(57)【要約】【課題】  糖尿病患者を治療するためのインスリン産生細胞の移植に用いる細胞を調製すること、ならびにそれに使用するための膵幹様細胞を安定、容易かつ安価に膵内分泌細胞の一種であるインスリン産生細胞に分化誘導する方法ならびに基材を提供すること。【解決手段】  中性ｐＨにおいて陽性荷電を有する基材表面上で膵幹様細胞を培養して、膵幹様細胞を膵内分泌細胞に分化誘導することを含む、膵内分泌細胞の製造方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
中性ｐＨにおいて陽性荷電を有する基材表面上で膵幹様細胞を培養して、膵幹様細胞を膵内分泌細胞に分化誘導することを含む、膵内分泌細胞の製造方法。
【請求項２】
中性ｐＨにおいて陽性荷電を有する基材がｐＨ＝６．５〜８．５において陽性荷電を有する基材である、請求項１に記載の膵内分泌細胞の製造方法。
【請求項３】
第３級アミノ基または第４級アンモニウム基が基材表面上に固定されている、請求項１又は２に記載の膵内分泌細胞の製造方法。
【請求項４】
第３級アミノ基または第４級アンモニウム塩を含有する単独重合体および共重合体を塗布した基材を使用する、請求項１から３の何れかに記載の膵内分泌細胞の製造方法。
【請求項５】
成長因子が添加された培地で培養する、請求項１から４の何れかに記載の膵内分泌細胞の製造方法。
【請求項６】
成長因子がＨＧＦである、請求項５に記載の膵内分泌細胞の製造方法。
【請求項７】
膵幹様細胞がＡＲ４２J細胞株である、請求項１から６の何れかに記載の膵内分泌細胞の製造方法。
【請求項８】
膵内分泌細胞がインスリン産生細胞である、請求項１から７の何れかに記載の膵内分泌細胞の製造方法。
【請求項９】
請求項１から８の何れかに記載の方法によって製造された膵内分泌細胞。
【請求項１０】
ｐＨ＝６．５〜８．５において陽性荷電を有することを特徴とする、膵幹様細胞を膵内分泌細胞に分化誘導するための分化誘導基材。
【請求項１１】
第３級アミノ基または第４級アンモニウム基が基材表面上に固定されている、請求項１０に記載の分化誘導基材。
【請求項１２】
第３級アミノ基または第４級アンモニウム塩を含有する単独重合体および共重合体を塗布した基材である、請求項１０又は１１に記載の分化誘導基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵幹様細胞からインスリン産生細胞などの膵内分泌細胞に分化誘導させる方法および該方法によって分化誘導された細胞に関する。さらに詳しくは、本発明は、膵幹様細胞からインスリン産生細胞などの膵内分泌細胞に分化誘導させる際に、陽性荷電を有する基材表面で培養することによって、少量の膵幹様細胞から大量かつ安価にインスリン産生細胞などの膵内分泌細胞を製造する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、日本のみならず世界的に広がっている深刻な疾病である。１９９７年に旧厚生省が行った調査では、「糖尿病が強く疑われる人」約６９０万人、この値に「糖尿病の可能性を否定できない人」６８０万人を加えると、約１３７０万人がリスク群と推定されている。ＷＨＯの推定する全世界の糖尿病人口は、２０００年で１億５千万人あまりであり、２０２５年では約３億人に達すると予測されている。
【０００３】
近年、糖尿病の根治的治療法として、膵島移植が注目を浴びるようになってきている。膵島移植は、生理的な血糖コントロールを可能とし、手技も簡単で、ハイリスク例にも応用可能な優れた糖尿病治療法として期待されている。膵島移植は糖代謝の改善による糖尿病性二次病変の進行阻止または改善を目的としているが、強化インスリン療法やインスリン持続皮下注入療法でも血糖コントロールの難しいインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）は、まさに膵島移植の良い適応であると考えられている。
【０００４】
膵島移植は、局所麻酔で可能なほどで、手術侵襲が極めて小さいため、糖尿病患者にとってより安全であり、血管吻合の必要がないため、血管病変の進行により膵（臓器）移植の適応外になった患者でも実施可能である。また、門脈循環にインスリンが放出されるため生理学的にも有利である。さらに、分離膵島の凍結保存によるいわゆるバンキング（ｂａｎｋｉｎｇ）も可能である等膵（臓器）移植と比較して多くの利点を有している。
【０００５】
また、インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）臨床の実際では、積極的にインスリン療法が用いられている。これは、インスリンを投与することにより、患者自身の膵島β細胞を休息させ、それによりβ細胞の機能が回復してくるのを待つという考え方からであり、近年積極的に導入され好結果が報告されている。このことは、ＮＩＤＤＭにおいても、膵島移植によって治療可能であることを示しており、ＮＩＤＤＭ例のβ細胞機能が低下してきている時期に膵島を移植すれば、再びβ細胞機能が回復し、ＮＩＤＤＭの悪化を防止できる可能性も考えられている。
【０００６】
実験的医療の段階から始まった膵島移植は、当初成績が芳しくなかったが、１９９９年３月よりカナダのエドモントンにあるアルバータ大学において、新しい画期的なエドモントンプロトコール（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）が実施され、膵島移植施行７例全例が  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔとなったということが報告され（非特許文献１参照）、このプロトコール（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）による多施設共同トライアルも準備されている。
【０００７】
このように、膵島移植の臨床研究までに発展した理由としては、大動物膵よりの大量膵島分離法の研究がなされ、１９８４年Ｒｉｃｏｒｄｉらは独自の自動膵島分離装置を考案しブタ、ヒト膵よりの大量膵島分離に成功したことが大きい。しかしながら、臓器ドナー不足からくる移植用膵島細胞の絶対的不足が指摘されている。
【０００８】
そこで、幹細胞を大量に取得しインスリン産生細胞に分化させるという試みがなされている。インスリン産生細胞に分化させる方法としては、サイトカイン類や成長因子類、さらには基底膜による刺激による分化方法が試みられているが、今、なお、満足のいくものがないのが現状である。
【０００９】
