(57)【要約】【課題】煩雑な手法を用いることなく、選択的に所定の動物細胞を固定することができる動物細胞固定化材及び動物細胞固定化方法を提供すること。【解決手段】本発明の動物細胞固定化材は、基材に動物細胞を固定させる固定化材であって、基材が、少なくとも動物細胞を固定させる箇所に、式(１)のホスホリルコリン類似基及び式(２)のヒドラジド基を有する。本発明の動物細胞固定化方法は、Ｎ−レブリノイルマンノサミンを含む培地において培養した動物細胞を含む液状物を、上記動物細胞固定化材に接触させる工程を含む。【化１】2005080579.tif 000009(Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3：Ｈ、Ｃ１〜６のアルキル基等、ｎ：１〜４の整数)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞を固定させる基材を備えた動物細胞固定化材であって、基材が、少なくとも動物細胞を固定させる箇所に、式(１)で表されるホスホリルコリン類似基及び式(２)で表されるヒドラジド基を有することを特徴とする動物細胞固定化材。
【化１】
2005080579.tif 000007
(式(１)中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、ヒドロキシアルキル基又はフェニル基を示す。ｎは１〜４の整数である。)
【請求項２】
式(３)で表されるホスホリルコリン類似基含有モノマー及び式(４)で表されるヒドラジド基含有モノマーを含むモノマー組成物を共重合させたポリマー(Ｘ)を、基材に接触・固定させて得たことを特徴とする請求項１記載の動物細胞固定化材。
【化２】
2005080579.tif 000008
(式(３)中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、ヒドロキシアルキル基又はフェニル基を示し、Ｒ4は炭素数１〜６のアルキレン基又はフェニレン基を示し、Ｒ5は水素原子又はメチル基を示す。ｎは１〜４の整数である。また式(４)中、Ｒ6は水素原子又はメチル基を示す。)
【請求項３】
Ｎ−レブリノイルマンノサミンを含む培地において培養した動物細胞を含む液状物を、請求項１又は２記載の動物細胞固定化材に接触させることにより該所定の動物細胞を固定することを特徴とする動物細胞固定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定の動物細胞を固定する際に用いる動物細胞固定化材及び、該固定化材を用いた動物細胞固定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞は種々の生理活性物質を産生し、またこれを受け取ることにより個体としての恒常性を維持している。近年、このような生体内で細胞相互間に働く生理活性物質を取出し再び生体内に戻すこと、即ち、該生理活性物質を生体内由来の医薬品として利用することの有用性が明らかにされてきた。従来、このような生理活性物質の取得は、特にヒトの場合、血液、尿等から抽出されているため、大量に入手するには大きな制約があった。
そこで、このような生理活性物質等の有用物質を大量に入手する方法として、無限に増殖可能なヒトを含む動物由来の各種の株細胞に遺伝子操作や細胞融合操作を施し、これらの細胞を大量に培養し、目的とする物質、例えば、インターフェロン、インターロイキン、各種の細胞増殖因子、ホルモン、血液凝固因子、モノクローナル抗体等を産生させる方法が検討されている。
しかし、これらの無限増殖可能な株細胞はガン細胞類似のものと考えられ、その使用は安全性の面で問題を残している。また、異種動物由来の細胞を用いて産生した糖タンパク質は、ヒト型のものに比べて通常、糖構造が異なっているため、生理活性物質が本来有する活性に比べて低くなるか、あるいは活性が全く失われる場合が多い。
従って、生体由来の有用生理活性物質を効率良く生産するために、ヒトを含む動物組織から遊離した正常細胞、即ち、動物遊離細胞を生体外の人工的な環境のもとで高密度且つ大量に培養する技術を確立することが求められている。
【０００３】
動物遊離細胞の培養は、生きた細胞を人工臓器の一部として利用するハイブリッド型人工臓器や皮膚移植のための細胞供給源としてもその応用が期待されている。例えば、劇症肝炎をはじめとする肝不全の治療のために人工的に肝機能を代行するための肝機能補助装置、並びに人工肝臓においては、肝臓の機能があまりにも複雑で現在なお解明されていない部分も多いため人工的な手段のみでその機能を完全に代行することは現状不可能であり、生体由来の肝素材、中でも遊離肝細胞を利用するハイブリッド型のものの開発、実用化が期待されている。このような装置においては、細胞が生体内において発現していた機能を保持したままで遊離細胞を長時間安定に培養できなければならない。
