(57)【要約】【課題】            真皮線維芽細胞，表皮細胞の両方に作用して、シワやハリの低下といった皮膚の老化症状の予防，改善効果、表皮水分量の増加効果、表皮状態の改善効果に優れた皮膚外用剤を提供する。【解決手段】        コラーゲン中の主要構成アミノ酸成分であるヒドロキシプロリン若しくはヒドロキシプロリンのアシル化誘導体又はその塩と、カイネチンを併用して皮膚外用剤に配合する。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシプロリン若しくはヒドロキシプロリンのアシル化誘導体又はその塩と、カイネチンとを含有して成る、皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真皮線維芽細胞，表皮細胞の両方に作用して、シワやハリの低下といった皮膚の老化症状の予防，改善効果、表皮水分量の増加効果、表皮状態の改善効果に優れた皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、加齢，紫外線曝露等によリ、皮膚の角質層及び表皮細胞，真皮細胞がダメージを受け、表皮の細胞数が減少、表皮細胞の代謝が低下して皮膚のターンオーバー速度が遅くなり、真皮においてはヒアルロン酸の減少、コラーゲンやエラスチンなどの変性が起こり、しわの形成や弾性の低下といった皮膚の老化や肌荒れ症状の原因となることが知られている。これらの進行を防止あるいは改善するため、多くの皮膚外用剤が提案されてきた。最近では自然志向及び植物志向を反映してか、植物抽出成分において、真皮マトリックスの構成成分であるコラーゲンやエラスチン，ヒアルロン酸等の分解を抑制したり、これらの産生を促進したりする成分、表皮細胞や真皮線維芽細胞を賦活化する成分の検索が盛んに行われている。
【０００３】
たとえば、表皮細胞を賦活化する成分としては、パセリ抽出物とブナの木抽出物の併用（特許文献１参照）等が開示されている。また、線維芽細胞の賦活或いは増殖促進剤としては、ビワ抽出物（特許文献２参照），α-ヒドロキシ酢酸（特許文献３参照），α-ヒドロキシ酸のステロールエステル（特許文献４参照），6-ベンジルアミノプリン（特許文献５参照），特定のリボヌクレアーゼ（特許文献６参照），L-リシル-L-グリシル-L-ヒスチジン（特許文献７参照），乳汁由来線維芽細胞増殖因子（特許文献８参照），酸化型コエンザイムＡ（特許文献９参照）、アーモンド、セイヨウタンポポ、セイヨウニワトコ、センキュウ、センブリ、ソウハクヒ、トウニン、ニンジン、ホップ、ムクゲ、ヨクイニン（特許文献１０参照）等が、コラーゲン代謝改善剤としてはケイ酸関連物質（特許文献１１参照）が、コラーゲン合成促進剤としてはグリシン，プロリン，アラニン併用系（特許文献１２参照）が、ヒアルロン酸産生促進剤としては、牛血清の分子量５，０００以下の低分子量画分（特許文献１３参照），酵母エキス（特許文献１４参照）等が開示されている。
【０００４】
ヒドロキシプロリン若しくはそのアシル化誘導体又はその塩を化粧料については、その老化抑制，肌質改善効果（特許文献１５参照）、及び水溶性ビタミン，油溶性ビタミン，高分子ペプチド，高分子多糖，スフィンゴ脂質及び海草エキスとの併用（特許文献１６参照）が既に知られている。
【０００５】
一方、カイネチンは、植物ホルモンとして知られており、皮膚外用剤に配合した場合の保湿効果（特許文献１７参照）、皮膚老化防止効果（特許文献１８参照）、育毛効果（特許文献１９参照）、美白効果（特許文献２０参照）等が知られている。
【０００６】
【特許文献１】特開平１１−３３５２５７号公報
【特許文献２】特公平５−１７２０６号公報
【特許文献３】特開平５−１１２４２２号公報
【特許文献４】特開平８−１０４６３２号公報
【特許文献５】特開平７−２３３０３７号公報
【特許文献６】特開平７−３０９７７８号公報
【特許文献７】特開平７−３１６１９２号公報
【特許文献８】特開平８−１１９８６７号公報
【特許文献９】特開平８−１７５９６１号公報
【特許文献１０】特開平１０−３６２７９号公報
【特許文献１１】特開平７−１８８０３６号公報
【特許文献１２】特開平７−１９４３７５号公報
【特許文献１３】特開平８−２３９４０４号公報
【特許文献１４】特開平８−１６３９８３号公報
【特許文献１５】ＷＯ００／５１５６１号公報
【特許文献１６】特開２００２−８０３２１号公報
【特許文献１７】特開昭４８−３９６４６号公報
【特許文献１８】特表平１０−５１０２４０号公報
【特許文献１９】特開平６−２１１６３２号公報
【特許文献２０】特開２００１−３１５４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記した細胞賦活効果を有する成分等の中には、作用効果が不十分であったり、安定性が悪かったりして、皮膚外用剤基剤中に含有させた場合、有効な効果を得るにはかなりの量を含有させなければならないものも存在していた。また、好ましくない副作用や刺激性等を有していたり、製剤安定性に悪影響を及ぼすものや、臭いや色の点で外用剤に配合しにくいもの、一定の作用，品質を維持することの困難なものも多かった。
