(57)【要約】【課題】  ウエストナイルウイルスを特異的、高感度かつ迅速に検出する方法を提供すること。【解決手段】  ウエストナイルウイルスのエンベロープ蛋白遺伝子塩基配列から設計された任意の塩基配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、核酸増幅の検出によるウエストナイルウイル検出方法、並びにウエストナイルウイルス検出用キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるウエストナイルウイルスのエンベロープ蛋白遺伝子塩基配列の、１０２８番〜１２２８番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２】
ウエストナイルウイルスのエンベロープ蛋白遺伝子塩基配列から選ばれた配列番号２〜１０で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含む請求項１記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３】
ウエストナイルウイルスの標的核酸上の３'末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５'末端側からＲ３、Ｒ２、Ｒ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＲ３ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた少なくとも1種の塩基配列からなることを特徴とする請求項１〜２記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３'末端側に有し、５'末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＲ２領域を３'末端側に有し、５'末端側に標的核酸のＲ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＲ３領域を有する塩基配列。
【請求項４】
ウエストナイルウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、５'末端から３'末端に向かい以下の（ｅ）および／または（ｆ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項１〜３記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ｅ）５'−（配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３の塩基配列）−３'
（ｆ）５'−（配列番号５の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号６の塩基配列に相補的な塩基配列）−３'
【請求項５】
請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ウエストナイルウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするウエストナイルウイルスの検出方法。
【請求項６】
ウエストナイルウイルスの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする請求項５記載のウエストナイルウイルスの検出方法。
【請求項７】
請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてウエストナイルウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、ウエストナイルウイルスの存在の有無を検出することを特徴とするウエストナイルウイルス検出方法。
【請求項８】
ウエストナイルウイルス検出方法において、請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウエストナイルウイルスの検出方法に関し、さらに詳しくは遺伝子の、高感度な検出法を利用したウエストナイルウイルス感染症の診断方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ウエストナイルウイルスはウエストナイル脳炎あるいはウエストナイル熱などのウエストナイルウイルス感染症の原因ウイルスで、フラビウイルス科に属する１本鎖ＲＮＡウイルスである。（例えば、非特許文献１。）。フラビウイルス属内でも特に日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルス、Kunjin ウイルスと相同性が高く、抗原的に交叉反応を示す日本脳炎血清型群（Japanese encephalitis serocomplex ）に分類される。
ウエストナイルウイルスは、鳥と蚊の間で感染環が維持され、主に蚊を介してヒトや馬に感染する。従来、アフリカ、中近東、地中海、西アジアが流行の中心であったが、近年北米でも流行し、日本にも伝播する可能性がある。そこで本ウイルスの同定、鑑別は、臨床医学上のみならず防疫や獣医学のためにも重要性を増している。
【０００３】
ヒトにおけるウエストナイルウイルス感染症の主な臨床症状は発熱、頭痛、背部痛、筋肉痛、筋力低下、食欲不振、皮膚発疹、リンパ節の腫脹で、一部の患者では脳脊髄炎を発症する。しかしこれらの症状は、他のウイルス疾患、例えば日本脳炎ウイルス感染などの症状とほとんど同じで、症状のみから他の疾患と鑑別する事は難しい。
【０００４】
