(57)【要約】  【課題】カベオリンを簡単にかつ短時間に測定することができるカベオリン測定システムを提供すること。  【解決手段】カベオリン測定システムは、カベオリンのＮ末端を含む部分ポリペプチド（カベオリン変異体）と、グルタチオンーＳートランスフェラーゼなどの融合タンパク質との結合体を宿主に大量に発現させて、分離精製し、得られた生成カベオリン変異体−融合タンパク質結合体を用いてＥＬＩＳＡ競合法によってカベオリンを簡単にかつ短時間に検出することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カベオリン変異体と融合タンパク質とが結合したキメラ蛋白であることを特徴とするカベオリン−融合タンパク質結合体。
【請求項２】
請求項１に記載のカベオリン−融合タンパク質結合体において、前記カベオリン変異体が、カベオリン−１の全アミノ酸配列（配列番号1）中、Ｎ末端から１０１番目までのアミノ酸からなる水溶性ポリペプチド（Ｃａｖ-Ｎ１０１）またはＮ末端から始まるその断片ポリペプチド（Ｃａｖ-Ｎ１０１(１〜１０１)）であることを特徴とするカベオリン−融合タンパク質結合体。
【請求項３】
請求項１または２に記載のカベオリン−融合タンパク質結合体において、前記カベオリン変異体が、Ｎ末端から６０番目までのアミノ酸からなるオリゴマーを形成しない水溶性ポリペプチド（Ｃａｖ-Ｎ６０）またはＮ末端から始まるその断片ポリペプチド（Ｃａｖ-Ｎ６０(１〜６０)）であることを特徴とするカベオリン−融合タンパク質結合体。
【請求項４】
請求項１に記載のカベオリン−融合タンパク質結合体において、前記カベオリン変異体が、カベオリン-２の全アミノ酸配列（配列番号２）中、Ｎ末端から８６番目までのアミノ酸からなる水溶性ポリペプチド（Ｃａｖ-２Ｎ８６）またはＮ末端から始まるその断片ポリペプチド（Ｃａｖ-２Ｎ８６(１〜８６)）であることを特徴とするカベオリン−融合タンパク質結合体。
【請求項５】
請求項１または４に記載のカベオリン−融合タンパク質結合体において、前記カベオリン変異体が、Ｎ末端から４６番目までのアミノ酸からなるオリゴマーを形成しない水溶性ポリペプチド（Ｃａｖ-２Ｎ４６）またはＮ末端から始まるその断片ポリペプチド（Ｃａｖ-２Ｎ４６(１〜４６)）であることを特徴とするカベオリン−融合タンパク質結合体。
【請求項６】
請求項１に記載のカベオリン−融合タンパク質結合体において、前記カベオリン変異体が、カベオリン-３の全アミノ酸配列（配列番号３）中、Ｎ末端から７４番目までのアミノ酸からなる水溶性ポリペプチド（Ｃａｖ-３Ｎ７４）またはＮ末端から始まるその断片ポリペプチド（Ｃａｖ-３Ｎ７４(１〜７４)）であることを特徴とするカベオリン−融合タンパク質結合体。
【請求項７】
請求項１または６に記載のカベオリン−融合タンパク質結合体において、前記カベオリン変異体が、Ｎ末端から３３番目までのアミノ酸からなるオリゴマーを形成しない水溶性ポリペプチド（Ｃａｖ-３Ｎ３３）またはＮ末端から始まるその断片ポリペプチド（Ｃａｖ-３Ｎ３３(１〜３３)）であることを特徴とするカベオリン−融合タンパク質結合体。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載のカベオリン−融合タンパク質結合体において、前記カベオリン変異体が前記融合タンパク質のＣ末端側またはＮ末端側に融合していることを特徴とするカベオリン−融合タンパク質結合体。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載のカベオリン−融合タンパク質結合体において、前記融合タンパク質がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジン−タグ、マルトース結合タンパク（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグまたは緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）などであることを特徴とするカベオリン−融合タンパク質結合体。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載のカベオリン−融合タンパク質結合体において、前記融合タンパク質がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）であることを特徴とするカベオリン−融合タンパク質結合体。
【請求項１１】
請求項１に記載のカベオリン変異体をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組換えベクターにおいて、前記カベオリン変異体が、請求項２に記載の水溶性ポリペプチド（Ｃａｖ-Ｎ１０１）もしくはその断片ポリペプチド（Ｃａｖ-Ｎ１０１(１〜１０１)）または請求項３に記載の水溶性ポリペプチド（Ｃａｖ-Ｎ６０）もしくはその断片ポリペプチド（Ｃａｖ-Ｎ６０(１〜６０)）（配列番号４）であることを特徴とする組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の組換えベクターにおいて、前記カベオリン変異体が、請求項４に記載の水溶性ポリペプチド（Ｃａｖ-２Ｎ８６）もしくはその断片ポリペプチド（Ｃａｖ-２Ｎ８６(１〜８６)）または請求項５に記載の水溶性ポリペプチド（Ｃａｖ-２Ｎ４６）もしくはその断片ポリペプチド（Ｃａｖ-２Ｎ４６(１〜４６)）（配列番号５）であることを特徴とする組換えベクター。
【請求項１４】
請求項１１に記載の組換えベクターにおいて、前記カベオリン変異体が、請求項６に記載の水溶性ポリペプチド（Ｃａｖ-３Ｎ７４）もしくはその断片ポリペプチド（Ｃａｖ-３Ｎ７４(１〜７４)）または請求項７に記載の水溶性ポリペプチド（Ｃａｖ-３Ｎ３３）またはその断片ポリペプチド（Ｃａｖ-３Ｎ３３(１〜３３)）（配列番号６）であることを特徴とする組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１１ないし１５のいずれか１項に記載の組換えベクターにおいて、融合タンパク質をコードする塩基配列を更に含んでいることを特徴とする組換えベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組換えベクターにおいて、前記融合タンパク質がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジン−タグ、マルトース結合タンパク（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグまたは緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）などであることを特徴とする組換えベクター。
【請求項１７】
請求項１１ないし１６のいずれか１項に記載の組換えベクターで形質転換されることを特徴とする形質転換体。
【請求項１８】
