(57)【要約】      （修正有）【課題】天然の基質に対する糖転移活性が向上したアノマー保持型糖加水分解酵素を提供する。【解決手段】野生型アノマー保持型糖加水分解酵素の求核触媒残基のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基をシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基で置換したアノマー保持型糖加水分解酵素変異体。野生型アノマー保持型糖加水分解酵素または野生型アノマー保持型糖加水分解酵素において求核触媒残基以外のアミノ酸を置換、挿入または欠失させたアノマー保持型糖加水分解酵素の求核触媒残基のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基をシステイン残基で置換し、得られた酵素を酸化処理して、前記システイン残基のチオールを酸化してシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基としてアノマー保持型糖加水分解酵素変異体を得る、変異体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素の求核触媒残基のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基をシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基で置換したアノマー保持型糖加水分解酵素変異体。
【請求項２】
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー１に属する酵素であり、求核触媒残基がグルタミン酸残基である請求項1に記載の変異体。
【請求項３】
グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属する酵素が
β-グルコシダーゼ
シアノゲニックβ-グルコシダーゼ、
ミロシナーゼ、及び
6-フォスホ-β-グルコシダーゼ
からなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素である請求項２に記載の変異体。
【請求項４】
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー１３に属する酵素であり、求核触媒残基がグリコシドハイドロラーゼファミリー１３の保存領域２中のアスパラギン酸残基である請求項1に記載の変異体。
【請求項５】
グリコシドハイドロラーゼファミリー１３に属する酵素が、
α−アミラーゼ、
マルトテトラオース生成アミラーゼ、
マルトジェニックα−アミラーゼ、
ネオプルラナーゼ、
ネオプルラナーゼ-α−アミラーゼ、
α−グルコシダーゼ、
オリゴ-1,6-グルコシダーゼ、
デキストラングルコシダーゼ、
シクロデキストリナーゼ、
プルラナーゼ、
イソアミラーゼ、
サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、
ブランチングエンザイム、
マルトオリゴシルトレハロース合成酵素、
トレハロヒドロラーゼ、及び
トレハロース 6-リン酸ヒドロラーゼ、
アミロシュークラーゼ
からなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素である請求項４に記載の変異体。
【請求項６】
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー３１に属する酵素であり、求核触媒残基がグリコシドハイドロラーゼファミリー３１の領域Ａ中のアスパラギン酸残基である請求項1に記載の変異体。
【請求項７】
グリコシドハイドロラーゼファミリー３１に属する酵素が、
α-グルコシダーゼ、
α-キシロシダーゼ、
スクラーゼ‐イソマルターゼ複合体、
グルコアミラーゼ‐マルターゼ複合体、
α-グルカンリアーゼ、及び
イソマルトシルトランスフェラーゼ
からなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素である請求項６に記載の変異体。
【請求項８】
野生型酵素より高い糖転移効率を示す請求項１〜７のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項９】
野生型酵素のシステイン残基がシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基で置換された請求項１〜８のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項１０】
野生型酵素のシステイン残基がセリン残基、アラニン残基、グリシン残基、またはスレオニン残基で置換された請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項１１】
前記アミノ酸の置換以外のアミノ酸の置換、挿入または欠失をさらに有する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項１２】
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素または野生型アノマー保持型糖加水分解酵素において求核触媒残基以外のアミノ酸を置換、挿入または欠失させたアノマー保持型糖加水分解酵素の求核触媒残基のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基をシステイン残基で置換し、得られた酵素を酸化処理して、前記システイン残基のチオールを酸化してシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基としてアノマー保持型糖加水分解酵素変異体を得る、変異体の製造方法。
【請求項１３】
前記酸化処理をヨウ化カリウムおよび/または臭素を用いて行う請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記アノマー保持型糖加水分解酵素が、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属する酵素、グリコシドハイドロラーゼファミリー１３に属する酵素、グリコシドハイドロラーゼファミリー３１に属する酵素から選ばれる請求項１２または１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー１に属する酵素であり、求核触媒残基がグルタミン酸残基である請求項１２または１３に記載の製造方法。
【請求項１６】
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー１３に属する酵素であり、求核触媒残基がグリコシドハイドロラーゼファミリー１３の保存領域２中のアスパラギン酸残基である請求項１２または１３に記載の製造方法。
【請求項１７】
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー３１に属する酵素であり、求核触媒残基がグリコシドハイドロラーゼファミリー３１の領域Ａ中のアスパラギン酸残基である請求項１２または１３に記載の製造方法。
【請求項１８】
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素または野生型アノマー保持型糖加水分解酵素において求核触媒残基以外のアミノ酸を置換、挿入または欠失させたアノマー保持型糖加水分解酵素の求核触媒残基のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基をシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基とすることを含む、野生型アノマー保持型糖加水分解酵素を野生型酵素より高い糖転移効率を示す変異体に変換する方法。
【請求項１９】
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー１に属する酵素であり、求核触媒残基がグルタミン酸残基である請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー１３に属する酵素であり、求核触媒残基がグリコシドハイドロラーゼファミリー１３の保存領域２中のアスパラギン酸残基である請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２１】
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー３１に属する酵素であり、求核触媒残基がグリコシドハイドロラーゼファミリー３１の領域Ａ中のアスパラギン酸残基である請求項１８に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型酵素より高い糖転移効率を示すアノマー保持型糖加水分解酵素変異体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴ糖は構成糖および結合様式によって、極めて多様である。この種類に応じて、エネルギー源としてばかりではなく、整腸作用、免疫腑活作用、ならびに制癌作用など、幅広い有用な機能をもつ。生理的にも細胞認識など情報伝達物質であることが明らかにされており、癌やHIVを含む様々な病気に対する治療薬のデザインにも有益な情報を与える。
