(57)【要約】      （修正有）【課題】コンパクチンをプラバスタチンに変換する方法を提供する。【解決手段】アクチノマデュラ由来の因子（チトクロームＰ４５０システムとは異なる独立のヒドロキシラーゼ）と当該コンパクチンを、当該因子がコンパクチンをプラバスタチンに変換する条件下で接触させる。さらに、アクチノマデュラの一株、アクチノマデュラの細胞不含抽出物、アクチノマデュラのヒドロキシラーゼおよび哺乳類のコレステロールレベルの低下方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンパクチンを供給し：そして
該コンパクチンをアクチノマデュラに由来する因子と、該因子がコンパクチンをプラバスタチンに変換する条件下で、接触させることよりなる
コンパクチンのプラバスタチンへの変換方法。
【請求項２】
プラバスタチンを単離する工程をさらに含む、請求項1の方法。
【請求項３】
アクチノマデュラに由来する因子が、アクチノマデュラが生産するヒドキシル化酵素である、請求項1の方法。
【請求項４】
ヒドキシル化酵素が、チトクロームP450システムとは独立のヒドロキシラーゼである、請求項3の方法。
【請求項５】
ヒドキシル化酵素が構成的に発現される酵素である、請求項3の方法。
【請求項６】
コンパクチンが、コンパクチンを生産する微生物により供給される、請求項1の方法。
【請求項７】
コンパクチンを生産する微生物が、菌類（fungus）およびバクテリアからなる群から選択される、請求項6の方法。
【請求項８】
コンパクチンが、コンパクチンを生産する微生物の細胞不含抽出物として供給される、請求項1の方法。
【請求項９】
コンパクチンが、コンパクチンを生産する微生物を予め培養したものの細胞不含培養培地として供給される、請求項1の方法。
【請求項１０】
コンパクチンが、コンパクチンを含有する溶液として供給される、請求項1の方法。
【請求項１１】
コンパクチンが、実質的に精製されたコンパクチンとして供給される、請求項1の方法。
【請求項１２】
コンパクチンが、何回かに分割して供給される、請求項1の方法。
【請求項１３】
コンパクチンとアクチノマデュラに由来する因子との接触が、アクチノマデュラの全菌体とコンパクチンを接触させることにより行われる、請求項1の方法。
【請求項１４】
コンパクチンとアクチノマデュラに由来する因子との接触が、アクチノマデュラの細胞不含抽出物とコンパクチンを接触させることにより行われる、請求項1の方法。
【請求項１５】
コンパクチンとアクチノマデュラに由来する因子との接触が、アクチノマデュラを予め培養したものの細胞不含培養培地とコンパクチンを接触させることにより行われる、請求項1の方法。
【請求項１６】
コンパクチンとアクチノマデュラに由来する因子との接触が、アクチノマデュラに由来する因子を含む溶液とコンパクチンを接触させることにより行われる、請求項1の方法。
【請求項１７】
コンパクチンとアクチノマデュラに由来する因子との接触が、コンパクチンを生産する微生物を予め培養したものの細胞不含培養培地をアクチノマデュラを予め培養したものと接触させることにより行われる、請求項6の方法。
【請求項１８】
コンパクチンとアクチノマデュラに由来する因子との接触が、コンパクチンを生産する微生物を予め培養したものの細胞不含培養培地をアクチノマデュラの出発培養物と接触させることにより行われる、請求項6の方法。
【請求項１９】
コンパクチンとアクチノマデュラに由来する因子との接触が、コンパクチンを生産する微生物の出発培養物をアクチノマデュラを予め培養したものと接触させることにより行われる、請求項6の方法。
【請求項２０】
コンパクチンとアクチノマデュラに由来する因子との接触が、コンパクチンを生産する微生物の出発培養物をアクチノマデュラの出発培養物と接触させることにより行われる、請求項6の方法。
【請求項２１】
コンパクチンとアクチノマデュラに由来する因子との接触が、コンパクチンを生産する微生物の細胞不含抽出物をアクチノマデュラの培養物と接触させることにより行われる、請求項6の方法。
【請求項２２】
コンパクチンとアクチノマデュラに由来する因子との接触が、コンパクチンを生産する微生物の培養物をアクチノマデュラの細胞不含抽出物と接触させることにより行われる、請求項6の方法。
【請求項２３】
コンパクチンとアクチノマデュラに由来する因子との接触が、コンパクチンを生産する微生物の細胞不含抽出物をアクチノマデュラの細胞不含抽出物と接触させることにより行われる、請求項6の方法。
【請求項２４】
コンパクチンのプラバスタチンへの変換が少なくとも約50％である、請求項1の方法。
【請求項２５】
コンパクチンのプラバスタチンへの変換が少なくとも約80％である、請求項1の方法。
【請求項２６】
コンパクチンをプラバスタチンへ変換する因子を含む、アクチノマデュラ由来の細胞不含抽出物。
【請求項２７】
アクチノマデュラ由来の細胞不含抽出物が、アクチノマデュラの破砕細胞から粒状の細胞屑を実質的に除去したものである、請求項26の細胞不含抽出物。
【請求項２８】
コンパクチンをプラバスタチンへ変換する因子がヒドロキシラーゼである、請求項26の細胞不含抽出物。
【請求項２９】
ヒドロキシラーゼが構成的に発現される酵素であり、該ヒドロキシラーゼの酵素活性は、ATP、アスコルビン酸、およびMg++のいずれによっても刺激されるが、Fe++およびFe+++のいずれによっても刺激されず、且つ該ヒドロキシラーゼはチトクロームP450システムとは独立した酵素である、請求項28の細胞不含抽出物。
【請求項３０】
コンパクチンのプラバスタチンへの変換が少なくとも約50％である、請求項26の細胞不含抽出物。
【請求項３１】
コンパクチンのプラバスタチンへの変換が少なくとも約80％である、請求項26の細胞不含抽出物。
【請求項３２】
コンパクチンをプラバスタチンに変換するアクチノマデュラ由来のヒドロキシラーゼにおいて、
該ヒドロキシラーゼは構成的に発現される酵素であり；
該ヒドロキシラーゼ活性はATP、アスコルビン酸およびMg++のいずれによっても刺激されるが、Fe++およびFe+++のいずれによっても刺激されず、そして、
