(57)【要約】      （修正有）【課題】  正確かつ迅速にサルモネラ菌の強毒株と弱毒株を識別する方法、およびサルモネラ菌の弱毒化方法を提供すること。【解決手段】  毒性を示すサルモネラ菌に特異的に含まれる、特定のアミノ酸配列からなるタンパク質若しくはその塩またはこのタンパク質をコードするｍＲＮＡを検出すること、およびサルモネラ菌の過酸化水素耐性を検査することを含む、サルモネラ菌の毒性検査方法、および弱毒化したサルモネラ菌を含むワクチンを提供した。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルモネラ菌に含まれる、
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質若しくはその塩、または
（ｂ）前記タンパク質をコードするｍＲＮＡ、を検出することを含むサルモネラ菌の毒性検査方法。
【請求項２】
前記タンパク質またはその塩の検出を、前記タンパク質に対する抗体を用いて行うことを特徴とする、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩の生物活性を阻害することを含む、サルモネラ菌の弱毒化方法。
【請求項４】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の発現を抑制することを含む、サルモネラ菌の弱毒化方法。
【請求項５】
前記発現の抑制が、サルモネラ菌において前記タンパク質をコードするＤＮＡを欠失させることにより行われることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項３から５のいずれか１項に記載の方法で弱毒化したサルモネラ菌。
【請求項７】
請求項６に記載のサルモネラ菌を含む、サルモネラ菌感染に対するワクチン。
【請求項８】
前記サルモネラ菌が、さらにＩｎｖＡをコードするＤＮＡが欠失されている、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを用いて宿主を形質転換することを含む、該宿主の過酸化水素耐性を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毒性を示すサルモネラ菌において特異的に発現しているタンパク質に関連するサルモネラ菌の毒性検査方法、弱毒化方法、および弱毒化したサルモネラ菌を含むワクチン等に関する。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラ菌は、大腸菌属や赤痢菌属などとともにグラム陰性の通性嫌気性桿菌で、腸内細菌科に含まれる細菌の一種であり、非常に多くの血清型が見出されている。このうち約１００程度の血清型が食中毒に関与しているものと考えられているが、特に問題とされているのは、ヒトの急性胃腸炎の原因となるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（以下「ＳＥ」という）という血清型である。ＳＥによる食中毒は卵関連食品によるものが多く、主としてＳＥに感染した保菌鶏が産んだ卵に起因している。サルモネラ菌対策として、洗浄や消毒、隔離による伝播の防止のほか、適切なサルモネラ菌検査、汚染種鶏の淘汰、不活化ワクチンの応用などが重要視されている。
【０００３】
サルモネラ菌による汚染の有無の検査方法として、サルモネラ菌が保持している遺伝子をＰＣＲ法によって特異的に増幅し、この遺伝子を検出する方法が知られている。検出する遺伝子としては、例えば、サルモネラ菌が腸管から侵入する際、サルモネラ菌を腸管上皮細胞に付着させるタンパク質をコードするＩｎｖＡ遺伝子が挙げられる。
【０００４】
従来から、サルモネラ菌、特にＳＥで食中毒を起こすのは限られた株であり、毒性を有しない株も存在するとの報告がある。しかし、ＩｎｖＡ遺伝子はほとんど全てのサルモネラ菌が保持しており、これを検出することによって強毒株と弱毒株を識別することはできない。
【非特許文献１】Parkhill J. et al. Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2. Nature. 413:852-856. 2001.
