(57)【要約】【課題】  腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒素類似毒素遺伝子（ＴＲＨ）の迅速・高感度な遺伝子検査試薬を構成するのに好適なオリゴヌクレオチドの組み合わせを提供すること。【解決手段】  腸炎ビブリオ菌のＴＲＨ ＲＮＡに特異的な領域の塩基配列と相同的あるいは相補的な配列を有するプライマーを用いることにより、ＴＲＨ１およびＴＲＨ２ ＲＮＡのみを特異的に増幅させて検出する方法と、ＴＲＨ ＲＮＡの特定部位に結合するオリゴヌクレオチドによって、前記課題を解決する。【選択図】      図２
2005080531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に存在する腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒類似溶血毒素遺伝子（ＴＲＨ）の検出において利用するための検出試薬であって、
ＴＲＨ遺伝子に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、該特定配列に相補的な配列を有する第一のプライマーおよび該特定配列に相同的な配列を有する第二のプライマーを用い、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成し、ここで該第一または第二のプライマーのいずれか一方のプライマーは５’ 末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加した配列を有するものであり、
リボヌクレアーゼＨにより該ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡ部を分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、
該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより前記ＲＮＡの特定配列または前記ＲＮＡの特定配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして
該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるｃＤＮＡ合成の鋳型となる、
といった段階を含んで成るＲＮＡ増幅工程を利用した検出法において利用するための検出試薬であり、ここで該第一のプライマーとして配列番号２に示す配列の少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に示す配列の少なくとも連続した１０塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加され且つ前記特定配列に特異的に結合できるオリゴヌクレオチド、該第二のプライマーとして配列番号１に示す配列の少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に示す配列の少なくとも連続した１０塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加され且つ前記特定配列に相補的な配列に特異的に結合できるオリゴヌクレオチド、を含むことを特徴とする、検出試薬。
【請求項２】
前記第一のプライマーが配列番号２に示す配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１記載の検出試薬。
【請求項３】
前記第二のプライマーが配列番号１に示す配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１又は２記載の検出試薬。
【請求項４】
前記ＲＮＡ増幅工程が前記標的ＲＮＡを前記特定配列の５’末端で切断する、該特定配列の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有する切断用オリゴヌクレオチドの存在下で実施され、ここで該オリゴヌクレオチドは配列番号４、５又は６に示す配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の検出試薬。
【請求項５】
前記ＲＮＡ増幅工程がインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド存在下で実施され、反応液の蛍光強度を測定することにより腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒類似溶血毒素の検出が行われ、ここで該オリゴヌクレオチドの配列は前記ＲＮＡ転写産物の少なくとも一部の配列と相補的であり、該オリゴヌクレオチドの該ＲＮＡ転写産物との相補結合によって、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するものである、請求項１〜４のいずれか１項記載の検出試薬。
【請求項６】
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドが配列番号３に示した配列の少なくとも連続した１０塩基からなることを特徴とする、請求項５記載の検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床検査、公衆衛生、食品検査または食中毒検査における腸炎ビブリオ菌の検出試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）は、一般に感染性食中毒の原因菌として知られている。胃腸炎患者から分離される腸炎ビブリオ菌の９５％以上が、我妻培地において溶血活性を示す神奈川現象陽性菌であるのに対し、魚や水から分離した菌の９９％は神奈川現象陰性菌である。このことから、病原性腸炎ビブリオ菌と神奈川現象とは深く関与しているとされてきた。
