(57)【要約】【課題】  ｍＲＮＡの逆転写により生成されるターゲットｃＤＮＡの鎖長制御方法を提供する。【解決手段】  ｍＲＮＡの逆転写反応において、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーと、ジデオキシ核酸（Dideoxynucleic acid）を添加し、逆転写反応により伸長される相補ＤＮＡ鎖長を制御する。【選択図】  図３ 
2005040089.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡの逆転写反応において、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーと、ジデオキシ核酸（Dideoxynucleic acid）を添加し、逆転写反応により伸長される相補ＤＮＡ鎖長を制御することを特徴とする断片化ｃＤＮＡターゲットの作成方法。
【請求項２】
前記ランダムオリゴヌクレオチドプライマーが蛍光標識されていることを特徴とする請求項１に記載の断片化ｃＤＮＡターゲットの作成方法。
【請求項３】
ＤＮＡマイクロアレイにおけるターゲットｍＲＮＡの逆転写反応に用いられることを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の断片化ｃＤＮＡターゲットの作成方法。
【請求項４】
ランダムオリゴヌクレオチドプライマーと、ジデオキシ核酸（Dideoxynucleic acid）を含むことを特徴とするｍＲＮＡ逆転写反応用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ターゲットｍＲＮＡの逆転写により生成されるターゲットｃＤＮＡの鎖長制御に関する。特に、蛍光標識された断片化ｃＤＮＡターゲットの作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、アンチセンス（antisense）ＲＮＡ（以下ａＲＮＡという）ターゲットの断片化方法は知られているが、ｃＤＮＡターゲットの鎖長制御方法は知られていない。
【０００３】
Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ（Polymerase）を用いてｍＲＮＡを蛍光標識する方法では、Ｔ７ プロモーター（promoter）を有するポリ（Ｔ）プライマーを用い逆転写反応を介して二本鎖ｃＤＮＡを生成し、そのあとＴ７ ＲＮＡ ポリメラーゼを用いてａＲＮＡを増幅する。この際、ａＲＮＡの鎖長は長いもので数キロベース長以上に達する。また、ＲＮＡ鎖は塩基同士の相補結合（水素結合）のエネルギーが高いため、二次構造を形成しやすい。その二次構造は、マイクロアレイ実験でのハイブリダイゼーション反応の障害となる。このため、オリゴヌクレオチドをプローブとして使うマイクロアレイでは、ａＲＮＡの鎖長を１００〜３００塩基長にマグネシウムイオンか亜鉛イオンを使い断片化する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、一本鎖ｃＤＮＡはａＲＮＡとは違い、Ｍｇ++又はＺｎ++では断片化することができないという問題がある。
【０００５】
また、蛍光標識方法として蛍光分子を付加したヌクレオチドの派生体を塩基伸長時に取り込ませる方法が知られているが、２色の蛍光分子で異なるターゲットを標識する場合に取込み効率の差が生じ、蛍光強度データ精度の低下を生じるという問題がある。
【０００６】
上記問題に鑑み、本発明の目的は、オリゴヌクレオチドプローブを使用したマイクロアレイ実験用のターゲット蛍光標識作業を逆転写反応のみで高感度を提供する標識並びに断片化する方法論を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明者らは、ターゲットｍＲＮＡの逆転写反応において、特定の物質の組合せを添加することで、逆転写反応により伸長される相補ＤＮＡ鎖長を制御できることを見出し、本発明に到達した。
【０００８】
即ち、第１に、本発明は断片化ｃＤＮＡターゲットの作成方法の発明であり、ｍＲＮＡの逆転写反応において、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーと、ジデオキシ核酸（Dideoxynucleic acid）を添加し、逆転写反応により伸長される相補ＤＮＡ鎖長を制御することを特徴とする。
【０００９】
ここで、ランダムプライマーが蛍光標識されていると、蛍光強度が増加し、好ましい。
【００１０】
本発明の断片化ｃＤＮＡターゲットの作成方法は、特に、ＤＮＡマイクロアレイにおけるターゲットｍＲＮＡの逆転写反応に好ましく用いられる。
【００１１】
上記構成をとることにより、本発明は、手段として可能な逆転写開始地点を増やすためのランダムプライマーに複数の蛍光分子をカプリングさせ、逆転写効率を妨げない鎖長を備え、その結果蛍光強度を増加させることができる。
【００１２】
又、本発明は、断片化を行う手法として、逆転写反応において塩基の伸長を抑止するジデオキシ核酸（Dideoxynucleic acid）を用い鎖長を制御することができる。更に、逆転写反応にランダムプライマーを用いターゲットｍＲＮＡの全領域をカバーすることができる。
【００１３】