【非特許文献２】Martinez A & Kolter R. Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein dps. J. Bacteriol. 179:5188-5194. 1997.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
食品のサルモネラ菌の汚染を検査する際に、食中毒を起こす強毒株か、起さない弱毒株かまで識別することができれば、弱毒株に対しては上述したサルモネラ菌対策を行う必要がなくなる。また、その識別法を応用して、毒性を弱めることができるようになれば、この弱毒化サルモネラ菌をワクチンに用いることができる。
【０００６】
すなわち、本発明は、正確かつ迅速にサルモネラ菌の強毒株と弱毒株を識別する方法、およびサルモネラ菌の弱毒化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に鑑みて検討と研究を重ねた。その結果、予想外にも、
（１）マウスに対する致死性を示す強毒株では発現し、致死性を示さない弱毒株では発現していないタンパク質が存在すること；
（２）上記タンパク質をコードする遺伝子を欠損させると、強毒株も弱毒化されること；また、
（３）上記タンパク質を発現している強毒株は、弱毒株に比較して過酸化水素耐性に優れていること、等を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、
〔１〕サルモネラ菌に含まれる、（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質若しくはその塩、または（ｂ）前記タンパク質をコードするｍＲＮＡ、を検出することを含むサルモネラ菌の毒性検査方法；〔２〕前記タンパク質またはその塩の検出を、前記タンパク質に対する抗体を用いて行うことを特徴とする、上記〔１〕に記載の検査方法；〔３〕配列番号：１に記載のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩の生物活性を阻害することを含む、サルモネラ菌の弱毒化方法；〔４〕配列番号：１に記載のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の発現を抑制することを含む、サルモネラ菌の弱毒化方法；〔５〕前記発現の抑制が、サルモネラ菌において前記タンパク質をコードするＤＮＡを欠失させることにより行われることを特徴とする上記〔４〕に記載の方法；上記〔３〕から〔５〕のいずれか１項に記載の方法で弱毒化したサルモネラ菌；〔７〕上記〔６〕に記載のサルモネラ菌を含む、サルモネラ菌感染に対するワクチン；〔８〕前記サルモネラ菌が、さらにＩｎｖＡをコードするＤＮＡが欠失されている、上記〔７〕に記載のワクチン；〔９〕配列番号：１に記載のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを用いて宿主を形質転換することを含む、該宿主の過酸化水素耐性を向上させる方法、に関する。
【０００９】
以下に、本願明細書において記載する記号、用語等の意義等を示して、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明に係るサルモネラ菌の毒性検査方法は、サルモネラ菌に含まれる、配列番号：１に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、まとめて「ＳＥＰ２２」という）またはその塩を検出することを含む。本発明者らは、養鶏場において卵、埃、壁等から採取したＳＥのクローンを、ＢＡＬＢ／ｃマウスに経口的に投与し、１６日間にわたって観察した。その結果、マウスに対して致死性を示す強毒性のクローン４種、ほとんど致死性を示さない弱毒性のクローン４種を得た。そして、それぞれのクローンの細胞抽出液を電気泳動により分離したところ、強毒株において大量に発現し、弱毒株ではほとんど発現が見られない分子量約２２ＫＤａのタンパク質を見出し、これをＳＥＰ２２と名付けた。
【００１１】
次に、抗ＳＥＰ２２抗体を作製し、これを用いて強毒株サンプルおよび弱毒株サンプルをウェスタンブロット法により分析したところ、強毒株では、弱毒株に比較してＳＥＰ２２の発現が顕著に多いことがさらに明らかとなった。
【００１２】
ＳＥＰ２２のアミノ酸配列を解析した結果、このタンパク質は、配列番号：１に記載のアミノ配列からなり、非特許文献１で「サルモネラ菌Ｄｐｓタンパク質」として報告されているタンパク質と同一であることが確認された。サルモネラ菌Ｄｐｓタンパク質については、従来その性質に関する報告はほとんどなく、サルモネラ菌の病原性との関連についてもまったく知られていなかった。