【０００３】
その後、この神奈川現象は腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ｄｉｒｅｃｔ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ：ｔｄｈ）が菌体外へ放出されるために起こる現象であることが判明し、ｔｄｈが腸炎ビブリオ菌の病原因子として注目されるようになってきた。ｔｄｈ遺伝子は、現在、ｔｄｈ１からｔｄｈ５までの５種類の遺伝子が知られている。
さらに近年では、神奈川現象陰性の菌株でありながら病原性を示す菌株から、ｔｄｈに類似した塩基配列を有し、一部共通抗原性を有する溶血毒（耐熱性溶血毒類似溶血毒（ｔＤＨ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）：ＴＲＨ）も確認された。ＴＲＨ遺伝子は、現在、ＴＲＨ１とＴＲＨ２の２種類が知られている。
【０００４】
腸炎ビブリオ菌の検出および同定を行なう方法として増菌培養あるいは分離培養の後に神奈川現象を判定する方法等が知られているが、腸炎ビブリオ菌の遺伝子や該遺伝子に由来するＲＮＡ中の特定の配列を増幅した上で検出する方法が、感度、迅速性、および操作性の点で好適である。特に、一定温度で標的核酸を増幅する方法は検査装置の自動化という点においても好適である。
【特許文献１】特開２００１−２５８５６９号公報
【特許文献２】特開２００１−３４００８７号公報
【特許文献３】特開２００１−３４００８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
腸炎ビブリオ菌の検出および同定を行なう方法として、ＴＲＨ１あるいはＴＲＨ２のいずれかに由来するＲＮＡを比較的低温（４１℃）で特異的に増幅させる方法が報告されている（特開２００１−２５８５６９号公報、特開２００１−３４００８７号公報、特開２００１−３４００８８号公報）。この方法では、ＴＲＨ１またはＴＲＨ２に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、該特定配列に相補的な配列を有する第一のプライマーおよび該特定配列に相同的な配列を有する第二のプライマー（ここで第一または第二のプライマーのいずれか一方のプライマーは５’ 末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加した配列を有する）を用い、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成し、リボヌクレアーゼＨによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより前記ＲＮＡ配列または前記ＲＮＡ配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程を利用する。
【０００６】
しかしながら、上記方法は、以下の問題点を有する。１番目は感度が低いことである。特開２００１−３４００８７号公報によれば、初期ＲＮＡ量が１０3コピー以上のＴＲＨ１ ＲＮＡを検出し得るデータしか示されておらず、初期ＲＮＡ量が１０3コピー未満（例えば１０2コピー）のＴＲＨ１ ＲＮＡを検出し得るかどうか不明であり、特開２００１−３４００８８号公報によれば、初期ＲＮＡ量が１０3コピー以上のＴＲＨ２ ＲＮＡを検出し得るデータしか示されておらず、初期ＲＮＡ量が１０3コピー未満（例えば１０2コピー）のＴＲＨ２ ＲＮＡを検出し得るかどうか不明である。
【０００７】
２番目は、実用上必要とされるＴＲＨ１とＴＲＨ２をともに検出する試薬は報告されていないことである。例えば、特開２００１−３４００８７号公報によれば、初期ＲＮＡ量が１０3コピー以上のＴＲＨ１ ＲＮＡを検出し得る試薬はＴＲＨ２を検出しない。また、特開２００１−３４００８８号公報によれば、初期ＲＮＡ量が１０3コピー以上のＴＲＨ２−ＲＮＡを検出し得る試薬はＴＲＨ１を検出しない。
【０００８】
３番目は、迅速性に関するデータがないことである。特開２００１−３４００８７号公報および特開２００１−３４００８８号公報はともに、反応開始３０分後の電気泳動のパターンしか開示されておらず、反応の迅速性は不明である。
【０００９】
そこで本発明は、感度および迅速性に優れ、腸炎ビブリオ菌のＴＲＨ１とＴＲＨ２をともに検出するＴＲＨ ＲＮＡ検出試薬を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは感度および迅速性に優れた腸炎ビブリオ菌のＴＲＨ ＲＮＡ検出試薬を構築するにあたり、鋭意研究を重ね、ＴＲＨ１とＴＲＨ２のいずれに対しても初期ＲＮＡ量が１０2コピーを２０分以内で検出が可能な試薬を構築した。
【００１１】
本発明は、試料中に存在する腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒類似溶血毒素遺伝子（ＴＲＨ）の検出において利用するための検出試薬であって、
ＴＲＨ遺伝子に由来するＲＮＡの特定配列、即ち、該ＲＮＡの少なくとも一部、を鋳型として、該特定配列に相補的な配列を有する第一のプライマーおよび該特定配列に相同的な配列を有する第二のプライマー（ここで第一または第二のプライマーのいずれか一方のプライマーは５’ 末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加した配列を有する）を用い、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成し、
