(57)【要約】【課題】本発明の課題は、女性ホルモン分解能力を有する女性ホルモン分解微生物の存在量を短時間で特異的に評価する方法を提供することである。【手段】女性ホルモン分解微生物の16S rＤＮＡ塩基配列におけるコンセンサス領域を基に設計したプライマーによって、活性汚泥等の女性ホルモン分解微生物に由来する核酸試料に対してＰＣＲ法を行い、該ＰＣＲ法により得られた増幅産物を検出することを含む方法により、上記課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）又は（ｃ）に記載のオリゴヌクレオチドを含むプライマー：
（ａ）配列番号１及び２、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号５及び７の各組み合わせのうち、何れかの塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット；
（ｂ）配列番号８及び９、配列番号１０及び１１、配列番号１０及び１２の各組み合わせのうち、何れかの塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット；
（ｃ）配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８、配列番号１９及び２０、配列番号２１及び２２、配列番号２１及び２３の各組み合わせのうち、何れかの塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット。
【請求項２】
活性汚泥等に存在する女性ホルモン分解微生物を検出する方法であって、該女性ホルモン分解微生物に由来する核酸試料を対象にして、請求項１に記載の少なくとも１つのプライマーセットを使用してＰＣＲ法を行い、該ＰＣＲ法により得られた増幅産物を検出することを含む方法。
【請求項３】
請求項２の女性ホルモン分解微生物検出方法であって、請求項１に記載の（ａ）〜（ｃ）から２つ以上のプライマーセットを選択し、それらのプライマーセットを使用して各対象分解微生物をそれぞれ検出し、各プライマーセットによって検出した各クラスター微生物の総量から女性ホルモン分解微生物を網羅的に検出することを含む方法。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の方法により女性ホルモン分解微生物の濃度を測定し、測定した濃度に基づいて前記活性汚泥等の女性ホルモン分解能力を評価することを含む、活性汚泥等の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、女性ホルモン分解能力を有する微生物を特異的に検出するための核酸、及びその核酸を用いる女性ホルモン分解微生物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、下水やその処理水が流入する河川流域において、雄性魚の血中ビテロジェニン濃度の上昇や卵胞の形成といった、雄性魚が雌性化する兆候が確認されている。さらに、これらの原因として、下水や排水中に存在する人畜由来の女性ホルモンである１７β-エストラジオールやエストロンの影響が指摘されている。
【０００３】
具体的には、実際に、僅か10ng/L程度の低濃度の17β―エストラジオールやエストロンを添加した清水中で飼育した雄性魚に雌性化の兆候が確認されている。また、多くの河川では、17β―エストラジオールやエストロンが1ng/Lを超える濃度域で検出されている。さらに、下水や畜産系排水には、17β―エストラジオールが100ng/L以上の濃度で検出され、下水処理水にも17β―エストラジオールやエストロンが10ng/L以上の濃度で検出されている。またピルの主成分であるエチニルエストラジオールなどの合成女性ホルモンも生活排水や環境水から検出されている。
【０００４】
このように、天然又は合成の女性ホルモンに起因する河川や湖沼などの水環境における生態系への悪影響が懸念されている。したがって、下水や畜産系排水などに存在する女性ホルモンをng/Lレベル以下の極めて低い濃度になるまで除去する技術が必要とされてきた。
【０００５】
それら水環境から女性ホルモンを除去する技術としては、オゾン処理法、促進酸化法、活性炭吸着法、逆浸透膜分離法のような処理技術が効果的であることは既に確認されている。しかし、この種の技術は一部の下水処理場において処理水の再利用を目的とした高度な処理法として適用されるものである。仮にそのような高度な処理法によって希薄な女性ホルモンを含み得る多大な下水処理水の全量を処理するとすれば、あまりにも非効率的であるし、また多大なエネルギー及びコストを要するので現実的な解決とはならない。
【０００６】
