(57)【要約】【課題】  本発明が解決すべき課題は、テトラクロロエチレンに汚染された土壌や地下水等を浄化処理するに当たって、比較的大規模な実施が可能である方法を提供するものである。また、本発明では、上記方法に使用可能な脱塩素微生物を提供することも課題としている。【解決手段】  本発明に係るＰＣＥの分解方法は、少なくともテトラクロロエチレンに汚染された土壌または水に脱塩素微生物を添加し、微好気的条件下でＰＣＥを脱塩素化する工程を含むことを特徴とするものである。また、本発明の脱塩素微生物は、ＫＢＣ−１株である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
テトラクロロエチレン（以下、「ＰＣＥ」という）を分解する方法であって、
少なくともＰＣＥに汚染された土壌または水に脱塩素微生物を添加し、微好気的条件下でＰＣＥを脱塩素化する工程（以下、「ＰＣＥ脱塩素化工程」という）を含むことを特徴とするＰＣＥの分解方法。
【請求項２】
請求項１に記載のＰＣＥ分解方法において、上記ＰＣＥ脱塩素化工程の後に、好気性微生物によってＰＣＥの脱塩素化物を好気的条件下で分解する工程（以下、「ＰＣＥ脱塩素化物の分解工程」という）を行なう方法。
【請求項３】
請求項２に記載のＰＣＥ分解方法において、上記ＰＣＥ脱塩素化工程および上記ＰＣＥ脱塩素化物の分解工程を、交互に少なくとも２回以上行なう方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のＰＣＥ分解方法において、ＰＣＥ脱塩素化工程でＰＣＥをトリクロロエチレン（以下、「ＴＣＥ」という）まで分解する方法。
【請求項５】
請求項４に記載のＰＣＥ分解方法において、上記脱塩素微生物として、ＰＣＥを脱塩素化してＴＣＥとする能力を有するＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌が含まれるものを使用する方法。
【請求項６】
請求項５に記載のＰＣＥ分解方法において、上記Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌として、ＫＢＣ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７３）を使用する方法。
【請求項７】
請求項６に記載のＰＣＥ分解方法において、ＰＣＥ脱塩素化工程の温度を１０〜４２℃とする方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のＰＣＥ分解方法において、上記微好気的条件の酸素分圧を０．５％以下とする方法。
【請求項９】
脱塩素微生物であるＫＢＣ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７３）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、汚染土壌或いは汚染水に含まれるテトラクロロエチレン（以下、「ＰＣＥ」という）を分解する方法、および当該方法に用いることができる脱塩素微生物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
有機塩素系溶剤であるＰＣＥは、その優れた溶解能や揮発性、不燃性といった特性により、ドライクリーニングやフロンガスの製造原料、金属部品の脱脂洗浄用途、繊維の精錬加工等に使用されてきた。その一方で、ＰＣＥは、動物実験により発ガン性が確認されており、また、中枢神経や肝臓・腎臓に障害を与えることなども報告されている。
【０００３】
この様に、使用量が多い一方で毒性の高いＰＣＥには、化学的に安定であり環境中で分解され難いという欠点もある。そこで、これまでにも吸引吸着法など様々な処理方法が検討されてきたが、近年では、より穏和な条件で安価に実施でき、省エネルギーの観点からも優れている微生物による処理（バイオレメディエーション）が注目されており、開発が行なわれている。
【０００４】
例えば、特許文献１には、先ず嫌気性微生物によって塩素数３〜４の塩素化エチレン類の塩素数を低減し、次いで好気性微生物によりこの低塩素化有機化合物を二酸化炭素と水まで分解する技術が記載されている。また、特許文献２には、汚染土壌等に対して、嫌気性生物処理工程と好気性生物処理工程を交互に繰り返す方法が記載されている。更に、特許文献３には、ＰＣＥを嫌気的条件でトリクロロエチレン（以下、「ＴＣＥ」という）へ脱塩素化した後、このＴＣＥを好気的条件で分解処理する方法が記載されている。
【０００５】
