(57)【要約】【課題】本発明の目的は、L-スレオニンの生産方法を提供することである。【解決手段】metJ遺伝子が不活性化された染色体を持ち、L-スレオニンを生産する特性を持つ大腸菌（Escherichia coli）菌株、およびそれを利用したL-スレオニンの生産方法。本発明の大腸菌菌株によれば、metJ遺伝子が不活性化された染色体を持っているため、metL遺伝子産物によるスレオニン生合成関連遺伝子の発現が阻害されず、スレオニンを高濃度で生産できる。本発明のL-スレオニンの生産方法によれば、高効率で高濃度のL-スレオニンを生産できる。【選択図】図4
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
metJ遺伝子が不活性化された染色体を持ち、L-スレオニンを生産する特性を持つ大腸菌菌株。
【請求項２】
metJ遺伝子は挿入によって不活性化されたことを特徴とする、請求項1記載の大腸菌菌株。
【請求項３】
スレオニン類似体、リジン類似体、イソロイシン類似体、およびメチオニン類似体に対して耐性を示すことを特徴とする、請求項1記載の大腸菌菌株。
【請求項４】
大腸菌FTR1221（受託番号KCCM-10392）であることを特徴とする、請求項3記載の大腸菌菌株。
【請求項５】
（a）請求項1から4のいずれか一項記載の大腸菌菌株を培養する段階、および
（b）前記培養物からL-スレオニンを回収する段階
を含む、L-スレオニンを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はL-スレオニンを生産する大腸菌（Escherichia coli）菌株、およびそれを利用してL-スレオニンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
L-スレオニンは必須アミノ酸の一種であって飼料および食品添加剤として広く使われ、医薬用として水液剤、医薬品の合成原料としても使われる。
【０００３】
L-スレオニンは醗酵法で製造するが、大腸菌、コリネ型細菌、セラチア属細菌およびプロビデンシア属菌株の野生株から誘導された人工変異株を使用している。このような変異菌株としては、アミノ酸類似体および薬剤変異耐性株またはそれら耐性株にジアミノピメリン酸、メチオニン、リジンおよびイソロイシン栄養要求性を付与した人工変異株が公示されている。このような変異株は、たとえば、特許文献1および2、非特許文献1に開示されている。前記特許文献2にはメチオニン要求性、スレオニン類似体（AHV：α-アミノ-β-ヒドロキシ吉草酸）に対する耐性、リジン類似体（AEC：S-（2-アミノエチル）-L-システイン）に対する耐性、イソロイシン類似体（α-アミノ酪酸）に対する耐性、およびメチオニンの類似体（エチオニン）に対する耐性を持ち、L-スレオニンを生産する大腸菌TF4076（KFCC10718）を開示している。
【０００４】
遺伝子組換え菌株を利用した醗酵法としては、たとえば、セラチア属L-スレオニン生産菌から由来したアスパルトキナーゼ（aspartokinase）、ホモセリンキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼおよびスレオニンシンターゼの遺伝情報を含有したDNA切片を含む、組換え菌株を利用して多量のスレオニンを生産する方法（特許文献3参照）およびプロビデンシア属に属し、かつメチオニン代謝拮抗物質に耐性を持つ菌株から由来した遺伝子を組換えて生産性を高める方法（特許文献4参照）がある。
【０００５】
また、特定遺伝子の発現性を高めるための方法としては、1個の微生物が持つ遺伝子の数を増加させる方法があるが、そのために、通常微生物当りコピー数が高く維持されるプラスミドを使用する（非特許文献2参照）。すなわち、プラスミドに所望の遺伝子を挿入し、このような組換えプラスミドを再び微生物に形質転換させることによって、微生物当りのプラスミドのコピー数を増やす効果を期待できる。このような方法でスレオニンの生産性向上を試みて部分的な成功が報告されたことがある（特許文献5参照）。しかし、このようなプラスミドを利用した技術は多くの場合、特定遺伝子だけを過度に発現させることによって、宿主微生物に大きな負担を与え、培養中にプラスミドが消失してプラスミド安定性が低くなる問題点がある。
【０００６】
