(57)【要約】【課題】汚染環境中に存在する微生物の汚染物質分解能力を迅速に判定できる方法の提供を目的とする。【解決手段】前記目的を達成するために、本発明の環境の生物活性判定方法は、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）およびトリクロロエチレン（ＴＣＥ）の少なくとも一方の有機塩素化合物で汚染された環境の生物活性判定方法であって、環境試料から抽出した核酸を遺伝子増幅方法により増幅してターゲットとし、前記ターゲットを前記有機塩素化合物の分解関連バクテリアに特有の塩基配列からなるＤＮＡプローブの少なくとも１つとハイブリダイズさせることで前記環境中の前記バクテリアを検出し、検出された前記バクテリアの前記有機塩素化合物およびその脱塩素化物に対する分解能力に基づき、前記環境の前記有機塩素化合物の除去能力を判定することを特徴とする。【選択図】図１
2005237251.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）およびトリクロロエチレン（ＴＣＥ）の少なくとも一方の有機塩素化合物で汚染された環境の生物活性判定方法であって、環境試料から抽出した核酸を遺伝子増幅方法により増幅してターゲットとし、前記ターゲットを前記有機塩素化合物の分解関連バクテリアに特有の塩基配列からなるＤＮＡプローブの少なくとも１つとハイブリダイズさせることで前記環境中の前記バクテリアを検出し、検出された前記バクテリアの前記有機塩素化合物およびその脱塩素化物に対する分解能力に基づき、前記環境の前記有機塩素化合物の除去能力を判定することを特徴とする環境の生物活性判定方法。
【請求項２】
前記有機塩素化合物分解関連バクテリアが、下記ＡからＲからなる群から選択されれる少なくとも１種を含む嫌気性バクテリアである請求項１に記載の生物活性判定方法。
Ａ：デハロスピリルム  マルチヴォボランス（Dehalospirillum multivorans）
Ｂ：デスルフィトバクテリウム  フラピエリ（Desulfitobacterium frappieri）
Ｃ：アクチノマイセタレス  Ｓｍ-１（ロドコッカス  sp.  Sm-1）（Actinomycetales Sm-1 (Rhodococcus sp. Sm-1)）
Ｄ：ロドコッカス  ロドコッカス（Rhodococcus rhodococcus）
Ｅ：キサントバクター  フラバス（Xanthobacter flavus）
Ｆ：マイコバクテリウム  L1（Mycobacterium L1）
Ｇ：デスルフォミクロビウム  ノルベギカム（デスルフォヴィブリオ  バキュラタス）（Desulfomicrobium norvegicum (Desulfovibrio baculatus)）
Ｈ：デスルフィトバクテリウム  デハロゲナンス（Desulfitobacterium dehalogenans）
Ｉ：デスルフィトバクテリウム  ハフニエンス（Desulfitobacterium hafniense）
Ｊ：クロストリジウム  フォルミコアセチカム（Clostridium formicoaceticum）
Ｋ：デスルフロノナス  クロロエテニカ（Desulfuromonas chloroethenica）
Ｌ：アセトバクテリウム  ウッディ  DSM 1030（Acetobacterium woodii DSM 1030）
Ｍ：デハロバクター  レストリクタス（Dehalobacter restrictus）
Ｎ：デスルフィトバクテリウム  sp.  PCE１（Desulfitobacterium sp. strain PCE1）
Ｏ：デスルフィトバクテリウム  フラピエリ  TCE１（Desulfitobacterium frappieri TCE1）
Ｐ：アセトバクテリウム  ウッディ  DSM 2396（Acetobacterium woodii DSM 2396）
Ｑ：デスルフォモニル  タイドジェイ  DCB-１（Desulfomonile tiedjei DCB-1）
Ｒ：デハロコッコイデス  エタノジェネス１９５（Dehalococcoides ethenogenes 195）
【請求項３】
前記Ｊ、ＬおよびＰの少なくとも１種のバクテリアが検出された場合に、前記環境が、ＰＣＥをＴＣＥに分解する能力を有すると判定する請求項１または２に記載の生物活性判定方法。
【請求項４】
前記Ａ、ＧおよびＭの少なくとも１種のバクテリアが検出された場合に、前記環境が、ＰＣＥをシス型ジクロロエチレン（cisＤＣＥ）に分解する能力を有すると判定する請求項１から３のいずれかに記載の生物活性判定方法。
【請求項５】
前記Ｂ、Ｉ、Ｈ、Ｎ、ＯおよびＱの少なくとも１種のバクテリアが検出された場合に、前記環境が、ＰＣＥおよびＴＣＥをcisＤＣＥに分解する能力を有すると判定する請求項１から４のいずれかに記載の生物活性判定方法。
【請求項６】
前記Ｋのバクテリアが検出された場合に、前記環境が、ＰＣＥおよびＴＣＥをＤＣＥに分解する能力を有すると判定する請求項１から５のいずれかに記載の生物活性判定方法。
【請求項７】
前記Ｒのバクテリアが検出された場合に、前記環境が、ＰＣＥ、ＴＣＥ、ＤＣＥおよびビニルクロライド（ＶＣ）をエテンに分解する能力を有すると判定する請求項１から６のいずれかに記載の生物活性判定方法。
【請求項８】
前記Ｃ、ＤおよびＥの少なくとも１種のバクテリアが検出された場合に、前記環境が、ＤＣＥおよびＶＣを二酸化炭素に分解する能力を有すると判定する請求項１から７のいずれかに記載の生物活性判定方法。
【請求項９】
前記Ｆのバクテリアが検出された場合に、前記環境が、ＶＣを二酸化炭素に分解する能力を有すると判定する請求項１から８のいずれかに記載の生物活性判定方法。
