(57)【要約】【課題】核酸増幅方法及び装置を提供する。【解決手段】核酸増幅用反応物が含まれた反応物水溶液と、反応物水溶液と相分離されて増幅反応に関与しない流体を異なるインレットチャンネルを通じて反応容器内に注入させる第１段階と、反応物水溶液が流体と出合って反応容器内に流体によって取り囲まれた複数の反応物水溶液滴を形成する第２段階と、複数の反応物水溶液滴内で核酸の増幅反応を起こす第３段階と、を備える核酸増幅方法。また、基板と、基板の内部に形成された反応容器と、基板の内部に形成され、反応容器の一端に連結されて核酸増幅用反応物が含まれた水溶液を反応容器の内部に注入するための少なくとも一つの第１インレットチャンネルと、基板の内部に形成され、反応容器の一端に連結されて、水溶液と相分離されて増幅反応に関与しない流体を反応容器の内部に注入するための第２インレットチャンネルと、基板に熱的に接触されるように設置されて基板を加熱する加熱装置と、を備える核酸増幅装置。【選択図】図１Ａ
2005253466.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅用反応物が含まれている反応物水溶液と、前記反応物水溶液と相分離されて増幅反応に関与しない流体を異なるインレットチャンネルを通じて反応容器内に注入させる第１段階と、前記反応物水溶液が前記流体と出合って、前記反応容器内に前記流体によって取り囲まれた複数の反応物水溶液滴を形成する第２段階と、
前記複数の反応物水溶液滴内で核酸の増幅反応を起こす第３段階と、を備えることを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項２】
前記流体は、シリコンオイル、鉱物性オイル、過フッ化オイル、炭化水素オイル及び植物性オイルよりなる群から選択された少なくとも一つのオイルであることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
前記第３段階で、前記反応物水溶液滴内での核酸増幅反応は、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ及びＬＡＭＰよりなる群から選択された何れか一つの方法によって行われることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅方法。
【請求項４】
前記第３段階で、前記反応物水溶液滴内での核酸増幅反応は、ＰＣＲ方法によって行われることを特徴とする請求項３に記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
前記第３段階で、前記反応物水溶液滴内での核酸の増幅反応は、基板全体を一定の温度に加熱及び冷却を反復することによって、核酸の増幅反応がなされるようにするＰＣＲ方法によって行われることを特徴とする請求項４に記載の核酸増幅方法。
【請求項６】
前記第３段階で、前記反応物水溶液滴内での核酸の増幅反応は、基板を異なる温度を有する少なくとも二つの温度領域に加熱した状態で、前記複数の反応物水溶液滴を前記温度領域に交互に反復的に通過させることによって、核酸の増幅反応がなされるようにする連続フローＰＣＲ方法によって行われることを特徴とする請求項４に記載の核酸増幅方法。
【請求項７】
独立して制御される複数のヒータを使用して前記基板を変更可能な少なくとも二つの温度領域に加熱することを特徴とする請求項６に記載の核酸増幅方法。
【請求項８】
前記第１段階で、定量分析のためのネガティブコントロール及びポジティブコントロールのうち少なくとも一つの水溶液と標準サンプル水溶液とを、前記インレットチャンネルとはさらに異なるそれぞれのインレットチャンネルを通じて前記反応容器内に注入させ、
前記第２段階で、前記ネガティブコントロール及びポジティブコントロールのうち少なくとも一つの水溶液と前記標準サンプル水溶液とが前記流体と出合って、前記反応容器内に前記複数の反応物水溶液滴と共に複数のコントロール水溶液滴と複数の標準サンプル水溶液滴とを形成することを特徴とする請求項４に記載の核酸増幅方法。
【請求項９】
前記第１段階で、前記標準サンプル水溶液は、少なくとも２つの濃度に調節されて前記反応容器内に注入されることを特徴とする請求項８に記載の核酸増幅方法。
【請求項１０】
前記第１段階で、少なくとも２種類のプライマーがそれぞれ含まれている少なくとも二種類の反応物水溶液が、異なるインレットチャンネルを通じて前記反応容器内に注入されることを特徴とする請求項４に記載の核酸増幅方法。
【請求項１１】
前記第１段階で、核酸水溶液、重合酵素とｄＮＴＰとを含む共通成分及びプライマーをそれぞれのインレットチャンネルに注入し、これらが前記反応容器に注入される直前に混合されて前記反応物水溶液を形成するようにすることを特徴とする請求項４に記載の核酸増幅方法。
【請求項１２】
前記反応容器は、二つの１次反応チャンネルと、前記二つの１次反応チャンネルそれぞれの末端に連結される一つの２次反応チャンネルとからなり、前記第１段階、第２段階及び第３段階は、前記二つの１次反応チャンネルそれぞれについて行われ、
前記第３段階以後に、
前記２次反応チャンネルの開始端で前記複数の反応物水溶液滴が合わせられて前記２次反応チャンネル内に複数の合わせられた反応物水溶液滴を形成する第４段階と、
前記複数の合わせられた反応物水溶液滴内で再び核酸の増幅反応を起こす第５段階と、をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅方法。
【請求項１３】
前記反応容器は、少なくとも一つの反応チャンバよりなり、
前記第３段階以後に、
前記反応チャンバ内の前記複数の反応物水溶液滴を合わせる第４段階と、
前記合わせられた反応物水溶液滴内で再び核酸の増幅反応を起こす第５段階と、をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅方法。
【請求項１４】
前記第４段階で、前記複数の反応物水溶液滴は、遠心分離によって合わせられることを特徴とする請求項１３に記載の核酸増幅方法。
【請求項１５】
基板と、
前記基板の内部に形成された反応容器と、
前記基板の内部に形成され、前記反応容器の一端に連結されて、核酸増幅用反応物が含まれた水溶液を前記反応容器の内部に注入するための少なくとも一つの第１インレットチャンネルと、
前記基板の内部に形成され、前記反応容器の一端に連結されて、前記水溶液と相分離されて増幅反応に関与しない流体を前記反応容器の内部に注入するための第２インレットチャンネルと、
前記基板に設置されて前記基板を加熱する加熱装置と、を備え、
前記反応物水溶液が前記流体と出合って前記反応容器内に前記流体によって取り囲まれた複数の反応物水溶液滴を形成し、前記複数の反応物水溶液滴内で核酸の増幅反応が起こるようにしたことを特徴とする核酸増幅装置。
【請求項１６】
前記流体は、シリコンオイル、鉱物性オイル、過フッ化オイル、炭化水素オイル及び植物性オイルよりなる群から選択された少なくとも一つのオイルであることを特徴とする請求項１５に記載の核酸増幅装置。
【請求項１７】
前記基板は、疎水性の表面性質を有することを特徴とする請求項１５に記載の核酸増幅装置。
【請求項１８】
前記基板は、ＰＤＭＳ、シリコン、二酸化ケイ素、プラスチック及びガラスよりなる群から選択された何れか一つの物質よりなることを特徴とする請求項１７に記載の核酸増幅装置。
【請求項１９】
前記基板は、下部基板及び上部基板よりなり、前記下部基板と上部基板との間に前記反応容器、第１インレットチャンネル及び第２インレットチャンネルが形成されることを特徴とする請求項１５に記載の核酸増幅装置。
【請求項２０】
前記水溶液滴内での核酸増幅反応は、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ及びＬＡＭＰよりなる群から選択された何れか一つの方法によって行われることを特徴とする請求項１５に記載の核酸増幅装置。
【請求項２１】
前記反応物水溶液滴内での核酸増幅反応は、ＰＣＲ方法によって行われることを特徴とする請求項２０に記載の核酸増幅装置。
【請求項２２】
前記反応容器は、蛇行曲線型の反応チャンネルであり、前記反応チャンネルの開始端に前記第１インレットチャンネルと第２インレットチャンネルとが連結され、前記反応チャンネルの末端に前記流体と増幅産物とを排出させるための排出口が設けられたことを特徴とする請求項２１に記載の核酸増幅装置。
【請求項２３】
前記加熱装置は、前記基板の下部に配置されて前記基板を異なる温度を有する少なくとも二つの温度領域に加熱する少なくとも二つのヒータを有することを特徴とする請求項２２に記載の核酸増幅装置。
【請求項２４】
前記加熱装置は、前記基板を変更可能な少なくとも二つの温度領域に加熱できるように、前記基板の下部に互いに平行に配置され、独立して制御される複数のヒータを有することを特徴とする請求項２２に記載の核酸増幅装置。
【請求項２５】
前記反応チャンネルは、前記温度領域を交互に反復的に通過するように形成されることを特徴とする請求項２３に記載の核酸増幅装置。
【請求項２６】
前記第２インレットチャンネルは、前記反応チャンネルの開始端から直線状に延びるように形成され、前記第１インレットチャンネルは、前記第２インレットチャンネルに対して直交するように形成されることを特徴とする請求項２２に記載の核酸増幅装置。
【請求項２７】
前記基板の内部に形成され、前記反応チャンネルの一端に連結されて、定量分析のためのネガティブコントロール及びポジティブコントロールのうち少なくとも一つの水溶液を前記反応チャンネルの内部に注入するための第３インレットチャンネルと、
前記基板の内部に形成され、前記反応チャンネルの一端に連結されて、定量分析のための標準サンプル水溶液を前記反応チャンネルの内部に注入するための第４インレットチャンネルと、をさらに備えることを特徴とする請求項２２に記載の核酸増幅装置。
【請求項２８】
前記第４インレットチャンネルには、標準サンプルがそれぞれ注入される少なくとも二つの標準サンプルインレットチャンネルと、前記標準サンプルを所定濃度に希釈するための蒸溜水が注入される蒸溜水インレットチャンネルが連結されたことを特徴とする請求項２７に記載の核酸増幅装置。
【請求項２９】
前記第４インレットチャンネルは、蛇行曲線を特徴とする請求項２８に記載の核酸増幅装置。
【請求項３０】
前記第１インレットチャンネルは、少なくとも二つが形成され、前記少なくとも二つの第１インレットチャンネルに異なる種類のプライマーを注入するための少なくとも二つのプライマーインレットチャンネルが前記少なくとも二つの第１インレットチャンネルにそれぞれ連結されたことを特徴とする請求項２２に記載の核酸増幅装置。
