(57)【要約】【課題】特に遺伝情報を担っているＤＮＡやＲＮＡを人為的に操作するために、核酸分子を物理的に効率よく切断する方法について提案する。【解決手段】核酸分子を切断するに当たり、金属製針の表面の少なくとも一部に、抵抗率ρが１０５Ω・ｍ以上の絶縁性のセラミック被膜を形成した、穿刺針を用いる。【選択図】図２
2005270049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子を切断するに当たり、金属製針の表面の少なくとも一部に、抵抗率ρが１０５Ω・ｍ以上の絶縁性のセラミック被膜を形成した、穿刺針を用いることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【請求項２】
請求項１において、前記穿刺針のセラミック被膜の厚みが０．０１〜５．０μｍであることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【請求項３】
請求項１または２において、前記穿刺針のセラミック被膜が、Al、ＢおよびSiの窒化物、炭化物および酸化物のうちから選んだ少なくとも一種からなることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【請求項４】
請求項１、２または３において、前記穿刺針の基材金属がステンレス鋼であることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【請求項５】
請求項１、２、３または４において、前記穿刺針のセラミック被膜が、ダイヤモンド・ライク・カーボンからなることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）やＲＮＡ（リボ核酸）に大別される核酸を効果的に切断する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡを主とする遺伝情報に関する分子生物学の進歩は目ざましく、ＤＮＡの組み替え技術を利用して新製品の開発が盛んに行われるようになってきている。ＤＮＡは、図１の模式図（例えば、生命科学のコンセプト「分子生物学」小関治男ほか著、化学同人、ｐ．２８参照）で示すように、長さ約１０〜２０μｍ程度、太さが約２０Å（図では２．３ｎｍとなっている）で非常に長い（例えば細菌ウイルスの一種であるラムダファージでは約１７μｍの長さをもつ）の鎖状の高分子であるが、物理的に適当なサイズに切断することは簡単ではない。
【０００３】
現在、このようなＤＮＡの切断は、例えば非特許文献１に記載されているように、酵素を用いて行われるのが一般的であるが、その操作は複雑で長時間を要すること、また任意の位置で切断するには適切な酵素を選択しなければならないこと、などの問題がある。
【非特許文献１】Sambrook,J.,E.F.Fritsch，and T.J.Maniatis.1989.Molecular cloning:a laboratory manual,２nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ここで、酵素を使用せずにＤＮＡの切断が可能となった場合には、目的とするＤＮＡの結合あるいは組み替えが容易になるため、新規遺伝子の組み替え体の作製や、遺伝子制御システムの人工合成等が可能となることが期待されているが、未だその期待に十分に答える技術は開発されていない。
【０００５】
そこで、本発明は、特に遺伝情報を担っているＤＮＡやＲＮＡを人為的に操作するために、核酸分子を物理的に効率よく切断する方法について提案することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の現状に鑑み、発明者らは、ＤＮＡの切断に有効な方法（器材の利用）を種々の観点から、特にＤＮＡの生物学的活性を指標にして鋭意検討を行い、数多くの試行実験を重ねた。
その結果、ＤＮＡを取り扱う際には、従来とは全く異なった素材の器具（注射針）を採用することによって、ＤＮＡの有効な切断が可能であることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。
【０００７】
本発明は、上記の知見に立脚するものである。すなわち、本発明の要旨構成は次のとおりである。
（１）核酸分子を切断するに当たり、金属製針の表面の少なくとも一部に、抵抗率ρが１０５Ω・ｍ以上の絶縁性のセラミック被膜を形成した、穿刺針を用いることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【０００８】
（２）上記（１）において、前記穿刺針のセラミック被膜の厚みが０．０１〜５．０μｍであることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【０００９】
（３）上記（１）または（２）において、前記穿刺針のセラミック被膜が、Al、ＢおよびSiの窒化物、炭化物および酸化物のうちから選んだ少なくとも一種からなることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【００１０】
