(57)【要約】【課題】一酸化炭素を用いない製造方法により、ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンとの複合体を含む人工酸素運搬体を脱酸素（窒素、その他の不活性ガス）雰囲気下で製造する方法を提供する。【解決手段】一酸化炭素および酸素を実質的に含まないガス雰囲気下で、ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンとを混合することを特徴とする、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体の製造方法。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一酸化炭素および酸素を実質的に含まないガス雰囲気下で、ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンとを混合することを特徴とする、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体の製造方法。
【請求項２】
ポルフィリン構造を有するオキシ型金属錯体をポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体へ転換させ、アルブミンと混合する、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
還元剤の存在下で、ポルフィリン構造を有するオキシ型金属錯体をポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体へ転換させる、請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
窒素置換によって、ポルフィリン構造を有するオキシ型金属錯体をポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体へ転換させる、請求項２記載の製造方法。
【請求項５】
ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンとを混合する工程において、ポルフィリン構造を有する金属錯体の中心金属が還元型である、請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
溶存酸素を除去したアルブミン水溶液を、一酸化炭素および酸素を実質的に含まないガスで満たされた密閉容器中に添加し、ついでポルフィリン構造を有する金属錯体の有機溶媒溶液および還元剤を混合する、請求項１記載の製造方法。
【請求項７】
ポルフィリン構造を有する金属錯体が、ヘム誘導体である、請求項１記載の製造方法。
【請求項８】
ガスが不活性ガスである、請求項１記載の製造方法。
【請求項９】
不活性ガスが、水素、ヘリウム、アルゴン、窒素およびネオンからなる群から選ばれる１種または２種以上の気体からなる、請求項１記載の製造方法。
【請求項１０】
還元剤が、亜ジチオン酸、亜ジチオン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、ロンガリット、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、エリソルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム、システイン、チオグリセロール、アルファチオグリセリン、エデト酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸イソプロピル、ジクロルイソシアヌール酸カリウム、チオグリコール酸ナトリウム、チオリンゴ酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム１，３−ブチレングリコール、ブチルヒドロキシアニソール、ジブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、アスコルビン酸パルミテート、ビタミンＥ関連、ｄｌ−α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、天然ビタミンＥ、ｄ−δ−トコフェロール、濃縮混合トコフェロール、グアヤク脂、ノルジヒドログアヤレト酸、Ｌ−アスコルビン酸ステアリン酸エステル、大豆レシチン、パルミチン酸アスコルビン酸、ベンゾトリアゾール、ペンタエリスリチル−テトラキス［３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート］２−メルカプトベンズイミダゾール、エチレンジアミン四酢酸カルシウム２ナトリウムおよびエチレンジアミン四酢酸２ナトリウムからなる群から選ばれる１〜２種以上である、請求項３記載の製造方法。
【請求項１１】
有機溶媒がエタノールである、請求項６記載の製造方法。
【請求項１２】
還元剤が添加され、又は／および酸素が除去された水溶液を置換液として使用し、限外濾過を行うことを特徴とする、請求項１記載の方法により得られるポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体の精製方法。
【請求項１３】
還元剤が添加され、又は／および酸素が除去された水溶液を透析液として使用し、透析を行うことを特徴とする、請求項１記載の方法により得られるポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体の精製方法。
【請求項１４】
請求項１記載の製造方法により得られる、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体。
【請求項１５】
請求項１４記載のポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体をそのまま、又は一酸化炭素結合体として、又は酸素結合体として保存容器に充填してなる人工酸素輸液製剤。
【請求項１６】
電解質、糖類、ｐＨ調整剤、等張化剤および膠質浸透圧を付与する高分子からなる群から選ばれる１〜２種以上を含有する、請求項１５記載の人工酸素輸液製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内で酸素を可逆的に吸脱着できる人工酸素運搬体、人工酸素運搬体を含む人工酸素輸液製剤に関する。
