(57)【要約】【課題】  単独で各種ＰＶＡ誘導体に対しても優れた分解・資化能を有するＰＶＡ分解菌及び当該菌を用いたＰＶＡの分解・資化方法を提供すること、及びゼラチン、デンプンなどの微生物により資化容易な栄養源共存環境においても、当該菌を含む微生物群が高いＰＶＡ分解活性を示すＰＶＡの分解・資化方法を提供すること。【解決手段】  スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）種に属する菌株、上記菌株を含む微生物群、又は上記菌株の菌体成分を、ポリビニルアルコール又はポリビニルアルコール誘導体に接触させることを含む、ポリビニルアルコール又はポリビニルアルコール誘導体の分解方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）種に属する菌株、上記菌株を含む微生物群、又は上記菌株の菌体成分を、ポリビニルアルコール又はポリビニルアルコール誘導体に接触させることを含む、ポリビニルアルコール又はポリビニルアルコール誘導体の分解方法。
【請求項２】
スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）種に属する菌株が、スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans ）ＵＦ−７（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８７）である、請求項１に記載のポリビニルアルコール又はポリビニルアルコール誘導体の分解方法。
【請求項３】
スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）種に属する菌株、上記菌株を含む微生物群、又は上記菌株の菌体成分を、ポリビニルアルコールあるいはポリビニルアルコール誘導体を含有する排水、排液又は土壌に接触させることを含む、排水、排液又は土壌の浄化処理方法。
【請求項４】
スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）種に属する菌株が、スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans ）ＵＦ−７（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８７）である、請求項３に記載の排水、排液又は土壌の浄化処理方法。
【請求項５】
スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans ）ＵＦ−７（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８７）として寄託されたポリビニルアルコール分解菌。
【請求項６】
スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）UF-7（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８７）を含む微生物群を担体に固定化し、ポリビニルアルコールあるいはポリビニルアルコール誘導体に接触させることを含む、ポリビニルアルコールあるいはポリビニルアルコール誘導体の分解方法。
【請求項７】
スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）UF-7（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８７）を含む微生物群を担体に固定化し、ポリビニルアルコールあるいはポリビニルアルコール誘導体を含有する排水、排液又は土壌に接触させることを含む、排水、排液又は土壌の浄化処理方法。
【請求項８】
固定化担体が活性炭又は架橋高分子である、請求項６又は７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリビニルアルコール（以下、「ＰＶＡ」）の分解・資化に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＶＡは水溶性の合成高分子として工業的に広く用いられており、合成繊維あるいはフイルムの原料、繊維加工剤、紙加工剤、接着剤、無機物のバインダー、塩化ビニル樹脂の重合安定剤など広く利用されている。
【０００３】
近年、地球規模での環境問題に対する関心が高まり、自然環境中で微生物や酵素により分解される生分解性高分子の研究が盛んに行われている。また各種化合物を環境に放出される前に分解処理し、環境への負荷を低減する技術が注目されている。ＰＶＡ廃液は従来から排水中のＣＯＤ上昇の一因として考えられており、活性汚泥などによる微生物処理の検討がなされ、分解菌の探索も進められている。ＰＶＡに対して分解能を有する微生物としては、シュードモナス属細菌、エンテロバクター属細菌、アシネトバクター属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロードコッカス属細菌、カセオバクター属細菌、スフィンゴモナス属細菌等が知られているが（特許文献１〜６等）、これまでに報告されている微生物は、単独でＰＶＡ分解能を有する菌、共生菌を必要とする菌である。
