(57)【要約】【課題】本発明は、安価に入手可能な出発原料を用いて、工業的に有利かつ簡便な経路でジペプチドを製造する方法を提供することを課題とする。【解決手段】アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、または該微生物の菌体処理物を用いて、アミノ酸エステルおよびアミノ酸からジペプチドを製造する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロファーガ属、ウイークセラ属、ペドバクター属、パーシコバクター属、フレキシスリクス属、チティノファーガ属、サイクロバクテリウム属、ルネラ属、サーモネマ属、サイクロセルペンス属、ゲリディバクター属、ディアドバクター属、フラメオビルガ属、スピロソマ属、フレクトバチルス属、テナシバクラム属、ロドターマス属、ゾベリア属、ムリカウダ属、サレゲンティバクター属、タキセオバクター属、チトファーガ属、マリニラビリア属、レビネラ属、サプロスピラ属、またはハリスコメノバクター属に属し、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、該微生物の菌体処理物、または、該微生物に由来するペプチド生成酵素を用いて、アミノ酸エステルとアミノ酸からジペプチドを製造することを特徴とするジペプチドの製造方法。
【請求項２】
アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、該微生物の菌体処理物、または、該微生物に由来するペプチド生成酵素を用いて、アミノ酸エステルとアミノ酸からジペプチドを製造する際に、反応液に金属酵素阻害剤を添加することを特徴とする、請求項１に記載のジペプチドの製造方法。
【請求項３】
前記アミノ酸エステルが、Ｌ−アラニンエステルであることを特徴とする、請求項１または２に記載のジペプチドの製造方法。
【請求項４】
前記アミノ酸が、Ｌ−グルタミンであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載のジペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複雑な合成方法を経ることなく、簡便かつ安価にジペプチドを製造する方法に関し、より詳細には、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを製造する方法、当該ジペプチドの製造方法に使用するペプチド生成酵素およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ジペプチドは、医薬品素材、機能性食品等のさまざまな分野で利用されている。例えば、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンは無血清培地の成分として有用であり、Ｌ−グルタミンに比べ安定で、水溶性も高いことから輸液成分に用いられる。
【０００３】
ジペプチドの製造法としては従来から化学合成法が知られているが、その製造法は必ずしも簡便なものではなかった。例えば、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアラニン（以下Ｚ−アラニンと称する）と保護Ｌ−グルタミンを用いる方法（非特許文献１；Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３４，７３９（１９６１）、非特許文献２；Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３５，１９６６（１９６２））、Ｚ−アラニンと保護Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステルを用いる方法（非特許文献３；Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３７，２００（１９６４））、Ｚ−アラニンエステルと無保護グルタミン酸を用いる方法（特許文献１；特開平１−９６１９４号公報）、２−置換−プロピオニルハロイドを原料として、Ｎ−（２−置換）−プロピオニルグルタミン誘導体を中間体として合成する方法（特許文献２；特開平６−２３４７１５号公報）等が知られている。
【０００４】
しかしながら、いずれの方法においても、保護基の導入脱離、もしくは中間体の合成が必要であり、工業的に有利で十分に満足できる製造方法ではなかった。
【０００５】
酵素を用いたジペプチドの代表的製造法としては、Ｎ保護、Ｃ無保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミン成分を用いる縮合反応（反応１）、およびＮ保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミン成分を用いる置換反応（反応２）が知られており、反応１の例としては、Ｚ−アスパラギン酸とフェニルアラニンメチルエステルからのＺ−アスパルチルフェニルアラニンメチルエステルの製造方法（特許文献３；特開昭５３−９２７２９号公報）、反応２の例としてはアセチルフェニルアラニンエチルエステルとロイシンアミドからのアセチルフェニルアラニルロイシンアミドの製造方法（非特許文献４；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．，  １６３，  ５３１  （１９７７））が挙げられる。Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分を用いる方法の研究報告例は極めて少なく、Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミン成分を用いる置換反応（反応３）の例としては特許文献４（特許ＷＯ  ９０／０１５５５）があり、例えばアルギニンエチルエステルとロイシンアミドからのアルギニルロイシンアミドの製造方法が挙げられる。Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ無保護のアミン成分を用いる置換反応（反応４）の例としては、特許文献５（特許ＥＰ  ２７８７８７Ａ）があり、例えばチロシンエチルエステルとアラニンからのチロシルアラニンの製造方法が挙げられる。これらの方法の中で最も安価な製造方法となり得るのは、当然ながら保護基の数が最も少ない反応４の範疇に入る反応である。
【０００６】
しかしながら、反応４の先行例（特許文献５；特許ＥＰ  ２７８７８７Ａ）に使用する酵素は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母あるいはカビ、植物に由来する  比較的高価なｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ標品の試薬を用いており、また生産されるジペプチドも比較的疎水度の高いアミノ酸を含むものであった。特許文献５（特許ＥＰ２７８７８７Ａ）においては、細菌およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母を除く酵母由来の酵素を用いる方法は全く知られておらず、また親水性の高いアラニルグルタミンやアラニルアスパラギンの製造方法については全く知られていなかった。このような背景の下、これらペプチドの工業的安価な製造法の開発が望まれていた。
【０００７】
【特許文献１】
特開平１−９６１９４号公報
【特許文献２】
特開平６−２３４７１５号公報
【特許文献３】
特開昭５３−９２７２９号公報
【特許文献４】
特許ＷＯ  ９０／０１５５５
【特許文献５】
特許ＥＰ  ２７８７８７Ａ
【非特許文献１】
Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３４，７３９（１９６１）
【非特許文献２】
Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３５，１９６６（１９６２）
【非特許文献３】
Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３７，２００（１９６４）
【非特許文献４】
