(57)【要約】【課題】安定性に優れ、かつホウ酸もしくはその塩などの阻害剤を必要とせず高濃度のグルコースの定量が可能なデヒドロゲナーゼ、その製造法、それを用いたグルコースの測定法、及び測定試薬の提供。【解決手段】スルフォロバス・トウコウダイ  ストレイン７  ＮＢＲＣ１０５４５菌株の、少なくともトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０中での８０℃１０分の熱処理で９０％以上の活性を保持し、かつグルコースに対して３．９Ｍ以上のＫｍ値をもつ新規なデヒドロゲナーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記理化学的性質を有するデヒドロゲナーゼ。
（１）トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０中での８０℃１０分の熱処理で少なくとも９０％以上の活性を保持する
（２）グルコースに対するＫｍが３．９Ｍ以上である
【請求項２】
デヒドロゲナーゼが、スルフォロバス属に属する微生物由来である請求項１に記載のデヒドロゲナーゼ。
【請求項３】
スルフォロバス属に属する微生物が、スルフォロバス・トウコウダイ  ストレイン７  ＮＢＲＣ１０５４５菌株である、請求項２に記載のデヒドロゲナーゼ。
【請求項４】
デヒドロゲナーゼが、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼである請求項１〜３のいずれかに記載のデヒドロゲナーゼ。
【請求項５】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すデヒドロゲナーゼ。
（ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼ。
（ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をからなり、かつ請求項１記載の理化学的性質を有するデヒドロゲナーゼ。
【請求項６】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列表の配列番号１において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ請求項１に記載の理化学的性質を有するタンパク質。
【請求項７】
配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項８】
配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項９】
請求項８の形質転換体を培地で培養し、その培養物からデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするデヒドロゲナーゼの製造法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれかに記載のデヒドロゲナーゼを用いることを特徴とするグルコース測定法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかに記載のデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は溶液状態での安定性に優れ、かつグルコースに対するＫｍ値が大きい新規なデヒドロゲナーゼ、その製造法およびグルコース測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１７９）はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤと略称する）もしくはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェイト（以下ＮＡＤＰと略称する）の存在下、基質として１モルのＤ−キシロースに作用して１モルのＮＡＤもしくはＮＡＤＰを消費し、１モルのＤ−キシロノラクトンおよび１モルの還元型ＮＡＤ（以下ＮＡＤＨと略称する）もしくは還元型ＮＡＤＰ（以下ＮＡＤＰＨと略称する）に変換、およびその逆反応を触媒する作用を有する。従来、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼは、ブタ肝臓（非特許文献１）、ピキア・スティピティス（非特許文献２）、エシェリヒア・コリ Ｋ１２株（特許文献１）、アースロバクター・ｓｐ（特許文献２）由来のものなどが知られているが、これらのＤ−キシロースデヒドロゲナーゼのグルコースに対するＫｍ値及び安定性に関する記載は無い。
【０００３】
Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼを用いた糖の定量は、例えばエシェリヒア・コリ Ｋ１２株由来（特許文献１）または、アースロバクター・アウレセンサ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓａ）ＩＦＯ１２１３６株由来（特許文献３）のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを用いた例が挙げられる。しかしながら、これらは五炭糖の定量方法であり、六炭糖であるグルコースの測定に用いた例は無い。
【０００４】
血清および尿などの体液中のグルコース濃度は病態を良く反映していることから、体液中のグルコース濃度定量は、ヒトの健康診断、特に糖尿病の鑑別診断において、必須の検査項目となっている。そして重篤な糖尿病の患者では、ときには１０ｇ／ｄＬの高濃度におよぶ大量のグルコースが尿中に排泄される。酵素を用いた体液中のグルコースの定量方法として、グルコースオキシダーゼ・ペルオキシダーゼ系を用いた測定法、グルコキナーゼ・グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた測定法、そしてグルコースデヒドロゲナーゼを用いた測定法が利用されている（非特許文献３など）。グルコースオキシダーゼ・ペルオキシダーゼ系を用いた測定法では、高濃度のグルコースを測定する場合、溶存酸素の濃度が全反応を律速するものとなりやすく、正確なグルコース濃度の測定が困難になる。他方、グルコキナーゼ・グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた測定法では、グルコキナーゼのグルコースに対するＫｍ値が数ｍＭ程度と小さいため、反応終末端において存在するＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの紫外部吸収を測定する方法となるが、光学測定器の測定可能な吸光度限界によって、その測定可能な濃度範囲が一定の範囲に限られるため高濃度のグルコースを測定する事ができないという欠点がある。また、グルコースデヒドロゲナーゼを用いた測定法の場合も、グルコースに対するＫｍ値が数ｍＭ程度と小さいものであるためグルコキナーゼ・グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた測定法と同様の欠点がある。
【０００５】
この問題点を解決するために、グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの定量試薬にグルコースデヒドロゲナーゼとグルコースデヒドロゲナーゼの阻害剤としてホウ酸もしくはその塩の添加により、グルコースデヒドロゲナーゼの見かけのＫｍ値を増大し、高濃度域でのグルコースの定量が可能にする方法が報告されている（特許文献４）。しかしながら、ホウ酸もしくはその塩には経皮吸収による細胞毒性があり、例えば、殺菌消毒に有効だったホウ酸軟膏は、現在、皮膚外用剤として日本薬局方から削除されているほどであり、ホウ酸もしくはその塩を使用した試薬の使用および製造には危険が伴う。また、臨床診断薬用酵素は、液状での安定性に優れていることが必須の条件であるため、特許文献４の方法においてもグルコースデヒドロゲナーゼの安定性に優れている事が必須の条件となるが、特許文献４には阻害剤として使用されるホウ酸もしくはその塩がグルコースデヒドロゲナーゼの安定性に与える影響に関する記述は無い。
【０００６】
