(57)【要約】【課題】タンパク質溶液の結晶化状態を判定する。【解決手段】タンパク質溶液についての観察された電子画像を用いて解析するタンパク質溶液の結晶化状態の判定方法。タンパク質溶液のサンプルについて、原画像取得ステップＳ４２と、原画像行列算出ステップＳ４４と、原画像統計量算出ステップＳ４６と、画像微分ステップＳ４８と、微分画像行列算出ステップＳ５０と、微分画像統計量算出ステップＳ５２と、第１の判定ステップＳ５４と、第２の判定ステップＳ５４を適用して判定する。【選択図】  図８
2005009949.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質溶液の電子画像を取得して原画像とする原画像取得ステップと、
該原画像の少なくとも一部分について第１の同時生成行列を算出する原画像行列算出ステップと、
該第１の同時生成行列から第１組の画像統計量を算出する原画像統計量算出ステップと、
該原画像に微分処理を行なって微分画像を得る画像微分ステップと、
該微分画像の少なくとも一部分について第２の同時生成行列を算出する微分画像行列算出ステップと、
該第２の同時生成行列から第２組の画像統計量を算出する微分画像統計量算出ステップと、
該第２組の画像統計量を用いて、タンパク質溶液の電子画像を少なくとも２種に分類する第１の判定ステップと、
前記第１の判定ステップで分類された結果、前記２種のうちの第１種に属すると判定されたタンパク質溶液の電子画像をさらに前記第１組の画像統計量を用いて少なくとも２種に分類する第２の判定ステップと
を含む、タンパク質溶液の結晶化状態の判定方法。
【請求項２】
前記第１の判定ステップで分類された結果、前記第１種以外の種に分類されたタンパク質溶液の電子画像を、前記第２組の画像統計量を用いてさらに少なくとも２種に分類する第３の判定ステップ
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
予め判定されているタンパク質の結晶状態の電子画像を用いて、前記第１の判定ステップにおいて用いる第１の判定基準と第２の判定基準とを、前記第２組の画像統計量に基づく線形判別法により確立するステップと、
前記予め判定されているタンパク質の結晶状態の電子画像を用いて、前記第２の判定ステップにおいて用いる第３の判定基準を、前記第１組の画像統計量に基づく線形判別法により確立するステップと、
前記予め判定されているタンパク質の結晶状態の電子画像を用いて、前記第３の判定ステップにおいて用いる第４の判定基準を、前記第２組の画像統計量に基づく線形判別法により確立するステップと
をさらに含み、
前記第１の判定ステップは、前記第１の判定基準と前記第２の判定基準とにより、前記第２組の画像統計量を用いて電子画像を３種に分類するものであり、
前記第２の判定ステップは、前記第３の判定基準により、該第１組の画像統計量を用いて前記３種のうちの第１種に属する電子画像をさらに２種に分類するものであり、
前記第３の判定ステップは、前記第４の判定基準により、該第２組の画像統計量を用いて前記第１種以外のいずれかの種に属する電子画像をさらに２種に分類するものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、透明状態、第１〜第４の沈殿状態、微結晶状態、および結晶状態を要素として構成される複数の状態のいずれかにタンパク質溶液の電子画像を分類する方法であって、
前記第１の判定基準は、タンパク質溶液が、透明状態と第１〜第３の沈殿状態とからなる状態のいずれか、あるいは、第４の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態のいずれかのどちらにあるかを判定するものであり、
前記第２の判定基準は、タンパク質溶液が、透明状態と第１の沈殿状態とからなる状態のいずれか、あるいは、第２〜第４の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態のいずれかのどちらにあるかを判定するものであり、
前記第３の判定基準は、タンパク質溶液が、透明状態、あるいは、第１の沈殿状態のどちらにあるかを判定するものであり、
前記第４の判定基準は、タンパク質溶液が、第２の沈殿状態、あるいは、第３の沈殿状態のどちらにあるかを判定するものであり、
前記第１の判定ステップは、前記第１の判定基準と前記第２の判定基準とにより、タンパク質溶液が、透明状態と第１の沈殿状態からなる状態のいずれか、第２〜第３の沈殿状態からなる状態のいずれか、あるいは、第４の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態のいずれかのいずれにあるかを判定するステップであり、
前記第２の判定ステップは、前記第３の判定基準により、透明状態と第１の沈殿状態からなる状態のいずれかにあるタンパク質溶液が、透明状態、あるいは、第１の沈殿状態のどちらにあるかを判定するステップであり、
前記第３の判定ステップは、前記第４の判定基準により、第２〜第３の沈殿状態からなる状態のいずれかにあるタンパク質溶液が、第２の沈殿状態、あるいは、第３の沈殿状態のどちらにあるかを判定するステップである、方法。
【請求項５】
タンパク質溶液の電子画像を取得して原画像とする原画像取得手段と、
該原画像の少なくとも一部分について第１の同時生成行列を算出する原画像行列算出手段と、
該第１の同時生成行列から第１組の画像統計量を算出する原画像統計量算出手段と、
該原画像に微分処理を行ない、微分画像を得る画像微分手段と、
該微分画像の少なくとも一部分について第２の同時生成行列を算出する微分画像行列算出手段と、
該第２の同時生成行列から第２組の画像統計量を算出する微分画像統計量算出手段と、
