(57)【要約】【課題】  cDNAマイクロアレイ法等の網羅的mRNA測定において、細胞１個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を測定する方法を提供すること。【解決手段】  以下の工程を含む、細胞1個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を測定する方法。  (a) 生体試料のホモジネートの細胞数を計測又はDNA量を測定する工程  (b) 前記ホモジネート中の遺伝子にクロスハイブリダイズせず、かつ、複数の異なる塩基配列を有するスパイクRNAを多段階濃度で含む混合物を調製する工程  (c) 前記ホモジネートに、その細胞数又はDNA量と相関する既知量の前記混合物を添加し、RNA抽出をして検体サンプルを調製する工程  (d) 検体サンプルのRNAの測定値から、スパイクRNAの測定値に基づいて作成した検量線を用いて細胞１個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を求める工程【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、細胞1個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を測定する方法。
(a) 生体試料のホモジネートの細胞数を計測又はDNA量を測定する工程
(b) 前記ホモジネート中の遺伝子にクロスハイブリダイズせず、かつ、複数の異なる塩基配列を有するスパイクRNAを多段階濃度で含む混合物を調製する工程
(c) 前記ホモジネートに、その細胞数又はDNA量と相関する既知量の前記混合物を添加し、RNA抽出をして検体サンプルを調製する工程
(d) 検体サンプルのRNAの測定値から、スパイクRNAの測定値に基づいて作成した検量線を用いて細胞１個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を求める工程
【請求項２】
複数の異なる塩基配列を有するスパイクRNAの測定値が、下記式で表される直線上にプロットされることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【化１】
2005080588.tif 000008
（式中、Ｓは測定値、ＳMAXは最大測定値、ＣはスパイクRNAの濃度、ＳＣ50は50％反応濃度、γはHill係数を示す。）
【請求項３】
検体サンプルのRNAの測定値が、cDNAマイクロアレイ法又は定量的RT−PCR法によって得られたものである、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の絶対発現量を測定する方法、詳しくはcDNAマイクロアレイ法等の網羅的mRNA測定において、細胞１個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一つの生物や細胞における遺伝子の発現状態の全貌であるトランスクリプトームを網羅的にハイスループットに解析する強力なツールとして、cDNAマイクロアレイが利用されている。cDNAマイクロアレイ法は、アレイ基板上に数百〜数万のDNAのためのプローブを整列・固定させ、標識した試料RNA（ターゲット）をハイブリダイズさせることによって、ゲノムスケールで全ての遺伝子の発現パターンを同時に知ることができる。
【０００３】
マイクロアレイデータは、別々に調製された異なるサンプルからのシグナルを異なる蛍光物質で標識して検出するので、複数のサンプルからの生データを正規化（ノーマライゼーション）する必要がある。正規化の方法としては、(i)各スポットから得られる蛍光シグナルの総計や中間(median)値より補正係数を算出し、各スポットの蛍光シグナル強度を補正するグローバル補正（非特許文献１）、（ii)各細胞における発現量が一定と考えられる遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子）の蛍光シグナル強度より補正係数を算出し、各スポットの蛍光シグナル強度を補正する方法（非特許文献２）などがある。これらの方法は、「大多数の遺伝子の発現レベルは一定であって、わずかな遺伝子だけしか事象（疾病、薬剤投与など）によって変化しない。」という仮定に基づいていることから、大幅に変動した遺伝子以外で実際に変動している遺伝子の存在が無視されてしまう点、あるいは実際に変動している遺伝子と変動しなかった遺伝子との区別が不可能であるという点で、正確性を欠く。
