(57)【要約】      （修正有）【課題】Ａｘｌリガンド結合領域蛋白質の組換え法による製造に有用なＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞、該形質転換体を用いてＡｘｌ結合領域蛋白質を製造する方法及びＡｘｌ結合領域蛋白質を用いたスクリーニング方法の提供。【解決手段】  以下の(a)又は(b)の蛋白質であり、かつＧａｓ６との結合活性を有するＡｘｌリガンド結合領域蛋白質。(a) 特定のアミノ酸配列からなる蛋白質(b) 特定のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)の蛋白質であり、かつＧａｓ６との結合活性を有するＡｘｌリガンド結合領域蛋白質。
(a) 配列番号２または４で表わされるアミノ酸配列を含む蛋白質
(b) 配列番号２または４で表わされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質
【請求項２】
以下の(a)又は(b)のＡｘｌのＧａｓ６との結合活性を有するリガンド結合領域蛋白質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号２または４で表わされるアミノ酸配列を含む蛋白質
(b) 配列番号２または４で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質
【請求項３】
以下の(c)又は(d)のＤＮＡであり、ＡｘｌのＧａｓ６との結合活性を有するリガンド結合領域蛋白質をコードするＤＮＡ。
(c) 配列番号１または３で表される塩基配列を含むＤＮＡ
(d) 配列番号１または３の塩基配列を含むＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項２または３に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からＡｘｌのリガンド結合領域蛋白質を採取することを特徴とするＡｘｌのリガンド結合領域蛋白質の製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載のＡｘｌのリガンド結合領域蛋白質に対する抗体。
【請求項８】
請求項１に記載のＡｘｌのリガンド結合領域蛋白質を用いたスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項７に記載の抗体を用いたスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＡｘｌの細胞質外領域の内、リガンド結合領域蛋白質、即ちＧａｓ６結合領域蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有し、大腸菌内で複製可能な発現ベクター、該ベクターを用いるＡｘｌのリガンド結合領域蛋白質およびその誘導体の製造方法、並びにそのようにして製造された蛋白質に関するものである。
【０００２】
Ａｘｌはガン原遺伝子として見出された、チロシンキナーゼ型受容体であり、細胞膜に大量に発現すると、細胞を形質転換する作用を持つことが報告されている。Ａｘｌは細胞外ドメインに２つのイムノグロブリン様ドメインと２つのフィブロネクチンタイプIIIドメインを持つことが知られている。
【０００３】
Ｇａｓ６はｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ6の略語で、ビタミンＫ依存性細胞増殖因子であり、種々の細胞、線維芽細胞、血管平滑筋細胞やメサンギウム細胞に対して増殖促進活性や細胞接着活性をもつ。例えばマウス腎臓のメサンギウム細胞において、Ｇａｓ６はチロシンキナーゼ型の受容体であるＡｘｌと結合し、その下流シグナルを活性化することにより、細胞増殖を制御することが知られている。メサンギウム細胞の増殖は糸球体腎炎、糖尿病性腎炎、ＩｇＡ腎炎に共通した病状であり、その増殖の抑制は、種々の腎臓疾患の治療効果が期待される。また、Ｇａｓ６は血漿の凝固活性をもつ内因性因子であることが示唆されており、動脈硬化の成因因子としても注目されている。
【０００４】
最近の研究では活性発現に際して、同受容体は二量体などの多量体構造をなしていると考えられる。Ｇａｓ６とＡｘｌとの複合体形成反応、また多量体化の機構を解明することは、関連する疾患や異常の研究、治療または予防に有効である。例えば、腎炎に伴う糸球体硬化、尿中蛋白の増加がＧａｓ６により引き起こされることが示唆されているが、それをＡｘｌに拮抗する物質で阻止することが可能である。
【０００５】
従って、本発明はＡｘｌとリガンドとの相互作用に関連する疾患の研究や治療に有用であり、臨床的に投与した場合には、生体内のＡｘｌに対する拮抗作用を通して、Ｇａｓ６依存性の疾患や異常、例えば、動脈硬化や腎炎の治療または予防にも途を開くものである。
【０００６】
本発明のＧａｓ６結合領域蛋白質は、ペプチドライブラリーなどを用いてのペプチド性のＧａｓ６のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング、非ペプチド性のＧａｓ６のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングを可能にし、Ｇａｓ６とその受容体であるＡｘｌの結合の研究(その立体構造の解析など)を飛躍的に発展させ、ひいてはＧａｓ６のアゴニスト、アンタゴニストの合成を可能にするものである。
