(57)【要約】【構成】１）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ由来の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を宿主に導入して、制限遺伝子を発現させ；２）ＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ活性をコードし且つ発現するプラスミドを含む宿主を発酵させ；次いで３）ＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼをコードし且つ発現するプラスミドを含む発酵させた宿主からＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼを精製することによる、ＢｇｌＩＩエンドヌクレアーゼをクローニング及び産生するための方法。【効果】ＢｇｌＩＩエンドヌクレアーゼの製造を可能にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ．４の８１４−１４８５位と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の組換えベクターにより形質転換した宿主細胞。
【請求項４】
エンドヌクレアーゼが発現するのに好適な条件下で、請求項３に記載の宿主細胞を培養することを含むＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼの産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ並びに組換えＤＮＡを含む細胞からこれらの酵素を産生することに関する。
【背景技術】
【０００２】
制限エンドヌクレアーゼは、今や分子生物学の主要な道具のひとつである。これらは天然では広範な微生物、ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ及びａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ［Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＭａｃｅｌｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２０：２１６７−２１８０（１９９２）］の両方に産生するが、精製すると配列−特異的方法でＤＮＡを小さなフラグメントに切断するために使用し得る。多くの種類の制限酵素を大規模に使用し得ることにより、ＤＮＡ分子を成分遺伝子に特定的に識別し且つ細分し得る。
【０００３】
制限エンドヌクレアーゼは制限−修飾（ＲＭ）系の一成分であり、４０年にわたり広く研究されてきた［Ｌｕｒｉａ及びＨｕｍａｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．６４：５５７−５６９，（１９５２）；Ｂｅｒｔａｎｉ及びＷｅｉｇｌｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．６５：１１３−１２１，（１９５３）］。通常この系は第二成分の修飾メチラーゼを含んでいる［Ａｒｂｅｒ及びＬｉｎｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３８：４６７−５００，（１９６９）；Ｂｏｙｅｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１５３−１７６，（１９７１）］。自然界ではＲＭ系は、細胞内に入る外来ＤＮＡを破壊する“バクテリア免疫系”として作用すると考えられている［Ｓｍｉｔｈ，ＰＡＡＢＳ  ＲＥＶＩＳＴＡ  ５：３１３−３１８，（１９７６）］。しかしながら、個々の微生物は７つもの異なったＲＭ系を含むことが公知であり、この明白な冗長性はこれらの系が他の機能も同様に提供することを示唆している［Ｓｔｅｉｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：４８９９−４９０６，（１９９２）］。
【０００４】
微生物に於いて、制限エンドヌクレアーゼは特異的認識配列に関して入ってくるＤＮＡを精査し、ＤＮＡ分子内で二重鎖を切断する［Ｍｅｓｅｌｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：４４７−４６６，（１９７２）］。修飾メチラーゼはその制限相手の作用に対して微生物自身のＤＮＡを保護するように作用する。メチラーゼはその対応するエンドヌクレアーゼと同一ＤＮＡ配列を識別且つ結合するが、切断するかわりに制限配列内で特定残基をメチル化し、これによりエンドヌクレアーゼによる（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）結合または切断を妨害する［Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０５：４５５−４６２，（１９７９）］。このようにして、微生物宿主ＤＮＡは、細胞内で制限エンドヌクレアーゼによる切断に対して完全に耐性となる。
【０００５】
“ＲＭ系”という用語は当初、成分が遺伝子的に定義された系のみに適用されていた。しかしながら、現在、この用語は微生物から単離した任意の部位−特異的エンドヌクレアーゼを指すようになった。多くの場合、修飾メチラーゼ成分の存在は厳密な証拠なく仮定されている［Ｒｏｂｅｒｔｓ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１２３−１６４，（１９７６）］。
【０００６】
多くの制限酵素が種々の微生物から単離されることが明らかになったとき、Ｓｍｉｔｈ及びＮａｔｈａｎｓ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８１：４１９−４２３，（１９７３）］は、今日では少し変形されている学名命名法を案出した。制限酵素は、それが単離された属及び種を略称する３つの文字の名称で名付けられる。必要により、４つの文字を追加して株を示す（Ｈｉｎｄなど）。系の名前の後のローマ数字は、同一起源由来の多くの酵素と異なることを示している。接頭文字Ｒ及びＭは、各々制限エンドヌクレアーゼまたは修飾メチラーゼを指すが、通常含まれない。３文字の名称を接頭文字なしに使用する際、これはエンドヌクレアーゼを指すと理解される。
【０００７】
制限エンドヌクレアーゼ、及びＤＮＡメチラーゼは幾分、遺伝子工学に関してそれほど重要な試薬ではなくなってきている。生物工学の分野が成長及び発達するにつれて、これらの酵素を多量に産生するための商業的動機が高まって来た。しかしながら、これらの天然の微生物から制限酵素を大量生産するのは、幾つかの理由から困難である。第１に、多くの微生物が数種のＲＭ系を産生するので、異なる産物を生物化学的に分離するのは問題がある。第２に、多くの制限系以外に、微生物は制限酵素調製物から生物化学的に分離するのが困難なＤＮＡ結合タンパク質及び他のヌクレアーゼも産生し得る。第３に、微生物により産生された特定の酵素量は非常にまちまちで、生長条件に依存して変動し得る。最後に、数種の微生物は、生長させるのが困難、高価または危険でさえある。これらの問題を解決するために及び制限酵素を複製可能に多量に得るために、遺伝子工学方法を微生物の高度に産生可能な株を作り出すために適用した。
【０００８】
ＲＭ系のクローニングは最初に１９７０年代に始まったが、以来、努力にも拘わらず多くの問題を包含している。個々のクローニングプロジェクトに固有の問題とは、重要な遺伝子を識別及び単離することである。幾つかのＲＭ系はプラスミド由来であり、これらの場合メチラーゼ及びエンドヌクレアーゼ遺伝子の両方をコードするＤＮＡを単離し、これらを新しいベクターの上に転移させるのは比較的容易である［ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｃ．１２：３６５９−３６７６，（１９８４）；ＰａｅＲ７：Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ及びＲｏｙ，Ｇｅｎｅ  １９：３５５−３５９，（１９８２）；Ｇｉｎｇｅｒａｓ及びＢｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：４０２−４０６，（１９８３）；ＰｖｕＩＩ：Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌ．１６４：５０１−５０９，（１９８５）］。
【０００９】
しかしながら、非常に多くのＲＭ系はコードされたプラスミドではない。これらは主に、染色体ＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼまたは他の手段を使用してクローン化可能な大きさの小さな断片に切断する“ショットガン”法によりクローン化されてきた。これらの断片をクローニングベクター上にｅｎ  ｍａｓｓｅ連結し、各遺伝子が多数回現れる“ライブラリー”を産生する好適な微生物宿主に形質転換する。産生された数千ものの中から重要な遺伝子を保持するこれらのクローンを識別する選択方法を発見するのは困難である。
【００１０】
系の従来の特性により影響を受けたＲＭ系をクローン化するのに成功裏に使用した第１の選択方法は、バクテリオファージの使用を含んでいた。ファージの攻撃に暴露された時、ＲＭ系を保持する細胞は生存したが、ＲＭ系を発現しないものは生存しなかった［ＨｈａＩＩ：Ｍａｎｎら，Ｇｅｎｅ  ３：９７−１１２，（１９７８）：ＰｓｔＩ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５０３−１５０７，（１９８１）］。意外にも、この方法は全てはうまく行かなかった。クローン化ＲＭ系は選択的に生存物を与えるようには常に発現されない。さらに、細胞中に多くのＲＭ系が存在する場合、特定のＲＭ系をターゲットできなくても、クローン化したいであろう。さらにＲＭ系以外の他のクローン化機能は細胞をファージの攻撃から守り、選択後生存できるようにし得る［Ｍａｎｎら，略；Ｈｏｗａｒｄら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：７９３９−７９５１，（１９８６）；Ｓｌａｔｋｏら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：９７８１−９７９６，（１９８７）］。
【００１１】
より広く成功している第２の方法では、メチラーゼ遺伝子の発現を選択し、形質転換時、クローン化されたメチラーゼ遺伝子を含み且つ発現するライブラリー内の任意のプラスミドはその同種の認識部位をメチル化する。ライブラリーが好適な特異性のエンドヌクレアーゼにより切断されて順に選択される場合、修飾プラスミドは切断されずに、第２の形質転換段階時にも生存可能なままでなければならない。メチラーゼ遺伝子を含まない他のプラスミドはエンドヌクレアーゼにより切断されて、より低い効率で形質転換しなければならない［Ｋｉｓｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：６４０３−６４２１，（１９８５）；Ｌｕｎｎｅｎら，  Ｇｅｎｅ，７４：２５−３２，（１９８８）］。このように研究されて来た全てのＲＭ系に於いて、制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼ遺伝子は互いに非常に近接している［Ｗｉｌｓｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：２５３９−２５６６，（１９９１）］ので、メチラーゼ選択は完全ＲＭ系を産生することもある。他の場合では、選択によりメチラーゼ遺伝子のみが産生することもある。しかしながら、第２段階でエンドヌクレアーゼ遺伝子を含むより大きいかまたは隣接フラグメントをクローン化することも可能であった（Ｋｉｓｓら，略）。
【００１２】
好適な選択方法を知見する以外に、ＲＭ系をクローン化しようとする際に他の多くの問題点が発生した。例えばある系では、エンドヌクレアーゼ遺伝子を修飾により予め保護していない宿主細胞に導入する際に問題が発生した。両方の遺伝子を共通のＤＮＡフラグメントに一緒に導入する場合、例えばエンドヌクレアーゼが非常に早くまたは非常に多量に産生される場合、メチラーゼはエンドヌクレアーゼの作用から宿主ゲノムを好適に保護し得ない。エンドヌクレアーゼ遺伝子が導入される前にエンドヌクレアーゼ遺伝子の活性に対して細胞を保護するために、異なるベクター上に別個に２つの遺伝子をクローン化することが案出されてきた（Ｈｏｗａｒｄら，略）。ベクターの賢明な選択は、クローンの安定性並びにエンドヌクレアーゼの十分な産生にも重要である［Ｂｒｏｏｋｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：８４１−８５０，（１９９１）］。