このような問題を解決するために培養液中に抗生剤を添加するか、発現の調節が可能なプラスミドを使用する方法が開発された（非特許文献3参照）。発現調節が可能なプラスミド使用する場合は、生長期には遺伝子の発現が起きない条件で培養して宿主微生物への負担を減らし、微生物が十分に成長した後に一時的に発現を誘導することによって目的物を得る方法に当る。しかし、このようなプラスミドの大部分は最終目的物が蛋白質である場合にのみ該当する。目的物が1次代謝産物である場合は、微生物の生長と密接な関連があるために生長期に目的遺伝子の発現の効果がなければ遺伝子発現による1次代謝産物の増加効果を期待し難い。1次代謝産物の一種であるスレオニンも同じ場合に該当するといえる。
【０００７】
したがって、このような短所を補完するための努力として、スレオニン生産のためにスレオニン生合成関連特定遺伝子を染色体DNA中に挿入する方法が利用された事例があった（特許文献6参照）。また、スレオニンオペロンのプロモータをタック（tac）プロモータに交替（特許文献7参照）するか、オペロンの発現調節部位を大腸菌λファージのλcIリプレッサーおよびPRプロモータに交替することによって、オペロンの発現を意図的に調節できる方法（特許文献8参照）によってスレオニンを生産する方法が公知である。しかし、この場合は、誘導性プロモータを持つ遺伝子を染色体に存在する同じ遺伝子と置換する方法を利用するためにスレオニンオペロン遺伝子の画期的な発現増加を期待し難かった。
【０００８】
これに対し、本発明者は前記のような従来のL-スレオニンの生産方法の問題点を解決するために、スレオニンおよびメチオニン生合成経路を調節する遺伝子の一つであるmetL遺伝子を抑制するmetJ遺伝子を不活性化させた染色体を持つ大腸菌が、L-スレオニンを高い収率で生産できるということを見つけ、本発明を完成するに至った。
【０００９】
【特許文献１】特開平2-219582号公報
【特許文献２】韓国公開特許第92-12423号公報
【特許文献３】特開平第5-10076号公報
【特許文献４】特開平第1-289493号公報
【特許文献５】米国特許第5,538,873号公報
【特許文献６】米国特許第5,939,307号公報
【特許文献７】国際公開公報第98／04715号
【特許文献８】欧州特許第0593792号公報
【非特許文献１】Appl.Microbiol.Biotechnol.、29、550〜553、1988
【非特許文献２】Sambrookら、Molecular cloning、第2版、1989、1.3〜1.5
【非特許文献３】Sambrookら、Molecular cloning、第2版、1989、1.5〜1.6、1.9〜1.11
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、高い効率でL-スレオニンを生産できる大腸菌を提供することである。
【００１１】
また、本発明の目的は、前記大腸菌を利用してL-スレオニンを効率的に生産できるL-スレオニン生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一態様によれば、metJ遺伝子が不活性化された染色体を持ち、L-スレオニンを生産する特性を持つ大腸菌菌株が提供される。
【００１３】
本発明のさらに他の一態様によれば、本発明の大腸菌菌株を培養する段階、および前記培養物からL-スレオニンを回収する段階を含むL-スレオニンを生産する方法が提供される。
【００１４】
本発明に係る大腸菌菌株においては、（1）metJ遺伝子が不活性化された染色体を持ち、L-スレオニンを生産する特性を持つことを特徴とする。
【００１５】
本発明に係る大腸菌菌株においては、（2）metJ遺伝子は挿入によって不活性化された、上記（1）記載の大腸菌菌株であることを特徴とする。
【００１６】
本発明に係る大腸菌菌株においては、（3）スレオニン類似体、リジン類似体、イソロイシン類似体、およびメチオニン類似体に対して耐性を示す、上記（1）記載の大腸菌菌株であることを特徴とする。
【００１７】
本発明に係る大腸菌菌株においては、（4）大腸菌FTR1221（受託番号KCCM-10392）である、上記（3）記載の大腸菌菌株であることを特徴とする。
【００１８】
本発明に係るL-スレオニンを生産する方法においては、（5）（a）上記（1）から（4）のいずれかに記載の大腸菌菌株を培養する段階、および（b）前記培養物からL-スレオニンを回収する段階を含む方法であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の大腸菌菌株によれば、metJ遺伝子が不活性化された染色体を持っているため、metL遺伝子産物によるスレオニン生合成関連遺伝子の発現が阻害されず、スレオニンを高濃度で生産できる。