【背景技術】
【０００７】
既に、ヒト由来のＡｘｌをコードするＤＮＡはクローニングされ、配列が明らかにされている(非特許文献１参照)。
【０００８】
Ｂｅｌｌｏｓｔａ  Ｐらは、Ａｘｌの細胞外領域の発現に成功したことを報告しているが（非特許文献２参照）、動物細胞を用いて、相補ＤＮＡの細胞外全配列を発現させたものであり、その発現量は低く、需要を満たすだけのＡｘｌの製造には最適でなく、構造解析、反応機構の研究も十分に行うことができなかった。
【０００９】
Ｈｅｉｒｉｎｇ  Ｈらは、Ａｘｌと同一のファミリーに属するＴｙｒｏ３のリガンド結合部位の発現に大腸菌を用いて成功している(非特許文献３参照)。Ｔｙｒｏ３のリガンド結合部位とＡｘｌの相同性は３７％である。Ｇａｓ６との結合定数はＡｘｌが１ｎＭであるのに対し、Ｔｙｒｏ３は１０．８ｎＭであり、Ｔｙｒｏ３の結合活性はＡｘｌの１０分の１である。ＡｘｌとＴｙｒｏ３の生体内での作用は大きく異なる。例えばＡｘｌはメサンギウム細胞の増殖を伴う腎炎への関与が示唆されるのに対し、Ｔｙｒｏ３は始原生殖細胞の増殖制御や性分化に関与していることが示唆されている。Ｔｙｒｏ３とＧａｓ６の結合様式とＡｘｌとＧａｓ６の結合様式が類似しているかどうかは不明である。
【００１０】
【非特許文献１】O‘Bryan JPら,Mol Cell Biol,11 5016-5031(1991)
【非特許文献２】Bellosta Pら,Mol Cell Biol, 15 614-625(1995)
【非特許文献３】Heiring Cら, J Biol Chem,279(8) 6952-6958(2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、Ａｘｌのリガンド結合領域蛋白質の組換え法による製造に有用なＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞および該形質転換体を用いてＡｘｌ結合領域蛋白質を製造する方法の提供を目的とする。また本発明は、さらにＡｘｌリガンド結合領域蛋白質の提供を目的とする。さらに、本発明は、該蛋白質を用いたＧａｓ６のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
Ａｘｌのアミノ酸配列は、文献により、ヒト及びマウス等に関して既知である。即ち、Ｏ’Ｂｒｙａｎ  ＪＰらはＡｘｌをコードするｃＤＮＡ(相補ＤＮＡ)をクローニングし、この受容体はイムノグロブリン様領域(以下Ｉｇ領域と略す)、フィブロネクチンタイプＩＩＩ領域からなることを示した（前掲）。
【００１３】
シグナル伝達にはＡｘｌ全体が必要であると考えられているが、ドメイン領域の一部が結合活性を保持している可能性はある。即ち部分的ドメイン領域のみでも、天然とほぼ同じ構造を維持してフォールドさせ、発現させることが出来れば、従来、発現が困難であったＡｘｌを始め、様々な受容体の機能的なドメイン領域を大量に取り出すことが可能となる。次いで、発現産物のリガンド結合活性を調べ、この部分のリガンド結合への寄与の程度を明確にすることができる。このようにして、小分子量のリガンド結合活性を有する蛋白質を大量に得ることが可能となる。そのような小分子量のリガンド結合蛋白質は、Ｘ線やＮＭＲの高次構造解析において著しく有利である。上記の理由から、本発明で開示する、Ａｘｌのリガンド結合領域、特にＩｇ領域の蛋白質のＤＮＡ組換え法による製造は、従来困難であった他の受容体のリガンド結合領域蛋白質の製造への途をも開くものである。本発明者らは、上記の様々な目的を達成するためには、Ａｘｌの全分子の内、特に、Ｇａｓ６との結合に必要な領域の蛋白質が有用であることに着目し、そのようなリガンド結合領域蛋白質のＤＮＡ及びアミノ酸構造を決定しその有効な製造方法を確立するために研究を重ね、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち本発明は以下のとおりである。
[１] 以下の(a)又は(b)の蛋白質であり、かつＧａｓ６との結合活性を有するＡｘｌリガンド結合領域蛋白質、
(a) 配列番号２または４で表わされるアミノ酸配列を含む蛋白質
(b) 配列番号２または４で表わされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質
[２]  以下の(a)又は(b)のＡｘｌのＧａｓ６との結合活性を有するリガンド結合領域蛋白質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号２または４で表わされるアミノ酸配列を含む蛋白質
(b) 配列番号２または４で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質
[３]  以下の(c)又は(d)のＤＮＡであり、ＡｘｌのＧａｓ６との結合活性を有するリガンド結合領域蛋白質をコードするＤＮＡ。
(c) 配列番号１または３で表される塩基配列を含むＤＮＡ