【００１３】
Ｅ．ｃｏｌｉ中のＲＭ系をクローニングするもう一つの障害は、異種のメチラーゼ類をクローン化し且つ発現させる試みの際に現れた。Ｅ．ｃｏｌｉは、異種チトシン及び／またはアデニンメチル化を含む外来ＤＮＡを制限する種々の系を持つ［Ｒａｌｅｉｇｈ及びＷｉｌｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９０７０−９０７４，．（１９８６）；Ｎｏｙｅｒ−Ｗｅｉｄｎｅｒら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０５：４６９−４７５，（１９８６）；Ｗａｉｔｅ−Ｒｅｅｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：５２０７−５２１９，（１９９１）］。これらの系は、種々のメチラーゼ遺伝子をクローン化し、遺伝子的に印をつけたＥ．ｃｏｌｉ株中でこれらを発現させる試みのときだけに現出した。この問題は、時折、これらの系を欠くＥ．ｃｏｌｉ変異体を産生させることにより克服できた。ＲＭ系をクローニングするときにも問題が残っているが、より多くの系が研究されるにつれて、より良いクローニング方法が開発されている。
【００１４】
グラム陽性細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ由来のＢｇｌＩＩは、識別及び特徴付けすべき第１のＲＭ系のひとつであった［Ｗｉｌｓｏｎ及びＹｏｕｎｇ，Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ（編集），Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９７６，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．３０５−３５７，（１９７６）］。名称が包含するように同一種から単離されたもうひとつのＲＭ系、即ちＢｇｌＩが存在する。ＢｇｌＩ及びＢｇｌＩＩ系の両方は従来法に於いて、未改変バクテリオファージによる感染に対してバクテリアを保護するように挙動する。研究者らは、酵素が似たような分子量及びイオン特性を持つため、生化学的手段によりＲ．ＢｇｌＩＩからＲ．ＢｇｌＩを分離することが非常に困難であることを知見した［Ｐｉｒｒｏｔｔａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３：１７４７−１７６０，（１９７６）］ので、遺伝子方法を使用した。Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉを、標準法により突然変異誘発し、個々の単離物を非常に関連した株のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ上で増幅させた未改変ファージを使用する低レベルのファージ制限に関してスクリーニングした。各々Ｒ．ＢｇｌＩまたはＲ．ＢｇｌＩＩのみを産生するＢ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６１及びＲＵＢ５６２と名付けられた２つの変異株をこの方法で産生させた［Ｄｕｎｃａｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４：３３８−３４４，（１９７８）］。変異株はＢｇｌＩ及びＢｇｌＩＩの両方に関するメチラーゼを保持していた。本出願人は、ファージ制限に関するスクリーニングと組み合わせた突然変異誘発を使用することは、ＲＭ系成分の分離及び精製に関して一般的に適用し得る方法であると考えた。しかしながら、以後、ＲＭ系の発見は異種バクテリア内の遺伝子系の開発よりもずっと速度が速く、この方法は他のＲＭ系に適用できなかった。それにも拘わらず、２つのＢ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ株はＢｇｌＩ及びＢｇｌＩＩエンドヌクレアーゼの産生に広く使用されてきた。さらに、両方の株は以下に記載の如くＢｇｌＩＩ  ＲＭ系のクローニングにも重要であることが証明された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６２（Ｄｕｎｃａｎら，前掲；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得られるＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼに関する遺伝子をコードする組換えＤＮＡ並びに組換えＤＮＡを含む細胞から酵素を産生させる関連方法に関する。本発明は、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩ、即ちＤＮＡ配列５’−ＡＧＡＴＣＴ−３’を認識し、ＡとＧの間の認識配列内で切断し、４塩基５’伸長を残す酵素（Ｐｉｒｒｏｔｔａ，前掲）を発現する形質転換された宿主にも関する。本発明により産生したＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋で、実施例１、段階１９に記載の通常法により製造した制限エンドヌクレアーゼ中に通常知見される汚染物を含まない。ＢｇｌＩＩ  ＲＭ系をクローニングする好ましい方法の一つは、好適なベクターを構築し、Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６１（ＲＩＩ−ＭＩＩ＋）由来のＤＮＡを含む幾つかのライブラリーを作成し、ＢｇｌＩＩ修飾メチラーゼをコードするＤＮＡを含むこれらのクローンを単離し、ＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼタンパク質を精製してそのアミノ末端配列を決定し、エンドヌクレアーゼ遺伝子の５’末端に特異的な変性オリゴヌクレオチドプローブを設計し、ＢｇｌＩＩメチラーゼをコードするプラスミド上でエンドヌクレアーゼ遺伝子の末端及び方向を決め、Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６１由来のｂｇｌＩＩＭをコードするフラグメントの制限プロフィールとＢ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６２（ＲＩＩ＋ＭＩＩ＋）染色体の対応する領域とを比較し、Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６２由来の好適なフラグメントをクローニングし、エンドヌクレアーゼ活性に関して得られたクローンをスクリーニングし、調節プロモーターの後ろのエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングし、調節エンドヌクレアーゼ構築物を中程度のコピー数のベクター上でＢｇｌＩＩメチラーゼ遺伝子を保持する宿主に形質転換し、上記条件下で細胞を生長させてエンドヌクレアーゼの発現を誘発させ、次いで標準法を用いてＢｇｌＩＩエンドヌクレアーゼを精製することを含む。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、ＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ並びにこのような組換えＤＮＡを含むクローンから産生した酵素に関する。
【００１７】
本発明を通じて、ＢｇｌＩＩ  ＲＭ系のクローニングが幾つかの因子のために複雑であることが分かった。第１に、共通のクローニングベクター（即ち、ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１９，ｐＡＣＹＣ１８４など）はいずれもＢｇｌＩＩ部位を含まなかったので、新規ベクターを製造しなくてはならなかった。第２に、より重要な点として、クローン化された他の多くのＲＭ系と異なり、２つのＢｇｌＩＩ  ＲＭ遺伝子は天然Ｅ．ｃｏｌｉ宿主に１段階でトランスファーできない。従来法でライブラリーを作成及び選択しようとする試みは効果がないことが判明した（図１参照）。幸い、本出願人はＢｇｌＩＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（ｂｇｌＩＩＲ）が不活化された突然変異Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ株を自由に使用できた。突然変異株から単離したＤＮＡと一緒に、多重ＢｇｌＩＩ部位をもつ本出願人の新規ベクターを使用して、本出願人は、ライブラリーの構築、Ｍ．ＢｇｌＩＩ発現の選択及び組換えプラスミド上のＢｇｌＩＩメチラーゼ遺伝子を保持するクローンを単離できた。
【００１８】
突然変異株由来のｂｇｌＩＩＭのクローニングにより、ｂｇｌＩＩＲのクローニングがさらに複雑になった。変異株ライブラリーから活性ｂｇｌＩＩＲをクローン化できなかったので、非常に多くの追加段階が必要なことが判明した。これらの段階には、高コピー数ベクター上でのｂｇｌＩＩＭのサブクローニング及び過剰発現、Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６２由来のＲ．ＢｇｌＩＩの非常に純粋なサンプルの製造；エンドヌクレアーゼタンパク質のサイズ決定及びそのアミノ末端の配列決定、対応するＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブの設計並びにｂｇｌＩＩＭ組換えプラスミドへのプローブのハイブリダイゼーションの探知を含む。さらに、メチラーゼ遺伝子がクローン化された変異株Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６１株が、突然変異工程の結果としてエンドヌクレアーゼ遺伝子領域に任意の目立った染色体転移を含んでいたかどうかを検討することが必要であった。全く転移が起きなかったことを確認後、ｂｇｌＩＩＲの５’末端を含む領域をｂｇｌＩＩＭプラスミド上にマッピングし、一連のＰＣＲ実験からエンドヌクレアーゼ遺伝子の方向を決定した。この情報を使用して、第２のゲノムライブラリーを、ｐＡＣＹＣ１７７にクローン化したＢ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６２  ＤＮＡのサイズ−選択制限フラグメントから製造した。ライブラリーを、ｂｇｌＩＩＭ−含有プラスミドにより保護したＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞に形質転換した。形質転換コロニーをＲ．ＢｇｌＩＩ活性に関して５０個の群でスクリーニングし、これらの群からｂｇｌＩＩＲを保持し且つ発現する個々のコロニーを識別した。Ｒ．ＢｇｌＩＩのオーバーエクスプレッサーを製造するためにさらにクローンを操作することが必要であった。
【００１９】
ｂｇｌＩＩＭ及びｂｇｌＩＩＲが好ましくクローン化され且つ発現される本明細書中に記載の方法は図２に示されており、以下の段階を含む。
【００２０】
１．クローニングベクター構築：プラスミドｐＡＭＢ３、即ち３つの計画的に配置されたＢｇｌＩＩ部位を含むｐＢＲ３２２誘導体（図３）を構築する。その構築法は実施例１に記載されている。
【００２１】
２．ゲノムＤＮＡ精製：ｂｇｌＩＩＭのクローニングに関しては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６１をＬＢ培地で生長させる。ｂｇｌＩＩＲのクローニングに関しては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６２を同様に生長させる。細胞を収穫し、ＤＮＡを精製する。
【００２２】
３．ゲノムＤＮＡ消化：Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６１  ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ、例えばＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩまたはＰｓｔＩで完全に消化させる。ＰｓｔＩは消化するとｂｇｌＩＩＭクローンしか与えないので、この操作の詳細のみ記載する。
