(57)【要約】【課題】ＤＮＡ分析によるイチゴの品種識別において、少ない数のプライマーの組み合わせで高い識別精度が得られる識別方法を確立する。【解決手段】多型検出にＡＦＬＰ法を適用し、ＰＣＲ増幅に必要なプライマーとして、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＧＣ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＡＡ」のプライマー対を用いることにより、わずか１種のプライマー対を用いるだけで、１０品種程度のイチゴの品種を識別することが可能となる。これに加えて、複数種の補助的なプライマー対を用いることにより、さらに識別精度を高めることができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抽出したイチゴのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＭｓｅＩで切断した断片にアダプタを連結し、予備的にＰＣＲ増幅して断片の相対数を変更し、この断片を鋳型として選択的ＰＣＲ増幅を行うときのプライマー対として、ＥｃｏＲＩ切断側にＡＧＣの３塩基を付加したプライマー「ＥｃｏＲＩ＋ＡＧＣ」と、ＭｓｅＩ切断側にＣＡＡの３塩基を付加したプライマー「ＭｓｅＩ＋ＣＡＡ」を用いることを特徴とするＡＦＬＰ法による多型検出を利用したイチゴの品種識別方法。
【請求項２】
前記「ＥｃｏＲＩ＋ＡＧＣ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＡＡ」のプライマー対を用いた選択的ＰＣＲ増幅のほかに、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＡＣ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＡＡ」、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＣＣ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＡＡ」、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＣＧ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＡＡ」、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＣＴ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＴＡ」、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＣＡ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＴＡ」、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＣＣ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＴＡ」の各プライマー対を用いて選択的ＰＣＲ増幅を行う請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ分析によるイチゴの品種識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物新品種の保護に関しては種苗法の改正により育成者の権利が強化されるなどの制度整備がなされているが、他者による育成者権の侵害に対しては育成者権者が侵害事実を立証すること、すなわち自らの育成品種と不法利用の疑いのある品種が同一であることを立証する必要がある。そのため、客観的な品種識別が可能であるＤＮＡ分析技術の開発、利用が望まれている。
【０００３】
ＤＮＡ分析による植物の品種識別は、異なる品種間に存在するＤＮＡ塩基配列の差異（これを多型という）を検出することにより行われる。この多型の検出方法としては、すでに開発された方法として、たとえばＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic DNA）法、ＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法、ＣＡＰＳ（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）法、ＡＦＬＰ（Amplified Fragment Length Polymorphism）法といわれる方法がある。
【０００４】
ＲＡＰＤ法は、ＤＮＡをランダムプライマーによりＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）増幅する方法であり、ＲＦＬＰ法は、ＤＮＡを制限酵素で切断し、特定の断片を検出する方法であり、ＣＡＰＳ法は、ＤＮＡの特定領域をＰＣＲ増幅し、制限酵素で切断する方法であり、ＡＦＬＰ法は、ＤＮＡを制限酵素で切断し、ＰＣＲ増幅する方法である。それぞれの方法は、ＤＮＡの特定領域で多型を示す個々の塩基配列の数、再現性、一度に解析できる特定領域の数、分析操作の難易度、識別能などの点で長所、短所があるとされている。
【０００５】
