(57)【要約】【課題】本発明は、生菌を含有するか含有する可能性のある検体から細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬を用いて生菌を検出する方法であって、従来から知られている方法と比較してより正確に生菌の検出を行うことができる方法および生菌計数装置を提供すること。【解決手段】微生物採取用フィルタ上に捕捉した菌に細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬を接触させてから、または、細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬を接触させた菌を微生物採取用フィルタ上に捕捉してから、励起光を照射することで生じる光点を検出した後、フィルタ表面に補足した生菌を細胞膜溶解剤に接触させて細胞膜を破損溶解させ、再度細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬に接触させて励起光を照射することで生じる光点を検出した後、前後の光点を比較して輝度が設定した値以上に上昇した光点を生菌由来の光点と判断することを特徴とする生菌検出方法。【選択図】図２
2005278546.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物採取用フィルタ上に捕捉した菌に細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬を接触させてから、または、細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬を接触させた菌を微生物採取用フィルタ上に捕捉してから、励起光を照射することで生じる光点を検出した後、フィルタ表面に補足した生菌を細胞膜透過性処理し、再度細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬に接触させて励起光を照射することで生じる光点を検出した後、前後の光点を比較して輝度が設定した値以上に上昇した光点を生菌由来の光点と判断することを特徴とする生菌検出方法。
【請求項２】
細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬とは、よう化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ），臭化エチジウム（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ，ＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ，ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ，ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅから選ばれることを特徴とする請求項１記載の生菌検出方法。
【請求項３】
細胞膜透過性処理として菌を細胞膜溶解剤に接触させることで細胞膜を破損溶解させることを特徴とする請求項１の生菌検出方法。
【請求項４】
細胞膜溶解剤とはエタノール、メタノール、界面活性剤から選ばれることを特徴とする請求項３記載の生菌検出方法。
【請求項５】
微生物採取用フィルタ上に捕捉した菌と夾雑物質との上に、硬化前のＵＶ硬化樹脂液を滴下し余剰なＵＶ硬化型樹脂液を除去した後、ＵＶ光をフィルタ表面に照射してＵＶ硬化樹脂を硬化させることでフィルタ表面に捕捉した菌、夾雑物を微生物採取用フィルタ上に接着固定することを特徴とする請求項１記載の生菌検出方法。
【請求項６】
硬化前の余剰なＵＶ硬化樹脂液を微生物採取用フィルタ上からろ過により除去することを特徴とする請求項５記載の生菌検出方法。
【請求項７】
微生物採取用フィルタ上の表面からＵＶ硬化樹脂液を除去した後フィルタのポア内部に残るＵＶ硬化樹脂液がＵＶ光照射後硬化しフィルタのポアを閉塞してしまうことを防ぐ手段を備えたことを特徴とする請求項５記載の生菌検出方法。
【請求項８】
ポア内部に残るＵＶ硬化樹脂液がＵＶ光照射後硬化しフィルタのポアを閉塞してしまうことを防ぐ手段として、ＵＶ光照射前に蒸留水等をフィルタ上に滴下し、ろ過することでポア内部に残るＵＶ硬化樹脂液を洗い落とした後ＵＶ光を照射して硬化させることでフィルタのポアの完全閉塞を防ぐことを特徴とする請求項７記載の生菌検出方法。
【請求項９】
微生物採取用フィルタ表面のＵＶ光照射手段と、微生物採取用フィルタの微小な一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、微生物採取用フィルタ上で細胞膜溶解剤に接触させて細胞膜を破損溶解させ、再度細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬に接触させる前と後にそれぞれ前記光源によって励起光が照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、再度細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬に接触させる前と後の光点の輝度を比較し、輝度が設定値以上に上昇した光点を生菌由来の光点と判断する生菌判断手段と、前記微小な一定面積を連続または断続的に移動させる移動手段と、生菌判断手段から生菌と判断された信号から生菌の数量を積算する積算手段を有することを特徴とする生菌計数装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生菌を含有するか含有する可能性のある検体から核酸染色蛍光試薬を用いて生菌を検出する方法であって、従来から知られている方法と比較してより正確に生菌の検出を行うことができる方法および生菌計数装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬が死菌を検出するための試薬として有用であることは、当業者によく知られている事実である。