(57)【要約】      （修正有）【課題】新規な酢酸耐性遺伝子を取得し、また取得した酢酸耐性遺伝子を用いて、酢酸耐性が増強された酢酸菌を育種すること、酢酸菌に属する微生物の酢酸耐性を向上させる方法、さらに酢酸耐性が向上した酢酸菌を用いて、高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供すること。【解決手段】下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質ＴＰＩをコードするＤＮＡ。（Ａ）特定のアミノ酸配列を含むタンパク質。（Ｂ）特定のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位を含むアミノ酸配列を含み、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質ＴＰＩ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位を含むアミノ酸配列を含み、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【請求項２】
下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質ＴＰＩをコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位を含むアミノ酸配列を含み、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【請求項３】
下記の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３４０〜１１９７からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号３４０〜１１９７からなる塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質ＴＰＩをコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号３４０〜１１９７からなる塩基配列又はその一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質ＴＰＩをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項６】
請求項２又は３に記載のＤＮＡからのコピー数が細胞内において増幅されていることを特徴とする酢酸耐性が増強された微生物。
【請求項７】
微生物がアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌である請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
請求項６又は７記載の微生物を、アルコールを含有する培地で培養し、該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法により得られる、酢酸を高濃度に含む食酢。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酢酸耐性微生物に関し、より具体的には、微生物に由来する酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子のコピー数を増幅した微生物、及びこれらの微生物を用いて食酢を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
【０００３】
そのため、酢酸発酵においては、より高い酢酸濃度でも増殖能力や発酵能力が低下しないこと、すなわち酢酸耐性の強い酢酸菌を開発することが求められており、その一手段として、酢酸耐性に関与する遺伝子（酢酸耐性遺伝子）をクローニングし、その酢酸耐性遺伝子を用いて酢酸菌を育種、改良することが試みられている。
【０００４】
これまでの酢酸菌の酢酸耐性遺伝子に関する知見としては、アセトバクター属の酢酸菌の酢酸耐性を変異させて酢酸感受性にした株を元の耐性に回復させることのできる相補遺伝子として、クラスターを形成する３つの遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）がクローニングされていた（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
この内、ａａｒＡ遺伝子はクエン酸合成酵素をコードする遺伝子であり、又、ａａｒＣ遺伝子は酢酸の資化に関係する酵素をコードする遺伝子であると推定されたが、ａａｒＢ遺伝子については機能が不明であった（例えば、非特許文献２参照）。
【０００６】
これらの３つの酢酸耐性遺伝子を含む遺伝子断片をマルチコピープラスミドにクローニングし、アセトバクター・アセチ・サブスペシーズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO3288）株に形質転換して得られた形質転換株は、酢酸耐性の向上レベルが僅かでしかなく、また実際の酢酸発酵での能力の向上の有無については不明であった（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
一方、酢酸菌からクローニングされた膜結合型アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）をコードする遺伝子を酢酸菌に導入することによって、酢酸発酵において最終到達酢酸濃度の向上が認められた例が開示されている（例えば、特許文献２参照）。しかし、ＡＬＤＨはアルデヒドを酸化する機能を有する酵素であって酢酸耐性に直接関係する酵素ではないことから、ＡＬＤＨをコードする遺伝子が真に酢酸耐性遺伝子であるとは断定できないものであった。
【特許文献１】特開平３−２１９８７８号公報
【特許文献２】特開平２−２３６４号公報
【非特許文献１】Fukaya, M.ら、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）、１７２巻、ｐ．２０９６−２１０４、１９９０年」
【非特許文献２】Fukaya, M.ら、「ジャーナル・オブ・ファーメンテイション・アンド・バイオエンジニアリング（Journal of Fermentation and Bioengineering）、７６巻、ｐ．２７０−２７５、１９９３年」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上のように、従来より酢酸菌の酢酸耐性を遺伝子レベルで解明し、高い酢酸耐性を有する実用酢酸菌の開発に成功した例は報告されていない。しかし、酢酸耐性にすぐれた酢酸菌が開発されれば、従来より高濃度の酢酸発酵が行われ、高濃度酢酸、高濃度食酢の効率的製造が可能となることから、本発明者らは、再度、酢酸菌の酢酸耐性の向上を遺伝子レベルで解明することとした。
【０００９】
そして、本発明者らは各方面から検討した結果、酢酸耐性を実用レベルで向上させうる機能を有するタンパク質をコードする新規な酢酸耐性遺伝子を取得し、また、取得した酢酸耐性遺伝子を用いて、より強い酢酸耐性を有する酢酸菌を育種することが重要であるとの観点にたち、酢酸菌に属する微生物由来の酢酸耐性に関与する新規な遺伝子を提供すること、及び該遺伝子を用いて微生物の酢酸耐性を向上させる方法、特に酢酸菌に属する微生物の酢酸耐性を向上させる方法、さらに酢酸耐性が向上した酢酸菌を用いて、より高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供することを新規技術課題として新たに設定した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、酢酸存在下でも増殖し、発酵することができる酢酸菌には、他の微生物には存在しない特異的な酢酸耐性に関与する遺伝子が存在するとの仮説を立て、こうした遺伝子を用いれば、従来以上に微生物の酢酸耐性を向上させることができ、さらには高濃度の酢酸を含有する従来得ることができなかった新規食酢の効率的な製造法を開発することが可能になるとの新規着想を得た。
