(57)【要約】【課題】  連続的に効率よく糖鎖の精製を行うことができる糖鎖精製装置を提供する。【解決手段】  プロテアーゼをカラムに充填可能な担体に固定化してカラムに充填した固定化プロテアーゼカラムと、グリコペプチダーゼをカラムに充填可能な担体に固定化してカラムに充填した固定化グリコペプチダーゼカラムを直列連結した装置に、分解すべき糖タンパク質を適当な緩衝液とともにカラムに連続通液しながら反応を行う。【効果】  糖タンパク質糖鎖の遊離工程が極めて簡便化・省力化され、穏和かつ簡便に糖鎖の遊離が行えるようになる。【選択図】図２
2005278592.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖タンパク質を含む試料から、糖鎖を精製する糖鎖精製装置であって、
緩衝液を送液するポンプと、当該緩衝液の流れに前記試料を注入するインジェクタと、糖タンパクを糖ペプチドに分解するための酵素が固定化された第１のカラムと、糖ペプチドを糖鎖とペプチドに分解するための酵素が固定化された第２のカラムを備え、当該第２のカラムからの溶出液を捕集することにより、糖鎖を得ることを特徴とする糖鎖精製装置。
【請求項２】
請求項１において、
前記第１のカラムには、カラムに充填可能な担体に、タンパク質を分解する酵素を結合させたものが充填されることを備えたことを特徴とする糖鎖精製装置。
【請求項３】
請求項１において、
前記第２のカラムには、カラムに充填可能な担体に、タンパク質或いはペプチドから糖鎖を分解する酵素を結合させたものが充填されることを備えたことを特徴とする糖鎖精製装置。
【請求項４】
請求項１において、
前記第２のカラムを経た溶液を検出する検出器と、当該検出器からの検出結果に基づき、成分ごとに分取を行うフラクションコレクタとを備えたことを特徴とする糖鎖精製装置。
【請求項５】
請求項１において、
前記第１のカラムが複数設けられ、前記第２のカラムが複数設けられ、更に、
前記複数の第１のカラム間を循環させるための手段と、前記複数の第２のカラム間を循環させるための手段とを備えたことを特徴とする糖鎖精製装置。
【請求項６】
請求項５において、
前記第１のカラムを経た溶液を検出する第１の検出器と、前記第２のカラムを経た溶液を検出する第２の検出器と、当該第２の検出器からの検出結果に基づき、成分ごとに分取を行うフラクションコレクタとを備えたことを特徴とする糖鎖精製装置。
【請求項７】
請求項２または３において、
前記第１及び第２のカラムに充填可能な担体は、多糖由来の担体やポリビニル化合物由来の担体，シリカゲル誘導体，酸化金属由来の磁性体ビーズまたは共重合体やこれらの混合物であることを特徴とする糖鎖精製装置。
【請求項８】
請求項２において、
前記酵素は、プロテアーゼ，ペプチダーゼ，トリプシン，キモトリプシン，サーモリシン，ペプシンのいずれかを用いることを特徴とする糖鎖精製装置。
【請求項９】
請求項３において、
前記酵素は、エンドグリコシダーゼ，エンドグリコシダーゼＤ，エンドグリコシダーゼＨ，エンドグリコシダーゼＦ，ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ，エンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ，エンド−β−ガラクトシダーゼのいずれかを用いることを特徴とする糖鎖精製装置。
【請求項１０】
上記請求項１において、
前記ポンプは、洗浄液を送液し、前記第１及び第２のカラムをすることを特徴とする糖鎖精製装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖タンパク質からの糖鎖精製装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質の糖鎖構造解析のためには、まず糖タンパク質から糖鎖を分離する必要がある。これは酵素によって糖鎖を遊離させるか、化学的にグリコシド結合を切断するかのどちらかで行う。
【０００３】
アスパラギン結合型糖鎖を遊離させる酵素には、アーモンド由来グリコペプチダーゼ
