(57)【要約】【課題】  本発明は、正確に定量対象物質を定量することができ、かつ製造が容易な酵素機能電極を得ることを目的とする。【解決手段】  定量対象である定量対象物質を定量する酵素機能電極であって、前記定量対象物質と反応し、前記定量対象物質との反応に応じて生成物質を生成する第１酵素と、前記定量対象物質の定量を行う電極と、前記電極上に固定または前記電極に埋め込まれ、前記生成物質と反応する第２酵素と、前記電極上に固定または前記電極に埋め込まれ、前記生成物質と前記第２酵素との反応に応じ、前記電極と反応する電子伝達メディエータとを含み、前記第１酵素と前記電子伝達メディエータとの反応性よりも前記第１酵素による生成物質の生成反応の反応性の方が高い酵素機能電極を提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
定量対象である定量対象物質を定量する酵素機能電極であって、
前記定量対象物質と反応し、前記定量対象物質との反応に応じて生成物質を生成する第１酵素と、
前記定量対象物質の定量を行う電極と、
前記電極上に固定または前記電極に埋め込まれ、前記生成物質と反応する第２酵素と、
前記電極上に固定または前記電極に埋め込まれ、前記生成物質と前記第２酵素との反応に応じ、前記電極と反応する電子伝達メディエータとを含み、
前記第１酵素と前記電子伝達メディエータとの反応性よりも前記第１酵素による生成物質の生成反応の反応性の方が高い、酵素機能電極。
【請求項２】
前記第１酵素、第２酵素及び電子伝達メディエータは前記電極上に固定されている、請求項１に記載の酵素機能電極。
【請求項３】
前記第１酵素及び第２酵素は前記電極上に固定され、前記電子伝達メディエータは前記電極に埋め込まれている、請求項１に記載の酵素機能電極。
【請求項４】
前記第１酵素は前記電極上に固定され、前記第２酵素及び電子伝達メディエータは前記電極に埋め込まれている、請求項１に記載の酵素機能電極。
【請求項５】
前記電極上には、前記第２酵素と前記電子伝達メディエータからなる第１層が形成され、前記第１層を覆うよう前記第１酵素が固定されている、請求項１に記載の酵素機能電極。
【請求項６】
前記第１酵素、前記第２酵素及び前記電子伝達メディエータは、ポリアリルアミンまたはポリ−Ｌ−リジンと一体化することにより前記電極上に固定されている、請求項５に記載の酵素機能電極。
【請求項７】
前記電子伝達メディエータはフェロセン誘導体であり、
前記電子伝達メディエータは、ポリアリルアミンまたはポリ−Ｌ−リジンを介して前記電極と固定されている、請求項１に記載の酵素機能電極。
【請求項８】
請求項１〜７に記載の酵素機能電極を有する酵素センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正確に定量対象物質を定量することができる酵素機能電極及び酵素センサに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
酵素の基質特異性を利用した分析法が、臨床分析化学、食品製造、工業、環境化学等の分野で利用されている。とりわけ、臨床分析化学の分野では、従来からグルコース、尿素、尿酸などを選択的に検出できる酵素センサが知られている。このような酵素センサとして、定量対象である定量対象物質と酵素との反応に応じて、電子伝達メディエータが電極表面で酸化される時の酸化電流により定量対象物質を定量するセンサがある。例えば、血液中のグルコース濃度を測定するグルコースセンサでは、図１６（ａ）に示す反応を利用してグルコース（ＧＯＤ）の定量を行う。つまり、酵素機能電極上に固定された酸化酵素であるＧＯＤの存在下で、血液中のグルコースがグルコン酸に酸化される。この反応で酸化型電子伝達メディエータ（Ｍｏｘ）は還元され還元型電子伝達メディエータ（Ｍｒｅｄ）になる。そして、電極で、ＭｒｅｄがＭｏｘに酸化される。このとき発生する酸化電流が血液中のグルコース濃度に比例することを利用し、グルコース濃度の定量を行う。
【０００３】
一方、定量対象物質と酵素との反応に応じて、電子伝達メディエータの電極表面での還元電流により定量対象物質を定量する酵素センサがある。この酵素センサでは、例えば、定量対象物質を特異的に認識する酸化酵素及びペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を用い、２段階の酵素反応を利用して定量対象物質を定量する。まず、１段階目の酵素反応においては、酸化酵素の存在下で定量対象物質が酸化され、この反応で溶存酸素（Ｏ2）が過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）に還元される。２段階目の酵素反応は、ＰＯＤの存在下でＨ2Ｏ2が水（Ｈ2Ｏ）に還元される。その反応において、ＰＯＤの存在下で、ＭｒｅｄがＭｏｘに酸化される。そして、電極表面においてＭｏｘがＭｒｅｄに還元され、還元電流が生じる。この還元電流を測定することにより定量対象物質を定量する。前述の２段階の反応を用いる酵素センサにおいては、上述した２段階の反応以外に、酸化酵素が定量対象物質を酸化する反応に共役して、酸化酵素がＭｏｘをＭｒｅｄに還元する反応が生じる。この反応は、Ｏ2と反応して生じるＨ2Ｏ2を減少させ、測定される還元電流を減少させてしまう妨害反応となる。そこで、このような酸化酵素と電子伝達メディエータとの間の反応を阻止するために、酸化酵素と電子伝達メディエータとを隔離する隔膜が設けられている。このような隔膜が設けられた酵素電極を有する酵素センサが非特許文献１〜５に開示されている。
【０００４】