【０００４】
【特許文献１】特公昭５５−１７９１号公報
【特許文献２】特公昭５７−２７７１３号公報
【特許文献３】特公昭５７−２７７１４号公報
【特許文献４】特開平８−１４０６６７号公報
【特許文献５】特開平７−１０８２９７号公報
【特許文献６】特開２００３−２５０５２７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、単独で各種ＰＶＡ誘導体に対しても優れた分解・資化能を有するＰＶＡ分解菌及び当該菌を用いたＰＶＡの分解・資化方法を提供すること、及びゼラチン、デンプンなどの微生物により資化容易な栄養源共存環境においても、当該菌を含む微生物群が高いＰＶＡ分解活性を示すＰＶＡの分解・資化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、河川、土壌等の自然界及び活性汚泥等から広く微生物を探索したところ、富士写真フイルム株式会社  富士宮工場活性汚泥より分離したスフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）及び当該細菌を含む微生物群がＰＶＡ及びその誘導体に対して優れた分解・資化能を有し、これを用いることにより、多種類のＰＶＡを含んだ排液等を良好に浄化処理できることを見出した。また、排液中にゼラチン、デンプンなどの微生物により資化容易な栄養源が存在しても、PVAの分解が遅滞することなく良好に浄化処理できることを見出した。
【０００７】
即ち、本発明によれば、スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）種に属する菌株、上記菌株を含む微生物群、又は上記菌株の菌体成分を、ポリビニルアルコール又はポリビニルアルコール誘導体に接触させることを含む、ポリビニルアルコール又はポリビニルアルコール誘導体の分解方法が提供される。
【０００８】
本発明の別の側面によれば、スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）種に属する菌株、上記菌株を含む微生物群、又は上記菌株の菌体成分を、ポリビニルアルコールあるいはポリビニルアルコール誘導体を含有する排水、排液又は土壌に接触させることを含む、排水、排液又は土壌の浄化処理方法が提供される。
好ましくは、スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）種に属する菌株は、スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans ）ＵＦ−７（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８７）である。
【０００９】
本発明の別の側面によれば、スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans ）ＵＦ−７（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８７）として寄託されたポリビニルアルコール分解菌が提供される。
【００１０】
本発明のさらに別の側面によれば、スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）UF-7（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８７）を含む微生物群を担体に固定化し、ポリビニルアルコールあるいはポリビニルアルコール誘導体に接触させることを含む、ポリビニルアルコールあるいはポリビニルアルコール誘導体の分解方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）UF-7（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８７）を含む微生物群を担体に固定化し、ポリビニルアルコールあるいはポリビニルアルコール誘導体を含有する排水、排液又は土壌に接触させることを含む、排水、排液又は土壌の浄化処理方法が提供される。
好ましくは、固定化担体は活性炭又は架橋高分子である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＰＶＡ分解方法は、各種排水、排液、土壌等の浄化処理、コンポスト処理におけるＰＶＡの分解・資化に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明におけるＰＶＡとしては、ポリ酢酸ビニルを鹸化することにより得られるＰＶＡの他に、機能性を賦与したＰＶＡ誘導体、例えばアニオン性、カチオン性、シラン反応性、末端疎水性ＰＶＡ等が挙げられる。本発明の細菌を用いることにより、ＰＶＡの重合度や完全鹸化、部分鹸化を問わず、これを分解・資化することができるが、分解性に優れるＰＶＡとしては、重合度３００〜３５００で、鹸化度８６〜９９％のものが挙げられ、またＰＶＡ誘導体としては、アニオン性あるいは末端疎水性ＰＶＡ等が挙げられる。
