(57)【要約】【目的】  抗癌剤タキソール（Taxol）に対する感受性固形癌細胞を簡便かつ高精度に判定することのできる方法を提供する。【構成】  固形癌細胞のcyclin B1遺伝子発現を測定し、タキソール非感受性固形癌細胞よりもcyclin B1遺伝子発現の多い細胞をタキソール感受性細胞と判定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固形癌細胞が抗癌剤タキソール感受性であるか否かを判定する方法であって、固形癌細胞のcyclin B1遺伝子発現を測定し、タキソール非感受性固形癌細胞よりもcyclin B1遺伝子発現の多い細胞をタキソール感受性細胞と判定することを特徴とする方法。
【請求項２】
固形癌細胞が胃癌細胞である請求項１の方法。
【請求項３】
抗癌剤タキソールによる固形癌治療に先だって投与される薬剤であって、cyclin B1をコードするポリヌクレオチドが固形癌細胞内で発現可能な形態を有する薬剤。
【請求項４】
請求項３の薬剤を患者に投与して固形癌細胞にcyclin B1タンパク質を発現させ、次いで抗癌剤タキソールの有効投与量を患者に投与することを特徴とする固形癌治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、抗癌剤タキソール感受性固形癌細胞の判定方法と、固形癌治療方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌の一般的な治療法の１つに化学療法があり、各種の抗癌剤投与が行われている。しかしながら癌の種類や患者個々人の差により有効な抗癌剤は異なり、もし効かない抗癌剤を投与した場合は抗癌剤の副作用により患者の体力が低下し、次に有効な別の抗癌剤を投与しても十分な効力を発揮できない恐れがある。従って、投与前に有効な抗癌剤を正確に特定する手段が求められている。
【０００３】
従来、癌に対する抗癌剤の感受性検査としては、患者から単離した癌細胞に様々な抗癌剤を接触させ、癌細胞の増殖抑制等を指標としてその癌細胞に有効と思われる抗癌剤を特性する方法が採用されてきた。しかしながら、このような従来技術では、検査結果と臨床治療効果が必ずしも一致しないという問題があり、また多くの抗癌剤を試験するためには大量の癌細胞が必要となり、患者に多くの負担をかけるといった不都合も存在した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この出願の発明は、前記従来技術の問題点に鑑みてなされたものであって、抗癌剤タキソール（Taxol）に対する感受性固形癌細胞を簡便かつ高精度に判定することのできる方法を提供することを課題としている。
【０００５】
またこの出願は、タキソール非感受性の固形癌細胞に対して、タキソールによる有効な治療を可能とする治療方法と、その際にタキソールと併用する薬剤を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この出願は、前記の課題を解決するための第１の発明として、固形癌細胞が抗癌剤タキソール感受性であるか否かを判定する方法であって、固形癌細胞のcyclin B1遺伝子発現を測定し、タキソール非感受性固形癌細胞よりもcyclin B1遺伝子発現の多い細胞をタキソール感受性細胞と判定することを特徴とする方法を提供する。
【０００７】
またこの出願は、第２の発明として、抗癌剤タキソールによる固形癌治療に先だって投与される薬剤であって、cyclin B1をコードするポリヌクレオチドが固形癌細胞内で発現可能な形態を有する薬剤を提供する。
【０００８】
さらにこの出願は、第３の発明として、前記第２発明の薬剤を患者に投与して固形癌細胞にcyclin B1タンパク質を発現させ、次いで抗癌剤タキソールの有効投与量を患者に投与することを特徴とする固形癌治療方法を提供する。
【０００９】
すなわちこの出願の発明者らは、後記実施例に示すような以下の知見を得た。
(１)タキソール感受性の固形癌細胞（胃癌細胞）のcyclin B1発現には有意に高い相関関係が存在する。
(２)タキソール非感受性の胃癌細胞にcyclin B1を過剰発現させると、その細胞はタキソール感受性となる。
(３)タキソール感受性の胃癌細胞のcyclin B1遺伝子を発現抑制すると、その細胞はタキソール非感受性となる。
(４)マウスに移植した胃癌細胞でcyclin B1遺伝子を過剰発現させた後にタキソールをマウスに投与すると、移植癌細胞のサイズは有意に縮小する。
【００１０】
この出願の発明は、以上のとおりの新規な知見に基づくものである。
【００１１】
