(57)【要約】【課題】イソフラボン含有組成物から活性化酸素阻害剤を提供する。【解決手段】大豆蛋白、米糠及び米胚芽に納豆菌で発酵させた発酵液をプロテアーゼ分解後、オカラ発酵物、モロヘイヤ、エゾウコギエキス及び茶カテキンを加えてイソプロピルアルコール抽出して得たイソフラボン含有組成物は活性化酸素阻害剤あり、抗酸化作用並びに活性化酸素フリーラジカル消去作用を有し、毒性も極めて低い。【選択図】なし・【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆蛋白、米糠及び米胚芽に納豆菌で発酵させた発酵液をプロテアーゼ分解後、更に、オカラ発酵物、モロヘイヤ、エゾウコギエキス及び茶カテキンを加えてイソプロピルアルコール抽出して得たイソフラボン含有組成物。
【請求項２】
大豆蛋白、米糠及び米胚芽に納豆菌で発酵させた発酵液をプロテアーゼ分解後、オカラ発酵物、モロヘイヤ、エゾウコギエキス及び茶カテキンを加えてイソプロピルアルコール抽出して得たイソフラボン含有組成物を有効成分として含有することを特徴とする活性化酸素阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、新規なイソフラボン含有組成物及び活性化酸素阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】従来技術で、活性化酸素阻害剤としてのＳＯＤはその製造が困難であり又原料の入手に制限があり、ビタミンＥ、ビタミンＣ、カテキン・フラボノイド及びペプチド類等は、生体を用いた実験では活性化酸素阻害作用が十分でない等の難点があり、又、活性化酸素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用を示す活性化酸素阻害剤の多くは、その殆どが化学合成で製造されたものであり、たとえ植物や動物からの材料を用いた天然物由来のものであっても、その製造過程で人体に害を及ぼす化学物質を用い、生成物の一部を化学物質と反応させて作られたものが多い。このような背景のもと、更に強力な作用を有する活性化酸素阻害剤が要望されている。
【特許文献１】特開平０６−１２８１６８号公報
【特許文献２】特開平０８−００９８９２号公報
【特許文献３】特開平０９−０５９２９７号公報
【特許文献４】特開平０９−１５７２９１号公報
【特許文献５】特開平０９−１５７２９２号公報
【特許文献６】特開平１１−０３５５９８号公報
【特許文献７】特開平１１−０３５５９９号公報
【特許文献８】特開平１１−２９２８９７号公報
【非特許文献１】ＭｃＣｏｒｄ，Ｊ．Ｍ．＆Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ｉ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４，６０４９（１９６９）
【非特許文献２】山口等、ニューフードインダストリー、３１巻、１８−２２頁（１９８９年）
【非特許文献３】拓殖等、日本農芸化学会誌，６５巻，１６３５頁（１９９１年）
【非特許文献４】陳等、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，４６卷，４９頁（１９９８年）
【非特許文献５】工藤等、日本食品科学工学会誌，４８巻，４４頁（２００１年）
【非特許文献６】受田等、日本農芸化学会誌，７２巻，１１８１頁（１９９８年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】活性化酸素が関与する疾病は、火傷、関節炎などの炎症、再環流障害、抗癌剤の副作用、放射線障害、消化性潰瘍、細菌性ショック、悪液質、自己免疫疾患など幅広く存在する。好中球やマクロファージなどの活性化によって、発生する大量の活性化酸素が引き起こす疾患は、すべて対象となる。一般に、酸素には動物に必須の酸素（三重項酸素分子：３Ｏ２）と、特定の条件あるいは体の不調時に生じるラジカル（活性化酸素）とが存在する。ラジカルは直接又は間接的（過酸化反応という形で）に細胞膜、細胞内顆粒膜、あるいはＤＮＡをはじめ種々の細胞成分を変質、損傷させたりする。このラジカルは体内で生産され、その種類はスーパーオキシドアニオン（−Ｏ２・）、一重項酸素（１Ｏ２・）、水酸化ラジカル（・ＯＨ）等が存在する。このうちスーパーオキシドアニオン（−Ｏ２・）は細胞膜の不飽和脂肪酸等に作用して過酸化反応を引き起こし、脂質に対する酸化力は動物に必須な酸素の数千倍も高いといわれている。活性化酸素阻害剤としてのスーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ、酵素番号ＥＣ１．１５．１．１）は、１９６９年マクコルドら［非特許文献１］によってその作用が発見された酵素であり、酸素分子が一電子還元されて生じるスーパーオキシドアニオン（−Ｏ２・）を不均化する