該ヒドロキシラーゼはチトクロームP450システムとは独立した酵素である、上記アクチノマデュラ由来のヒドロキシラーゼ。
【請求項３３】
コンパクチンをプラバスタチンに変換する因子を含有する、純化されたアクチノマデュラATCC55678。
【請求項３４】
コンパクチンをプラバスタチンに変換する因子がヒドロキシラーゼである、請求項33のアクチノマデュラ。
【請求項３５】
哺乳類の血中コレステロールレベルを低下させるために哺乳類を治療する方法において、
プラバスタチンを用意し；
該プラバスタチンは、コンパクチンをプラバスタチンに変換するアクチノマデュラ由来の因子とコンパクチンを接触させることにより、該コンパクチンから生じたものであり；そして
該プラバスタチンを上記治療を必要とする哺乳類に投与して、該哺乳類の血中コレステロールレベルを低下させる
ことよりなる上記治療方法。
【請求項３６】
アクチノマデュラ由来の因子がヒドロキシラーゼである、請求項35の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状バクテリアであるアクチノマデュラに由来する因子によってコンパクチンをプラバスタチンに変換する方法、哺乳類のコレステロール値を低下させる方法、およびアクチノマデュラならびにアクチノマデュラのヒドロキシラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化症および冠状動脈性疾患の大きな理由の一つは血中コレステロールの高値にある。体内コレステロールの約50％は、デノボ（De novo）コレステロール合成に由来する。コレステロール生合成経路における主たる律速工程は、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル（HMG）-CoAリダクターゼにより触媒される。コンパクチンおよびプラバスタチンはHMG-CoAリダクターゼの競合的インヒビターであると報告され、いずれかの存在はコレステロール生合成の阻害をもたらす。
【０００３】
コンパクチンの微生物的ヒドロキシル化は、コンパクチンのヒドロキシル化体、例えばプラバスタチンをもたらす。ヒドロキシル化体のあるものは、HMG-CoAリダクターゼの競合的インヒビターとして、コンパクチンより効果的であると報告されている。このようなヒドロキシル化は、多くの異なる真菌属、およびバクテリアのノカルジアおよびストレプトマイセス ロゼオクロモゲナスおよびストレプトマイセス カルボフィラスにより異なる程度に行うことができると報告されている。例えば、米国特許5,179,013；4,448,979；4,346,227；4,537,859；カナダ特許1,150,170；1,186,647；Serizawa et al., J. Antibiotics 36: 887-891 (1983)を参照。
【０００４】
プラバスタチンの製造に真菌を用いることの問題は、真菌は一般に培養培地中に添加されるコンパクチンの増加に耐えられず、これはおろらくコンパクチンの抗真菌活性によるとおもわれる。Serizawa et al., J. Antibiotics 36: 887-891 (1983)を参照。
【０００５】
ストレプトマイセス カルボフィラスでの、コンパクチンからプラバスタチンへのヒドロキシル化には、チトクローム P450 系が必要とされることが示されている。Matsuoka et al., Eur. J. Biochem. 184:707-713 (1989)。そのような酵素の使用に伴う問題は、当該系は単一蛋白質ではなく蛋白質の複合物であり、組み換えDNA操作が困難であり、そしてチトクローム P450 系のインデューサーであるコンパクチンが非常に高価であることである。
【特許文献１】米国特許5,179,013
【特許文献２】米国特許4,448,979
【特許文献３】米国特許4,346,227
【特許文献４】米国特許4,537,859
【特許文献５】カナダ特許1,150,170
【特許文献６】カナダ特許1,186,647
【非特許文献１】Serizawa et al., J. Antibiotics 36: 887-891 (1983)
【非特許文献２】Matsuoka et al., Eur. J. Biochem. 184:707-713 (1989)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、効率的かつ比較的安価な、コンパクチンからプラバスタチンへの変換方法を提供することである。
本発明の他の目的は、コンパクチンをプラバスタチンへ変換するために、アクチノマデュラ（糸状バクテリア）を用いることである。
【０００７】
本発明のさらに別の目的は、コンパクチンをプラバスタチンへ変換するために、アクチノマデュラのヒドロキシラーゼを用いることである。
本発明のさらに別の目的は、コンパクチンをプラバスタチンへ変換するために、コンパクチンをインデューサーとして必要としないアクチノマデュラの構成的ヒドロキシラーゼを用いることである。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、哺乳類の血中コレステロール値を低下させる治療のため、コンパクチンをプラバスタチンに変換するアクチノマデュラのヒドロキシラーゼにより得られたプラバスタチンを用いることである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によると、コンパクチンをプラバスタチンへ変換する方法が提供される。コンパクチンを供給し、本発明の因子、例えばヒドロシキル化酵素、例えばヒドロキシラーゼ（これは、例えばアクチノマデュラに由来する構成的でかつチトクローム P450 系とは独立のもの）と、該因子がコンパクチンをプラバスタチンに変換する条件下で接触させる。ある態様では、プラバスタチンは単離される。
【００１０】
