主細胞はインビボグリコシル化ができる真核生物宿主細胞であり、そして／またはｂ）ポリペプチドはインビトロで非ポリペプチド部分にコンジュゲートされる。
コンジュゲートは結合された非ポリペプチド部分の数、生成された分子の大きさおよび形状（例えばそれらが直鎖状か分岐状か）、およびポリペプチド中の結合部位に関し最適な分子が生成されるよう設計されなければならない。使用される非ポリペプチド部分の分子量は、例えば達成すべき所望作用に基づき選択される。例えば、コンジュゲートの主目的が高分子量のコンジュゲートを達成することであれば（例えば腎臓クリアランスを下げるために）、通常可能な限り少数の高分子型非ポリペプチド部分をコンジュゲートさせ、所望分子量を得ることが望ましい。高いシールディングが望まれる場合、それは十分な数の低分子型非ポリペプチド部分（例えば分子量が約３００Ｄａないし約５ｋＤａ、例えば分子量が３００Ｄａないし２ｋＤａのもの）を用い、ポリペプチドの全て、または殆ど全てのプロテアーゼ切断部位またはその他脆弱部位を効果的にシールドすることで得られる。
【００６５】
脂肪親和性化合物のコンジュゲート
ポリペプチドおよび脂肪親和性化合物は直接またはリンカーを利用し、相互にコンジュゲートされる。脂肪親和性化合物は飽和型または不飽和型脂肪酸、脂肪酸ジケトン、テルペン、プロスタグランジン、ビタミン、カロテノイドまたはステロイドの様な天然化合物、または１またはそれ以上のアルキル、アリール、アルケニルまたはその他複数の不飽和型化合物を有する炭素酸、アルコール、アミンおよびスルホン酸の様な合成化合物である。随意リンカーを使用する、ポリペプチドおよび脂肪親和性化合物間のコンジュゲートは、当分野既知の方法、例えばＰｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７６にＢｏｄａｎｓｚｋｙにより記載さた、およびＷＯ９６／１２５０５に記載の方法に従い行われる。
【００６６】
ポリペプチドのＮ−末端にポリマー分子をコンジュゲートさせることを含む、ポリマー分子へのコンジュゲート
ポリペプチドにコンジュゲートされるポリマー分子は、典型的には分子量が約３００−１００，０００Ｄａの範囲、例えば約５００−２０，０００Ｄａ，より好ましくは約５００−１５，０００Ｄａ、さらにより好ましくは約２−１２Ｋｄａの範囲、例えば約３−１０ｋＤａの範囲にある天然または合成ホモポリマーまたはヘテロポリマーの様な好適ポリマーである。ここで用語”約”が特定の分子量と結びつけられて用いられる場合、語”約”はおおよその平均分子量を示しており、そのポリマー標本にはある分子量分布が通常あるという事実を反映している。
ホモポリマーの例にはポリオール（即ちポリ−ＯＨ）、ポリアミン（即ちポリ−ＮＨ２）およびポリカルボン酸（即ちポリ−ＣＯＯＨ）が含まれる。ヘテロポリマーは、例えばヒドロキシル基とアミン基のように異なる結合基を含むポリマーである。
【００６７】
好適ポリマー分子の例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）の様なポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）を含むポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、分岐型ＰＥＧｓ、ポリ−ビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリ−（ビニルプロピリドン）、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、カルボキシメチル−デキストランを含むデキストラン、または免疫原性を下げること、および／または機能的インビボ半減期および／または血清半減期を上昇させることに適したその他バイオポリマーが含まれる。ポリマー分子のその他の例はヒトアルブミン、またはその他豊富な血漿蛋白質である。一般にポリアルキレングリコール誘導ポリマーは生体適合性の無毒、無抗原性、無免疫原性であり、様々な水溶特性を有し、生物から容易に排泄される。
ＰＥＧは例えばデキストランの様な多糖類に比べると架橋結合する可能性のある反応基がごく僅かであることから、好適なポリマー分子である。具体的には単官能性ＰＥＧ、例えばメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）は、その結合化学が比較的単純（ポリペプチドの結合基とコンジュゲートできる反応基が１つのみ）であることから、興味深い。従って、架橋形成のリスクが無くなり、生じるポリペプチドコンジュゲートはより均一であり、ポリマー分子とポリペプチドとの反応はより簡単に制御される。
【００６８】
ポリペプチドへのポリマー分子の共有結合させるために、ポリマー分子のヒドロキシル末端基は活性型にならねばならず、即ち反応性官能基（例としては１次アミノ基、ヒドラジド（ＨＺ）、チオール、琥珀酸エステル（ＳＵＣ）、スクシンイミジル琥珀酸エステル（ＳＳ）、スクシンイミジルスクシナミド（ＳＳＡ）、スクシンイミジルプロプリオネート（ＳＰＡ）、スクシンイミジカルボキシメチレート（ＳＣＭ）、ベンゾトリアゾール炭酸エステル（ＢＴＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、アルデヒド、ニトロフェニルカルボン酸エステル（ＮＰＣ）およびトレシレート（ＴＲＥＳ）が挙げられる）が提供されなければならない。好適活性型ポリマー分子は、例えばＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、米国またはＰｏｌｙＭＡＳＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｐｌｃ、英国より市販されている。
あるいはポリマー分子は当業界既知の通常の方法、例えばＷＯ９０／１３５４０に開示の方法により活性化することができる。本発明に使用できる活性化直鎖または分岐型ポリマー分子の具体例は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｉｎｃ．１９９７および２０００年版カタログ（参照されここに取り込まれているＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）に記載されている。活性化ＰＥＧポリマーの具体例としては、次の直鎖型ＰＥＧｓが挙げられる：ＮＨＳ−ＰＥＧ（例えばＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＢＡ−ＰＥＧ、ＳＳ−ＰＥＧ、ＳＳＡ−ＰＥＧ、ＳＣ−ＰＥＧ、ＳＧ−ＰＥＧおよびＳＣＭ−ＰＥＧ）およびＮＯＲ−ＰＥＧ、ＢＴＣ−ＰＥＧ、ＥＰＯＸ−ＰＥＧ、ＮＣＯ−ＰＥＧ、ＮＰＣ−ＰＥＧ、ＣＤＩ−ＰＥＧ、ＡＬＤ−ＰＥＧ、ＴＲＥＳ−ＰＥＧ、ＶＳ−ＰＥＧ、ＩＯＤＯ−ＰＥＧおよびＭＡＬ−ＰＥＧ、ならびに例えばＰＥＧ２−ＮＥＳや共に参照されここに取り込まれている米国特許第５，９３２，４６２号および米国特許第５，６４３、５７５号に記載の分岐型ＰＥＧが挙げられる。さらに参照されここに取り込まれている次の公開物も有益なポリマー分子および／またはＰＥＧ化化学を開示している：米国特許第５，８２４，７７８号、米国特許第５，４７６，６５３号、ＷＯ９７／３２６０７号、欧州特許第２２９、１０８号、欧州特許第４０２，３７８号、米国特許第４，９０２、５０２号、米国特許第５，２８１，６９８号、米国特許第５，１２２，６１４号、米国特許第５，２１９，５６４号、ＷＯ９２／１６５５５、ＷＯ９４／０４１９３、ＷＯ９４／１４７５８、ＷＯ９４／１７０３９、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／２８０２４、ＷＯ９５／００１６２、ＷＯ９５／１１９２４、ＷＯ９５／１３０９０、ＷＯ９５／３３４９０、ＷＯ９５／３３４９０、ＷＯ９６／０００８０、ＷＯ９７／１８８３２、ＷＯ９８／４１５６２、ＷＯ９８／４８８３７、ＷＯ９９／３２１３４、ＷＯ９９／３２１３９、ＷＯ９９／３２１４０、ＷＯ９６／４０７９１、ＷＯ９８／３２４６６、ＷＯ９５／０６０５８、欧州特許第４３９  ５０８号、ＷＯ９７／０３１０６、ＷＯ９６／２１４６９、ＷＯ９５／１３３１２、欧州特許第９２１  １３１号、米国特許第５、７３６、６２５号、ＷＯ９８／０５３６３、欧州特許第８０９  ９９６号、米国特許第５，６２９，３８４号、ＷＯ９６／４１８１３、ＷＯ９６／０７６７０、米国特許第５，４７３，０３４号、米国特許第５，５１６，６７３号、欧州特許第６０５，９６３号、米国特許第５，３８２，６５７号、欧州特許第５１０  ３５６号、欧州特許第４００  ４７２号、欧州特許第１８３  ５０３号および欧州特許第１５４  ３１６号。
【００６９】
ポリペプチドおよび活性化ポリマー分子のコンジュゲートは、例えば次の参考資料（ポリマー分子の活性化に関する好適方法も記載している）に開示されている様な通常の方法を用い、行われる：Ｒ．Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ、（１９９１）、“蛋白質固定化。基礎と応用（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ．Ｆｕｎｄａｍｅｔｎａｌ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）”、マクセルデッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．），；Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ、（１９９２）、“蛋白質のコンジュゲーションと架橋の化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ”、ＣＲＣプレス（Ｐｒｅｓｓ）、フロリダ（Ｆｌｏｒｉｄａ）、米国（ＵＳＡ）；Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら、（１９９３）、“固定化親和性リガンド技術（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）”、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．））。当業者は使用する活性化法および／またはコンジュゲート化学がポリペプチドの結合基（上記詳細の例）およびポリマーの官能基（例えばアミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、スルフィドリル、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルフォン、またはハロ酢酸エステルの様な）に依存することに気付くだろう。ＰＥＧ化はポリペプチドのあらゆる利用可能な基（即ちポリペプチドの表面に露出している結合基）へのコンジュゲートを目的とするか、あるいは１またはそれ以上の特異的結合基、例えば米国特許５，９８５，２６５号記載のＮ−末端アミノ基に向けられている。さらに、コンジュゲートは１段階または段階的に行うことができる（例えばＷＯ９９／５５３７７号記載の様に）。
【００７０】
ＰＥＧ化は、結合するＰＥＧ分子の数、その様な分子の大きさおよび形状（例えばそれらが直鎖状または分岐状か）、およびポリペプチド内での結合部位に関し最適な分子を生成する様にデザインされる。使用するポリマーの分子量は、例えば得ようとする所望効果に基づき選択される。例えば、コンジュゲートの主目的が高分子量を持つコンジュゲートを得ることである場合には（例えば腎臓クリアランスを下げるために）、所望分子量を得るためには通常可能な限り小数の高分子量のポリマーをコンジュゲートすることが望まれる。高いシールディングが望まれる場合、それは十分な数の低分子型非ポリペプチド部分（例えば分子量が約３００Ｄａないし約５ｋＤａを持つもの）を用い、ポリペプチドの全て、または殆ど全てのプロテアーゼ切断部位またはその他脆弱部位を効果的にシールドすることで得られる。例えば２−８種類、例えば３−６種類のポリマーが用いられる。
蛋白質の単一結合基（例えばＮ−末端のアミノ基）にだけコンジュゲートさせる場合には、直鎖型または分岐型であるポリマー分子は高分子量、好ましくは約１０−２５ｋＤａ、例えば約１５−２５ｋＤａ、例えば約２０ｋＤａの分子量を持つことが好都合である。
一般に、ポリマーコンジュゲートは利用可能なポリマー結合基の多くがポリマー分子と結合することを狙った条件の下に、実施される。これは、ポリペプチドに対し好適なモル過剰量のポリマーを使うことで達成される。典型的には、ポリペプチドに対する活性化ポリマー分子のモル比は約１０００−１までであり、例えば約２００−１、または約１００−１までである。しかし幾つかの例では、最適反応を得るためのこの比率は若干低く、例えば約５０−１、１０−１、または５−１である。
【００７１】
本発明ではまた、リンカーを介しポリペプチドにポリマー分子を結合させることも想定される。好適リンカーは当業者周知である。高適例は塩化シアヌール酸である（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、（１９７７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２、３５７８−３５８１；米国特許第４，１７９，３３７号；Ｓｈａｆｅｒら、（１９８６）、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．，２４，３７５−３７８）。
コンジュゲートに続き残存活性化ポリマー分子が当該分野既知の方法、例えば一次アミンを反応混合液に加えることでブロックされ、そして得られた不活性化ポリマー分子は好適方法により除かれる。
例えばポリペプチドのアミノ酸配列、使用する活性化ＰＥＧ化合物の性質、およびポリペプチドに対するＰＥＧのモル比を含む具体的なＰＥＧ化条件といった条件に応じ多様な強さでＰＥＧ化することができ、そして一般には高度のＰＥＧ化はポリペプチドに対するＰＥＧ比が高い場合に得られることが理解されるだろう。しかし特定のＰＥＧ化工程より生じたＰＥＧ化ポリペプチドは、一般にＰＥＧ化の程度が若干異なるポリペプチドコンジュゲートが確率的に分布したものを含む。
本発明の関心実施態様では、本発明のポリペプチドコンジュゲートは、配列番号１に示す野生型ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチドのＡ１Ｎ末端に共有結合したポリマーを含み、この場合前記ポリマー分子はポリペプチドに結合したポリマーポリペプチドのみである。好ましくは、この様なポリペプチドコンジュゲートは、ポリペプチドのＮ−末端に結合した単一ＰＥＧ分子を含み、その他ＰＥＧ分子は含まないコンジュゲートである。具体的には分子量が少なくとも約５ｋＤａ、特には約１０−２５ｋＤａ、例えば約１５−２５ｋＤａ，例えば約２０ｋＤａの直鎖型または分岐型ＰＥＧ分子が好ましい。本実施態様によるポリペプチドコンジュゲートは、さらにポリペプチドのＮ−結合またはＯ−結合グリコシル化部位に結合した１またはそれ以上の糖成分、またはインビトログリコシル化により結合された糖成分を含む。
