(57)【要約】【課題】              ＲＮＡｉによって遺伝子の発現抑制を効果的に起こしている実績データの基本配列に基づいて、発現を抑制したい任意の遺伝子のＲＮＡ干渉用ターゲット配列を効率的に抽出、推定する方法を提供する。【解決手段】          ＲＮＡ干渉用ターゲット配列上の予め定められた所定位置における４種類の塩基の出現頻度情報に基づき前記所定位置におけるそれぞれの塩基の有意性統計値を記憶部に用意しておき、（ａ）入力装置から、発現抑制対象となる遺伝子の塩基配列から選択されたターゲット配列候補を入力する工程と、（ｂ）前記ターゲット配列候補上での塩基に対応する有意性統計値を、前記記憶部から読み出し、有意性統計値に基づき、優先度スコアを導出する工程と、（ｃ）前記優先度スコアに関連付けて前記ターゲット配列候補を出力装置より出力する工程と、を含む。【選択図】            図１
2005353000.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンピュータを用いてＲＮＡ干渉用ターゲット配列を推定する方法であって、
ＲＮＡ干渉用ターゲット配列上の予め定められた所定位置における４種類の塩基の出現頻度情報に基づき前記所定位置におけるそれぞれの塩基の有意性統計値を記憶部に用意しておき、
（ａ）入力装置から、発現抑制対象となる遺伝子の塩基配列から選択されたターゲット配列候補を入力する工程と、
（ｂ）前記ターゲット配列候補上での塩基に対応する有意性統計値を、前記記憶部から読み出し、有意性統計値に基づき、優先度スコアを導出する工程と、
（ｃ）前記優先度スコアに関連付けて前記ターゲット配列候補を出力装置より出力する工程と、
を含む、ことを特徴とする、ＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定方法。
【請求項２】
コンピュータを用いてＲＮＡ干渉用ターゲット配列を推定する方法であって、
（ａ）入力装置よりＲＮＡ干渉用ターゲット配列を入力する工程と、
（ｂ）入力した前記ＲＮＡ干渉用ターゲット配列上の予め定められた所定位置における４種類の塩基の出現頻度情報を求め、前記出現頻度情報に基づき、前記所定位置におけるそれぞれの塩基の有意性統計値を導出して記憶部に記憶する工程と、
（ｃ）前記入力装置から、発現抑制対象となる遺伝子の塩基配列から選択されたターゲット配列候補を入力する工程と、
（ｄ）前記ターゲット配列候補上での塩基に対応する有意性統計値を、前記記憶部から読み出し、有意性統計値に基づき、優先度スコアを導出する工程と、
（ｅ）前記優先度スコアに関連付けて前記ターゲット配列候補を出力装置より出力する工程と、
を含む、ことを特徴とする、ＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定方法。
【請求項３】
前記（ａ）の工程において、複数のＲＮＡ干渉用ターゲット配列を前記入力装置から入力し、
前記（ｂ）の工程が、
（ｂ１）前記複数のＲＮＡ干渉用ターゲット配列の所定の位置における４種類の塩基の出現頻度を計算する工程と、
（ｂ２）前記出現頻度の有意性を検定し、有意性のある塩基について上位有意性統計値及び／又は下位有意性統計値を算出する工程と、
（ｂ３）前記上位有意性統計値及び下位有意性統計値を前記有意性統計値として前記位置に関連付けて前記記憶部に記憶する工程と、
を含む、ことを特徴とする請求項２に記載のＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定方法。
【請求項４】
前記（ｂ２）の工程において、
2005353000.tif 000015
（ただし、ｐａは、塩基の出現率、
ｐｂは、塩基の母集団の出現率、
Ｐは、ｐａとｐｂの加重平均、
ｎａは、ｐａのサンプル数、
ｎｂはｐｂのサンプル数
である。）
により、９５％又は９９％の有意水準について有意性の検定が行われる、ことを特徴とする請求項３に記載のＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定方法。
【請求項５】
前記（ｄ）の工程において、入力されたターゲット配列候補の塩基配列のそれぞれの位置の塩基に対応する上位有意性統計値の総和から下位有意性統計値の総和を減算して、
前記優先度スコアを求める、ことを特徴とする請求項２に記載のＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡ干渉用ターゲット配列候補は、発現抑制対象の遺伝子の翻訳開始コドンの下流、及び、翻訳終止コドンの上流１００塩基以上の領域に存在し、
連続する２つのａから始まる２１〜２３塩基長の配列である、ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一に記載のＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定方法。
【請求項７】
複数の前記ターゲット配列候補について計算された複数の前記優先度スコアを比較する工程と、
複数の前記優先度スコアに基づき、複数の前記ターゲット配列候補の優先順位を決定する工程と、
をさらに含む、ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一に記載のＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定方法。
【請求項８】
前記優先度スコアを導出するにあたり、次式
2005353000.tif 000016
（ただし、
2005353000.tif 000017
2005353000.tif 000018
ｖは、有意確率、
ｐは、配列上の位置