好ましくは、コンパクチンは、例えばコンパクチンを生産する微生物、例えば真菌またはバクテリアにより、またはコンパクチンを生産する微生物の細胞を含まない抽出物、コンパクチンを生産する微生物を予め培養したものからの細胞を含まない培養液、コンパクチンを含む溶液、準精製コンパクチン、または実質的に精製されたコンパクチンとして供給される。
【００１１】
ある種の態様では、コンパクチンと上記因子との接触は、例えばアクチノマデュラの全菌体をコンパクチンと接触させることにより、アクチノマデュラの細胞不含抽出物をコンパクチンと接触させることにより、あらかじめ培養したアクチノマデュラの細胞不含培養液をコンパクチンと接触させることにより、アクチノマデュラ因子を有する溶液をコンパクチンと接触させることにより、または準精製もしくは実質的に精製されたアクチノマデュラ因子をコンパクチンと接触させることにより、行われる。
【００１２】
変法には、例えば、コンパクチンを生産する微生物の培養物、例えば予め培養した培養物または出発培養物、または細胞不含抽出物、または準精製もしくは実質的に精製されたコンパクチンと、例えば、アクチノマデュラの培養物、例えば予め培養した培養物または出発培養物、または細胞不含抽出物、または準精製もしくは実質的に精製されたアクチノマデュラ因子との接触を包含する。
【００１３】
本発明の他の観点は、アクチノマデュラに由来する細胞不含抽出物であって、コンパクチンをプラバスタチンに変換する因子、例えばヒドロキシラーゼを含むものに関する。
本発明の他の観点は、コンパクチンをプラバスタチンに変換するアクチノマデュラ由来のヒドロキシラーゼ、例えば準精製したものまたは実質的に精製したものに関し、該ヒドロキシラーゼの活性はATP、アスコルビン酸またはMg++のいずれによっても刺激されるが、Fe++またはFe+++によっては刺激されず、且つ当該ヒドロキシラーゼはチトクローム P450 系とは独立のものである。
【００１４】
本発明の別の観点は、コンパクチンをプラバスタチンへ変換する因子を有する精製されたアクチノマデュラATCC55678に関する。
本発明のさらに別の観点は、哺乳類の血中コレステロール値を低下させるために該哺乳類を治療する方法に関する。コンパクチンをプラバスタチンへ変換するアクチノマデュラ由来の因子、例えばヒドロキシラーゼとコンパクチンを接触させることによりコンパクチンから誘導されたプラバスタチンが提供される。
【発明の効果】
【００１５】
このプラバスタチンを上記治療を必要とする哺乳類に投与して該哺乳類の血中コレステロール値を低下させる。
本発明の上記及びその他の目的、構成及び効果は以下の記載により、良く理解されよう。
【発明の実施の形態】
【００１６】
本発明はコンパクチンをプラバスタチンに変換する方法を提供する。コンパクチンを供給し、アクチノマデュラ由来の因子と当該因子がコンパクチンをプラバスタチンに変換する条件下で接触させる。幾つかの態様では、プラバスタチンは単離される。
【００１７】
コンパクチン（メバスタチン、ML-236B及びCS-500としても知られている）には、例えば酸体（ML-236Bカルボン酸としても知られている）、ラクトン体（ML-236Bラクトンとしても知られている）、および塩及びエステルも含まれる。ラクトン体のコンパクチンは次式（I）で表される：
【００１８】
【化１】
2005278649.tif 000002
【００１９】
好ましいコンパクチンはコンパクチンのナトリウム塩である。
プラバスタチン（エプタスタチン、メザロチン、プラバコール、CS-514、及びSQ-31000としても知られている）には、例えば、酸体、ラクトン体、及び塩並びにエステルも含まれる。プラバスタチンの3β-ヒドロキシラクトン体は次式（II）で表される：
【００２０】
【化２】
2005278649.tif 000003
【００２１】
ヒドロキシル化コンパクチンの他の型には、コンパクチン分子の他の位置、例えば6位にヒドロキシ基が付加されたものが含まれる。
【００２２】
コンパクチンは、上記因子が作用できる任意の方法で供給してよい。例えば、コンパクチンは、コンパクチンを生産する微生物、例えば真菌またはバクテリアとして供給して良い。微生物には、例えばそのままの微生物細胞、固定化したものまたは浸透性としたもの（permeabilized）も含まれる。微生物によるコンパクチンの製造とは、微生物自身の遺伝子もしくは遺伝子群を用いてまたはそれらの断片を用いてコンパクチンを製造すること、および/または微生物が外来遺伝子もしくは遺伝子群を用いてまたはそれらの断片を用いてコンパクチンを製造することも含む。外来遺伝子の微生物への導入は、この技術分野で知られている標準的分子生物学的技術により、またはコンパクチン製造遺伝子または遺伝子群もしくはその断片の発現を該微生物にもたらす任意の方法で、行うことができる。幾つかの態様では、コンパクチンはコンパクチンを生産する微生物の細胞不含抽出物を用いて供給される。細胞不含抽出物は、当該技術分野で知られている種々の方法、例えば物理的または化学的手段により、細胞を破壊することにより調製可能である。そのような方法には、例えば、磨砕、超音波処理、または酵素もしくは表面活性剤処理が含まれる。好ましくは、細胞不含抽出物は、フレンチプレスで調製する。細胞不含抽出物とは、任意の調製方法による材料、または任意の調製方法による溶解画分を含む。好ましくは、細胞不含抽出物は、粒状の細胞屑、例えば細胞壁を含まない細胞成分よりなり、例えば細胞壁は実質的に除去されている。細胞不含抽出物は、細胞の活発な増殖の前、間、または後に調製できる。他の態様においては、コンパクチンは、コンパクチンを産生する微生物を予め培養した培養物からの細胞不含培養培地を用意することにより供給できる。他の態様では、コンパクチンはコンパクチンを含む溶液を用意することにより供給できる。さらに別の態様では、コンパクチンは準精製されたまたは実質的に精製されたコンパクチンを用いることにより供給できる。コンパクチンは遊離でも固定化されていてもよい。本発明においては他の任意のコンパクチンの供給源も使用できる。コンパクチンは、本発明においてプラバスタチンの製造をもたらす任意の濃度で用いることができる。好ましくは、コンパクチン濃度は、約0.1ないし約100 g/リットル、より好ましくは約0.2ないし約25 g/リットルであり、最も好ましくは約1及び約10 g/リットルである。いくつかの態様では、コンパクチンはアクチノマデュラ因子に対して、分割的に添加される。分割的とは、該因子を何回か連続添加することを意味する。実施例3を参照のこと。
