(57)【要約】【課題】  新規な硫酸運搬作用を有するタンパク質および該タンパク質をコードする核酸を見出すことによる生体内での物質運搬の仕組みの解明、更には硫酸運搬因子の遺伝子工学的な合成法の確立が期待されている。また一方、採取した組織から、早期に信頼性の高い結果が得られる「組織の癌化を検出する方法」の開発が望まれている。【解決手段】  新規な活性硫酸運搬作用を有するタンパク質、および、該タンパク質をコードする核酸、および、「被検組織における、前記タンパク質をコードする核酸の転写産物量」と「当該被検組織の癌化」とを関連づけることによる「組織の癌化の検出方法」。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は、転位を有し、かつ活性硫酸運搬作用を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質を有効成分として含む活性硫酸運搬作用剤。
【請求項３】
活性硫酸運搬作用が、3'-ホスホアデノシン-5'-ホスホ硫酸運搬作用であることを特徴とする請求項２記載の活性硫酸運搬作用剤。
【請求項４】
配列番号１記載の全塩基配列の一部又は該一部の塩基配列に相補的な塩基配列を含み２０ｂｐ以上であることを特徴とする核酸。
【請求項５】
配列番号１記載の全塩基配列の一部又は該一部の塩基配列に相補的な塩基配列が、２０〜１８００ｂｐの塩基配列であることを特徴とする請求項４記載の核酸。
【請求項６】
配列番号１記載の塩基番号１２０２〜１２８２からなる塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列を含むことを特徴とする請求項５記載の核酸。
【請求項７】
配列番号１記載の塩基番号３６１〜１５６６からなる塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列を含むことを特徴とする請求項５又は請求項６記載の核酸。
【請求項８】
配列番号１記載の塩基番号３６１〜１５６６からなる塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなることを特徴とする請求項５記載の核酸。
【請求項９】
請求項１記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項１０】
配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列を含むことを特徴とする請求項５記載の核酸。
【請求項１１】
ＤＮＡであることを特徴とする請求項４〜１０何れか一項に記載の核酸。
【請求項１２】
下記（ａ）または（ｂ）のタンパク質の「被検組織における発現量の検出値」と、「前記被検組織の癌化」とを関連づけることを特徴とする被検組織の癌化の検出方法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は、転位を有し、かつ活性硫酸運搬作用を有するタンパク質。
【請求項１３】
「被検組織における発現量の検出値」が、請求項１２記載の「（ａ）または（ｂ）のタンパク質」をコードする核酸の被検組織と健常組織における転写産物量をそれぞれ定量し、該定量によって得られた被検組織における値と健常組織における値との差であることを特徴とする請求項１２記載の被検組織の癌化の検出方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の「（ａ）または（ｂ）のタンパク質」をコードする核酸の転写産物量が下記（Ａ）又は（Ｂ）記載の塩基配列からなる核酸の転写産物量であることを特徴とする請求項１３記載の被検組織の癌化の検出方法。
（Ａ）配列番号１記載の塩基配列の一部を含み、２０ｂｐ以上の塩基配列
（Ｂ）配列番号１記載の塩基配列の一部の塩基配列に相補的な塩基配列を含み、２０ｂｐ以上である塩基配列。
【請求項１５】
「配列番号１記載の塩基配列の一部」が、「配列番号１記載の塩基番号３６１〜１５６６からなる塩基配列」、又は、「配列番号１記載の塩基番号１２０２〜１２８２からなる塩基配列」であることを特徴とする請求項１４記載の被検組織の癌化の検出方法。
【請求項１６】
前記被検組織が大腸由来の組織であることを特徴とする請求項１２〜１５何れか一項記載の被検組織の癌化の検出方法。
【請求項１７】
請求項４〜１１何れか一項記載の核酸の、被検組織の癌化の検出のための使用。
【請求項１８】
請求項４〜１１何れか一項記載の核酸を用いる、請求項１記載のタンパク質の発現量の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な活性硫酸運搬作用を有するタンパク質、および、該タンパク質をコードする核酸、および、前記タンパク質の「被検組織における発現量の検出値」と「当該被検組織の癌化」とを関連づけることによる「組織の癌化の検出方法」に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、硫酸運搬因子としては、例えば硫酸イオン運搬因子（非特許文献１）、活性硫酸運搬因子（非特許文献２（分子量75kDaの活性硫酸運搬因子を開示）、非特許文献３（分子量230kDaの活性硫酸運搬因子を開示））等が知られていた。しかし、何れもアミノ酸配列や核酸配列は判明しておらず、遺伝子工学的にこれら硫酸運搬因子を合成する技術は確立されていなかった。
【０００３】
また、組織の癌化を検出する方法としては、様々な方法が知られており、例えばＸ線検査、内視鏡検査や、CA19-9等の腫瘍マーカー検査等があげられる。Ｘ線検査や内視鏡検査などでは組織を外観からしか観察できず、また、腫瘍マーカーは偽陽性、偽陰性が現れる点で確定的な診断には不十分であった。
【０００４】
組織の癌化の確定診断は、実際に組織を生検により採取し、その組織の培養を行って確認する方法が行われているが、この方法は組織の培養の為の相当の時間を要する。
一方、内視鏡下で外科的手法により、生体組織の病変部を切除する手術は一般に行われており、その様な病変部について簡単に癌化の有無を確認する手法が存在すれば、癌化の早期発見にも繋がり、その後の患者の治療や予防に有用となる。
