(57)【要約】【課題】  pH 10〜12で増殖が可能で、かつインジゴ還元能を有する微生物を提供するものである。【解決手段】  本発明は、pH 10〜12で生育することができるアルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）に属する微生物であって、インジゴ還元能を有するインジゴ還元微生物、及び該微生物を用いたインジゴの還元方法にある。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生育pHがpH 10〜pH 12で、インジゴ還元能を有するアルカリバクテリウム（Alkalibacterium）属に属する微生物。
【請求項２】
アルカリバクテリウム（Alkalibacterium）属に属する微生物が、インジゴ還元能を有するアルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）に属する微生物である請求項１記載の微生物。
【請求項３】
アルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）に属する微生物が、アルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）IDR2-2T株である請求項２記載の微生物。
【請求項４】
アルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）に属する微生物が、アルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６４８である、請求項２に記載の微生物。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかの項記載の微生物を含有する、インジゴ還元用組成物。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれかの項記載の微生物を固定化した、インジゴ還元用組成物。
【請求項７】
生育培地又は藍から調製されたすくもを含有する発酵建液中で、インジゴと請求項１乃至４のいずれかの項記載の微生物とを接触することを特徴とする、インジゴを還元する方法。
【請求項８】
生育培地又は藍から調製されたすくもを含有する発酵建液中で、インジゴと請求項５又は６に記載のインジゴ還元用組成物とを接触することを特徴とする、インジゴを還元する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なインジゴ還元微生物等に関するものである。特に、pH 10〜pH 12の
高アルカリ側で増殖が可能で、かつインジゴ還元能を有するインジゴ還元好アルカリ性微
生物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、インジゴによる染色は、(1) 天然藍、すなわち植物の蓼藍から調製されたすくも
を用いての発酵建による方法（正藍建）、(2) (1)の発酵建液に化学合成された合成インジゴを添加する方法（割建）、(3) 藍から調製されたすくも及び合成インジゴをハイドロサルファイトで還元する化学建（ハイドロ建）による方法が行なわれている。
【０００３】
このうち、(1) の天然藍由来のすくもや(2) (1)の発酵建液に合成インジゴを加えた方法により染色した製品は、関与する微生物の作用により、より優美にして鮮明な色調が得られ、耐水性が強い等多くの特徴を有している。
【０００４】
ただ、(1)の発酵建による方法及び(1)に合成インジゴを加える方法は、発酵に長時間を要すこと、管理が非常に難しく相当の経験がないと建てることができないという欠点を有している。
【０００５】
これまで、インジゴの微生物還元に関する特許としては高原らによる「合成藍の微生物還元法」（特許文献１）が出されているだけである。これに関連して高原らは研究論文（非特許文献２）の中で、藍の発酵建液中に存在するインジゴ還元能を有する微生物を単離し、バチルス（Bacillus）属の新種、すなわちバチルス  アルカリフィラス（Bacillus alkaliphilus）を提案したが、現在では本微生物は何処にも保管されていない。さらに本微生物は藍玉（蓼藍から調製されたすくもを玉状にしたもの）の中に含まれる7種類のアミノ酸からなるペプチドが必須で、これらのペプチドが含まれていない培地では増殖できない。
【０００６】
一方、1999年パデン（A. N. Padden）らの研究論文｛インターナショナル  ジャーナルオブ  システマチック  バクテリオロジー、第49巻、pp. 1025−1031（1999年）｝の中で、大青（たいせい）というアブラナ科の植物の葉を大樽の中で発酵させた発酵液からインジゴ還元能を有する偏性嫌気性細菌クロストリジウム  イサチジス（Clostridium isatidis）の単離した。ただ大青は蓼藍とは品種が異なっていること、本微生物は偏性嫌気性であるためその培養が困難である、通常の還元条件であるpH 10以上の生育が良好ではないなど問題が多い。
【０００７】
