(57)【要約】【課題】  品質の優れたビール大麦を育種するために利用可能な遺伝マーカーを提供する。【解決手段】  麦芽アルコール飲料成分中に含まれるタンパク質を網羅的に解析し、オオムギＥＳＴ配列にヒットするタンパク質を見出した。これらのオオムギＥＳＴ配列に基づく遺伝マーカーは品質の優れたビール大麦を育種するために利用可能である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オオムギゲノムＤＮＡ中に存在する遺伝マーカーであり、
麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質をコードするオオムギの発現遺伝子に含まれる塩基配列を有し、
オオムギ遺伝子の改変によって麦芽アルコール飲料成分中に含まれるタンパク質を変化させるために利用可能な遺伝マーカーであって、
配列番号１に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、配列番号２に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、または配列番号１に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーと配列番号２に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとを組み合わせたプライマーセットのいずれかのプライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする遺伝マーカー。
【請求項２】
上記配列番号１に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号１０または１１に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなり、上記配列番号２に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号１２または１３に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなることを特徴とする請求項１に記載の遺伝マーカー。
【請求項３】
オオムギゲノムＤＮＡ中に存在する遺伝マーカーであり、
麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質をコードするオオムギの発現遺伝子に含まれる塩基配列を有し、
麦芽アルコール飲料成分中に含まれる麦芽アルコール飲料の泡持ちに関連するタンパク質の発現量が多いオオムギ品種と、当該麦芽アルコール飲料の泡持ちに関連するタンパク質の発現量が少ないオオムギ品種とを区別するために利用可能な遺伝マーカーであって、
配列番号１に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、配列番号２に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、または配列番号１に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーと配列番号２に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとを組み合わせたプライマーセットのいずれかのプライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする遺伝マーカー。
【請求項４】
上記配列番号１に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号１０または１１に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなり、上記配列番号２に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号１２または１３に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなることを特徴とする請求項３に記載の遺伝マーカー。
【請求項５】
オオムギゲノムＤＮＡ中に存在する遺伝マーカーであり、
麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質をコードするオオムギの発現遺伝子に含まれる塩基配列を有し、
オオムギ遺伝子の改変によって麦芽アルコール飲料成分中に含まれるタンパク質を変化させるために利用可能な遺伝マーカーであって、
配列番号３に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、配列番号４に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、または配列番号３に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーと配列番号４に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとを組み合わせたプライマーセットのいずれかのプライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする遺伝マーカー。
【請求項６】
上記配列番号３に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号１４または１５に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなり、上記配列番号４に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号１６または１７に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなることを特徴とする請求項５に記載の遺伝マーカー。
【請求項７】
オオムギゲノムＤＮＡ中に存在する遺伝マーカーであり、
麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質をコードするオオムギの発現遺伝子に含まれる塩基配列を有し、
麦芽アルコール飲料成分中に含まれる麦芽アルコール飲料の泡持ちに関連するタンパク質の発現量が多いオオムギ品種と、当該麦芽アルコール飲料の泡持ちに関連するタンパク質の発現量が少ないオオムギ品種とを区別するために利用可能な遺伝マーカーであって、
配列番号３に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、配列番号４に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、または配列番号３に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーと配列番号４に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとを組み合わせたプライマーセットのいずれかのプライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする遺伝マーカー。
【請求項８】
上記配列番号３に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号１４または１５に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなり、上記配列番号４に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号１６または１７に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなることを特徴とする請求項７に記載の遺伝マーカー。
【請求項９】
オオムギゲノムＤＮＡ中に存在する遺伝マーカーであり、
麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質をコードするオオムギの発現遺伝子に含まれる塩基配列を有し、
オオムギ遺伝子の改変によって麦芽アルコール飲料成分中に含まれるタンパク質を変化させるために利用可能な遺伝マーカーであって、
配列番号５に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、配列番号６に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、または配列番号５に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーと配列番号６に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとを組み合わせたプライマーセットのいずれかのプライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする遺伝マーカー。
【請求項１０】
上記配列番号５に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号１８または１９に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなり、上記配列番号６に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号２０または２１に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなることを特徴とする請求項９に記載の遺伝マーカー。
【請求項１１】
オオムギゲノムＤＮＡ中に存在する遺伝マーカーであり、
麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質をコードするオオムギの発現遺伝子に含まれる塩基配列を有し、
麦芽アルコール飲料成分中に含まれる麦芽アルコール飲料の泡持ちに関連するタンパク質の発現量が多いオオムギ品種と、当該麦芽アルコール飲料の泡持ちに関連するタンパク質の発現量が少ないオオムギ品種とを区別するために利用可能な遺伝マーカーであって、
