(57)【要約】      （修正有）【課題】  特に、オオムギにおいて皮裸性遺伝子の座乗位置を特定することが可能な遺伝マーカーと、その利用法とを提供する。【解決手段】  8種類の特定の塩基配列又はその一部を有するポリヌクレオチドからなり、植物の皮裸性遺伝子に連鎖する遺伝マーカー。この遺伝マーカーを用いれば、オオムギ７Ｈ染色体の皮裸性遺伝子近傍の詳細な連鎖地図を作成することが可能となり、この連鎖地図を用いれば、植物染色体から皮裸性遺伝子の座乗位置を特定することが可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示される塩基配列又はその一部を有するポリヌクレオチドからなり、植物の皮裸性遺伝子に連鎖することを特徴とする遺伝マーカー。
（ａ）配列番号１〜８のいずれかに示される塩基配列。
（ｂ）配列番号１〜８のいずれかに示される塩基配列において、１又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列。
【請求項２】
配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１５、１６及び１７、配列番号１８及び１９、配列番号２０及び２１、又は、配列番号２２及び２３のいずれかに示されるプライマーセットを用いて増幅される、植物の皮裸性遺伝子に連鎖することを特徴とする遺伝マーカー。
【請求項３】
上記植物は、オオムギであることを特徴とする請求項１又は２に記載の遺伝マーカー。
【請求項４】
上記遺伝マーカーは、オオムギ７Ｈ染色体における遺伝マーカーであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝マーカー。
【請求項５】
オオムギのゲノムＤＮＡに存在し、ＡＦＬＰ分析により選抜された、皮裸性遺伝子に連鎖する遺伝マーカーであって、オオムギ７Ｈ染色体長腕におけるオオムギの皮裸性遺伝子の位置から、それぞれ１．２ｃＭ、２．９ｃＭ、５．３ｃＭ末端部側のいずれかの位置に座乗することを特徴とする遺伝マーカー。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝マーカーを少なくとも１つ含み、オオムギ７Ｈ染色体の連鎖地図の作成に用いられることを特徴とする遺伝マーカー群。
【請求項７】
さらに、オオムギの７Ｈ染色体に位置づけられる遺伝マーカーを含むことを特徴とする請求項６に記載の遺伝マーカー群。
【請求項８】
上記請求項６又は７に記載の遺伝マーカー群を用いて作成されることを特徴とするオオムギ７Ｈ染色体の連鎖地図。
【請求項９】
上記請求項１〜５に記載のいずれかの遺伝マーカーを少なくとも１つ用いて、植物染色体から、皮裸性遺伝子の座乗位置を特定する工程を含むことを特徴とする、皮裸性遺伝子の単離方法。
【請求項１０】
上記遺伝マーカーをプライマー又はプローブとして用いることを特徴とする請求項９に記載の皮裸性遺伝子の単離方法。
【請求項１１】
以下の（ａ）又は（ｂ）記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２７に示される塩基配列における４０番目のアデニン（Ａ）、１０８番目のアデニン（Ａ）、１４９番目のチミン（Ｔ）、１９３番目のグアニン（Ｇ）、２２６番目のシトシン（Ｃ）、２８７番目のチミン（Ｔ）、２９８番目のアデニン（Ａ）、３６６番目のチミン（Ｔ）、４４５番目のチミン（Ｔ）のうち、少なくとも１つの一塩基多型を含み、かつ、当該一塩基多型の前後における２０以上の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号２７に示される塩基配列において、１個又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列であり、当該塩基配列２７を基準として、４０番目のアデニン（Ａ）、１０８番目のアデニン（Ａ）、１４９番目のチミン（Ｔ）、１９３番目のグアニン（Ｇ）、２２６番目のシトシン（Ｃ）、２８７番目のチミン（Ｔ）、２９８番目のアデニン（Ａ）、３６６番目のチミン（Ｔ）、４４５番目のチミン（Ｔ）のうち、少なくとも１つの一塩基多型を含み、かつ、当該一塩基多型の前後における２０以上の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１〜６に記載のいずれかの遺伝マーカー又は請求項１１に記載のポリヌクレオチドを少なくとも１つ指標として、植物の皮裸性を判別する方法。
【請求項１３】
以下の（ｃ）又は（ｄ）記載のポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号２７に示される塩基配列における１４１番目のチミン（Ｔ）、１８１番目のグアニン（Ｇ）、２４４番目のアデニン（Ａ）のうち、少なくとも１つの一塩基多型を含み、かつ、当該一塩基多型の前後における２０以上の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号２７に示される塩基配列において、１個又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列であり、当該塩基配列２７を基準として、１４１番目のチミン（Ｔ）、１８１番目のグアニン（Ｇ）、２４４番目のアデニン（Ａ）のうち、少なくとも１つの一塩基多型を含み、かつ、当該一塩基多型の前後における２０以上の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを少なくとも１つ指標として、裸性オオムギの産地を判別する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮裸性遺伝子に連鎖する遺伝マーカー（例えば、ＤＮＡマーカー）、及びその利用に関するものであり、特にオオムギにおける皮裸性遺伝子の染色体上の座乗位置を特定するために好適に用いられる遺伝マーカーとその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
栽培オオムギは、脱穀時に穎と種子が分離できない「皮性」（皮ムギ）と容易に分離できる「裸性」（裸ムギ）に大別される。皮性と裸性の分化は栽培オオムギに特有で、他のムギ類の栽培種はすべて裸性である。皮ムギは醸造・飼料用に使われるのに対し、種子が穎から分離できる裸ムギは食用に適し、東アジアに偏って分布する。皮ムギの穎は、種子を外界の環境ストレスから保護する役目も果たしている。したがって、皮裸性は農学的にも重要な形質であるだけでなく、オオムギの栽培化や伝播の過程を解明する上でも鍵となる形質である。
【０００３】
皮性と裸性という形態の顕著な違いは単一の主働遺伝子によって支配され、皮性が裸性に対して優性である。皮裸性を支配する皮裸性遺伝子は、７Ｈ染色体長腕に位置することが知られている（例えば、非特許文献１参照）。しかし、皮裸性遺伝子の厳密な位置は特定されておらず、その遺伝子単離の試みはなされていない。皮裸性遺伝子を含む連鎖地図は、形態マーカーや（例えば、非特許文献２参照）、分子マーカー（例えば、非特許文献３・４・５・６・７参照）に基づいていくつか作成されている。
【非特許文献１】Scholz F(1955)Mutationsversuche an Kulturpflanzen.IV.Kulturpflanze 3:69-89
【非特許文献２】Franckowiack JD(1996)Revised linkage maps for morphological markers in barley,Hordeum vulgare.Naked caryopsis.Special Issue Barley Genet Newslett 26:51-52
【非特許文献３】Becker J, Heun M(1995)Barley microsatellites:allele variation and mapping.Plant Mol Biol 27:835-845
【非特許文献４】Qi X, Stam P, Lindhout P(1998)Use of locus-specific AFLP markers to construct a high-density molecular map in barley.Theor Appl Genet 96:376-384
【非特許文献５】Costa JM, Corey A, Hayes PM, Jobet C, Kleinhofs A, Kopisch-Obusch A, Kramer SF, Kudrna D, Li M, Riera-Lisarazu, Sato K, Szucs P, Toojinda T, Vales MI, Wolfe RI(2001)Molecular mapping of the Oregon Wolfe Barleys:a phenotypically polymorphic doubled-haploid population.Theor Appl Genet 103:415-424
【非特許文献６】Graner A, Bauer E, Kellermann A, Kirchner S, Muraya JK, Jahoor A, Wenzel G(1994)Progress of RFLP-map construction in winter barley.Barley Genet Newslett 23:53-59
【非特許文献７】Ramsay L, Macaulay M, degli Ivanissevich S, MacLean K, Cardle L, Fuller J, Edwards KJ, Tuvesson S, Morgante M, Massari A, Maestri E, Marmiroli N, Sjakste T, Ganal M, Powell W, Waugh R(2000) A simple sequence repeat-based linkage map of barley.Genetics 156:1997-2005）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上述した従来の連鎖地図は、皮裸性遺伝子座周辺のマーカーの密度が低いために解析能が低く、詳細な連鎖地図としては十分ではない。すなわち、皮裸性遺伝子座の高い解析能を有する分析のためには、多数の遺伝マーカーを用いた詳細な連鎖地図の開発が不可欠である。したがって、そのような多数の遺伝マーカーが得られれば、詳細な連鎖地図を作成することができ、皮裸性遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離が可能となり、ひいては、皮性の優良品種を裸性に改変した品種の作出など、各種育種プログラムへの応用が可能となる。
【０００５】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、オオムギにおける皮裸性遺伝子の染色体上の座乗位置を特定するために好適に用いられる遺伝マーカーとその利用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、オオムギの裸性品種「コビンカタギ」と、皮性品種「Triumph」との交配に由来するＦ２集団を用いたバルクセグレガント分析により、皮裸性遺伝子近傍の遺伝マーカーを開発し、これらを用いることにより、上記課題を解決することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明にかかる遺伝マーカーは、上記課題を解決するために、以下の（ａ）又は（ｂ）に示される塩基配列又はその一部を有するポリヌクレオチドからなり、植物の皮裸性遺伝子に連鎖することを特徴としている。（ａ）配列番号１〜８のいずれかに示される塩基配列。（ｂ）配列番号１〜８のいずれかに示される塩基配列において、１又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列。
【０００８】
また、本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１５，１６及び１７、配列番号１８及び１９、配列番号２０及び２１、又は、配列番号２２及び２３のいずれかに示されるプライマーセットを用いて増幅され、植物の皮裸性遺伝子に連鎖することを特徴としている。
【０００９】
上記植物は、オオムギであることが好ましい。また、上記遺伝マーカーは、オオムギ７Ｈ染色体における遺伝マーカーであることが好ましい。
【００１０】
さらに、本発明にかかる遺伝マーカーには、オオムギのゲノムＤＮＡに存在し、ＡＦＬＰ分析により選抜された、皮裸性遺伝子に連鎖する遺伝マーカーであって、オオムギ７Ｈ染色体長腕におけるオオムギの皮裸性遺伝子の位置から、それぞれ１．２ｃＭ、２．９ｃＭ、５．３ｃＭ末端部側のいずれかの位置に座乗する遺伝マーカーも含まれる。
【００１１】
また、本発明にかかる遺伝マーカー群は、上記遺伝マーカーを少なくとも１つ含み、オオムギ７Ｈ染色体の連鎖地図の作成に用いられることを特徴としている。この遺伝マーカー群は、さらに、オオムギの７Ｈ染色体に位置づけられる遺伝マーカーを含んでいてもよい。加えて、本発明には、これら遺伝マーカー群を用いて作成されるオオムギ７Ｈ染色体の連鎖地図が含まれていてもよい。
【００１２】
さらに、本発明にかかる皮裸性遺伝子の単離方法は、上記いずれかの遺伝マーカーを少なくとも１つ用いて、植物染色体から、皮裸性遺伝子の座乗位置を特定する工程を含むことを特徴としている。この単離方法においては、上記遺伝マーカーをプライマー又はプローブとして用いることができる。