上記のような技術に比べて、有機性排水処理に広く利用されている活性汚泥法などの生物学的処理方法は、前述の方法と比べて低コストであり、多大な処理量にも対処することが可能である。したがって、微生物を利用する生物学的処理によって、汚水に含まれる17β-エストラジオール、エストロン、エストリオール、又はエチニルエストラジオールのような女性ホルモンを魚類等の生態系に影響を及ぼさない程度に十分に低い濃度レベルにまで低減できる技術を提供することが切望されている。
【０００７】
一方、女性ホルモンを分解する微生物に関する報告としては、非特許文献１および非特許文献２がある。しかし、両文献では、１００ｍｇ／Ｌ以上という下水中濃度の１０７倍もの高濃度域における女性ホルモンの分解現象が報告されているに過ぎない。
【０００８】
【非特許文献１】Applied Environmental Microbiology Apr.2002. p2057-2060
【非特許文献２】日本内分泌攪乱物質学会、２００２年、第５回研究発表会要旨集第４３２頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
活性汚泥等の公知の生物処理技術について検討してみると、問題とされる各種女性ホルモンについて十分な対策が図られているとは言えない。
現在の下水処理場の多くは、活性汚泥処理法等の好気的な生物処理法により汚水を処理しており、かかる好気性生物処理では１７β-エストラジオールやエストロンなど天然女性ホルモンの除去が不安定であり、十分な除去が達成できない場合が多いことが知られている。中でも、エストロンは処理水中に残留しやすく、環境への影響が特に懸念されている。また、合成女性ホルモンであるエチニルエストラジオールは、天然女性ホルモンと同等の高い女性ホルモン活性を有していることから、その対策が必要であるが、天然女性ホルモンよりさらに分解性は低い。
【００１０】
上述のような背景の中で、難分解性の合成女性ホルモンを含め各種女性ホルモンを生態系への影響が無くなる極低濃度まで効率的に分解処理でき、さらに容易に培養・増殖できる微生物を見出すことについての要求が存在する。
【００１１】
上記の要求に対し、本発明者である恩田らは、極低濃度の女性ホルモンに対して高い基質親和性を示し、且つ高い分解速度を発揮する微生物を下水処理場の活性汚泥から分離し、かかる微生物を女性ホルモン分解微生物として提案している（特願２００３−０５６７４）。
【００１２】
一般に、活性汚泥法等による汚水の浄化は、汚泥による対象物質の吸着と、汚泥中の微生物による対象物質の分解作用とによって行われている。ところが、汚水中の女性ホルモンは極めて低濃度で分析が容易でないことから、汚水中の女性ホルモンの除去機構については、現在のところ十分に解明されておらず、そのため、女性ホルモンを安定して処理することは困難だった。
【００１３】
例えば、汚水中の女性ホルモンを安定的に除去しようとする場合、処理水中の女性ホルモン濃度のモニタリングが有効である。しかし、上述のように汚水中の女性ホルモンは極めて低濃度なため、分析方法が煩雑かつ高度であり、短時間で容易に汚水中の女性ホルモン濃度を知ることはできなかった。そのため、汚水やその処理水中に含まれる女性ホルモンの濃度を指標として、女性ホルモンを安定に処理することは難しかったのである。
【００１４】
さらに、活性汚泥法などの生物処理によって汚水中の女性ホルモンを効率的に除去しようとする場合、活性汚泥や生物膜中に存在する女性ホルモン分解微生物の濃度も重要な因子になると考えられる。また、特定の微生物の女性ホルモン分解作用によって汚水中の女性ホルモンを除去する場合には、対象となる女性ホルモン分解微生物を特異的に検出する方法が必要であった。しかしながら、女性ホルモン分解微生物を特異的に検出する方法に関しては、これまで全く検討がなされていなかった。
【００１５】
以上のような状況に鑑み、本発明の課題は、女性ホルモン分解能力を有する女性ホルモン分解微生物の存在量を短時間で特異的に評価する方法を提供することである。より詳細には、本発明の課題は、下水や汚水等の好気性生物処理に利用される活性汚泥等や生物膜中に存在し、該処理工程において女性ホルモンの分解に関与する女性ホルモン分解微生物を特異的に検出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、下水や汚水を処理する活性汚泥等に存在し、優れた女性ホルモン分解能を有する女性ホルモン分解微生物に関し、その微生物由来の遺伝子を特異的に検出するためのＰＣＲプライマーとなるオリゴヌクレオチドを見出し、本発明を完成させた。
【００１７】
すなわち、本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）のうち少なくとも一組のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットである：