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．，  １６３，  ５３１  （１９７７）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安価に入手可能な出発原料と安価に供給できる酵素源（微生物の培養物、微生物菌体、菌体処理物等）を用いて、工業的に有利かつ簡便な経路でジペプチドを製造する方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的に鑑み鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは安価に培養できる、ある種の細菌、酵母に属する微生物が、安価に入手可能なＬ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕  セルロファーガ属、ウイークセラ属、ペドバクター属、パーシコバクター属、フレキシスリクス属、チティノファーガ属、サイクロバクテリウム属、ルネラ属、サーモネマ属、サイクロセルペンス属、ゲリディバクター属、ディアドバクター属、フラメオビルガ属、スピロソマ属、フレクトバチルス属、テナシバクラム属、ロドターマス属、ゾベリア属、ムリカウダ属、サレゲンティバクター属、タキセオバクター属、チトファーガ属、マリニラビリア属、レビネラ属、サプロスピラ属、またはハリスコメノバクター属に属し、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、該微生物の菌体処理物、または、該微生物に由来するペプチド生成酵素を用いて、アミノ酸エステルとアミノ酸からジペプチドを製造することを特徴とするジペプチドの製造方法。
〔２〕  アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、該微生物の菌体処理物、または、該微生物に由来するペプチド生成酵素を用いて、アミノ酸エステルとアミノ酸からジペプチドを製造する際に、反応液に金属酵素阻害剤を添加することを特徴とする、上記〔１〕に記載のジペプチドの製造方法。
〔３〕  前記アミノ酸エステルが、Ｌ−アラニンエステルであることを特徴とする、上記〔１〕または〔２〕に記載のジペプチドの製造方法。
〔４〕  前記アミノ酸が、Ｌ−グルタミンであることを特徴とする、上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載のジペプチドの製造方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のジペプチドの製造方法は、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、または、該微生物の菌体処理物を用いることを特徴とする。本発明のジペプチドの製造方法における反応は下記反応式により表される。下記化学式に例示されるように、本明細書において「ジペプチド」とは、ペプチド結合を１つ有するペプチドポリマーのことをいう。
【００１２】
（化学式１）
Ｒ１−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯＯＲ    ＋  Ｈ２Ｎ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−Ｒ２→  Ｒ１−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−Ｒ２  ＋  ＲＯＨ
（Ｒは置換または無置換の炭化水素鎖、Ｒ１はアミノ酸エステルの側鎖、Ｒ２はアミノ酸の側鎖を表す）
【００１３】
アミノ酸エステルは、安価に入手可能な化合物である。アミノ酸エステルと無保護アミノ酸を出発原料として、細菌、酵母を酵素源として水溶液中で反応せしめる本発明の方法は、従来にはない新しいジペプチドの製造方法であり、医薬品素材、機能性食品として有用なジペプチドをより安価に提供することを可能とするものである。
【００１４】
以下、本発明のジペプチドの製造方法を、
〔Ｉ〕アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物
〔ＩＩ〕ジペプチドの製造方法
〔ＩＩＩ〕ペプチド合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの単離等
の順に詳細に説明する。
【００１５】
〔Ｉ〕アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物
本発明に使用する微生物としては、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物を特に限定なく使用することができる。アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物としては、セルロファーガ属、ウイークセラ属、ペドバクター属、パーシコバクター属、フレキシスリクス属、チティノファーガ属、サイクロバクテリウム属、ルネラ属、サーモネマ属、サイクロセルペンス属、ゲリディバクター属、ディアドバクター属、フラメオビルガ属、スピロソマ属、フレクトバチルス属、テナシバクラム属、ロドターマス属、ゾベリア属、ムリカウダ属、サレゲンティバクター属、タキセオバクター属、チトファーガ属、マリニラビリア属、レビネラ属、サプロスピラ属、またはハリスコメノバクター属に属する微生物を挙げることができるが、具体的には以下のものを例示することができる。
【００１６】
セルロファーガ  リティカ  ＮＢＲＣ  １４９６１
（Ｃｅｌｌｕｌｏｐｈａｇａ  ｌｙｔｉｃａ）
ウイークセラ  ビロサ  ＮＢＲＣ  １６０１６
（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａ  ｖｉｒｏｓａ）
ペドバクター  ヘパリナス  ＮＢＲＣ  １２０１７
（Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ  ｈｅｐａｒｉｎｕｓ）
パーシコバクター  ディフルエンス  ＮＢＲＣ  １５９４０
（Ｐｅｒｓｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ）
フレキシスリクス  ドロテア  ＮＢＲＣ  １５９８７
（Ｆｌｅｘｉｔｈｒｉｘ  ｄｏｒｏｔｈｅａｅ）
チティノファーガ  ピネンシス  ＮＢＲＣ  １５９６８
（Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ  ｐｉｎｅｎｓｉｓ）
サイクロバクテリウム  マリナム  ＡＴＣＣ  ２５２０５
（Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ）
ルネラ  スリシフォルミス  ＡＴＣＣ  ２９５３０
（Ｒｕｎｅｌｌａ  ｓｌｉｔｈｙｆｏｒｍｉｓ）
サーモネマ  ラプサム  ＡＴＣＣ  ４３５４２
（Ｔｈｅｒｍｏｎｅｍａ  ｌａｐｓｕｍ）
サイクロセルペンス  ブルトネンシス  ＡＴＣＣ  ７００３５９
（Ｐｓｙｃｈｒｏｓｅｒｐｅｎｓ  ｂｕｒｔｏｎｅｎｓｉｓ）
ゲリディバクター  アルゲンス  ＡＴＣＣ  ７００３６４
（Ｇｅｌｉｄｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇｅｎｓ）
ディアドバクター  ファーメンタンス  ＡＴＣＣ  ７００８２７
（Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）
フラメオビルガ  アプリカ  ＮＢＲＣ  １５９４１
（Ｆｌａｍｍｅｏｖｉｒｇａ  ａｐｒｉｃａ）
スピロソマ  リングアレ  ＤＳＭＺ  ７４
（Ｓｐｉｒｏｓｏｍａ  ｌｉｎｇｕａｌｅ）
フレクトバチルス  マジョール  ＤＳＭＺ  １０３
（Ｆｌｅｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｊｏｒ）
テナシバクラム  マリティマム  ＡＴＣＣ４３３９８
（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ  ｍａｒｉｔｉｍｕｍ）
ロドターマス  マリナス  ＤＳＭＺ  ４２５２
（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）
ゾベリア  ガラクタニボランス  ＤＳＭＺ  １２８０２
（Ｚｏｂｅｌｌｉａ  ｇａｌａｃｔａｎｉｖｏｒａｎｓ）
ムリカウダ  ルエストリンゲンシス  ＤＳＭＺ  １３２５８
（Ｍｕｒｉｃａｕｄａ  ｒｕｅｓｔｒｉｎｇｅｎｓｉｓ）
サレゲンティバクター  サレゲンス  ＤＳＭＺ  ５４２４
（Ｓａｌｅｇｅｎｔｉｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｅｇｅｎｓ）
タキセオバクター  ゲルプルプルアッセンス  ＤＳＭＺ  １１１１６
（Ｔａｘｅｏｂａｃｔｅｒ  ｇｅｌｕｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ）
チトファーガ  フッチンソニイ  ＮＢＲＣ  １５０５１
（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎｉｉ）
マリニラビリア  サルモニカラー  ＮＢＲＣ  １５９４８
（Ｍａｒｉｎｉｌａｂｉｌｉａ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）
レビネラ  コハエレンス  ＡＴＣＣ  ２３１２３
（Ｌｅｗｉｎｅｌｌａ  ｃｏｈａｅｒｅｎｓ）
サプロスピラ  グランディス  ＡＴＣＣ  ２３１１９
（Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａ  ｇｒａｎｄｉｓ）