請求項１７に記載の形質転換体から請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のカベオリン−融合タンパク質結合体を得ることを特徴とするカベオリン−融合タンパク質結合体の製造方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載のカベオリン−融合タンパク質結合体の製造方法によって得られたカベオリン−融合タンパク質結合体を精製することを特徴とするカベオリン−融合タンパク質結合体の精製方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載のカベオリン−融合タンパク質結合体の精製方法によって精製したカベオリン−融合タンパク質結合体を切断してカベオリン変異体を得ることを特徴とするカベオリン変異体の製造方法。
【請求項２１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のカベオリン−融合タンパク質結合体と、抗カベオリン抗体との組み合わせることによりカベオリンをＥＬＩＳＡ法によって測定することを特徴とするカベオリン測定方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載のカベオリン測定方法において、前記カベオリンがカベオリン−１、カベオリン−２またはカベオリン−３であることを特徴とするカベオリン測定方法。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載のカベオリン測定方法において、前記抗カベオリン抗体が抗カベオリンポリクローナル抗体または抗カベオリンモノクローナル抗体であることを特徴とするカベオリン測定方法。
【請求項２４】
請求項２１ないし２３のいずれか１項に記載のカベオリン測定方法において、前記カベオリン−融合タンパク質結合体が請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のカベオリン−融合タンパク質結合体であることを特徴とするカベオリン測定方法。
【請求項２５】
請求項２１ないし２４のいずれか１項に記載のカベオリン測定方法において、前記融合タンパク質がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジン−タグ、マルトース結合タンパク（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグまたは緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）などであることを特徴とするカベオリン測定方法。
【請求項２６】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のカベオリン−融合タンパク質結合体と、抗カベオリン抗体と、からなることを特徴とするカベオリン測定キット。
【請求項２７】
請求項２６に記載のカベオリン測定キットにおいて、抗融合タンパク質モノクローナル抗体あるいは抗融合タンパク質ポリクローナル抗体と、標識抗体とが更に含まれていることを特徴とするカベオリン測定キット。
【請求項２８】
請求項２６または２７に記載のカベオリン測定キットにおいて、標識抗体の検出基質が更に含まれていることを特徴とするカベオリン測定キット。
【請求項２９】
請求項２６ないし２８のいずれか１項に記載のカベオリン測定キットを使用してカベオリンを測定することを特徴とするカベオリン測定方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載のカベオリン測定方法において、前記カベオリンがカベオリン−１、カベオリン−２またはカベオリン−３であることを特徴とするカベオリン測定方法。
【請求項３１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のカベオリン−融合タンパク質結合体と、抗カベオリン抗体との組み合わせることによりカベオリンをＥＬＩＳＡ法によって測定することを特徴とするカベオリンの疾病診断方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載のカベオリンの疾病診断方法において、請求項２１ないし２５のいずれか１項に記載または請求項２９または３０に記載のカベオリン測定方法を使用してカベオリン関与疾病を診断することを特徴とするカベオリンの疾病診断方法。
【請求項３３】
請求項３１または３２に記載のことを特徴とするカベオリンの疾病診断方法において、前記カベオリンがカベオリン−１、カベオリン−２またはカベオリン−３であることを特徴とするカベオリンの疾病診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、カベオリン抗原とその用途に関するものである。更に詳細には、この発明は、カベオリン−融合タンパク質結合体、カベオリン変異体ＤＮＡを含む組換えベクター、その形質転換体、その形質転換体からのカベオリン−融合タンパク質結合体の製造方法ならびに精製方法、カベオリン変異体を用いたカベオリン測定方法およびそれを用いたカベオリンの疾患診断法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カベオリンは、細胞表面の小さな陥没であるカベオラの最も重要な構造タンパク質である。これまでに、３つの遺伝子でコードされるカベオリン−１、カベオリン−２およびカベオリン−３が同定されている（非特許文献１、２、３）。このうち、カベオリン−１およびカベオリン−２は多くの細胞に存在するが、カベオリン−３の発現は骨格筋、心筋などに限られる。これらの３分子とも分子量は２０kDa前後で、Ｎ、Ｃ末端は親水性が高く、中央部のややＣ末端側に疎水性部分がある（非特許文献４）。
【０００３】
カベオリンは、カベオラの形成に必須であるが、近年様々な機能を有することが提唱されてきている。１つは、カベオリンは、コレステロール結合能が高く（非特許文献５）、小胞体（ER）で新規に合成されたコレステロールをゴルジ体を介さず直接細胞膜へ輸送するというコレステロール輸送能、また、カベオリンにはScaffolding domainが存在し(非特許文献６)、この部位を介して様々な分子と結合し、その機能を調節するという情報伝達調節機能も知られている。前者は、コレステロール代謝、後者は細胞増殖等の細胞機能に密接に関わるものとされているが、生理的意義については不明な点も多い。
【０００４】
従来、カベオリンは、膜タンパク質として知られてきたが、カベオリンが可溶化型カベオリンとして細胞質にも存在すること、さらには、ＨＤＬ様粒子に含まれた状態で細胞外に分泌されることが示された(非特許文献７)。カベオリンの分泌は様々な細胞で報告されている(非特許文献７、８)。また膵外分泌細胞では、セクレチン、コレシストキニンなどのホルモンにより、その分泌が促進されることも報告されている。さらに、ヒト前立腺癌細胞において、カベオリン−１の発現が増加すると共に血中への分泌が高められていることが報告された(非特許文献９)。前立腺癌患者の可溶化型カベオリンの血中レベルは、健常者と比し高く、カベオリン−１がヒト前立腺癌の兆候マーカーになり得ることが報告されている(非特許文献１０)。分泌されたカベオリンが、autocrine/paracrine因子として働きアンドロゲン非感受性前立腺癌の転移に寄与しているとの報告もある(非特許文献８)。
