(57)【要約】      （修正有）【課題】分子量を揃え、二本鎖を保持した高純度ＤＮＡの調製方法と、機能性素材としてのＤＮＡを提供する。【解決手段】高純度高分子ＤＮＡに、ＤＮＡ鎖を切断する酵素で酵素分解処理し、目的とする分子量のＤＮＡに切断調整した後、これに一本鎖ＤＮＡを特異的に切断する酵素で更に酵素処理して一本鎖ＤＮＡを切断し、その切断された一本鎖ＤＮＡを除去することによって、目的の分子量に揃えるとともに二本鎖ＤＮＡの割合が高くなることを特徴とする機能性素材としてのＤＮＡの調製方法である。また、該調製方法で得られた機能性素材としてのＤＮＡ溶液と脂質溶液とを混合攪拌してＤＮＡ−脂質コンプレックスを得て、これを熱による圧着や有機溶媒に溶解し、広げるように延ばして乾燥させ、薄膜状のＤＮＡフイルムを得ることを特徴とする高機能性ＤＮＡフイルムの調製方法である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
高純度高分子ＤＮＡに、ＤＮＡ鎖を切断し得る酵素を加えて酵素分解処理し、目的に応じた分子量のＤＮＡに切断調整した後、これに一本鎖ＤＮＡを特異的に切断し得る酵素を加えて更に酵素処理して一本鎖ＤＮＡを切断し、その切断された一本鎖ＤＮＡを除去することによって、目的の分子量に揃えるとともに二本鎖ＤＮＡの割合が高くなることを特徴とする機能性素材としてのＤＮＡの調製方法。
【請求項２】
高純度高分子ＤＮＡに、ＤＮＡ鎖を切断し得る酵素を加えて酵素分解処理し、目的に応じて分子量５万−３００万（１００−５０００塩基対）のＤＮＡに切断調整した後、これに一本鎖ＤＮＡを特異的に切断し得る酵素を加えて酵素処理して一本鎖ＤＮＡを切断し、その切断された一本鎖ＤＮＡを除去することによって、目的に応じて分子量５万−３００万（１００−５０００塩基対）に揃えるとともに二本鎖ＤＮＡの割合が高くなることを特徴とする機能性素材としてのＤＮＡの調製方法。
【請求項３】
高純度高分子ＤＮＡに、ＤＮＡ鎖を切断し得る酵素を加えて酵素分解処理することにより目的に応じた所定の分子量のＤＮＡに切断調整したうえ、これに一本鎖ＤＮＡを特異的に切断し得る酵素を加えて酵素処理することにより一本鎖ＤＮＡを切断し、その切断された一本鎖ＤＮＡを除去することによって、目的に応じて分子量を５万−３００万（１００−５０００塩基対）に揃えるとともに、二本鎖ＤＮＡの割合が高くなるようにして、二本鎖構造に基づくDNAの機能が高められたことを特徴とする機能性素材としてのＤＮＡ。
【請求項４】
高純度高分子ＤＮＡに、ＤＮＡ鎖を切断し得る酵素としてプロテアーゼを加えて酵素分解処理し、ほぼ２００−６００塩基対のＤＮＡに切断調整した後、これに一本鎖ＤＮＡを特異的に切断し得る酵素としてＳ１ヌクレア−ゼを加えて酵素処理して一本鎖ＤＮＡを切断し、その切断された一本鎖ＤＮＡを除去することによって、目的に応じて３００−５００塩基対に揃えるとともに二本鎖ＤＮＡの割合が高くなることを特徴とする機能性素材としてのＤＮＡの調製方法。
【請求項５】
高純度高分子ＤＮＡに、ＤＮＡ鎖を切断し得る酵素を加えて酵素処理し、目的に応じた分子量のＤＮＡに切断調整した後、これに一本鎖ＤＮＡを特異的に切断し得る酵素を加えて更に酵素処理して一本鎖ＤＮＡを切断し、その切断された一本鎖ＤＮＡを除去することによって、目的の分子量に揃えるとともに二本鎖ＤＮＡの割合が高くなることを特徴とする機能性素材としてのＤＮＡに調製したうえ、当該目的の分子量に調整し且つ二本鎖ＤＮＡの割合が高い機能性素材としてのＤＮＡ溶液と脂質溶液とを混合攪拌してＤＮＡ−脂質コンプレックスを得、当該ＤＮＡ−脂質コンプレックスを熱による圧着や有機溶媒に溶解し、これを広げるように延ばして乾燥させ、薄膜状のＤＮＡフイルムを得るようにしたことを特徴とする高機能性ＤＮＡフイルムの調製方法。
【請求項６】