【０００５】
【非特許文献１】Cell, 78(6), pp.1073-1087 (1994)
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, pp.10707-10711 (1994)
【非特許文献３】Biochemistry, 35, pp.3695-3703 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
新規な硫酸運搬作用を有するタンパク質および該タンパク質をコードする核酸を見出すことによる生体内での物質運搬の仕組みの解明、更には硫酸運搬因子の遺伝子工学的な合成法の確立が期待されている。また一方、採取した組織から、早期に信頼性の高い結果が得られる「組織の癌化を検出する方法」の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ヒトDNAライブラリーから特定の核酸を新たに見出し、当該核酸がコードするタンパク質が「活性硫酸運搬活性」を有すること、および、「癌化した組織における前記タンパク質の発現量」が「健常組織における前記タンパク質の発現量」よりも減少しているという実験結果に基づき、これら知見を組織の癌化の検出方法に応用することで本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は以下の（１）〜（１８）に関する。
（１）下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、一若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は、転位を有し、かつ活性硫酸運搬作用を有するタンパク質。
（２）上記（１）記載のタンパク質を有効成分として含む活性硫酸運搬作用剤。
（３）活性硫酸運搬作用が、3'-ホスホアデノシン-5'-ホスホ硫酸運搬作用であることを特徴とする上記（２）記載の活性硫酸運搬作用剤。
【０００９】
（４）配列番号１記載の全塩基配列の一部又は該一部の塩基配列に相補的な塩基配列を含み２０ｂｐ以上であることを特徴とする核酸。
（５）配列番号１記載の全塩基配列の一部又は該一部の塩基配列に相補的な塩基配列が、２０〜１８００ｂｐの塩基配列であることを特徴とする上記（４）記載の核酸。
（６）配列番号１記載の塩基番号１２０２〜１２８２からなる塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列を含むことを特徴とする上記（５）記載の核酸。
【００１０】
（７）配列番号１記載の塩基番号３６１〜１５６６からなる塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列を含む核酸であることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の核酸。
（８）配列番号１記載の塩基番号３６１〜１５６６からなる塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなることを特徴とする上記（５）記載の核酸。
（９）上記（１）記載のタンパク質をコードする核酸。
（１０）配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列を含むことを特徴とする上記（５）記載の核酸。
【００１１】
（１１）ＤＮＡであることを特徴とする上記（４）〜（１０）の何れか一つに記載の核酸。
（１２）下記（ａ）または（ｂ）のタンパク質の「被検組織における発現量の検出値」と、「前記被検組織の癌化」とを関連づけることを特徴とする被検組織の癌化の検出方法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、一若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は、転位を有し、かつ活性硫酸運搬作用を有するタンパク質。
【００１２】
（１３）「被検組織における発現量の検出値」が、上記（１２）記載の「（ａ）または（ｂ）のタンパク質」をコードする核酸の被検組織と健常組織における転写産物量をそれぞれ定量し、該定量によって得られた被検組織における値と健常組織における値との差であることを特徴とする上記（１２）記載の被検組織の癌化の検出方法。
（１４）上記（１２）記載の「（ａ）または（ｂ）のタンパク質」をコードする核酸の転写産物量が下記（Ａ）又は（Ｂ）記載の塩基配列からなる核酸の転写産物量であることを特徴とする上記（１３）記載の被検組織の癌化の検出方法。
（Ａ）配列番号１記載の塩基配列の一部を含み、２０ｂｐ以上の塩基配列
（Ｂ）配列番号１記載の塩基配列の一部の塩基配列に相補的な塩基配列を含み、２０ｂｐ以上である塩基配列。
（１５）「配列番号１記載の塩基配列の一部」が、「配列番号１記載の塩基番号３６１〜１５６６からなる塩基配列」、又は、「配列番号１記載の塩基番号１２０２〜１２８２からなる塩基配列」であることを特徴とする上記（１４）記載の被検組織の癌化の検出方法。
【００１３】
（１６）前記被検組織が大腸由来の組織であることを特徴とする上記（１２）〜（１５）の何れか一つに記載の被検組織の癌化の検出方法。
（１７）上記（４）〜（１１）の何れか一つに記載の核酸の、被検組織の癌化の検出のための使用。
（１８）上記（４）〜（１１）の何れか一つに記載の核酸を用いる、組織における（１）記載のタンパク質の発現量の検出方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明タンパク質からなる新規な活性硫酸運搬作用剤の提供、および、本発明タンパク質の発現を指標とする組織の癌化の検出方法を提供する。また、本発明核酸の配列の開示により、新規な活性硫酸運搬作用を有するタンパク質の遺伝子工学的製造方法が可能となり、さらに、医学、生化学等の研究用の試薬又は診断薬として利用も考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
（１）本発明タンパク質
