(57)【要約】【課題】少量のサンプルを用いても、データ変動が小さく再現性も良好で、多くのサンプルを同時にかつ簡便に測定することができるＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性の測定方法や、かかる測定方法を利用したＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法や、それら方法に有利に用いることができるＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キットを提供すること。【解決手段】バナジン酸と［３Ｈ］ＡＴＰとを含む反応緩衝液にヒトＰ糖タンパク質が発現した昆虫細胞膜を添加してプレインキュベーションを行い、次いで、被験化合物を添加して反応させ、反応終了後の反応液を９６ウェルタイプのグラスフィルターに添加し、吸引洗浄法を用いて１ステップによるＰ糖タンパク質発現メンブレンへの［３Ｈ］ＡＤＰ吸着量を測定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＢＣ（ＡＴＰ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）タンパク質が発現している膜画分と、標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体と、ヌクレオシド三リン酸又はその誘導体のリン酸イオンと置換してヌクレオシド二リン酸と複合体を形成し、ヌクレオシド二リン酸と膜タンパク質との結合を維持するヌクレオシド二リン酸不動化物質と、被験物質とを接触させる工程と、前記膜タンパク質が発現している膜画分を洗浄液で洗浄し、少なくとも未反応の標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体をフィルターにより濾過して分離する工程と、フィルター上の標識及び／又は濾液中の標識を測定する工程とを有することを特徴とするＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
フィルターにより濾過して分離する工程が、フィルターにより吸引濾過及び／又は遠心濾過して分離する工程であることを特徴とする請求項１記載のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
ヌクレオシド二リン酸不動化物質が、バナジン酸であることを特徴とする請求項１又は２記載のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
ヌクレオシド三リン酸が、ＡＴＰであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
標識が、放射性標識，蛍光標識又は光親和基標識であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
放射性標識が、３２Ｐ，３３Ｐ，３５Ｓ，１４Ｃ又は３Ｈであることを特徴とする請求項５記載のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
ＡＢＣタンパク質が発現している膜画分が、ＡＢＣタンパク質が発現している哺乳類又は昆虫の細胞膜画分であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
ＡＢＣタンパク質と相互作用する物質が、ＡＢＣタンパク質に対する基質であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
ＡＢＣタンパク質と相互作用する物質が、ＡＢＣタンパク質の阻害物質であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
ＡＢＣタンパク質が、ＡＢＣＡサブファミリー，ＡＢＣＢサブファミリー，ＡＢＣＣサブファミリー，ＡＢＣＤサブファミリー，ＡＢＣＥサブファミリー，ＡＢＣＦサブファミリー又はＡＢＣＧサブファミリーに属するヒトＡＢＣタンパク質であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
ＡＢＣ（ＡＴＰ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）タンパク質が発現している膜画分と、標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体と、ヌクレオシド三リン酸又はその誘導体のリン酸イオンと置換してヌクレオシド二リン酸と複合体を形成し、ヌクレオシド二リン酸と膜タンパク質との結合を維持するヌクレオシド二リン酸不動化物質と、少なくとも未反応の標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体を濾過・分離しうるフィルターとを有することを特徴とするＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キット。
【請求項１２】
濾過・分離しうるフィルターが、吸引濾過及び／又は遠心濾過手段を備えていることを有することを特徴とする請求項１１記載のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キット。
【請求項１３】
ヌクレオシド二リン酸不動化物質が、バナジン酸であることを特徴とする請求項１１又は１２記載のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キット。
【請求項１４】
ヌクレオシド三リン酸が、ＡＴＰであることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか記載のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キット。
【請求項１５】
標識が、放射性標識，蛍光標識又は光親和基標識であることを特徴とする請求項１１〜１４のいずれか記載のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キット。
【請求項１６】
放射性標識が、３２Ｐ，３３Ｐ，３５Ｓ，１４Ｃ又は３Ｈであることを特徴とする請求項１５記載のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キット。
【請求項１７】
ＡＢＣタンパク質が発現している膜画分が、ＡＢＣタンパク質が発現している哺乳類又は昆虫の細胞膜画分であることを特徴とする請求項１１〜１６のいずれか記載のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キット。
【請求項１８】
ＡＢＣタンパク質と相互作用する物質が、ＡＢＣタンパク質に対する基質であることを特徴とする請求項１１〜１７のいずれか記載のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キット。
【請求項１９】
ＡＢＣタンパク質と相互作用する物質が、ＡＢＣタンパク質の阻害物質であることを特徴とする請求項１１〜１７のいずれか記載のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キット。
【請求項２０】
ＡＢＣタンパク質が、ＡＢＣＡサブファミリー，ＡＢＣＢサブファミリー，ＡＢＣＣサブファミリー，ＡＢＣＤサブファミリー，ＡＢＣＥサブファミリー，ＡＢＣＦサブファミリー又はＡＢＣＧサブファミリーに属するヒトＡＢＣタンパク質であることを特徴とする請求項１１〜１９のいずれか記載のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キット。