【０００３】
この多様なオリゴ糖を効率よく合成する手法が必要とされる。一般的に、次の３法がある。
1. 有機合成的方法（水野卓, 糖類の化学合成, 関東化学（株）学術部, 東京 (1981
)）。
2. 糖転移酵素の利用（Johnson K.F., Synthesis of oligosaccharides by bacterial enzymes, Glycoconj J. (1999) 16,141-146）。
3. 糖質加水分解酵素の縮合・糖転移反応を利用（北畑寿美雄, 微生物酵素による有用オリゴ糖の合成: 澱粉科学, 37, 59-67(1990)、鯵坂勝美、藤本浩, 加水分解酵素の縮合作用によるオリゴ糖の合成: 澱粉科学, 36,113-122(1989)）。
【０００４】
方法１は、グリコシド結合の形成や脱保護などを含む煩雑な多段階の合成ステップを要し、結合選択性・位置選択性ともに制御が難しい。実験室レベルの小規模合成に限られる。
方法２は、高価な糖ヌクレオチドを必要とする。また、酵素の特異性が一般に高く、多様なオリゴ糖合成には必ずしも有利ではない。
方法３は、加水分解酵素を用いるために、収率の低下が問題となる。
【非特許文献１】水野卓, 糖類の化学合成, 関東化学（株）学術部, 東京 (1981)
【非特許文献２】Johnson K.F., Synthesis of oligosaccharides by bacterial enzymes, Glycoconj J. (1999) 16,141-146
【非特許文献３】北畑寿美雄, 微生物酵素による有用オリゴ糖の合成: 澱粉科学, 37, 59-67(1990)
【非特許文献４】鯵坂勝美、藤本浩, 加水分解酵素の縮合作用によるオリゴ糖の合成: 澱粉科学, 36,113-122(1989)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
方法３の問題である収率の低下を改善して、オリゴ糖の効率的合成を行うことが種々試みられている。この目的のための従来の手法は、以下３法ある。
(1)有機溶媒を添加により、加水分解を抑制する。
(2)アリルグリコシドやフッ化グリコシドなど活性化された基質を使用する。
(3)グリコシンターゼ反応（触媒アミノ酸残基を欠失した酵素と活性化された基質を用いた反応。加水分解を示さない。）
【０００６】
いずれの手法によっても、加水分解は抑制されて、オリゴ糖の合成量は増加する。しかし、（１）は高濃度有機溶媒で安定な酵素は非常に限定される。（２）及び（３）で用いる活性化基質には不安定なものが多く、工業的な生産には不向きである。
【０００７】
実用的なオリゴ糖合成の効率化には、天然の基質に対する糖転移活性が向上した加水分解酵素が不可欠である。しかし、加水分解酵素の一種であるアノマー保持型糖加水分解酵素では、天然の基質に対する糖転移活性が向上した加水分解酵素は知られていない。
【０００８】
そこで本発明は、天然の基質に対する糖転移活性が向上したアノマー保持型糖加水分解酵素を提供することにある。
【０００９】
そこで本発明者らは、タンパク質工学的な手法とタンパク質の化学修飾法とを組み合わせて酵素を改変する技術を用いて、野生型酵素より高い糖転移効率を示すアノマー保持型糖加水分解酵素変異体が得られることを見出して本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下の通りである。
[請求項１]野生型アノマー保持型糖加水分解酵素の求核触媒残基のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基をシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基で置換したアノマー保持型糖加水分解酵素変異体。
[請求項２]野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー１に属する酵素であり、求核触媒残基がグルタミン酸残基である請求項1に記載の変異体。
[請求項３]グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属する酵素が
β-グルコシダーゼ
シアノゲニックβ-グルコシダーゼ、
ミロシナーゼ、及び
6-フォスホ-β-グルコシダーゼ
からなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素である請求項２に記載の変異体。
[請求項４]野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー１３に属する酵素であり、求核触媒残基がグリコシドハイドロラーゼファミリー１３の保存領域２中のアスパラギン酸残基である請求項1に記載の変異体。
[請求項５]グリコシドハイドロラーゼファミリー１３に属する酵素が、
α−アミラーゼ、
マルトテトラオース生成アミラーゼ、
マルトジェニックα−アミラーゼ、
ネオプルラナーゼ、
ネオプルラナーゼ-α−アミラーゼ、
α−グルコシダーゼ、
オリゴ-1,6-グルコシダーゼ、
デキストラングルコシダーゼ、
シクロデキストリナーゼ、
プルラナーゼ、
イソアミラーゼ、
サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、
ブランチングエンザイム、
マルトオリゴシルトレハロース合成酵素、
トレハロヒドロラーゼ、及び
トレハロース 6-リン酸ヒドロラーゼ、
アミロシュークラーゼ
からなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素である請求項４に記載の変異体。
[請求項６]野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー３１に属する酵素であり、求核触媒残基がグリコシドハイドロラーゼファミリー３１の領域Ａ中のアスパラギン酸残基である請求項1に記載の変異体。
[請求項７]グリコシドハイドロラーゼファミリー３１に属する酵素が、
α-グルコシダーゼ、
α-キシロシダーゼ、
スクラーゼ‐イソマルターゼ複合体、
グルコアミラーゼ‐マルターゼ複合体、
α-グルカンリアーゼ、及び
イソマルトシルトランスフェラーゼ
からなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素である請求項６に記載の変異体。
[請求項８]野生型酵素より高い糖転移効率を示す請求項１〜７のいずれか１項に記載の変異体。
[請求項９]野生型酵素のシステイン残基がシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基で置換された請求項１〜８のいずれか１項に記載の変異体。
[請求項１０]野生型酵素のシステイン残基がセリン残基、アラニン残基、グリシン残基、またはスレオニン残基で置換された請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異体。
[請求項１１]前記アミノ酸の置換以外のアミノ酸の置換、挿入または欠失をさらに有する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の変異体。
[請求項１２]野生型アノマー保持型糖加水分解酵素または野生型アノマー保持型糖加水分解酵素において求核触媒残基以外のアミノ酸を置換、挿入または欠失させたアノマー保持型糖加水分解酵素の求核触媒残基のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基をシステイン残基で置換し、得られた酵素を酸化処理して、前記システイン残基のチオールを酸化してシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基としてアノマー保持型糖加水分解酵素変異体を得る、変異体の製造方法。
[請求項１３]前記酸化処理をヨウ化カリウムおよび/または臭素を用いて行う請求項１２に記載の製造方法。
[請求項１４]前記アノマー保持型糖加水分解酵素が、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属する酵素、グリコシドハイドロラーゼファミリー１３に属する酵素、グリコシドハイドロラーゼファミリー３１に属する酵素から選ばれる請求項１２または１３に記載の製造方法。
[請求項１５]野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー１に属する酵素であり、求核触媒残基がグルタミン酸残基である請求項１２または１３に記載の製造方法。
[請求項１６]野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー１３に属する酵素であり、求核触媒残基がグリコシドハイドロラーゼファミリー１３の保存領域２中のアスパラギン酸残基である請求項１２または１３に記載の製造方法。
