(57)【要約】      （修正有）【課題】熱などに安定化なホスホリパーゼＤ及びホスホリパーゼＤの安定化方を提供すること。【解決手段】ストレプトミセス由来の特定なアミノ酸配列若しくはその派生配列において、ａ）ストレプトミセス由来の特定なアミノ酸配列の４２６位に対応するアミノ酸と、グリシン、フェニルアラニン、チロシン若しくはヒスチジンとの置換及び／又は４３３位に対応するアミノ酸と、スレオニン、セリン、システイン、アルギニン、ヒスチジン若しくはアスパラギン酸との置換を導入する、ＰＬＤの安定化方法；ストレプトミセス由来の特定なアミノ酸配列若しくはその派生配列において、前記ａ）及び／又はｂ）と、ｃ）１８８位に対応するアミノ酸と、フェニルアラニン、バリン、トリプトファン若しくはセリンとの置換とを導入する、ホスホリパーゼＤの安定化方法；並びに該安定化方法により得られる、安定化型ホスホリパーゼＤ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによりアライメントし、算出された配列同一性が、少なくとも５０％であり、かつホスホリパーゼＤ活性を呈するポリペプチドのアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有し、かつホスホリパーゼＤ活性を呈するポリペプチドのアミノ酸配列、
からなる群より選ばれた１つのアミノ酸配列において、
ａ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４２６位に対応するアミノ酸残基と、グリシン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基及びヒスチジン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換、及び／又は
ｂ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４３３位に対応するアミノ酸残基と、スレオニン残基、セリン残基、システイン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びアスパラギン酸残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換
を導入することを特徴とする、ホスホリパーゼＤの安定化方法。
【請求項２】
下記（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによりアライメントし、算出された配列同一性が、少なくとも５０％であり、かつホスホリパーゼＤ活性を呈するポリペプチドのアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有し、かつホスホリパーゼＤ活性を呈するポリペプチドのアミノ酸配列、
からなる群より選ばれた１つのアミノ酸配列において、
ａ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４２６位に対応するアミノ酸残基と、グリシン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基及びヒスチジン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換、及び／又は
ｂ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４３３位に対応するアミノ酸残基と、スレオニン残基、セリン残基、システイン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びアスパラギン酸残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換
と、
ｃ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における１８８位に対応するアミノ酸残基と、フェニルアラニン残基、バリン残基、トリプトファン残基及びセリン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換
とを導入することを特徴とする、ホスホリパーゼＤの安定化方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載のホスホリパーゼＤの安定化方法により得られる、安定化型ホスホリパーゼＤ。
【請求項４】
下記（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによりアライメントし、算出された配列同一性が、少なくとも５０％であり、かつホスホリパーゼＤ活性を呈するポリペプチドのアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有し、かつホスホリパーゼＤ活性を呈するポリペプチドのアミノ酸配列、
からなる群より選ばれた１つのアミノ酸配列において、
ａ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４２６位に対応するアミノ酸残基と、グリシン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基及びヒスチジン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換、及び／又は
ｂ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４３３位に対応するアミノ酸残基と、スレオニン残基、セリン残基、システイン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びアスパラギン酸残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換
を有する、安定化型ホスホリパーゼＤ。
【請求項５】
下記（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによりアライメントし、算出された配列同一性が、少なくとも５０％であり、かつホスホリパーゼＤ活性を呈するポリペプチドのアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有し、かつホスホリパーゼＤ活性を呈するポリペプチドのアミノ酸配列、
からなる群より選ばれた１つのアミノ酸配列において、
ａ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４２６位に対応するアミノ酸残基と、グリシン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基及びヒスチジン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換、及び／又は
ｂ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４３３位に対応するアミノ酸残基と、スレオニン残基、セリン残基、システイン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びアスパラギン酸残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換、
と、
ｃ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における１８８位に対応するアミノ酸残基と、フェニルアラニン残基、バリン残基、トリプトファン残基及びセリン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換
とを有する、安定化型ホスホリパーゼＤ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホリパーゼＤの安定化方法及び安定化型ホスホリパーゼに関する。さらに詳しくは、本発明は、安定性、特に、優れた熱安定性を発揮するホスホリパーゼＤの創製に有用なホスホリパーゼＤの安定化方法、及びリン脂質の合成、リン脂質の各種誘導体の合成等において、優れた安定性を示す安定化型ホスホリパーゼＤに関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホリパーゼＤは、植物、微生物、哺乳動物細胞等に存在し、リン脂質をホスファチジン酸と塩基（例えば、コリン、エタノールアミン等）とに加水分解する酵素であり、エタノール等のアルコール存在下では、ホスファチジル基転移反応を触媒する酵素である。
【０００３】
また、前記ホスホリパーゼＤは、好中球の機能の活性化等を引き起こすことが知られている。
【０００４】
また、前記ホスホリパーゼＤによるリン脂質の加水分解反応又はホスファチジル基転位反応は、例えば、リン脂質の誘導体の製造等に利用されている（特許文献１等）。
【０００５】
しかしながら、前記ホスホリパーゼＤは、リン脂質の合成、リン脂質の各種誘導体の合成等に用いるには、熱等に対して不安定であり、酵素の寿命が短いという欠点がある。
【特許文献１】特表２０００‐５１３５８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ホスホリパーゼの安定性を向上させること、化粧品基材、医薬品等に有用な、リン脂質、該リン脂質の誘導体の製造に有用な性質、特に、安定性を呈するホスホリパーゼＤを得ること等を可能にする、ホスホリパーゼＤの安定化方法を提供することを目的とする。また、本発明は、化粧品基材、医薬品等に有用な、リン脂質、該リン脂質の誘導体の製造に有用な性質、特に、安定性を発揮する安定化型ホスホリパーゼＤを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕  下記（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによりアライメントし、算出された配列同一性が、少なくとも５０％であり、かつホスホリパーゼＤ活性を呈するポリペプチドのアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有し、かつホスホリパーゼＤ活性を呈するポリペプチドのアミノ酸配列、
からなる群より選ばれた１つのアミノ酸配列において、
ａ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４２６位に対応するアミノ酸残基と、グリシン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基及びヒスチジン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換、及び／又は
ｂ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４３３位に対応するアミノ酸残基と、スレオニン残基、セリン残基、システイン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びアスパラギン酸残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換
を導入することを特徴とする、ホスホリパーゼＤの安定化方法、
〔２〕  下記（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによりアライメントし、算出された配列同一性が、少なくとも５０％であり、かつホスホリパーゼＤ活性を呈するポリペプチドのアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有し、かつホスホリパーゼＤ活性を呈するポリペプチドのアミノ酸配列、
からなる群より選ばれた１つのアミノ酸配列において、
ａ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４２６位に対応するアミノ酸残基と、グリシン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基及びヒスチジン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換、及び／又は
ｂ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４３３位に対応するアミノ酸残基と、スレオニン残基、セリン残基、システイン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びアスパラギン酸残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換
と、
ｃ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における１８８位に対応するアミノ酸残基と、フェニルアラニン残基、バリン残基、トリプトファン残基及びセリン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換
とを導入することを特徴とする、ホスホリパーゼＤの安定化方法、
〔３〕  前記〔１〕又は〔２〕記載のホスホリパーゼＤの安定化方法により得られる、安定化型ホスホリパーゼＤ、
〔４〕  下記（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによりアライメントし、算出された配列同一性が、少なくとも５０％であり、かつホスホリパーゼＤ活性を呈するポリペプチドのアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有し、かつホスホリパーゼＤ活性を呈するポリペプチドのアミノ酸配列、
からなる群より選ばれた１つのアミノ酸配列において、
ａ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４２６位に対応するアミノ酸残基と、グリシン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基及びヒスチジン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換、及び／又は
ｂ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４３３位に対応するアミノ酸残基と、スレオニン残基、セリン残基、システイン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びアスパラギン酸残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換
を有する、前記〔３〕記載の安定化型ホスホリパーゼＤ、並びに
