(57)【要約】    【課題】  安価な培地成分を用いてバクテリアセルロースを提供すること。    【解決手段】  タンパク質成分の一部として加水分解コラーゲンを含むことを特徴とするバクテリアセルロース生産培地および該培地を用いるバクテリアセルロースの生産方法を提供する。【選択図】図３
2005080571.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物培養用標準培地において、タンパク質成分の一部として加水分解コラーゲンを含むことを特徴とするバクテリアセルロース生産培地。
【請求項２】
培地中の加水分解コラーゲン濃度が０．５〜２．０％であることを特徴とする請求項１に記載の培地。
【請求項３】
培地中の加水分解コラーゲン濃度が０．５％であることを特徴とする請求項２に記載の培地。
【請求項４】
さらにタンパク質成分としてイーストエクストラクトを含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の培地。
【請求項５】
標準培地がヘストリン−シュラム標準培地であることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の培地。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載の培地中でセルロース生産菌を培養することを特徴とするバクテリアセルロースの生産方法。
【請求項７】
セルロース生産菌が酢酸菌であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物によるバクテリアセルロース生産のための培地構成成分に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは主に高等植物によってつくられるが、微生物の中にもセルロースをつくるものが知られている。そのような微生物としては、Acetobacter属、Agrobacterium属、Rhizobium属、Sarcina属、Pseudomonas属、Achromobacter属、Alcaligenes属、Aerobacter属、Azotobacter属などがある。このなかでも酢酸菌、Acetobacter属の一種はセルロースを菌体外に大量に生産することが知られている。
【０００３】
これらの微生物により産生されるセルロースは、微生物セルロースまたはバクテリアセルロースとよばれている。バクテリアセルロースは、木材中のセルロースと異なりヘミセルロースやリグニンをまったく含まない純粋なセルロースである。また、高結晶性、高弾性、高吸水性等すぐれた物理的性質をもち、さまざまな工業材料としての可能性や食品材料としての応用が期待されている。
【０００４】
バクテリアセルロースは膜の網目構造を利用した分離膜や高強度を利用した音響振動板、分散化したセルロースの水分保持機能を利用した添加剤などへの利用が可能であることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
また、効率的な生産ができるように、回転円板型、攪拌型、連続紡糸型などさまざまな形態のバイオリアクターが検討されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
生分解性高分子化合物であるセルロースは生活に密接な関係があるため生産量が増えつつあるが、地球環境保全の観点からセルロース生産の樹木依存性を低め、バイオマスによるセルロース生産を増やすことが望まれている。しかし、酢酸菌などのバクテリアにより生産されるセルロースは、生産コストが高く、商品化することは難しい。
【０００７】
生産性を改善するために、糖蜜蝋やパルプスラッジなどの安価に入手できる原料の利用や遺伝子組換えによる育種改良が検討されているが、いまだに生産性に見合う手段は見出されていない。
【０００８】
生産性の向上、低環境負荷型条件下での製品性能の改善も必要であるが、コスト低減にはまず原材料のコストダウンを考える必要がある。中でも培地構成成分はそれぞれ大量に使われる上、高価であるため、バクテリアセルロース製造コストを押し上げる要因となっている。したがって、一成分でも低価格のものを用いることができれば生産コスト低減に大きく貢献できる。
【０００９】
しかし、安易に培地成分を変えるとバクテリアの変態が起こり、生産多糖の糖残基構成や立体構造まで変わってしまう危険性がある。
【特許文献１】特開平１０−１９５７１３号公報
【非特許文献１】セルロース学会編、「セルロースの事典」、初版、朝倉書店、２０００年１１月１０日、ｐ．４３−４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は安価に高品質のバクテリアセルロースを生産するための方法および該方法に用いられる培地を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、原材料としてタンパク質成分に的をしぼり、供給量、価格、品質などを種々検討の結果、脊椎動物結合組織の主要タンパク質であるコラーゲンを加熱変性させたゼラチンに注目した。このゼラチンを酸または酵素で加水分解した水溶性ペプチド（以下、加水分解コラーゲンと称する）を含有する培地でセルロース生産菌を培養することにより、安価に高品質のバクテリアセルロースを生産することができることを見出した。
