(57)【要約】      （修正有）【課題】  前立腺癌マーカポリペプチド、該ポリペプチドに対する抗体、及び該ポリペプチドを利用した前立腺癌の診断方法を提供する。【解決手段】  前立腺由来の特定なアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチド、該前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体、及び前立腺由来の特定なアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドの少なくとも１種を検出することを特徴とする、前立腺癌の診断方法である。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列から、アミノ酸残基１以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導する変異ポリペプチド。
【請求項３】
下記(1)又は(2)のポリペプチド断片であって、かつ配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導するポリペプチド断片：
(1)  配列番号１〜３５いずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチド；
(2)配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列から、アミノ酸残基１以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導するポリペプチド。
【請求項４】
少なくとも１５アミノ酸残基を含む、請求項３記載のポリペプチド断片。
【請求項５】
少なくとも２０アミノ酸残基を含む、請求項３記載のポリペプチド断片。
【請求項６】
少なくとも２５アミノ酸残基を含む、請求項３記載のポリペプチド断片。
【請求項７】
配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドの少なくとも１種を検出することを特徴とする、前立腺癌の診断方法。
【請求項８】
被験者から得た検体と、該前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体とを接触させる工程を有する、請求項７記載の診断方法。
【請求項９】
配列番号１８〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドの少なくとも１種を検出することを特徴とする、アンドロゲン非依存性前立腺癌の診断方法。
【請求項１０】
被験者から得た検体と、該前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体とを接触させる工程を有する、請求項９記載の診断方法。
【請求項１１】
下記(a)、(b)又は(c)を含む、配列番号１〜３５のいずれか１に記載されたアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対し、特異性を有する抗体製造用組成物：
(a)  配列番号１〜３５のいずれか１に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b)  配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列から、アミノ酸残基１以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導するポリペプチド；又は
(c)  (a)又は(b)のポリペプチド断片であって、かつ配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導するポリペプチド断片。
【請求項１２】
(c)のポリペプチド断片が、少なくとも１５アミノ酸残基を含む、請求項１１記載の抗体製造用組成物。
【請求項１３】
(c)のポリペプチド断片が、少なくとも２０アミノ酸残基を含む、請求項１１記載の抗体製造用組成物。
【請求項１４】
(c)のポリペプチド断片が、少なくとも２５アミノ酸残基を含む、請求項１１記載の抗体製造用組成物。
【請求項１５】
配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体。
【請求項１６】
モノクローナル抗体である、請求項１５記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１１記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体を製造する方法。
【請求項１８】
配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体を、少なくとも１種含有する、前立腺癌治療用医薬組成物。
【請求項１９】
配列番号１８〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体を、少なくとも１種含有する、アンドロゲン非依存性前立腺癌治療用医薬組成物。
【請求項２０】
配列番号１８〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体を、少なくとも１種含有する、アンドロゲン非依存性前立腺癌形成阻害用医薬組成物。
【請求項２１】
配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体を、少なくとも１種含有する、前立腺癌診断用キット。
【請求項２２】
配列番号１８〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体を、少なくとも１種含有する、アンドロゲン非依存性前立腺癌診断用キット。
【請求項２３】
下記(i)、(ii)又は(iii)を含む、前立腺癌診断用核酸プローブ：
(i)  配列番号３６〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列と、相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド；
(ii)  配列番号３６〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列と、相補的なヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片；又は
(iii)  配列番号３６〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド断片。
【請求項２４】
配列番号３６〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドの少なくとも１種を検出することを含む、前立腺癌の診断方法。
【請求項２５】
被験者から得た検体と、請求項２３記載の前立腺癌診断用核酸プローブを接触させることを含む、請求項２４記載の診断方法。
【請求項２６】
被験者から得た検体に含まれるポリヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ)で増幅することを含む、請求項２４記載の診断方法。
【請求項２７】
配列番号３６〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片からなる前立腺癌診断用プライマー。
【請求項２８】
配列番号３６〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列と、相補的なヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片からなる、前立腺癌診断用プライマー。
【請求項２９】
請求項２３記載の前立腺癌診断用核酸プローブを含む、前立腺癌診断用キット。
【請求項３０】
さらに請求項２７及び２８記載の前立腺癌診断用プライマーを含む、請求項２９記載の前立腺癌診断用キット。
【請求項３１】
下記(iv)、(v)又は(vi)を含む、アンドロゲン非依存性前立腺癌診断用核酸プローブ：
(iv)  配列番号５３〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列と、相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド；
(v)  配列番号５３〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列と、相補的なヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片；又は
(vi)  配列番号５３〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド断片。
【請求項３２】
配列番号５３〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドの少なくとも１種を検出することを含む、アンドロゲン非依存性前立腺癌の診断方法。
【請求項３３】
被験者から得た検体と、請求項３１記載の核酸プローブを接触させることを含む、請求項３２記載の診断方法。
【請求項３４】
被験者から得た検体に含まれるポリヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅することを含む、請求項３２記載の診断方法。
【請求項３５】
配列番号５３〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片からなるアンドロゲン非依存性前立腺癌診断用プライマー。
【請求項３６】
配列番号５３〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列と、相補的なヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片からなる、アンドロゲン非依存性前立腺癌診断用プライマー。
【請求項３７】
請求項３１記載の前立腺癌診断用核酸プローブを含む、アンドロゲン非依存性前立腺癌診断用キット。
【請求項３８】
さらに請求項３５及び３６記載のアンドロゲン非依存性前立腺癌診断用プライマーを含む、請求項３７記載の前立腺癌診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺癌マーカポリペプチド、該ポリペプチドに対する抗体、及び該ポリペプチドを利用した前立腺癌の診断方法に関するものである。さらに詳細に述べると、アンドロゲン依存性前立腺癌、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌それぞれに特異的なマーカポリペプチド、それらに対する抗体、及び該マーカポリペプチド及び抗体を利用した前立腺癌の診断方法、及び治療用医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、前立腺癌は、米国において男性の罹患率第１位、かつ死亡率第２位の癌で、日本でも高齢化と生活の欧米化の影響でその患者数が急激に増加しているが、前立腺癌は初期症状がないため、転移を伴う進行癌の状態で発見されることが多い。
また現在、前立腺癌の腫瘍マーカとして前立腺特異抗原(Prostatic  pecific  Antigen;  PSA)が広く使われているが、PSAを用いた診断では、偽陽性が多く、良性と悪性との境界領域が広い等の問題があり（非特許文献１）、新たな腫瘍マーカが検討されてきた。例えば、前立腺癌特異性のアンドロゲンで調節された細胞表面セリンプロテアーゼである20PlF12/TMPRS2に由来する腫瘍マーカ（特許文献１）、ヒト前立腺癌において発現されるＣ型レクチン膜貫通抗原（特許文献２）、その他、多くの前立腺癌特異的タンパク質の発見に伴う腫瘍マーカ（特許文献３）などである。しかし、これまで確度が高い診断を可能にする前立腺癌マーカは発見、又は実用化されていなかった。
【０００３】
さらに、初期の前立腺癌は増殖するために男性ホルモン（アンドロゲン）が必要であり、そのため、アンドロゲン遮断療法が行われる。一方、該前立腺癌はアンドロゲン非依存性を獲得して再増殖を始めるため、通常、該遮断療法の効果は２年以内に失われる。そのため前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得すると多くの患者は１年以内に死亡するので、前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得しているか否かを判断することは重要であるにも係わらず、アンドロゲン非依存性の獲得を示す前立腺癌マーカは存在せず、アンドロゲン非依存性前立腺癌に対し、ホルモン療法以外の治療法を早期から実施することができなかった。
【特許文献１】特表２００２−５１７１８５号公報
【特許文献２】特表２００３−５０７０４２号公報
【特許文献３】特表２００２−５２００５４号公報
【非特許文献１】Chan DW, Sokoll LJ. Prostate-specific antigen: update 1997. J IntFed Clin Chem 1997; 9: 120-5
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、アンドロゲン依存性前立腺癌マーカポリペプチド、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌マーカポリペプチド、該マーカポリペプチドに特異的な抗体、及び該マーカポリペプチド及び抗体を利用した前立腺癌の診断方法、及び治療用医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、前立腺癌組織からタンパク質を取り出し、アガロース２ＤＥ法と液体クロマトグラフィー又はタンデム質量分析を組み合わせ、プロテオーム解析により発現タンパク質の解析を行った。その結果、Gene  Bank  データベースに登録されたタンパク質の中から新たにアンドロゲン依存性前立腺癌、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌のマーカとなるポリペプチドを見出すことができた。本発明は、かかる研究成果に基づきなされたものである。
【０００６】
したがって、本発明は、配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドを提供する。
また、本発明は、配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列から、アミノ酸残基１以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導する変異ポリペプチドを提供する。
