(57)【要約】【課題】  チップ形状の高さに比して底面積の大きい平板状の反応測定容器を用いる抗原抗体反応あるいは遺伝子検出法において、再現性のよい定量的な測定結果が得られる分析装置を提供すること。【解決手段】  異なる位置に複数の試薬が点着された平板状の反応容器と、該反応容器に試料を供給する試料供給機構と、該試料供給機構により試料が供給された反応容器上の前記複数の試薬が点着された位置毎に光を照射し、検出される光信号を測定する測定機構と、を備えた分析装置。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる位置に複数の試薬が点着された平板状の反応容器と、
該反応容器に試料を供給する試料供給機構と、
該試料供給機構により試料が供給された反応容器上の前記複数の試薬が点着された位置毎に光を照射し、検出される光信号を測定する測定機構と、
を備えたことを特徴とする分析装置。
【請求項２】
請求項１記載の測定機構は、試料が供給され、かつ試薬が点着されていない位置にも光を照射し、検出される光信号を測定することを特徴とする分析装置。
【請求項３】
請求項１記載の測定機構は、試料が供給され、かつ試薬が点着されていない、異なる複数位置にも光を照射し、検出される光信号を測定することを特徴とする分析装置。
【請求項４】
請求項１記載の測定機構は、試料が供給された反応容器上の前記複数の試薬が点着された位置に順次に光を照射し、試薬が点着された位置の間においても光を照射して検出される光信号を測定することを特徴とする分析装置。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載の分析装置であって、試料が供給され、かつ試薬が点着されていない位置で検出された光信号に基き、試薬が点着された位置で検出された光信号の測定値を補正する演算機構を備えたことを特徴とする分析装置。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の反応容器は底面積１平方センチメートル以上，１００平方センチメートル以下，高さ１センチメートル以下であり、上面が開放された凹形状であることを特徴とする分析装置。
【請求項７】
異なる位置に複数の試薬が点着された平板状の反応容器を用い、
該反応容器に試料を供給する試料供給ステップと、
該試料が供給された反応容器上の前記複数の試薬が点着された位置毎に光を照射し、検出される光信号を測定する測定ステップと、
前記試薬が点着された位置の間においても光を照射して検出される補正用の光信号を測定する補正信号測定ステップと、
を含む分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は平板状の反応容器中で試料と試薬を混合・反応させる機構を備えた分析装置に係り、特に反応容器の異なる位置に複数種の異なる試薬を点着させて用いる分析装置及び分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体サンプル中の特定抗原・抗体あるいは核酸の定性・定量分析においてはプラスチック，ガラス等からなる平板（チップと称される）を反応面として用いることがある。例えば平板上に予め試薬を付着させておき、試料を添加して反応させる。抗原抗体反応においては抗原，抗体、また、遺伝子検出法においてはＤＮＡ断片を標識物質と結合させ、プローブあるいはトレーサとして用いる。
【０００３】
このような反応チップに関しては例えば特許文献１に記載されているようなものがある。
【０００４】
特許文献１記載の技術は異なるＤＮＡフラグメント（エレメント）をチップ上に設け、被測定試料をチップ上に導入して、どのフラグメントでハイブリダイズが生じているかを測定する方法に係り、特に異なる位置に点着したエレメントと試料との反応を測定した蛍光シグナルの定量化のため、同じ試薬を濃度を変えて点着し、それらの測定結果に基づき測定結果を校正する技術に関するものである。
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−１２１４４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１記載の技術では、同じエレメント（試薬）の濃度を２０，４０，６０，８０，１００％と変えたチップを用いて測定しているが、各試薬を点着した位置にどのように光を照射して測定するかについては記載がない。光源からの光をチップ全体に照射して試薬より発する蛍光を測定する場合は、光源の光度分布が均一でない定量分析結果を得るのは難しい。また、測定値からバックグランド値（濃度０、すなわちブランク値）を差し引いて測定値の絶対値を補正する方法についても記載がない。相対値を得るだけなら特許文献１記載の技術で対応可能であるが、分析の目的によっては絶対値の測定を必要とする場合がある。
