(57)【要約】【課題】  ＭＡＰキナーゼカスケードの研究やＭＡＰキナーゼをターゲットとした製薬や農薬の分野に有用な活性型ＭＡＰキナーゼを工業的にも十分に効率的に製造するための方法、当該ＭＡＰキナーゼを活性をもつに十分なほどにリン酸化する組換えＭＡＰＫＫおよび当該活性化ＭＡＰＫＫの製造方法を提供すること。【解決手段】  ＭＡＰキナーゼを高効率でリン酸化して活性型にする活性化ＭＡＰＫＫ、当該ＭＡＰＫＫの製造方法ならびに当該ＭＡＰＫＫを用いた活性型ＭＡＰＫの製造方法。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸化されたＭＡＰＫＫの立体構造をリン酸化されることなく保持することができるタンパク質との融合形態をとることを特徴とする活性化ＭＡＰＫＫ。
【請求項２】
ＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）との融合タンパク質であることを特徴とする請求項１記載の活性化ＭＡＰＫＫ。
【請求項３】
植物由来のＭＡＰＫとの融合タンパク質であることを特徴とする請求項１又は２記載の活性化ＭＡＰＫＫ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の活性化ＭＡＰＫＫの製造方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の活性化ＭＡＰＫＫを用いた活性型ＭＡＰＫの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え技術を用いた活性型ＭＡＰキナーゼの工業生産に用いるための新規ＭＡＰＫキナーゼ融合タンパク質、該タンパク質の発現用のベクター、および新規ＭＡＰＫキナーゼを用いたＭＡＰキナーゼの活性化方法と活性型ＭＡＰキナーゼの効率的製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＡＰキナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）カスケードは酵母から高等植物、人間までの真核生物に広く保存され、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）の３種類のプロテインキナーゼから構成されているシグナル伝達系である。当初は細胞増殖刺激により活性化されるシグナル伝達系として知られていたが、その後、細胞増殖のみならず、細胞分化、細胞死、細胞周期の制御、初期発生、体内時計の制御から記憶と学習まで、生物の生理現象のさまざまな局面において重要な機能を果たしていることが明らかになってきている。
【０００３】
すなわち、外界から増殖因子やストレスなどの刺激が来ると、最初にＭＡＰＫＫＫが活性化され、ＭＡＰＫＫをリン酸化して活性化する。活性化されたＭＡＰＫＫはＭＡＰＫをリン酸化して活性化する。そして活性化されたＭＡＰＫが転写因子などの標的タンパク質をリン酸化することで細胞内部（核）にシグナルを伝えていく。例えば、細胞増殖因子によってＭＡＰＫＫＫであるＲａｆ、ＭＡＰＫＫであるＭＥＫを通して活性化されＭＡＰＫの一つであるＥＲＫは核に移行され、さまざまな転写因子をリン酸化、種種の遺伝子群の転写を制御する。また、ＥＲＫは細胞の異常増殖である癌化にも関与する。ＥＲＫのＭＡＰＫＫであるＭＥＫの活性型変異体は細胞をトランスフォームし、逆にＭＥＫの優性不能型変異体はｒａｓ、ｒａｆなどの癌遺伝子による細胞のトランスフォームを抑制する。
【０００４】
ストレス応答のＭＡＰＫ情報伝達系の例としては、ｐ３８ファミリーのＭＡＰＫとその上流因子が知られている（ＭＡＰＫＫとしてはＭＫＫ３とＭＫＫ６、さらに上流のＭＡＰＫＫＫは多彩である）。例えばｐ３８ＭＡＰＫは、免疫系の細胞がリポ多糖（ＬＰＳ）に刺激された際にリン酸化、活性化されることが知られており、炎症性サイトカインの産生に関わっている。炎症性サイトカインの産生を抑制するＳＢ試薬（ＳＢ２０３５８０など）はｐ３８ＭＡＰＫに特異的阻害剤である。実際に特異性や効力を高めたｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を用いて、慢性関節リウマチやエンドトキシンショックに対する臨床治験が開始されている。さらに、高等植物においては、例えば、タバコのＭＡＰＫＫＫであるＮＰＫ１はＭＡＰＫＫであるＮＱＫ１、ＭＡＰＫであるＮＲＫ１（ＮＴＦ６）とシグナルを伝達して植物細胞分裂時の特に細胞質分裂に関与することが報告されている。
【０００５】
従来、活性型ＭＡＰキナーゼの工業生産には、生体内ではリン酸化ＭＡＰＫＫが働いているのでｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞の抽出物やそれを活性化するＭＡＰＫＫＫを同定した上でリン酸化し活性型を作るといった非常に手間のかかる方法をとっていた。これらの方法では手間がかかるばかりでなくその活性も十分なものが得られない、また、再現性がないなどの問題点があった。
【０００６】
その改良法として最近、ＭＡＰＫＫのリン酸化部位のセリン残基やスレオニン残基を酸性アミノ酸であるグルタミン酸やアスパラギン酸にかえた組換えタンパク質がＭＡＰＫをリン酸化し活性型にする方法が報告された。当該方法では、ＭＡＰＫＫのリン酸化部位のセリン残基やスレオニン残基を酸性アミノ酸であるグルタミン酸やアスパラギン酸に変えた組換えタンパク質を作製しこれを利用する方法が用いられている。
【０００７】