該第２組の画像統計量を用いて、タンパク質溶液の電子画像を少なくとも２種に分類する第１の判定手段と、
前記第１の判定手段で分類された結果、前記２種のうちの第１種に属すると判定されたタンパク質溶液の電子画像をさらに前記第１組の画像統計量を用いて少なくとも２種に分類する第２の判定手段と
を含む、タンパク質溶液の結晶化状態の判定システム。
【請求項６】
前記第１の判定手段で分類された結果、前記第１種以外の種に分類されたタンパク質溶液の電子画像を、前記第２組の画像統計量を用いてさらに少なくとも２種に分類する第３の判定手段
をさらに含む、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
判定基準設定手段をさらに備え、
該判定基準設定手段は、
予め判定されているタンパク質の結晶状態の電子画像を用いて、前記第１の判定手段において用いる第１の判定基準と第２の判定基準とを、前記第２組の画像統計量に基づく線形判別法により確立し、
前記予め判定されているタンパク質の結晶状態の電子画像を用いて、前記第２の判定手段において用いる第３の判定基準を、前記第１組の画像統計量に基づく線形判別法により確立し、
前記予め判定されているタンパク質の結晶状態の電子画像を用いて、前記第３の判定手段において用いる第４の判定基準を、前記第２組の画像統計量に基づく線形判別法により確立するものであり、
前記第１の判定手段は、前記第１の判定基準と前記第２の判定基準とにより、前記第２組の画像統計量を用いて電子画像を３種に分類するものであり、
前記第２の判定手段は、前記第３の判定基準により、該第１組の画像統計量を用いて前記３種のうちの第１種に属する電子画像をさらに２種に分類するものであり、
前記第３の判定手段は、前記第４の判定基準により、該第２組の画像統計量を用いて前記第１種以外のいずれかの種に属する電子画像をさらに２種に分類するものである、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
請求項７に記載のシステムにおいて、透明状態、第１〜第４の沈殿状態、微結晶状態、および結晶状態を要素として構成される複数の状態のいずれかにタンパク質溶液の電子画像を分類するシステムであって、
前記第１の判定基準は、タンパク質溶液が、透明状態と第１〜第３の沈殿状態とからなる状態のいずれか、あるいは、第４の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態のいずれかのどちらにあるかを判定するものであり、
前記第２の判定基準は、タンパク質溶液が、透明状態と第１の沈殿状態とからなる状態のいずれか、あるいは、第２〜第４の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態のいずれかのどちらにあるかを判定するものであり、
前記第３の判定基準は、タンパク質溶液が、透明状態、あるいは、第１の沈殿状態のどちらにあるかを判定するものであり、
前記第４の判定基準は、タンパク質溶液が、第２の沈殿状態、あるいは、第３の沈殿状態のどちらにあるかを判定するものであり、
前記第１の判定手段は、前記第１の判定基準と前記第２の判定基準とにより、タンパク質溶液が、透明状態と第１の沈殿状態からなる状態のいずれか、第２〜第３の沈殿状態からなる状態のいずれか、あるいは、第４の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態のいずれかのいずれにあるかを判定するものであり、
前記第２の判定手段は、前記第３の判定基準により、透明状態と第１の沈殿状態からなる状態のいずれかにあるタンパク質溶液が、透明状態、あるいは、第１の沈殿状態のどちらにあるかを判定するものであり、
前記第３の判定手段は、前記第４の判定基準により、第２〜第３の沈殿状態からなる状態のいずれかにあるタンパク質溶液が、第２の沈殿状態、あるいは、第３の沈殿状態のどちらにあるかを判定するものである、システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、タンパク質溶液におけるタンパク質結晶生成を自動化するためのタンパク質結晶状態を判定する方法およびそのシステムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、タンパク質の結晶構造を解析するためにＸ線結晶構造解析法が用いられている。かかる構造解析法においては、構造解析対象のサンプルとなるタンパク質の良質な結晶を得るために、構造解析サンプル作成の準備として、タンパク質の溶液（水溶液）から水分を蒸発させて結晶を生成する方法（結晶化法）が用いられる。この際、構造や性質が未知であるタンパク質溶液から結晶が得られるかどうかを選別するスクリーニング作業が行なわれている。
【０００３】
従来のこのスクリーニング作業では、結晶状態を顕微鏡画像から人の目で逐次検討し、そのサンプルの結晶生成の様子を判定している。この判定においては、サンプルのタンパク質溶液が、溶液のままであるか、沈殿を起こしているか、微結晶が得られているか、あるいは、結晶が得られるかが判定される。表１に、このスクリーニングにおいて用いられる判定基準を示す。
【表１】
2005009949.tif 000003
【０００４】