２−Ｏ２・＋２Ｈ＋→Ｈ２Ｏ２＋Ｏ２
を触媒する。人体が正常なときにはＳＯＤが働いてスーパーオキシドアニオンの発生を抑えている。このＳＯＤ活性は加齢と共に低下し、すなわち壮年期から老年期になると活性が低下し、ＳＯＤ活性の増減は生体の老化、癌化のバロメーターともいわれている。このようなＳＯＤ活性が低下するとラジカルの発生は抑えにくくなりＳＯＤを摂取補強するか、又はラジカルを捕捉除去する活性化酸素阻害剤の摂取が必要となってくる。
一方、水溶性の抗酸化剤としてのアミノ酸から蛋白質にいたるポリペプチドの活性化酸素阻害作用は、油脂をペプチド類か包み込むことにより酸素分子と不飽和脂肪酸の接触を阻害し、脂質ペルオキシラジカル（ＬＯＯ・）の発生を抑制すると考えられており、ＢＨＡ（ブチルヒドロキシルアニソール）及びＢＨＴ（ジブチルヒドロキシトルエン）の抗酸化作用のように、油脂（Ｌ）の酸化の際に生じるラジカル（ＬＯＯ・）に作用して、酸化の連鎖反応を停止させるラジカル捕捉作用とは区別している。
ＬＯＯ・＋ＡＨ２→ＬＯＯＨ＋ＡＨ・
２ＡＨ・→２ＡＨ２＋Ａ  又は  ＬＯＯ・ＡＨ・→ＬＯＯＨ＋Ａ
（ＡＨ２；抗酸化剤）
今日、抗癌、老化防止に対する特効薬がない状況で、環境中からＤＮＡ損傷因子、突然変異因子、発癌因子、老化因子等を取り除き不活性化し、活性化酸素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用を示す活性化酸素阻害剤に関する研究や検討が進められている。一方、水溶性の抗酸化剤として、アミノ酸から蛋白質に至るポリペプチドのアミノ酸配列と抗酸化力に関する知見は極めて少なく、山口ら［非特許文献２］は、ジペプチドがアミノ酸や蛋白質よりも抗酸化力が強いことを示しており、又、最近、拓殖ら［非特許文献３］がＡｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ，Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ，Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎを、陳ら［非特許文献４］がＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ他５種類の抗酸化ペプチドを，工藤ら［非特許文献５］がＡｌａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔを報告している。これに対し、発明者らはカテキン類［特許文献１］及び活性化酸素消去ペプチド（抗酸化ペプチド）［特許文献２〜８］等を数多く報告してきているが、これら活性化酸素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用等を有する沽性化酸素阻害剤が、未だ医薬品として開発が進んでいるとの報告はない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】本発明者は、大豆蛋白、米糠及び米胚芽に納豆菌で発酵させた発酵液をプロテアーゼ分解後、更に、オカラ発酵物、モロヘイヤ、エゾウコギエキス及び茶カテキンを加えてイソプロピルアルコール抽出して得たイソフラボン含有組成物が強い活性化酸素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用を有することを見出した。そして、これら新規なイソフラボン含有組成物を医薬品として実用化するための研究を鋭意行った。その結果、これら新規なイソフラボン含有組成物が活性化酸素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用を有し、天然物由来の活性化酸素阻害剤としての有用性を見出した。本発明は係る知見に基づくものである。以下に本発明を詳細に説明する。本発明に係る新規なイソフラボン含有組成物は常温における性状は白色の粉末である。【０００５】本発明に係る新規なイソフラボン含有組成物を調製する場合には、素材として、大豆蛋白質、米糠及び米胚芽を用いる。これらに清水を加えホモジナイズした混合液に納豆菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｔｔｏ）を加えた後、撹拌しながら培養する。更に、培養液に蛋白質分解酵素（例えば、Ｐｒｏｔｅａｓｅ）を加えた後、同様に撹拌しながら酵素分解する。酵素分解終了後、蛋白質分解酵素を失活させる為、煮沸処理する。酵素分解液を冷却後、オカラ発酵物、米糠、エゾウコギエキス及び茶カテキンを加えた後、撹拌しながら加温する。その後、反応液を酸性側にｐＨ（例えば、ｐＨ３〜４）を調整した後、連続遠心分離機（例えば、デラバル、デカンター等）、更に、超高速遠心分離機（例えば、シャープレス）を用いて遠心分離（例えば、４，０００ｒｐｍ〜１５，０００ｒｐｍ）して、遠心上清液を得る。