(57)【要約】【課題】入手が困難な実験小動物の胃癌株化細胞を提供する。【解決手段】胃腫瘍自然高発系統コトンラットに見いだされた病態末期個体の腹水由来細胞を同系動物に腹腔内移植継代することにより、より悪性度の高い腫瘍細胞を増殖・維持するとともに、これらの細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ系に導入培養し、クローン化した株化細胞を得た。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コトンラット胃癌由来株細胞
【請求項２】
請求項１記載の株細胞を用いて作製した担癌モデル動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明はコトンラットの胃癌由来株細胞に関するもので、癌研究用の材料として主に医学分野での利用が見込まれる他、コトンラットという特殊な実験動物及び消化管由来という特徴を生かした新しいバイオ素材としても有望と思われる。
【背景技術】
【０００２】癌研究の分野ではしばしばモデル実験としてマウスなどの小動物を用いることがあるが、胃癌を自然発生する実験小動物は稀である。したがって胃癌研究に利用が可能な、胃癌を自然発生する実験小動物あるいはそれに由来する材料は現状では極めて限られている。【０００３】そこで従来は、ヌードマウスやスキッドマウスといった免疫不全動物にヒト胃癌由来組織もしくは培養株化胃癌細胞を人為的に移植して担癌モデル動物を作製し、抗癌剤や治療法の検討などに利用してきた。しかし、このような免疫不全動物の低拒絶反応を利用した、移植による異種動物の組み合わせモデルは、通常同一個体内で発生し、増殖する癌の進行状況を正確に反映しているとは言い難い。【０００４】コトンラットは実験小動物のなかで、例外的に胃の腫瘍が自然発生的に観察される動物のひとつである。コトンラットに発生する胃腫瘍が、ヒトの胃癌と全く同一とはいえないのは当然としても、一方で癌の自然発生、増殖そして病態の進行に関する癌の基本的な性質を理解するために格好な動物モデルとしての有用性が見込まれる。（第５３回日本癌学会総会抄録集、６１、１９９４、およびＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４５（３），２４４−２４８，１９９５）。【０００５】ただし従来コトンラットで観察される自然発生胃腫瘍の悪性度はそれほど高くなく、これに由来する腫瘍細胞を株化することが困難であった。そのため従来はコトンラットに自然発生的に出現する腫瘍組織本体のみを利用の対象とせざるを得なかった
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】実験小動物として利用可能なコトンラットに由来する胃癌株化細胞を提供すること。【０００７】これにより利用可能な対象が、コトンラットに自然発生する腫瘍組織本体から、取り扱いの制御がより容易な細胞レベルとなる。これを健康な同種動物に移植することにより正常な免疫状態下における担癌動物を任意に作製することが可能となり、より自然に近い癌の進行を研究することができる。また株細胞としてｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養が可能となれば、よりシンプルな実験系を組むことができ、応用可能な分野が格段に拡がる。【０００８】特に本来の胃癌に関連した分野は勿論のこと、それ以外でも、消化器系株細胞という利点を生かした、消化器関連の各種研究のための新しいモデル素材としての可能性が得られる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】まず株細胞の母体となる自然発生胃腫瘍がコンスタントに入可能な、そして発生した腫瘍細胞を移植する際に拒絶反応が起こらないような、遺伝的に均一な胃腫瘍自然高発コトンラットの系統が必要となる。【００１０】次にこれらコトンラット系統において発生する腫瘍のなかから、同系の他個体へ移植継代が可能なより悪性度の高いものを移植材料として選別し、動物間における継代操作法を確立する。【００１１】その上で、これら移植材料から分離した細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系に導入し、コンスタントな増殖系が得られるまで継代を繰り返す。【００１２】その後、これら増殖細胞のクローン化をはかり、さらに安定した増殖を示すものを株細胞として樹立する。なおこれらの過程において、性質の異なるいくつかの細胞系が得られる場合には、それぞれを分離株として樹立することが可能である。