（ａ）配列番号１及び２、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号５及び７の各組み合わせのうち何れかの塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット；
（ｂ）配列番号８及び９、配列番号１０及び１１、配列番号１０及び１２の各組み合わせのうち何れかの塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット；
（ｃ）配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８、配列番号１９及び２０、配列番号２１及び２２、配列番号２１及び２３の各組み合わせのうち何れかの塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット。
【００１８】
また、本発明は、女性ホルモン分解微生物を検出する方法であって、活性汚泥等の女性ホルモン分解微生物に由来する核酸試料を対象にして、上記のいずれかのオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲ法を行い、該ＰＣＲ法により得られた増幅産物を検出することを含む方法である。
【００１９】
さらに、本発明は、上記女性ホルモン分解微生物検出法において、（ａ）〜（ｃ）のうち少なくとも２組以上からそれぞれ代表されるプライマーセットを使用して各対象分解微生物を検出し、その総量から活性汚泥等の女性ホルモン分解微生物を網羅的に検出する方法である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、優れた女性ホルモン分解能力を有する女性ホルモン分解微生物について、その存在量を特異的かつ短時間に評価することができる。また、本発明によれば、有機性廃水や汚水等の好気性生物処理に利用される活性汚泥等や生物膜中に存在し、かつその処理工程において女性ホルモンの分解に関与する女性ホルモン分解微生物を特異的かつ網羅的に検出することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
本発明は、活性汚泥等に存在する女性ホルモン分解微生物に由来する１６S ｒＤＮＡ遺伝子の存在をＰＣＲ法によって選択的に検出することを含む、女性ホルモン分解微生物の検出方法に関する。
【００２２】
本発明における活性汚泥等とは、標準活性汚泥法、オキシデーションディッチ法、ステップ流入法などの各種活性汚泥変法の汚泥、および、好気性ろ床法、回転円板法、又は接触酸化法などの生物膜法の生物膜など、好気性生物処理の触媒となる生物汚泥の全て含んだものを意味する。
【００２３】
本発明における女性ホルモンとしては、１７β−エストラジオール、１７α−エストラジオール、エストロン、エストリオール、エチニルエストラジオール、それらの抱合体、およびこれらに類した女性ホルモン様物質を挙げることができ、以上の化学物質から選ばれる少なくとも１種または以上の化学物質のあらゆる組み合わせが含まれる。
【００２４】
本発明において女性ホルモン分解微生物とは、女性ホルモンを分解する能力を有するすべての微生物（細菌、真菌等）を意味する。例えば、女性ホルモン分解微生物としては、Sphingomonas属細菌、およびNovosphingobium属細菌を挙げることができる。さらに、Sphingomonas属女性ホルモン分解微生物としては、Sphingomonas sp.ＪＥＭ−３株（FERM P- 19235）、Sphingomonas sp.ＪＥＭ−１４株（FERM P- 19236）、およびこれらの菌株と１６SｒDNA全長の塩基配列の相同性が97％以上である近縁細菌を挙げることができる。また、Novosphingobium属細女性ホルモン分解微生物としては、ＪＥＭ−１株（FERM P- 19234）、およびこの菌株と１６SｒDNA全長の塩基配列の相同性が97％以上である近縁細菌を挙げることができる。
【００２５】