【０００７】
さらに、本発明は、下記(1)又は(2)のポリペプチド断片であって、かつ配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導するポリペプチド断片を提供する。
(1)  配列番号１〜３５いずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチド；及び
(2)配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列から、アミノ酸残基１以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導するポリペプチドである。
【０００８】
さらに本発明は、配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドの少なくとも１種を検出することを特徴とする、前立腺癌の診断方法を提供する。
さらに、本発明は、配列番号１８〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドの少なくとも１種を検出することを特徴とする、アンドロゲン非依存性前立腺癌の診断方法を提供する。
さらに、本発明は、下記(a)、(b)又は(c)を含む、配列番号１〜３５のいずれか１に記載されたアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに対し特異性を有する抗体製造用組成物を提供する。
(a)  配列番号１〜３５のいずれか１に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b)  配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列から、アミノ酸残基１以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導するポリペプチド；及び
(c)  (a)又は(b)のポリペプチド断片であって、かつ配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導するポリペプチド断片である。
【０００９】
さらに本発明は、配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体を提供する。
さらに本発明は、前記抗体製造用組成物を哺乳動物に投与することを含む、配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体を製造する方法を提供する。
さらに本発明は、配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体を、少なくとも１種含有する、前立腺癌治療用医薬組成物を提供する。
さらに本発明は、配列番号１８〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体を、少なくとも１種含有する、アンドロゲン非依存性前立腺癌治療用医薬組成物、又はアンドロゲン非依存性前立腺癌形成阻害用医薬組成物を提供する。
【００１０】
さらに本発明は、配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体を、少なくとも１種含有する、前立腺癌診断用キットを提供する。
さらに本発明は、配列番号１８〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マプチドに特異性を有する抗体を、少なくとも１種含有する、アンドロゲン非依存性前立腺癌診断用キットを提供する。
さらに本発明は、下記(i)、(iii)を含む、前立腺癌診断用核酸プローブを提供する。
(i)  配列番号３６〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列と、相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド；
(ii)  配列番号３６〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列と、相補的なヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片；又は
(iii)  配列番号３６〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド断片である。
【００１１】
さらに、本発明は、配列番号３６〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドの少なくとも１種を検出することを含む、前立腺癌の診断方法を提供する。
さらに本発明は、配列番号３６〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片からなる前立腺癌診断用プライマー（フォワードプライマー）、及び配列番号３６〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列と、相補的なヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片からなる、前立腺癌診断用プライマー（リバースプライマー）を提供する。
【００１２】
さらに本発明は、前記前立腺癌診断用核酸プローブを含む、前立腺癌診断用キットを提供する。
さらに本発明は、下記(iv)、(v)又は(vi)を含む、アンドロゲン非依存性前立腺癌診断用核酸プローブを提供する。
(iv)  配列番号５３〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列と、相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド；
(v)  配列番号５３〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列と、相補的なヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片；又は
(vi)  配列番号５３〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド断片である。
【００１３】
さらに本発明は、配列番号５３〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドの少なくとも１種を検出することを含む、アンドロゲン非依存性前立腺癌の診断方法を提供する。
さらに本発明は、配列番号５３〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片からなるアンドロゲン非依存性前立腺癌診断用プライマー（フォワードプライマー）、及び配列番号５４〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列と、相補的なヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片からなる、アンドロゲン非依存性前立腺癌診断用プライマー（リバースプライマー）を提供する。
【００１４】
さらに本発明は、前記前立腺癌診断用核酸プローブを含む、アンドロゲン非依存性前立腺癌診断用キットを提供する。
（定義）
本明細書で用いる用語「前立腺癌マーカポリペプチド」とは、ヒト前立腺癌細胞抽出液から抽出され、アガロース二次元電気泳動によりゲル上に展開して得られた、ヒト前立腺癌細胞に特異的なスポットから分離されたポリペプチドをいう。なお、該前立腺癌マーカポリペプチドは、前立腺癌細胞から一般的に発現するポリペプチドであるが、アンドロゲン非依存性を獲得した前立腺癌細胞において特徴的に発現量が変化するものがある。なお、当該前立腺癌マーカポリペプチドは、癌細胞から分離、又は単離された形態のポリペプチドを含むものである。
【００１５】
また、本明細書中で用いる用語「血清中抗体」とは、血清中に存在し、配列番号１〜３５にいずれか１を含むポリペプチドと結合する抗体IgGを意味する。また、本明細書中で用いる用語「抗体」、及び「標式化抗体」とは、配列番号１〜３５にいずれか１を含むポリペプチド、その変異ポリペプチド、及びこれらのポリペプチド断片を免疫原として作成されたポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体を意味する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、新規な、かつ優れた前立腺癌マーカポリペプチド、アンドロゲン非依存性前立腺癌マーカポリペプチド、これら前立腺癌マーカポリペプチドに特異的な抗体、及び該マーカポリペプチド及び抗体を利用した前立腺癌の診断方法、及び治療用医薬組成物を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（前立腺癌マーカポリペプチドの検索に用いた前立腺癌組織）
本発明の前立腺癌マーカポリペプチド検索に用いる、アンドロゲン依存性前立腺癌細胞とアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞は、従来知られている方法で作成することができる（1）。例えば、アンドロゲン依存性ヒト前立腺癌細胞として、市販されているLNCaP細胞株(American  Type  Culture  Collection  (ATCC),  Rockville,  MD,  USA)を用いることができる。該LNCaP細胞株を、ウシ胎仔血清10％を含有する培養培地（例えば、Roswell  Park  Memorial  Institute  (RPMI)  medium）中で維持、培養した後、該培養LNCaP  細胞1x107個を0.1  ml  マトリゲル(Matrigel,  Becton  Dickinson  Labware,  NJ,  USA)  に混入して、雄ヌードマウス  (BALB/c  strain)  の皮下に接種し、腫瘍が100から200  mm3になったところで、精巣を摘除する。該腫瘍は一次的に縮小するが、まもなく再増殖を始める。このときの精巣摘除前の腫瘍をアンドロゲン依存性前立腺癌、精巣摘除後に再増殖した腫瘍をアンドロゲン非依存性前立腺癌として用いることができる。
【００１８】
（ヒト正常前立腺組織とヒト前立腺癌組織の採取）
本発明で用いたヒト正常前立腺組織と前立腺癌組織は、手術を施した患者の摘除検体から採取した。主として、神奈川県相模原市にある北里大学病院泌尿器科で手術を受けた患者から同意を得て採取されたものである。該正常前立腺組織は、例えば、膀胱癌治療のために膀胱全摘除術が行われたときに同時に合併切除される前立腺から採取されたものである。また、前立腺肥大症により前立腺切除術が実施されたときに非癌前立腺組織も採取した。さらにヒト前立腺組織は、前立腺癌治療のために前立腺全摘除術もしくは前立腺切除術が行われたときに摘除される前立腺、或いは、前立腺癌診断の際に実施される前立腺生検術のときに採取されたものである。このとき、事前に男性ホルモン遮断療法が施されていて、前立腺癌が再増殖を始めた症例の前立腺癌をアンドロゲン非依存性前立腺癌とした。
【００１９】
（前立腺癌マーカポリペプチドの検索）
前記検索用の前立腺癌組織から得た細胞抽出物に含まれるポリペプチドを、常法であるアガロース二次元電気泳動法によりゲル上に展開した(2)。すなわち、タンパク質の混合液をまず各タンパク質が保有する電荷（等電点）で分離し（一次元目）、続いて分子量で分離する（二次元目）手法である。最も一般的な方法は固定化ｐＨ勾配二次元電気泳動法（イモビライン２ＤＥ）であり、例えば、アマシャムバイオサイエンス（株）から販売されているキットを用いて実施することができる。
【００２０】
この方法は、あらかじめｐＨ勾配が固定化されたポリアクリルアミドゲルを一次元目に用い、続いてＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分子量によってタンパク質を分離する手法であるが、一次元目にアクリルアミドゲルを用いるため、高分子量タンパク質が分離できないという欠点がある（3)。
【００２１】
本発明者らが用いたアガロース二次元電気泳動法は、一次元目にアガロースゲルを用いることでこの欠点を克服したものである。典型的な該アガロース二次元電気泳動法の手法を説明する。まず、アガロース１％、D−ソルビトール１２％、５Ｍ尿素、１Ｍチオ尿素、及び両性担体（例えば、ファルマライト、アマシャムバイオサイエンス（株））を混合し、直径3.4  mm、長さ180  mmのガラス管に注入して1次元目のゲルを作成する。この一端にタンパク質混合液、細胞抽出液、組織抽出液、又は血清などのサンプルを注入し、５００〜１０００ボルトの電圧をかけることにより電気勾配を作り、等電点電気泳動を行なう。二次元目は５〜２０％の濃度に調製したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを作成し、電気泳動をかける（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。所望の時間、電気泳動した後、二次元電気泳動ゲルをクーマジー染色、銀染色、シプロルビー染色などで染色して可視化する。このようにして、サンプルに含まれるポリペプチドをゲル上のスポットとして得ることができる。
【００２２】
（ゲル上のポリペプチド（タンパク質）の同定）
該ポリペプチドの同定は、プロテオーム解析により行なうことができる。すなわち、アガロース二次元電気泳動法に、自動ライン化された液体クロマトグラム−タンデム質量分析法  (LC/MS/MS)  を組み合わせた公知の方法で実施できる(4)。すなわち、まず、ゲルのタンパク質スポットをトリプシンなどでゲル内消化することでペプチドに分解する。様々な部位で切断された、色々な長さの各ペプチド断片をLC/MS/MSで測定すると、ペプチドの正確な質量が質量プロダクトイオン、又はマスタグとして得ることができる。このマスタグの質量スペクトルのデータを使って、ゲノム解析で作製されたデータベースを検索し、ポリペプチドを同定することができる。本発明者らは、該ペプチド断片の質量スペクトルデータを、解析ソフトウエア(SEQUEST)を用いて解析し、米国NCBIのデータベースを用いて同定した。
【００２３】
（二次元電気泳動ゲルの定量的スポット解析）
