(57)【要約】【課題】ＨｂＡ１ｃの従来の免疫的測定法である酵素免疫測定法は、免疫的測定の特徴である特異性は発揮できるものの、操作が煩雑で測定完了に３時間程度要するため、操作の容易性と測定時間の向上に対する課題があった。【解決手段】微粒子の表面上に、ＨｂＡ１ｃの特徴的部位（エピトープ）の構造を有するフルクトシルアミノ酸が、少なくとも２つ以上結合したフルクトシルアミノ酸標識物、およびこれを用いたＨｂＡ１ｃの免疫的測定方法を提供する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子と前記微粒子の表面に結合した２分子以上の化学式：
【化１】
2005024328.tif 000004
で示されるフルクトシルアミノ酸とを含むフルクトシルアミノ酸標識物。
【請求項２】
前記微粒子の粒径が１ｎｍ以上１０μｍ以下である請求項１記載のフルクトシルアミノ酸標識物。
【請求項３】
前記微粒子が、ラテックスまたは金属コロイドである請求項１記載のフルクトシルアミノ酸標識物。
【請求項４】
前記微粒子が、ポリペプチドまたはタンパク質である請求項１記載のフルクトシルアミノ酸標識物。
【請求項５】
（ａ）微粒子と、前記微粒子の表面に結合した２分子以上の化学式：
【化２】
2005024328.tif 000005
で示されるフルクトシルアミノ酸とを含むフルクトシルアミノ酸標識物を含む第１の懸濁液を調製する工程、
（ｂ）前記第１の懸濁液に、ＨｂＡｌｃに特異的に結合する抗ＨｂＡｌｃ抗体を添加して第２の懸濁液を調製する工程、
（ｃ）前記第１の懸濁液に、ＨｂＡ１ｃを含む試料液および前記ＨｂＡｌｃに特異的に結合する抗ＨｂＡ１ｃ抗体を添加して第３の懸濁液を調製する工程、
（ｄ）前記第２の懸濁液および前記第３の懸濁液に光を照射し、前記第２の懸濁液からの散乱光の強度と前記第３の懸濁液からの散乱光の強度とを比較し、前記試料液に含まれるＨｂＡ１ｃの濃度を定量的に測定する工程
を含むことを特徴とするＨｂＡ１ｃの免疫的測定方法。
【請求項６】
前記光および前記散乱光の波長が２００〜９００ｎｍである請求項５記載のＨｂＡ１ｃの免疫的測定方法。
【請求項７】
微粒子と、前記微粒子の表面に結合した２分子以上の化学式：
【化３】
2005024328.tif 000006
で示されるフルクトシルアミノ酸とを含むフルクトシルアミノ酸標識物を用いたＨｂＡｌｃ免疫的定量測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖尿病管理において有効なマーカーとなる糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の免疫的検出に有用なフルクトシルアミノ酸標識物、およびこの標識物を用いたＨｂＡ１ｃの免疫的測定方法および測定装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＨｂＡ１ｃは血液中に存在するヘモグロビンの一種であり、糖尿病管理のマーカーとして有用である。しかし、その構造は、他のヘモグロビン（大部分はＨｂＡ０）の構造と非常に似かよっており、違いはアミノ酸β鎖のＮ末端にフルクトースが結合しているか否かという点だけである。したがって、ＨｂＡ１ｃの測定には、このわずかな違いを見分ける技術が必要である。
【０００３】