リボヌクレアーゼＨにより該ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡ部を分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、
該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより前記ＲＮＡの特定配列または前記ＲＮＡの特定配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして
該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるｃＤＮＡ合成の鋳型となる、
といった段階を含んで成るＲＮＡ増幅工程を利用した検出法において利用するための検出試薬であり、ここで該第一のプライマーとして配列番号２に示す配列の少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に示す配列の少なくとも連続した１０塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加され且つ前記特定配列に特異的に結合できるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に示す配列の少なくとも連続した１０塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし且つ前記特定配列に特異的に結合できるオリゴヌクレオチド、該第二のプライマーとして配列番号１に示す配列の少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に示す配列の少なくとも連続した１０塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加され且つ前記特定配列に相補的な配列に特異的に結合できるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に示す配列の少なくとも連続した１０塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし且つ前記特定配列に相補的な配列に特異的に結合できるオリゴヌクレオチド、を含むことを特徴とする、検出試薬に関する。
高ストリンジェント条件とは、例えば以下の実施例に示すような、６０ｍＭのＴｒｉｓ、１７ｍＭの塩化マグネシウム、１１０ｍＭの塩化カリウム、１ｍＭのＤＴＴの存在下、４４℃でのハイブリダイゼーション条件であってよい。
【００１２】
好ましくは、前記第一のプライマーは配列番号２に示す配列からなるオリゴヌクレオチドであってよく、前記第二のプライマーは配列番号１に示す配列からなるオリゴヌクレオチドであってよい。
尚、ＴＲＨ遺伝子に由来するＲＮＡに対して相補的であるＲＮＡを検出の対象とする場合には、第一のプライマー及び第二のプライマーとして、それぞれ、それらの５’末端と３’末端が逆となるものと相補的なプライマーを用いればよい。
【００１３】
好ましくは、前記ＲＮＡ増幅工程は前記標的ＲＮＡを前記特定配列の５’末端で切断する、該特定配列の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有する切断用オリゴヌクレオチドの存在下で実施される。該オリゴヌクレオチドは配列番号４、５又は６に示す配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００１４】
更に好ましくは、前記ＲＮＡ増幅工程はインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド存在下で実施され、反応液の蛍光強度を測定することにより腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒類似溶血毒素の検出が行われる。ここで該オリゴヌクレオチドの配列は前記ＲＮＡ転写産物の少なくとも一部の配列と相補的であり、該オリゴヌクレオチドの該ＲＮＡ転写産物との相補結合によって、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するものである。
好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは配列番号３に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなる。以下、本発明を詳細に説明する。
【発明の効果】
【００１５】
本願発明の検出法は腸炎ビブリオ菌のＴＲＨ１とＴＲＨ２  ＲＮＡを同時にかつ高感度に検出するのに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、第一および第二のプライマーは、それぞれ各配列番号として記載した塩基配列の全長を用いることができるが、特定核酸配列等への特異的な結合は１０塩基程度あれば十分であるから、各配列の中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドの組合わせを使用しても良い。
【００１７】
