(57)【要約】【課題】  毛髪疾患の診断、脱毛症の予知、毛周期の診断等のために有用な育毛剤評価方法および育毛剤評価キットの提供。【解決手段】  例えば、塩基配列5'-CCAAAACTGA AGCCGAGAAG-3'（配列番号：１）を有するオリゴヌクレオチドおよび塩基配列5'-ATCGATGCGG GTACAATGTG A-3'（配列番号：２）を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてインスリン様増殖因子−１受容体mRNAからDNAを増幅し、増幅生成物を測定してインスリン様増殖因子−１受容体遺伝子の発現を調べる事により、育毛効果を知る。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養毛包上皮系細胞または単離毛包のインスリン様増殖因子−１型受容体（IGF-1R）のmRNA量を測定することを特徴とする育毛剤評価方法。
【請求項２】
毛包上皮系細胞上皮系細胞中のIGF-1R蛋白質をコードするmRNAを含むRNA画分を得る工程、IGF-1R蛋白質をコードするmRNAを鋳型にしたcDNAを作成する工程、そのcDNAを、IGF-1R蛋白質をコードするmRNAの一部と同一なまたはそれに対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて増幅する工程、および増幅産物の量を測定する工程を含むことを特徴とする、育毛剤評価方法。
【請求項３】
IGF-1R蛋白質をコードするmRNAの一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、(a)塩基配列5'-CCAAAACTGA AGCCGAGAAG-3'（配列番号：１）またはこの配列に対して４個以下の塩基が、除去、付加及び／または置換期より修飾されている塩基配列、あるいは(b)塩基配列5'-ATCGATGCGG GTACAATGTG A-3'（配列番号：２）またはこの配列に対して４個以下の塩基が、除去、付加及び／または置換期より修飾されている塩基配列、を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
IGF-1R蛋白質をコードするmRNAの一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、(a')塩基配列5'-CCAAAACTGA AGCCGAGAAG-3'（配列番号：１）、あるいは(b')塩基配列5'-ATCGATGCGG GTACAATGTG A-3'（配列番号：２）を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３または４に記載の、塩基配列(a)または(a')を有するオリゴヌクレオチドと、塩基配列(b)または(b')を有するオリゴヌクレオチドとを一対として含むPCR増幅用プライマー。
【請求項６】
IGF-1R蛋白質をコードするmRNAの一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、(c)塩基配列5'-CGGAGAGATG TCATGCAAGT G-3'（配列番号：３）またはこの配列に対して４個以下の塩基が、除去、付加及び／または置換期より修飾されている塩基配列、あるいは(d)塩基配列5'-AACACCACCA TGTCCAGCCG A-3'（配列番号：４）またはこの配列に対して４個以下の塩基が、除去、付加及び／または置換より修飾されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含んで成るプローブ。
【請求項７】
IGF-1R蛋白質をコードするmRNAの一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、(c')塩基配列5'-CGGAGAGATG TCATGCAAGT G-3'（配列番号：３）、あるいは(d')塩基配列5'-AACACCACCA TGTCCAGCCG A-3'（配列番号：４）を有するオリゴヌクレオチドを含んで成るプローブ。
【請求項８】
標識されている請求項６または７に記載のプローブ。
【請求項９】
請求項５に記載のオリゴヌクレオチドプライマー、および請求項６〜８のいずれか１項に記載のプローブを含んで成る育毛剤評価キット。
【請求項１０】