【発明の効果】
【００１３】入手が困難な実験小動物の胃癌株細胞を提供することにより、これを同種動物へ移植することで癌研究に有用な担癌動物を容易に作製することが可能となる。また細胞培養というよりシンプルな実験系により、癌研究のみならず消化器関連分野の新たな実験素材として、この分野の研究の進展に寄与できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】まず胃腫瘍を自然発生するコトンラットを選別しながら兄妹交配を２１代以上にわたり実施し、胃腫瘍を高発に自然発生するコトンラット近交系を確立する（ミクロスコピア、１６（３）、３２−３９、１９９９）。【００１５】次に、これら胃腫瘍自然高発近交系において胃腫瘍を自然発生する動物のなかから、剖検により胃腫瘍の腹膜播種が確認される病態末期個体の腹水を無菌的に採取する。【００１６】採取した腹水中に含まれる細胞成分を、抗生物質を添加した滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて遠心操作を加えながら洗浄後、再度上記ＰＢＳに懸濁し、同系のコトンラットへ腹腔内接種により移植する。【００１７】移植後は注意深く移植動物を経過観察し、移植した腫瘍細胞の増殖による影響が顕著になるようであれば、動物をエーテル麻酔下で屠殺・解剖し、腫瘍を無菌的に回収、ピンセットなどを用いて細胞を物理的にほぐすなどして滅菌ＰＢＳに懸濁して、さらに別の動物へ継代する。【００１８】このような手段により、動物体内で数代にわたり腫瘍の移植を繰り返す間に、移植された動物の生存期間が短縮したり、腫瘍の他臓器への転移性の獲得、さらに腫瘍の病理組織学的な検索により、例えば未分化型細胞集団への移行や分裂像の増加など悪性化の指標となる変化が認められたものを選択して移植継代する。【００１９】こうして継代が繰り返され、より悪性度の高い材料を移植したコトンラットの末期症例から腹水が採取可能なものを選び出し、これに含まれる細胞成分を分離して、通常のｊｎ  ｖｉｔｒｏ培養系に移行させる。【００２０】すなわち培養の当初は市販の細胞培養液のみのいわゆる無血清培地にて培養し、このような条件下でも生存しうる細胞のみを選抜する。以後生き残った細胞については、市販の細胞培養液にウシ胎児血清を加えたものを基本培養液とし、これを分注した培養用のプラスティックディッシュに懸濁して、３７℃のＣＯ２インキュベーター内に静置して増殖させる。【００２１】細胞がディッシュ底面に接着した後、およそ３〜４日おきに培養液の交換を行う。細胞が増殖し、ディッシュ全体に拡がるようであれば、細胞をはがして、さらにディッシュによる継代を続ける。【００２２】細胞の増殖が安定化すれば、クローニングを行う。すなわち増殖する細胞集団から限界希釈法、カップ法、軟寒天法等により細胞が１個ずつになるように分離し、それぞれをマイクロプレート１ウェル内にて培養を続け、細胞１個から増殖派生した細胞群をそれぞれ独立したクローンとする。その後さらにそれぞれのクローンについて継代培養を繰り返し、増殖が安定したものを株化細胞とする。
【実施例】
【００２３】以下実施例により、詳しく本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお後述の実施例で得られたコトンラット胃癌株化細胞  ＣｏＲａ  ６２２  Ｇ６は平成１４年７月２５日より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９４８  として寄託されている。