表１において、「透明」とは、タンパク質溶液が何らの結晶も生成しない様子を表わしている。また、「沈殿」は、４つに分類される。即ち、粒が見られず黒ずんでいたり褐色を示すもの（沈殿（ｉ））、点状の組織が観察されるもので白色にみえ、少し点々があるもの（沈殿（ｉｉ））、アモルファス様の組織で透明に見えることがあるもの（沈殿（ｉｉｉ））、大きなアモルファス様の組織で粒子が見えることがあるもの（沈殿（ｉｖ））に分類される。また、結晶が生成されているものは、５つに分類される。即ち、５０μｍ程度以下の結晶で頂点が観察されるもの（微結晶）、針状結晶が観察されるもの（結晶（ｉ））、板状結晶が観察されるもの（結晶（ｉｉ））、重なり合った結晶が観察されるもの（結晶（ｉｉｉ））、良質な結晶が観察されるもの（結晶（ｉｖ））というように分類される。便宜的に、各分類に対してスコアとなる数字が割り当てられて分類されることもある。ただし、タンパク質の結晶の成長過程に従ってこのスコアが順次増してゆくように変化するものとは限らない。このように分類される画像の模式図を、スコアごとに図７に示す。特に、未知タンパク質溶液の結晶化実験においてこれらに分類されるサンプルの数が多数であるため、大変有用な手段となる。
【０００５】
従来の人の観察を基礎とするスクリーニング作業では、観察者はトレーニングによって養成されて、経験的にこのような分類を行なうことができるようになる。養成された観察者が多数のサンプルについて得た顕微鏡画像を観察して選別を行なう。このときに判定された分類は、それ自体も、Ｘ線構造解析向けのサンプルについての有用な情報であり、タンパク質の構造解析や性質の決定に際して重要な指標となっている。
【０００６】
この結晶を得るための手法においては、大別すると、タンパク質溶液をカバーガラスの下面に下垂させて蒸発を行なう手法（ハンギングドロップ蒸気拡散法）と、タンパク質溶液を蒸発容器の上に載置させて蒸発を行なう手法（シッティングドロップ蒸気拡散法）とが用いられる。多数のタンパク質溶液の顕微鏡画像を得るには、自動的に顕微鏡画像を記録することが有効であり、機械化の容易なシッティングドロップ蒸気拡散法が望ましい。
【０００７】
特に、表１に示した透明、沈殿（ｉ）、沈殿（ｉｉ）、沈殿（ｉｉｉ）に未知タンパク質溶液のサンプルが分類されることが多いが、これ等に分類されるサンプルは、いまだ結晶が生成されておらず、観察者がこれらを全て観察するのは、効率が悪い。
【０００８】
また、従来のテクスチャ解析手法の例が、非特許文献１に記載されている。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｒ．  Ｍ．  Ｈａｒａｌｉｃｋ，  Ｋ．  Ｓｈａｎｍｕｇａｍ  ａｎｄ  Ｉ．  Ｄｉｎｓｔｅｉｎ，  ”Ｔｅｘｔｕｒｅ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ”  ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．  Ｓｙｓｔ．，  Ｍａｎ，  Ｃｙｂｅｒｎ．，  ｖｏｌ．ＳＭＣ−３，  ｎｏ６，  ｐｐ．６１０−６２１，  １９７３
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来のタンパク質溶液の結晶化状態判定方法では、人の目による分類が欠かせず、スクリーニング作業で処理できるサンプルの数に限界がある。また、その分類基準についても、観察者ごとに判定が異なる場合があり、さらに、同じ観察者であっても繰り返し同じ判定が行なえない場合がある。
多数のサンプルの判定を行なうためには、シッティングドロップ蒸気拡散法による機械化が望ましいが、結晶化状態の判定は、ハンギングドロップ蒸気拡散法の顕微鏡画像に比べて判定が難しい傾向がある。
【００１１】
本発明は、かかる従来のタンパク質溶液の結晶化状態判定方法を、顕微鏡画像に対してテクスチャ解析の手法を用いて機械化することを課題とする。また、機械化されて自動撮影される顕微鏡画像おいても良好に判定が行なえる判定方法を提供し、撮影から判定までを機械化することができるような効率の高い安定したタンパク質の結晶化状態の判定を可能にする方法やシステムを提供することを課題とする。さらに、表１に示した透明、沈殿（ｉ）、沈殿（ｉｉ）、沈殿（ｉｉｉ）を適切に分類する方法を確立することも課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明では、タンパク質溶液の電子画像を取得して原画像とする原画像取得ステップと、該原画像の少なくとも一部分について第１の同時生成行列を算出する原画像行列算出ステップと、該第１の同時生成行列から第１組の画像統計量を算出する原画像統計量算出ステップと、該原画像に微分処理を行なって微分画像を得る画像微分ステップと、該微分画像の少なくとも一部分について第２の同時生成行列を算出する微分画像行列算出ステップと、該第２の同時生成行列から第２組の画像統計量を算出する微分画像統計量算出ステップと、該第２組の画像統計量を用いて、タンパク質溶液の電子画像を少なくとも２種に分類する第１の判定ステップと、前記第１の判定ステップで分類された結果、前記２種のうちの第１種に属すると判定されたタンパク質溶液の電子画像をさらに前記第１組の画像統計量を用いて少なくとも２種に分類する第２の判定ステップとを含む、タンパク質溶液の結晶化状態の判定方法が提供される。
【００１３】
画像の解析は、一般にテクスチャ解析と呼ばれる手法を用いることができる。この解析対象に、タンパク質溶液の原画像（電子的に取得して明るさや領域の切り出し等の予備的な調整をしたのみの画像で、微分していない画像）と、その原画像を微分した微分画像を共に用いることにより、未知タンパク質の溶液における結晶化の状態を良好に判定できる。
また、判定を２段階に行なうことにより、タンパク質溶液の結晶化状態を判定する作業の機械化が容易となる。本方法によれば、表１に示した透明と沈殿（ｉ）とを他のものから適切に分類することが可能となる。
【００１４】
また、本発明においては、前記第１の判定ステップで分類された結果、前記第１種以外の種に分類されたタンパク質溶液の電子画像を、前記第２組の画像統計量を用いてさらに少なくとも２種に分類する第３の判定ステップをさらに含む方法が提供される。