例えば、非特許文献２および特許文献１には、グルカゴンライクペプチド−１（ＧＬＰ−１）やエキセンディン−４（Ｅｘｅｎｄｉｎ−４）のようなタンパク性の物質を膵幹様細胞であるＡＲ４２Ｊ細胞に作用させて、インスリンを産生させる細胞に分化させることが報告されている。しかしながら、ＧＬＰ−１やＥｘｅｎｄｉｎ−４は、アミノ酸残基が１０個以上結合したペプチドタンパクであり、そのため細胞培養中に分解したり、長期保存安定性が悪く、さらに調製のために非常にコストがかかるという欠点があった。非特許文献３には、ヒトの膵臓の導管の上皮細胞を、マトリゲル（商標）上で培養することによって、ランゲルハンス島様の内分泌細胞集団へと分化させることが記載されている。しかし、マトリゲル（商標）はＥＨＳマウス肉腫細胞から単離した再構成基底膜であり、ラミニンをはじめとした様々なタンパク質と、未知成分の混合物であるため、安定性や品質の均一性に問題がある。
【００１０】
したがって、これらの欠点を解消するために、サイトカイン類や成長因子類の代替物質として、細胞培養中でも安定で長期保存性がよく、かつ、安価に作製できるものとして非タンパク性の化合物を利用することが考えられる。
【００１１】
膵幹細胞の分化を促進する非タンパク性の化合物としては、非特許文献４に、ラット膵腫瘍細胞ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３に対して、植物や微生物の二次代謝産物や既知の伝達阻害剤を添加した結果、ＨＧＦとビンカアルカロイドである非タンパク性の化合物のコノフィリンを併用することによって、該細胞が形態変化を起こし、インスリンを発現することが報告されている。コノフィリンは、市販品として安価に入手することができないという問題点に加え、植物から抽出精製しなければならず、大量に化学合成できないという欠点があった。
【００１２】
すなわち、これまで膵幹様細胞を安定、容易、かつ、安価に内分泌細胞の一種であるインスリン産生細胞に分化誘導する優れた方法はなく、さらに、膵幹様細胞を内分泌細胞の一種であるインスリン産生細胞に分化誘導させるための物質で、細胞培養中に安定で、かつ、長期保存安定性がよい、安価で大量合成可能な非タンパク性の化合物はないのが現状である。
【００１３】
生体外においての種々の処理を施した基材上で動物細胞を培養し、細胞の分化を誘導する方法が良く知られている。特許文献２には陽性荷電を有する４級アンモニウム塩モノマーの重合体を有する基材上で線維芽細胞や肝細胞の接着性を向上する方法の記載がある。しかし単に細胞の接着性が向上することを述べているだけであり、膵臓の幹細胞を分化させることを示唆する記載は無い。特許文献３には多塩基性ポリアミノ酸または細胞外マトリクス処理表面にニューロン細胞を付着させ神経芽細胞を産生する方法の記載があるが、神経系細胞の付着性の向上及び、分化に関する記載のみで、膵臓の幹細胞を分化させることを示唆する記載は無く、多塩基性ポリアミノ酸または細胞外マトリクスは生分解性を起こしやすく不安定であり、さらに細胞外マトリクスは天然由来のためコスト的に問題を有する。
【００１４】
特許文献４には、側鎖に水酸基を含有した重合性モノマーを共重合させたビニル系共重合体を用いた動物細胞培養基材の開示がある。しかし、上記のような共重合体を塗布した基材表面が中性ｐＨにおいて陽性荷電を有していることを示す記載は無い。さらに、膵島細胞、ランゲルハンス細胞、膵臓癌由来の細胞株の培養への応用が記載されているが、該動物細胞培養基材によって膵幹様細胞を内分泌細胞に分化させうることを示す記載は見あたらない。
【００１５】
特許文献５には、細胞接着活性を示すポリペプチドを含有することを特徴とする幹細胞培養用基材の開示がある。また特許文献６には、ラミニン様活性ペプチドと生分解性膜複合体およびそれを利用した組織再生方法の開示があるが、両特許文献ともに生物由来のペプチドであり、そのため細胞培養中に分解したり、長期保存安定性が悪く、さらに調製のために非常にコストがかかるという欠点がある。
【００１６】
特許文献７には、未分化幹細胞を非接着性の容器内で浮遊培養することにより、細胞の三次元凝集塊を作製する方法の開示があるが、凝集塊形成により幹細胞の分化が促進されても、浮遊培養では接着依存性が強い細胞の場合は、細胞が死滅してしまうという欠点を有する。
【００１７】
すなわち、これまで膵幹様細胞を安定、容易かつ安価に内分泌細胞の一種であるインスリン産生細胞に分化誘導可能な優れた基材および分化誘導方法はなかった。
【００１８】
【非特許文献１】Shapiro AM, Lakey JRT, Ryan EA, Korbutt GS, Toth E, Warnock GL, Kneteman NM, Rajotte RV: N Eng J Med,343,230-238(2000)
【非特許文献２】Jie Zhou, Xiaolin Wang, Marco A.Pineyro, Josephine M Egan: Diabetes,48,2358-2366(1999)
【非特許文献３】Susan Bonner-Weir et al: Proceed National Acad Sci, 97(14), 7999-8004 (2000)
【非特許文献４】Umezawa K et al: Biomed Pharmacother, 57(8),341-350 (2003)
【特許文献１】特公表２００２−５２２０６８号公報
【特許文献２】特開平７−２７４９５３号公報
【特許文献３】特開平８−５０５５２８号公報
【特許文献４】特開平６−１５３９０５号公報
【特許文献５】特開２００２−３１５５６７号公報
【特許文献６】特開２００２−３７１０１０号公報
【特許文献７】特開２００３−３０４８６６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の課題は、糖尿病患者を治療するためのインスリン産生細胞の移植に用いる細胞を調製すること、ならびにそれに使用するための膵幹様細胞を安定、容易かつ安価に膵内分泌細胞の一種であるインスリン産生細胞に分化誘導する方法ならびに基材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者は、上記の課題を解決するために、表面に種々の処理を施した基材を用いて膵幹様細胞を培養し、この細胞の分化を検出するという方法により、膵幹様細胞を分化させる基材表面を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに、中性ｐＨにおいて陽性荷電を有する基材表面上で培養することによって膵幹様細胞を膵内分泌細胞に分化誘導できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【００２１】
（１）  中性ｐＨにおいて陽性荷電を有する基材表面上で膵幹様細胞を培養して、膵幹様細胞を膵内分泌細胞に分化誘導することを含む、膵内分泌細胞の製造方法。
（２）  中性ｐＨにおいて陽性荷電を有する基材がｐＨ＝６．５〜８．５において陽性荷電を有する基材である、（１）に記載の膵内分泌細胞の製造方法。