【００１３】
大腸菌もＤｐｓタンパク質を有することが知られる。サルモネラ菌Ｄｐｓタンパク質のアミノ酸配列は、大腸菌Ｄｐｓタンパク質のそれと９５％の相同性を示す。大腸菌Ｄｐｓタンパク質に関しては、ＤＮＡ付着性タンパク質であること、菌の過酸化水素耐性を向上させる機能を有することなどが報告されている。しかし、大腸菌Ｄｐｓタンパク質が、大腸菌の病原性や毒性と関連性を有するとの報告は今日まで全くされていない（非特許文献２）。
【００１４】
ここで、「配列番号：１に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸」とは、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸列、配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を意味する。かかるアミノ酸配列を含むタンパク質は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と、活性が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。
【００１５】
また、本発明に係るサルモネラ菌の毒性検査方法は、サルモネラ菌に含まれる、ＳＥＰ２２をコードするｍＲＮＡを検出して行うこともできる。発明者らが、サルモネラ菌をＤＮＡレベルおよびｍＲＮＡレベルで解析したところ、強毒株および弱毒株のいずれにおいてもＳＥＰ２２をコードするＤＮＡは検出されること、および強毒株ではｍＲＮＡが大量に発現しているが、弱毒株ではほとんど発現していないことを見出した。従って、ＳＥＰ２２をｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで検出することによって、毒性を判別することができる。
【００１６】
本発明における「塩」は、薬理学的に許容される塩である限りにおいて特に種類は限定されず、例えば塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩などの無機酸の付加塩；酢酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、トリフルオロ酢酸塩などの有機カルボン酸の付加塩；メタンスルホン酸塩、ヒドロキシメタンスルホン酸塩、ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、タウリン塩などの有機スルホン酸の付加塩；トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、プロカイン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ,Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、トリス（ヒドロキシメチルアミノ）メタン塩、フェネチルベンジルアミン塩などのアミンの付加塩；アルギニン塩、リジン塩、セリン塩、グリシン塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などのアミノ酸の付加塩等が好適である。
【００１７】
上記タンパク質またはその塩の検出方法は、自体公知の方法に従って行うことができ特に限定されないが、抗体を用いる方法が有効であり、例えばウェスタンブロット法その他のイムノアッセイなどが挙げられる。ウェスタンブロット法は、ＳＤＳ等を含むサンプルバッファーでタンパク質試料を変性させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥあるいは二次元電気泳動によりタンパク質を分子量に従って分離させる。続いて、ゲル内に展開したタンパク質を電気的に膜（例えば、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜等）に転写し、目的タンパク質に対する抗体と膜上で反応させる。抗体を125Ｉ標識やビオチン化等により標識しておくか、この抗体に結合する二次抗体を用いて、目的タンパク質を定量的に検出することができる。二次抗体には、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）やａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＰ）で標識した抗体などを用いることができ、一次抗体にウサギの産生する抗体を用いた場合は標識した抗ウサギＩｇＧ、マウスの産生する抗体を用いた場合は抗マウスＩｇＧが用いられる。
【００１８】