を表わす。）を用いて、前記優先度スコアＳを算出する、ことを特徴とする請求項５に記載のＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定方法。
【請求項９】
ＲＮＡ干渉用ターゲット配列上の予め定められた所定位置における４種類の塩基の出現頻度情報に基づき前記所定位置におけるそれぞれの塩基の有意性統計値を記憶した記憶手段と、
発現抑制対象となる遺伝子の塩基配列から選択されたターゲット配列候補を入力する手段と、
前記ターゲット配列候補上での塩基に対応する有意性統計値を、前記記憶部から読み出し、有意性統計値に基づき、優先度スコアを導出するスコア演算手段と、
前記優先度スコアに関連付けて前記ターゲット配列候補を出力装置より出力する手段と、
を含む、ことを特徴とする、ＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定装置。
【請求項１０】
ＲＮＡ干渉用ターゲット配列を入力する入力手段と、
入力した前記ＲＮＡ干渉用ターゲット配列上の予め定められた所定位置における４種類の塩基の出現頻度情報を求め、前記出現頻度情報に基づき、前記所定位置におけるそれぞれの塩基の有意性統計値を導出して記憶手段に記憶する手段と、
発現抑制対象となる遺伝子の塩基配列から選択されたターゲット配列候補を前記入力手段より入力し、前記ターゲット配列候補上での塩基に対応する有意性統計値を、前記記憶部から読み出し、有意性統計値に基づき、優先度スコアを導出するスコア演算手段と、
前記優先度スコアに関連付けて前記ターゲット配列候補を出力装置より出力する手段と、
を含む、ことを特徴とする、ＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定装置。
【請求項１１】
複数のＲＮＡ干渉用ターゲット配列を前記入力手段より入力し、入力した前記複数のＲＮＡ干渉用ターゲット配列の所定の位置における４種類の塩基の出現頻度を計算する手段を備え、
前記出現頻度の有意性を検定し、有意性のある塩基について上位有意性統計値及び／又は下位有意性統計値を算出し、前記上位有意性統計値及び下位有意性統計値を前記有意性統計値として前記位置に関連付けて前記記憶手段に記憶する手段を備えている、ことを特徴とする請求項９又は１０に記載のＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定装置。
【請求項１２】
前記有意性の検定にあたり、次式
2005353000.tif 000019
（ただし、ｐａは、塩基の出現率、
ｐｂは、塩基の母集団の出現率、
Ｐは、ｐａとｐｂの加重平均、
ｎａは、ｐａのサンプル数、
ｎｂはｐｂのサンプル数
である。）
により、９５％又は９９％の有意水準について有意性の検定が行われる、ことを特徴とする請求項１１に記載のＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定装置。
【請求項１３】
前記スコア演算手段は、前記入力されたターゲット配列候補の塩基配列のそれぞれの位置の塩基に対応する上位有意性統計値の総和から下位有意性統計値の総和を減算して、前記優先度スコアを求める、ことを特徴とする請求項９又は１０に記載のＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定装置。
【請求項１４】
前記ＲＮＡ干渉用ターゲット配列候補は、発現抑制対象の遺伝子の翻訳開始コドンの下流及び翻訳終止コドンの上流１００塩基以上の領域に存在し、連続する２つのａから始まる２１〜２３塩基長の配列である、ことを特徴とする請求項９乃至１３のいずれか一に記載のＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定装置。
【請求項１５】
複数の前記ターゲット配列候補について計算された複数の前記優先度スコアを比較する手段と、
複数の前記優先度スコアに基づき、複数の前記ターゲット配列候補の優先順位を決定する手段と、
をさらに含む、ことを特徴とする請求項９乃至１４のいずれか一に記載のＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定装置。
【請求項１６】
前記スコア演算手段は、式
2005353000.tif 000020
（ただし、
2005353000.tif 000021
2005353000.tif 000022
ｖは、有意確率、
ｐは、配列上の位置
を表わす。）を用いて、前記優先度スコアを計算することを特徴とする請求項１３に記載のＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定装置。
【請求項１７】
ＲＮＡ干渉用ターゲット配列上の予め定められた所定位置における４種類の塩基の出現頻度情報に基づき前記所定位置におけるそれぞれの塩基の有意性統計値を記憶した記憶部を備え、ＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定装置を構成するコンピュータに、
（ａ）入力装置から、発現抑制対象となる遺伝子の塩基配列から選択されたターゲット配列候補を入力する処理と、
（ｂ）前記ターゲット配列候補上での塩基に対応する有意性統計値を、前記記憶部から読み出し、有意性統計値に基づき、優先度スコアを導出する処理と、
（ｃ）前記優先度スコアに関連付けて前記ターゲット配列候補を出力装置より出力する処理と、
を実行させるプログラム。
【請求項１８】
ＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定装置を構成するコンピュータに、
（ａ）入力装置よりＲＮＡ干渉用ターゲット配列を入力する処理と、
