(57)【要約】      （修正有）【課題】短時間で比較的簡易に活性化された細胞を検出することができる手段を提供する。【解決手段】基板上に複数のウェルを有し、かつ前記ウェルの底部にｐＨ感応性蛍光色素を含有するセンサ部を有するマイクロウェルアレイチップ。このチップの製造方法。このマイクロウェルアレイチップのウェルに被検体を含む溶液を収納し、次いで前記ウェルに収納された溶液のｐＨの変化を、センサ部からの蛍光強度を計測することで求めて、被検体の活性を検定する方法。【選択図】図１
2005253412.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に複数のウェルを有し、かつ前記ウェルの底部にｐＨ感応性蛍光色素を含有するセンサ部を有するマイクロウェルアレイチップ。
【請求項２】
ｐＨ感応性蛍光色素を含有するセンサ部が、ｐＨ感応性蛍光色素を基板表面に共有結合させたものである請求項1に記載のマイクロウェルアレイチップ。
【請求項３】
ｐＨ感応性蛍光色素を含有するセンサ部が、ｐＨ感応性蛍光色素を含有する多孔質ガラスである請求項1に記載のマイクロウェルアレイチップ。
【請求項４】
センサ部上に水素イオン透過性膜をさらに設けた請求項1〜3のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップ。
【請求項５】
水素イオン透過性膜が酢酸セルロース膜またはニトロセルロース膜である請求項4に記載のマイクロウェルアレイチップ。
【請求項６】
前記ｐＨ感応性蛍光色素が、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートをはじめとするフルオレセインの誘導体、８−ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸、セミナフトローダフロース（SNARF）及びセミナフトフルオレセイン(SNAFL)とそれらの誘導体である請求項１〜5のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップ。
【請求項７】
前記ウェルが、直径５〜１００μｍの範囲である請求項１〜6のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップ。
【請求項８】
基板表面にｐＨ感応性蛍光色素を含有する層を設け、次いでｐＨ感応性蛍光色素を含有する層の上に、ウェルを形成するための複数の貫通孔を有する層を設けることを含む請求項1に記載のマイクロウェルアレイチップの製造方法。
【請求項９】
基板表面にアミノ基含有層を設け、アミノ基含有層にアミノ基と反応し得る官能基を有するｐＨ感応性蛍光色素を反応させて、基板表面にｐＨ感応性蛍光色素を共有結合させ、次いで得られたｐＨ感応性蛍光色素層の上に、ウェルを形成するための複数の貫通孔を有する層を設けることを含む請求項2に記載のマイクロウェルアレイチップの製造方法。
【請求項１０】
基板表面に多孔質ガラス層を設け、この多孔質ガラス層にｐＨ感応性蛍光色素を固定化し、次いで得られたｐＨ感応性蛍光色素固定化多孔質ガラス層の上に、ウェルを形成するための複数の貫通孔を有する層を設けることを含む請求項3に記載のマイクロウェルアレイチップの製造方法。
【請求項１１】
基板表面にｐＨ感応性蛍光色素を含有する層を設け、ｐＨ感応性蛍光色素を含有する層の上に、水素イオン透過性膜を設け、次いで水素イオン透過性膜の上にウェルを形成するための複数の貫通孔を有する層を設けることを含む請求項4に記載のマイクロウェルアレイチップの製造方法。
【請求項１２】
ウェルを形成するための複数の貫通孔を有する層が、光不透過性である請求項8〜11のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜7のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップのウェルに被検体を含む溶液を収納し、次いで前記ウェルに収納された溶液のｐＨの変化を、センサ部からの蛍光強度を計測することで求めて、被検体の活性を検定する方法。
【請求項１４】
前記ウェル１つに１つの前記被検体が収納されている請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記被検体が細胞である請求項13または14に記載の方法。
【請求項１６】