【０００４】
また、現在のトランスクリプトーム解析は、mRNAの絶対量を得るようには設計されていない。例えば、ハイブリダイゼーション条件を最適範囲に保持するために、同量の全RNAが各マイクロアレイに適用される。しかしながら、このようなアプローチでは、標的組織又は細胞中のmRNAの定量的情報が抹消され、高濃度で存在するmRNAも微量に存在するmRNAも全RNAに対する比率として扱われてしまう。
【０００５】
さらに、データは通常、同時に存在する対照（１又は複数）に対して、又は実験全体の全遺伝子発現レベルに対して何倍増加したか、又は何倍減少したかという比率で表される。対照に対する比率をとった場合、分母がゼロに近いとノイズが比率データにおいて著しく増幅されるといったような不都合や、対照の発現プロフィールが実験間で異なると実験間で比率データを容易に比較することができないなどの問題がある。このような欠点は、薬剤や化学物質の毒性試験のような大規模スケールの複数の実験からなるデータベースを作成することを目的としたプロジェクトにおいて致命的である。
【０００６】
一方、マイクロアレイ上の多くの遺伝子の発現量を正確に定量するため、アレイ上に大腸菌遺伝子用のプローブを配置し、大腸菌遺伝子由来のcDNAの一定量をサンプル中に混合し、その検出シグナルをコントロール（スパイキングコントロール）とすることによって、アレイ間の標準化を行うという手法がある。しかしながら、この方法は、マイクロアレイ上での蛍光強度を標準化するもの、換言すれば、全RNA量を対象に標準化するものである。また、ある一つの濃度での補正であるから、原点（無添加）との２点を結んだ直線に対してのみ標準化するにすぎず、アレイ上の測定スポットのシグナル／濃度特性が比例関係にあるという前提でしか使用できない。その結果、細胞１個当たりの絶対量を求めることは不可能であるのみならず、全RNAに対してもマイクロアレイの特性を無視した不正確な補正にとどまる。
【０００７】
【非特許文献１】Wilson, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 12833-12838, 1999
【非特許文献２】Heller, R.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 2150-2155, 1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
かかる状況下、マイクロアレイ解析において、生物学的興味の対象は対照サンプルに対する変化よりはむしろ、単一細胞中の各mRNA分子数の変化をモニタリングすることに移行してきている。データが「細胞１個当たりの」値として生成されるならば、複数の実験からデータベースを構築するために、そして最終的には各生物学的イベントに関与する遺伝子カスケード情報を得るために最適である。
【０００９】
従って、本発明は、cDNAマイクロアレイ法等の網羅的mRNA測定において、細胞１個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、複数の異なる塩基配列を有するスパイクRNAを含む混合物が、用量−作用標準曲線として用いられると同時にサンプル中の細胞数の直接的指標となりうるという知見を得た。そして、この混合物をサンプルの細胞数又はDNA濃度に比例する量で添加して遺伝子発現を測定すると、対照を含む全てのサンプルのデータがゼロから始まる均等目盛でプロットでき、得られた測定値が細胞１個当たりの絶対量に変換できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) 以下の工程を含む、細胞1個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を測定する方法。
(a) 生体試料のホモジネートの細胞数を計測又はDNA量を測定する工程
