(57)【要約】  【課題】    DNA分子等の誘電体高分子を無修飾かつ折り畳まれていないひもの状態でレーザートラップを使って継続的にトラップすることは実験的にも理論的にも不可能であるとされてきた。レーザートラップ技術による光ピンセットで代表される光学的操作技術を用いて、対象高分子を捕捉し、移動し、又は解放し、又はこれらの方法を組み合わせて、自由に高分子の型化、固定、輸送などの操作を可能とする。  【解決手段】    対象高分子を溶媒高分子を溶解させた溶液の中に入れることにより、通常溶液（例えば、高分子を含まない水等）中に比べレーザー(光)に対する応答効率を上げることができる。即ち、本発明は、第１の高分子の溶液に異種高分子を溶解させ、該溶液中にレーザー光を集光させて、該異種高分子をその焦点に捕捉するか又は斥力を生じさせることから成る方法であって、該異種高分子が誘電体であり、該異種高分子の分子量が該第１の高分子の分子量の１０倍以上であること又は該第１の高分子の溶液がゲルであることを特徴とする高分子の操作方法である。  【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の高分子の溶液に異種高分子を溶解させ、該溶液中にレーザー光を集光させて、該異種高分子をその焦点に捕捉するか又は斥力を生じさせることから成る方法であって、該異種高分子が誘電体であり、該異種高分子の分子量が該第１の高分子の分子量の１０倍以上であること又は該第１の高分子の溶液がゲルであることを特徴とする高分子の操作方法。
【請求項２】
前記第１の高分子の溶液が前記異種高分子に対して貧溶媒である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
更に、前記異種高分子又はその一部を前記レーザーの焦点に捕捉したま該焦点を移動すること、又は該レーザー照射を停止することにより該異種高分子をその焦点から解放することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記異種高分子がＤＮＡである請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、レーザートラップ技術による光ピンセットで代表される光学的操作技術を用いて、対象高分子を捕捉し、移動し、又は解放する方法に関する。これらの方法を組み合わせることにより、自由に高分子の型化(patterning)、固定(trapping)、輸送(transporting)などの操作をすることができる。
【背景技術】
【０００２】
DNA等の誘電体高分子の操作について従来の技術を大別すると、溶液全体を対象とするが無修飾が可能な操作と、１分子を対象とするが修飾が必要な操作に分けられる。前者は電気泳動、交流電場、対流、容器形状を利用したものであり、後者は光ピンセットやガラス細管・ピペットなどを使用したものである。ここで修飾とはビーズやピペット等による化学的・接触的修飾のことをいう。また、１分子からの操作で非修飾を特徴とするものとして、コイル−グロビュール相転移を利用したものと、分散ビーズを利用した上で光ピンセットを使用可能にするものがある。上記の既存技術には一長一短があり、普遍的な技術は登場していない。
【０００３】
一方、誘電体である物体をレーザーで補足するレーザートラップ技術はよく知られており(非特許文献１)、この技術を用いれば集光レーザーの中に誘電体を補足することができる。
本発明者らは、このレーザートラップを利用して、液状溶媒中に浮遊させた高分子等の誘電体にレーザーを集光させて仕事エネルギーを取り出すことのできる微小モーターを開示している（特許文献１）。しかし、水等の溶媒にグロビュール状ＤＮＡなどの誘電体高分子を浮遊させてレーザーを照射すると、この高分子はレーザーから得たエネルギーにより高分子が伸長する（特許文献２、３）。そのため、この高分子は一旦はその焦点に捕捉されるが、高分子が伸長して誘電体でなくなる結果、レーザートラップされず、その焦点から外れるという問題を有していた。
これまでDNA分子等の誘電体高分子を無修飾かつ折り畳まれていないひもの状態でレーザートラップを使って継続的にトラップすることは実験的にも理論的にも不可能であると考えられてきた。
【０００４】
