(57)【要約】【課題】  致死性の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を発症するモデル動物や、かかるＧＶＨＤモデル動物を用いたＧＶＨＤの予防・治療剤のスクリーニング方法や、ＭＨＣクラスＩ分子を認識する受容体タンパク質ＰＩＲ−Ｂ及びその遺伝子や、ＰＩＲ−Ｂのヒトホモログを有効成分とするＧＶＨＤの予防・治療剤を提供すること。【解決手段】  ＰＩＲ−Ｂをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、ＰＩＲ−Ｂを発現する機能を失なったマウスをＧＶＨＤモデル動物として用い、ＧＶＨＤの予防・治療剤をスクリーニングする。ＰＩＲ−Ｂのヒトホモログとしては、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２等を挙げることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＩＲ−Ｂをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、ＰＩＲ−Ｂを発現する機能を失なった非ヒト動物からなることを特徴とする移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデル動物。
【請求項２】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１記載の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデル動物。
【請求項３】
致死量以下の放射線照射を行い、非自己の脾臓細胞を静脈内に投与することにより、致死性の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を発症することを特徴とする請求項１又は２記載の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデル動物。
【請求項４】
請求項１又は２記載の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデル動物に、非自己の脾臓細胞と被検物質とを静脈内に投与し、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の症状改善の程度を測定・評価することを特徴とする移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
致死量以下の放射線照射を行った後に、非自己の脾臓細胞と被検物質とを静脈内に投与することを特徴とする請求項４記載の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
ＰＩＲ−Ｂのヒトホモログを有効成分とすることを特徴とする移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防・治療剤。
【請求項７】
ＰＩＲ−ＢのヒトホモログがＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３又はＬＩＬＲＢ４であることを特徴とする請求項６記載の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防・治療剤。
【請求項８】
以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなるＭＨＣクラスＩ分子を認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＨＣクラスＩ分子との結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＭＨＣクラスＩ分子との結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列；
（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＭＨＣクラスＩ分子との結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＭＨＣクラスＩ分子との結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
【請求項９】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるＭＨＣクラスＩ分子を認識する受容体タンパク質。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がＭＨＣクラスＩ分子との結合活性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がＭＨＣクラスＩ分子との結合活性を有するアミノ酸配列；
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデル動物、詳しくはＰＩＲ−ＢノックアウトマウスからなるＧＶＨＤモデル動物や、かかるＧＶＨＤモデル動物を用いたＧＶＨＤの予防・治療剤のスクリーニング方法や、ＭＨＣクラスＩ分子を認識する受容体タンパク質ＰＩＲ−Ｂ及びその遺伝子や、ＰＩＲ−Ｂのヒトホモログを有効成分とするＧＶＨＤの予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫システムは、２つの確立した自己認識機構を有している。すなわち、Ｔ細胞、ＮＫ細胞の、それぞれＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキラー受容体である。胸腺間質細胞上に自己ペプチドを有する主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びクラスII分子は、自己に対する適切な反応性を有するＴＣＲをもつＴ細胞の選択に使われる。他方で、同種ＭＨＣクラスＩを有する細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）へのＴＣＲの関与は、ターゲットの除去を誘発する。ＮＫ細胞上の抑制キラー受容体は自己組織に損傷を与えないように、クラスＩ分子を認識する（例えば、非特許文献１〜３参照）。組織移植では、ドナーとレシピエントとの間のＭＨＣのミスマッチは、レシピエントＣＴＬによる移植片の拒絶を導く。反対に、免疫無防備状態の個体への骨髄移植は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の原因となり、ドナーのＣＴＬが、同種のＭＨＣクラスＩを有する樹状細胞（ＤＣ）等のレシピエントの抗原提示細胞によって活性化され、宿主組織に有害なダメージを与える（例えば、非特許文献４参照）。
【０００３】
最近、様々なヒトリンパ球及び骨髄細胞に発現するいくつかの白血球免疫グロブリン（Ｉｇ）様受容体（ＬＩＬＲ、以前は、ＩＬＴ／ＬＩＲ／ＭＩＲ／ＨＭ）が、ＭＨＣクラスＩ又はそれに関連する分子に結合することが示された（例えば、非特許文献５〜７参照）。ＩＴＩＭ（Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif）をハーバリングする抑制ＬＩＬＲである、ＭＨＣクラスＩを有するＬＩＬＲＢ１又はＬＩＬＲＢ２の関与は、ＣＤ４０リガンドを介してＩＬ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６等の様々なサイトカインの骨髄単球性細胞による分泌をダウンレギュレートするネガティブシグナルを伝達する（例えば、非特許文献５、７、９参照）。さらに近年、ＬＩＬＲＢ２及びＬＩＬＲＢ４が、同種間心臓移植における、移植片生着に関与していることが示唆された（例えば、非特許文献１０参照）。しかし、適切な動物モデルが存在しないため、ヒトＬＩＬＲの生理学的、病理学的な重要性に関する多くの解釈は、まだ確認されていない。
【０００４】
