(57)【要約】【課題】  軟骨損傷治療のため、生体内および生体外での軟骨組織再生を可能にする三次元細胞結合体の製造を、産業化を前提に、より実用的にするためには、ＴＧＦ−βのような蛋白性因子に替わる非蛋白性の軟骨誘導因子、特に軟骨組織創製促進を可能する非蛋白性の軟骨誘導因子を見つけだすことが重要な課題である。【解決手段】  インビトロで培養された軟骨細胞、同前駆細胞、間葉系幹細胞あるいは生体内に存在するこれら細胞を、生体内、生体外において還元型コーエンザイムＱ１０あるいは酸化型コーエンザイムＱ１０あるいはこれらの混合物を含有する三次元培養環境下で軟骨細胞に分化誘導させる方法および同方法による生体内および生体外での軟骨組織再生用を可能にする三次元細胞結合体の製造方法を開発することにより、上記課題解決が可能となる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内、生体外において、脂溶性ビタミンを含有する培地を使用する三次元培養環境下で生体組織由来の細胞、同前駆細胞あるいは間葉系幹細胞を培養することを特徴とする生体組織を創製する方法。
【請求項２】
脂溶性ビタミンが還元型コーエンザイムＱ１０もしくは酸化型コーエンザイムＱ１０あるいはその混合物である請求項第１項記載の生体組織創製方法。
【請求項３】
三次元培養環境で使用する培地が、アスコルビン酸を含有する培地である請求項第１項記載の生体組織創製方法。
【請求項４】
三次元培養環境下の細胞が、単純な細胞塊である請求項第１項記載の生体組織創製方法。
【請求項５】
三次元培養環境下の細胞が、細胞を天然物由来の生体適合性材料から作製された組織再生用の支持体に播種した三次元細胞結合体である請求項第１項記載の生体組織創製方法。
【請求項６】
三次元培養環境下の細胞が、細胞を非天然物由来の生体適合性材料から作製された組織再生用の支持体に播種した三次元細胞結合体である請求項第１項記載の生体組織創製方法。
【請求項７】
三次元培養環境下の細胞が、生体組織損傷部に移植した請求項第４項記載の細胞塊あるいは請求項５、６項記載の三次元細胞結合体である請求項第１項記載の生体組織創製方法。
【請求項８】
生体組織が軟骨組織である請求項第１〜７のいずれか１項記載の生体組織創製方法。
【請求項９】
軟骨組織が関節軟骨組織である請求項第８項記載の生体組織創製方法。
【請求項１０】
請求項１〜９項のいずれか１項記載の方法で創製された生体内および生体外の生体組織。
【請求項１１】
請求項１〜９項のいずれか１項記載の方法および請求項第１０項記載の生体組織を用いた生体損傷治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試験管内で培養された軟骨細胞、同前駆細胞、間葉系幹細胞あるいは生体内に存在するこれら細胞を脂溶性ビタミンを含有する三次元環境下で培養することによる生体内および生体外で効率的軟骨組織製造方法およびこれを用いた軟骨損傷治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節症などの軟骨疾患は、老齢人口の増加とともに急速な増加傾向にあり、これに起因する社会的経済的コストは大きく、関節機能を回復できる有効な治療法が強く望まれている。
【０００３】
従来、損傷関節面が適切な細胞外基質を再構築するとみられる自己由来細胞を移植することにより損傷関節面が修復されるという仮説に基づき、主に関節由来の軟骨細胞を培養し同じ患者の膝に導入する治療が有望とされ、これの実用化、製品化もなされた（Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇら（非特許文献１、非特許文献２）。しかしながらこの治療方法はスポーツ障害など小規模の軟骨損傷を対象としたもので患者数の多い重篤度の高い変形性膝関節症など大規模な軟骨損傷への適用は無理とされている。また小規模軟骨損傷への適用においても加齢による患者軟骨細胞の軟骨組織形成能力の低下、あるいは年齢を問わず体外で増幅させることによる軟骨組織形成能の低下などによりその治療効果に疑問が投げかけられているのが現実である（非特許文献３）。
【０００４】
さらに自己の関節由来軟骨細胞など自家組織を細胞ソースとする自家移植治療においては、患者自身の細胞を関節より採取する必要があることよる侵襲性の問題がある。そこで採取による侵襲度が比較的に低い間葉系幹細胞の利用が期待され、この実用化の検討も行われている。