【請求項１０】
前記ＡからＲのバクテリアに特有の塩基配列からなるＤＮＡプローブが、下記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなる請求項２から９のいずれかに記載の生物活性判定方法。
（１）配列番号１から１７および配列番号１９から１０５のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）前記（１）のポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（３）前記（１）のポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドとの相同性が90％以上であるポリヌクレオチド。
（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記バクテリアＡを検出するためのＤＮＡプローブが、前記（１）の配列番号が配列番号１および配列番号１９から２５のいずれかである前記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである請求項１０に記載の生物活性判定方法。
【請求項１２】
前記バクテリアＢを検出するためのＤＮＡプローブが、前記（１）の配列番号が配列番号２および配列番号２６から３０のいずれかである前記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである請求項１０に記載の生物活性判定方法。
【請求項１３】
前記バクテリアＣを検出するためのＤＮＡプローブが、前記（１）の配列番号が配列番号３および配列番号３１から３５のいずれかである前記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである請求項１０に記載の生物活性判定方法。
【請求項１４】
前記バクテリアＤを検出するためのＤＮＡプローブが、前記（１）の配列番号が配列番号４および配列番号３６から４０のいずれかである前記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである請求項１０に記載の生物活性判定方法。
【請求項１５】
前記バクテリアＥを検出するためのＤＮＡプローブが、前記（１）の配列番号が配列番号５および配列番号４１から４５のいずれかである前記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである請求項１０に記載の生物活性判定方法。
【請求項１６】
前記バクテリアＦを検出するためのＤＮＡプローブが、前記（１）の配列番号が配列番号６および配列番号４６から４８のいずれかである前記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである請求項１０に記載の生物活性判定方法。
【請求項１７】
前記バクテリアＧを検出するためのＤＮＡプローブが、前記（１）の配列番号が配列番号７および配列番号４９から５３のいずれかである前記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである請求項１０に記載の生物活性判定方法。
【請求項１８】
前記バクテリアＨを検出するためのＤＮＡプローブが、前記（１）の配列番号が配列番号８および配列番号５４から５７のいずれかである前記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである請求項１０に記載の生物活性判定方法。
【請求項１９】
前記バクテリアＩを検出するためのＤＮＡプローブが、前記（１）の配列番号が配列番号９および配列番号５８から６２のいずれかである前記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである請求項１０に記載の生物活性判定方法。
【請求項２０】
前記バクテリアＪを検出するためのＤＮＡプローブが、前記（１）の配列番号が配列番号１０および配列番号６３から６８のいずれかである前記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである請求項１０に記載の生物活性判定方法。
【請求項２１】
前記バクテリアＫを検出するためのＤＮＡプローブが、前記（１）の配列番号が配列番号１１および配列番号６９から７４のいずれかである前記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである請求項１０に記載の生物活性判定方法。
【請求項２２】
前記バクテリアＬを検出するためのＤＮＡプローブが、前記（１）の配列番号が配列番号１２および配列番号７５から７９のいずれかである前記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである請求項１０に記載の生物活性判定方法。
【請求項２３】
前記バクテリアＭを検出するためのＤＮＡプローブが、前記（１）の配列番号が配列番号１３および配列番号８０から８６のいずれかである前記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである請求項１０に記載の生物活性判定方法。
【請求項２４】
前記バクテリアＮを検出するためのＤＮＡプローブが、前記（１）の配列番号が配列番号１４および配列番号８７から９１のいずれかである前記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである請求項１０に記載の生物活性判定方法。
【請求項２５】
