(57)【要約】      （修正有）【課題】  ストレプトミセス属細菌、特にε-ポリ-L-リジン生産菌の分子育種に有用なストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）のための宿主ベクター系を提供する。【解決手段】  ストレプトミセス属細菌で機能しうる自律複製領域、好ましくは特定の塩基配列に示す領域、及びストレプトミセス属細菌に耐性を与える薬剤マーカーを含むＤＮＡセグメントを有する組換え体プラスミドを用いて、ストレプトミセス属細菌を形質転換する。【選択図】  図３
2005237335.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトミセス属細菌で機能しうるストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）ＩＦＯ１４１４７株が保持する内因性プラスミドｐＮＯ３３由来の自律複製領域、及びストレプトミセス属細菌に耐性を与える薬剤マーカーを含むＤＮＡセグメントを有する組換え体プラスミド。
【請求項２】
薬剤マーカーがチオストレプトン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の組換え体プラスミド。
【請求項３】
図１に示された制限酵素地図を持つ、請求項２記載の組換え体プラスミド。
【請求項４】
前記自律複製領域が、配列番号１に示す塩基配列を有するDNA、又は配列番号１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつストレプトミセス属細菌内で複製可能なDNAである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え体プラスミド。
【請求項５】
前記ストレプトミセス属細菌が、ストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）、又はストレプトミセス・リヴィダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え体プラスミド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え体プラスミドに、エシェリヒア属細菌用クローニングベクターを連結させてなる、エシェリヒア属細菌・ストレプトミセス属細菌用組換え体シャトルベクター。
【請求項７】
エシェリヒア属細菌用クローニングベクターがｐＮＥＢ１９３又はその改変体である、請求項６記載の組換え体シャトルベクター。
【請求項８】
図２に示された制限酵素地図を持つ、請求項７記載の組換え体シャトルベクター。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の組換え体シャトルベクターによって形質転換されたストレプトミセス属細菌。
【請求項１０】
ストレプトミセス属細菌が、ストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）、又はストレプトミセス・リヴィダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）である、請求項９記載のストレプトミセス属細菌。
【請求項１１】
ε-ポリ-L-リジン生産能を有し、かつ、内因性プラスミドを脱落処理されたことを特徴とする、請求項９又は１０記載のストレプトミセス属細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレプトミセス属細菌、特にε-ポリ-L-リジンを生産するストレプトミセス属細菌の分子育種に有用な宿主ベクター系に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
放線菌目（Ａｃｔｉｏｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の中でもストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する細菌は抗生物質をはじめとする各種生理活性物質を生産することから、産業上非常に有用な微生物である。そして微生物による生産を行う場合、通常生産性の向上などを目的として菌株の育種が行われる。育種の方法としては化学物質による変異誘発処理による方法だけでなく、遺伝子組み換えによっても行われるが、近年の遺伝子工学の発達によりストレプトミセス属の細菌でも遺伝子組み換えを行うことが可能となっている。一般に、外部からの遺伝子の導入には、主に、抗生物質耐性遺伝子をもつベクターと該抗生物質に感受性となる宿主の系において、ベクターとして用いるプラスミドに遺伝子を挿入し、このプラスミドを宿主に導入することにより形質転換株を作製する。このためのストレプトミセス属細菌用の宿主−ベクター系が、例えば、Ｋａｔｚらによって開発されている（非特許文献１、参照）。また、特に、ストレプトミセス属細菌用の宿主−ベクター系にエシェリヒア属細菌とのシャトルベクターを利用することは、遺伝子操作が容易となり時間浪費が防げるエシェリヒア属細菌を宿主として利用できるため利点が多い。このようなストレプトミセス・エシェリヒア属細菌用シャトルベクター例として、特許文献１又は２に記載のものがあげられる。
