(57)【要約】      （修正有）【課題】トランスサイレチンとアミロイドβ−ペプチドとの間の相互作用を明らかにする。【解決手段】アミロイドβ−ペプチド（Ａβ）の沈着は、アルツハイマー病（ＡＤ）脳の主な病理学的特徴であり、Ａβを減少させることが主要な治療目的として考えられている。発明者らは、ＴＴＲが４０−および４２−アミノ酸Ａβ（Ａβ1-40およびＡβ1-42）の凝集に及ぼす影響について調査し、そしてＴＴＲがｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＡβ1-40およびＡβ1-42の線維形成を予防することを示した。ＴＴＲからのＮＭＲ共鳴のＡβ−誘導型摂動をモニターすることによって、ＴＴＲ上のＡβ−結合表面の同定に成功した。ＴＴＲとＡβとの間の相互作用する界面はサイロキシン結合チャンネルである。ＴＴＲのサイロキシン結合チャンネルは主に、Ａβの残基２５−３５と疎水結合によって相互作用し、そしてクロスβ−シートへの構造変化を妨げ、アミロイドーシスの速度を遅らせる。【選択図】図１
2005097194.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスサイレチンのサイロキシン結合チャンネルおよびその近傍部位への被験物質の結合特性を評価することを特徴とするアルツハイマー病の病因物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
トランスサイレチンのＬｅｕ１７、Ｌｅｕ１１０、Ｃｙｓ１０、Ａｌａ１９、Ｇｌｙ２２、Ａｌａ２５、Ｈｉｓ３１、Ａｒｇ１０４およびＳｅｒ１１５からなる群から選ばれる少なくとも１種と被験物質の結合特性を評価することを特徴とする請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
アミロイドβ−ペプチド（Ａβ）の残基２５−３５からなるトランスサイレチンのサイロキシン結合チャンネルとの結合性を有するポリペプチド。
【請求項４】
１２７アミノ酸残基からなるトランスサイレチンのＬｅｕ１７、Ｌｅｕ１１０、Ｃｙｓ１０、Ａｌａ１９、Ｇｌｙ２２、Ａｌａ２５、Ｈｉｓ３１、Ａｒｇ１０４およびＳｅｒ１１５以外の１もしくは複数のアミノ酸を改変してなるアミロイドβ−ペプチドとの結合性が増強されたトランスサイレチン改変体の製造方法。
【請求項５】
トランスサイレチンのサイロキシン結合チャンネルとアミロイドβ−ペプチドを被験物質の存在下に混合し、被験物質の存在によりトランスサイレチンのサイロキシン結合チャンネルとアミロイドβ−ペプチドとの結合特性がどのように変化するのかを調べることを特徴とする、アルツハイマー病の治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の病因物質のスクリーニング方法、トランスサイレチンのサイロキシン結合チャンネルとの結合性を有するポリペプチド、アミロイドβ−ペプチドとの結合性が増強されたトランスサイレチン改変体の製造方法、アルツハイマー病の治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）患者の脳は、主要な成分中のアミロイドβ−ペプチド（Ａβ）の線維によって形成される細胞外老人斑（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｎｉｌｅ  ｐｌａｑｕｅｓ）によって特徴づけられる（非特許文献１）。Ａβはまた、ヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）および血漿中で可溶性の形態で見出された（非特許文献２）。Ａβは３９−４３−アミノ酸ペプチドであり、β−およびγ−セクレターゼ（ｓｅｃｒｅｔａｓｅｓ）による２つの連続するタンパク質分解プロセッシングによってアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）から開裂される（非特許文献３、非特許文献４）。４０−アミノ酸Ａβ（Ａβ1-40）は４２−アミノ酸Ａβ（Ａβ1-42）よりも大量に産生されるけれども、Ａβ1-42は、Ａβ1-40よりも迅速に凝集し、また老人斑の主要な成分である（非特許文献５、非特許文献６）。Ａβのアミロイド蓄積が病理学的なカスケードの開始の原因であり且つ最終的にＡＤの完全な病理学的および臨床学的な症状を引き起こすこと（アルツハイマー病のＡβ仮説）が、一般的に認識されている（非特許文献７）。実際、最近の証拠によって、Ａβのオリゴマーおよび線維前駆体（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌｓ）が神経毒性の原因であるかもしれないことが示唆されている（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。それゆえ、Ａβ凝集を阻害することは、ＡＤの処置のための魅力的な治療法である。
【０００３】