【請求項３１】
前記少なくとも二つの第１インレットチャンネルそれぞれは、蛇行曲線を特徴とする請求項３０に記載の核酸増幅装置。
【請求項３２】
前記第１インレットチャンネルには、前記第１インレットチャンネルにプライマーを注入するためのプライマーインレットチャンネルと、前記第１インレットチャンネルに重合酵素とｄＮＴＰとを含む共通成分を注入するための共通成分インレットチャンネルが連結されることを特徴とする請求項２２に記載の核酸増幅装置。
【請求項３３】
前記反応チャンネルの開始端の近くの一部分は、蛇行曲線を特徴とする請求項３２に記載の核酸増幅装置。
【請求項３４】
前記反応容器は、蛇行曲線型の二つの１次反応チャンネルと、前記二つの１次反応チャンネルそれぞれの末端に共に連結されて蛇行曲線型の一つの２次反応チャンネルとからなり、前記第１インレットチャンネルと第２インレットチャンネルとは、前記二つの１次反応チャンネルの開始端に連結されることを特徴とする請求項１５に記載の核酸増幅装置。
【請求項３５】
前記加熱装置は、前記二つの１次反応チャンネル及び一つの２次反応チャンネルそれぞれに二つの温度領域を提供できるように、前記基板の底面に配置され、独立して制御される複数のヒータを有することを特徴とする請求項３４に記載の核酸増幅装置。
【請求項３６】
前記反応容器は、反応チャンバであり、前記反応チャンバの一端に前記第１インレットチャンネルと第２インレットチャンネルとが連結され、前記反応チャンバの他端に前記流体と増幅産物とを排出させるためのアウトレットチャンネルが連結されたことを特徴とする請求項１５に記載の核酸増幅装置。
【請求項３７】
前記反応チャンバ、前記第１インレットチャンネル、前記第２インレットチャンネル及び前記アウトレットチャンネルは、それぞれ複数個が形成されたことを特徴とする請求項３６に記載の核酸増幅装置。
【請求項３８】
前記加熱装置は、前記基板の下部に配置されて前記基板全体を所定温度に加熱する一つのヒータを有することを特徴とする請求項３６に記載の核酸増幅装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅方法及び装置に係り、さらに詳細には、微量の核酸をその分析に必要な量ほど大量に増幅させる方法及びその方法を行うための核酸増幅装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
塩基序列分析及び疾病診断を目的としてＤＮＡ及びＲＮＡのような核酸の遺伝情報を分析するためには、微量の核酸をその分析に必要な量ほど大量に増幅させる必要がある。このような核酸の増幅方法には、当業者に公知のように、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ−Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及びＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のような従来の等温増幅方法と、最近に主に利用されているＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）のような非等温増幅方法がある。
【０００３】
このうち、ＰＣＲ方法について詳細に説明すれば、ＰＣＲは、３つの反応段階に進められる。第一には、変性段階であって、この段階では、二重鎖のＤＮＡを約９０℃以上に加熱して単一鎖のＤＮＡに解離させる。そして、第二には、アニーリング段階であって、この段階では、二種類のプライマーをそれぞれ相補的な単一鎖のＤＮＡに結合させる。このとき、従来のＰＣＲ装置において、前記反応条件は、通常５５〜６５℃で３０秒ないし数分ほどとなる。第三には、伸張段階であって、この段階ではＤＮＡ重合酵素を作動させてプライマーからヌクレオチドを一つずつ延長して二重鎖のＤＮＡを合成させる段階である。伸張反応に必要な時間は、鋳型ＤＮＡの濃度、増幅断片のサイズ、反応温度によって異なる。一般的に、多く使われているＴａｑ（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）重合酵素を使用する場合、７２℃で３０秒ないし数分ほどとなる。
【０００４】
しかし、前記のような増幅方法を利用して核酸を増幅する時、核酸が非常に少ない濃度で存在する場合には、反応効率が低下して増幅がほとんどなされないか、または非特異的な反応が頻繁に生じる問題点がある。
【０００５】
このような問題点を解決するために、Ｋｅｍｐらは、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ方法を提案したが、この方法は、外側プライマー対と内側プライマー対とを使用して二段階でＰＣＲを施行する方法である（非特許文献１）。再び説明すれば、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ方法は、１段階では、外側プライマーを使用する増幅反応を行い、２段階では、内側プライマーを使用するＰＣＲを行うことによって、非特異的な産物の発生を抑制する方法である。しかし、この方法において、２段階ＰＣＲ実行以前に、外側プライマーを除去しなければ、外側プライマーと内側プライマーとの相互作用をあらかじめ考慮せねばならない難点がある。また、１段階反応と２段階反応との間に反応容器を開いて反応物を注入する必要があるため、この過程で相互汚染の可能性があり、注意しなければならないという不便さがある。
【０００６】
最近では、反応容器のサイズが小さいという長所を有するマイクロデバイスを利用して、単一分子から出発して短時間内にＰＣＲ増幅を行う方法も報告されている（非特許文献２）。しかし、この方法においては、シリコンやガラス製の微細反応容器の表面に核酸が異常に吸着して増幅反応に悪影響を及ぼすこともあり、反応物の体積が小さくて蒸発の危険性があるという問題点がある。
【０００７】
一方、ＰＣＲを行う時、温度が融解温度以下になれば、プライマーダイマー形成をはじめとする非特異的な反応が生じるという問題点がある。
【０００８】
この問題点を解決するために、第１サイクルで、融解温度に到達するまでは増幅反応の共通成分、例えば、重合酵素を注入しない方法と、ホットスタートＰＣＲ方法が提案されたところがある。具体的に、第１サイクルで、融解温度に到達した後に共通反応成分を添加する方法と、ワックスビードを反応溶液上に置いて加熱融解した後、固形化層を作り、固形化層上に共通反応成分を入れて、第１サイクルで融解温度に到達した後に反応溶液と共通反応成分とを互いに混合する方法と、Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素抗体を添加して、第１サイクルで融解温度に到達する過程で重合酵素からＴａｑスタート抗体が流離されつつ重合酵素を活性化させる方法がある。しかし、このような方法によれば、反応中の間に反応物を添加する過程が複雑であり、かつ相互汚染の素地があり、Ｔａｑスタート抗体を使用する場合には、通常１０分以上の活性化時間を経ねばならないという短所がある。
【０００９】
ＰＣＲ方法において、ｎサイクル以後の増幅産物の量は、理論的に初期核酸の量の２ｎ倍といえる。しかし、反応初期には増幅産物の量がサイクルによって対数的に増加するが、実際には、プライマーのアニーリング効率や、ＤＮＡ鎖の合成効率が１００％にならないので、増幅産物の量がある限度を超えれば、増幅産物の増加が低下しつつ最終的には増幅されない安定期（プラトー）現象が現れる。したがって、ＰＣＲ増幅産物の量として増幅前の初期ＤＮＡ量を推定できないので、従来には、内部標準サンプルを利用してターゲット核酸の初期量を定量している。
【００１０】
Ｋｏｐｐらは、チップ内に異なる温度で制御される領域を置き、マイクロチャンネルを通じてＰＣＲ反応溶液を流すことによって、反応溶液が異なる温度領域を通過しつつ連続的なＰＣＲ増幅がなされるようにした（非特許文献３）。この方法は、反応容器全体を加熱する方式ではないので、反応速度が昇温／冷却速度によって決まるものではなく流速によって決定される。しかし、このようなＰＣＲ方法においては、定量分析のためにいくつかの標準サンプルのための別途のチャンネルが必要であり、したがって、チップのサイズが非常に大きくなるという短所がある。また、反復実験のためには、多数のチップを使用せねばならない。もし、一つのチャンネルを使用して異なるサンプルを増幅する場合には、チャンネルの表面に吸着されたＤＮＡによる汚染の問題点が発生する。
【００１１】
Ｂａｋｅｒらは、ガラスチップを利用して流体が流れつつＰＣＲ増幅がなされるようにした（非特許文献４）。そして、チップの温度調節は、チャンネルの間にあるヒータを使用してチップ全体を昇温し、チップの下側にある冷却水を利用してチップを冷却する方式を採択した。Ｂａｋｅｒらは、チャンネル内にサンプルを希釈して充填し、増幅のための温度サイクルが反復される間に蛍光シグナルを測定した結果、単一分子が存在する所で蛍光シグナルのピークを感知できると主張している。しかし、このような結果を得るためには、微弱な蛍光シグナルから背景シグナルを除去する分析過程を通じなければならない。したがって、蛍光シグナルの分析過程が明確ではなく、その蛍光シグナルが本当に単一分子についてのものであるか否かについての定量はできないという短所がある。
【００１２】
Ｎａｋａｎｏらは、反応器としてｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ乳濁液を利用する単一分子ＰＣＲ方法を提案した（非特許文献５）。この方法を説明すれば、まず、ＰＣＲ混合液が入っている水溶液とオイル、界面活性剤をＰＣＲチューブに入れて、マグネチック攪拌バーを利用して混合して、ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ乳濁液を作る。次いで、ＰＣＲの初期のいくつかのサイクルは、小さな水溶液滴内で反応を起こす。次いで、遠心分離によって水溶液及びオイルの層分離を起こして小さな水溶液滴を合わせた以後に増幅反応の後期サイクルを進める。Ｎａｋａｎｏらは、このような方法を使用して単一分子ＰＣＲ方法を可能にしたと主張している。一般的に、鋳型ＤＮＡの濃度が非常に低い場合、鋳型とプライマーとの反応より相対的に濃度が高いプライマー間の反応がさらに容易に起こって非特異的な産物が生じる可能性がさらに高い。したがって、この方法は、ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ乳濁液を反応器として使用して、初期反応は、相対的に高い濃度の鋳型が含まれた水溶液滴内で１次的な増幅反応を起こした。次いで、初期いくつかのサイクルを経つつ鋳型が存在する水溶液滴内の反応物の一つであるプライマーがいずれも消費されれば、遠心分離を通じてこの水溶液滴と鋳型が存在していなかった他の水溶液滴とを合わせることによって、他の水溶液滴内に残っているプライマーによって２次的な増幅反応を起こした。しかし、このような方法を実際に適用するには色々な難しさがある。例えば、伝染性のある疾病診断のために毎回乳濁液を作る度にマグネチック攪拌バーを使用することは不便であるだけでなく、汚染の可能性が濃厚である。そして、このように作られた水溶液滴は、そのサイズが多様で再現性の問題がありうる。また、鋳型ＤＮＡの濃度が非常に低い場合には、実験を多く反復して診断せねばならない問題点があり、反応溶液の体積が約５０μｌほどと大きく、定量ＰＣＲが不可能であるという短所がある。