細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬は、細胞膜に何らかの破損、ダメージがある場合、その部分より細胞内に取り込まれ、核酸に特異的に結合し蛍光増強する蛍光基質である。従って、微生物採取用フィルタ上に捕捉した菌に細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬を接触させてから、または、細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬を接触させた菌を微生物採取用フィルタ上に捕捉してから、フィルタ上に励起光を照射することで生じる光点を死菌と判定する方法が古くから知られている。
【０００３】
しかしながら、上記の方法では細胞膜に破損、ダメージのない生菌を検出することはできない。また死菌も正確に検出することができないという問題がある。なぜならば、死菌に取り込まれた蛍光物質の蛍光波長と類似した蛍光波長を有する自家蛍光物質が自然界には多く存在するので、このような自家蛍光物質がフィルタ上に存在すると、励起光を照射することで生じる光点が、いずれの物質由来のものであるのか区別をつけがたい側面を有するからである。また、それ以外に細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬は菌以外の夾雑物に非特異的に吸着し蛍光増強を起こし、励起光を照射することで生じる蛍光試薬による光点が死菌の光点ではない場合があるからである。
【０００４】
下記の特許文献１は、細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬で検体となる菌を染色して、蛍光発光した死菌細胞数を計測する第１のステップと、前記検体となる菌に殺菌処理を施した上で、当該殺菌処理した菌を細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬で再度染色して、蛍光発光した死菌細胞数を計測する第２のステップとを備え、前記第１ステップで計測した数と前記第２ステップで計測した数とを比較することにより、生菌細胞数及び死菌細胞数を計測することを特徴とする微生物計測方法である。
【特許文献１】特開２００３−１６９６９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら上記の特許文献１において提案されている方法によっても、必ずしも満足できる成果を得ることができるわけではない。単に第1ステップ、第2ステップで得られた画像中光点を輝度値の判別のみで計数化した後、増加した分が生菌数であると決定する方法では生菌数を正確に検出することができない。なぜならば細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬で第1ステップ、第2ステップと菌を染色したとき第１ステップで染色されていた菌は第２ステップの染色が充分に行えず、その光点の輝度は不十分なものになってしまう現象が確認されている。したがって第２ステップの画像中の光点をある輝度値で識別計数化したときに、正確な全菌数を計数化できているとはいえないことが発生する。また菌以外の夾雑物に非特異的に吸着し蛍光増強を起こした光点でも２回の染色で同様な問題が発生する。また、第1ステップ、第2ステップとの撮影の間に行う染色作業により、菌、夾雑物が流れて移動してしまうため、必ずしも第1ステップ、第2ステップと同一物体での輝度を見ているとは言えない等の問題があるためである。
【０００６】
そこで本発明は、菌を含有するか含有する可能性のある検体から細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬を用いて生菌を検出する方法であって、従来から知られている方法と比較してより正確に生菌の検出を行うことができる方法および生菌計数装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の点に鑑みてなされた本発明の生菌検出方法は、請求項１記載の通り微生物採取用フィルタ上に捕捉した菌に細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬を接触させてから、または、細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬を接触させた菌を微生物採取用フィルタ上に捕捉してから、励起光を照射することで生じる光点を検出した後、フィルタ表面に補足した生菌を細胞膜透過性処理し、再度細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬に接触させて励起光を照射することで生じる光点を検出した後、前後の光点を比較して輝度が設定した値以上に上昇した光点を生菌由来の光点と判断することを特徴とする。
