(57)【要約】【課題】  各種のＳＰＲ測定装置の装置感度の比較を迅速、高精度、かつ簡便に評価する方法を提供する。【解決手段】  表面プラズモン共鳴測定装置の感度をフローインジェクション分析法を用いて測定、評価する方法であって、  屈折率や粘性、密度等の物理化学定数の定まった各種濃度の蔗糖溶液を装置評価の試料溶液として用い、純水を移動相として一定の流速で流通させた表面プラズモン共鳴測定装置に一定体積の蔗糖溶液を注入し、蔗糖溶液の屈折率の違いを反映して得られる表面プラズモン共鳴の角度変化を測定し、  次いで、各濃度での表面プラズモン共鳴の角度変化応答に対する蔗糖溶液の屈折率と純水の屈折率の差分を求め、  求めた各値から蔗糖溶液と純水の屈折率の相関式を得、この相関式の比例定数部を相互に比較することにより、各種の表面プラズモン測定装置の感度を求めることを特徴とする、表面プラズモン共鳴測定装置の感度評価方法。【選択図】      なし 【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン共鳴測定装置の感度をフローインジェクション分析法を用いて測定、評価する方法であって、
屈折率や粘性、密度等の物理化学定数の定まった各種濃度の蔗糖溶液を装置評価の試料溶液として用い、純水を移動相として一定の流速で流通させた表面プラズモン共鳴測定装置に一定体積の蔗糖溶液を注入し、蔗糖溶液の屈折率の違いを反映して得られる表面プラズモン共鳴の角度変化を測定し、
次いで、各濃度での表面プラズモン共鳴の角度変化応答に対する蔗糖溶液の屈折率と純水の屈折率の差分を求め、
求めた各値から蔗糖溶液と純水の屈折率の相関式を得、この相関式の比例定数部を相互に比較することにより、各種の表面プラズモン測定装置の感度を求めることを特徴とする、表面プラズモン共鳴測定装置の感度評価方法。
【請求項２】
表面プラズモン共鳴測定装置の感度をフローインジェクション分析法を用いた測定、評価を、恒温槽による厳密な温度制御の条件の下で行うことを特徴とする請求項１に記載の感度評価方法。
【請求項３】
表面プラズモン共鳴測定装置用の試料分析用フローセルの性能評価方法であって、
フローインジェクション分析法を用い、純水を試料溶液として用い、蔗糖溶液を移動相として一定の流速で流通させ、一定体積の純水を注入し、純水が試料分析用フローセル上を流通する際に生じる移動相の蔗糖溶液との屈折率の違いを反映して得られる表面プラズモン共鳴の角度変化を測定し、
次いで、各濃度での表面プラズモン共鳴の角度変化応答に対する蔗糖溶液の屈折率から純水の屈折率の差分を求め、
求めた各値から純水と蔗糖溶液の相関式を得、この相関式の比例定数部を相互に比較することにより、試料分析用フローセルの性能を算出することを特徴とする、試料分析用フローセルの性能評価方法。
【請求項４】
表面プラズモン共鳴測定装置用の試料分析用フローセルの性能評価を、恒温槽による厳密な温度制御の条件の下で行うことを特徴とする請求項３に記載の性能評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴現象を利用した非標識でのリアルタイムの生体由来分子の相互作用を測定する表面プラズモン共鳴測定装置の装置感度評価方法及びその試料分析用フローセルの性能評価方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、表面プラズモン共鳴（以下、ＳＰＲとも称する）現象を利用した非標識でのリアルタイムの生体分子間相互作用を測定する装置（ＳＰＲバイオセンサー）が開発され、抗原・抗体の相互作用などがリアルタイムで観測可能になり、その原理を利用した様々な測定装置が市販されている。ＳＰＲバイオセンサーのほとんどは、Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ構造のプリズムデバイスを用いるものであり、平坦な金属界面の近傍に主として表面に垂直な振動電界成分が光によって誘起されることを利用している。