（３）  第３級アミノ基または第４級アンモニウム基が基材表面上に固定されている、（１）又は（２）に記載の膵内分泌細胞の製造方法。
（４）  第３級アミノ基または第４級アンモニウム塩を含有する単独重合体および共重合体を塗布した基材を使用する、（１）から（３）の何れかに記載の膵内分泌細胞の製造方法。
【００２２】
（５）  成長因子が添加された培地で培養する、（１）から（４）の何れかに記載の膵内分泌細胞の製造方法。
（６）  成長因子がＨＧＦである、（５）に記載の膵内分泌細胞の製造方法。
（７）  膵幹様細胞がＡＲ４２J細胞株である、（１）から（６）の何れかに記載の膵内分泌細胞の製造方法。
（８）  膵内分泌細胞がインスリン産生細胞である、（１）から（７）の何れかに記載の膵内分泌細胞の製造方法。
【００２３】
（９）  （１）から（８）の何れかに記載の方法によって製造された膵内分泌細胞。
（１０）  ｐＨ＝６．５〜８．５において陽性荷電を有することを特徴とする、膵幹様細胞を膵内分泌細胞に分化誘導するための分化誘導基材。
（１１）  第３級アミノ基または第４級アンモニウム基が基材表面上に固定されている、（１０）に記載の分化誘導基材。
（１２）  第３級アミノ基または第４級アンモニウム塩を含有する単独重合体および共重合体を塗布した基材である、（１０）又は（１１）に記載の分化誘導基材。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の方法・基材を用いることにより、膵幹様細胞を安定、容易、かつ、安価にインスリン産生細胞などの膵内分泌細胞に分化誘導することができる。また、本発明の方法により分化誘導された膵内分泌細胞は、糖尿病の治療に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明を詳細に説明する
本発明による膵内分泌細胞の製造方法は、中性ｐＨにおいて陽性荷電を有する基材表面上で膵幹様細胞を培養して、膵幹様細胞を膵内分泌細胞に分化誘導することを特徴とする方法である。インスリン産生細胞等の特定の細胞に効率よく分化させることを考慮すると、膵幹様細胞を前記培養基材上で培養する際、さらに成長因子が添加された培地で培養することが好ましい。
【００２６】
中性ｐＨにおいて陽性荷電を有するとは、有機溶媒の含有量が５０％未満の水溶液、および湿度１０％ＲＨから１００％ＲＨの通常大気中において、動物細胞が生存できるｐＨ、すなわちｐＨ５〜１０、より望ましくはｐＨ６．５〜８．５の範囲において基材表面の荷電が陽性である状態をいう。該水溶液中には塩化ナトリウムなどの無機塩類が存在していてもかまわない。
【００２７】
基材表面の荷電の符号、すなわち陽性荷電を有するか否かを決定する方法は特に限定されないが、例えば、ゼータ電位測定、コロイド滴定、イオン交換滴定、陰性荷電を有する色素の吸着、原子間力顕微鏡AFM(Atomic force microscopy)による表面電位の測定などが挙げられる。その数値は陽性荷電を示す正の値であればよい。さらにその陽性荷電の強さを見積る方法も特に限定されないが、上記の測定法は何れも測定原理を全く異にする測定法であるため、同じ陽性荷電であっても値や単位系などが異なる場合がある。従って本発明においては、上記測定法のうち、ゼータ電位測定を中性ｐＨで行った場合の測定値が正の値を示した場合を陽性荷電と判断することとした。その測定値としては０〜＋１０Ｖが好ましく、より好ましくは０〜＋１０００ｍＶである。また、陽性荷電の強さを見積るには、前記のようなゼータ電位測定の他に、原子間力顕微鏡を用いる方法等も好適に用いられる。
【００２８】
本発明で用いることができる基材とは、水溶液と界面を形成することが可能な固体、並びにそれらの表面を改質してなる固体である。基材の材質としては入手しやすさや安定性、安全性、成形性および滅菌性に優れ、細胞毒性が低いという点でポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子自体ならびにそれを架橋した構造体、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニム等の金属を用いることができるが、中でも合成高分子が好ましい。また基材の形状としては平板、メッシュ、織布、不織布、スポンジ状構造体、粒子集合体等が挙げられ、これらをそのまま、あるいは積層体、３次元成型体（ブロック状）等の形態で用いることができる。膵幹様細胞培養時に観察が容易であることにより、この中でも透明で平板状の基材が好適である。
【００２９】
本発明に用いることが可能な中性ｐＨにおいて陽性荷電を有する基材は、人工合成が容易で、かつ、品質も安定しているため、本基材を用いることにより、膵幹様細胞から膵内分泌細胞へと安定、容易かつ安価に分化誘導することが可能となる。例えば、陽性荷電を有する重合体等はラジカル重合、イオン重合、放射線重合、電子線重合といった通常の合成条件によって容易に得ることができる。これらを、水溶液と界面を形成することが可能な固体、例えば組織培養用ポリスチレン製培養皿にエタノールなどの溶媒を用いて塗布するなどにより容易に本発明に用いることが可能な基材を製造することができる。
【００３０】
本発明で用いる分化誘導基材は、中性pＨで基材表面に陽性荷電を有することを特徴とする。そのため、上記の基材表面を陽性荷電にすることが必要となるが、基材表面に陽性荷電を付与する方法としては、陽性荷電を有する化学種あるいは官能基を表面に導入する方法などがある。以下に、陽性荷電を有する化学種あるいは官能基を表面に導入する方法について説明する。
【００３１】
陽性荷電を有する化学種あるいは官能基としては、第１級アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基、第４級アンモニウム基、ピリジル基、イミダゾリル基、第４級ホスホニウム塩基、金属イオンなどを使用できるがこれに限定されない。陽性荷電の強さを考慮すると第３級アミノ基、第４級アンモニウム塩、第４級ホスホニウム塩が望ましく、更にはコーティングのしやすさを考慮すると第３級アミノ基、第４級アンモニウム塩を含有する単独重合体または共重合体が望ましい。
【００３２】
基材表面に第３級アミノ基、第４級アンモニウム塩を固定する方法としては、該化学種または官能基を含む低分子化合物や高分子化合物を、吸着、イオン結合、配位結合、共有結合、グラフト重合、コーティング及び基材成形時にブレンドするなどの方法により固定することが可能であり、より望ましくは、第３級アミノ基、第４級アンモニウム塩を含有する単独重合体または共重合体を塗布することが好適である。また表面改質により直接に化学反応で基材表面に第３級アミノ基、第４級アンモニウム塩を導入することも本発明には好適である。さらには、陰性荷電を持つ基材表面に、第３級アミノ基、第４級アンモニウム塩を持つ重合体の水溶液を接触させて、表面にポリイオンコンプレックスを形成させて、材料の最表面を陽性荷電にすることもできる。