（ｂ）入力した前記ＲＮＡ干渉用ターゲット配列上の予め定められた所定位置における４種類の塩基の出現頻度情報を求め、前記出現頻度情報に基づき、前記所定位置におけるそれぞれの塩基の有意性統計値を導出して記憶部に記憶する処理と、
（ｃ）前記入力装置から、発現抑制対象となる遺伝子の塩基配列から選択されたターゲット配列候補を入力する処理と、
（ｄ）前記ターゲット配列候補上での塩基に対応する有意性統計値を、前記記憶部から読み出し、有意性統計値に基づき、優先度スコアを導出する処理と、
（ｅ）前記優先度スコアに関連付けて前記ターゲット配列候補を出力装置より出力する処理と、
を実行させるプログラム。
【請求項１９】
請求項１８記載のプログラムにおいて、
前記（ａ）の処理として、複数のＲＮＡ干渉用ターゲット配列を前記入力装置から入力する処理、
前記（ｂ）の処理として
（ｂ１）前記複数のＲＮＡ干渉用ターゲット配列の所定の位置における４種類の塩基の出現頻度を計算する処理と、
（ｂ２）前記出現頻度の有意性を検定し、有意性のある塩基について上位有意性統計値及び／又は下位有意性統計値を算出する処理と、
（ｂ３）前記上位有意性統計値及び下位有意性統計値を前記有意性統計値として前記位置に関連付けて前記記憶部に記憶する処理と、
を前記コンピュータに実行させるプログラム。
【請求項２０】
請求項１９記載のプログラムにおいて、
前記（ｂ２）の処理として、
2005353000.tif 000023
（ただし、ｐａは、塩基の出現率、
ｐｂは、塩基の母集団の出現率、
Ｐは、ｐａとｐｂの加重平均、
ｎａは、ｐａのサンプル数、
ｎｂはｐｂのサンプル数
である。）
により、９５％又は９９％の有意水準について有意性の検定を行う処理、
を前記コンピュータに実行させるプログラム。
【請求項２１】
請求項１８記載のプログラムにおいて、
前記（ｄ）の処理として、入力されたターゲット配列候補の塩基配列のそれぞれの位置の塩基に対応する上位有意性統計値の総和から下位有意性統計値の総和を減算して、
前記優先度スコアを求める処理、
を前記コンピュータに実行させるプログラム。
【請求項２２】
前記ＲＮＡ干渉用ターゲット配列候補は、発現抑制対象の遺伝子の翻訳開始コドンの下流、及び、翻訳終止コドンの上流１００塩基以上の領域に存在し、
連続する２つのａから始まる２１〜２３塩基長の配列である、ことを特徴とする請求項１７乃至２１のいずれか一に記載のプログラム。
【請求項２３】
請求項１７乃至２２のいずれか一に記載のプログラムにおいて、
複数の前記ターゲット配列候補について計算された複数の前記優先度スコアを比較する処理と、
複数の前記優先度スコアに基づき、複数の前記ターゲット配列候補の優先順位を決定する処理と、
を前記コンピュータに実行させるプログラム。
【請求項２４】
請求項２１記載のプログラムにおいて、
前記優先度スコアを導出するにあたり、次式
2005353000.tif 000024
（ただし、
2005353000.tif 000025
2005353000.tif 000026
ｖは、有意確率、
ｐは、配列上の位置
を表わす。）を用いて、前記優先度スコアＳを算出する処理を前記コンピュータに実行させるプログラム。
【請求項２５】
配列番号２４〜２９に示した塩基配列から選択される少なくとも１つの塩基配列及びその相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドからなることを特徴とする、単離された短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）。
【請求項２６】
請求項２５に記載のｓｉＲＮＡと医薬的に許容される担体とを含有する、ことを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ配列の推定方法と装置並びにプログラムに関し、特に、遺伝子発現を抑制（サイレンシング）する方法として用いられるＲＮＡ干渉法を行うために必要となる基本配列（「ターゲット配列」という）の推定に適用して好適とされる方法と装置並びにコンピュータプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：RNA interference）は、細胞に２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を導入することにより、相同なｍＲＮＡが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象である（例えば、非特許文献１参照）。この現象が１９８８年に線虫において初めて発見された後、昆虫、植物、更には哺乳動物等で同様な現象のあることが判明した（例えば、非特許文献２参照）。ＲＮＡｉ反応の第一ステップは長い二本鎖ＲＮＡがDicerというヌクレアーゼによりＡＴＰ依存的に２１〜２３塩基の短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：short interfering RNA）に分解される。その後、これらのｓｉＲＮＡはＲＩＳＣ(RNA-induced silencing complex)と呼ばれるタンパク質複合体に取り込まれ、二本鎖ＲＮＡがほどけてｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が相補的な塩基配列を有するターゲットｍＲＮＡにＲＩＳＣを誘導する。最後に、二本鎖を形成したｓｉＲＮＡとターゲットｍＲＮＡの中央部の１箇所で、ｍＲＮＡが分解される。
【０００３】