【００１３】
一方、従来のＰＣＲは、単に反応の終点で電気泳動を利用して増幅されたＤＮＡの定性的な結果のみを示すものであって、ＤＮＡの定量的な検出においては、不正確性など多くの問題点を有していた。このような問題を解決するために、光学的な検出システムを利用して増幅されたＤＮＡの濃度に比例する蛍光の強度を検出することによって、ＤＮＡの定量分析を可能にするリアルタイムＰＣＲ方法が開発された。
【００１４】
しかし、従来のリアルタイムＰＣＲ方法を利用して定量ＰＣＲを行う場合には、ネガティブコントロール、ポジティブコントロール及び少なくとも３個の異なる濃度を有する標準サンプルを使用して、３回以上反復実験せねばならないので、多数の反応器が必要であった。ＰＣＲチップに、前記のように多数の反応器を構成することは無理があり、チップのサイズが大きくならざるをえないという短所がある。
【非特許文献１】Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｋｅｍｐら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｖｏｌ．８６，ｐｐ２４２３〜２４２７
【非特許文献２】Ｅ．Ｔ．Ｌａｇａｌｌｙら，２００１，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３，ｐｐ５６５〜５７０
【非特許文献３】Ｍａｒｔｉｎ  Ｕ．Ｋｏｐｐら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８０，ｐｐ１０４６〜１０４８
【非特許文献４】Ｊｉｌｌ  Ｂａｋｅｒら，２００３，Ｍｉｃｒｏ  ＴＡＳ，ｐｐ１３３５〜１３３８
【非特許文献５】Ｍｉｃｈｉｈｉｋｏ  Ｎａｋａｎｏら，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０２，ｐｐ１１７〜１２４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明が解決しようとする課題は、前記従来の技術の問題点を解決するために創出されたものであって、特に、互いに分離される流体と核酸増幅用反応物が含まれた水溶液とを異なる流入チャンネルを通じて反応容器内に流入させて、反応容器内に流体によって取り囲まれた水溶液滴を形成し、この水溶液滴内で核酸の増幅反応がなされるようにする核酸増幅方法を提供することである。
【００１６】
また、本発明が解決しようとする課題は、前記核酸増幅方法を行うための核酸増幅装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
前記課題を解決するために、本発明は、核酸増幅用反応物が含まれた反応物水溶液と、前記反応物水溶液と相分離されて増幅反応に関与しない流体を、異なるインレットチャンネルを通じて反応容器内に注入させる第１段階と、前記反応物水溶液が前記流体と出合って、前記反応容器内に前記流体によって取り囲まれた複数の反応物水溶液滴を形成する第２段階と、前記複数の反応物水溶液滴内で核酸の増幅反応を起こす第３段階と、を備える核酸増幅方法を提供する。
【００１８】
ここで、前記流体は、シリコンオイル、鉱物性オイル、過フッ化オイル、炭化水素オイル及び植物性オイルよりなる群から選択された少なくとも一つのオイルであることが望ましい。
【００１９】
前記第３段階で、前記反応物水溶液滴内での核酸増幅反応は、ＰＣＲ方法によって行われ、これ以外にも、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡまたはＬＡＭＰ方法によって行われうる。
【００２０】
具体的に、前記反応物水溶液滴内での核酸の増幅反応は、基板全体を一定の温度に加熱及び冷却を反復することによって、核酸の増幅反応がなされるようにするＰＣＲ方法によって行われうる。
【００２１】
また、前記反応物水溶液滴内での核酸の増幅反応は、基板を異なる温度を有する少なくとも二つの温度領域に加熱した状態で、前記複数の反応物水溶液滴を前記温度領域に交互に反復的に通過させることによって、核酸の増幅反応がなされるようにする連続フローＰＣＲ方法によって行われることもある。この場合、独立して制御される複数のヒータを使用して前記基板を変更可能な少なくとも二つの温度領域に加熱できる。
【００２２】
そして、リアルタイムＰＣＲのために、前記第１段階で、定量分析のためのネガティブコントロール及びポジティブコントロールのうち少なくとも一つの水溶液と標準サンプル水溶液とを、前記インレットチャンネルとはさらに異なるそれぞれのインレットチャンネルを通じて前記反応容器内に注入させ、前記第２段階で、前記ネガティブコントロール及びポジティブコントロールのうち少なくとも一つの水溶液と前記標準サンプル水溶液とが前記流体と出合って前記反応容器内に前記複数の反応物水溶液滴と共に、複数のコントロール水溶液滴と複数の標準サンプル水溶液滴とを形成できる。この場合、前記標準サンプル水溶液は、少なくとも２つの濃度に調節されて前記反応容器内に注入されうる。
【００２３】
また、多重ＰＣＲのために、前記第１段階で、少なくとも２種類のプライマーがそれぞれ含まれた少なくとも２種類の反応物水溶液が、異なるインレットチャンネルを通じて前記反応容器内に注入されうる。
【００２４】
また、ホットスタートＰＣＲのために、前記第１段階で、核酸水溶液、重合酵素とｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）を含む共通成分及びプライマーをそれぞれのインレットチャンネルに注入し、これらが前記反応容器に注入される直前に混合されて前記反応物水溶液を形成するようにすることが望ましい。
【００２５】
また、単一分子ＰＣＲのために、前記反応容器は、二つの１次反応チャンネルと、前記二つの１次反応チャンネルそれぞれの末端に連結される一つの２次反応チャンネルからなり、そして前記第１段階、第２段階及び第３段階は、前記二つの１次反応チャンネルそれぞれについて行われ、前記第３段階以後に、前記２次反応チャンネルの開始端で前記複数の反応物水溶液滴が合わせられて前記２次反応チャンネル内に複数の合わせられた反応物水溶液滴を形成する第４段階と、前記複数の合わせられた反応物水溶液滴内で再び核酸の増幅反応を起こす第５段階と、をさらに備えうる。
【００２６】
一方、前記反応容器は、少なくとも一つの反応チャンバよりなり、前記第３段階以後に、前記反応チャンバ内の前記複数の反応物水溶液滴を合わせる第４段階と、前記合わせられた反応物水溶液滴内で再び核酸の増幅反応を起こす第５段階と、をさらに備えることもある。この場合、前記複数の反応物水溶液滴は、遠心分離によって合わせられうる。
【００２７】
そして、前記課題を解決するために、本発明は、基板と、前記基板の内部に形成された反応容器と、前記基板の内部に形成され、前記反応容器の一端に連結されて、核酸増幅用反応物が含まれた水溶液を前記反応容器の内部に注入するための少なくとも一つの第１インレットチャンネルと、前記基板の内部に形成され、前記反応容器の一端に連結されて、前記水溶液と相分離されて増幅反応に関与しない流体を前記反応容器の内部に注入するための第２インレットチャンネルと、前記基板に熱的に接触されるように設置されて前記基板を加熱する加熱装置と、を備え、前記反応物水溶液が前記流体と出合って、前記反応容器内に前記流体によって取り囲まれた複数の反応物水溶液滴を形成し、前記複数の反応物水溶液滴内で核酸の増幅反応が起こったことを特徴とする核酸増幅装置を提供する。
【００２８】
ここで、前記基板は、疎水性の表面性質を有することが望ましい。そして、前記基板は、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、シリコン、二酸化ケイ素、プラスチック及びガラスよりなる群から選択された何れか一つの物質よりなりうる。また、前記基板は、下部基板及び上部基板よりなり、前記下部基板と上部基板との間に前記反応容器、第１インレットチャンネル及び第２インレットチャンネルが形成されうる。
【００２９】
そして、連続フローＰＣＲのために、前記反応容器は、蛇行曲線型の反応チャンネルであり、前記反応チャンネルの開始端に前記第１インレットチャンネルと第２インレットチャンネルとが連結され、前記反応チャンネルの末端に前記流体と増幅産物を排出させるための排出口が設けられうる。
【００３０】
この場合、前記加熱装置は、前記基板の下部に配置されて前記基板を異なる温度を有する少なくとも二つの温度領域に加熱する少なくとも二つのヒータを有しうる。
【００３１】
一方、前記加熱装置は、前記基板を変更可能な少なくとも二つの温度領域に加熱できるように、前記基板の下部に互いに平行に配置され、独立して制御される複数のヒータを有することもある。
【００３２】
そして、前記反応チャンネルは、前記温度領域を交互に反復的に通過するように形成されうる。
【００３３】
また、前記第２インレットチャンネルは、前記反応チャンネルの開始端から直線状に延びるように形成され、前記第１インレットチャンネルは、前記第２インレットチャンネルに対して直交するように形成されうる。
【００３４】
そして、リアルタイムＰＣＲのために、本発明による核酸増幅装置は、前記基板の内部に形成され、前記反応チャンネルの一端に連結されて、定量分析のためのネガティブコントロール及びポジティブコントロールのうち少なくとも一つの水溶液を前記反応チャンネルの内部に注入するための第３インレットチャンネルと、前記基板の内部に形成され、前記反応チャンネルの一端に連結されて、定量分析のための標準サンプル水溶液を前記反応チャンネルの内部に注入するための第４インレットチャンネルと、をさらに備えうる。
