(57)【要約】      （修正有）【課題】本開示は、少なくとも１塩基対異なる二本鎖ＤＮＡ種の分割法を提供する。【解決手段】突然変異ＤＮＡを含む試料中から、より高耐熱性の融解ドメインに連続した独特な融解温度を持つイソ融解ドメインを形成し、ポリマーマトリックス及び高電場を利用して、簡単で、迅速且つ再現性のある突然変異ＤＮＡまたはＲＮＡ及び野生ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を高解像度で分離する。また未反応ＤＮＡから化学的に反応した（例えばメチル化ＤＮＡ）ＤＮＡまたはＲＮＡを分離する【選択図】図１
2005040138.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
得られた時に、突然変異体ＤＮＡおよび非−突然変異体ＤＮＡが１つのイソ−融解ドメインを含むが、このイソ−融解ドメインはより高熱耐性のイソ−融解ドメインとは連続していない、非−突然変異体ＤＮＡからの突然変異体ＤＮＡの分割法であって、
ａ）  二本鎖ＤＮＡを生物源から単離し；
ｂ）  工程ａ）で得たＤＮＡを断片化して、断片化した二本鎖ＤＮＡを得；
ｃ）  断片化ＤＮＡを大きさの分離により部分的に単離して、部分単離ＤＮＡ断片を得；
ｄ）  ｃ）で部分単離した断片化ＤＮＡに、得られた時にＤＮＡに含まれるイソ−融解ドメインよりもより高熱耐性のイソ−融解ドメインであるＤＮＡ配列を結合し、これによりより高熱耐性のイソ−融解ドメインに連続したイソ−融解ドメインを含むＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ断片を生成し；
ｅ）  工程ｄ）で得たＤＮＡ断片を融解し、そして二重鎖ＤＮＡを形成するために適切な条件下で再アニーリングし、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を生成し；
ｆ）  工程ｅ）で得た混合物を交換可能なポリマーマトリックスに導入し、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を含む交換可能なポリマーマトリックスを生成し；
ｇ）  ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を含む交換可能なポリマーマトリックスを、高電場および部分変性条件に供し、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖が部分的に融解し、そしてＤＮＡホモ二重鎖が融解せず、そしてＤＮＡヘテロ二重鎖がＤＮＡホモ二重鎖よりも交換可能なポリマーマトリックス中を遅い速度で移動し、ＤＮＡヘテロ二重鎖をＤＮＡホモ二重鎖から分離する、
工程を含んで成る上記分割法。
【請求項２】
検出工程が、ａ）特定の時間に交換可能なポリマーマトリックス中のＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の相対位置を検出する、ｂ）ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の相対的移動を、それらが固定した位置の検出器を通過する時に検出する、およびｃ）ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の相対的移動を、それらが交換可能なポリマーマトリックスから出る時に検出する、ことから成る群から選択される、検出工程をさらに含んで成る請求項１に記載の方法。
【請求項３】
得られた時に、突然変異体ＤＮＡおよび非−突然変異体ＤＮＡが１つのイソ−融解ドメインを含むが、このイソ−融解ドメインはより高熱耐性のイソ−融解ドメインとは連続していない、非−突然変異体ＤＮＡからの突然変異体ＤＮＡの分割法であって、
ａ）  二本鎖ＤＮＡを生物源から単離し；
ｂ）  単離ＤＮＡを断片化して、断片化した二本鎖ＤＮＡを得；
ｃ）  断片化ＤＮＡを大きさの分離により部分的に単離して、部分単離ＤＮＡ断片を得；
ｄ）  工程ｃ）で得たＤＮＡ断片を融解し、そしてより高熱耐性のＤＮＡ配列を結合して得られているイソ−融解ドメインを含むＤＮＡ配列を含んで成る合成ＤＮＡと、１方の鎖が他方の鎖よりも短い２つのＤＮＡ鎖を含んで成る二重鎖ＤＮＡを形成するために適切な条件下で再アニーリングさせ；
ｅ）  工程ｄ）で得た二重鎖ＤＮＡの短鎖をＤＮＡポリメラーゼを用いて延長させて同じ長さの二本の鎖を含んで成る二重鎖を形成させ、これによりより高熱耐性のイソ−融解ドメインに連続したイソ−融解ドメインを含むＤＮＡを含んで成るＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を生成し；
ｆ）  工程ｅ）で得た混合物を、ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を含む交換可能なポリマーマトリックスに導入し；
ｇ）  ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を含む交換可能なポリマーマトリックスを、高電場および部分変性条件に供し、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖が部分的に融解し、そしてＤＮＡホモ二重鎖が融解せず、そしてＤＮＡヘテロ二重鎖がＤＮＡホモ二重鎖よりも交換可能なポリマーマトリックス中を遅い速度で移動し、ＤＮＡヘテロ二重鎖をＤＮＡホモ二重鎖から分離する、
工程を含んで成る上記分割法。
【請求項４】
得られた時、突然変異体ＤＮＡおよび非−突然変異体ＤＮＡが適当なイソ−融解ドメインを欠く、非−突然変異体ＤＮＡからの突然変異体ＤＮＡの分割法であって、
ａ）  二本鎖ＤＮＡを生物源から単離し；
ｂ）  単離ＤＮＡを断片化して、断片化した二本鎖ＤＮＡを得；
ｃ）  断片化ＤＮＡを大きさの分離により部分的に単離して、部分単離ＤＮＡ断片を得；
ｄ）  工程ｃ）で部分単離した断片化ＤＮＡの１方の末端に、断片化ＤＮＡよりもより高熱耐性のイソ−融解ドメインであるＤＮＡ配列を結合し、そして他方の末端に、断片化ＤＮＡ配列の平均融解温度で、またはそれに近い温度で融解するイソ−融解ドメインであるＤＮＡ配列を結合し、これによりより高熱耐性のイソ−融解ドメインに連続したＤＮＡ配列を含む適当なイソ−融解ドメインを含んで成るＤＮＡ断片を形成し；
ｅ）  工程ｄ）で得たＤＮＡ断片を融解し、そして二重鎖ＤＮＡを形成するために適切な条件下で再アニーリングさせ、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を生成し；
ｆ）  工程ｅ）で得た混合物を、ポリマーマトリックスに導入し、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を含むポリマーマトリックスを生成し；
ｇ）  ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を含むポリマーマトリックスを、高電場および部分変性条件に供し、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖が部分的に融解し、そしてＤＮＡホモ二重鎖が融解せず、そしてＤＮＡヘテロ二重鎖がＤＮＡホモ二重鎖よりもポリマーマトリックス中を遅い速度で移動し、ＤＮＡヘテロ二重鎖をＤＮＡホモ二重鎖から分離する、
工程を含んで成る上記分割法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
核酸配列および個体群の多形性における多様性は、バイオテクノロジー、突然変異誘発、ヒト遺伝学および癌遺伝学の分野で研究されている。これまでに存在した核酸配列中（野生型ＤＮＡ）の変種は、突然変異と呼ばれている。突然変異は、ＤＮＡ配列中の１つ、または幾つかの塩基対の変化を含む。変化には付加、欠失、逆位または置換がある。
【０００２】
遺伝的疫学の分野では突然変異の原因を立証するために、突然変異のパターンを検出できることが有用である。小児遺伝学の分野では、突然変異の検出が新生児に稀な遺伝疾患の初期診断のためのスクリーニングに有用である。予想される両親の遺伝的カウンセリングでは、彼らの細胞中の突然変異の検出には重大な価値があると考えられる。また突然変異の検出は、規制標準へのコンプライアンスを確認するために、ワクチンまたは組換えタンパク質のような生物学的に生産される医薬品の製造にも有用である。突然変異の検出はまた、遺伝的損傷が化粧品中の添加物または環境的混入物のような特定の原因によって生じたのかどうかを決定するために、毒物学的研究においても有用である。
【０００３】
特定の遺伝子座での突然変異は（例えば、点特異的突然変異）、有意に変化した細胞性の挙動を生じ得る。しかし、突然変異ＤＮＡを含むかもしれないＤＮＡ試料として与えられた中の全ＤＮＡ分子中に、突然変異したＤＮＡ分子の部分は大変多様に存在する。すなわち、多くの病状はたとえ小部分のＤＮＡが突然変異しても発病しうる。例えば、組織または血液試料中の小さな細胞部分に存在する突然変異で、癌細胞を検出する能力は、癌の転移を検出するために、癌が再発しているシグナルとして、または癌発生の初期のスクリーニングとして有用となり得る。さらに、例えば腫瘍を持つ器官中の非−腫瘍組織中での腫瘍抑制遺伝子、ｐ５３の突然変異的範囲を決定することは、おそらく個々の腫瘍の可能性のある原因を同定できる（非特許文献１）。
【０００４】
細胞からＤＮＡの単離、クローニングおよびクローン化生成物のシークエンシングを含む多くの方法が、突然変異ＤＮＡを検出するために使用されてきた。幾つかの電気泳動法は、突然変異ＤＮＡを野生型ＤＮＡから分離するために使用され、その方法には例えば変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）（非特許文献２および３）を含む。しかしこれらの方法は遅く、そして使用し難い。さらに放射性リン酸を用いた標識ＤＮＡ分子の生成のような、一定の普通の研究室における数日間の実験で、これらの方法を妨害する放射性分解が起こった。妨害反応生成物は、６０℃以上の温度で何時間にも及ぶ分離による熱分解、通常の研究室の蛍光灯備品からの光での光化学反応、および水溶液中に存在する活性酸素種が関与すると思われる化学反応からも生じることが判明した。
【０００５】
したがって、試料中に存在する全ＤＮＡ分子数に比べて、小さなＤＮＡ部分として存在する突然変異ＤＮＡ配列を含む試料中に含まれる突然変異ＤＮＡ配列を検出できる迅速かつ再現性のある方法は、大変重要である。
【非特許文献１】Ｈａｒｒｉｓ，Ｃ．Ｃ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６２：１９８０−１９８１（１９９３年、１２月２４日）
【非特許文献２】Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．Ｇ．およびＬｅｒｍａｎ，Ｌ．Ｓ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：１５７９−１５８３（１９８３）；
【非特許文献３】Ｃａｒｉｅｌｌｏ，Ｎ．Ｆ．，ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，４２：７２６−７３４（１９８８）
【発明の開示】
【０００６】
発明の要約
本発明は突然変異ＤＮＡを含むＤＮＡ分子の分離、または分割および検出法に関する。本発明はまた、突然変異ＤＮＡを含む試料中、試料中の全ＤＮＡに関連する突然変異ＤＮＡの部分を濃縮する方法に関する。特に本発明は、突然変異核酸配列（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を非−突然変異（野生型）核酸配列から分割（すなわち、物理的分離）する方法に関する。本発明の方法は、部分的な変性条件、ポリマーマトリックスおよび高電場を使用して、簡単で、迅速かつ再現性のある突然変異ＤＮＡまたはＲＮＡおよび野生型ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を、高解像度で分離する方法を提供する。また本発明は、未反応ＤＮＡから化学的に反応した（例えばメチル化ＤＮＡ）ＤＮＡまたはＲＮＡを分離する。
【０００７】
本明細書に記載する分離法では、突然変異または非−突然変異ＤＮＡ分子の分離は、ポリマーマトリックス内の高電場で部分的に融解した（部分変性）二本鎖−ＤＮＡ分子の移動度（動き）が、非融解（完全にアニールしている）二本−鎖分子に比べて減少するという事実に基づく。本方法での使用に適するＤＮＡまたはＲＮＡ配列は、２つのイソ−融解ドメインを含む：第一イソ−融解ドメインは、第一温度で融解する低温イソ−融解ドメインと言い、そして第二イソ−融解ドメインは第二のより高温で融解する高温イソ−融解ドメインと言う。本明細書では、高温イソ−融解ドメインは低温イソ−融解ドメインよりもより高熱耐性なドメインとも言う。２つのイソ−融解ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡ配列内で連続している。（これからは用語ＤＮＡは、ＲＮＡに適用される記載について同等に使用する、と理解される。）本明細書で定義される“融解”という用語は、２つの一本鎖ＤＮＡを形成することにより、ＤＮＡの相補的二本鎖が互いに分離する傾向を言う。本明細書で使用する“部分融解”とは、低温イソ−融解ドメインは融解しているが、高温イソ−融解ドメインは完全にアニールしている問題のＤＮＡ状態を言う。本明細書では、イソ−融解ドメインは、中のすべての塩基対がある一定の条件下で本質的に同時に融解する二本鎖ＤＮＡ配列と定める。したがって存在する条件に依存して、特定のＤＮＡ配列は完全にアニールしているか、あるいは完全に融解しているかのいずれかである。一定の変性剤濃度および／または温度範囲内で、ＤＮＡ配列中の高温および低温イソ−融解ドメインの両方の存在は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡの両方を含む安定な部分的融解中間体の存在を確実にする。完全融解および非融解ドメイン間の平衡が存在する。そのような平衡は、共同的平衡として統計力学の分野で説明される。
【０００８】
低温イソ−融解ドメイン中の１つ以上の塩基変化が異なる、高温および低温イソ−融解ドメインを含む二本鎖ＤＮＡ分子の混合物が、部分変性条件下（すなわち、低温イソ−融解ドメインの融解を生じるが、高温イソ−融解ドメインは融解しない条件）で、ポリマーマトリックスを用い電気泳動した時、二重鎖は非融解ＤＮＡおよび部分融解種間で種々の協同的平衡状態を表す。ゆっくりと、部分的に融解する状態のＤＮＡ分子による消費時間は、特定の配列の間で異なる。非融解二本鎖ＤＮＡは、ポリマーマトリックスを最も速く通って移動する一方、部分融解種はよりゆっくりと移動する。したがって、マトリックスを通る部分融解状態の速度は、非融解状態の速度よりも遅い。結果として、塩基対変化を有する核酸分子はポリマーマトリックスを通る相対移動度に基づき識別できる（分離される）。
【０００９】
本発明の重要な工程は、問題のＤＮＡを単離した時に得た突然変異体ホモ二重鎖ＤＮＡ配列の、野生型ＤＮＡ配列を持つヘテロ二重鎖への転化である。典型的には、ＤＮＡ試料は優勢な野生型配列の中に小部分の突然変異体配列が存在する。野生型配列および突然変異体配列を含む試料を加熱することにより、二本鎖配列が融解し、そして一本鎖配列が形成する。これらの一本鎖配列は、逆平行突然変異体鎖およびほとんど同一の野生型鎖が、１つの野生型鎖および１つの突然変異体鎖を含むヘテロ二重鎖ＤＮＡを形成する条件下で、再度アニールされる。本明細書で使用する“ほとんど同一”という用語は、既に存在する核酸配列から最高約２５塩基対の配列変化を含むものと定める。突然変異体配列に対する野生型の比は高いので、本質的にすべての一本鎖突然変異体配列が野生型配列と再会合する。重要なことは、そのような各ヘテロ二重鎖の融解温度が、完全に対合している野生型ホモ二重鎖の融解温度よりも有意に低いことである。したがって、本質的にすべての突然変異ＤＮＡ配列が、本明細書に記載された方法を使用して優勢な野生型（ホモ二重鎖）ＤＮＡ配列から容易に分離される状態（ヘテロ二重鎖）に転換される。
【００１０】