更に、ハイブリッド型人工臓器において動物細胞を固定する際には動物細胞固定化材を用いることが考えられるが、目的とする動物細胞のみを選択的に固定化でき、抗原性がなく、耐久性が高く、低分子物質が溶出せず、血小板を付着、破壊しない等の条件を満足する動物細胞固定化材については完成していないのが現状である。
【０００４】
一方、医療用材料の研究において、ホスホリルコリン類似基含有ポリマーは、生体膜に由来するリン脂質類似構造に起因して、血液適合性、補体活性、生体物質非吸着性等の特性を有していることが明らかにされ、こうした機能を利用した生体関連材料の開発が盛んに行われている。
例えば、特許文献１には、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(以下、MPCと略す)の製造方法とその重合体が優れた生体適合性を有することが開示されている。特許文献２には、MPCとメタクリル酸エステルとの共重合体が血小板の粘着、凝集や血漿タンパク質の付着が起こり難く、医療用材料として有用であることが開示されている。特許文献３には、ホスホリルコリン類似基を側鎖に有するポリマーを用いた医療用材料が開示されている。特許文献４及び５には、ホスホリルコリン類似基を有する重合体を樹脂表面にコーティングして、優れた生態適合性が得られることが開示されている。特許文献６には、ホスホリルコリン類似基を有する重合体をポリエチレンテレフタレートにコーティングして、血球細胞、株細胞及び初代培養細胞を分離、回収する分離剤及び回収方法が開示されている。
しかし、ホスホリルコリン類似基及びヒドラジド基の両方を有する動物細胞固定化材については知られていない。
【特許文献１】特開昭５４−３６０２５号公報(第１頁)
【特許文献２】特開平３−３９３０９号公報(第２頁)
【特許文献３】特開平９−１８３８１９号公報(第２頁)
【特許文献４】特表平６−５０２２００号公報(第２頁)
【特許文献５】特表平７−５０２０５３号公報(第２頁)
【特許文献６】特開２００２−９８６７６号公報(第２頁)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、煩雑な手法を用いることなく、選択的に所定の動物細胞を固定することができる動物細胞固定化材を提供することにある。
本発明の別の目的は、煩雑な手法を用いることなく、選択的に所定の動物細胞を生きた状態においても固定できる動物細胞固定化方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、動物細胞を固定させる基材を備える動物細胞固定化材であって、基材が、少なくとも動物細胞を固定させる箇所に、式(１)で表されるホスホリルコリン類似基及び式(２)で表されるヒドラジド基を有することを特徴とする動物細胞固定化材が提供される。
【化３】
2005080579.tif 000002
(式(１)中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、ヒドロキシアルキル基又はフェニル基を示す。ｎは１〜４の整数である。)
また本発明によれば、Ｎ−レブリノイルマンノサミンを含む培地において培養した動物細胞を含む液状物を、上記動物細胞固定化材に接触させることにより該所定の動物細胞を固定することを特徴とする動物細胞固定化方法が提供される。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の動物細胞固定化材は、ホスホリルコリン類似基及びヒドラジド基を有するので、血球系由来の浮遊系細胞であっても効率良く固定することができ、加えて、目的である動物細胞以外の繊維芽細胞等の付着性細胞が粘着したりすることなく、選択的に所定の動物細胞が固定できる。更に、本発明の動物細胞固定化方法は、本発明の上記固定化材を用いるので、選択的に所定の動物細胞を生きた状態においても固定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の動物細胞固定化材は、目的とする所定の動物細胞のみを基材に選択的に固定させることができる固定化材であって、基材が、少なくとも動物細胞を固定させる箇所に、前記式(１)で表されるホスホリルコリン類似基及び前記式(２)で表されるヒドラジド基を有する。
式(１)で表されるホスホリルコリン類似基及び式(２)で表されるヒドラジド基を付与する基材の形態は特に限定されず、例えば、細胞培養用ディッシュ、細胞培養用マルチディッシュ、細胞培養用プレート、細胞培養用バック、細胞培養用フラスコ等の既存の細胞培養具の形態が挙げられる他、シート状、膜状、糸状、繊維状等の形態であっても良い。
