(57)【要約】【課題】１つのマイクロチップ上において、複数の分析対象物質を同時に、且つ高感度に分析可能な時間分解蛍光分析方法を提供する。【解決手段】前記方法は、（Ａ）マイクロチップ上にドット状に担持された複数の分析対象物質と、（Ｂ）（ａ）水不溶性高分子化合物から実質的になるコア部分と（ｂ）反応性官能基を有する水溶性高分子化合物から実質的になり、前記コア部分の表面をブラシ状に覆うシェル部分とからなり、しかも、前記コア部分と前記シェル部分とが、全体として、水不溶性高分子と水溶性高分子とのブロックコポリマーからなるコア−シェル型粒子において、前記コア部分に蛍光性希土類金属錯体が封入され、前記シェル部分に、分析対象物質に特異的に結合可能なパートナーが結合されている、蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子とを接触させる工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）マイクロチップ上にドット状に担持された複数の分析対象物質と、
（Ｂ）（ａ）水不溶性高分子化合物から実質的になるコア部分と、（ｂ）反応性官能基を有する水溶性高分子化合物から実質的になり、前記コア部分の表面をブラシ状に覆うシェル部分とからなり、しかも、前記コア部分と前記シェル部分とが、全体として、水不溶性高分子と水溶性高分子とのブロックコポリマーからなるコア−シェル型粒子において、前記コア部分に蛍光性希土類金属錯体が封入され、前記シェル部分に、分析対象物質に特異的に結合可能なパートナーが結合されている、蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子と
を接触させる工程を含むことを特徴とする、時間分解蛍光分析方法。
【請求項２】
マイクロチップ上にドット状に担持された前記分析対象物質が、（１）マイクロチップ上にドット状に固定化された、前記分析対象物質に特異的に結合可能なパートナーに結合することにより、マイクロチップ上にドット状に担持されているか、あるいは、（２）マイクロチップ上にドット状に直接、固定化されている、請求項１に記載の時間分解蛍光分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の分析対象物質を１つのマイクロチップ上に担持させ、蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子を用いて前記分析対象物質を分析する、時間分解蛍光分析方法に関する。本明細書における「分析」には、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」とが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
抗原抗体反応、リガンドとレセプターとの結合反応、あるいは、ＤＮＡ又はＲＮＡのハイブリダイズ反応等を検出する方法については多くの検討がなされ、それに比例して多くの報告が出されている。
最も一般性があって１９５０年代から行われてきたのはラジオアイソトープ標識法であり、前記反応の解析全てに用いられてきた。しかし、放射性物質取り扱いと廃棄の規制から、それに代わるものが求められ、酵素、蛍光物質、又は発光物質などの標識法が開発されてきた。
【０００３】
標識用酵素としてはペルオキシダーゼ又はアルカリフォスファターゼ等が多用され、その基質として発色基質、蛍光基質、又は発光基質等が用途に応じて使い分けられてきた。
蛍光物質としてはフルオレッセイン又はローダミン等が一般的であり、最近では赤色、青色、及び黄色等の蛍光物質を使い分けていくつかの情報を一度に取り出す工夫もなされている。
発光物質としてはアクリジニウムエステル又はルミノール誘導体等が用いられ、直接標識した上、発光開始剤を加えて光らせて検出器で測定している。
【０００４】
最近、ＤＮＡチップ又はプロテインチップという概念が騒がれ出した。これはスライドグラスやプラスチックチップ等の表面にＤＮＡプローブや抗原又は抗体などを多種類個別にドット状に固定化し、サンプルを含む反応液を全面にかけてそれぞれのドットとの反応性を一度に調べようとするものである。
このチップ反応の標識物には、直接チップ上のドットを画像処理装置で検出することができるように、蛍光物質が好まれて用いられてきた。また、高感度化の試みとして標識物に酵素を用い、発光基質を全面にかけて光るドットのシグナルをカメラでとらえる方法も検討されている。
【０００５】
集積チップの標識には蛍光物質が好んで用いられているが、これは蛍光物質の標識法が楽であること、チップ上での結合反応終了後、液体を捨てて乾燥状態で観測することができること、あるいは、色調の異なる蛍光物質をサンプルに標識して多くの情報を得ることができること等のメリットによっている。しかし、蛍光物質自体の検出感度は１０のマイナス９乗モルレベルであり、１ｍＬ当たりマイクログラムレベルの濃度の物質しか測定することができない。
ＤＮＡを検出するにはポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法でサンプル濃度を増幅し観測することができるため、蛍光物質標識と組み合わせて１チップ上で何千〜何万というドットのシグナルを検出することができるようになっている。しかし、あくまでもＰＣＲ法でサンプルを増幅してから測定するという限定付きの方法である。
【０００６】