本発明の増幅行程は、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの協奏的作用によって（逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼが協奏的に作用するような条件下で反応させ）ＴＲＨ１およびＴＲＨ２ ＲＮＡ配列を増幅させるＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法、あるいは例えば特開２０００−０１４４００号公報に記載のＲＮＡ検査法（ＴＲＣ法）等を含む。ここで温度については特に制限はないが３５〜５０℃が好ましい。
【００１８】
上記本願発明の一態様において、標的ＲＮＡは、特定配列の５’末端で切断される必要がある。このように標的ＲＮＡを切断する方法としては、特定配列の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（切断用オリゴヌクレオチド）を添加することによって、標的ＲＮＡをリボヌクレアーゼＨ等により切断する方法が好ましい。該オリゴヌクレオチドは配列番号４、５又は６に示す配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。該切断用オリゴヌクレオチドは、３’末端側からの伸長反応をおさえるために、３’末端水酸基が化学的に修飾されたもの、例えばアミノ化等されているものを使用することが望ましい。
【００１９】
以上の核酸増幅方法で得られた増幅産物は既知の核酸検出方法で検出することができるが、好適な態様では前記核酸増幅をインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測定することが望ましい。該オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中のリンにリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合させたもので、標的核酸（相補的核酸）と２本鎖を形成するとインターカレーター部分が２本鎖部分にインターカレートして蛍光特性が変化するため、分離分析を必要としないことを特徴とする(Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９７)。
【００２０】
該オリゴヌクレオチドが結合する配列は、ＴＲＨ ＲＮＡに特異的な配列のいずれであってもよく、特に限定はないが、配列番号３に示した配列中の少なくとも連続した１０塩基からなる配列、あるいはその相補配列であることが望ましい。また、該オリゴヌクレオチドをプライマーとした伸長反応を抑えるために該オリゴヌクレオチドの３’末端の水酸基は化学的に修飾（たとえばグリコール酸付加）することが望ましい。
【００２１】
これにより、腸炎ビブリオ菌のＴＲＨ１ ＲＮＡおよびＴＲＨ２ ＲＮＡのいずれに対しても、一チューブ内、一定温度、一段階で、迅速かつ高感度に増幅し、検出することが可能となり、自動化への適用も容易となる。
【００２２】
以下、本願発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
表１および図１に示す組み合わせ（ａ）〜（ｊ）で、腸炎ビブリオ菌のＴＲＨ ＲＮＡの増幅効率を比較した。
【００２４】
（１）腸炎ビブリオ菌のＴＲＨ１およびＴＲＨ２ ＲＮＡの塩基番号１から６１０（ＲＮＡの塩基番号は西渕ら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５８、２４４９−２４５７（１９９２）に従った）を含む標準ＲＮＡ（６１６塩基）を試料とし、２６０ ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０）、１ ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ ｍＭ ＤＴＴ、０．５ Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ製））を用い１０3 コピー／５ μＬとなるよう希釈した。コントロール試験区（陰性）には希釈液のみを用いた。
【００２５】
（２）以下の組成の反応液２０ μＬを０．５ ｍＬ容ＰＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、アプライドバイオシステム製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５ μＬを添加した。なお、第一プライマー・第二プライマー・切断用オリゴヌクレオチドの組み合わせが表１に示す組み合わせになるよう溶液を調製した。
【００２６】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
６０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．６）
１７ ｍＭ  塩化マグネシウム
１３０ ｍＭ  塩化カリウム（組み合わせ（ｊ）のみ１００ ｍＭで実施）
６ Ｕ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
１ ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ ｍＭ  ＩＴＰ
各３．０ ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
０．１６ μＭの切断用オリゴヌクレオチド
１．０ μＭの第二プライマー
１．０ μＭの第一プライマー
２５ ｎＭのインターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＴＲＨ−Ｓ−Ｇ、配列番号３、５’末端から５番目の「Ｃ」と６番目の「Ａ」との間のリンにインターカレーター性蛍光色素が標識されている。また３’末端の水酸基はグリコール基で修飾されている。）
