(57)【要約】      （修正有）【課題】糖転移率の高い新規なα−グルコシダーゼ及びその製造法の提供。【解決手段】マルハナバチ属に属するハチの胸部唾液腺から分泌される糖転移率の高い新規なα−グルコシダーゼ及びその製造法を提供する。本発明のα−グルコシダーゼは、その糖加水分解および糖転移活性により、ａ）β−Ｄ−フルクトフラノシル  α−Ｄ−イソマルトオリゴ糖（Ｇα１→（６Ｇα１） n=0-10→６Ｇα１→２βＦ）；ｂ）イソマルトオリゴ糖（Ｇα１→（６Ｇα１）n=0-10→６Ｇ）；および／またはｃ）ボンバスオリゴ糖（Ｇα１→（６Ｇα１）n=0-10→６Ｇα１→１Ｆ）およびトレハルロース（Ｇα１→１Ｆ）；（ここで、Ｇはグルコースを、Ｆはフルクトースをそれぞれ示す）を産生することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
新規α−グルコシダーゼであって、以下の理化学的性質：
（１）スクロース（Ｇα１→２βＦ；グルコース（Ｇで示す）とフルクトース（Ｆで示す）がそれぞれα１とβ２で結合）に対する高い基質特異性；
（２）最大６０％以上の糖転移率となる糖転移活性；
を有し、かつ、当該α−グルコシダーゼがスクロースを基質とする、糖分解および糖転移反応によって次のａ、ｂ及び／又はｃのオリゴ糖：
ａ）β−Ｄ−フルクトフラノシル  α−Ｄ−イソマルトオリゴ糖（β-D-Fructofuranosyl α-D-isomaltooligosaccharides：Ｇα１→（６Ｇα１）n=0-10→６Ｇα１→２βＦ）；
ｂ）イソマルトオリゴ糖（Isomaltooligosaccharides：  Ｇα１→（６Ｇα１）n=0-10→６Ｇ）；
ｃ）ボンバスオリゴ糖（Bombusoligosaccharides；Ｇα１→（６Ｇα１）n=0-10→６Ｇα１→１Ｆ）およびトレハルロース（Trehalurose：Ｇα１→１Ｆ）；
を産生することを特徴とする、前記α−グルコシダーゼ。
【請求項２】
マルハナバチ属（Ｂｏｍｂｕｓ）に属するハチに由来する、請求項１に記載の新規α−グルコシダーゼ。
【請求項３】
マルハナバチ属（Ｂｏｍｂｕｓ）に属するハチが、トラマルハナバチ、コマルハナバチ、エゾトラマルハナバチ、セイヨウオオマルハナバチ、クロマルハナバチ、エゾオオマルハナバチ、オオマルハナバチに属するハチであることを特徴とする請求項２に記載の新規α−グルコシダーゼ。
【請求項４】
マルハナバチ属に属するハチの胸部唾液腺により分泌される請求項１から３のいずれか１項に記載の新規α−グルコシダーゼ。
【請求項５】
ｐＨ５−７の至適ｐＨ；２５−４０℃の至適温度；５０ｍＭクエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）中、４５℃で３０分間のインキュベーション後では約９０％程度、５０℃で３０分間のインキュベーション後では約５０％程度の活性を維持する熱安定性；および、Ｃａ2+要求性である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の新規α−グルコシダーゼ。
【請求項６】
請求項１から５に記載の新規α−グルコシダーゼの製造方法であって、以下の工程：
１）マルハナバチ属に属するハチの胸部唾液腺を取り出してホモジネートし、または、マルハナバチ属に属するハチの蜂蜜を採取し；および、
２）透析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点電気泳動、およびポリアクリルアミドゲル電気泳動からなる群から選択される１以上の方法によって、本発明のα−グルコシダーゼを分離精製して酵素を得る；
ことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖転移率の高い新規なα−グルコシダーゼ及びその製造法に関するものであり、さらに詳しくは、マルハナバチの胸部唾液腺から分泌される糖転移率の高い新規なα−グルコシダーゼ及びその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴ糖は単糖類が２個以上グリコシド結合でつながった糖の総称で、結合する単糖の数で、二糖類（disaccharide）、三糖類（trisaccharide）、四糖類（tetrasaccharide）、五糖類（pentasaccharide）、六糖類（hexasaccharide）などに分類される。天然に最も多いオリゴ糖は二糖類で、なかでも、ほとんどの植物体に含まれる蔗糖（スクロース：Ｇα１→２βＦ、グルコース（Ｇ）とフルクトース（Ｆ）がそれぞれα１とβ２で結合）が最も多く、次が動物のミルクの乳糖（ラクトース：  Ｇａｌβ１→４Ｇ）がある。オリゴ糖を消化吸収で区別すると消化性と難消化性に大別できる。消化性のオリゴ糖（スクロース（Ｇ１α→２βＦ）、トレハロース（Ｇα１→α１Ｇ）、パラチノース（Ｇ１α→６Ｆ）、マルトオリゴ糖（Ｇα１→（４Ｇα１）n=0-8→４Ｇ）、カップリングシュガー（Ｇα１→４Ｇα１→４Ｇα１→２Ｆ））は小腸でアミラーゼなどにより分解され単糖で吸収され、大腸には達しない。一方、難消化性のオリゴ糖（キシロオリゴ糖（Ｘβ１→（４Ｘβ１）n=0-3→４Ｘ；ここで、Ｘはキシロースを示す）、フルクトオリゴ糖（Ｇα１→（２Ｆα１）n=1-3→２Ｆ）、ガラクトオリゴ糖（Ｇａｌβ１→（４Ｇａｌβ１）n=1-4→４Ｇ）、乳化オリゴ糖（Ｇａｌβ１→４Ｇα１→２Ｆ）、ラクチュロース（Ｇａｌβ１→４Ｆ））は小腸の消化酵素では分解されず、大腸内において腸内細菌（ビフィズス菌）に資化されて、単糖となって吸収される。したがって、難消化性オリゴ糖は結果としてビフィズス菌の割合を増加させる。このように、糖や配糖体に更に糖を修飾することにより、それらの糖や配糖体に新たな生理活性や物性を付与することが知られている。例えば、甘味度を増加あるいは低減、苦味を緩和あるいは消去、ビフィズス活性（腸内有用菌の活性化）、抗う触性などを挙げることができ、個々のオリゴ糖を種々の機能で特徴付けている。
【０００３】
グルコースのみからなるオリゴ糖は水飴に含まれるα１，４結合のみからなる構造をもった代表的なオリゴ糖（マルトオリゴ糖）に対して、α１，６結合のみからなるイソマルトオリゴ糖をはじめとして、α１，２結合及びα１，３結合といったα１，４結合とは異なった結合を有するオリゴ糖などもある。またこれらの結合様式が混在したり、分岐構造を持ついわゆる分岐オリゴ糖も存在する。近年、これらオリゴ糖について研究が進み、好ましい特性として知られていた甘味特性、優れた保湿性、澱粉性食品の劣化防止効果などとともに、抗う触性及びビフィズス因子特性があることが明らかにされ注目を集めている。一般的なイソマルトオリゴ糖の製造法は、澱粉をα−アミラーゼで液化した後、β−アミラーゼとプルラナーゼ及びα−グルコシダーゼと呼ばれる３種類の酵素を作用させ、イソマルトオリゴ糖を約５０％含有する糖化液を得、イオン交換樹脂を用いたクロマト分離によりイソマルトオリゴ糖の含有率を８５％以上に高めているが、酵素反応のみで高含有率のイソマルトオリゴ糖を得ることはできていない（「植物資源の生理活性物質ハンドブック」監修：谷村顕雄、ｐ４１１−４１７（１９９８）、株式会社サイエンスフォーラム：非特許文献１）。したがって、高含有率のイソマルトオリゴ糖を得るには、グルコースをα１，６結合で転移させる能力の高い、食品製造に供することのできる安全性の高いα−グルコシダーゼが望まれていた。α−グルコシダーゼは、配糖体あるいはオリゴ糖のグルコシド結合を加水分解する機能とグルコースをα型で糖転移させる機能のふたつの相反する機能を有しており、オリゴ糖の合成には糖転移率の高いα−グルコシダーゼの開発が望まれていた。
【０００４】
オリゴ糖の酵素合成では、糖供与体として糖ヌクレオチドを用いるグリコシルトランスフェラーゼを用いる方法もあるが、糖ヌクレオチドは一般的に高価で、それ自身を調製するためにまた別の酵素を必要とするのが通例である。一方、本発明のようにグルコシダーゼによるオリゴ糖合成は一般的に安価な基質を用いることが可能で、操作も簡単なのが特徴である（「糖鎖工学」、監修：糖鎖工学研究協議会、ｐ．５０６（１９９２）、産業調査会：非特許文献２）。しかし、上述したα−グルコシダーゼなどではその転移の位置特異性の低さから、多種類のオリゴ糖が生じて生成物の単離精製が困難になるなどの問題が生じることがある（「糖質の化学」、新家龍ら、ｐ．６０（１９９８）、朝倉書店：非特許文献３）。したがって、グルコシダーゼによるオリゴ糖の合成においては、糖転移反応の位置特異性の高い酵素が望まれていた。