前記バクテリアＯを検出するためのＤＮＡプローブが、前記（１）の配列番号が配列番号１５および配列番号９２から９６のいずれかである前記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである請求項１０に記載の生物活性判定方法。
【請求項２６】
前記バクテリアＰを検出するためのＤＮＡプローブが、前記（１）の配列番号が配列番号１６および配列番号９７から９９のいずれかである前記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである請求項１０に記載の生物活性判定方法。
【請求項２７】
前記バクテリアＱを検出するためのＤＮＡプローブが、前記（１）の配列番号が配列番号１７および配列番号１００から１０５のいずれかである前記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブである請求項１０に記載の生物活性判定方法。
【請求項２８】
前記汚染された環境が、土壌、地下水、池および海水の少なくとも１つである請求項１から２７のいずれかに記載の生物活性判定方法。
【請求項２９】
ＰＣＥおよびＴＣＥの少なくとも一方の有機塩素化合物で汚染された環境のバイオレメディエーションの方法であって、請求項１から２８のいずれかに記載の方法により前記環境の生物活性判定方法を行う工程と、前記有機塩素化合物分解関連バクテリアが検出された場合に、前記バクテリアの増殖および活性の少なくとも一方を促進して前記有機塩素化合物またはその脱塩素化物の分解を促進する工程と含むバイオレメディエーションの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオレメディエーションサイトの生物活性判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）およびトリクロロエチレン（ＴＣＥ）をはじめ、各種の有機塩素化合物による地下水や土壌の汚染は、世界共通の深刻な問題であり、しばしば、新聞紙上等のマスコミでも詳細に取り上げられ、これらの物質による環境汚染を修復するための技術開発が社会的に強く要求されている。
【０００３】
汚染環境修復技術として、物理化学的方法と生物的方法とがあげられるが、低濃度汚染の修復には、微生物を用いる生物的環境修復方法（バイオレメディエーション）が特に適している。バイオレメディエーションは、土壌の掘削が必要なく、建造物下の環境修復も容易であること、低コストで環境負荷が少ないことから、その実用化への期待が大きい。
【０００４】
バイオレメディエーションの方式には、汚染された土壌や地下水に元来生息する微生物に、例えば、各種栄養物質等を供給し、微生物の持つ環境汚染物質の分解除去能力を増強させる方式（バイオスティミュレーション）と、環境汚染物質を分解除去する能力を持つ微生物を汚染環境に直接導入する方式（バイオオーギュメンテーション：例えば、特許文献１参照）とがある。ＴＣＥに汚染された地下水の環境修復を、バイオスティミュレーションとバイオオーギュメンテーションにより行い、優れた成果をあげた例もある。
【０００５】
バイオレメディエーションを適用するにあたり、その汚染サイトがバイオスティミュレーション可能か、あるいは、系外から汚染物質分解能力を持つ微生物を導入するバイオオーギュメンテーションを適用しなければならないかの判定を迅速に行うことが望まれている（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特開2003-154332号公報
【特許文献２】特開2000-079000号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、汚染環境中に存在する微生物の汚染物質分解能力を迅速に判定できる方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明の環境の生物活性判定方法は、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）およびトリクロロエチレン（ＴＣＥ）の少なくとも一方の有機塩素化合物で汚染された環境の生物活性判定方法であって、環境試料から抽出した核酸を遺伝子増幅方法により増幅してターゲットとし、前記ターゲットを前記有機塩素化合物の分解関連バクテリアに特有の塩基配列からなるＤＮＡプローブの少なくとも１つとハイブリダイズさせることで前記環境中の前記バクテリアを検出し、検出された前記バクテリアの前記有機塩素化合物およびその脱塩素化物に対する分解能力に基づき、前記環境の前記有機塩素化合物の除去能力を判定することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明者等は、ＰＣＥやＴＣＥ等の有機塩素化合物による汚染環境のバイオレメディエーションについて、汚染環境中から嫌気性有機塩素化合物分解関連バクテリアを迅速に検出できれば、バイオスティミュレーションが可能か否かの判定が容易になることに着目して鋭意研究を重ねた。その結果、現在報告されている１８種の嫌気性有機塩素化合物分解関連バクテリアのそれぞれに特有の塩基配列からなるＤＮＡプローブを使用すれば、例えば、一度に１８種類のバクテリアについて検出か可能となることを見出し、本発明に到達した。
【０００９】
本発明によれば、汚染環境中の有機塩素化合物分解関連バクテリアを、ＤＮＡプローブを用いて迅速に検出し、前記汚染環境のＰＣＥおよびその脱塩素化物の除去能力を判定できるから、例えば、バイオレメディエーションにおけるバイオスティミュレーションが可能か否かの判定が容易となり、適切な環境修復方法の選択が可能となる。さらに、環境修復方法を迅速、適切に選択することで、環境修復を安価なものとすることが可能となる。
