(57)【要約】【課題】長期間培養可能な細胞スフェロイドアレイを利用した遺伝子発現を検査するキットの提供【解決手段】パタン化した基板上に内皮細胞のような第一の細胞を培養し、その上に肝臓のような第２の細胞をスフェロイド上に形成せしめ、長期培養を可能にした細胞スフェロイドアレイへ遺伝子を導入し、長期的に発現解析できることを可能にした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
長期間培養可能なスフェロイド培養細胞を利用した遺伝子発現ツール
【請求項２】
細胞スフェロイドが基板上に１〜１００，０００個パタン化されていることを特徴とする請求項１の遺伝子発現ツール
【請求項３】
細胞スフェロイドアレイが第一の細胞上に異なる細胞のスフェロイドを形成することを特徴とする請求項２のツール
【請求項４】
細胞アレイが内皮細胞上に異なる細胞のスフェロイドを形成することを特徴とする請求項２−３のツール
【請求項５】
細胞アレイが内皮細胞上に肝臓細胞のスフェロイドを形成することを特徴とする請求項２−４のツール
【請求項６】
細胞スフェロイドが１マイクロメートルから１ミリメートルまでのサイズであることを特徴とする請求項２−５までのツール
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【発明の属する分野】
【０００１】  本発明は、高度に組織化された細胞アレイを利用し、外来遺伝子を導入し、発現を調べることのできるキットの製造に関する。
【背景技術】
【背景技術】
【０００２】    天然のウイルスを利用した遺伝子治療はすでに様々な形で検討されているものの、ベクター自身による副作用が重大な問題を引き起こしており、最近では完全合成ベクターへの期待が高まっている。このような状況の下、遺伝子発現効率を検討するツールとして培養細胞は広く用いられている。しかしながら通常の培養細胞ではヒトや動物と異なるデータ得られることが極めておおい。さらに肝臓のような細胞では通常の培養法では長期間の培養が困難であり、長期的な遺伝子発現の検討ができないのが現状である。【０００３】  このような問題点を解決するため、たとえば旋回培養法などにより細胞をある程度の固まり（スフェロイド）として組織に近づけ、長期間の培養を可能にするような方法が開発されている（非特許文献：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１９９６，５０，４０４−４１５）。実際、このような旋回培養法によって作製したスフェロイドへの遺伝子導入試験が行われているものの（非特許文献：Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，２００２，１８（１），１３−２７）、このようにして調製したスフェロイドは常に撹拌を続けなければ大きな固まりに融合してしまい、死滅してしまうため、マイクロチップ上に固定化することは極めて困難であり、定量的遺伝子発現情報をとるのは不可能である。さらに、特定の細胞に対する経時的発現解析も不可能であり、統計的処理のみにならざるを得ない。
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  本発明は発明者らが開発してきた細胞スフェロイドアレイを利用し、遺伝子発現解析キットを作製しようというものである。すなわち、細胞非接着性表面上にプラズマエッチングなどのパタン作製技術により細胞接着性のマイクロドメインを作成し、このマイクロドメインに予め内皮細胞のようなフィーダー層となる細胞を接着させた後に肝細胞のような機能細胞を培養することにより、基板上細胞スフェロイドを固定化した長期間培養可能なチップを開発している（特許文献１：特願２００１−２２６２９３、培養肝細胞スフェロイド）。このような基板上に固定した細胞スフェロイドに裸のあるいは様々なベクターに包み込んだ遺伝子を導入することにより、導入した遺伝子の長期間発現解析を可能にするキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】  細胞接着性の低い基材表面にマイクロドメインを作製し、このマイクロドメインに予め内皮細胞のようなフィーダー層となる細胞を接着させた後に肝細胞のような機能細胞を培養することにより、基板上細胞スフェロイドを固定化した長期間培養可能なチップを作製する。このような基板上に固定した細胞スフェロイドに裸のあるいは様々なベクターに包み込んだ遺伝子を導入することにより、導入した遺伝子の長期間発現解析を可能にするキットが提供される。
【発明の効果】