配列番号５に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、配列番号６に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、または配列番号５に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーと配列番号６に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとを組み合わせたプライマーセットのいずれかのプライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする遺伝マーカー。
【請求項１２】
上記配列番号５に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号１８または１９に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなり、上記配列番号６に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号２０または２１に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなることを特徴とする請求項１１に記載の遺伝マーカー。
【請求項１３】
オオムギゲノムＤＮＡ中に存在する遺伝マーカーであり、
麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質をコードするオオムギの発現遺伝子に含まれる塩基配列を有し、
オオムギ遺伝子の改変によって麦芽アルコール飲料成分中に含まれるタンパク質を変化させるために利用可能な遺伝マーカーであって、
配列番号７に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、配列番号８に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、または配列番号７に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーと配列番号８に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとを組み合わせたプライマーセットのいずれかのプライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする遺伝マーカー。
【請求項１４】
上記配列番号７に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号２２または２３に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなり、上記配列番号８に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号２４または２５に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなることを特徴とする請求項１３に記載の遺伝マーカー。
【請求項１５】
オオムギゲノムＤＮＡ中に存在する遺伝マーカーであり、
麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質をコードするオオムギの発現遺伝子に含まれる塩基配列を有し、
オオムギ遺伝子の改変によって麦芽アルコール飲料成分中に含まれるタンパク質を変化させるために利用可能な遺伝マーカーであって、
配列番号９に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする遺伝マーカー。
【請求項１６】
上記配列番号９に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号２６または２７に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなることを特徴とする請求項１５に記載の遺伝マーカー。
【請求項１７】
麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質をコードする遺伝子の一部であって、以下の（ａ）または（ｂ）に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１ないし９に示される塩基配列。
（ｂ）配列番号１ないし９に示される塩基配列において１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加された変異塩基配列。
【請求項１８】
以下に記載のポリヌクレオチドの少なくともいずれか１つが支持体上に固定化されていることを特徴とする遺伝子検出器具。
（１）請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
（２）請求項１７に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つの一部からなるポリヌクレオチド。
（３）請求項１７に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つの全部または一部を部分配列として含むポリヌクレオチド。
（４）請求項１７に記載のポリヌクレオチドのうち、配列番号ｎ（ｎは奇数）に示される塩基配列またはその変異塩基配列の全部または一部と配列番号ｎ＋１に示される塩基配列またはその変異塩基配列の全部または一部とを部分配列として含むポリヌクレオチド。
（５）請求項１７に記載のポリヌクレオチドのうち、配列番号ｎ（ｎは奇数）に示される塩基配列に基づいて設計される複数のプライマーおよび配列番号ｎ＋１に示される塩基配列に基づいて設計される複数のプライマーから任意に選択した２つのプライマーの組み合わせによるプライマーセットを用いて増幅されるＤＮＡ断片の塩基配列の全部または一部からなるポリヌクレオチド。
【請求項１９】
上記支持体上に固定化されているポリヌクレオチドは少なくとも２種類以上であることを特徴とする請求項１８に記載の遺伝子検出器具。
【請求項２０】
上記支持体上に固定化されているポリヌクレオチドはｃＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１８または１９に記載の遺伝子検出器具。
【請求項２１】
以下に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの少なくともいずれか１つが支持体上に固定化されていることを特徴とするポリペプチド相互作用物質検出器具。
（１）請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
（２）請求項１７に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つの一部からなるポリヌクレオチド。
（３）請求項１７に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つの全部または一部を部分配列として含むポリヌクレオチド。
（４）請求項１７に記載のポリヌクレオチドのうち、配列番号ｎ（ｎは奇数）に示される塩基配列またはその変異塩基配列の全部または一部と配列番号ｎ＋１に示される塩基配列またはその変異塩基配列の全部または一部とを部分配列として含むポリヌクレオチド。
【請求項２２】
上記支持体上に固定化されているポリペプチドは少なくとも２種類以上であることを特徴とする請求項２１に記載のポリペプチド相互作用物質検出器具。
【請求項２３】
以下に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに対する抗体の少なくともいずれか１つが支持体上に固定化されていることを特徴とするポリペプチド検出器具。
（１）請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
（２）請求項１７に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つの一部からなるポリヌクレオチド。
（３）請求項１７に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つの全部または一部を部分配列として含むポリヌクレオチド。
（４）請求項１７に記載のポリヌクレオチドのうち、配列番号ｎ（ｎは奇数）に示される塩基配列またはその変異塩基配列の全部または一部と配列番号ｎ＋１に示される塩基配列またはその変異塩基配列の全部または一部とを部分配列として含むポリヌクレオチド。
【請求項２４】
上記支持体上に固定化されている抗体は少なくとも２種類以上であることを特徴とする請求項２３に記載のポリペプチド検出器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビール大麦の育種に利用可能な遺伝マーカーおよびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
麦芽アルコール飲料（ビール、発泡酒など）は麦芽を主原料として糖化によって麦汁を得、この麦汁に酵母を加えて主発酵を行い、次いで主発酵で得られる発酵液を後発酵（貯酒）工程に付し、濾過、ビン詰め工程を経て製造される。このように製造される麦芽アルコール飲料の外観品質のうち、最も重視される性質の一つに泡がある。
【０００３】
麦芽アルコール飲料中のタンパク質は、泡を構成する主要な成分である。一般的に5kDa 以上のタンパク質は泡持ちにプラスに寄与すると考えられている（非特許文献１参照）。泡に濃縮されるタンパク質には、protein Z の他にlipid transferprotein （LTP1）が多いことが報告されている（非特許文献２、３参照）。LTP1 タンパク質とは脂質との親和性を有する9,694Daのタンパク質である。Bech やLusk らによってLTP1 は泡品質（泡立ち、泡持ち）において重要であることがすでに見出されている（特許文献１、非特許文献４参照）。しかしながら、麦芽アルコール飲料中に残存するタンパク質種の網羅的な解析は行われておらず、またそれらのタンパク質と麦芽アルコール飲料品質との相関関係等の検証はこれまで行われてこなかった。
【０００４】
一方、近年、ムギ類等の作物の育種においては育種期間の短縮、労働力および圃場面積の縮減を図るため、遺伝マーカーを指標とした選抜による育種法が用いられるようになってきた。遺伝マーカーは、１９８０年代後半にＤＮＡマーカーが登場し、ＤＮＡマーカー利用による詳細な連鎖地図作成が大きく進んだ。その結果、そのような高密度連鎖地図に基づいて多くの生物で連鎖解析が行われるようになった。目標形質に強く連鎖する遺伝マーカーが開発され、これを利用することにより、効率的な育種が実現可能となる。本発明者らは、ムギ類の遺伝マーカーを精力的に開発しており、例えば１）オオムギにアルミニウム耐性を付与する遺伝子に連鎖する遺伝マーカーとその利用に関する技術（特許文献２参照）や、２）オオムギ染色体由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するための新規なプライマーセット（特許文献３参照）とその利用に関する技術等を提案している。
