(57)【要約】【課題】免疫クロマトグラフィーによりインフルエンザウイルスを検査する際に、非特異反応を抑制してより正確に検査を行うために必要な検体の前処理液及び前処理方法を提供することである。【解決手段】免疫クロマトグラフィーによりインフルエンザの検査を行う場合において、検体を少なくともチオシアン系化合物を含む前処理液で処理することによる。チオシアン系化合物として、チオシアン酸カリウム（ＫＳＣＮ）を使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫クロマトグラフィーによるインフルエンザウイルスの検査用検体の前処理液であって、少なくともチオシアン酸系化合物を含むことを特徴とする検体前処理液。
【請求項２】
前記チオシアン酸系化合物を少なくとも０．１Ｍ含むことを特徴とする請求項１に記載の前処理液。
【請求項３】
上記検体が、鼻汁、痰又は咽頭ぬぐい液である請求項１又は２に記載の前処理液。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１に記載の前処理液を使用する検査用検体の処理方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１に記載の前処理液を含む免疫クロマトグラフィー用検査キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、免疫クロマトグラフィー検査用検体の前処理液に関する。より詳しくは、インフルエンザウイルスの検査用検体の前処理液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インフルエンザウイルスは、直径８０〜１２０ｎｍのＲＮＡウイルスであり、外皮を有し、ＨＡ（赤血球凝集素）とＮＡ（ノイラミニダーゼ）の２種の酵素タンパク質の突起で覆われている。ＨＡは血球凝集性の抗原で、ヒトの細胞に吸着・侵入する際に細胞表面にあるシアル酸と結合して、ウイルス粒子が細胞内に取り込まれるときの重要な役割を果たしている。一方、ＮＡは、ウイルス粒子が感染後期で細胞表面から離れる際にシアル酸を切断する働きを示し、感染性を獲得するのに役立っている。抗原性は、ＨＡとＮＡの組合せで決まり、Ａ、Ｂ、Ｃの３型に大別される。Ａ型はさらに香港型などの亜種が知られている。Ａ型では１０余年の周期で異なった亜型が登場し不連続変異大流行を起こしている。また、同じ亜型でも毎年少しずつ抗原性が変異する。このため、インフルエンザウイルスを検査する場合には、インフルエンザ抗原の変異の有無に関わらず、共通して検査可能な部位を検出することが必要である。
【０００３】
また、インフルエンザは罹患してから数日で治癒することが多いため、インフルエンザの的確な診断及び治療方法を提供するためには、迅速に検査結果が得られることが望ましい。現在では抗原検出のために組織培養を行う方法や、抗体検査として赤血球凝集阻止（ＨＩ）、補体結合試験（ＣＦ）及び間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）などの検査方法が実用化されている。
【０００４】
従来から、抗原抗体反応を簡便に利用する方法が数多く報告されている。例えば、特許文献１、２等に開示されている免疫クロマトグラフィーを利用した測定方法は、採取した検体を、目的とする抗体を含む検査器具に染み込ませるだけで、抗原の有無や量を知ることができる。この方法は、ニトロセルロースなどの多孔質膜の一端に、目的とする特定の抗原に対する特異抗体を含み、多孔質膜の中程には同様に特定の抗原のみに結合する別の特異抗体が帯状に多孔質膜に固定されているものを使用する。一端に含む特異抗体は、予め着色されており、その特異抗体が存在している多孔質膜の一端上にサンプル液を染み込ませるとサンプル液中に特異抗体と反応する抗原があれば、その抗原は特異抗体と結び付いて着色粒子を付けた状態で多孔質膜を毛細管現象によってサンプル液を染み込ませた側と反対の片端へ向かって移動する。移動の途中で帯状に固定されている別の特異抗体の個所を通過する際に、抗原は多孔質膜上の特異抗体に捕捉され、多孔質膜上に帯状の染みが現れる。このことにより目的の抗原がサンプル中に存在していること及びその量を知ることができる。
【０００５】
このような技術を応用すれば、インフルエンザの検査を迅速に行うことができ、有用である。インフルエンザの検査は、通常鼻汁、痰又は咽頭ぬぐい液を検体として行われる。上記免疫クロマトグラフィーの手法を利用できる検体は、原理上、多孔質膜中を毛細管現象によって通過できなければならない。しかし、鼻汁や咽頭ぬぐい液は、これらに存在する高粘性物質であるムチンが多孔質膜の孔を塞ぎ、またムチンは生体から剥がれ落ちた上皮付着細胞を凝集させるため、これらの物質により多孔質膜の孔が塞がれて検査を行うことができない。
【０００６】
例えば、ヒト唾液試料中のミュータンス連鎖球菌を免疫クロマトグラフィーによって同定・定量する際に、水酸化ナトリウムを含有する水溶液、酒石酸及び／又はクエン酸を含有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液と、非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤とから構成され、界面活性剤が水溶液及び／又は緩衝液に予め混合されているか、又は水溶液及び緩衝液とは別になっている唾液の前処理用キットを用いることが既に開示されている（特許文献３）。しかしながら、インフルエンザの検査については全く開示されていない。
【０００７】