【０００８】
また、請求項２記載の生菌検出方法は、請求項１記載の生菌検出方法において細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬とは、よう化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ），臭化エチジウム（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ），ＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ，ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ，ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅから選ばれることを特徴とする。
【０００９】
また、請求項３記載の生菌検出方法は、請求項１記載の生菌検出方法において細胞膜透過性処理として菌を細胞膜溶解剤に接触させることで細胞膜を破損溶解させることを特徴とする。
【００１０】
また、請求項４記載の生菌検出方法は、請求項３記載の生菌検出方法において細胞膜溶解剤とはエタノール、メタノール、界面活性剤から選ばれることを特徴とする。
【００１１】
また請求項５記載の生菌検出方法は請求項１記載の生菌検出方法において、微生物採取用フィルタ上に捕捉した菌と夾雑物質との上に、硬化前のＵＶ硬化樹脂液を滴下し余剰なＵＶ硬化型樹脂液を除去した後、ＵＶ光をフィルタ表面に照射してＵＶ硬化樹脂を硬化させることでフィルタ表面に捕捉した菌、夾雑物を微生物採取用フィルタ上に接着固定することを特徴とする。
【００１２】
また、請求項６記載の生菌検出方法は、請求項５記載の生菌検出方法において硬化前の余剰なＵＶ硬化樹脂液を微生物採取用フィルタ上からろ過により除去することを特徴とする。
【００１３】
また、請求項７記載の生菌検出方法は請求項５記載の生菌検出方法において、微生物採取用フィルタ上の表面からＵＶ硬化樹脂液を除去した後フィルタのポア内部に残るＵＶ硬化樹脂液がＵＶ光照射後硬化しフィルタのポアを閉塞してしまうことを防ぐ手段を備えたことを特徴とする。
【００１４】
また、請求項８記載の生菌検出方法は請求項７記載の生菌検出方法において、またポア内部に残るＵＶ硬化樹脂液がＵＶ光照射後硬化しフィルタのポアを閉塞してしまうことを防ぐ手段としてＵＶ光照射前に蒸留水等をフィルタ上に滴下し、ろ過することでポア内部に残るＵＶ硬化樹脂液を洗い落とした後ＵＶ光を照射して硬化させることでフィルタのポアの完全閉塞を防ぐことを特徴とする。
【００１５】
また、請求項９記載の生菌検出方法は請求項１記載の生菌検出方法において、微生物採取用フィルタ表面のＵＶ光照射手段と、微生物採取用フィルタの微小な一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、微生物採取用フィルタ上で細胞膜溶解剤に接触させて細胞膜を破損溶解させ、再度細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬に接触させる前と後にそれぞれ前記光源によって励起光が照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、再度細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬に接触させる前と後の光点の輝度を比較し、輝度が設定した値以上に上昇した光点を生菌由来のものと判断する生菌判断手段と、前記微小な一定面積を連続または断続的に移動させる移動手段と、生菌判断手段から生菌と判断された信号から生菌の数量を積算する積算手段を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の生菌検出方法は、蛍光染色法により微生物採取用フィルタ上に捕捉した菌由来の光点を選択するとき、自家蛍光物質の光点、細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬が菌以外の夾雑物に非特異的に吸着し蛍光増強を起こした光点に惑わされずに、従来から知られている方法と比較して正確に生菌の検出を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明において用いることができる細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬としては、よう化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ），臭化エチジウム（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ），ＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ，ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ，ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅなどの公知の試薬が挙げられる。これらの試薬は、細胞膜に何らかの破損、ダメージがある場合、その部分より細胞内に取り込まれ、核酸に特異的に結合し蛍光増強する。