細胞が、免疫細胞であり、抗原を用いた刺激に対する免疫細胞の活性変化を測定する請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜7のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップのウェルに動物の組織の初代もしくは継代培養細胞を含む溶液を収納し、かつ前記溶液に被試験物質を共存させた状態で、前記ウェルに収納された溶液のｐＨの変化をセンサ部からの蛍光強度を計測することで求めて、前記被試験物質の前記細胞に対する影響を試験する方法。
【請求項１８】
前記動物がヒトである請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記被試験物質が生理活性物質であり、この生理活性物質の前記細胞に対する薬理活性を求める請求項17又は18に記載の方法。
【請求項２０】
前記被試験物質が環境試料であり、この環境試料の前記細胞に対する毒性を求める請求項17又は18に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウェルにｐＨセンサ機能を付与したマイクロウェルアレイチップ、より詳しくは、本発明は、マイクロアレイ型の光計測に基づくｐＨセンサチップに関する。さらに本発明は、このマイクロウェルアレイチップの製造方法、及びこのマイクロウェルアレイチップを用いた被検体、例えば、細胞の活性検定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、DNAチップ、プロティンチップに続くバイオチップとして細胞チップが関心を集めている。本発明者らは直径10μmのマイクロウェルを１チップあたり数十万個、アレイ状に配置したマイクロウェルアレイチップを用いて、そこにリンパ細胞を1個ずつ配置し、抗原刺激することで陽性の細胞を１個単位で選び出し、回収し、遺伝子解析などを行うことで、効率的、かつ特異的な抗体医薬の開発につなげる研究を行っている[民谷ら：バイオインダストリー, 20(7), 60-67(2003)]。
【非特許文献１】民谷ら：バイオインダストリー, 20(7), 60-67(2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
この技術では、活性化された細胞を検出する技術が重要となる。これまでは、例えば、細胞が免疫細胞の場合、マイクロウェルアレイチップの各マイクロウェルに抗原を添加し、細胞を刺激し、抗原に反応する細胞を、Ｃａイオン依存性蛍光色素を用いて検出していた。しかるに、Ｃａイオン依存性蛍光色素を用いた検出は、以下のような問題があった。
(1)蛍光が短時間しか続かず観察が難しい。
(2)抗原刺激以外の外部環境変化による刺激に対しても同様の応答がみられることがある。
【０００４】
そこで本発明は、上記問題を解決するためになされたものであり、短時間で比較的簡易に活性化された細胞を検出することができる手段を提供することにある。
【０００５】
本発明者らは、細胞の生育に伴って乳酸が生成され、細胞を取り囲む培養液に放出されることに注目し、細胞を収納したウェル内の液のｐＨ変化を、細胞活性化の指標として利用することを考え、この考えを基に、細胞を収納したウェル内の液のｐＨ変化を検知する方法について種々検討した結果、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
[請求項１]基板上に複数のウェルを有し、かつ前記ウェルの底部にｐＨ感応性蛍光色素を含有するセンサ部を有するマイクロウェルアレイチップ。
[請求項２]ｐＨ感応性蛍光色素を含有するセンサ部が、ｐＨ感応性蛍光色素を基板表面に共有結合させたものである請求項1に記載のマイクロウェルアレイチップ。
[請求項３]ｐＨ感応性蛍光色素を含有するセンサ部が、ｐＨ感応性蛍光色素を含有する多孔質ガラスである請求項1に記載のマイクロウェルアレイチップ。
[請求項４]センサ部上に水素イオン透過性膜をさらに設けた請求項1〜3のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップ。
[請求項５]水素イオン透過性膜が酢酸セルロース膜またはニトロセルロース膜である請求項4に記載のマイクロウェルアレイチップ。
[請求項６]前記ｐＨ感応性蛍光色素が、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートをはじめとするフルオレセインの誘導体、８−ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸、セミナフトローダフロース（SNARF）及びセミナフトフルオレセイン(SNAFL)とそれらの誘導体である請求項１〜5のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップ。