【００７２】
本発明のさらに関心の実施態様では、本発明のポリペプチドコンジュゲートは配列番号１に示す野生型ＦＶｉｉａポリペプチドのＡ１Ｎ−末端およびＩ１５３Ｎ−末端に共有結合したポリマー分子を含み、この場合前記ポリマー分子はポリペプチドに結合したポリマー分子のみである。好ましくはこの様なポリペプチドコンジュゲートは、ＦＶＩＩａの両Ｎ−末端に結合したＰＥＧ分子を含むが、他のＰＥＧ分子は含まないコンジュゲートである。具体的には、分子量が少なくとも約５ｋＤａ、特にはは約１０−２５ｋＤａ、例えば約１５−２５ｋＤａ，例えば約２０ｋＤａの直鎖型または分岐型ＰＥＧ分子が好ましい。本実施態様によるポリペプチドコンジュゲートは、さらにポリペプチドのＮ−結合またはＯ−結合グリコシル化部位に結合した１またはそれ以上の糖成分、またはインビトログリコシル化により結合された糖成分を含む。
ＰＥＧ分子の様なポリマー分子をポリペプチドのＮ−末端に選択的に結合させる好適方法の一つは、米国特許第５、９８５、２６５号に開示の方法である。この方法は、還元性アルキル化（ポリペプチドのＮ−末端アミノ基を、ＮａＣＮＢＨ３の様な還元剤存在下にアルデヒド−ＰＥＧの様なアルデヒド含有ポリペプチドと反応させる）を含む。この方法はポリペプチドの誘導化に利用可能な異なるタイプの一次アミノ基（リジン対Ｎ−末端）の示差的反応性を利用し、それによりアルデヒド−ＰＥＧの様なカルボニル基含有ポリマー分子でＮ−末端にあるポリペプチドを実質選択的に誘導化する。この反応は、リジン残基のε−アミノ基間のｐＫａ差とポリペプチドのＮ−末端残基のα−アミノ基とのｐＫａ差が利用可能なｐＨで実施される。この示差的反応性を実現するために、反応は一般に若干酸性の条件で行われる。好適ｐＨ域の具体例としては、ｐＨ４．５−７、例えばｐＨ４．５−６、例えばｐＨ５−６、特には約ｐＨ５が挙げられる。
【００７３】
別の特異的実施態様では、本発明のポリペプチドコンジュゲートはＰＥＧ化に利用可能なポリペプチド中の各リジン残基に結合したＰＥＧ分子、具体的には、たとえば分子量約１−１５ｋＤａ、典型的には約２−１２ｋＤａ、例えば３−１０ｋＤａ、例えば約５または６ｋＤａの直鎖状または分岐状ＰＥＧ分子を含む。
さらに別の実施態様では、本発明のポリペプチドコンジュゲートはＰＥＧ化に利用可能なポリペプチド中の各リジン残基に加え、さらにポリペプチドのＮ−末端アミノ酸残基に結合したＰＥＧ分子分子を含む。
ポリペプチドのアミノ酸残基への炭水化物成分（例えばデキストラン）のインビトロ共有結合、例えば第ＷＯ８７／０５３３０号およびＡｐｌｉｎら、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，ｐｐ．２５９−３０６、１９８１に記載の様なインビトロ共有結合も利用される。炭水化物成分または蛋白質−およびペプチド−結合Ｇｌｎ残基へのインビトロ結合は、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）により行うことができる。トランスグルタミナーゼは所謂架橋反応での、ドナーアミン基の蛋白質−およびペプチド−結合Ｇｌｎ残基への転移を触媒する。ドナーアミン基は、Ｌｙｓ−残基中のε−アミノ基の様な蛋白質−またはペプチド結合であるか、または小または大有機分子の一部である。ＴＧａｓｅ触媒架橋反応に於いてアミノドナーとして機能する小有機分子の例はプトレシン（１，４−ジアミノブタン）である。ＴＧａｓｅ触媒架橋反応に於いてアミノドナーとして機能するより大型の有機分子の例は、アミン含有ＰＥＧである（Ｓａｔｏら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５、１３０７２−１３０８０）。
【００７４】
一般にＴＧａｓｅｓは高度に特異的な酵素であり、蛋白質表面に露出している全てのＧｌｎ−残基がアミノ含有物質へのＴＧａｓｅ触媒架橋反応に関与するわけではない。これに対し、極僅かなＧｌｎ−残基はそのままのかたちでＴＧａｓｅ基質として機能するが、どのＧｌｎ−残基が良好なＴＧａｓｅ基質になるかを制御している正確なパラメータは不明である。即ち、蛋白質をＴＧａｓｅ触媒架橋反応に反応できるようにするために、ＴＧａｓｅ基質として非常によく機能することが知られているアミノ酸好配列のストレッチを好都合な位置に加える必要があること多々ある。複数のアミノ酸配列が良好な天然ＴＧａｓｅ基質であるか、またはそれを含むことが知られており、例えばサブスタンスＰ，エラフィン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、α2−プラスミン阻害剤、α−カゼイン、およびβ−カゼインがそれである。
【００７５】
糖成分への結合
１またはそれ以上のグリコシル化部位を含むＦＶＩＩ分子をインビボグリコシル化するには、ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列をグリコシル化している真核生物発現宿主内に挿入しなければならない。発現宿主細胞は真菌（糸状菌または酵母）、昆虫または動物細胞、あるいはトランスジェニック植物細胞より選択される。実施態様の一つでは、宿主細胞はＣＨＯ細胞、ＢＨＫ、またはＨＥＫ、例えばＨＥＫ２９３細胞、またはＳＦ９細胞の様な昆虫細胞、あるいはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅもしくはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの様な酵母細胞、または以下記すいずれかの宿主細胞である。
【００７６】
有機誘導化作用物質への結合
ポリペプチドの共有修飾は、ポリペプチドの１またはそれ以上の結合基と有機誘導化作用物質とを反応させることで行われる。好適誘導化作用物質および方法は当該分野周知である。例えばシステイニル残基は、最も一般的にはクロロ酢酸またはクロロアセトアミドの様なαハロアセテート（および対応するアミン類）と反応し、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を与える。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（４−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロマーキュリベンゾエート、２−塩化水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応し、誘導化される。ジエチルピロカーボネートが比較的ヒスチジル側鎖に特異的であることから、ヒスチジル残基はｐＨ５．５−７．０にてジエチルピロカーボネートと反応し誘導化される。パラ−ブロモフェンアシルブロマイドも有益である。反応はｐＨ６．０にて０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中にて好ましく行われる。リジンおよびアミノ末端残基は、コハク酸またはその他無水カルボン酸と反応させられる。これら作用物質による誘導化は、リシニル残基の電荷を逆転する効果を持っている。その他α−アミノ−含有残基を誘導化するのに好適な試薬としては、メチルピコリンイミド、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオンの様なイミドエステル、およびグリコしレートとのトランスアミナーゼ−触媒反応が含まれる。アルギニル残基は、１または複数の通常試薬、とりわけフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応により修飾される。アルギニン残基の誘導化には、グアニジン官能基のpKaが高いことからアルカリ条件下で反応を行う必要がある。
【００７７】
さらにこれら試薬は、リジンの基ならびにアルギニングアニジド基と反応する。カルボキシル側基（アスパチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ‘）との反応で選択的に修飾される（前記式中のＲおよびＲ’は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルフォリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４、４−ジメチルフェニル）カルボジイミドのような異なるアルキルである）。さらにアスパチルまたはグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【００７８】
官能部位のブロッキング
過剰なポリマーコンジュゲートは、非ポリペプチド部分がコンジュゲートすることで、ポリペプチドの活性の消失を招くことがあると報告されている。この問題は、例えば官能部位に局在する結合基を除くこと、またはコンジュゲート前に官能部位を可逆的にブロッキングし、コンジュゲート中官能部位を遮蔽することで解消できる。後者の考え方は、本発明の更なる実施態様を構成する（最初の方策は例えば官能部位に近傍に配置されるリジン残基を除くことにより、上記にさらに例示されて）。より具体的には、第２の方策ではポリペプチドと非ポリペプチド部分間のコンジュゲートは、ポリペプチド官能部位が補助分子、例えばポリペプチドの官能部位に結合できる組織因子、またはセリンプロテアーゼ阻害剤により遮蔽される条件下に実施される。
好ましくは、補助分子は受容体の様なポリペプチド官能基を特異的に認識する分子、具体的には完全長または適当に切断された組織因子の様な組織因子、あるいは１つが組織因子でありもう一方が触媒トライアッド周辺域（触媒トライアッド内原子から１０Åの範囲にあるアミノ酸として好ましく規定される）に結合し、それを保護するペプチドまたはペプチド阻害剤である２分子である。
あるいは補助分子は抗体、特にはＦＶＩＩポリペプチドを認識するモノクローナル抗体である。具体的には補助分子は、中和モノクローナル抗体である。
ポリペプチドはコンジュゲートする前に補助分子と相互作用させられる。これによりポリペプチドの官能部位は確実に遮蔽または保護され、その結果ポリマーの様な非ポリペプチド部分による誘導化を受けなくなる。補助分子より溶出することで、非ポリペプチド部分とポリペプチドとのコンジュゲートは、少なくとも部分的に保存された官能部位を持つかたちで回収できる。
遮蔽された官能部位を持つポリペプチドをその後、ポリマー、脂肪親和性化合物、糖成分、有機誘導化作用物質またはその他化合物とコンジュゲートさせることは、“．．へのコンジュゲート”と題する上記節に記載されている一般的方法により実施される。
【００７９】
コンジュゲートからポリペプチド官能部位を遮蔽するために使用される補助分子の性質とは無関係に、補助分子は分子の中に非ポリペプチド部分に関する結合基を全く持たないか、または殆ど持たないことが望ましく、この様な基へのコンジュゲートは補助分子からのコンジュゲートポリペプチドの脱着を妨げる。こうすることでポリペプチドの非遮蔽部分にある結合基への選択的コンジュゲートが得られ、コンジュゲートの反復サイクルに補助分子を再使用することが可能となる。例えば、非ポリペプチド部分が結合基としてリジンまたはＮ−末端アミノ酸残基のイプシロンアミノ基を持つＰＥＧの様なポリマー分子である場合には、補助分子は本質的にイプシロンアミノ基を持たないことが望ましく、好ましくはいずれのイプシロンアミノ基も持たない。即ち、好適実施態様では、補助分子はポリペプチドの官能部位に結合できる蛋白質またはペプチドであり、前記蛋白質またはポリペプチドは選択した非ポリペプチド部分に対しコンジュゲート可能な結合基を持たない。
【００８０】
さらなる実施態様では、補助分子はまずカラム充填物質、例えばセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）またはアガロースビーズの様な固相、または反応容器の様な表面に共有結合される。続いてポリペプチドが補助分子を有するカラム材料に加えられ、当該分野既知の方法、例えば“．．へのコンジュゲート”と題する上記節に記載されている方法によりコンジュゲートが行われる。この作業によって、溶出により補助分子からポリペプチドコンジュゲートを分離することができる。ポリペプチドコンジュゲートは、ポリペプチドの本質的な分解を招くことのない物理−化学的条件下に、通常の技術により溶出される。ポリペプチドコンジュゲートを含む液相は、補助分子が共有結合し続ける固相から分離される。分離はその他の方法でも行うことができる：例えば補助分子は、特定結合体（例えばストレプトアビジン）により認識可能な第２分子（例えばビオチン）により誘導化されてもよい。特異的結合体が固相に結合され、それにより補助分子−第２分子複合体は保持するがポリペプチドコンジュゲートは保持しない第２補助体−固相カラムを通過させ、溶出することで補助分子−第２分子複合体からポリペプチドコンジュゲートを分離することができる。ポリペプチドコンジュゲートは補助分子より適当な様式で開放されるだろう。脱保護は、補助分子が結合しているＦＶＩＩの官能部位から補助分子を解離させる条件を提供することで達成される。例えば、ポリマーがコンジュゲートする抗体と抗イディオタイプ抗体との複合体は、ｐＨを酸性またはアルカリ性ｐＨに調節することで解離することができる。より好適な方法は、ＦＶＩＩのＣａ２＋特異的立体構造を認識する立体構造特異的抗体を利用することであり、そして緩やかな条件下にＥＤＴＡで溶出することができる。
【００８１】
セリンプロテアーゼ阻害剤の結合
セリンプロテアーゼ阻害剤の結合は、第ＷＯ９６／１２８００号記載の方法により実施できる。
【００８２】
タグ付きポリペプチドのコンジュゲート
別実施態様では、ポリペプチドはタグ、即ち典型的には１−３０、例えば１−２０アミノ酸残基からなるアミノ酸配列またはストレッチとの融合蛋白質として発現される。迅速かつ容易な精製が可能になることに加え、タグはタグ付きポリペプチドと非ポリペプチド部分との間でコンジュゲートを行う上でも便利なツールである。具体的には、タグはマイクロタイタープレートまたは磁性ビーズの様なその他キャリアー内で、タグを介してタグ付きポリペプチドを固定しコンジュゲートを達成するのに使用される。例えばマイクロタイタープレート内でタグ付きポリペプチドへコンジュゲートさせる場合、タグ付きポリペプチドをマイクロタイタープレート内に培養ブロスから直接固定でき（原則的には精製なしに）、コンジュゲートにかけることができるという利点がある。これにより工程の総段階数（発現からコンジュゲートまで）を減らすことができる。さらに、タグはスペーサー分子としても機能し、コンジュゲート対象となる固定化ポリペプチドへの接近性も改善する。タグ付きポリペプチドを用いたコンジュゲートは、ここに開示されたいずれかの非ポリペプチド部分に対するもの、例えばＰＥＧの様なポリマー分子にたいするものである。
使用される具体的タグの性質は、タグがポリペプチドと共に発現可能であり、好適表面またはキャリアー材料に固定化できる限りにおいては、重要ではない。多くの好適タグが、例えばユニザイムラボラトリーズ（Ｕｎｉｚｙｍｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、デンマーク（Ｄｅｎｍａｒｋ）より販売されている。例えばタグは次の配列の何れかより成る：
【００８３】
Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｓｉ−Ｈｉｓ
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｓｉ−Ｈｉｓ
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｓｉ−Ｈｉｓ
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｓｉ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
または以下の何れか：
ＤＱＫＬＩ  ＳＥＥＤＬ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３６１０−１６，１９８５記載のＣ末端タグ）
ＤＹＫＤＤＤＤＫ（Ｃ−またはＮ−末端タグ）
ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ
【００８４】
上記タグに対する抗体は、例えばＡＤＩ、エーブスラボアンドリサーチダイアグノスティクス（Ａｖｅｓ  Ｌａｂ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）から販売されている。
続くポリペプチドからのタグの開裂は、市販の酵素を用い行うことができる。
本発明のポリペプチドまたは本発明のコンジュゲートの調製方法
本発明のポリペプチドまたは本発明のコンジュゲートのポリペプチド部分は、随意グリコシル化型であり、当該分野既知の好適方法により産生される。この様な方法としては、ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を構築すること、および好適形質転換またはトランスフェクション宿主で配列を発現させることが挙げられる。好ましくは、宿主細胞はほ乳動物細胞の様なガンマカルボキシル化を行う宿主細胞である。しかし、本発明のポリペプチドは、効率的ではないが、化学合成または化学合成の組み合わせ、あるいは化学合成と組換え体ＤＮＡ技術との組み合わせにより産生してもよい。
【００８５】
本発明のコンジュゲートのポリペプチドまたはポリペプチドの一部をコードするヌクレオチド配列は、配列番号あに示すアミノ酸配列を持つｈＦＶＩＩの様な親ＦＶＩＩをコードするヌクレオチド配列を単離するか、または合成することにより構築し、次にヌクレオチド配列を関連アミノ酸残基が効果的に導入（即ち挿入または置換）あるいは除去（即ち欠失または置換）できる様に変更してもよい。
ヌクレオチド配列は通常の方法による部位指定突然変異誘導により好都合に変更される。あるいはヌクレオチド配列は化学合成を利用し、例えばオリゴヌクレオチド合成装置を利用し調製され、この場合オリゴヌクレオチドは所望ポリペプチドのアミノ酸配列に基づきデザインされ、好ましくは組換え体ポリペプチドが産生される宿主細胞にとって好ましいコドンが選択される。例えば所望ポリペプチドの部分をコードする複数の小ヌクレオチドがＰＣＲ、ライゲーション、またはライゲーションチェインリアクション（ＬＣＲ）（Ｂａｒａｎｙ、ＰＮＡＳ  ８８：１８９−１９３、１９９１）により合成され、組み立てられる。一般に個々のオリゴヌクレオチドは相補的組み立てのための５’または３’オーバーハングを含んでいる。
【００８６】
別のヌクレオチド配列修飾法は、高処理型スクリーニング、例えば米国特許第５，０９３、２５７号に開示の相同的クロスオーバーを含む方法、および遺伝子シャッフリング、即ち開始時のヌクレオチド配列と比較したとき複数のヌクレオチドの変更を有する新規ヌクレオチドを生ずる２またはそれ以上の相同的ヌクレオチド間の組み換えを含む方法がポリペプチド変異体を産生するのに利用できる。遺伝子シャッフリング（ＤＮＡシャッフリングとしても知られている）は、ヌクレオチドのランダムな切断と組み立ての１またはそれ以上のサイクルと、それに続く所望特性を持つポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を選択するスクリーニングとを含む。相同性をベースとした核酸シャッフリングを行うためには、ヌクレオチド配列の関連部分が少なくとも５０％同一であり、例えば少なくとも６０％同一、より好ましくは少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一であることが好ましい。組み換えはインビトロまたはインビボで行うことができる。
【００８７】
好適インビボ遺伝子シャッフリング法の例は、Ｓｔｅｍｍｅｒら、（１９９４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；９１巻、ｐｐ．１０７４７−１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ、３７０巻、ｐｐ．３８９−３９１；Ｓｍｉｔｈ（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ、３７０巻、ｐｐ．３２４−３２５；Ｚｈａｏら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８、Ｍａｒ；１６（３）：２５８−６１；Ｚｈａｏ  ＨとＡｒｎｏｌｄ，ＦＢ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９７、２５巻、Ｎｏ．６  ｐｐ．１３０７−１３０８；Ｓｈａｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９８、Ｊａｎ  １５；２６（２）：ｐｐ．６８１−８３；および第ＷＯ９５／１７４１３号に開示されている。
好適インビボ遺伝子シャッフリング法の例は第ＷＯ９７／０７２０５号に開示されている。インビトロまたはインビボ組換え体による核酸配列の突然変異に関するその他方法は第ＷＯ９７／２００７８号および米国特許第５、８３７、４５８号に開示されている。具体的シャッフリング技術の例には、”ファミリーシャッフリング”、”合成シャッフリング”および”インシリコシャッフリング”が含まれる。
ファミリーシャッフリング”は、異なる種に由来する相同遺伝子のファミリーを１またはそれ以上のシャッフリングサイクルにかけ、続いてスクリーニングまたは選別を行うことを含む。ファミリーシャッフリング”技術はＣｒａｍｅｒｉら、（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ、３９１巻、ｐｐ２８８−２９１；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら（１９９９）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７巻、ｐｐ．２５９−２６４；Ｃｈａｎｇら、（１９９９）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７巻、ｐｐ．７９３−７９７；およびＮｅｓｓら（１９９９）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７巻、８９３−８９６に開示されている。
【００８８】
合成シャッフリングは、例えば関心の相同遺伝子の配列アラインメントに基づき重複する合成オリゴヌクレオチドのライブラリーを提供することを含む。合成により生成されたオリゴヌクレオチドは組み換えられ、得られた組換え体核酸配列をスクリーニングし、必要に応じ更なるシャッフリングサイクルに用いる。合成シャッフリング技術は第ＷＯ００／４２５６１号に開示されている。
インシリコシャッフリングとは、コンピューターシステムを用い実行される、またはモデル化され、それによって核酸を物理的に操作する必要を一部または全て回避するＤＮＡシャッフリング操作を意味する。インシリコシャッフリングの技術は第ＷＯ００／４２５６０号に開示されている。
組み立てた後（合成、部位指定突然変異誘導、またはその他の方法により）、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は組換え体ベクターに挿入され、所望の形質転換宿主細胞でのＦＶＩＩ発現に必要な制御配列に作動性に結合される。
【００８９】
もちろん、全てのベクターおよび発現制御配列が等しく良好に機能し、ここに記したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するわけではない。全ての宿主が同一発現システムと等しく、良好に機能することもない。しかし当業者はこれらベクター、発現制御配列、および宿主を特段の実験なしに選択するだろう。例えば、ベクターの選択では、ベクターは宿主内で複製し、または染色体内に組み込まれなければならないことから、宿主に配慮すべきである。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力およびベクターによりコードされたその他蛋白質、例えば抗生物質マーカーの発現も考慮に入れるべきである。発現制御配列の選択では、各種因子を考慮に入れるべきである。これら因子としては、例えば配列の相対強度、その制御性、およびポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との適合性、特には潜在的な二次構造が含まれる。宿主は選択したベクターとの適合性、ヌクレオチド配列によるコードされる産物の毒性、それらの分泌特性、正確にポリペプチドが畳み込まれる能力、それらの発酵および培養条件、そしてヌクレオチド配列によりコードされた産物の精製の容易度を考慮しながら選択すべきである。
組換え体ベクターは自己複製型ベクター、即ち染色外単位として存在するベクターであり、その複製は染色体複製、例えばプラスミドに依存している。あるいはこのベクターは、宿主細胞内に導入された場合、宿主細胞のゲノム内に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製される。
【００９０】
ベクターは好ましくは発現ベクターであり、本発明のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列はヌクレオチド配列の転写に必要な追加断片と作動性に結合している。ベクターは典型的にはプラスミドまたはウイルスＤＮＡより誘導される。ここに記した宿主細胞内での発現に好適な複数の発現ベクターが市販され、あるいは文献中に記載されている。真核宿主に有益なベクターとしては、例えばSV40、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含むベクターが挙げられる。具体的ベクターは、例えばｐＣＤＮ３．１（＋）Ｈｙｇ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア（ＣＡ）、米国）およびｐＣＩ−ｎｅｏ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラジョラ（Ｌａ  Ｊｏｌａ）、カリフォルニア、米国）である。酵母に関する有益な発現ベクターは、２μｇのプラスミドとその誘導体、ＰＯＴ１ベクター（米国特許第４，９３１，３７３号）、Ｏｋｋｅｌｓ、Ａｎｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８２、２０２−２０７、１９９６に記載のｐＪＳ０３７ベクター、およびｐＰＩＣＺＡ、ＢまたはＣ（インビトロゲン社）を含む。昆虫細胞に関し有用なベクターとしては、ｐＶＬ９４１、ｐＢＧ３１１（Ｃａｔｅら、”ミューラー阻害物質に関するウシおよびヒト遺伝子の単離と動物細胞に於けるヒト遺伝子の発現（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｏｖｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ）”、Ｃｅｌｌ、４５、ｐｐ６８５−９８（１９８６）、ｐＢｌｕｅｂａｃ４．５およびｐＭｅｌｂａｃ（共にインビトロゲン社）が挙げられる。細菌宿主に関し有益な発現ベクターとしては、既知細菌プラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＥＴ３ａおよびｐＥＴ１２ａ（共にノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ウイスコンシン（ＷＩ）、米国）を含む大腸菌由来プラスミド、ＲＰ４の様な広宿主域プラスミド、例えばＮＭ９８９の様なラムダファージおよびＭ１３の様なその他ＤＮＡファージに由来する各種誘導体、および繊維状単鎖ＤＮＡファージの様なファージＤＮＡが挙げられる。
【００９１】
本発明での利用に適したその他ベクターとしては、増幅対象のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を複数コピーできるベクターを包含する。この様なベクターは当該分野周知である。それらには、例えばＤＨＦＲ増幅（例えばＫａｕｆｍａｎ、米国特許第４，４７０，４６１号、ＫａｕｆｍａｎとＳｈａｒｐ、”モジュール型ジヒドロ葉酸還元酵素ｃＤＮＡ遺伝子の構築；効果的発現に利用されるシグナルの分析（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｄｉｈｙｄｒａｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃＤＮＡ  Ｇｅｎｅ；Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌｓ  Ｕｔｉｌｉｚｅｄ  Ｆｏｒ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２、っｐ。１３０４−１９（１９８２））およびグルタミン合成酵素（”ＧＳ”）増幅（例えば米国特許第５，１１２，４６４号および欧州特許第３３８、８４１号参照）が含まれる。
組換え体ベクターはさらに、ベクターを問題の宿主細胞内で複製できるようにするＤＮＡ配列を含む。この様な配列の例（宿主細胞が哺乳動物細胞の場合）はＳＶ４０の複製開始点である。宿主細胞が酵母細胞の場合、ベクターを複製できる様にする好適配列は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰ１−３および複製開始点である。
【００９２】
ベクターはさらに選択可能マーカー、例えばその産物が宿主細胞内で欠失しているものである遺伝子、例えば時ヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードしている遺伝子またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅＴＰＩ遺伝子（Ｐ．Ｒ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｇｅｎｅ  ４０、１９８５、ｐｐ．１２５−１３０に記載）、または薬剤、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシンまたはメトトレキセートに対する耐性を付与する遺伝子を含んでも良い。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｃｉｓｉａｅの場合、選択マーカーにはｕｒａ３およびｌｅｕ２が含まれる。糸状菌の場合、選択マーカーとしてはａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｃＢ、ｎｉａＤおよびｓＣが挙げられる。