この現象は、電子集団の励起表面プラズマ振動による表面波（表面プラズモン波）によって生じる。ＳＰＲバイオセンサーでは、デバイスとする金属界面に抗体又は抗原等を固定化した界面を設けて抗原抗体反応を行わせ、その際の金属薄膜に接する媒体部分の屈折率の変化から起こるプラズモン波の波数の変化や吸収ピークの大きさの変化などから生体分子間相互作用に関するセンシング情報を得ている。例えば、現在、世界中で最も使用されているＳＰＲバイオセンサーであるＢｉａｃｏｒｅシステム（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ社）も同様の測定原理から構築され、ＳＰＲ検出系、センサーチップ、マイクロ流路系の３つの技術を統合して、生体分子間相互作用を測定することで、標識分子を使わずにリアルタイムで生体分子の検出と複数個の分子間での相互作用をモニタリングできる。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ社のＳＰＲ測定装置の感度は１ＲＵ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｕｎｉｔｅ）＝１０ｐｇ／ｍｍ２とされ、１０μＬの測定試料量と少量化された高感度、高信頼性を有するバイオセンサーシステムである。
【０００３】
しかしながら、従来、実用化されている数々のＳＰＲ測定装置や研究者が試作したＳＰＲ測定装置は、各々での測定感度や試料分析用フローセル間での性能評価の指標が存在せず、相互の装置感度を比較検討することができず、最も優れた性能を示すＳＰＲ測定装置の作成とその試料分析用フローセルの設計や製作、または選択を行うことが出来なかった。現在の市販ＳＰＲ測定装置では、特に試料分析用フローセルは各社での独自性が高く、その構造も秘密とされており、各社各様の閉鎖系を取るため、使用者が独自の発案で自由に試料分析用フローセルや分析システムを構築することは困難であった。また、ＳＰＲ測定装置を自作する際でも、どのような構成が生体分子間相互作用を測定する上での最上の選択であるかについての評価指標がないため、百人百様の方法や構造が提案されているが、相互比較の方法が無かった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、このような従来技術の状況を踏まえてなされもので、各種のＳＰＲ測定装置の装置感度の比較を迅速、高精度、かつ簡便に評価する方法を提供することをその課題とする。
また、本発明は、前記ＳＰＲ測定装置の試料分析用フローセルの性能評価を迅速、高精度、かつ簡便に評価する方法を提供することを別の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、上記課題は下記の技術的手段により解決される。
（１）表面プラズモン共鳴測定装置の感度をフローインジェクション分析法を用いて測定、評価する方法であって、
屈折率や粘性、密度等の物理化学定数の定まった各種濃度の蔗糖溶液を装置評価の試料溶液として用い、純水を移動相として一定の流速で流通させた表面プラズモン共鳴測定装置に一定体積の蔗糖溶液を注入し、蔗糖溶液の屈折率の違いを反映して得られる表面プラズモン共鳴の角度変化を測定し、
次いで、各濃度での表面プラズモン共鳴の角度変化応答に対する蔗糖溶液の屈折率と純水の屈折率の差分を求め、
求めた各値から蔗糖溶液と純水の屈折率の相関式を得、この相関式の比例定数部を相互に比較することにより、各種の表面プラズモン測定装置の感度を求めることを特徴とする、表面プラズモン共鳴測定装置の感度評価方法。
（２）表面プラズモン共鳴測定装置の感度をフローインジェクション分析法を用いた測定、評価を、恒温槽による厳密な温度制御の条件の下で行うことを特徴とする前記（１）に記載の感度評価方法。