上記アミノ酸変換は、もっぱら遺伝子操作技術によって行われる。そこでは、目的のタンパク質の精製を容易にするために別のタンパク質との融合体にしたり、アミノ酸タグを付加させることがある。当該融合タンパク質としてはＧＳＴ融合タンパク質（例えば、特許文献１参照）等、アミノ酸タグとしてはＨｉｓタグタンパク質（例えば、特許文献２、３参照）等が例示される。
【０００８】
上記ＧＳＴとＭＡＰＫの融合タンパク質、例えばＧＳＴ−ＭＥＫ２がＭＡＰＫであるＥＲＫを活性化している例が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。前記融合タンパク質の場合、活性型ＭＡＰＫを調製するのにＧＳＴ−ＭＥＫ２が少なくとも２５０ｎｇ以上と、非常に大量のＭＡＰＫＫを使用する必要があり、活性化したＭＡＰＫＫとは言えないのが実状であった。事実、上記文献では、ＭＥＫ２の活性化方法を検討しており、組換えＭＥＫ２をＮＩＨ３Ｔ３細胞抽出液で処理することにより活性化している。
【０００９】
また、ＧＳＴとタバコのＭＡＰＫＫのＮＱＫ１の融合タンパク質が、リン酸化し活性化することが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。前記融合タンパク質においては、使用するタンパク量が５０ｎｇを使用している。しかしながら、この量が酸性アミノ酸に変えた組換えタンパク質に比較して十分に強い活性かどうか、つまり、産業上利用できるレベルであるかどうか不明である。また、上記融合タンパク質のＭＡＰＫに対する特異性についても不明である。
【００１０】
以上のように、上記方法のいずれもがそのＭＡＰＫＫタンパク質の活性化能が低く、効率的な工業生産ができないという問題点があった。さらに、目的のＭＡＰＫのみ特異的に活性化できるかどうかも不明であった。
【００１１】
【特許文献１】特公平６−８１５９６号
【特許文献２】日本特許第２１４０１８１号
【特許文献３】日本特許第２６８６０９０号
【非特許文献１】チェング（Ｚｈｅｎｇ，Ｃ．Ｆ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８，１１４３５（１９９３）
【非特許文献２】ソヤノ（Ｓｏｙａｎｏ，Ｔ．）ら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１７，１０５５−６７．（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、上記従来技術を鑑みて行われたものであり、ＭＡＰキナーゼカスケードの研究やＭＡＰキナーゼをターゲットとした製薬や農薬の分野に有用な活性型ＭＡＰキナーゼを工業的にも十分に効率的に製造するための方法、当該ＭＡＰキナーゼを活性をもつに十分なほどにリン酸化する組換えＭＡＰＫＫおよび当該活性化ＭＡＰＫＫの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意研究の結果、従来よりもＭＡＰキナーゼを高効率でリン酸化して活性型にする組換えタンパク質を見出した。さらに、当該タンパク質を用いて、従来のアミノ酸置換を行なった活性型ＭＡＰＫＫやＮａｔｉｖｅの活性を起こすために細胞抽出物などにより処理したＭＡＰＫＫに比較して、少量で高効率にターゲットのＭＡＰＫをリン酸化、活性化する方法を見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明の第１の発明は、リン酸化されたＭＡＰＫＫの立体構造をリン酸化されることなく保持することができるタンパク質との融合形態をとることを特徴とする活性化ＭＡＰＫＫに関する。
【００１５】
本発明の第１の発明において、ＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）との融合タンパク質であってもよく、植物由来のＭＡＰＫとの融合タンパク質であってもよい。
【００１６】
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明の活性化ＭＡＰＫＫの製造方法に関する。
【００１７】
本発明の第３の発明は、本発明の第１の発明の活性化ＭＡＰＫＫを用いた活性型ＭＡＰＫの製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により活性型ＭＡＰキナーゼが産業規模で効率よく生産、供給できることにより、細胞の癌化を抑制するターゲットとしてＭＡＰキナーゼの活性化現象をとらえることができることから、癌の抑制剤の開発研究、製造に有用である。さらに、本発明により産業規模で効率よく大量に植物の活性型のＭＡＰＫが生産、供給できることから、植物の細胞分裂の終結の細胞板形成のキー因子として活性型ＭＡＰキナーゼを大量に調製できることから、農薬の開発研究、製造に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本明細書においてＭＡＰＫＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ）とは、ＭＡＰＫＫＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ）によりリン酸化され、ＭＡＰＫをリン酸化することでシグナルを伝達するプロテインキナーゼのことを言う。
また、活性化ＭＡＰＫＫとは、ターゲットＭＡＰＫをリン酸化でき、その結果リン酸化（活性型）ＭＡＰＫがそのターゲットタンパク質をリン酸化できる状態にあるＭＡＰＫＫのことを言う。
【００２０】