更に、逆転写酵素、若しくはDNAポリメラーゼ、またはその両者を含む、請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、育毛剤の評価法に関する技術分野に属する。より詳細には、本発明は、インスリン様作用により毛根の毛母細胞等の活動を活性化させて育毛効果を生じさせる育毛剤の評価法に関する。本発明は更に、薬剤の作用を感度良く、正確に、再現性良く測定することによる育毛剤の評価に有用な育毛剤評価方法、およびそのための育毛剤評価キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
毛髪の成育には、成長期、退行期、休止期の周期があることが知られている。育毛剤評価においては毛周期の診断が重要な項目の一つであり、そのマーカーとしてオルニチンデカルボキシラーゼ(J. Invest. Dermatol. Vol.70, p.307-313 (1978))、γ−グルタミルトランスフェラーゼ(J. Invest. Dermatol. Vol.103, p.122-126 (1994))、スキンスルフヒドリルオキシダーゼ(Biochim. Biophys. Acta. Vol.615, p.309-323 (1980))、アルカリホスファターゼ(Br. J. Dermatol. Vol.131, p.303-310 (1994))、チロシナーゼ、ドーパクロムトートメラーゼ(J. Invest. Dermatol. Vol.102, p.862-869 (1994))などが提案されている。
【０００３】
しかし、上述の酵素は毛髪の他、皮膚にも存在するため毛髪の特異的マーカーとしては必ずしも適当なものではなく、また、蛋白質は毛髪中に残存する傾向があるので成長期から退行期、休止期への移行を素早く知る必要のある育毛剤評価には適していない。
【０００４】
この育毛作用に関して、最近、画期的な事実が明らかになった。
すなわち、血中のインスリン様成長因子−Ｉ(IGF-1)が上昇している者に、多毛症になる者が認められるという報告がなされ、このIGF-1が、育毛に何らかの作用を及ぼしていることが示唆された(Verhandlungen der deutshen gesellschaft fur innere medizin Vol.9, p.266-274 (1987))。
【０００５】
さらに、このIGF-Iの育毛作用については、ヒト器官培養系で、IGF-1のほかに、インスリンにおいても認められること(The journal of investigative dermatology Vol.102, p.857-862 (1994年)、ヒトヒゲ毛包由来毛乳頭、外毛根鞘細胞培養での男性ホルモン依存性外毛根鞘細胞の生育を、IGF-I抗体が阻害すること(British journal of dermatology Vol.132, p.527-532 (1995年)、ラット毛周期における退行期においては、IGF-1のmRNAレベルが低下すること(The journal of investigative dermatology Vol.103, p.715-720 (1994)などが報告されている。すなわち、IGF-1ないしインスリンが、毛乳頭等からなる毛根の働きを活発化することで、育毛作用が認められることが明らかになり、現に、IGF-1を有効成分とする育毛剤が既に知られている（特公平4-60567号公報等）。
【０００６】
一方、IGF-I受容体（以下IGF-1R）が、細胞分裂の盛んな毛母細胞において特異的に発現していること(J. Invest. Dermatol. Vol.106, p.564-570 (1996))が明らかになっている。すなわち、IGF-1の育毛作用は、IGF-1Rとの相互作用により細胞内へシグナル伝達され、成長期おける毛成長を促進するものと考えられた。
【０００７】
【特許文献１】特公平4-60567号公報
【０００８】
【非特許文献１】J. Invest. Dermatol. Vol.70, p.307-313 (1978)
【非特許文献２】J. Invest. Dermatol. Vol.103, p.122-126 (1994)
【非特許文献３】Biochim. Biophys. Acta. Vol.615, p.309-323 (1980)
【非特許文献４】Br. J. Dermatol. Vol.131, p.303-310 (1994)
【非特許文献５】J. Invest. Dermatol. Vol.102, p.862-869 (1994)