【００１０】
さらに、ＰＣＥの分解は、好気性条件では困難であると考えられており、また、通常、地表より５０ｃｍ以下は嫌気性であると考えられるから、例えば、ＰＣＥ汚染環境や地表５０ｃｍ以下の汚染環境を、本来利用可能な嫌気性微生物ではなく好気性微生物で修復することは、余分なコストの投入となる場合もある。しかし、本発明によれば、嫌気性有機塩素化合物分解関連バクテリアを検出して、前記バクテリアの分解活性に基づき環境の生物活性を判定できるから、余分なエネルギーの使用を回避することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、検出する有機塩素化合物分解関連バクテリアは、下記ＡからＲのバクテリアからなる群から選択される少なくとも１種を含むバクテリアであることが好ましい。
Ａ：デハロスピリルム  マルチヴォボランス（Dehalospirillum multivorans）
Ｂ：デスルフィトバクテリウム  フラピエリ（Desulfitobacterium frappieri）
Ｃ：アクチノマイセタレス  Ｓｍ-１（ロドコッカス  sp.  Sm-1）（Actinomycetales Sm-1 (Rhodococcus sp. Sm-1)）
Ｄ：ロドコッカス  ロドコッカス（Rhodococcus rhodococcus）
Ｅ：キサントバクター  フラバス（Xanthobacter flavus）
Ｆ：マイコバクテリウム  L1（Mycobacterium L1）
Ｇ：デスルフォミクロビウム  ノルベギカム（デスルフォヴィブリオ  バキュラタス）（Desulfomicrobium norvegicum (Desulfovibrio baculatus)）
Ｈ：デスルフィトバクテリウム  デハロゲナンス（Desulfitobacterium dehalogenans）
Ｉ：デスルフィトバクテリウム  ハフニエンス（Desulfitobacterium hafniense）
Ｊ：クロストリジウム  フォルミコアセチカム（Clostridium formicoaceticum）
Ｋ：デスルフロノナス  クロロエテニカ（Desulfuromonas chloroethenica）
Ｌ：アセトバクテリウム  ウッディ  DSM 1030（Acetobacterium woodii DSM 1030）
Ｍ：デハロバクター  レストリクタス（Dehalobacter restrictus）
Ｎ：デスルフィトバクテリウム  sp.  PCE１（Desulfitobacterium sp. strain PCE1）
Ｏ：デスルフィトバクテリウム  フラピエリ  TCE１（Desulfitobacterium frappieri TCE1）
Ｐ：アセトバクテリウム  ウッディ  DSM 2396（Acetobacterium woodii DSM 2396）
Ｑ：デスルフォモニル  タイドジェイ  DCB-１（Desulfomonile tiedjei DCB-1）
Ｒ：デハロコッコイデス  エタノジェネス１９５（Dehalococcoides ethenogenes 195）
【００１２】
本発明の環境の生物活性判定方法において、少なくとも前記Ｊ、Ｌ、Ｐのいずれかのバクテリアが検出された場合、前記環境が、ＰＣＥをＴＣＥに分解する能力を有すると判定できる。
【００１３】
本発明の環境の生物活性判定方法において、少なくとも前記Ａ、Ｇ、Ｍのいずれかのバクテリアが検出された場合、前記環境が、ＰＣＥをシス型ジクロロエチレン（cisＤＣＥ）に分解する能力を有すると判定できる。
【００１４】
本発明の環境の生物活性判定方法において、少なくとも前記Ｂ、Ｉ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｑのいずれかのバクテリアが検出された場合、前記環境が、ＰＣＥおよびＴＣＥをcisＤＣＥに分解する能力を有すると判定できる。
【００１５】
本発明の環境の生物活性判定方法において、少なくとも前記Ｋのバクテリアが検出された場合に、前記環境が、ＰＣＥおよびＴＣＥをＤＣＥに分解する能力を有すると判定できる。
【００１６】
本発明の環境の生物活性判定方法において、少なくとも前記Ｒのバクテリアが検出された場合、前記環境が、ＰＣＥ、ＴＣＥ、ＤＣＥおよびビニルクロライド（ＶＣ）をエテンに分解する能力を有すると判定できる。
【００１７】
本発明の環境の生物活性判定方法において、少なくとも前記Ｃ、Ｄ、Ｅのバクテリアが検出された場合、前記環境が、ＤＣＥおよびＶＣを二酸化炭素に分解する能力を有すると判定できる。
【００１８】
本発明の環境の生物活性判定方法において、少なくとも前記Ｆのバクテリアが検出された場合、前記環境が、ＶＣを二酸化炭素に分解する能力を有すると判定できる。
【００１９】
本発明の環境の生物活性判定方法において、前記ＡからＲのバクテリアに特有の塩基配列からなるＤＮＡプローブとしては、下記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブがあげられる。
（１）配列番号１から１７および配列番号１９から１０５のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）前記（１）のポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（３）前記（１）のポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドとの相同性が90％以上であるポリヌクレオチド。
（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００２０】