対のIｇ様受容体（ＰＩＲ）−Ａ及び−Ｂ（例えば、非特許文献１１、１２参照）は、構造、発現形式及びゲノム位置の類似性により、ヒトＬＩＬＲの関連体又はオルソログとして提案されている（例えば、非特許文献１３〜１７参照）。ＰＩＲ−Ａ及び−Ｂは、Ｂ細胞、マスト細胞、マクロファージ、顆粒球及びＤＣを含む様々な造血細胞系譜で発現するが、Ｔ細胞やＮＫ細胞では発現しない（例えば、非特許文献１２、１３参照）。ＰＩＲ−Ａ及びＰＩＲ−Bの外部ドメインのアミノ酸配列は、それらの中では、かなり相同性が高い（同一性９２％以上）（例えば、非特許文献１２、１３参照）。ＰＩＲ−Ａは、数多くの遺伝子によりコードされ、細胞表面での発現と、活性化シグナルのデリバリーには、Ｆｃ受容体共通γ鎖（ＦｃＲγ）を必要としている（例えば、非特許文献１４、１８〜２０参照）。反対に、ＰＩＲ−Ｂは、単一の遺伝子によってコードされ、その細胞質部分にＩＴＩＭを有し、Ｂ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）などの他の活性化型受容体の細胞間の関与によって、インビトロの受容体を介しての活性化シグナルを抑制する（例えば、非特許文献１９、２１、２２参照）。ＰＩＲ−Ｂ欠損（ＰＩＲ−Ｂ-/-）マウスを、Ｔ依存性抗原で免疫化したところ、増大したＩＬ−４生成及び増強したＩｇＧ１及びＩｇＥ生成を含む、Tヘルパー２（ＴH２）応答が増強し、アレルギー反応等のＴH２ゆがみ状況（ＴH２skewing condition）の発達におけるＰＩＲ−Ｂの制御的役割を示唆した（例えば、非特許文献２３参照）。ＬＩＬＲＢとの類似性と、及び脾細胞内のＰＩＲ−Ｂの恒常的なリン酸化が、β2−ミクログロブリン（β2ｍ）欠損（β2ｍ-/-）マウスにおいて減少することを見い出したこと（例えば、非特許文献２４参照）で、ＰＩＲ−Ｂが、古典的又は非古典的なＭＨＣクラスＩ分子を認識することを示唆した。胎児栄養芽細胞の非古典的なＭＨＣクラスＩｂである、ヒトの組織適合白血球抗原（ＨＬＡ）−Ｇが、ＰＩＲ−Ｂと結合する（例えば、非特許文献２５参照）との観察が、この点を裏付けている。しかし、ＰＩＲとＭＨＣクラスI間の相互作用、又は生理学的な重要性に対する直接な証拠はない。
【０００５】
他方、骨髄移植の際、免疫抑制剤（コルチコステロン（プレドニゾロン）、抗胸腺細胞グロブリン、シクロスポリン、など）が用いられている。これらの免疫抑制剤は、現在のところ拒絶反応を抑えるためには必須であるが、正常な免疫力低下（易感染症）以外にも、肝・腎機能を低下させるといった副作用がある。また、α−グリコシルセラミドを含有する移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を抑制し、かつ移植片の生着率を促進する薬剤（例えば、特許文献１参照）や、レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）アゴニストを有効成分とする移植片対宿主疾患および臓器移植時の移植片拒絶反応の予防・治療剤（例えば、特許文献２参照）や、末梢血移植後に、ヒトＧ−ＣＳＦを移植レシピエントに投与することにより、ＧＶＨＤを抑制する方法（例えば、特許文献３参照）が提案されている。
【０００６】
また、生体内でのＴｈ２型免疫応答の機構や、アレルギーの発症機構が解析することができ、かつＢ細胞の過剰応答のみならずアレルギーなどを発症しやすい、ＰＩＲ−Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損したＴｈ２型過剰免疫応答モデルマウスも知られている（例えば、特許文献４参照）。
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−２８４６９２号公報
【特許文献２】特開平１０−１５８１９２号公報
【特許文献３】ＷＯ０１／０２８５８１号公報
【特許文献４】特開２００３−１３４９６４号公報
【非特許文献１】Scand. J. Immunol. 55, 221-228, 2002
【非特許文献２】Nat. Rev. Immunol. 1, 41-49, 2001
【非特許文献３】Science 290, 84-89, 2000
【非特許文献４】Science 285, 412-415, 1999
【非特許文献５】J. Leukoc. Biol. 66, 375-381, 1999
【非特許文献６】Cytokine Growth Factor Rev. 11, 209-217, 2000
【非特許文献７】Annu. Rev. Immunol. 17, 875-904, 1999
【非特許文献８】J. Exp. Med. 186, 1809-1818, 1997
【非特許文献９】J. Immunol. 160, 3096-3100, 1998
【非特許文献１０】Nat. Immunol. 3, 237-243, 2002
【非特許文献１１】J. Biol. Chem. 272, 7320-7327, 1997
【非特許文献１２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 5261-5266, 1997
【非特許文献１３】J. Biochem. 123, 358-368, 1998
【非特許文献１４】J. Exp. Med. 189, 309-318, 1999
【非特許文献１５】Curr. Top. Microbiol. Immunol, 244, 137-149, 1999
【非特許文献１６】Immunol. Rev. 181, 215-222, 2001
【非特許文献１７】Nat. Rev. Immunol. 3, 445-453, 2003
【非特許文献１８】J. Exp. Med. 188, 991-995, 1998
【非特許文献１９】J. Immunol. 161, 4042-4047, 1998
【非特許文献２０】J. Biol. Chem. 274, 30288-30296, 1999
【非特許文献２１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2446-2451, 1998
【非特許文献２２】J. Exp. Med. 187, 1355-1360, 1998
【非特許文献２３】Nat. Immunol. 6, 542-548, 2002
【非特許文献２４】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 15086-15090, 1999
【非特許文献２５】Eur. J. Immunol. 32, 2418-2426, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＧＶＨＤの抑制物質としてのＴ細胞およびＮＫ細胞上に発現する分子が、Ｔ細胞およびＮＫ細胞上に発現し、ＧＶＨＤに関与する遺伝子欠損動物を用いたＧＶＨＤモデルなどで検討されているが、ＧＶＨＤでの特異的な関与がまだ明確ではない。本発明の課題は、致死性の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を発症するモデル動物や、かかるＧＶＨＤモデル動物を用いたＧＶＨＤの予防・治療剤のスクリーニング方法や、ＭＨＣクラスＩ分子を認識する受容体タンパク質ＰＩＲ−Ｂ及びその遺伝子や、ＰＩＲ−Ｂのヒトホモログを有効成分とするＧＶＨＤの予防・治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＰＩＲ−Ｂ、及び実質的にＰＩＲ−Ａも、様々なＨ−２分子と結合し、Ｈ−２結合後チロシン系細胞シグナリングを開始できることを見い出した。ＰＩＲ−Ｂ分子の細胞外部分のリコンビナント蛋白を哺乳類細胞のシステムを用いて作製し、ＰＩＲ−Ｂ蛋白とＭＨＣクラスＩ分子との結合をBiacore assay（表面共鳴反応）を行い、具体的にはBiacoreのセンサーチップ上にＭＨＣクラスＩ分子を固定したのちに、ＰＩＲ−Ｂ蛋白を流し、解離定数を測定することにより、ＭＨＣクラスＩ分子がＰＩＲ−Ｂのリガンドであることを証明した。また、ＧＶＨＤの抑制物質ＰＩＲ−Ｂが、ＧＶＨＤの起点となる樹状細胞上でＭＨＣクラスＩ分子の認識機構において重要な役割を果たすことを見い出した。さらに、あらかじめ非致死線量である６Ｇｙの放射線照射を行ったＰＩＲ−Ｂ-/-Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６、Ｈ−２b）マウスにＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）マウスの脾臓細胞を静脈注射したレシピエントマウスでは、樹状細胞（ＤＣ）の活性化が増加し、同時にＰＩＲ−Ａのアップレギュレーションがおきるので、急激に致命的なＧＶＨＤを発症することを見い出した。ＰＩＲ−Ｂは樹状細胞や、Ｂ細胞、マスト細胞をはじめとする骨髄球系細胞において、主要組織適合抗原ＭＨＣクラスＩ分子を認識する免疫グロブリン様受容体であり、その遺伝子欠損マウスは高感受性のＧＶＨＤモデル動物になるとの知見を得た。またＰＩＲ−ＢはＧＶＨＤの抑制物質として作用し、移植治療における新規の阻害物質となりうるとの知見を得た。本発明はこれらの知見に基づき完成するに至ったものである。
【００１０】
