(57)【要約】  【課題】  ＭＰＶウイルスに特異的に発現するタンパク質を抗原として用いた、特異的かつ高感度なＭＰＶの血清学的検査・診断方法を確立すること。  【解決手段】  ＭＰＶ（マウスパルボウイルス）の構造タンパク質であるＶＰ２を提供する。また、該タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。また、ＭＰＶのＶＰ２をコードするＤＮＡを含む組換えプラスミド、及び、ＭＰＶのＶＰ２をコードするＤＮＡを含む組換えプラスミドによって形質転換された大腸菌を提供する。さらに、ＭＰＶの構造タンパク質であるＶＰ２を抗原として用いた抗体検出キット、及び、ＭＰＶの構造タンパク質であるＶＰ２を抗原として用いる抗体検出方法を提供する。  【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＰＶ（マウスパルボウイルス）の構造タンパク質であるＶＰ２。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１記載のタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えプラスミド。
【請求項４】
請求項１記載のタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えプラスミドによって形質転換された大腸菌。
【請求項５】
ＭＰＶ感染マウスの臓器をすりつぶした後遠心して得た乳剤上清を別のマウスに接種し、ＭＰＶを継代する手順と、
継代に用いたマウスの臓器を採取して、該臓器からＤＮＡを抽出する手順と、
抽出したＤＮＡのうち、ＶＰ２をコードする領域を増幅する手順と、
増幅したＤＮＡを大腸菌に組み込んで形質転換する手順と、
を含むＶＰ２作製方法。
【請求項６】
ＭＰＶ（マウスパルボウイルス）の構造タンパク質であるＶＰ２を抗原として用いた抗体検出キット。
【請求項７】
ＭＰＶ（マウスパルボウイルス）の構造タンパク質であるＶＰ２を抗原として用いる抗体検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＰＶ（マウスパルボウイルス）の構造タンパク質であるＶＰ２及び該タンパク質をコードするＤＮＡ、並びに、該タンパク質を抗原として用いた抗体検出キット及び抗体検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マウスのパルボウイルス感染症は、米国を中心とする多くの動物実験施設で汚染が拡大しており、日本国内でも汚染拡大が憂慮されている。
【０００３】
従来、マウス由来のパルボウイルスとしては、ＭＶＭ（ｍｉｎｕｔｅ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ）が知られていたが、１９９０年代になってＭＶＭと抗原的に交差反応性を示すが、ＨＩ反応（血球凝集抑制反応）で血清学的にＭＶＭとは異なる新規のパルボウイルスが発見され、ＭＰＶ（マウスパルボウイルス）と命名された。
【０００４】
なお、非特許文献１、非特許文献２には、ＭＰＶについての記載がある。
【非特許文献１】Ball-Goodrich LJ, Johnson E., Molecular characterization of a newly recognized mouse parvovirus.J Virol. 1994 Oct;68(10):6476-6486
【非特許文献２】Jacoby RO, Ball-Goodrich LJ, Besselsen DG, McKisic MD, Riley LK, Smith AL., Rodent parvovirus infections.Lab Anim Sci. 1996 Aug;46(4):370-380.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＭＰＶは、培養細胞での増殖が困難であったため、ＭＰＶを培養細胞に感染・増殖させ、その培養細胞をすりつぶすことにより、大量のウイルスを分離精製するという従来のウイルス分離精製方法を用いることができなかった。そのため、ＭＰＶについては、ＭＰＶ−１、ＭＰＶ−１ｂ、ＭＰＶ−１ｃ等の各株の塩基配列が知られているのみで、ＭＰＶ又はＭＰＶが産生するタンパク質の分離精製は、行うことができなかった。従って、ＭＰＶが産生するタンパク質を抗原として用いた、ＭＰＶに特異的な血清学的検査・診断方法が確立されていないという問題があった。
【０００６】
