(57)【要約】【課題】薬物に対する細胞の薬物代謝活性度を簡便に測定し得る細胞の薬物代謝活性測定方法を提供する。【解決手段】上方にカウンター電極４と参照電極５とが配設されたＩＴＯ電極２の表面において細胞１４を培地で培養し、細胞１４に薬物を添加した後に、ＩＴＯ電極２とカウンター電極４との間に交流電流Ｉを印加して薬物の添加直後からのＩＴＯ電極２と参照電極５との間におけるインピーダンスのリアクタンス成分についての時間的変化を測定する。【選択図】図１
2005080522.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上方に対電極と参照電極とが配設された作用電極の表面において細胞を培地で培養し、
前記細胞に薬物を添加した後に、前記作用電極と前記対電極との間に所定周波数の交流信号を印加して前記薬物の添加直後からの当該作用電極と当該参照電極との間におけるインピーダンスのリアクタンス成分についての時間的変化を測定する細胞の薬物代謝活性測定方法。
【請求項２】
前記測定した前記リアクタンス成分を前記薬物の添加直後に測定した前記リアクタンス成分で正規化し、
当該正規化したリアクタンス成分の時間的変化を前記リアクタンス成分の時間的変化として前記細胞の薬物代謝活性度を測定する請求項１記載の細胞の薬物代謝活性測定方法。
【請求項３】
上方に対電極と参照電極とが配設された作用電極の表面において細胞を培地で培養し、
前記細胞に薬物を添加した後に、前記作用電極と前記対電極との間にその周波数を変更しつつ交流信号を印加して当該作用電極と当該参照電極との間を流れる交流電流に基づいて当該各周波数毎に当該作用電極と当該参照電極との間におけるインピーダンスのリアクタンス成分を測定する測定処理を、前記薬物の添加直後と当該添加直後から所定時間を経過した時点とでそれぞれ実施し、
前記所定時間を経過した時点で測定した前記各周波数毎の前記リアクタンス成分を、前記添加直後に測定した前記各周波数毎の前記リアクタンス成分で正規化し、
当該正規化したリアクタンス成分が最大となる周波数を前記所定の周波数とする請求項１または２記載の細胞の薬物代謝活性測定方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の細胞の薬物代謝活性測定方法を前記薬物の濃度を変えて複数回実施する細胞の薬物代謝活性測定方法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載の細胞の薬物代謝活性測定方法を実行可能に構成されている細胞の薬物代謝活性測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の薬物代謝活性度を簡易に測定する細胞の薬物代謝活性測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞活性測定方法として、特開平７−１８４６８６号公報に開示された測定方法が知られている。この細胞活性測定方法は、同公報中の図１に示すように、作用電極１と対電極２とが設けられた電極基板４を培養容器５の内部底面に設置し、接着依存性を有した細胞９を培養液１０と共に培養して作用電極１の表面に細胞９を接着させる。次いで、作用電極用リード線６および対電極用リード線７を、ロックインアンプ１２が接続されたポテンシオスタット１１に接続し、作用電極１の表面のインピーダンスを測定する。この細胞活性測定方法によれば、測定したインピーダンスの実効成分とリアクタンス成分とに基づいてナイキストプロット図（同公報中の図２）を作成することにより、作用電極１表面への細胞接着の有無や細胞接着数に関する情報を得ることが可能となっている。
【０００３】