【０００５】
カベオリンの詳細なメカニズムは未だ不明な点が多いが、このような機能を有するカベオリンを血中から検出することは、各種がんばかりではなく、高コレステロール血症が深く関与する動脈硬化や冠動脈疾患の診断、病態把握、予後診断などに有用である。これまでカベオリンの検出は、ウェスタンブロットによってのみ行われていた。しかしながら、この方法は、サンプル調製を含めると、１５時間から３０時間を要するという欠点を有する。
【０００６】
カベオリンのうち、カベオリン−１は、１７８個のアミノ酸からなるタンパク質で、１０２−１３４番目の部位が疎水性の膜挿入部位を形成している、いわゆる膜タンパク質であるところから、疎水性部分を含む全長鎖カベオリン−１の精製は困難である。一方、カベオリン−１の１−１０１番目のＮ末端の親水性領域においても、その６１−１０１番目は、Ｎ末端オリゴマー形成部位であり、この領域を含むと、オリゴマーが形成され、ネイティブ条件下でのカベオリン−１の精製は難しくなる。
【０００７】
カベオリン−２は、１６２個のアミノ酸からなっており、８７−１１９番目の部位が疎水性の膜挿入部位を形成しているので、疎水性部分を含む全長鎖カベオリン−２の精製も困難である。また、カベオリン−２の１−８６番目のＮ末端の親水性領域においても、その４７−８６番目は、Ｎ末端オリゴマー形成部位であり、この領域を含むと、オリゴマーが形成され、ネイティブ条件下での精製が難しくなる。
【０００８】
同様に、カベオリン−３は、１５１個のアミノ酸からなっており、７５−１０７番目の部位が疎水性の膜挿入部位を形成しているので、疎水性部分を含む全長鎖カベオリン−３の精製は困難である。また、カベオリン−３の１−７４番目のＮ末端の親水性領域においても、その３４−７４番目は、Ｎ末端オリゴマー形成部位であり、この領域を含むと、オリゴマーが形成され、ネイティブ条件下での精製が難しくなる。
なお、参考までに、ヒトにおけるカベオリン−１、カベオリン−２およびカベオリン−３の１次構造とアイソフォーム間の相同性を示すアミノ酸配列の比較を示す（図１）。
上記したように、カベオリン−１、カベオリン−２およびカベオリン−３からなるカベオリンファミリーは、いずれもその全長鎖をネイティブ条件下で精製するのは困難である。
【非特許文献１】Rothberg, K. G., Heuser, J. E., Donzell, W. C., Ying, Y. S., Glenney, J. R. and Anderson, R. G. W. (1992) Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell, 68, 673-682
【非特許文献２】Scherer, P. E., Okamoto, T., Chun, M., Nishimoto, I., Lodish, H. F. and Lisanti, M. P. (1996) Identification, sequence, and expression of caveolin-2 defines a caveolin gene family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 131-135
【非特許文献３】Tang, Z., Scherer, P. E., Okamoto, T., Song, K., Chu, C., Kohtz, D. S., Nishimoto, I., Lodish, H. F. and Lisanti, M. P. (1996) Molecular cloning of caveolin-3, a novel member of the caveolin gene family expressed predominantly in muscle. J. Biol. Chem., 271, 2255-2261
【非特許文献４】Dietzen, D. J. and Hastings, W. R. (1995) Caveolin is palmitoylated on multiple cysteine residues. J. Biol. Chem., 270, 6838-6842
【非特許文献５】Murata, M., Peranen, J., Schreiner, R., Wieland, F., Kurzchalia, T. V. and Simons,  K. (1995) VIP21/caveolin is a cholesterol-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 10339-10343
【非特許文献６】Fielding, C. J. and Fielding, P. E. (1997) Intracellular cholesterol transport. J. Biol. Chem., 272, 6525-6533
【非特許文献７】Lie, P., Li, W., Machleidt, T. and Anderson, R. G. W. (1999) Identification of caveolin-1 in lipoprotein particles secreted by exocrine cells. Nat. Cell Biol., 1, 369-375
【非特許文献８】Tahir, S. A., Yang, G., Ebara, S., Timme, T. L., Satoh, T., Li L., Goltsov, A., Ittmann, M., Morrisett, J. D. and Thompson, T. C. (2001) Secreted caveolin-1 stimulates cell survival/clonal growth and contributes to metastasis in androgen-insensitive prostate cancer. Cancer Res., 61, 3882-3885
【非特許文献９】Yang, G., Truong, L. D., Timme, T. L., Ren, C., Wheeler, T. M., Park, S. H., Nasu,  Y., Bangma, C. H., Kattan, M. W., Scardino, P. T. and Thompson, T. C. (1998) Elevated expression of caveolin-1 is associated with prostate and breast cancer. Clin. Cancer Res., 4, 1873-1880
【非特許文献１０】Yang, G., Truong, L. D., Wheeler, T. M. and Thompson, T.  C. (1999) Caveolin-1 expression in clinically confined human prostate cancer: A novel prognostic marker. Cancer Res., 59, 5719-5723