簡単に述べると、本発明は以下の工程を含む。問題のＤＮＡ（すなわち、本方法で分析されるＤＮＡ）は、突然変異を含むと疑われる、または問題とする突然変異の生物起源に由来する、典型的には約１００−５００塩基対のＤＮＡ配列である。問題のＤＮＡを次に細胞、ウイルス、体組織および体液のような生物的起源、プラスミド、環境試料または実験混合物から単離する。単離により、問題のＤＮＡは実質的に他の細胞性高分子、例えばタンパク質を含まない。単離は周知の実験技術を使用して行うことができる。
【００１１】
問題のＤＮＡの融解温度は、計算して（もしａ ｐｒｉｏｒｉで知られていないならば）、ＤＮＡが２つのイソ−融解ドメイン、第一イソ−融解ドメイン（第一融解温度で融解する低温イソ−融解ドメインと言う）および第二イソ−融解ドメイン（第二の融解温度で融解する高温イソ−融解ドメインと言う）を含むかどうかを測定する。あるいは、ＤＮＡの融解温度を実験的に決定する。
【００１２】
問題の突然変異は、適当な低温イソ−融解ドメイン内になければならず、すなわちイソ−融解ドメインはより高熱耐性のイソ−融解ドメインと接している。さらに、低温イソ−融解ドメインは適当な長さ（例えば、約１００−１５０塩基対）でなければならない。もし問題の突然変異がそのようなイソ−融解ドメイン内になければ、問題のＤＮＡを修飾して連続的な高および／または低イソ−融解ドメイン（１つ）／（複数）に付けることができ、すなわち突然変異を含むイソ−融解ドメインを、適当な低温融解ドメインに転換することができる。ＤＮＡの修飾は、種々の方法で行える。例えば、高温クランプ配列をＤＮＡリガーゼの反応により、問題のＤＮＡに付けることができる。あるいはクランプは、高熱耐性の配列を含むイソ−融解配列を１つのＤＮＡプライマーとして使用して、適当な増幅手段（すなわち高複製ＰＣＲのような低い誤差率の増幅法）により問題の配列を増幅することにより付けることができる。配列修飾は、以下に記載するように、より高熱耐性の配列を含む所望の配列を５’方向に含む、既に合成した過剰モルのＤＮＡ配列を用いて、問題のＤＮＡを融解または再アニーリングすることにより行うことができる。この反応は、不均一な長さの２つの鎖から成るＤＮＡを生じる（すなわち、１方の鎖が他方の鎖よりも短い）。次に短いＤＮＡ鎖を、ＤＮＡポリメラーゼの作用により延長して、同じ長さの二本の鎖を含んで成る二本鎖分子を作成する。
【００１３】
イソ−融解ドメインを含む問題の単離された、二本鎖ＤＮＡ配列を、制限エンドヌクレアーゼまたはＤＮＡを配列−特異的様式で切断できる他の薬剤に接近できるようにするために、さらに処理することができる。単離されたＤＮＡを次に１つ以上の適当に選択された制限エンドヌクレアーゼまたは他の配列−特異的薬剤で切断し、二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ：ｄｓ）非−突然変異体／非−突然変異体および突然変異体／突然変異体ＤＮＡ断片を生成する。生成したＤＮＡ断片は得たままで処理することができ、あるいは場合によっては望ましくない断片の幾つかを除去するために部分精製するか、または特定の長さの断片を得ることができ、これにより生成した問題の断片化二本鎖ＤＮＡを濃縮する。部分単離は、例えばＰＡＧＥ、分子ふるいマトリックスでのキャピラリー電気泳動による大きさに基づく分離、あるいは他の周知な実験技法に基づく。本明細書に記載する方法により分析されるＤＮＡ配列は同じ長さであるか、または長さが異なり、そしてわずかヌクレオチド１塩基対異なるだけでもよいことに注目されたい。
【００１４】
ｄｓＤＮＡ断片を制御された条件下で加熱により融解し（変性）、そして冷却（再アニール）して、非−突然変異体配列および突然変異体配列が、非−突然変異体／突然変異体ヘテロ二重鎖を形成できるようにする。再アニーリング時には、非−突然変異体／非−突然変異体鎖を含むホモ二重鎖ならびに突然変異体／突然変異体鎖を含むホモ二重鎖も形成する。突然変異体／突然変異体鎖を非−突然変異体／突然変異体ヘテロ二重鎖に転換する工程は、断片化処理の後か、または前でもよい。幾つかの問題のＤＮＡは、実験的にヘテロ二重鎖を形成させるための操作が必要無いような状態で自然に得ることができる。これは“突然変異体”ＤＮＡが化学的変化を持つとき、まさにそうである。
【００１５】
ヘテロ二重鎖を次に、非−突然変異体／非−突然変異体ホモ二重鎖を融解せずに、非−突然変異体／突然変異体ヘテロ二重鎖を部分融解する部分変性条件を使用して、ホモ二重鎖から分離する。部分融解時のヘテロ二重鎖は、非融解ホモ二重鎖よりもポリマーマトリックス中を遅い速度で移動する。
【００１６】
ポリマーマトリックスは、高電場中での使用に適する材料から成る流路または導管内に含まれる。１つの態様では、流路はキャピラリーカラムである。これらの流路は並べて配列させることができ、同時に多数の試料を分析して高処理量を可能にする。（キャピラリーカラムおよび一定の変性条件を使用するとき、本明細書に記載する方法も、定変性剤キャピラリー電気泳動法（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、すなわちＣＤＣＥと言う）。
【００１７】
本発明の１つの態様において重要なことは、ポリマーマトリックスが“取り替えられる”ように形成される、すなわち試料の泳動後に流路から容易に取り出せ（抽出または押し出される）、次の試料を泳動する前に流路中に新しいポリマーマトリックスを導入できる点である。このように連続的なＣＤＣＥのサイクルを容易に行うことができる。各サイクルには、試料をＣＤＣＥに供すること、分離されたヘテロ二重鎖を含む部分を回収すること、場合によっては適当な増幅手段により部分を増幅すること、ポリマーマトリックスを交換すること、および再度ヘテロ二重鎖をＣＤＣＥに供することが含まれる。ＣＤＣＥの各サイクルは、突然変異体ＤＮＡの検出を有意に向上させることができる。
【００１８】
別の態様では、流路は溝または小さいプレートに切断されたカナル（ｃａｎａｌ）、またはチップ（ｃｈｉｐ）である。各チップは単一または多流路を含むことができ、したがってまた多数の試料の分析が可能である。
【００１９】
本発明に記載する分離および分析法は、低温イソ−融解ドメインを融解するが、高温イソ−融解ドメインは融解しない部分変性条件下で行われる。１つの態様では、問題の各ＤＮＡ配列のための適当な部分変性条件は、流路内に含まれるポリマーマトリックスの温度、およびポリマーマトリックス内に含まれる化学変性剤（例えば尿素および／またはホルムアミド）の組み合わせにより行われる。別の態様では、適当な部分変性条件は、ポリマーマトリックス単独の温度により達成される。例えば、変性条件は周囲温度（例えば、周辺温度または室温）よりわずかに高い温度、およびポリマーマトリックス中の化学変性剤の適度な濃度により達成される。あるいは、ポリマーマトリックス中の変性剤の濃度を増加させるならば、より低温を使用することもできる。変性条件はポリマーマトリックス中に化学変性剤の存在無しに、温度のみで達成することができる。この態様では、変性条件に到達するために選択した温度は、非−突然変異体／非−突然変異体ホモ二重鎖の低温イソ−融解ドメインが融解する温度、またはその温度に近い温度である。一般的に本明細書に記載する方法は、ポリマーマトリックスの温度が約２４℃から約１００℃である。しかし、特定のＤＮＡ配列には、問題のヌクレオチド配列に応じて、部分融解を達成するためにわずかに高い、またはわずかに低い温度が必要かもしれない。いずれの態様においても、部分変性条件は一定であるか、あるいは段階的に達成できる。
【００２０】
ポリマーマトリックスを、マトリックス中のホモ二重鎖からヘテロ二重鎖を分離するために十分な時間、高電場に供する（例えば、約５０から約１２００ボルト／ｃｍ）。二重鎖の相対移動度は、それらがマトリックスを通って移動し、そして固定した場所に位置する検出器を通った時に検出できる。あるいは、マトリックスを通る二重鎖の移動は、電場を切ることにより、または二重鎖の移動を妨害する特別な条件をポリマーマトリックス中に達成することにより、本質的にマトリックス中の二重鎖を“固定”する特別な時間で停止される。次に止めた二重鎖の相対的位置を、マトリックスをスキャンニングすることにより決定できる。最終的に二重鎖の相対的移動は、ヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖を含む流出液をマトリックスから出る時にモニタリングすることにより（すなわち溶出液）検出できる。（このポリマーマトリックス中の、またはそれらがマトリックスから出た時の二重鎖の相対位置のプロフィールを、本明細書では電気泳動図と言う。）いずれの場合においても、マトリックスを通るヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖の相対的移動度は、特別な部分変性条件下のＤＮＡ断片のイソ−融解ドメインの協同的平衡により支配される。
【００２１】
マトリックスを通過した二重鎖の移動の検出（または記録）は、放射性、蛍光または化学発光手段を含む様々な手段により行うことができる。特に、レーザー誘導蛍光（１ａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ＬＩＦ）は便利であり、そして高感度な検出が可能である。溶出液画分は、流路を出る時に集めることもできる。回収した画分を増幅して、またはしないで周知のシークエンシング法により分析でき、回収した画分中に含まれるＤＮＡの核酸配列を決定できる。あるいは、野生型ＤＮＡ画分に比べてヘテロ二重鎖部分を濃縮する手段として、画分を回収し、そしてヘテロ二重鎖含有画分をポリマーマトリックスに何回も通すことができ、そしてこのようにして問題の突然変異の検出を増大させる。
【００２２】
本明細書に記載する分離および検出法の重要な利点は、迅速な熱の消散および低電流の発生を可能にする薄いポリマーマトリックスの使用であり、これにより高電場の使用を可能にする。高電場の使用で、従来の変性ゲル電気泳動を使用する時間よりも短時間で、突然変異体および野生型ＤＮＡ配列の分離が可能である。さらに、粘性レベルを減少させるために、低濃度の化学変性剤を含む、または化学変性剤を含まない非−架橋−結合ポリマーマトリックスの使用により、各泳動後のマトリックスの交換が可能となり、これは再現性および各操作の容易性を大いに増大させる。
【００２３】
典型的な１００−２００塩基対（ｂｐ）ＤＮＡ断片に関して、突然変異体−含有ヘテロ二重鎖は、野生型ホモ二重鎖配列から一般的に３０分以内で分離される。本明細書に記載する方法の利点は、問題のＤＮＡ配列が同数の塩基対（例えば、同じ長さの配列）を含むことがてきる点である。本明細書に記載する方法の別の利点は、試料中の全ＤＮＡ配列の中に小部分を示すだけの問題のＤＮＡ配列を検出する能力である。特に、この方法は試料中に存在する全ＤＮＡ分子の中に小部分を示すだけの突然変異体ＤＮＡ分子の検出を可能にする。例えば、本明細書に記載されるようなキャピラリーカラムで泳動された突然変異体および野生型分子の全混合物の、わずか３×１０−４を示す突然変異体ＤＮＡ分子部分を検出できる。すなわち、本明細書に記載する一定の変性条件下で泳動されるポリマーマトリックスを含有するキャピラリーカラムは、ピークあたり１０１０−１０１１分子で飽和せず、ｄｓＤＮＡのわずか３×１０４コピーのピークがＬＩＦを使用してバックグラウンドより高く視覚化できる。また本明細書に記載するように、この突然変異体ＤＮＡ分子の部分は、より一層少量の突然変異体分子（例えば５×１０−６）でさえも検出できるように、連続的なＣＤＣＥのサイクルで濃縮できる。
【００２４】
本明細書に記載する方法は、突然変異体が試料中に含まれる全ＤＮＡの小部分だけを表す時、野生型配列から突然変異体ＤＮＡ配列を分離そして検出する迅速かつ再現性のある方法を提供する。本発明の分離法は、突然変異体配列の検出が重要である任意のバイオテクノロジー的応用に良く適している。この方法は、ＤＮＡ配列中の点突然変異、プラスミド中の突然変異、ならびに遺伝子治療に使用する核酸配列の検出、突然変異的スペクトロメトリー（例えば、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子のような、与えられた配列に関する突然変異の種類および数の決定）、あるいは多形性または胚突然変異についてプールしたヒト組織試料を同時にスクリーニングするために、特によく適している。
発明の詳細な説明
本発明は、生物試料に由来する核酸配列に存在する非−突然変異体核酸配列から突然変異体核酸配列を分離または分割し、試料中に含まれる全ＤＮＡに比較して突然変異体ＤＮＡの部分を濃縮する方法、ならびに点突然変異を検出する、または突然変異の範囲または突然変異のプロフィールを決定する方法に関する。生物試料は核酸を含む任意の起源、例えば血液、尿、脳脊髄液、リンパ節組織および痰のような特に細胞を含む組織または体液、プラスミド、組換え核酸、組換え植物のような農産物起源、あるいは任意の合成核酸配列のような任意の起源に由来してよい。特に本明細書に記載する方法は、選択した突然変異体ＤＮＡ配列を、選択した、または標的とした突然変異体ＤＮＡ配列（すなわち、問題の配列）、選択した突然変異体ＤＮＡ配列以外の突然変異体ＤＮＡ配列および非突然変異体（本明細書では野生型とも言う）ＤＮＡ配列を含む複雑なＤＮＡ分子群から分離、そして同定するために有用である。したがって、本明細書に記載する変性条件、ポリマーマトリックスおよび高電場を使用して、約１００−２００塩基対のＤＮＡイソ−融解配列中に単一の塩基対差、または幾つかの塩基対差（例えば、ここで用語“幾つか”とは２５塩基対も含むことができる）を含むＤＮＡ配列を迅速かつ高い再現性で分離することが可能である。
【００２５】
さらに本明細書に記載した方法は、突然変異体配列が試料中に存在する全ＤＮＡの小部分のみを表すとき、野生型ＤＮＡ配列から突然変異体ＤＮＡ配列を分離する手段を提供する。さらに本明細書に記載した方法の変更により、最高約１０００塩基対長のＤＮＡイソ−融解配列中のほとんどの突然変異の検出を合理的に行うことができる。本明細書に記載するように、突然変異体核酸は、対応する野生型（非−突然変異体または無変化）配列と１つ以上のヌクレオチドが異なる配列である。これらの差異には、ヌクレオチド修飾、欠損、置換または挿入を含む。核酸配列はＤＮＡまたはＲＮＡ配列であることができる。突然変異体核酸配列は、例えば自然にメチル化したＤＮＡまたは化学的発癌物質と反応したＤＮＡのような化学的に変化した塩基対を含む配列でもある。
【００２６】
問題の突然変異体配列の存在を分析すべきＤＮＡ試料、または問題の突然変異体配列は、細胞を含む体液または他の試料（例えば、細菌、ウイルス、他の微生物またはプラスミド）から、周知技法を使用して得られる。分析に必要な細胞数は、ある一定の応用（検出すべき特定の突然変異（１つまたは複数））、ならびに細胞あたりに存在する分析すべき問題のＤＮＡ配列のコピー数に依存する。問題のＤＮＡは、標準的な実験法により単離して、タンパク質、炭化水素、脂肪およびＲＮＡを含まない単離ＤＮＡ（またはＤＮＡを含まないＲＮＡ）を得る。
【００２７】
本明細書に記載した方法は、高温イソ−融解ドメインおよび低温イソ−融解ドメインの両方を有する二本鎖ＤＮＡ配列を分離するために使用できる。イソ−融解ドメインは、配列が完全にアニールするか、または完全に融解するために、中のすべての塩基対が本質的に同時に融解するドメインである。完全に融解したドメインと非融解ドメイン間に協同的平衡が存在する。本明細書に記載する方法による分離に適するＤＮＡ配列は、２つのイソ−融解ドメインを含み、その中の“高”温融解ドメインは“低”温融解ドメインよりも約５℃高い温度で融解する。低温融解ドメインは、高温融解ドメインと隣接している。
【００２８】