〔５〕  下記（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによりアライメントし、算出された配列同一性が、少なくとも５０％であり、かつホスホリパーゼＤ活性を呈するポリペプチドのアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有し、かつホスホリパーゼＤ活性を呈するポリペプチドのアミノ酸配列、
からなる群より選ばれた１つのアミノ酸配列において、
ａ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４２６位に対応するアミノ酸残基と、グリシン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基及びヒスチジン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換、及び／又は
ｂ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４３３位に対応するアミノ酸残基と、スレオニン残基、セリン残基、システイン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びアスパラギン酸残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換、
と、
ｃ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における１８８位に対応するアミノ酸残基と、フェニルアラニン残基、バリン残基、トリプトファン残基及びセリン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換
とを有する、前記〔３〕又は〔４〕記載の安定化型ホスホリパーゼＤ、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のホスホリパーゼＤの安定化方法によれば、ホスホリパーゼＤの安定性を向上させることができ、化粧品基材、医薬品等に有用な、リン脂質、該リン脂質の誘導体の製造に有用な性質、特に、安定性、具体的には、優れた熱安定性を呈するホスホリパーゼＤを得ることができるという優れた効果を奏する。また、本発明の安定化型ホスホリパーゼＤによれば、化粧品基材、医薬品等に有用な、リン脂質、該リン脂質の誘導体の製造に有用な性質、特に、安定性、具体的には、優れた熱安定性を発揮するという優れた効果を奏する。また、本発明によれば、ホスホリパーゼＤの至適温度の向上を図ることができ、反応温度の上昇により、基質溶解度の向上が達成されるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、低い熱安定性を呈するホスホリパーゼＤ（Ｋ１ＰＬＤ）と、高い熱安定性を呈するホスホリパーゼＤ（ＴＨ−２ＰＬＤ）とを用い、種々のキメラ酵素を作製した場合、高い熱安定性を呈するＴＨ−２ＰＬＤに由来する部分の比率に関係なく、高い熱安定性を示すキメラ酵素と低い熱安定性を示すキメラ酵素とを生じさせうる要因となるアミノ酸残基が存在するという本発明者らの驚くべき知見及び同程度の高い熱安定性を呈するホスホリパーゼＤ（Ｋ６ＰＬＤ及びＴＨ−２ＰＬＤ）とを用い、種々のキメラ酵素を作製した場合でも、各キメラ酵素間で熱安定性の顕著な差が生じる要因となるアミノ酸残基が存在するという本発明者らの驚くべき知見に基づく。
【００１０】
なお、前記ＴＨ−２ＰＬＤは、ストレプトマイセス・セプタタス  ＴＨ−２(Streptomyces septatus TH-2)株由来のホスホリパーゼＤであり、Ｋ１ＰＬＤは、ストレプトマイセス・ハルステディ  Ｋ１(Streptomyces halstedii K1)由来のホスホリパーゼＤであり、Ｋ６ＰＬＤは、ＰＬＤは、ストレプトマイセス・ハルステディ  サブスピーシーズ  スカビーズ  Ｋ６(Streptomyces halstedii subsp. scabies K6)株由来のホスホリパーゼＤである。
【００１１】
本発明のホスホリパーゼＤの安定化方法は、前記ＴＨ−２ＰＬＤのアミノ酸配列における４２６位に対応するアミノ酸残基を、グリシン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基及びヒスチジン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基に置換すること及び／又は４３３位に対応するアミノ酸残基をスレオニン残基、セリン残基、システイン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びアスパラギン酸残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基に置換することにより、ホスホリパーゼＤを安定化させる方法である。
【００１２】
なお、本明細書において、「（１８８、４２６又は４３３）位に対応するアミノ酸残基」とは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を参照配列とし、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによりアライメントされた配列において、配列番号：２に示されるアミノ酸配列における特定の位置（１８８位、４２６位又は４３３位）に対応する残基としてアラインメントされた残基を意味する。
【００１３】
本発明の安定化方法は、具体的には、下記（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによりアライメントし、算出された配列同一性が、少なくとも５０％であり、かつホスホリパーゼＤ活性を呈するポリペプチドのアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有し、かつホスホリパーゼＤ活性を呈するポリペプチドのアミノ酸配列、
からなる群より選ばれた１つのアミノ酸配列において、
ａ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４２６位に対応するアミノ酸残基と、グリシン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基及びヒスチジン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換、及び／又は
ｂ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４３３位に対応するアミノ酸残基と、スレオニン残基、セリン残基、システイン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びアスパラギン酸残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換
を導入することを特徴とする方法〔方法１ともいう〕である。
【００１４】
本発明の安定化方法においては、野生型ホスホリパーゼのアミノ酸配列において、配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４２６位に対応するアミノ酸残基を、グリシン、フェニルアラニン残基、チロシン残基及びヒスチジン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基に置換すること及び／又は配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４３３位に対応するアミノ酸残基を、スレオニン残基、セリン残基、システイン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びアスパラギン酸残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基に置換することを１つの大きな特徴とする。したがって、本発明の安定化方法によれば、ホスホリパーゼＤに対して、野生型ホスホリパーゼＤに比べ、より高い安定性、具体的には、高い熱安定性を付与させることができるという優れた効果を発揮する。そのため、本発明の安定化方法によれば、化粧品基材、医薬品等に有用な、リン脂質、該リン脂質の誘導体の製造に有用な性質、特に、安定性を呈するホスホリパーゼＤ（以下、「安定化型ホスホリパーゼＤ」ともいう）を得ることができるという優れた効果を発揮する。
【００１５】
さらに、本発明の安定化方法によれば、前記４２６位に対応するアミノ酸残基及び／又は前記４３３位に対応するアミノ酸残基に加え、野生型ホスホリパーゼのアミノ酸配列において、配列番号：２に示されるアミノ酸配列における１８８位に対応するアミノ酸残基を、フェニルアラニン残基、バリン残基、トリプトファン残基及びセリン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基にさらに置換することにより、より高い安定性、具体的には、高い熱安定性を呈する安定化型ホスホリパーゼＤを得ることができる。
【００１６】
すなわち、前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１つのアミノ酸配列において、前記ａ）の置換及び／又は前記ｂ）の置換と、
ｃ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における１８８位に対応するアミノ酸残基と、フェニルアラニン残基、バリン残基、トリプトファン残基及びセリン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換
とを導入することを特徴とする方法〔方法２ともいう〕も本発明に含まれる。
【００１７】
本明細書において、前記「野生型ホスホリパーゼＤ」とは、生物において天然に生じる天然型ホスホリパーゼＤ及び該天然型ホスホリパーゼＤをコードする核酸を本来の起源とは異なる生物に導入して発現させることにより得られた組換ホスホリパーゼＤをいう。
【００１８】
本発明の安定化方法においては、前記野生型ホスホリパーゼＤとして、（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列を含有したホスホリパーゼＤが挙げられる。
【００１９】
前記（Ａ）のアミノ酸配列は、ストレプトマイセス・セプタタス  ＴＨ−２(Streptomyces septatus TH-2)株由来のホスホリパーゼＤのアミノ酸配列である。
【００２０】
また、本発明においては、ホスホリパーゼＤ活性を呈するものであれば、前記野生型ホスホリパーゼＤは、
（Ｂ）前記配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによりアライメントし、算出された配列同一性が、少なくとも５０％であり、かつホスホリパーゼＤ活性を呈するポリペプチドのアミノ酸配列、又は
（Ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有し、かつホスホリパーゼＤ活性を呈するポリペプチドのアミノ酸配列
を含有したホスホリパーゼＤであってもよい。
【００２１】
前記（Ｂ）のアミノ酸配列における「配列同一性」をＢＬＡＳＴアルゴリズムにより算出する際の条件としては、期待値  １０、Ｗｏｒｄｓｉｚｅ  ３、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１）等が挙げられる。
【００２２】
前記配列同一性は、少なくとも５０％、好ましくは、７０％以上、より好ましくは、７９％以上、さらに好ましくは、９０％以上、よりさらに好ましくは、９５％以上である。
【００２３】
前記（Ｃ）のアミノ酸配列において、置換、欠失、付加又は挿入の数は、少なくとも１個、好ましくは、１個又は複数個、より好ましくは、１個又は数個である。
【００２４】
ホスホリパーゼＤの活性は、加水分解活性及び／又は転移活性により評価されうる。
前記加水分解活性は、例えば、
（Ｉ）測定対象のタンパク質１００ｎｇ相当量の水溶液０．１ｍｌを、反応液〔組成：２ｍＭ  ホスファチジルパラニトロフェノール、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、０．６２５％  ＴｒｉｔｏｎTMＸ  １００）  ０．９ｍｌに添加し、３７℃で、インキュベーションしながら、１分間あたりの３６０ｎｍでの吸光度変化量を求めるステップ、
（II）前記ステップ（Ｉ）で得られた吸光度変化量から、ｐＨ５．５におけるパラニトロフェノールのミリモル分子吸光係数６．８に基づき、１分間あたりのパラニトロフェノールの生成量を算出するステップ
を行なうことにより評価されうる。なお、ホスホリパーゼＤの加水分解活性の１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのパラニトロフェノールを遊離させる酵素活性として定義される。
前記転移活性は、例えば、
（ｉ）測定対象のタンパク質  ２００ｎｇ相当量の水溶液  ０．０５ｍｌを反応用エマルジョン〔１１．４２ｍＭ  パラニトロフェノールと、７．５ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）と、５７．１４ｗ／ｗ％  ベンゼンと、２．８６ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミンとを含む混合液を、１５分間、超音波にて分散させ、エマルジョン化し、３７℃で５分間加熱させたもの〕  ０．３５ｍｌに添加し、得られた混合物を３７℃、１０分間インキュベーションするステップ、
（ii）前記ステップ（ｉ）で得られた産物に、１Ｎ  塩酸  ０．１ｍｌを添加し反応を停止するステップ、
(iii) 前記ステップ（ii）で得られた混合物に、１Ｎ  水酸化ナトリウム溶液  ０．１５ｍｌとクロロホルム／メタノール（３／１）溶液０．４ｍｌとを添加し、ついで、得られた混合物を４℃で１０分間遠心するステップ、及び
（iv）前記ステップ(iii) で得られた水相  ０．０２ｍｌと０．１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）  ０．１８ｍｌとを混合し、得られた混合物について、４０５ｎｍの吸光度を測定するステップ、
を行なうことにより評価されうる。なお、ホスホリパーゼＤの転移活性の１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのパラニトロフェノールを遊離させる酵素活性として定義される。
【００２５】
前記野生型ホスホリパーゼＤとしては、放線菌、具体的には、ストレプトマイセス属の菌、アクチノマデューラ属の菌、キタサトスポラ属の菌、ストレプトベルチシリウム属の菌等に由来するホスホリパーゼＤが挙げられる。
【００２６】