【特許文献１】特開平７−１８４６８６号公報（第１，４頁、第１−２図）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところが、この細胞活性測定方法には、細胞の薬物に対する薬物代謝活性度、つまり、添加された薬物を細胞が代謝しているか否か、および薬物代謝活性によってどの程度の生成物（代謝生成物）が生成されているかについては測定することができないという問題点がある。このため、これらを測定する従来の手法としては、まず、肝由来細胞をシャーレ上で培養すると共に、この細胞に目的の薬物を添加する。次いで、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ナノ液体クロマトグラフィー・ナノエレクトロスプレーイオン化・イオントラップ型タンデム質量分析計）を用いて、採取した培養液の上澄み中に含まれている代謝生成物の量を測定すると共に、代謝生成物の構成を特定している。しかしながら、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは非常に高価であるために、誰もが使用できるものではない。このため、薬物に対する細胞の薬物代謝活性度を簡便に測定できる方法の実現が望まれている。
【０００５】
本発明は、かかる要望に鑑みてなされたものであり、薬物に対する細胞の薬物代謝活性度を簡便に測定し得る細胞の薬物代謝活性測定方法、および細胞の薬物代謝活性測定装置を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成すべく本発明に係る細胞の薬物代謝活性測定方法は、上方に対電極と参照電極とが配設された作用電極の表面において細胞を培地で培養し、前記細胞に薬物を添加した後に、前記作用電極と前記対電極との間に所定周波数の交流信号を印加して前記薬物の添加直後からの当該作用電極と当該参照電極との間におけるインピーダンスのリアクタンス成分についての時間的変化を測定する。この場合、インピーダンスのリアクタンス成分の時間的変化については、前記作用電極と前記対電極との間に交流信号を印加した状態において、当該作用電極と前記参照電極との間を流れる交流電流に基づいて測定することができる。また、この測定したリアクタンス成分の時間的変化に基づいて、前記薬物に対する前記細胞の薬物代謝活性度が測定される。
【０００７】
また、請求項２記載の細胞の薬物代謝活性測定方法は、請求項１記載の細胞の薬物代謝活性測定方法において、前記測定した前記リアクタンス成分を前記薬物の添加直後に測定した前記リアクタンス成分で正規化し、当該正規化したリアクタンス成分の時間的変化を前記リアクタンス成分の時間的変化として前記細胞の薬物代謝活性度を測定する。
【０００８】
さらに、請求項３記載の細胞の薬物代謝活性測定方法は、上方に対電極と参照電極とが配設された作用電極の表面において細胞を培地で培養し、前記細胞に薬物を添加した後に、前記作用電極と前記対電極との間にその周波数を変更しつつ交流信号を印加して当該作用電極と当該参照電極との間を流れる交流電流に基づいて当該各周波数毎に当該作用電極と当該参照電極との間におけるインピーダンスのリアクタンス成分を測定する測定処理を、前記薬物の添加直後と当該添加直後から所定時間を経過した時点とでそれぞれ実施し、前記所定時間を経過した時点で測定した前記各周波数毎の前記リアクタンス成分を、前記添加直後に測定した前記各周波数毎の前記リアクタンス成分で正規化し、当該正規化したリアクタンス成分が最大となる周波数を前記所定の周波数とする。
【０００９】
また、請求項４記載の細胞の薬物代謝活性測定方法は、請求項１または２に記載の細胞の薬物代謝活性測定方法を前記薬物の濃度を変えて複数回実施する。
【００１０】