[請求項７]前記ウェルが、直径５〜１００μｍの範囲である請求項１〜6のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップ。
[請求項８]基板表面にｐＨ感応性蛍光色素を含有する層を設け、次いでｐＨ感応性蛍光色素を含有する層の上に、ウェルを形成するための複数の貫通孔を有する層を設けることを含む請求項1に記載のマイクロウェルアレイチップの製造方法。
[請求項９]基板表面にアミノ基含有層を設け、アミノ基含有層にアミノ基と反応し得る官能基を有するｐＨ感応性蛍光色素を反応させて、基板表面にｐＨ感応性蛍光色素を共有結合させ、次いで得られたｐＨ感応性蛍光色素層の上に、ウェルを形成するための複数の貫通孔を有する層を設けることを含む請求項2に記載のマイクロウェルアレイチップの製造方法。
[請求項１０]基板表面に多孔質ガラス層を設け、この多孔質ガラス層にｐＨ感応性蛍光色素を固定化し、次いで得られたｐＨ感応性蛍光色素固定化多孔質ガラス層の上に、ウェルを形成するための複数の貫通孔を有する層を設けることを含む請求項3に記載のマイクロウェルアレイチップの製造方法。
[請求項１１]基板表面にｐＨ感応性蛍光色素を含有する層を設け、ｐＨ感応性蛍光色素を含有する層の上に、水素イオン透過性膜を設け、次いで水素イオン透過性膜の上にウェルを形成するための複数の貫通孔を有する層を設けることを含む請求項4に記載のマイクロウェルアレイチップの製造方法。
[請求項１２]ウェルを形成するための複数の貫通孔を有する層が、光不透過性である請求項8〜11のいずれか１項に記載の製造方法。
[請求項１３]請求項１〜7のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップのウェルに被検体を含む溶液を収納し、次いで前記ウェルに収納された溶液のｐＨの変化を、センサ部からの蛍光強度を計測することで求めて、被検体の活性を検定する方法。
[請求項１４]前記ウェル１つに１つの前記被検体が収納されている請求項13に記載の方法。
[請求項１５]前記被検体が細胞である請求項13または14に記載の方法。
[請求項１６]細胞が、免疫細胞であり、抗原を用いた刺激に対する免疫細胞の活性変化を測定する請求項15に記載の方法。
［請求項１７］
請求項１〜7のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップのウェルに動物の組織の初代もしくは継代培養細胞を含む溶液を収納し、かつ前記溶液に被試験物質を共存させた状態で、前記ウェルに収納された溶液のｐＨの変化をセンサ部からの蛍光強度を計測することで求めて、前記被試験物質の前記細胞に対する影響を試験する方法。
［請求項１８］
前記動物がヒトである請求項17に記載の方法。
［請求項１９］
前記被試験物質が生理活性物質であり、この生理活性物質の前記細胞に対する薬理活性を求める請求項17又は18に記載の方法。
［請求項２０］
前記被試験物質が環境試料であり、この環境試料の前記細胞に対する毒性を求める請求項17又は18に記載の方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のマイクロウェルアレイチップは、チップ上のマイクロウェルにｐＨ計測機能が賦与されており、細胞1個の代謝活性変化を検出することができる。細胞1個の代謝活性変化を計測することができれば、上述のようなリンパ細胞のみならず、新規開発薬品の薬理活性の評価や環境試料の毒性評価などにおいても従来法より詳細な情報を得ることができる有力な手法となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のマイクロウェルアレイチップは、基板上に複数のウェルを有し、かつ前記ウェルの底部にｐＨ感応性蛍光色素を含有するセンサ部を有するものである。
【０００９】
（マイクロウェルアレイチップ）
本発明のマイクロウェルアレイチップにおいて基板には、特に制限はない、例えば、ガラス基板、シリコン基板、樹脂基板等であることができる。
【００１０】