図１に、Sphingomonas属、及びNovosphingobium属に属する細菌群の系統樹を示す。図１に示されるように、これらの微生物は遺伝的に３種類のクラスター（ＥＢ２、Ｇ１，Ｇ２）に分類することができる。本発明においては、この３種類のクラスターを非特異的に検出・定量することもできるが、３種類のクラスターのそれぞれを特異的に検出・定量する方法が好ましい。なぜなら、これら３つの細菌群の総量から、活性汚泥等における女性ホルモン分解に寄与する女性ホルモン分解微生物群を総括的に把握することが可能になるからである。つまり、試料によって存在するクラスターが異なるため、各クラスターに対応するプライマーセットで検出することにより、どのクラスターに属する分解微生物が処理に関与しているかがわかるだけでなく、それらの総和、又は最も高濃度の分解微生物群の濃度から、活性汚泥等に存在する女性ホルモン分解微生物群を総括的に把握することができるのである。さらには、クラスターごとに評価することにより、試料の持つ女性ホルモン分解能力を評価できるばかりか、当該処理場の処理水中の女性ホルモン濃度をも推定することが可能にある。こうした測定のためには、それぞれのクラスターの細菌群に特異的な遺伝子配列を探し出し、そのオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、その増幅産物を検出する方法が特に好ましい。
【００２６】
女性ホルモンの分解においては、前述のSphingomonas sp.ＪＥＭ−３株（FERM P- 19235）、Sphingomonas sp.ＪＥＭ−１４株（FERM P- 19236）、Novosphingobium sp.ＪＥＭ−１株（FERM P- 19234）などの女性ホルモン分解微生物が優れた女性ホルモン分解能を有することから、これらの分離株を利用して効率的な女性ホルモンの処理を行うことが可能である。この場合、これらの分離株を特異的にモニターする必要があるが、分離した分解微生物は各クラスターに属することから、クラスターごとにＰＣＲ反応を行ってその増幅産物を検出する方法が、分離株を特異的にモニタリングする手法として有効である。
【００２７】
ＰＣＲに利用可能な女性ホルモン分解微生物に特異的なプライマー配列として、本発明者らによって分離された各クラスターに属する分解微生物と女性ホルモン非分解微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ領域の塩基配列とを比較することによって、本発明者らは、３つのクラスターにそれぞれ特異的な配列を見出した。本発明者らが見出した配列を利用すれば、女性ホルモン分解能力を有する細菌のうち、それぞれのクラスターに分類される細菌を分類学的に近縁である他のSphingomonas属細菌を含む試料から特異的に検出し、定量することが可能である。さらに、各プライマーは、各クラスターに属する女性ホルモン分解微生物に特異的であることから、分離した分解微生物株を特異的に検出することも可能である。
【００２８】
本発明においてＰＣＲ法に使用されるプライマーは、所定のＰＣＲ条件下で、女性ホルモン分解微生物の対象となるクラスターに属する細菌由来の１６SｒＲＮＡ遺伝子にはアニールできるが、それと同一の条件下では、それ以外のいかなる生物由来の１６SｒＲＮＡ遺伝子にもアニールしないような塩基配列を有するように設計されている。
【００２９】
本発明において使用できるプライマーとしては、クラスターＥＢ２に特異的なプライマーとして配列番号１（TTGAAACTGGGTAGCTAGAATCCTG）及び配列番号２（CAACTGAATGATGGCAACTAAGGAC）、配列番号３（AATACCGGATGATGTCTTCGG）及び配列番号４（GGATTTCACCCCTGACTTGAAT）、配列番号５（TGATCGCGGATTAGAGAGATCT）及び配列番号６（TAGCTACCCCTCGCGAGG）、ならびに配列番号５及び配列番号７（TTGCTGCCCACTGTCACC）のプライマーセットを例示することができるが、これに限定される訳ではない。また、クラスターＧ２に特異的なプライマーとしては、配列番号８（GGTACGGAATAACAGTGAGAAATT）及び配列番号９（TCAACAGTCGTCCAGTGAGC）、配列番号１０（ACTGCATCGCTTGAACGTC）及び配列番号１１（AACTGAAGGAAACCATCTCTGGA）、ならびに配列番号１０及び配列番号１２（CATGCAGCACCTGTCACCT）のプライマーセットを例示することができるがこれに限定される訳ではない。さらに、クラスターＧ１に特異的なプライマーとしては、配列番号１３（ACCCGTGATGATAATGACAGTAGC）及び配列番号１４（AACTGAAGGAAAGTGTCTCCACG）、配列番号１５（ACCCGTGATGATAATGACAGTAG）及び配列番号１６（GAACTGAAGGAAAGTGTCTCCA）、配列番号１７（GACTGCATCGCTTGAATCCA）及び配列番号１８（TGAAGGAAAGTGTCTCCACG）、配列番号１９（CTGGGTGCATGGCACTTA）及び配列番号２０（CAGCACCTGTGCACGG）、配列番号２１（TCTGGGTGCATGGCACTTA）及び配列番号２２（GCAGCACCTGTGCACG）、ならびに配列番号２１及び配列番号２３（CTGAAGGAAAGTGTCTCCACG）のプライマーセットを例示することができるが、これらに限定される訳ではない。本発明の検出法において使用できるプライマーには、塩基長やＰＣＲ条件等に依存して、上に列挙した塩基配列と実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットも含まれる。