ＰＣＥに汚染された土壌等のバイオレメディエーションに用いられる嫌気性微生物としては、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属やＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属の菌が知られており、下記のような知見が知られている。Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の菌としては、非特許文献１にＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓが、非特許文献２にＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．（ＰＣＥ１）が記載されている。また、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属の菌としては、非特許文献３および４に、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓが記載されている。さらに、特許文献４には、ＰＣＥを脱塩素化できる細菌（Ｙ５１株）と共にＰＣＥ脱塩素化酵素と同酵素をコードする遺伝子が、特許文献５には、ＰＣＥ脱塩素化酵素と同酵素をコードする遺伝子が記載されている。
【０００６】
しかし以上の従来技術においては、何れも嫌気的条件でＰＣＥを脱塩素化している。従って、比較的大規模な処理には適用し難いという問題があった。即ち、ＰＣＥによる土壌や地下水の汚染は広範囲に及ぶことがあるが、斯かる場合には土壌等を大量に処理する方が効率的である。ところが従来技術は、嫌気的な条件でＰＣＥを脱塩素化するものであるために、巨大な密閉容器など嫌気的条件を達成するための条件を整える必要があった。それでは設備に要する固定費用がかかるのみならず、処理に長期間を要し、巨大な密閉容器を嫌気的条件にするのも困難である。
【０００７】
また、従来技術でＰＣＥを脱塩素化するために用いられていた脱塩素微生物は、酸素に対する感受性が高く、好気的条件に数秒間暴露されるだけでも脱塩素活性が消失してしまうものが多く（非特許文献４参照）、培養が困難であった。さらに、公知文献には嫌気的条件でしかＰＣＥを脱塩素化できないとの知見しかなく、微好気的条件下ではＰＣＥを脱塩素化できないか或いは脱塩素化効率が極端に低下するものであった。その上、従来の脱塩素微生物の生育温度範囲は比較的高く（例えば、非特許文献２に記載されている脱塩素微生物では１９〜４２℃）、寒冷地の屋外でＰＣＥを脱塩素化するのは困難であった。
【特許文献１】特開平１０−３４１２８号公報（請求項１）
【特許文献２】特開２００３−１６４８５０号公報（請求項１）
【特許文献３】特開２０００−１０２３７７号公報（請求項１と２）
【特許文献４】特開２００１−２６９１７５号公報（特許請求の範囲）
【特許文献５】特開２００２−１７３５８号公報（特許請求の範囲）
【非特許文献１】ＩＬＹＡ  ＵＴＫＩＮ，他２名，インターナショナル・ジャーナル・オブ・システマチック・バクテリオロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），第４４巻，第４号，ｐ．６１２−６１９（１９９４年）
【非特許文献２】Ｊａｎ  Ｇｅｒｒｉｔｓｅ，他５名，アーカイブス・オブ・マイクロバイオロジー（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ），第１６５巻，ｐ．１３２−１４０（１９９６年）
【非特許文献３】Ｒｅｋｈａ  Ｓｅｓｈａｄｒｉ，他２４名，サイエンス（ＳＣＩＥＮＣＥ），第３０７巻，ｐ１０５−１０８（２００５年）
【非特許文献４】Ｌｏｒｅｎｚ  Ａｄｒｉａｎ，他３名，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第４０８巻，ｐ５８０−５８３（２０００年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述した状況の下、本発明が解決すべき課題は、ＰＣＥに汚染された土壌や地下水等を浄化処理するに当たって、比較的大規模な実施も可能である方法を提供するものである。
【０００９】
これに加えて、本発明では、上記方法に使用可能な脱塩素微生物を提供することも課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するためバイオレメディエーションによるＰＣＥ汚染土壌等の浄化処理条件につき鋭意研究を進めたところ、微好気条件下でＰＣＥを脱塩素化処理できればコストを低減でき、また、本発明に係る脱塩素微生物であるＫＢＣ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７３）であれば、嫌気的条件下のみならず微好気条件下でも、ＰＣＥを効率的に脱塩素化処理できることを見出して本発明を完成した。
【００１１】
即ち、本発明のＰＣＥ分解方法は、ＰＣＥを分解する方法であって、少なくともＰＣＥに汚染された土壌または水に脱塩素微生物を添加し、微好気的条件下でＰＣＥを脱塩素化する工程（以下、「ＰＣＥ脱塩素化工程」という）を含むことを特徴とする。
【００１２】
上記ＰＣＥ脱塩素化工程後には、好気性微生物によってＰＣＥの脱塩素化物を好気的条件下で分解する工程（以下、「ＰＣＥ脱塩素化物の分解工程」という）を行なうことが好ましい。ＰＣＥの脱塩素化物は、安全性や低コスト、省エネルギーの観点から、やはりバイオレメディエーションで処理するのが好適だからである。
