(57)【要約】【課題】蛍光標識されたタンパク質とサンプルとの反応との反応を、簡便かつ短時間で精度よく検出する方法を提供する。【解決手段】細胞外遺伝子発現システムまたは細胞外転写・翻訳システムなどの発現システムを用いて、構築したベクターからタンパク質を発現させる反応を行う。このとき、蛍光標識したアミノ酸を、蛍光標識したアミノ酸を持つtRNAの形などで発現システムに導入する。タンパク質の発現に伴い蛍光標識されたアミノ酸がタンパク質に取り込まれ、蛍光標識したタンパク質（以下、蛍光標識タンパク質と呼ぶ）が生成される。蛍光標識タンパク質とサンプルＳを混合して混合液を作り、FCS測定を行う。FCS測定での測定値に基づいて、反応の有無を検出する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外でタンパク質の発現を行う発現システム、タンパク質をコードする遺伝子を組み込まれたベクター、および蛍光標識されたアミノ酸を用いて、蛍光標識されたタンパク質を合成するステップと、
前記蛍光標識されたタンパク質を含む溶液とサンプルとを混合するステップと、
蛍光解析法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の大きさ、明るさまたは数を求めるステップと
を有することを特徴とするタンパク質とサンプルとの反応を検出する方法。
【請求項２】
前記蛍光解析法は、蛍光相関分光法(FCS)、蛍光相互相関分光法(FCCS)、蛍光強度分布解析法（FIDA）、多項目蛍光強度分布解析法（FIMDA）または蛍光偏光解析法(FIDA-polarization)であることを特徴とする請求項１のタンパク質とサンプルとの反応を検出する方法。
【請求項３】
細胞外でタンパク質の発現を行う発現システム、タンパク質をコードする遺伝子を組み込まれたベクター、および蛍光標識されたアミノ酸を用いて、蛍光標識されたタンパク質を合成するステップと、
前記蛍光標識されたタンパク質を含む溶液、サンプルおよび前記タンパク質に反応する物質を混合するステップと、
蛍光解析法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の大きさ、明るさまたは数を求めるステップと
を有することを特徴とするタンパク質とサンプルとの反応を検出する方法。
【請求項４】
細胞外でタンパク質の発現を行う発現システム、タンパク質をコードする遺伝子を組み込まれたベクター、および蛍光標識されたアミノ酸を用いて、蛍光標識されたタンパク質を合成するステップと、
前記蛍光標識されたタンパク質を含む溶液とサンプルとを混合して第一の混合液をつくるステップと、
蛍光解析法により第一の混合溶液中の蛍光標識を有する物質の大きさ、明るさまたは数を求める第一の解析ステップと、
前記蛍光標識されたタンパク質を含む溶液、サンプルおよび前記タンパク質に反応する物質を混合して第二の混合液をつくるステップと、
蛍光解析法により第二の混合溶液中の蛍光標識を有する物質の大きさ、明るさまたは数を求める第二の解析ステップと、
第一の解析ステップで求められた蛍光標識を有する物質の大きさ、明るさまたは数と
第二の解析ステップで求められた蛍光標識を有する物質の大きさ、明るさまたは数とに基づいて、前記反応する物質による反応への促進、阻害または影響無しを検出するステップと
を有することを特徴とするタンパク質とサンプルとの反応を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質とサンプルとの反応を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特開2000-139468号公報は、標識物質よりなるラベル部と、タンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物よりなるアクセプター部とから構成されるラベル化試薬の存在下、プロモーター領域の制御下にある、終止コドンが削除されたコーディング領域からなるDNAから転写された産物を鋳型として無細胞翻訳系または生細胞系でタンパク質合成を行うことを記載する。
【０００３】
特許第2953783号公報は、遺伝子転写レベルで活性な医薬の有効な同定方法を記載する。  
特開2001-321199号公報は、生物学的資料中のDNA結合タンパク質を定量する方法を記載する。
【０００４】
特開2003-88369号公報は、蛍光相関分光法(FCS)を利用してDNAエンドヌクレアーゼ活性を検出する方法、および分子量の大小と並進拡散時間(translational diffusion time)の大小との関係を記載する。  
特表2002-543414号公報は、試料中の蛍光分子又は他の粒子を特徴付ける方法、および蛍光強度多重(multiple)分布分析(FIMDA)および蛍光自己たたみ込み(autoconvoluted)強度分布分析(FACID)から並進拡散時間が得られることを記載する。
