(57)【要約】【課題】小腸でのグルコース取り込み阻害または促進剤の提供。【解決手段】Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を阻害または促進する化合物またはその塩を含有してなる小腸でのグルコース取り込み阻害または促進剤など。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる小腸でのグルコース取り込み阻害剤。
【請求項２】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる小腸でのグルコース取り込み阻害剤。
【請求項３】
食後過血糖改善剤である請求項１または２記載の剤。
【請求項４】
糖尿病、肥満症または高脂血症予防・治療剤である請求項１ないし３記載の剤。
【請求項５】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる小腸でのグルコース取り込み促進剤。
【請求項６】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩を含有してなる小腸でのグルコース取り込み促進剤。
【請求項７】
グルコースの吸収促進剤である請求項５または６記載の剤。
【請求項８】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT)ホモログが配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項１ないし７記載の剤。
【請求項９】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT)ホモログが配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項１ないし７記載の剤。
【請求項１０】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT)ホモログが配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項１ないし７記載の剤。
【請求項１１】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT)ホモログが配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項１ないし７記載の剤。
【請求項１２】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる小腸でのグルコース取り込み阻害剤。
【請求項１３】
食後過血糖改善剤である請求項１２記載の剤。
【請求項１４】
糖尿病、肥満症または高脂血症の予防・治療剤である請求項１２または１３記載の剤。
【請求項１５】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT)ホモログをコードするポリヌクレオチドが配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：５１で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含有するポリヌクレオチドである請求項１２ないし１４記載の剤。
【請求項１６】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログに対する抗体を含有してなる小腸でのグルコース取り込み阻害剤。
【請求項１７】
食後過血糖改善剤である請求項１６記載の剤。
【請求項１８】
糖尿病、肥満症または高脂血症予防・治療剤である請求項１６または１７記載の剤。
【請求項１９】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT)ホモログが配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項１６ないし１８記載の剤。
【請求項２０】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログに対する抗体を含有してなる食後過血糖の診断薬。
【請求項２１】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログをコードするポリヌクレオチドを含有してなる食後過血糖の診断薬。
【請求項２２】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログを用いることを特徴とする、該ホモログの小腸でのグルコース取り込み活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項２３】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT)ホモログが配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項２２記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログを含有することを特徴とする、該ホモログの小腸でのグルコース取り込み活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項２５】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、該ホモログの小腸でのグルコース取り込み活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項２６】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT)ホモログをコードするポリヌクレオチドが配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：５１で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含有するポリヌクレオチドである請求項２５記載のスクリーニング方法。
【請求項２７】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、該ホモログの小腸でのグルコース取り込み活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項２８】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を阻害することを特徴とする小腸でのグルコース取り込み阻害方法。
【請求項２９】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの遺伝子の発現を阻害することを特徴とする小腸でのグルコース取り込み阻害方法。
【請求項３０】
食後過血糖改善方法である請求項２８または２９記載の方法。
【請求項３１】
糖尿病、肥満症または高脂血症予防・治療方法である請求項２８ないし３０記載の方法。
【請求項３２】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を促進することを特徴とする小腸でのグルコース取り込み促進方法。
【請求項３３】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの遺伝子の発現を促進することを特徴とする小腸でのグルコース取り込み促進方法。
【請求項３４】
グルコースの吸収促進方法である請求項３２または３３記載の方法。
【請求項３５】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする小腸でのグルコース取り込み阻害方法。
【請求項３６】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする小腸でのグルコース取り込み阻害方法。
【請求項３７】
食後過血糖改善方法である請求項３５または３６記載の方法。
【請求項３８】
糖尿病、肥満症または高脂血症予防・治療方法である請求項３５ないし３７記載の方法。
【請求項３９】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする小腸でのグルコース取り込み促進方法。
【請求項４０】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする小腸でのグルコース取り込み促進方法。
【請求項４１】
グルコースの吸収促進方法である請求項３９または４０記載の方法。
【請求項４２】
小腸でのグルコース取り込み阻害剤の製造のためのNa+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を阻害する化合物またはその塩の使用。
【請求項４３】
小腸でのグルコース取り込み阻害剤の製造のためのNa+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を阻害する化合物またはその塩の使用。
【請求項４４】
小腸でのグルコース取り込み阻害剤が食後過血糖改善剤である請求項４２または４３記載の使用。
【請求項４５】
小腸でのグルコース取り込み阻害剤が糖尿病、肥満症または高脂血症予防・治療剤である請求項４２ないし４４記載の使用。
【請求項４６】
小腸でのグルコース取り込み促進剤の製造のためのNa+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を促進する化合物またはその塩の使用。
【請求項４７】
小腸でのグルコース取り込み促進剤の製造のためのNa+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を促進する化合物またはその塩の使用。
【請求項４８】
小腸でのグルコース取り込み促進剤がグルコースの吸収促進剤である請求項４６または４７記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性または該ホモログの遺伝子の発現を調節（阻害または促進）する化合物またはその塩を含有してなる小腸でのグルコース取り込み調節（阻害または促進）剤、該ホモログを用いることを特徴とする、該ホモログの小腸でのグルコース取り込み活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法、そのスクリーニング方法によって得られうる化合物またはその塩、その化合物または塩を含有する医薬などに関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコースが細胞内外を移行するには、細胞膜上に糖輸送担体と呼ばれる膜蛋白質が必要である。
【０００３】
グルコースの輸送担体は、受動輸送担体である促通拡散型グルコーストランスポーター (GLUT)とNa+イオン輸送と共役することでグルコースを濃度勾配に逆らって輸送する能動輸送担体であるNa+/グルコーストランスポーター (SGLT)に大別される。GLUT は、8種類のアイソフォームが存在し、分子量約5万の細胞膜を12回貫通する共通構造を有している。
【０００４】
SGLT は、分子量7.5万の細胞膜を14回貫通する共通構造を有している。
【０００５】
非特許文献１（日本臨床  55, 1997、増刊号、糖尿病I、59-64）にはSGLT1および2の機能や発現部位が概説されている。
【０００６】
ヒトSGLT1 は、小腸、腎臓に特異的に発現しグルコースに対して高親和性で輸送能は小さく、ヒトSGLT2 は、腎臓特異的に発現しグルコースに対して低親和性で輸送能は大きい事が知られている。SGLTは、グルコースの小腸からの吸収と、腎臓から一旦尿中に排出されたグルコースを再吸収する役割を担っている。
【０００７】
また、SGLTホモログは、特許文献１（ＷＯ０２／５３７３８）に開示された蛋白質であり、肝臓で発現しており、これを賦活化することで糖新生を抑制し空腹時高血糖を是正する糖尿病治療薬となると考えられる。
【０００８】
一方、  糖尿病における食後高血糖（食後過血糖）は、食事摂取後の血糖値の上昇に対応したインスリン分泌の低下と肝臓・筋肉におけるインスリン抵抗性が加わって生じる。食後高血糖を是正する手段としてα-グルコシダーゼ阻害薬がある。α-グルコシダーゼ阻害薬は、多糖類から単糖への消化を抑制することで、腸管から糖を吸収する速度を遅延する。しかし、食事中のグルコースの吸収は抑制できないため、長期的な血糖値の指標であるHbA1c値の低下効果は低い。また、小腸内に未分解で残るスクロースやマルトースにより、水溶性下痢、腹部膨満感などの副作用を生じることがある。
【非特許文献１】日本臨床  55, 1997、増刊号、糖尿病I、59-64
【特許文献１】ＷＯ０２／５３７３８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
小腸で主に糖の吸収の役割を担っていると考えられているSGLT1を阻害すれば、食事中のグルコースの吸収を抑制し、α-グルコシダーゼ阻害薬よりも強力に食後高血糖を是正することが期待できる。また、二糖類に比べて単糖のグルコースは水分貯留が軽度であるため、消化管症状の副作用も軽減できることが期待される。
【００１０】
しかしながら、SGLTの阻害剤であるフロリジンおよびその誘導体は、ラットにおいて、SGLTを阻害することで、腎臓におけるグルコースの再吸収を抑制し、尿中にグルコースを排出することで血糖値を降下させる作用が示されている(Diabetes 48:1794-1800,1999)が、腸管からの糖の吸収抑制作用は弱いことが報告されている(Journal of Medicinal Chemistry 42: 5311-5324, 1999)。
【００１１】
これは、小腸においてフロリジンに耐性が強い別のSGLTが存在するためと考えられる(Am J Physiol 256 : G618-G623, 1989, Am J Physiol 270 : G833-G843, 1996) が、その実体は現在まで明らかでない。フロリジン耐性のSGLTの実体を明らかにし、SGLT阻害作用を応用した腸管からの糖の吸収抑制作用を有する化合物のスクリーニング方法、該スクリーニング方法によって得られうる化合物を提供することが課題である。
【００１２】
従って、小腸でのグルコース取り込みを特異的に調節（阻害または促進）しうる薬剤の開発が待たれているのが現状である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すること目的とし、Gene Logic データベースを検索した結果、Na+／グルコーストランスポーター蛋白質であるヒトSGLTホモログが、ヒトSGLT1の約二倍、小腸において発現していることを見い出した。かかる知見に基づき、さらに研究を進めた結果、SGLTホモログが、小腸におけるグルコースの吸収に重要な輸送担体であることを突き止め、さらに、これを阻害することは、食後血糖の上昇を抑制する糖尿病治療薬として有効であり、これを促進することは、グルコースの吸収を促進する低血糖治療薬、胃腸薬として有効であると考え、検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、
（１）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる小腸でのグルコース取り込み阻害剤；
（２）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる小腸でのグルコース取り込み阻害剤；
（３）食後過血糖改善剤である前記（１）または（２）記載の剤；
（４）糖尿病または高脂血症予防・治療剤である前記（１）ないし（３）記載の剤；
（５）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる小腸でのグルコース取り込み促進剤；
（６）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩を含有してなる小腸でのグルコース取り込み促進剤；
（７）グルコースの吸収促進剤である前記（５）または（６）記載の剤；
（８）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT)ホモログが配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である前記（１）ないし（７）記載の剤；
（９）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT)ホモログが配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である前記（１）ないし（７）記載の剤；
（１０）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT)ホモログが配列番号：５または配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である前記（１）ないし（７）記載の剤；
（１１）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる小腸でのグルコース取り込み阻害剤；
（１２）食後過血糖改善剤である前記（１１）記載の剤；
（１３）糖尿病または高脂血症の予防・治療剤である前記（１１）または（１２）記載の剤；
