(57)【要約】【課題】  担体に固定化されたクチナーゼであって、高いエステル合成活性を有する固定化クチナーゼの製造方法を提供する。【解決手段】  平均孔径が２〜２０ｎｍの細孔を有する担体に、ｐＨ６〜７の条件下でクチナーゼを固定化することを特徴とするエステル合成反応用固定化クチナーゼの製造方法である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均孔径が２〜２０ｎｍの細孔を有する担体に、ｐＨ６〜７の条件下でクチナーゼを固定化することを特徴とするエステル合成反応用固定化クチナーゼの製造方法。
【請求項２】
前記クチナーゼは、クリプトコッカス  エスピー  エス−ツー（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ  Ｓ−２；ＦＥＲＭ  Ｐ−１５１５５）由来である請求項１に記載のエステル合成反応用固定化クチナーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エステル合成反応用固定化クチナーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エステル合成反応により得られるエステル化合物は各種分野で利用されており、エステル交換反応は工業的にみて重要な反応である。例えば、多価カルボン酸と多価アルコールが縮重合したポリエステルはポリウレタンの主要な原料であり、塗料・接着材料・繊維等の汎用品分野から、電子材料等の特殊用途分野まで幅広く利用されている。
従来、エステル化合物を合成する反応（エステル合成反応）として、化学触媒を利用した高温・高圧の反応が行われていた。しかし、化学触媒を利用したエステル合成反応には、反応物中に触媒が残存する、反応副生物ができる、高温・高圧であるため多量のエネルギーを必要とするといった問題があった。
【０００３】
一方、生体触媒である酵素を利用したエステル合成反応は、酵素の高い基質特異性を利用した反応であることから目的物を効率よく製造でき、また温和な条件下の反応であるため使用エネルギーが少ないといった利点を有する。
エステル合成反応を触媒できる酵素としては、リパーゼが一般的に知られている（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照。）。
エステル合成反応は有機溶媒中での反応であることから、これに適用できる酵素は限られており、エステル合成反応に使用可能なその他の酵素が望まれている。
【０００４】
エステル合成活性を有する酵素として、植物の表層を覆うクチン質を分解することを特徴とするクチナーゼが知られている（例えば、非特許文献３、特許文献１参照。）。なお、特許文献１においてクリプトコッカス  エスピー  エス−ツー（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ  Ｓ−２）由来の酵素はリパーゼであると考えられていたが、その後遺伝子などが詳細に検討された結果、クチナーゼであることが明らかとなっている（非特許文献４参照。）
【０００５】
酵素を用いてエステル合成反応を行う場合には、有機溶媒中で反応させることが多い。したがって、酵素の失活を防ぎ、実用化に耐えうる十分な反応を行うためには、酵素を担体に保持させて（固定化して）繰り返し利用することが望ましい。酵素を固定化し利用する方法は、リパーゼにおいて良く知られている。（例えば、特許文献２、特許文献３参照。）
【特許文献１】特開２００２−２３３３９３号公報
【特許文献２】特許第３１１９３１４号公報
【特許文献３】特開平６−３８７５３号公報
【非特許文献１】ＰＯＢＥＲＴＬＯＲＴＩＥ、「バイオテクノロジー・アドバンス（Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅ）」、１９９７年、第１５巻、第１号、ｐ．１−１５
【非特許文献２】Ｅｒｎｓｔ  Ｗｅｈｔｊｅ、Ｐａｔｒｉｃｋ  Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ、「バイオテクノロジー・レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）」、１９９７年６月、第１１巻、第６号、ｐ．５３７−５４０