さらに詳細には、医療分野において、虚血部位や腫瘍組織への酸素供給用、大量出血患者の輸血用、臓器保存灌流液、体外循環液、細胞培養液として使用され、高い安全性および高い品質を有する、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の血管内における血液量の維持には、血漿コロイドである血漿蛋白質が重要な役割を果たしていることが知られている。このため、従来より、患者の出血性ショックを回復させるには、生体の血液とほぼ等しい膠質浸透圧を有する血漿増量剤を補液する手法が採られてきた。しかしながら、循環血液量の３０％以上の出血を伴う場合には、末梢組織への酸素供給が不十分となり、血漿増量剤の投与に加えて、さらに酸素運搬体の投与が必要となる。
【０００３】
従来、このような酸素運搬体としては、天然赤血球を含有する天然血液あるいは赤血球濃厚液が用いられてきた。しかし、抗原抗体反応による凝血を回避するために、供血者と受血者の血液型を一致させ、使用時には交差適性試験を行う必要があり、また、このような天然血液あるいは赤血球濃厚液は、その有効保存期間が３週間（４℃）と短く、凍結保存によって長期保存可能な凍結血液は、コスト高や使用の際の浸透圧ショックによって溶血しやすいという問題があった。さらに、肝炎やエイズ等の感染症の発生も懸念されていた。
【０００４】
このような問題を解決する酸素運搬体として、種々の人工酸素運搬体が研究されてきた。ヘム誘導体である2-[8-[N-(2-メチルイミダゾリル)]オクタノイロキシメチル]-5,10,15,20-テトラキス(α,α,α,α-o-ピバラミド)フェニルポルフィナト鉄錯体等を、ヒト由来アルブミンまたは組換えアルブミンの疎水ポケットに吸着させた酸素輸液剤（以下、アルブミン-ヘム）が合成され、その酸素運搬能が確認されている（非特許文献１参照）。
【０００５】
これらの人工酸素運搬体の製造には、従来から有毒な一酸化炭素（以下、ＣＯ）が利用されてきた。
非特許文献２には、アルブミンヘムは酸素存在下では、２５℃：８時間、あるいは３７℃：２時間で、５０％のアルブミンヘムが劣化することが記載される。このように、製造工程中に酸素が存在すると２価の鉄錯体が３価になってしまい、酸素運搬体としての機能を果たさない状態になり、結果として、十分な酸素運搬能力をもつアルブミンヘムが得られない。
しかし、製造工程で完全に酸素の混入を遮断するためは、非常に高度な設備が必要であり、通常の設備では酸素の混入を防ぐことができず、従来は製造工程で酸素が混入しても酸素運搬体が劣化しないよう、ＣＯを用いて酸素運搬体を製造する方法が広く用いられてきた。ＣＯがポルフィリン鉄錯体（以下、ヘムと略記）に結合することによって、ヘムの二価鉄の状態が安定に保たれ、三価鉄への酸化反応が抑制されるからである。
【０００６】
ＣＯを用いた人工酸素運搬体の製造方法の一例を挙げると、まず、ピケットフェンスポルフィリン（以下、ＰＦＰ）をＣＯと反応させてＣＯ−ＰＦＰを形成させる。このＣＯ−ＰＦＰをさらに亜ジチオン酸塩で還元する。次にＣＯ−ＰＦＰをヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡ）と混合し、ＨＳＡとの複合体（以下、ＣＯ−ＰＦＰ−ＨＳＡ）を得る。ＣＯ−ＰＦＰ−ＨＳＡの形成は、クロマトグラフィーおよび限外濾過によって確認することができる。ＣＯの除去は、酸素を有するトノメーター中で試料に光を照射することによって行われる。結果として得られるＯ２−ＨＳＡ−ＰＦＰを、窒素置換によって酸素を除去すると、ＨＳＡ−ＰＦＰが得られる。（特許文献１参照）
しかしながら、このような製造工程をＣＯ雰囲気下に置くためには大量のＣＯが必要であり、人体に致命的な傷害を与える恐れがある。
従って、製造工程においてもＣＯを用いずに、尚かつ人工酸素運搬体の劣化が生じないような製造方法が望まれていた。
【０００７】
また、このようにして製造された人工酸素運搬体はそのままＣＯ雰囲気下で冷蔵保存すると、同様に酸化反応による劣化が抑制される。しかしながら、ＣＯが結合した状態のままでは酸素結合能が無いため、投与を行う前にＣＯを除去する操作が必要であり、この時にもＣＯが発生し、人体に影響を及ぼす恐れや、緊急時の投与に対応できないといった問題もある。
このような問題を解決する方法として、特許文献３には、アルブミン−ヘムをデオキシ型ヘムに変換させて保存する方法が記載されている。詳細には、非特許文献１に従って調製したアルブミン-ヘムの生理食塩水溶液について、ヘムが鉄二価の状態であることを確認した後、この分散液から酸素を除去する方法として、酸素を含まない窒素、その他の不活性ガス（アルゴン、ヘリウムなど）に曝して、溶解している酸素を排気させ、オキシ型のヘムを酸素が結合していないデオキシ型ヘムに変換させて保存する。
しかしながら、この特許文献３に記載の方法は、保存形態においてＣＯを用いずにデオキシ化を行っているものの、製造工程では依然としてＣＯを使用していた（例えば、特許文献３の実施例１、実施例７および非特許文献３参照）。
【０００８】
ＣＯを用いた人工酸素運搬体（例えば、ヘモグロビン小胞体、リピドヘム小胞体、リピドヘム−トリグリセリド小球体、アルブミン-ヘムなど）のこれまでの製造方法には上記のような問題があり、より安全で扱い易い人工酸素運搬体の製造方法が求められる。しかし、これまで、製造工程でＣＯを用いない人工酸素運搬体の製造方法は用いられていなかった。
【０００９】
【特許文献１】特表平１０−５０３４８９号公報  第１４頁第５〜１１行
【特許文献２】特開平８−３０１８７３号公報
【特許文献３】特開２００１−７２５９５号公報  段落００２８
【非特許文献１】E. Tsuchida, et al., Bioconjugate Chemistry, vol.8, 534-538, 1997
【非特許文献２】小松ら，Bioconjugate Chemistry vol.10,797-802, 1999  第800頁左欄下から２行〜右欄第１行