前記野生型ホスホリパーゼＤとしては、より具体的には、前記ＴＨ−２ＰＬＤ〔塩基配列（配列番号：１）、アミノ酸配列（配列番号：２）、ジーンバンクアクセッション番号：ＡＢ０５８７３〕、前記Ｋ１ＰＬＤ〔塩基配列（配列番号：３）、アミノ酸配列（配列番号：４）、ジーンバンクアクセッション番号：ＡＢ０６２１３６〕、前記Ｋ６ＰＬＤ〔塩基配列（配列番号：５）、アミノ酸配列（配列番号：６）、ジーンバンクアクセッション番号：ＡＢ０７４３０５〕、ストレプトベルチシリウム・シナモネウム(Streptoverticillium cinnamoneum)由来のホスホリパーゼＤ〔塩基配列（配列番号：７）、アミノ酸配列（配列番号：８）、ジーンバンクアクセッション番号：ＡＢ００７１３２〕、ストレプトマイセス・アンチバイオティカス(Streptomyces antibioticus)由来のホスホリパーゼＤ〔塩基配列（配列番号：９）、アミノ酸配列（配列番号：１０）、ジーンバンクアクセッション番号：Ｄ１６４４〕等が挙げられる。
【００２７】
本発明の安定化方法は、例えば、前記方法１の場合
（Ｉ）前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１つのアミノ酸配列を含有したホスホリパーゼＤをコードする核酸において、前記ａ）の置換及び／又は前記ｂ）の置換を生じさせるための変異導入を行ない、核酸構築物を得る工程、
（ＩＩ）前記工程（Ｉ）で得られた核酸構築物を宿主に導入し、形質転換体を得る工程、及び
（ＩＩＩ）前記工程（ＩＩ）で得られた形質転換体を培養して、核酸構築物の発現産物として安定化型ホスホリパーゼＤを得る工程、
により行なわれうる。
【００２８】
なお、前記方法２の場合、前記工程（Ｉ）の代わりに、
（Ｉ’）前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１つのアミノ酸配列を含有したホスホリパーゼＤをコードする核酸において、前記ａ）の置換及び／又は前記ｂ）の置換と、前記ｃ）の置換を生じさせるための変異導入を行ない、核酸構築物を得る工程を行なえばよい。
【００２９】
前記工程（Ｉ）及び（Ｉ’）において、変異導入は、例えば、慣用の部位特異的変異導入方法等、具体的には、ギャップド・デュプレックス（ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ）法、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）法、ＰＣＲによる変異導入法等により行なわれうる。なお、アミノ酸残基の置換に用いられる核酸は、安定化型ホスホリパーゼＤを発現させるための宿主のコドン使用頻度に合わせ、デザインされうる。
【００３０】
前記核酸構築物の作製には、使用する宿主に応じて、慣用のベクターを用いうる。前記ベクターとしては、例えば、宿主が、大腸菌の場合、ｐＵＣ１８及びその誘導体、ｐＢＲ３２２及びその誘導体、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ及びその誘導体、ｐＧＥＭ（登録商標）及びその誘導体等のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１等のファージベクターが挙げられ、宿主が、酵母の場合、ｐＹＡＣ誘導体等が挙げられる。前記核酸構築物は、誘導可能なプロモーター、選択用マーカー遺伝子、ターミネーター等の因子を含有してもよい。また、前記核酸構築物は、発現対象のポリペプチドの単離精製が容易になるように、発現対象のポリペプチドが、Ｈｉｓタグポリペプチド又はＧＳＴ融合ポリペプチドとして発現されうる配列を含有してもよい。
【００３１】
前記工程（Ｉ）及び（Ｉ’）において、前記ａ）の置換の場合、配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４２６位に対応するアミノ酸残基を、グリシン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基及びヒスチジン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基、熱安定性の向上の観点から、好ましくは、グリシン残基、フェニルアラニン残基及びチロシン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基に置換することが望ましい。また、前記工程（Ｉ）及び（Ｉ’）において、前記ｂ）の置換の場合、配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４３３位に対応するアミノ酸残基を、スレオニン残基、セリン残基、チロシン残基、システイン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びアスパラギン酸残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基、熱安定性の向上の観点から、好ましくは、スレオニン残基、チロシン残基、システイン残基、アルギニン残基及びヒスチジン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基に置換することが望ましい。さらに、前記ｃ）の置換の場合、配列番号：２に示されるアミノ酸配列における１８８位に対応するアミノ酸残基を、フェニルアラニン残基、バリン残基、トリプトファン残基及びセリン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基、熱安定性の向上の観点から、好ましくは、フェニルアラニン残基に置換することが望ましい。
【００３２】
また、熱安定性の向上の観点から、好ましくは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４２６位に対応するアミノ酸残基の置換と４３３位に対応するアミノ酸残基の置換との組み合わせが望ましく、より好ましくは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４２６位に対応するアミノ酸残基の置換と４３３位に対応するアミノ酸残基の置換と１８８位に対応するアミノ酸残基の置換との組み合わせが望ましい。前記組み合わせとしては、特に限定されないが、例えば、配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４２６位に対応するアミノ酸残基のフェニルアラニン残基への置換と４３３位に対応するアミノ酸残基のスレオニン残基への置換との組み合わせ、配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４２６位に対応するアミノ酸残基のフェニルアラニン残基への置換と４３３位に対応するアミノ酸残基のスレオニン残基への置換と１８８位に対応するアミノ酸残基のフェニルアラニン残基への置換との組み合わせ、配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４２６位に対応するアミノ酸残基のグリシン残基への置換と４３３位に対応するアミノ酸残基のスレオニン残基への置換と１８８位に対応するアミノ酸残基のフェニルアラニン残基への置換との組み合わせ等が挙げられる。
【００３３】
前記工程（ＩＩ）において、宿主への核酸構築物の導入は、慣用の形質転換法、例えば、特に限定されないが、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等が挙げられる。
【００３４】
前記宿主としては、特に限定されないが、例えば、大腸菌、酵母、枯草菌、緑濃菌、サルモネラ菌、Ｌ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ｓｆ９細胞等が挙げられる。前記大腸菌としては、具体的には、ＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株等が挙げられる。なかでも、発現制御の観点から、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株が好適である。
【００３５】
前記工程（ＩＩＩ）において、形質転換体の培養条件は、使用した宿主、ベクター等に応じて、適宜設定できる。
【００３６】
培養に用いられる培地としては、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地、ＳＯＣ培地、Ｌ培地等が挙げられる。
【００３７】
前記培養条件としては、具体的には、宿主として、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用い、ベクターとして、ｐＥＴＫｍＳ２を用いる場合、ナオト  ミシマ(Naoto Mishima) ら、Biotechnol. Prog., 13(1997) 864-868に記載の培地を用い、形質転換体を３０℃で１２時間培養し、その後、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を該培地に添加し、１６℃で９６時間培養する条件が挙げられる。
【００３８】
また、前記工程（ＩＩＩ）において、核酸構築物の発現産物である安定化型ホスホリパーゼＤは、形質転換体の培養物から、一般的な精製方法によって単離精製されうる。
【００３９】
前記精製方法としては、塩析、超遠心分離、イオン交換カラムクロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー等が挙げられる。
【００４０】
前記工程（ＩＩＩ）においては、前記精製方法を、適宜組み合わせて、前記安定化型ホスホリパーゼＤを精製し、各精製段階において、前記加水分解活性及び／又は転移活性の評価法によりホスホリパーゼＤ活性を測定し、かつ慣用のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法及び未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により精製物の精製度を評価することにより、前記核酸構築物の発現産物を得ることができる。ついで、６０℃、６５℃、及び７０℃それぞれで１０分間インキュベーションした場合の前記発現産物の残存活性を算出し、下記ｉ）〜iii）：
ｉ）６０℃の場合において、インキュベーション前の活性の少なくとも９５％、好ましくは、９７％以上、より好ましくは、１００％以上の残存活性を有すること
ii）６５℃の場合において、インキュベーション前の活性の少なくとも７０％、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上の残存活性を有すること
iii）７０℃の場合において、インキュベーション前の活性の少なくとも５０％、好ましくは、７０％以上、より好ましくは、９０％以上の残存活性を有すること
からなる群より選ばれた少なくとも１つを満たすことを指標として、所望の安定化型ホスホリパーゼＤを選別することができる。
【００４１】
なお、本発明の安定化方法は、野生型ホスホリパーゼの他、前記ａ）〜ｃ）の置換を除く変異を有するホスホリパーゼ（変異型ホスホリパーゼ）に対しても適用することができる。また、人工的に作製されたキメラ型ホスホリパーゼに大しても適用することができる。
【００４２】
本発明の安定化方法により得られる安定化型ホスホリパーゼＤは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を含有した野生型ホスホリパーゼＤに比べ、より高い安定性、具体的には、高い熱安定性を示すという優れた性質を発現する。本発明には、本発明の安定化方法により得られる安定化型ホスホリパーゼＤも含まれる。
【００４３】
本発明の安定化型ホスホリパーゼＤとしては、具体的には、前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１つのアミノ酸配列において、前記ａ）置換及び／又は前記ｂ）の置換を有する安定化型ホスホリパーゼＤ、並びに前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１つのアミノ酸配列において、前記ａ）の置換及び／又は前記ｂ）の置換と、前記ｃ）の置換とを有する安定化型ホスホリパーゼＤが挙げられる。
【００４４】
本発明の安定化型ホスホリパーゼＤは、前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１つのアミノ酸配列において、前記置換を有するため、酵素反応において最大活性を与える温度域が高温（例えば、５５〜７５℃）にまで広がっている。したがって、本発明の安定化型ホスホリパーゼＤは、高い温度で酵素反応を行なうことができるという優れた効果を発揮する。
【００４５】
したがって、本発明の安定化方法により得られる安定化型ホスホリパーゼＤは、化粧品基材、医薬品等に有用な、リン脂質、該リン脂質の誘導体の製造の際の反応条件下に、活性を安定に保持し、発現することができ、繰返して使用されうるという優れた効果を発揮する。
【００４６】
本発明の安定化型ホスホリパーゼＤとしては、特に限定されないが、例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８及び配列番号：１０からなる群より選ばれた１つのアミノ酸配列において、
ａ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４２６位に対応するアミノ酸残基と、グリシン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基及びヒスチジン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換、及び／又は
ｂ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４３３位に対応するアミノ酸残基と、スレオニン残基、セリン残基、システイン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びアスパラギン酸残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換
を有する安定化型ホスホリパーゼＤ；配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８及び配列番号：１０からなる群より選ばれた１つのアミノ酸配列において、
ａ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４２６位に対応するアミノ酸残基と、グリシン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基及びヒスチジン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換、及び／又は
ｂ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における４３３位に対応するアミノ酸残基と、スレオニン残基、セリン残基、システイン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びアスパラギン酸残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換、