【非特許文献３】Ｃ．ＳＡＲＡＺＩＮ、Ｇ．ＧＯＥＴＨＡＬＳ、Ｊ．Ｐ．ＳＥＧＵＩＮ、Ｍ．Ｄ．ＬＥＧＯＹ、Ｊ．Ｎ．ＢＡＲＢＯＮ、「バイオカタリシス・イン・ノン‐コンベンショナル  メディア（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｎｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉａ）」、Ｊ．Ｔｒａｍｐｅｒら編、１９９２年、ｐ．２３−２９
【非特許文献４】２００２年度日本生物工学会大会予稿集、講演番号８０５「Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  Ｓ−２由来リパーゼ（クチナーゼ）によるポリ乳酸の分解」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、固定化された酵素の持つ酵素活性は、用いる酵素の種類や坦体、さらに固定化処理時の方法によって異なり、エステル合成活性を実際に発揮させるような至適固定化条件を一般的に特定することはできていない。多くの研究例があるリパーゼにおいても、従来の各種方法では、得られる酵素活性、酵素の固定化量等について、それぞれ一長一短があり、必ずしも満足できる固定化方法が確立されていない。
さらにクチナーゼについては、十分なエステル合成活性を持ち、その利用が期待される酵素であるにも関わらず、これまでクチナーゼを固定化して利用した例はなかった。
【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、担体に固定化されたクチナーゼであって、高いエステル合成活性を有する固定化クチナーゼの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一般に、酵素は分子量によって異なった大きさであり、また酵素反応に重要な部分である活性部位の位置・構造は様々である。酵素を固定化した際に十分な活性を維持させるためには、固定化させたときの活性部位の位置が重要である。即ち、酵素を担体に固定化する際は、酵素を固定化した場合に活性部位が反応すべき基質と十分に接触できるように、例えば坦体表面の外側に酵素の活性部位が位置できるようにすることが望ましい。
【０００９】
また、酵素を固定化する場合、一般的には酵素が失活しないｐＨ、即ち当該酵素の反応の至適ｐＨで固定化する手法が用いられている。その理由は、ｐＨにより酵素の立体構造が変化し失活することを抑制するためであると考えられている。しかし、それら反応の至適ｐＨは、一般的には酵素の分解活性で論じられることが多く、酵素と基質の反応性に主眼が置かれていると共に、酵素が遊離した状態での反応に基づく値である。また、固定化酵素を用いたエステル合成反応においては、固定化酵素が有機溶媒中で使用され、高温での反応が行われる。したがって、酵素が遊離した状態での至適ｐＨを、酵素を固定化させて合成反応を行わせる場合に単に適用しても、エステル合成反応における反応活性が良好になるとは限らない。
【００１０】
本発明者らは、上記観点に基づいて鋭意検討した結果、クチナーゼを固定化する坦体の孔径及びクチナーゼを坦体に固定化させる時のｐＨに着目し、それらを最適に組み合わせることにより上記目的が達成されることを見出した。
すなわち本発明のエステル合成反応用固定化クチナーゼの製造方法は、平均孔径が２〜２０ｎｍの細孔を有する担体に、ｐＨ６〜７の条件下でクチナーゼを固定化することを特徴とする。