【００３３】
上記の方法のうち、重合体を基材表面に塗布する方法について、具体的な処理条件を説明のために例示する。重合体が溶解可能で、かつ塗布される基材側が耐性である適当な溶媒(例えばエタノール)に重合体を１０重量％〜0.000001重量％の範囲で溶解したコーティング液を調製する。これに基材の表面を浸せきし、０〜８０℃で1分〜24時間放置し、重合体を基材表面に物理吸着させる。これをこのまま用いてもよいし、さらに０〜１００℃で常圧、或いは減圧乾燥することによって、重合体を基材表面に塗布可能である。
【００３４】
以上、中性ｐＨにおいて陽性に荷電する基材の製造方法について説明したが、本発明では、上記の基材に磁場や電場を印加して表面の分極を促して陽性に荷電する方法を用いることも可能である。
【００３５】
本発明の膵内分泌細胞の製造方法においては、以上のようにして得られる中性ｐＨにおいて陽性荷電を有する基材表面で膵幹様細胞を培養して膵内分泌細胞に分化誘導することを特徴とする。次に、分化誘導する方法について詳説する。
【００３６】
膵幹様細胞とは、膵臓を形成する細胞に分化する能力を有した幹細胞のことを意味し、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、成体幹細胞、胎児組織由来幹細胞、それらを癌化させた継代可能な細胞株等が挙げられる。また膵臓を酵素処理などで消化して得られる細胞であって、表現型の異なる細胞に分化する能力を持った細胞も含まれる。表現型の異なる細胞に分化するとは、採取直後は消化酵素を分泌する膵外分泌細であったものが、適当な刺激を加えることによってインスリンなどのホルモンを分泌しうる内分泌細胞に分化転換する場合や、採取直後は膵臓内の管腔構造を形成する導管細胞であったものが、適当な刺激を加えることによってインスリンなどのホルモンを分泌しうる内分泌細胞に分化転換する場合（例えば非特許文献３）や、あるいはその全く反対の現象などを言うが、これに限定されない。
【００３７】
膵内分泌細胞とは、膵臓を構成する細胞の中でも内分泌機能を有する細胞をいい、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び／又は膵ポリペプチド(PP)などの膵臓の内分泌ホルモンをタンパク質またはmRNAの形で発現または産生する細胞をいう。これらのホルモンは前駆体であるプレプロインスリンあるいはプロインスリンの形で発現または産生されていてもよい。膵内分泌細胞の具体例としては、膵β細胞、膵α細胞、膵δ細胞、膵PP細胞、それらの機能的集塊であるランゲルハンス島(ラ島、膵島も同様の意味で用いる)などが挙げられる。糖尿病の治療に用いられるインスリン産生細胞は、膵内分泌細胞の一種であり、膵β細胞がその本体である。ただし、膵β細胞と膵α細胞の両方の性質を有する細胞、より具体的にはインスリンとグルカゴンの両方を産生する細胞なども糖尿病治療には使用可能と考えられるため、膵β細胞のみには限定されない。
【００３８】
本発明の方法においては、上記した膵幹様細胞のいずれも用いることができる。インスリン産生型の細胞に分化させる基材や培養方法のスクリーニングを実施する際には、好ましくは成体幹細胞および胎児組織由来の幹細胞、より好ましくは膵臓由来の幹細胞である。また、大量のスクリーニングを実施することを考慮すると、膵臓由来の細胞で癌化させた継代可能な細胞株が最も好ましい。
【００３９】
癌化させた継代可能な細胞株としては、ラット膵腫瘍から樹立されたＡＲ４２Ｊ細胞株(Mashima H, Ohnishi H, Wakabayashi K, Mine T, Miyagawa J, Hanafusa T, Seno M, Yamada H and Kojima I:J Clin Invest 97:1647-1654,1996)、マウスの膵管や膵島から樹立した細胞株であるＩＭＤ-１，ＩＭＩ−１細胞株(Sharma A, Taneja M, Rietz P, Weitekamp J and Bonner-Weir S: Diabetes 50,S42-43,2001)等が挙げられる。
【００４０】
陽性荷電を有する基材表面での培養、または陽性荷電を有する基材表面での培養時に成長因子を添加する場合での培養によって、膵内分泌細胞の一種であるインスリン産生細胞へと分化させるのに用いる膵幹様細胞としては、これまでに述べてきた何れの細胞も好適に使用できる。ただし、ヒトの治療に用いるヒト由来の膵幹様細胞を大量に入手することは倫理的に困難であるため、本明細書中以下に記載する実施例においては、細胞の入手や培養の簡便さを考慮し、ＡＲ４２Ｊ細胞株や、より好ましくは分化効率の安定性の点で、ＡＲ４２Ｊ細胞株からサブクローニングされたＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３株を使用した。
【００４１】
上記の膵幹様細胞は、通常０〜１０のＦＣＳなどの血清を含む動物細胞用培地(例えばＤＭＥＭ）を用いて５％ＣＯ2条件下において中性ｐＨを保ち、３７℃で培養皿を用いて培養する。ＡＲ４２Ｊ細胞株の場合、ここに分化誘導刺激として、ＨＧＦとアクチビンの両者を添加して２〜７日間培養することによって、相乗効果によりインスリン産生細胞へと分化することが知られている(Mashima H, Shibata H,  Mine T and Kojima I: Endocrinology 137:3969-3976,1996)。ＡＲ４２Ｊ細胞株以外の膵幹様細胞においても、通常の動物細胞の培養条件に加え、適切な分化誘導刺激を加えることによって膵内分泌細胞となすことができる。
【００４２】
本発明では、分化誘導の際に成長因子を併用して用いることもできる。
成長因子とは、一般的には、細胞・組織・臓器・個体を問わず、数・重量・体積等を増加させる作用を持つ物質のことをいい、その細胞に対する働きとしては、形態を変化させ、肥大化させたり、細胞分裂を促進させたりする働きがある。
【００４３】