【００１３】
また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）記載のポリヌクレオチドである。（ａ）配列番号２７に示される塩基配列における４０番目のアデニン（Ａ）、１０８番目のアデニン（Ａ）、１４９番目のチミン（Ｔ）、１９３番目のグアニン（Ｇ）、２２６番目のシトシン（Ｃ）、２８７番目のチミン（Ｔ）、２９８番目のアデニン（Ａ）、３６６番目のチミン（Ｔ）、４４５番目のチミン（Ｔ）のうち、少なくとも１つの一塩基多型を含み、かつ、当該一塩基多型の前後における２０以上の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチド。（ｂ）配列番号２７に示される塩基配列において、１個又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列であり、当該塩基配列２７を基準として、４０番目のアデニン（Ａ）、１０８番目のアデニン（Ａ）、１４９番目のチミン（Ｔ）、１９３番目のグアニン（Ｇ）、２２６番目のシトシン（Ｃ）、２８７番目のチミン（Ｔ）、２９８番目のアデニン（Ａ）、３６６番目のチミン（Ｔ）、４４５番目のチミン（Ｔ）のうち、少なくとも１つの一塩基多型を含み、かつ、当該一塩基多型の前後における２０以上の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【００１４】
加えて、本発明にかかる植物の皮裸性を判別する方法は、上記のいずれかの遺伝マーカー又は上記ポリヌクレオチドを少なくとも１つ指標としていることを特徴としている。
【００１５】
また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載のポリヌクレオチドであってもよい。（ｃ）配列番号２７に示される塩基配列における１４１番目のチミン（Ｔ）、１８１番目のグアニン（Ｇ）、２４４番目のアデニン（Ａ）のうち、少なくとも１つの一塩基多型を含み、かつ、当該一塩基多型の前後における２０以上の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチド。（ｄ）配列番号２７に示される塩基配列において、１個又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列であり、当該塩基配列２７を基準として、１４１番目のチミン（Ｔ）、１８１番目のグアニン（Ｇ）、２４４番目のアデニン（Ａ）のうち、少なくとも１つの一塩基多型を含み、かつ、当該一塩基多型の前後における２０以上の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【００１６】
さらに、本発明にかかる裸性オオムギの産地を判別する方法は、上記ポリヌクレオチドを少なくとも１つ指標として用いることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１７】
本発明にかかる遺伝マーカーは、以上のように、配列番号１ないし８のいずれかに示される塩基配列又はその一部を有するポリヌクレオチドからなり、植物の皮裸性遺伝子に連鎖するものである。この遺伝マーカーを用いれば、オオムギ７Ｈ染色体の皮裸性遺伝子座近傍の詳細な連鎖地図を作成することが可能となり、この連鎖地図を用いれば、植物染色体から皮裸性遺伝子の座乗位置を特定することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、言うまでもないが、本発明は、特に本実施の形態の記載内容にのみ限定されるものではない。
【００１９】
（１）本発明にかかる遺伝マーカー
本発明にかかる遺伝マーカーは、以下の（ａ）又は（ｂ）に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドからなり、植物の皮裸性遺伝子に連鎖する遺伝マーカーであればよい。（ａ）配列番号１〜８のいずれかに示される塩基配列。（ｂ）配列番号１〜８のいずれかに示される塩基配列において、１又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列。
【００２０】
なお、本発明でいう「ポリヌクレオチド」には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡには、ｍＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ等が含まれる。また、ＤＮＡは２本鎖でも１本鎖でもよく、１本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡでもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい。さらに、本発明の「遺伝マーカー」は、上記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列以外に、その他の塩基配列、例えば、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの塩基配列を含むものであってもよい。
【００２１】
また、本発明でいう「１又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、公知の人為的な手法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加される変異を意味する。また、上記変異は、人為的に導入された変異ではなくてもよい。例えば、天然に存在する植物のゲノムＤＮＡから同様の変異を有するポリヌクレオチドを単離して、本発明にかかる遺伝マーカーとしてもよい。
【００２２】
本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号１から８で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドそのものであってもよいが、その塩基配列の一部を有するポリヌクレオチドであってもよい。ここでいう「一部の塩基配列」とは、遺伝マーカーとして使用可能な程度の長さの塩基配列を示すものであり、その長さは特に限定されるものではない。
【００２３】
また、上記植物は、イネ科植物であることが好ましく、オオムギ属であることがさらに好ましい。言い換えれば、上記遺伝マーカーは、イネ科植物由来であることが好ましく、オオムギ由来であることがより好ましい。ここでいう「イネ科植物」とは、オオムギ属、コムギ属、イネ等の植物をいう。オオムギは、二条・六条等の条性、裸性、皮性、並・渦性等の諸性質は特に限定されないことはいうまでもない。
【００２４】
上記遺伝マーカーの好ましい一例として、本実施の形態では、例えば、＜１＞配列番号１に示される塩基配列を有するゲノムＤＮＡ（マーカー名：ＫＴ１）＜２＞配列番号２に示される塩基配列を有するゲノムＤＮＡ（マーカー名：ＫＴ２）＜３＞配列番号３、７、８のいずれかに示される塩基配列を有するゲノムＤＮＡ（マーカー名：ＫＴ３）＜４＞配列番号４に示される塩基配列を有するゲノムＤＮＡ（マーカー名：ＫＴ７）＜５＞配列番号５に示される塩基配列を有するゲノムＤＮＡ（マーカー名：ＫＴ９）＜６＞配列番号６に示される塩基配列を有するゲノムＤＮＡ（マーカー名：ＫＴ１４）又はこれらをもとに作成されたＳＣＡＲマーカーの他、上記ゲノムＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡ等が挙げられる。
【００２５】
なお、上記遺伝マーカーＫＴ１、ＫＴ２、ＫＴ３、ＫＴ７、ＫＴ９、ＫＴ１４は、皮裸性遺伝子に密接に連鎖したＡＦＬＰ（Amplified Fragment Length Polymorphism）マーカーであることが好ましい。「ＡＦＬＰマーカー」とは、ＡＦＬＰ分析により選抜されたマーカーをいう。「ＡＦＬＰ分析」とは、サンプルＤＮＡを２種類の制限酵素で切断し、それらの粘着末端にアダプタを連結させ、当該アダプタに特異的で、且つ制限酵素断片の中にも数塩基伸長したプライマーを用いて、当該制限酵素断片を選択的に増幅し、アクリルアミドゲル電気泳動で検出できるフィンガープリントを得るものである。またこの選択的に増幅された断片をＡＦＬＰ断片という。ＡＦＬＰ断片にはアダプタ配列が含まれているので、上記の配列番号で示されている塩基配列は、ＡＦＬＰ断片の塩基配列からアダプタの塩基配列を除外したものである。
【００２６】
また、ＳＣＡＲマーカー（Sequence-Characterised Amplified Region）とは、一般に連鎖地図上の位置が知られている塩基配列を基に作成された、プライマーによるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）マーカーをいう。ＳＣＡＲマーカーがＳＴＳマーカーと異なる点は、もととなる塩基配列は単一コピーとは限らず、ゲノムＤＮＡ中に何度も現れる配列を含んでいてもよい点である。ＳＣＡＲマーカー化、すなわちもととなる塩基配列からＳＣＡＲマーカーを作成する場合は、反復配列部分を避けて特異的なマーカーになるようにプライマーを設計する。かかるＳＣＡＲマーカーを用いることにより、ＰＣＲのみで特定形質の有無が判別可能となる。
【００２７】
以下、上記＜１＞〜＜６＞の遺伝マーカー及びこれらをＳＣＡＲマーカー化したものについて、図２〜７及び図１０，１１に基づいて詳細に説明する。また、図２〜７において、二重下線を引いた塩基配列は制限酵素により認識される配列であり、直線又は波線の下線を引いた塩基配列は、ＳＣＡＲマーカーのプライマー設計部位である。これら各事項については、後述する。なお、図中「？」で示した塩基配列は不確かな塩基配列である。また、図２及び図３における塩基配列の一塩基多型部位では、上段（図中Ｔと記載）が「Triumph」の塩基配列を示し、下段（図中Ｋと記載）に「コビンカタギ」の一塩基多型のみを示している。さらに図４における塩基配列の一塩基多型部位は太線の下線で示す。
【００２８】
なお、図１０（ａ）、（ｂ）、（ｃ）はＳＣＡＲマーカーｓＫＴ２、ｓＫＴ３、ｓＫＴ７を用いた連鎖解析の電気泳動像を示す。図中「Ｔ］は「Triumph」、「Ｋ」は「コビンカタギ」、「Ｆ２」はＦ２個体、「Ｍ」はサイズマーカー（１００ｂｐ ladder）を示す。
【００２９】
また、図１１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）は、それぞれＳＣＡＲマーカーｓＫＴ１、ｓＫＴ２、ｓＫＴ３（プライマーセットＥ０３Ｍ１９Ｆ２、Ｅ０３Ｍ１９Ｒ２使用）、ｓＫＴ３（プライマーセットＥ０３Ｍ１９Ｆ２、Ｅ０３ＫＦ２、Ｅ０３Ｍ１９Ｒ２使用）、ｓＫＴ７、ｓＫＴ９、ｓＫＴ１４を用いた多型検出における電気泳動像である。図中「Ｔ］は「Triumph」、「Ｋ」は「コビンカタギ」、「Ｆ１」はヘテロ個体、「Ｍ」はサイズマーカー（１００ｂｐ ladder）を示す。
【００３０】
＜１＞遺伝マーカー：ＫＴ１、ｓＫＴ１
ＫＴ１は、配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる遺伝マーカーであって、皮裸性遺伝子の近傍に位置し、当該皮裸性遺伝子と連鎖する遺伝マーカーである。
【００３１】
具体的には、ＫＴ１は、図２に示すように、４５１ｂｐからなる遺伝マーカーであり、「Triumph」でも「コビンカタギ」でも増幅される共優性ＡＦＬＰマーカーである。ＫＴ１には、９番目、７２番目、１３８番目、１５９番目、１８８番目、２５０番目、３９１番目の塩基に一塩基多型が存在する。配列番号１では、９番目の塩基においてｗで示される一塩基多型は、「Triumph」ではチミン（Ｔ）であり、「コビンカタギ」ではアデニン（Ａ）である。また、１８８番目の塩基においてｗで示される一塩基多型は、「Triumph」ではアデニン（Ａ）であり、「コビンカタギ」ではチミン（Ｔ）である。７２番目及び１５９番目の塩基において、ｓで示される一塩基多型は、「Triumph」ではグアニン（Ｇ）であり、「コビンカタギ」ではシトシン（Ｃ）である。１３８番目の塩基においてｙで示される一塩基多型は、「Triumph」ではチミン（Ｔ）であり、「コビンカタギ」ではシトシン（Ｃ）である。また、２５０番目の塩基においてｙで示される一塩基多型は、「Triumph」ではシトシン（Ｃ）であり、「コビンカタギ」ではチミン（Ｔ）である。３９１番目の塩基において、ｍで示される一塩基多型は、「Triumph」ではアデニン（Ａ）であり、「コビンカタギ」ではシトシン（Ｃ）である。
【００３２】
また、「コビンカタギ」ではＫＴ１の１０３番目から１０７番目、１３４番目から１３８番目、４３０番目から４３４番目の塩基配列は、ＨｉｎｆＩの認識部位である。しかし、「Triumph」では、上記１３８番目の塩基にみられる一塩基多型により、ＫＴ１の１０３番目から１０７番目、４３０番目から４３４番目の２つ塩基配列のみがＨｉｎｆＩの認識部位となる。すなわちＫＴ１の１３４番目番目から１３８番目の塩基配列は、「コビンカタギ」のみで、ＨｉｎｆＩによって切断される制限酵素部位となる。
【００３３】
また、本発明の遺伝マーカーは、上記ＫＴ１をＳＣＡＲマーカー化した遺伝マーカーであってもよく、具体的な一例としてｓＫＴ１を挙げることができる。ｓＫＴ１は、配列番号１に示される塩基配列のうち、１６番目の塩基から４４５番目の塩基までの４３０ｂｐからなる塩基配列を有する遺伝マーカーであって、皮裸性遺伝子の近傍に位置し、当該皮裸性遺伝子と連鎖する遺伝マーカーである。図２では、ｓＫＴ１は、下線で示されるフォワードプライマー設計部位の最初の塩基からリバースプライマー設計部位の最後の塩基までの部分として示される。