検査法としては、培養細胞を用いたウイルスの分離が行われているが、十分な設備が必要で、時間もかかる。比較的簡便な方法として免疫学的方法が知られている。これは血液、血清、あるいは髄液などの検体に含まれる、ウイルスの抗原に対する抗体の存在を調べるもので、ウエストナイルウイルスでは酵素免疫測定法 (ELISA) が知られている（例えば、非特許文献２。）。しかし日本脳炎ウイルスとは近縁のため、免疫学的な交差反応があることが知られ、完全な鑑別ができない。
【０００５】
この他に、ウイルスの遺伝子をＲＴ−ＰＣＲ法あるいはＮＡＳＢＡ法で増幅する事で検出する方法も知られている。（例えば、非特許文献３、４。）しかしこれら方法は、検出に１時間以上必要であり、さらに検出感度が低いという問題が示唆されていた。そこで、迅速かつ高感度にウエストナイルウイルスを検出できる検査法が望まれていた。
【０００６】
本発明者らは、現在知られている方法、免疫学的測定法やＰＣＲ法より高感度で特異的かつ所要時間が短い検出方法、すなわちＬＡＭＰ法を用いることで、本発明の目的を達成できた。
【０００７】
【非特許文献１】森田公一、ウエストナイルウイルス脳炎、日本脳炎、「臨床と微生物」、３９巻４号、３５１ページ（２００３年）
【非特許文献２】Lanciotti,R.S.et.al,"Science" 286 (5448), 2333-2337 (1999)
【非特許文献３】Lanciotti, R. S., et.al. "J. Clin. Microbiol. "38: 4066-4071.(2000)
【非特許文献４】Lanciotti, R. S. and A. J. Kerst. , "J. Clin. Microbiol." 39: 4506-4513.(2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ヒトや馬などの哺乳類、あるいは鳥類などのウエストナイルウイルス感染症の診断のために、その病原ウイルスであるウエストナイルウイルスを高感度に検出させることを目的とする。また媒介動物となりうる蚊などの昆虫のウエストナイルウイルスの保有を検査することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ウエストナイルウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ＬＡＭＰ法によりウエストナイルウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、ウエストナイルウイルスを高感度に検出できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）配列番号１で示されるウエストナイルウイルスのエンベロープ蛋白遺伝子の塩基配列の、１０２８番〜１２２８番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（２）ウエストナイルウイルスのＲＮＡポリメラーゼ塩基配列から選ばれた配列番号２〜１０で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含む（１）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（３）ウエストナイルウイルスの標的核酸上の３'末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５'末端側からＲ３、Ｒ２、Ｒ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＲ３ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた少なくとも１種の塩基配列からなることを特徴とする（１）〜（２）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３'末端側に有し、５'末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＲ２領域を３'末端側に有し、５'末端側に標的核酸のＲ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＲ３領域を有する塩基配列。
（４）ウエストナイルウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、５'末端から３'末端に向かい以下の（ｅ）〜（ｈ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１）〜（３）記載のオリゴヌクレオチプライマー。
（ｅ）５'−（配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３の塩基配列）−３'
（ｆ）５'−（配列番号５の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号６の塩基配列に相補的な塩基配列）−３'
（５）（１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ウエストナイルウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするウエストナイルウイルスの検出方法。
（６）ウエストナイルウイルスの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする（５）記載のウエストナイルウイルスの検出方法。
（７）（１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてウエストナイルウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、ウエストナイルウイルス感染の有無を診断することを特徴とするウエストナイルウイルス感染症の診断方法。