Ｈｏｌｔｚｍａｎらは、抗−Ａβ抗体が血液−脳関門を通過しないにも関わらず、ＡＤの性質を有するように遺伝子操作されたマウスへ投与されたＡβに対する抗体が脳においてアミロイド沈着を減少させることを見出した。さらに、彼らは、抗−Ａβ抗体の末梢投与がＣＳＦおよび血液におけるＡβレベルを増加させることを見出し、脳からＣＳＦおよび血液への循環がＡβを脳から取り除くための「末梢シンク（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｓｉｎｋ）」として働くかも知れないことを示唆した。これらの発見は、Ａβへ結合し、そして脳Ａβの減少を導く末梢／脳の動力学を変える化合物の大きな重要性を示唆する（非特許文献１１、非特許文献１２）。
【０００４】
トランスサイレチン（ＴＴＲ）は、独立して主に肝臓および脳の脈絡叢において合成されるタンパク質であり（非特許文献１３）、また１２７アミノ酸モノマーからなる５５ｋＤａテトラマーとして血漿（０．２−０．３ｍｇ／ｍｌ）およびＣＳＦ（０．０２ｍｇ／ｍｌ）中で循環する。ＴＴＲのＸ線解析によって、各モノマーがＡからＨとして与えられる８つのβ−鎖および１つの短いα−へリックスを含むことが示された（非特許文献１４）。末梢において、ＴＴＲは、肝細胞によって血清中へ分泌され、そしてサイロキシンの輸送において役割を果たす。ＴＴＲはまた、レチノール−結合タンパク質（ＲＢＰ）（血液中のレチノールキャリア）へ結合することによって、レチノールの輸送に間接的に関与する（非特許文献１５、非特許文献１６）。中枢神経系（ＣＮＳ）内で、ＴＴＲは脈絡叢の上皮によって合成された後ＣＳＦ中へ分泌され（非特許文献１７）、またＴＴＲ−サイロキシン複合体は、ＣＳＦ循環を通じてサイロキシンを配送する機能（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を有する（非特許文献１８）。
【０００５】
サイロキシンおよびレチノールに対して輸送タンパク質として働くことに加え、ＴＴＲは、ＡＤの病因において重要な役割を果たすことが示唆された（非特許文献１９）。スウェーデン変異を有するヒトＡＰＰ（ＡＰＰｓｗ）の変異型を過剰発現するトランスジェニックマウスの脳において、Ａβの高レベルな発現が観察された。これにも関わらず、アミロイド斑は１２月齢になるまで発達せず、神経消失は、ＡＰＰｓｗマウスにおいて、１６月齢になるまで全く存在しなかった。ＴＴＲの発現はＡＰＰｓｗマウスの海馬において選択的に増加し、このことは、ＡＰＰｓｗマウスの海馬ニューロンにおいて、十分に発達したアルツハイマー病の進行の遅延および消失を部分的に担っていることを示す（非特許文献２０）。さらに、ＡＤの進行に予防効果を示すいくつかの化合物が存在し、それらは一般的に、ＴＴＲ発現およびＣＮＳにおける分泌を誘導する（非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３）。さらに、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  におけるＡβおよびＴＴＲの共発現が、不溶性Ａβ沈着の顕著な減少を導くことが示された（非特許文献２４）。
【０００６】
ＣＳＦ中のＡβ1-42レベルが、コントロールと比べて、ＡＤ患者において顕著に低いことが見出され（非特許文献２５）、一方ＣＳＦ中のＴＴＲレベルは、コントロールと比べて、ＡＤ患者において有意に減少しており、ＡＤ脳における老人斑の存在量に負の相関がある。「末梢シンク（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｓｉｎｋ）」仮説に基づき、ＡＤを有するＣＳＦ中のＡβ1-42レベルの減少は、ＣＳＦ中のＴＴＲレベルの減少によって説明され得、それゆえ、ＡＤ脳におけるＡβ1-42の沈着は、ＣＳＦ中のＴＴＲによるＡβ1-42の除去の減少によって引き起こされ得る。従って、Ａβの除去および沈着がＴＴＲによってどのように影響を受けているかということは、ＡＤの病理を理解するために、および可能性のあるＡＤ治療薬を設計するための方法を開発するために、重要である。
【非特許文献１】G. G. Glenner, C. W. Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 885 (1984)
【非特許文献２】P. Seubert, C. Vigo-Pelfrey, F. Esch, M. Lee, H. Dovey, D. Davis, S. Sinha, M. Schlossmacher, J. Whaley, C. Swindlehurst, et al. Nature 359, 325 (1992)
【非特許文献３】M. Shoji, T. E. Golde, J. Ghiso, T. T. Cheung, S. Estus, L. M. Shaffer, X. D. Cai, D. M. McKay, R. Tintner, B. Frangione, et al., Science 258, 126 (1992)