前記クチナーゼは、クリプトコッカス  エスピー  エス−ツー（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｕｓ  ｓｐ  Ｓ−２；ＦＥＲＭ  Ｐ−１５１５５）由来であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の製造方法によれば、高いエステル合成活性を有する固定化クチナーゼを容易に提供することができる。しかも、クチナーゼの担体への固定化を効率よく行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のエステル合成反応用固定化クチナーゼ（以下、「固定化クチナーゼ」という。）の製造方法は、平均孔径が２〜２０ｎｍの細孔を有する担体に、ｐＨ６〜７の条件下でクチナーゼを固定化することを特徴とする。
（担体）
本発明に用いられる担体は、平均孔径が２〜２０ｎｍの細孔を有する。
坦体の種類としては、クチナーゼが固定化されうる坦体であり、クチナーゼのエステル合成活性に影響を与えず、操作に際して物理的・化学的に安定であれば良い。
また、固定化クチナーゼをエステル合成反応に用いることを考慮して、エステル合成反応に用いられる溶剤に不溶性の坦体であればよい。
各種溶剤に不溶性の担体として、例えば、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、モレキュラーシーブ、多孔質ガラス、セラミック等の無機坦体、あるいはアクリル樹脂、ポリエステル樹脂、イオン交換樹脂、セルロースパウダー等の有機坦体が挙げられる。本発明においては、有機坦体を用いることが好ましい。
【００１３】
本発明において、坦体の細孔径は重要である。坦体は、多孔質の平均孔径が２〜２０ｎｍであることが必要である。このような坦体としては、例えばレバチット  ＶＰ  ＯＣ  １６００（商品名；バイエル社製、平均孔径１５ｎｍ）、レバチット  ＶＰ  ＯＣ  １０６４ＭＤ（商品名；バイエル社製、平均孔径５−１０ｎｍ）、がある。
【００１４】
（クチナーゼ）
本発明で使用することのできるクチナーゼとしては、種々のクチナーゼ産生微生物に由来するものが例示できる。例えば、クリプトコッカス  エスピー  エス−２（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ  Ｓ−２；ＦＥＲＭ  Ｐ−１５１５５）、フサリウム  ソラニ  ピシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｕ  ｓｏｌａｎｉ  ｐｉｓｉ；ＩＦＯ  ９４２５、ＩＦＯ  ９９７５等）、ボトリチス  シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ；ＡＴＣＣ  １１５４２等）、グロメレラ  シングラータ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｃｉｎｇｕｌａｔａ；ＩＦＯ  ５２５７、ＩＦＯ  ５９０７、ＩＦＯ  ５９１０等）、ファイトフソーラ  ブラシカエ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ；ＣＢＳ  １７８．８７、ＣＢＳ  １７９．８７等）、ファイトフソーラ  カプシシ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｐｓｉｃｉ；ＣＢＳ  １２８．８３、ＣＢＳ  １７８．２６等）、ネクトリア  ハエマトコッカ（Ｎｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｃｏｃａ；ＡＴＣＣ  １６２３９等）、モニリニア  フルクチコラ（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ；ＩＦＯ  ９０６８、ＩＦＯ  ３０４５１等）、ブルメリア  グラミニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、アスペルギルス  オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ；ＩＦＯ  ４０７５、ＩＦＯ  ３０１０２等）、ピレノペジザ  ブラシカエ（Ｐｙｒｅｎｏｐｅｚｉｚａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ；ＡＴＣＣ  ２００７０９、ＡＴＣＣ  ２００７１０、ＡＴＣＣ  ４８３４６、ＡＴＣＣ  ６４６８０等）、アルテルナリア  ブラシシコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ；ＩＦＯ  ３１２２６、ＩＦＯ  ３１２２７等）、アスコチタ  ラビエイ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ  ｒａｂｉｅｉ；ＡＴＣＣ  ２４８９１等）、などの微生物に由来するクチナーゼを、好適な例として挙げることができる。