(b) 前記ホモジネート中の遺伝子にクロスハイブリダイズせず、かつ、複数の異なる塩基配列を有するスパイクRNAを多段階濃度で含む混合物を調製する工程
(c) 前記ホモジネートに、その細胞数又はDNA量と相関する既知量の前記混合物を添加し、RNA抽出をして検体サンプルを調製する工程
(d) 検体サンプルのRNAの測定値から、スパイクRNAの測定値に基づいて作成した検量線を用いて細胞１個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を求める工程
【００１２】
(2) スパイクRNAの測定値が、下記式で表される直線上にプロットされることを特徴とする、(1)に記載の方法。
【００１３】
【化１】
2005080588.tif 000002
（式中、Ｓは測定値、ＳMAXは最大測定値、ＣはスパイクRNAの濃度、ＳＣ50は50％反応濃度、γはHill係数を示す。）
【００１４】
(3) 検体サンプルのRNAの測定値が、cDNAマイクロアレイ法又は定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によって得られたものである、(1)又は(2)に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法によれば、cDNAマイクロアレイ法等が生成する遺伝子データを細胞１個当たりの絶対量としてゼロを原点する均等目盛（linear scale)表示をすることができる。従って、従来の比率表示や対数表示を介したノーマライズ化手法による数値変換を一切必要としない。また、遺伝子発現量の多寡や、対照群での発現の有無に左右されず、生成された遺伝子データの全てを用いたデータベースを構築することが可能となり、トランスクリプトーム解析を飛躍的に効率化、精密化することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明によれば、細胞1個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を測定する方法が提供され、該方法は以下のステップを含む。
(a) 生体試料のホモジネートの細胞数を計測又はDNA量を測定する工程
(b) 前記ホモジネート中の遺伝子にクロスハイブリダイズせず、かつ、複数の異なる塩基配列を有するスパイクRNAを多段階濃度で含む混合物を調製する工程
(c) 前記ホモジネートに、その細胞数又はDNA量と相関する既知量の前記混合物を添加し、RNA抽出をして検体サンプルを調製する工程
(d) 検体サンプルのRNAの測定値から、スパイクRNAの測定値に基づいて作成した検量線を用いて細胞１個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を求める工程
各工程について以下に説明する。
【００１７】
まず、工程(a)では、培養細胞や臓器などの生体試料よりホモジネートを調製する。ここで、測定対象とする生体試料としては組織又は細胞が挙げられる。
【００１８】
生体試料のホモジネートの調製は定法に従って行う。例えば、組織の場合、凍結した組織を液体窒素中でホモジナイザーなどの細胞破砕装置を使用して粉砕する方法で行えばよい。
【００１９】
次に、培養細胞のように細胞数を容易に計測又は確実に推定できる場合は、その細胞数を計測し、臓器のように細胞数を測定することが手技的に困難な場合は、DNA量を測定する。
【００２０】
細胞数の計測の方法は生体試料の種類によって異なるが、培養細胞の場合を例にとると、RNA抽出用と同一条件で培養した細胞を単離し、血球計算盤を用いて細胞数をカウントすることによって行う。
【００２１】
DNA量を測定する場合は、Picogreen色素を利用した「DNA量直接測定法」により行う。本方法は上記のホモジネートのアリコートを10μlという極微量用いるだけでDNA量を測定できるので、次の工程で行うRNA抽出用の試料を十分な量確保できる上で好ましい。
【００２２】
また、RNA抽出サンプルの一部を用いて実施できるのでDNAとRNAのための別個のサンプルを必要とせず、迅速かつ簡便であり、しかも再現性もよい。
【００２３】
