(57)【要約】【課題】バイオマスの効率的な利用等の、有用な用途を有する微生物を提供する。【解決手段】アルカリ性で生育能を有する、パニバチルス(Paenibacillus)属に属する微生物。特に、アルカリ性カタラーゼ添加培養法により、静岡県の茶畑からアルカリ性(pH9.2)の天然培地で生育し、グラム染色陰性、桿菌、有芽胞、運動性、色素非産生、カタラーゼ反応陽性で、グルコース、フルクトース、D-キシロース、マンノース、マンニトール等幅広い基質資化性を有するパニバチルス属に属する微生物、パニバチルス・カズサエンシス(Paenibacillus kazusaensis) T-5株を取得した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリ性で生育能を有する、パニバチルス(Paenibacillus)属に属する微生物。
【請求項２】
pH9.2の培地で生育し、グラム染色陰性、桿菌、有芽胞、運動性、色素非産生、カタラーゼ反応陽性で、グルコース、フルクトース、D-キシロース、マンノース及びマンニトールを資化する、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
パニバチルス属に属する微生物がパニバチルス・カズサエンシス(Paenibacillus kazusaensis)種に属する微生物である請求項１及び請求項２記載の微生物。
【請求項４】
パニバチルス・カズサエンシス種に属する微生物が、パニバチルス・カズサエンシスT-5株(独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  寄託番号FERM P-19663)である、請求項３記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はパニバチルス(Paenibacillus)属に属する新規微生物に関する。更に詳細には、アルカリ性で良好に生育し、バイオマスの利用に使用することが期待されるパニバチルス属に属する新規微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
周知のように、従来より自然界から微生物を分離し、培養する方法としては1876年にコッホが発明した平板培養法が知られている。この古くから知られている平板培養法は、多種多様の微生物が混在する試料を平板培地(プレート)に播き一定時間培養後プレート上に形成されたコロニーを単離し、微生物の単一コロニーまたは単一細胞を分離する方法であり、通常、単離した微生物(コロニー)の中から目的にかなった微生物が検索される。この平板培養法をベースとして様々な方法が開発され、産業上有用な微生物が数多く分離され利用されてきた。
【０００３】
ところが、1970年代の後半に蛍光顕微鏡を用いる分離源中の全菌数計数法が確立され、一方で自然界の分離源中の微生物に起因する生物活性を蛍光色素染色法で検出する技術が開発された。これらの技術開発によって従来の平板培養法では培養できない微生物が自然界に多く存在することが解明されてきた。このような自然界に存在し生物活性を示すが、通常の栄養培地で培養の困難な微生物群はVBNC状微生物(生きているが培養が困難な微生物)として知られるようになった。
【０００４】
VBNC状微生物に関する研究の例を挙げると、Colwell等は、コレラ菌、赤痢菌、大腸菌等を滅菌水中に接種し静置することによって平板培養法でのコロニー形成菌数が顕著に減少することを指摘している(非特許文献1:Microbial.Ecol.8,313-323,1982)。これに対して蛍光染色法による全菌数は変化しないこと、及びコロニー形成菌数よりもはるかに多数の菌が蛋白質合成能力を有していることが確認されている(非特許文献2:Kogure,K.et al ;Can.J.Microbiol.25,415-420,1979)。このような微生物の生理状態をColwell等はVBNC(Viable But Not Culturable)と称した。
【０００５】
VBNC状態の微生物は自然界に多く存在することが示されている。例えば、V. Torsvikらは土壌中の微生物について全菌数中に占めるコロニーを形成できる菌数は0.3%であったと報告している(非特許文献3:Appl. Environ. Microbiol. 56, 782-787 (1990))。M. Wagner らは活性汚泥中の全菌数中コロニーを形成できる菌数は1ないし15%にすぎないと報告している(非特許文献4:Appl. Environ.Microbiol. 59, 1520-1525 (1993))。J. T.Staleyらは中性を示す湖水中の全菌数に占めるコロニーを形成できる菌数の割合は0.1ないし1%であったと報告している(非特許文献5:Annu. Rev. Microbiol. 39, 66-68 (1985))。