（１４）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT)ホモログをコードするポリヌクレオチドが配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：５１で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含有するポリヌクレオチドである前記（１１）ないし（１３）記載の剤；
（１５）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログに対する抗体を含有してなる小腸でのグルコース取り込み阻害剤；
（１６）食後過血糖改善剤である前記（１５）記載の剤；
（１７）糖尿病または高脂血症予防・治療剤である前記（１５）または（１６）記載の剤；
（１８）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT)ホモログが配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である前記（１５）ないし（１７）記載の剤；
（１９）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログに対する抗体を含有してなる食後過血糖の診断薬；
（２０）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログをコードするポリヌクレオチドを含有してなる食後過血糖の診断薬；
（２１）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログを用いることを特徴とする、該ホモログの小腸でのグルコース取り込み活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法；
（２２）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT)ホモログが配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である前記（２１）記載のスクリーニング方法；
（２３）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログを含有することを特徴とする、該ホモログの小腸でのグルコース取り込み活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット；
（２４）前記（２１）もしくは（２２）記載のスクリーニング方法または前記（２３）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩；
（２５）前記（２４）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬；
（２６）食後過血糖改善剤である前記（２５）記載の医薬；
（２７）糖尿病または高脂血症予防・治療剤である前記（２５）または（２６）記載の医薬；
（２８）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、該ホモログの小腸でのグルコース取り込み活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法；
（２９）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT)ホモログをコードするポリヌクレオチドが配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：５１で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含有するポリヌクレオチドである前記（２８）記載のスクリーニング方法；
（３０）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、該ホモログの小腸でのグルコース取り込み活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット；
（３１）前記（２８）もしくは（２９）記載のスクリーニング方法または前記（３０）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩；
（３２）前記（３１）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬；
（３３）食後過血糖改善剤である前記（３２）記載の医薬；
（３４）糖尿病または高脂血症予防・治療剤である前記（３２）または（３３）記載の医薬；
（３５）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を阻害することを特徴とする小腸でのグルコース取り込み阻害方法；
（３６）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの遺伝子の発現を阻害することを特徴とする小腸でのグルコース取り込み阻害方法；
（３７）食後過血糖改善方法である前記（３５）または（３６）記載の方法；
（３８）糖尿病または高脂血症予防・治療方法である前記（３５）ないし（３７）記載の方法；
（３９）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を促進することを特徴とする小腸でのグルコース取り込み促進方法；
（４０）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの遺伝子の発現を促進することを特徴とする小腸でのグルコース取り込み促進方法；
（４１）グルコースの吸収促進方法である前記（３９）または（４０）記載の方法；
（４２）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする小腸でのグルコース取り込み阻害方法；
（４３）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする小腸でのグルコース取り込み阻害方法；
（４４）食後過血糖改善方法である前記（４２）または（４３）記載の方法；
（４５）糖尿病または高脂血症予防・治療方法である前記（４２）ないし（４４）記載の方法；
（４６）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする小腸でのグルコース取り込み促進方法；
（４７）Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする小腸でのグルコース取り込み促進方法；
（４８）グルコースの吸収促進方法である前記（４６）または（４７）記載の方法；
（４９）小腸でのグルコース取り込み阻害剤の製造のためのNa+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を阻害する化合物またはその塩の使用；
（５０）小腸でのグルコース取り込み阻害剤の製造のためのNa+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を阻害する化合物またはその塩の使用；
（５１）小腸でのグルコース取り込み阻害剤が食後過血糖改善剤である前記（４９）または（５０）記載の使用；
（５２）小腸でのグルコース取り込み阻害剤が糖尿病または高脂血症予防・治療剤である前記（４９）ないし（５１）記載の使用；
（５３）小腸でのグルコース取り込み促進剤の製造のためのNa+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を促進する化合物またはその塩の使用；
（５４）小腸でのグルコース取り込み促進剤の製造のためのNa+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログの活性を促進する化合物またはその塩の使用；
（５５）小腸でのグルコース取り込み促進剤がグルコースの吸収促進剤である前記（５３）または（５４）記載の使用；などに関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明で用いられるタンパク質の活性や遺伝子発現を調節する化合物またはその塩、該タンパク質の活性を調節する中和抗体は、例えば食後過血糖改善剤またはグルコースの吸収促進剤などとして使用することができる。また、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明で用いられるタンパク質の発現を調節することができ、例えば、食後過血糖改善剤などとして使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明で用いられるNa+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログ（以下、本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称することもある）としては、例えば、ＷＯ０２／５３７３８に開示されたSGLTホモログ、ＷＯ０１／７５０６７に開示されたSGLTホモログ、ＷＯ０１／９２３０４に開示されたSGLTホモログ（TRICH）、ＷＯ０２／４５２０に開示されたSGLTホモログ（TRICH）、ＷＯ０２／１０２１６に開示されたSGLTホモログなどが挙げられるが、なかでも、ＷＯ０２／５３７３８に開示されたSGLTホモログが好ましく、とりわけ、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質が好ましく用いられる。
【００１７】
Na+/グルコーストランスポーター (SGLT) ホモログは、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
【００１８】
本明細書において、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、比較するアミノ酸配列に対して、例えば、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
【００１９】
例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
【００２０】
実質的に同質の活性としては、例えば、グルコースの能動輸送活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、グルコースの能動輸送活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００２１】
グルコースの能動輸送活性などの活性の測定は、公知の方法に準じて行うことが出来るが、例えば、Cloning and functional expression of an SGLT-1-like protein from the Xenopus laevis intestine (Am. J. Phisiol. 276: G1251-G1259, 1999)に記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。
【００２２】
また、本発明で用いられるタンパク質としては、例えば、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
【００２３】
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
【００２４】
本発明で用いられるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
【００２５】
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
【００２６】
本発明で用いられるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
【００２７】
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
【００２８】
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するヒト由来のタンパク質などがあげられる。
【００２９】
本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明のタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明のタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
【００３０】
本発明のタンパク質が構成するアミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
【００３１】
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
【００３２】
本発明の部分ペプチドとしては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において例えば第176番目〜201番目、第471番目〜491番目のアミノ酸配列を含有するペプチドが好ましい。配列番号：３で表されるアミノ酸配列において例えば第172番目〜197番目、第467番目〜487番目のアミノ酸配列を含有するペプチドが好ましい。配列番号：５で表されるアミノ酸配列において例えば第175番目〜200番目、第470番目〜490番目のアミノ酸配列を含有するペプチドが好ましい。配列番号：５０で表されるアミノ酸配列において例えば第176番目〜201番目、第471番目〜491番目のアミノ酸配列を含有するペプチドが好ましい。
【００３３】
また、本発明で用いられる部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
【００３４】
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
【００３５】
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。
【００３６】
たとえば、後述する本発明の抗体を調製する目的には、例えば配列番号：１で表されるアミノ酸配列において第261〜275番目, 第399〜417番目, 第500〜649番目のアミノ酸配列を含有するペプチドなどがあげられる。配列番号：３で表されるアミノ酸配列において第257〜271番目, 第395〜413番目, 第496〜645番目のアミノ酸配列を含有するペプチドなどがあげられる。配列番号：５で表されるアミノ酸配列において第260〜274番目, 第398〜416番目, 第499〜648番目のアミノ酸配列を含有するペプチドなどがあげられる。配列番号：５０で表されるアミノ酸配列において第261〜275番目, 第399〜417番目, 第500〜649番目のアミノ酸配列を含有するペプチドなどがあげられる。
【００３７】
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００３８】
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
【００３９】
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００４０】
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
【００４１】
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，  ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００４２】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００４３】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００４４】
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
【００４５】
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
【００４６】
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
【００４７】
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００４８】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
【００４９】
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００５０】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００５１】
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
【００５２】
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
【００５３】
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（i）〜（v）に記載された方法が挙げられる。
（i）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
（ii）SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