本発明で用いることができる成長因子の具体例としては、上皮増殖因子(EGF;epidermal growth factor)、トランスフォーミング  グロースファクターα(TGF-α;transforming growth factor-α)、アンフィレグリン(amphiregulin)、シュワンノーマデライブド  グロースファクター(SDGF;Schwannoma-derived growth factor)、ヘパリン−バインディング EGF-ライク  グロースファクター(HB-EGF;heparin binding EGF-like growth factor)、ベータセルリン(betacellulin)、ニューレグリンズ(neuregulins)、血小板由来増殖因子(PDGF;platelet-derived growth factor)、ヘパリン−バインディング  グロースファクター-1(HBGF-1;heparin binding growth factor-1)、ヘパリン−バインディング  グロースファクター-2(HBGF-2;heparin binding growth factor-2)、int-2、hst-1/K-fgf、FGF-5、FGF.6/hst-2、ケラチノサイト  グロースファクター(KGF;keratinocyte growth factor)、アンドロゲンインデュースド  グロースファクター(AIGF;androgen-induced growth factor)、ファイブロブラスト  グロースファクター-9(FGF-9)、ファイブロブラスト  グロースファクター−1,2(FGF-1,2;fibroblastgrowth factor-1,2)、インスリン−ライク  グロースファクターＩ，ＩＩ(IGF-I,II;insulin-like growth factor-I,II)、インスリン(insulin)、インスリン−ライク  グロースファクター(IGFBP;insulin-like growth factor binding protein)、肝細胞増殖因子(HGF;hepatocyte growth factor)、血管内皮増殖因子(VEGF;vascular endothelial growth factor)、胎盤由来増殖因子(PIGF;plasenta growth factor)、神経成長因子(NGF;nerve growth factor)、ミッドカイン(midkine)、プレイオトロフィン(pleiotrophin)等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
本発明の方法において、細胞の増殖能を高めた上で分化の状態を調べることを考慮すると、上記成長因子を用いることが好ましい。その際、上記成長因子のいずれも用いることができるが、インスリン産生細胞に効率よく分化させることを考慮するとベータセルリン(betacellulin)やＨＧＦ(Hepatocyte growth factor)を用いることが好ましく、より好ましくはＨＧＦである。
【００４５】
成長因子は分化誘導の過程において培養液に終濃度(1pM〜1μM)になるように添加すればよい。
【００４６】
以上、本発明に従って膵幹様細胞を膵内分泌細胞に分化誘導する方法について説明したが、本発明において、細胞の分化とは、細胞が成熟、すなわち、もとの非特殊細胞より、性質または機能がより特殊化した状態になる過程をいう。例えば、受精した卵細胞は一定の順序を経て分裂増加しながら、種々の特殊の機能を有する器官や臓器を形成する細胞に変化する。成長は、同一の単位の増幅の繰り返しの過程であるが、分化は、これらの単位が異なった方向、より特殊な機能へ変化する過程をいう。
【００４７】
分化は、細胞が目で見える変化をきたす前に始まっているもので、この化学的変化による分化の状態を不可視性(invisible)または化学分化(chemodifferentiation)と呼ぶ。すべての細胞に共通した能力ないし特徴から、最終的には全く特殊な細胞となるが、これは遺伝的な影響のほかホルモン等の影響を受けている。化学的には、細胞内のタンパク合成等がなんらかの引き金で顕性となり、その後、その細胞に備わった遺伝的な能力ないし潜在力が続発し続けるものと考えられている。
【００４８】
例えば、ＡＲ４２Ｊ細胞株の場合、ＨＧＦとアクチビンの添加によって、インスリン産生細胞へと分化することが知られている(Mashima H, Shibata H,  Mine T and Kojima I: Endocrinology 137:3969-3976,1996)。この際、ＡＲ４２Ｊ細胞の形態は、球状から紡錘状に形態変化する。
【００４９】
したがって、ＡＲ４２Ｊ細胞株の場合、細胞が分化したか否かを検出する方法としては、顕微鏡による目視観察が簡単である。一般的には、ある特定の細胞に分化したか否かを検出するためには、例えば、特定のタンパク質のmRNAの転写活性を該タンパク質遺伝子の上流に存在するプロモーターの活性で測定する方法や、特定のタンパク質のmRNAをRT-PCR法で検出する方法、細胞内外に産生された特定のタンパク質を検出する方法が挙げられる。
【００５０】
ＡＲ４２Ｊ細胞株の場合、ＨＧＦとアクチビンの添加によって、インスリン産生細胞へと分化する際、インスリンの発現誘導はもちろん、転写因子であるPax4およびneurogenin3の発現が誘導されることが報告(Zhang YQ et al.: Diabetes 50:S10-14 2001)されており、これらの遺伝子の定量またはプロモーター活性によっても分化を確認可能である。
【００５１】
例えば、ＡＲ４２Ｊ細胞内に産生されたインスリンは、蛍光抗体により染色し、蛍光顕微鏡で観察することによって検出することや、インスリンのmRNAをRT-PCR法で検出すること、さらにはインスリンやPax4遺伝子のプロモーター活性をレポータージーンアッセイ法などで定量化することによって、内分泌細胞への分化を確認ができる。また、インスリン産生をする膵β細胞以外の膵内分泌細胞への分化も、例えば膵α細胞への分化を例にとれば、グルカゴン(glucagon)のmRNAやタンパク質を上記と同様な方法論で評価することによって確認できる。
【００５２】
従って本発明においては、膵幹様細胞を膵内分泌細胞に分化誘導したことを、ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞株を用いて、上記測定法のうち、顕微鏡による目視観察によって判断することができ、細胞の形態変化があるか否かによって、特に基材表面に直接接着している細胞が突起状のものを出し紡錘状に変化した場合、およびその細胞の上に強く付着する状態でランゲルハンス島に類似した細胞集塊が認められる場合を分化誘導したと判断し、逆に丸い形状のままで形態変化した細胞が培養時に出現しない場合には分化誘導が達成されていないと判断することができる。あるいは、ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞株を用いて、RT-PCR法により膵内分泌細胞だけが分泌する特定のタンパク質として、インスリンやグルカゴンのmRNA量を定量して、これらの量が未分化のＡＲ４２Ｊ細胞に比べて２倍以上に増加した場合を分化誘導したと判断することができる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００５３】
実施例１：陽性荷電を有する重合体の調製
