(57)【要約】【課題】メチル置換複素環式化合物から環上にカルボキシル基を有する複素環式化合物を高収率に製造する方法の提供【解決手段】メチル置換複素環式化合物をエキソフィアラ（Exophiala）属に属する微生物の菌体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物で処理する工程を含む方法【特許請求の範囲】
【請求項１】
環上に１個のカルボキシル基を有する複素環式化合物の製造方法であって、メチル置換複素環式化合物をエキソフィアラ（Exophiala）属に属する微生物の菌体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物で処理する工程を含む製造方法。
【請求項２】
該メチル置換複素環式化合物が環上に２個以上のメチル基を有する請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
エキソフィアラ属に属する微生物がExophiala  dermatitidis（Kano）de  Hoogである請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
エキソフィアラ属に属する微生物がExophiala  dermatitidis（Kano）de  Hoog（JCM 12395）である請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
メチル置換複素環式化合物が２，６−ジメチルピリジンであり、環上に１個のカルボキシル基を有する複素環式化合物が６−メチルピコリン酸である請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
メチル置換複素環式化合物が２，６−ジメチルピラジンであり、環上に１個のカルボキシル基を有する複素環式化合物が６−メチル−２−ピラジンカルボン酸である請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法に使用するためのエキソフィアラ属に属する微生物。
【請求項８】
メチル置換複素環式化合物のメチル基をカルボキシル基に酸化する方法であって、メチル置換複素環式化合物をエキソフィアラ属に属する微生物の菌体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物で処理する工程を含む方法。
【請求項９】
環上に２個以上のメチル基を有するメチル置換複素環式化合物のメチル基のうちの１個のメチル基を選択的に酸化する方法であって、メチル置換複素環式化合物をエキソフィアラ属に属する微生物の菌体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物で処理する工程を含む方法。
【請求項１０】
環上に１個のカルボキシル基を有する複素環式化合物の製造方法であって、環上に２個以上のメチル基を有するメチル置換複素環式化合物を微生物の菌体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物で処理する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を利用して環上にカルボキシル基を有する複素環式化合物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
６-メチルピコリン酸、６-メチル−２−ピラジンカルボン酸などの環上にカルボキシル基を有する複素環式化合物（以下、「カルボキシ置換複素環式化合物」という）は医農薬中間体、写真現像処理剤中間体などとして用いられ、産業上有用な化合物である。このような化合物のうち、例えばピリジンカルボン酸については、工業的な製造方法として、アルキルピリジンのオゾン酸化法、すなわち、触媒として硫酸金属塩（硫酸バナジル（ＶＯＳＯ4）、硫酸セリウム（Ｃｅ2(ＳＯ4)3）、硫酸コバルト（ＣｏＳＯ4）、硫酸鉄（ＦｅＳＯ4）、又は硫酸マンガン（ＭｎＳＯ4））を用い、硫酸中でオゾン酸化する方法（非特許文献１、特許文献１）、イミド化合物、コバルト化合物、及びマンガン化合物からなる触媒の存在下、分子状酸素で酸化する方法（特許文献２）が知られている。
【０００３】
従来の工業的製法ではアルキルピリジンとしてアルキル基を２個有するアルキルピリジンを使用する場合には、モノカルボン酸とジカルボン酸が得られ、アルキル基を３個有するアルキルピリジンを使用する場合には、モノカルボン酸とジカルボン酸とトリカルボン酸が得られる。反応は、まずアルキルピリジンからモノカルボン酸が生成し、ついでモノカルボン酸からジカルボン酸が生成するという逐次反応で進行する。モノカルボン酸のみを選択的にかつ高収率に製造する方法はこれまで知られておらず、従来の方法はいずれも改善の余地がある。
【０００４】
２,６-ジメチルピリジンの酸化反応は特許文献２ではモノカルボン酸とジカルボン酸の収率がそれぞれ３７％と４％、２,６-ジメチルピリジンの転化率は５１％であり、特許文献１ではモノカルボン酸のみが得られているが収率は５０％である。また、これらの方法は高温、高圧下で大量の有機溶媒や強酸を用いるため爆発などの危険が伴うほか、触媒の処理等環境への影響も無視できない。
