(57)【要約】【目的】ビリルビンオキシダーゼ等の酵素を必要としないため、安価で長期間安定に保存することが可能であり、試料中のビリルビン濃度を簡便かつ正確に測定できる、試料中のビリルビンの測定方法、及び試料中のビリルビンの測定試薬を提供する。【構成】本発明は、試料をｐＨ７以上の条件下で亜鉛イオンと接触させ、その光学的変化を測定することよりなる、試料中のビリルビンの測定方法である。  また、本発明は、ｐＨ７以上であり、かつ亜鉛イオンを含む、試料中のビリルビン測定試薬である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料をｐＨ７以上の条件下で亜鉛イオンと接触させ、その光学的変化を測定することよりなる、試料中のビリルビンの測定方法。
【請求項２】
ｐＨが９以上であることを特徴とする、請求項１記載の試料中のビリルビンの測定方法。
【請求項３】
ｐＨ７以上であり、かつ亜鉛イオンを含む、試料中のビリルビン測定試薬。
【請求項４】
ｐＨが９以上であることを特徴とする、請求項３記載の試料中のビリルビン測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、試料中のビリルビンの測定方法及び測定試薬に関するものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】  ビリルビンは、老化赤血球から遊離するヘモグロビン由来の物質で、胆汁中に多く存在する。このビリルビンは生体試料中にグルクロナイド抱合型あるいは非抱合型（遊離型）として存在しており、前者はジアゾ試薬と直接反応するため直接ビリルビンと呼ばれ、後者はアルコール等の反応促進剤の存在によって初めてジアゾ試薬と反応するため、間接ビリルビンと呼ばれている。この直接ビリルビンと間接ビリルビンとの合計を総ビリルビンと呼んでいる。
また、生体試料中のビリルビン濃度は、肝炎、肝硬変、肝がん等の肝疾患、胆石、閉塞性黄疸、溶血性黄疸、又は溶血性貧血等により変動し、その測定は臨床上極めて重要とされている。【０００３】  ビリルビンの測定方法として使用されている方法としては、ジアゾ試薬を使用する方法（例えば、非特許文献１参照。）、ビリルビンオキシダーゼを使用する方法（例えば、非特許文献２参照。）、高速液体クロマトグラフィーを使用する方法（例えば、非特許文献３参照。）、フィルム法（例えば、特許文献１参照。）、及び化学酸化法等がある（例えば、特許文献２参照。）。
しかしながら、ジアゾ試薬を使用する方法は、感度が低く共存物質や反応温度の影響を受けるという問題がある。また、ビリルビンオキシダーゼを使用する方法は、ビリルビンオキシダーゼの安定化が難しく、また、測定に要する費用が高いという問題点がある。更に、高速液体クロマトグラフィーを使用する方法やフィルム法は、高い測定精度を有しているが、専用装置が必要であり、一度に処理できる試料の数に限界があること等の問題点がある。また、化学酸化法のうち、酸化剤としてシアン化物を利用した方法は、廃液処理が難しいという問題点がある。【０００４】
【特許文献１】    特開昭５９−１７１８６４号公報
【０００５】
【特許文献２】    特開平５−１８９７８号公報
【０００６】
【非特許文献１】    Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１９巻，４８１頁，１９３７年
【０００７】
【非特許文献２】    Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０巻，７８３頁，１９７４年
【０００８】
【非特許文献３】    Ｉｓｒａｅｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３巻，２４１−２４７頁，１９８３年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  したがって、本発明の課題は、安価で長期間安定に保存することができ、かつ試料中のビリルビン濃度を簡便に測定することができる方法及び試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本発明者は、上記の課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、試料中のビリルビンを測定する方法において、試料をｐＨ７以上の条件下で亜鉛イオンと接触させることにより、試料中のビリルビン濃度を測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】  すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１）  試料をｐＨ７以上の条件下で亜鉛イオンと接触させ、その光学的変化を測定することよりなる、試料中のビリルビンの測定方法。【００１２】（２）  ｐＨが９以上であることを特徴とする、前記（１）記載の試料中のビリルビンの測定方法。【００１３】（３）  ｐＨ７以上であり、かつ亜鉛イオンを含む、試料中のビリルビン測定試薬。【００１４】（４）  ｐＨが９以上であることを特徴とする、前記（３）記載の試料中のビリルビン測定試薬。
【発明の効果】
【００１５】  本発明の試料中のビリルビンの測定方法、及び測定試薬によれば、試料をｐＨ７以上の条件下で亜鉛イオンと接触させ、その光学的変化を測定することにより、試料中のビリルビンを測定することができるものである。
また、本発明の試料中のビリルビンの測定方法、及び測定試薬は、ビリルビンオキシダーゼ等の酵素を必要としないので、安価で長期間安定に保存することが可能であり、試料中のビリルビン濃度を簡便かつ正確に測定できるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】  本発明は、試料をｐＨ７以上の条件下で亜鉛イオンと接触させ、その光学的変化を測定することよりなる、試料中のビリルビンの測定方法、及びｐＨ７以上であり、かつ亜鉛イオンを含む試料中のビリルビン測定試薬である。【００１７】（１）  亜鉛イオン
本発明の試料中のビリルビンの測定方法、及び測定試薬において使用する亜鉛イオンとしては、亜鉛イオンであればどのようなものでもよい。例えば、亜鉛イオンを含む化合物を用いることができる。具体的には、亜鉛イオンと酸基よりなる化合物、亜鉛イオンの水酸化物、亜鉛イオンの塩等を挙げることができる。より具体的には、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、酢酸亜鉛、乳酸亜鉛、フッ化亜鉛、塩化亜鉛、臭化亜鉛、又はヨウ化亜鉛等の亜鉛塩等を挙げることができる。