なお、この出願の発明における「固形癌」とは、浮遊癌（腹水癌、胸水癌等）以外の癌を意味し、具体的には、食道癌、胃癌、肺癌、腎癌、甲状腺癌、耳下腺癌、頭頚部癌、骨・軟部肉腫、尿管癌、膀胱癌、子宮癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、卵管癌等を言う。
【００１２】
また、この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、この発明の治療方法等に使用可能な薬剤の調製はRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。
【発明の効果】
【００１３】
この出願の第１の発明によれば、タキソールによる抗癌治療の前に、その固形癌細胞（特に胃癌細胞）がタキソール感受性か否かを簡便かつ正確に判定することができるため、より効果的な固形癌治療が可能となる。
【００１４】
またこの出願の第３発明の方法によれば、タキソール非感受性の固形癌に対してもタキソールを効果的に作用させることが可能となり、抗癌作用に優れたタキソールを広範な固形癌に適用することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
第１発明の方法は、固形癌細胞のcyclin B1遺伝子発現を測定し、タキソール非感受性固形癌細胞よりもcyclin B1遺伝子発現の多い細胞をタキソール感受性細胞と判定することを特徴とする。
【００１６】
すなわち、タキソール非感受性固形癌細胞のcyclin B1遺伝子発現レベルを事前に測定し、この発現レベルよりも１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらにより好ましくは２０％以上、最も好ましくは３０％以上のcyclin B1遺伝子発現レベルを示す固形癌細胞をタキソール感受性の固形癌細胞と判定する。
【００１７】
cyclin B1遺伝子の発現レベルは、当該技術分野で一般的に行われている様々な方法で簡便かつ高精度に測定することができる。例えば、被験細胞から単離したRNAを鋳型とするPCR（Polymerase Chain Reaction）法によって定量する方法、被験細胞から単離したRNAから合成した標識cDNAをDNAマイクロアレイによって定量する方法、cyclin B1タンパク質に対する抗体を用いたウェスタンブロット分析法や免疫測定法（例えばELISA法）等である。これらの測定方法に使用する材料、例えばPCR法に使用するプライマーやDNAマイクロアレイのプローブは、公知のcyclin B1遺伝子（cDNA）配列（GenBank/NM_031966）等に基づいて設計し、公知の方法によって化学合成することができる。cyclin B1タンパク質に対する抗体は、市販の抗cyclin B1モノクローナル抗体（sc-245、Santa Cruz社製）を使用することができる。また公知のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体作成法によって作成することもできる。
【００１８】
以上のとおりの第１発明の方法によって、タキソールによる抗癌治療の前に、その固形癌細胞（特に胃癌細胞）がタキソール感受性か否かを簡便かつ正確に判定することができるため、より効果的な固形癌治療が可能となる。また、この第１発明の方法によってタキソール非感受性の固形癌と判定された患者に対しても、第２発明の薬剤を用いた第３発明の治療法によって、タキソールによる抗癌治療が可能となる。
【００１９】
第２発明の薬剤は、cyclin B1をコードするポリヌクレオチドが固形癌細胞内で発現可能な形態を有する薬剤である。このような薬剤は、例えば、cyclin B1 cDNA（GenBank/NM_031966）またはそのコード領域（ORF領域）に相当するポリヌクレオチドを「むき出し（naked）DNA」として（例えば、米国特許第5,580,859号参照）、あるいは組換えウイルスベクターの形態で製剤化される。そして、この薬剤は、癌患者の固形癌組織に局所的に投与することを含め、どのような投与経路によっても投与することが可能である。
【００２０】
ウイルスベクターとしては、バキョロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、またはピコルナウイルス科から選ばれるウイルスのゲノムに由来するものとすることができる。各々の親ベクターの都合のよい長所を利用したキメラベクターもまた用いることができる（例えば、Feng（1997）Nature Biotechnology 15:866-870参照）。このようなウイルスゲノムは、複製欠損性か、条件により複製するか、または複製コンピテントとなるべくさらに加工されてもよい。