本発明で使用するマイクロウェルアレイチップは、基板上に複数個のマイクロウェルを有し、１つのマイクロウェルの寸法及びマイクロウェルには特に制限はない。マイクロウェルの形状は、例えば、円筒形であることができ、円筒形以外に、直方体、逆円錐形、逆角錐形（逆三角錐形、逆四角錐形、逆五角錐形、逆六角錐形、七角以上の逆多角錐形）等であることもでき、これらの形状の二つ以上を組み合わせた形状であることもできる。例えば、一部が円筒形であり、残りが逆円錐形であることができる。また、逆円錐形、逆角錐形の場合、底面がマイクロウェルの開口となるが、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状である（その場合、マイクロウェルの底部は平坦になる）こともできる。円筒形、直方体の場合は、マイクロウェルの底部は通常、平坦であるが、曲面（凸面や凹面）とすることもできる。マイクロウェルの底部を曲面とすることができるのは、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状の場合も同様である。
【００１１】
マイクロウェルの形状や寸法は、マイクロウェルに格納されるべき非検体の種類や量を考慮して、適宜決定される。
マイクロウェルに格納されるべき非検体としては、例えば、動物細胞、酵母細胞または細菌細胞を挙げることができ、さらに動物細胞としては、リンパ球、単球、及び顆粒球のような血液細胞、肝臓や神経などの組織由来の初代もしくは継代培養細胞を挙げることができる。
【００１２】
非検体がリンパ球であり、１つのマイクロウェルに１つのリンパ球が格納されるようにする場合、リンパ球の種類（リンパ球の形状や寸法等）を考慮して、マイクロウェルの形状及び寸法は適宜決定される。１つのマイクロウェルに１つのリンパ球が格納されるようにするためには、例えば、マイクロウェルの平面形状に内接する最大円の直径が、マイクロウェルに格納しようとするリンパ球の直径の1〜2倍の範囲、好ましくは1.1〜1.9倍の範囲、より好ましくは1.2〜1.8倍の範囲であることが適当である。また、マイクロウェルの深さは、マイクロウェルに格納しようとするリンパ球の直径の1〜2倍の範囲、好ましくは1.1〜1.9倍の範囲、より好ましくは1.2〜1.8倍の範囲であることが適当である。
【００１３】
マイクロウェルが円筒形の場合、その寸法は、例えば、直径5〜100μｍであることができ、リンパ球がＢリンパ球の場合、好ましくは、直径は5〜15μｍである。また、深さは、例えば、5〜100μｍであることができ、リンパ球がＢリンパ球の場合、好ましくは、深さは5〜40μｍであることができる。但し、マイクロウェルの寸法は、上述のように、マイクロウェルに格納しようとするリンパ球の直径とのマイクロウェルの寸法の好適な比を考慮して適宜決定する。
【００１４】
1つのマイクロウェルアレイチップが有するマイクロウェルの数は、特に制限はないが、抗原特異的リンパ球の頻度が105個に1個から多い場合には約500個であるという観点から、1cm2当たり、例えば、2,000〜1,000,000個の範囲であることができる。
【００１５】
本発明のマイクロウェルアレイチップは、基板上の各ウェルの底部にｐＨ感応性蛍光色素を含有するセンサ部を有する。
ｐＨ感応性蛍光色素を含有するセンサ部は、例えば、基板表面に固定化したもの、あるいはｐＨ感応性蛍光色素を含有する多孔質ガラスであることができる。ｐＨ感応性蛍光色素を含有するセンサ部は、これら以外にも、センサ部と接触するウェル内の液のｐＨの変化に感応する状態で蛍光色素を含有するものからからなるものであれば、特に制限はない。
【００１６】
センサ部に含まれるｐＨ感応性蛍光色素は、センサ部と接触するウェル内の液のｐＨの変化に感応し得る蛍光色素であればよく、例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートをはじめとするフルオレセインの誘導体、８−ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸、セミナフトローダフロース（SNARF）及びセミナフトフルオレセイン(SNAFL)とそれらの誘導体、等を挙げることができる。
【００１７】
ｐＨ感応性蛍光色素を含有するセンサ部の一例である、基板表面にｐＨ感応性蛍光色素を共有結合させたものとは、例えば、基板表面に設けられた反応性基とｐＨ感応性蛍光色素が有する反応性基とを共有結合させたものであることができる。ｐＨ感応性蛍光色素の基板表面への共有結合による固定化は、ｐＨ感応性蛍光色素が作動可能な状態で固定化されていればよい。基板表面へのｐＨ感応性蛍光色素の共有結合に形成については後述する。
【００１８】