【請求項２１】
ＡＢＣ（ＡＴＰ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）タンパク質が発現している膜画分と、標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体と、ヌクレオシド三リン酸又はその誘導体のリン酸イオンと置換してヌクレオシド二リン酸と複合体を形成し、ヌクレオシド二リン酸と膜タンパク質との結合を維持するヌクレオシド二リン酸不動化物質と、ＡＢＣタンパク質の基質とを接触させる工程と、前記膜タンパク質が発現している膜画分を洗浄液で洗浄し、少なくとも未反応の標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体をフィルターにより濾過して分離する工程と、フィルター上の標識及び／又は濾液中の標識を測定する工程とを有することを特徴とするＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＡＢＣ（ＡＴＰ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）タンパク質（ＡＢＣトランスポーター）と相互作用する物質のスクリーニング方法や、ＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性の測定方法や、これらスクリーニング方法や測定方法に有利に用いることができるＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞は形質膜や小胞体，ミトコンドリアなどの細胞内小器官膜を介してイオンや栄養素の輸送ならびに老廃物や毒素の排出を行うことにより細胞機能を維持している。これらの物質輸送は、チャネル，トランスポーターと呼ばれる膜輸送タンパク質により選択的に行われている。イオンや栄養素等の物質が細胞膜を透過するための機構としていくつか知られているが、その一つとしてＡＢＣタンパク質が知られている（例えば、非特許文献１参照）。ＡＢＣタンパク質は、トランスポーター，チャネル，受容体（レギュレーター）という多様な機能に分化し、それぞれの生物で重要な生理機能を果たしており、いずれも類似の２次構造をもち、膜貫通ドメインを含むＡＴＰ結合ドメインを共通に有する膜タンパク質ファミリーであり、細胞内ＡＴＰ、ＡＤＰによって駆動あるいは制御されている。ＡＢＣタンパク質は、細菌から酵母、植物、哺乳類に至る広い生物種に分布する最も大きい遺伝子ファミリーの一つである。ヒトでは現在約５０以上のＡＢＣタンパク質遺伝子が同定されてこれらのタンパク質の大部分は、膜間の分子の能動輸送に関連していることから、ＡＢＣタンパク質はＡＢＣトランスポーターとも呼ばれている。
【０００３】
ＡＢＣタンパク質は、ＡＴＰ加水分解のエネルギーをタンパク質分子の構造変化に変換し、それとカップリングすることによって薬剤を細胞の中から外へ輸送することから、薬物の体内動態プロファイル（吸収、分布、代謝、排泄、ターゲット部位での薬剤実効濃度）を規定し、ひいては薬物の全体的な薬理効果をも左右するといわれており、例えば、小腸上皮細胞や脳血管内皮細胞に発現したＡＢＣトランスポーターは、経口投与した薬物のバイオアベイラビリティーや中枢神経系への薬物移行に大きく影響を与える。また、ＡＢＣタンパク質遺伝子の異常が病気と関連しているといわれており、特にヒトにおいては、ＡＢＣタンパク質の異常がさまざまな疾病を引き起こすことが明らかになり、ＡＢＣタンパク質の生体防御機構としての重要性が理解されつつある。例えば、ＡＢＣタンパク質ファミリーに属するＰ−糖タンパク質（ＭＤＲ１）やＭＲＰ１が過剰発現すると、多くの制癌剤を細胞外へ排出することによって癌細胞が耐性になることが、癌の化学療法の分野では良く知られている。
【０００４】
そして、ＡＢＣタンパク質がトランスポーターとして細胞膜を介して薬物を輸送する機構は次のように考えられている。
（１）ＡＢＣタンパク質は細胞膜の両面（細胞の内側及び外側）にわたって膜中に存在する。
（２）このＡＢＣタンパク質に、細胞の内側から、エネルギー源としての１分子のＡＴＰ及び輸送されるべき１分子の薬物が結合し、ＡＴＰはＡＢＣタンパク質のＡＴＰアーゼ活性によりＡＤＰとリン酸とに加水分解され、この際に放出されるエネルギーによるＡＢＣタンパク質の変形により薬物は細胞の内側から外側に輸送される。
（３）前記薬物は細胞の内側に放出されると共に、（２）において生成したリン酸もＡＢＣタンパク質から開放される。
（４）ＡＢＣタンパク質に、細胞の内側から、新たなＡＴＰ分子が結合し、このＡＴＰがＡＤＰとリン酸とに分解し、エネルギーが開放され、このエネルギーにより前記（２）において変形したＡＢＣタンパク質の形状が復旧する。
（５）前記（４）において生成したＡＤＰ及びリン酸がＡＢＣタンパク質から開放され、輸送系は前記（１）の状態に戻る。
【０００５】
現在、ＡＢＣトランスポーターの中で最も注目を浴びているＰ−糖タンパク質のアッセイにおいて、Ｐ−糖タンパク質が発現している膜に基質を添加した際のＡＴＰアーゼ活性を測定する方法が多くの製薬会社等で採用されている。具体的には、上記のサイクルにおいて、上記（２）の段階において輸送されるべき薬物の存在によりＡＴＰがＡＢＣタンパク質に結合し、ＡＤＰに分解されることから、ＡＢＣタンパク質に結合した状態のＡＤＰを測定すれば、ＡＢＣタンパク質により認識される薬物を検出することができる。従って、ＡＴＰに標識を付しておき、標識が結合したＡＢＣタンパク質（すなわち標識されたＡＤＰが結合しているＡＢＣタンパク質）を測定すれば、ＡＢＣタンパク質によって輸送される薬物又は阻害剤を検出することができる。この手法の長所としては、試薬代が非常に安価であること、大量の検体を処理することが可能であること等の長所を有する。しかしながら、上記輸送系は酵素回転しており動的状態にあるので、標識されたＡＢＣタンパク質を測定することは事実上困難である。また、膜自体の持つ内因性ＡＴＰアーゼ活性により若干バックグラウンドが高くなる場合があることや、リン酸濃度の分解量を測定することから、感度が比較的低いといった弱点があった。
【０００６】
そこで、上述のＡＴＰアーゼ活性を測定する手法に変わる方法として、バナデート法を応用したアッセイが考案された。バナデート法は、１９９５年以降に論文に報告されるようになった方法であり、ＡＢＣトランスポーターがＡＴＰを分解する際、リン酸イオンがバナデートに置換されることによって、ＡＤＰがトランスポーターに結合するという現象を利用するものである。すなわち、ＡＴＰとして予めラジオアイソトープ等で標識したＡＴＰを用い、上記輸送系にバナジン酸を存在させれば、上記（２）の段階で、バナジン酸がリン酸と置き換わり、上記輸送系の回転が停止し、標識されたＡＤＰがＡＢＣタンパク質に結合した状態に留まり、ＡＢＣタンパク質に結合したＡＤＰの量を定量することができ、間接的にＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性を測定することが可能となる。
【０００７】
この測定において、従来は、細胞膜から膜タンパク質及びＡＢＣタンパク質を遊離せしめ、遊離したＡＢＣタンパク質を電気泳動により他のタンパク質から分離し、ＡＢＣタンパク質に結合している標識（すなわち標識されたＡＤＰ）を測定していた。この方法によれば被験薬物がＡＢＣタンパク質の基質又は阻害剤であるか否かを決定することが可能であるが、多量の被験物質を短時間に試験することは不可能であった。
【０００８】