別の態様においては、ベクターはアデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルスゲノムに由来する複製非コンピテントベクター、例えば米国特許第6,096,718号；6,110,458号；6,113,913号；5,631,236号参照）；アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスゲノムに由来するベクターである。レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（MuLV）、テナガザル白血病ウイルス（GaLV）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、およびそれらの組合せを主成分とするものが含まれる（例えば、米国特許第6,117,681号；6,107,478号; 5,658,775号; 5,449,614号；Buchscher（1992）J. Virol. 66:2731-2739; Johann（1992）J. Virol. 66:1635-1640参照）。これらのウイルスベクターと、cyclin B1ポリヌクレオチドを組込んだコスミドとを細胞に導入し、細胞内で相同組換えすることによって、第２発明の薬剤を調製することができる。
【００２１】
そして、第３発明の治療方法においては、タキソール非感受性の固形癌と判定された患者に対して、第２発明の薬剤を事前に投与して固形癌細胞にcyclin B1遺伝子を過剰発現させる。これによって固形癌細胞はタキソール感受性に形質転換し、その後のタキソール処理によって有効な抗癌治療が可能となる。
【００２２】
以下、実施例として、この出願の発明の基礎となった実験的知見を説明する。ここで説明する実験には、この出願の発明に関する実施例が含まれるが、この出願の発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
（1）材料および方法
（1-1）細胞培養
ヒト胎児腎細胞である293細胞(HEK-293、CRL-1573)およびヒト胃癌細胞AGS(CRL-1739)はAmerican type culture collection(ATCC)より入手した。AZ521細胞(TKG0185)は東北大・加齢医学研究所より、GCIY、GT3KBおよびHGC27細胞は理化学研究所より入手した（RCB0555、RCB0885およびRCB0500）。NUGC3およびＮUGC3/5Fu細胞は、稲葉実先生により（財）癌研究会、癌化学療法センター・基礎部において樹立された。4-1ST、OKIBA、ALFおよびAOTOは、河口徳一氏（（財）癌研究会、癌研究所）により樹立された。1ST-1は寺島雅典先生（岩手医大）より、HCS-42は西山正彦先生（広島大）より、さらにKWS-1およびTGS-IIは本山悌一先生（山形大）より供与を受けた。293細胞は、10％仔牛血清(GIBCO)を含むDMEM培地(Dulbecco's modified Eagle medium、日水)で、ヒト胃癌細胞20系は5％仔牛血清(GIBCO)を含むRPMI1640培地（日水）を用いて、5％CO2存在下、37℃で培養を行った。
（1-2）組換えアデノウイルスの作製
ヒトアデノウイルス５型由来のコスミドpAx-cw(1)は斎藤泉博士（東京大学）より供与を受けた。組換えアデノウイルス作製に用いるコスミドpAxCAB1は、pAx-cwのClaI部位に発現カセット(CA promoter+cyclin B1 cDNA+poly A)を組み込んで作製した。これらを293細胞にCOS-TPC法（Miyake, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 1320-1324, 1996; Yoshida, Y. et al., Hum. Gene Ther. 9, 2503-2515, 1998; Yamaguchi, S. et al., Nucleic Res. 23, 2080-2081, 1995）にてトランスフェクションすることにより、組換えアデノウイルスAxCAB1を作製した。以下にCOS-TPC法の概要を示す。
【００２４】
COS-TPC法：アデノウイルス遺伝子のほぼ全長(E1A・E1B およびE3領域を欠損している)を含む発現単位挿入用ベクターに目的遺伝子発現カセットを挿入したコスミドとアデノウイルスDNAの末端に共有結合で結合し複製のプロモーターとして働いている末端タンパク質が付いたままの状態のウイルスDNA(Ad5 DNA-TPC)を293細胞にコトランスフェクトし、293細胞内での相同組換えによりアデノウイルスベクターを作製する方法である（図1）。293細胞はE1A・E1Bを恒常的に発現している特殊な細胞であるため、このウイルスベクターは293細胞内で増殖することができる。
（1-3）アデノウイルスを用いたin vitro遺伝子導入