ジメチルアミノエチルメタクリレート:DMAEMA(6.29g,40mmol)をエタノール２０ｇに溶解し、アゾビスイソブチロニトリル：AIBN(33mg,0.20mmol)を添加し氷冷下溶解させながら、容器内をアルゴン置換した。容器を密栓後70℃で８時間反応した。反応液を多量のｎ−ヘキサンに加え生じた沈殿を減圧下乾燥し、第３級アミノ基含有単独重合体であるポリジメチルアミノエチルメタクリレート（以下、重合体１と表記）4.70gを得た。
【００５４】
ジメチルアミノエチルメタクリレート:DMAEMA (3.14g,20mmol)とメチルメタクリレート:MMA(2.00g,20mmol)をエタノール２０ｇに溶解し、アゾビスイソブチロニトリル：AIBN(33mg,0.20mmol)を添加し氷冷下溶解させながら、容器内をアルゴン置換した。容器を密栓後70℃で８時間反応した。反応液を多量のｎ−ヘキサンに加え生じた沈殿を減圧下乾燥し、第３級アミノ基含有共重合体を得た（以下重合体２と表記）4.45gを得た。共重合の組成はNMRにより確認し、DEMAEMA:MMA=50:50であることを確認した。
【００５５】
ジメチルアミノエチルメタクリレート(1.89g,12mmol)と２ヒドロキシエチルメタクリレート:HEMA(3.65g,28mmol)をエタノール２０ｇに溶解し、アゾビスイソブチロニトリル：AIBN(33mg,0.20mmol)を添加し氷冷下溶解させながら、容器内をアルゴン置換した。容器を密栓後70℃で８時間反応した。反応液を多量のｎ−ヘキサンに加え生じた沈殿を減圧下乾燥し、第３級アミノ基含有共重合体を得た（以下、重合体３と表記）4.76gを得た。共重合の組成はNMRにより確認し、DEMAEMA:HEMA=73:27であった。
【００５６】
４−ビニルベンジルクロリド（4.19g,27.5mmol）とスチレン(2.60g,25mmol)をトルエン20mlに溶解し、AIBN(41mg,0.25mmol)存在下、常圧下80℃で１５時間反応した。反応液をエタノールに加え生じた沈殿を減圧下乾燥し、(４−ビニルベンジルクロリド／スチレン)モル比が68/32の割合で共重合した化合物(1.65g)を得た。上記モル比はNMRにより確認した。次に４−ビニルベンジルクロリドに対し等モル量のピリジン(2.18g,27.5mmol)を加えエタノールとトルエンの１：１の混合溶媒中、常圧下80℃で１５時間反応し、反応液をエーテルに加え生じた沈殿を減圧乾燥し、第４級アンモニウム塩含有共重合体(以下、重合体４と表記)2.66gを得た。
【００５７】
実施例２：ＡＲ４２Ｊ細胞を用いた形態観察による分化誘導能の評価
組織培養用FalconTM96穴プレート353072(Becton Dickinson社製)への実施例１で作製した重合体１から重合体４のコーティングは以下のようにして行った。重合体１から重合体４の0.01重量％から0.0001重量％のエタノール溶液をそれぞれ調整し、上記９６穴プレートに200μl/wellで添加した。これを室温で１時間放置して重合体を物理吸着させた。コーティングに用いた溶液を取り除き、室温で乾燥した。比較のために、第一級アミノ基を有する多塩基性ポリアミノ酸で、神経細胞の培養になど使用されるポリ-L-リジン（以下：Poly-L-Lysと表記する）：Poly-L-Lys・HBr(SIGMA社製 品番P-1274(Mw 83,800))をリン酸緩衝生理食塩水液pH=7.4（以下PBS(-)と表記する）で同様にコーティングしたもの、および何もコーティングしていない基材を対照として用いた。
【００５８】
ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞（群馬大学生体調節研究所小島至教授より供与をうけた）を、HEPES-NaOH(20mM)(Sigma社製)、5mMのNaHCO3(Sigma社製)、ペニシリンーストレプトマイシン（米国、GIBCO-BRL社製）、および10％のFCS(GIBCO-BRL社製)を含むDMEM培地(pH7.4)(Sigma社製D-5523)で継代培養した。 その後、1×105個/mlの濃度の上記細胞200μlの細胞懸濁液を上記で調整したコーティング済みの96穴プレートの各ウェルに播種した。これを5％CO2条件下、37℃で３日間培養した。ＡＲ４２Ｊ細胞株の場合、ＨＧＦとアクチビンの添加によって、インスリン産生細胞へと分化することが知られている(Mashima H, Shibata H,  Mine T and Kojima I: Endocrinology 137:3969-3976,1996)。この際、ＡＲ４２Ｊ細胞の形態は、球状から紡錘状に形態変化する。したがって、この細胞が分化したか否かを検出する方法として、顕微鏡による目視観察を行った。また比較対照として、この細胞が分化した状態の形態を、何もコーティングしていない96穴プレートに終濃度100pMのＨＧＦと終濃度2nMのActivin A(Genzyme/Techne社製)を添加したものを5％CO2条件下、37℃で３日間培養することによって誘導した。
【００５９】
ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の光学顕微鏡写真結果を図１〜４に示す。図１は、ＨＧＦ、Activin Aのいずれも添加せず、何もコーティングしていない96穴プレートで培養したコントロールのＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の光学顕微鏡写真を示す。ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞は、丸い形状を保ったままであり、細胞の形態変化は認められない。図２は、ＨＧＦ(100pM)とActivin A(2nM)を添加し何もコーティングしていない96穴プレート上で分化した状態のＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の光学顕微鏡写真を示す。ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞は、突起状のものを出して紡錘状になり形態変化したことが認められる。図３は、重合体４の0.01重量％溶液にてコーティングをした表面上でのＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の光学顕微鏡写真を示す。ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞は、突起状のものを出し形態変化したものがあることが認められる。図４は、重合体１の0.0001重量％溶液をコーティングをした表面上でのＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の光学顕微鏡写真を示す。ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞は、突起状のものを出し形態変化したものがあることに加え、その細胞の上に付着する状態でランゲルハンス島に類似したより生理的と思われる細胞集塊(以下：クラスターと表記))が認められる。このクラスターは図１で認められる細胞集塊や浮遊培養時に形成される細胞凝集とは異なり、基材表面に比較的強く付着している。