【００１３】
本発明のポリビニルアルコール分解・資化能を有する細菌は、スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）種に属する菌株である。
【００１４】
このポリビニルアルコール分解・資化能を有するスフィンゴモナス・アロマティシボランス種は、広く自然界より検索したものである。例えば以下の様にして分離することができる。
【００１５】
本発明のポリビニルアルコール分解・資化能を有するスフィンゴモナス・アロマティシボランス種は、例えば以下の様にして分離される。すなわち、河川、活性汚泥、土壌、海水、湖水等の試料を、メンブランフィルター（孔径０．１〜０．５μｍ）で濾過し、メンブランフィルターをＰＶＡ液体培地中に浸して振とう培養してＰＶＡ分解菌の有無を判断する。その後、その培養液を適当な培地に撒き、コロニーを形成させる。得られたコロニーをＰＶＡを含む低栄養培地に接種し、ＰＶＡ分解能を有する菌を選別分離すればよい。
【００１６】
本発明によるＰＶＡ及びその誘導体に対して分解・資化能を有する細菌の一例としては、スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans） UF-7株が挙げられる。このSphingomonas aromaticivorans UF-7株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１  中央第６）に、２００４年２月４日付で受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９６６４として寄託され、２００４年１２月２１日付けでブタペスト条約の下での国際寄託に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８７として移管されている。スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans） UF-7株の菌学的性質及び遺伝学的解析結果を以下に記載する。
【００１７】
（菌学的性質）
培地的性質：LB寒天培地（Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY.）で、黄色、低凸状、円形コロニーを形成する。
【００１８】
（遺伝学的解析）
16SrDNAの解析
UF-7株をLB寒天培地に植菌し、30℃での培養物からDNAを抽出し、PCRによる増幅、PCR産物の精製を行った後、BigDyeTM Terminator v.3.1（Appried Biosystem社）を用いてサイクルシークエンス反応を行って16SrDNAの塩基配列を決定し、WEB上のDNA Data Bank of Japan（http://www.ddbj.nig.ac.jp/）のFASTAプログラムを用いてして16SrDNA解析を行った。その結果、本発明のUF-7株の16SrDNAは、スフィンゴモナス・アロマティシボランスSphingomonas aromaticivorans（M. Sakamoto et al., DDBJ/EMBL/GenBank databases direct submittion. Accession No. AB025012）のそれと98.2%の相同性を有していた。
【００１９】
上記細菌の培養は、原則的に、例えばスフィンゴモナス属に属する微生物の培養に準じるものであり、通常液体培養による振盪培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行なわれるのが好適である。
【００２０】
培養に用いられる培地としては、好気性細菌用の各種の合成培地、半合成培地、天然培地等をいずれも用いることができる。例えば、肉エキス、ペプトン等でよい。また、上記細菌はメチオニンを必須栄養素とする。
【００２１】
培地のｐＨは、６〜８とするのが好ましい。培養温度は、スフィンゴモナス・アロマティシボランスが良好に生育する温度、通常約１５〜４２℃、特に好ましくは約２５〜３８℃付近に保つのがよい。培養時間は、液体振盪培養及び通気攪拌培養のいずれの場合も、一般に２日〜１週間程度好気的に行うことができる。なお、上記の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件等に応じて適宜変更することができる。
【００２２】
本発明の細菌は、後記実施例に示すようにＰＶＡ及びＰＶＡ誘導体を良好に分解・資化できる。従って、スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）種に属する菌株、上記菌株を含む微生物群、又は上記菌株の菌体成分を、例えば家庭排水、工場排水、排液等の産業排棄物、土壌等のＰＶＡ含有物に接触させることにより、これを浄化処理することができる。ここで、菌体成分としては、スフィンゴモナス属に属する菌の培養菌体、固定化した菌体、菌体抽出物、固定化した菌体抽出物、菌体抽出液、培養液、培養瀘液等が含まれる。菌の固定に用いることができる担体としては、活性炭又は架橋高分子などが挙げられる。