【００３５】
この場合、前記第４インレットチャンネルには、標準サンプルがそれぞれ注入される少なくとも二つの標準サンプルインレットチャンネルと、前記標準サンプルを所定濃度に希釈するための蒸溜水が注入される蒸溜水インレットチャンネルとが連結されうる。また、前記第４インレットチャンネルは、蛇行曲線であるが望ましい。
【００３６】
そして、多重ＰＣＲのために、前記第１インレットチャンネルは、少なくとも二つが形成され、前記少なくとも二つの第１インレットチャンネルに異なる種類のプライマーを注入するための少なくとも二つのプライマーインレットチャンネルが、前記少なくとも二つの第１インレットチャンネルにそれぞれ連結されうる。この場合、前記少なくとも二つの第１インレットチャンネルそれぞれは、蛇行曲線であることが望ましい。
【００３７】
そして、ホットスタートＰＣＲのために、前記第１インレットチャンネルには、前記第１インレットチャンネルにプライマーを注入するためのプライマーインレットチャンネルと、前記第１インレットチャンネルに重合酵素とｄＮＴＰとを含む共通成分を注入するための共通成分インレットチャンネルとが連結されうる。この場合、前記反応チャンネルの開始端の近くの一部分は、蛇行曲線であることが望ましい。
【００３８】
そして、単一分子ＰＣＲのために、前記反応容器は、蛇行曲線型の二つの１次反応チャンネルと、前記二つの１次反応チャンネルそれぞれの末端に共に連結され、蛇行曲線型の一つの２次反応チャンネルからなり、前記第１インレットチャンネルと第２インレットチャンネルとは、前記二つの１次反応チャンネルの開始端に連結されうる。
【００３９】
この場合、前記加熱装置は、前記二つの１次反応チャンネルと一つの２次反応チャンネルそれぞれに二つの温度領域を提供できるように、前記基板の底面に配置され、独立して制御される複数のヒータを有しうる。
【００４０】
一方、前記反応容器は、反応チャンバであり、前記反応チャンバの一端に前記第１インレットチャンネルと第２インレットチャンネルとが連結され、前記反応チャンバの他端に前記流体と増幅産物とを排出させるためのアウトレットチャンネルが連結されうる。
【００４１】
この場合、前記反応チャンバ、前記第１インレットチャンネル、前記第２インレットチャンネル及び前記アウトレットチャンネルはそれぞれ複数個が形成されうる。
【００４２】
そして、前記加熱装置は、前記基板の下部に配置されて前記基板全体を所定温度に加熱する一つのヒータを有しうる。
【発明の効果】
【００４３】
本発明によれば、反応物水溶液が一定の断面積を有するインレットチャンネルを一定の速度で通過させるので、反応チャンネルまたは反応チャンバ内にオイルによって取り囲まれ、微細かつ均一なサイズを有する複数の水溶液滴を容易に形成できる。したがって、比較的小さなサイズの装置内に数十ないし数百個の水溶液滴を作って反復実験できるので、ＰＣＲを非常に短時間に行えるという長所がある。また、水溶液滴がオイルによって取り囲まれているので、核酸増幅反応物が反応チャンネルの内面に吸着されて汚染を誘発する問題点が発生しないだけでなく、反応物の体積が非常に小さくても蒸発の危険性がないという長所がある。
【００４４】
そして、一つの反応チャンネル内に反応物水溶液だけでなく、ＮＴＣ水溶液及び標準サンプル水溶液を共に注入して同時に実験できるので、ＰＣＲ装置のサイズが従来に比べて小さくなり、リアルタイムＰＣＲに必要な時間もはるかに短縮されるという長所がある。また、反応チャンネルに沿って所定間隔をおいて流れている複数の水溶液滴それぞれから蛍光シグナルが発散されるので、反応チャンネル全体から蛍光シグナルが発散される従来の場合に比べてはるかに簡単かつ明確に蛍光シグナルの定量分析が可能になる。また、一つの装置で一回のイメージ分析からリアルタイムＰＣＲ曲線が得られ、これを使用して核酸の定量分析をできるという長所がある。
【００４５】
そして、本発明によれば、インレットチャンネルの構造を変更することによって小さなサイズの一つの装置内で色々な遺伝子を一度に分析する多重ＰＣＲが可能であるだけでなく、ホットスタートＰＣＲも可能になる。
【００４６】
そして、独立して制御される複数のヒータを有する加熱装置を備えれば、基板の温度領域を多様にプログラムできるので、一つの装置を使用しつつも多様な温度条件で核酸増幅実験をできるという長所がある。
【００４７】
そして、本発明によれば、一つの装置内で二段階のＰＣＲによる単一分子ＰＣＲが可能になり、ＰＣＲの感度も向上するという長所がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
以下、添付された図面を参照しつつ本発明による核酸増幅方法及び核酸増幅装置の望ましい実施例を詳細に説明する。以下の図面で、同じ参照符号は同じ構成要素を表す。
【実施例】
【００４９】
［実施例１］連続フローＰＣＲ
図１Ａは、本発明の望ましい第１実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図であり、図１Ｂは、図１Ａに示された核酸増幅装置の分離斜視図である。
【００５０】
図１Ａ及び図１Ｂを共に参照すれば、本発明の第１実施例による核酸増幅装置は、基板１１０と、前記基板１１０の内部に形成された反応チャンネル１３０及び少なくとも二つのインレットチャンネル１４１，１５１と、前記基板１１０を所定温度に加熱するための加熱装置１２０と、を備える。
【００５１】
前記基板１１０は、ＰＤＭＳ、シリコン、二酸化ケイ素、プラスチックまたはガラスよりなりうる。そして、前記基板１１０は、疎水性の表面性質を有することが望ましい。疎水性の表面性質を有していない物質よりなる基板１１０の場合には、疎水性を有するようにその表面を改質することが望ましい。また、前記基板１１０は、その内部に前記反応チャンネル１３０を形成するために、互いにボンディングされる下部基板１１１と上部基板１１２とからなりうる。このような基板１１０の構成は、以下の全ての実施例でも同一に適用されうる。
【００５２】
前記反応チャンネル１３０は、前記基板１１０の内部に形成されて核酸増幅反応が起こる反応容器としての役割を行う。具体的に、前記反応チャンネル１３０は、後述するように、異なる温度に加熱される基板１１０の二つの領域を交互に反復して通過できるように蛇行曲線型の形状を有しうる。
【００５３】
前記二つのインレットチャンネル１４１，１５１のうち、第１インレットチャンネル１４１を通じては核酸増幅用反応物が含まれた水溶液（以下では、単純に“反応物水溶液”という）が注入され、第２インレットチャンネル１５１を通じては前記水溶液と混合されずに互いに分離され、増幅反応に関与しない性質を有する流体が注入される。
【００５４】
前記二つのインレットチャンネル１４１，１５１は、それぞれ前記反応チャンネル１３０の開始端に連結される。具体的に、前記第２インレットチャンネル１５１は、反応チャンネル１３０の開始端から直線状に延びるように形成され、前記第１インレットチャンネル１４１は、反応チャンネル１３０と第２インレットチャンネル１５１との連結部位に第２インレットチャンネル１５１に対して直交するように連結されうる。すなわち、反応チャンネル１３０と第１及び第２インレットチャンネル１４１，１５１とは、実質的に“Ｔ”字形状に連結されうる。
【００５５】
前記反応チャンネル１３０と第１及び第２インレットチャンネル１４１，１５１とは、下部基板１１１と上部基板１１２との間に形成される。すなわち、前記チャンネル１３０，１４１，１５１は、図１Ｂに示されたように、下部基板１１１の上面から所定深さで形成されうる。一方、前記チャンネル１３０，１４１，１５１は、上部基板１１２に形成されることもあり、下部基板１１１と上部基板１１２とに分けられて形成されることもある。そして、前記チャンネル１３０，１４１，１５１は、図１Ｂに示されたように、四角形の断面形状を有することが、その形成が容易で望ましいと言えるが、これ以外にも多角形や円形の断面形状を有することもある。
【００５６】
そして、前記第１及び第２インレットチャンネル１４１，１５１には、それぞれ外部から前記反応物水溶液と流体とを注入するための注入口１４２，１５２が連結され、前記反応チャンネル１３０の末端には、核酸増幅反応によって生成された増幅産物と前記流体とを外部に排出するための排出口１６２が連結される。前記注入口１４１，１４２と排出口１６２とは、図１Ｂに示されたように、前記上部基板１１２を垂直に貫通して形成されうるが、これとは異なる形態に形成されることもある。
【００５７】
前記加熱装置１２０は、前記基板１１０の下部に配置されて前記基板１１０を所定温度に加熱する。このような加熱装置１２０は、異なる温度で制御される二つのヒータ１２１，１２２より構成されうる。前記ヒータ１２１，１２２は、下部基板１１１の底面に熱的に接触されて、前記基板１１０を、異なる二つの温度に加熱する役割を行う。したがって、前記基板１１０は、異なる二つの温度領域、例えば、約６５℃に加熱される領域と約９５℃に加熱される領域とに分けられる。一方、前記加熱装置１２０は、異なる温度に制御される３個以上のヒータより構成されることもある。
【００５８】
以下では、前記のように構成された本発明の第１実施例による核酸増幅装置を利用した核酸増幅方法を説明する。
【００５９】
まず、前記のように核酸増幅用反応物が含まれた水溶液と、前記水溶液と分離されて増幅反応に関与しない流体とをそれぞれ前記第１インレットチャンネル１４１と第２インレットチャンネル１５１とを通じて前記反応チャンネル１３０内に注入する。このとき、前記反応物は、ターゲットＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰｓ、重合酵素及びバッファを含み、このような反応物が蒸溜水に溶解されて水溶液を形成する。そして、前記流体としては、例えば、シリコンオイル、鉱物性オイル、過フッ化オイル、炭化水素オイルまたは植物性オイルが使用されうる。
【００６０】
前記のように、前記反応物水溶液と流体、例えば、オイル１３１を、異なるインレットチャンネル１４１，１５１を通じて一定のフロー速度で反応チャンネル１３０内に注入すれば、前記反応物水溶液がオイル１３１と出合ってオイル１３１によって取り囲まれて水溶液滴１３２を形成する。このとき、前記基板１１０は、前述したように疎水性の表面性質を有するので、反応物水溶液は、反応チャンネル１３０の内面に吸着されず、オイル１３１によって取り囲まれて水溶液滴１３２を形成する。
【００６１】
そして、前記第１インレットチャンネル１４１を通過する反応物水溶液のフロー速度を調節すれば、反応チャンネル１３０内に一定の体積を有する水溶液滴１３２が一定の時間間隔をおいて複数個が形成されうる。