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者等は、このカベオリンファミリーのＮ末端部分は、親水性であると共に１次構造が異なっており、この部位が特異性に関与していること、また各種の抗カベオリン抗体がＮ末端を認識することを利用して、そのＮ末端のみを含む各種カベオリン変異体を考案し、全体として疎水性でオリゴマーを形成しやすく、精製が困難なカベオリンの精製を容易にすることを試みた。そこで、カベオリン測定系を開発するために、カベオリンの特定領域を大腸菌で発現させ、精製し、トレーサーとして用いることを検討した。
その結果、カベオリン変異体は、キメラ蛋白として大腸菌内で大量に発現させ、容易に高純度に精製することが可能であること、更にカベオリン蛋白を容易にかつ大量に精製できることを見出して、この発明を完成させた。
【００１０】
したがって、この発明は、その１つの態様として、ガン診断マーカーなどとして有用なカベオリンを測定するのに有用でかつカベオリンの部分アミノ酸配列からなるカベオリン変異体と融合タンパク質とが結合したカベオリン−融合タンパク質結合体をキメラ蛋白として提供することを目的としている。
【００１１】
この発明は、その好ましい態様として、カベオリン−融合タンパク質結合体の一方の構成員として、カベオリン−１、カベオリン−２またはカベオリン−３からの部分アミノ酸配列からなるカベオリン変異体が含まれていると共に、その他方の構成員として、後述する融合タンパク質が含まれているカベオリン−融合タンパク質結合体を提供することを目的としている。
【００１２】
更に、この発明は、その別の態様として、カベオリン−融合タンパク質結合体からなるキメラ蛋白を産生するために有用な組換えベクターを提供することを目的としている。
この発明はまた、その別の態様として、かかる組換えベクターで形質転換された形質転換体するとともに、かかる形質転換体からカベオリン−融合タンパク質結合体を得ることからなるカベオリン−融合タンパク質結合体の製造方法を提供することを目的としている。
【００１３】
この発明は、その更に別の態様として、得られたカベオリン−融合タンパク質結合体を精製すると共に、その精製したカベオリン−融合タンパク質結合体を切断して、そのカベオリン−融合タンパク質結合体を構成するカベオリン変異体をすることからなるカベオリン変異体の製造方法を提供することを目的としている。
【００１４】
この発明は、その更に別の態様として、カベオリン−融合タンパク質結合体を用いることによって、カベオリンを測定することができるカベオリン測定方法を提供することを目的としている。
【００１５】
この発明は、その更に別の態様として、カベオリン−融合タンパク質結合体を用いてカベオリンを測定することができるカベオリン測定システムもしくはキットを提供することを目的としている。
【００１６】
この発明はまた、その更に別の態様として、カベオリン測定方法またはカベオリン測定システムもしくはキットを利用した疾病診断方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記目的を達成するために、この発明は、ガン診断マーカーなどとして有用なカベオリンを測定するのに有用でかつカベオリンの部分アミノ酸配列からなるカベオリン変異体と融合タンパク質とが結合したカベオリン−融合タンパク質結合体を提供する。
【００１８】
また、この発明は、好ましい態様として、上記カベオリンの部分アミノ酸配列からなるカベオリン変異体と、融合タンパク質との結合体であるキメラ蛋白を提供する。
【００１９】
なお、この発明において使用する「カベオリン」という用語は、特段の定めある場合もしくはその意味が明白な場合を除き、カベオリン−１（配列番号１）、カベオリン−２（配列番号２）およびカベオリン−３（配列番号３）からなるカベオリンファミリーを総括してまたは個別に意味するものとする。
また、この発明において使用する「カベオリン変異体」という用語は、上記カベオリンの部分アミノ酸配列を意味するものであり、特にカベオリンのＮ末端側親水性領域だけを含むが、全体として疎水性のオリゴマーを形成することができる部分アミノ酸配列を指称する。
【００２０】
この発明は、上記カベオリン−融合タンパク質結合体を宿主において発現させるために、カベオリン−融合タンパク質結合体をそれぞれコードする塩基配列を有する組換えベクターを提供するとともに、この組換えベクターで形質転換した形質転換体を提供する。また、この発明は、上記形質転換体からカベオリン−融合タンパク質結合体を製造する方法を提供する。
【００２１】
更にまた、この発明は、上記カベオリン−融合タンパク質結合体を精製する精製方法を提供すると共に、上記精製カベオリン−融合タンパク質結合体から融合タンパク質を切断してカベオリンを得ることからなるカベオリン製造方法を提供する。
【００２２】
また、この発明は、上記カベオリン−融合タンパク質結合体を用いることによって、カベオリンを測定することができるカベオリン測定方法を提供するとともに、カベオリン測定方法に使用することができるカベオリン測定システムもしくはキットを提供すると共に、その測定システムもしくはキットを使用したカベオリン測定方法を提供する。
【００２３】
更に、この発明は、上記カベオリン測定方法またはカベオリン測定システムもしくはキットを利用した疾病診断方法を提供する。
【発明の効果】
【００２４】
この発明に係るカベオリン測定方法によれば、組織中や細胞中に含まれるカベオリン濃度の測定を、従来のウェスタンブロット法に比べて非常に簡便で、短時間にかつ定量的に行うことが可能である。
また、この発明に係るカベオリン測定方法によって血中に分泌されるカベオリンを測定することにより、前立腺がんや乳がんなど各種がんの診断、病態把握、予後診断に応用することが可能である。更に、カベオリンは、コレステロール結合活性を有することから、高コレステロール血症が深く関与する動脈硬化や冠動脈疾患の診断、病態把握、予後診断などにも利用可能である。
したがって、この発明に係る疾病診断方法は、従来の診断方法に比べて、極めて短時間にカベオリンを検出することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
この発明は、血中に分泌されるカベオリンを簡便にかつ短時間に測定することができるカベオリン測定システムを構築することを目的としている。
この発明においては、カベオリン測定システムを構築するためのカベオリン−融合タンパク質結合体がキメラ蛋白として提供される。
【００２６】
このためには、まず、カベオリンファミリーを構成するカベオリン−１、カベオリン−２ならびに／もしくはカベオリン−３のＮ末端側の所定部位のアミノ酸からなるポリペプチドもしくはその断片ペプチドがカベオリン変異体として作製される。かかるカベオリン変異体を作製するに際しては、これらのポリペプチドが、カベオリンのＮ末端側の親水性領域にありかつオリゴマー形成領域内にはないこと、またトレーサーとして各カベオリンを全体としてもしくは実質的に全体として特異的に検出することができるように作製するのがよい。