現在、ＨｂＡ１ｃを測定する方法の主流はＨＰＬＣ法であるが、操作の容易性および特異性の観点からみると、抗原抗体反応を利用した免疫的測定の方が有利である。そして、ＨｂＡ１ｃを免疫的に測定する方法としては、抗ＨｂＡ１ｃ抗体とこれに結合する酵素標識２次抗体とを用いた酵素免疫測定法が主流である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上述の酵素免疫測定法においては、免疫的測定の特徴である特異性は発揮させることができるものの、操作が煩雑で、測定が完了するまでに３時間程度の時間を要するため、操作の容易性および測定時間に問題がある。そこで、本発明は、操作が用意で測定時間の短いＨｂＡｌｃの免疫的定量測定を可能とすることを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上述のような問題を解決すべく、本発明は、微粒子と、前記微粒子の表面に結合した２分子以上の化学式：
【０００６】
【化４】
2005024328.tif 000002
【０００７】
で示されるフルクトシルアミノ酸とを含むフルクトシルアミノ酸標識物を提供する。
【０００８】
前記フルクトシルアミノ酸標識物においては、前記微粒子の粒径が１ｎｍ以上１０μｍ以下であるのが好ましい。
また、前記微粒子が、ラテックスまたは金属コロイドであるのが好ましい。
また、前記微粒子は、ポリペプチドまたはタンパク質でもよい。
【０００９】
さらに、本発明は、前記フルクトシルアミノ酸標識物を用いたＨｂＡｌｃの免疫的測定方法も提供する。この方法は、
（ａ）微粒子と、前記微粒子の表面に結合した２分子以上の化学式：
【００１０】
【化５】
2005024328.tif 000003
【００１１】
で示されるフルクトシルアミノ酸とを含むフルクトシルアミノ酸標識物を含む第１の懸濁液を調製する工程、
（ｂ）前記第１の懸濁液に、ＨｂＡｌｃに特異的に結合する抗ＨｂＡｌｃ抗体を添加して第２の懸濁液を調製する工程、
（ｃ）前記第１の懸濁液に、ＨｂＡ１ｃを含む試料液および前記ＨｂＡｌｃに特異的に結合する抗ＨｂＡ１ｃ抗体を添加して第３の懸濁液を調製する工程、
（ｄ）前記第２の懸濁液および前記第３の懸濁液に光を照射し、前記第２の懸濁液からの散乱光の強度と前記第３の懸濁液からの散乱光の強度とを比較し、前記試料液に含まれるＨｂＡ１ｃの濃度を定量的に測定する工程を含むことを特徴とする。
【００１２】
この免疫的測定方法においては、前記光および前記散乱光の波長が２００〜９００ｎｍであるのが好ましい。
【００１３】
また、本発明は、前記フルクトシルアミノ酸標識物を用いたＨｂＡ１ｃ免疫的定量測定装置にも関する。かかる免疫測定装置は、免疫反応を行わせる反応セルと、波長２００ｎｍ〜８００ｎｍの光を照射し得る光源と、前記波長の散乱光を検出し得る検出器と、検出した散乱光の強度をＨｂＡｌｃ濃度に変換する解析装置とで構成される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、抗ＨｂＡ１ｃ抗体が結合するＨｂＡ１ｃ上の特徴的部位（エピトープ）と同じ構造を有する化合物である上記化学式で示されるフルクトシルアミノ酸を、少なくとも２分子以上、微粒子の表面上に結合させて得られるフルクトシルアミノ酸標識物、これを用いたＨｂＡ１ｃの免疫的測定方法、および測定装置を提供する。
【００１５】
本発明に係るフルクトシルアミノ酸標識物は、微粒子の表面上に上記化学式で示されるフルクトシルアミノ酸を少なくとも２分子以上結合させたものである。上限は特にないが、５０分子程度であればよい。本発明における微粒子としては、種々のものを用いることができるが、その粒径がおよそ１００μｍ以下の微粒子であるのが好ましい。例えば、ラテックス粒子、金属コロイド、およびタンパク質などが挙げられる。なかでも、粒径が０．１μｍ以下の粒子は、懸濁液中での分布が均一になりやすく、散乱光も測定しやすいため好ましい。