実施例１コトンラットに原発した胃腫瘍由来細胞の採取とその動物間での移植継代。胃腫瘍自然高発系コトンラットのコロニーから、外科手術を用いた肉眼的診断によって胃腫瘍の発症が確認された個体（すべて高ガストリン血症を示す雌）を選別し、それぞれアルミニューム製のケージに個別に収容して、市販の固型飼料（ＣＭＦ：オリエンタル酵母工業社製）と水道水を自由に与えて飼育した。そのうち腹部が膨満し動きの鈍くなった病態末期の個体を、エーテル麻酔下にて屠殺解剖した。その際腹腔内に貯留した腹水を注射筒にて無菌的に吸引採取した。この個体は剖検により腹壁及び肝臓に限局的な白色結節を認め（参考写真１）、胃腫瘍由来の腹腔内播種が確認された。その後の病理組織所見により、肝臓の結節には腫瘍性の細胞増殖は認められなかったものの、腹壁の結節には原発巣に類似した腺管構造を含む組織が結節の表面付近に観察された。一方腹壁に付着した結節の底部には、比較的大きな核を有し一定の形態を呈するほぼ単一種の細胞からなる増殖巣が観察され、分化度の異なる組織構造を併せ持つ腫瘍であることが確認された。採取した腹水は、軽く遠心（１５０ｒ．ｐ．ｍ．・１０分間）し、上清を捨て沈渣部の細胞画分を回収した。これに抗生物質（ペニシリンＧカリウム：萬有製薬社製、及び硫酸ストレプトマイシン：明治製菓社製、それぞれ５０万単位及び１ｇ力価／Ｌの濃度）を添加した滅菌ＰＢＳを適当量加え、ピペッティングと遠心操作を加えながら数回洗浄後、再度滅菌ＰＢＳ約５０ｍｌに懸濁し同系のコトンラット（高ガストリン血症状態の雌５匹）にそれぞれ約１ｍｌずつ腹腔内接種により移植した。接種動物は胃腫瘍原発動物同様に、それぞれ個別にケージに収容し、固型飼料と水道水を自由に与えて飼育を続けた。接種後５週から６週にかけて動物が次々と死亡したため、生き残った動物をエーテル麻酔下にて屠殺解剖した。剖検では腹水の貯留が認められなかったので、接種部位皮下の腫瘤を無菌的に採取し、滅菌ＰＢＳを入れたシャーレ内で有鉤ピンセットなどを用いて１９Ｇ注射針を通過するように細かくほぐした。これを遠心管に集め、遠心操作とピペッティングを加えながら滅菌ＰＢＳで数回洗浄したものを、初回の移植操作同様に同系のコトンラット（高ガストリン血症状態の雌５匹）に移植した。動物間での移植の時期は移植された動物の一般状態をよく経過観察し、できるだけ腫瘍死直前のものから材料を採取し、次の動物へ継代した。移植継代の初期（継代４代目まで）は、移植先動物として高ガストリン血症状態の雌コトンラットを、移植材料としては、腹水の採取が可能であれば、腹水由来の細胞を、もし腹水の採取が無理であれば腫瘍から物理的に分離した細胞を用いた。その後（継代５代以降）は、移植後の動物からほぼ安定して大量の腹水の採取が可能となり、それと同時に移植先動物も高ガストリン血症の雌のみならず、健康な雄でも移植可能であることが確認できたので、移植継代がさらに容易に実施できるようになった。【００２４】実施例２腫瘍細胞の動物間での移植継代から  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ初代培養系への導入。動物間での継代３代目のコトンラット１例に肝臓への転移を確認した（参考写真２）。病理組織所見ではこの転移巣は比較��大型の核と核小体を有しほぼ同形態を呈する単一種の細胞からなる集団を形成し、その中に多くの分裂像が観察されたことから活発な増殖状態にあると考えられた。この腫瘍細胞を移植継代し、２５日後の瀕死状態のコトンラット（継代４代目）を解剖したところ、約２０ｍｌの腹水が採取された。そこでこの腹水中の細胞成分を  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系の初代細胞として用いた。すなわち、採取した腹水を軽く遠心し上清を捨て、遠心管底部の細胞画分に、抗生物質を添加した滅菌ＰＢＳを適当量加えて再度懸濁洗浄した。この操作を数回繰り返した後、得られた細胞画分を市販の液体培地（血清を含まないＲＰＭＩ  １６４０：シグマ社製）に細胞数が１０２／ｍｌ個程度になるように分散させ、線維芽細胞が接着しにくい非コーティング−プラスティックディッシュ（ＣＯＲＮＩＮＧもしくはＮＵＮＣ社製）に入れ３７℃のＣＯ２インキュベーター内（９５％空気・５％ＣＯ２）に静置し培養を開始した。約１週間後、上記培養条件において生存している細胞のみを選抜するため、培養液に浮遊する細胞成分は培養液の遠心処理により、また培養ディッシュにはりついているものは０．２５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ溶液によりディッシュからはがしたものを遠心処理により集めた。これらをＲＰＭＩ  １６４０液体培地に１０％の割合でウシ胎児血清（ＦＣＳ：旭テクノグラス社取り扱い）を添加した培養液で数回遠心操作を加えながら洗浄し、デイッシュ当たりの細胞数が１０７〜１０８個になるように同培養液に分散したものを、今度は細胞培養用にコーティングされた新しいプラスティックディッシュ（ＣＯＲＮＩＮＧもしくはＮＵＮＣ社製）に蒔いた。