【００１３】
上記ＰＣＥ脱塩素化工程と上記ＰＣＥ脱塩素化物の分解工程は、交互に少なくとも２回以上行なうのが好適な場合がある。例えば、高濃度ＰＣＥに汚染された土壌等を処理する場合や、ＰＣＥに加えてＴＣＥなど他の有害物質による複合汚染の場合である。
【００１４】
上記ＰＣＥ脱塩素化工程では、ＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化することが好ましい。ＰＣＥの脱塩素化物としては、ＴＣＥの他にジクロロエチレンや塩化ビニル等が考えられるが、これらはＴＣＥよりも毒性が高いため、いったんＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化した上で、好気性微生物によりＴＣＥを二酸化炭素等にまで分解する方が、環境に与える悪影響が少ないからである。
【００１５】
上記ＰＣＥ脱塩素化工程で使用する脱塩素微生物としては、ＰＣＥを脱塩素化してＴＣＥとする能力を有するＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌が含まれるものを使用することが好ましい。Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌は、高いＰＣＥ脱塩素化能を有するからである。
【００１６】
更に上記Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌としては、ＫＢＣ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７３）が好適である。また、上記ＰＣＥ脱塩素化工程の実施条件としては、実施温度を１０〜４２℃、上記微好気的条件の酸素分圧を０．５％以下とすることが好適である。従来の脱塩素微生物によれば、当該条件ではＰＣＥを脱塩素化できないか或いは効率的な脱塩素化が困難であって、寒冷地の屋外での実施ができなかったり、嫌気的条件でしかＰＣＥを効率的に脱塩素化することができなかったが、本発明に係るＫＢＣ−１株によれば、当該条件下でもＰＣＥの脱塩素化処理が可能である。従って、これら規定には、本発明と従来技術との相違点を明確にする意義がある。
【００１７】
本発明の脱塩素微生物は、ＫＢＣ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７３）である。ＫＢＣ−１株は、嫌気的条件下のみならず微好気的条件下においても、また、従来の脱塩素化微生物では脱塩素化能を発揮することができなかった様な低温下でも、ＰＣＥを分解することができる。さらに、ＫＢＣ−１株は、ＰＣＥをより毒性の高いジクロロエチレンではなく、ＴＣＥまで分解することができる。従って、ＫＢＣ−１株は、上記本発明方法のみならず、従来方法でもＰＣＥを分解できる脱塩素微生物として、非常に価値が高い。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のＰＣＥ分解方法は、ＰＣＥにより汚染された土壌や地下水を比較的大規模に浄化する場合であっても、効率的且つ低コストで処理できる。また、本発明の脱塩素微生物であるＫＢＣ−１株は、当該方法でも使用できるものであって、微好気条件下や寒冷地など比較的温度が低い地域であってもＰＣＥを脱塩素化処理できる。従って、本発明方法と本発明の脱塩素微生物は、ＰＣＥに汚染された土壌等を浄化できるものとして、産業上極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に、本発明方法の実施形態とその効果について説明する。
【００２０】
本発明のＰＣＥ分解方法では、先ず、少なくともＰＣＥに汚染された土壌または水に脱塩素微生物を添加し、微好気的条件下でＰＣＥを脱塩素化する（ＰＣＥ脱塩素化工程）。
【００２１】
「少なくとも」とは、本発明方法は主としてＰＣＥを分解するものであるが、ＴＣＥやジクロロエチレン等との複合汚染の場合であっても、本発明方法を適用できることを示すものである。
【００２２】
処理対象がＰＣＥ汚染土壌である場合には、土壌を採取して、例えば反応器中で脱塩素微生物の菌液を添加し、微好気的条件にすることによってＰＣＥを脱塩素化することができる。ここで使用する「反応器」は、微好気的条件と好気的条件の切り替えが可能なものであれば、特に制限なく使用することができる。例えば、当該条件の切り替えが可能な単なる容器でもよく、また、脱塩素微生物と非処理土壌等との接触を効率的なものとするための攪拌手段を有するものであってもよい。
【００２３】
ここで「微好気的条件」とは、常圧での酸素分圧でいえば０％超（好適には、０．１％以上），１％以下（好適には、０．５％以下）をいうものとする。酸素分圧を０％にするには密閉容器内を窒素ガス等の嫌気性ガスで置換したり真空吸引する必要があり、大規模な汚染土壌等の浄化処理が困難になるからである。一方、酸素分圧が１％を超えると、脱塩素微生物によるＰＣＥ処理が困難になるからである。なお、この微好気的条件を水中における酸化還元電位でいえば、−１００ｍＶ以上，＋１００ｍＶ以下に相当する。