哺乳動物細胞においては、Dicerによって短く切断されたｓｉＲＮＡを直接細胞に導入すれば、インターフェロン経路の活性化なしにＲＮＡｉ経路を働かせることができる。このｓｉＲＮＡは化学合成したｄｓＲＮＡでも同様の効果があることが示されて、遺伝子の発現抑制方法として急速に採用されるようになってきた（例えば、非特許文献３参照）。
【０００４】
遺伝子の発現抑制方法としてＲＮＡｉを用いる場合、まず２１〜２３塩基のｄｓＲＮＡを作製する必要があるが、その作製の元になるのが基本配列（ターゲット配列）である。このｄｓＲＮＡは、まず発現を抑制したい任意の遺伝子の塩基配列に基づいてターゲット配列（ｃＤＮＡ配列）を作り、次に２本鎖のｄｓＲＮＡの形に合成されるが、前記遺伝子の種々の位置から合成された異なるターゲット配列のｓｉＲＮＡは、当該遺伝子の発現抑制効果も異なることが知られている。すなわち、ターゲット配列（位置）の選択がＲＮＡ干渉作用の効果を発揮するために重要である。
【０００５】
従来、ターゲット配列の選択は、経験的な方法により、例えば、遺伝子のコード領域（ＯＲＦ）の開始コドンから５０〜７５塩基下流の連続する２つのａ（ａａ）に続く１９〜２１塩基列で、ＧＣ含量が５０％前後のものを探し、ターゲット配列を選択している。しかしながら、実際にはいろいろと試行錯誤を行い、上記以外の様々な部分（位置）から選択されていることが知られている（例えば、非特許文献４参照）。また、生成されたターゲット配列が本当に抑制効果を持つか否かを検証するには、実際に、実験で確認してみなければならなかった。
【０００６】
【非特許文献１】Sharp, P.A. :Genes Dev., 13, 3191-3197 (2001)
【非特許文献２】Hutvagner, G., Zemore, P.D. :Curr. Opin. Genet. Dev., 12, 225-232 (2002)
【非特許文献３】Elbashir, S. M et al., :Nature, 411, 494-498 (2001)
【非特許文献４】Ray, Z. X. et al., :Genes Dev., 16, 2923-2934 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記のような問題点に鑑みてなされたものであって、その主たる目的は、ＲＮＡｉによって遺伝子の発現抑制を効果的に起こしている実績データの基本配列を基にして、その特徴を抜き出し、これに基づいて発現を抑制したい任意の遺伝子のＲＮＡ干渉用ターゲット配列を効率的に抽出、推定する方法と装置並びにプログラムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願で開示される発明は、上記課題を達成するため、概略以下の通りとされる。
【０００９】
本発明の１つのアスペクト（側面、視点ともいう）に係るＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定方法は、ＲＮＡ干渉用ターゲット配列上の予め定められた所定位置における４種類の塩基の出現頻度情報に基づき前記所定位置におけるそれぞれの塩基の有意性統計値を記憶部に用意しておき、
（ａ）入力装置から、発現抑制対象となる遺伝子の塩基配列から選択されたターゲット配列候補を入力する工程と、
（ｂ）前記ターゲット配列候補上での塩基に対応する有意性統計値を、前記記憶部から読み出し、有意性統計値に基づき、優先度スコアを導出する工程と、
（ｃ）前記優先度スコアに関連付けて前記ターゲット配列候補を出力装置より出力する工程と、を含む。
【００１０】
本発明の他の視点に係る装置は、ＲＮＡ干渉用ターゲット配列上の予め定められた所定位置における４種類の塩基の出現頻度情報に基づき前記所定位置におけるそれぞれの塩基の有意性統計値を記憶した記憶手段と、
発現抑制対象となる遺伝子の塩基配列から選択されたターゲット配列候補を入力する手段と、
前記ターゲット配列候補上での塩基に対応する有意性統計値を、前記記憶部から読み出し、有意性統計値に基づき、優先度スコアを導出するスコア演算手段と、
前記優先度スコアに関連付けて前記ターゲット配列候補を出力装置より出力する手段と、を含む。
【００１１】
本発明のさらに他のアスペクト（側面）に係るコンピュータプログラムは、ＲＮＡ干渉用ターゲット配列上の予め定められた所定位置における４種類の塩基の出現頻度情報に基づき前記所定位置におけるそれぞれの塩基の有意性統計値を記憶した記憶部を備え、ＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定装置を構成するコンピュータに、
（ａ）入力装置から、発現抑制対象となる遺伝子の塩基配列から選択されたターゲット配列候補を入力する処理と、
（ｂ）前記ターゲット配列候補上での塩基に対応する有意性統計値を、前記記憶部から読み出し、有意性統計値に基づき、優先度スコアを導出する処理と、
（ｃ）前記優先度スコアに関連付けて前記ターゲット配列候補を出力装置より出力する処理と、を実行させるプログラムよりなる。
【００１２】
本発明のさらに別の視点に係る単離された短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、配列番号２４〜２９に示した塩基配列から選択される少なくとも１つの塩基配列及びその相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドからなる。ｓｉＲＮＡは細胞内におけるサイクリンＢ１の発現を特異的に抑制することができ、いろいろな場面、例えば、疾病の予防や治療における医薬組成物として利用することができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＲＮＡｉによって遺伝子の発現抑制を効果的に起こしている実績データから統計的及び演算処理によって導かれた優先度スコアを用いているため、従来法に比べて精度よくＲＮＡ干渉用ターゲット配列を推定することができる。