と、
ｃ）  配列番号：２に示されるアミノ酸配列における１８８位に対応するアミノ酸残基と、フェニルアラニン残基、バリン残基、トリプトファン残基及びセリン残基からなる群より選ばれた１つのアミノ酸残基との置換
とを有する安定化型ホスホリパーゼＤ等が挙げられる。
【００４７】
以下、実施例等により本発明を詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４８】
（１）  キメラホスホリパーゼＤ（キメラＰＬＤ）の作製
キメラＰＬＤの作製のための融合対象のホスホリパーゼＤをコードする核酸として、高い熱安定性を呈するストレプトマイセス・セプタタス  ＴＨ−２(Streptomyces septatus TH-2)株由来ホスホリパーゼＤ（以下、ＴＨ−２ＰＬＤ）をコードする核酸(DDBJ アクセッション番号:AB05873)と、低い熱安定性を呈するストレプトマイセス・ハルステディ  Ｋ１(Streptomyces halstedii K1)株由来ホスホリパーゼＤ（以下、Ｋ１ＰＬＤという）をコードする核酸（DDBJアクセッション番号:AB062136)とを用いた。なお、前記ＴＨ−２ＰＬＤのアミノ酸配列を配列番号：２に示し、ＴＨ−２ＰＬＤをコードする核酸の塩基配列を配列番号：１に示す。また、前記Ｋ１ＰＬＤのアミノ酸配列を配列番号：４に示し、Ｋ１ＰＬＤをコードする核酸の塩基配列を配列番号：３に示す。
【００４９】
前記Ｋ１ＰＬＤをコードする核酸と、ＴＨ−２ＰＬＤをコードする核酸とを用い、Ｎ末端側にＫ１ＰＬＤ由来のポリペプチドが配置され、かつＣ末端側にＴＨ−２ＰＬＤ由来のポリペプチドが配置されたキメラＰＬＤ群（以下、Ｋ１／ＴＨ−２と総称する）を作製した。
【００５０】
キメラＰＬＤ群Ｋ１／ＴＨ−２の作製のために、前記Ｋ１ＰＬＤをコードする核酸と、ｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ）の制御下に発現するネズミチフス菌由来フラジェリン遺伝子であるｆｌｊＢ遺伝子と、ＴＨ−２ＰＬＤをコードする核酸と、インフレームで発現するｌａｃＺとを、この順にｐＡＣＹＣ１８４上にタンデムに配置し、これらの核酸の間にストレプトマイシン及びスペクチノマイシン耐性遺伝子を挿入して、Ｋ１／ＴＨ−２融合遺伝子調製用ベクターを構築した。なお、ＴＨ−２ＰＬＤのＣ末端側のＨＫＤモチーフのアスパラギン酸以降の領域が、宿主細胞に対して毒性を呈するため、かかるＨＫＤモチーフのアスパラギン酸以降の領域に対応する部分を除去して得られた核酸（配列番号：１の塩基番号：１５１〜１４７９を用いた。
【００５１】
ストレプトマイシン耐性であり、かつ一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子にｓｓｂ−３変異を有する大腸菌ＭＫ１０１９株に、エレクトロポレーション法により、前記融合遺伝子調製用ベクターを導入し、得られた形質転換体を、グルコース最小培地〔組成：グルコース（２ｇ／Ｌ）と、フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（０．５ｇ／Ｌ）と、５−ブロモ−４−クロロ−３−ガラクトピラノシドとを含むminimal A 培地（J.H.Miller著、A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. に記載) 〕に播種し、青色を呈するｐａｐｉｌｌａｅを選別し、シングルコロニーを得た。
【００５２】
得られたシングルコロニーより、慣用の方法により、それぞれキメラＰＬＤを得た。
【００５３】
（２）キメラＰＬＤ群Ｋ１／ＴＨ−２のホスホリパーゼＤ活性測定
前記（１）で得られたキメラＰＬＤ群Ｋ１／ＴＨ−２について、以下のように、ホスホリパーゼＤの加水分解活性の測定及び転移活性を測定した。
【００５４】
（ｉ）ホスホリパーゼＤの加水分解活性の測定
測定対象のタンパク質１００ｎｇ相当量の水溶液０．１ｍｌを、反応液〔組成：２ｍＭ  ホスファチジルパラニトロフェノール、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、０．６２５％  ＴｒｉｔｏｎＴＭＸ１００〕０．９ｍｌに添加し、３７℃で、インキュベーションしながら、１分間当たりの３６０ｎｍでの吸光度変化量を求め、得られた吸光度変化量から、ｐＨ５．５におけるパラニトロフェノールのミリモル分子吸光係数６．８に基づき、１分間当たりのパラニトロフェノールの生成量を算出した。なお、ホスホリパーゼＤの加水分解活性の１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのパラニトロフェノールを遊離させる酵素活性として定義した。
【００５５】
（ｉｉ）ホスホリパーゼＤの転移活性の測定
各種濃度のパラニトロフェノールの希釈系列について、４０５ｎｍの吸光度を測定し、検量線を作成した。測定対象のタンパク質２００ｎｇ相当量の水溶液０．０５ｍｌを反応用エマルジョン〔１１．４２ｍＭ  パラニトロフェノールと、７．５ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）と、５７．１４ｗ／ｗ％  ベンゼンと、２．８６ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンとを含む混合液を１５分間超音波にて分散させ、エマルジョン化し、３７℃で５分間加熱させたもの）０．３５ｍｌに添加し、得られた混合物を３７℃、１０分間インキュベーションした。得られた産物に、１Ｎ  塩酸  ０．１ｍｌを添加し反応を停止した。得られた混合物に、１Ｎ  水酸化ナトリウム溶液  ０．１５ｍｌとクロロホルム／メタノール（３／１）溶液０．４ｍｌとを添加した後、得られた混合物を４℃で１０分間遠心した。得られた水相  ０．０２ｍｌと０．１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）  ０．１８ｍｌとを混合し、得られた混合物について、４０５ｎｍの吸光度を測定した。得られた測定値より、前記検量線に基づき、転移反応によるパラニトロフェノール生成量を算出した。なお、ホスホリパーゼＤの転移活性の１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのパラニトロフェノールを遊離させる酵素活性として定義した。
【００５６】
その結果、キメラＰＬＤ群Ｋ１／ＴＨ−２について、ホスホリパーゼＤの加水分解活性及び転移活性は検出されなかった。
【００５７】
（３）活性を呈するキメラＰＬＤの作製
前記（２）の結果より、ホスホリパーゼＤ活性を検出することができなかったため、キメラＰＬＤ群Ｋ１／ＴＨ−２のＣ末端側に、Ｋ１のＣ末端側６７アミノ酸（配列番号：４のアミノ酸番号：４３８〜５０４）を有するキメラＰＬＤ群（以下、Ｋ１／ＴＨ−２／Ｋ１と総称して表記する）の作製を試みた。
【００５８】
前記（１）で得られた各菌株から、慣用の方法によりプラスミドを単離し、該プラスミドのそれぞれから、キメラＰＬＤをコードする断片を得た。
【００５９】
ついで、得られた各断片中、Ｋ１／ＴＨ−２のＣ末端に対応する位置の直後に、Ｋ１ＰＬＤのＣ末端６７アミノ酸をコードする核酸（配列番号：３の塩基番号：１５２３〜１７２１）をそれぞれ連結し、得られた産物を、発現ベクターｐＥＴＫｍＳ２〔名古屋大学の岩崎雄吾先生より供与されたもの、ナオト  ミシマ(Naoto Mishima) ら、Biotechnol. Prog., 13(1997) 864-868 に記載〕に挿入し、キメラＰＬＤ群Ｋ１／ＴＨ−２／Ｋ１の発現用ベクターを得た。
【００６０】
得られた発現ベクターを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ホスホリパーゼＤの加水分解活性を指標として、Ｋ１／ＴＨ−２／Ｋ１を発現する菌株を得た。
【００６１】
ついで、得られた各菌株より、慣用の方法により、それぞれキメラＰＬＤを得た。
【００６２】
キメラＰＬＤ群Ｋ１／ＴＨ−２／Ｋ１について、前記（２）の（ｉ）の活性測定法と同様に、ホスホリパーゼＤの加水分解活性を測定した。
【００６３】
ついで、ホスホリパーゼＤの活性を呈するキメラＰＬＤを産生する菌株から、プラスミドを単離し、その後、該プラスミドを用いて、シークエンスを行ない、キメラＰＬＤの組換ポイントの位置を決定した。
【００６４】
その結果、図１の左パネルに示されるキメラＰＬＤ  Ａ〜Ｆが、ホスホリパーゼＤ活性を呈することがわかった。
【００６５】
ついで、Ｋ１ＰＬＤ、ＴＨ−２ＰＬＤ、キメラＰＬＤ  Ａ〜Ｆ  各０．００５Ｕ相当量水溶液０．０２ｍｌを６０℃で１０分間インキュベーションした。インキュベーション後のＫ１ＰＬＤ、ＴＨ−２ＰＬＤ、キメラＰＬＤ  Ａ〜Ｆについて、前記（２）の（ｉ）と同様に、加水分解活性を測定した。なお、対照として、６０℃で１０分間のインキュベーションをしないＫ１ＰＬＤ、ＴＨ−２ＰＬＤ、キメラＰＬＤ  Ａ〜Ｆ  各０．００５Ｕ相当量水溶液０．０２ｍｌを用い、前記と同様に加水分解活性を測定した。その結果を図１の右パネルに示す。図１の右パネル中、インキュベーションをしない場合の加水分解活性を１００として算出した残存活性を示す。
【００６６】
その結果、図１の右パネルに示すように、キメラＰＬＤ  Ａ〜Ｆは、高い熱安定性を呈するＴＨ−２ＰＬＤに由来するペプチドの含有量に非依存的に高い熱安定性を示すことがわかった。特に、キメラＰＬＤ  Ｃは、高い熱安定性を呈するＴＨ−２ＰＬＤに由来する２６５アミノ酸からなるペプチド部分を有するにもかかわらず、予想外にも、６０℃で１０分間のインキュベーションにより、著しく残存活性が少なく、低い熱安定性を呈することがわかった。
【実施例２】
【００６７】
実施例１で得られたキメラＰＬＤ  Ｃの組換ポイントを調べた結果より、キメラＰＬＤ  Ｃの１８８位周辺のアミノ酸残基が熱安定性に関与することが示唆されたため、前記キメラＰＬＤ  Ｃの１８８位のアミノ酸残基が存在するαヘリックスにおいて、キメラＰＬＤ  Ｃと、該キメラＰＬＤ  Ｃについで低い熱安定性を呈するキメラＰＬＤ  Ｄとの間で異なる４残基に関して、図２の左パネルに示す変異酵素Ｃ１〜Ｃ４を作製した。
【００６８】
ついで、キメラＰＬＤ  Ｃ及び前記変異酵素Ｃ１〜Ｃ４  各０．００５Ｕ相当量水溶液０．０２ｍｌを６０℃で１０分間インキュベーションした。インキュベーション後のキメラＰＬＤ  Ｃ及び変異酵素Ｃ１〜Ｃ４について、前記実施例１の（２）の（ｉ）と同様に、加水分解活性を測定した。なお、対照として、６０℃で１０分間のインキュベーションをしないキメラＰＬＤ  Ｃ及び変異酵素Ｃ１〜Ｃ４  各０．００５Ｕ相当量の水溶液０．０２ｍｌを用い、前記と同様に加水分解活性を測定した。結果を図２の右パネルに示す。なお、図２の右パネル中、インキュベーションをしない場合の加水分解活性を１００として算出した残存活性を示す。
【００６９】
その結果、図２の右パネルに示されるように、６０℃での熱安定性が低いものは、１８８位に対応する残基が、ＴＨ−２と同じグリシンである変異酵素であり、６０℃での熱安定性が著しく向上したものは、いずれもＫ１と同じセリンである変異酵素であることがわかった。
【実施例３】
【００７０】
（１）  ＴＨ−２ＰＬＤの変異酵素の作製
ＴＨ−２ＰＬＤにおいては、前記セリン残基に対応する位置は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列中、１８８位のグリシン（Ｇ）に相当する。そこで、１８８位のＧを他の１９アミノ酸のそれぞれに置換した１９種の変異酵素を作製した。
【００７１】
具体的には、まず、プライマーＴ１〔AGCGCGAAGAAGCACGTCGA（配列番号：１１）とプライマーＴ２〔GGATCCGAGCCCTGGCAGAGGCC（配列番号：１２）〕とを用い、ＴＨ−２ＰＬＤをコードした核酸を鋳型として、ＧＣ−ＲＩＣＨ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍキット（ロッシュ社製）を用いてＰＣＲを行なった。
【００７２】
なお、前記プライマーＴ１は、ＴＨ−２ＰＬＤの塩基配列（配列番号：１）の塩基番号：１１３２〜１１５１に相当する配列からなるプライマーである。また、前記プライマーＴ２は、ＴＨ−２ＰＬＤの塩基配列（配列番号：１）の塩基番号：１６６３〜１６６７の下流にCGGATCC（配列番号：１３）を付加した配列からなり、得られた増幅断片を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、ｐＥＴＫｍＳ２のＢａｍＨＩ認識部位に挿入することにより、Ｈｉｓタグがインフレームで挿入されるようにデザインしたプライマーである。
【００７３】
ＰＣＲ条件は、プライマー濃度を１μＭ、アニーリング温度を５０℃、伸長時間を３０秒とした以外は、前記キットに添付のプロトコールにしたがった。
【００７４】
ＰＣＲで得られた約５４０ｂｐの増幅産物を、ＴＡクローニングキット（プロメガ社製）のｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙにクローニングし、塩基配列を確認した。その後、前記増幅産物を制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで切り出した。得られた断片と、ｐＥＴＫｍＳ２上のＴＨ−２ＰＬＤをコードする核酸中の制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで切り出される部分とを置換することにより、ＴＨ−２ＰＬＤのＣ末端にＨｉｓタグが付加されたポリペプチドをコードする核酸を保持した発現ベクターを得た。前記発現ベクターを用い、実施例２と同様にしてＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤを得た。
【００７５】
また、プライマーＴ３〔TCGGACGTCGATCTCGCGCT（配列番号：１４）〕とプライマーＴ４〔GTCGTAGAGGCGGACGTCGTA （配列番号：１５）〕とを用い、ＴＨ−２ＰＬＤをコードした核酸を鋳型として、ＧＣ−ＲＩＣＨ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍキット（ロッシュ社製）を用いてＰＣＲを行なった。
【００７６】
なお、前記プライマーＴ３は、ＴＨ−２ＰＬＤの塩基配列（配列番号：１）の塩基番号：７５１〜７７０において、塩基番号：７６２のＣをＴに置換することにより、アミノ酸残基（Asp ）を変化させることなく、制限酵素ＳａｌＩ認識部位（配列番号：１の塩基番号：７５７）を消滅させるプライマーである。また、前記プライマーＴ４は、ＴＨ−２ＰＬＤの塩基配列の塩基番号：１１９８から１２１８に対応するプライマーである。
【００７７】