【０００６】  本発明により、これまで単純な培養細胞のみでしかできなかったｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子発現解析が、１ヶ月以上にもわたってできることが可能となるとともに、基板上のアレイでの発現解析のため、共焦点レーザー顕微鏡等の解析システムと組み合わせることにより新しい遺伝子発現解析ができるだけでなく、最大１，０００，０００にも及ぶ細胞スフェロイドをアレイ化することによりハイスループットで遺伝子関連創薬分野にも利用可能である。
【発明の好適な様態】
【０００７】  以下、本発明を特定するのに使用した用語について具体的に説明しながら、本発明の内容をより明瞭にする。
【０００８】  細胞接着性の低い基材表面にマイクロドメインを作製し、このマイクロドメインに予め内皮細胞のようなフィーダー層となる細胞を接着させた後に肝細胞のような機能細胞を培養することにより、基板上細胞スフェロイドを固定化した長期間培養可能なチップを作製する。このような基板上に固定した細胞スフェロイドに裸のあるいは様々なベクターに包み込んだ遺伝子を導入することにより、導入した遺伝子の長期間発現解析を可能にするキットが提供される。
【０００９】  細胞接着性の低い表面としては水溶性ポリマーをコーティングしたもの、ブラシ状に固定したものや架橋によって膨潤度を抑えたものなどが利用できる。水溶性ポリマーとしてはポリエチレングリコールやポリビニルアルコール、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、デキストラン、セルロースなど、様々なものが利用可能である。また、これらの材料に光や電子線で架橋する官能基を導入した材料も可能である。
【００１０】  マイクロドメインの作成法としては、基材によって様々ではあるが、マスクを利用したプラズマエッチング法、光リソグラフィー法、電子線リソグラフィー法、Ｘ線リソグラフィー法、エキシマレーザー法、やスポッターを用いたアルカリエッチング法、マイクロプリンティング法など、通常のパタン形成方法が可能である。
【００１１】  パタンのサイズは細胞や用途によって様々異なるが、５０ナノメートルから１０ミリメートル程度が可能であり、１マイクロメートルから１ミリメートル程度がよい。さらに好ましくは１０マイクロメートルから５００マイクロメートル程度がさらによい。
【００１２】  このような細胞を目的により１個から１，０００，０００個程度基板上に並べて利用する。アレイ数は目的にもよるが、１〜１００，０００個程度でも可能であり、１〜１０，０００個程度のものが作製できる。
【００１３】  細胞スフェロイドの間隔は様々に設定できるが、５マイクロメートル以上で可能であり、２０マイクロメートル以上が良く、５０マイクロメートル以上がさらによい。
【００１４】  このようにして作製したパタン上に細胞を培養させる。フィーダー細胞としては広範な細胞を利用することができるが、内皮細胞や線維芽細胞、平滑筋細胞等が利用される。フィーダー細胞の上に培養される細胞としては接着性細胞であれば特に限定はないが、肝臓細胞や軟骨細胞、膵臓細胞、脳細胞などの他、幹細胞も培養可能である。
【００１５】  細胞スフェロイドアレイにパタンを形成する方法としては、作製した基板上にまず、通常の方法でフィーダー細胞を播種し、培養する。この時の細胞数は培養基盤に対して１／１０コンフルエント〜１０コンフルエントの細胞数が必要であり、１／４コンフルエント〜４コンフルエントが好ましく、１／２〜２コンフルエントが最適である。培養時間は１時間以上であれば特に制限はないが、通常３時間から３日間、好ましくは１０時間から３０時間程度としている。
【００１６】  フィーダー細胞パタン形成後、スフェロイドにする細胞を播種する。細胞はフィーダー細胞に乗るものであれば特に限定はないが、肝臓や膵臓、腎臓、軟骨、脳など様々な細胞が可能である。また幹細胞も可能である。この時の細胞数は培養基盤に対して１／１０コンフルエント〜１０コンフルエントの細胞数が必要であり、１／４コンフルエント〜４コンフルエントが好ましく、１／２〜２コンフルエントが最適である。培養時間は１時間以上であれば特に制限はないが、通常３時間から３ヶ月間、好ましくは１０時間から１ヶ月間間程度としている。
【００１７】  このようにして調製した細胞スフェロイドアレイにＤＮＡを導入し、発現実験を行うことができる。導入するレポーター遺伝子としては、発現解析可能なＤＮＡなら何でも良いが、たとえばＧＦＰを有するプラスミド、ルシフェラーゼを有するプラスミドなどが利用される。
【００１８】  このような遺伝子を直接細胞アレイに混合することにより、取り込まれた遺伝子の発現を解析する。この場合、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡などで解析することもできる。
【００１９】  遺伝子の取り込み試験にはレトロウイルスのようなベクター以外にポリイオンコンプレックスミセルのような完全合成ベクターに封入したプラスミドやアンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡなどを用いることも可能である。また、マイクロインジェクション法を利用して直接取り込ませるとともに経時的に発現を解析することが可能なキットである。
【実施例】
【００２０】  以下、特定の例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。
【実施例１】
【００２１】メトキシＰＥＧ−ＰＬｙｓ（Ｚ）の製造【００２２】
【化１】
2005278608.tif 000002
【００２３】  アルゴン下、ナスフラスコ中、室温において、ベンゼン凍結乾燥により脱水乾燥したメトキシ−ＰＥＧ−アミン０．１４ｍｍｏｌ（１．７２ｇ）を溶媒ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１７ｍＬに溶解させ、次いでε位をベンジルオキシカルボニル基により保護したＬ−リシンＮ−カルボン酸無水物（Ｌｙｓ（Ｚ）−ＮＣＡ）１１．４ｍｍｏｌ（３．５０ｇ）を溶媒ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３５ｍＬに溶解させたものを加えて４０℃で一日撹拌し、アニオン開環重合を行った。【００２４】  赤外吸収スペクトルによりＬｙｚ（Ｚ）−ＮＣＡ由来の１８５０，１７６０，９２５ｃｍ−１の吸収ピークの消失を確認した後、ＤＭＦをエバポレーションにより取り除いて９０ｍＬのクロロホルムに再溶解させた。【００２５】  この溶液をジエチルエーテル１Ｌに対して滴下することにより再沈殿操作を行い、得られたポリマーの精製を行った。この生成物の収量は４．１２ｇ（８７．３％）であった。精製したポリマーをジメチルスルホキシド−ｄ６中に溶解させ１Ｈ−ＮＭＲによる解析を行った結果、Ｌｙｓ（Ｚ）ユニットは７１と算出された。また、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により分子量分布の解析を行ったところ、１．１３という結果が得られた。
【実施例２】
【００２６】メトキシＰＥＧ−ＰＬＬのＰＬＬ側鎖へのＳＨ基の導入
【化２】
2005278608.tif 000003
【００２７】  ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（Ｚ）（ＰＥＧ分子量１２０００、ＰＬｙｓ（Ｚ）の重合度７１、１２−７１と表記）１ｇに３０％ＨＢｒ／ＣＨ３ＣＯＯＨ２５ｇを添加し、室温で３時間ほど撹拌しながら反応させた。反応終了後、ジエチルエーテルでの再沈を１回、洗浄を２回行った。その後、沈殿したポリマーを純水にて溶解させ、約２００倍量の純水に対して分画分子量１０００の透析膜を用いて透析を行い、塩の除去を行った。透析終了後、サンプルを凍結乾燥して、ＰＥＧ−ＰＬＬ／ＨＢｒを回収した。【００２８】  回収されたサンプルを１０ｍｇ／ｍＬとして重水中に溶解させ、１Ｈ−ＮＭＲで測定し、Ｚ基のピークの消失から脱保護の確認を行った。Ｚ基由来のピークが確認されないことから、脱保護が完全に進行したことが確認された。【００２９】  ついで、脱保護されたＰＥＧ−ＰＬＬ／ＨＢｒ２００ｍｇをアルゴンバブリングにより酸素を除去した５％塩化リチウム／Ｎ−メチルピロリドン（５％ＬｉＣｌ／ＮＭＰ）に２０ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解させ、６６ｍｇのＮ−スクシイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）および溶液の１／１０量のジイソプロピルエチレンアミンを加え、撹拌しながら３時間反応させた。【００３０】  反応終了後、アルゴンバブリングにより酸素を除去したジエチルエーテルに対して再沈を行い、沈殿の生成を確認してから一晩静置した。次に、この溶液の上澄みを除去し、ジエチルエーテルによる洗浄を２回行った。洗浄後、０．０１Ｎ−塩酸を添加し沈殿を溶解させ、この溶液を１００倍量の純水に対して分画分子量２０００の透析膜を用いて透析を行い、塩を除去した。３時間の透析終了後、サンプルを凍結乾燥してピリジルジチオプロピオン酸基（ＰＤＰ）が導入されたポリマー（ＰＥＧ−ＰＬＬ−ＰＤＰ）を回収した。【００３１】  回収したポリマーを重水に溶解させ１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定したところＰＤＰが有するピリジン環由来のピーク強度とＰＥＧ鎖メチレン基由来のピーク強度の比より、ＰＤＰ基のＰＬＬ側鎖への導入率はユニット換算で２０ユニット、２８％と確認された。