【００１４】
更に、本発明の推定方法を用いることによりＲＮＡ干渉用ターゲット配列を精度良く抽出することができるため、遺伝子の発現抑制方法を用いた様々な研究、例えば、細胞周期を調節する遺伝子を抑制して細胞の増殖やガン化のメカニズムを解明する等の研究に有効であり、ｓｉＲＮＡに基づいた研究用試薬や医薬品等の開発に大きく寄与すると思料される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
［本発明の概要］
本発明のＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定方法（以下「本発明の方法」という。）の具体的手順について図面を参照して詳細に説明する。図１は本発明の方法の具体的手順を示す流れ図である。以下、これに基づいて説明する。
【００１６】
ステップ１０：＜ＲＮＡ干渉作用の確認された複数のターゲット配列の整列化＞
まず公開されている複数のｓｉＲＮＡのターゲット配列を整列化し、ｃＤＮＡの形で整理する。これまでにネット上等で公開された文献情報から、哺乳動物を含む多くの生物で特定の遺伝子発現を抑制したｓｉＲＮＡのターゲット塩基配列が知られている。
【００１７】
例えば、図２にその一例を示す。これらのターゲット配列から合成される典型的なｓｉＲＮＡは、２１塩基長の２本の鎖からなり、５’リン酸基をもち、１９塩基対（ｂｐ）の二本鎖領域と２塩基の塩基対を形成しない水酸基をもつ３’末端からなる。従って、図２のように連続する２つのａから順にターゲット配列を整列化した場合には、３番目〜２１番目までの１９塩基の配列が遺伝子抑制作用において重要な意味を持つと考えられる。このような観点から、本実施形態においては、公知文献において報告されている１６１種類の異なる哺乳動物ｃＤＮＡから２４９種類のｓｉＲＮＡターゲット塩基配列を選択し、統計的な解析を行った。なお、本実施形態で用いた上記２４９種類のｓｉＲＮＡターゲット塩基配列は本明細書の末尾に記載した参考文献１〜２７に記載されているものであり、これらの内容は引用により本明細書に組み込まれる。
【００１８】
ステップ２０：＜各位置における塩基の出現頻度計算及び有意性の検定＞
ターゲット配列で抑制現象上重要な配列は、３位から２１位までの塩基配列と考えられるので、これらの各位置において、４種類の各塩基（ａ、ｇ、ｃ、ｔ）がどのような出現状況になっているのかを示したものが以下の表１及び表２である。表１において最上位行にある３〜２１の数字は塩基の配列順（配列上の位置）を示し、最左端のａ、ｇ、ｃ、ｔは塩基の種別を表している。従って、表１は整列化（アライメント）されたターゲット配列の各位置における４種類の塩基がどれくらい出現しているかを示す。例えば、８番目の配列（８位）の列をみると、ａが８１、ｇが６２、ｃが４９及びｔが５７となっているが、これは２４９種のデータを集計して、配列８番目には塩基ａが８１個、塩基ｇが６２個、塩基ｃが４９個、塩基ｔが５７個出現していることを示している。他の列についても同様の意味である。さらにこれを比率（百分率）で表わしたものが表２である。
【００１９】
【表１】
2005353000.tif 000003
【００２０】
【表２】
2005353000.tif 000004
【００２１】
次に、これらのデータを統計的検定の観点から有意性があるかどうかを判別する。これは、例えば、表２において、各列における塩基の出現率が、各塩基が均等に出現した場合（各塩基の本母集団における出現率（本母集団での平均値））に比べ、どの程度の信頼性で有意性があるかについて、次式（１）を使って調べることができる（例えば、岩原信九朗「教育と心理のための推計学」日本文化科学社参照）。
【００２２】
2005353000.tif 000005
ここで、
ｐａ：表２における各塩基の出現率
ｐｂ：各塩基の本母集団の出現率
Ｐ  ：ｐａとｐｂの加重平均
ｎａ：表１でのサンプル数（２４９）
ｎｂ：ｐｂのサンプル数（４７２３）
【００２３】
式（１）を使って統計的検定を行い、整理したものが以下の表３である。表３において、例えば、３列目の塩基ａは９９％の信頼性で有意性のあるデータであることを示している。３列目の塩基ｇ、ｔについても同様の意味である。有意性は両サイド（多く出現している側と少なく出現している側）に出てくるので、表３において、↑は多く出現している側（上位側）を、↓は少なく出現している側（下位側）を示す。従って、８列目は、塩基ａが９５％の信頼性で上位側に有意性があることを示している。表３においてｓｔは有意性統計値を示す。他の列についても同様である。
【００２４】
【表３】
2005353000.tif 000006
【００２５】
表３に示した有意性統計値は、信頼性の基準として９９％又は９５％の有意確率を用いているが、母集団のサンプル数やターゲット配列の特徴に応じ適宜選択されたその他の有意確率、例えば、９０％等の信頼性を基に算出してもよいことは当然である。
【００２６】
ステップ３０：＜スコア計算式の定義＞
次に、これらの有意性データを基にスコア計算式を作成する。スコア計算式は、与えられた任意の塩基配列のｓｉＲＮＡとしての優先度スコアを与えるものであれば特に制限はないが、例えば、次式（２）を用いることができる。
【００２７】
2005353000.tif 000007
ここで、
2005353000.tif 000008
2005353000.tif 000009
ｖ：９５−有意確率９５％（有意レベル０．０５）
９９−有意確率９９％（有意レベル０．０１）
ｐ：配列上の位置（３〜２１）
【００２８】
上式（２）に対して、上記で求めた、表３の有意性データ（有意性統計値）を代入すると、スコアＳは、次式（３）で与えられる。