【非特許文献３】小松ら，人工血液，vol.6，110-114，1998  第111頁左欄第16〜19行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明では、ＣＯを用いずに、人工酸素運搬体であるポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンとの複合体を製造する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、本発明者らは鋭意検討した結果、ＣＯ結合していないデオキシ型のポルフィリン構造を有する金属錯体は、非常に酸化されやすく、ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンとの複合体の精製工程で、限外ろ過に用いる置換液や、透析に用いる透析液等によりかなりの酸化反応が起こることが分かった。そこで一酸化炭素（ＣＯ）および酸素（以下、Ｏ２）を実質的に含まないガス雰囲気下で、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体を製造し、還元剤を精製工程で使用する置換液、透析液に添加することによって、上記課題が解決されることを見出し、本発明に到達した。
【００１２】
すなわち、本発明は、
（１）  一酸化炭素および酸素を実質的に含まないガス雰囲気下で、ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンとを混合することを特徴とする、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体の製造方法、
（２）  ポルフィリン構造を有するオキシ型金属錯体をポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体へ転換させ、アルブミンと混合する、上記（１）記載の製造方法、
（３）  還元剤の存在下で、ポルフィリン構造を有するオキシ型金属錯体をポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体へ転換させる、上記（２）記載の製造方法、
（４）  窒素置換によって、ポルフィリン構造を有するオキシ型金属錯体をポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体へ転換させる、上記（２）記載の製造方法、
（５）  ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンとを混合する工程において、ポルフィリン構造を有する金属錯体の中心金属が還元型である、上記（１）記載の製造方法、
（６）  溶存酸素を除去したアルブミン水溶液を、一酸化炭素および酸素を実質的に含まないガスで満たされた密閉容器中に添加し、ついでポルフィリン構造を有する金属錯体の有機溶媒溶液および還元剤を混合する、上記（１）記載の製造方法、
（７）  ポルフィリン構造を有する金属錯体が、ヘム誘導体である、上記（１）記載の製造方法、
（８）  ガスが不活性ガスである、上記（１）記載の製造方法、
（９）  不活性ガスが、水素、ヘリウム、アルゴン、窒素およびネオンからなる群から選ばれる１種または２種以上の気体からなる、上記（１）記載の製造方法、
（１０）  還元剤が、亜ジチオン酸、亜ジチオン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、ロンガリット、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、エリソルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム、システイン、チオグリセロール、アルファチオグリセリン、エデト酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸イソプロピル、ジクロルイソシアヌール酸カリウム、チオグリコール酸ナトリウム、チオリンゴ酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム１，３−ブチレングリコール、ブチルヒドロキシアニソール、ジブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、アスコルビン酸パルミテート、ビタミンＥ関連、ｄｌ−α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、天然ビタミンＥ、ｄ−δ−トコフェロール、濃縮混合トコフェロール、グアヤク脂、ノルジヒドログアヤレト酸、Ｌ−アスコルビン酸ステアリン酸エステル、大豆レシチン、パルミチン酸アスコルビン酸、ベンゾトリアゾール、ペンタエリスリチル−テトラキス［３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート］２−メルカプトベンズイミダゾール、エチレンジアミン四酢酸カルシウム２ナトリウムおよびエチレンジアミン四酢酸２ナトリウムからなる群から選ばれる１〜２種以上である、上記（３）記載の製造方法、
（１１）  有機溶媒がエタノールである、上記（６）記載の製造方法、
（１２）  還元剤が添加され、又は／および酸素が除去された水溶液を置換液として使用し、限外濾過を行うことを特徴とする、上記（１）記載の方法により得られるポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体の精製方法、
（１３）  還元剤が添加され、又は／および酸素が除去された水溶液を透析液として使用し、透析を行うことを特徴とする、上記（１）記載の方法により得られるポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体の精製方法、
（１４）  上記（１）記載の製造方法により得られる、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体、
（１５）  上記（１４）記載のポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体をそのまま、又は一酸化炭素結合体として、又は酸素結合体として保存容器に充填してなる人工酸素輸液製剤、および
（１６）  電解質、糖類、ｐＨ調整剤、等張化剤および膠質浸透圧を付与する高分子からなる群から選ばれる１〜２種以上を含有する、上記（１５）記載の人工酸素輸液製剤
である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体は、製造工程でＣＯを用いていないため、より安全性の高い人工酸素運搬体として使用できる。