【００２３】
コンパクチンをアクチノマデュラ由来の因子と接触させる。アクチノマデュラは糸状バクテリアのアクチノミセテスに属する一属である。アクチノマデュラは、野性型のものまたはコンパクチンをプラバスタチンに変換する能力を有する任意の変異体を含む。変異体は、例えば自然に、または物理的要因（例えば紫外線照射、高周波の電磁波または放射線照射）により、または化学的要因により、または遺伝子操作技術により誘導できる。
【００２４】
本発明に含まれる新たに単離された株の形態学的及び化学分類学的特性を、類似した分類の菌と比較したところ、結果は、当該株がアクチノマデュラ属に属することを示した。これらのアクチノマデュラ細胞（2966株）の寄託は、1995年6月1日に、12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852の、ATCCになされ、受託番号ATCC55678が付与された。
【００２５】
アクチノマデュラ由来の因子とは、例えば酵素（例えばヒドロキシル化酵素、例えばヒドロキシラーゼ）またはその任意の部分で、コンパクチンをプラバスタチンに変換する能力を有するものを含む。アクチノマデュラの因子は、in vivoまたはin vitroのいずれで調製してもよく、例えば細胞不含系または化学合成のいずれで調製してもよい。この因子は野性型及び変異型を含む。変異型の因子は、天然に、アクチノマデュラを変異させて（例えば物理的要素または化学的要素により）、または当業者に知られている遺伝子工学技術を用いて、得られるいずれの変異でもよい。変異型の因子は当業者に知られている化学技術で合成することもできる。当該因子はまた、例えば遺伝子工学操作により、当該因子またはその任意の活性部分をコードする核酸が当該因子の野性型の制御領域と異なる制御領域またはその一部に機能的に結合されたアクチノマデュラ株から得られたものも含む。幾つかの態様では、アクチノマデュラの因子をコードする核酸は、別のタイプの細胞、例えばバクテリア（例えば大腸菌、枯草菌、Bacillus brevisまたはStreptomyces lividans）、真菌（例えばサッカロミセス セレビシエ、ピキア パストリス、ハンセヌラ ポリモルファ）、昆虫細胞、トランスジェニック植物、またはトランスジェニック動物の細胞内にクローニングされる。好ましい態様においては、アクチノマデュラの因子は、コンパクチンを生産する能力を有する（例えば、その微生物自身の遺伝子（群）により、または外来遺伝子（群）により）微生物中にクローニングされる。
【００２６】
本発明の因子は構成的酵素であり、したがって、コンパクチンによる誘導を必要としない。実施例6を参照のこと。Mg++、ATP及びアスコルビン酸は単独または協力して当該因子の酵素活性を刺激するが、Fe++またはFe+++は酵素活性を刺激しない。実施例8を参照のこと。好ましくは、NADPHをH+ ドナーとして用いるが、NADHまたは他のH+ドナーを用いることもできる。コファクター類、例えばα-ケトグルタレート、CoCl2 、NiCl2 、CuSO4、FMNまたはFADは当該因子の酵素活性を刺激しない。この因子はチトクロームP450の系とは独立のものである。実施例7参照。
【００２７】
コンパクチンは当該因子がコンパクチンをプラバスタチンへ変換することを可能ならしめる任意の方法で当該因子に接触させることができ。例えば、コンパクチンをアクチノマデュラの全菌体と、またはアクチノマデュラの細胞不含抽出物と、またはアクチノマデュラを予め培養した培養物からの細胞不含培養培地と、またはアクチノマデュラの因子を含有する溶液と、または準精製したもしくは実質的に精製したアクチノマデュラ因子と接触させてよい。
【００２８】
いくつかの態様においては、コンパクチンを生産する微生物を予め培養した培養物を、予め培養したアクチノマデュラの培養物と接触させる。予め培養した培養物とは、細胞を接種した後ある長さの期間、好ましくは約1ないし約8日、より好ましくは約1ないし約5日、そして最も好ましくは約2ないし約4日間培養したものをいう。他の態様においては、予め培養した微生物の培養物を、アクチノマデュラの出発培養物と接触させる。出発培養物とは、例えばスラント培養物、凍結培養物、凍結乾燥培養物または液状種培養物からの細胞を接種した培養物を意味する。他の態様においては、コンパクチンを生産する微生物の出発培養物を、アクチノマデュラの予め培養した培養物と接触させる。他の態様においては、コンパクチンを生産する微生物の出発培養物を、アクチノマデュラの出発培養物と接触させる。この培養物混合物をある長さの時間、好ましくは約0.5ないし約8日、より好ましくは約1日ないし5日、そして最も好ましくは約2ないし約4日間増殖させる。
【００２９】
他の態様においては、コンパクチンを生産する微生物の細胞不含抽出物を、アクチノマデュラの例えば出発培養物または予め培養した培養物と接触させる。他の態様においては、コンパクチンを生産する微生物の例えば出発培養物または予め培養した培養物を、アクチノマデュラの細胞不含抽出物と接触させる。さらに別の態様においては、コンパクチンを生産する微生物の細胞不含抽出物を、アクチノマデュラの細胞不含抽出物と接触させる。他の態様においては、コンパクチンを生産する微生物の培養物、例えば出発培養物または予め培養した培養物を、アクチノマデュラの細胞不含抽出物と接触させる。準精製または実質的に精製したコンパクチン、または準精製または実質的に精製したアクチノマデュラ因子の組み合わせ使用も本発明に含まれる。
【００３０】