そこで、本発明者らは、ＡＢＣ−結合カセット（ＡＢＣ）蛋白質に対する基質のスクリーニング方法において、ＡＢＣ蛋白質が発現している細胞膜画分、標識されたＡＴＰ及びバナジン酸、並びに被験試料を混合してインキュベートし、この混合物を、ＡＢＣ蛋白質に対する抗体が固定化された支持体に添加する、又はその支持体上で標識試薬及び被験試料等を混合してインキュベートし、そして固定化された標識又は固定化されなかった標識を測定するＡＢＣ蛋白質の基質のスクリーニング方法を提案した（特許文献１参照）。かかるスクリーニング方法によれば、ＡＢＣトランスポーターが発現した細胞膜画分を、抗体を介して支持体（例えば９６ウェルマイクロプレート）に結合させ、ＡＢＣトランスポーターに結合した［３２Ｐ］ＡＴＰ（ＡＤＰ）の結合量を測定することによりＡＢＣトランスポーターに対する基質又は阻害剤を極めて効率よくスクリーニング可能であり、ハイスループットスクリーニングへの応用が可能となる。しかしながら、上記の方法及びキットでは、抗体を介して支持体に固定化した後のＡＢＣトランスポーターが発現している細胞膜画分は生理活性が不安定であること、１ウェルあたりに吸着可能な細胞膜画分の量に制限があり、実験データの再現性に問題がある等の不都合があり、安定したデータ解析の可能なより実用的な実験系の構築に迫られていた。
【０００９】
【特許文献１】
国際公開第０２／０５２２６２号パンフレット
【非特許文献１】
Ｃ．  Ｆ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ８，  ６７  （１９９２）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、少量のサンプルを用いても、データ変動が小さく再現性も良好で、多くのサンプルを同時にかつ簡便に測定することができるＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性の測定方法や、かかる測定方法を利用したＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法や、それら方法に有利に用いることができるＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キットを提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、本発明者らによる既存のバナデート法（特許文献１参照）の改良に着手し、バナジン酸と［３Ｈ］ＡＴＰとを含む反応緩衝液にヒトＰ糖タンパク質が発現した昆虫細胞膜を添加してプレインキュベーションを行い、次いで、被験化合物を添加して反応させ、反応終了後の反応液を９６ウェルタイプのグラスフィルターに添加し、吸引洗浄法を用いて１ステップによるＰ糖タンパク質発現メンブレンへの［３Ｈ］ＡＤＰ吸着量を測定したところ、少量のサンプルを用いても、データ変動が小さく再現性も良好で、多くのサンプルを同時にかつ簡便に測定することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、ＡＢＣ（ＡＴＰ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）タンパク質が発現している膜画分と、標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体と、ヌクレオシド三リン酸又はその誘導体のリン酸イオンと置換してヌクレオシド二リン酸と複合体を形成し、ヌクレオシド二リン酸と膜タンパク質との結合を維持するヌクレオシド二リン酸不動化物質と、被験物質とを接触させる工程と、前記膜タンパク質が発現している膜画分を洗浄液で洗浄し、少なくとも未反応の標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体をフィルターにより濾過して分離する工程と、フィルター上の標識及び／又は濾液中の標識を測定する工程とを有することを特徴とするＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法（請求項１）や、フィルターにより濾過して分離する工程が、フィルターにより吸引濾過及び／又は遠心濾過して分離する工程であることを特徴とする請求項１記載のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法（請求項２）や、ヌクレオシド二リン酸不動化物質が、バナジン酸であることを特徴とする請求項１又は２記載のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法（請求項３）や、ヌクレオシド三リン酸が、ＡＴＰであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法（請求項４）や、標識が、放射性標識，蛍光標識又は光親和基標識であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法（請求項５）や、放射性標識が、３２Ｐ，３３Ｐ，３５Ｓ，１４Ｃ又は３Ｈであることを特徴とする請求項５記載のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法（請求項６）や、ＡＢＣタンパク質が発現している膜画分が、ＡＢＣタンパク質が発現している哺乳類又は昆虫の細胞膜画分であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法（請求項７）や、ＡＢＣタンパク質と相互作用する物質が、ＡＢＣタンパク質に対する基質であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法（請求項８）や、ＡＢＣタンパク質と相互作用する物質が、ＡＢＣタンパク質の阻害物質であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法（請求項９）や、ＡＢＣタンパク質が、ＡＢＣＡサブファミリー，ＡＢＣＢサブファミリー，ＡＢＣＣサブファミリー，ＡＢＣＤサブファミリー，ＡＢＣＥサブファミリー，ＡＢＣＦサブファミリー又はＡＢＣＧサブファミリーに属するヒトＡＢＣタンパク質であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法（請求項１０）に関する。
【００１３】
また本発明は、ＡＢＣ（ＡＴＰ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）タンパク質が発現している膜画分と、標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体と、ヌクレオシド三リン酸又はその誘導体のリン酸イオンと置換してヌクレオシド二リン酸と複合体を形成し、ヌクレオシド二リン酸と膜タンパク質との結合を維持するヌクレオシド二リン酸不動化物質と、少なくとも未反応の標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体を濾過・分離しうるフィルターとを有することを特徴とするＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キット（請求項１１）や、濾過・分離しうるフィルターが、吸引濾過及び／又は遠心濾過手段を備えていることを有することを特徴とする請求項１１記載のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キット（請求項１２）や、ヌクレオシド二リン酸不動化物質が、バナジン酸であることを特徴とする請求項１１又は１２記載のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キット（請求項１３）や、ヌクレオシド三リン酸が、ＡＴＰであることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか記載のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キット（請求項１４）や、標識が、放射性標識，蛍光標識又は光親和基標識であることを特徴とする請求項１１〜１４のいずれか記載のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キット（請求項１５）や、放射性標識が、３２Ｐ，３３Ｐ，３５Ｓ，１４Ｃ又は３Ｈであることを特徴とする請求項１５記載のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キット（請求項１６）や、ＡＢＣタンパク質が発現している膜画分が、ＡＢＣタンパク質が発現している哺乳類又は昆虫の細胞膜画分であることを特徴とする請求項１１〜１６のいずれか記載のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キット（請求項１７）や、ＡＢＣタンパク質と相互作用する物質が、ＡＢＣタンパク質に対する基質であることを特徴とする請求項１１〜１７のいずれか記載のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キット（請求項１８）や、ＡＢＣタンパク質と相互作用する物質が、ＡＢＣタンパク質の阻害物質であることを特徴とする請求項１１〜１７のいずれか記載のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キット（請求項１９）や、ＡＢＣタンパク質が、ＡＢＣＡサブファミリー，ＡＢＣＢサブファミリー，ＡＢＣＣサブファミリー，ＡＢＣＤサブファミリー，ＡＢＣＥサブファミリー，ＡＢＣＦサブファミリー又はＡＢＣＧサブファミリーに属するヒトＡＢＣタンパク質であることを特徴とする請求項１１〜１９のいずれか記載のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キット（請求項２０）に関する。
【００１４】
さらに本発明は、ＡＢＣ（ＡＴＰ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）タンパク質が発現している膜画分と、標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体と、ヌクレオシド三リン酸又はその誘導体のリン酸イオンと置換してヌクレオシド二リン酸と複合体を形成し、ヌクレオシド二リン酸と膜タンパク質との結合を維持するヌクレオシド二リン酸不動化物質と、ＡＢＣタンパク質の基質とを接触させる工程と、前記膜タンパク質が発現している膜画分を洗浄液で洗浄し、少なくとも未反応の標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体をフィルターにより濾過して分離する工程と、フィルター上の標識及び／又は濾液中の標識を測定する工程とを有することを特徴とするＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性の測定方法（請求項２１）に関する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法としては、ＡＢＣタンパク質が発現している膜画分と、標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体と、ヌクレオシド三リン酸又はその誘導体のリン酸イオンと置換してヌクレオシド二リン酸と複合体を形成し、ヌクレオシド二リン酸と膜タンパク質との結合を維持するヌクレオシド二リン酸不動化物質と、被験物質とを接触させる工程と、前記膜タンパク質が発現している膜画分を洗浄液で洗浄し、少なくとも未反応の標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体をフィルターにより濾過して分離する工程と、フィルター上の標識及び／又は濾液中の標識を測定する工程とを有するスクリーニング方法であれば特に制限されるものではなく、また、本発明のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性の測定方法としては、ＡＢＣタンパク質が発現している膜画分と、標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体と、ヌクレオシド三リン酸又はその誘導体のリン酸イオンと置換してヌクレオシド二リン酸と複合体を形成し、ヌクレオシド二リン酸と膜タンパク質との結合を維持するヌクレオシド二リン酸不動化物質と、ＡＢＣタンパク質の基質とを接触させる工程と、前記膜タンパク質が発現している膜画分を洗浄液で洗浄し、少なくとも未反応の標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体をフィルターにより濾過して分離する工程と、フィルター上の標識及び／又は濾液中の標識を測定する工程とを有する測定方法であれば特に制限されるものではなく、そしてまた、本発明のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キットとしては、ＡＢＣタンパク質が発現している膜画分と、標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体と、ヌクレオシド三リン酸又はその誘導体のリン酸イオンと置換してヌクレオシド二リン酸と複合体を形成し、ヌクレオシド二リン酸と膜タンパク質との結合を維持するヌクレオシド二リン酸不動化物質と、少なくとも未反応の標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体を濾過・分離しうるフィルターとを有する測定用キットであれば特に制限されるものではない。
【００１６】
ＡＢＣタンパク質は、ＡＴＰの加水分解によって得られるエネルギーを駆動力として物質を輸送したり、チャンネルを制御する。ＡＢＣタンパク質は、特徴的なＡＴＰ−結合部位を持ち、その１次構造はＡＢＣタンパク質の種類を超えて、また生物種を超え、進化を通してよく保持されている。特に、ＡＢＣタンパク質のＡＴＰ結合部位は、膜貫通部等の部分の１次構造と比較してアミノ酸残基配列が保存されている。ＷａｌｋｅｒＡとＷａｌｋｅｒＢモチーフ（Ｗａｌｋｅｒ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ｓａｒａｓｔｅ，  Ｍ．，  Ｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｍ．Ｊ．，  Ｇａｙ，  Ｎ．  Ｊ．  （１９８２）  ＥＭＢＯ  Ｊ  １，  ９４５−９４１）及びＡＢＣ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅモチーフ（Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｃ．  Ｆ．  （１９９２）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８，６７−１１３）が、そのＡＴＰ結合部位に共通のアミノ酸残基配列としてほぼ例外なく存在する。
【００１７】