【非特許文献６】Verhandlungen der deutshen gesellschaft fur innere medizin Vol.9, p.266-274 (1987)
【非特許文献７】The journal of investigative dermatology Vol.102, p.857-862 (1994年)
【非特許文献８】British journal of dermatology Vol.132, p.527-532 (1995年)
【非特許文献９】The journal of investigative dermatology Vol.103, p.715-720 (1994)
【非特許文献１０】J. Invest. Dermatol. Vol.106, p.564-570 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者等はかかる事情に鑑み鋭意検討した結果、IGF-1R蛋白質が毛包上皮系細胞に成長期特異的に発現していることより、IGF-1R蛋白質をコードするmRNAの量を、当該mRNAの全部または一部にに対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドとのハイブリッドの量により測定する、またはIGF-1R蛋白質をコードするmRNAを鋳型にしたcDNAを増幅してその量を測定する成長期延長育毛剤評価方法を完成するに至ったものであって、その目的とするところは、育毛剤の成長期延長効果を感度良く、正確に、再現良く測定することにより、薬剤の選定に有用な育毛剤評価法および育毛剤評価キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、毛包上皮系細胞中のIGF-1R蛋白質をコードするmRNA量を測定することを特徴とする成長期延長育毛剤評価方法に関するものであり、毛包上皮系細胞中のIGF-1R蛋白質をコードするmRNAを含むRNA画分を得る工程、IGF-1R蛋白質をコードするmRNAを鋳型にしたcDNAを作成する工程、そのcDNAを、IGF-1R蛋白質をコードするmRNAの一部と同一または相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて増幅する工程、および増幅されたcDNAの量を測定する工程からなることを特徴とする育毛剤評価方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、IGF-1R蛋白質をコードするmRNAの一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、(a)塩基配列5'-CCAAAACTGA AGCCGAGAAG-3'（配列番号：１）またはこの配列に対して４個以下の塩基が、除去、付加及び／または置換期より修飾されている塩基配列、あるいは(b)塩基配列5'-ATCGATGCGG GTACAATGTG A-3'（配列番号：２）またはこの配列に対して４個以下の塩基が、除去、付加及び／または置換期より修飾されている塩基配列、を有するオリゴヌクレオチドを提供する。好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは、(a')塩基配列5'-CCAAAACTGA AGCCGAGAAG-3'（配列番号：１）、あるいは(b')塩基配列5'-ATCGATGCGG GTACAATGTG A-3'（配列番号：２）を有する。
【００１２】
本発明はまた、前記の塩基配列(a)または(a')を有するオリゴヌクレオチドと、塩基配列(b)または(b')を有するオリゴヌクレオチドとを一対として含むPCR増幅用プライマーを提供する。
【００１３】
本発明は更に、IGF-1R蛋白質をコードするmRNAの一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、(c)塩基配列5'-CGGAGAGATG TCATGCAAGT G-3'（配列番号：３）またはこの配列に対して４個以下の塩基が、除去、付加及び／または置換期より修飾されている塩基配列、あるいは(d)塩基配列5'-AACACCACCA TGTCCAGCCG A-3'（配列番号：４）またはこの配列に対して４個以下の塩基が、除去、付加及び／または置換より修飾されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含んで成るプローブを提供する。上記のプローブは、好ましくは、(c')塩基配列5'-CGGAGAGATG TCATGCAAGT G-3'（配列番号：３）、あるいは(d')塩基配列5'-AACACCACCA TGTCCAGCCG A-3'（配列番号：４）を有する。好ましくは、前記プローブは標識されている。
