(57)【要約】【課題】ＤＮＡワクチンの有用性を拡大するために、ＤＮＡワクチンの投与により産生した抗原量を生体内で検出するための手段を提供することが本発明の課題である。【解決手段】針無注射器を用いてＤＮＡワクチンを投与すると、ＤＮＡワクチンの細胞への導入効率が高まるために、投与されたＤＮＡワクチンから産生される抗原量が増加した。よって、投与されたＤＮＡワクチンから産生される抗原を通常の酵素抗体法の手段により生体内で測定することが可能となった。本発明の方法はＤＮＡワクチンの有用性を拡大するために資するものと考えられる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
針無注射器を用いてＤＮＡワクチンを投与することにより、通常の針付注射器による投与と比較して当該ＤＮＡワクチンから産生される抗原量を増加させることを特徴とする、ＤＮＡワクチンから産生される抗原量を増加させる方法。
【請求項２】
針無注射器を用いて前記ＤＮＡワクチンの細胞への導入効率を高めることにより、当該ＤＮＡワクチンから産生される抗原量が増加していることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記針無注射器がジェット噴射式針無注射器であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡワクチンを筋肉内投与することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記抗原量が抗原の検出手段の検出限界以上であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記検出手段が、通常の酵素抗体法であることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
針無注射器を用いてＤＮＡワクチンを投与することにより、通常の針付注射器による投与と比較して当該ＤＮＡワクチンから産生される抗原量を増加させることを特徴とする、ＤＮＡワクチンの投与方法。
【請求項８】
針無注射器を用いて前記ＤＮＡワクチンの細胞への導入効率を高めることにより、当該ＤＮＡワクチンから産生される抗原量が増加していることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記針無注射器がジェット噴射式針無注射器であることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡワクチンを筋肉内投与することを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記抗原量が抗原の検出手段の検出限界以上であることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
前記検出手段が、通常の酵素抗体法の手段であることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
針無注射器を用いてＤＮＡワクチンを投与し、その後に当該ＤＮＡワクチンによって産生された抗原を検出することを特徴とする、ＤＮＡワクチンが産生した抗原を検出する方法。
【請求項１４】
前記針無注射器がジェット噴射式針無注射器であることを特徴とする、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡワクチンを筋肉内投与することを特徴とする、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記抗原量が抗原の検出手段の検出限界以上であることを特徴とする、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