【００３０】
これらの塩基配列は、女性ホルモン分解微生物に特異的な配列であることから、これらの一部の配列をＤＮＡプローブとしたFISH法やサザンハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーションなどを実施することも可能である。
【００３１】
本明細書においてオリゴヌクレオチドに関して使用される「塩基配列が実質的に相同である」という表現は、当該オリゴヌクレオチドがＰＣＲプライマー等として機能し得る程度の断片長と相同性を有することを意味する。例えば、本発明において使用するプライマーは、使用目的や条件によっては、必ずしも100％の相同性を有している部位から設計する必要はなく、目的とする領域のプライマーの５’末端付近で数塩基が異なっていてもよい。そのようなプライマーを使用しても、アニーリング温度等を検討することによって目的ＤＮＡ断片を適宜増幅させることは可能である。例えば、本発明を実施するに際し、高い特異性が要求される場合には、完全に相同な配列部位（典型的には、配列番号１〜２３の塩基配列）を使用し且つそのような配列でしかアニーリングしないＰＣＲ条件を選択すればよく、その反面、比較的特異性の低い条件が許容される場合には、配列番号１〜２３の塩基配列とは数塩基異なる配列を使用し且つそれでもアニーリングするようなＰＣＲ条件を選択することができる。
【００３２】
上記のように所望の特異性を有する本発明のプライマーの何れかのセットを使用するＰＣＲによると、その結果として女性ホルモン分解微生物が存在する試料では所望の核酸増幅が起こるが、女性ホルモン分解微生物が実質的に存在しない試料では有意な核酸増幅は起こらないこととなる。したがって、本発明のプライマーを使用するＰＣＲ法においては、クラスターごとに期待される核酸が増幅されるか否かを調べるだけで、活性汚泥等に存在する女性ホルモン分解微生物の総括的検出が可能となる。さらに、本発明においては、上述のように女性ホルモン分解微生物の濃度を測定し、測定した濃度に基づいて前記活性汚泥等の女性ホルモン分解能力を評価することができる。
【００３３】
これら試料からのＤＮＡの抽出・精製、遺伝子の検出・定量法としては、当該技術分野において公知のあらゆる手段を使用することができるが、ＰＣＲ法を利用した定量方法が特に好ましい。さらに、ＰＣＲ法を利用した定量方法としては、リアルタイムＰＣＲ法、競合ＰＣＲ法、ＤＧＧＥ法などを好ましい手法として適用することができる。
【００３４】
さらに、上記のプライマーのうち何れかのセットを使用するＰＣＲ法において、増幅産物の塩基配列を比較することにより、クラスターレベルだけでなく、株レベルで、女性ホルモン分解微生物を特異的に定量・検出することが可能である。この場合、増幅産物の塩基配列の比較法としては、公知のあらゆる手段を使用することができるが、ハイブリダーゼーションプローブ法、又はＤＧＧＥ法などが好ましく、リアルタイムＰＣＲ法におけるハイブリダーゼーションプローブ法が特に好ましい。
【００３５】
以上説明したように、本発明によれば、短時間で簡易なＰＣＲ法による女性ホルモン分解微生物の検出法が提供される。
【００３６】
女性ホルモン分解菌の例
本発明の検出方法において、検出対象となり得る女性ホルモン分解菌の一例について、説明する。
【００３７】
すなわち、本発明の分解菌として、Novosphingobium属またはSphingomonas属のいずれかに属する女性ホルモン分解細菌であって、下記性質（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）女性ホルモンのうち、少なくともエチニルエストラジオールを分解する能力を有する；
（ｂ）女性ホルモンのうち、少なくとも17β-エストラジオール及び／又はエストロンを分解する能力を有し、且つ該17β-エストラジオール及び／又は該エストロンの分解速度定数ｋ1が0.05以上である；又は
（ｃ）女性ホルモンのうち、少なくとも17β-エストラジオール及び／又はエストロンを分解する能力を有し、且つ汚水等の処理対象物に含まれる該17β-エストラジオール及び／又は該エストロンの濃度を10ng/L未満まで減少させる能力を有する；
のうち、少なくともいずれか一つを有する細菌を挙げることができる。
【００３８】
前記（ａ）の性質に関し、本発明の細菌には、前記（ａ）の性質を有する細菌であって、さらに17β-エストラジオール、エストロン、及びエストリオールを分解する能力を有する細菌が含まれる。
【００３９】