第３の判定ステップにより、透明と沈殿（ｉ）との分類に加えて、沈殿（ｉｉ）と沈殿（ｉｉｉ）とを他のものから分類することができる。
【００１５】
さらに、本発明においては、上記方法において、予め判定されているタンパク質の結晶状態の電子画像を用いて、前記第１の判定ステップにおいて用いる第１の判定基準と第２の判定基準とを、前記第２組の画像統計量に基づく線形判別法により確立するステップと、前記予め判定されているタンパク質の結晶状態の電子画像を用いて、前記第２の判定ステップにおいて用いる第３の判定基準を、前記第１組の画像統計量に基づく線形判別法により確立するステップと、前記予め判定されているタンパク質の結晶状態の電子画像を用いて、前記第３の判定ステップにおいて用いる第４の判定基準を、前記第２組の画像統計量に基づく線形判別法により確立するステップとをさらに含む方法が提供される。ここで、前記第１の判定ステップは、前記第１の判定基準と前記第２の判定基準とにより、前記第２組の画像統計量を用いて電子画像を３種に分類するものであり、前記第２の判定ステップは、前記第３の判定基準により、該第１組の画像統計量を用いて前記３種のうちの第１種に属する電子画像をさらに２種に分類するものであり、前記第３の判定ステップは、前記第４の判定基準により、該第２組の画像統計量を用いて前記第１種以外のいずれかの種に属する電子画像をさらに２種に分類するものである。
【００１６】
判定ステップを適切に選択された４つの基準を適切な順序で用いるものとして構築すれば、判定の際のエラーが低減され、人による判定を十分に再現できる良好な判定が人による分類を経ずとも行なえる。
【００１７】
本発明においては、上記方法において、透明状態、第１〜第４の沈殿状態、微結晶状態、および結晶状態を要素として構成される複数の状態のいずれかにタンパク質溶液の電子画像を分類する方法が提供される。ここで、前記第１の判定基準は、タンパク質溶液が、透明状態と第１〜第３の沈殿状態とからなる状態のいずれか、あるいは、第４の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態のいずれかのどちらにあるかを判定するものであり、前記第２の判定基準は、タンパク質溶液が、透明状態と第１の沈殿状態とからなる状態のいずれか、あるいは、第２〜第４の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態のいずれかのどちらにあるかを判定するものであり、前記第３の判定基準は、タンパク質溶液が、透明状態、あるいは、第１の沈殿状態のどちらにあるかを判定するものであり、前記第４の判定基準は、タンパク質溶液が、第２の沈殿状態、あるいは、第３の沈殿状態のどちらにあるかを判定するものであり、前記第１の判定ステップは、前記第１の判定基準と前記第２の判定基準とにより、タンパク質溶液が、透明状態と第１の沈殿状態からなる状態のいずれか、第２〜第３の沈殿状態からなる状態のいずれか、あるいは、第４の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態のいずれかのいずれにあるかを判定するステップであり、前記第２の判定ステップは、前記第３の判定基準により、透明状態と第１の沈殿状態からなる状態のいずれかにあるタンパク質溶液が、透明状態、あるいは、第１の沈殿状態のどちらにあるかを判定するステップであり、前記第３の判定ステップは、前記第４の判定基準により、第２〜第３の沈殿状態からなる状態のいずれかにあるタンパク質溶液が、第２の沈殿状態、あるいは、第３の沈殿状態のどちらにあるかを判定するステップである。
【００１８】
テクスチャ解析においては、判定基準は一般には様々な画像に基づいて確立することができるが、本発明においては、原画像と微分画像を用い、それぞれの基準が判定する特徴に適した画像の種類をこのように選択することが出来る。これにより、判定のエラーが低減され、人による判定を十分に再現可能な良好な判定の機械化が可能となる。
【００１９】
本発明では、さらに、タンパク質溶液について観察された画像を解析することによって該タンパク質溶液における結晶化状態を判定する結晶化状態判定システムが提供される。このシステムは、タンパク質溶液の電子画像を取得して原画像とする原画像取得手段と、該原画像の少なくとも一部分について第１の同時生成行列を算出する原画像行列算出手段と、該第１の同時生成行列から第１組の画像統計量を算出する原画像統計量算出手段と、該原画像に微分処理を行ない、微分画像を得る画像微分手段と、該微分画像の少なくとも一部分について第２の同時生成行列を算出する微分画像行列算出手段と、該第２の同時生成行列から第２組の画像統計量を算出する微分画像統計量算出手段と、該第２組の画像統計量を用いて、タンパク質溶液の電子画像を少なくとも２種に分類する第１の判定手段と、前記第１の判定手段で分類された結果、前記２種のうちの第１種に属すると判定されたタンパク質溶液の電子画像をさらに前記第１組の画像統計量を用いて少なくとも２種に分類する第２の判定手段とを含んで構成される。
【００２０】
本発明の解析システムは、タンパク質溶液の結晶化を判定するサンプルについて電子画像を用いて結晶化状態の判定を行なうことが出来る。これにより、従来は観察者に頼っていた結晶化状態の判定作業の機械化が可能となる。