本発明においてＡＢＣタンパク質とは、ＷａｌｋｅｒＡモチーフ（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−［Ｓｅｒ，  Ｔｈｒ，  Ｇｌｎ］（配列番号１）とＷａｌｋｅｒＢモチーフ（［Ｌｅｕ，  Ｉｌｅ，  Ｐｈｅ］−［Ｉｌｅ，  Ｌｅｕ，  Ｖａｌ］−Ｘ−Ａｓｐ−［Ｇｌｕ，  Ａｓｐ，  Ｓｅｒ］）（配列番号２）であり、且つ以下のＡＢＣ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅモチーフ  （［Ｌｅｕ，  Ｉｌｅ，  Ｖａｌ，  Ｍｅｔ，  Ｐｈｅ，  Ｔｙｒ，  Ｃｙｓ］−［Ｓｅｒ，  Ａｌａ］−［Ｓｅｒ，  Ａｌａ，  Ｐｒｏ，  Ｇｌｙ，  Ｌｅｕ，  Ｖａｌ，  Ｐｈｅ，  Ｔｙｒ，  Ｌｙｓ，  Ｇｌｎ，  Ｈｉｓ］−Ｇｌｙ−［Ａｓｐ，  Ｇｌｕ，  Ａｓｎ，  Ｇｌｎ，  Ｍｅｔ，  Ｔｒｐ］−［Ｌｙｓ，  Ａｒｇ，  Ｇｌｎ，  Ａｌａ，  Ｓｅｒ，  Ｐｒｏ，  Ｃｙｓ，  Ｌｅｕ，  Ｉｌｅ，  Ｍｅｔ，  Ｐｈｅ，  Ｔｒｐ］−［Ｌｙｓ，  Ａｒｇ，  Ａｓｎ，  Ｇｌｎ，  Ｓｅｒ，  Ｔｈｒ，  Ａｌａ，  Ｖａｌ，  Ｍｅｔ］−［Ｌｅｕ，  Ｉｌｅ，  Ｖａｌ，  Ｍｅｔ，  Ｐｈｅ，  Ｔｙｒ，  Ｐｒｏ，  Ａｌａ，  Ａｓｎ］−［Ｐｒｏ，  Ｈｉｓ，  Ｔｙｒ］−［Ｌｅｕ，  Ｉｌｅ，  Ｖａｌ，  Ｍｅｔ，  Ｐｈｅ，  Ｔｒｐ］−［Ｓｅｒ，  Ａｌａ，  Ｇｌｙ，  Ｃｙｓ，  Ｌｅｕ，  Ｉｌｅ，  Ｖａｌ，  Ｐｈｅ］−［Ｐｈｅ，  Ｔｙｒ，  Ｔｒｐ，  Ｈｉｓ，  Ｐｒｏ］−［Ｌｙｓ，  Ａｒｇ，  Ｈｉｓ，  Ｐｒｏ］−［Ｌｅｕ，  Ｉｌｅ，  Ｖａｌ，  Ｍｅｔ，  Ｐｈｅ，  Ｔｙｒ，  Ｔｒｐ，  Ｓｅｒ，  Ｔｈｒ，  Ａｌａ］（ただしＸは不特定のアミノ酸を意味する。）（配列番号３）を有するタンパク質及びそれに類似するタンパク質をいい、その由来は細菌、酵母、植物及び動物など、特に制限されない。
【００１８】
かかるＡＢＣタンパク質としては、ＡＢＣＡ１（別名ＡＢＣ１，ＴＧＤ，ＨＤＬＤＴ１），ＡＢＣＡ２（別名ＡＢＣ２），ＡＢＣＡ３（別名ＡＢＣ３，ＡＢＣ−Ｃ，ＥＳＴ１１１６５３），ＡＢＣＡ４（別名ＳＴＧＤ１，ＲＰ１９，ＦＦＭ，ＳＴＧＤ），ＡＢＣＡ５（別名ＥＳＴ９０６２５），ＡＢＣＡ６（別名ＥＳＴ１５５０５１），ＡＢＣＡ７，ＡＢＣＡ８，ＡＢＣＡ９，ＡＢＣＡ１０（別名ＥＳＴ６９８７３９），ＡＢＣＡ１１（別名ＥＳＴ１１３３５３０），ＡＢＣＡ１２（ＤＫＦＺＰ４３４Ｇ２３２）等のＡＢＣＡサブファミリー（別名ＡＢＣ１サブファミリー）に属するヒトＡＢＣタンパク質や、ＡＢＣＢ１（別名ＭＤＲ１，Ｐ−ｇｐ，ＰＧＹ１），ＴＡＰ１（別名ＰＳＦ１，ＲＩＮＧ４，Ｄ６Ｓ１１４Ｅ），ＴＡＰ２（別名ＰＳＦ２，ＲＩＮＧ１１，Ｄ６Ｓ２１７Ｅ），ＡＢＣＢ４（別名ＭＤＲ２／３，ＰＦＩＣ−３，ＰＧＹ３），ＡＢＣＢ５（別名ＥＳＴ４２２５６２），ＡＢＣＢ６（別名ＥＳＴ４５５９７，ｕｍａｔ，Ｈｓ．１０７９１１），ＡＢＣＢ７（別名ＥＳＴ１４０５３５，Ａｔｍｌｐ，ＡＢＣ７），ＡＢＣＢ８（別名ＥＳＴ３２８１２８，Ｍ−ＡＢＣ１），ＡＢＣＢ９（別名ＥＳＴ１２２２３４），ＡＢＣＢ１０（別名ＥＳＴ２０２３７），ＡＢＣＢ１０Ｐ（別名Ｍ−ＡＢＣ２，ＭＡＢＣ２），ＡＢＣＢ１１（別名ＳＰＧＰ，ＰＦＩＣ−２，ＢＳＥＰ，ＰＧＹ４）等のＡＢＣＢサブファミリー（別名ＭＤＲ／ＴＡＰサブファミリー）に属するヒトＡＢＣタンパク質や、ＡＢＣＣ１（別名ＭＲＰ１，ＭＲＰ，ＧＳ−Ｘ），ＡＢＣＣ２（別名ＭＲＰ２，ｃＭＯＡＴ，ｃＭＲＰ），ＡＢＣＣ３（別名ＭＲＰ３，ｃＭＯＡＴ２，ＥＳＴ９０７５７，ＭＬＰ２，ＭＯＡＴ−Ｄ），ＡＢＣＣ４（別名ＭＲＰ４，ＥＳＴ１７０２０５，ＭＯＡＴ−Ｂ），ＡＢＣＣ５（別名ＭＲＰ５，ＳＭＲＰ，ＥＳＴ２７７１４５，ＭＯＡＴ−Ｃ），ＡＢＣＣ６（別名ＭＲＰ６，ＥＳＴ３４９０５６，ＭＬＰ１，ＡＲＡ），ＣＦＴＲ（別名ＣＦ，ＭＲＰ７，ＡＢＣＣ７），ＡＢＣＣ８（別名ＳＵＲ１，ＭＲＰ８，ＰＨＨＩ，ＨＩ，ＨＲＩＮＳ），ＡＢＣＣ９（別名ＳＵＲ２），ＡＢＣＣ１０（別名ＥＳＴ１８２７６３），ＡＢＣＣ１１，ＡＢＣＣ１２（別名ＭＲＰ９），ＡＢＣＣ１３（別名ＰＲＥＤ６，Ｃ２１ｏｒｆ７３）等のＡＢＣＣサブファミリー（別名ＣＦＴＲ／ＭＲＰサブファミリー）に属するヒトＡＢＣタンパク質や、ＡＢＣＤ１（別名ＡＬＤＰ，ＡＬＤ，ＡＭＮ），ＡＢＣＤ１Ｐ１，ＡＢＣＤ１Ｐ２，ＡＢＣＤ１Ｐ３，ＡＢＣＤ１Ｐ４，ＡＢＣＤ２（別名ＡＬＤＲ，ＡＬＤＲＰ，ＡＬＤＬ１），ＡＢＣＤ３（別名ＰＭＰ７０，ＰＸＭＰ１），ＡＢＣＤ４（別名Ｐ７０Ｒ，ＥＳＴ３５２１８８，ＰＸＭＰ１Ｌ，ＰＭＰ６９）等のＡＢＣＤサブファミリー（別名ＡＬＤサブファミリー）に属するＡＢＣタンパク質や、ＡＢＣＥ１（別名ＲＮＳ４Ｉ，ＲＬ１，ＯＡＢＰ，ＲＮＡＳＥＬＩ）等のＡＢＣＥサブファミリー（別名ＯＡＢＰサブファミリー）に属するＡＢＣタンパク質や、ＡＢＣＦ１（別名ＥＳＴ１２３１４７，ＡＢＣ５０），ＡＢＣＦ２（別名ＥＳＴ１３３０９０，Ｈｓ．１５３６１２），ＡＢＣＦ３（別名ＥＳＴ２０１８６４）等のＡＢＣＦサブファミリー（別名ＧＣＮ２０サブファミリー）に属するヒトＡＢＣタンパク質や、ＡＢＣＧ１（別名ＷＨＩＴＥ，ＡＢＣ８），ＡＢＣＧ２（別名ＥＳＴ１５７４８１，ＭＸＲ，ＢＣＲＰ，ＡＢＣＰ），ＡＢＣＧ３（別名Ａｂｃｐ２，Ｍｘｒ２），ＡＢＣＧ４（別名ＷＨＩＴＥ２），ＡＢＣＧ５，ＡＢＣＧ８等のＡＢＣＧサブファミリー（別名ＷＨＩＴＥサブファミリー）に属するヒトＡＢＣタンパク質などを挙げることができるが、これらの中でも、Ｐ糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ），ＭＲＰ１，ＭＲＰ２，ＣＦＴＲ，ＳＵＲ１，ＡＢＣ１，ＴＡＰ１等を好適に例示することができる。
【００１９】
上記のＡＢＣタンパク質が発現している膜画分としては、ＡＢＣタンパク質遺伝子が導入され、ＡＢＣタンパク質が発現している生体膜の画分であればどのようなものでもよく、かかる生体膜としては細胞膜や小胞体，ミトコンドリアなどの細胞内小器官膜を挙げることができる。これら生体膜の由来としては特に制限されるものではないが、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真核細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、アフリカツメガエル等の卵母細胞等の動植物細胞などを挙げることができるが、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞が好ましい。
【００２０】
ＡＢＣタンパク質が発現している膜画分の調製方法としては、ＡＢＣタンパク質を発現している細胞の調製し、ＡＢＣタンパク質を発現している細胞からの膜画分の調製する方法を挙げることができる。上記ＡＢＣタンパク質を発現している細胞の調製方法としては、例えば、ＡＢＣタンパク質をコードするｃＤＮＡを選択マーカーを有する発現ベクターに組み込み、哺乳類細胞，昆虫細胞，酵母，細菌等の培養細胞にトランスフェクションする方法を挙げることができる。選択マーカーを有する発現ベクターとして、例えば、ネオマイシン，ピューロマイシン，ハイグロマイシン等の特定の抗生物質に対して耐性を付与する遺伝子を持つベクターを使用し、トランスフェクションした細胞を抗生物質の存在下で培養することによって、ＡＢＣタンパク質の発現ベクターを持つ細胞のみを選択する。ＡＢＣタンパク質の発現をＲＴ−ＰＣＲ又は特異的抗体によって確認することが好ましい。かくして得られたＡＢＣタンパク質発現細胞を大量に培養する。また、ＡＢＣタンパク質を発現している細胞からの膜画分の調製方法としては、例えば、上記ＡＢＣタンパク質発現細胞の培養物を遠心分離し、ＡＢＣタンパク質を発現する細胞を集め、細胞を超音波、浸透圧処理等によって破砕して、遠心によって膜画分を採取し、採取した膜画分を緩衝液中に懸濁して、ショ糖濃度勾配遠心によって細胞膜画分を単離精製する方法を挙げることができる。調製後の細胞膜画分は、そのタンパク質濃度を測定した後、液体窒素温度で瞬時凍結して摂氏−８０℃で保存することが好ましい。
【００２１】