【００３４】
ｓＫＴ１は、図１１（ａ）に示されるように、ＫＴ１同様「Triumph」でも「コビンカタギ」でも増幅される共優性マーカーである。また、ＫＴ１の９塩基目の一塩基多型部位が除かれて、６個の一塩基多型を有する。なお、ｓＫＴ１の、その他の一塩基多型及び制限酵素部位についてはＫＴ１について説明したとおりである。図１１（ａ）は、ＨｉｎｆＩで増幅断片を消化した後の電気泳動像を示す。「Triumph」ではＨｉｎｆＩの認識部位が２箇所あり、３２７ｂｐ、８８ｂｐ、１５ｂｐの断片が生じるため、３２７ｂｐの断片長を示すバンドが認められる。これに対して「コビンカタギ」ではＨｉｎｆＩの認識部位が３箇所あり、２９６ｂｐ、８８ｂｐ、３１ｂｐ、１５ｂｐの断片が生じるため、２９６ｂｐの断片長を示すバンドが認められる。
【００３５】
＜２＞遺伝マーカー：ＫＴ２、ｓＫＴ２
ＫＴ２は、配列番号２に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる遺伝マーカーであって、皮裸性遺伝子の近傍に位置し、当該皮裸性遺伝子と連鎖する遺伝マーカーである。
【００３６】
具体的には、ＫＴ２は、図３に示すように、３２６ｂｐからなる遺伝マーカーであり、「Triumph」でも「コビンカタギ」でも増幅される共優性ＡＦＬＰマーカーである。ＫＴ２には、５４番目、８８番目の塩基に一塩基多型が存在する。配列番号２では、ｒで示されるこの一塩基多型は、「Triumph」ではグアニン（Ｇ）であり、「コビンカタギ」ではアデニン（Ａ）である。また、ｋで示されるこの一塩基多型は、「Triumph」ではチミン（Ｔ）であり、「コビンカタギ」ではグアニン（Ｇ）である。
【００３７】
また、「コビンカタギ」では８７番目から９０番目の塩基配列は、ＨａｅIIIの認識部位である。しかし、「Triumph」では、上記８８番目の塩基にみられる一塩基多型によりＨａｅIIIの認識部位は存在しない。すなわち、ＫＴ２には、８７番目から９０番目の塩基配列に、「コビンカタギ」のみが、ＨａｅIIIによって切断される制限酵素部位が存在する。したがって、図３の下線で示すプライマーセットを用いて得られた増幅産物を、ＨａｅIIIで消化すると、「Triumph」では、３２６ｂｐからなる単一の断片が生じるのに対し、「コビンカタギ」では２３８ｂｐと８８ｂｐの２つの断片が得られる。
【００３８】
なお、ＫＴ２をもととなる塩基配列として、作成したＳＣＡＲマーカーはＫＴ２と同一のものであるため、以下ＫＴ２を便宜上、ＫＴ２（ｓＫＴ２）と称する。図１０（ａ）は、増幅断片をＨａｅIIIで消化すると、「コビンカタギ」でのみ２３８ｂｐと８８ｂｐのバンドが検出されることを示している。Ｆ２個体のうち＊で示されているものは、ｎｎホモ接合体（裸性ホモ接合体）を示す。
【００３９】
＜３＞遺伝マーカー：ＫＴ３、ｓＫＴ３
ＫＴ３は、配列番号３、７、８のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる遺伝マーカーであって、皮裸性遺伝子の近傍に位置し、当該皮裸性遺伝子と連鎖する遺伝マーカーである。
【００４０】
具体的には、図４に示すように、波下線の設計部位に対応するプライマーセット（Ｅ０３Ｍ１９Ｆ１（配列番号１３）及びＥ０３Ｍ１９Ｒ１（配列番号１４））を用いて、オオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅すると、上段（図中Ｈと記載、配列番号３に対応する）に示す塩基配列、中段（図中Ｋと記載、配列番号７に対応する）に示す塩基配列、下段（図中Ｔと記載、配列番号８に対応する）に示す塩基配列のいずれかからなる塩基配列が得られる。上段の塩基配列は「ＯＵＨ６０２」で、中段の塩基配列は「コビンカタギ」で、下段の塩基配列は「Triumph」で増幅される。ここで、「ＯＵＨ６０２」は皮性の一系統である。なお、世界各地のオオムギ品種・系統を調査したところ、皮性品種・系統の中に、Triumph型とＯＵＨ６０２型の２タイプが検出されている。このように、ＫＴ３は、「Triumph」でも「コビンカタギ」でも「ＯＵＨ６０２」でも増幅される共優性ＡＦＬＰマーカーである。
【００４１】
すなわち、波下線の設計部位に対応するプライマーセットＥ０３Ｍ１９Ｆ１及びＥ０３Ｍ１９Ｒ１を用いて、「ＯＵＨ６０２」で増幅される遺伝マーカー（以下、便宜上ＫＴ３（Ｈ）と称する）は、図２に示すように、８４５ｂｐからなる遺伝マーカーである。これに対して、「コビンカタギ」で増幅される遺伝マーカー（以下、便宜上ＫＴ３（Ｋ）と称する）は、８１１ｂｐからなり、ＫＴ３（Ｈ）の１４５番目から１７８番目の３４ｂｐの塩基配列が欠失している。また、「Triumph」で増幅される遺伝マーカー（以下、便宜上ＫＴ３（Ｔ）と称する）は、４７３ｂｐからなり、ＫＴ３（Ｈ）の１６７番目から５３２番目の３６６ｂｐの塩基配列及び５５０番目から５５５番目の６ｂｐの塩基配列が欠失している。
【００４２】
したがって、波下線の設計部位に対応するプライマーセットを用いて、オオムギのゲノムＤＮＡを増幅すると、「ＯＵＨ６０２」では８４５ｂｐの、「コビンカタギ」では８１１ｂｐの、「Triumph」では４７３ｂｐの増幅断片が得られる。
【００４３】
また、図４から明らかなように、ＫＴ３（Ｋ）及びＫＴ３（Ｔ）において塩基配列が欠失している領域以外では、これらの３つの塩基配列は高い相同性を有する。相同性を有する領域では、ＫＴ３（Ｈ）を基準にすると、ＫＴ３（Ｈ）の３８４番目、３８７番目、４６０番目、４７０番目、４７１番目、５５４番目、６０６番目、６０８番目、６３１番目、６５４番目、７０３番目の塩基に一塩基多型が存在する。
【００４４】
ＫＴ３（Ｈ）の３８４番目のアデニン（Ａ）、３８７番目のアデニン（Ａ）、４６０番目のアデニン（Ａ）、４７０番目のシトシン（Ｃ）、４７１番目のグアニン（Ｇ）、５５４番目のチミン（Ｔ）に対しては、ＫＴ３（Ｋ）の３５０番目のグアニン（Ｇ）、３５３番目のグアニン（Ｇ）、４２６番目のチミン（Ｔ）、４３６番目のチミン（Ｔ）、４３７番目のチミン（Ｔ）、５２０番目のアデニン（Ａ）がそれぞれ一塩基多型を示す。
【００４５】
また、ＫＴ３（Ｈ）の６０６番目のチミン（Ｔ）、６０８番目のグアニン（Ｇ）、６３１番目のシトシン（Ｃ）、６５４番目のチミン（Ｔ）、７０３番目のアデニン（Ａ）に対しては、ＫＴ３（Ｋ）の５７２番目のシトシン（Ｃ）、５７４番目のシトシン（Ｃ）、５９７番目のチミン（Ｔ）、６２０番目のシトシン（Ｃ）、６６９番目のグアニン（Ｇ）と、ＫＴ３（Ｔ）の２３４番目のシトシン（Ｃ）、２３６番目のシトシン（Ｃ）、２５９番目のチミン（Ｔ）、２８２番目のチミン（Ｔ）、３３１番目のグアニン（Ｇ）とがそれぞれ一塩基多型を示す。
【００４６】
また、本発明の遺伝マーカーは、上記ＫＴ３をＳＣＡＲマーカー化した遺伝マーカーであってもよく、具体的な一例としてｓＫＴ３が挙げられる。ｓＫＴ３は、図４において、波下線で示されるプライマーセット（Ｅ０３Ｍ１９Ｆ１及びＥ０３Ｍ１９Ｒ１）、下線で示されるプライマーセット（Ｅ０３Ｍ１９Ｆ２及びＥ０３Ｍ１９Ｒ２）、下線で示されるプライマーセット（Ｅ０３ＫＦ２及びＥ０３Ｍ１９Ｒ２）のいずれかを用いて増幅される遺伝マーカーであればよい。
【００４７】
下線で示される設計部位に対応するプライマーセット（Ｅ０３Ｍ１９Ｆ２及びＥ０３Ｍ１９Ｒ２）を用いて増幅する場合、上記「ＯＵＨ６０２」では７４４ｂｐの、「コビンカタギ」では７１０ｂｐの、「Triumph」では３７２ｂｐの増幅断片が得られる。また、下線で示される設計部位に対応するプライマーセット（Ｅ０３ＫＦ２及びＥ０３Ｍ１９Ｒ２）を用いる場合、上記「ＯＵＨ６０２」と「コビンカタギ」では、ともに２７４ｂｐの増幅断片が得られるが、「Triumph」では増幅されない。図１０（ｂ）、図１１（ｃ）は、プライマーセット（Ｅ０３Ｍ１９Ｆ２及びＥ０３Ｍ１９Ｒ２）を用いて増幅すると、「コビンカタギ」では７１０ｂｐの、「Triumph」では３７２ｂｐの増幅断片を検出することができることを示している。図１０（ｂ）中Ｆ２個体のうち＊で示されているものは、ｎｎホモ接合体（裸性ホモ接合体）を示す。
【００４８】
＜４＞遺伝マーカー：ＫＴ７、ｓＫＴ７
ＫＴ７は、配列番号４に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる遺伝マーカーであって、皮裸性遺伝子の近傍に位置し、当該皮裸性遺伝子と連鎖する遺伝マーカーである。
【００４９】
具体的には、ＫＴ７は、図５に示すように、６４１ｂｐからなる遺伝マーカーであり、「コビンカタギ」でのみ増幅される優性ＡＦＬＰマーカーである。
【００５０】
また、本発明の遺伝マーカーは、上記ＫＴ７をＳＣＡＲマーカー化した遺伝マーカーであってもよく、具体的な一例としてはｓＫＴ７が挙げられる。ｓＫＴ７は、配列番号４に示される塩基配列のうち、１０１番目の塩基から５６７番目の塩基までの４６７ｂｐからなる塩基配列を有する遺伝マーカーであって、皮裸性遺伝子の近傍に位置し、当該皮裸性遺伝子と連鎖する遺伝マーカーである。図５では、ｓＫＴ７は、下線で示されるフォワードプライマー設計部位の最初の塩基からリバースプライマー設計部位の最後の塩基までの部分として示される。
【００５１】
ｓＫＴ７は、図１０（ｃ）、図１１（ｅ）に示されるように、ＫＴ７同様「コビンカタギ」でのみ増幅される優性マーカーである。図１０（ｃ）中Ｆ２個体のうち☆で示されているものはＮＮホモ接合体（皮性ホモ接合体）を示す。
【００５２】
＜５＞遺伝マーカー：ＫＴ９、ｓＫＴ９
ＫＴ９は、配列番号５に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる遺伝マーカーであって、皮裸性遺伝子の近傍に位置し、当該皮裸性遺伝子と連鎖する遺伝マーカーである。
【００５３】
具体的には、ＫＴ９は、図６に示すように、６５０ｂｐからなる遺伝マーカーであり、「Triumph」でのみ増幅される優性ＡＦＬＰマーカーである。
【００５４】
また、本発明の遺伝マーカーは、上記ＫＴ９をＳＣＡＲマーカー化した遺伝マーカーであってもよく、具体的な一例としてはｓＫＴ９が挙げられる。ｓＫＴ９は、配列番号５に示される塩基配列のうち、１番目の塩基から６０４番目の塩基までの６０４ｂｐからなる塩基配列を有する遺伝マーカーであって、皮裸性遺伝子の近傍に位置し、当該皮裸性遺伝子と連鎖する遺伝マーカーである。図６では、ｓＫＴ９は、下線で示されるフォワードプライマー設計部位の最初の塩基からリバースプライマー設計部位の最後の塩基までの部分として示される。
【００５５】
ｓＫＴ９は、図１１（ｆ）に示されるように、ＫＴ９同様「Triumph」でのみ増幅される優性マーカーである。
【００５６】
＜６＞遺伝マーカー：ＫＴ１４、ｓＫＴ１４
ＫＴ１４は、配列番号６に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる遺伝マーカーであって、皮裸性遺伝子の近傍に位置し、当該皮裸性遺伝子と連鎖する遺伝マーカーである。
【００５７】
具体的には、ＫＴ１４は、図７に示すように、６１２ｂｐからなる遺伝マーカーであり、「コビンカタギ」でのみ増幅される優性ＡＦＬＰマーカーである。
【００５８】
また、本発明の遺伝マーカーは、上記ＫＴ１４をＳＣＡＲマーカー化した遺伝マーカーであってもよく、具体的な一例としてｓＫＴ１４が挙げられる。ｓＫＴ１４は、配列番号６に示される塩基配列のうち、６５番目の塩基から６０７番目の塩基までの５４３ｂｐからなる塩基配列を有する遺伝マーカーであって、皮裸性遺伝子の近傍に位置し、当該皮裸性遺伝子と連鎖する遺伝マーカーである。図７では、ｓＫＴ１４は、下線で示されるフォワードプライマー設計部位の最初の塩基からリバースプライマー設計部位の最後の塩基までの部分として示される。
【００５９】
ｓＫＴ１４は、図１１（ｆ）に示されるように、ＫＴ１４同様「コビンカタギ」でのみ増幅される優性マーカーである。
【００６０】
また、本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１５、１６及び１７、配列番号１８及び１９、配列番号２０及び２１、又は、配列番号２２及び２３のいずれかに示されるプライマーセットを用いて増幅される、植物の皮裸性遺伝子に連鎖する遺伝マーカーを含む。このような遺伝マーカーは、植物のゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型として上記いずれかのプライマーセットを用いて増幅し、増幅ＤＮＡ断片として単離することができる。また、これにより、ＰＣＲのみで特定形質の有無が判別可能となる。
【００６１】
具体的には、これらのプライマーセットは、上記ＡＦＬＰマーカーをもとに、上記ＳＣＡＲマーカーを作成するために設計されたプライマーセットである。配列番号９及び１０に示されるプライマーセットは、図２の下線部に対応し、ｓＫＴ１の作成のために設計されたものであり、プライマーの長さはそれぞれ２０塩基である。また、配列番号１１及び１２に示されるプライマーセットは、図３の下線部に対応し、ｓＫＴ２の作成のために設計されたもので、配列番号１１に示されるプライマーは２１塩基からなり、配列番号１２に示されるプライマーは２６塩基からなる。
【００６２】