【非特許文献１】「植物資源の生理活性物質ハンドブック」、監修：谷村顕雄、ｐ４１１−４１７（１９９８）、株式会社サイエンスフォーラム
【非特許文献２】「糖鎖工学」、監修：糖鎖工学研究協議会、ｐ．５０６（１９９２）、産業調査会
【非特許文献３】「糖質の科学」、新家  龍ら、ｐ．６０（１９９８）、朝倉書店
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、糖転移活性の高い新規なα−グルコシダーゼ、およびその製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の新規α−グルコシダーゼは、以下の理化学的性質：
（１）スクロース（Ｇα１→２βＦ；グルコース（Ｇで示す）とフルクトース（Ｆで示す）がそれぞれα１とβ２で結合）に対する高い基質特異性；
（２）最大６０％以上の糖転移率となる糖転移活性；
を有し、かつ、当該α−グルコシダーゼがスクロースを基質としたとき、糖分解および糖転移反応によって次のａ、ｂ及び／又はｃのオリゴ糖：
ａ）β−Ｄ−フルクトフラノシル  α−Ｄ−イソマルトオリゴ糖（β-D-Fructofuranosyl α-D-isomaltooligosaccharides：Ｇα１→（６Ｇα１）n=0-10→６Ｇα１→２βＦ）；
ｂ）イソマルトオリゴ糖（Isomaltooligosaccharides：  Ｇα１→（６Ｇα１）n=0-10→６Ｇ）；
ｃ）ボンバスオリゴ糖（Bombusoligosaccharides；Ｇα１→（６Ｇα１）n=0-10→６Ｇα１→１Ｆ）およびトレハルロース（Trehalurose: Ｇα１→１Ｆ）；
を産生する性質を有する。
【０００７】
本発明の新規なα−グルコシダーゼは、マルハナバチ属に属するハチが胸部唾液腺から分泌する高い糖転移活性を有するα−グルコシダーゼとして見いだされた。
発明に至った経緯
マルハナバチ属（Ｂｏｍｂｕｓ）に属するハチは施設園芸作物の受粉用昆虫として近年、利用が広まっている。ミツバチと同様にマルハナバチ属（Ｂｏｍｂｕｓ）に属するハチも花の蜜を集め、巣の中に貯蔵し、それが熟成し蜂蜜となるが、その利用はほとんどなされておらず、蜜中に蓄積する及びマルハナバチ属（Ｂｏｍｂｕｓ）に属するハチが分泌するα−グルコシダーゼに高い糖転移率を有することも全く知られておらず、本発明によって初めて明らかとなった。
【０００８】
蜂蜜採取用のセイヨウミツバチ（Apis mellifera）の蜂蜜の糖組成は、花の蜜の主成分であるスクロースから唾液中の酵素により生成した転化糖（グルコースとフルクトースの混合物）が主成分で、全糖量の約１０％程度が糖転移反応で生成した低重合度オリゴ糖（α１，４結合が主体）である。一方、マルハナバチ属（Ｂｏｍｂｕｓ）に属するハチの蜂蜜、特にトラマルハナバチ（Bombus diversus diversus）の蜂蜜においては、スクロース（Ｇα１−２βＦ、グルコース（Ｇ）とフルクトース（Ｆ）がそれぞれα１とβ２で結合）及びスクロースを構成する単糖であるグルコース（Ｇ）がほとんど存在せず、スクロースを構成するもう一方のフルクトース（Ｆ）と構造不明のオリゴ糖が５０％以上を占める、特徴的な組成を示していた。
【０００９】
本発明者らは構造不明のオリゴ糖の構造を調べ、次の３種のオリゴ糖からなることを明らかにした。
ａ）  β−Ｄ−フルクトフラノシル  α−Ｄ−イソマルトオリゴ糖（β-D-Fructofuranosyl α-D-isomaltooligosaccharides：Ｇα１→（６Ｇα１）n=0-10→６Ｇα１→２βＦ）：これは、スクロースのグルコース残基の６位にグルコースがα１，６結合で結合し、場合によりさらに、非還元末端側のグルコース残基の６位にグルコースがα１，６結合で次々に結合した構造を有するオリゴ糖である。ｎ＝２以上は今までに明確な物理および化学的特性が記載されていないオリゴ糖である。
【００１０】
ｂ）  イソマルトオリゴ糖（Isomaltooligosaccharides：Ｇα１→（６Ｇα１）n=0-10→６Ｇ）：これは、グルコースがα１，６結合で次々に結合した構造を有するオリゴ糖である。
【００１１】