二次元電気泳動ゲルの乾燥後、該ゲルの像を画像ファイルとしてコンピュータに取り込み、画像解析ソフトウエア（例えば、Phoretix  2D  Advanced  Version  5.01  (Nonlinear  Dynamics  Ltd,  UK)など）を用いて、各タンパク質スポット毎に定量した。また、同様の画像解析ソフトウエアによって、各ゲルのタンパク質スポットの適合、解析ができるので、ここからＴ検定などの統計学的手法を用いて、対照群別の比較検討を行った。
【００２４】
（前立腺癌マーカポリペプチド）
このような二次元電気泳動ゲルと、プロテオーム解析により、本発明では、配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドを得ることができた。これらのポリペプチドは、それぞれ特定の機能、又は発現する臓器などが知られていたが、本発明者らが見出すまで、前立腺癌との関係は全く知られていなかった。したがって、本発明者らは、これらのポリペプチドが前立腺癌マーカとして利用できることを初めて見出したのである。
【００２５】
本発明の前立腺癌マーカポリペプチドを、従来知られていた名称などで列記する。なお、それぞれのマーカポリペプチドに付された番号は、本明細書に添付された配列表のアミノ酸配列番号と一致している。なお、該前立腺癌マーカの具体的な同定手順は、本明細書の実施例１〜３に具体的に記載されている。
【００２６】
１．KIAA0336  遺伝子産物（KIAA0336  gene  product）
２．TAR  RNA-相互作用タンパク質（TRIP  TAR  RNA-interacting  protein,  TRIP）
３．RAD50  ホモログ（RAD50  homolog）
４．仮想タンパク質  FLJ10839  （Hypothetical  protein  FLJ10839）
５．富ロイシンPPR-モチーフ包含（Leucine-rich  PPR-motif  containing）
６．RNA  ヘリカーゼ  KIAA0801  （RNA  helicase  KIAA0801）
７．ユビキチン特異性プロテアーゼ  7  （Ubiquitin  specific  protease  7）
８．カルシウム(ca2+)恒常性内部原形質網状質タンパク質
（Calcium  (ca2+)  homeostasis  endoplasmic  reticulum  protein）
【００２７】
９．関連ヌクレオポリン133kDa、又はMGC21133タンパク質
（Nucleoporin  133kDa,  Protein  for  MGC21133）
１０．RNA ヘリカーゼ関連タンパク質（RNA  helicase-related  protein）
１１．MOP-4（MOP-4）
１２．インスリン減成酵素（Insulin-degrading  enzyme）
１３．ＭＣＭ５ ミニクロモソーム維持欠陥５，細胞分画サイクル４６
（MCM5  minichromosome  maintenance  deficient  5,  cell  division  cycle  46  (S.  cerevisiae))
１４．電圧依存性アニオン選択チャンネルタンパク質  1、又はＶＤＡＣ１
（Voltage-dependent  anion-selective  channel  protein  1  (VDAC-1)）
【００２８】
１５．プロヒビチン（Prohibitin）
１６．NipSnap1タンパク質（NipSnap1  protein）
１７．ペロキシレドキシン  4  （Peroxiredoxin  4）
１８．スプライシングコアクチベータサブユニットSRm300
（Splicing  coactivator  subunit  SRm300）
１９．ロンプロテアーゼホモログ（Lon  protease  homolog）
２０．ピュロマイシン感受性アミノペプチダーゼ
（Puromycin-sensitive  aminopeptidase）
【００２９】
２１．EBNA-2  コアクチベータ  (100kD)  （EBNA-2  co-activator  (100kD)）
２２．JKTBP1
２３．GTP-結合性タンパク質ベータ鎖ホモログ
（GTP-binding  protein  beta  chain  homolog）
２４．核・塩素イオンチャンネルタンパク質
（Nuclear  chloride  ion  channel  protein）
２５．ウィリアム−ベウレン症候群染色体領域１ホモログ
（William-Beuren  syndrome  chromosome  region  1  homolog）
２６．抗酸化性タンパク質  2  （Antioxidant  protein  2  ）
【００３０】
２７．ペルオキシレドクシン  1  （Peroxiredoxin   1）
２８．コフィリン  1  （Cofilin  1）
２９．クルッペルタイプ亜鉛フィンガータンパク質、もしくは、PEG3
（Kruppel-type  zinc  finger  protein,  PEG3）
３０．スカフフォルドアッタッチメント因子B、又はHSP27  ERE-TATA-結合性タンパク質
（Scaffold  attachment  factor  B,  HSP27  ERE-TATA-binding  protein）
３１．スプライソゾーム関連タンパク質130（Spliceosome-associated  protein  130）
３２．T  細胞により認識される扁平上皮癌抗原３、又はSART3 
（Squamous  cell  carcinoma  antigen  recognized  by  T  cells  3,  SART3）
３３．ユビキチン活性化酵素  E1  （Ubiquitin-activating  enzyme  E1）
３４．カリオフェリン(インポルチン)ベータ１（Karyopherin  (importin)  beta  1）
【００３１】
３５．ha1225  遺伝子産物（The  ha1225  gene  product）
これら前立腺癌マーカポリペプチドを、アンドロゲン依存性前立腺癌の群とアンドロゲン非依存性前立腺癌の群とで発現を統計学的に比較検討したところ、p＜0.1において非依存群で増加したマーカポリペプチドが12個、減少したマーカポリペプチドが6個認められた。すなわち、前記前立腺癌マーカポリペプチドのうち、特にアンドロゲン非依存性前立腺癌に特異的なマーカが見出された。該アンドロゲン非依存性前立腺癌のマーカポリペプチドは次のとおりである。
【００３２】
（アンドロゲン非依存性を獲得した後、発現量が増加するマーカポリペプチド）
１８．スプライシングコアクチベータサブユニットSRm300
１９．ロンプロテアーゼホモログ
２０．ピュロマイシン感受性アミノペプチダーゼ
２１．EBNA-2  コアクチベータ  (100kD)
２２．JKTBP1
２３．GTP-結合性タンパク質ベータ鎖ホモログ
２４．核・塩素イオンチャンネルタンパク質
２５．ウィリアム−ベウレン症候群染色体領域１ホモログ
２６．抗酸化性タンパク質  2
２７．ペルオキシレドクシン  1
２８．コフィリン  1
（アンドロゲン非依存性を獲得した後、発現量が減少するマーカポリペプチド）
【００３３】
２９．クルッペルタイプ亜鉛フィンガータンパク質
３０．スカフフォルドアッタッチメント因子B、又はHSP27  ERE-TATA-結合性タンパク質
３１．スプライソゾーム関連タンパク質130
３２．T  細胞により認識される扁平上皮癌抗原３
３３．ユビキチン活性化酵素  E1
３４．カリオフェリン(インポルチン)ベータ１
３５．ha1225  遺伝子産物
【００３４】
したがって、抗体などを用いた検査により、被検者の血液中などに、前記１〜３５の前立腺癌マーカポリペプチドが見出された場合、該被験者を前立腺癌患者、又は前立腺癌ハイリスク者と判定することができる。また、被験者に、前記１８〜２８の前立腺癌マーカポリペプチドの少なくとも１種の増加、及び／又は２９〜３５の前立腺癌マーカポリペプチドの少なくとも１種の減少が観察される場合、該被験者はアンドロゲン非依存性前立腺癌を有するか、又はそのハイリスク者と判定することができる。
【００３５】
したがって、被験者から得た検体と、該前立腺癌マーカポリペプチドを検出することにより、前立腺癌を診断することができる。さらに、被験者から得た検体から、配列番号１８〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドの少なくとも１種を検出することにより、アンドロゲン非依存性前立腺癌の診断を行なうことができる。該前立腺癌マーカポリペプチドの検出は、被験者から得た検体と、該前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体とを接触させることにより行なうことができる。
【００３６】
本発明で用いる抗体は、配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体である。該抗体は、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。
本発明の抗体を用いる免疫検定(測定)法を挙げると、酵素免疫測定法(EIA)、酵素イムノメトリックアッセイ法(ELISA)、蛍光免疫測定法(FIA)、放射線免疫測定法(RIA)、発光免疫測定法、イムノブロット法、ウエスタンブロット法、免疫染色法などがある。
ウエスタンブロット法は、生体試料中に存在する当該タンパク質の分子量を知るために有効である。この方法は、例えば、臓器組織由来の粗抽出液などの生体試料液をアクリルアミドゲル電気泳動させた後、メンブランに転写し、当該タンパク質、又は当該ペプチドを認識する抗体と反応させ、生成する免疫複合体を標識第二抗体を用いて検出するものである。この方法では、該免疫複合体と結合する標識第二抗体の標識量を測定する。
【００３７】
免疫染色法は、組織、及び細胞における対象ポリペプチドの発現部位を解析するために有効である。この方法は、例えば、スライドガラス上に固定された組織切片、細胞などを、本発明の抗体と反応させ、生成する免疫複合体を標識第二抗体を用いて検出することにより実施する。この方法では、該免疫複合体と結合した標識第二抗体の標識量を測定する。
【００３８】
前記前立腺癌マーカポリペプチドを認識する抗体を用いる免疫検定の好ましい例として、ELISA法を挙げることができる。このELISA法は、一般的な競合法、サンドイッチ法などの手法に従って実施でき、更に液相系でも、固相系でも実施できる。
ELISA法の好ましい実施態様は次のとおりである。まず、標準抗原(例えば、精製した当該ペプチド)を適当な担体に固定化し、ブロッキングする。次いで、検出が望まれるマーカペプチドを含有するサンプル、及び当該抗体を、上記固定化標識抗原と接触させて、抗体-免疫複合体、及び抗体-標準抗原免疫複合体を競合的に生成させる。生成した抗体-免疫複合体の量を測定し、予め作製した検量線からサンプル中の、又は当該ポリペプチドの質量を決定することができる。
【００３９】
本発明の抗体と標準抗原との反応性が予め判っており、検量線などが作成できる場合には、前記固定化標準抗原の代わりに、当該ポリペプチドを含有するサンプルを固定化して用いることもできる。
上記ELISA法の実施態様においては、当該抗体を第一抗体として用い、この第一抗体に対する第二抗体を標識して用いることもできる。この場合は抗体-免疫複合体の量は、これに結合した標識第二抗体の標識量を測定することにより容易に求めることができる。上記方法の変法として、標識した第二抗体を用いることなく、第一抗体を、例えば酵素で標識して利用することもできる。更に、第一抗体をビオチンで標識し、第二抗体の代わりにアビシン、又はストレプトアビシンに酵素を結合させたものを用いてもよい。
【００４０】
（本発明の抗体の調製）
本発明で用いる抗体は、本発明の前立腺癌マーカポリペプチドを認識し、抗原抗体反応するものであれば、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明の抗体の製造に用いる抗原となる、ポリペプチド、ペプチド又はその断片には下記のものがある：
(1)  配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチド；
(2)  配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列から、アミノ酸残基１以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導する変異ポリペプチド；及び
(3)  前記(1)又は(2)のポリペプチド断片であって、かつ配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導するポリペプチド断片である。
【００４１】
なお、該ポリペプチド断片は、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導することができれば、特にその長さに制限はないが、通常、少なくとも１５アミノ酸残基、好ましくは、少なくとも２０アミノ酸残基、特に好ましくは、少なくとも２５アミノ酸残基を含むものである。なお、これらの(1)又は(2)のポリペプチド、又は(3)そのペプチド断片を、抗体誘導に好ましい成分と組み合わせて、抗体製造用組成物として用いることができる。本発明で用いる抗体を下記の方法で調製することができる。
【００４２】
（モノクローナル抗体の調製）
まず、モノクローナル抗体産生細胞を次のように作成することができる。本発明の前記(1)又は(2)のポリペプチド、又は(3)そのペプチド断片を、単独で、又は担体、希釈剤などと組み合わせて温血動物に投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。該投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なう。投与する温血動物の例を挙げると、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどがあり、特にマウス、及びラットが好ましい。
【００４３】
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓、又はリンパ節を採取する。そして、採取された組織に含まれる抗体産生細胞を同種、又は異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。
【００４４】
抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後述する標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature）、256、495  (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤の例を挙げると、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどがあり、特にＰＥＧが好ましい。