【０００８】
そこで本発明においては、真皮線維芽細胞，表皮細胞の両方に作用して、シワやハリの低下といった皮膚の老化症状の予防，改善効果、表皮水分量の増加効果、表皮状態の改善効果に優れた皮膚外用剤を得ることを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するべく種々検討したところ、ヒドロキシプロリン若しくはヒドロキシプロリンのアシル化誘導体又はその塩と、カイネチンとを併用して皮膚外用剤に配合することにより、真皮線維芽細胞，表皮細胞の両方に作用して、シワやハリの低下といった皮膚の老化症状の予防，改善効果、表皮水分量の増加効果、表皮状態の改善効果を発揮することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、真皮線維芽細胞，表皮細胞の両方に作用して、シワやハリの低下といった皮膚の老化症状の予防，改善効果、表皮水分量の増加効果、表皮状態の改善効果に優れた皮膚外用剤を得ることができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ヒドロキシプロリンは、コラーゲン中の主要構成アミノ酸成分として、また、エラスチンの構成アミノ酸成分として自然界に広く存在する。天然に存在するヒドロキシプロリンとしては、プロリンがＤ体かＬ体か、水酸基の位置が３位か４位か、およびその立体異性体がシス体かトランス体かによって、８種類の立体異性体が知られている。通常は、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが一般的であり、他の立体異性体の存在は自然界では極めて限定されている。
【００１２】
本発明で用いるヒドロキシプロリンは、その基原を問わず、豚や牛等の動物由来のコラーゲンより精製したものや、微生物を用いて製造したものを用いることができる。ここで、動物由来のヒドロキシプロリンを用いる場合は、動物由来のウイルスや、狂牛病の原因タンパク質であるプリオン等の混入に充分注意する必要がある。そこで、本発明においては、微生物を用いて製造したものを用いることが好ましい。
【００１３】
微生物としては、アミコラトプシス（Amycolatopsis）属、ダクチロスポランジウム（Dactylosporangium）属、及びストレプトマイセス（Streptomyces）属から選ばれる属に属する微生物由来のプロリン３位水酸化酵素またはプロリン４位水酸化酵素遺伝子を導入された微生物等を用いることができる。アミコラトプシス属、ダクチロスポランジウム属およびストレプトマイセス属から選ばれる属に属する微生物由来のプロリン３位水酸化酵素またはプロリン４位水酸化酵素遺伝子を微生物へ導入することにより行う方法は，文献公知である。
【００１４】
例えば、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは、アミコラトプシス属またはダクチロスポランジウム属より単離したプロリン４位水酸化酵素（特開平７−３１３１７９号公報）を用い製造することができ、また、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは、ストレプトマイセス属より単離したプロリン３位水酸化酵素（特開平７−３２２８８５号公報）を用い製造することもできる〔バイオインダストリー, 14, 31 (1997)〕。
【００１５】
本発明で用いるヒドロキシプロリンのアシル化誘導体のアシル部分としては、例えば、炭素数２〜２３の直鎖または分岐状のアシルがあげられ、より具体的には、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル、デカノイル、エイコサノイル、ラウロイル等があげられるが、中でも、アセチル、プロピオニルが好ましい。
【００１６】
ヒドロキシプロリンのアシル化誘導体は、公知の方法により製造することができる。例えば、炭素数１〜２２のアルキル基を有する脂肪酸の活性誘導体（酸無水物、酸塩化物等）を用い、ヒドロキシプロリンを水性媒体中または有機溶媒中でアシル化することにより調製することができる。得られたヒドロキシプロリンのアシル化誘導体は、そのままでも、また結晶化、クロマトグラフィー等の通常の精製法を用いて精製したものを用いてもよい。
【００１７】
ヒドロキシプロリンもしくはヒドロキシプロリンのアシル化誘導体の塩における塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等のアンモニウム塩、モルホリン、ピペリジン等の付加した有機アミン付加塩等があげられる。
【００１８】
本発明の皮膚外用剤において、シス／トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ／Ｄ−プロリン、シス／トランス−３−ヒドロキシ−Ｌ／Ｄ−プロリン等のヒドロキシプロリンもしくはヒドロキシプロリンのアシル化誘導体またはその塩は、単独または混合して用いることができる。