与えられたＤＮＡ配列の融解特性は、周知のコンピューター法により決定できる。例えば、ＤＮＡ配列の特別なドメインの融解温度は、ＦｉｓｃｈｅｒおよびＬｅｒｍａｎ（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．Ｇ．，およびＬｅｒｍａｎ，Ｌ．Ｓ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：１５７９−１５８３（１９８３）：Ｌｅｒｍａｎ，Ｌ．Ｓ．，およびＳｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｋ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：４８２−５０１（１９８７））により開発されたアルゴリズムを使用して算出できる。このアルゴリズムは、ＤＮＡの融解温度をそのヌクレオチド配列のみに基づいて予測する。例えば、ＦｉｓｃｈｅｒおよびＬｅｒｍａｎ法により算出されたヒト  ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＲＰＴ）のエキソン３に関する融解マップを、図１Ａに示す。ＤＮＡ配列が数百塩基対のドメイン中に組織されていることに注目されたい。あるいは、低温イソ−融解ドメインを融解するために必要な条件は、本明細書に記載する方法を使用して実験的に決定できる。どの条件が配列内に含まれるドメインの融解を生じるかを決定するために、問題のＤＮＡ試料のアリコートを様々な変性条件下で泳動できる。
【００２９】
したがって本発明の分離に適当なＤＮＡは、２つの隣接するイソ−融解ドメインを含む。第一イソ−融解ドメインを本明細書では低温イソ−融解ドメインと言い、そして第二融解ドメインを本明細書では高温イソ−融解ドメインと言う（すなわち、第一イソ−融解ドメインよりも高熱耐性のドメイン）。問題の突然変異は、高熱耐性のドメインに連続している低温融解ドメインに存在すべきである。しかし、高温融解ドメインが天然に存在するＤＮＡ分子中の突然変異を含むドメインに連続して見いだされなければ、様々な技術を使用して高熱耐性ドメインを適切な位置に組み込むことができ、このように問題の突然変異を含むドメインを、本質的に高温融解ドメインに連続する低温融解ドメインに転換する。
【００３０】
例えば、より高熱耐性（すなわち、より高い融解温度）の二本鎖ＤＮＡ配列の“クランプ”を、当該技術分野で周知な方法により問題のＤＮＡ配列へ結合させることができる（Ｃａｒｉｅｌｌｏ，Ｎ．Ｆ．，ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，４２：７２６−７３４（１９８８））。この合成クランプ配列は、単調ではない核酸配列でなければならない。（例えば、グアニン塩基（Ｇ）だけから成る核酸およびその相補鎖は、クランプとして適当ではない。）クランプ配列の結合は、周知のＤＮＡライゲーション法により合成の高温融解ドメインを問題の配列に連結することにより行える。あるいは高温融解ドメインは、以下に記載するようにヘテロ二重鎖を形成することにより、高温融解ドメインに隣接し、そしてＤＮＡポリメラーゼでヘテロ二重鎖の突然変異体ＤＮＡ鎖を高温融解ドメインに延長する合成的に作成した野生型の配列に結合できる。
【００３１】
時々、問題のＤＮＡが適当なイソ−融解ドメインを含まないことがある。例えば、低温イソ−融解ドメインの好適な長さは、約１００から約１５０塩基対である。もし問題のＤＮＡが１００塩基対長未満ならば、さらに配列を付加して適当なイソ−融解ドメインを得ることが必要かもしれない。問題のＤＮＡ配列を次に修飾して、配列の１方の末端に高熱耐性ドメインを結合するだけでなく、配列の他方に問題の天然に存在するＤＮＡ配列が融解する温度またはそれに近い温度で融解するドメインを結合できる。この方法は、適当な低温イソ−融解ドメインを作成するためにも同様に使用できる。これは高温イソ−融解ドメインを結合するために、上記に記載したようにも行うことができる。
【００３２】
単離ＤＮＡを処理して、本方法での分離に適する状態の二本鎖ＤＮＡを生成する。特別には、分離するためにＤＮＡを適当な大きさ、または長さに断片化する。本方法に使用するために適する断片化したＤＮＡ中の低温イソ−融解ドメインの長さは、典型的には１０００塩基対長未満であり、好ましくは７５から２００塩基対長の間であり、そして最も好ましくは７５から１２５塩基対長の間である。分析するＤＮＡ断片の最適な大きさは、分子中の突然変異の位置にも依存する。所定の長さの断片を得るために、特別な長さの二本鎖ＤＮＡ断片を、例えば断片化または消化のような様々な方法により作成できる。重要なことは、本明細書に記載した方法が、配列が同じ長さでも突然変異体および野生型ＤＮＡ配列を分離できることである。一般的に、断片化は選択した制限エンドヌクレアーゼ（１つまたは複数）、またはＤＮＡを配列−特異的様式で認識して切断できる他の化学試薬で切ることにより行われる。この制限エンドヌクレアーゼまたは他の試薬は、問題の突然変異が所望の長さのＤＮＡ断片内に含まれるようにＤＮＡ配列を切断するために選択される。
【００３３】
この断片化工程は、様々な長さの多くの種々のＤＮＡ断片を生じる。問題のＤＮＡ断片の部分単離は、ＰＡＧＥまたは他の大きさで分離する手段のような様々の標準的方法により行える。部分単離は、大部分の断片化ＤＮＡを除去し、そして続くＤＮＡ処理、例えばＤＮＡ増幅を簡略にする。この工程で生成した二本鎖ＤＮＡ断片を、周知技術を使用してフルオレセイン、赤外線色素または放射性物質のような検出可能なレポーター基で標識することもできる。
【００３４】
ＤＮＡ断片の分離前、特に野生型ＤＮＡ配列から突然変異体ＤＮＡを分離する前に、二本鎖ＤＮＡ配列を野生型ＤＮＡ鎖および逆−平行突然変異体ＤＮＡ鎖を含むヘテロ二重鎖分子に転換する。この転換工程は、断片化工程に先立つか、または断片化工程に続く。いずれの場合でも、ヘテロ二重鎖の転換は、試料中のＤＮＡ配列を加熱して二本鎖ＤＮＡを融解し（２本の鎖に分離）し、そして試料を冷却して鎖を再度アニールして二重鎖を形成する。（例えば、米国特許第５，０４５，４５０号明細書を参照にされたい、この教示は引用により本明細書に編入する。）融解／再アニール工程中、非−突然変異体ＤＮＡ配列が突然変異体ＤＮＡ配列と複合体を形成し、これを本明細書ではヘテロ二重鎖と呼ぶ。突然変異体／突然変異体鎖および非突然変異体／非突然変異体鎖を含むホモ二重鎖も形成する。
【００３５】
突然変異体ＤＮＡ配列がヘテロ二重鎖を形成することを確実にするために、過剰な野生型配列が試料中に存在しなければならない。本方法より分析されるほとんどの試料中には、野生型ＤＮＡが突然変異体ＤＮＡ配列の１０−１０，０００，０００−倍過剰を示す。したがって、転換工程は試料をさらに処理する必要無く行うことができる。過剰な野生型配列が存在しない場合には、モル過剰（≧１０Ｘ）の野生型配列が存在することを確実にするために、転換に先立ち野生型配列を付加して過剰にすることが必要になるかもしれない。試料中にモル過剰量の野生型配列が存在すると、突然変異体／突然変異体ホモ二重鎖を形成を有意に減らす。したがって、突然変異体ＤＮＡ配列と混合した優勢な野生型ＤＮＡ配列を含む試料混合物を加熱することにより、質量作用により、突然変異体ホモ二重鎖の有意な部分が、１つの突然変異体および１つの野生型鎖を含むヘテロ二重鎖に転換される。本方法の分析に適するＤＮＡには、本方法の分析前にヘテロ二重鎖の形成を必要としない自然な状態で得られるものもあることは特記すべき重大なことである。
【００３６】
重要なことは、各ヘテロ二重鎖の融解温度はそのヘテロ二重鎖に特徴的であり、そして完全に対合する野生型ホモ二重鎖の融解温度よりも有意に低い点である。特別な条件下でのヘテロ二重鎖は部分的に融解して、非融解の完全に対合したホモ二重鎖より遅い速度で移動するだろう。したがって、突然変異体は優勢な野生型から容易に分離される形態に転換される。この工程で使用する野生型ＤＮＡ配列を、フルオレセインのような検出可能なプローブで標識し、標識化二重鎖を形成でき、これは後の検出を容易にする。
【００３７】
突然変異体−含有ヘテロ二重鎖分子を、次に本明細書に記載した方法によりホモ二重鎖分子から分離する。野生型／突然変異体ヘテロ二重鎖、野生型／野生型ホモ二重鎖、および元の試料に残る他のＤＮＡ配列の混合物を含む試料アリコートを、ポリマーマトリックスを含有する流路に添加する。電気泳動装置への導入法は、例えば電気注入、物理的添加、または他の試料添加手段によりことができる。ポリマーマトリックスは流路に含まれている。流路は高電場に適するものではなければならない。例えば、もし流路がキャピラリーカラムならば、キャピラリーは典型的には小さい口径直径（例えば、約１０から４００ミクロン、より好ましくは５０−２００ミクロンの直径）を有する融合シリカ管である。キャピラリーの内壁は中性の被覆材料で被覆され、融合シリカの荷電が無視できる程度に減少している。被覆（例えばオルガノシラン）は流路の壁に吸着または共有的に結合している。本方法の使用に適するキャピラリーカラムは、米国特許第５，１１２，４６０号明細書で検討され、その教示は引用により本明細書に編入する。キャピラリーカラムが本明細書に記載した分離法に好適だが、スラブもまたこの方法に使用できる。スラブは薄く、約１０−４００ミクロン、好ましくは５０−２００ミクロンの厚さを有するべきである。
【００３８】
本発明の分離法は、小さいプレート、または“チップ（ｃｈｉｐ）”または一連の“チップ”での使用にも適合できる。例えば流路をチップにエッチングまたは切断し、そしてポリマーマトリックスを充填し、試料を添加し、完全な大きさのキャピラリーカラム分離と同じ解像度で、そして野生型ホモ二重鎖を野生型／突然変異体ヘテロ二重鎖から分離するのに十分な条件で電気泳動する。さらに、チップを容易に取りはずし、そして新しいチップを各分離に使用できる。
【００３９】
ポリマーマトリックスは一般的にポリアクリルアミドである。しかし、メチルセルロース、デキストランまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような他のポリマーマトリックスを使用できる（例えば、Ｇａｎｚｌｅｒ，Ｋ．，ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６４：２６６５−２６７１（１９９２）を参照にされたい）。本方法の好適な態様では、ポリマーマトリックスは“交換可能”である。すなわち、流路に含まれるポリマーマトリックスに各試料アリコートを載せる前に、典型的には古いマトリックスを吹き出すことにより消費したマトリックスを取り出し、そして新しいマトリックスを入れる。各泳動のために流路中のポリマーマトリックスを交換できる能力は、本分離方法の再現性に重要である。試料がマトリックス中を泳動した後、そのイオン強度は変化し、マトリックスの伝導度が変化する。高温に暴露することもマトリックスに対して破壊的である。消費したマトリックスを流路から吹き出し、そして新しいマトリックスを各試料泳動に導入することは、再現性のある変性条件を確実にする。あるいは、もしチップを使用するならば、チップは各泳動後に捨てることができる。
【００４０】
ポリアクリルアミドマトリックスは一般的に、１５％以下のモノマー濃度を有する。好ましくは、本方法には７％以下の濃度が使用され、そしてより好ましくは交換可能なポリマーマトリックスについて、濃度は４−６％の間である。ビスアクリルアミド架橋結合剤または他の適当な架橋結合剤は、省略されるか、または大変低濃度でのみ含まれる。好ましくは交換可能なポリマーマトリックスに関しては、マトリックスは直鎖ポリアクリルアミドである。ポリマーマトリックスヘの試料添加は、二重鎖を融解せずに試料のマトリックス中への最初の移動が可能となる条件下で導入できなければならない。
【００４１】
ＤＮＡホモ二重鎖からＤＮＡヘテロ二重鎖の分離は、流路に高電場を供することにより始まり、そこを負に荷電したＤＮＡが移動する、すなわちポリマーマトリックスを通って反対の流路末端の正に荷電した陽極に向かって移動する。電場は分離の条件に依存して変化できる。例えば、流路がキャピラリーカラムであるとき、１２００ボルト／ｃｍ以上の電場をこの方法に使用できる。典型的には、電場は５０から１２００ボルト／ｃｍの間であり、そして好ましくは電場は１００−５００ボルト／ｃｍの間である。いったん電場を適用したら、試料がカラムの伝導度よりも低い伝導度を有するならば、試料アリコート中のＤＮＡは流路の頂点で大変小容量に“集束”するか、または濃縮する。ＤＮＡ試料の集束は、本方法により達成される高解像度に対する重要な因子である。分離法のこの時点で、すべての二重鎖は同じ、またはほとんど同じ速度でマトリックスを通過している。好ましくはこの速度は、約１−２ｃｍ／分である。
【００４２】
ポリマーマトリックスの始めから短い距離で、移動している二重鎖は“変性ゾーン”と言う流路の部分に入る。変性ゾーンは、ヘテロ二重鎖が部分的に変性するがホモ二重鎖は完全なままである条件の流路内の部分を含んで成る。部分的な変性ヘテロ二重鎖は、マトリックスを通る移動が遅い。すなわち、いったん野生型ホモ二重鎖および野生型／突然変異体ヘテロ二重鎖がこの変性ゾーンに入ると、それらの速度が区別できるようになる。すなわち、変性ゾーン中での野生型ホモ二重鎖の速度は、野生型／突然変異体ヘテロ二重鎖の速度よりも大きい。例えば、二重鎖分子が変性ゾーン中を移動するとき、少なくとも１つの誤対合塩基対を含むヘテロ二重鎖分子は、野生型ホモ二重鎖分子が融解する変性条件とは異なる変性条件で融解する。したがって変性ゾーンの条件は、野生型ホモ二重鎖分子が野生型／突然変異体ヘテロ二重鎖の速度よりも早い速度で移動し、そして野生型ホモ二重鎖が変性ゾーン中の野生型突然変異体ヘテロ二重鎖からの相対的位置として分離できる。
【００４３】
この方法で使用する変性ゾーン条件は、問題のＤＮＡの融解特性に依存する。特に変性ゾーン内の条件は、ヘテロ二重鎖ＤＮＡ分子、特に低温イソ−融解ドメインの部分的変性を起こさなければならない。部分変性条件は、ゾーン中で一定であるか、または断続的であり（例えば、ポリマーマトリックス内に形成された温度勾配または化学変性剤の勾配）。部分変性条件は、温度または、温度およびゾーン内のポリマーマトリックス中に含まれる化学変性剤の組み合わせにより形成される。典型的には、温度は加温温度（本明細書では加温温度とは周囲温度よりも高い温度を意味する）である。例えば、周囲温度が約２２℃ならば（約７２ＯＦ）、加温温度は約２４℃以上で泳動される。化学変性剤がポリマーマトリックスに存在するならば、本方法は周囲温度で行うことができる。一般的に、加温によりポリマーマトリックス中で望ましくない化学反応が起こることなく、迅速なマトリックス通過が起こる。しかし、化学変性剤が存在すると、マトリックスをゆっくりと通過するように温度を下げることができる。温度および化学変性剤の最適な組み合わせは、問題の各配列によって異なるだろう。これらの条件は、部分変性条件を変える本方法で、問題のＤＮＡの試験アッセイにより実験的に決定できる。
【００４４】
キャピラリーカラムの温度は、ウォータージャケット、加熱ブロックまたは他の適当な手段によりキャピラリーの周囲部分から周囲温度より高く上げることができる。一般的に、カラムの開始部および反対の終了部は変性ゾーンに含まれていない。例えば、キャピラリーの有効長が１８ｃｍである場合（注入からカラム上の検出点まで）、キャピラリーの１０ｃｍ部分が加熱される。ランプまたは熱風のような他の従来の熱制御法も使用できる。
【００４５】
選択した温度は、問題のＤＮＡ配列の融解特性、ならびにあるとすればポリマーマトリックス中の化学変性剤の量および種類に依存するだろう。一般的に、温度範囲は周囲温度より高い（例えば、約２４℃から約１００℃の間）。マトリックス中に化学変性剤が存在するならば、使用する温度は周辺温度に近くなるかもしれない。化学変性剤がマトリックス中に存在しなければ、加温だけで所望の変性条件を達成できる。最適な温度は、問題の各配列について経験的に定めることができる。例えば、問題のＤＮＡ配列の融解温度が６３℃ならば、最初の泳動を６０℃で、第二泳動を６１℃で行うことができ、そして第４回までそのようにして、電気泳動図から観察される所望の部分変性剤条件に到達するように最適温度が決定される。したがって、もし温度を野生型／突然変異体ヘテロ二重鎖の融解温度よりも数度高く設定すれば、野生型ホモ二重鎖は、ほとんど最大速度で、非融解状態でカラムを通過する一方、より低い熱耐性を有する野生型／突然変異体ヘテロ二重鎖は、部分的に融解してゾーンをより遅い移動度で通過するだろう。変性ゾーンの外側の流路領域は、すべての二本鎖ＤＮＡ種が未融解で、そして一定速度で移動する。したがって、変性ゾーンを移動している間、部分融解した状態の野生型／突然変異体ヘテロ二重鎖は、未融解の野生型／野生型ホモ二重鎖よりも遅い速度で移動し、ホモ二重鎖からヘテロ二重鎖の分離を生じる。
【００４６】
