(57)【要約】【課題】ATRA耐性白血病細胞を分化誘導させ、分化後の白血病細胞にアポトーシスを誘導させることができる、ATRA耐性白血病の治療剤として有用な化合物を提供すること。【解決手段】コンピュータグラフィックスを用いて、オールトランス型レチノイン酸（ATRA）に耐性の急性前骨髄球性白血病細胞のRARαに結合し易いと予測されるリガンド（ATRAのカルボキシル基をプロピオニル基に置換したATRA誘導体；TWB-8083）をデザインし、合成した。このTWB-8083は、UF-1細胞を特異的に好中球様細胞へと分化誘導し、分化後のUF-1細胞にアポトーシスを誘導する。従って、TWB-8083はATRA耐性APLの治療剤として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式(1)で表される化合物。
【化１】
2005068080.tif 000008
【請求項２】
PML-RARαキメラタンパク質（GenBank Accession No.M73779）の変異型キメラタンパク質に起因し、オールトランス型レチノイン酸に耐性の急性前骨髄球性白血病の治療剤であって、下式(1)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする治療剤。
【化２】
2005068080.tif 000009
【請求項３】
前記変異型キメラタンパク質は、611番目のアミノ酸残基がアルギニンからトリプトファンに置換した突然変異を有することを特徴とする請求項２に記載の治療剤。
【請求項４】
PML-RARαキメラタンパク質（GenBank Accession No.M73779）の変異型キメラタンパク質を発現する白血病細胞の分化誘導剤であって、下式(1)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする分化誘導剤。
【化３】
2005068080.tif 000010
【請求項５】
前記変異型キメラタンパク質は、611番目のアミノ酸残基がアルギニンからトリプトファンに置換した突然変異を有することを特徴とする請求項４に記載の分化誘導剤。
【請求項６】
PML-RARαキメラタンパク質（GenBank Accession No.M73779）の変異型キメラタンパク質を発現する白血病細胞のアポトーシス誘導剤であって、下式(1)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするアポトーシス誘導剤。
【化４】
2005068080.tif 000011
【請求項７】
前記変異型キメラタンパク質は、611番目のアミノ酸残基がアルギニンからトリプトファンに置換した突然変異を有することを特徴とする請求項６に記載のアポトーシス誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オールトランス型レチノイン酸（ATRA：all-trans retinoic acid）耐性の急性前骨髄球性白血病に対する治療に有用な化合物、並びに、その化合物を有効成分として含有する治療剤、分化誘導剤、及びアポトーシス誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性前骨髄球性白血病（APL；acute promyelocytic leukemia）は急性骨髄球性白血病の約10％を占め、その特異な染色体異常ｔ(15；17)の結果生じるPML/RARαキメラ遺伝子が分子病態に関与する。即ち、PML-RARαキメラ遺伝子の産物であるPML/RARα融合タンパク質が、情報伝達を阻害して前骨随球以降の分化を阻害する結果、APL細胞が生じることが明らかにされている。
【０００３】
近年、急性前骨髄球性白血病の治療法としてオールトランス型レチノイン酸（all-trans retinoic acid：ATRA）を用いた経口投与により、APL細胞を分化誘導およびアポトーシス誘導で治療する方法が開発された。APL細胞は、ATRAの分化誘導作用に対する感受性が高く、ATRA投与により、APL細胞において、阻害されていた情報伝達が回復し、好中球様細胞への分化が誘導され、その結果アポトーシスが誘導される（非特許文献１参照）。このようなATRAの性質を利用することにより、ATRAはAPL治療における有効な治療薬として、臨床で広く用いられている。
【０００４】
しかしながら、最近、ATRAに耐性のAPLが頻繁に見出されるようになっており、このAPLに対する新たな治療剤が求められている。