【特許文献１】米国特許第５９９３８６５号明細書
【特許文献２】特開２００２−２９１４７４号公報（２００２（平成１４）年１０月８日公開）
【特許文献３】特開２００３−１１１５９３号公報（２００３（平成１５）年４月１５日公開）
【非特許文献１】Asano, K.; Hashimoto, N. Isolation and characterization of foaming proteins in beer. J. Am. Soc. Brew. Chem. 1976, 38, 129-137.
【非特許文献２】Kaersgaard, P.; Hejgaard, J. Antigenic beer macromolecules, an experimental survey of purification methods. J. Inst. Brew. 1979, 85, 103-111.
【非特許文献３】Sorensen, S. B.; Bech, L. M.; Muldbjerg, M.;Beenfeldt, T.; Breddam, K. Barley lipid transfer protein 1 is involved in beer foam formation. Master Brew. Assoc. Am. Tech. Q.1993, 30, 136-145.
【非特許文献４】Lusk, L.T.; Ting, p.;Goldstein, H.; Ryder, D.; Navarro, A A foam tower fractionation of beer proteins and bittering acids. Monogr. Eur. Brew. Conv. 27 th , 1999, 166-187.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のように、これまで麦芽アルコール飲料中に残存するタンパク質種の網羅的な解析は行われておらず、またそれらのタンパク質と麦芽アルコール飲料の品質との相関関係等の検証はこれまで行われてこなかった。したがって、ビール大麦の育種においても、明確な育種目標は特定されていなかった。
【０００６】
麦芽アルコール飲料中のタンパク質種の網羅的解析により、麦芽アルコール飲料の品質に関連するタンパク質を特定すれば、そのようなタンパク質をコードする遺伝子を選抜するために利用可能な遺伝マーカーの開発が可能となる。さらに、麦芽アルコール飲料の品質を向上させるタンパク質を強く発現するオオムギを容易に選抜できる遺伝マーカーが開発されれば、優れたビール大麦を効率よく選抜育種することができる。
【０００７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、優れたビール大麦の育種に利用可能な遺伝マーカーを提供するとともに、その代表的な利用法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、麦芽アルコール飲料成分中に含まれるタンパク質中に、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ（expressed sequence tag）配列にヒットするタンパク質を見出し、当該ＥＳＴが含まれるオオムギ遺伝子の改変により麦芽アルコール飲料成分中に含まれるタンパク質を変化させることが可能であることを見出した。本発明者らはさらに解析を進め、当該ＥＳＴ配列に基づく遺伝マーカーを開発し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明に係る遺伝マーカーは、オオムギゲノムＤＮＡ中に存在し、麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質をコードするオオムギの発現遺伝子に含まれる塩基配列を有し、オオムギ遺伝子の改変によって麦芽アルコール飲料成分中に含まれるタンパク質を変化させるために利用可能な遺伝マーカーであって、配列番号１に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、配列番号２に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、または配列番号１に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーと配列番号２に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとを組み合わせたプライマーセットのいずれかのプライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記配列番号１に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号１０または１１に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなり、上記配列番号２に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号１２または１３に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなることが好ましい。これらのプライマーセットにより増幅される断片に含まれる多型を検出すれば、育種目標の遺伝子型を有する個体を容易に選抜することができる。
【００１０】
上記遺伝マーカーは麦芽アルコール飲料成分中に含まれる麦芽アルコール飲料の泡持ちに関連するタンパク質の発現量が多いオオムギ品種と、当該麦芽アルコール飲料の泡持ちに関連するタンパク質の発現量が少ないオオムギ品種とを区別するために利用可能である。したがって、当該遺伝マーカーにより泡持ちの良いオオムギ品種の育種を効率的に行うことができる。
【００１１】
また、本発明に係る遺伝マーカーは、オオムギゲノムＤＮＡ中に存在し、麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質をコードするオオムギの発現遺伝子に含まれる塩基配列を有し、オオムギ遺伝子の改変によって麦芽アルコール飲料成分中に含まれるタンパク質を変化させるために利用可能な遺伝マーカーであって、配列番号３に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、配列番号４に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、または配列番号３に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーと配列番号４に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとを組み合わせたプライマーセットのいずれかのプライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記配列番号３に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号１４または１５に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなり、上記配列番号４に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号１６または１７に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなることが好ましい。これらのプライマーセットにより増幅される断片に含まれる多型を検出すれば、育種目標の遺伝子型を有する個体を容易に選抜することができる。
【００１２】
上記遺伝マーカーは麦芽アルコール飲料成分中に含まれる麦芽アルコール飲料の泡持ちに関連するタンパク質の発現量が多いオオムギ品種と、当該麦芽アルコール飲料の泡持ちに関連するタンパク質の発現量が少ないオオムギ品種とを区別するために利用可能である。したがって、当該遺伝マーカーにより泡持ちの良いオオムギ品種の育種を効率的に行うことができる。
【００１３】
また、本発明に係る遺伝マーカーは、オオムギゲノムＤＮＡ中に存在し、麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質をコードするオオムギの発現遺伝子に含まれる塩基配列を有し、オオムギ遺伝子の改変によって麦芽アルコール飲料成分中に含まれるタンパク質を変化させるために利用可能な遺伝マーカーであって、配列番号５に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、配列番号６に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、または配列番号５に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーと配列番号６に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとを組み合わせたプライマーセットのいずれかのプライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記配列番号５に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号１８または１９に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなり、上記配列番号６に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号２０または２１に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなることが好ましい。これらのプライマーセットにより増幅される断片に含まれる多型を検出すれば、育種目標の遺伝子型を有する個体を容易に選抜することができる。
【００１４】
上記遺伝マーカーは麦芽アルコール飲料成分中に含まれる麦芽アルコール飲料の泡持ちに関連するタンパク質の発現量が多いオオムギ品種と、当該麦芽アルコール飲料の泡持ちに関連するタンパク質の発現量が少ないオオムギ品種とを区別するために利用可能である。したがって、当該遺伝マーカーにより泡持ちの良いオオムギ品種の育種を効率的に行うことができる。