従来の酢酸耐性遺伝子の取得方法は、酢酸菌の酢酸感受性の変異株を相補する遺伝子をクローニングする方法などが一般的であった。
【００１１】
しかし、このような方法では産業上有用な酢酸耐性遺伝子を見出すことは困難であると考え、鋭意検討した結果、本発明者らは、酢酸菌から酢酸耐性遺伝子を見出す方法として、酢酸菌の染色体ＤＮＡライブラリーを構築し、この染色体ＤＮＡライブラリーを酢酸菌に形質転換し、通常１％程度の酢酸の存在下でしか生育できない株を、２％の酢酸の存在下でも生育可能にする遺伝子をスクリーニングすることによって取得する方法を開発した。
【００１２】
この方法によって、実際に食酢製造に用いられているグルコンアセトバクター属の酢酸菌から、酢酸耐性を実用レベルで向上させる機能を有する新規な酢酸耐性遺伝子をクローニングすることにはじめて成功した。
【００１３】
得られた酢酸耐性遺伝子は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいてホモロジー検索した結果、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子やブラディリゾビウム・ヤポニカム（Bradyrhizobium japonicum）のトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子などによって生産されるタンパク質とある程度の相同性を有しており、酢酸菌のトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子であると推定された。
【００１４】
取得された酢酸菌のトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子とアミノ酸配列レベルで３９．２％の、またブラディリゾビウム・ヤポニカムのそれとは３８．８％の相同性を有しており、その相同性の程度はきわめて低いものであったことから、トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子とはある程度似ているものの、酢酸菌に特異的な新規タンパク質（以下、「トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）」ともいう）をコードする新規遺伝子(以下、「トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）遺伝子」ともいう)であることが確認された。
【００１５】
また、該遺伝子をプラスミドベクターに連結して酢酸菌に形質転換し、コピー数を増幅させた形質転換株においては、顕著に酢酸耐性が向上し、その結果、エタノール存在下で該形質転換株を通気培養した場合に、増殖誘導期が短縮する上に、増殖速度、生酸速度が向上すると共に、さらに最終到達酢酸濃度が顕著に向上することなどを見出し、更に該タンパク質のアミノ酸配列、及びそれをコードする遺伝子ＤＮＡの塩基配列の決定にも成功し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明は下記のとおりである。
（１）下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質ＴＰＩ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位を含むアミノ酸配列を含み、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【００１７】
（２）下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質ＴＰＩをコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位を含むアミノ酸配列を含み、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【００１８】
（３）下記の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３４０〜１１９７からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号３４０〜１１９７からなる塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質ＴＰＩをコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号３４０〜１１９７からなる塩基配列又はその一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質ＴＰＩをコードするＤＮＡ。
【００１９】
（４）（２）又は（３）に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（５）（４）に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
（６）（２）又は（３）に記載のＤＮＡからのコピー数が細胞内において増幅されていることを特徴とする酢酸耐性が増強された微生物。
（７）微生物がアセトバクター属、又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌である（６）に記載の微生物。
（８）（６）又は（７）記載の微生物を、アルコールを含有する培地で培養し、該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
（９）（８）に記載の方法により得られる、酢酸を高濃度に含む食酢。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、酢酸耐性に関与する新規な遺伝子が提供される。この遺伝子を用いて、高酢酸濃度存在下での増殖機能（酢酸耐性）が向上し、高酢酸濃度の食酢を高効率で製造可能な育種株を取得することが可能である。従って、本発明は、高酢酸濃度の食酢を高効率に製造するために有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のタンパク質ＴＰＩをコードするＤＮＡの単離及びタンパク質
本発明のＤＮＡは、酢酸菌に由来するＴＰＩ遺伝子及び該遺伝子の調節配列をコードするものであり、また酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質ＴＰＩをコードしている（配列番号２）。
本発明のＤＮＡは、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の染色体ＤＮＡから次のようにして取得することができる。
【００２２】
まず、グルコンアセトバクター・エンタニイ、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（独立行政法人  産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、昭和５９年２月２３日に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託されている）の染色体ＤＮＡライブラリーを調製する。なお、染色体ＤＮＡは、常法（例えば、特開昭６０−９４８９号公報参照）により取得することができる。