前記検出手段が、通常の酵素抗体法であることを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、針無注射器を用いてＤＮＡワクチンを投与することにより細胞への導入効率を高め、よって投与されたＤＮＡワクチンから産生される抗原量を増加させる方法に関する。更に本発明は、投与されたＤＮＡワクチンから産生された抗原量を増加させるようなＤＮＡワクチンの投与方法に関する。更に本発明は針無注射器を用いてＤＮＡワクチンを投与し、そのＤＮＡワクチンから産生される抗原量を検出する方法に関する。本発明の方法によれば、投与されたＤＮＡワクチンから産生された抗原を通常の酵素抗体法の手段により生体内で検出することができる。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡワクチンは、ウイルス遺伝子断片などの目的とする抗原の遺伝子を、発現プラスミドに組み込んで作製したワクチンである。ＤＮＡワクチンの遺伝子は被接種者の細胞内で発現して蛋白抗原を産生し、その蛋白抗原に対する免疫の産生を誘導することにより特異的な免疫応答を引き起こすと考えられている。ＤＮＡは安定な物質であり、遺伝子の複製技術を用いることにより大量に安価で提供することが可能であるのでＤＮＡワクチンの実用性は高く、次世代のワクチンとしてＤＮＡワクチンの応用範囲の拡大が期待されている。
【０００３】
ところでＤＮＡワクチンは一般的には筋肉内に投与されるが、筋肉に投与されたＤＮＡワクチンからどの程度の病原体抗原が産生されているかを測定することはこれまでできなかった。通常の針付注射器（シリンジ注射器）による投与では抗原産生量が微量であるために、現在確立されている抗原測定技術では検出限界以下であるからである。しかし、ＤＮＡワクチンが抗体を誘導する原理を証明するために、またワクチンの検定や混合ワクチンを作製する際のドーズ調整を行うために、ＤＮＡワクチンにより産生した抗原量を生体内で捉える必要があった。
【０００４】
ＤＮＡワクチンが作用するための機構を解析するために、ＤＮＡワクチンの遺伝子が発現して蛋白抗原が産生していることを証明する実験は、主としてインビトロの系で行われてきた。そしてインビボでの数少ないこれまでの知見は殆どがリポーター遺伝子を用いたものであり（非特許文献１、非特許文献２）、ウイルスの抗原については、その遺伝子を皮膚の細胞に導入した際の遺伝子発現が、免疫組織学的な手法で証明されているだけであった（非特許文献３）。
【０００５】
ところで近年、注射器先端部の突端に設けられたジェット噴射口から強い圧力で薬液をジェット噴射することにより、注射針を使わずに薬液を皮膚から体内に注入することが可能な、ジェット噴射式針無注射器が開発されてきている。このジェット噴射式針無注射器は、殆ど無痛で薬液を簡単に注射することができるので、例えば糖尿病患者が日常的にインスリンを自分で注射（自己注射）するのにも使われている。
【０００６】
これまでの検討において針無注射器を用いてＤＮＡワクチンを投与することにより、ＤＮＡワクチンの取り込みの増加（非特許文献４）や動物において誘導される抗体レベルが上昇すること（非特許文献５、非特許文献６）が近年報告されてきている。それは、針無注射器を使用して投与されたワクチンＤＮＡが効率良く細胞内に導入されるために、通常の針付注射器より多くの細胞にワクチンＤＮＡが導入されるためであると考えられる。これまでにおいて、ＤＮＡワクチンの針無注射器による抗体産生増強を示唆する知見は得られていたが、その知見は抗体産生増強という現象に留まっており、ＤＮＡワクチンから産生された抗原を検出することには成功していなかった。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｗｏｌｆｆ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９０）  ｖｏｌ．２４７，  ｐｐ１４６５−８
【非特許文献２】
Ｄａｖｉｓ  ＨＬ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  （１９９３）  ｖｏｌ．４，  ｐｐ１５１−９
【非特許文献３】
Ｒａｚ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  （１９９４）  ｖｏｌ９１，  ｐｐ９５１９−２３
【非特許文献４】
Ｍａｎａｍ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  （２０００）  ｖｏｌ４３，  ｐｐ２７３−８１
【非特許文献５】
Ｇｒａｍｚｉｎｓｋｉ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  （１９９８）  ｖｏｌ４，  ｐｐ１０９−１８