ハリスコメノバクター  ヒドロシス  ＡＴＣＣ  ２７７７５
（Ｈａｌｉｓｃｏｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｓｓｉｓ）
【００１７】
上記菌株のうち、ＡＴＣＣ番号が記載されているものは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０，  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。上記菌株のうち、ＮＢＲＣ番号が記載されているものは、独立行政法人製品評価機構生物遺伝資源部門（〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。上記菌株のうち、ＤＳＭＺ番号が記載されているものは、Ｄｅｕｔｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ  （Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ，  ３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）  に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。
【００１８】
これらの微生物としては、野生株または変異株のいずれを用いてもよいし、また、細胞融合もしくは遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導される組み換え株等も用いることができる。
【００１９】
このような微生物の菌体を得るには、当該微生物を適当な培地で培養増殖せしめるとよい。このための培地はその微生物が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
【００２０】
例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭水化物類あるいはこれらの混合物などを使用することができる。
【００２１】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機塩のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができる。
【００２２】
他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。
【００２３】
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてｐＨ５〜８、温度５〜６５℃の範囲でｐＨおよび温度を適当に制限しつつ１２〜１００時間程度培養を行えばよい。
【００２４】
〔ＩＩ〕ジペプチドの製造方法
本発明のジペプチドの製造方法は、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、該微生物の菌体処理物、または、該微生物に由来するペプチド生成酵素を用いて、アミノ酸エステルおよびアミノ酸からジペプチドを製造するものである。上記微生物の産生するペプチド生成酵素は、アミノ酸エステルとアミノ酸を基質としてジペプチドを生成する活性を有するものである。
【００２５】
上記微生物の産生するペプチド生成酵素をアミノ酸エステルおよびアミノ酸に作用せしめる方法としては、上記微生物を培養しながら、培養液中に直接基質を添加してもよいし、培養終了後の培養液あるいは微生物培養物から遠心分離等により菌体を分離し、これをそのままもしくは洗浄した後、緩衝液に再懸濁したものにアミノ酸エステルとアミノ酸を添加して反応させてもよい。あるいは、ポリアクリルアミドゲル法、カラギーナン法、アルギン酸ゲル法等の公知の方法で固定化した菌体を用いることができる。
【００２６】
また、微生物菌体の処理物として、菌体破砕物、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体を用いてもよい。菌体破砕には超音波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等の方法を用いることができ、また溶菌させる場合には卵白リゾチームや、ペプチターゼ処理、またはこれらを適宜組み合わせた方法が用いられる。さらに、当該微生物菌体処理物からペプチド生成酵素を回収し、粗酵素液として使用してもよいし、必要に応じて、酵素を精製して用いてもよい。培養物からの精製法としては通常の酵素精製法をもちいることができる。具体的には遠心分離等によって菌体を集め、超音波処理、ガラスビーズ、ダイノミルなどの機械的方法によって菌体を破砕し、細胞片等の固形物を遠心分離によって除き、粗酵素を得て、超遠心分離分画、塩析、有機溶媒沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等を行うことによって上述のペプチド生成酵素が精製される。
【００２７】
なお、「微生物に由来するペプチド生成酵素」とは、当該微生物菌体処理物から上記精製工程を経て得られた酵素のみならず、当該酵素の遺伝子を異種または同種の宿主において発現させることによる、いわゆる遺伝子工学的手法によって生産された酵素をも含む。
【００２８】
すなわち、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有する画分であれば、酵素と当該酵素含有物全てを使用することが可能である。ここで、「酵素含有物」とは、当該酵素を含有するものであればよく、具体的形態としては、当該酵素を生産する微生物の培養物、当該培養物から分離された微生物菌体、菌体処理物などが含まれる。微生物の培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的には、微生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生成された物質の混合物などのことをいう。また、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体として用いてもよい。また、菌体処理物には、菌体を破砕、溶菌、凍結乾燥したものなどが含まれ、さらに菌体などを処理して回収される粗酵素、さらに精製した精製酵素なども含まれる。精製処理された酵素としては、各種精製法によって得られる部分精製酵素等を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化酵素を使用してもよい。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清も酵素含有物として利用できる。
【００２９】
なお、培養物、培養菌体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物を用いる場合には、ペプチドの生成に関与せずに生成ペプチドを分解する酵素が存在することが多く、この場合には、金属酵素阻害剤、例えばエチレンジアミンン四酢酸  （ＥＤＴＡ）のような金属プロテアーゼ阻害剤などを添加するほうが好ましい場合がある。添加量は、０．１ｍＭから１００ｍＭの範囲で、好ましくは１ｍＭから５０ｍＭである。
【００３０】
酵素または酵素含有物の使用量は、目的とする効果を発揮する量（有効量）であればよく、この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば洗浄菌体を用いる場合は反応液１リットル当たり１〜５００ｇである。
【００３１】
アミノ酸エステルとしては、当該ペプチド生成酵素の基質特異性においてＬ−アミノ酸とジペプチドを生成できるアミノ酸エステルであればいかなるものも使用でき、例えば、Ｌ−アミノ酸のメチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｉｓｏ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ｉｓｏ−ブチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル等が挙げられる。また、天然型のアミノ酸に対応したＬ−アミノ酸エステルだけでなく、非天然型のアミノ酸もしくはその誘導体に対応するＬ−アミノ酸エステルまたはＤ−アミノ酸エステルも使用可能である。本発明において、アミノ酸エステルとして好ましくは、Ｌ−アラニンエステルを用いることができる。アミノ酸としては、当該ペプチド生成酵素の基質特異性においてアミノ酸エステルとジペプチドを形成するものであれば特に限定なく公知のものを使用できる。
【００３２】
アミノ酸としては、Ｌ−アミノ酸、Ｃ保護Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｃ保護Ｄ−アミノ酸、アミン等が挙げられる。また、アミンとしは、天然型アミンだけでなく、非天然型のアミンもしくはその誘導体などが例示される。また、アミノ酸としては、天然型アミノ酸だけではなく非天然型アミノ酸もしくはその誘導体も例示される。α−アミノ酸の他、アミノ基の結合位置の異なる、β−、γ−、ω−等のアミノ酸なども例示される。本発明においては、アミノ酸として好ましくは、Ｌ−グルタミンを用いることができる。