【特許文献１】特開2000-139468号公報
【特許文献２】特許第2953783号公報
【特許文献３】特開2001-321199号公報
【特許文献４】特開2003-88369号公報
【特許文献５】特表2002-543414号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記従来技術のうち、特許第2953783号公報、特開2001-321199号公報および特開2003-88369号公報に記載される各検出方法は、特定の配列、または特定の配列を有する分子を検出する際に、放射性同位元素を用いたり、電気泳動法や固体基質への分子の固定による選別などを行うので、操作が煩雑で検出結果を得るまでに時間がかかる問題がある。
【０００６】
また、タンパク質を標識するために、タンパク質にGFPやユーロを取り込ませるあるいは融合させる方法は、タンパク質にタンパク質以外の大きな物質を取り込ませることになるので、タンパク質の本来の機能を維持することができない。従って、そのようなタンパク質を用いて反応実験を行っても、生体内で実際に行われている反応を精度良く再現することが難しい、という問題がある。
【０００７】
特許第2953783号公報、特開2001-321199号公報および特開2003-88369号公報は、タンパク質の解析のために、蛍光相関分光法(FCS)、蛍光強度多重(multiple)分布分析(FIMDA)および蛍光自己たたみ込み(autoconvoluted)強度分布分析(FACID)を用いることを記載しない。  
特開2003-88369号公報および特表2002-543414号公報は、蛍光標識されたタンパク質とサンプルとの反応を検出する方法については記載しない。
【０００８】
本発明の目的は、蛍光標識されたタンパク質とサンプルとの反応を、簡便かつ短時間で精度よく検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成する本発明の特徴は、細胞外でタンパク質の発現を行う発現システム、タンパク質をコードする遺伝子を組み込まれたベクター、および蛍光標識されたアミノ酸を用いて、蛍光標識されたタンパク質を合成し、蛍光標識されたタンパク質を含む溶液とサンプルとを混合し、蛍光解析法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の大きさ、明るさまたは数を求めることにある。
【００１０】
この特徴によれば、タンパク質にタンパク質以外の大きな物質を取り込ませることやタンパク質を化学修飾することなしに、タンパク質を蛍光標識でき、タンパク質本来の機能を維持したままで反応実験を行うことができ、各溶液の混合と蛍光解析法によって蛍光標識を有する物質の大きさ、明るさまたは数を求めることができるので、放射性同位元素の利用、電気泳動法、固体基質への分子の固定作業、洗浄作業などの煩雑な操作を行わずに、反応の有無、タンパク質の大きさの変化、明るさの変化、数の変化などの検出結果を簡便に短時間で精度良く得ることができる。
【００１１】
特に、タンパク質と反応物質とを溶液中で混合して反応させるという、ホモジーニアスな系での反応実験ができるので、試薬の移動などが自動化でき、様々な形の反応容器が使用できる。そしてマイクロプレート上で一度に大量のサンプルを扱うことができるので、計数的または連続的に簡便に短時間で精度良く解析できる。また、固体支持体を用いないので、固相化しにくいタンパク質でも反応と解析ができる。
【００１２】
また、各溶液の混合と、蛍光相関分光法(FCS)、蛍光相互相関分光法(FCCS)、蛍光強度分布解析法（FIDA）、多項目蛍光強度分布解析法（FIMDA）または蛍光偏光解析法(FIDA-polarization)の利用により、浮遊系における反応生成物の大きさの変化、明るさの変化、数の変化をｎＭオーダーという非常に良い感度で検出することができる。
【００１３】
本発明の他の特徴は、細胞外でタンパク質の発現を行う発現システム、タンパク質をコードする遺伝子を組み込まれたベクター、および蛍光標識されたアミノ酸を用いて、蛍光標識されたタンパク質を合成し、蛍光標識されたタンパク質を含む溶液とサンプルとタンパク質に反応する物質とを混合し、蛍光解析法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の大きさ、明るさまたは数を求めることにある。
【００１４】
この特徴によれば、タンパク質にタンパク質以外の大きな物質を取り込ませることやタンパク質を化学修飾することなしに、タンパク質を蛍光標識でき、タンパク質本来の機能を維持したままで反応実験を行うことができ、各溶液の混合と蛍光解析法によって蛍光標識を有する物質の大きさ、明るさまたは数を求めることができるので、放射性同位元素の利用、電気泳動法、固体基質への分子の固定作業、洗浄作業などの煩雑な操作を行わずに、反応の有無、タンパク質の大きさの変化、明るさの変化、数の変化や、タンパク質に反応する物質による反応への促進、阻害または影響無しなどの検出結果を簡便に短時間で精度良く得ることができる。