【００２０】
本発明のL-スレオニンの生産方法によれば、高効率で高濃度のL-スレオニンを生産できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明はmetJ遺伝子が不活性化された染色体を持ってL-スレオニンを生産する特性を持つ大腸菌菌株を提供する。
【００２２】
本発明において、前記metJ遺伝子の不活性化はmetJ遺伝子の発現が全くまたはほとんど起きないだけでなく、発現されるとしても活性が全くまたはほとんどないことを意味する。前記不活性化は任意の突然変異によって誘導されうる。前記突然変異にはたとえば挿入、欠失、および逆位が含まれ、望ましくは挿入によってmetJ遺伝子が不活性化されることである。metJ遺伝子が挿入によって不活性化される場合、metJ遺伝子の全部または一部分が除去される部分に、抗生剤に抵抗性を付与する遺伝子（以下、「抗生剤マーカー」という）の挿入によって不活性化されることが望ましい。そのようにすることによって、metJ遺伝子が不活性化された菌株を選抜し、その選抜された菌株を培養するに当って、特定の抗生剤を選抜剤として使用できるために有利である。前記抗生剤マーカーはたとえば、kanr、tetrおよびamprなどが使われうるが、これに限定されるものではない。
【００２３】
前記metJ遺伝子の不活性化は、化学物質または光を利用して突然変異を誘発し、前記metJ遺伝子が不活性化された菌株を選抜するか、遺伝子組換え方法を利用して前記metJ遺伝子だけを特異的に不活性化させる方法によって行われうる。遺伝子組換え方法の例として、metJ遺伝子との相同性を持つ配列を一部分含み、不活性化されたmetJ遺伝子を含むDNA断片を宿主大腸菌に導入し、染色体内のmetJ遺伝子と相同組換えを誘発させた後、metJ遺伝子が不活性化された大腸菌菌株を選抜することによってなされうる。前記DNA断片は、たとえば、図2に示したΔmetJ：：loxpKanでありうる。
【００２４】
前記metJ遺伝子はスレオニンとメチオニンとの生合成に関連するmetL遺伝子の発現を抑制するmetJ蛋白質をコーディングする。metJ蛋白質は大腸菌のメチオニン生合成経路の調節蛋白質であって、S-アデノシルメチオニン（S-adenosylmethionine、SAM）と結合してスレオニン合成に関するmetL遺伝子の発現を抑制する。前記metL遺伝子は図4に示したように、thrAおよびlysCと共にアスパラギン酸キナーゼI、II、およびIIIをコーディングし、thrAと共にホモセリンデヒドロゲナーゼIおよびIIをコーディングする遺伝子である。したがって、本発明の大腸菌菌株はmetJ遺伝子を不活性化させてmetL遺伝子発現の抑制を解除し、metL遺伝子の発現を誘導することによってスレオニンの生合成をさらに促進させるものである。
【００２５】
本発明において、前記大腸菌菌株はスレオニン生産能を持つものである。前記菌株は望ましくは、スレオニン類似体、リジン類似体、イソロイシン類似体およびメチオニン類似体に対して耐性を示すことを特徴とする大腸菌菌株である。また、前記菌株には、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（以下、ppc遺伝子）のようなスレオニン生合成に関連する遺伝子が追加で含まれうる。望ましくは、大腸菌FTR1221（受託番号KCCM-10392）である。
【００２６】
前記大腸菌FTR1221（受託番号KCCM-10392）は、染色体DNA中にppc遺伝子およびスレオニンオペロンの数を2つに増加させた大腸菌pGmTN-PPC12（受託番号KCCM-10236）のmetJ遺伝子を不活性化させたものである。前記大腸菌pGmTN-PPC12（受託番号KCCM-10236）は、L-スレオニンの生産菌株である大腸菌TF4076（受託番号KFCC-10718）（特許文献2参照）の染色体からPCRを通じて得たppc遺伝子およびスレオニンオペロンを再び親菌株である大腸菌TF4076の染色体に挿入させて製造したものである。したがって、前記大腸菌pGmTN-PPC12菌株は、PEPからスレオニン生合成の前駆体であるオキサロ酢酸に転換する酵素であるppc遺伝子の発現量、およびオキサロ酢酸からスレオニンを合成する経路に関する遺伝子thrA、thrB、thrCの発現量が増加するにつれて、L-スレオニンの生産量が向上した特徴を持っている。このpGmTN-PPC12菌株は2000年12月29日付で韓国微生物保存センターに寄託した（受託番号KCCM-10236）。