本発明タンパク質は、下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、一若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は、転位を有し、かつ活性硫酸運搬作用を有するタンパク質。
【００１６】
一般に生理活性を有するタンパク質のアミノ酸配列において一若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、或いは転位しても生理活性が維持されることが知られており、その様な変異を有するタンパク質も同一タンパク質のバリアントであると言うことが出来る。本発明タンパク質における(a)のタンパク質においても、配列番号２記載のアミノ酸配列に一若しくは数個（好ましくは１個以上５０個以下、更に好ましくは１個以上４５個以下、更には１個以上４０個以下が好ましい）のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、或いは転位が起こっていても、活性硫酸を運搬する運搬作用を保持している限りにおいて、上記(a)で表されるタンパク質と実質的に同一の物質であるということができ、本発明タンパク質に包含される。上記(b)のタンパク質は、この様なタンパク質を示す。この様な変異を有するタンパク質は、配列番号１記載の塩基番号３６１〜１５６６の領域において一若しくは数個（好ましくは１個以上１５０個以下、更に好ましくは１個以上１３５個以下、更には１個以上１２０個以下が好ましい）の塩基の置換、欠失、挿入、又は転位を有する塩基配列にてコードされるタンパク質であるということが出来る。
【００１７】
この様な変異を有するタンパク質のアミノ酸配列は、上記(a)で表されるポリペプチドのアミノ酸配列と８７％以上、好ましくは８８％以上、更には９０％以上の相同性を有することが好ましい。アミノ酸配列の相同性は、FASTAのような周知のコンピューターソフトウェアを用いて容易に算出することができ、この様なソフトウェアはインターネットによっても利用に供されている。
【００１８】
すなわち、天然に存在するタンパク質には、それをコードする遺伝子DNAの多型や変異以外にも、生成後のタンパク質の細胞内及び生成中の修飾反応などによって、そのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにも拘わらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示す物があることが知られている。この様に（ａ）のタンパク質に対し構造的に若干の相違があってもその機能については大きな違いが認められないタンパク質も、本発明タンパク質に包含される。人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記の様な変異を導入した場合も同様であり、この場合には更に多種多様の「変異を有するタンパク質」を作製することが可能である。
例えば、ヒトインターロイキン２（IL-2）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリン残基に置換したタンパク質がIL-2の活性を保持することが知られている（Science, 224(1984), p.1431）。また、ある種のタンパク質は活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られており、このような活性に必須でないペプチド領域の配列を有するタンパク質は、一次構造上は異なった形で存在している。例えば、細胞外に分泌されるタンパク質に存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれに当たり、これら活性には必須でないペプチド領域のほとんどは、翻訳後又は活性型タンパク質への転換に際して除去される。なお、（ａ）のタンパク質と同等の活性硫酸運搬作用を有するタンパク質であれば、本発明タンパク質についてもそのような配列が連結していても良い。このような「変異を有するタンパク質」は「部位特異的変異法」など公知の方法により容易に作製することが可能である。
【００１９】
なお、本発明タンパク質のうち、上記（ａ）に示すタンパク質は配列番号１記載の塩基配列の塩基番号３６１〜１５６６の領域（コード領域：CDS）にコードされるタンパク質である。なお、縮重（一つのアミノ酸をコードする塩基配列（コドン）が数個存在すること）により、配列番号１記載の塩基配列とは必ずしも同一で無い場合もあるが、コドンが対応しているアミノ酸が同一であれば、構わない。
【００２０】
例えば、配列番号１記載の塩基配列の塩基番号１４５８の塩基はシトシン（Ｃ）であるが、この塩基がチミンであっても、コードされているアミノ酸はロイシン（Ｌｅｕ）であり、アミノ酸は同一となる。
【００２１】
本発明タンパク質が運搬する活性硫酸としては、アデノシン５'−ホスホ硫酸（以下「APS」とも記載する）および３'−ホスホアデノシン５'−ホスホ硫酸（以下、「PAPS」とも記載する）が好ましく、特にPAPSが好ましい。
【００２２】
本発明タンパク質が有する活性硫酸運搬作用の確認は、例えば、J. Biol. Chem., 275, pp.13580-13587 (2000)の方法等に従って行うことができる。すなわち、[14Ｃ]、[3Ｈ]、又は[35Ｓ]などの放射性同位元素（特に[35Ｓ]が好ましい）で放射能標識した活性硫酸（PAPS等)と、本発明タンパク質又はこれを含む抽出物とを混合し、移行した放射能標識した活性硫酸の放射能を測定する方法で行うことができる（この様な方法としては、具体的には後述の実施例２記載の方法が例示される）。
【００２３】
本発明タンパク質の製造方法は特に限定されず、天然物から上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を単離してもよく、化学合成や遺伝子工学的手法によって上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を製造しても良い。遺伝子工学的手法によって本発明タンパク質を製造する方法については、後述する本発明核酸を用いるポリペプチドの製造法を参照されたい。
【００２４】