本明細書において活性型ＭＡＰＫとは、活性化ＭＡＰＫＫによりリン酸化され、ターゲットの基質タンパク質をリン酸化することにより、シグナルを伝達するプロテインキナーゼのことを言う。
【００２１】
本明細書においてＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とは、細胞内では２量体としてはたらき、解毒作用などが知られているグルタチオン抱合酵素のことを言う。
【００２２】
以下に本発明について詳細に説明する。
（１）本発明の活性化ＭＡＰＫＫ
本発明の活性化ＭＡＰＫＫは、リン酸化された（活性化された）ＭＡＰＫＫの立体構造を保持するように機能する異種タンパク質との融合タンパク質である。すなわち、リン酸化された（活性化された）ＭＡＰＫＫの立体構造を保持できるタンパク質であればいずれのタンパク質も本発明に利用できる。当該タンパク質としては特に限定はされないが、例えばＧＳＴ等が好ましい。
また、本発明の活性化ＭＡＰＫＫにおいて、ＭＡＰＫＫは特に限定はされないが例えば、シロイヌナズナ由来のＭＡＰＫＫであるＡＮＱ１、タバコ由来のＭＡＰＫＫであるＮＱＫ１等が好適である。
当該タンパク質の融合形態については、特に限定はされないが、例えばｐＧＥＸ系のベクターを用いてＧＳＴに融合された形態で精製されたものが好ましい。また化学的に２つのタンパク質を結合させてもよい。
本発明の活性化ＭＡＰＫＫは、上記融合形態をとることにより、従来の活性化ＭＡＰＫＫに比較して同等、もしくはそれ以上の活性を有する。
さらに本発明の活性化ＭＡＰＫＫは、組換え体で製造後、さらにリン酸化処理をする必要がなく組換え体そのもので活性があることから容易に産業規模での活性型ＭＡＰＫの製造に使用することができる。
【００２３】
本発明の活性化ＭＡＰＫＫの一態様、シロイヌナズナの活性化ＭＡＰＫＫであるＧＳＴ−ＡＮＱ１は、従来の活性化方法であるＡＮＱ１のリン酸化部位のセリン、スレオニン残基を酸性アミノ酸であるアスパラギン酸に変換した組換えタンパク質Ｈｉｓ−Ｔ７−ＡＮＱ１：ＳＤＴＤの２倍以上のＭＡＰＫリン酸化活性を有することができる。さらに、融合タンパク質のＧＳＴ部分を利用することにより、本発明の活性化ＭＡＰＫＫを容易に精製することができる。すなわち、本発明のＧＳＴ−ＡＮＱ１は容易に精製可能であり、ＭＡＰＫＫＫを用いていちいちリン酸化する必要がなく、また、従来の組換え体を用いた活性化ＭＡＰＫＫよりも高活性であるので、直接、効率よく活性型ＭＡＰＫの製造に使用することができる。
【００２４】
さらに、本発明の活性化ＭＡＰＫＫの別態様、タバコの活性化ＭＡＰＫＫであるＧＳＴ−ＮＱＫ１についても従来の活性化方法であるＮＱＫ１のリン酸化部位のセリン、スレオニン残基を酸性アミノ酸であるグルタミン酸に変換した組換えタンパク質Ｈｉｓ−Ｔ７−ＮＱＫ１：ＳＥＴＥの１５倍以上のＭＡＰＫリン酸化活性を有することができる。さらに、融合タンパク質のＧＳＴ部分を利用することにより、本発明の活性化ＭＡＰＫＫを容易に精製することができる。すなわち、本発明のＧＳＴ−ＮＱＫ１は容易に精製可能であり、ＭＡＰＫＫＫを用いていちいちリン酸化する必要がなく、また、従来の組換え体を用いた活性化ＭＡＰＫＫよりも高活性であるので、直接、効率よく活性型ＭＡＰＫの製造に使用することができる。
【００２５】
（２）本発明の活性化ＭＡＰＫＫの製造方法
本発明の活性化ＭＡＰＫＫの製造方法は、ＭＡＰＫＫをリン酸化することなく、リン酸化ＭＡＰＫＫと同等以上の活性を有するように立体構造を変形・保持するような機能を示すタンパク質との融合形態をとるＭＡＰＫＫの製造方法に関する。
【００２６】
本発明の活性化ＭＡＰＫＫの製造方法としては、遺伝子工学的に融合タンパク質として製造する方法、リン酸化ＭＡＰＫＫと同等以上の活性を有するように立体構造を変形・保持するような機能を示すタンパク質とＭＡＰＫＫを化学的に結合させて製造する方法のいずれもが好適に使用できる。特に好ましくは、ＧＳＴとの融合タンパク質の形態で発現できるようなベクターに目的のＭＡＰＫＫ遺伝子を導入する方法が例示される。また、本発明においては、リン酸化ＭＡＰＫＫと同等以上の活性を有するように立体構造を変形・保持するような機能を示すタンパク質のレセプター、リガンドあるいは抗体を固定化したカラムを用いて精製することができる。
【００２７】
本発明の製造方法の一態様としては、シロイヌナズナの活性化ＭＡＰＫＫであるＧＳＴ−ＡＮＱ１の場合が例示される。すなわち、配列表の配列番号１記載の完全なコード領域を持ったＡＮＱ１  ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片は、市販のシロイヌナズナのｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ等の核酸増幅方法によって得ることができる。特に限定はされないが例えば組換えＭＡＰＫＫタンパク質は、Ｇｕａｎら、アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）  １９２（２）：２６２−２６７（１９９１）記載のＧＳＴ融合型タンパク質を発現するベクターであるｐＧＥＸ−ＫＧベクターに上記ｃＤＮＡ断片をクローニングし、組換えＧＳＴ融合タンパク質として得ることができる。当該融合タンパク質は、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャム社製）を用いたアフィニティカラムクロマトで容易に精製することができる。
【００２８】