（３）表面プラズモン共鳴測定装置用の試料分析用フローセルの性能評価方法であって、
フローインジェクション分析法を用い、純水を試料溶液として用い、蔗糖溶液を移動相として一定の流速で流通させ、一定体積の純水を注入し、純水が試料分析用フローセル上を流通する際に生じる移動相の蔗糖溶液との屈折率の違いを反映して得られる表面プラズモン共鳴の角度変化を測定し、
次いで、各濃度での表面プラズモン共鳴の角度変化応答に対する蔗糖溶液の屈折率から純水の屈折率の差分を求め、
求めた各値から純水と蔗糖溶液の相関式を得、この相関式の比例定数部を相互に比較することにより、試料分析用フローセルの性能を算出することを特徴とする、試料分析用フローセルの性能評価方法。
（４）表面プラズモン共鳴測定装置用の試料分析用フローセルの性能評価を、恒温槽による厳密な温度制御の条件の下で行うことを特徴とする前記（３）に記載の性能評価方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のＳＰＲ測定装置の装置感度の評価方法によれば、屈折率既知の溶液（温度を例えば２０℃に制御し、かつ濃度を厳密に調整した蔗糖溶液）を使用することで、ＳＰＲ角度が一定の割合で変化すること、換言すれば所定の濃度に調製した蔗糖溶液を使用することで、ＳＰＲ測定装置の感度評価法の標準化が可能となる。
本発明は、蔗糖溶液の濃度が増加することにしたがい蔗糖溶液の屈折率が増加することに着目し、このような屈折率を一義的に定められる標準溶液を用いてＳＰＲ測定装置の感度定数を算出するようにしたので、該装置の感度を的確・簡便に評価できるといった利点を有する。
また、本発明によれば、ＳＰＲ測定装置の試料分析用フローセルの性能評価を迅速、高精度、かつ簡便に評価する方法を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象（文献：B. Liedberg, C. Nylander, I. Lundst-roem, Biosensing with Surface Plasmon Resonance - How It All Started, Biosens. Bioelectron., 10, 1-6, 1995、M. Ito, T. Imae, K. Aoi, K. Tsutsumiuchi, H. Noda, M. Okada, In situ Investigatation of Adlayer Formation and Adsorption Kinetics of Amphiphic Surface-Block Dendtrimers on Solid Substrates, Langmuir,18, 1140-1141, 2002）を利用したＳＰＲ測定装置における装置感度（装置定数）の測定、評価方法として、屈折率や粘性、密度等の物理化学定数の定まった蔗糖溶液を利用し、フローインジェクション（以下、ＦＩＡとも称する）分析法（文献：最新の分離・精製・検出法、梅澤善夫・澤田嗣郎・中村  洋監修、エヌ・ティー・エス、１９９７年、ｐ４５４−４７０）を用いて評価、測定する方法が知られている。また、近年、ＳＰＲ測定装置では、装置の一層のダウンサイジングによる分析試料量の微少量化、高感度、高分析効率化が重要とされ、このために試料分析用フローセルのマイクロ流路化の研究開発が精力的に推進されている。本発明は、このような背景を考慮してなされたものである。
【０００８】