スルフォロバス・トウコウダイ  ストレイン７  ＮＢＲＣ１０５４５菌株の全ゲノム解析は終了しているので、配列表に示した当該Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列は公知である（非特許文献４）。しかし、非特許文献４中で配列表の遺伝子はアミノ酸一次配列の特徴からグルコースデヒドロゲナーゼをコードしている事を予想しているにすぎず、実際に配列表の遺伝子がコードしているタンパク質を発現および精製し、性質の検討を行った結果ではない。すなわち、配列表の遺伝子がコードしているタンパク質の性質は未知であった。
【特許文献１】英国特許出願公開第２２２０９４０号明細書
【特許文献２】特開昭５２−１３０９８３号公報
【特許文献３】特開平１１−３４６７９７号公報
【特許文献４】特開２０００−２６２２９９号公報
【非特許文献１】Aokiら、Identity of dimeric dihydrodiol dehydrogenase as NADP(+)-dependent D-xylose dehydrogenase in pig liver、Chemico-Biological  Interactions、Netherlands、ScienceDirect、2001、Jan 30、1-3、Vol.130-132、775-784
【非特許文献２】Kotterら、Isolation and characterization of the Pichia stipitis xylitol dehydrogenase gene、XYL2、and construction of a xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae transformant、Current Genetics、Sweden、Goteborg University、1990 Dec6、Vol.18、493-500
【非特許文献３】Hans-Ulrich Bergmeyer、Methods of Enzymatic Analysis、Vol.3、1983  November、1196-1227
【非特許文献４】Kawarabayasiら、Complete Genome Sequence of an Aerobic Thermoacidophilic Crenarchaeon、Sulfolobus tokodaii strain7、DNAReserch．Universal Academy Press、Inc.、2001 Aug31、4、Vol.8、123-140
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
安定性に優れ、かつホウ酸もしくはその塩などの阻害剤を必要とせず高濃度のグルコースの定量が可能なデヒドロゲナーゼ、その製造法、およびそれを用いたグルコースの測定法、測定試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
臨床診断薬分野では試薬を液状で保存するために、臨床診断薬用酵素は液状での安定性が優れていることが必須の条件である。また、酵素の反応速度論に基づいて、その酵素の基質となる物質を定量する場合、酵素の基質に対するＫｍ値（ミカエリス定数）が測定系における基質濃度よりも充分大きい事も必須の条件である。本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意努力した結果、スルフォロバス・トウコウダイ  ストレイン７  ＮＢＲＣ１０５４５菌株の遺伝子（配列表の配列番号２にそのＤＮＡ配列を記載）が、少なくともトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０中での８０度１０分の熱処理で９０％以上の活性を保持し、かつグルコースに対して３．９Ｍ以上のＫｍ値をもつ新規なＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする事を見出した。すなわち、本発明は以下の構成を有する。
[１]下記理化学的性質を有するデヒドロゲナーゼ。
（１）トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０中での８０℃１０分の熱処理で少なくとも９０％以上の活性を保持する
（２）グルコースに対するＫｍが３．９Ｍ以上である
[２]デヒドロゲナーゼが、スルフォロバス属に属する微生物由来である上記[１]に記載のデヒドロゲナーゼ。
[３]スルフォロバス属に属する微生物が、スルフォロバス・トウコウダイ  ストレイン７  ＮＢＲＣ１０５４５菌株である、上記[２]に記載のデヒドロゲナーゼ。
[４]デヒドロゲナーゼが、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼである上記[１]〜[３]のいずれかに記載のデヒドロゲナーゼ。
[５]以下の（ａ）または（ｂ）に示すデヒドロゲナーゼ。
（ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼ。
（ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をからなり、かつ請求項１記載の理化学的性質を有するデヒドロゲナーゼ。
[６]以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列表の配列番号１において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記[１]に記載の理化学的性質を有するタンパク質。
[７]配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクター。
[８]配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクターを含む形質転換体。
[９][８]の形質転換体を培地で培養し、その培養物からデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするデヒドロゲナーゼの製造法。
[１０] 上記[１]〜[５]のいずれかに記載のデヒドロゲナーゼを用いることを特徴とするグルコース測定法。
[１１]上記[１]〜[５]のいずれかに記載のデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定用試薬キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、安定性が良く、しかもホウ酸もしくはその塩などの阻害剤の非存在下でもグルコースに対するＫｍが充分に大きいＤ−キシロースデヒドロゲナーゼおよび微生物学的製造法、それを用いたグルコースの測定法、およびそれを用いたグルコース測定試薬を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のデヒドロゲナーゼは、少なくともトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０中での８０℃１０分の熱処理で９０％以上の活性を保持し、かつグルコースに対するＫｍ値が３．９Ｍ以上のデヒドロゲナーゼであれば、何ら限定されるものではないが、好ましくはスルフォロバス・トウコウダイ  ストレイン７ＮＢＲＣ１０５４５菌株由来のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼが挙げられる。本発明者らはスルフォロバス・トウコウダイ  ストレイン７ＮＢＲＣ１０５４５菌株由来の遺伝子（配列表の配列番号２）が、前記理化学的性質を有するＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする事を見出し、該酵素の精製および諸性質を検討した。
つぎに本発明で得られるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの酵素活性測定法および理化学的性質を述べる。
【００１１】
＜酵素作用＞
キシロースを基質として用いたときの反応式が式１、グルコースを基質として用いたときの反応式が式２のとおりである。
Ｄ−キシロース  ＋  ＮＡＤ（Ｐ）＋  ＜＝＞  Ｄ−キシロノラクトン  ＋  ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ  （式１）
Ｄ−グルコース  ＋  ＮＡＤ（Ｐ）＋  ＜＝＞  Ｄ−グルコノ−１、５−ラクトン  ＋  ＮＡＤ（Ｐ）  （式２）
【００１２】
＜酵素活性測定法＞