また、本発明の製造方法を用いることによって、これまで人工酸素運搬体の製造工程において必要であった、厳重なＣＯ漏洩の管理システム等が不要となり、製造設備を簡素化、小型化することができる。
さらに、製造工程でＣＯを用いた場合、最終的に酸素運搬体として使用するためには、ＣＯを除去する工程が必要である。その際、非常に強い光と酸素を吹き込むため、ポルフィリン構造を有する金属錯体が酸化型となり、酸素運搬体としての機能を果たさない状態になる恐れがある。本発明の製造方法において、製造工程でＣＯを用いない場合には、ＣＯを除去する工程が必要なく、品質の劣化を防ぐことができる。また、緊急時使用する際には、そのまま投与することが可能となる。
【００１４】
本発明のポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体は、酸素運搬体として、医学および薬学での広い応用が可能であり、また輸血用血液と同様、そのまま或いは必要に応じ添加物を加えた状態で、血液代替物として臨床治療に利用される。
また、本発明のポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体は、長期保存のためのＣＯ化処理を行わなければ、そのまま静脈内投与することが可能である。投与されたポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体は、先ず肺を通過するときに直ちに酸素と結合してオキシ型となり、末梢血管にて酸素を放出する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明において、「ポルフィリン構造を有する金属錯体」とは、ポルフィリン環に中心金属が配位した金属錯体を指し、ポルフィリン環が変形したものであっても、酸素との可逆的な結合能を有するもの全てが包含される。ポルフィリン環とは、図１に示すような４つのピロール環がα位置で４つのメチン基と交互に結合した大環状化合物とその誘導体である。ポルフィリン構造を有する金属錯体としては、例えば、図２に示すようなポルフィリン環（2-[8-[N-(2-メチルイミダゾリル)]オクタノイロキシメチル]-5,10,15,20-テトラキス(α,α,α,α-o-ピバラミド)フェニルポルフィリン）の中心に鉄が配位したものが挙げられる。これらの金属錯体の中心金属は、通常、遷移元素であり、元素周期表第６〜１０族の遷移元素が好ましく、第４周期の遷移元素がより好ましい。そのうち、鉄、コバルト、クロムなどが好ましく、さらに好ましくは鉄（II）、コバルト（II）である。
また「デオキシ型金属錯体」とは、中心金属に酸素が結合していない金属錯体であり、例えば中心金属である鉄（II）に酸素が結合していない金属錯体が挙げられる。「オキシ型金属錯体」とは、中心金属に酸素が結合した金属錯体であり、例えば中心金属である鉄（II）に酸素が結合した金属錯体が挙げられる。
本発明における「ポルフィリン構造を有する金属錯体」は、好ましくは「ヘム誘導体」である。「ヘム誘導体」とは、ポルフィリン構造を有する鉄錯体を指し、ポルフィリン環が変形した誘導体等であっても、酸素との可逆的な結合能を有するもの全てが包含される。ヘム誘導体としては、例えば、テトラフェニルポルフィリン、プロトポルフィリン、オクタアルキルポルフィリンおよびそれらの誘導体などが挙げられる。この中、テトラフェニルポルフィリンが好ましい。
【００１６】
本発明において、「ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体」は、ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンとを結合させることによって得られ、酸素の可逆的吸脱着能を有している。例えば、ヘム誘導体とアルブミンの複合体（以下、アルブミン−ヘム）などが挙げられる。
中心金属が酸化型であるポルフィリン構造を有する金属錯体は、酸素の可逆的吸脱着能がないため、本発明のポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体においては、中心金属が還元型であることが必要である。しかしながら、ポルフィリン構造を有する金属錯体の中心金属が酸化型の状態（例えば、鉄（III））でアルブミンと結合させた場合、結合後に中心金属を還元型（例えば、鉄（II））にするのは難しい。
従って、ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンとを結合させる際、ポルフィリン構造を有する金属錯体の中心金属は還元型であることが好ましい。例えば、ポルフィリン構造を有する鉄錯体をアルブミンと結合させる際、錯体の中心金属は還元型の鉄（II）であることが好ましい。
なお、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体以外にも、ヘモグロビン小胞体、リピドヘム小胞体、リピドヘム−トリグリセリド小球体など、あるいはそれらの混合物や複合体などの人工酸素運搬体においても、本発明の概念を応用することが可能である。
【００１７】
本発明で使用するアルブミンは特に限定されないが、例えば、ヒト血清アルブミン、動物由来血清アルブミン、遺伝子組換え型ヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）、およびそれらの多量体等が挙げられる。感染防止等の観点からは、特にｒＨＳＡが好ましい。
本発明におけるアルブミン−ヘムの一例として、テトラフェニルポルフィリン鉄誘導体である2-[8-[N-(2-メチルイミダゾリル)]オクタノイロキシメチル]-5,10,15,20-テトラキス(α,α,α,α-o-ピバラミド)フェニルポルフィナト鉄錯体等を、アルブミンの疎水ポケットに包接させたもの（非特許文献１参照）などが挙げられる。
【００１８】