標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体における標識としては、検出可能なものであれば特に限定されないが、３２Ｐ，３３Ｐ，３５Ｓ，１４Ｃ，３Ｈ等の放射性同位体を用いる放射性標識や、フルオレスセインイソチオシアネート，フィコビリタンパク，希土類金属キレート，ダンシルクロライド，テトラメチルローダミンイソチオシアネート等を用いる蛍光標識や、アジド基，ベンゾフェノン等を用いる光親和基標識や、ペルオキシダーゼ，アルカリフォスファターゼ等を用いる酵素標識などを挙げることができ、中でも放射性標識を特に好適に例示することができる。
【００２２】
標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体におけるヌクレオシド三リン酸としては、ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＩＴＰ，ＵＴＰ，ＣＴＰ等を例示することができるが、中でもＡＴＰを特に好適に例示することができる。また、ヌクレオシド三リン酸の誘導体、例えば、ＡＴＰの誘導体としては、〔３５Ｓ〕ＡＴＰγＳ，α、β−メチレンＡＴＰ，８−アジドＡＴＰ等を挙げることができる。
【００２３】
本発明におけるヌクレオシド二リン酸不動化物質としては、ヌクレオシド三リン酸又はその誘導体のリン酸イオンと置換してヌクレオシド二リン酸と複合体を形成し、ヌクレオシド二リン酸と膜タンパク質との結合を維持する化学物質であれば特に制限されるものではなく、バナジン酸やその塩等を挙げることができる。バナジン酸塩としては、バナジン酸ナトリウム（オルトバナジン酸ナトリウムＮａ３ＶＯ４，ピロバナジン酸ナトリウムＮａ４Ｖ２Ｏ７，メタバナジン酸ナトリウムＮａＶＯ３），バナジン酸カリウム（オルトバナジン酸カリウムＫ３ＶＯ４，ピロバナジン酸カリウムＫ４Ｖ２Ｏ７，メタバナジン酸カリウムＫＶＯ３），バナジン酸カルシウム（オルトバナジン酸カルシウムＣａ３（ＶＯ４）２，ピロバナジン酸カルシウムＣａ２Ｖ２Ｏ７，メタバナジン酸カルシウムＣａ（ＶＯ３）２）等を例示することができる。
【００２４】
本発明において用いられるフィルターとしては、未反応の標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体を濾過・分離しうるフィルターであれば特に制限されるものではないが、吸引濾過手段，遠心濾過手段，限外濾過手段等を備えているものが濾過・分離効率の点で好ましく、中でも底部にフィルターが内蔵されたプレートとフィルター下方に吸引濾過手段を備えたものが好ましく、例えば、底部にフィルターが内蔵されたマイクロプレート「ユニフィルタ」（Ｎｏ．７７００−３３０３、Ｗｈａｔｍａｎ社製）、マルチスクリーンプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  Ｐｌａｔｅ；ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、サイレントスクリーンプレート（Ｓｉｌｅｎｔ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｐｌａｔｅ；Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ社製）などを具体的に挙げることができる。
【００２５】
本発明のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法における被験物質としては、抗腫瘍剤等の薬剤の候補物質を好適に例示することができ、また、本発明のＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性の測定方法におけるＡＢＣタンパク質の基質としては、ＡＢＣタンパク質がＰ糖タンパク質の場合、ベラパミル（ワソラン），キニジン，ローダミン１２３，ドキソルビシン，ジゴキシン，ビンクリスチン，ビンブラスチン，ダウノルビシン，フォレート，コルチゾール，アルドステロン等の一部のステロイド等を挙げることができ、ＡＢＣタンパク質がＭＲＰ２の場合、β−エストラジオール−１７−（β−Ｄ−グルクロニド），スルフォブロモフタレイン等を挙げることができる。
【００２６】
本発明のＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法［ＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性の測定方法］について、ＡＢＣタンパク質がＰ糖タンパク質、標識されたヌクレオシド三リン酸が放射性標識ＡＴＰ、ヌクレオシド二リン酸不動化物質がバナジン酸の場合について説明する。Ｐ糖タンパク質が発現している膜画分と、放射性標識されたＡＴＰと、バナジン酸と、被験物質［Ｐ糖タンパク質の基質］とをＴｒｉｓ−ＨＣｌ，リン酸緩衝液等の反応緩衝液中で反応させる。反応緩衝液のｐＨは６〜８、特にｐＨ７〜７．５が好ましい。反応時間は１０秒〜３時間、例えば１〜３０分程度とすることが好ましい。反応は、例えば０℃に冷却した緩衝液を過剰量（例えば、反応液の２０〜１００倍量）反応液に加えて混合することにより停止させる。次いで、反応終了後の反応液を、例えば９６ウェルグラスフィルターに添加して吸引洗浄を行う。洗浄液としては、緩衝液をあらかじめ４℃に氷冷したものを使用し、１ウェル当たり５０〜５００μｌ、例えば２００μｌの洗浄液で複数回吸引洗浄する。この吸引洗浄操作により、反応液中の未反応のＡＴＰ，バナジン酸，被験物質［Ｐ糖タンパク質の基質］がフィルターにより濾過・分離され除去することができる。次に、膜画分が存する洗浄後のプレート１ウェル当たり３０〜１００μｌ、例えば５０μｌの液体シンチレーションカクテルを添加し、約１時間プレートを室温で静置した後、液体シンチレーションやベーターカウンターを用いて放射性標識を測定する。この測定値と被験物質［Ｐ糖タンパク質の基質］未添加の場合の測定値とを比較し、Ｐ糖タンパク質のトランスポーター活性が大きい場合はＰ糖タンパク質に対する基質であると判断し、Ｐ糖タンパク質のトランスポーター活性が小さい場合はＰ糖タンパク質の阻害物質であると判断することができる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１
（資材と材料）
９６ウェルタイプのグラスフィルターを使用し、吸引洗浄法を用いて１ステップによるＰ糖タンパク質発現メンブレンへの［３Ｈ］ＡＤＰ吸着量測定法の構築を試みた。９６ウェルタイプのグラスフィルターとしては、３５０μｌユニフィルタ（Ｎｏ．７７００−３３０３、Ｗｈａｔｍａｎ社製）を用いた。反応緩衝液Ａとしては、０．２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、３ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２ｍＭ  Ｏｕａｂａｉｎ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の組成のものを用いた。ラジオアイソトープとしては、［３Ｈ］ＡＴＰ（ＮＥＴ−４２０、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。Ｓｆ９メンブレンとしては、ヒトＰ糖タンパク質（Ｐｇｐ  ｏｒ  ＭＤＲ１）発現メンブレン（Ｎｏ．４５３２２８、第一化学薬品社製）とＳｆ９コントロールメンブレン（Ｎｏ．４５３２００、第一化学薬品社製）を用いた。液体シンチレーションカクテルとしては、ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ（登録商標）２０（Ｎｏ．６０１３６２１、Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。
【００２８】
（測定方法）