【００１２】
即ち、本発明は、微生物培養用標準培地において、タンパク質成分の一部として加水分解コラーゲンを含むことを特徴とするバクテリアセルロース生産培地を提供する。
【００１３】
本明細書において「加水分解コラーゲン」とは、ゼラチンを酸または酵素によって加水分解した水溶性ペプチドのことをいう。ゼラチンは市販のものであってもよいし、動物、例えば、豚皮、牛皮、牛骨、魚皮などから得たコラーゲンを変性させたものでのよい。ゼラチンの加水分解に用いる酸としては、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、蟻酸などが挙げられ、酵素としては、コラゲナーゼ（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶなど）、トリプシンなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。加水分解によって生じた水溶性ペプチドの分子量は５００〜２０００程度のものが好ましい。
【００１４】
培地中の加水分解コラーゲン濃度は、０．５〜２．０（Ｗ／Ｖ）％が好適であるが、より生産コストを安価にするためには０．５（Ｗ／Ｖ）％が特に好適である。
【００１５】
なお、培地中のタンパク質成分の総量は使用するセルロース生産菌の種類に応じて適宜定めればよく、特に限定されない。例えば、酢酸菌を用いる場合は総濃度０．２〜５．０％、好ましくは、０．５〜２．０％である。
【００１６】
加水分解コラーゲンと組み合わせて用いるタンパク質成分としては、通常微生物の培地に添加することが知られている成分、例えば、市販されているイーストエクストラクト、バクトペプトンなどが挙げられる。特にイーストエクストラクトと共に用いるのが好ましい。標準培地に含まれるタンパク質成分として、バクトペプトンに代えて加水分解コラーゲンを用い、イーストエクストラクトと加水分解コラーゲンを組合せて用いる場合に特に好適にバクテリアセルロースが生産される。
【００１７】
タンパク質成分として、例えば、微生物培養のための標準培地において、従来から用いられているバクトペプトンに代えて、加水分解コラーゲンを用いても、従来から用いられている培地で生産されたバクテリアセルロースと同じ構造および物性を示す多糖が生産される。即ち、加水分解コラーゲンを用いることによってセルロース生産菌に変態が起きて異なる糖残基構成・立体構造のバクテリアセルロースが生産されることはない。
【００１８】
本発明において、新たなタンパク質成分として用いられる加水分解コラーゲンは、安価なゼラチンから入手することが出来る。したがって、本発明の培地を用いることにより、生産コストの削減をはかることができる。また、本発明の培地を用いて生産されるバクテリアセルロースの品質が従来のものに比べて低下することはない。即ち、本発明によって、低コストで高品質のバクテリアセルロースの生産が達成される。
【００１９】
また、本発明は、上記のタンパク質成分の一部として加水分解コラーゲンを含む培地中でセルロース生産菌を培養することを特徴とするバクテリアセルロースの生産方法を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
タンパク質成分の一部として安価なゼラチン由来の加水分解コラーゲンを含む培地を用いてセルロース生産菌を培養することにより、低いコストで高品質のバクテリアセルロースが得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
培養に用いる微生物は、セルロースを生産する菌であれば特に限定されず、上述のセルロース生産菌のいずれを用いてもよい。特に酢酸菌、なかでもアセトバクター・キシリナム(Acetobacter Xylinum)が好適である。
【００２２】
セルロース生産菌が、加水分解コラーゲン存在下で良好に増殖するものであればそのまま培養すればよい。好ましくは、セルロース生産菌を加水分解コラーゲンを含む培地で継代培養して順化させる。継代培養によって順化させることにより、加水分解コラーゲンに親和性の高いセルロース生産菌が得られる。
【００２３】
本発明において用いる微生物培養用標準培地としては、用いる微生物に応じて適宜選択すればよい。例えば酢酸菌を用いる場合は、例えば、炭素源（例えばグルコース）、バクトペプトン、イーストエクストラクト、第一リン酸ナトリウム、クエン酸からなるヘストリン−シュラム(Hestrin-Schramm)（以下ＨＳと称する）標準培地において、タンパク質成分としてバクトペプトンに代えて加水分解コラーゲンを含む培地を挙げることができる。これは、タンパク質成分として、本発明の加水分解コラーゲンと市販のイーストエクストラクトを組み合わせて用いるものである。本発明の培地はこれに限定されるものではなく、従来から知られているセルロース生産菌によってバクテリアセルロースを生産させることのできる公知の微生物培養用標準培地のタンパク質成分の一部を加水分解コラーゲンと置き換えたものがいずれも好適に用いられる。