（非特許文献１：Biochem. Biophys. Res. Commun., 76, 1194）やナタマメ由来グリコペプチダーゼ（非特許文献２：Biochem. Biophys. Res. Commun., 112, 155）やＮ−グリカナーゼ（非特許文献３：J. Biol. Chem., 259, 10700）がある。また化学的に糖−タンパク質間を切断する方法としては、ヒドラジン分解が最もよく利用されるが、この他の化学的糖鎖切断法としてはトリフルオロアセトリシスやＬｉＢＨ4によるものがある。
【０００４】
糖タンパク質糖鎖の切断について、酵素法と化学法との利点・不利点を比較してみると、酵素法の利点はヒドラジン分解に比べて操作法が非常に簡単である点である。すなわち試料を徹底的に乾燥させる必要がなく、酵素を加えて一晩放置するだけでよい。反応液の後処理も簡単であり、適当なカラムを用いてゲル濾過を行うことで糖部分が分画される。また、酵素法では切断された糖鎖に修飾が起こらないことが利点としてあげられる。
【０００５】
ヒドラジン分解では、Ｎ−アセチルヘキソサミンのアセチル基が脱離するので、ヘキソサミンの再Ｎ−アセチル化が必要である。さらに、植物由来の糖タンパク質では、アスパラギンに結合するＮ−アセチルグルコサミンにα−１，３結合でフコースが結合しているが、このフコースは特にヒドラジン分解の条件下で遊離しやすいことが報告されている
（非特許文献４：Glycoconjyugate J.，3, 27）。
【０００６】
また糖タンパク質に酵素を直接作用させた際、タンパク質の高次構造に起因する立体障害により糖タンパク質糖鎖が完全に遊離しないことがある一方で、ヒドラジン分解では糖鎖の結合していたタンパク質はアミノ酸まで分解されてしまうため、糖タンパク質の高次構造を推察するには有効ではない。現在最もよく使用されているアーモンド由来グリコペプチダーゼは、アスパラギン結合型糖鎖の中でもアシアロ化したものについては、どのような糖鎖にでも構造の区別なく働くこと、また糖タンパク質がペプチダーゼ処理などによって、ある程度小さな糖ペプチド分子にまで分解されているときに、特に高い反応効率を示すことが知られているが、ヒドラジン分解に関しては糖鎖のシアル酸の有無やタンパク質の高次構造如何にかかわらず、アスパラギン結合型糖鎖を切り出すことができる点で優れている。
【０００７】
以上の点から、より穏和かつ勘弁に糖鎖の遊離が行えるグリコペプチダーゼによる反応の前段階に、ペプチダーゼによるタンパク質部分の消化を組み合わせた２段階の酵素反応による糖タンパク質糖鎖の精製は、糖タンパク質糖鎖構造解析研究において非常に有効であると考えられる。微生物学や生化学の進歩により微生物や酵素等の生体触媒が広く工業に利用されるようになったが、多くの場合そのプロセスはバッチ式、すなわち基質溶液に生体触媒を投入し、反応後に除去する方法が取られてきた。
【０００８】
図１に示す表の右側欄に、従来の方法の一例を示す。
【０００９】
【非特許文献１】Biochem. Biophys. Res. Commun., 76, 1194
【非特許文献２】Biochem. Biophys. Res. Commun., 112, 155
【非特許文献３】J. Biol. Chem., 259, 10700
【非特許文献４】Glycoconjyugate J.，3, 27
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来実施されているバッチ方法では、バッチ毎に大型の反応槽を用意する必要があり、大型のプラントが必要になる。また、一度使用された生体触媒を回収し再利用するのは極めて困難であるため、一反応毎に廃棄することになる。酵素はもともと生物から取り出すものであるために少量でも高価であり、一反応毎に廃棄することになる従来の方法は非常に不経済な使用方法である。
【００１１】
本発明は、連続的に効率よく糖鎖の精製を行うことができる糖鎖精製装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するために本発明は、糖タンパクを糖ペプチドに分解するための酵素が固定化された第１のカラムと、糖ペプチドを糖鎖とペプチドに分解するための酵素が固定化された第２のカラムとを連結し、これらのカラムに試料を導入して、糖鎖を遊離させる。
