(57)【要約】【課題】心筋障害におけるＭＫの動態を明らかにし、臨床応用への可能性を検討する。【解決手段】野生型マウスを用いて心筋虚血再灌流モデルを作成し、ＭＫの発現パターンを解析する。また同モデルをＭＫＫＯマウスでも作成し、野生型マウスと比較検討することで、ＭＫの生体における役割を明らかにする。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミッドカインによる心筋障害の予防効果。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は心筋障害の予防、および障害に対する治療に関する。
【背景技術】
【０００２】  ミッドカイン（ｍｉｄｋｉｎｅ：ＭＫ）は胚性腫瘍細胞のレチノイン酸による分化誘導過程で一過性に発現する遺伝子産物として発見されたヘパリン結合性増殖因子である。（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５１：１３１２−１３１８，１９９０）。ＭＫは種間でのタンパク質保存度が高く保たれており、ヒトとマウスのＭＫではアミノ酸配列において、８７％の相同性がある。ＭＫは神経細胞の生存・分化、組織修復、線溶系活性化能など様々な生物活性を有し、病態との関連性も注目されている。特にＭＫは多くのヒト癌で発現が上昇し、ＭＫｃＤＮＡの導入による強制発現により、正常細胞が癌化する（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７５：３５４−３５９，１９９７）ことからヒト癌の発生と進展に深く関与すると考えられる。またＭＫ遺伝子を欠くノックアウトマウスでは頚動脈障害モデルにおいて新生内膜の形成が著しく低下することからＭＫは血管病変の生起にも関与すると考えられる（Ｈｏｒｉｂａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５：４８９−４９５，２０００）。さらにＭＫはＢｃｌ−２の発現を増強することでアポトーシス抑制作用も有する（Ｑｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２７：２６９−２７７，２０００）。これらのＭＫ生物活性を応用することにより、いくつかの細胞障害性疾患に対して治療効果があると考えられる。【０００３】  虚血性心疾患、拡張型心筋症などの心筋障害は致死的な疾患であり、仮に生命を維持できたとしても心不全に陥る可能性は高く、Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅが著しく制限されるものである。特に重度の心不全に対しては現在根治的な治療は無く、心臓移植が唯一有効な手段であるが全世界的にドナー不足の状態が続いている。近年、心筋障害進行の過程においてアポトーシスの関連が注目されつつあり（Ｇｉｎａｒｄ，ＢＮ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１１：１４５７−１４５９，２００３）、ＭＫが心筋障害予防に繋がることが期待される。
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  本発明は、心筋障害を予防し治療に応用する事を大目的として、ＭＫの心筋に対するメカニズムを明らかとし、心筋障害におよぼす影響を解明する事を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】  心筋障害のモデルとして、野生型マウス心筋虚血再灌流モデルを作成し、再灌流後の心筋でのＭＫ発現パターンをＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇにて、またＭＫの局在を免疫組織染色で詳細に検討した。さらに生体でのＭＫの影響をみるため、ＭＫ欠損（ＭＫＫＯ）マウスでも同モデルを作成し、病変の程度について野生型マウスとの比較検討を行った。心筋障害に対するＭＫの直接作用の解析としてはアポトーシスを誘導した培養心筋細胞に対してＭＫを添加し、細胞死の抑制を検討した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】  以下添付の図面に従ってこの発明を詳細に説明する。図１は心筋虚血再灌流後のＭＫ発現パターンを調べたＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇである。図２はその心筋でのＭＫ発現を免疫組織染色で証明したものである。図３は野生型とＭＫＫＯマウスでの心筋障害の程度を比較検討したものである。【０００７】    マウス心筋虚血再灌流モデルの作成方法について説明する。ペントバルビタールによる腹腔麻酔後、気管内挿管し人工呼吸器管理とする。左傍胸壁切開を加えて心臓を露出させた後、実体顕微鏡下に左冠動脈を結紮、１時間後に再解放する。