【００１４】
本発明は更に、前記のオリゴヌクレオチドプライマー、および前記のプローブを含んで成る育毛剤評価キットを提供する。このキットは、好ましくは更に、逆転写酵素、若しくはDNAポリメラーゼ、またはその両者を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の構成について詳説する。本発明で記載するところの毛包上皮系細胞とは、毛髪を生じる表皮組織が陥没してできた組織を形成する細胞を指し、毛母細胞、毛根鞘細胞等が挙げられる。本発明で用いられる毛包上皮系細胞を含む生体試料としては、毛髪の生えた皮膚などが挙げられ、また抜去した毛髪なども挙げられる。
【００１６】
本発明において用いられるRNAは、毛包上皮系細胞を含む生体試料より調製して得られる。本発明に用いられるRNAの調製方法としては、フェノール法やチオシアン酸グアニジン法など、通常RNAの調製に用いられている方法が挙げられる。RNA中のIGF-1R-mRNAの検出法としては、逆転写酵素によってcDNA断片を合成し、IGF-1R蛋白質をコードするmRNAの一部と同一のまたはそれに対して相補的な配列を含む２種のオリゴヌクレオチドをプライマーとし用いるポリメラーゼ連鎖反応（以下PCR）により目的のcDNA断片を増幅してその産物量を定量する方法が挙げられる。
【００１７】
本発明に用いられるIGF-1R蛋白質をコードするmRNAを含む画分を調製する方法としては、毛包上皮系細胞をヒトまたは哺乳動物の毛包から収集するか、毛包上皮系細胞を含む皮膚を一部採取するかして得た試料を、グアニジンイソシアネート溶液で抽出後、クロロホルム／フェノールで粗RNA画分を抽出し、必要に応じて担体などを用いてさらにmRNAに精製する方法が挙げられる。
【００１８】
本発明に用いられるcDNAの合成方法としては、ヒトまたは哺乳類動物から毛包上皮系細胞を単離培養し、これより抽出して得たRNAを鋳型にして逆転写酵素を用いてcDNAを合成する方法が挙げられる。逆転写酵素とはRNA依存のDNA合成を触媒する酵素をいい、例えばRNA腫瘍ウイルス由来の逆転写酵素の遺伝子組換え体が挙げられる。プライマーとしては、市販のランダムヘキサマー、オリゴdTプライマーの他、増幅しようとする配列の3′末端のcDNA配列と相補的な20塩基程度の下流アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成する方法が挙げられる。
【００１９】
本発明に用いられるIGF-1R-cDNAフラグメントのPCRによる増幅の方法としては、IGF-1R蛋白質の塩基配列を基に合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして、DNAポリメラーゼを用いて行うことができる。プライマーとして例えば、上流プライマーとして増幅しようとする配列の５′末端のおよそ10〜40塩基、好ましくは約15〜30塩基、更に好ましくはおよそ20塩基程度のセンスプライマー、下流プライマーとして増幅しようとする配列の３′末端の前記の塩基数のアンチセンスプライマーを用いればよい。
【００２０】
IGF-1R蛋白質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、GENBANKアクセッション番号NM-000875；及び、Ullrich, A.et al., EMBO J.5(10), 2503-2512 (1986)に記載されており、それらの配列を配列番号：５に示す。IGF-1R蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列中の増幅すべき領域の位置は特に限定されないが、例えば、N-末端側コード領域、C-末端側コード領域、中間コード領域が好ましい。配列番号５の３〜４kbのインシュリンレセプターなどの類縁物質の塩基配列と相同性が高い領域以外が好ましい。
【００２１】
増幅される領域の長さは特に限定されないが、例えば150〜1000塩基程度、好ましくは200〜300塩基程度、である。