【００３２】実施例３：レポーター遺伝子としてＧＦＰを有するプラスミドとＰＥＧ−ＰＬＬ−ＰＤＰ（１２−７１−（２０Ｕ−２８％））からなるＳＳ架橋型ＰＩＣミセルベクター（ＰＥＧ−ＰＬＬ−ＰＤＰ−ＧＦＰ）の調製【００３３】  ＰＥＧ−ＰＬＬ−ＰＤＰ  （１２−７１−（２０Ｕ−２８％））  ブロックコポリマー溶液（４ｍｇ／ｍｌ  ｉｎ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ＝７．４）に、（±）−ジチオスレイトール溶液（１０ｍＭ  ｉｎ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を体積比１０／１で添加し，３０分間静置した。ＧＦＰ遺伝子をコードしたプラスミドＤＮＡ溶液（５０μｇ／ｍｌ  ｉｎ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）２ｍｌに、先に調製したブロックコポリマー溶液を添加、総量を３ｍＬとして，一晩静置した。【００３４】  次いで、分画分子量１０００の透析膜を用いて生理食塩水中で計３日間の透析を行った後、無菌的に溶液を回収し、架橋ミセルサンプルとした【００３５】実施例４：合成ベクターの評価に用いる肝細胞スフェロイドアレイの調製【００３６】  ガラス基板（厚さ０．１７ｍｍ、直径２２ｍｍ、円形）上に１００μｍの直径を��する細胞接着性ドメインを１００μｍ間隔で構築した。エチレンオキシドガスにより滅菌を行った後、ウシ大動脈血管内皮細胞（ＢＡＥＣ、ＪＣＲＢより購入、細胞株名：ＨＨ、継代数：２０）をガラス基板面積に対してコンフルエントになるように播種し、１０％ウシ血清および抗生物質を含むダルベッコ改変イーグル培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。【００３７】  一晩の培養後、顕微鏡にてウシ血管内皮細胞が良好なマイクロパターンを形成しているのを確認した後、５週齢のウィスターラットよりコラゲナーゼ潅流法で採取したラット肝実質細胞１０６個をウシ血管内皮細胞マイクロパターン上に追加播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養を行った【００３８】  肝細胞播種から２４時間が経過した時点で培地を取り除き、２価イオン（カルシウムイオンおよびマグネシウムイオン）を含む生理条件リン酸緩衝液で洗浄し、接着していない細胞を取り除いた。洗浄後に位相差顕微鏡観察を行ったところ、ラット肝実質細胞はウシ血管内皮細胞マイクロパターン上選択的に接着し、長期にわたって生体内環境に匹敵する肝特異的機能を示す非分裂性スフェロイドとして培養されていることが確認された。［図１］【００３９】実施例５：肝細胞スフェロイドアレイを用いたＰＥＧ−ＰＬＬ−ＰＤＰ−ＧＦＰミセルの非分裂性細胞へのトランスフェクション実験【００４０】  肝細胞播種から十日が経過した肝細胞スフェロイドアレイに対し、ＤＮＡ換算で６μｇＤＮＡ／ｗｅｌｌとなる濃度でＰＥＧ−ＰＬＬ−ＰＤＰ−ＧＦＰを加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養を行った。その後、定期的に培地交換し、蛍光顕微鏡観察を行うことでＧＦＰの発現状態を追跡したところ、ミセル添加から三日が経過した時点からＧＦＰの発現が確認され始め、発現細胞数は時間の経過と共に増大する傾向が示された［図２］【００４１】  また、ＰＥＧ−ＰＬＬ−ＰＤＰ−ＧＦＰを加えた時点から十日が経過した時点で、ＰＢＳ（＋）により洗浄の後に４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで処理することで細胞を固定化した。固定化した細胞を１％トリトン−Ｘ１００／ＰＢＳで１５分間処理することで細胞膜に穴を穿ち、更にローダミンラベルしたファロイジンを加えて２時間静置することでフィラメント状アクチンを染色した。このサンプルを共焦点レーザー顕微鏡によって確認したところ、ＧＦＰ由来の蛍光はフィラメント状アクチンで取り囲まれるように確認されたことから、ＧＦＰは確かに細胞骨格で取り囲まれ、細胞内で発現していることが示された。［図３］
【図面の簡単な説明】
【図１】肝細胞スフェロイドアレイの位相差顕微鏡写真を示している。
【図２】肝細胞スフェロイドを培養しているウェルにミセルを加えた後の蛍光顕微鏡観察結果を示している。
【図３】ミセルを加えて１０日が経過した時点での共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示している。ＧＦＰ由来の蛍光（緑色）がフィラメント状アクチンのネットワークの中に存在する（細胞内で発現している）ことが確認される。
【図１】
2005278608.tif 000004
【図２】
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【図３】
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