【０００７】
本発明は、チップ形状の高さに比して底面積の大きい平板状の反応測定容器を用いる抗原抗体反応あるいは遺伝子検出法において、再現性のよい定量的な測定結果が得られる分析装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するための本発明の構成は以下の通りである。
【０００９】
異なる位置に複数の試薬が点着された平板状の反応容器と、該反応容器に試料を供給する試料供給機構と、該試料供給機構により試料が供給された反応容器上の前記複数の試薬が点着された位置毎に光を照射し、検出される光信号を測定する測定機構と、を備えた分析装置。
【００１０】
また、異なる位置に複数の試薬が点着された平板状の反応容器を用い、該反応容器に試料を供給する試料供給ステップと、該試料が供給された反応容器上の前記複数の試薬が点着された位置毎に光を照射し、検出される光信号を測定する測定ステップと、前記試薬が点着された位置の間においても光を照射して検出される補正用の光信号を測定する補正信号測定ステップと、を含む分析方法。
【００１１】
平板状とは高さに比べて底面積の大きな容器のことを総称しているものである。好ましくは、反応容器は底面積１平方センチメートル以上，１００平方センチメートル以下，高さ１センチメートル以下であり、上面が開放された凹形状であるが、これに限定されるものではない。また容器上方からみた形状も四角形である必要は無く真円，楕円でも良いし多角形でも良い。試料供給機構はいかなる様式のものでもよいが、試料を収容する試料容器から分析に必要な量をノズルを用いて分取し、ノズルを反応容器上に移動させた後、分取した試料を吐出する方式が好ましい。反応容器上への試薬の点着方法（実施例ではドットと称するがいずれも一定面積にあるものを付着させるという意味で用いている）も特に限定されないが、プラスチック、ガラス等からなる反応容器の底面上に試薬を直接固定する方法、あるいはビオチン・アビジン反応のような抗原・抗体反応を起す物質を反応容器の底面上及び試薬の双方に付着させ、結合する方法等任意の方法により、円形状等のスポットを形成する方法が好ましい。スポット形状は円でなくとも本発明の効果には影響を及ぼさないことは言うまでもない。反応容器の底面にはスポット毎の仕切りは特に必要ではない。測定機構の光源はハロゲンランプ，レーザ，ＬＥＤ等任意の光源から選択できる。光信号検出器は光電子増倍管（フォトマルチプライヤ），フォトダイオード等いずれの形式でも蛍光，燐光等の光の強度を測定できるものであれば何でも良い。光源からの光は必要に応じて光学レンズによりビーム径が調整された後、試薬が点着されたスポットに照射される。光ビームのスポット間の移動は、光源位置を移動させても良いし、反応容器を搭載した架台を移動させても良い。
【発明の効果】
【００１２】
（１）本発明によれば、測定対象物によらない影響を取り除き、測定対象物から得られるシグナルを取り出し、測定対象物の再現性と精度を有した測定検出分析を行う手法と提供される。
（２）本発明によれば、また、チップを用いた反応測定方法において、サンプル，試薬あるいは洗浄液にさらされるがサンプルに含まれ得る測定対象物に結合する核酸、糖質あるいはタンパク質あるいはそれらを稀釈する希釈液に含まれる成分を点着することなく、これらが点着されていないチップ面の測定を行うことにより測定対象物のより良好な分析性能を得ることを特徴とするチップ，反応測定方法あるいは方法を実施する装置が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施例を図１から図６を用いて説明する。
【実施例１】
【００１４】
図１に示す凹形状のプラスチック製チップを作製する。左側円で示されるものは、抗原抗体反応あるいは核酸ハイブリダイゼーションのなされる個所（スポット）であり、必ずしもチップ底面との境界がチップにあることを示すものではない。
【００１５】
図２にチップ洗浄装置とチップ測定装置のシステム概要を示す。チップは、チップ洗浄装置にて、抗原抗体反応あるいは核酸ハイブリダイゼーションを行う。その後、チップ測定装置にてスポットの分析測定を行う。分析測定データはＰＣに表示されるか、データ解析がなされる。