プライマーの塩基配列は、IGF-1R蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列中の対応する領域の塩基配列に対して完全に相補的語的であることが望ましいが、必ずしもその必要はなく、例えばプライマーの塩基数20個当り４個以下、例えば３個以下、好ましくは２個以下、例えば２個又は１個の塩基が、除去、付加、若しくは他の塩基による置換により修飾されていてもよい。例えば、配列番号：１および配列番号：２に記載の塩基配列を有する塩基数20又は21のプライマーにおいて、４個以下、例えば４個、３個、２個又は１個の塩基が、付加、除去または他の塩基による置換によって修飾されていてもよい。
【００２２】
PCR反応の具体例としては、２本鎖DNAの１本鎖DNAへの熱変性、増幅を目的とする部位の両端の配列に相当する２種類のオリゴヌクレオチドと前記熱変性DNAとのアニーリング、前記オリゴヌクレオチドをプライマーとしたDNAポリメラーゼ反応、からなる増幅サイクルを繰り返すことにより、IGF-1R-cDNAフラグメントを指数関数的に増幅する方法が挙げられる。本発明に用いられるDNAポリメラーゼとしては熱安定性の高いDNAポリメラーゼが望ましく、例えば、Thermus aquaticus由来の耐熱性DNAポリメラーゼの遺伝子組換え体が挙げられる。
【００２３】
また、本発明における毛包上皮系細胞中のIGF-1Rの発現量の定量方法としては、上述のPCR法によって迅速に測定することができる。すなわちRNAを鋳型として逆転写酵素を用いてcDNAを合成し、引き続きDNAポリメラーゼを用いたPCR反応を行って増幅産物を定量する方法が挙げられる。PCR法などの配列増幅法により、最初に存在したDNAまたはRNAの量を定量する方法は、当業界でよく知られている（Ferre F., PCR Method Appl.1992, p1〜9; Gause WC.et al, PCR Method Appl.1994, S123-35; Umlauf SW et al, Mol.Cell.Biol.1995, p3197〜205）。
【００２４】
増幅されたDNAを検出または定量するためいは、その増幅されたDNAと特異的にハイブリダイズするハブリダイゼーションプローブを用いるのが便利である。ハイブリダイゼーションプローブの長さは、およそ10〜40塩基、好ましくは約15〜30塩基、更に好ましくはおよそ20塩基程度である。プローブの塩基配列は、上記のようにして、例えばPCR増幅されたDNAの塩基配列に対して特異的にハイブイダイズするものであればよい。
【００２５】
プローブの塩基配列は、増幅されたDNAの塩基配列に対して完全に相補的語的であることが望ましいが、必ずしもその必要はなく、例えばプライマーの塩基数20個当り４個以下、例えば３個以下、好ましくは２個以下、例えば２個又は１個の塩基が、除去、付加、若しくは他の塩基による置換により修飾されていてもよい。例えば、配列番号：３および配列番号：４に記載の塩基配列を有する塩基数20又は21のプローブにおいて、４個以下、例えば４個、３個、２個又は１個の塩基が、付加、除去または他の塩基による置換によって修飾されていてもよい。
【００２６】
プローブは、その検出のために、検出可能な標識により標識されているのが好ましい。この標識としては、例えば蛍光標識、放射性同位原素、酵素などを使用することが出来る。蛍光標識が好ましい。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、この実施例等により本発明の技術的範囲が限定的に解釈されるべきものではない。
実施例１. 薬剤添加による、ヒト毛包上皮系細胞のIGF-1R蛋白質をコードするmRNAの定量
(1) ヒト毛包上皮系細胞の採取
外科手術の副産物として得られたヒト男性頭皮から毛周期における成長期の毛包を実体顕微鏡下で機械的に採取した。この成長期の毛包を1000U/ml dispase・0.2％コラゲナーゼを含むダルベッコの改変MEM(DMEM)で30分間、37℃で処理し、注射針の先を用いてdermal sheathやdermal papilla、毛球部上皮組織を除去して、0.05％トリプシン・0.02％EDTAを含むリン酸緩衝液〔PBS(-):(-)とはカルシウムイオンやマグネシウムイオンを含まない意味である〕で５分間、37℃で処理した。
【００２８】