本発明において、「一酸化炭素および酸素を実質的に含まないガス雰囲気下」とは、ＣＯの含有量が人体に影響のある量より少なく、Ｏ２の含有量がポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体を劣化させる量よりも少ないガス雰囲気下である。すなわち、人体に影響のない範囲の一酸化炭素の含有、および本発明のポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体が安定して得られる範囲の酸素の含有は許容することを意味する。具体的には、上記ガス雰囲気における一酸化炭素の濃度は、好ましくは0.1ppm以下であり、上記ガス雰囲気における酸素の濃度は、好ましくは１％（約10000ppm）以下であり、より好ましくは０．１％（約1000ppm）以下で、更に好ましくは100ppm以下である。
上記ガス雰囲気下のガスは、不活性ガスであることが好ましい。不活性ガスとは、化学的に不活性なガスを意味し、例えばヘリウム、アルゴン、ネオンなどの希ガスに加えて、窒素や水素が含まれる。工業上窒素ガスを用いることが好ましい。
【００１９】
本発明における還元剤としては、例えば、亜ジチオン酸、亜ジチオン酸塩（亜ジチオン酸ナトリウムなど）、亜硫酸水素塩（亜硫酸水素ナトリウムなど）、亜硫酸塩（亜硫酸ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウムなど）、ピロ亜硫酸塩（ピロ亜硫酸ナトリウムなど）、メタ重亜硫酸塩（メタ重亜硫酸ナトリウムなど）、ロンガリット（ＣＨ２ＯＨＳＯ２Ｎａ）、アスコルビン酸またはその塩（Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウムなど）、エリソルビン酸またはその塩（エリソルビン酸ナトリウムなど）、システイン（好ましくは塩酸システイン）、チオグリセロール、アルファチオグリセリン、エデト酸塩（エデト酸ナトリウムなど）、クエン酸、クエン酸イソプロピル、ジクロイソシアヌール酸塩（ジクロルイソシアヌール酸カリウムなど）、チオグリコール酸塩（チオグリコール酸ナトリウムなど）、チオリンゴ酸塩（チオリンゴ酸ナトリウムなど）、ピロ亜硫酸ナトリウム１，３−ブチレングリコール、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、没食子酸プロピル、アスコルビン酸パルミテート、ｄｌ−α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、天然ビタミンＥ、ｄ−δ−トコフェロール、濃縮混合トコフェロール、グアヤク脂、ノルジヒドログアヤレト酸（ＮＤＧＡ）、Ｌ−アスコルビン酸ステアリン酸エステル、大豆レシチン、パルミチン酸アスコルビン酸、ベンゾトリアゾール、ペンタエリスリチル−テトラキス［３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート］２−メルカプトベンズイミダゾール、エチレンジアミン四酢酸カルシウム２ナトリウムおよびエチレンジアミン四酢酸２ナトリウムが挙げられる。この中、Ｌ−アスコルビン酸またはＬ−アスコルビン酸ナトリウムが好ましい。また、これらの群から選ばれる１種の還元剤のみを用いてもよく、２種以上の還元剤を同時に用いてもよい。
【００２０】
本発明において、「窒素置換」とは、目的物を窒素雰囲気下に置くことにより、酸素を除去する操作である。例えば、ポルフィリン構造を有するオキシ型金属錯体を窒素雰囲気下におくことにより、酸素を除去し、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体に転換させることができる。窒素置換の方法としては、目的物の溶液に窒素ガスのバブリングを行う方法（以下、窒素バブル）や、目的物の溶液表面に窒素ガスを吹き付ける方法（窒素フロー）が挙げられる。
【００２１】
本発明の製造方法は、溶存酸素を除去したアルブミン水溶液を、一酸化炭素および酸素を実質的に含まないガスで満たされた密閉容器中に添加し、ついでポルフィリン構造を有する金属錯体の有機溶媒溶液および還元剤を混合する工程を含むことが好ましい。
【００２２】
ポルフィリン構造を有する金属錯体を溶解させる有機溶媒としては、ポルフィリン構造を有する金属錯体が溶解できるものであれば特に限定されないが、通常、水溶性の有機溶媒が用いられ、医薬品としての使用上、好ましくはエタノールが用いられる。有機溶媒溶液中のポルフィリン構造を有する金属錯体の量は、使用目的に応じて調節できるが、好ましくはアルブミン１モル量に対して、約１〜１０モル量である。ポルフィリン構造を有する金属錯体の有機溶媒中には上記の還元剤を添加しておくことが好ましい。
ポルフィリンポルフィリン構造を有する金属錯体の有機溶媒溶液は、窒素バブル等の窒素置換を行うことによって、あらかじめアルブミン水溶液との混合前に、ポルフィリン構造を有するオキシ型金属錯体をポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体に転換させておく。窒素バブルの時間は、約１〜３０分が好ましい。
【００２３】
アルブミン水溶液の濃度は、約２５％(w/w)未満であることが好ましい（濃度が薄い場合は製造効率が悪くなる）。アルブミン水溶液は、あらかじめポルフィリン構造を有する金属錯体の有機溶媒溶液と混合する前に、酸素を除去しておくことが好ましい。例えば、窒素バブル等により酸素を除去した溶媒（注射用水、生理食塩水、緩衝液など、注射剤の製造に使用できる溶媒であれば特に限定されない。）と混合し、さらに必要に応じて窒素フローすることによって、酸素を除去しておくことができる。アルブミン水溶液に窒素を直接バブリングするとアルブミンが変性してしまうため、好ましくない。窒素バブルの時間は、約１〜６０分が好ましい。
【００２４】
ポルフィリン構造を有する金属錯体を溶解させる有機溶媒とアルブミン水溶液の混合は、まず、アルブミン水溶液を、一酸化炭素および酸素を実質的に含まないガスで満たされた密閉容器中に添加し、次に、ポルフィリン構造を有する金属錯体を溶解させる有機溶媒を少量ずつ添加しながら攪拌混合することが好ましい。該混合は、水溶液の凍結やアルブミンの変性が起こらないよう、通常、約０〜６０℃、好ましくは約１０〜５０℃の温度条件で行われる。混合時間は、ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンが均一に混合され、ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンの複合体が目的量得られるために必要な時間である。
【００２５】