（iii）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
（iv）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
（v）矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００５４】
本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
【００５５】
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
【００５６】
本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。また、例えば、配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。また、例えば、配列番号：６で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。また、例えば、配列番号：５１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：５１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：５０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
【００５７】
例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
【００５８】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
【００５９】
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
【００６０】
より具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００６１】
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）としては、前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
【００６２】
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００６３】
配列番号：２で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
【００６４】
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
【００６５】
本発明で用いられるタンパク質、部分ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００６６】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
【００６７】
クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００６８】
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００６９】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
【００７０】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
【００７１】
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００７２】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
【００７３】
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
【００７４】
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００７５】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
【００７６】
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology），１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
【００７７】
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
【００７８】
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。
【００７９】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
【００８０】
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
【００８１】
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，マウスＡＴＤＣ５細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。さらに、ヒト癌細胞由来細胞株（ＤＬＤ−１細胞、ＨＣＴ−１５細胞、ＳＷ−４８０細胞、ＬｏＶｏ細胞、ＨＣＴ−１１６細胞、ＷｉＤｒ細胞、ＨＴ−２９細胞、ＬＳ−１７４Ｔ細胞、ＳＮＵ−Ｃ１細胞、ＳＮＵ−Ｃ４細胞、ＳＮＵ−Ｃ２Ａ細胞、ＣＸ−１細胞、ＧＩ−１１２細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｒａｊｉ細胞、Ｇ３６１細胞、Ｓ３細胞）なども用いられる。
【００８２】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００８３】
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００８４】
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００８５】
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００８６】
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。
【００８７】
このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
【００８８】
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００８９】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
【００９０】
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
【００９１】
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
【００９２】
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００９３】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００９４】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００９５】
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
【００９６】
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
【００９７】
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
【００９８】
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００９９】
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
【０１００】
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
【０１０１】
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより測定することができる。
【０１０２】
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
【０１０３】
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
【０１０４】
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
【０１０５】
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【０１０６】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
【０１０７】
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
【０１０８】
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
【０１０９】
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
【０１１０】
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
【０１１１】
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
【０１１２】
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【０１１３】
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ（以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある））の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明のＤＮＡの塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよいが、アンチセンスＤＮＡが好ましい。
【０１１４】
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、（イ）翻訳阻害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、本発明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、（ロ）ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、イントロンを含む本発明のＤＮＡの全塩基配列の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である。
【０１１５】
具体的には、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、好ましくは例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド（より好ましくは、配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列の一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド）などが挙げられる。
【０１１６】
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
【０１１７】
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。また、各ヌクレオチドの糖（デオキシリボース）は、２’−Ｏ−メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、塩基部分（ピリミジン、プリン）も化学修飾を受けたものであってもよく、配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするものであればいずれのものでもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
【０１１８】
本発明に従えば、本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチドを、クローン化した、あるいは決定されたタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるポリヌクレオチド（核酸）は、本発明のタンパク質遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のタンパク質関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のタンパク質関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のタンパク質関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。タンパク質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
【０１１９】
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、対象物と「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【０１２０】
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
【０１２１】
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
【０１２２】
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
【０１２３】
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【０１２４】
以下に、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）、本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある））、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、および本発明のＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド（以下、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと略記する場合がある）の用途を説明する。
（１）本発明のタンパク質が関与する各種疾病の予防・治療剤
本発明のタンパク質は、Na+／グルコーストランスポーターとしてグルコースの能動輸送活性を有し、小腸においては、グルコース取り込みに寄与している。
本明細書において、「小腸」とは広義の小腸（即ち、十二指腸を含む）を示してもよいが、好ましくは狭義の小腸（即ち、十二指腸を含まない）を示す。また、グルコースの取り込みは、単糖類（例えば、グルコース、マンノース、フルクトース、ソルボース、ガラクトース、リボース、アラビノース、キシロースなど）の取り込みに読み替えてもよいが、好ましくはグルコースの取り込みを示す。
【０１２５】
したがって、本発明のタンパク質の活性や該タンパク質の遺伝子の発現量を、小腸において減少させることにより、食後過血糖の改善などに有効であり、例えば、糖尿病、肥満症、高脂血症、代謝症候群などの疾患の治療・予防剤などの医薬として使用することができる。また、本発明のタンパク質の活性や該タンパク質の遺伝子の発現量を、小腸において亢進させることにより、グルコースの吸収促進剤など低血糖治療薬、胃腸薬などの医薬として使用することができる。
【０１２６】
例えば、小腸において本発明のタンパク質が減少あるいは欠損しているために、グルコースの小腸への取り込みが十分に、あるいは正常に発揮されない患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のタンパク質を発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のタンパク質を発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のタンパク質を該患者に投与することなどによって、該患者における本発明のタンパク質の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
【０１２７】
また、例えば、小腸において本発明のタンパク質の発現が亢進しているために、グルコースの小腸への取り込みが亢進され、食後過血糖の症状を呈している患者がいる場合に、（イ）本発明のアンチセンスＤＮＡを該患者に投与することによって、（ロ）本発明の抗体を産生する細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明の抗体を該患者に投与することによって、該患者における本発明のタンパク質の役割を抑制させることができる。