【非特許文献１】Nat. Med. 7(6), 680-6, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、オールトランス型レチノイン酸と同様に、白血病細胞を分化誘導させ、分化後の白血病細胞にアポトーシスを誘導させることができる、ATRA耐性APLの治療剤として有用な化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、式(1)で表される化合物が、ATRA耐性APL患者から採取した白血病細胞（以下、「UF-1細胞」と称する。）の分化を誘導し、また、UF-1細胞のアポトーシスを誘導することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明に係る化合物は、下式(1)で表される化合物であることを特徴とする。  
【化１】
2005068080.tif 000002
【０００８】
また、本発明に係る治療剤は、下式(1)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。この治療剤は、PML-RARαキメラタンパク質（GenBank Accession No.M73779）の変異型キメラタンパク質に起因し、オールトランス型レチノイン酸に耐性の急性前骨髄球性白血病に用いることができるが、611番目のアミノ酸残基がアルギニンからトリプトファンに置換した突然変異を有する変異型キメラタンパク質に起因し、オールトランス型レチノイン酸に耐性の急性前骨髄球性白血病に用いることが好ましい。なお、突然変異は611番目のアミノ酸残基に限られず、式(1)の化合物がその突然変異を有する白血病細胞に起因する白血病の治療剤になりうるものであれば何でもよい。  
【化２】
2005068080.tif 000003
【０００９】
また、本発明に係る分化誘導剤は、下式(1)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。この分化誘導剤は、PML-RARαキメラタンパク質（GenBank Accession No.M73779）の変異型キメラタンパク質を発現する白血病細胞に用いることができるが、611番目のアミノ酸残基がアルギニンからトリプトファンに置換した突然変異を有する変異型キメラタンパク質を発現する白血病細胞に用いることが好ましい。なお、突然変異は611番目のアミノ酸残基に限られず、式(1)の化合物がその突然変異を有する白血病細胞に起因する白血病の治療剤になりうるものであれば何でもよい。  
【化３】
2005068080.tif 000004
【００１０】
また、本発明に係るアポトーシス誘導剤は、下式(1)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。このアポトーシス誘導剤は、PML-RARαキメラタンパク質（GenBank Accession No.M73779）の変異型キメラタンパク質を発現する白血病細胞に用いることができるが、611番目のアミノ酸残基がアルギニンからトリプトファンに置換した突然変異を有する変異型キメラタンパク質を発現する白血病細胞に用いることが好ましい。なお、突然変異は611番目のアミノ酸残基に限られず、式(1)の化合物がその突然変異を有する白血病細胞に起因する白血病の治療剤になりうるものであれば何でもよい。  
【化４】
2005068080.tif 000005
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、白血病細胞を分化誘導またはアポトーシス誘導させ、ATRA耐性APLに対して有用な化合物を提供することができる。また、前記化合物を用いることにより、ATRA耐性APLを治療することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１３】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１４】
＝＝＝式(1)で表される化合物の薬理作用＝＝＝
本発明者らは、ATRA耐性APL患者からUF-1細胞を採取し、PML/RARαキメラ遺伝子の塩基配列を調べた。その結果、その産物であるPML/RARα融合タンパク質におけるRARα（レチノイン酸レセプターα）領域のリガンド結合部位において１塩基置換が生じ、RARα領域の276番目のアミノ酸残基が塩基性のArg（アルギニン）から疎水性のTrp（トリプトファン）に置換していることが明らかになった。この結果から、UF-1細胞においては、PML/RARα融合タンパク質（GenBank Accession No.M73779）の611番目のアミノ酸残基の点突然変異により、変異型PML/RARα融合タンパク質がATRAに対する結合能を失い、ATRA耐性を獲得したことが示唆された。