【００１５】
また、本発明に係る遺伝マーカーは、オオムギゲノムＤＮＡ中に存在し、麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質をコードするオオムギの発現遺伝子に含まれる塩基配列を有し、オオムギ遺伝子の改変によって麦芽アルコール飲料成分中に含まれるタンパク質を変化させるために利用可能な遺伝マーカーであって、配列番号７に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、配列番号８に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、または配列番号７に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーと配列番号８に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとを組み合わせたプライマーセットのいずれかのプライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記配列番号７に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号２２または２３に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなり、上記配列番号６に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号２４または２５に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなることが好ましい。これらのプライマーセットにより増幅される断片に含まれる多型を検出すれば、育種目標の遺伝子型を有する個体を容易に選抜することができる。
【００１６】
また、本発明に係る遺伝マーカーは、オオムギゲノムＤＮＡ中に存在し、麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質をコードするオオムギの発現遺伝子に含まれる塩基配列を有し、オオムギ遺伝子の改変によって麦芽アルコール飲料成分中に含まれるタンパク質を変化させるために利用可能な遺伝マーカーであって、配列番号９に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記配列番号７に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーは、配列番号２６または２７に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなることが好ましい。これらのプライマーセットにより増幅される断片に含まれる多型を検出すれば、育種目標の遺伝子型を有する個体を容易に選抜することができる。
【００１７】
本発明に係るポリヌクレオチドは、麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質をコードする遺伝子の一部であって、（ａ）配列番号１ないし９に示される塩基配列、または（ｂ）配列番号１ないし９に示される塩基配列において１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加された変異塩基配列からなることを特徴としている。これらの塩基配列からなるポリヌクレオチドは、麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質をコードする遺伝子の一部を構成するポリヌクレオチドであるため、当該ポリヌクレオチドは遺伝マーカーとして利用でき、また当該ポリペプチドの塩基配列に基づいて設計されるプライマーセットによる増幅断片を遺伝マーカーとして利用でき、さらに当該ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて遺伝子を改変することができる。
【００１８】
本発明に係る遺伝子検出器具は、以下の（１）〜（５）に記載のポリヌクレオチドの少なくともいずれか１つが支持体上に固定化されていることを特徴としている。（１）上記本発明に係るポリヌクレオチド。（２）上記本発明に係るポリヌクレオチドのいずれか１つの一部からなるポリヌクレオチド。（３）上記本発明に係るポリヌクレオチドのいずれか１つの全部または一部を部分配列として含むポリヌクレオチド。（４）上記本発明に係るポリヌクレオチドのうち、配列番号ｎ（ｎは奇数）に示される塩基配列またはその変異塩基配列の全部または一部と配列番号ｎ＋１に示される塩基配列またはその変異塩基配列の全部または一部とを部分配列として含むポリヌクレオチド。（５）上記本発明に係るポリヌクレオチドに記載のポリヌクレオチドのうち、配列番号ｎ（ｎは奇数）に示される塩基配列に基づいて設計される複数のプライマーおよび配列番号ｎ＋１に示される塩基配列に基づいて設計される複数のプライマーから任意に選択した２つのプライマーの組み合わせによるプライマーセットを用いて増幅されるＤＮＡ断片の塩基配列の全部または一部からなるポリヌクレオチド。また、上記支持体上に固定化されているポリヌクレオチドは少なくとも２種類以上であって、ｃＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドであることが好ましい。本発明に係る遺伝子検出器具を用いれば、麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質の発現量や本発明に係る遺伝マーカーの遺伝子型を容易に検出することができる。
【００１９】
本発明に係るポリペプチド相互作用物質検出器具は、以下の（１）〜（４）に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの少なくともいずれか１つが支持体上に固定化されていることを特徴としている。１）上記本発明に係るポリヌクレオチド。（２）上記本発明に係るポリヌクレオチドのいずれか１つの一部からなるポリヌクレオチド。（３）上記本発明に係るポリヌクレオチドのいずれか１つの全部または一部を部分配列として含むポリヌクレオチド。（４）上記本発明に係るポリヌクレオチドのうち、配列番号ｎ（ｎは奇数）に示される塩基配列またはその変異塩基配列の全部または一部と配列番号ｎ＋１に示される塩基配列またはその変異塩基配列の全部または一部とを部分配列として含むポリヌクレオチド。また、上記支持体上に固定化されているポリペプチドは少なくとも２種類以上であることが好ましい。本発明に係るポリペプチド相互作用検出器具を用いれば、麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質と相互作用する物質を容易に検出することができる。
【００２０】
本発明に係るポリペプチド検出器具は、以下の（１）〜（４）に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに対する抗体の少なくともいずれか１つが支持体上に固定化されていることを特徴としている。（１）上記本発明に係るポリヌクレオチド。（２）上記本発明に係るポリヌクレオチドのいずれか１つの一部からなるポリヌクレオチド。（３）上記本発明に係るポリヌクレオチドのいずれか１つの全部または一部を部分配列として含むポリヌクレオチド。（４）上記本発明に係るポリヌクレオチドのうち、配列番号ｎ（ｎは奇数）に示される塩基配列またはその変異塩基配列の全部または一部と配列番号ｎ＋１に示される塩基配列またはその変異塩基配列の全部または一部とを部分配列として含むポリヌクレオチド。また、上記支持体上に固定化されている抗体は少なくとも２種類以上であることが好ましい。本発明に係るポリペプチド相互作用検出器具を用いれば、麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質を容易に検出することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係るポリヌクレオチドおよび遺伝マーカーは、麦芽アルコール飲料成分中に含まれるタンパク質の質量解析の結果オオムギＥＳＴ配列にヒットしたタンパク質のコードする遺伝子の一部、または当該遺伝子の一部の配列に基づくプライマーセットにより増幅される断片からなるものである。したがって、上記ポリヌクレオチドまたは遺伝マーカーを用いることにより、優れたビール大麦の育種を効率的に行うことができるという効果を奏する。また、本発明に係る遺伝子検出器具、ポリペプチド相互作用物質検出器具およびポリペプチド検出器具を用いれば、優れたビール大麦の育種をより一層効率的に行うことができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２３】
１．遺伝マーカー
発明者らは、麦芽アルコール飲料中のタンパク質を二次元電気泳動またはSDS-PAGEに供し、主要なタンパク質スポットまたはバンドを質量解析した。質量解析の結果を用いて発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴデータベースを検索し、ヒットするＥＳＴを見出した（実施例参照）。配列番号１ないし９に示される塩基配列は、上記麦芽アルコール飲料中のタンパク質がヒットしたオオムギＥＳＴの塩基配列である。麦芽アルコール飲料とは、麦芽を原料として製造されるアルコール飲料を意味し、ビール、発泡酒などが含まれる。
【００２４】
ここで、発明者らが独自に開発したＥＳＴについて簡単に説明する。発明者らは、数種類のオオムギ品種の葉からｍＲＮＡを調製し、公知の方法によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。これらのｃＤＮＡが挿入されたプラスミドを鋳型とし、挿入部位の両側から１回のシークエンス解析で読んだ塩基配列を品質調整し、ベクター配列を取り除いたものが当該オオムギＥＳＴ配列である。発明者らは現在約１４万個のＥＳＴ配列をデータベース化している。
【００２５】
したがって、配列番号１ないし９に示される塩基配列は、５個のｃＤＮＡクローンの部分配列である。具体的には、配列番号１および２は、クローン名：BaGS15J04についてそれぞれ５’側および３’側から読んだ塩基配列である。配列番号３および４は、クローン名：bast10G1113についてそれぞれ５’側および３’側から読んだ塩基配列である。配列番号５および６は、クローン名：BaAK4F13についてそれぞれ５’側および３’側から読んだ塩基配列である。配列番号７および８は、クローン名：BaAL1024についてそれぞれ５’側および３’側から読んだ塩基配列である。配列番号９は、クローン名：BaAK22H07について５’側から読んだ塩基配列である。すなわち、上記５個のｃＤＮＡによりコードされるタンパク質が、麦芽アルコール飲料成分中に含まれオオムギＥＳＴ配列にヒットしたタンパク質と推定される。なお、クローン名は発明者らが独自に命名したものである。