ディッシュは上記同様の条件に設定されたＣＯ２インキュベーター内に静置され、細胞の増殖が図られた。細胞の増殖が認められたディッシュについては増殖の程度にあわせ、３〜７日毎に培養液の交換及び細胞の収集・継代を繰り返した。【００２５】実施例３ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養細胞からのクローニングと株細胞の樹立。実施例２によりｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて安定した増殖・継代が可能になった培養細胞集団よりクローニングを実施した。すなわち細胞が十分増殖していることを確認したディッシュより、上記細胞剥離用試薬を用いて細胞をはがし、集めた細胞に遠心操作を加えながらＦＣＳを添加した培養液で洗浄した後、細胞を同培養液中に均一になるように十分希釈・分散させて新たなディッシュに蒔いた。ディッシュを倒立顕微鏡下で観察しながら、ディッシュ底面に沈んできた細胞を、先端を極細に加工した手製の滅菌ガラス管を用いて、１個ずつ別々に採取した。採取した細胞を別に用意した９６孔平底マイクロプレート（旭テクノグラス社製）に、一孔当たり細胞が１個ずつになるように投入した。マイクロプレートの各孔には、ハイブリドーマクローニング用のブライクローン（ＡＲＣＨＰＯＲＴ社製）を上記培養液に１％の濃度で加えたものを、あらかじめ分注しておいた。フィダー細胞は使用しなかった。細胞を入れたマイクロプレートは実施例２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養と同条件下のＣＯ２インキュベーター内で培養を継続した。培養継続中に１個の細胞から増殖が認められたものは培養液の交換及び増殖細胞数に応じてマイクロプレート孔からより大きな培養容器を用いた培養へ移行しさらに継代培養を続けた。その際、ブライクローンの含まないＦＣＳ添加培養液に変更した。こうしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで安定した増殖を示すクローン株ＣｏＲａ  ６２２  Ｇ６を得た。【００２６】実施例４ＣｏＲａ  ６２２  Ｇ６の形態観察。ＣｏＲａ  ６２２  Ｇ６株細胞が増殖中のプラスティックディッシュ内の培養液を捨て、代わりに病理用のリン酸緩衝１０％ホルマリン液をディッシュに注入し細胞を固定した。ホルマリンを除去後、蒸留水で軽くディッシュを洗浄・乾燥してからギムザ染色を施し、倒立顕微鏡下にて細胞の形態を観察・記録した。細胞が低密度でディッシュ底面にはりついているところでは、隣り合った細胞同士が長い偽足状の細胞質突起を伸ばし、全体でネットワーク様形態を示した（図２）。株細胞の増殖中と考えられる部分では、隣り合った細胞同士が接するようになり、その形態も紡錘形ないしは敷石状を呈した（図３）。さらに細胞が高密度の部分では接触阻止はみられず、隣り合った細胞同士が重度に密接・重なり合い全体的に細胞同士のランダムな流れ模様を形成した（図１）。また株細胞が高密度にフォーカスを形成した部分の周辺には巨大な細胞質内に多核を有する細胞集団がしばしば観察された（図４）。【００２７】実施例５ＣｏＲａ  ６２２  Ｇ６を用いた担癌動物の作製。（１）腹腔内接種。培養容器底面にすき間無く当該株細胞が増殖した状態のものから常法に従い、培養液を除き、０．０５％トリプシン及び０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ・４Ｎａ混液を少量加えて培養容器をゆすったり、ピペッティングなどにより細胞の剥離を促進しながら、細胞を分散させて遠心管に集めた。これに遠心操作を加えながら抗生物質を加えた滅菌ＰＢＳで数回洗浄した後、適当な濃度に再度分散させ、その一部について血球計算盤を用いて細胞数をカウントした。接種材料は所定の細胞濃度になるように調製して用いた。すなわち細胞数が１×１０８、１×１０５及び１×１０２個／ｍｌの各３濃度のものを、生後１ヶ月齢の同系雄コトンラット１匹ずつにそれぞれ約０．７ｍｌ腹腔内接種した。１×１０８個／ｍｌの濃度を接種したものは接種後１６日目に、１×１０５及び１×１０２個／ｍｌのものはそれぞれ４０日目及び３４日目に死亡した。死亡動物はいずれも腹腔内に大量の腹水を貯留し、腹壁及び大網部などに腫瘍塊が確認できた。