（８）ウエストナイルウイルス感染症の診断方法において、（１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、特異的、高感度かつ迅速にウエストナイルウイルスを検出できる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において使用される試料としては、ヒト、馬あるいは鳥などの動物由来の検体、例えば血液、血清、髄液、尿、組織抽出液、あるいは蚊などの昆虫の虫体抽出液などが挙げられる。
【００１３】
このような生体由来の核酸を増幅するためには、近年、納富らが開発した、ＰＣＲ法で不可欠とされる温度制御が不要な新しい核酸増幅法：ＬＡＭＰ（ Loop-mediated Isothermal Amplification）法と呼ばれるループ媒介等温増幅法（特許公報国際公開第00/28082号パンフレット）で達成させられる。この方法は、鋳型となるヌクレオチドに自身の３'末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。また、ＬＡＭＰ法では、プライマーの３'末端が常に試料に由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能するため、その結果として、高感度にかつ特異性の高い核酸増幅反応を可能としている。
【００１４】
ＬＡＭＰ反応で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の計６領域、すなわち３'末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという領域と、５'末端側からＲ３、Ｒ２、Ｒ１という領域の塩基配列を認識する少なくとも４種類のプライマーであって、各々インナープライマーＦ及びＲ、アウタープライマーＦ及びＲと呼ぶ。また、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃの相補配列をそれぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３、またＲ１、Ｒ２、Ｒ３の相補鎖をＲ１ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ３ｃと呼ぶ。インナープライマーとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を３'末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５'末端に有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ２より選ばれた塩基配列」及び「Ｆ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーＦ（以下ＩＰＦ）、そして「Ｒ２より選ばれた塩基配列」と「Ｒ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーＲ（以下ＩＰＲ）と呼ぶ。インナープライマーは、「Ｆ２より選ばれた塩基配列」と「Ｆ１ｃより選ばれた塩基配列」の間、あるいは「Ｒ２より選ばれた塩基配列」と「Ｒ１ｃより選ばれた塩基配列」の間に、塩基数０〜５０の任意の塩基配列を持っても良い。一方、アウタープライマーとは、標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」の３'末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーＦ（以下ＯＰＦ）、「Ｒ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーＲ（以下ＯＰＲ）と呼ぶ。ここで、各プライマーにおけるＦとは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示であり、一方Ｒとは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示である。ここで、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは、１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上で、化学合成あるいは天然のどちらでも良く、各プライマーは単一のオリゴヌクレオチドであってもよく、複数のオリゴヌクレオチドの混合物であってもよい。
【００１５】
ＬＡＭＰ法においては、インナープライマーとアウタープライマーに加え、さらにこれとは別のプライマー、すなわちループプライマーを用いる事ができる。ループプライマー(Loop Primer)は、ダンベル構造の5'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーである。このプライマーを用いると、核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる（特許文献国際公開第02/24902号パンフレット）。ループプライマーの塩基配列は上述のダンベル構造の5'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、標的遺伝子の塩基配列あるいはその相補鎖から選ばれても良く、他の塩基配列でも良い。また、ループプライマーは１種類でも２種類でも良い。
【００１６】
ウエストナイルウイルスはＲＮＡウイルスである。ＬＡＭＰ法は鋳型がＲＮＡの場合には、鋳型がＤＮＡの場合の反応液に逆転写酵素を添加する事で、同様に核酸増幅反応を進めることができる（ＲＴ−ＬＡＭＰ法）。
【００１７】