【００２３】
次に、ＴＰＩ遺伝子を単離するために、上述のように得られた染色体ＤＮＡから染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々のＤＮＡ断片混合物を得る。切断反応時間などを調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。例えば、Ｓａｕ３ＡＩを温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／ｍｌで様々な時間（１分〜２時間）、染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。なお、後述する実施例１においてはＳａｕ３ＡＩを用いた。
【００２４】
次いで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、酢酸菌内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結し、組換えベクターを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素Ｓａｕ３ＡＩと相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素（例えばＢａｍＨＩ）を温度３０℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で、１時間以上ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。
【００２５】
次に、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と切断開裂されたベクターＤＮＡを混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼを温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で、１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えＤＮＡを得る。
染色体ＤＮＡから染色体ＤＮＡライブラリーを作製する方法は当技術分野で公知であり（例えばショットガン法）、上述した方法に限定されるものではない。
【００２６】
得られた組換えＤＮＡを用いて、通常は寒天培地上で１％よりも高濃度の酢酸の存在下では増殖することのできない酢酸菌、例えばアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No.1023）株（独立行政法人  産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、昭和５８年６月２７日に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託されている）を形質転換し、その後２％酢酸含有寒天培地に塗布し、培養する。生じたコロニーを液体培地に接種して培養し、得られる菌体からプラスミドを回収することで酢酸耐性遺伝子ＴＰＩを含むＤＮＡ断片を得ることができる。
【００２７】
本発明のＤＮＡとして、具体的には、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ、その内、塩基番号３４０〜１１９７からなる塩基配列はコード領域であり、配列番号２に示すタンパク質をコードするものである。
【００２８】
配列番号１に示す塩基配列及び配列番号２に示すアミノ酸配列（配列番号１の塩基番号３４０〜１１９７に対応）は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいてホモロジー検索したところ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子とアミノ酸配列レベルで３９．２％の、またブラディリゾビウム・ヤポニカム（Bradyrhizobium japonicum）のそれとは３８．８％の相同性を有しており、その相同性の程度はきわめて低いものであったことから、トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子とはある程度似ているものの、酢酸菌に特異的な新規タンパク質（タンパク質ＴＰＩ）をコードする新規遺伝子(ＴＰＩ遺伝子)であることが確認された。
【００２９】
本発明のＤＮＡは、該ＤＮＡがコードするＴＰＩ遺伝子の塩基配列が明らかとなったので、例えば、鋳型として酢酸菌グルコンアセトバクター・エンタニイのゲノムＤＮＡを用い、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ反応）によって、又は該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。そのようなプライマー又はプローブとしての機能を有する、ＴＰＩ遺伝子の一部の配列から作製されたＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。具体的には、限定されるものではないが、配列番号３及び４に示す配列からなるＤＮＡは、本発明においてプライマーとして使用することができる。ここで「プライマー又はプローブとしての機能を有する」とは、プライマー又はプローブとして使用することが可能な塩基配列の長さ、塩基配列の塩基組成などを有することを意味し、このようなプライマー又はプローブとして機能するＤＮＡの設計は当業者に周知である。
【００３０】
ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）の合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）製のサーマルサイクラーGene Amp PCR System 2400を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して、定法に従って行なうことができる。
【００３１】
また、本発明のＴＰＩタンパク質は、上記ＤＮＡによりコードされるものであり、具体的には配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むものである。配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が、酢酸耐性を増強する機能を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸に置換、欠失、挿入、付加、逆位等の変異が生じてもよい。
【００３２】
例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、本発明のタンパク質に含まれる。
【００３３】
上記のような変異アミノ酸配列を含む酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、あるいは逆位として塩基配列を改変することによっても取得することができる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、公知の突然変異処理によっても取得することができる。
【００３４】