【０００５】
間葉系幹細胞（ＭＳＣs）は脂肪、骨、軟骨、弾性、筋および線維などの結合組織を含む特殊な型の間葉あるいは結合組織に分化することのできる骨髄、血液、真皮、および骨膜に見出される形成多能芽細胞あるいは胚状細胞である。これらの細胞は通常骨髄に非常に低い頻度で存在する。組織培養でこれらの細胞の集団を分離し、精製し、また増幅させるプロセスは、フリーデンスタイン他により既に報告されている（非特許文献４）。
【０００６】
またＭＳＣsの軟骨細胞への分化は既に数多く報告されている（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。生体内でのＭＳＣsから軟骨創製は、ウサギを用いて軟骨欠損治療実験を行ったＷａｋｉｔａｎｉらの報告がある（非特許文献９）あるいは。また生体外での軟骨創製は、Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅらのウサギ骨髄由来間葉系幹細胞を用いた軟骨創製に関する報告など（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）がある。
【非特許文献１】ＢｒｉｔｔｂｅｒｇらＴｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌ．３３１，Ｎｏ．１４、８８９−８９５（１９９４）
【非特許文献２】諸橋ら（培養自己軟骨移植法の米国における企業化事例）組織培養工学、Ｖｏｌ．２３、５６８−５７１
【非特許文献３】Ｂｒｅｉｎａｎら  Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ  Ｖｏｌ．２０：５２５−５３８（１９９７）
【非特許文献４】Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎら  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｎｅｔ．Ｖｏｌ．２０、２６３−２７２（１９８７）
【非特許文献５】Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１０６，２１３９（１９８８）
【非特許文献６】Ｂａｂら  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．Ｖｏｌ．８４、１３９−１５１（１９８６）
【非特許文献７】Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎら  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．７、２４３−２７２（１９９０）
【非特許文献８】Ｃａｐｌａｎら  Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．９、６４１−６５０（１９９１）
【非特許文献９】Ｗａｋｉｔａｎｉら  Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ａｍ．、Ｖｏｌ．７６Ａ、５７９（１９９４）
【非特許文献１０】Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら  Ｔｒａｎｓ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．Ｓｏｃ．Ｖｏｌ．２１、６５（１９９６）
【非特許文献１１】Ｊｏｈｏｎｓｔｏｎｅら  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２３８、２６５−２７２（１９９８）
【非特許文献１２】Ｍａｃｋａｙら  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌ．４、Ｎｏ．４、４１５−４２８（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の現状において軟骨細胞、同前駆細胞あるいは間葉系幹細胞を用いる場合ともに課題とされるのが、如何に細胞に軟骨組織形成能を維持させるかである。すなわち軟骨細胞では加齢あるいは増幅操作による軟骨細胞機能の低下、喪失、また間葉系幹細胞では同じく加齢あるいは増幅操作による軟骨細胞への分化能の低下、喪失が問題となる。そのような状況で、より安定に軟骨細胞機能あるいは軟骨細胞への分化能を保持し、良好な軟骨形成を導く環境の設定が望まれている。