【００３３】
出発原料であるアミノ酸エステルおよびアミノ酸の濃度は各々１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍであるが、アミノ酸エステルに対してアミノ酸を等量以上添加したほうが好ましい場合がある。また、必要ならば、例えば基質が高濃度だと反応を阻害するような場合には、反応中にこれらを阻害しない濃度にして逐次添加する事ができる。
【００３４】
反応温度は３〜７０℃、好ましくは５〜５０℃であり、反応ｐＨはｐＨ２〜１２好ましくはｐＨ３〜１１である。かくして２〜１００時間程度反応を行うことにより、反応混合物中にジペプチドが生成蓄積する。生成されたジペプチドは、定法により回収し、必要に応じて精製することができる。
【００３５】
〔ＩＩＩ〕ペプチド合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの単離等
〔ＩＩＩ―１〕ＤＮＡの単離
本発明で用いられる微生物は、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有しており、上記の微生物群などから遺伝子工学的な手法を用いて、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成するタンパク質をコードするＤＮＡ単離し、形質転換体を作製することにより、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成するタンパク質（ペプチド合成酵素）を得ることもできる。以下に、例として、微生物からＬ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成するタンパク質をコードするＤＮＡ単離し、形質転換体を作製する方法についての実施形態を説明する。
【００３６】
はじめに、上記の微生物から上記〔ＩＩ〕の欄で説明したようにして生成酵素を得て、精製されたペプチド生成酵素のアミノ酸配列を決定する。エドマン法（Ｅｄｍａｎ，Ｐ．，  Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．  Ｓｃａｎｄ．  ４，  ２２７  （１９５０））を用いてアミノ酸配列を決定することができる。またＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のシークエンサーを用いてアミノ酸配列を決定することができる。精製されたペプチド生成酵素について、Ｎ末端から３０残基のアミノ酸配列を決定し、明らかとなったアミノ酸配列に基づいて、これをコードするＤＮＡの塩基配列を演繹できる。ＤＮＡの塩基配列を演繹するには、ユニバーサルコドンを採用する。
【００３７】
演繹された塩基配列に基づいて、３０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成する。該ＤＮＡ分子を合成する方法はＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２２，  １８５９  （１９８１）に開示されている。また、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のシンセサイザーを用いて該ＤＮＡ分子を合成できる。該ＤＮＡ分子は、微生物菌体からペプチド生成酵素をコードするＤＮＡ全長を、染色体遺伝子ライブラリーから単離する際に、プローブとして利用できる。あるいは、ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡをＰＣＲ法で増幅する際に、プライマーとして利用できる。ただし、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡは、ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡ全長を含んでいないので、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡをプローブとして用いて、ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡ全長を微生物の染色体遺伝子ライブラリーから単離する。
【００３８】
ＰＣＲ法の操作については、Ｗｈｉｔｅ，  Ｔ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  ５，  １８５  （１９８９）等に記載されている。染色体ＤＮＡを調製する方法、さらにＤＮＡ分子をプローブとして用いて、遺伝子ライブラリーから目的とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている。
【００３９】
単離されたペプチド生成酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  （１９８５）に記載されている。また、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基配列を決定することができる。
【００４０】
本発明で用い得るＤＮＡは、上記のようにして得られるＤＮＡのみではない。ある特定の菌体の染色体ＤＮＡから単離されたペプチド生成酵素をコードするＤＮＡに人工的に変異を加えたＤＮＡであっても、ペプチド生成酵素をコードする場合には、本発明で用い得るＤＮＡである。人工的に変異を加える方法として頻繁に用いられるものとして、Ｍｅｔｈｏｄ．  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４  （１９８７）に記載されている部位特異的変異導入法がある。
【００４１】
さらに、上記のようにして染色体ＤＮＡなどから単離されたＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、ペプチド生成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明で用いることができるＤＮＡである。
【００４２】
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、このましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。ペプチド生成酵素の活性については既に上記にて説明したとおりである。ただし、相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で元のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００４３】
さらに、単離されたＤＮＡでコードされるタンパク質と実質的に同一のタンパク質も本発明で用いることができる。したがって、単離されたＤＮＡでコードされるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するペプチド生成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明において用いることができる。ここで「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、ペプチド生成酵素活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。また、ペプチド生成酵素の活性については、既に説明した通りである。ただし、アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で元のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００４４】
上記のように、微生物からＤＮＡを単離した場合、本発明では下記のＤＮＡを好適に用いることができる。なお、例として、単離されたＤＮＡの特定された塩基配列を塩基配列ｙとし、当該塩基配列でコードされるアミノ酸配列をアミノ酸配列Ｙという。
【００４５】
（ｉ）塩基配列ｙからなるＤＮＡ。
（ｉｉ）塩基配列ｙと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するペプチド生成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｉｉｉ）アミノ酸配列Ｙを有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｉｖ）アミノ酸配列Ｙにおいて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するペプチド生成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００４６】