【００１３】
具体的には、上記第１のカラムは固定化プロテアーゼカラムであり、上記第２のカラムは固定化グリコペプチダーゼカラムである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の糖鎖精製装置を用いることにより、これまで非常に煩雑であった糖タンパク質糖鎖の遊離工程が極めて簡便化・省力化され、穏和かつ簡便に糖鎖の遊離が行えるようになる。
【００１５】
また、ハイスループットな糖タンパク質糖鎖自動精製システムを構築することができる。また、本装置は工程全体がクローズドシステムであるため回収率の向上を図ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、酵素を一回だけでなく繰り返し使用するために、糖鎖の遊離工程に応じた酵素を固定化したカラムを備えたことに有る。
【００１７】
酵素を一回だけでなく繰り返し使用することを目的として、使用する酵素をガラスビーズ，セルロース，プラスチック膜，活性炭，シリカゲルなどの表面に付け固定化酵素として使用する。化学結合などにより強固に酵素が固定化されていれば反応基質となり、試料を通した時よく反応し，酵素の流出も防ぐことができる。この安定化した固定化酵素をカラムに充填しリアクターとして使えば複数回の使用が可能になり、反応効率も向上すると考えられる。
【００１８】
一般に酵素の固定化は、酵素の回収・再利用，安定性の強化，有機溶媒中への適用などを可能にするといわれているが、固定化による酵素分子周りの微視的な環境の変化は酵素の機能や安定性に大きく影響するため、使途に応じた適切な物理的・化学的特性を持つ固定化担体を選択し、種々の固定化法を試行した上で、酵素に応じた固定化方法を探索する必要がある。
【００１９】
一般的な固定化酵素の利点を挙げると以下のようになる。
（１）反応の開始，停止を固定化酵素の添加，除去により容易に制御できる。
（２）酵素と生成物との分離が容易になり、プロセスを簡素化できる。
（３）固定化酵素を充填したカラムに原料溶液を通すことで反応を進行させられるので、      装置を小型化できる。
（４）酵素を繰り返し使用出来るので経済的である。
（５）固定化により酵素や微生物の安定性が向上する（場合がある）。
【００２０】
酵素を固体表面に固定化する方法はこれまでに数多く開発されており、それらは次の三種類の方法に大別される。
（１）担体結合法：水不溶性の担体に酵素を結合させる方法。
（２）架橋法：担体を使用せずに酵素を２個もしくはそれ以上の官能基を持つ試薬と架橋      反応させて不溶化する方法。
（３）包括法：酵素をゲルの微細な格子の中に包み込むか、半透性のポリマーの皮膜によって被覆する方法。
【００２１】
固定化により酵素の安定性は一般的に向上するという報告は多くなされており、その理由は次のように推測されている。
【００２２】
酵素（タンパク質）は複雑な高次構造を取っており、その立体構造が酵素の触媒能力や物質識別能力に大きく作用している。熱や他の化学薬品等により立体構造が破壊されると酵素は変性し触媒能力は失われる。酵素を固定化した場合には酵素−担体間に複数の化学結合が生じる事により、一般的には酵素の立体構造が補強され変性しにくくなると考えられる。酵素を工業的に使用する際には、酵素が長期間に渡って安定に働くことが求められるため、固定化による酵素の安定性の向上は好ましい。
【００２３】
上記方法によって得られた固定化，水系溶媒中でよく膨潤する固定化担体に適当量のプロテアーゼを共有結合で固定化したものを固定化プロテアーゼとし、この固定化プロテアーゼをカラムに充填し固定化プロテアーゼカラムとする。また、グリコペプチダーゼを共有結合で固定化したものを固定化グリコペプチダーゼとし、カラムに充填し固定化グリコペピチターゼカラムとする。
【００２４】