この遠心上清液を凍結乾燥及びスプレードライしてイソフラボン含有粗粉末とする。このイソフラボン含有粗粉末に対して、アルコール類（例えば、イソプロピルアルコール）で分画する。これらイソフラボンを多く含む分画部からアルコール類（例えば、イソプロピルアルコール）を除いた後、逆浸透膜（ＲＯ膜）及び精密濾過膜（ＭＦ膜）で低分子分画部分を除いた後、凍結乾燥及びスプレードライしてイソフラボン含有組成物粉末とする。【０００６】本発明に係る新規なイソフラボン含有組成物は、静脈内への繰り返し投与を行った場合、抗体産生を惹起せず、アナフィラキシーショックを起こさせない。又、これらイソフラボン含有組成物は投与後、生体内の分解酵素により徐々に分解される為、毒性は極めて低く安全性は極めて高い（ＬＤ５０＞５０００ｍｇ／ｋｇ：ラット経口投与）。
これらイソフラボン含有組成物は、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等に調整することができる。投与法としては、通常は活性化酸素による酸化ストレス症を有している哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射すること、あるいは経口投与することがあげられる。投与量は、例えば、動物体重１ｋｇ当たりこれらイソフラボン含有組成物を０．１〜１００ｍｇの量である。投与回数は、通常、１日１〜４回程度であるが、投与経路によって、適宜、調整することができる。上記の各種製剤において用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤の種類は、特に限定されず、通常の注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤あるいはカプセル剤に用いられるものを使用することができる。【０００７】錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤に用いる添加剤としては、下記のものをあげることができる。賦形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール等の糖アルコール類、でんぷん類、無水リン酸カルシウム等；結合材としてはでんぷん類、ヒドロキシルプロピルメチルセルローズ等；崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロース及びそのカリウム塩類；滑沢剤としてはステアリン酸及びその塩類、タルク、ワックス類をあげることができる。又、製剤の調整にあたっては、必要に応じメントール、クエン酸およびその塩類、香料等の矯臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、常法により、これらイソフラボン含有組成物を、注射用水、生理食塩液及びキシリトールやマンニトールなどの糖アルコール注射液、プロピレングリコールやポリエチレングリコール等のグリコールに溶解又は懸濁させて注射剤とすることができる。この際、緩衝液、防腐剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加することができる。これらイソフラボン含有組成物を含有する製剤は凍結乾燥品又は乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解剤、例えば、水又は生理食塩液にて溶解して用いることもできる。
【発明の効果】
【０００８】活性化酸素はマクロファージ等の食細胞内に生じ、食細胞が捕食した異物を分解する役割を有しているが、活性化酸素が過剰に生産されると細胞の外に分泌され、他の組織に障害を起こす。本発明に係る新規なイソフラボン含有組成物は、優れた活性化酸素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用を有し活性化酸素阻害作用を示す。更にひいては、組織障害を引き起こす過剰な活性酸素を分解して組織を守る作用を持つことから、例えば抗炎症剤として関節炎やリュウマチなどに有効であるほか、ベーチュット病、心筋梗塞等に対しても有用である。
【発明を実施するための最良の形態・実施例】
【０００９】本発明は、医薬品として有用性を有する下記の本発明に係る新規なイソフラボン含有組成物及びイソフラボン含有組成物を有効成分とする活性化酸素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用を有する活性化酸素阻害剤に関する。
以下に実施例として、製造例及び試験例を記載し本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１０】製造例１