【００４５】
該骨髄腫細胞の例を挙げると、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞があり、特にＰ３Ｕ１が好ましい。
融合時における抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は、１：１〜２０：１程度である。細胞融合は、ＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００を１０〜８０％程度の濃度で添加し、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率良く実施できる。
【００４６】
得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングは種々の方法で行なうことができる。例えば、前立腺癌マーカポリペプチドの抗原を直接、又は担体とともに吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）に、ハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いた細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる。）、又はプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法；抗免疫グロブリン抗体、又はプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したマーカポリペプチドを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
【００４７】
モノクローナル抗体の選別は、常法に従って行なうことができる。通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。また、選別、及び育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、牛胎児血清１〜２０％、好ましくは１０〜２０％含むRPMI  1640培地、牛胎児血清１〜１０％を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））、又はハイブリドーマ培養用無血清培地（SFM-101、日水製薬（株））などを用いることができる。
【００４８】
培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常、炭酸ガス５％の湿潤環境下で行なう。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００４９】
モノクローナル抗体の分離、精製は、常法に従って行なうことができる。例えば、通常、免疫グロブリンの分離、精製に利用される、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、DEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相による方法、並びにプロテインＡ又はプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法などである。
【００５０】
（ポリクローナル抗体の調製）
本発明のポリクローナル抗体は、常法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原自体、又はその抗原性ペプチド断片とキャリアタンパク質との複合体をつくり、前記モノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
【００５１】
温血動物の免疫に用いる免疫複合体を調製する場合、キャリアタンパク質の種類、及び該キャリアタンパク質とハプテンとの混合比は、キャリアタンパク質に架橋させたハプテンに対して抗体が効率よく産生されれば、特に制限されない。例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又はヘモシアニンをキャリアタンパク質として用いた場合、これらを重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合で架橋させるのが好ましい。
【００５２】
また、ハプテンとキャリアタンパク質のカップリングには、種々の縮合剤を用いることができる。該縮合剤の例を挙げると、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等がある。該縮合生成物を、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体、又は担体、希釈剤とともに投与する。
【００５３】
投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なう。ポリクローナル抗体は、前記方法で免疫された温血動物の血液、腹水などから採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして行なうことができる。また、ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離、精製法により行なうことができる。
【００５４】
本発明のガン診断用キットは、このようにして得られたポリクローナル、又はモノクローナル抗体を含むものである。該ガン診断用キットは、配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体を、少なくとも１種利用することで、前立腺癌の診断に使用することができる。また、該ガン診断用キットは、配列番号１８〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体を、少なくとも１種を利用することにより、アンドロゲン非依存性前立腺癌を診断することができる。
【００５５】
なお、該診断用キットは、必要に応じて、免疫反応用ウェル、染色剤、検出用の酵素標識抗体、洗浄液、抗体希釈液、検体希釈液、酵素基質、酵素基質液希釈液、その他の試薬を含むものである。
また、配列番号１〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体は、前立腺癌特異的タンパク質の発現を抑制するものであるから、ガン化の予防、進行遅延、及び治療に使用することができる。特に、配列番号１８〜３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体は、前立腺癌のアンドロゲン非依存性獲得を阻害し、アンドロゲン非依存性前立腺癌の進行遅延、及び治療に使用することができる。
【００５６】
本発明の前記前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体を含む医薬組成物は、経口的に、又は非経口的に投与することができ、さらに該非経口的投与は、組織への局所的な投与を含む。
本発明の医薬組成物を経口投与する場合、汎用されている担体などの製剤用成分、例えば、充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、緩衝剤、等張化剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、コーティング剤、界面活性剤、吸収促進剤、保湿剤、湿潤剤、吸着剤、滑沢剤及び賦形剤などを用いることができる。また、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などの添加剤を用いてもよい。
【００５７】
製薬用成分の具体的な例を挙げると、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸などの賦形剤、水、エタノール、単シロツプ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラツク、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖などの崩壊剤、白糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩等の滑沢剤などである。さらに必要に応じて、上記の各剤形について公知のドラッグデリバリーシステムの技術を採用し徐放化、局所適用化（トローチ、バッカル剤、舌下錠等）、薬物放出制御、腸溶性化、胃溶性化などを施すことができる。
【００５８】
また、本発明の医薬組成物を非経口投与する場合、点滴、静脈注射、皮下注射、筋肉注射などの注射による投与、油脂製坐剤、水溶性坐剤、座剤による直腸投与などの形態とすることができる。該調剤は、製薬分野における通常の担体を用い、常法により容易に行なうことができる。
本発明の抗体を含む医薬組成物は、例えば、ヒト、その他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。該抗体の投与量は、対象の状態、投与ルートなどにより適宜変わるが、例えば、注射剤の形態で体重６０ｋｇの成人患者に投与する場合は、一日につき約５０〜５００mg程度、好ましくは約１００〜２５０mg程度、より好ましくは約１２０〜２００mg程度を静脈から投与するのが好ましい。
【００５９】
また、本発明の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、すなわち、配列番号３６〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドの少なくとも１種を検出することにより、被験者が前立腺癌を有するか、又はそのそのハイリスク者であるか否かを判定することができる。特に、配列番号５３〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドの少なくとも１種を検出することにより、被験者がアンドロゲン非依存性前立腺癌を有するか、又はそのハイリスク者であるか否かを判定することができる。
【００６０】
本発明の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する、前立腺癌の診断方法では、被験者から得た検体、例えば、血液、細胞抽出液、生検試料などに含まれるポリヌクレオチドを検出する。
該ポリヌクレオチドの検出は、本発明の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、その部分配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅するか、又は適当なベクターに組み込んだポリヌクレオチドを、本発明のポリペプチドの一部、又は全領域をコードするポリヌクレオチド、又は合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって行なうことができる。該ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング(5)に記載の方法などで行なうことができる。該ハイブリダイゼーションは、ハイストリンジェントな条件、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、特に約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、特に約６０〜６５℃の条件で行なうのが好ましい。また、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
【００６１】
本発明では、下記(i)、(ii)又は(iii)を含む、前立腺癌診断用核酸プローブを用いることができる。
(i)  配列番号３６〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列と、相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド；
(ii)  配列番号３６〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列と、相補的なヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片；又は
(iii)  配列番号３６〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド断片である。
【００６２】
特に、配列番号５３〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、アンドロゲン非依存性癌診断用核酸プローブとして用いることができる。
また、本発明の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＰＣＲ法によって検出する場合、常法で行なうことができる。
該ＰＣＲ法では、配列番号３６〜７０のいずれか１種のヌクレオチド配列に対するセンス鎖断片をフォワードプライマーとして、アンチセンス鎖断片をリバースプライマーとして用いる。
特に、配列番号５３〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片からなるプライマー（フォワードプライマー）、及び配列番号５３〜７０のいずれか１のヌクレオチド配列と、相補的なヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片からなるプライマー（リバースプライマー）を用いることにより、アンドロゲン非依存性前立腺癌の診断を行なうことができる。
【００６３】
なお、該フォワードプライマーの長さは、特に制限する必要はないが、通常１４〜６０bpであり、かつリバースプライマーの長さも特に制限する必要はないが、通常１４〜６０pbとするのが好ましい。
本発明の前立腺癌診断用キットは、本発明の前立腺癌マーカポリペプチドをハイブリダイゼーションによって検出する場合、配列番号３６〜７０のいずれか１のポリペプチド配列の一部、又は全領域をコードするポリヌクレオチド、又は合成ＤＮＡを用いて標識したものを、前立腺癌診断用核酸プローブとして含む。
【００６４】
また、該前立腺癌診断用キットが、アンドロゲン非依存性前立腺癌の検出を目的とし、該前立腺癌マーカポリペプチドをハイブリダイゼーションによって検出する場合、配列番号５３〜７０のいずれか１のポリペプチド配列の一部、又は全領域をコードするポリヌクレオチド、又は合成ＤＮＡを用いて標識したものを、前立腺癌診断用核酸プローブとして含む。