すなわち本発明は、ＰＩＲ−Ｂをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、ＰＩＲ−Ｂを発現する機能を失なった非ヒト動物からなることを特徴とする移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデル動物（請求項１）や、非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１記載の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデル動物（請求項２）や、致死量以下の放射線照射を行い、非自己の脾臓細胞を静脈内に投与することにより、致死性の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を発症することを特徴とする請求項１又は２記載の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデル動物（請求項３）や、請求項１又は２記載の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデル動物に、非自己の脾臓細胞と被検物質とを静脈内に投与し、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の症状改善の程度を測定・評価することを特徴とする移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項４）や、致死量以下の放射線照射を行った後に、非自己の脾臓細胞と被検物質とを静脈内に投与することを特徴とする請求項４記載の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項５）や、ＰＩＲ−Ｂのヒトホモログを有効成分とすることを特徴とする移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防・治療剤（請求項６）や、ＰＩＲ−ＢのヒトホモログがＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３又はＬＩＬＲＢ４であることを特徴とする請求項６記載の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防・治療剤（請求項７）や、以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなるＭＨＣクラスＩ分子を認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＨＣクラスＩ分子との結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＭＨＣクラスＩ分子との結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列；
（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＭＨＣクラスＩ分子との結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＭＨＣクラスＩ分子との結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；（請求項８）や、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるＭＨＣクラスＩ分子を認識する受容体タンパク質。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がＭＨＣクラスＩ分子との結合活性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がＭＨＣクラスＩ分子との結合活性を有するアミノ酸配列；（請求項９）に関する。
【発明の効果】
【００１１】
骨髄移植後のＧＶＨＤは、移植された骨髄にあるドナーの免疫細胞が宿主の組織に対する抗体を作ることにより起こるものである。具体的には、骨髄移植後のＧＶＨＤは、ドナーの細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）がレシピエント（宿主）の抗原提示細胞（樹状細胞等）を活性化し、宿主組織を傷害することにより発症・増悪化する。本発明のＧＶＨＤモデル動物では、ＰＩＲ−Ｂがノックアウトされているので、ＰＩＲ−Ｂによる抑制がかからないため、ＰＩＲ−Ａが優位となり、ドナーのＣＴＬｓを活性化し、ＧＶＨＤに高感受性となる。この結果、ＧＶＨＤ発症がＰＩＲ−Ｂにより抑制されることが明らかとなった。白血病や重度の免疫不全症などの根治治療法として骨髄移植が実施されているが、非血縁者からの骨髄移植でしばしば急性のＧＶＨＤを発症し、死を招くことがある。しかし、本発明により、ＰＩＲ−ＢはＧＶＨＤの抑制物質として作用し、移植治療における新規の治療法を提供するものとして期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のモデル動物としては、ＰＩＲ−Ｂをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、ＰＩＲ−Ｂを発現する機能を失ない、ＧＶＨＤを発症する非ヒト動物であれば特に制限されないが、例えば６Ｇｙ程度の致死量以下の放射線照射を行い、非自己の脾臓細胞を静脈内に投与することにより、致死性のＧＶＨＤを発症するＧＶＨＤモデル動物を好適に例示することができる。上記非ヒト動物としては、ＰＩＲ−Ｂの発現が認められるマウスやラットの他、ＰＩＲ−ＢのトリホモログＣＨＩＲ（Dennis G Jr, Kubagawa H, Cooper MD. Paired Ig-like receptor homologs in birds and mammals share a common ancestor with mammalian Fc receptors.Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Nov 21;97(24):13245-50.）をコードする内在性遺伝子が不活性化され、ＣＨＩＲを発現する機能を失なったトリを便宜上例示することができる。以下、ＰＩＲ−Ｂをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、ＰＩＲ−Ｂを発現する機能を失なったＰＩＲ−Ｂノックアウトマウスについて説明する。
【００１３】
ＰＩＲ−Ｂノックアウトマウスは、文献（Nature 379, 346-349, 1996）に記載する方法等によって作製することができる。具体的には、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、ＰＩＲ−Ｂ遺伝子 をスクリーニングし、スクリーニングされたＰＩＲ−Ｂ遺伝子 を組換えＤＮＡ技術により、ＰＩＲ−Ｂ遺伝子 の全部又は一部を、例えばネオマイシン耐性遺伝子等のマーカー遺伝子で置換し、５′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入してターゲティングベクターを作製し、この作製されたターゲッティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質に抵抗性を示すＥＳ細胞を選択する。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。
【００１４】
上記組換えＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスと交配させると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを交配させることによって、ＰＩＲ−Ｂノックアウトマウスを得ることができる。そして、かかるＰＩＲ−ＢノックアウトマウスにおけるＰＩＲ−Ｂ遺伝子 が染色体上で欠損していることを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウス脾臓Ｂ細胞からＤＮＡを単離してサザンブロット法等により調べる方法や、このマウスの脾臓Ｂ細胞等から抽出したタンパク質をイムノブロット分析等により調べる方法等を挙げることができる。
【００１５】
本発明のＧＶＨＤモデル動物は、ＧＶＨＤ発症のメカニズムの解析に有用であり、致死量以下の放射線照射を行い、非自己の脾臓細胞を静脈内に投与することにより、致死性のＧＶＨＤを発症することから、本発明のＧＶＨＤモデル動物を用いて、これらの生体反応を調節する物質のスクリーニングに使用することができる。すなわち、かかるＧＶＨＤモデル動物を用いると、ＰＩＲ−Ｂと同様の抑制作用を有する物質等のＧＶＨＤの予防・治療剤のスクリーニングの予防・治療剤のスクリーニングを行うことができる。
【００１６】
本発明のＧＶＨＤの予防・治療剤のスクリーニング方法としては、本発明のＧＶＨＤモデル動物に、非自己の脾臓細胞と被検物質とを静脈内に投与し、ＧＶＨＤの症状改善の程度を測定・評価するスクリーニング方法であれば特に制限されず、非自己の脾臓細胞と被検物質との静脈内への投与は、例えば６Ｇｙ程度の致死量以下の放射線照射を行った後に行うことが好ましい。ＧＶＨＤの症状改善の程度の測定・評価は、ＧＶＨＤの発症の程度を対照となる野生型と目視により比較する方法の他、以下の実施例に記載されているように、B細胞及びマクロファージ上のネイティブＰＩＲとＨ−２との結合の程度や、ＰＩＲを介してのＨ−２のシグナリング開始の程度や、レシピエントＤＣによるＰＩＲ−Ａのアップレギュレートの程度を測定し、対照となる野生型と比較する方法を挙げることができる。
【００１７】