【００１９】
これらヒドロキシプロリンもしくはそのアシル化誘導体又はその塩の皮膚外用剤中の配合量は、目的とする効果に応じて特に限定されないが、全重量に対し、好ましくは０.０１〜５重量％、より好ましくは０.１〜５重量％、さらに好ましくは０.５〜３重量％配合することができる。５重量％以上配合しても、本発明の効果の向上は認められない。
【００２０】
本発明で用いるカイネチンは、プリンの誘導体で、６−フルフリルアミノプリンとも呼ばれるものである。本発明のカイネチンは、化学的に合成され、例えば、アデニンとフルフリルクロライドとの反応、６−メチルメルカプトプリンとフルフリルアミンとの反応などによって得られる。また、カイネチンは、例えば、ニシンの精子などのＤＮＡを多量に含む天然物を高圧加熱することによっても得ることができる。このように本発明のカイネチンは、化学合成法により合成されたものやＤＮＡを多量に含む天然物の高圧加熱物のいずれでも使用可能である。
【００２１】
カイネチンの皮膚外用剤中の配合量は、目的とする効果に応じて特に限定されないが、全重量に対し、好ましくは０.０１〜５重量％、より好ましくは０.１〜５重量％、さらに好ましくは０.５〜３重量％配合することができる。５重量％以上配合しても、本発明の効果の向上は認められない。
【００２２】
本発明に係る皮膚外用剤は、ローション剤，乳剤，ゲル剤，クリーム剤，軟膏剤，粉末剤，顆粒剤等、種々の剤型で提供することができる。また、化粧水，乳液，クリーム，美容液，パック等の皮膚化粧料、メイクアップベースローション，メイクアップベースクリーム等の下地化粧料、乳液状，油性，固形状等の各剤型のファンデーション，アイカラー，チークカラー等のメイクアップ化粧料、クレンジングクリーム，クレンジングローション，クレンジングフォーム，洗顔石鹸，ボディシャンプー等の皮膚洗浄料、ヘアーシャンプー，ヘアーリンス，ヘアートリートメント等の毛髪用化粧料等としても提供することができる。
【００２３】
なお、本発明に係る皮膚外用剤には、ヒドロキシプロリン若しくはヒドロキシプロリンのアシル化誘導体又はその塩と、カイネチンのほかに、油性成分，界面活性剤，保湿剤，顔料，紫外線吸収剤，抗酸化剤，香料，防菌防黴剤等の一般的な医薬品及び化粧料用原料や、抗炎症剤，美白剤等の生理活性成分を含有させることができる。
【実施例】
【００２４】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。実施例の説明に先立ち本発明で用いた効果試験方法について説明する。
【００２５】
［使用試験］
本発明の実施例１〜実施例４について使用試験を行い、（１）皮膚老化症状改善効果、（２）水分量改善効果、（３）表皮肌質改善効果を評価した。同時に、実施例１に於いて配合したカイネチン若しくはヒドロキシ-L-プロリンをそれぞれ精製水に代替して乳剤を調製し、それぞれ比較例１，比較例２として、使用試験を行った。使用試験は、各試料について３０〜６０才代の男女計２０名を一群としてブラインドにて１カ月間使用させ、使用前後の皮膚状態の変化を観察して評価した。
【００２６】
（１）老化症状改善効果
皮膚の老化症状の指標として、皮膚のしわ，きめ，はりの３項目を選び、しわ，きめについては写真撮影により観察し、改善状況を評価した。皮膚のはりについては、皮膚弾性の測定により評価した。改善状況は、「改善」，「やや改善」，「変化なし」の三段階で評価し、表１に各評価を得たパネラー数にて示した。
【００２７】
（２）表皮水分量改善効果
被験者のうち１０名に対し使用試験開始前後の塗布部位の水分量を測定し、水分量の差の平均値比較することにより評価した。水分量は、スキコン−２００（アイ・ビー・エス社製）を用い、プローブを被検部位に垂直にあてて肌伝導度（＝水分含量）を測定した。測定値が高いほど水分含量が高いことを示す。被検部位の肌の伝導度変化（相対伝導度）は、無処理部位の伝導度変化に対する相対値として、下記式に従って相対伝導度（％）を算出し平均点を水分量とした。
相対伝導度（％）＝（被検部位の１ヵ月後の伝導度／被検部位の試験前の伝導度）／（無処理部位の１ヵ月後の伝導度／無処理部位の試験前の伝導度）×１００
【００２８】
（３）表皮肌質改善効果
水分量の測定を行わなかった被験者１０名に対し使用試験開始前後の塗布部位のシリコンレプリカ〔商品名「スキンキャスト」使用、山田粧業社製〕を作製し、下記基準により肌状態のスコアを求め肌質改善効果を評価し、平均値を算出した。
肌状態スコア：
スコア１：肌の皮溝が不鮮明であり、はがれた角質が認められる。
スコア２：肌の皮溝がやや不鮮明であるかまたは一方向性が強い。
スコア３：肌の皮溝は認められるが、浅いかまたは一方向性が強い。
スコア４：肌の皮溝が認められるかまたはやや網目状である。
スコア５：肌の皮溝がはっきり認められるかまたはきれいな網目状である。
【００２９】
［実施例１］  乳剤
(１)（ヒドロキシステアリン酸／イソステアリン酸）        ０．５０(重量％)
ジペンタエリスリチル