具体的には、前記バクテリアＡを検出するためのＤＮＡプローブとしては、配列番号１および配列番号１９から２５のいずれかの塩基配列に由来する前記ＤＮＡプローブが好ましい。ここで、配列番号１の塩基配列に由来する前記ＤＮＡプローブとは、前記（１）の配列番号が配列番号１である前記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブを意味する。
【００２１】
前記バクテリアＢを検出するためのＤＮＡプローブとしては、配列番号２および配列番号２６から３０のいずれかの塩基配列に由来する前記ＤＮＡプローブが好ましい。
【００２２】
前記バクテリアＣを検出するためのＤＮＡプローブとしては、配列番号３および配列番号３１から３５のいずれかの塩基配列に由来する前記ＤＮＡプローブが好ましい。
【００２３】
前記バクテリアＤを検出するためのＤＮＡプローブとしては、配列番号４および配列番号３６から４０のいずれかの塩基配列に由来する前記ＤＮＡプローブが好ましい。
【００２４】
前記バクテリアＥを検出するためのＤＮＡプローブとしては、配列番号５および配列番号４１から４５のいずれかの塩基配列に由来する前記ＤＮＡプローブが好ましい。
【００２５】
前記バクテリアＦを検出するためのＤＮＡプローブとしては、配列番号６および配列番号４６から４８のいずれかの塩基配列に由来する前記ＤＮＡプローブが好ましい。
【００２６】
前記バクテリアＧを検出するためのＤＮＡプローブとしては、配列番号７および配列番号４９から５３のいずれかの塩基配列に由来する前記ＤＮＡプローブが好ましい。
【００２７】
前記バクテリアＨを検出するためのＤＮＡプローブとしては、配列番号８および配列番号５４から５７のいずれかの塩基配列に由来する前記ＤＮＡプローブが好ましい。
【００２８】
前記バクテリアＩを検出するためのＤＮＡプローブとしては、配列番号９および配列番号５８から６２のいずれかの塩基配列に由来する前記ＤＮＡプローブが好ましい。
【００２９】
前記バクテリアＪを検出するためのＤＮＡプローブとしては、配列番号１０および配列番号６３から６８のいずれかの塩基配列に由来する前記ＤＮＡプローブが好ましい。
【００３０】
前記バクテリアＫを検出するためのＤＮＡプローブとしては、配列番号１１および配列番号６９から７４のいずれかの塩基配列に由来する前記ＤＮＡプローブが好ましい。
【００３１】
前記バクテリアＬを検出するためのＤＮＡプローブとしては、配列番号１２および配列番号７５から７９のいずれかの塩基配列に由来する前記ＤＮＡプローブが好ましい。
【００３２】
前記バクテリアＭを検出するためのＤＮＡプローブとしては、配列番号１３および配列番号８０から８６のいずれかの塩基配列に由来する前記ＤＮＡプローブが好ましい。
【００３３】
前記バクテリアＮを検出するためのＤＮＡプローブとしては、配列番号１４および配列番号８７から９１のいずれかの塩基配列に由来する前記ＤＮＡプローブが好ましい。
【００３４】
前記バクテリアＯを検出するためのＤＮＡプローブとしては、配列番号１５および配列番号９２から９６のいずれかの塩基配列に由来する前記ＤＮＡプローブが好ましい。
【００３５】
前記バクテリアＰを検出するためのＤＮＡプローブとしては、配列番号１６および配列番号９７から９９のいずれかの塩基配列に由来する前記ＤＮＡプローブが好ましい。
【００３６】
前記バクテリアＱを検出するためのＤＮＡプローブとしては、配列番号１７および配列番号１００から１０５のいずれかの塩基配列に由来する前記ＤＮＡプローブが好ましい。
【００３７】
本発明の生物活性判定方法を適用する環境としては、土壌、地下水、池および海水の少なくとも１つがあげられる。
【００３８】
本発明のバイオレメディエーションの方法は、ＰＣＥおよびＴＣＥの少なくとも一方の有機塩素化合物で汚染された環境のバイオレメディエーションの方法であって、本発明の環境の生物活性判定方法を行う工程と、前記有機塩素化合物分解関連バクテリアが検出された場合に、前記バクテリアの増殖および活性の少なくとも一方を促進して前記有機塩素化合物またはその脱塩素化物の分解を促進する工程と含むバイオレメディエーションの方法である。
【００３９】
まず、本発明の環境の生物活性判定方法において、検出対象とする有機塩素化合物分解関連バクテリアについて説明する。現在、ＰＣＥの分解に関連する嫌気性バクテリアとしてしては、前記ＡからＲの１８種が知られている。本発明においては、前記ＡからＲの少なくとも１種を検出対象とし、好ましくは、前記ＡからＲの全てのバクテリアを検出対象とするが、本発明において検出対象とする有機塩素化合物分解関連バクテリアは、これらに限られず、今後ＰＣＥの分解に関連するとして明らかになるバクテリアを含むものである。なお、前記ＡからＱのバクテリアは、以下に示す生物資源保存機関ＡＴＣＣまたはＤＳＭＺの寄託番号が付されている。
Ａ：DSM 12446  Ｂ：DSM 13498  Ｃ：ATCC 51239  Ｄ：ATCC 21197  Ｅ：DSM 10330
Ｆ：DSM 6695   Ｇ：DSM 1741   Ｈ：DSM 9161    Ｉ：DSM 10644   Ｊ：ATCC 27076
Ｋ：DSM 12431  Ｌ：DSM 1030   Ｍ：DSM 9455    Ｎ：DSM 10344   Ｏ：DSM 12704
Ｐ：DSM 2396   Ｑ：ATCC 49306
【００４０】
ＰＣＥの分解は、例えば、図５Ａに示すとおり、ＰＣＥ、ＴＣＥ、ジクロロエチレン（ＤＣＥ）、ビニルクロライド（ＶＣ）と進み、前記ＶＣは、エテンまたは二酸化炭素に分解される。前記ＡからＲのバクテリアのＰＣＥおよびその脱塩素化物に対する分解活性を、図５Ｂに示す。図５Ｂに示すとおり、前記ＡからＲのバクテリアのＰＣＥおよびその脱塩素化物に対する分解活性は様々である。例えば、前記バクテリアＲは、ＰＣＥを、エテンまで一つずつ脱塩素化していくが、前記バクテリアＭ、ＡおよびＧは、ＰＣＥを、シス型のＤＣＥに分解する。