【０１２８】
本発明のＤＮＡ（アンチセンスＤＮＡも含む）を上記の予防・治療剤として使用する場合は、本発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたはその他の温血動物に投与することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
【０１２９】
本発明のタンパク質を上記の予防・治療剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
【０１３０】
本発明のタンパク質は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のタンパク質等を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【０１３１】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
【０１３２】
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
【０１３３】
本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
【０１３４】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、温血動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
【０１３５】
本発明のタンパク質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、グルコースの吸収促進剤の目的で本発明のタンパク質等を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該タンパク質を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該タンパク質等の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、グルコースの吸収促進剤の目的で本発明のタンパク質等を注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該タンパク質等を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１３６】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、ヒトSGLTホモログタンパクと表記することがある）はヒトの小腸、膵臓、肝臓において組織特異的に高発現するので、例えば糖尿病などの疾患マーカーとして利用することが出来る。すなわち、糖尿病における早期診断、症状の重症度の判定、疾患進行の予測のためのマーカーとして有用である。
【０１３７】
小腸においてヒトSGLTホモログタンパク質の活性を阻害する化合物もしくはその塩を含有する医薬は、例えば小腸へのグルコース取り込みを阻害し、血糖値を減少できるので、例えば、食後過血糖改善剤などとして有用であり、また、例えば、糖尿病、肥満症、高脂血症、代謝症候群などの治療・予防剤として使用することができる。
【０１３８】
一方、小腸においてヒトSGLTホモログタンパク質の活性を促進する化合物もしくはその塩を含有する医薬は、例えば小腸へのグルコース取り込みを促進できるので、例えば、グルコースの吸収促進剤などとして有用であり、また、例えば、低血糖治療薬、胃腸薬として使用することができる。
（２）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質の活性を調節（促進または阻害、好ましくは阻害）する化合物もしくはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を調節（促進または阻害、好ましくは阻害）する化合物もしくはその塩は、例えば、食後過血糖改善剤またはグルコースの吸収促進剤などとして使用することができる。好ましくは食後過血糖改善剤などである。
【０１３９】
したがって、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の活性を調節（促進または阻害、好ましくは阻害）する化合物もしくはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を調節（促進または阻害、好ましくは阻害）する化合物もしくはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
【０１４０】
すなわち本発明は、本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の活性を調節（促進または阻害、好ましくは阻害）する化合物、あるいは本発明のタンパク質の遺伝子の発現を調節（促進または阻害、好ましくは阻害）する化合物のスクリーニング方法を提供する。より具体的には、上記スクリーニング方法においては、例えば、(1)試験化合物存在下と(2)試験化合物非存在下の場合における、本発明のタンパク質の遺伝子発現量を測定して、比較することを特徴とするものである。
【０１４１】
上記スクリーニング方法においては、例えば、(1)と(2)の場合における、小腸へのグルコース取り込み作用と本発明のタンパク質の遺伝子発現量を測定して、比較することを特徴とするものである。
【０１４２】
また、本発明は、
（１）本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の活性（例えば、グルコースの能動輸送活性など）を促進または阻害する化合物またはその塩（以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、
（２）（ｉ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞の糖取り込み活性と（ii）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物の糖取り込み活性の比較を行なうことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
【０１４３】
具体的には、前記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉ）と（ii）の場合において、糖取り込み活性を3H標識したグルコースまたは2-deoxy-glucoseなどのグルコース類縁体の細胞内への蓄積を放射活性で測定し、グルコースの能動輸送活性の指標として比較することを特徴とするものである。
【０１４４】
本発明のスクリーニングにおいては、タンパク質を産生する能力を有する細胞に、グルコースの能動輸送活性阻害剤（例、フロリジン）などをポジティブコントロールとして使用してもよい。
【０１４５】
すなわち、本発明は
(i)本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞に、3H標識したグルコースまたはグルコース類縁体を取り込ませると同時もしくは取り込ませる前に、グルコースの能動輸送活性阻害剤を添加した場合と、(ii) 本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞に、3H標識したグルコースまたはグルコース類縁体を取り込ませると同時もしくは取り込ませる前に、グルコースの能動輸送活性賦活化剤または阻害剤、および試験化合物を添加した場合とを比較し、その取り込み量の変化を測定することを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
【０１４６】
本発明のタンパク質のグルコースの能動輸送活性は、公知の方法、例えば、Cloning and functional expression of an SGLT-1-like protein from the Xenopus laevis intestine (Am. J. Phisiol. 276: G1251-G1259, 1999)に記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って測定することができる。
【０１４７】
例えば、前記（ii）の場合におけるグルコースの能動輸送活性を、前記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩として選択することができる。
【０１４８】
また、例えば、前記（ii）の場合におけるグルコースの能動輸送活性を、前記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害（または抑制）する試験化合物を本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
【０１４９】
また、本発明のタンパク質SGLTホモログ遺伝子のプロモーター下流に分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなどの遺伝子を挿入し、前記の各種細胞に発現させ、該細胞に前記試験化合物を接触させた場合における酵素活性を賦活化または阻害する化合物またはその塩を探索することによって本発明のタンパク質（SGLTホモログ）の発現を促進または抑制（すなわち、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害）する化合物またはその塩をスクリーニングすることができる。
【０１５０】
更に遺伝子産物によって発現が制御されると考えうる遺伝子などのプロモーターを用いたレポーター・ジーン・アッセイにおいてその活性の調節を特徴とするスクリーニング法を提供する。
【０１５１】
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、生体由来非ペプチド性化合物（糖質、脂質など）、合成化合物、微生物培養物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【０１５２】
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適した培地を用いて培養する。培地は、本発明のタンパク質の遺伝子発現に影響を与えないものであればいずれでもよい。
【０１５３】
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。本発明のタンパク質を発現し得る細胞の培養方法は、前記した本発明の形質変換体の培養法と同様である。また、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、上述の形質転換体のみならず、SGLTホモログを産生する能力を有するヒトまたは温血動物の小腸上皮細胞などを用いてもよい。また、この時の細胞は単離された細胞であってもよく、あるいは、該細胞を含有する組織、器官などの形態で用いてもよい。
【０１５４】
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。
【０１５５】
本発明のタンパク質の活性を促進する活性を有する化合物は、本発明のタンパク質の作用を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
【０１５６】
本発明のタンパク質の活性を阻害する活性を有する化合物は、本発明のタンパク質の生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
【０１５７】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物である。該化合物の塩としては、前記した本発明のペプチドの塩と同様のものが用いられる。
【０１５８】
さらに、本発明のタンパク質をコードする遺伝子も、小腸において発現が多く見られるので、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩も、例えば、食後過血糖改善剤またはグルコースの吸収促進剤として使用することができる。好ましくは食後過血糖改善剤などである。
【０１５９】
したがって、本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
【０１６０】
スクリーニング方法としては、（iii）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と、（iv）試験化合物の存在下、本発明で用いられるタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うことを特徴とするスクリーニング方法が挙げられる。
【０１６１】
上記方法において、（iii）と（iv）の場合における、前記遺伝子の発現量（具体的には、本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードするｍＲＮＡ量）を測定して、比較する。
【０１６２】
試験化合物および本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、上記と同様のものが挙げられる。
【０１６３】
タンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
【０１６４】
本発明の遺伝子発現量は、自体公知の方法、例えば、ノーザンブロッティングやReverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)やTaqMan polymerase chain reactionなどの方法あるいはそれに準じる方法にしたがって測定することができる。
【０１６５】
例えば、上記(iv)の場合における遺伝子発現量を、上記(iii)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上阻害するあるいは増強する試験化合物を本発明のタンパク質の活性を阻害するあるいは増強する化合物として選択することができる。
【０１６６】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、または本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するものである。
【０１６７】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のタンパク質の活性あるいは本発明のタンパク質の遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩である。
【０１６８】
該化合物の塩としては、前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。
【０１６９】
本発明のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩、および本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩はそれぞれ、例えば、食後過血糖改善剤またはグルコースの吸収促進剤などとして有用である。
【０１７０】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の治療・予防剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
【０１７１】
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
【０１７２】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of hydrogenated  castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記化合物またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
【０１７３】
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記化合物が含有されていることが好ましい。
【０１７４】
なお前記した各組成物は、上記化合物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【０１７５】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
【０１７６】
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、食後過血糖改善剤の目的で本発明のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、食後過血糖改善剤の目的で本発明のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を小腸に注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（２ａ）本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明のタンパク質に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）は、本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