【００６５】
本発明の前立腺癌診断用キットは、本発明の前立腺癌マーカポリペプチドをＰＣＲ法によって検出する場合、配列番号３６〜７０のいずれか１種のヌクレオチド配列に対するセンス鎖断片をフォワードプライマーとして、アンチセンス鎖断片をリバースプライマーとして含む。また、本発明の前立腺癌診断用キットが、アンドロゲン非依存性前立腺癌の検出を目的とし、前立腺癌マーカポリペプチドをＰＣＲ法によって検出する場合、配列番号５３〜７０のいずれか１種のヌクレオチド配列に対するセンス鎖断片をフォワードプライマーとして、アンチセンス鎖断片をリバースプライマーとして含むものである。
【００６６】
本発明の前立腺癌マーカポリペプチドは、そのコードされているポリヌクレオチドである、配列番号３６〜７０のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込み、かつ該発現ベクターで適当な宿主を形質転換し、該宿主を増殖させることにより製造することができる。
【００６７】
本発明の前立腺癌マーカポリペプチドの発現ベクターは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当なベクター中のプロモーターの下流に連結することで製造することができる。
ここで用いるベクターには、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどがある。
【００６８】
本発明で用いるプロモーターは、使用する宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどがある。該宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどがあり、該宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、該宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどがあり、さらに該宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどである。
【００６９】
本発明の発現ベクターには、さらに所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジンなどを含むものを用いることができる。該選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などがある。また、必要に応じて、宿主に適したシグナル配列を、本発明のポリペプチドのＮ端末側に付加する。該宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡシグナル配列、OmpＡシグナル配列などが、該宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列などが、該宿主が酵母である場合は、ＭＦαシグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列などが、該宿主が動物細胞である場合には、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などを利用できる。このように構築した本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００７０】
本発明で用いる宿主には、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、及び動物細胞などがある。該バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular  ＆  General  Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法がある。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods  in  Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA），７５巻，１９２９(１９７８)などの方法がある。昆虫細胞又は昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6,  47-55(1988）などに記載の方法がある。また、動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法がある。このようにして、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を作製することができる。
【００７１】
該宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含くまれている。ここで炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープリカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液など、また無機栄養分としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどある。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００７２】
エシェリヒア属菌を培養する培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal  of  Experiments  in  Molecular  Genetics），４３１−４３３，Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  New  York１９７２〕が好ましい。
また、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
【００７３】
宿主が酵母である形質転換体を培養する培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian,  K.  L.  ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter,  G.  A.  ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA），８１巻，５３３０（１９８４）〕がある。該培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００７４】
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する場合、グレイスインセクト培地(Grace's  Insect  Medium:  Grace,  T.C.C.,Nature,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を加えた倍地などを用いる。該培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００７５】
また、宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ  １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The  Journal  of  the  American  Medical  Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding  of  the  Society  for  the  Biological  Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などを用いる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。このようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜又は細胞外に本発明のポリペプチドを産生させることができる。
【００７６】
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、常法に従う。例えば、本発明のポリペプチドを培養菌体、細胞から抽出するに際して、培養後、公知の方法で菌体又は細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などである。該緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体又は細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、又は抽出液中に含まれるポリペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行なう。これらの公知の分離・精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などがある。
【００７７】
該ポリペプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法よって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。なお、組換え体が産生するポリペプチドを、精製前又は精製後に適当なタンパク修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどがある。このようにして生成した本発明のポリペプチドは、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
【実施例１】
【００７８】
前立腺癌細胞株からのポリペプチド試料の抽出
American  Type  Culture  Collection  (ATCC,  Rockville,  MD,  USA)から入手した、ヒト前立腺癌細胞株LNCaPを前立腺癌マーカポリペプチドを検索するサンプリングとして使用した。LNCaP細胞を、ウシ胎仔血清10％を含有するRPMI倍地(Roswell  Park  Memorial  Institute  medium:  RPMI)中で、CO2５%湿潤環境下、３７℃で培養した。また、本実施例では、LNCaP細胞を日本SLC（静岡、日本）から購入したオスヌードマウス  (BALB/c  strain)に移植した。
【００７９】
まず、LNCaP細胞1x107個をマトリゲル0.1  ml  (Matrigel:  Becton  Dickinson  Labware,  NJ,  USA)  に混入し、該混合物を雄ヌードマウスの背部皮下に移植した。癌組織が100から200  mm3になったところで、精巣を摘除した。癌組織は一次的に縮小したが、まもなく再増殖を始めた。該癌が200から400  mm3に達したところで摘出した。精巣摘除前に採取した癌をアンドロゲン依存性  (Androgen  Dependent;  AD)、精巣摘除後に再増殖した癌をアンドロゲン非依存性  (Androgen  Independent;  AI)  とした。
【実施例２】
【００８０】
癌マーカポリペプチド分布マップの作製
実施例１で得た癌細胞を２０倍重量のタンパク抽出液でホモジュナイズし、超遠心した後、得られた上清をプロテオーム解析に使用した。本発明者らは、該プロテオーム解析をアガロース二次元電気泳動法にタンデム質量分析法(MS/MS)を組み合わせて実施した。
【００８１】
アガロース二次元電気泳動法は、一次元目の等電点電気泳動にアガロースを適用した公知の方法によって行った(2)。すなわち、前記抽出液100μl（タンパク質１mgに相当）を直径3.4  mm、長さ180  mmのアガロースゲル上端に置き、700  vの電荷を20時間かけた。その後、このゲルを195×120  mmのSDS-PAGEゲル  (12%均一ゲルと6-10%濃度勾配ゲル)の上に置き、SDSサンプルバッファー  (SDS2%、グリセロール10%、2-メルカプトエタノール5%、ブロモフェニルブルー0.02%、0.05Mトリス-HCl,  pH  6.5)  を上部から流して、60  mAで泳動した。泳動終了後、ゲルをクーマジーブリリアントブルーR-350  (Coomasie  Brilliant  Blue  R-350)で染色した。
【００８２】
前立腺癌のアガロース二次元電気泳動ゲル上の合計324個のタンパク質スポットの同定を進め、ゲル間で重複しているスポットを除いて303個のスポットに番号をつけて二次元電気泳動ゲルマップを作成した。高分子タンパク質領域に重点をおいた6-10%濃度勾配ゲルから108個（図１）、中低分子タンパク質領域に重点を置いた12%均一ゲルから195個（図２）のスポットに番号を付した。その後、これらスポットから、合計233個のタンパク質を同定することができた。
【００８３】
なお、図１及び２は、実施例１のアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞に由来する、癌マーカポリペプチドの分布を示すマップである。また、得られた二次元電気泳動ゲルは乾燥後、画像ファイルとしてコンピュータに取り込み、画像解析ソフトウエア(Phoretix  2D  Advanced  Version  5.01  :  Nonlinear  Dynamics  Ltd,  UK)を用いてタンパク質スポットの定量解析を行った。
【実施例３】
【００８４】
実施例２で得られた二次元電気泳動ゲルのスポットを、公知の液体クロマトグラム−タンデム質量分析法(LC-MS/MS)によって同定した。すなわち、ゲル上のスポットを切り出し、タンパク質をトリプシンでゲル内消化したのちに約１５pmolに相当する量をLC-MS/MSにかけた。ここから得られたペプチド断片の質量情報を解析ソフトウエア(SEQUEST)を用いて解析し、米国NCBIのデータベースにより前記ゲル上のスポットに含まれるタンパク質を同定した。タンパク質のアミノ酸配列と塩基配列もNCBIデータベースによった。なお、２００３年９月１日現在、下記ＵＲＬでプロテオーム解析ソフトウエア(SEQUEST)を入手することができる。
【００８５】
URL:  http://fields.scripps.edu/sequest/index.html
またNCBIデータベースのURLは次のとおりである。
URL:  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi/