【０００３】
ストレプトミセス属の一種であるストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）は、現在食品保存料として幅広い食品に用いられているε-ポリ-L-リジンを生産する菌株として、その有用性が知られている（特許文献３、参照）。これまで、ε-ポリ-L-リジンの製造に適した優良菌株への育種には、例えばニトロソグアニジン処理などの化学的変異処理が行われてきた（特許文献４又は５参照）が、このような変異体取得方法は、変異体の取得に時間を要するため、効率的でなかった。それ故、遺伝子工学の手法を背景に、物質生合成系の解明による効率的な製造を可能とし、さらにその生合成系を利用した新規物質を創製する技術が、例えばε-ポリ-L-リジンを生産するストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）においても求められている。そのためには、該菌株における遺伝子操作系の確立が必要である。
【０００４】
これまでストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）を宿主として利用できる宿主−ベクター系については、産業上利用できる実用的事例は報告されていない。前述のようにストレプトミセス属細菌用のプラスミドは多くのものが知られているが、一般的に、ストレプトミセス属細菌のプラスミドは概して宿主域が限定されているものも多く、導入できたとしても安定して保持されない場合もある。そのため、できればストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）が元々保有しているプラスミドをベクターとして用いることが理想的である。
【０００５】
ε-ポリ-L-リジン生産菌であるストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）ＩＦＯ１４１４７株及び該菌株に由来する変異株は、環状のプラスミドＤＮＡｐＮＯ３３を保有することが知られており（特許文献６参照）、該プラスミドの全塩基配列についても明らかにされている（特許文献７参照）。このプラスミドＤＮＡはストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）用の有望なベクター候補となりうるが、ベクターとして利用するためには、適当な抗生物質耐性遺伝子マーカーの導入や、形質転換率や遺伝子操作上有利となる全鎖長の短縮化、ある
いはエシェリヒア属細菌とのシャトルベクター化などの工夫が望まれる。また、宿主となるε-ポリ-L-リジンを生産するストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）においても、形質転換前に宿主内にプラスミドが存在していては、不和合性の問題から導入プラスミドが排除されるため、せっかくベクター系の開発をしたとしても、形質転換効率が非常に低くなるなどの問題が生じる。そのため、形質転換をおこなう前の宿主からプラスミドを脱落させた変異株の取得が望まれている。
【特許文献１】特開平６−３０３９８５号公報
【特許文献２】特開昭６１−８５１９１号公報
【特許文献３】特公昭５９−２０３５９号公報
【特許文献４】特開平０９−１７３０５７号公報
【特許文献５】特開平１０−２９０６８８号公報
【特許文献６】特開２０００−２２８９８１号公報
【特許文献７】特開２００２−２３３３８０号公報
【非特許文献１】J.Gen.Microbiol．，vol. 129, p2703−2714, 1983
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、産業上有用なストレプトミセス属細菌、特にε-ポリ-L-リジン生産菌の分子育種に有用なストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）のための宿主ベクター系を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、まず既に、特開２０００−２２８９８１号公報によって明らかにされているストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）ＩＦＯ１４１４７株由来プラスミドｐＮＯ３３の自律複製領域を特定し、この領域と薬剤耐性遺伝子を連結した組換え体プラスミドｐＢＢＨ４を、該薬剤感受性のストレプトミセス・リヴィダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）を用いて構築した。さらに、該プラスミドとエシェリヒア属細菌用クローニングベクターとのシャトル化を行い、エシェリヒア属細菌及びストレプトミセス属細菌において安定して維持されるシャトルベクターｐＬＡＥ００１を構築した。またストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）から内因性プラスミドを欠落させた菌株を取得し、該菌株へのプラスミドベクターの導入方法を確立した。これがストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）の宿主ベクター系となることを見出し、その知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００８】