本発明において、「ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体の精製方法」とは、種々公知の血液浄化方法等を用いて、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体を含む溶液中の溶媒あるいは不純物を、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体から分離させる方法である。例えば、種々公知の血液透析、血液透析濾過、血液濾過等の浄化方法を応用することができる。血液濾過の方法を用いて、限外濾過膜により濾過を行い、必要に応じて置換液をポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体を含む溶液に補充することが好ましい。また、血液透析の方法を用いて、半透膜と透析液による透析を行ってもよい。この場合に使用する置換液または透析液は、還元剤が添加され、且つ／又は酸素が除去された水溶液であることが好ましい。還元剤としては、上記のようなポルフィリン構造を有する金属錯体の溶媒中に添加するものと同様のものを使用することができ、酸素を除去する方法としては、窒素バブル等の種々公知の方法を用いることができる。このような置換液を使用することにより、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体の酸素化を防止することができる。
【００２６】
本発明の方法により得られる人工酸素輸液製剤は、酸素運搬能を有する、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体を含有する液体である。
本発明の人工酸素輸液製剤は必要に応じて、膠質浸透圧を付与しうる化合物を含有させてもよい。膠質浸透圧を付与しうる化合物としては、膠質浸透圧を有するものであれば医薬用に用いられる種々の高分子を使用することができるが、一例として、デキストラン（例えば、低分子デキストラン）、デキストラン誘導体（例えば、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシデキストラン、カチオン化デキストラン、デキストラン硫酸）、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、ゼラチン（例えば、修飾ゼラチン）、アルブミン（例えば、ヒト生血漿、ヒト血清アルブミン、加熱ヒト血漿蛋白、遺伝子組み換え型ヒト血清アルブミン）、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、アカシアゴム、グルコース、デキストロース（例えば、D-ブドウ糖一水化物）、少糖類（例えば、オリゴ糖）、多糖類分解物、アミノ酸、蛋白分解物等が挙げられる。この中でも特に低分子デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、修飾ゼラチン、遺伝子組み換え型アルブミンが好ましい。
【００２７】
上記したようなポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体は、ポルフィリン構造を有する金属錯体が還元型のときには酸素を可逆的に結合するのに対して、酸化型であるときは酸素結合能が無い。例えば、ヘムの中心元素である鉄が二価鉄（Ｆｅ2+）のときには酸素を可逆的に結合するのに対して、酸化型の三価鉄（Ｆｅ3+）であるときには酸素結合能は無い。また酸素が結合した二価鉄錯体でも、スーパーオキサイドアニオン（Ｏ2-)を遊離して次第に自動酸化し、三価鉄（メト体）となって酸素結合能を失う。更に、メト体からはヘムおよび鉄イオンが遊離し易くなるといった、生体への悪影響が懸念される。
したがって、これらポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体を含む人工酸素輸液製剤を保存する場合には、この酸化反応を抑制する必要がある。
【００２８】
酸化反応の抑制方法としては、単に冷蔵保存して反応速度を低下させることも可能であるが、徐々に三価鉄が増大するため、これに対する対策として、赤血球に本来存在しているメトヘモグロビン還元酵素系や、カタラーゼおよびスーパーオキサイドディスムターゼなどの活性酸素を消去する酵素を添加する方法が知られている。保存温度は、-20℃〜60℃の間で可能であるが、好ましくは４〜25℃の冷暗所保存をする。
また、酸素を遮断して保存するために、例えば硝子瓶に直接封入したり、アルミニウム/ポリエチレン層状バッグ(aluminized polyethylene bag)や、ポリ塩化ビニリデン系、エチレン−ビニルアルコール共重合体系など、酸素透過性が極めて低い材質から成る容器に入れて封入したり、またはプラスチック製バックに封入しこれを更に酸素を透過しない容器に入れることが好ましい。
さらに、人工酸素輸液を収容した容器中の酸素を除去した後、酸素を遮断して保存することにより、ポルフィリン構造を有する金属錯体の酸化、また脂質などその他の成分の酸素酸化を抑制することができる。酸素除去操作後に、溶液中に残存している微量の酸素を更に除去することを目的として、人工酸素輸液を収容した容器内に、適量の酸素と反応する試薬(抗酸化剤)を分散させても良い。ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体が溶液中に分散している場合は、溶媒中に抗酸化剤を添加してもよい。
【００２９】