例えば、非特許文献１〜４においては、ＧＯＤを酸化酵素とし、隔膜が設けられたグルコースセンサが開示されている。このグルコースセンサの酵素機能電極は、ＰＯＤ及びＧＯＤの２種類の酵素を有しており、図１７（ａ）に示す反応が生じる。まず、１段階目の反応において、ＧＯＤの存在下で、グルコースはグルコン酸に酸化され、Ｏ2はＨ2Ｏ2に還元される。次に２段階目の反応では、Ｈ2Ｏ2を特異的に認識するＰＯＤの存在下で、Ｈ2Ｏ2が水に還元され、ＭｒｅｄはＭｏｘに酸化される。そして、電極上において、ＭｏｘがＭｒｅｄに再還元される。このとき発生する還元電流を測定することでグルコース濃度の定量を行う。ここで、グルコースセンサの酵素電極には図１７（ａ）に示す隔膜が設けられている。これは、図１７（ｂ）に示す妨害反応によって、測定される還元電流が減少し定量対象物質に誤差が生じるからである。つまり、ＧＯＤ等の酸化酵素は、酸化反応を触媒するオキシダーゼ活性を有すると同時に、還元反応を触媒するデヒドロゲナーゼ活性を有する。そのため、デヒドロゲナーゼ活性を有するＧＯＤを用いたグルコースセンサでは、ＧＯＤがグルコースをグルコン酸に酸化する反応と同時に、ＭｏｘをＭｒｅｄに還元する反応（図１７（ｂ）参照）が生じる。よって、ＧＯＤがグルコースをグルコン酸に酸化し、Ｏ2をＨ2Ｏ2に還元する１段階目の反応が妨害される。このとき、ＭｏｘがＭｒｅｄに還元される際に電極で測定される還元電流が減少して測定誤差が生じる。そこで、妨害反応を阻止するためにＧＯＤと電子伝達メディエータとの間に隔膜を設けている。また、非特許文献５においては、グルコースセンサ以外にコレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＤ）を用いた酵素センサが開示されている。この非特許文献５の酵素センサの酵素機能電極においても酵素固定化のために設けられたＰＡＰＯ等の隔膜が妨害反応を防いでいる。
【０００５】
このような電子伝達メディエータが還元される際の還元電流を測定する系では、前述の酸化電流を測定する系に比べて電極電位が低い（約０ｍＶ  ｖ.ｓ.Ａｇ／ＡｇＣｌ）。よって、測定される酸化電流の誤差が生じ難く、正確に定量を行うことができる。また、隔膜が設けられているため、ＧＯＤやＣＨＯＤ等の酸化酵素がＭｏｘをＭｒｅｄに還元する妨害反応が低減され、測定誤差が低減される。
【非特許文献１】H.Kinoshita, M.Torimura, K.Kano, and T.Ikeda, Electroanalysis 1997,9,1234-1238
【非特許文献２】G.Kenausis, Q Cheng, and A.Heller, Anal. Chem.1997,69,1054-1060
【非特許文献３】H.Kinoshita, M.Torimura, K.Kano, and T.Ikeda, J.Electroanal.Chem.1999,9,478,33-39
【非特許文献４】R.Matsumoto, M.Mochizuki, K.Kano, and T.Ikeda, Anal. Chem.2002,74,3297-3303
【非特許文献５】Y. Nakabayashi, and H. Yoshikawa, Analytical Sciences June 2000,Vol.16
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
電子伝達メディエータが電極表面で酸化される時の酸化電流により定量対象物質を定量する酵素センサは、電極電位が高い（約５００ｍＶから６００ｍＶ  ｖ.ｓ.Ａｇ／ＡｇＣｌ）。よって、その電極電位と同程度の電位で酸化または還元される物質が試料溶液中に存在すると、測定される酸化電流に誤差が生じ、正確な定量を行えなくなる。また、この系では、酵素が定量対象物質を酸化する反応に共役して、図１６（ｂ）に示すような反応が生じる。つまり、試料溶液中の溶存酸素（Ｏ2）が酸化酵素であるＧＯＤによりＨ2Ｏ2に還元される。そのため、電極において測定される酸化電流が減少し、定量対象物質の定量に誤差が生じる。
【０００７】
また、非特許文献１〜５に記載の隔膜を有する酵素電極においては、隔膜により妨害反応を低減し正確に定量対象物質を定量することができる。しかし、隔膜を設けることにより製造工程が増加するため、酵素電極の製造が煩雑になる。また、酵素電極の小型化や安価な酵素電極の作成が困難となる。
そこで、本発明は、正確に定量対象物質を定量することができ、かつ製造が容易な酵素機能電極を得ることを目的とする。
また、本発明は、正確に定量対象物質を定量することができ、かつ製造が容易な酵素機能電極を有する酵素センサ得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願第１発明は、上記の課題を解決するために、定量対象である定量対象物質を定量する酵素機能電極であって、前記定量対象物質と反応し、前記定量対象物質との反応に応じて生成物質を生成する第１酵素と、前記定量対象物質の定量を行う電極と、前記電極上に固定または前記電極に埋め込まれ、前記生成物質と反応する第２酵素と、前記電極上に固定または前記電極に埋め込まれ、前記生成物質と前記第２酵素との反応に応じ、前記電極と反応する電子伝達メディエータとを含み、前記第１酵素と前記電子伝達メディエータとの反応性よりも前記第１酵素による生成物質の生成反応の反応性の方が高い酵素機能電極を提供する。
【０００９】
第１酵素の基質である定量対象物質（以下、第１基質）及び第２基質を含む試料溶液中に上記の酵素機能電極を浸漬する。まず、第１基質である定量対象物質と第１酵素との反応が生じる。さらに第１酵素は、第１基質である定量対象物質と前記第１酵素との反応に応じて第２基質と反応する。次に、第２酵素は、第１酵素と第２基質との反応により生じる生成物質（以下、第３基質）と反応する。最後に、電子伝達メディエータは、第２酵素と第３基質である生成物質との反応に応じて電極と電極反応を生じる。上記の酵素機能電極では、この電極反応により生じる電流を測定することにより第１基質である定量対象物質を定量する。