また、請求項５記載の細胞の薬物代謝活性測定装置は、請求項１から３のいずれかに記載の細胞の薬物代謝活性測定方法を実行可能に構成されている。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る細胞の薬物代謝活性測定方法および細胞の薬物代謝活性測定装置によれば、上方に対電極と参照電極とが配設された作用電極の表面において細胞を培地中で培養して、細胞に薬物を添加した後に、作用電極と対電極との間に所定周波数の交流信号を印加しつつ、例えば、作用電極と参照電極との間を流れる交流電流に基づいて、薬物の添加直後からの作用電極と参照電極との間におけるインピーダンスのリアクタンス成分の時間的変化を測定する。したがって、測定したリアクタンス成分の時間的変化に基づいて、薬物に対する細胞の薬物代謝活性度を測定することにより、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いることなく、薬物に対する細胞の薬物代謝活性度を簡便に測定することができる。また、細胞の薬物代謝活性測定装置を簡易に構成することができる。
【００１２】
また、本発明に係る細胞の薬物代謝活性測定方法および細胞の薬物代謝活性測定装置によれば、測定したリアクタンス成分を、薬物の添加直後に測定したリアクタンス成分で正規化し、正規化したリアクタンス成分の時間的変化に基づいて細胞の薬物代謝活性度を測定することにより、各電極とインピーダンス測定装置との間に生じる接触抵抗や、添加した薬物の添加量のばらつきなどの外部誤差要因をキャンセルすることができるため、微小なリアクタンス成分の時間的変化を感度よく測定することができる。したがって、添加した薬物に対する細胞の薬物代謝活性度を確実に測定することができる。
【００１３】
また、本発明に係る細胞の薬物代謝活性測定方法および細胞の薬物代謝活性測定装置によれば、上方に対電極と参照電極とが配設された作用電極の表面において細胞を培地中で培養して、細胞に薬物を添加した後に、作用電極と対電極との間にその周波数を変更しつつ交流信号を印加して作用電極と参照電極との間を流れる交流電流に基づいて各周波数毎に作用電極と参照電極との間におけるインピーダンスのリアクタンス成分を測定する測定処理を、薬物の添加直後と添加直後から所定時間を経過した時点とでそれぞれ実施し、所定時間を経過した時点で測定した各周波数毎のリアクタンス成分を、添加直後に測定した各周波数毎のリアクタンス成分で正規化し、正規化したリアクタンス成分が最大となる周波数を所定の周波数とすることにより、特異的に検出感度の高い周波数を所定周波数として使用することができるため、微小なリアクタンス成分を感度よく測定することができる。
【００１４】
また、本発明に係る細胞の薬物代謝活性測定方法によれば、上記の細胞の薬物代謝活性測定方法を薬物の濃度を変えて複数回実施することにより、薬物の濃度変化に伴う細胞による代謝生成物の生成量の相対的な変化を測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、添付図面を参照して、本発明に係る細胞の薬物代謝活性測定方法および細胞の薬物代謝活性測定装置の一形態について説明する。
【００１６】
最初に、細胞の薬物代謝活性測定方法を実施するための測定装置の構成について、図１，２を参照して説明する。
【００１７】
測定装置１は、本発明における細胞の薬物代謝活性測定装置に相当し、図１に示すように、作用電極としてのＩＴＯ（インジウム−酸化スズ）電極２、クローニングリング３、カウンター電極（対電極）４、参照電極５、２本の引出電極６，７、電極固定器８、インキュベータ９、薬物添加装置１０、インピーダンス測定装置１１、およびパーソナルコンピュータ１２（以下、「コンピュータ１２」ともいう）を備えて構成されている。ＩＴＯ電極２は、ガラス板（一例として、１．５ｃｍ×１．５ｃｍ）の片面全体にＩＴＯが蒸着されて構成されている。また、ＩＴＯ電極２のＩＴＯ蒸着面には、直線状の白金ワイヤが引出電極６として連結されている。クローニングリング３は、図２に示すように、外径、内径および高さがそれぞれ１．２ｃｍ、１．０ｃｍおよび１．０ｃｍに形成された円筒状ガラスリングで構成されている。なお、図２においては、理解を容易にするために、クローニングリング３の高さを実際よりも低く誇張して表している。また、クローニングリング３は、図１，２に示すように、ＩＴＯ電極２におけるＩＴＯ蒸着面の中央に、一方の端部側がエポキシ系接着剤で接着されて固定されている。