(d) 配列番号１または３の塩基配列を含むＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、蛋白質をコードするＤＮＡ
[４]  [２]または[３]のＤＮＡを含有する組換えベクター、
[５]  [４]の組換えベクターを含む形質転換体、
[６]  [５]の形質転換体を培養し、得られる培養物からＡｘｌのリガンド結合領域蛋白質を採取することを特徴とするＡｘｌのリガンド結合領域蛋白質の製造方法、
[７]  [１]のＡｘｌのリガンド結合領域蛋白質に対する抗体、
[８]  [１]のＡｘｌのリガンド結合領域蛋白質を用いたスクリーニング方法、ならびに
[９]  [７]の抗体を用いたスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、大腸菌を宿主とする遺伝子組換え法によって本発明のリガンド結合領域蛋白質、即ち、ＡｘｌのＩｇ領域またはＩｇ１領域を発現させ、該宿主からＩｇ領域またはＩｇ１領域を抽出・精製する方法を確立したものである。また該蛋白質を用いたＧａｓ６のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法をも確立することができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の目的に従い、本明細書で用いる語句を以下に定義する。本発明において、Ａｘｌという語句はヒトを含む天然のあらゆる哺乳動物起源のＡｘｌを意味すると共に、遺伝子操作によって作られるそれら天然のＡｘｌの変異体も含むものとする。Ａｘｌのリガンド結合領域蛋白質とは、Ａｘｌの内、Ｇａｓ６との結合に関与する領域を構成する蛋白質を指す。該蛋白質は、ＡｘｌのＩｇ領域を構成するアミノ酸配列を有する。発明の目的にとっては、天然のアミノ酸配列を有するリガンド結合領域蛋白質のみならず、当業者既知の方法で１またはそれ以上のアミノ酸の変異によって得られる、同様の活性を有するペプチドも有用である。従って、本明細書中、単に、リガンド結合領域蛋白質と言うときは、天然のアミノ酸配列を有する蛋白質のみならず、上記ペプチドをも包含するものとする。Ｉｇ領域とは、上記の定義に従うＡｘｌのリガンド結合領域を意味し、Ｉｇ１領域とはＩｇ領域中のリガンド結合領域を意味する。Ａｘｌのリガンド結合領域蛋白質をコードするＤＮＡとは、Ａｘｌの内、Ｇａｓ６との結合に関与する領域を構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを指す。該ＤＮＡは、ＡｘｌのＩｇ領域を構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するものである。また、該ＤＮＡは、ＡｘｌのＩｇ１領域を構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するものである。上記の蛋白質に関する定義と同様に、該ＤＮＡは天然のリガンド結合領域蛋白質をコードするもののみならず、当業者既知の方法で得られた該蛋白質の誘導体をコードするＤＮＡをも包含する。ＤＮＡは、相補ＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
【００１７】
Ｉｇ領域とは、配列表の１番目のグルタミン酸から１９０番目のトレオニンに至る部分を指す。また、Ｉｇ１領域とは、配列表の１番目のグルタミン酸から１０６番目のロイシンに至る部分を指す。しかしながら、Ｉｇ領域およびＩｇ１領域の開始部位および終了部位は必ずしも、本発明にとって厳密でなく、該Ｉｇ領域またはＩｇ１領域全体の立体構造に大きな影響を与えることはない。その機能が保持されることを条件として、Ｎ末端および／またはＣ末端の数残基のアミノ酸が欠失あるいは付加したものも包含される。通常、このような一次構造上の僅かな差異は該Ｉｇ領域またはＩｇ１領域全体の立体構造に大きな影響を与えず、機能は保たれると考えられる。
【００１８】
配列番号１に本発明のＡｘｌのリガンド結合領域蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を、配列番号２に本発明のＡｘｌのリガンド結合領域蛋白質のアミノ酸配列を例示し、また、配列番号３に本発明のＡｘｌのＩｇ１領域蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を、配列番号４に本発明のＡｘｌのＩｇ１領域蛋白質のアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列からなるタンパク質がＡｘｌのリガンド結合領域蛋白質の活性、すなわちＧａｓ６と結合する活性を有する限り、当該アミノ酸配列において１個、若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加の変異が生じてもよい。
【００１９】
また、本発明のＡｘｌの結合領域蛋白質をコードするＤＮＡは、配列番号１または配列番号３の塩基配列と、BLAST等を用いてデフォルトの条件で計算したときに、少なくとも80％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上の相同性を有しており、Ａｘｌのリガンド結合領域蛋白質の活性を有する蛋白質をコードする塩基配列からなるＤＮＡも含む。