それに対して、タンパク質、又は生理活性を持つ化学物質などは増幅することができず、なおかつ生体に関与する時の濃度が低いため、蛍光物質標識チップ法では検出することができない状態である。この蛍光物質の感度不足を打破しようとするチップシステムの検討も進んでおり、酵素標識と発光基質それにＣＣＤカメラを組み合わせた測定系が報告されている。しかし、この方法は発光基質を液体のままチップにのせ、上方からカメラで取るという制限の大きなシステムを必要とし、種々のコンタミ物質が原因で非特異的に発光基質が光って測定の信頼性を無くしているという現状である。
【０００７】
このように集積チップに関する技術的進展がある一方、標識物質、例えば、蛍光物質の改良も試みられている。例えば、国際公開第ＷＯ０２／０９７４３６号パンフレット（特許文献１）には、シグナル生成物質封入コア−シェル型粒子が開示されている。このシグナル生成物質封入コア−シェル型粒子は、（１）水不溶性高分子化合物から実質的になるコア部分と、（２）反応性官能基を有する水溶性高分子化合物から実質的になり、前記コア部分の表面をブラシ状に覆うシェル部分とからなり、しかも、前記コア部分と前記シェル部分とが、全体として、水不溶性高分子と水溶性高分子とのブロックコポリマーからなるコア−シェル型粒子において、前記コア部分にシグナル生成物質が封入されており、高感度な標識物質として利用可能である。
【０００８】
しかし、前記パンフレットには、ユーロピウムキレート封入粒子標識抗ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートにおいて、時間分解蛍光測定方法によりＣＲＰを実際に測定可能であったことが実施例に記載されているものの、前記シグナル生成物質封入コア−シェル型粒子がマイクロチップ上での時間分解蛍光測定に用いることができることの開示も示唆もない。
【０００９】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０２／０９７４３６号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、１つのマイクロチップ上において、複数の分析対象物質を同時に、且つ高感度に分析可能な時間分解蛍光分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題は、本発明による、
（Ａ）マイクロチップ上にドット状に担持された複数の分析対象物質と、
（Ｂ）（ａ）水不溶性高分子化合物から実質的になるコア部分と、（ｂ）反応性官能基を有する水溶性高分子化合物から実質的になり、前記コア部分の表面をブラシ状に覆うシェル部分とからなり、しかも、前記コア部分と前記シェル部分とが、全体として、水不溶性高分子と水溶性高分子とのブロックコポリマーからなるコア−シェル型粒子において、前記コア部分に蛍光性希土類金属錯体が封入され、前記シェル部分に、分析対象物質に特異的に結合可能なパートナーが結合されている、蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子と
を接触させる工程を含むことを特徴とする、時間分解蛍光分析方法により解決することができる。
【００１２】
本発明の時間分解蛍光分析方法の好ましい態様によれば、マイクロチップ上にドット状に担持された前記分析対象物質が、（１）マイクロチップ上にドット状に固定化された、前記分析対象物質に特異的に結合可能なパートナーに結合することにより、マイクロチップ上にドット状に担持されているか、あるいは、（２）マイクロチップ上にドット状に直接、固定化されている。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の時間分解蛍光分析方法によれば、１つのマイクロチップ上において、複数の分析対象物質を同時に、且つ高感度に分析可能である。すなわち、一反応で一項目の測定結果しか得られなかった高感度分析法が、本発明により一反応で多項目同時に情報が得られるようになった。検出器の対応さえすれば、ドットの数は自由に調製することができ、タンパク質とＤＮＡや、薬剤とＤＮＡ等、異なった情報も１チップの反応で得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（ａ）水不溶性高分子化合物を主成分とするコア部分と、（ｂ）反応性官能基を有する水溶性高分子化合物を主成分とし、前記コア部分の表面をブラシ状に覆うシェル部分とからなるコア−シェル型粒子、すなわち、水不溶性高分子化合物を主成分とするコア部分の表面に、表層に反応性官能基を有する水溶性高分子化合物ブラシを有するコア−シェル型粒子それ自体は、背景技術で先述したように、公知である。また、そのコア部分に蛍光性希土類金属錯体が封入され、更に、シェル部分に、分析対象物質に特異的に結合可能なパートナーが結合されている蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子それ自体も、公知である。
【００１５】
本発明において、コア部分を形成するのに用いることのできる水不溶性高分子化合物は、水に溶解しない高分子化合物であって、しかも、コア部分を形成した際に、その内部に蛍光性希土類金属錯体を封入することができる高分子化合物である限り、特に限定されるものではない。前記水不溶性高分子化合物としては、例えば、疎水性ポリマー［例えば、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ポリイソプレン、ポリ塩化ビニル、ポリ乳酸、ポリラクトン、又はポリラクタムなど］、水溶性ポリマー（例えば、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリアリルアミン、又はポリアクリル酸など）の架橋ゲル、あるいは、水不溶性天然高分子化合物（例えば、ゼラチン又は多糖など）などを挙げることができる。