上記の様に、これまでインジゴ還元能を有する微生物が単離されているが、現在それらの微生物を用いての発酵建が行なわれている例はない。
【０００８】
【特許文献１】特許第124188号（発行日：1959.5.14）
【非特許文献１】「醗酵工学雑誌」第40巻、第2号、pp. 77−80（1962年）
【非特許文献２】インターナショナル  ジャーナルオブ  システマチック  バクテリオロジー、第49巻、pp. 1025−1031（1999年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在、インジゴ還元能を有する特定の微生物を用いたインジゴの染色は、工業的には全く行われていない。
【００１０】
現在一般的に行なわれている発酵建法は、天然染料としてすくもからインジゴを可溶化した藍の発酵建液又はこの発酵建液に合成インジゴを添加したものに、繊維を漬けることにより染色を行なっているが、この方法では発酵建液を染色可能な状態にするにはかなりの日数が必要となっている。そこで新規でインジゴ還元能の優れた微生物を単離することができれば、そのような微生物を上記発酵建液に添加することにより、大幅に日数の短縮が可能となるばかりではなく、鮮明な色彩、深淵な色調、強い対耐水性をもった商品を得ることが期待できる。
【００１１】
そこで、本発明の目的は、インジゴ還元能に優れた微生物の単離及び当該微生物を用いたインジゴの還元方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を行なった結果、天然の蓼藍から調製されたすくもの発酵建液中に、インジゴ還元能に優れた微生物が存在することを見出し、本発明を完成するに到った。
【００１３】
本発明者らは、北海道伊達市で作られた発酵建液からインジゴ還元能に優れた微生物を単離することに成功し、単離したインジゴ還元菌をIDR2-2株と命名した。そして、この微生物の特徴を分析し、この微生物がアルカリバクテリウム（Alkalibacterium）属に属する新種であるという知見を得た。
【００１４】
本発明の要旨は次のとおりである。
すなわち、本発明は、（１）生育pHがpH 10〜pH 12で、インジゴ還元能を有するアルカリバクテリウム（Alkalibacterium）属に属する微生物である。  
【００１５】
また、本発明は、（２）アルカリバクテリウム（Alkalibacterium）属に属する微生物が、インジゴ還元能を有するアルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）に属する微生物である上記（１）記載の微生物である。
【００１６】
また、本発明は、（３）アルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）に属する微生物が、アルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）IDR2-2T株である上記（２）記載の微生物である。
【００１７】
また、本発明は、（４）アルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）に属する微生物が、アルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６４８である、上記（２）記載の微生物である。
【００１８】
また、本発明は、（５）上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の微生物を含有する、インジゴ還元用組成物である。
【００１９】
また、本発明は、（６）上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の微生物を固定化した、インジゴ還元用組成物である。
【００２０】
また、本発明は、（７）生育培地又は藍から調製されたすくもを含有する発酵建液中で、インジゴと上記（１）乃至（４）のいずれかの項記載の微生物とを接触することを特徴とする、インジゴを還元する方法である。
【００２１】
また、本発明は、（８）生育培地又は藍から調製されたすくもを含有する発酵建液中で、インジゴと上記（５）乃至（６）に記載のインジゴ還元用組成物とを接触することを特徴とする、インジゴを還元する方法である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、新規なインジゴ還元微生物、及びそれらを用いたインジゴを還元する方
法が提供される。本発明のインジゴ還元微生物は、合成インジゴ単体の液体培養、のみな
らずインジゴをふくんだ植物の蓼藍から調製されたすくもの液体培養液及びそれに合成イ
ンジゴを加えたの培養液に対しても還元能を示す。また、本発明のインジゴ還元微生物は
好アルカリ性であるので、高アルカリ側でのインジゴの還元が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２４】
先ず、本発明のインジゴ還元微生物について説明する。