【非特許文献６】
Ａｇｕｉａｒ  ＪＣ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  （２００１）  ｖｏｌ２０，  ｐｐ２７５−８０
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
よって、ＤＮＡワクチンの有用性を拡大するために、ＤＮＡワクチンの投与により生体内で産生した抗原量を検出することを可能とする手段を提供することが本発明の課題である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討を行った結果、針無注射器を用いてＤＮＡワクチンを投与することにより、筋肉内におけるＤＮＡワクチンの抗原産生量を、現在の酵素免疫測定法の抗原測定技術で検出可能なレベルにまで上昇させることに成功した。よって本発明は、針無注射器を用いてＤＮＡワクチンを投与して細胞への導入効率を高めることにより、そのＤＮＡワクチンが産生する抗原産生量を増加させる方法を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
下記の実施例において示すように、本発明者らは通常の針付注射器（シリンジ注射器）および針無注射器を用いて、種々の病原体（日本脳炎ウイルス中山株、デング２型ウイルスニューギニアＣ株、デング１型ウイルス望月株）に対するＤＮＡワクチンを筋肉内に投与した。筋肉を経時的に採取し、生成した抗原量を酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。その結果、日本脳炎ウイルス中山株のＤＮＡワクチンについて、ジェット噴射式針無注射器を用いて投与したＤＮＡワクチンに由来するウイルスエンベロップ抗原（Ｅ抗原）を検出することができた。一方針付注射器を用いて投与した場合には抗原を検出することはできなかった。よって針無注射器でＤＮＡワクチンを投与することにより、投与されたＤＮＡワクチンから生成する抗原を検出することが可能となった。
【００１１】
なお本検討で使用したＤＮＡワクチンは、分泌型の抗原を作製することができるので、ＤＮＡをベロ細胞にトランスフェクトして培地に放出された抗原を検討することにより、インビトロの抗原産生量を検討した。その結果、インビトロの抗原産生量と筋肉中に生成したインビボの抗原産生量の間には良い相関関係が認められた。更に抗原産生量と中和抗体の産生量との関係を検討するために、中和抗体産生量についても併せて検討を行ったところ、中和抗体の産生量と抗原産生量の間についても良い相関関係が認められた。
【００１２】
下記の実施例においてはＤＮＡワクチンとして、日本脳炎ウイルス中山株、デング２型ウイルスニューギニアＣ株、デング１型ウイルス望月株に対するＤＮＡワクチンを使用した。しかし投与されるＤＮＡワクチンはそれに限定されるものではなく、他の病原体に対するＤＮＡワクチンを針無注射器で投与するという態様も本発明の範囲内に含まれるものである。そのようなＤＮＡワクチンには、種々のウイルスに起因する感染症に対するＤＮＡワクチンのみならず、種々の細菌や寄生虫に起因する感染症に対するＤＮＡワクチンなども含まれる。
【００１３】
本発明において使用される針無注射器は、特に限定されるものではなく、医療目的などにおいて一般的に使用されているものと中心として、注入するＤＮＡワクチンの量やＤＮＡワクチンを注入する組織に合わせて種々のものを採用することができる。なおジェット噴射式針無注射器（ｎｅｅｄｌｅ−ｆｒｅｅ  ｊｅｔ  ｉｎｊｅｃｔｏｒ）を使用することは本発明において特に好ましい態様である。本発明の目的における使用に適した針無注射器の例としては、島津製作所から提供されるシマジェット、バイオインジェクト社から提供されるバイオインジェクター２０００、メディジェクト社から提供されるメディジェクターチョイス、アクティバブランドプロダクト社から提供されるアドバンタジェットアクティバ、マーダインターナショナル社から提供されるマーダジェットＸＬなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。なお、外来遺伝子を導入する目的で遺伝子銃（ジーンガン）による投与方法が用いられているが、本発明の針無注射器は所謂「ジーンガン」とは異なっており、それを意味するものではない。