この亜鉛イオンの濃度は、特に限定されないが、例えば、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．００１〜３００ｍＭの範囲にあることが好ましく、０．０１〜７５ｍＭの範囲が特に好ましい。なお、この亜鉛イオンの濃度は、３００ｍＭを超えて含有させても問題はないが、その量までで充分な効果が得られる。【００１８】  また、本発明の測定方法及び測定試薬が、１ステップ法（１試薬系）である場合には、亜鉛イオンの濃度は、上記の範囲のものとすればよく、２ステップ法（２試薬系）である場合には、試料と第１試薬を試料中のビリルビンを測定する際の各々の添加量の比で混合した際、及び試料と第１試薬及び第２試薬を試料中のビリルビンを測定する際の各々の添加量の比で混合した際に、この混合後の測定反応液中の亜鉛イオンの濃度が上記の範囲となるように、亜鉛イオンを第１試薬又は第２試薬のいずれかに含ませればよい。
また、混合後の測定反応液中の亜鉛イオンの濃度が上記濃度範囲に入るのであれば、亜鉛イオンは第１試薬と第２試薬の両方に含ませてもよい。
なお、測定方法及び測定試薬が多ステップ法（３試薬以上）の場合も同様である。
但し、亜鉛イオンは、第２試薬に含ませるか、又は第１試薬と第２試薬の両方に含有させることが好ましい。【００１９】  さらに本発明の測定方法及び測定試薬においては、アルカリ性下において亜鉛水酸化物の沈殿が生じることを防ぐ目的で、亜鉛イオンにキレート能力を持つ物質を含有させてもよい。
ここで、亜鉛イオンにキレート能力を持つ物質とは、亜鉛イオンに配位する多座配位子であって、亜鉛イオンへの配位により亜鉛を含んだ環状構造（キレート環）を形成する物質をいう。
ここで、亜鉛イオンにキレート能力を持つ物質としては、例えば、酒石酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、若しくはアジピン酸等のジカルボン酸又はその塩、クエン酸、イソクエン酸、若しくはｃｉｓ−アコニット酸等のトリカルボン酸又はその塩、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、若しくはニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）又はその塩等を挙げることができる。【００２０】  また、亜鉛イオンにキレート能力を持つ物質の濃度は、特に限定されないが、例えば、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．０００１〜４５０ｍＭの範囲にあることが好ましく、０．００１〜１２０ｍＭの範囲が特に好ましい。【００２１】（２）  ｐＨ
本発明において、試料に亜鉛イオンを接触させる際のｐＨは、ｐＨ７以上である。
また、本発明の測定方法及び測定試薬が１ステップ法（１試薬系）である場合は、測定試薬のｐＨを前記のｐＨ範囲とすればよく、２ステップ法（２試薬系）である場合には、第１試薬と第２試薬を混合した後の混合物のｐＨが前記のｐＨ範囲となるように適宜設定すればよい。
ここで、前記のｐＨ範囲となるように使用する緩衝剤としては、前記のｐＨ範囲に緩衝能がある従来公知の緩衝剤を適宜使用することができる。
このような緩衝剤として使用できるものとしては、例えば、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、イミダゾール、グリシルグリシン、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、若しくはＣＡＰＳ又はこれらの塩等の各緩衝剤を挙げることができる。【００２２】（３）  反応調整剤
本発明においてビリルビンを測定する場合には、亜鉛イオンのビリルビンに対する反応を調整する反応調整剤を使用することもできる。ここで、反応調整剤とは、亜鉛イオンのビリルビンに対する反応を促進する反応促進剤、又は、亜鉛イオンのビリルビンに対する反応を抑制する反応抑制剤を挙げることができる。
本発明において、反応促進剤として使用できるものとしては、例えば、２，２’−ビピリジン、チオシアン酸塩、チオ尿素、イソオクチル硫酸塩、又は塩酸グアニジン等を挙げることができる。
また、チオシアン酸塩としては、例えば、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸マグネシウム、チオシアン酸リチウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸カルシウム等を挙げることができる。
また、イソオクチル硫酸塩としては、例えば、イソオクチル硫酸ナトリウム、イソオクチル硫酸マグネシウム、イソオクチル硫酸リチウム、イソオクチル硫酸カリウム、イソオクチル硫酸カルシウム等を挙げることができる。【００２３】  これらの反応促進剤の濃度は、反応促進剤の種類によって異なり、亜鉛イオンのビリルビンに対する反応を促進できる濃度であれば特に限定されない。
例えば、上記の反応促進剤のうち、２，２’−ビピリジンの場合には、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．０１〜１００ｍＭの範囲にあることが好ましく、０．１〜５０ｍＭの範囲にあることが特に好ましい。チオシアン酸塩の場合には、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．１〜５００ｍＭの範囲にあることが好ましく、１〜１００ｍＭの範囲にあることが特に好ましい。チオ尿素の場合には、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．１〜５００ｍＭの範囲にあることが好ましく、１〜１００ｍＭの範囲にあることが特に好ましい。イソオクチル硫酸塩の場合には、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．０１〜１０％の範囲にあることが好ましく、０．１〜５％の範囲にあることが特に好ましい。塩酸グアニジンの場合には、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．０１〜１５Ｍの範囲にあることが好ましく、０．１〜１０Ｍの範囲にあることが特に好ましい。