その他のイムノアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、免疫発光測定法、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ、あるいはＥＬＩＳＡ）などを用いることができる。固相に固定した抗体を用いる固相化法がよく用いられ、この抗体と目的タンパク質との複合体に標識した二次抗体を結合させる方法、結合阻止法（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、競合法などにより、抗体−目的タンパク質複合体を検出することができる。標識を用いずに、複合体の沈降反応、凝集反応、溶血反応などにより抗体−目的タンパク質複合体を検出する方法を用いてもよい。
【００１９】
ｍＲＮＡの検出も、自体公知の方法に従って行うことができ、特に限定されないが、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法やノーザンブロット法などが好適である。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法は、検出したいｍＲＮＡと相補的な配列を有するＲＮＡプローブを用いて、ｍＲＮＡの発現を検出する方法である。プローブはＲＩラベル（35Ｓ、33Ｐ等）や非ＲＩラベル（ｄｉｇｏｘｙ  ｇｅｎｉｎ（ＤＩＧ）、ビオチン、蛍光等）により標識しておく。標識したＲＮＡプローブ被検試料を接触させ、目的ｍＲＮＡと該ｍＲＮＡプローブとをハイブリダイズさせ、この標識によるシグナルを検出する。
【００２０】
ノーザンブロット法の場合は、まず変性条件下でｍＲＮＡを電気泳動により分離したのち、このｍＲＮＡを電気的に膜（例えば、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜等）に転写し、標識したＤＮＡやＲＮＡプローブを用いて、目的ｍＲＮＡを検出する。プローブは、目的ｍＲＮＡとハイブリダイズするＤＮＡやＲＮＡを用いることができるが、好ましくはｃＤＮＡである。ｃＤＮＡは、例えばＲＩ（〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ）や、ＤＩＧにより標識することができる。
【００２１】
本発明は、ＳＥＰ２２に対する抗体を含むサルモネラ菌の毒性検査用キットを提供する。上述のように、この抗体を用いてＳＥＰ２２を検出することにより、サルモネラ菌の毒性の有無または強弱を判別することができ、食品検査等に用いることができる。
【００２２】
上記抗体は、ＳＥＰ２２に特異的に結合するものであればよく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。ヒト以外の哺乳動物を本タンパク質で免疫することによって得た抗体のほか、ヒト抗体や、遺伝子組換えにより得られた抗体も、本発明のＳＥＰ２２に特異的に結合する限り本発明に含まれる。本発明にかかる抗体は、自体公知またはそれに準じた方法により製造することができるが、以下に代表的方法を例示する。ポリクローナル抗体は、ＳＥＰ２２を用いて哺乳動物、好ましくはマウスやラット等のげっ歯目、ウサギ目、サルなどの霊長目の動物を免疫し、血清を得て、この血清をＳＥＰ２２又はその部分ペプチドを固定したアフィニティーカラムに通して精製することにより得ることができる。またモノクローナル抗体は、まず同様に哺乳動物を免疫し、この動物から得た抗体産生細胞と、増殖力の強いミエローマ細胞とを融合させ、個々の融合細胞を分離し、求める抗体の生産能を検定することによって抗原の一つのエピトープに特異的に反応する抗体分子を1種だけ生産する細胞を選択し、この細胞を培養することによって製造することができる。またモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをベクターに挿入し、このベクターを宿主に導入して産生させて遺伝子工学的方法で得ることもできる。ヒト抗体遺伝子を導入したトランスジェニック動物を免疫すれば、ヒト抗体を産生することもでき、マウスのモノクローナル抗体の抗原結合部位をコードするｃＤＮＡとヒトのＩｇＧ遺伝子の定常部をコードする遺伝子を連結してこれをＢリンパ球に導入すればキメラ抗体分子を生産させることも可能であり、これらの抗体も本発明に含まれる。本発明の抗体は、ＳＥＰ２２を特異的に認識して結合する限り、フラグメントや修飾された抗体であってもよい。抗体のフラグメントとしては例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃフラグメント、またはシングルチェインＦｖなどが挙げられ、修飾された抗体としては例えばポリエチレングリコールなどの化合物と結合された抗体などが挙げられる。