次にコラーゲン（Type I）コーティングした培養皿に毛包を静置し、外殖片培養を行った。なおこの際の培地は、無血清培地〔Keratinocyte Growth Medium(KGM)〕を用いた（他にKeratinocyte Serum Free Mediumを用いることもできる）。
この培養の４〜５日後に、毛包の培養皿への接着及び細胞の増殖が確認できた時点で培地を交換し、これ以降２日おきに培地交換を行った。
このようにして増殖させた細胞を、0.05wt％トリプシン−0.02％EDTAで37℃で５分間処理した後、等量の0.1％トリプシンインヒビターで反応を停止させ、遠心処理（800×ｇ、５分間）を施して細胞を回収した。
【００２９】
次に、細胞を上記の無血清培地に浮遊させて、5000細胞／cm2 の密度でコラーゲンコーティング(TYPE I)した培養皿に播種し、細胞がサブコンフルエント（subconfluent）になるまで２日おきに培地交換を行い、再び0.05wt％トリプシン−0.02％EDTAにより37℃にて５分間処理した後、等量の0.1％トリプシンインヒビターで反応を停止させ、遠心処理（800×ｇ、５分間）を施して、これにより得られたヒト毛包上皮系細胞に細胞凍結液（セルバンカー：ダイヤトロン製）を添加し、1.0×106細胞／mlの濃度に調整して、各凍結チューブに1.0×106細胞ずつ入れ、これを凍結保存した。なお、これらの細胞数は、血球算定板で算出した。
【００３０】
(2) 対象物質の添加
上記方法により得た細胞を２万個／ウエルの割合で、24ウエルプレート（Ｉ型コラーゲンコーティングプレート：ファルコン社製）に播種し、無血清増殖培地Keratinocyte Growth Medium（クラボウ社製）またはKeratinocyte Serum Free Medium（GIBCO BRL社製）中で、37℃、５％ CO2で３日間培養を行った。その後、培地を対象物質を含む基礎培地Keratinocyte Basal Medium（クラボウ社製）に交換し、一定時間培養した。
ヒト毛包上皮系細胞RNAの抽出：ヒト毛包上皮系細胞RNAの抽出は、不死化ヒト毛包上皮系細胞約８万個をMagNA Pure LC（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて精製て約１μｇのmRNA画分を得た。
【００３１】
(3) プライマー、およびハイブリダイゼーションプローブ
IGF-1Rの逆転写反応には、オリゴｄＴプライマー（GIBCO BRL社製）、およびcDNAの増幅にIGF-1R上流プライマーとして5'-CCAAAACTGA AGCCGAGAAG-3'（配列番号：１）を、IGF-1R下流プライマーとして5'-ATCGATGCGG GTACAATGTG A-3'（配列番号：２）を合成して用いた。また、ハイブリダイゼーションプローブとして、3'末端をフルオレセイン標識したプローブ１：5'-CGGAGAGATG TCATGCAAGT G−フルオレセイン-3'（配列番号：３）、5'末端をLCレッドで標識し、3'末端をリン酸化したプローブ２：5'-LC レッド-AACACCACCA TGTCCAGCCG A-リン酸-3'（配列番号：４）を合成した。
【００３２】
(4) 逆転写酵素反応
(2)で得たRNA画分1μgに24μLの滅菌水を加え0.75μMのオリゴdTプライマーを加えた。10分間70℃に保ったのち速やかに４℃にした。そこに終濃度0.5mMのデオキシヌクレオチド３−リン酸混合液（dNTPs）、10mMのジチオスレイトール、更に100Uの逆転写酵素（Super Script II, GIBCO BRL製）、10μLの×５緩衝液（250mM トリス−塩酸、375mM塩化カリウム、15mM塩化マグネシウム、pH8.3）を加え反応液を20μLとし、42℃で１時間反応後70℃で10分保ち急冷して逆転写を終了した。
【００３３】
(4) PCR
（3)で得た転写物に最終濃度0.5μMの上流および下流プライマー、0.1μMのプローブ１、0.2μMのプローブ２、0.5mMのdNTPs、３mM塩化マグネシウム、2μLの×10 PCRバッファー、0.5UのDNAポリメラ-ゼ（ロシュダイアグノスティックス社製）を加え、ライトサイクラー（ロシュダイアグノスティックス社製）95℃で10分保った後、熱変性95℃で10秒、アニール60℃で10秒、伸長反応72℃で10秒、の温度サイクルを40回繰り返して増幅反応を行い、増幅産物は、特異的ハイブリダイゼーションプローブの蛍光強度より、下記計算式にしたがって算出した。
【００３４】
Ｒ＝２ΔN
Ｒ：遺伝子発現増加率、被験物質無添加時と比較した増加率