【００２４】
処理対象が地下水である場合、或いは地下水を処理することによりその近辺の土壌質をも改善する場合には、地下水をくみ上げ、ＰＣＥ脱塩素化工程およびそれに続くＰＣＥ脱塩素化物の分解工程により処理し、処理済地下水を戻せばよい。この場合は、土壌の掘削を行なう必要がないため、低コストで処理することができる。
【００２５】
ＰＣＥ脱塩素化工程で使用する脱塩素微生物の種類は、先に定義した微好気条件においてＰＣＥを脱塩素化できるものであれば特に制限されず、また、単離されたもののみならず、ＰＣＥを脱塩素化できる微生物群であってもよい。
【００２６】
本発明で用いられるＰＣＥ脱塩素化能を有する脱塩素微生物（微生物群を含む）は、従来法により単離或いは濃縮することができる。即ち、ＰＣＥを含む培地中で継代培養すればよい。
【００２７】
しかし、脱塩素微生物は優先種となり難いものであり、培養や単一コロニー分離が難しい微生物の一つである。従って、何世代にもわたる継代培養が必要であった。そこで本発明者は、フローサイトメトリーを用いて、優れたＰＣＥ脱塩素化能を有し、微好気的条件でもＰＣＥを脱塩素化できる脱塩素微生物を単離した。詳しくは、ＰＣＥ脱塩素微生物を含む微生物集団（ＰＣＥ脱塩素化コンソーシア）を嫌気的条件で培養した後、蛍光色素で染色したものをフローサイトメーターにより解析する。この解析結果によって、例えば蛍光強度と細胞の大きさに基づいて分類し、各カテゴリー（本明細書では、リージョン（Ｒｅｇｉｏｎ）とも称する）ごとにＰＣＥ脱塩素化活性を測定するか或いは高濃度のＰＣＥ存在下や微好気条件で培養することで、ＰＣＥ脱塩素化能の高い脱塩素微生物を見出すことができる。より優れた脱塩素微生物を得るには、以上の操作（分類と培養）を数回繰り返したり、高いＰＣＥ脱塩素化能を有するカテゴリーからより少ない数の微生物（例えば１細胞）を分取し培養すればよい。
【００２８】
ＰＣＥ脱塩素化工程で使用する好適な脱塩素微生物としては、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属などの細菌が挙げられるが、中でも高いＰＣＥ脱塩素化能を有するＫＢＣ−１株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７３）を用いることで、本工程をより効率よく行なうことができる。このＫＢＣ−１株は、後述する実施例の通り、フローサイトメトリーにより単離した嫌気性の脱塩素微生物であり、微好気的条件でも高濃度のＰＣＥを効率的に処理できる等、特に優れたＰＣＥ脱塩素化能を有する。また、比較的低温（１０℃程度）でも生育可能でありＰＣＥを脱塩素化できることから、寒冷地の屋外でもＰＣＥ汚染土壌等の処理が可能である。さらにＫＢＣ−１株は、ＰＣＥを比較的毒性が低いＴＣＥまで素早く脱塩素化することができ、より有毒な中間代謝物であるジクロロエチレン（以下、「ＤＣＥ」という」）や塩化ビニルなどをほとんど産生しないという利点も有する。なお、ＫＢＣ−１株は、本発明方法のみならず、従来の嫌気的なＰＣＥ処理方法でも使用することができる。
【００２９】
このＫＢＣ−１株の特徴を表１に示す。表１では、非特許文献１に記載されているＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓと非特許文献２のＰＣＥ１株を、比較対象として、同時に示す。また、ＫＢＣ−１株の電子顕微鏡写真を図１として示す。
【００３０】
【表１】
2005270970.tif 000002
【００３１】
脱塩素微生物の添加量は、処理すべき土壌等の量や汚染度（ＰＣＥの汚染濃度）等により異なるが、例えば０．１〜１０％程度の菌液を適量加え、処理状況をモニターしつつ添加量を調整すればよい。
【００３２】
微好気的条件は、反応器内の最終的な酸素分圧や酸化還元電位が少なくとも上述の範囲内であれば十分であり、反応器内に導入する水や窒素ガスなどから酸素を完全に除去する必要がないため、嫌気的状態よりも比較的容易に形成することができる。そのため、嫌気的状態を形成する過程で、反応器内に酸素を含まない嫌気の水や窒素ガス等を注入したり、反応器が密閉系であれば反応器内の空気を窒素ガス等の酸素を含有しないガスで置換するか、若しくは酸素を含まない嫌気の水を通水する過程を厳密に行なう必要はない。従って、従来技術によれば嫌気的条件でしかＰＣＥを脱塩素化できなかったが、本発明方法は微好気的条件で実施できるので、特に大規模で汚染土壌等の処理を行なう場合には、厳密な密閉容器を用いる必要がなく、実施コストを低減させることができる。因みに、従来技術では、汚染土壌等を密閉状態におくことで、土壌等に含まれる好気性微生物の生育により自然に嫌気性状態にするものもあるが、大規模の実施では完全な密閉状態にすること自体が困難であり、また、嫌気的状態の形成を好気性微生物の生育に頼っているのでは時間がかかり、処理期間の延長に繋がってしまっていた。
【００３３】