【００１６】
また、本発明に係るＨｂＡ１ｃの免疫的測定方法および測定装置は、上記フルクトシルアミノ酸標識物と抗ＨｂＡ１ｃ抗体とが結合・架橋した際に凝集するという現象を利用し、その凝集度に応じて変化する照射光の散乱光強度を測定し、その測定値からＨｂＡ１ｃの濃度を免疫的に測定するものである。
【００１７】
フルクトシルアミノ酸標識物と抗ＨｂＡ１ｃ抗体とは、本来結合して凝集するが、同じ系内にＨｂＡ１ｃが存在すると、抗体は抗原であるＨｂＡ１ｃと優先的に結合し、微粒子標識物と結合する抗体の量、すなわち凝集に関与する抗体の量が減少し、その結果、凝集度が低下する。したがって、これによる散乱光の強度も減少するため、この散乱光強度の減少度からＨｂＡ１ｃの濃度を測定することができる。
【００１８】
ここで、測定に用いる光の波長は、２００ｎｍ〜９００ｎｍであるのが望ましい。なかでも、６００ｎｍ〜９００ｎｍの長波長領域の光は、混在する不純物の影響を受けにくいため好ましい。
【００１９】
また、本発明は、（ａ）微粒子と、前記微粒子の表面に結合した２分子以上の上記化学式で示されるフルクトシルアミノ酸とを含むフルクトシルアミノ酸標識物を含む第１の懸濁液を調製する工程、（ｂ）前記第１の懸濁液に、ＨｂＡｌｃに特異的に結合する抗ＨｂＡｌｃ抗体を添加して第２の懸濁液を調製する工程、（ｃ）前記第１の懸濁液に、ＨｂＡ１ｃを含む試料液および前記ＨｂＡｌｃに特異的に結合する抗ＨｂＡ１ｃ抗体を添加して第３の懸濁液を調製する工程、（ｄ）前記第２の懸濁液および前記第３の懸濁液に光を照射し、前記第２の懸濁液からの散乱光の強度と前記第３の懸濁液からの散乱光の強度とを比較し、前記試料液に含まれるＨｂＡ１ｃの濃度を定量的に測定する工程を含むことを特徴とするＨｂＡ１ｃの免疫的測定方法をも提供する。
【００２０】
前記光および前記散乱光の波長が２００〜９００ｎｍであるのが好ましい。
また、本発明は、前記フルクトシルアミノ酸標識物を用いたＨｂＡ１ｃ免疫的定量測定装置にも関する。かかる免疫測定装置は、免疫反応を行わせる反応セルと、波長２００ｎｍ〜８００ｎｍの光を照射し得る光源と、前記波長の散乱光を検出し得る検出器と、検出した散乱光の強度をＨｂＡｌｃ濃度に変換する解析装置とで構成される。
【００２１】
【実施例】
以下に、具体的な実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００２２】
《実施例１：フルクトシルアミノ酸標識物の作製》
本実施例では、微粒子としてタンパク質であるチキンγ―グロブリン（ＣＧＧ）を用い、測定に使用した光の波長は７００ｎｍとした。
【００２３】
（１）フルクトシルアミノ酸の製造
５００ｍｇの合成ペプチド（Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ）と２７０ｍｇのグルコースとを、２５ｍｌのピリジン／酢酸＝１／１混合溶媒中に溶解し、遮光下室温で５日間攪拌した。真空下で溶媒を除去した後、残さを２５ｍｌの水に溶解して再び真空下で濃縮した。これを少量の水に溶解し、強酸性イオン交換樹脂であるＤｏｗｅｘ５０ＷＸ８カラム（シグマ社製、直径３．５ｃｍ×長さ２５ｃｍ）にチャージした。約２リットルの水で洗浄してグルコースを除去した後、１Ｎアンモニア水で生成物を溶出し、これを凍結乾燥した。
【００２４】