本発明では、所期の目的達成のため、所定の濃度に調製した蔗糖溶液をその屈折率の厳密に定まった試料溶液として用い、試料溶液のフローセル通過の際でのＳＰＲ変化を検討した結果、ＳＰＲ検出値が一定の割合で変化することを利用し、この特性値の変化を利用することによりＳＰＲ測定装置の感度評価を可能とする。また、本発明では、通常のフローセル（非マイクロ流路型セル）とマイクロ流路型セルを利用して、ＳＰＲ測定データを収集することで、フローセルの性能評価を可能とする。換言すれば、本発明では、屈折率既知の各種溶液の流通時におけるＳＰＲ化を検出し、検出値からＳＰＲ装置の感度（装置感度定数）を算出することにより、ＳＰＲ測定装置の性能、及び使用するフローセルの性能を評価可能にする。また、本発明によれば、ＳＰＲ測定装置と試料分析用フローセル、送液ポンプ、測定溶液の全てを温度制御の厳密な恒温相中で温度制御することで、測定溶液や測定試薬の物理化学的性質を一定に制御することにより、高安定性・高再現性を示すデータが得られるＳＰＲ測定方法を実現する。
【実施例】
【０００９】
次に、本発明を下記の実施例によりさらに詳細に説明する。なお、これらの実施例は本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００１０】
本発明の実施例において利用したＳＰＲ測定システムを図１に示す。測定システムはＦＩＡ分析の構成に基づいて構築されている。検出に利用したＳＰＲ測定装置へ試料溶液を送液するポンプ（シリンジポンプやマイクロポンプ、プランジャーポンプなど）から試料溶液を導入する試料インジェクト部位を介してＳＰＲ測定部の結合したフローセル部分を経て、廃液溜へ廃液される構成になっている装置定数を測定するために試料溶液を調製した。測定試料溶液は文献のCRC Handbook of Chemistry and Physics(67th Edition,D-218〜D-269)に記載されている重量パーセント濃度に調製した蔗糖溶液を用いた。調整した蔗糖溶液の濃度範囲は０．５ｗｔ％から３０ｗｔ％までの範囲である。測定データの取り扱いを容易にするため、本発明では溶液屈折率変化を測定溶液の屈折率から純水の屈折率分を減じた値として用いた（Δｎ＝ｎ−ｎ０、ここでｎは各濃度の蔗糖溶液の屈折率で、ｎ０は純水の屈折率をそれぞれ示す）。その代表的な値としては、０．５ｗｔ％蔗糖溶液：７×１０−４、１ｗｔ％蔗糖溶液：１４×１０−４、５ｗｔ％蔗糖溶液７３×１０−４、１０ｗｔ％蔗糖溶液：１４８×１０−４、２０ｗｔ％蔗糖溶液：３０９×１０−４、３０ｗｔ％蔗糖溶液：４８２×１０−４を用いた。
【００１１】
ＳＰＲ測定においては、試料溶液の屈折率差を鋭敏に検出できるためＳＰＲ測定装置の検出範囲を満足しなければならない。使用した装置の検出範囲はＳＰＲ角度が６５°から７５°までである。さらに、ＣＲＣハンドブックでの屈折率の測定条件は２０℃となっているため、制御とデータ収集用のコンピューターをのぞいた、送液ポンプ、試料インジェクト部、試料溶液溜、測定溶液、ＳＰＲ測定装置はすべて恒温槽内へ入れ２０±０．１℃に保ち、試料溶液の温度も２０±０．１℃に制御することが本発明の要点である。図１に示す恒温槽で温度制御されたＳＰＲ測定システムを使用して以下のＳＰＲ測定を行った。
【００１２】
代表的なＳＰＲ測定条件としては試料注入量を１０μＬ、試料を送液するシリンジポンプの送液速度は１０μＬ／ｍｉｎである。屈折率測定を行うために純水（ｎ＝１．３３３０）を移動層として送液してＳＰＲ応答の時間依存性のベースラインが安定（角度変化が、０．０００５°／５分以下の小さな値となったことから判断）になったところで、濃度０．５ｗｔ％から３０ｗｔ％の蔗糖溶液の各１０μＬをそれぞれインジェクト部からＳＰＲ測定装置内に導入し、溶液の屈折率変化に伴うＳＰＲ応答を測定した。結果の一例を図２に示す。図２では、蔗糖溶液の濃度範囲は０．５ｗｔ％から３０ｗｔ％までを濃度の低いほうから順に注入し、三回繰り返して測定した。各ＳＰＲ応答が非常に良い再現性を示すことが明らかである。
【００１３】