【００１５】
そこで、本発明者らは、コンピュータグラフィックスを用いて、UF-1細胞の変異型PML/RARα融合タンパク質に結合し易いと思われるATRA誘導体をいくつかデザインして合成し、これらのリガンドが実際にUF-1細胞を好中球へと分化誘導するかどうかを調べた。その結果、合成したリガンドのうち、ATRAのカルボキシル基をエチルカルボニル基に置換したATRA誘導体であるTWB-8083（式(1)で表される化合物）が、UF-1細胞を好中球様細胞へと分化誘導することが明らかになった。また、TWB-8083がUF-1細胞を分化誘導した後、アポトーシスを誘導することも明らかとなった。
【００１６】
以上のことから、TWB-8083は、ATRA耐性APL由来の白血病細胞に対する分化誘導剤及びアポトーシス誘導剤として有用であり、さらにATRA耐性APLの進行抑制剤や治療剤として有用であることが示された。
【００１７】
＝＝＝その他の実施態様＝＝＝
＜本発明に係る医薬組成物と腫瘍治療との併用効果＞
APL患者の大半はATRAによる治療で寛解を達成するが、ATRA単独では一般に治癒し難いことが知られている（Blood 72(2), 567-72, 1988、Blood 76(9), 1704-9, 1990）。臨床試験においては、寛容導入法としてATRAと化学療法を併用することの有用性のほか、維持療法としてATRAを用いることの有用性について明らかにされている（Blood 94(4), 1192-200, 1999、Leukemia 14(8), 1371-7, 2000、N. Engl. J. Med. 337(15), 1021-8, 1997）。ATRAと化学療法との併用では、APL患者の２年生存率が上昇することが報告されている（Blood 94(4), 1192-200, 1999、N. Engl. J. Med. 337(15), 1021-8, 1997）。従って、TWB-8083または薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物は、化学療法と併用させることにより、ATRA耐性APLの治療の効果をさらに増強させることが期待できる。また、TWB-8083または薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物は、腫瘍の治療として知られている放射線療法と併用させることにより、化学療法と同様にATRA耐性APLの治療の効果をさらに増強させることができると期待される。なお、化学療法に用いられる抗腫瘍剤には、例えば、ダウノルビシンやシタラビンなどがある。
【００１８】
＝＝＝式(1)で表される化合物の製造方法＝＝＝
式(1)で表される化合物TWB-8083の製造方法の一例を実施例１及び２に記載する。なお、下記の反応工程式中の式(5)〜式(8)で表される化合物はATRA耐性APL細胞の分化誘導をほとんど示さなかったが（図示しない）、下記の反応工程式中の式(9)で表される化合物の「R」が疎水性の基であることが重要であると考えられる。従って、式(9)で表される化合物の「R」がメチル基やイソプロピル基以外の疎水性の基であってもATRA耐性APL由来の白血病細胞に対する分化誘導剤及びアポトーシス誘導剤として有用であり、さらにATRA耐性APLの進行抑制剤や治療剤として有用である可能性があると考えられる。なお、本発明に係る治療剤、分化誘導剤、及びアポトーシス誘導剤は、TWB-8083またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴としているが、式(4)で表される化合物を含有していてもよい。
【化５】
2005068080.tif 000006
【００１９】
以下の実施例において、核磁気共鳴スペクトル（1H-NMRおよび13C-NMR）はJEOL JNM-GX400を用いて測定した。測定溶媒は重クロロホルムを使用し、テトラメチルシラン（TMS）を内部標準物質としてδ値を示した。また、質量スペクトルはJMS-T100LC型質量分析計（日本電子製）を用いて測定し、赤外吸収スペクトルはFT-210FT赤外分光光度計（堀場製作所製）を用いて測定した。薄層クロマトグラフィー(TLC)はMerck Art. 5715 Kieselgel 60F254（40μm-100μm）を使用し、リンモリブデン硫酸で呈色した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーはSilica gel 60N（関東化学）を用いた。なお、各反応は特に記載のない限り、アルゴン雰囲気下で行った。