ｃ）  ボンバスオリゴ糖（Bombusoligosaccharides：Ｇα１→（６Ｇα１）n=0-10−６Ｇα１→１Ｆ）：これは、トレハルロース（Ｇα１→１Ｆ）のグルコース残基の６位にグルコースがα１，６結合で結合し、場合によりさらに、非還元末端側のグルコース残基の６位にグルコースがα１，６結合で次々に結合した構造を有するオリゴ糖である。ボンバスオリゴ糖は今までにない新規なオリゴ糖であり、ボンバス（Ｂｏｍｂｕｓ）オリゴ糖と命名した。ただし、トレハルロースも蜂蜜中に残存している。
【００１２】
これらオリゴ糖は、主骨格はイソマルトオリゴ糖（Ｇα１→（６Ｇα１）n→６Ｇ）グルコオリゴ糖であり、β−Ｄ−フルクトフラノシルα−Ｄ−イソマルトオリゴ糖はスクロースを、イソマルトオリゴ糖はグルコースを、ボンバスオリゴ糖はトレハルロースを、それぞれの還元末端に結合した構造を有する。そして、構造解析の結果、ミツバチ由来のα−グルコシダーゼの転移生成物で見られるα１，４結合したグルコオリゴ糖など、二級水酸基を介して結合したオリゴ糖はほとんど認められず、すべてα１，６結合したオリゴ糖であった。
【００１３】
新規α−グルコシダーゼの酵素作用
本発明者らは、これらオリゴ糖はマルハナバチ（Ｂｏｍｂｕｓ）に属するハチの胸部唾液腺から分泌される糖転移率の高い新規なα−グルコシダーゼの作用により生成されたものであると結論づけた。すなわち、上記３つのオリゴ糖ａ、ｂおよびｃは、当該新規なα−グルコシダーゼによる加水分解反応および糖転移反応により以下のように生成されたものである：
ａ）の糖は、当該新規なα−グルコシダーゼの糖転移活性により、スクロースのグルコース残基の６位にグルコースがα１，６結合で転移し、さらに、非還元末端側のグルコース残基の６位にグルコースがα１，６結合で次々に転移して生じたオリゴ糖であり；
ｂ）の糖は、当該α−グルコシダーゼの加水分解活性によりスクロースから生じたグルコースに、当該α−グルコシダーゼの糖転移活性により別のグルコースがα１，６結合で転移し、さらに、非還元末端側のグルコース残基の６位にグルコースがα１，６結合で次々に転移して生じたオリゴ糖であり；そして、
ｃ）の糖は、当該α−グルコシダーゼによるスクロースの加水分解・糖転移反応によりトレハルロース（Ｇα１→１Ｆ）が生成し、次いで、トレハルロースのグルコース残基の６位にグルコースがα１，６結合で転移し、さらに、非還元末端側のグルコース残基の６位にグルコースがα１，６結合で次々に転移して生じたオリゴ糖である。
【００１４】
酵素学的性質
本発明のα−グルコシダーゼはスクロースを主な基質とする。すなわち、スクロースをグルコース側から切断し、グルコシル酵素中間体もしくは複合体とフルクトースとする。基質が高濃度に存在する場合、スクロースや加水分解反応で生じたフルクトース、および加水分解反応で生じたグルコースを初期受容体として、α型でグルコシル残基を転移し、オリゴ糖を生成する。生じたオリゴ糖も糖転移の受容体になり得るので、次々とグルコシル残基が転移し、糖鎖が伸長してボンバスオリゴ糖をはじめとするマルハナバチ（Ｂｏｍｂｕｓ）に特有の高重合オリゴマーを生じる。この結果として、マルハナバチ（Ｂｏｍｂｕｓ）に属するハチの蜂蜜中にはスクロースとグルコースがほとんど存在せず、フルクトースと様々な重合度のオリゴ糖が半分ずつ占めるという特有の糖組成を形成する。このように、生じるオリゴ糖を構造解析した結果、本発明のα−グルコシダーゼは、グルコースの６位水酸基もしくはそれに構造的に類似したフルクトースの１位などの一級水酸基にのみ糖転移を起こすことが明らかになった。したがって、本発明のα−グルコシダーゼは基質のスクロースから切り出されたグルコースがほとんど残存しなくなるまでの高い糖転移活性を有しているのが特徴である。高い糖転移活性の指標となるのは、糖転移率（スクロースを基質として、糖転移率（％）＝（（Ｆ−Ｇ）／Ｆ）ｘ１００（Ｆは、生成したフルクトース量、Ｇは生成したグルコース量））である。糖転移率は、スクロースなどの基質の初期濃度の増加に伴って増大していくが、基質濃度が十分に高いと飽和に達する。本発明のα−グルコシダーゼにおいて飽和の糖転移率は、酵素の由来や反応の条件に応じて変化するが、典型的には６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上の糖転移率（％）である。このような高い糖転移率はいままでになく、産業利用上、非常に有用である。