本発明者らは、ウエストナイルウイルスのエンベロープ蛋白遺伝子の塩基配列より、配列番号１で示される塩基配列から、ウエストナイルウイルスの特異的な塩基配列を迅速に増幅できるＬＡＭＰ法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、下記のプライマーセットを選定した。
ＩＰＦ：5'-TTGGCCGCCTCCATATTCATCATTTTCAGCTGCGTGACTATCATGT-3'    （配列番号８）
ＯＰＦ：5'-TGGATTTGGTTCTCGAAGG-3'                            （配列番号４）
ＩＰＲ：5'-TGCTATTTGGCTACCGTCAGCGTTTTTGAGCTTCTCCCATGGTCG-3'   （配列番号９）
ＯＰＲ：5'-GGTCAGCACGTTTGTCATT-3'                            （配列番号１０）
ＬＰＦ：5'-CATCGATGGTAGGCTTGTC-3'        （配列番号１１）
ＬＰＲ：5'-TCTCCACCAAAGCTGCGT-3'      （配列番号１２）
【００１８】
核酸合成で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、Bst ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント)、Bca(exo-)ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡ ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられ、好ましくはBst ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント)が挙げられる。
【００１９】
ＲＴ-ＬＡＭＰ法に用いる逆転写酵素としては、AMVやMMLVの逆転写酵素、SuperscriptII、ReverTraAce、Thermoscript等が挙げられ、好ましくは、AMV 逆転写酵素が挙げられる。またBca ＤＮＡポリメラーゼのように、逆転写酵素活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の両活性を有する酵素があり、このような酵素を用いると、ＲＴ-ＬＡＭＰ反応を１つの酵素で行う事ができる。
【００２０】
ＬＡＭＰ反応による核酸増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。例えば、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドや蛍光性インターカレーター法（特許文献特開2001-242169号公報）を用いたり、あるいは反応終了後の反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にかけても容易に検出できる。アガロースゲル電気泳動では、ＬＡＭＰ増幅産物は、塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状に検出される。また、ＬＡＭＰ法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸が、共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、反応液が肉眼でも確認できる程に白濁する。したがって、この白濁を、反応終了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例えば400nmの吸光度変化を通常の分光光度計を用いて確認することも可能である（特許文献国際公開第01/83817号パンフレット）。
【００２１】
本発明のプライマーを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキット化する事ができる。具体的には、本発明のプライマーあるいはループプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰ、核酸合成を行うＤＮＡポリメラーゼ、逆転写活性を持つ酵素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして提供される。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２２】
実施例１．検出感度の確認
ＬＡＭＰ法と、ＰＣＲ法の特異性と検出感度の比較を行った。
１．試料及び試薬の調製
１）ウイルス株と定量
検討にはウエストナイルウイルス(WNV)のNY99株とEg 101株、デングウイルス(DEN)のDEN-2株、日本脳炎ウイルス(JEV)のJaOArS982、セントルイス脳炎ウイルス(SLE)のParton株を用いた。
各ウイルス株はヒトスジシマカC6/36細胞で増殖させ、Vero細胞を使ったプラークアッセイで定量した。
ＲＮＡ抽出はQIAanpウイルスRNAミニキット（キアゲン社製）を用い、添付の説明書の方法で行った。これを蒸留水で希釈し、各濃度の試料溶液を調製した。
【００２３】
２）ＰＣＲ法に用いるプライマーと方法
ＰＣＲ法のためのｃＤＮＡ合成は、ＬＡＭＰ法のＯＰＲ（配列番号１０）を用いた。またＰＣＲ法で使用するプライマーとして、ＬＡＭＰ法のＯＰＦ（配列番号４）とＯＰＲ（配列番号１０）を用いた。
３）ＬＡＭＰ法に用いるプライマー
ＬＡＭＰ法はＲＴ−ＬＡＭＰ法で行った。プライマーとしてＩＰＦ（配列番号８）、ＯＰＦ（配列番号４）、ＩＰＲ（配列番号９）、ＯＰＲ（配列番号１０）、ＬＰＦ（配列番号１１）、ＬＰＲ（配列番号１２）を用いた。
【００２４】
２．核酸増幅法による反応
１）ＰＣＲ法による反応