【００２６】
本発明に係る遺伝マーカーはオオムギゲノムＤＮＡ中に存在し、麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質をコードするオオムギの発現遺伝子に含まれる塩基配列を有し、オオムギ遺伝子の改変によって麦芽アルコール飲料成分中に含まれるタンパク質を変化させるために利用可能な遺伝マーカーであって、以下のｉ）〜ｖ）に記載のプライマーセットを用いて増幅される遺伝マーカーである。
【００２７】
ｉ）配列番号１に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、配列番号２に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、または配列番号１に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーと配列番号２に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとを組み合わせたプライマーセットのいずれかのプライマーセット。
【００２８】
ｉｉ）配列番号３に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、配列番号４に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、または配列番号３に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーと配列番号４に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとを組み合わせたプライマーセットのいずれかのプライマーセット。
【００２９】
ｉｉｉ）配列番号５に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、配列番号６に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、または配列番号５に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーと配列番号６に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとを組み合わせたプライマーセットのいずれかのプライマーセット。
【００３０】
ｉｖ）配列番号７に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、配列番号８に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット、または配列番号７に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーと配列番号８に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとを組み合わせたプライマーセットのいずれかのプライマーセット。
【００３１】
ｖ）配列番号９に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーを組み合わせたプライマーセット。
【００３２】
ｉ）〜ｖ）のいずれにおいてもプライマーはそれぞれの配列番号に示される塩基配列に基づいて設計されるものであればよい。また、それぞれの範囲内で任意にプライマーを組み合わせてプライマーセットとすればよいが、非特異的な増幅産物がほとんど生じないプライマーセットであることが好ましい。具体的には、増幅産物を電気泳動に供した場合に主たる増幅産物のバンドが明確に確認できればよい。このようなプライマーセットとしては、以下に挙げるプライマーを組み合わせることが好ましい。ただし、これらに限定されるものではない。
【００３３】
ｉ）配列番号１に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとしては、配列番号１０または１１に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなるプライマー。配列番号２に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとしては、配列番号１２または１３に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなるプライマー。
【００３４】
ｉｉ）配列番号３に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとしては、配列番号１４または１５に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなるプライマー。配列番号４に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとしては、配列番号１６または１７に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなるプライマー。
【００３５】
ｉｉｉ）配列番号５に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとしては、配列番号１８または１９に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなるプライマー。配列番号６に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとしては、配列番号２０または２１に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなるプライマー。
【００３６】
ｉｖ）配列番号７に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとしては、配列番号２２または２３に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなるプライマー。配列番号８に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとしては、配列番号２４または２５に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなるプライマー。
【００３７】
ｖ）配列番号９に示される塩基配列に基づいて設計されたプライマーとしては、配列番号２６または２７に示される塩基配列またはそれらの相補配列からなるプライマー。
【００３８】
すなわち、上記のプライマーセットを用いて増幅されるＤＮＡ断片が本発明に係る遺伝マーカーである。具体的には、上記のプライマーセットを用いて異なるオオムギ品種のゲノムＤＮＡをそれぞれ鋳型として増幅反応を行い、各品種の増幅ＤＮＡ断片間の多型を検出することにより、育種における個体の選抜や品種の区別を行うことができる。ここで、増幅手段はＰＣＲ等の公知の方法を用いればよく、特に限定されるものではない。
【００３９】
増幅産物の多型としては、増幅断片長多型、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入欠失等を挙げることができる。増幅断片長多型は、増幅されたＤＮＡ断片の長さが異なる多型である。増幅産物を電気泳動に供し、バンドの位置が異なることにより検出することができる。したがって、プライマーで挟まれるゲノムＤＮＡの範囲に、ある程度の長さの挿入や欠失がある場合が該当する。また、品種により当該プライマーセットにより増幅断片が得られない場合も増幅断片の有無により品種の区別が可能であるため、広義の増幅断片長多型に含まれる。一塩基多型（ＳＮＰ）は、増幅断片の塩基配列を比較したときに、一カ所の塩基のみ異なる多型である。ＳＮＰのタイピング、すなわち一塩基多型部位の塩基を実際に確認することにより検出できる。また、制限酵素認識配列中にＳＮＰが存在する場合は、当該制限酵素で切断できるか否かにより多型を検出することが可能となる。このような遺伝マーカーはＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）マーカーと称される。ＣＡＰＳマーカーは、増幅ＤＮＡ断片を制限酵素処理した後に電気泳動に供し、バンド数またはバンドの位置により検出することができる。その他、電気泳動のバンドでは確認できない程度の少数塩基の挿入欠失も多型に含まれる。当該挿入欠失が制限酵素認識配列中に存在する場合や、当該挿入欠失により新たな制限酵素認識配列が生じた場合はＣＡＰＳマーカーとなる。
【００４０】
本発明に係る遺伝マーカーは、オオムギ遺伝子の改変によって麦芽アルコール飲料成分中に含まれるタンパク質を変化させるために利用可能である。すなわち、当該オオムギＥＳＴデータベースにヒットした麦芽アルコール飲料成分中のタンパク質は、オオムギの遺伝子によって誘導されたｍＲＮＡに由来することが明らかなので、遺伝子のエクソン部分の配列を改変することによってタンパク質そのものを変化させることが可能である。
【００４１】
具体的には、複数のオオムギ品種について当該ＥＳＴ配列に基づいて設計されたプライマーを用いて遺伝子領域のゲノム配列を増幅し、その塩基配列を比較する。なお、ＥＳＴ配列に当該増幅断片の塩基配列を整合すれば、アミノ酸をコードするエクソン領域を特定できる。上記複数のオオムギ品種として、なるべく麦芽アルコール飲料醸造品質の異なる品種を多数用いれば、麦芽アルコール飲料成分中のタンパク質の差異を多数検出することができる。複数のオオムギ品種から得た増幅断片の塩基配列を、品種ごとにアミノ酸に翻訳し、品種間のアミノ酸配列を比較する。品種間でアミノ酸配列に差異が認められれば、産生されるタンパク質にも差異がある可能性が高い。タンパク質産生の差異を確認するには、それぞれのオオムギ品種を原料に用いて製造した麦芽アルコール飲料中の当該タンパク質の発現量を比較すればよい。発現量を比較するための方法は、公知の方法を用いればよい。例えば、後述する実施例に示す二次元電気泳動等の手法を好適に用いることができる。また逆に、例えば二次元電気泳動の結果、当該タンパク質のスポットについて発現量が異なる品種を見出した場合には、上記当該ＥＳＴ配列に基づいて設計されたプライマーを用いてこれらの品種の遺伝子領域のゲノム配列を増幅し、その塩基配列を比較することにより、遺伝子配列の品種間の差異を検出することもできる。