【００１８】
以下、本発明の生菌検出方法を順を追って説明する。
【００１９】
まず、微生物採取用フィルタ上に捕捉した菌に細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬を接触させるか、または、細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬を接触させた菌を微生物採取用フィルタ上に捕捉する。この操作は自体公知の方法に準じて行えばよい。本発明において菌を含有するか含有する可能性のある検体は液状検体であるが、検査対象が飲料水などの液状サンプルの場合は、それ自体が液状検体となる。検査対象が野菜や肉をはじめとする食材などの固体サンプルの場合は、それをホモジナイズして液状検体としたり、その表面から綿棒などを用いて菌を採取し、これを生理食塩水などに遊離させて液状検体としたりする。また、まな板などの調理器具などが検査対象となる場合、その表面から綿棒などを用いて菌を採取し、これを生理食塩水などに遊離させて液状検体とする。こうした液状検体を微生物採取用フィルタで吸引濾過することでフィルタ上に菌を捕捉してから試薬をフィルタの上方から滴下するか、または、液状検体に試薬を混合した後、液状検体を微生物採取用フィルタで吸引ろ過することで、フィルタ上に染色された菌を捕捉する。
【００２０】
なお、微生物採取用フィルタとしては、例えば、孔径が０．１μｍ〜１μｍの公知のものを用いることができる。
【００２１】
次に微生物採取用フィルタ上に捕捉した菌と検体中に含まれる夾雑物質との上に、硬化前のＵＶ硬化樹脂液を適量滴下した後、余剰なＵＶ硬化型樹脂液はろ過により除去する。ＵＶ硬化型樹脂液は適度な粘性を保つ様に調整しておくことで、微生物採取用フィルタ表面、及び微生物採取用フィルタ上に捕捉した菌と検体中に含まれる夾雑物質の表面には１μｍ〜５μｍのＵＶ硬化型樹脂液の膜が形成される。
【００２２】
さらにＵＶ硬化樹脂液が微生物採取用フィルタのポアを塞いでしまわないようＵＶ硬化樹脂液にＵＶ光を照射する前に、蒸留水等をフィルタ上に適量滴下した後、ろ過することで微生物採取用フィルタのポア内部に残るＵＶ硬化樹脂液の一部を洗い落とす。また、微生物採取用フィルタ上に捕捉した菌と夾雑物質の表面を覆う１μｍ〜５μｍのＵＶ硬化型樹脂液の膜も一部洗い落とす。この後ＵＶ光を微生物採取用フィルタ全面に照射してＵＶ硬化樹脂液を硬化させる。ＵＶ光照射の強度、時間はＵＶ硬化樹脂液が微生物採取用フィルタ上に捕捉した菌と検体中に含まれる夾雑物質を微生物採取用フィルタ表面に粘着する程度でよく、後工程で実施する微生物採取用フィルタ表面の生菌を細胞膜溶解剤に接触させて細胞膜を破損溶解させ、再度細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬に接触させる作業で菌、夾雑物質が流れて動かない固定強度が確保できればよい。
【００２３】
またＵＶ硬化樹脂液の選定に当っては、ｐＨ値は７前後であることが蛍光試薬の蛍光発光現象にとって必要であり、また硬化後において光透明性が高く、光散乱性のないものを選択する必要がある。さらには、ＵＶ硬化樹脂液の溶媒は微生物採取用フィルタやその他の採取用構造体樹脂、菌、夾雑物質等を溶解、大きな損傷を与えないものでなくてはならない。例えば、樹脂はアクリル系樹脂、溶媒は無溶媒を選択するか、アルコール系を用いるとよい。
【００２４】
次に、フィルタ上に励起光を照射することで生じる光点を検出する。この操作は、例えば、よう化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ）は、波長５３５ｎｍ付近の励起光を照射した場合、波長６１７ｎｍ付近の蛍光を発するので、当該蛍光をＣＣＤカメラを用いて画像撮影することにより行えばよい。
【００２５】
次に、微生物採取用フィルタ上に細胞膜溶解剤を適量滴下しフィルタ上に満たす。この状態にて捕捉した生菌の細胞膜に欠損が生じる時間放置する。その後、余剰な細胞膜溶解剤を微生物採取用フィルタ上よりろ過して取り除く。これにより細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬は微生物採取用フィルタ上に捕捉した生菌の細胞膜を透過することが可能な状態となり、生菌の核酸を細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬で染色することができる。
【００２６】
細胞膜溶解剤としてはエタノール、メタノール、各種界面活性剤などが利用でき適正な濃度と適正な細胞接触時間を選定する必要がある。一例としてエタノールの場合は濃度７０％ｗ／ｖ溶液にて細胞接触時間を１０分程度として細胞膜欠損を行うことができる。
【００２７】
その後、微生物採取用フィルタ上に細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬を適量滴下させ微生物採取用フィルタ上の菌に接触させる。このとき微生物採取用フィルタ上のすべての菌が染色される。また検体中に含まれる夾雑物質も再度同様に染色される。その後微生物採取用フィルタ上の細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬をろ過して取り除く。
【００２８】
この二度目の染色工程を前記細胞膜溶解の工程とを同時に行うことも有効である。