抗酸化剤としては、通常、医薬用に用いられる種々の抗酸化剤を使用することができるが、一例として、亜ジチオン酸、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム（例えば、メタ重亜硫酸ナトリウム）、ロンガリット（CH2OHSO2Na）、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、エリソルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム、システイン、アセチルシステイン、塩酸システイン、ホモシステイン、グルタチオン、チオグリセロール、アルファチオグリセリン、エデト酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸イソプロピル、ジクロルイソシアヌール酸カリウム、チオグリコール酸ナトリウム、チオリンゴ酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム1、3-ブチレングリコール、エチレンジアミン四酢酸カルシウム二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、アミノ酸亜硫酸塩（例えば、L-リジン亜硫酸塩）、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、ジブチルヒドロキシトルエン(BHT)、没食子酸プロピル、アスコルビン酸パルミテート、ビタミンＥおよびその誘導体（例えばdl-α-トコフェロール、酢酸トコフェロール、天然ビタミンＥ、d-δ-トコフェロール、濃縮混合トコフェロール、ｔｒｏｌｏｘ）、グアヤク脂、ノルジヒドログアヤレト酸(NDGA)、L-アスコルビン酸ステアリン酸エステル、大豆レシチン、パルミチン酸アスコルビン酸、ベンゾトリアゾール、ペンタエリスリチル-テトラキス[3-(3、5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)プロピオネート]2-メルカプトベンズイミダゾール等が挙げられる。このうち、亜ジチオン酸、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、システイン、アセチルシステイン、dl-α-トコフェロール、酢酸トコフェロール、グルタチオン、ｔｒｏｌｏｘが好ましい。
【００３０】
また、本発明のポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体は、ＣＯ化してから保存してもよい。例えば、ポルフィリン構造を有する金属錯体がヘム（鉄錯体）である場合、ヘムに対して酸素よりも２００倍の親和度を示すＣＯを結合させて、長期保存を行うことができる。
この場合、ＣＯの使用量は必要最小限に止めることが安全性の面などから好ましい。そのためには、例えば、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体がアルブミン−ヘムの場合、従来の様にヘムエタノール溶液の調製からアルブミンへの包接までの長時間に亘り、ＣＯ雰囲気で行うよりも、包接反応後、容器へ充填し、容器内をＣＯ置換するほうが好ましい。これによって、ＣＯ使用量は従来よりも遙かに少量で済む。
具体的には、例えば、ヘム誘導体のエタノール溶液にＬ−アスコルビン酸の水溶液を添加し、密閉容器中で窒素置換しながら、溶存酸素を除去したアルブミン水溶液中に加え、攪拌混合し、デオキシ型のアルブミン−ヘムを生成させた後に、ＣＯ雰囲気下に置くことにより、アルブミン−ヘムをＣＯ化し保存する方法が挙げられる。
【００３１】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
非特許文献１記載の手法に従い、2-[8-[N-(2-メチルイミダゾリル)]オクタノイロキシメチル]-5,10,15,20-テトラキス(α,α,α,α-o-ピバラミド)フェニルポルフィナト鉄錯体を得た。
この錯体(3.0ｍＭ)のエタノール溶液(2 ｍＬ)を密閉容器中で窒素置換しながら、L-アスコルビン酸(1.2ｍＭ)の水溶液(4 μL)を添加し、10分間反応させた溶液Ａを得た。
これとは別に、遺伝子組み換えヒト血清アルブミン(1.5 ｍＭ、0.5 ｍＬ)を窒素バブルで溶存酸素を除去したリン酸水溶液(ｐＨ 8.1、1.0 ｍＭ、7.5 ｍＬ)に加えた溶液Ｂを調製した。
次に溶液Ａを溶液Ｂに添加し、室温で約５分間攪拌混合した。
その混合液を限外濾過装置(アドバンテック製ウルトラフィルター：限外濾過分子量50000)で5 ｍＬまで濃縮後、L-アスコルビン酸(1.2ｍＭ)の水溶液(200μＬ)を添加したリン酸緩衝液(ｐＨ7.4、1.0ｍＭ、50ｍＬ)を用いて定容量限外濾過によりエタノールを除去した。これを2.0ｍＬまで濃縮した。得られた混合液をガラス製バイアル瓶に充填密封し、容器中は窒素置換した。
こうしてアルブミン濃度5.38％、ポルフィリン濃度3.24ｍＭのポルフィリン金属錯体−アルブミン複合体を得た。
【００３３】
（試験例１）
実施例1で得られた分散液に酸素をフローすると、オキシ体が得られ、その可視吸収スペクトルはλmaxが420ｎｍであった。この分散液を希釈し、窒素雰囲気下で少量の亜ジチオン酸を添加するとデオキシ体が得られ、その可視吸収スペクトルはλmaxが441ｎｍになった。
なお、酸素及び窒素の交互の通気を繰り返すことによって酸素の吸脱着を確認した。また、電気泳動法により、アルブミンの変性を確認した結果、変性は認められなかった。
【実施例２】
【００３４】
実施例１と同様にして、2-[8-[N-(2-メチルイミダゾリル)]オクタノイロキシメチル]-5,10,15,20-テトラキス(α,α,α,α-o-ピバラミド)フェニルポルフィナト鉄錯体を得た。
この錯体(1.2 ｍＭ)のエタノール溶液(5ｍＬ)を密閉容器中で窒素バブルしながら、L-アスコルビン酸(1.2ｍＭ)の水溶液(10μＬ)を添加し、10分間反応させ、溶液Ａを得た。
これとは別に、遺伝子組み換えヒト血清アルブミン(1.5ｍＭ、0.5ｍＬ)を窒素バブルで溶存酸素を除去したリン水溶液(ｐＨ8.1、1.0ｍＭ、24.5ｍＬ)に加え、溶液Ｂを調製した。
次に溶液Ａを溶液Ｂに添加し、室温で約５分間攪拌混合した。
その混合液を限外濾過装置(アドバンテック製ウルトラフィルター：限外濾過分子量50000)で5ｍＬまで濃縮後、L-アスコルビン酸(1.2ｍＭ)の水溶液(200μL)を添加したリン酸緩衝液(ｐＨ7.4、1.0ｍＭ、50ｍＬ)を用いて定容量限外濾過によりエタノールを除去した。これを2.0ｍＬまで濃縮した。得られた混合液をガラス製バイアル瓶に充填密封し、容器中は窒素置換した。
こうして目的とする、アルブミン濃度4.344％、ポルフィリン濃度3.55ｍＭのポルフィリン金属錯体−アルブミン複合体を得た。
【００３５】
（試験例２）
実施例２で得られた分散液に酸素をフローすると、オキシ体が得られ、その可視吸収スペクトルはλmaxが421.5ｎｍであり、この分散液を希釈し、窒素雰囲気下で少量の亜ジチオン酸を添加するとデオキシ体が得られ、その可視吸収スペクトルはλmaxが441.5ｎｍに得られた。