一方、インフルエンザの検査用試料の前処理方法として、界面活性剤、還元性物質から選ばれた少なくとも１種と有機酸もしくはその塩を含む検体前処理液による処理については特許文献４に開示されている。
【０００８】
【先行文献】
【特許文献１】特開昭６１−１４５４５９号公開公報
【特許文献２】特開平６−１６０３８８号公開公報
【特許文献３】特開２００２−３５７５９９号公開公報
【特許文献４】国際公開  ＷＯ  ０２／１０７４４号パンフレット
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、免疫クロマトグラフィーによりインフルエンザウイルスを検査する際に、非特異反応を低減化してより正確に検査を行うために必要な検体前処理液及び前処理方法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、免疫クロマトグラフィーによりインフルエンザの検査を行う場合において、生体から採取した検体をチオシアン酸系化合物を含む前処理液で処理すると、非特異反応が抑制され、正確にインフルエンザの検査が可能となることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
即ち本発明は、
１．免疫クロマトグラフィーによるインフルエンザウイルスの検査用検体の前処理液であって、少なくともチオシアン酸系化合物を含むことを特徴とする検体前処理液、
２．前記チオシアン酸系化合物を少なくとも０．１Ｍ含むことを特徴とする前項１に記載の前処理液、
３．上記検体が、鼻汁、痰又は咽頭ぬぐい液である前項１又は２に記載の前処理液、
４．前項１〜３のいずれか１に記載の前処理液を使用する検査用検体の処理方法、
５．前項１〜３のいずれか１に記載の前処理液を含む免疫クロマトグラフィー用検査キット、からなる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において測定の対象となるインフルエンザウイルスは、一般的に定義されているものであれば良く、特に限定されない。具体的には、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型のいずれであっても良い。また、インフルエンザウイルスに属するウイルスであれば、変異されたウイルス又は将来出現する変異ウイルスであっても良い。
【００１３】
（検体）
本発明において、測定対象物となる検体は生体から取得でき、インフルエンザウイルスを混入しうるものであれば良く特に限定されないが、好ましくは鼻汁、痰及び／又は咽頭ぬぐい液などが挙げられる。こららの検体を採取する方法は、特に限定されず、公知の方法を採用することができる。具体的には、綿棒を用いて、鼻汁、痰及び／又は咽頭ぬぐい液を採取することができる。
【００１４】
（検体前処理液）
本発明の検体前処理液に含まれるチオシアン酸系化合物は、チオシアン酸（ＨＮＣＳ）の他、チオシアン酸エステルやチオシアン酸塩等水溶性であれば、特に制限はない。チオシアン酸を構成する塩としては、ナトリウム、カリウム等の金属を含む無機塩基、あるいは有機塩基アンモニウム塩等が挙げられる。さらに、その塩の水和物や溶媒和物をも包含する。具体的には、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸グアニジン等が挙げられる。好ましくはチオシアン酸カリウム、チオシアン酸グアニジンが適用される。
【００１５】
チオシアン酸系化合物は、少なくとも０．１Ｍ、好ましくは０．１２５〜１．０Ｍ、より好ましくは０．１２５〜０．３７５Ｍの濃度で前処理液に含ませることができる。
【００１６】
本発明の検体前処理液には、上記チオシアン酸系化合物の他、一般的に当業者が使用しうる成分を含ませることができる。具体的には界面活性剤、反応に至適なｐＨである５〜９に保持うる緩衝液を構成する成分や、その他の適切な有機酸などを含ませることができる。検体の処理は、通常の方法に従えば良く、例えば検体前処理液０．５〜１．０ｍＬに対して検体を０．１〜０．２ｍＬを加え、よく振り混ぜて混和することにより行うことができる。同様に鼻汁などの検体を採取した綿棒を検体前処理液に浸し、検体前処理液と検体をよく混和することにより行うことができる。本明細書では検体を前処理液で処理したものを、便宜上「試料」という。
【００１７】
本発明に係る検体前処理液及び処理方法によって処理して得られた試料について、従来の免疫クロマトグラフィーを用いた抗原抗体反応によりインフルエンザの同定・定量等の検査が可能である。
【００１８】
（免疫クロマトグラフィー）
免疫クロマトグラフィーの手法は既に公知であるが、その原理を模式的に図１に示す。
図１の標識部材（２）に抗インフルエンザ抗体標識着色粒子を保持させ、インフルエンザウイルス検出部位（４）に抗インフルエンザ抗体を固定する。
図１の試料添加部材（１）に上記の処理した検体を試料として滴下し、クロマト膜担体（３）を介して吸収部材（５）の方向に試料を展開させる。検体中に対象とするインフルエンザウイルスが混入している場合には、インフルエンザウイルスと抗インフルエンザ抗体標識着色ラテックス粒子が反応し、これらの複合体が、抗インフルエンザ抗体子固定したインフルエンザウイルス検出部位（４）に補足され、着色のバンドが現れる。（４）に現れたバンドの色調等により、検体中に含まれるインフルエンザウイルスの量を概略的に把握することができる。
【００１９】