上記のようにして作用の異なった２本のカラムを得る。前段に固定化プロテアーゼカラム、後段に固定化グリコペプチダーゼカラムの順にセットする。あらかじめ熱変性させた糖タンパク質溶液をこの連続カラムに通液すると、はじめに固定化プロテアーゼカラム中で添加した糖タンパク質の部分的な分解がおこり糖ペプチドの状態になる。引き続きこの糖ペプチド溶液が固定化グリコペプチダーゼカラムに通液すると、糖鎖の還元末端側にアスパラギン酸が結合した形で糖タンパク質糖鎖が遊離してくる。必要に応じてそれぞれのカラムへの通液回数や使用する固定化酵素カラムの本数を調節する。最終的に生成した糖鎖をフラクションコレクタにより分取することにより、糖タンパク質から糖鎖を分離，精製することができる。
【００２５】
本発明で利用できるカラムに充填可能な担体としては、特に限定されないが、セルロースやアガロース，キチン，キトサンなど多糖由来の担体やこれらの誘導体，アクリルアミド誘導体，メタクリルアミド誘導体，アクリル酸，メタクリル酸などの重合体，ポリスチレン誘導体、これらと他のビニル化合物との共重合体，ポリビニルアルコール，ポリエチレングリコール，ポリプロピレングリコール、そのほかのポリビニル化合物由来の担体，シリカゲル誘導体、またはこれらの混合物や酸化金属由来の磁性体ビーズなどが挙げられる。
【００２６】
本発明でいう選択的な官能基に対して反応する分子構造が水系溶媒中で穏和な条件下で化学反応や光反応を起こすことで共有結合を形成できるものや、プロテアーゼや糖タンパク質およびグリコペプチダーゼに対してアフィニティー結合能やイオン結合能および疎水性結合能などを有する構造を含むリンカーというのは、特に限定はされないが、アミノ基やカルボキシル基，カルボン酸活性エステル，エポキシ基やアルデヒド基やイミダゾール基や水酸基，ＣＮＢｒ基やチオール基、そのほかＳＡＮＤ,ＡＮＢ−ＮＯＳ,ＳＡＮＰＡＨなどの光官能基のように共有結合で酵素を固定できるリンカーが、酵素の漏れが無いなどの面から考えて好ましい。
【００２７】
例えば、酵素タンパク質表面の不特定のアミノ基は、６−アミノヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを表面に有するアガロースなどのビーズに対して、ｐＨ５−１０の緩衝液中で容易にアミド結合を形成し、タンパク質は固定化される。このような担体は市販されてもいるので、非常に容易に固定化酵素が調製できる。また、ＣＮＢｒアガロースなど比較的水中で不安定になりやすいリガンドを持つ担体に対しても３時間ほどでタンパク質の固定化が終了するという報告もあるので、様々な固定化担体、そしてリガンドと酵素の組み合わせを検討することができる。この組み合わせの選択も基本的に制限はなく、リガンドの反応に適したｐＨで使用する酵素が安定であればよい。また、リガンドの長さに関しても固定化するタンパク質の大きさを考慮して選択するとよい。
【００２８】
本発明で使用するタンパク質分解酵素も、特に限定はされない。プロテアーゼはその基質特異性により様々なグループに分けられているが、我々が糖鎖を取り出す原料とする糖タンパク質も前記で述べたように非常に多様性に富んでいる分子であるため、糖鎖を取り出すための目的糖タンパク質に合わせて酵素を選択する必要がある。一般的には、トリプシン，キモトリプシン，サーモリシン，ペプシンをよく用いる。しかし、次にグリコペプチダーゼでの糖鎖遊離反応を行う際、基質となる糖ペプチドの構造によっては糖鎖の遊離の効率が大きく変わる場合があるので、種々の固定化酵素カラムを調製し、次にどういう構造の糖鎖をとるかに合わせてそれを用いる必要がある。たとえば、一般的に基質糖ペプチドのペプチド部位のアミノ酸数は３−３０が適当といわれている。しかし、前段階のプロテアーゼ処理によって分解された結果、糖鎖に結合したアミノ酸がアスパラギン１個のものは、グリコペプチダーゼによる糖鎖のリリース効率が非常に悪いことが知られている。このために、グリコペプチダーゼ処理に先立ったプロテアーゼでの分解を行う際には、慎重な酵素の選択が必要である。遊離してくる糖鎖にシアル酸が結合している可能性のある場合、シアル酸ごと糖鎖を得るためには、一度タンパク質を還元カルボキシメチル化した後、中性条件下でサーモリシンを使用する。シアル酸が切断されてもよい場合は酸性条件下でペプシン消化する。
【００２９】