前記基材を形成する材料は特に限定されず、例えば、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、セルロース、ポリスルフォン、ポリウレタン、ナイロン、アクリル樹脂、ガラス、金属等が挙げられる。また、基材に式(１)で表されるホスホリルコリン類似基及び式(２)で表されるヒドラジド基を付与するにあたり、後述する化学結合等を利用する場合には、表面加工や、更には所望の官能基等を付与する処理等を基材に施すこともできる。例えば、ポリウレタンやナイロンで形成された基材表面の少なくとも一部をアルカリにより加水分解処理することにより、アミノ基等を表面に露出させることができる。また、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン等のシランカップリング剤を用いることにより、ガラス、金属等の基材表面にアミノ基等を付与することもできる。
【０００９】
式(１)において、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、ヒドロキシアルキル基又はフェニル基を示す。炭素数１〜６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基としては、例えば、ヒドロキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル基、５−ヒドロキシペンチル基、６−ヒドロキシへキシル基等が挙げられる。
【００１０】
式(１)で表されるホスホリルコリン類似基及び式(２)で表されるヒドラジド基を基材に付与するには、例えば、ホスホリルコリン類似基を有する反応性化合物及びヒドラジド基を有する反応性化合物を用いて基材に化学修飾することにより付与する方法、ホスホリルコリン類似基及びヒドラジド基を有するポリマーを基材に接触・固定させて被覆する方法、ホスホリルコリン類似基及びヒドラジド基を有するポリマーを基材に化学結合させる方法等が挙げられる。中でも、前記ポリマーを基材に接触・固定させて被覆する方法は、簡便に、且つ均一にホスホリルコリン類似基及びヒドラジド基を基材の所望箇所に付与できるので適している。
前記被覆に用いるポリマーは、式(１)で表されるホスホリルコリン類似基及び式(２)で表されるヒドラジド基を有するポリマーであれば特に限定されないが、式(３)で表されるホスホリルコリン類似基含有モノマー及び式(４)で表されるヒドラジド基含有モノマーを含むモノマー組成物を共重合させて得たポリマー(Ｘ)が好ましく挙げられる。
【００１１】
【化４】
2005080579.tif 000003
式(３)中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、ヒドロキシアルキル基又はフェニル基を示し、Ｒ4は炭素数１〜６のアルキレン基又はフェニレン基を示し、Ｒ5は水素原子又はメチル基を示す。ｎは１〜４の整数である。また式(４)中、Ｒ6は水素原子又はメチル基を示す。炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基としては、前述の式(１)で例示した各基が好ましく挙げられる。炭素数１〜６のアルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基、シクロヘキシレン基等が挙げられる。
【００１２】
式(３)で表されるホスホリルコリン類似基含有モノマーとしては、例えば、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、３−((メタ)アクリロイルオキシ)プロピル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、４−((メタ)アクリロイルオキシ)ブチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、５−((メタ)アクリロイルオキシ)ペンチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、６−((メタ)アクリロイルオキシ)ヘキシル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリエチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリプロピルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリブチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリシクロヘキシルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリフェニルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)プロピル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)ブチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)ペンチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート、２−((メタ)アクリロイルオキシ)ヘキシル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート等が挙げられる。