（４）上記（１）、（２）または（３）において、前記穿刺針の基材金属がステンレス鋼であることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【００１１】
（５）上記（１）、（２）、（３）または（４）において、前記穿刺針のセラミック被膜が、ダイヤモンド・ライク・カーボンからなることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、長い主鎖に配列されたＤＮＡを効果的に切断することが可能であり、他の方面への応用も期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を具体的に説明する。ここでは、ＤＮＡについて説明するが、本発明は、ＲＮＡについてもＤＮＡの場合と同様に適合することは勿論である。
まず、本発明の特徴は、ＤＮＡを採取する際には、電気抵抗が実質的に無限大である絶縁物のセラミック被覆した、細い径の穿刺針を新たに採用したことにある。発明者らは、特開２００３−３１０７５９号公報に記載したように、現行の金属のステンレス鋼の導体金属（電気抵抗：１０−６〜１０−８Ωｍ）とは全く異なる穿刺針を使用した。すなわち、高プラズマ雰囲気を利用して、高真空中で絶縁性（電気抵抗：１０９Ωｍ以上の絶縁体の特性を有する）に優れた薄膜のセラミック被覆穿刺針を用いたものである。
【００１４】
また、従来のセラミックコーティングの技術では、セラミックスと金属とは熱膨張係数が異なるので、高真空中で被覆したセラミック膜が使用中に剥離するため安定使用が不可能であった。しかしながら、上記公報に記載の新技術を新たに採用することによって、０．０１〜５．０μｍ厚のセラミック薄膜においても、セラミック膜が使用中に剥離が全く無く安定使用が可能となったものである。この新技術骨子は、セラミックコーティングの際には、セラミックの膜厚方向に成分組成を変化させる（傾斜機能を具備させる）方法をすることによって、セラミックと金属とが剥離しない、密着性に優れたセラミック被覆穿刺針を使用し、ＤＮＡ実験に初めて採用したものである。
【００１５】
次に、ＤＮＡの切断を高精度に検出する方法に鋭意工夫を行った。すなわち、分子数の少ないＤＮＡ溶液（λｃ１８５７ファージＤＮＡ（４×１０６分子／ｍｌ）０．５ｍｌをエッペンチューブにとり、試験対象となる穿刺針を装着した注射器でＤＮＡ液を出し入れし、いわゆるｓｈｅａｒｌｎｇ  ｆｏｒｃｅによるＤＮＡの切断を実験した。ＤＮＡの切断を生物的活性で測定するため、λファージ・パッチング系に採取したＤＮＡを加えてファージ粒子をｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製し、次にファージ数を大腸菌（指示菌）とプレートする軟寒天法によりアッセイした。
【００１６】
図２は、細菌ウィルスの数の変化（対数目盛り）をセラミック被覆穿刺針あるいは通常のステンレス鋼穿刺針を用いて、ＤＮＡ溶液の出し入れの回数に関して比較して示したものである。図２から明らかなように、セラミック被覆穿刺針を使用した場合には、細菌のウィルスの数が通常のステンレス鋼穿刺針を使用した場合よりも約７〜１５倍少ないことがわかる。
この理由は、明確に解明された訳ではないが、ＤＮＡ分子が穿刺針を通過する際ｓｈｅａｒｌｎｇ  ｆｏｒｃｅがかかると共に、針の先端が先鋭でかつ絶縁性に優れた高硬度（１７００〜２１００Ｈｖ）の穿刺針を採用すると、より効率よくＤＮＡ切断が可能であることを意味していると考えられる。
【００１７】
次に、図３の写真は、指示菌として大腸菌ＢＴ３２株を用いて、セラミック被覆穿刺針あるいは通常のステンレス鋼穿刺針にて採取した、ＤＮＡをパッケージングして生じたファージ粒子を培養した時の、両者の比較を示す。本発明の手法で採取したＤＮＡより得たファージ粒子は、常用のステンレス針を用いた場合よりも極端に少ない事が明らかである。
【００１８】
本発明に使用する穿刺針は、針の表面にセラミックスを被成するので、針の基材としては金属材料であれば何でも使用可能であるが、特に好ましくはステンレス鋼である。というのは、ステンレス鋼は、表面が錆びず、かつ精密加工処理が容易だからであり、とりわけフェライト系ステンレス鋼が有利に適合する。
【００１９】
例えば、ステンレス鋼にて穿刺針の基体を製造する場合、ステンレス鋼素材を、連続鋳造し、熱間圧延−冷間圧延−光輝焼鈍を行った後、精密加工により外径：０．０５〜２．５ｍｍおよび長さ：１０〜２５０ｍｍ程度の、目的に応じた種々の針形状に加工処理する。なお、この際の処理工程は、従来技術に従って行えば良い。ついで、得られた針の表面を、超音波洗浄や電解研磨等によって清浄にしたのち、セラミック膜を被成するわけであるが、かようなセラミックスとしては、電気抵抗が１０５Ω・ｍ以上の絶縁性セラミックを用いることが重要である。というのは、電気抵抗が１０５Ω・ｍ未満のセラミックスでは、採取したＤＮＡへの影響が小さいからである。
【００２０】