本発明の製造方法の別の態様としては、タバコの活性化ＭＡＰＫＫであるＧＳＴ−ＮＱＫ１の場合が例示される。すなわち、配列表の配列番号５記載の完全なコード領域を持ったＮＱＫ１  ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片は、上記シロイヌナズナの場合と同様の方法で製造する事ができる。
【００２９】
本発明の製造方法は、ＭＡＰＫＫが活性化されるような融合タンパク質の形態をとることができる方法であればいずれの方法も好適に使用できる。上記方法によって特に限定はされないが、配列表の配列番号１３、１４記載の塩基配列、アミノ酸配列を有するＧＳＴ−ＮＱＫ１融合タンパク質、配列表の配列番号１５、１６記載の塩基配列、アミノ酸配列を有するＧＳＴ−ＡＮＱ１融合タンパク質が調製できる。
【００３０】
（３）本発明の活性化ＭＡＰＫＫを用いた活性型ＭＡＰＫの製造方法
本発明の活性型ＭＡＰＫの製造方法は、ＭＡＰＫＫＫによるリン酸化の工程を経ることなく活性型組換えＭＡＰＫＫを用いることにより、容易に、大量に活性型ＭＡＰＫを製造できるという特徴を有する。特に限定はされないが例えば、上記（１）記載の活性化ＭＡＰＫＫを用いることができる。また、ＭＡＰＫは、天然物あるいは人工物のいずれもが好適に使用できる。
本発明の方法は、ＭＡＰＫＫのリン酸化の工程を簡略化することができるため、低いコストで活性型ＭＡＰＫを製造することができる。
さらに、本発明の活性化ＭＡＰＫＫを固定化することにより、バイオリアクターとして利用することができる。
本発明の製造方法により、活性型ＭＡＰＫ、例えば活性型ＥＲＫ１、ＮＲＫ１、ＡＮＲ１等を工業レベルで製造することができる。
【００３１】
本発明の活性型ＭＡＰＫの製造方法の一態様として、シロイヌナズナの活性型ＭＡＰＫであるＡＮＲ１（＝ＡｔＭＰＫ４）の場合が例示される。当該活性型ＡＮＲ１は、本発明の活性化ＭＡＰＫＫであるＧＳＴ−ＡＮＱ１を用いることにより、工業レベルで調製、精製できる。まず、配列表の配列番号９記載の完全なコード領域を持ったシロイヌナズナのＭＡＰＫであるＡＮＲ１  ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片は、市販のシロイヌナズナのｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって得ることができる。当該ＡＮＲ１のアミノ酸配列を配列表の配列番号１０に示す。当該組換えＭＡＰＫタンパク質は、Ｈｉｓ−Ｔ７タグ融合型タンパク質を発現するベクターであるｐＥＴ−２８aベクターに上記ｃＤＮＡ断片をクローニングし、組換えＨｉｓ−Ｔ７タグ融合タンパク質として得ることができる。得られたＨｉｓタグ融合タンパク質は、ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰ（アマシャム製）を用いたアフィニティカラムクロマトで精製できる。また、上記ＭＡＰＫのみを常法により発現させたものを用いてもよい。
【００３２】
得られた融合タンパク質ＡＮＲ１は、活性化ＭＡＰＫＫであるＧＳＴ−ＡＮＱ１を用い、５０μＭ  ＡＴＰを含むキナーゼバッファー［４０ｍＭ  ヘペス／水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、２ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１５ｍＭ  塩化マグネシウム］で２５℃  ３０分反応することにより、リン酸化し活性型にすることができる。
【００３３】
また、本発明の活性型ＭＡＰＫの製造方法の別態様として、タバコの活性型ＭＡＰＫであるＮＲＫ１の場合が例示される。すなわち、配列表の配列番号１１記載の完全なコード領域を持ったタバコのＭＡＰＫであるＮＲＫ１  ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を、市販のタバコのｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって得、該ＤＮＡ断片を上記シロイヌナズナの場合と同様の方法で活性型ＮＲＫ１にすることができる。当該ＮＲＫ１のアミノ酸配列を配列表の配列番号１２に示す。
【００３４】
以上のように本発明の方法においてＭＡＰＫＫＫは必要としないし、ＭＡＰＫＫをリン酸化する必要もない。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３６】
実施例１  シロイヌナズナ活性化ＭＡＰＫＫ、ＧＳＴ−ＡＮＱ１の調製とＭＡＰＫのリン酸化
配列表の配列番号１に記載のシロイヌナズナ由来ＭＡＰＫＫであるＡＮＱ１をコードするＤＮＡ断片を調製した。すなわち、配列表の配列番号３及び４記載の塩基配列を有するＢａｍＨＩ−ＡＮＱ１プライマーとＮｏｔＩ−ＡＮＱ１プライマーをＤＮＡ合成機で合成した。上記プライマーを用いて市販のシロイヌナズナのｃＤＮＡ（ストラタジーン社製）を鋳型にして、ＡＮＱ１  ｃＤＮＡを増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）のＢａｍＨＩＮｏｔＩサイトにクローニングした。次にこのプラスミドをＮｏｔＩ（タカラバイオ社製）で処置した後、Ｋｌｅｎｏｗ断片（タカラバイオ社製）で処理し、更にＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で処理して、完全なコード領域を持ったＡＮＱ１  ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を調製した。当該ＡＮＱ１のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。