[請求項１７]野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー３１に属する酵素であり、求核触媒残基がグリコシドハイドロラーゼファミリー３１の領域Ａ中のアスパラギン酸残基である請求項１２または１３に記載の製造方法。
[請求項１８]野生型アノマー保持型糖加水分解酵素または野生型アノマー保持型糖加水分解酵素において求核触媒残基以外のアミノ酸を置換、挿入または欠失させたアノマー保持型糖加水分解酵素の求核触媒残基のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基をシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基とすることを含む、野生型アノマー保持型糖加水分解酵素を野生型酵素より高い糖転移効率を示す変異体に変換する方法。
[請求項１９]野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー１に属する酵素であり、求核触媒残基がグルタミン酸残基である請求項１８に記載の製造方法。
[請求項２０]野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー１３に属する酵素であり、求核触媒残基がグリコシドハイドロラーゼファミリー１３の保存領域２中のアスパラギン酸残基である請求項１８に記載の製造方法。
[請求項２１]野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー３１に属する酵素であり、求核触媒残基がグリコシドハイドロラーゼファミリー３１の領域Ａ中のアスパラギン酸残基である請求項１８に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、多様なオリゴ糖合成を実用化可能な、全く新規なアノマー保持型糖加水分解酵素変異体を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明では、アノマー保持型加水分解酵素の求核触媒アミノ酸残基であるアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基をシステインとした変異酵素をタンパク質工学的手法により作出し、さらにこのシステインのチオール基をヨウ化カリウムにより穏やかに酸化することで、システイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基とした変異体を得た。この変異体（システイン酸化酵素）は、活性化基質だけではなく、天然の基質に対しても高い糖転移活性を示す。
【００１３】
同様の手法によって、アノマー反転型加水分解酵素（グルコアミラーゼ）のシステイン酸化酵素が作出されている（Henri-Pierre Fierobe, Ekaterina Mirgorodskaya, Kirsten Arnvig McGuire, Peter Roepstorff, Birte Svensson and Anthony J. Clarke, Restoration of Catalytic Activity beyond Wild-Type Level in Glucoamylase from Aspergillus awamori by Oxidation of the Glu400→Cys Catalytic-Base Mutant to Cysteinesulfinic Acid, Biochemistry (1998), 37, 3743-3752.）。しかし、このシステイン酸化酵素は、野生型酵素と同等の活性を示すが、加水分解反応しか触媒しない。アノマー反転型酵素の反応のモデルでは求核アミノ酸残基は考えられず、一般塩基触媒アミノ酸残基（グルタミン酸）を酸化型システインとしたためだと考えられる。オリゴ糖の合成には全く利用できず、本発明の変異体とは全く異なる。即ち、本発明は、多様なオリゴ糖合成を実用化可能な、全く新規な酵素をもちいた技術である。
【００１４】
本発明のアノマー保持型糖加水分解酵素変異体（以下、単に変異体ということがある）は、野生型アノマー保持型糖加水分解酵素の求核触媒残基のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基をシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基で置換したものである。
【００１５】
アノマー保持型糖加水分解酵素を含むグリコシドハイドロラーゼはその性質に基づいて、幾つかのファミリーに分類されている（B. Henrissat, A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities, Biochem. J., 280 (1991) 309-316. B. Henrissat, A. Bairoch, New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities, Biochem. J., 293 (1993) 781-788.）。その中で、アノマー保持型糖加水分解酵素は、３０以上のファミリーに分類され、代表的なものとしてグリコシドハイドロラーゼファミリー1、13及び31を挙げることができる。
【００１６】
本発明において、野生型アノマー保持型糖加水分解酵素は、例えば、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属する酵素、グリコシドハイドロラーゼファミリー１３に属する酵素、及びグリコシドハイドロラーゼファミリー３１に属する酵素から選ばれる。
【００１７】
グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属する酵素としては、例えば、β-グルコシダーゼ、シアノゲニックβ-グルコシダーゼ、ミロシナーゼ、及び6-フォスホ-β-グルコシダーゼを挙げることができる。
【００１８】
グリコシドハイドロラーゼファミリー１３に属する酵素としては、例えば、α−アミラーゼ、マルトテトラオース生成アミラーゼ、マルトジェニックα−アミラーゼ、ネオプルラナーゼ、ネオプルラナーゼ-α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、オリゴ-1,6-グルコシダーゼ、デキストラングルコシダーゼ、シクロデキストリナーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ブランチングエンザイム、マルトオリゴシルトレハロース合成酵素、トレハロヒドロラーゼ、及びトレハロース 6-リン酸ヒドロラーゼアミロシュークラーゼを挙げることができる。
【００１９】
グリコシドハイドロラーゼファミリー３１に属する酵素としては、α-グルコシダーゼ、α-キシロシダーゼ、スクラーゼ‐イソマルターゼ複合体、グルコアミラーゼ‐マルターゼ複合体、α-グルカンリアーゼ、及びイソマルトシルトランスフェラーゼを挙げることができる。
【００２０】
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー１に属する酵素である場合、求核触媒残基はグルタミン酸残基である。
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー１３に属する酵素である場合、求核触媒残基はグリコシドハイドロラーゼファミリー１３の保存領域２中のアスパラギン酸残基である。
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー３１に属する酵素である場合には、求核触媒残基は、グリコシドハイドロラーゼファミリー３１の領域Ａ中のアスパラギン酸残基である。
【００２１】
各ファミリーに属する酵素のアミノ酸配列は、多重整列(アライメント)させることで類似する機能を有する部位を推定することができ、その結果、求核触媒残基のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基を知ることもできる。
【００２２】
多重整列(アライメント)の方法は、現在ではソフトウエアを利用してコンピューターで行うことができる。多重整列のためのソフトウエアは数多くあり、例えば、国立遺伝学研究所 生命情報・DDBJ研究センターが提供しているCLASTAL Wを用いる方法がある。参考文献としては、Hompson, J.D., Gibson, T.J.,Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D.G.: Nucl. Acids Res., 25,4876-4882(1997)がある。使用方法としては、http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/clustalw-j.htmlへアクセスをし、CLASTALWの部分をクリックする。ついで、多重整列をしたい配列(アミノ酸配列)を解析配列データの欄に入力し、Submitボタンを押すことにより解析が開始される。得られた結果を、GeneDoc Ver. 2.5 [http://www.psc.edu/biomed/genedoc/] を用い表示することができる。
【００２３】