【００２３】
本発明は、ＳＥＰ２２またはその塩の生物活性を阻害することを含む、サルモネラ菌の弱毒化方法をも包含する。発明者らは、強毒株においてＳＥＰ２２遺伝子をノックアウトする実験を行ったところ、この強毒株のマウスに対する致死性が弱められることを確認した。ここでノックアウトとは、目的遺伝子を欠失させるか、または目的遺伝子に変異を施して機能不全とすることを意味する。「生物活性を阻害する」とは、ＳＥＰ２２に直接又は間接的に作用することにより、ＳＥＰ２２の生物活性を低下させることを意味し、例えば、ＳＥＰ２２をコードする遺伝子の発現を抑制すること、ＳＥＰ２２と直接または間接的に相互作用することによりＳＥＰ２２の活性を阻害すること、などが挙げられる。ＳＥＰ２２遺伝子の発現を抑制する例としては、上述のノックアウト法に加え、アンチセンス法、ＲＮＡ干渉法（ＲＮＡｉ法）などが挙げられる。またＳＥＰ２２の活性を阻害する方法としては、ＳＥＰ２２抗体、ＳＥＰタンパク質のアンタゴニスト、その他ＳＥＰ２２タンパク質に親和性を有する物質等を用いる方法等が挙げられる。
【００２４】
本発明は、上記弱毒化されたサルモネラ菌を含む、サルモネラ菌感染に対するワクチンも提供する。ワクチンは、弱毒化されたサルモネラ菌と医薬的に許容される担体と混合することによって得ることができる。担体としては当該分野で慣用のもの、例えば生理食塩水、ダルベッコのイーグル培地などが使用でき、この中には例えば塩類、ｐＨ緩衝剤、安定化剤（例えばスキムミルク、カゼイン水解物）、乳化剤、保存料、等を含有させることができる。またワクチンには、さらに免疫力を増強するためのアジュバント（例えば油乳剤、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、リポポリサッカライド、サポニン類、ポリアニオン類、消化性ポリマー類など）を含有させてもよい。
【００２５】
上記ワクチンに含まれるサルモネラ菌は、さらにＩｎｖＡタンパク質の発現も抑制されていることが好ましい。ＩｎｖＡは、上述のように、サルモネラ菌が腸管から侵入する際、サルモネラ菌を腸管上皮細胞に付着させるタンパク質であり、これを持たないサルモネラ菌は腸管から侵入することができない。従って、サルモネラ菌におけるＩｎｖＡタンパク質の発現を抑制することにより、ワクチンの安全性をさらに高めることができる。ＩｎｖＡタンパク質の発現抑制は、ＩｎｖＡ遺伝子をノックアウトする方法、アンチセンス法、ＲＮＡ干渉法などにより行うことができる。
【００２６】
さらに、本発明は、ＳＥＰ２２をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを用いて宿主を形質転換することを含む、該宿主の過酸化水素耐性を向上させる方法をも含む。発明者らは、強毒株および弱毒株の各コロニーに過酸化水素を添加したところ、強毒株は過酸化水素に対して高い耐性を示すことを確認した。また、ＳＥＰ２２遺伝子をノックアウトした強毒株は、弱毒株に等しい低い耐性しか示さないことを確認し、ＳＥＰ２２と過酸化水素耐性の関係を明らかにした。上記過酸化水素耐性を向上させる方法によれば、バイオリアクタ中での培養など、過酸化水素濃度が高い環境におかれる細胞の過酸化水素耐性を向上させることができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、ＳＥＰ２２を検出することにより、正確かつ迅速に、サルモネラ菌の強毒株と弱毒株を識別することができる。また、ＳＥＰ２２の生物活性を阻害することによってサルモネラ菌を弱毒化することが可能となり、弱毒化されたサルモネラ菌をワクチンに用いることができる。さらに、ＳＥＰ２２による過酸化水素耐性を応用し、他の細胞等の過酸化水素耐性を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下に示す本発明の実施例、参考例等は例示的なものであり、本発明は以下の具体例に制限されるものではない。当業者は、以下に示す実施例に様々な変更を加えて本発明を最大限の実施することができ、かかる変更は本願特許請求の範囲に包含される。
【実施例１】
【００２９】
サルモネラ菌に含まれるＳＥＰ２２量またはＳＥＰ２２をコードするｍＲＮＡ量と毒性との関係
（１）強毒株および弱毒株の分類
表１に示す８種類のサルモネラ菌（ＳＥ）のクローンを、それぞれ１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに経口投与し、投与後１６日間にわたって生存数を観測した。結果を図１に示す。黒い三角は１匹について１×１０8個のサルモネラ菌を投与した結果を、白い丸は１匹について１×１０6個投与した結果を表す。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