【００３７】
次にＧｕａｎら、アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）  １９２（２）：２６２−２６７（１９９１）記載のＧＳＴ融合型タンパク質を発現するベクターであるｐＧＥＸ−ＫＧベクターを調製し、該ベクターをＸｈｏＩ／Ｋｌｅｎｏｗ、ＢａｍＨ処理した。当該ベクター処理物に上記ＡＮＱ１  ｃＤＮＡ断片をクローニングした。
上記プラスミドで大腸菌ＤＨ１０Ｂを常法により形質転換し、組換えＧＳＴ融合タンパク質を得た。融合タンパク質は、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  （アマシャム製）を用いたアフィニティカラムクロマトで精製した。この組換えタンパク質は、ＧＳＴ−ＡＮＱ１と命名した。当該タンパク質をコードする塩基配列を配列表の配列番号１５にアミノ酸配列を配列番号１６に示す。
【００３８】
次に、対照となるキナーゼ不活性型タンパク質、つまり、ＧＳＴ−ＡＮＱ１のＡＴＰ結合部位のアミノ酸変異体を調製した。すなわち、ＰＣＲ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法を用いてＡＮＱ１の９９番目のアミノ酸であるリジンをトリプトファンに置換し発現できるように発現プラスミドを作製した。このプラスミドを用いて上記と同様に発現精製したキナーゼ不活性型タンパク質を調製した。この組換えタンパク質は、ＧＳＴ−ＡＮＱ１：ＫＷと命名した。
【００３９】
また、対照となるＨｉｓタグのついたＡＮＱ１を調製した。すなわち、上記で調製したｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ  ＳＫにクローニングしたＡＮＱ１をコードするＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ処理し、得られたＤＮＡ断片をＨｉｓタグ、Ｔ７タグ融合タンパク質を発現するベクターｐＥＴ−２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩサイトに導入した。
得られたプラスミドで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を常法により形質転換し、組換えＨｉｓ−Ｔ７タグタンパク質を得た。得られたＨｉｓタグ融合タンパク質は、ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰ（アマシャム製）を用いたアフィニティカラムクロマトで精製した。この組換えタンパク質は、Ｈｉｓ−Ｔ７−ＡＮＱ１と命名した。
【００４０】
上記と同様にＨｉｓ−Ｔ７−ＡＮＱ１のアミノ酸変異体をゴトウら、オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）  ９（７）、ｐ．１８９１−１８９８（１９９４）又はＢｒｕｎｅｔら、オンコジーン  ９（１１）、ｐ．３３７９−３３８７（１９９４）に記載の酸性アミノ酸へのアミノ酸置換法を用いてＡＮＱ１のリン酸化部位と考えられるＳ２２１とＴ２２７をアスパラギン酸に置換し発現した。この活性化タンパク質は、Ｈｉｓ−Ｔ７−ＡＮＱ１：ＳＤＴＤと命名した。
【００４１】
基質とするＭＡＰＫに関しては、配列表の配列番号１７及び１８記載の塩基配列を有するプライマーを用いて上記と同様にＰＣＲによるｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法を行い、配列表の配列番号１２記載のタバコのＭＡＰＫであるＮＲＫ１の６７番目のアミノ酸であるリジンをトリプトファンに置換し発現できるように発現プラスミドを調製し、発現精製した。このキナーゼ不活性型ＮＲＫ１  ＭＡＰキナーゼは、Ｈｉｓ−Ｔ７−ＮＲＫ１：ＫＷと命名した。
【００４２】
上記の組換えＭＡＰＫＫタンパク質（２５０ｎｇ）について、上記Ｈｉｓ−Ｔ７−ＮＲＫ１：ＫＷ  ２μｇを基質に、５０μＭ  ＡＴＰと１０μＣｉの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含む２０μｌのキナーゼバッファー［４０ｍＭ  ヘペス／水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、２ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１５ｍＭ  塩化マグネシウム］で２５℃  ３０分反応した。反応は、２０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥの２×サンプルバッファー（０．１２５Ｍ  トリス／塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）、１０％２−メルカプトエタノール、４％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．００４％ブロモフェノールブルー）を加えることで停止した。反応終了後のサンプルを１０％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＢＡＳ−１８００イメージアナライザー（富士フイルム社製）で活性検出した。その結果を図１に示す。
【００４３】
すなわち、図１は、ＢはＡの結果を相対活性で表しグラフ化しまとめたものであり、図中Ａの上のパネルがキナーゼ活性、下のパネルがＣＢＢで染色したＡＮＱ１タンパク質である。