本発明は、ストレプトミセス属細菌、特に、ストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）、ストレプトミセス・リヴィダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）においてベクターとして機能しうる自立複製可能な組換え体プラスミドを提供する。さらに、該組換え体ＤＮＡにエシェリヒア属細菌用クローニングベクターを利用して構築されたことを特徴とするストレプトミセス属細菌・エシェリヒア属細菌用シャトルベクターを提供する。さらに、本発明は該プラスミドやシャトルベクター系の宿主となりうるストレプトミセス属細菌、特に、プラスミド脱落変異処理を施したストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）を提供する。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）  ストレプトミセス属細菌で機能しうるストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）ＩＦＯ１４１４７株が保持する内因性プラスミドｐＮＯ３３由来の自律複製領域、及びストレプトミセス属細菌に耐性を与える薬剤マーカ
ーを含むＤＮＡセグメントを有する組換え体プラスミド。
（２）  薬剤マーカーがチオストレプトン耐性遺伝子であることを特徴とする（１）の組換え体プラスミド。
（３）  図１に示された制限酵素地図を持つ、（２）の組換え体プラスミド。
（４）  前記自立複製領域が、配列番号１に示す塩基配列を有するDNA、又は配列番号１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつストレプトミセス属細菌内で複製可能なDNAである、（１）〜（３）のいずれかの組換え体プラスミド。
（５）  前記ストレプトミセス属細菌が、ストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）、又はストレプトミセス・リヴィダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）である、（１）〜（４）のいずれかの組換え体プラスミド。
（６）  （１）〜（５）のいずれかの組換え体プラスミドに、エシェリヒア属細菌用クローニングベクターを連結させてなる、エシェリヒア属細菌・ストレプトミセス属細菌用組換え体シャトルベクター。
（７）  エシェリヒア属細菌用クローニングベクターがｐＮＥＢ１９３又はその改変体である、（６）の組換え体シャトルベクター。
（８）  図２に示された制限酵素地図を持つ、（７）の組換え体シャトルベクター。
（９）  （６）〜（８）のいずれかの組換え体シャトルベクターによって形質転換されたストレプトミセス属細菌。
（１０）  ストレプトミセス属細菌が、ストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）、又はストレプトミセス・リヴィダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）である、（９）のストレプトミセス属細菌。
（１１）  ε-ポリ-L-リジン生産能を有し、かつ、内因性プラスミドを脱落処理されたことを特徴とする、（９）又は（１０）のストレプトミセス属細菌。
【発明の効果】
【００１０】
ストレプトミセス属に属する微生物は、多くの抗生物質または有用生理活性物質の生産菌として知られており、それらの生合成系を解明することで、有用物質を効率よく製造することが可能となる。本発明によって得られた組換え体プラスミドや組換え体シャトルベクターは、ストレプトミセス属細菌、特に食品や医薬品工業上有用なε-ポリ-L-リジンを生産するストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）や遺伝子工学の研究上有用なストレプトミセス・リヴィダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）において自立複製可能で有効に機能しうるため、ストレプトミセス属細菌由来の産業上有用な物質の、生合成系遺伝子の解析や遺伝操作を用いた工業的生産に必要な手段の提供に寄与できる。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のプラスミドは、ストレプトミセス属細菌で機能しうる自律複製領域、及びストレプトミセス属細菌に耐性を与える薬剤マーカーを含むＤＮＡセグメントを有する組換え体プラスミドである。なお、本発明においては、ストレプトミセス属細菌の種類は特に制限されないが、ストレプトミセス・アルブラス及びストレプトミセス・リヴィダンスがより好ましい。