ΔＮ＝Ｎ1−Ｎ0
Ｎ1；対象物質添加時の立ち上がりサイクル数
Ｎ0；無添加時の立ち上がりサイクル数
ここに、立ち上がりサイクル数とは、ハイブリダイゼーションプローブの蛍光強度が指数関数的に増幅されている領域のサイクル数を指す。
その結果を表１に示す。無添加時の増幅産物量は２0 ＝１である。
【００３５】
【表１】
2005237273.tif 000002
以上の結果より、被験物質１、２および３に効果があり、被験物質４には効果がないと評価した。
【００３６】
実施例２. IGF-1R蛋白質をコードするmRNAの一部と同一または相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて抜去毛または毛包上皮系細胞中のIGF-1R蛋白質をコードするmRNAを鋳型にしたcDNAを増幅して測定する育毛剤評価キット
以下に記載した１０種の溶液よりなる育毛剤評価キットを作製した。
【００３７】
Ａ液：デオキシヌクレオチド３−リン酸混合液10 mM dATP、10 mM dCTP、10 mM dGTPおよび10 mM dTTPの水溶液
Ｂ液：100 mM ジチオスレイトール水溶液
Ｃ液：10 μM 合成オリゴｄＴプライマー水溶液
Ｄ液：５×逆転写緩衝液：250 mM トリス−塩酸、375 mM 塩化カリウム、15 mM 塩化マグネシウム（pH 8.3）
Ｅ液：逆転写酵素（Super Script II Rnase H-  Reverse Transcriptase,GIBCO BRL製）溶液（200U/μL）
【００３８】
Ｆ液：IGF-1Rプライマー混合溶液：10μM合成オリゴヌクレオチド5'-CCAAAACTGA AGCCGAGAAG-3'（配列番号：１）及び5'-ATCGATGCGG GTACAATGTG A-3'（配列番号：２）の混合水溶液
Ｇ液：25mM  塩化マグネシウム水溶液
Ｈ液：10×PCR緩衝液：500 mM 塩化カリウム、100 mM トリス−塩酸、pH 8.3
Ｉ液：DNAポリメラーゼ5U/μL AmpliTaq DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer社製）
Ｊ液：ハイブリダイゼーションプローブ溶液：10μMハイブリダイゼーションプローブ混合溶液
Ｋ液：0.2％ジエチルピロカルボネート水溶液
【００３９】
試験例２. 対象物質の成長期延長効果の評価
実施例１に記述した方法でRNAを抽出し1μgのRNAを得た。実施例２の育毛剤評価キットを用いてIGF-1R-mRNAをRT-PCR法で検出した。
すなわち、得られたRNA溶液（50ng/μL）に合成オリゴdTプライマー溶液（Ｃ液）2μL加え、10分間70℃に保ったのち速やかに４℃にした。そこに8μLのデオキシヌクレオチド３リン酸溶液（Ａ液）、4μLのジチオスレイトール（Ｂ液）、10μLのＸ５逆転写緩衝液（Ｄ液）、2μLの逆転写酵素溶液（Ｅ液）を加え反応液を20μLにする。42℃で１時間反応後、70℃で５分保ち急冷して逆転写を完成した。
【００４０】
PCR反応は、ライトサイクラー（ロシュダイアグノスティックス社製）を用いて行った。反応は上記の逆転写物に1μLのIGF-1R上流プライマー混合溶液（Ｆ液）、4μLの塩化マグネシウム溶液（Ｇ液）、8μLの10×PCR緩衝液（Ｈ液）、0.5μLのDNAポリメラーゼ（Ｉ液）、1μLハイブリダイゼーション混合溶液（Ｊ液）、およびジエチルピロカルボネート水（Ｋ液）を加え、液量を20μLに調整し、95℃で10分保った。そして熱変性95℃で10秒、アニール60℃で10秒、伸長反応72で℃10秒の温度サイクルを40回繰り返して増幅したDNAフラグメントをハイブリダイゼーションプローブの蛍光強度で評価し、実施例１に示した計算式により増加率Ｒを算出して表２に示した。
【００４１】
【表２】
2005237273.tif 000003
以上の結果より、被験物質５に効果があり、被験物質６には効果がないと評価した。
【００４２】
発明の効果
以上の結果から、本発明により毛髪または皮膚に特異的に発現するIGF-1R蛋白質をコードするmRNAを測定することにより毛髪の成育状態を感度良く、正確に、再現良く判定できる、毛髪疾患の診断、脱毛症の予知、毛周期の診断等に有用な育毛剤評価方法および育毛剤評価剤を提供できることは明らかである。
【配列表】
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