５０μｌの上記反応緩衝液ＡにＰ糖タンパク質発現メンブレン５μｇを添加し、３７℃で１分間のプレインキュベーションを行った。次に、被験物質［Ｐ糖タンパク質の基質化合物］を上記反応液に添加し、３７℃で一定時間（１〜３０分間）反応させた。反応終了後、上記反応液を９６ウェルグラスフィルターに添加し、吸引洗浄を行った。反応緩衝液Ａをあらかじめ４℃に氷冷したものを洗浄液として使用し、１ウェル当たり２００μｌの洗浄液で５回吸引洗浄を行った。次に、洗浄後のプレート１ウェル当たり５０μｌの液体シンチレーションカクテルを添加した。約１時間、プレートを室温で静置した後、パッカード社製、ＴＯＰ  ＣＯＵＮＴ（Ｃ９９０２０１／４２６３７）を用いてＲＩ活性を測定した。すべての実験は、基本的にＮ＝３で行った。
【００２９】
実施例２（経時変化検討）
Ｐ糖タンパク質発現メンブレン及びＳｆ９コントロールメンブレンを用いて、バナデート法による［３Ｈ］ＡＤＰ結合量の経時変化を測定した。使用化合物（陽性対照）として、Ｐ糖タンパク質の代表的基質として知られているベラパミルを使用した。ベラパミルの最終濃度は５０μＭとした。結果を図１に示す。図１から、コントロールメンブレンにおいては［３Ｈ］ＡＤＰのメンブレンへの結合における経時変化は見られないが、Ｐ糖タンパク質発現メンブレンにおいては、ベラパミル添加時において、［３Ｈ］ＡＤＰ結合量の上昇が経時的に観察されることがわかった。興味深い点として、Ｐ糖タンパク質発現メンブレンにベラパミルを未添加状態であっても、ベースラインが高くなるという若干の［３Ｈ］ＡＤＰ結合活性が観察されることが明らかになった。この活性は、Ｐ糖タンパク質の内因性の働きに依存した活性ではないかと考えられる。
【００３０】
実施例３（メンブレン使用量）
グラスフィルターを利用した吸引洗浄法では、１ウェル当たりの反応メンブレン量を自由に設定できる。そこで、至適反応メンブレン量を探るため、ウェル当たりのメンブレン量を３段階（５μｇ、２．５μｇ、１μｇ）に振り、化合物としてベラパミルを用いて反応を行った。ベラパミルの添加濃度は、最終濃度２０μＭとした。結果を図２に示す。図２から、メンブレン使用量の増加に従い、検出域が広がることが明らかになった。そこで、今回の条件ではメンブレン使用量５μｇが適当であると判断し、以下の実験に用いるＰ糖タンパク質発現メンブレンの使用量を、１ウェル当たり５μｇに設定した。
【００３１】
実施例４（ベラパミルとＰ糖タンパクの基質親和性）
ベラパミルのＰ糖タンパク質に対する基質親和性（濃度依存性）を測定するため、０〜１０００ｎＭの濃度のベラパミルを反応緩衝液Ａに添加し、ＲＩ活性を測定した。結果を図３に示す。図３からもわかるように、約３００ｎＭというＫｍ値が得られた。これは従来法であるＰ糖タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性測定時におけるベラパミルのＫｍ値１７μＭと比較して、約２０分の１という非常に低い値である。ＡＴＰａｓｅ活性測定時ではＡＴＰのＰ糖タンパク質に対する反応は競合的であるが、バナデート法においては、一旦反応したＡＴＰ（正確にはＡＤＰ）はバナデートにより非競合的に結合してしまうため、見かけのＫｍ値が低く見積もられるのではないかと考えた。この結果より、本発明によるアッセイ方法は、従来法であるＡＴＰａｓｅ法と比較して、低濃度でアッセイが可能であると考えられる。
【００３２】
実施例５（Ｐ糖タンパク質の基質特異性）
ベラパミルの他、１３種類の化合物におけるバナデート法での［３Ｈ］ＡＤＰ結合量の測定を行った。反応条件は、反応時間５分、反応温度３７℃、基質添加濃度０．０５ｍＭで行った。測定結果は、コントロールメンブレンのバックグラウンドを差し引いてある。結果を図４に示す。図４から、一般的にＰ糖タンパク質の基質と考えられているベラパミルＶｅｒａｐａｍｉｌ，キニジンＱｕｉｎｉｄｉｎｅ，ビンブラスチンＶｉｎｂｒａｓｔｉｎｅ，ビンクリスチンＶｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ，ジゴキシンＤｉｇｏｘｉｎ，ローダミン１２３Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３，ドクソルビシンＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ，ダウノルビシンＤａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ，メソトリキセートＭｅｔｈｏｔｏｌｉｘａｔｅ，フォレートＦｏｌａｔｅにおいて［３Ｈ］ＡＤＰ結合活性の有意な上昇が観察された。興味深いことに、ブロモサルファレインＢｒｏｍｏｓｕｌｆａｌｅｉｎにおいては、基質未添加のＰ糖タンパク質発現膜による測定値（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（−））と比較して有意な［３Ｈ］ＡＤＰ結合活性の低下が観察されている。この低下分は実施例２で検出されたＰ糖タンパク質の内因性の働きを阻害した結果と考えられ、この測定値はコントロールメンブレンにおける測定値（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とほぼ同等である。ブロモサルファレインは一般にＰ糖タンパク質の阻害剤と考えられている。よって、このアッセイ系を用いた化合物スクリーニングによりＰ糖タンパク質の基質（アゴニスト）になるか阻害剤（アンタゴニスト）となるかを同時に検出することができることが分かった。
【００３３】
実施例６（洗浄法の検討）
測定のバックグラウンドを下げるための手段として、一般に有効と考えられるプレートのＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）によるブロッキング法及びＰＢＳによる洗浄法を検討した。ベラパミルの最終濃度は２０μＭとした。ＰＶＰによるブロッキング法は、具体的には洗浄用プレート使用直前に、反応緩衝液ＡにＰＶＰを１％溶解したブロッキング液を１ウェルあたり２００μｌ添加し、室温で１時間放置した。その後、反応緩衝液Ａ２００μｌで１回洗浄後、使用した。また、ＰＢＳによる洗浄法は、１ウェルあたり２００μｌ添加し、５回吸引洗浄を行った。結果を図５に示す。この結果、両手法ともに、劇的な効果は得られなかった。ＰＢＳによる洗浄に関しては、特異的な［３Ｈ］ＡＤＰの結合をむしろ抑制する結果であった。測定のバックグラウンドの原因は、プレートへの吸着のみではなく、むしろメンブレンそのものへの内因性の結合の影響が大きいと考えられる。
【００３４】
実施例７（ヒトＭＲＰ２発現Ｓｆ９メンブレンの調製）
ＰＣＲ法を用いて常法によりクローニングを行ったヒトＭＲＰ２をコードするｃＤＮＡを、バキュロウイルスベクターｐＦＡＳＴＢａｃ１（ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣＲ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１０３５９−０１６））に組み込み、Ｓｆ９細胞（Ｓｆ９  Ｆｒｏｚｅｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ｂ８２５−０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にリポフェクション法によりトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞からバキュロウイルスを回収し、バキュロウイルスを更にＳｆ９細胞に感染させることによりＭＲＰ２タンパク質を発現する細胞を得た。また、ＭＲＰ２の発現をウェスタンブロット法によって確認することにより得られたＭＲＰ２発現Ｓｆ９細胞を無血清昆虫培地（ＳＦ９００ＩＩ−ＳＦＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、２７℃で３日間培養した。ＭＲＰ２発現Ｓｆ９細胞を遠心分離（３０００ｒｐｍで１０分）によって集めた後、超音波処理（ソニケーター中で１０分間処理）によって破砕して、遠心分離（１００，０００ｒｐｍで３０分）によってヒトＭＲＰ２発現Ｓｆ９細胞膜画分を採取し、分離した膜画分をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中に懸濁して、ショ糖濃度勾配遠心によって細胞膜画分を単離精製した。細胞膜画分のタンパク質濃度を測定した後、液体窒素温度で瞬時凍結して摂氏−８０℃で保存した。