アデノウイルスによる遺伝子導入効率は、レポーター遺伝子としてLacZを発現するアデノウイルスAxCAZ3を細胞に感染させることにより検討した。4×105cells/wellの胃癌細胞を12ウエル組織培養プレートに播き込んだ。翌日、細胞培養上清を除去した後、新鮮培地で希釈調整した種々の濃度のアデノウイルス液(200μl)を添加した。アデノウイルス液添加後１時間、37℃でインキュベートした後、新鮮な培地を加えて48時間培養後、X-gal染色を行った。実験は各濃度２ウエルで行った（Yoshida, Y. et al., Hum. Gene Ther. 9, 2503-2515, 1998）。
（1-4）X-gal染色アッセイ
感染細胞は、0.5％グルタルアルデヒドで10分間、室温にて固定した。固定後、リン酸緩衝液[PBS(-)]で洗浄し、１mM MgCl2および5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-galactoside(X-Gal、1mg/ml)、５mM K4Fe(CN)6、５mM K3Fe(CN)6を含む染色液を加え６時間、37℃で反応させた（Shockett, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6522-6526, 1995）。β-gal遺伝子発現効率は、LacZ陽性およびLacZ陰性細胞の数を各アデノウイルス濃度のウエルにおいて無作為に６視野測定する(100個細胞／１視野）ことにより行った。統計学的検定にはStudent's t-testを用いた。
（1-5）SRBアッセイ
各細胞における抗がん剤63剤の薬剤感受性は、SRBアッセイを用いて行った。５×103個の各胃癌細胞を96ウエル細胞培養プレートに播き込んだ。24時間後、種々の濃度のタキソール（Taxol）を各ウエルに添加し、48時間、タキソールに曝露した後、SRBアッセイ（Skehan, P. et al., J. Natl. Cancer Inst., 82, 1107-1112, 1990）にて生細胞数を測定した。すなわち、10％トリクロロ酢酸水溶液にて生存細胞（接着細胞）を固定し、各ウエルに0.4％SRB(sulforhodamine B,SIGMA)-１％酢酸水溶液50μｌを添加した後、室温で10分インキュベートし、microplate reader(Model 3550、Bio-Rad)で測定した。これより得られた各細胞の薬剤反応曲線より各薬剤の50％細胞増殖阻害濃度GI50値をもとめデータベース化を行った（Yamori, T. et al., Cancer Res. 59, 4042-4029, 1999）。
【００２５】
また、アデノウイルスベクターAxCAB1によるcyclin B1過剰発現の影響についての検討は、以下の方法で行った。５×103個のMKN1細胞を96ウエル細胞培養プレートに播き込んだ。24時間後、AxCAB1および対照としてAxCAZ3(MOI 300)を細胞に感染させた。アデノウイルス感染24時間後に種々の濃度のタキソールを各ウエルに添加した。薬剤添加48時間後、前者と同様の方法で生細胞数を測定した。すべての実験は3回繰り返した。
（1-6）cDNAアレイ法
各胃癌細胞における遺伝子発現は、Atlas Human 3.6 Array(CLONTECH)を用いて3537遺伝子について行った。
【００２６】
まず、各胃癌細胞よりトータルRNAをTrizol試薬(Life Technologies, Inc.)を用いて分取し、RNeasy Kit(QIAGEN)で精製した。これらを用いてAtlas Pure Total RNA Labeling System(CLONTECH)にて、polyA RNAより32P(PB10474,Amersham Pharmacia biotech)でラベルしたcDNAプローブを合成し、デュプリケイトでハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション条件をはじめとして、この系における種々の実験条件を最適化した結果、デュプリケイトの実験において、相関係数r＝0.96と極めて高い再現性を得た。この結果を受けて、20系の細胞の遺伝子発現データを取り込み、抗がん剤感受性データとともに情報をデータベース化し、これらを基に相関解析を行った。
（1-7）正規化
各メンブランにおいて上位10％の発現強度値を１（コントロール値）とした。これの30％の値をカットオフ値とし、これ以下のものは発現していないものとした。デュプリケイトでの実験結果において、その発現強度差が1/2倍以上２倍以下のものについて検討を行った。
（1-8）RT-PCR分析
胃癌細胞20系由来でcDNAアレイ法で使用した同一のトータルRNA 2 μgを用いてRT反応を行った後、下記に示したcyclinB1特異的プライマーを用いてPCR 反応を行った。