なお、本発明においては、１種類の反応促進剤を用いてもよく、又は２種類以上の反応促進剤を組み合わせて用いてもよい。【００２４】  また、本発明において、反応抑制剤として使用できるものとしては、例えば、アルブミン等の蛋白質、カルシウム塩、セチルトリメチルアンモニウム塩、又はコール酸塩等を挙げることができる。
また、蛋白質としては、例えば、アルブミン、αグロブリン、βグロブリン、又はγグロブリン等を挙げることができる。このアルブミンとしては、例えば、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、又は卵白アルブミン等を挙げることができる。
また、カルシウム塩としては、例えば、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、乳酸カルシウム、フッ化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、又はシアン化カルシウム等を挙げることができる。
また、セチルメチルアンモニウム塩としては、例えば、セチルメチルアンモニウムクロライド等を挙げることができる。
また、コール酸塩としては、例えば、コール酸ナトリウム等を挙げることができる。【００２５】  これらの反応抑制剤の濃度は、反応抑制剤の種類によって異なり、亜鉛イオンのビリルビンに対する反応を抑制できる濃度であれば特に限定されない。
例えば、前記の反応抑制剤のうち、蛋白質の場合には、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．０１〜１０％の範囲にあることが好ましく、０．１〜８％の範囲にあることが特に好ましい。また、アルブミンの場合には、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．０１〜１０％の範囲にあることが好ましく、０．１〜８％の範囲にあることが特に好ましい。また、カルシウム塩の場合には、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．０１〜１００ｍＭの範囲にあることが好ましく、０．１〜１０ｍＭの範囲にあることが特に好ましい。また、セチルトリメチルアンモニウム塩の場合には、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．００１〜２Ｍの範囲にあることが好ましく、０．０１〜１Ｍの範囲にあることが特に好ましい。コール酸塩の場合には、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．００１〜２Ｍの範囲にあることが好ましく、０．０１〜１Ｍの範囲にあることが特に好ましい。
なお、本発明においては、１種類の反応抑制剤を用いてもよく、又は２種類以上の反応抑制剤を組み合わせて用いてもよい。【００２６】  なお、反応抑制剤のうち、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン等のアルブミン、及びカルシウム塩は、亜鉛イオンの間接ビリルビンに対する反応を強く抑制することができる。このため、直接ビリルビンの発するシグナルのみを測定することができるので、直接ビリルビンの分別定量に使用することができる。【００２７】  また、本発明において、亜鉛イオンとともにアルブミンを含有させて直接ビリルビンの分別定量を行う場合には、亜鉛イオンの間接ビリルビンに対する反応を更に抑制し、かつ亜鉛イオンの直接ビリルビンに対する反応を促進させる物質を使用してもよい。
ここで、亜鉛イオンの間接ビリルビンに対する反応を抑制し、かつ亜鉛イオンの直接ビリルビンに対する反応を促進させる物質としては、例えば、カプリル酸、カプロン酸、若しくはカプリン酸等の脂肪酸又はその塩、又は１−ナフトール、ｍ−トリルジエタノールアミン、ο−トリジン、Ｎ−メチルアセトアニリド、若しくはビタミンＫ３等の芳香族性化合物等を挙げることができる。
更に、本発明において、亜鉛イオンとともにカルシウム塩を含有させて直接ビリルビンの分別定量を行う場合には、亜鉛イオンの間接ビリルビンに対する反応を更に抑制し、かつ亜鉛イオンの直接ビリルビンに対する反応を促進させる物質として、例えば、陰イオン性界面活性剤等を使用してもよい。
ここで、陰イオン性界面活性剤としては、例えば、カプリル酸、カプロン酸、リノール酸、デカン酸、ラウリン酸、コール酸、サルコシネート、ヘキシル硫酸、オクチル硫酸、デシル硫酸、ドデシル硫酸、ヘキシルスルホン酸、オクチルスルホン酸、デカンスルホン酸、ドデカンスルホン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸、又はその塩等を挙げることができる。【００２８】  更に、本発明においては、反応調整剤として、ドデシル硫酸ナトリウム等のドデシル硫酸塩を用いることができる。なお、このドデシル硫酸塩は、濃度によって反応促進剤としても反応抑制剤としても使用することができる。例えば、後に示す表６に記載したように、ドデシル硫酸塩の濃度によって、適宜使い分けを行うことができる。【００２９】（４）  測定における他の構成成分
本発明においては、前記の成分の他に、公知の防腐剤、又は安定化剤等を必要に応じて適宜使用することができる。
なお、本発明の測定試薬において、亜鉛イオンとともに界面活性剤を含有させる場合には、試料との反応や界面活性剤の曇点に由来する濁り等が生じるのを、非イオン性界面活性剤等の他の界面活性剤や糖類等を添加することにより防止してもよい。【００３０】（５）  試薬等の構成、及び構成成分の濃度等
本発明の測定方法及び測定試薬は、１ステップ法（１試薬系）で実施、構成してもよく、又は２ステップ法（２試薬系）等の多ステップ法（多試薬系）で実施、構成してもよい。
また、本発明の測定方法及び測定試薬が１ステップ法（１試薬系）である場合は、前記した各構成成分の濃度、及びｐＨ等は前記の範囲のものとすればよく、多ステップ法（多試薬系）である場合には、前記構成成分を試料中のビリルビンを測定する際の各々の添加量の比で混合した時に、前記した各構成成分の濃度範囲、及びｐＨ範囲等となるように各試薬の構成成分の濃度等を定めればよい。【００３１】（６）  試料