コンパクチンからプラバスタチンへの変換反応は、プラバスタチンの生産を生じる任意の条件で行うことができる。任意の培養方法を用いてよく、例えば発酵法（例えばバッチ培養法、供給式バッチ培養法（fed-batch culture）、連続培養法または固相培養法を用いて良い。好ましくは、攪拌液面下培養を用い、最も好ましくは大量の工業的発酵に適するタイプの培養法を用いる。細胞内でのヒドロキシル化系の発達に寄与する添加剤を、増殖の間に用いてもよい。
【００３１】
好ましい温度は約18℃ないし約50℃、より好ましくは約25℃ないし約37℃、そして最も好ましくは約28℃ないし約31℃である。好ましいpHは約5ないし約10、より好ましくは約6ないし約8.5、そして最も好ましくは約7.2ないし約8.0である。好ましくは、例えば攪拌および/または通気による好気性条件を与える。好ましい浸透条件は約0 rpmないし約400 rpm、より好ましくは約200 rpmないし約250 rpm、そして最も好ましくは約220 rpmである。
【００３２】
本発明は、アクチノマデュラ因子によるコンパクチンのいかなる変換率％も含み、好ましくは少なくとも約10％、より好ましくは少なくとも約25％、さらにより好ましくは少なくとも約40％、さらにより好ましくは少なくとも約50％、さらにより好ましくは少なくとも約60％、さらにより好ましくは少なくとも約70％、そして最も好ましくは少なくとも約80％の変換率である。変換率％は、プラバスタチン濃度を、投入した（最初に添加した）コンパクチンの濃度で割ってさらに100倍した値として計算される。
【００３３】
好ましい態様では、プラバスタチンは単離される。単離とは、例えば、濃縮され、分離されまたは精製されることを意味する。単離は当業者に知られる任意の方法で行うことができ、例えば、沈殿、抽出（例えば酢酸エチルまたはブタノールなどの溶媒による抽出及び例えば蒸留による溶媒除去）、クロマトグラフィー（例えば、アルミナまたはシリカゲルのような支持体を用いて行われる、例えば薄層クロマトグラフィーまたはカラムクロマトグラフィー）及び引き続く溶出、により行うことができる。好ましいクロマトグラフィー法は、例えば高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）を含む。例えばSerizawa et al., J. Antibiotics（1983）を参照。
【００３４】
本発明はさらに、コンパクチンをプラバスタチンへ変換する因子、例えばヒドロキシラーゼを含む、アクチノマデュラからの細胞不含抽出物も包含する。細胞不含抽出物は、上記方法を含めて、任意の方法で得られたものでよい。好ましくは、細胞不含抽出物は、粒状の細胞屑、実質的に例えば壁を含まない細胞成分からなり、例えば、壁は実質的に除去されている。好ましくは細胞不含抽出物によるコンパクチンのプラバスタチンへの変換率は少なくとも約10％、より好ましくは少なくとも約25％、さらにより好ましくは少なくとも約40％、さらにより好ましくは少なくとも約50％、さらにより好ましくは少なくとも約60％、さらにより好ましくは少なくとも約70％、そして最も好ましくは少なくとも約80％である。
【００３５】
本発明はまた、アクチノマデュラからのコンパクチンをプラバスタチンへ変換するヒドロキシラーゼを包含し、例えば準精製または実質的に精製されたものである。このヒドロキシラーゼは構成的酵素である。ヒドロキシラーゼの活性は、ATP、アスコルビン酸及びMg++またはこれらの組み合わせにより刺激されるが、Fe++またはFe+++によっては刺激されない。好ましくは、NADPHをH+ドナーとして用いるが、NADHまたは他のH+ドナーを用いることもできる。コファクター類、例えばα-ケトグルタレート、CoCl2、NiCl2、CuSO4、FMNまたはFADはヒドロキシラーゼの活性を刺激しない。ヒドロキシラーゼはチトクロームP450の系とは独立のものである。
【００３６】
本発明はまた、コンパクチンをプラバスタチンへ変換するための因子、例えばヒドロキシラーゼを有するアクチノマデュラATCC55678も包含する。
本発明はさらに、哺乳類の血中コレステロールレベルを低下させるための当該哺乳類の治療方法も包含する。コンパクチンをコンパクチンをプラバスタチンへ変換するアクチノマデュラに由来する当該因子、例えばヒドロキシラーゼと接触させることにより、コンパクチンから誘導されたプラバスタチンが与えられる。上記治療を要する哺乳類にプラバスタチンを投与し、当該哺乳類の血中コレステロールレベルの低下を生じさせる。
【００３７】
哺乳類とは、ヒト並びに非ヒト哺乳類も含む。血中コレステロールレベルの低下のために哺乳類を治療するとは、例えば高血中コレステロールレベルを防止または低下させることを含む。
【００３８】
プラバスタチンの投与は、プラバスタチンをその標的に到達させることを可能にする任意の方法で行うことができる。標的とは、プラバスタチンが哺乳類内におけるコレステロール生合成経路を阻止できる任意の場所を意味する。投与方法は、例えば注射、デポ、移植、座剤、経口投与、吸入、局所投与、またはプラバスタチンによる標的への到達が達成できる他の任意の投与方法を含む。注射は、例えば静注、皮内、皮下、筋注、または腹腔投与であってよい。移植は、移植可能薬剤配給システム、例えばミクロスフェア、ヒドロゲル、ポリマー性のリザーバ、コレステロールマトリックス、ポリマーシステム（例えばマトリックス崩壊および/または拡散性システム）及び非ポリマーシステム（例えば圧縮、溶融または部分溶融ペレット）を挿入することを含む。座剤は、グリセリン座剤を含む。経口投与剤、例えばピルは腸溶コーティングを施してよい。吸入剤は、吸入器中の噴霧として、単独でまたは吸入可能な担体とともにプラバスタチンを投与することを含む。
【００３９】
プラバスタチンは液体に懸濁させてもよく、例えば溶解形態またはコロイド形態にしてもよい。液体は溶剤、部分溶剤、または非溶剤であってよい。多くの場合、水または有機の液体を用いることができる。いくつかの態様においては、プラバスタチンを適当な担体、例えば薬学的に許容される担体と混合してもよい。いくつかの態様においては、プラバスタチンはリポソーム中に包含させ、またはポリマー性の放出システムに包含させる。