ｐＨ感応性蛍光色素を含有するセンサ部の一例である、ｐＨ感応性蛍光色素を含有する多孔質ガラスとしては、例えば、基板表面に設けられた多孔質ガラスにｐＨ感応性蛍光色素を含有、固定化させたものであることができる。多孔質ガラスの形成は、例えばゾルゲル法により行うことができる。蛍光色素を含有したガラス層を形成するには、触媒として酸を加えたテトラメトキシシラン溶液と蛍光色素溶液を混合して、ガラス基板上に展開し、密封して冷暗所で乾燥させればよい。また多孔質ガラス表面に固定化するには、上記のようにゾルゲル法で多孔質ガラス層を形成した後、３−アミノプロピルトリエトキシシランの５％トルエン溶液を８０℃で一晩還流してガラス表面にアミノ基を導入して、固定化すればよい。
【００１９】
多孔質ガラスへのｐＨ感応性蛍光色素の固定化は、ｐＨ感応性蛍光色素が作動可能な状態で固定化されていればよい。多孔質ガラスへのｐＨ感応性蛍光色素の固定化については後述する。
【００２０】
本発明のマイクロウェルアレイチップは、上記センサ部上に水素イオン透過性膜をさらに設けたものであることが好ましい。これは、被検体が細胞等である場合、細胞がセンサ部上に沈析して、センサ部とウェル中の液との接触を妨げ、センサ部の機能を妨害することがあるあるからである。水素イオン透過性膜としては、例えば、酢酸セルロース膜またはニトロセルロース膜、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）膜、ＨＥＭＡとエチルメタクリレート（ＥＭＡ）の共重合体膜、ポリウレタン、親水性ポリビニリデンジフロライド、親水性ポリテトラフルオロエチレン等を挙げることができる。
【００２１】
(マイクロウェルアレイチップの製造方法)
請求項1に記載のマイクロウェルアレイチップは、例えば、基板表面にｐＨ感応性蛍光色素を含有する層を設け、次いでｐＨ感応性蛍光色素を含有する層の上に、ウェルを形成するための複数の貫通孔を有する層を設けることを含む方法により製造することができる。この方法の概略説明図を図1に示す。
【００２２】
基板表面にｐＨ感応性蛍光色素を含有する層は、その種類に応じて種々の方法で作製することができる。ｐＨ感応性蛍光色素を基板表面に共有結合させる方法、及び多孔質ガラス層にｐＨ感応性蛍光色素を固定化する方法を後述する。
【００２３】
ウェルを形成するための複数の貫通孔を有する層は、例えば、ウェル形状の複数の貫通孔を有するシートを、ｐＨ感応性蛍光色素を含有する層の上に設ける(積層する)ことで形成することができる。そのようなシートとしては、例えば、PDMS(ポリジメチルシロキサン)のようなシリコン樹脂シートを用いることができる。貫通孔の形状及び寸法は、ウェルに格納する被検体の種類に応じて適宜決定する。
【００２４】
請求項2に記載のマイクロウェルアレイチップは、例えば、基板表面にアミノ基含有層を設け、アミノ基含有層にアミノ基と反応し得る官能基を有するｐＨ感応性蛍光色素を反応させて、基板表面にｐＨ感応性蛍光色素を共有結合させ、次いで得られたｐＨ感応性蛍光色素層の上に、ウェルを形成するための複数の貫通孔を有する層を設けることを含む方法により製造することができる。
【００２５】
基板表面へのアミノ基含有層の敷設は、例えば、ポリL-リジンを基板表面に被覆すること、基板表面をアミノ化することにより行うことができる。基板表面のアミノ化は、基板がガラスの場合、以下のように行うことができる。アミノプロピルトリエトキシシランのような官能基を持ったトリアルコキシシラン誘導体で処理することでガラス表面にアミノ基を導入することができる。
また、ポリL-リジン基板やアミノ化基板は、そのようなスライドグラスを市販品として入手することもできる。
【００２６】
基板表面のアミノ基含有層に、アミノ基と反応し得る官能基を有するｐＨ感応性蛍光色素を反応させる。アミノ基と反応し得る官能基を有するｐＨ感応性蛍光色素としては、例えば、イソチオシアネート基、ジアゾニウム基、酸アジド基、活性型ハロゲン化アルキル基等を有するｐＨ感応性蛍光色素を挙げることができ、イソチオシアネート基を有するｐＨ感応性蛍光色素として、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)を挙げることができる。
【００２７】
基板表面のアミノ基含有層とｐＨ感応性蛍光色素の官能基との反応は、例えば、以下のように行うことができる。0.5M, pH9.5の炭酸緩衝液にＦＩＴＣを0.5g/l となるよう溶かし、この溶液にアミノ基を表面に導入したガラスを浸漬し、遮光して４時間反応させる。これを純水で洗浄することにより結合させることができる。
【００２８】
上記反応により基板表面にｐＨ感応性蛍光色素を共有結合させた層を形成することができる。次いで得られたｐＨ感応性蛍光色素層の上に、ウェルを形成するための複数の貫通孔を有する層を設ける。この層の形成方法は、上述した方法と同様に、ウェル形状の複数の貫通孔を有するシートを、ｐＨ感応性蛍光色素を共有結合させた層の上に設ける(積層する)ことで形成することができる。