本発明において、試料とは、試料中のビリルビンの測定を行おうとするもののことであり、このようなものであれば特に限定されない。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、汗等の体液、ヒト若しくは動物の腎臓、心臓、肺、脳等の臓器等の抽出液；骨格筋、骨髄、皮膚、又は神経組織等の抽出液；毛髪等の抽出液、ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞の抽出液等が挙げられる。【００３２】（７）  ビリルビン
本発明におけるビリルビンとしては、抱合型ビリルビンであるジタウロビリルビン、モノグルクロナイドビリルビン又はジグルクロナイドビリルビン、非抱合型（遊離型）ビリルビン、アルブミン結合型ビリルビンであるデルタビリルビン等を挙げることができる。
また、本発明においては、抱合型ビリルビンを直接ビリルビン、非抱合型（遊離型）ビリルビンを間接ビリルビンと呼ぶこともある。なお、この直接ビリルビンと間接ビリルビンとを合計したものを総ビリルビンと呼ぶこともある。【００３３】（８）  試料中のビリルビン測定方法
本発明の試料中のビリルビンの測定方法及び測定試薬を用いて試料中のビリルビンを測定する場合の例を具体的に説明する。
試料中の総ビリルビンを測定する場合には、例えば、試料とｐＨ７以上の第１試薬とを混合し、この溶液をビリルビンが吸収を示す波長域（４００〜４８０ｎｍ）の特定の波長、好ましくは４５０ｎｍ付近の波長において、分光光度計を用いて吸光度を測定する。
次いで、試料と第１試薬の混合物に、亜鉛イオンを含む第２試薬を添加し、２５〜４０℃で３〜１５分間反応を行い、試料中のビリルビンをビリベルジンに変化させた後、再度ビリルビンが吸収を示す波長域（４００〜４８０ｎｍ）の特定の波長における吸光度を測定する。
ここで得られた吸光度の値と先に得られた吸光度の値に液量補正等を行った後、ビリルビンの酸化反応前後での吸光度変化量を求める。この吸光度変化量と、あらかじめビリルビン濃度既知の標準液を用いて、上記と同様の操作を行って得られた吸光度変化量によって作成された検量線から、試料中の総ビリルビン濃度を算出することができる。
なお、４００〜４８０ｎｍの任意の波長を主波長とし、この主波長の他に副波長として任意の波長を設定し、主波長における吸光度差と副波長における吸光度差を用いて総ビリルビンの測定を行うこともできる。【００３４】  また、直接ビリルビンを測定する場合には、例えば、間接ビリルビンの反応抑制剤としてウシ血清アルブミン、若しくはヒト血清アルブミン等のアルブミン、又はカルシウム塩を添加した第１試薬、及び亜鉛イオンを含む第２試薬を用いて、前記した試料中の総ビリルビンを測定する場合と同様にして測定を行えばよい。
なお、直接ビリルビンと間接ビリルビンの合計が総ビリルビンとなるので、間接ビリルビン濃度は、総ビリルビン濃度から直接ビリルビン濃度を差し引くことによって求めることができる。
【実施例】
【００３５】  以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】（ビリルビン測定時の直線性の検討）
本発明のビリルビン測定試薬において、ビリルビン測定を行う際の直線性の検討を行った。【００３７】１．  測定試薬の調製
（１）  ビリルビン測定用第１試薬（Ａ）の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ９．０（２０℃）のビリルビン測定用第１試薬（Ａ）を調製した。
Ｂｉｃｉｎｅ（緩衝剤）  ０．１Ｍ【００３８】  （２）  ビリルビン測定用第１試薬（Ｂ）の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ１０．０（２０℃）のビリルビン測定用第１試薬（Ｂ）を調製した。
ＣＡＰＳ（緩衝剤）  ０．１Ｍ【００３９】  （３）  ビリルビン測定用第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．２（２０℃）に調整し、ビリルビン測定用第２試薬を調製した。
硫酸亜鉛  ２ｍＭ
酒石酸ナトリウムカリウム  ２５ｍＭ【００４０】２．  試料の調製
生理食塩水に干渉チェックＡプラス・ビリルビンＣ（シスメックス社製）を、抱合型ビリルビン（ビリルビンＣ；ＢＩＬ−Ｃ）の濃度が１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ｍｇ／ｄＬになるように添加したものを〔試料１〕とした。
また、生理食塩水に干渉チェックＡプラス・ビリルビンＦ（シスメックス社製）を、遊離型ビリルビン（ビリルビンＦ；ＢＩＬ−Ｆ）の濃度が１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ｍｇ／ｄＬになるように添加したものを〔試料２〕とした。
更に、生理食塩水をビリルビン無添加試料（ビリルビン濃度が０ｍｇ／ｄＬ）とした。【００４１】３．  試料の測定
前記２の各試料中の抱合型ビリルビン又は遊離型ビリルビン濃度を、前記１で調製した第１試薬及び第２試薬にて測定した。
本発明の測定試薬における抱合型ビリルビン又は遊離型ビリルビンの測定は、日立製作所社製７１７０Ｓ形自動分析装置にて行い、前記２で調製した試料１又は試料２の各１０μＬに各々前記１の（１）で調製したビリルビン測定用第１試薬（Ａ）１６０μＬを添加して、混和後３７℃で５分間反応させた後、前記１の（３）で調製したビリルビン測定用第２試薬１６０μＬを添加し、３７℃で５分間反応させた。第１試薬添加後４分３０秒目（１６ポイント目）と第２試薬添加後５分１７秒目（３４ポイント目）の波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、その差を求めた。
また、第１試薬を前記１の（２）で調製したビリルビン測定用第１試薬（Ｂ）に変えて同様に測定を行った。【００４２】４．  測定結果
試料の測定結果を図１及び図２に示した。図１は試料中の抱合型ビリルビンを測定したものであり、図２は試料中の遊離型ビリルビンを測定したものである。なお、これらの図において横軸は試料中のビリルビン濃度（ｍｇ／ｄＬ）を表し、縦軸は測定により得られた吸光度差を表す。【００４３】  この結果から、本発明の亜鉛を含むビリルビン測定試薬を用いた場合には、試料中のビリルビン濃度と測定により得られる吸光度差の値との関係が直線的となり、これにより直線的な検量線が得られ、そして低濃度域から高濃度域までビリルビン濃度測定値がほぼ直線上に位置するようになることが分かる。