【０００６】
上述のように、自然界には平板培養法により単離される微生物は少なく限られたものであり、一方のVBNC状微生物は多数存在するにもかかわらず、コロニー形成能を欠くため容易に利用することが出来ない。従って自然界にはいまだかって分離されたことのない未知の微生物種、新種の微生物の存在が想定される。
【０００７】
最近、このようなVBNC状微生物を蘇生させ新たな微生物資源として利用する方法が開発され平成14年日本農芸化学会大会で発表された(非特許文献6及び7:日本農芸化学会平成14年度大会講演要旨集、280頁、講演番号3-6Ca03及びCa04、日本農芸化学会発行、平成14年3月5日発行参照)。この方法は自然界から平板培養法微生物を分離する際、カタラーゼを含有する平板培地を用いることを特徴とする微生物の分離方法である(以下カタラーゼ添加法と称する)。
【０００８】
特に非特許文献6には低温処理してVBNC状にしたE.coli K-12をカタラーゼ添加培養すると蘇生率が5〜10倍に向上し、この方法を土壌からの微生物の分離に応用すると平板培地(プレート)上のコロニー数が72%向上すること、非特許文献7記載のゲルマイクロドロップ(gel microdroplet)とフローサイトメトリー(flow cytometry) 法と組み合わせるとプレート上のコロニー数が3〜14倍向上することが記載されている。更に、プレートから分離した菌株は、16S rDNAの塩基配列の解析から新規微生物である可能性が高いことが記載されている。
【０００９】
ところで、大気、土壌、海洋等の汚染、生態系の破壊、及び地球温暖化等の今日の環境問題を解決する方策の一つとして、バイオマスの有効利用が求められている(非特許文献8:湯川英明編著  バイオマス  化学工業日報社)。
【００１０】
バイオマスは、その種類にもよるがセルロース系バイオマスの場合、不溶性のセルロース繊維がヘミセルロースやリグニンによって周囲を固められた構造を持っている。このうちセルロースはグルコースがβ-1,4結合で結ばれた直鎖状のホモポリマーで、ヘミセルロースはマンノース、アラビノース等の六単糖やキシロース等の五単糖を構成成分とする多糖類である。これらバイオマスを微生物を用いた発酵原料に使用する場合は構成成分を微生物が利用できる形まで分解する必要がある(非特許文献9:湯川英明監修  バイオマスエネルギー利用の最新技術  シーエムシー)。
【００１１】
従来これらバイオマスの処理技術として、前処理と糖化を組み合わせた方法がよく知られている。アルカリ法はバイオマスをアルカリで前処理し、アルカリ性で脱リグニンを行った後、アルカリ性で多糖類分解酵素を反応させるプロセスである。
【００１２】
セルロース系バイオマスを原料として、微生物を用いた発酵により有用な物質を産生するためには、上記のようなアルカリ性の処理物中で生育可能で、且つ幅広い基質を資化する能力を有する微生物が好ましい。したがって、これらの条件を良好なレベルで兼ね備えた微生物が求められている。
【００１３】
【非特許文献１】Microbial.Ecol.8,313-323,1982
【非特許文献２】Kogure,K.et al ;Can.J.Microbiol.25,415-420,1979
【非特許文献３】Appl. Environ. Microbiol. 56, 782-787 (1990)
【非特許文献４】Appl. Environ.Microbiol. 59, 1520-1525 (1993)
【非特許文献５】Annu. Rev. Microbiol. 39, 66-68 (1985)
【非特許文献６】日本農芸化学会平成14年度大会講演要旨集、280頁、講演番号3-6Ca03、日本農芸化学会発行、平成14年3月5日発行
【非特許文献７】日本農芸化学会平成14年度大会講演要旨集、280頁、講演番号3-6Ca04、日本農芸化学会発行、平成14年3月5日発行
【非特許文献８】湯川英明編著  バイオマス  化学工業日報社
【非特許文献９】湯川英明監修  バイオマスエネルギー利用の最新技術  シーエムシー
【非特許文献１０】Ash,C. (1993) Antonie van Leeuwenhoek. 64:253-260
【非特許文献１１】Osamu,S. (1997) International Journal of Systematic Bacteriology 47,No.2:289-298
【非特許文献１２】Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 第9版
【非特許文献１３】Barrow,G.I.(1993) Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria. 3rd edition.