【００１４】
またＤＮＡワクチンを針無注射器により投与する経路は特に限定されるものではない。ＤＮＡワクチンは一般的には筋肉内投与又は皮内投与の経路により投与されるので、かかる投与経路を採用することは本発明において好ましく、ＤＮＡワクチンを筋肉内投与することは特に好ましい。しかし、ＤＮＡワクチンとしての効果を得ることができるならば、必要に応じて他の経路により投与することも理論的には可能である。
【００１５】
本発明において、ＤＮＡワクチンの投与により産生した抗原の産生量を測定する。その手段としては、手間と感度を考えると、本技術分野において抗原の測定に汎用されている酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）を用いることが好ましい。
【００１６】
なお本発明における「検出限界」とは、上記の酵素抗体法により抗原を検出する際の技術的な検出限界を意味するものである。酵素抗体法は微量の抗原を検出するための優れた方法であって、ｎｇ／ｍｌのオーダーという微量の抗原を検出することが可能である。通常のＥＬＩＳＡ法における検出限界は多くの場合には０．１  ｎｇ／ｍｌ程度であり、ジェット噴霧式針無注射器により投与されたＤＮＡワクチンから生成する抗原濃度がそれ以上であるであるならば、その抗原を検出することが可能である。
【００１７】
針無注射器でＤＮＡワクチンを投与することにより、投与されたＤＮＡワクチンから生成する抗原の量が増加するために抗原を検出することが可能となった。なお本発明において産生される抗原量が増加するとは、通常の針付注射器（シリンジ注射器）により投与した場合と比較して増加していることを意味するものである。検出された抗原の量が、インビトロの抗原産生量と中和抗体の力価と相関していたという知見は、ＤＮＡワクチンの作用がそのＤＮＡから生成した抗原によって誘導された中和抗体を介して起こるという考えを支持するものであり、ＤＮＡワクチンが中和抗体を誘導する原理に関する有用な知見を与えるものである。
【００１８】
ところで、デング４価ワクチンなどの混合ＤＮＡワクチンを開発する際に、当該ワクチン中で組み合わせる各ＤＮＡ成分のドーズを調整する必要あり、そのようなドーズ調整はＤＮＡワクチンがその効果を適切に発揮しうるかを決定する鍵となりうる。しかし、それぞれのＤＮＡ成分から産生される抗原量が異なっているために、混合ＤＮＡワクチンにおいて各ＤＮＡ成分のドーズを適切に調整し、必要とする中和抗体誘導能を得ることは容易ではなかった。よって、ドーズ調整のためにはＤＮＡワクチンにより産生した抗原量を生体内で測定する必要があったが、本発明はそれを可能とする技術を初めて提供するものである。
【００１９】
更にＤＮＡワクチンの有効性を検定する際に、投与されたＤＮＡワクチンから対応する抗原が生成していることを確認することが好ましい。本発明の方法はかかるＤＮＡワクチンの検定の目的においても非常に有用であると考えられる。
下記の実施例や図面を用いて本発明を更に詳しく説明するが、その記載は本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００２０】
【実施例】
ＤＮＡワクチンとして、日本脳炎ウイルス中山株ｐｒＭ／Ｅ遺伝子をｐｃＤＮＡ３ベクターに組み込んで作製したｐｃＪＥＭＥと、デング１型ウイルスニューギニアＣ株ｐｒＭ／Ｅ遺伝子をｐｃＤＮＡ３ベクターに組み込んで作製したｐｃＤ１ＭＥと、デング２型ウイルス望月株のｐｒＭ／Ｅ遺伝子をｐｃＤＮＡ３ベクターに組み込んで作製したｐｃＤ２ＭＥとを用いた。なお、ｐｃＪＥＭＥの塩基配列を配列表の配列番号１に、ｐｃＤ１ＭＥの塩基配列を配列表の配列番号２に、ｐｃＤ２ＭＥの塩基配列を配列表の配列番号３に、それぞれ示す。
【００２１】
４週齢のＩＣＲマウス（各群６から１２匹）を用いて、５０μｇのＤＮＡを大腿部に針無注射器または通常の針付注射器により接種した後、４日目まで毎日筋肉を採取した。なお針無注射器としてはシマジェット（島津製作所）を使用した。筋肉を１０％磨砕液とし、サンドイッチＥＬＩＳＡにより抗原量を測定した。インビトロでの抗原産生量を比較するため、２μｇのＤＮＡをベロ細胞にトランスフェクトし、４日目まで毎日培養液を採取し、培養液中の抗原量をサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。また、１００μｇのＤＮＡで免疫したマウスの血清中の中和抗体価を、接種後１８週まで経時的に測定した。