【００４０】
本発明のある態様においては、投与は或る時間の間、例えば何時間、何日、何週間、何ヵ月または何年間、連続的なプラバスタチンへの暴露をもたらすように計画できる。このことはプラバスタチンを上記の方法のいずれかで繰返投与することにより、または繰返投与することなくプラバスタチンを哺乳類に長期間配給する制御放出供給システムの使用により達成される。そのようなシステムによる投与は、例えば長期作用性経口投与剤型、大量注射、経皮パッチ、及び皮下移植であってよい。
【００４１】
プラバスタチンは、高血中コレステロールレベルの出現の前または後に投与できる。ある態様においては、プラバスタチンは高血中コレステロールレベルの家族歴を有する患者に、または高血中コレステロールレベルの遺伝傾向を有する患者に投与される。他の態様においては、プラバスタチンは一定の年齢に達し、そのため高血中コレステロールレベルを生じやすい患者に投与される。さらに別の態様においては、プラバスタチンは高血中コレステロールレベルの初期症状または進行症状を呈する患者に投与される。プラバスタチンはまた予防手段としての投与も可能である。
【００４２】
プラバスタチンは哺乳類に治療有効量で投与される。治療有効量とは、高血中コレステロールレベルを少なくとも部分的に予防もしくは改善できる量を意味する。治療有効量は、個々の患者毎に決定され、少なくとも一部は、哺乳類の種、哺乳類の大きさ、使用する供給システムの種類、血中コレステロールレベルとの関連における投与時間、及び採用する投与法が一回投与、複数回投与または制御放出投与であるか、等を考慮して決定される。これらの要因を考慮し、そして日常的検査を用いるだけで当業者が治療有効量を決定することができる。
【００４３】
好ましくは、ヒトに対するプラバスタチンの用量は、約0.1ないし約5000 mg/日、より好ましくは約1ないし約500 mg/日、そして最も好ましくは約10ないし約50 mg/日である。好ましくは、用量は哺乳類に実質的な悪影響を与えない量である。
【実施例】
【００４４】
実施例1：アクチノマデュラの健全細胞によるコンパクチンのプラバスタチンへの生物学的変換
本実施例は、アクチノマデュラ細胞によるコンパクチンのプラバスタチンへの生物学的変換を記載する。アクチノマデュラATCC55678はYM培地（1リットル当たり、イーストエキス3 g、麦芽エキス3 g、ペプトン5 g、グルコース10 g，pH6.5）中で、48時間、28℃で、220 rpmの振とうで培養した。次いで、500μg/mlのNaコンパクチン（ニューヨーク，NYのFluka Chemical Corp.から入手）を添加した。アクチノマデュラ培養物を同じ培地中で、さらに1、2、3、4または5日インキュベートした。各インキュベート時間の後、HPLCによりコンパクチン（CP）及びプラバスタチン（PV）の量を測定した。
【００４５】
使用したHPLC条件は、3μm Lichrospher 100 RP-18カラム（ジブスタウン，NJのEM Separations Technologyから入手）；移動相A：800 mlのMilli-Q水中の2.5 g NaH2PO4にアセトニトリル200 ml及びメタノール110 mlを添加し、85％H3PO4でpHを2.5に調整；移動相B：水200 ml、アセトニトリル800 ml、メタノール110 ml及び85％H3PO4 1 mlの混合物；注入容積10μl；流速1 ml/分；及びUV 237 nmでの検出。勾配は下表のとおり：
【式１】
【００４６】
2005278649.tif 000004
【００４７】
【表１】
2005278649.tif 000005
【００４８】
変換％は、使用したコンパクチンではなく投入したコンパクチンに基づいて計算した（添加前にコンパクチンを秤量したが、投入量は時間0におけるHPLCアッセイにより決定した）。
【００４９】
実施例2：アクチノマデュラの健全細胞によるコンパクチンのプラバスタチンへの生物学的変換のカイネティック
本実施例は、アクチノマデュラの健全細胞によるコンパクチンのプラバスタチンへの生物学的変換のカイネティックを記載する。グルコース2％、ペプトン0.5％、イーストエキス0.3％、及び麦芽エキス0.3％を含有する培養培地を調製し、pHを5.5に調整した。容量250 mlのエルレンマイヤーフラスコ（各々、20 mlの培地を含む）を121℃で15分間滅菌した。次いで、各フラスコにスラント培養したアクチノマデュラATCC55678の細胞を含むプラチナループで接種し、250 rpmの振とうを行いながら28℃で5日間培養した。この方法によりペレットと濁った液を含む懸濁液を得た。培養物の濁った液部分2 mlを、培地20 mlを含む別の250 mlエルレンマイヤーフラスコに接種し、250 rpmで振とうしながら、28℃で2日間インキュベートし、種培養物を得た。上記培地の50 mlアリコートを500 mlエルレンマイヤーフラスコに加え、121℃で15分間滅菌した。各フラスコに5 mlの種培養物を添加した。2日後、コンパクチンを各フラスコに500μg/mlの量で添加し、さらに36時間培養を続けた。36時間の生物学的変換の間に、種々の時間間隔で、プラバスタチン生産率を実施例1に記載の方法で測定した。結果を表2に示す。
【００５０】
【表２】
2005278649.tif 000006
【００５１】
16時間の間、プラバスタチンの生産及びコンパクチンの消費は共に直線的であった。
さらなる実験を行って、コンパクチン濃度200μg/ml及び500μg/mlにおいて、より短い7時間のインターバルでの生物学的変換を調べた。
結果を表3及び表4に示す。
【００５２】
【表３】
2005278649.tif 000007
【００５３】
【表４】
2005278649.tif 000008
【００５４】
上記の結果より、二種のコンパクチン濃度の間にプラバスタチン生産速度の点で実質的差異がないことが明らかである。
【００５５】