従って、低濃度域から高濃度域まで試料中のビリルビン濃度を正確に測定できるようになる。【００４４】  これらのことより、ｐＨ７以上の条件下で、かつ亜鉛イオンを含有させた本発明の測定試薬及び測定方法は、試料中のビリルビン濃度を正確に測定できることが確かめられた。【００４５】〔実施例２〕
（亜鉛イオンのビリルビンに対する反応の反応促進剤の検討１）
亜鉛イオンのビリルビンに対する反応への各種反応促進剤による促進効果を確かめた。【００４６】１．  測定試薬の調製
（１）  本発明・第１試薬（Ａ）の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ１０．０（２０℃）の本発明・第１試薬（Ａ）を調製した。
２，２’−ビピリジン  １０ｍＭ
ＣＡＰＳ（緩衝剤）  ０．１Ｍ【００４７】  （２）  本発明・第１試薬（Ｂ）の調製
前記（１）の本発明・第１試薬（Ａ）の２，２’−ビピリジンを５０ｍＭのチオシアン酸ナトリウムに変えること以外は、前記（１）と同様にして本発明・第１試薬（Ｂ）の調製を行った。【００４８】  （３）  本発明・第１試薬（Ｃ）の調製
前記（１）の本発明・第１試薬（Ａ）の２，２’−ビピリジンを５０ｍＭのチオ尿素に変えること以外は、前記（１）と同様にして本発明・第１試薬（Ｃ）の調製を行った。【００４９】  （４）  対照・第１試薬の調製
前記（１）の本発明・第１試薬（Ａ）の２，２’−ビピリジンを含有させないこと以外は、前記（１）と同様にして対照・第１試薬の調製を行った。【００５０】  （５）  第２試薬の調製
実施例１の１の（３）で調製したビリルビン測定用第２試薬をそのまま使用した。【００５１】２．  試料の調製
生理食塩水に干渉チェックＡプラス・ビリルビンＣ（シスメックス社製）を、抱合型ビリルビン（ビリルビンＣ；ＢＩＬ−Ｃ）の濃度が１０、２０、３０、４０、又は５０ｍｇ／ｄＬになるように添加したものを〔試料１〕とした。
また、生理食塩水に干渉チェックＡプラス・ビリルビンＦ（シスメックス社製）を、遊離型ビリルビン（ビリルビンＦ；ＢＩＬ−Ｆ）の濃度が１０、２０、３０、４０、又は５０ｍｇ／ｄＬになるように添加したものを〔試料２〕とした。
更に、生理食塩水をビリルビン無添加試料（ビリルビン濃度が０ｍｇ／ｄＬ）とした。【００５２】３．  試料の測定
前記２の各試料中の抱合型ビリルビン又は遊離型ビリルビン濃度を、前記１で調製した本発明・第１試薬（Ａ）〜（Ｃ）及び第２試薬にて実施例１の３と同様にして測定を行った。また、第１試薬を前記１の（４）で調製した対照・第１試薬に変えて同様に測定を行った。【００５３】４．  測定結果
試料の測定結果を表１に示した。また、表１に示した値は、測定で得られた吸光度差を１０，０００倍した値である。なお、表１において、かっこ内の数値は、対照・第１試薬を使用した際の測定値（吸光度差）を１００％とした時の百分率を求めたものである。【００５４】
【表１】
2005134368.tif 000002
【００５５】  この結果から、第１試薬に各種反応促進剤を含有させた本発明・第１試薬を用いた場合には、反応促進剤無添加の対照・第１試薬を用いた場合に比べて、抱合型ビリルビン、遊離型ビリルビンのいずれにおいても、測定で得られた吸光度差が増加していることが分かる。【００５６】  これらのことより、本発明のビリルビン測定試薬に、更に２，２’−ビピリジン、チオシアン酸ナトリウム、又はチオ尿素を添加することにより、亜鉛イオンのビリルビンに対する反応を促進できることが確かめられた。【００５７】〔実施例３〕
（亜鉛イオンのビリルビンに対する反応の反応促進剤の検討２）
亜鉛イオンのビリルビンに対する反応への反応促進剤による促進効果を確かめた。【００５８】１．  測定試薬の調製
（１）  本発明・第１試薬の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ１０．０（２０℃）の本発明・第１試薬を調製した。
イソオクチル硫酸ナトリウム  ３％
ＣＡＰＳ（緩衝剤）  ０．１Ｍ【００５９】  （２）  対照・第１試薬の調製
前記（１）の本発明・第１試薬のイソオクチル硫酸ナトリウムを含有させないこと以外は、前記（１）と同様にして対照・第１試薬の調製を行った。【００６０】  （３）  第２試薬の調製
実施例１の１の（３）で調製したビリルビン測定用第２試薬をそのまま使用した。【００６１】２．  試料の調製
実施例２の２で調製した試料をそのまま使用した。【００６２】３．  試料の測定
前記２の各試料中の抱合型ビリルビン又は遊離型ビリルビン濃度を、前記１で調製した本発明・第１試薬及び第２試薬にて実施例１の３と同様にして測定を行った。また、第１試薬を前記１の（２）で調製した対照・第１試薬に変えて同様に測定を行った。【００６３】４．  測定結果
試料の測定結果を表２に示した。また、表２に示した値は、測定で得られた吸光度差を１０，０００倍した値である。なお、表２において、かっこ内の数値は、対照・第１試薬を使用した際の測定値（吸光度差）を１００％とした時の百分率を求めたものである。【００６４】
【表２】
2005134368.tif 000003
【００６５】  この結果から、第１試薬に反応促進剤を含有させた本発明・第１試薬を用いた場合には、反応促進剤無添加の対照・第１試薬を用いた場合に比べて、抱合型ビリルビン、遊離型ビリルビンのいずれにおいても、測定で得られた吸光度差が増加していることが分かる。【００６６】  これらのことより、本発明のビリルビン測定試薬に、更にイソオクチル硫酸ナトリウムを添加することにより、亜鉛イオンのビリルビンに対する反応を促進できることが確かめられた。【００６７】〔実施例４〕
（亜鉛イオンのビリルビンに対する反応の反応促進剤の検討３）
亜鉛イオンのビリルビンに対する反応への反応促進剤による促進効果を確かめた。【００６８】１．  測定試薬の調製
（１）  本発明・第１試薬の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを１０．０（２０℃）に調整し、塩酸グアニジン濃度の異なる３種類の本発明・第１試薬を調製した。
塩酸グアニジン  ０．０１Ｍ、０．１Ｍ、又は１Ｍ
ＣＡＰＳ（緩衝剤）  ０．１Ｍ【００６９】  （２）  対照・第１試薬の調製
前記（１）の本発明・第１試薬の塩酸グアニジンを含有させないこと以外は、前記（１）と同様にして対照・第１試薬の調製を行った。【００７０】  （３）  第２試薬の調製
実施例１の１の（３）で調製したビリルビン測定用第２試薬をそのまま使用した。【００７１】２．  試料の調製