さらに本発明の解析システムに、タンパク質の溶液の結晶化サンプルの自動観察手段を組合わせれば、未知タンパク質の観察とその未知タンパク質の結晶化状態の判定とを連続して自動で行なうタンパク質結晶化状態観察解析システムが構築できる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明は、コンピュータ装置を用いて実施される。このコンピュータには、適当な画像入力手段が接続されている。その画像入力手段は、例えば顕微鏡に備えられたＣＣＤ（電荷結合デバイス）などの撮像装置、Ａ／Ｄコンバータ、適当なメモリなどによって電子的な画像を取得し、コンピュータに入力する。また、コンピュータには、演算装置、記憶装置、表示装置、通信装置などの通常の装置が備えられる。本発明の各ステップや各手段は、演算装置に実現された機能ブロックとして処理が行なわれ、機能が実現される。例えば、判定ステップや判定手段は、演算装置において、記憶装置から読み込まれたプログラムが必要なレジスタやメモリによって構成される記憶動作と演算処理動作によって判定を行なう機能として実現される。本発明は、このようなコンピュータを用いて、画像処理および画像の分類を用いて、タンパク質溶液の結晶化状態を判定するための方法や手段を提供するものである。
【００２２】
以下、図面を参照して、本発明の実施の形態について説明する。
図１は、本発明において観察対象の溶液においてタンパク質の結晶化（析出）をさせるために製作されるサンプルの準備された様子を表わす断面図である。本発明の観察対象は、タンパク質溶液１を観察する光学顕微鏡の観察像である。タンパク質溶液１は、水分を含んだ溶液である。このタンパク質溶液１は、容器３内に配置された滴下ステージ５に滴下して準備される。容器３の開口部は、カバースリップ２によって覆われ、容器３とカバースリップ２の接触部はシールされて、以後気密が保たれる。容器３には、予め沈殿材４が配置されており、容器内の水分を吸収してゆく。
【００２３】
このようなサンプルでは、数日から数年の時間をかけて、溶液中の水分が減少してゆき、タンパク質の飽和溶解度に達すると、徐々にタンパク質の結晶が成長してゆくことがある。タンパク質の種類によっては、全く結晶を生成しない場合や、沈殿を生じる場合もある。
【００２４】
図２は、本実施形態の結晶化状態判定システム１００の構成を説明する構成図である。本システムには、原画像取得手段１２、原画像行列算出手段１４、原画像統計量算出手段２０、画像微分手段２２、微分画像行列算出手段２４、微分画像統計量算出手段２６、判定基準設定手段２８、判定基準格納手段３２、判定手段３４が備えられている。なお、判定手段３４には、図示しないが、第１〜第３の判定手段が含まれているものとしてもよい。また、本システムにおいては、判定基準を確立するために、予め結晶化状態が分類されたタンパク質の画像について、外部にある撮像装置１６からの電子画像のデータ１８を取得し、結晶状態データ３０を取得するものであってもよい。本システムは、未知タンパク質溶液の画像について、外部にある撮像装置１６からの電子画像のデータ１８を取得し、その未知タンパク質溶液の結晶化状態を判定して、その結晶状態のデータ３６を出力する。
【００２５】
原画像取得手段１２は、例えば顕微鏡に備えられた撮像装置１６によって撮影され、デジタル化された電子画像のデータ１８を取得して、その電子画像を調整して原画像のデータ１２２とする。調整は、デジタル化されたデータの明度等を適切な範囲に調整したり、計算に十分な範囲で階調の削減を行ったり、必要な領域を切り出す処理などの一般的な処理である。
【００２６】
原画像行列算出手段１４は、その調整された原画像のデータ１２２の少なくとも一部分の各画素を走査して、該原画像のデータ１２２に基づいて第１の同時生成行列１４２を算出する。
【００２７】
ここで、同時生成行列とは、画像の濃度（画素値）ｉの点から一定の変位δ＝（ｒ、θ）（図３ａ参照）だけ離れた点の濃度がｊとなる確率を要素として持つような行列である。例えば、図３ｂのような画像については、（ｒ、θ）毎に次式のような同時生成行列が計算される。
【数１】
2005009949.tif 000004
ここでは、処理対象の範囲の画素が走査されて、同時生成行列の行列要素に加算されている。
【００２８】
この各行列に現われる要素は、その（ｒ、θ）と（ｉ、ｊ）の組合わせごとの画素の出現頻度を表わしている。この画素の出現頻度を確率に換算するために正規化処理を行なう。この確率を要素とする同時生成行列の行列要素を以後Ｅ（ｉ，ｊ）とする。なお、（ｒ、θ）毎にこの要素が計算されているが、記載を省略する。原画像行列算出手段１４はこのような確率を求める機能を有しており、適当なメモリーを用いて頻度を計算し、その頻度を正規化して確率を要素とする同時生成行列を出力する機能を有している。
【００２９】
このようにして定められる同時生成行列Ｅ（ｉ，ｊ）に基づいて、原画像統計量算出手段２０は、第１組の画像統計量２０２を算出する。この画像統計量の組は、次式で表わされる。
【数２】
2005009949.tif 000005
ここで、この各画像統計量の計算には、次の関係式が用いられている。
【数３】
2005009949.tif 000006
なお、これらの画像統計量は、非特許文献１によって上記と同様に導入されている。
【００３０】
画像微分手段２２は、原画像取得手段１２の出力する原画像１２２に微分処理を行なう。この微分処理は、本実施の形態においては、一次微分フィルタとして知られるＳｏｂｅｌフィルタ（水平微分フィルタ：図４ａ参照、垂直微分フィルタ：図４ｂ参照）を適用する。この際、図４では、注目画素である中央の画素に対して、周囲の画素を図示する各重みを考慮して加算する処理が、注目画素を順次走査して行なわれる。これにより、画像微分手段２２によって微分画像２２２が得られる。
【００３１】
微分画像行列算出手段２４は、原画像行列算出手段１４が原画像１２２に行なった処理と同様の処理により、微分画像２２２に基づいて第２の同時生成行列２４２を算出する。また、微分画像統計量算出手段２６は、原画像統計量算出手段２０と同様の処理により、第２の同時生成行列２４２から第２組の画像統計量２６２を算出する。