【００２２】
図１は、針無注射器で５０μｇのｐｃＪＥＭＥ（●で示す）、ｐｃＤ１ＭＥ（▲で示す）、ｐｃＤ２ＭＥ（□で示す）を投与した筋肉内に産生された抗原量の経時変化のグラフである。なおここで示した値は、ＥＬＩＳＡ法により測定した各ウイルスのＥ抗原の量である。針無注射器で投与した場合、１日目および２日目に１ｎｇ／ｍｌの抗原が検出できたが、３日目以降この抗原量は低下した。また、ｐｃＤ１ＭＥ、ｐｃＤ２ＭＥ投与群において抗原は検出されなかった。一方５０μｇのｐｃＪＥＭＥを通常の針付注射器により接種した場合、接種後４日目まで抗原は検出されなかった。この結果は、針無注射器でＤＮＡワクチンを投与することにより、筋肉内において抗原産生量が増加していることを示す。
【００２３】
インビボの抗原産生量（図１）とインビトロの抗原産生量が相関しているかを調べるために、各々のＤＮＡワクチンでトランスフェクトしたベロ細胞における抗原産生量を検討した。図２は、２μｇのｐｃＪＥＭＥ（●で示す）、ｐｃＤ１ＭＥ（▲で示す）、ｐｃＤ２ＭＥ（□で示す）をトランスフェクトしたベロ細胞の培養液に放出された、インビトロの抗原産生量の経時変化を示すグラフである。インビトロにおける抗原産生量は、ｐｃＪＥＭＥおよびｐｃＤ２ＭＥにおいて検出することができた。なお、３種のＤＮＡワクチンの抗原産生量は、ｐｃＪＥＭＥ  ＞  ｐｃＤ２ＭＥ  ＞  ｐｃＤ１ＭＥの順であった。
【００２４】
また、３つのプラスミドの抗体中和抗体価を比較した。図３は、１００μｇのｐｃＪＥＭＥ（●で示す）、ｐｃＤ１ＭＥ（▲で示す）、ｐｃＤ２ＭＥ（□で示す）を、通常の針付注射器または針無注射器で接種したマウスに誘導された中和抗体価の経時変化を示すグラフである。なお図３の上段は針無注射器により接種した結果を、下段は通常の針付注射器を用いて接種した結果をそれぞれ示す。その結果、３種のＤＮＡワクチンにより誘導された中和抗体価は、接種後２週から１１週目までｐｃＪＥＭＥ  ＞  ｐｃＤ２ＭＥ  ＞  ｐｃＤ１ＭＥの順であった。また、針無注射器で投与した群は、通常の針付注射器により接種した群より高い中和抗体価を誘導した。特にｐｃＤ１ＭＥにより誘導された中和抗体価は、針無注射器により接種した場合には通常の針付き注射器を用いて接種した場合と比較して、３２倍もの高い中和抗体価を示した。なおいずれの投与システムにおいても、免疫開始から５週目で中和抗体価は最大となった。
【００２５】
以上の結果は、針無注射器でＤＮＡワクチンを筋肉内に投与することにより、産生されるウイルス抗原が検出レベルまで上昇したことを示すものである。また、針無注射器投与法により投与されたＤＮＡワクチンからインビボまたはインビトロにおいて産生された抗原産生量は、誘導された中和抗体の力価と良く相関していた。
【００２６】
【発明の効果】
針無注射器を用いてＤＮＡワクチンを投与すると、ＤＮＡワクチンの細胞への導入効率が高まるために、投与されたＤＮＡワクチンから産生される抗原量が増加した。よって、投与されたＤＮＡワクチンから産生される抗原量を通常の酵素抗体法の手段により生体内で測定することが可能となった。本発明の方法はＤＮＡワクチンの有用性を拡大するために資するものと考えられる。
【００２７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、種々のＤＮＡワクチンを針無注射器で筋肉内に投与した際にインビボで産生された抗原量の経時変化を示すグラフである
【図２】図２は、種々のＤＮＡワクチンによりトランスフェクトされたベロ細胞の培養液に放出された、インビトロの抗原産生量の経時変化を示すグラフである
【図３】図３は、種々のＤＮＡワクチンを通常の針付注射器または針無注射器で接種したマウスにおいて誘導された、中和抗体価の経時変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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