【００１０】
前述の一連の反応においては、第１酵素と第２基質との反応性は、第１酵素と電子伝達メディエータとの反応性よりも高い。よって、第１酵素と電子伝達メディエータとの反応に起因する電極反応が生じ難い。そのため、第２酵素と電子伝達メディエータとの反応に起因する電極反応が、第１酵素と電子伝達メディエータとの反応に起因する電極反応により妨害されない。つまり、第２酵素と電子伝達メディエータとの反応に起因して電極に生じる電流量が、第１酵素と電子伝達メディエータとの反応により起因して電極に生じる電流量により増加または減少しない。以上より本発明の酵素機能電極では、第１酵素と電子伝達メディエータとの反応を阻害するための隔膜を設ける必要がなく、酵素機能電極を容易に作製することができる。また、電子伝達メディエータと電極との電極反応により生じる電流を測定することで、定量対象物質の定量を正確に行うことができる。
【００１１】
さらに、上記の酵素機能電極においては、第２酵素及び電子伝達メディエータが電極に固定されているため、第２酵素が電極表面または電極表面近傍に位置している。よって、第２酵素による酵素反応及び電子伝達メディエータによる電極反応が効率的に行われる。よって、第２酵素と第３基質である生成物質との反応に起因する、電子伝達メディエータと電極との電極反応の反応性を高め、電極反応により生じる電流を電極において即時に測定することができる。また、酵素量及び電子伝達メディエータ量を低減することができる。また、電極に固定することにより、酵素及び電子伝達メディエータを回収して繰り返し利用することができる。
【００１２】
本願第２発明は、前記第１発明において、前記第１酵素、第２酵素及び電子伝達メディエータは前記電極上に固定されている酵素機能電極を提供する。
第１酵素、第２酵素及び電子伝達メディエータが電極に固定されているため、第１酵素による酵素反応、第２酵素による酵素反応及び電子伝達メディエータによる電極反応が効率的に行われる。よって、酵素量及び電子伝達メディエータ量を低減することができる。また、電極に固定することにより、酵素及び電子伝達メディエータを回収して繰り返し利用することができる。さらに、第１酵素、第２酵素及び電子伝達メディエータが電極表面または電極表面近傍に位置しているため、酵素反応及び電極反応により生じる電流を電極において即時に測定することができる。
【００１３】
本願第３発明は、前記第１発明において、前記第１酵素及び第２酵素は前記電極上に固定され、前記電子伝達メディエータは前記電極に埋め込まれている酵素機能電極を提供する。
第１酵素、第２酵素及び電子伝達メディエータが電極表面または電極表面近傍に位置、あるいは電極に埋め込まれているため、酵素反応及び電極反応により生じる電流を電極において即時に測定することができる。また、酵素量や電子伝達メディエータ量の低減や再利用が可能である。さらに、電子伝達メディエータが電極に埋め込まれているので、電子伝達メディエータを電極に固定する必要が無い。よって、電子伝達メディエータを有する電極を容易に作製することができる。
【００１４】
本願第４発明は、前記第１発明において、前記第１酵素は前記電極上に固定され、前記第２酵素及び電子伝達メディエータは前記電極に埋め込まれている酵素機能電極を提供する。
第１酵素、第２酵素及び電子伝達メディエータが電極表面または電極表面近傍に位置、あるいは電極に埋め込まれているため、酵素反応及び電極反応により生じる電流を電極において即時に測定することができる。また、酵素量や電子伝達メディエータ量の低減や再利用が可能である。さらに、第２酵素及び電子伝達メディエータが電極に埋め込まれているので、第２酵素及び電子伝達メディエータを電極に固定する必要が無い。よって、第２酵素及び電子伝達メディエータを有する電極を容易に作製することができる。
【００１５】
本願第５発明は、前記第１発明において、前記電極上には、前記第２酵素と前記電子伝達メディエータからなる第１層が形成され、前記第１層を覆うよう前記第１酵素が固定されている酵素機能電極を提供する。
第１酵素を酵素機能電極の最表面に固定することで、第１酵素が定量対象物質と反応し易くなる。また、電子伝達メディエータ及び第２酵素を電極基板側の最表面に固定することで、第２酵素と電子伝達メディエータとの間の反応性を高め、かつ電子伝達メディエータと電極との電極反応を高め、電極において即時に電流を測定することができる。
【００１６】
本願第６発明は、前記第５発明において、前記第１酵素、前記第２酵素及び前記電子伝達メディエータは、ポリアリルアミンまたはポリ−Ｌ−リジンと一体化することにより前記電極上に固定されている酵素機能電極を提供する。
第２酵素を電極に固定するためのポリマーと第１酵素を電極に固定するためのポリマーとを別々のポリマーとすることができる。例えば、第１酵素を固定するために最適なポリマーと第２酵素を固定するために最適なポリマーとが異なる場合であっても、それぞれの酵素に対して最適なポリマーを用いてそれぞれの酵素を固定することができる。
【００１７】
本願第７発明は、前記第１発明において、前記電子伝達メディエータはフェロセン誘導体であり、前記電子伝達メディエータは、ポリアリルアミンまたはポリ−Ｌ−リジンを介して前記電極と固定されている酵素機能電極を提供する。