【００２３】
本発明の微生物を用いたＰＶＡの分解方法としては、例えば排水浄化の場合には個別発生源に本発明細菌スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）又は当該菌を含む微生物群を固定化した処理装置を取り付ける手段、排水処理場において本発明細菌又は当該菌を含む微生物群を曝気槽等に添加する手段、土壌浄化の場合には土壌に本発明細菌又は当該菌を含む微生物群を施用する手段等が挙げられる。また、環境浄化の場合には、自然環境の河川や湖沼に本発明細菌又は当該菌を含む微生物群を施用する手段を採用することができる。尚、斯かるＰＶＡ分解処理は、ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ５〜８、処理温度５〜４０℃、好ましくは１５〜３５℃で、通常０．５時間〜１４日、好ましくは１時間〜７日行うのがよい。
以下の実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
実施例１：スフィンゴモナス・アロマティシボランスUF-7株の単離
PVA培地（表1）を100ml調製し、原料PVAに含まれる酢酸塩等の不純物を除去するために、PVA分解能を持たない大腸菌野生株MG1655を接種し、30℃で一晩振とう培養した。培養液をメンブレンフィルター（孔径0.2μm）で濾過滅菌し、濾過培養液にPVA廃液処理汚泥懸濁液50μlを濾過処理PVA培地に接種し、30℃で10日間振とう培養した。培養液の一部をLB寒天培地に塗布し、30℃にて一週間培養した後、生育が認められたプレートから単一コロニーを選択し、PVA分解能の確認および同定試験を行い、スフィンゴモナス・アロマティシボランスUF-7株を得た。
【００２５】
【表１】
2005278639.tif 000002
【００２６】
実施例２：スフィンゴモナス・アロマティシボランスUF-7株を用いたPVAの分解・資化
前培養としてLB寒天培地に生育したUF-7株をLB液体培地４mlに白金耳にて接種し、30℃で4日程度振とう培養を行った。培養液から菌体を分離し、改変PVA培地（表２）で数回洗浄を行い、新しい改変PVA培地に接種し、30℃にて振とう培養を行った。経時的に培養液の一部を抜き取り、濁度（OD600）およびPVA濃度の測定（Kim, B. C., C. K. Sohn, S. K. Lim, J. W. Lee, and W. park. (2003) Degradation of polyvinyl alcohol by Sphingomonas sp. SA3 and its symbiote. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 30, 70-74）を行った。結果を図１に示す。図１の結果から分かるように、UF-7株は、PQQの添加を必要とせず、単独でPVAを効率的に分解することが示された。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
実施例３：スフィンゴモナス・アロマティシボランスUF-7株を含む微生物群を用いたPVAの分解・資化
活性汚泥より集積したスフィンゴモナス・アロマティシボランスUF-7株を含む微生物群培養液1mlを各種PVAを含む培地（表３）20mlに添加し、28℃、140rpmで振とう培養し実施例２と同様に経時的に培養液の一部を抜き取り、PVA濃度の測定を行った。結果を図２に示す。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
図２の結果から分かるように、本微生物群はPVA種に依存せず高いPVA分解活性を示した。資化容易なゼラチンが共存してもPVA分解に遅滞は認められなかった。
【００３１】
実施例４：スフィンゴモナス・アロマティシボランスUF-7株を含む微生物群を固定化した担体を用いたPVAの分解・資化
活性汚泥より集積したスフィンゴモナス・アロマティシボランスUF-7株を含む微生物群培養液をクラレ製担体（クラゲール）35gに固定化した後、表４に示す培地100mlを添加し28℃、140rpmで振とう培養した。実施例２と同様に経時的に培養液の一部を抜き取り、PVA濃度の測定を行った。結果を図３に示す。図３の結果から分かるように、短時間でPVAを処理できることが確認された。
【００３２】
【表４】
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【００３３】
実施例５：活性炭担体に固定化した集積汚泥によるPVA分解処理
スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）  UF-7株を含む微生物群を、水処理用活性炭系担体BCP(デンカエンジニアリング)と共に2週間程度PVA含有培地で培養し菌体を固定化した。この担体を用い下記の実験を行った。
微生物固定化BCP 6ml にPVA0.5％、酵母エキス0.1％含有培地20mlを添加して、28℃、140pm、振とう培養した。培養液をサンプリング、遠心分離した上清中のPVA濃度をFinley法（KI/I2-H3BO3,690nm）で定量した。結果を以下の図４に示す。PVA濃度は3日で1/10以下まで低下し、担体固定化による菌体の高密度化の効果が現れている。