（２）本発明核酸
本発明核酸は、配列番号１記載の全塩基配列の一部又は該一部の塩基配列に相補的な塩基配列を含むことを特徴とする核酸であれば、用いる目的により必要な長さを選択することが出来るが、２０ｂｐ以上好ましい。中でも２０〜１８００ｂｐが好ましく、２０〜１７００ｂｐがより好ましく、２０〜１６００ｂｐが更に好ましい。本発明核酸を使用する際には、その目的を効率良く行う為に他の塩基配列を連結してもよい。
【００２５】
本発明核酸における「配列番号１記載の全塩基配列の一部」とは、２０ｂｐ以上の長さからなり、２０〜１８００ｂｐが好ましく、２０〜１７００ｂｐがより好ましく、更には２０〜１６００ｂｐが好ましい。この様な核酸としては、例えば配列番号１記載の塩基番号１２０２〜１２８２の塩基配列からなる核酸、及び、配列番号１記載の塩基番号３６１〜１５６６の塩基配列からなる核酸等が例示される。この様な核酸又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸は、後述の本発明検出方法で使用することができ、また、特にこの様な長さの核酸は、とりわけハイブリダイズ能と取り扱い易さの双方を兼ね備えているため、ハイブリダイズ用プローブとして優れている。上記で例示される核酸以外にも、上記例示した長さの範囲内で、配列番号１記載の全塩基配列の一部、特に塩基番号３６１〜１５６６の範囲内の塩基配列の一部を含む核酸等を適宜選択することができる。
【００２６】
なお、本明細書における核酸の長さを表す単位「ｂｐ」とは、核酸が二本鎖となっている場合には、その二本鎖を形成する塩基対の数、一本鎖となっている場合には、その核酸に相補的な塩基配列からなる一本鎖がハイブリダイズした二本鎖の塩基対数に相当する数に換算した核酸の長さである。従って、例えば、「１０００ｂｐ」の一本鎖のＤＮＡは１０００個のヌクレオチドで形成されていることになり、「１０００ｂｐ」の二本鎖のＤＮＡは２０００個のヌクレオチド（１０００対のヌクレオチド）で形成されていることになるが、双方とも同じ「１０００個のヌクレオチドからなる鎖長」のＤＮＡを表すことになる。
【００２７】
また、配列番号１記載の塩基配列からなる核酸または配列番号１記載の塩基番号３６１〜１５６６の塩基配列を含む核酸は、タンパク質合成における終止コドンに相当する塩基配列を含むため、「配列番号２記載のアミノ酸番号１〜４０１のアミノ酸配列からなるポリペプチド」を遺伝子工学的に調製するために用いることができ、有用である。
【００２８】
本発明核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであっても良いが、後述の本発明検出方法でハイブリダイズ用プローブ等として使用する場合や、組換ベクターや組換体の調製時に安定である点で優れるため、ＤＮＡであることが好ましい。
【００２９】
また、上記「配列番号１記載の全塩基配列の一部または該一部の塩基配列に相補的な塩基配列を含む核酸」に対してストリンジェントな条件下でハブリダイズする核酸（特にＤＮＡ）も、例えば配列番号１記載の塩基配列を有する核酸の転写産物の生体内での発現状況などの検査に際し、ハイブリダイズ用プローブとして使用することができ、医学、生化学等の研究用の試薬又は診断薬として極めて有用である。
【００３０】
ここで「ストリンジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Sambrook,  J.  et  al.,  Molecular  Cloning,  A  Laboratory  Manual,  Second  Edition,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press  (1989)等参照）。一般に「核酸のハイブリダイズを使用する実験手法（例えばノザンブロットハイブリダイゼーション、サザンブロットハイブリダイゼーション）」等で用いられる条件が挙げられ、好ましくは３７．５％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／EDTA（エチレンジアミン四酢酸）緩衝液）、５×デンハルト溶液（Denhardt's solution）、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）存在下での４２℃の条件が例示される。
【００３１】
本発明核酸は例えば以下の方法により調製することが可能である。
公知のUDP-ガラクトース運搬関連遺伝子（human UDP-galactose transporter related gene:UGTREL1）の塩基配列（GenBank accession No.NM#005827）をクエリーとしてBLASTにより塩基配列の検索を行ない、配列番号１の全配列を含むクローン(GenBank accession No.NM#015948)を得ることができる。得られたクローンを相補配列として用いポリメラーゼチェイン反応（以下「PCR法」とも記載する）などを行いcDNAライブラリー等から本発明核酸（例えば本発明DNA）を増幅して調製することができる。
【００３２】
本発明核酸は、例えば配列番号３記載の塩基配列（aaaaagcaggcttccataatggcatggacttg）を5'プライマーとして、配列番号４記載の塩基配列（agaaagctgggtctacagtctgtgccagcgt）を3'プライマーとして使用し、例えばヒトゲノムcDNAライブラリーを鋳型として常法に従って一次PCR法を行い、更に配列番号５記載の塩基配列（ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct）を5'プライマー、配列番号６記載の塩基配列（ggggaccactttgtacaagaaagctgggt）を3'プライマーとして使用し、上記一次PCR法による産物を鋳型として二次PCR法を行うことで調製することができる。
【００３３】