典型的には、ホルムアミドおよび尿素のような化学変性剤が、単独または組み合わせて使用される。しかし、二本鎖ＤＮＡを融解する傾向がある他の標準的化学変性剤を本発明に使用することができ、それには例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）がある。最適な化学変性剤およびその最適濃度は、問題のＤＮＡ配列に大変依存する。化学変性剤の濃度は変性剤ゾーンで一定であるか、または例えばゾーン始めの低濃度からゾーン終わりの高濃度へと広がる勾配濃度であることができる。最適な化学変性剤およびその適当濃度を決定できる。
【００４７】
本発明の１つの態様では、ポリマーマトリックス中の部分変性条件は一定である。一定の変性条件下のキャピラリーカラムを使用することを、本明細書では一定変性キャピラリー電気泳動法またはＣＤＣＥと呼ぶ。本発明の別の態様では、勾配変性条件を使用して突然変異体配列を分離そして検出することができる。勾配（化学品または温度）は、試料中に含まれるホモ二重鎖から多くのヘテロ二重鎖を一回のアッセイで分離することができる。したがって、勾配はさらなる分析に使用する一定変性条件の迅速な決定のために使用できる。勾配変性条件は、分析する多くの配列が異なる融解特性をもつ場合にも望ましい。さらに、勾配変性条件は、二重鎖の相対的位置を決定するためにマトリックス中をスキャンニングする目的のために、二重鎖をポリマーマトリックス中で“固定”するための方法として使用できる。例えば、移動している二重鎖はマトリックスを通過し、そして特定の点で変性条件が変化して移動が停止し、そして二重鎖がマトリックス中で固定されるようになる。続いて、マトリックス中の二重鎖の相対的位置を測定するために、マトリックスをスキャンニングすることができる。既知の融解特性を用いた標準を、マトリックスをキャリブレーションするために使用できる。
【００４８】
分離した野生型ホモ二重鎖および野生型／突然変異体ヘテロ二重鎖の検出は、マトリックスを通過した二重鎖の移動のモニタリング、またはマトリックスからの二重鎖の溶出、あるいは特別な時間で電場を切ることにより二重鎖の移動を流路に対する相対的位置で止め、そしてマトリックスをスキャンニングすることを含む数々の方法で行うことができる。特に、キャピラリー電気泳動法は、少数のヘテロ二重鎖分子のオン−ライン検出について重大な利点を提供する。（Ｋａｒｇｅｒ、Ｂ．Ｌ．，ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．４９２：５８５−６１４（１９８９））。適当なオン−ライン法は高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）について開発された検出法に準じる。例えば、ＤＮＡ断片を蛍光化合物、または近赤外線色素で従来法により分離前に標識できる。そのような多数の化合物は当該技術分野で周知であり、フルオレセインがこの種の化合物の員として通常使用されている。
【００４９】
流路の変性ゾーンを越えた任意の便利な点に（流路の添加点から離れた端）、光源（例えば、アルゴンレーザー）および検出器（例えば、光電子増倍管）を配置する。レーザーは蛍光性化合物の蛍光を引き出すと知られている波長に合わせられ、そして流路を通った光が検出器に向けられるように配置する。蛍光的に標識された化合物がアルゴンレーザービームを通過した時、蛍光性化合物は励起され、そしてその蛍光が検出器により検出される。検出器はアナログ−デジタルインターフェイスを介して制御ユニットにデータを送る。次にデータが電気泳動図にレコーダーでプロットされる（すなわち、溶出または移動プロフィール）。
【００５０】
本発明の１つの態様では、レーザー誘導蛍光（ＬＩＦ）検出デバイスがマトリックスを移動しているホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖をモニターするために使用され、このようにして電気泳動図が作成される。流路は、ヘテロ二重鎖および／またはホモ二重鎖を含む既知試料を流すことによりキャリブレーションすることができる。次に未知試料の電気泳動図を標準的な電気泳動図と比較して、問題のヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖を同定できる。
【００５１】
上記の分光法に加えて、他の検出法も開発された。伝導度はＨｕａｎｇら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．４５８：３０３（１９８８））により成功裏に利用された。この検出器は、高伝導性のイオン用として有用であることが示されている。電気化学的検出器も、ＷａｌｌｉｎｇｆｏｒｄおよびＥｗｉｎｇ（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５９：１７６２（１９８７））により開発された方法を使用して使用できる。第三の検出型の開発は放射性検出器である（例えば、Ｇｏｒｄｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：２２４（１９８８））。
【００５２】
キャピラリー電気泳動と組み合わせて有用な別の検出器は、マススペクトロメーターである。（Ｓｍｉｔｈら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：１９４８（１９８８））；（Ｌｅｅら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．４５８：３１３（１９８８））。
【００５３】
別の従来法も、分離したＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖を分析するために使用できる。例えば分離した二重鎖を含む個々の部分を、それらがポリマーマトリックスから出た時に回収することができる。次にこれらの部分を、特別な場合では紫外線光検出器の吸収（例えば、ＵＶ光への暴露が分析の精度を妨害しない場合）およびシンチレーションカウンターのような遠隔検出器に供する。あるいは、必要ならばこれらの回収した部分を増幅でき（例えばクローニングにより、または米国特許出願第０７／９９９，１７９号明細書（この教示は引用により本明細書に編入する）に記載されたような高度に忠実に複製するＰＣＲ法：ｈｉｇｈ  ｆｉｅｌｉｔｙ  ＰＣＲによる）、そして標準的方法を使用して配列決定し、部分に含まれる二重鎖の正確な核酸配列を決定する。あるいは、流出が膜上に直線的痕跡を生成するようにキャピラリーの遠方の先端を移動膜に接触させることができる。次に膜を、染色またはオートラジオグラフィーのような従来の分析に供することができる。
【００５４】
本発明の１つの態様では、ポリマーマトリックスは交換可能なマトリックスであり、これは第一分離泳動後に流路から容易に取り出すことができる。したがって、問題のＤＮＡ二重鎖を含む部分がマトリックスから出て来た時に回収した後、古いマトリックスを吹き出し、そして新しいマトリックスと交換する。ヘテロ二重鎖を含む回収した部分、または回収したプール部分を、場合によっては適当な低−誤差増幅法により増幅することができ、そして新しいポリマーマトリックスに再度導入し、そして上記のように再び同一の部分変性条件下、または異なる条件下で高電場に供することができる。例えば２００倍に濃縮した突然変異体ＤＮＡは、さらにもう１回行った。ヘテロ二重鎖を含むこの部分（１つまたは複数）を、再度集め、場合によっては増幅し、そしてヘテロ二重鎖のＤＮＡ配列を決定するためにシークエンシングすることができる。この分離工程で、回収した部分中にヘテロ二重鎖が濃縮され、したがって問題の突然変異を分析し易い。
【００５５】
本明細書に記載する野生型ホモ二重鎖を野生型／突然変異体ヘテロ二重鎖から分離する方法は、問題の突然変異体ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ試料から野生型ＤＮＡ配列を効率的に除く再現性ある手段を提供し、したがって突然変異体−含有部分を濃縮する。例えば、問題のＤＮＡ配列の典型的な分析は、現在約７．５時間で行うことができる。さらに本明細書に記載した至適化法により、この時間をさらに合理的に短縮できる。さらに、本明細書に記載した方法は容易に自動化でき、これにより試料または一連の試料の迅速な処理が可能になる。
【００５６】
ヒト  ヒポキサンチン  グアニン  ホスホリボシル  トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子は、本明細書に記載した分離法により、ヒト細胞中の点突然変異を検出する実験のための適当なモデルである。ＨＰＲＴ遺伝子は、ゲノムＤＮＡ中に約４４ｋｂ広がり、そして９つのエキソンに分かれている。エキソン３はコーディング枠の最大連続部分を含む（２８％）。このエキソンは図１Ａに概略して示すような、１０４塩基対（ｂｐ）の低温イソ−融解ドメインに隣接する８０ｂｐの高温イソ−融解ドメインを含む。
【００５７】
さらに、通風を生じる原因であるＨＰＲＴ遺伝子の突然変異体は同定され、そして配列決定された。突然変異体対立遺伝子はＨＰＲＴ−Ｍｕｎｉｃｈと命名された。この突然変異体対立遺伝子は、エキソン３の低温融解ドメイン中、エキソンの３’末端から７塩基対の塩基対３１２でＧＣからＴＡへのトランスバージョンを含む。換言すると、野生型（ｗｔ）および突然変異体（ｍｕ）は、低温融解ドメイン中のエキソンの３’末端から第７番目の位置が、唯一ＣＧからＡＴヘトランスバージョンして異なる１８４ｂｐ  ｄｓＤＮＡ分子である。（Ｃａｒｉｅｌｌｏ，Ｎ．Ｆ．，ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，４２：７２６−７３４（１９８８））。
【００５８】
野生型ＨＰＲＴエキソン３およびＨＰＲＴ−Ｍｕｎｉｃｈエキソン３を、実施例１に詳細に記載するようにゲノムＤＮＡから単離して増幅した。個々の増幅生成物を、これも実施例１に記載したようにＰＡＧＥおよびＤＧＧＥにより精製した。ＤＮＡ断片をゲルに添加する前に、断片を混合して野生型／突然変異体ＤＮＡ配列を含むヘテロ二重鎖を形成できるようにした。再アニールした生成物をＤＧＧＥに供し、そして分離したヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖をゲルから分離し、そしてマイクロリットルあたり約１０８コピーに希釈した。
【００５９】
野生型ＨＰＲＴエキソン３ＤＮＡを単独で、室温で実施例１に記載するようにキャピラリー電気泳動システムを用い初めに泳動した。７Ｍ尿素を含む変性ポリマーマトリックスで泳動した時、室温で野生型断片の低温融解ドメインは融解しない。図２を見るとわかるように、野生型二重鎖ＤＮＡは、レーザー誘導蛍光（ＬＩＦ）検出器を単一ピークで２７から２８分の間に通過した。
【００６０】
図３は、６０℃の加温温度で野生型配列単独の電気泳動図を示す（水中に約１０８のコピー数）。注入後１７と１８分との間の早いピークは、一本鎖ＤＮＡを表すと考えられる。注入後３８と３９分との間に現れる第二ピークは、部分変性した部分的に二重鎖構造を表すと思われる。
【００６１】
図４は、ＨＰＲＴ−Ｍｕｎｉｃｈ  ＤＮＡ（約１０８コピー）を６０℃の加温温度でキャピラリーカラムで泳動した実験の電気泳動図を表す、早い主ピークが約１９分に現れ、これは野生型実験で見られるよりも幾分早い。注入後４３と４４分の間に現れる後のピークは、ＨＰＲＴ−Ｍｕｎｉｃｈ二重鎖断片の部分変性状態を表すと考えられる。
【００６２】
ＨＰＲＴ−Ｍｕｎｉｃｈ断片は野生型ＨＰＲＴよりも低温で融解することが知られている。これは、野生型ピークがＨＰＲＴ−Ｍｕｎｉｃｈピークよりも電気泳動図上で早く現れる、という事実から合理的に説明される。図３および４の後のピークをそれぞれ含む野生型および突然変異体断片が、低温融解ドメインの変性と二重鎖状態との間のコンホメーション的平衡状態で移動することを推定すると、ＨＰＲＴ−Ｍｕｎｉｃｈに比して野生型の平衡状態が完全な二重鎖状態に向かってシフトするであろうと予想することは合理的である。これは野生型が突然変異体に比べて、そのより高い融解温度ゆえに完全な二重鎖に向かう傾向が大きいという事実によるものである。完全に二重鎖の状態は、より速くキャピラリーマトリックス中を移動し、それゆえに図３の後のピークが、図４の後のピークよりも約４−５分早く現れる。
【００６３】
一本鎖野生型および突然変異体種は、それぞれ約１８および２０分に早いピークとして現れるように、より低い程度で分離されることも分かる。そのような分離は、そのような同様な多様性が一本鎖コンホメーションの多形性法（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に使用された事実を考えると意外ではないであろう。
【００６４】
図５は、野生型ＨＰＲＴ断片および突然変異体ＨＰＲＴ−Ｍｕｎｉｃｈ断片の混合物の電気泳動図を示す。この混合物は約１：１であり、全断片数が約１０８である。図５に４つのピークが現れる。初めの２つのピークは、図３、４および５に関連して記載したように、完全な二重鎖および完全な一本鎖を含んで成るピークとほとんど同一の時点で検出器を通過した。第一は検出器を３８から３９分の間に通過し、そして一部融解した二重鎖状態の野生型ＨＰＲＴ断片を表す。後の第二ピークは４３から４４分の間に現れ、そしてＨＰＲＴ−Ｍｕｎｉｃｈ断片の一部融解二重鎖状態を表す。したがって本方法で使用する一定変性条件で、平衡融解差により引き起こされる分別移動速度を介して、試料中に含まれる二本鎖ＤＮＡ種（すなわち、突然変異体／野生型ヘテロ二重鎖、突然変異体／突然変異体ホモ二重鎖および野生型／野生型ホモ二重鎖）の分離が起こる。
【００６５】
本発明の別の態様では、使用するアクリルアミドの濃度を約６％に下げることによりポリマーマトリックスの粘度を減少させ、そしてもし使用するならば、使用する変性化学品の種類および濃度を変更する（例えば、３．３Ｍ尿素および２０％ホルムアミド）。この適度な粘性のポリマーマトリックスは、“交換可能なポリマーマトリックス”の基本を形成する。今回、各試料の泳動後に、この消費マトリックスを簡単に都合よく吹き出し、そして新しいマトリックスを導入することにより交換が可能である。この方法は、各試料の泳動について高い再現性を可能にする。
【００６６】
実施例２では、従来の変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）および一定変性剤キャピラリー電気泳動（ＣＤＣＥ）の結果を、交換可能なポリマーマトリックスを使用して比較している。ヒトミトコンドリアゲノム中の２０６ｂｐのＤＮＡ配列を同定し、これは部分的融解時に低温融解ドメインヘテロ二重鎖が野生型ホモ二重鎖から分離できる、連続的な低温融解ドメイン（１１２ｂｐ）および高温融解ドメイン（９４ｂｐ）を有した。１つの塩基対が異なる２つの配列を、方法を説明するために使用した。第一は、ＧＣと呼ばれ、低温融解ドメインの末端から３０ｂｐにＧＣ塩基対を有し、そしてＡＴと呼ばれる第二はこの位置にＡＴ塩基対を有した。野生型（ＧＣ）断片の融解マップを図６に示す。ＤＧＧＥについては、実施例２に記載したように、これら両方の配列を同じプライマーの組（ＣＷ７（低温融解ドメイン）およびＪ３（高温融解ドメイン））によりＰＣＲ増幅し、そしてＰＡＧＥにより精製した。
【００６７】
等モル量のＧＣおよびＡＴ配列の混合物を、加熱および再アニールし、４種を作成し、それらは２つのホモ二重鎖に加えて誤対合ヘテロ二重鎖であり、ＧＣおよびＡＴのクロスハイブリダイゼーションにより生じたものである。これらの２つのヘテロ二重鎖を、それぞれＧＴおよびＡＣと呼ぶ。場合によっては、再アニーリング無しの加熱により得た一本鎖ＤＮＡも、試料中に含まれた。
【００６８】
図７は、３２Ｐを用いた放射性検出を使用する従来のスラブ−ゲルＤＧＧＥにより、４種の分離を表している。試料は実施例２に記載するように、これらの特別な配列を分離するために至適化した標準的なＤＧＧＥ条件下で泳動された。図７に示すように、ＧＣ＞ＡＴ＞ＧＴ＞ＡＣの低温融解ドメインの熱耐性順序で、非−再アニール化一本鎖断片（ｓｓ）が最も先に移動し、次に再アニール化断片が続いた。
【００６９】
ＧＣおよびＡＴホモ二重鎖、ならびに一本鎖ＤＮＡの同一性を、別個のレーンに純粋種を泳動することにより決定した。２つのヘテロ二重鎖のピークを同定するために、フルオレセイン標識ＡＴ（Ａを含むホモ二重鎖の鎖を標識した）を、非標識ＧＣと再アニールした。この方法により、フルオレセイン標識ＡＴおよびＡＣを生成するが、ＧＣおよびＧＴは未標識である。隣接するレーン中の３２Ｐ標識断片の隣のフルオレセイン標識混合物のＤＧＧＥ分離は、ＡＣヘテロ二重鎖が最も不安定なＤＧＧＥバンドと同じ距離移動した。