また、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明のＤＮＡの変異型であって、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするものを合成することもできる。なお、ＤＮＡ、すなわち遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutan-K(タカラバイオ社製)やMutan-G(タカラバイオ社製)）などを用いて変異の導入が行われる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えばエラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャッフリングについてはStemmer, W. P. 1994, Nature, 370:389-391及びStemmer W. P., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 10747-10751を参照されたい。
【００３５】
ここで、本発明において「酢酸耐性を増強する機能」とは、高濃度の酢酸の存在下における微生物の増殖の促進や死滅を抑制する機能を指す。上述のようにして変異を導入した遺伝子が酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするか否かは、実施例に示すように、酢酸を含有する培地での生育の有無を判別することにより確認することができる。
【００３６】
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
【００３７】
具体的には、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基配列番号３４０〜１１９７からなる塩基配列又はその一部から作製したプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする核酸を単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一の、すなわち酢酸耐性を増強する機能を保持するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば７０％以上の相同性を有する核酸同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
【００３８】
（２）本発明の酢酸菌
本発明のＤＮＡは、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質ＴＰＩをコードするため、本発明のＤＮＡを利用して、高濃度酢酸存在下における増殖が促進された、すなわち酢酸耐性が増強された微生物を作製することができる。
【００３９】
微生物における酢酸耐性の増強は、例えば、組換えベクターにＴＰＩ遺伝子を連結し、該ベクターを用いて微生物を形質転換することによって、該遺伝子の細胞内でのコピー数を増幅すること、又は、該遺伝子の構造遺伝子と微生物中で効率よく機能するプロモーター配列とを連結した組換えベクターを用いて該微生物を形質転換することによって、該遺伝子からのコピー数を増幅して発現を増強することにより行うことができる。
【００４０】
本発明の組換えベクターは、前項「（１）本発明のタンパク質ＴＰＩをコードするＤＮＡの単離及びタンパク質」に記載したＴＰＩタンパク質をコードするＤＮＡを適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体は、本発明の組換えベクターを用いてＴＰＩ遺伝子が発現し得るように宿主を形質転換することにより得ることができる。
【００４１】
組換えベクターとしては、宿主で自律的に増殖し得るファージミド又はプラスミドを使用することができる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１１８，ｐＥＴ１６ｂ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３，ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージミドＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０，λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などを用いて形質転換体を作製することもできる。
【００４２】
また、マルチコピーベクター又はトランスポゾンなどを用いて目的のＤＮＡを宿主に導入することもでき、本発明においてはそのようなマルチコピーベクター又はトランスポゾンも本発明の組換えベクターに含まれるものとする。マルチコピーベクターとしては、ｐＵＦ１０６（例えば、Fujiwara, M. et al., Cellulose, 1989, 153-158参照）、ｐＭＶ２４（例えば、Fukaya, M. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1989, 55:171-176参照）、ｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）（例えば、特開昭６０−９４８８号公報参照）などが挙げられ、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１（例えば、Okumura, H. et al., Agric. Biol. Chem., 1988, 52:3125-3129参照）も挙げられる。また、トランスポゾンとしては、ＭｕやＩＳ１４５２などが挙げられる。
【００４３】
ベクターに本発明のＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００４４】
本発明のＤＮＡは、そのＤＮＡがコードする遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明の組換えベクターには、プロモーター、本発明のＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００４５】
また、染色体ＤＮＡ上のＴＰＩ遺伝子のプロモーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列に置き換えるには、相同組換え用のベクターを構築し、該ベクターを用いて微生物の染色体に相同組換えを起こすようにすればよい。そのようなプロモーター配列としては、例えば、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ３９６（タカラバイオ社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなどの酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列が挙げられる。相同組換えを行うためのベクターの構築に関しては当業者に周知である。このようにして微生物における内因性ＴＰＩ遺伝子を強力なプロモーターの制御下に配置することによって、該ＴＰＩ遺伝子からのコピー数が増幅され、発現が増強される。
【００４６】
形質転換に使用する微生物としては、導入されるＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌、乳酸菌等）、酵母やアスペルギルス属などの真菌が挙げられる。本発明においては、その増殖促進機能を増強するという目的から、微生物としては酢酸菌を使用することが好ましい。酢酸菌の中でも、アセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する細菌が特に好ましい。
【００４７】
アセトバクター属に属する細菌として、例えば、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）が挙げられ、具体的には例えば、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）、アセトバクター・アセチ・サブスピーシーズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８株（Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO3288）を用いることができる。