【００２３】
４．“ショットガン”ライブラリー製造：消化したゲノムＤＮＡを、ＰｓｔＩ−切断して脱ホスホリル化したｐＡＭＢ３ベクターに連結する。連結混合物を使用してＲＲ１またはＫ８０２（各々、ＡＴＣＣ  ３１３４３及びＡＴＣＣ  ３３５２６）のようにＥ．ｃｏｌｉ宿主を形質転換する。ＲＲ１は好ましい宿主株である。エレクトロポレーションは形質転換の好ましい方法であるが、化学的方法も使用し得る。
【００２４】
５．細胞ライブラリー選択：形質転換混合物を選択的抗生物質培地上に載置する。この場合、テトラサイクリンプレートを使用する。一晩インキュベーション後、形質転換体をプレートから掻き出し、細胞ライブラリーを構築するためにプールする。Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉゲノムを好適に確実に発現させるために、１０，０００コロニー以上を含むライブラリーだけを使用する。
【００２５】
６．組換えプラスミド精製：組換えプラスミドを細胞ライブラリーからｉｎ  ｔｏｔｏ精製し、プラスミドライブラリーを形成する。精製方法は、塩化セシウム−臭化エチジウム勾配遠心分離を含むのが好ましい。
【００２６】
７．プラスミドライブラリー選択：次いでプラスミドライブラリーを、Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６２細胞から製造した大過剰のＲ．ＢｇｌＩＩで完全に消化させる。エンドヌクレアーゼ消化は、完全ｂｇｌＩＩＭ−保持プラスミドの集団中で比較的頻度を高める未改変プラスミド（ｂｇｌＩＩＭを発現しない）を選択的に切断する。切断したプラスミドを、ｂｇｌＩＩＭを発現しないプラスミドの形質転換効率を減少させるようにも作用する大過剰のアルカリホスファターゼで処理する。
【００２７】
８．ｂｇｌＩＩＭクローンの識別：消化したプラスミドライブラリーＤＮＡを、ＲＲ１またはＫ８０２のように好適な宿主株にエレクトロポレーションにより形質転換し、形質転換体を抗生物質培地上で選択する。ＤＮＡを個々のコロニーから単離し、Ｒ．ＢｇｌＩＩによる切断に対する耐性によるＭ．ＢｇｌＩＩ−特異的改変に関して分析する。プラスミドＤＮＡは消化に対して完全にまたは実質的に耐性でなければならない。さらに確認する場合には、λファージを推定上のｂｇｌＩＩＭクローン上で生長させ、ファージＤＮＡを精製し、次いでＲ．ＢｇｌＩＩ切断に関してチェックする。最終的に、組換えプラスミドの挿入領域を欠失し、残りのベクターを形質転換し、次いで精製し、完全ＢｇｌＩＩ部位の存在に関してチェックする。
【００２８】
９．ｂｇｌＩＩＭのマッピング及びサブクローニング：メチラーゼ遺伝子はＢ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６１、即ちエンドヌクレアーゼ活性を欠く変異株からクローン化されているので、メチラーゼクローンは活性Ｒ．ＢｇｌＩＩを産生するとは予測されないし、且つ産生しない。第２のＢ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ株（即ち、ＲＵＢ５６２）から別の段階でｂｇｌＩＩＲをクローン化する必要がある。クローニング前に、高レベルでＭ．ＢｇｌＩＩを産生する宿主を構築しなければならない。この目的に関しては、Ｔｎ５トランスポゾン突然変異マッピングと組み合わせた欠失マッピングによってｂｇｌＩＩＭを挿入物内に配置する。フラグメントをｐＩＪ２９２６、即ち多重クローニング部位内にＢｇｌＩＩ部位を持つｐＵＣ１９誘導体にトランスファーする［Ｊａｎｓｓｅｎ及びＢｉｂｂ，Ｇｅｎｅ  １２４：１３３−１３４，（１９９３）］。一連の欠失実験により、高レベルのｂｇｌＩＩＭを発現するサブクローンを構築する（図４）。このプラスミドをｐＭＢＮ２と名づける（図４Ｄ）。
【００２９】
１０．Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６１及びＲＵＢ５６２  ＤＮＡのサザンブロット比較：Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６１由来のｂｇｌＩＩＭを含む７．５ｋｂ  ＰｓｔＩフラグメントを、各々Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６１及びＲＵＢ５６２由来のゲノムＤＮＡに並行にハイブリダイズし、この領域内の全染色体転移がＲＵＢ５６１またはＲＵＢ５６２株の突然変異に関与したかを調査する。そのような転移は知見されない。
【００３０】
１１．ｂｇｌＩＩＲの配置：Ｒ．ＢｇｌＩＩをＢ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６２細胞から殆ど均一となるまで精製する。精製タンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で約２７ｋＤａの単一バンドとして移動する。従って、これは約７５０ｂｐの遺伝子によりコードされる。
【００３１】
最初の２１アミノ酸の配列を決定する。エンドヌクレアーゼ遺伝子の５’末端に特異的な変性オリゴヌクレオチドプローブを合成し、ハイブリダイゼーション実験で使用するために放射活性標識する。ハイブリダイゼーション実験から、ｂｇｌＩＩＭに近位のクローン化ＰｓｔＩフラグメントの末端にｂｇｌＩＩＲがあることが判明した。
【００３２】
ｐＢＲ３２２特異的プライマーと組み合わせてセンス及びアンチセンスｂｇｌＩＩＲオリゴヌクレオチドを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ｂｇｌＩＩＲの方向を決定する。ＰＣＲ実験から、ｂｇｌＩＩＲ転写の方向がｂｇｌＩＩＭに向かっていることを示す。
【００３３】
１２．ｂｇｌＩＩＲのクローニング：ＢｇｌＩＩ  ＲＭ系の一段階クローニングに含まれる問題を回避するために、ＢｇｌＩＩＲを改変宿主細胞にクローン化する。精製Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６２  ＤＮＡをＰｓｔＩエンドヌクレアーゼにより完全に消化させ、好適なサイズに切断されたフラグメントをゲル精製して、ＰｓｔＩ切断ｐＡＣＹＣ１７７に連結させる。連結混合物を、ｂｇｌＩＩＭを発現するプラスミドｐＭＢＮ２を保持するＥ．ｃｏｌｉ細胞にエレクトロポレーションにより形質転換させる。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ８０２を宿主として選択する。両方のプラスミドを保持し、２つの抗生物質（即ち、アンピシリン及びカナマイシン）に対して耐性の形質転換体を選択する。
【００３４】
１３．ｂｇｌＩＩＲを保持するクローンの識別：選択した形質転換体を抗生物質プレート上に５０群を二重に載置し、エンドヌクレアーゼ活性に関してスクリーニングする。各対の１枚のプレート由来のコロニーをプールし、溶解させ、次いで粗な抽出物をＲ．ＢｇｌＩＩ活性に関してアッセイする。試験で陽性の群に関しては、個々のコロニーを生長させ、Ｒ．ＢｇｌＩＩ活性に関して別個にアッセイする。プラスミドＤＮＡを陽性クローンから精製し、その特性を確認するために挿入フラグメントを分析する。ｂｇｌＩＩＲ及びｂｇｌＩＩＭをコードする７．５ｋｂ  ＰｓｔＩフラグメントを含むｐＡＣＹＣ１７７プラスミドを識別し、これをｐＭＲＢ１と名付ける（図６Ａ）。
【００３５】
１４．ｂｇｌＩＩＭ及びｂｇｌＩＩＲ遺伝子のマッピング及びキャラクタリゼーション：完全ＢｇｌＩＩ  ＲＭ系を、制限マッピング及びサブクローニング図（６Ｂ）により元の７．５ｋｂ  ＰｓｔＩフラグメントの３．０ｋｂ  ＰｓｔＩ−ＨｉｎｃＩＩサブフラグメント上に配置する。３．０ｋｂ  サブフラグメントのヌクレオチド配列は、メチラーゼ及びエンドヌクレアーゼ遺伝子の過剰発現を助長するように産生される。
【００３６】
１５．ｂｇｌＩＩＭの発現の増加：予備実験から、ｂｇｌＩＩＲを過剰発現させるために、最初にｂｇｌＩＩＭ発現を増加させることが必須であることが判明した。ｂｇｌＩＩＭ過剰発現に関する多くの試みとしては、種々の強いＥ．ｃｏｌｉプロモーターの後ろのＥ．ｃｏｌｉ染色体上にｂｇｌＩＩＭを移動させ、その産物がＢｇｌＩＩ認識配列を含む部位をメチル化する、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｙ由来のｂｓｔＹＩＭをｂｇｌＩＩＭと置換することを含む。しかしながら最適な結果は、中程度のコピー数のプラスミドｐＳＹＸ１９、即ちｐＢＲ３２２−及びｐＡＣＹＣ−ベースのプラスミドの両方と適合性のｐＳＣ１０１誘導体上のｌａｃプロモーターからｂｇｌＩＩＭを発現させることにより得られる（図５；Ｓ．Ｘｕ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。製造した構築物をｐＳＹＸＢｇｌＭと名付ける（図４Ｇ）。
【００３７】
１６．ｂｇｌＩＩＲの過剰発現：ｂｇｌＩＩＲの最適発現への試みとしては、種々のコピー数レベルのプラスミド上の構成及び誘導可能な強いプロモーターの両方を使用することを含む。強い構成プロモーターの後ろにクローン化する際、ｂｇｌＩＩＲ  は不安定であることが判明した。ベクターｐＡＧＲ３、即ちイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導可能な、ｔａｃプロモーターにより発現されるｐＢＲ３２２誘導体を使用すると最良の結果が得られる（図７；Ｗ．Ｊａｃｋ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。ｂｇｌＩＩＲ遺伝子をｐＡＧＲ３にトランスファーし、ＮｃｏＩ部位でｔａｃプロモーターにフレーム内で融合させる。これは、ＰＣＲによりｂｇｌＩＩＲを含むＤＮＡフラグメントの増幅により実施する。あるいは、この構築物は、ＰＣＲのかわりに特定部位の突然変異誘発を用いて実施し得、且つ製造した。このエンドヌクレアーゼ−発現プラスミドをｐＡＧＲＢｇｌＲ２と名付ける（図６Ｅ）。
【００３８】
１７．過剰発現株の構築：過剰発現に関しては、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＥＲ２２０６（Ｅ．Ｒａｌｅｉｇｈ，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）が好ましい宿主である。ＥＲ２２０６はｌａｃリプレッサーのオーバープロデューサーである。細胞内の高濃度のｌａｃリプレッサーは、誘発前のｔａｃプロモーター由来の発現を減少させる。プラスミドｐＳＹＸＢｇｌＭをエレクトロポレーションにより株に形質転換し、形質転換体をカナマイシン耐性に関して選択した。
【００３９】
第２段階では、ＥＲ２２０６（ｐＳＹＸＢｇｌＭ）を、ｐＡＧＲＢｇｌＲ２でエレクトロポレーションにより形質転換してコンピテントとし、二重形質転換体を抗生物質培地上で選択する。液体培地上で後期対数増殖期まで生長させ、ＩＰＴＧで数時間誘導し、次いで粗な抽出物を製造後、形質転換体をＲ．ＢｇｌＩＩ活性に関して試験する。
【００４０】
１８．Ｒ．ＢｇｌＩＩの産生：Ｒ．ＢｇｌＩＩは、ＥＲ２２０６（ｐＳＹＸＢｇｌＭ；ｐＡＧＲＢｇｌＭＲ２）細胞から、富裕培地、例えば好適な抗生物質を含むＬＢ中、発酵器内での増殖により産生し得る。ＩＰＴＧで数時間誘導後、細胞を遠心分離により収穫し、超音波処理により破砕し、次いでＲ．ＢｇｌＩＩ活性を含む粗な細胞抽出物を得る。
【００４１】
１９．Ｒ．ＢｇｌＩＩの精製：酵素が実質的に他の汚染エンド−及びエキソヌクレアーゼを含まなくなるまで、標準タンパク質精製法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）により段階１８に記載の粗な細胞抽出物からＲ．ＢｇｌＩＩを精製する。
【００４２】
上記概要の段階は、本発明を実施する好ましい態様を示すが、当業者には上記の試みは、公知方法によって変形し得ることは公知である。
【００４３】
以下の実施例は、現在のところ実施する上で好ましいものとして本発明の態様を例示するものである。実施例は本発明を説明するものであって、特許請求の範囲の記載以外には本発明を一切限定するものではない。
【実施例１】
【００４４】
ＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼ遺伝子のクローニング
［注：実施例１で使用する標準法の詳細は、本セクションの最後に含まれる］
１．クローニングベクター構築：使用したクローニングベクターは、以下の如く３つのＢｇｌＩＩリンカーの挿入によりｐＢＲ３２２から誘導したｐＡＭＢ３であった。
【００４５】