【非特許文献４】D. J. Selkoe, Physiol. Rev. 81, 741 (2001)
【非特許文献５】A. E. Roher, J. D. Lowenson, S. Clarke, A. S. Woods, R. J. Cotter, E. Gowing, M. J. Ball, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 10836 (1993)
【非特許文献６】T. Iwatsubo, A. Odaka, N. Suzuki, H. Mizusawa, N. Nukina, Y. Ihara, Neuron 13, 45 (1994)
【非特許文献７】J. A. Hardy, G. A. Higgins, Science 256, 184 (1992)
【非特許文献８】M. P. Lambert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 6448 (1998)
【非特許文献９】D. M. Walsh, A. Lomakin, G. B. Benedek, M. M. Condron, D. B. Teplow, J. Biol. Chem. 272, 22364 (1997)
【非特許文献１０】H. A. Lashuel, D. Hartley, B. M. Petre, T. Walz, P. T. Jr. Lansbury, Nature 418, 291 (2002)
【非特許文献１１】R. B. DeMattos, K. R. Bales, D. J. Cummins, J. C. Dodart, S. M. Paul, D. M. Holtzman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 8850 (2001)
【非特許文献１２】R. B. DeMattos, K. R. Bales, D. J. Cummins, S. M. Paul, D. M. Holtzman, Science 295, 2264 (2002)
【非特許文献１３】D. R. Soprano et al., J. Biol. Chem. 260, 11793 (1985)
【非特許文献１４】C. C. Blake, M. J. Geisow, S. J. Oatley, B. Rerat, C. Rerat, J. Mol. Biol. 121, 339 (1978)
【非特許文献１５】R. N. Ferguson, H. Edelhoch, H. A. Saroff, J. Robbins, H. J. Cahnmann, Biochemistry 14, 282 (1975)
【非特許文献１６】P. P. van Jaarsveld, H. Edelhoch, D. S. Goodman, J. Robbins, J. Biol. Chem. 248, 4698 (1973)
【非特許文献１７】J. Herbert, J. N. Wilcox, K. T. Pham, R. T. Jr, Fremeau, M. Zeviani, A. Dwork, D. R. Soprano, A. Makover, D. S. Goodman, E. A. Zimmerman, et al. Neurology 36, 900 (1986)
【非特許文献１８】C. M. Mendel, R. A. Weisiger, A. L. Jones, R. R. Cavalieri, Endocrinology 120, 1742 (1987)
【非特許文献１９】A. L. Schwarzman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8368 (1994)
【非特許文献２０】T. D. Stein, J. A. Johnson, J Neurosci. 22, 7380 (2002)
【非特許文献２１】L. G. Puskas, K. Kitajka, C. Nyakas, G. Barcelo-Coblijn, T. Farkas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 1580 (2003)
【非特許文献２２】C. M. Watanabe, S. Wolffram, P. Ader, G. Rimbach, L. Packer, J. J. Maguire, P. G. Schultz, K. Gohil, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 6577 (2001)
【非特許文献２３】Li, MD, Kane, JK, Matta, SG, Blaner, WS, Sharp, BM. J Neurosci. 20, 1318 (2000)