(２)トリイソステアリン酸グリセリル                    ２０．００
(３)スクワラン                                          ８．００
(４)ジステアリン酸デカグリセリル                        ４．００
(５)ミツロウ                                            １．００
(６)水素添加大豆リン脂質                                ０．５０
(７)ベヘニルアルコール                                  ０．２０
(８)グリセリン                                        １０．００
(９)トリ（大豆由来脂肪酸）グリセリル                    ２．００
(10)ヤシ油                                              ６．００
(11)カイネチン                                          ０．１０
(12)1,3-ブチレングリコール                              ５．５０
(13)水酸化カリウム(１０重量％水溶液)                    ２．００
(14)精製水                                            ３９．９０
(15)カルボキシビニルポリマー                            ０．２０
(16)パラオキシ安息香酸エステル                          ０．１０
(17)N-ステアロイル-L-グルタミン酸ナトリウム             ０．２０
(18)ポリアクリル酸ナトリウム(０．２５重量％水溶液)      ０．５０
(19)グリチルリチン酸ジカリウム                          ０．０５
(20)ヒドロキシ-L-プロリン                               ０．５０
製法：（１）〜（11）の油相成分を混合し、加熱溶解して７５℃とする。一方、（12）〜（18）の水相成分を混合，溶解して７５℃とする。これに前記油相を加えてホモミキサーにて均一に乳化し、冷却後４０℃で(19)，(20)を添加し、混合する。
【００３０】
［実施例２］  ローション剤
(１)エタノール                                      ２０．００(重量％)
(２)ポリオキシエチレン(60EO)硬化ヒマシ油              １．００
(３)パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１０
(４)ジプロピレングリコール                            ５．００
(５)1,3-ブチレングリコール                          １０．００
(６)精製水                                          ６２．７０
(７)グリセリン                                        ０．５２
(８)1,3-ブチレングリコール                            ０．２０
(９)カイネチン                                        ０．０１
(10)水酸化ナトリウム(１０重量％水溶液)                ２．００
(11)クエン酸(１０重量％水溶液)                        ２．８０
(12)精製水                                            ０．２５
(13)カルボキシビニルポリマー                          ０．０１
(14)モノラウリン酸ポリオキシエチレン(20EO)ソルビタン  ０．０１
(15)ヒドロキシ-L-プロリン                             ０．２０
製法：（６）に（１）〜（５）及び(７)〜(15)を順次添加して混合，溶解する。
【００３１】
［実施例３］  水中油型クリーム剤
(１)ミツロウ                                          ６．００（重量％）
(２)セタノール                                        ５．００
(３)還元ラノリン                                      ８．００
(４)スクワラン                                      ２７．５０
(５)グリセリル脂肪酸エステル                          ４．００
(６)親油型グリセリルモノステアリン酸エステル          ２．００