用語“制御配列”は、ここでは本発明のポリペプチドの発現に必要または有利である全ての成分を包含するものと規定される。各制御配列はポリペプチドをコードする核酸配列にとって本来のものでも、または外来性のものでもよい。この様な制御配列には、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、エンハンサーまたは上流活性化配列、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターが含まれるが、これらに限定されない。最低でもコントロール配列はプロモーターを含む。
本発明では広範な発現制御配列が利用できる。この様な有益な発現コントロール配列には、前記発現ベクターの構造遺伝子に関連した発現制御配列および前核細胞または真核細胞、またはそれらのウイルスおよびその各種組み合わせの遺伝子発現を制御することが知られている配列を含む。
【００９３】
哺乳動物細胞での転写方向を指示するのに好適な制御配列の例は、ＳＶ４０およびアデノウイルスの初期および後期プロモーター、例えばアデノウイルス２主要後期プロモーター、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、ヒトサイトメガロウイスル早期初期遺伝子（ＣＭＶ）、ヒト延長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター、ショウジョウバエ最小熱ショック蛋白質７０プロモーター、ラウス（Ｒｏｕｓ）肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、ヒト成長ホルモンターミネーター、ＳＶ４０またはアデノウイルスＥｌｂ領域ポリアデニル化シグナル、およびコザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ、Ｍ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９８７  Ａｕｇ  ２０；１９６（４）：９４７−５０）を含む。
哺乳動物細胞での発現を改善するために、ポリペプチドをコードする５‘非翻訳域に合成イントロンを挿入してもよい。合成イントロンの例はプラスミドｐＣＩ−Ｎｅｏ由来の合成イントロン（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ウイスコンシン（ＷＩ）、米国より入手可能）である。
【００９４】
昆虫細胞での転写方向付けに好適な制御配列の例には、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多角体病ウイルス塩基性蛋白質プロモーター、バキュロウイルス早期型初期遺伝子Ｉプロモーターおよびバキュロウイスル３９Ｋ遅延型後期遺伝子プロモーター、およびＳＶ４０ポリアデニル化配列が含まれる。酵母宿主細胞での使用に好適な制御配列の例には、酵母α接合系のプロモーター、酵母トリオースイソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーター、酵母解糖遺伝子またはアルコール脱水素酵素のプロモーター、ＡＤＨ２−４ｃプロモーター、および誘導型ＧＡＬプロモーターが含まれる。糸状菌宿主細胞での利用に好適な制御配列の例には、ＡＤＨ３プロモーターおよびターミネーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼトリオースリン酸イソメラーゼまたはアルカリプロテアーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒα−アミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒまたはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓグルコアミラーゼ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテアーゼまたはリパーゼをコードしている遺伝子に由来するプロモーター、ＴＰＩ１ターミネーターおよびＡＤＨ３ターミネーターが含まれる。細菌性宿主細胞での使用に好適な制御配列の例には、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系のプロモーター、およびラムダファージの主要プロモーター領域が含まれる。
【００９５】
シグナルペプチドの有無は、例えば発現されるポリペプチドの産生に使用される宿主細胞（それが細胞内または細胞外ポリペプチドであるかは問わず）、および分泌させることを望むかに依存するだろう。糸状菌での使用に関しては、単一ペプチドはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．アミラーゼまたはグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼまたはプロテアーゼ、もしくはＨｕｎｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼをコードする遺伝子から容易に誘導できる。シグナルペプチドは、Ａ．ｏｒｙａｚｅＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ中和α−アミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ酸安定性アミラーゼまたはＡ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼをコードしている遺伝子から好ましく誘導される。昆虫細胞での使用に関しては、シグナルペプチドは昆虫遺伝子（第ＷＯ９０／０５７８３号）、例えばＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ  ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａアジポキネティクホルモン前駆体（米国特許第５，０２３，３２８号）、ミツバチメリチン（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、エクジステロイドＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼ（ｅｇｔ）（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４，３４９−３５７（１９９３）またはヒト膵臓リパーゼ（ｈｐｌ）（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２８４、ｐｐ．２６２−２７２、１９９７）をコードする遺伝子から好都合に誘導される。哺乳動物細胞での使用に適したシグナルペプチドは、ｈＦＶＩＩまたはマウスＩｇカッパ軽鎖シグナルペプチド（Ｃｏｌｏｍａ、Ｍ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５２：８９−１０４）のシグナルペプチドである。酵母細胞での使用に関しては、好適シグナルペプチドはＳ．ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ（米国特許４、８７０、００８号）由来のα因子シグナル、改良型カルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（Ｌ．Ａ．Ｖａｌｌｓら、Ｃｅｌｌ４８、１９８７、ｐｐ．８８７−８９７）、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド（第ＷＯ８７／０２６７０号）、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド（Ｍ．Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉら、Ｙｅａｓｔ  ６、１９９０，っｐ。１２７−１３７）および合成リーダー配列ＴＡ５７（第ＷＯ９８／３２８６７号）であることが見出されている。大腸菌細胞での使用に関しては、好適シグナルペプチドはシグナルペプチドｏｍｐＡであることが見出されている（欧州特許第５８１８２１号）。
【００９６】
ＦＶＩＩポリペプチドをコードしている本発明のヌクレオチド配列は、部位指定突然変異誘導法、ＰＣＲ、またはその他方法のいずれにより調製さたかに関わらず、随意にシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。シグナルペプチドは、ポリペプチドが、ポリペプチドがその中で発現されている細胞から分泌される場合に存在する。この様なシグナルペプチドは、存在する場合には、ポリペプチドの発現に合わせ選択された細胞により認識されるものでなければならない。シグナルペプチドはポリペプチドに対し相同的（例えば一般的にｈＦＶＩＩと関連している）または異質的（即ちｈＦＶＩＩ以外の供給源に由来する）であるか、または宿主細胞に対し相同的または異質的であり、即ちシグナルペプチドは宿主細胞から正常に発現されるシグナルペプチドであるか、または宿主細胞からは一般に発現されないシグナルペプチドである。従ってシグナルペプチドは前核性、例えば大腸菌の様な最近に由来するものであるか、真核性、例えば哺乳動物または昆虫、あるいは酵母細胞に由来するものである。
【００９７】
好適宿主は本発明のコンジュゲートのポリペプチドまたはポリペプチド部分を産生するのに用いられ、細菌、真菌（酵母を含む）、植物、昆虫、哺乳動物、またはその他適当な動物細胞または細胞株、ならびにトランスジェニック動物または植物を含む。細菌宿主細胞の例としては、例えばＢ．ｂｒｅｖｓｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｌｓの様なＢａｃｉｌｌｕｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｍａｙｃｅｓの様なグラム陽性細菌、またはＥ．ｃｏｌｉの様なグラム陰性細菌を含む。細菌宿主細胞へのベクターの導入は、例えばプロトプラスト形質変換（例えばＣｈａｎｇとＣｏｈｅｎ、１９７９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６８：１１１−１１５参照）により、コンペテント細胞を使い（例えばＹｏｕｎｇとＳｐｉｚｉｚｉｎ、１９６１、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ８１：８２３−８２９またはＤｏｂｎａｕとＤａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ、１９７１、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５６：２０９−２２１参照）、エレクトロポレーション（例えばＳｈｉｇｅｋａｗａとＤｏｗｅｒ、１９８８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２−７５１）または接合（例えばＫｏｅｈｌｅｒとＴｈｒｎｅ、１９８７、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １６９：５７７１−５２７８参照）を用い実行される。好適糸状菌宿主細胞例には、例えばＡ．ｏｒｚａｅ、Ａ．ｎｉｇｅｒまたはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ様なＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、ＦｕｓａｒｉｕｍまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａが含まれる。真菌細胞は、それ自体既知の方法によるプロトプラスト形成、プロとプラストの形質転換、および細胞壁の再生を含む工程により形質転換される。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主細胞の形質転換に好適な手段は欧州特許第２３８  ０２３号および米国特許第５、６７９、５４３号に記載されている。Ｆｕｓａｒｉｕｍ種を形質転換する好適方法はＭａｌａｒｄｉｅｒら、１９８９、Ｇｅｎｅ  ７８：１４７−１５６および第ＷＯ９６／００７８７号に記載されている。好適酵母宿主細胞例は、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの様なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＰ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａの様なＰｉｃｈｉａ、Ｈ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの様なＨａｎｓｅｎｕｌａ、またはＹａｒｒｏｗｉａを含む。酵母はＢｅｃｋｅｒｅとＧｕａｒｅｎｔｅ、Ａｂｅｌｓｏｎ、Ｊ．Ｎ．とＳｉｍｏｎｍＭ．Ｉ．，編集、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４巻、ｐｐ．１８２−１８７、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；ｉｔｏら、１９８３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １５３：１６３；Ｈｉｎｎｅｎら、１９７８、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ７５：１９２０記載の方法；およびクローンテックラボラトリーズ社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒ��ｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ）、パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）、カリフォルニア（ＣＡ）、米国により開示された方法（ＹｅａｓｔｍａｋｅｒＴＭＹｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍキットに関する製品プロトコール）を用い形質転換される。好適昆虫宿主細胞例には、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９またはＳｆ２１）の様なＬｅｐｉｄｏｐｔｏｒａ細胞株、またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉｏｎ  ｎｉ細胞（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ）（米国特許第５，０７７，２１４号）が含まれる。昆虫細胞の形質転換およびその中での異質ポリペプチドの産生は、インビトロゲン社貴社に様に実施される。好適哺乳動物細胞の例にはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えばＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ミドリサル細胞株（ＣＯＳ）（例えばＣＯＳ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、ＣＯＳ７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）；マウス細胞（例えばＮＳ／Ｏ）、ベイビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３２またはＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）およびヒト細胞（例えばＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３））ならびに植物細胞組織培養体が含まれる。さらに別の好適細胞株が当該分野既知であり、米国標準培養体コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ）の様な好適寄託機関より入手できる。またＣＨＯ細胞の様な哺乳動物細胞は、例えば米国特許第５，０４７、３３５号記載の様にしてシアリルトランスフェラーゼ、例えば１，６−シアリルトランスフェラーゼを発現し、改良されたＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチドを提供する様に変更してもよい。