図１に示したように本発明のＧＳＴ−ＡＮＱ１融合タンパク質は、従来のＨｉｓ−Ｔ７−ＡＮＱ１：ＳＤＴＤに比較して２倍以上の活性を持つことが確認できた。
【００４４】
実施例２  活性化ＭＡＰＫＫ、ＧＳＴ−ＡＮＱ１によるＭＡＰＫの活性化とその特異性
実施例１で調製した組換え活性化ＭＡＰＫＫタンパク質ＧＳＴ−ＡＮＱ１（ＷＴ）５０ｎｇと不活性型タンパク質ＧＳＴ−ＡＮＱ１：ＫＷ５０ｎｇについて、実施例１と同様に組換えＨｉｓタグ融合タンパク質の形で大腸菌で発現精製したアラビドプシスの各種ＭＡＰＫ（ＮＲＫ１：ＫＷ、ＮＲＫ１並びにＡｔＭＰＫ１、４、５、６、１１、１３それぞれ１００ｎｇ）に対する特異性を検討した。
ＮＲＫ１は、配列表の配列番号１７及び１８記載の塩基配列を有するプライマーを用いて実施例１と同様にＰＣＲ法によりタバコｃＤＮＡライブラリーから増幅し発現精製した。また、ＡｔＭＰＫ４は、配列表の配列番号１９及び２０記載の塩基配列を有するプライマーを用いて実施例１と同様にＰＣＲ法によりシロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーから増幅し発現精製した。当該ＡｔＭＰＫ４（＝ＡＮＲ１）の塩基配列、アミノ酸配列を配列表の配列番号９、１０に示す。さらに、ＡｔＭＰＫ１、５、６、１１、１３は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号、ＮＭ＿１００８９５、ＮＭ＿１１７２０４、ＮＭ＿１２９９４１、ＮＭ＿１０００３８、ＮＭ＿１００６６２の配列の完全なコード領域を持ったシロイヌナズナのＭＡＰＫの配列をもとに設計したプライマーを用いて実施例１と同様にＰＣＲ法によりシロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーから増幅し発現精製した。
本実施例においては実施例１の活性測定法と同様にして検出した。その結果を図２に示す。
【００４５】
すなわち、図２は、ＡＮＱ１のアラビドプシスのどのＭＡＰＫをリン酸化するかを示したものであり、図２の上のパネルが、キナーゼ活性を検出した結果、下のパネルは、Ｔ７抗体で検出した組み換えＭＡＰＫタンパク質を示しており泳動量を比較できる。
【００４６】
図２に示したようにＧＳＴ−ＡＮＱ１は、アラビドプシスのＭＡＰＫの中ではＨｉｓ−Ｔ７−標識したＡｔＭＰＫ４（＝ＡＮＲ１）を特異的にリン酸化することが分かった。
この特異性は、Ｈｉｓ−Ｔ７−ＡＮＱ１：ＳＤＴＤでも同様な結果であった。
従って、ＧＳＴ融合型にした場合でも特異性が保たれていることから、ＡＮＱ１タンパク質の基質タンパク質に対する生化学的性質が保たれていることが確認できた。このことから、活性化型ＭＡＰＫを作成するｔｏｏｌとしてＧＳＴ融合型を用いることができることを確認した。
【００４７】
実施例３  タバコ活性化ＭＡＰＫＫであるＧＳＴ−ＮＱＫ１の調製とＭＡＰキナーゼのリン酸化
配列表の配列番号５記載のタバコのＭＡＰＫＫであるＮＱＫ１をコードするＤＮＡ断片をすなわち、配列表の配列番号７及び８記載の塩基配列を有するＢａｍＨＩ−ＮＱＫ１プライマーとＮｏｔＩ−ＮＱＫ１プライマーをＤＮＡ合成機で合成した。上記プライマーを用いて市販のタバコのｃＤＮＡライブラリー（ストラタジーン社製）を鋳型にして、ＮＱＫ１  ｃＤＮＡを増幅し、ｐＥＴ２８ａ（ノバジェン社製）のＢａｍＨＩＮｏｔＩサイトにクローニングした。次にこのプラスミドをＮｏｔＩ（タカラバイオ社製）で処置した後、Ｋｌｅｎｏｗ断片（タカラバイオ社製）で処理し、更にＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で処理して、完全なコード領域を持ったＮＱＫ１  ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を調製した。当該ＮＱＫ１のアミノ酸配列を配列表の配列番号６に示す。
【００４８】
次に実施例１と同様にＧＳＴ融合型タンパク質を発現するベクターであるｐＧＥＸ−ＫＧベクターを調製し、該ベクターをＸｈｏＩ／Ｋｌｅｎｏｗ、ＢａｍＨ処理した。当該ベクター処理物に上記ＮＱＫ１  ｃＤＮＡ断片をクローニングした。
上記プラスミドで大腸菌ＤＨ１０Ｂを常法により形質転換し、組換えＧＳＴ融合タンパク質を得た。融合タンパク質は、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  （アマシャム製）を用いたアフィニティカラムクロマトで精製した。この組換えタンパク質をＧＳＴ−ＮＱＫ１と命名した。当該タンパク質をコードする塩基配列を配列表の配列番号１３にアミノ酸配列を配列番号１４に示す。
【００４９】
また、上記のＮＱＫ１  ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片をＨｉｓタグ、Ｔ７タグ融合タンパク質を発現するベクターｐＥＴ−２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩサイトに導入した。
得られたプラスミドで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を常法により形質転換し、組換えＨｉｓ−Ｔ７タグタンパク質を得た。組換えタンパク質の精製方法は、実施例１記載の方法を用いた。精製した組換えタンパク質は、Ｈｉｓ−Ｔ７−ＮＱＫ１と命名した。
【００５０】