ｐＢＲ３２２  １０μｇを、５０μｌの反応容積中、ＰｖｕＩＩ（エンドヌクレアーゼはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手し、供給された緩衝液を使用して推薦条件下で反応を実施した）１０単位で３７℃２時間消化させた。反応混合物１０μｌを、供給されたリガーゼ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．８，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＡＴＰ，２５μｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン）中の２μｇ非ホスホリル化ＢｇｌＩＩリンカー（ｄＣＡＧＡＴＣＴＧ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、４０単位  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）及び２０単位  ＳｓｐＩを含む１００μｌ  連結反応混合物に添加した。混合物を室温で一晩インキュベートした。次いで等容量のクロロホルムで一回抽出した。連結混合物をＣａＣｌ２法を使用してＥ．ｃｏｌｉ  ＲＲ１細胞に形質転換し、細胞をアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート（１リットルのＬＢ培地は、１０ｇ  トリプトン，５ｇ  酵母抽出物，１０ｇ  ＮａＣｌ，１ｇ  デキストロース，１ｇ  ＭｇＣｌ２を含み、ＮａＯＨでｐＨを７．２に調節した。ＬＢ寒天は、１．５％寒天を添加したＬＢ培地である）上に載置した。プラスミドＤＮＡをアルカリ溶解ミニプレプ方法を使用して個々の形質転換体から単離し、ＢｇｌＩＩで消化させ、次いでリンカーを含むプラスミドに関してスクリーニングするためにアガロースゲル上の電気泳動により分析した。この構築物をｐＢ２０６６と名付けた。
【００４６】
実験の第２ラウンドでは、非ホスホリル化ＢｇｌＩＩリンカーを、上記方法の反復によりｐＢ２０６６のＳｓｐＩ部位に挿入した。ｐＡＭＢ２と名付けたこの新しい構築物は、２つのＢｇｌＩＩリンカーを含んでいた。
【００４７】
別の実験では、ｐＢＲ３２２  ４μｇをＤｒａＩ  ４０単位で消化させた。３７℃で３０分後、反応を停止し、フェノール／クロロホルム抽出法を用いてＤＮＡを精製した。再懸濁したＤＮＡを、ホスホリル化ＢｇｌＩＩリンカー（ｄ（ｐＣＡＧＡＴＣＴＧ）；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用したこと、及び制限エンドヌクレアーゼを連結反応に添加しなかったことを除いて上記の如く過剰量のＢｇｌＩＩリンカーに連結した。１６℃で２時間連結後、反応混合物をフェノール、次いでクロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。次いで精製ＤＮＡをＢｇｌＩＩで消化させて過剰に連結したリンカーを除去した。エンドヌクレアーゼを加熱失活し、反応を１６℃で１時間、再連結した。クロロホルム抽出後、反応混合物を使用してＣａＣｌ２法でＥ．ｃｏｌｉ  ＲＲ１細胞を形質転換し、載置した細胞をアンピシリン−耐性コロニーに関して選択した。アルカリ溶解法により個々の形質転換体から単離したプラスミドをＢｇｌＩＩで消化させ、正しい構築物をスクリーニングするためにアガロースゲル電気泳動により分析した。ｐＢ３２３２と名付けたこの構築物は、アンピシリン耐性遺伝子の外の１９ｂｐ  ＤｒａＩフラグメントの代わりにＢｇｌＩＩリンカーを有していたが、アンピシリン耐性遺伝子内にＤｒａＩ部位も持ち、遺伝子は完全且つ機能的なままであった。
【００４８】
ベクターｐＡＭＢ３を以下の方法によりｐＡＭＢ２及びｐＢ３２３２を組み合わせて製造した。ｐＡＭＢ２  １０μｇを単一１５０μｌ反応液中、ＰｓｔＩ及びＮｄｅＩ各々２０単位で消化させ、ｐＢ３２３２  １０μｇを並行反応中、ＰｓｔＩ、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ各々２０単位で消化させた。消化したＤＮＡを０．７％  アガロースゲル（ＩＢＩ，分子グレード）上で電気泳動し、ｐＡＭＢ２由来の３０５１ｂｐ  ＰｓｔＩ−ＮｄｅＩフラグメント及びｐＢ３２３２由来の１３１２ｂｐ  ＮｄｅＩ−ＰｓｔＩフラグメントを単離した。各フラグメント２μｇを連結混合物中で混和した。室温で一晩連結し、クロロホルム抽出後、連結混合物をＣａＣｌ２法を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＲＲ１細胞を形質転換するために使用した。形質転換体をアンピシリン及びテトラサイクリンを両方含むＬＢ寒天プレート上で選択し、個々の単離物由来のプラスミドをＢｇｌＩＩで消化させ、次いで正しい構築物を調査するために電気泳動により分析した。ｐＡＭＢ３プラスミドは図３に示されている。
【００４９】
２．ゲノムＤＮＡ精製：メチラーゼ選択ライブラリー用のＤＮＡをＢａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ株ＲＵＢ５６１から精製した。Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６１を、一晩培養した培地１０ｍｌを使用してＬＢ培地５００ｍｌに接種し、振盪しながら３７℃で飽和するまで生長させた。ＪＡ−１７ローターのついたＢｅｃｋｍａｎ  Ｊ２−２１遠心分離機中、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより細胞を収穫した。細胞ペレットを全部で１００ｍｌ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ  緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０，１００ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で再懸濁させることにより洗浄し、次いで前記の如く再遠心分離した。ペレットを全部で１０ｍｌ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液中に再懸濁させ、プールした。遠心分離ボトルを追加の１０ｍｌ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で洗浄し、プールに加えた。リゾチーム（Ｓｉｇｍａ）を終濃度０．１２５ｍｇ／ｍｌで添加し、懸濁液を緩やかに転倒することにより混合し、少なくとも３０分間３７℃でインキュベートした。次いで懸濁液をｐＨ  ９．０でＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液の等容量で希釈し、ＳＤＳを終濃度１％で添加し、懸濁液を５０℃で１５分間インキュベートし、完全に溶解させた。
【００５０】
プロテイナーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ）を終濃度０．０５ｍｇ／ｍｌで添加し、３７℃で１〜２時間インキュベーションを継続した。ＳＤＳをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対する透析で除去し、透析物をＴＥ１容量で希釈した。固体ＣｓＣｌを１ｇ／ｍｌになるまで添加し、臭化エチジウムを１００μｇ／ｍｌになるまで添加した。溶液をＢｅｃｋｍａｎ  Ｔｉ７０ローター中、４４，０００ｒｐｍで４８時間、超遠心分離にかけ、ＤＮＡバンドをシリンジで抽出し、臭化エチジウムをイソアミルアルコールで抽出除去した。ＣｓＣｌを上記の如く透析除去し、透析物をフェノール、次いでクロロホルムで抽出し、溶液を上記の如くＴＥに対して最後に透析した。最終収量は、５００ｍｌ  飽和培地からＢ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６１  ＤＮＡが２００μｇであった。
【００５１】
３．ゲノム及びベクターＤＮＡ消化：ＢｇｌＩＩ  ＲＭ系をクローニングしようと試みる間、ライブラリーを多くの制限消化物から作成した。ＰｓｔＩは消化して１個のクローンを産生するので、その操作の詳細のみを記載する。
【００５２】
Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６１  ＤＮＡ  ５μｇを、標準条件下、過剰量のＰｓｔＩを使用して完全に切断し、反応液をフェノールで１回抽出した。ＤＮＡを９５％  エタノールを２容量添加して沈殿させた。
【００５３】
ｐＡＭＢ３  ＤＮＡ  ５μｇをＰｓｔＩで３７℃で９０分間、消化させた。仔ウシ腸ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ）２２単位を添加し、反応を３７℃でさらに３０分間継続した。Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＤＮＡと同様の方法で反応をフェノール抽出し、次いでエタノール沈殿させた。
【００５４】
４．ＤＮＡ連結：ＰｓｔＩ−消化ベクター（ｐＡＭＢ３）及び挿入物（Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６１  染色体ＤＮＡ）を、推奨された連結緩衝液中に４００ｎｇ  挿入ＤＮＡ、１００ｎｇ  ベクターＤＮＡ及び２０単位  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを含む１００μｌ  反応液中で室温で一晩一緒に連結した。次いで、連結混合物をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＶＳ  フィルター上でＨ２Ｏに対して室温で３０分間透析した。フィルターを追加の１００μｌ  Ｈ２Ｏで洗浄し、洗浄液を連結混合物と混和した。
【００５５】
５．一次細胞ライブラリー構築：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＲ１細胞を標準法を使用してエレクトロポレーション用に製造した。段階４からの透析した連結混合物５μｌをＥ．ｃｏｌｉ  ＲＲ１細胞にエレクトロポレーションした。形質転換細胞をテトラサイクリンを含む大きな（１５０ｍｍ）ＬＢ寒天プレート上に塗布した。３７℃で一晩インキュベーション後、全部で約１２，０００個の形質転換体がプレート４枚から得られた。プレートをＬＢ上に重ね、一次細胞ライブラリーを形成するためにコロニーをプールした。
【００５６】
６．一次プラスミドライブラリー単離：標準Ｔｒｉｔｏｎ溶解方法を使用して、プラスミドを一次細胞ライブラリーから単離した。超遠心分離後、精製ＤＮＡを約０．１ｍｇ／ｍｌの終濃度になるように、１ｍｌ  ＴＥの終容量に再懸濁した。
【００５７】
７．プラスミドライブラリーの選択：一次ライブラリーＤＮＡ約２μｇを、１００μｌ反応容積中、３７℃でＢｇｌＩＩエンドヌクレアーゼ４８単位で消化させた。９０分消化後、仔ウシ腸ホスファターゼ２２単位及び追加の３２単位のＢｇｌＩＩを添加し、さらに６０分間インキュベーションを継続した。ＤＮＡを記載の如く精製し、１５μｌ  ＴＥ中に再懸濁させた。再懸濁したＤＮＡで、完全消化及び脱ホスホリル化反応を繰り返した。処理したプラスミドＤＮＡを上記の如くＨ２Ｏに対して透析した。
【００５８】
８．形質転換：約５ｎｇ  ＤＮＡを含む、１：１００に希釈した透析サンプル５μｌを使用して、エレクトロポレーションによりＥ．ｃｏｌｉ  ＲＲ１細胞４０μｌを形質転換した。形質転換細胞をテトラサイクリンを含むＬＢ寒天プレート上に載置した。３７℃で一晩インキュベーション後、プレート１枚当たり平均して８つの形質転換体が選択ライブラリーＤＮＡ５ｎｇから得られ、未選択ライブラリーＤＮＡと匹敵する量のプレート１枚当たり約８３００個が得られた。従って選択倍率は約１０００倍であった。
【００５９】
９．生存するプラスミドの分析：選択後生存する形質転換体１６個を液体培地上で生長させ、そのプラスミドＤＮＡを標準ミニプレプ方法を使用して単離した。プラスミドを各々ＰｓｔＩ及びＢｇｌＩＩを用いる並行反応で消化させ、アガロースゲル電気泳動により分析した。１６個のプラスミドの内１５個は７．５ｋｂ  ＰｓｔＩ挿入物を含んでおり、ＢｇｌＩＩ切断に対して完全に耐性であった。残り１個のプラスミドは全く挿入物を含んでおらず、ＢｇｌＩＩ切断に対して耐性ではなかった。耐性クローンのうち１個をさらなる物性評価のために選択し、そのプラスミドをｐＭＢ０５と名付ける（図４Ａ）。
【００６０】