これにより、クローニングリング３は、ＩＴＯ電極２と共に、底面積０．７８５ｃｍ２、体積０．７８５ｃｍ３のインピーダンス測定容器１３を構成する。カウンター電極４は、図２に示すように、一例として、直径１ｍｍの白金ワイヤを用いて、内径が６．４ｍｍのリング体に形成されている（なお、同図ではカウンター電極４を板状に示している）。また、カウンター電極４には、カウンター電極４と直交するように直線状の白金ワイヤが引出電極７として連結されている。さらに、カウンター電極４は、図１に示すように、絶縁材料で形成された電極固定器８に引出電極７が固定されることにより、クローニングリング３の内部におけるＩＴＯ電極２の上方において、ＩＴＯ電極２と平行で、かつＩＴＯ電極２との距離Ｌ１が一例として１．０ｍｍとなるように配設されている。参照電極５は、直線状の白金ワイヤで構成されている。また、参照電極５は、電極固定器８に固定されることにより、ＩＴＯ電極２の上方におけるカウンター電極４の軸線上に配設されると共に、ＩＴＯ電極２側の端部とＩＴＯ電極２との距離Ｌ２が一例として０．５ｍｍとなるように配設されている。また、ＩＴＯ電極２およびクローニングリング３（インピーダンス測定容器１３）、引出電極６、参照電極５、カウンター電極４、引出電極７、電極固定器８は、金属製の載置台９ａ上に載置されてインキュベータ９内に配設されている。
【００１８】
薬物添加装置１０は、一例として、注入器１０ａ、注入管１０ｂおよびチューブ１０ｃを備えている。注入器１０ａは、インキュベータ９の外部に配設されると共に、電極固定器８に固定された注入管１０ｂにチューブ１０ｃを介して連結されている。これにより、薬物添加装置１０は、インキュベータ９の外部から所定濃度の薬物をインピーダンス測定容器１３内に添加可能に構成されている。インピーダンス測定装置１１は、インキュベータ９の外部に配設されると共に、プローブ１１ａ，１１ｂ，１１ｃを介して参照電極５、引出電極６および引出電極７にそれぞれ接続されている。また、インピーダンス測定装置１１は、引出電極６と引出電極７との間（つまり、ＩＴＯ電極２とカウンター電極４との間）にプローブ１１ｂ，１１ｃを介して任意の周波数の交流電圧（交流信号）Ｖを供給（印加）しつつ、参照電極５と引出電極６との間（つまり、参照電極５とＩＴＯ電極２との間）を流れる交流電流Ｉをプローブ１１ａ，１１ｂを介して検出することにより、インピーダンス測定容器１３の底面（ＩＴＯ電極２の表面）に接着した細胞１４のインピーダンスＺを３端子法によって測定可能に構成されている。また、インピーダンス測定装置１１は、交流電流Ｉと交流電圧Ｖとの位相差θを測定する機能も備えている。コンピュータ１２は、インピーダンス測定装置１１を制御してインピーダンス測定動作を実行させると共に、インピーダンス測定装置１１によって測定されたインピーダンスＺと、位相差θとを入力して記憶する。
【００１９】
次いで、測定装置１を用いた細胞の薬物代謝活性測定方法について説明する。なお、一例として、ＣＹＰ３Ａ４活性を発現したヒト肝由来細胞株であるＧＳ−３Ａ４−ＨｅｐＧ２細胞の薬物（テストステロン）に対する薬物代謝活性度を測定する例について説明する。この場合、テストステロンはＣＹＰ３Ａ４の活性を評価する最も一般的な試薬とされている。
【００２０】
まず、インピーダンス測定容器１３の内部に細胞１４を培養する（培養ステップ）。具体的には、インピーダンス測定容器１３の底面（ＩＴＯ電極２の表面）に３０万個／ウェル単位で細胞１４を播種し、ＣＯ２５％、湿度１００％、３７℃のインキュベータ９内で接着させて単層培養する。培地として、１０％ＦＢＳ入りのＲＤＦ（ＨＯ）培地（サプリメントとして２．５７６ｇ／ｌ  グルコース，２ｇ／ｌ  ＮａＨＣＯ３，０．３３３ｇ／ｌ  グルタミン，５８．８ｍｇ／ｌ  ペニシリンＧ，１２０ｍｌ／ｌ  ストレプトマイシン，０．２％（ｖ／ｖ）Ｚｅｏｃｉｎを添加）を使用し、各ウェルに５００μｌ，を使用して培養する。なお、ＲＤＦ培地は、ＲＰＭＩ１６４０：ＤＭＥＭ：Ｆ１２＝２：１：１の混合培地であり、ＲＤＦ（ＨＯ）培地はＲＤＦ培地からグルタミンとグルコースを抜いたものである。