電子伝達メディエータであるフェロセン誘導体は、ポリアリルアミンまたはポリ−Ｌ−リジンの側鎖に固定される。よって、ポリアリルアミンまたはポリ−Ｌ−リジンを電極に結合することにより、電子伝達メディエータであるフェロセン誘導体を電極表面又は電極表面近傍に固定することができる。また、前記ポリマーはアミノ基を有しているため、架橋剤を介してポリマー同士を結合して網目構造を形成することにより第１酵素または第２酵素を固定することができる。あるいは、架橋剤を介してポリマー骨格と第１酵素または第２酵素とを架橋させることで、酵素をポリマーに固定することができる。
【００１８】
本願第８発明は、本願第１発明〜第７発明に記載の酵素機能電極を有する酵素センサを提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の酵素機能電極は、隔膜を設ける必要がないため製造が容易である。また、本発明の酵素機能電極を用いれば、正確に定量対象物質を定量することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
＜基本構成＞
本発明に係る定量対象物質を測定するための酵素機能電極は、電極、第１酵素、第２酵素、及び電子伝達メディエータ（Ｍ）を有している。この酵素機能電極が、試料溶液３に浸漬されている。試料溶液３には、第１酵素と特異的に反応する２種類の基質が含まれている。２種類の基質の一方は、定量対象である定量対象物質（以下、第１基質（Ｓ１）という）であり、他方は第１基質と第１酵素との反応に応じて第１酵素と特異的に反応する第２基質（Ｓ２）である。このように第１酵素は、試料溶液３中の第１基質及び第２基質と特異的に反応する。また、第２酵素は、第１酵素と第２基質との反応により生じた生成物質（以下、第３基質という）と、電子伝達メディエータと特異的に反応する。電子伝達メディエータは、第２酵素と第３基質との反応に応じて第２酵素と反応する。ここで、第１酵素としては、第１酵素と電子伝達メディエータとの反応性よりも第１酵素と第２基質との反応性の方が高い酵素、つまり第１酵素と電子伝達メディエータとの反応性よりも第１酵素と第２基質との反応による生成物質の生成反応の反応性の方が高い酵素が選択される。あるいは、第１酵素と電子伝達メディエータとが反応しない酵素が選択される。
【００２１】
この系を、試料溶液３に浸漬すると、まず第１基質である定量対象物質が第１酵素と特異的に反応し、その反応に共役して第１酵素と第２基質とが反応する。次に、第２酵素は、第１酵素と第２基質との反応により生じる第３基質である生成物質と反応する。最後に、電子伝達メディエータは、第２酵素と第３基質との反応に応じて電極と電極反応を生じる。上記の酵素機能電極を有する酵素センサでは、この電極反応により生じる電流を測定することにより第１基質である定量対象物質を定量する。
この一連の反応においては、第１酵素と第２基質との反応性は、第１酵素と電子伝達メディエータとの反応性よりも高い。あるいは、第１酵素は電子伝達メディエータと反応しないため、第１酵素と電子伝達メディエータとの反応に起因する電極反応が生じ難い。よって、第２酵素と電子伝達メディエータとの反応に起因する電極反応が、第１酵素と電子伝達メディエータとの反応に起因する電極反応により妨害されない。つまり、第２酵素と電子伝達メディエータとの反応に起因して電極に生じる電流量が、第１酵素と電子伝達メディエータとの反応に起因して電極に生じる電流量により増加または減少しない。以上より本発明の酵素機能電極では、第１酵素と電子伝達メディエータとの反応を防止するための隔膜を設けることなく第１基質である定量対象物質を定量可能な、酵素機能電極を容易に作成することができる。
【００２２】
電極、第１酵素、第２酵素、及び電子伝達メディエータ（Ｍ）を有する酵素機能電極として、例えば次のような構成が挙げられる。
（１）構成１
本発明の酵素機能電極の１形態の模式図を図１に示す。図１の酵素機能電極は、電極１上に第１酵素、第２酵素、電子伝達メディエータ（Ｍ）が混在して固定された形態である。この酵素機能電極が試料溶液３中に浸漬されている。このとき、試料溶液３中には、第１基質（Ｓ１）である定量対象物質及び第２基質（Ｓ２）が含まれている。また、第２基質は、電極に固定されていても良い。図１に示す酵素機能電極では、第１酵素、第２酵素、及び電子伝達メディエータ（Ｍ）が電極に固定されているため、第１酵素による酵素反応、第２酵素による酵素反応及び電子伝達メディエータによる電極反応が効率的に行われる。よって、酵素量及び電子伝達メディエータ量を低減することができる。また、電極１に固定することにより、酵素及び電子伝達メディエータを回収して繰り返し利用することができる。例えば、酵素が固定された酵素機能電極を試料溶液から引き上げ、軽く洗浄して再度測定することができる。さらに、第１酵素、第２酵素及び電子伝達メディエータが電極表面または電極表面近傍に位置しているため、酵素反応及び電極反応により生じる電流を電極１において即時に測定することができる。
（２）構成２
本発明の酵素機能電極の１形態の模式図を図２に示す。図２の酵素機能電極は、電極１に電子伝達メディエータ（Ｍ）が埋め込まれており、電極１上に第１酵素及び第２酵素が混在して固定された形態である。この電極１は、例えばカーボンペースト５に電子伝達メディエータを練り込んで形成されている。この酵素機能電極が第１基質（Ｓ１）である定量対象物質及び第２基質（Ｓ２）を含む試料溶液３中に浸漬されている。また、第２基質は、電極に固定されていても良い。図２に示す酵素機能電極では、電子伝達メディエータが電極１に埋め込まれ、かつ第１酵素、第２酵素が電極表面または電極表面近傍に位置しているため、酵素反応及び電極反応により生じる電流を電極において即時に測定することができる。また、酵素及び電子伝達メディエータが電極に固定または埋め込まれているため、酵素量及び電子伝達メディエータ量を減らしたり再利用することができる。さらに、電子伝達メディエータが電極１に埋め込まれているので、電子伝達メディエータを電極に固定する必要が無い。よって、電子伝達メディエータを有する電極１を容易に作製することができる。