次に実施例１記載の変異導入方法を用いてＮＱＫ１の９８番目のアミノ酸であるリジンをトリプトファンに置換し発現できるように発現プラスミドを作製した。このプラスミドを用いて上記と同様に発現精製したキナーゼ不活性型タンパク質を調製した。得られたタンパク質は、Ｈｉｓ−Ｔ７−ＮＱＫ１：ＫＷと命名した。
【００５１】
同様の変異導入法を用いてＮＱＫ１のリン酸化部位であるＳ２１９とＴ２２５をグルタミン酸に置換し発現できるように発現精製した。当該活性化型タンパク質は、Ｈｉｓ−Ｔ７−ＮＱＫ１：ＳＥＴＥと命名した。
【００５２】
これらの上記組換えタンパク質のそれぞれ５０ｎｇについて、実施例１に示したＨｉｓ−Ｔ７−ＮＲＫ１：ＫＷ  ２５０μｇを基質にして実施例１と同様にしてリン酸化活性を検出した。その結果を図３に示す。
【００５３】
すなわち、図３は、ＧＳＴ−ＮＱＫ１と各種ＮＱＫ１の相対活性を示すものであり、図中、上のパネルはキナーゼ活性を表し、相対活性は下に数字で示した。図中下のパネルはＮＱＫ１抗体で検出した各種ＮＱＫ１タンパク質である。
【００５４】
図３に示したようにＧＳＴ−ＮＱＫ１は、Ｈｉｓ−Ｔ７−ＮＱＫ１の５７倍以上の活性、Ｈｉｓ−Ｔ７−ＮＱＫ１：ＳＥＴＥの１５倍以上の活性を持つことが確認できた。
また、ＧＳＴ−ＮＱＫ１のリン酸化部位をグルタミン酸に置換したＧＳＴ−ＮＱＫ１：ＳＥＴＥの活性は、ＧＳＴ−ＮＱＫ１と同程度であることが確認できた。このことから、ＧＳＴ−ＮＱＫ１はこれ以上活性化できない十分な活性化型であることが確認できた。
【００５５】
実施例４    活性化ＭＡＰＫＫであるＧＳＴ−ＮＱＫ１によるＭＡＰＫの活性化とその特異性
実施例３と同様に作成した組換えタンパク質ＧＳＴ−ＮＱＫ１（５０ｎｇ）を用いて、基質として、実施例３と同様に組換えＨｉｓタグ融合タンパク質の形で大腸菌で発現精製したタバコの各種ＭＡＰＫ（ＮＲＫ１、ＮＴＦ３、４、ＷＩＰＫ、ＳＩＰＫいずれも２５０μｇ）に対する特異性について検討した。
上記ＮＴＦ３、４、ＷＩＰＫ、ＳＩＰＫは、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号、Ｘ６９９７１、Ｘ８３８８０、Ｄ６１３７７、Ｕ９４１９２の配列の完全なコード領域を持ったタバコのＭＡＰＫの配列をもとに設計したプライマーを用いて実施例１と同様にＰＣＲ法によりタバコｃＤＮＡライブラリーから増幅し発現精製した。
本実施例においては実施例１の活性測定法と同様にして検出した。その結果を図４に示す。
【００５６】
すなわち図４は、ＮＱＫ１のタバコのどのＭＡＰＫをリン酸化するかを示すものであり、図中、上のパネルが、キナーゼ活性を示し、中央のパネルは、Ｔ７抗体で検出した組み換えＭＡＰＫタンパク質を示しておりＭＡＰＫタンパク質量を比較でき、下のパネルはＮＱＫ１抗体で検出した組換えＮＱＫ１タンパク質を示しておりＮＱＫ１量を比較できる。
【００５７】
図４に示したようにＧＳＴ−ＮＱＫ１は、Ｈｉｓ−Ｔ７−標識したＮＲＫ１（ＮＴＦ６）を特異的にリン酸化することが確認できた。
また、Ｈｉｓ−Ｔ７−標識したＮＲＫ１のＷＴの２つのバンドは、ともにリン酸化されてシフトしたバンドを示している。すなわち、ＮＲＫ１がＮＱＫ１によってリン酸化され、中程度のバンドシフトが起きる。このリン酸化ＮＲＫ１は、図の下側のバンドである。さらにリン酸化されたＮＲＫ１が自己リン酸化によってシフトしたものが、図の上側のバンドに相当することが確認できた。
【００５８】
実施例５  ｉｎ  ｇｅｌアッセイを用いたＭＡＰＫの活性化の検討
実施例１と同様に作成した組換えタンパク質ＧＳＴ−ＡＮＱ１（５０ｎｇ）を用いて、実施例１と同様に組換えＨｉｓタグ融合タンパク質の形で大腸菌を用いて発現精製したシロイヌナズナの各種ＭＡＰＫ（ＡｔＭＰＫ４、６及び１３いずれも２５０ｎｇ）を基質として、５０μＭ  ＡＴＰを含む２０μｌのキナーゼバッファーで２５℃  ３０分反応した。
【００５９】
反応停止は実施例１と同様にした。さらに分析方法については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥをゲルに１ｍｇ／ｍｌのＭＢＰ（シグマアルドリッチ社製）を含むものと含まないもので行う以外は実施例１と同様にした。
【００６０】
電気泳動後、ゲルを２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）２−プロパノール、５０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む溶液で洗い、次に５０ｍＭ  トリス／塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含む溶液（バッファーＣ）で洗うことによりＳＤＳを除いた。
次にゲルを、６Ｍ  グアニジン塩酸塩を含むバッファーＣで１時間、０．０４％Ｔｗｅｅｎ  ４０を含むバッファーＣで４℃  １６時間処理した後、室温で１時間、リン酸化酵素反応バッファー［４０ｍＭ  ヘペス／水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、２ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１５ｍＭ  塩化マグネシウム、２５μＭ  ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（１．８ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）］中でインキュベートした。
【００６１】
反応後のゲルは、反応停止液（５％トリクロロ酢酸、１％ピロリン酸）で洗い乾燥した後、ＸＡＲ−５フィルム（コダック社製）を用いてオートラジオグラフィーを行った。その結果を図５に示す。