【００１６】
本発明において、前記のコア部分は、前記の水不溶性高分子化合物１種類のみから実質的に形成されているか、又は前記の水不溶性高分子化合物２種類以上の組み合わせから実質的に形成されていることができる。
【００１７】
前記コア部分の形状は特に限定されるものではないが、一般的には大略球状あるいは大略楕球状である。また、前記コア部分の寸法も特に限定されるものではなく、用途に応じて適宜変化させることができるが、大略球状のコア部分の直径は、一般的には５ｎｍ〜５００ｎｍ程度である。
【００１８】
本発明において、シェル部分を形成するのに用いることのできる水溶性高分子化合物は、直鎖状の高分子化合物であり、その一方の末端（結合末端）でコア部分の表面と結合することができると共に、もう一方の末端（自由末端）に反応性官能基を有するか、あるいは、反応性官能基を導入することができ、しかも、前記コア部分の表面にブラシ状に配置することが可能である限り、特に限定されるものではない。本明細書において、「コア部分の表面をブラシ状に覆うシェル部」とは、シェル部が多数の直鎖状水溶性高分子化合物からなり、それら直鎖状水溶性高分子化合物の各々が一方の結合末端でコア部分の表面と結合し、しかも、もう一方の自由末端が、少なくとも水溶性高分子化合物と導入物（例えば、抗原又は抗体）とを反応させる反応液中において、その反応液の系中に糸状又は棒状に表面から突出していることを意味する。また、これらのブラシ状の水溶性高分子化合物鎖の自由末端には、それぞれ導入物［例えば、生理活性物質（例えば、抗体、酵素、又はＤＮＡ）］と結合可能な反応性官能基が存在するので、シェル部分の最外殻は、多数の反応性官能基で覆われている。
【００１９】
前記水溶性高分子化合物としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアミノ酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸ジメチルアミノエチル、又はポリアリルアミンなどを挙げることができ、ＰＥＧ又はポリビニルアルコールが好ましい。
【００２０】
本発明において、シェル部を構成する水溶性高分子化合物鎖は、各水溶性高分子化合物鎖が前記の水溶性高分子化合物１種類のみから実質的に形成されているか、又は各水溶性高分子化合物鎖が相互に異なる前記の水不溶性高分子化合物２種類以上の組み合わせから実質的に形成されていることができる。また、それぞれの鎖の長さは同じである必要はなく、各水溶性高分子化合物鎖が１種類の水溶性高分子化合物のみから形成されている場合であっても、１種類の長さの鎖のみから実質的に形成されていることもできるし、あるいは、２種類以上の長さの鎖の組み合わせから実質的に形成されていることができる。更に、各水溶性高分子化合物鎖が相互に異なる水不溶性高分子化合物２種類以上の組み合わせから実質的に形成されている場合でも、それぞれ異なる鎖の長さを選択して組み合わせることも可能である。
【００２１】
前記シェル部分を構成する水溶性高分子化合物鎖は、前記のコア部分の全表面を実質的に完全に覆っているのが好ましい。また、前記シェル部分を構成する各水溶性高分子化合物鎖は、それぞれ、実質的に同じ長さである必要はないが、各水溶性高分子化合物鎖の自由末端によって大略球状又は大略楕球状のシェル部分外殻表面が形成されるのが好ましい。
【００２２】
前記コア部分の直径と前記シェル部分の厚さとの比率は、用途に応じて適宜変化させることができる。例えば、コア部分の直径を、例えば、５ｎｍ〜５００ｎｍとすることができ、また、シェル部分の厚さを、例えば、５ｎｍ〜５００ｎｍとすることができる。
【００２３】
前記水溶性高分子化合物鎖の自由末端に存在する反応性官能基は、前記水溶性高分子化合物の一方の末端（結合末端）をコア部分表面に結合させる前からもう一方の末端（自由末端）に存在するか、あるいは、前記水溶性高分子化合物の一方の末端（結合末端）をコア部分表面に結合させた後からもう一方の末端（自由末端）に導入するができる。これらの反応性官能基は、いずれも水（又は水系溶媒）中で安定であり、しかも、本発明の蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子を標識物質として使用する際の導入物［例えば、生理活性物質（例えば、抗体、酵素、又はＤＮＡ）］と反応可能な官能基である限り、特に限定されるものではなく、例えば、アルデヒド基、カルボキシル基、メルカプト基、アミノ基、マレイミド基、ビニルスルホン基、又はメタンスルホニル基などを挙げることができ、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基、又はマレイミド基が好ましい。
【００２４】
また、本発明の蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子を標識物質として使用する際の導入物［例えば、生理活性物質（例えば、抗体、酵素、又はＤＮＡ）］の導入量を調節するために、自由末端に存在する反応性官能基を持たない水溶性高分子化合物鎖（例えば、水素原子、メチレン基、又は水酸基などを自由末端に有する水溶性高分子化合物鎖）を任意の割合で混合することも可能である。この場合、導入物と自由末端に存在する官能基の反応に干渉させないために、反応性官能基を持たない水溶性高分子化合物鎖の長さを、反応性官能基を持つ水溶性高分子化合物鎖より短くすることが望ましい。