配列番号１記載の塩基配列においてポリペプチドをコードしている領域（塩基番号３６１〜１５６６）は、配列番号７の塩基配列（atggacttgacacagcaagcaaaag）を5'プライマーとして及び配列番号８の塩基配列（ctatacagtctgtgccagcgtcctt）を3'プライマーとして用いPCR法で調製することができる。また、配列番号１記載の全塩基配列からなる核酸の調製は、例えば配列番号９の塩基配列（gacgccacgcaggctgccgtcaccc）を5'プライマー、配列番号１０記載の塩基配列（aaagatcacagaataattttattta）を3'プライマーとして使用して、市販のcDNAライブラリーを鋳型としてPCR法により調製することができる。更に、配列番号１記載の塩基番号１２０２〜１２８２の領域は、配列番号１１の塩基配列（gattaggccctgcagtaacatt）を5'プライマーとして、配列番号１２の塩基配列（atccagtgagggaaaaaagga）を3'プライマーとして使用し、同様にcDNAライブラリーから調製することができる。
【００３４】
この場合、配列番号３及び配列番号４のプライマーを使用したPCR法では、産物として１２３９ｂｐのDNA断片が得られ、配列番号５及び配列番号６のプライマーを使用したPCR法においては産物として１２７３ｂｐのDNA断片が得られ、配列番号７及び配列番号８のプライマーを使用したPCR法において産物として１２０６ｂｐのDNA断片が得られる。これらをアガロースゲル電気泳動等の様な分子量によりDNA断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す等の様な常法に従って単離して「本発明核酸」を得ることができる。
【００３５】
このようにして単離した本発明核酸は、本発明核酸がコードするポリペプチドを発現する組換体を調製するために使用することができる。すなわち、常法に従い、本発明核酸の両端に制限末端（粘着末端又は平滑末端）を連結し、発現ベクターに挿入することができる。当業者であれば制限末端は発現ベクターに適合するように適宜選択することが可能である。発現ベクターは、「本発明核酸がコードするタンパク質を発現させたい宿主細胞」に適したものを当業者であれば適宜選択することができる。このような発現ベクターには、本発明核酸を目的の宿主細胞中で発現しうるように遺伝子発現に関与する領域（プロモータ領域、エンハンサー領域、オペレーター領域等）が適切に配列されており、さらに、本発明核酸が適切に発現するように構築されていることが好ましい。
【００３６】
上記「本発明核酸を含む発現ベクター」を宿主細胞に組み込み、組換体を得ることができる。宿主細胞としては、真核細胞（ほ乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）も原核細胞（大腸菌、枯草菌等）も使用することができる。宿主細胞として真核細胞を使用する場合には「本発明核酸を含む発現ベクター」の元となるベクター（以下「基本ベクター」とも記載する）として「真核細胞用の発現ベクター」を選択し、宿主細胞として原核細胞を使用する場合には基本ベクターとして「原核細胞用の発現ベクター」を選択する。
【００３７】
ところで、本発明核酸はヒトゲノムライブラリーから発見された核酸であり、更に運搬因子に関連する遺伝子であると考えられるため、本発明においては真核細胞を組換体の宿主細胞として用いるとより天然物に近い性質を有した本発明タンパク質が得られる（例えば糖鎖が付加された態様など）と考えられる。従って、宿主細胞としては真核細胞、好ましくはほ乳類細胞又は酵母、特にほ乳類細胞を選択することが好ましい。また、「本発明核酸を含む発現ベクター」の基本ベクターは真核細胞用のベクター、特にほ乳類細胞用のベクターを選択することが好ましい。
【００３８】
近年、遺伝子工学的手法として、形質転換体を培養、生育させて、その培養物や生育物から目的物質を単離・精製する手法が確立されている。「本発明核酸を含む発現ベクター」は、本発明核酸がコードするポリペプチドの単離・精製が容易となるように構築されていることが好ましい。特に、上記目的物質が、「本発明核酸がコードするポリペプチド」と「標識ペプチド」との「融合タンパク質」の形態で発現するように構築した「本発明核酸を含む発現ベクター」を用い、遺伝子工学的にポリペプチドを調製すると、単離・精製が容易となるため好ましい。
【００３９】
なお、培養物や生育物とは、形質転換体を生育させた後の培地（培養液の上清）及び培養された宿主細胞・分泌物・排出物等を含み、形質転換体の培養、生育の条件（培地や培養条件等）は、用いる宿主に合わせて適宜選択できる。また、単離、精製の方法は、タンパク質の公知の抽出・精製方法によって行うことが出来る。
【００４０】
標識ペプチドの例としては、本発明核酸がコードするポリペプチドを遺伝子組み換えによって調製する際に、該「ポリペプチド」を「標識ペプチド」と結合した「融合タンパク質」として発現させることにより、形質転換体の生育物から「本発明核酸がコードするポリペプチド」の分泌・分離・精製又は検出を容易にすることを可能とする機能を有したペプチドが例示される。標識ペプチドとしては、例えばシグナルペプチド（多くのタンパク質のN末端に存在し、細胞内の膜透過機構においてタンパク質の選別のために細胞内で機能している15〜30アミノ酸残基からなるペプチド：例えばOmpA、OmpT、Dsb等）、プロテインキナーゼA、プロテインA（黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約42,000のタンパク質）、グルタチオンS転移酵素、Hisタグ（ヒスチジン残基を6乃至10個並べて配した配列）、mycタグ（cMycタンパク質由来の１３アミノ酸配列）、FLAGペプチド（8アミノ酸残基からなる分析用マーカー）、T7タグ（gene10タンパク質の最初の11アミノ酸残基からなる）、Sタグ（膵臓RNaseA由来の15アミノ酸残基からなる）、HSVタグ、pelB（大腸菌外膜タンパク質pelBの22アミノ酸配列）、HAタグ（ヘマグルチニン由来の10アミノ酸残基からなる）、Trxタグ（チオレドキシン配列）、CBPタグ（カルモジュリン結合ペプチド）、CBDタグ（セルロース結合ドメイン）、CBRタグ（コラーゲン結合ドメイン）、β-lac/blu（βラクタマーゼ）、β-gal（βガラクトシダーゼ）、luc（ルシフェラーゼ）、HP-Thio（His-patchチオレドキシン）、HSP（熱ショックペプチド）、Lnγ（ラミニンγペプチド）、Fn（フィブロネクチン部分ペプチド）、GFP（緑色蛍光ペプチド）、YFP（黄色蛍光ペプチド）、CFP（シアン蛍光ペプチド）、BFP（青色蛍光ペプチド）、DsRed、DsRed2（赤色蛍光ペプチド）、MBP（マルトース結合ペプチド）、LacZ（ラクトースオペレーター）、IgG（免疫グロブリンG）、アビジン、プロテインG等のペプチドが挙げられ、何れの標識ペプチドであっても使用することが可能である。