なお、各酵素の求核触媒残基は、同定配列を比較して求めることが出来る。そして、その際にグリコシドハイドロラーゼファミリー１の場合、Sulfolobus solfataricus β-glycosidase、グリコシドハイドロラーゼファミリー１３の場合、α-amylase、グリコシドハイドロラーゼファミリー３１の場合、Shizosaccharomyces pombe  α-glucoisdaseを基準として用いることで各酵素の求核触媒残基を容易に求めることができる。このようにして求めた各ファミリーの求核触媒残基を以下の表１〜３に示す。尚、表中に太文字で表されているアミノ酸が求核触媒残基（アスパラギン酸残基Ｄまたはグルタミン酸残基Ｅ）である。
【００２４】
【表１】
2005253302.tif 000002
アミノ酸配列の最初の番号は、アミノ酸配列断片の最初のアミノ酸の番号である。各アミノ酸は、上から配列番号３〜１３として配列表に示されている。
【００２５】
【表２】
2005253302.tif 000003
2005253302.tif 000004
保存領域2に示すアミノ酸配列の最初の番号は、アミノ酸配列断片の最初のアミノ酸の番号である。各アミノ酸は、上から配列番号１４〜５０として配列表に示されている。
【００２６】
【表３】
2005253302.tif 000005
領域Aに示すアミノ酸配列の最初の番号は、アミノ酸配列断片の最初のアミノ酸の番号である。各アミノ酸は、上から配列番号５１〜６９として配列表に示されている。
【００２７】
糖質加水分解酵素は、アミノ酸配列の相同性と反応機構により、80以上のファミリーに分類される (ファミリー21、40、41、60は削除) [http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/]。この分類では、活性中心の触媒残基が保存されていることと反応機構 (一般酸塩基触媒) も重要視している。触媒機構は、基質と生成物のアノマー型を保持する反応 (α→α, β→β; retaining ) と、反転する反応 (α→β, β→α; inverting) の2つに大別される。例えば、α‐グルコシダーゼとグルコアミラーゼは、α-グルカンの非還元末端側からグルコースの遊離を同様に触媒するが、α‐グルコシダーゼはα-グルコースを生成する保持型反応を行うのに対して、グルコアミラーゼはβ-グルコースを生成する反転型反応を行う。このため、両者は全く異なる反応を触媒する酵素である。
【００２８】
アノマー保持および反転型酵素のいずれの場合にも、活性中心の保存されている本質的な触媒残基は2つのカルボン酸であり、多くの場合、アスパラギン酸やグルタミン酸残基である。それら距離は、アノマー保持型酵素で概ね5オングストロームであり、アノマー反転型酵素では9-10オングストロームである。アノマー保持型酵素では、カルボン酸残基の一方は求核性残基として働き、もう片方は酸/塩基触媒として働く。まず、酸/塩基触媒により、アグリコン上の酸素原子がプロトン化され、続いて求核性残基のカルボン酸がアノマー炭素を攻撃する。その結果、グリコシド結合は切断され、糖-酵素中間体が生成する。糖-酵素中間体に水が攻撃すれば加水分解反応となり、最終的に糖を遊離する。一方、水分子に優先して他の糖が攻撃すれば、糖転移反応となり、この場合は新しいグリコシド結合が形成される。アノマー反転型酵素では、基質と塩基性触媒の間に位置する水分子が、基質のC-1へ求核反応によりOH‐を転移し加水分解反応が起こる。
【００２９】
【化１】
2005253302.tif 000006
【００３０】
本発明においては、アノマー保持型糖加水分解酵素の求核触媒残基をシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基で置換する。この置換により得られた変異体は、活性化基質だけではなく、天然の基質に対しても高い糖転移活性を示す。
【００３１】
例えば、野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー１に属する酵素である場合、求核触媒残基はグルタミン酸残基である。このグルタミン酸残基をシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基で置換することにより、野生型酵素より糖転移能に優れた修飾酵素となる。ここで優れた糖転移能とは、野生型酵素と比較して糖転移産物の生成量が上がる場合と、糖転移の受容体基質の特異性が改善された場合の両方を意味する。
【００３２】
また、野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー１３に属する酵素である場合、求核触媒残基はグリコシドハイドロラーゼファミリー１３の保存領域２中のアスパラギン酸残基である。ファミリー13に分類される酵素は、触媒反応に重要な役割をする4つの高度に保存された領域がある。このうち、保存領域2に存在するアスパラギン酸残基が求核触媒残基として機能する(表2)。このアスパラギン酸残基をシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基で置換することにより、野生型酵素より糖転移能に優れた修飾酵素となる。
【００３３】
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー３１に属する酵素である場合には、求核触媒残基は、グリコシドハイドロラーゼファミリー３１の領域Ａ中のアスパラギン酸残基である。このアスパラギン酸残基をシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基で置換することにより、野生型酵素より糖転移能に優れた修飾酵素となる。
【００３４】
さらにアノマー保持型糖加水分解酵素は、野生型酵素において、酵素活性に影響のない範囲で、求核触媒残基以外のアミノ酸に変異があってもよい。例えば、本発明のアノマー保持型糖加水分解酵素変異体は、前記置換以外のアミノ酸の置換、挿入または欠失をさらに有することもできる。この場合、このようなアミノ酸の置換、挿入または欠失は、本発明のアノマー保持型糖加水分解酵素変異体の酵素活性に影響のない範囲で行われたものであることが適当である。
【００３５】
例えば、本発明の変異体は、上記システイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基での置換以外に、野生型酵素が本来するシステイン残基がシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基で置換された物であることができる。このような変異体は、求核触媒残基のステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基への置換の際の酸化処理により、導入されることができる。
【００３６】
あるいは、野生型酵素が本来有するシステイン残基がＳＨ基を有さない別の残基に置換されたものであることもできる。ＳＨ基を有さない別の残基は、システイン残基と大きさ等が類似しており、酵素の活性に影響を与えないものから適宜選択される。そのような残基としては、セリン残基、アラニン残基、グリシン残基、またはスレオニン残基等を例示出来る。
【００３７】
（本発明の変異体の製造方法）
本発明の変異体は、野生型アノマー保持型糖加水分解酵素の求核触媒残基のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基をシステイン残基で置換し、得られた酵素を酸化処理して、前記システイン残基のチオールを酸化してシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基としてアノマー保持型糖加水分解酵素変異体を得ることで得られる。
【００３８】
また、上記野生型アノマー保持型糖加水分解酵素の代りに、野生型アノマー保持型糖加水分解酵素において求核触媒残基以外のアミノ酸を置換、挿入または欠失させたアノマー保持型糖加水分解酵素を用いることもできる。前記求核触媒残基の置換以外のアミノ酸の置換、挿入または欠失は、本発明のアノマー保持型糖加水分解酵素変異体の酵素活性に影響のない範囲で行われたものであることが適当である。尚、求核触媒残基の置換以外のアミノ酸の置換、挿入または欠失は、システイン残基のチオールを酸化してシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基とした後に行うこともできる。
【００３９】
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素は、例えば、グリコシドハイドロラーゼファミリー１に属する酵素、グリコシドハイドロラーゼファミリー１３に属する酵素、グリコシドハイドロラーゼファミリー３１に属する酵素から選ばれる。
【００４０】
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー１に属する酵素である場合、求核触媒残基はグルタミン酸残基である。
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー１３に属する酵素である場合、求核触媒残基はグリコシドハイドロラーゼファミリー１３の保存領域２中のアスパラギン酸残基である。
