(57)【要約】【課題】積層細胞層、特に多種類の細胞層が多層構造の重積状態で存在する積層細胞層を簡単に、かつ効率的に作製することができる培養容器、該容器を使用した培養物と培養方法、ならびに前記培養物を使用した生体組織の再生方法の提供。【解決手段】増殖用細胞が播種される複数の培養棚が上下方向に設置され、かつ前記培養棚の少なくとも１個が培養中で分解可能な材料で形成されたことを特徴とする培養容器、該培養容器の各培養棚に増殖用細胞を播種した培養容器、この増殖用細胞を播種した培養容器を培養した培養物、および該培養物を利用した細胞組織再生方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖用細胞が播種される複数の培養棚が上下方向に設置され、かつ少なくとも１個の培養棚が培養中で分解可能な材料（以下、この材料を生分解性材料ともいう）で形成されたものであることを特徴とする培養容器。
【請求項２】
培養棚がフィルム、平面状スポンジあるいは繊維束で構成されたことを特徴とする請求項１に記載の培養容器。
【請求項３】
増殖用細胞層を載持した培養棚を構成するフィルムが、多孔性であることを特徴とする請求項２に記載の培養容器。
【請求項４】
最下層の培養棚の培養中における分解速度が、他の培養棚の培養中における分解速度より低いことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の培養容器。
【請求項５】
最下層の培養棚は、増殖用細胞層の培養が完了した時点で該培養棚上の載持物を保持するに十分な物性を維持するのものであることを特徴とする請求項４に記載の培養容器。
【請求項６】
最下層および最上層の培養棚の分解速度が、他の培養棚の分解速度より低いことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の培養容器。
【請求項７】
最下層の培養棚が生体組織の再生誘導のための足場になるものであることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の培養容器。
【請求項８】
最上層の培養棚が、生体組織の再生誘導における他の生体物質の侵入を防止する機能を奏するものであることを特徴とする請求項６または７に記載の培養容器。
【請求項９】
増殖用細胞層を載持する培養棚が、増殖用細胞層との接着性を向上するための表面改質が施されたものであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の培養容器。
【請求項１０】
表面改質がプラズマ照射および／またはコロナ放電により行われたものであることを特徴とする請求項９に記載の培養容器。
【請求項１１】
増殖用細胞を各培養棚に播種した請求項１〜１０のいずれかに記載の培養容器。
【請求項１２】
播種する増殖用細胞の種類が全て異なるものであることを特徴とする請求項１１に記載の培養容器。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の培養容器の増殖用細胞を培養した培養物。
【請求項１４】
培養容器の最下層あるいは最下層と最上層の培養棚が、所望の培養が完了した時点で未分解であることを特徴とする請求項１３に記載の培養物。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれかに記載の培養容器と該培養容器を収納する外箱よりなる培養具セット。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれかに記載の培養容器の各培養棚に増殖用細胞を播種後、該培養容器を培養液中に浸漬させ増殖用細胞の培養と最下層の培養棚あるいは最下層と最上層の培養棚を除く培養棚の分解を行い、この結果、分解除去された培養棚に載持された増殖用細胞層を下層の増殖用細胞層に重力落下させるとともに前記増殖用細胞層を接着させることを特徴とする培養物の作製方法。
【請求項１７】
増殖用細胞を播種した請求項１３または１４に記載の培養容器の培養物を生体に移植して細胞増殖させることを特徴とする生体組織の再生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞層が多層の形で積層された積層細胞層、特に多種類の細胞層が多層の形で積層された積層細胞層を作製するために使用される培養容器、増殖用細胞が播種された前記の培養容器、増殖用細胞が播種された前記の培養容器の培養物とその培養方法、および前記培養物を使用した生体組織の再生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、組織欠損部位への移植用材料として、代表的なものに人工皮膚が挙げられる。これら細胞膜の多くはコラーゲンに代表される生体由来の吸収性材料を、細胞増殖の基材として細胞を三次元で培養することにより作製されている。しかしながら、このようにして作製した細胞膜は単層構造であり、増殖された細胞層が積層された形で存在する積層細胞層、特に多種類の増殖された細胞層が積層された形で存在する積層細胞層を作製することは、困難であった。