処理中には、必要に応じて脱塩素微生物の生育に必要な炭素源や窒素源、ビタミン等の栄養源も添加する。また、処理中の温度とｐＨ条件は、後述する実施例の結果より、温度は１０〜４２℃、ｐＨは７．０〜９．０に調整することが好ましい。脱塩素微生物としてＫＢＣ−１を用いれば、１０℃以上であって、３０℃以下（例えば１８℃以下や１２℃以下）の温度で適用することもできる。
【００３４】
ＰＣＥ脱塩素化工程の処理時間は、処理すべき土壌等の量や汚染度等によるが、土壌サンプルや気相に放出されるＰＣＥの濃度を測定することにより処理の進行状況を把握し、ＰＣＥの脱塩素化が終了した時点或いはＰＣＥの脱塩素化がそれ以上進行しなくなった時点で次工程に移ればよい。
【００３５】
上記ＰＣＥ脱塩素化工程の後には、好気性微生物によって好気的条件下でＰＣＥの脱塩素化物を分解する（ＰＣＥ脱塩素化物の分解工程）。
【００３６】
本工程でＰＣＥ脱塩素化物の好気的分解を行なう微生物は特に制限されず、例えば、被処理土壌中に含まれる好気性微生物をそのまま利用することができる。ＰＣＥ脱塩素化物は好気性微生物によって処理され易いからであり、また、好気性微生物は土壌中に多く含まれるからである。本発明で使用できる好気性微生物として、具体的には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ属から選択される１または２以上を挙げることができる。但し、より効率的な処理を可能にするために、ＰＣＥ脱塩素化物の分解能に優れた好気性微生物を、本工程の実施前に添加してもよい。
【００３７】
微好気的条件から好気的条件への転換は、好気性微生物の生育やＰＣＥ脱塩素化物が分解されるに充分な酸素を含有するガス（例えば空気）や好気の水（酸素を適度に含む水）を導入することにより行なえばよい。また、好気性微生物の生育に必要な栄養源も添加する。その他、効率的なＰＣＥ脱塩素化物の分解のために、温度やｐＨも調整すべきである。
【００３８】
本発明方法では、最初にＰＣＥ脱塩素化工程を行なった後にＰＣＥ脱塩素化物の分解工程を実施するが、その後も、ＰＣＥ脱塩素化工程とＰＣＥ脱塩素化物の分解工程を交互に行なってもよい。土壌等が高濃度のＰＣＥにより汚染されている場合には、ＰＣＥ脱塩素化物の蓄積により好気性微生物による分解が阻害されることがあるため、ＰＣＥとＰＣＥ脱塩素化物の分解を交互に行なってこれらの量を徐々に低減すれば、高度に汚染された土壌等であっても効率的な処理が可能になり得る。
【００３９】
以下に、実施例を示すことによって本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
実施例１  ＫＢＣ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７３）の単離
先ず、嫌気性培養のための液体培地を、以下に示す通り調製した。表２の成分を水に溶解し、１Ｎ  ＫＯＨ水溶液でｐＨを７．２に調整し、更に水を添加して５００ｍＬにメスアップしたものを２０％ＣＯ2−８０％Ｎ2ガスで液相パージした後、オートクレーブ滅菌した。
【００４１】
【表２】
2005270970.tif 000003
【００４２】
表２中、微量元素溶液は、表３に示す組成を有する。因みに、成分中ＦｅＣｌ2・４Ｈ2Ｏは溶解し難かったため、先ず塩酸に溶解させた後に蒸留水を加え、更に他の成分を加えて均一溶液とした。
【００４３】
【表３】
2005270970.tif 000004
【００４４】
また、表２中のビタミン溶液は、表４に示す組成からなる均一溶液を２００ｍＬにメスアップした後、フィルター滅菌したものを用いた。
【００４５】
【表４】
2005270970.tif 000005
【００４６】
次に、別途表５に示す溶液を調製して滅菌後、嫌気的に混合した。さらに、滅菌した嫌気水を加えて約１Ｌに調整した。
【００４７】
【表５】
2005270970.tif 000006
【００４８】
上記液体培地１８ｍＬを、２５ｍＬ容量のバイアル瓶へ嫌気的に分注した。ここへ、大根畑土壌に由来するＰＣＥ脱塩素化コンソーシアを接種した後、ＰＣＥ濃度が１ｐｐｍとなる様に飽和ＰＣＥ溶液（１５０ｐｐｍ）を液体培地へ添加し、バイアル瓶を密閉して３０℃，１５０ｒｐｍで５週間振とう培養を行なった。
【００４９】
上記培養後のＰＣＥ脱塩素化コンソーシアから、特にＰＣＥ脱塩素化能に優れるＫＢＣ−１株を、フローサイトメトリーを用いて純化した。詳しくは、上記培養液に、生細胞検出用の蛍光色素である５−および６−カルボキシフルオロセイン  ジアセテート（ＣＦＤＡ）を最終濃度が１ｍＭになるように添加し、３０℃で３０分間保温・染色した。染色後の細胞を適当に希釈し、フローサイトメーター（ベックマンコールター社，ＥＰＩＣＳ  ＡＬＴＲＡ）を用いて解析し、縦軸をＣＦＤＡの蛍光強度、横軸を細胞の大きさとしたサイトグラムを作製した（図２（１））。細胞群集を蛍光強度と大きさに基づいてＡ〜Ｅの５種類のリージョンに分類し、リージョンＡから１０個の細胞を分取・培養し、再びフローサイトメーターで解析した（図２（２））。更に、図２（２）のリージョンＣから１個の細胞を分取・培養し、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属するＫＢＣ−１株を得た（図２（３））。このＫＢＣ−１株は、１個の細胞から培養された単一菌である。