【００４１】
中でも特にシグナルペプチド、プロテインキナーゼA、プロテインA、グルタチオンS転移酵素、Hisタグ、mycタグ、FLAGペプチド、T7タグ、Sタグ、HSVタグ、pelB又はHAタグが、遺伝子工学的手法による本発明タンパク質の発現、精製がより容易となることから好ましく、更にはHAタグとの融合タンパク質であると「本発明核酸がコードするポリペプチド」の発現の確認が極めて容易となるため、HAタグが最も好ましい。
【００４２】
ほ乳類細胞で発現可能であって、且つ、上述のHAタグとの融合タンパク質として「本発明核酸がコードするポリペプチド」を得ることができる基本ベクターとしては、例えばYEP352 GAPIIやpYES-DEST52（インビトロジェン社製）等が例示されるが、当業者であれば「本発明核酸がコードするポリペプチド」の発現に使用する宿主細胞、制限酵素、標識ペプチドなどから判断して適当な基本ベクターを選択することが可能である。
【００４３】
なお、本発明によって本発明核酸の塩基配列が開示されたため、当業者であれば目的とする本発明核酸や調製したい「本発明核酸の一部の領域」の両端の塩基配列を基に適宜プライマーを作製し、それを用いてPCR法などによって目的の領域を増幅して調製することが容易である。
【００４４】
（３）本発明検出方法
本発明検出方法は、本発明タンパク質の「被検組織における発現量の検出値」と「前記被検組織の癌化」とを関連づけることを特徴とする被検組織の癌化の検出方法である。
【００４５】
本発明検出方法における本発明タンパク質の発現量の検出は、例えば本発明タンパク質が有する活性硫酸運搬作用を指標として測定し検出することが可能である。また、上記本発明核酸の発現量や上記本発明核酸の遺伝情報の転写によって生じる転写産物量を指標として測定することでも検出可能であり、例えば本発明核酸のうち「配列番号１記載の塩基番号１２０２〜１２８２の塩基配列を含むDNAの転写産物量の変化」を測定することによって簡単に行なうことができる。
【００４６】
上述のDNAの転写産物量の測定は、例えば上記で例示したDNAの5'末端と3'末端の塩基配列を基に作製したプライマーと、蛍光色素と消光物質とを結合させたプローブを用いた定量的リアルタイムPCR法（以下「定量的RT-PCR法」とも記載する）等を利用することにより定量可能である。定量的RT-PCR法に使用するプローブとしては、例えば配列番号１３記載の塩基配列（tgtgcaaagaatccagttcggaccta）の核酸が例示される。
【００４７】
なお、遺伝子の発現量を測定し比較する場合、一般的に、c DNA調製の元となるｍＲＮＡ量の違い等に起因する全体のmＲＮＡ総量の違いを補正する必要があり、例えば、健常組織と癌化組織とに於ける遺伝子の発現量を比較するには、各組織に於けるβ-アクチン遺伝子やグリセロアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）の様な標準遺伝子の転写産物量の測定値で目的とする遺伝子の転写産物量の測定値を補正した値を用いるのが好ましい。
【００４８】
本発明検出方法が適用可能な組織としては、何れの組織であっても使用することが可能であるが、食道、胃、肺、膵臓、肝臓、腎臓、十二指腸、小腸、大腸、直腸および結腸などが挙げられ、好ましくは食道、胃、小腸および大腸が例示され、最も好ましくは大腸が例示される。また、本発明検出方法は、組織から分離して得られる「組織片」を使用して行うことが好ましく、すなわち、生検などによって得られた組織に含まれる病変部分の組織（被検組織）と該病変部分の周辺の健常部分の組織（健常組織）とを用いることが好ましい。
【００４９】
例えば、上述の様に、「配列番号１記載の塩基番号１２０２〜１２８２の塩基配列を含むＤＮＡの転写産物量の変化」を指標として本発明検出方法を行う場合、生検等により得られた病変部分の組織とその周辺の健常部分の組織における当該ＤＮＡの転写産物量を各々定量し、同様に定量した標準遺伝子の転写産物量で定量した当該DNA転写産物量を補正した検出値を対比することで、被検組織の癌の診断や治療の経過観察等ができ、有用である。
【００５０】
組織の癌化は、被検組織における補正した上記DNAの転写産物量の検出値が、健常組織と比べて減少している場合に当該被検組織が癌化していると判定される。
【００５１】
なお、本発明検出方法におけるDNAの転写産物の定量は、「DNA」又は「DNAから転写されて生ずるm RNA（DNAの転写産物）」を増幅することにより、その量を測定するPCR法などの方法などがあるが、必ずしも「DNAから転写されて生ずるm RNA（DNAの転写産物）」を定量して行なうことに限定はされず、例えば上記DNAが転写・翻訳されて生ずる「本発明核酸がコードするポリペプチド」を定量して行なうことも可能である。このようなポリペプチドの定量は、例えば精製した「本発明核酸がコードするポリペプチド」を使用して常法によって調製した抗体などを用いて常法（ウエスタンブロッティング、エンザイムイムノアッセイ等）に従って行なうことができる。中でもPCR法やRT-PCR法が好ましく、特にRT-PCR法が最も好ましい。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。しかしながら、これにより本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。
【００５３】
（実施例１）本発明核酸の調製方法
ヒトUDP-ガラクトース運搬関連遺伝子（UGTREL1）の塩基配列（GenBank accession No.