【００２７】
本発明はまた、下記段階を含むL-スレオニンを生産する方法を提供する。
（a）前記metJ遺伝子が不活性化された染色体を持ち、L-スレオニンを生産する特性を持つ大腸菌菌株を培養する段階、および
（b）前記培養物からL-スレオニンを回収する段階。
【００２８】
段階（a）において、前記菌株の培養は、当業者に公知の大腸菌の培養に使われる通常的な培地および条件下で行われうる。前記培養方法は使われる菌株および培養の規模によって変わる。
【００２９】
段階（b）において、培養物からL-スレオニンを回収する段階は、当業者に公知の回収方法であればいずれも使用できる。たとえば、培養物から菌体を除去してイオン交換クロマトグラフィーおよび結晶化などの方法が使用できるが、これに限定されるものではない。
【００３０】
本発明の方法を例としてさらに詳細に説明すれば次の通りである。
【００３１】
1.組換えプラスミドの製作
スレオニン生産菌株から染色体DNAを抽出し、その染色体DNA鋳型を利用してmetJ遺伝子部分が含まれる切片を含む組換えプラスミドpT7Blue／metJを得る。使用できるクローニングベクターは特別に限定されないが、pT7Blueクローニングベクターを利用することが望ましい。
【００３２】
組換えプラスミドpT7Blue／metJにloxp部分を含むカナマイシン耐性遺伝子切片を挿入して組換えプラスミドpT7ΔmetJ：：loxpKanを作る。その結果、不活性化されたmetJ遺伝子を含む組換えプラスミドが得られる。
【００３３】
2.不活性化されたmetJ遺伝子を含むDNA断片の挿入および菌株選別
組換えプラスミドpT7ΔmetJ：：loxpKanを大腸菌に形質転換させ、プラスミドDNAを抽出して制限酵素を処理した後、電気泳動してDNA断片（ΔmetJ：：loxpKan）を得る（図3）。
【００３４】
この得られたDNA断片（ΔmetJ：：loxpKan）をスレオニン生産菌株に形質転換させ、相同性組換えによって天然metJ遺伝子部分を前記DNA切片（ΔmetJ：：loxpKan）に置換させる。
【００３５】
この形質転換体をカナマイシンが含まれた固体培地に塗抹してコロニーを選別することによって、最終的にmetJ遺伝子が不活性化された組換え菌株を選別できる。
【００３６】
このような組換え菌株は、生長を繰り返してもmetJの不活性化特性が永久保存され、親菌株と比較してスレオニン生産能が非常に優秀であることが分かった。
【００３７】
以下、実施例を通じて本発明をより具体的に説明する。しかし、本発明の範囲はそれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
組換えプラスミドの製造およびそれを利用したmetJ遺伝子破壊
QIAGEN Genomic-tipシステムを利用してスレオニン生産菌株pGmTN-PPC12（受託番号KCCM-10236）から染色体DNAを抽出し、この染色体DNA鋳型からPCRを利用してmetJ遺伝子のORFを含む切片約700bpを増幅させた。この時、使われたプライマーは配列番号：1および2であり、使われた反応液はPCR premix（Bioneer社製）であり、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で1分30秒の伸長を30回反復実行した。
【００３９】
このPCR結果物を1.0％アガロースゲルで電気泳動した後、所望の大きさのバンドを溶離して得、pT7Blueクローニングベクター（Novagen社製）に摂氏16℃で一晩ライゲーションさせた（図1）。このように得た組換えプラスミドpT7Blue／metJを大腸菌NM522に形質転換させ、カルベニシリンが含まれた（50mg／L）固体培地に塗抹して摂氏37℃で一晩培養した。
【００４０】
コロニーを爪楊枝によりカルベニシリンが含まれた液体培地3mLに接種して一晩培養した後、QIAGENミニプレップキット（mini prep kit）を利用してプラスミドDNAを抽出して大きさを確認し、制限酵素（Mlu I）でも処理した後、metJ遺伝子のクローニング如何を確認した。確認されたプラスミドDNA（pT7Blue／metJ）を制限酵素Mlu Iで処理した後、0.8％アガロースゲルから約3.6kb大きさのバンドを溶離してクレノウ（Klenow）酵素で処理し、平滑末端とした。プラスミドpUG6（Ulrichら、Nucleic Acids Research、1996、24、pp2519〜2524）で制限酵素Hinc II、EcoR Vで処理して得たloxp部分を含むカナマイシン耐性遺伝子切片（約1.7kb）と平滑末端連結反応を行って組換えプラスミドpT7ΔmetJ：：loxpKan（約5.3kb）を得た（図2）。