高純度高分子ＤＮＡに、ＤＮＡ鎖を切断し得る酵素としてプロテアーゼを加えて酵素処理し、ほぼ２００−６００塩基対のＤＮＡに切断調整した後、これに一本鎖ＤＮＡを特異的に切断し得る酵素としてＳ１ヌクレア−ゼを加えて酵素処理して一本鎖ＤＮＡを切断し、その切断された一本鎖ＤＮＡを除去することによって、３００−５００塩基対に揃え且つ二本鎖ＤＮＡの割合が高くなっている機能性素材としてのＤＮＡに調製したうえ、当該３００−５００塩基対に揃え且つ二本鎖ＤＮＡの割合が高い機能性素材としてのＤＮＡ溶液と脂質溶液とを混合攪拌してＤＮＡ−脂質コンプレックスを得て、当該ＤＮＡ−脂質コンプレックスを熱による圧着や有機溶媒に溶解し、これを薄膜状に延ばして乾燥させ、ＤＮＡフイルムを得るようにしたことを特徴とする高機能性ＤＮＡフイルムの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
近年DNAは、単に抵抗力の増加、老化防止などの生理機能に着目した健康食品として利用されるだけではなく、有機導電性素材、非線型光学材料、記録素子、有機EL素子、有害物質除去剤、医療用素材等の高分子機能性素材として注目されている。このように新しい機能性素材としてのDNAが、広く利用される為には、高純度のDNAであって、DNA特有の二重らせん、二本鎖構造を保持していること、分子量が揃っていること、一本鎖DNAが出来るだけ少ないことが必要とされている。本発明は、このような要請に応えた機能性素材としてのDNAを実現すべく、分子量を揃え、二本鎖を保持した高純度DNAを調製する方法と、機能性素材として望ましい姿に調製したDNAを提供せんとするものである。
【背景技術】
【０００２】
DNAは、構造上安定で規則正しい二本鎖構造をしており、その塩基配列により、ｍRNAを経てペプチド合成に至る遺伝子情報を担う分子として良く知られている。一方、DNAは、その二本鎖の内側には、π電位に富んだ塩基が配列されており、電気を通しやすい性質や、分子を配向化する性質を持っている。また、その二本鎖中に平面構造の有害物質（ダイオキシンなど）を取り込むこと（インターカレート）ができる性質もある。このような特性から、ＤＮＡはその導電性を利用した導電性素材や非線型光学材料、インターカレーター能を利用した記録素子や有機ＥＬ素子、有害物質除去剤、医療用素材など様々な用途での利用が、期待されている。
【０００３】
本来、ＤＮＡは、二本のポリヌクレオチドがらせんを巻いた二本鎖構造をもち、巨大な分子量を持った繊維状の形態を示している。この巨大な分子量を持つＤＮＡは機能性素材等として期待されているが、分子量が大きいほど溶媒への溶解が困難であり、扱い難い問題を持ち合わせている。そのため、この巨大な分子量を持った高分子ＤＮＡを分解して、適当な分子量のＤＮＡに低分子化することにより、取扱い易くなり、機能性素材として、用途の拡大が見込まれる。
【０００４】
従来より行われているＤＮＡの製造方法では、加熱や酸や酵素により二本鎖構造の破壊や低分子化が起こることが知られている。しかし、ＤＮＡの製造法においてその二本鎖構造の破壊や低分子化をコントロールすることまでは、発想されておらず、二本鎖のＤＮＡと一本鎖のＤＮＡと、大きさの異なる分子量のＤＮＡとが広く混在した粉末になっているのが普通である。しかし、このように、二本鎖構造が破壊されてしまっていては、機能性素材としてのＤＮＡの機能や特性が失われてしまうことが多く、また分子量の範囲が広いとその分子量の違いによって、粘性等の物性が異なり、製造等において取扱い難いものとなる。
【０００５】
そのため、機能性素材として役立つＤＮＡは、少なくとも次のような条件を備えていることが望まれている。
ａ）夾雑タンパクの少ない高純度ＤＮＡであること。
ｂ）二重らせん、二本鎖構造を保持しているＤＮＡであること。
ｃ）一本鎖DNAを出来るだけ除去し、二本鎖率の高いＤＮＡになっていること。
ｄ）適度な大きさの分子量に揃っているＤＮＡであること。
【０００６】
尚、機能性素材としてのＤＮＡは、高分子であればあるほど、溶液時の粘性が高くなり扱いが困難になることから、ある程度低分子化し、粘性を低下させることも求められる。即ち、用途や目的によっては分子量が所定の大きさに揃っていることが要請されている。従って、使い勝手のよい機能性素材等としてのＤＮＡとは、ＤＮＡを適度に低分子化処理し、粘性を低下させたものといえるが、同時に目的や用途に応じて分子量を揃えるようにすることと、二本鎖が保持されていることという調製がなされたＤＮＡということが出来る。