【非特許文献１】小原實ら著「先端エレクトロニクスシリーズ５・レーザー応用光学・第６章レーザーによる微粒子のマニピュレーション」共立出版株式会社(1998)
【特許文献１】特開2002-46100
【特許文献２】特開2003-18985
【特許文献３】特開2000-125866
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はDNA等の誘電体高分子を溶液中で確実に捕捉し、その結果、この高分子について自在にパターンニングを行い、そのまま或いは、基板に固着化等して利用できる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者らは対象高分子を溶媒高分子を溶解させた溶液の中に入れることにより、通常溶液（例えば、高分子を含まない水等）中に比べレーザー(光)に対する応答効率を上げられる（溶液によるランダム力比で１０倍以上）ことを見出し、また同時に応答の斥力・引力をコントロールできることを見出した。これにより、(走査型)レーザートラップによって、自在なパターンニングの実現に成功した。
本発明の方法によれば、ホスト高分子溶液の中の異種高分子を１分子レベルから光によって自在にコントロールすることができる。操作対象である異種高分子に合わせてホスト高分子の分子量や種類、濃度とレーザーの種類(波長・振動モード・走査)を選ぶことによって目的に対して最適化することができる。
【０００７】
即ち、本発明は、第１の高分子の溶液に異種高分子を溶解させ、該溶液中にレーザー光を集光させて、該異種高分子をその焦点に捕捉するか又は斥力を生じさせることから成る方法であって、該異種高分子が誘電体であり、該異種高分子の分子量が該第１の高分子の分子量の１０倍以上であること又は該第１の高分子の溶液がゲルであることを特徴とする高分子の操作方法である。
本発明は、更に、前記異種高分子又はその一部を前記レーザーの焦点に捕捉したま該焦点を移動すること、又は該レーザー照射を停止することにより該異種高分子をその焦点から解放することを含む上記高分子の操作方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法により、高分子に溶液中で自在な操作をすることが可能になる。例えば、単分子コイルDNA及び複数のDNA分子をコイル状態のままで自在に移動やパターニングすることが可能になる。DNA等の高分子を無修飾で扱えるため、塩基配列同定や酵素反応観察の前段階処理として利用できる他、長い紐状分子を直線ではなく渦巻状などの形状を取らせることで、各種測定のランダムアクセス効率を高めることが可能である。また、DNA電線の敷設に際し、基板上に任意の回路パターンを設定できることが可能である。そして、光に対する応答の違いを利用して高分子を分離、例えばキャピラリー内でのレーザー多数反射、或いは表面プラズモン効果を利用した干渉縞など、光強度の粗密を通してDNAを塩基配列の相違によって分離が実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
レーザートラップとは、レーザー光（電磁波）を集光し、物体（誘電体）をその焦点に置くことにより、その誘電体に生じる双極子によりレーザー光の力学的な力が物体に電磁波濃度の高い場所方向へかかり、レーザー光をレンズ等で集光させることによりその焦点に物体を捕捉する技術である。
レーザートラップには、理論的に考えられるすべてのレーザーが使用できるが、本発明に於いては対象高分子に悪影響を与えないレーザーを選ぶ必要がある。その点で、ＤＮＡを対照高分子とする場合には紫外レーザーは適当ではない。赤外レーザーは対象へのダメージが少ないという点で好ましい。
レーザーとしては、固体レーザ（Cr3+:Al2O2、Nd3+:YAG、Nd3+:リン酸ガラス、Nd3+:ケイ酸ガラス、Nd3+:GSGG、Nd3+:GSAG、Nd3+:YLF、Nd3+:NYAB）、半導体レーザ（InxGa1-xAs, InAs1-xPx, In1-xGaxP, AlxGa1-xAs, GaAs1-xPx, Pb1-xCdxS, InAs1-xSbx, PbS1-xSex, Pb1-xSnxTe, Pb1-xSnxSe）、気体レーザー（HF, HCl, He-Ne, HBr, DBr, DF）及び波長可変レーザー（Ti：サファイア、Ar+、Ar+-Kr+、Er3+:ガラス、Ho-YAG 、KCl:Li(FAII)、NaCl(F2+)H、Cr3+:BeAl2O3、Co2+:MgF2）等が挙げられる。