０．５Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を０．４ｍｌ、０．１ＭのＤ−グルコースまたはＤ−キシロースを０．１ｍｌ、および適当に希釈した酵素液０．４５ｍｌからなる酵素活性測定溶液０．９５ｍｌを層長１ｃｍの石英セル中で５０℃３分間予備加温した後、０．０２５ＭのＮＡＤまたはＮＡＤＰを０．０５ｍｌ添加して酵素反応を開始し、反応開始後１分後から２分後の３４０ｎｍにおける吸光度差を測定する（Ａｓ）。また、盲検として適当に希釈した酵素液の代わりに蒸留水を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定する（Ａｂ）。この酵素液使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位（１ユニット）は５０度で１分間に１マイクロモルのＮＡＤまたはＮＡＤＰをＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに還元する酵素量とし、計算式は次のとおりである。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×０．３５７×酵素の希釈倍率
【００１３】
＜熱安定性＞
Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼを１．８４ｍｇ／ｍｌになるように１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中に溶解し、各温度で１０分間熱処理した後のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果を図１に示す。これより少なくとも８０℃１０分で９０％以上の活性を保持していたことがわかった。
【００１４】
＜Ｄ−グルコースとＤ−キシロースに対するＫｍ値＞
ＮＡＤＰを補酵素としてＤ−グルコースまたはＤ−キシロースを基質として各基質と補酵素に対する見かけのＫｍ値を測定した。ＮＡＤＰ濃度は反応液中１．２５ｍＭに固定して、Ｄ−グルコースまたはＤ−キシロースの濃度を変化させて反応速度を測定し、ラインウェーバー・バーク逆数プロットによりＤ−グルコースまたはＤ−キシロースに対する見かけのＫｍ値を測定した。その結果、１．２５ｍＭのＮＡＤＰを補酵素としたときのＤ−キシロースデヒドロゲナーゼのグルコースに対するＫｍ値は３．９Ｍであり、キシロースに対するＫｍ値は１．４Ｍであった。
【００１５】
＜ＮＡＤＰに対するＫｍ値＞
Ｄ−グルコースまたはＤ−キシロースを基質としてＮＡＤＰに対する見かけのＫｍ値を測定した。Ｄ−グルコースとＤ−キシロース濃度は反応液中１０ｍＭに固定して、ＮＡＤＰの濃度を変化させて反応速度を測定し、ラインウェーバー・バーク逆数プロットによりＮＡＤＰに対する見かけのＫｍ値を測定した。その結果、１０ｍＭのＤ−グルコースを基質としたときのＤ−キシロースデヒドロゲナーゼのＮＡＤＰに対するＫｍ値は０．０２２ｍＭであり、１０ｍＭのＤ−キシロースを基質としたときのＤ−キシロースデヒドロゲナーゼのＮＡＤＰに対するＫｍ値は０．０１４ｍＭだった。
【００１６】
＜分子量＞
分子量は２５７ｋＤａ（Ｓｕｐｅｒｒｏｓｅ６ＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によるゲル濾過法にて）、４６ｋＤａ（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法にて）、４４、４１３（アミノ酸一次配列からの計算値）であった。したがって、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼは６量体である。
【００１７】
＜至適ｐＨ＞
前記酵素活性測定法にしたがって至適ｐＨを求め、その結果を図２に示す。図２は、ｐＨ５．５からｐＨ７．５の範囲は２００ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（図中○印）、ｐＨ７．５からｐＨ９．０の範囲はトリス−塩酸緩衝液（図中△印）、およびｐＨ９．０からｐＨ１０．０の範囲はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（図中□印）を使用した場合の最大活性を１００％とした相対活性を示すもので、これよりＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの至適ｐＨはｐＨ８．０からｐＨ９．０であることがわかった。
【００１８】
＜至適温度＞
前記酵素活性測定法にしたがって、活性測定時の反応温度を２０℃から９０℃の範囲とした結果を図３に示す。図３は活性測定時の反応温度を２０℃から９０℃の範囲とした場合の最大活性を１００％とした相対活性を示すもので、これよりＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの至適温度は５５℃であることがわかった。
【００１９】
＜ｐＨ安定性＞
１００ｍＭの各種緩衝液（Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼ、１．８４ｍｇ／ｍｌ）を３７℃で３０分間処理してその残存活性を前記酵素活性測定法にしたがって測定した結果を図４に示す。図４は、ｐＨ３．５からｐＨ５．５の範囲は１００ｍＭの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（図中○印）、ｐＨ５．５からｐＨ７．５の範囲は１００ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（図中△印）、ｐＨ７．５からｐＨ９．０の範囲はトリス−塩酸緩衝液（図中□印）、ｐＨ９．０からｐＨ１０．５の範囲はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（図中●印）、およびｐＨ１１．０からｐＨ１２．０の範囲はリン酸１水素ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（図中▲印）を使用したときの最大活性を１００％とした相対活性を示すもので、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼはｐＨ７．０からｐＨ１２．０の範囲で安定であった。
【００２０】
＜基質特異性＞
表１に示す各化合物を基質として前記酵素活性測定法にしたがって、補酵素としてＮＡＤまたはＮＡＤＰを使用した場合のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの活性を測定した。基質としてキシロース、補酵素としてＮＡＤまたはＮＡＤＰを使用した場合の測定値を１００％とした相対活性を表１に示した。Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼは基質としてキシロース、補酵素としてＮＡＤＰに基質特異性を示す。
【００２１】
＜金属イオンの影響＞
表２に示す各種金属塩を前記酵素活性測定溶液中に１ｍＭになるように添加し、各種金属塩がＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ活性に与える影響を調べた。金属塩を添加しない場合の測定値を１００％とした相対活性は表２に示すとおりで、各種金属塩による強い阻害は見らなかった。
【００２２】
本発明に関する配列表の配列番号１は、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼタンパクのアミノ酸配列を示し、配列番号２は、そのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をアミノ酸配列とともに示す。
その配列番号１のアミノ酸配列の１から４１２で表記されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側はアミノ酸残基またはポリペプチド残基を含む場合であってもよく、そのアミノ酸残基としてはシグナルペプチドまたはＴ７タグ、Ｈｉｓタグ、Ｓタグ、Ｔｒｘタグ、ＣＢＤタグ、ＤｓｂＡタグ、ＧＳＴタグ、ＮｕｓタグなどのＦｕｓｉｏｎ  Ｔａｇが挙げられる。
【００２３】