配列番号１３及び１４に示されるプライマーセットは、図４の波下線部に対応するＥ０３Ｍ１９Ｆ１及びＥ０３Ｍ１９Ｒ１に該当し、ｓＫＴ３の作成のために設計されたものである。Ｅ０３Ｍ１９Ｆ１は、２２塩基からなり、Ｅ０３Ｍ１９Ｒ１は、２５塩基からなる。
【００６３】
また、配列番号１５及び１６に示されるプライマーセットは、図４の下部に対応するＥ０３Ｍ１９Ｆ２及びＥ０３Ｍ１９Ｒ２に該当する。該プライマーセットは、ヘテロ接合体がなく純系に固定している場合、例えば、世界中の皮ムギと裸ムギの判別等に有効に用いることができる。Ｅ０３Ｍ１９Ｆ２及びＥ０３Ｍ１９Ｒ２は、ともに２０塩基からなる。
【００６４】
配列番号１５、１６及び１７に示されるプライマーセットは、それぞれ、図４の下線部に対応するＥ０３Ｍ１９Ｆ２、Ｅ０３Ｍ１９Ｒ２及びＥ０３ＫＦ２に該当する。これは、プライマーセットＥ０３Ｍ１９Ｆ２及びＥ０３Ｍ１９Ｒ２では、ヘテロ接合体の判別で、図１１（ｃ）に示されるように、７１０ｂｐからなる長い方の増幅産物の増えが悪く（アリールフェードアウト）、誤判定が起こる可能性があるために追加されたプライマーセットである。配列番号１５、１６及び１７に示されるプライマーセットを用いてオオムギの皮裸性の判別を行うと、「Triumph」では３７２ｐｂの増幅断片が、「コビンカタギ」では２７４ｂｐと７１０ｂｐの２種類の増幅断片が検出される。図１１（ｄ）は、配列番号１５、１６及び１７に示されるプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合の電気泳動像を示すが、ヘテロ接合体では、２７４ｂｐと３７２ｂｐの２本のバンドが認められ、ヘテロ接合体を含む試料の判別が可能となることが分かる。なお、「コビンカタギ」の７１０ｂｐからなる増幅断片は、２７４ｂｐからなる短い増幅断片が優先的に増幅されるため、はっきりとしたバンドとしては認められない。このように、配列番号１５、１６及び１７に示されるプライマーセットは、ヘテロ接合体を含む試料の判別、例えば、連鎖解析に好適に用いることができる。なお、プライマーＥ０３ＫＦ２は２０塩基からなる。
【００６５】
また、配列番号１８及び１９に示されるプライマーセットは、図５の下線部に対応し、ｓＫＴ７の作成のために設計されたものであり、ともに２０塩基からなる。配列番号２０及び２１に示されるプライマーセットは、図６の下線部に対応し、ｓＫＴ９の作成のために設計されたものであり、ともに２０塩基からなる。配列番号２２及び２３に示されるプライマーセットは、図７の下線部に対応し、ｓＫＴ１４の作成のために設計されたものである。配列番号２２に示すプライマーは、２３塩基からなり、配列番号２３に示すプライマーは２４塩基からなる。
【００６６】
また、上記プライマーは上記配列番号に示されるプライマーに限られるものではなく、上記配列番号に示される塩基配列やその一部の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーであってもよい。
【００６７】
増幅に際して鋳型として用いられるゲノムＤＮＡは、例えばオオムギでは、オオムギの植物体より従来公知の方法で抽出することができる。具体的には、植物体からゲノムＤＮＡを抽出するための一般的方法（Komatsuda et al.(1998)など）が好適な例として挙げられる。また、上記のゲノムＤＮＡは、根、茎、葉、生殖器官など、オオムギを構成するいずれの組織を用いても抽出可能である。また、場合によってはオオムギのカルスから抽出してもよい。なお、上記生殖器官には、花器官や種子も含まれる。ゲノムＤＮＡの抽出は、例えば、オオムギの芽生え期の葉を用いて行われる。これにより、組織の摩砕が比較的容易で、多糖類などの不純物の混合割合が比較的少ないだけでなく、種子から短期間で育成が可能である。
【００６８】
ゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーを用いて増幅する方法は、従来公知のＤＮＡ増幅法を採用することができる。一般には、ＰＣＲ法や、その改変法が用いられる。ＰＣＲ法やその改変法を用いる際の反応条件は特に限定されるものではなく、通常と同様の条件下で増幅することができる。
【００６９】
上記本発明にかかる遺伝マーカーは、オオムギ７Ｈ染色体における遺伝マーカーであることが好ましく、オオムギ７Ｈ染色体長腕における遺伝マーカーであることがより好ましい。上述したように、皮裸性遺伝子はオオムギ７Ｈ染色体長腕に位置するため、これにより、皮裸性遺伝子近傍の詳細な連鎖地図を作成することが可能となる。
【００７０】
また、本発明にかかる遺伝マーカーは、オオムギのゲノムＤＮＡに存在し、ＡＦＬＰ分析により選抜された、皮裸性遺伝子に連鎖する遺伝マーカーであって、オオムギ７Ｈ染色体長腕におけるオオムギの皮裸性遺伝子の位置から、それぞれ１．２ｃＭ、２．９ｃＭ、５．３ｃＭ末端部側のいずれかの位置に座乗する遺伝マーカーであってもよい。
【００７１】
これらの遺伝マーカーとしては、本発明者が見出したＡＦＬＰマーカーである、ＫＴ４、ＫＴ５、ＫＴ６が挙げられる。いずれの上記遺伝マーカーもオオムギ７Ｈ染色体に位置づけられる。ＫＴ４は皮裸性遺伝子から１．２ｃＭ末端部側の位置に、ＫＴ５は皮裸性遺伝子から２．９ｃＭ末端部側の位置に、ＫＴ６は皮裸性遺伝子から５．３ｃＭ末端部側の位置に座乗する。これらを用いることにより、皮裸性遺伝子近傍の詳細な連鎖地図を作成することが可能となる。
【００７２】
（２）本発明にかかる遺伝マーカーの利用
本発明にかかる遺伝マーカーの用途としては、交配、遺伝子のクローニング、細胞融合等において、目的とする遺伝子の所在を追跡するためのマーカーとして広く用いることができる。
【００７３】
また、本発明にかかる遺伝マーカーを用いる対象となる生物は特に限定されるものではないが、これら遺伝マーカーがオオムギ由来のものであるので、特に好ましい対象としては、オオムギ及びコムギ、イネ科植物を挙げることができる。もちろん、用途によってはイネ科植物以外の植物や場合によっては動物も対象とすることができる。
【００７４】
＜連鎖地図の作成＞
本発明にかかる遺伝マーカーは、それぞれ単独で上述した各種用途に用いることもできるが、特に、オオムギ染色体の連鎖地図の作成に用いるために、複数を組み合わせて遺伝マーカー群として用いることが好ましい。本発明にかかる遺伝マーカー群をマッピングして得られた連鎖地図は、染色体から目的とする遺伝子を特定する用途に好適に用いることができるが、本発明では、特に、皮裸性遺伝子の座乗位置を特定する用途に好適に用いることができる。
【００７５】
本発明にかかる遺伝マーカー群は、本発明にかかる遺伝マーカーを少なくとも１つ含んでいればよいが、さらに他のオオムギ７Ｈ染色体に位置づけられる遺伝マーカーを含んでいてもよい。
【００７６】
上記他のオオムギ７Ｈ染色体に位置づけられる遺伝マーカーとしては、染色体上で遺伝的な標識として用いることができるものであれば特に限定されないが、具体的には、例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ、Restriction Fragment Length Polymorphism）マーカーやマイクロサテライト（ＳＳＲ、Simple Sequence Repeat）マーカー、ＡＦＬＰマーカー、又は、ＲＡＰＤ（Ramdom Amplified polymorphic DNA）マーカー等を挙げることができる。
【００７７】
後述する（３）や実施例では、例えばオオムギの皮裸性遺伝子に連鎖するＡＦＬＰマーカー及び／又は上記ＳＣＡＲマーカーを用いて連鎖地図を作成している。このように多数の遺伝マーカーを用いることにより、従来は、マーカーの密度が低く、詳細な連鎖地図が得られなかった皮裸性遺伝子座近傍において、詳細な連鎖地図の作成が可能となる。しかしながら、本発明にかかる遺伝マーカーと、従来から知られているＲＦＬＰマーカーやＳＳＲマーカーとを組み合わせて遺伝マーカー群として用いれば、さらに詳細な連鎖地図を作成することができるので、その有用性はさらに一層向上する。
【００７８】
例えば、図８、図９に示すように、本発明にかかる遺伝マーカーと、ＡＦＬＰマーカー、ＳＳＲマーカー、ＲＦＬＰマーカー等とを、組み合わせてオオムギ７Ｈ染色体長腕における連鎖地図を作成することができる。以下に、本発明にかかる連鎖地図について説明する。
【００７９】
本発明にかかる連鎖地図は、本発明にかかる遺伝マーカーの少なくとも１つ、又はこれらに加えて、さらにオオムギの７Ｈ染色体に位置づけられる遺伝マーカーとを用いて作成されているオオムギ７Ｈ染色体の連鎖地図であればよい。また、本発明にかかる連鎖地図は、オオムギ７Ｈ染色体長腕の連鎖地図であることがより好ましい。
【００８０】
上記オオムギの７Ｈ染色体に位置づけられる遺伝マーカーとしては、従来から知られている遺伝マーカーが挙げられる。具体的には、例えば、図８に示すような、Ｂｍａｇ０１２０、Ｂｍａｇ０３４１、Ｂｍａｇ０５０７、ＥＢｍａｃ０７６４、ＥＢｍａｃ０７８５、ＣＤＯ６７３、ＭＷＧ２０３１、又はＲｉｓ１５等が挙げられる。本発明にかかる連鎖地図は、これらの従来公知の遺伝子マーカーを含んでいることが好ましいが、これらに限られるわけではなく、本発明の遺伝マーカーと併せて連鎖地図を作成することによって、より正確な連鎖地図が作成できる程度の従来の遺伝マーカーが用いられていればよい。例えば、上記従来のマーカーのうち、いずれか１つの遺伝マーカーを含んでいればより正確な連鎖地図が作成できる場合は、従来の遺伝マーカーは１つでよい。
【００８１】
また、後述する実施例に示すように、上記、ＫＴ１、ｓＫＴ１、ＫＴ２（ｓＫＴ２）、ＫＴ３、ｓＫＴ３、ＫＴ４、ＫＴ５、ＫＴ６、ＫＴ７、ｓＫＴ７、ｓＫＴ９、ｓＫＴ１４は、いずれも７Ｈ染色体長腕部に位置することが明らかになっている。図８（ｂ）に示すのは、従来知られていたオオムギ７Ｈ染色体長腕（Long arm side）の連鎖地図である。図８（ａ）及び図９に示される連鎖地図は本発明にかかる連鎖地図である。
【００８２】
本発明にかかる連鎖地図の一例である図８（ａ）に示される連鎖地図は、本発明にかかる遺伝マーカーであるＫＴ１、ｓＫＴ１、ＫＴ２、ＫＴ３、ＫＴ４、ＫＴ５、ＫＴ６、ＫＴ７に加えて、アンカーマーカーとしてＢｍａｇ０１２０、Ｂｍａｇ０３４１、Ｂｍａｇ０５０７、ＥＢｍａｃ０７６４、ＥＢｍａｃ０７８５、ＣＤＯ６７３、ＭＷＧ２０３１、及びＲｉｓ１５を用い、１５１個体からなるＦ２集団を供試して作成されたものである。図８に示すように、８個の遺伝マーカー、ＫＴ１、ｓＫＴ１、ＫＴ２、ＫＴ３、ＫＴ４、ＫＴ５、ＫＴ６、ＫＴ７のうちのＫＴ１、ｓＫＴ１を除く６個が、ＭＷＧ２０３１とＥＢｍａｃ０７６４の間にマッピングされる。皮裸性遺伝子座（図中「ｎｕｄ」と記載）は、ＫＴ３及びＫＴ７と共分離している。なお、共分離とは、複数の形質が遺伝的分離においてともに行動することをいう。この皮裸性遺伝子、ＫＴ３，ＫＴ７は、遺伝マーカーＫＴ２とＫＴ４の間に挟まれていて、遺伝マーカーＫＴ２は皮裸性遺伝子に最も近く、皮裸性遺伝子から動原体側に０．３ｃＭの位置に座乗している。また、ＫＴ４は、皮裸性遺伝子から末端部側に１．２ｃＭの位置に座乗している。また、ＫＴ１及びｓＫＴ１は皮裸性遺伝子から動原体側に５．０ｃＭの位置に座乗し、ＫＴ５、ＫＴ６は皮裸性遺伝子から末端部側にそれぞれ２．９ｃＭ、５．３ｃＭの位置に座乗している。
【００８３】
これまで公表されている連鎖地図には、図８（ｂ）に示される「Lina」×「Hordeum spontaneum」集団による連鎖地図（Ramsay et al.(2000) A simple sequence repeat-based linkage map of barley.Genetics 156:1997-2005）や形態マーカーによる連鎖地図（非特許文献２）等が挙げられる。このうち、ＳＳＲマーカーに基づく前者の連鎖地図と本発明の連鎖地図との比較が、アンカーマーカーの位置を比較することにより可能となる。Ｂｍａｇ０５０７とＥＢｍａｃ０７６４との間の距離は、前者の連鎖地図においては２．０ｃＭであるが、本発明の連鎖地図においては２５．９ｃＭと長くなっている。この一因として、従来の連鎖地図では、この皮裸性遺伝子の近傍に連鎖する遺伝マーカーがほとんどなかったことが考えられる。また、従来は皮裸性遺伝子を挟んでＭＷＧ２０３１とＥＢｍａｃ０７６４の間の領域は遺伝マーカーが１つもなかったが、この領域に、上記本発明の連鎖地図では、上述したように６個の本発明にかかる遺伝マーカーがマッピングされている。以上のように、本発明にかかる遺伝マーカーを用いることにより、従来の連鎖地図と比較して、１オーダー詳細な連鎖地図を作成することが可能となる。
【００８４】
また、本発明にかかる連鎖地図の一例である図９に示される連鎖地図は、本発明にかかる皮裸性遺伝子座近傍の遺伝マーカーであるｓＫＴ２、ｓＫＴ３、ｓＫＴ７、ｓＫＴ９、ｓＫＴ１４を用い、さらに多数（４５８個体）のＦ２個体を供試して、皮裸性遺伝子に近い領域の連鎖地図として作成されたものである。図９に示すように、５個のマーカーはすべて、皮裸性遺伝子（図中「Ｎｕｄ」と記載）を挟んで末端部側に３．５ｃＭの位置と、動原体側に０．３ｃＭの位置との間にマッピングされている。皮裸性遺伝子は、遺伝マーカーｓＫＴ３とｓＫＴ１４の間に挟まれていて、ｓＫＴ３は皮裸性遺伝子に最も近く、皮裸性遺伝子から動原体側に０．２ｃＭの位置に座乗している。また、ｓＫＴ１４は、皮裸性遺伝子から末端部側に３．５ｃＭの位置に座乗している。ｓＫＴ２は皮裸性遺伝子から動原体側に０．３ｃＭの位置に座乗している。また、ｓＫＴ７、ｓＫＴ９は、皮裸性遺伝子と共分離している。
【００８５】