特に、クリプトコッカス  エスピー  エス−ツー（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｕｓ  ｓｐ  Ｓ−２；ＦＥＲＭ  Ｐ−１５１５５）由来のクチナーゼが好ましい。
上記のクチナーゼは一種以上で使用することが必要であるが、２種以上のものを組み合わせて使用する事も可能である。
なお、クチナーゼ産生微生物に由来するクチナーゼは、クチナーゼ産生微生物自体がタンパク質として産生したものであってもよいし、クチナーゼ産生微生物に由来する遺伝子を導入された他の微生物等が産生したものであってもよい。
【００１５】
（クチナーゼ産生微生物の培養方法）
本発明で使用するクチナーゼは、上記クチナーゼ産生微生物を常法に従って培養し、培養物から分離、精製する事によって取得する事が出来る。例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ  Ｓ−２の場合、ＹＭ培地（酵母エキス０．３質量％、麦芽エキス０．５質量％、ペプトン０．５質量％、グルコース１質量％）にて２５℃、４０時間前後培養（５．４〜５．８×１０８個／ｍｌ）した菌体を、通常の本培養に供する接種菌とする。
本培養として、酵母エキス０．５質量％、ＫＨ２ＰＯ４質量１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１質量％、トリオレイン１質量％を酵素生産培地とし、前培養した菌を１％（ｖ／ｖ）接種し、２５℃１００ｒｐｍの振とう培養を行って、クチナーゼの生産を行うことができる。培養後、クチナーゼを培養物から分離精製する。その方法は常法に従えばよいが、例えば培養物を濃縮した後、クロマトグラフィー処理等の既知の精製方法を組み合わせて行えば良い。
【００１６】
（固定化時のｐＨ）
本発明においては、担体にクチナーゼを固定化させる時のｐＨを６〜７に調整することが重要である。
例えば、ｐＨ６〜７に調整したクチナーゼ溶液に、前記担体を添加してクチナーゼ‐担体含有液を調製することで、ｐＨ６〜７の条件下でクチナーゼと担体とを接触させ、固定化クチナーゼを含む溶液を得ることができる。
【００１７】
（緩衝剤）
ｐＨを調整するためには、一般的な、緩衝剤を使用する方法を用いることができる。緩衝剤の種類としてはクチナーゼのエステル合成活性を阻害しないものであれば何でも良い。すなわち、各種緩衝液、例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液を用いてｐＨを６〜７に調整した水性溶媒にクチナーゼを溶解させてクチナーゼ溶液とすればよい。緩衝剤の濃度はクチナーゼのエステル合成活性を阻害しない濃度であれば特に限定されないが、好ましくは５−５００ｍＭが良く、さらに好ましくは１０−１００ｍＭである。
【００１８】
（その他固定化条件）
例えば上記クチナーゼ‐担体含有液中で固定化を行わせる温度は、クチナーゼが失活しない温度であれば問題ないが、好ましくは５０℃以下、さらに好ましくは５〜２０℃の条件で行う。
固定化を行わせる時間は、好ましくは５時間から４０時間、さらに好ましくは１０時間から２４時間である。
【００１９】
（固定化クチナーゼ）
上記固定化条件で得られた固定化クチナーゼを含む溶液を、そのままエステル合成反応に用いてもよい。
また、所望により、酵素（クチナーゼ）‐担体溶液を濾別し、濾過残渣を回収し、水あるいは緩衝液で洗浄した後、乾燥させて、粉体状の固定化クチナーゼを得て、これをエステル合成反応に用いてもよい。この場合、固定化クチナーゼは、酵素活性を損なわない乾燥方法により乾燥すれば良く、例えば３０℃以下の冷風乾燥や減圧乾燥・凍結乾燥を行うことができる。