（３）構成３
本発明の酵素機能電極の１形態の模式図を図３に示す。図３の酵素機能電極は、電極１に電子伝達メディエータ（Ｍ）及び第２酵素が埋め込まれており、電極１上に第１酵素が固定された形態である。この電極１は、例えばカーボンペースト５に電子伝達メディエータ及び第２酵素を練り込んで形成されている。この酵素機能電極が第１基質（Ｓ１）である定量対象物質及び第２基質（Ｓ２）を含む試料溶液３中に浸漬されている。また、第２基質は、電極に固定されていても良い。図３に示す酵素機能電極では、電子伝達メディエータ及び第２酵素が電極に埋め込まれ、かつ第１酵素が電極に固定されているため、第１酵素及び第２酵素が電極表面または電極表面近傍に位置している。よって、第１酵素及び第２酵素の酵素量を減らしたり再利用することができる。また、電子伝達メディエータが電極に埋め込まれているため、酵素反応及び電極反応により生じる電流を電極において即時に測定することができる。さらに、第２酵素及び電子伝達メディエータが電極に埋め込まれているので、第２酵素及び電子伝達メディエータを電極に固定する必要が無い。よって、第２酵素及び電子伝達メディエータを有する電極を容易に作製することができる。
（４）構成４
本発明の酵素機能電極の１形態の模式図を図４に示す。電極１上には、第２酵素と電子伝達メディエータが混在する第１層９が固定され、その第１層９を覆うように第１酵素からなる第２層１１が固定されている。この酵素機能電極が第１基質（Ｓ１）である定量対象物質及び第２基質（Ｓ２）を含む試料溶液３中に浸漬されている。また、第２基質は、電極に固定されていても良い。図４に示す酵素機能電極では、第１酵素を酵素機能電極の最表面に固定することで、第１酵素と定量対象物質との接触確率が高まり反応し易くなる。また、電子伝達メディエータ及び第２酵素を電極基板側の最表面に固定することで、第２酵素と電子伝達メディエータとの間の反応性が高まり、かつ電子伝達メディエータと電極１との電極反応が高まる。よって、電極１において即時に電流を測定することができる。さらに、酵素が電極に固定されているため、第１酵素及び第２酵素の酵素量を減らすことができる。
＜第１実施形態例＞
図５は、第１実施形態例に係る酵素機能電極が試料溶液に浸漬されている様子を示す概略図である。第１実施形態例に係る酵素機能電極では、第２酵素であるペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤという）及び電子伝達メディエータ（Ｍ）がポリマー１５及び架橋剤１７により電極１上に固定されている。この酵素機能電極が、試料溶液３に浸漬されている。試料溶液３には、第１酵素と、第１酵素と特異的に反応する２種類の第１基質（Ｓ１）及び第２基質とが含まれている。第１基質は、定量対象である定量対象物質であり、第２基質は、試料溶液中に溶存している溶存酸素（Ｏ2）である。Ｏ2は、第１基質（Ｓ１）と第１酵素との反応に応じて第１酵素と特異的に反応し、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）に還元される。このように第１酵素は、試料溶液３中の第１基質である定量対象物質及び第２基質であるＯ2と特異的に反応する。また、第２酵素は、第１酵素によりＯ2が還元されて生成された過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）と、電子伝達メディエータと特異的に反応する。電子伝達メディエータは、第２酵素とＨ2Ｏ2との反応に応じて第２酵素と反応する。ここで、第１酵素としては、第１酵素と電子伝達メディエータとの反応性よりも第１酵素と第２基質であるＯ2との反応性の方が高い酵素、つまり第１酵素と電子伝達メディエータとの反応性よりも第１酵素とＯ2との反応による生成されるＨ2Ｏ2の生成反応の反応性の方が高い酵素が選択される。あるいは、第１酵素と電子伝達メディエータとが反応しない酵素が選択される。
【００２３】
第１酵素としては、例えばコレステロールオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ及びヒスタミンオキシダーゼが選択されると好ましい。
電子伝達メディエータ及びポリマー１５としては、電子伝達メディエータが結合した電子伝達メディエータ結合ポリマーが挙げられる。電子伝達メディエータ結合ポリマーとしては、例えば電子伝達メディエータがフェロセン誘導体であるフェロセン結合ポリアリルアミンまたはフェロセン結合ポリ−Ｌ−リジンを用いる。これらのポリマーは、電子伝達メディエータであるフェロセン誘導体が、ポリアリルアミンまたはポリ−Ｌ−リジンの側鎖に固定されている。よって、電子伝達メディエータ結合ポリマーを電極に結合することにより、電子伝達メディエータを電子伝達メディエータ結合ポリマーと一体化して電極表面又は電極表面近傍に固定することができる。ポリマー１５と電極１とは、例えば疎水性相互作用により結合されている。
【００２４】
また、ポリマーはアミノ基を有しているため、架橋剤１７を介してポリマー同士を結合して網目構造を形成することにより第１酵素または第２酵素を固定することができる。また、架橋剤１７を介してポリマー骨格と第１酵素または第２酵素とを架橋させることで、酵素をポリマーに固定することができる。フェロセン結合ポリアリルアミンの合成方法は、例えばE.J.Calvo et al, / Anal.Chem. 1996,68,4186-4193に記載されている。フェロセン結合ポリ−Ｌ−リジンの合成方法は、例えばS.Iijima et al, / Anal.Chem.Acta, 1993,281,438-487に記載されている。