【０１７７】
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法を提供する。
【０１７８】
上記（ii）の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質のＣ末端部に反応する抗体であることが望ましい。
【０１７９】
また、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質の定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')２ 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
【０１８０】
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
【０１８１】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【０１８２】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
【０１８３】
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
【０１８４】
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
【０１８５】
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
【０１８６】
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
【０１８７】
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
【０１８８】
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【０１８９】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
【０１９０】
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
【０１９１】
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のタンパク質を感度良く定量することができる。
【０１９２】
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパク質を検出するために使用することができる。また、本発明のタンパク質を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク質の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。
（３）遺伝子診断薬
本発明のDNAは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジーなど）における本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするDNAまたはmRNAの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該DNAまたはmRNAの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該DNAまたはmRNAの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
【０１９３】
本発明のDNAを用いる上記遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやPCR-SSCP法（ゲノミックス（Genomics）,第５巻,874〜879頁、1989年、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）,第86巻,2766〜2770頁、1989年）などにより実施することができる。
（４）アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明のDNAに相補的に結合し、該DNAの発現を調節することができるアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質または本発明のDNAの機能を調節（好ましくは抑制）することができるので、例えば、食後過血糖改善剤などとして使用することができる。
【０１９４】
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防・治療剤として使用する場合、自体公知の方法にしたがって製剤化し、投与することができる。
例えば、該アンチセンスポリヌクレオチドを用いる場合、該アンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエイテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段にしたがって、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドはそのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
【０１９５】
さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリポゾームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下、関節腔内等に投与してもよい。
【０１９６】
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、食後過血糖改善剤の目的で本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約０．１〜１００ｍｇ投与する。
【０１９７】
さらに、該アンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【０１９８】
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ（本発明のポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ）、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイム、本発明のタンパク質が結合するＤＮＡ配列に対するデコイオリゴヌクレオチドなども、本発明の遺伝子の発現を抑制することができ、生体内における本発明で用いられるタンパク質または本発明で用いられるＤＮＡの機能を抑制することができるので、例えば、食後過血糖改善剤などとして使用することができる。
【０１９９】
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Nature, 411巻, 494頁, 2001年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
【０２００】
リボザイムは、公知の方法（例、TRENDS in Molecular Medicine, 7巻, 221頁, 2001年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。
【０２０１】
デコイオリゴヌクレオチドは、公知の方法（例、The Journal of Clinical Investigation, 106巻, 1071頁, 2000年）に準じて、本発明のタンパク質が結合するＤＮＡの配列を基に設計して製造することができる。具体的には、該デコイオリゴヌクレオチドとしては、本発明のタンパク質が結合するＤＮＡの配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のタンパク質が結合し得るものであれば何れのものでもよい。本発明のタンパク質が結合するＤＮＡの配列とハイブリダイズできる塩基配列としては、例えば、本発明のタンパク質が結合するＤＮＡの配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが用いられる。
【０２０２】
上記の二重鎖ＲＮＡ、リボザイムまたはデコイオリゴヌクレオチドを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
（５）本発明の抗体を含有する医薬
本発明のタンパク質の活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、例えば食後過血糖改善剤などの予防・治療剤などの医薬もしくは診断薬として使用することができる。
【０２０３】
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療・予防剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、関節内投与）に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、食後過血糖改善剤のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、粉末吸入剤により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【０２０４】
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与（例、関節内投与）に適する剤形として提供される。好ましくは吸入剤として提供される。
【０２０５】
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
（６）ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
【０２０６】
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１)記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
【０２０７】
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
【０２０８】
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
【０２０９】
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
【０２１０】
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
【０２１１】
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
【０２１２】
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
【０２１３】
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
【０２１４】
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
【０２１５】
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、1)ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳がんウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、2)各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
【０２１６】
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
【０２１７】
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流 に連結することも目的により可能である。
【０２１８】
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
【０２１９】
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
【０２２０】
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
【０２２１】
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
【０２２２】
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
【０２２３】
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【０２２４】
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
【０２２５】
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、食後過血糖改善剤またはグルコースの吸収促進剤などのスクリーニング試験にも利用可能である。好ましくは食後過血糖改善剤などのスクリーニング試験である。
【０２２６】
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【０２２７】
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
【０２２８】
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。
【０２２９】
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、例えば食後過血糖改善剤またはグルコースの吸収促進剤のスクリーニング試験にも利用可能である。好ましくは食後過血糖改善剤のスクリーニング試験である。
【０２３０】
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
1)組織培養のための細胞源としての使用、
2)本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたペプチド組織を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性についての解析、
3)ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
4)上記3)記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
5)本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
【０２３１】
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
【０２３２】
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
【０２３３】
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
（７）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
【０２３４】
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）第（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【０２３５】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
【０２３６】
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【０２３７】
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
【０２３８】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
【０２３９】
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
【０２４０】
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
【０２４１】
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
【０２４２】
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
【０２４３】
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
【０２４４】
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリプシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
【０２４５】
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin  プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