前記（ｂ）の性質に関し、本発明の細菌には、前記（ｂ）の性質を有する細菌であって、該17β-エストラジオール及び／又は該エストロンの分解速度定数ｋ1が好ましくは0.5以上、より好ましくは該エストロンの分解速度定数ｋ1が1.5以上である細菌が含まれる。
【００４０】
前記（ｃ）の性質に関し、本発明の細菌には、前記（ｃ）の性質を有する細菌であって、該17β-エストラジオール及び／又は該エストロンの濃度を約10μg/Lから約10ng/L未満へ、好ましくは約１ng/Lまで減少させる能力を有する細菌が含まれる。さらに本発明の細菌には、前記（ｃ）の性質を有する細菌であって、それらの適正な菌体濃度下で、前記濃度減少を多くとも24時間、好ましくは３時間で達成する能力を有する細菌が含まれる。
【００４１】
より具体的には、本発明の検出方法において、検出対象となり得る女性ホルモン分解菌として、ＪＥＭ−１（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２３４）、ＪＥＭ−２、ＪＥＭ−３（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２３５）、ＪＥＭ−１４（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２３６）を挙げることができる。また、これらの菌株は、それぞれ配列番号２６〜２９に示される１６Ｓ  ｒＲＮＡ塩基配列を有する。
【００４２】
（１）JEM-1株は、Novosphingobium属に分類され、16s-rRNAの相同性解析の結果、既知の女性ホルモン分解菌との間で96％の相同性、及び他の近縁な公知細菌に対して多くとも95％の相同性しか有さない。
【００４３】
従って、本細菌には、JEM-1株と同等の性質を有するNovosphingobium属に属する細菌であって、配列番号２６に記載の塩基配列に対し95％を超える相同な塩基配列、好ましくは96％を超える相同な塩基配列、より好ましくは、少なくとも98％相同な塩基配列を有する細菌が含まれる。
【００４４】
（２）JEM-2株は、Sphingomonas属に分類され、16s-rRNAの相同性解析の結果、既知の女性ホルモン分解菌との間で91％の相同性、及び他の近縁な公知細菌に対して多くとも93％の相同性しか有さない。
【００４５】
従って、本細菌には、JEM-2株と同等の性質を有するSphingomonas属に属する細菌であって、配列番号２７に記載の塩基配列に対し、91％を超える相同な塩基配列、好ましくは93％を超える相同な塩基配列、より好ましくは少なくとも95％相同な塩基配列を有する細菌が含まれる。
【００４６】
（３）JEM-3株は、Sphingomonas属に分類され、16s-rRNAの相同性解析の結果、既知の女性ホルモン分解菌との間で91％の相同性、及び他の近縁な公知細菌に対して多くとも93％の相同性しか有さない。
【００４７】
従って、本細菌には、JEM-3株と同等の性質を有するSphingomonas属に属する細菌であって、配列番号２８に記載の塩基配列に対し、91％を超える相同な塩基配列、好ましくは93％を超える相同な塩基配列、より好ましくは少なくとも95％相同な塩基配列を有する細菌が含まれる。
【００４８】
（４）JEM-14株は、Sphingomonas属に分類され、16s-rRNAの相同性解析の結果、既知の女性ホルモン分解菌との間で92％の相同性、及び他の近縁な公知細菌に対して多くとも95％の相同性しか有さない。
【００４９】
従って、本細菌には、JEM-14株と同等の性質を有するSphingomonas属に属する細菌であって、配列番号２９に記載の塩基配列に対し、92％を超える相同な塩基配列、好ましくは95％を超える相同な塩基配列、より好ましくは少なくとも98％相同な塩基配列を有する細菌が含まれる。
【００５０】
上記細菌の中でも、公知の女性ホルモン分解細菌ARI-1株との間の相同性について、JEM-2株及びJEM-3株には91％の相同性しか認められず、同様にJEM-14株には92％の相同性しか認められなかった。これらの相同性の低さから見て、それら菌株は、Sphingomonas属の新種であると結論づけられた。
【００５１】
表１は、上記の代表的女性ホルモン分解菌の微生物学的性状である。
【００５２】
【表１】
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【実施例】
【００５３】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
なお、本明細書において、「Ｍ」という単位は「ｍｏｌ／Ｌ」を意味する。
［実施例１］
女性ホルモン分解微生物の16S rＤＮＡ上に存在するコンセンサス配列を探るため、本発明者らによって分離された複数の女性ホルモン分解微生物の16S rＤＮＡ塩基配列について、系統学的見地から解析を行った。