【００２７】
上記のようにして、例えば、次のようなカベオリン変異体を作製することができる。
つまり、そのカベオリン変異体の１つの態様としては、カベオリン−１の全アミノ酸配列（配列番号１）のＮ末端から１０１番目までのアミノ酸からなる水溶性ポリペプチド（Ｃａｖ-Ｎ１０１）（配列番号４）および／またはＮ末端から始まるその断片ポリペプチド [Ｃａｖ-Ｎ１０１(１〜１０１）]と、最適なポリペプチドとして、Ｃａｖ-Ｎ１０１のＮ末端から６０番目までのアミノ酸からなるオリゴマーを形成しない水溶性ポリペプチド（Ｃａｖ-Ｎ６０）および／またはＮ末端から始まるその断片ポリペプチド [Ｃａｖ-Ｎ６０(１〜６０）] などが挙げられる。
【００２８】
カベオリン変異体の別の態様としては、カベオリン−２の全アミノ酸配列（配列番号２）のＮ末端から８６番目までのアミノ酸からなる水溶性ポリペプチド（Ｃａｖ-２Ｎ８６）（配列番号５）および／またはＮ末端から始まるその断片ポリペプチド[Ｃａｖ-２Ｎ８６(１〜８６）]と、最適なポリペプチドとして、Ｃａｖ-２Ｎ８６のＮ末端から４６番目までのアミノ酸からなるオリゴマーを形成しない水溶性ポリペプチド(Ｃａｖ-２Ｎ４６)および／またはＮ末端から始まるその断片ポリペプチド[Ｃａｖ-２Ｎ４６(１〜４６）]が挙げられる。
【００２９】
同様に、カベオリン変異体の更に別の態様として、カベオリン−３の全アミノ酸配列（配列番号３）のＮ末端から７４番目までのアミノ酸からなる水溶性ポリペプチド（Ｃａｖ-３Ｎ７４）（配列番号６）および／またはＮ末端から始まるその断片ポリペプチド[Ｃａｖ-３Ｎ７４(１〜７４）]と、最適なポリペプチドとして、Ｃａｖ-３Ｎ７４のＮ末端から３３番目までのアミノ酸からなるオリゴマーを形成しない水溶性ポリペプチド(Ｃａｖ-３Ｎ３３)および／またはＮ末端から始まるその断片ポリペプチド[Ｃａｖ-３Ｎ３３(１〜３３）]が挙げられる。
【００３０】
また、カベオリン−１、カベオリン−２およびカベオリン−３は、Ｎ末端の長さが違うほか、４７−６０番目の領域については３つのアイソフォーム間で非常に高い相同性があるが、それよりＮ末端側では１次構造が全く異なる。このことを利用して、例えば、Ｃａｖ-Ｎ４６を作成することにより、カベオリン−１のみをさらに特異的に検出する測定系を開発できる。さらに、カベオリン−２やカベオリン−３についても、同様に、Ｎ末端の特異的領域（カベオリン−２にあっては、１−３１、カベオリン−３にあっては１−１９）をトレーサーとすることにより特異的な検出系を作成することが可能である。
【００３１】
更に、この発明は、上記カベオリン−融合タンパク質結合体を構成する他方の構成員である融合タンパク質としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジン−タグ、マルトース結合タンパク（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグまたは緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）などが挙げられるが、好ましくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である。
【００３２】
なお、上記融合タンパク質のうち、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）としては、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）由来のもの；ヒスチジン−タグとしては、通常アミノ酸であるヒスチジンが６個程度つなげたもの；Ｓ−タグとしては、ウシのＲＮＡ分解酵素に由来（１−２０番目のアミノ酸に相当）のもの；Ｍｙｃ−タグとしては、例えば、ヒトのｃ−Ｍｙｃに由来（４１０−４１９番目のアミノ酸に相当）のもの；ＦＬＡＧ−タグとしては、バクテリオファージＴ７のｇｅｎｅ１０遺伝子の産物に由来するもの；緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）としては、オワンクラゲ由来の緑色蛍光を発光するタンパク質などを使用することができる。なお、これらのタンパク質もしくはペプチドをコードする遺伝子を組み込んだプラスミドベクターは、市販されていて入手することができるので、この発明の目的遺伝子であるカベオリンｃＤＮＡはこのプラスミドベクターに挿入することができる。
【００３３】
上記のような構成からなるカベオリン−融合タンパク質結合体を作製するために、まず、上記のようなカベオリン変異体がカベオリンから作製される。使用するカベオリンにしては、例えば、ヒト、マウスなどの動物の種々の細胞や組織由来のものを使用することができる。かかるカベオリンからカベオリン変異体は、種々の既知方法を使用して作製することができ、例えば、それ自体公知のＤＮＡクローニング法、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法などによるスクリーニング法などを使用して作製することができる。
【００３４】
上記のようにして得られたカベオリン変異体は、発現ベクターに組み込まれるが、カベオリン−融合タンパク質結合体からなるキメラ蛋白として発現させるためには、この融合タンパク質をコードする塩基配列と共に同一ベクターに組み込むようにする。かかるカベオリン変異体をベクターに組み込む場合、例えば、この融合タンパク質もしくはペプチドをコードする遺伝子を組込んだ市販プラスミドベクターにカベオリン変異体を挿入することが便利である。また、カベオリン変異体を組み込む場合、このカベオリン変異体が融合タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側のいずれにも結合するように調製することもできる。なお、カベオリン変異体をベクターに組み込むには、それ自体公知の方法に従って行なうことができる。
【００３５】
この発明において、使用できるベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルス、バクテリオファージなどのベクターが挙げられる。
【００３６】
上記のようにして作製した発現ベクターは、カベオリン−融合タンパク質結合体を発現させるために、例えば、リン酸カルシウム法やエレクトロポーレーションなどの自体公知の方法で宿主に導入することができる。使用できる宿主としては、例えば、大腸菌、バチルス菌などの細菌、酵母、動物細胞などを用いることができる。かかる宿主の具体例はいずれも文献に記載されているものから選択することができる。
【００３７】
このように発現ベクターを導入した宿主はそれ自体公知の方法によって形質転換されて、形質転換体が得られる。次に、この形質転換体は、この発明のカベオリン−融合タンパク質結合体をコードするＤＮＡが発現可能な条件下で適切な培地を用いて培養し、かかるカベオリン−融合タンパク質結合体を菌体内もしくは細胞内に生成・蓄積する。培養は、必要に応じて、通気培養、攪拌培養など慣用されている方法に従って行なうことができる。培地にしても、培養する形質転換体の生育に必要な各種の栄養源をその生育が促進するように適切に含有するようにその組成を調製するのがよい。培養条件は、使用する宿主や発現ベクターの種類などによって変えるのがよく、一般的には、培養温度は約１５℃〜４０℃の範囲、培養時間は約３時間から５日間の範囲に設定することができる。また、培地のｐＨにしても、約５〜８の範囲に設定することができる。