【０００８】
三次元環境下での培養が脱分化を抑制し、各組織細胞への分化能を維持させることは知られており、三次元環境下で体外あるいは体内で軟骨創製を行うことによりある程度軟骨組織の形成が維持、増強されるとの報告は数多くなされている。しかしながら実際の臨床における軟骨再生ではまだまだ十分といえる状況ではなく、分化能の低下を改善するさらなる手法の開発が強く望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
分化能を維持させる最も簡便であり、実用的な手法は因子の活用である。軟骨細胞としての機能を維持あるいは間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化誘導効果を有するものとして、デキサメタゾンなどのグルココルチコイド、トランスフォーミング成長因子−βファミリーと呼ばれる因子（ＴＧＦ−β）、例えば骨形態形成タンパク質（望ましくはＢＭＰ−２あるいはＢＭＰ−４）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インヒビンＡあるいは軟骨形成刺激活性因子（ＣＳＡ）など、Ｉ型コラーゲン（とりわけゲル形態にあるもの）などのコラーゲン性細胞外基質、およびレチノイン酸などのビタミンＡ類似体、アスコルビン酸などがある。
【００１０】
上記の「背景技術」の項で述べてきたより実用的な軟骨作製研究では、軟骨細胞、間葉系幹細胞からの軟骨創製ではともにアスコルビン酸が有効な因子として用いられているが増幅に伴う脱分化を満足できるレベルで抑制するものではない。
【００１１】
以上の課題を解決すべく種々の因子を探索、検討した結果、脂溶性ビタミン類のひとつ還元型コーエンザイムＱ１０および酸化型コーエンザイムＱ１０が軟骨細胞あるいは間葉系幹細胞を用いた軟骨再生においてアスコルビン酸の組織形成能増強作用をさらに強めることを見出し、この還元型コーエンザイムＱ１０および酸化型コーエンザイムＱ１０を用いた軟骨組織形成促進方法、さらにはこれを活用することによる軟骨損傷治療方法を提供する本発明の完成に至った。
【００１２】
即ち、本発明の第１は、生体内、生体外において、脂溶性ビタミンを含有する培地を使用する三次元培養環境下で生体組織由来の細胞、同前駆細胞あるいは間葉系幹細胞を培養することを特徴とする生体組織を創製する方法に関する。好ましい実施態様では、脂溶性ビタミンが還元型コーエンザイムＱ１０もしくは酸化型コーエンザイムＱ１０あるいはその混合物である。本発明の第２は、第１発明の方法で得られた生体組織を用いた生体損傷治療方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、軟骨損傷治療のための生体内および生体外での軟骨組織再生用三次元細胞結合体の製造を、産業化を前提に、より実用的にするための手段を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
軟骨細胞としての機能を維持あるいは間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化誘導効果を有する因子として、デキサメタゾンなどのグルココルチコイド、トランスフォーミング成長因子−βファミリーと呼ばれる因子（ＴＧＦ−β）、例えば骨形態形成タンパク質（望ましくはＢＭＰ−２あるいはＢＭＰ−４）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インヒビンＡあるいは軟骨形成刺激活性因子（ＣＳＡ）など、Ｉ型コラーゲン（とりわけゲル形態にあるもの）などのコラーゲン性細胞外基質、およびレチノイン酸などのビタミンＡ類似体、ビタミンＢ１２、トコフェロールなどの脂溶性ビタミンあるいはアスコルビン酸など水溶性ビタミンがある。特にＴＧＦ−βは軟骨創製において必須のものであるとされている。
【００１５】
本発明の非蛋白性の軟骨分化因子探索では、上記の軟骨分化誘導活性を有する蛋白性因子を共存させることなく、血清存在下で培養した関節軟骨細胞の軟骨基質産生を促進するものをターゲットとしてスクリーニングを行った。結果、脂溶性ビタミン、特に還元型コーエンザイムＱ１０および酸化型コーエンザイムＱ１０にこの強い活性を見出した。
【００１６】
本発明において、還元型コーエンザイムＱ１０および酸化型コーエンザイムＱ１０の３次元培養環境下での濃度は、１ｎｇ／ｍｌ以上、１０００μｇ／ｍｌ以下であり、望ましくは１００ｎｇ／ｍｌ以上、１００μｇ／ｍｌ以下である。