【０００７】
二本鎖構造を保持した高分子ＤＮＡの大量精製技術については、近年各方面で研究開発が進められているが、いまだ工業的規模での生産が行われる段階には至っていない。そのため、二本鎖構造を保持した高分子ＤＮＡは非常に高価である。このような背景から、本発明者らは、機能性素材として様々な分野からのニーズに答えられる使い勝手の良い、機能性素材としてのＤＮＡを製造することを目的に、二本鎖を保持し、望ましい所定の分子量が揃ったＤＮＡを調製する技術を開発することとした。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本出願人は、これまでにサケ白子由来のヌクレオプロテインからドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いた抽出・精製により、高純度でかつ高分子量のＤＮＡを大量に調製する方法を種々研究開発し確立してきた。その調製方法の一例が、図１に示した工程図の通りである。この調製法は、先ず、本出願人において、サケ白子から調製したヌクレオプロテインを原料として用いた。当該ヌクレオプロテインを水に懸濁し、ＳＤＳおよびNａＣｌを添加してＤＮＡを抽出した。ＳＤＳとコンプレックスを形成したプロタミンを遠心分離により除去し、得られた上清にエタノール（EｔOH）を加えてＤＮＡを沈殿物として得た。得られたＤＮＡを洗浄後、凍結乾燥により乾燥し、白色で繊維状のDNAを得た。更に、本出願人は、コスト低減の検討に関して、エタノールに代えて変性アルコール等の使用及びＵＦ膜を用いる方法を開発した。
【０００９】
このような図1の方法で得られたＤＮＡは、市販されているサケ由来のＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ社製；二本鎖率約８０％）と比較してＤＮＡ含量が同等であり、また夾雑タンパク含量が、１％未満と、市販品より優れていた。そのＤＮＡの分析結果は、表１の通りである。この結果、本製法によって市販品と同等以上のタンパク含量の低い、高純度のＤＮＡが得られた。しかも、本製法で製造された高純度ＤＮＡは、ＮａＣｌを用いて、温和な条件でＤＮＡを抽出しているので高分子量で二本鎖構造を保持したＤＮＡが高収率で含まれている。従って、この製法で得られた高純度で高分子量のＤＮＡは、機能性素材としてのＤＮＡを調製する原料としてふさわしいと判断された。
【００１０】
【表１】
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【００１１】
本発明者らは、前記製法で得られた高純度高分子ＤＮＡを原料として用いて、機能性素材等としてのＤＮＡを調製することを目的とした。尚、原料となる高純度高分子ＤＮＡというのは、二本鎖構造を保持しておりかつ高純度高分子であれば、必ずしも前記の調製法により得られたものに限る必要がなく、他の方法で調製されたものであっても良いことは勿論である。
【００１２】
高分子ＤＮＡを分解して低分子化し、所定の分子量に調整する技術としては超音波処理や酸、アルカリ処理が考えられるがＤＮＡの二本鎖構造が破壊される等あまり実用的ではない。その点、ＤＮＡ分解能を有する酵素は、種々ありその分解能特性も様々である。その点に着目して、酵素によるＤＮＡの分解処理について研究することとした。
【００１３】
本発明者らは、鋭意研究の結果、高純度高分子ＤＮＡをＤＮＡ鎖を切断する酵素を用いて酵素処理すると、まず、所定の大きさに揃った分子量に低分子化できること、及びＤＮＡ一本鎖ＤＮＡを特異的に分解する酵素によって酵素処理すると、一本鎖ＤＮＡを切断・除去することができるとの知見を得た。そこで、両酵素による処理を組み合わせてみたところ、分子量を調整しながら二本鎖率の高いＤＮＡを調製できることを見出し、本発明を完成させたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