【００２０】
本発明では、クチナーゼを担体に固定化して固定化クチナーゼを得るに際し、上述の通り担体として平均孔径２〜２０ｎｍの細孔を有するものを用い、かつ、固定化の条件をｐＨ６〜７とすることで、高いエステル合成活性を有する固定化クチナーゼを得ることができる。
このことは、以下の理由によると推定される。
即ち、酵素の大きさに対して坦体の細孔の径が小さすぎる場合には、細孔に酵素が進入できず、固定化に供した酵素量に対して、固定化される酵素量が少なくなり、固定化酵素としての活性が低くなってしまう。一方、細孔径が大きすぎる場合には、酵素は細孔に容易に進入し固定されうるが、酵素が細孔あたりに対して多量に固定化されすぎると、酵素の活性部位が塞がってしまい反応すべき基質との接触機会が少なくなって、結果的に固定化酵素としての活性が低くなってしまう。
これに対し、本発明では、平均孔径２〜２０ｎｍの担体を用いることで、担体の細孔に固定化されるクチナーゼの量が確保される。さらに、担体の平均孔径が上記範囲を満たすことと、平均孔径に影響される、クチナーゼの細孔に対する固定化量と、固定化が上記範囲のｐＨで行われることとが連関し合って、坦体に適合した立体構造をクチナーゼに持たせ、かつ反応性を損なわない立体構造を持たせるような固定化を実現できるため、高い活性を発現できるものと推定される。
【００２１】
例えば、一分子の質量が２０キロダルトンから５０キロダルトン程度のクチナーゼの大きさは３ｎｍから１０ｎｍにあると思われる。従って、そのようなサイズのクチナーゼに対して、固定化に用いる坦体の細孔サイズは、酵素サイズ近傍、即ち２ｎｍから２０ｎｍであることが特に有効である。
このようなサイズを有するクチナーゼの一例としては、前記クリプトコッカス  エスピー  エス−ツー由来のクチナーゼをあげることができる。該クチナーゼの分子は約２２キロダルトンで、構成されるアミノ酸の立体配置の推定から、分子サイズは３−５ｎｍであると推定される。よって、当該クチナーゼを、平均孔径２〜２０ｎｍの担体を用いた本発明の製造方法に供することが好ましい。
【００２２】
（エステル合成反応）
本発明の製造方法で得られた固定化クチナーゼは、高いエステル合成活性を有する固定化クチナーゼであり、種々のエステル合成反応に利用することができる。低分子のエステル合成反応だけでなく、高分子量のポリエステル合成反応にも有用である。
本発明により得られた固定化クチナーゼは、有機溶媒中でのエステル合成反応において、高いエステル合成活性を示す。ここでのエステル合成反応は、リパーゼ酵素を触媒とする公知のエステル合成反応と同様に、カルボン酸とアルコールからの水の脱離を伴って反応が進行する酵素反応である。
なお、以下詳述するが、固定化クチナーゼを触媒とするエステル合成反応では、エステル合成反応の反応系が少量の水を含んでいても、エステル合成反応は阻害されることなく進行する。また、溶剤や界面活性剤の使用に頼った逆ミセルの反応系を用いなくても、エステル合成の反応が良好に行われる。
【００２３】
通常、リパーゼ酵素を触媒とするエステル化合物の製造方法では、生成する縮合水は、エステル化反応の逆反応である加水分解反応を促進し、エステル化合物の製造を阻害する方向に働く。このため、反応を迅速に進行させるためには、酵素を水和するのに必要な最低量以外の水を除去することが望ましいといわれる。そのために、反応系を真空に近い減圧処理を施して縮合水を除いたり、モレキュラーシーブスによる縮合水の除去操作を行うことが望ましい。酵素として、本発明により得られた固定化クチナーゼを用いれば、このような縮合水の除去操作にかかる負荷を軽減、つまり減圧処理や、モレキュラーシーブスによる縮合水の除去作業にかかる負荷を軽減できる。
【００２４】
具体的には、反応系に少量の水を含んでいても反応は阻害されることなく進行し、その反応系の水分量が０．５質量％〜８．５質量％であるとき、エステル化合物の合成の反応が良好に行われる。さらに好ましくは、反応系の水分量が１質量％〜６質量％であるときに合成の反応が良好に行われる。例えば、これらの水分量の範囲にエステル合成の反応系をコントロールするのであれば、減圧処理による脱水を行う場合も真空に近い減圧処理の必要はない。また、溶剤や界面活性剤の使用に頼った逆ミセルの反応系を用いなくても、エステル合成の反応が良好に行われる。