ｂｇｌＩＩＭ遺伝子を保持すると考えられている７．５ｋｂ  ＰｓｔＩ挿入物をＢｇｌＩＩ−耐性クローンの１つから除去し、そのＢｇｌＩＩ部位が完全であるかどうかを評価するためにベクターを再連結させた。約１μｇのクローンＤＮＡをＰｓｔＩ  ２０単位で消化させ、ベクターを１ｍｌ容積中で一晩、再連結させた。約０．５μｇのＤＮＡをＣａＣｌ２法を使用してＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、形質転換体ＤＮＡをアルカリ溶解ミニプレプ方法により単離した。次いでプラスミドを上記の如くＰｓｔＩ及びＢｇｌＩＩで並行反応で消化させ、アガロースゲル電気泳動により分析した。試験した全てのプラスミドが７．５ｋｂ挿入物を欠失し且つＢｇｌＩＩにより完全に消化されており、これがＢｇｌＩＩ消化に対する耐性を与える７．５ｋｂ挿入物中にコードされた機能であったことが確認できた。
【００６１】
１０．メチラーゼ−産生宿主の構築：ｐＭＢ０５の広範囲にわたる制限マップを作成し（図４Ａ）、欠失及びＴｎ５挿入突然変異誘発により好適なｂｇｌＩＩＭ部位を決定した。高レベルのメチラーゼ発現をもつｂｇｌＩＩＭクローンを構築するために、ｐＭＢ０５挿入物を高コピー数ｐＵＣ−誘導ベクターにトランスファーし、非必須ＤＮＡの２領域を挿入物から欠失させた。
【００６２】
ｐＭＢ０５  ＤＮＡ  ２０μｇを容量５００μｌ中ＰｓｔＩ  ８０単位で３７℃３時間消化させた。消化フラグメントを０．７％  アガロースゲル上の電気泳動により分離し、７．５ｋｂ挿入物をＤＥＡＥペーパー溶離プロトコルを用いてゲルから単離した。単離フラグメントを、ＰｓｔＩ−切断し次いで脱ホスホリル化ｐＩＪ２９２６ベクターＤＮＡに連結した。連結混合物を、ＲｂＣｌ法によりコンピテントにしたＥ．ｃｏｌｉ  ＥＤ８７６７細胞［Ｒａｌｅｉｇｈら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１５６３−１５７５，（１９８８）］に形質転換し、プラスミドをアルカリ溶解法を用いて単離し、ベクター内の挿入物の方向を制限消化物から決定した。この構築物をｐＭＢ２６１と名付けた（図４Ｂ）。
【００６３】
ｐＭＢ２６１ミニプレプＤＮＡ  １μｇを５０μｌ反応液中、ＥｃｏＲＶ  ２０単位で消化させた。５０μｌ消化物（０．２５μｇ  ＤＮＡを含む）のうちの１２．５μｌを６００μｌ連結反応中で希釈した。連結混合物をフェノールで１回抽出し、クロロホルムで１回抽出し、２容量のエタノールを添加してＤＮＡを沈殿させ、次いで−２０℃で一晩凍結させた。ＤＮＡをＣａＣｌ２法を使用してコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＲＲ１細胞に形質転換し、プラスミドを６つの形質転換体から単離し、好適な制限パターンに関してチェックした。この新規構築物をｐＭＢ２６３と名付けた（図４Ｃ）。
【００６４】
ｐＭＢ２６３ミニプレプＤＮＡ  ４μｇを１００μｌ容量中、ＮｄｅＩで完全に消化させた。フェノール及びクロロホルム抽出、エタノール沈殿後、再懸濁させたＤＮＡ  １μｇを５００μｌ反応液中で室温で一晩連結させた。連結反応をクロロホルムで１回抽出し、ＣａＣｌ２法でコンピテントとしたＥ．ｃｏｌｉ  ＥＤ８７６７細胞を形質転換するのに使用した。９つの形質転換体由来のプラスミドを単離し、好適な制限パターンに関してチェックした。この新規構築物をｐＭＢＮ２と名付けた（図４Ｄ）。
【００６５】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ８０２細胞をコンピテントとし、標準法を使用してｐＭＢＮ２により電気泳動的に形質転換した。個々の形質転換コロニーをアンピシリン耐性に関して選択し、プラスミドをミニプレプ法により単離し、その制限プロフィールをチェックした。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ８０２（ｐＭＢＮ２）をエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするための宿主として使用した。
【００６６】
１１．Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６２  ＤＮＡの精製及び分析：Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６２由来のＤＮＡを段階２に記載のＲＵＢ５６１  ＤＮＡと同様の方法で精製した。
【００６７】
サザンブロットハイブリダイゼーション分析［Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８２）］から、ｂｇｌＩＩＭを取り囲む領域中、株ＲＵＢ５６１及びＲＵＢ５６２の間に明らかな染色体の差はないことが明らかになった。
【００６８】
１２．ｂｇｌＩＩＲの配置：ｂｇｌＩＩＲの配置及び方向を、エンドヌクレアーゼタンパク質のアミノ末端配列から誘導した縮退オリゴヌクレオチドプローブを使用して決定した。
【００６９】
この目的のために、ＢｇｌＩＩエンドヌクレアーゼを標準タンパク質精製法を使用してＢ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６２細胞から殆ど均一になるように精製した。精製タンパク質の最初の１６アミノ酸残基のタンパク質配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７０Ａ  気相シーケンサーで逐次分解により決定し、Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ（配列番号１）であることが判明した。タンパク質配列に基づいて、コンプレキシティ（ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）２５６の２１−塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドプローブ：（ＡＴＹＴＣＲＴＣＮＧＣＲＴＧＲＴＣＲＴＡＲ；配列番号２）及びコンプレキシティ３６の１７−塩基のセンスプローブ：（ＡＴＧＡＡＲＡＴＨＧＡＹＡＴＨＡＣ；配列番号３）（但し、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ、Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴである）を合成した。
【００７０】
これらの縮退エンドヌクレアーゼ−特異的ハイブリダイゼーションプローブ（Ｈｏｗａｒｄら，前掲）を用いるｐＭＢ０５プラスミドのサザンブロットハイブリダイゼーション分析により、エンドヌクレアーゼ遺伝子の５’末端をｐＭＢ０５挿入物内の１．１ｋｂ  ＰｓｔＩ−ＮｄｅＩフラグメント上に配置した。さらに、ｐＢＲ３２２  ＰｓｔＩ時計方向及び反時計方向プライマーと一緒に上記センス及びアンチセンスプライマーを使用するＰＣＲ実験を、ｂｇｌＩＩＲの方向を決定するためにｐＭＢ０５上で実施した。この実験結果から、クローン化ＰｓｔＩフラグメントが完全遺伝子を含まなくてはならないようにｂｇｌＩＩＲが配置且つ配向されていることが明白になった。
【００７１】
１３．ｂｇｌＩＩＲのクローニング：ｂｇｌＩＩＲを、ｐＡＣＹＣ１７７中の７．５ｋｂ  サイズ選択したＢ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６２  ＤＮＡ  ＰｓｔＩフラグメントのプラスミドライブラリーからクローン化した。
【００７２】
Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６２  ゲノムＤＮＡ  ２５μｇを容積４００μｌ中、ＰｓｔＩで３７℃４．５時間消化させた。消化したＤＮＡを０．７％  アガロースゲル上の電気泳動により分離し、約６．５〜８．５ｋｂのサイズのフラグメントをＤＥＡＥペーパー溶離により単離した。サイズ選択したＤＮＡを１５μｌ  ＴＥ（終濃度約８０μｇ／ｍｌ）中に再懸濁させた。
【００７３】
ｐＡＣＹＣ１７７ベクターＤＮＡ５μｇをＰｓｔＩで３７℃で１．５時間消化させた。仔ウシ腸−ホスファターゼ及び追加のＰｓｔＩをこの時点で添加し、さらに６０分間インキュベーションを継続した。消化したＤＮＡを精製し、２０μｌ  ＴＥ中に再懸濁させた。
【００７４】
サイズ選択したＲＵＢ５６２  ＰｓｔＩフラグメント約０．６μｇを、５３μｌ反応容積中、Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼ４００単位でＰｓｔＩ−消化及び脱ホスホリル化ｐＡＣＹＣ１７７  ０．２μｇに連結した。連結混合物５０ｎｇを使用して、ＣａＣｌ２法を用いるコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ８０２（ｐＭＢＮ２）を形質転換した。形質転換体をカルベニシリン及びカナマイシンの両方の耐性に関して選択した。
【００７５】
１４．エンドヌクレアーゼ−産生クローンの識別：サイズ選択ライブラリーの形質転換体から、５０コロニーの１１セットをカルベニシリン及びカナマイシンを補ったＬＢ寒天プレート上に二重に拾い出した。各セットの１プレートからコロニーを５ｍｌ  ＬＢに集め、プールし、遠心分離して収穫し、次いで０．８ｍｌ超音波緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．０，１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）中に再懸濁させた。１０μｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ及び２５μｌ  １０ｍｇ／ｍｌリゾチームを細胞の各チューブに添加し、チューブを−７０℃で凍結させた。融解後、細胞抽出物をＨｅａｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｗ−２２５Ｒ  ソニケーター（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）中で１５分間超音波処理し、１０分間遠心分離して細胞破片を除去した。各粗な抽出物の１μｌ及び７μｌをそれぞれ、ＢｇｌＩＩ用に推薦された緩衝液中、単一ＢｇｌＩＩ部位を含むＢａｍＨＩ−直線化ｐＢＲ３２３２  ＤＮＡ上でＲ．ＢｇｌＩＩ活性に関して、３７℃で１時間分析した。Ｒ．ＢｇｌＩＩ活性は、分析した粗な抽出物の１１個のプールの内９個に知見された。
【００７６】
陽性プレートの１個から個々のコロニーをカルベニシリン及びカナマイシンを補った５ｍｌ  ＬＢ上で一晩生長させ、抽出物を製造し、上記の如くＲ．ＢｇｌＩＩ活性に関して分析した。分析した１１個の粗な抽出物の内２個がＲ．ＢｇｌＩＩ活性を示した。さらなる実験から、両方のクローンが細胞１グラム当たり約１００，０００単位のＲ．ＢｇｌＩＩ活性を発現し、Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６２細胞の約３倍の過剰発現であることが判明した。ｂｇｌＩＩＲ及びｂｇｌＩＩＭを含むｐＡＣＹＣ１７プラスミドをｐＭＲＢ１と名付けた（図６Ａ）。
【００７７】
１５．ｂｇｌＩＩＭ及びｂｇｌＩＩＲのヌクレオチド配列決定：標準制限マッピング法を使用して、ｂｇｌＩＩＲ及びｂｇｌＩＩＭを３．０ｋｂ  ＰｓｔＩ−ＨｉｎｃＩＩフラグメントにマップした（図６Ｂ）。領域を標準法により幾つかの断片にサブクローン化し、ヌクレオチド配列をＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）及び／またはＣｉｒｃｕｍＶｅｎｔ  シークエンシング法（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いるジデオキシ法［Ｓａｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７，（１９７７）；Ｓａｎｇｅｒ及びＣｏｕｌｓｏｎ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ８７：１０７−１１０，（１９７８）］により完全領域に関して製造した。ｂｇｌＩＩＭ及びｂｇｌＩＩＲをコードする３１８８ｂｐ領域のヌクレオチド配列を配列番号４に示す。
【００７８】
１６．過剰発現するメチラーゼ構築物の製造：その発現を増加させるために、ｂｇｌＩＩＭをｐＳＹＸ１９にクローン化した（図５）。
【００７９】