かかるＧＶＨＤの予防・治療剤としては、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３、ＬＩＬＲＢ４等のＰＩＲ−Ｂのヒトホモログを有効成分とする予防・治療剤を挙げることができ、これら予防・治療剤は、骨髄移植患者のＧＶＨＤ発症の予防や、ＧＶＨＤを発症した骨髄移植患者の治療等に用いることができる。医薬品として用いる場合、経口的あるいは非経口的に投与することができるが、静脈投与等の非経口的投与が好ましい。非経口投与剤として注射剤、経皮製剤あるいは座薬等とすることができる。また、経口投与剤としては散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤などの固形製剤あるいはシロップ剤、エリキシル剤などの液状製剤とすることができる。これらの製剤は活性成分に薬理学的、製剤学的に認容される助剤を加えることにより常法に従って製造することができる。助剤としては、例えば、経口剤および粘膜投与剤にあっては、軽質無水ケイ酸、澱粉、乳糖、結晶セルロース、乳糖カルシウム等の賦形剤、カルボキシメチルセルロ−ス等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシム等の滑沢剤などの製剤用成分が、また注射剤にあっては、生理食塩水、マンニトール、プロピレングリコ−ル等の溶解剤ないし溶解補助剤、界面活性剤などの懸濁化剤などの製剤用成分が、さらに外用剤にあっては、水性ないし油性の溶解剤ないし溶解補助剤、粘着剤などの製剤用成分が使用される。また、投与量は、対象疾患の種類、患者の年齢、性別、体重、症状、投与形態に応じて適宜決定することができる。
【００１８】
本発明のＭＨＣクラスＩ分子を認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡとしては、（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列（ＰＩＲ−Ｂの外部ドメイン）をコードする塩基配列；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＨＣクラスＩ分子との結合活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＭＨＣクラスＩ分子との結合活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列（ＰＩＲ−Ｂの外部ドメインをコードするＤＮＡ）；（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＭＨＣクラスＩ分子との結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は（Ｆ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＭＨＣクラスＩ分子との結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；の何れかの塩基配列からなるＤＮＡであれば特に制限されず、また、本発明のＭＨＣクラスＩ分子を認識する受容体タンパク質としては、（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＨＣクラスＩ分子との結合活性を有するアミノ酸配列；又は（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＭＨＣクラスＩ分子との結合活性を有するアミノ酸配列；の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質であれば特に制限されず、ここで「ＭＨＣクラスＩ分子との結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列」とは、ＭＨＣクラスＩ分子との結合に何らかの形で関与するタンパク質をコードする塩基配列を意味し、その具体的な作用機構は特に限定されない。
【００１９】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。
【００２０】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００２１】
上記「配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列との相同性が６０％以上であれば特に制限されるものではなく、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上であることを意味する。
【００２２】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２３】
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
【００２４】
本発明のＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列又は塩基配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該ＤＮＡが存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。
【００２５】
本発明のＭＨＣクラスＩ分子を認識する受容体タンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
【００２６】
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のＭＨＣクラスＩ分子を認識する受容体タンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本発明のタンパク質が細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。
【００２７】
さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を示す配列番号１に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡをプローブとしてマウス以外の生物より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、動物細胞用発現ベクターに組み込み適当な動物細胞で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。
【００２８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
［結果］
１．組換えＰＩＲ−Ｂの外部ドメインとＨ−２との結合
哺乳類細胞発現機構に、単一の抑制性のＰＩＲアイソフォームであるＰＩＲ−Ｂの外部ドメインの組換えタンパク質を作製した。親和性を測定するために、Ｈ−２モノマーが固定されたバイオセンサーチップを装備した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析用のフローセル内に適用した。組換えＰＩＲ−Ｂ（ｒＰＩＲ−Ｂ）は、バイオセンサーチップ上で、Kd＝２．４×１０-11Ｍの高親和性で、抗ＰＩＲ−Ａ／Ｂモノクローナル抗体（６Ｃｌ）と結合できることを確認し（図１ａ）、その後、ｒＰＩＲ−ＢとＨ−２モノマー間の結合反応を評価した。不適切なタンパク質、ウシ血清アルブミンは、Ｈ−２モノマーと結合しなかったが、ｒＰＩＲ−ＢはH−２Ｌd、H−２Ｄd、Ｈ−２Ｋb、H−２Ｋk及びＨ−２ＫdのH−２分子とＫd＝１．９−５．６×１０-7Ｍの親和性で結合した（図１ｂ、ｃ）。単量体H−２においては、ＰＩＲ−Ｂ外部ドメインは、例えば、ＩｇＧと低親和性Fｃγ受容体間の親和性（Curr. Opin. Immunol. 14, 798-802, 2002、Nat. Rev. Immunol. 8, 580-592, 2002）に匹敵する程度の低親和性を示した。低親和性のFｃγ受容体は、インビトロ及びインビボで、多量体ＩｇＧ又はＩｇＧ免疫複合体と非常に効率的に結合できる。予想通り、ＳＰＲ分析でＰＩＲ−B外部ドメインは、Ｈ−２Ｌd、Ｋb、Ｄd、Ｋkにそれぞれ、Ｋｄ＝２．６×１０-9、１．０×１０-8、１．２×１０-8、１．４×１０-8Mの高い親和性で、四量体Ｈ−２と結合した。
【００３０】
最近、ＬＩＬＲＢ１は、ＭＨＣクラスIのβ2ｍと結合することが報告されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 8856-8861, 2003）。そこで次に、ｒＰＩＲ−Ｂが、マウスβ2ｍと結合できるかどうかを調べた。図１ｄに示すように、ｒＰＩＲ−Ｂは、Ｋd＝４．６×１０-8Ｍの親和性で、β2ｍと結合した。この結果は、ｒＰＩＲ−ＢとＨ−２間の少なくとも１つの接触面がβ2ｍに局在し、ｒＰＩＲ−ＢとＨ−２モノマーへの明らかに広範な結合特異性の理由を説明できるかもしれない。
【００３１】
２．B細胞及びマクロファージ上のネイティブＰＩＲとＨ−２との結合