【０００５】
６−メチル−２−ピラジンカルボン酸の合成例としては、２，６−ジメチルピラジンの過マンガン酸カリウム酸化により収率２１％で得られた例（非特許文献２）があるが、これはジカルボン酸との混合物でありモノカルボン酸のみを特異的に収率よく製造するには不適当である。
【特許文献１】特開平１１−３４３２８３号公報
【特許文献２】特開２００１−２５３８３８公報
【非特許文献１】Chemical Abstract 95: 24981h[Zh.Prikl. Khim.,54(2)，450-2(1981)]
【非特許文献２】J．Org．Chem．，67 (2) 556 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、常温、常圧の条件下で実施でき、安全かつ極めて単純な工程で、メチル置換複素環式化合物からカルボキシ置換複素環式化合物を高収率に製造する方法を提供することにある。特に、環上に２個以上のメチル基を有する化合物のメチル基の１個のみを選択的に酸化してモノカルボキシ置換化合物を高収率に製造する方法を提供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決すべく検討を重ねた結果、エキソフィアラ属に属する微生物が、メチル置換複素環式化合物からカルボキシ置換複素環式化合物を生成することを見出した。生産性を高めるため、さらに培養条件、反応条件を鋭意検討した結果、極めて安全かつ単純な方法で、メチル置換複素環式化合物からカルボキシ置換複素環式化合物を製造できること、また環上に２個以上のメチル基を有する複素環式化合物のメチル基の１個のみを選択的に酸化してモノカルボキシ置換複素環式化合物を高収率に製造することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、環上に１個のカルボキシル基を有する複素環式化合物の製造方法であって、メチル置換複素環式化合物をエキソフィアラ（Exophiala）属に属する微生物の菌体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物で処理する工程を含む製造方法を提供する。
【０００９】
本発明の好ましい態様によれば、該メチル置換複素環式化合物が環上に２個以上のメチル基を有する上記の製造方法；エキソフィアラ属に属する微生物がExophiala  dermatitidis（Kano）de  Hoogである上記いずれかの製造方法；エキソフィアラ属に属する微生物がExophiala  dermatitidis（Kano）de  Hoog（JCM 12395）である上記いずれかの製造方法が提供される。
【００１０】
本発明のさらに好ましい態様によれば、メチル置換複素環式化合物が２，６−ジメチルピリジンであり、環上に１個のカルボキシル基を有する複素環式化合物が６−メチルピコリン酸である上記いずれかの製造方法；メチル置換複素環式化合物が２，６−ジメチルピラジンであり、環上に１個のカルボキシル基を有する複素環式化合物が６−メチル−２−ピラジンカルボン酸である上記いずれかの記載の製造方法が提供される。
【００１１】
別の観点からは、上記いずれかの製造方法に使用するためのエキソフィアラ属に属する微生物が提供される。さらに別の観点からは、メチル置換複素環式化合物のメチル基をカルボキシル基に酸化する方法であって、メチル置換複素環式化合物をエキソフィアラ属に属する微生物の菌体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物で処理する工程を含む方法；及び環上に２個以上のメチル基を有するメチル置換複素環式化合物のメチル基のうちの１個のメチル基を選択的に酸化する方法であって、メチル置換複素環式化合物をエキソフィアラ属に属する微生物の菌体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物で処理する工程を含む方法が提供される。
【００１２】
さらに別の観点からは、環上に１個のカルボキシル基を有する複素環式化合物の製造方法であって、環上に２個以上のメチル基を有するメチル置換複素環式化合物を微生物の菌体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物で処理する工程を含む方法が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、安全かつ単純な工程で、メチル置換複素環式化合物からカルボキシ置換複素環式化合物を高収率に製造することができる。特に、環上に２個以上のメチル基を有するメチル置換複素環式化合物のメチル基のうち１個のメチル基のみを選択的に酸化してカルボキシル基に変換できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明方法で用いられる「複素環式化合物」は、単環性、縮合環性のいずれでもよいが、単環性が好ましい。また、芳香族複素環化合物が好ましい。複素環を構成するヘテロ原子としては、例えば窒素、酸素、硫黄等が挙げられるが、窒素が好ましい。複素環を構成するヘテロ原子の数は特に限定されないが、１個または２個が好ましい。