本明細書において、「インジゴ」とは合成インジゴのみならずインジゴ成分を含有している植物（蓼藍、大青、琉球藍、インディゴなど）等が含まれる。例えば、合成インジゴ植物由来インジゴ、微生物由来インジゴ、その他インジゴ含有化物等が挙げられる。
【００２５】
本発明のインジゴ還元微生物は、pH 10〜pH 12で生育することができるアルカリバ
クテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）に属する微生物であり、例えば、アルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）IDR2-2T株が挙げられる。本微生物は、前記pH 10〜pH 12で生育することができ、且つインジゴ還元能を有するアルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス変種又は変異株であってもよい。さらに、本発明にはアルカリバクテリウム属（Alkalibacterium spp.）に属する生育pHがpH 10〜pH 12で、インジゴ還元能を有する全ての微生物も含まれる。
【００２６】
本発明者らが単離した一例の微生物（IDR2-2T株）は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６４８として寄託されている。上記微生物は、蓼藍から調製されたすくもを発酵させた発酵建液から単離されたものである。IDR2-2T株の分離のために、ペプトン／酵母エキス／合成インジゴ／無機塩類／アルカリ（PYA）培地及び強化クロストリジウム寒天（RCA）培地を使用し、PYA培地で還元型インジゴを生成させ、その還元能を指標として選択した。
【００２７】
この微生物の菌学的性質は、次のとおりである。
〔１〕形態学的性質
（１）グラム染色：陽性
（２）芽胞：無し
（３）運動性：有り
（４）菌形：桿菌
〔２〕培地における生育特性
色調は無色であり、コロニーの形状は円形であり、コロニーの表面は平滑である。
〔３〕化学分類学的特性
ＤＮＡのＧ＋Ｃモル含有量は４０．６％である。
〔４〕生理・生化学的特性
カタラーゼ試験：陰性
オキシダーゼ試験：陰性
デンプン分解：陰性
ゼラチン分解：陰性
各pHにおける生育
6：−
7：−
8：−
9：−
10：＋
11：＋
12：＋
各食塩（NaCl）濃度における生育
0％：＋
3％：＋
5％：＋
7％：＋
9％：＋
10％：＋
11％：＋
12％：＋
13％：＋
14％：＋
15％：＋
16％：＋
17％：＋
18％：−
20％：−
各温度における生育
0℃：−
5℃：＋
10℃：＋
20℃：＋
30℃：＋
40℃：＋
45℃：＋
50℃：−
【００２８】
本発明のインジゴ還元微生物は、D-アラビノース、D-キシローズ、D-グルコース、及びマルトースから酸を産生する。しかしラフィノース、myo-イノシトール、マンニトール、及びシュークロースから酸を産生しない。
【００２９】
本発明インジゴ還元微生物の菌体脂肪酸の種類と脂肪酸組成は、デカン酸（C10:0；0.7%），テトラデカン酸（C14:0；10.9%）、ヘキサデカン酸（C16:0；37.7%）、ヘキサデセン酸（C16:17c；2.2%）、ヘキサデセン酸（C16:19c；34.7%）、オクタデカン酸（C18:0；1.5%）、及びオクタデセン酸（C18:19c；10.3%）である。
【００３０】
IDR2-2T株のDNAを抽出し、PCR法により16S rRNA遺伝子を増幅し、増幅して得られた16S rRNA遺伝子の塩基配列をオートシークエンサーで解析し、ブラストサーチにより類似した塩基配列を調べた。その結果に基づき、類似した塩基配列と多重アラインメントを取り、得られた結果に基づき近隣結合法（Neighbor-Joining）により系統樹を作成したところ、IDR2-2T株はアルカリバクテリウム（Alkalibacterium）属細菌に分類されることが判明した。作成した系統樹を図１に示す。図１は、Alkalibacterium psychralcaliphilus IDR2-2T株の16S rRNA遺伝子に基づく系統的位置を示す図であり、系統樹内の数字はブートストラップ値が500以上を示す。バーは、0.1 Kuncユニットを示す。
【００３１】
中でもアルカリバクテリウム  オリボアプロリテイカス（Alkalibacterium olivoaprovliticus）と最も高い相同性が示された。
【００３２】
上記16S rRNA遺伝子の塩基配列における相同性において相同性の高かったアルカリバクテリウム  オリボアプロリテイカス（Alkalibacterium olivoaprovliticus）及びマリニラクチバチルス  サイクロトレランス（Marinilactibacillus psychrotolerans）について、微生物を保存機関より入手し、IDR2-2T株株からDNAを抽出し、IDR2-2T株のDNAをフォトビオチンでラベルしプローブを作成し、ブラックマイクロプレートに披検DNAを固定し、相同性を蛍光測定により算出した。結果はIDR2-2T株がAlkalibacterium olivoaprovliticus及びMarinilactibacillus psychrotoleransとそれぞれ24.3%及び7.6%の相同性を示した。DNA−DNA相同性試験において70%以上であると同一種と考えられるが、IDR2-2T株はAlkalibacterium 属に属する新種であることが示された。