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素がグリコシドハイドロラーゼファミリー３１に属する酵素である場合、求核触媒残基はグリコシドハイドロラーゼファミリー３１の領域Ａ中のアスパラギン酸残基である。
【００４１】
野生型アノマー保持型糖加水分解酵素の求核触媒残基のシステイン残基での置換は、例えば、以下のいずれかの方法により行うことができる。
メガプライマーPCR法［Datta, A. K. (1995) Efficient amplification using 'megaprimer' by asymmetric polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 23, 4530-4531参照］
Kunkel法［Kunkel, T. A.（1985）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488参照］Oligonucleotide−directed Dual Amber (ODA)法［Hashimoto-Gotoh, T., et al.（1995）Gene 152, 271-275参照］
【００４２】
求核触媒残基をシステイン残基で置換した酵素の酸化処理は、酵素の機能を損なうことなくシステイン残基のＳＨ基を酸化してシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基にできる方法であれば特に制限はない。例えば、ヨウ化カリウムおよび/または臭素を用いる方法を挙げることができる。ヨウ化カリウムを用いる場合、その濃度は、例えば、酸化処理する酵素の１０００〜１０万モル倍とすることができ、臭素を用いる場合、その濃度は、例えば、化処理する酵素の３〜３０００モル倍とすることができる。反応時間は、例えば、１〜３５０時間の範囲とすることができる。
【００４３】
本発明は、また、野生型アノマー保持型糖加水分解酵素を野生型酵素より高い糖転移効率を示す変異体に変換する方法を包含する。この方法は、野生型アノマー保持型糖加水分解酵素の求核触媒残基をシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基とすることを含む。酵素の求核触媒残基をシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基とするには、前記製造方法において説明した求核触媒残基をシステイン残基で置換し、さらにシステイン残基を酸化してシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基とする方法を挙げることができるが、この方法に限定されない。
【００４４】
上記野生型アノマー保持型糖加水分解酵素の代りに、野生型アノマー保持型糖加水分解酵素において求核触媒残基以外のアミノ酸を置換、挿入または欠失させたアノマー保持型糖加水分解酵素を用いることもできる。前記求核触媒残基の置換以外のアミノ酸の置換、挿入または欠失は、本発明のアノマー保持型糖加水分解酵素変異体の酵素活性に影響のない範囲で行われたものであることが適当である。尚、求核触媒残基の置換以外のアミノ酸の置換、挿入または欠失は、システイン残基のチオールを酸化してシステイスルフィン酸残基及び/又はシステイスルホン酸残基とした後に行うこともできる。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例によりさらに説明する。
実施例中、ＷＴｃｓは、野生型酵素中に存在する2つのシステイン残基をセリンに置換した酵素であり、酵素的性質は野生型酵素とほとんど同じである。Ｄ１９４Ｃｃｓは、ＷＴｃｓの194番目のアスパラギン酸をシステインに置換した変異酵素である。
【００４６】
実験方法
大腸菌とプラスミドDNA
プラスミドDNAの調製にDH5α、組換え酵素の生産にBL21 (DE3) CodonPlus-RIL (Stratagene; La Jolla、 CA、 USA) をそれぞれ用いた。発現ベクターにpET23d (Novagen; Darmstadt、Germany) を用いた。プラスミドDNAの調製をアルカリ / SDS法 [Sambrook, J. & Russell, D. W. (2001) Prepa比n of plasmid DNA by alkaline lysis with SDS: miniprepa比n. In Molecular Cloning volume 1 (Argentine, J., Irwin, N., Janssen, K. A., Curtis, S., Zierler, M., Dickerson, M., Sialiano, I., Mclnerny, N., Brown, D. & Schaefer, S.) pp. 32-34. Cold Spring Harbor Laboratory Press., New York.] により行い、PEG/NaCl沈殿によりRNAを除去した。
【００４７】
塩基配列の解析
塩基配列をジデオキシ法により解析した。解析にABI PRISM 310 Genetic Analyzer (PE Biosystems) を使用した。シーケンス反応をBigDyeTM Terminator ver. 3.1 シーケンスキット (PE Biosystems; CA、 USA) を用いて行った。鋳型として調製した発現プラスミド500 ngを用い、以下に示す4本のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてそれぞれシーケンス反応を行った。5'-TAATACGACTCACTATAGG (sense)(配列番号70)、5’-TTCTGGATTGATAAAGGTATTGGT (sense) (配列番号71)、5’-AGATTGATAAAACACGAGGCA (antisense) (配列番号72)、5’-CTAGTTATTGCTCAGCGGT (antisense) (配列番号73)。
【００４８】
タンパク質の定量
タンパク質の定量を組換え酵素の精製ではUV法、精製酵素に対してはアミノ酸分析により行った。UV法ではタンパク質溶液の波長280 nmの吸光度を測定し、比吸光係数から濃度を算出した。アミノ酸分析により測定した精製酵素の濃度から算出した比吸光係数をそれぞれ用いた。Wtcsでは19.7、D194CcsOXでは21.2である。アミノ酸分析では、600℃で3時間処理した試験管中で精製酵素約30 μgを含む溶液を窒素ガスにより乾固し、高真空脱気下で110℃定沸点塩酸中で24時間処理することにより加水分解した。得られたアミノ酸をニンヒドリン比色により定量した。分析にJLC/500V (日本電子、東京) を用いた。
【００４９】
SDS-PAGE
SDS-PAGEをLaemmliの方法 [Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685] に従って行った。試料用緩衝液を等容量加えた試料を95℃に3分間保持し、これを泳動試料とした。試料用緩衝液の組成を以下に示す。4％ (w/v) SDS、0.02％ (w/v) ブロモフェノール ブルー  (BPB)、 20％ (w/v) グリセロール、 10％ (v/v) 2-メルカプトエタノール、 125 mM Tris-HCl バッファー (pH 6.8)。泳動をMini-Protean III (BIO-RAD; Richmond、 CA、 USA) を用いて行った。電流を厚さ0.75 mmのゲル1枚あたり濃縮ゲル中では15 mA、分離ゲル中では24 mAに設定した。泳動後のタンパク質をRapid CBB KANTO (関東化学、東京) を用いて染色し、 10% (v/v) 酢酸、15% (v/v) メタノールからなる脱色液により脱色した。分子量のスタンダードには市販の分子量マーカー (Sigma-Aldrich Co.; Steinheim, Germany) を用いた。
【００５０】
発現プラスミドの構築
Wtcsの発現プラスミドの構築方法を以下に示す。WtcsではStreptococcus mutans由来デキストラングルコシダーゼのC129およびC532をSerにoverlap extension PCR法 [Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K. & Pease, L. R. (1989) Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene 77, 51-59] により置換した。Streptococcus mutans由来デキストラングルコシダーゼの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号1に示す。1段階目のPCRを5'-GATACCATG(G)AAAAACATTGGTGGCAC (sense; 下線はNcoIサイト、カッコを付けた塩基は置換された塩基を示す。プライマーAとする。)(配列番号74) と5'-ATTTGGCTGGTCA(G)ACCAAATATAATA (antisense) (配列番号75)、5'-TATTATATTTGGT(C)TGACCAGCCAAAT (sense) (配列番号76)と