本発明者らは、ＰＩＲ−B-/-マウスの脾臓B細胞は、恒常的に活性化され、ＢＣＲ刺激に対して反応性亢進（hyper-reactive）となることを既に報告している（Nat. Immunol. 6, 542-548, 2002）。上記の結果と合わせて、B細胞上のＰＩＲ−Ｂは、周囲の細胞又は自らの細胞上でH−２と結合し、それはＢ細胞の恒常的サイレンシングを導くかもしれない。そこで、本発明者らは、Ｈ−２とＢ細胞上のＰＩＲ−Ｂのインビトロでの結合を確認しようとした。未熟なＢ細胞が、Ｌｙ４９Ｄ等のＨ−２結合分子を発現するにもかかわらず（J. Immunol. 171, 4630-4638, 2003）、脾臓Ｂ２２０+Ｂ細胞の大部分（９０％以上）は成熟Ｂ細胞であり、ＰＩＲ−Ａ（Nat. Immunol. 6, 542-548, 2002）も他の周知のＨ−２結合分子も発現しない。したがって、脾臓Ｂ細胞は、Ｈ−２とＰＩＲ−Ｂの結合を調べるために適している。脾臓Ｂ２２０+Ｂ細胞は、ＦＩＴＣ−共役Ｈ−２Ｌd四量体、及びＰＥ標識抗ＰＩＲ−Ａ／Ｂモノクローナル抗体（６Ｃｌ）のいづれかで標識化し、その局在性を調べた。ＳＰＲ分析と一致して、６Ｃｌの蛍光は、実質的に、Ｈ−２Ｌd四量体の蛍光と共在していた（図２ａ）。反対に、ＰＩＲ−B-/-マウスの脾臓Ｂ細胞は、ＦＩＴＣ標識Ｈ−２四量体又はＰＥ−６Ｃｌと結合しない。これらの結果は、Ｂ細胞上のネイティブＰＩＲ−Ｂが、四量体Ｈ−２と結合することを強く示唆した。
【００３２】
Ｂ細胞とは対照的に、マクロファージは、ＰＩＲ−Ａ及びＰＩＲ−Ｂ両方を発現する（Nat. Immunol. 6, 542-548, 2002）。ＰＩＲ−Ｂ欠損マクロファージでは、抗ＰＩＲ−Ａ／Ｂモノクローナル抗体により認識されているターゲット分子は、ＰＩＲ−Ａである。これに対し、ＦｃＲγ欠損（ＦｃＲγ-/-）マウスのマクロファージでは、ＰＩＲ−Ｂである（Nat. Immunol. 6, 542-548, 2002）。ＰＩＲ−Ｂ-/-及びＦｃＲγ-/-マウス並びに野生型マウスの腹膜マクロファージを、ＦＩＴＣ−Ｈ−２Ｌd及びＰＥ−６Ｃｌの両方で標識化したところ、全ての遺伝子型でこれらの細胞で、Ｈ−２Ｌd四量体とＰＥ−６Ｃｌ結合の共在を観察し（図２ｂ）、マクロファージの未変性ＰＩＲ−Ａ及びＰＩＲ−ＢのＭＨＣクラスＩとの結合を示唆した。ＰＩＲ−Ｂ-/-及びＦｃＲγ-/-マクロファージで観察したＨ−２Ｌd及び６Ｃｌ結合の蛍光強度は、野生型マクロファージのより小さく（図２ｂ；各遺伝子型の上パネル）、それぞれＰＩＲ−Ｂ又はＰＩＲ−Ａの貢献の減少を示唆した。この概念、すなわちＰＩＲ−ＡとＭＨＣクラスＩの結合は、ＰＩＲ−ＡとＰＩＲ−Ｂの外部ドメインのアミノ酸配列の相同性が非常に高い（同一性９２％）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 5261-5266, 1997、J. Biochem. 123, 358-368, 1998）ので、論理的である。これらの結果は、ネイティブＰＩＲ−Ｂ及び実質的にＰＩＲ−Ａも、四量体Ｈ−２と効率的に結合することを強く示唆している。
【００３３】
３．ＰＩＲを介してのＨ−２のシグナリング開始
Ｈ−２分子は、様々なマウス造血細胞及び非造血細胞に幅広く発現している。四量体Ｈ−２とＢ細胞のＰＩＲ−Ｂとの結合は、ＰＩＲ−Ｂ細胞質部分中の恒常的なＩＴＩＭのリン酸化により、Ｂ細胞が恒常的にサイレントになるので、隣接細胞又はそれ自体におけるＨ−２分子が、ＰＩＲ−Ｂの恒常的なクラスター形成を誘導することを示唆した（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 15086-15090, 1999、Eur. J. Immunol. 32, 2418-2426, 2002）。この点は、インビトロ及びインビボでＢＣＲの特異的な刺激が欠如しているときの、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスのＢ細胞の反応性亢進状態と一致している（Nat. Immunol. 6, 542-548, 2002）。そこで、四量体Ｈ−２分子と、Ｂ細胞のＰＩＲ−Ｂとの結合が、実際にＰＩＲ−Ｂのチロシンのリン酸化のアップレギュレーションを導くかどうかを調べた。様々なＨ−２四量体を、Ｂ２２０+脾臓Ｂ細胞に添加し、続いてＰＩＲ−Ｂのホスホチロシル化（phosphotyrosylation）を、免疫沈降法及びイムノブロット分析でモニターした。各Ｈ−２四量体での刺激後、著しく増強したＰＩＲ−Ｂのホスホチロシル化を観察したが、増強は、比較的少なく、最大でもコントロールの約１．８倍であった（図３ａ）。
【００３４】
他方、ＰＩＲ−Ａと関連している（J. Exp. Med. 189, 309-318, 1999、J. Exp. Med. 188, 991-995, 1998、J. Immunol. 161, 4042-4047, 1998、J. Biol. Chem. 274, 30288-30296, 1999）ＦｃＲγのホスホチロシル化も、四量体Ｈ−２刺激後、野生型マウスの腹腔マクロファージで、著しくアップレギュレートした（図３ｂ）。ＦｃＲγのホスホチロシル化は、特異的な刺激なしに、腹腔マクロファージで恒常的であり、かかる恒常的なホスホチロシル化は、ＰＩＲ−Ｂを欠損しているときに著しく増加し（図３ｃ）、細胞が静止状態のときも、ＰＩＲ−ＢがＦｃＲγの恒常的なホスホチロシル化を抑制することを示唆した。四量体Ｈ−２分子がＰＩＲ−Ａ及びＰＩＲ−Ｂと相互作用し、チロシンのリン酸化を誘導するというこれらの結果は、Ｈ−２分子がＰＩＲ−Ａ及びＰＩＲ−Ｂの生理学的なリガンドであると結論づけた。しかし、ＰＩＲ−Ａ／Ｂに他のリガンドが存在する可能性を否定したわけではない。ＰＩＲ−Ｂのリン酸化状態が、ＭＨＣクラスＩ欠失（classI-less）β２ｍ-/-マウスで著しく減少し、ＰＩＲ−ＢのＭＨＣクラスＩ又はクラスＩ様リガンドの間接的な論拠を提供したことは注目すべきである（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 15086-15090, 1999）。ヒトＢリンパ腫細胞における研究で、ＢＣＲを介した活性化のための許容限界レベルが、Ｂ細胞膜に存在するＭＨＣクラスＩ分子の実際の数に依存するか、それにより決定されることを示唆している（Cell.Immumol. 173, 295-302, 1996）。
【００３５】
４．ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスにおけるＧＶＨＤの増悪
同種個体間の、組織又は骨髄移植の成功に、ＭＨＣクラスＩ分子は重要である。免疫無防備状態の個体への骨髄移植は、ＧＶＨＤを引き起こす。そこでドナー由来のアロ反応性ＣＤ４+Ｔ細胞は、樹状細胞（ＤＣ）等のレシピエントの活性化した抗原提示細胞上の同種のＭＨＣクラスIIに反応する。その後、エフェクターＣＤ４+T細胞となり、アロ反応性ドナーＣＤ８+Ｔ細胞を活性化し、同種ＭＨＣクラスＩを有するレシピエントＤＣと組み合わさり、活性化したＣＤ８+ＣＴＬとなる。興味深いことに、心臓移植を受けた拒絶反応のなかった患者では、樹状細胞（ＤＣ）におけるＬＩＬＲＢ２及びＬＩＬＲＢ４の発現レベルは、アップレギュレートされ（Nat. Immunol. 3, 237-243, 2002、Transpl. Immumol. 11, 245-258, 2003）、同種移植片の拒絶又は生着に、ＬＩＬＲ及びＰＩＲを含む陽性又は陰性に制御する免疫受容体が関与する可能性を示唆している。ＰＩＲのリガンドとしてＨ−２分子が同定されたことは、ＰＩＲ−Ｂと同種Ｈ−２間の相互作用が、造血細胞移植の拒絶又は生着に影響するかどうかを調べることの契機となった。
【００３６】
致死性のＧＶＨＤモデルを用いた。その中で、致死量以下の照射を行った、ＰＩＲ−Ｂ-/-又は野生型Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６、Ｈ−２b）宿主に、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）脾臓細胞を静脈内に注入した。図４ａに示されているように、宿主ＰＩＲ−Ｂ-/-Ｂ６マウスの死亡率は、野生型Ｂ６宿主より再現性よく高かった。移植６日後に、レシピエントの脾臓細胞をフローサイトメトリーで分析したとき、ＩＦＮ−γ+ＣＤ４+Ｔ細胞及びＩＦＮ−γ+ＣＤ８+Ｔの細胞集団は、両方とも、野生型Ｂ６レシピエントよりＰＩＲ−Ｂ-/-Ｂ６レシピエントが著しく高かった（図４ｂ）。ＰＩＲ−Ｂ-/-又は野生型ＢＡＬＢ／ｃがＢ６脾臓細胞を受け入れた逆の場合にも、ＰＩＲ−Ｂ-/-レシピエントにおけるＩＦＮ−γ+ＣＤ４+又はＣＤ８+Ｔ細胞の死亡率及び活性化の増加は、同様であった。脾臓細胞において、移植６日後に観察されたＴ細胞集団は、ドナー脾臓細胞から独占的に派生することが確認された。なぜなら、ＰＩＲ−Ｂ-/-ＢＡＬＢ／ｃマウスがＧＦＰトランスジェニックＢ６マウスから脾臓細胞を受け入れたときに、ＣＤ４+又はＣＤ８+Ｔ細胞の１００％近くが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現したからである。
【００３７】
５．レシピエントＤＣによるＰＩＲ−Ａのアップレギュレート