【００４１】
次に、本発明の環境の生物活性判定方法において、検出対象とするＰＣＥ分解バクテリアの検出に用いるＤＮＡプローブについて説明する。本発明におけるＤＮＡプローブとしては、前記有機塩素化合物分解関連バクテリアに特有の配列であれば、特に制限されず、例えば、全ゲノム、ｔＤＮＡ、ｒＤＮＡ等の配列を使用できるが、好ましくは、ｒＤＮＡ中のＩＴＳ配列である。原核生物のリボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）である、１６ＳｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡおよび５ＳｒＲＮＡは、通常、一つの転写単位（オペロン）として転写されるため、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子は隣り合ってゲノム上に配置されている。この１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子との間の領域が、１６Ｓ-２３Ｓ Internal Transcribed Spacer（ＩＴＳ）と呼ばれる領域である。本発明者らは、前記ＡからＱのバクテリアにおける前記ＩＴＳの配列（それぞれ、配列番号１から１７）を初めて決定し、このＩＴＳ配列であれば、前記ＡからＱのバクテリアに特有のＤＮＡプローブが作製できることを初めて見出したのである。
【００４２】
なお、前記バクテリアＲのゲノム配列は、コーネル大のDr. Zinder氏により配列決定されたものである。本発明者らは、前記バクテリアＲのＩＴＳ配列（配列番号１８）からなるＤＮＡプローブが前記バクテリアＲに特異的であり、前記１７種のバクテリアのＩＴＳ配列からＤＮＡプローブと併用すれば、前記ＡからＱの１８種のバクテリアを全て検出できるＤＮＡプローブとすることができることも、初めて見出した。
【００４３】
さらに、本発明者らは、前記ＩＴＳ配列（配列番号１から１８）の一部も、ＤＮＡプローブとして使用できることも見出した。したがって、本発明の環境の生体活性判定方法に用いるＤＮＡプローブとしては、下記（１）から（４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡプローブがあげられる。
（１）配列番号１から１８のいずれかの塩基配列またはその一部からなるポリヌクレオチド。
（２）前記（１）のポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（３）前記（１）のポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドとの相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド。
（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００４４】
ここで、欠失、置換もしくは付加が可能な塩基数としては、例えば、４０塩基に対して、欠失・付加で、１個〜６個であり、１個〜３個が好ましく、より好ましくは１個〜２個であり、置換で、１個〜４個であり、１個〜２個が好ましく、より好ましくは１個である。ハイブリダイズする前記ストリンジェントな条件としては、例えば、配列番号で示された塩基配列のＴｍ値の±１０℃があげられる。また、前記相同性としては、例えば、９０％以上であり、９５％以上が好ましく、より好ましくは、９７．５％以上である。
【００４５】
本発明におけるＤＮＡプローブとしては、前記ＩＴＳ配列全体よりもその一部の塩基配列からなるものが好ましい。ＤＮＡプローブは、通常、その長さが短くなるほど配列特異性が増し、信頼度が向上するからである。一方、配列自体が前記バクテリアそれぞれに対して特有である必要がある。したがって、ＤＮＡプローブの長さとしては、特に制限されないが、例えば、１０塩基から前記ＩＴＳ配列全体であり、４０〜８０塩基が好ましい。
【００４６】
前記配列番号１から１８のＩＴＳ領域の一部である塩基配列の具体例が、長さ４０塩基の配列番号１９から１１５の塩基配列である。配列番号１９から２５が配列番号１の一部に該当し、配列番号２６から３０が配列番号２の一部に該当し、配列番号３１から３５が配列番号３の一部に該当し、配列番号３６から４０が配列番号４の一部に該当し、配列番号４１から４５が配列番号５の一部に該当し、配列番号４６から４８が配列番号６の一部に該当し、配列番号４９から５３が配列番号７の一部に該当し、配列番号５４から５７が配列番号８の一部に該当し、配列番号５８から６２が配列番号９の一部に該当し、配列番号６３から６８が配列番号１０の一部に該当し、配列番号６９から７４が配列番号１１の一部に該当し、配列番号７５から７９が配列番号１２の一部に該当し、配列番号８０から８６が配列番号１３の一部に該当し、配列番号８７から９１の配列番号１４の一部に該当し、配列番号９２から９６が配列番号１５の一部に該当し、配列番号９７から９９が配列番号１６の一部に該当し、配列番号１００から１０５が配列番号１７の一部に該当し、配列番号１０６から１１５が配列番号１８の一部に該当する。
【００４７】