【００１５】
本発明のα−グルコシダーゼの転移反応はスクロースを糖供与体として、スクロースのグルコース残基を糖受容体となるグルコース６位の一級水酸基もしくはそれと化学的環境が似たフルクトース１位一級水酸基に転移する初発反応ばかりか、スクロースやこの転移反応で生じたグルコオリゴ糖も糖受容体として認識し、その非還元末端のグルコース残基６位水酸基にも伸長転移反応を起こす。それゆえ中長鎖イソマルトオリゴ糖を主要部分構造とするオリゴ糖を生成する。
【００１６】
加水分解基質および糖供与体に対する特異性
本発明の酵素のα−グルコシダーゼ活性に対する基質特異性を検討した。その結果、スクロースが最良の基質であり、その分解活性を１００％とするとトレハロース（Ｇα１−α１Ｇ）は１％、イソマルトースは０．７％とごく僅かしか作用しなかった。また、マルトース（Ｇα１−４Ｇ）、およびメチルα−Ｄ−グルコピラノシド０％と全く作用しなかった。さらに、スクロースの位置異性体であるトレハルロース（Ｇα１−１Ｆ）、ツラノース（Ｇα１−３Ｆ）、マルチュロース（Ｇα１−４Ｆ）、パラチノース（Ｇα１−６Ｆ）も、いずれも０％とまったく分解されなかった。スクロースの合成アナログである６G−デオキシスクロース、６G−デオキシ−６G−フルオロスクロース、６F,６G−ジデオキシ−６F,６G−ジフルオロスクロースにも全く作用しなかった（表１参照）。
【００１７】
したがって、本発明のα−グルコシダーゼにおいて、スクロースに対する高い基質特異性とは、スクロースについての分解活性を１００％としたときに、その他の基質に対しての分解活性が５ないし０％であることをいう。
【００１８】
以上のように、本発明の酵素はスクロースに極めて高い基質特異性をもつα−グルコシダーゼである。
【００１９】
【表１】
2005080515.tif 000002
【００２０】
糖受容体に対する特異性
この転移反応の糖受容体特性を明らかにするため、転移反応がほとんど起こらずもっぱら加水分解反応が進む低濃度（１０ｍＭ）のスクロースを糖供与体として用い、１０ｍＭの各種糖を添加し、それらが糖受容体となりうるかを検討した（表２および３を参照）。
【００２１】
その結果、グルコース、フルクトースやスクロースは糖受容体としての性能はむしろ低く、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソマルトテトラオース、イソマルトペンタオースのほうが圧倒的に糖受容体として優れていた（表２参照）。このことは、前述の初発糖転移反応よりも中長鎖オリゴ糖伸長反応がおきやすいことを示している。また、驚いたことにイソマルト系オリゴ糖は酵素反応液中に共存すると糖供与体のスクロース分解反応を促進することが観測された。すなわち、初発反応は基質となるスクロースやフルクトースの濃度が蜂蜜中では極めて高いためにその低い糖受容体能にもかかわらず充分な割合で起きると考えられ、いったん初発糖転移反応さえ起きれば後のオリゴ糖伸長反応が促進されることとなる。これらの結果は本酵素の高いオリゴ糖合成能力と、マルハナバチ属の蜂蜜の特徴である中長鎖オリゴ糖蓄積をよく説明している。
【００２２】
一方、非天然型の基質においても検討を行った（表３参照）。メチル  α−Ｄ−マンノピラノシド、メチル  α−Ｄ−ガラクトピラノシドも糖受容体となり、その６位にグルコースがα型で転移されることがわかった。また、メチル  α−Ｄ−グルコピラノシドはグルコースに比べて格段に優れた糖受容体となりうることから、糖受容体の１位の置換基が酵素によく認識されていることがわかる。また、メチル  ３−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシドはその受容体能がメチル  α−Ｄ−グルコピラノシドより極端に低下することから本酵素はメチル  α−Ｄ−グルコピラノシドの３位水酸基を認識していることが示唆される。
【００２３】
【表２】
2005080515.tif 000003
【００２４】
【表３】
2005080515.tif 000004
【００２５】
理化学的性質