中でも、２−((メタ)アクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートが好ましく、更に２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート(これは２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとも言う、以下、MPCと略す)が入手性の点より好ましい。
式(４)で表されるヒドラジド基含有モノマーは、アクリロイルヒドラジド又はメタクリロイルヒドラジドである。
【００１３】
前記ポリマー(Ｘ)は、式(３)で表されるホスホリルコリン類似基含有モノマー及び式(４)で表されるヒドラジド基含有モノマーを共重合させたポリマーであっても、またこれらモノマーに加えて更に他のモノマーを含むモノマー組成物を共重合させたポリマーでも良い。
前記他のモノマーは、本発明の所望の効果が損なわれず、また他の所望の効果を付与しうるものであって、共重合可能なモノマーであれば特に限定されない。例えば、ポリマー(Ｘ)を基材に化学結合させうる官能基の付与を可能にしたり、ポリマー(Ｘ)に疎水性基を付与しうる他のモノマーを用いることにより、ポリマー(Ｘ)の耐溶出性を向上させることができる。
このような他のモノマーとしては、例えば、２−ヒドロキシエチル(メタ)アクリレート、２−ヒドロキシブチル(メタ)アクリレート、４−ヒドロキシブチル(メタ)アクリレート等の水酸基含有モノマー、(メタ)アクリレート、アクリル酸、メタクリル酸、スチレンスルホン酸、(メタ)アクリロイルオキシホスホン酸、２−ヒドロキシ−３−(メタ)アクリルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド等のイオン性基含有モノマー、(メタ)アクリルアミド、アミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチル(メタ)アクリレート等の含窒素モノマー、(メタ)アクリル酸クロライド、グリシジル(メタ)アクリレート、(メタ)アクリロイルオキシエチルイソシアネート等の反応性基含有モノマー、ポリエチレングリコールモノ(メタ)アクリレート等が挙げられる。これらは使用に際して１種又は２種以上の混合物として用いることができる。
【００１４】
前記他のモノマーとして、上記例示以外に、特に、疎水性基を付与しうるモノマーとしては、例えば、メチル(メタ)アクリレート、エチル(メタ)アクリレート、ブチル(メタ)アクリレート、２−エチルヘキシル(メタ)アクリレート、ラウリル(メタ)アクリレート、ステアリル(メタ)アクリレート等の直鎖又は分岐アルキル(メタ)アクリレート、シクロヘキシル(メタ)アクリレート等の環状アルキル(メタ)アクリレート、ベンジル(メタ)アクリレート、フェノキシエチル(メタ)アクリレート等の芳香族(メタ)アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ(メタ)アクリレート等の疎水性ポリアルキレングリコール(メタ)アクリレート、スチレン、メチルスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレン系モノマー、メチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル等のビニルエーテル系モノマー、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル系モノマー等が挙げられる。これらは使用に際して１種又は２種以上の混合物として用いることができる。
【００１５】
前記他のモノマーを用いる場合、他のモノマーに由来する構成単位は、ポリマー(Ｘ)の構成単位中８９．９モル％以下が好ましく、特に、１〜８９．９モル％が好ましい。他のモノマーの構成単位が８９．９モル％を超えると、基材に付与される式(１)で表されるホスホリルコリン類似基及び式(２)で表されるヒドラジド基の量が少なくなり、所望の効果が十分に発揮されない恐れがあり好ましくない。
ポリマー(Ｘ)が他のモノマーに由来する構成単位を有することにより、例えば、ポリマー(Ｘ)の耐溶出性を向上させることができる。具体的には、他のモノマーとしてグリシジル(メタ)アクリレートを用いる場合、基材がその表面等にアミノ基、カルボキシル基等を有すると、基材にポリマー(Ｘ)を化学的に結合させることができるので、ポリマー(Ｘ)の耐溶出性が向上し、後述する動物細胞を培養する際に培地等に界面活性剤、有機溶剤等を使用することを可能できる。
【００１６】
前記ポリマー(Ｘ)は、式(３)で表されるホスホリルコリン類似基含有モノマー等の式(１)で表されるホスホリルコリン類似基を有するモノマーと、式(４)で表されるヒドラジド基含有モノマー等の式(２)で表されるヒドラジド基を有するモノマーと、更に必要に応じて他のモノマーとを含むモノマー組成物を重合したポリマーである。