【００６２】
ここで、反応チャンネル１３０内にオイル１３１によって取り囲まれた水溶液滴１３２を形成する方法は、Ｌａｍａｇｉｌｏｖらによって提案された方法（Ｒｕｓｔｅｍ  Ｆ．Ｌａｍａｇｉｌｏｖら，Ａｎｇｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００３，４２，Ｎｏ．７，ｐｐ７６８〜７７１）を使用できる。
【００６３】
前記のように形成された複数の水溶液滴１３２は、それぞれ核酸増幅反応の反応器としての役割を行う。すなわち、前記複数の水溶液滴１３２内で核酸の増幅反応が起こる。再び説明すれば、前記複数の水溶液滴１３２は、反応チャンネル１３０に沿って流れつつ前記ヒータ１２１，１２２によって加熱された基板１１０の二つの温度領域を交互に反復的に通過する。この過程で、前記複数の水溶液滴１３２内の核酸増幅反応物も加熱と冷却とを反復的に経験するので、水溶液滴１３２内でＰＣＲの３段階、すなわち変性、アニーリング及び伸張反応段階が、複数のサイクルで反復して起こる。これにより、水溶液滴１３２内には、前記のような連続フローＰＣＲ方法によって生成された増幅産物の濃度が次第に高まる。
【００６４】
前記のように、本発明によれば、反応物水溶液が一定の断面積を有する第１インレットチャンネル１４１を一定の速度で通過するので、反応チャンネル１３０内に形成される水溶液滴１３２のサイズが均一になる。そして、本発明によれば、ｎｌ単位の微細な体積を有する数十ないし数百個の水溶液滴１３２を容易に作りうるので、比較的小さなサイズの装置内で反復実験を行えるようになる。これにより、約４０サイクルのＰＣＲを非常に短時間、例えば、１０分以内に行えるという長所がある。また、水溶液滴１３２がオイル１３１によって取り囲まれているので、核酸増幅反応物が反応チャンネル１３０の内面に吸着されて汚染を誘発する問題点が発生しないだけでなく、反応物の体積が非常に小さくても蒸発の危険性がないという長所がある。
【００６５】
一方、前記本発明の第１実施例による核酸増幅装置は、連続フローＰＣＲ方法を行うために、基板１１０を二つの温度領域に加熱する二つのヒータ１２１，１２２を有していると図示されかつ説明された。しかし、本発明の第１実施例による核酸増幅装置は、一つのヒータのみを備えることもあり、この場合には、基板１１０の全体を同じ温度に加熱及び冷却するＰＣＲ方法が行われうる。また、この場合には、ＰＣＲ方法ではなく、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ及びＬＡＭＰのような従来の等温増幅方法が行われることもある。すなわち、本発明は、ＰＣＲ方法に限定されるものではなく、多様な核酸増幅方法に適用されうる。
【００６６】
［実施例２］リアルタイムＰＣＲ
図２は、本発明の第２実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図であり、図３及び図４は、本発明の第２実施例による核酸増幅装置及び方法を使用してＰＣＲを行った場合、各水溶液滴から発散される蛍光シグナルについてのＣＣＤイメージを示す図面、及びサイクル数による蛍光シグナルの強度を示すグラフである。
【００６７】
まず、図２を参照すれば、本発明の第２実施例による核酸増幅装置は、基板１１０と、前記基板１１０の内部に形成された反応チャンネル１３０及び複数のインレットチャンネル２４１，２４３，２４５ａ，２４５ｂ，２４７，２４９，１５１と、前記基板１１０を所定温度に加熱するための加熱装置１２０と、を備える。
【００６８】
ここで、前記基板１１０、反応チャンネル１３０及び加熱装置１２０の構成は、前述した第１実施例と同じであるので、これらについての詳細な説明は省略する。
【００６９】
本発明の第２実施例による核酸増幅装置は、リアルタイムＰＣＲが可能な構成を有する。このために、前記基板１１０の内部には、複数のインレットチャンネル２４１，２４３，２４５ａ，２４５ｂ，２４７，２４９，１５１が形成される。詳細に説明すれば、前記反応チャンネル１３０の開始端には、前記核酸増幅用反応物が含まれた水溶液を注入するための第１インレットチャンネル２４１と、前記流体、例えば、オイルを注入するための第２インレットチャンネル１５１だけでなく、ネガティブコントロール（ＮＴＣ：Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）水溶液を注入するための第３インレットチャンネル２４３と、標準サンプル水溶液を注入するための第４インレットチャンネル２４９とが連結される。具体的に、前記第２インレットチャンネル１５１は、反応チャンネル１３０の開始端から直線状に延びるように形成され、前記第１、第３及び第４インレットチャンネル２４１，２４３，２４９は、互いに所定間隔をおいて前記反応チャンネル１３０に対して直交するように連結されうる。そして、第１インレットチャンネル２４１と第３インレットチャンネル２４３とには、それぞれ外部と連結される注入口２４２，２４４が連結されうる。
【００７０】
一方、前記第３インレットチャンネル２４３を通じてネガティブコントロールの代りに、ポジティブコントロールが注入されることもあり、ポジティブコントロールを注入するためのインレットチャンネルがさらに設けられることもある。
【００７１】
前記第４インレットチャンネル２４９には、２つの標準サンプルがそれぞれ注入される二つの標準サンプルインレットチャンネル２４５ａ，２４５ｂと、前記標準サンプルを所定濃度に希釈するための蒸溜水が注入される蒸溜水インレットチャンネル２４７とが連結されうる。また、二つの標準サンプルインレットチャンネル２４５ａ，２４５ｂと蒸溜水インレットチャンネル２４７とには、それぞれ外部と連結される注入口２４６ａ，２４６ｂ，２４８が連結されうる。このような構成によれば、前記第４インレットチャンネル２４９で前記標準サンプルと蒸溜水とが出合って所定濃度の標準サンプル水溶液が生成される。したがって、標準サンプルと蒸溜水とのフロー速度を調節すれば、異なる濃度を有する標準サンプル水溶液を多様で容易に作りうる。このとき、標準サンプルと蒸溜水とが十分に混合されるように、前記第４インレットチャンネル２４９は、蛇行曲線型であることが望ましい。
【００７２】
前記のような構成を有する本発明の第２実施例による核酸増幅装置において、前記第２インレットチャンネル１５１を通じてオイル１３１を注入しつつ前記第１、第３及び第４インレットチャンネル２４１，２４３，２４９それぞれを通じて反応物水溶液、ＮＴＣ水溶液及び標準サンプル水溶液を注入すれば、前述した第１実施例で説明したように、反応チャンネル１３０の内部にそれぞれオイル１３１によって取り囲まれた複数の反応物水溶液滴２３２、複数のＮＴＣ水溶液滴２３３及び複数の標準サンプル水溶液滴２３４が形成される。このとき、前記水溶液を所定の時間間隔をおいて交互に注入すれば、図２に示されたように、反応チャンネル１３０内に前記水溶液滴２３２，２３３，２３４がそれぞれ数個ずつ交互に形成されうる。このように、形成された水溶液滴２３２，２３３，２３４が反応チャンネル１３０に沿って流れつつ二つのヒータ１２１，１２２によって加熱された基板１１０の二つの温度領域を交互に反復的に通過すれば、前記水溶液滴２３２，２３３，２３４内で連続フローＰＣＲがなされる。
【００７３】
そして、蛍光染料を各水溶液内に入れた後、光学的な検出システムを利用して各水溶液滴２３２，２３３，２３４から発散される蛍光シグナルを検出すれば、核酸の定量分析が可能になる。再び説明すれば、初期の反応物水溶液滴２３２が反応チャンネル１３０の末端部に到達した時、ＣＣＤカメラを使用して、図３に示されたような蛍光シグナルについてのＣＣＤイメージが得られる。図３を参照すれば、反応チャンネルに沿って所定間隔をおいて流れている複数の水溶液滴それぞれから蛍光シグナルが発散されるので、反応チャンネル全体から蛍光シグナルが発散される従来の場合に比べて、はるかに簡単で明確に蛍光シグナルの定量分析が可能になる。そして、このように得られた前記ＣＣＤイメージを分析すれば、図４に示されたようなリアルタイムＰＣＲ曲線が得られる。
【００７４】
前記のように、本発明の第２実施例によれば、一つの装置で一回のイメージ分析でリアルタイムＰＣＲ曲線が得られ、これを使用して核酸の定量分析をできるという長所がある。そして、一つの反応チャンネル１３０内に反応物水溶液だけでなく、ＮＴＣ水溶液及び標準サンプル水溶液を共に注入して同時に実験できるので、ＰＣＲ装置のサイズが従来に比べて小さくなり、リアルタイムＰＣＲに必要な時間もはるかに短縮するという長所がある。また、標準サンプル及び蒸溜水のフロー速度を調節すれば、異なる濃度を有する標準サンプル水溶液を多様で容易に作りうるので、さらに正確な定量分析が可能であるという長所がある。
【００７５】
［実施例３］多重ＰＣＲ
図５は、本発明の第３実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図である。
【００７６】
図５を参照すれば、本発明の第３実施例による核酸増幅装置において、基板１１０、反応チャンネル１３０及び加熱装置１２０の構成は、前述した第１実施例と同じであるので、これらについての詳細な説明は省略する。
【００７７】
本発明の第３実施例による核酸増幅装置は、一つの装置内で色々な遺伝子を一度に分析する多重ＰＣＲが可能な構成を有する。このために、前記基板１１０の内部には、反応物水溶液を注入するための複数個、例えば、３個の第１インレットチャンネル３４１と、前記複数の第１インレットチャンネル３４１に異なる種類のプライマーＡ、Ｂ及びＣをそれぞれ注入するための複数のプライマーインレットチャンネル３４３と、オイルを注入するための一つの第２インレットチャンネル１５１と、が形成される。前記第２インレットチャンネル１５１は、反応チャンネル１３０の開始端から直線状に延びるように形成され、前記複数の第１インレットチャンネル３４１は、互いに所定間隔をおいて前記反応チャンネル１３０に対して直交するように連結されうる。そして、前記複数のプライマーインレットチャンネル３４３は、複数の第１インレットチャンネル３４１にそれぞれ連結される。また、複数の第１インレットチャンネル３４１と複数のプライマーインレットチャンネル３４３とには、それぞれ外部と連結される注入口３４２，３４４が連結されうる。
【００７８】