【非特許文献１４】Dasman,  International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2002), 52:1669-1674
【非特許文献１５】Sanger,F.et al;Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463-5467,1977
【非特許文献１６】Saitou, N. and Nei, M.: The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 1987, 4, 406-425
【非特許文献１７】Altschul, S.F., Madden, T.F.: Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Mucleic Acids Res. 1997. 25, 3389-3402
【非特許文献１８】Ito Y, Appl Environ Microbiol.  (2003), 69(12):6969-78
【非特許文献１９】Paal K, Biochem J. 2003 Oct 16
【非特許文献２０】Hong TY, Appl Microbiol Biotechnol. (2003),61(5-6):472-8
【非特許文献２１】Khalikova E, J Chromotogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. (2003) Nov5,796(2):315-26
【非特許文献２２】Kaulpiboon J, J Biochem Mol Biol.(2003),36(4):409-16
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、バイオマスの効率的な利用等の、有用な用途を有する微生物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、自然界に多く存在するVBNC状の微生物群から上記課題を解決する微生物を見出すことを試み、カタラーゼ添加法について更に研究を行った。その結果、パニバチルス属の微生物において、特定条件のカタラーゼ添加法でそのような課題を解決しうる微生物を得た。具体的には、アルカリ性のカタラーゼ添加平板を用いて平板培養を行い、平板上に生育したコロニーの中から見出されたパニバチルス属に属する微生物、特にパニバチルス・カズサエンシス(Paenibacillus kazusaensis)T‐5株を、新規でかつバイオマス処理等に利用できる産業上有用な微生物として見出し本発明を完成するに至った。
【００１６】
即ち本発明によれば、下記［１］〜［４］が提供される:
［１］アルカリ性で生育能を有する、パニバチルス(Paenibacillus)属に属する微生物。
［２］pH9.2の培地で生育し、グラム染色陰性、桿菌、有芽胞、運動性、色素非産生、カタラーゼ反応陽性で、グルコース、フルクトース、D-キシロース、マンノース及びマンニトールを資化する、前記［１］記載の微生物。
［３］パニバチルス属に属する微生物がパニバチルス・カズサエンシス(Paenibacillus kazusaensis)種に属する微生物である前記［１］又は［２］記載の微生物。
［４］パニバチルス・カズサエンシス種に属する微生物が、パニバチルス・カズサエンシスT-5株(独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  寄託番号FERM P-19663)である、前記［３］記載の微生物。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のパニバチルス属に属する新規微生物は、上記のようにアルカリ性で生育し、且つ幅広い基質資化性を有しうることから、バイオマスの前処理工程等、アルカリ性での生育能及び/又は幅広い基質資化性を活用しうる用途に利用することができる。また本発明の微生物は有用酵素生産能を有しうることから、アルカリ前処理で得られるバイオマス等の物質を発酵原料として利用できるとともに有用酵素を生産することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の微生物は、パニバチルス(Paenibacillus)属に属する。パニバチルス属はかつてバチルス属として分類されていたが、バチルス属はその後10グループに分けられ最近そのうちの5グループが別の属として命名された。そのうちの1つがパニバチルス属である(非特許文献10:Ash,C. (1993) Antonie van Leeuwenhoek. 64:253-260、及び非特許文献11:Osamu,S. (1997) International Journal of Systematic Bacteriology 47,No.2:289-298)。
【００１９】