アロ反応性ＣＴＬの活性化は、ドナーＤＣ４+Ｔ細胞及びその活性化による、抗原提示細胞上のペプチドと宿主同種のＭＨＣクラスＩ分子の前もっての認識を要求している（Science 285, 412-415, 1999）。この点と一致して、Ｂ６脾臓細胞を受け入れた４日目の宿主野生型又はＰＩＲ−Ｂ-/-ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞ＤＣは、移植を受けていないコントロールマウスと比較して、ＭＨＣクラスＩ及びＣＤ４０（図５ａ左）、ＣＤ８０及びＣＤ８６を含む共刺激分子の発現増加の点で、同じ様に、著しく活性化した。興味深いことに、このＤＣ活性化と同時に、ＰＩＲ−Ａ／Ｂの発現レベルは、野生型及びＰＩＲ−Ｂ-/-ＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＣ上で著しく上昇し（図５ａ右）、アロ反応性ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞の調節(modulation)における、ＰＩＲ−Ａ及びＰＩＲ−Ｂの役割の重要性を示唆した。ＰＩＲ−B-/-レシピエントのＤＣは、コントロールレシピエントと比較してＩＦＮ−γが、著しく陽性であることを示唆し（図５ｂ）、ＰＩＲ−B欠損ＤＣは、野生型マウスより、活性化していることを示した。
【００３８】
［考察］
上記のように、Ｈ−２分子が、生理学的及び病理学的な意味を有するＰＩＲ−Ａ及びＰＩＲ−Ｂの生理学的リガンドであると結論づけたが、ＰＩＲ−Ａ／Ｂに他のリガンドが存在する可能性を否定していない。ＭＨＣクラスI分子が、ＰＩＲ−B（図１及び２ａ）及び実質的にＰＩＲ−Ａ（図２ｂ）とも結合することができ、細胞間のシグナリング現象を開始することができる（図３）という観察の重要性は、他の活性化／抑制性免疫制御受容体対と関連して、評価しなければならない。FｃγR、ＬＩＬＲＡ／Ｂ及びＫＩＲ等のほとんどの制御受容体対は、それぞれの同一のリガンドを認識する。例えば、活性化FｃγＲＩ／IIIと抑制性FｃγＲIIＢは、両方ともＩｇＧを認識し、ＩＴＡＭ及びＩＴＩＭリン酸化を介して、免疫細胞を対抗制御（counter regulate）する（Nat. Rev. Immunol. 8, 580-592, 2002）。マウスに活性化ＦＣγＲＩ／IIIが欠如すると、アレルギー反応及び自己免疫疾患は大幅に抑制されるが、ＦＣγＲIIＢの欠失は、アナフィラキシーの増悪と自己免疫疾患を誘導する。ＭＨＣクラスIの受容体としてのＰＩＲ−Ａ及びＰＩＲ−Ｂの解明は、かかる受容体対が免疫細胞を陽性及び陰性に制御することを示唆した。
【００３９】
本発明者らは、ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスにおけるＤＣの成熟障害が、胸腺依存性抗原に反応して、ＴH２極性化の増大を導くことを既に提案している（Nat. Immunol. 6, 542-548, 2002）。ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスの骨髄由来の培養したＤＣは、攪乱した（perturbed）細胞間のチロシンのリン酸化を示し、ＧＭ−ＣＳＦ刺激後、野生型ＤＣより、ＧＭ−ＣＳＦ共通β鎖のトランジェントなリン酸化を示した。上記観察結果を合わせ考慮すると、ＰＩＲ−Ａ／ＢとＨ−２の恒常的な相互反応は、ＤＣを成熟に導くために発達させる特有のＧＭ−ＣＳＦシグナリングに重要であると考えられる。Ｈ−２とＰＩＲの恒常的な結合と、ＧＭ−ＣＳＦシグナリングの細胞間現象との関係の精密なメカニズムの解明は、サイトカインによる刺激が、生理学的な状況の下で、どのように継続的に制御されているかに関して重要な洞察を提供する。
【００４０】
宿主ＤＣは、ＧＶＨＤの誘発に不可欠とされ（Science 285, 412-415, 1999）、ドナーＴ細胞−宿主抗原提示細胞の相互作用が、移植片対宿主反応を誘発するために不可欠であることを示唆している（図６）。ＰＩＲ−Ｂの発現が、野生型ＤＣ及びマクロファージにおけるＰＩＲ―Ａの発現を支配しているので、ＰＩＲ−Ｂは、移植片対宿主反応の初期段階でＨ−２分子と優位に結合する。しかし、ＰＩＲ−Ｂが欠失していると、ＰＩＲ−Ａは同種Ｈ−２と単体で接触し、レシピエントの抗原提示細胞及びＰＩＲ−Ａ発現を活性化する。ドナーＴ細胞上の同種Ｈ−２分子と、レシピエントＤＣ上でアップレギュレートされたＰＩＲ−Ａ間の相互作用は、ｔＤＣ活性化をさらに増強することがあり、その結果、主要なエフェクターサイトカインの一つであるＩＦＮ−γの生成を増加する。抑制性免疫グロブリン様受容体の１つであるプログラム死１（Programmed Death-1）をブロックすると、ＩＦＮ−γ依存性機構を介して、ＧＶＨＤの死亡率が加速するという近年の研究（J. Immunol. 171, 1272-1277, 2003）は、致死性のＧＶＨＤにおけるＩＦＮ−γの重要な役割を裏付けている。したがって、ＰＩＲ−Ｂは、少なくともＩＦＮ−γ生成の抑制を介してＣＴＬを制御することができるＤＣ等の抗原提示細胞に付与することができる。
【００４１】
第１及び第２のクラスＩ−認識システムは、それぞれＴＣＲ及びキラー受容体により達成されているが、ＰＩＲ−Ｂ、及び実質的にＰＩＲ−Ａが、第３のＭＨＣクラスＩ認識システムを構成することを提案する。ＰＩＲ−ＢによるクラスＩ認識の特異性は、幅広いように見えるが、この認識システムは、特にＢ細胞及びＤＣ等の骨髄細胞にとって特に重要であり、自己及び非自己との間での識別をするとはかぎらない。ＰＩＲ−Ｂのヒトのホモログと考えられるＬＩＬＲＢ１及びＬＩＬＲＢ２は、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ及び−Ｃ等の様々なＭＨＣクラスＩ分子を結合し、明らかな対立遺伝子の特異性を有していない（J. Exp. Med. 186, 1809-1818, 1997、J. Immunol. 160, 3096-3100, 1998、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 8856-8861, 2003、Immunity 7, 273-282, 1997）。ヒトβ2ｍに実質的な親和性を示すヒトＬＩＬＲＢと同様（Nat. Immunol. 4, 913-919, 2003）、ＰＩＲ−Ｂ外部ドメインはマウスβ2ｍと、４．６×１０-8Ｍの親和性で結合することができる。これらの結果は、ＰＩＲ−Ｂは、可変のＭＨＣクラスＩ重鎖及び一定のβ2ｍの両方を認識し、少なくとも１つの結合部位がβ2ｍに属し、ＭＨＣクラスＩ重鎖の他の接触部位が、ＰＩＲ−Ｂとの全体的な結合親和性を変更できることを示唆した。マウスＰＩＲ−Ｂ及びヒトＬＩＬＲＢ１／２によるＭＨＣクラスＩ分子の幅広い認識は、細胞の活性化に適切な許容限界を維持し、阻害しなければ自己免疫を導く、不適切な細胞活性化を阻害するために重要である。近年、ヒト抑制性キラー受容体遺伝子、ＬＩＬＲサブファミリー及びＬＩＬＲは、自己免疫性関節炎と何らかの関連性があることが示された（Ann. Rheum. Dis. 60, 166-169, 2001、Int. Immunol. 14, 471-479, 2002、Arthritis. Rheum. 46, 2972-2982, 2002）。ＭＨＣクラスＩ遺伝子の多型性が、自己免疫性障害に対する感受性と関連していることは、広く受け入れられており、Ｉｇ様受容体と免疫エフェクター細胞上のＭＨＣクラスＩ間の相互作用は、自己免疫の発達における重要な段階であることを示唆している。ＰＩＲ−Ａ／ＢによるＭＨＣクラスＩ認識は、自己免疫や同種反応（allogeneic response）の制御にも関与する。ＰＩＲ−Ａ／Ｂ機構の調節は、自己免疫及び移植片拒絶を防ぐ新しい道を提供できるかもしれない。
【００４２】
［方法］
１．マウス
Ｃ５７ＢＬ／6（Ｂ６、Ｈ−２b）及びＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）は、Charles River Japan, Inc.より購入した。Ｂ６バックグラウンドのＧＦＰトランスジェニックマウス（ＧＦＰｔｇＢ６）は、M. Okabe氏（大阪大学）から供与された。ＰＩＲ−Ｂ-/-１２９／Ｂ６マウス（Nat. Immunol. 6, 542-548, 2002）を、Ｂ６に１２世代に亘って、戻し交配した。ＰＩＲ−Ｂ-/-１２９／Ｂ６マウスは、ＢＡＬＢ／ｃに８世代に亘って、戻し交配した。マウスは、環境が管理された特定病原体除去施設である東北大学加齢医学研究所（ＩＤＡＣ）の動物飼育室で、施設が規定した実験動物の指針に従い、維持、飼育した。提出した動物プロトコールは、ＩＤＡＣ動物研究委員会により承認された。全ての実験は、年齢が一致した８〜１２週齢のマウスを用いて行った。
【００４３】
２．ＭＨＣクラスＩタンパク質