１３％  ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
【００２７】
（３）上記の反応液を４４℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４４℃で２分間保温した酵素液５ μＬを添加した。
【００２８】
酵素液の組成（各数値は最終反応液量３０ μＬにおける値）
２．０％  ソルビトール
３．６ μｇ  牛血清アルブミン
１４２ Ｕ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン製）
６．４ Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素（タカラバイオ製）
容量調整用蒸留水
【００２９】
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４４℃で保温して、励起波長４７０ ｎｍ、蛍光波長５２０ ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
【００３０】
（５）各オリゴヌクレオチドの組み合わせを使用した時の立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値の１．２倍になるまでの時間）の結果を表２に示した。組み合わせ（ａ）から（ｊ）のいずれを用いてもＴＲＨ１およびＴＲＨ２  ＲＮＡを１５分以内に検出していたため，これらの組み合わせで使用したオリゴヌクレオチドは腸炎ビブリオ菌のＴＲＨ  ＲＮＡの検出に有効であることが示された。
【００３１】
【表１】
2005080531.tif 000003
【００３２】
表１は本実験系で用いた第一プライマー・第二プライマー・切断用オリゴヌクレオチドの組み合わせ、およびその組み合わせを用いて増幅される特定バンドの鎖長を示す。各オリゴヌクレオチドの組み合わせでの、腸炎ビブリオ菌のＴＲＨ ＲＮＡにおけるオリゴヌクレオチドの位置および増幅領域は図１に示している。切断用オリゴヌクレオチドの塩基配列のうち、３’末端の水酸基はアミノ化されている。第二プライマーの塩基配列のうち、５’末端側第１番目の「Ａ」から第２２番目の「Ａ」までの領域はＴ７プロモーター領域であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から第２８番目の「Ａ」までの領域はエンハンサー配列である。
【００３３】
切断用オリゴヌクレオチド
ＴＲ−Ｓ２２（配列番号４、塩基番号３３から５４）
ＴＲ−Ｓ２６（配列番号５、塩基番号２９から５４）
ＴＲ−Ｓ３０（配列番号６、塩基番号２５から５４）
第二プライマー
ＴＲ−Ｆ２３（配列番号７、塩基番号５０から７２）
ＴＲ−Ｆ２６（配列番号８、塩基番号５０から７５）
ＴＲ−Ｆ２９（配列番号９、塩基番号５０から７８）
第一プライマー
ＴＲ−Ｒ２１（配列番号１０、塩基番号２２５から２４５）
ＴＲ−Ｒ２４（配列番号１１、塩基番号２２５から２４８）
ＴＲ−Ｒ２７（配列番号２、塩基番号２２５から２５１）
ＴＲ−Ｒ２０＋１１（配列番号１２、塩基番号２３６から２５５）
【００３４】
【表２】
2005080531.tif 000004
【００３５】
表２は表１に示したオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、１０3コピー／試験のＴＲＨ１およびＴＲＨ２  ＲＮＡを測定した結果である。表１に示したオリゴヌクレオチドの組み合わせは全てＴＲＨ１およびＴＲＨ２ ＲＮＡを１５分以内に検出していた。
【実施例２】
【００３６】
表１に示す組み合わせ（ｊ）を用いて、腸炎ビブリオ菌のＴＲＨ１およびＴＲＨ２ ＲＮＡの様々な初期コピー数における検出を行なった。
【００３７】
（１）実施例１と同様の腸炎ビブリオ菌のＴＲＨ１およびＴＲＨ２ ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ  ８．０)、１ ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ製））を用い、１０7 コピー／５μＬから１０ コピー／５μＬまでとなるよう希釈した。コントロール試験区（陰性）には希釈液のみを用いた。
【００３８】
（２）以下の組成の反応液２０ μＬをＰＣＲ用チューブ（容量０．５ ｍＬ；Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、アプライドバイオシステム製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５ μＬを添加した。
【００３９】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
６９ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．６）
１７．８５ ｍＭ  塩化マグネシウム
１００ ｍＭ  塩化カリウム
６ Ｕ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
１ ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ ｍＭ  ＩＴＰ
各３．０ ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
０．１６ μＭの切断用オリゴヌクレオチド（ＴＲ−Ｓ２６、配列番号５、３’末端の水酸基はアミノ化されている。）