〔ＩＩＩ−２〕形質転換体の作製
次に、ペプチド生成酵素活性を有するタンパク質を発現する形質転換体の作製について説明する。組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。
【００４７】
本発明の方法で用いることができる形質転換体としては、例えば下記（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）などのタンパク質を発現することができる形質転換体が好適なものとして挙げられる。
【００４８】
（Ａ）アミノ酸配列Ｙを有するタンパク質。
（Ｂ）アミノ酸配列Ｙにおいて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するペプチド生成酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）塩基配列ｙと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するペプチド生成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡでコードされるタンパク質。
【００４９】
上記（Ａ）〜（Ｃ）のペプチド生成酵素活性を有するタンパク質を発現する形質転換体を作製するためには、上記〔ＩＩＩ―１〕の欄に示した（ｉ）〜（ｉｖ）のＤＮＡを宿主細胞に導入すればよい。すなわち、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）のＤＮＡを宿主細胞で発現可能な発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入する。
【００５０】
上記（Ｂ）に示されるような変異は、例えば部位特異的変異法によって、本酵素遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されるように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、本酵素をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び本酵素をコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法などが挙げられる。
【００５１】
タンパク質を組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、該タンパク質を生産する形質転換体内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
【００５２】
このようにして得られるタンパク質封入体は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
【００５３】
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
【００５４】
さらに、融合タンパク質として発現させた後に、目的のタンパク質を切り出すため、制限プロテアーゼの認識配列を適当な位置に配しておくことも有効である。
【００５５】
タンパク質を組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができるが、一般に大腸菌などの腸内細菌、好ましくは大腸菌（エシェリヒア  コリ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が用いられる。大腸菌などの腸内細菌を用いてタンパクを大量生産する技術について数多くの知見があるためである。以下、形質転換された大腸菌を用いてペプチド生成酵素を製造する方法の一形態を説明する。
【００５６】
ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。
【００５７】
ペプチド生成酵素を融合タンパク質封入体として生産させるためには、ペプチド生成酵素遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ  １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
【００５８】
これらの遺伝子とペプチド生成酵素をコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよい。
【００５９】
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい場合がある。このターミネータとしては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
【００６０】
ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。より具体的には、ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８等を用いることができる。他にもファージＤＮＡ、トランスポゾンＤＮＡのベクターも利用できる。
【００６１】
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほか）。
【００６２】
プロモータ、ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、ターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組み換えＤＮＡを得る。
【００６３】
該組み換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質が発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、例えばエシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ  （１９８９）等に記載されている。
【００６４】
融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、ペプチド生成酵素内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてペプチド生成酵素を切り出せるようにしてもよい。
【００６５】
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
【００６６】
ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。ペプチド生成酵素あるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりペプチド生成酵素あるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、ペプチド生成酵素あるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
【００６７】
タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパク質とともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
【００６８】
再生工程時のタンパク質濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したペプチド生成酵素が自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
【００６９】
なお、遺伝子工学的な手法については、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ  （１９８９）などの文献に記載された手法に準拠して実施することができる。
【００７０】
【実施例】
以下、実施例をあげて、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例におけるＬ−アラニン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの定量は高速液体クロマトグラフィーを用いる方法（カラム：ＧＬサイエンス社製  ＩｎｅｒｔｓｉＬ  ＯＤＳ−２、溶離液：リン酸水溶液（ｐＨ２．２、５．０ｍＭ  １−オクタンスルホン酸ナトリウム溶液／メタノール＝１００／１５、流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出２１０ｎｍ）により行った。
【００７１】
（実施例１）  Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する微生物