【００３８】
上記のようにして培養して得られた培養物からこの発明のペプチドは分離精製される。その分離精製方法としては、当該技術分野で慣用されている分離精製方法であればいずれも使用するができる。この発明のペプチドは、培養終了後、それ自体公知の方法に従って、培養液から培養菌体もしくは細胞を分離し、その分離菌体もしくは細胞を破壊して菌体外もしくは細胞外に抽出される。つまり、この発明のペプチドは、例えば、培養液に、尿素、塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤やトリトン（TM）などの界面活性剤などを含む緩衝液を添加して培養菌体もしくは細胞を懸濁し、超音波、リゾチームなどによりその菌体もしくは細胞を遠心分離などの慣用方法で破壊した後、遠心分離、ろ過などの手段によって抽出することができる。
【００３９】
一方、この発明に係るカベオリン−融合タンパク質結合体からなるキメラ蛋白としてのペプチドが菌体外もしくは細胞外に分泌される場合には、例えば、培養終了後、培養液から菌体もしくは細胞を遠心分離、ろ過などの手段によって除去し、得られた上清やろ液から上記ペプチドを分離精製することができる。使用できる分離精製法としては、例えば、塩析法、溶媒沈殿法、透析法、限界ろ過法、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテイ−クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの慣用方法が使用することができる。
上記のようにして精製したカベオリン−融合タンパク質結合体は、この発明のカベオリン測定システムに使用することができる。
【００４０】
ここで、従来のウェスタンブロットに代わる簡便で定量性の高いこの発明の内因性カベオリン検出システムについて、図２を参照して簡単に説明する。
この発明に係るカベオリン測定システムの基本原理は、ＥＬＩＳＡ(enzyme-linked immumosorbent assay)・競合法である。
このＥＬＩＳＡ競合法は、カベオリン抗体に対して、測定対象物中のカベオリンと一定量のカベオリン−融合タンパク質結合体を競合的に結合させ、これにビオチン化融合タンパク質抗体を反応させ、ビオチン−ストレプトアビジン法で検出することからなっている。
より具体的に説明すると、マイクロプレートに抗カベオリン−１ポリクローナル抗体を固相化する。次に、カベオリン−融合タンパク質結合体をトレーサーとして混合したサンプルを分注する。抗カベオリン−１ポリクローナル抗体との結合をカベオリン−融合タンパク質結合体とカベオリン変異体で競合させ、ビオチン化融合タンパク質抗体をカベオリン−融合タンパク質結合体と結合させる。さらに、このカベオリン変異体にペルオキシダ−ゼ標識ストレプトアビジンを結合させた後、基質を加え発色させる。サンプル中のカベオリンが固相化抗体に反応する場合、カベオリン−融合タンパク質結合体の抗体への結合が競合的に阻害され、検出される酵素活性が減少する。
このようにして、この発明のカベオリン検出システムを使用すると、約４時間から５時間でカベオリンを検出完了することが可能である。
【００４１】
なお、この発明のカベオリン測定システムにおいてカベオリン−融合タンパク質結合体に対して競合的に使用されるカベオリン標準品は、上記のように精製されたカベオリン−融合タンパク質結合体を、プロテアーゼなどの適切な薬剤でカベオリン変異体と融合タンパク質とを切断して分離することによって得ることができる。
【００４２】
この発明に利用されるＥＬＩＳＡ競合法を用いてカベオリン標準曲線を作成することができる          。このカベオリン標準曲線を利用すれば、カベオリンを定量的に検出することができる。
その方法は、まず、精製カベオリン標準品を所定濃度に希釈し、上記ＥＬＩＳＡ競合法によりカベオリンの濃度を測定する。つまり、カベオリンの濃度は、カベオリン変異体と競合させていない精製融合タンパク質−カベオリン変異体の発光強度を１００％とし、縦軸に発光強度の百分率を、横軸にカベオリン変異体量をモル数を対数で示すことによって表すことができる。その結果、約０．０１pmolから１０pmolの範囲で有効な検量線を得た（図３）。
【００４３】
以下に、カベオリン変異体として水溶性ペプチドＣａｖ-Ｎ６０を、また融合タンパク質としてはＧＳＴを利用した場合について説明する。ただし、以下の説明は、この発明を一切限定して解釈されるものではなく、この発明をより具体的に説明するためだけに単に例示的に記載されているものと留意すべきである。
【００４４】
カベオリン測定系を開発するために、ヒトカベオリン−１の１−６０番目の領域（Ｃａｖ-Ｎ６０）を大腸菌で発現させ、精製し、トレーサーとして用いる。具体的には、Ｃａｖ-Ｎ６０をpGEX-6P-3ベクターに組み込み、大腸菌ＢＬ２１内に大量に発現させ、グルタチオン・セファロース４ＢカラムにてＧＳＴ−Ｃａｖ-Ｎ６０を精製する。また、検出システムにおけるカベオリン標準物質となるＣａｖ-Ｎ６０は、ＧＳＴ−Ｃａｖ-Ｎ６０をPreScissionプロテアーゼを用いて切断することにより得ることができる。
【００４５】
その結果、Ｃａｖ-Ｎ６０は、ＧＳＴとのキメラ蛋白（カベオリン−融合タンパク質結合体）として大腸菌内で大量に発現させることが可能であり、グルタチオン・セファロース４Ｂカラムを用いることで容易に高純度に精製できることが分かった。また、PreScissionプロテアーゼによりＣａｖ-Ｎ６０のみを精製することも容易に行うことができる。したがって、この発明に係る方法により、容易にかつ大量にカベオリン蛋白を精製できる。
【００４６】
なお、この発明のカベオリン測定システムに使用できる抗カベオリン−ウサギポリクローナル抗体は、ヒトカベオリン−１の１−９７番目の領域を用いて作成されたものであり、カベオリン−１、カベオリン−２およびカベオリン−３のいずれも認識することが可能であり、この領域に含まれるＣａｖ-Ｎ６０を認識することができる。また、Ｃａｖ-Ｎ６０部位は、用いた抗カベオリンポリクローナル抗体の抗原部位でもあり、この発明方法のＥＬＩＳＡ競合法に適したものと考えられる。
【００４７】
次に、この発明のカベオリン測定キットについて概説する。
この発明に係るカベオリン測定キットは、一般的には、この発明のカベオリン−融合タンパク質結合体と、抗カベオリン抗体と、抗融合タンパク質抗体と、標識抗体と、基質と、からなっているのがよい。抗カベオリン抗体としては、抗カベオリンポリクローナル抗体あるいは抗カベオリンモノクローナル抗体が使用でき、また抗融合タンパク質抗体としては、抗融合タンパク質モノクローナル抗体あるいは抗融合タンパク質ポリクローナル抗体が使用できる。また、標識抗体としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体、アルカリフォスファターゼ標識抗ＩｇＧ抗体などの酵素標識抗体、蛍光標識抗ＩｇＧ抗体、放射性同位元素標識抗ＩｇＧ抗体などができる。更に、この標識抗体の検出基質として歯、例えば、ECLキットをはじめとする化学発光基質ならびに発色基質等が使用できる。