【００９８】
分泌を増すために、本発明のポリペプチドをエンドプロテアーゼ、特にＫｅｘ２エンドプロテアーゼ（例えば第ＷＯ００／２８０６５号記載の様な）の様なＰＡＣＥ（対塩基性アミノ酸変換酵素）（例えば米国特許第５，９８６、０７９号を参照）と共に産生することは特に興味深い。
外来性ＤＮＡを哺乳動物宿主細胞内に導入する方法には、リン酸カルシウム介在トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＤ−デキストラン介在トランスフェクション法、リポソーム介在トランスフェクション法、ウイルスベクター法、およびリポフェクタミン２０００を用いたライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ）、ペイスレイ（Ｐａｉｓｌｅｙ）、英国記載のトランスフェクション法が含まれる。これら方法は当該分野周知であり、例えばＡｕｓｂｅｌら（編集）１９９６、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョンウイリーアンドソンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、米国に記載されている。哺乳動物細胞の培養は確立された方法、例えば（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｎｉｇｅｌ  Ｊｅｎｋｉｎｓ編集、１９９９、ヒューマンプレスインク（Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ）、トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）、ニュージャージー（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、米国およびＨａｒｒｕｉｓｏｎ  ＭＡとＲａｅ  ＩＦ、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、ケンブリッジユニバーシティープレス（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）  １９９７）に開示されている方法により実施される。
【００９９】
本発明の製造方法では、細胞は当分野既知の方法を用いたポリペプチド産生に関し好適な栄養培地中に培養される。例えば、細胞は好適培地中にて、ポリペプチドを発現させ、そして／または単離することができる条件の下に、振盪フラスコ培養、研究用または産業用ファーメンターによる小規模または大規模発酵（連続式、バッチ式、フェド−バッチ式、または個体発酵式を含む）により培養される。培養は炭素および窒素源ならびに無機塩類を含む好適栄養培地中にて、当分野既知の方法を用い行われる。好適方法は商業的供給会社から入手することができ、または公開された組成に従い調製される（例えば米国標準株コレクションのカタログ内）。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合には、ポリペプチドは培地から直接回収できる。ポリペプチドが分泌されない場合には、それは細胞溶解物から回収できる。
【０１００】
得られたポリペプチドは、当該分野既知の方法により回収される。例えばポリペプチドは遠心分離、濾過、抽出、スプレー乾燥、蒸発または沈殿を含むが、これらに限定されない通常の方法により、栄養培地から回収される。
ポリペプチドは、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除式）、電気泳動法（例えば調製等電点フォーカシング）、溶解度差（例えば硫安沈殿法）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは抽出（例えばＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｊ，−Ｃ．ＪａｎｓｏｎとＬａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ、編集、ＶＣＨ出版、ニューヨーク、１９８９参照）  を含むが、これらに限定されない当該分野既知の各種方法により精製される。
単鎖ＦＶＩＩは、文献記載の様々な方法により精製され、２本鎖ＦＶＩＩａに活性化できる（ＢｒｏｚｅとＭａｊｅｒｕｓ、１９８０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１２４２−４７およびＨｅｄｎｅｒとＫｉｓｉｅｌ、１９８３、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１：１８３６−４１）。単鎖ＦＶＩＩを精製することができるその他方法は、米国特許第５，７００，９１４号記載の様にＺｎイオンを精製中に取り込ませる方法である。
好適実施態様では、ポリペプチドは単鎖ＦＶＩＩとして精製され、それはさらにＰＥＧ化される。ＰＥＧ化されたＦＶＩＩ単鎖ポリペプチドは固定化酵素（例えば第ＩＩａ、ＩＸａ、Ｘａ、およびＸＩＩａ因子）を用いるか、または陽荷電型イオン交換マトリックス等を用いて自己活性化することで、活性化される。
ＦＶＩＩをまず単鎖型に精製し、続いてＰＥＧ化（望まれる場合）し、そして最後に上記方法の一つまたはＰｅｄｅｒｓｅｎら、１９８９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：９３３１−３６記載の様にして自己活性化することが好都合である。活性化前にＰＥＧ化することの利点は、Ｒ１５２−Ｉ１５３の劈開により形成される新たなアミノ末端のＰＥＧ化を回避することである。Ｄ２４２とＩ１５３のアミノ末端間の水素結合形成が活性にとって必要であることから、この新規アミノ末端のＰＥＧ化は分子を不活性化するだろう。
【０１０１】
本発明の医薬品組成物およびその利用
更なる側面では、本発明は組成物、特に本発明のポリペプチドまたはコンジュゲート（上記の不活性型コンジュゲートを含む）および医薬品に許容されるキャリアーまたは賦形剤を含む医薬品組成物に関する。
本発明によるコンジュゲート、ポリペプチドまたは医薬品組成物は薬剤として使用される。
好ましくはポリペプチドまたは（活性型）コンジュゲートは、哺乳動物に於けるＦＶＩＩａ／ＴＦ関連疾患または障害の治療または予防のための薬剤の製造に利用される。例えば、ポリペプチドまたは（活性型）コンジュゲートは、例えば血管に対する損傷に反応し血液凝固が不適当となる病気の患者の治療といった、凝固形成の促進が望まれる病気の治療または予防に関する薬剤の製造に使用される。具体的にはポリペプチドまたは（活性型）コンジュゲートは血友病、ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸに対する阻害剤による血友病、血小板減少症患者、グランツマン血小板無力血小板放出障害および血小板貯蔵プール病の様な血小板障害症患者、フォン・ヴィルブランド（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）病患者、肝臓疾患患者、または例えば外傷または大手術による重度の出血問題を持つ健康人、ＦＶＩＩａに対する阻害剤を生じたヒト、血友病の様な出血障害、および一般的に重度の組織損傷を伴うその他例の治療に適した薬剤の製造に使用される。
【０１０２】
同様に、本発明の不活性型コンジュゲートは、哺乳動物に於けるＦＶＩＩａ／ＴＦ−関連疾患または障害の治療あるいは予防に適した薬剤の製造に使用される。例えば本発明の不活性型コンジュゲートは、凝固形成の低下が望まれる病気の治療または予防、例えば敗血症、深部静脈血栓症の患者や心筋梗塞または血栓発作の危険がある患者、肺梗塞、急性冠動脈症候群（心筋梗塞および不安定型狭心症）患者、心臓病および再狭窄に対する冠動脈予防措置を受けている患者、末梢血管病の患者の様な、凝固亢進状態にある患者の予防または治療に関する薬剤の製造に使用される。本発明の不活性型コンジュゲートはまた呼吸疾患、腫瘍増殖および転移の治療に関する薬剤の製造にも使用される。
別の側面では、本発明のポリペプチド、（活性型）コンジュゲートまたは（活性型）コンジュゲートを含む医薬組成物は、治療を必要とする哺乳動物にポリペプチド、コンジュゲートまたは組成物の有効量を投与することを含む、ＦＶＩＩａ／ＴＦ−関連疾患または障害（例えば上記の疾患または障害の１またはそれ以上の）に罹った哺乳動物の治療に関する方法に使用できる。
同様に本発明の不活性型コンジュゲートまたは不活性型コンジュゲートを含む医薬組成物は、治療を必要とする哺乳動物にこの様な不活性型コンジュゲートまたは組成物の有効量を投与することを含む、ＦＶＩＩａ／ＴＦ−関連疾患または障害（例えば上記の１またはそれ以上の疾患または障害）を持つ哺乳動物に関する治療法に使用される。
【０１０３】
本発明のポリペプチドまたはコンジュゲートは、患者に治療有効量、一般にはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ(R)の様なｒＦＶＩＩを用いた治療で使用される量と同等量、またはそれより高い用量投与される。ここでは”治療有効量”とは、投与対象の条件に関連し望まれる効果を生じせしめるのに十分な投与量を意味する。正確な投与量はその状況に依存し、そして当業者により既知技術を用い確認できるだろう。一般に投与量は治療対象となる状態あるいは適用の重傷度または広がりを防止するか、または軽減できるものでなければならない。本発明のポリペプチド、コンジュゲートまたは組成物の有効量が、とりわけ病気、投与量、投与スケジュール、ポリペプチドまたはコンジュゲートあるいは組成物が単独で投与されるか、あるいは他の治療薬とともに投与されるか否か、組成物の血漿半減期、および患者の一般健康状態に依存する。好ましくは、本発明のポリペプチド、コンジュゲートまたは組成物は有効量、特には凝固障害を正常化するのに十分な投与量投与される。
本発明のポリペプチドは医薬品に許容されるキャリアーまたは賦形剤を含む組成物の形で好ましく投与される。”医薬品に許容される”とは、投与された患者に有害反応を起こさないキャリアーまたは賦形剤を意味する。この様な医薬品に許容されるキャリアーおよび賦形剤は当業界周知である（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、編集、マック出版会社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐｎａｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｔｕｃｉａｌ  Ｆｏｒｕｍｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｓ．ＦｒｏｋｊａｅｒとＬ．Ｈｏｖｇａａｒｄ、編集、テイラーアンドフランシス（Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ）［２０００］；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、３版、Ａ．Ｋｉｂｂｅ編集、ファルマシューティカルプレス（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ）［２０００］参照）。
【０１０４】
本発明のポリペプチドまたはコンジュゲートは周知の方法により医薬品組成物に製剤化できる。好適な製剤は、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅに記載されている（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，１６版、１９８０）。
本発明のポリペプチドまたはコンジュゲートは”そのまま”および／またはその塩の形で使用できる。好適な塩には、アルカリ金属またはアルカリ土金属、例えばナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムとの塩、ならびに例えば亜鉛塩が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの塩または錯体は結晶構造体および／または無晶構造体として存在する。
本発明の医薬品組成物は単独、または他の治療薬と組み合わせ投与される。これら薬剤は同一医薬品組成物の一部として取り込むか、または本発明のポリペプチドまたはコンジュゲートとは別に、同時あるいは別の治療スケジュールに従い投与される。さらに、本発明のポリペプチド、コンジュゲートまたは医薬品組成物は他の治療のアジュバントとして投与される。
本発明の目的に関する”患者”にはヒトおよびその他の哺乳動物が含まれる。即ちこの方法はヒトの治療および獣医分野に応用できる。本発明のポリペプチドまたはコンジュゲートの医薬品組成物は様々な形状、例えば液体、ゲル、凍結乾燥または圧縮固体の様な形状に製剤化される。好適形状は、具体的な治療適用に依存し、そしてそれは当業者には明らかであろう。
【０１０５】
具体的には、本発明のポリペプチドまたはコンジュゲートの医薬品組成物は凍結乾燥または安定した溶液形状に製剤化される。ポリペプチドまたはコンジュゲートは当分野既知の各種方法により凍結乾燥される。ポリペプチドまたはコンジュゲートは、蛋白質分解部位を除去または遮蔽することで安定な液体形状になる。安定液体製剤を得る利点は、緊急時に患者へ素早く手当てできることであり、これは救命に寄与する。好適形状は具体的な治療適用に依存し、そしてそれは当業者に明らかであろう。