ＰＣＲ条件は、プライマー濃度を１μＭ、アニーリング温度を５０℃、伸長時間を３０秒とした以外は、前記キットに添付のプロトコールにしたがった。
【００７８】
ＰＣＲで得られた約４７０ｂｐの増幅産物を、ＴＡクローニングキット（プロメガ社製）のｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙにクローニングし、塩基配列を確認した。その後、前記増幅産物を制限酵素ＡａｔＩＩで切り出し、得られた断片と、ｐＥＴＫｍＳ２上のＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤ遺伝子の制限酵素ＡａｔＩＩで切り出される部分とを置換することにより、ＴＨ−２ＰＬＤのＣ末端にＨｉｓタグが付加されたポリペプチドをコードした核酸であり、かつ制限酵素ＳａｌＩ部位（７５７位）を消滅させた核酸を保持した発現ベクターを得た。
【００７９】
さらに、プライマーＴ５〔GAACGCCCGGGCACGAAGCGGCTG（配列番号：１６）とプライマーＴ６〔GTGTCGACGTAGTCGTCCTTCCANNNGTTGAT（配列番号：１７）〕とを用い、ＴＨ-2ＰＬＤをコードした核酸を鋳型として、ＧＣ−ＲＩＣＨ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍキット（ロッシュ社製）を用いてＰＣＲを行なった。
【００８０】
なお、前記プライマーＴ５は、ＴＨ−２ＰＬＤの塩基配列（配列番号：１）の塩基番号：３３７〜３６０に対応する配列からなるプライマーである。また、前記プライマーＴ６は、ＴＨ−２ＰＬＤの塩基配列（配列番号：１）の塩基番号：７０６〜７３７に対応するプライマーであり、ＴＨ−２ＰＬＤの塩基配列（配列番号：１）の塩基番号：７１２〜７１４の塩基配列を置換することにより、ＴＨ−２ＰＬＤの１８８位のアミノ酸残基を置換することができるようにデザインされたプライマーである。
【００８１】
ＰＣＲ条件は、プライマー濃度を１μＭ、アニーリング温度を５０℃、伸長時間を３０秒とした以外は、前記キットに添付のプロトコールにしたがった。
【００８２】
ＰＣＲで得られた約４００ｂｐの増幅産物を、ＴＡクローニングキット（プロメガ社製）のｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙにクローニングし、塩基配列を確認した。その後、前記増幅産物を制限酵素ＳａｌＩで切り出し、得られた断片と、ｐＥＴＫｍＳ２上のＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤをコードする核酸中の制限酵素ＳａｌＩで切り出される部分とを置換することにより、ＴＨ−２ＰＬＤのＣ末端にＨｉｓタグが付加され、ＴＨ−２ＰＬＤの１８８位のGly を他のアミノ酸に置換したＨｉｓタグ付ＰＬＤの発現ベクターを得た。前記発現ベクターを用い、実施例２と同様にして、Ｈｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤを発現させた。
【００８３】
ついで、得られたＨｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤ  各０．００５Ｕ相当量の水溶液  ０．０２ｍｌを６０℃で１０分間インキュベーションした。インキュベーション後のＨｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤについて、前記実施例１の（２）の（ｉ）と同様に、加水分解活性を測定した。なお、対照として、６０℃で１０分間のインキュベーションをしないＨｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤ（各０．００５Ｕ相当量）水溶液０．０２ｍｌを用い、前記と同様に、加水分解活性を測定した。その結果を図３に示す。図３中、インキュベーションをしない場合の加水分解活性を１００として算出した残存活性を示す。
【００８４】
その結果、１８８位のＧが、Ｃ（システイン）、Ｅ（グルタミン酸）、Ｋ（リジン）、Ｌ（ロイシン）、Ｍ（メチオニン）、Ｎ（アスパラギン）及びＲ（アルギニン）のそれぞれに置換された７種の変異酵素は、ホスホリパーゼＤ活性を示さなかった。
【００８５】
図３に示されるように、ＴＨ−２ＰＬＤでは、残存活性が１０％以下であるのに対し、１８８位のＧが、比較的疎水性の高い、Ｖ（バリン）、Ｆ（フェニルアラニン）及びＷ（トリプトファン）のそれぞれに置換された変異酵素（Ｇ１８８Ｖ、Ｇ１８８Ｆ及びＧ１８８Ｗ）では、残存活性が５０％を超えることがわかった。
【００８６】
（２）熱安定性の検討
得られたＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤを発現する菌株並びに１８８位のアミノ酸残基がＶ（バリン）、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｗ（トリプトファン）、又はＳ（セリン）であるＨｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ〔Ｇ１８８Ｖ、Ｇ１８８Ｆ、Ｇ１８８Ｗ又はＧ１８８Ｓ〕を発現する菌株について、その培養上清を７０％  飽和硫酸アンモニウムで濃縮し、得られた沈殿物を、１／１５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。得られた産物を、ニッケルアフィニティカラム（商品名：ＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎｓ、クロンテック社製）に供して、Ｈｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤのそれぞれを得た。
【００８７】
ついで、得られたＨｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤのそれぞれを用いて、至適温度を評価した。Ｈｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤ（１．０μｇ相当量）のそれぞれを、実施例１の（２）の（ｉ）の活性測定法と同様に、３５℃、４５℃、５５℃、６５℃、７５℃及び８５℃のそれぞれにおけるホスホリパーゼＤの加水分解活性を測定した。その結果を図４のパネルＡに示す。図４のパネルＡ中、最大活性を１００として算出した相対活性を示す。
【００８８】
また、Ｈｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤ（１．０μｇ相当量）のそれぞれについて、実施例１の（２）の（ｉ）の活性測定法と同様に、３７℃及び６５℃のそれぞれにおける活性を測定し、比活性を算出した。その結果を図４のパネルＢに示す。
【００８９】
図４のパネルＡに示されるように、Ｈｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤのいずれも、６５℃付近で最大活性を示すことがわかる。なかでも、Ｇ１８８Ｖ、Ｇ１８８Ｆは、７５℃でもほぼ最大活性と同じ活性を示し、もとのＴＨ−２ＰＬＤよりも、高い活性を示す温度範囲が拡大していることがわかる。
【００９０】
また、図４のパネルＢに示されるように、３７℃における比活性は、Ｈｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤのいずれも３５−４０Ｕ／ｍｇであり、至適温度の６５℃では、いずれも６０Ｕ／ｍｇ前後の値を示したので、これらの置換は、触媒能には影響を与えないことがわかる。
【００９１】
ついで、Ｈｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤ（０．１ｍｇ／ｍｌ）のそれぞれについて、１５℃、５５℃、６５℃、６８℃、７５℃のそれぞれで１０分間インキュベーションした後の残存活性を測定した。示された温度及びインキュベーション時間で、予めＨｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤをインキュベーションすることを除き、実施例１の（２）の（ｉ）と同様に、加水分解活性を測定した。結果を図５のパネルＡに示す。図５のパネルＡ中、インキュベーションをしない場合の加水分解活性を１００として算出した残存活性を示す。
【００９２】
また、６８℃で、５分間、１０分間、１５分間インキュベーションした場合の残存活性の継時変化を測定した。示された温度及びインキュベーション時間で、予めＨｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤをインキュベーションすることを除き、実施例１の（２）の（ｉ）と同様に、加水分解活性を測定した。結果を図５のパネルＢに示す。図５のパネルＢ中、インキュベーションしない場合の加水分解を１００として算出した残存活性を示す。
【００９３】
図５のパネルＡに示されるように、ＴＨ−２ＰＬＤ及びＧ１８８Ｓでは、６５℃で１０分間のインキュベーションにより、残存活性が２０％以下となるのに対し、Ｇ１８８Ｖ、Ｇ１８８Ｆ及びＧ１８８Ｗでは、ほぼ１００％活性を保持していることがわかる。
【００９４】
また、図５のパネルＢに示されるように、６８℃での残存活性の継時変化を比較した結果から、Ｇ１８８Ｖ、Ｇ１８８Ｆ及びＧ１８８Ｗの中でも、特に、Ｇ１８８Ｆが最も熱安定性に優れていることがわかる。
【実施例４】
【００９５】
プライマー：プライマーＰＤＫ６−Ｃ１〔5'-TCCAGGACTTCGGGTACGTGGTG-3'（配列番号：１８）〕と５'−末端側にＮｃｏＩ、ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩ認識部位を有するとプライマーＰＤＫ６−Ｃ２〔5'-ACCATGGGGTACCGGATCCGAGGCCGGGCAGAGG-3'（配列番号：１９）〕とを用い、ストレプトマイセス・ハルステディ  サブスピーシーズ  スカビーズ  Ｋ６(Streptomyces halstedii subsp. scabies K6)株由来のホスホリパーゼＤ（Ｋ６ＰＬＤ）遺伝子（ＰＤＫ６という）の３’−末端領域をＰＣＲで増幅した。前記ＰＣＲは、ＰＤＫ６を保持したプラスミドを鋳型として、ＧＣ−ＲＩＣＨ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍキット〔ロシュ社製〕を用いて行なった。得られた増幅産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製にクローン化した。
【００９６】
また、発現ベクターｐＥＴＫｍＳ２に前記ＰＤＫ６が組み込まれたプラスミドから、Ｔ７−ｌａｃプロモーターと大腸菌ＰｅｌＢタンパク質の分泌シグナルをコードする核酸とＰＤＫ６との融合遺伝子（３’−末端領域を除く）を切り出した。得られた断片を、ＰＤＫ６の３’−末端領域と連結した。
【００９７】
一方、発現ベクターｐＥＴＫｍＳ２上のＨＩＳタグに対応する核酸及びＴ７ターミネーターを、プライマーＨＩＳ６−１〔5'-TCGGATCCGAATTCGAGCTCCG-3'（配列番号：２０）〕とプライマーＨＩＳ６−２〔5'-AGATATCTCCGGATATAGTTCCTCCTTTC-3'（配列番号：２１）〕とを用いて、ＰＣＲで増幅した。前記ＰＣＲは、ｐＥＴＫｍＳ２を鋳型として、ＧＣ−ＲＩＣＨ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍキット〔ロシュ社製〕を用いて行なった。得られた増幅産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製にクローン化した。その後、前記増幅産物に対応する断片を切り出し、該断片をストレプトマイセス・セプタタス  ＴＨ−２(Streptomyces septatus TH-2)株由来のホスホリパーゼＤ遺伝子（ＰＤＴＨ２）の3'-末端に連結させた。
【００９８】
ついで、ＰＤＫ６の３’末端に付加したＮｃｏＩ認識部位と、ＰＤＴＨ２の開始コドン付近に付加したＮｃｏＩ認識部位とを利用して２つのホスホリパーゼＤ遺伝子をタンデムに連結した。得られたプラスミドから、Ｔ７−ｌａｃプロモーター／ｐｅｌＢシグナル−ＰＤＫ６／ＰＤＴＨ２−Ｈｉｓタグ／Ｔ７ターミネーターを含む断片を切り出し、ｐＡＣＹＣ１８４のテトラサイクリン耐性遺伝子領域に挿入して、ｐＡＣＴ（Ｋ６／ＴＨ２）を得た。
【００９９】
ｐＮＣ１２４をＫｐｎＩで消化することにより、ゲンタマイシン（Ｇｍ）耐性遺伝子とｒｐｓＬとを含む断片を切り出し、得られた断片を、前記ｐＡＣＴ（Ｋ６／ＴＨ２）のＰＤＫ６とＰＤＴＨ２との連結部位に設けたＫｐｎＩ認識部位に挿入し、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＤＮＡシャフリング用プラスミドｐＡＣＴ（Ｋ６／ＧＳ／ＴＨ２）を得た。
【０１００】
さらに、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）〔ノバージェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製〕からｌａｃＩを含む断片切り出し、得られた断片を、前記ｐＡＣＴ（Ｋ６／ＴＨ２）に挿入してｐＡＣＴＩ（Ｋ６／ＴＨ２）を構築した。ｐＴＮ１１１７からｃｃｄＡ及びｃｃｄＢを切り出し、得られた断片を、前記ｐＡＣＴＩ（Ｋ６／ＴＨ２）に挿入して、ｐＡＣＴＩＳ２（Ｋ６／ＴＨ２）を得た。ついで、ｐＮＣ１２４から切り出したＧｍ耐性遺伝子とｒｐｓＬとを、前記ｐＡＣＴＩＳ２（Ｋ６／ＴＨ２）に組込み、シャフリング用プラスミドｐＡＣＴＩＳ２（Ｋ６／ＧＳ／ＴＨ２）を得た。
【０１０１】
商品名：Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ〔バイオラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）社製〕を用いてエレクトロポレーションにより、前記シャフリング用プラスミドｐＡＣＴＩＳ２（Ｋ６／ＧＳ／ＴＨ２）を大腸菌ＭＫ１０１９株［rpsL(Smr)ssb-3］に導入した。
【０１０２】
得られた細胞を、５０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールと２０μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシンとを含有したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）固体培地のプレート〔ＬＢ（Ｃｍ、Ｇｍ）プレートという〕に播種し、３７℃で一晩程度培養した。生えてきたコロニーを、別のＬＢ（Ｃｍ，Ｇｍ）プレート及び５０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールと２０μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシンと５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンとを含有したＬＢ固体倍地プレート〔ＬＢ（Ｃｍ、Ｇｍ、Ｓｍ）プレートという〕に播種し、３７℃で一晩程度培養して、ストレプトマイシン（Ｓｍ）感受性の確認を行なった。