NM_005827）をクエリーとして、BLAST検索を行った。その結果、STP2の塩基配列（GenBank accession No.NM_015948）がホモロジーを有することが判明し、その塩基配列は配列
番号１の通りであった。この塩基配列がコードするアミノ酸配列は配列番号２の通りである。
【００５４】
配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡを得るために、ヒト大腸由来のｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社製）を鋳型とし、５'プライマーとして配列番号３記載の塩基配列（aaaaagcaggcttccataatggcatggacttg）、３'プライマーとして配列番号４記載の塩基配列（agaaagctgggtctacagtctgtgccagcgt）からなるＤＮＡを用いて、常法により一次ＰＣＲ法を行った。なお、一次ＰＣＲの反応液は、２μＬの１０ x pfx amplification緩衝液（インビトロジェン社製）、０．４μＬの５０ｍＭ硫酸マグネシウム溶液、４μＬの１０ x PCRxenhancer 溶液（インビトロジェン社製）、２．５μＬの２．５ｍＭ dＮＴＰ混合溶液、０．５μＬの鋳型となるＤＮＡ（約５０ｎｇ）、１μＬの５'プライマー（終濃度０．５μＭとなる様に添加）、１μＬの３'プライマー（終濃度０．５μＭとなる様に添加）、０．５μＬのplatium pfx DNAポリメラーゼ（インビトロジェン社製）に、蒸留水を８．１μＬ加え、全量２０μＬとした。
【００５５】
更に配列番号５記載の塩基配列（ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct）を５'プライマーに、配列番号６記載の塩基配列（ggggaccactttgtacaagaaagctgggt）を３'プライマーとして使用して二次ＰＣＲ法を行った。なお、二次ＰＣＲの反応液は、２μＬの１０ x pfx amplification緩衝液、０．４μＬの５０ｍＭ硫酸マグネシウム溶液、３μＬの２．５ｍＭｄＮＴＰ混合溶液、４μＬの一次ＰＣＲの産物、２μＬの５'プライマー（終濃度１μＭとなる様に添加）、２μＬの３'プライマー（終濃度１μＭとなる様に添加）、０．５μＬのplatium pfx DNAポリメラーゼに、蒸留水を６．１μｌ加え、全量を２０μＬとした。
二次ＰＣＲの産物から、アガロースゲル電気泳動を用いて、１２７３ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って回収した。
【００５６】
（実施例２）
実施例１で得られたＤＮＡ断片を、Gatewayクローニングシステム（インビトロジェン社製）の説明書に従って酵母発現ベクターであるYEP352 GAPIIに挿入して組換ベクターYEP352 GAPII-STP2を得た。常法に従って、このベクターを生育にウラシルを要求する酵母の株（Ｗ３００３Ａ酵母）に導入して形質転換体を得た。この様にして得た形質転換体をウラシルを含まないＳＤ培地からなる寒天プレートで培養して形質転換酵母を選別し、得られた形質転換体をウラシルを含まないＳＤ液体培地で大量培養した。尚、上記寒天プレートとＳＤ液体培地は、Current protocols in molecular biologyの記載に従い、Gibco（インビトロジェン社）のYeast-Nitrogen base（硫酸アンモニウム、アミノ酸を含まないもの）3.4g/Lに、10g/Lの硫酸アンモニウムと、40g/Lのグルコース、それにウラシル以外のアミノ酸を適量添加して作成した。更に、寒天プレートについては、10%寒天となる様に寒天を加えて固めて作製した。
【００５７】
この様に培養した形質転換体を１０ｍｍｏｌ／Ｌのアジ化ナトリウム（ＮａＮ3）を含む蒸留水で洗浄した後、約５ｇの形質転換体を５倍量の消化液（１．４ｍｏｌ／Ｌのソルビトール、５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウム、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＮ3、及び４０ｍｍｏｌ／Ｌの２−メルカプトエタノールを含むｐＨ７．５の溶液）に懸濁し、Zymolyase100T（生化学工業株式会社製）を１ｍｇ／ｇ菌体となる様に添加して、３７℃で３０分間反応させ、形質転換体の細胞壁を消化した。その後、０．８ｍｏｌ／Ｌのソルビトール溶液で２回洗浄し、１０ｍｌの消化液（０．８ｍｏｌ／Ｌのソルビトール、１０ｍｍｏｌ／Ｌのトリエタノールアミン、５μｇ／ｍＬのペプスタチンＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌのフェニルメチルスルホニルフルオライドを含むｐＨ７．２の溶液）に懸濁し、ダウンスホモジナイザーを用いて形質転換体をホモジナイズした。これを４℃、１０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収して細胞抽出液とした。
【００５８】
この細胞抽出液を４℃で１０,０００×ｇの超遠心分離を１５分間行い、沈殿を回収した。この沈殿からなる画分（Ｐ１０）は、小胞体を多く含む画分であった。
さらに、Ｐ１０を除去した上清を、４℃で１００,０００×ｇの超遠心分離を１時間行い、沈殿を回収した。この沈殿からなる画分（Ｐ１００）は、ゴルジ体を多く含む画分であった。また、Ｐ１００を除去した超遠心分離の上清をＳ１００とし、サイトゾル画分とした。
【００５９】