【００２０】
また、上記遺伝子と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであってＡｘｌのリガンド結合領域蛋白質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡも本発明の遺伝子に含まれる。ここでストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定したフィルターを用いて、0.7〜1.0MのNaCl存在下、68℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC溶液（1倍濃度のSSCとは150mM NaCl、15mM クエン酸ナトリウムからなる）を用い、68℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。
【００２１】
さらに、上記ＤＮＡに対するＲＮＡ、又は該ＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＲＮＡであってＡｘｌのリガンド結合領域蛋白質の活性を有する蛋白質をコードするＲＮＡも本発明に含まれる。
さらに、配列番号１または３の塩基配列の縮重変異体も、本発明のＤＮＡに含められる。
【００２２】
遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用いて容易に行うことができる。
【００２３】
ここで、Ａｘｌのリガンド結合領域蛋白質の活性とはＧａｓ６への結合活性またはＧａｓ６とＡｘｌとの結合を阻害する活性であり、蛋白質がＧａｓ６に結合するかどうかは、公知の方法で決定することができる。なお、本発明の蛋白質は、Ｇａｓ６と結合するが、Ｇａｓ６とアミノ酸レベルで約４２％の相同性を有するヒトおよびウシのProteinSとは結合しない。
【００２４】
配列番号１または３の塩基配列の変異または修飾により、天然のリガンド結合領域蛋白質よりも望ましい生物学的活性を有する、すなわちＧａｓ６への結合活性またはＧａｓ６とＡｘｌとの結合を阻害する活性が促進されたリガンド結合蛋白質を得ることができ、本発明はこれらの活性が促進されたリガンド結合蛋白質および該蛋白質をコードするＤＮＡも含む。
【００２５】
後述の実施例においては、ヒトＡｘｌのＩｇ部分またはＩｇ１部分に対応する領域の相補ＤＮＡを用いてリガンド結合領域蛋白質の発現を示したが、合成ＤＮＡを用いてもよい。当業者ならば容易に理解するように、コドンの異なるＤＮＡであっても、本発明の蛋白質のアミノ酸配列をコードする限り、本発明の範囲に含まれる。
【００２６】
本発明はまたＡｘｌ結合領域蛋白質の製造方法を提供するものである。そのような蛋白質の製造は、本発明のＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、形質転換体を培養することにより行うことができる。
【００２７】
本発明のＡｘｌの発現には、例えば、大腸菌のような原核性微生物、Ｓ.セレビシエのような真核性微生物、S121等の昆虫細胞さらにはCOS細胞、CHO細胞等哺乳類細胞が用いられる。組織培養細胞にはトリ、または哺乳類細胞、例えばネズミ、ラットおよびサル細胞が含まれる。適当な宿主細胞−ベクターシステムの選択および使用方法等は、当業者に既知であり、それらの内から本発明のＡｘｌのリガンド結合領域蛋白質をコードするＤＮＡの発現に適した系を任意に選択することができる。しかしながら、本発明の目的には、上記の理由から、大腸菌が好ましい。本明細書の実施例では、まず、リガンド結合領域蛋白質としてＡｘｌのＩｇ領域蛋白質またはＩｇ１領域蛋白質をコードするＤＮＡを用いた。該領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡはＰＣＲ法によって得ることができる。また、ＤＮＡ合成法によっても得ることができる。
【００２８】
Ｉｇ領域またはＩｇ１領域をコードするＤＮＡを大腸菌宿主中で発現させるためには、あらかじめ、このＤＮＡを大腸菌の遺伝子発現系に連結しておく必要がある。大腸菌の発現系についてはすでに多くの成書があり、それらに従って操作すればよい。即ち、大腸菌を用いる遺伝子操作法は、当該技術分野で既知の文献［マニアティスら（Ｍaniatis)，(１９８２),Moleular Cloning：A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory］を初めとして、近年出版された多くの実験書に詳述されている。また蛋白質の精製などの基本的な方法も生化学実験講座（日本生化学編,東京化学同人）などの多くの成書に詳述されている。本発明方法はこれら文献既知の方法を用いて行うことができるが、以下に、簡単に説明する。
【００２９】