ｐＳＹＸ１９  １．６μｇを総容量５０μｌ中ＢａｍＨＩ  ６０単位で消化させた。３７℃で９０分間、消化を実施した。仔ウシ腸ホスファターゼ１０単位を添加し、反応をさらに３７℃で３０分インキュベートした。消化したＤＮＡを精製し、１０μｌ  ＴＥ中に再懸濁させた。
【００８０】
１μｇ  ｐＭＢＮ２を総容量５０μｌ中、ＨｉｎｃＩＩ  ３０単位で３７℃で１時間消化させた。消化したＤＮＡを上記の如く精製し、１０μｌ  ＴＥ中に再懸濁させ、総容量５０μｌ中Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ４００単位で再連結させた。連結を１６℃で一晩実施した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＤ８７６７細胞を連結したＤＮＡ２ｎｇでエレクトロポレーションし、細胞をカルベニシリンを含むＬＢ寒天プレート上に載置した。プラスミドをアルカリ溶解ミニプレプ法を使用して形質転換体から単離し、最初にＮｄｅＩ、次いでＨｉｎｃＩＩでタンデム反応中で消化させ、アガロースゲル上の電気泳動により分析した。所望のＨｉｎｃＩＩ欠失をもつ形質転換体のひとつ由来のプラスミドをＴｒｉｔｏｎ溶解法を使用して精製し、これをｐＢＭ１と名付けた（図４Ｅ）。
【００８１】
ｐＢＭ１  ５μｇを総容量５０μｌ中、ＮｄｅＩ  ６０単位で３７℃１時間消化させた。消化したＤＮＡを上記の如く精製し、２０μｌ  ＴＥ中に再懸濁させた。再懸濁したＤＮＡを５０μｌ  反応容積中、推薦された緩衝液中のＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメント１０単位並びにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ各０．３ｍＭで処理し、その末端を充填した。反応を２５℃で３０分、次いで６５℃で５分インキュベートした。この反応混合物１０μｌを、１μｇ  ホスホリル化ＢａｍＨＩリンカー（ｄ（ｐＣＧＧＡＴＣＣＧ）；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）及びＴ４  ＤＮＡリガーゼ１２００単位を含む連結反応混合物１００μｌに添加した。連結を１６℃で一晩実施した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＤ８７６７細胞を消化したＤＮＡ約５ｎｇでエレクトロポレーションし、細胞をカルベニシリンを含むＬＢ寒天上に載置した。プラスミドをアルカリ溶解ミニプレプ法を使用して形質転換体から単離し、ＢａｍＨＩで消化させ、次いでアガロースゲル上の電気泳動により分析した。所望のＢａｍＨＩリンカーのついた形質転換体のひとつからのプラスミドをＴｒｉｔｏｎ溶解法を用いて単離し、これをｐＢＭ１−Ｂａｍと名付けた（図４Ｆ）。
【００８２】
ｐＢＭ１−Ｂａｍ  １０μｇを総容量１５０μｌ中、ＢａｍＨＩ  １６０単位で消化させた。消化を３７℃で６０分間実施した。消化したプラスミドのフラグメントを０．５％アガロースゲル上の電気泳動により分離した。１．８ｋｂ  ＤＮＡバンドを切り出し、製造業者の説明書に従ってＰｒｅｐ−ａ−Ｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて精製した。ＤＮＡをＰｒｅｐ−ａ−Ｇｅｎｅ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒの終容量７５μｌに再懸濁させた。
【００８３】
ＢａｍＨＩ−消化ｐＳＹＸ１９  ０．１μｇを反応容量５０μｌ中のＴ４  ＤＮＡリガーゼ４００単位でｂｇｌＩＩＭフラグメント０．７５μｇに１６℃で１８時間連結した。連結をクロロホルム等容量で一回抽出して停止し、Ｈ２Ｏで透析した。
【００８４】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＤ８７６７細胞を連結混合物１０μｌでエレクトロポレーションし、カナマイシンを含むＬＢ寒天上に細胞を載置した。３７℃で一晩インキュベーション後、得られた形質転換体１２個をカナマイシンを含むＬＢブイヨンの５ｍｌ培地上で生長させ、そのプラスミドＤＮＡをアルカリ溶解ミニプレプ法を使用して単離した。プラスミドＤＮＡを正しい制限フラグメントに関してチェックした。１つのコロニーをｉｎ  ｖｉｖｏでλｖｉｒファージ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）ＤＮＡをメチラートする能力に関して試験した。この新しい構築物をｐＳＹＸＢｇｌＭと名付けた（図４Ｇ）。
【００８５】
１７．誘導可能なエンドヌクレアーゼ構築物の製造：エンドヌクレアーゼ遺伝子を過剰発現させるために、発現ベクターｐＡＧＲ３（図７）を使用した。ｂｇｌＩＩＲをｐＢｇｌＲ１．８Ｂと呼称される存在するクローンからＰＣＲにより増幅した（図６Ｃ）。ＢｓｐＨＩ及びＢｓｍＨＩ部位を反応で使用したオリゴヌクレオチドプライマー中に作成した。プライマー１は、ｂｇｌＩＩＲの翻訳開始を含む配列を含み、下線をつけたＢｓｐＨＩ部位：５’  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  Ｇ  ３’（配列番号５）を作り出すために元の配列の変化した２塩基を含んでいた。プライマー２は、ｂｇｌＩＩＲ由来の停止コドンの直後に配列を含んでおり、下線をつけたＢａｍＨＩ部位：５’  ＴＧＴ  ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＣＴＣ  ＡＣ  ３’（配列番号６）を作成するために元の配列の変化した２塩基を含んでいた。これらの２つのプライマー間の０．８ｋｂフラグメントを、（１６．６ｍＭ  （ＮＨ４）ＳＯ４，６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．８，６．７ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール，１８７μＭ  各ｄＮＴＰ，１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中の２．５単位Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１０ｎｇ  ｐＢｇｌＲ１．８Ｂ  鋳型、及び０．２５ｍＭ  各プライマーと、ＰＣＲ反応中、９３℃で１．５分、６０℃で１．５分、及び７２℃で１．５分、３０サイクル増幅した。サンプルを第１のサイクル前に９３℃で５分間インキュベートし、最終サイクル後７２℃で３分間インキュベートした。
【００８６】
次いで、ＰＣＲ産物をフェノール、次いでクロロホルムで各１回ずつ抽出し、ドライアイス−エタノール浴中エタノールで１２分間沈殿させ、遠心分離により収集し、次いで１０μｌ  ＴＥ中に再懸濁させることにより消化用に精製した。再懸濁させたＤＮＡ（約３μｇ）を５０μｌ反応容積中、５０単位ＢａｍＨＩ及び１２．５単位ＢｓｐＨＩで３７℃で６０分間消化させた。消化したＤＮＡを０．７％アガロースゲル上の電気泳動により分離し、正しいバンドを切り出し、製造業者の説明書に従ってＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｅｐ−ａ−Ｇｅｎｅキットを使用してＤＮＡを精製し、次いで３０μｌ  Ｐｒｅｐ−ａ−Ｇｅｎｅ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁させた。
【００８７】
消化したＰＣＲ産物をＮｃｏＩ−及びＢａｍＨＩ−消化及び脱ホスホリル化ｐＡＧＲ３  ＤＮＡに連結し、連結混合物をｐＳＹＸＢｇｌＭプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２２０６細胞にエレクトロポレーションした。形質転換細胞をカルベニシリン、カナマイシン及びテトラサイクリンを含むＬＢ寒天プレート上で選択した。プラスミドをアルカリ溶解法を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼで消化させ、アガロースゲル電気泳動を使用して分析した。正しい配置をもつプラスミドを含むクローンを粗な抽出物中でエンドヌクレアーゼ活性に関して試験した。この新規エンドヌクレアーゼ−発現プラスミドをｐＡＧＲＢｇｌＲ２と名付けた（図６Ｅ）。
【００８８】
新規クローンを最適生長及び発現条件に関して試験した。クローンをカルベニシリン、カナマイシン及びテトラサイクリンを含むＬＢ上で３０℃で後期対数増殖期（Ｋｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ  ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｅｒ中で１００の読取値）まで生長させ、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘発させ、次いでさらに３０℃で２０時間生長させて収穫すると、最適結果が得られた。これらの条件下で、Ｒ．ＢｇｌＩＩの収量は細胞１グラム当たり１，２００，０００単位であり、Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６２細胞の４０倍の過剰発現であった。さらに物性分析及び最適化用に選択したクローンの単離物は株ＮＥＢ＃７３１であった。ＮＥＢ＃７３１のサンプルは、１９９３年２月２３日にＭｅｒｙｌａｎｄ州、ＲｏｃｋｖｉｌｌｅのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、寄託番号Ｎｏ．６９２４７を受けた。ＮＥＢ＃７３１の粗な細胞抽出物から産生されたＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ活性の滴定を図８に示す。
【００８９】
１８．発酵：好適な抗生物質を含むＬＢ１リットルに接種するのに単一コロニーを使用し、培地を最終密度１０９細胞／ｍｌになるまで３０℃で一晩生長させた。一晩培養した培地を使用して、ｐＨ７．１の同一培地１００リットルを入れた発酵器に接種するのに使用した。発酵器の培地をＫｌｅｔｔ＝１００になるまで３０℃で生長させ、０．３ｍＭ  ＩＰＴＧで誘発し、３０℃で一晩生長させた。細胞をＳｈａｒｐｌｅｓ遠心分離機で１６，０００ｒｐｍで連続収穫した。最終収量は細胞７５８グラムであった。
【００９０】
１９．Ｒ．ＢｇｌＩＩ精製：細胞約４００グラムを、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．１，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）約１２００ｍｌに再懸濁させ、Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎ  １５Ｍ  ラボホモジナイザー（１２，０００ｐｓｉで約４回またはＯＤ５９５及びＯＤ２６０レベルオフになるまで）で破壊した。破片をＳｈａｒｐｌｅｓ  遠心分離機で４０分間遠心分離して除去した。固体ＮａＣｌを上清に終濃度４００ｍＭで添加し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を７．５％になるまで添加した（３０分で撹拌しながら添加した）。ＰＥＧをＢｅｃｋｍａｎ遠心分離機で４０００ｒｐｍで２０分間回転させることにより沈殿させ、ペレットを廃棄した。
【００９１】
上清を緩衝液Ａで終濃度１５０ｍＭ  ＮａＣｌになるまで希釈し、伝導度メーターでモニターした。サンプルを１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで平衡化させた５ｃｍ×１３ｃｍのヘパリン−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上に載置した。カラムを１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａ  約５００ｍｌで洗浄した。タンパク質を緩衝液Ａ中、１５０ｍＭ〜１２００ｍＭ  ＮａＣｌの勾配液２０００ｍｌで溶離させ、画分２４ｍｌを集めた。Ｒ．ＢｇｌＩＩ活性は０．６と０．８５Ｍ  ＮａＣｌの間に溶離した。この時点及び精製する間、活性を基質として１μｌλＤＮＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、１μｌカラム画分及び標準緩衝液条件を使用するアッセイにより測定し、３７℃で２分間インキュベートした。
【００９２】