【０００３】
多種類の細胞が多層構造の重積状態で存在する積層細胞層を作製する方法としては、例えば単層の細胞層を重積する方法が用いられているが（非特許文献１）、この方法では単層の細胞層を連続的に重積する必要があり、多くの手間がかかり効率的でない。
【０００４】
【非特許文献１】バイオマテリアルス２４（２００３）２３０９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
解決しようとする課題は、積層細胞層、特に多種類の細胞層が多層構造の重積状態で存在する積層細胞層を簡単に、かつ効率的に作製することができる培養容器、該容器を使用した培養物と培養方法、ならびに前記培養物を使用した生体組織の再生方法の提供。
なお、本発明でいう多種類の細胞層が多層構造の重積状態で存在する積層細胞層とは、複数の細胞層が重積状態で存在するものは全て含まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１は、増殖用細胞が播種される複数の培養棚を有して構成され、かつ少なくとも１個、好ましくは培養棚全部が生分解性材料で形成されたことを特徴とする培養容器にある。
前記増殖用細胞層を載持可能な複数の培養棚の形状としては、生分解性材料で構成されるフィルム、平面状スポンジあるいは繊維束等が挙げられるが、これらは多孔性であってもよい。前記培養棚は多孔性であることにより、該フィルムに載持される前記増殖用細胞層の該フィルムへの接着性が向上するとともに、前記増殖用細胞層中に十分な酸素や培養液の栄養分を供給することができる。
ただし、多種類の増殖された積層細胞層を作製する場合、播種された細胞毎に好ましい培養液が存在するので、各細胞層の培養に適した培養液が使用されるので、このような培養方法を採用する場合、各培養液が混合しないように、前記培養棚は無孔のもの、例えば無孔のフィルムを使用することが好ましい。
前記培養棚、特にフィルムで構成される培養棚は、増殖用細胞層との接着性を向上するためにプラズマ照射、コロナ放電等により表面改質したものが好ましい。また、この培養棚の厚さは、増殖用細胞層の培養時間や培養棚を構成する生分解性材料の分解速度等を考慮して適宜決定される。
【０００７】
本発明の培養容器においては、最下層の培養棚の培養中での分解速度が他の培養棚の分培養中での分解速度より低いことが好ましい。培養容器の最下層の培養棚が前記のような分解特性を有することにより、増殖用細胞層の所定の培養が完了した時点で、最下層の培養棚以外の増殖用細胞層を載持する培養棚は生分解により少なくとも部分的に破壊、好ましくは完全に破壊状態にあるとしても、最下層の培養棚の分解速度が、他の培養棚の分解速度に比較して低いことにより、最下層の培養棚は該層上に載持されている載持物を保持するに十分に強度等の維持しているから、作製された積層細胞層の取扱い、例えば生体への移植する等に際しての取扱い、あるいは移植の作業が簡単となる。
【０００８】
さらに前記最下層の培養棚は、生体組織の再生誘導のための足場になるものが好ましい。すなわち、通常、培養物を生体組織に移植して組織の再生誘導を行う場合、血液細胞を除いて欠損部位組織の再生誘導のために足場を必要とするが、前記最下層の培養棚が前記のような生体組織の再生誘導における足場の機能を奏することにより、別途生体組織の再生誘導に際して別途前記のような足場の機能を奏する材料を使用する必要がなく、生体組織の再生誘導を簡単に行うことができるという効果を奏することができる。
【０００９】
また、本発明の培養容器としては、その最上層の培養棚が最下層の培養棚と同様に、その分解速度が他の培養棚の分解速度より低いものも好ましい。すなわち、通常、培養物を生体組織に移植して組織の再生誘導を行う場合、再生誘導を図る箇所に目的とする再生誘導の細胞以外の細胞あるいはタンパク質が侵入することがあり、これら生体物質の侵入を防止するための隔離手段が別途採用されているが、最上層の培養棚の分解特性を前記のように低いものとすることにより、生体組織に移植する段階においてもその形態を保持させることにより、従来のように隔離手段を別途使用しなくても再生誘導の細胞以外の細胞あるいはタンパク質の侵入を防止することができる。
本発明の培養容器における培養棚の数および培養棚に載持される増殖用細胞の種類は、作製される該細胞膜の使用分野あるいは用途に応じて適宜決定される。
【００１０】
本発明の培養容器を利用して、例えば皮膚再生用の重積細胞層層を製造することができる。すなわち、皮膚は角化細胞、色素細胞やメルケル細胞等で構成される表皮層、線維芽細胞と呼ばれる細胞でつくられた線維と基質で構成される真皮層および真皮の下にあり、脂肪細胞を含み、血管や神経幹も走っている下皮を基本構成とするものであるが、皮膚細胞は他の生体組織、またこれに代わる物質に付着して増殖し，平面上に層を作る性質があり、従来、細胞培養床としてポリスチレンや合成高分子物質に天然高分子物質をコーティングしたもの等を利用して細胞増殖が行われている。