【００３５】
実施例８
ＭＲＰ２は、肝臓の胆管側に高発現し、多くの薬物を肝臓から大腸側へ排出するという、肝臓の解毒機構に重要な働きを持ったＡＢＣトランスポーターの一種である。そこで、９６ウェルタイプのグラスフィルターを使用し、吸引洗浄法を用いて１ステップによるヒトＭＲＰ２発現メンブレンへの［３Ｈ］ＡＤＰ吸着量測定法の構築を試みた。ヒトＰ糖タンパク質発現メンブレンに代えて実施例７で調製したヒトＭＲＰ２発現Ｓｆ９メンブレンを用いる他は、実施例１と同様に測定した。ＭＲＰ２に輸送されることが良く知られている代表的な化合物であるβ−エストラジオール−１７−（β−Ｄ−グルクロニド）β−Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ−１７−（β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）及びスルフォブロモフタレインＳｕｌｆｏｂｒｏｍｏｐｈｔｈａｌｅｉｎ添加時におけるバナデート法での［３Ｈ］ＡＤＰ結合量の測定を行った。反応条件は、反応時間５分、反応温度３７℃、基質添加濃度０．１ｍＭで行った。結果を図６に示す。図６中、Ａはβ−エストラジオール−１７−（β−Ｄ−グルクロニド）を、Ｂはスルフォブロモフタレインを、Ｃは基質無添加を表す。その結果、上記２種類の化合物において、基質未添加のＭＲＰ２発現膜による測定値と比較して、有意な［３Ｈ］ＡＤＰ結合活性の上昇が観察され、ＭＲＰ２においても吸引洗浄法によるスクリーニングシステムの有用性が確認された。
【００３６】
【発明の効果】
本発明のグラスフィルターを用いた吸引洗浄法による条件検討の結果、バナデート法によるＰ糖タンパク質やＭＲＰ２検出系の確立に成功した。得られた測定結果は、データ変動が小さく再現性も良好であるため、バナデート法の応用法である本方法は、Ｐ糖タンパク質やＭＲＰ２等のＡＢＣタンパク質の基質認識性測定において、非常に大きなメリットを有している。特に、国際公開第０２／０５２２６２号パンフレット（特許文献１）に開示されるＥＬＩＳＡプレートを用いたバナデート法と比較した場合の利点として、以下の４点を挙げることができる。
１．１ウェル当たりのメンブレン量を自由に増量できる。
２．ＥＬＩＳＡプレートへの膜結合ステップを省略できるため、製品の品質をコントロールしやすく、コストも低下することが可能である。
３．従来法のＡＴＰａｓｅ法と比較して、少量の化合物量でアッセイが可能である。
４．アッセイを行う化合物が、ＡＢＣトランスポーターへのアゴニストであるか、アンタゴニストであるかを、一度にアッセイ可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｐ糖タンパク質発現メンブレンにベラパミルを添加したとき（●：Ｐ−ｇｐ／Ｖｅｒ．（＋））、Ｐ糖タンパク質発現メンブレンにベラパミルを添加しなかったとき（○：Ｐ−ｇｐ／Ｖｅｒ．（−））、Ｓｆ９コントロールメンブレンにベラパミルを添加したとき（■：Ｃｏｎｔｒｏｌ／Ｖｅｒ．（＋））、並びにＳｆ９コントロールメンブレンにベラパミルを添加しなかったとき（□：Ｃｏｎｔｒｏｌ／Ｖｅｒ．（＋））における［３Ｈ］ＡＴＰ結合活性の経時変化を示す図である。
【図２】Ｐ糖タンパク質発現メンブレンの使用量を検討した図であり、５μｇ、２．５μｇ又は１μｇのＰ糖タンパク質発現メンブレンにベラパミルを添加したとき（Ｖｅｒａｐａｍｉｌ（＋））又は添加しなかったとき（Ｖｅｒａｐａｍｉｌ（−））における［３Ｈ］ＡＴＰ結合活性の変化を示す図である。
【図３】ベラパミルのＰ糖タンパク質に対する濃度依存性を示す図である。
【図４】Ｐ糖タンパク質に対する各種被験物質の結合活性を示す図である。
【図５】洗浄条件の検討結果を示す図であり、反応緩衝液Ａによる洗浄とＰＶＰによるブロッキング法との組合せ（Ｂｕｆ．Ａ＋ＰＶＰ）、反応緩衝液Ａによる洗浄（Ｂｕｆ．Ａ）、ＰＢＳによる洗浄とＰＶＰによるブロッキング法との組合せ（ＰＢＳ＋ＰＶＰ）、及びＰＢＳによる洗浄（ＰＢＳ）について検討結果を示す図である。
【図６】Ａ；β−エストラジオール−１７−（β−Ｄ−グルクロニド）及びＢ；スルフォブロモフタレイン添加時におけるバナデート法でのヒトＭＲＰ２発現Ｓｆ９メンブレンへの［３Ｈ］ＡＤＰ結合量の測定結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年4月17日(2003.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
実施例５（Ｐ糖タンパク質の基質特異性）
ベラパミルの他、１３種類の化合物におけるバナデート法での［３Ｈ］ＡＤＰ結合量の測定を行った。反応条件は、反応時間５分、反応温度３７℃、基質添加濃度０．０５ｍＭで行った。測定結果は、コントロールメンブレンのバックグラウンドを差し引いてある。結果を図４に示す。図４から、一般的にＰ糖タンパク質の基質と考えられているベラパミルＶｅｒａｐａｍｉｌ，キニジンＱｕｉｎｉｄｉｎｅ，ビンブラスチンＶｉｎｂｒａｓｔｉｎｅ，ビンクリスチンＶｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ，ジゴキシンＤｉｇｏｘｉｎ，ローダミン１２３Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３，ドクソルビシンＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ，ダウノルビシンＤａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ，メソトリキセートＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ，フォレートＦｏｌａｔｅにおいて［３Ｈ］ＡＤＰ結合活性の有意な上昇が観察された。興味深いことに、ブロモサルファレインＢｒｏｍｏｓｕｌｆａｌｅｉｎにおいては、基質未添加のＰ糖タンパク質発現膜による測定値（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（−））と比較して有意な［３Ｈ］ＡＤＰ結合活性の低下が観察されている。この低下分は実施例２で検出されたＰ糖タンパク質の内因性の働きを阻害した結果と考えられ、この測定値はコントロールメンブレンにおける測定値（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とほぼ同等である。ブロモサルファレインは一般にＰ糖タンパク質の阻害剤と考えられている。よって、このアッセイ系を用いた化合物スクリーニングによりＰ糖タンパク質の基質（アゴニスト）になるか阻害剤（アンタゴニスト）となるかを同時に検出することができることが分かった。


【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
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