【実施例２】
【００４１】
不活性化されたmetJ遺伝子を含むDNA断片が染色体に挿入された菌株の選別
この組換えプラスミドpT7ΔmetJ：：loxpKanをNM522に形質転換させ、カルベニシリンおよびカナマイシン（それぞれ50mg／Lおよび25mg／L）が含まれた固体培地に塗抹して摂氏32℃で一晩培養した。コロニーを爪楊枝によりカルベニシリンおよびカナマイシンが含まれた液体培地3mLに接種して200rpmで一晩培養した後、QIAGENミニプレップキットを利用してプラスミドDNAを抽出した。プラスミドDNAを制限酵素で処理して期待されるDNAサイズを確認した後、このプラスミドDNAを制限酵素Pvu IIで処理した後、0.7％アガロースゲルで約2.4kb大きさのDNA切片（ΔmetJ：：loxpKan）を溶離した（図2）。このDNA切片（ΔmetJ：：loxpKan）をスレオニン生産菌株（pGmTN-PPC12）に形質転換させた後、カナマイシンが含まれた固体培地に塗抹してコロニーを選別することによって、最終的にmetJ遺伝子が不活性化された組換え菌株を選別した。
【実施例３】
【００４２】
選別菌株に対する三角フラスコでのスレオニン生産力価の比較実験
実施例2で抗生剤カナマイシンが含まれた固体培地に塗抹してコロニー30株を選別し、表1に表したスレオニン力価培地を使用して三角フラスコでスレオニン生産性を比較した。
【００４３】
（表１）スレオニン力価培地
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【００４４】
32℃のインキュベータでLB固体培地中に一晩培養した単一コロニーを、25mlの力価培地に1ループずつ接種して32℃で250rpmで48時間培養した。分析結果を表2に表した。表2に表したように、metJ遺伝子が破壊された組換え菌株は30株のうち25株で約24〜25g／L以上の成績を示した。一方、親菌株であるpGmTN-PPC12は培養液中に23g／Lを生産した。前記結果で現れたように、本発明の組換え菌株は親菌株と比較して優秀な成績を示した。
【００４５】
この結果に基づいて収率が親菌株対比最大約8％程度向上したことを観察し、最も高い収率向上を示した菌株を大腸菌FTR1221と命名し、その菌株を2002年6月25日付で韓国微生物保存センターに受託した（受託番号第KCCM-10392）。
【００４６】
（表２）組換え菌株のフラスコ力価試験結果
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【実施例４】
【００４７】
サザンブロット分析を利用したmetJ遺伝子の破壊確認実験
実施例2で選別した菌株のmetJ遺伝子が特異的に組換えられたかどうかを確認するためにサザンブロット分析を行った。親菌株であるpGmTN-PPC12および前記選別された大腸菌FTR1221（受託番号KCCM-10392）菌株をカナマイシンを含む3ml液体培地に200rpmで一晩培養した後、QIAGEN染色体キット20を利用して染色体DNAを分離した。このDNAを制限酵素Mlu Iを利用して一晩切断し、0.7％アガロースゲルで電気泳動してDNA切片の大きさにより分離した。電気泳動が終わったゲルを毛細管移動（Sambrookら、Molecular Cloning、vol 1、pp6.31〜6.38）法を利用して一晩DNAをナイロンメンブレン（YOUNG Sci.Biodyne B Membrane）に付着した。メンブレンを乾燥させた後、UV（120mJ／cm2、SpectroLinker（商標））を照射してDNAをメンブレンに固定させた。このメンブレンを摂氏55℃で2時間プレハイブリダイゼーション溶液I（Roche ＃1093657）でプレハイブリダイゼーションさせ、変性されたDNAプローブを入れた後、摂氏55℃に固定されたハイブリダイゼーションオーブン（BAMBINO 230300）中で一晩ハイブリダイゼーションさせた。
【００４８】
ここで使用したプローブは次のように調製した。QIAGENキットを利用して分離したプラスミドpUG6を制限酵素Hinc IIおよびEcoRVで処理してloxp部分を含むカナマイシン耐性遺伝子断片（約1.7kb）を得る。このDNA断片を摂氏100℃の沸騰水で5分間加熱した後、直ちに氷でまた5分間冷却させて単一鎖DNAを得る。このDNAをDIG（Digoxigenin）ラベル付きおよび検出キット（Roche ＃1093657）を使用して摂氏37℃で一晩反応させて、DIG-UDPが含まれたDNAプローブを製造した。