【００６０】
複数の視野を観察し、この結果をまとめたものを表１に示した。表１において、−は図１のような未添加、未コートと同じ形態、+，＋＋，＋＋＋は基材表面の細胞の形態変化の割合を目視にて３段階で評価したもの、Cはクラスターが認められるものであり、クラスターと形態変化が同時に認められるものは併記してある。陽性荷電基を有する重合体を表面に塗布する際、コーティング濃度を調節することによってＡＲ４２Ｊ細胞の形態変化を誘導できることが示された。中でも実施例１において作製した重合体１、重合体２、重合体４は多塩基性ポリアミノ酸であるPoly-L-Lysよりも強い効果を示し、分化誘導に適していることが示された。
【００６１】
【表１】
2005278501.tif 000002
【００６２】
実施例３：ＨＧＦ存在下でのＡＲ４２Ｊ細胞を用いた形態観察による分化誘導能の評価
実施例２と同様な実験を、成長因子の一種であるＨＧＦ存在下で行った。すなわち各基材表面に細胞を播種後、終濃度100pMのＨＧＦを添加して同様に行った。表１と全く同様な結果が得られ、成長因子の添加に関係なく、ＡＲ４２Ｊ細胞の形態変化を誘導できることが示された。
【００６３】
実施例４：ゼータ電位測定による基材表面の荷電状態評価
重合体１、重合体３、重合体４のそれぞれ0.001重量％エタノール溶液を調整し、組織培養用ポリスチレン製スライド（NUNC社製160004）を室温で一時間浸漬後取り出し、過剰の溶液を取り除いた後、乾燥することによって重合体が表面にコーティングされた基材を得た。比較のために、第一級アミノ基を有するポリアミノ酸で、神経細胞の培養に使用されるpoly-L-Lys(SIGMA社製)の0.001wt%のリン酸緩衝生理食塩水液（以下PBS(-)と表記する）で同様にコーティングしたもの、および何もコーティングしていない基材を対照として用いた。
【００６４】
これらを、大塚電子社製ELS-800と平板セルを用いて、基材表面のゼータ電位測定を行った。測定は大塚電子社製の標準粒子を用い、純水で２倍に希釈したPBS(-),pH=7.4の条件で行った。結果を表２に示す。ゼータ電位は基材表面の荷電の状態を反映しており、この数値が正の値であれば陽性荷電をもった表面、負の値であれば陰性荷電であり、その絶対値は表面荷電の強さを反映すると考えられている。また、表中に実施例２と同様にして行った場合の形態変化も併せて示した。
【００６５】
【表２】
2005278501.tif 000003
【００６６】
表２の結果から、ｐH=7.4（中性ｐH）においては、重合体１および重合体４をコートしたスライドのみが基材表面に陽性荷電を持っていることが判る。重合体１および重合体４は、元々陰性荷電であったポリスチレン製組織培養用スライドの表面を、0.001重量％という低濃度のコーティング溶液でコーティングしても陽性荷電を表面に付与することが可能であった。一方、重合体３およびpoly-L-Lysの0.001重量％コートスライドでは実質的に基材表面は陽性荷電を持っていない、あるいは測定時に浸漬された水溶液によって容易に脱離してしまうことが明らかとなり、このような状態においては、ＡＲ４２Ｊ細胞が膵内分泌細胞の一種であるインスリン産生細胞に分化するのに伴って観察される形態変化を、誘導しないことが明らかとなった。これらの知見より、中性pHで陽性荷電を有する基材表面上で培養して、膵幹様細胞を膵内分泌細胞に分化誘導する方法が有用であることが示された。また、本発明においては、第３級アミノ基または第４級アンモニウム基が表面上に固定されている基材の方が分化効率や安定性の点においてより望ましいことが明らかとなった。
【００６７】
実施例５：原子間力顕微鏡AFMによる表面荷電の強さの見積もり
実施例２と同様な方法により、組織培養用FalconTMシャーレ353001(Becton Dickinson社製)に重合体１を0.01重量％および0.0001重量％にてコーティングした基材表面、Poly-L-Lysを0.01重量％にてコーティングした基材表面、および比較のために何もコーティングしていない基材を調整した。これを原子間力顕微鏡AFM(Digital Instruments製 Nano Scope IV D3100)、使用プローブはDNP-S(Si3N4先鋭化探針：200μm-narrow,バネ定数2.0N/m)を用い、大気中1.6μmのスキャン距離でフォースカーブ測定を行った。解析は、プローブが基材表面から力を受けない距離(この点はプローブのたわみ０)から基材に向かってプローブ徐々に近づけていき、プローブがサンプルに接触する点でのたわみ量をプローブのバネ定数より定量化した（プローブ先端は誘電体であるため、荷電を持った表面に近づくほど引力が働き、プローブがたわむ）。この測定では、基材表面とプローブとの静電引力＋ファンデルワールス力の合算値が算出されるが、ファンデルワールス力は静電引力に比べ小さく、さらにサンプル間で相違が少ないと考えられるので、表面荷電の強さを主に反映している。測定は３回行い、結果を表３に平均値±標準偏差として示した。
【００６８】
【表３】
2005278501.tif 000004
【００６９】
表３の結果から分かるように、未コートシャーレ（市販組織培養用ポリスチレン製シャーレ）では引力は検出されないのに対し、重合体１およびPoly-L-Lysをコーティングしたシャーレでは表面陽性荷電に由来する引力が検出された。また、Poly-L-Lys-0.01wt%コートシャーレと重合体１-0.0001重量％コートシャーレは同程度であり、重合体１-0.01重量％コートシャーレは非常に強い。本発明においては、第１級アミノ基よりも第３級アミノ基を有する表面の方が荷電が強く、陽性荷電の基材を創出するのにより好適に用いることができる。
【００７０】
実施例６：基材表面で分化誘導したＡＲ４２Ｊ細胞のreal time RT-PCR法による評価
実施例２と同様な方法により、組織培養用FalconTMシャーレ353001(Becton Dickinson社製)に重合体１を0.01重量％および0.0001重量％にてコーティングした基材表面、Poly-L-Lysを0.01重量％にてコーティングした基材表面、および比較のために何もコーティングしていない基材を調整した。これらを細胞の培養直前にPBS(-)で一回洗浄したのち使用した。
【００７１】