本発明でいう糖タンパク質およびグリコペプチターゼとは、エンドグリコシダーゼのことであり、その種類は特に限定されないが、好ましくはエンドグリコシダーゼＤ，エンドグリコシダーゼＨ，エンドグリコシダーゼＦ，ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ，エンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ，エンド−β−ガラクトシダーゼを用いる。
【００３０】
以下に、本発明をより具体的に説明する。
【実施例１】
【００３１】
図２に、本発明の糖鎖精製装置の概略構成図を示す。緩衝液１がポンプ２より送液され、インジェクタ３によって糖たんばく質を含む試料が、緩衝液１の流れ中に注入される。試料は、固定化プロテアーゼカラム４，固定化グリコペプチダーゼカラム５を経ることで糖鎖が遊離され、検出器６で遊離された糖鎖を検出し、フラクションコレクタ７で糖鎖を分取する。検出器６は、例えば紫外吸収を検出するＵＶ検出器が用いられる。
【００３２】
以下に、上記装置の固定化プロテアーゼカラム４，固定化グリコペプチダーゼカラム５についての詳細を示す。
【００３３】
固定化プロテアーゼカラム４は、以下の手順により作成される。
【００３４】
ＣＮＢｒ活性化アガロースゲル０.５ｇを、１ｍＭ塩酸１００ｍＬで３回に分けて洗浄した。これにブタ膵臓由来トリプシン１０００ユニット，１０ｍＭ ＣａＣｌ2，０.０５％ ＮａＮ3を含む２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.２）を５ｍＬ加えて４℃で
１２時間、緩やかに振とうした。固定化酵素をガラスフィルターでろ別し、トリプシンを加えていない上記緩衝液５ｍＬで固定化酵素を洗浄した。上記緩衝液に２mg／ｍＬの濃度になるようにウシ血清アルブミンを溶解した後、この緩衝液で固定化酵素を洗浄し未反応の活性基をブロックした。１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、ついで蒸留水で洗浄したのち、
１０ｍＭ ＣａＣｌ2，０.０５％ ＮａＮ3を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液(ｐＨ8.2)中に固定化酵素を浸漬し４℃で保存した。この固定化ブタ膵臓由来トリプシンをカラムに充填し、固定化プロテアーゼカラム４とした。
【００３５】
固定化グリコペプチダーゼカラム５は、以下の手順により作成される。
【００３６】
Ｎ−スクシニミジル−６−［４′−アジド−２′−ニトロフェニルアミノ］ヘキサノエイト５０mgを２.５６ｍＬ のジメチルスルフォキシドに溶解する。アミノ基で修飾された親水性ビニルポリマービーズを２.７ｍＬ とり、５０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａと０.０５％アジ化ナトリウムを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.２）２３.０ｍＬに縣濁し、Ｎ−スクシニミジル−６−［４′−アジド−２′−ニトロフェニルアミノ］ヘキサノエイト溶液をこれに加え、２４時間、遮光しながら室温で振とうする。Ｎ−スクシニミジル−６−［４′−アジド−２′−ニトロフェニルアミノ］ヘキサノエイトの結合したビーズを遮光状態でガラスフィルターでろ別しながら、１０％（ｖ／ｖ）を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）３００ｍＬ を数回に分けて遮光しながら洗浄する。引き続き１０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａと０.０５％アジ化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.２）３００ｍＬでも洗浄し、１５ｍＬの容器中に移しFlavobacterium maningoseoticum由来グリコペプチダーゼ固定化用担体とした。この固定化担体２.７ｍＬに、１０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａと０.