さらに、本発明のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを構成するアミノ酸配列は、配列表のアミノ酸配列の１から４１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する均等物も含まれる。例えば、配列番号１のアミノ酸配列の１から４１２のアミノ酸配列の一部から実質的になるアミノ酸配列や酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損または付加したものである。
【００２４】
本発明の配列表のアミノ酸配列１から４１２で表されるアミノ酸配列をコードする新規なＤＮＡは、そのＮ末端側およびＣ末端側のアミノ酸残基またはポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちいずれか１個のコドンからなるＤＮＡであれば良い。
【００２５】
さらに、本発明のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、配列表のアミノ酸配列１から４１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する均等物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡであっても良い。例えば、アミノ酸配列１から１、２３６中の一部分からなる実質的になるアミノ酸配列をコードするＤＮＡであってもよく、また酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損または付加したものである。
【００２６】
上記ＤＮＡの好適な例として配列表の配列番号１の１から１、２３６で表される塩基配列を有するＤＮＡを挙げる事ができる。該ＤＮＡは、５’末端の上流側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有したものでもよく、ＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡ以外のコドンであれば良い。さらに好ましくはＡＴＧ、ＧＴＧ、それら以外の開始コドンまたはシグナルペプチドに対応するコドンを有したものを挙げる事ができる。３’末端の１、２３６下流側には、アミノ酸をコードするコドンを１個以上有するか、または翻訳終止コドンを有するかのいずれでもよく、さらに、その３’末端側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有する場合には、このアミノ酸をコードするコドンの３’末端側に翻訳終止コドンを有する事が望ましい。
【００２７】
Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子の供与体である、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼを生産する微生物よりＤＮＡを分離精製した後、制限酵素などを用いて切断した該ＤＮＡと、同じく切断して直鎖状にした発現ベクターとを、両ＤＮＡの末端部をＤＮＡリガーゼなどにより結合閉環させ、かくして得られた組み換えＤＮＡプラスミドを宿主微生物に導入し、発現ベクターのマーカーと、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼの活性発現若しくはＤＮＡプローブを指標としてスクリーニングを行い、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有する組み換えＤＮＡプラスミドを保持する微生物を分離し、該遺伝子組み換え微生物を培養し、該培養菌体から該組み換えＤＮＡプラスミドを分離精製し、次いで該組み換えＤＮＡプラスミドからＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子であるＤＮＡを取得することにより得られる。
【００２８】
該ＤＮＡの供与体である微生物としては、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼを生産する微生物であれば、なんら限定されるものではないが、好ましくはスルフォロバス・トウコウダイ  ストレイン７（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ ｓｔｒａｉｎ７）ＮＢＲＣ１０５４５菌株が挙げられる。本発明を実施するにあたり、スルフォロバス属の培養形態としては液体培養、固体培養いずれも可能であるが工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。また、使用する培養源としては一般に微生物培養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩およびその他の微量栄養源の他、スルフォロバス属に属する微生物の利用できる栄養源であればすべて使用できる。
【００２９】
炭素源としてはグルコース、サッカロース、キシロース、マルトース、グリセロール、デキストリン、デンプン、アミノ酸などの他、脂肪酸、油脂、有機酸などが単独でまたは組み合わせて用いられる。窒素源としては無機窒素源、有機窒素源のいずれも使用可能であり、無機窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム、塩化アンモニウムなどがあげられる。また、有機窒素源としては大豆、米、トウモロコシ、小麦などの粉、コーンスティープリカー、ペプトン、肉エキス、カゼインアミノ酸、酵母エキスなどがあげられる。無機塩および微量栄養素としてはリン酸、マグネシウム、カリウム、鉄、カルシウム、亜鉛などの塩類の他ビタミン、非イオン性界面活性剤、消泡剤などの菌の生育やＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの生産を促進するものであれば必要に応じて使用できる。
【００３０】
培養は好気的条件で、培養温度は菌が発育し、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼが生産する範囲であればよく、通常６５から８０℃、好ましくは７０から７５℃である。培養時間は条件により異なるがＤ−キシロースデヒドロゲナーゼが最高収量に達する時間まで培養すればよく、通常２４から６０時間程度である。またＤ−キシロースデヒドロゲナーゼタンパク質をコードするＤＮＡを得るためには、具体的には以下のように行えば良いが、その操作法のうち常法とされるものは、例えばマニアティスらの方法（参考文献１）や、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。
【００３１】
Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼを生産する微生物に由来するＤＮＡ（以下ｔｏｔａｌＤＮＡと略称する）を採取するには、例えばＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを生産する微生物を培養し、得られる培養菌液から菌体を集菌し、次いでこれを溶菌させることによってＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有する溶菌物を調製する。溶菌方法としては、例えばリゾチームなどの細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要によりプロテアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併用され、さらに細胞壁の物理的破壊法である凍結融解（参考文献２）やフレンチプレス処理を上述の溶菌法と組合せで行っても良い。
【００３２】
この様にして得られた溶菌物からｔｏｔａｌＤＮＡを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール抽出による除タンパク処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。ｔｏｔａｌＤＮＡを分離する菌株としては、少なくとも８０℃１０分で９０％以上の活性を保持し、かつグルコースに対して３．９Ｍ以上のＫｍ値をもつＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを生産する微生物なら何でも良いが、好ましくはスルフォロバス・トウコウダイ  ストレイン７（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ ｓｔｒａｉｎ７）ＮＢＲＣ１０５４５菌株を使用すれば良い。