図１から、クローンＮｏ．４、１４、１６、２６、２８はマウスに対する致死性をほとんど示さず、クローンＮｏ．７、１５、２３は致死性が高いことが確認され、それぞれ以降の実験で、弱毒株、強毒株として用いた。  
【００３２】
（２）各ＳＥクローンに含まれるタンパク質の比較
弱毒株および強毒株のクローンに含まれる全タンパク質を一次元電気泳動により分離した。結果を図２に示す。強毒株には見られる分子量約２２ＫＤａのバンドが、弱毒株には見られないことが確認された。  
【００３３】
（３）ウェスタンブロッティングによる解析
抗ＳＥＰ２２抗体を作製し、ウェスタンブロッティングを行った。定法に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、泳動したタンパクをＰＶＤＦ膜に転写後、抗ＳＥＰ２２抗体を用い、免疫染色により、ＳＥＰ２２を検出した。
結果を図３に示す。強毒株において、ＳＥＰ２２が非常に多く発現していることがより明らかになった。弱毒株においても、ＳＥＰ２２が少量発現していることが確認された。
【００３４】
以上（１）〜（３）の結果から、サルモネラ菌に含まれるＳＥＰ２２を検出することにより、そのサルモネラ菌の毒性が検査できることがわかった。また、抗ＳＥＰ２２抗体を用いて、ＳＥＰ２２を検出できることが確認された。  
【００３５】
（４）ＳＥＰ２２のアミノ酸配列解析
次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により、単独の泳動像を示したＳＥＰ２２を、ＰＶＤＦ膜に転写し、切り出したサンプルをサワディーテクノロジー社のカスタムプロテインシーケンシングサービスにより、エドマン法にて解析し、Ｎ末端側の１０個のアミノ酸の配列を決定した。決定したアミノ酸配列を、ゲノムネットからＢＬＡＳＴで検索したところ、このタンパク質は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる、サルモネラのＤｐｓが該当した。ＮＣＢＩのデータベースから、塩基配列を調べたところ、この遺伝子の上流および前半一部と後半一部およびその下流が判明したため、この遺伝子を挟み込むようにプライマーを作成し、ＰＣＲにより遺伝子配列を読んだ。
サルモネラ菌Ｄｐｓは、大腸菌Ｄｐｓタンパク質とアミノ酸配列において９５％の相同性を示した。  
【００３６】
（５）ＳＥＰ２２量と細胞周期との関係
サルモネラを培養し、経時的に菌を回収し、菌体をソニケートしたのち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写の後、抗ＳＥＰ２２抗体により免疫染色を行い、ＳＥＰ２２の発現と細胞周期の関係を調べた。  
【００３７】
結果を図４（Ａ）〜（Ｃ）に示す。
ＳＥＰ２２は、分裂期にはほとんど検出されず、分裂期から静止期にかけて急激に増加することが確認された。ＳＥＰ２２はＤＮＡ付着性を有するため、分裂期にＳＥＰ２２が存在すると、ＤＮＡに付着して分裂を阻害するためであると考えられる。  
【００３８】
（６）ＤＮＡレベルおよびｍＲＮＡレベルでのＳＥＰ２２の検出
菌体を、１００℃５分間加熱後、遠心後その上清をＳＥＰ２２特異的なプライマーを用いＰＣＲを行うと、ＤＮＡレベルでのＳＥＰ２２の検出が出来る。一方、菌体からトータルＲＮＡ抽出キットを用い、ＲＮＡを生成した後、ＤＮＡ分解酵素処理し、ＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、ＳＥＰ２２がｍＲＮＡに転写されているかを確認した。
【００３９】
結果を図５（Ａ）および（Ｂ）に示す。図５（Ａ）に示されるように、強毒株および弱毒株において、ＤＮＡレベルでは差が見られなかったが、同図（Ｂ）に示されるように、ｍＲＮＡレベルでは、強毒株にははっきりとＳＥＰ２２ｍＲＮＡのバンドが見られ、弱毒株には見られなかった。
【００４０】
（６）の結果から、ＳＥＰ２２をコードするＤＮＡを検出しても強毒株か弱毒株かの識別はできないが、ｍＲＮＡを検出することによって、この識別ができることが確認された。
【実施例２】
【００４１】
過酸化水素耐性
（１）強毒株および弱毒株の過酸化水素耐性の観測
強毒株および弱毒株の過酸化水素に対する耐性を測定した。強毒株、弱毒株の各クローンから、１コロニーずつ採取し、５ｍｌのＬＢ培地において、３７℃で１４時間培養した。氷上で培養液を１５分冷却し、ＯＤ５５０で濃度を調節した。直ちに冷過酸化水素を、最終濃度が０、１、５または１０ｍＭとなるように添加し、３７℃の湯せんにして、１５０ストローク／分で振とうさせた。氷上で培養液を１０分間冷却し、１０倍に希釈した。次に、１０の６乗および７乗倍に希釈した菌液を、ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃一晩培養後、形成されたコロニー数により生菌数を測定しＣＦＵとした。