本発明においては、強度の強いレーザー、特にＮｄ：ＹＡＧレーザー等の赤外レーザーを用いることが好ましい。
【００１０】
ホスト高分子（第１の高分子）は、一般的な鎖状(ポリスチレンなどのひも状のもの、タンパク質等の球状のものは好ましくない。)の高分子なら、溶媒の液体に溶けさえすれば用いることができる。
【００１１】
ホスト高分子を溶解させる溶媒として、いかなるものを用いてもよいが、液状媒質は上記物質を浮遊させればよく、レーザー光を吸収しても吸収しなくてもよい。液状媒質としては、水(H2O)、重水(D2O)、ジメチルホルムアミド、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド等が挙げられるが、一般に水（Ｈ２Ｏ）を用いるのが簡便である。水（Ｈ２Ｏ）はＮｄ：ＹＡＧレーザーのレーザー光（波長１０６４ｎｍ）を吸収するため、水（Ｈ２Ｏ）を媒質として用いる場合には、一旦この水がレーザー光を吸収し、そのエネルギーが水中に浮遊する物体に移動することにより、その物体の運動エネルギーとなる。一方、このレーザー光を吸収しない重水（Ｄ２Ｏ）を用いてもよい。
溶媒中の(ホスト)高分子溶液の濃度は通常60mg/ml 以上であるが、ホスト高分子の分子量(重合度)が大きい場合には、より低い濃度でもよい。
【００１２】
一方、異種高分子は、ホスト高分子とは異なる高分子である。この高分子は、誘電体である必要がある。この高分子としては、例えば、ポリスチレンスルホン酸塩、ポリビニルピリジニウム塩、ＤＮＡ等の芳香族系高分子鎖が挙げられ、そのサイズは数十ｎｍ〜数百μｍの範囲が好適である。この高分子は１分子でもよく多分子の集合体であってもよい。但し、液状媒質中に浮遊する必要がある。
また、異種高分子の分子量が該第１の高分子の分子量の１０倍以上であること又は第１の高分子の溶液がゲルであるを要する。これは、レーザーに対する応答を上げ又は相分離を容易にするためである。
【００１３】
また、異種高分子は、ホスト高分子溶液と相分離しやすい傾向(貧溶媒)があると、捕捉効果がレーザーの集光点で良くなるため好ましい。PEGやDextranはＤＮＡにとって貧溶媒である。相分離は高分子間で堅さの違いや分子量の違いなどで、各々が仲間同士に分離してしまう現象である。
このような異種高分子として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アクチンファイバー、などが挙げられる。
【００１４】
操作は、レーザーを対物レンズで直径約１μｍ程度に集光させて、それをそのまま異種(対象)高分子に当てる。すると、即座にトラップ(吸い込み)や広げる作用(斥力)が始まる。第１の高分子を含む溶液に対して対象高分子の誘電率が高い場合には、レーザーの焦点に該高分子が捕捉され、逆に第１の高分子を含む溶液に対して対象高分子の誘電率が低い場合には、レーザーの焦点の高分子に斥力が働く。
その状態でレーザーの焦点を走査、或いは操作すると、それに応じたパターンを作ることができる。通常レーザーは10〜1000 mW 程度又はそれ以上の出力で使用する。
【００１５】
本発明の方法は原理的にいかなる高分子に対しても可能である。操作対象高分子は液体中で３次元的にパターン(形状)を保って捕捉され、それをそのまま利用することで基板の影響を無視できるが、輸送(泳動)や基板への固着を目的とすることもできる。また、光に対する応答の差から対象高分子に異なる種類のものが混じっていてもそれらを分離することが可能である。例としてＤＮＡの塩基配列による分離が挙げられる。
本発明の操作を適宜組み合わせることにより、任意の形状で標的高分子を捕捉、パターニング、固定、保持、輸送、測定、圧縮、伸張、分離、吸引、拡散促進、注入、排出等の操作を行うことができる。
パターニング(patterning)は、溶液中にＤＮＡ等の高分子を１分子で一筆書きすること等をいう。また、これをそのまま、基板などに貼り付ければ、ＤＮＡ電線や各種測定などに使うことができる。吸引とは、ひとつながりの標的高分子の一端を掴んで、残りを吸い取ることをいう。注入や排出は、例えば、微小流路の入り口などに捕捉や斥力、或いは吸引やレーザーが引き起こす対流等で対象物を注入や排出することをいう。