イチゴの品種識別方法に関しては、従来は果実の形や大きさ、葉の形や大きさ、草型などの比較により行われてきたが、これでは正確に品種を識別することは困難である。そこで、イチゴについてもＤＮＡ分析による品種識別方法が研究され、その方法が特許文献１として開示されている。この特許文献１に記載のイチゴの品種識別方法は、イチゴのガクを含む果実あるいは葉より抽出したＤＮＡを鋳型として、イチゴ品種間で異なる塩基配列を標的としたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡの多型および増幅したＤＮＡの制限酵素による消化で生じる多型を識別することによって、イチゴの品種を識別する方法である。
【特許文献１】特開２００３−３３９３９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に記載のイチゴの品種識別方法は、ＣＡＰＳ法を適用した識別方法である。前述のようにＣＡＰＳ法による多型検出方法は、予めＤＮＡの特定領域を選択し、この特定領域をＰＣＲ増幅し、制限酵素で切断する方法であるので、ＤＮＡ解析の進んだ米や大豆などの主要穀類と比較して、ＤＮＡ解析が不十分なイチゴの場合は、品種識別を目的として選択できるＤＮＡの特定領域が少ないことに加え、一度の操作で得られる多型の数が少ないことから、多数の品種の識別を行うためには、選択した特定領域を対象に、働きの異なる複数の制限酵素で処理しなければならない、という問題がある。
【０００７】
本発明が解決すべき課題は、ＤＮＡ分析によるイチゴの品種識別、とくに新品種のイチゴに対して他者による育成者権の侵害の疑いのある場合の対象物の品種識別において、少ない数のプライマーの組み合わせでより多くの品種識別が可能な識別方法を確立することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、イチゴの品種識別の先行技術である特許文献１に記載のＣＡＰＳ法を適用した識別方法と、植物の品種識別に広く利用されているＡＦＬＰ法を適用した識別方法を参考にして、ＤＮＡ分析によるイチゴの品種識別方法について鋭意検討し、イチゴの品種識別にＡＦＬＰ法を適用することにより、品種識別に有効な多くの多型を一度に検出できるだけでなく、識別精度を高めることができるとの知見を得、これに基づいてＰＣＲ増幅に必要なプライマーとして最適のプライマー対を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、ＤＮＡ分析によるイチゴの品種識別方法であって、抽出したイチゴのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＭｓｅＩで切断した断片にアダプタを連結し、予備的にＰＣＲ増幅して断片の相対数を変更し、この断片を鋳型として選択的ＰＣＲ増幅を行うときのプライマー対として、ＥｃｏＲＩ切断側にＡＧＣの３塩基を付加したプライマー「ＥｃｏＲＩ＋ＡＧＣ」と、ＭｓｅＩ切断側にＣＡＡの３塩基を付加したプライマー「ＭｓｅＩ＋ＣＡＡ」を用いることを特徴とするＡＦＬＰ法による多型検出を利用したイチゴの品種識別方法である。さらに識別精度を高めるために、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＡＣ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＡＡ」、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＣＣ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＡＡ」、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＣＧ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＡＡ」、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＣＴ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＴＡ」、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＣＡ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＴＡ」、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＣＣ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＴＡ」の各プライマー対を用いて、選択的ＰＣＲ増幅を行うことができる。
【発明の効果】
【００１０】
ＤＮＡ分析によるイチゴの品種識別において、多型検出にＡＦＬＰ法を適用することにより、ＤＮＡ情報の少ないイチゴの品種識別を効率的に実施することができる。また、ＰＣＲ増幅に必要なプライマーとして、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＧＣ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＡＡ」のプライマー対を用いることにより、わずか１種のプライマー対を用いるだけで、１０品種程度のイチゴの品種を識別することが可能となる。これに加えて、複数種の補助的なプライマー対を用いることにより、１０品種程度のすべての識別精度を９９％以上に高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明に係るＤＮＡ分析によるイチゴの品種識別においては、多型検出をＡＦＬＰ法によって行う。ＡＦＬＰ法自体は公知の方法であり、イチゴの場合に固有なＤＮＡ抽出法とプライマーの選定以外は、公知のＡＦＬＰ法の手法に従って実施する。イチゴには多糖類が多く、この除去の程度がその後のＤＮＡ解析の成否に大きく影響するので、ＤＮＡの抽出は概略以下の手順によるのが好ましい。