実施例２の２で調製した試料をそのまま使用した。【００７２】３．  試料の測定
前記２の各試料中の抱合型ビリルビン又は遊離型ビリルビン濃度を、前記１で調製した３種類の本発明・第１試薬及び第２試薬にて実施例１の３と同様にして測定を行った。また、第１試薬を前記１の（２）で調製した対照・第１試薬に変えて同様に測定を行った。【００７３】４．  測定結果
試料の測定結果を表３に示した。また、表３に示した値は、測定で得られた吸光度差を１０，０００倍した値である。なお、表３において、かっこ内の数値は、対照・第１試薬を使用した際の測定値（吸光度差）を１００％とした時の百分率を求めたものである。【００７４】
【表３】
2005134368.tif 000004
【００７５】  この結果から、第１試薬に反応促進剤として塩酸グアニジンを含有させた本発明・第１試薬を用いた場合には、反応促進剤無添加の対照・第１試薬を用いた場合に比べて、抱合型ビリルビン、遊離型ビリルビンのいずれにおいても、測定で得られた吸光度差が増加していることが分かる。【００７６】  これらのことより、本発明のビリルビン測定試薬に、更に塩酸グアニジンを添加することにより、亜鉛イオンのビリルビンに対する反応を促進できることが確かめられた。【００７７】〔実施例５〕
（亜鉛イオンのビリルビンに対する反応の反応抑制剤の検討１）
亜鉛イオンのビリルビンに対する反応への反応抑制剤による抑制効果を確かめた。【００７８】１．  測定試薬の調製
（１）  本発明・第１試薬の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを１０．０（２０℃）に調整し、コール酸ナトリウム濃度の異なる４種類の本発明・第１試薬を調製した。
コール酸ナトリウム  ０．００１Ｍ、０．０１Ｍ、０．１Ｍ、又は０．５Ｍ
ＣＡＰＳ（緩衝剤）  ０．１Ｍ【００７９】  （２）  対照・第１試薬の調製
前記（１）の本発明・第１試薬のコール酸ナトリウムを含有させないこと以外は、前記（１）と同様にして対照・第１試薬の調製を行った。【００８０】  （３）  第２試薬の調製
実施例１の１の（３）で調製したビリルビン測定用第２試薬をそのまま使用した。【００８１】２．  試料の調製
生理食塩水に干渉チェックＡプラス・ビリルビンＣ（シスメックス社製）を、抱合型ビリルビン（ビリルビンＣ；ＢＩＬ−Ｃ）の濃度が４、８、１２、１６、又は２０ｍｇ／ｄＬになるように添加したものを〔試料１〕とした。
また、生理食塩水に干渉チェックＡプラス・ビリルビンＦ（シスメックス社製）を、遊離型ビリルビン（ビリルビンＦ；ＢＩＬ−Ｆ）の濃度が４、８、１２、１６、又は２０ｍｇ／ｄＬになるように添加したものを〔試料２〕とした。
更に、生理食塩水をビリルビン無添加試料（ビリルビン濃度が０ｍｇ／ｄＬ）とした。【００８２】３．  試料の測定
前記２の各試料中の抱合型ビリルビン又は遊離型ビリルビン濃度を、前記１で調製した４種類の本発明・第１試薬及び第２試薬にて実施例１の３と同様にして測定を行った。また、第１試薬を前記１の（２）で調製した対照・第１試薬に変えて同様に測定を行った。【００８３】４．  測定結果
試料の測定結果を表４に示した。また、表４に示した値は、測定で得られた吸光度差を１０，０００倍した値である。なお、表４において、かっこ内の数値は、対照・第１試薬を使用した際の測定値（吸光度差）を１００％とした時の百分率を求めたものである。【００８４】
【表４】
2005134368.tif 000005
【００８５】  この結果から、第１試薬に反応抑制剤としてコール酸ナトリウムを含有させた本発明・第１試薬を用いた場合には、反応抑制剤無添加の対照・第１試薬を用いた場合に比べて、抱合型ビリルビン、遊離型ビリルビンのいずれにおいても、測定で得られた吸光度差が減少していることが分かる。【００８６】  これらのことより、本発明のビリルビン測定試薬に、更にコール酸ナトリウムを添加することにより、亜鉛イオンのビリルビンに対する反応を抑制できることが確かめられた。【００８７】〔実施例６〕
（亜鉛イオンのビリルビンに対する反応の反応抑制剤の検討２）
亜鉛イオンのビリルビンに対する反応への反応抑制剤による抑制効果を確かめた。【００８８】１．  測定試薬の調製
（１）  本発明・第１試薬の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ１０．０（２０℃）の本発明・第１試薬を調製した。
セチルトリメチルアンモニウムクロライド  ０．１Ｍ
２，２’−ビピリジン  ２ｍＭ
ＣＡＰＳ（緩衝剤）  ０．１Ｍ【００８９】  （２）  対照・第１試薬の調製
前記（１）の本発明・第１試薬のセチルトリメチルアンモニウムクロライドを含有させないこと以外は、前記（１）と同様にして対照・第１試薬の調製を行った。【００９０】  （３）  第２試薬の調製
実施例１の１の（３）で調製したビリルビン測定用第２試薬をそのまま使用した。【００９１】２．  試料の調製
実施例５の２で調製した試料をそのまま使用した。【００９２】３．  試料の測定
前記２の各試料中の抱合型ビリルビン又は遊離型ビリルビン濃度を、前記１で調製した本発明・第１試薬及び第２試薬にて実施例１の３と同様にして測定を行った。また、第１試薬を前記１の（２）で調製した対照・第１試薬に変えて同様に測定を行った。【００９３】４．  測定結果
試料の測定結果を表５に示した。また、表５に示した値は、測定で得られた吸光度差を１０，０００倍した値である。なお、表５において、かっこ内の数値は、対照・第１試薬を使用した際の測定値（吸光度差）を１００％とした時の百分率を求めたものである。【００９４】
【表５】
2005134368.tif 000006
【００９５】  この結果から、第１試薬に反応抑制剤としてセチルトリメチルアンモニウムクロライドを含有させた本発明・第１試薬を用いた場合には、反応抑制剤無添加の対照・第１試薬を用いた場合に比べて、抱合型ビリルビン、遊離型ビリルビンのいずれにおいても、測定で得られた吸光度差が減少していることが分かる。【００９６】  これらのことより、本発明のビリルビン測定試薬に、更にセチルトリメチルアンモニウムクロライドを添加することにより、亜鉛イオンのビリルビンに対する反応を抑制できることが確かめられた。【００９７】〔実施例７〕
（亜鉛イオンのビリルビンに対する反応の反応調整剤の検討）
反応調整剤の亜鉛イオンのビリルビンに対する反応への反応調整剤による調整効果を確かめた。【００９８】１．  測定試薬の調製