１．０ μＭの第二プライマー（ＴＲ−Ｆ２６、配列番号８）
１．０ μＭの第一プライマー（ＴＲ−Ｒ２０＋１１、配列番号１２）
２５ ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＴＲＨ−Ｓ−Ｇ、配列番号３、５’末端から５番目の「Ｃ」と６番目の「Ａ」との間のリンにインターカレーター性蛍光色素が標識されている。また３’末端の水酸基はグリコール基で修飾されている。）
１３％  ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
【００４０】
（３）上記の反応液を４４℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４４℃で２分間保温した酵素液５ μＬを添加した。
【００４１】
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
２．０％  ソルビトール
３．６ μｇ  牛血清アルブミン
１４２ Ｕ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン製）
６．４ Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素（タカラバイオ製）
容量調整用蒸留水
【００４２】
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４４℃で保温して、励起波長４７０ ｎｍ、蛍光波長５２０ ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
【００４３】
酵素添加時の時刻を０分として、試料の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの蛍光強度値）の経時変化を図２（Ａ）と図３（Ａ）に示した。また、初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値の１．２倍になるまでの時間）との関係の結果を図２（Ｂ）と図３（Ｂ）に示した。なお、初期ＲＮＡ量は１０ コピー／試験から１０7 コピー／試験である。
【００４４】
図２と図３より、ＴＲＨ１  ＲＮＡでは１０2 コピーが約１５分で検出され、ＴＲＨ２  ＲＮＡは１０3コピーが約１９分で検出された。また本組み合わせはＴＲＨ１およびＴＲＨ２  ＲＮＡが１０3コピー／試験においても２０分以内で検出されたことから、従来の方法（特開２００１−３４００８７号公報および特開２００１−３４００８８号公報）と比較してＴＲＨ１とＴＲＨ２の同時検出およびＴＲＨ ＲＮＡの迅速・高感度な検出が可能となっている。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
以上の説明のように、本願発明の検出法は腸炎ビブリオ菌のＴＲＨ１とＴＲＨ２  ＲＮＡを同時にかつ高感度に検出するのに有用である。
【００４６】
本願発明のオリゴヌクレオチドは、配列表に記載した塩基配列（１８塩基から２３塩基）の物に限られず、これら配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドであれば良い。これらは、比較的低温（好ましくは４４℃）条件下で、プライマーまたはプローブの標的核酸への特異性を確保するためには１０塩基程度の塩基配列があれば十分であることから明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は実施例１で使用した各オリゴヌクレオチドの位置および増幅領域を示している。図中の塩基番号は西渕らの論文（Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５８、２４４９−２４５７（１９９２））に従った。
【図２】図２は実施例２で行なったＴＲＨ１初期ＲＮＡ量１０ コピー／試験から１０7コピー／試験において、反応時間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光強度比のグラフ（Ａ）および初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間との間で得られた検量線（Ｂ）である。Ｎｅｇａとは、ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いたサンプルのことである。初期コピー数１０2 コピー／試験のＴＲＨ１ ＲＮＡが反応約１５分で検出でき、初期ＲＮＡ量と立ち上がり時間との間に相関関係のあることが示された。
【図３】図３は実施例２で行なったＴＲＨ２初期ＲＮＡ量１０ コピー／試験から１０7コピー／試験において、反応時間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光強度比のグラフ（Ａ）および初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間との間で得られた検量線（Ｂ）である。Ｎｅｇａとは、ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いたサンプルのことである。初期コピー数１０3 コピー／試験のＴＲＨ２ ＲＮＡが反応約１９分で検出でき、初期ＲＮＡ量と立ち上がり時間との間に相関関係のあることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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