【００２５】
本発明によって得られた固定化クチナーゼを酵素として使用することにより、系内に水分が存在しても、エステル化反応の反応性が水分の影響を受けにくい。このためブタノール等の１価アルコールと酢酸等の１価カルボン酸を用いてもよいが、反応により多くの水が発生する多価カルボン酸と多価アルコールからポリエステルを得る反応に対し、本発明の製造方法で得られた固定化クチナーゼは好適である。
【００２６】
当該固定化クチナーゼを用いたエステル合成反応において使用することのできる多価カルボン酸とは１分子中にカルボキシル基を２個以上含有する化合物であり、このうち２価のカルボン酸としては、例えば、１）シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ウンデカンジカルボン酸、ドデカンジカルボン酸、テトラデカンジカルボン酸、フマル酸、イタコン酸、マレイン酸、リンゴ酸、クエン酸等の脂肪族ジカルボン酸、２）無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸、テトラヒドロ無水フタル酸、ヘキサヒドロ無水フタル酸、テトラブロモ無水フタル酸、テトラクロル無水フタル酸、無水ヘット酸、無水ハイミック酸等の環状酸無水物、３）フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、テトラクロルフタル酸、クロルフタル酸、ニトロフタル酸、ｐ−カルボキシフェニル酢酸、ｐ−フェニレン二酢酸、ｍ−フェニレンジグリコール酸、ｐ−フェニレンジグリコール酸、ｏ−フェニレンジグリコール酸、ジフェニル酢酸、ジフェニル−ｐ，ｐ’−ジカルボン酸、ナフタレン−１，４−ジカルボン酸、ナフタレン−１，５−ジカルボン酸、ナフタレン−２，６−ジカルボン酸、アントラセンジカルボン酸等の芳香族カルボン酸、４）ヘキサヒドロテレフタル酸等の脂環式ジカルボン酸等を挙げることができる。
【００２７】
また、３価以上の多価カルボン酸としては、例えば、トリメリット酸、無水トリメリット酸、メチルシクロヘキセントリカルボン酸無水物、ピロメリット酸、無水ピロメリット酸、ナフタレントリカルボン酸、ナフタレンテトラカルボン酸、ピレントリカルボン酸、ピレンテトラカルボン酸等を挙げることができる。
【００２８】
また、このエステル合成反応における多価アルコールは、１分子中に水酸基を２個以上含有する化合物である。このうち２価のアルコールとしては、例えばエタンジオール、プロパンジオール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、ネオペンチルグリコール、トリエチレングリコール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオール、ドデカンジオール等の脂肪族ジオール、水素化ビスフェノールＡ、ビスフェノールＡ、シクロヘキサンジオール芳香族、または脂環式のジオール等を挙げることができる。
また、３価以上の多価アルコールとしては、例えば、グリセリン、トリメチロールエタン、トリメチロールプロパン、トリスヒドロキシメチルアミノペンタン、ペンタエリスリトール、ジペンタエリスリトール、ヘキサメチロールメラミン、ヘキサエチロールメラミン、テトラメチロールベンゾグアナミン、テトラエチロールベンゾグアナミン等を挙げることができる。
【００２９】
モノマーである多価カルボン酸と多価アルコールの仕込量は特に制限はないが、これらを同モル量使用することが好ましい。
固定化クチナーゼの添加量は、モノマーである多価カルボン酸１モルに対して、クチナーゼの分量として、タンパク質重量で０．０１ｇ〜１０ｇ、好ましくは０．５ｇ〜５ｇ添加することが好ましい。
反応温度は２０℃〜７０℃が好ましい。この範囲において良好な収率を期待する事ができる。上記範囲外の温度では、酵素が失活、変性してしまうおそれがある。