【００２５】
水不溶性高分子化合物を主成分とするコア部分の表面に、表層に反応性官能基を有する水溶性高分子化合物ブラシを有するコア−シェル型粒子を調製する方法としては、これまで報告されている様々な公知方法が適用可能である。前記公知方法としては、例えば、
（１）（ａ）反応性官能基を有する親水性セグメントと疎水性セグメントとを結合したブロック共重合体（親−疎水型ブロック共重合体）と、（ｂ）疎水性ポリマーとを混合して粒子を調製するエマルジョン法；
（２）反応性官能基を有する水溶性高分子マクロモノマーを分散剤として、疎水性モノマーを重合させる分散重合法；又は
（３）ハイドロゲル粒子表面に水溶性高分子化合物ブラシを導入する方法
などを挙げることができる。
【００２６】
前記のエマルジョン法（１）で用いる親−疎水型ブロック共重合体の合成方法、及び前記の分散重合法（２）で用いる反応官能基を有する水溶性高分子マクロモノマーの合成方法としては、例えば、既に本発明者及びその共同研究者が開発した方法（例えば、ＷＯ９６／３３２３３号公報、ＷＯ９９／５７１７４３号公報、特開平１１−３２２９１７号公報、又は特開２００１−３２４５０７号公報）を用いることができる。
【００２７】
前記の親−疎水型ブロック共重合体又は水溶性高分子マクロモノマーとして使用することのできる化合物としては、例えば、ＷＯ９６／３３２３３号公報に記載の式（ＩＡ）：
【化１】
2005134348.tif 000002
［式中、Ｒ１Ａ及びＲ２Ａは、独立して、炭素数１〜１０のアルコキシ基、アリールオキシ基、又はアリール−（炭素数１〜３のアルキルオキシ）基であるか、あるいは、Ｒ１Ａ及びＲ２Ａは、一緒になって、炭素数１〜６のアルキル基で置換されていてもよい式：
−Ｏ−ＣＨ（Ｒ’）−ＣＨ−Ｏ−
（ここでＲ’は水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基である）
で表されるエチレンジオキシであるか、あるいは、Ｒ１Ａ及びＲ２Ａは、一緒になって、オキシ（＝Ｏ）であり、
Ｌは、式：
−ＣＨ（Ｒ３Ａ）−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ４Ａ）−
又は
−（ＣＨ２）ｒ−
で表される２価の基であり、ここで、Ｒ３Ａ及びＲ４Ａは、独立して、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、アリール基、又はアリール−（炭素数１〜３のアルキルオキシ）基であり、ｒは２〜５の整数であり、ｍＡは２〜１０，０００の整数であり、ｎＡは２〜１０，０００の整数であり、ｐＡは１〜５の整数であり、ｑは０又は１〜２０の整数であり、そして、ＺＡは、ｑが０であるとき、水素原子、アルカリ金属、アセチル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、シンナモイル基、ｐ−トルエンスルホニル基、２−メルカプトプロピオニル基、２−アミノプロピオニル基、アリル基、又はビニルベンジル基であり、ｑが１〜２０の整数であるとき、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキシルメルカプト基、又はアミノ基である］
で表されるヘトロテレケリックブロックコポリマーを挙げることができる。前記の式（ＩＡ）で表されるヘトロテレケリックブロックコポリマーは、例えば、ＷＯ９６／３３２３３号公報に記載の製造方法により調製することができる。
【００２８】
また、前記の親−疎水型ブロック共重合体又は水溶性高分子マクロモノマーとして使用することのできる化合物としては、例えば、ＷＯ９９／５７１７４３号公報に記載の式（ＩＢ）：
【化２】
2005134348.tif 000003
（式中、Ａ’及びＢ’は、相互に独立して、有機シリル型のアミノ保護基を表すか、あるいは、それらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜７員のジシラ−アザシクロヘテロ環式環を形成することのできる有機シリル型のアミノ保護基であり、
Ｙは、水素原子、アルカリ金属、又は適当な反応によりアルカリ金属に代えて導入可能な有機基であり、
Ｒは水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基であり、
ｎＢは１〜２０，０００の整数であり、そして、
ｍＢは０〜２０，０００の整数である）
で表されるポリオキシエチレン誘導体を挙げることができる。前記の式（ＩＢ）で表されるポリオキシエチレン誘導体は、例えば、ＷＯ９９／５７１７４３号公報に記載の製造方法により調製することができる。
【００２９】
また、前記の親−疎水型ブロック共重合体又は水溶性高分子マクロモノマーとして使用することのできる化合物としては、例えば、特開平１１−３２２９１７号公報に記載の式（ＩＣ）：
【化３】
2005134348.tif 000004
（式中、Ｒ１Ｃ、Ｒ２Ｃ、及びＲ３Ｃは、相互に独立して、直鎖若しくは分岐のアルキル基又はアラルキル基を表し、
ＺＣは、水素原子、アクリロイル基、メタクリロイル基、ビニルベンジル基、アリル基、パラトルエンスルホニル基、モノ−若しくはジ−低級アルキル置換アミノ基、カルボキシル基若しくはそのエステル基を有するアルキル基、アルデヒド基若しくはそのアセタール基を有するアルキル基、及びアルカリ金属からなる群より選ばれ、
ｍＣは０又は１であり、
ｎＣは０〜２０，０００の整数であり、そして、
ｐＣは正数２又は３であるが、
但し、ｍＣとｎＣは同時に０とならない）