特許を受けようとする第１発明は、高純度高分子ＤＮＡに、ＤＮＡ鎖を切断し得る酵素を加えて酵素処理し、目的に応じた分子量のＤＮＡに切断調整した後、これに一本鎖ＤＮＡを特異的に切断し得る酵素を加えて更に酵素処理して一本鎖ＤＮＡを切断し、その切断された一本鎖ＤＮＡを除去することによって、目的の分子量に揃えるとともに二本鎖ＤＮＡの割合が高くなることを特徴とする機能性素材としてのＤＮＡの調製方法である。
【００１５】
本発明に用いられるＤＮＡ鎖を切断し得る酵素とは、高分子のＤＮＡを目的の分子量に調整するためにＤＮＡ鎖を切断する分解能を有する酵素であり試薬レベルにまで精製されていることに限らず、工業用酵素等でもＤＮＡ鎖切断能を有すればこれに該当する。これらの例としてはデオキシリボヌクレアーゼＩ、デオキシリボヌクレアーゼＩＩ、ホスホジエステラーゼ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌヌクレアーゼ、また、食品工業用酵素ではウマミザイム、ニューラーゼＦ、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＭ、プロテアーゼＰ３、プロメラインＦ、プロレザー（以上、天野エンザイム（株）製）、パンチダーゼＮＰ−2、プロテアーゼＹＰ−ＳＳ（以上、ヤクルト薬品工業（株）製）、フレーバーザイム（ノボノルディスク製）、精製パパインＦ（アサヒビール（株）製）、ビオプラーゼＰＮ−4（ナガセケムテックス（株）製）等が挙げられる。
【００１６】
本発明に用いられるＤＮＡ一本鎖を特異的に切断する酵素とは、特に限定されるものでなく、例えばBAL 31 ヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレア−ゼ、マングマメヌクレア−ゼ（ヌクレア−ゼＭＢ）、ヌクレアーゼＰ１等が挙げられる。
【００１７】
前記二種類の分解能特性をもった酵素による酵素処理を組み合せることにより、目的の分子量に揃え且つ二本鎖ＤＮＡの割合が高い機能性素材としてのＤＮＡを調製できるのである。
【００１８】
特許を受けようとする第２発明は、高純度高分子ＤＮＡに、ＤＮＡ鎖を切断し得る酵素を加えて酵素分解処理し、目的に応じて分子量５万−３００万（１００−５０００塩基対）のＤＮＡに切断調整した後、これに一本鎖ＤＮＡを特異的に切断し得る酵素を加えて酵素処理して一本鎖ＤＮＡを切断し、その切断された一本鎖ＤＮＡを除去することによって、目的に応じて分子量５万−３００万（１００−５０００塩基対）に揃えるとともに二本鎖ＤＮＡの割合が高くなることを特徴とする機能性素材としてのＤＮＡの調製方法である。
【００１９】
当該第２発明の分子量を揃える範囲については、酵素のＤＮＡ分解能と、本発明を実施する目的とを勘案して実用性、実現性の可能なものとして確認して、分子量５万−３００万（１００−５０００塩基対）の範囲に限定した。尚、今後の研究如何では更に高分子のＤＮＡや低分子のＤＮＡが求められる可能性があるが、この製法を使うと上記範囲外であっても要求される分子量のＤＮＡを調製することが可能と思われる。
【００２０】
特許を受けようとする第３発明は、高純度高分子ＤＮＡに、ＤＮＡ鎖を切断し得る酵素を加えて酵素分解処理することにより目的に応じた所定の分子量のＤＮＡに切断調整したうえ、これに一本鎖ＤＮＡを特異的に切断し得る酵素を加えて酵素処理することにより一本鎖ＤＮＡを切断し、その切断された一本鎖ＤＮＡを除去することによって、目的に応じて分子量を５万−３００万（１００−５０００塩基対）に揃えるとともに、二本鎖ＤＮＡの割合が高くなるようにして、二本鎖構造に基づくDNAの機能が高められたことを特徴とする機能性素材としてのＤＮＡである。
【００２１】