（１）イチゴの新鮮な葉、ガク片のいずれか一つ以上を少量採取し、極低温でできるだけ細かく破砕する。
（２）破砕後、ソルビトールとポリエチレングリコールを含む緩衝液を注入し、撹拌する。
（３）撹拌後、遠心し、上清をできるだけ除いた後、多糖類の除去に有効なＤＮＡ抽出剤によってＤＮＡを精製、分離して、抽出する。
【００１２】
ＰＣＲ増幅に必要なプライマーの選定は本発明にとって最も重要な事項である。ＡＦＬＰ法では、抽出したイチゴのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＭｓｅＩで切断した断片にアダプタを連結し、予備的にＰＣＲ増幅して断片の相対数を変更し、この断片を鋳型として選択的ＰＣＲ増幅を行うのであるが、この２回目のＰＣＲ増幅のときに用いるプライマーとしては、制限酵素ＥｃｏＲＩ切断側に３塩基を付加したプライマーと、制限酵素ＭｓｅＩ切断側に３塩基を付加したプライマーとがある。
【００１３】
ＥｃｏＲＩ切断側に付加する３塩基の配列としては、ＡＡＡ、ＡＡＴ、ＡＡＧ、ＡＡＣをはじめ、４×４×４＝６４種あり、ＭｓｅＩ切断側に付加する３塩基の配列も同様に６４種ある。したがって、ＥｃｏＲＩ切断側プライマーとＭｓｅＩ切断側プライマーを対とする組み合わせは、６４×６４＝４，０９６通りあることになる。これら４，０９６通りの組み合わせのすべてのプライマー対を用いて選択的ＰＣＲ増幅を行ったのでは、選択的ＰＣＲ増幅およびその後の解析に膨大な時間を要することになる。品種識別を効率的に行うためには、最少のプライマー対で最大の識別能を得ることのできるプライマー対を選定する必要がある。
【００１４】
本発明においては、選択的ＰＣＲ増幅に用いるプライマー対として、ＥｃｏＲＩ切断側にＡＧＣの３塩基を付加したプライマー「ＥｃｏＲＩ＋ＡＧＣ」と、ＭｓｅＩ切断側にＣＡＡの３塩基を付加したプライマー「ＭｓｅＩ＋ＣＡＡ」を用いる。この一対のプライマーを用いるだけで、１０品種程度のイチゴの品種を識別することが可能である。さらに識別精度を高めるためには、プライマー対として、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＡＣ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＡＡ」、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＣＣ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＡＡ」、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＣＧ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＡＡ」、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＣＴ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＴＡ」、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＣＡ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＴＡ」、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＣＣ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＴＡ」の各プライマー対を用いてＰＣＲ増幅する。これにより、最終的には９９％以上の確率で品種識別が可能となる。これらのプライマーは、自製することも可能であるが、市販品の試薬キット（たとえばアプライドバイオシステムジャパン株式会社製の試薬キット）を利用することもできる。
【実施例】
【００１５】
以下、新品種を含む１０品種のイチゴを対象にしてＤＮＡ分析による品種識別を行った実施例について説明する。識別対象としたイチゴの品種名は、「福岡Ｓ６号」、「とよのか」、「さちのか」、「女峰」、「とちおとめ」、「アスカルビー」、「レッドパール」、「さがほのか」、「章姫」、「アイベリー」であり、「福岡Ｓ６号」が新品種である。
【００１６】
上記品種の未展開葉またはガク片０．０５ｇを、ジルコニアボールを入れた２．０ｍｌのエンッペンチューブにそれぞれ分取し、−８０℃で保存した。これらのチューブを液体窒素中に沈めた後、ワーリングブレンダー３００ＭＭ（Ｒｅｔｃｈ社製）にセットし、３０秒間破砕した。破砕後、０．１％チオグリコール酸を添加した５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５ｍＭＥＤＴＡ、３５０ｍＭＳｏｒｂｉｔｏｌ、１０％ＰＥＧ含む）を各１ｍｌ分注し、撹拌した。その後、温度４℃、６０００回転／分のもとで５分間遠心し、上清をできるだけ除いた後、ＤＮＡ抽出キットＮｕｃｌｅｏｎ  ＰＨＹＴＯ  Ｐｕｒｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて全ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは１００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に溶解し、紫外吸光測定器ＤＵ６４０（ＢＥＣＫＭＡＮ社製）で定量し、その値を基に濃度を調整して供試した。
【００１７】