J. Biol. Chem. 275, 13580-13587 (2000), S. K. Roy, Y. Chiba, M. Takeuchi and Y. Jigamiを参考にして、上記で得られた各画分の活性硫酸（３'−ホスホアデノシン５'−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ））の運搬作用を測定した。つまり、２００μｇのＰ１０、Ｐ１００およびＳ１００画分各々に１００μＬの反応液（０．２５Ｍのショ糖、５ｍＭの塩化マグネシウム溶液（MgCl2溶液）、１ｍＭの塩化マンガン溶液（MnCl2溶液）、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１μＭの35Ｓ標識ＰＡＰＳを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（p H７．５、Tris-HCｌ緩衝液））を添加して反応を開始した。５分後に１０倍量の氷冷した反応停止液（０．２５Ｍのショ糖、５ｍＭのMgCl2溶液、１５０ｍＭの塩化カリウム（KCl）を含む２０ｍＭのTris-HCl緩衝液（p H7.5））を各々の画分に添加し、孔径０．４５μｍのニトロセルロースフィルターで濾過した。このフィルターを１０ｍＬの氷冷した上記反応停止液で洗浄した後、本発明タンパク質と反応した35Ｓ標識ＰＡＰＳの量を測定する為、液体シンチレーションカウンターを用いて、フィルターの35Ｓ放射能量を測定した（図１）。なお、本発明タンパク質と反応したＰＡＰＳはフィルター上に残存する。陰性対照としては、YEP352 GAPIIのみによって酵母Ｗ３００３Ａ株を形質転換した形質転換体を用いて上記と同様に調製した各画分を用いた。その結果、Ｐ１００画分に強いＰＡＰＳ運搬作用が観察された。
【００６０】
更に、強いＰＡＰＳ運搬作用が観察されたＰ１００画分について、35Ｓ標識ＰＡＰＳに代えて、3Ｈ標識ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（UDP-GlcNAc）、3Ｈ標識グアノシン二リン酸−フコース（GDP-Fuc）、3Ｈ標識ウリジン二リン酸−ガラクトース（UDP-Gal）、3Ｈ標識シチジン一リン酸−シアル酸（CMP-Sia）、3Ｈ標識ウリジン二リン酸−グルコース（UDP-Glc）、3Ｈ標識ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン（UDP-GalNAc）、3Ｈ標識グアノシン二リン酸−マンノース（GDP-Man）及び、14Ｃ標識ウリジン二リン酸−グルクロン酸（UDP-GlcA）を用い、同様に測定した。つまり、フィルターにおける各種糖ヌクレオチドの標識元素の放射能量を測定し、本発明タンパク質による上記各種糖ヌクレオチドの運搬作用を測定した（図２）。
【００６１】
その結果、本発明タンパク質はＰＡＰＳについてのみ特異的に運搬する作用を顕著に有していることが判明した。他の糖ヌクレオチドについては、本発明タンパク質により運搬されるものもあったが、何れも陰性対照の結果と有意差がなかった。
【００６２】
（実施例３）大腸癌組織における本発明ＤＮＡ発現量の変化
定量的リアルタイムＰＣＲ法を用いてヒト大腸癌組織と同一患者の健常大腸組織での本発明ＤＮＡの転写産物量を比較した。
【００６３】
ヒト大腸癌組織及び健常大腸組織のＲＮＡを、RNeasy Mini Kit（キアゲン社製）で抽出し、Super-Script First-Strand Synthesis System（インビトロジェン社製）を用いたOligo（dT）法によりsingle strand DNAとした。このDNAを鋳型とし、配列番号１１記載の塩基配列（gattaggccctgcagtaacatt）を５'プライマーとして、配列番号１２記載の塩基配列（atccagtgagggaaaaaagga）を３'プライマーとして、及び、配列番号１３記載の塩基配列（tgtgcaaagaatccagttcggaccta）をTaqManプローブとして用いてABI PRISM 7700（アプライドバイオシステム社製）により定量的リアルタイムＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ反応の条件は、９５℃、１０分で反応を行った後、９５℃１５秒、６０℃１分のサイクルを４０回繰り返して行った。内部標準としてβ−アクチン遺伝子(-Actを用い、β-アクチン遺伝子の転写産物の発現量に対するＳＴＰ２遺伝子の転写産物の発現量の比を算出して対比した。（表１、図３）
【００６４】
【表１】
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【００６５】
表１および図３の結果より、STP2遺伝子の転写産物の発現の測定値自体については、健常組織より癌化組織において上昇している試料と逆に減少している試料と両方あったが、β-アクチン遺伝子の転写産物の測定値でSTP2遺伝子の転写産物の測定値を補正した比（STP2遺伝子転写産物の測定値／β-アクチン遺伝子転写産物の測定値）は、一様に癌化組織では健常組織と比べて減少していることが判明した。よって、STP2遺伝子転写産物の測定値／β-アクチン遺伝子転写産物の測定値の比が減少している組織は、癌化している可能性が高いと関連づけることが出来ることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】実施例２で得られたＰ１００画分における、35Ｓ標識３'−ホスホアデノシン５'−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）の運搬作用を示す。白いバーは陰性対照の結果を示し、縦軸はＰ１００画分１ｍｇ当たりの５分間の放射能の取り込み量を示す。
【図２】強いＰＡＰＳ運搬作用が確認されたＰ１００画分における、3Ｈ標識ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（UDP-GlcNAc）、3Ｈ標識グアノシン二リン酸−フコース（GDP-Fuc）、3Ｈ標識ウリジン二リン酸−ガラクトース（UDP-Gal）、3Ｈ標識シチジン一リン酸−シアル酸（CMP-Sia）、3Ｈ標識ウリジン二リン酸−グルコース（UDP-Glc）、3Ｈ標識ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン（UDP-GalNAc）、3Ｈ標識グアノシン二リン酸−マンノース（GDP-Man）及び14Ｃ標識ウリジン二リン酸−グルクロン酸（UDP-GlcA）を運搬する作用を示す。白いバーは陰性対照の結果を示し、縦軸はＰ１００画分１ｍｇ当たりの５分間の放射能の取り込み量を示す。
【図３】同一患者の大腸癌組織と健常組織でのＳＴＰ２遺伝子の転写産物の発現量を示す。白抜きバーは健常組織での発現量を、黒色バーは大腸癌組織での発現量を示し、縦軸は、内部標準として用いたβ-アクチン遺伝子の転写産物の発現量に対するＳＴＰ２遺伝子の転写産物の発現量の相対値を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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