本発明の培養容器を利用すると、皮膚再生用の重積細胞層の他、血管再生用の重積細胞層、内臓臓器再生用の重積細胞層等を容易に作成することができる。
【００１１】
本発明の培養容器の培養容器を構成する生分解性材料としては、大きく分けて合成高分子材料、天然高分子材料および無機材料がある。
高分子材料としては、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、乳酸−グリコール酸共重合体、乳酪−カプロラクトン共重合体等が挙げられ、特に前記共重合体はその共重合成分の共重合比を変えることにより、その特性、例えば前記生分解性の速度を変更することができる。
【００１２】
天然高分子材料としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸等が挙げられる。また、これら天然高分子材料、コラーゲン、ゼラチン等は架橋処理することにより、その生分解性を任意に変更することができる。その他、生分解性無機材料としては、リン酸三カルシウム、炭酸カルシウムが挙げられる。
【００１３】
本発明の培養容器を使用した増殖用細胞の培養は、例えば以下のようにして行うことができる。
本発明の前記培養容器の培養棚に、作製した細胞膜自体の使用分野あるいは用途に応じて適当な増殖用細胞を播種した後、培養液（例えば血清を含有した培養液）を有する容器中に浸漬して培養を開始し増殖用細胞層を培養し、培養養開始後、最下層の培養棚あるいは最下層と最上層の培養棚を除いた培養棚が分解消失させ、この分解除去した培養棚に載持された増殖用細胞層を下層の増殖用細胞層に重力落下させ、前記殖用細胞層が接着された積層細胞層を形成させる。前記のようにして作成した培養物は、それを生体に移植して細胞増殖させることにより生体組織の再生を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
多種類の細胞層が層状構造に重積した培養容器および該培養容器を使用した細胞膜の作製方法
【実施例１】
【００１５】
多種類の細胞層が層状構造に重積した培養容器
図１に基づいて説明する。
分子量１０万のポリグリコール酸を用いて押し出し成形にて厚みが２００μｍのフィルム、および同様にして乳酸−カプロラクトン共重合体のフィルムを得た。得られた前記両フィルムは放電処理により親水化処理して増殖用細胞層に対する接着性を改善し、シリコーン製ロッドをスペーサとして前記両フィルムを重積した。前記フィルムの重積は、最下層のフィルムのみをポリグリコール酸フィルムに比較して生分解速度の低い乳酸−カプロラクトン共重合体フィルムとして、他のフィルムをポリグリコール酸フィルムとして４層の培養容器を作製し、γ線滅菌した。
【実施例２】
【００１６】
前記実施例１の培養容器を使用した重積細胞層の作製方法
図１に基づいて説明する
前記培養容器のフィルム２（第１の棚）上に表皮細胞、フィルム３上に真皮細胞（第２の棚）、フィルム３（第３の棚）上に血管内皮前駆細胞を別々に１．０×１０4個を播種した。図１に示す１０％血清含有培養液を入れたポリスチレン製箱体４内に前記増殖細胞を播種した培養容器を浸漬し、該浸漬状態で１０日間培養することで細胞を増殖させ、増殖細胞が重積した重積細胞層を得た。得られた重積細胞層は無血清培地下、フィルム１〜４を構成するポリグリコール酸が分解、消失されるまで膜状態を維持したままさらに培養した。培養開始から２０日後、図２に示すようにポリグリコール酸が完全に消失して、かつ全ての増殖細胞層６，７および８は最下層の乳酸−カプロラクトン共重合体の膜Ｃ上に、各増殖細胞層問が接着して多層構造を有した細胞層を得た。
【実施例３】
【００１７】
実施例２の増殖細胞の培養を、各培養棚に載持された培養細胞の培養に適した培養液をそれぞれ別個に供給して培養を行う以外、実施例２と同様にして培養を行った。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１の培養容器の構成を示した説明図である。
【図２】培養が終了した時点における、実施例１の培養容器の状態を示した説明図である。
【符号の説明】
【００１９】
１    フィルム（最上層）
２    フィルム（第１の棚）
３    フィルム（第２の棚）
４    フィルム（第３の棚を構成する最下層）
５    培養容器および培養液が収納される外箱
６    第１の棚上で増殖された細胞層
７    第２の棚上で増殖された細胞層
８    第２の棚上で増殖された細胞層
Ａ    シリコーン製ロッド
Ｂ    シリコーン製ロッド
Ｃ    シリコーン製ロッド
【図１】
2005080540.tif 000003
【図２】
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