【００３２】
判定基準設定手段２８は、原画像１２２が表１の結晶状態のいずれのものあるかを結晶状態データ３０として受け付ける。この結晶状態データ３０は、表１のスコア０〜９の１０段階のいずれであるかを示すデータである。また、判定基準設定手段２８は、前記第１組の画像統計量２０２と、前記第２組の画像統計量２６２とを受け付ける。
【００３３】
判定基準設定手段２８は、これらの受け付けたデータから、４種の判定基準を線形判別法により確立する。線形判別法は、統計標本が持ついくつかの特性から、統計標本がどの群（クラス）に属するかを識別する手法である。このとき、統計標本としては、結晶状態データ３０を用い、その識別が行なわれる空間（特徴空間）として、微分を用いない原画像に基づいている第１の画像統計量の１４次元空間、あるいは、微分画像に基づいている第２の画像統計量の１４次元空間が選択される。
【００３４】
判定基準は、線形識別関数という関数として表現され、一つの線形識別関数で判定対象を２つに分類するような基準である。この線形識別関数は、１４次元空間内の超平面（１４次元空間を２つの半空間に仕切る１３次元の自由度を有する面）として決定される。つまり、線形識別関数は、１４次元空間に散布されたデータ（各々が、予め判定されているタンパク質の結晶状態のいずれかの情報によって分類可能であり、第１の画像統計量または第２の画像統計量のデータを座標値としてプロットされている点）を２つに仕切る際の超平面として定義される。
【００３５】
線形識別関数を決定するための指標は、直感的には、予め分類されている各データを出来るだけ分離させるような仕切り方となる超平面（線形識別関数）を定めることである。具体的には、第１の画像統計量または第２組の画像統計量を要素とするデータｕ＝（ｕ１、・・・、ｕ１４）Ｔと、係数行列（係数ベクトル）Ａとの内積をとって、スカラー量ｚを算出する（式（１５））。なお、ここでは、係数行列Ａは、後にフィッティングされる未知パラメータを要素としている。また、データｕは、多数のデータが用いられるが、各々が、予め結晶状態が判定されていて結晶状態データ３０が得られ、第１の画像統計量および第２画像統計量が算出される複数のデータである。
【数４】
2005009949.tif 000007
【００３６】
次に、クラス内共分散行列ΣＺ、クラス間共分散行列ΣＢが、式（１６）、（１７）により求められる。
【数５】
2005009949.tif 000008
ここで、Ｐ（ωｉ）は２つに分類された分類の各クラスωｉの事前確率、Σｉはクラスωｉの共分散行列、ｍｉはクラスωｉの特徴データ（１４次元の座標値）の単純平均によって作られるベクトル、ｍは全パターンにおける同様の平均のベクトルを表わす。
【００３７】
データｕを係数行列Ａで変換したことに対応させて、スカラー量ｚのクラス内およびクラス間の分散Σ〜Ｚ、Σ〜Ｂを求めると、
【数６】
2005009949.tif 000009
のようになる。これを用いて、評価関数ＪΣ（Ａ）を式（２０）のように定める。
【数７】
2005009949.tif 000010
この評価関数は、分類されるクラス間の分離度を表わしている。従って、最適となる係数行列Ａは、この評価関数ＪΣの最大値を与えるものである。
【００３８】
評価関数ＪΣの最大値を与えるＡを算出するには、式（２１）によって与えられる行列の最大の固有値を与える固有ベクトルを求めればよい。
【数８】
2005009949.tif 000011
【００３９】
このようにして求められた最適なＡは、式（２２）に定義される識別関数の超平面の法線ベクトルを与えるものである。
【数９】
2005009949.tif 000012
なお、式２２のｕ０は、１４元のベクトルｕにｍを代入した場合にｇ（ｍ）＝０が成立するように定められる。
【００４０】
以上のような処理を、判定基準設定手段２８が実行する。このために、判定基準設定手段２８には、図示はしないが、行列演算を適切に行なうための手段が備えられる。具体的には、内積計算（式１５、１７等）、積和演算（式１６、１７）、固有値演算（固有値の算出、固有ベクトルの決定）が処理できる演算機能を有する。上記の式の説明では、式変形の順を追って説明しているが、判定基準設定手段２８は式１８〜２０については特段計算する必要がない。
【００４１】
本実施形態の結晶化状態判定システム１００の機能としての判定基準設定手段２８の具体的な処理を、図５を用いて説明する。判定基準設定手段２８は、まず、予め結晶状態が判定されている観察画像（教示用の観察画像）について、結晶状態データ３０の入力（図５、Ｓ２）と、その画像について計算された第１組の画像統計量および第２組の画像統計量の入力（Ｓ４）を受け付ける。次に、確立する判定基準を選択する（Ｓ６）。そして、処理に用いる画像統計量の組が判定基準に依存するので、確立する判定基準を選択し、予め判定された結晶状態のデータによって各画像を分類する（Ｓ８）。この分類は、表１に示した各分類を要素とし、その要素の組合わせによってそれぞれが構成された２つの分類である。この分類は、以下に説明するように、そのとき確立しようとする判定基準によって定まる。
【００４２】