現在のところ、ＭＰＶがマウスに感染しているかどうかを検査する方法としては、ＭＶＭを抗原として用いたＥＬＩＳＡ法やＩＦＡ法で抗体陽性を示し、ＭＶＭに対するＨＩ反応が陰性の場合に、ＭＰＶ陽性と判断する方法が用いられている。しかしながら、上記のＭＰＶ感染の検査法は、交差反応性に基づいているため感度が低く、あくまでも便宜的な方法であった。そこで、ＭＰＶに特異的に発現するタンパク質を抗原として用いた、特異的かつ高感度なＭＰＶの血清学的検査・診断方法を確立する必要性があった。
【０００７】
以上の通り、本発明は、ＭＰＶウイルスに特異的に発現するタンパク質を抗原として用いた、特異的かつ高感度なＭＰＶの血清学的検査・診断方法を確立することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の技術的課題を解決するために、本発明では、まず、ＭＰＶ（マウスパルボウイルス）の構造タンパク質であるＶＰ２を提供する。また、該タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
【０００９】
現在のところ、各種パルボウイルス（マウスに感染するものも含む）に関する研究成果から、パルボウイルスの主要構造タンパク質であるＶＰ２は、ウイルスごとの特異性が高いことが知られている。そこで、ＭＰＶのＶＰ２及びそれをコードするＤＮＡを用いることにより、他のパルボウイルス（ＭＶＭを含む）との鑑別や、ＭＰＶ内の同種異株間の識別を、高い精度で行うことができる。
【００１０】
ＭＰＶのＶＰ２の例として、後述する本発明に係る手順により分離精製された、新規のＭＰＶ株であるＭＰＶ／ＵＴ株のアミノ酸配列を配列番号１に、塩基配列を配列番号２に示す。但し、後述する抗ＭＰＶ抗体に対する抗原として利用できるものであれば、ＭＰＶのＶＰ２の塩基配列又はアミノ酸配列は、上記のものに限定されない。
【００１１】
次に、本発明では、ＭＰＶのＶＰ２をコードするＤＮＡを含む組換えプラスミド（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７５０）、及び、ＭＰＶのＶＰ２をコードするＤＮＡを含む組換えプラスミドによって形質転換された大腸菌を提供する。
【００１２】
例えば、ＭＰＶのＶＰ２をコードするＤＮＡを大腸菌用発現プラスミドベクターに挿入し、該ベクターを大腸菌にトランスフェクションすることにより、大腸菌を形質転換することができる。大腸菌を形質転換させることにより、ＭＰＶのＶＰ２を大量かつ効率的に作製することができる。
【００１３】
また、本発明では、ＭＰＶ感染マウスの臓器をすりつぶした後遠心して得た乳剤上清を別のマウスに接種し、ＭＰＶを継代する手順と、継代に用いたマウスの臓器を採取して、該臓器からＤＮＡを抽出する手順と、抽出したＤＮＡのうち、ＶＰ２をコードする領域を増幅する手順と、増幅したＤＮＡを大腸菌に組み込んで形質転換する手順と、を含むＶＰ２作製方法をも提供する。
【００１４】
ＭＰＶは、前記の通り、培養細胞で増殖しないため、ウイルスの分離精製が困難であった。そこで、ＭＰＶをマウスで継代したうえで、該マウスの臓器からＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡのうち、ＶＰ２をコードする領域のみを増幅することにより、ＭＰＶのＶＰ２をコードするＤＮＡを、充分量作製することができる。従って、該ＤＮＡを大腸菌に組み込んで形質転換することにより、ＭＰＶのＶＰ２を大量かつ効率的に作製できる。
【００１５】
次に、本発明では、ＭＰＶ（マウスパルボウイルス）の構造タンパク質であるＶＰ２を抗原として用いた抗体検出キット、及び、ＭＰＶの構造タンパク質であるＶＰ２を抗原として用いる抗体検出方法を提供する。
【００１６】
ＭＰＶのＶＰ２を抗原として用いることにより、抗ＭＰＶ抗体の特異的かつ高感度な検出が可能となる。従って、例えば、ＭＰＶに感染したマウスの血清を採取し、該血清とＶＰ２を抗原抗体反応させることにより、血清中の抗ＭＰＶ抗体を、特異的に検出できる。また、血清中の抗ＭＰＶ抗体を定量的に測定することもできる。血清中の抗ＭＰＶ抗体の検出及び定量的な測定は、マウスのＭＰＶ感染の診断・判定に利用できる。
【００１７】
また、本発明に係るＶＰ２抗原は、ＭＰＶに感染したマウスの血清中の抗ＭＰＶ抗体と特異的に反応するので、マウスのＭＶＭ感染を含む他のウイルス感染と容易に識別することできる。従って、ＭＰＶ感染個体を簡易かつ確実に検出することが可能になり、また、ＭＰＶ感染に対する特異的かつ簡易な血清診断が可能になる。
【００１８】
その他、マウス飼育集団におけるＭＰＶ汚染を早期に摘発したり、実験用マウス飼育施設全体や飼育室の汚染状況を高感度にモニターしたりすることも可能になる。従って、本発明は、ＭＰＶの施設内等での汚染拡大を、早期診断等により効果的に予防できる。
【００１９】