腹水は注射針を装着した注射筒により無菌的に吸入採取が容易であり、これから遠心操作で集めた遊離細胞成分の一部を滅菌ＰＢＳに懸濁して接種材料とした。これを別に用意したコトンラットにそのまま注射することにより、簡単に安定して継代することが可能であった。図５に腹腔内継代過程における接種動物の平均生存日数（一継代当たり５匹のコトンラットを使用）を示す。またこれら腹腔内接種例においてはしばしば接種部位の皮下に腫瘤が認められることから、皮下接種により限局的な病巣を作製することも十分可能と思われた。（２）経血管内接種。株細胞の全身分布への影響を知るためには、経血管内注射などによる担癌動物の作製を試みることが望ましい。ただしコトンラットはマウスと異なり尾静脈からの注射が困難なため、便宜的に心臓へ直接接種する方法を試みた���すなわち当該細胞数が１×１０６個／ｍｌになるように調製した接種材料を、２５Ｇ注射針を装着した１ｍｌツベルクリン注射筒（テルモ社製）に吸入し、軽くエーテル麻酔したコトンラットの胸部外側から注射針を挿入、血液の流入及び心臓の拍動を確認しつつ１匹当たり０．４ｍｌずつ、計１０匹のコトンラット心臓内へ注入した。これら心臓接種コトンラットの平均生存日数は１７日であった。このうち剖検及び組織学的検査が可能であった例の所見から、明らかに経血管性に肝臓に定着したと考えられる癌病巣が確認（参考写真３）される例がある一方で、接種材料の漏出によるとみられる心筋内癌病巣（参考写真４）や胸腔内播種例も散見され、すべてを経血管性による腫瘍の分布と断定することはできなかった。そこで次に麻酔下で背を下に保定したコトンラット腹側の後脚付け根部分の皮膚を切開しサフェナ静脈を露出させ、これから上記同様に調製した接種材料を２７Ｇ注射針を装着したインスリン用注射筒（マイジェクター：テルモ社製）により各０．２ｍｌずつ計５匹に血管内注射した。接種後は切開部分を縫合し、それぞれ個別にケージに収容して飼育を継続した。接種後２８日目に２匹が死亡したので、これらを剖検するとともに、残りの動物についてもすべて屠殺解剖し、肉眼的な腫瘍の分布を確認した。その結果接種例すべての肺に複数個の腫瘍巣が確認された（参考写真５）。またこれら５例の胸腔内は、肺の腫瘍に由来したと考えられる出血性もしくは漏出性の胸水で満たされており、一部の例では胸腔壁に播種によると思われる転移性腫瘍も認められた。以上、当該株細胞を同系のコトンラットの体内に接種することにより、簡単に担癌モデル動物を作製することができたのみならず、接種方法の選択により、腫瘍の腹水播種もしくは胸水播種といった異なる状況を分けて作出することも可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００２８】バイオ産業においては、各種動物由来の組織及び細胞あるいはこれらから抽出された多くの生物素材がすでに商品化されている。しかるにコトンラットより樹立された株細胞としては、当該株細胞が最初であり、コトンラットを対象とした実験系のバイオ素材として幅広い用途が見込める。すなわち当該株細胞はこれ単独でｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験系で、抗癌剤のスクリーニング試験など創薬分野での利用が可能であるばかりか、これをコトンラットに接種することにより、容易に担癌モデル動物を作製することが可能なため、癌研究の分野における利用の拡大が期待できる。これにより、従来寄生虫研究など限られた分野で、自家繁殖により細々と利用されてきたコトンラット自体が、実験動物として商業ベースで利用されるようになる可能性もある。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣｏＲａ  ６２２  Ｇ６株細胞の高密度における形態像を示す顕微鏡写真。
【図２】ＣｏＲａ  ６２２  Ｇ６株細胞の低密度における形態像を示す顕微鏡写真。
【図３】ＣｏＲａ  ６２２  Ｇ６株細胞の増殖中における形態像を示す顕微鏡写真。
【図４】ＣｏＲａ  ６２２  Ｇ６株細胞の高密度フォーカス周辺にしばしば認められる多核巨細胞の形態像を示す顕微鏡写真。
【図５】ＣｏＲａ  ６２２  Ｇ６株細胞のコトンラット腹腔内移植継代過程における接種動物の平均生存日数。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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