【００４２】
品種間に上記増幅断片の塩基配列の差異が全く認められない場合には、差異の認められない品種の種子等を突然変異誘発物質で処理することにより人為的に変異を導入し、多数の処理個体について、上記の手法により配列解析を行うことができる。突然変異誘発物質としては、例えばガンマ線やＥＭＳ（エチルメタンサルフォネート）等を挙げることができるが、これに限定されるものではない。アミノ酸置換や停止コドンを含む個体が見出されれば、それらの個体における当該タンパク質の発現量を確認すればよい。
【００４３】
以上のようなタンパク質の変化は、全てオオムギの遺伝子配列の品種間差異に基づいているものであるため、マーカー化が可能である。したがって、育種によってタンパク質の変化をタンパク質の品種に導入することができる。
【００４４】
本発明に係る遺伝マーカーのうち、上記ｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）に記載のプライマーの組み合わせによるプライマーセットで増幅される遺伝マーカーは、麦芽アルコール飲料成分中に含まれる麦芽アルコール飲料の泡持ちに関連するタンパク質の発現量が多いオオムギ品種と、当該麦芽アルコール飲料の泡持ちに関連するタンパク質の発現量が少ないオオムギ品種とを区別するために利用可能である。すなわち、上記ｉ）の配列番号１および２に示される塩基配列を含むクローン名：BaGS15J04にヒットしたタンパク質は泡持ちの良い品種Ａのみに出現したスポット中のタンパク質であり、上記ｉｉ）の配列番号３および４に示される塩基配列を含むクローン名：bast10G1113にヒットしたタンパク質、およびｉｉｉ）の配列番号５および６に示される塩基配列を含むクローン名：BaAK4F13にヒットしたタンパク質は、泡持ちの悪い品種Ｂより泡持ちの良い品種Ａにより多く発現しているスポット中のタンパク質である。したがって、これらの遺伝マーカーの多型を検出すれば、麦芽アルコール飲料成分中に含まれる麦芽アルコール飲料の泡持ちに関連するタンパク質の発現量が多いオオムギ品種と、当該麦芽アルコール飲料の泡持ちに関連するタンパク質の発現量が少ないオオムギ品種とを区別することができる。
【００４５】
２．ポリヌクレオチド
本発明に係るポリヌクレオチドは、麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質をコードする遺伝子の一部であって、配列番号１ないし９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号１ないし９に示される塩基配列において１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加された変異塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００４６】
既に説明したように、上記配列番号１ないし９に示される塩基配列は、麦芽アルコール飲料成分中のタンパク質がヒットしたオオムギＥＳＴの塩基配列である。また、上記配列番号１ないし９に示される塩基配列において１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加された変異塩基配列からなるポリヌクレオチドは、麦芽アルコール飲料成分中のタンパク質がヒットしたオオムギＥＳＴの変異塩基配列である。例えば、当該ＥＳＴ配列内に品種間の多型がある場合に、一方の品種の塩基配列は配列番号１ないし９に示される塩基配列と異なるものになり、それらは上記変異塩基配列に該当する。なお、これらの変異については、自然界に存在する変異に限定されるものではなく、人為的に導入したものでもよい。
【００４７】
本発明に係るポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの塩基配列内に品種間の多型があれば遺伝マーカーとして使用できる。また、また当該ポリペプチドの塩基配列に基づいてプライマーを設計することに使用できる。さらに、当該ポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドが一部として含まれるｃＤＮＡがコードするタンパク質の改変のために使用することができる。
【００４８】
３．遺伝子検出器具
本発明に係る遺伝子検出器具は、以下の（１）ないし（５）に記載のポリヌクレオチドの少なくともいずれか１つが支持体上に固定化されているものであればよい。本遺伝子検出器具により、麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質の発現量、または本発明に係る遺伝マーカーの遺伝子型を迅速かつ簡便に検出することが可能となる。
（１）配列番号１ないし９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号１ないし９に示される塩基配列において１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加された変異塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）上記（１）に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つの一部からなるポリヌクレオチド。
（３）上記（１）に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つの全部または一部を部分配列として含むポリヌクレオチド。
（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドのうち、配列番号ｎ（ｎは奇数）に示される塩基配列またはその変異塩基配列の全部または一部と配列番号ｎ＋１に示される塩基配列またはその変異塩基配列の全部または一部とを部分配列として含むポリヌクレオチド。
（５）上記（１）に記載のポリヌクレオチドのうち、配列番号ｎ（ｎは奇数）に示される塩基配列に基づいて設計される複数のプライマーおよび配列番号ｎ＋１に示される塩基配列に基づいて設計される複数のプライマーから任意に選択した２つのプライマーの組み合わせによるプライマーセットを用いて増幅されるＤＮＡ断片の塩基配列の全部または一部からなるポリヌクレオチド。
【００４９】
上記支持体上に固定化されているポリヌクレオチドは２種類以上であることが好ましい。２種類以上、すなわち複数のポリヌクレオチドがそれぞれ別個の領域に固定化されていれば、麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質の発現量、または本発明に係る遺伝マーカーの遺伝子型を網羅的に解析することが可能となる。
【００５０】
支持体としては、ポリヌクレオチドを固定化できるものであれば特に限定されるものではなく、どのような形状や材質であってもよい。支持体の材料としては、一般的には、例えば、ガラス、シリコンウエハ等の無機系材料、紙等の天然高分子、ニトロセルロースやナイロン等の合成高分子、合成高分子や天然高分子を用いたゲル体等を挙げることができる。また、支持体の形状も、ポリヌクレオチドを固定化できる十分な面積を有するものであれば特に限定されるものではないが、一般的には、可撓性が小さいかほとんど無い基板、可撓性を有する膜（メンブレン）、その中間となる可撓性基板等のように、二次元的な広がりを有するものを好ましく用いることができる。なお、上記基板や膜の厚みについては特に限定されるものではなく、その材質や用途に応じて適宜設定すればよい。さらに、支持体として各種ビーズを用いることもできる。
【００５１】
本遺伝子検出器具の支持体上には、上記（１）〜（５）に記載のポリヌクレオチドのみが固定化されていてもよく、上記（１）〜（５）に記載のポリヌクレオチドおよびそれ以外のポリヌクレオチドが固定化されていてもよい。また、支持体上の複数の領域にポリヌクレオチドが固定化される場合、個々の領域に固定化されるそれぞれのポリヌクレオチドはその塩基配列が全て重複しないものであってもよく、重複する部分を有するものであってもよく、同一の塩基配列からなるポリヌクレオチドが複数の異なる領域に固定化されているものでもよい。重複の形態についても限定されるものではなく、２つのポリヌクレオチドにおいてそれぞれの一部が重複するものでもよく、２つのポリヌクレオチドのうち一方が他方の部分配列となっているものでもよい。さらに、１つの領域に固定化されるポリヌクレオチドは１種類に限定されるものではなく、１つの領域に２種類以上の複数のポリヌクレオチドが固定化されているものであってもよい。
【００５２】
既に説明したように、配列番号１ないし９に示される塩基配列は麦芽アルコール飲料成分中のタンパク質がヒットしたオオムギＥＳＴの塩基配列である。すなわち、これらの配列はオオムギｃＤＮＡの部分配列である。したがって、上記（１）〜（４）のポリヌクレオチドはオオムギｃＤＮＡの配列を含んでいるため、当該遺伝子の発現を検出することができる。
【００５３】
上記（５）に記載のポリヌクレオチドは、本発明に係る遺伝マーカーの塩基配列からなるポリヌクレオチドであればよい。すなわち、（５）に記載のプライマーセットを用いて増幅されるＤＮＡ断片中に品種間の多型を有するものであればよい。例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む領域の塩基配列からなるポリヌクレオチドを支持体上に固定化すればよい。検出可能な多型は一塩基多型（ＳＮＰ）に限定されるものではなく、断片長多型等その他の多型も検出することができる。
【００５４】
本発明に係る遺伝子検出器具の作製には、公知の遺伝子発現検出器具の作製法や遺伝子多型検出器具の作製法を好適に応用することができる。例えば、ｃＤＮＡ溶液、増幅ＤＮＡ断片溶液、合成オリゴヌクレオチド溶液等をスポッター等により支持体上にスポットして固定化すれば本遺伝子検出器具を作製することができる。また、基板上でＤＮＡを合成する、いわゆるアフィメトリクス型のＤＮＡチップ作製技術を用いることも可能である。
【００５５】