本発明の酵素は塩基性糖タンパク質で、約７３ｋＤａ及び約７１ｋＤａの２種があり、両酵素の差は糖鎖の違い（グライコフォーム）である。スクロースの加水分解反応におけるミカエリス定数（Ｋｍ）は、７３ｋＤａの酵素（ＢＤＴＧａｓｅ  Ｉ）では４２．９ｍＭ、７１ｋＤａの酵素（ＢＤＴＧａｓｅ  ＩＩ）では４８．１ｍＭであった（表４参照）。なお、ミカエリス定数の測定値は、測定条件や酵素のロットにより上記値と若干異なる可能性があることは、理解すべきである。
【００２６】
当該新規なα−グルコシダーゼの至適ｐＨは約５−７、至適温度は約２５−４０℃、５０ｍＭクエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）中、４５℃で３０分間のインキュベーション後では約９０％程度、５０℃で３０分間のインキュベーション後では約５０％程度の活性を維持する。また、本発明のα−グルコシダーゼについて陽イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーを行うと、本酵素は活性が著しく低下するが、その低下はＣａ2+の添加で回復できることから、本酵素はＣａ2+要求性である。
【００２７】
【表４】
2005080515.tif 000005
【００２８】
製造方法
本発明は、本発明のα−グルコシダーゼの製造方法も提供する。
本発明のα−グルコシダーゼは、マルハナバチ属に属するハチの胸部唾液腺により分泌される酵素である。また、本発明の酵素は、マルハナバチ属に属するハチの蜂蜜中にも蓄積されている。したがって、本発明のα−グルコシダーゼの製造方法は、以下の工程：
１）マルハナバチ属に属するハチの胸部唾液腺を取り出してホモジネートし、または、マルハナバチ属に属するハチの蜂蜜を採取し；および、
２）透析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を含むがこれに限定されない常法によって、本発明のα−グルコシダーゼを分離精製して酵素を得る；
ことを含む方法である。
【００２９】
マルハナバチ属に属するハチの胸部唾液腺の採取とホモジネートは、例えば以下のように行う。まず、マルハナバチを二酸化炭素で麻酔し、胸部を腹側の正中線に沿って切開し、クチクラ層を左右に広げ回胸する。胸部筋肉群をわけながら食道の両側にある胸部唾液腺を切除する。切除した胸部唾液腺は液体窒素に漬けながらガラス棒でつぶし、ホモジネートとする。
【００３０】
透析は、例えば、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶いた上記ホモジネートやマルハナバチの蜂蜜を透析膜に入れ、同緩衝液に対して０℃の条件で行うことができる。
【００３１】
イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０から７．０）で平衡化したＣＭ−セファロース（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）に透析後の粗酵素を付与し、同緩衝液でカラムを洗った後、塩化カリウムで濃度勾配溶出することで行うことができる。
【００３２】
ゲルろ過クロマトグラフィーは、例えば、セファデックスＧ１００（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）を用いて５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０から７．０）で展開することにより行うことができる。
【００３３】
等電点電気泳動は、ｐＨ３〜８程度のアマシャムバイオサイエンス株式会社製のポリバッファー交換体などを用いてｐＨ勾配を作成し、行うことができる。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動での本発明のα−グルコシダーゼの分離は、ゲル濃度６％程度のポリアクリルアミドを作成し、行うことができる。
【００３４】