本実施の形態では、判定基準ｇ１〜ｇ４を確立し、これを判定に用いる。ｇ１は、タンパク質溶液が、透明状態と第１〜第３の沈殿状態とからなる状態にあるか、または、第４の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態にあるかを判定する（第１の判定基準）。ｇ２は、タンパク質溶液が、透明状態と第１の沈殿状態とからなる状態にあるか、または、第２〜第４の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態にあるかを判定する（第２の判定基準）。ｇ３は、タンパク質溶液が、透明状態にあるか、または、第１の沈殿状態にあるかを判定する（第３の判定基準）。ｇ４は、タンパク質溶液が、第２の沈殿状態にあるか、または、第３の沈殿状態にあるかを判定する（第４の判定基準）。なお、各判定基準は式２２の多項式の係数を定めるものであり、判定されるべき画像についての画像統計量（１４個の統計量）ｕによって各判定基準の多項式の値を計算し、その正負によって分類がなされる。判定基準ｇ１〜ｇ４の正負をどのように定めるかについては、上述した最大固有値の固有ベクトルが、反転されても同様に同じ固有値の固有ベクトルとなる任意性を利用して、任意に定め得る。本実施の形態では、表１のスコアが小さい側の分類が、各判定基準の多項式の評価値が正となるように定める。
【００４３】
例えば判定基準ｇ１による判定においては、透明状態と第１の沈殿状態とからなる状態（第１の状態）と、第２〜第４の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態（第２の状態）とのいずれにあるかを、分類することに相当する。このように、各判定基準によって異なる分け方で分類が行なわれる。
【００４４】
そして、ステップＳ８において判定基準に合わせて分類された分類を用いて、クラス内共分散行列とクラス間共分散行列を、式１６および１７に従って算出する（Ｓ１０）。そして、式２１の行列を算出して（Ｓ１２）、その行列の最大固有値に対応する固有ベクトルを算出する（Ｓ１４）。この計算には、行列の固有値や固有ベクトルを数値的に算出する任意の計算方法を用いることが出来る。固有ベクトルが求まると、その固有ベクトルを係数とする多項式（式２２）が、ベクトルｕにｍ（ｍは全パターンにおける特徴データの平均のベクトル）を代入した場合にｇ（ｍ）＝０が成立するように、ｕ０を定める（Ｓ１６）。
【００４５】
これにより、式２２の全ての係数が算出されて、その判定基準が確立する。
判定基準ｇ１〜ｇ４の全てについてこのような過程を繰り返すことにより（Ｓ１８）、判定基準が全て確立することとなる。なお、ｇ３、ｇ４は、既にｇ１、ｇ２によって分類されたあと判定にのみ用いるため、ステップＳ８における判定基準に合わせた分類は、確立したｇ１、確立したｇ２によって分類されたものについて判定を行なえばよい。以上のようにして、判定基準設定手段２８が判定基準を確立する。
【００４６】
判定基準設定手段２８は、判定基準ｇ１〜ｇ４を判定基準格納手段３２に格納する。このような判定基準ｇ１〜ｇ４によって表１の右端の列に示す計算による分類Ａ〜Ｅが分類される。また、いずれの分類にも入らないものがＦとして分類される。
【００４７】
本実施の形態では、実際にスコア０〜９に分類される画像を用いて判定基準ｇ１〜ｇ４を確立している。判定基準の確立に用いた画像は、スコア０〜９の各分類について、予め熟練した観察者によって分類されている２０枚から６０枚程度の画像である。
【００４８】
続けて、本実施の形態のシステム１００によって未知タンパク質溶液のサンプルについて判定を行なう方法について説明する。この判定に際しては、判定手段３４が判定基準格納手段３２から判定基準ｇ１〜ｇ４を読み込むことにより行なう。
【００４９】
未知タンパク質溶液についても、図１に示したようにサンプルが準備される。そして、光学像として観察画像を取得し、判定基準を確立する際と同一の手段（原画像取得手段、原画像行列算出手段、原画像統計量算出手段、画像微分手段、微分画像行列算出手段、微分画像統計量算出手段）によって同一の処理がなされる。これにより、該未知タンパク質溶液のサンプルについての第１組の画像統計量と第２組の画像統計量が得られる。
【００５０】
第１組の画像統計量と第２組の画像統計量は、各々１４次元の数値データからなるベクトルであるので、これらに、判定基準設定手段２８によって確立された４種の判定基準ｇ１〜ｇ４を適用して判定を行なう。つまり、判定基準を示す多項式にこの未知タンパク質溶液から得られた画像統計量のベクトルを代入して、値の正負を評価することにより、判定を行なう。判定結果のデータ３６は、判定基準設定手段２８から出力され、適当な表示手段に表示されたり、記憶手段に格納される。
【００５１】
次に、図６に従って、第１〜第４の判定基準（ｇ１〜ｇ４）を適用する具体的なステップについて説明する。
判定手段は、まず、第１の判定基準ｇ１と第２の判定基準ｇ２とを用いて、判定を行なう（図６、Ｓ２０）。ここで、ｇ１が正であることは、透明状態と第１〜第３の沈殿状態とからなる状態にあることに対応し、ｇ１が負であることは、第４の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態にあることに対応する。同様に、ｇ２の正と負は、それぞれ、透明状態と第１の沈殿状態とからなる状態にあること、第２〜第４の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態にあることに対応する。したがって、ｇ１とｇ２が共に正のときは、未知タンパク質溶液が透明状態と第１の沈殿状態からなる状態（図６、分枝２０２；表１、ＡまたはＢ）にある。また、ｇ１が正、ｇ２が負のときは、第２〜第３の沈殿状態からなる状態（分枝２０４；表１、ＣまたはＤ）にあり、ｇ１とｇ２が共に負のときは、第４の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態（分枝２０６；表１、Ｅ）にある。なお、判定基準において、ｇ１が負、ｇ２が正という組合わせについて、実際のタンパク質溶液の結晶化状態を示す画像がこのようになることはほとんどなく、この場合はエラーとして図示しない処理がなされ、表１のＦに分類される。
【００５２】