【００５４】
図１は、16S rＤＮＡ塩基配列をもとに作成した、女性ホルモン分解微生物と近縁微生物との系統樹である。女性ホルモン分解微生物はクラスターＥＢ２，Ｇ１，Ｇ２の３つのクラスターに分類されることから、これらのクラスターごとにコンセンサス配列を探索した。
【００５５】
解析の結果、各クラスターの微生物群について、それぞれ複数のコンセンサス配列が特定された。これらのコンセンサス配列に相補的なオリゴヌクレオチドを、プライマーとして設計し、オリゴヌクレオチド合成機を用いて合成した。
【００５６】
具体的には、クラスターＥＢ２に対するプライマーセットは、EB2F（配列番号１）とEB2R（配列番号２）、EB2F2（配列番号３）とEB2R2（配列番号４）、EB2F3（配列番号５）とEB2R3（配列番号６）、およびEB2F3（配列番号５）とEB2R4（配列番号７）である。各プライマーセットを用いたＰＣＲの増幅産物の大きさは、順に５０９，４０３，２８３，２６５ベースペアである。
【００５７】
また、クラスターＧ２に対するプライマーセットは、G2F（配列番号８）とG2R（配列番号９）、G2F2（配列番号１０）とG2R2（配列番号１１）、およびG2F2（配列番号１０）とG2R3（配列番号１２）である。各プライマーセットを用いたＰＣＲの増幅産物の大きさは、順に５７５，３９３，４２１ベースペアである。
【００５８】
さらに、クラスターＧ１に対するプライマーセットは、G1F（配列番号１３）とG1R（配列番号１４）、G1F2（配列番号１５）とG1R2（配列番号１６）、G1F3（配列番号１７）とG1R3（配列番号１８）、G1F4（配列番号１９）とG1R4（配列番号２０）、G1F5（配列番号２１）とG1R5（配列番号２２）、およびG1F5（配列番号２１）とG1R6（配列番号２３）である。各プライマーセットを用いたＰＣＲの増幅産物の大きさは、順に５６８，５６９，３９０，２２４，２２６，１９９ベースペアである。
【００５９】
以上のプライマーは、女性ホルモン分解微生物に特異的な16ＳｒＤＮＡと対合するため、活性汚泥等の混合菌群中に存在する細菌群の中から、女性ホルモン分解微生物を特異的に検出し、定量することが可能となる。
【００６０】
［実施例２］
（１）ＤＮＡの抽出
以下の手順によりＤＮＡを抽出した。
１mlの活性汚泥または培養菌体に、等量のTE緩衝液（10mM Tris-HCl、1mM EDTA）を加え、遠心分離（10000rpm, 4分間）した後に、上澄を除去した。250mlの抽出緩衝液（pH9, 100mM Tris-HCl, 40mM EDTA）、50mlの10% ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、および150mlの塩化ベンジルをペレットに加えて攪拌した後、5分ごとに攪拌しながら30分間50℃に保温した。3Mの酢酸ナトリウム150mlを加えて氷冷し、遠心分離（15000rpm, 4℃, 15分間）した。上層を新しいチューブに採取し、等量のイソプロパノールを加えて遠心分離（15000rpm, 4℃, 15分間）し、ＤＮＡを沈殿させた。70% エタノールで沈殿を洗浄して、真空遠心機で乾燥させた後、500mlのTE緩衝液に溶解させ、ＤＮＡ抽出液を得た。
【００６１】
（２）ＰＣＲによる１６Ｓ ｒＤＮＡの増幅
（１）の方法により得られた抽出ＤＮＡ溶液を利用して、下記の手順でＰＣＲ反応を行い、女性ホルモン分解微生物が存在するかを調査した。
（１）で得た抽出ＤＮＡ溶液１μＬをテンプレートにして、１６Ｓ ｒＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅の反応液の全容量は１００μＬとし、２．５ＵのＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造製）、２００μＭのｄＮＴＰを使用した。プライマーセットはそれぞれ２０ｐｍｏｌ使用した。その他の反応液組成はＰＣＲキットに添付のマニュアルに従った。ＰＣＲ反応は、９４℃、２分のＰｒｅ−ｈｅａｔｉｎｇの後に、第１段階（９４℃、２０秒）、第２段階（５８℃、３０秒）、および第３段階（７２℃、２分）で構成されるサイクルを３０回繰り返し、最後に、Ｐｏｓｔ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎとして７２℃、７分で処理した。なお、第２段階の温度は、プライマーごとに異なる。各プライマーセットにおける反応温度を表２に記載した。
【００６２】
一方で、女性ホルモン分解微生物の各菌株からも、ＤＮＡを抽出して、同様の操作によりＰＣＲ反応を行った。
女性ホルモン分解微生物の検出は、上記ＰＣＲ反応液２μＬをアガロース電気泳動にかけておこなった。予想される大きさのＤＮＡ断片が合成されれば、女性ホルモン分解微生物が存在すると判断した。