前記モノマー組成物は、前記ホスホリルコリン類似基を有するモノマー１０〜９９モル％、特に２０〜８９モル％と、前記ヒドラジド基を有するモノマー０．１〜５０モル％、特に０．５〜４０モル％と、前記他のモノマー０〜８９．９モル％、特に１〜８９．９モル％とからなることが好ましい。前記ホスホリルコリン類似基を有するモノマーの含有割合が１０モル％未満では、目的の動物細胞以外の細胞粘着や、タンパク質の吸着が生じる可能性が高くなるので好ましくない。また、前記ヒドラジド基を有するモノマーの含有割合が０．１モル％未満では、目的の動物細胞の固定化効率が低下するので好ましくなく、一方、５０モル％を超えるとヒドラジド基に由来する細胞毒性が発現する恐れがあるので好ましくない。
【００１７】
前記ポリマー(Ｘ)の分子量は、重量平均分子量で５０００〜５００００００の範囲が好ましく、目的の動物細胞を固定させ、またポリマー(Ｘ)の耐溶出性を向上させるために、１０００００〜２００００００の範囲が更に好ましい。
【００１８】
前記基材全体若しくは一部をポリマー(Ｘ)により被覆して、基材に式(１)で表されるホスホリルコリン類似基及び式(２)で表されるヒドラジド基を付与するには、例えば、ポリマー(Ｘ)を溶剤に溶解した後、基材を浸漬するか、あるいは基材にポリマー(Ｘ)の溶液をスプレーする方法等により容易に行うことができる。
前記溶剤としては、例えば、水、エタノール、メタノール、イソプロパノール等の単独溶剤あるいは、水とエタノール、エタノールとイソプロパノール等の混合溶剤を用いることができる。好ましくはポリマー(Ｘ)の溶解性が高く、被覆する際に基材に対して影響が少ない、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコールの使用が好ましい。
前記溶剤に溶解するポリマー(Ｘ)の濃度は、動物細胞固定化効果を十分に発揮させるために通常０．０１〜１０質量％、特に０．１〜１質量％が好ましい。
【００１９】
ポリマー(Ｘ)が、エポキシ基、イソシアネート基、スクシンイミド基、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の化学結合可能な官能基を有する場合には、ポリマー(Ｘ)の溶剤としてはこれら官能基と反応しない溶剤を用いることが好ましい。また基材は、これら官能基と反応可能なアミノ基、カルボキシル基、水酸基等を有することが好ましい。このような基材、ポリマー(Ｘ)及び溶剤を用いて本発明の動物細胞固定化材を調製するには、例えば、ポリマー(Ｘ)を前記溶剤に溶解し、基材と化学結合させて被覆した後に、未反応のポリマー(Ｘ)を洗浄除去し、乾燥させる方法等により得ることができる。
前記ポリマー(Ｘ)における化学結合可能な官能基を利用する際に、基材に化学結合可能な官能基が存在しない場合には、例えば、基材表面をγ線処理、電子線処理、コロナ放電処理等の既存の表面処理技術を用いて処理することにより化学結合可能とすることができる。中でも基材の物性にあまり影響を与えないコロナ放電処理が好ましい。
また基材に、式(１)で表されるホスホリルコリン類似基及び式(２)で表されるヒドラジド基を付与するに際して化学試薬を用いることもできる。例えば、基材がガラス、金属の場合は、好ましくはγ−アミノプロピルトリエトキシシラン等のシランカップリング剤を用いて式(１)で表されるホスホリルコリン類似基及び式(２)で表されるヒドラジド基を基材に付与することができる。
【００２０】
本発明の動物細胞固定化材において、式(１)で表されるホスホリルコリン類似基及び式(２)で表されるヒドラジド基による基材への表面の被覆の程度は、表面分析方法により評価できる。
具体的には、Ｘ線光電子分光分析によって測定したスペクトルにおける、リンのピーク面積Ｐ、酸素のピーク面積Ｏ、窒素のピーク面積Ｎ、炭素のピーク面積Ｃにより、各基の表面組成を算出することにより確認することができる。
本発明の動物細胞固定化材において、基材に付与される式(１)で表されるホスホリルコリン類似基及び式(２)で表されるヒドラジド基の量は、本発明の所望の効果を得ることができれば特に限定されないが、前記Ｘ線光電子分光分析により算出した値が、式(１)で表されるホスホリルコリン類似基が通常１０〜９９モル％、式(２)で表されるヒドラジド基の基が０．１〜５０モル％が好ましい。更には、細胞毒性が低くより効率良く目的の細胞のみを固定化することを可能にするために、式(１)で表されるホスホリルコリン類似基が２０〜８９モル％、式(２)で表されるヒドラジド基が０．５〜４０モル％であることがより好ましい。
【００２１】
本発明の動物細胞固定化材を用いて固定できる動物細胞は、後述するＮ−レブリノイルマンノサミンによる処理が可能なものであれば特に限定されず、例えば、赤血球、白血球等の血球細胞、各種株細胞、初代培養細胞等が挙げられる。具体的には、白血球としては、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球等が挙げられる。リンパ球としては、例えば、T細胞、B細胞等が挙げられる。