大豆蛋白質１００ｋｇ、米糠２５ｋｇ及び米胚芽２５ｋｇに清水３，０００リットルを加え撹拌した。撹拌しながら、液温９５℃で１時間、滅菌操作を行った。冷却後、市販納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｔｔｏ）４．５ｋｇ（大豆蛋白質、米糠及び米胚芽に対し３％）を加え、液温４０〜４５℃で２８時間、撹拌しながら培養した。次に、納豆菌培養液に蛋白質分解酵素（Ｐｒｏｔｅａｓｅ）４．５ｋｇ（大豆蛋白質、米糠及び米胚芽に対し３％）を加え、液温４５〜５０℃で１５時間、撹拌しながら酵素分解を行った。酵素失活の為、９５℃で１０分間煮沸処理した後、冷却後、オカラ発酵物１００ｋｇ、米胚芽２５ｋｇ及びエゾウコギエキス１０ｋｇ及び茶カテキン１３０ｇを加え、液温５５〜６０℃で２時間、撹拌しながら反応を行った。次に、反応液のｐＨをクエン酸を用いてｐＨ３．８に調整した後、連続遠心分離機デラバル（４，０００ｒｐｍ〜６，０００ｒｐｍ）、更に、超高速遠心分離機シャープレス（１０，０００ｒｐｍ〜１５，０００ｒｐｍ）を用いて遠心分離して、遠心上清液を得た。次に、遠心上清液を凍結乾燥してイソフラボン含有粗粉末５０．３ｋｇを得た。このイソフラボン含有粗粉末に対して、冷所（５℃）にて５％〜９５％イソプロピルアルコール分画を行った。イソフラボン含有の高い分画部分から、減圧濃縮機エバポールにてイソプロピルアルコールを除去した後、逆浸透膜（ＲＯ膜）及び精密瀘過膜（ＭＦ膜）で濾過し、低分子分画部分を除くと同時にイソフラボン含有の更に高い分画部分を得た。これを凍結乾燥してイソフラボン含有粉末４２．７ｋｇを得た。
上記製造例によって得られた本発明に係る新規なイソフラボン含有組成物は、以下に示す試験によって、活性化酸素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用等の活性化酸素阻害作用が確認された。
【００１１】試験例１
（活性化酸素フリーラジカル消去作用の測定）
受田らの方法［非特許文献６］に従って測定した。即ち、２．５ｍＬの緩衝液（５０ｍＭ）が入った試験管に３ｍＭキサンチン、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＸＴＴ及び試料溶液をそれそれ０．１ｍＬ加え、直ちにトリガーとして５７ｍＵ／ｍＬ  ＸＯＤを０．１ｍＬ加えた。２５℃で正確に２０分間反応させた後，４７０ｎｍにおける吸光度を測定した。活性化酸素フリーラジカル（スーパーオキシドアニオン）によるＸＴＴの還元を５０％阻害する濃度をＩＣ５０値とした。結果を図１に示した。本発明に係る新規なイソフラボン含有組成物の活性化酸素フリーラジカル消去活性すなわち活性化酸素阻害活性（ＩＣ５０値）は、１．２６×１０−３である。
試験例１
（抗酸化作用の測定）
抗酸化作用の測定として、反応液はリノール酸５１．１ｍｇ、エタノール４．０５２ｍＬ、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４．０ｍＬ、脱イオン水１．９４８ｍＬの混合液に、抗酸化作用を有するペプチド１−３ｍｇ添加し、全量が１０ｍＬとなるように調製した。この溶液をネジ付き試験管で密封し５０℃の恒温器中に放置し、２４時間毎にリノール酸の過酸化物価をロダン鉄法で測定した。
即ち反応液０．１ｍＬ、７５％エタノール液９．７ｍＬ、３０％ロダンアンモニウム液０．１ｍＬ、０．０２Ｍ塩化第二鉄を含む３．５％塩酸溶液０．１ｍＬを添加し、３分間反応させた後、吸光度５００ｎｍを測定した。その際、５００ｎｍの吸光値が０．３００に達するまでの日数を誘導期間（日）とした。結果を図２に示した。本発明に係る新規なイソフラボン含有組成物の０．１ｍｇの抗酸化活性（誘導日数）は６３．７日、０．２ｍｇ；７２．４日、０．３ｍｇ；８１．９日である。
以上の試験の結果、本発明に係る新規なイソフラボン含有組成物は、活性化酸素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用等の活性化酸素阻害作用を有することが確認された。従って、本発明に係る新規なイソフラボン含有組成物は活性化酸素阻害剤の対象となる虚血性心疾患者、慢性関節リュウマチ及び重症火傷患者の治療又は予防薬として有用である。尚、本発明に係る新規なイソフラボン含有組成物は、構造的にそのフラボノイド類において、構造中に採用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る新規なイソフラボン含有組成物の、製造例１におけるイソフラボン含有粉末の活性化酸素フリーラジカル消去作用を示す図である。
【図２】本発明に係る新規なイソフラボン含有組成物の、製造例１におけるイソフラボン含有粉末の抗酸化作用を示す図である。
【図１】
2005080655.tif 000002
【図２】
2005080655.tif 000003