で表される有機シリルスルフィド基含有化合物又はポリオキシエチレン誘導体を挙げることができる。前記の式（ＩＣ）で表される有機シリルスルフィド基含有化合物又はポリオキシエチレン誘導体は、例えば、特開平１１−３２２９１７号公報に記載の製造方法により調製することができる。
【００３０】
更に、前記の親−疎水型ブロック共重合体又は水溶性高分子マクロモノマーとして使用することのできる化合物としては、例えば、特開２００１−３２４５０７号公報に記載の式（ＩＤ）：
Ａ−Ｌ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＤ−Ｌ２−（Ｂ）ｎＤ−Ｌ３−ＣＲ＝ＣＨ２    （ＩＤ）
［式中、Ａは官能基を表し、Ｂは、
【化４】
2005134348.tif 000005
のユニットを表し、Ｒ１は、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ２は、水素原子、メチル基、１−メチルエチル基、１−メチルプロピル基、２−メチルプロピル基、２−ベンジルオキシカルボニルエチル基、又はベンジルオキシカルボニルメチル基であり、Ｌ１は、式：
−（ＣＨ２）ｑＤ−Ｏ−
（ここで、ｑＤは１〜６の整数である）の連結基を表し、Ｌ２は、原子価結合又は式：
−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−
の連結基を表し、Ｌ３は、カルボニル基、メチレン基、
【化５】
2005134348.tif 000006
の基を表し、Ｒは、水素原子又はメチル基を表し、ｍＤは１０〜２０，０００の整数であり、そして、ｎＤは０〜１０，０００の整数である］
で表されるホモポリマー又はブロックコポリマーを挙げることができる。なお、官能基Ａは、特に限定されるものではないが、例えば、アルデヒド基（−ＣＨＯ）、アミノ基（−ＮＨ２）、メルカプト基（−ＳＨ）、水酸基（−ＯＨ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を挙げることができる。前記の式（ＩＤ）で表されるホモポリマー又はブロックコポリマーは、例えば、特開２００１−３２４５０７号公報に記載の製造方法により調製することができる。
【００３１】
コア−シェル型粒子の前記エマルジョン法（１）によれば、前記の式（ＩＡ）、式（ＩＢ）、式（ＩＣ）、又は式（ＩＤ）で表される各化合物（すなわち、親−疎水型ブロック共重合体）と、疎水性ポリマーとを混合することにより、コア−シェル型粒子（すなわち、蛍光性希土類金属錯体を封入する前の粒子）を調製することができる。
【００３２】
また、コア−シェル型粒子の前記分散重合法（２）によれば、前記の式（ＩＡ）、式（ＩＢ）、式（ＩＣ）、又は式（ＩＤ）で表される各化合物（すなわち、水溶性高分子マクロモノマー）を分散剤として、疎水性モノマーを重合させることにより、コア−シェル型粒子（すなわち、蛍光性希土類金属錯体を封入する前の粒子）を調製することができる。
【００３３】
また、コア−シェル型粒子の前記分散重合法（２）によれば、水溶性高分子マクロモノマーを分散剤として、蛍光性希土類金属錯体と疎水性モノマーを懸濁させた後に重合させることにより、蛍光性希土類金属錯体の封入とコア−シェル型粒子の調製を同時に行うことができる。更に、例えば、前記の式（ＩＡ）における基ＺＡ、式（ＩＢ）における基Ｙ、又は式（ＩＣ）における基ＺＣとして、蛍光性希土類金属と錯体を形成できる官能基であるカルボキシル基、β−ジケトン配位子、又はフェロイン系配位子を導入し、蛍光性希土類金属錯体を安定化した蛍光性希土類金属錯体の封入とコア−シェル型粒子を調製することも可能である。
【００３４】
本発明において使用することのできる蛍光性希土類金属錯体は、コア−シェル型粒子のコア部分に封入した状態でも、そのシグナルをコア−シェル型粒子の外側から分析（検出及び測定を含む）することのできる物質である限り、特に限定されるものではなく、例えば、ランタノイド（例えば、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、又はルテチウム）、イットリウム、又はスカンジウム等の各錯体を挙げることができ、ランタノイド錯体が好ましく、ユーロピウム、サマリウム、テルビウム、又はジスプロシウムの各錯体がより好ましい。
【００３５】
蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子の直径も、用途に応じて適宜変化させることができるが、大略球状の粒子の場合、１０ｎｍ〜１ｍｍ程度であることができる。
【００３６】
本発明で用いることのできる蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子は、例えば、公知の製造方法（例えば、国際公開第ＷＯ０２／０９７４３６号パンフレットに記載の製造方法）により調製することができる。
【００３７】
例えば、国際公開第ＷＯ０２／０９７４３６号パンフレットに記載の製造方法では、例えば、先に説明した種々の公知方法により調製したコア−シェル型粒子（すなわち、蛍光性希土類金属錯体を封入する前の粒子）に、蛍光性希土類金属錯体を封入するのに、まず、コア−シェル型粒子のコア部分を形成する水不溶性高分子化合物を膨潤させる有機溶媒（例えば、アセトン又はトルエン等）が一定比率で含まれる溶液中に、前記コア−シェル型粒子及び蛍光性希土類金属錯体を浸漬させる。前記浸漬により、前記水不溶性高分子化合物は膨潤し、その膨潤に伴って蛍光性希土類金属錯体がコア部分に取り込まれる。続いて、この混合物から、有機溶媒を除去すると、前記水不溶性高分子化合物は収縮するが、疎水的な蛍光性希土類金属錯体はコア部分から外に出ることができず、コア部分に封入される。所望により、コア部分に取り込まれなかった蛍光性希土類金属錯体を除去することにより、蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子を得ることができる。