溶解性のビオチン標識したＭＨＣクラスＩモノマー（ペプチドＴＰＨＰＡＲＩＧＬ（配列番号３）とＨ−２Ｌd；ペプチドＶＧＰＱＫＮＥＮＬ（配列番号４）とＨ−２Ｄd；ペプチドＴＹＱＲＴＲＡＬＶ（配列番号５）とＨ−２Ｋd；ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号６）とＨ−２Ｋb；及びペプチドＨＥＴＴＦＮＳＩ（配列番号７）とＨ−２Ｋk）及びβ2ｍは英国Proimmne社より購入した。ＦＩＴＣ−共役Ｈ２Ｌd、Ｄd、Ｋd、Ｋb、Ｋk四量体も、Proimmne社より購入した。
【００４４】
３．ＰＩＲ−Ｂ外部ドメインの作製
ＰＩＲ−Ｂの外部ドメインをコードするＤＮＡ（残基１〜６１５）を、フォーワードプライマーとして、5'-GTGGTACCAGGGTCCCTC-3'（配列番号８）、リバースプライマーとして 5'-TGTCTAGATGAGCTCCACAGGG-3'（配列番号９）を用いて、pcEXV−３ベクターに挿入された全長ＰＩＲ−Ｂ ＤＮＡから増幅した（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 5261-5266, 1997）。その結果生じた断片を、制限酵素KpnI及びXbaIで処理し、pcDNA4/HisMax Ｂベクター（Invitrogen社製）内に結紮し、哺乳類細胞系発現システムにおける組換えタンパク質のグリコシル化を可能にした（J. Cell. Biochem. 77, 540-559, 2000）。プラスミドの完全性をシークエンシングにより確認した。プラスミドを、Ｐ３Ｕ１マウス骨髄細胞内に、Lipofectamine 2000 （Invitrogen社製）を用いてトランスフェクトし、この形質転換細胞を、５０μｇｍｌ-1カナマイシン（Wako Pure Chemical Industries社製）を含むＧＩＴ培地（Nihon pharmaceutical社製）で培養した。２日培養後、０．８ｍｇ・ｍｌ-1ゼオシン（zeocine）（Invitrogen社製）を含む選択的培地を添加し、耐性コロニーが現れるまで、インキュベーションを３７℃で行った。ＰＩＲ−Ｂ細胞外ドメインタンパク質を効率的に生成する単細胞を入手するために、コロニーをスクリーニングした。５日培養後、細胞を回収した。細胞ペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１％のNonident Ｐ−４０（Sigma社製）、１ｍＭのＰＭＳＦ（Sigma社製）、１％のProtease Inhibitor Cocktail（Sigma 社製）を含む氷冷の溶解緩衝液内に、１時間、４℃で可溶化した。溶解した細胞を、１０，０００×ｇで１０分間、遠心分離し、上清（可溶化液）を回収した。ＰＩＲ−Ｂ外部ドメインタンパク質を、可溶化液から、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー（Hitrap Chelating HP, Amersham Bioscience 社製）、続いてゲル濾過（Hiload  １６/６０Superdex 200prep grade, Amersham Bioscience社製）で精製した。
【００４５】
４．バイオセンサー分析
ＭＨＣクラスI分子モノマー、β2ｍ又は抗ＰＩＲＡ／Ｂ抗体（６Ｃｌ）とｒＰＩＢ−Ｂ間の相互作用を分析するために、BIAcore 2000 biosensor system （BIAcore社製）を用いた。製造者推薦の手順に従って、６Ｃｌは、ＣＭ５−チップ（BIACore社製）上に、アミンカップリング（amine coupling）で固定した。ビオチン標識したＭＨＣクラスＩモノマーは、ＳＡ−チップ（BIACore社製）に、製造者推薦の手順に従って固定した。ｒＰＩＲ−Ｂを、室温で２０ｍＭのリン酸緩衝液内に固定化したフローセル上に注入した。ＭＨＣクラスＩとｒＰＩＲ−Ｂ間の結合相互反応は、短い注入時間（３０秒）で、２０μｌmin-1で、分析した。各濃度の結合反応を、不適切なビオチン標識したタンパク質又はインタクトなフローセルにカップリングしたフローセルに対する非特異的反応から、サブトラクションした。運動定数（kinetic constant）は、BIA evaluation ３．０２．２ プログラムを用いたsensorgramデータから引き出した。解離平衡定数（Ｋd）は、１：１Langmuir結合モデルの非直線的な回帰分析から引き出した。
【００４６】
５．細胞の分離
脾臓懸濁液を、赤血球、顆粒球及びマクロファージの除去のために、Ficoll-paque（Amersham Bioscience社製）で処理した。ＰＩＲ−Ｂ-/-Ｂ６及び野生型Ｂ６マウスから、脾臓Ｂ細胞を分離するために、Ｂ２２０+細胞を、ＭＡＣＳマグネチックセルソーター（Miltenyi Biotec GmbH, Bergish社製）を使用して、精製した。ＰＩＲ−Ｂ-/-Ｂ６及び野生型Ｂ６マウスから、腹腔マクロファージを調製するために、氷冷したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で腹腔腔を洗浄し、腹腔細胞を単離した。細胞を１時間培養し、非付着細胞をＰＢＳで洗浄し、付着細胞を腹腔マクロファージとして使用した。
６．フローサイトメトリー及び細胞質間サイトカイン染色
フローサイトメトリー分析に、下記の抗マウス抗体を使用した：ＦＩＴＣ共役抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体並びに抗ＣＤ１１抗体、ＰＥ共役抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＰＩＲ−Ｂ／Ａ抗体並びに抗ＩＦＮ−γ抗体、ビオチン共役抗Ｋb抗体、抗Ｋd抗体、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体、及びスルレプトアビジン−トリコロール。全ての抗体は、ＢＤPharMingen社製である。細胞の表面を、従来の技術で染色し、フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳ ＬＳＲ及びCellQuest software (Becton Dickinson社製)を使用して行った。細胞質間サイトカイン染色には、レシピエントの２×１０6脾臓細胞を、Ｂ６マウスのターゲットの腹腔付着細胞で、５時間、１μｇ・ｍｌ-1のbrefeldin A （BDPharMingen社製）の存在下で、３７℃で、５ｍｌ培養培地（１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）で、６ｃｍディッシュプレート（Becton Dickinson社製）上でインキュベートした。その後懸濁した細胞を０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ共役抗Ｋb抗体及びビオチン共役抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、又は抗ＣＤ１１ｃ抗体で染色した。Cytofix/Cytoperm  (BD PharMingen社製)で固定後、細胞を透過処理行った緩衝液（BD PharMingen社製)内で洗浄し、ＰＥ共役抗ＩＦＮ−γ抗体で染色した。染色した細胞を、ＦＡＣＳ ＬＳＲ及びCellQuest softwareを使用して分析した。
【００４７】
７．共焦点光学顕微鏡
脾臓B細胞及び腹腔マクロファージの共焦点レーザー顕微鏡は、４％パラホルムアルデヒドで固定したＦＩＴＣ共役Ｈ−２Ｌd四量体（１０μｇｍｌ-1、Proimmune社製）及びＰＥ共役抗ＰＩＲ−Ａ／Ｂモノクローナル抗体（BD PharMingen社製）で染色した。ＦＩＴＣ及びＰＥ陽性シグナルを、共焦点レーザー顕微鏡（Radiance 2100, BIO-RAD社製）で回収した。蛍光強度の平均値は、共焦点顕微鏡システムの各低出力分野で測定した。
【００４８】
８．免疫沈降
１ｍｌのＰＢＳ内の脾臓B細胞（２×１０6細胞）を、０分又は３０分間３７℃で、Ｈ−２四量体（１０μｇｍｌ-1）とインキュベートした。細胞を、プロテイナーゼ抑制剤（Sigma社製）を補充した２ｍMのバナジン酸ナトリウム（sodium vanadate）を含む溶解緩衝液（１％ＮＰ−４０、２０ｍM Tris（ｐＨ７．３）、３００ｍMのＮａＣｌ及び１０ｍM ＥＤＴＡ）内に可溶化した。あらかじめ清澄化した溶解物は、経時的に抗ＰＩＲ−Ａ／Ｂ抗体（BD PharMingen社製）又はウサギ抗ＦｃＲγ抗体（ポリクロナールウサギＩｇＧ）及びタンパク質Ｇ共役セファロース４Ｂ（Amersham Bioscience社製）とインキュベートした。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、ＨＲＰ抗ホスホチロシン抗体（マウスＩｇＧ２ｂにモノクローナル抗体４Ｇ１０、Upstate Biotechnology 社製）により、電子化学ルミネッセンスシステム（Amersham Bioscience社製）で検出した。検出した膜を、６２．５ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ６．８）、１００μＭ２−メルカプトエタノール及び２％ＳＤＳを含むストリッピングバッファー（stripping buffer）での抗体検出で除去し、適切な抗体でブロットした。その結果、抗ＰＩＲ−Ａ／Ｂ抗体、ＨＲＰ−ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Amersham Bioscience社製）又は抗ＦｃＲγ抗体及びＨＲＰヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Amersham Bioscience社製）であった。