5'-ATCCT(C)G(A)(G)TATCTTAATA(G)AAAAAGCAT (antisense; 下線はXhoIサイトを示す。プライマーBとする。) (配列番号77) の2組のプライマーを用いて行った。PCRの鋳型に野生型酵素の発現プラスミド [佐分利  亘、森  春英、奥山  正幸、木村  淳夫 (2003) Streptococcus mutans由来dextran glucosidase変異酵素の長鎖基質に対する作用. 日本農芸化学会大会講演要旨集 (2003、東京) 99] を用いた。PCR反応液50 μlの組成を以下に示す。KOD バッファー ＃1、100 μM each dNTP、1 mM MgCl2、0.4μM プライマー、20 pg/μl鋳型DNA、0.01 U/μl KOD ポリメラーゼ(東洋紡、大阪)。PCRを以下のように行った。94℃、2分間に続き、[94℃、10秒間−55℃、10秒間−72℃、30秒間] のサイクルを25回繰り返し、最後に72℃に2分間保持した。増幅されたDNA断片をそれぞれPCR Purification Kit (Qiagen; GmbH, Hilden, Germany) を用いて精製し、10 mM Tris-HCl バッファー (pH 8.0) 50 μlに溶解した。2段階目のPCRではこのうち2 μlを鋳型DNAとして使用した。まずこれらの鋳型DNA、KOD バッファー ＃1、100 μM each dNTP、1 mM MgCl2からなる溶液48μlを94℃に10分間保持し、37℃まで1分間に1.2℃の割合で温度を下げた。これにKOD DNA ポリメラーゼを0.5 U加え、72℃に5分間保持した。その後20 μMプライマーAおよびBをそれぞれ1 μlずつ反応液に添加し、[94℃、10秒間−55℃、10秒間−72℃、１分間] のサイクルを25回繰り返し、最後に72℃に2分間保持した。増幅されたDNA断片およびpET23-dをNcoIおよびXhoI (宝酒造; 京都) によりそれぞれ消化し、アガロースゲル電気泳動後、ゲルからSephaglasTM BandPrep Kit (Amersham Pharmacia Biotech; Piscataway、NJ、USA) を用いて目的のDNA断片を回収した。得られた2本のDNA断片をDNA Ligation Kit ver. 2 (宝酒造) により連結した。
【００５１】
次にD194Ccsの発現プラスミドの構築方法を示す。D194のCysへの置換をmegaprimer PCR法 [Datta, A. K. (1995) Efficient amplification using 'megaprimer' by asymmetric polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 23, 4530-4531] によって行った。1段階目のPCRではプライマーBおよび5'-GGCTTTCGGATG(T)(G)CGTCATTGATATG (sense)（配列番号78） を用い、鋳型DNAにWtcsの発現プラスミドを用いた。鋳型DNA、プライマー以外はWtcsの1段階目のPCR反応液と同組成の反応液により以下に示すようにPCRを行った。96℃、2分間に続き、[96℃、10秒間−58℃、5秒間−72℃、1秒間] のサイクルを25回繰り返し、最後に72℃に2分間保持した。増幅されたDNA断片をPCR Purification Kitを用いて精製し、10 mM Tris-HCl バッファー (pH 8.0) 50 μlに溶解した。2段階目のPCRでこのうち20 μlをメガプライマーとして使用した。メガプライマー、KOD バッファー ＃1、100 μM each dNTP、1 mM MgCl2、20 pg/μl Wtcs発現プラスミドおよび0.01 U/μl KOD DNA ポリメラーゼからなる溶液49 μlを96℃に5分間保持し、[96℃C、1分間−72℃、15秒間] のサイクルを5回繰り返した。これに20μMプライマーAを1 μl加え、[96℃、10秒間−60℃、2秒間−72℃、１分間] のサイクルを25回繰り返した。得られたDNA断片をWtcsの発現プラスミドの構築方法と同様にpET23-dに組み込んだ。  構築した発現プラスミドの塩基配列をそれぞれ解析し、PCRエラーが無いことを確認した。
【００５２】
組換えタンパク質の生産と精製
Hanahanの方法 [Hanahan, D. (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580] に従って各発現プラスミドで形質転換した大腸菌を得た。これらの形質転換体を100 μg/ml アンピシリンおよび50 μg/mlクロラムフェニコールを含むLuria-Bertani培地50 ml (Wtcs) あるいは100 ml (D194Ccs) により37℃で一晩振とう培養し、Wtcsでは950 ml、D194Ccsでは1900 mlの同培地に植え継いだ。これを37℃でさらに1.5時間培養して波長600 nmの吸光度を約0.5とした。培養液を氷冷し、1/1000容量の0.1 M イソプロピルチオβ-ガラクトシド (終濃度0.1 mM) を加え、酵素の生産を誘導した。誘導後18℃で18時間培養した。
【００５３】
10,000xg、4℃で10分間遠心分離を行い、菌体を回収した。菌体を0.5 M NaClを含む20 mM リン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) 40 mlに懸濁し、ソニケーションにより破砕した。ソニケーションをSONIFER 250を用いてout put 4、duty cycle 50%の条件で30秒間ずつ30回行った。なお、各回ごとに1分間氷冷した。これを14,000xg、4℃で10分間遠心分離し、上清を得た。これを粗酵素液とした。
【００５４】
粗酵素液から組換え酵素をNi-キレーティング・クロマトグラフィーにより精製した。0.5 M NaClを含む20 mM リン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) で平衡化したNi-キレーティング Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences AB; Uppsala、 Sweden) 8 mlを内径1.6 cmのガラスカラムに充填し、これに粗酵素液を供した。非吸着タンパク質を30 mM イミダゾールおよび0.5 M NaClを含む20 mM リン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) により溶出した後、吸着タンパク質を30-500 mMのイミダゾールの直線濃度勾配により溶出した。SDS-PAGEにより組換え酵素の溶出した画分を確認し、純度の高い画分を回収して20 mM リン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) に対して透析した。透析後、精製酵素をCentriprep YM-30 (Millipore; Bedford、 MA、USA) によって数mg/mlまで濃縮し、保存した。全ての精製操作を4℃で行った。
【００５５】
KIによる酸化条件の検討
チオール基の酸化に最適なKI濃度を検討した方法を示す。3.16 μM D194Ccs (Wtcs 3.51 μM)、0-0.3 M KI、10 μM 臭素および0.25 M リン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) からなる溶液100 μlを25℃に30 h保持し、その酵素活性を測定した。次にチオール基の酸化に対する臭素濃度の影響を調べた方法を示す。3.16 μM D194Ccs (Wtcs 3.51 μM)、0-1 mM 臭素、0.2 M KIおよび0.25 M リン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) からなる溶液100 μlを25℃に30 h保持し、その酵素活性を測定した。KIによるチオール基の酸化の経時変化を以下の方法に従って行った。3.16 μM D194Ccs (Wtcs 3.51 μM)、0.2 M KI、10 μM 臭素および0.25 M リン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) からなる溶液2.5 mlを25℃に保持し、その酵素活性を24、54、102、148、195、245、288および342時間に測定した。
【００５６】
チオール基を酸化したD194Ccs (D194CcsOX) の大量調製
3.16 μM D194Ccs 0.2 M KIおよび0.25 M リン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) からなる溶液50 mlを25℃に240 h保持し、20 mM リン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) に対して透析した。透析後、精製酵素をCentriprep YM-30によって数mg/mlまで濃縮し、保存した。