【００２５】
架橋剤１７としては、グルタルアルデヒドまたはポリエチレングリコールジグリシジルエーテルなどが挙げられる。これらの架橋剤のアルデヒド基またはエポキシ基が、ポリアリルアミン、ポリ−Ｌ−リジンあるいは酵素のアミノ基とシッフ塩基を形成し結合する。
架橋する際に、ポリアリルアミン、ポリ−Ｌ−リジン等のポリマーまたは牛血アルブミン（ＢＳＡ）をさらに添加すると、ポリマーと架橋剤との反応により網目構造が形成され、酵素の固定が容易である。
次に、上記の酵素機能電極の反応について図６を用いて説明する。上記の酵素機能電極を、第２基質である酸素（Ｏ2）、第１酵素及び第１基質である定量対象物質を含む試料溶液３に浸漬すると、まず第１基質が第１酵素により酸化される。さらに第１基質と第１酵素との反応に応じ、第１酵素は、第２基質であるＯ2を過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）に還元する。このとき、第２酵素であるＰＯＤは還元されたＨ2Ｏ2を水（Ｈ2Ｏ）に還元し、この反応に応じてＰＯＤは還元型電子伝達メディエータ（Ｍｒｅｄ）を酸化する。最後に、酸化型電子伝達メディエータ（Ｍｏｘ）が、電極１から電子を受け取りＭｒｅｄに還元される。ここで、第１酵素であるコレステロールオキシダーゼ、ウリカーゼ、アルコールオキシダーゼ及びヒスタミンオキシダーゼは、デヒドロゲナーゼ活性よりもオキシダーゼ活性が優勢である。つまり、上記の一連の反応においては、第１酵素とＯ2との反応性は、第１酵素とＭｏｘとの反応性よりも高い。よって、Ｍｏｘが第１酵素により還元されにくく、Ｍｒｅｄが電極において酸化される反応が生じ難い。以上より本発明の酵素機能電極では、第１酵素と電子伝達メディエータとの反応を阻害するための隔膜を設けることなく第１基質である定量対象物質を定量できる。そのため、酵素機能電極を容易に作成することができる。また、Ｍｏｘが電極においてＭｒｅｄに還元される際に生じる電流量が、定量対象物質の量に比例して測定されるため、定量対象物質の定量を正確に行うことができる。
【００２６】
さらに、電極における電子伝達メディエータの還元電流を測定する場合の電極電位は、電子伝達メディエータの酸化電流を測定する際の電極電位よりも低電位である。そのため、その電位において酸化または還元される物質によるノイズが生じ難く正確に定量対象物質を定量することができる。例えば、高電位であると、血中に存在する尿酸、アスコルビン酸及びアセトアミノフェン等が酸化される可能性があるが、低電位であるとそれらの物質の酸化されず測定電流に誤差が生じない。
また、上記の酵素機能電極においては、第２酵素及び電子伝達メディエータが電極に固定されているため、第２酵素が電極１表面または電極１表面近傍に位置している。よって、第２酵素による酵素反応及び電子伝達メディエータによる電極反応が効率的に行われる。そのため、よって、第２酵素と第３基質である生成物質との反応に起因する、電子伝達メディエータと電極との電極反応の反応性を高め、電極反応により生じる電流を電極において即時に測定することができる。また、酵素量及び電子伝達メディエータ量を低減することができる。また、電極に固定することにより、酵素及び電子伝達メディエータを回収して繰り返し利用することができる。
【００２７】
さらに、図７に示すように第１酵素、ＰＯＤ及び電子伝達メディエータをポリマー１５及び架橋剤１７により電極１上に固定すると好ましい。第１酵素、ＰＯＤ及び電子伝達メディエータが電極１表面または電極１表面近傍に位置するため、第１酵素及びＯ2の反応により生じるＨ2Ｏ2とＰＯＤとの反応性を高め、電極反応により生じる電流を電極１において即時に測定することができる。また、効率良く酵素反応が起こるため、第１酵素、ＰＯＤ及び電子伝達メディエータの酵素量を減らすことができる。
＜第２実施形態例＞
図８は、第２実施形態例に係る酵素機能電極が試料溶液に浸漬されている様子を示す概略図である。電子伝達メディエータ（Ｍ）をカーボンペースト２０に練り込み、カーボンペースト電極２２を形成する。第２実施形態例に係る酵素機能電極では、第２酵素であるＰＯＤ及び第１酵素がポリマー１５及び架橋剤１７によりカーボンペースト電極２２上に固定されている。この酵素機能電極が、試料溶液３に浸漬されている。試料溶液３には、第１基質（Ｓ１）である定量対象物質と、第２基質である溶存酸素（Ｏ2）とを有している。第１酵素は、第１基質及び第２基質と特異的に反応する。また、第２酵素は、第１酵素によりＯ2が還元されて生成された過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）と、電子伝達メディエータと特異的に反応する。電子伝達メディエータは、第２酵素とＨ2Ｏ2との反応に応じて第２酵素と反応する。また、第１酵素は、第１実施形態例と同様の酵素を用いる。
【００２８】
また、図９に示すようにＰＯＤ及び電子伝達メディエータをカーボンペースト３０に練り込んだカーボンペースト電極３２を形成し、カーボンペースト電極３２上に第１酵素を固定しても良い。第２実施形態例に係る酵素機能電極の反応は、第１実施形態例と同様である。
上述の第２実施形態例に係る酵素機能電極では、酵素量を減らしつつ、第１酵素、第２酵素及び電子伝達メディエータにおける反応により生じる電流を電極１において即時に測定することができる。また、電子伝達メディエータや第２酵素を練り込んで電極を形成するため、電極の形成を容易に行うことができる。