ここでのエステル合成反応では、必要に応じて各種溶媒を添加しても良い。溶媒としては、イソプロピルエーテルやイソオクタン等を挙げることができる。
【００３０】
以上説明したように、本発明では、特定の孔径の細孔を有する担体を用い、かつ、固定化条件のうちｐＨを特定の範囲とすることで、実際に高いエステル反応活性を発揮する固定化クチナーゼを得ることができる。しかも、（固定化に供した酵素量に対する）酵素の固定化率が大きく、また、固定化された単位酵素量あたりエステル合成活性の高い固定化クチナーゼが得られる。したがって、固定化を行う時点での酵素の仕込み量を有効にエステル合成操作に引き継がせることができ経済的であり、しかも、エステル合成反応において、少量の酵素で充分なエステル合成反応を行えるので経済的である。
【実施例】
【００３１】
以下に本発明の実施例と比較例を挙げるが、本発明は実施例等に限定されるものではない。なお、％は特に断りのない限り質量％を表す。
【００３２】
［製造例］
（クチナーゼ産生微生物の培養）
クチナーゼ産生微生物を、以下の方法により培養した。
５００ｍｌ容量の坂口フラスコに培地成分として以下の成分１００ｍｌを添加して１２１℃、２０分のオートクレーブ殺菌を行った。
酵母エキス（オキゾイド社製）０．５％
ＫＨ２ＰＯ４（和光純薬社製）  １．０％
ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ（和光純薬社製）  ０．１％
ｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨ・１Ｎ  ＨＣｌ  にて５．６に調整。
上記培地にクリプトコッカス  エスピー  エス−ツー（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｕｓ  ｓｐ  Ｓ−２；ＦＥＲＭ  Ｐ−１５１５５）を１白金耳植菌し、２５℃、１００ｒｐｍで４８ｈｒ培養した。  
丸菱バイオエンジ社製５Ｌ培養槽（ＭＤＬ５００）に培地３Ｌを添加して１２１℃、３０分のオートクレーブ殺菌を行った。培地成分は上記の培地成分にさらにトリオレイン１．０％及び泡消剤としてＣＡ１２３（日本油脂社製）０．１％となるように添加した。上記の坂口フラスコで培養した菌を種菌として５Ｌ培養槽に植菌し、通気量０．８ＶＶＭ、回転数１００ｒｐｍで１２０時間培養した。
【００３３】
（クチナーゼの精製）
固定化に使用したクチナーゼは以下の方法により精製した。
培養終了後、培養液を８０００ｒｐｍ、１０分の条件で遠心分離して上清を得た。その上清を旭化成社製ＭＦ膜（マイクローザ  ＰＳＰ−１１３）にて濾過し、透過液を得た。透過液を旭化成社製ＵＦ膜（マイクローザ  ＡＩＰ−１０１０）にて濃縮・脱塩し酵素液を得た。酵素液を凍結乾燥により乾燥粉末として、クチナーゼ酵素乾燥粉末（１）を得た。
【００３４】
（緩衝液の作製）
ｐＨ調整に用いるｐＨ４及びｐＨ５緩衝液は、酢酸緩衝液（酢酸ナトリウム及び酢酸を用いて作製）を用いて作製した。また、ｐＨ６、７、８は、リン酸緩衝液（リン酸水素ニナトリウム及びリン酸水素一ナトリウムを用いて作製）を用いて作製した。
【００３５】
［実験例１］
（酵素の固定化）
２０ｍｌ容量の三角フラスコに上述製造例で得たクチナーゼ酵素乾燥粉末（１）を０．５ｇ添加し、ｐＨを４、５、６、７、８に調整した緩衝液５ｍｌ（緩衝液としてｐＨ４、５は酢酸緩衝液を使用し、ｐＨ６、７、８はリン酸緩衝液を使用した。濃度はすべて５０ｍＭとした。）を添加し十分攪拌した。そこへ、担体としてレバチットＶＰ  ＯＣ  １６００（商品名；バイエル社製  平均孔経  １５ｎｍ）を１ｇ添加した。三角フラスコを１５℃のインキュベータ内で１００ｒｐｍにて２４ｈｒ振とうすることで、固定化反応を行った。固定化反応終了後、坦体画分を濾過・蒸留水で洗浄後１５℃の冷風にて乾燥して固定化クチナーゼ（１）を得た。
【００３６】
（評価１）
固定化クチナーゼ（１）のエステル合成活性の測定