【００４８】
また、グルコンアセトバクター属に属する細菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・ユウロパエウスＤＭ６１６０（Gluconacetobacter europaeus DSM6160）、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）が挙げられ、具体的には例えば、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）を用いることができる。
【００４９】
酢酸菌を含む細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法（例えば、Fukaya, M. et al., Agric. Biol. Chem., 1985, 49:2091-2097参照）、エレクトロポレーション法（例えば、Wong, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:8130-8134参照）等が挙げられる。
【００５０】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などが用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００５１】
形質転換体は、導入する遺伝子内に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用して選択される。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、Ｇ４１８薬剤に抵抗性を示す微生物を選択する。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態において、形質転換体は、少なくとも配列番号１に示す塩基配列を有する核酸を含む組換えベクターであって、例えば、酢酸菌−大腸菌シャトルベクター（マルチコピーベクター）ｐＵＦ１０６に当該核酸を挿入した組換えベクターｐＴＰＩを、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）株に導入することにより得られる（実施例参照）。
【００５３】
アルコール酸化能を有するアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌において、上記のようにしてその酢酸耐性を増強すると、酢酸の生産量や生産効率を増大させることができる。
【００５４】
（３）食酢製造法
前項「（２）本発明の酢酸菌」に記載のようにして作製される、酢酸耐性を増強する機能を有する遺伝子のコピー数が増幅されたことにより酢酸耐性が選択的に増強された微生物（酢酸菌）であってアルコール酸化能を有するものは、酢酸存在下においても増殖し、さらに酢酸を生産することが可能であるため、食酢の製造に利用することができる。従って、ＴＰＩ遺伝子の発現コピー数が増幅された微生物をアルコール含有培地で培養し、該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることにより、高濃度の酢酸を含有する食酢を効率よく製造することができる。
【００５５】
本発明の製造法における酢酸発酵は、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行なえばよく、特に限定されるものではない。酢酸発酵に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物、エタノールを含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。
【００５６】
炭素源としては、グルコースやスクロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
【００５７】
また、培養は、静置培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は通常３０℃で行なう。培地のｐＨは通常２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調製することもできる。通常１〜２１日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸が蓄積する。
【００５８】
本発明によれば、微生物に対して、酢酸耐性を増強する機能を付与することができる。そして、アルコール酸化能を有する微生物、特に酢酸菌においては、高濃度酢酸存在下での増殖機能（酢酸耐性）が向上し、培地中に高濃度の酢酸を効率良く蓄積する能力を付与することができる。このようにして育種された微生物（酢酸菌）は、高濃度酢酸を含有する食酢の製造に有用である。
【実施例】
【００５９】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
（実施例１）グルコンアセトバクター・エンタニイからの酢酸耐性遺伝子のクローニングと塩基配列及びアミノ酸配列の決定
（１）染色体ＤＮＡライブラリーの作製
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）を、６％酢酸、４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン）で３０℃にて振盪培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。得られた菌体より、特開昭６０−９４８９号公報に記載の染色体ＤＮＡ調製法に従って染色体ＤＮＡを調製した。
【００６０】
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（タカラバイオ社製）で部分消化し、また大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＵＦ１０６を制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化して、切断した。これらのＤＮＡを適量ずつ混合し、ライゲーションキット（TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2、タカラバイオ社製）を用いて連結してグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを構築した。
【００６１】
（２）酢酸耐性遺伝子のクローニング
上記のようにして得られたグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを、通常は寒天培地上で酢酸濃度１％程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）に形質転換した。
その後、形質転換されたアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を、２％酢酸、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ寒天培地で、３０℃で４日間培養した。
【００６２】