【００５０】
実施例２  温度依存性試験
容量２５ｍＬのバイアルビンに上記実施例１の液体培地を２０ｍＬ分注し、ＰＣＥ濃度が１０ｐｐｍとなる様に飽和ＰＣＥ溶液を添加した。一週間程度培養（ＰＣＥ：１０ｐｐｍ，３０℃）したＫＢＣ−１株の菌液を、終濃度１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）となる様に添加し、バイアルビンをテフロン（登録商標）でコートされたブチルゴム栓とアルミシールで密栓して各温度で静置培養した。また、比較例として、脱塩素化能を有する嫌気性菌であるＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓを、同様の条件により培養した。
【００５１】
バイアルビン中から、注射針を用いて培養液を一定量ずつサンプリングし、分光光度計により６００ｎｍでの濁度（ＯＤ６００ｎｍ）を測定し、また、下記ヘッドスペースガスクロマトグラフィーによって培養液中のＰＣＥ量を測定した。結果を図３に示す。図３中、図３−Ａ，Ｂの「μmax（Ｄａｙ-1）」は、濁度上昇の最大速度を示し、当該値が高い程菌の増殖速度が速く、増殖が活発であることが分かる。また、図３−Ｃ，Ｄの「ｔ50（Ｄａｙ）］は、１０ｐｐｍのＰＣＥの５０％を脱塩素するのに必要な日数を示し、当該値が高いほど菌のＰＣＥ脱塩素化活性が低い。
【００５２】
ヘッドスペースガスクロマトグラフィーの測定条件
バイアルビン中のヘッドスペースガスについて、下記の条件により測定を行なった。
装置  ：  島津製作所社製  ＧＣ−１４Ｂ
検出装置  ：  電子捕獲型検出器（ＥＣＤ）
分離カラム  ：  ＤＢ−６２４キャピラリーカラム（６０ｍ×０．２５ｍｍ、Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カリフォルニア）
キャリアガス  ：  ９９．９９９９％ヘリウム（流量：５０ｍＬ／分，圧力：３００ｋＰａ）
分析温度  ：  ２５０℃（サンプル注入部および検出部）
カラム温度  ：  １５０℃
上記条件で５．７分付近に検出されるピークをＰＣＥ由来のピークとした。
【００５３】
図３−ＡおよびＢに示す結果によれば、両菌の生育至適温度は３４℃付近であったが、ＫＢＣ−１株の増殖速度はＤ．ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓよりも優れていた。ＫＢＣ−１株は１０℃でも僅かながら生育できたのに対し、Ｄ．ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓでは生育が認められなかった。
また、図３−ＣおよびＤに示す結果によれば、ＰＣＥ脱塩素化活性については、ＫＢＣ−１株は１０℃でもＰＣＥを脱塩素化したのに対し、Ｄ．ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓでは生育が認められなかったため、ＰＣＥの脱塩素化も認められなかった。従って、ＫＢＣ−１株はＤ．ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓと比べて、適応できる温度領域が広く、低温（１０℃程度）でも生育でき且つＰＣＥを脱塩素化することができるので、冬場や高冷地でも適用可能であり、より実用性が高いことが実証された。
【００５４】
実施例３  ｐＨ依存性試験
菌の生育とＰＣＥ脱塩素化活性に対するｐＨの影響を調べるために、上記実施例１の液体培地のｐＨを種々変更して、菌の培養を行なった。即ち、上記実施例１の液体培地の成分中、目的とするｐＨに応じてＫＨ2ＰＯ4の代わりに以下の物質を最終濃度２５ｍＭで添加し、液体培地に緩衝能を持たせた。ＮａＨＣＯ3は、ｐＨを大きく変化させるため、培地組成から除いた。
【００５５】
目的ｐＨ              緩衝液
ｐＨ６．２〜６．８  ＭＥＳ（2-モルホリノエタンスルホン酸）
ｐＨ７．１〜７．８  リン酸塩
ｐＨ８．２〜９．０  ＴＡＰＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノ
プロパンスルホン酸）
上記液体培地を用いて３０℃で静置培養した以外は上記実施例２と同様の条件でＫＢＣ−１株とＤ．ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓを培養し、サンプルにつき６００ｎｍでの濁度とＰＣＥ脱塩素化活性を測定した。結果を図４に示す。
【００５６】
図４に示す結果によれば、ＫＢＣ−１株はｐＨ７．１〜８．８の範囲で増殖が活発でありＰＣＥ脱塩素化活性も有しており、生育至適ｐＨは７．５、ＰＣＥ脱塩素化至適ｐＨは８．５付近であった。一方、Ｄ．ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓはｐＨ６．４〜８．８の範囲でなだらかな増殖が認められ、また、ｐＨ６．７〜８．８の範囲でＰＣＥ脱塩素化活性が見られた。生育至適ｐＨは７．１〜７．４、ＰＣＥ脱塩素化至適ｐＨは８〜８．５であった。従って、ＫＢＣ−１株はＤ．ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓに比べてアルカリ側での増殖速度とＰＣＥ脱塩素化能に優れることが明らかにされた。