【００１５】
本明細書において「メチル置換複素環式化合物」とは複素環の環上にメチル基を有する化合物を意味する。環上のメチル基の個数は１個又は２個以上のいずれでもよいが、２個以上が好ましい。メチル基の置換位置はとくに限定されないが、ヘテロ原子、好ましくは窒素原子に隣接する炭素原子への置換が好ましい。
【００１６】
特に好ましい「メチル置換複素環式化合物」としては、２，６−ジメチルピリジン、及び２，６−ジメチルピラジンが挙げられる。また、特に好ましい、原料である「メチル置換複素環式化合物」と生成物である「カルボキシ置換複素環式化合物」との組み合わせとしては、２，６−ジメチルピリジンと６−メチルピコリン酸、及び２，６−ジメチルピラジンと６−メチル−２−ピラジンカルボン酸の組み合わせが挙げられる。
【００１７】
本発明の方法は、メチル置換複素環式化合物をエキソフィアラ（Exophiala）属に属する微生物若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物と接触させてカルボキシ置換複素環式化合物を得ることを特徴としている。
【００１８】
本発明で使用される微生物はエキソフィアラ（Exophiala）属に属する微生物であって、例えばExophiala  dermatitidis（Kano）de  Hoogを例示することができる。Exophiala  dermatitidis（Kano）de  Hoogは、土壌より分離された菌株であり、平成１６年２月２０日付けで独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設（日本国埼玉県和光市広沢２番１号）にJCM 12395として寄託されており、出願人は本菌株の保存及び分譲を保証している。なお、本菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１）に寄託することができない微生物に該当している。
【００１９】
Exophiala  dermatitidis（Kano）de  Hoog（JCM 12395）の分類学上の菌学的性質を下記に示す。
菌株の特性
１．コロニー色調は暗色系（オリーブ）である。
２．酵母状である。
３．有隔壁菌糸を有する。ふつうの栄養菌糸と数珠状菌糸の２タイプの菌糸を形成する。
４．分生子形成細胞は栄養菌糸状に形成されるタイプとフリーな酵母状細胞の２タイプである。
５．分生子形成様式はアネロ型、分生子の分離痕は１〜３個、分離痕の幅は約１μmである。
６．分生子は１細胞、亜球形〜楕円形で大きさは２〜２．５μm。
７．２週間の培養検体では有性世代の形成が認められない。
【００２０】
本発明で使用される微生物は、野生株、変異株のいずれでもよい。変異株として、同菌株に突然変異処理を施し、酸化物の生産性が増大したものを選択して用いてもよい。そのような突然変異体としては、例えば、メチル置換複素環式化合物および／またはカルボキシ置換複素環式化合物に対する耐性の向上した変異株、カルボキシ置換複素環式化合物を分解しなくなった変異株、メチル置換複素環式化合物からカルボキシ置換複素環式化合物の生成に関与する酵素類の生産性の高い変異株などが挙げられる。また、本発明に使用される微生物は細胞融合等の細胞工学的手法若しくはＤＮＡクローニング、遺伝子操作等の遺伝子工学的手法により誘導される組換え株等であってもよい。
【００２１】
本発明で使用される微生物は、通常用いられる液体培地で培養することができる。培地の炭素源としては、グルコース、デンプン等の糖類等、菌体が資化し生育できる炭化水素化合物であればいずれでも使用可能である。ｎ−ドデカンを培地に添加すると菌株の生育及びメチル基の酸化活性が向上するため好ましい。窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源、大豆加水分解物、酵母エキス、ペプトン、肉エキスなどの有機窒素源を使用することができる。これらの他に、必要に応じて、無機塩類、微量金属塩、ビタミンなどを添加することもできる。
【００２２】
培養は、嫌気下でも好気下でもいずれも行うことができるが、増殖速度が速いことから好気下での振盪培養が好ましく、また常圧下で行うことができる。培養条件は、用いる微生物や培地組成などに応じてメチル置換複素環式化合物からカルボキシ置換複素環式化合物への製造効率が最大になるように設定すればよい。例えば、好ましくは１５〜４５℃、より好ましくは２５〜３５℃で、好ましくはｐＨ４〜１０、より好ましくはｐＨ５．５〜８．５付近で培養すればよい。また、培養は1日〜１４日間、好ましくは４日〜１０日間行う。
【００２３】