【００１２】
ストレプトミセス属細菌で機能しうる自律複製領域は、該領域を含むプラスミドをストレプトミセス属細菌に導入したときに、プラスミドが複製できる領域である限り特に制限されないが、例えば、ストレプトミセス・アルブラスＩＦＯ１４１４７株が保持する内因性プラスミドｐＮＯ３３（特開２００２−２３３３８０号公報）に由来する自律複製領域を挙げることができる。ｐＮＯ３３に由来する自律複製領域は、ｐＮＯ３３の全長であってもよいが、遺伝子操作を容易にするために、ｐＮＯ３３の一部であることが好ましい。
ｐＮＯ３３の一部としては、配列番号１に示す塩基配列を有する領域を挙げることができる。この領域は、ｐＮＯ３３を制限酵素ＢｃｌＩとＢａｍＨＩで切断して得られる約４．１ｋｂｐの領域である。さらに、ストレプトミセス属細菌で機能しうる限り、配列番号１に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換・欠失・挿入等された配列を有するＤＮＡ領域、又は配列番号１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドもしくは該配列から調製されうるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ領域であってもよい。ここで、数個とは例えば、２〜５０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個である。また、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１%ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１%ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００１３】
上記のようなプラスミドｐＮＯ３３の自律複製に必要な領域は、抗生物質感受性宿主菌内での抗生物質耐性遺伝子の発現を指標とする欠失実験によって特定できる。即ち、プラスミドｐＮＯ３３に放線菌由来のチオストレプトン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子を導入した後、該遺伝子を消化しない単独あるいは組合せの制限酵素によって消化し、ＤＮＡ連結酵素により再環状化し、その後薬剤感受性のストレプトミセス・リヴィダンスを形質転換させる。この中から薬剤耐性を指標にして選択されるチオストレプトン耐性菌株には、プラスミドｐＮＯ３３の自律複製領域を含む派生プラスミドを持ち、それらのプラスミドの制限酵素地図を比較することによりプラスミドｐＮＯ３３の自律複製領域が特定できる。例えば、図４はこのようにして得られた派生プラスミドの制限酵素地図の比較図で、これから制限酵素ＢｃｌＩ−ＢａｍＨＩで切断して得られる４．１ｋｂｐの断片がプラスミドｐＮＯ３３の自律複製に必要な領域であることが判る。なお、上記のような方法等によって、さらに上記４．１ｋｂｐの断片から、自律複製領域を短縮することも可能である。
【００１４】
一方、ストレプトミセス属細菌に耐性を与える薬剤マーカーとしては、該細菌に導入したときに薬剤耐性を付与する遺伝子であれば特に制限されないが、チオストレプトン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などを挙げることができるが、この中では、チオストレプトン耐性遺伝子がより好ましい。チオストレプトン耐性遺伝子としては、ストレプトミセス属由来のプラスミドｐＩＪ７０２（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１２９、２７０３（１９８３））を制限酵素ＢｃｌＩで消化することによって得られる遺伝子（配列番号３）を挙げることができる。
【００１５】
本発明のプラスミドは、上記自律複製領域及び薬剤マーカーを含むプラスミドであるが、このようなものとして具体的には、図１に示すｐＢＢＨ４を例示することができる。ｐＢＢＨ４は、上記ｐＮＯ３３を制限酵素ＢｃｌＩとＢａｍＨＩで切断して得られる自律複製領域を含む４．１ｋｂｐの断片と、上記ｐＩＪ７０２をＢｃｌＩで切断して得られる断片を連結することによって構築される全長５１５８ｂｐからなる環状２本鎖ＤＮＡプラスミドである。なお、本発明のプラスミドはｐＢＢＨ４が改変されたものであってもよい。改変としては、複製能や薬剤耐性に関与しない部位における変異、図に示す制限酵素部位のうちの一部の欠損や置換などを挙げることができる。さらに、ストレプトミセス属細菌で機能しうるプロモーターなどがさらに組み込まれるような改変であってもよい。