1×105個/mlの濃度のＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞4mlの細胞懸濁液を上記で調整したコーティング済みのシャーレに播種した。更にＨＧＦを終濃度100pMになるように加え、5％CO2条件下、37℃で３日間培養した。また比較対照として、この細胞が膵内分泌細胞の一種であるインスリン産生細胞に分化した状態を、何もコーティングしていないシャーレに終濃度100pMのＨＧＦと終濃度2nMのActivin A(Genzyme/Techne社製)を添加したものを5％CO2条件下、37℃で３日間培養することによって誘導した。同様に細胞が未分化の状態として、何もコーティングしていないシャーレにＨＧＦのみの添加及びＨＧＦとActivin Aの両方を添加しなかったものも作製した。これらの細胞が膵内分泌細胞分化したか否かを検出する方法として、real time RT-PCR法によってラットのインスリンI＋インスリンII mRNAの総量、あるいはラットグルカゴンのmRNAの量を定量した。
【００７２】
すなわち培養後の細胞をトリプシン-EDTA処理により基材から剥離し、血清存在下遠心分離することによって細胞ペレットを得た。細胞ペレットを1.5ml PPチューブ（ポリプロピレン、Sorenson BioScience,Inc社、SafeSeal Microcentrifuge Tubes) に移し、ISOGEN（日本国  ニッポンジーン社製)1mlで細胞を溶解後、説明書に従ってtotal RNAを抽出した。このtotal RNA 1μgを説明書に従ってDNase I(Amplification Grade) (米国  GIBCO BRL 社製）処理した後、Oligo dT（米国  GIBCO BRL社製）を加え、Superscript II RT(米国  GIBCO BRL社製）を用いて、説明書に従ってcDNAを作製した。作製したcDNAは仕込みのtotal RNA換算の濃度で5ng/μlの濃度に希釈して、PCR反応のテンプレートとした。
【００７３】
上記PCRテンプレートをLightCycler クイックシステム330(独国  Roche Diagnostics社製) を用いて、Insulin I+ II mRNA量及びGlucagon mRNA量のreal time PCR定量を行った。また、内部標準としてhouse keeping geneG3PDH遺伝子の定量も行った。検出法は何れもSYBR Green I法を使用し、LightCyclerTM  FastStart DNA Master SYBR Green I(独国  Roche Diagnostics社製)を使用した。プライマーはInsulin I+ Insulin II用(5-TACACACCCAAGTCCCGTCG-3（配列番号１）, および5-TGATCCACAATGCCACGCTT-3（配列番号２）)、Glucagon用(5-TCGTGGCTGGATTGTTTGTA-3（配列番号３）, および5-ACGGCGGGAGTCTAGGTATT-3（配列番号４）)、G3PDH用(5-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3（配列番号５）, および5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3（配列番号６）)を用いた。
【００７４】
PCR反応用のキャピラリーはLightCyclerTM  Capillaries(独国  Roche Diagnostics社製)を使用し、PCR反応溶液中のMg2+濃度は2mMにした。PCRの温度サイクルは95℃で10分の後、95℃で10秒、63℃で8秒及び72℃ で13秒の３温度サイクルを50サイクル繰り返した、解析は各サンプルのInsulin I+ II mRNA量またはGlucagon mRNA量をG3PDH mRNA量で規格化してInsulin I+ II/G3PDHまたはGlucagon/G3PDHをそれぞれ算出し、さらに何もコーティングしていないシャーレにHGF、Activin Aの両者を添加していない細胞(未処理未刺激細胞)のサンプルのInsulin I+ II mRNA量またはGlucagon mRNA量を１とした相対値で算出した。結果を表４に示した。
【００７５】
【表４】
2005278501.tif 000005
【００７６】
表４の結果から分かるように、重合体１の0.01重量％コーティングした基材で培養した場合及びActivinA + ＨＧＦ添加した分化controlでの培養のみがインスリン I+IIのｍRNAの発現量増加を認め、インスリン産生細胞へと分化していることが示された。また、インスリン産生細胞以外の膵内分泌細胞（膵α細胞）が特異的に分泌するグルカゴンのmRNAも、重合体１をコーティングにより塗布した表面での培養した場合には著しく発現が増強され、膵内分泌細胞に分化していることが示された。また、多塩基性ポリアミノ酸であるPoly-L-Lysコーティングでは分化の誘導が弱いことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の方法及び基材によって、膵幹様細胞を安定、容易かつ安価にインスリン産生細胞などの膵内分泌細胞に分化誘導可能である。本発明の方法により得られる膵内分泌細胞は、糖尿病の治療や再生医療の分野で好適に使用することができ、これにより慢性的な臓器不足を解消することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、ＨＧＦ、Activin Aのいずれも添加せず、何もコーティングしていない96穴プレートで培養したコントロールのＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の光学顕微鏡写真を示す。
【図２】図２は、ＨＧＦ(100pM)とActivin A(2nM)を添加し、何もコーティングしていない96穴プレート上で培養し分化した状態のＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の光学顕微鏡写真を示す。
【図３】図３は、重合体４の0.01重量％溶液をコーティングした表面上でのＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の光学顕微鏡写真を示す。
【図４】図４は、重合体１の0.0001重量％溶液をコーティングした表面上でのＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の光学顕微鏡写真を示す。
【図１】
2005278501.tif 000006
【図２】
2005278501.tif 000007
【図３】
2005278501.tif 000008
【図４】
2005278501.tif 000009
【配列表】
2005278501000001.app