【００３３】
分離精製されたｔｏｔａｌＤＮＡを切断する方法は、常法に従って制限酵素処理により行えばよく、特に得られるｔｏｔａｌＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易ならしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に作用する、例えば、ＳａｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＭｌｕＩなどのＩＩ形制限酵素が適している。
【００３４】
ｔｏｔａｌＤＮＡ断片を組み込むベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組み換え用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主微生物とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが使用できる。また、プラスミドベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、プラスミドｐＥＴ−３ａ、ｐＥＴ−１１ａ、ｐＥＴ−３２ａなどのｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮ Ｉ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、枯草菌を宿主とする場合にはｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、放線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、酵母特にサッカロマイセス・セレビジアエを宿主とする場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３などが使用できる。このようなベクターを、ｔｏｔａｌＤＮＡの切断に使用した制限酵素で生成するＤＮＡ末端と、同じ末端を生成する制限酵素で切断してベクター断片を作成し、ｔｏｔａｌＤＮＡ断片とベクター断片とを、ＤＮＡリガーゼ酵素により常法に従って結合させれば良い。
【００３５】
ｔｏｔａｌＤＮＡの断片を結合したプラスミドを移入する宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１ｔｒｘＢ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃｌ、エシェリヒア・コリ ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｏｒｉｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｔｕｎｅｒ、エシェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００などが利用できる。また、微生物宿主が枯草菌に属する微生物の場合、バチルス・サチリス ＩＳＷ１２１４など、放線菌に属する微生物の場合、ストレプトマイセス・リビダンス ＴＫ２４など、サッカロマイセス・セルビシエに属する微生物の場合、サッカロマイセス・セルビシエ ＩＮＶＳＣ１などが使用できる。
【００３６】
宿主微生物に組み換えＤＮＡを移入する方法としては、例えば、宿主微生物がエシェリヒア・コリやサッカロマイセス・セルビシエ、ストレプトマイセス・リビダンスに属する微生物の場合には、常法に従ってコンピテントセル化した宿主菌株に組み換えＤＮＡの移入を行えばよく、菌株によっては電気穿孔法を使用しても良い。
【００３７】
形質転換体からのＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡの分離は、常法に従って行えば良い。上述の方法によって得られたＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子のＤＮＡの塩基配列は、デオキシ法（参考文献３）で解読すればよく、またＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを構成するポリペプチドの全アミノ酸配列は、塩基配列より予測決定できる。この様にして一度選択された組み換えＤＮＡは、組み換えＤＮＡを保持する形質転換微生物から取り出され、他の宿主微生物に移入することも容易に実施できる。また、さらに、該組み換えＤＮＡから制限酵素などにより切断してＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを切り出し、前記と同様な方法により切断して得られる他の開環ベクターの末端に結合させて新規な特徴を有する組み換えＤＮＡを作製して、他の宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
【００３８】
かくして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地に培養されることによりＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを産生し得るが、宿主微生物によってはＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子を移入するだけではＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ生産性を有しない場合がありうる。このような場合、得られたＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ゾラーの方法による部位特異的変異法による制限酵素認識部位の作製や、制限酵素による切り出しなどにより適切な形態で分離し、該宿主微生物に適合する遺伝子プロモーター下流にＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子を結合したＤＮＡを組み込んだプラスミドにより、新たな形質転換体を作成し、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼを産生させれば良い。
【００３９】
例えば、上記宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子を接続する遺伝子プロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子プロモーター（参考文献４）などが例示され、これらのプロモーターの下流にリボソーム結合部位を介在して、開始コドンＡＴＧやＧＴＧを有するＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ構造遺伝子を接続し、大腸菌を宿主とするベクターに組み込み、かくのごとくして作成されたプラスミドで大腸菌を形質転換すれば良い。
上記の遺伝子操作に一般的に使用される量的関係は、供与微生物からのＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡを０．１から１０μｇに対し、制限酵素を約１から１０ｕ、リガーゼ約３００ｕ、その他の酵素約１から１０ｕ、程度が例示される。
【００４０】
また、本発明のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼは公知の遺伝子操作手段により、本来の反応を触媒する性質を損なわないペプチドの変異をなしてもよく、このような変異体Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子は、本発明のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子から遺伝子工学的手法により作製される人工変異遺伝子を意味し、この人工変異遺伝子は前出の部位特異的変異法や、目的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮＡで置換するなどの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得られる。かくして取得された人工変異Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子をベクターに挿入して宿主微生物に移入させることによって変異体Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼを発現させることが可能であり、優れた性質を有する変異体Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼができればそれを製造することも可能である。