【０２４６】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
【０２４７】
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【０２４８】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
【０２４９】
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
【０２５０】
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
【０２５１】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
【０２５２】
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
【０２５３】
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
【０２５４】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
【０２５５】
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
（８ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
【０２５６】
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
【０２５７】
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【０２５８】
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
【０２５９】
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【０２６０】
本発明のスクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【０２６１】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。
【０２６２】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
【０２６３】
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の食後過血糖患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の食後過血糖患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（８ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【０２６４】
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
【０２６５】
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
【０２６６】
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
【０２６７】
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
【０２６８】
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
【０２６９】
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
【０２７０】
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【０２７１】
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現の調節、該タンパク質の機能を調節することができるので、食後過血糖改善剤またはグルコースの吸収促進剤、好ましくは食後過血糖改善剤として有用である。
【０２７２】
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【０２７３】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
【０２７４】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
【０２７５】
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の食後過血糖患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の食後過血糖患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０２７６】
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療剤の開発に大きく貢献することができる。
【０２７７】
また、本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパク質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのタンパク質を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【０２７８】
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ              ：アデニン
Ｔ              ：チミン
Ｇ              ：グアニン
Ｃ              ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
Ａｓｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｓｅｃ          ：セレノシステイン（selenocysteine）
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ            ：メチル基
Ｅｔ            ：エチル基
Ｂｕ            ：ブチル基
Ｐｈ            ：フェニル基
ＴＣ            ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ          ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ          ：ホルミル
Ｂｚｌ          ：ベンジル
Cl2-Bzl         ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ          ：ベンジルオキシメチル
Ｚ              ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ        ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ        ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ          ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ          ：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ          ：トリチル
Ｂｕｍ          ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ        ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ        ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ      ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ        ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
ＤＣＣ          ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒトSGLTホモログタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するヒトSGLTホモログタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
マウスSGLTホモログタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するマウスSGLTホモログタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
ラットSGLTホモログタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６〕
配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するラットSGLTホモログタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
実施例２（１）で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
実施例２（１）で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
実施例２（１）で用いられたプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
実施例２（１）で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
実施例２（１）で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
実施例２（２）で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
実施例２（２）で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
実施例２（２）で用いられたプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
実施例２（２）で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
実施例２（２）で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
実施例４で用いられたペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１８〕
実施例５（１）で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
実施例５（１）で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
実施例５（１）で用いられたプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
実施例５（１）で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
実施例５（１）で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
実施例５（２）で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
実施例５（２）で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
実施例５（２）で用いられたプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
実施例５（２）で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
実施例５（２）で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３５〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３６〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３７〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３８〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３９〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４０〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４１〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４２〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４３〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４４〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４５〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４６〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４７〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４８〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４９〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５０〕
ハムスターSGLTホモログタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５１〕
配列番号：５０で表されるアミノ酸配列を有するハムスターSGLTホモログタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５２〕
ハムスターSGLT1タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５３〕
配列番号：５３で表されるアミノ酸配列を有するハムスターSGLT1タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５４〕
実施例１０で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５５〕
実施例１０で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５６〕
実施例１０で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５７〕
実施例１０で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
【０２７９】
以下において、実施例により本発明をより具体的にするが、この発明はこれらに限定されるものではない。
【０２８０】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
【実施例１】
【０２８１】
フロリジンによる糖取りこみ抑制作用の測定
ＷＯ０２／５３７３８の実施例４に記載の方法に従って、ヒトSGLT ホモログ（hSGLTh）、マウスSGLT ホモログ（mSGLTh）、 ラットSGLT ホモログ（rSGLTh）、ヒトSGLT1（hSGLT1）、ヒトSGLT2（hSGLT2）発現CHO細胞株を作製し、実験に用いた。SGLTによって選択的に細胞内に取りこまれるグルコースアナログであるα-Methyl Glucose の取り込み実験は、Am. J. Physiol. 270 : G833-G843, 1996およびJ. Clin. Invest 93 : 397-404, 1994 の方法に従って行った。細胞を96well プレートに1×105 細胞 / well 、100μl 10% FBS 添加DMEM 培地で播種し、37℃、一夜培養した。細胞をバッファー (125 mM N-Methyl-D-Glucamine, 1.2mM KH2PO4, 2.5mM CaCl2, 1.2mM MgSO4, 4mM Glutamine, 10mM HEPES (pH 7.2) , 0.1mg/ml BSA) 150μlで3回洗浄後同バッファーで１時間培養し、残存するグルコースを除去した。バッファーを除去し、同バッファーおよびN-Methyl-D-Glucamine (NMDG)をNaCl あるいは NaCl + Phlorizin (Sigma 社) に置き換えたバッファー  90μl を添加した。1mM α-Methyl Glucose を各well に10μl ( [14C]α-Methyl Glucose (アマシャム  ファルマシア  バイオテク社) 0.02μCi を含む) 添加し１時間後、冷PBS バッファー 200μlで3回洗浄した。各well に液体シンチレータ100μl を添加し、細胞に取り込まれた14Cのカウントを測定した。