【００１６】
本発明のプラスミドはまた、ストレプトミセス属細菌で機能しうる自律複製領域、及びストレプトミセス属細菌に耐性を与える薬剤マーカーを含むＤＮＡセグメントに、さらにエシェリヒア属細菌内で複製可能な配列が連結された、ストレプトミセス属細菌・エシェリヒア属細菌用シャトルベクターであってもよい。シャトル化により、エシェリヒア属細菌内において遺伝子操作を容易に行うことができる。エシェリヒア属細菌内で複製可能な
配列は特に制限されないが、例えば、エシェリヒア属細菌用プラスミドに含まれる複製配列を使用することができる。このような複製配列は、エシェリヒア属細菌用プラスミドから切断して使用してもよいが、エシェリヒア属細菌用プラスミドをそのまま、ストレプトミセス属細菌の自律複製領域、及び薬剤マーカーを含むＤＮＡセグメントに連結させてもよい。例えば、ｐＢＢＨ４を、図４のようにエシェリヒア属細菌用クローニングベクターｐＢＧＬ１９３（ニューイングランドバイオラボ社製ｐＮＥＢ１９３を部位特異的変異誘発により改変し、制限酵素ＢｇｌＩＩの切断部位を導入したもの：後述）と連結してシャトル化し、ストレプトミセス属細菌・エシェリヒア属細菌用シャトルベクターを構築することもできる。システムとして確立しているエシェリヒア属細菌用クローニングベクターとのシャトル化は、時間の節約や、例えば図２の組換え体プラスミドｐＬＡＥ００１（配列番号２）のように、エシェリヒア属細菌用クローニングベクター内に配置されているマルチクローニングサイト、ＨｉｎｄＩＩＩ，ＳｂｆＩ，ＰｍｅＩ，ＸｂａＩ，ＰａｃＩ，ＢａｍＨＩ，ＡｓｃＩ，およびＳａｃＩを利用した遺伝子導入が可能となり、今後のストレプミセス属細菌の分子遺伝学実験を極めて容易とするものである。市販のエシェリヒア属細菌用クローニングベクターとしては、その他、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２（以上タカラバイオ（株））などが利用できる。
【００１７】
本発明のプラスミドは、ストレプトミセス・アルブラスへの遺伝子導入に好適に使用することができる。即ち、ε-ポリ-L-リジン生産株の分子育種に必要なストレプトミセス・アルブラス用のベクターとしても利用できる。例えば、上記組換え体プラスミドｐＢＢＨ４及びその改変体は、ストレプトミセス・アルブラスＩＦＯ１４１４７株が保有するプラスミドｐＮＯ３３由来の自律複製領域を有するため、ε-ポリ-L-リジン生産株であるストレプトミセス・アルブラスの菌株内において、数十個程度のコピー数で安定的に保持することができる。また該プラスミドｐＢＢＨ４はさらにストレプトミセス属細菌の遺伝子組み換えに汎用されているｐＩＪ１０１（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｔ．１８５、２２３−２２８，１９８２）やＳＣＰ２（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３ (２)株が有する３１ｋｂｐのクリプティックプラスミド；Ｇｅｎｅ  ３５，２２３−２３５，１９８５）由来のプラスミドベクターとは自律複製領域の塩基配列が異なるため、それらのプラスミドベクターと同一宿主菌体内で共存させることも可能である。ストレプトミセス・アルブラスとしては、上記ＩＦＯ１４１４７株以外にも、例えば、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ ｓｕｂｓｐ.ｌｙｓｉｎｏｐｏｌｙｍｅｒｕｓ）Ｂ２１０２１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９２６号；特開２００３−１８０３９１号公報）、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリ メラスＢ１５２０８株(ＦＥＲＭ Ｐ−１５７８２；特開平１０−２９０６８８号公報)、ストレプトマイセス・アルブルス・サブスペシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｌｉｓ ｓｕｂｓｐ.） ＳＰ−２５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７９９８；特開２００２−０９５４６７号公報）などを挙げることができる。なお、ストレプトミセス属細菌への組換え体プラスミドの導入は、宿主をリゾチーム処理することによりプロトプラストとした後に導入する方法や、電気穿孔法などを用いることができる。
【００１８】