【００２４】
培養条件としては、使用するセルロース生産菌が生育できる条件を適宜選択すればよい。例えば、酢酸菌を生産菌として用いる場合は、培地のｐＨは３〜７、好ましくは６〜７付近に制御すればよく、培養温度は室温、例えば、１０〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃の範囲とすればよい。培養期間は、酢酸菌を用いる場合、約７日間でゲル状のバクテリアセルロース膜が得られる。
【００２５】
培地表面に生成したバクテリアセルロースは、次いで洗浄する。洗浄は、例えば、１（Ｗ／Ｖ）％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液中で５時間還流洗浄、次いで４（Ｗ／Ｖ）％水酸化ナトリウム水溶液中で５時間還流洗浄することにより、充分に洗浄するのが好ましい。その後乾燥させることにより、バクテリアセルロース膜が得られる。
【００２６】
本発明の方法で製造されたバクテリアセルロースを培地から分離回収すると同時に直接フィラメント状またはシート状に成形することにより、生産工程が簡略化され、さらにコストの低減をはかることもできる。
【００２７】
連続培養装置を用いてバクテリアセルロースフィラメントまたはシートを製造する方法を簡単に説明する。
【００２８】
培養液を培養容器に連続的に添加しつつ静置培養を行い、培養液上層にバクテリアセルロースを集積させる。ここで、培養液上層に生成したゲル状バクテリアセルロース薄層を所望の太さとなるように伸長しつつ収束することにより、フィラメントが製造される。また。所望の幅になるようにゲルを緊張下で巻き取ることにより、所望のシートが製造される。
【００２９】
このように巻き取り装置付き連続培養装置を用いると、培養器表面から直接バクテリアセルロースをフィラメントまたはシートとして収穫できるため、バクテリアセルロースフィラメントまたはシートの生産コストをさらに低くすることができる。
【００３０】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００３１】
（加水分解コラーゲンの製造）
以下の実施例において、ゼラチンは、市販されているものを用いた。加水分解コラーゲンとしては、ゼラチンを酢酸で加水分解した水溶性のペプチドを用いるか、あるいは市販されているものを用いた。
【００３２】
（継代培養）
寒天培地中−２０℃で保存した酢酸菌(Acetobacter xylinum ATCC-23769、10245、53582株)を、炭素源としてグルコースを含むＨＳ培地（表１）で立ち上げた。次いでタンパク質成分として加水分解コラーゲン（濃度０〜２．０％）およびイーストエクストラクト（濃度０．５％）を含むＨＳ培地中に該酢酸菌０．５ｍｌを接種した。図１に示すように、０．５ｍｌの酢酸菌培養液を５０ｍｌのエルレンマイヤーに入れた１５ｍｌの新鮮な培地に継代することを３−６回繰り返した。繰り返し継代培養することにより、加水分解コラーゲンに親和性の高い酢酸菌を得た（培養条件は以下の通りであった：温度２８℃、ｐＨ６．０、期間３日／継代）。
【００３３】
【表１】
2005080571.tif 000003
【００３４】
（本培養）
表１の培地のタンパク質成分であるバクトペプトンおよびイーストエクストラクトを以下の表２および表３のように、様々な濃度のバクトペプトン、イーストエクストラクト、加水分解コラーゲン、Aminocall（Ｇ５５０またはＧ１０００）に変化させた。これら培地各１５ｍｌを５０ｍｌのエルレンマイヤーに入れ、上記のようにして継代培養した酢酸菌０．５ｍｌを加えて２８℃で７日間静置培養した（図１を参照）。表２におけるタンパク質成分は、表１におけるバクトペプトンの代わりに用いたものであり、表３におけるタンパク質成分は、表１におけるイーストエクストラクトの代わりに用いたものである。その他の成分は表１の成分と同じものを用いた。
【００３５】
【表２】
2005080571.tif 000004
【００３６】
表中、「バクトペプトン（対照）」とは、Difco社から市販されているものである。
「加水分解コラーゲン（ＰＲＡ）」とは、（株）ニッピ製ペプチドＰＲＡを、酢酸で加水分解処理した、水溶性のものである。
「加水分解コラーゲン（ＡＦＣ）」とは、（株）ニッピ製加水分解コラーゲンＡＦＣである。
「Aminocall（Ｇ５００）」とは、サンオリエント化学（株）製分子量５００のペプチドである。
「Aminocall（Ｇ１０００）」とは、サンオリエント化学（株）製分子量１０００のペプチドである。
【００３７】
【表３】
2005080571.tif 000005
表中、「イーストエクストラクト（対照）」とは、Difco社から市販されているものである。
「イーストエクストラクト（Sigma)」とは、Sigma社から市販されているものである。
「Aminocall（Ｇ５００）」とは、サンオリエント化学（株）製分子量５００のペプチドである。