Ｉｇ領域またはＩｇ１領域は、ポリメラーゼチェインリアクション法（以下ＰＣＲ法と略す）によって取り出すことができる。次いで、上記のＩｇ領域またはＩｇ１領域遺伝子を大腸菌由来の発現プラスミッドに挿入する。大腸菌由来の遺伝子発現系としては、それ自身の菌体内で機能している遺伝子のプロモーター活性と翻訳能とを持つＤＮＡ断片由来のものが多い。このようなものとしては、トリプトファン遺伝子、ラクトース遺伝子、アルカリ性ホスファターゼ遺伝子、さらには、トリプトファン遺伝子とラクトース遺伝子のハイブリッドであるｔａｃ遺伝子などがある［中原,松原(１９８６),日本生化学会編,“遺伝子工学研究法ＩＩ",１〜１７２,東京化学同人］。通常は、これらのＤＮＡ断片を目的物の遺伝子の前に連結させることによって、該遺伝子を発現させる。通常、発現には菌体内発現と分泌発現の２種類があり、各々について適当な発現系が存在する。
【００３０】
本発明の蛋白質は、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００３１】
培養後、本発明の蛋白質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより本発明の蛋白質を抽出する。また、本発明の蛋白質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、蛋白質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明の蛋白質を単離精製することができる。
【００３２】
後述の実施例では、Ｉｇ領域またはＩｇ１領域をＨｉｓ６に融合させ、融合蛋白質として発現させた後、Ｎｉアフィニティカラムを用いて精製を行っている。融合させる蛋白質はＨｉｓ６に限らず、マルトース結合たんぱく質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、チオレドキシン、プロテインＡ、ベーターガラクトシダーゼを用いて、さらにマルトース結合たんぱく質の場合はアミロースのカラムを用いて、グルタチオンＳトランスフェラーゼの場合はグルタチオンカラムを用いて、チオレドキシンの場合は金属キレートカラムを用いて、プロテインＡの場合はＩｇＧカラムを用いて精製することができる。この態様では、発現プロモーターとして、ＩＰＴＧの添加によって誘導がかかるｔａｃプロモーターを用いている。細胞の不溶性成分に蓄積した融合蛋白質を抽出し、Ｎｉアフィニティカラム、Ｑ−セファロース、ゲルろ過カラム、エンテローキナーゼによる目的ペプチドの切り出し、さらにＱ−セファロースの使用からなる一連の操作によって、目的とするＩｇ領域またはＩｇ１領域を単一物質にまで精製することができる。これらの一連の方法は単なる例示にすぎず、当業者既知の他の精製系を用いても、目的物質は得ることができる。上記の方法により、天然のアミノ酸配列を有する蛋白質を得ることができたが、１またはそれ以上のアミノ酸の変異（欠失、挿入または置換）を有する該Ｉｇ領域またはＩｇ１領域の変異体も同様にして大腸菌に発現させることができる。そのような変異は、リガンド結合活性の改善、インビボの安定性等を改善することを目的とする。
【００３３】
即ち、本発明は、好ましくは、大腸菌遺伝子発現系の制御下にＡｘｌのリガンド結合部位蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ発現プラスミッド、および該発現プラスミッドによって形質転換された形質転換体を提供する。さらに本発明は、該形質転換体を用いるリガンド結合部位蛋白質の製造方法、並びに該製造方法によって得られるリガンド結合部位蛋白質を提供する。リガンド結合部位蛋白質はＩｇ領域およびＩｇ１領域蛋白質を含有する。本発明法により大腸菌を宿主として生産されたＩｇ領域またはＩｇ１領域の生理活性を、リガンドへの結合能を指標として測定したところ、Ｉｇ領域またはＩｇ１領域のリガンドへの結合能が認められた。この結果は、本発明方法で得られた組換えリガンド結合領域蛋白質が、Ａｘｌのリガンド結合活性を保持しており、生理学的に活性であって、臨床面での有用性を有すると同時に、立体構造解析などのＡｘｌの研究の飛躍的な発展をもたらし得ることを示すものである。
【００３４】
本発明は、Ａｘｌのリガンド結合領域蛋白質に対する抗体をも含む。抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の両者を含む。抗体は公知の方法により作製できる。
【００３５】
本明細書において、「抗体」は、いずれのイムノグロブリンクラス及びサブクラスを有する抗体も包含する。また、「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体および抗体ライブラリー由来の抗体、ならびにそれらの機能的断片をも含む。抗体の機能的断片とは、（Fab）2フラグメントおよび（Fab）フラグメント等を含む抗体分子の可変部を保持しているあらゆる分子を意味する。
【００３６】
産生された抗体は、プロテインAあるいはプロテインGカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等の公知の精製方法を適宜組み合わせて精製すればよい。
【００３７】
抗体は、本発明の蛋白質の精製に用いることができ、またのリガンド結合領域をブロックすることにより、Ｇａｓ６がＡｘｌ受容体に結合するのを阻害するのに用いることもできる。
【００３８】