本発明の微生物は、好ましくはパニバチルス・カズサエンシス(Paenibacillus kazusaensis)種に属し、さらに好ましくはパニバチルス・カズサシエンス T-5株(独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  寄託番号FERM P-19663、寄託日:2004年2月4日)である。本発明の微生物としては、グラム染色陰性、桿菌、有芽胞、運動性、色素非産生、カタラーゼ反応陽性で、グルコース、フルクトース、D-キシロース、マンノース及びマンニトールを資化するものが好ましい。
【００２０】
本発明の微生物は、アルカリ性で生育能を有する。具体的には例えば、pH9.2において生育能を有する。具体的には例えば、生育可能pH範囲が5〜9.2である微生物とすることができる。
【００２１】
本発明の微生物の好ましい具体例であるパニバチルス・カズサエンシスT‐5株の菌学的性質を非特許文献12(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 第9版)に従い以下に詳述する。尚、グラム染色、胞子の有無、鞭毛による運動性の確認等の形態学的性質及び培養的性質は、Nutrient液体培地(Oxoid社製、England)で培養後、定法に従って行ない観察されるものである(非特許文献13:Barrow,G.I.(1993) Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria. 3rd edition.)。
【００２２】
コロニーの形態はNutrient  Agar(Oxoid社製、England)で30℃、48時間培養後観察されるものである。液体培地での諸性質はNutrient液体培地(Oxoid社製、England)で12時間培養後、培養液を観察して見出されるものである。ここで観察には光学顕微鏡U-LH1000(オリンパス社製、日本)を用いることができる。生理学的性質については、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸およびガス産生、ブドウ糖の酸化/発酵(O-Fテスト)については定法に従って実施し観察されるものである(非特許文献13)。
【００２３】
糖の資化を含めた生理学的性質検討はBIOMERIEUX社製API50HBシステムを使用して測定されるものである。
【００２４】
(a)形態的性質
1)細胞の形及び大きさ:桿菌(0.8 x 2.0 μm)
2)運動性の有無:有り
3)胞子の形成:有り
4)細胞の多形性:無し
(b)培養的性質
(肉汁寒天平板培養で48時間培養して観察)
生育状況:良好な生育を示す
集落の形態:円形、全縁滑らか、低凸状
集落の色調: クリーム色、光沢無し
拡散性色素:生産しない
(液体培養48時間培養して観察)
表面発育:無し
混濁状態:一様に分布、沈殿物無し
(c)生理学的性質
グラム染色性:陰性
硝酸塩の還元:陰性
VPテスト:陰性
インドールの生成:無し
硫化水素の生成:無し
澱粉の加水分解:有り
クエン酸の利用性:無し
色素の生成:無し
ウレアーゼ:陰性
オキシダーゼ:陽性
カタラーゼ:陽性
生育の範囲(pH):5.0〜9.2
生育温度:28〜37℃で生育
酸素に対する態度:好気性
O-Fテスト:陰性
糖類からの産及びガスの生成(+;利用する  -;利用しない)
D-リボース              +
D-アラビノース          +
L-アラビノース          +
D-キシロース            +
D-グルコース            +
D-マンノース            +
D-フラクトース          +
D-ガラクトース          +
L-フコース              +
マルトース              +
セロビオース            +
メリビオース            +
ゲンチビオース          +
シュークロース          +
ラムノース              +
ラクトース              +
ラフィノース            +
トレハロース            +
D-ソルビトール          -
D-マンニトール          +
イノシトール            -
グリセリン              +
澱    粉                +
グリコーゲン            +
イヌリン                +
N-アセチルグルコサミン  +
アミグダリン            +
(d)その他の生理学的性質
グルコン酸を酸化しない
エスクリンを分解する
馬尿酸を分解しない
10%NaClで生育しない
嫌気で生育する
【００２５】
後述する実施例中に記載される方法に従い決定した、T-5株より分離した16S rDNAの塩基配列(5'端側の500bp)を、配列表の配列番号1に示す。この16S rDNAの塩基配列を用いて、GenBankに登録されている近縁種(非特許文献14(Dasman,  International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2002), 52:1669-1674)を参照して選択)についてGenBankデータベースによるホモロジー解析を行なうと、図1に示す発生系統樹が得られる。ホモロジー解析の結果からT-5株はパニバチルス・グリカニリチカス(Paenibacillus  glycanilyticus)の16S rDNAに対し最も相同性が高いといえる。また分子系統樹上ではT-5株の16S rDNAは単独で枝を形成するがパニバチルス属の16S rDNAが形成するクラスター内に含まれる。上記菌学的性質及びホモロジー解析の結果から、T-5株はパニバチルス属に属する微生物と判定される。