当該第３発明は、機能性素材としてのＤＮＡという物の発明である。近年、機能性素材としてのＤＮＡが注目されるようになり、各方面で研究されているが、目的に応じて分子量を揃えるように切断することと、一本鎖ＤＮＡを切断し、その切断された一本鎖ＤＮＡを可及的に除去して二本鎖ＤＮＡの割合を高くするという２つの要請を同時に満足させることは、技術的に困難な課題であるとされていた。このように機能性素材としてのＤＮＡに前記のような２つの要請を同時に満足させることは、二本鎖ＤＮＡの構造を出来るだけ壊すことなく、取り扱いやすい分子量に切断することである。特に一本鎖ＤＮＡを特異的に切断し、その切断された一本鎖ＤＮＡを可及的に除去することは、これまで想起されておらず、それを実現する技術の提案はされていなかった。本発明者は、高分子ＤＮＡを酵素処理によって切断する方法に着目し、鋭意研究をしたところ、酵素の種類、酵素処理の際の温度や濃度や時間などの条件を調整することによって、切断する分子量の大きさも、一本鎖ＤＮＡの特異的な切断についてもコントロールしながら調製することが可能であるとの新しい知見を得た。本発明は、この新しい技術的知見に基づいて本願発明を完成したものである。その結果、目的に応じて分子量が揃い、二本鎖ＤＮＡの割合が高くて、二本鎖構造に基づくDNAの機能が高められたことを特徴とする機能性素材としてのＤＮＡを初めて具現化することができたのである。
【００２２】
特許を受けようとする第４発明は、高純度高分子ＤＮＡに、ＤＮＡ鎖を切断し得る酵素としてプロテアーゼＰ３を加えて酵素分解処理し、ほぼ２００−６００塩基対のＤＮＡに切断調整した後、これにＳ１ヌクレア−ゼを加えて酵素処理して一本鎖ＤＮＡを切断し、その切断された一本鎖ＤＮＡを除去することによって、目的に応じて３００−５００塩基対に揃えるとともに二本鎖ＤＮＡの割合が高くなることを特徴とする機能性素材としてのＤＮＡの調製方法である。
【００２３】
当該第４発明は、ＤＮＡ鎖を切断し得る酵素としてプロテアーゼＰ３、S１ヌクレアーゼを用いて、３００−５００塩基対に揃えるとともに二本鎖ＤＮＡの割合が高いＤＮＡに調製した実施態様項である。当該特定された分子量の範囲は、目的の汎用性が広いうえ、粘性も適度に低下していて使い勝手のよい機能性素材としてのＤＮＡとなっている。
【００２４】
特許を受けようとする第５発明は、高純度高分子ＤＮＡに、ＤＮＡ鎖を切断し得る酵素を加えて酵素処理し、目的に応じた分子量のＤＮＡに切断調整した後、これに一本鎖ＤＮＡを特異的に切断し得る酵素を加えて更に酵素処理して一本鎖ＤＮＡを切断し、その切断された一本鎖ＤＮＡを除去することによって、目的の分子量に揃えるとともに二本鎖ＤＮＡの割合が高くなることを特徴とする機能性素材としてのＤＮＡに調製したうえ、当該目的の分子量に調整し且つ二本鎖ＤＮＡの割合が高い機能性素材としてのＤＮＡ溶液と脂質溶液とを混合攪拌してＤＮＡ−脂質コンプレックスを得て、当該ＤＮＡ−脂質コンプレックスを有機溶媒に溶解し、これを薄膜状に延ばして乾燥させ、薄膜状のＤＮＡフイルムを得るようにしたことを特徴とする高機能性ＤＮＡフイルムの調製方法である。
【００２５】
当該第５発明は、機能性素材としてのＤＮＡを利用した高機能性ＤＮＡフイルムの調製方法である。ＤＮＡフイルムであって目的に応じて分子量を揃えるとともに二本鎖ＤＮＡの割合が高いものは、高機能性を具備しているが、その製造が困難である。本発明のように前段で、酵素を利用して分解処理し、目的の分子量に揃えるとともに二本鎖ＤＮＡの割合が高い機能性素材としてのＤＮＡとなし、次いで当該調製された機能性素材としてのＤＮＡを原料として薄膜化加工処理をすることによって簡単に高機能性ＤＮＡフイルムを調製することができる。このように、本願発明を用いれば高機能性ＤＮＡフイルムを工業的手段で大量生産することが可能となる。
【００２６】