０５％アジ化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.２）を４.０ｍＬ加えたのち、１.０ｍＬ に溶解した５０ミリユニットのFlavobacterium maningoseoticum由来グリコペプチダーゼを加えた。この後、遮光・振とうしながら３００ｎｍの紫外光を照射し、室温で１２時間反応させた。８４００ｇで遠心分離しビーズを回収した後、反応に用いた緩衝液を１００ｍＬ使用してビーズの洗浄を行い、固定化グリコペプチダーゼを得た。これをカラムに充填し、固定化グリコペプチターゼカラム５とした。
【００３７】
上記で作成した固定化プロテアーゼカラム４と固定化グリコペプチダーゼカラム５を図２のように連結して装置に組み込むことで、糖鎖の遊離反応を実施した例を図１に示す表の左欄に示す。
【００３８】
精製卵白アルブミン１００mgを２ｍＭメルカプトエタノール，１％ノニデートＰ−４０，０.１％ＳＤＳを含む１２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.６）１ｍＬに溶解し、試料としてインジェクタ３から注入する。ポンプ２は、緩衝液１を流速２μＬ／ｍｉｎで通液する。注入された試料は、固定化プロテアーゼカラム４を介し、引き続き固定化グリコペプチダーゼカラム５に流入し、反応を行う。カラム温度は３７℃で、反応時間は２４時間である。固定化グリコペプチダーゼカラム５より流出した反応液を検出器６で紫外吸収を測定し、紫外吸収のある画分をフラクションコレクタ７により分取する。固定化グリコペプチダーゼカラム５より流出した反応液は、ペプチドから糖鎖が遊離しているため、これにより、糖鎖のみを切り出すことができる。
【００３９】
また、図１から分かるように、本実施例の装置を用いることで、従来の手法に比べて非常に簡単な工程で、糖鎖精製を行うことが可能となる。
【００４０】
たとえば、従来法では不可欠であったタンパク質消化後のプロテアーゼを失活させる熱処理工程が不要になり、次反応に用いるグリコプロテアーゼが前工程での残存プロテアーゼにより分解されるという問題が本装置では容易に解決できる。このため本精製装置は、「一度糖タンパク質試料をこのシステムにインジェクトすると遊離した糖鎖とアミノ酸のみが得られる」というほどに簡便化・省力化されたものであり、作業工程の自動化を図ることが可能である。
【実施例２】
【００４１】
実施例１においては、固定化プロテアーゼカラム４および固定化グリコペプチダーゼカラム５のそれぞれ１本を連結して糖鎖精製を実施したが、糖タンパク質の種類によっては、１種類のプロテアーゼもしくは１種類のグリコペプチターゼでは精製が達成されない場合が発生する。上記の場合においては、複数の固定化プロテアーゼカラムおよび複数の固定化グリコペプチダーゼカラムを使用して精製を行う必要がある。この場合の実施例について図３を用いて説明する。
【００４２】
図３は、２種類の固定化プロテアーゼカラムおよび２種類のグリコペプチダーゼカラムを使用して糖鎖精製装置を構成した例である。
【００４３】
ここで、切替バルブｂ１０は、インジェクタ３と固定化プロテアーゼカラム４或いは固定化プロテアーゼカラム２３を結ぶ流路と、接続流路ａ１２と固定化プロテアーゼカラム２３或いは固定化プロテアーゼカラム４を結ぶ流路とを交互に切り替え可能である。切替バルブｃ１１は、固定化プロテアーゼカラム４と接続流路ｂ１３或いは検出器６を結ぶ流路と、固定化プロテアーゼカラム２３と検出器６或いは接続流路ｂ１３を結ぶ流路とを交互に切り替え可能である。切替バルブｄ１４は、検出器６と切替バルブｅ１５或いは接続流路ａ１２を結ぶ流路と、接続流路ｂ１３と接続流路ａ１２或いは切替バルブｅ１５を結ぶ流路とを交互に切り替え可能である。
【００４４】