標識部材（２）及びインフルエンザウイルス検出部位（４）に使用する抗体は、インフルエンザの異なる部位を認識する抗体であれば良い。これらの抗体は、通常用いられる方法によって得ることができる。例えば、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ，  Ｃ．  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５−４９７．  １９７５）による細胞融合によるハイブリドーマの樹立法によっても良く、単に抗原を動物に免疫してその血清を精製したものであっても良い。標識部材（２）の標識着色粒子として、免疫クロマトグラフィーに使用される公知のものを使用することができる。例えば、金コロイドや着色ラテックス粒子が挙げられる。クロマト用膜担体（３）は、免疫クロマトグラフィーにおいて一般的に使用される膜であればよく、通常多孔質膜であり、具体的にはニトロセルロース膜を使用することができる。
【００２０】
（キット）
また、本発明は、上記検体前処理液を含むインフルエンザ検出のための免疫クロマトグラフィー用検出キットにも及ぶものである。具体的には、検体前処理液、免疫クロマトグラフィー用デバイス、各種抗体等が含まれるもの等が挙げられる。
【００２１】
【実施例】
本発明の理解のために、以下に実施例を示して説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２２】
（実施例１）各種化合物を検体前処理液に加えた場合の効果
１）  検体前処理液の組成
０．１（ｖ／ｖ）％  ＮＰ−４０（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル）、１００ｍＭクエン酸−０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む溶液（ｐＨ６．０）に、表１に示す化合物を０．５Ｍとなるように加え、検体前処理液とした。
【００２３】
２）  検体及びその処理
鼻汁を綿棒にて採取したもの検体とした。鼻汁検体は、ＭＤＣＫ細胞による培養法（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂ．２８（６）  １３０８−１３１３  （１９９０））によりインフルエンザＡ及びＢが陰性と判定されたものを用いた。
綿棒に含ませた鼻汁を、上記前処理液約０．８ｍＬを含む容器内に浸し、検体前処理液と混和したものを試料とした。その後、静置した試料液をメンブレンフィルター（膜孔径１μｍ）でろ過し、測定用試料とした。
【００２４】
３）  免疫クロマトグラフィー
免疫クロマトグラフィー用ストリップ（図１）の材料として、試料添加用部材（１）はガラス繊維ろ紙、標識保持部材（２）は、市販の抗インフルエンザ抗体を感作し、青色に着色したラテックスを保持したポリビニル処理ガラス繊維ろ紙、クロマト用膜担体（３）はニトロセルロース膜、吸収部材（５）はガラス繊維とセルロースの混合ろ紙を使用した。また検出部位（４）には、市販の抗インフルエンザ抗体を感作した。培養法によりインフルエンザ陽性と確認された検体について、通常の方法で前処理したものを免疫クロマトグラフィー用デバイスに滴下し、クロマトグラフィーを行った。
各濃度のＫＳＣＮを含む検体前処理液で前処理した測定用試料液を０．２０ｍＬを免疫クロマトグラフィー用デバイスに滴下し、免疫クロマトグラフィーを２０分行った。
【００２５】
【表１】
2005024324.tif 000002
【００２６】
その結果、表１に示す化合物のうちチオシアン酸グアニジン又はチオシアン酸カリウムを含む検体前処理液で前処理すると、培養法で陰性と認めた検体はすべて陰性となった。このことから、チオシアン酸系化合物を含む検体前処理液で検体を処理すると、非特異反応が抑制されることが確認された。
【００２７】
（実施例２）チオシアン酸カリウムの効果
本実施例は、検体前処理液中の各濃度のチオシアン酸カリウム（ＫＳＣＮ）のクロマト膜担体上のバックグランドに及ぼす効果を確認することを目的として行った。
【００２８】
１）  検体前処理液の組成
０．１（ｖ／ｖ）％  ＮＰ−４０（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル）、１００ｍＭクエン酸−０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む溶液（ｐＨ６．０）に、ＫＳＣＮの濃度が０，  ０．１００，  ０．１２５，  ０．２５０及び０．３７５Ｍの各濃度となるように加え、検体前処理液とした。２）検体及びその処理ならびに３）免疫クロマトグラフィーは、実施例１の手法に従った。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
その結果、表２に示すようにＫＳＣＮを全く含まない場合は非特異反応が認められたが、ＫＳＣＮを添加することにより非特異反応が抑えられた。
【００３１】
【発明の効果】
以上詳述したように、免疫クロマトグラフィーにより検査する場合において、本発明の検体の検体前処理液を用いて検体を前処理することにより、非特異反応を抑制し、より正確にヒトの検体中のインフルエンザウイルスを検査することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】免疫クロマトグラフィー用ストリップの概略を示す図である。
【符号の説明】
１    試料添加部材
２    標識部材（抗インフルエンザ抗体標識着色粒子保持部）
３    クロマト用膜担体
４    検出部位（抗インフルエンザ抗体固定部）
５    吸収部材
【図１】
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