なお、本発明にかかる連鎖地図の作成方法には、従来公知の方法が利用でき、特に限定されるものではない。例えば、計算ソフトを使った通常の方法が挙げられる（Lander et al.(1987)）。
【００８６】
また、本発明でいう「連鎖地図」とは、いわゆる遺伝子地図、遺伝地図、染色体地図とよばれるものをも含むものである。
【００８７】
＜皮裸性遺伝子の単離＞
上記のように、本発明にかかる遺伝マーカーや遺伝マーカー群を用いれば、皮裸性遺伝子を特定するための詳細な連鎖地図を作成することができるので、本発明には、上記遺伝マーカーや遺伝マーカー群を用いて、オオムギ染色体から皮裸性遺伝子の座乗位置を特定する工程を含む皮裸性遺伝子の単離方法が含まれる。
【００８８】
本発明の遺伝マーカーを用いて皮裸性遺伝子を単離する方法としては、本発明にかかる上記遺伝マーカーをプライマー又はプローブとして用いることにより皮裸性遺伝子を単離する方法であればよく、例えば、次のような方法を挙げることができる。
【００８９】
オオムギではゲノムＤＮＡのＢＡＣライブラリーが複数作成されている。そこで、このようなＢＡＣライブラリーを用いて、従来公知のマップベースクローニングの手法にしたがって、皮裸性遺伝子と連鎖する本発明の遺伝マーカーで当該マーカーを含むＢＡＣクローンを同定し、そこからＢＡＣのコンティグを作成して塩基配列を確定することにより、最終的な皮裸性遺伝子に到達することができる。
【００９０】
皮裸性の違いは登熟期に子房壁からの糊状物質の分泌の有無によって決まるとされるが、この詳しいメカニズムは不明である。皮裸性遺伝子の単離及び機能解析は、このメカニズムの解明に役立つだけでなく、裸ムギの起源や東アジアへの伝播過程の解明にもつながる。
【００９１】
また、得られた皮裸性遺伝子を含むＤＮＡ断片を、公知の方法により、アグロバクテリウム又はパーティクルガンを用いて植物やオオムギのゲノムＤＮＡに導入することによって、形質転換植物、形質転換オオムギを得ることも可能となる。裸性オオムギは上述したように東アジアでのみ食用に栽培されてきたが、最近北米では健康志向から、裸ムギへの関心が高まっている（Liu CT, Wesenberg DM, Hunt CW, Branen AL, Robertson LD, Burrup DE, Dempster KL, Haggerty RJ(1996)Hulles barley:a new look for barley in Idaho.Rsources for Idaho http://info.ag.uidaho.edu/)。また、裸ムギは血中コレステロールを低下させる作用のあるβ−グルカンを多量に含み、白米に混ぜて”麦飯”として消費されるなど健康食品として注目されている。従って、単離した皮裸性遺伝子を用いれば、上記遺伝子工学的手法で皮性の優良品種を食用に適した裸性に短期間で改変することが可能となる。
【００９２】
＜上記遺伝マーカーを用いた分析により得られる裸性オオムギに特徴的な塩基配列からなるポリヌクレオチド＞
本発明にかかる遺伝マーカーを用いて、世界各地の様々なオオムギ品種・系統を調査することにより、オオムギの皮裸性遺伝子座近傍の塩基配列の変異を調べることができる。この変異がオオムギの皮裸性に関する一定の品種・系統に特徴的である場合には、かかる塩基配列からなるポリヌクレオチドは、その品種・系統の判別に用いることが可能となる。
【００９３】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号２７に示される塩基配列における４０番目のアデニン（Ａ）、１０８番目のアデニン（Ａ）、１４９番目のチミン（Ｔ）、１９３番目のグアニン（Ｇ）、２２６番目のシトシン（Ｃ）、２８７番目のチミン（Ｔ）、２９８番目のアデニン（Ａ）、３６６番目のチミン（Ｔ）、４４５番目のチミン（Ｔ）のうち、少なくとも１つの一塩基多型を含み、かつ、当該一塩基多型の前後における２０以上の連続した塩基配列を含んでいる。
【００９４】
また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号２７に示される塩基配列において、１個又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列であり、当該塩基配列２７を基準として、４０番目のアデニン（Ａ）、１０８番目のアデニン（Ａ）、１４９番目のチミン（Ｔ）、１９３番目のグアニン（Ｇ）、２２６番目のシトシン（Ｃ）、２８７番目のチミン（Ｔ）、２９８番目のアデニン（Ａ）、３６６番目のチミン（Ｔ）、４４５番目のチミン（Ｔ）のうち、少なくとも１つの一塩基多型を含み、かつ、当該一塩基多型の前後における２０以上の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチドであってもよい。
【００９５】
上記ポリヌクレオチドは、オオムギ裸性栽培種に特徴的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである。かかるポリヌクレオチドは、皮性系統と裸性系統との判別に用いることができる。
【００９６】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号２７に示される塩基配列を基準として、４０番目のアデニン（Ａ）、１０８番目のアデニン（Ａ）、１４９番目のチミン（Ｔ）、１９３番目のグアニン（Ｇ）、２２６番目のシトシン（Ｃ）、２８７番目のチミン（Ｔ）、２９８番目のアデニン（Ａ）、３６６番目のチミン（Ｔ）、４４５番目のチミン（Ｔ）のうち、少なくとも１つの一塩基多型を含んでいればよい。したがって上記一塩基多型を、例えば、１つ以上含んでいてもよいし、２つ以上含んでいてもよいし、９つすべてを含んでいてもよい。中でも、上記ポリヌクレオチドは、配列番号２７に示される塩基配列を基準として、１０８番目のアデニン（Ａ）、４４５番目のチミン（Ｔ）のうち、少なくとも１つの一塩基多型を含んでいることがより好ましい。後述するように、上記２個の一塩基多型は、野生種、栽培種を問わず、裸性オオムギに特徴的な一塩基多型である。それゆえ、野生種及び栽培種を含む全てのオオムギにおける皮性系統と裸性系統との判別が可能となる。
【００９７】
また、上記ポリヌクレオチドは、上記少なくとも１つの一塩基多型を含み、かつ、当該一塩基多型の前後における２０以上の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチドであれば、その長さは特に限定されるものではない。したがって上記ポリヌクレオチドは、配列番号２７に示される塩基配列そのものであってもよい。また使用の方法によっては付加的な塩基配列を加えたものであってもよい。
【００９８】
具体的には、配列番号２７で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、図１２に示すように、４６７ｂｐからなるポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは、配列番号１８及び１９に示されるプライマーセットを用いて、オオムギ裸性栽培種のゲノムＤＮＡを増幅したものである。なお、上記プライマーセットはＡＦＬＰマーカーＫＴ７をＳＣＡＲマーカー化したｓＫＴ７を作成するために設計されたものである。
【００９９】
上記プライマーセットを用いて、オオムギ野生種、皮性栽培種及び裸性栽培種を含む２５９系統のゲノムＤＮＡを増幅したところ、約１３０系統において４６７ｂｐの増幅産物が生成した。このＰＣＲ増幅産物を、制限酵素を用いて分析することにより、３種類の対立遺伝子ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの存在が明らかとなった。また、増幅産物が得られないものはヌル対立遺伝子（Ｉ）とした。野生種では、対立遺伝子Ｉ〜ＩＶの全てがみられ、皮性栽培種では対立遺伝子Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのみがみられる。これに対して全ての裸性栽培種は対立遺伝子ＩＶを有していることがわかった。
【０１００】
さらに上記対立遺伝子ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶについて、塩基配列の変異を調べるために、オオムギの４１系統の塩基配列を決定した。表１０は上記増幅産物すなわちｓＫＴ７のハプロタイプをまとめたものである。表１０では、アフガニスタンで採取された系統（ＯＵＨ７４４、ハプロタイプＩＩａ）を基準として、塩基多型の部分のみを示している。図中アスタリスク（＊）で示されている塩基は、基準となるハプロタイプＩＩａの塩基と同一の塩基を示す。塩基多型は、４６７ｂｐ中の４１箇所で確認され、合計１２のハプロタイプＩＩａ〜ｅ、ＩＩＩａ及びＩＩＩｂ、ＩＶａ〜ｅが検出された。表１１は、塩基配列が決定された４１系統について、ハプロタイプ、皮裸性、条性、採取地域等の情報をまとめたものである。なお表中「wild」は野生種、「hulled domes.」は皮性栽培種、「naked domes.」は裸性栽培種を示す。
【０１０１】
【表１０】
2005040125.tif 000002
【０１０２】
【表１１】
2005040125.tif 000003
【０１０３】
対立遺伝子ＩＩについては、オオムギ６系統の塩基配列が決定され、５つのハプロタイプＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃ、ＩＩｄ、ＩＩｅの存在が明らかとなった。塩基多型は２０箇所で見つかっている。
【０１０４】
対立遺伝子ＩＩＩについては、オオムギ４系統の塩基配列が決定され、２つのハプロタイプが見つかった。この２つのハプロタイプＩＩＩａ、ＩＩＩｂは、１つの一塩基多型によってのみ異なっている。
【０１０５】
対立遺伝子ＩＶについては、３１系統の塩基配列が決定され、５つのハプロタイプＩＶａ、ＩＶｂ、ＩＶｃ、ＩＶｄ、ＩＶｅが存在することが明らかとなった。表１０に示すようにこれらの５つのハプロタイプは全て、対立遺伝子ＩＩ及びＩＩＩと比較して、この対立遺伝子ＩＶにのみ特徴的な７個の一塩基多型を、位置４０番目、１４９番目、１９３番目、２２６番目、２８７番目、２９８番目及び３６６番目に有している。対立遺伝子ＩＶが有するこれらの一塩基多型は、位置４０番目はアデニン（Ａ）、位置１４９番目はチミン（Ｔ）、位置１９３番目はグアニン（Ｇ）、位置２２６番目はシトシン（Ｃ）、位置２８７番目はチミン（Ｔ）、位置２９８番目はアデニン（Ａ）、位置３６６番目はチミン（Ｔ）となっている。これに対して、対立遺伝子ＩＩ、ＩＩＩでは、位置４０番目はシトシン（Ｃ）又はグアニン（Ｇ）、位置１４９番目はグアニン（Ｇ）、位置１９３番目はシトシン（Ｃ）、位置２２６番目はグアニン（Ｇ）、位置２８７番目はシトシン（Ｃ）、位置２９８番目はシトシン（Ｃ）、位置３６６番目はグアニン（Ｇ）となっている。なお、後述する図１３において、二重下線で示される塩基は上記７個の一塩基多型に対応している。
【０１０６】
さらに、対立遺伝子ＩＶの５つのハプロタイプＩＶａ〜ＩＶｅの中でも、ＩＶａは、皮性野生種の系統ＯＵＨ６２５で検出されており、この系統は調査した全ての系統の中で、裸性栽培種以外で対立遺伝子ＩＶを有する唯一の系統である。これに対して、他の４つのハプロタイプＩＶｂ〜ＩＶｅは、全て裸性栽培種に存在する。また、ハプロタイプＩＶａは、ハプロタイプＩＶｂ〜ＩＶｅと、５箇所で塩基配列が異なり、わずかに異なっている。このハプロタイプＩＶｂ〜ＩＶｅに特徴的な部分は、裸性栽培種に特徴的な部分であり、裸性オオムギの判別に用いることができる。表１０に示すように、上記４つのハプロタイプＩＶｂ〜ＩＶｅは全て、対立遺伝子ＩＩ及びＩＩＩと比較して、ハプロタイプＩＶｂ〜ＩＶｅにのみ特徴的な９個の一塩基多型を、位置４０番目、１０８番目、１４９番目、１９３番目、２２６番目、２８７番目、２９８番目、３６６番目及び４４５番目に有している。すなわち上記９個の一塩基多型は、対立遺伝子ＩＩ、ＩＩＩを有する野生種や皮性栽培種と比較して、裸性栽培種に特徴的な一塩基多型である。さらに、上記９個の一塩基多型の中で１０８番目、４４５番目に位置する２個の一塩基多型は、対立遺伝子ＩＩ、ＩＩＩ、及びハプロタイプＩＶａと比較して、ハプロタイプＩＶｂ〜ＩＶｅにのみ特徴的な一塩基多型である。すなわち上記２個の一塩基多型は、野生種及び栽培種の全てのオオムギにおいて、裸性オオムギに特徴的な一塩基多型である。４つのハプロタイプＩＶｂ〜ＩＶｅが有するこれらの一塩基多型は、位置４０番目はアデニン（Ａ）、位置１０８番目はアデニン（Ａ）、位置１４９番目はチミン（Ｔ）、位置１９３番目はグアニン（Ｇ）、位置２２６番目はシトシン（Ｃ）、位置２８７番目はチミン（Ｔ）、位置２９８番目はアデニン（Ａ）、位置３６６番目はチミン（Ｔ）、位置４４５番目はチミン（Ｔ）、となっている。これに対して、対立遺伝子ＩＩ、ＩＩＩでは、位置４０番目はシトシン（Ｃ）又はグアニン（Ｇ）、位置１０８番目はグアニン（Ｇ）、位置１４９番目はグアニン（Ｇ）、位置１９３番目はシトシン（Ｃ）、位置２２６番目はグアニン（Ｇ）、位置２８７番目はシトシン（Ｃ）、位置２９８番目はシトシン（Ｃ）、位置３６６番目はグアニン（Ｇ）、位置４４５番目はシトシン（Ｃ）となっている。なお、後述する図１２において、二重下線で示される塩基は上記９個の一塩基多型に対応している。
【０１０７】