【００６３】
表２に、各プライマーセットを用いて各試料に対しＰＣＲ反応を行い、増幅産物の有無を調べた結果を示す。表中、○は増幅産物が検出されたことを意味する。表２に示す結果から、上記の各プライマーセットによって対象のクラスターのみを特異的に検出できることが確認された。
【００６４】
【表２】
2005253428.tif 000003
【００６５】
（３）Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒによる定量
（１）の抽出ＤＮＡ溶液について、リアルタイムＰＣＲ装置であるＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（ロッシュ・ダイアグノスティック株式会社製）を用いて定量検出を行った。ここでは、ＥＢ２クラスターを検出するプライマーとして、ＥＢ２Ｆ及びＥＢ２Ｒに相補的なオリゴヌクレオチドを利用した。ＰＣＲ反応は、同社製Ｌｉｇｈｔ ＣｙｃｌｅｒＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ SYBR Green Iキット（商標）を使用し、そのマニュアルに従って行った。
【００６６】
図２に、既知濃度のＪＥＭ−１株より得られたＤＮＡ試料に対する、リアルタイムＰＣＲ法の検出サイクル数と菌体濃度との関係を示す検量線を示す。図中、縦軸はＰＣＲのサイクル数（回）、横軸は微生物濃度（個／ml）である。
【００６７】
［実施例３］
ＳＲＴの異なる二つの下水処理装置について、実施例２に記載の方法により活性汚泥中の女性ホルモン分解微生物濃度を測定し、処理水中のエストロン濃度を比較した。Ａ系の平均ＳＲＴは７．６日、Ｂ系の平均ＳＲＴは２３日である。クラスターＥＢ２を定量するプライマーとして、ＥＢ２Ｆ（配列番号１）とＥＢ２Ｒ（配列番号２）のプライマーセット、クラスターＧ２を検出するプライマーとして、Ｇ２Ｆ（配列番号８）とＧ２Ｒ（配列番号９）のプライマーセットを使用した。
【００６８】
図３に結果を示す。ＳＲＴの異なる処理装置では、活性汚泥中のＥＢ２クラスターの女性ホルモン分解菌濃度に明確な差が認められ、特に、ＳＲＴの長い運転では、分解微生物濃度が安定して高く、処理水中の女性ホルモン濃度が低かった。
【００６９】
また、Ｇ２クラスターの細菌であるＪＥＭ−２に特異的なハイブリダイゼーションプローブとして、Ｇ２Ｐ１（gctaatccta cgcgggctca tcct：配列番号２４）をＦＩＴＣ（Fluorescence isothiocyanate）で標識したもの、およびＧ２Ｐ２（gggcgataaa tctttggact tacgtca：配列番号２５）をLC-Red 640で標識したものを使用し、ハイブリダイゼーションプローブ法によるＪＥＭ−２株の定量を行った。ＰＣＲ反応は、ロッシュ・ダイアグノスティック株式会社製Light Cycler DNA Master Hybridization Probesキット（商標）を使用し、そのマニュアルに従って行った。
その結果、Ｇ２のうち、ＪＥＭ−２株だけを特異的に定量できることが確認された（図３）。
【００７０】
［実施例４］
ＳＲＴが５日で運転中の分解微生物濃度の低い活性汚泥について、反応槽内の分解微生物濃度をモニターし、分解菌濃度の低下に合わせて、１日目、６日目、９日目に別途培養した女性ホルモン分解微生物ＪＥＭ−３株を添加した。ＪＥＭ−３株の定量は、Ｇ２Ｆ（配列番号８）とＧ２Ｒ（配列番号９）のプライマーセットを用い、リアルタイムＰＣＲ法により行った。
【００７１】
図４に、女性ホルモン分解微生物濃度と処理水エストロン濃度の変化を示す。添加したＪＥＭ−３株濃度をモニターし、減少に合わせてＪＥＭ−３株を添加することで、女性ホルモンを安定して処理できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、16S rＤＮＡ塩基配列に基づく、女性ホルモン分解微生物の系統樹を示す。
【図２】図２は、リアルタイムＰＣＲ法による、女性ホルモン分解微生物（ＪＥＭ−１株）の検量線を示す。縦軸はＰＣＲのサイクル数（回）、横軸は微生物濃度（個／ml）である。
【図３】図３は、ＳＲＴの異なる処理装置における、活性汚泥中の女性ホルモン分解微生物と処理水中の女性ホルモン濃度との関係を示す。Ａ系の平均ＳＲＴは７．６日、Ｂ系の平均ＳＲＴは２３日である。
【図４】図４は、反応槽内に女性ホルモン分解微生物を添加した場合の女性ホルモン処理性状を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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