次に、前記ＤＮＡプローブを用いた前記有機塩素化合物分解関連バクテリアの検出方法としては、特に制限されず、例えば、対象環境の試料から抽出した核酸からターゲットを調製し、前記ターゲットと前記ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションを利用する方法で検出できる。前記ターゲットは、試料中のバクテリアの配列であって、前記ＤＮＡプローブの配列の相補配列であり、検出方法に応じた標識をされた前記ターゲットと前記ＤＮＡプローブとがハイブリダイズすることで検出可能となる。前記ハイブリダイゼーションの検出方法は、例えば、サザンブロット、ＤＮＡアレイ、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ等、従来公知の遺伝子検出技術を利用できる。これらのなかでも、前記ＡからＲの全てバクテリアに対応するＤＮＡプローブを固定したものであれば、一度に環境試料中のバクテリアの検出ができることから好ましい。
【００４８】
本発明の生物活性判定方法の対象環境としては、特に制限されず、例えば、汚染れた土壌、地下水、池、海水等があげられる。前記対象環境の試料から核酸を抽出する方法は、特に制限されず、従来公知の方法でよく、例えば、市販の核酸抽出キットを用いることができる。前記ターゲットは、前記核酸のＤＮＡプローブに対応する領域を増幅することで調製できる。前記核酸は、例えば、ＤＮＡでもよく、ＲＮＡでもよい。遺伝子増幅方法も、特に制限されず、従来公知の増幅方法を適用できる。また、前記ハイブリダイゼーションの検出方法に応じて、遺伝子増幅と同時に、ターゲットに標識することも好ましい。前記標識としては、特に制限されず、例えば、蛍光標識やＲＩ標識を利用できる。前記ＩＴＳ領域を利用したＤＮＡプローブに対応するターゲットをＰＣＲ法で調製する場合、そのプライマーとして、例えば、センスプライマーとして配列番号１１６で表される塩基配列からなるプライマーを使用でき、アンチセンスプライマーとしては、前記バクテリアＲ以外には、配列番号１１７で表される塩基配列からなるプライマーを使用でき、前記バクテリアＲには、配列番号１１８で表される塩基配列からなるプライマーを使用できる。
【００４９】
以上のようにして、環境中の有機塩素化合物分解関連バクテリアを検出できるが、前記環境のＰＣＥおよびＴＣＥの除去能力の判定は、例えば、検出されたバクテリアと図５Ｂとを比較することで行うことができる。
【００５０】
次に、本発明のバイオレメディエーションの方法は、ＰＣＥおよびＴＣＥの少なくとも一方の有機塩素化合物で汚染された環境のバイオレメディエーションの方法であって、本発明の環境の生物活性判定方法を行う工程と、前記方法により前記有機塩素化合物分解関連バクテリアが検出された場合に、前記バクテリアの増殖および活性の少なくとも一方を促進して前記有機塩素化合物またはその脱塩素化物の分解を促進する工程と含むバイオレメディエーションの方法である。バイオレメディエーションにあたり、予め本発明の生物活性判定方法により環境のＰＣＥ等の有機塩素化合物の分解除去能力を把握することで、より的確かつ迅速なバイオレメディエーションの方法の選択が可能となる。例えば、バクテリアＲが検出されれば、前記バクテリアＲでＰＣＥをエテンにできるから、前記バクテリアＲの増殖や活性を高める栄養素を環境に導入するバイオスティミュレーションを選択できる。また、例えば、バクテリアＫとＣとが検出された場合も、前記２種のバクテリアでＰＣＥを二酸化炭素に分解できるから、前記２種のバクテリアの増殖や活性を高める栄養素を環境に導入するバイオスティミュレーションが選択できる。また、前記有機化合物分解関連バクテリアが検出されない場合は、バイオスティミュレーションを行わないという選択ができる。
【００５１】
以下に、本発明の実施例について説明する。
【実施例１】
【００５２】
松下空調環境エンジニアリング株式会社の提供による土壌試料の２５０ｍｇから、FastPrep bead-beater and soil DNA extraction kit（Q Biogene社製）を用い、取扱い説明書に従って、ＤＮＡを抽出した。前記ＤＮＡの約１μｌを、非標識センスプライマー２７Ｆ（配列番号１１６）とＣｙ３標識アンチセンスプライマー１３２Ｒ（配列番号１１７）または３４１Ｒ（配列番号１１８）とを含む５０μｌの standard Amplitaq Gold PCR 混合液（アプライドバイオシステムズ社製）に添加した。ＰＣＲを標準的なプロトコールにより行った後、ＰＣＲ増幅産物を Autoseq G-50（ファルマシア社製）を用いて脱塩し、SpeedVac（Savant社製）を用いて吸引乾燥した。乾燥した前記ＰＣＲ増幅産物を、最終濃度が５×ＳＳＣ、０.２％ＳＤＳ、５０％ホルムアミドであるバッファーに溶解させ、その溶解液を、９４℃で３分間ボイルして少なくとも２分間氷冷した後、ＤＮＡマイクロアレイ上にアプライした。その後、カバーグラスを前記マイクロアレイ上にかぶせ、そのように準備したものを４２℃で設定されたハイブリダイゼーションチャンバー内に少なくとも４時間配置した。その後、ＤＮＡマイクロアレイを、０.２×ＳＳＣ、０.２％ＳＤＳで５分間、０.２×ＳＳＣで５分間、そして、０.０５×ＳＳＣで数秒間洗浄し、1,800ｒｐｍでスピンドライした。その後、ＤＮＡマイクロアレイを Scanarry version 5（パーキンエルマージャパン社製）でスキャンした。
【００５３】