【００７０】
図８は、ピークパターンに対するキャピラリーカラム温度の役割を調査することを通して、一定変性剤キャピラリー電気泳動法の重要な観点を示している。実施例７と同じ試料（一本鎖ＤＮＡが無いことを除く）を、フルオレセイン標識ＤＮＡ断片を使用して調製し、そしてキャピラリーカラムを各電気泳動図に掲げた数種の温度で泳動した。（実施例２を参照にされたい。）等量の試料を各泳動で注入した。キャピラリーポリマーマトリックスは、６％Ｔ直鎖ポリアクリルアミドで、３．３Ｍ尿素および２０％（容量／容量）ホルムアミド（ＴＢＥ中）を含む泳動緩衝液を用いた。電場は２５０Ｖ／ｃｍであった。
【００７１】
問題の特別なＤＮＡ配列に対する温度効果を図８に示す。図に示すように、３１℃で、単一ピークが観察された。このピークは４つの二重鎖すべてを非融解状態で含む。３３℃で、ｄｓＤＮＡよりも遅く移動するさらなるピークが得られる。このピークはすべての４つの二重鎖の中で最も不安定な、ヘテロ二重鎖ＡＣである。（図８のピークの同定は、図７に記載したものと同様な様式で決定した。）
温度を３５℃に上げると、別の遅く移動するピーク、ＧＴヘテロ二重鎖を生じる。３６℃で、４つのピークが観察され、これらは２つのホモ二重鎖ＧＣおよびＡＴ、ならびに２つのヘテロ二重鎖ＧＴおよびＡＣである。温度を３７℃、３８℃および４０℃にあげると、分離はすべての４種が同一の遅い速度を有するまで変化する。これは、すべての４種が変性ゾーン中で完全に部分変性状態に転換し、そして電場中で同一の速度を有したことを意味するものと解釈された。
【００７２】
部分融解／再アニーリング段階は迅速に起こると予想すると、各バンドの移動時間は部分融解工程の平衡定数Ｋに依存するだろう。
【００７３】
【数１】
2005040138.tif 000003
【００７４】
式中、Ｘはモル部分であり、そして下つき文字ｐｍおよびｕｍは、部分的に融解した、および非融解断片である。変性ゾーン中の種の電気泳動速度（ν）は、
【００７５】
【数２】
2005040138.tif 000004
【００７６】
と表記され、式中、νｕｍおよびνｐｍはそれぞれ非融解および部分融解断片の速度である。式（１）および（２）から、Ｋが変性ゾーン中の温度で増加すると、ＤＮＡ種の速度はνｕｍからνｐｍへ下がる（図８中、νｕｍ〜４νｐｍ）。νを温度の関数として測定することにより、νｐｍおよびνｕｍ値に加えて、キャピラリー内部のＤＮＡ融解平衡の熱力学的パラメーターを得ることができるということは注目すべきである。
【００７７】
上記の結果に基づき、単純な方法を利用して約１００−２００塩基対の特別なＤＮＡ配列中の突然変異を検出することができる。低温融解イソ−融解ドメインのおよその融解温度は、Ｌｅｍａｎのアルゴリズムを使用して、変性剤濃度に関する適当な補正を用いて、最初に算出できる（Ｌｅｍａｎ，Ｌ．Ｓ．およびＳｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｋ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：４８２−５０１（１９８７）。この推定温度は、次に野生型配列を様々な温度で試験泳動することにより確認にできる。ホモ二重鎖の最適分離温度は、野生型配列が５０％部分的に融解している温度であり（図８の３８℃におけるＧＣについて）、そしてヘテロ二重鎖の最適温度は、野生型がちょうどわずかに融解した温度である（図８の３６℃におけるＧＣについて）。各分離サイクルは、わずか５−１０分間で完了できるので、至適化は大まかに１／２時間で完了できた。この至適化法は、予想される突然変異体に関して、事前に配列以外に何の情報も必要としないことにも注目されたい。
【００７８】
本明細書に記載した方法の成功に極めて重要なことは、各泳動後に新しいマトリックスを作成する能力であった。この効果の原因を見い出すための一連の実験で、二重鎖の不安定性は様々なＤＮＡ調製物で異なり、そしてまた、ＤＮＡ試料を分析するために同じキャピラリーカラムを連続的に使用した時、悪くなることが分かった。この実験で、変化したＤＮＡ試料中の塩濃度が、カラムを通る高い抵抗領域の先端と混ざると、各ＤＮＡ試料をカラム中に引きずるというように説明される結果をまねいた。一回目の試料ではこの効果は小さかったが、続く実験では局部的加熱に付随する低抵抗領域がＤＮＡ二重鎖の不安定性の明らかな原因であった。しかし、およそ３０の泳動後にカラムに第二回目の試料を注入すると、部分融解状態の移動時間の再現性が悪かった（２０％より悪い）。実施例１で、各泳動前にキャピラリーの頂点を切断するか、またはキャピラリー全体を交換するかのいずれかを行い、記載した結果に達したことは注目すべきである。これらの観察により、固定された低イオン強度と各泳動後のポリマーマトリックスの物理的交換とを組み合わせる、本明細書のポリマーマトリックスヘのＤＮＡへの添加法が、シリンジ注入のように簡単な方法となる。交換可能なマトリックスを使用して、良好な移動時間再現性が泳動毎に観察され、その再現性は約±２％の相対標準偏差であった。融解温度は媒質（例えばイオン強度）にきわめて敏感なので、各泳動後の直鎖ポリアクリルアミドマトリックス／緩衝液交換が、部分融解した種の部分を一定にすることを維持するために提供される。さらに、さらなる利点として、交換可能なポリマーマトリックス作成、緩衝液およびマトリックス条件は、所望する時直ぐに交換できる。
【００７９】
もし試料が実施例８の条件下でカラムに２度目に注入されたとき、カラム中で起こり得る変化の重要な例は、変性前の試料を注入することにより確認されたような、唯一の一本鎖断片のピークが得られることである。マトリックスを交換した時に、適切な４つのピークパターンが再度観察された。
【００８０】
“使用済”または消耗したマトリックスヘの２回目の注入による一本鎖ピーク出現の理由は、キャピラリーの陰極末端の回りで見いだされる低伝導度ゾーンの形成かもしれない。このゾーンは、バルク溶液および分子ふるいマトリックス中の緩衝液イオンの移動数の差異による。この小さいゾーンを通る電圧低下が高いので、ジュール熱が生じ、そしてこの熱がこの条件下ではＤＮＡ断片を完全に融解して一本鎖種にするのに十分なようである。おそらく、低伝導度のために融解温度もこの低伝導度“熱ゾーン”中で下がり、そしてこれによりｄｓＤＮＡの変性を助長する。
【００８１】
図８に示す結果により説明される驚くべき特徴は、非融解状態に比べて部分融解ＤＮＡ断片のピーク幅が有意に上昇することである（たとえ移動度の差異を補正した後でも）。部分融解した状態の分離能（それぞれの平均ピーク幅で除算した２種に関する移動時間の差異として定義される）が突然変異配列の混合物の分離に重要なので、分離能に対する幾つかの操作パラメーターの役割を、２つのヘテロ二重鎖ＧＴおよびＡＣの分離について調査した。
【００８２】
図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃは、電場および温度の分離能に対する役割を説明する一連の電気泳動図である。５％の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓ）を添加した試料を、以下のように泳動した：（Ａ）３６℃で、条件は図８；（Ｂ）（Ａ）と同じであるが、８３Ｖ／ｃｍそして（Ｃ）６％Ｔのマトリックス、６３℃で１２５Ｖ／ｃｍ、泳動緩衝液ＴＢＥ、変性剤無し。電気泳動図を視覚的に比較できるようにするために、３つの泳動の時間軸は、バンドが同時に現れるように調整した。
【００８３】
初めに注目すべきことは、変性ゾーン中でバンドが滞在する時間を延長すると（図９Ｂ）、分離能が図９Ａよりも１．６倍向上する。図９Ａに匹敵する分離能は、２５０Ｖ／ｃｍの電場でバンドがキャピラリーの加熱部分滞在する時間を、変性ゾーンの長さを３倍延長すことにより同等に延ばした時、すなわち加熱ゾーン内により多くのキャピラリーを含む時に見いだされた。変性ゾーン内での時間に伴う分離能の上昇は、図９Ｂに見られるように、ヘテロ二重鎖についてより狭いピーク幅（移動時間に対して標準化された）による。部分融解状態のバンド幅は、このように拡散工程よりは動力学的工程により制御される。そのような遅い動力学は、部分融解状態と直鎖ポリアクリルアミドとの相互作用から生じたか、あるいは融解／再アニーリング工程自体によるものである。
【００８４】
このような知見に基づき、より高温を試験した。図９Ｃは６３℃にてポリマーマトリックス中に変性剤無しで操作した結果を示す。図９Ａと比較して、ここでも主により鋭いバンドにより、分離時間の増加無しに２．６倍まで分離能が向上する。加温により速度制限動力学工程が加速され、より狭いバンドをもたらした。ｓｓＤＮＡの位置も異なる操作条件により図９Ｃではシフトしたことに注目されたい。
【００８５】
実施例に示すように、レーザー誘導蛍光（ＬＩＦ）は、蛍光色素で標識した少数のＤＮＡ分子を検出する高感度な手段を提供する。これにもかかわらず、大量のＤＮＡを添加できる能力が極めて重要となる場合もある（突然変異のスペクトロメトリーを含む）。本システムの起動範囲（例えば分子数を検出できる能力の範囲）を決定するために、示した量のＧＣホモ二重鎖を、０．２μｌの試料からキャピラリーカラムに注入し、そして周囲温度（２２℃）で泳動した。結果を図１０に示す。１０１０コピーについては、レーザービームを１０倍縮小し、そして増幅は通常の１／１０であった。３×１０４コピーについては、レーザー出力を５倍に増加し、そしてノイズはカーブの各点を囲む１０秒間隔にわたって平均化することによりフィルターした。（ピーク面積は電気泳動図に含まれることに注意されたい。）１０１１ものコピーが添加され、そして測定された。しかし、１０１０分子より多くの添加は、ピークの歪みを生じた。ｄｓＤＮＡの３×１０４コピーのピークは、システムのバックグラウンドよりは高く、目で見ることができる。分子数対ピーク面積のキャリブレーションプロットは、３×１０４−１０１１分子の全範囲で直線に近いことが分かった。
【００８６】
さらに低い検出レベルも理論的には可能であるが、検出のより重要な測定は、大過剰の野生型ホモ二重鎖の存在中で突然変異体の部分が観察できることである。図１１は、野生型ホモ二重鎖とわずか０．３％のヘテロ二重鎖混合物が、本発明の方法を使用して測定できることを示している。ＡＣおよびＧＴ突然変異体ヘテロ二重鎖、各々３×１０５コピーを大過剰（１０９）の野生型ＧＣホモ二重鎖コピーと混合し、そして３５℃（変性剤を含む交換可能なマトリックス）にてキャピラリーで泳動した。図１０に示すものとは対照的に、図１１で見られるバックグラウンドノイズは、少量で存在する突然変異体の同定を妨害し、明らかに化学的に反応した野生型ＤＮＡ分子から成っている。
【００８７】
実施例３に示すように、シグナル対ノイズ比は、ＤＮＡ試料を２サイクルの一定変性キャピラリー電気泳動に供することにより、有意に減少させることができる。ＧＴおよびＡＣヘテロ二重鎖、各々５×１０４コピーを１０９コピーの野生型ＧＣホモ二重鎖と混合し、そしてＣＤＣＥに供した。分離したヘテロ二重鎖を含む部分を集め、高複製ＰＲＣにより増幅し、そして第２サイクルのＣＤＣＥに供した。各サイクルで試料は新しいポリマーマトリックスを使用するＣＤＣＥに供し、ヘテロ二重鎖を含む部分を回収し、そして回収した部分を適当な増幅手段により増幅した。
【００８８】
図１２Ａで、約１６．５および１８．０分に出現するヘテロ二重鎖−含有ピークは、ノイズピークよりも数十倍大きい。図１２Ｂで、２サイクル目のＣＤＣＥ後、ヘテロ二重鎖−含有ピークはノイズピークよりも数百倍大きい。重大な知見は、バックグラウンドノイズレベルはヘテロ二重鎖−含有部分の増幅と同時に増幅されなかったことである。これはもとの標準試料中、わずか５×１０−６の突然変異体が検出できたことを示している。
本発明の使用
本発明に記載の方法は、突然変異体核酸配列の検出が重要である任意のバイオテクノロジー的応用に有用である。低温イソ−融解ドメイン中に突然変異を含む任意のＤＮＡが、本明細書に記載した方法による分離に適している。この分離法は、特に試料中の全ＤＮＡの少部分を表す突然変異体ＤＮＡの検出に適する。特に、本明細書に記載した方法は遺伝子治療に使用するＤＮＡまたはＲＮＡ、プラスミドＤＮＡの分析、組換えＤＮＡまたは組換え植物ＤＮＡの分析、突然変異のスペクトロメトリーのような特別なＤＮＡ座での体細胞突然変異の検出、ならびに前悪性突然変異体の組織をスクリーニングするために有用である。
腫瘍学
腫瘍細胞の検出では、腫瘍学者は新たな腫瘍の早期診断を、あるいは腫瘍が見いだされた場合には、癌細胞移入（転移）または化学療法後もしくは放射線療法後の再発の程度を調べる。さらに、腫瘍抑制遺伝子中の特定の特別な突然変異により、人は特定の腫瘍に早くかかりやすくなることが知られている。本発明はそのような稀な配列を、実際的かつ効率的に検出および測定可能する。
癌と思われる集団のスクリーニング
稀に遺伝する癌性突然変異の場合には、血液または組織試料中に含まれるＤＮＡのＰＣＲ増幅、ならびにその結果をシークエンシングして、突然変異が個体および採取したＤＮＡ配列中に存在するか否かを明らかにできた（この様式で検出できる頻度で突然変異が存在するならば）。しかし、１万人に１人の個体が、そのような幾つかの調査した配列に突然変異を持つかもしれないだけである。本発明を用い、研究室で各千の試料に由来する血液のマイクロリットルアリコートを混ぜ、そしてアッセイしたＤＮＡ配列の任意のヌクレオチド中、に１つ以上の突然変異を持つ存在についてアッセイすることができる。次に罹患している個体の同定は、サブ集団試料の幾つかを検査して、正常配列を持つものを排除することができる。
癌細胞検出
本発明は、任意のヒト組織または糞便（結腸癌の検出）、尿（膀胱癌の検出）、唾液（気管支癌の検出）、血液（白血病、リンパ腫等）あるいは胸部吸込物（ｂｒｅａｓｔ  ａｓｐｉｒａｔｅ）（乳癌）を含む体液のＤＮＡに応用できる。この分析法はＤＮＡ断片の重要な大きさのスクリーニングを可能にし、したがって調査したＤＮＡ配列の任意の突然変異体の本質的な検出感度に加えて、癌細胞検出の可能性も増す。他の方法に勝る、特定の塩基対置換に特異的な本発明の利点は、発癌遺伝子が腫瘍抑制遺伝子の“すべての可能な発癌性突然変異体”というよりも“より可能性のある”発癌性突然変異体を目的とすることである。本方法により、すべての可能な発癌性突然変異体を所望の配列中に見いだすことができる。
【００８９】
未診断の癌の場合の早期発見に加えて、本発明の方法は疾患の転移または再発の程度を判断するための臨床病理学に応用できる。時を得た様式で得られるそのような知見は、治療的手段の効果を増すものと考えられる。例は乳腺をドレインする軸のリンパ節の調査である。乳癌が広がり始めるとき、幾つかの細胞がこれらのリンパ節に捕まり、そして識別染色された組織試料の分析のような標準的な方法を使用して有資格者の病理学者により認識されるだろう。リンパ節の関与が起こっているならば、より積極的な治療的手段が示される。本発明は染色した組織試料中で見えるよりはかなり低い頻度の癌細胞に共通な突然変異体ＤＮＡ配列を検出できた。癌細胞の周囲で突然変異することがよく見られるｐ５３のような腫瘍抑制遺伝子については、本発明は千に１つの突然変異体を検出するために使用された。本明細書に記載した方法は、適当なＤＮＡ増幅法と組み合わせて、そのようなリンパ節試料中の突然変異体の測定を、患者がバイオプシーのために未だに麻酔をかけられている間に、外科的切除の範囲を決定する時間スケールで測定することを可能にすることさえできる。
【００９０】
癌の化学療法は、本質的に腫瘍の各細胞を殺すことである。もし１つの細胞または幾つかの細胞が処置で生き残ったならば、それらは成長して再度腫瘍を発生させる。これらの細胞の成長を早期に認識することが、後の治療を成功させることになると考えられている。本方法は、患者の特別な突然変異に関する知識と組み合わせて、そのような再発について患者を日常的に、そして効率的にスクリーニングできる。この方法は、既知の任意の発癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子中に発癌性の突然変異を持つ多くの患者をモニタリングするための同じ装置および材料を使用できる。