前記株細胞及び初代培養細胞は、由来の動物、由来の臓器及び形態は特に限定されず、例えば、繊維芽細胞、表皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、神経細胞、膵臓細胞、肝細胞、幹細胞、胚性幹細胞、ハイブリドーマ等が挙げられる。特に好ましくは、ハイブリッド型人工臓器で利用可能な膵臓細胞、肝細胞や、再生医療で利用可能な胚性幹細胞、バイオリアクターで利用可能なハイブリドーマ等が挙げられる。
【００２２】
本発明の動物細胞固定化方法は、Ｎ−レブリノイルマンノサミンを含む培地において培養した所定の動物細胞を含む液状物を、上述の本発明の動物細胞固定化材に接触させることにより実施することができる。要するに、Ｎ−レブリノイルマンノサミンを含む培地において培養した動物細胞のみが、選択的に本発明の動物細胞固定化材に固定される。
前記Ｎ−レブリノイルマンノサミンを含む培地において、Ｎ−レブリノイルマンノサミンの含有量は、終濃度で１〜１００mMが好ましい。この際、１mM未満では基材に固定される動物細胞数が少なくなり好ましくなく、１００mMを超えると細胞毒性が生じる恐れがあるので好ましくない。また、Ｎ−レブリノイルマンノサミンを含む培地で培養する際に用いる培養液としては、既存の各種培養液を用いることが可能であり、例えば、DMEM、RPMI１６４０、ハンクス、アール等が好ましく挙げられる。
培養期間は、０．５日間〜７日間が好ましい。０．５日未満では、基材に固定される動物細胞が少なくなり好ましくなく、７日間を超えると細胞が増殖し、単位細胞あたりのＮ−レブリノイルマンノサミン量が少なくなるので好ましくない。培養を行う際の培養条件は、動物細胞の種類に応じて公知の培養条件に従い行うことができる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例及び比較例により更に詳述するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
合成例１
メチルメタクリレート２５ｇ(０．２５モル)とヒドラジン・１水和物７．５ｇ(０．１５モル)とを氷冷下で１時間撹拌後、氷冷下１０mmHｇで未反応物を除去した。更に減圧蒸留にて精製後、トルエンにより再結晶し無色の結晶を得た。1H-NMR及び元素分析を行った結果、得られた結晶は、メタクリロイルヒドラジド(以下MHと略す)であることが確認された。
尚、1H-NMRの測定結果は、α−CH3(１．９ppm)、末端のNH2(３．８ppm)、−CO−NH−(７．０ppm)、元素分析の測定結果は、C(５７．１４／５７．２４：理論値／実測値)、H(９．５２／９．９２：理論値／実測値)、N(３３．３３／３２．８６：理論値／実測値)であった。
【００２４】
合成例２
MPC１１．１ｇ、ｎ−ブチルメタクリレート(以下、BMAと略す)１４．９ｇ及び合成例１で調製したMH０．７５ｇ(MPC／BMA／MH(モル比)＝２５／７０／５)をエタノール３５８ｇに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ。続いて、６０℃で２０質量％のｔ−ブチルパーオキシピバレートのトルエン溶液２．１８ｇを加えて５時間重合反応させた。重合液を３リットルのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈澱を濾過し、４８時間室温で真空乾燥を行って、粉末５．３ｇを得た。1H-NMRにて組成分析した結果、MPC／BMA／MH(モル比)＝１８／７７／５であった。また、GPCにより測定した重量平均分子量は１８６０００であった。得られたポリマーをポリマー(Ｘ−１)とする。
【００２５】
尚、GPCの測定条件は以下のとおりである。
(１)試料：試料０．５質量％臭化リチウムを含むクロロホルム／メタノール＝６／４(体積／体積)混合溶媒に溶解し、０．５質量％のポリマー溶液を調製した。試料溶液使用量は２０μLであった。
(２)カラム：Plgel ５μｍMIXEDC-C、２本直列(ポリマー・ラボラトリー社製)、カラム温度は４０℃、東ソー社製インテグレーター内蔵分子量計算プログラム(SC-８０２０用GPCプログラム)にて調整した。
(３)溶出溶媒：０．５質量％臭化リチウムを含むクロロホルム／メタノール＝６／４(体積／体積)混合溶媒、流速は１．０ｍL／分である。
(４)標準物質：ポリメチルメタクリレート(以下、PMMAと略す)(ポリマー・ラボラトリー社製)。
【００２６】
合成例３