【００１５】
本発明の他の特徴は、細胞外でタンパク質の発現を行う発現システム、タンパク質をコードする遺伝子を組み込まれたベクター、および蛍光標識されたアミノ酸を用いて、蛍光標識されたタンパク質を合成し、  
蛍光標識されたタンパク質を含む溶液とサンプルとを混合して第一の混合液をつくり、  
蛍光標識されたタンパク質を含む溶液とサンプルとタンパク質に反応する物質とを混合して第二の混合液をつくり、  
蛍光解析法により第一の混合溶液中の蛍光標識を有する物質の大きさ、明るさまたは数を求め、  
蛍光解析法により第二の混合溶液中の蛍光標識を有する物質の大きさ、明るさまたは数を求め、  
反応する物質による反応への促進、阻害または影響無しを検出することにある。
【００１６】
この特徴によれば、タンパク質にタンパク質以外の大きな物質を取り込ませることやタンパク質を化学修飾することなしに、タンパク質を蛍光標識でき、タンパク質本来の機能を維持したままで反応実験を行うことができ、各溶液の混合と蛍光解析法によって蛍光標識を有する物質の大きさ、明るさまたは数を求めることができるので、放射性同位元素の利用、電気泳動法、固体基質への分子の固定作業、洗浄作業などの煩雑な操作を行わずに、反応の有無、タンパク質の大きさの変化、明るさの変化、数の変化や、タンパク質に反応する物質による反応への促進、阻害または影響無しなどの検出結果を簡便に短時間で精度良く得ることができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、タンパク質本来の機能を維持したままで反応実験を行うことができ、放射性同位元素の利用、電気泳動法、固体基質への分子の固定作業、洗浄作業などの煩雑な操作を行わずに、反応の有無、タンパク質の大きさの変化、明るさの変化、数の変化などの検出結果を簡便に短時間で精度良く得ることができる。
【００１８】
また、各溶液の混合と、蛍光相関分光法(FCS)、蛍光相互相関分光法(FCCS)、蛍光強度分布解析法（FIDA）、多項目蛍光強度分布解析法（FIMDA）または蛍光偏光解析法(FIDA-polarization)の利用により、浮遊系における反応生成物の大きさの変化、明るさの変化、数の変化をｎＭオーダーという非常に良い感度で検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本実施の様態では、以下の手順でタンパク質の解析を行う。図１に手順の例を示す。  
（１）遺伝子発現のためのベクター構築  
解析したいタンパク質をコードする遺伝子を、プロモーター領域およびターミナル領域を持つベクター内に組み込む。
【００２０】
（２）タンパク質の発現と蛍光標識の導入  
細胞外遺伝子発現システムまたは細胞外転写・翻訳システムなどの発現システムを用いて、構築したベクターからタンパク質を発現させる反応を行う。このとき、蛍光標識したアミノ酸を、蛍光標識したアミノ酸を持つtRNAの形などで発現システムに導入する。タンパク質の発現に伴い蛍光標識されたアミノ酸がタンパク質に取り込まれ、蛍光標識したタンパク質（以下、蛍光標識タンパク質と呼ぶ）が生成される。
【００２１】
（３）タンパク質の精製  
蛍光標識タンパク質を精製する。解析方法によっては、精製せずにそのまま利用してもよい。
【００２２】
（４）反応実験  
蛍光標識タンパク質とサンプルＳを混合して混合液Ａを作り、生体内の温度条件、例えば３７℃で反応させる。また、混合液Ａに蛍光標識タンパク質に反応することがわかっている物質Ｐを加えて混合液Ｂを作ってもよい。
【００２３】
（５）ＦＣＳ解析  
反応させた混合液をFCS測定用のガラスボトムプレート、例えばマイクロプレートに移し、FCS測定を行う。FCS測定での測定値に基づいて、反応の有無を検出する。
【００２４】
FCS測定では、微小領域内の蛍光分子の揺らぎを測定し、求められた値に基づいて並進拡散時間(Diffusion Time)を求める。並進拡散時間の大小は分子量の大小を示すので、反応の前後で並進拡散時間を比較することにより、分子量の増加または減少がわかる。分子量の増加は生体分子間の結合反応を、分子量の減少は生体分子の分解反応を、分子量の維持は生体分子に結合も分解も無かったことを示す。従って、蛍光標識タンパク質とサンプルとの反応の前後で、蛍光標識された物質の並進拡散時間の増加を検出することにより、蛍光標識タンパク質とサンプルとの結合反応を検出することができる。
【００２５】
また、未精製の蛍光標識タンパク質を用いたときには、未反応の蛍光標識tRNAとの２成分解析(2comp解析)を行うことによって、タンパク質の並進拡散時間の変化を解析できる。
【００２６】