【実施例１】
【００２０】
＜3,7-ジメチル-9-(2,6,6-トリメチルシクロヘキシ-1-エニル)-ノナ-2,4,6,8-テトラエン酸メトキシメチルアミドの合成＞
化学式(2)で表されるレチノイン酸（ATRA）106.7mg（0.355mmol）を無水のN,N-ジメチルホルムアミド（DMF）1 mlに溶解し、これに氷冷下でN-メトキシ-N-メチルアミンの塩酸塩（MeONMe・HCl）64.2 mg（0.548mmol）と、ジエチルシアノホスホン酸（DEPC）54.3mg（0.331mmol）と、トリエチルアミン 0.12mlとを加え、0℃、2時間撹拌した。2時間後、反応液をトルエン10ｍlで2回抽出し、トルエン層を1N HCl 10ml、飽和重曹水10ml、飽和食塩水10mlで順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムにより脱水した後、減圧下濃縮した。得られた残渣（145.9 mg）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル＝7/1）で精製し、式(3)で表される3,7-ジメチル-9-(2,6,6-トリメチルシクロヘキシ-1-エニル)-ノナ-2,4,6,8-テトラエン酸メトキシメチルアミド化合物112.2mg（0.327mmol）を黄色油状物質として得た（収率：91％）。
【００２１】
1H-NMRの化学シフト値（ppm）：6.96(H), 6.35(H), 6.26(H), 6.25(H), 6.14(H), 6.13(H), 3.69(3H), 3.23(3H), 2.34(3H), 2.02(2H), 2.00(3H), 1.72(3H), 1.63(2H), 1.48(2H), 1.03(6H)
13C-NMRの化学シフト値（ppm）：168.3, 150.3, 138.9, 137.8, 137.4, 136.1, 130.0, 129.8, 129.6, 128.3, 117.3, 61.6, 39.6, 34.3, 33.1, 32.4, 29.0x2, 21.8, 19.2, 13.2, 12.9
HRESIMS(m/z)：366.24255 calcd for C22H33NO2Na 366.24090
IR；図１参照
TLC（ヘキサン/酢酸エチル=5/1）：Rf値0.19
【実施例２】
【００２２】
＜5,9-ジメチル-11-(2,6,6-トリメチルシクロヘキシ-1-エニル)-アンデカ-4,6,8,10-テトラエン-3-オンの合成＞
実施例1により得られた式(3)で表される化合物169.1mg（0.493mmol）をテトラヒドロフラン（無水）（dry THF）4mlに溶解し、氷冷下で臭化エチルマグネシウムを含むテトラヒドロフラン溶液1.7mlを加え、0℃、1時間撹拌した。この反応液に10％ 塩酸−メタノール溶液（0.89mol/L）2mlを加えて反応を止め、この溶液に飽和食塩水 50mlを加えた。その後、クロロホルム 50mlで2回抽出し、クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムにより脱水した後、減圧濃縮し、得られた残渣（433.1mg）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル＝25/1）で精製し、粗精製物165.9mgを得た。これを再びシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン/ヘキサン＝3/4）で精製し、5,9-ジメチル-11-(2,6,6-トリメチルシクロヘキシ-1-エニル)-アンデカ-4,6,8,10-テトラエン-3-オンのトランス体（式(1)で表される化合物；TWB-8083）91.3mg（0.292mmol，黄色固体；収率53.1％）とシス体（式(4)で表される化合物）14.6mg（0.046mmol，黄色固体；収率9.3％）を得た。
【００２３】
＜トランス体＞
1H-NMRの化学シフト値（ppm）：7.05(H), 6.29(H), 6.25(H), 6.15(H), 6.14(H), 6.13(H), 2.50(2H), 2.34(3H), 2.03(2H), 2.01(3H), 1.72(3H), 1.61(2H), 1.47(2H), 1.10(3H), 1.03(6H)