MPC３７．７ｇ、MH０．７５ｇ及びグリシジルメタクリレート(以下、GMAと略す)２．１ｇ(MPC／MH／GMA(モル比)＝８５／５／１０)をイソプロパノール３５８ｇに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ。続いて、６０℃で２０質量％のｔ−ブチルパーオキシピバレートのトルエン溶液２．１８ｇを加えて５時間重合反応させた。重合液を３リットルのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈澱を濾過し、４８時間室温で真空乾燥を行って、粉末１７．１ｇを得た。1H-NMRにて組成分析した結果、MPC／MH／GMA(モル比)＝８７／３／１０であった。合成例２と同様にGPCにより測定した重量平均分子量は４２０００であった。得られたポリマーをポリマー(Ｘ−２)とする。
【００２７】
合成例４
BMA２１．３ｇをエタノール１６０ｇに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ後、６０℃でアゾビスイソブチロニトリル０．８２ｇを加えて８時間重合反応させた。重合液を３リットルのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈澱を濾過し、４８時間室温で真空乾燥を行って、粉末１３．６ｇを得た。合成例２と同様にGPCにより測定した重量平均分子量は２９８０００であった。得られたポリマーをポリマー(Ｘ−３)とする。
【００２８】
合成例５
MPC１３．２ｇ及びBMA１４．９ｇ(MPC／BMA(モル比)＝３０／７０)をエタノール１６０ｇに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ。続いて、６０℃でアゾビスイソブチロニトリル０．８２ｇを加えて８時間重合反応させた。重合液を３リットルのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈澱を濾過し、４８時間室温で真空乾燥を行って、粉末２１．６ｇを得た。1H-NMRにて組成分析した結果、MPC／BMA(モル比)＝３０／７０であった。合成例２と同様にGPCにより測定した重量平均分子量は２１３０００であった。得られたポリマーをポリマー(Ｘ−４)とする。
【００２９】
合成例６
BMA２０．３ｇ及びMH０．７５ｇ(BMA／MH(モル比)＝９５／５)をエタノール３５８ｇに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ。続いて、６０℃２０質量％のｔ−ブチルパーオキシピバレートのトルエン溶液２．１８ｇを加えて５時間重合反応させた。重合液を３リットルのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈澱を濾過し、４８時間室温で真空乾燥を行って、粉末１０．３ｇを得た。1H-NMRにて組成分析した結果、BMA／MH(モル比)＝９７／３であった。合成例２と同様にGPCにより測定した重量平均分子量は１６３０００であった。得られたポリマーをポリマー(Ｘ−５)とする。
【００３０】
実施例１−１及び比較例１−１〜１−３
合成例２、４〜６において合成したポリマー(Ｘ−１)、(Ｘ−３)〜(Ｘ−５)の各々０．５ｇをエタノール１００mlに溶解し、ポリマー溶液を調製した。基材として低蛍光セルディスク(住友ベークライト社製)を用い、該基材を上記で調製した溶液にそれぞれ室温で５分間浸漬した。次いで、溶液から基材を取出し室温で１時間乾燥させた。
更に、乾燥器内を６０℃まで昇温し、そのままの温度で４時間減圧乾燥させ、セルディスク形状の動物細胞固定化材を調製した。得られた動物細胞固定化材の表面に存在するリンのピーク面積Ｐ、酸素のピーク面積Ｏ、窒素のピーク面積Ｎ、炭素のピーク面積Ｃを求めるために、Ｘ線光電子分光分析機(商品名「ＥＳＣＡ−３３００」、島津製作所製)を用いて、Ｘ線の照射角が９０°のときの各元素のスペクトルを測定し、各ピークの面積を測定した。各ピークの面積より、各基の表面組成を算出して、式(１)で表されるホスホリルコリン類似基及び式(２)で表されるヒドラジド基の表面存在量を測定した。結果を表１に示す。
得られた動物細胞固定化材を２４穴マルチディッシュの底面に入れて、シリコンリングにより固定して動物細胞固定化材を有する容器を作製した。
ここで、ポリマー(Ｘ−１)を用いて得た容器を容器(１)(実施例１−１)、ポリマー(Ｘ−３)を用いて得た容器を容器(３)(比較例１−１)、ポリマー(Ｘ−４)を用いて得た容器を容器(４)(比較例１−２)、並びにポリマー(Ｘ−５)を用いて得た容器を容器(５)(比較例１−３)とする。
【００３１】
実施例１−２
低蛍光セルディスク(住友ベークライト社製)を空気中でコロナ放電処理(照射エネルギー１Ｊ／cm2)して表面にカルボキシル基を生成させた。次いで、合成例３により合成したポリマー(Ｘ−２)０．５ｇをイソプロパノール１００mlに溶解しポリマー溶液を調製し、上記コロナ放電処理した低蛍光セルディスクを室温で５分間浸漬した。溶液からセルディスクを取出し室温で１時間乾燥させた。更に、乾燥器内で６０℃まで昇温し、そのままの温度で４時間減圧乾燥させ、セルディスク形状の動物細胞固定化材を調製した。得られた動物細胞固定化材について実施例１−１と同様に式(１)で表されるホスホリルコリン類似基及び式(２)で表されるヒドラジド基の表面存在量を測定した。結果を表１に示す。