【００９１】
最後にこの方法の早さおよび簡便性は、核酸融解の熱力学および動力学、ならびにＤＮＡと他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列との結合相互作用、ならびに協同的平衡により支配されているＤＮＡ−タンパク質相互作用に関する研究を楽にする。
【００９２】
したがって本明細書に記載した研究の結果、新たな突然変異の分析法が提供された。この方法は迅速であり、部分的に融解した種の解像度が優れている。本方法は、野生型および突然変異体ＤＮＡの混合試料中に含まれる突然変異体ＤＮＡの部分を濃縮するための優れた手段を提供する。さらなる濃縮は、濃縮した試料を続いて再度濃縮することにより得られる。そのようなリサイクリングは、１０−３未満の突然変異体部分、特に１０−８−１０−３の範囲であるときに極めて重要である。
【００９３】
本明細書に記載した方法はレーザー誘導型蛍光検出法を使用して、広範な直線的な起動範囲で高感度である。特に本明細書に記載した方法は、容易にコンピューター化および自動化される。さらに、試料の高処理量は多チャンネルアレイの平行処理により行うことができる。
【００９４】
本発明は、限定するものではない以下の実施例により説明される。
【実施例１】
【００９５】
ＨＰＲＴの電気泳動
ＤＮＡ試料の調製
野生型ＨＰＲＴエキソン３ならびにＨＰＲＴ−Ｍｕｎｉｃｈエキソン３を、単離ゲノムＤＮＡから図１Ｂに概略して示すようにＰＣＲ法を変更することにより増幅した。野生型ゲノムＤＮＡを指数的重力モルのＴＫ６ヒトリンパ芽球から単離した（例えば、Ｐｏｒｔｅｏｕｓ，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅ１１．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１：４４５−４５４（１９８５）を参照にされたい）。以下のプライマーを増幅法に使用した：
Ｐ１：５’−ＣＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＴＡＴＡＣＴＣＡＣ−３’（配列番号：１）
Ｐ２：５’−ＴＣＣＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＡＧ−３’（配列番号：２）および
Ｐ３：５’−ＧＡＣＴＧＡＡＣＧＴＣＴＴＧＣＴＣＧＡＧ−３’（配列番号：３）
１回目の増幅で、野生型ＨＰＲＴエキソン３の約１０６コピーおよびＨＰＲＴ−Ｍｕｎｉｃｈエキソン３の１０６コピーを、非標識プライマーＰ１およびＰ２を用いたプライミング増幅法により別個に増幅し、２２４塩基対の増幅生成物を作成した。ＤＮＡを約１００万倍、各々約１０１２コピーに増幅した。増幅はＳｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）ポリメラーゼ（Ｕ．Ｓ．バイオケミカルズ：Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して、製造元の指示に従い行った。増幅したＤＮＡを次にポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で精製した。
【００９６】
約１０６コピーの精製２２４塩基対増幅生成物を、第２回目の増幅に供した。第２回目では、合成を２０４塩基対ＤＮＡ断片を生成するプライマーＰ１およびＰ３で釣り上げた。プライマーＰ３を従来法でフルオレセインを用いて末端−標識した。重合をＶｅｎｔ（商標）ポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボズ：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、製造元の指示に従い行った。このＤＮＡも約１００万倍に増幅した。
【００９７】
２０４塩基対断片を２回の精製に供し、突然変異を誘導する任意のポリメラーゼを除去した。１回目の精製はＰＡＧＥにより行った。２０４塩基対バンドをアクリルアミドゲルから切り取り、従来法により溶出した。第２回目の精製は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）であった（例えば、Ｃａｒｉｅｌｌｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４２：７２６−７３４（１９８８）を参照にされたい）。ＤＮＡを変性勾配マトリックスに添加する前に、２０４塩基対断片を変性させた。野生型ＨＰＲＴおよび２０４塩基対断片に由来するＨＰＲＴ−Ｍｕｎｉｃｈの両方を、別の試験管中で煮沸してＤＮＡを変性させた。変性したＤＮＡを次に６５℃で約３時間インキューべーションし、そして再アニーリングさせた。再度アニールした生成物を、エタノール沈殿させ、再懸濁し、そして変性勾配ゲルで分離した。野生型ＨＰＲＴ断片およびＨＰＲＴ−Ｍｕｎｉｃｈ断片を変性勾配ゲルから切り取り、溶出し、エタノール沈殿させ、そして水中に再懸濁させた。これら試料の濃度をマイクロリットルあたり約１０８に希釈した。
キャピラリー電気泳動装置
この研究に使用したキャピラリー電気泳動装置は、６０ｋＶの高電圧ｄ．ｃ．パワーサプライを使用してマトリックスを充填したキャピラリーに電位を作成することを除いて、Ｃｏｈｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：９６６０（１９８８））により記載されたように構成した。
【００９８】
使用したレーザー検出システムは、ＫｕｈｒおよびＹｅｕｎｇ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０：２６４２（１９８８））に記載されたものと同様であった。４×６脚の光学テーブル上に搭載したアルゴンイオンレーザーは、８−１０ｍＷで光−調節モードで操作した。レーザー光を、ビームステーラーを使用して反射により向けられた狭いバンドパスフィルターを通し、そして２４−ターン焦点距離レンズでキャピラリー中に集束させた。試料からの蛍光を４０×顕微鏡対物レンズで集め、そして干渉フィルターおよびカラーガラスフィルターを通した。７００Ｖで操作した光電子倍増管および光電子倍増管の表示を、蛍光検出に使用した。生じる電圧出力はストリップチャートレコーダーに表示され、そして同時にアナログ−から−デジタル（Ａ／Ｄ）インターフェイスに伝達されてＰＣに送られる。
【００９９】
加温デバイスは、キャピラリーが中に挟まれている２つのセラミックブロックから作られていた。７５ワットのヒーターおよび温度制御機は、ブロック中に導入され、ブロックの温度を加熱および制御する。８０％以上のキャピラリーが２つのセラミックブロックに挟まれ、所望の温度に加熱される。上記に掲げた部品のモデル番号および製造元は、Ｃｏｈｅｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．５１６：４９−６０（１９９０）に与えられている。
【０１００】
キャピラリーカラム
キャピラリー電気泳動は、内径が７５μｍ、３７５μｍ  ＯＤ．、有効長（１）＝３２０−３５０ｍｍ、全長（Ｌ）＝５００ｍｍの融合−シリカ管（ポリミクロ  テクノロジーズ：Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フェニックス、アリゾナ州）中で行った。キャピラリーはＨｅｉｇｅｒら、（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．５１６：３３−４８（１９９０））に記載されているように調製した。簡単に述べると、メタクリルオキシプロピル−トリメトキシシランを始めに融合−シリカキャピラリー壁に共有結合させた。０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ホウ酸（ｐＨ８．２）、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび７Ｍ尿素中のアクリルアミド溶液（７％Ｔ、０％Ｃ）を調製し、脱気し、そして処理したキャピラリーに過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）に続いて導入した。試料はカラムに、キャピラリーの陰極末端を試料液につけることにより注入し、そして３００Ｖ／ｃｍの電圧を１０−２０秒かけた。分離は３００Ｖ／ｃｍの典型的な電場で行った。
【実施例２】
【０１０１】
交換可能なマトリックスを用いた一定変性剤キャピラリー電気泳動
準備は実施例１に記載したものと同様であった。簡単に述べると、パワーサプライは３０ｋＶ  ｄｃであり（モデルＣＺＥ  １０００Ｒ−２０３２、スペルマン：Ｓｐｅｌｌｍａｎプレインビュー、ニューヨーク州）。低出力アルゴンイオンレーザー（オムニクロム：Ｏｍｎｉｃｈｒｏｍｅ、チーノ、カリフォルニア州）を５ｍＷで使用した。垂直型レーザービームを４８８ｎｍ（１０ｎｍバンド幅）フィルター（コリオン：Ｃｏｒｉｏｎ、ホリストン、マサチューセッツ州）を通してフィルターし、そして水平型の分離キャピラリー中に集束した。集束レーン、キャピラリーおよび対物レンズを、３−Ｄのマイクロポジショナーに搭載し、そしてシステムを光学ベンチに置いた。発光を顕微鏡の対物レンズにより（オリエル：Ｏｒｉｅ１、スタムフォード、コネチカット州）、キャピラリーおよびビームの両方に対して右の角度で集め、そして２つの５２０ｎｍ（１０ｎｍのバンド幅）フィルターを通して光電子倍増管中（オリエル）に向けた。光電子倍増管からの信号を電流プレアンプリファイヤー（オリエル）により１０Ｖのフルスケールに増幅（１０８Ｖ／Ａ）し、そして１６ビットのデータ取得システムにより（ＭＰ１００、バイオパック  システムズ：Ｂｉｏｐａｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ゴレタ、カリフォルニア州）記録した。
キャピラリー電気泳動条件
電気泳動は、実施例１のように被覆し、そしてＴＢＥ（８９ｍＭ  Ｔｒｉｓ、８９ｍＭホウ酸および１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中の５−６％の直鎖ポリアクリルアミド、３．３Ｍ  尿素、２０％（容量／容量）ホルムアミドを充填した７５μｍＩＤ、３５０μｍ  ＯＤキャピラリー（ポリミクロテクノロジーズ社：Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，フェニックス、アリゾナ州）に、様々な電場をかけて行った。図９Ｃの１つの例では、化学変性剤の尿素およびホルムアミドを省略した。
【０１０２】
アクリルアミドは１０ｍｌのガラスシリンジ管中で、長いポリマー鎖が形成されるような条件で重合した。重合が完了した後、シリンジを−１５℃で数週間保存できた。１０ｍｌシリンジからの直鎖ポリアクリルアミドを、必要に応じて１００μｌの高圧ガス−充填シリンジ（ハミルトン：Ｈａｍｉｌｔｏｎ、レノ、ネバタ州）中に分配した。このシリンジは各泳動前にポリアクリルアミドマトリックスを交換するために使用した。典型的には、キャピラリーは数週間使用し、そして数百回の注入に耐えた。
【０１０３】
例えば検出器の検量のようなキャピラリー中への正確なＤＮＡ注入量が重要な場合には、水または希釈緩衝液中（０．１×ＴＢＥ以下）の０．２μｌの試料を３５０μｍＩ．Ｄ．からキャピラリー中に電気−注入した（１μＡで２分）。キャピラリーの注入末端にテフロンローブを付けた。いったん検出器を検量したら、試料は１μＡオーダーの電流を数秒間かけることにより大容量（典型的には５μｌ）から直接注入した。必要な場合には、２μｌ試料から多くても８５％のＤＮＡ物質を１回の注入で注入した（１μＡで２分間）。
変性勾配マトリックス電気泳動（ＤＧＧＥ）
ＤＮＡの調製
全ＤＮＡを凍結ヒト女性のＴＫ−６リンパ芽球から単離した。ＤＧＧＥ用に、問題の断片をｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン：Ｓｔｒａｔ  ａｇｅｎｅ、ラジョラ、カリフォルニア州）を用い、製造元の手順に従い増幅し、標準的な８％ＰＡＧＥにより精製し、そしてエチジウムブロミド染色により定量した。プライマーは次の通りである：
ＣＷ７  ５’−ＡＣＣＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴＡＡＣ（配列番号：４）；ＣＷｍｕｔ  ５’−ＡＣＣＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴＡＡＣＴＡＧＴＴＴＴＧＡＴＡＡＣＡＴＴＣＡＡＡ（配列番号：５）および５’−フルオレセイン標識、ならびに非標識Ｊ３
５’−ＡＴＧＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＧＣＧＧＧＣ（配列番号：６）をシンセティック  ジェニティックス（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）（サンディエゴ、カリフォルニア州）から得た。ＤＧＧＥの放射活性検出の場合には、Ｊ３をＰＣＲ増幅前に３２ＰでＹ標識した。ＧＣをＡＴ置換に導入するために、プライマーＣＷ７ｍｕｔ（これはＴ：Ｃ誤対合を鋳型を用いて３０位に形成する）を用いＰＣＲ反応でＣＷ７を置換した。点突然変異の導入は、ＰＣＲ生成物をシークエンシングすることにより確認した。煮沸および再アニーリングのために、水中のＤＮＡを１００℃で１０秒間加熱し、そして２００ｍＭ  ＮａＣＬ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８、２ｍＭ  ＥＤＴＡに調整し、そして６０℃で２時間インキューべーションした。２つのホモ二重鎖（ＧＣおよびＡＴ）ならびに２つのヘテロ二重鎖（ＧＴおよびＡＣ）の等モル量の混合物を、これらの特別な配列のために至適化した以下のスラブマトリックスに標準的なＤＧＧＥ条件下で泳動した：６０℃で１６時間；マトリックス：１２％アクリルアミド、０．４％ビス−アクリルアミド、１×ＴＡＥ；２０ｃｍ長の直線変性剤勾配：頂点：６％（容量／容量）ホルムアミド、１．０５Ｍ  尿素、底部１４％（容量／容量）ホルムアミド、２．８Ｍ  尿素。ＤＮＡを３２Ｐで末端標識した：マトリックスを乾燥し、そしてホスホイメージャー（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｈｅｒ）（モレキュラー  ダイナミックス：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）でスキャンした。
【０１０４】
ＤＧＧＥ分離の結果はＣＤＣＥ分離の結果と、上記記載のように比較した。
【実施例３】
【０１０５】
交換可能なマトリックスを用いた繰り返しサイクルでの一定変性剤キャピラリー電気泳動
ＤＮＡ試料を実施例２に記載したように調製した。２つの可能な対（ＧＴおよびＡＣ）の突然変異体／野生型ヘテロ二重鎖を、野生型／野生型ホモ二重鎖を混合し、１０９の野生型／野生型（ＷＴ／ＷＴ）ホモ二重鎖に加えて５×１０４の各ヘテロ二重鎖を含む試料混合物を得た。
【０１０６】
この混合物を、実施例２に記載した条件下で一定変性剤キャピラリー電気泳動により分離した。突然変異体／ＷＴヘテロ二重鎖を含む部分（約１４から２０分から現れる部分）を集め、高複製ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、そして混合物を新しいポリマーマトリックスを使用して一定変性剤キャピラリー電気泳動に供した。図１２Ａに見られるように、４つの明らかなピークが電気泳動図に現れる。約６．０分に現れるピークは、内部対照（ＰＣＲプライマー）を表す。約１１．０分に現れるピークはＷＴ／ＷＴホモ二重鎖を表す。約１６．５および１８分に現れるピークは、ＧＴおよびＡＣ突然変異体／ＷＴヘテロ二重鎖をそれぞれ表す。
【０１０７】
ヘテロ二重鎖を含む部分を、再度集め、プール増幅し、そしてＣＤＣＥ分離に供した。結果を図１２Ｂに示す。約１０．５分に現れるピークは、ＷＴ／ＷＴホモ二重鎖を表し、約１２．０分に現れるピークは突然変異体／突然変異体ホモ二重鎖を表し、そして約１５および１７分に現れるピークはＧＴおよびＡＣヘテロ二重鎖を表す。
均等物