【０１０３】
ＬＢ（Ｃｍ、Ｇｍ）プレートからＳｍ感受性クローンのコロニーを選択し、得られたコロニーを、５０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール含有ＬＢ液体培地  ２ｍｌに播種して、３７℃で一晩程度振盪培養することによってキメラ形成を促した。
【０１０４】
その後、得られた培養物を適宜希釈した後、ＬＢ（Ｃｍ、Ｓｍ）プレートにまいて３７℃で一晩程度培養し、前記プレート上に生えてきたＳｍ耐性復帰コロニーから、アルカリミニプレップ法により、プラスミドを調製した。
【０１０５】
得られたプラスミドを用いて、大腸菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）〔ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）社製〕を形質転換し、シングルコロニーをクロラムフェニコール含有ＬＢ液体培地に接種後、３７℃で一晩振盪培養した。得られた培養液  ０．５ｍｌを、発現用培地〔ナオト  ミシマ(Naoto Mishima) ら、Biotechnol. Prog., 13(1997) 864-868 に記載の培地、５０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール〕  ５０ｍｌに接種し、３０℃で１２時間、１２５ｒｐｍで振盪培養した。その後、培地に、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるよう添加し、１６℃で４〜５日間、１２５ｒｐｍで振盪培養した。
【０１０６】
得られた培養物を３５００×ｇ、６０分間遠心分離し、培養上清を得た。得られた培養上清を、商品名：ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｈｉｓ−ｔａｇ−キット（東洋紡績社製）に供して、各種キメラＰＬＤを得た。
【０１０７】
その結果、キメラＰＬＤ〔図６のキメラＰＬＤ  ａ〜キメラＰＬＤ  ｉ〕が得られた。
【０１０８】
前記キメラＰＬＤ  ａ〜ｉのそれぞれについて、前記実施例１の（２）の（ｉ）と同様に、加水分解活性を測定した。また、対照として、放線菌Ｋ６株由来のＰＬＤ（Ｋ６ＰＬＤ）及びＴＨ‐２株由来のＰＬＤ（ＴＨ‐２ＰＬＤ）のそれぞれを用いた。
【０１０９】
キメラＰＬＤ  ａ〜ｉ、Ｋ６ＰＬＤ及びTＨ−２ＰＬＤのそれぞれを５０、５５、６０、６５及び７０℃で１０分間インキュベーションし、ついで、得られた各酵素について、ホスファチジル‐ｐ‐ニトロフェノールを用い、加水分解活性を測定した。その結果を図７に示す。なお、図７中、１５℃でインキュベーションした後の残存活性を１００として示す。
【０１１０】
その結果、図７に示されるように、TＨ−２ＰＬＤ及びＫ６ＰＬＤは、６０℃で１０分間インキュベーションを行なった後も、ほぼ１００％の活性を保持していたが、キメラＰＬＤについては、熱安定性の低下が観察された。
【０１１１】
また、５０℃で１０分間インキュベーションを行なった場合における熱安定性及び５５℃で１０分間インキュベーションを行なった場合における熱安定性のそれぞれを図８に示す。
【０１１２】
その結果、図８に示されるように、キメラＰＬＤにおいては、５０℃で１０分間インキュベーションを行なった場合における熱安定性及び５５℃で１０分間インキュベーションを行なった場合における熱安定性のそれぞれで、顕著な差が認められた。
【０１１３】
なかでも、キメラｇは、５０℃で１０分間インキュベーションを行なった場合、完全に失活したが、その他のキメラＰＬＤは、５０℃で１０分間インキュベーションを行なっても、対照の活性の７割以上を保持していた。
【０１１４】
したがって、キメラｇの組換ポイント周辺の領域に温度感受性に関わるアミノ酸残墓が存在することが示唆された。
【０１１５】
一方、５５℃で１０分間インキュベーションを行なった場合、キメラｇ、キメラｆ及びキメラｈは、ほぼ完全に失活した。
【０１１６】
したがって、キメラｆ及びキメラｈそれぞれの組換ポイント近傍のアミノ酸残基も温度感受性に関わることが示唆された。
【比較例１】
【０１１７】
前記実施例４と同様の手法により、キメラＦにおける組換ポイントとキメラＧにおける組換ポイントとの間に組換ポイントを有する３種類のキメラＰＬＤ〔キメラＰＬＤ  ｊ、キメラＰＬＤ  ｋ及びキメラＰＬＤ  ｌ〕を作製した。前記キメラＰＬＤ  ｊ、キメラＰＬＤ  ｋ及びキメラＰＬＤ  ｌそれぞれの組換ポイント付近のアミノ酸配列を図９の左パネルに示す。
【０１１８】
前記キメラＰＬＤ  ｊ、キメラＰＬＤ  ｋ及びキメラＰＬＤ  ｌそれぞれについて、前記実施例３の（２）と同様の手法により、５０℃、５５℃及び６０℃それぞれで１０分間インキュベーションした場合の残存活性を調べた。結果を図９の右パネルに示す。なお、図中、１５℃でインキュベーションした後の残存活性を１００として示す。
【０１１９】
その結果、キメラＰＬＤ  ｊ、キメラＰＬＤ  ｋ及びキメラＰＬＤ  ｌのいずれもキメラＰＬＤ  ｇと同様に５０℃で１０分のインキュベーションでほぼ完全に失活した。
【０１２０】
キメラＰＬＤ  ｆとキメラＰＬＤ  ｊとの違いは、３３１位のアミノ酸残基及び３３３位のアミノ酸残基が、キメラＰＬＤ  ｊにおいて、Ｋ６ＰＬＤと同様に、それぞれ、グリシン及びイソロイシンであるのに対し、キメラＰＬＤ  ｆにおいて、ＴＨ−２ＰＬＤと同様に、それぞれリジン及びバリンである点である。したがって、３３１位のアミノ酸残基及び３３３位のアミノ酸残基の両方又は一方の残基が熱安定性に関与することが示唆された。
【０１２１】
ついで、最も熱安定性が低いキメラＰＬＤ  ｇについて、前記実施例３と同様の手法により、３３１位のグリシンのリジンへの置換及び／又は３３３位のイソロイシンのバリンへの置換を有する変異酵素〔変異酵素ＧＩ／ＫＶ、変異酵素Ｇ／Ｋ、変異酵素Ｉ／Ｖ〕を作製した。
【０１２２】
なお、変異酵素ＧＩ／ＫＶの作製には、プライマーＧ６８２：5'-TGTCAGAACAGGAACAACATC-3'（配列番号：２２）とプライマーｃｈｉｍＧ（ＧＩ／ＫＶ）：5'-AGATCTCGACGTGCTTCTTCGCGCT-3'（配列番号：２３）とからなるプライマー対、変異酵素Ｇ／Ｋの作製には、前記プライマーＧ６８２とプライマーＧ／Ｋ：5'-AGATCTCGATGTGCTTCTTCGCGCT-3'（配列番号：２４）とからなるプライマー対、変異酵素Ｉ／Ｖの作製には、前記プライマーＧ６８２とプライマーＩ／Ｖ：5'-AGATCTCGACGTGCCCCTTCGCGCT-3'（配列番号：２５）とからなるプライマー対をそれぞれ用いた。
【０１２３】
得られた変異酵素それぞれについて、５５℃で、０、５、１０又は１５分間インキュベーションした後、得られた変異酵素について、実施例１の（２）の（ｉ）と同様に、加水分解活性を測定した。結果を図１０に示す。なお、図中、インキュベーションをしない場合の加水分解活性を１００として算出した残存活性を示す。また、得られた変異酵素それぞれについて、１５℃、５０℃、５５℃又は６０℃で１０分間インキュベーションした後、得られた変異酵素について、実施例１の（２）の（ｉ）と同様に、加水分解活性を測定した。結果を図１１に示す。なお、図中、１５℃でインキュベーションした後の残存活性を１００として示す。
【０１２４】
その結果、図１０及び図１１に示されるように、キメラＰＬＤ  ｇにおいて、ＴＨ−２ＰＬＤにおける３３１位に対応するアミノ酸残基及び３３３位に対応するアミノ酸残基を、キメラＰＬＤ  ｆにおける対応のアミノ酸残基に置換しても熱安定性は変化しないことがわかった。すなわち、これらのアミノ酸残基は、熱安定性に直接関与しないことが示唆された。
【実施例５】
【０１２５】
前記実施例４と同様の手法により、キメラＨにおける組換ポイントとキメラＩにおける組換ポイントとの間に組換ポイントを有する３種類のキメラＰＬＤ〔キメラＰＬＤ  ｍ、キメラＰＬＤ  ｎ及びキメラＰＬＤ  ｏ〕を作製した。前記キメラＰＬＤ  ｍ、キメラＰＬＤ  ｎ及びキメラＰＬＤ  ｏそれぞれの組換ポイント付近のアミノ酸配列を図１２の上部パネルに示す。
【０１２６】
前記キメラＰＬＤ  ｍ、キメラＰＬＤ  ｎ及びキメラＰＬＤ  ｏそれぞれについて、前記実施例２と同様の手法により、５５℃で１０分間インキュベーションした場合の残存活性を調べた。結果を図１２の上部パネルに示す。なお、図中、１５℃でインキュベーションした後の残存活性を１００として示す。
【０１２７】
その結果、キメラＰＬＤ  ｈが完全に失活したのに対し、キメラＰＬＤ  ｍ、キメラＰＬＤ  ｎ、キメラＰＬＤ  ｏは、いずれもキメラＰＬＤ  ｉと同様に、残存活性が９０％以上であった。
【０１２８】
キメラＰＬＤ  ｈについて、４２６位、４３０位、４３２位及び４３３位のアミノ酸残基が、それぞれ、アラニン、アスパラギン酸、アラニン及びリジンであるのに対し、キメラＰＬＤ  ｍについて、フェニルアラニン、リジン、プロリン及びスレオニンである点である。したがって、これらの残基のうち１若しくは複数の残基が熱安定性に関与することが示唆された。
【実施例６】
【０１２９】
前記実施例３と同様の手法により、キメラＰＬＤ  ｍにおける４２６位のフェニルアラニン、４３０位のリジン、４３２位のプロリン及び４３３位のスレオニンを、それぞれ、キメラＰＬＤ  ｈにおける対応のアミノ酸残基、具体的には、アラニン、アスパラギン酸、アラニン及びリジンに置換した変異酵素Ｆ／Ａ、Ｋ／Ｄ、Ｐ／Ａ及びＴ／Ｋを作製した。
【０１３０】
変異酵素の作製に際し、キメラＰＬＤ  ｈの４２８−４２９番目のセリン−セリンの部分に対応する塩基配列において、アミノ酸配列を変えることなく、制限酵素サイトＸｈｏＩを導入した。すなわち、プライマーＫ６Ｂｇｌ２：5'-ATCTCCAGCGCGAAGGGGCAC-3'（配列番号：２６）とプライマーＸｈｏＩＢａｍＨＩ：5'-GGATCTGCTCGAGCGGGCGGTGGCGAGCTGGAG-3'（配列番号：２７）とからなるプライマー対を用いて、約３００ｂｐの断片を増幅し、得られた産物をｐＵＣ１９上にサブクローニングし、ついで、該３００ｂｐの断片と、キメラＰＬＤ  ｈのＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩとで切り出される領域とを置換した。
【０１３１】
その後、プライマーＸｈｏＩ１２８１：5'-CTCGAGCGACAGCGCCAAGTGGGCCG-3'（配列番号：２８）とプライマーＰＬＤＨＩＳ：5'-GGATCCGAGCCCTGGCAGAGGCC-3' （配列番号：２９）とからなるプライマー対により、約３００ｂｐの断片を増幅し、得られた断片を、キメラＰＬＤ  ｈをコードする核酸のＸｈｏＩより上流側部分に対応する増幅産物と入れ替えたものを、ＸｈｏＩとＢａｍＨＩとで切断し、その切り口に下流側で増幅したものを挿入した。
【０１３２】
得られた産物を用い、変異酵素Ｆ／Ａは、キメラＰＬＤ  ｈをコードする核酸のＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ間の３００ｂｐの断片と置換することで作製し、変異酵素Ｋ／Ｄ、変異酵素Ｐ／Ａ及び変異酵素Ｔ／Ｋは、キメラＰＬＤ  ｈをコードする核酸のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ間の３００ｂｐの断片と置換することで作製した。
【０１３３】
なお、変異酵素Ｆ／Ａの作製には、プライマーＸｈｏＩ−ＤＡＫ／ＫＰＴ：5'-CTCGAGCAAGAGCCCCACGTGGGCCG-3' （配列番号：３０）と前記プライマーＰＬＤＨＩＳとからなるプライマー対、変異酵素Ｋ／Ｄの作製には、プライマーＸｈｏＩ−ＤＡＫ／ＤＰＴ：5'-CTCGAGCGACAGCCCCACGTGGGCCG-3'（配列番号：３１）と前記プライマーＰＬＤＨＩＳとからなるプライマー対、変異酵素Ｐ／Ａの作製には、プライマーＸｈｏＩ−ＤＡＫ／ＫＡＴ：5'-CTCGAGCAAGAGCGCCACGTGGGCCG-3'（配列番号：３２）と前記プライマーＰＬＤＨＩＳとからなるプライマー対、変異酵素Ｔ／Ｋの作製には、プライマーＸｈｏＩ−ＤＡＫ／ＫＰＫ：5'-CTCGAGCAAGAGCCCCAAGTGGGCCG-3'（配列番号：３３）と前記プライマーＰＬＤＨＩＳとからなるプライマー対をそれぞれ用いた。
【０１３４】
得られた変異酵素それぞれについて、６０℃で、０、５、１０又は１５分間インキュベーションした後、得られた変異酵素について、実施例１の（２）の（ｉ）と同様に、加水分解活性を測定した。結果を図１３に示す。なお、図中、インキュベーションをしない場合の加水分解活性を１００として算出した残存活性を示す。また、得られた変異酵素それぞれについて、１５℃、５０℃、５５℃又は６０℃で１０分間インキュベーションした後、得られた変異酵素について、実施例１の（２）の（ｉ）と同様に、加水分解活性を測定した。結果を図１４に示す。なお、図中、１５℃でインキュベーションした後の残存活性を１００として示す。
【０１３５】
図１３及び１４に示されるように、ＴＨ−２ＰＬＤにおける４２６位に対応するアミノ酸残基及び４３３位に対応するアミノ酸残基が熱安定性に関与する残基であることが示唆された。
【実施例７】
【０１３６】
前記実施例３と同様の手法により、キメラＰＬＤ  ｈにおいて、ＴＨ−２ＰＬＤにおける４２６位に対応するアミノ酸残基及び４３３位に対応するアミノ酸残基を、キメラＰＬＤ  ｈに比べて易熱性であるキメラＰＬＤ  ｍにおける対応のアミノ酸残基に置換した変異酵素〔キメラＰＬＤ  ｈ  Ａ／Ｆ、キメラＰＬＤ  ｈ  Ｋ／Ｔ及びキメラＰＬＤ  ｈ  ＡＫ／ＦＴ〕を作製した。
【０１３７】
なお、キメラＰＬＤ  ｈ  Ａ／Ｆの作製には、前記プライマーＫ６Ｂｇｌ２とプライマーＡ／Ｆ−ＸｈｏＩ：5'-CTCGAGCGGAAGGTGGCGAGCTGGAG-3'（配列番号：３４）とからなるプライマー対、キメラＰＬＤ  ｈ  Ｋ／Ｔの作製には、プライマーＸｈｏＩ−ＤＡＫ／ＤＡＴ：5'-CTCGAGCGACAGCGCCACGTGGGCCG-3' （配列番号：３５）と前記プライマーＰＬＤＨＩＳとからなるプライマー対を用いた。また、キメラＰＬＤ  ｈ  ＡＫ／ＦＴの作製は、ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ間でキメラＰＬＤ  ｈ（Ａ／Ｆ）とキメラＰＬＤ  ｈ（Ｋ／Ｔ）とを連結させることにより作製した。
【０１３８】