【００２７】
♯0029:5'TGGGTCGGCCTCTACCTTTGCACTTC（SEQ ID No. 1）
♯0030:5'CGATGTGGCATACTTGTTCTTGACAGTCA（SEQ ID No. 2）
PCR反応は、95℃５分で変性後、95℃１分、アニール60℃１分、72℃１分で25サイクル行った。反応終了後、PCR産物の1/5量を2％アガロースゲルにて電気泳動を行った。目的のcyclinB1由来の断片(32lbp)をUV下で確認後、各細胞由来の断片画像をNIHイメージにて取り込み遺伝子発現データとした。
（1-9）ウェスタンブロット分析
アデノウイルス感染48時間後の細胞を分取し、細胞lysis緩衝液（Wunner, W. H. in Virology: a practical approach (Mahy B.W.J.,ed.), pp.79-93, IRL Press, Oxford, 1985）を用いてタンパク質溶液を調製した。DC protein assay kit (Bio-Rad)でタンパク質濃度を求めた後、その溶液を10％SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。CyclinB1タンパク質のウェスタンブロット分析は、cyclin B1特異的モノクローナル抗体(sc-245,Santa Cruz)を用い、ECL detection system(Amersham)にて測定した。
（1-10）Cyclin B1 siRNAの細胞への導入実験
Cyclin B1に対するRNAiを用いて、遺伝子発現抑制に対するタキソール感受性に及ぼす影響を検討した。
【００２８】
胃癌細胞MKN-1（2.5×105/wellまたは5.0×105/well）を５％ FBS-DMEM（抗生物質なし）で培養した。細胞は、siRNA処理群、siRNAコントロール群、非処理群に分けた。siRNAの細胞への導入は、lipofectamine 2000(Invitrogene, ♯11668-019)を用いて公知の方法に従って行った。次いで、各細胞培地に抗癌剤（タキソール：0、10-6〜10-10M、タキソテール（Taxotere）: 0、10-6〜10-10M、MMC: 0、10-4〜10-8M）を添加し、生存細胞を測定した。なお、実験は2回繰り返して行った。
（1-11）胃癌細胞MKN-1のin vivo増殖に対するcyclin B1発現とタキソール処理の効果
MKN-1細胞をヌードマウスの皮下に移植し腫瘍を形成させた。このマウスにアデノウイルスベクターAxCAB1（１×109 pfu/20μl/day）を3日間連続で腫瘍内投与してcyclin B1を過剰発現させたのちに、タキソール（8 mg/Kg/day）を5日間連続で投与した。腫瘍サイズを経時的に測定した。
【００２９】
コントロールとしては、無処理群、タキソール単独投与群、cyclin B1発現アデノウイルスベクターAxCAB1単独投与群、LacZ発現アデノウイルスベクターAxCAZ3単独投与群、およびAxCAZ3＋タキソール投与群を設けた。マウスは一群あたり5匹づつとした。
（2）結果
（2-1）ヒト胃癌細胞におけるタキソール感受性とcyclin B1遺伝子発現との関係
各胃癌細胞における3537遺伝子の発現を、Atlas Human 3.6 Array(CLONTECH)を用いて検討した結果、3537遺伝子のうち少なくとも一つの細胞株で発現していた遺伝子数は1770遺伝子であった。そのうち10系以上の細胞株で発現が認められた227遺伝子について抗がん剤感受性とのピアソンの相関解析を行った。その結果、5-FU、MMC、CDDP、Taxol等の抗がん剤と正または負の有意な相関（ｐ＜0.05以下）を示す複数の遺伝子を抽出した。これら遺伝子のうち、胃癌細胞20系におけるcyclin B1遺伝子の発現とタキソール感受性との関係を図２に示した。20細胞中14細胞で解析可能であり、そのうち２細胞ではcyclin B1の発現が認められなかった。これら解析を行った胃癌細胞のタキソール感受性が高くなるに従って、細胞中のcyclin B1遺伝子の発現は高い傾向が認められ、ピアソンの相関係数ｒ＝0.549,ｐ＝0.0420であり、タキソール感受性とcyclin B1の発現は正の相関を示した。
（2-2）RT-PCR法によるcDNAアレイ法データの検証
図２で認められた相関関係は、、各胃癌細胞におけるcyclin B1の発現をRT-PCR法により測定した場合にも認められた（図３）。
（2-3）胃癌細胞におけるアデノウイルスベクターAxCAZ3の導入効率