本発明のプラスミドが導入されるストレプトミセス・アルブラスは、内因性プラスミドが脱落したものであることが好ましい。ここで、内因性プラスミドとは、ｐＮＯ３３及びそれに類似したプラスミドなどを指す。ε-ポリ-L-リジン生産能を有するストレプトミセス・アルブラスの内因性プラスミド脱落株は、例えば、アクリルオレンジを含んだ培地で生育させることによって得ることができる（J Bacteriol. 1979 137(2):891-899）。その際、元となるストレプトミセス・アルブラスは、ε-ポリ-L-リジン生産株として土壌中から分離されたＩＦＯ１４１４７株などの野生株であるに限らず、該菌株の変異株でもよい。またプラスミド存在の有無は、アクリルオレンジを含んだ培地で生育させることによって得られたコロニーを液体培地で培養し、プラスミドを抽出したのち、アガロースゲル電
気泳動による解析を行うことによって確認できる。このようにして得られたストレプトミセス・アルブラスの内因性プラスミド脱落変異株は、菌体内に内因性プラスミドｐＮＯ３３及びそれに類似したプラスミドを保持していないため、プラスミドｐＮＯ３３の自律複製領域を持つプラスミドベクターを導入した形質転換株を作製する場合において、より効率的に形質転換株を作製することが可能である。
【００１９】
そして、これら本発明の組換え体プラスミドおよびシャトルベクターをベクターとし、プラスミド脱落株を宿主微生物とすることで、ストレプトミセス・アルブラスの形質転換及びε-ポリ-L-リジン生産菌株の分子育種を行うことができる。例えばε-ポリ-L-リジン生産菌が元来保持していない異種外来のε-ポリ-L-リジン生産遺伝子あるいは元々保持しているε-ポリ-L-リジン生産遺伝子をε-ポリ-L-リジン生産菌株に導入することによって生産性を向上させることができる。
【００２０】
そして本発明の宿主ベクター系を用いて異種外来遺伝子を導入したε-ポリ-L-リジン生産菌の形質転換株は、ε-ポリ-L-リジンの生産に使用することができる。ε-ポリ-L-リジンの生産は、例えば、特開平０６−０８６６８６号公報、特開平０９−１７３０５７号公報などに記載された方法によって行うことができる。
【００２１】
本発明のプラスミドは、さらに、ストレプトミセス・アルブラス以外のストレプトミセス属細菌、例えば、ストレプトミセス属細菌用の宿主ベクター系の宿主として最も一般的に用いられているストレプトミセス・リヴィダンスにおいて使用されるものであってもよい。例えば、上記組換え体プラスミドｐＢＢＨ４及びその改変体は、ストレプトミセス・リヴィダンスにおいても安定に保持されるため、ストレプトミセス・リヴィダンスを形質転換するためのベクターとしても用いることができる。ストレプトミセス・リヴィダンスとしてはＴＫ２３株、ＴＫ６４株（Ｇｅｎｅ，３５，２２３〜２３５，１９８５）などを挙げることができる。また、本発明のプラスミドで形質転換される細菌は、上記の他、ストレプトマイセス・ノールセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎｏｕｒｓｅｉ）に属する菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−９７９７；特開平１−１８７０９０号公報）、ストレプトマイセス・ヘルバリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｅｒｂａｒｉｃｏｌｏｒ） ＳＰ−１３株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７８４５；特開２００２−０９５４６６号公報）、ストレプトマイセス・ラベンデュラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ） ＵＳＥ−５３株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０５；特開２００３−０５２３５８号公報）、ストレプトマイセスｓｐ．ＳＰ−６６株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７２２３；特開２００１−０１７１５９号公報）、ストレプトマイセスｓｐ．ＳＰ−７２株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８１０；特開２０００−０６９９８８号公報）などであってもよい。
【実施例】
【００２２】
以下実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はその趣旨を超えない限り、この実施例の範囲には限定されない。
【００２３】
ストレプトミセス属細菌由来のプラスミドからの組換え体プラスミドの構築は、通常エシェリヒア属細菌などで行われる制限酵素消化反応及びＤＮＡ連結酵素反応によって行った。ストレプトミセス属細菌からのプラスミト゛の抽出や実験に用いたストレプトミセス・リヴィダンスＴＫ２３株（Hopwood DA, Hintermann G, Kieser T, Wright HM, Integrated DNA sequences in three streptomycetes form related autonomous plasmids after transfer to Streptomyces lividans., Plasmid. 1984 Jan; 11(1): 1-16）は、「プラクティカル  ストレプトミセス  ジェネティクス（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、ザ・ジョン・インス・ファウンデーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ），ノリッジ、Ｕ．Ｋ．（２０００）に記載の方法によって取り扱った。また、エシェリヒア属細菌の形質転換や菌体からのプラス