【００４８】
以下に、この発明を実施例によって説明するが、下記実施例はこの発明を制限する意図ではなく、発明を例示してより簡潔に説明する目的のものであることを理解すべきである。また、発明についての説明を簡潔にするために、カベオリン変異体としては水溶性ペプチドＣａｖ-Ｎ６０を、また融合タンパク質としてはＧＳＴを利用した場合について説明するが、以下の実施例は、この発明を一切限定するものではなく、この発明をより具体的に説明するためだけに単に例示的に記載されているものと留意すべきである。
【００４９】
以下の実施例に使用する物質と材料は下記の通りである。
ＰＣＲ法により増幅されたヒトカベオリン−１ｃＤＮＡ(1-180 bp) 断片
pGEX-6P-3プラスミド発現ベクター
大腸菌ＢＬ２１
PreScissionプロテアーゼ
グルタチオンセファロース（Glutathione Sepharose ）４Ｂカラム
９６−ウェルプレート
抗カベオリンポリクローナル抗体
抗ＧＳＴモノクローナル抗体
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：horseradish peroxidase）標識抗マウスＩｇＧ
抗体
ＥＣＬ (Enhanced Chemiluminescence）検出キット
化学発光検出装置（ＬＡＳ−１０００）
【実施例１】
【００５０】
組換えＣａｖ-Ｎ６０発現ベクターの作成
ヒトカベオリンｃＤＮＡは、ＲＴ-ＰＣＲ法によりヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）よりクローン化し  た。使用したプライマーは、5'-CCGGAATTCATGTCTGGGGGCAAATACGTA-3'(1-21 bpに相当（開始コドンＡＴＧ   のＡを＋１とする）（配列番号７）および5'-CCGGAATTCTATTTCTTTCTGCAAGTTG-3'（515-533 bpに相当）  （配列番号８）である。増幅したｃＤＮＡ断片は、pｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングし、シ  ークエンスを確認した。
ついで、クローニングしたヒトカベオリンｃＤＮＡを鋳型として、5’-CCGGAATTCATGTCTGGGGGCAAATAC  GTA-3’(1-21 bpに相当（開始コドンＡＴＧ のＡを＋１とする）) （配列番号９）と5’-CGCGTCGAC//  GTTGAGGTGTTTAGGGTCGCG-3’（159-180 bpに相当）（配列番号１０）の２つのプライマーを用い、ＰＣＲ  法によりＣａｖ-Ｎ６０に相当するｃＤＮＡ断片を増幅した。このｃＤＮＡ断片を制限酵素BamHIおよび  Sal Iで切断した後、あらかじめ同じ制限酵素で切断しておいたpGEX-6P-3ベクターにサブクローニング  した。これをpGEX-Ｃａｖ-Ｎ６０発現ベクターとした。
【００５１】
大腸菌での組換えＣａｖ-Ｎ６０の発現誘導
pGEX-Ｃａｖ-Ｎ６０発現ベクターを大腸菌に導入し、目的タンパク質の発現が確認された大腸菌クロ  ーンを50  mlのアンピシリン入りＬＢ培地に植菌し、一晩培養した。翌日、500 mlのアンピシリンＬＢ培  地を入れた三角フラスコの中に培養液を移し、37℃でインキュベートし、O.D.600=0.7になった時点で最  終濃度0.2 mMのＩＰＴＧを添加し、37℃でさらに８時間培養した。その後、培養液を遠心管に移し、4℃  で6000 rpm、１０分間遠心して集菌した。沈殿を50 mlのsonication buffer (20 mM Tris-HCl (pH8.0),   150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5％ NP-40) によく懸濁し、氷水中でチューブを冷却しながら超音波破砕を  行った。さらに、4℃で14000 rpm、１０分間遠心分離し、上清をカラムクロマトグラフィーによるアフ  ィニティー精製に用いた。
【００５２】
グルタチオンセファロースカラムによるアフィニティー精製(pGEX−Ｃａｖ-Ｎ６０)
前処理としてグルタチオンセファロース４Ｂカラム (Amersham) を冷却した15 mlのNETN100 buffer (  20 mM Tris-HCl (pH8.0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5％  NP-40) を添加し、樹脂を平衡化した。こ  のカラムに大腸菌抽出物を重層し、静かに１０分間転倒混和し、ＧＳＴ融合タンパクをカラムに結合させ  た。その後、15 mlのNETN100 buffer で洗浄した。最後に、5 mlのelution buffer (50 mM Tris-HCl (  pH8.0), 5 mM glutathione) を添加し、pGEX-Ｃａｖ-Ｎ６０の溶出を行い、500μlずつ分け取り、こ  れをpGEX-Ｃａｖ-Ｎ６０試料とした。
【００５３】
グルタチオンセファロースカラムによるアフィニティー精製(Ｃａｖ-Ｎ６０)
前処理としてグルタチオンセファロース４Ｂカラムを冷却したNETN100 bufferで洗浄することにより平  衡化した。このカラムに大腸菌抽出物を重層し、静かに１０分間転倒混和し、ＧＳＴ融合タンパクを結合  させた。その後、15 mlのCleavage buffer (50 mM Tris-HCl (pH7.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM   dithiothreital)で樹脂を洗浄した後、50 unitsのPreScission プロテアーゼ (Amersham) を含む2 ml C  leavage bufferを添加し4℃で一晩静置した。翌日、溶出液を500μlずつ分け取り、これをＣａｖ-Ｎ  ６０試料とした。
【００５４】
ウエスタンブロッテイング解析
上述した方法で精製したＧＳＴ−Ｃａｖ-Ｎ６０およびＣａｖ-Ｎ６０をＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク  質を分離し、ＰＶＤＦメンブレン(MILLIPORE)に電気的に転写した。これをWashing buffer (PBS (phosp  hate-buffered saline : 137 mM NaCl, 8.1 mM Na2HPO4・12 H2O, 2.68 mM KCl, 1.47mM KH2PO4  ), 0.05％ Tween 20) で１０分間、３回洗浄後、4℃で一晩5％スキムミルクを含むWashing bufferを  用いてブロッキングした。次に、一次抗体として抗カベオリン−１ポリクローナル抗体(10000倍希釈)を  用いて３０分間反応させ、二次抗体としてＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識抗ウサギＩｇＧ抗  体(10000倍希釈)を３０分間反応させた。次に、ＥＣＬ plus kit (Amersham) を用いて発光させた。デ  ータの読取および解析は化学発光検出装置ＬＡＳ−１０００(Fuji Film)を用いて行った。