具体的には、標準試料としてλファージDNAを用い、上記ホモジネートのアリコートにRNase及びProtenase K処理を施した粗精製検体に蛍光色素Picogreenを加え、振とう、インキュベーション後、蛍光測定（励起485nm／発光538nm）を行う。蛍光測定には市販の蛍光測定装置（例えば、FluorImager(アマシャム ファルマシア バイオテク社製）等が利用できる。
【００２４】
DNA量（濃度）は、蛍光測定装置で読み取った蛍光測定値（Ｆ）から、下記の濃度-蛍光換算式を用いて求めることができる。
【００２５】
【化２】
2005080588.tif 000003
（式中、ＣはDNA濃度（ng/ml)、Ｆは蛍光測定値、ｐはλファージDNAの希釈範囲内で求めたF/C比を表す。）
【００２６】
1個の細胞のDNA量は生物の種（species)によって既知で一定であるから、ここで測定されるDNA量からホモジネート中の細胞数が一義的に決定できる。
【００２７】
次に、工程(b)では、前記ホモジネート中の遺伝子にクロスハイブリダイズせず、かつ、複数の異なる塩基配列を有するスパイクRNAを多段階濃度で含む混合物を調製する。
【００２８】
本明細書において、「スパイクRNA」とは、mRNA測定系に添加する検量線作成用の標準RNAをいう。スパイクRNAは、ホモジネート中の遺伝子にクロスハイブリダイズしない遺伝子、例えば、ヒト、マウス、ラットに発現しない遺伝子であれば特に限定はされないが、具体的には、大腸菌(E.coli)、枯草菌（B.subtilis)のRNAなどが好適に使用される。用いるスパイクRNAは異なる塩基配列を有していればよく、数はスパイクRNAの測定値（cDNAマイクロアレイ法ではシグナル強度、定量的RT-PCR法ではCt値）から検量線を作成する上で、４〜８個、好ましくは、５〜７個とすることが例示される。
【００２９】
スパイクRNAの多段階濃度の範囲は、測定する検体サンプル中のRNA量（例えば、GeneChipTM(Affymetrix)を用いる場合ハイブリダイゼーション液中で1.2pM〜97.2pM）をカバーできるような範囲に、連続希釈系列(例えば、ｘ、３ｘ、３２ｘ、３３ｘ・・・・）で設定する。本明細書において、このスパイクRNAを多段階濃度で含む混合物を「多段階用量スパイクカクテル(GSC:graded-dosed spike cocktail)」という。
【００３０】
工程(c)では、生体試料のホモジネートに、その細胞数又はDNA量と相関する既知量の上記「多段階用量スパイクカクテル」を添加し、RNA抽出を行って検体サンプルを調製する。ここで、「細胞数又はDNA量と相関する既知量」とは、細胞数又はDNA量から一次関数式（生体試料によって異なる）によって計算される量で、細胞数又はDNA量とは比例関係にある。「多段階用量スパイクカクテル」の細胞数又はDNA量と相関する添加量は、工程（ｂ）で求めたDNA量（濃度）にホモジネート液量（ｑ）及びスパイクカクテル最適添加率（ｒ）を乗じて決定する（下式参照）。
【００３１】
【化３】
2005080588.tif 000004
（式中、ＣはDNA濃度（ng/ml)、ｑはホモジネート液量(μl）、ｒは最適添加率(μl／ngDNA)を表す。）
【００３２】
上記式中、多段階用量スパイクカクテルの最適添加率（ｒ）は、Spike facorと呼び、マウスやラットの肝臓や腎臓、一般的なマウス由来の細胞株の場合は0.02(μl／ngDNA)
である。
【００３３】
生体試料のホモジネートからのRNA抽出は、当該分野において通常用いられる手法、例えば、グアニジン／塩化セシウム法、グアニジン／チオシアネート法（グアニジン／セシウムＴＦＡ法）、塩化リチウム／尿素法、ホットフェノール法、ＡＧＰＣ法（アシッドグアニジウム−フェノール−クロロホルム法）などに従って実施することができる。RNA抽出に際しては、RNeasy等の市販のRNA抽出用キットに添付される抽出プロトコルを改良した独自のプロトコルに従って行うことが好ましい。
【００３４】
最後に、工程（ｄ）では検体サンプルのRNAの測定値から、スパイクRNAの測定値に基づいて作成した検量線を用いて細胞１個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を求める。
【００３５】