cDNA合成反応は、各ウイルスの試料溶液5mLをcDNA合成反応溶液15mLに加え、最終反応溶液20mＬ中の各試薬濃度が下記になるよう調製し、42℃30分その後85℃5分で行った。
反応溶液組成
・10mM Tris-HCl pH8.3
・15mM KCl
・0.6mM MgSO4
・2 mM DTT
・0.5mM dNTPs
・24U PrimeRNase inhibitor(Eppendorf)
・100U RiverTraAce(Toyobo)
・50 pM ＯＰＲ
ＰＣＲ反応は、 タカラ Taq ＰＣＲキット（タカラバイオ社製）を用い、添付の説明書の方法で行った。反応溶液に、ｃＤＮＡ合成した溶液5μLを加え、最終反応溶液 50μLとし、94℃2分静置後、熱変性94℃30秒、アニーリング55℃1分、ポリメラーゼ伸長反応72℃1分を1サイクルとして計30サイクル行った。所要時間は約1時間20分だった。反応終了後の反応溶液 10μLを 3%アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色した。
【００２５】
２）ＬＡＭＰ法による反応
ＬＡＭＰ法による増幅のため、最終反応溶液 25μＬ中の各試薬濃度が下記になるよう調製した。
反応溶液組成
・40mM Tris-HCl pH8.8
・20mM KCl
・8mM MgSO4
・1.4mM dNTPs
・20mM (NH4)2SO4
・0.6M Betaine（Sigma）
・0.1% Triton X-100 (new England Biolabs)
・50 pM ＩＰＦ及びＩＰＲ
・5 pM ＯＰＦ及びＯＰＲ
・25 pM ＬＰＦ及びＬＰＲ
・0.125 U AMV Reverse Transcriptase（Invitrogen）
・8 U Bst DNA polymerase（New England Biolabs）
【００２６】
ＬＡＭＰ反応は上記試薬24μＬに、試料溶液 1μLを加え、最終反応溶液 25μLとし、0.2mLの専用チューブ内で、63℃で60分ＬＡＭＰ反応を行った。反応終了後の反応溶液10μL を3%アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色した。
３．電気泳動法による各増幅反応の検出感度の比較結果
ＲＴ−ＬＡＭＰ法の電気泳動の結果を図１Ａに、ＲＴ−ＰＣＲ法の電気泳動の結果を図１Ｂに示す。その結果、WNVのNY99株ではＰＣＲ法ＬＡＭＰ法とも増幅産物の確認ができた。ＰＣＲ法では、10PFUまでは明瞭に、1PFUでは薄くは201bpの特異的バンドが認められた。これに対しＬＡＭＰ法では、0.1PFUまで特異的増幅のラダー状のバンドを確認することができた。WNVのEg 101株と他のウイルスでも同様に実験を行った（図示せず）。また、増幅反応に要した時間は、ＬＡＭＰ法が1時間なのに対し、ＰＣＲ法はｃＤＮＡの合成に35分、増幅反応に約1時間20分だった。
【００２７】
実施例２．ＬＡＭＰ法のリアルタイム濁度測定法による検出時間の検討
実施例１のＬＡＭＰ法の反応溶液にウエストナイルウイルスのNY99株の試料溶液 1μLを添加し、増幅反応をリアルタイム濁度計LA-200（テラメックス社製) を用い、65℃で60分間400nmの吸光度で濁度を測定した。
図２にその結果を示す。ＲＴ−ＬＡＭＰ法のリアルタイム濁度法によるウエストナイルウイルスN99株の検出感度は0.1PFUだった。
またWNVのEg 101株と他のウイルスでも同様に測定を行った（図示せず）。
実施例１と実施例２の結果をまとめて表１に示す。
【表１】
2005080507.tif 000002
ＲＴ−ＰＣＲ法とＲＴ−ＬＡＭＰ法の電気泳動法では、バンドが認められたものを＋、認められなかったものを−とした。またＲＴ−ＬＡＭＰ法のリアルタイム濁度法では、60分以内に400nmの吸光度の増加が確認できたものは分で示し、認められなかったものを−とした。
この結果、ＰＣＲ法とＬＡＭＰ法どちらの方法でも、ウエストナイルウイルスのN99株とEg101株の両者とも検出でき、さらに日本脳炎ウイルス、デングウイルス、セントルイス脳炎ウイルスは検出されなかった。これらのことより、ウエストナイルウイルスを特異的に検出できることが確認された。またウエストナイルウイルスのNY99株の検出感度はＬＡＭＰ法では0.1PFUだったのに対し、ＰＣＲ法では1PFUで、ＬＡＭＰ法の方が高感度だった。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明によれば、ウエストナイルウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ＬＡＭＰ法によりウエストナイルウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、ウエストナイルウイルスを特異的、高感度かつ迅速に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】電気泳動法によるＲＴ−ＬＡＭＰ法（Ａ）とＲＴ−ＰＣＲ法（Ｂ）の検出感度を示す。
【図２】リアルタイム濁度法によるＲＴ−ＬＡＭＰ法の検出感度を示す。横軸は時間（分）、縦軸は400nmでの吸光度（濁度）である。
【符号の説明】
【００３０】
レーンＭ：マーカー
レーン１：10,000 PFU
レーン２：1,000 PFU
レーン３：100 PFU
レーン４：10 PFU
レーン５：1 PFU
レーン６：0.1 PFU
レーン７：0.01 PFU
レーン８：0.001 PFU
レーン９：0.0001 PFU
レーン１０：0.00001 PFU
【図１】
2005080507.tif 000003
【図２】
2005080507.tif 000004
【配列表】
2005080507000001.app