【００４９】
ハイブリダイゼーションが終われば洗浄溶液I、II（Roche ＃1093657）を利用してメンブレンに非特異的に付着されたDNAを除去した。プレハイブリダイゼーション2（Roche ＃1093657）を利用して常温で30分間メンブレンをマスキングした後、DIG-UTPに特異的に結合する抗DIG抗体を添加して常温で30分間反応させた。洗浄溶液III（Roche ＃1093657）を利用して非特異的にメンブレンに付着されている抗DIG抗体を除去し、標識および検出キット（Roche ＃1093657）を使用してバンドが現れるまで常温で発色反応させた。図3のような結果を得た。親菌株であるpGmTN-PPC12（レーン2）ではカナマイシン遺伝子がないためにいかなるバンドも現れなかった。一方、本研究で新しく選別された大腸菌FTR1221（受託番号KCCM-10392）菌株（レーン3）では予想通りに約1.3kb程度のバンドが現れた。これはmetJ遺伝子の一部である0.5kbとカナマイシン耐性遺伝子約0.8kbとを合わせて約1.3kbの大きさが得られた。レーン1はサイズマーカーである。
【実施例５】
【００５０】
醗酵槽を利用したスレオニン比較試験
実施例2で選別され、実施例4で遺伝子破壊が確認された大腸菌FTR1221（受託番号KCCM-10392）および親菌株pGmTN-PPC12を使用して、5L醗酵槽でスレオニン生産性を比較してみた。初期培地組成は表3に表した。種菌培養はLB培地にブドウ糖10g／LおよびL-メチオニンを0.1g／Lになるように添加した培地を使用し、醗酵槽の初期接種体積は初期培養体積の3％から5％で調整した。糖の追加は6回に分けて行い、追加した後のブドウ糖濃度を5％にし、追加時点はブドウ糖が枯渇された時点である。また、ブドウ糖を追加する時、燐酸二水素カリウム（KH2PO4）を重量基準で1％になるように共に添加した。初期の培養体積は1.5Lであり、最終体積は3.0Lであり、醗酵終了後に投入された総ブドウ糖の濃度は250g／Lである。攪拌速度は700〜1,000rpmにし、pHおよび温度はそれぞれ7.0および32℃に合せた。培養中にpHの調節は25％から28％のアンモニア水を使用した。また、通気量は0.5vvmに調整した。
【００５１】
実験結果を表4に表した。親菌株は93.5g／Lのスレオニンを生産して消費したブドウ糖に対して37.4％の収率を示した一方、大腸菌FTR1221は105g／Lのスレオニンを生産して42％の収率を示し、濃度および収率面で親菌株と比較して4.6％の優秀な成績向上を示した。
【００５２】
（表３）5リットル醗酵槽の初期培地組成
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【００５３】
（表４）組換え菌株の5リットル醗酵槽での醗酵成績
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【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明によるmetJ遺伝子が不活性化された染色体を持つ、L-スレオニンを生産する特性を持つ大腸菌菌株、およびそれを用いたL-スレオニンの生産方法は、L-スレオニンを高効率で生産するのに有効である。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】組換えプラスミドpT7Blue／metJ製作過程を示した図面である。
【図２】組換えプラスミドpT7ΔmetJ：：loxpKan製作過程およびΔmetJ：：loxpKan DNA切片製作過程を示した図面である。
【図３】FLA-5000映像処理システム（FUJIFILM）を利用してイメージスキャンしたサザンブロット分析結果であって、レーン1はサイズマーカーであり、レーン2は親菌株であるpGmTN-PPC12を示し、レーン3は大腸菌FTR1221（受託番号KCCM-10392）を示す図面である。
【図４】メチオニンおよびスレオニンの生合成経路を示したフローチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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