第２に、本発明は上記断片化ｃＤＮＡターゲットの作成方法に用いる試薬キットの発明であり、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーと、ジデオキシ核酸（Dideoxynucleic acid）を含むことを特徴とするｍＲＮＡ逆転写反応用キットである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、下記の効果を奏する。
１）ｍＲＮＡの逆転写反応において、逆転写反応により伸長される相補ＤＮＡ鎖長を制御することが可能となり、ｃＤＮＡターゲットを断片化できる。
２）オリゴヌクレオチドプローブを使用したマイクロアレイ実験用のターゲット蛍光標識作業を逆転写反応のみで高感度の標識付与ができる。
３）逆転写開始地点を増やすためのランダムプライマーに複数の蛍光分子をカプリングさせ、逆転写効率を妨げない鎖長を備え、その結果蛍光強度を増加する。
４）逆転写反応にランダムプライマーを用いることで、ターゲットｍＲＮＡの全領域をカバーできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を実施する場合の一形態を図面を参照して具体的に説明する。
【００１６】
図１は、ジデオキシ核酸（Dideoxynucleic acid）を用いたｃＤＮＡ長の制御を示す模式図である。図１の１０１は、通常のポリ（Ｔ）プライマーを使った逆転写の様子を表す。この反応中ではプライマーの３’末端−ＯＨにヌクレオチドを一つづつ追加してゆく。この酵素反応による伸張の長さは７０００塩基以上に及ぶ。また、この反応は一本のｍＲＮＡに一本のプライマーが伸張の開始点となり一本のｃＤＮＡが生成される。
【００１７】
図１の１０２では、そこへジデオキシ核酸（Dideoxynucleic acid）を投入する。このジデジキシ核酸は次のヌクレオチドを繋げるための水酸基を有しないために、ｃＤＮＡの伸張を止める機能がある。この性質を利用したものはＤＮＡ塩基配列決定（シーケンシング）方法論に使われている。この伸張の長さはジデオキシ核酸の濃度に反比例する。本発明では、１００〜３００塩基長になるジデオキシ核酸の濃度を決定する。
【００１８】
図２は、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーによるｃＤＮＡの増幅効果を示す模式図である。図２の２０１は通常のポリ（Ｔ）プライマーを用いた逆転写反応であって、前述した様に１本のｍＲＮＡから１本のｃＤＮＡが生成される。これに対して、図２の２０２は、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーをポリ（Ｔ）プライマーの代替で使用した場合である。ランダムオリゴヌクレオチドプライマーは１本のｍＲＮＡ上に複数の逆転写開始地点を設けることが出来るので、ｍＲＮＡの広範囲の複数の箇所でｃＤＮＡが生成される。この頻度はランダムオリゴヌクレオチドプライマーの塩基長により決定されてくる。本発明では、ジデオキシ核酸を併用した場合にランダムオリゴヌクレオチドプライマーの塩基長と生成ｃＤＮＡの塩基長との組み合わせを、逆転写生成物をオリゴマイクロアレイでのターゲットとして使用したときの感度とデータの整合性（実際の遺伝子発現度合い）により決定するものである。
【００１９】
図３は、ジデオキシ核酸（Dideoxynucleic acid）及びランダムオリゴヌクレオチドプライマーを併用する場合で、ジデオキシ核酸（Dideoxynucleic acid）を用いたｃＤＮＡ長の制御、及びランダムオリゴヌクレオチドプライマーによるｃＤＮＡの増幅効果を示す模式図である。図３の３０１に示すように、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーによって、１本のｍＲＮＡ上に複数の逆転写開始地点が設けられ、ｍＲＮＡの広範囲の複数の個所でｃＤＮＡが生成される。これに加えて、系中のジデオキシ核酸（Dideoxynucleic acid）は次のヌクレオチドを繋げるための水酸基を有しないために、ｃＤＮＡの伸張を止め、ｃＤＮＡターゲットを断片化することができる。このように、図１及び図２の相乗効果により逆転写開始点の総数が増え、且つｃＤＮＡ塩基長が１００−３００に調整される。
【００２０】
このランダムオリゴヌクレオチドプライマーには蛍光色素、又は、蛍光色素をカプリングするためのリンカーがついたヌクレオチドが導入されている。このため、蛍光色素を直接逆転写時に導入する方法と比べ、導入効率の差が出ないのが特徴とり、マイクロアレイを使った実験での２色比較法での利用に適している。
【産業上の利用可能性】
【００２１】
オリゴヌクレオチドプローブを使用したマイクロアレイ実験用のターゲット蛍光標識作業を逆転写反応のみで感度向上させることができる。これにより、ｍＲＮＡの逆転写によるｃＤＮＡの検索及び利用に役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ジデオキシ核酸（Dideoxynucleic acid）を用いたｃＤＮＡ長の制御を示す模式図である。
【図２】ランダムオリゴヌクレオチドプライマーによるｃＤＮＡの増幅効果を示す模式図である。
【図３】ジデオキシ核酸（Dideoxynucleic acid）及びランダムオリゴヌクレオチドプライマーを併用する場合で、ジデオキシ核酸（Dideoxynucleic acid）を用いたｃＤＮＡ長の制御、及びランダムオリゴヌクレオチドプライマーによるｃＤＮＡの増幅効果を示す模式図である。
【図１】
2005040089.tif 000003
【図２】
2005040089.tif 000004
【図３】
2005040089.tif 000005