これを０．１Ｍのトリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ＝８．２）に溶解し、アフィゲル６０１カラム（ファルマシア製、直径１．７ｃｍ×長さ２０ｃｍ）にチャージした。１リットルの０．１Ｍのトリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ＝８．２）、ついで１リットルの水で洗浄し、最後に０．１％のギ酸で溶出して、これを凍結乾燥した。５０ｍｇのフルクトシルアミノ酸（フルクトース−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ）が得られた。
【００２５】
（２）ＣＧＧのピリジルジチオプロピオニル化（ＣＧＧ−ＳＰＤＰの作製）
まず、微粒子であるＣＧＧの前処理として、これをピリジルジチオプロピオニル化し、ＣＧＧ−ＳＰＤＰを作製した。
２００ｍｇ（１．３３×１０−３ｍｍｏｌ）のＣＧＧを、１５ｍｌのリン酸バッファーサリン（ＰＢＳ）に溶解し、得られた溶液に、撹拌しながら１ｍｌのＳＰＤＰ／エタノール溶液（ＳＰＤＰ＝２０．８ｍｇ、０．０６６７ｍｍｏｌ、５０等量）を滴下した。その後、室温で３０分間撹拌した。セファデックスＧ２５Ｍカラム（ファルマシア社製、直径２ｃｍ×長さ８０ｃｍ）でゲル濾過し、４８ｍｌのＣＧＧ−ＳＰＤＰ／ＰＢＳ溶液を得た。
【００２６】
ＣＧＧ１分子あたりのＳＰＤＰの結合数を次のように決定した。得られたＣＧＧ−ＳＰＤＰのＰＢＳ溶液のうち０．５ｍｌを用い、２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度は、８．０７であった。
【００２７】
前記ＣＧＧ−ＳＰＤＰ／ＰＢＳ溶液に、１００ｍＭのジチオスイレイトール（ＤＴＴ）水溶液２５μｌを加え、５分間放置した後、３４３ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度は、６．６１であった。
【００２８】
ＤＴＴ還元によって放出されたピリジン−２−チオンの３４３ｎｍにおける分子吸光係数を８．０８×１０３として、ピリジン−２−チオンの濃度［ピリジン−２−チオン］は、
［ピリジン−２−チオン］＝６．６１／（８．０８×１０３）＝８．１８×１０−４（Ｍ）
のように求められた。この濃度は、ＣＧＧに導入されたＳＰＤＰの濃度に等しかった。
【００２９】
また、ＳＰＤＰの２−ピリジルジスルフィド基が２８０ｎｍおける吸光度に寄与するため、ＣＧＧ濃度の計算には次のような補正を行った。ＣＧＧに起因する２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０，ＣＧＧ）は、
（Ａ２８０，ＣＧＧ）＝８．０７−（８．１８×１０−４×５．１×１０３）＝３．９０
のように求めることができた。ただし、２−ピリジルジスルフィド基の２８０ｎｍにおける分子吸光係数を５．１×１０３とした。
【００３０】
したがって、ＣＧＧの濃度［ＣＧＧ］、およびＣＧＧ１分子当たりに導入されたＳＰＤＰの分子数［ＳＰＤＰ］／［ＣＧＧ］は、
［ＣＧＧ］＝  ３．９０／（１．９９×１０５）＝１．９６×１０−５（Ｍ）
［ＳＰＤＰ］／［ＣＧＧ］＝８．１８×１０−４／（１．９６×１０−５）＝４１．８
のように求めることができた。ただし、ＣＧＧの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を１．９９×１０５とした。
【００３１】
（３）フルクトシルアミノ酸のＣＧＧ標識物の作製