【００４１】
Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含み、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼを産生し得る形質転換微生物の具体的な例示としては、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９株にＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＥＴ−３２ａ−ＳＴ２５５６（図５）を導入した形質転換微生物が挙げられる。
【００４２】
また形質転換微生物により該Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼを製造するに当たっては、該形質転換微生物を栄養培地で培養して菌体内または培養液中に該Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼを産生せしめ、培養終了後、得られた培養物を濾過または遠心分離などの手段により菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡおよび／または適当な界面活性剤などを添加して該Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼの水溶液を濃縮するか、または濃縮する事なく硫安分画、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより処理して、純度の良い該Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼを得ることができる。
【００４３】
形質転換微生物の培養条件は、その栄養生理的性質を考慮して選択すれば良く、通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれば良く、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００４４】
培養温度は微生物が発育し、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくは２０から４２℃程度である。培養条件は、条件によって多少異なるが、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、エシェリヒア・コリの場合、通常は１２から４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくはｐＨ６から８程度である。
【００４５】
Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼは主としてその菌体内に含有、蓄積されており、その菌体内から抽出すれば良い。Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼの抽出法を例示すればまず培養物を固液分離し、得られた湿潤菌体をリン酸緩衝液やトリス−塩酸緩衝液などの溶液に分散し、リゾチーム処理、超音波処理、フレンチプレス処理、ダイノミル処理などの菌体破砕手段を適宜選択組み合わせて、粗製のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ含有液またはＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ封入体を得る。
【００４６】
封入体のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを可溶化する方法として、ｉｎ ｖｉｖｏでは大腸菌シャペロン遺伝子を共役発現して可溶性度を増大する方法がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏではメルカプトエタノール、尿素やグアニジンのような変性剤で封入体を完全にアンフォールディングした後、透析あるいは希釈により変性剤を除去してリフォールディングできる。この際、リフォールディング効率を上げるためにシクロアミロース、シクロデキストリン、界面活性剤、グルタチオン、アルギニンなどを使用しても良い。
【００４７】
粗製のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ含有液から公知のタンパク質や酵素などの単離、精製手段を用いて精製Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼを得る。例えば、粗製のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ含有液にアセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、硫酸アンモニウム、食塩などによる塩析法などを適用してＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを沈殿させ、回収する。さらに、この沈殿物を必要に応じて透析、等電点沈殿を行った後、電気泳動法などで単一の帯を示すまで、イオン交換体、ゲル濾過剤、吸着体などを用いるカラムクロマトグラフィーなどにより精製する。また、これらの方法を適当に組み合わせることによりＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの精製度が上がる場合は適宜組み合わせて行うことができる。
【００４８】
これらの方法によって得られる酵素は安定化剤として、各種の塩類、糖類、タンパク質、脂質、海面活性化剤などを加え、あるいは加えることなく、限外濾過濃縮、凍結乾燥などの方法により、液状または固形のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを得ることができ、また、適宜凍結乾燥を行ってもよく、この場合安定化剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミンなどを０．５から１０％程度添加しても良い。
【００４９】
本発明のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの定量法について説明する。本方法は、グルコースを含有する体液などの試料にＤ−キシロースデヒドロゲナーゼとＮＡＤまたはＮＡＤＰを作用させ、ＮＡＤまたはＮＡＤＰが還元されて生成するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨについて、その増加速度を紫外部におけるＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの吸光度増加により測定し、定量するものである。本発明のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼによるグルコースの測定方法の特徴は、（１）該酵素はデヒドロゲナーゼであるために、高濃度のグルコースを測定する場合、溶存酸素の濃度が全反応を律速しない、（２）該Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼはグルコースに対するＫｍ値が３．９Ｍと試料中のグルコース濃度に比べ充分大きいため、反応終末端において存在するＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの紫外部吸収を測定する方法と異なり、高濃度のグルコースを測定する場合でも、光学測定器の測定可能な吸光度限界によって、その測定可能な濃度範囲が一定の範囲に限られない、（３）該Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼはグルコースに対するみかけのＫｍ値を増大するために、酵素阻害剤を全く必要としない、という点にある。本発明のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼによりグルコースを測定すると、後述する実施例８に示すように、反応液中のグルコース濃度０．０２３g／ｄｌから１２．６ｇ／ｄｌまでＲ２＝０．９９９の正確な測定が可能である。すなわち本測定法の実施により、高濃度のグルコースを含有する試料であっても、検体の希釈等の煩雑な操作を省き、正確なグルコース定量が出来る。なお、本発明のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの定量法に使用される該Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼ量およびＮＡＤ（Ｐ）量は、測定する試料中のグルコース濃度に応じて変更できる。