配列番号２７で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、裸性栽培種で特徴的なハプロタイプＩＶｂ〜ＩＶｅを表している。図１２に示すようにハプロタイプＩＶｂ〜ＩＶｅは、互いに非常に似ており、最も頻度の高いＩＶｂと比較すると、ＩＶｃ、ＩＶｄ、ＩＶｅは、それぞれただ１つの一塩基多型でＩＶｂと異なっている。すなわちハプロタイプＩＶｂ〜ＩＶｅの中では、１４１番目、１８１番目、２４４番目の塩基に一塩基多型が存在する。配列番号２７では、１４１番目の塩基においてｙで示される一塩基多型は、ＩＶｂ、ＩＶｃ、ＩＶｄではシトシン（Ｃ）であり、ＩＶｅではチミン（Ｔ）である。また、１８１番目の塩基においてｋで示される一塩基多型は、ＩＶｂ、ＩＶｃ、ＩＶｅではチミン（Ｔ）であり、ＩＶｄではグアニン（Ｇ）である。また、２４４番目の塩基において、ｒで示される一塩基多型は、ＩＶｂ、ＩＶｄ、ＩＶｅではグアニン（Ｇ）であり、ＩＶｃではアデニン（Ａ）である。すなわち１４１番目のチミン（Ｔ）はＩＶｅに特徴的な一塩基多型であり、１８１番目のグアニン（Ｇ）はＩＶｄに特徴的な一塩基多型であり、２４４番目のアデニン（Ａ）はＩＶｃに特徴的な一塩基多型である。なお、ハプロタイプＩＶｂ、ＩＶｃ、ＩＶｄ、ＩＶｅの塩基配列をそれぞれ配列番号２９、３０、３１，３２に示す。また、図１２中アスタリスク（＊）で示されている塩基は、ＩＶｂの塩基と同一の塩基を示す。
【０１０８】
また、配列番号２８は、上記ハプロタイプＩＶｂ〜ＩＶｅに加えてＩＶａを含む対立遺伝子ＩＶの塩基配列をまとめて示している。調査した野生種のうち単一の系統で検出されたハプロタイプＩＶａは、図１３に示すように、裸性栽培種で検出されたＩＶｂ〜ＩＶｅの４つのハプロタイプとは５箇所で塩基が異なっている。すなわち、配列番号２８ではｒで示す１０８番目の塩基は、ＩＶｂ〜ＩＶｅではアデニン（Ａ）であり、ＩＶａではグアニン（Ｇ）である。また配列番号２８ではｙで示す２１１番目の塩基は、ＩＶｂ〜ＩＶｅではシトシン（Ｃ）であり、ＩＶａではチミン（Ｔ）である。また、配列番号２８ではｒで示す２３９番目の塩基は、ＩＶｂ〜ＩＶｅではグアニン（Ｇ）であり、ＩＶａではアデニン（Ａ）である。また、配列番号２８ではｒで示す２７２番目の塩基は、ＩＶｂ〜ＩＶｅではグアニン（Ｇ）であり、ＩＶａではアデニン（Ａ）である。また、配列番号２８ではｙで示す４４５番目の塩基は、ＩＶｂ〜ＩＶｅではチミン（Ｔ）であり、ＩＶａではシトシン（Ｃ）である。
【０１０９】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号２７に示される塩基配列に限られず、これらにおいて１個又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列から、上記９個の一塩基多型を少なくとも１つ含み、２０以上の連続した塩基配列を含むものであってもよい。１個又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列とは、上記少なくとも１つの一塩基多型は含むが、品種や系統によって塩基の一部が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたものいう。この例としては、例えば図１２に示すハプロタイプにみられるように、裸性のオオムギに特徴的な対立遺伝子ＩＶの中でも、系統によって一部の塩基に多型が見られるようなものを挙げることができる。
【０１１０】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号２７に示される塩基配列における１４１番目のチミン（Ｔ）、１８１番目のグアニン（Ｇ）、２４４番目のアデニン（Ａ）のうち、少なくとも１つの一塩基多型を含み、かつ、当該一塩基多型の前後における２０以上の連続した塩基配列を含んでいるものであってもよい。
【０１１１】
また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号２７に示される塩基配列において、１個又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列であり、当該塩基配列２７を基準として、１４１番目のチミン（Ｃ）、１８１番目のグアニン（Ｇ）、２４４番目のアデニン（Ａ）のうち、少なくとも１つの一塩基多型を含み、かつ、当該一塩基多型の前後における２０以上の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチドであってもよい。
【０１１２】
上記ポリヌクレオチドは、オオムギ裸性栽培種のハプロタイプＩＶｂ〜ＩＶｅのいずれかに特徴的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである。かかるポリヌクレオチドは、裸性栽培種の中での品種の分類、産地の特定に用いることができる。例えば、チベットを除く中国、韓国、日本を産地とするオオムギ栽培種は、ハプロタイプＩＶｃを有している。それゆえ、上記ポリヌクレオチドの中で、ＩＶｃに特徴的な一塩基多型を含む上記ポリヌクレオチドは、上記地域を産地とする裸性オオムギと、上記以外の地域を産地とする裸性オオムギとの判別に用いることができる。
【０１１３】
上述したように、裸性栽培種で特徴的なハプロタイプＩＶｂ〜ＩＶｅの中では、１４１番目の塩基がチミン（Ｔ）であることは、ＩＶｅに特徴的である。したがって、上記ポリヌクレオチドは、配列番号２７に示される塩基配列における１４１番目のチミン（Ｔ）を一塩基多型として含み、かつ、当該一塩基多型の前後における２０以上の連続した塩基配列を含んでいるものであってもよい。これにより、裸性栽培種の中でハプロタイプＩＶｅを有する品種を判別することが可能となる。
【０１１４】
また、上述したように、裸性栽培種で特徴的なハプロタイプＩＶｂ〜ＩＶｅの中では、１８１番目の塩基がグアニン（Ｇ）であることは、ＩＶｄに特徴的である。したがって、上記ポリヌクレオチドは、配列番号２７に示される塩基配列における１８１番目のグアニン（Ｇ）を一塩基多型として含み、かつ、当該一塩基多型の前後における２０以上の連続した塩基配列を含んでいるものであってもよい。これにより、裸性栽培種の中でハプロタイプＩＶｄを有する品種を判別することが可能となる。
【０１１５】
さらに、上述したように、裸性栽培種で特徴的なハプロタイプＩＶｂ〜ＩＶｅの中では、２４４番目の塩基がアデニン（Ａ）であることは、ＩＶｃに特徴的である。したがって、上記ポリヌクレオチドは、配列番号２７に示される塩基配列における２４４番目のアデニン（Ａ）を一塩基多型として含み、かつ、当該一塩基多型の前後における２０以上の連続した塩基配列を含んでいるものであってもよい。これにより、裸性栽培種の中でハプロタイプＩＶｃを有する品種を判別することが可能となる。
【０１１６】
また、上記ポリヌクレオチドは、上記少なくとも１つの一塩基多型を含み、かつ、当該一塩基多型の前後における２０以上の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチドであれば、その長さは特に限定されるものではない。したがって上記ポリヌクレオチドは、配列番号２７に示される塩基配列そのものであってもよい。また使用の方法によっては付加的な塩基配列を加えたものであってもよい。
【０１１７】
また、上記ポリヌクレオチドは、配列番号２７に示される塩基配列に限られず、これらにおいて１個又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列から、上記３個の一塩基多型を少なくとも１つ含み、２０以上の連続した塩基配列を含むものであってもよい。
【０１１８】
以上のことから、上記一塩基多型を含むポリペプチドは、裸性と皮性に関する品種や系統・産地の検定や同定に利用することができる。これにより、オオムギの品種改良を効果的に行うことができる。
【０１１９】
＜皮裸性又は産地の判別＞
本発明にかかる皮裸性の判別方法は、上記いずれかの遺伝マーカー又は裸性栽培種に特徴的な９個の一塩基多型のうち少なくとも１つの一塩基多型を含む上記ポリヌクレオチドを少なくとも１つ指標として、植物の皮裸性を判別する方法であればよく、その他の工程、条件、材料等は特に限定されるものではない。
【０１２０】
また、本発明にかかる裸性オオムギの産地を判別する方法は、ハプロタイプＩＶｂ〜ＩＶｅのいずれかに特徴的な一塩基多型を含む上記ポリヌクレオチドを少なくとも１つ指標として、植物の皮裸性を判別する方法であればよく、その他の工程、条件、材料等は特に限定されるものではない。
【０１２１】
本発明にかかる判別の具体的方法としては、植物育種における従来公知の手法が利用でき、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、交配等により作出した植物のゲノムＤＮＡを抽出し、本発明にかかる遺伝マーカーの有無、増幅断片長、又は増幅断片を制限酵素消化後の断片長等を指標として植物を選抜する方法が挙げられる。なお、上記遺伝マーカーを検出する手段としては、例えば、上記遺伝マーカーの一部の配列を固定化させたＤＮＡチップを用いる方法、又は上記遺伝マーカーの一部の配列をプライマーとするＰＣＲにより上記遺伝マーカーを増幅させる方法等の従来公知の方法が利用でき、特に限定されるものではない。
【０１２２】
これにより、例えば、皮ムギと裸ムギの交雑組み合わせにおいて幼植物段階で皮裸性の判定を可能にし、育種の効率化に貢献できる。通常は、皮裸性は種子が稔る最終段階にならないと判定できないので、遺伝マーカーで種子や幼植物の段階で皮裸性を判定できる意義は大きい。
【０１２３】
さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１２４】
（３）本発明にかかる遺伝マーカーの作成方法
本発明にかかる遺伝マーカーは、後述する実施例で詳細に説明するように、裸性品種「コビンカタギ」と皮性品種の「Triumph」のＦ２集団から抽出されたＤＮＡのバルクを作成し、ＡＦＬＰ分析で皮裸性遺伝子と連鎖するＡＦＬＰマーカーを選抜し、ＳＣＡＲ化することにより作成している。
【０１２５】
具体的には、ＡＦＬＰ分析で、２７４２とおりのプライマーセットにつき、両親とＦ２集団のホモ接合体との間での多型を調査し、皮裸性遺伝子に連鎖するＡＦＬＰマーカーを選び出す。選び出したＡＦＬＰマーカーをもととなる塩基配列として、ＳＣＡＲマーカーのプライマーを設計する。
【０１２６】
もちろん本発明にかかる遺伝マーカーの作成方法はこれに限定されるものではなく、公知の他の方法を用いて作成してもよい。すなわち、本発明では、前述した遺伝マーカーやこれを含む遺伝マーカー群を作成できるような方法であれば、どのような方法を採用してもよい。
【実施例】
【０１２７】
以下の実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１２８】
〔実施例１：遺伝マーカーの作成〕
（ｉ）植物材料
「コビンカタギ」と「Triumph」、「コビンカタギ」と「Triumph」を交配して得られたＦ２集団を用いた。「コビンカタギ」は日本の六条オオムギの裸性栽培種であり、「Triumph」はヨーロッパの二条オオムギの皮性栽培種である。皮性のＦ２個体の遺伝子型は、約２０個体からなるＦ３系統を用いた後代検定により決定された。
【０１２９】
（ｉｉ）ＤＮＡ抽出
テンプレートＤＮＡは両親とＦ２集団から、Komatsuda et al(Komatsuda T,Nakamura I,Takaiwa F,Oka S(1998)Development of STS markers closely linked to the vrs1 locus in barley,Hordeum vulgare.Genome 41:680-685)の方法にしたがって抽出した。
【０１３０】
（ｉｉｉ）バルクセグレガント分析（bulked segregant analisis)
オオムギ皮裸性遺伝子に密接に連鎖したＡＦＬＰマーカーを開発するために、ＨＥＧＳ／ＡＦＬＰ分析システムを用いてバルクセグレガント分析（Michelmore RW,Paran I,Kesseli RV,(1991)Identification of markers linked to disease resistance genes by bulked segregant analysis:a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations.Proc Natl Acad Sci USA 88:9828-9832)を行った。すなわち、裸性品種「コビンカタギ」と皮性品種「Triumph」の交配に由来するＦ２集団で、裸性と皮性のホモ接合体のバルクＤＮＡをそれぞれ作成し、バルクＤＮＡ及び両親のＤＮＡを用いて、ＨＥＧＳ／ＡＦＬＰ分析を行った。
【０１３１】
１次スクリーニングには、それぞれの遺伝子型のＦ２ホモ接合体の８個体からそれぞれ同量のＤＮＡをとって、皮性（ＮＮ）バルク、裸性（ｎｎ）バルクとしたものを供した。このスクリーニングでは、合計２７４２のプライマーセットを調査した。
【０１３２】
２次スクリーニングには、それぞれの遺伝子型のＦ２ホモ接合体の４個体から、それぞれ同量のＤＮＡをとったものを１セットとし、３セットのＮＮバルクとｎｎバルクとしたものを供した。すなわち、Ｆ２皮性ホモ接合体及びＦ２裸性ホモ接合体それぞれ１２個体から、ＮＮバルク３個とｎｎバルク３個の合計６個のバルクを作成した。上記Ｆ２ホモ接合体の２４個体に加え、他のＦ２皮性ホモ接合体の２個体も供した。
【０１３３】