検量線は、多段階用量スパイクカクテルの用量−作用（濃度−シグナル強度）関係が次式(I)のHill の式に従うという仮定に基づき、両パラメータをlog-log 変換することによって作成する。例えば、cDNAマイクロアレイ法ではスパイクRNAの濃度の対数を横軸にとり、cDNAマイクロアレイ法で測定したシグナル強度（直読値）の対数（シグナル強度が十分に最大シグナル強度より低い場合）、あるいはS／Smax−Sの対数（シグナル強度が最大シグナル強度に近い場合）を縦軸にプロットすればよい。また、定量的RT-PCR法ではスパイクRNA量（鋳型量）の対数を横軸にとり、測定したCt値を縦軸にプロットすればよい。作成された検量線は、次式(II)で表される直線化式で表される。
【００３６】
【化４】
2005080588.tif 000005
（式中、Ｓは測定値、ＳMAXは最大測定値、ＣはスパイクRNAの濃度、ＳＣ50は50％反応濃度、γはHill係数を示す。）
【００３７】
検体サンプルに添加した多段階スパイクカクテルの量は既知であるので、上記検量線から求めた検体サンプル中のmRNA量（濃度）は、「細胞1個当たり」の絶対量に変換することができる。
【００３８】
本発明の方法が適用できるmRNA測定系としては、代表的にはcDNAマイクロアレイ法であるが、定量的RT-PCR法であってもよい。従って、上記の「測定値」は、cDNAマイクロアレイ法にあっては、蛍光シグナル強度をいい、定量的RT-PCR法にあってはCt(threshold cycle)値をいう。また、cDNAマイクロアレイ法は、Gene ChipTM(Affymetrix)を用いることが好ましいが、これに限定されるわけではない。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでない。
（実施例１）  スパイクRNAの調製、多段階用量スパイクカクテルの確立
Affymetrix社製GeneChipTM:MG-U74v2、RG-U34、HG-U95、HG-U133、RAE230、及びMOE430において共通に調製され、かつ 標準Affymetrix プロトコルでは用いられてない 下記の５つの枯草菌 (Bacillus subtilis)のRNA配列(TRP,DAP,PHE,LYS,THR)をAffymetrix GeneChipTMの遺伝子リストから選択した。
(i)TRP(AFFX-TrpX-3_at):B subtilis K01391 のヌクレオチドの塩基配列（配列番号１）の1883番〜4400 番に対応するTrpE タンパク質、TrpD タンパク質、TrpC タンパク質
(ii)THR(AFFX-ThrX-3_at):B subtilis X04603 のヌクレオチドの塩基配列（配列番号２）の248番〜2229番に対応するthrC、thrB遺伝子
(iii)DAP(AFFX-DapX-3_at):B subtilis L38424 のヌクレオチドの塩基配列（配列番号３）の1358番〜3197番に対応するdapB、jojF、jojG 遺伝子 
(iv)PHE(AFFX-PheX-3_at):B subtilis M24537 のヌクレオチドの塩基配列（配列番号４）の2017番〜3334番に対応するpheB、pheA 遺伝子
(v)LYS(AFFX-LysX-3_at):B subtilis X17013 のヌクレオチドの塩基配列（配列番号５）の350番〜1345番に対応するdiaminopimelate decarboxylaseのlys遺伝子
【００４０】
これら５つの枯草菌遺伝子のcDNAをATCC 遺伝子ライブラリー (http://www.atcc.org/) から購入し、発現ベクターに挿入し、大腸菌 (E. coli) で増幅し、MEGAscript キット (Ambion Inc.社製)により転写し、MACS mRNA(Miltenyi Biotec GmbH.社製)により精製した。
【００４１】
また、スパイクRNAとしてこれら５つの枯草菌遺伝子のmRNAを、latin square コンビネーション（表１）にて混合し、多段階用量のスパイクRNAを含むサンプル（スパイクカクテル）を調製した。
【００４２】
【表１】
2005080588.tif 000006
【００４３】