【００２６】
本発明の微生物は、バイオマスの処理に用いることができる。具体的には例えば、セルロースを含むバイオマスの処理に用いることができる。より具体的には例えば、セルロース、ヘミセルロース及び／又はリグニン等を含むバイオマスに、本発明の微生物を、必要に応じてアルカリによる処理と組み合わせて作用させる工程を含む方法により処理することができる。本発明の微生物はアルカリ性の環境下において生育可能であるため、アルカリによる処理と同時に、アルカリ環境下で本発明の微生物を活動させてバイオマスの処理に適用することができる。
【００２７】
本発明の微生物はまた、それらが産生する有用な酵素を製造するために用いることができる。具体的には例えば、バイオマス及び／又はバイオマス処理物を資化させることにより本発明の微生物を増殖させ、それに伴い産生される酵素を必要に応じて分離、精製し、利用することが可能である。本発明の微生物により製造しうる酵素としては、例えばキシラナーゼ、グルコシルセラミダーゼ、β-1,3グルカナーゼ、デキストラナーゼ、サイクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ等が挙げられる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例に基づき、本発明についてさらに詳細に説明する。なお、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２９】
(実施例1)
(自然界から微生物を分離・取得する方法)
微生物の分離源として各地の土壌、砂漠、温泉等から50数件の試料(サンプル)を採取した。サンプル各1gを生理食塩水(0.85%)10mlに懸濁し原液とした。これを1/10倍ごとに段階希釈し供試液を調製した。
【００３０】
一方、微生物の分離に使用するカタラーゼ含有アルカリ性寒天平板(プレート)は以下のようにして調整した。まず1/2YM寒天培地(Bacto  Yeast-extract  0.16%、Malt  Extract  0.16%、Peptone  0.26%、Dextrose  0.5%、寒天  1.5%)を調製しKOHを用いてpH9.2に調整した。これにカビ類による汚染を抑制するために蒸気殺菌処理を施したシクロヘキシミド溶液を25mg/lの濃度になるように添加した。プレートの寒天が固化した後、予め準備したカタラーゼ溶液を1プレートに対し2,000ユニットになるように塗布した。尚、カタラーゼとしては市販のカタラーゼ(Sigma社、商品カタログ番号:C3515)を使用した。
【００３１】
試料原液を1/10倍ごとに段階希釈して調製した供試液をカタラーゼ含有アルカリ性寒天培地に塗布し、30℃、48時間平板培養後、生育してきた菌株をアルカリ性生育菌として取得した。対照としてカタラーゼを含んでいないアルカリ性寒天培地を用いて同様に平板培養した。その結果、カタラーゼ添加した場合のサンプル1g当りのコロニー出現率は2.0x108に対し、カタラーゼを含まない場合は7.3x107であった。カタラーゼ添加によりコロニー出現率が2.8倍に増加することが示された。
【００３２】
(16S rDNAの塩基配列決定)
上記、カタラーゼ添加培養法で取得したコロニーの中から55株を選定し、55株について以下の方法により16S rDNAの塩基配列を決定した。
【００３３】
各菌体をアルカリ性1/2YM液体培地に植菌し、30℃で2日間培養した。培養液から菌体を採取し、染色体DNAをPrepMan  Method(Applied  Biosystems,CA,USA)の方法に準じて抽出した。
【００３４】
抽出した染色体DNAを鋳型として16SリボソーマルRNA遺伝子(16S rDNA)の5'末端側約500bpの領域をPCR法により増幅した。PCR法(複製連鎖反応:polymerase chain reation)は非特許文献15(Sanger,F.et al;Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463-5467,1977)の方法に準じて行った。
【００３５】
その後増幅された塩基配列をシーケンシングし16S rDNAの塩基配列を得た。PCR産物の精製、サイクルシーケンスにはMicroSeq500 16S rDNA BacterialSequencing  Kit(Applied Biosystems, CA,USA)を使用した。サーマルサイクラーにはGeneAmp PCR System 9600(Applied Biosystems,CA,USA)を使用した。ゲノムDNAの抽出からサイクルシーケンスまでの基本操作はApplied Biosystems社のプロトコール(P/N4308132  Rev.A)に準じて行った。