【００４９】
９．ＧＶＨＤの誘導
フローサイトメトリー分析用に、ＧＦＰｔｇＢ６マウスの４×１０7脾臓細胞を、致死量以下（６Ｇｙ）照射したＢＡＢＬ／ｃ又はＰＩＲ−Ｂ-/-ＢＡＢＬ／ｃマウスに、静脈内に注入した。宿主の生存率分析及び細胞間のサイトカイン染色用には、ＢＡＢＬ／ｃマウスの４×１０7脾臓細胞を、致死量以下（６Ｇｙ）照射したＢ６又はＰＩＲ−Ｂ-/-Ｂ6マウスに、静脈内に注入した。マウスの死亡率を２４時間毎に２１日間観察した。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ｒＰＩＲ−Ｂ外部ドメインとＭＨＣクラスＩ間の相互作用のバイオセンサー分析結果を示す図である。（ａ）ｒＰＩＲ−Ｂ外部ドメインと抗ＰＩＲ−Ａ／Ｂモノクローナル抗体間の相互作用のバイオセンサー分析。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析におけるｒＰＩＲ−Ｂの信頼度を確認する、ｒＰＩＲ−Ｂの抗ＰＩＲモノクローナル抗体への結合反応を陽性コントロールとして、及び空のセンサーチップへの非特異的な反応を示した。ｒＰＩＲ−Ｂと抗ＰＩＲ抗体の相互反応の親和性値（Ｋd）は、高親和性（Ｋd＝２．４×１０11Ｍ）を示した。（ｂ）ｒＰＩＲ−Ｂ外部ドメインとＭＨＣクラスＩ間の相互反応のバイオセンサー分析。Ｈ２−Ｌd、Ｄd、Ｋb、Ｋk、Ｋdモノマーに注入したｒＰＩＲ−Ｖ（５０ｎＭ）の結合反応の比較を示した。陰性コントロールとして、ＢＳＡ又は空のセンサーチップとＨ−２分子との結合反応も示した。ｒＰＩＲ−Ｂ調製物の中への、抗ＰＩＲモノクローナル抗体の抱合は、ＭＨＣクラスＩへの結合に影響せず、抗ＰＩＲモノクローナル抗体は、ＰＩＲのＨ−２への結合を妨害しないこと（示されていない）を示唆した。（ｃ）ＭＨＣクラスＩモノマーとｒＰＩＲ−Ｂ間の、指定された濃度での結合反応曲線（ＲＵ）。各曲線の傾斜は、Ｈ−２分子とｒＰＩＲ−Ｂ間のＫdを示す。各センサーグラムに、空のセンサーチップへの非特性反応をサブトラクションした。黒い四角は、Ｈ−２Ｌd；白い四角は、Ｄ−２Ｄd：黒い三角は、Ｈ−２Ｋb；白い三角は、Ｈ−２Ｋk；黒い丸はＨ−２Ｋdを示す。（挿入図）ＭＨＣクラスＩモノマーとｒＰＩＲ−Ｂ間のＫdを示す。（ｄ）β2ｍとｒＰＩＲ−Ｂ間の、指定された濃度での結合反応曲線（ＲＵ）。曲線の傾斜は、β2ｍとｒＰＩＲ−Ｂ間のＫd（４．６×１０-8Ｍ）を示す。結果は、３回の別個の実験の代表例である。
【図２】Ｈ−２四量体は脾臓Ｂ細胞でＰＩＲ−Ｂと結合し、腹腔マクロファージでＰＩＲ−Ａと結合し、チロシンのリン酸化を誘導することを示す図である。（ａ）Ｈ−２四量体と脾臓Ｂ細胞のＰＩＲ−Ｂへの結合反応の、共焦点光学顕微鏡分析。上パネル；野生型Ｂ６マウスの脾臓Ｂ細胞を、ＦＩＴＣ共役Ｈ−２Ｌｄ四量体及びＰＥ共役抗ＰＩＲ−Ａ／Ｂ抗体、６Ｃ１で二重染色した後の低倍率（最初の倍率；×４０）と高倍率（最初の倍率；×６０）の、共焦点光学顕微鏡の画像。組み合わせた画像は、Ｂ６マウスの細胞表面のＨ２−Ｌｄ及びＰＩＲ−Ｂの共在を証明した。下パネル：ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスのＢ細胞内で、Ｈ−２Ｌdと抗ＰＩＲ−Ａ／Ｂ抗体は、有意な結合を示さなかった。Ｈ−２Ｌdと抗ＰＩＲ−Ａ／Ｂ抗体結合の蛍光強度の平均値（mean fluorescent intensity）は、低倍率の画像で示す。（ｂ) Ｂ６、ＰＩＲ−Ｂ-/-及びＦｃＲγ-/-マウスの腹腔マクロファージのＨ−２四量体と抗ＰＩＲ−Ａ／Ｂ抗体間の結合の共焦点光学顕微鏡分析は、（ａ）と同様に行った。ＰＩＲ−Ｂ-/-Ｂ６マウスの細胞の組み合わせた画像は、Ｈ−２Ｌdと抗ＰＩＲ−Ａ／Ｂ抗体の共在を示した。Ｈ−２Ｌdと抗ＰＩＲ−Ａ／Ｂ抗体結合の蛍光強度の平均値（mean fluorescent intensity）を、低倍率の画像で示す。これらの結果は、３回の別個の実験の代表例である。
【図３】ＰＩＲ−Ｂ及びＰＩＲ−Ａが、Ｈ−２結合後、チロシン系細胞間シグナリングを開始できることを示す図である。（ａ）Ｈ−２四量体で刺激したＢ細胞のＰＩＲ−Ｂのチロシンのリン酸化状態。上パネル；脾臓細胞は、指定されたＨ−２四量体で３０分刺激した。抗ＰＩＲモノクローナル抗体沈殿後、ウェスタンブロット分析をホスホチロシンとＰＩＲに行った。下のグラフ；チロシン−リン酸化したＰＩＲ−Ｂタンパク質のシグナル強度を、濃度測定スキャニングで測定した。各強度をＰＩＲ−Ｂの強度でノーマライズし、コントロールと比較した。各ＭＨＣクラスＩ四量体は、脾臓Ｂ細胞のＰＩＲ−Ｂチロシンのリン酸化を誘導した。パネルは、代表例で、増加を示す値は、３回の別個の実験の平均値±ＳＤ（標準偏差）を示す。＊Ｐ＜０．０５。（ｂ）Ｈ−２四量体で刺激した腹腔マクロファージ内の、ＰＩＲ−Ａを含む免疫受容体の膜アダプターであるＦｃＲγのチロシンのリン酸化。刺激及びウェスタンブロット分析をａと同様に行った。パネルは、代表例で、増加を示す値は、３回の別個の実験の平均値±ＳＤを示す。＊Ｐ＜０．０５。（ｃ）ＰＩＲ−Ｂ-/-マウスの腹腔マクロファージで、ＦｃＲγのチロシンのリン酸の状態は、アップレギュレートした。パネルは、代表例で、増加を示す値は、３回の別個の実験の平均値±ＳＤを示す。＊Ｐ＜０．０５。
【図４】ＰＩＲ−Ｂ-/-における致死性ＧＶＨＤの誘導を示す図である。（ａ）ＰＩＲ−Ｂ-/-Ｂ６（ｎ＝１６、黒い四角）又はＢ６マウス（ｎ＝１６、黒い丸）におけるＧＶＨＤの生存曲線。４×１０7ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞を、６Ｇｙ照射ＰＩＲ−Ｂ-/-Ｂ６又はＢ６レシピエントに注入した。死亡率を２４時間毎に、２１日間評価した。統計学的分析をFisher's exact testを使用して行った。＊ＰＩＲ−Ｂ-/-Ｂ６とＢ６マウス間では、Ｐ＜０．０５。（ｂ）移植６日後の、ＰＩＲ−Ｂ-/-Ｂ６又はＢ６レシピエントからのドナー脾臓細胞の細胞間ＩＦＮ−γ生成のフローサイトメトリー分析。上パネル；Ｂ６レシピエント。下パネル；ＰＩＲ−Ｂ-/-Ｂ６レシピエント。パネルは、代表例で、パーセンテージは、３回の別個の実験の平均値±ＳＤを示す。＊＊ＰＩＲ−Ｂ-/-とＢ６レシピエント間では、Ｐ＜０．０１。
【図５】ＧＶＨＤにおけるレシピエントの活性化したＤＣは、ＰＩＲ−Ａ／Ｂの発現をアップレギュレートすることを示す図である。（ａ）移植４日後に、ＣＤ１１ｃ+レシピエント脾臓細胞のフローサイトメトリー分析を行った。左パネル；ＣＤ４０発現。右パネル；ＰＩＲ−Ａ／Ｂ発現。太い赤線；ＢＡＬＢ／ｃレシピエント。太い黒線；コントロールＰＩＲ−Ｂ-/-ＢＡＬＢ／ｃマウス。黒点線；イソ型コントロール（ラットＩｇＧ１）。３回の別個の実験のＰＩＲ−Ａ／Ｂ発現の蛍光強度の平均値（mean fluorescent intensity）±ＳＤを示した。（ｂ）移植４日後に、Ｋb陽性ＣＤ１１ｃ+レシピエント脾臓細胞における細胞間ＩＦＮ−γ生成のフローサイトメトリー分析。左パネル；Ｂ６レシピエント。右パネル；ＰＩＲＢ-/-Ｂ６レシピエント。パネルは、代表例で、パーセンテージは、３回の別個の実験の平均値±ＳＤを示す。＊＊ＰＩＲ−Ｂ-/-とＢ６レシピエント間では、Ｐ＜０．０１。
【図６】ＧＶＨＤのＤＣ上のＰＩＲ−Ａ／Ｂと同種ＭＨＣクラスＩ分子との相互作用中の役割を示す図である。ＤＣのＰＩＲ−Ｂ及びＰＩＲ−Ａは、周囲細胞又は自己細胞上で自己ＭＨＣクラスＩ分子を認識する。ＰＩＲ−Ｂは、ＰＩＲ−Ａを含む活性化型受容体により誘導された細胞間シグナリングを陰性に調節する。ＧＶＨＤの発達中、ドナー由来のアロ反応性ＣＤ４+Ｔ細胞は、活性化したレシピエントＤＣの同種ＭＨＣクラスＩＩ分子に反応し、エフェクターＣＤ４+Ｔ細胞となり、その後アロ反応性ドナーＣＤ８+Ｔ細胞を活性化し、活性化したＣＤ８+細胞障害性Ｔリンパ球になる。活性化したドナーＣＤ８+Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ等のエフェクター分子を介してレシピエントの組織をターゲットとし、ＧＶＨＤを誘導する。ＰＩＲ−Ｂが欠如していると、レシピエントＤＣは、ＰＩＲ−Ａの発現が増加したため、さらに活性化し、アロ反応性エフェクターＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞を活性化し、結果としてＧＶＨＤの増悪を導く。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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