【００１６】
図３にチップ測定装置の光学路配置図を示す。チップ表面の最終反応産物はレーザからの励起光により蛍光を発し、これは光電子増倍管に捉えられる。チップ上の各スポットあるいは測定ポイントは、Ｘ−Ｙ移動ステージにより移動され分析測定される。
【実施例２】
【００１７】
図４に、補正用ポイントを含めた各々スポットの測定手法の例を示す。Ｘ−Ｙ移動ステージの複雑にならないよう矢印のとおりの簡易な移動経路を選択する。
【実施例３】
【００１８】
抗原抗体反応を用いたアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）測定例を示す。
【００１９】
チップに約２mm径のスポットを作製し、０.１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９.６）で５マイクロ（μ）ｇ／ｍＬに稀釈した抗ヒトＡＦＰ抗体（日本バイオテスト研究所製）を２μＬ分注し、４℃一夜静置コーティングを行う。その後、０.０５％Tween２０加生理食塩水で洗浄した後、１％ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)，２％シュクロース加炭酸緩衝液(ｐＨ９.１)２００μＬを加え、３７℃にて静置する。１時間後、０.０５％Tween２０（シグマ製）加生理食塩水で洗浄し、１％ＢＳＡ加生理食塩水にて、ヒトＡＦＰ標準品（ＤＡＣＯ 
Immunoglobulins 製）を１０倍段階稀釈し、その２００μＬをチップに加える。チップ洗浄装置に搭載し、１時間連続的に振とう後、０.０５％Tween２０加生理食塩水で洗浄する。その後、ビオチン標識抗ＡＦＰ抗体（ＤＡＣＯ Immunoglobulins製）を１％ＢＳＡ加生理食塩水にて１μｇ／ｍＬに稀釈し、その２００μＬを各チップに分注し、装置にて１時間振とうさせる。その後、０.０５％Tween２０加生理食塩水で洗浄し、ストレプトアビジン標識蛍光色素の２００μＬをチップに分注する。
【００２０】
室温にて３０分静置後、０.０５％Tween２０加生理食塩水で洗浄した。チップをキセノンランプ光源蛍光測定装置（日立ハイテクノロジーズ）にて発光量を計測する。
【００２１】
図５に容器から測定される蛍光値あるいは試料に含まれる成分が結合しない反応条件下での蛍光測定値を補正対照値とした場合の検量線形状の特性を示す（点線）。縦軸に発光量（signal intensity）、横軸にヒトＡＦＰ標準品濃度を示す。特に低値において検量線にそりあるいは曲がりが生じやすく、その範囲において真値とは大きく異なる読み値を返すことがある。
【００２２】
図６に、補正のポイントを複数ポイント取る場合と、１ポイントのみの場合との検量線形状ばらつきを示す。チップ２０枚にそれぞれヒトＡＦＰ標準品およびビオチン標識抗
ＡＦＰ抗体を分注し、各々１０枚ずつを振とうあるいは静置したときの検量線を示す。縦軸に発光量（signal intensity）、横軸にヒトＡＦＰ標準品濃度を示す。
【００２３】
左図  補正ポイントを複数ポイントとした場合の検量線のばらつき
右図  補正ポイントを１ポイントとした場合の検量線のばらつき
補正ポイントを数ポイントとした場合、補正による検量線のばらつきは大きくはなく、その検量線を用いた読み値のばらつきも大きくはないことがわかる。スポット以外の点複数ポイントを補正ポイントとすることは図１の形状のチップにおいては容易であり、測定対象物の測定スポット数を減数することなく、複数の補正ポイントが得られる。
【００２４】
補正ポイントは数が多いほうが良い。また複数のポイントであることにより、チップ底面の歪みあるいは傾きを感知することも可能であり、これらからの測定値補正も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】チップ形状容器概要。
【図２】チップ洗浄装置とチップ測定装置のシステム概要。
【図３】チップ測定装置の光学路概図。
【図４】補正用ポイントを含めた各々スポットの測定手法。
【図５】測定対象物を反応し得ない条件下での検量線形状の特性。
【図６】複数ポイントでの補正を行った検量線と行わない検量線の例。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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