【００３６】
(帰属分類群の推定)
決定した上記55株の16S rDNAの塩基配列のそれぞれと、DNA塩基配列データベース中の配列との間の相同検索を行い、相同率の上位10株を決定後、近隣結合法(非特許文献16:Saitou, N. and Nei, M.: The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 1987, 4, 406-425)により分子系統樹を作製し、近縁種および帰属分類群の検討を行った。相同性検索および系統樹の作製には、まずMicroSeq Microbial Identification System Software V.1.4.1を使用し、相同性の対比対象の配列のデータベースとしてMicroSeq Bacterial 500 Library v.0023を使用した。MicroSeq Bacterial 500 Libraryで相同率が97%を超える配列が無かった場合はさらにBLAST(非特許文献17:Altschul, S.F., Madden, T.F.: Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Mucleic Acids Res. 1997. 25, 3389-3402)を用いてDNA塩基配列データーベースGenBank中の配列に対して相同性検索を行い、系統学的解析を行った。ここでの系統学的解析には市販のソフトウェア(「CLUSTAL W」:プログラム集「Phylogeny Programs」)で計算された多重アライメント及び進化距離(相同性)を、PHLYPフォーマットデータで出力し、これを系統樹作成ソフト「TreeView」(Tree drawing software for Apple Machintosh:by Roderic D., Page 1995, Institute of Biomedical and Life sciences, University of Glasgow, UK)に読み込ませることによって行った。PHLYP(Felsenstein J.(1995) Phylogenetic inference package, version 3.5.7., Department of Genetics, University of Washington, Seatle WA, USA)は、上記Phylogeny Programsに含まれている。その結果、新種と思われる6種の株が見出された。
【００３７】
(アルカリ性での生育解析)
16S rDNAの解析を行った後、上記55株についてアルカリ性(pH9.2)での生育テストを行った。アルカリ性での生育テストは各菌株を1/2YM寒天培地(Bacto Yeast-extract  0.16%、Malt Extract0.16%、Peptone0.26%、Dextrose0.5%、agar1.5%  pH9.2(KOH)) にて30℃で一晩培養後、1/2YM液体培地(Bacto Yeast-extract  0.16%、Malt Extract0.16%、Peptone0.26%、Dextrose0.5%、K2HPO4 90 mM、KH2PO4200 mM   pH9.2(K2CO3))4 mlにNUNC社製イノキュレートループを用いて1白金耳(エーゼ)植菌し、30℃で振盪培養(70rpm)した。培養開始後経時的に培養液の吸光度変化をバイオフォトレコーダーTN1506(アドバンテック東洋社製)を使用して測定した。
【００３８】
アルカリ性(pH9.2)での生育テストの結果、55株の中から特に良好に生育する5株を選択し、前述したAPIシステムにより糖資化能を測定した。その結果、他の菌株に比較し特に幅広い糖資化能を有し、且つ上記帰属分類群の推定においてパニバチルス属に属する新種と思われた菌株を見出した。この菌株は、静岡県の茶畑から取得した試料に含まれていた菌株であった。当該菌株を、T-5株と命名した。
【００３９】
(近縁種との対比)
16S rDNAの相同性検索の結果においてT-5株と最も相同性の高いとされたパニバチルス・グリカニリチカスと、次いで近縁なパニバチルス・クルドラノリチカス(Paenibacillus curdlanolyticus)及びパニバチルス・コベンシス(Paenibacillus kobensis)の3種を近縁の微生物として選び、T-5株と菌学的性質を比較した。尚、パニバチルス・グリカニリチカスの代表菌株としてはパニバチルス・グリカニリチカスDS-1T株を使用し、パニバチルス・コベンシスの代表菌株としてはパニバチルス・コベンシスIFO 15729T株を使用した(非特許文献14:Dasman,  International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2002), 52:1669-1674)。その結果を表1に示す。
【００４０】
【表１】
2005237333.tif 000002
【００４１】
表1に示すように、グラム染色性陰性である点及び生育可能なpH範囲の点で明らかに、T-5株とアルカリ性で生育できない近縁の菌株との差が認められた。
【００４２】