また、本発明において、マルハナバチ属に属するハチは、コマルハナバチ（Bombus ardens）、エゾトラマルハナバチ（Bombus diversus tersatus）、トラマルハナバチ（Bombus diversus diversus）、セイヨウオオマルハナバチ（Bombus terrestris）、クロマルハナバチ（Bombus ignites）、エゾオオマルハナバチ（Bombus hypocrita sapporoensis）、オオマルハナバチ（Bombus hypocrita hypocrita）および和名がない種としてボンバス  インパチエンス（Bombus impatiens）を含む。クロマルハナバチ（Bombus ignites）、セイヨウオオマルハナバチ（Bombus terrestris）、およびボンバス  インパチエンス（Bombus impatiens）はオランダのKoppert Biological System社より入手可能で、コマルハナバチ（Bombus ardens）、トラマルハナバチ（Bombus diversus diversus）、オオマルハナバチ（Bombus hypocrita hypocrita）は山梨県、長野県の低山帯に生息しており採集可能である。また、エゾオオマルハナバチ（Bombus hypocrita sapporoensis）、エゾトラマルハナバチ（Bombus diversus tersatus）は北海道沙流郡に生息しおり採集可能である。これらのマルハナバチ属（Ｂｏｍｂｕｓ）に属するハチはいずれもなんら制限なく入手することができる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明のα−グルコシダーゼは、糖転移反応において高い糖転移率と、高い糖転移位置特異性を有する。すなわち、本発明の酵素は、グルコースあるいはそれと類似構造の一級水酸基に、高選択的かつ高効率で、グルコースを転移できる点が特徴である。特に、本発明のα−グルコシダーゼは、グルコースをα１，６結合で転移させる活性が非常に高いため、イソマルトオリゴ糖、または、一部にイソマルトオリゴ糖の構造を含むオリゴ糖の効率のよい生産に貢献する。本発明のα−グルコシダーゼを用いてオリゴ糖の生産を行うと、オリゴ糖として生成する割合が高いため、精製に手間がかからない点でも大きな効果を発揮する。
【００３６】
また、本酵素は糖以外の受容体になりうる水酸基を持つ化合物などにグルコースを転移し、新たな配糖体を合成することに用いられ、これにより不溶性もしくは難溶性物質に水溶性を付与することが可能である。
次に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。しかし、本発明は、実施例に限定されない。
【実施例】
【００３７】
実施例１  マルハナバチ属（Ｂｏｍｂｕｓ）に属する蜂蜜中のオリゴ糖生産酵素の精製
トラマルハナバチの蜂蜜を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．０）で１０倍に希釈し、遠心分離により花粉などの不要物を除去後、上清を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．０）に対して透析を行い、この透析内液（高分子量成分）を限外濾過にて濃縮した。この濃縮物を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＣＭ−セファロースカラムクロマトグラフィーに供し、同緩衝液で非吸着成分を溶出後ＫＣｌ濃度勾配法（ｐＨ７．０，ＫＣｌ  ０→０．６Ｍ）により溶出した。図１に示すように、タンパク質の溶出を△で、活性を●で示した。
【００３８】
活性は各画分に塩化カルシウムを０．２ｍＭとなるように添加後、以下のように測定した。まず各画分１０〜数十μｌを最終濃度０．５Ｍのスクロース５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液に最終量３００μｌになるように添加し３０℃で３０分間インキュベートした。次にこの反応液に４．４ｍＭ  ２，４−ジニトロサリチル酸、１．２Ｍ  （＋）酒石酸カリウムナトリウム、０．４Ｍ  水酸化ナトリウムからなる発色試薬３ｍｌを加え１００℃で１０分間加熱した。室温に冷却後、５７０ｎｍにおける吸光度を測定し、酵素反応で生じた還元糖量を求め酵素活性の測定とした。
【００３９】