活性画分をプールし、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａ  ４リットルで一晩透析した。透析物を１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで平衡化させた１．５ｃｍ×３４ｃｍの第２のヘパリン−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ）上に載置した。カラムを１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａの２カラム容積で洗浄した。タンパク質を緩衝液Ａ中１５０ｍＭ〜１２００ｍＭ  ＮａＣｌの勾配液１０００ｍｌで溶離させ、画分１２ｍｌを集めた。上記の如くアッセイしたＲ．ＢｇｌＩＩエンドヌクレアーゼ活性は、０．４と０．６５Ｍ  ＮａＣｌの間に溶離した。
【００９３】
活性画分をプールし、ウシ胎児血清アルブミンを終濃度１００μｇ／ｍｌで添加し、溶液を貯蔵緩衝液（５０ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．４，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，５０％  グリセロール）で一晩透析し、容積を減少させた。
【００９４】
透析物をＳｅｐａｄｅｘ  Ｇ−７５サイジングカラム（２．５ｃｍ×１１４ｃｍ）に載置し、カラムに緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．４，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，１０％  グリセロール）を流速４．５ｍｌ／時で流した。Ｒ．ＢｇｌＩＩは容積６０ｍｌで溶離し、活性画分をプールし、ウシ血清アルブミンを終濃度２００ｍｇ／ｍｌで添加し、酵素を貯蔵緩衝液で再透析した。
【００９５】
この精製方法を使用して、Ｒ．ＢｇｌＩＩ  １．２×１０６単位を得た。収率は１６％であった。
【００９６】
この精製法により得られたＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋で、非特異的エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを含んでいなかった。ＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ製剤の純度を以下の標準法によりチェックした。
【００９７】
１）連結：λＤＮＡが１５倍過剰発現した後、産生したＤＮＡフラグメントの９５％以上はＴ４  ＤＮＡリガーゼに連結できた（１６℃で１−２ｍＭ  の５’末端濃度）。これらの連結フラグメントのうち９５％は再切断可能であった。
【００９８】
２）延長消化：λ  ＤＮＡ  １μｇ及び酵素４００単位を含む５０μｌ反応液を１６時間インキュベーション後、１時間インキュベートした酵素１単位を含む反応液と同一パターンのバンドが生じた。
【００９９】
３）エキソヌクレアーゼ活性：超音波処理した［３Ｈ］ＤＮＡ（１０５ｃｐｍ／ｍｇ）１μｇを含む５０μｌ反応液中、酵素３，０００単位で３７℃で４時間インキュベーション後、放射能０．１％未満が放出された。
【０１００】
４）エンドヌクレアーゼ汚染：１μｇφ  Ｘ１７４  ＲＦＩ  ＤＮＡを含む５０μｌ反応液中、酵素８０単位で３７℃で４時間インキュベーション後、ＤＮＡの１０％がＲＦＩＩに転換した。全ての試験を以下の反応緩衝液［５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ（ｐＨ  ７．９，２５℃）］中で実施した。
【０１０１】
標準法の説明
１．抗生物質の培地への添加：液体培地及び寒天プレートの両方に、必要により所定濃度の以下の抗生物質：アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）；カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）；テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）；カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を添加した。
【０１０２】
２．制限エンドヌクレアーゼ消化後のＤＮＡ精製：制限消化反応を等容量のフェノールで１回及び等容量のクロロホルムで１回抽出した。９５％エタノール２容量を添加し、混合物をドライアイス−エタノール浴中で１０分インキュンベートし、ＤＮＡを沈殿させる。ＤＮＡをエッペンドルフミクロ遠心分離機中で４℃で１０分間遠心分離することにより集め、上清をデカンテーションし、ＤＮＡペレットを好適な容量のＴＥ緩衝液に再懸濁させる。
【０１０３】
３．ＣａＣｌ２を用いるコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞の製造：Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を後期対数増殖期（Ｋｌｅｔｔ＝１００）まで液体培地中で生長させ、次いで遠心分離により収穫することにより形質転換用に製造する。細胞を５０ｍＭ  ＣａＣｌ２の半分の容量で洗浄し、前述の如く収穫し、最終的に元の５０ｍＭ  ＣａＣｌ２の１／５０容量中に再懸濁させる。
【０１０４】
４．コンピテントカルシウム−処理Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の形質転換：ＤＮＡと２００μｌ細胞と混合し、次いで氷上で２０分間インキュベートすることにより細胞を形質転換する。細胞を４２℃で２分間インキュベーションすることにより熱ショックを与える。ＬＢ培地を添加し、細胞を３７℃で１時間インキュンベートし、好適な（複数の）抗生物質を含む寒天プレート上に散布する。
【０１０５】
５．アルカリ溶解“ニミプレプ”法によるプラスミド単離：５ｍｌの一晩培養した培地からの細胞をＢｅｃｋｍａｎ  ＪＡ−１７ローター中、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより収穫し、１００μｌ氷冷ＧＥＴ緩衝液（５０ｍＭ  グルコース，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０，４ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム）中に再懸濁させる。室温で５分間インキュベーション後、新しく調製した溶液（０．２Ｎ  ＮａＯＨ，１％  ＳＤＳ）２００μｌを添加する。溶液を転倒することにより緩やかに混合し、氷上で５分間インキュンベートする。氷酢酸でｐＨ  ４．８に調節した５Ｍ  酢酸カリウム溶液１５０μｌを溶解物に添加する。細胞溶解物を混合し、氷上で５分間インキュンベートし、エッペンドルフ遠心分離機で４℃で５分間遠心分離する。上清をフェノール：クロロホルム１：１の等容量で１回洗浄し、混合し、エッペンドルフ遠心分離機で２分間回転させる。９５％エタノール２容量を最上層に添加し、混合物を室温で５分間インキュンベートし、ＤＮＡをエッペンドルフ遠心分離機中５分間遠心分離して集める。ペレットを７０％エタノール１ｍｌで洗浄し、上記の如く再遠心分離する。上清をデカンテーションし、ＤＮＡペレットを風乾または真空デシケーター中で乾燥させ、乾燥ペレットを２０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅを含む５０μｌ  ＴＥ中に再懸濁させる。
【０１０６】
６．エレクトロポレーションによるＥ．ｃｏｌｉ細胞の形質転換：１リットルのＬＢ培地にＥ．ｃｏｌｉ細胞の一晩培養した培地を１：５００で接種する。培地が中間対数増殖期（Ｋｌｅｔｔ＝６５）に到達したら、細胞をＪＡ−１４ローターのついたＢｅｃｋｍａｎ  Ｊ２−２１遠心分離機中、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することにより収穫する。上清をデカンテーションし、細胞を１リットルの滅菌Ｈ２Ｏ中に４℃で再懸濁させる。細胞を上記の如く収穫し、０．５リットルの滅菌Ｈ２Ｏに４℃で再懸濁させる。細胞を上記の如く収穫し、１０％グリセロールを含む２０ｍｌ滅菌Ｈ２Ｏ中で４℃で３回再懸濁させる。細胞を上記の如く収穫し、最後に１０％グリセロールを含む２ｍｌ滅菌Ｈ２Ｏ中で４℃で再懸濁させる。この時点までの細胞密度は、少なくとも３×１０１０細胞／ｍｌでなければならない。このようにして製造した細胞はすぐに使用し得るが、−７０℃で無期限に貯蔵でき、使用直前に氷上で融解する。
【０１０７】
細胞をＤＮＡ（１−４０ｍｌ容積）と４０μｌ細胞と一緒に混合し、次いで氷上で１分間インキュンベートすることによりエレクトロポレーションする。２５μＦＤ静電容量及び２．５ｋＶパルスで２００Ω抵抗に設定したＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置で混合物に電流をかける。エレクトロポレーションした細胞を１ｍｌ  ＬＢ中に再懸濁させ、３７℃で１時間インキュンベートし、好適な抗生物質を含む寒天プレート上に散布する。
【０１０８】
７．Ｔｒｉｔｏｎ溶解によるプラスミド単離方法：細胞を、ＪＡ−１７ローターをつけたＢｅｃｋｍａｎ  Ｊ２−２１遠心分離機中で５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することにより液体培地から収穫し、培地１リットル当たり８ｍｌ  Ｔｒｉｓ−蔗糖緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．０，２５％蔗糖）中に再懸濁させる。細胞をプールし、このプールに培地１リットル当たり０．８ｍｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、０．８ｍｌ  １０ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム及び５．６ｍｌ  Ｔｏｒｉｔｏｎ緩衝液（６２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０）を添加する。成分を緩やかに転倒することにより混合し、氷上で３０分間インキュベートし、上記と同一ローター中１６，０００ｒｐｍで４５分間遠心分離して細胞破片を分離する。１．１ｇ／ｍｌ  ＣａＣｌを上清に添加し、臭化エチジウムを１００μｇ／ｍｌになるまで添加する。混合物をＴｉ７０ローターのついたＢｅｃｋｍａｎ  Ｌ８−５５超遠心分離機中で４４，０００ｒｐｍで４８時間（または５５，０００ｒｐｍで２４時間、その後４４，０００ｒｐｍで１時間）回転させる。遠心分離後、ＤＮＡバンドをＣｓＣｌ勾配液からシリンジで除去し、Ｈ２Ｏ  ２容量で希釈し、ＤＮＡを９５％エタノール２容量を添加することにより得られた溶液から沈殿させ、−２０℃で少なくとも３０分間凍結させる。ＤＮＡをＪＡ−１７ローターのついたＢｅｃｋｍａｎ  Ｊ２−２１遠心分離機中、１２，０００ｒｐｍで２０分間回転させることにより集め、上清をデカンテーションし、ペレットを１−２ｍｌ  ＴＥに再懸濁させる。ＤＮＡ溶液をフェノール等容量で１回抽出し、次いでクロロホルム等容量で抽出する。ＬｉＣｌを０．２Ｍ  濃度で添加し、次いで９５％  エタノール２容量を添加する。ＤＮＡを−７０℃で一晩凍結することにより２度沈殿させ、上記の如く集める。最終ＤＮＡペレットを０．５ｍｌ  ＴＥに再懸濁させる。
【０１０９】
８．アガロースからのＤＮＡのペーパー溶離：ワットマンクロマトグラフィーペーパーＤＥ８１を２．５Ｍ  ＮａＣｌ中に数時間浸漬させ、Ｈ２Ｏで数分間洗浄し、乾燥させる。
【０１１０】
アガロースゲル電気泳動によりフラグメントを分離後、精製すべきＤＮＡバンドの隣のゲルにウエルを切り込み、上記の如く製造したＤＥＡＥペーパーをウエルに挿入する。ウエルに緩衝液を満たし、所望のバンドが切断ウエルに移動するようにゲルを９０°の角度で回転させ、バンドが移動するまでは浸水させないようにする。
【０１１１】
洗浄装置は、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ内部に配置された底に穴のついた０．５ｍｌエッペンドルフチューブからなる。調製チューブ内で、液体にペーパーを浸し、遠心分離により底の穴を通して液体を排水することにより、ＤＥＡＥペーパーを１５０μｌ低塩緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で２回洗浄する。これを７５μｌ高塩緩衝液（１．０Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で４回実施する。高塩洗浄液をプールし、フェノール：クロロホルム１：１の等容量で１回及びクロロホルムで１回抽出する。９５％エタノールを２容量以上添加することによりＤＮＡを沈殿させ、ドライアイス−エタノール浴中で１５分間凍結させ、次いで４℃で１０分間遠心分離する。上清を注意深く除去し、ペレットを乾燥させ、好適な容量のＴＥ中に再懸濁させる。