【００２９】
請求項3に記載のマイクロウェルアレイチップは、基板表面に多孔質ガラス層を設け、この多孔質ガラス層にｐＨ感応性蛍光色素を固定化し、次いで得られたｐＨ感応性蛍光色素固定化多孔質ガラス層の上に、ウェルを形成するための複数の貫通孔を有する層を設けることを含む方法で製造することもできる。基板表面への多孔質ガラス層の敷設は、例えば、ゾルゲル法を用いて以下のように行うことができる。ゾルゲル法を用いる場合、ガラス層の敷設と色素導入は同時に行う。即ち、基板表面に蛍光試薬を封入した多孔質ガラス層を形成する。具体的には、テトラメトキシシラン（ＴＭＯＳ）と1mM塩酸を混合し３０分間ソニケーションにかけて分散させる。ここにpH8.9のトリス塩酸緩衝液に溶かしたｐＨ感応性蛍光色素溶液を加える。混合後２５分以内に混合物をガラス基板上に均一に塗布して、密封した容器に入れて、４℃で乾燥・保存することでガラス基板上にｐＨ感応性蛍光色素の層を敷設することができる。
【００３０】
ｐＨ感応性蛍光色素固定化多孔質ガラス層の上への、ウェルを形成するための複数の貫通孔を有する層の形成は、上述した方法と同様に、ウェル形状の複数の貫通孔を有するシートを、ｐＨ感応性蛍光色素固定化多孔質ガラス層の上に設ける(積層する)ことで形成することができる。
【００３１】
前述のように、本発明のマイクロウェルアレイチップはセンサ部上に水素イオン透過性膜をさらに設けたものであることができる(請求項4に記載のマイクロウェルアレイチップ)。このマイクロウェルアレイチップは、例えば、基板表面にｐＨ感応性蛍光色素を含有する層(例えば、基板表面にｐＨ感応性蛍光色素を共有結合させた層、多孔質ガラス層にｐＨ感応性蛍光色素を固定化した層)を設け、ｐＨ感応性蛍光色素を含有する層の上に、水素イオン透過性膜を設け、次いで水素イオン透過性膜の上にウェルを形成するための複数の貫通孔を有する層を設けることを含む方法により製造することができる。
【００３２】
水素イオン透過性膜は、前述のように、例えば、酢酸セルロース膜またはニトロセルロース膜、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）膜、ＨＥＭＡとエチルメタクリレート（ＥＭＡ）の共重合体膜、ポリウレタン、親水性ポリビニリデンジフロライド、親水性ポリテトラフルオロエチレン等を挙げることができる。これら酢酸セルロース膜またはニトロセルロース膜のｐＨ感応性蛍光色素を含有する層の上への敷設は、以下のように行うことができる。酢酸セルロースを、アセトンとシクロヘキサノンを体積比３：２で混合した溶媒に、40g/l となるよう溶かしたものを、ｐＨ感応性蛍光色素を含有する層を敷設したガラス基板上に、均一に塗布し、常温・暗所で乾燥させることで行うことができる。
【００３３】
上記のように、基板表面にｐＨ感応性蛍光色素含有層を設け、次いでこのｐＨ感応性蛍光色素含有層上に、ウェルを形成するための複数の貫通孔を有する層を設ける場合、ウェルを形成するための複数の貫通孔を有する層のウェル以外の部分(シートの部分)と基板との間にもｐＨ感応性蛍光色素含有層が存在する。そこで、この場合、ウェルを形成するための複数の貫通孔を有する層は、光不透過性であることが好ましい。貫通孔を有する層が光不透過性であることで、マイクロウェルアレイチップからの蛍光はウェルから、即ち、ウェル底部のｐＨ感応性蛍光色素含有層から発せられるものに限られ、これにより、マイクロウェルアレイチップを用いての蛍光測定の際の感度(SN比)を向上させることができる。
【００３４】
貫通孔を有する層を光不透過性にするには、例えば、貫通孔を有する層を前記のように樹脂シートを用いて形成する場合、この樹脂シートに光吸収性の成分を含有させることができる。そのような光吸収性の成分としては、例えば、黒色顔料色素、極微細炭素粉末等を挙げることができる。
【００３５】
(被検体の活性検定方法)
本発明は、上記本発明のマイクロウェルアレイチップのウェルに被検体を含む溶液を収納し、次いで前記ウェルに収納された溶液のｐＨの変化を、センサ部からの蛍光強度を計測することで求めて、被検体の活性を検定する方法を包含する。
【００３６】
被検体を含む溶液は、被検体の種類に応じて適宜設定することができ、例えば、被検体が細胞の場合、細胞の培養液であることができる。さらに、本発明では、ウェル１つに１つの被検体が収納されるようにすることができ、そうすることで、例えば、被検体が細胞の場合、個々の細胞を検定し、選別することができる。例えば、細胞が、免疫細胞(リンパ球)である場合、抗原を用いた刺激に対する免疫細胞の活性変化を測定することができる。