以下、ＨＥＧＳ／ＡＦＬＰ分析についてさらに詳細に説明する。
【０１３４】
（ｉｖ）ＨＥＧＳ／ＡＦＬＰ分析
ＡＦＬＰ分析は、高効率で電気泳動を行うために、ＨＥＧＳ（高効率遺伝子スキャンニング）電気泳動システム（Kawasaki and Murakami 2000;Kawasaki et al.2000)(Kawasaki S,Murakami Y,Imaizumi H,Shimizu A,Mikami I(in press)High Efficiency Genome Scanning(HEGS) and its application to genome analyses of Lotus japonicus and other crops-Construction of high-density map, genome library, and saturation mapping of nodulation genes in Brassicas and Legumes.In:Nagata Y and Tabata S (eds) From Genome Structure to Breeding. Springer-Verlag)と組み合わた。ＨＥＧＳ電気泳動システムは、２セットの２４．５×２６．５ｃｍのガラスプレートを備えた電気泳動装置であって、それぞれのセットは１００レーンにゲルが入っているものを用いた。この、ＨＥＧＳ電気泳動システムは、１回に２００サンプルの分析が可能である。また、ゲルの厚みが厚い（１ｍｍ）ため、ゲルが扱いやすく、バンドも検出されやすいという長所を有している。
【０１３５】
ＡＦＬＰ分析はVos et al.(Vos,P.,Hogers,R.,Bleeker,M.,Reijans,M.,Lee,TVD.,Hornes,M.,Frijters,A.,Pot,J.,Peleman,J.,Kuiper,M.,Zabeau,M.(1995)AFLP:a new technique for DNA fingerprinting,Nucleic Acid Res 23:4407-4414)の方法に従った。まず、上記ＤＮＡ試料をＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩの２つの制限酵素で２重消化した。生じた制限酵素断片に対して、制限酵素の粘着末端に特異的に結合するアダプタをライゲーションした。上記アダプタとしては、ＥｃｏＲＩによる粘着末端にライゲーションするＥ側アダプタと、ＭｓｅＩによる粘着末端にライゲーションするＭ側アダプタとを用いた。次に、上記アダプタに相補的なプライマーを用いて１次増幅（pre-amplification)を行い、１次増幅産物を得た。
【０１３６】
続いて、この一次増幅産物を鋳型とし、上記アダプタに相補的なプライマーであるＥ又はＭの３’末端に３個の選択ヌクレオチドを付加したプライマーセットを用いて、２次増幅（selective-amplification)を行い、２次増幅物であるＡＦＬＰ断片を得た。
【０１３７】
得られたＡＦＬＰ断片を電気泳動により分離した。電気泳動は１３％非変性ポリアクリルアミドゲル上で行い、Vistra Green(アマルシャム  ファルマシア  バイオテック社）で染色後可視化した。ゲル像をＦＭＢＩＯ II Multi-View(日立製作所製）で走査した。
【０１３８】
（ｖ）ＡＦＬＰマーカーの開発
ＨＥＧＳ／ＡＦＬＰ分析システムを用いたバルクセグレガント分析の結果、オオムギの大きなゲノムサイズは問題とならず、１レーンにつき約３５のバンドが検出された。２７４２のプライマーセットについてバルク間及び両親の間で多型を示すバンドをスクリーニングした。１次的なスクリーニングで選ばれたプライマーセットについて、それぞれ３個のＮＮバルクとｎｎバルクを用いた２次スクリーニングを行い、３個のバルクＮＮと３個のｎｎで揃って多型が認められたプライマーセットを、皮裸性遺伝子に連鎖するＡＦＬＰマーカーを与えるプライマーセットの候補とした。
【０１３９】
以上のように候補として選ばれたプライマーセットについてさらに、上記６個のバルクを作成した２４個体のＦ２集団と、さらにＦ２集団からの皮性ホモの２個体とを用いて分析した。このようにして合計１２のＡＦＬＰマーカーが選択された。これらのＡＦＬＰマーカーのうち、８個が優性で、４個が共優性であった。８個の優性マーカーのうち、６個が皮性の両親「Triumph」、２個が裸性の両親「コビンカタギ」に由来するものであった。これらの１２個のＡＦＬＰマーカーのうち、判別容易なマーカーを７個選択し、ＫＴ１、ＫＴ２、ＫＴ３、ＫＴ４、ＫＴ５、ＫＴ６、ＫＴ７と名づけた。また、同様にして、さらに２個のＡＦＬＰマーカーＫＴ９及びＫＴ１４を開発した。
【０１４０】
以下の表１に上記ＡＦＬＰマーカーについて、用いられたプライマーセット、マーカータイプ、ＡＦＬＰ断片長を示す。なお、表１中＊は塩基配列解析により決定されたＡＦＬＰ断片長を示す。また、「Ｔ」は「Triumph」由来、「Ｋ」は「コビンカタギ」由来であることを示す。ＫＴ１、ＫＴ２では、塩基配列解析の結果、Ｋ、Ｔそれぞれに由来するＡＦＬＰ断片長は同じであったが、１３％非変性ポリアクリルアミドゲル上では、両ＡＦＬＰ断片の立体構造の違いによって電気泳動像に差が見られた。表中プライマーを表す「Ｅ」は上記Ｅ側アダプタに相補的なプライマーを、「Ｍ」は上記Ｍ側アダプタに相補的なプライマーを示す。
【０１４１】
【表１】
2005040125.tif 000004
【０１４２】
なお、ＫＴ３は表１では、「Triumph」でのみ増幅される優性マーカーとされているが、塩基配列決定により中心領域に約３００ｂｐの塩基配列が挿入された対立遺伝子が同定され、共優性マーカーであることが明らかとなった。
【０１４３】
図１は、Ｆ２のバルクと個体とを用いた皮裸性遺伝子に連鎖するマーカーのＨＥＧＳ／ＡＦＬＰ分析の結果得られた電気泳動後のゲル像を示す。図１（ａ）には、皮性の両親「Triumph」（図中Ｔと記載）、裸性の両親「コビンカタギ」（図中Ｋと記載）、皮性のホモ接合体のＦ２個体から作成したバルク（図中ＮＢ１、２、３と記載）、裸性のホモ接合体のＦ２個体から作成したバルク（図中ｎＢ１、２、３と記載）の電気泳動像が示されている。図中Ｍはサイズマーカーφｘ１７４ＨａｅIII digestを示す。皮性と裸性との間で多型が認められたバンドが、図中矢印で示されている。なお、矢印で示されているのは、ＫＴ３の電気泳動像である。図１（ｂ）には、Ｆ２のホモ接合体の個体を用いたＫＴ３の電気泳動像が示されている。
【０１４４】
（ｖｉ）ＡＦＬＰマーカーの塩基配列決定
上記ＡＦＬＰ断片は、電気泳動後の１ｍｍの厚さのポリアクリルアミドゲルから直接切り取られた。ＡＦＬＰ断片は切り取られたゲルの部分から透析膜（和光純薬工業）を用いて溶出し、対応する選択的なプライマーを用いて再増幅した。ＰＣＲは、９４℃で４分間プレヒートを行った後に、９４℃で１分間変性し、５６℃で１分間アニールし、７２℃で１．２分間伸長する、というサイクルを３サイクル繰り返し、最後に７２℃で７分間伸長して、４℃で保存するという条件を用いた。得られたＰＣＲ産物を２％のアガロースゲル上で電気泳動した。アガロースゲルからバンドを切り取り、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社）を用いてクローニングした。コロニーをスクリーニングするために、１０〜２０の白いコロニーについて、対応する選択的なプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を４種類の制限酵素で消化し、２％のアガロースゲル上で分離した。大多数のバンドパターンを示すコロニーを選び塩基配列を決定した。
【０１４５】
（ｖｉｉ）ＡＦＬＰマーカーのＳＣＡＲマーカー化
得られたＡＦＬＰ断片の塩基配列からアダプタの塩基配列を除外した塩基配列に基づき、ＳＣＡＲマーカーのプライマーを設計した。プライマーの設計には、ソフトウェアPrimer 3(Whitehead Institute,Cambridge,Mass.)を用いた。
【０１４６】
以下の表２に、作成されたＳＣＡＲマーカーのマーカータイプ、プライマー、ＰＣＲ産物長を、表３に、制限酵素、制限酵素処理後ＰＣＲ産物長、ＰＣＲ反応組成液、ＰＣＲプログラムを示す。表３のｓＫＴ３の上段は、表２に示すプライマーセットＡ、下段は同様に表２に示すプライマーセットＢのものを示す。表２及び３において、「Ｔ］は「Triumph」由来、「Ｋ」は「コビンカタギ」由来であることを示す。また、表３中、「制限酵素」はＰＣＲ産物を制限酵素で処理し配列内の多型を検出する方法（ＣＡＰＳ(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）法）に用いられる制限酵素を示す。これは上述したように、ｓＫＴ１ではＨｉｎｆＩ、ｓＫＴ２ではＨａｅIIIである。また、表３に示されるＰＣＲ反応液組成の内容は表４及び表５に、ＰＣＲプログラムの内容は表６に示す。これらの組成及びプログラムは、マッピングや品種調査に好適に用いられる。なお、表６中ｘで示されるアニーリング温度は遺伝マーカーによって異なり、表３に示されている。
【０１４７】
【表２】
2005040125.tif 000005
【０１４８】
【表３】
2005040125.tif 000006
【０１４９】
【表４】
2005040125.tif 000007
【０１５０】
【表５】
2005040125.tif 000008
【０１５１】
【表６】
2005040125.tif 000009
【０１５２】
〔実施例２：遺伝マーカーのマッピング〕
（ｉ）植物材料
遺伝マーカーのマッピングには、「コビンカタギ」と「Triumph」を交配して得られた１５１個体のＦ２集団を供した。
【０１５３】
（ｉｉ）遺伝マーカーのマッピング
バルクセグレガント分析により選抜された７個のＡＦＬＰマーカーＫＴ１、ＫＴ２、ＫＴ３、ＫＴ４、ＫＴ５、ＫＴ６、ＫＴ７及びＳＣＡＲマーカーｓＫＴ１を、Ｆ２の１５１個体を用いた連鎖解析に使用した。この解析も、ＨＥＧＳシステムを用いて行った。上記８個のＡＦＬＰマーカー又はＳＣＡＲマーカーにアンカーマーカー８個を加えて、計１６個の遺伝マーカーを用いて連鎖解析を行った。
【０１５４】
アンカーマーカーとして用いたのは、５個のマイクロサテライトマーカー（ＳＳＲ）と、３個の増幅切断多型配列（ＣＡＰＳ：Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)又は配列タグ部位（ＳＴＳ：Sequence Tagg Site）であった。
【０１５５】
５個のＳＳＲマーカーとしては、Ｂｍａｇ０１２０、Ｂｍａｇ０３４１、Ｂｍａｇ０５０７、ＥＢｍａｃ０７６４、ＥＢｍａｃ０７８５(Ramsey L,Macaulay M,degli Ivanissevich S,MacLean K,Cardle L,Fuller J,Edwards KJ,Tuvesson S,Morgante M,Massari A,Marmiroli N,Sjakste T,Ganal M,Powell W,Waugh R(2000) A simple sequence repeat-based linkage map of barley.Genetics 156:1997-2005)を用いた。
【０１５６】
また、３個のＣＡＰＳ又はＳＴＳマーカーとしては、ＲＦＬＰマーカーＣＤＯ６７３(Heun M,Kennedy AE,Anderson JA,Lapitan NLV,Sollells ME,Tanksley SD(1991)Construction of a restriction fragment length polymorphism map for barley(Hordeum vulgare).Genome 34:437-447)、ＭＷＧ２０３１及びＲｉｓ１５(Kuenzel G,Korzun L,Meister A(2000)Cytologically integrated physical restriction fragment length polymorphism maps for the barley genome based on translocation breakpoints.Genome 154:397-412)に基づくものを用いた。上記のマーカーはいずれも７Ｈ染色体にマップされている。
【０１５７】
ＲＦＬＰプローブの配列はGrain Genes データベースから得た。ＣＤＯ６７３に基づき、ＰＣＲプライマー 5'-CTCACGCTTAAGCTCTCGCT-3'（配列番号２４）及び 5'-CGAGAGGATCCAGTTCTTG-3'（配列番号２５）を設計した。ＭＷＧ２０３１には、発明者のリバースプライマー 5'-TACGTCGGCATAATTGGCA-3'（配列番号２６）をフォワードプライマーＭＷＧ２０３１Ｔ７（Sayed-Tabatabaei BE,Komatsuda T,Takaiwa F,Graner A(1998)DNA sequencing and primer designing for RFLP clones evenly distributed in the barley genome.Barley Genet Newslett 28:15-18)）と組み合わせた。Ｒｉｓ１５に対応するものとしてはKuenzel et al.(2000)によって発表されたＰＣＲプライマーを用いた。ＣＤＯ６７３及びＭＷＧ２０３１のＰＣＲ産物は、多型を検出するために、Ｔｓｐ５０９ＩとＭｗｏＩとでそれぞれ消化された。Ｒｉｓ１５のＰＣＲ産物では、多型は消化されることなく検出された。