（１）  本発明・第１試薬の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを１０．０（２０℃）に調整し、ドデシル硫酸ナトリウム濃度の異なる４種類の本発明・第１試薬を調製した。
ドデシル硫酸ナトリウム  ０．０１Ｍ、０．１Ｍ．０．５Ｍ、又は０．８Ｍ
ＣＡＰＳ（緩衝剤）  ０．１Ｍ【００９９】  （２）  対照・第１試薬の調製
前記（１）の本発明・第１試薬のドデシル硫酸ナトリウムを含有させないこと以外は、前記（１）と同様にして対照・第１試薬の調製を行った。【０１００】  （３）  第２試薬の調製
実施例１の１の（３）で調製したビリルビン測定用第２試薬をそのまま使用した。【０１０１】２．  試料の調製
実施例５の２で調製した試料をそのまま使用した。【０１０２】３．  試料の測定
前記２の各試料中の抱合型ビリルビン又は遊離型ビリルビン濃度を、前記１で調製した４種類の本発明・第１試薬及び第２試薬にて実施例１の３と同様にして測定を行った。また、第１試薬を前記１の（２）で調製した対照・第１試薬に変えて同様に測定を行った。【０１０３】４．  測定結果
試料の測定結果を表６に示した。また、表６に示した値は、測定で得られた吸光度差を１０，０００倍した値である。なお、表６において、かっこ内の数値は、対照・第１試薬を使用した際の測定値（吸光度差）を１００％とした時の百分率を求めたものである。【０１０４】
【表６】
2005134368.tif 000007
【０１０５】  この表６に示されるように、ドデシル硫酸ナトリウムの添加濃度及び試料中のビリルビン濃度により、亜鉛イオンのビリルビンに対する反応が促進される場合と、亜鉛イオンのビリルビンに対する反応が抑制される場合があることが分かる。【０１０６】  これらのことより、本発明のビリルビン測定試薬に、更にドデシル硫酸ナトリウムを添加することにより、亜鉛イオンのビリルビンに対する反応を調整できることが確かめられた。
すなわち、ドデシル硫酸ナトリウムの濃度を適宜調整することにより、亜鉛イオンのビリルビンに対する反応を促進する反応促進剤として、又は亜鉛イオンのビリルビンに対する反応を抑制する反応抑制剤として使用できることが確かめられた。【０１０７】〔実施例８〕
（試料中の直接ビリルビンの分別定量の確認１）
反応抑制剤を使用して試料中の直接ビリルビンの分別定量の可能性を確かめた。【０１０８】１．  測定試薬の調製
（１）  本発明・第１試薬の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを１０．０（２０℃）に調整し、本発明・第１試薬を調製した。
ウシ血清アルブミン  ５％
ＣＡＰＳ（緩衝剤）  ０．１Ｍ【０１０９】  （２）  対照・第１試薬の調製
前記（１）の本発明・第１試薬のウシ血清アルブミンを含有させないこと以外は、前記（１）と同様にして対照・第１試薬の調製を行った。【０１１０】  （３）  第２試薬の調製
実施例１の１の（３）で調製したビリルビン測定用第２試薬をそのまま使用した。【０１１１】２．  試料の調製
実施例５の２で調製した試料をそのまま使用した。【０１１２】３．  試料の測定
前記２の各試料中の抱合型ビリルビン又は遊離型ビリルビン濃度を、前記１の（１）で調製した本発明・第１試薬及び第２試薬にて実施例１の３と同様にして測定を行った。
また、第１試薬を前記１の（２）で調製した対照・第１試薬に変えて同様に測定を行った。【０１１３】４．  測定結果
試料の測定結果を表７に示した。また、表７に示した値は、測定で得られた吸光度差を１０，０００倍した値である。なお、表７において、かっこ内の数値は、対照・第１試薬を使用した際の測定値（吸光度差）を１００％とした時の百分率を求めたものである。【０１１４】
【表７】
2005134368.tif 000008
【０１１５】  この結果から、第１試薬にウシ血清アルブミンを含有させた本発明・第１試薬を用いた場合には、ウシ血清アルブミン無添加の対照・第１試薬を用いた場合に比べて、遊離型ビリルビンにおいて測定で得られた吸光度差が減少していることが分かる。【０１１６】  これらのことより、本発明のビリルビン測定試薬に、更にウシ血清アルブミンを添加することにより、亜鉛イオンの遊離型ビリルビン（間接ビリルビン）に対する反応を強く抑制できることが確かめられた。
すなわち、ウシ血清アルブミンの存在下で、試料を亜鉛イオンと接触させると、亜鉛イオンと遊離型ビリルビン（間接ビリルビン）との反応性を強く抑制することができるので、これにより抱合型ビリルビン（直接ビリルビン）の分別定量を行うことができる。【０１１７】〔実施例９〕
（試料中の直接ビリルビンの分別定量の確認２）
反応抑制剤としてカルシウム塩を含有させた測定試薬を使用して、試料中の直接ビリルビンの分別定量の可能性を確かめた。【０１１８】１．  測定試薬の調製
（１）  第１試薬（Ａ）の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを１０．０（２０℃）に調整し、第１試薬（Ａ）を調製した。
ＣＡＰＳ（緩衝剤）  ０．１Ｍ【０１１９】  （２）  第１試薬（Ｂ）の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを１０．０（２０℃）に調整し、第１試薬（Ｂ）を調製した。
塩化カルシウム  ０．１ｍＭ
ＣＡＰＳ（緩衝剤）  ０．１Ｍ【０１２０】  （３）  第１試薬（Ｃ）の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを１０．０（２０℃）に調整し、第１試薬（Ｃ）を調製した。
塩化カルシウム  １ｍＭ
ＣＡＰＳ（緩衝剤）  ０．１Ｍ【０１２１】  （３）  第２試薬の調製
実施例１の１の（３）のビリルビン測定用第２試薬と同様にして第２試薬の調製を行った。【０１２２】２．  試料の調製
実施例２の２の試料と同様にして試料１、試料２及びビリルビン無添加試料の調製を行った。【０１２３】３．  試料の測定
前記２の各試料中の抱合型ビリルビン又は遊離型ビリルビン濃度を、前記１で調製した第１試薬及び第２試薬にて測定した。