抗ＭＰＶ抗体検出キットは、ＶＰ２を抗原として用いることにより抗ＭＰＶ抗体を検出できるものであれば、特に限定されない。例えば、ＥＬＩＳＡ法を利用する抗体検出キットを構成することができる。その場合、まず、マイクロプレート中に、ＶＰ２を不溶化抗原として固定する。次に、検出キットに血清を加え、マイクロプレートに固定されたＶＰ２に、血清中に含まれる抗ＭＰＶ抗体を結合させる。そして、結合した抗ＭＰＶ抗体と酵素標識試薬を反応させることにより、血清中の抗体の検出又は該抗体の定量的測定を行う。
【００２０】
また、抗ＭＰＶ抗体検出方法も、前記と同様、特に限定されない。例えば、ＥＬＩＳＡ法を応用することにより、特異的かつ高感度に抗ＭＰＶ抗体を検出できる。また、定量的な測定も可能となる。ＥＬＩＳＡ法に用いる酵素標識試薬も、目的に応じて適宜選択でき、例えば、ペルオキシダーゼ標識プロテインＡを用いることにより、吸光度測定を用いた高感度かつ定量的な測定が可能になる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係るＶＰ２は、抗ＭＰＶ抗体と特異的に結合することができる。
【実施例１】
【００２２】
実施例１では、ＭＰＶ／ＵＴ株のＶＰ２遺伝子のクローニングを行った。
【００２３】
ＭＰＶは、前記のとおり、培養細胞での増殖が困難であるため、培養細胞を用いたウイルスの分離・精製ができない。そこで、本願発明者は、培養細胞での分離培養に代わる方法として、次の手順を用いてＭＰＶを継代し、継代可能になったウイルス材料からＤＮＡを抽出して、クローニングを行う手順を採用した。
【００２４】
ＭＰＶの継代は、次の手順で行った。まず、ＭＰＶ抗体（ＭＶＭ抗原と交差反応性を示す抗体）を保有するマウスを見つけて、そのマウス個体の脾臓を採取した。そして、採取した脾臓をホモジナイズ後遠心し、遠心して得た脾臓乳剤上清を、別のマウス（ＩＣＲマウス又はヌードマウス）に腹腔内接種した。そして、腹腔内接種したマウスから再び脾臓乳剤上清を作製して別のマウスに腹腔内接種し、ＭＰＶの継代を行った。
【００２５】
次に、ＶＰ２をコードするＤＮＡのクローニングを次の手順で行った。まず、継代しているＭＰＶ感染マウスの脾臓乳剤上清を、ＩＣＲマウス又はヌードマウスに腹腔内接種し、接種の一週間後にそのマウスの脾臓及び肝臓からＤＮＡを抽出した。そして、ＶＰ２遺伝子の両末端の塩基配列に対するプライマーを用いて、ＶＰ２タンパク質をコードするＤＮＡ領域をＰＣＲ法で増幅した。
【００２６】
なお、プライマーの設計は、ＭＰＶ−１株（ＧｅｎｅＢａｎｋにａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ１２４６９で登録されているＭＰＶの株のひとつで、塩基配列が既知）の塩基配列に基づいて行い、５’プライマーにはＥｃｏＲＩ切断配列を、３’プライマーにはＸｈｏI切断配列を付加した。５’プライマーを配列番号３に、３’プライマーを配列番号４に示す。
【００２７】
次に、増幅したＤＮＡをアガロースゲルで電気泳動し、約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出して精製したのち、プラスミドベクターｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙに組み込んでクローニングし、その塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、蛍光ダイデオキシ・サイクルシークエンス法で行った。
【００２８】
前記手順によりクローニングした遺伝子の塩基配列と既知の塩基配列とを比較した結果、塩基配列が、ＭＰＶ−１のＶＰ２遺伝子領域の遺伝子配列と９８．１％、ＭＶＭ（ｐ）のＶＰ２遺伝子領域の遺伝子配列と６８．５％一致した。このことから、本ウイルスは、既知のＭＰＶとは異なる、新規のＭＰＶ株であることが示唆された。そこで、本ウイルスをＭＰＶ／ＵＴ株と命名した。なお、ＭＰＶ／ＵＴ株のアミノ酸配列を配列番号１に、塩基配列を配列番号２に示した。
【実施例２】
【００２９】
実施例２では、組換えプラスミドの作製と、大腸菌によるＶＰ２タンパク質の大量発現・精製を行った。
【００３０】
まず、実施例１で作製したＭＰＶ／ＵＴ株のＶＰ２遺伝子を、大腸菌用発現プラスミドベクターｐＧＥＸ−５Ｘ−１に挿入し、大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。具体的手順は、次の通りである。
【００３１】
実施例１でｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙに組み込んでクローニングしたＶＰ２遺伝子と、大腸菌用発現プラスミドベクターｐＧＥＸ−５Ｘ−１を、それぞれ、制限酵素ＥｃｏＲIとＸｈｏIで切断し、両者をライゲーション（連結反応）した。そして、作製した組換えプラスミドで大腸菌ＢＬ２１株を形質転換し、ＶＰ２抗原発現大腸菌を作製した。