得られた変異酵素それぞれについて、１５℃、５０℃、５５℃又は６０℃で１０分間インキュベーションした後、得られた変異酵素について、実施例１の（２）の（ｉ）と同様に、加水分解活性を測定した。結果を図１５に示す。なお、図中、１５℃でインキュベーションした後の残存活性を１００として示す。また、得られた変異酵素それぞれについて、５５℃で、０、５、１０又は１５分間インキュベーションした後、得られた変異酵素について、実施例１の（２）の（ｉ）と同様に、加水分解活性を測定した。結果を図１６に示す。なお、図中、インキュベーションをしない場合の加水分解活性を１００として算出した残存活性を示す。
【０１３９】
その結果、図１５及び１６に示されるように、キメラＰＬＤ  ｈにおいて、ＴＨ−２ＰＬＤにおける４２６位に対応するアミノ酸残基及び４３３位に対応するアミノ酸残基を、キメラＰＬＤ  ｍにおける対応のアミノ酸残基に置換することにより、キメラＰＬＤ  ｈの熱安定性が向上することがわかった。
【０１４０】
すなわち、ＴＨ−２ＰＬＤにおける４２６位に対応するアミノ酸残基及び４３３位に対応するアミノ酸残基を、Ｋ６ＰＬＤと同様のアミノ酸残基に置換することにより、熱安定性が向上することがわかった。
【実施例８】
【０１４１】
実施例３と同様の手法により、ＴＨ−２ＰＬＤの４２６位のアラニン及び４３３位のリジンのそれぞれを、Ｋ６ＰＬＤと同様のアミノ酸残基に置換した変異酵素〔ＴＨ−２ＰＬＤ  Ａ／Ｆ、ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｋ／Ｔ及びＴＨ−２ＰＬＤ  ＡＫ／ＦＴ〕を作製した。
【０１４２】
ＴＨ−２ＰＬＤの変異酵素の作製に際し、ＴＨ−２ＰＬＤの４２８−４２９番目（1281番目の塩基）のセリン−セリンの部分に対応する塩基配列において、アミノ酸配列を変えることなく、制限酵素サイトＸｈｏＩを導入した。
【０１４３】
プライマーＴＨ２Ｂｇｌ２：5'-AGCGCGAAGAAGCACGTCGA-3' （配列番号：３６）と前記プライマーＸｈｏＩＢａｍＨＩとからなるプライマー対を用いて、約３００ｂｐの断片を増幅し、得られた産物をｐＵＣ１９上にサブクローニングし、ついで、該３００ｂｐの断片と、ＴＨ−２ＰＬＤのＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩとで切り出される領域とを置換した。
【０１４４】
その後、前記プライマーＸｈｏＩ１２８１と前記プライマーＰＬＤＨＩＳとを用いて、約３００ｂｐの断片を増幅し、得られた断片を、ＴＨ−２をコードする核酸のＸｈｏＩより上流側に対応する増幅産物と入れ替えたものを、ＸｈｏＩとＢａｍＨＩとで切断し、その切り口に下流側で増幅したものを挿入した。
【０１４５】
得られた産物を用い、変異酵素ＴＨ−２ＰＬＤ  Ａ／Ｆは、ＴＨ−２ＰＬＤをコードする核酸のＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ間の３００ｂｐの断片と置換することで作製し、変異酵素ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｋ／Ｔは、ＴＨ−２ＰＬＤをコードする核酸のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ間の３００ｂｐの断片と置換することで作製した。
【０１４６】
なお、ＴＨ−２ＰＬＤ  Ａ／Ｆの作製には、前記プライマーＴＨ２Ｂｇｌ２と前記プライマーＡ／Ｆ−ＸｈｏＩとからなるプライマー対、ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｋ／Ｔの作製には、前記プライマーＸｈｏＩ−ＤＡＫ／ＤＡＴと前記プライマーＰＬＤＨＩＳとからなるプライマー対を用いた。また、ＴＨ−２ＰＬＤ  ＡＫ／ＦＴの作製は、ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ間でＴＨ−２ＰＬＤ  Ａ／ＦとＴＨ−２ＰＬＤ  Ｋ／Ｔとを連結させることにより作製した。
【０１４７】
得られた変異酵素それぞれについて、１５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃又は７０℃で１０分間インキュベーションした後、得られた変異酵素について、実施例１の（２）の（ｉ）と同様に、加水分解活性を測定した。結果を図１７に示す。なお、図中、１５℃でインキュベーションした後の残存活性を１００として示す。また、得られた変異酵素それぞれについて、６０℃及び６２℃それぞれで、０、５、１０又は１５分間インキュベーションした後、得られた変異酵素について、実施例１の（２）の（ｉ）と同様に、加水分解活性を測定した。結果を図１８及び図１９それぞれに示す。なお、図中、インキュベーションをしない場合の加水分解活性を１００として算出した残存活性を示す。
【０１４８】
その結果、図１８及び図１９それぞれに示されるように、ＴＨ−２ＰＬＤの４２６位のアラニン及び４３３位のリジンのそれぞれを、Ｋ６ＰＬＤと同様に、フェニルアラニン及びスレオニンそれぞれに置換することにより、熱安定性が向上することがわかった。
【実施例９】
【０１４９】
前記実施例３と同様の手法により、ＴＨ−２ＰＬＤにおいて、１８８位のグリシンのフェニルアラニンへの置換と、４２６位のアラニンのフェニルアラニンへの置換及び／又は４３３位のリジンのスレオニンへの置換とを有する変異酵素〔ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｇ１８８Ｆ、ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｇ１８８ＦＡ／Ｆ、ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｇ１８８ＦＡＫ／ＦＴ〕を作製した。
【０１５０】
前記ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｇ１８８Ｆは、前記実施例３と同様に作製した。
【０１５１】
ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｇ１８８ＦＡ／Ｆ及びＴＨ−２ＰＬＤ  Ｇ１８８ＦＡＫ／ＦＴは、前記ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｇ１８８Ｆと、実施例８で得られたＴＨ−２ＰＬＤ  Ａ／Ｆ及びＴＨ−２ＰＬＤ  ＡＫ／ＦＴのそれぞれを用い、ＢｇｌＩとＢａｍＨＩとを用いて作製した。
【０１５２】
得られた変異酵素それぞれについて、１５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃又は７０℃で１０分間インキュベーションした後、得られた変異酵素について、実施例１の（２）の（ｉ）と同様に、加水分解活性を測定した。結果を図２０に示す。なお、図中、１５℃でインキュベーションした後の残存活性を１００として示す。また、得られた変異酵素それぞれについて、７０℃、７２℃及び７４℃それぞれで、０、５、１０又は１５分間インキュベーションした後、得られた変異酵素について、実施例１の（２）の（ｉ）と同様に、加水分解活性を測定した。結果を図２１、図２２及び図２３それぞれに示す。なお、図中、インキュベーションをしない場合の加水分解活性を１００として算出した残存活性を示す。
【０１５３】
その結果、図２０、図２１、図２２及び図２３それぞれに示されるように、ＴＨ−２ＰＬＤにおいて、１８８位のグリシンのフェニルアラニンへの置換に加え、４２７位のアラニンをフェニルアラニンに置換すること及び／又は４３４位のリジンをスレオニンに置換することにより、１８８位のグリシンのフェニルアラニンへの置換のみを有する場合と比べ、熱安定性が向上することがわかった。
【実施例１０】
【０１５４】
前記実施例３と同様の手法により、ＴＨ−２ＰＬＤにおいて、４２６位のアミノ酸残基に対応するアラニンが他のアミノ酸残基に置換された変異酵素〔ＴＨ−２（Ａ４２６Ｇ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｖ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｉ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｌ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｆ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｗ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｙ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｈ）〕及び４３３位のアミノ酸残基に対応するリジンが他のアミノ酸残基に置換された変異酵素〔ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｔ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｓ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｙ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｃ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｒ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｈ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｄ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｅ）〕を作製した。
【０１５５】
なお、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｔ）の作製には、前記プライマーＸｈｏＩ−ＤＡＫ／ＤＡＴと前記プライマーＰＬＤＨＩＳとからなるプライマー対、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｙ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３ｈ）又はＴＨ−２（Ｋ４３３Ｄ）の作製には、プライマーＸｈｏＩ−Ｋ／ＹＨＤ：5'-CTCGAGCGACAGCGCCBACTGGGCCG-3'（Ｂ＝Ｔ又はＧ又はＣ）（配列番号：３７）と前記プライマーＰＬＤＨＩＳとからなるプライマー対、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｓ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｃ）又はＴＨ−２（Ｋ４３３Ｒ）の作製には、プライマーＸｈｏＩ−Ｋ／ＳＣＲ：5'-CTCGAGCGACAGCGCCHGCTGGGCCG-3' （Ｈ＝Ａ又はＴ又はＣ）（配列番号：３８）と前記プライマーＰＬＤＨＩＳとからなるプライマー対、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｅ）の作製には、プライマーＸｈｏＩ−Ｋ／Ｅ：5'-CTCGAGCGACAGCGCCGAGTGGGCCG-3' （配列番号：３９）と前記プライマーＰＬＤＨＩＳとからなるプライマー対をそれぞれ用いた。
【０１５６】
得られた変異酵素それぞれについて、１５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃又は７０℃で１０分間インキュベーションした後、得られた変異酵素について、実施例１の（２）の（ｉ）と同様に、加水分解活性を測定した。結果を図２４及び図２５に示す。なお、図中、１５℃でインキュベーションした後の残存活性を１００として示す。また、得られた変異酵素それぞれについて、６５℃で、０、５、１０又は１５分間インキュベーションした後、得られた変異酵素について、実施例１の（２）の（ｉ）と同様に、加水分解活性を測定した。結果を図２６及び図２７それぞれに示す。なお、図中、インキュベーションをしない場合の加水分解活性を１００として算出した残存活性を示す。
【０１５７】
その結果、図２４及び図２５に示されるように、ＴＨ−２ＰＬＤにおいて、４２６位のアミノ酸残基に対応するアラニンについて、グリシン、フェニルアラニン又はチロシンに置換することにより、ＴＨ−２ＰＬＤに比べ、熱安定性が向上することがわかった。
【０１５８】
また、図２６及び図２７に示されるように、ＴＨ−２ＰＬＤにおいて、４３３位のアミノ酸残基に対応するリジンが、スレオニン、セリン、チロシン、システイン、アルギニン又はヒスチジンに置換することにより、ＴＨ−２ＰＬＤに比べ、熱安定性が向上することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１５９】
本発明によれば、化粧品基材、医薬品等に有用な、リン脂質、該リン脂質の誘導体の製造における効率の向上に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】図１は、キメラホスホリパーゼＤ（キメラＰＬＤ）の構造及び熱安定性を示す図である。左パネルは、ストレプトマイセス  ハルステディ  Ｋ１(Streptomyces halstedii K1)株由来ホスホリパーゼＤ（Ｋ１ＰＬＤ）、ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２(Streptomyces septatus TH-2)株由来ホスホリパーゼＤ（ＴＨ−２ＰＬＤ）及び該Ｋ１ＰＬＤとＴＨ−２ＰＬＤとから作製したキメラホスホリパーゼＤのそれぞれの１次構造を示す概略図である。左パネル中、「ａａ」は、アミノ酸残基を示す。右パネルは、６０℃１０分間インキュベーションした場合のＫ１ＰＬＤ、ＴＨ−２ＰＬＤ及びキメラＰＬＤの熱安定性を示す図である。
【図２】図２は、変異酵素Ｃ１〜Ｃ４における変異部位及び熱安定性を示す図である。左パネルは、キメラＰＬＤ  Ｃの変異酵素Ｃ１〜Ｃ４における変異部位の構造を示す。右パネルは、６０℃１０分間インキュベーションした場合のキメラＰＬＤ  Ｃ及び変異酵素Ｃ１〜Ｃ４の熱安定性を示す。
【図３】図３は、６０℃１０分間インキュベーションした場合のＴＨ−２ＰＬＤ変異酵素の熱安定性を示す図である。
【図４】図４は、ＴＨ−２ＰＬＤ変異酵素の至適温度条件を調べた結果を示す図である。パネルＡは、至適温度を調べた結果を示し、パネルＢは、３７℃及び６５℃のそれぞれにおける比活性を調べた結果を示す。なお、図中、白丸は、１８８位が、Ｇ、黒丸は、Ｖ、白三角は、Ｆ、黒三角は、Ｓ、白四角は、Ｗである変異酵素を示す。
【図５】図５は、ＴＨ−２ＰＬＤ及びその変異酵素（０．１ｍｇ／ｍｌ）の熱安定性を示す図である。パネルＡは、１５℃、５５℃、６５℃、６８℃、７５℃のそれぞれで１０分間インキュベーションした後の残存活性を示し、パネルＢは、６８℃で、５分間、１０分間、１５分間インキュベーションした場合の残存活性の継時変化を示す。なお、図中、白丸は、１８８位が、Ｇ、黒丸は、Ｖ、白三角は、Ｆ、黒三角は、Ｓ、白四角は、Ｗである変異酵素を示す。