＜第３実施形態例＞
図１０は、第３実施形態例に係る酵素機能電極を示す概略図である。電極１上には、第２酵素であるＰＯＤと電子伝達メディエータとからなる第１層３６が固定され、第１層３６上に第１酵素が固定されている。つまり、試料溶液と近接する酵素機能電極の最表面には第１酵素が位置しており、電極１の基板に近接するようにＰＯＤ及び電子伝達メディエータが固定されている。第１層３６内のＰＯＤ及び電子伝達メディエータは、ポリマー１５及び架橋剤１７により電極１上に固定されている。第２層３８内の第１酵素は、ポリマー１５及び架橋剤１７により互いに結合している。また、第１層３６及び第２層３８は、架橋剤１７により互いに結合している。その他の構成は、第１実施形態例と同様である。この酵素機能電極を、第１基質である定量対象物質と溶存酸素（Ｏ2）とを含む試料溶液に浸漬すると、第１実施形態例と同様の反応が生じる。
【００２９】
第１酵素と第２酵素であるＰＯＤとを別々の層に固定することで、ＰＯＤを電極に固定するためのポリマーと第１酵素を電極に固定するためのポリマーとを別々のポリマーとすることができる。例えば、第１酵素を固定するために最適なポリマーとＰＯＤを固定するために最適なポリマーとが異なる場合であっても、それぞれの酵素に対して最適なポリマーを用いてそれぞれの酵素を固定することができる。
また、第１酵素を酵素機能電極の最表面に固定することで、第１酵素と第１基質である定量対象物質との接触確率が高くなり反応し易くなる。また、電子伝達メディエータ及び第２酵素であるＰＯＤを電極１側の最表面に固定することで、電子伝達メディエータとＰＯＤとが凝集する。よって、ＰＯＤと電子伝達メディエータとの間の反応性が高まり、かつ電子伝達メディエータと電極１との電極反応が高まり、電極１において即時に電流を測定することができる。さらに、物質移動速度の観点から、第１基質である定量対象物質の移動速度がＨ2Ｏ2の移動速度よりも小さい場合、前述のように第１酵素を酵素機能電極の最表面に固定すると、高い応答電流を得ることができる。これは、第１基質である定量対象物質が第１層３６及び第２層３８を移動するよりも、酵素機能電極の最表面に固定した第１酵素により第１基質をＨ2Ｏ2に変えてから第１層３６及び第２層３８中を移動させたほうが、移動速度が速いためである。
＜実験例１＞
図１１を用いて実験例１を説明する。実験例１に係る酵素センサは、試料溶液中のコレステロールを定量するコレステロールセンサである。
【００３０】
実験例１に係るコレステロールセンサの酵素機能電極部は以下の構成から成る。電極１は直径３ｍｍのグラッシーカーボンであり、電極１上にペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＤ）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Ｆｃ−ＰＡＡ）がPoly（ethylene  glycol）diglycidyl  ether（ＰＥＧＤＥ）により架橋されて固定されている。それぞれ以下の最適の濃度により電極１上に固定されている。
ＰＯＤ＝０．８ユニット、ＣＨＯＤ＝０．２ユニット、Ｆｃ−ＰＡＡ＝１６μｇ、ＰＥＧＤＥ＝１０μｇで調整されている。
【００３１】
図１２は、実験例１に係るコレステロールセンサの系の一例を示す。攪拌子４０が入れられた恒温ガラスセル４２がスターラマシン４４上に載置されている。恒温ガラスセル４２には、酵素等が固定された酵素機能電極４６、対極４８及び参照極５０が電極固定部５２により固定されている。酵素機能電極４６は、グラッシーカーボン電極、対極は白金線、参照極は銀／塩化銀電極で構成されている。これらの電極は、それぞれ定電位設定装置５４を介して測定された電流等を記録する記録装置５６に接続されている。恒温ガラスセル４２には、試料溶液６０を満たし、３７℃で攪拌子４０により２０００ｒｐｍで攪拌した。試料溶液６０としては、所定濃度のコレステロールを含む０．１Ｍ／１Ｔｒｉｓ塩酸塩の緩衝水溶液（ｐＨ７．０）を用いた。
【００３２】
前述のコレステロールセンサを用いて次のように定量を行った。酵素機能電極４６には、参照極５０に対して０ｍＶの電位を印加した。このとき、試料溶液６０中のコレステロールは、コレステロールオキシダーゼ存在下でコレステノンに酸化され、この反応で溶存酸素（Ｏ2）が過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）に還元される。次に、ＰＯＤの存在下で、生成されたＨ2Ｏ2は水に還元される。この反応で電子伝達メディエータであるフェロセンが酸化され、フェリシニウムイオンが生成される。酵素機能電極４６には、参照極５０に対して０ｍＶの電位が印加されているため、フェリシニウムイオンは、酵素機能電極４６から電子を受け取りフェロセンに還元される。酵素機能電極４６での電子の移動による電流を測定することにより、試料溶液中のコレステロール濃度を測定した。
【００３３】
実験例１における測定結果を図１３に示す。図１３は、酵素機能電極４６において測定された還元電流の変化量とコレステロール濃度との関係図である。図１３より、還元電流の変化量とコレステロール濃度は、良好な比例関係を示した。よって。実験例１の酵素センサでは、隔膜を用いることなくコレステロールを正確に定量できた。
＜実験例２＞
次に図１４を参照して、実験例２を説明する。実験例２に係るコレステロールセンサの酵素機能電極は以下の構成から成る。電極は、電子伝達メディエータであるフェロセンが練り込まれた直径３ｍｍのカーボンペースト電極７０である。この電極７０上にペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）が固定されており、さらに透析膜１００によりペルオキシダーゼを電極１に固定するために被覆する。透析膜１００としては、分子量１２０００〜１４０００の再生セルロースを用いた。