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００１６】
本実施例においては、蛍光顕微鏡（NikonTE-300）にYAGレーザー（Spectra Physics, Nd:YAG, 1064 nm, CW）を導入した用いた光ピンセットシステムを用い、レーザー出力を５００〜１０００mWに調節した。レーザー光の焦点走査には音響光学回折機、ガルバノミラーを用いた。用いた装置の概略図を図１に示す。
操作対象高分子としてT4ファージの遺伝子DNA（日本ジーン、56μm、166kbp）を0.1μM(bp濃度)に調整し、蛍光色素DAPI 0.1μMで可視化した。ホスト高分子としてポリエチレングリコール６０００（メルク社、分子量6000）を80 mg/mlに調整し、リン酸Naバッファー 5mM の水溶液にした。
蛍光顕微鏡の紫外線を励起光とし、青色の蛍光を観察するフィルターをセットした後、高感度SITカメラを使用して記録した。
対物レンズ（Nikon Plan Flour ×１００、開口数1.30）を通してレーザー光を照射し、DNA１分子をレーザーの焦点に捕捉し圧縮した。その様子を図２及び図３に示す。
図２中の白い塊がＤＮＡ１分子であり、溶液中で広がっていたＤＮＡ（例えば、t=0参照）が、t=0でレーザー焦点をその傍に入れると、そこに吸い寄せられて、レーザーの焦点に捕捉され、ついでに圧縮された状態（例えば、t=14.25参照）になることがわかる。
図３のグラフは、ＤＮＡの端から端までの長さ（長軸長）を時間を追ってプロットしたものであり、レーザー照射によりＤＮＡが吸い込まれて小さくなる様子を表している。
【実施例２】
【００１７】
ポリエチレングリコールの代わりにデキストラン１５０００（ナカライ社、分子量15000）を425 mg/mlに調整して用い、実施例１と同様の操作を行い、レーザーの焦点を手動で動かすことにより、DNA分子の形状を操作した。その様子を図４及び図５に示す。
図４は、レーザーでＤＮＡの一端を捕捉して「コ」の字型に移動する様子を示す。
図５は、このようにして形成した「コ」の字型パターンのDNA分子を示す。図５の真ん中付近(白円内)の「コ」の字型のものが対象のDNAである。周りに見えるそれ以外のDNA(黒円内)は、通常の広がりの大きさのままである。
ＤＮＡとレーザーの相互作用を斥力の場合に、レーザーの焦点をＤＮＡに当ててやると、ＤＮＡが広がることが明らかになった。これを利用すると、ＤＮＡの紐が寄り集まっているところにレーザー焦点を当ててやることで、ＤＮＡを引き伸ばすことができる。この状態でレーザーの焦点をＤＮＡの近傍で走査することにより、図５中央の白円の中にある微妙に明るい(コントラスト悪いですが)ＤＮＡの様に所望の形を取らせることができる。本実施例の場合には、DNA分子を「コ」の字型のパターンにすることができた。
本実施例は手動では焦点を走査したが、コンピュータに高速走査を行わせてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例で用いた装置の概略図を示す図である。XY-AOMは音響光学回折機を示す。
【図２】実施例１においてレーザー光の焦点に紐の状態の１分子DNAを捕捉した様子を示す図である。各図の上の数字はレーザー照射からの時間（秒）を表す。t=0はレーザー照射開始時を示す。
【図３】実施例１において捕捉したDNAの長軸長の時間変化を示す図である。t=0はレーザー照射開始時を示す。
【図４】実施例２において、DNA分子の端にレーザー光の焦点を当て移動することによりに、DNA分子を「コ」の字型のパターンに形成した様子を示す図である。
【図５】実施例２において、操作で形成した「コ」の字型パターンのDNA分子とその周辺の様子を示す図である。
【図１】
2005080516.tif 000002
【図３】
2005080516.tif 000003
【図２】
2005080516.tif 000004
【図４】
2005080516.tif 000005
【図５】
2005080516.tif 000006