次に、T-5株、及びT-5株の近縁と思われる数種の菌株において、各種炭素源に対する資化性の有無を比較した。その結果を表2に示す。
【００４３】
【表２】
2005237333.tif 000003
【００４４】
表2の結果から、T-5株は、他の菌株が資化しないものをも含む多種の炭素原を資化することが分かる。比較的資化性が近いP.グリカニリチカスと対比しても、T-5株はD-アラビノース及びイヌリンを資化する点において異なっている。
【００４５】
上記菌学的性質の比較からT‐5株に最も近縁と考えられるP. グリカニリチカスDS-1T株と、表3に示すT‐5株の近縁種について、T‐5株との相同性を比較した。表3に示すT‐5株の近縁種について、定法に従って16S rDNAを単離し塩基配列を決定した。得られた塩基配列について、GenBankのデータベースを用いて相同性分析を行った。その結果を表3に示す。
【００４６】
【表３】
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【００４７】
表3に示すように、菌学的性質の比較から最も近縁なP. グリカニチリカス DS-1Tと相同性を比較すると97.8%の相同性しかなかった。以上の知見より、T-5株は菌学的性質及び16S rDNA塩基解析からパニバチルス属の公知の種とは区別されることから、本発明者らはT-5株をパニバチルス属の新種の微生物と判定し、パニバチルス・カズサエンシス(Paenibacillus kazusaensis)と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1  中央第6)に、寄託日2004年2月4日に寄託番号FERM P-19663として寄託した。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の微生物はアルカリ性で生育することからバイオマスの前処理工程へ利用することができる。また、本発明の微生物のうち、グリセロール、D-アラビノース、 L-アラビノース、リボース、 D-キシロース、 β-メチル-D-キシロース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、ラムノース、マンニトール、α-メチル-D-グルコース、 N-アセチルグルコサミン、アルブチン、サリシン、セロビオース、マルトース、シュークロース、トレハロース、イヌリン、澱粉、グリコーゲン等の幅広い基質を資化する能力を有するものの場合、バイオマスの前処理工程において被処理物を特に良好に処理することができる。
【００４９】
またこのアルカリ法によってバイオマスを分解した場合、その分解物の構成糖としてはグルコースを主にキシロース、マンノース、アラビノース、さらにはセロビオース等多種多様であるが、構成成分は微生物が利用できる形まで分解されているためこれらバイオマスを微生物を用いた発酵原料に使用することができる。
【００５０】
パニバチルス属の細菌についてはキシラナーゼ(非特許文献18:Ito Y, Appl Environ Microbiol.  (2003), 69(12):6969-78)、グルコシルセラミダーゼ(非特許文献19:Paal K, Biochem J. 2003 Oct 16)β-1,3グルカナーゼ(非特許文献20:Hong TY, Appl Microbiol Biotechnol. (2003),61(5-6):472-8)、デキストラナーゼ(非特許文献21:Khalikova E, J Chromotogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. (2003) Nov5,796(2):315-26)、サイクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ(非特許文献22:Kaulpiboon J, J Biochem Mol Biol.(2003),36(4):409-16)等数多くの酵素を生産することが報告されている。
【００５１】
本発明の微生物はパニバチルス属に属しかつ上記のように幅広い基質資化能を有しうることからこれら有用酵素を生産する能力を具備しうる。したがって有用酵素生産のみならず、アルカリ前処理で得られるアルカリ性のバイオマスを発酵原料として有用酵素を生産することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】アルカリ性カタラーゼ添加培養法で分離したパニバチルス・カズサエンシスT-5株及びその近縁微生物の発生系統樹を示す図である。図中において、縦棒は各微生物の系統樹上の位置関係を示す。横棒は、各微生物種間の16S rDNA塩基配列の相同性を示す。目盛り(0.01)は16S rDNA遺伝子の塩基配列の相同性について100個の塩基中1個が相違した時の横棒の長さを示す。また、数字は、相同性が同一と出た結果が1000回にうち何回出たかを示す。
【図１】
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【配列表】
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