【００３８】
前記製造方法において、前記混合物から有機溶媒を除去する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、エバポレートなどにより有機溶媒を蒸発乾固する方法、あるいは、非溶媒中で収縮させる方法（例えば、有機溶媒を含有する溶液を、前記有機溶媒を含有しない溶液に置換する方法）などを挙げることができる。
【００３９】
また、コア部分を膨潤するのに用いる前記有機溶媒含有溶液における有機溶媒の割合は、蛍光性希土類金属錯体が水不溶性高分子化合物に取り込まれる程度まで、前記水不溶性高分子化合物を膨潤させることができる割合である限り、特に限定されるものではないが、例えば、４０〜６０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％であることができる。
【００４０】
本発明においては、蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子の表面に存在する反応性官能基に、更に、前記反応性官能基と反応可能な導入物（例えば、生理活性物質）として、分析対象物質に特異的な結合可能なパートナーを結合させることができる。
【００４１】
前記パートナーは、蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子の表面に存在する反応性官能基と反応可能であって、しかも、分析対象物質に特異的な結合可能である限り、特に限定されるものではないが、生理活性物質、例えば、タンパク質（例えば、抗体又は酵素）又は核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）などを挙げることができる。
【００４２】
導入物と、蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子の表面に存在する反応性官能基とを結合させる方法は、公知の結合方法の中から、前記導入物及び反応性官能基の種類に応じて適宜選択することができる。
【００４３】
例えば、反応性官能基がアルデヒド基である場合には、生理活性物質［例えば、タンパク質（例えば、抗原、抗体、又はレセプター等）、ペプチド、低分子ホルモン、又はＤＮＡ等］のアミノ基とシッフベースを形成させることにより、結合することができる。
【００４４】
また、反応性官能基がカルボキシル基である場合には、生理活性物質のアミノ基との間を、縮合剤（例えば、カルボジイミドなど）を用いて結合することができる。あるいは、予めカルボキシ基をスクシンイミド又はマレイミド等で活性化しておいて、その状態のまま、生理活性物質と混合することにより結合させることもできる。
【００４５】
蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子としては、これまで述べた種々の粒子を用いることができるが、寿命の長い蛍光を持つユーロピウムキレートを中心の核となるスチレン部分に多量に含み、外部表面は親水性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がブラシ状に生えていて親水性を持ち、ＰＥＧ末端の感能基に化学修飾によって抗体やＤＮＡや生理活性物質を、活性を保ったまま結合することができるという性質を持った高機能性粒子が好ましい。
【００４６】
この粒子に３５０ｎｍ付近に波長特性を持つ励起光をパルスで照射し、マイクロ秒単位の時間をおいてから６１５ｎｍに波長特性を持つ蛍光を測定すると、まわりの蛍光に影響を受けず高いＳＮ比で検出することができる。また、この粒子は観測時に溶液を必要とせず、蛍光物質同様乾燥状態で測定することができる。一個のユーロピウムキレートでは測定感度に限界があるが、粒子にユーロピウムキレートを多数封入したこの試薬は酵素と発光基質を用いた検出系より高感度に測定することができる。この粒子をチップシステムの標識物として用いることで、今までの標識物がかかえていた問題を解決することができる。
【００４７】
本発明方法で用いるマイクロチップとしては、ＤＮＡチップ（ＤＮＡアレイ）又はプロテインチップとして一般的に用いられるチップを利用することができる。本発明方法では、例えば、ガラスやプラスチック製基板に多種類の抗原やＤＮＡを個別にドット状に固定化して分析に使用する。
ガラスに固定化する場合には、例えば、シランカップリング剤で表面を活性化する方法や、ＤＮＡ固定化の場合はポリリジンコートでＤＮＡ又はＲＮＡを吸着する方法を用いることができる。
プラスチックチップの場合には、スチレン製チップに吸着させる方法、カルボキシル基導入プラスチックチップのカルボキシル基をカルボジイミドで活性化してタンパク質又はＤＮＡのアミノ基と結合する方法、あるいは、アミノ基含有プラスチック製チップをグルタルアルデヒドなどで活性化してタンパク質又はＤＮＡのアミノ基と結合する方法などを採用することができる。他にも金属製チップなどの利用方法も最近開発されている。
【００４８】
チップとして、透明のチップ、又は不透明のチップのいずれも使用することができる。透明なチップの場合は、励起光を反応面にあてて、チップを透過してきた蛍光を測定することも、あるいは、チップから反射してきた蛍光を測定することもできる。不透明な場合には、チップから反射してきた蛍光を測定することとなる。