【００１７】
軟骨細胞、同前駆細胞は生体の軟骨組織すべてを供給元として用いることができるが好ましくは関節あるいは肋骨由来の軟骨細胞である。特に関節軟骨細胞は最も好ましい供給元である。軟骨細胞はこれら組織からコラゲナーゼを用いることにより分離することができる。分離された軟骨細胞は、ウシまたはヒト血清環境あるいは合成無血清環境下で培養増幅され、軟骨組織の形成はこれらの細胞を三次元形態、望ましくは三次元環境を付与する支持体との混合物（三次元細胞結合体と呼ぶ）として合成無血清あるいは血清環境下で培養することにより行われた。この三次元細胞結合体は体外および体内での軟骨形成に適用することができる。
【００１８】
間葉系幹細胞（ＭＳＣs）は骨髄、血液（末梢血を含む）、骨膜および真皮、ならびに中胚葉起源を持つ他の組織などからウシまたはヒト血清環境あるいは合成無血清環境下の密度勾配分画などにより分離することができる。それら組織に含まれているＭＳＣｓは年齢と共に大幅に減少するが、とりわけ骨髄から分離することができ、分離された分画調製物は細胞の少くとも約９０％、また望ましくは少くとも約９５％がヒト間葉幹細胞の細胞を含むであろうということが考えられる。
【００１９】
さらに分画調製された同細胞は、ウシまたはヒト血清培地を含む環境あるいは無血清合成培地を含む環境下で培養増幅され、軟骨組織の形成はこれらの細胞を三次元形態、望ましくは三次元環境を付与する支持体との混合物（三次元細胞結合体と呼ぶ）として無血清合成培地を含む環境下で培養することにより行われた。この三次元細胞結合体は体外および体内での軟骨形成に適用することができる。
【００２０】
三次元培養環境としては、以下のものを用いることができる。軟骨細胞、前駆細胞、間葉系幹細胞を遠心分離等の処理をすることにより単純な細胞塊状態の三次元培養環境を構築することができる。ここで言う単純な細胞塊とは、三次元培養環境を付与する特別の支持体のない状態の細胞塊である。また天然物あるいは非天然物由来の生体適合性材料を用いて作製した支持体を三次元培養環境として用いることができる。
【００２１】
天然物由来の生体適合性材料としては、コラーゲン、ゼラチン、キチン、キトサン、寒天、基底膜成分、フィブロネクチン、ラミニン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸およびそれらの混合物を用いることができる。
【００２２】
非天然物由来の生体適合性材料としては、α及びβ−ヒドロキシカルボン酸の加水分解性ポリマーであるポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸／グリコール酸共重合体、ポリεカプロラクトン、乳酸／εカプロラクトン共重合体等を用いることができる。
【００２３】
なお本発明において「組織再生用の支持体」とは、生体を構成する種々組織の再生用支持体を意味する。本発明の組織再生用支持体の構造としてはゲル、不織布、フォーム、スポンジ、織物構造等が挙げられることができる。
【００２４】
また本発明で使用される組織再生用支持体は、厚さを適宜設定し、患部を補填するために必要なサイズにすることができる。本発明の支持体の厚さは、好ましくは５０μｍから１ｃｍである。なおヒトの膝あるいは股関節の治療に用いる場合には、１ないし４ｍｍの厚さのものが実際上好ましい。
【００２５】
また上記支持体の形状および面積については特に限定はなく、患部を補填するために十分なサイズのものを作製することができる。例えば、ヒトの膝あるいは股関節の治療に用いる場合には、好ましくは１０ないし２０ｍｍの直径の円筒形のものである。
【００２６】
次に、本発明の軟骨組織再生用三次元細胞結合体の製造法について説明する。上記製造法は、本発明で使用される三次元支持体に、軟骨細胞、同前駆細胞あるいは間葉系幹細胞を播種し、人工環境内および／または生体内で合成培地を用い三次元培養環境下で培養することを特徴とする。
【００２７】
ここで使用される「合成培地」という用語は、この発明の組成物がとりわけこの発明の方法に従って試験管内軟骨形成を受けることができ、また最小必須培地、アスコルビン酸塩あるいはその類似体、鉄源等微量金属およびインスリンもしくはインスリン状成長因子を含むような維持、成長あるいは培養培地を意味する。なお、その他蛋白性因子としてヒトでの実績のあるウシアルブミンを用いることが好ましい。本実験では最小必須培地としてＤＭＥＭ、鉄源等微量、インスリン、ウシアルブミンを別添加として用いた。