【００２１】
次いで、細胞１４の形態観察を顕微鏡で定期的に行い、ＩＴＯ電極２上の細胞１４が増殖してコンフレントになったときに、培養培地をすべて抜き取ると共に、ＦＢＳなしの測定用培地（Ｌ−１５培地）２００μｌに変更する。続いて、インキュベータ９内を大気で満たすと共に温度を３７℃に設定し、この状態でインピーダンス測定装置１１を作動させて、交流電圧Ｖを細胞１４に供給することにより、細胞１４についてのインピーダンスＺの測定を開始する。その後、インピーダンスＺの値が安定するのを待って、テストステロンを細胞１４に添加する。続いて、細胞１４のインピーダンスＺの測定と、交流電流Ｉおよび交流電圧Ｖの位相差θについての測定とを、所定時間（一例として２分間隔）毎に、交流電圧Ｖの周波数を１００Ｈｚから１ＭＨｚまで所定周波数ステップでスイープさせつつ、予め決められた時間（一例として１１８分）だけ実施する（インピーダンス測定ステップ）。この際に、コンピュータ１２は、インピーダンス測定装置１１によって測定されたインピーダンスＺと位相差θとを互いに対応させて記憶する。
【００２２】
続いて、コンピュータ１２に記憶されたテストステロンの添加直後からの各所定時間毎の全周波数についてのインピーダンスＺのリアクタンス成分Ｘ（ｔ）を、インピーダンスＺとそれに対応する位相差θとに基づいてコンピュータ１２上ですべて計算すると共に、コンピュータ１２に記憶させる（リアクタンス成分算出ステップ）。次いで、コンピュータ１２を用いて、テストステロンの添加直後（ｔ＝０）の１００Ｈｚから１ＭＨｚまでの各周波数毎のリアクタンス成分Ｘ（ｔ＝０）を基準として、テストステロンの添加直後（ｔ＝０）からの各所定時間毎の全周波数についてのリアクタンス成分τＸ（ｔ）を正規化すると共に、正規化したリアクタンス成分τＸ（ｔ）をコンピュータ１２に記憶させる（リアクタンス成分正規化ステップ）。
【００２３】
次いで、テストステロンの添加直後から任意の時間（ｔ＝ａ：例えば、ａを１１８分とする）だけ経過した時点での、１００Ｈｚから１ＭＨｚまでの全周波数におけるリアクタンス成分τＸ（ｔ＝ａ）の最大値を求めると共に、リアクタンス成分τＸ（ｔ＝ａ）が最大となる周波数を測定周波数（所定周波数）として決定する（測定周波数決定ステップ）。リアクタンス成分τＸ（ｔ＝ａ）の最大値を求める手法としては、例えば、１００Ｈｚから１ＭＨｚまでの各周波数毎のリアクタンス成分τＸ（ｔ＝ａ）の変化の様子を図３において●印で示すようにグラフ化し、このグラフに基づいてリアクタンス成分τＸ（ｔ＝ａ）が最大となる測定周波数を決定する。実験によれば、細胞１４があるときのリアクタンス成分τＸ（ｔ＝ａ）は、細胞１４がないときのリアクタンス成分τＸ（ｔ＝ａ）（同図中において○印で示す）とは異なり、値が大きく増加する周波数帯域が存在することを確認した。例えば、図３では、１００ｋＨｚ近傍でτＸ（ｔ＝ａ）が最大となるため、１００ｋＨｚを測定周波数として決定する。これにより、最も検出感度の高い測定周波数の交流電圧Ｖを印加したときのリアクタンス成分τＸ（ｔ）に基づいて細胞１４の薬物代謝活性度を測定することができるため、測定感度を向上させることができる。
【００２４】
上記した培養ステップ、インピーダンス測定ステップ、リアクタンス成分算出ステップ、リアクタンス成分正規化ステップ、および測定周波数決定ステップを、添加するテストステロンに測定溶液を加えてその濃度を変えて複数回実施する。一例として、０μＭ（マイクロモル）、５０μＭ、７５μＭ、１５０μＭ、３００μＭの各濃度のテストステロンについて、上記の各ステップを実施して、各濃度における上記のリアクタンス成分τＸ（ｔ）を算出すると共に、測定周波数を決定する。
【００２５】