この場合、微生物採取用フィルタ上に滴下させるのは、細胞膜溶解剤と細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬とを混合し、それぞれ指定の終濃度にしたものである。
【００２９】
その後、一回目の撮影と同一の場所の微生物採取用フィルタ上の面に励起光を照射し画像撮影する。一回目と二回目の画像で光点の定点比較をすることで光点の輝度増加を調べる。その結果、画像中のある光点において一回目の画像における輝度に比較して二回目の画像における輝度が設定した値以上に増加した光点は、生菌が細胞膜溶解剤により細胞膜に欠損を受け細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬により核酸が染色されて二回目の画像に光点として確認できた生菌のものである。一方、もともと死菌であったものでも細胞膜溶解剤により細胞膜に大きく欠損を受け細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬を多量に取り込み、輝度が増加する場合もあれば、細胞膜溶解剤により細胞そのものが欠損してしまい細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬が細胞に留まらなくなり輝度が低下してしまう場合もうる。また蛍光物質の蛍光波長と類似した蛍光波長を有する自家蛍光物質、細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬が非特異的に吸着し蛍光増強を起こす菌以外の夾雑物も一回目、二回目の画像で輝度変化が全く発生しない訳ではない。しかしながら生菌由来の光点輝度増加量と、これら生菌由来以外の物質の輝度変化量とは、その変化量の大きさで大きな差異があり、その差異に輝度閾値を設定することで生菌のみの光点を見出すことは容易である。
【００３０】
図２は、本発明の生菌検出方法を好適に実施するための生菌計数装置の一態様を示す概念図である。この生菌計数装置１は、光源３、光源集光手段としてのレンズ５受光部１１を含む。光源３から発せられた励起光から目的の波長を取り出すために励起光分光フィルタ４で分光する。分光された励起光はダイクロイックミラー８を経て、光路を変化させられる。光路を変化させられた励起光はレンズ５を経て検査台６にセットされた微生物採取用フィルタ２（別途の操作によりフィルタ上に染色された菌を捕捉してあるもの）上に集光される。光源３から発せられた励起光は、レンズ５によって集光されるが、その際、レンズ５によって励起光を照射する範囲は微小な一定面積に集光される。ここで、微小な一定面積とは、生菌の大きさに基づいて設定した場合、直径１ｍｍ程度の範囲を指し示す。励起光を照射する範囲（微小な一定面積）は、フィルタ上の全域にわたって図略の移動手段により連続的にまたは断続的に移動させられる。励起光により励起された菌が発する蛍光は、再びダイクロイックミラー８を透過する。その際、蛍光はダイクロイックミラー８をそのまま透過し、受光部１１に到達する。一定の時間内に受光部１１に到達した蛍光は、目的の蛍光のみを取り出すために蛍光分光フィルタ９を経て、受光部１１に内蔵された光電変換素子１０に到達し、信号化され、認識されて画像にされる。
【００３１】
この生菌計数装置１は、検査台６にセットされた微生物採取用フィルタ２のＵＶ光照射手段７を有する。このＵＶ光照射段７は、例えば、紫外線を主としてフィルタ上に照射することができるブラックライト、またはＬＥＤである。一回目の画像撮影が行う前に、微生物採取用フィルタ２をセットした検査台６は、ＵＶ光照射手段７の下方に移動させられ、微生物採取用フィルタ２にＵＶ光が照射されることで、微生物採取用フィルタのＵＶ硬化樹脂液膜を硬化する。
【００３２】
次に微生物採取用フィルタ２をセットした検査台６は、レンズ５の下方に移動させられ、フィルタ上に励起光が照射されてから一回目の画像を撮影される。
【００３３】
その後生菌計数装置１の検査台６にセットされた微生物採取用フィルタ２を取り出し、細胞溶解の工程と再蛍光染色の工程を実施した上で、再度生菌計数装置１の検査台６にセットする。このとき微生物採取用フィルタ２を検査台６にセットするとき位置ずれが大きく発生しないように、検査台６には位置出しのピンなどが具備されている。
【００３４】
次に微生物採取用フィルタ２をセットした検査台６は、レンズ５の下方に再度移動させられ、フィルタ上に励起光が照射されてからニ回目の画像を撮影される。
【００３５】
最後に、生菌判断手段１２によって、一回目、二回目の画像比較による光点の定点比較がなされ、光点の増加を調べる。その結果、画像中のある光点において一回目の画像における輝度に比較して二回目の画像における輝度が設定した値以上に増加した光点は生菌由来の光点と判断され、生菌と判断された光点は図略の積算手段により積算されて計数される。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の記載に何ら限定して解釈されるものではない。
【００３７】
（実施例１）本発明の生菌検出法の効果について
１つの前培養した大腸菌懸濁水を用意した。液状検体を各々孔径が０．４μｍの微生物採取用フィルタ（メンブレンフィルタ）で吸引濾過し、フィルタ上に大腸菌を捕捉した。