【００３２】
次に、ＶＰ２抗原発現大腸菌の溶菌を、以下の手順により行った。形質転換したＶＰ２抗原発現大腸菌を、室温（２２〜２５℃）、ＬＢ培地で振盪培養して、ＯＤ６００が０．５〜０．８になった時点でＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ  ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を０．４Ｍになるように添加した。ＩＰＴＧ添加後、さらに４時間振盪培養を続けてＶＰ２タンパク質の発現誘導を行った。
【００３３】
発現誘導を行った培養菌液を２０００ｇ、１０分、４℃で遠心して、上清を除去したのち、ＰＢＳ（−）を、培養液の１／２０量入れ、菌体ペレットを浮遊させた。そして、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を１％になるように添加したのち、凍結融解と超音波破砕処理を行い、８０００ｇ、２０分、４℃で遠心後上清を回収した。
【００３４】
次に、アフィニティークロマトグラフィーにより、前記手順で作製された大腸菌融解液からＶＰ２タンパク質を回収・精製した。なお、本実験では、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１を発現ベクターとして用いて、ＶＰ２タンパク質を、ＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）との融合タンパク質（ＶＰ２−ＧＳＴ融合タンパク質）として発現させた。従って、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅをリガントとするアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、目的のＶＰ２タンパク質（ＶＰ２−ＧＳＴ融合タンパク質）を、簡便かつ高純度に精製することができた。
【００３５】
アフィニティークロマトグラフィーの具体的手順は次の通りである。上記の回収した上清に、上清５０ｍｌあたり１ｍｌの５０％ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを添加し、室温で３０分間転倒混和したのち、カラムに全量を移して液体分画を自然流下させた。次いで、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂの２０倍量のＰＢＳ（−）でカラムを３回洗浄し、続いて、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂの２倍量の還元ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅを加えて室温で２０分間静置した。静置後、カラムからの流下液を回収した。以下、同様の手順で、還元ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅを加えて室温で２０分間静置し、静置後、カラムからの流下液を回収する操作を３回繰り返した。以上の手順により、カラムからの流下液の中に、ＶＰ２タンパク質が高濃度に含有するようになり、高純度のＶＰ２タンパク質溶液を回収できた。
【実施例３】
【００３６】
実施例３では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＶＰ２−ＧＳＴ融合タンパク質の検出を行った。染色には、ＣＢＢ（ｃｏｏｍａｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ）を用いた。結果を図１に示す。
【００３７】
図１中、レーン１は分子量マーカー、レーン２はＶＰ２−ＧＳＴ融合タンパク質発現大腸菌溶解液（精製前）、レーン３はＶＰ２−ＧＳＴ融合タンパク質（精製後）である。
【００３８】
図１・レーン３に見られるように、ＶＰ２−ＧＳＴ融合タンパク質の分子量から予想される位置にバンドが検出された。
【実施例４】
【００３９】
実施例４では、ウエスタンブロット法によるＶＰ２−ＧＳＴ融合タンパク質の検出を行った。結果を図２に示す。
【００４０】
図２中、レーン１は分子量マーカー、レーン２はＶＰ２−ＧＳＴ融合タンパク質発現大腸菌溶解液（精製前）、レーン３はＶＰ２−ＧＳＴ融合タンパク質（精製後）である。
【００４１】