また、チップとしては、例えば、全く平面なチップ、反応部分だけへこんだチップ、平面部分の周囲に反応液がこぼれないように壁で囲まれたチップなどの形状を使用することができる。
【００４９】
本発明方法で分析可能な対象物（すなわち、分析対象物質）は、それに特異的な結合可能なパートナーが存在する限り、特に限定されるものではないが、例えば、タンパク質（例えば、抗原、抗体、又はレセプターなど）、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）、又は生理活性を持つ化学物質などである。また、本発明方法で分析可能な被検試料は、前記分析対象物質を含む可能性のある試料であれば、特に限定されず、特には生体試料、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、又は細胞若しくは組織破砕液などを挙げることができる。
【００５０】
本発明方法では、複数の分析対象物質を１つのマイクロチップ上にドット状に、例えば、前記結合方式により直接的に固定化するか、あるいは、分析対象物質に特異的に結合するパートナーを介して間接的に担持させることができる。間接的に担持させる場合には、例えば、前記パートナーを前記結合方式によりマイクロチップ上にドット状に固定化した後、前記被検試料をチップ上のドット全体に接触させることにより実施することができる。前記接触反応は、静置反応とすることもできるし、あるいは、振盪又は加温による反応促進法を採用することもできる。
【００５１】
ドット状に分析対象物質又はそのパートナーを置くには、例えば、ピンの先に付けてチップに押しつける方法や、インクジェット方式で離れたところから打ちつける方法などを採用することができる。１つのマイクロチップ上に固定化する複数の被検試料は、１種類の被検試料（すなわち、全て同じ被検試料）であることもできるし、異なる２種類以上の被検試料であることもできる。
【００５２】
マイクロチップ上にドット状に担持された分析対象物質と、前記分析対象物質に対するパートナーが結合された蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子との接触は、例えば、前記粒子を含む懸濁液を、チップ上全体に置いて反応させることにより実施することができる。この反応は、例えば、被検試料と混ぜて一緒に行う場合と、被検試料を除いてから行う場合とがあり、特異的なシグナルが得られる方を選択する。
【００５３】
続いて、反応に寄与しなかった標識物（すなわち、蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子）を洗浄などの方法で除いてからチップ上に固定化された標識物の時間分解蛍光を分析（好ましくは測定）する。チップが透明な場合には、励起光を当てた方角又は反対側から蛍光を測定する。例えば、蛍光性希土類金属錯体としてユーロピウムキレートを用いた場合には、３４０ｎｍ付近に波長特性を有する励起光をチップ面にナノ秒からマイクロ秒という短時間照射し、マイクロ秒単位待ってから６１５ｎｍ付近の蛍光を測定することにより、チップ基板が持つ蛍光、固定化物質が持つ蛍光、及び／又は測定装置側から出る蛍光などの影響を受けずにユーロピウムキレート封入粒子の蛍光を測定することができる。
【００５４】
時間分解蛍光を分析する場合には、例えば、励起光をドット毎別々にあてる方法と、チップ全体にあてる方法とがある。ドット毎別々にあてる方法は、蛍光のクロストークなどが無く、ドットの持つ蛍光量を正確に測ることができる長所がある。チップ全体にあてる方法は、多数のドットの蛍光量を一度に測定することができる長所がある。しかし、この場合には、二次元平面の蛍光を画像としてとらえる装置が必要となる。
以上のような実施形態で、一枚のチップでの反応から検体が持つ多くの情報を一度に得ることができる。
【００５５】
これまで説明したように、本発明方法の一態様は、
（１）マイクロチップ上に、分析対象物質を含む可能性のある複数の被検試料を、ドット状に固定化する工程；
（２）マイクロチップ上にドット状に固定化された前記分析対象物質と、前記分析対象物質に特異的に結合可能なパートナーが結合された蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子とを接触させる工程；
（３）マイクロチップ上に固定化された前記分析対象物質と未反応の蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子をマイクロチップ上から除去する工程；及び
（４）マイクロチップ上に固定化された前記分析対象物質に結合した蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子の蛍光性希土類金属錯体に由来する蛍光を、時間分解蛍光分析により分析する工程
を含む。
【００５６】
また、本発明方法の別の態様は、
（１）マイクロチップ上に、分析対象物質に特異的に結合可能な複数のパートナーを、ドット状に固定化する工程；
（２）マイクロチップ上にドット状に固定化された前記パートナーと、前記分析対象物質を含む可能性のある被検試料とを接触させる工程；
（３）マイクロチップ上に固定化された前記パートナーに結合した分析対象物質と、前記分析対象物質に特異的に結合可能なパートナーが結合された蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子とを接触させる工程；