上記（２）で得た微粒子であるＣＧＧ−ＳＰＤＰにフルクトシルアミノ酸を結合させた。１３．６ｍｌのＣＧＧ−ＳＰＤＰ／ＰＢＳ溶液に、１２．３ｍｇ（１．６７×１０−２ｍｍｏｌ、１．５等量対ＳＰＤＰ）のフルクトシルアミノ酸を加え、室温で３時間撹拌した後、３４３ｎｍにおける吸光度（Ａ３４３）を測定した。Ａ３４３＝５．９１であった。得られた上清をセファデックスＧ２５カラム（ファルマシア社製、直径２ｃｍ×長さ８０ｃｍ）でゲル濾過し、２２ｍｌのフルクトシルアミノ酸のＣＧＧ標識物を得た。
【００３２】
ＣＧＧ１分子当たりのフルクトシルアミノ酸の結合数を次のように決定した。反応後のＡ３４３が５．９１であることより、放出されたピリジン−２−チオンの３４３ｎｍにおける分子吸光係数を８．０８×１０３とし、その濃度［ピリジン−２−チオン］を、
［ピリジン−２−チオン］＝５．９１／（８．０８×１０３）＝７．３１×１０−４（Ｍ）
のように求めた。
【００３３】
この濃度は、ＣＧＧに導入されたフルクトシルアミノ酸の濃度に等しかった。ＣＧＧの濃度は１．９６×１０−５Ｍであったので、ＣＧＧ１分子当たりに導入されたフルクトシルアミノ酸の分子数［フルクトシルアミノ酸］／［ＣＧＧ］は、
［フルクトシルアミノ酸］／［ＣＧＧ］＝７．３１×１０−４／１．９６×１０−５＝３７．３
のように求めることができた。
【００３４】
《実施例２：フルクトシルアミノ酸標識物を用いたＨｂＡ１ｃの測定》
ＭＯＰＳ緩衝液（最終体積２ｍｌ）に抗ＨｂＡ１ｃ抗体（最終濃度５．７５×１０−６Ｍ）を加え、これに実施例１で作製したフルクトシルアミノ酸標識物（最終濃度５．６２×１０−７Ｍ）を添加して懸濁液を得、５分間放置した後、７００ｎｍの光を照射してその散乱光強度を測定した。散乱光強度は４８５．９であった。
【００３５】
次に、ＭＯＰＳ緩衝液（最終体積２ｍｌ）に抗ＨｂＡ１ｃ抗体（最終濃度５．７５×１０−６Ｍ）とＨｂＡ１ｃ（最終濃度１０−７Ｍ）とを加え、これに実施例１で作製したフルクトシルアミノ酸標識物（最終濃度５．６２×１０−７Ｍ）を添加して懸濁液を得、５分間放置した後、７００ｎｍの光を照射してその散乱光強度を測定した。散乱光強度は４８９．１であった。
【００３６】
以降、他の条件は同じにして、ＨｂＡ１ｃの最終濃度がそれぞれ、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、８×１０−４Ｍ、６×１０−４Ｍ、４×１０−４Ｍ、２×１０−４Ｍ、および１０−４Ｍの場合について同様に散乱光強度の測定を行った。散乱光強度はそれぞれ、４５３．３、４４３．５、２８０．４、６８．８、３９．３、２４．６、１１．３であった。結果を図１に示した。図１に示すように、ＨｂＡ１ｃの濃度が高くなるにしたがって凝集反応に対する阻害が起こり、散乱光の強度が低下することを確認できた。
【００３７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明に係るフルクトシルアミノ酸標識物は、抗ＨｂＡ１ｃ抗体が結合するＨｂＡ１ｃ上の特徴的部位（エピトープ）の構造を有するため、抗ＨｂＡ１ｃ抗体と弱く結合することができ、ＨｂＡ１ｃ測定の際の有用な擬似抗原となる。また、本発明のＨｂＡ１ｃの測定方法を用いれば、免疫的測定の特徴である特異性を活かしつつ、操作の容易性に加え、迅速性をも発揮できる効果がある。これにより、より簡単、迅速にＨｂＡ１ｃを測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨｂＡ１ｃ濃度と散乱光強度との関係を示す図である。
【図１】
2005024328.tif 000007