(７)ポリオキシエチレン(20EO)ソルビタン                ５．００
モノラウリン酸エステル
(８)プロピレングリコール                              ５．００
(９)パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１０
(10)精製水                                          ３６．２０
(11)グリセリン                                        ０．５２
(12)1,3-ブチレングリコール                            ０．２０
(13)精製水                                            ０．２５
(14)カルボキシビニルポリマー                          ０．０１
(15)モノラウリン酸ポリオキシエチレン(20EO)ソルビタン  ０．０１
(16)カイネチン                                        ０．０１
(17)ヒドロキシ-L-プロリン                             ０．２０
製法：(１)〜(７)の油相成分を混合，溶解して７５℃とする。一方、(８)〜(10)を混合，溶解し、７５℃に加熱する。次いで、この水相成分に前記油相成分を添加して予備乳化した後、ホモミキサーにて均一に乳化する。撹拌しながら冷却し、４０℃にて予め混合しておいた(11)〜(17)の成分を添加して、混合する。
【００３２】
［実施例４］  油中水型エモリエントクリーム
(１)流動パラフィン                                  ３０．００（重量％）
(２)マイクロクリスタリンワックス                      ２．００
(３)ワセリン                                          ５．００
(４)ジグリセリルジオレイン酸エステル                  ５．００
(５)L-グルタミン酸ナトリウム                          １．６０
(６)L-セリン                                          ０．４０
(７)ヒドロキシ-L-プロリン                             ０．５０
(８)プロピレングリコール                              ３．００
(９)パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１０
(10)精製水                                          ５１．３０
(11)香料                                              ０．１０
(12)イソステアリン酸ソルビタン                        ０．５０
(13)パルミチン酸オクチル                              ０．２９
(14)トリベヘン酸グリセリル                            ０．２０
(15)カイネチン                                        ０．０１
製法：(5)，(6)を(10)の一部に溶解して５０℃とし、あらかじめ５０℃に加温した(4)に撹拌しながら徐々に添加する。これをあらかじめ混合し、７０℃に加熱溶解した(1)〜(3)に均一に分散する。これに、(７)〜(９)を(10)の残部に添加し、７０℃に加熱したものを撹拌しながら加え、ホモミキサーにて乳化する。冷却後、４０℃にて予め混合しておいた(11)〜(15)の成分を添加して、混合する。
【００３３】
老化症状改善効果の評価結果を表１に示す。表１から明らかなように、ヒドロキシプロリン若しくはカイネチンを単独で配合した比較例使用群のそれぞれにおいても、ある程度のしわ及び皮膚弾性の改善傾向が認められていたが、両成分を併用して配合した実施例使用群においては、比較例使用群に比べて、明確な改善を認めた被験者の数が多くなっていた。
【００３４】
【表１】
2005068070.tif 000002
【００３５】
水分量改善効果及び表皮肌質改善効果の測定結果は、表２に示した通り、ヒドロキシプロリン若しくはカイネチンを単独で配合した比較例使用群のそれぞれにおいても、ある程度の水分量の増加傾向及び肌質改善傾向が認められていたが、両成分を併用して配合した実施例使用群においては、比較例使用群に比べて、明確な水分量の増加ならびに肌質改善が認められた。
【００３６】
【表２】
2005068070.tif 000003
【００３７】
なお実施例１〜実施例４については、２５℃で６カ月間保存した場合において状態の変化は全く認められず、男性被験者３０名による４８時間の背部閉塞貼付試験においても、問題となる皮膚刺激性反応は認められなかった。