【００５７】
チオール基の定量
Ellman法 [Elluman, G. L. (1959) Tissue sulfhidryl groups. Arch. Biochem. Biophys. 82, 70-77] によりチオール基の定量を行った。Ellman法では5, 5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸) とチオール基の反応により遊離する3-カルボキシ-4-ニトロフェノレートイオンを定量することによりチオール基の量を求める。以下にその方法を示す。D194Ccs 2.96 nmolあるいはD194CcsOX 3.46 nmolを減圧遠心濃縮器により乾固し、これを6 M グアニジン-HClおよび10 mM EDTAを含む0.1 M Tris-HCl バッファー (pH 7.0) 90 μlに溶解した。これに4 mM 5, 5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸) を含む50 mM リン酸ナトリウムバッファー (pH 7.0) 10 μlを加え、室温に10分間保持した。この波長412 nmの吸光度を測定し、遊離した3-カルボキシ-4-ニトロフェノレートイオンをモル吸光係数ε1 M, 412 nm = 14290 [Gething, M. J. H. & Davidson, B. E. (1972) The molar absorption coeficient of reduced Ellman's reagent: 3-carboxylato-4-nitro-thioフェノールate. Eur. J. Biochem. 30, 352-353] に基づいて定量した。
【００５８】
酵素活性の測定
通常の活性測定ではp-ニトロフェニルα-D-グルコピラノシド(pNPG) を基質とした。適当な濃度の酵素、40 mM リン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0)、2 mM pNPG、および0.02% BSAからなる反応液50 μlを37℃に10分間保持し、これに1 M Na2CO3 100 μlを添加して酵素反応によって遊離したp-ニトロフェノールを定量した。すなわち波長400 nmの吸光度を測定し、モル吸光係数ε1 mM, 400 nm = 5.56に基づいてp-ニトロフェノールの量を算出した。KIによるチオール基の酸化の検討における酵素活性の測定では反応時間を20分間とした。1分間に1 μmolのp-ニトロフェノールを遊離する酵素量を1 Uとした。
【００５９】
イソマルトース、ｐNPG、フェニル α-グルコシド (PG)に対する速度パラメーターの測定方法を示す。イソマルトースは加水分解反応の速度パラメーターとしてWtcsおよびD194CcsOXについて求め、pNPGおよびPGでは糖転移反応の速度パラメーターとしてD194CcsOXのみについて求めた。WtcsではpNPGおよびPGを基質とした際に糖転移反応と加水分解反応が同時に起こり、両者を区別することができないために、これらの基質に対する速度パラメーターを求められない。糖転移反応でも、Scheme 1に基づいた平衡状態近似によりアグリコンの遊離速度はミカエリスメンテンの式に従う。
【００６０】
【化２】
2005253302.tif 000007
【００６１】
この時Kmおよびkcatは各反応段階の速度定数により次式のように表わされる。
【００６２】
【数１】
2005253302.tif 000008
【００６３】
以下に示す濃度の基質および酵素、40 mM リン酸ナトリウムバッファー、0.02% BSAからなる反応液100 μlを37℃に10分間保持した。イソマルトースに対する速度パラメーターの測定において、Wtcsでは1-20 mM、D194CcsOXでは0.6-2 mMの範囲で基質濃度を設定した。pNPG、PGではそれぞれ2-9、4-20 mMの範囲である。Wtcsの濃度をイソマルトースでは0.784 nMとし、D194CcsOXの濃度をイソマルトース、pNPGおよびPGにおいてそれぞれ64、384および30.8 nMとした。イソマルトースおよびPGでは2 M Tris-HCl バッファー (pH 7.0)、pNPGでは1 M NaCO3をそれぞれ200 μl添加して反応を停止し、遊離したグルコース、p-ニトロフェノールおよびフェノールをそれぞれ測定した。遊離したグルコースをグルコースオキシダーゼ-ペルオキシド法 [Miwa, I. Okudo, J. Maeda, K. & Okuda, G. (1972) Mutarotase effect on colorimetric determination of blood グルコース with β-D-グルコース oxidase. Clin. Chim. Acta 37, 538-540] により測定した。すなわちGlucose AR-II (和光純薬工業、大阪) を反応液に40 μl加え、37℃に1時間保持した。この波長505 nmの吸光度を測定し、グルコースの標準曲線 (0-500 μM) に基づきグルコース量を求めた。p-ニトロフェノールの定量方法は前述の通りである。遊離したフェノールを以下に示す方法により測定した。反応液に0.2% 2,6-ジブロモ-N-クロロ-p-ベンゾキノンモノイミドのエタノール溶液を40 μl加えて室温に1時間保持した。この波長660 nmの吸光度を測定し、フェノールの標準曲線 (0-500 μM) に基づきフェノール量を求めた。各基質濃度に対する反応速度を基質濃度に対してプロットし、それをミカエリスメンテンの式にフィットさせて速度パラメーターを求めた。
【００６４】
糖転移反応の基質濃度依存性を調べた方法を示す。アグリコンとグリコンの遊離速度の比から全体の反応に占める糖転移反応の割合を知ることができる。グリコンであるグルコースは加水分解では遊離するが、糖転移反応では受容体に転移されるために遊離しない。一方アグリコンであるp-ニトロフェノールあるいはフェノールは糖転移反応、加水分解反応によらず遊離する。したがって遊離グルコースは加水分解反応だけの反応生成物であり、遊離したアグリコンは全反応の生成物である。糖転移反応の全反応にしめる割合 (トランスグルコシレーション 比) は次式により得られる。
【００６５】
【数２】
2005253302.tif 000009
【００６６】
pNPGおよびPGを基質として遊離したグリコンとアグリコンをそれぞれ独立して測定した方法を示す。以下に示す濃度の基質および酵素、40 mM リン酸ナトリウムバッファー、0.02% BSAからなる反応液250 μlを37℃に10分間保持した。pNPG、PGの濃度はそれぞれ0.2-8、1-20 mMの範囲である。Wtcs およびD194CcsOXの濃度をpNPGでは0.784、384 nMとし、PGでは0.980、30.8 nM nMとした。反応液から100 μlずつとり、これをフェノールの定量のためには2 M Tris-HCl バッファー (pH7.0) 200 μl、p-ニトロフェノールの定量には1 M NaCO3 200 μl、グルコースの定量には4 M Tris-HCl バッファー (pH7.0) 50 μlとそれぞれ混合し反応を停止させた。それぞれ遊離したフェノール、p-ニトロフェノールおよびグルコースを前述の方法により定量した。
【００６７】
TLCによる糖転移反応の解析
イソマルトースに対する糖転移反応の基質濃度依存性を以下に示す方法によって調べた。2-20 mM イソマルトース (Wtcsでは20 mMのみ)、192 nM D194CcsOXあるいは19.6 nM Wtcs、および10 mM リン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) からなる反応液を37℃に30分間保持した。これを3分間煮沸して反応を停止させ、糖を15 μgずつTLCに供した。TLCを2-プロパノール: 1-ブタノール: H2O = 12 : 3 : 4の混合液により展開した。展開後、TLCプレートに5%硫酸エタノール溶液を噴霧し、加熱して糖を検出した。
【００６８】
次に受容体特異性を以下に示す方法にしたがって調査した。288 nM D194CcsOXあるいは11.8 nM Wtcs、5 mM PG、50 mM 受容体および10 mM リン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) からなる反応液を37℃に1時間保持した。受容体にグルコース、マンノース、ガラクトース、キシロース、フルクトース、フコース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、マルトース、セロビオース、サッカロース、ラクトース、グルシトール、マンニトールおよび2-デオキシグルコース用いた。反応液を3分間煮沸して反応を停止した後、このうち2μlをTLCに供した。TLCおよび糖の検出の条件は前述の通りである。
【００６９】
TLCによる基質特異性の解析