13C-NMRの化学シフト値（ppm）：202.0, 150.9, 139.7, 137.7, 137.3, 135.7, 132.1, 130.1, 129.6, 128.8, 125.6, 39.6, 37.9, 34.3, 33.1, 29.0x2, 21.8, 19.2, 14.2, 12.9, 8.4
ESIMS（m/z）：335 (MNa)
IR；図２参照
TLC（トルエン）：Rf値0.43
【００２４】
＜シス体＞
1H-NMRの化学シフト値（ppm）：7.80(H), 7.03(H), 6.27(H), 6.25(H), 6.13(H), 6.00(H), 2.47(2H), 2.07(3H), 2.01(2H), 2.00(3H), 1.72(3H), 1.61(2H), 1.47(2H), 1.09(3H), 1.04(6H)
13C-NMRの化学シフト値（ppm）：201.6, 149.16, 140.0, 137.7, 137.5, 133.3, 130.5, 130.3, 130.1, 128.6, 123.7, 39.6, 37.7, 34.2, 33.1, 28.9x2, 21.7, 20.9, 19.2, 12.9, 8.3
ESIMS（m/z）：335 (MNa)
IR；図３参照
TLC（トルエン）：Rf値0.57
【実施例３】
【００２５】
APL細胞から好中球へと分化した細胞は、NBT（nitro blue tetrazolium）を還元する活性酸素生成能が上昇することが知られている。従って、NBT還元能を測定することにより、好中球への分化誘導率を計算することができる。そこで、本発明者らは、NBT還元能を測定し、TWB-8083がATRA感受性APL細胞であるNB4細胞とATRA非感受性UF-1細胞の分化誘導に与える影響を調べた。なお、NBT還元能の測定は、細胞をNBT（nitro blue tetrazolium）で処理してホルマザン沈殿を生じさせ、青色に染色した細胞をカウントすることにより行った。
【００２６】
5×104細胞/ml の細胞溶液（NB4細胞またはUF-1細胞）をRPMI 1640培地を用いて調製した。この細胞溶液を24穴プラスチックプレートに1ウェルあたり500μlずつ蒔き、同時に最終濃度で1×10-8、3×10-8、1×10-7、3×10-7、1×10-6mol/lとなるようにTWB-8083またはATRAを添加して適宜インキュベートした（コントロールとして、これらの薬剤を添加しないウェルも用意した。）。その後、NBT（Wako, Osaka, Japan）およびTPA（Sigma, St. Louis, USA）を、それぞれ最終濃度1.25mg/mlおよび200ng/mlとなるように蒸留水に溶解したNBT溶液を調製し、これを1ウェルあたり300μlずつ加えて、37℃、5％ CO2の条件下で30分間インキュベートした。この細胞懸濁液を1.5ml エッペンドルフチューブに移して遠心分離（3500rpm×5分間）し、培地を除去した。ここにPBS-（Ca2+,Mg2+-free PBS；8.0g/l NaCl, 0.2g/l KCl, 2.3g/l NaHPO4・12H2O, 0.2g/l KH2PO4）を150μl加えて再懸濁した。NBTのホルマザン沈殿により青くなっている細胞を分化細胞として、血球計算盤（エルマ）により分化細胞および全細胞数をカウントした。分化誘導率は、（分化細胞数）÷（全細胞数）×100より算出した。その結果を図４に示す。
【００２７】
ATRA感受性NB4細胞においては、ATRAの投与によってNBT陽性細胞は増加したが、TWB-8083の投与によってNBT陽性細胞は増加しなかった。一方、ATRA非感受性UF-1細胞においては、ATRAの投与によってNBT陽性細胞は増加しなかったが、TWB-8083の投与によってNBT陽性細胞は増加した。従って、ATRAはNB4細胞の分化を誘導するのに対してUF-1細胞の分化を誘導しないこと、及びTWB-8083はNB4細胞の分化を誘導しないがUF-1細胞の分化を誘導することが示された。以上のことから、ATRAのカルボキシル基をプロピオニル基に置換することにより、TWB-8083はATRA非感受性UF-1細胞特異的に好中球様細胞へと分化誘導することが明らかとなった。
【実施例４】
【００２８】
次に、TWB-8083で処理したUF-1細胞がアポトーシスを誘導するかどうかを調べた。  