本発明の製剤の投与は、経口、皮下、静脈内、脳内、鼻内、経皮的、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、直腸内、眼内、またはその他利用可能な方法を含む様々な方法で行うことができるが、これらに限定されるものではない。製剤は一回大量注射も可能であるが、ポンプまたは移植といった当分野周知の技術を用い、注入により連続的に投与するこができる。幾つかの例では、製剤は溶液またはスプレーの様な形で直接適用される。
【０１０６】
非経口剤
医薬品組成物の好適例は非経口投与用に工夫された溶液である。多くの例では、医薬品溶液製剤は緊急利用に適当な液体形状で提供されるが、この様な非経口製剤はまた凍結または凍結乾燥形状でも提供される。凍結形状では組成物は使用前に融解しなければならない。凍結乾燥形状は、凍結乾燥製剤がその溶液製剤に比べ一般的はより安定であることが当業者により認識されていることから、広範な保存条件における組成物中に含まれる活性化合物の安定性を高めるのにしばしば使用される。この様な凍結乾燥製剤は使用前に、注射用無菌水または滅菌生理食塩水液の様な好適な医薬品に許容される希釈液を１またはそれ以上加えることで再生される。
非経口投与例では、製剤は保管に備えて凍結乾燥製剤、または適当な場合には所望純度を持つポリペプチドと一般に当分野で使用される１またはそれ以上の医薬品に許容されるキャリアー、賦形剤または安定化剤（これらをまとめて”賦形剤”と呼ばれる）、例えば緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張剤、非イオン性表面活性剤または界面活性剤、および／または各種添加剤と混合することで水溶液として調製される。
【０１０７】
緩衝剤は生理的条件に近い範囲にｐＨを維持するのに役立つ。それらは典型的には約２ｍＭないし約５０ｍＭの範囲である。本発明での使用に好適な緩衝化剤には、クエン酸緩衝液（例えばクエン酸１ナトリウム−クエン酸２ナトリウム混合体、クエン酸−クエン酸３ナトリウム混合体、クエン酸−クエン酸１ナトリウム混合体等）、琥珀酸緩衝液（例えば琥珀酸−琥珀酸１ナトリウム混合体、琥珀酸−水酸化ナトリウム混合体、琥珀酸−琥珀酸２ナトリウム混合体等）、酒石酸緩衝液（例えば酒石酸−酒石酸ナトリウム混合体、酒石酸−酒石酸カリウム混合体、酒石酸−水酸化ナトリウム混合体等）、フマール酸緩衝液（例えばフマール酸−フマール酸１ナトリウム混合体、フマール酸−フマール酸２ナトリウム混合体、フマール酸１ナトリウム−フマール酸２ナトリウム混合体等）、グルコン酸緩衝液（例えばグルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合体、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合体、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合体等）、シュウ酸緩衝液（例えばシュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合体、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合体、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合体等）、乳酸緩衝液（例えば乳酸−乳酸ナトリウム混合体、乳酸−水酸化ナトリウム混合体、乳酸−乳酸カリウム混合体等）および酢酸緩衝液（例えば酢酸−酢酸ナトリウム混合体、酢酸−水酸化ナトリウム混合体等）の様な有機酸と無機酸の両方、およびその塩が含まれる。さらにリン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、およびトリスの様なトリメチルアミン塩も利用できるだろう。
【０１０８】
安定化剤とは、増量剤から、治療薬を可溶化し又は変性し、あるいは容器壁への接着を防止するの役立つ添加物までを含む、多様な機能を持つ広範な賦形剤の分類を表している。典型的な安定化剤は多水酸基糖アルコール（上記に列挙）；アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン等のアミノ酸、乳糖、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロール等、イノシトールとしてシクリトールを含む有機糖または糖アルコール；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウムの様な硫黄含有還元剤；低分子ポリペプチド（即ち＜１０残基）；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンの様な蛋白質；ポリビニルピロリドンの様な親水性ポリマー；キシロース、マンノース、果糖およびグルコースの様な単糖；乳糖、マルトースおよびショ糖の様な２糖類；ラフィノースの様な３糖類、およびデキストランの様な多糖類である。安定化剤は活性蛋白質重量を元に、一般的には０．１ないし１０，０００重量部の範囲で存在している。
【０１０９】
保存剤は微生物の増殖を抑制するために加えられ、一般には約０．２％−１％（ｗ／ｖ）の量加えられる。本発明での使用に好適な保存剤にはフェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば塩化、臭化またはヨウ化ベンザルコニウム）、塩化ヘキサメトニウム、メチルまたはプロピルパラベンの様なアルキルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノールおよび３−ペンタノールが含まれる。
等張剤は、溶液組成物の等張性を確保するために加えられ、多価糖アルコール、好ましくは３価もしくはそれ以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールが含まれる。多価アルコールはその他成分の相対量を勘案しながら、０．１ないし２５重量％、典型的には１％ないし５％の範囲の量存在できる。
非イオン性表面活性剤または界面活性剤（”湿潤剤”としても知られる）は、治療作用物質の可溶化を助けるため、および治療ポリペプチドが攪拌時に凝集するのを防ぐために加えられ、さらにこれによりポリペプチドに変性を起こすことなく製剤を剪断面応力に曝らせるようになる。好適な非イオン性表面活性剤にはポリソルベート（２０、８０等）、ポリオキサマー（１８４、１８８等）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ(R)ポリオール、ポリキシエチレンソルビタンモノエーテル（Ｔｗｅｅｎ(R)−２０、Ｔｗｅｅｎ(R)−８０等）。
【０１１０】
その他賦形剤には、増量剤または充填剤（例えばデンプン）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）および補助溶媒が含まれる。
活性成分はまた、例えばコアセルベーション技術、または界面重合法により調製された内、例えばヒドロキシメチルセルロース、ゼラチンまたはポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内、コロイド薬物運搬システム（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェアー、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンに封入される。この様な技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記に開示されている。
インビボ投与に使用される非経口製剤は無菌でなければならない。これは、例えば無菌濾過膜を使った濾過により、容易に実施される。
【０１１１】
持続型放出製剤
持続型放出製剤の例には、ポリペプチドまたはコンジュゲートを含む固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックス、フィルムまたはマイクロカプセルの様な好適形状をしたマトリックスが含まれる。持続型放出マトリックスの例には、ポリエステル、ハイドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）、ポリアオクチド、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタミン酸エステルのコポリマー、非分解性エチレンビニルアセテート、ＰｒｏＬｅａｓｅ(R)技術またはＬｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ(R)（乳酸−グリコール酸コポリマーとロイプロリドアセテートより成る注射可能なマイクロスフェアー）の様な分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸の様なポリマーは、１００日またはそれ以上といった長期間分子を放出することができるが、あるハイドロゲルは蛋白質をより短期間放出する。カプセル封入されたポリペプチドが体内に長時間留まる場合、それらは３７℃で湿気に曝される結果変性または凝集し、その結果生物活性を失うか、免疫原性が変化する可能性がある。これに関係するメカニズムに基づき安定化させる合理的な方策を考案することができる。例えば凝集のメカニズムは、チオ−ジスルフィド相互交換により分子間にＳ−Ｓ結合が形成されることであることが判明したならば、スルフィドリル残基を変更すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、含有湿度を制御すること、適当な添加物を利用すること、および特異的ポリマーマトリックス組成物を開発することで安定化することができるだろう。
本発明は、次の非限定実施例によりさらに記載される。
【０１１２】
［配列リスト］
配列番号１はｈＦＶＩＩ蛋白質（γ−カルボキシル化残基を含む）を示す。
配列番号２はｈＦＶＩＩ蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列を示す。
配列番号３はｈＦＶＩＩ蛋白質（γ−カルボキシル化残基を含まない）を示す。
配列番号４は哺乳動物でのＦＶＩＩの発現に関する発現カセットを示す。
配列番号５はＣＢＰｒｏＥｐｒ１７４プライマーを示す。
配列番号６はＣＢＰｒｏＥｐｒ１７５プライマーを示す。
配列番号７はＣＢＰｒｏＥｐｒ２１６プライマーを示す。
配列番号８はＣＢＰｒｏＥｐｒ２２９プライマーを示す。
配列番号９はＣＢＰｒｏＥｐｒ２２１プライマーを示す。
配列番号１０はＣＢＰｒｏＥｐｒ２２８プライマーを示す。
配列番号１１はＣＢＰｒｏＥｐｒ２２６プライマーを示す。
【０１１３】
［材料と方法］
修飾されるアミノ酸の決定方法
接触可能表面積（ＡＳＡ）
コンピュータープログラムアクセス（Ａｃｃｅｓｓ）（Ｂ．ＬｅｅとＦ，Ｍ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：３７９−４００（１９７１））バージョン２（(c)１９８３エール大学）を用い、構造中の個々の原子について接触可能面積を計算した。この方法は一般には１．４Åのプローブサイズを使用し、接触可能面積（ＡＳＡ）をプローブ中心により形成される面積として規定する。計算の前に、全ての水分子と全ての水素原子を、蛋白質とは直接関係しない他の原子と同様に座標セットから取り除かねばならない。
【０１１４】
側鎖分画ＡＳＡ
側鎖原子の分画ＡＳＡは、側鎖内にある原子のＡＳＡの合計を、延長したＡｌａ−ｘ−Ａｌａトリペプチド内のこの残基の側鎖原子のＡＳＡを表す値で除して計算される（Ｈｕｂｂａｒｄ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２０，５０７−５３０参照）。この例では、ＣＡ原子はグリシン残基の側鎖の一部であり、残りの残基にはないと考えられる。次表は側鎖の標準１００％ＡＳＡとして用いられる。
【０１１５】
【表３】
2005270110.tif 000005
【０１１６】
構造中に検出されない残基は、それらが柔軟領域内に存在すると考えられることから、１００％露出しているものとして規定される。位置６、７、１４、１６、１９、２０，２５、２６、２９および３５にあるガンマ−カルボキシグルタミン酸は全て１００％露出しているものと規定される。
原子間距離の決定
原子間の距離は、分子グラフィックソフトウエアー、例えばＩｎｓｉｇｈｔＩＩ(R)ｖ．９８．０、ＭＳＩ  ＩＮＣを用いて容易に決定できる。
触媒部位領域
触媒部位領域は、触媒トライアッド（残基Ｈ１９３、Ｄ２４２、Ｓ３４４）内にあるいずれかの原子の１０Å内に少なくとも１個の原子を持つ残基として規定される。
組織因子結合部位の決定
受容体結合部位は、受容体結合によりそれらの接触可能面積が変化する残基を全て含むものとして規定されている。これは少なくとも２種類のＡＳＡ計算；即ちリガンド／受容体複合体内の単離された状態のリガンドに関する計算と、完全なリガンド／受容体複合体に関する計算により決定される。
【０１１７】
［ＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａ特性の試験方法］
機能的インビボ半減期の測定
インビボ生物学的半減期の測定は、文献に記載されている様々な方法で実施できる。ｒＦＶＩＩａまたはその変異体のインビボ半減期の測定に関するアッセイの例はＦＤＡ参照番号９６−０５９７に記載されている。簡単に述べると、ＦＶＩＩ凝固活性はコンジュゲート、ポリペプチドまたは組成物の投与前、および投与後２４時間に採取された血漿について測定される。定常状態に於ける分布の見かけ上の中央容積が測定され、中央クリアランス値が決定される。
蛋白質分解に対する感受性低下の測定
コンジュゲート（１００−７５０μｇ／ｍｌ、好ましくは６００μｇ／ｍｌ）、１．５ｍｇＣａ２＋／ｍｌ（塩化カルシウムとして）、マンニトール（３０ｍｇ／ｍｌ）、ポリソルベート８０（０．１ｍｇ／ｍｌ）、塩化ナトリウム（３ｎｇ／ｍｌ）およびグリシル−グリシン緩衝液（１．３ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．５）を含む組成物が調製される。
野生型ｒＦＶＩＩａを含む同様の組成物が調製される。
次に“凝固活性測定法”と題する節に記載、または“低レベル触媒活性測定法”または“触媒活性測定法”と題する節に記載の様にして初期凝固活性、または初期アミド溶解活性を決定する。
次に野生型ｒＦＶＩＩを含む組成物が初期凝固またはアミド溶解活性の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％消失するまで、組成物を３７℃でインキュベーションする。
次に、本発明のコンジュゲートを含む組成物の凝固またはアミド溶解活性を測定する。
次に野生型ｒＦＶＩＩａと比較した場合の、本発明のコンジュゲートの蛋白質分解に対する感受性低下をパーセンテージで表す。