Ｃｅｌｌｕｌｏｐｈａｇａ  ｌｙｔｉｃａ  ＮＢＲＣ  １４９６１  あるいは  Ｆｌｅｘｉｔｈｒｉｘ  ｄｏｒｏｔｈｅａｅ  ＮＢＲＣ  １５９８７の培養には、ダイゴ人工海水ＳＰ  １Ｌ中に、トリプトン  １ｇ、酵母エキス  １ｇ、寒天  １５ｇを含む寒天固体培地（ｐＨ７．２、１２０℃で１５分殺菌）を用いた。この培地にて３０℃、４８時間、シード培養したＣｅｌｌｕｌｏｐｈａｇａ  ｌｙｔｉｃａ  ＮＢＲＣ  １４９６１あるいは  Ｆｌｅｘｉｔｈｒｉｘ  ｄｏｒｏｔｈｅａｅ  ＮＢＲＣ  １５９８７  の菌体を同培地に塗布し、３０℃、４８時間、メイン培養した。
【００７２】
Ｗｅｅｋｓｅｌｌａ  ｖｉｒｏｓａ  ＮＢＲＣ  １６０１６  の培養には、羊血液寒天培地（日水プレート、日水製薬製）を用いた。この培地にて３０℃、４８時間、シード培養したＷｅｅｋｓｅｌｌａ  ｖｉｒｏｓａ  ＮＢＲＣ  １６０１６  を同培地に塗布し、３０℃、４８時間、メイン培養培養した。
【００７３】
Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ  ｈｅｐａｒｉｎｕｓ  ＮＢＲＣ  １２０１７  の培養には、蒸留水１Ｌ中に、ペプトン  １０ｇ、酵母エキス  ２ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｇ、寒天  １５ｇを含む寒天固体培地（ｐＨ  ７．０ｐ、１２０℃で１５分殺菌）を用いた。この培地にて３０℃、４８時間、シード培養した  Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ  ｈｅｐａｒｉｎｕｓ  ＮＢＲＣ  １２０１７  の菌体を同培地に塗布し、３０℃、４８時間、メイン培養した。
【００７４】
Ｐｅｒｓｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ  ＮＢＲＣ  １５９４０  の培養には、ダイゴ人工海水ＳＰ  １Ｌ中に、ＫＮＯ３  ０．５ｇ、グリセロリン酸ナトリウム  ０．１ｇ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン  １ｇ、トリプトン  ５ｇ、酵母エキス５ｇ、寒天  １５ｇ、微量元素溶液  １ｍｌを含む寒天固体培地（ｐＨ  ７．０，  １２０℃で１５分殺菌）を用いた（尚、微量元素溶液は蒸留水１Ｌ中に、Ｈ３ＢＯ４  ２．８５ｇ，  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２０  １．８ｇ，  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０  １．３６ｇ，  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２０  ２６．９  ｍｇ，  ＺｎＣｌ２  ２０．８  ｍｇ，  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２０  ４０．４  ｍｇ，  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２０  ２５．２  ｍｇ，  ｓｏｄｉｕｍ  ｔａｒｔａｒａｔｅ  １．７７  ｇを含む）。この培地にて２５℃、４８時間、シード培養した  Ｐｅｒｓｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ  ＮＢＲＣ  １５９４０  の菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養した。
【００７５】
Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ  ｐｉｎｅｎｓｉｓ  ＮＢＲＣ  １５９６８  の培養には、蒸留水  １Ｌ中に、バクトカジトン  ３ｇ、酵母エキス  １ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２０    １．３６ｇ、寒天  １５ｇを含む寒天固体培地（ｐＨ  ７．０，  １２０℃で１５分殺菌）を用いた。この培地にて２５℃、４８時間、シード培養したＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ  ｐｉｎｅｎｓｉｓ  ＮＢＲＣ  １５９６８の菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養した。
【００７６】
Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ  ＡＴＣＣ  ２５２０５  の培養には、ダイゴ人工海水ＳＰ  １Ｌ中に、ペプトン  ５ｇ、酵母エキス  １ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０    ０．２ｇ、寒天  １５ｇを含む寒天固体培地（ｐＨ  ７．０，  １２０℃で１５分殺菌）を用いた。この培地にて２５℃、４８時間、シード培養したＣｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ  ＡＴＣＣ  ２５２０５の菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養した。
【００７７】
Ｒｕｎｅｌｌａ  ｓｌｉｔｈｙｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９５３０  の培養には、蒸留水１Ｌ中に、ペプトン  １ｇ、酵母エキス  １ｇ、グルコース  １ｇ、寒天  １５ｇを含む寒天固体培地（ｐＨ  ７．０，  １２０℃で１５分殺菌）を用いた。この培地にて２５℃、４８時間、シード培養したＲｕｎｅｌｌａ  ｓｌｉｔｈｙｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９５３０  の菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養した。
【００７８】
Ｔｈｅｒｍｏｎｅｍａ  ｌａｐｓｕｍ  ＡＴＣＣ  ４３５４２  の培養には、蒸留水  １Ｌ中に、Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ０．２ｇ、０．０３％    ＦｅＣｌ３溶液  ２ｍｌ、ＣａＳＯ４・２Ｈ２０    ０．１２ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０  ０．２ｇ、ＮａＣｌ  ０．０１６ｇ、ＫＮＯ３  ０．２１ｇ、ＮａＮＯ３  １．４ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４  ０．２２ｇ、微量元素溶液  ２ｍｌ、寒天  １５ｇを含む寒天固体培地（ｐＨ  ８．２，  １２０℃で１５分殺菌）を用いた（尚、微量元素溶液は蒸留水１Ｌ中に、Ｈ２ＳＯ４  ０．５ｍｌ，  ＭｎＳＯ４・２．２ｇ，  ＺｎＳＯ４  ０．５ｇ，  Ｈ３ＢＯ３  ０．５ｇ，  ＣｕＳＯ４  ０．０１６ｇ，  Ｎａ２ＭｏＯ４  ０．０２５ｇ，  ＣｏＣｌ２  ０．０４６ｇを含む）。この培地にて６０℃、４８時間、シード培養した  Ｔｈｅｒｍｏｎｅｍａ  ｌａｐｓｕｍ  ＡＴＣＣ  ４３５４２  の菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養した。
【００７９】
Ｇｅｌｉｄｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ７００３６４  あるいは  Ｌｅｗｉｎｅｌｌａ  ｃｏｈａｅｒｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２３１２３  あるいは  Ｐｓｙｃｈｒｏｓｅｒｐｅｎｓ  ｂｕｒｔｏｎｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ  ７００３５９  あるいは  Ｓａｌｅｇｅｎｔｉｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｅｇｅｎｓ  ＤＳＭＺ  ５４２４  の培養には、Ｍａｒｉｎｅ  Ａｇａｒ  ２２１６（Ｄｉｆｃｏ製）を用いた。この培地にて、Ｇｅｌｉｄｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ７００３６４  あるいはＰｓｙｃｈｒｏｓｅｒｐｅｎｓ  ｂｕｒｔｏｎｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ  ７００３５９  の場合には１０℃、７２時間、シード培養した菌体を同培地に塗布し、１０℃、７２時間、メイン培養培養した。Ｌｅｗｉｎｅｌｌａ  ｃｏｈａｅｒｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２３１２３  の場合には、３０℃、４８時間、シード培養した菌体を同培地に塗布し、３０℃、４８時間、メイン培養培養した。Ｓａｌｅｇｅｎｔｉｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｅｇｅｎｓ  ＤＳＭＺ  ５４２４  の場合には、２５℃、４８時間、シード培養した菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養培養した。