【００５７】
実施例４  ＰＣＥ脱塩素化特性試験
液体培地に添加するＰＣＥ濃度を、図５に記載のように、最終濃度で５〜７５０ｐｐｍの間で段階的に変化させて調整した以外は上記実施例２と同様の条件でＫＢＣ−１株とＤ．ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓを培養し、サンプルにつき６００ｎｍでの濁度とＰＣＥ脱塩素化活性を測定した。結果を図５に示す。
【００５８】
図５に示す結果によれば、ＫＢＣ−１株は培養開始６日目で、５〜１００ｐｐｍのＰＣＥを検出限界以下（０．０１ｐｐｍ)にまで脱塩素化した。１５０ｐｐｍでは、ＰＣＥ脱塩素化活性は認められたものの、培養１９日目で０．０５％（０．０７５ｐｐｍ）程度のＰＣＥが残存していた。飽和濃度以上のＰＣＥ濃度（７５０ｐｐｍ）では、ＫＢＣ−１株の生育とＰＣＥ脱塩素化活性は認められなかった。
【００５９】
一方、Ｄ．ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓでは、培養開始６日目で５〜５０ｐｐｍのＰＣＥを検出限界以下（０．０１ｐｐｍ）にまで脱塩素化したものの、培養１９日目で約０．０５％程度（０．０７５ｐｐｍ）のＰＣＥが残存していた。つまり、１００ｐｐｍのＰＣＥ汚染に対し、Ｄ．ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓを用いた場合では若干のＰＣＥが残存する一方で、ＫＢＣ−１株では６日目でＰＣＥを検出限界未満まで脱塩素化することができる。従って、本発明のＫＢＣ−１株は、より高濃度のＰＣＥ汚染に適用できることが実証された。
【００６０】
実施例５  酸素耐性試験
酸素分圧による菌の生育とＰＣＥ脱塩素化活性の変化を調べるために、上記実施例１の液体培地から還元作用を有する成分（Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ2ＯとＮａ2Ｓ・９Ｈ2Ｏ）を除き、ＰＣＥ濃度が１０ｐｐｍとなる様に飽和ＰＣＥ溶液を添加して調整したものを、容量７０ｍＬのバイアルビンに１０ｍＬずつ分注した（気相は６０ｍＬ）。その中に、予め一週間程度培養した（ＰＣＥ：１０ｐｐｍ，３０℃）ＫＢＣ−１株の菌液を、終濃度１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）になるように添加し、テフロン（登録商標）でコートされたブチルゴム栓とアルミシールで密栓した。そして、気相中の酸素分圧が表６に記載した値となるようにマイクロシリンジを用いて酸素を注入し、３０℃で１８日間静置培養を行なった。その後、上記実施例２と同様の条件で、サンプルの６００ｎｍでの濁度とＰＣＥ脱塩素化活性を測定した。結果を表６に示す。
【００６１】
【表６】
2005270970.tif 000007
【００６２】
表６に示す結果の通り、ＫＢＣ−１株は、酸素分圧０．６％以上ではＰＣＥ脱塩素化と濁度上昇共に認められないものの、酸素分圧０．４％以下では、ＰＣＥ脱塩素化と濁度上昇が認められた。従って、本発明のＫＢＣ−１株は、微好気条件下で生育することができ且つＰＣＥ脱塩素化活性を有することが示された。
【００６３】
実施例６
予めＰＣＥを１０ｐｐｍ含む液体培地にて、実施例１に記載のＫＢＣ−１株を３０℃で一週間程度培養した培養液（ＫＢＣ−１培養液）を作成した。別途、２５ｍＬのバイアルビンに、実施例１で用いた５ｍＬの液体培地を分注し、ＰＣＥで汚染された土壌（８ｇ）を加えた。当該土壌中には、ＰＣＥをｃｉｓ−ＤＣＥまで脱塩素化する微生物であるＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＫＢＣ７６株が含まれていることを確認した。バイアルビン中へＫＢＣ−１細菌の最終菌濃度が１０5／ｍＬとなるように上記ＫＢＣ−１培養液添加し、テフロン（登録商標）でコートされたブチルゴム栓とアルミシールで密栓して３０℃で静置培養し、土壌中の好気性細菌を生育させるによって、バイアルビン中の酸素分圧を次第に低下させた。上記ＫＢＣ−１培養液を加えない対照も作成した。培養１日目〜５日目まで１日毎にバイアルビン中のヘッドスペースガス（１００μＬ）を取り出し、ＰＣＥ、ＴＣＥおよびＤＣＥの含有量を測定した。なおＴＣＥおよびＤＣＥの含有量の測定は、上記実施例２と同様な条件でヘッドスペースガスクロマトグラフィーを行い、４．７分前後に検出されるピークをＴＣＥ由来のピークとし、４．２分付近に検出されるピークをｃｉｓ−ＤＣＥ由来のピークとして測定した。結果を図６および７に示す。
【００６４】