【０１１８】
蛋白質分解に対する感受性低下を測定する別の方法
蛋白質分解は米国特許第５，５８０、５６０号、蛋白質が自己蛋白質分解である実施例５に記載のアッセイを用い測定できる。
さらに、蛋白質分解の低下は放射線標識されたサンプルを用い、血液サンプルを採取してこれらをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにかけることで野生型およびコンジュゲートの蛋白質分解とを比較するインビボモデルで試験できる。
蛋白質分解の決定に使用するアッセイの種類にかかわらず、“蛋白質分解の低下”はクマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのゲルスキャニング、ＨＰＬＣで測定した時に、または以下記載の発色アッセイを用いて残った触媒活性を野生型の活性と比較した時に、非コンジュゲート型野生型ＦＶＩＩａにより得られたものに比べ切断が無視できない低下を示すこと意味する。
【０１１９】
ｒＦＶＩＩおよびそのコンジュゲートの分子量の決定
コンジュゲート型または非コンジュゲート型ｒＦＶＩＩ、またはそのコンジュゲートの分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濾過、ウエスタンブロット、マトリックス補助レーザー吸収マススペクトロメトリーまたは平衡遠心分離のいずれか、例えばＬａｅｍｍｌｉ、英国、Ｎａｔｕｒｅ  ２２７巻（１９７０）、ｐｐ．６８０−８５によるＳＤＳ−ＰＡＧにより決定される。
低レベル触媒活性測定法
ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの希釈検体、および発酵溶液／コンディショニング培地中のアミド溶解活性は、ＣＯＡＳＥＴ(R)ＦＶＩＩ（クロモゲニクス（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）、製品番号８２１９００）を用い決定できる。アミド溶解活性は、メーカー指示書に従い決定された。簡単に述べると、ＦＸは過剰に存在しており、３７℃においてＦＶＩＩａによってＦＸａに変換される。産生したＦＸａは次に発色基質Ｓ２７６５（Ｎ−α−Ｃｂｏ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）を加水分解し、発色団分子、波長４０５ｎｍの光を吸収するパラ−ニトロ−アニリン（ｐＮＡ）の放出をもたらす。反応は酢酸を添加し停止される。サンプル中のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ量は、ＦＶＩＩａより調製された標準曲線（アッセイ緩衝液中１２５ｐｇ／ｍｌから１ｎｇ／ｍｌの範囲）と比較し、決定される。
【０１２０】
触媒活性測定法
小ペプチド基質を切断するコンジュゲートの能力は、発色基質Ｓ−２２８８（Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド）を用い測定できる。組換え体ＦＶＩＩａは０．１％ＢＳＡを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ８．３で希釈される。反応はＳ−２２８８基質を１ｍＭまで添加し介しされ、３７℃にて３０分間インキュベーションした後に４０５ｎｍの吸収が測定される。
凝固活性測定法
ＦＶＩＩａ活性は、第ＷＯ９２／１５５８６号に実質記載されている標準的な１段階凝固アッセイを用い測定される。簡単に述べると、試験サンプルは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１％ＢＳＡで希釈され、そして１００μｌが１００μｌのＦＶＩＩ欠損血漿および１０ｍＭのＣａ＋＋を含む２００μｌのトロンボプラスチンＣとインキュベーションされる。凝固時間が測定され、連続希釈されたクエン酸加正常ヒト血漿のプールを用いた標準曲線と比較される。
抗凝固活性測定法
不活性型ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａコンジュゲートの抗凝固活性は、上記１段階凝固アッセイ（凝固活性測定法）を用い測定できるが、このとき不活性コンジュゲートは限定量の脂質が再付加された（ｒｅｌｉｐｉｄａｔｅｄ）組織因子を巡り野生型ＦＶＩＩと競合する。アッセイは実質的に参照されここに取り込まれている第ＷＯ９２／１５６８６号、実施例３の記載に従い実施される。不活性コンジュゲートの示す野生型ＦＶＩＩ凝固時間延長能が記録され、抗凝固活性測定値とされる。
［実施例］
【０１２１】
【実施例１】
【０１２２】
Ｂａｎｎｅｒら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１９９６；２８５：２０８９による可溶性組織因子との複合体に於けるｈＦＶＩＩのＸ線構造を本サンプルに用いる。参考のために付けた残基の番号は配列通りでないことに注意。ここでは我々は配列番号１に従った連続番号を用いている。位置６、７、１４、１６、１９、２０、２５、２６、２９および３５にあるガンマ−カルボキシグルタミン酸はここではＧＬＵ（３文字略語）またはＥ（１文字略語）で表される。残基１４３−１５２は構造中に存在しない。
【０１２３】
表面露出
方法に記載した非標準および／または消失残基の接近性に関する定義と合わせ、ＦＶＩＩ断片単独について分画ＡＳＡ計算を行ったところ、以下の残基が２５％より多いそれらの側鎖が表面に露出していることされた：Ａ１、Ｎ２、Ａ３、Ｆ４、Ｌ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ８、Ｒ９、Ｐ１０、Ｓ１２、Ｌ１３、Ｅ１４、Ｅ１６、Ｋ１８、Ｅ１９、Ｅ２０、Ｑ２１、Ｓ２３、Ｆ２４、Ｅ２５、Ｅ２６、Ｒ２８、Ｅ２９、Ｆ３１、Ｋ３２、Ｄ３３、Ａ３４、Ｅ３５、Ｒ３６、Ｋ３８、Ｌ３９、Ｗ４１、Ｉ４２、Ｓ４３、Ｓ４５、Ｇ４７、Ｄ４８、Ｑ４９、Ａ５１、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｑ５６、Ｇ５８、Ｓ６０、Ｋ６２、Ｄ６３、Ｑ６４、Ｌ６５、Ｑ６６、Ｓ６７、Ｉ６９、Ｆ７１、Ｌ７３、Ｐ７４、Ａ７５、Ｅ７７、Ｇ７８、Ｒ７９、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｈ８４、Ｋ８５、Ｄ８６、Ｄ８７、Ｑ８８、Ｌ８９、Ｌ９０、Ｖ９２、Ｎ９３、Ｅ９４、Ｇ９７、Ｅ９９、Ｓ１０３、Ｄ１０４、Ｈ１０５、Ｔ１０６、Ｇ１０７、Ｔ１０８、Ｋ１０９、Ｓ１１１，Ｒ１１３、Ｅ１１６、Ｇ１１７、Ｓ１１９、Ｌ１２０、Ｌ１２１、Ａ１２２、Ｄ１２３、Ｇ１２４、Ｖ１２５、Ｓ１２６、Ｔ１２８、Ｐ１２９、Ｔ１３０、Ｖ１３１、Ｅ１３２、Ｉ１４０、Ｌ１４１、Ｅ１４２、Ｋ１４３、Ｒ１４４、Ｎ１４５、Ａ１４６、Ｓ１４７、Ｋ１４８、Ｐ１４９、Ｑ１５０、Ｇ１５１、Ｔ１５２、Ｇ１５５、Ｋ１５７、Ｖ１５８、Ｐ１６０、Ｋ１６１、Ｅ１６３、Ｌ１７１、Ｎ１７３、Ｇ１７４、Ａ１７５、Ｎ１８４、Ｔ１８５、Ｉ１８６、Ｈ１９３、Ｋ１９７、Ｋ１９９，Ｎ２００、Ｒ２０２、Ｎ２０３、Ｉ２０５、Ｓ２１４、Ｅ２１５、Ｈ２１６、Ｄ２１７、Ｇ２１８、Ｄ２１９、Ｓ２２２、Ｒ２２４、Ｓ２３２、Ｔ２３３、Ｖ２３５、Ｐ２３６、Ｇ２３７、Ｔ２３８、Ｔ２３９、Ｎ２４０、Ｈ２４９、Ｑ２５０、Ｐ２５１、Ｖ２５３、Ｔ２５５、Ｄ２５６、Ｅ２６５、Ｒ２６６、Ｔ２６７、Ｅ２７０、Ｒ２７１、Ｆ２７５、Ｖ２７６、Ｒ２７７、Ｆ２７８、Ｌ２８０、Ｌ２８７、Ｌ２８８、Ｄ２８９、Ｒ２９０、Ｇ２９１、Ａ２９２、Ｔ２９３、Ｌ２９５、Ｅ２９６、Ｎ３０１、Ｍ３０６、Ｔ３０７、Ｑ３０８、Ｄ３０９、Ｌ３１１、Ｑ３１２、Ｑ３１３、Ｒ３１５、Ｒ３１６、Ｖ３１７、Ｇ３１８、Ｄ３１９、Ｓ３２０、Ｐ３２１、Ｎ３２２、Ｔ３２４、Ｅ３２５、Ｙ３２６、Ｙ３３２、Ｓ３３３，Ｄ３３４、Ｓ３３６、Ｋ３４１、Ｇ３４２、Ｈ３５１、Ｒ３５３、Ｇ３５４、Ｑ３６６、Ｇ３６７、Ｔ３７０、Ｖ３７１、Ｇ３７２、Ｒ３７９、Ｅ３８５、Ｑ３８８、Ｋ３８９、Ｒ３９２、Ｓ３９３、Ｅ３９４、Ｐ３９５、Ｒ３９６、Ｐ３９７、Ｇ３９８、Ｖ３９９、Ｌ４００，Ｌ４０１、Ｒ４０２、Ｐ４０４およびＰ４０６。
【０１２４】
以下の残基はそれらの５０％より多い側鎖が表面に露出している：Ａ１、Ａ３、Ｆ４、Ｌ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ８、Ｒ９、Ｐ１０、Ｅ１４、Ｅ１６、Ｋ１８、Ｅ１９、Ｅ２０、Ｑ２１、Ｓ２３、Ｅ２５、Ｅ２６、Ｒ２８、Ｅ２９、Ｋ３２、Ａ３４、Ｅ３５、Ｒ３６、Ｋ３８、Ｌ３９、Ｉ４２、Ｓ４３、Ｇ４７、Ｄ４８、Ａ５１、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｑ５６、Ｇ５８、Ｓ６０、Ｋ６２、Ｌ６５、Ｑ６６、Ｓ６７、Ｉ６９、Ｆ７１、Ｌ７３、Ｐ７４、Ａ７５、Ｅ７７、Ｇ７８、Ｒ７９、Ｅ８２、Ｈ８４、Ｋ８５、Ｄ８６、Ｄ８７、Ｑ８８、Ｌ８９、Ｌ９０、Ｖ９２、Ｎ９３、Ｅ９４、Ｇ９７、Ｔ１０６、Ｇ１０７、Ｔ１０８、Ｋ１０９、Ｓ１１１、Ｅ１１６、Ｓ１１９、Ｌ１２１、Ａ１２２、Ｄ１２３、Ｇ１２４、Ｖ１３１、Ｅ１３２、Ｌ１４１、Ｅ１４２、Ｋ１４３、Ｒ１４４、Ｎ１４５、Ａ１４６、Ｓ１４７、Ｋ１４８、Ｐ１４９、Ｑ１５０、Ｇ１５１、Ｔ１５２、Ｇ１５５、Ｋ１５７、Ｐ１６０、Ｎ１７３、Ｇ１７４、Ａ１７５、Ｋ１９７、Ｋ１９９，Ｎ２００、Ｒ２０２、Ｓ２１４、Ｅ２１５、Ｈ２１６、Ｇ２１８、Ｒ２２４、Ｖ２３５、Ｐ２３６、Ｇ２３７、Ｔ２３８、Ｈ２４９、Ｑ２５０、Ｖ２５３、Ｄ２５６、Ｔ２６７、Ｆ２７５、Ｒ２７７、Ｆ２７８、Ｌ２８８、Ｄ２８９、Ｒ２９０、Ｇ２９１、Ａ２９２、Ｔ２９３、Ｌ２９５、Ｎ３０１、Ｍ３０６、Ｑ３０８、Ｄ３０９、Ｌ３１１、Ｑ３１２、Ｑ３１３、Ｒ３１５、Ｒ３１６、Ｇ３１８、Ｄ３１９、Ｎ３２２、Ｅ３２５、Ｄ３３４、Ｋ３４１、Ｇ３５４、Ｇ３６７、Ｖ３７１、Ｅ３８５、Ｋ３８９、Ｒ３９２、Ｅ３９４、Ｒ３９６、Ｐ３９７、Ｇ３９８、Ｒ４０２、Ｐ４０４およびＰ４０６。
【０１２５】
組織因子結合部位
ＡＳＡ計算を実施したところ、複合体ではヒトＦＶＩＩの次の残基はそれらのＡＳＡを変える：Ｌ１３、Ｋ１８、Ｆ３１、Ｅ３５、Ｒ３６、Ｌ３９、Ｆ４０、Ｉ４２、Ｓ４３、Ｓ６０、Ｋ６２、Ｄ６３、Ｌ６５、Ｉ６９、Ｃ７０、Ｆ７１、Ｃ７２、Ｌ７３、Ｐ７４、Ｆ７６、Ｅ７７、Ｇ７８、Ｒ７９、Ｅ８２、Ｋ８５、Ｑ８８、Ｉ９０、Ｖ９２、Ｎ９３、Ｅ９４、Ｒ２７１、Ａ２７４、Ｆ２７５、Ｖ２７６、Ｒ２７７、Ｆ２７８、Ｒ３０４、Ｌ３０５、Ｍ３０６、Ｔ３０７、Ｑ３０８、Ｄ３０９、Ｑ３１２、Ｑ３１３、Ｅ３２５およびＲ３７９。
【０１２６】
活性部位領域
活性部位領域は、触媒トライアッド（残基Ｈ１９３、Ｄ２４２、Ｓ３４４）中の原子から１０Åの距離内に少なくとも１個の原子を有する残基として定義されている：Ｉ１５３、Ｑ１６７、Ｖ１６８、Ｌ１６９、Ｌ１７０、Ｌ１７１、Ｑ１７６、Ｌ１７７、Ｃ１７８、Ｇ１７９、Ｇ１８０、Ｔ１８１、Ｖ１８８，Ｖ１８９、Ｓ１９０、Ａ１９１、Ａ１９２、Ｈ１９３、Ｃ１９４、Ｆ１９５、Ｄ１９６、Ｋ１９７、Ｉ１９８、Ｗ２０１、Ｖ２２８、Ｉ２２９、Ｉ２３０、Ｐ２３１、Ｓ２３２、Ｔ２３３，Ｙ２３４、Ｖ２３５、Ｐ２３６、Ｇ２３７、Ｔ２３８、Ｔ２３９、Ｎ２４０、Ｈ２４１、Ｄ２４２、Ｉ２４３、Ａ２４４、Ｌ２４５、Ｌ２４６、Ｖ２８１、Ｓ２８２、Ｇ２８３、Ｗ２８４、Ｇ２８５、Ｑ２８６、Ｔ２９３、Ｔ３２４、Ｅ３２５、Ｙ３２６、Ｍ３２７、Ｆ３２８、Ｄ３３８、Ｓ３３９、Ｃ３４０、Ｋ３４１、Ｇ３４２、Ｄ３４３、Ｓ３４４、Ｇ３４５、Ｇ３４６、Ｐ３４７、Ｈ３４８、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｇ３６０、Ｉ３６１、Ｖ３６３、Ｓ３６３、Ｗ３６４、Ｇ３６５、Ｃ３６８、Ｖ３７６、Ｙ３７７，Ｔ３７８、Ｒ３７９、Ｖ３８０、Ｑ３８２、Ｙ３８３、Ｗ３８６、Ｌ３８７、Ｌ４００およびＦ４０５。
活性部位結合裂溝のリッジ
活性部位結合裂溝領域のリッジは、ＦＶＩＩａ構造１ＦＡＫ．ｐｄｂを目視検査し、次であると定義された：Ｎ１７３、Ａ１７５、Ｋ１９９，Ｎ２００、Ｎ２０３、Ｄ２８９、Ｒ２９０、Ｇ２９１、Ａ２９２、Ｐ３２１およびＴ３７０。
【実施例２】
【０１２７】
哺乳動物細胞でのヒト血液凝固ＶＩＩ因子の発現に適した発現カセットのデザイン
哺乳動物細胞での高発現を容易にするために、ヒト血液凝固ＶＩＩ因子をコードする完全長ｃＤＮＡの短型と、その本来の短シグナルペプチド（Ｈａｇｅｎら、１９８６、ＰＮＡＳ８３：２４１２）とを包含する配列番号２に示すＤＮＡ配列を合成した。まずＡＴＧ開始コドンの前後をコザックコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ、Ｍ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９８７  Ａｕｇ  ２０；１９６（４）：９４７−５０）により修飾し、ＡＴＧ開始コドンの上流コンセンサス配列を完全に一致させた。第２に元のヒト血液凝固因子ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームを、コドン使用に関する偏りを高度に発現するヒト遺伝子で頻繁に使用されているコドンのものに合わせ、変更した。さらに、効果的に翻訳を停止させることを目的として、オープンリーディングフレームの末端に２カ所翻訳停止コドンを挿入した。完全に合成的かつ発現に最適化されたヒトＦＶＩＩ遺伝子を、７０−ｍｅｒのＤＮＡオリゴヌクレオチドから組み立て、最後に５‘および３’末端それぞれにＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位を挿入した末端プライマーを使い、標準的ＰＣＲにより増幅し、以下の配列を得た（配列番号４）：
【０１２８】
【化１】
2005270110.tif 000006
【０１２９】
未変性ヒト血液凝固ＶＩＩ因子に関する発現カセットを含む生成ＰＣＲ産物のクローニングに適したベクターを、ｐＣＩＮｅｏ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））のイントロン内にクローニングし調製した。ＰＣＩ−Ｎｅｏ由来の合成イントロンは上記の標準的ＰＣＲ条件と次のプライマーを使い増幅され：
CBProFpr174：5’-AGCTGGCTAGCCACTGGGCAGGTAAGTATCA-3’および
CBProFpr175：5’-TGGCGGGATCCTTAAGAGCTGTAATTGAACT-3’
その結果３２２ｂｐのＰＣＲ断片を得た。この断片はｐＣＤＮＡ３．１／ＨｙｇＲ（インビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏ  Ｇｅｎ）より得た）にクローニングする前にＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで切断され、ＰＦ＃３４を得た。
未変性ヒト血液凝固ＶＩＩ因子の発現カセットはＰＦ＃３４のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位間にクローニングされ、プラスミドＰＦ＃２２６を得た。
【実施例３】
【０１３０】
追加のインビボグリコシレーション部位を持ったヒト血液凝固ＶＩＩ因子の変異形をコードした発現カッセットの構築