細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬として、よう化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ）濃度２０μＭの水溶液を滴下し、２分間染色を行った後、再び吸引濾過してフィルタ上の液状成分を除去した。次にＵＶ硬化樹脂液としてｐＨ値は7、アクリル系樹脂系、無溶媒性のものを用意した。フィルタの上方から硬化前のＵＶ硬化樹脂液をフィルタ上に適量滴下した後、すぐに余剰なＵＶ硬化型樹脂液はろ過により除去した。引き続いて、滅菌蒸留水をフィルタ上に適量滴下し再びすぐに吸引濾過してフィルタ上の滅菌蒸留水を除去した。
【００３８】
その後生菌計数装置１の検査台６に微生物採取用フィルタ２をセットする。そして後生菌計数装置１に運転の指令を与えると微生物採取用フィルタ２をセットした検査台６は、ＵＶ光照射手段７の下方に移動させられ、微生物採取用フィルタ２に波長３７５ｎｍ１５ＷのＵＶ光が10分間照射されることで微生物採取用フィルタのＵＶ硬化樹脂液膜が硬化する。
【００３９】
その後フィルタ上に波長が５３５ｎｍの励起光を照射して波長が６１７ｎｍの蛍光を発する光点の初期画像撮影を行った。
【００４０】
初期画像撮影を行った後、生菌計数装置１の検査台６より微生物採取用フィルタ２を取り出す。フィルタ上に濃度７０％ｗ／ｖエタノール溶液を滴下し細胞に１０分程度接触させ細胞膜欠損を行う。その後余剰なエタノール溶液をろ過により除去した。二回目の細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬として、よう化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ）濃度２０μＭの水溶液を滴下し、２分間染色を行った後、再び吸引濾過してフィルタ上の液状成分を除去した。その後生菌計数装置１の検査台６に微生物採取用フィルタ２をセットする。そして後生菌計数装置１に運転の指令を与えフィルタ上に波長が５３５ｎｍの励起光を照射して波長が６１７ｎｍの蛍光を発する光点の二回目の画像撮影を行った。
【００４１】
初期画像と二回目の画像中において、一定以上の輝度のピーク値（ＣＣＤ階調レベル０〜２５５）と大きさ（ＣＣＤ画素数）を持つオブジェクトを抽出した。二つの画像中のオブジェクト位置関係を対比し、初期画像にあったものは二回目の画像中で同一のものの輝度ピーク値と大きさの変化を調べた。図１のグラフにて同一オブジェクトで二回目の画像中の輝度ピーク値から初期画像中での輝度ピーク値を差引いたもの、つまり輝度ピーク変化値を横軸座標に、また同一オブジェクトで二回目の画像中の輝度ピーク値とサイズの積の値から初期画像中での輝度ピーク値とサイズの積の値を差引いたものを縦軸座標にして黒丸印でプロットした。つぎに初期画像にはなくて二回目の画像中で確認できるものは、そのオブジェクトの輝度ピーク値を横軸座標に、また輝度ピーク値とサイズの積の値を縦軸座標にして白丸印でプロットした。この図１のグラフで明確に示せているが、フィルタ上に捕捉された菌で細胞溶解剤で細胞膜に損傷を与えることで、初めて細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬よう化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ）により核酸染色が行われて、二回目の画像にて、光点と確認できたもの（図１グラフ中の白丸）が生菌由来のものである。これは初回の画像中で確認された光点、死菌由来のものとは図１のグラフに於いて、明確にセグメント化できている。また、図１のように輝度ピーク値、輝度ピーク値とサイズ積算の変化を座標として表した時にグラフ中に点線で示す部分が生菌の定義領域とすることができる。領域の定義ポイント値はデータ数を蓄積することで最適化が可能である。画像中のオブジェクトを比較するものとして、輝度ピーク値、サイズ以外に、輝度の平均値、累積値などを利用して定義することも有効である。また死菌に取り込まれた蛍光物質の蛍光波長と類似した蛍光波長を有する自家蛍光物質は初期の画像と二回目の画像とで、輝度ピーク値、サイズには大きな変化が発生しないこと、また細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬が菌以外の夾雑物に非特異的に吸着し蛍光増強を起こし、励起光を照射することで生じる蛍光試薬による光点は死菌の光点と同様の輝度変化となることも確認できている。以上のような手順と図１のグラフで示す生菌定義領域により、生菌数を正確に検出することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、生菌を含有するか含有する可能性のある検体から細胞膜非透過性核酸染色蛍光試薬を用いて生菌を検出する方法であって、従来から知られている方法と比較してより正確に生菌の検出を行うことができる方法および生菌計数装置を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】実施例における本発明の輝度変化データを示すグラフ
【図２】本発明の生菌検出方法を好適に実施するための生菌計数装置の一態様を示す概念図
【符号の説明】
【００４４】
１  生菌計数装置
２  微生物採取用フィルタ
３  光源
４  励起光分光フィルタ
５  レンズ
６  検査台
７  ＵＶ光照射手段
８  ダイクロイックミラー
９  蛍光分光フィルタ
１０  光電変換素子
１１  受光部
１２  生菌判断手段
【図１】
2005278546.tif 000003
【図２】
2005278546.tif 000004