なお、土壌中のＫＢＣ−１株およびＫＢＣ７６株の菌数の測定は下記の方法で行なった。まず菌から得られたＤＮＡを鋳型とし、各々の菌が有するデハロゲナーゼ遺伝子を特異的に検出することができる下記プライマーを用いてＰＣＲを行なった。次にＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供し、ＫＢＣ−１株では５４３ｂｐ、ＫＢＣ７６株では４０８ｂｐ付近でのバンドの有無を指標として用い、ＭＰＮ−ＰＣＲ法（３系列法）にてデハロゲナーゼ遺伝子の有無から菌数を推定した。
【００６５】
・  ＤＮＡの抽出方法
ＤＮＡ抽出は、ＤＮＡ抽出キット（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製のＦａｓｔＤＮＡ  ＳＰＩＮ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌ）を用いて行なった。
【００６６】
・  ＰＣＲ条件
上記キットで得られたＤＮＡを鋳型とし、下記の条件でＰＣＲを行なった。
【００６７】
Ａ．プライマー
ＫＢＣ−１株のデハロゲナーゼ遺伝子検出用プライマー  ：  配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
ＫＢＣ７６株のデハロゲナーゼ遺伝子検出用プライマー  ：  配列番号３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）および配列番号４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
Ｂ．ＰＣＲ反応液（１００μＬ中）
１×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆ．
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ溶液
１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2
０．２μＭ  上記２種類のプライマー
０．２５Ｕ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）
１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）段階希釈ＤＮＡ溶液
Ｃ．ＰＣＲ増幅装置：Ｇｅｎｅａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（アプライドバイオシステムズ）
Ｄ．ＰＣＲサイクル
９４℃×５分を行った後、９４℃×３０秒、５３℃×３０秒、７２℃×３０秒を３０サイクル行ない、さらに７２℃×７分の工程を行った後、４℃で保存した。
【００６８】
図６はＫＢＣ−１培養液を添加した場合の結果を示したものであり、図７はＫＢＣ−１培養液を添加しない場合の結果を示したものであり、各々縦軸にＰＣＥ、ＴＣＥおよびＤＣＥ含有量を取り、横軸に培養時間を取ったものである。その結果、ＰＣＥの分解は、ＫＢＣ−１培養液を添加したもの（図６）では１日目以降から盛んに起こっているのに対し、ＫＢＣ−１培養液を添加しないもの（図７）では少なくとも４日の日数を要している。また、ＫＢＣ−１培養液を添加したもの（図６）では、ＰＣＥの分解に伴って比較的毒性が低いＴＣＥが生産され、培養３日目以降からはＴＣＥの分解に伴ってＤＣＥが生産されているのに対し、ＫＢＣ−１培養液を添加しないもの（図７）では、ＴＣＥはほとんど生産されずＴＣＥよりも毒性が高いＤＣＥが次第に生産されていった。
【００６９】
従って、本発明のＫＢＣ−１株は、ＰＣＥを効率よく短時間で処理できることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明のＫＢＣ−１株の電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）である。
【図２】ＫＢＣ−１株の単離のために使用したサイトグラムである。
【図３】ＫＢＣ−１株とＤ．ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓの、各温度における生育状況とＰＣＥ脱塩素化活性を示す図である。
【図４】ＫＢＣ−１株とＤ．ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓの、各ｐＨにおける生育状況とＰＣＥ脱塩素化活性を示す図である。
【図５】濃度５〜７５０ｐｐｍのＰＣＥにおける、ＫＢＣ−１株とＤ．ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓによる脱塩素化活性を示す図である。
【図６】ＰＣＥに汚染された土壌（脱塩素微生物を含む）にＫＢＣ−１株を添加した土壌ＰＣＥ・ＴＣＥ・ＤＣＥの変動を示した図である。
【図７】ＰＣＥに汚染された土壌（脱塩素微生物を含む）のＰＣＥ・ＴＣＥ・ＤＣＥの変動を示した図である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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