また本発明には、本発明のＡｘｌリガンド結合領域蛋白質あるいはそれに対する抗体に特異的に結合し、かつ本発明のタンパク質の特徴であるＧａｓ６結合活性を阻害、拮抗または増強する作用を有する物質をＡｘｌリガンド結合領域蛋白質の結合調節物質として得ることができるスクリーニング方法をも含む。この結合調節物質のスクリーニング方法は、本発明のタンパク質に特異的に結合し、且つ該タンパク質のＧａｓ６結合活性を阻害、拮抗または増強する作用を有する物質が得られる方法であれば如何なるものであってもよい。例えば、まず本発明のタンパク質と被検物質とを接触させ、該タンパク質との結合性を指標として選抜した後に、Ｇａｓ６結合活性の変化を指標として被検物質を選抜する方法を用いることができる。ビアコア２０００を用いてセンサーチップにＩｇ領域またはＩｇ１領域を固定化し、被検物質を送液することにより結合する物質を選抜した後、被検物質をＧａｓ６と同時に送液し結合活性の変化を測定することでスクリーニングを行うことができる。また当業者既知の方法でＡｘｌリガンド結合領域蛋白質対する抗体によりキットを作製し、これによりこの結合調節物質をスクリーニングすることもできる。この結合調節物質は、Ａｘｌリガンド結合領域とＧａｓ６の結合活性を変化させるアゴニスト、アンタゴニストをさし、ペプチド、蛋白質、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、ＤＮＡ等が考えられる。
【００３９】
また本発明には、本発明のＡｘｌリガンド結合領域蛋白質あるいはそれに対する抗体に特異的に結合し、かつ本発明のタンパク質の特徴であるＧａｓ６結合活性を阻害、拮抗または増強する作用を有する物質をＡｘｌリガンド結合の結合調節物質として得ることができるＡｘｌリガンド結合領域タンパク質を用いたスクリーニング方法をも含む。
【実施例】
【００４０】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明する。
【００４１】
実施例１
ＡｘｌのＧａｓ６結合領域解析：
Ｇａｓ６の結合領域であるＧａｓ６ＬＧドメインの精製蛋白をＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄビーズ（アマシャム）に共有結合させ、Ｇａｓ６ＬＧアフィニティビーズを作製した。Ａｘｌ−Ｆｃ（シグマ）は２５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．８中にてＶ８プロテアーゼを基質：酵素＝１：５０の割合で反応させることで、Ａｘｌ―Ｆｃを切断し、断片ペプチドとした(図１)。２５ｍＭトリス塩酸緩衝液、１５０ｍM食塩、１ｍｇ/ｍｌＢＳＡ、１％ＮＰ４０の結合バッファー中で断片ペプチドＡｘｌ−ＦｃをＧａｓ６ＬＧアフィニティビーズに混合し、免疫沈降法を利用した結合試験を行なった。十分にアフィニティビーズを洗浄することで、非特異的に結合している分子を洗い流した後、酸（グリシン塩酸 ０．１Ｍ、ＰＨ２．７）にて溶出した。ポリアクリルアミド電気泳動をした後、抗Ａｘｌ抗体（シグマ）を用いた免疫染色を行った。その結果、Ｇａｓ６ＬＧを共有結合させたアフィニティビーズにＡｘｌ―Ｆｃ切断フラグメントの結合が認められた。Ｇａｓ６ＬＧと結合するＡｘｌ断片ペプチドは１２０ｋＤａ、７５ｋＤａ、５０ｋＤａ、３５ｋＤａの４種類認められ（図２）、Ｎ末解析によりＧａｓ６ＬＧと結合する全てのＡｘｌ断片ペプチドは、Ｎ末端が同一のアミノ酸配列Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅであることが明らかとなった。この配列は、Ｉｇ領域のＮ端に存在する。溶出された３５ｋＤａのＡｘｌ断片ペプチドは５０ｍＭ  リン酸緩衝液  ＰＨ７．５中、Ｎ-ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅＦ処理により約２５ｋＤａになることから、Ｇａｓ６と相互作用するＡｘｌ部分領域は、Ｉｇ領域であることが示唆された。
【００４２】
実施例２
結合領域の蛋白作製：
（１）ＡｘｌのＩｇ領域蛋白質をコードするＤＮＡの調製および大腸菌発現ベクターｐＥＴ１５ｂ−Ｉｇの構築
公知のヒトＡｘｌのアミノ酸配列蛋白質をコードするＤＮＡを配列表１で示すように設計した。このＤＮＡ断片の調製に際しては、配列表１にある１番グルタミン酸から１９０番トレオニンをコードすると共に、その部分をＨｉｓ６との融合蛋白質として発現させ、発現された融合蛋白質から所望のＩｇ領域蛋白質を単離、精製することができるよう、Ｈｉｓ６をコードするベクターに挿入可能な形に設計した。即ち、Ｈｉｓ６とＡｘｌの間にエンテローキナーゼの認識部位であるＡｓｐ-Ａｓｐ-Ａｓｐ-Ａｓｐ-Ｌｙｓをコードする配列がさらにＮ末端側に挿入されるよう設計した。従って、Ｈｉｓ６と融合した形で発現したＡｘｌは、制限プロテアーゼエンテローキナーゼによる切断によってＨｉｓ６から切り離される。またＣ末端には終結コドンＴＡＡをさらに付加した。その上にＤＮＡ断片をｐＥＴ１５ｂのＮｄｅ１とＸｈｏ１部位に連結すべく、該ＤＮＡのＮ末端側とＣ末端側をさらに延長して、その延長部にＮｄｅ１とＸｈｏ１認識部位を形成し、発現ベクターｐＥＴ１５ｂ−Ｉｇを構築した（図３）。
【００４３】