【００３４】
実施例６：アミノ酸要求性検討
改変PVA培地に標準アミノ酸２０種（各アミノ酸０．１％、計０．２０％）を加え、UF-7株を単独培養したところ、菌体の増殖が見られ、約０．１２％のPVAが５日間でほぼ完全に分解されることが確認された（図５）。そのため、UF-7株が必要とする成分は標準アミノ酸２０種中に存在することが明らかになった。
【００３５】
更に、標準アミノ酸の役割を調べた。乾燥酵母エキスを含まないグルコース培地を２つ用意し、一方に標準アミノ酸２０種を適量添加した。それら２種類の培地でUF-7株を１週間単独培養し、菌の増殖を観察した。その結果、アミノ酸を添加した培地には菌の増殖が確認されたが、アミノ酸を添加しなかった培地では増殖が見られなかった。この結果から、標準アミノ酸２０種はPVA分解に限らず、UF-7株が増殖するために栄養素として必要であると考えられる。
【００３６】
次に、標準アミノ酸２０種の中からUF-7株の必須アミノ酸を検討した。まず改変PVA培地を２つ用意し、１０種類ずつ２つのグループに分けた各アミノ酸混合物を、それぞれ培地に適量添加してUF-7株を１週間培養し、菌体量及びPVA濃度変化量を測定した。菌体増殖及びPVA分解活性を示したアミノ酸群の中から、同様の操作を行って必須アミノ酸を絞込み、特定した。その結果、メチオニンのみを添加しただけで、菌が増殖し、PVAが分解されることが確認された（図６）。以上の結果から、UF-7株に必須な栄養素はメチオニンであることが明らかになった。
【００３７】
改変ＰＶＡ培地                                
ＰＶＡ                              １．０ｇ
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ  （下記）      ５０ｍｌ
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩ  （下記）    ５０ｍｌ
Ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ  （下記）    ２ｍｌ    
Ｈ2Ｏで１．０Ｌに調製
【００３８】
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ                        
（ＮＨ4）2ＳＯ4          ２０ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ4              １９．６ｇ／ｌ
ＮａＣｌ                ２．０ｇ／ｌ        
【００３９】
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩ                      
ＫＨ2ＰＯ4            ８．０  ｇ／ｌ
Ｋ2ＨＰＯ4            ６４  ｇ／ｌ          
【００４０】
Trace metal                                   
ＣａＣｌ2                ２５０  μＭ
（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24      １．５  μＭ
Ｈ3ＢＯ3                  ２００  μＭ
ＣｏＣｌ2                  １５  μＭ
ＣｕＳＯ4                    ５  μＭ
ＭｎＣｌ2                  ４０  μＭ
ＺｎＳＯ4                    ５  μＭ
ＦｅＳＯ4                    ５  ｍＭ        
【００４１】
【表５】
2005278639.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、スフィンゴモナス・アロマティシボランスUF-7株を用いたPVAの分解・資化を測定した結果を示す。
【図２】図２は、スフィンゴモナス・アロマティシボランスUF-7株を含む微生物群を用いたPVAの分解・資化を測定した結果を示す。
【図３】図３は、スフィンゴモナス・アロマティシボランスUF-7株を含む微生物群を固定化した担体を用いたPVAの分解・資化を測定した結果を示す。
【図４】図４は、活性炭担体に固定化した集積汚泥によるPVA分解を測定した結果を示す。
【図５】図５は、アミノ酸添加ＰＶＡ培地におけるUF-7株の増殖とＰＶＡ分解能を示す。
【図６】図６は、アミノ酸およびメチオニン添加ＰＶＡ培地でのUF-7株のＰＶＡ分解能を示す。
【図１】
2005278639.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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