本発明の測定試薬における抱合型ビリルビン又は遊離型ビリルビンの測定は、日立製作所社製７１８０形自動分析装置にて行い、前記２で調製した試料１、試料２及びビリルビン無添加試料の各８μＬに各々前記１の（１）で調製した第１試薬１４０μＬを添加して、混和後３７℃で５分間反応させた後、前記１の（３）で調製した第２試薬１４０μＬを添加し、３７℃で５分間反応させた。第１試薬添加後４分３０秒目（１６ポイント目）と第２試薬添加後５分１７秒目（３４ポイント目）の波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、その差を求めた。【０１２４】４．  測定結果
試料の測定結果を表８に示した。また、表８に示した値は、測定で得られた吸光度差を１０，０００倍した値である。なお、表８において、かっこ内の数値は、第１試薬（Ａ）を使用した際の測定値（吸光度差）を１００％とした時の百分率を求めたものである。【０１２５】
【表８】
2005134368.tif 000009
【０１２６】  この結果から、第１試薬にカルシウム塩を含有させた第１試薬（Ｂ）を用いた場合には、カルシウム塩無添加の第１試薬（Ａ）を用いた場合に比べて、遊離型ビリルビンにおいて測定で得られた吸光度差が減少していることが分かる。【０１２７】  これらのことより、本発明のビリルビン測定試薬に、更にカルシウム塩を添加することにより、亜鉛イオンの遊離型ビリルビン（間接ビリルビン）に対する反応を強く抑制できることが確かめられた。
すなわち、カルシウム塩の存在下で、試料を亜鉛イオンと接触させると、亜鉛イオンと遊離型ビリルビン（間接ビリルビン）との反応性を強く抑制することができるので、これにより抱合型ビリルビン（直接ビリルビン）の分別定量を行うことができる。【０１２８】〔実施例１０〕
（試料中の直接ビリルビンの分別定量の確認３）
反応抑制剤であるカルシウム塩に更に陰イオン性界面活性剤を含有させた測定試薬を使用して、試料中の直接ビリルビンの分別定量の可能性を確かめた。【０１２９】１．  測定試薬の調製
（１）  第１試薬（Ａ）の調製
実施例９の１の（１）で調製した第１試薬（Ａ）をそのまま使用した。【０１３０】  （２）  第１試薬（Ｂ）の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを１０．０（２０℃）に調整し、第１試薬（Ｂ）を調製した。
塩化カルシウム  １０ｍＭ
ＣＡＰＳ（緩衝剤）  ０．１Ｍ【０１３１】  （３）  第１試薬（Ｃ）の調製
前記（２）の第１試薬（Ｂ）に１０ｍＭとなるようにヘキシル硫酸ナトリウムを添加すること以外は、前記（２）と同様にして第１試薬（Ｃ）の調製を行った。【０１３２】  （４）  第１試薬（Ｄ）の調製
前記（２）の第１試薬（Ｂ）に１０ｍＭとなるようにオクチル硫酸ナトリウムを添加すること以外は、前記（２）と同様にして第１試薬（Ｄ）の調製を行った。【０１３３】  （５）  第１試薬（Ｅ）の調製
前記（２）の第１試薬（Ｂ）に１０ｍＭとなるようにデシル硫酸ナトリウムを添加すること以外は、前記（２）と同様にして第１試薬（Ｅ）の調製を行った。【０１３４】  （６）  第２試薬の調製
実施例１の１の（３）のビリルビン測定用第２試薬と同様にして第２試薬の調製を行った。【０１３５】２．  試料の調製
（１）  試料１の調製
生理食塩水に干渉チェックＡプラス・ビリルビンＣ（シスメックス社製）を、抱合型ビリルビン（ビリルビンＣ；ＢＩＬ−Ｃ）の濃度が１０、２０、３０、４０、又は５０ｍｇ／ｄＬになるように添加したものを試料１とした。【０１３６】  （２）  試料２の調製
生理食塩水に干渉チェックＡプラス・ビリルビンＦ（シスメックス社製）を、遊離型ビリルビン（ビリルビンＦ；ＢＩＬ−Ｆ）の濃度が１０、２０、３０、４０、又は５０ｍｇ／ｄＬになるように添加したものを試料２とした。【０１３７】  （３）  試料３の調製
生理食塩水を試料３（ビリルビン無添加試料：ビリルビン濃度が０ｍｇ／ｄＬ）とした。【０１３８】  （４）  試料４の調製
ヒト血清に干渉チェックＡプラス・ビリルビンＣ（シスメックス社製）を、抱合型ビリルビン（ビリルビンＣ；ＢＩＬ−Ｃ）の添加濃度が１０、２０、３０、４０、又は５０ｍｇ／ｄＬになるように添加したものを試料４とした。【０１３９】  （５）  試料５の調製
ヒト血清に干渉チェックＡプラス・ビリルビンＦ（シスメックス社製）を、遊離型ビリルビン（ビリルビンＦ；ＢＩＬ−Ｆ）の添加濃度が１０、２０、３０、４０、又は５０ｍｇ／ｄＬになるように添加したものを試料５とした。【０１４０】  （６）  試料６の調製
干渉チェックＡプラス・ビリルビンＣ又は干渉チェックＡプラス・ビリルビンＦの代わりに生理食塩水を添加したものを試料６（ビリルビン無添加試料：ビリルビン添加濃度が０ｍｇ／ｄＬ）とした。【０１４１】３．  試料の測定
前記２の各試料中の抱合型ビリルビン又は遊離型ビリルビン濃度を、前記１で調製した第１試薬（Ａ）〜（Ｅ）及び第２試薬にて実施例９の３と同様にして測定を行った。【０１４２】４．  測定結果
試料１〜３の測定結果を表９に、試料４〜６の測定結果を表１０に示した。なお、表９及び表１０に示した値は、測定で得られた吸光度差を１０，０００倍した値である。また、表９及び表１０において、かっこ内の数値は、第１試薬（Ａ）を使用した際の測定値（吸光度差）を１００％とした時の百分率を求めたものである。【０１４３】
【表９】
2005134368.tif 000010
【０１４４】
【表１０】
2005134368.tif 000011
【０１４５】  表９及び表１０から明らかなように、第１試薬にカルシウム塩とともに陰イオン性界面活性剤を含有させた第１試薬（Ｃ）〜（Ｅ）を用いた場合には、カルシウム塩のみを含有させた第１試薬（Ｂ）を用いた場合に比べて、抱合型ビリルビン（直接ビリルビン）の測定で得られた吸光度差と遊離型ビリルビン（間接ビリルビン）の測定で得られた吸光度差との差異が増加していることが分かる。【０１４６】  これらのことより、カルシウム塩と陰イオン性界面活性剤の存在下で、試料を亜鉛イオンと接触させると、抱合型ビリルビン（直接ビリルビン）の測定で得られた吸光度差と遊離型ビリルビン（間接ビリルビン）の測定で得られた吸光度差との差異を増加させることができるので、これにより抱合型ビリルビン（直接ビリルビン）の分別定量を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のビリルビン測定試薬を用いて試料中のビリルビンを測定した結果を示したグラフである。
【図２】本発明のビリルビン測定試薬を用いて試料中のビリルビンを測定した結果を示したグラフである。
【図１】
2005134368.tif 000012
【図２】
2005134368.tif 000013