【００３４】
この酵素機能電極を実験例１の図１２に示す酵素機能電極４６として、実験例１と同様にコレステロール濃度を定量するための電流測定を行った。このとき、恒温ガラスセル４２には、試料溶液６０を満たし、３７℃で攪拌子４０により７００ｒｐｍで攪拌した。試料溶液６０としては、１０μｇのコレステロールオキシダーゼ、０．５２ｍＭのコレステロールエステル及び１％TritonX-100を含む０．１Ｍ／１Ｔｒｉｓ塩酸塩の緩衝水溶液（ｐＨ７．０）を用いた。
＜比較例１＞
比較例１では、実験例２と同様の酵素機能電極を用いてグルコース濃度を定量するための電流測定を行った。
【００３５】
実験例１の図１２に示す恒温ガラスセル４２に、試料溶液６０を満たし、３７℃で攪拌子４０により７００ｒｐｍで攪拌した。酵素機能電極４６としては、実験例２に示した透析膜１００を有する酵素機能電極を用いた。また、試料溶液６０としては、１０μｇのグルコースオキシダーゼ及び５μＭのグルコースを含む０．１Ｍ／１Ｔｒｉｓ塩酸塩の緩衝水溶液（ｐＨ７．０）を用いた。
実験例２及び比較例１の実験結果を図１５に示す。図１５は、電子伝達メディエータであるフェロセン濃度と応答電流の減少との関係を示すグラフであり、反応開始から５００秒後の電流変化を応答電流とした。ここで、図１５では、フェロセンを添加しない場合における、酵素機能電極４６での応答電流を１００％として応答電流の減少割合を示している。
【００３６】
図１５の結果より、実験例１でのコレステロールに対する応答電流は、フェロセン濃度により影響を受けていないが、比較例１のグルコースに対する応答電流は、フェロセン濃度により影響を受けていることが分かった。
比較例２の実験においては、グルコースオキシダーゼ存在下でグルコースがグルコン酸に酸化される反応でＯ2がＨ2Ｏ2に還元される反応が生じる。次に、ＰＯＤの存在下でＨ2Ｏ2が水に還元される反応で還元型のフェロセンが酸化される反応が生じる。さらに、グルコースオキシダーゼの存在下で、酸化型のフェロセンが還元される妨害反応を生じる。そのため、酵素機能電極４６表面において酸化型のフェロセンが還元型のフェロセンに還元される際の応答電流が減少してしまったことが分かる。一方、コレステロールオキシダーゼは、フェロセンとほとんど反応しないため、フェロセンと溶存酵素Ｏ2とが共存していても応答電流は影響を受けない。
【００３７】
以上の通り、コレステロールオキシダーゼのような電子伝達メディエータと反応しにくい、あるいは反応しない酵素は、Ｏ2との反応が電子伝達メディエータの共存によって妨害されることがほとんどなく、隔膜なしでも高精度なセンサを作製することができると分かった。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明を用いれば、隔膜を設ける必要のない酵素機能電極を作成することができるため、製造が簡単な酵素センサを得ることができる。また、酵素機能電極の小型化や安価な酵素センサの提供に本発明を用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の酵素機能電極の１形態の模式図（１）。
【図２】本発明の酵素機能電極の１形態の模式図（２）。
【図３】本発明の酵素機能電極の１形態の模式図（３）。
【図４】本発明の酵素機能電極の１形態の模式図（４）。
【図５】第１実施形態例に係る酵素機能電極が試料溶液に浸漬されている様子を示す概略図。
【図６】酵素機能電極の反応の説明図。
【図７】第１実施形態例に係る別の酵素機能電極が試料溶液に浸漬されている様子を示す概略図。
【図８】第２実施形態例に係る酵素機能電極が試料溶液に浸漬されている様子を示す概略図。
【図９】第２実施形態例に係る別の酵素機能電極が試料溶液に浸漬されている様子を示す概略図。
【図１０】第３実施形態例に係る酵素機能電極を示す概略図。
【図１１】実験例１に係る酵素機能電極を示す模式図。
【図１２】実験例１に係るコレステロールセンサの系の一例。
【図１３】実験例１における測定結果を示すグラフ。
【図１４】実験例２に係る酵素機能電極を示す模式図。
【図１５】実験例２及び比較例１の実験結果を示すグラフ。
【図１６】（ａ）従来のグルコースセンサにおける反応の説明図。（ｂ）従来のグルコースセンサにおける妨害反応の説明図。
【図１７】（ａ）従来の別のグルコースセンサにおける反応の説明図。（ｂ）従来の別のグルコースセンサにおける妨害反応の説明図。
【符号の説明】
【００４０】
１：電極    
３：試料溶液    
１５：ポリマー  
１７：架橋剤  
３６：第１層  
３８：第２層  
４０：攪拌子  
４２：恒温ガラスセル  
４６：酵素機能電極  
４８：対極  
５０：参照極  
【図１】
2005083964.tif 000003
【図２】
2005083964.tif 000004
【図３】
2005083964.tif 000005
【図４】
2005083964.tif 000006
【図５】
2005083964.tif 000007
【図６】
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【図７】
2005083964.tif 000009
【図８】
2005083964.tif 000010
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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