配列オーバーハング延長（ＳＯＥ）ＰＣＲを用い、置換コドンを持った変異型ヒト血液凝固因子オープンリーディングフレームを作製した。ＳＯＥ−ＰＣＲでは、ＦＶＩＩオープンリーディングフレームのＮ−末端部分とＣ−末端部分の両方がまず独立に一次ＰＣＲで増幅された。
例えばコドンＲ３１５とＶ３１７を、コドンＮ３１５とＴ３１７に変更するためには、次のプライマーを使い一次ＰＣＲを行う：
【０１３１】
CBProFpr216：5’-CTTAAGGATCCCGCCACCATGGTCAGCCAG-3‘と
CBProFpr229：5’-GGAGTCCCCGGTTTTGTTGGACTGCTGC-3’、
および
CBProFpr221：5’-ACTTAAGCTTTTATCAAGGGA-3’と
CBProFpr228：5’-GCAGCAGTCCAACAAAACCGGGGACTCC-3’。
【０１３２】
一次ＰＣＲ産物は次にまとめられ、末端プライマー(CBProFpr216とCBProFpr221）を加え、所望のＲ３１５Ｎ＋Ｖ３１７ＴＦＶＩＩ変異体をコードする第２完全長を得た。２次ＰＣＲ産物はベクターＰＦ＃３４内、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位間にクローニングしＰＦ＃２４９を得る前に、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切り詰められた。
さらに、導入された突然変異が発現プラスミド中の固有の制限エンドヌクレアーゼ部位に十分近い場合には、変異体遺伝子は単独ＰＣＲ段階と、続くクローニングとを包含する構築手順を用い構築される。例えばＫ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｔは次のＰＣＲプライマーを単一ＰＣＲ反応中に使用し導入された：
【０１３３】
CBProFpr226：5’-CATTCTAGAAAACCGGACCGCTAGCAAACC-3’および
CBProFpr221：5’-ACTTAAGCTTTTATCAAGGGA-3’。
【０１３４】
ＰＣＲ産物は次に制限エンドヌクレアーゼ部位ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いてクローニングされた。
上記のストラテジーを用い、次のグリコシル化コンジュゲートを調製し、そのアミド溶解活性を低レベル触媒活性測定法と題する節に記載した様にして試験した。さらにコンジュゲートの幾つかを凝固活性測定法と題する節に記載の１段階凝固アッセイにかけた。得られた結果を下表に示す。
【０１３５】
【表４】
2005270110.tif 000007
【０１３６】
【実施例４】
【０１３７】
別の基部（Ｎ−末端局在）グリコシル化部位の導入によるグリコシル化部位有用性の改良
野生型ヒトＦＶＩＩａグリコシル化部位の自己溶解を防ぐために、置換：上記Ｒ３１５ＮとＶ３１７Ｔを行い位置３１５にグリコシル化部位を導入してＰＦ＃２４９を得た。
リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆａｃｔａｍｉｎｅ）２０００を用いたＣＨＯ  Ｋ１細胞のトランスフェクションにより、一過性の低発現レベルを得た。アミド溶解アッセイ、ＣＯＡＳＥＴ(R)ＦＶＩＩにより２４時間の一過性上清をアッセイしたところ、変異体が活性であることを示した。４００μｇ／ｍｌのヒグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）Ｂを用い選別して安定型クローンのプールを得た。このプールはＲ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｔ変異体を約０．２μｇ／ｍｌで発現し、ウエスタンブロット分析により導入されたグリコシル化部位の有用性を決定することができた。安定型プールより得た２４時間上清をウエスタンブロットでアッセイしたところ、位置３１５に導入されたグリコシル化部位が部分的に有用であり、完全に加工された分泌蛋白質の約半数がグリコシル化されていることが示された。しかし、位置１４５の本来のグリコシル化部位が、置換Ｋ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｔにより位置１４３に移された場合、位置３１５に導入されたグリコシル化部位は完全にグリコシル化されるとウエスタンブロットにより判定された。
【実施例５】
【０１３８】
ＨＥＫ２９３細胞でのＦＶＩＩの発現
細胞株ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５７３）は、ＥＭＥＭ、高グルコース１０％熱不活性化ＦＣＳ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬカタログ＃１００９１）、５μｇ／ｍｌフィロキノンを含むＴ−２５フラスコ中に２０％集密度で接種し、融合するまで増殖させた。この融合単細胞層に１、２、５、１０および２０μｇの上記プラスミドｐ２２６を、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をメーカー指示書通りに用いてトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後にサンプルを採取した。２４時間の一過性発現実験に於けるＦＶＩＩ濃度は平均して０．１５μｇ／ｍｌであった。
続いて、１００μｇ／ｍｌのヒグロマイシンＢを含む選択培地を細胞に投与した。３日または４日毎に培地を新しくしながら３週間選別した後に、ヒグロマイシン耐性細胞を１μｇのプラスミドＤＮＡと２μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクションしたフラスコ中に融合融合させた。５個のフラスコそれぞれから得た細胞を集め、プールした。得られた未変性ヒト血液凝固ＶＩＩ因子を発現するトランスフェクタントの安定型プールを液体窒素中に標準的方法に従い凍結した。
【実施例６】
【０１３９】
安定してＦＶＩＩを発現するＨＥＫ２９３細胞の作成
ＨＥＫ２９３ＰＦ＃２２６トランスフェクタントプールのバイアルを融解し、細胞を１５ｍｌのＤＭＥＭ高グルコース、１０％のＦＣＳ、フィロキノン（５μｇ／ｍｌ）、１００Ｕ／ｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む７５ｃｍ２組織フラスコに接種し、２４時間増殖させ、そして以後の実験はこれを用いて行った。細胞を集め、希釈し、９６ウエルマイクロタイタープレートに１／２細胞／ウエルの密度で接種した。１２日後、約２０−１００細胞のコロニーがウエル内に存在し、１コロニーのみ含むウエルを標識した。さらに２日間増殖させた後、１００μｌの培地をウエルに追加し加えた。２日後、１コロニーのみを含む全てのウエルの培地を交換した。最初のコロニーは２５ｃｍ２組織フラスコに移され、３日間培養された後集密度に応じてコロニーは２５ｃｍ２組織フラスコに移され、さらに１１日間培養された。Ｔ−２５組織フラスコで融合した場合には、培地が交換され、コロニーに２４時間増殖培地中にＦＶＩＩを分泌させ、その後上清を集めてＣＯＡＳＥＴ  ＦＶＩＩアミド溶解アッセイを用いてＶＩＩ因子の存在についてアッセイされた。１クローン、Ｃ１８が２９μｇ／ｍｌのＦＶＩＩを発現することが見いだされた。
【実施例７】
【０１４０】
ＦＶＩＩａの機能を阻害するアミド溶解能を持たないＦＶＩＩグリコシル化変異体の発現
活性部位リッジ突然変異体Ｒ２９０Ｎ＋Ａ２９２ＴおよびＧ２９１の発現に適した発現プラスミドを、実質的に実施例３記載通りに構築した。
アミド溶解アッセイＣＯＡＳＥＴ(R)ＦＶＩＩ（上記参照）を用い、２種類のグリコシル化変異体、Ｒ２９０Ｎ＋Ａ２９２ＴおよびＧ２９１ＮのｒＦＶＩＩａ活性阻害能力を評価した。Ｒ２９０Ｎ＋Ａ２９２ＴをコードしているプラスミドＰＦ＃２５０とＧ２９１ＮをコードしているプラスミドＰＦ＃２９４を、リポフェクタミン２０００を用いて、ほぼ集密的まで血清培養されたＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞は、トランスフェクション後、培地を無血清培地（ＤＭＥＭ、ＩＴＳ−Ａ、ＥｘＣｙｔｅ、フィロキノン、Ｐ／Ｓ）に交換するまえに、５％ＣＯ２下、３７℃で３時間インキュベーションされた。トランスフェクション４時間後に、コンディショニング培地を集め、分析にかけるために遠心分離し清浄化した。
標準曲線はｒＦＶＩＩａ：０．０１２５ｎｇ、０．０２５ｎｇ、０．０５ｎｇ、０．０７５ｎｇおよび０．１ｎｇを用い作成した。２種類のグリコシル化変異体Ｒ２９０Ｎ＋Ａ２９２ＴおよびＧ２９１Ｎについて得た未希釈、２倍希釈、５倍希釈、１０倍希釈、そして５０倍希釈のコンディショニング培地、またはモックトランスフェクション由来のコンディショニング培地の一部を０．０２５ｎｇのｒＦＶＩＩａでスパイクした。ＣＯＡＳＥＴ  ＦＶＩＩアッセイでアッセイした場合、０．０２５ｎｇのＦＶＩＩａはＯＤ４０５＝０．３５（初回測定）とＯＤ４０５＝０．２６（第２回測定）のシグナルに相当した。
得られた結果を下表にまとめる：
【０１４１】
【表５】
2005270110.tif 000008
【０１４２】
上記データから明らかな様に、グリコシル化コンジュゲートＧ２９１ＮおよびＲ２９０Ｎ＋Ａ２９２Ｔは機能的ｒＦＶＩＩａを阻害する。
【実施例８】
【０１４３】
ＦＶＩＩの精製およびその後の活性化
野生型ＦＶＩＩおよびそのコンジュゲートの精製は４℃で行われた。コンジュゲート（または野生型ＦＶＩＩ）を発現している細胞より得た上清を無菌濾過し（０．２２μｍ）、冷ミリＱ水で２倍に希釈した。サンプルを４℃にて１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．６に平衡化されたＯ−セファロースファーストフロー樹脂（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけた。サンプルを加えた後、カラムを１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．６）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで２８０ｎｍの吸光度がベースラインになるまで洗浄した。次にカラムを１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．６）、１００ｍＭのＮａＣｌで平衡化した。結合したコンジュゲート（または野生型ＦＶＩＩ）は１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．６）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２で溶出された。コンジュゲート（または野生型ＦＶＩＩ）を多く含む分画をプールし、透析により、またはＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮装置（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を用い濃縮した。
【０１４４】
コンジュゲート（または野生型ＦＶＩＩ）の自己活性化は、濃縮し、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．８−８．６）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２中に溶出蛋白質をインキュベーションすることで得た。
あるいはコンジュゲート（または野生型ＦＶＩＩ）はＣＮＢｒ活性化セファロースに結合された第Ｘａ因子により、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４−８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２中で活性化された。
コンジュゲート（または野生型ＦＶＩＩ）は１０ｍＭのＣａＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、３％マンニトール、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０を含みｐＨ５．６に緩衝化された溶液中に緩衝液交換され、無菌濾過後に−８０℃で保管された。
【実施例９】
【０１４５】
ＦＶＩＩのＮ−末端グリコシル化
第ＶＩＩ因子は、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍMＣａＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５を含む緩衝液中にＭ−ＰＥＧ−ＣＨＯ（Ｍ−ＡＬＤ−５０００，シェアウォーター（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ）より得た）を用い、約５ｋＤａの分子量を持つメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）でコンジュゲートされた。Ｍ−ＰＥＧ−ＣＨＯは５０−１００倍モル過剰に存在し、そしてその蛋白質濃度は０．２−０．５ｍｇ／ｍｌであった。反応は室温で１時間、攪拌しながら３００−１５００μｌのバッチで行われ、それからＮａＢＨ３ＣＮが５００−１０００倍過剰量加えられ、一晩、攪拌しながら室温にて連続インキュベーションされた。
ＰＥＧ化ＦＶＩＩは緩衝液Ａ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６）に緩衝液交換され、緩衝液Ａで平衡化されたモノＱカラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に４℃にてかけられた。結合蛋白質は４０倍量の０−１００％Ｂ（１０ｍＭ  Ｔｒｓｉ（ｐＨ７．６）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）の勾配で溶出された。
【実施例１０】
【０１４６】
ラットでの薬物動態研究
野生型ＦＶＩＩと本発明のコンジュゲートを、１．５ｍｇ／ｍｌＣａＣｌ２、３０ｍｇ／ｍｌマンニトール、０．１ｍｇ／ｍｌポリソルバット８０および３ｍｇ／ｍｌＮａＣｌを含むｐＨ５．５のグリシル−グリシン緩衝液中に１．３ｍｇ／ｍｌで調合した。各調剤のインビボ半減期を測定するために、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに静脈内への１回大量注射により投与した。高濃度のＣａ２＋を原因として起こり得る心不全のリスクを減らす為に、注射は約１０秒以上かけてゆっくりと行った。それぞれについて、９匹の麻酔をかけたラットから好適間隔、例えば注射後１分、１５分、３０分、４５分および１時間目に採血を行った。血液サンプルは凝固を防ぐために、５０μｌのアデニン添加クエン酸−リン酸−デキストロース液（シグマ（Ｓｉｇｍａ）＃Ｃ４４３１）を含む１ｍｌのチューブに集められた。採血後すぐに、サンプルはアッセイのために遠心分離してクエン酸血漿上清が集められるまで約０℃に保管された。サンプルは凝固活性測定法の節に記載の１段階凝固アッセイでアッセイされ、続いて半減期が計算された。