【００８０】
Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＡＴＣＣ  ７００８２７  の培養には、蒸留水  １Ｌ中に、ＮＨ４Ｃｌ  ０．８ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．２５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．４ｇ、ＫＮＯ３  ０．５０５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２０    １５ｍｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２０  ２０ｍｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０  ７ｍｇ、Ｎａ２ＳＯ４  ５ｍｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２０  ５ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  ０．５ｍｇ、ＺｎＣｌ２  ０．５ｍｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２０  ０．５ｍｇ、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２０  ０．５ｍｇ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２０  ０．３ｍｇ、 Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２０  １０ｍｇ、酵母エキス  ０．５ｇ、ペプトン  ０．５ｇ、カザミノ酸  ０．５ｇ、デキストロース  ０．５ｇ、可溶性デンプン  ０．５ｇ、ピルビン酸ナトリウム  ０．５ｇ、寒天  １５ｇを含む寒天固体培地（ｐＨ  ７．０，  １２０℃で１５分殺菌）を用いたこの培地にて２５℃、４８時間、シード培養した  Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＡＴＣＣ  ７００８２７  の菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養した。
【００８１】
Ｆｌａｍｍｅｏｖｉｒｇａ  ａｐｒｉｃａ  ＮＢＲＣ  １５９４１の培養には、ダイゴ人工海水ＳＰ  １Ｌ中に、トリプトン  ２ｇ、牛肉エキス  ０．５ｇ、酵母エキス  ０．５ｇ、酢酸ナトリウム  ０．２ｇ、寒天  １５ｇを含む寒天固体培地（ｐＨ  ７．２，  １２０℃で１５分殺菌）を用いた。この培地にて２５℃、４８時間、シード培養したＦｌａｍｍｅｏｖｉｒｇａ  ａｐｒｉｃａ  ＮＢＲＣ  １５９４１の菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養した。
【００８２】
Ｓｐｉｒｏｓｏｍａ  ｌｉｎｇｕａｌｅ  ＤＳＭＺ  ７４  あるいは  Ｆｌｅｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｊｏｒ  ＤＳＭＺ  １０３の培養には、蒸留水１Ｌ中に、グルコース  １ｇ、ペプトン  １ｇ、酵母エキス  １ｇ、寒天  １５ｇを含む寒天固体培地（ｐＨ  ７．０，  １２０℃で１５分殺菌）を用いた。この培地にて２５℃、４８時間、シード培養したＳｐｉｒｏｓｏｍａ  ｌｉｎｇｕａｌｅ  ＤＳＭＺ  ７４  あるいは  Ｆｌｅｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｊｏｒ  ＤＳＭＺ  １０３の菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養した。
【００８３】
Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ  ｍａｒｉｔｉｍｕｍ  ＡＴＣＣ４３３９８  の培養には、蒸留水３００ｍｌ、ダイゴ人工海水ＳＰ７００ｍｌ中に、トリプトン  ０．５ｇ、酵母エキス  ０．５ｇ、牛肉エキス  ０．２ｇ、酢酸ナトリウム  ０．２ｇ、寒天  １５ｇを含む寒天固体培地（ｐＨ  ７．０，  １２０℃で１５分殺菌）を用いた。この培地にて２５℃、４８時間、シード培養したＴｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ  ｍａｒｉｔｉｍｕｍ  ＡＴＣＣ４３３９８  の菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養した。
【００８４】
Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＤＳＭＺ  ４２５２  の培養には、  １Ｌ中に、酵母エキス  ２．５ｇ、トリプトン２．５ｇ、Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  １００ｍｇ、ＣａＳＯ４・２Ｈ２０  ４０ｍｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２０  ２００ｍｇ、０．０１Ｍ  Ｆｅ  ｃｉｔｒａｔｅ  ０．５ｍｌ、微量元素溶液  ０．５ｍｌ、リン酸バッファー  １００ｍｌ、蒸留水９００ｍｌ、寒天  ２８ｇを含む寒天固体培地（ｐＨ  ７．２，  １２０℃で１５分殺菌）を用いた（尚、微量元素溶液は蒸留水１Ｌ中に、Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  １２．８  ｇ，  ＦｅＣｌ２・４Ｈ２０  １ｇ，  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２０  ０．５ｇ，  ＣｏＣｌ２・４Ｈ２０  ０．３ｇ，  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２０  ５０ｍｇ，  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２０  ５０ｍｇ，  Ｈ３ＢＯ３  ２０ｍｇ，  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２０  ２０ｍｇを含む。リン酸バッファーは蒸留水１Ｌ中にＫＨ２ＰＯ４    ５．４４ｇ，  Ｋ２ＨＰＯ４    ４３ｇを含む）。この培地にて６０℃、４８時間、シード培養した  Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＤＳＭＺ  ４２５２  の菌体を同培地に塗布し、６０℃、４８時間、メイン培養した。
【００８５】
Ｚｏｂｅｌｌｉａ  ｇａｌａｃｔａｎｉｖｏｒａｎｓＤＳＭＺ  １２８０２  の培養には、  ＢＡＣＴＯ  ＭＡＲＩＮＥ  ＢＲＯＴＨ  （  ＤＩＦＣＯ  ２２１６）を含む寒天固体培地（寒天  １．５％、ｐＨ  ７．６，  １２０℃で１５分殺菌）を用いた。この培地にて３０℃、４８時間、シード培養した  Ｚｏｂｅｌｌｉａ  ｇａｌａｃｔａｎｉｖｏｒａｎｓＤＳＭＺ  １２８０２  の菌体を同培地に塗布し、３０℃、４８時間、メイン培養した。
【００８６】
Ｍｕｒｉｃａｕｄａ  ｒｕｅｓｔｒｉｎｇｅｎｓｉｓ  ＤＳＭＺ  １３２５８  の培養には、蒸留水  １Ｌ中に、酵母エキス  １．５ｇ、ペプトン  ２．５ｇ、ヘキサデカン  ２ｇ、ＮａＣｌ  １７．７ｇ、ＫＣｌ  ０．４８ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２０  ３．４ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０  ４．４６ｇ、ＣａＣｌ２  ０．９８ｇ、寒天  １５ｇを含む寒天固体培地（ｐＨ  ７．２，  １２０℃で１５分殺菌）を用いたこの培地にて３０℃、４８時間、シード培養した  Ｍｕｒｉｃａｕｄａ  ｒｕｅｓｔｒｉｎｇｅｎｓｉｓ  ＤＳＭＺ  １３２５８  の菌体を同培地に塗布し、３０℃、４８時間、メイン培養した。
【００８７】
Ｔａｘｅｏｂａｃｔｅｒ  ｇｅｌｕｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ    ＤＳＭＺ  １１１１６  の培養には、蒸留水  １Ｌ中に、カジトン  ３ｇ、酵母エキス  １ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２０  １．３６ｇ、寒天  １５ｇを含む寒天固体培地（ｐＨ  ７．２，  １２０℃で１５分殺菌）を用いたこの培地にて３０℃、４８時間、シード培養した  Ｔａｘｅｏｂａｃｔｅｒ  ｇｅｌｕｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ    ＤＳＭＺ  １１１１６  の菌体を同培地に塗布し、３０℃、４８時間、メイン培養した。