次いで、測定周波数におけるテストステロンの添加直後からのリアクタンス成分τＸ（ｔ）の時間的変化を、テストステロンの各濃度毎に、例えば図４に示すようにグラフ化し、このグラフに基づいて細胞１４のテストステロンに対する薬物代謝活性度を測定する（薬物代謝活性度測定ステップ）。同図によれば、テストステロンの濃度が０μＭのときは、添加直後からほぼ一定の割合でリアクタンス成分τＸ（ｔ）が増加しているのが理解される。一方、５０μＭ〜３００μＭの濃度のテストステロンを添加したときには、各濃度におけるリアクタンス成分τＸ（ｔ）は、テストステロンの濃度に関係なく添加後４分から１０分までの間では、テストステロンの濃度が０μＭのときと同様に増加するが、その後１０分から６０分までの間では、テストステロンの濃度に応じて、テストステロンの濃度が０μＭのときとは異なる変化を示す。この場合、薬物代謝活性が極めて低いＨｅｐＧ２細胞を用いた同様の実験では、図示はしないが、リアクタンス成分τＸ（ｔ）は、５０μＭ〜３００μＭの各濃度において一様に増加することが確認されている。また、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて代謝生成物を測定したが、５０μＭ〜３００μＭのいずれの濃度においても代謝生成物は検出されなかった。一方、ＧＳ−３Ａ４−ＨｅｐＧ２細胞については、図５において■印で示すように、５０μＭ〜３００μＭの各濃度において代謝生成物（６−ベータ−ハイドロキシ−テストステロン）の生成がＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって確認されると共に、濃度が高まるにつれて代謝生成物の生成量が増加することが確認されている。したがって、テストステロンを添加したときのリアクタンス成分τＸ（ｔ）が、時間と共にほぼ一定の割合で増加せずに、添加後しばらくしてから、増加が一時的に停止したり、さらには一時的に減少したりする傾向が観察されたときには、細胞１４によってテストステロンが代謝されて、代謝生成物が生成されていると判別することができる。つまり、リアクタンス成分τＸ（ｔ）の時間的変化を観察することにより、細胞１４によるテストステロンの薬物代謝活性度を測定することができる。
【００２６】
次いで、５０μＭ〜３００μＭの各濃度でのリアクタンス成分τＸ（ｔ）の時間的変化を濃度０μＭのリアクタンス成分τＸ（ｔ）を基準として観察し、濃度０μＭのリアクタンス成分τＸ（ｔ）を基準としたときの各濃度でのリアクタンス成分τＸ（ｔ）の時間的変化が最大となる添加直後からの経過時間を求める。図４においては、テストステロンの添加直後から約４０分経過した時点において、濃度０μＭのリアクタンス成分τＸ（ｔ）を基準とした５０μＭ〜３００μＭの各濃度でのリアクタンス成分τＸ（ｔ）の時間的変化が最大となることが観察される。次いで、テストステロンの添加から約４０分経過後の濃度０μＭのリアクタンス成分τＸ（ｔ＝４０）をδ０μＭとし、５０μＭ〜３００μＭの各濃度でのリアクタンス成分τＸ（ｔ＝４０）をδαμＭとして、δ０μＭとδαμＭとの差分の絶対値ΔτＸを５０μＭ〜３００μＭの各濃度毎に求める。その結果、濃度０μＭについての絶対値ΔτＸはゼロであり、濃度５０μＭについての絶対値ΔτＸは０．０１６である。また、濃度７５μＭ、１５０μＭ、３００μＭについての絶対値ΔτＸは、それぞれ０．０２３、０．０４１、０．０４８である。次いで、求めた各濃度における絶対値ΔτＸをテストステロンの濃度を横軸として図５において□印で示すようにグラフ化する（代謝物生成量測定ステップ）。この場合、同図に示すように、各濃度毎の絶対値ΔτＸは、各濃度において細胞１４が代謝生成した代謝生成物の生成量（同図において■印で示す）と相関関係にある。なお、同図において■印で示す代謝生成物の生成量は、テストステロンの濃度が５０μＭのときの生成量を１として正規化したものである。したがって、同図を観察することにより、テストステロンの各濃度での細胞１４による代謝生成物の生成量の絶対値を測定するのは困難であるものの、テストステロンの各濃度での代謝生成物の生成量の相対的な変化を測定することができる。