【００３３】
本発明のインジゴ還元微生物は、合成インジゴ単体を直接還元することができる。また天然染料としてすくもからインジゴを可溶化した蓼藍の発酵建液及び本液に合成インジゴを添加した発酵建液に本インジゴ還元微生物を加えることにより発酵建液を染色可能な状態にするための日数の大幅な短縮可能となる。本微生物そのものをインジゴを含む生育培地あるいは発酵建液中に直接添加してもよいし、固相担体（例えば、光硬化性樹脂、ウレタンプレポリマー、エポキシ樹脂、寒天、キトサン、アルギン酸等）に菌体を固定してから用いてもよい。この際、発酵pHは10〜12が望ましい。また本発明のインジゴ還元微生物は5〜45℃の範囲の温度で増殖することができるので、広い温度範囲での利用が可能である。
【００３４】
次に、本発明のインジゴ還元法について説明する。本発明のインジゴ還元微生物は、そのまま合成インジゴの還元に用いることもでき、またすくもからの発酵建液に含まれるインジゴを還元することもできる。さらに、本発明のインジゴ還元微生物を含有するインジゴ還元用組成物として用いてもよい。
【００３５】
このようなインジゴ還元組成物としては、例えば液状製剤や粉末製剤が挙げられる。
液状製剤とするには、例えば下記方法によって実施可能である。
インジゴ還元微生物を培養し、この培養液物を遠心分離し、菌体を回収し、pH 10に調整した生理食塩水を加えて適当な濃度となるように懸濁し、インジゴ還元用組成物とする。また、インジゴ還元用組成物には、必要に応じてpH調整剤等を加えてもよい。
【００３６】
粉末製剤とするには、例えば下記方法によって実施可能である。
インジゴ還元微生物を培養し、この培養液を凍結乾燥等によって乾燥し、粉末製剤とする。また、培養液から菌体を遠心分離によって回収し、pH 10に調整した生理食塩水や新鮮な培地と懸濁した後、凍結乾燥等によって乾燥しもよい。また、凍結乾燥前にpH調整剤等を加えてもよい。
【００３７】
また、本発明のインジゴ還元用組成物は、上記インジゴ還元微生物を固相担体に固定して製造することができる。インジゴ還元微生物を固定するための固相担体としては、微生物の固定に使用できるものであればいずれでも良く、特に限定されるものではない。例えば、アルギン酸、活性炭、珪藻土セラミック多孔体等があげられる。このような固相担体の形状としては、球状または円柱等が好適であり、球状の場合、粒径は好ましくは0.3〜2.8 mm程度であり、さらに好ましくは0.3〜1.2 mm程度である。
【００３８】
次に、本発明のインジゴ成分を還元する方法について説明する。本発明のインジゴを還元する方法は、本発明のインジゴ還元微生物、又はインジゴ還元用組成物を、インジゴ成分を含有する培地又は発酵建液と接触することを特徴とする。
【００３９】
本発明のインジゴ成分を還元する方法は、インジゴ分を含有する培地に、本発明のインジゴ還元微生物を、又はインジゴ還元用組成物を投与することによって実施することができる。インジゴ還元微生物、又はインジゴ還元用組成物の投与量に特に制限はなく、培地又は天然藍由来のすくもからの発酵建液中のインジゴを還元できる量でもよい。なお、培地又は発酵建液のpHは10〜12の範囲が好ましいが、それ以下でもよい。本発明の微生物を用いることによって、合成インジゴ又は天然藍由来のすくもからの発酵建液中のインジゴを還元する方法により得られた還元型インジゴで、繊維の染色が可能となる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例にその技術範囲が限定されるものではない。なお、以下の実施例において%は、特に断りのない限り質量%を表す。
【００４１】
実施例１
北海道伊達市の黎明観で調製された天然蓼藍を原料としたインジゴを含む発酵建液を、インジゴ還元微生物を単離するための材料として用いた。
【００４２】
インジゴ還元能の優れた微生物を取得するための集積培養には、PYA培地｛PY培地（ペプトン、8 g；酵母エキス、3 g； インジゴ0.1 g；K2HPO4、1 g；EDTA、3.5 mg；ZnSO4・7H2O、3 mg；FeSO4・7H2O、10 mg；MnSO4・nH2O、2 mg；CuSO4・5H2O、0.1 mg；Co(NO3)2・6H2O、2 mg；H3BO3、1 mg；蒸留水、900 ml）、及びpH 10に調整するためのアルカリ緩衝液（1 MのNaHCO3／Na2CO3）100 mlをそれぞれ別滅菌し、滅菌後混合した｝を用いた。
【００４３】
また、集積培養で得られたインジゴ還元微生物の単離には、アルカリ−RCA寒天培地（アルカリ−強化クロストリジウム寒天培地）｛RCA培地（Reinforced Clostridial寒天培地：シグマ）900 ml及びpH 10に調整するためのアルカリ緩衝液（1 MのNaHCO3／Na2CO3）100 mlをそれぞれ別滅菌し、混合したものを、シャーレに分注し固化してインジゴ還元微生物単離用培地とした。