図２に示す結果より各々のＳＰＲ応答の基準となる純水を移動層とした際の安定値（ベースライン）から各蔗糖溶液を注入した際のＳＰＲ変化が最大になる角度を算出して、各試料溶液のΔｎ＝ｎ−ｎ０に対してプロットした結果を図３に示す。ここで横軸は純水に対する各溶液の屈折率変化（Δｎ＝ｎ−ｎ０）であり、縦軸はそれぞれの濃度の蔗糖試料溶液を導入した際に得られる純水基準からの最大のＳＰＲ変化量である。ここで、各ＳＰＲ変化量と各溶液の屈折率変化との間には、各測定点で殆どばらつきが無く（縦軸のエラーバーが殆ど無い）、かつ非常に良い相関関係（相関係数：Ｒ＝０．９９９９）が得られることから、ＳＰＲ応答の測定感度が高精度の評価できることを示した。
【００１４】
一方、送液ポンプ、試料インジェクト部、試料溶液溜、測定溶液、ＳＰＲ測定装置を恒温槽内へ入れず、試料溶液の温度を制御しない場合を図４に示す。ここで、各ＳＰＲ変化量と各溶液の屈折率変化との間には、各測定点での変動が大きく（縦軸のエラーバーが大きい）、図３に比べて相関関係（相関係数：Ｒ＝０．９８８２）の若干の低下がみられた。これより、ＳＰＲ測定システム全体の温度制御の重要性が明らかとなった。
【００１５】
上記のＳＰＲ感度の評価方法を他の市販ＳＰＲ測定装置に適用した結果を図５に示す。図５から本実施例で使用したＳＰＲ測定装置の溶液の屈折率変化に対する応答感度が従来のＳＰＲ装置よりも優れていることが明らかとなった。従って、構成の異なるＳＰＲ測定装置間でも、同じＳＰＲ評価手法を用いることにより、装置間相互のＳＰＲ応答感度の比較が可能であることが実証できた。
【００１６】
次に、上述の評価方法により、汎用型フローセルと三種類のマイクロ流路型セルを用いた溶液の屈折率変化に対する応答感度についての性能評価を行った。
使用した汎用型フローセルと三種類のマイクロ流路型セルの形状とセル室の内部容積を表１に示す。ＳＰＲ応答の測定条件はサンプル量１０μＬ、試料を送液するシリンジポンプの送液速度は１０μＬ／ｍｉｎである。純水（ｎ＝１．３３３０）を移動層にしてＳＰＲ応答のベースラインが安定（角度変化が、０．０００５°／５分以下の小さな値となったことから判断）になったところで、濃度０．５ｗｔ％から３０ｗｔ％の蔗糖溶液をＳＰＲ測定装置内に導入し溶液の屈折率変化に伴うＳＰＲ応答を測定した。
【００１７】
マイクロ流路型セル（１）を用いた場合の結果を図６に示す。マイクロ流路型セル（２）を用いた場合の結果を図７に示し、マイクロ流路型セル（３）を用いた場合の結果を図８にそれぞれ示す。各々、蔗糖溶液の濃度範囲は０．５ｗｔ％から３０ｗｔ％までを濃度の低いほうから順にインジェクトし、三回繰り返して測定した。各ＳＰＲ応答が非常に良い再現性を示すことが明らかである。
【００１８】
図６から図８に示す結果より、各々のＳＰＲ応答での純水をベースラインとしたものから屈折率変化が最大になる角度を算出し、プロットした結果を図９に示す。ここで、横軸は屈折率変化であり縦軸はそれぞれの蔗糖濃度のサンプルを導入した際のＳＰＲ変化量である。その変化量からＳＰＲ装置の測定感度がマイクロ流路型フローセルを用いた場合でも感度評価できることが明らかとなった。
【００１９】
汎用型フローセルとマイクロ流路型セル（１）を用いた場合のＳＰＲ応答でのベースラインの安定性を比較した結果を図１０に示す。０．５ｗｔ％蔗糖溶液を用いた５回の連続測定で、汎用型フローセルではＳＰＲ応答のＳＰＲ応答でのベースラインが徐々に右下がりとなる、一方、マイクロ流路型セルを用いた場合には、このようなドリフトはみられない。この結果より、マイクロ流路型セルを用いた場合には、汎用型フローセルに比べてＳＰＲ応答でのベースラインの安定性が向上することが明らかとなった。
【００２０】