次に、画像が透明状態と第１の沈殿状態からなる状態（分枝２０２；表１、ＡまたはＢ）に判定されると、第３の判定基準ｇ３を用いて判定を行なう（Ｓ２２）。ｇ３の正負は、それぞれ、未知タンパク質溶液が、透明状態（分枝２２２；表１、Ａ）にあるか、第１の沈殿状態（分枝２２４；表１、Ｂ）にあるかに対応する。
【００５３】
また、画像が、第２〜第３の沈殿状態からなる状態（分枝２０４；表１、ＣまたはＤ）に判定されると、第４の判定基準ｇ４を用いて判定を行なう（Ｓ２４）。ｇ４の正負は、それぞれ、未知タンパク質溶液が、第２の沈殿状態（分枝２４２；表１、Ｃ）にあるか、第３の沈殿状態（分枝２４４；表１、Ｄ）にあるかに対応する。
以上のようにして、表１のＡ〜Ｅのいずれであるかが判定された後、各判定結果に応じて、判定結果を保持する変数Ｘにその結果を格納する（Ｓ２６ａ〜Ｓ２６ｅ）。そして、その判定結果を出力する（Ｓ２８）。
【００５４】
表２に、本実施の形態において得られた未知タンパク質の画像の各分類の結果を示す。表の各行には、同じ画像を人により分類した結晶化状態であり、各列には、本実施の形態のシステムによって処理をして求められた分類である。各データは、人による分類と計算による分類とに当てはまる画像の実際の枚数である。「結果」の列には、人により分類されている画像が、計算によって適切に分類されている割合を示している。
【表２】
2005009949.tif 000013
このように、人によって分類されていた分類のうち、透明（表１、Ａ）、沈殿（ｉ）（Ｂ）、沈殿（ｉｉ）（Ｃ）、沈殿（ｉｉｉ）（Ｄ）が、これらの相互からも、そして、残りの分類（Ｅ）からも良好に分類されている。
【００５５】
本実施の形態の構成から、本発明によって提供されるタンパク質溶液の結晶化状態の判定方法をまとめると図８のようになる。
即ち、タンパク質溶液の電子画像を取得して原画像とする（原画像取得ステップ、Ｓ４２）。そして、該原画像の少なくとも一部分について第１の同時生成行列を算出する（原画像行列算出ステップ、Ｓ４４）。さらに、該第１の同時生成行列から第１組の画像統計量を算出する（原画像統計量算出ステップ、Ｓ４６）。
原画像には、微分処理を行なって微分画像が求められる（画像微分ステップ、Ｓ４８）。微分画像の少なくとも一部分について第２の同時生成行列が算出される（微分画像行列算出ステップ、Ｓ５０）。この第２の同時生成行列から第２組の画像統計量が算出される（微分画像統計量算出ステップ、Ｓ５２）。第２組の画像統計量は、タンパク質溶液の電子画像を少なくとも２種に分類するのに用いられる（第１の判定ステップ、Ｓ５４）。第１の判定ステップで分類された結果、前記２種のうちの第１種に属すると判定されたタンパク質溶液の電子画像は、さらに前記第１組の画像統計量を用いて少なくとも２種に分類される（第２の判定ステップ、Ｓ５６）。ここで、第１の判定ステップは、図６においてステップＳ２０として表わされ、第２の判定ステップは、図６においてステップＳ２２として表わされている。この処理は、第１の判定ステップおよび第２の判定ステップに本実施の形態のようにして確立した判定基準を用いてコンピュータの動作により実行される。
【００５６】
【発明の効果】
タンパク質溶液の電子画像の原画像と微分画像を共に用いることにより、タンパク質の溶液における結晶化の状態を良好に判定できる。また、判定ステップを２段階とすることにより、タンパク質溶液の結晶化状態を判定する作業の機械化が容易となり、判定のエラーが低減される。また、透明、沈殿（ｉ）、沈殿（ｉｉ）、沈殿（ｉｉｉ）を適切に分類することが可能となる。判定基準とその順序を適切に構築することにより、判定の際のエラーが低減され、人による判定が良好に再現されて機械化が可能となる。さらに本発明の解析システムに、タンパク質の溶液の結晶化サンプルの自動観察手段を組合わせれば、未知タンパク質の観察とその未知タンパク質の結晶化状態の判定とを連続して自動で行なうタンパク質結晶化状態観察解析システムが構築できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態におけるサンプルの構成を示すサンプル容器の断面図である。
【図２】本発明の実施の形態における結晶化状態判定システムの構成サンプルの構成を示す構成図である。
【図３】本発明の実施の形態におけるテクスチャ解析の手法を説明する説明図である。
【図４】本発明の実施の形態におけるテクスチャ解析における微分方法を説明する説明図である。
【図５】本発明の実施の形態における判定基準の確立の方法を示すフローチャートである。
【図６】本発明の実施の形態における判定方法を示すフローチャートである。
【図７】タンパク質溶液の結晶状態の画像による分類を模式的に示す説明図である。
【図８】本発明により提供されるタンパク質溶液の結晶状態の判定方法を表すフローチャートである。
【符号の説明】
１  タンパク質溶液
２  カバースリップ
３  容器
４  沈殿材
５  滴下ステージ
１００  結晶化状態判定システム
１２  原画像取得手段
１４  原画像行列算出手段
１６  撮像装置
２０  原画像統計量算出手段
２２  画像微分手段
２４  微分画像行列算出手段
２６  微分画像統計量算出手段
２８  判定基準設定手段
３２  判定基準格納手段
３４  判定手段
【図１】
2005009949.tif 000014
【図２】
2005009949.tif 000015
【図３】
2005009949.tif 000016
【図４】
2005009949.tif 000017
【図５】
2005009949.tif 000018
【図６】
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【図７】
2005009949.tif 000020
【図８】
2005009949.tif 000021