なお、前記ＤＮＡマイクロアレイは、Affymetrix 417 Arrayerを用いてＤＮＡプローブをTakara Hubble Slideにカスタムプリントして作製した。使用したＤＮＡマイクロアレイ上のプローブは、バクテリアＡのプローブＡ１からＡ７が、それぞれ、配列番号１９から２５の塩基配列であり、バクテリアＢのプローブＢ１からＢ５が、それぞれ、配列番号２６から３０の塩基配列であり、バクテリアＣのプローブＣ１からＣ５が、それぞれ、配列番号３１から３５の塩基配列であり、バクテリアＤのプローブＤ１からＤ５が、それぞれ、配列番号３６から４０の塩基配列であり、バクテリアＥのプローブＥ１からＥ５が、それぞれ、配列番号４１から４５の塩基配列であり、バクテリアＦのプローブＦ１からＦ３が、それぞれ、配列番号４６から４８の塩基配列であり、バクテリアＧのプローブＧ１からＧ５が、それぞれ、配列番号４９から５３の塩基配列であり、バクテリアＨのプローブＨ１からＨ４が、それぞれ、配列番号５４から５７の塩基配列であり、バクテリアＩのプローブＩ１からＩ５が、それぞれ、配列番号５８から６２の塩基配列であり、バクテリアＪのプローブＪ１からＪ６が、それぞれ、配列番号６３から６８の塩基配列であり、バクテリアＫのプローブＫ１からＫ６が、それぞれ、配列番号６９から７４の塩基配列であり、バクテリアＬのプローブＬ１からＬ５が、それぞれ、配列番号７５から７９の塩基配列であり、バクテリアＭのプローブＭ１からＭ７が、それぞれ、配列番号８０から８６の塩基配列であり、バクテリアＮのプローブＮ１からＮ５が、それぞれ、配列番号８７から９１の塩基配列であり、バクテリアＯのプローブＯ１からＯ５が、それぞれ、配列番号９２から９６の塩基配列であり、バクテリアＰのプローブＰ１からＰ３が、それぞれ、配列番号９７から９９の塩基配列であり、バクテリアＱのプローブＱ１からＱ６が、それぞれ、配列番号１００から１０５の塩基配列であり、バクテリアＲのプローブＲ１からＲ１０が、それぞれ、配列番号１０６から１１５の塩基配列である。
【００５４】
前記ＤＮＡマイクロアレイをスキャンした結果の一部を図１に示す。図１Ａは、スキャンイメージを示し、図１Ｂは、定量化した結果のグラフを示す。図１に示すとおり、バクテリアＭ（Dehalobacter restrictus  DSM 945）のプローブに対する有意なハイブリダイズが検出された。従って、前記試料の土壌には、ＰＣＥをcisＤＣＥに分解する能力があると判定できた（図５Ｂ参照）。
【００５５】
なお、前記９７種類のＤＮＡプローブが、それぞれのバクテリアに特異的であり、クロスハイブリをしないことを、ターゲットを前記ＡからＲのバクテリアからそれぞれ調製し、そのターゲットを前記ＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイズすることで確認した。
【００５６】
その結果をまとめたものを図２に示す。図２は、縦軸に示された１８のバクテリアのＩＴＳ配列のターゲットと、横軸に示す９７のＤＮＡプローブとハイブリダイズしたかどうかを示すグラフであり、黒塗りの部分が、５００蛍光ユニット以上のシグナルを示してＤＮＡプローブとターゲットとがハイブリダイズしたことを示す。なお、横軸の系統樹は、ＩＴＳ配列のアライメントから作製したものである。図２に示すとおり、前記ＡからＲのバクテリアそれぞれから調製したターゲットは、クロスハイブリダイズすることなく、前記ＡからＲのバクテリアのＤＮＡプローブのみと有意にハイブリダイズすることが示された。
【実施例２】
【００５７】
前記土壌試料の代わりに、松下空調環境エンジニアリング株式会社の提供による３００ｍｌの地下水試料を使用し、7,000ｒｐｍで遠心分離したデブリからＤＮＡを抽出したほかは、実施例１と同様にして、前記地下水試料中のバクテリアを前記ＤＮＡマイクロアレイを用いて検出した。
【００５８】
その結果の一部を図３に示す。図３Ａは、スキャンイメージを示し、図３Ｂは、定量化した結果のグラフを示す。図３に示すとおり、バクテリアＪ（Clostridium formicoaceticum  ATCC 27076）のプローブに対する有意なハイブリダイズが検出された。従って、前記試料の土壌には、ＰＣＥをＴＣＥに分解する能力があると判定できた（図５Ｂ参照）。
【実施例３】
【００５９】
前記土壌試料の代わりに、T.H. Lee博士（韓国）の提供による嫌気的集積培養試料を用いた他は、実施例１と同様にして、前記試料中の前記バクテリアを検出した。
【００６０】
その結果を図４に示す。図４に示すとおり、バクテリアＡ、Ｊ、Ｍ、ＮおよびＯの一部のプローブに強いシグナルが検出され、バクテリアＢおよびＩのプローブからも弱いシグナルが検出された。したがって、前記試料には、ＰＣＥをcisＤＣＥに変換する能力があると判定できた（図５Ｂ参照）。この判定結果は、T.H. Lee博士による前記集積培養のＰＣＥ／cisＤＣＥの分析データと一致する内容であった。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
以上、説明したとおり、本発明の環境の生物活性判定方法は、汚染環境の修復方法、とりわけ、バイオレメディエーションの分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、本発明の一例におけるバクテリアの検出結果を示す図である。
【図２】図２は、本発明の一例におけるＤＮＡマイクロアレイによる検出結果を示す図である。
【図３】図３は、本発明のその他の例におけるバクテリアの検出結果を示す図である。
【図４】図４は、本発明のさらにその他の例におけるバクテリアの検出結果を示す図である。
【図５】図５は、本発明に関わる嫌気性有機塩素化合物分解関連バクテリアの分解活性を説明する図である。
【配列表フリーテキスト】
【００６３】
配列番号１１６  ＰＣＲ用センスプライマー２７Ｆ
配列番号１１７  ＰＣＲ用アンチセンスプライマー１３２Ｒ
配列番号１１８  ＰＣＲ用アンチセンスプライマー３４１Ｒ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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