図２・レーン３に見られるように、免疫染色によって、ＶＰ２−ＧＳＴ融合タンパク質のバンドが検出された。従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（実施例３）とウエスタンブロットの結果より、ＶＰ２タンパク質の発現と精製が明らかになった。
【実施例５】
【００４２】
実施例５では、実施例２で作製したＶＰ２−ＧＳＴ融合タンパク質を抗原として用いることにより、ＥＬＩＳＡ法に基づいて、ＭＰＶ抗体を特異的に検出できることを示す実験を行った。手順を以下に示す。
【００４３】
まず、ＶＰ２−ＧＳＴ融合タンパク質を０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）で希釈し、４０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌの抗原溶液を調製した。そして、これらの抗原溶液を、９６−ｗｅｌｌマイクロプレートに２００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、４℃で一晩静置した。
【００４４】
次に、２５０μｌ／ｗｅｌｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（−）で各ｗｅｌｌを１分間ずつ３回振盪洗浄後、０．１％  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ−ＰＢＳ（−）を２５０μｌ／ｗｅｌｌずつ加え、４℃で１時間静置した。そして、前記のマスキング処理後、液を捨ててプレートを乾燥させた。
【００４５】
次に、ＭＰＶ実験感染マウス血清及び非感染マウス血清をそれぞれＰＢＳ（−）で１／４０〜１／６４０まで２倍階段希釈し、その階段希釈血清を、上記マイクロプレートに２００μｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、３７℃、１時間の反応を行った。
【００４６】
次に、２５０μｌ／ｗｅｌｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（−）で各ｗｅｌｌを1分間ずつ3回振盪洗浄し、洗浄後、ペルオキシダーゼ標識プロテインＡを含む１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）を２００μｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、３７℃で１時間の反応を行った。
【００４７】
そして、２５０μｌ／ｗｅｌｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（−）で各ｗｅｌｌを1分間ずつ３回振盪洗浄し、洗浄後、１．５ｍｇ／ｍｌ、σ−フェニレンジアミン・２塩酸塩−０．０１％Ｈ２Ｏ２−ＰＢＳ（−）を２００μｌ／ｗｅｌｌずつ加え、遮光して３７℃、１０分間の発色反応を行った。３．５Ｎ硫酸を５０μｌ／ｗｅｌｌずつ加えて振盪混和し、混和後、４９２ｎｍの測定波長で吸光度を測定した。
【００４８】
吸光度の測定結果を表１、表２及び図３、図４に示す。
【００４９】
【表１】
2005278536.tif 000003
【００５０】
【表２】
2005278536.tif 000004
表１、表２及び図３、図４に示すとおり、ＶＰ２が抗原となって、ＭＰＶ感染マウスの血清中に含有する抗ＭＰＶ抗体を、抗原抗体反応により検出することができることが示された。また、上記のＥＬＩＳＡの結果は、抗原濃度及び抗体濃度依存的な反応強度を示している。従って、本発明により、ＭＰＶ抗体を定量的にも測定可能であることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明に係るＶＰ２及び該タンパク質をコードするＤＮＡは、抗ＭＰＶ抗体に対する特異的抗原として、産業上の利用可能性がある。
【００５２】
本発明に係る組換えプラスミド、形質転換した大腸菌、及び、ＶＰ２作製方法は、抗ＭＰＶ抗体の抗原であるＶＰ２を大量作製できる点で、産業上有用である。
【００５３】
本発明に係る抗体検出キット及び抗体検出方法は、抗ＭＰＶ抗体を高感度で検出できる点で、産業上有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図面代用写真。
【図２】ウエスタンブロットの結果を示す図面代用写真。
【図３】ＭＰＶ感染マウス血清の吸光度測定結果のグラフ。
【図４】正常マウス血清の吸光度測定結果のグラフ。
【図１】
2005278536.tif 000005
【図２】
2005278536.tif 000006
【図３】
2005278536.tif 000007
【図４】
2005278536.tif 000008
【配列表】
2005278536000001.app