遺伝子の発現を検出するために設計された公知の手法は、本遺伝子検出器具に好適に応用することができる。例えば、対象のオオムギから調製したｃＤＮＡやｃＲＮＡを蛍光標識しておき、支持体上に固定化されたポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ、そのハイブリダイゼーションの強度を蛍光を指標に測定することにより遺伝子の発現量を評価することができる。また、２種類の試料から調製したｃＤＮＡやｃＲＮＡをそれぞれ異なる色を発する蛍光物質で標識し、同一の支持体上のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせれば、その色調と蛍光強度を測定することにより、遺伝子発現の差異を評価することができる。
【００５６】
また、遺伝子の多型を検出するために設計された公知の手法は、本遺伝子検出器具に好適に応用することができる。
【００５７】
例えば、本遺伝子検出器具を用いて、ＲＦＬＰ（restriction fragment length polymorphism）等の断片長多型を検出することが可能である。より具体的には、例えば１つのスポットに同一クローンのｃＤＮＡの複数の部分配列を固定化することにより、断片長多型を検出することができる。ここで、３つの部分配列を１つのスポットに固定化したスポットにおけるハイブリダイゼーション強度は、３つの部分配列全てとハイブリダイズする断片が最も強く、２つまたは１つの部分配列とのみハイブリダイズする断片はハイブリダイゼーション強度が弱くなる。したがってハイブリダイゼーション強度の指標となる蛍光等の強度を測定することにより、断片長多型を検出することができる。また、断片によって一つのスポットにハイブリダイゼーションする領域が明らかに異なる場合には、二つの断片を異なる蛍光色素で標識することによって、断片長多型を検出することができる。
【００５８】
また、一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するために設計された代表的な製品として、アフィメトリクス社製のＤＮＡ解析（ジェノタイピング）用ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイを挙げることができる。このアレイは、全ゲノムＤＮＡを制限酵素で切断し、４塩基の突出末端を認識するアダプターをライゲーションする。サイズにかかわらず、制限酵素処理で生じる全ての断片がアダプターライゲーションできる。これらの断片から250-1000bpの断片を選択的にＰＣＲ増幅して、ＳＮＰ部分が一致および不一致するように配置されたアレイにハイブリダイズすることでＳＮＰを検出するものである。この他にも多数のＳＮＰ検出用アレイが市販されており、これらの手法を本遺伝子多型検出器具に応用すればよい。
【００５９】
なお、作製法や評価法は上記に限定されるものではない。
【００６０】
４．ポリペプチド相互作用物質検出器具およびポリペプチド検出器具
本発明に係るポリペプチド相互作用物質検出器具は、以下の（１）ないし（４）に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの少なくともいずれか１つが支持体上に固定化されているものであればよく、本発明に係るポリペプチド検出器具は、以下の（１）ないし（４）に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドに対する抗体の少なくともいずれか１つが支持体上に固定化されているものであればよい。本ポリペプチド相互作用物質検出器具またはポリペプチド検出器具により、麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質や当該タンパク質と相互作用する物質を迅速かつ簡便に検出することが可能となる。
（１）配列番号１ないし９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号１ないし９に示される塩基配列において１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加された変異塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）上記（１）に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つの一部からなるポリヌクレオチド。
（３）上記（１）に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つの全部または一部を部分配列として含むポリヌクレオチド。
（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドのうち、配列番号ｎ（ｎは奇数）に示される塩基配列またはその変異塩基配列の全部または一部と配列番号ｎ＋１に示される塩基配列またはその変異塩基配列の全部または一部とを部分配列として含むポリヌクレオチド。
【００６１】
上記支持体上に固定化されているポリペプチドまたは抗体は２種類以上であることが好ましい。２種類以上、すなわち複数のポリペプチドまたは抗体がそれぞれ別個の領域に固定化されていれば、麦芽アルコール飲料成分中に含まれるオオムギ由来タンパク質や当該タンパク質と相互作用する物質を網羅的に解析することが可能となる。
【００６２】
支持体としては、ポリヌクレオチドを固定化できるものであれば特に限定されるものではなく、どのような形状や材質であってもよい。支持体の材料としては、一般的には、例えば、ガラス、シリコンウエハ等の無機系材料、紙等の天然高分子、ニトロセルロースやナイロン等の合成高分子、合成高分子や天然高分子を用いたゲル体等を挙げることができる。また、支持体の形状も、ポリヌクレオチドを固定化できる十分な面積を有するものであれば特に限定されるものではないが、一般的には、可撓性が小さいかほとんど無い基板、可撓性を有する膜（メンブレン）、その中間となる可撓性基板等のように、二次元的な広がりを有するものを好ましく用いることができる。なお、上記基板や膜の厚みについては特に限定されるものではなく、その材質や用途に応じて適宜設定すればよい。さらに、支持体として各種ビーズを用いることもできる。
【００６３】
既に説明したように、配列番号１ないし９に示される塩基配列は麦芽アルコール飲料成分中のタンパク質がヒットしたオオムギＥＳＴの塩基配列である。すなわち、これらの配列はオオムギｃＤＮＡの部分配列である。したがって、上記（１）〜（４）のポリヌクレオチドはタンパク質をコードする領域を含んでおり、これらのポリヌクレオチドがコードするポリペプチドまたは当該ポリペプチドに対する抗体を支持体上に固定化することができる。
【００６４】
〔ポリペプチド相互作用物質検出器具〕
本発明に係るポリペプチド相互作用物質検出器具の支持体上には、上記（１）〜（４）に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのみが固定されていてもよく、上記（１）〜（４）に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドおよびそれ以外のポリペプチドが支持体上に固定化されているものでもよい。また、支持体上の複数の領域にポリペプチドが固定化される場合、個々の領域に固定化されるそれぞれのポリペプチドはそのアミノ酸配列が全て重複しないものであってもよく、重複する部分を有するものであってもよく、同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドが複数の異なる領域に固定化されているものでもよい。重複の形態についても限定されるものではなく、２つのポリペプチドにおいてそれぞれの一部が重複するものでもよく、２つのポリペプチドのうち一方が他方の一部となっているものでもよい。さらに、１つの領域に固定化されるポリペプチドは１種類に限定されるものではなく、１つの領域に２種類以上の複数のポリペプチドが固定化されているものであってもよい。
【００６５】
タンパク質（ポリペプチド）の相互作用を検出するために設計された公知の手法は、本ポリペプチド相互作用検出器具に好適に応用することができる。例えば、サイファージェン・バイオシステムズ社より、プロテインチップの１種類としてバイオロジカルチップが販売されている。これは基板（支持体）の表面にカルボニルジイミダゾールまたはエポキシの活性基を持つもので、ユーザーが自由に目的のタンパク質や抗体を固定化して使用するものである。本発明に係るポリペプチド相互作用検出器具の作製にこれを応用することが可能である。なお、上記カルボニルジイミダゾールやエポキシ等の活性基は抗体やポリヌクレオチドを固定化することもできるので、本発明に係る他の検出器具の作製にも応用することができる。
【００６６】
〔ポリペプチド検出器具〕
本発明に係るポリペプチド検出器具の支持体上には、上記（１）〜（４）に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドに対する抗体のみが固定されていてもよく、上記（１）〜（４）に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドに対する抗体およびそれ以外の抗体が支持体上に固定化されているものでもよい。抗体は特定の抗原を認識・結合できる免疫グロブリンを意味するが、本発明における抗体は、必ずしも抗体分子の全体を意味するものではなく、抗原結合部位を含む抗体分子の一部分であっても抗体と称するものとする。また、１つの領域に固定化されるポリペプチドは１種類に限定されるものではなく、１つの領域に２種類以上の複数のポリペプチドが固定化されているものであってもよい。
【００６７】
抗体を用いてタンパク質（ポリペプチド）を検出するために設計された公知の手法は、本ポリペプチド検出器具に好適に応用することができる。
【００６８】
ここでは本発明に係るポリペプチド検出器具の一例として、ビーズ型抗体アレイについて説明する。ただし、支持体としてのビーズに固定化可能なものは抗体に限定されるものではなく、他のポリペプチドやポリヌクレオチドであってもよい。したがって、本発明に係る遺伝子検出器具、遺伝子多型検出器具、ポリペプチド相互作用検出器具をビーズアレイとして実施することも可能である。
【００６９】
ビーズ型抗体アレイは１つのビーズに１種類の抗体が固定化されており、当該抗体の作製に用いられるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのオオムギ１Ｈ染色体における順序の情報が付与されていることが好ましい。例えば、マイクロタイタープレートの１ウェルを小容器とし、この小容器内に識別コード（固定化されている抗体の情報、染色体上の位置情報等）を付与したビーズを複数仕込む。この識別コードを読み取ることにより、固定化されている抗体が何であるか等の情報を特定することができる。特に、２波長のレーザー光を用いれば１００種類以上のビーズに対する定量が可能となる。この手法は液相での検出が可能なので、特にタンパク質などの定量に有用である。代表的なものとして日立ソフトウエアエンジニアリング社製蛍光マイクロビーズアレイシステムLuminexを挙げることができる。