【図６】図６は、ＴＨ−２ＰＬＤとＫ６ＰＬＤとのキメラＰＬＤであるキメラＰＬＤ  ａ〜ｉの構造を示す図である。
【図７】図７は、５０、５５、６０、６５及び７０℃で１０分間インキュベーションした場合のキメラＰＬＤ  ａ〜ｉの熱安定性を示す図である。図中、Ａ〜Ｉは、それぞれ、キメラＰＬＤ  ａ〜ｉに対応する。また、図中、Ｋ６は、Ｋ６ＰＬＤ、ＴＨ−２は、ＴＨ−２ＰＬＤを示す。
【図８】図８は、５０℃又は５５℃１０分間インキュベーションした場合のキメラＰＬＤ  ａ〜ｉの熱安定性を示す図である。
【図９】図９は、キメラＰＬＤ  ｆ、キメラＰＬＤ  ｊ、キメラＰＬＤ  ｋ、キメラＰＬＤ  ｌ及びキメラＰＬＤ  ｇの構造並びに熱安定性を示す図である。左パネルは、キメラＰＬＤ  ｆ、キメラＰＬＤ  ｊ、キメラＰＬＤ  ｋ、キメラＰＬＤ  ｌ及びキメラＰＬＤ  ｇそれぞれの組換ポイント付近のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号：４０〜４４）を示す。右パネルは、５０℃、５５℃及び６０℃それぞれで１０分間インキュベーションした場合のキメラＰＬＤ  ｆ、ｊ、ｋ、ｌ及びｇ（Ｆ、Ｊ、Ｋ、Ｌ及びＧ）の熱安定性を示す。
【図１０】図１０は、５５℃で、０、５、１０又は１５分間インキュベーションした場合の変異酵素ＧＩ／ＫＶ、変異酵素Ｇ／Ｋ及び変異酵素Ｉ／Ｖの熱安定性を示す図である。
【図１１】図１１は、１５℃、５０℃、５５℃又は６０℃で１０分間インキュベーションした場合の変異酵素ＧＩ／ＫＶ、変異酵素Ｇ／Ｋ及び変異酵素Ｉ／Ｖの熱安定性を示す図である。
【図１２】図１２は、キメラＰＬＤ  ｍ、キメラＰＬＤ  ｎ及びキメラＰＬＤ  ｏの構造並びに熱安定性を示す図である。上部パネルは、前記キメラＰＬＤ  ｍ〜キメラＰＬＤ  ｏそれぞれの組換ポイント付近のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号：４５〜４９）を示す。下部パネルは、５５℃で１０分間インキュベーションした場合の前記キメラＰＬＤ  ｍ〜キメラＰＬＤ  ｏそれぞれの熱安定性を示す。
【図１３】図１３は、６０℃で、０、５、１０又は１５分間インキュベーションした場合のキメラＰＬＤ  ｍの変異酵素Ｆ／Ａ、Ｋ／Ｄ、Ｐ／Ａ及びＴ／Ｋの熱安定性を示す図である。
【図１４】図１４は、１５℃、５０℃、５５℃又は６０℃で１０分間インキュベーションした場合のキメラＰＬＤ  ｍの変異酵素Ｆ／Ａ、Ｋ／Ｄ、Ｐ／Ａ及びＴ／Ｋの熱安定性を示す図である。
【図１５】図１５は、１５℃、５０℃、５５℃又は６０℃で１０分間インキュベーションした場合のキメラＰＬＤ  ｈの変異酵素〔キメラＰＬＤ  ｈ  Ａ／Ｆ、キメラＰＬＤ  ｈ  Ｋ／Ｔ及びキメラＰＬＤ  ｈ  ＡＫ／ＦＴ〕の熱安定性を示す図である。
【図１６】図１６は、５５℃で、０、５、１０又は１５分間インキュベーションしたのキメラＰＬＤ  ｈの変異酵素〔キメラＰＬＤ  ｈ  Ａ／Ｆ、キメラＰＬＤ  ｈ  Ｋ／Ｔ及びキメラＰＬＤ  ｈ  ＡＫ／ＦＴ〕の熱安定性を示す図である。
【図１７】図１７は、１５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃又は７０℃で１０分間インキュベーションした場合のＴＨ−２ＰＬＤの変異酵素〔ＴＨ−２ＰＬＤ  Ａ／Ｆ、ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｋ／Ｔ及びＴＨ−２ＰＬＤ  ＡＫ／ＦＴ〕の熱安定性を示す図である。
【図１８】図１８は、６０℃で、０、５、１０又は１５分間インキュベーションした場合のＴＨ−２ＰＬＤの変異酵素〔ＴＨ−２ＰＬＤ  Ａ／Ｆ、ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｋ／Ｔ及びＴＨ−２ＰＬＤ  ＡＫ／ＦＴ〕の熱安定性を示す図である。
【図１９】図１９は、６２℃で、０、５、１０又は１５分間インキュベーションした場合のＴＨ−２ＰＬＤの変異酵素〔ＴＨ−２ＰＬＤ  Ａ／Ｆ、ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｋ／Ｔ及びＴＨ−２ＰＬＤ  ＡＫ／ＦＴ〕の熱安定性を示す図である。
【図２０】図２０は、１５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃又は７０℃で１０分間インキュベーションした場合のＴＨ−２ＰＬＤの変異酵素〔ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｇ１８８Ｆ、ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｇ１８８ＦＡ／Ｆ、ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｇ１８８ＦＡＫ／ＦＴ〕の熱安定性を示す。
【図２１】図２１は、７０℃で、０、５、１０又は１５分間インキュベーションした場合のＴＨ−２ＰＬＤの変異酵素〔ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｇ１８８Ｆ、ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｇ１８８ＦＡ／Ｆ、ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｇ１８８ＦＡＫ／ＦＴ〕の熱安定性を示す図である。
【図２２】図２２は、７２℃で、０、５、１０又は１５分間インキュベーションした場合のＴＨ−２ＰＬＤの変異酵素〔ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｇ１８８Ｆ、ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｇ１８８ＦＡ／Ｆ、ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｇ１８８ＦＡＫ／ＦＴ〕の熱安定性を示す。
【図２３】図２３は、７４℃で、０、５、１０又は１５分間インキュベーションした場合のＴＨ−２ＰＬＤの変異酵素〔ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｇ１８８Ｆ、ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｇ１８８ＦＡ／Ｆ、ＴＨ−２ＰＬＤ  Ｇ１８８ＦＡＫ／ＦＴ〕の熱安定性を示す。
【図２４】図２４は、１５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃又は７０℃で１０分間インキュベーションした場合のＴＨ−２ＰＬＤの変異酵素〔ＴＨ−２（Ａ４２６Ｇ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｖ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｉ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｌ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｆ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｗ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｙ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｈ）〕の熱安定性を示す図である。
【図２５】図２５は、１５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃又は７０℃で１０分間インキュベーションした場合のＴＨ−２ＰＬＤの変異酵素〔ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｔ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｓ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｙ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｃ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｒ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｈ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｄ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｅ）〕の熱安定性を示す図である。
【図２６】図２６は、６５℃で、０、５、１０又は１５分間インキュベーションした場合のＴＨ−２ＰＬＤの変異酵素〔ＴＨ−２（Ａ４２６Ｇ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｖ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｉ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｌ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｆ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｗ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｙ）、ＴＨ−２（Ａ４２６Ｈ）〕の熱安定性を示す図である。
【図２７】図２７は、６５℃で、０、５、１０又は１５分間インキュベーションした場合のＴＨ−２ＰＬＤの変異酵素〔ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｔ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｓ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｙ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｃ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｒ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｈ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｄ）、ＴＨ−２（Ｋ４３３Ｅ）〕の熱安定性を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１６１】
配列番号：１１は、プライマーＴ１の配列である。
【０１６２】
配列番号：１２は、プライマーＴ２の配列である。
【０１６３】
配列番号：１３は、リンカー配列である。
【０１６４】
配列番号：１４は、プライマーＴ３の配列である。
【０１６５】
配列番号：１５は、プライマーＴ４の配列である。
【０１６６】
配列番号：１６は、プライマーＴ５の配列である。
【０１６７】
配列番号：１７は、プライマーＴ６の配列である。２４位〜２６位のｎは、任意のヌクレオチドである。
【０１６８】
配列番号：１８は、プライマーＰＤＫ６-Ｃ１の配列である。
【０１６９】
配列番号：１９は、プライマーＰＤＫ６-Ｃ２の配列である。
【０１７０】
配列番号：２0は、プライマーＨＩＳ６-１の配列である。
【０１７１】
配列番号：２１は、プライマーＨＩＳ６-２の配列である。
【０１７２】
配列番号：２２は、プライマーＧ６８２の配列である。
【０１７３】
配列番号：２３は、プライマーｃｈｉｍＧ（ＧＩ／ＫＶ）の配列である。
【０１７４】
配列番号：２４は、プライマーＧ／Ｋの配列である。
【０１７５】
配列番号：２５は、プライマーＩ／Ｖの配列である。
【０１７６】
配列番号：２６は、プライマーＫ６Ｂｇｌ２の配列である。
【０１７７】
配列番号：２７は、プライマーＸｈｏＩＢａｍＨＩの配列である。
【０１７８】
配列番号：２８は、プライマーＸｈｏＩ１２８１の配列である。
【０１７９】
配列番号：２９は、プライマーＰＬＤＨＩＳの配列である。
【０１８０】
配列番号：３0は、プライマーＸｈｏＩ−ＤＡＫ／ＫＰＴの配列である。
【０１８１】
配列番号：３１は、プライマーＸｈｏＩ−ＤＡＫ／ＤＰＴの配列である。
【０１８２】
配列番号：３２は、プライマーＸｈｏＩ−ＤＡＫ／ＫＡＴの配列である。
【０１８３】
配列番号：３３は、プライマーＸｈｏＩ−ＤＡＫ／ＫＰＫの配列である。
【０１８４】
配列番号：３４は、プライマーＡ／Ｆ−ＸｈｏＩの配列である。
【０１８５】
配列番号：３５は、プライマーＸｈｏＩ−ＤＡＫ／ＤＡＴの配列である。
【０１８６】
配列番号：３６は、プライマーＴＨ２Ｂｇｌ２の配列である。
【０１８７】
配列番号：３７は、プライマーＸｈｏＩ−Ｋ／ＹＨＤの配列である。
【０１８８】
配列番号：３８は、プライマーＸｈｏＩ−Ｋ／ＳＣＲの配列である。
【０１８９】
配列番号：３９は、プライマーＸｈｏＩ−Ｋ／Ｅの配列である。
【０１９０】
配列番号：４0は、キメラＰＬＤ  ｆの部分配列である。
【０１９１】
配列番号：４１は、キメラＰＬＤ  ｊの部分配列である。
【０１９２】
配列番号：４２は、キメラＰＬＤ  ｋの部分配列である。
【０１９３】
配列番号：４３は、キメラＰＬＤ  ｌの部分配列である。
【０１９４】
配列番号：４４は、キメラＰＬＤ  ｇの部分配列である。
【０１９５】
配列番号：４５は、キメラＰＬＤ  ｈの部分配列である。
【０１９６】
配列番号：４６は、キメラＰＬＤ  ｍの部分配列である。
【０１９７】
配列番号：４７は、キメラＰＬＤ  ｎの部分配列である。
【０１９８】
配列番号：４８は、キメラＰＬＤ  ｏの部分配列である。
【０１９９】
配列番号：４９は、キメラＰＬＤ  ｉの部分配列である。
【図１】
2005080519.tif 000002
【図２】
2005080519.tif 000003
【図３】
2005080519.tif 000004
【図４】
2005080519.tif 000005
【図５】
2005080519.tif 000006
【図６】
2005080519.tif 000007
【図７】
2005080519.tif 000008
【図８】
2005080519.tif 000009
【図９】
2005080519.tif 000010
【図１０】
2005080519.tif 000011
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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