【００２７】
このように、この細胞の薬物代謝活性測定方法によれば、上方にカウンター電極４と参照電極５とが配設されたＩＴＯ電極２の表面に細胞１４を接着させて単層培養して、細胞１４にテストステロンを添加した後に、ＩＴＯ電極２とカウンター電極４との間に交流電圧Ｖを供給しつつＩＴＯ電極２と参照電極５との間を流れる交流電流Ｉを測定することによってテストステロンの添加直後からのＩＴＯ電極２と参照電極５との間におけるインピーダンスＺのリアクタンス成分Ｘ（ｔ）の時間的変化を測定し、このリアクタンス成分Ｘ（ｔ）の時間的変化に基づいて、テストステロンに対する細胞１４の薬物代謝活性度を測定することにより、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いることなく、テストステロンに対する細胞１４の薬物代謝活性度を簡便に測定することができる。また、その分、測定装置１を簡易に構成することができる。
【００２８】
また、測定したリアクタンス成分Ｘ（ｔ）を、テストステロンの添加直後に測定したリアクタンス成分Ｘ（ｔ＝０）で正規化し、正規化したリアクタンス成分τＸ（ｔ）の時間的変化に基づいて細胞の薬物代謝活性度を測定することにより、各電極５，６，７とインピーダンス測定装置１１との間に生じる接触抵抗や、添加したテストステロンの添加量のばらつきなどの外部誤差要因をキャンセルすることができるため、微小なリアクタンス成分Ｘ（ｔ）の時間的変化を感度よく測定することができる。したがって、テストステロンに対する細胞１４の薬物代謝活性度を確実に測定することができる。
【００２９】
さらに、上方にカウンター電極４と参照電極５とが配設されたＩＴＯ電極２の表面に細胞１４を接着させて単層培養して、細胞１４にテストステロンを添加した後に、ＩＴＯ電極２とカウンター電極４との間にその周波数を変更しつつ交流電圧Ｖを供給してＩＴＯ電極２と参照電極５との間を流れる交流電流Ｉに基づいて各周波数毎にＩＴＯ電極２と参照電極５との間におけるインピーダンスのリアクタンス成分Ｘ（ｔ）を測定するインピーダンス測定ステップ（測定処理）を、テストステロンの添加直後と添加直後から所定時間を経過した時点（ｔ＝ａ）とでそれぞれ実施し、所定時間を経過した時点で測定した各周波数毎のリアクタンス成分Ｘ（ｔ）を、添加直後に測定した各周波数毎のリアクタンス成分Ｘ（ｔ）で正規化し、正規化したリアクタンス成分τＸ（ｔ）が最大となる周波数を測定周波数（所定周波数）とすることにより、特異的に検出感度の高い周波数を測定周波数として使用することができるため、微小なリアクタンス成分を感度よく測定することができる。
【００３０】
また、添加するテストステロンの濃度を変えて正規化したリアクタンス成分τＸ（ｔ）の各濃度毎の時間的変化を複数回測定することにより、テストステロンの濃度変化に伴う細胞１４による代謝生成物の生成量の相対的な変化を測定することができる。
【００３１】
なお、上記した本発明に係る細胞の薬物代謝活性測定方法では、各電極５，６，７とインピーダンス測定装置１１との間に生じる接触抵抗や、添加したテストステロンの添加量（濃度）のばらつきなどの外部誤差要因をキャンセルして、微小なリアクタンス成分Ｘ（ｔ）の時間的変化を感度よく測定するために、測定したリアクタンス成分Ｘ（ｔ）を、テストステロンの添加直後に測定したリアクタンス成分Ｘ（ｔ＝０）で正規化した例について説明したが、接触抵抗が極めて小さく、かつテストステロンをばらつきの少ない状態で添加できる測定装置を用いるときは、測定したリアクタンス成分Ｘ（ｔ）を正規化することなく、そのリアクタンス成分Ｘ（ｔ）の時間的変化に基づいて薬物に対する細胞の薬物代謝活性度を測定することができる。また、上記した本発明に係る細胞の薬物代謝活性測定方法では、テストステロンの複数の濃度での代謝生成物の生成量の相対的な変化を測定するために、添加するテストステロンの濃度を変えて、複数の濃度毎のリアクタンス成分τＸ（ｔ）を算出する例について説明したが、細胞１４がテストステロンを代謝するか否かを測定するだけであれば、複数の濃度について測定する必要はなく、１種類の濃度のテストステロンを添加する方法を採用することができる。