種々の胃癌細胞におけるアデノウイルスベクターの遺伝子導入効率を、レポーター遺伝子LacZを発現するAxCAZ3を用いて検討した結果を図４および図５に示した。各細胞における遺伝子導入効率はウイルス用量依存的に上昇した。検討を行った８細胞中６細胞(St-4、MKN1、MKN28、MKN45、NUGC3およびNUGC3/GFu細胞)では、MOI 300でほぼ100％遺伝子導入できることが判った。導入効率の低かったMKN7およびMKN74細胞は、MOI 300においてもその導入効率は、86.5％および75.3％であった。
（2-4）In vitro胃癌細胞におけるアデノウイルスベクターAxCAB1を用いたcyclin B1過剰発現がそのTaxol感受性に及ぼす影響
胃癌細胞におけるcyclin B1遺伝子過剰発現がそのタキソール感受性に及ぼす影響について、アデノウイルスベクターAxCAB1を用いて検討した結果を図６に示した。胃癌は、MKN1およびNUGC3細胞を用いた。検討を行ったすべての細胞は、MOI 300でアデノウイルスべクターを感染させた。このMOIは、それぞれの細胞にほぼ100％遺伝子導入できるウイルス用量である(図４、図５)。実験の結果、胃癌細胞のタキソール感受性は、AxCAB1によってcyclin B1を過剰発現させた場合に上昇することが判明した (図６)。
（2-5）胃癌細胞におけるcyclin B1遺伝子のノックダウンがタキソール感受性に及ぼす影響
cyclin B1遺伝子の強制発現によりタキソール感受性が有意に増強した胃癌細胞MKN-1を用いて、cyclin B1に対するsiRNAによる遺伝子発現抑制がMKN-1細胞のタキソール感受性に及ぼす影響について検討を行った。その結果、cyclin B1をsiRNAでノックダウンすることにより、胃癌細胞MKN1におけるタキソール感受性は低下した（タキソール濃度10-6〜10-8M）。
【００３０】
一方、siRNAを用いたcyclin B1遺伝子のノックダウンにより、タキソテール感受性の変化は認められなかった。また、同様にMMC処置群でも感受性の変化は見られなかった(図７)。
（2-6）胃癌細胞MKN-1のin vivo腫瘍増殖に及ぼすcyclin B1過剰発現＋タキソールの併用効果
胃癌細胞におけるcyclin B1遺伝子の発現がタキソール感受性に及ぼす影響について検討することを目的として、cyclin B1過剰発現＋タキソールの併用がxenograft(MKN-1細胞)の腫瘍増殖に及ぼす影響について検討を行った。MKN-1細胞へのcyclin B1遺伝子導入は、アデノウイルスべクターAxCAB1を用いて行った。その結果、MKN-1腫瘍の増殖は、アデノウイルスべクターAxCAB1の３日間連日投与後、タキソールを５日間連日投与することにより、タキソール単独投与群およびAxCAZ3＋Taxol併用群に較べ有意な腫瘍増殖抑制効果を示した(図８)。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
以上詳しく説明したとおり、この出願の第１発明の方法によって、頻用されている抗癌剤であるタキソールによる抗癌治療の前に、その固形癌細胞（特に胃癌細胞）がタキソール感受性か否かを簡便かつ正確に判定することが可能となる。これによって、タキソールによる効果的な固形癌治療が可能となる。また、第２発明の薬剤およびこれを用いる第３発明の治療方法によって、タキソール非感受性の固形癌に対してもタキソールを効果的に作用させることが可能となり、抗癌作用に優れたタキソールを広範な固形癌に適用することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例で用いたアデノウイルスベクターの作製方法を示した工程図である。
【図２】胃癌細胞20系におけるcyclin B1遺伝子の発現とタキソール感受性との関係を示す。
【図３】各胃癌細胞におけるcyclin B1の発現をRT-PCR法により検証した結果である。
【図４】種々の胃癌細胞におけるアデノウイルスベクターの遺伝子導入効率を検討した結果である。
【図５】図４と同様の検討結果である。
【図６】胃癌細胞におけるcyclin B1遺伝子過剰発現がそのタキソール感受性に及ぼす影響について検討した結果である。三角は未処理の胃癌細胞株、円はAxCAZ3を感染させた胃癌細胞株、四角はAxCAB1を感染させた胃癌細胞株の生存率である。
【図７】siRNAを用いたcyclin B1遺伝子のノックダウンによるタキソテール感受性の変化を検討した結果である。
【図８】in vivo胃癌細胞におけるcyclin B1遺伝子の発現がタキソール感受性に及ぼす影響について検討した結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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