本発明微生物を用いメチル置換複素環式化合物からカルボキシ置換複素環式化合物を生成、蓄積させる工程は、バッチ式で行っても、また、バイオリアクターを用いた連続式で行ってもよい。上記の培養方法で増殖させた菌体をろ過または遠心分離により回収し、得られた菌体をそのまま生理食塩水等に懸濁して反応に供してもよいし、破砕菌体、菌体培養液、粗酵素、精製酵素等の菌体処理物としてもよい。培養菌体または該菌体処理物は、メチル置換複素環式化合物を含む水系溶媒に懸濁させるか、または公知の固定化法で固定化し、固定化物をメチル置換複素環式化合物を含む水系溶媒と接触させることによってカルボキシ置換複素環式化合物を反応液中に蓄積させ、これを採取する。反応時の菌体濃度は乾燥重量として好ましくは１〜１００ｇ／ｌの範囲で行われる。水性溶媒としては、例えば、リン酸緩衝液等の緩衝液を用いることができる。
反応は１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３５℃、さらに好ましくは３０℃付近で、１０分間〜４時間、好ましくは３０分間〜２時間行う。
【００２４】
メチル置換複素環式化合物からカルボキシ置換複素環式化合物を生成するための反応に用いるメチル置換複素環式化合物は０．５〜２０ｍＭ、好ましくは２〜１０ｍＭの濃度で反応系に供給する。供給は一度に添加してもよいが、基質による反応阻害が見られるような場合には少量ずつ分けて添加することもできる。また原料であるメチル置換複素環式化合物の残存濃度を測定し、適宜原料を追加することにより、さらに効率よく反応を行うことができる。
【００２５】
反応液中のカルボキシ置換複素環式化合物は常法に従い回収すればよい。すなわち、反応液をろ過、遠心分離等により処理した後、溶剤抽出等の方法により回収することができる。また溶液に塩酸や硫酸等の酸溶液を加えて酸性化することにより、カルボキシ置換複素環式化合物を回収することも可能であり、クロマトグラフィー等公知の精製方法を適宜併用することができる。
【００２６】
なお、本発明の製造法において、カルボキシ置換複素環式化合物の検出及び定量は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって行えばよい。すなわち、オクタデシル基を有したシリカゲルパックドカラムなどを固定相に用い、リン酸水溶液とアセトニトリルの混合物を移動相とする一般的な逆相クロマトグラフィーによって分析が可能である。検出は紫外部分光検出器によって波長２３０ｎｍ付近で行えばよい。
【実施例】
【００２７】
以下に代表的な実施例を示し本発明の具体的な説明を行うが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００２８】
（参考例）Exophiala  dermatitidis（Kano）de  Hoog（JCM 12395）の土壌からの分離
メチル基酸化活性を有する微生物を取得するために、表１に示すアルカンをそれぞれ単一炭素源とした表２の組成の培地を用いてアルカン資化性菌を土壌から分離した。使用したそれぞれのアルカンにつき表１に示す数の資化性菌を分離した。
【００２９】
【表１】
2005237206.tif 000002
【００３０】
【表２】
2005237206.tif 000003
【００３１】
【表３】
2005237206.tif 000004
【００３２】
得られたアルカン資化性菌それぞれの休止菌体を調製し、２，６−ジメチルピリジン（５ｍＭ）及びリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０；１００ｍＭ）を含む５ｍｌの懸濁液とした。該懸濁液の３０℃で２４時間の振とう反応を行い、酸化物の生成をＨＰＬＣにより分析することにより酸化活性を評価した。評価した微生物の中で高活性を示したＤＡ５５０１−２株を選択した。選択したＤＡ５５０１−２株は、形態学的情報からExophiala  dermatitidis（Kano）de  Hoogに属する微生物であることがわかった。
【００３３】
（例１）
表４に示す培地を調製した。
【表４】
2005237206.tif 000005
【００３４】
表４の培地３０ｍｌにExophiala  dermatitidis（Kano）de  Hoog（JCM 12395）を接種し、３０℃で５日間、好気的条件で培養した。培養後、遠心分離により菌体を集め、これを濃度０．１Ｍ、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液に懸濁、洗浄し、再度同緩衝液に懸濁して菌体濃縮液２ｍｌを得た。
【００３５】
この菌体濃縮液２ｍｌと濃度１Ｍ、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液０．５ｍｌと２，６−ジメチルピリジン２．５ｍｌを混合し、全容が５ｍｌで２，６−ジメチルピリジン濃度が５ｍＭの反応液を調製し、３０℃で３時間の反応を行った。反応終了後、反応液のＨＰＬＣ分析を行ったところ原料である２，６−ジメチルピリジンは全て消失し、６−メチルピコリン酸に相当する単一ピークのみが観察された。このピークを分取しＮＭＲ測定したところ、６−メチルピコリン酸に一致した。変換率は８９％であった。
【００３６】
（例２）
２，６−ジメチルピリジンに代えて２，６−ジメチルピラジンを用いた以外は例１と同様の操作を行った。その結果、実施例１と同様に２，６−ジメチルピラジンが消失し、代わりに生成した単一ピークを分取し、ＮＭＲ測定したところ、６−メチル−２−ピラジンカルボン酸と同定された。