図１は、各サンプルの測定結果を均等目盛／均等目盛スケールでプロットした用量−作用（濃度−シグナル強度）曲線である（ｘ軸は調整濃度Ｃ（μM）；ｙ軸はシグナル強度Ｓ）。用量−作用（濃度−シグナル強度）特性は、Langmuir の式ではなく、前記式（I)に示すHillの式（Sigmoid Emax model)に従った（図１Ａ（ａ））。この５つのスパイクサンプルのデータを前記式（II）によって直線化すると、スパイクRNAの添加量に比例してほぼ直線パターンとなった（図１Ａ（ｂ））（この時、γ（Hill係数）は約１＞γ＞０.８の範囲のであった）。
【００４４】
各濃度において５つのスパイクRNAのうちから１つずつ重複しないように、かつ広範囲のシグナル強度をカバーするように選択したスパイクRNA（図１Ａ（ｂ）、丸で囲んだ）を混合して多段階用量スパイクカクテルとした。その組成を表２に示す。
【００４５】
本スパイクカクテルは、最終ハイブリダイゼーション溶液中で約1.2pM〜97.2pMのRNA
をカバーできる。
【００４６】
【表２】
2005080588.tif 000007
【００４７】
また、図１ｃには、上記の５つの多段階用量スパイクRNAを混合したスパイクカクテルを含む空サンプル、及び５つの同用量（最高用量）スパイクRNAを含む空サンプルの遺伝子発現の散布図を示す（５つのスパイクRNAは矢印付きの黒色点で表す）。スパイクRNAは、GeneChipTM（MG-U74v2）において20未満のシグナル強度を示す他のプローブセットとクロスハイブリダイズしないことが示された。
【００４８】
図１ｄは、スパイクカクテルを含む肝臓サンプルと含まない肝臓サンプルの遺伝子発現の散布図を示す（５つのスパイクRNAは矢印付きの黒色点で表す）。スパイクカクテルを含まない肝臓サンプルのシグナル強度は100未満であり、肝臓サンプル中のRNAがスパイクRNAとクロスハイブリダイズしないことが示された。
【００４９】
（実施例２）  多段階用量スパイクカクテルの添加量算定の例
マウス肝臓ホモジネート液（4倍希釈）を、DNA直接測定法のプロトコル（後記実施例３参照）に従って処理し、蛍光測定した結果、蛍光測定値（Ｆ)が6.925であった。用量−蛍光換算式：Ｃ=Ｆ/0.023903（ＣはDNA濃度（ng/ml)、Ｆは蛍光測定値、ｐはλファージDNAの希釈範囲内で求めたF/C比）によりDNA濃度（Ｃ）を求めたところ、1158.85ng/mlとなった。
【００５０】
これより、RNA抽出に用いるホモジネート液量を350μlとすると、添加すべき多段階用量スパイクカクテル量は1158.85ng/ml×0.35×0.02＝8.11μlと算定できる。
【００５１】
一方、マウス赤血球前駆細胞由来の細胞株（4倍体細胞）SLC3において、細胞2.63×10７個に含まれる全DNAを測定したところ90.1ngであった。よって、肝臓細胞などの２倍体の正常マウス体細胞では、1×10６個あたりのDNA量は1.71ngと算定できる。これより、上記肝臓ホモジネート350μlに含まれる細胞数は、1158.85×0.35／1.71＝2.37×10８個となるので、DNA量と相関する多段階用量スパイクカクテル添加量は、細胞数と相関する添加量に変換できる。
【００５２】
（実施例３）  多段階用量スパイクカクテルを用いた細胞１個当たりとしての遺伝子の絶対発現量測定方法
(1)RNA抽出及び組織ホモジナイズ
重量約30〜60mgの組織塊のサンプルを2mlプラスチック製チューブ (Eppendorf GmbH.社製）に入れ、RNA later (Ambion Inc.社製) に４℃で一夜浸漬し、RNA抽出操作まで保存した。次いで、RNA later を除去し、0.1mlのRLT緩衝液 (Qiagen GmbH.社製）及び直径5mmのジルコニウムビーズ (Funakoshi社製）を加え、MixerMill 300 (Qiagen GmbH.社製)によって20Hzの速度で5分間振盪し、組織をホモジナイズした。このホモジネートのアリコートを以下に述べるDNA量の測定に用いた。
【００５３】
(2) DNA量の測定