【００２９】
2005353000.tif 000010
2005353000.tif 000011
【００３０】
ステップ４０：＜発現抑制ターゲット配列候補のスコア計算＞
次に、発現を抑制したい任意の遺伝子の塩基配列から複数のＲＮＡ干渉用ターゲット配列候補を選択し、上記スコア計算式（３）により当該ターゲット配列候補の優先度スコアを計算する。例えば、発現抑制を起こしたい遺伝子をサイクリンＢ１遺伝子(CCNB1, NM_031966)（配列番号１）とする。この遺伝子は翻訳開始コドンから翻訳終始コドンまで１３０１ｂｐの塩基長があり、従来の方法に従って翻訳開始コドンの下流及び翻訳終止コドンの上流に１００塩基以上離れた領域に存在し、連続する２つのａから始まる２１塩基長の配列（ａａＮ１９)を選択すると全部で１１１個のターゲット配列候補が得られる。これらの配列を表４に示した。なお、本実施形態においては、翻訳開始コドンの下流及び翻訳終止コドンの上流に１００塩基以上離れた領域について検索しているが、この領域は対象遺伝子によって適宜調節可能であり、例えば、翻訳開始コドンから５０ｂｐ又は７５ｂｐ下流の領域に設定することもできる。
【００３１】
【表４】
2005353000.tif 000012
【００３２】
表４のStart No.は翻訳開始コドンからターゲット配列候補（ｃＤＮＡ）の開始塩基までの塩基長を表わしている。例えば、３番目の候補(Seq No. 3)は、翻訳開始コドンから数えて１２６番目が開始塩基となっていることを示す。
【００３３】
これらの各候補に対して、上式（３）を用いてスコア計算を行う。例えば、４番目の候補(Seq No. 4)は次式により計算される。
【００３４】
2005353000.tif 000013
＝3.02−（2.35＋2）＝-1.33
【００３５】
同様に他のターゲット配列候補についてもスコアの計算を行い、その結果を表４のスコア欄に示した。例えば、１番目の配列は９．７、２番目の配列は７．４及び３番目の配列は−６．９等である。
【００３６】
ステップ５０：＜ターゲット配列候補の優先順位決定＞
次に、ステップ４０で計算された優先度スコアに関連付けてターゲット配列候補を出力（表示）する。例えば、優先度スコアの大きな順にターゲット配列候補を並び替えた結果を表５に示す。
【００３７】
表５においてNseq No.は新しく振りなおされた順番である。表５で一番上位のターゲット配列候補は、翻訳開始コドンからの開始塩基(Start No.)が２１８の配列で、スコアは１５．１、ｇｃ含量は２６％である。
【００３８】
【表５】
2005353000.tif 000014
【００３９】
このようにして、複数のターゲット配列候補について計算された優先度スコアを比較し、上記ターゲット配列候補の優先順位を決定することができる。上記比較に際し、ターゲット配列候補のｇｃ含量を考慮することが好ましい。一般的にｇｃ含量は５０％前後が望ましいと考えられる。従って、表５において開始塩基が２１８のターゲット配列候補はｇｃ含量が２６％と極端に低いため、優先順位を下げるか、又はターゲット配列候補から削除することができる。このようなｇｃ含量を考慮する際の基準は、例えば、３５％（６５％）、４０％（６０％）、又は４５％（５５％）を基準にすることができる。
【００４０】
更に、このようにして得られた結果、例えば、表５の各配列についてホモロジー検索を行って当該配列が目的遺伝子に対して特異的であることを確認する。公共のデータベース、例えば、ＮＣＢＩデータベースのＢＬＡＳＴ検索を利用することもできる。他の遺伝子にも相同性がある場合には、目的遺伝子の発現を特異的に抑制しない可能性を考慮して優先順位を決定することができる。
【００４１】
＜システム構成＞
次に、本発明を実施するための一実施形態のシステムについて説明する。図３は、本発明の一実施形態のシステム構成を示す図である。
【００４２】
図３を参照すると、本実施形態に係るシステムは、情報処理装置（計算装置）１００と、ｓｉＲＮＡターゲット配列情報に関する外部データベースやホモロジー検索等の外部プログラムを提供する外部システム２００とをネットワーク３００を介して通信可能に接続されて構成されている。
【００４３】
また、計算装置１００は、ターゲット配列各塩基の有意性統計値テーブルを保存した記憶部１１０と、ターゲット配列候補の入力部１２０と、スコア演算手段１３０と、優先度スコアの出力部１４０とを含む。
【００４４】
ネットワーク３００は、計算装置１００と外部システム２００とを相互に接続し、特に制限されないが、例えばＩＰ（Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）網等である（ＬＡＮ、ＷＡＮを問わない）。
【００４５】
外部システム２００は、ネットワーク３００を介して、計算装置１００と相互に接続され、利用者に対して配列情報等に関する外部データベースやホモロジー検索等の外部プログラムを実行するウェブサイトを提供する機能を有する。
【００４６】
計算装置１００は、テーブル形式で情報を記憶する記憶部１１０と、ターゲット配列候補を入力する入力部１２０と、スコア演算手段１３０と、優先度スコアを出力する出力部１４０を備えている。これら各部は計算装置１００内で接続され、図示されない制御装置（ＯＳ）の制御のもと動作が制御される。スコア演算手段１３０、記憶部１１０の書き込み、読み出し、入力部１２０からの入力、出力部１４０からの出力は計算装置１００を構成するＣＰＵ（データ処理装置、プロセッサ）上で実行されるプログラムによりその処理、機能が実現される。より詳細には、図１を参照して説明した処理手順は、計算装置１００を構成するＣＰＵで実行されるプログラムによりその処理・機能が実現される。