【００８８】
Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎｉｉ  ＮＢＲＣ  １５０５１  の培養には、蒸留水  １Ｌ中に、カジトン  ３ｇ、酵母エキス  １ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２０  １．３６ｇ、セロビオース  ５ｇ、寒天  １５ｇを含む寒天固体培地（ｐＨ  ７．２，  １２０℃で１５分殺菌）を用いたこの培地にて３０℃、４８時間、シード培養した  Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎｉｉ  ＮＢＲＣ  １５０５１  の菌体を同培地に塗布し、３０℃、４８時間、メイン培養した。
【００８９】
Ｍａｒｉｎｉｌａｂｉｌｉａ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ  ＮＢＲＣ  １５９４８  の培養には、蒸留水  ２５０ｍｌ、ダイゴ人工海水ＳＰ  ７５０ｍｌ中に、ペプトン  １０ｇ、酵母エキス  ２ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０  ０．５ｇ、寒天  １５ｇを含む寒天固体培地（ｐＨ  ７．２，  １２０℃で１５分殺菌）を用いたこの培地にて３０℃、４８時間、シード培養した  Ｍａｒｉｎｉｌａｂｉｌｉａ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ  ＮＢＲＣ  １５９４８  の菌体を同培地に塗布し、３０℃、４８時間、メイン培養した。
【００９０】
Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａ  ｇｒａｎｄｉｓ  ＡＴＣＣ  ２３１１９  の培養には、ダイゴ人工海水ＳＰ  １Ｌ中に、ＫＮＯ３  ０．５ｇ、グリセロリン酸ナトリウム  ０．１ｇ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン  １ｇ、トリプトン  ２ｇ、酵母エキス  ２ｇ、寒天  １５ｇ、微量元素溶液  １ｍｌを含む寒天固体培地（ｐＨ  ７．０，  １２０℃で１５分殺菌）を用いた（尚、微量元素溶液は蒸留水１Ｌ中に、Ｈ３ＢＯ４  ２．８５ｇ，  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２０  １．８ｇ，  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０  １．３６ｇ，  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２０  ２６．９  ｍｇ，  ＺｎＣｌ２  ２０．８  ｍｇ，  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２０  ４０．４  ｍｇ，  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２０  ２５．２  ｍｇ，  ｓｏｄｉｕｍ  ｔａｒｔｒａｔｅ  １．７７  ｇを含む）。この培地にて３０℃、４８時間、シード培養した  Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａ  ｇｒａｎｄｉｓ  ＡＴＣＣ  ２３１１９  の菌体を同培地に塗布し、３０℃、４８時間、メイン培養した。
【００９１】
Ｈａｌｉｓｃｏｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｓｓｉｓ  ＡＴＣＣ  ２７７７５  の培養には、蒸留水１Ｌ中に、ＫＨ２ＰＯ４  ２７ｍｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ４０ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２０  ４０ｍｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２０  ５０ｍｇ、  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０  ７５ｍｇ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２０  ５ｍｇ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２０  ３ｍｇ、グルタミン酸  １．３１ｇ、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ２．５ｍｇ、チアミン  ０．４ｍｇ、ビタミンＢ１２  ０．０１ｍｇ、グルコース  ２ｇ、微量元素溶液  １ｍｌを含む寒天固体培地（ｐＨ  ７．５，  １２０℃で１５分殺菌）を用いた（尚、微量元素溶液は蒸留水１Ｌ中に、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０  ０．１ｇ，  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２０  ０．０３ｇ，  Ｈ３ＢＯ３  ０．３ｇ，  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２０  ０．２ｇ，  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２０  ０．０１ｇ，  ＮｉＣｌ２  ・６Ｈ２０  ０．０２ｇ，  Ｎａ２ＭｏＯ４・Ｈ２０  ０．０３ｇを含む）。この培地にて２５℃、４８時間、シード培養した  Ｈａｌｉｓｃｏｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｓｓｉｓ  ＡＴＣＣ  ２７７７５  の菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養した。
【００９２】
このようにして得られたそれぞれの菌体を寒天培地より集菌し、湿菌体として１００ｇ／Ｌになるように１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁した。これらの微生物の菌体懸濁液０．１ｍＬに、ＥＤＴＡ１０ｍＭ、Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩２００ｍＭ、及びＬ−グルタミン４００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．１ｍＬをそれぞれ添加し、全量を０．２ｍＬとした後、２０℃にて、表１に示した反応時間で反応をおこなった。このときのＬ―アラニル−Ｌ−グルタミン（Ａｌａ−Ｇｌｎ）の生成量（ｍＭ）を表１に示す。
【００９３】
【表１】
2005040037.tif 000002
【００９４】
（実施例２）  種々のＬ−アラニルエステルを基質に用いた場合のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生産
実施例１と同様に同様に培養した  Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ  ｈｅｐａｒｉｎｕｓ  ＮＢＲＣ  １２０１７  の菌体を寒天培地より集菌し、湿菌体として１００ｇ／Ｌになるように１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁した。これらの微生物の菌体懸濁液０．１ｍＬに、ＥＤＴＡ１０ｍＭ、Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩２００ｍＭ、表２に示すアラニンエステル塩酸塩２００ｍＭ、及びＬ−グルタミン４００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．１ｍＬをそれぞれ添加し、全量を０．２ｍＬとした後、２０℃にて、１時間、反応をおこなった。このときのＬ―アラニル−Ｌ−グルタミン（Ａｌａ−Ｇｌｎ）の生成量（ｍＭ）を表２に示す。
【００９５】
【表２】
2005040037.tif 000003
【００９６】
【発明の効果】
本発明のジペプチドの製造方法により、複雑な合成方法を経ることなく、安価に入手可能なアミノ酸エステルとアミノ酸を用いてジペプチドを製造することができ、医薬品素材、機能性食品等として有用なジペプチドの製造コストダウンが可能となる。また、本発明のジペプチドの製造方法によれば、様々な種類のアミノ酸エステルおよびアミノ酸を原料として、種々のタイプのジペプチドを生成することができる。