当業者は、日常的な実験を使用するだけで本明細書に記載した本発明の特別な態様の多くの均等物を知り、または確認することができる。これらの、および他のすべての均等物は以下の請求の範囲に包含されるものと考える。
【０１０８】
なお、本発明の主な態様は次のとおりである。
【０１０９】
１．突然変異体ＤＮＡおよび非−突然変異体ＤＮＡが２つのイソ−融解ドメインを含み、低温イソ−融解ドメインと呼ばれる第一のイソ−融解ドメインは、第一温度で融解し、そして高温イソ−融解ドメインと呼ばれる第二のイソ−融解ドメインは、より高温の第二温度で融解し、そして突然変異体ＤＮＡは低温イソ−融解ドメイン中に問題の突然変異を含む、非−突然変異体ＤＮＡから突然変異体ＤＮＡの分割法であって、ａ）問題の二本鎖ＤＮＡを生物源から単離し；
ｂ）ａ）で得た問題のＤＮＡを断片化して断片化した問題の二本鎖ＤＮＡを得；
ｃ）工程ｂ）で得た問題の断片化二本鎖ＤＮＡを融解し、そして二重鎖ＤＮＡを形成するために適切な条件下で再アニーリングし、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を生成し；
ｄ）工程ｃ）で生成した混合物を交換可能なポリマーマトリックスに導入し、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を含む交換可能なポリマーマトリックスを生成し；
ｅ）ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を含む交換可能なポリマーマトリックスを、高電場および部分変性条件に供し、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖が部分的に融解し、そしてＤＮＡホモ二重鎖が融解せず、そしてＤＮＡヘテロ二重鎖がＤＮＡホモ二重鎖よりも交換可能なポリマーマトリックス中を遅い速度で移動し、ＤＮＡヘテロ二重鎖をＤＮＡホモ二重鎖から分離する、
工程を含んで成る上記分割法。
【０１１０】
２．工程ｂ）がさらに、大きさの分離により断片化した問題の二本鎖ＤＮＡを部分単離することを含んで成る、前記第１項に記載の方法。
【０１１１】
３．検出工程が、ａ）特定した時間に交換可能なポリマーマトリックス中のＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の相対位置を検出する、ｂ）ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の相対的移動を、それらが固定した位置の検出器を通過する時に検出する、およびｃ）ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の相対的移動を、それらが交換可能なポリマーマトリックスから出る時に検出する、ことから成る群から選択される、検出工程をさらに含んで成る前記第１項に記載の方法。
【０１１２】
４．ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の部分を、それらが交換可能なポリマーマトリックスから出る時に回収し、そして回収した部分中に含まれる二重鎖のヌクレオチド配列を決定することをさらに含んで成る、前記第３項に記載の方法。
【０１１３】
５．シークエンシング前に回収した部分中の二重鎖を増幅することをさらに含んで成る、前記第４項に記載の方法。
【０１１４】
６．工程ｂ）の断片化二本鎖ＤＮＡが、問題の単離ＤＮＡを適当に選択された制限エンドヌクレアーゼを用いて消化することにより得られる、前記第１項に記載の方法。
【０１１５】
７．変性条件が一定変性条件である、前記第１項に記載の方法。
【０１１６】
８．工程ｅ）において部分変性条件が、交換可能なポリマーマトリックス中の化学変性剤の存在および約２４℃から約１００℃のポリマーマトリックス温度を含んで成り、そして高電場が約５０から約１２００ボルト／ｃｍである、前記第１項に記載の方法。
【０１１７】
９．工程ｅ）において、交換可能なポリマーマトリックスが化学変性剤を含まず、部分変性条件が約２４℃から約１００℃のポリマーマトリックス温度を含んで成り、そして高電場が約５０から約１２００ボルト／ｃｍである、前記第１項に記載の方法。
【０１１８】
１０．交換可能なポリマーマトリックスが流路に含まれる、前記第１項に記載の方法。
【０１１９】
１１．流路がキャピラリーカラムである、前記第１０項に記載の方法。
【０１２０】
１２．得られた時に、突然変異体ＤＮＡおよび非−突然変異体ＤＮＡが１つのイソ−融解ドメインを含むが、このイソ−融解ドメインはより高熱耐性のイソ−融解ドメインとは連続していない、非−突然変異体ＤＮＡから突然変異体ＤＮＡの分割法であって、
ａ）問題の二本鎖ＤＮＡを生物源から単離し；
ｂ）工程ａ）で得た問題のＤＮＡを断片化して、断片化した問題の二本鎖ＤＮＡを得；
ｃ）問題の断片化ＤＮＡを大きさの分離により部分的に単離して、部分単離ＤＮＡ断片を得；
ｄ）ｃ）で部分単離した問題の断片化ＤＮＡに、得られた時にＤＮＡに含まれるイソ−融解ドメインよりもより高熱耐性のイソ−融解ドメインであるＤＮＡ配列を結合し、これによりより高熱耐性のイソ−融解ドメインに連続したイソ−融解ドメインを含むＤＮＡ配列を含んで成る目的のＤＮＡ断片を生成し；
ｅ）工程ｄ）で得たＤＮＡ断片を融解し、そして二重鎖ＤＮＡを形成するために適切な条件下で再アニーリングし、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を生成し；
ｆ）工程ｅ）で得た混合物を交換可能なポリマーマトリックスに導入し、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を含む交換可能なポリマーマトリックスを生成し；
ｇ）ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を含む交換可能なポリマーマトリックスを、高電場および部分変性条件に供し、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖が部分的に融解し、そしてＤＮＡホモ二重鎖が融解せず、そしてＤＮＡヘテロ二重鎖がＤＮＡホモ二重鎖よりも交換可能なポリマーマトリックス中を遅い速度で移動し、ＤＮＡヘテロ二重鎖をＤＮＡホモ二重鎖から分離する、
工程を含んで成る上記分割法。
【０１２１】
１３．検出工程が、ａ）特定した時間に交換可能なポリマーマトリックス中のＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の相対位置を検出する、ｂ）ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の相対的移動を、それらが固定した位置の検出器を通過する時に検出する、およびｃ）ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の相対的移動を、それらが交換可能なポリマーマトリックスから出る時に検出する、ことから成る群から選択される、検出工程をさらに含んで成る前記第１２項に記載の方法。
【０１２２】
１４．ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の部分を、それらが交換可能なポリマーマトリックスから出る時に回収し、そして回収した部分中に含まれる二重鎖のヌクレオチド配列を決定することをさらに含んで成る、前記第１３項に記載の方法。
【０１２３】
１５．シークエンシング前に回収した部分中の二重鎖を増幅することをさらに含んで成る、前記第１４項に記載の方法。
【０１２４】
１６．工程ｂ）の断片化二本鎖ＤＮＡが、問題の単離ＤＮＡを適当に選択された制限エンドヌクレアーゼを用いて消化することにより得られる、前記第１２項に記載の方法。
【０１２５】
１７．工程ｂ）の断片化二本鎖ＤＮＡが、検出可能なレポーター基により標識されている、前記第１２項に記載の方法。
【０１２６】
１８．部分変性条件が一定変性条件である、前記第１２項に記載の方法。
【０１２７】
１９．工程ｇ）において部分変性条件が、交換可能なポリマーマトリックス中の化学変性剤の存在および約２４℃から約１００℃のポリマーマトリックス温度を含んで成り、そして高電場が約５０から約１２００ボルト／ｃｍである、前記第１２項に記載の方法。
【０１２８】
２０．工程ｇ）において、交換可能なポリマーマトリックスが化学変性剤を含まず、部分変性条件が約２４℃から約１００℃の交換可能なポリマーマトリックス温度を含んで成り、そして電場が約５０から約１２００ボルト／ｃｍである、前記第１２項に記載の方法。
【０１２９】
２１．交換可能なポリマーマトリックスが流路に含まれる、前記第１２項に記載の方法。
【０１３０】
２２．流路がキャピラリーカラムである、前記第２１項に記載の方法。
【０１３１】
２３．得られた時に、突然変異体ＤＮＡおよび非−突然変異体ＤＮＡが１つのイソ−融解ドメインを含むが、このイソ−融解ドメインはより高熱耐性のイソ−融解ドメインとは連続していない、非−突然変異体ＤＮＡから突然変異体ＤＮＡの分割法であって、
ａ）問題の二本鎖ＤＮＡを生物源から単離し；
ｂ）問題の単離ＤＮＡを断片化して、断片化した問題の二本鎖ＤＮＡを得；
ｃ）断片化ＤＮＡを大きさの分離により部分的に単離して、部分単離ＤＮＡ断片を得；
ｄ）工程ｃ）で得たＤＮＡ断片を融解し、そしてより高熱耐性のＤＮＡ配列を結合して得られているイソ−融解ドメインを含むＤＮＡ配列を含んで成る合成ＤＮＡと、１方の鎖が他方の鎖よりも短い２つのＤＮＡ鎖を含んで成る二重鎖ＤＮＡを形成するために適切な条件下で再アニーリングさせ；
ｅ）工程ｄ）で得た二重鎖ＤＮＡの短鎖をＤＮＡポリメラーゼを用いて延長させて同じ長さの二重鎖を形成させ、これによりより高熱耐性のイソ−融解ドメインに連続したイソ−融解ドメインを含むＤＮＡを含んで成るＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を生成し；
ｆ）工程ｅ）で得た混合物を、ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を含む交換可能なポリマーマトリックスに導入し；
ｇ）ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を含む交換可能なポリマーマトリックスを、高電場および部分変性条件に供し、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖が部分的に融解し、そしてＤＮＡホモ二重鎖が融解せず、そしてＤＮＡヘテロ二重鎖がＤＮＡホモ二重鎖よりもポリマーマトリックス中を遅い速度で移動し、ＤＮＡヘテロ二重鎖をＤＮＡホモ二重鎖から分離する、
工程を含んで成る上記分割法。
【０１３２】
２４．検出工程が、ａ）特定した時間に交換可能なポリマーマトリックス中のＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の相対位置を検出する、ｂ）ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の相対的移動を、それらが固定した位置の検出器を通過する時に検出する、およびｃ）ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の相対的移動を、それらが交換可能なポリマーマトリックスから出る時に検出する、ことから成る群から選択される、検出工程をさらに含んで成る前記第２３項に記載の方法。
【０１３３】
２５．ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の部分を、それらが交換可能なポリマーマトリックスから出る時に回収し、そして回収した部分中に含まれる二重鎖のヌクレオチド配列を決定することをさらに含んで成る、前記第２４項に記載の方法。
【０１３４】
２６．工程ｂ）の断片化二本鎖ＤＮＡが、問題の単離ＤＮＡを適当に選択された制限エンドヌクレアーゼを用いて消化することにより得られる、前記第２３項に記載の方法。
【０１３５】
２７．工程ｂ）の断片化二本鎖ＤＮＡが、検出可能なレポーター基により標識されている、前記第２３項に記載の方法。
【０１３６】
２８．部分変性条件が一定変性条件である、前記第２３項に記載の方法。
【０１３７】
２９．工程ｇ）において部分変性条件が、交換可能なポリマーマトリックス中の化学変性剤の存在および約２４℃から約１００℃のポリマーマトリックス温度を含んで成り、そして高電場が約５０から約１２００ボルト／ｃｍである、前記第２３項に記載の方法。
【０１３８】
３０．工程ｇ）において、交換可能なポリマーマトリックスが化学変性剤を含まず、部分変性条件が約２４℃から約１００℃のポリマーマトリックス温度を含んで成り、そして電場が約５０から約１２００ボルト／ｃｍである、前記第２３項に記載の方法。
【０１３９】
３１．交換可能なポリマーマトリックスが流路に含まれる、前記第２３項に記載の方法。
【０１４０】
３２．流路がキャピラリーカラムである、前記第３１項に記載の方法。
【０１４１】
３３．得られた時、突然変異体ＤＮＡおよび非−突然変異体ＤＮＡが適当なイソ−融解ドメインを欠く、非−突然変異体ＤＮＡから突然変異体ＤＮＡの分割法であって、
ａ）問題の二本鎖ＤＮＡを生物源から単離し；
ｂ）問題の単離ＤＮＡを断片化して断片化した問題の二本鎖ＤＮＡを得；
ｃ）断片化ＤＮＡを、大きさの分離により部分単離して、部分的に単離したＤＮＡ断片を得；
ｄ）工程ｃ）で部分単離した問題の断片化ＤＮＡの１方の末端に、断片化ＤＮＡよりもより高熱耐性のイソ−融解ドメインであるＤＮＡ配列を結合し、そして他方の末端に、断片化ＤＮＡ配列の平均融解温度、またはそれに近い温度で融解するイソ−融解ドメインであるＤＮＡ配列を結合し、これによりより高熱耐性のイソ−融解ドメインに連続した問題のＤＮＡ配列を含む適当なイソ−融解ドメインを含んで成るＤＮＡ断片を形成し；
ｅ）工程ｄ）で得た問題のＤＮＡ断片を融解し、そして二重鎖ＤＮＡを形成するために適切な条件下で再アニーリングさせ、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を生成し；
ｆ）工程ｅ）で得た混合物を、ポリマーマトリックスに導入し、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を含むポリマーマトリックスを生成し；
ｇ）ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を含むポリマーマトリックスを、高電場および部分変性条件に供し、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖が部分的に融解し、そしてＤＮＡホモ二重鎖が融解せず、そしてＤＮＡヘテロ二重鎖がＤＮＡホモ二重鎖よりもポリマーマトリックス中を遅い速度で移動し、ＤＮＡヘテロ二重鎖をＤＮＡホモ二重鎖から分離する、
工程を含んで成る上記分割法。
【０１４２】
３４．ポリマーマトリックスが交換可能なポリマーマトリックスである、前記第３３項に記載の方法。
【０１４３】
３５．検出工程が、ａ）特定した時間にポリマーマトリックス中のＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の相対位置を検出する、ｂ）ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の相対的移動を、それらが固定した位置の検出器を通過する時に検出する、およびｃ）ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の相対的移動を、それらがポリマーマトリックスから出る時に検出する、ことから成る群から選択される、検出工程をさらに含んで成る前記第３４項に記載の方法。
【０１４４】
３６．ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の部分を、それらがポリマーマトリックスから出る時に回収し、そして回収した部分中に含まれる二重鎖のヌクレオチド配列を決定することをさらに含んで成る、前記第３５項に記載の方法。
【０１４５】
３７．工程ｂ）の断片化二本鎖ＤＮＡが、問題の単離ＤＮＡを適当に選択された制限エンドヌクレアーゼを用いて消化することにより得られる、前記第３４項に記載の方法。
【０１４６】
３８．工程ｂ）の断片化二本鎖ＤＮＡが、検出可能なレポーター基で標識される、前記第３４項に記載の方法。