【０１１２】
９．ＲｂＣｌを使用するコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞の製造：Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を液体培地中、中間対数増殖期（Ｋｌｅｔｔ＝６０〜８０）になるまで生長させ、氷上で凍結させ、次いでＢｅｃｋｍａｎ  ＪＡ−１４ローター中、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して収穫する。細胞を１／５容量のＴＦＢ  Ｉ（３０ｍＭ  酢酸カリウム，１００ｍＭ  ＲｂＣｌ，１０ｍＭ  ＣａＣｌ２，５０ｍＭ  ＭｎＣｌ２，１５％  グリセロール，０．２Ｍ  酢酸によりｐＨ  ５．８としたもの）中に再懸濁させ、凍結させ、上記の如く収穫する。細胞を元の容量の１／５０のＴＦＢ  ＩＩ（１０ｍＭ  ＭＯＰＳ，７５ｍＭ  ＣａＣｌ２，１０ｍＭ  ＲｂＣｌ，１５％  グリセロール，ＫＯＨでｐＨ６．５にしたもの）に再懸濁させ、使用前に上記の如く氷上で１５〜６０分間凍結させる。
【０１１３】
ＣａＣｌ２で処理した細胞に関して記載された同一形質転換プロトコルをＲｂＣｌで処理した細胞に関して実施する。
【０１１４】
１０．メチル化のファージアッセイ：０．０４％  マルトース及び好適な抗生物質を含んだ富裕ブロス（１リットル当たり富裕ブロスは以下のものを含む：１０ｇ  トリプトン；５ｇ  酵母抽出物；５ｇ  ＮａＣｌ；１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを７．０に調節）を形質転換体の一晩培養した培地に１：１００で接種する。新規培地を３７℃で振盪しながら中間対数増殖期まで生長させ、細胞を遠心分離（４０００ｒｐｍ５分）により収穫し、１ｍＭ  ＳＭ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ，８ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５，０．０１％  ゼラチン）中に再懸濁させる。λｖｉｒファージを感染の多重度１０になるように添加し、細胞を３７℃で２０分間インキュベートして、ファージを吸着させる。インキュベーション後、０．０４％  マルトースを含む富裕ブロスを添加して容積を２０ｍｌに戻し、培地を３７℃で一晩生長させる。翌日、クロロホルム２００μｌを培地に添加し、細胞破片を遠心分離し、次いで０．４５μｍフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｕｅｌｌ）を通して濾過して除去する。ファージＤＮＡをフェノール、次いでクロロホルムとの抽出により澄んだ上清１ｍｌから単離し、−７０℃でエタノール沈殿させ、遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＡ−１７ローター中、１２０００ｒｐｍ、２０分）し、次いで２０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅを含む１００μｌ  ＴＥ中にペレットを再懸濁させる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６２（ＲＩＩ＋ＭＩＩ＋）由来のＢｇｌＩＩ  ＲＭ系をクローン化する試みを示す。図示の如く、この株由来の完全系をクローン化する試みは成功しないことを証明した。従って、これらは本明細書内には記載されない。
【図２】明細書に記載の如くＢｇｌＩＩエンドヌクレアーゼをクローン化及び産生する好ましい方法を示す。
【図３】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉゲノムライブラリーを作成するために使用したベクターｐＡＭＢ３の図式である。ベクターはｐＢＲ３２２から誘導する。本図は、プラスミド（１９９０−１９９１，ｐ１１０）のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログマップから書き換えて、番号をつけてある。このマップは、ｐＢＲ３２２を１度または２度切断する酵素の制限部位を示す。単一の部位をボールド型で示す。Ａｐ＝アンピシリン耐性遺伝子；Ｔｃ＝テトラサイクリン耐性遺伝子；ｒｏｐはＲＮａｓｅＩの活性を仲介するタンパク質をコードする；ＯＲＩ＝複製開始点。３つの挿入ＢｇｌＩＩリンカーの大凡の位置を矢印で示す。
【図４】ｂｇｌＩＩＭ遺伝子のマッピング及びサブクローニングを図示する。図中、影のついた太線は、挿入Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６１（ＲＩＩ−ＭＩＩ＋）ＤＮＡを示す。プラスミドベクターＤＮＡは細線により表されている。ｂｇｌＩＩＭの位置及び方向は長い矢印により示されている。存在する場合のｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）の相対位置及び方向が短い矢印により示されている。各構築物中で使用されたプラスミドベクターは左端の括弧内に示されている。ベクターｐＡＭＢ３及びｐＳＹＸ１９の詳細は図３及び５に各々与えられている。  Ａ．ｐＭＢ０５を構築するためにｐＡＭＢ３上にトランスファーした、ｂｇｌＩＩＭを保持するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＤＮＡの７．５ｋｂ  ＰｓｔＩフラグメントである。挿入物内の重要な制限部位が示されている。  Ｂ．ｐＭＢ２６１を形成するために発現ベクターｐＩＪ２９２６に無傷の状態でトランスファーしたＰｓｔＩフラグメントである。ベクター内に関連制限部位が含まれている。Ｃ．ｐＭＢ２６１のＥｃｏＲＶ部位の間の１．７ｋｂ欠失により形成された、プラスミドｐＭＢ２６３の挿入フラグメントである。  Ｄ．プラスミドｐＭＢ２６３のＮｄｅＩ欠失により形成された、ｐＭＢＮ２の挿入フラグメントである。欠失により、ｐＩＪ２９２６ベクターの２２０ｂｐに沿って挿入ＤＮＡ１３５０ｂｐを除去した。  Ｅ．ｐＭＢＮ２の４．７ｋｂ  ＨｉｎｃＩＩ欠失により形成された、ｐＢＭ１の挿入フラグメントである。  Ｆ．クレノウポリメラーゼでＮｄｅＩ部位を充填し、次いでその末端にＢａｍＨＩリンカーを付加することにより作成した、ｐＭＢ１−Ｂａｍの挿入フラグメントである。  Ｇ．ｐＳＹＸＢｇｌＭを形成するためにベクターｐＳＹＸ１９中に挿入されたｂｇｌＩＩＭを含む１．８ｋｂの得られたＢａｍＨＩフラグメント、Ｒ．ＢｇｌＩＩ過剰発現クローンに関して使用したメチラーゼ構築物である。
【図５】プラスミドベクターｐＳＹＸ１９の図を示す。プラスミド、即ち、ｐＷＳＫ１２９［Ｗａｎｇ及びＫｕｓｈｎｅｒ，Ｇｅｎｅ  １００：１９５−１９９，（１９９１）］は、そのコピー数を増加させるその複製開始点（ｐＳＣ１０１  ｏｒｉ）に於ける突然変異を含む。図中、ｆ１  ｏｒｉ＝ｆ１複製開始点；Ｋａｎ＝カナマイシン耐性遺伝子；ＭＣＳ＝多重クローニング部位及びＰｌａｃ＝ｌａｃプロモーターが示されており、その位置及び方向が短い矢印で示されている。ｂｇｌＩＩＭが挿入されるＢａｍＨＩ部位は、ＭＣＳに配置されている。
【図６】ｂｇｌＩＩＲが特徴付けされ、サブクローン化され次いで過剰発現される工程を図示している。図中、太い影の線は、ｂｇｌＩＩＭ及びｂｇｌＩＩＲ遺伝子を含むＢ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６２（ＲＩＩ＋ＭＩＩ＋）ＤＮＡを示している。重要な制限部位が示されている。ｂｇｌＩＩＲ及びｂｇｌＩＩＭ遺伝子の位置及び方向が長い矢印で示されている。プロモーターＰｌａｃ及びＰｔａｃは短い矢印で示されている。プラスミドベクターは括弧内に示されている。プラスミドｐＡＧＲ３は図７に記載されている。  Ａ．ｐＭＲＢ１を形成するためにｐＡＣＹＣ１７７［Ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４：１１４１−１１５６，（１９７８）］にクローン化されるｂｇｌＩＩＭ及びｂｇｌＩＩＲを含むＢ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ  ＲＵＢ５６２由来の７．５ｋＢ  ＰｓｔＩフラグメントである。  Ｂ．そのヌクレオチド配列が決定された完全ＢｇｌＩＩＲＭ系を含む３．０ｋｂ  ＰｓｔＩ−ＨｉｎｃＩＩ領域である。  Ｃ．ｐＢｇｌＲ１．８Ｂを形成するためにｐＵＣ１８にクローン化された、ｂｇｌＩＩＲフラグメントを含む２．０ｋｂ  ＰｓｔＩ−ＳｐｈＩフラグメントである。  Ｄ．ｂｇｌＩＩＲを含むＰＣＲにより産生された８００ｂｐフラグメントである。末端では、フラグメントがＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ部位間で発現ベクターｐＡＧＲ３に直接クローン化され得るようにＢｓｐＨＩ及びＢａｍＨＩ部位をプライマー内に作製した。  Ｅ．ｐＡＧＲＢｇｌＲ２を形成するために発現ベクター中にクローン化された、ｂｇｌＩＩＲを含むフラグメントである。
【図７】プラスミドベクターｐＡＧＲ３の図を示している。Ｗ．Ｊａｃｋ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）により構築されたプラスミドは、ｌａｃＩｑリプレッサー遺伝子、転写ターミネーター（ｒｒｎｂ）及びｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ）が付加された、ｐＲＳ４１５［Ｓｉｍｏｎｓら，Ｇｅｎｅ  ５３：８５−９６，（１９８７）］の誘導体である。図中に示されている他の特徴は、正しい方向にｂｇｌＩＩＲを挿入するために使用された、複製開始点（ｏｒｉ）、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐ）並びにＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩクローニング部位である。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）はＮｃｏＩ部位内に配置されており、ベクターのリボソーム結合部位の後ろに最適に配置されている。
【図８】ＮＥＢ＃７３１の細胞抽出物から得られたＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ活性の滴定を示すアガロースゲルの写真である。ゲル上のレーンの番号は、左から右へレーン１から８まである。ＮＥＢ＃７３１から作成した粗な細胞抽出物を各々、希釈緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ  ８．０，１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中に１：１００及び１：１０００で希釈した。各希釈液から１μｌ及び５μｌを使用して、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ８．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０単位ＳｓｐＩを含む５０μｌ反応混合物中で、ＰＩＪ２９２６ＤＮＡ  ０．５μｇを消化させた。３７℃で３０分間インキュベーション後、各希釈液からの反応混合物３０μｌを０．７％  ＴＢＥアガロースゲル上に載置し、これを１時間泳動して、写真を撮った。ゲルのレーン中に含まれるものは、分子量マーカーとしてＢｓｔＥＩＩで切断したλＤＮＡ（レーン１及び８）；１６単位精製ＢｇｌＩＩを含む反応混合物（陽性対照；レーン２）；０．０５μｌ  粗抽出物を含む反応混合物（レーン３）；０．０１μｌ粗抽出物を含む反応混合物（レーン４）；０．００５μｌ粗抽出物を含む反応混合物（レーン５）；０．００１μｌ粗抽出物を含む反応混合物（レーン６）；全くＢｇｌＩＩを含まない反応混合物（陰性対照；レーン７）であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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