【００７０】
なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００７１】
１．試験醸造用麦芽の製造および分析
麦芽の製造は90kgスケールパイロット製麦設備を用いて行った。泡持ちの良い品種Ａと悪い品種Ｂを用いて製麦を行った。製麦は、浸麦工程は温度14℃で両品種とも浸麦度（発芽開始時の大麦水分含量）が43%に達するまで行い（品種Ａで合計40.5時間、品種Ｂで合計48.5時間。いずれも６時間WET／６時間DRYサイクル）、発芽工程は温度14℃で144時間行い、焙燥工程は合計18時間（55℃5時間、60℃5.5時間、65℃2時間、70℃1.5時間、83℃4時間）で行った。
【００７２】
麦芽分析は、ＥＢＣ標準法（European Brewery Convention編、Analytica EBC (4th Ed)、1987）を用いて行った。
【００７３】
２．ビール試験醸造
〔麦芽サンプル〕
原料麦芽としては、上記の製造方法にて製造した麦芽を使用した。
【００７４】
〔仕込工程〕
上記の麦芽について、400Lスケール仕込設備によりビール（麦芽使用率71%）仕様での仕込を行った。仕込条件は以下の通りである。
【００７５】
麦芽50kgと副原料（コーンスターチ、コーングリッツ、米）合計20kgを合計230Lの仕込用水により、２回煮沸法で、50℃、20分→65℃、30分→75℃、3分のダイアグラムに従って仕込み、ロイター設備により麦汁ろ過を行い、最終的に360Lのろ過麦汁を得た。得られたろ過麦汁にホップペレット(苦味分析値44.9ＢＵ(EBC))400gを添加して90分間煮沸し、10℃まで冷却し、加水によるエキス調整により、エキス含量11.0%の冷麦汁とした。
【００７６】
〔冷麦汁分析〕
得られた冷麦汁の分析は、ＥＢＣ標準法（European Brewery Convention編、Analytica EBC (4th Ed)、1987）を用いて行った。結果を表１に示した。表１から明らかなように、記載した一般的な分析項目に関しては、品種Ａと品種Ｂの２点の間で、明らかな差は認められなかった。
【００７７】
【表１】
2005278487.tif 000002
【００７８】
〔発酵・貯酒工程〕
上記仕込工程で得られた冷麦汁を400Lスケールシリンドロコニカル型タンクに移し、初期濃度1500万cells/mlとなるように酵母を添加し、10.5℃にて主発酵を行った。発酵液のエキスが2.5%まで切れた段階で、発酵液のうち30Lを蒸気殺菌した30Lスケールシリンドロコニカル型タンクに移し替え、貯酒工程を行った。貯酒工程は初期の8日間を8℃にて、その後3週間を0℃にて行った。
【００７９】
貯酒工程の終わった発酵液は、パイロットスケールのビールろ過設備、充填設備にてビールろ過、壜への充填を行った。
【００８０】
〔ビールの分析〕
ＥＢＣ標準法（European Brewery Convention編、Analytica EBC (4th Ed)、1987）により製品の分析を行った。結果を表２に示した。表２から明らかなように、一般分析値に関しては、品種Ａと品種Ｂの２点の間で、明らかな差は認められなかった。
【００８１】
【表２】
2005278487.tif 000003
【００８２】
〔泡持ち分析〕
製品の泡持分析は、NIBEM法を利用した。Haffmans社のFOAM STABILITY TESTERを使用し、泡持ちを分析した。結果を表３に示した。表３から明らかなように、品種Ａは品種Ｂと比べて、NIBEM値が46ポイント高く、優れた泡持ち特性を有していた。
【００８３】
【表３】
2005278487.tif 000004
【００８４】
３．ビールタンパク質の調製
上記のように醸造した泡持ちの良い品種Ａおよび悪い品種Ｂのビールを用いて、タンパク質を調製した。まず、ビールのガス抜きを行い、次に、カラム（PD-10 columns；AmershamBioscience）による脱塩処理を施した。その後、滅菌水によりタンパク質を溶出し、凍結乾燥することで濃縮した。
【００８５】
４．ビールタンパク質の電気泳動解析
４−１  二次元電気泳動
〔一次元目電気泳動〕
上記のように調整したタンパク質を、サンプルバッファー（8M Urea, 2% CHAPS, 2% IPG buffer, BPB）に溶解して用いた。一次元目の電気泳動の前に、サンプルをpI4-7およびpI6-9の24cmIPGストリップ（AmershamBioscience）に膨潤させた。方法は、2-D Electrophoresisマニュアル(AmershamBioscience)に従った。膨潤後、一次元目の電気泳動を実施した。これも、方法は、2-D Electrophoresisマニュアル(AmershamBioscience)に従った。なお、ここまでの電気泳動は、MultiphorII電気泳動装置(AmershamBioscience)を使用した。
【００８６】
〔二次元目電気泳動〕
二次元目の電気泳動の前に、SDSによる平衡化を２回行った。１回目の平衡化バッファー（50mM Tris-Cl;pH8.8, 6M Urea, 30% Glycerol, 2% SDS, 1% DTT）に浸漬し、20分間、室温で振とうさせた。次に、１回目の平衡化バッファーを捨て、２回目の平衡化バッファー（50mM Tris-Cl;pH8.8, 6M Urea, 30% Glycerol, 2% SDS, 2.5% Iodoacetamide）に浸漬し、さらに20分間、室温で振とうさせることで平衡化した。これらのサンプルを、12.5% Ettan DALT II Gel（AmershamBioscience）を用い、Ettan DALTsix Electrophoresis System（AmershamBioscience）の方法に従い、二次元目の電気泳動を行った。
【００８７】
４−２  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上記二次元電気泳動の一次元目電気泳動と同様に、凍結乾燥したタンパク質をサンプルバッファー（8M Urea, 2% CHAPS, 2% IPG buffer, BPB）に溶解した。これらのサンプルを、12-14% ExcelGel SDS XL (AmershamBioscience)を用い、MultiphorII電気泳動装置(AmershamBioscience)にて、電気泳動を実施した。なお、泳動条件、方法は、2-D Electrophoresisマニュアル(AmershamBioscience)に従った。
【００８８】
４−３  ゲルの染色
二次元電気泳動およびＳＤＳ−ＰＡＧＥとも、ゲルの染色は、銀染色MSキット（和光純薬工業株式会社）を用いて行った。スキャナによりゲル画像の取りこみを行い、品種Ａと品種Ｂを比較した。
【００８９】
品種Ａの二次元電気泳動の結果を図１に示した。図１中、７７および７８のスポットは品種Ａに特異的なスポットである。８８、８９および９０のスポットは両品種に共通のスポットであるが、品種Ａの方が品種Ｂより発現量が多いスポットである。
【００９０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２に示した。図２から明らかなように、40KDのタンパク質の発現量は品種Ａの方が品種Ｂより多かった。
【００９１】
５．質量解析
上記品種Ａの二次元電気泳動ゲルからスポット（77、78）、スポット88、およびスポット（89、90）を切り取った（図１参照）。なお、スポット77と78、およびスポット89と90については、２スポットを含むゲルを切り取った。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルから品種Ａの40KDのバンドと品種Ｂの40KDのバンドを切り取った（図２参照）。ゲルの切り取りにはメスを用い、脱銀処理したものを質量解析のサンプルとした。各サンプルに、Trypsinを含むTrisバッファー（pH8.0）を加え、35℃、20時間の処理を行った。その後、サンプル溶液の50％容量をLC-MS/MS分析に供した。LC-MS/MS分析条件は、以下の通りである。
HPLC装置：MAGIC 2002 (Michrom BioResources, Inc., USA)
カラム：Magic C18 (0.1×50 mm, Michrom BioResources, Inc.)
溶媒A：2％アセトニトリル/0.1%ギ酸
溶媒B：90％アセトニトリル/0.1%ギ酸
流速：400〜500nl/min
グラジエント    0(min)    5(B%)
1        10
21        50
22        95
23        95
24         5
質量分析装置：Q-Tof2 (Micromass, UK)
イオン化方式：Nanoflow-LC ESI
イオン化モード：Positive mode
キャピラリー電圧：2 kV
コリジョンエネルギー：20〜35 eV
６．データベース検索
全てのプリカーサーイオンについて得られたプロダクトイオンの数値をMascotを用いて大麦データベース（BaEST20020808）を検索した。結果を表４に示した。質量解析のサンプルとした各スポットは、それぞれ表４に示したオオムギＥＳＴ配列にヒットした。
【００９２】
【表４】
2005278487.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明は、ビール大麦の育種に用いることができ、効率的な育種により優れたビール大麦品種を作出することに貢献できる。したがって、農業分野に利用可能であり、さらにビール製造業等の食品産業にも利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】品種Ａを用いて製造したビール中のタンパク質の二次元電気泳動の結果を示す画像である。
【図２】品種Ａを用いて製造したビール中のタンパク質、および品種Ｂを用いて製造したビール中のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す画像である。
【図１】
2005278487.tif 000006
【図２】
2005278487.tif 000007
【配列表】
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