(1)で採取したアリコート10μｌを1.5ml密栓チューブ内で、RNase(Nippon Gene Inc.社製）にて37℃で30分間、次いでプロテナーゼＫ (Roche Diagnostics GmbH.社製）にて55℃で3時間処理した。処理したサンプルを、標準DNAを含む96ウェルプレート (λファージDNA, PicoGreen キット, Molecular Probes Inc.社製）に移し、蛍光染料 PicoGreen (Molecular Probes Inc.社製）を各ウェルに加え、10秒間ずつ4回振盪し、30℃で2分間インキュベートし、DNA濃度を96ウェル蛍光プレートリーダー（励起485nm／発光538nm）で測定した。本方法（Picogreen法）は、標準法であるフェノール抽出法とよく相関し、互換性のあるデータを生成した（図２）。
【００５４】
(3) LBM（肝臓-脳ミックスを語源とする名称）標準サンプルセットを用いた用量相関性の確認
非類似の遺伝子発現パターンを有する１対のサンプルを用いて、前記(1)に従って調製したサンプルのホモジネートに、前記(2)の手法に従ってDNA量を測定し、このDNA量に相関する既知量の多段階用量スパイクカクテルをそれぞれ加え、２つのサンプルのホジネートを、100：0、75：25、50：50、25：75及び0：100の比率で混合したサンプルを調製した。マウスを対象とする場合は、マウスの肝臓と脳を１対のサンプルとし、ヒトを対象とする場合は、ヒト由来の２つの癌細胞株（卵巣癌細胞株OVCAR-4、直腸癌細胞株HT-29)を１対のサンプルとして選択した（これら５つの混合サンプルのセットをLBM標準サンプルセットと呼ぶ：LBMは、肝臓-脳ミックスを語源とする名称）。
【００５５】
ヒト由来の２つの癌細胞株（卵巣癌細胞株OVCAR-4、直腸癌細胞株HT-29)を選択した場合、これらの５つのサンプルについて、Affymetrix HG-U133 GeneChipを用いて遺伝子発現を測定した。図３ａはMAS5(Micro Array Suite version 5)ソフトウェアで直接生成した生データ、図３ｂは全遺伝子の分布を用いてグローバル補正したデータ、図３ｃは、多段階用量スパイクカクテルによって絶対量化したデータをそれぞれ示す。図３ａ、ｂ及びｃは、50：50サンプルでノーマライズした遺伝子の発現比であるから、理想的なマイクロアレイは50：50サンプルの１の点を通る右下がり、右上がり、水平の何れかの直線を生じるはずである。図３ｃに於いて、５本の黒色線で表される多段階用量スパイクカクテルRNAは、いずれも水平の直線であることから検量線として正しく機能し、測定されていることを示している。また、歪みの少ない蝶形パターンは、正しく絶対量化されていることと、このマイクロアレイがいずれかのサンプルで発現される約6000遺伝子に対して極めて良好な用量−作用特性を有することを示すものである。
【００５６】
図３ｄはLBM標準サンプルセットによる約6000の各遺伝子の5点の直線性を検討するために求めた回帰直線の確定係数（Ｒ２値）の累積分布を示す。多段階用量スパイクカクテルによる絶対量化データがより直線状に配列する5点のデータ（Ｒ２が生データ及びグローバルデータよりもより１に近づく）を生成することが示される。
【００５７】
（実施例４）  測定データの絶対量化の例
雌マウスの卵巣を摘出して14日間経過し、子宮の萎縮を確認した後、試験化合物（エストロジェン作動性化学物質：THBP）を0、30、100、300及び1000mg/kgの用量で７日間皮下投与した。図４ａに用量−相関子宮重量増加をモニタリングした結果を示す。
【００５８】
実施例３の方法に従って、子宮組織の遺伝子発現をAffymetrix MG-U74v2 GeneChip を用いて分析し（１グループ当たり三つの平均）、データを GeneSpring ソフトウェア (Silicon Genetics社製）によって可視化した（図４ｂ）。図４ｂ（左）は、Affymetrix MAS5 ソフトウェアから直接読み出した生データ、図４ｂ（中央）は、全遺伝子の分布を用いてデータをグローバル補正したデータ、図４ｂ（右）は、多段階用量スパイクカクテルの検量線を用いて絶対量化したデータを示した。各図は、均等目盛スケール（上）、及び各遺伝子の中央値に対する log 比（下）でプロットしている。
【００５９】
多段階用量スパイクカクテルを示す黒色線が平行に整列していること（細胞数が一定であることを示す）、そして大多数の遺伝子が試験化合物のエストロジェン刺激に応答した子宮重量増加と相関していることが観察された。
【００６０】