切替バルブｅ１５は、切替バルブｄ１４と固定化グリコペプチダーゼカラム５或いは固定化グリコペプチダーゼカラム２４を結ぶ流路と、接続流路ｃ１８と固定化グリコペプチダーゼカラム２４或いは固定化グリコペプチダーゼカラム５を結ぶ流路とを交互に切り替え可能である。切替バルブｆ１６は、固定化グリコペプチダーゼカラム５と接続流路ｄ19或いは検出器１７を結ぶ流路と、固定化グリコペプチダーゼカラム２４と検出器１７或いは接続流路ｄ１９を結ぶ流路とを交互に切り替え可能である。切替バルブｇ２０は、検出器１７と切替バルブｈ２１或いは接続流路ｃ１８を結ぶ流路と、接続流路ｄ１９と接続流路ｃ１８或いは切替バルブｈ２１を結ぶ流路とを交互に切り替え可能である。
【００４５】
図３の装置では、例えば以下のように処理が行われる。
【００４６】
ポンプ２が、緩衝液１を送液し、インジェクタ３から試料が注入される。注入された試料は、切替バルブｂ１０を介し、固定化プロテアーゼカラム４へ導かれる。その後、切替バルブｃ１１，接続流路ｂ１３，切替バルブｄ１４，接続流路ａ１２，切替バルブｂ１０を介し、固定化プロテアーゼカラム２３へ導かれる。これにより、２種類の固定化プロテアーゼカラムにより、糖タンパク質を糖ペプチドへ分割することができる。その後、切替バルブｃ１１，検出器６，切替バルブｄ１４を介して、次の固定化グリコペプチダーゼカラムによる工程に導入する。
【００４７】
切替バルブｄ１４から導かれた溶液は、切替バルブｅ１５を介して固定化グリコペプチダーゼカラム５へ導かれる。その後、切替バルブｆ１６，接続流路ｄ１９，切替バルブ
ｇ２０，接続流路ｃ１８，切替バルブｅ１５を介し、固定化グリコペプチダーゼカラム
２４へ導かれる。これにより、２種類の固定化グリコペプチダーゼカラムにより、糖鎖をペプチドから遊離することができる。その後、切替バルブｆ１６，検出器１７，切替バルブｇ２０を介して、フラクションコレクタ７側へ導かれる。
【００４８】
フラクションコレクタ７で分取される際は、切替バルブｈ２１をフラクションコレクタ７側へ切り替え、検出器１７で紫外吸収を測定し、紫外吸収のある画分をフラクションコレクタ７により分取する。
【００４９】
上記では、２つの固定化プロテアーゼカラム，２つの固定化グリコペプチダーゼカラムをそれぞれ１回通した処理であるが、これに限らず、複数回各カラムを通すようにしても良い。これは、各切替バルブの制御で容易に行うことができる。また、各固定化プロテアーゼカラム，各固定化グリコペプチダーゼカラムは、それぞれ異なる性質のものであっても良いし、同じ物を用意しても良い。
【００５０】
また、図３の例では、洗浄するための手段も備えている。
【００５１】
洗浄を行う場合は、切替バルブａ９を洗浄液８側、切替バルブｂ１０を固定化プロテアーゼカラム４側、切替バルブｃ１１を固定化プロテアーゼカラム４と接続流路ｂ１３が繋がる側に、切替バルブｄ１４を接続流路ｂ１３と切替バルブｅ１５が繋がる側に、切替バルブｅ１５は切替バルブｄ１４と接続流路ｃ１８が繋がる側に、切替バルブｇ２０は接続流路ｃ１８と切替バルブｈ２１が繋がる側に、切替バルブｈ２１をドレイン２２側に切替えた後に、洗浄液８をポンプ２により送液することで、固定化プロテアーゼカラム４の洗浄を実施する。同様に、各切替えバルブを切替えることで、固定化プロテアーゼカラム
２３，固定化グリコペプチダーゼカラム５，固定化グリコペプチダーゼカラム２４の洗浄を実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】糖タンパク質糖鎖の精製方法に関して、本発明と従来法の比較した図である。
【図２】実施例１の糖鎖精製装置の概略構成図である。
【図３】実施例２の糖鎖精製装置の概略構成図である。
【符号の説明】
【００５３】
１…緩衝液、２…ポンプ、３…インジェクタ、４，２３…固定化プロテアーゼカラム、５，２４…固定化グリコペプチダーゼカラム、６…検出器、７…フラクションコレクタ、８…洗浄液、９…切替バルブａ、１０…切替バルブｂ、１１…切替バルブｃ、１２…接続流路ａ、１３…接続流路ｂ、１４…切替バルブｄ、１５…切替バルブｅ、１６…切替バルブｆ、１７…検出器、１８…接続流路ｃ、１９…接続流路ｄ、２０…切替バルブｇ、２１…切替バルブｈ、２２…ドレイン。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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