前記NCBIデータベースで同定した全タンパク質233個をMedLineを用いて検索したところ、これまで前立腺癌との関連性が報告されていないタンパク質35個が含まれており、すなわち、新たな前立腺癌マーカポリペプチドが見出された。
【００８６】
ここで同定されたタンパク質は、本明細書の実施の態様の項に列挙されている。それぞれのタンパク質に付された番号は、本明細書に添付された配列表のアミノ酸配列番号と一致している。
【実施例４】
【００８７】
アンドロゲン非依存性前立腺癌マーカポリペプチドの選別
二次元電気泳動ゲルは乾燥後に画像ファイルとしてコンピュータに取り込み、画像解析ソフトウエアPhoretix  2D  Advanced  Version  5.01  (Nonlinear  Dynamics  Ltd,  UK)を用いてタンパク質スポットの定量解析を行った。アンドロゲン依存群５検体と非依存群5検体の二次元電気泳動ゲルのタンパク質スポットを個別にPhoretix  2D  Advanced  Version  5.01で定量比較し、２群間における各スポットの発現量をＴ検定によって統計学的に検定した。
【００８８】
アンドロゲン依存群と非依存群とでタンパク質の発現を統計学的に比較検討したところ、実施例３で見出された前立腺癌マーカポリペプチドのうち、p＜0.1において非依存群で増加したタンパク質が12個、減少したタンパク質が6個認められた。同様に、p＜0.05では、増加したタンパク質が７個、減少したタンパク質が4個認められた。
【００８９】
図３に、前立腺癌のアンドロゲン非依存性獲得に伴い統計学的有意差 (p＜0.05) をもって量的増減を示したタンパク質スポットと、その定量比較グラフを示した。図３において、ADはアンドロゲン依存群を、AIはアンドロゲン非依存群をPNは、図１及び２におけるタンパク質スポット特定番号（Protein-identification  number）を示す。なお、該PNは実施例で用いるタンパク質スポットの固有番号であり、本明細書の配列表の配列番号とは一致していない。
【００９０】
また、肉眼的に各群のゲルで増減のみられたポリペプチドも含めて文献的に検討したところ、従来、前立腺癌との関連が報告されていないものは1７個あった（図３）。これらは、配列表に記載されている配列番号１８〜３６のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドである。これらポリペプチドの電気泳動像を解析の結果、配列番号１８〜２８のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得した場合に発現量が増加し、配列番号２９〜３６のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、発現量が減少することが明らかになった。
【実施例５】
【００９１】
ヒト前立腺癌における前立腺癌マーカポリペプチドの発現
ヒト前立腺癌における、前記前立腺癌マーカポリペプチドの発現を、抗体を用いたウエスタンブロットにより確認した。
（ヒト前立腺癌サンプルの調製）
本実施例で用いたヒトの前立腺癌組織、及び正常前立腺組織は、神奈川県相模原市にある北里大学病院泌尿器科で手術を受けた患者から同意を得て採取した。患者の詳細は以下のとおりである。
【００９２】
１．ＮＰ１：正常前立腺組織：51歳男性、膀胱癌にて合併摘除された前立腺から正常前立腺組織を採取した。
２．Ｐ８：正常前立腺組織：70歳男性、前立腺癌にて前立腺全摘除術を施行された。非癌部位から正常前立腺組織を採取した。
３．Ｐ３：正常前立腺組織：６０歳男性、膀胱癌にて合併摘除された前立腺から正常前立腺組織を採取した。
４．Ｐ５：前立腺癌組織（アンドロゲン依存性）：５０歳男性、前立腺癌にて前立腺全摘除術を施行された。肉眼的に癌部位から前立腺癌組織を採取した。
５．Ｐ１：前立腺癌組織（アンドロゲン非依存性）：８０歳男性、前立腺癌にてアンドロゲン除去療法を試行後に再発し、尿閉となったため、経尿道的前立腺切除術が施行された。切除組織はアンドロゲン非依存性前立腺癌であり、これを採取した。
【００９３】
６．ＣａＰ５：前立腺癌組織（アンドロゲン非依存性）：６４歳男性、前立腺癌のため、6ヶ月間の術前アンドロゲン除去療法を施行後に前立腺全摘除術を施行された。肉眼的に癌部位から前立腺癌組織を採取した。
得られた癌組織を20倍重量のタンパク抽出液でホモジュナイズし、超遠心後の上清を用いて検討を行った。
まず、LNCaPマウス接種モデルの癌抽出液と前記ヒト前立腺組織抽出液のタンパク質濃度を公知のBradford法で定量し、SDSサンプルバッファー  (SDS2%、グリセロール10%、2-メルカプトエタノール5%、ブロモフェニルブルー0.02%、0.05Mトリス-HCl、pH  6.5)で希釈して2  mg/mlに調製した。これを97℃で15分間インキュベートしてサンプルを調製した。
【００９４】
該サンプルを各10μlずつ12.5%  SDS-PAGEゲルで電気泳動した。このゲルのタンパク質をPVDF膜上に転写した。これを3％ゼラチン溶液でブロッキングして、当該タンパク質の一次抗体溶液で反応させ、アルカリフォスファターゼ標識の二次抗体を反応させた。
（前立腺癌マーカポリペプチドと抗体）
使用した一次抗体は下記のとおりである。
配列番号３のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチド(Rad50)：市販の抗ヒトRAD50ウサギポリクローン性抗体（AB3754,  Chemicon  International,  Inc.,  CA,  USA）
配列番号１１.のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチド(Mop-4)：市販の抗ヒトMOP4ウサギポリクローン性抗体（AB5442P,  Chemicon  International,  Inc.,  CA,  USA）
配列番号１４のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチド(VDAC-1)：市販の抗ヒトVDAC-1ヤギポリクローン性抗体（sc-8828,  Santa  Cruz  Biotechnology,  Inc.,  CA,  USA）
配列番号１９のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチド(LON  protease)：配列番号１９のアミノ酸配列のポリペプチド断片（配列番号７１）を合成し、キャリアタンパク質と組み合わせてウサギの皮下に８回接種後、血清を採取し、該血清を一次抗体として使用した。
【００９５】
ポリペプチド断片  CFDIAFPDEQAEALAVER  （配列番号：７１）
配列番号２１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチド(EBNA-2  co-activator;  p100)：配列番号２１のアミノ酸配列のポリペプチド断片（配列番号７２）を合成し、キャリアタンパク質と組み合わせてウサギの皮下に８回接種後、血清を採取し、該血清を一次抗体として使用した。
【００９６】
ポリペプチド断片  RPASPATETVPAFSERTC  （配列番号：７２）
配列番号３０のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチド(Scaffold  attachment  factor  B,  HSP27  ERE-TATA-binding  protein)：配列番号３０のアミノ酸配列のポリペプチド断片（配列番号７３）を合成し、キャリアタンパク質と組み合わせてウサギの皮下に８回接種後、血清を採取し、該血清を一次抗体として使用した。
【００９７】
ポリペプチド断片  CRMQAQWEREERERLEIAR  （配列番号：７３）
配列番号３３のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチド(Ubiquitin-activating  enzyme  E1)：市販の抗ヒトUbiquitin-activating  enzyme  E1マウスモノクローン性抗体  (MAB3520,  Chemicon  International,  Inc.,  CA,  USA)
使用した二次抗体は下記とおりで、購入して使用した。
【００９８】
抗マウスIgG（アルカリフォスファターゼ標識）(115-055-003,  Jackson  ImmunoResearch  Laboratories,  Inc.,  PA,  USA)
抗ウサギIgG（アルカリフォスファターゼ標識）(172-1016,  Bio-Rad  Laboratories,  CA,  USA)
抗ヤギIgG（アルカリフォスファターゼ標識）(AP-5000,  Vector  Laboratories,  Inc.,  CA,  USA)
（結果）
配列番号３のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチド(Rad50)の抗体による検出結果：
Rad50は正常前立腺組織で強い発現が認められるが、前立腺癌組織では発現が減少していた（図４）。
【００９９】
配列番号１１.のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチド(Mop-4)の抗体による検出結果：
Mop-4は正常前立腺組織で強い発現が認められるが、前立腺癌組織では発現が減少していた（図５）。
配列番号１４のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチド(VDAC-1)の抗体による検出結果：
VDAC-1は正常前立腺組織で発現が少なく、前立腺癌組織では発現が増加していた（図６）。
【０１００】
配列番号１９のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチド(LON  protease)の抗体による検出結果：
LON  proteaseは正常前立腺組織で発現が少なく、前立腺癌組織では発現が増加していた。さらに、アンドロゲン依存群に比べて非依存群で発現が増加していた（図７）。
配列番号２１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチド(EBNA-2  co-activator;  p100)の抗体による検出結果：
EBNA-2  co-activator;  p100は正常前立腺組織で強い発現が認められるが、前立腺癌組織では発現が減少していた。また、アンドロゲン依存群に比べて非依存群で発現が増加していた（図８）。
【０１０１】
配列番号３０のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチド(Scaffold  attachment  factor  B,  HSP27  ERE-TATA-binding  protein)の抗体による検出結果：
該マーカポリペプチドは、正常前立腺組織で発現が少なく、前立腺癌組織では発現が増加していた。また、アンドロゲン依存群に比べて非依存群で発現が減少していた（図９）。
【０１０２】
配列番号３３のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチド(Ubiquitin-activating  enzyme  E1)の抗体による検出結果：
Ubiquitin-activating  enzyme  E1は正常前立腺組織で発現が少なく、前立腺癌組織では発現が増加していた。また、アンドロゲン依存群に比べて非依存群で発現が減少していた（図１０）。
【実施例６】
【０１０３】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)による分析
アンドロゲン依存性、及びアンドロゲン非依存性のヒト前立腺癌における、前立腺癌マーカポリペプチドをコードする、配列番号５３から７０のmRNA発現レベルを、RT-PCを用いて次のように分析することができる。
まず、前立腺組織中のmRNAの抽出を、ISOGEN RNA 分離キット(ISOGEN  RNA  isolation  kit,  ISOGEN社)を用いて製造業者の仕様書にそって行なう。RT-PCRは、タカラRNA  LA  PCR  キットVer.  1.1(Takara  RNA  LA  PCR  kit  Ver.  1.1,タカラ酒造、大津)を用いて公知の方法に拠って行なう(6)。
【０１０４】
すなわち、第１鎖  cDNAは総RNA  (1.5μg)をテンプレートとして合成する。ランダムヘキサマー(Random  hexamer,  50  pM)を5  mM  MgCl2,  1  x  RNA  PCR  緩衝液,  10  mM  dNTP  mix,  20  U  リボヌクレアーゼ阻害剤を含む反応液で30℃10分、55℃15分、99℃5分間、インキュベートする。蒸留水で40μlになるよう希釈した後、そのうちの5μlに2.5  U  Tag  ポリメラーゼ(タカラ酒造)，1.5  mM  MgCl2,  1  x  RNA  PCR  緩衝液,  10  mM  dNTP  mix,  そして、フォワードプライマー及びリバースプライマーそれぞれ20  pMを加え、DNA  サーマルサイクラー(ASTEC、福岡)を用いて35サイクル増幅する。PCR産物を3%アガロースゲル電気泳動によって分析する。この分析のために用いるプライマー／プローブのセットの最適な配列を、コンピュータによって決定する。
【０１０５】
本明細書の配列表の配列番号は、以下に説明する配列を示す。なお、配列番号１〜３５のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、これまで前立腺癌との関係が知られておらず、本発明者らにより初めて前立腺癌との関係が知られたものである。また、配列番号３６〜７０のポリヌクレオチドは、配列番号１〜３５のいずれか１のポリペプチドをコードするmRNA  又はDNAである。また、下記説明における略号「NCBI」は、データベース  National  Center  for  Biotechnology  Information  を意味し、「PN」は、図１及び２の電気泳動像におけるスポットの番号を意味する。
【０１０６】
（配列番号：１）  本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列は、KIAA0336遺伝子産物のアミノ酸配列でもある。該遺伝子産物は、脳cDNAライブラリーに見られ、モチーフデータベースから、シグナル伝達、核酸調節、細胞骨核に関与することが報告されている。NCBI  Accession  No.7662062,  PN:029