実施例3：コンパクチンを分割的に添加したときの、アクチノマデュラの健全細胞によるコンパクチンのプラバスタチンへの生物学的変換
本実施例は、アクチノマデュラの健全細胞によるコンパクチンのプラバスタチンへの生物学的変換により得られるプラバスタチンの濃度は、コンパクチンを分割的に添加した場合に増大することを説明する。アクチノマデュラATCC55678を実施例2に記載したようにして、500μg/mlコンパクチンを記載のように添加して増殖させた。最初の日に300μg/mlの追加量のコンパクチンを添加し、そしてさらに第2日目にさらなる追加量300μg/mlのコンパクチンを添加した。コンパクチン及びプラバスタチンの量を実施例1の記載の方法により測定した。結果を表5に示す。
【００５６】
【表５】
2005278649.tif 000009
【００５７】
この結果は、コンパクチンを分割的に添加すると7日後に非常に高濃度のプラバスタチン（821μg/ml）が得られることを示した。コンパクチンを一度に（非分割的に）添加した点を除いて類似の条件下で行った実験では、プラバスタチンの産生濃度は低かった。加えて、表5に示されているとおり、分割的添加実験では生物学的変換の率は78％まで増大した。したがって、コンパクチンを分割的に添加するとプラバスタチンの濃度及び変換率が高まった。コンパクチンからプラバスタチンへの生物学的変換の速度は増大しなかった。
【００５８】
実施例4：規定培地で増殖させたアクチノマデュラの細胞による増殖及びコンパクチンからプラバスタチンへの生物学的変換
本実施例では、規定培地がアクチノマデュラの増殖を支持し、複雑な培地に比べてコンパクチンのプラバスタチンへの生物学的変換のためにより効果的であることを示す。化学的に規定された培地（培地Aと命名する）は次の成分を含有する：
【００５９】
【化３】
2005278649.tif 000010
【００６０】
アクチノマデュラATCC55678を、培地A、及び複雑なYM培地（リットル当たりイーストエキス3 g、麦芽エキス3 g、ペプトン5 g、グルコース10 g、pH 6.5）中で45時間、5 ml/250 mlフラスコ、28℃、220 rpmの振とうにより増殖させた。45時間目にコンパクチン（250μg/ml）を添加した。インキュベートを8時間継続した。バイオマスを測定すると、培地Aでの細胞増殖はYM培地での細胞増殖に比べて約25％少なかった。細胞数は少なかったにもかかわらず、培地Aで増殖した細胞はYM培地で増殖したものに比べて、コンパクチンのプラバスタチンへの生物学的変換は大きかった。YM培地では6.7％の変換であり、培地Aでは13％の変換が見られた。
【００６１】
実施例5：NADPHに依存するアクチノマデュラの細胞不含抽出物によるコンパクチンのプラバスタチンへの酵素的変換
本実施例は、アクチノマデュラの細胞不含抽出物がコンパクチンをプラバスタチンへ変換し、かつこの酵素的変換において、NADPHがNADHよりも優れたH+ドナーであることを示す。
【００６２】
アクチノマデュラの細胞不含抽出物は、アクチノマデュラATCC55678をYM培地中で実施例1に記載したようにして2日間増殖させて得た。細胞を15,000 rpmで30分の遠心により収穫した。細胞を20 mlの新たなYM培地に再懸濁させ、Naコンパクチンを約500μg/mlに添加し、29℃で220 rpm、3時間のインキュベートを行った。この間に、196μg/mlのコンパクチンが消失し、70μg/mlのプラバスタチンが生じた。細胞を遠心で収穫し、冷水で2回、そしてバッファーA（80 mMのトリス-塩酸バッファー，pH7.4に20％グリセロール及び2 mMのDTTを添加したもの）で一回、洗浄した。細胞を5 mlのバッファーAに再懸濁し、-80℃で貯蔵した。その後、細胞懸濁液を解凍し、フレンチプレスで破砕した。ホモジネートを30,000 rpmで60分間遠心した。上清を細胞不含抽出物として-80℃で保存した。
【００６３】
反応条件は、160μlの細胞不含抽出物、0.26 mM NADHまたはNADPH、0.23 mMのコンパクチン、総量220μl、30℃、250 rpm。コントロールとして、細胞不含抽出物を含まないバッファーAを含めた。プラバスタチンの量は、実施例1に記載したようにして、HPLCで測定した。結果を表6に示す。
【００６４】
【表６】
2005278649.tif 000011
【００６５】
この結果は、細胞不含抽出物によりコンパクチンからプラバスタチンへの酵素変換が生じること、及びH+ドナーとしてNADPHを用いる方がNADHよりも優れていることを示している。
【００６６】
実施例6：細胞不含抽出物で測定した場合の、誘導及び非誘導アクチノマデュラによるコンパクチンからのプラバスタチンへの酵素的変換
本実施例は、細胞不含抽出物で測定したとき、アクチノマデュラにおけるコンパクチンからプラバスタチンへの酵素的変換には、誘導の必要がないこと、及びしたがってアクチノマデュラのヒドロキシラーゼは構成的酵素であることを示すものである。
【００６７】
コンパクチンにより誘導した細胞及び誘導しない細胞の両者から細胞不含抽出物を調製した。アクチノマデュラATCC55678細胞は実施例2に記載した様に、但し温度は29℃で2日間増殖させ、収穫し，そして二つのフラスコに分け入れた。次いで、一方のフラスコにコンパクチンを約300μg/mlの濃度に添加した（これを誘導培養物とする）。両方のフラスコを29℃、250 rpm、3時間インキュベートした。細胞を収穫し、そして実施例4に記載したようにして、フレンチプレスを用いて細胞不含抽出物を調製した。反応条件は次のようにした：160μl細胞不含抽出物、0.26 mM NADPH、0.23 mM コンパクチン、全量220μl、30℃、250 rpmで60分のインキュベート。細胞不含抽出物による酵素変換反応は、0、10、30及び60分目に、実施例1に記載したHPLCにより測定した。結果を表7に示す。
【００６８】
【表７】
2005278649.tif 000012
【００６９】
この結果、誘導は酵素的変換速度を増加させなかった。したがって、アクチノマデュラのヒドロキシラーゼ酵素は構成的酵素である。