前記のような構成を有する本発明の第３実施例による核酸増幅装置において、前記複数のプライマーインレットチャンネル３４３を通じて異なる種類のプライマーＡ、Ｂ及びＣを複数の第１インレットチャンネル３４１内にそれぞれ注入すれば、複数の第１インレットチャンネル３４１の内部の反応物水溶液には、異なる種類のプライマーがそれぞれ含まれる。この過程で、反応物水溶液とプライマーとが十分に混合されるように、前記複数の第１インレットチャンネル３４１それぞれは、蛇行曲線型が望ましい。
【００７９】
次いで、第２インレットチャンネル１５１を通じてオイル１３１を注入しつつ前記複数の第１インレットチャンネル３４１それぞれを通じて反応物水溶液を反応チャンネル１３０の内部に注入すれば、反応チャンネル１３０の内部には、それぞれオイル１３１によって取り囲まれて異なるプライマーが含まれた水溶液滴３３２ａ，３３２ｂ，３３２ｃが形成される。このとき、複数の第１インレットチャンネル３４１それぞれを通じて前記水溶液を所定の時間間隔をおいて交代に注入すれば、図５に示されたように、反応チャンネル１３０内に前記水溶液滴３３２ａ，３３２ｂ，３３２ｃが一つずつ交代に形成されうる。
【００８０】
前記のように、本発明の第３実施例によれば、小さなサイズの一つの装置内で色々な遺伝子を一度に分析する多重ＰＣＲが可能であるという長所がある。また、異なるプライマーを有する水溶液滴３３２ａ，３３２ｂ，３３２ｃがそれぞれオイル１３１に取り囲まれて互いに接触しないので、反応物水溶液間の相互汚染が防止されるという長所がある。
【００８１】
［実施例４］ホットスタートＰＣＲ
図６は、本発明の第４実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図である。
【００８２】
図６を参照すれば、本発明の第４実施例による核酸増幅装置において、基板１１０、反応チャンネル１３０及び加熱装置１２０の構成は、前述した第１実施例と同じであるので、これらについての詳細な説明は省略する。
【００８３】
本発明の第４実施例による核酸増幅装置は、ホットスタートＰＣＲが可能な構成を有する。このために、前記基板１１０の内部には、反応物水溶液を注入するための第１インレットチャンネル４４１と、前記第１インレットチャンネル４４１にプライマーを注入するためのプライマーインレットチャンネル４４３と、前記第１インレットチャンネル４４１に反応の共通成分、例えば、重合酵素、ｄＮＴＰｓ、バッファを注入するための共通成分インレットチャンネル４４５と、オイルを注入するための第２インレットチャンネル１５１とが形成される。前記第２インレットチャンネル１５１は、反応チャンネル１３０の開始端から直線状に延びるように形成され、前記第１インレットチャンネル４４１は、前記反応チャンネル１３０に対して直交するように連結されうる。そして、前記プライマーインレットチャンネル４４３と共通成分インレットチャンネル４４５とは、それぞれ前記第１インレットチャンネル４４１のほぼ中間部位に連結される。また、前記第１インレットチャンネル４４１、プライマーインレットチャンネル４４３及び共通成分インレットチャンネル４４５には、それぞれ外部と連結される注入口４４２，４４４，４４６が連結されうる。
【００８４】
前記のような構成を有する本発明の第４実施例による核酸増幅装置において、前記第１インレットチャンネル４４１にターゲットＤＮＡ水溶液を注入しつつ、プライマーインレットチャンネル４４３と共通成分インレットチャンネル４４５にプライマーと反応の共通成分とをそれぞれ注入すれば、前記第１インレットチャンネル４４１のほぼ中間部位でターゲットＤＮＡ水溶液及びプライマーと共通成分とが混合されて核酸増幅用反応物水溶液が生成される。このように生成された反応物水溶液は、前記第１インレットチャンネル４４１を通じて反応チャンネル１３０内に注入され、これにより、反応チャンネル１３０の内部には、オイル１３１によって取り囲まれた複数の反応物水溶液滴４３２が形成される。次いで、前記水溶液滴４３２が反応チャンネル１３０に沿って流れつつ二つのヒータ１２１，１２２によって加熱された基板１１０の二つの温度領域を交互に反復的に通過すれば、前記水溶液滴４３２内で連続フローＰＣＲがなされる。
【００８５】
この過程で、水溶液滴４３２が第１サイクルの融解温度に到達する前に水溶液滴４３２内の反応物が均一な温度に十分に加熱されるように、前記反応チャンネル１３０の開始端の近くの一部分は、蛇行曲線型が望ましい。
【００８６】
前記のように、本発明の第４実施例によれば、ＰＣＲの第１サイクル直前にターゲットＤＮＡ水溶液及びプライマーと共通成分とが混合されて核酸増幅用反応物水溶液が生成されるので、ホットスタートＰＣＲが可能になる。したがって、ＰＣＲが開始される前の低い温度で発生できるプライマーダイマーの形成のような非特異的な反応を防止できる。
【００８７】
［実施例５］温度プログラムが可能な連続フローＰＣＲ
図７は、本発明の第５実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図である。
【００８８】
図７を参照すれば、本発明の第５実施例による核酸増幅装置において、基板１１０、反応チャンネル１３０及びインレットチャンネル４４１，４４３，４４５，１５１の構成は、前述した第４実施例と同じであるので、これらについての詳細な説明は省略する。
【００８９】
本発明の第５実施例による核酸増幅装置には、独立して制御される複数のヒータ５２１１〜５２１ｎを有する加熱装置５２０が備えられる。具体的に、前記ヒータ５２１１〜５２１ｎは、互いに平行に配置され、前記基板１１０の底面に熱的に接触される。このように配置された前記ヒータ５２１１〜５２１ｎは、それぞれ基板１１０の一部分を所定温度に加熱する役割を行う。
【００９０】
このような構成によれば、各個別ヒータ５２１１〜５２１ｎの温度条件を必要に応じて変更して基板１１０の温度領域を多様にプログラムできる。例えば、前記ヒータ５２１１〜５２１ｎを３グループに分けて、各グループを異なる温度で制御すれば、基板１１０に３つの温度Ｔ１，Ｔ２，Ｔ３領域が形成されうる。したがって、本実施例によれば、一つの装置を使用しつつも多様な温度条件で核酸増幅実験をできるという長所がある。  
【００９１】
そして、前記のような構成を有する加熱装置５２０は、前述した第１実施例ないし第４実施例による核酸増幅装置にも適用されうる。
【００９２】
［実施例６］単一分子ＰＣＲ
図８は、本発明の第６実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図である。
【００９３】
図８を参照すれば、本発明の第６実施例による核酸増幅装置は、単一分子ＰＣＲが可能な構成を有する。このために、基板１１０の内部には、１段階ＰＣＲのための二つの１次反応チャンネル６３１，６３２及び２段階ＰＣＲのための一つの２次反応チャンネル６３３と、前記二つの１次反応チャンネル６３１，６３２それぞれに反応物水溶液を注入するための第１インレットチャンネル６４１と、前記１次反応チャンネル６３１，６３２それぞれにオイルを注入するための二つの第２インレットチャンネル６５１，６５３と、が形成される。
【００９４】
前記二つの第２インレットチャンネル６５１，６５３は、二つの１次反応チャンネル６３１，６３２の開始端にそれぞれ連結され、前記第１インレットチャンネル６４１は、二つの１次反応チャンネル６３１，６３２の開始端に共通的に連結される。そして、第１インレットチャンネル６４１と二つの第２インレットチャンネル６５１，６５３とには、それぞれ外部と連結される注入口６４２，６５２，６５４が連結されうる。
【００９５】
一方、前記二つの１次反応チャンネル６３１，６３２について共通的な一つの第２インレットチャンネルが設けられうる。そして、前記二つの１次反応チャンネル６３１，６３２それぞれについて一つずつの第１インレットチャンネルが設けられることもある。
【００９６】
前記二つの１次反応チャンネル６３１，６３２それぞれの末端は、前記２次反応チャンネル６３３の開始端に共に連結され、２次反応チャンネル６３３の末端には、外部と連結される排出口６３４が設けられる。
【００９７】
そして、前記基板１１０の下部には、前記基板を加熱するための加熱装置が配置される。前記加熱装置は、図８に示されたように、前記基板１１０の底面に熱的に接触されて独立して制御される複数のヒータより構成されうる。前記複数のヒータそれぞれは、基板１１０の底面に熱的に接触されて、前記基板１１０を複数の温度領域に加熱する。例えば、図８に示されたように、前記ヒータ６２１〜６２５は、二つの１次反応チャンネル６３１，６３２と一つの２次反応チャンネル６３３それぞれに二つの温度領域を提供するように５個より構成されうる。
【００９８】
前記のような構成を有する本発明の第６実施例による核酸増幅装置によれば、二つの１次反応チャンネル６３１，６３２それぞれの内部に、オイル６６１によって取り囲まれた水溶液滴６６２ａ，６６２ｂが形成される。このとき、反応物水溶液に含まれた核酸の濃度が非常に低い場合、１次反応チャンネル６３１，６３２内には、核酸が相対的に低い濃度で含まれるか、または核酸が含まれていない第１水溶液滴６６２ａと核酸が相対的に高い濃度で含まれた第２水溶液滴６６２ｂとが形成されうる。このように形成された水溶液滴６６２ａ，６６２ｂが１次反応チャンネル６３１，６３２に沿って流れつつ１段階のＰＣＲがなされる。この過程で、核酸が相対的に高い濃度で含まれた第２水溶液滴６６２ｂ内のプライマーはほぼ消費される一方、第１水溶液滴６６２ａ内のプライマーは、ほぼそのままに残っている。
【００９９】
このように、１段階のＰＣＲが完了した水溶液滴６６２ａ，６６２ｂは、前記２次反応チャンネル６３３で出合って混合される。このとき、第１水溶液滴６６２ａ同士または第２水溶液滴６６２ｂ同士合わせられることもあるが、第１水溶液滴６６２ａと第２水溶液滴６６２ｂとが互いに合わせられて、第３水溶液滴６６２ｃを形成することもある。後者の場合に、第２水溶液滴６６２ｂ内の核酸が第１水溶液滴６６２ａ内のプライマーと出合うので、第３水溶液滴６６２ｃ内には、核酸とプライマーとがいずれも存在する。したがって、第３水溶液滴６６２ｃが２次反応チャンネル６３３に沿って流れつつ２段階のＰＣＲがなされる。
【０１００】
前記のように、本実施例によれば、一つの装置内で２段階のＰＣＲがなされ、これにより、ＰＣＲの敏感度が画期的に向上しうる。そして、一つの装置内に数十ないし数百個の水溶液滴６６２ａ，６６２ｂを継続的に作りうるので、一回の実験によっても低濃度の核酸を十分に増幅させうる。また、反応器としての役割を行う水溶液滴６６２ａ，６６２ｂ，６６２ｃの体積が非常に小さいので、低濃度の核酸の増幅において、その感度がはるかに高まる。
【０１０１】
一方、前記のような２段階のＰＣＲによる単一分子ＰＣＲ方法は、チャンネル形態の反応容器を有する核酸増幅装置だけでなく、後術するチャンバ形態の反応容器を有する核酸増幅装置にも適用されうる。