結合特異性明らかにするためにトレハロース、コージビオース、ニゲロース、マルトースおよびイソマルトースに対してD194CcsOXおよびWtcsを作用させ、反応の有無をTLCによって確認した。20 mM各基質、D194CcsOX 1920 nMあるいはWtcs 32.7 nM、および10 mM リン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) からなる反応液を37°Cに1時間保持し、3分間煮沸して反応を停止した。このうち2 μlをTLCに供した。TLCおよび糖の検出の条件は前述の通りである。
【００７０】
実験結果
１．求核残基をCysに置換した変異酵素のチオール基の酸化
Cysを含まない変異酵素Wtcsの生産と性質
活性部位に存在しない2残基のCys、C129およびC532をSerに置換した変異酵素Wtcsを調製した。求核残基をCysに置換した変異酵素を酸化した後、その酸化酵素の性質を明らかにする上で、他の部位におけるCysの酸化の影響を除外するためである。Wtcs発現プラスミドにより形質転換した大腸菌の培養液1 Lから、1回のNi-キレーティング・クロマトグラフィーにより20 mgの精製酵素を得た。Wtcsのイソマルトースに対する速度パラメーターを求めた。Kmは7.75 mM、kcatは422 s-1であり、野生型酵素のKm 9.35 mM、kcat 483 s-1とよく一致した。また両者の最適pHはともに6.1だった。したがってWtcsは野生型酵素と同様な性質を有することが明らかになった。これを以下のD194CcsのKIによる酸化実験では比較対照として用いた。
【００７１】
チオール基の酸化条件の検討
求核残基D194をCysに置換した変異酵素を作成した。本変異酵素でもWtcsと同様にC129およびC532をそれぞれSerに置換している。この変異酵素をD194Ccsとする。D194Ccs発現プラスミドにより形質転換した大腸菌の培養液2 LからWtcsと同様な精製法により精製酵素35 mgを得た。
【００７２】
チオール基の酸化をKIによって行った。まずチオール基の酸化に最適なKIの濃度を明らかにするために、0-0.3 MのKIでD194Ccsを処理した。対照としてWtcsを同様に処理した。その結果、D194CcsはKI濃度に依存して活性が上昇した (図 1)。0.3 MのKIにより処理したD194Ccsは未処理のD194Ccsの35倍の酵素活性を示した。一方Wtcsは0.2 Mまでの濃度のKIにはほとんど影響を受けず、0.3 M KIにより活性が減少した。このためWtcsの活性に影響を与えず、かつ活性の回復の度合いが高い0.2 Mを最適濃度とした。
【００７３】
次にD194Ccsのチオール基の酸化の経時変化を調べた (図 2)。対照としてWtcsを同様に処理した。活性は195 hまで上昇し、その後変化しなくなった。195 hで未処理の177倍の酵素活性を示した。この間Wtcsの酵素活性には変化はない。
本酸化処理における臭素の影響を調べた。KIによるチオール基の完全な酸化には酵素濃度の数倍程度の臭素を必要とすることが報告されているが [Fierobe, H. P., Mirgorodskaya, E., McGuire, K. A., Roepstorff, P., Svensson, B. & Clarke, A. J. (1998) Resto比n of catalytic activity beyond wild-type level in glucoamylase from Aspergillus awamori by oxidation of the Glu400→Cys catalytic-base mutant to cysteinesulfinic acid. Biochemistry 37, 3743-3752]、D194Ccsの場合は臭素により活性の回復が全く影響されなかった。
【００７４】
２．チオール基を酸化したD194Ccs (D194CcsOX) の性質
KI処理前後におけるD194Ccsのチオール基の定量
KI処理の前後のD194Ccsのチオール基をEllman試薬によって定量した。酸化前のD194Ccsでは1分子あたりのチオール基が1個と算出されたが、KIによる酸化処理後のD194CcsOXはEllman試薬と全く反応しなかった。したがって、D194CcsOXではチオール基が完全に酸化されていることが確認された。
【００７５】
D194CcsOXの基質特異性と各種基質に対する反応速度のWtcsとの比較
D194CcsOXの結合特異性をWtcsと比較することを目的に、トレハロース、kojibiose、ニゲロース、マルトースおよびイソマルトースに対してD194CcsOXおよびWtcsを作用させ、反応の有無をTLCによって確認した。その結果D194CcsOXはWtcsと同様に、イソマルトースのみに作用し、α-1,6-グルコシド結合に特異的であることが明らかになった。D194Ccsの速度パラメーターをイソマルトースに対しては加水分解、pNPGおよびPGに対しては糖転移として求めた (表4)。イソマルトース、pNPGおよびPGに対するKmはそれぞれ12.4、0.732、13.1 mM、kcatは11.3、0.594、40.2 s-1だった。
【００７６】
D194CcsOXとWtcsのpNPG、PGおよびイソマルトースに対する反応速度を8 mM pNPGおよび20 mM PGではそれぞれ基質の分解速度、イソマルトースでは反応効率 (kcat/Km) により比較した (表5)。D194CcsOXのpNPG、PGおよびイソマルトースに対する反応速度はWtcsよりも低く、それぞれ野生型酵素の0.34%、3.1%および1.7%だった。
【００７７】
【表４】
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【００７８】
【表５】
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【００７９】
D194CcsOXの糖転移活性
糖転移活性の基質濃度に対する依存性を調べた。すなわちアグリコンとグリコンをそれぞれ独立して測定することにより糖転移反応の全体の反応に占める割合 (トランスグルコシレーション 比) を求めた。
D194CcsOXはWtcsと同様に全ての濃度のpNPGおよびPGにおいてグルコースの遊離速度はアグリコンの遊離速度よりも低く、糖転移反応が起こっていることが示唆された (図3a-d)。D194CcsOXのpNPGおよびPGに対するトランスグルコシレーション 比はWtcsよりも高く、D194CcsOXはWtcsよりも高い糖転移活性を有していることが明らかになった (図3e、f)。両酵素のトランスグルコシレーション 比の差は特に低基質濃度において顕著だった。一方高基質濃度では、D194CcsOXは4 mM以上のpNPGおよびPGに対して95%以上のトランスグルコシレーション 比を示し、それ以上の基質濃度におけるトランスグルコシレーション 比はほぼ一定だった。Wtcsでは4 mM pNPGおよびPGに対するトランスグルコシレーション 比は 75%および55%であり、それ以上の基質濃度においてもトランスグルコシレーション 比は基質濃度に依存して増加した。
【００８０】
D194CcsOXは天然基質であるイソマルトオリゴサッカライドに対してもWtcsよりも高い糖転移活性を示した。D194CcsOXでは4 mM以上の基質濃度で顕著に糖転移反応生成物が認められた (図4)。この反応生成物はイソマルトオリゴサッカライド標品とのTLCにおける移動度の比較からイソマルトトリオースであると予想される。Wtcsでは20 mM イソマルトースに対する反応において、糖転移反応生成物がほとんど検出されていない。
【００８１】
D194CcsOXの糖転移反応における受容体特異性を各種糖を受容体、PGを供与体として調査した。D194CcsOXはグルコース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、マルトース、イソマルトース、スクーロス、グルシトール、2-デオキシグルコースを受容体とした。この時、二糖のほうが単糖より多くの転移生成物を生じ、受容体として優れていた。D194CcsOXはマンノース、ガラクトース、キシロース、フルクトース、フコース、セロビオース、ラクトース、マンニトールを受容体としなかった。Wtcsではトレハロース、コージビオース、ニゲロース、マルトース、イソマルトース、スクロースを受容体としたときのみわずかに糖転移生成物を検出した。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明のアノマー保持型糖加水分解酵素変異体はオリゴ糖の効率的合成に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】チオール基の酸化実験結果。
【図２】D194Ccsのチオール基の酸化の経時変化の実験結果。
【図３】糖転移反応の基質濃度依存性の実験結果。
【図４】D194CcsOXの糖転移活性の実験結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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