（実施例５）  測定データの絶対量化の例
12週齢雄性C57BL/6マウスを用い、ペンタクロロフェノールの毒性試験を行った。マウスは１群につき３匹とし、投与開始からの経過時間について４時点（2時間、4時間、８時間、24時間）、投与量について４用量（0mg／体重kg、10mg／体重kg、30mg／体重kg、100mg／体重kg）からなる合計16群を設定した（溶媒：CMC)。
【００６１】
時間をｘ軸、用量をｙ軸、cDNAマイクロアレイ法によって測定した肝臓の遺伝子発現データを実施例３の方法に従って絶対量化したシグナル強度をz軸にとると、ゼロから均等目盛表示した三次元グラフに描画することができた（図５）。
【００６２】
一つの遺伝子は4×4の立体地図状の曲面を描くので、22690遺伝子がマイクロアレイ（GeneChipTM)に載っている場合、一つの実験グラフは、22690枚の曲面からなる（これを「ミルフィーユ」データと名づけた）。
【００６３】
このミルフィーユデータ表示によれば、例えば、日内変動、溶媒効果、対照群では全く発現が無く処置によってのみ誘導がかかる遺伝子群の把握のほか、曲面の可視化を通して動的な遺伝子カスケードの情報の抽出が著しく促進されると同時に、アーティファクトの判定とその除去にも大きく貢献する。さらに、発現がゼロである遺伝子の表記が問題なく可能であることから、遺伝子ノックアウト動物と野生型動物のデータを対等に記載し比較することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の方法は、cDNAマイクロアレイ法等の網羅的mRNA測定において、細胞1個当たりとしての遺伝子の絶対発現量を得ることができるので、その値をサンプル間で、あるいは独立して実施された複数の実験間で直接比較することが可能となる。したがって、本発明の方法は、薬剤や化学物質の毒性評価、薬剤や化学物質の毒性発現予測データベースの構築、疾患関連遺伝子の探索と同定、創薬標的遺伝子の探索と同定、創薬の有効性評価、新規遺伝子の機能推定、早期癌遺伝子診断、癌患者の分類と予後の予測などにおいて非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１Ａ】ａは、各スパイクRNAの濃度−シグナル強度曲線を示す図である。ｂは、各スパイクRNAの濃度−シグナル強度曲線を直線化した図である（図中、丸で囲んだスパイクRNAを多段階用量スパイクカクテル用に選択した）。
【図１Ｂ】ｃは、多段階用量の５つのスパイクRNA混合物を含む空サンプル、及び同用量（最高用量）の５つのスパイクRNAを含む空サンプルにおける遺伝子発現の散布図を示す。ｄは、スパイクカクテルを含む肝臓サンプルと含まない肝臓サンプルにおける遺伝子発現の散布図を示す。
【図２】Picogreen法を用いたDNA量直接測定法とフェノール抽出法との互換性を示す。
【図３】cDNAマイクロアレイ法によるヒト由来の２つの癌細胞株（卵巣癌細胞株OVCAR-4、直腸癌細胞株HT-29)を１対の元サンプルとしたLBM（肝臓-脳ミックスを語源とする名称）標準サンプルセットの遺伝子発現解析結果を示す図である。図３ａはMAS5ソフトウェアで直接生成した生データ、図３ｂは全遺伝子の分布を用いてグローバル補正したデータ、図３ｃは、多段階用量スパイクカクテルによって絶対量化したデータをそれぞれ示す。図３ｄはLBM標準サンプルセット５点による回帰直線の確定係数（Ｒ２値）の累積分布を示す。
【図４】図４ａは、化学物質投与量と子宮重量増加の関係を示す。図４ｂは、cDNAマイクロアレイ法による子宮標準サンプルの遺伝子発現解析結果を示す図である（左：生データ、中央：グローバル補正したデータ、右：絶対量化したデータ）。
【図５】化学物質毒性試験に対するミルフィーユデータの概念図を示す（ｘ軸は時間経過；ｙ軸は用量レベル；ｚ軸は絶対量化シグナル強度）。
【図１Ａ】
2005080588.tif 000009
【図１Ｂ】
2005080588.tif 000010
【図２】
2005080588.tif 000011
【図３】
2005080588.tif 000012
【図４】
2005080588.tif 000013
【図５】
2005080588.tif 000014
【配列表】
2005080588000001.app