（２）プラスミッドｐＥＴ１５ｂ−Ｉｇで形質転換された大腸菌によるＩｇドメイン領域の製造
この発現ベクターｐＥＴ１５ｂ−Ｉｇを用いて、これを１００μlの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株コンピテントセルと混合し、０℃で３０分間、さらに４２℃で２分間インキュベートすることで大腸菌へ移入した。バクトトリプトン(ディフコ)１０ｇ、イーストエキス(ディフコ)５ｇ、食塩５ｇ、１００μg／mlアンピシリンおよび０．２％グルコースを含む培地１リットルに上記形質変換体を接種し、３７℃で（Ａ６００＝約０．５)まで増殖させる。それにＩＰＴＧ(シグマ社)を最終濃度が１mＭになるように添加する。続いて、約５時間培養後、菌体を集める。集めた菌体は５ｍM  ＥＤＴＡを含む２５ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．５に懸濁した後超音波にて破砕する。１２,０００回転の遠心を行った後、沈殿を集める。
【００４４】
沈殿画分は２０ｍＭトリス緩衝液、６Ｍグアニジン塩酸、４ｍＭＤＴＴ（ｐＨ７．５）を加えて可溶化した。これをＮｉカラム（アマシャム）に添加する。つぎに洗浄液（２０mＭトリス緩衝液、６Ｍグアニジン塩酸塩、４ｍＭＤＴＴ、４０ｍＭイミダゾール  ）で洗浄した後、溶出液（２０ｍＭトリス緩衝液、６Ｍグアニジン塩酸、４ｍＭＤＴＴ、３００ｍＭイミダゾール）にて目的物を溶出する。ＳＤＳを含む１４〜１６％のポリアクリルアミド電気泳動で約２５ｋＤａの分子量を示すことで確認することができる。目的物は、回収後２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液、１０ｍＭシステイン（ｐＨ８）に希釈し、一晩４℃にてインキュベートする。回収後２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に対して透析する。次に、この透析物をＱ−セファロースに添加する。溶出は、０Ｍから１Ｍの食塩の濃度勾配で行う。目的物をポリアクリルアミド電気泳動で約２５キロダルトンの分子量を示すことで確認する。これを２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化したゲルろ過カラムに添加し１．５カラムの２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）にて溶出する。目的物は１４〜１６％のポリアクリルアミドゲル電気泳動で約２５ｋＤａの分子量を示すことで確認出来る。目的物の画分は回収してエンテローキナーゼを添加して１６℃で１日間反応させる。これによりＩｇがＨｉｓ６から切り放される。次いで、得られた画分を５倍量の２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）で希釈し、同緩衝液で平衡化したＱ−セファロースに添加する。溶出は０Ｍ〜１Ｍの食塩の濃度勾配で行う。これにより目的物は単一な標品に精製される。
【００４５】
実施例３
Ｇａｓ６の受容体結合ドメインであるＧａｓ６ＬＧとＩｇとの結合能：
Ｇａｓ６の受容体結合ドメインであるＧａｓ６ＬＧとＩｇの結合能を、ビアコア２０００を用いて測定した。ビアコアはリアルタイムでタンパク質の相互作用の解析が可能な装置である。タンパク質同士の結合、乖離に伴うセンサーチップの微量な質量変化を検出することで相互作用を観測することができる。相互作用を測定するタンパク質の一方、すなわち作製したＩｇをセンサーチップＣＭ５に固定し、他方であるＧａｓ６ＬＧを送液することで結合を測定した。結合バッファーの組成は０．０１Ｍヘペス緩衝液、０．１５ＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、ｐＨ７．４とした。Ｇａｓ６ＬＧの濃度は、３，４，７，１０μＭを用いた。作製したＩｇにＧａｓ６ＬＧの結合が認められた（図４）。
【００４６】
実施例４
結合領域の蛋白作製：
（１）ＡｘｌのＩｇ１領域蛋白質をコードするＤＮＡの調製および大腸菌発現ベクターｐＥＴ１５ｂ−Ｉｇ１の構築
公知のヒトＡｘｌのアミノ酸配列蛋白質をコードするＤＮＡを配列表１で示すように設計した。このＤＮＡ断片の調製に際しては、配列表１にある１番グルタミン酸から１０６番をコードするロイシンと共に、その部分を発現させた。Ｃ末端には終結コドンＴＡＡを付加した。その上にＤＮＡ断片をｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｃｏ１とＸｈｏ１部位に連結すべく、該ＤＮＡのＮ末端側とＣ末端側をさらに延長して、その延長部にＮｃｏ１とＸｈｏ１認識部位を形成し、発現ベクターｐＥＴ１５ｂ−Ｉｇ１を構築した（図５）。
【００４７】
（２）プラスミッドｐＥＴ１５ｂ−Ｉｇ１で形質転換された大腸菌によるＩｇ１ドメイン領域の製造