【００３７】
本発明のマイクロウェルアレイチップは、例えば、細胞1個が入る微小なウェルが1チップ上に10〜20万個並んだチップである。細胞は糖やアミノ酸を食べて乳酸等の有機酸を放出することからpH変化は細胞の代謝活性の有力な指標の１つである。本発明のマイクロウェルアレイチップは、各ウェルにpH計測機能が賦与されており、細胞1個の代謝活性変化をモニタリングでき、さらにその結果を利用して細胞1個の遺伝子解析・機能解析が可能である。
【００３８】
本発明のpH計測マイクロウェルアレイチップは、FITCのような蛍光色素プローブを用いたセンサー部を有し、細胞培養等により生成された乳酸等の有機酸による溶液のpH変化により生じるセンサー部からの蛍光強度変化により、溶液のpHや細胞の代謝活性を計測できる。
【００３９】
本発明においてマイクロウェルアレイチップは、より具体的には複数のマイクロウェルの各マイクロウェルが被検体リンパ球を１個含むことができる形状及び寸法を有するものであることができる。各マイクロウェルが被検体リンパ球を１個含むこと、及び各マイクロウェル中の被検体リンパ球の生育状況を特定でき、その結果、抗原特異的リンパ球を細胞レベルで特定することが可能になる。即ち、このマイクロウェルアレイチップを用いると、マイクロウェルに含まれる被検体リンパ球が１個であることから、抗原に反応する被検体リンパ球を１個の細胞として特定でき、結果として、抗原特異的リンパ球を１個の細胞として検出できる。そして、検出された１個の抗原特異的リンパ球のみを、マイクロウェルから取り出し、この遺伝子をクローニングすることができる。
【００４０】
但し、同一のマイクロウェルには、リンパ球以外の細胞が被検体リンパ球とともに含まれていても良い。リンパ球以外の細胞であれば、抗原に反応せず、検出されることもないからである。
【００４１】
さらに本発明は、上記本発明のマイクロウェルアレイチップのウェルに動物の組織の初代もしくは継代培養細胞を含む溶液を収納し、かつ前記溶液に被試験物質を共存させた状態で、前記ウェルに収納された溶液のｐＨの変化をセンサ部からの蛍光強度を計測することで求めて、前記被試験物質の前記細胞に対する影響を試験する方法を包含する。
上記動物は、例えば、ヒトであることができ、ヒトの初代もしくは継代培養細胞に対する被試験物質の影響を試験することができる。
【００４２】
被試験物質は、特に制限されないが、例えば、生理活性物質であることができ、この生理活性物質の前記細胞に対する薬理活性を求めることかできる。具体的には、例えば、肝臓や神経由来の初代培養細胞や継代培養細胞を各ウェルに格納しておき、そこへ新規開発医薬品などを添加し、この医薬品の共存下での細胞の活性を測定する。これにより、新規開発医薬品の安全性の評価や、薬理効果を、定量的に評価することが可能となる。その結果、創薬におけるスピードアップと、動物実験量の低減を図ることができる。
【００４３】
また、被試験物質は環境試料であり、この環境試料の細胞に対する毒性を求めることもできる。具体的には、例えば肝臓や神経由来の初代培養細胞や継代培養細胞を各ウェルに格納しておき、そこへ工場排水や埋め立て地からの漏出水などの被試験物質を添加し、この被試験物質の共存下での細胞の活性を測定する。これにより、被試験物質のヒトや生態系への安全性の評価を迅速かつ定量的に評価することが可能となり、より的確な環境管理が実現できる。
【実施例】
【００４４】
以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
例1
(FITCのpHプローブとしての評価)
0.05Mリン酸緩衝液(pH6.5〜8.0)を用いて2mg/lFITC溶液を調製し、蛍光分光光度計によりマイクロアレイスキャナーでの測定条件(励起波長473nm、蛍光波長535nm)での蛍光強度を測定した。
【００４５】
(FITCのpHプローブとしての評価)
図2に結果を示す。pH6.5〜8.0の範囲でpHの上昇とともに蛍光強度の増大が確認された。このようにマイクロアレイスキャナーの測定条件でもFITCは十分にpHに依存した蛍光を示すことがわかった。
【００４６】
例2
(pH計測マイクロウェルアレイチップの作製)
ポリジメチルシロキサン(PDMS)を用いウェル径10μmのPDMSシートを作製し、3NHClに１晩浸漬し親水処理を行った。表面にアミノ基が導入されたスライドガラス（DNAチップグレード）をFITCが0.5M、pH9.5の炭酸緩衝液に0.5g/lとなるよう溶かした溶液に室温で約4時間浸漬し、FITCを固定化した。PDMSシートをその基板に貼ってpH計測マイクロウェルアレイチップを作製した。