ここに、電気抵抗が１０５Ω・ｍ以上のセラミックスとしては、Ａｌ、ＢおよびＳｉの窒化物、炭化物および酸化物のうちから選んだ少なくとも一種が有利に適合する。さらに、最近使用が可能になったダイヤモンド・ライク・カーボン（Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｌｉｋｅ  Ｃａｒｂｏｎ：ＤＬＣ）による被膜も有利に適合する。また、かかるセラミック膜の被覆厚みについては、０．０１〜５．０μｍとすることが好ましい。というのは、セラミック膜厚が０．０１μｍに満たないと十分な絶縁性の確保が困難であり、一方セラミック膜厚が５．０μｍを超えると、セラミック膜とマトリックスとの密着性の確保が困難になるだけでなく、コーティングによるコストアップを招くからである。
【００２１】
さらに、上記のようなセラミック膜の被覆方法としては、高イオン化および高速成膜が可能なマグネトロン・スパッタ法の適用が最適であるが、その他ＲＦ（Ｒａｐｉｄ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）やＨＣＤ（中空陰極放電法）、アーク放電法などの公知のＰＶＤコーティング法を使用することもできる。
【００２２】
ここに、マグネトロン・スパッタ法による、セラミック膜の好適被覆条件は次のとおりである。例えば、ＳｉＮｘコーティングを行うため、フェロシリコン・ターゲットを使用した場合には、投入パワー：２〜１０ＫＷ、真空度：０．８×１０−４〜３×１０−３Ｔｏｒｒ、Ａｒガス：５０〜５００ｓｃｃｍ、Ｎ２ガス：５０〜５００ｓｃｃｍが最適条件である。なお、セラミック膜の被覆は、必ずしも針の全面に施す必要はなく、少なくともその使用に際してＤＮＡ溶液と接触する領域が被覆されていれば良い。
【００２３】
次に、ＤＮＡ溶液の選択であるが、精度高く切断現象を把握するため希釈した溶液で実験を行った方が良い。濃度が高くなるとｓｈｅａｒｌｎｇ  ｆｏｒｃｅがかかりにくいことは知られている。また、セラミック被覆針を用いて、ＤＮＡ溶液の出し入れの回数を増やすことにより、有効な切断が可能であることは実験で明らかにされている。
【実施例】
【００２４】
（ａ）Ｃ：０．０４ｍａｓｓ％、Ｓｉ：０．１５ｍａｓｓ％、Ｍｎ：０．１８ｍａｓｓ％、Ｐ：０．００９ｍａｓｓ％、Ｓ：０．０１１ｍａｓｓ％およびＣｒ：１８．９ｍａｓｓ％を含有し、残部はＦｅおよび不可避的不純物の組成になるフェライト系ステンレス鋼の素材を、連続鋳造し、その後、熱間圧延、冷間圧延、そして光輝焼鈍を施した。このようにして得たステンレス鋼板に、超音波洗浄後、マグネトロン・スパッタ法を用いて高プラズマ雰囲気中で種々のセラミック膜を被成して試料とし、曲げ試験および電気抵抗率の測定に供した。
【００２５】
セラミック膜の密着性は、別途用意したステンレス鋼板の表面に、同様の方法でセラミック膜を成膜したセラミック被覆鋼板を、種々の径の棒材に巻付け、被膜剥離が生じなかった最小径で評価した。
【００２６】
また、同様にして得たステンレス鋼板を素材として、精密加工により外径：０．８ｍｍ、長さ：４０ｍｍの穿刺針を作製した。ついで、これらの穿刺針を超音波洗浄した後、マグネトロン・スパッタ法を用いて高プラズマ雰囲気中で上記曲げ試験用試料と同種の種々のセラミック膜を被成した。かくして得られたセラミック被覆した穿刺針は、分子数の少ないＤＮＡ溶液〔λｃ１８５７ファージＤＮＡ（４×１０６分子／ｍｌ）〕０．５ｍｌをエッペンチューブにとり、試験対象となる穿刺針を装着した注射器でＤＮＡ液を出し入れし、いわゆるｓｈｅａｒｉｎｇ  ｆｏｒｃｅによるＤＮＡの切断を実験した。
また、比較のために通常のステンレス鋼製の穿刺針を用いて同様のＤＮＡの切断実験を行った。
【００２７】
表１にセラミック被膜の性能と、ＤＮＡ切断実験時の細菌ウィルス数を示す。本発明に従うセラミック被膜はいずれも電気抵抗率が実質上無限大であり、また被膜の密着性も高い。さらに、本発明のセラミック被膜を有する穿刺針を使用したＤＮＡ切断実験では、通常のステンレス鋼製穿刺針を使用した場合に比べて、格段に少ない細菌ウィルス数が観測された。
【００２８】
【表１】
2005270049.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明によれば、ＤＮＡの切断操作を従来の酵素を用いる切断方法に比較してはるかに簡便に行えるため、医療、医薬品の研究開発、遺伝子組み換え技術を利用した動植物の品種改良、その他生化学分野などに広く利用することができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＤＮＡの模試図を示す図である。
【図２】セラミック被覆穿刺針とステンレス鋼針とを使用してＤＮＡ溶液から採取した細菌ウィルス数を比較した図である。
【図３】セラミック被覆穿刺針とステンレス鋼針とを使用して処理した、ＤＮＡ溶液から採取したＤＮＡをパッケージングして、生じたファージ粒子を大腸菌ＢＴ３２株（指示菌）を用いて培養した時の様子を比較して示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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