ミドＤＮＡの抽出および各制限酵素、修飾酵素の使用、制限酵素地図の作製はＭａｎｉａｔｉｓらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎ．Ｙ．，１９８２）記載の方法等によって実施した。
【００２４】
（１）プラスミドｐＮＯ３３の分離精製
ストレプトミセス・アルブラスＩＦＯ１４１４７株をＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％）で３０℃、２０時間培養し、遠心分離によって菌体を集めた。そしてこの菌体からｐＮＯ３３を、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８９巻，９４〜９６頁（２０００）に記載の方法により分離精製した。なお、ＩＦＯ１４１４７株は財団法人発酵研究所（Institute for fermentation, Osaka; IFO）に登録された株であるが、現在はその移管先である独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）より入手可能である。
【００２５】
（２）プラスミドｐＮＯ３３の複製に必要な領域の特定
プラスミドｐＮＯ３３の複製に必要な領域を特定するために、次の欠失実験をおこなった。（１）で得たプラスミドｐＮＯ３３を制限酵素ＢｃｌＩ及びＢａｍＨＩで完全消化したＤＮＡ断片と、ｐＩＪ７０２（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１２９、２７０３（１９８３））を制限酵素ＢｃｌＩで完全消化しその際に生じたチオストレプトン耐性遺伝子を含む１ｋｂのＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼにより連結した。この溶液を用いてストレプトミセス・リヴィダンスＴＫ２３株を、「プラクティカル  ストレプトミセス  ジェネティクス（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、ザ・ジョン・インス・ファウンデーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ），ノリッジ、Ｕ．Ｋ．（２０００）に記載のＰＥＧ法により形質転換し、チオストレプトン耐性変異株を取得した。このチオストレプトン耐性変異株はプラスミドｐＮＯ３３株の複製に必要な領域を含むＤＮＡ断片を有するプラスミドを有すことが予想されるので、それらのプラスミドを解析するため、上記記載の方法にてプラスミドを抽出、精製した。その結果、図４に示された１２．５ｋｂのＢｃｌＩ断片、１５．５ｋｂのＢａｍＨＩ断片、および二重消化した際の４．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｃｌＩＤＮＡ断片とチオストレプトン耐性遺伝子が連結された組換え体プラスミドｐＢＣＬ１２、ｐＢＣＬ１５、およびｐＢＢＨ４が得られた。これらの制限酵素地図の比較からプラスミドｐＮＯ３３は、少なくとも組換え体プラスミドｐＢＢＨ４のＢａｍＨＩ−ＢｃｌＩ４．１ｋｂＤＮＡ断片があればストレプトミセス属細菌で複製可能であることが判った。
【００２６】
（３）組換え体プラスミドｐＢＢＨ４の構築及びストレプトミセス・リヴィダンスの形質転換
（１）で得たプラスミドｐＮＯ３３を制限酵素ＢｃｌＩとＢａｍＨＩで完全消化し、（２）および図４の結果で知り得たプラスミドｐＮＯ３３の自律複製領域を含む４．１ｋｂのＤＮＡ断片とｐＩＪ７０２を制限酵素ＢｃｌＩで完全消化し、その際に生じた１ｋｂのチオストレプトン耐性遺伝子（配列番号３）を含むＤＮＡ断片を混合後ＤＮＡリガーゼにより連結した。この溶液を用いてストレプトミセス・リヴィダンスＴＫ２３株を、「プラクティカル  ストレプトミセス  ジェネティクス（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、ザ・ジョン・インス・ファウンデーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ），ノリッジ、Ｕ．Ｋ．（２０００）に記載のＰＥＧ法により形質転換し、チオストレプトン耐性変異株を取得した。このチオストレプトン耐性変異株から上記記載のプラスミド精製方法にてプラスミドを精製し、得られた組換え体プラスミドをｐＢＢＨ４と命名した（図１および図３）。
【００２７】
（４）プラスミドシャトルベクターｐＬＡＥ００１の構築