１０ｍｌ容量の試験管にアジピン酸０．１５ｇ、ブタノール３ｍｌ、水を終濃度４％となるように添加した。そこへ上述で得た各ｐＨ条件にて固定化した固定化クチナーゼを、タンパク質の量が同一になるように添加し、４０℃で３ｈｒ反応させた。その後、エステル合成生成物であるアジピン酸ジブチルエステルの濃度をガスクロマトグラフにて測定した。
坦体の添加前後のタンパク質濃度をバイオラッド社製プロテインアッセイキットにて測定して、以下の式により酵素固定化率を算出した。
酵素固定化率（％）＝（坦体添加前のタンパク質濃度−坦体添加後のタンパク質濃度）／（坦体添加前のタンパク質濃度）×１００
固定化時のｐＨと、酵素固定化率及び添加した酵素（タンパク質）１ｍｇ当たりのアジピン酸ジブチルの生成量（ガスクロマトグラフのピークエリア面積）を図１に示す。
図１から明らかなように、酵素の固定化率はいずれのｐＨにおいても充分であり、ｐＨが低い程高い傾向にあった。固定化された酵素１ｍｇ当たりのエステル合成活性はｐＨ＝６、７の場合が高かった。
【００３７】
［実験例２］
固定化用坦体としてレバチット  ＶＰ  ＯＣ  １０６４ＭＤ（商品名；バイエル社製  平均孔径  ５〜１０ｎｍ）を使用した以外は実施例１と同じ方法で固定化クチナーゼ（２）を得た。
（評価２）
実施例２で得られた固定化クチナーゼ（２）について、評価１と同様の方法で、エステル合成活性及び酵素固定化率（％）を測定した。
固定化時のｐＨと、酵素固定化率及び添加した酵素（タンパク質）１ｍｇ当たりのアジピン酸ジブチルの生成量（ガスクロマトグラフのピークエリア面積）を図２に示す。図２から明らかなように、酵素の固定化率はいずれのｐＨにおいても充分であり、ｐＨが低い程高い傾向にあったが、固定化された酵素１ｍｇ当たりのエステル合成活性はｐＨ＝６、７の場合が高かった。
【００３８】
［比較例１］
固定化用坦体としてトヨナイト２００（商品名；東洋電化工業社製  平均孔径  約８０ｎｍ）を使用した以外は実施例１と同様の方法でクチナーゼの固定化を行ない、固定化クチナーゼ（３）を得た。
【００３９】
（評価３）
比較例１で得られた固定化クチナーゼ（３）について、評価１と同様の方法で、エステル合成活性及び酵素固定化率（％）を測定した。
固定化時のｐＨと、酵素固定化率及び固定化された酵素（タンパク質）１ｍｇ当たりのアジピン酸ジブチルの生成量（ガスクロマトグラフのピークエリア面積）を図３に示す。図１〜３から明らかなように、比較例１における酵素の固定化率は実施例１、２に比較して低い値であり、固定化された酵素１ｍｇ当たりのエステル合成活性もｐＨにより差が見られず一貫して低い値であった。
【００４０】
図１〜３の表示において、例えば１．０Ｅ＋７とは、１．０×１０７を示す。
以上の実施例と比較例より、平均孔径２〜２０ｎｍを有する坦体にｐＨ６〜７の条件下でクチナーゼを担持させる製造方法により、エステル合成活性に優れた固定化クチナーゼが得られることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明により得られた固定化クチナーゼは、有機溶媒中での高いエステル合成活性を示すことから、これを用いて各種のエステル合成反応を容易に行うことができる。例えば各種ポリステルの製造、各種脂肪酸エステル、糖エステル、ステロイド等の製造、あるいは植物油、動物油の改質方法に適用でき、産業上の幅広い分野への利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】平均孔径が１５ｎｍである坦体を用いてクチナーゼを固定化させた時の酵素固定化率と固定化された酵素１ｍｇ当たりのエステル合成活性を示すグラフである。
【図２】平均孔径が５〜１０ｎｍである坦体を用いてクチナーゼを固定化させた時の酵素固定化率と固定化された酵素１ｍｇ当たりのエステル合成活性を示すグラフである。
【図３】平均孔径が８０ｎｍである坦体を用いてクチナーゼを固定化させた時の酵素固定化率と固定化された酵素１ｍｇ当たりのエステル合成活性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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