上述した手順では、（５）で反応生成物の並進拡散時間を求めるために蛍光相関分光法(fluorescence correlation spectroscopy：FCS)を用いたが、蛍光相関分光法(FCS)の代わりに、蛍光相互相関分光法(fluorescence cross correlation spectroscopy)、蛍光強度分布解析法（Fluorescence Intensity Distribution Analysis）、多項目蛍光強度分布解析法（Fluorescence Intensity Multiple Distribution Analysis）または蛍光偏光解析法(FIDA-polarization)を用いてもよい。これらの解析法から、反応後のタンパク質結合分子の大きさ、数、明るさに関連するデータを求める。これらのデータから、反応前後での分子の大きさの変化、数の変化、明るさの変化を得ることができる。例えば、FCS測定の結果、反応の前後でタンパク質の大きさに顕著な差はないが、1分子あたりの蛍光の明るさに変化がある場合には、蛍光強度分布解析法（FIDA）を行うことによって、反応の有無を知ることができる。
【００２７】
次に、（４）作る混合液ＡおよびＢによる解析結果の違いについて説明する。  
（Ａ）蛍光標識タンパク質とサンプルＳとの混合液  
（３）で得られた蛍光標識タンパク質とサンプルＳを混合して反応実験を行う。次に、蛍光相関分光法(FCS)、蛍光相互相関分光法(FCCS)、蛍光強度分布解析法（FIDA）、多項目蛍光強度分布解析法（FIMDA）または蛍光偏光解析法(FIDA-polarization)を用いて、蛍光標識された反応生成物について大きさ、明るさ、数のデータを得る。これらのデータに基づいて、反応の前後での反応生成物の大きさの変化、明るさの変化、数の変化を求める。変化があれば、蛍光標識タンパク質とサンプルとが反応していることを検出できたことになる。また、蛍光標識タンパク質とサンプルによる反応性生物の数や反応の度合いを定量できたことになる。
【００２８】
（Ｂ）蛍光標識タンパク質、サンプルＳ、蛍光標識タンパク質に反応することがわかっている物質Ｐとの混合液  
（３）で得られた蛍光標識タンパク質とサンプルＳ、そして蛍光標識タンパク質に反応することがわかっている物質Ｐと混合して反応実験を行う。次に、蛍光相関分光法(FCS)、蛍光相互相関分光法(FCCS)、蛍光強度分布解析法（FIDA）、多項目蛍光強度分布解析法（FIMDA）または蛍光偏光解析法(FIDA-polarization)を用いて、蛍光標識された反応生成物について大きさ、明るさ、数のデータを得る。これらのデータに基づいて、反応の前後での反応生成物の大きさの変化、明るさの変化、数の変化、そして、物質Ｐによる反応の促進・阻害・変化なしを求める。これらの結果から蛍光標識タンパク質とサンプルとが反応していることを検出できたことになる。また、反応性生物の数や反応の度合いを定量できたことになる。
【００２９】
さらに、（Ａ）の混合液を使った場合に求められた反応生成物の大きさの変化、明るさの変化、数の変化と、（Ｂ）の混合液を使った場合に求められた反応生成物の大きさの変化、明るさの変化、数の変化とを比較することにより、蛍光標識タンパク質とサンプルとの反応の検出、蛍光標識タンパク質とサンプルによる反応性生物の数や反応の度合いをより精度良く定量できる。
【００３０】
本実施例によれば、タンパク質にタンパク質以外の大きな物質を取り込ませることやタンパク質を化学修飾することなしに、タンパク質を蛍光標識でき、タンパク質本来の機能を維持したままで反応実験を行うことができるので、反応の有無、タンパク質の大きさの変化などを精度良く検出することができる。
【００３１】
また、蛍光標識タンパク質とサンプル、その他の混合と、蛍光相関分光法(FCS)、蛍光相互相関分光法(FCCS)、蛍光強度分布解析法（FIDA）、多項目蛍光強度分布解析法（FIMDA）または蛍光偏光解析法(FIDA-polarization)の利用により、浮遊系における反応生成物の大きさの変化、明るさの変化、数の変化をｎＭオーダーという非常に良い感度で検出することができる。
【００３２】
また、放射性同位元素の利用、電気泳動法、固体基質への分子の固定作業、洗浄作業などの煩雑な操作を行わずに、検出結果を簡便に短時間で得ることができる。特に、タンパク質と反応物質とを溶液中で混合して反応させるという、ホモジーニアスな系での反応実験ができるので、試薬の移動などが自動化でき、様々な形の反応容器が使用できる。そしてマイクロプレート上で一度に大量のサンプルを扱うことができるので、計数的または連続的に簡便に短時間で精度良く解析できる。また、固体支持体を用いないので、固相化しにくいタンパク質でも反応と解析ができる。
【００３３】
また、本発明は、自動分注機、プレートスタッカーを用いれば、大量のサンプルについて、蛍光標識タンパク質が反応するかどうかを解析するような、スクリーニング作業にも応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本実施様態におけるタンパク質解析手順の例を示す図。
【図１】
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