【００７０】
実施例7：アクチノマデュラ細胞不含抽出物中のチトクロームP450の測定
本実施例は、アクチノマデュラのヒドロキシラーゼ活性がチトクロームP450酵素でないことを示すものである。アクチノマデュラATCC55678の細胞不含抽出物を実施例5のようにして調製した。調製物1、2および3をバッファーA（80 mMのトリス-塩酸バッファー、pH7.4に2 mMのDTT及び20％グリセロールを添加したもの）に再懸濁し、調製物4はリン酸バッファーに再懸濁した。反応条件は次のようにした：160μl細胞不含抽出物、0.26 mM NADPH、0.23 mM コンパクチン、全量220μl、30℃，250 rpm。ヒドロキシラーゼ活性は実施例1に記載のようにしてHPLCで測定した。
【００７１】
チトクロームP450活性は次のようにして測定した。2 mgのソディウム・ジチオネートをアクチノマデュラATCC55678の細胞不含抽出物3 mlに添加してP450を還元した。細胞不含抽出物をベックマンモデル24スペトクロフォトメーター内に置いたサンプル細胞および対照細胞に加えた。400 nmから500 nm迄の吸光を記録した。サンプルセル内の細胞不含抽出物に、COを泡立つように1分間吹き込んで、P450-CO複合体を形成させた。スペクトルを再度記録した。これらの二つのスペクトルの相違はP450の差スペクトルである。
【００７２】
異なる細胞不含抽出物調製物中のP450含量およびヒドロキシラーゼ活性は表8に示されている。細胞不含抽出物（CFE）調製物の番号は、独立の細胞不含抽出物調製物を示す。
【００７３】
【表８】
2005278649.tif 000013
【００７４】
ヒドロキシラーゼ活性とチトクロームP450活性の間に相関は認められなかった。したがって、アクチノマデュラ由来のヒドロキシラーゼ活性はチトクロームP450酵素によるものではない。
【００７５】
実施例8：アクチノマデュラの細胞不含抽出物中でのコンパクチンからプラバスタチンへの変換に対する種々の因子の影響
本実施例は、Mg++、ATPおよびアスコルビン酸は単独または協力して、アクチノマデュラのコンパクチンからプラバスタチンへの変換を刺激するが、Fe++またはFe+++は刺激しないことを示すものである。Mg++は多くの酵素のコファクターである。ATPは種々の酵素反応に与えられる共通エネルギー源である。Fe++およびFe+++は、多くのオキシゲナーゼの活性部位に存在する。アスコルビン酸は、オキシゲナーゼ反応にしばしば必要とされる還元剤である。反応条件は次のようにした：160μl細胞不含抽出物、0.72 mM NADPH、0.2 mM コンパクチン，全量211μl、30℃、250 rpm、60分。各因子を0時間に次の濃度になるよう添加した：MgCl22.4 mM、FeSO4 0.09 mM、FeCl3 0.1 mM、ATP 1.9 mMおよびアスコルビン酸 12 mM。結果を表9および10に示す。
【００７６】
【表９】
2005278649.tif 000014
【００７７】
【表１０】
2005278649.tif 000015
【００７８】
実施例9：予め培養したピーシロマイセス(Peacilomyces)をアクチノマデュラの出発培養物と接触させることによるプラバスタチン製造
ピーシロマイセスsp.M2016（Endo et al., J. Antibiotics 39:1609-1610 (1986)）の真菌を、グルコース3.5％、スターチ1％、ソイビーンミール2％、肉エキス0.5％、ペプトン0.5％、NaCl 0.2％、KH2PO40.05％およびMgSO4・7H2O 0.05％を含み、pHを5.8に調節した培地で増殖させた。容量250 mlのエルレンマイヤーフラスコの各々に20 mlの培地を添加して、121℃で15分間滅菌した。各フラスコにピーシロマイセスsp.M2016のスラント培養物を白金ループで接種し、25℃、7日間、250 rpmで振とう培養した。製造されたコンパクチンは実施例1に記載したようにしてHPLCで検出した。製造されたコンパクチンは40μg/mlであった。次にpHを7.2に調節した。アクチノマデュラATCC55678の種培養物は実施例2に記載したようにして調製し、ピーシロマイセス sp.の7日培養物に添加した。28℃、250 rpmで1日インキュベートした後、培養物中のプラバスタチンを実施例1に記載したようにしてHPLCで検出した。培養物中のプラバスタチンの濃度は30μg/mlであった。
【００７９】
実施例10：ピーシロマイセスの出発培養物をアクチノマデュラの細胞不含抽出物と接触させることによるプラバスタチンの製造
ピーシロマイセスsp.M2016真菌の培養物は、実施例9に記載のようにして調製したが、但し培養物はスラント培養物からの接種直後に（7日間の予備培養なしに）混合した。アクチノマデュラATCC55678の細胞不含抽出物は、実施例5に記載したようにして調製した。ピーシロマイセスsp.の培養物をpH7.5に調節し、ピーシロマイセスsp.の培養物20 mlに対してアクチノマデュラの細胞不含抽出物5 mlを添加した。混合物を30℃、250 rpmで2時間インキュベートした。コンパクチンから製造されたプラバスタチンは、実施例1に記載したようにして、HPLCで調べた。培養物中のプラバスタチンの濃度は30μg/mlであった。
【００８０】
実施例11：高血中コレステロールレベルの治療
本実施例は、コンパクチンをプラバスタチンに変換するアクチノマデュラヒドロキシラーゼにより製造されたプラバスタチンによる、ヒトの高コレステロールレベルを低下させる方法の説明である。患者にピルの形で20 mgのプラバスタチンを1日2回毎日経口投与する。投与は3ケ月行われる。この治療により患者の血中コレステロールレベルの低下がもたらされる。
【００８１】
当業者は、日常的実験を用いる以上の作業を必要とせず、本明細書に記載されている特定の態様について多くの均等態様を確認することができる。そのようなものを含めて全ての均等な態様は、本出願の請求の範囲に含まれる。