【０１４７】
３９．部分変性条件が一定変性条件である、前記第３４項に記載の方法。
【０１４８】
４０．変性条件が勾配変性条件である、前記第３３項に記載の方法。
【０１４９】
４１．工程ｇ）において部分変性条件が、ポリマーマトリックス中の化学変性剤の存在および約２４℃から約１００℃のポリマーマトリックス温度を含んで成り、そして高電場が約５０から約１２００ボルト／ｃｍである、前記第３４項に記載の方法。
【０１５０】
４２．工程ｇ）において、ポリマーマトリックスが化学変性剤を含まず、そして部分変性条件が約２４℃から約１００℃のポリマーマトリックス温度を含んで成り、そして電場が約５０から約１２００ボルト／ｃｍである、前記第３４項に記載の方法。
【０１５１】
４３．ポリマーマトリックスが流路に含まれる、前記第３４項に記載の方法。
【０１５２】
４４．流路がキャピラリーカラムである、前記第４３項に記載の方法。
【０１５３】
４５．突然変異体ＤＮＡおよび非−突然変異体ＤＮＡが２つのイソ−融解ドメインを含み、低温イソ−融解ドメインと呼ばれる第一のイソ−融解ドメインは第一温度で融解し、そして高温イソ−融解ドメインと呼ばれる第二のイソ−融解ドメインは、より高温の第二温度で融解し、そして突然変異体ＤＮＡは低温イソ−融解ドメイン中に問題の突然変異を含む、非−突然変異体ＤＮＡから突然変異体ＤＮＡの分割法であって、
ａ）問題のＤＮＡを生物源から単離し；
ｂ）問題の単離ＤＮＡを断片化して、問題の断片化二本鎖ＤＮＡを得；
ｃ）工程ｂ）で得た二本鎖ＤＮＡ断片を融解し、そして二重鎖ＤＮＡを形成するために適切な条件下で再アニーリングし、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を生成し；
ｄ）工程ｃ）で得た混合物を流路に含まれるポリマーマトリックスに導入し、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を含むポリマーマトリックスを生成し；
ｅ）ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を含むポリマーマトリックスを、高電場および部分変性条件に供し、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖が部分的に融解し、そしてＤＮＡホモ二重鎖が融解せず、そしてＤＮＡヘテロ二重鎖がＤＮＡホモ二重鎖よりもポリマーマトリックス中を遅い速度で移動し、ＤＮＡヘテロ二重鎖をＤＮＡホモ二重鎖から分離し；
ｆ）ＤＮＡヘテロ二重鎖がＤＮＡホモ二重鎖の相対移動を、それらがポリマーマトリックスから出る時に検出し、そしてＤＮＡヘテロ二重鎖がＤＮＡホモ二重鎖を含む部分を、それらがポリマーマトリックスから出る時に回収し；
ｇ）流路からポリマーマトリックスを取り出し；そして新しいマトリックスを流路に導入し、そして
ｈ）工程ｆ）で回収したＤＮＡヘテロ二重鎖を新しいポリマーマトリックスに再導入し、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖を含む新しいポリマーマトリックスを形成し、そしてこのポリマーマトリックスを高電場に供し、そして工程ｅ）を行い、そしてＤＮＡヘテロ二重鎖を含む部分を、それらがポリマーマトリックスから出る時に回収する、
工程を含んで成る上記分割法。
【０１５４】
４６．ポリマーマトリックスが交換可能なポリマーマトリックスである、前記第４５項に記載の方法。
【０１５５】
４７．工程ｆ）がさらに、部分中に回収したＤＮＡヘテロ二重鎖を、工程ｈ）の前に適当な増幅法により増幅することを含んで成る、前記第４６項に記載の方法。
【０１５６】
４８．工程ｆ）から工程ｈ）が１回以上繰り返され、回収した部分中のＤＮＡヘテロ二重鎖を濃縮する、前記第４６項に記載の方法。
【０１５７】
４９．工程ｈ）がさらに、部分中に回収されたＤＮＡヘテロ二重鎖のＤＮＡ配列を決定することを含んで成る、前記第４６項に記載の方法。
【０１５８】
５０．工程ｈ）がさらに、部分中に回収したＤＮＡヘテロ二重鎖を適当な増幅法により増幅し、そしてＤＮＡヘテロ二重鎖のＤＮＡ配列を決定することを含んで成る、前記第４６項に記載の方法。
【０１５９】
５１．突然変異体ＤＮＡおよび非−突然変異体ＤＮＡが２つのイソ−融解ドメインを含み、低温イソ−融解ドメインと呼ばれる第一のイソ−融解ドメインは第一温度で融解し、そして高温イソ−融解ドメインと呼ばれる第二のイソ−融解ドメインは、より高温の第二温度で融解し、そして突然変異体ＤＮＡは低温イソ−融解ドメイン中に問題の突然変異を含む、ＤＮＡ試料の突然変異体のスクリーニング法であって、
ａ）問題のＤＮＡを生物源から単離し；
ｂ）単離ＤＮＡを断片化して、問題の断片化二本鎖ＤＮＡを得；
ｃ）工程ｂ）で得た問題の断片化ＤＮＡを、検出可能なレポーター基を用いて標識し、これにより問題の標識化ＤＮＡを生成し；
ｄ）問題の標識化二本鎖ＤＮＡ断片を融解し、そして二重鎖ＤＮＡを形成するために適切な条件下で再アニーリングし、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を生成し；
ｅ）工程ｄ）で生成した二重鎖の混合物を、流路に含まれる交換可能なポリマーマトリックスに導入し；
ｆ）ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を含むポリマーマトリックスを、高電場および部分変性条件に供し、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖が部分的に融解し、そしてＤＮＡホモ二重鎖が融解せず、そしてＤＮＡヘテロ二重鎖がＤＮＡホモ二重鎖よりもポリマーマトリックス中を遅い速度で移動し、ＤＮＡヘテロ二重鎖をＤＮＡホモ二重鎖から分離し；
ｇ）ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の相対移動を、それらがポリマーマトリックスから出る時に検出し、そしてＤＮＡヘテロ二重鎖がＤＮＡホモ二重鎖を含む部分を、それらがポリマーマトリックスから出る時に回収する、
上記スクリーニング法。
【０１６０】
５２．さらに、
ｈ）流路から交換可能なポリマーマトリックスを取り出し、そして流路に新しい交換可能なポリマーマトリックスを導入し；
ｉ）工程ｇ）で回収したＤＮＡヘテロ二重鎖を新しい交換可能なポリマーマトリックスに再導入し、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖を含む新しい交換可能なポリマーマトリックスを形成し、そしてこの交換可能なポリマーマトリックスを工程ｆ）のように高電場に供し、そしてＤＮＡヘテロ二重鎖を含む部分を、それらが交換可能なポリマーマトリックスから出る時に回収することを含んで成る、前記第５１項に記載の方法。
【０１６１】
５３．工程ｇ）がさらに、部分中に回収したＤＮＡヘテロ二重鎖を適当な増幅法により増幅することを含んで成る、前記第５１項に記載の方法。
【０１６２】
５４．工程ｇ）から工程ｉ）が１回以上繰り返され、回収した部分中のＤＮＡヘテロ二重鎖を濃縮する、前記第５１項に記載の方法。
【０１６３】
５５．工程ｉ）がさらに、ＤＮＡヘテロ二重鎖のＤＮＡ配列を決定することを含んで成る、前記第５１項に記載の方法。
【０１６４】
５６．工程ｉ）がさらに、部分中に回収したＤＮＡヘテロ二重鎖を適当な増幅法により増幅し、そしてＤＮＡヘテロ二重鎖のＤＮＡ配列を決定することを含んで成る、前記第５１項に記載の方法。
【０１６５】
５７．変性条件が一定変性条件である、前記第５１項に記載の方法。
【０１６６】
５８．工程ｄ）の変性条件が、交換可能なポリマーマトリックス中の化学変性剤の存在および約２４℃から約１００℃のポリマーマトリックス温度を含んで成り、そして高電場が約５０から約１２００ボルト／ｃｍである、前記第５１項に記載の方法。
【０１６７】
５９．交換可能なポリマーマトリックスが化学変性剤を含まず、そして部分変性条件が約２４℃から約１００℃のポリマーマトリックス温度を含んで成り、そして電場が約５０から約１２００ボルト／ｃｍである、前記第５１項に記載の方法。
【０１６８】
６０．流路がキャピラリーカラムである、前記第５１項に記載の方法。
【０１６９】
６１．二本鎖ＤＮＡ断片が２つのイソ−融解ドメインを含み、低温イソ−融解ドメインと呼ばれる第一のイソ−融解ドメインは第一温度で融解し、そして高温イソ−融解ドメインと呼ばれる第二のイソ−融解ドメインは、より高温の第二温度で融解し、そして突然変異体ＤＮＡは問題の突然変異を低温イソ−融解ドメイン中に含む、少なくとも１塩基対が異なる二本鎖ＤＮＡ断片の２種以上を分割する方法であって、
ａ）蛍光レポーター基で標識された二本鎖ＤＮＡ断片を含む液体試料を提供し；
ｂ）標識二本鎖ＤＮＡ断片を融解し、そして二重鎖ＤＮＡを形成するために適切な条件下で再アニーリングして二本鎖ＤＮＡを形成し、これにより標識ＤＮＡヘテロ二重鎖および標識ＤＮＡホモ二重鎖の混合物を生成し；
ｃ）工程ｂ）で生成した二重鎖の標識混合物を、キャピラリーに含まれる交換可能なポリマーマトリックスに導入し、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖を含む交換可能なポリマーマトリックスを形成し；
ｄ）ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＤＮＡホモ二重鎖の混合物を含む交換可能なポリマーマトリックスを、一定変性キャピラリー電気泳動に供し、これによりＤＮＡヘテロ二重鎖が部分的に融解し、そしてＤＮＡホモ二重鎖が融解せず、そしてＤＮＡヘテロ二重鎖がＤＮＡホモ二重鎖よりも交換可能なポリマーマトリックス中を遅い速度で移動し、ＤＮＡヘテロ二重鎖をＤＮＡホモ二重鎖から分離し；
ｅ）標識ＤＮＡヘテロ二重鎖および標識ＤＮＡホモ二重鎖の相対移動を、それらがキャピラリーカラムから出る時に、キャピラリーカラムの末端部を蛍光レポーター基の蛍光を刺激するために適切な波長エネルギーに暴露し、そして検出器で蛍光を検出することにより検出し、これにより別れた標識ＤＮＡ二重鎖の相対移動を交換可能なポリマーマトリックスを出る時に検出し；そして
ｆ）標識ＤＮＡヘテロ二重鎖を含む部分を、それらが交換可能なポリマーマトリックスから出る時に回収する
工程を含んで成る、上記分割法。
【０１７０】
６２．さらに、
ｇ）キャピラリーカラムから交換可能なポリマーマトリックスを取り出し、そしてキャピラリーカラムに新しい交換可能なポリマーマトリックスを導入し；
ｉ）工程ｆ）で回収したＤＮＡヘテロ二重鎖を新しい交換可能なポリマーマトリックスに再導入し、そしてこの交換可能なポリマーマトリックスを工程ｄ）のような一定変性キャピラリー電気泳動に供し、そしてＤＮＡヘテロ二重鎖を含む部分をそれらが交換可能なポリマーマトリックスから出る時に回収することを含んで成る、前記第６１項に記載の方法。
【０１７１】
６３．工程ｆ）がさらに、部分中に回収したＤＮＡヘテロ二重鎖を適当な増幅法により増幅することを含んで成る、前記第６１項に記載の方法。
【０１７２】
６４．工程ｆ）から工程ｈ）が１回以上繰り返され、回収した部分中のＤＮＡヘテロ二重鎖を濃縮する、前記第６２項に記載の方法。
【０１７３】
６５．工程ｈ）がさらに、ＤＮＡヘテロ二重鎖のＤＮＡ配列を決定することを含んで成る、前記第６１項に記載の方法。
【０１７４】
６６．工程ｈ）がさらに、部分中に回収したＤＮＡヘテロ二重鎖を適当な増幅法により増幅し、そしてＤＮＡヘテロ二重鎖のＤＮＡ配列を決定することを含んで成る、前記第６１項に記載の方法。
【０１７５】
６７．工程ｅ）の変性条件が、交換可能なポリマーマトリックス中の化学変性剤の存在および約２４℃から約１００℃のポリマーマトリックス温度を含んで成り、そして高電場が約５０から約１２００ボルト／ｃｍである、前記第６１項に記載の方法。
【０１７６】
６８．交換可能なポリマーマトリックスが化学変性剤を含まず、そして部分変性条件が約２４℃から約１００℃のポリマーマトリックス温度を含んで成り、そして電場が約５０から約１２００ボルト／ｃｍである、前記第６１項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】図１Ａは、ＨＰＲＴエキソン３融解マップおよび増幅法で使用したオリゴヌクレオチドプライマーの相対位置を表す概略図である。
【０１７８】
図１Ｂは、ＨＰＲＴエキソン３のＰＣＲ法の概略を示している。
【図２】図２は、室温で７Ｍ尿素中での７％モノマー直鎖ポリアクリルアミドを使用する野生型ＨＰＲＴエキソン３断片のＤＮＡ結合プロフィールを示すキャピラリー電気泳動図である。唯一のピーク、非−突然変異体／非−突然変異体ホモ二重鎖が観察される。
【図３】図３は、６０℃で７Ｍ尿素中での７％モノマー直鎖ポリアクリルアミドを使用する野生型ＨＰＲＴエキソン３断片のＤＮＡ結合プロフィールを示すキャピラリー電気泳動図である。高温融解ドメインを含む幾つかのホモ二重鎖が完全に融解した。これは電気泳動で高速な一本鎖ＤＮＡを生成する。
【図４】図４は、６０℃で７Ｍ尿素中での７％モノマー直鎖ポリアクリルアミドを使用するＨＰＲＴ−Ｍｕｎｉｃｈ突然変異体エキソン３断片のＤＮＡ結合プロフィールを示す電気泳動図である。
【図５】図５は、６０℃で７Ｍ尿素中での７％モノマー直鎖ポリアクリルアミドを使用する野生型ＨＰＲＴエキソン３断片混合物のＤＮＡ結合プロフィールを示す電気泳動図である。ここでは低イソ−融解ドメインの種々の融解温度で、突然変異体および非−突然変異体ホモ二重鎖が明瞭に分離されたことが分かる。
【図６】図６は、ＣＷ７、Ｊ３と命名された非−突然変異体ヒトミトコンドリアＤＮＡ断片の融解マップ、およぴＰＣＲプライマーの位置を示す。垂直の矢印は、本発明を試験するために使用した配列中のＣＷ７およびＣＪ３それぞれの唯一の塩基対差の位置を示す。マップ上の１塩基対は、ヒト  ミトコンドリアゲノムのｂｐ１０，０１１に対応する。
【図７】図７は、図６の配列を使用した、通常のスラブ−ゲル変性勾配ゲル電気泳動（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）分離を示す。２つのホモ二重鎖（ＧＣおよびＡＴ）ならびに２つのヘテロ二重鎖（ＧＴおよびＡＣ）の等モル混合物。ｓｓ＝一本鎖断片。
【図８】図８は、カラム温度に関する一定変性剤キャピラリー電気泳動（ＣＤＣＥ）分離を示す一連の電気泳動図である。
【図９】図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃは、様々な変性条件で得た一連の電気泳動図を示し、これでは突然変異体／非−突然変異体ヘテロ二重鎖の鋭さがこれら条件に相関するようである。
【図１０】図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃは、レーザー−誘導蛍光発生およびフルオレセイン標識ＤＮＡ断片と組み合わせた時のＣＤＣＥの起動的範囲を示す一連の電気泳動図である。ピーク付近の数はピーク面積を示す。
【図１１】図１１は、大過剰な野生型ＤＮＡが存在する中で少量の突然変異体部分（３×１０−４）の検出を示す電気泳動図を表す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、一回のＣＤＣＥ／ＰＣＲ増幅後のヘテロ二重鎖の検出を示すキャピラリー電気泳動を表す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、適当な増幅および２回のＣＤＣＥ／ＰＣＲ増幅後のヘテロ二重鎖の検出を示すキャピラリー電気泳動を表す。
【図１】
2005040138.tif 000005
【図２】
2005040138.tif 000006
【図３】
2005040138.tif 000007
【図４】
2005040138.tif 000008
【図５】
2005040138.tif 000009
【図６】
2005040138.tif 000010
【図７】
2005040138.tif 000011
【図８】
2005040138.tif 000012
【図９】
2005040138.tif 000013
【図１０】
2005040138.tif 000014
【図１１】
2005040138.tif 000015
【図１２Ａ】
2005040138.tif 000016
【図１２Ｂ】
2005040138.tif 000017