「Aminocall（Ｇ１０００）」とは、、サンオリエント化学（株）製分子量１０００のペプチドである。
【００３８】
培地表面に生成した多糖ゲルを１（Ｗ／Ｖ）％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液中で５時間、次いで４（Ｗ／Ｖ）％水酸化ナトリウム水溶液で５時間それぞれ還流洗浄を行い、充分水洗後、ろ紙に挟んで乾燥させた。
【００３９】
（収率およびコスト）
図２は、標準ＨＳ培地において、バクトペプトンとイーストエクストラクとを上記の様々の培地成分に代えた場合の収量を示す。右側の軸はイーストエクストラクト対応物を、左側の軸はバクトペプトン対応物を示す。対照のバクトペプトンに代えて加水分解コラーゲンＰＲＡ（０．５−２．０％）を用いても標準ＨＳ培地と同様の収率が得られることが理解される。Aminocall（Ｇ５５０またはＧ１００）またはSigma社製イーストエクストラクトを用いても収率にあまり影響はなかった。
【００４０】
図３は、標準ＨＳ培地において、バクトペプトンとイーストエクストラクとを上記の様々の培地成分に代えた場合のコストを示す。左右の軸については図２と同様である。バクトペプトンに代えて加水分解コラーゲン（ＰＲＡ０．５％〜２．０％、特に、ＰＲＡ０．５％とSigma社製イーストエクストラクト０．５％の組合せ）を用いた場合、コストが従来の標準ＨＳ培地に比べてかなり低減される。Aminocall（Ｇ５５０またはＧ１０００）はコスト削減に有効ではなかった。
【００４１】
図４は、イーストエクストラクト（左（対照）はDifco社製、右（Sigma)はSigma社製）０．５％に、対照のバクトペプトン０．５％または加水分解コラーゲンＰＲＡ０．５％を組み合わせた場合の収量（左表）とコスト（右表）を示す。加水分解コラーゲンを用いた場合、イーストエクストラクトの種類（供給源）にかかわらず、バクトペプトンを用いた場合と同様の収率が得られると同時に、コストがかなり低減される。
【００４２】
図５は、イーストエクストラクト(Difco社製）０．５％に、対照のバクトペプトン、加水分解コラーゲンＰＲＡ、ＡＦＣ、Aminocall（Ｇ５５０またはＧ１０００）のいずれかを組み合わせた場合の収量（左表）とコスト（右表）を示す。加水分解コラーゲンＰＲＡを用いた場合、バクトペプトンを用いた場合と同様の収率が得られると同時に、コストがかなり低減される。ＡＦＣは、収率およびコストにあまり影響を及ぼさなかった。
【００４３】
（多糖の分析）
得られた多糖フィルムについてＦＴ−ＩＲ、ＸＲＤ、セルラーゼ(EC3.2.1.4)による加水分解特性等の試験を行って、生産された多糖の特性を確かめた。結果を図６〜８に示す。
【００４４】
図６は、培地を様々に変えた場合に得られた多糖のＦＴ−ＩＲ分析、図７は、ＸＲＤパターン、図８はセルラーゼによる加水分解物の高速液体クロマトグラフィーによる分析結果を示す。それぞれの場合において、対照の標準ＨＳ培地を用いた場合と比べて、ＦＴ−ＩＲスペクトル、ＸＲＤパターンおよびクロマトパターンに差は見られなかった。したがって、培地成分の１つであるバクトペプトンを加水分解コラーゲンに変えても生成するバクテリアセルロースの糖残基組成や構造は変化しないといえる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明によるセルロース生産菌、アセトバクター・キシリナム(Acetobacter Xylinum)の継代培養工程および本培養工程を示す図である。
【図２】タンパク質成分を様々に変化させた場合のバクテリアセルロースの収量を示す図である。
【図３】タンパク質成分を様々に変化させた場合のバクテリアセルロース生産のコストを示す図である。
【図４】イーストエクストラクトとともに、バクトペプトンまたは加水分解コラーゲン（ＰＲＡ）をタンパク質成分として用いた場合の、バクテリアセルロースの収量および生産コストを比較する図である。
【図５】イーストエクストラクトとともに、バクトペプトン、加水分解コラーゲン（ＰＲＡまたはＡＦＣ）、Aminocall（Ｇ５５０またはＧ１０００）をタンパク質成分として用いた場合の、バクテリアセルロースの収量および生産コストを比較する図である。
【図６】タンパク質成分を様々に変化させた場合に得られるバクテリアセルロースのＦＴ−ＩＲ分析を示す図である。
【図７】タンパク質成分を様々に変化させた場合に得られるバクテリアセルロースのＸＲＤパターンを示す図である。
【図８】タンパク質成分を様々に変化させた場合に得られるバクテリアセルロースのセルラーゼによる加水分解物のクロマトパターンを示す図である。
【図１】
2005080571.tif 000006
【図２】
2005080571.tif 000007
【図３】
2005080571.tif 000008
【図４】
2005080571.tif 000009
【図５】
2005080571.tif 000010
【図６】
2005080571.tif 000011
【図７】
2005080571.tif 000012
【図８】
2005080571.tif 000013