得られた動物細胞固定化材を２４穴マルチディッシュの底面に入れて、シリコンリングにより固定化して動物細胞固定化材を有する容器を調製した。この容器を容器(２)とする。
【００３２】
【表１】
2005080579.tif 000004
【００３３】
実施例２−１、２−２
１０ｍMのＮ−レブリノイルマンノサミン(モレキュラプローブ社製)及び１０体積％ウシ胎児血清を添加したRPMI１６４０培地に、１．０×１０5個／mlのヒト前骨髄性白血病細胞(以下、HL−６０と略す)を懸濁させた。３７℃、３日間炭酸ガスインキュベーターで培養した。培養終了後、１０００回転／分、１０分間、４℃にて遠心分離した。上清を除去して、１０体積％ウシ胎児血清を添加したRPMI１６４０培地で、１．５×１０5個／mlのHL−６０を懸濁させてＮ−レブリノイルマンノサミン処理HL−６０懸濁液を調製した。
得られたＮ−レブリノイルマンノサミン処理HL−６０懸濁液を、実施例１−１及び実施例１−２で調製した容器(１)及び(２)の各ウェルに１．０ml添加し、３７℃、２時間炭酸ガスインキュベーターで培養した。培養終了後、１０体積％ウシ胎児血清を添加したRPMI１６４０培地で各ウェルを洗浄した。洗浄終了後、HL−６０の固定化の有無を位相差顕微鏡により観察した。更に、３７℃、２時間炭酸ガスインキュベーターで培養した後、また、HL−６０の固定化の生死を位相差顕微鏡により観察した。結果を表２に示す。
【００３４】
比較例２−１〜２−３
容器(１)及び容器(２)の代わりに、比較例１−１〜１−３で調製した容器(３)〜(５)を用いた以外は実施例２−１、２−２と同様にHL−６０の固定化を行い各測定を行った。結果を表２に示す。
【００３５】
【表２】
2005080579.tif 000005
【００３６】
表２の結果より、ヒドラジド基を有する動物細胞固定化材は、浮遊細胞であるHL−６０を固定できることが判った。更に、ヒドラジド基を有するがホスホリルコリン類似基を有していない比較例２−３の容器(３)では、固定化されたHL−６０がネクロース(細胞死)し、細胞が黒く変色していた。一方、ヒドラジド基及びホスホリルコリン類似基を有する実施例２−１及び２−２の容器(１)及び(２)では、固定化されたHL−６０は綺麗な円形を維持しネクローシスしていないことが判った。
【００３７】
実施例３−１、３−２
５０μM CFSE(５又は６−(Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル)−３'，６'−O，O'−ジアセチルフルオレセイン)(同仁化学社製)を添加したダブレッコウ生理食塩水(以下、D-PBSと略す)溶液に、１．０×１０4個／mlのマウス繊維芽細胞(以下、Ｌ９２９と略す)を懸濁させた。続いて、３７℃、１５分間炭酸ガスインキュベーターで培養した。培養終了後、１０００回転／分、１０分間、４℃にて遠心分離した。上清を除去して、１０体積％ウシ胎児血清を添加したRPMI１６４０培地で１．０×１０4個／mlのＬ９２９を懸濁させて、CFSE処理Ｌ９２９(蛍光ラベル９２９)を調製した。
実施例２−１、２−２で調製したＮ−レブリノイルマンノサミン処理HL−６０懸濁液を、実施例１−１及び実施例１−２で調製した容器(１)及び(２)の各ウェルに１．０ml添加し、３７℃、２時間炭酸ガスインキュベーターで培養した。培養終了後、１０体積％ウシ胎児血清を添加したRPMI１６４０培地で各ウェルを洗浄した。洗浄終了後、上記で調製したCFSE処理Ｌ９２９懸濁液を各ウェルに１．０ml添加し、３７℃、１６時間炭酸ガスインキュベーターで培養した。培養終了後、１０体積％ウシ胎児血清を添加したRPMI１６４０培地で各ウェルを洗浄した。洗浄終了後、Ｌ９２９の接着の有無を蛍光顕微鏡により観察した。結果を表３に示す。
【００３８】
比較例３−１〜３−３
容器(１)及び容器(２)の代わりに、比較例１−１〜１−３で調製した容器(３)〜(５)を用いた以外は実施例３−１、３−２と同様にＬ９２９の固定化を行い測定を行った。結果を表３に示す。
【００３９】
【表３】
2005080579.tif 000006
【００４０】
表３の結果より、ホスホリルコリン類似基を有していない比較例３−１の容器(１)及び比較例３−３の容器(３)では、蛍光ラベルＬ９２９が非選択的に接着していることが観察された。要するに、この蛍光ラベルＬ９２９は非選択的に固定化されてしまった。しかし、ホスホリルコリン類似基を有する実施例３−１、３−２の動物細胞固定化材及び比較例３−２の容器では蛍光ラベルＬ９２９は一切観察されなかった。
【００４１】
表２及び３の結果より、ホスホリルコリン類似基及びヒドラジド基の双方を有している実施例の動物細胞固定化材は、選択的に動物細胞を固定でき、固定した細胞がネクローシスせず、且つ非選択的な細胞の固定が起きないことが判った。