2×105細胞/ml の細胞溶液（NB4細胞またはUF-1細胞）をRPMI 1640培地を用いて調製し、24ウェルプラスチックプレートに1ウェルあたり500μlずつ蒔き、同時に最終濃度で1×10-6mol/lとなるようにTWB-8083またはATRAを添加し、4日間インキュベートした。この細胞懸濁液を1.5 ml エッペンドルフチューブに移して遠心分離（3500rpm×5分間）し、上清を除去した。ここにPBS-を1ml加えて細胞懸濁液を調製し、これをスライドグラス・濾紙・チューブをセットしたcytospinローターSC-2（トミー精工, Tokyo, Japan）に移した。これを再度遠心分離（1000rpm×5分間）し、塗沫標本を作製した。
【００２９】
この標本を3％ パラホルムアルデヒドにて10分間固定し、蛍光抗体用PBS-（8.0g/l NaCl, 0.45g/l NaH2PO4・2H2O, 1.28g/l Na2HPO4）で洗浄し、細胞の浸透性を高めるため1％のTritonXに浸した。5分後、蛍光抗体用PBS-で洗浄し、15％のFBS（Sigma）で20分間ブロックした。その後、1μg/mlのマウス由来抗PML抗体（PG-M3：sc-966、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）および1.5％のFBSを含む蛍光抗体用PBS-を調製し、これに標本を浸して室温で1時間反応させた。そして、蛍光抗体用PBS-で5分おきに3回洗浄した後、2％のFBSを含む蛍光抗体用PBS-に20μg/mlのヤギ由来Alexa Fluor 488-conjugated抗マウスIgG抗体（Molecular Probes, Eugene, OR）を加えた溶液を調整し、室温で標本と1時間反応させた。標本を蛍光抗体用PBS-で洗浄した後、蛍光顕微鏡で観察・撮影を行った。
【００３０】
図５に示すように、TWB-8083で処理したUF-1細胞は、ATRAで処理したNB4細胞と同様に、アポトーシスのマーカーである核の凝集（nuclear body）が観察された（矢印部分）。このことから、UF-1細胞をTWB-8083で処理することにより、UF-1細胞がアポトーシス誘導されることが明らかとなった。
【実施例５】
【００３１】
骨髄球が好中球に分化すると骨髄球細胞表面にCD11b抗原が発現することが知られている。そこで、APL細胞の分化誘導能の指標として、NB4細胞またはUF-1細胞におけるCD11b抗原の発現をFACS解析により調べた。
【００３２】
2×105細胞/ml の細胞溶液（NB4細胞またはUF-1細胞）をRPMI 1640培地により調製し、最終濃度で1×10-8mol/lとなるようにTWB-8083またはATRAを添加して4日間インキュベートした後PBS-で洗い、1.5ml エッペンドルフチューブに移してAB serum（Sigma）を用いて30分間ブロックした。Buffer A（0.1％ NaN3, 0.1％ BSAを含むPBS-）にFITC結合抗CD11b抗体（Becton Dickinson, San Jose, CA）を加えた溶液を調製し、氷上で30分間反応させた。その後、遠心分離（3500rpm×5分間）して溶液を除去し、Buffer Aで洗浄した。再度、遠心分離して上清を除去した後Buffer Aで細胞を懸濁し、FACScalibur flow cytometer（Becton Dickinson）でCD11bの発現を調べた。また、分化したAPL細胞におけるアポトーシスを調べるために、上記と同様にして、アポトーシスのマーカーであるannexin V-FITC（PharMingen, San Diego, CA）で染色した。この測定結果にもとづいて算定した分化誘導率とアポトーシス誘導率を表１に示す。
【表１】
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表１に示すように、UF-1細胞に対して、TWB-8083はATRAに比べて、好中球細胞への分化をおよそ4倍誘導し、分化後のアポトーシスをおよそ３倍誘導することが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】式(3)で表される化合物の赤外線吸収スペクトルの測定結果を示す図である。
【図２】式(1)で表される化合物の赤外線吸収スペクトルの測定結果を示す図である。
【図３】式(4)で表される化合物の赤外線吸収スペクトルの測定結果を示す図である。
【図４】TWB-8083がUF-1細胞のNBT還元能に与える効果を示す図である。
【図５】TWB-8083がUF-1細胞の形態変化に与える効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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