制限酵素処理は、各イチゴ品種から抽出したＤＮＡと、制限酵素ＥｃｏＲＩ（１５ｕ／μｌ、Ｔａｋａｒａ社製）、ＭｓｅＩ（１０ｕ／μｌ、ＢｉｏＬａｂｓ社製）を用いてそれぞれ以下のように実施した。ＤＮＡ０．５μｇ、酵素１０ｕおよび１０倍濃度緩衝液を用い、滅菌蒸留水で２０μｌに調整して、温度３７℃、２時間処理した。ＡＦＬＰ法の実施にあたっては、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＡＦＬＰスタートアップモジュール（レギュラー用）およびＰＲＩＳＭ３１０ジェネティックアナライザーを使用し、解析用ソフトＧｅｎｅＳｃａｎを用いて解析した。
【００１８】
まず、新品種である「福岡Ｓ６号」の識別を目的に、この品種と交配親株の育成に利用した「とよのか」と「さちのか」を加えた３品種間のＡＦＬＰ法による多型の検出を行った。その結果を図１に示す。図中の記号◎は「福岡Ｓ６号」に、記号●は「とよのか」に、記号○は「さちのか」にそれぞれ単独の多型が得られたプライマーの組み合わせを示す。記号−はいずれにも単独の多型が得られなかったプライマーの組み合わせを示す。
【００１９】
図１に示すように、８種のＥｃｏＲＩ切断側プライマーと８種のＭｓｅＩ切断側プライマーを組み合わせた６４種のプライマー対のうち、５３種のプライマー対で多型が検出された。このうち、ＭｓｅＩ切断側にＣＡＡまたはＣＴＡの３塩基を付加したプライマーを用いた組み合わせで、供試した３品種に単独の多型が多く認められた。このことから、供試した全品種の多型検出には、ＭｓｅＩ切断側にＣＡＡまたはＣＴＡの３塩基を付加したプライマーを用いた組み合わせを用いると良いと考えられた。
【００２０】
そこで、供試した全１０品種に対して、ＭｓｅＩ切断にＣＡＡまたはＣＴＡの３塩基を付加したプライマーに８種のＥｃｏＲＩ切断側プライマーを組み合わせた１６種のプライマー対を用いてＡＦＬＰ法による多型の検出を行った。その結果、すべての組み合わせで多型が検出された。図２はその結果の一部を示す図であり、図中の記号＋は当該マーカーに対応するＤＮＡ断片が存在したことを示し、記号−は存在しなかったことを示す。同図に示されるように、多くの組み合わせのなかでも、ＥｃｏＲＩ切断側にＡＧＣの３塩基を付加したプライマー「ＥｃｏＲＩ＋ＡＧＣ」とＭｓｅＩ切断側にＣＡＡの３塩基を付加したプライマー「ＭｓｅＩ＋ＣＡＡ」の組み合わせでは、８個の多型が認められ、このプライマー対を用いるだけで、新品種である「福岡Ｓ６号」と他の９品種との同一または相違を識別可能であることが確認された。
【００２１】
さらに識別精度を高めるには、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＡＣ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＡＡ」、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＣＣ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＡＡ」、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＣＧ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＡＡ」、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＣＴ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＴＡ」、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＣＡ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＴＡ」、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＣＣ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＴＡ」の各プライマー対を用いて多型検出し、これらの結果を加えることで、たとえば、「福岡Ｓ６号」については、「ＥｃｏＲＩ＋ＡＧＣ」と「ＭｓｅＩ＋ＣＡＡ」のプライマー対を用いた多型検出では識別確率が約９６．６％であったものが、補助的なプライマー対を用いることにより識別確率は順次高くなり、最終的には９９．９９９９％の確率で識別可能となる。
【００２２】
なお上記実施例では、イチゴ品種として「福岡Ｓ６号」、「とよのか」、「さちのか」、「女峰」、「とちおとめ」、「アスカルビー」、「レッドパール」、「さがほのか」、「章姫」、「アイベリー」の１０品種を供試したが、これ以外の品種であっても、同様の方法により識別可能であることを実験で確認している。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明のイチゴの品種識別方法を採用することにより、客観的かつ高い精度で品種識別が可能となるので、他者による育成者権の侵害事実を立証することが容易になり、育成者権者の保護に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】３品種のイチゴのＤＮＡについて予備的に行った多型検出の結果を示す図である。
【図２】本発明の方法により１０品種のイチゴについてＤＮＡ分析による品種識別を行った結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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