【００５０】
上記のように、本発明Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼは従来知られている酵素とは明らかに異なる性質をもっており、特に高い安定性と大きなグルコースに対するＫｍ値をもっていた。
以下、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれらにより限定されるものではない。なお、実施例中、常法に従い、と記述した遺伝子操作技術は、例えば前出のマニアティスらの方法や、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。また、実験に使用した組み換えＤＮＡ実験酵素試薬（制限酵素など）、ベクターＤＮＡ、キット類は特に指摘しない限り宝酒造株式会社より購入したものである。
[参考文献]
参考文献１  Maniatis、T．、et al．Molecular Cloning．Cold Spring Harbor
Laboratory 1982、1989
参考文献２  特開昭６３−１８５３７１
参考文献３  Sangar、F.（1981）Science、214、1205-1210
参考文献４  特開平１−１４４９７６
【実施例１】
【００５１】
＜スルフォロバスの培養＞
スルフォロバス・トウコウダイ  ストレイン７（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ ｓｔｒａｉｎ７）ＮＢＲＣ１０５４５菌株は以下のような培地で培養した。
培地組成（１Ｌあたり）
（ＮＨ４）ＳＯ４                １．３ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                  ０．２８ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０          ０．２５ｇ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２０          ０．０７ｇ
ＦｅＣｌ３・６Ｈ２０          ０．０２ｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２０          １．８ｍｇ
Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２０    ４．５ｍｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０          ０．２２ｍｇ
ＣｕＣｌ２・２Ｈ２０          ０．０５ｍｇ
ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２０        ０．０３ｍｇ
ＣｏＳＯ４・７Ｈ２０          ０．０３ｍｇ
酵母エキス  １ｇ
カザミノ酸  １ｇ
上記培地１０ｍｌを水酸化ナトリウムでｐＨ３．０に調整し、オートクレーブ滅菌（１２１℃２０分）してスルフォロバス・トウコウダイを接種し、８０℃で４８時間前々培養した。これを、５ｍｌ水酸化ナトリウムでｐＨ３．０に調整し、オートクレーブ滅菌（１２１℃２０分）した上記の培地５０ｍｌに接種した。さらにこれを、８０℃で４８時間前培養したもの５０ｍｌを水酸化ナトリウムでｐＨ３．０に調整し、オートクレーブ滅菌（１２１℃２０分）した上記の培地５００ｍｌに接種し８０℃で４８時間培養した。培養終了後、培養物を７、０００ｒｐｍで１０分間遠心し集菌した。
【実施例２】
【００５２】
＜スルフォロバス・トウコウダイ  ストレイン７からのＤＮＡの抽出＞
実施例１で培養したスルフォロバス・トウコウダイ  ストレイン７ＮＢＲＣ１０５４５菌株の菌体を５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＥＤＴＡ、１５％シュークロースを含む１ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液で３７℃、１０分処理した後、ＳＤＳを最終濃度０．２５％になるよう添加して菌体を溶解した。さらに等量のフェノール／クロロホルム＝１：１混合液を加え、３０分攪拌した後、１２、０００ｒｐｍで１５分遠心分離処理をして水層を回収した。
回収した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を混合後、２倍量のエタノールを静かに重層し、ゲノムＤＮＡをガラス棒に巻き付かせて分離した。分離したゲノムＤＮＡを、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ水溶液（ＴＥバッファー）２０ｍｌに溶解し、２０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを２００μｌ加え、３７℃で１時間保温し、混在しているＲＮＡを分解した。次いで、等量のフェノール／クロロホルム混合液を加え、前記と同様に処理して、水層を分取した。分取した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）と２倍量のエタノールを加えて前記の方法でもう一度ゲノムＤＮＡを分離した。
この染色体を５０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶解し、ＴＥ飽和のフェノールとクロロホルムの１対１混和液２０ｍｌを加え、全体を懸濁した後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容器に移した。この分離した上層２０ｍｌに３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍｌとエタノール５０ｍｌを加え、撹拌後−７０℃で５分間冷却した後、遠心分離（２、０００Ｇ、４℃、１５分）し、沈澱した染色体を７５％ エタノールで洗い、減圧乾燥した。以上の操作によりスルフォロバス・トウコウダイ  ストレイン７のＤＮＡ標品１ｍｇを得た。
【実施例３】
【００５３】
＜ＰＣＲ法による配列表に示す遺伝子の増幅＞
ＰＣＲは以下の条件により行った。
【００５４】
（１）プライマー
センス：
５’−ｃａｃｇａｔａｃａｔａｔｇｇａａａｔａｔｃｔｃｔｃａａａｇｇ−３’
アンチセンス：
５’−ａａｔｔｇｇａｔｃｃｔｃａｔａｃｃｇｃａｃｃａｇａａｇｔａａ−３’
（２）ＰＣＲ反応溶液組成
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ                            １μｌ
１０倍濃縮のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに添付の緩衝液  ５μｌ
１ｍＭ塩化マグネシウム                               ２μｌ
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ                                 ７．５μｌ
１０１μｇ／ｍｌ  スルフォロバス・トウコウダイ  
ストレイン７のＤＮＡ                               １０μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ センスプライマー                  ５μｌ