（配列番号：２）  本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列は、TAR  RNA-相互作用タンパク質（TRIP  TAR  RNA-interacting  protein,  TRIP）又はTRIPポリペプチドと考えられている遺伝子産物のアミノ酸配列でもある。胎児心でmRNAが高発現することが報告されている。Reed  (1998)により卵巣癌cDNAライブラリーから分離され、MSで83kDだがSDS-PAGEでは160kDなので，ダイマー形成していると考えられている(Wilson,  1998)。NCBI  Accession  No.4758690,  PN:041
（配列番号：３）  本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列は、RAD50  ホモログ（RAD50  homolog:  S.cerevisiae）のアミノ酸配列でもある。該ホモログがアデノウイルスの腫瘍性タンパク質(oncoprotein)とRAD50-MRE11-NBS1複合体を不活化させて発癌性を発揮することが報告されている。
NCBI  Accession  No.19924129,  PN:045
【０１０７】
（配列番号：４）  本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列は、仮想ポリペプチドFLJ10839のアミノ酸配列でもある。SAPモチーフがあるため，DNA結合部位を有すると思われるが、これまで機能は不明であった。
NCBI  Accession  No.20471264,  PN:049
（配列番号：５）  本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列は、富ロイシンPPR-モチーフ包含（Leucine-rich  PPR-motif  containing）遺伝子産物のアミノ酸配列でもある。該遺伝子産物は、肝臓芽腫のcDNAで高発現し、そのアミノ酸配列から機能推定により、細胞骨格，細胞内輸送，転写，核細胞質閉鎖に関与していると考えられている。
NCBI  Accession  No.18959202,  PN:054
【０１０８】
（配列番号：６）  本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列は、RNA  ヘリカーゼ  KIAA0801  （RNA  helicase  KIAA0801）のアミノ酸配列でもある。NCBI  Accession  No.7662318,  PN:057.2
（配列番号：７）  本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列は、ユビキチン特異性プロテアーゼ  7  （Ubiquitin  specific  protease  7）のアミノ酸配列でもある。該プロテアーゼ７は、P53遺伝子を安定化させてp53を介する成長阻害やアポトーシスを補助する癌抑制タンパクであると報告されている。
NCBI  Accession  No.4507857,  PN:058
【０１０９】
（配列番号：８）  本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列は、カルシウム(ca2+)恒常性内部原形質網状質タンパク質（Calcium  (ca2+)  homeostasis  endoplasmic  reticulum  protein）のアミノ酸配列でもある。該タンパク質は、脳cDNAライブラリー、又はヒト赤白血病(HEL)細胞cDNA発現ライブラリーから発現が確認され、Ca2+の恒常性に働き、分化成長に関係することが報告されている。
NCBI  Accession  No.18204653,  PN:061
【０１１０】
（配列番号：９）  本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列は、MGC21133タンパク質（Nucleoporin  133kDa,  Protein  for  MGC21133）のアミノ酸配列でもある。該タンパク質は、メラノーマ細胞で発現し、mRNAの核外輸送を担っているという報告がある。NCBI  Accession  No.18043079,  PN:065
（配列番号：１０）  本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列は、RNA  ヘリカーゼ関連タンパク質（RNA  helicase-related  protein）又はその関連ポリペプチドと考えられる遺伝子産物のアミノ酸配列でもある。該遺伝子産物は、ヒト膵島cDNAライブラリーで確認され、デッドボックスポリペプチドファミリー(DEAD  box  protein  family)と考えられている。NCBI  Accession  No.11267525,  PN:069
【０１１１】
（配列番号：１１）  本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列は、MOP-4のアミノ酸配列でもある。該MOP-4は、ヒト単球に発現し、ユビキチン−プロテアソーム系でのタンパク分解の第1段階でユビキチンと結合、カスケードを開始させることが報告されている。NCBI  Accession  No.11990422,  PN:070
（配列番号：１２）  本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列は、インスリン減成酵素（Insulin-degrading  enzyme）のアミノ酸配列でもある。該酵素は、インスリン、グルカゴン、及びβアミロイドを分解する活性を有する。アルツハイマー病では、βアミロイドの脳背髄液中への産生量に変化がないにもかかわらず、βアミロイドが脳に沈着するので、該酵素の減少が原因といわれている。
NCBI  Accession  No.20548083,  PN:091
【０１１２】
（配列番号：１３）  本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列は、ＭＣＭ５ミニクロモソーム維持欠陥５，細胞分画サイクル４６（MCM5  minichromosome  maintenance  deficient  5,  cell  division  cycle  46  (S.  cerevisiae))遺伝子産物のアミノ酸配列でもある。該遺伝子産物は、Burkitリンパ腫で発現することが報告されている。NCBI  Accession  No.13177775,  PN:0102
（配列番号：１４）  本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列は、電圧依存性アニオン選択チャンネルタンパク質  1  (Voltage-dependent  anion-selective  channel  protein  1  (VDAC-1)）のアミノ酸配列でもある。該タンパク質はBCL-2ファミリーのアポトーシス調節に関与することが報告されている。
NCBI  Accession  No.130683,  PN:231
【０１１３】
（配列番号：１５）  本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列は、プロヒビチン（Prohibitin）のアミノ酸配列でもある。プロヒビチンは、DNA合成阻害、及びPHBの変異により乳癌発症に関与する可能性が報告されている。
NCBI  Accession  No.464371,  PN:244.2
（配列番号：１６）  本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列は、ニプスナップ１タンパク質(NipSnap1  protein)のアミノ酸配列でもある。該タンパク質は、C.エレガンス(C.elegance)染色体IIIの遺伝子産物に類似し、細胞内顆粒移動に関係することが報告されている。NCBI  Accession  No.17380144,  PN:258
（配列番号：１７）  本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列は、ペロキシレドキシン  4  （Peroxiredoxin  4）のアミノ酸配列でもある。該タンパク質は、サイトカインや免疫系の転写に関与していることが報告されている。
NCBI  Accession  No.3024727,  PN:259
【０１１４】
（配列番号：１８）  本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は上昇する。該配列は、スプライシングコアクチベータサブユニットSRm300  （Splicing  coactivator  subunit  SRm300）のアミノ酸配列でもある。該サブユニットSRm300は、RNA結合性ポリペプチド及び
AT-富要素結合因子などとして知られている。SRM160及び前駆mmrと会合して、核スペックル内に存在し、SRM160/SRM300デプリートスプライシン反応の再構成に関与することが報告されている。NCBI  Accession  No.19923466,  PN:002
（配列番号：１９）  本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は上昇する。該配列は、ロンプロテアーゼホモログ（Lon  protease  homolog）のアミノ酸配列でもある。該ホモログは、DNA損傷時にSOS遺伝子群が誘導され、その修復に働くことが報告されている。
NCBI  Accession  No.12644239,  PN:092.2
【０１１５】
（配列番号：２０）  本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は上昇する。該配列は、ピュロマイシン感受性アミノペプチダーゼ（Puromycin-sensitive  aminopeptidase）のアミノ酸配列でもある。該ペプチダーゼは神経ペプチドの活性化、細胞増殖と多様性に必要なプロテアーゼであり、胎児脳のcDNAライブラリーから同定され、かつ白血病細胞でビタミンDで刺激すると増加することが報告されている。NCBI  Accession  No.2499902,  PN:099
（配列番号：２１）  本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は上昇する。該配列は、EBNA-2  コアクチベータ（EBNA-2  co-activator  (100kD)）のアミノ酸配列でもある。EBNA-2  コアクチベータは、特定遺伝子の翻訳を活性化し、かつEBV関連のB細胞の転写に必須であり、さらにショウジョウバエのメラニン合成に関与することが報告されている。
NCBI  Accession  No.7657431,  PN:116,  088
【０１１６】
（配列番号：２２）  本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は上昇する。該配列は、異種核酸リボ核ポリペプチドＤ様ホモログ(JKTBP)のアミノ酸配列でもある。該ホモログについて、RNAのスプライシングと移動に関与することが報告されている。
NCBI  Accession  Nos.7446333,  4512253,  PN:223
【０１１７】
（配列番号：２３）  本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は上昇する。該配列は、GTP-結合性タンパク質ベータ鎖ホモログ（GTP-binding  protein  beta  chain  homolog）のアミノ酸配列でもある。該ホモログは、GTP-結合性ポリペプチドβ鎖ホモログ、HMC  B複合ポリペプチド12.3などとして知られ、リンパ球活性化機能、インスリン様生育因子(IGF-1)であるラットRACK1  (Rn.2568)のレセプターと類似することなどが報告されている。
NCBI  Accession  No.5174447,  PN:233,  237
【０１１８】
（配列番号：２４）  本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は上昇する。該配列は、核・塩素イオンチャンネルタンパク質（Nuclear  chloride  ion  channel  protein）のアミノ酸配列でもある。NCBI  Accession  No.2073569,  PN:243
（配列番号：２５）  本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は上昇する。該配列は、ウィリアム−ベウレン症候群染色体領域１ホモログ（William-Beuren  syndrome  chromosome  region  1  homolog）のアミノ酸配列でもある。該ホモログは、Wbscr1  代用スプライス産物、及び  William-Beuren症候群染色体領域  1ホモログ等として知られ、mRNA利用のレベルでポリペプチド合成の開始を刺激する機能が報告されている。
NCBI  Accession  No.18204592,  PN:251
【０１１９】
（配列番号：２６）  本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は上昇する。該配列は、抗酸化性タンパク質  2  （Antioxidant  protein  2  ）のアミノ酸配列でもある。該タンパク質は、細胞のレドックス制御に関連し、過酸化水素を減らし、短鎖有機脂肪酸及びリン脂質過酸化物を減らし、リン脂質の代謝制御及び酸化障害に対する防御における役割が報告されている。NCBI  Accession  Nos.1718024,  4758638,  PN:266
（配列番号：２７）  本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は上昇する。該配列は、ペルオキシレドクシン  1  （Peroxiredoxin  1）のアミノ酸配列でもある。ペルオキシレドクシン  1は、細胞内の過酸化水素を調節することで生育因子とTNFαのシグナル伝達をコントロールしており、酸化ストレス下に出現するということが報告されている。
NCBI  Accession  No.548453,  PN:284
【０１２０】