閉胸後自発呼吸の出現を確認して抜管、回復を待って通常の飼育状態にもどす。【０００８】    Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＢｌｏｔｔｉｎｇによるＭＫの発現について説明する。野生型マウスについて、心筋虚血再灌流術後６時間、１２時間、２４時間と経時的に再灌流モデルの心臓を取り出し、蛋白を抽出する。それぞれと等量の蛋白量についてＳＤＳゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の後、抗ＭＫ抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇを行い、デンシトメーターによる定量をすることでＭＫ蛋白発現量の経時的変化を評価する。【０００９】    免疫組織染色法によるＭＫ発現の評価について説明する。心筋虚血再灌流術施行２４時間後の野生型マウスを４％パラフォルムアルデヒドで固定後心臓を摘出し、パラフィン包埋後５μｍ厚の切片を作成する。１次抗体として抗ＭＫ抗体、２次抗体にＨＲＰ標識したＩｇＧ抗体を使用して酵素抗体法を施行後、発色基質（ＡＥＣ）にて発色させることでＭＫ蛋白の局在を評価する。【００１０】    心筋障害の評価方法について説明する。心筋虚血再灌流モデル作成２４時間後再開胸して採血したのち左冠動脈を結紮し、拍動心腔内にＥｖａｎｓ  Ｂｌｕｅを注入する。すると冠動脈血流の保たれた正常部位が青く染色され、それ以外の部位は虚血リスクエリアと同定される。心停止後心臓を摘出して約１ｍｍ厚の切片とし、ＴＴＣにて再度染色を加える。リスクエリアのうちＴＴＣで赤く染色される部位は心筋の生存が保たれている範囲で完全な梗塞エリアは白く残ることとなる。これらの色の面積を測定し、その比率を比較することで心筋障害の程度を定量化することが可能となる。さらに血清ＣＰＫを測定することで心筋障害を多角的に評価する。
【実施例】
【００１１】以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００１２】（実施例１）心筋虚血再灌流後のＭＫ発現のパターンをＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて解析した。（図１）に示すごとく、正常心筋ではわずかなＭＫ発現を認めるのみであったが、術後１２時間から漸増し、２４時間で発現のピークを認めた。４８時間後にも比較的強い発現が持続していた。【００１３】（実施例２）心筋虚血再灌流後２４時間の標本につて免疫組織染色法にてＭＫの発現範囲を評価した。（図２ａ）に示すようにＭＫは梗塞周辺の正常部位を中心に強く発現していた（赤く染色された部位）。その発現領域の境界は明瞭であり、強拡大すると主として心筋細胞膜に限局した発現が認められた（図２ｂ）。（実施例１）の所見と合わせると、ＭＫは心筋虚血再灌流後、梗塞巣周辺の正常心筋部位に強く発現し心筋組織の修復に関わりを有していることが示唆された。【００１４】（実施例３）心筋虚血再灌流後２４時間後の心筋障害の程度を野生型マウスとＭＫＫＯマウス間で比較し、生体においてＭＫが与える影響について検討した。（図３）で示すごとく、Ｅｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ、ＴＴＣのいずれにも染色されず白色に残存した心筋梗塞面積はＭＫＫＯマウスのものが野生型と比較して有意に大きく、また障害の程度を示す血中のＣＰＫもＭＫＫＯマウスで有意に高かった。さらに術後２４時間以内の死亡率もＭＫＫＯマウスで有意に高かった。これらのことより、心筋虚血再灌流においてＭＫが欠乏すると心筋障害がより悪化することが示された。
【発明の効果】
【００１５】  以上図示とともに説明したようにＭＫは障害心筋周囲に発現し、障害の進行を抑制していることが示された。概念図としてまとめると図４のようにＭＫが作用している事が推測される。これらのことからＭＫを障害心筋に投与することにより心不全の予防に繋がると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】  この発明の一実施例に関わる、心筋虚血再灌流後のＭＫ発現のパターンを示すＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇの図である。
【図２】  この発明の一実施例に関わる、ＭＫの発現範囲を示した免疫組織染色の図である。
【図３】  この発明の一実施例に関わる、虚血再灌流２４時間後の心筋障害の程度を野生型−ＭＫＫＯマウスの間で比較した図である。
【図４】  この発明の実施例よりまとめた概念図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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