【００２８】
上記製造法において、間葉系幹細胞あるいは前駆細胞の播種は公知の方法で行うことができるが、支持体１ｃｍ3あたり１０6〜１０8の密度となるように細胞又は前駆細胞を播種することが好ましい。
【００２９】
上記方法において、「人工環境内で培養」とは、試験管、培養器など生体外で培養することを意味する。静置または旋回でのバッチ培養、あるいは循環式の連続培養を行うことができ、望ましくは旋回バッチ培養あるいは循環式の連続培養である。
【００３０】
また本発明で使用された三次元細胞結合体の製造法において、人工環境内の培養は、培養液を支持体に対し毎秒０．１ｃｍから毎秒５０ｃｍの速度で移動させる条件で行われることが、三次元細胞結合体への新鮮な培地の供給の観点、また三次元細胞結合体からの老廃物の除去の観点より好ましい。
【００３１】
上記方法において、「生体内で培養」とは、例えば、支持体あるいは支持体と細胞の混合物を生体組織内に設置して細胞を培養するような、生体組織内での培養を意味する。
【実施例】
【００３２】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３３】
（実施例１）軟骨組織の創製
生後約１年の日本ザーネン種ヤギ膝関節より軟骨組織を採取し、コラゲナーゼにより軟骨細胞を分離した。この細胞を１０％ウシ胎児血清及び終濃度５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸を含有するＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地を用いて培養し、２回継代した軟骨細胞を培養軟骨の作製に供した。
【００３４】
１×１０7個／５ｍｌの細胞懸濁液（１０％ウシ胎児血清及び終濃度５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸を含有するＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地）１ｍｌを１５ｍｌのポリプロピレン製の遠心チューブに入れ、１２００ｒｐｍで５分間遠心処理することにより、遠心チューブ内に上清部の培地と下部の単純な細胞塊からなる３次元培養環境を作製した。酸化型コーエンザイムＱ１０、還元型コーエンザイムＱ１０をそれぞれ０．１７５μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌとなるように培地に添加し、５％ＣＯ2、３７℃で１４日間培養した。培地交換を３日間毎実施した。比較として、酸化型コーエンザイムＱ１０あるいは還元型コーエンザイムＱ１０無添加での培養を同様に行った。培養後の細胞塊について組織学的及び生化学的に評価した。組織学的評価としてはアルシアンブルー染色、生化学的評価としてグリコサミノグリカン産生の色素法による定量を行った。結果、細胞塊の組織染色では、図１に示されたように顕著なアルシアンブルー陽性を呈した。この培養軟骨を４Ｍグアニジン塩酸溶液で可溶化し、ＤＭＭＢ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｂｌｕｅ）法と呼ばれる色素法により軟骨に特徴的なマトリクスのひとつであるグリコサミノグリカンの定量を試みたところ、還元型コーエンザイムＱ１０あるいは酸化型コーエンザイムＱ１０の添加により顕著な産生増強が認められた（図２）。図２中、ＤＮＡ測定は抽出効率の違いによるバラツキを相殺するための内部標準として測定したものである。したがってグリコサミノグリカン量は単位ＤＮＡ量あたりの数字（グリコサミノグリカン産生比）で示されている。ＧＡＧ／ＤＮＡはグリコサミノグリカン／ＤＮＡを指す。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】１４日間培養したヤギ軟骨細胞塊の組織染色（アルシアンブルー染色）の結果を示したものである。
【図２】１４日間培養したヤギ軟骨細胞塊のグリコサミノグリカンを定量したものである。
【符号の説明】
【００３６】
１    ＱＸ；酸化型コーエンザイムＱ１０
２    ＱＨ；還元型コーエンザイムＱ１０
３    ＧＡＧ；グリコサミノグリカン
【図１】
2005080599.tif 000002
【図２】
2005080599.tif 000003