（配列番号：２８）  本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は上昇する。該配列は、コフィリン非筋肉アイソフォーム(Cofilin,  non-muscle  isoform  )(18  kDa  リンポリペプチド)１のアミノ酸配列でもある。該アイソフォームは、アクチンと結合し、その細胞質から核への移動を助け、LIM-キナーゼによりリン酸化された際、アクチンを脱重合させることが報告されている。NCBI  Accession  No.116848,  PN:297
（配列番号：２９）  本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は低下する。該配列は、クルッペルタイプ亜鉛フィンガータンパク質（Kruppel-type  zinc  finger  protein,  PEG3）のアミノ酸配列でもある。該タンパク質は、成人脳で高発現し、グリオーマ細胞にトランスフェクションさせると癌原性消失するので腫瘍抑制ポリペプチドと考えられている。
NCBI  Accession  No.11494024,  PN:028
【０１２１】
（配列番号：３０）  本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は低下する。該配列は、スカフフォルドアッタッチメント因子B、又はHSP27  ERE-TATA-結合性タンパク質（Scaffold  attachment  factor  B,  HSP27  ERE-TATA-binding  protein）のアミノ酸配列でもある。該タンパク質は、HSP27プロモーター結合タンパクで，各種乳癌の細胞ラインの核内で発現し、乳癌の原因遺伝子候補と考えられている。NCBI  Accession  No.21264343,  PN:043
（配列番号：３１）  本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は低下する。該配列は、スプライソゾーム関連タンパク質130（Spliceosome-associated  protein  130）のアミノ酸配列でもある。該タンパク質は、スプライシング因子3b,サブユニット3(130kDa)及びスプライセオソーム会合ポリペプチド130などとして知られ、スプライセオソームにおいて機能する複合体SF3bの構成要素であることが報告されている。
NCBI  Accession  No.11034823,  PN:059
【０１２２】
（配列番号：３２）  本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は低下する。該配列は、Ｔ細胞により認識される扁平上皮癌抗原３（Squamous  cell  carcinoma  antigen  recognized  by  T  cells  3,  SART3）のアミノ酸配列でもある。該抗原は、腫瘍特異性T細胞を誘導して腫瘍免疫に働き、また，mRNAスプライシングにも関与すること、及び大腸癌で発現，正常組織では発現していないことが報告されている。
NCBI  Accession  No.7661952,  PN:062
【０１２３】
（配列番号：３３）  本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は低下する。該配列は、ユビキチン活性化酵素Ｅ１（Ubiquitin-activating  enzyme  E1）のアミノ酸配列でもある。ユビキチン活性化酵素Ｅ１は、ユビキチン−プロテアソーム系でのタンパク分解の第1段階でユビキチンと結合、カスケードを開始させることが報告されている。
NCBI  Accession  No.4507763,  PN:074.2,  078
【０１２４】
（配列番号：３４）  本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は低下する。該配列は、カリオフェリン(karyopherin)ベータ１、又はインポルチン（importin）ベータ１のアミノ酸配列でもある。該遺伝子産物は、核内シグナルをもつタンパクと結合して、このタンパクを細胞質から核内へ輸送し、RANと結合することにより輸送は終了することが報告されている。NCBI  Accession  No.19923142,  PN:103
（配列番号：３５）  本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は低下する。該配列は、ha1225  遺伝子産物（The  ha1225  gene  product）のアミノ酸配列でもある。該遺伝子産物は、ヒトαグルコシダーゼに関連することが報告されている。
NCBI  Accession  No.577295,  PN:118
【０１２５】
（配列番号：３６）  配列番号１の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：３７）  配列番号２の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：３８）  配列番号３の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：３９）  配列番号４の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：４０）  配列番号５の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
【０１２６】
（配列番号：４１）  配列番号６の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：４２）  配列番号７の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：４３）  配列番号８の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：４４）  配列番号９の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：４５）  配列番号１０の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
【０１２７】
（配列番号：４６）  配列番号１１の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：４７）  配列番号１２の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：４８）  配列番号１３の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：４９）  配列番号１４の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：５０）  配列番号１５の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：５１）  配列番号１６の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
【０１２８】
（配列番号：５２）  配列番号１７の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：５３）  配列番号１８の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：５４）  配列番号１９の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：５５）  配列番号２０の前立腺癌マーカするmRNA又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：５６）  配列番号２１の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：５７）  配列番号２２の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
【０１２９】
（配列番号：５８）  配列番号２３の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：５９）  配列番号２４の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：６０）  配列番号２５の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：６１）  配列番号２６の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：６２）  配列番号２７の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
【０１３０】
（配列番号：６３）  配列番号２８の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：６４）  配列番号２９の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：６５）  配列番号３０の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：６６）  配列番号３１の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：６７）  配列番号３２の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmmr  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：６８）  配列番号３３の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
【０１３１】
（配列番号：６９）  配列番号３４の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：７０）  配列番号３５の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするmRNA  又はcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：７１）  配列番号１９の前立腺癌マーカポリペプチドのポリペプチド断片のアミノ酸配列を示す。
（配列番号：７２）  配列番号２１の前立腺癌マーカポリペプチドのポリペプチド断片のアミノ酸配列を示す。
（配列番号：７３）  配列番号３０の前立腺癌マーカポリペプチドのポリペプチド断片のアミノ酸配列を示す。
【０１３２】
（参考文献）
1.  Miyake  H,  Hara  S,  Arakawa  S,  Kamidono  S,  Hara  I.  Optimal  timing  and  dosage  of  chemotherapy  as  a  combined  treatment  with  androgen  withdrawal  in  the  human  prostate  LNCaP  tumour  model.  Br  J  Cancer.  2001,  84:859-63.
2.  Oh-Ishi  M,  Satoh  M,  Maeda  T.  Electrophoresis.  2000  May;  21(9):  1653-69
3.  Klose  J,  Kobalz  U.  Two-dimensional  electrophoresis  of  proteins:  an  updated  protocol  and  implications  for  a  functional  analysis  of  the  genome.  Electrophoresis  1995,  16:  1034-59
4.  Wilm  M,  Shevchenko  A,  Houthaeve  T,  Breit  S,  Schweigerer  L,  Fotsis  T,  et  al.  Femtomole  sequencing  of  proteins  from  polyacrylamide  gels  by  nano-electrospray  mass  spectrometry.  Nature  1996,  379:  466-9
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6.  Uchida  T,  Gao  JP,  Wang  C  et  al.  Mol  Urol.  2001  Summer;5(2):71-8
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】図１は、高分子タンパク質領域に重点をおいた6-10％濃度勾配ゲルのアガロース2次元電気泳動により得られた、前立腺癌に含まれるタンパク質の分布マップを示す。
【図２】図２は、中低分子タンパク質領域に重点をおいた12％濃度均一ゲルのアガロース2次元電気泳動により得られた、前立腺癌に含まれるタンパク質の分布マップを示す。
【図３】図３は、アンドロゲン依存群、及びアンドロゲン非依存群において、量的増減を示したタンパク質スポットと、その定量比較グラフを示す。
【図４】図４は、前立腺癌マーカポリペプチドであるRad50の前立腺癌組織における発現を示す電気泳動の像である。
【図５】図５は、前立腺癌マーカポリペプチドであるMop-4の前立腺癌組織における発現を示す電気泳動の像である。
【図６】図６は、前立腺癌マーカポリペプチドであるVDAC-1の前立腺癌組織における発現を示す電気泳動の像である。
【図７】図７は、前立腺癌マーカポリペプチドであるLON proteaseの前立腺癌組織における発現を示す電気泳動の像である。
【図８】図８は、前立腺癌マーカポリペプチドであるEBNA-2  co-activator;  p100の前立腺癌組織における発現を示す電気泳動の像である。
【図９】図９は、前立腺癌マーカポリペプチドであるScaffold  attachment  factor  B,  HSP27  ERE-TATA-binding  proteinの前立腺癌組織における発現を示す電気泳動の像である。
【図１０】図１０は、Ubiquitin-activating  enzyme  E1の前立腺癌組織における発現を示す電気泳動の像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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