【０１５８】
組み換え価は、コンピュータソフトＭＡＰＭＡＫＥＲ Version 2.0(Lander ES,Green P,Abrahamson J,Barlow A,Daly MJ,Lincoln SE,Newburg L(1987)MAPMAKER:an interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations.Gemomics 1:174-181)を用いて計算し、連鎖地図を３．０より大きいロッドスコアに基づいて作成した。地図距離は、Kosambi function(Kosambi DD,(1944)The estimation of map distance from recombination values.Ann Eugen 12:172-175)を用いて計算した。その結果を図８に示す。なお、その詳細な内容については、前記実施の形態にて説明したので省略する。
【０１５９】
〔実施例３：遺伝マーカーのマッピング〕
（ｉ）植物材料
遺伝マーカーのマッピングには、「コビンカタギ」と「Triumph」を交配して得られた４５８個体のＦ２集団を供した。
【０１６０】
（ｉｉ）遺伝マーカーのマッピング
上記ＳＣＡＲマーカーのうち、皮裸性遺伝子近傍の５マーカーｓＫＴ２、ｓＫＴ３、ｓＫＴ７、ｓＫＴ９、ｓＫＴ１４を、Ｆ２の４５８個体を用いた連鎖解析に使用した。この解析も、ＨＥＧＳシステムを用いて行った。なお、ｓＫＴ３では、プライマーセットＥ０３Ｍ１９Ｆ２、Ｅ０３ＫＦ２、Ｅ０３Ｍ１９Ｒ２を用いた。連鎖地図の作成方法は上記〔実施例２〕と同様であり、その結果は図９に示す。なお、その詳細な内容については、前記実施の形態にて説明したので省略する。
【０１６１】
なお、マッピングに用いられた皮裸性遺伝子及び全ての遺伝マーカーにおいて分離の歪みは検出されなかった。
【０１６２】
〔実施例４：ｓＫＴ３を用いた世界各地のオオムギ品種・系統の調査〕
プライマーセットＥ０３Ｍ１９Ｆ２、Ｅ０３Ｍ１９Ｒ２と、世界各地のオオムギ皮性栽培種（１０６系統）、裸性栽培種（１００系統）と野生種（４７系統）から抽出したＤＮＡとを用い、表４の反応液組成２、表６のＰＣＲプログラムＢ（アニーリング温度５８℃）に示す条件でＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物を１．５％アガロースで電気泳動することにより検出された対立遺伝子Ａ（コビンカタギ型）、対立遺伝子Ｂ（Triumph型）、対立遺伝子Ｃ（野生オオムギＯＵＨ６０２型）をそれぞれの系統が採取された地域ごとにまとめた。なお、調査したオオムギ系統の場合は、純系で遺伝的に安定しているため、ヘテロ接合体はない。表７に世界各地のオオムギ系統のｓＫＴ３に関する遺伝子型をまとめたものを示す。
【０１６３】
【表７】
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【０１６４】
〔実施例５：本発明にかかる遺伝マーカーを用いた裸性に特徴的な塩基配列の探索＞
（ｉ）植物材料
すべてが皮性である５３系統の野生種と、２０６系統の栽培種（うち１０６系統が皮性栽培種、１００系統が裸性栽培種）とを用いた。用いたオオムギの系統を表９に示す。これらの系統は、オオムギの遺伝的多様性を代表するように選んだ。野生種では、４１系統が二条（H.vulgare subsp. spontaneum)、１２系統が六条（subsp.agriocrithon）であった。六条の野生種はこれまでのところsubsp. spontaneumと六条栽培種との交雑産物であると考えられているが（Zohary 1963,Bothmer et al.1995)、本実施例では「野生種」として扱っている。栽培種の系統は殆どが在来種であり、３５系統が二条、残りの１７１系統が六条である。６系統を除く全てのオオムギ遺伝資源は岡山大学、資源生物科学研究所大麦野生植物資源研究センターから、６系統は四国農業試験場から入手した。
【０１６５】
【表９】
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【０１６６】
（ｉｉ）ＰＣＲによる増幅
ｓＫＴ７は、上述したように、ＡＦＬＰマーカーＫＴ７をＳＣＡＲマーカー化したもの
であり、「コビンカタギ」でのみ増幅される優性マーカーである。上述したオオムギの２５９系統全てについて、ｓＫＴ７をＰＣＲ増幅産物として与えるプライマーセット（配列番号１８及び１９に示されるプライマーセット）を用いて、増幅産物の有無、多型性を調査した。テンプレートＤＮＡは、上記のそれぞれの系統につき単一の植物の若い葉から、Komatsuda et al.(1998)の方法にしたがって抽出した。
【０１６７】
ＰＣＲは、配列番号１８及び１９に示すプライマーセットを用いて、表４の反応液組成２、以下に示す表８に示す条件で行った。
【０１６８】
【表８】
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【０１６９】
調査した２５９系統のうち、１３３系統において約４７０ｂｐの増幅産物が生成した。残りの１２６系統では増幅産物は生成せず、ヌル対立遺伝子を有すると考えられる。このようなヌル対立遺伝子を有する系統を対立遺伝子Ｉとする。対立遺伝子Ｉは野生種でも、栽培種でも皮性の系統のみに認められ、裸性の系統には存在しなかった。対立遺伝子Ｉの頻度は、皮性栽培種で９０．６％と、野生種における５６．６％より高かった。
【０１７０】
これに対して、約４７０ｂｐの増幅産物は、野生種の２３系統（４３．４％）、皮性栽培種の１０系統（９．４％）、１系統を除く全ての裸性栽培種で得られた。この裸性栽培種の例外的な１系統はチベットで採取された系統（ＯＵＣ６５２）で、約４００ｂｐの増幅産物が得られた。この約４００ｂｐの増幅産物は、裸性の「コビンカタギ」の４６７ｂｐからなる増幅産物と比較して、位置１８０番目〜２４４番目の６５ｂｐが欠損している以外は全く同じ塩基配列を有することが、塩基配列の決定により明らかになった。このことから、この例外的な系統も他の裸性のオオムギと同じグループに含めた。
【０１７１】
（ｉｉｉ）制限酵素によるＰＣＲ増幅産物の分析
１３３系統で得られた約４７０ｂｐのＰＣＲ増幅産物は、２単位（ユニット）の制限酵素ＮｓｐＩで消化し、２％アガロースゲルを担体として電気泳動にかけた。その結果の電気泳動像を図１４に示す。図１４の右半分に示すように、増幅産物は３種類の電気泳動パターンを示した。図中ＩＶでは、この他に４２ｂｐからなる断片が検出されたが図には表れていない。これにより、上記１３３系統は制限酵素ＮｓｐＩで切断される部位が異なる３種類の増幅産物を与える、３種類の対立遺伝子に分類できることがわかる。これらの対立遺伝子をＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶとする。図１５に対立遺伝子ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの制限酵素部位を示す。図中ｓＫＴ７Ｆ１、ｓＫＴ７Ｒ１と記載されている矢印は、ＳＣＡＲマーカーｓＫＴ７を形成するためのプライマーセットを示す。なお、図１４の左半分の１、２、３及び４はそれぞれ「Triumph」、「Debre Zeit40」、「70g」及び「コビンカタギ」から抽出したゲノムＤＮＡを上記プライマーセットを用いて増幅したものである。「Triumph」では増幅産物が生成されていないことがわかる。
【０１７２】
後述する塩基配列決定により、３種類の対立遺伝子ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶは、唯一の例外であるハプロタイプＩＩｄを除き、いずれも４６７ｂｐからなることがわかった。ハプロタイプＩＩｄは、表１０に示すように、１５１番目の塩基が欠失して４６６ｂｐからなっている。図１５に示すように、対立遺伝子ＩＩは制限酵素部位を有さない。これに対して対立遺伝子ＩＩＩは、２２１ｂｐからなる断片と２４６ｂｐからなる断片とに消化され、対立遺伝子ＩＶは、４２ｂｐからなる断片と２４６ｂｐからなる断片と１７９ｂｐからなる断片とに消化される。なお、ＩＩＩ及びＩＶにおける２４６ｂｐからなる断片は、４６７ｂｐからなる増幅産物の異なる位置に由来するものである。
【０１７３】
増幅産物の分析結果を対立遺伝子Ｉをも含めてまとめたものを図１６に示す。図１６（ａ）は野生種、図１６（ｂ）は皮性栽培種、図１６（ｃ）は裸性栽培種における結果を示し、それぞれ、表９に示される９地域における上記４種類の対立遺伝子Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの割合を示している。
【０１７４】
野生種では、対立遺伝子Ｉ〜ＩＶの全てがみられる。皮性栽培種では対立遺伝子Ｉ〜ＩＩＩがみられ、そのうちＩ（９０．６％）が多く、ＩＩ（７．５％）及びＩＩＩ（１．９％）は低い頻度でみられる。これに対して裸性栽培種では１００系統全てが対立遺伝子ＩＶを有している。
【０１７５】
（ｉｖ）ＰＣＲ増幅産物の塩基配列決定
上記対立遺伝子ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶについて、塩基配列の多様性を検出するために、オオムギの４１系統について、上記増幅産物の塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、BigDye Terminator v3.1 シークエンシングキット（Applied Biosystems製）及びＤＮＡシークエンサー（モデル3100、Applied Biosystems製）を用いて行った。塩基配列は、フォワードプライマーを含む側とリバースプライマーを含む側の両鎖について決定した。結果を表１０に示す。表１０については上記＜上記遺伝マーカーを用いた分析により得られる裸性オオムギに特徴的な塩基配列からなるポリヌクレオチド＞で説明したので、ここでは説明を省略する。
【産業上の利用可能性】
【０１７６】
本発明は、オオムギの連鎖地図を作成するために有用なだけでなく、学術上でも産業上でも有用な皮裸性遺伝子を有効に単離・同定することができるためにも有用なものとなっている。それゆえ、本発明にかかる遺伝マーカー及びその利用方法は、研究用の試薬や試料等を生産する産業だけでなく、植物を利用した各種バイオ産業や種苗産業にも応用の可能性が見出される。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】Ｆ２のバルクと個体とを用いた皮裸性遺伝子に連鎖する遺伝マーカーのＨＥＧＳ／ＡＦＬＰ分析の結果得られた電気泳動像を示す図である。
【図２】本発明にかかる遺伝マーカーの１つであるＫＴ１の塩基配列とＳＣＡＲマーカーｓＫＴ１のプライマー設計を示す図である。
【図３】本発明にかかる遺伝マーカーの１つであるＫＴ２の塩基配列とＳＣＡＲマーカーｓＫＴ２のプライマー設計を示す図である。
【図４】本発明にかかる遺伝マーカーの１つであるＫＴ３の塩基配列とＳＣＡＲマーカーｓＫＴ３のプライマー設計を示す図である。
【図５】本発明にかかる遺伝マーカーの１つであるＫＴ７の塩基配列とＳＣＡＲマーカーｓＫＴ７のプライマー設計を示す図である。
【図６】本発明にかかる遺伝マーカーの１つであるＫＴ９の塩基配列とＳＣＡＲマーカーｓＫＴ９のプライマー設計を示す図である。
【図７】本発明にかかる遺伝マーカーの１つであるＫＴ１４の塩基配列とＳＣＡＲマーカーｓＫＴ１４のプライマー設計を示す図である。
【図８】本発明にかかる遺伝マーカー群を用いて作成されたオオムギ７Ｈ染色体における皮裸性遺伝子近傍の連鎖地図（ａ）と、Ramsay etal.al(2000)のＳＳＲマーカーに基づく連鎖地図（ｂ）を示す図である。
【図９】本発明にかかるマーカー群を用いて作成されたオオムギ７Ｈ染色体の連鎖地図を示す図である。
【図１０】ＳＣＡＲマーカーｓＫＴ２、ｓＫＴ３、ｓＫＴ７を用いた連鎖解析の電気泳動像を示す図である。
【図１１】ＳＣＡＲマーカーｓＫＴ１、ｓＫＴ２、ｓＫＴ３、ｓＫＴ７、ｓＫＴ９、ｓＫＴ１４を用いた多型検出における電気泳動像を示す図である。
【図１２】本発明にかかるポリヌクレオチドの１つであるｓＫＴ７のハプロタイプＩＶｂ〜ＩＶｅの塩基配列を示す図である。
【図１３】本発明にかかるポリヌクレオチドの１つであるｓＫＴ７のハプロタイプＩＶａ〜ＩＶｅの塩基配列を示す図である。
【図１４】左半分は「Triumph」、「Debre Zeit40」、「70g」及び「コビンカタギ」を用いた多型検出における電気泳動像を示す図であり、右半分は、対立遺伝子Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの制限酵素ＮｓｐＩによる消化後の電気泳動像を示す図である。
【図１５】対立遺伝子ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶのＮｓｐＩ制限酵素部位を示す図である。
【図１６】図１６（ａ）は野生種、図１６（ｂ）は皮性栽培種、図１６（ｃ）は裸性栽培種における、９地域における対立遺伝子Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの割合を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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