特許を受けようとする第６発明は、高純度高分子ＤＮＡに鎖を切断し得る酵素プロテアーゼＰ３を加えて酵素処理し、ほぼ２００−６００塩基対のＤＮＡに切断調整した後、これに一本鎖ＤＮＡを特異的に切断し得る酵素としてＳ１ヌクレア−ゼを加えて酵素処理して一本鎖ＤＮＡを切断し、その切断された一本鎖ＤＮＡを除去することによって、３００−５００塩基対に揃えるとともに二本鎖ＤＮＡの割合が高くなっている機能性素材としてのＤＮＡに調製する。そのうえで、当該３００−５００塩基対に調整し且つ二本鎖ＤＮＡの割合が高い機能性素材としてのＤＮＡ溶液と脂質溶液とを混合攪拌してＤＮＡ−脂質コンプレックスを得て、当該ＤＮＡ−脂質コンプレックスを熱による圧着や有機溶媒に溶解し、これを広げるように延ばして乾燥させ、薄膜状のＤＮＡフイルムを得るようにしたことを特徴とする高機能性ＤＮＡフイルムの調製方法である。
【００２７】
当該第６発明は、使い勝手のよい機能性素材としてのＤＮＡを用いて実用性の高い高機能性ＤＮＡフイルムの調製方法を具現化した実施態様項である。
【発明の効果】
【００２８】
本願発明は、分子量を調整した二本鎖ＤＮＡの収率が高い機能性素材としてのＤＮＡや高機能性ＤＮＡフイルムの調製方法である。まず、機能性素材としてのＤＮＡは様々な分野での利用が考えられているが、その用途によって求められているＤＮＡの分子量は異なっている。しかし、どの分野でも重要なのは常に二本鎖を保持していることである。このように、目的の分子量に調製でき且つ二本鎖を保持しているDNAは、その機能性や品質が安定しているうえ、その粘度などの物性も一定であるため、取扱いやすいものとなり、機能性素材のＤＮＡとして高い評価を受けることができる。本発明は、この高い評価を受ける機能性素材としてのＤＮＡを所定の分子量に調整するための酵素と、一本鎖ＤＮＡを特異的に切断し、除去することによって二本鎖の割合を高めるための酵素との二種類の酵素処理により、簡単に調製できるようにしたものである。
【００２９】
また、分子量を調整した二本鎖ＤＮＡの収率が高い機能性素材としてのＤＮＡを用いて調製する高機能性ＤＮＡフイルムは、ＤＮＡ一本鎖を特異的に切断する酵素を作用させ、二本鎖率を高めることにより、より低い濃度でフイルム化することができるようになった。尚、本発明に係る調製法で得られた高機能性ＤＮＡフイルムは、高分子ＤＮＡにより作製されたフイルムと比較すると、少し厚みのあるフイルムであるが、粘性がなく、扱いやすい利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本願発明について、以下、実施例に基づいて、詳細に説明する。
【実施例１】
【００３１】
＜二本鎖３００−５００塩基対ＤＮＡの調製方法＞
２．５ｍｇ／ｍｌの高純度高分子ＤＮＡ  ８０ｍｌに、０．１ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼＰ３（天野エンザイム（株）製）を１０ｍｌ加えて、４５℃で３０分間加熱した後、酵素反応を停止させ、回収した。このようにプロテアーゼＰ３を作用させることにより、その中の夾雑ヌクレア−ゼにより、低分子化することによって所定の分子量に調整されたＤＮＡとなった。その後、得られたＤＮＡ溶液に、Ｓ１ヌクレア−ゼ（３０００Ｕ）６００μｌを加えて３７℃で３０分間加熱した後、ＤＮＡを回収した。その結果、Ｓ１ヌクレア−ゼにより、分子量が２０−３０万の３００−５００塩基対とほぼ揃ったＤＮＡに低分子化するとともに、一本鎖ＤＮＡを特異的に切断・除去して、二本鎖率を高めることができた。当該二本鎖３００−５００塩基対ＤＮＡの調製方法のフローを図２に示す。
【００３２】
＜分子量の確認＞
前記調製方法により得られた二本鎖３００−５００塩基対ＤＮＡの分子量分布をキャピラリー電気泳動により調べた。その結果、図３に示すように二本鎖３００−５００塩基対ＤＮＡは大部分が目的の分子量である３００−５００塩基対DNA付近に分布していることが確認できた。
【００３３】
＜ＤＮＡ二本鎖率の測定＞
次に、前記調製方法により得られた二本鎖３００−５００塩基対ＤＮＡをＳ１ヌクレア−ゼを用いたDNA二本鎖率測定法により測定した。その結果は、表２の通りＳ１ヌクレア−ゼ作用により、二本鎖率が高まることを確認した。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