その結果、ふたつの活性画分が見出され、それぞれの活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、ふたつのオリゴ糖生成酵素は単一のバンドを示すまで精製できた。次にこの精製した酵素を用いて物理化学的性質を検討した結果、本酵素は塩基性糖タンパク質で、７３ｋＤａ及び７１ｋＤａの２種があり、両酵素の差は糖鎖の違い（グライコフォーム）であった。至適ｐＨ  は５−７、至適温度は２５−４０℃、５０ｍＭクエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）中４５℃３０分間のインキュベーション後では９０％程度、５０℃３０分間のインキュベーション後では約５０％程度の活性を維持していた。また、Ｃａ2+要求性を示した。
【００４０】
実施例２  α１−６グルコシド結合の確認
スクロースと実施例１で取得した酵素（ＢＤＴＧａｓｅ）をＮＭＲチューブ内で反応させ、経時変化を13Ｃ  ＮＭＲを測定し、生成物の構造を確認した。具体的には５ｍｍ  ＮＭＲ用チューブに重水５０μｌ、１．２５Ｍ  スクロースの６２．５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）溶液２００μｌを入れ、次に当該グルコシダーゼ０．３０７ｕｎｉｔを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μｌを加え、反応を開始し１００．５ＭＨｚの共鳴周波数で13Ｃ核磁気共鳴スペクトルを完全プロトンデカップリング下、経時的に測定した。反応時間が進むとともに、基質のスクロース（Ｓ）のシグナルが消失し、代わりにフルクトース（Ｆ）のシグナルが増加し、また、ボンバスオリゴ糖をはじめとする明細書本文記載のａ、ｂ及びｃの構造をもつオリゴ糖の主要構造部分であるα１−６グルコシド結合の１位および６位炭素、フルクトース１位に結合したグルコース１位の炭素の増加を確認し、本酵素がα−グルコシダーゼで、グルコースをα１−６結合で転移させることを明らかにした。
【００４１】
実施例３  糖転移率の測定
５０μｍｏｌスクロースと０．１５ｕｎｉｔの実施例１で取得した酵素（ＢＤＴＧａｓｅ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．０，  スクロース濃度として０−５００ｍＭ）１００μｌ中、３０℃で２０分間反応させた。１ｕｎｉｔは同じ反応条件で１分間に１μｍｏｌのフルクトースを生成する酵素量と定義した。
【００４２】
１００℃で５分間加熱して反応を停止させた後、この反応液の一定量を採取し、Ｆ−キット（グルコース／フルクトース測定用、ヘキソキナーゼ／グルコース−６−リン酸オキシダーゼ／グルコース−６−リン酸イソメラーゼ法、ベーリンガーマンハイム社製）を用いて反応で生じたグルコース及びフルクトース量を測定した。加水分解率は、加水分解率（％）＝（生成したグルコース量／生成したフルクトース量）ｘ１００％として算出し、糖転移率は、糖転移率（％）＝（（生成したフルクトース量  −  生成したグルコース量）／生成したフルクトース量）ｘ１００として算出した。ＢＤＴＧａｓｅの加水分解率（％）及び糖転移率（％）を図２に示す。スクロース濃度１００ｍＭの糖転移率は４６％であり、スクロース濃度５００ｍＭでは、驚くべきことに糖転移率は８８％に達した。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィーによるトラマルハナバチ蜂蜜中のα−グルコシダーゼの精製において分取した各フラクションの分析結果を示すグラフ（左図）、および、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるα−グルコシダーゼの分析結果を示すゲルの写真（右図）である。ＢＤＴＧａｓｅ  ＩおよびＩＩは、本発明のα−グルコシダーゼのグライコフォームのそれぞれを意味する。左図において、△は、タンパク質濃度を、●は相対α−グルコシダーゼ活性を示す。
【図２】図２は、トラマルハナバチ胸部唾液腺由来のα−グルコシダーゼの糖転移活性と加水分解活性の基質濃度依存性を示すグラフである。△は相対糖転移率を、●は相対加水分解率を示す。
【図１】
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【図２】
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