この発現ベクターｐＥＴ１５ｂ−Ｉｇ１を用いて、これを１００μlの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株コンピテントセルと混合し、０℃で３０分間、さらに４２℃で２分間インキュベートすることで大腸菌へ移入した。バクトトリプトン(ディフコ)１０ｇ、イーストエキス(ディフコ)５ｇ、食塩５ｇ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び０．２％グルコースを含む培地１リットルに上記形質変換体を接種し、３７℃で（Ａ６００＝約０．５)まで増殖させる。それにＩＰＴＧ(シグマ社)を最終濃度が１ｍＭになるように添加する。続いて、約５時間培養後、菌体を集める。集めた菌体は５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２５ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．５に懸濁した後超音波にて破砕する。１２,０００回転の遠心を行った後、沈殿を集める。
【００４８】
沈殿画分は２０ｍＭトリス緩衝液、６Ｍグアニジン塩酸、４ｍＭ酸化型グルタチオン２０ｍｌを加えて可溶化した。一晩室温にてインキュベートした後、これに２０ｍＭトリス緩衝液、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、４００ｍＭ  Ｌアルギニン、２ｍＭ還元型グルタチオンを４０ｍｌ添加する。さらに一晩室温にてインキュベートした後、これを２０ｍＭトリス緩衝液、１ｍＭＥＤＴＡ、４００ｍＭ  Ｌアルギニン、２ｍＭ還元型グルタチオンを５０ｍｌ添加する。一晩室温にてインキュベートした後、２０ｍＭトリス緩衝液、０．５Ｍグアニジン塩酸、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡにて透析を一晩行う。さらに２０ｍＭトリス緩衝液、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡにて透析を行った。
【００４９】
Ｑカラム（アマシャム）に添加する。開始バッファーは２０ｍＭトリス緩衝液、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８）とし溶出バッファー１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス緩衝液とする。食塩の濃度勾配で溶出を行う。ポリアクリルアミド電気泳動で約１０ｋＤａの分子量を示すことでＡｘｌ−Ｉｇ１を確認することができる。これを２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したゲルろ過カラムに添加し１．５カラムの２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて溶出する。目的物はポリアクリルアミドゲル電気泳動で約１０ｋＤａの分子量を示すことで確認出来る。これにより目的物は単一な標品に精製される。
【００５０】
実施例５
（１）Ｇａｓ６の受容体結合ドメインであるＧａｓ６ＬＧとＩｇ１との結合能：
結合実験は結合、乖離により生じる質量変化を表面プラズモン共鳴シグナルの変化として測定するＢｉａｃｏｒｅを用いて行った。Ｉｇ１をＣＭ５センサーチップに固定化し、Ｇａｓ６ＬＧの濃度は、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭを用いた。相互作用を測定するタンパク質の一方、すなわち作製したＩｇ１をセンサーチップＣＭ５に固定し、他方であるＧａｓ６ＬＧを送液することで結合を測定した。結合バッファーの組成は０．０１Ｍヘペス緩衝液、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、ｐＨ７．４とした。作製したＩｇ１にＧａｓ６ＬＧの結合が認められた（図６）。
【００５１】
（２）Ｇａｓ６ＬＧとＡｘｌ−Ｆｃの結合に対するＩｇ１の作用：
Ａｘｌ−Ｆｃ (ｓｉｇｍａ)をＣＭ５センサーチップに固定化し、Ｇａｓ６ＬＧ  ５０ｎＭを送液することにより、Ｇａｓ６ＬＧとＡｘｌ−Ｆｃの結合を測定した。この結合はＩｇ１の投与により阻害された(図７)。Ｉｇ１を１５ｎＭ−１．２μＭ加えた。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ＡｘｌをＶ８プロテアーゼで切断した断片ペプチドの電気泳動の結果を示す図である。
【図２】Ｇａｓ６の受容体結合領域であるＧａｓ６ＬＧと結合するＡｘｌ断片ペプチドを示すウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図３】ＡｘｌのＩｇ領域蛋白質をコードするＤＮＡを含む大腸菌発現ベクターｐＥＴ１５ｂ−Ｉｇの構造を示す図である。
【図４】Ａｘｌのリガンド結合領域とＧａｓ６の受容体結合領域であるＧａｓ６ＬＧとの結合を示す図である。
【図５】ＡｘｌのＩｇ１領域蛋白質をコードするＤＮＡを含む大腸菌発現ベクターｐＥＴ１５ｂ−Ｉｇ１の構造を示す図である。
【図６】ＡｘｌのＩｇ１領域とＧａｓ６の受容体結合領域であるＧａｓ６ＬＧとの結合を示す図である。
【図７】Ｇａｓ６ＬＧとＡｘｌ−Ｆｃの結合に対するＩｇ１の作用を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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