なお、酸素及び窒素の交互の通気を繰り返すことによって酸素の吸脱着を行うことができた。また、電気泳動法により、アルブミンの変性を確認した結果、変性は認められなかった。
【実施例３】
【００３６】
実施例１と同様にして、2-[8-[N-(2-メチルイミダゾリル)]オクタノイロキシメチル]-5,10,15,20-テトラキス(α,α,α,α-o-ピバラミド)フェニルポルフィナト鉄錯体を得た。
この錯体(1.5 ｍＭ)のエタノール溶液(1 ｍＬ)を密閉容器中で窒素バブルしながら、L-アスコルビン酸(1.2ｍＭ)の水溶液(20 μL)を添加し、10分間反応させ、溶液Ａを得た。
これとは別に、遺伝子組み換えヒト血清アルブミン(0.375 ｍＭ、0.5 ｍＬ)を窒素バブルで溶存酸素を除去したリン酸水溶液(ｐＨ8.1、1.0 ｍＭ、4.5 ｍＬ)に加え、溶液Ｂを調製した。
次に溶液Ａを溶液Ｂに添加し、室温で約５分間攪拌混合した。
その混合液を限外濾過装置(アドバンテック製ウルトラフィルター：限外濾過分子量50000)で5 ｍＬまで濃縮後、リン酸緩衝液(ｐＨ 7.4、1.0 ｍＭ、50 ｍＬ)を用いて定容量限外濾過によりエタノールを除去した。これを0.5 mLまで濃縮した。得られた混合液をガラス製バイアル瓶に充填密封し、容器中は窒素置換した。
こうして目的とする、アルブミン濃度は5.252 ％、ポルフィリン濃度は1.74ｍＭのポルフィリン金属錯体−アルブミン複合体を得た。
【００３７】
（試験例３）
実施例３で得られた分散液に酸素をフローすると、オキシ体が得られ、その可視吸収スペクトルはλmaxが421.5 ｎｍであり、この分散液を1/50に希釈し、石英製分光測定用セルに移し、窒素雰囲気下で少量の亜ジチオン酸を添加するとデオキシ体の可視吸収スペクトルはλmaxが440.5 ｎｍに得られる。
なお、酸素及び窒素の交互の通気を繰り返すことによって酸素の吸脱着を行うことができた。また、電気泳動法により、アルブミンの変性を確認した結果、変性は認められなかった。
【実施例４】
【００３８】
実施例１と同様にして、2-[8-[N-(2-メチルイミダゾリル)]オクタノイロキシメチル]-5,10,15,20-テトラキス(α,α,α,α-o-ピバラミド)フェニルポルフィナト鉄錯体を得た。
この錯体(1.2 ｍＭ)のエタノール溶液(5 ｍＬ)を密閉容器中で窒素バブルしながら、L-アスコルビン酸(1.2ｍＭ)の水溶液(4 μL)を添加し、10分間反応させ、溶液Ａを得た。
これとは別に、遺伝子組み換えヒト血清アルブミン(1.5 ｍＭ、0.5 ｍＬ)を窒素バブルで溶存酸素を除去したリン酸水溶液(ｐＨ8.1、1.0ｍＭ、24.5ｍＬ)に加え、溶液Ｂを調製した。
次に溶液Ａを溶液Ｂに添加し、室温で約５分間攪拌混合した。
その後、限外濾過装置(アドバンテック製ウルトラフィルター：限外濾過分子量50000)を用いて、限外濾過を行い5ｍＬまで濃縮後、リン酸緩衝液(ｐＨ7.4、1.0ｍＭ、50ｍＬ)を用いて定容量限外濾過によりエタノールを除去した。これを2.0 mLまで濃縮した。
得られた混合液をガラス製バイアル瓶に充填密封し、容器中はＣＯで置換した。
こうして目的とする、アルブミン濃度5.041 ％、ポルフィリン濃度2.71ｍＭのポルフィリン金属錯体−アルブミン複合体を得た。
【００３９】
（試験例４）
実施例４で得られた分散液に酸素をフローしながら、氷浴中で光照射(500Ｗ)すると、オキシ体が得られる。その可視吸収スペクトルはλmaxが421.5ｎｍであり、この分散液を希釈し、石英製分光測定用セルに移し、窒素雰囲気下で少量の亜ジチオン酸を添加するとデオキシ体が得られ、その可視吸収スペクトルはλmaxが441.5ｎｍに得られる。
なお、酸素及び窒素の交互の通気を繰り返すことによって酸素の吸脱着を行うことができた。また、電気泳動法により、アルブミンの変性を確認した結果、変性は認められなかった。
【実施例５】
【００４０】
実施例１と同様にして、2-[8-[N-(2-メチルイミダゾリル)]オクタノイロキシメチル]-5,10,15,20-テトラキス(α,α,α,α-o-ピバラミド)フェニルポルフィナト鉄錯体を得た。
この錯体(1.5ｍＭ)のエタノール溶液(1 ｍＬ)を密閉容器中で窒素バブルしながら、L-アスコルビン酸(1.2ｍＭ)の水溶液(20 μL)を添加し、10分間反応させ、溶液Ａを得た。
これとは別に、遺伝子組み換えヒト血清アルブミン(0.375ｍＭ、0.5 ｍＬ)を窒素バブルで溶存酸素を除去したリン酸水溶液(ｐＨ8.1、1.0 ｍＭ、4.5 ｍＬ)に加え、溶液Ｂを調製した。
次に溶液Ａを溶液Ｂに添加し、室温で約５分間攪拌混合した。
その混合液を限外濾過装置(アドバンテック製ウルトラフィルター：限外濾過分子量50000)で5 ｍＬまで濃縮後、リン酸緩衝液(ｐＨ 7.4、1.0 ｍＭ、50 ｍＬ)を用いて定容量限外濾過によりエタノールを除去した。これを0.5 mLまで濃縮した。得られた混合液をガラス製バイアル瓶に充填密封し、容器中は窒素置換した。
こうして目的とする、アルブミン濃度3.16％、ポルフィリン濃度3.90ｍＭのポルフィリン金属錯体−アルブミン複合体を得た。
【００４１】
（試験例５）
実施例５で得られた分散液に酸素をフローすると、オキシ体が得られ、その可視吸収スペクトルはλmaxが421.5 ｎｍであり、この分散液を希釈し、窒素雰囲気下で少量の亜ジチオン酸を添加するとデオキシ体が得られ、その可視吸収スペクトルはλmaxが442.0 ｎｍに得られる。
なお、酸素及び窒素の交互の通気を繰り返すことによって酸素の吸脱着を行うことができた。また、電気泳動法により、アルブミンの変性を確認した結果、変性は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の医薬組成物は、酸素運搬体を必要とするあらゆる分野に利用できる。例えば、虚血部位や腫瘍組織への酸素の供給、出血時の輸血のために生体内へ投与されるか、あるいは臓器保存灌流液、体外循環液または細胞培養液として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ポルフィリン環の説明図である。
【図２】ポルフィリン環の一例を示す説明図である。
【図１】
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【図２】
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