ニューイングランドバイオラボ社製プラスミドｐＮＥＢ１９３の２６４６番目の位置が、制限酵素ＢｇｌＩＩの切断部位となるように部位特異的変異誘発させ、プラスミドｐＢＧＬ１９３を構築した。そのために、ｐＮＥＢ１９３をＡａｔ ＩＩ （２６４４番目）で消化し、平滑化後、タカラバイオ社製のｐＢｇｌ ＩＩ phosphorylated Linker（5'-CAGATCTG-3'）を連結酵素を用いて挿入し、制限酵素Ｂｇｌ ＩＩサイトが導入されたｐＢＧＬ１９３を構築した。該プラスミドｐＢＧＬ１９３を制限酵素ＢｇｌＩＩで消化したものと、（３）のｐＢＢＨ４を制限酵素ＢｃｌＩで消化したものを混合し、ＤＮＡリガーゼにより連結した。そしてこれを用いてエシェリヒア・コリＤＨ５α株（東洋紡社製）をコンピテントセル法により形質転換した。アンピシリン耐性を示す形質転換株の中から、ｐＢＧＬ１９３とｐＢＢＨ４が連結したプラスミドを持つ株を選択し、該プラスミドをｐＬＡＥ００１（配列番号２）と命名した（図２および図３）。
【００２８】
（５）ストレプトミセス・アルブラスプラスミド脱落変異株の作製
ストレプトミセス・アルブラスＩＦＯ１４１４７株の胞子懸濁液を０．２％酵母エキス、１％でんぷん、２％寒天、アクリルオレンジ  ２００μg/ｍｌからなる寒天平板培地に植菌し、３０℃で２ヶ月静置培養した。生育したコロニーをＬＢ液体培地で培養し、菌体を得た後、上記のプラスミドｐＮＯ３３の分離精製に記載した方法で、プラスミドを抽出した。そして該プラスミドを０．７％アガロースゲル電気泳動による解析を行い、プラスミドが脱落した菌株を選択した。
【００２９】
（６）ストレプトミセス・アルブラスのプラスミド脱落変異株へのプラスミドベクターの導入
ストレプトミセス・アルブラスプラスミド脱落変異株への（２）、（３）記載の組換え体プラスミドｐＢＢＨ４及び（４）記載のシャトルベクターｐＬＡＥ００１の導入は、ストレプトミセス・リヴィダンスの形質転換法に準じて行った。そしてプロトプラストを、チオストレプトンを含むＲ５培地（「プラクティカル  ストレプトミセス  ジェネティクス（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、ザ・ジョン・インス・ファウンデーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ），ノリッジ、Ｕ．Ｋ．（２０００））に植菌し、チオストレプトン耐性株を取得した。このようにしてｐＢＢＨ４又はｐＬＡ００１が導入されたストレプトミセス・アルブラスを取得した。それぞれの組換え体プラスミドをもつストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）形質転換株をＬＢ培地で３０℃にて２０時間培養し、プラスミドを抽出し、その制限酵素地図を調べたところ、それぞれの組換え体プラスミドｐＢＢＨ４及びｐＬＡＥ００１は安定に保持されていることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】組換え体プラスミドｐＢＢＨ４の制限酵素地図を示す図である。ｐＮＯ３３ｒｅｐはプラスミドｐＮＯ３３の自律複製領域を含むＤＮＡ断片である。ｔｓｒはチオストレプトン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片である。
【図２】組換え体シャトルベクターｐＬＡＥ００１の制限酵素地図を示す図である。ｐＮＯ３３ｒｅｐはプラスミドｐＮＯ３３の自律複製領域を含むＤＮＡ断片である。ｔｓｒはチオストレプトン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片である。また、Ｂｌａ、ｏｒｉ、ＬａｃＺαは、それぞれプラスミドｐＢＧＬ由来のアンピシリン耐性遺伝子、自律複製領域、βガラクトシダーゼ遺伝子を示す。
【図３】組換え体プラスミドｐＢＢＨ４および組換え体シャトルベクターｐＬＡＥ００１の構築図ならびに制限酵素地図を示す図である。ｐＮＯ３３ｒｅｐはプラスミドｐＮＯ３３の自律複製領域を含むＤＮＡ断片である。ｔｓｒはチオストレプトン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片である。また、Ｂｌａ、ｏｒｉ、ＬａｃＺαは、それぞれプラスミドｐＢＧＬ由来のアンピシリン耐性遺伝子、自律複製領域、βガラクトシダーゼ遺伝子を示す。
【図４】プラスミドｐＮＯ３３自律複製領域の特定の際におこなった欠失実験の結果で得られたプラスミドのプラスミドｐＮＯ３３の自律複製領域を含むＤＮＡ断片である。＋は得られたプラスミドがストレプトミセス・リヴィダンス内で保持されていたことを示す。また、（  ）内の数字はプラスミドｐＮＯ３３上に位置する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを１とした時の値である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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