【０１０２】
［実施例７］単一分子ＰＣＲ
図９Ａ及び図９Ｂは、本発明の第７実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図であって、図９Ａは、１段階ＰＣＲを説明するための図面であり、図９Ｂは、２段階ＰＣＲを説明するための図面である。
【０１０３】
まず、図９Ａを参照すれば、本発明の第７実施例による核酸増幅装置は、基板１１０と、前記基板１１０の内部に形成された反応チャンバ７３０、インレットチャンネル７４１，７５１及びアウトレットチャンネル７６１と、前記基板１１０を所定温度に加熱するための加熱装置と、を備える。
【０１０４】
前記基板１１０の構成は、前述した第１実施例と同じである。
【０１０５】
前記反応チャンバ７３０は、前記基板１１０の内部に形成されて核酸増幅反応が起こる反応容器としての役割を行い、多角形または円形の形状を有しうる。そして、前記反応チャンバ７３０は、一つの基板１１０上に複数個が形成されうる。
【０１０６】
前記反応チャンバ７３０の一端には、反応物水溶液が注入される第１インレットチャンネル７４１と、流体、例えば、オイル７３１が注入される第２インレットチャンネル７５１とが連結される。そして、前記反応チャンバ７３０の他端には、反応チャンバ７３０から増幅産物とオイル７３１とが排出されるアウトレットチャンネル７６１が連結される。また、前記第１及び第２インレットチャンネル７４１，７５１には、それぞれ外部と連結される注入口７４２，７５２が設けられ、前記アウトレットチャンネル７６１には、外部と連結される排出口７６２が設けられる。
【０１０７】
前記加熱装置は、前記基板１１０の下部に配置されて前記基板１１０を所定温度に加熱するヒータ７２１より構成される。
【０１０８】
以下では、前記のように構成された本発明の第７実施例による核酸増幅装置を利用した核酸増幅方法を説明する。
【０１０９】
まず、前記のように反応物水溶液と、流体、例えば、オイル７３１をそれぞれ前記第１インレットチャンネル７４１と第２インレットチャンネル７５１とを通じて前記反応チャンバ７３０内に注入して、前記反応チャンバ７３０内にオイル７３１によって取り囲まれた複数の水溶液滴７３２ａ，７３２ｂを形成する。このとき、前記第１インレットチャンネル７４１を通過する反応物水溶液のフロー速度を一定に調節すれば、反応チャンバ７３０内に形成される複数の水溶液滴７３２ａ，７３２ｂは、均一な体積を有する。この過程で、反応物水溶液に含まれた核酸の濃度が非常に低い場合には、反応チャンバ７３０内には、核酸が相対的に低い濃度で含まれるか、または核酸が含まれていない第１水溶液滴７３２ａと核酸が相対的に高い濃度で含まれた第２水溶液滴７３２ｂとが形成されうる。
【０１１０】
次いで、前記ヒータ７２１を利用して一定のサイクルで前記基板１１０を加熱及び冷却を反復すれば、前記水溶液滴７３２ａ，７３２ｂ内で１段階ＰＣＲがなされる。この過程で、核酸が相対的に高い濃度で含まれた第２水溶液滴７３２ｂ内のプライマーはほぼ消費される一方、第１水溶液滴７３２ａ内のプライマーは、ほぼそのままに残っている。
【０１１１】
次いで、図９Ｂを参照すれば、前記のように１段階ＰＣＲが完了した後、遠心分離を通じて第１水溶液滴７３２ａと第２水溶液滴７３２ｂとを互いに合わせて、さらに大きい体積を有する第３水溶液滴７３２ｃを形成する。それにより、第２水溶液滴７３２ｂ内の核酸が第１水溶液滴７３２ａ内のプライマーと出合うので、第３水溶液滴７３２ｃ内には、核酸とプライマーとがいずれも存在する。
【０１１２】
次いで、前記ヒータ７２１を利用して一定のサイクルで前記基板１１０を加熱及び冷却を反復すれば、前記第３水溶液滴７３２ｃ内で２段階ＰＣＲがなされる。
【０１１３】
前記本発明の第７実施例による核酸増幅装置は、ＰＣＲ方法を行うためのものと説明された。しかし、前記核酸増幅装置を使用してＰＣＲ方法だけでなく、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ及びＬＡＭＰのような従来の等温増幅方法も行える。
【０１１４】
［実験例］
前記本発明の第１実施例ないし第６実施例において、連続フローＰＣＲを実施する場合に、反応チャンネル内には、熱伝導率が異なる反応物水溶液とオイルとが流れているので、そのそれぞれの流速と、基板の厚さ、ヒータと反応チャンネルとの間隔など設計変数の設定が必要である。
【０１１５】
したがって、以下では、基板と、反応チャンネルの内部を流れる反応物水溶液及びオイルについての熱的特性を考慮したシミュレーションを通じて核酸増幅装置の設計に必要な変数が提供される。
【０１１６】
下記表１には、幾つかの物質についての熱的特性が表されている。
【０１１７】
【表１】
2005253466.tif 000003
【０１１８】
ＬＣＰ：液晶性ポリマー、  ＰＤＭＳ：ポリジメチルシロキサン
前記表１を参照すれば、ＰＤＭＳと過フッ化デカリン（Ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｄｅｋａｌｉｎ（Ｃ１０Ｆ１８））との熱的特性が最も悪い値が示されている。
【０１１９】
したがって、以下のシミュレーションにおいては、最悪の条件でシミュレーションを行うために、基板としてＰＤＭＳを選定し、オイルとして過フッ素化デカリンを選定した。
【０１２０】
［実験例１］２次元シミュレーション
図１０Ａ及び図１０Ｂは、２次元シミュレーション条件を説明するための概略的な増幅装置断面図である。
【０１２１】
まず、図１０Ａを参照すれば、基板はＰＤＭＳよりなり、基板の底面には、ヒータが配置され、基板の内部には、幅ＷＣと高さＨＣとがそれぞれ１００μｍである反応チャンネルが形成された。そして、反応チャンネルとヒータとの間の基板の厚さＧＰは、１０μｍと設定され、反応チャンネル内の水の高さＨＷは９０μｍと設定された。
【０１２２】
以上のような条件で第１の２次元シミュレーションが実施された。
【０１２３】
そして、反応チャンネルの縦横比（幅ＷＣ／高さＨＣ）と反応チャンネルの高さＨＣに対する水の高さＨＷの比とをそれぞれ幾つかに変更させつつ第２の２次元シミュレーションが実施された。
【０１２４】
次いで、図１０Ｂを参照すれば、第３の２次元シミュレーションのために、反応チャンネルとヒータとの間の基板の厚さＧＰが１００μｍに変更され、残りの条件は、図１０Ａに示されたように設定された。
【０１２５】
一方、反応チャンネル内の水の断面形状は、表面張力によって実際には円形に近いが、シミュレーションをさらに容易にするために、図１０Ａ及び図１０Ｂに示されたように、反応チャンネル内の水の断面形状を四角形と仮定した。
【０１２６】
そして、下記表２には、前記２次元シミュレーションの具体的な条件が整理されている。
【０１２７】
【表２】
2005253466.tif 000004
【０１２８】
図１１ないし図１５には、前記２次元シミュレーションの結果が示されている。
【０１２９】
図１１は、図１０Ａに示された条件によって実施された２次元シミュレーション結果、９５℃から６０℃に冷却する時に経時的な温度分布を示す図面である。
【０１３０】
図１１を参照すれば、０．５秒以内に核酸増幅装置の全領域、すなわち、基板と反応チャンネルの内部のオイル及び水が均一に目標温度に到達することが分かる。
【０１３１】
図１２は、前記表２の条件によって２次元シミュレーションを実施した結果、経時的な水の温度変化を示すグラフである。図１２で、各温度曲線は、水が存在する領域の一断面についての６ケ所の温度の平均値を経時的に表したものである。
【０１３２】
図１２のグラフを参照すれば、反応チャンネルとヒータとの間の基板の厚さＧＰが１０μｍである場合には、温度の下降及び上昇時、反応チャンネルの縦横比に関係なく０．５秒ほどであれば、目標温度に到達することが分かる。
【０１３３】
図１２で、温度の上昇及び下降時に温度変化に差があるので、温度変化を全温度変化値に対して正規化してその値を経時的に表したものが、図１３のグラフである。
【０１３４】
図１３のグラフを参照すれば、温度上昇時の経時的な温度変化と温度下降時の経時的な温度変化とがほぼ類似していることが分かる。
【０１３５】
前記シミュレーション結果を総合してみれば、本発明による核酸増幅方法及び装置によれば、温度変化に対する応答速度が非常に速くて迅速なＰＣＲがなされうることが分かる。
【０１３６】
本発明において、オイルによって取り囲まれた水滴内の温度変化時、温度の均一性が重要な項目となるが、前述したシミュレーションを通じてこれを検証した。
【０１３７】
図１４は、表２の条件によって２次元シミュレーションを実施した結果、経時的な水の温度の標準偏差を示すグラフである。図１４で、各標準偏差の曲線は、水が存在する領域の一断面についての６ケ所の温度の標準偏差の平均値を経時的に表したものである。
【０１３８】
図１４のグラフを参照すれば、反応チャンネルとヒータとの間の基板の厚さＧＰが１０μｍの場合には、標準偏差が１℃以内に均一になる時間が反応チャンネルの縦横比に関係なく０．３秒以内であるということが分かる。そして、反応チャンネルとヒータとの間の基板の厚さＧＰが１００μｍである場合にも、０．４秒以内に温度標準偏差が１℃以内に均一になるということが分かる。
【０１３９】
図１４のグラフに表された温度の標準偏差が全温度変化量で占める比率を表したものが図１５のグラフである。
【０１４０】
図１５のグラフを参照すれば、全温度変化量の２％内の温度均一性を有する安定化に必要な時間が０．５秒以内であることを確認できる。これは、５０℃の温度変化が起こる時、１℃以内の温度均一性を有するのに０．５秒で十分であるということを意味する。
【０１４１】
［実験例２］３次元シミュレーション
実験例２は、前述した２次元的な状態のシミュレーションを行った後、実際構造に近接した３次元構造についての熱的特性を解釈するためのものである。
【０１４２】
図１６は、３次元シミュレーションのための増幅装置の構造を示す概略図である。
【０１４３】
図１６を参照すれば、ＰＤＭＳよりなる基板の下部に二つのヒータが配置されており、基板の内部には、反応チャンネルが形成されている。そして、反応チャンネルの内部には、オイルによって取り囲まれた水が滴状に存在している。
【０１４４】
このような構造において、３次元シミュレーション実行のための具体的な条件は、図１０Ａに示された条件と同一に設定された。すなわち、反応チャンネルの幅ＷＣと高さＨＣとはそれぞれ１００μｍと設定され、反応チャンネルとヒータとの間の基板の厚さＧＰは１０μｍと設定された。水滴のサイズは、その高さ、幅及び長さがそれぞれ９０μｍと設定され、第１ヒータの長さは３０００μｍ、第２ヒータの長さは１０００μｍと設定された。