アンチセンスプライマー                               ５μｌ
蒸留水                                             １４．５μｌ
（３）ＰＣＲ反応条件
（ａ）９８℃１５秒、（ｂ）６５℃２秒、（ｃ）７４℃３０秒、（ａ）から（ｃ）を３０回繰り返す
【実施例４】
【００５５】
＜Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼ発現プラスミドの構築＞
実施例３で増幅したＰＣＲ産物はＮｃｏＩとＢａｍＨＩで切断して精製し、これをｐＥＴ−３２ａのＮｃｏＩとＢａｍＨＩの切断部位に挿入し、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子が連結されたプラスミドを構築し、本プラスミドをｐＥＴ−３２ａ−ＳＴ２５５６と命名した。プラスミドｐＥＴ−３２ａ−ＳＴ２５５６の構造を図１示す。なお、図中の「ＳＴ２５５６」はＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ構造遺伝子を、「ａｐ」はアンピシリン耐性構造遺伝子を、「ｏｒｉ」は大腸菌プラスミドの複製起点領域を、「ｌａｃＩ」はｌａｃプロモーター領域をそれぞれ表す。このｐＥＴ−３２ａ−ＳＴ２５５６をエシェリヒア・コリ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｏｄｏｎ+株に導入した。実施例４ではＤ−キシロースデヒドロゲナーゼはチオレドキシン融合タンパクとして発現される。
【実施例５】
【００５６】
＜ｐＥＴ−３２ａ−ＳＴ２５５６保持大腸菌の培養とその細胞抽出液の調製＞
ｐＥＴ−３２ａ−ＳＴ２５５６を導入したエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｏｄｏｎ+株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、培養液の６００ｎｍの吸光度が０．６になったときにｌａｃプロモーター誘導剤である１ｍＭのＩＰＴＧ（和光純薬社製）を添加した。その後、３７℃でさらに４時間培養し、遠心分離（１５、０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１５、０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。
【実施例６】
【００５７】
＜ｐＥＴ−３２ａ−ＳＴ２５５６保持大腸菌の培養とその封入体の調製＞
ｐＥＴ−３２ａ−ＳＴ２５５６を導入したエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｏｄｏｎ+株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＳＢ培地に接種し、培養液の６００ｎｍの吸光度が０．６になったときにｌａｃプロモーター誘導剤である１ｍＭのＩＰＴＧ（和光純薬社製）を添加した。その後、３７℃でさらに４時間培養し、遠心分離（１５、０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１５、０００Ｇ、５分、４℃）し、沈殿を取得して粗封入体とした。粗封入体は４％トライトン  Ｘ−１００を含むＴＥで１回以上洗浄した後、蒸留水で１回以上洗浄した。
【実施例７】
【００５８】
＜Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼの精製法＞
実施例６で調整した封入体は２０ｍＭのメルカプトエタノールを含む６Ｍの塩酸グアニジンで１ｍｇ／ｍｌになるようにアンフォールディングして溶解し、４００ｍＭ  アルギニン塩酸塩、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  還元型グルタチオン、０．５ｍＭ  酸化型グルタチオン、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液で６時間かけて６倍に希釈し、２日間４℃で放置した後限外濾過膜で濃縮し、この酵素液を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて１５時間透析し、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼの活性体を得た。Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼの活性体はＴＳＫ  Ｇ−３０００ＳＷによるゲル濾過法にて完全にリフォールディングされている事と電気泳動で均一である事を確認された。
【実施例８】
【００５９】
＜Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの定量＞
グルコース濃度０．０２３ｇ／ｄｌから１２．６ｇ／ｄｌのグルコースを含むグルコース測定試液を作成した。グルコース測定試液は、２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、０．０２３ｇ／ｄｌから１２．６ｇ／ｄｌグルコース、１．２５ｍＭ  ＮＡＤＰから成る。グルコース測定溶液１ｍｌを層長１ｃｍの石英セル中５０℃で３分間予備加温した後、１．８４  ｍｇ／ｍｌのキシロースデヒドロゲナーゼを０．０５ｍｌ添加して酵素反応を開始し、反応開始後１分後から２分後の３４０ｎｍにおける吸光度差を測定する（Ａｓ）。また、盲検として適当に希釈した酵素液の代わりに蒸留水を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定する（Ａｂ）。この酵素液使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）を図６の縦軸に表した。反応液中のグルコース濃度０．０２３g／ｄｌから１２．６ｇ／ｄｌまでＲ２＝０．９９９の正確な測定が可能であることが判明した。
【表１】
2005278597.tif 000002
【表２】
2005278597.tif 000003
【産業上の利用の可能性】
【００６０】
本発明のデヒドロゲナーゼを用いれば、溶液状態の安定性に優れ、ホウ酸もしくはその塩などの阻害剤を用いることなく高濃度のグルコースの定量が可能となった。具体的には、グルコースに対するＫｍが充分に大きくグルコース測定に好適なＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ、その微生物学的製造法、それを用いたグルコース測定方法、及び測定試薬を提供できた。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの熱安定曲線を示すものである。
【図２】本発明のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの至適ｐＨを示すものである。
【図３】本発明のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの至適温度曲線を示すものである。
【図４】本発明のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼのｐＨ安定曲線を示すものである。
【図５】本発明Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現プラスミドｐＥＴ−３２ａ−ＳＴ２５５６の制限酵素地図を示すものである。
【図６】本発明のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの定量例を示すものである。
【図１】
2005278597.tif 000004
【図２】
2005278597.tif 000005
【図３】
2005278597.tif 000006
【図４】
2005278597.tif 000007
【図５】
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【図６】
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【配列表】
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