【００４４】
まず、インジゴ還元微生物を取得するためＰＹＡ培地100 mlを入れた100mlの三角フラスコに、前記発酵建液5 mlを加え、27℃で静置培養を行った。微生物によるインジゴ還元が行なわれたのを確認後、この培養液を5 ml取り100 mlの三角フラスコに入った集積培養用培地に加えた。このような操作を５度行い、インジゴ還元能の優れた微生物を選別した。
【００４５】
なお、インジゴ還元の有無については、使用するインジゴは合成されたもので、水に不溶性の粉末で培養前にはフラスコの底に沈んでいるが、微生物により還元されることにより沈殿していたインジゴは可溶化し、培養液中に溶ける。インジゴの還元が進むにつれ、培養液の色は深緑又は緑色に変化する。培養液の色の変化、すなわち深緑又は緑色への変化で、インジゴ還元が起こっていると判断した。
【００４６】
上記インジゴ還元微生物を単離するため、インジゴ還元能の優れた微生物を含む培養液を１白金耳採り、上記アルカリ−RCA寒天培地に画線（接種）し、27℃で培養を行った。そして４８時間培養後に単一のコロニーを取り、再度アルカリ−RCA寒天培地に画線、単一コロニーを生成させた。この単離操作を５度繰り返し、インジゴ還元能の優れた微生物を単離した。
【００４７】
得られた単離微生物のインジゴ還元能をチェックするため、本微生物をPYGA培地（グルコース 2 gを加えたPY培地900 ml及びpH 10に調整するためのアルカリ緩衝液100 mlをそれぞれ別滅菌し、滅菌後混合した）に接種後、培養を行って培養液が深緑色又は緑色への変化することを観察した。
【００４８】
このようにして得られた単離微生物をIRD2-2T株と命名した。このIDR2-2T株は独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６４８として寄託されている。そして、この菌株についてその菌学的性質を検討した結果、本菌が、アルカリバクテリウム（Alkalibacterium）属に属する新種である知見を得、アルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）と同定した。  
【００４９】
実施例２
実施例１で示したアルカリ−ＲＣＡ寒天培地をシャーレに分注して固化したプレートに、アルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）IDR2-2T株を無菌的に１白菌耳接種し、２７℃で５日間静置培養を行う。得られる培養物から菌体を分離して、かかる菌体をインジゴ還元用組成物とした。
【００５０】
実施例３
実施例１で示したアルカリ−ＲＣＡ寒天培地の斜面（スラント）を作成し、このスラントにアルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）IDR2-2T株を無菌的に１白菌耳接種し、２７℃で５日間静置培養を行う。得られる培養物から菌体を分離して、かかる菌体をインジゴ還元用組成物とした。
【００５１】
実施例４
アルカリ−ＲＣＢ寒天培地｛アルカリ−強化クロストリジウム液体培地、ＲＣＢ培地（Reinforced Clostridial 液体培地）：シグマ｝225mlを肩付きフラスコ(500ml)に入れオートクレーブで滅菌後、アルカリ緩衝液（１ＭのNaHCO3／Na2CO3）を加えｐＨ１０に調製し、この培地にアルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）IDR2-2T株を無菌的に１白菌耳接種し、２７℃で１日（約２４時間）振とう培養（１２往復）を行った。得られる培養液をそのまま、或いはこの培養液を遠心分離（6,000rpm,30分間）にかけ集菌したものをインジゴ還元用組成物とした。
【００５２】
実施例５
アルカリ−ＲＣＢ寒天培地｛アルカリ-強化クロストリジウム液体培地、ＲＣＢ培地（Reinforced Clostridial 液体培地）：シグマ｝９0mlを三角フラスコ(100ml)に入れオートクレーブで滅菌後、アルカリ緩衝液（１ＭのNaHCO3／Na2CO3）10mlを加えｐＨ１０に調製し、この培地に実施例２で得られるインジゴ還元用組成物を加え、さらに別途滅菌した流動パラフィン15mlを加え、培地が微好気あるいは嫌気状態になるように調整し、２７℃で静置培養を行った。培養１日目で培養液の色が変化し始め、５日目には培養液の色は深緑色に変化し、インジゴの還元が完全に行われたことが確認できた。
【００５３】
さらに、上層の流動パラフィンを培養フラスコから除いた後、200ml容のビーカーに移し一般に使われている発酵建液と同様に布切れの染色を試みたところ同様の染色結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】アルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）IDR2-2T株の16S rRNA遺伝子に基づく系統的位置を示す図である。
【図１】
2005270028.tif 000002