【０１４５】
そして、３次元シミュレーションの初期条件は、下記の通りである。図１６で、右側の第１ヒータの温度は６０℃であり、第１ヒータが設置された領域のオイル及び水の初期温度は９５℃であり、左側の第２ヒータの温度は９５℃であり、第２ヒータが設置された領域のオイル及び水の初期温度は６０℃である。したがって、第１ヒータが設置された領域は、オイル及び水が９５℃から６０℃に冷却される領域となり、第２ヒータが設置された領域は、オイル及び水が６０℃から９５℃に加熱される領域となる。
【０１４６】
図１７ないし図２１には、前記３次元シミュレーションの結果が示されている。
【０１４７】
図１７は、図１６に示された条件によって実施された３次元シミュレーション結果、経時的な各領域の温度分布を示す図面である。
【０１４８】
図１７を参照すれば、０．５秒以内に核酸増幅装置の全ての領域が均一に目標温度に到達することが分かる。
【０１４９】
図１９は、図１６に示された条件によって３次元シミュレーションを実施した結果、経時的な水の温度変化を示すグラフである。図１９で、各温度曲線は、水が存在する領域で１８ケ所の温度の平均値を経時的に表したものである。そして、図２０は、図１９のグラフに表れた温度変化を全温度変化値で正規化して、その値を経時的に表したグラフである。
【０１５０】
前記図１９及び図２０のグラフには、３次元シミュレーション結果を２次元シミュレーション結果と比較するために３次元及び２次元シミュレーション結果が共に表示されており、３次元シミュレーションで加熱領域に対する温度曲線は１１（丸数字）で表示されており、冷却領域に対する温度曲線は１２（丸数字）で表示されている。
【０１５１】
図１９及び図２０のグラフを参照すれば、３次元シミュレーション結果は、２次元シミュレーション結果と大きい差を示さないことを確認できる。
【０１５２】
一方、迅速なＰＣＲのためには、オイルと水滴とが反応チャンネルに沿って流れつつ、その下側に配置されたヒータの温度まで短時間内に到達せねばならない。したがって、異なる温度を有する二つの領域が近接している場合、チャンネル内部の空間的な温度分布を調べた。
【０１５３】
図１８は、チャンネルの長手方向によるチャンネル内部の温度分布を示すグラフである。図１８で、左側の１ｍｍは温度が９５℃である領域であり、右側の３ｍｍは温度が６０℃である領域である。
【０１５４】
図１８を参照すれば、何れか一つの温度領域が他の温度領域に影響を及ぼす距離は、両方向にそれぞれ０．５ｍｍほどであるので、異なる温度を有する二つの領域が相互間の影響を完全に外れる距離は、約１ｍｍほど必要であると確認できる。
【０１５５】
前述した２次元シミュレーションと同様に、３次元シミュレーションを通じてオイルによって取り囲まれた水滴内の温度の均一性を確認するために、水滴内の１８箇所について温度の標準偏差を求めた。
【０１５６】
図２１は、３次元シミュレーション結果、温度の標準偏差が総温度変化量で占める比率を表すグラフである。前記図２１のグラフには、３次元シミュレーション結果を２次元シミュレーション結果と比較するために、３次元及び２次元シミュレーション結果が共に表示されており、３次元シミュレーションについての曲線は１１（丸数字）で表示されている。
【０１５７】
図２１のグラフを参照すれば、全温度変化量の２％内の温度均一性を有する安定化に必要な時間が０．５秒以内であることを確認できる。これは、５０℃の温度変化が起こる時、１℃以内の温度均一性を有するのに０．５秒で十分であるということを意味する。
【０１５８】
以上のシミュレーション結果、温度及び均一性の度合いについての応答特性は、下記表３に整理されている。
【０１５９】
【表３】
2005253466.tif 000005
【０１６０】
表３を参照すれば、熱的特性の重要な指標である経時的な温度の応答特性と温度の均一性はいずれも、１秒以内に所望のレベルに到達することを確認できる。特に、ヒータと反応チャンネルとの間のＰＤＭＳ基板の厚さが１０μｍほどである場合に、０．５秒以内に均一な温度分布を有し、所望の目標温度に到達できることを確認できる。
【０１６１】
本発明は、開示された実施例及び実験例を参考として説明されたが、これは、例示的なものに過ぎず、当業者ならば、これから多様な変形及び均等な他の実施例が可能であるということが分かる。したがって、本発明の真の技術的保護範囲は、特許請求の範囲によって決定されねばならない。
【産業上の利用可能性】
【０１６２】
本発明は、微量の核酸をその分析に必要な量ほど大量に増幅させる方法及びこの方法を行うための拡散増幅装置に利用されうる。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１Ａ】本発明の望ましい第１実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図である。
【図１Ｂ】図１Ａに示された核酸増幅装置の分離斜視図である。
【図２】本発明の第２実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図である。
【図３】本発明の第２実施例による核酸増幅装置を使用してＰＣＲを行った場合、各水溶液滴から発散される蛍光シグナルについてのＣＣＤイメージを示す図面である。
【図４】本発明の第２実施例による核酸増幅装置を使用してＰＣＲを行った場合、サイクル数による蛍光シグナルの強度を示すグラフである。
【図５】本発明の第３実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図である。
【図６】本発明の第４実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図である。
【図７】本発明の第５実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図である。
【図８】本発明の第６実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図である。
【図９Ａ】本発明の第７実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図であって、１段階ＰＣＲを説明するための図面である。
【図９Ｂ】本発明の第７実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図であって、２段階ＰＣＲを説明するための図面である。
【図１０Ａ】２次元シミュレーション条件を説明するための概略的な増幅装置の断面図である。
【図１０Ｂ】２次元シミュレーション条件を説明するための概略的な増幅装置の断面図である。
【図１１】図１０Ａに示された条件によって実施された２次元シミュレーション結果、９５℃から６０℃に冷却する時に経時的な温度分布を示す図面である。
【図１２】表２の条件によって２次元シミュレーションを実施した結果、経時的な水の温度変化を示すグラフである。
【図１３】図１２のグラフに示された温度変化を全温度変化値と正規化して、その値を経時的に示すグラフである。
【図１４】表２の条件によって、２次元シミュレーションを実施した結果、経時的な水の温度の標準偏差を示すグラフである。
【図１５】図１４のグラフに示された温度の標準偏差の全温度変化量に対する比率を示すグラフである。
【図１６】３次元シミュレーションのための増幅装置の構造を示す概略図である。
【図１７】図１６に示された条件によって実施された３次元シミュレーション結果、経時的な各領域の温度分布を示す図面である。
【図１８】チャンネルの長手方向によるチャンネル内部の温度分布を示すグラフである。
【図１９】図１６に示された条件によって３次元シミュレーションを実施した結果、経時的な水の温度変化を示すグラフである。
【図２０】図１９のグラフに示された温度変化を全温度変化値で正規化して、その値を経時的に示すグラフである。
【図２１】３次元シミュレーション結果、温度の標準偏差の全温度変化量に対する比率を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１６４】
１１０    基板
１１１    上部基板
１１２    下部基板
１２０    加熱装置
１２１、１２２    ヒータ
１３０    反応チャンネル
１３１    オイル
１３２    水溶液滴
１４１、１５１    チャンネル
１４２、１５２    注入口
１６２    排出口
２３２    反応物水溶液滴
２３３    ＮＴＣ水溶液滴
２３４    標準サンプル水溶液滴
２４１    第１インレットチャンネル
２４３    第３インレットチャンネル
２４９    第４インレットチャンネル
２４５ａ、２４５ｂ    標準サンプルインレットチャンネル
２４７    蒸留水インレットチャンネル
２４６ａ、２４６ｂ、２４８    注入口
３４１    第一インレットチャンネル
３４２、３４４    注入口
３４３    プライマーインレットチャンネル
【図１Ａ】
2005253466.tif 000006
【図１Ｂ】
2005253466.tif 000007
【図２】
2005253466.tif 000008
【図５】
2005253466.tif 000009
【図６】
2005253466.tif 000010
【図７】
2005253466.tif 000011
【図８】
2005253466.tif 000012
【図９Ａ】
2005253466.tif 000013
【図９Ｂ】
2005253466.tif 000014
【図１０Ａ】
2005253466.tif 000015
【図１０Ｂ】
2005253466.tif 000016
【図１２】
2005253466.tif 000017
【図１３】
2005253466.tif 000018
【図１４】
2005253466.tif 000019
【図１５】
2005253466.tif 000020
【図１６】
2005253466.tif 000021
【図２０】
2005253466.tif 000022
【図２１】
2005253466.tif 000023
【図３】
2005253466.tif 000024
【図４】
2005253466.tif 000025
【図１１】
2005253466.tif 000026
【図１７】
2005253466.tif 000027
【図１８】
2005253466.tif 000028
【図１９】
2005253466.tif 000029