次に、移動層として送液している純水を蔗糖溶液に換え（逆相）、各濃度の蔗糖溶液を移動層とした中へ純水を導入し、逆相ＦＩＡによるＳＰＲ測定による試料分析用フローセル性能の評価を行った。測定条件はサンプル量１０μＬ、試料を送液するシリンジポンプの送液速度は１０μＬ／ｍｉｎである。逆相によるＳＰＲ測定を行うために０．５ｗｔ％から３０ｗｔ％蔗糖溶液を移動層の溶液にしてＳＰＲ応答のベースラインが安定になったところで、純水（ｎ＝１．３３３０）を導入しＳＰＲ変化を測定した。純水を試料溶液として４回繰り返して測定した結果の一例として、マイクロ流路型セル（１）を用いた場合のＳＰＲ応答で、０．５ｗｔ％蔗糖溶液中へ純水を導入した結果を図１１に、１０ｗｔ％蔗糖溶液中へ純水を導入した結果を図１２に、３０ｗｔ％蔗糖溶液中へ純水を導入した結果を図１３にそれぞれ示す（各々で、水を移動層とするＳＰＲ応答の逆方向のＳＰＲ応答を示す）。各ＳＰＲ応答がそれぞれの条件で非常に良い再現性を示すことが明らかである。
【００２１】
図１１から１３に示す結果より各々のＳＰＲ応答の基準となる各蔗糖溶液を移動層とした際の安定値（ベースライン）から純水を注入した際のＳＰＲ変化が最大になる角度を算出して、各試料溶液のΔｎ＝ｎ−ｎ０に対してプロットした結果を図１４に示す。ここで横軸は純水に対する各溶液の屈折率変化（Δｎ＝ｎ−ｎ０）であり、縦軸はそれぞれの純水を導入した際に得られる各濃度の蔗糖試料溶液基準からの最大のＳＰＲ変化量である。ここで、マイクロ流路型セル（１）〜（３）では、逆相でも各ＳＰＲ変化量と各溶液の屈折率変化との間には、各測定点で殆どばらつきが無く（縦軸のエラーバーが殆ど無い）、かつ非常に良い相関関係（相関係数：Ｒ＝０．９９９８）が得られた。
【００２２】
一方、汎用型フローセルでは、ＳＰＲ変化量と各溶液の屈折率との間には、溶液の屈折率が大きな値となるに従い、マイクロ流路型セルに比べて小さな値が得られた。従来は、その評価方法が明らかでなかったため汎用型フローセルもマイクロ流路型セルも、ＳＰＲ感度は同じものとして扱われていたが、本手法を用いると使用するフローセル構成の違いによるＳＰＲ応答感度の違いが明らかとなる。この評価法を用いることにより、ＳＰＲ測定装置用の感度の高いフローセルの設計とその性能評価が可能となる。
【００２３】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明で使用したＳＰＲ測定装置の概略図。
【図２】各濃度の蔗糖溶液に対するＳＰＲ変化の時間依存性を示す図。
【図３】溶液の屈折率変化とＳＰＲ変化との関係（恒温槽により２０±０．１℃に温度制御下に測定）を示す図。
【図４】溶液の屈折率変化とＳＰＲ変化との関係（温度補正なし）を示す図。
【図５】各ＳＰＲ装置の感度比較（恒温槽により２０±０．１℃に温度制御下に測定）を示す図。
【図６】各濃度の蔗糖溶液のＳＰＲ変化の時間依存性（マイクロ流路型（１）ＮＴＴ−ＡＴ（社）製を使用）を示す図。
【図７】各濃度の蔗糖溶液のＳＰＲ変化の時間依存性（マイクロ流路型（２）ＮＴＴ−ＡＴ（社）製を使用）を示す図。
【図８】各濃度の蔗糖溶液のＳＰＲ変化の時間依存性（マイクロ流路型（３）ＮＴＴ−ＡＴ（社）製を使用）を示す図。
【図９】各種フローセルを用いて測定したＳＰＲ変化と屈折率との関係を示す図。
【図１０】マイクロ流路型セルと汎用型非マイクロ流路型セルによる比較（０．５ｗｔ％蔗糖溶液を試料として繰り返し測定）を示す図。
【図１１】０．５ｗｔ％蔗糖溶液を移動層として純水を試料とした際のＳＰＲ変化（逆相ＦＩＡ分析）を示す図。
【図１２】１０ｗｔ％蔗糖溶液を移動層として純水を試料とした際のＳＰＲ変化（逆相ＦＩＡ分析）を示す図。
【図１３】３０ｗｔ％蔗糖溶液を移動層として純水を試料とした際のＳＰＲ変化（逆相ＦＩＡ分析）を示す図。
【図１４】各種フローセルをＳＰＲ測定に用いた際の屈折率変化に対するＳＰＲ変化の関係（逆相ＦＩＡ分析）を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１０】
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