【００４７】
表面にアミノ基が導入されたDNAチップ用の3種類の基板を用いて、FITCの結合量、結合の均一性についての比較検討を行った。その結果、FITCの結合量は高密度アミノ基導入スライドガラスが最も優れており、均一性ではジーンスライドアミノ化が最も良い結果を示した。以上の結果からpH計測マイクロウェルアレイチップ作製にはジーンスライドアミノ化を基板として用いることにした。
【００４８】
次に、pH計測マイクロウェルアレイチップ作製時、FITCを固定化してからPDMSシートを貼った場合と、PDMSシートを貼ってからFITCを固定化した場合でFITCの結合状態を比較した。その結果FITCを先に固定化した方がFITCがより均一に固定化されることがわかり、以後、この方法を採用した。
【００４９】
(pH計測マイクロウェルアレイチップによるpHの計測)
作製したpH計測マイクロウェルアレイチップにpHの異なる0.05Mリン酸緩衝液を滴下しカバーガラスをかぶせた後、マイクロアレイスキャナーを用いて測定を行った。
具体的には、ウェル径2mmのPDMSシートでpH計測マイクロウェルアレイチップを作製し各ウェルにpH6.5〜8.0のリン酸緩衝液を滴下しpHに依存した蛍光強度が得られるか測定した。結果を図3に示す。蛍光分光光度計で測定した蛍光強度とほぼ同様の特性が見られた。次にウェル径10μmのpH計測マイクロウェルアレイチップにpH6.5及び8.0の0.05Mリン酸緩衝液を滴下しカバーガラスをかぶせてマイクロアレイスキャナーで測定した。その結果6.5と8.0では明確な蛍光強度の違いが見られた。
【００５０】
(pH計測マイクロウェルアレイチップによる細胞の代謝活性の計測)
死細胞は50％エタノールで30分間処理することで調製した。マウスリンパ球の生細胞と死細胞を2g/lのグルコース、8g/lのNaClを含む0.01M、pH7.0のリン酸緩衝液中に懸濁させ(細胞濃度９×106cells/ml)37℃のインキュベータ内で30分培養した。その後直径2mmウェルを装着、pH計測アレイチップ上に生細胞と死細胞を5μlずつ滴下しカバーガラスをかぶせてマイクロアレイスキャナーで測定した。
【００５１】
ウェル径2mmのpH計測アレイチップに生細胞、死細胞を入れてマイクロアレイスキャナーで観察したが、いずれも蛍光強度は増大し両者に有意の差は見られなかった。原因として細胞の沈降付着によりFITC膜が細胞の油脂膜等で覆われてFITC分子の周りの環境が変化したからではないかと考えた。そこで生体適合性に優れた酢酸セルロース膜を、H2O2位までの大きさの化学種を通すよう孔径を制御してFITC膜上に形成し、同様の実験を行った。酢酸セルロース膜は、酢酸セルロース0.4gをアセトン(3ml)とシクロヘキサノン（2ml）の混合溶媒に溶かしFITCを固定化した基板上に塗布して乾燥させることで形成した。その結果、生細胞を入れたウェルの方が蛍光強度は低くなり、pHが低いことを示す結果となり細胞の代謝活性を測定することができた。
【００５２】
FITCがマイクロアレイスキャナーの測定条件でpHに依存した蛍光を示すことがわかった。また、ジーンスライドアミノ化を基板としてFITCを先に固定化してからPDMSシートを貼る方法で10μmのマイクロウェルアレイチップを作製することができた。そこで、これを用いてpH6.5〜8.0の間でマイクロアレイスキャナーを用いて測定した。その結果、pHによる蛍光の変化が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によれば、例えば、特定の抗体を作成しえる免疫細胞を検出することができ、それを抗体医薬の製造に利用することができる。さらに本発明によれば、医薬品の開発や環境評価も簡便、迅速に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明のマイクロウェルアレイチップの製造方法の概略説明図を示す。
【図２】FITCのpHプローブとしての評価結果を示す。pH6.5〜8.0の範囲でpHの上昇とともに蛍光強度の増大が確認された。
【図３】ｐＨ計測マイクロウェルアレイチップによるｐＨの測定結果（ｐＨ依存性）を示す。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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