【０２８２】
結果を表１および表２に示した。
〔表１〕hSGLT1, hSGLT2, hSGLThのフロリジン耐性度の比較

α-Methyl Glucoseの取込量
(control 群に対する％表示)
hSGLT1     hSGLT2      hSGLTh
control群(NMDG添加・NaCl非添加群)      100± 18    100±15    100± 12
NaCl添加群                           1039±186    830±99    767± 85
NaCl＋フロリジン 3μM添加群           244± 48    139±23    570±142
NaCl＋フロリジン 100μM添加群          60± 14     48± 8    124± 19
〔表２〕mSGLTh, rSGLThのフロリジン耐性度の比較

α-Methyl Glucoseの取込量 
(control 群に対する％表示)
mSGLTh     rSGLTh      
control群(NMDG添加・NaCl非添加群)      100± 6    100± 1    
NaCl添加群                            819±54    953± 0    
NaCl＋フロリジン 15μM添加群          521±35    643±76
NaCl＋フロリジン 500μM添加群          78± 8    118± 6      
表１および表２から明らかなように、ヒト、マウス、ラットSGLT ホモログは、hSGLT1, hSGLT2 と同様に、Na＋濃度に依存してα-Methyl Glucose を取り込んだが、Phlorizin への耐性がSGLT１、SGLT2よりも強いことが証明された。
【実施例２】
【０２８３】
ヒト消化管におけるSGLTホモログの発現分布の解析
（１）TaqMan PCR によるヒトSGLTホモログの発現量の解析
TaqMan PCR に用いるプライマーおよびプローブは、Primer Express ver. 1.0 (PE バイオシステムジャパン)を用いて検索し、プライマー cccgatgctttccacatgcttc（配列番号：７）、プライマー  acaatgacctggtctgtgcacc（配列番号：８）、プローブ acatcccttggccaggtctcattttcgg（配列番号：９）を選択した。プローブのリポーター色素として、FAM (6-carboxyfluorescein) を付加した。
【０２８４】
スタンダードDNA として、ヒトSGLTホモログのPCR断片を使用した。PCR反応における反応液の組成はヒトSGLTホモログDNA 1μlを鋳型として使用し、Pfu Turbo DNA Polymerase（STRATAGENE社）1μl量、プライマー gggggccagaggatccaggtgta（配列番号：１０）およびプライマー gcaatcatcagcccccgcagac（配列番号：１１）を各0.5μM、dNTPsを200μM、および酵素に添付のバッファーを5μl加え、50μlの液量とした。PCR反応は、94℃・1分の後、96℃・20秒、60℃・30秒、72℃・1分のサイクルを35回繰り返し、最後に72℃・7分の伸長反応を行った。このPCR反応産物を1% アガロースゲル電気泳動し、0.7 Kbp DNA断片を切り出し、ゲルエクストラクションキット（Qiagen社）を用いてDNAを抽出した。該 PCR断片を100- 106 コピー/μl に調製してスタンダードDNA として使用した。
（２）TaqMan PCR によるヒトSGLT1の発現量の解析
TaqMan PCR に用いるプライマーおよびプローブは、Primer Express ver. 1.0 (PE バイオシステムジャパン)を用いて検索し、プライマー agcaccctcttcaccatgga（配列番号：１２）、プライマー  aaacaaccttccggcaatcat（配列番号：１３）、プローブ  ccaaggtccgcaagagagcatctga（配列番号：１４）を選択した。プローブのリポーター色素として、FAM (6-carboxyfluorescein) を付加した。
【０２８５】
スタンダードDNA として、ヒトSGLT1のPCR断片を使用した。PCR反応における反応液の組成はヒトSGLT1 DNA 1μlを鋳型として使用し、Pfu Turbo DNA Polymerase（STRATAGENE社）1μl量、プライマー tgtgtcgtcccttcagaatgtg（配列番号：１５）およびプライマー agaactagttcaggcaaaatatgcatg（配列番号：１６）を各0.5μM、dNTPsを200μM、および酵素に添付のバッファーを5μl加え、50μlの液量とした。PCR反応は、94℃・1分の後、96℃・20秒、60℃・30秒、72℃・1分のサイクルを35回繰り返し、最後に72℃・7分の伸長反応を行った。このPCR反応産物を1% アガロースゲル電気泳動し、1.0 Kbp DNA断片を切り出し、ゲルエクストラクションキット（Qiagen社）を用いてDNAを抽出した。該 PCR断片を100- 106 コピー/μl に調製してスタンダードDNA として使用した。
【０２８６】
各組織のcDNA ソースとして、ヒト消化管MTCパネル（クロンテック社）を使用した。上記プライマー（配列番号：７）200nM, 上記プライマー（配列番号：８）100nM, 上記プローブ（配列番号：９）50nM, 鋳型DNA に、TaqMan Universal PCR Master Mix (PE バイオシステムズジャパン)を添付書類記載の規定量加え、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (PE バイオシステムズジャパン)でPCR反応および解析を行った。
【０２８７】
ヒト消化管MTCパネル（クロンテック社）を用いて、TaqMan PCR 法でヒトSGLTホモログの発現分布を調べたところ、図１に示すとおり、食物由来のグルコースの主な吸収部位である空腸で最も高い発現が認められた。多糖類は十二指腸において膵アミラーゼによる分解を受け、空腸で主に吸収されるものと考えられる。
【実施例３】
【０２８８】
初代培養正常ヒト小腸上皮細胞におけるSGLT1, SGLTホモログの発現解析
正常ヒト小腸上皮細胞（Cell System-IE Cells）は、大日本製薬から購入した。コラーゲンコートプレート（24穴プレート）にCS-2.0培地（25mM グルコース、10%FBSおよび抗生物質添加）で2x105cells/well播種し、2日置きに培地交換し13日間培養した。RNAeasy mini キット(Quiagen)を用いて、トータルRNA を抽出し、TaqMan Gold RT-PCR キット (PE biosystems) を用い、TaqMan PCR 法でヒトSGLT（hSGLT）ホモログ、hSGLT1の発現量を測定した。図２に示すとおり、正常ヒト小腸上皮細胞（Cell System-IE Cells）において、hSGLTホモログ（hSGLTh）は、hSGLT1と同等以上に発現していた。
【実施例４】
【０２８９】
抗ヒトSGLTホモログ抗体によるヒト小腸切片の免疫染色
（１）抗ヒトSGLTホモログペプチド抗体の作製
ヒトSGLTホモログの261-275番目のペプチドの275番目のアミノ酸残基にシステインをつけたもの（クラボウ社）を免疫原ペプチド〔H-HisAsnLeuArgAspProValSerGlyAspIleProTrpGlyCys（配列番号：１７）-NH2＝ H-HNLRDPVSGDIPWGC-NH2〕として使用した。N-(γ-マレイミドブチリロキシ)サクシニミド(GMBS) とKeyhole Limpet Hemocyanin (KLH) を混合し、室温で40分反応した。セファデックスG-25カラムで分画し、マレイミド基の導入されたKLHを得た。免疫原ペプチド5mgとマレイミド基の導入されたKLHを等量混合し4℃で1日間反応した。PBS buffer で2日間透析し、PBS bufferに1mg/mlの濃度で懸濁した。
【０２９０】
完全フロイントアジュバントと抗原を等量で混合し（トータル0.6 ml）、３ヶ月齢のNew Zealand white rabbit に皮下免疫した。以後、２〜３週間おきに同量の免疫原を不完全フロイントアジュバントとともに3回追加免疫した。
【０２９１】
5mg の合成ペプチドとSulfo-Link gel 5ml をシステインを介して結合させ、PBS bufferで平衡化した。5mlの抗血清をペプチドを結合したゲルに通し、PBS buffer (5  ml) で3回洗浄した。ペプチドに結合した抗体を0.1N グリシン-HCl buffer (pH 2.5) 8 ml で溶出した。2.4 ml のTris buffer で中和し、抗ヒトSGLTホモログペプチド抗体とした。
【０２９２】
この抗体を用いて、ヒト小腸切片の免疫染色を行なったところ、Villiの基底部から先端まで糖吸収部位である上皮細胞（SGLT1もここで発現している（Eur.J.Physiol 430:151, 1995））において、タンパクレベルで発現が確認された。結果を図３に示す。
【実施例５】
【０２９３】
糖尿病動物におけるSGLTホモログの発現変動
糖尿病患者では、小腸からの糖吸収の亢進が認められている（ Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 282:G241-G248  2002）。糖尿病モデルマウスであるKKAyと正常マウスのC57/BL6および糖尿病モデルラットであるWistar fatty と正常ラットのWistar lean の小腸におけるSGLTホモログの発現量をTaqMan PCR法で比較した。
（１）TaqMan PCRによるマウスSGLTホモログの発現量の解析
TaqMan PCRに用いるプライマーおよびプローブは、Primer Express ver.1.0(PE バイオシステムズジャパン)を用いて検索し、
プライマー（5’-tgcacagaccaggtgattgtg-3’）〔配列番号：１８〕
プライマー（5’-gcacggagcctcccttg-3’）〔配列番号：１９〕
プローブ  （5’-ctcgcagccaacaatctttcacatg-3’） 〔配列番号：２０〕
を選択した。プローブのリポーター色素として、FAM(6-carboxyfluorescein)を付加した。
【０２９４】
スタンダードDNAとしてマウスSGLTホモログのPCR断片を使用した。PCR反応における反応液の組成はマウスSGLTホモログ DNA 1μlを鋳型として使用し、Pfu Turbo DNA polymerase(STRATAGENE社)1μl量、プライマー（5’-atctctaatgtccagcaatgtg-3’)〔配列番号：２１〕およびプライマー（5’-accagcttggggtaggcaat-3’）〔配列番号：２２〕を各0.5μM、dNTPsを200μM、および酵素に添付のバッファーを5μl加え、50μlの液量とした。PCR反応は、94℃・1分の後、96℃・20秒、62℃・30秒，72℃・30秒のサイクルを40回繰り返し、最後に72℃・7分の伸長反応を行った。該PCR反応産物を2％アガロースゲル電気泳動し、0.9kbp DNA断片を切り出し、ゲルエクストラクションキット（Qiagen社）を用いてDNAを抽出した。該PCR断片を100 - 106コピー/μlに調整してスタンダードDNAとして使用した。
【０２９５】
糖尿病モデルマウスであるKKAy と正常マウスのC57/BL6マウスより十二指腸および空回腸を摘出、ここからtotal RNAを抽出した。total RNAの抽出はISOGEN(ニッポンジーン社)の方法に従った。得られたRNA 0.1μgを鋳型としてTaqMan Reverse Transcription Reagents(Roche社)の方法に従い、cDNAを合成した。このcDNA1μlを鋳型とし、プライマー（5’-tgcacagaccaggtgattgtg-3’） 〔配列番号：１８〕200nM、プライマー（5’-gcacggagcctcccttg-3’）〔配列番号：１９〕200nM、プローブ （5’-ctcgcagccaacaatctttcacatg-3’）〔配列番号：２０〕 50nM、にTaqMan universal PCR Master mix(PE バイオシステムズジャパン)を添付書類記載の規定量加え、ABI PRISM 7700 sequence Detection system(PE バイオシステムズジャパン)でPCR反応および解析を行った。
（２）TaqMan PCRによるラットSGLTホモログの発現量の解析
TaqMan PCRに用いるプライマーおよびプローブは、Primer Express ver.1.0(PE バイオシステムズジャパン)を用いて検索し、
プライマー (5’-ctcacagtcttggccacctg-3’)〔配列番号：２３〕
プライマー（5’-agaaccggctctctctggag-3’）〔配列番号：２４〕
プローブ  （5’-tgcacggaccaggtgattgtgc-3’）〔配列番号：２５〕
を選択した。プローブのリポーター色素として、FAM(6-carboxyfluorescein)を付加した。
【０２９６】
スタンダードDNAとしてラットSGLTホモログのPCR断片を使用した。PCR反応における反応液の組成はラットSGLTホモログ DNA 1μlを鋳型として使用し、Pfu Turbo DNA polymerase(STRATAGENE社)1μl量、プライマー（5’-tctggagtcagcctgcacacct-3’）〔配列番号：２６〕およびプライマー（5’-cagccttctcagctgggctcag-3’）〔配列番号：２７〕を各0.5μM、dNTPsを200μM、および酵素に添付のバッファーを5μl加え、50μlの液量とした。PCR反応は、94℃・1分の後、96℃・20秒、62℃・30秒，72℃・30秒のサイクルを40回繰り返し、最後に72℃・7分の伸長反応を行った。該PCR反応産物を2％アガロースゲル電気泳動し、0.9kbp DNA断片を切り出し、ゲルエクストラクションキット（Qiagen社）を用いてDNAを抽出した。該PCR断片を100 - 106コピー/μlに調整してスタンダードDNAとして使用した。
【０２９７】
糖尿病モデルラットであるWistar fatty と正常ラットのWistar lean の小腸を上部、中部、下部に分け、ここからtotal RNAを抽出した。total RNAの抽出はISOGEN(ニッポンジーン社)の方法に従った。このRNA  0.1μgを鋳型としてTaqMan Reverse Transcription Reagents(Roche社)の方法に従い、cDNAを合成した。このcDNA 1μlを鋳型とし、プライマー200nM  (5’-ctcacagtcttggccacctg-3’)〔配列番号：２３〕、プライマー 200nM（5’-agaaccggctctctctggag-3’）〔配列番号：２４〕、プローブ  50nM（5’-tgcacggaccaggtgattgtgc-3’）〔配列番号：２５〕に、TaqMan universal PCR Master mix(PE バイオシステムズジャパン)を添付書類記載の規定量加え、ABI PRISM 7700 sequence Detection system(PE バイオシステムズジャパン)でPCR反応および解析を行った。
【０２９８】
結果を図４および図５に示す。糖尿病モデル動物であるKKAyマウスとWistar fatty ラットの小腸では、それぞれ対照の正常動物に比べて、SGLTホモログの発現亢進が認められ、糖尿病における小腸での糖吸収の亢進、食後過血糖の原因となっていることが示唆された。
【実施例６】
【０２９９】
ヒト、マウス、ラット、ハムスター、サル小腸におけるSGLTホモログの発現
ヒト、マウス、ラット、ハムスター、サル小腸におけるSGLT1, SGLTホモログの発現量をRT-PCR 法で比較した。
RT-PCRによる小腸におけるSGLTホモログの発現解析
ヒトSGLTホモログについては、ヒト空腸cDNA（DCA社）を鋳型とし、プライマー1 gggggccagaggatccaggtgta〔配列番号：２８〕、およびプライマー２ aaaatagccccagaggaagatgttga〔配列番号：２９〕を用いてPCR反応を行った。この反応における反応液の組成は上記cDNA 1μlを鋳型として使用し、Pfu Turbo DNA Polymerase（STRATAGENE社）1μl量、プライマー１およびプライマー２を各0.5μM、dNTPsを200μM、および酵素に添付のバッファーを5μl加え、50μlの液量とした。PCR反応は、94℃・1分の後、96℃・20秒、62℃・30秒、72℃・1.5分のサイクルを40回繰り返し、最後に72℃・7分の伸長反応を行った。同様にヒトSGLT1(NM_000343)についてはプライマー３ atcctgactgggtttgcttt〔配列番号：３０〕およびプライマー４ atgctgatgccaatcagcac〔配列番号：３１〕を用いてPCRを行い、反応条件は96℃・20秒、55℃・30秒、72℃・30秒を40回繰り返し、他の条件はヒトSGLTホモログの条件と同様とした。