【００５５】
ＥＬＩＳＡ
９６ウェルのマイクロプレートの各ウェルに50μlの抗カベオリン−１ポリクローナル抗体 (5000倍希  釈) を4℃で一晩固相化し、翌日ウェル内溶液を吸引除去後、各ウェルをPBS-0.2％Tween20で３回洗浄  した。次に300μlの0.8％BSAを用いて室温で１時間ブロッキングを行った。その後、ブロッキング液  を吸引除去し、各ウェルをPBS-0.2％Tween20で３回洗浄した。続いて、ＧＳＴ-Ｃａｖ-Ｎ６０ 1.5μ  gを含むＣａｖ-Ｎ６０標準液を50μlずつ各ウェルに分注し、室温で２時間静置して反応させた。ウェ  ル内溶液を吸引除去し、PBS-0.2％Tween20で３回洗浄した。次に、各ウェルに50μlのビオチン標識抗  ＧＳＴヤギ抗体(5000倍希釈)を分注し、室温で３０分間静置して反応させた。ウェル内溶液を吸引除去  し、PBS-0.2％Tween20で５回洗浄した。検出にはアルカリフォスファターゼ法のＡＢＣキット(Vector)  を用いて行った。ＥＣＬ plus kitを用いて発光させた。この発光の程度を化学発光検出装置ＬＡＳ−１  ０００で解析を行った。
【００５６】
細胞の処理
ＯＫ細胞(フクロネズミ近位尿細管由来)、MC3T3-E1細胞(マウス骨芽細胞由来)を超音波破砕した後  、1％ Triton, 60 mM オクチルグルコシドを添加し氷上で30分間可溶化した。4℃で12000 rpm １５分  間遠心した上清を細胞抽出液とした。
【００５７】
（結果）
ＧＳＴ−Ｃａｖ-Ｎ６０とＣａｖ-Ｎ６０との精製
pGEX−Ｃａｖ-Ｎ６０で大腸菌を形質転換し、ＩＰＴＧを用いて発現を誘導したところ、分子量34,500  （ＧＳＴ 26,000＋Ｃａｖ-Ｎ６０ 8,500）の大量のＧＳＴ−Ｃａｖ-Ｎ６０が発現された（図４Ａレー  ン１、図４Ｂレーン１）。
これを、グルタチオンセファロース４Ｂカラムでアフィニティー精製することにより、ＣＢＢ染色で単  一となるまで精製することができた(図４Ａレーン２)。カベオリン抗体によるウエスタンブロッティン  グ解析により確認したところ、図４Ｂレーン２のバンドはカベオリン反応を示した（図４Ａレーン２）。  ＧＳＴ−Ｃａｖ-Ｎ６０が精製されたことを確認した。本法により、25 mlの大腸菌培養液から25μgの  精製ＧＳＴ−Ｃａｖ-Ｎ６０を精製することができた。
【００５８】
また、pGEX−Ｃａｖ-Ｎ６０ベクターで形質転換した大腸菌の抽出物をグルタチオンセファロース４Ｂ  カラムに通過させ、グルタチオンセファロースと結合しなかったものを除去した後、PreScission プロテ  アーゼでＧＳＴとＣａｖ-Ｎ６０間を切断した。その溶出液をＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析するとＣａｖ-Ｎ６  ０を示す分子量8,500の位置に単一バンドが表れた（図４Ｂレーン３）。カベオリン抗体によるウエスタ  ンブロッティング解析で、このバンドはカベオリン反応を示した（図４Ａレーン３）。Ｃａｖ-Ｎ６０が  精製されたことが確認された。本法により、25 mlの大腸菌培養液から2.4μg のＣａｖ-Ｎ６０を精製  することができた。
【００５９】
細胞由来カベオリン−１の測定
カベオリン−１を発現していることが知られている骨芽細胞（MC3T3-E1細胞）の細胞抽出物をＥＬＩＳ  Ａ解析し、図３のカベオリン標準曲線から、各細胞抽出物のカベオリン濃度を算出し、カベオリン−１の  ００pmol相当の細胞抽出物と１００pmolのＣａｖ-Ｎ６０をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウエスタンブロ  ット法を用いて検定した(図５)。
一方、ウエスタンブロッティングで表れたバンドの強度をＬＡＳ−１０００にて定量したところ、カベ  オリン−１の１００pmolに相当するＣａｖ-Ｎ６０は174.85(レーン２)、細胞抽出物は181.57(レーン  ４)と、ほぼ同値を示したことから、本法により、内因性のカベオリン−１を定量できることが確認され  た。
さらに、本法により近位尿細管細胞株(OK細胞)とMC3T3-E1細胞におけるカベオリンの発現量を測定し  たところ、骨芽細胞では、全細胞タンパク1 μg当たり13.7 ng、近位尿細管細胞株では、10.7 ngであ  った。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
上記のような構成からなるこの発明のカベオリン検出システムでは、４時間から５時間でカベオリンを検出完了することが可能である。また、ウェスタンブロット解析では、困難であったカベオリンの定量的測定についても、Ｃａｖ-Ｎ６０を標準物質とすることにより、例えば、０．０１pmol から１０pmol の範囲で直線性が得られた（図３）。これにより、この発明のカベオリン検出システムに有用なＥＬＩＳＡ競合法を用いたカベオリン標準曲線を作成することができ、このカベオリン標準曲線を利用することによりカベオリンを定量的に測定することができる。
これに基づいて、この発明では、可溶化型カベオリンの機能および臨床的意義を検討するために、分泌型カベオリンの血中動態を簡便に測定できるカベオリン検出システムを開発することができる。つまり、例えば、ＧＳＴなどの融合タンパク質にＣａｖ-Ｎ６０などのカベオリン変異体が結合した融合タンパク質−カベオリン-１を精製し、これをトレーサーとしたＥＬＩＳＡ競合法によるアッセイシステムを開発することができる。
【００６１】
また、この発明に係るカベオリン−融合タンパク質結合体およびカベオリン測定方法は、血中に分泌さ  れるカベオリンを測定するのに極めて有用であり、このカベオリンを測定することにより、前立腺がんや  乳がんなど各種がんの診断、病態把握、予後診断に応用することが可能である。また、カベオリンはコレ  ステロール結合活性を有することから、高コレステロール血症が深く関与する動脈硬化や冠動脈疾患の診  断、病態把握、予後診断などにも利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ヒトにおけるカベオリンの１次構造とアイソフォーム間の相同性を示すアミノ酸配列の比較を示す図。
【図２】この発明のＥＬＩＳＡ競合法の原理を示す説明図。
【図３】カベオリン検量線を示すグラフ。
【図４】この発明に係る精製ＧＳＴ−Ｃａｖ-Ｎ６０とＣａｖ-Ｎ６０との分析結果を示す図。
【図５】ウェスタンブロット法によるカベオリン測定系の検定を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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