【００６２】
すなわち、図５はゲルのオートラジオグラフの結果であり、上のパネルはＭＢＰありのゲル、中央のパネルはＭＢＰなしのゲルの結果を示す。下のパネルは常法によりＴ７抗体を用いて各組換えタンパク質を検出したものである。
【００６３】
図５に示したように、ＧＳＴ−ＡＮＱ１によりＡｔＭＰＫ４（＝ＡＮＲ１）ＭＡＰキナーゼのみがリン酸化され（実施例２参照）、その結果活性型のＡｔＭＰＫ４（＝ＡＮＲ１）ＭＡＰキナーゼとなり、ＭＢＰをリン酸化したことが示された。従って、ＧＳＴ−ＡＮＱ１は活性型のＭＡＰキナーゼを作る能力をもつことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明により活性型ＭＡＰキナーゼが産業規模で効率よく生産、供給できる方法が提供される。また、本発明により、細胞の癌化を抑制するターゲットとしてＭＡＰキナーゼの活性化現象をとらえる観点から癌の抑制剤の開発研究、製造に有用である。さらに、本発明により植物の細胞分裂の終結の細胞板形成のキー因子として活性型ＭＡＰキナーゼを大量に調製できることから、農薬の開発研究、製造に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の活性化ＭＡＰＫＫの活性に関する結果を示す。
【図２】本発明の活性化ＭＡＰＫＫの特異性に関する結果を示す。
【図３】本発明の活性化ＭＡＰＫＫの活性に関する結果を示す。
【図４】本発明の活性化ＭＡＰＫＫの特異性に関する結果を示す。
【図５】本発明の活性化ＭＡＰＫＫを用いた活性型ＭＡＰＫの調製結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００６６】
SEQ ID NO:1; A nucleic acid sequence encoding Arabidopsis thaliana MAPKK
SEQ ID NO:2; An amino acid sequence of Arabidopsis thaliana MAPKK
SEQ ID NO:3; PCR primer BamHI-ANQ1 to amplify a DNA fragment encoding Arabidopsis thaliana MAPKK
SEQ ID NO:4; PCR primer NotI-ANQ1 to amplify a DNA fragment encoding Arabidopsis thaliana MAPKK
SEQ ID NO:5; A nucleic acid sequence encoding Nicotiana tabacum MAPKK
SEQ ID NO:6; An amino acid sequence of Nicotiana tabacum MAPKK 
SEQ ID NO:7; PCR primer BamHI-NQK1 to amplify a DNA fragment encoding Nicotiana tabacum MAPKK
SEQ ID NO:8; PCR primer NotI-NQK1 to amplify a DNA fragment encoding Nicotiana tabacum MAPKK
SEQ ID NO:9; A nucleic acid sequence encoding Arabidopsis thaliana MAPK
SEQ ID NO:10; An amino acid sequence of Arabidopsis thaliana MAPK
SEQ ID NO:11; A nucleic acid sequence encoding Nicotiana tabacum MAPK
SEQ ID NO:12; An amino acid sequence of Nicotiana tabacum MAPK
SEQ ID NO:13; A nucleic acid sequence encoding GST-NQK1 fusion protein
SEQ ID NO:14; An amino acid sequence encoding GST-NQK1 fusion protein
SEQ ID NO:15; A nucleic acid sequence encoding GST-ANQ1 fusion protein
SEQ ID NO:16; An amino acid sequence encoding GST-ANQ1 fusion protein
SEQ ID NO:17; PCR primer to amplify a DNA fragment encoding Nicotiana tabacum MAPK
SEQ ID NO:18; PCR primer to amplify a DNA fragment encoding Nicotiana tabacum MAPK
SEQ ID NO:19; PCR primer to amplify a DNA fragment encoding Arabidopsis thaliana MAPK
SEQ ID NO:20; PCR primer to amplify a DNA fragment encoding Arabidopsis thaliana MAPK
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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