ヒトactinについてはプライマー５ agagctacgagctgcctgac〔配列番号：３２〕およびプライマー６ acatctgctggaaggtggac〔配列番号：３３〕を用いてPCRを行い、反応条件は96℃・20秒、64℃・30秒、72℃・30秒を40回繰り返し、他の条件はヒトSGLTホモログの条件と同様とした。
【０３００】
以下にハムスターSGLTホモログ、SGLT1、サルSGLTホモログ、SGLT1、マウスSGLTホモログ、SGLT1、およびラットSGLTホモログ、SGLT1のRT-PCR反応条件について記す。
【０３０１】
ハムスターSGLTホモログおよびSGLT1は9週齢、雄性シリアンハムスター小腸より抽出したRNAを鋳型としてTaqMan reverse transcription reagents (Applied Biosystems社) を用いてランダムプライマーからcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として以下に記すPCRプライマーと反応条件でPCR反応を行った。
ハムスターSGLTホモログ
forward:tgccacagtacttgaagaaacgat〔配列番号：３４〕
reverse:tgaagaacattgggaggatt〔配列番号：３５〕
95℃ 20秒、50℃  30秒、72℃  30秒  を40回繰り返し
ハムスターSGLT1
forward:caatgaagtaggagggtatgagg〔配列番号：３６〕
reverse:tggcgctgttgaagatggaggtc〔配列番号：３７〕
95℃ 20秒、56℃  30秒、72℃  1分  を40回繰り返し  
サルSGLTホモログおよびSGLT1はカニクイザル小腸より抽出したRNAを鋳型としてTaqMan reverse transcription reagents を用いてランダムプライマーからcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として以下に記すPCRプライマーと反応条件でPCR反応を行った。
サルSGLTホモログ
forward:atctctaatgtccagcaatgtg〔配列番号：３８〕
reverse:gcaatcatcagcccccgcagac〔配列番号：３９〕
95℃ 20秒、57℃  30秒、72℃  1分  を40回繰り返し
サルSGLT1
forward:atcctgactgggtttgcttt〔配列番号：４０〕
reverse:atgctgatgccaatcagcac〔配列番号：４１〕
95℃ 20秒、55℃  30秒、72℃  1分  を40回繰り返し
マウスSGLTホモログおよびSGLT1は8週齢 雄性KKAyマウス小腸より抽出したRNAを鋳型としてTaqMan reverse transcription reagents を用いてランダムプライマーからcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として以下に記すPCRプライマーと反応条件でPCR反応を行った。
マウスSGLTホモログ
forward:ggcaatggaaccaggagtgtc〔配列番号：４２〕
reverse:tcacgcaaaatagccccagagaaag〔配列番号：４３〕
95℃ 20秒、60℃  30秒、72℃  2.5分  を40回繰り返し
マウスSGLT1(NM_019810)
forward:atggacagtagcaccttgagcc〔配列番号：４４〕
reverse:tcaggcaaaataggcatggcag〔配列番号：４５〕
95℃ 20秒、55℃  30秒、72℃  2.5分  を40回繰り返し
ラットSGLTホモログおよびSGLT1は22週齢 雄性Wistar fatty ラット小腸より抽出したRNAを鋳型としてTaqMan reverse transcription reagents を用いてランダムプライマーからcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として以下に記すPCRプライマーと反応条件でPCR反応を行った。
ラットSGLTホモログ
forward:caatggaacctggagcttcaag〔配列番号：４６〕
reverse: tcacgcaaaatagccccagagaaag〔配列番号：４７〕
95℃ 20秒、60℃  30秒、72℃  2.5分  を40回繰り返し
ラットSGLT1(NM_013033)
forward: atggacagtagcaccttgagcc〔配列番号：４８〕
reverse: tcaggcaaaataggcgtggcag〔配列番号：４９〕
95℃ 20秒、55℃  30秒、72℃  2.5分  を40回繰り返し
図６に示す結果のとおり、マウス、ラットでは、SGLTホモログに比べてSGLT1の発現が高いが、サルではヒトと同様にSGLT1, SGLTホモログの発現が同等で、ハムスターではSGLT1以上にSGLTホモログの発現が認められた。
【実施例７】
【０３０２】
マウス、ラット、ハムスター小腸器官培養系による糖取り込み量の測定
小腸器官培養系による糖取り込み量の測定は、Peptides, 19 : 1249-1253  1998および J. Agric. Food Chem. 48 : 5618-5623  2000の方法に従った。マウス、ラット、モルモット、ハムスターは、エーテル麻酔後頚動脈を切断して安楽死させた。空腸領域を切り出し、腸間膜脂肪を取り除き、管を切り開いて内容物を洗浄し、1cm 長に切り分けた。空腸切片をバッファー (125 mM N-Methyl-D-Glucamine (NMDG), 1.2mM KH2PO4, 2.5mM CaCl2, 1.2mM MgSO4, 4mM Glutamine, 10mM HEPES (pH 7.2) , 0.1mg/ml BSA) で3回洗浄後、48-wellプレートに1個ずつ移した。同バッファーおよびNMDGをNaCl あるいは NaCl +  Phlorizin 30μM) に置き換えたバッファー 270μl を添加した。10mM α-Methyl Glucose, 10mM D-mannitol を各well に30μl ( [14C]α-Methyl Glucose （AMG）(アマシャム  ファルマシア  バイオテク社) 0.12μCi , [3H]D-mannitol (Perkin Elmer LifeSciences)0.3μCi を含む) を添加し、37℃、10分間培養後、冷PBS バッファー 300ulで3回洗浄した。空腸切片を液体シンチレーション測定用ミニバイアルに移し、組織溶解剤 Solvable (Perkin Elmer LifeSciences)500μlを添加し、50℃で2時間処理して溶解した。液体シンチレータUltima Gold-XR (Perkin Elmer LifeSciences) 5ml を添加し、空腸切片に取り込まれた14C、3Hのカウントを測定した。図７に示す結果のとおり、ハムスターの小腸では、フロリジンに耐性の強いSGLT活性が認められ、SGLTホモログの糖取り込み活性が確認された。
【実施例８】
【０３０３】
SGLT1とSGLTホモログの基質特異性の検討
ヒトSGLTホモログまたはヒトSGLT1導入COS7細胞を作製しそれぞれの基質特異性を検討した。α-Methyl Glucoseの取り込み実験は、Am. J. Physiol. 270:G833-G843, 1996およびJ. Clin. Invest. 93:397-404, 1994の方法に従って行った。細胞を96穴プレートに3×104細胞／well、100μl 10% FBS添加DMEM培地で播種し、37℃で一夜培養した。各wellを125 mM のN-Methyl-D-Glucamineを添加した反応緩衝液（1.2 mM KH2PO4, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 4 mM Glutamine, 10 mM HEPES (pH7.2), 0.1 mg/ml BSA）で3回洗浄後、同緩衝液でさらに1時間培養し、細胞に残存するグルコースを除去した。次に150 mMの NaClを添加した上記反応緩衝液にGlucoseまたはGalactoseを0, 1, 10 mMを添加したものを調製し、それぞれ各wellに90μl添加した。さらに0.02μCiの［14C］-α-Methyl Glucose（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社）を含有する終濃度1 mM α-Methyl Glucoseを各wellに10μlずつ添加し、1時間の糖取り込み反応を行った。200μlの冷PBSで3回洗浄した後、液体シンチレータを各wellに100μlずつ添加し、細胞に取り込まれた14Cの量をシンチレーションカウンターで測定した。その結果、SGLT1がGlucoseとGalactoseに対し親和性を持つのに対し、SGLTホモログはGlucoseに親和性はあるもののGalactoseに対する親和性はほとんど無いことが示された。
【実施例９】
【０３０４】
SGLT1またはSGLTホモログを介する糖取り込みの速度論的解析
ヒトSGLTホモログまたはヒトSGLT1導入COS7細胞を作製しそれぞれの糖取り込みの速度論的解析を行った。α-Methyl Glucoseの取り込み実験は、Am. J. Physiol. 270:G833-G843, 1996およびJ. Clin. Invest. 93:397-404, 1994の方法に従って行った。細胞を96穴プレートに3×104細胞／well、100μl 10% FBS添加DMEM培地で播種し、37℃で一夜培養した。各wellを125 mM のN-Methyl-D-Glucamineを添加した反応緩衝液（1.2 mM KH2PO4, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 4 mM Glutamine, 10 mM HEPES (pH7.2), 0.1 mg/ml BSA）で3回洗浄後、同緩衝液でさらに1時間培養し、細胞に残存するグルコースを除去した。次に150 mMの NaClを添加した上記反応緩衝液にα-Methyl Glucoseを0-20 mMを添加したものを調製し、それぞれ各wellに90μl添加した。さらに0.02μCiの［14C］-α-Methyl Glucose（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社）を含有する終濃度1 mM α-Methyl Glucoseを各wellに10μlずつ添加し、1時間の糖取り込み反応を行った。200μlの冷PBSで3回洗浄した後、液体シンチレータを各wellに100μlずつ添加し、細胞に取り込まれた14Cの量をシンチレーションカウンターで測定し、糖取り込みのKmとVmaxを測定した。その結果、SGLT1がKm = 1.8 mM, Vmax = 3.9 nmol/hour/106 cellsであったのに対し、SGLTホモログはKm = 7.9 mM, Vmax = 8.0 nmol/hour/106 cellsであった。これらのことからSGLT1が高親和性、低輸送能のトランスポーターであるのに対し、SGLTホモログが低親和性、高輸送能のトランスポーターであることが示された。
【実施例１０】
【０３０５】
シリアンハムスター由来Na+/グルコーストランスポーター蛋白質をコードするcDNAのクローニング
鋳型となるcDNAは、9週齢、雄性シリアンハムスター小腸よりRNeasyキット(QIAGEN社)のマニュアルに従って抽出したRNAをもとに、TaqMan reverse transcription reagents (Applied Biosystems社) を用いてランダムプライマーから合成した。このハムスター小腸cDNAを鋳型とし、SGLTホモログのクローニングにはプライマーA (5’-gcaatggagcctggagattcag-3’)〔配列番号：５４〕およびプライマーB (5’-agcctgcctctggtcttg-3’) 〔配列番号：５５〕のセットを用いて、またSGLT1のクローニングのためにはプライマーC (5’-atggacagtagcaccttgagccccgcggtca-3’) 〔配列番号：５６〕およびプライマーD (5’-gattcaagcaaaatatccgtggcaaaaga-3’) 〔配列番号：５７〕を用いてPCRを行った。該反応における反応液の組成は上記cDNA 10 ngを鋳型として使用し、Pfu Turbo DNA Polymerase (STRATAGENE社)を1μl、プライマーを各0.5μM、dNTPsを200μM、および酵素に添付のバッファーを5μl加え、50μlの液量とした。反応は、94℃, 1分の後、96℃, 20秒、58℃, 30秒、72℃, 2分30秒のサイクルを40回繰り返し、最後に72℃, 7分の伸長反応を行った。該反応産物を1%アガロースゲル電気泳動で分離し、DNA断片を切り出し、ゲルエクストラクションキット(QIAGEN社)を用いてゲルから抽出した。抽出したDNAをTOPOライゲーションキット（インビトロジェン社）の処方に従い、pCR BluntIIベクターへサブクローニングした。これを大腸菌T0P10に導入し、cDNAクローンを得た。ハムスターSGLTホモログcDNAから予測されるアミノ酸配列を配列番号：５０に、配列番号：５０で示されるアミノ酸配列をコードする領域の塩基配列を配列番号：５１に示す。ハムスターSGLTホモログのアミノ酸配列のヒト、マウス、ラットのSGLTホモログのアミノ酸配列に対する相同性はそれぞれ86.4%, 88.4%, 88.3%であった。またハムスターSGLT1 cDNAから予測されるアミノ酸配列を配列番号：５２に、配列番号：５２で示されるアミノ酸配列をコードする領域の塩基配列を配列番号：５３に示す。ハムスターSGLT1のアミノ酸配列のヒト、マウス、ラットのSGLT１のアミノ酸配列に対する相同性はそれぞれ83.9%, 89.7%, 90.6%であった。
【実施例１１】
【０３０６】
ハムスターSGLTホモログまたはSGLT1を介する糖取り込み量の測定
ハムスターSGLTホモログ糖取り込み量は以下の手法で測定できる。ハムスター小腸cDNAよりクローニングしたハムスターSGLTホモログまたはSGLT1を動物細胞発現ベクターpcDNA3.1(インビトロジェン社)にサブクローニングすることによりハムスターSGLTホモログまたはSGLT1を動物細胞で発現せしめるベクターを構築する。該発現ベクター各1μgをFuGENE6試薬（Roche社）でCOS7細胞（5×105細胞）に導入しそれぞれの発現細胞を得る。ハムスターSGLTホモログまたはSGLT1導入COS7細胞のα-Methyl Glucoseの取り込み実験は、Am. J. Physiol. 270:G833-G843, 1996およびJ. Clin. Invest. 93:397-404, 1994の方法に従って行う。細胞を96穴プレートに3×104細胞／well、100μl 10% FBS添加DMEM培地で播種し、37℃で一夜培養する。細胞を125 mM のN-Methyl-D-Glucamineを添加した反応緩衝液（1.2 mM KH2PO4, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 4 mM Glutamine, 10 mM HEPES (pH7.2), 0.1 mg/ml BSA）で3回洗浄後、同緩衝液でさらに1時間培養し、細胞に残存するグルコースを除去する。150 mMの NaClを添加した反応緩衝液にphlorizin(Sigma社)を0, 0.1, 1 mMを添加したものをそれぞれ各wellに90μl添加する。さらに0.02μCiの［14C］-α-Methyl Glucose（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社）を含有する終濃度1 mM α-Methyl Glucoseを各wellに10μlずつ添加し、1時間の糖取り込み反応を行う。200μlの冷PBSで3回洗浄した後、液体シンチレータを各wellに100μlずつ添加し、細胞に取り込まれた14Cの量をシンチレーションカウンターで測定する。
【図面の簡単な説明】
【０３０７】
【図１】実施例２で得られた、消化管におけるヒトSGLTホモログの発現分布を示す。
【図２】実施例３で得られた、初代培養正常ヒト小腸上皮細胞におけるSGLT1, SGLTホモログの発現解析結果を示す。
【図３】実施例４で得られた、抗ヒトSGLTホモログ抗体によるヒト小腸切片の免疫染色結果を示す。
【図４】実施例５で得られた、糖尿病マウスにおけるSGLTホモログの発現変動の結果を示す。
【図５】実施例５で得られた、糖尿病ラットにおけるSGLTホモログの発現変動の結果を示す。
【図６】実施例６で得られた、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、サルの小腸におけるSGLT1, SGLTホモログの発現を示す。
【図７】実施例７で得られた、マウス、ラット、ハムスター小腸器官培養系による糖取り込み量の測定結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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