そこで生じたコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ培地に接種して培養し、得られた菌体からプラスミドを回収したところ、図１に示した約３．３ｋｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片がクローン化されたプラスミドが回収でき、このプラスミドをｐＴＰＩ−１と命名した。さらに、２％酢酸を含有するＹＰＧ寒天培地でアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を生育可能にするＤＮＡ断片は、ｐＴＰＩ−１にクローン化された約３．３ｋｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片中の約１．８ｋｂｐのＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片であ
ることが確認できた。
【００６３】
このようにして通常は寒天培地上で酢酸濃度１％程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を２％酢酸含有寒天培地でも増殖可能にする酢酸耐性遺伝子断片を取得した。
【００６４】
（３）クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列の決定
上記のクローン化されたＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＵＣ１９のＰｓｔＩ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ切断部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法によって決定した結果、配列番号１に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。このようにして得られた遺伝子をＴＰＩと命名した。
【００６５】
配列番号１に示す塩基配列中には、塩基番号３４０から塩基番号１１９７にかけて、配列番号２に示す２８６個のアミノ酸をコードするオープンリーディング・フレーム（ＯＲＦ）の存在が確認された。
【００６６】
（実施例２）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の酢酸耐性遺伝子で形質転換した形質転換株での酢酸耐性の増強
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
上記のようにしてクローン化されたアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）由来の酢酸耐性遺伝子を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法によって増幅した。酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＵＦ１０６（Fujiwara, M. et al., Cellulose, 1989, 153-158参照）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化し、その部位に、増幅したＤＮＡ断片を、ベクター中に存在するｌａｃプロモーターによってＯＲＦの発現制御可能な方向に挿入し、ｐＴＰＩを作製した。ｐＴＰＩに挿入された増幅断片の概略を図１に示した。
【００６７】
ＰＣＲ法は次のようにして実施した。すなわち、鋳型として上記酢酸菌由来のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１（５’−ＴＴＴＣＣＧＧＴＣＧＧＧＣＡＣＣＡＴＡＣ−３’；配列番号３）及びプライマー２（５’−ＣＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＴＡＧＡＴＣＣＣＣ−３’；配列番号４）を用い、下記の条件にて、ＰＣＲ法を実施した。
すなわち、ＰＣＲ法は９４℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃２分を１サイクルとして、３０サイクル行った。
【００６８】
このｐＴＰＩをアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（Wong, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:8130-8134参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
【００６９】
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、酢酸耐性遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
【００７０】
（２）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＴＰＩを有するアンピシリン耐性の形質転換株を、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育について、シャトルベクターｐＵＦ１０６のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と比較した。
【００７１】
具体的には、エタノール３％とアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する１００ｍｌのＹＰＧ培地と、エタノール３％、酢酸３％とアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する１００ｍｌのＹＰＧ培地のそれぞれに、ｐＴＰＩを有する形質転換株とシャトルベクターｐＵＦ１０６を有する元株を接種し、３０℃で振とう培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
【００７２】
その結果、図２に示すように、酢酸を含有しない培地では形質転換株及び元株はほぼ同様の増殖が可能であったのに対し、３％酢酸と３％エタノールを添加した培地では、形質転換株は増殖が可能であるのに対して、元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株は増殖できないことが確認でき、酢酸耐性遺伝子の酢酸耐性増強機能が確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明により、酢酸耐性に関与する新規な遺伝子が提供され、さらに該遺伝子を用いてより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造可能な育種株を取得することができ、更に、該育種株を用いたより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造する方法の提供が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】Ｓａｕ３ＡＩを用いてクローニングされたグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片（ｐＴＰＩ−１）の制限酵素地図と酢酸耐性遺伝子の位置、及びｐＴＰＩへの挿入断片の概略図である。
【図２】グルコンアセトバクター・エンタニイ由来酢酸耐性遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の培養経過を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００７５】
配列番号３及び４：合成オリゴヌクレオチド
【図１】
2005040098.tif 000002
【図２】
2005040098.tif 000003
【配列表】
2005040098000001.app