【００４７】
計算装置１００は、特に制限されないが、ルータ等の通信装置、専用線等の有線又は無線の通信媒体を介して、ネットワーク３００に通信可能に接続されている。
【００４８】
記憶部１１０に格納されるテーブルは、ＲＮＡ干渉用ターゲット配列の各位置における４種類の塩基の上位有意性統計値又は下位有意性統計値が格納された固定ディスク装置等の記憶手段である。上記有意性統計値は、複数のＲＮＡ干渉用ターゲット配列データに基づいて作成されるが、一旦作成されたテーブルをそのまま使用することもできるし、或いは、適宜データを追加してテーブルに格納された有意性統計値を更新して用いることもできる。
【００４９】
また、ターゲット配列候補の入力部１２０は、本発明の方法により有意性スコアの計算を行う複数のターゲット配列候補の塩基配列を入力する。例えば、キーボード等により個々のターゲット配列候補の塩基配列を入力しても良いが、発現を抑制したい任意の遺伝子配列を入力することにより自動的にターゲット配列候補を選択する手段を備えてもよい。また、塩基配列を入力する代わりに、キーワードやアクセッションＮｏ．等を入力し、ネットワーク３００を介して外部システム２００と接続し、外部データベースからこれらに対応する塩基配列をダウンロードすることも可能である。
【００５０】
スコア演算手段１３０は、定義されたスコア計算式等のプログラム、及び所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラム等により記憶部１１０に保存格納されたテーブルから有意性統計値を読み出して優先度スコアを計算する。また、計算された複数の優先度スコアを比較してその優先順位を決定する。当該優先順位の決定に際し、ネットワーク３００を介して外部プログラムに接続し、外部データに保存された既知遺伝子配列とのホモロジー検索を行ってもよい。
【００５１】
また、優先度スコアの出力部１４０は、上記計算された優先度スコア及びターゲット配列候補の優先順位を表示し出力する。出力部１４０は、特に制限されないが、表示装置及び／又はプリンタ等よりなる。あるいは、出力部１４０は出力をファイルに出力し、ネットワークで他のノードに転送するようにしてもよいことは勿論である。
【００５２】
＜ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉作用の検証＞
上記実施例のシステム、あるいは方法により推定されたＲＮＡ干渉用ターゲット配列に基づいてｓｉＲＮＡを合成し、所望の細胞にトランスフェクションすることによって遺伝子の発現抑制にどのように働いているかを検証することができる。ｓｉＲＮＡの合成は、当業者に公知の方法を用いて化学合成することができる。種々のＲＮＡ合成機が市販されており、又は委託合成することも可能である。
【００５３】
ターゲット配列に基づいてｓｉＲＮＡを合成する場合、一般的には、ターゲット配列の３位〜２１位までの配列に対応するＲＮＡ鎖の３’末端に２つのｄＴを付加したセンス鎖と、ターゲット配列の３位〜２１位までの配列と相補的な配列に対応するＲＮＡ鎖の３’末端に２つのｄＴを付加したアンチセンス鎖を合成し、これらをアニーリングして用いる。アニーリングの条件は当業者の技術常識に基づいて行うことができるが、例えば、１００ｍＭの酢酸カリウム、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２ｍＭの酢酸マグネシウムを含むアニーリングバッファーに等量（等モル数）のＲＮＡを混合し、溶液を９０℃で３分間加熱後７０℃で２分間、更に３７℃で６０分間静置する。その後、フェノール／クロロホルム抽出・エタノール沈殿を行っても良い。細胞へのトランスフェクションのための種々のキットが市販されており、例えば、Oligofectamin, Lipofectamine2000（Invitrogen社）、TransMessenger(QIAGEN社)、及びGeneSilencer siRNA Transfection Reagent(Gene Therapy Systems)等を使用することができ、当業者の技術常識に従って細胞へ直接導入する（例えば、別冊実験医学「遺伝子の機能阻害実験法」（羊土社）１９７−２０３頁参照）。
【実施例１】
【００５４】
上述した方法により推定されたＲＮＡ干渉用ターゲット配列が、実際にサイクリンＢ１の発現抑制効果を示すかどうかを検証した。表５に示したターゲット配列候補から、ハイスコア候補群、及びロースコア候補群をそれぞれ６種類ずつ選択し、ｓｉＲＮＡとした。ｇｃ含量は共に５０％に近い配列を選択し、ｇｃ含量による制約がないようにした。
【００５５】
開始塩基(Start nt)が翻訳開始コドンから７２１、３３５、４７６、８３５、７２４、及び５４８番目のターゲット配列はハイスコア候補群に属し、これらのターゲット配列から合成したｓｉＲＮＡ（１９塩基のセンス鎖）は以下の塩基配列を有する。
【００５６】
Start nt 335: 5'-aagaaaaacuuucgccugagc-3'  （配列番号２４）
Start nt 476: 5'-aagauggagcugauccaaacc-3'  （配列番号２５）
Start nt 548: 5'-aagagcaagcagucagaccaa-3'  （配列番号２６）
Start nt 721: 5'-aagaagaugcugcagcugguu-3'  （配列番号２７）
Start nt 724: 5'-aagaugcugcagcugguuggu-3'  （配列番号２８）
Start nt 835: 5'-aagcaccaaaucagacagaug-3'  （配列番号２９）
【００５７】