このように二本鎖３００−５００塩基対ＤＮＡ調製において、Ｓ１ヌクレア−ゼ処理によって二本鎖率は増加した。そして、このＳ１ヌクレア−ゼ処理によって二本鎖を９０％以上保持したＤＮＡが得られることが確認できた。これらのことから、高純度高分子ＤＮＡから、プロテアーゼＰ３中の夾雑ヌクレア−ゼにより低分子化した後、Ｓ１ヌクレア−ゼ処理により一本鎖部分を除去することにより、二本鎖３００−５００塩基対ＤＮＡを得ることが出来た。
【実施例２】
【００３６】
＜二本鎖３００−５００塩基対DNA−脂質コンプレックスとそのフイルムの調製＞
二本鎖ＤＮＡの収率が高い機能性素材としてのＤＮＡとして５０ｍｇ／２０ｍｌ二本鎖３００−５００塩基対ＤＮＡ溶液と１．１倍当量の脂質溶液（ジラウリルジメチルアンモニウムブロミド）を混合し、室温で1時間攪拌した。そして未反応ＤＮＡの洗浄のため、脱イオン水添加と遠心分離（１００００ｒｐｍ、０℃、１０分）を３回繰り返した。その後、脱脂する目的でジエチルエーテルを添加し、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、０℃、１０分）を３回繰り返した。その後、凍結乾燥し、ＤＮＡ−脂質コンプレックスを得た。
このＤＮＡ−脂質コンプレックスをクロロホルム・エタノール溶液（クロロホルム・エタノール＝４：１）に所定濃度になるように溶解させた。そしてクロロホルム・エタノール溶液を滴下したガラスシャーレ内にテフロンプレートを置き、そのテフロンプレート上に前記ＤＮＡ−脂質コンプレックス溶液を移した。１日静置後、乾燥したものをＤＮＡフイルムとして回収した。尚、ＤＮＡフイルムの調製法は岡畑らの方法（J．Am．Chem．Soc．，１１８（44），10679（1996）を元に行った。
【００３７】
Ｓ１ヌクレア−ゼを作用させたものとさせていないものの２種類を用い、フイルムの比較を行った。２００μｌのクロロホルム・エタノール溶液にそれぞれ５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇを溶かし、フイルムを作製した。その結果、Ｓ１ヌクレア−ゼを作用させなかったものは、１０ｍｇでもフイルム調製が困難であったが、Ｓ１ヌクレア−ゼを作用させ、二本鎖率を高めることによって、５ｍｇでもフイルム化できることが確認できた。また、高分子ＤＮＡにより作製したフイルムと比較すると、少し厚みのあるフイルムであった。このようにして作製された二本鎖３００−５００塩基対ＤＮＡフイルムが高分子フイルムより優れている点は、高分子ＤＮＡを用いた場合溶解することが困難な濃度である１００mg／ｍｌでも容易に溶解し、高分子ＤＮＡ（２５mg／ｍｌ）と比べると粘性がなく、扱い易いことである。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
ＤＮＡは、π電子が豊富な塩基対がスタッキングし、かつ分子量が揃った不斉二重らせん構造をとる生体高分子であり、これらの構造に基づいた導電性、分子の配向化、インターカレーター吸着能といった特性を示す。これらの特性を生かした新機能素材の調製法が本発明である。本発明に係る分子量を調整した二本鎖ＤＮＡの収率が高い機能性素材としてのＤＮＡは、分子量が目的に合わせて調整してあることと、二本鎖ＤＮＡの収率が高いことによって、高機能性を発揮できる機能性素材となっており、例えばＤＮＡ有機導電体、非線型光学材料、ダイオキシン等の吸着剤、医療用素材等広い分野での利用が期待されている。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】高純度高分子量DNAを大量に調製する方法の工程図である。
【図２】二本鎖３００−５００塩基対ＤＮＡの調製方法のフローである。
【図３】キャピラリー電気泳動による分子量の測定結果を示す分子量分布図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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