【００４２】
結果を図６に示す。ＳＥＰ２２をほとんど産生しない弱毒株（Ｎｏ．１６）は、過酸化水素濃度の上昇に対するコロニー数の減少が速く、１０ｍＭでは生存しているコロニー数はゼロであった。一方、ＳＥＰ２２を産生する強毒株（Ｎｏ．１５）は、過酸化水素耐性に優れ、１０ｍＭでは、コロニー数はほとんど減少しなかった。  
【００４３】
（２）ＳＥＰ２２遺伝子をノックアウト時における強毒株の過酸化水素耐性の変化
温度感受性プラスミドｐＣＡＣＴＵＳを用いて、強毒株（Ｎｏ．１５）を定法に従いＳＥＰ２２遺伝子領域を欠損させることにより、ＳＥＰ２２ノックアウト株を作成した。これらの株の過酸化水素に対する耐性の変化は、ＬＢ培地一晩培養菌体を、低温下で一定の量の過酸化水素にさらした後、希釈によりＣＦＵを測定し調べた。
【００４４】
ノックアウト株、弱毒株（Ｎｏ．１６）および強毒株（Ｎｏ．１５）について、ウェスタンブロットを行い、ＳＥＰ２２遺伝子のノックアウトにより、ＳＥＰ２２の発現が阻止されたことを確認した。結果を図８に示す。
【００４５】
４つのノックアウト株（Ｎｏ．１５ＫＯ２〜５）には、ＳＥＰ２２は全く発現していなかった。強毒株には太いバンドが見られ、弱毒株にも少量のＳＥＰ２２が発現していることが確認された。
【００４６】
続いて、これらの株から採取した各クローンの過酸化水素耐性を測定した。測定方法は、上記（１）に従った。結果を図９に示す。
【００４７】
４つのノックアウト株および弱毒株から採取したサンプルでは、残存クローン数は、過酸化水素濃度５ｍＭでほとんどゼロとなった。これに対し、強毒株に由来するクローンは、過酸化水素濃度が１０ｍＭになっても、ほとんどのクローンが生存していた。
【００４８】
以上の結果から、ＳＥＰタンパク質を有することにより、サルモネラ菌の過酸化水素耐性が向上されることが明らかとなった。このことから、遺伝子組み換えによって、ある細胞内にＳＥＰ２２を発現させることでその細胞の過酸化水素耐性が向上されるといえる。
【００４９】
また、上記４つのノックアウト株および強毒株を、マウスに経口投与し、観測した。結果を図１０に示す。ＳＥＰ２２を発現しないノックアウト株を投与しても、強毒株ほどの強い致死性を示さないことが確認され、過酸化水素耐性がマウスへの致死性と相関性を有することがわかった。
【００５０】
過酸化水素の耐性実験と同様な方法で、菌が生存する最も高い過酸化水素濃度を測定し、この濃度の過酸化水素にさらした後、菌体を回収し、菌体をソニケートしたのち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写の後、抗ＳＥＰ２２抗体により免疫染色を行い、ＳＥＰ２２が誘導されるかを調べた。
【００５１】
過酸化水素の濃度を変化させ、３７℃で１時間インキュベートしてＳＥＰ２２の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＳＥＰ２２抗体を用いて検出した。結果を図１１に示す。過酸化水素の濃度が高くなるほど、ＳＥＰ２２の発現量が増加していることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】強毒株および弱毒株をマウスに経口投与した場合の致死性を測定した結果を示す。
【図２】強毒株および弱毒株の細胞抽出液の電気泳動の結果を示す。
【図３】図３は、強毒株および弱毒株の細胞抽出液を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す。
【図４】細胞周期とＳＥＰ２２量の変化の関係を測定した結果を示す。
【図５】ｍＲＮＡレベルおよびＤＮＡレベルでのＳＥＰ２２の検出実験の結果を示す。
【図６】強毒株および弱毒株の過酸化水素耐性を測定した結果を示す。
【図７】ノックアウト実験の概略を示す。
【図８】ＳＥＰ２２ノックアウト株、弱毒株および強毒株に含まれるＳＥＰ２２量を測定した結果を示す。
【図９】ＳＥＰ２２ノックアウト株、弱毒株および強毒株の過酸化水素耐性を測定した結果を示す。
【図１０】ＳＥＰ２２ノックアウト株、弱毒株および強毒株をマウスに経口投与した場合の致死性を測定した結果を示す。
【図１１】ＳＥＰ２２発現の過酸化水素による誘導を測定した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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