開始番号(Start No)が１９９、３３９、６１５、６４４、７８０、及び１０７２のターゲット配列はロースコア候補群に属し、これらのターゲット配列から合成したｓｉＲＮＡ（１９塩基のセンス鎖）は以下の塩基配列を有する。
Start nt 199: 5'-aaaccuucagcuacuggaaaa-3'  （配列番号３０）
Start nt 339: 5'-aaaacuuucgccugagccuau-3'  （配列番号３１）
Start nt 615: 5'-aauugacuggcuaguacaggu-3'  （配列番号３２）
Start nt 644: 5'-aauucagguuguugcaggaga-3'  （配列番号３３）
Start nt 780: 5'-aauguacccuccagaaauugg-3'  （配列番号３４）
Start nt 1072: 5'-aauggugaauggacaccaacu-3'  （配列番号３５）
【００５８】
上記ＲＮＡの３’末端に２つのｄＴを付加した２１塩基長のセンス鎖と、上記ＲＮＡと相補的なＲＮＡの３’末端に２つのｄＴを付加した２１塩基長のアンチセンス鎖を株式会社日本バイオサービス(JBioS)に委託して化学合成し、以下のような方法でアニーリングを行った。ＲＮＡサンプルをそれぞれ５０μＭ（５０ｐｍｏｌ／μｌ）に希釈した。乾固したＲＮＡは水に溶けにくいので、時々氷につけながら、時間を掛けて、ボルテックスミキサーを使ってよく溶かした。ＲＮＡサンプルを３０μｌずつと5×annealing buffer(500 mM potassium acetate,150mM HEPES-KOH pH 7.4,10mM magnesium acetate)１５μｌとを混合した（全量５×１５＝７５μl））。この溶液を９０℃で１分間加熱し、スピンダウン後に３７℃６０分間静置した。オリゴは２本鎖になり、最終濃度は２０μＭ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）になる。
【００５９】
HeLa細胞を、１０％牛胎児血清及び１００μｇ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシンを添加したダルベッコ基本培地(ＤＭＥＭ； Invitrogen社製)で生育させた。トランスフェクションを行う前に、細胞を約２４時間無血清ＤＭＥＭ培地中で維持した。この細胞に、上記アニールした二本鎖ＲＮＡをOligofectAMINE(Invitrogen社製)又はNucleofector (Amaxa biosystems社製)を用いてトランスフェクトした。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養後、定法に従って細胞抽出液を調製した。一次抗体として抗ヒトサイクリンＢ１マウスモノクローナル抗体（ＵＢＩ）及び抗チューブリンモノクローナル抗体、二次抗体としてＨＲＰ融合抗マウス抗体を用いてイムノブロッティングを行った結果を図４に示した。図４（Ａ）において、ハイスコア群の開始位置(start nt)が３３５、４７６、５４８、８３５のものはほとんど遺伝子発現が見られず、７２４、７２１も極めて少ないことが分かる。一方、ロースコア群は、６種の配列において、遺伝子発現が見られ、遺伝子発現の抑制度合いが極めて低いことが分かる。図４（Ｂ）は、それぞれのｓｉＲＮＡについて、サイクリンＢ１とチューブリンの発現比率を示したものである。細胞周期を通じてチューブリンタンパク質レベルは安定しているため、これを対照として用いた。また、ロースコア群６種の発現量を１とした時のハイスコア群６種の発現量の度合いを求めたところ、その比率は０．０３８、即ち、ハイスコア群はロースコア群に比べて平均して３．８％しか発現していないことが分かった。以上の結果より明らかなように、ハイスコア群は遺伝子抑制の度合いが極めて高く、本発明の方法により計算された優先度スコアと実験結果とが相関関係を示していることが確認された。
【００６０】
サイクリンＢは、ヒトをはじめとする哺乳動物の細胞周期の動作に関係するタンパク質であり、ｓｉＲＮＡはそのサイクリンＢの発現を抑制できることから、次の様な利用法がある。
（1）細胞周期の詳細機構の解明
例えば、細胞周期の動作において、サイクリンＢが発現されなかった場合全体的にどのように振舞うのか詳細に調べることができて、様々な応用が考えられる。
（2）細胞周期の異常に起因すると考えられる疾患の予防及び治療用医薬
例えば、癌、自己免疫疾患、神経変性疾患、発生異常や染色体異常に基づく疾患等の予防及び治療の医薬として有効である。
【００６１】
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【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明のＲＮＡ干渉用ターゲット配列の推定方法を示すフローチャートである。
【図２】ＲＮＡ干渉用ターゲット配列のいくつかの例を整列化した表である。
【図３】本発明の１つの実施形態に係る計算装置を用いるシステムのブロック図である。
【図４】本発明の方法により推定されたｓｉＲＮＡを用いてサイクリンＢ１の発現抑制効果を調べたイムノブロッティング（Ａ）及びサイクリンＢ１の発現比率（Ｂ）を示した図である。
【符号の説明】
【００６３】
１００  計算装置
１１０  記憶部
１２０  入力部
１３０  スコア演算手段
１４０  出力部
２００  外部システム
３００  ネットワーク
【図１】
2005353000.tif 000027
【図２】
2005353000.tif 000028
【図３】
2005353000.tif 000029
【図４】
2005353000.tif 000030
【配列表】
2005353000000001.app