また、細胞１４のリアクタンスを測定するに最適な測定周波数が既知のときには、交流電圧Ｖの周波数を所定時間毎にスイープさせる必要がないため、その既知の測定周波数で交流電圧Ｖの周波数を固定してリアクタンスを測定する方法を採用することもできる。また、本発明に係る細胞の薬物代謝活性測定方法は、テストステロンに対するＧＳ−３Ａ４−ＨｅｐＧ２細胞、ＨｅｐＧ２細胞の薬物代謝活性度の測定のみならず、任意の薬物に対する任意の細胞の薬物代謝活性度の測定にも適用できるのは勿論である。例えば、チトクローム４５０（ＣＹＰ）分子種を持つ細胞に上記のＣＹＰの基質となる薬物を添加する際に、上記の細胞の薬物代謝活性測定を有効に適用することができる。
【００３２】
また、上記の電極２，４，５〜７としては、金属、高分子、炭素など導電性を持つ物質を少なくとも1種類用いていれば、いかなる材質のものであってもよい。また、電極２，４，５〜７のサイズおよび形状は、細胞１４が培養できる限り、任意のものを用いることができる。また、測定溶液については、薬物が溶解できる水溶液もしくは有機溶媒を少なくとも含んだものであればいかなる組成であってもよい。さらに、リアクタンス成分の測定系については、電極と測定溶液を接触させ得る系が少なくとも一組ある限り、いかなる構成であってもよい。また、使用する細胞１４としては、シトクロムＰ−４５０（ＣＹＰ）を含んだ細胞を少なくとも1種類以上用いている限り、骨髄由来細胞、胚性幹細胞、正常肝由来細胞、株化肝由来細胞、不死化肝由来細胞といったいかなる細胞の組み合わせでもよく、細胞の分化度や由来源となる臓器・組織等も特に限定されるものではない。
【００３３】
また、細胞１４の由来となる生物は人であることが好ましいが、特に限定されるものではなく、脊椎動物、無脊椎動物、植物、昆虫、菌体、微生物など少なくともＣＹＰを発現しているものであれば任意のものでよい。さらに、薬物については、シトクロムＰ−４５０（ＣＹＰ）の基質となりえるものを少なくとも一種類添加すれば、測定を妨げない限り、いかなる種類や濃度であってもよい。また、本発明で使用する細胞には、遺伝子導入が施されていてもよく、その遺伝子は、少なくとも1種類の遺伝子が導入されていれば、いかなる数や種類の遺伝子が導入されていてもよく、また、その遺伝子導入の方法も、最終的に少なくとも1種類の遺伝子が導入されていればいかなる手段を用いてもよい。加えて、本発明で使用する細胞の培養条件、例えば培養時の温度、供給する酸素や二酸化炭素の濃度、塩濃度やアミノ酸混合比、サイトカイン含有量、ビタミン含有量およびホルモン含有量といった培地成分、培地のｐＨ、培養基質、培養スケールなどは、少なくとも細胞１４が生存できるものであれば、いかなる条件であってもよいのは勿論である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】測定装置１の構成図である。
【図２】測定装置１のインピーダンス測定容器１３、および各電極４，５，６，７の構成を示す斜視図である。
【図３】周波数に対するリアクタンス成分τＸ（ｔ＝ａ）の変化の様子を示す特性図である。
【図４】テストステロンの濃度を変えたときのリアクタンス成分τＸ（ｔ）の時間的変化を示す特性図である。
【図５】テストステロンの濃度を変えたときの各濃度における代謝生成物の生成量と絶対値ΔτＸの各変化を示す特性図である。
【符号の説明】
【００３５】
１  測定装置
２  ＩＴＯ電極（作用電極）
４  カウンター電極（対電極）
５  参照電極
１４  細胞
Ｉ  交流電流
Ｖ  交流電圧
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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