（４）マイクロチップ上に固定化された前記パートナーに結合した前記分析対象物質と未反応の蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子をマイクロチップ上から除去する工程；及び
（５）マイクロチップ上に固定化された前記パートナーに結合した前記分析対象物質に結合した蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子の蛍光性希土類金属錯体に由来する蛍光を、時間分解蛍光分析により分析する工程
を含む。
【００５７】
本発明方法では、これらの全工程を１つの自動化システムとして構築することができる。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。以下、コア−シェル型粒子を「ナノ粒子」と称することがある。
【００５９】
実施例１：アレルゲン特異抗体を一斉分析するための抗ヒトＩｇＥ抗体結合ユーロピウムキレート封入ナノ粒子の調製
蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子として、中心のスチレンポリマー中にユーロピウムキレートを含有し、表面のブラシ状ＰＥＧ末端にアミノ基を有する直径１６０ｎｍのナノ粒子（株式会社ナノキャリア製）を用いた。１０ｍｇ／ｍＬのナノ粒子（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液ｐＨ７．０）０．５ｍＬに、ジメチルホルムアミドで５ｍｇ／ｍＬに調整したＮ−スクシンイミジル−４−Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）５０μＬを加え、室温で１時間振盪反応させた。セファデックスＧ２５カラム（１．５×１２ｃｍ，５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化）に前記反応液を通し、白濁した粒子部分だけをプールした。
一方、２ｍｇの抗ヒトＩｇＥ抗体Ｆ（ａｂ’）２分画（５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液ｐＨ４．５）１ｍＬに２００ｍｍｏｌ／Ｌの２−メルカプトエチルアミン５０μＬを加え、３７℃で９０分間還元反応をした後、セファデックスＧ２５カラム（１．５×１２ｃｍ，５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化）を通して、最初に溶出される抗体Ｆａｂ’分画をプールした。
マレイミド基導入ナノ粒子４ｍｇと抗体Ｆａｂ’分画１．５ｍｇとを混合し、室温で一夜静置反応させた。
反応物をセファロースＣＬ６Ｂカラム（１×９０ｃｍ，生理食塩水で平衡化）に通し、最初に溶出される白濁した抗ヒトＩｇＥ抗体結合ナノ粒子をプールした。
【００６０】
実施例２：７種類のアレルギー原因タンパク質、陽性標準物ドット、及びブランクドットを有するタンパク質チップの作製
反応槽として一辺１２ｍｍの正方形スチレン板に４ｍｍの壁を有するチップを作製し、そこに２μＬずつのダニ、コムギ、コメ、ダイズ、タマゴ、ミルク、及びピーナッツの各アレルゲン原因タンパク質、並びに標準ＩｇＥ血清を個別に置き、９点目はブランクとして何も置かない状態で室温で１時間吸着させた。
それぞれのドットの液体をアスピレートで除いた後、０．１５ｍｏｌ／Ｌ食塩を加えた２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと称する）に更に０．１％のツィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を加えた緩衝液（以下、Ｔ−ＰＢＳと称する）で反応槽全体を３回洗浄してアレルゲン固定化チップとした。
【００６１】
実施例３：免疫反応
アレルギーの疑われる検体血清２０μＬにＰＢＳ２００μＬを加えたサンプルを、実施例２で調製したアレルゲン固定化チップの反応槽に入れ、室温で１時間静置反応させた。
反応液をアスピレート除去した後、Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄した。１％アルブミンを含むＰＢＳで調製した抗ヒトＩｇＥ抗体結合ナノ粒子（時間分解蛍光量として２０００万カウント／秒）２００μＬをチップの反応槽に入れ、室温で１時間静置反応させた。
反応液をアスピレート除去した後、Ｔ−ＰＢＳで５回洗浄した。このチップをチップ時間分解蛍光測定器（コロナ電気社製、試作機）にのせ、９ドットの時間分解蛍光量を測定した。
【００６２】
本発明方法による測定結果（すなわち、アレルギー陽性検体一例の７項目アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体測定値）を表１に示す。また、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの９ウェルを用いて、実施例２で用いたのと同じタンパク質を別々に固定化し、実施例３の免疫反応をそれぞれに行い、時間分解蛍光プレートリーダー（ワラック）で測定した結果を対照として示す。前記対照で用いた、アレルゲン原因タンパク質の量、検体血清の量及び希釈方法、抗ヒトＩｇＥ抗体結合ナノ粒子の量は、それぞれ、本発明方法における条件と全く同じとした。
【００６３】
【表１】
2005134348.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明方法は、時間分解蛍光分析に適用することができる。