【非特許文献２４】C. D. Link, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 9368 (1995)
【非特許文献２５】R. Motter, C. Vigo-Pelfrey, D. Kholodenko, R. Barbour, K. Johnson-Wood, D. Galasko, L. Chang, B. Miller, C. Clark, R. Green, et al., Ann Neurol. 38, 643 (1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は、ＡβとＴＴＲとの間の結合界面の同定に基づく技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の項１〜項５を提供することを目的とする。
【０００９】
項１．  トランスサイレチンのサイロキシン結合チャンネルおよびその近傍部位への被験物質の結合特性を評価することを特徴とするアルツハイマー病の病因物質のスクリーニング方法。
【００１０】
項２．  トランスサイレチンのＬｅｕ１７、Ｌｅｕ１１０、Ｃｙｓ１０、Ａｌａ１９、Ｇｌｙ２２、Ａｌａ２５、Ｈｉｓ３１、Ａｒｇ１０４およびＳｅｒ１１５からなる群から選ばれる少なくとも１種と被験物質の結合特性を評価することを特徴とする項１に記載のスクリーニング方法。
【００１１】
項３．  アミロイドβ−ペプチド（Ａβ）の残基２５−３５からなるトランスサイレチンのサイロキシン結合チャンネルとの結合性を有するポリペプチド。
【００１２】
項４．  １２７アミノ酸残基からなるトランスサイレチンのＬｅｕ１７、Ｌｅｕ１１０、Ｃｙｓ１０、Ａｌａ１９、Ｇｌｙ２２、Ａｌａ２５、Ｈｉｓ３１、Ａｒｇ１０４およびＳｅｒ１１５以外の１もしくは複数のアミノ酸を改変してなるアミロイドβ−ペプチドとの結合性が増強されたトランスサイレチン改変体の製造方法。
【００１３】
項５．  トランスサイレチンのサイロキシン結合チャンネルとアミロイドβ−ペプチドを被験物質の存在下に混合し、被験物質の存在によりトランスサイレチンのサイロキシン結合チャンネルとアミロイドβ−ペプチドとの結合特性がどのように変化するのかを調べることを特徴とする、アルツハイマー病の治療薬のスクリーニング方法。
【００１４】
本発明により、ＡβはＴＴＲのサイロキシン結合チャンネルおよびその近傍部位に結合することが明らかにされた。ＴＴＲのサイロキシン結合チャンネルに結合する物質は、ＡβとＴＴＲの複合体形性の阻害を介して、Ａβの凝集を引き起こし、ひいてはアルツハイマー病の増悪因子になると考えられる。
【００１５】
従って、サイロキシン結合チャンネルおよびその近傍部位への被験物質の結合特性を評価することで、アルツハイマー病の増悪因子をスクリーニングすることが可能になる。
【００１６】
また、トランスサイレチンのサイロキシン結合チャンネルとアミロイドβ−ペプチドの結合特性が、被験物質の存在によりどのように影響されるのかを調べることにより、被験物質が該結合を強める場合には、Ａβ凝集を阻害するアルツハイマー病治療薬を見出すことができる。
【００１７】
さらに、トランスサイレチンのサイロキシン結合チャンネルとアミロイドβ−ペプチドは、トランスサイレチンのＬｅｕ１７、Ｌｅｕ１１０、Ｃｙｓ１０、Ａｌａ１９、Ｇｌｙ２２、Ａｌａ２５、Ｈｉｓ３１、Ａｒｇ１０４およびＳｅｒ１１５と結合するので、これら結合部位以外のアミノ酸残基を改変することにより、さらにＡβとの結合特性の優れたタンパク質が得られ得る。なお、Ｌｅｕ１７、Ｌｅｕ１１０、Ｃｙｓ１０、Ａｌａ１９、Ｇｌｙ２２、Ａｌａ２５、Ｈｉｓ３１、Ａｒｇ１０４およびＳｅｒ１１５に関し、同様なアミノ酸との変異（例えばロイシンとイソロイシン、アルギニンとリシン）は許容される。
本研究において、ＴＴＲがＡβ1-40およびＡβ1-42の凝集に及ぼす影響は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの定量的チオフラビン−Ｔ蛍光アッセイによって調べられた（図１Ａ）。凝集Ａβは、チオフラビンを結合し、蛍光スペクトルにおいてシフトを引き起こす（H. Naiki, K. Higuchi, M. Hosokawa, T. Takeda, Anal. Biochem. 177, 244 (1989)）。Ａβ1-40凝集の阻害は、低いＴＴＲ濃度においても観察され、濃度依存的に促進される。一方、２５０μｇ／ｍｌより低いＴＴＲ濃度において、Ａβ1-42凝集の阻害は観察されなかった。Ａβ1-42の凝集を阻害するためには、Ａβ1-42に対して等モル量のＴＴＲ（テトラマー）が必要である。それゆえ、十分量（６００μｇ／ｍｌ）のＴＴＲを用いて、Ａβ凝集の経時的アッセイ（ｔｉｍｅ−ｌａｐｓ  ａｓｓａｙ）を行った（図１Ｂ）。Ａβ1-42の凝集は、Ａβ1-40のものに比べて非常に迅速であり、ＴＴＲの非存在下において４８時間でプラトー（ｐｌａｔｅａｕ）に達する。Ａβ1-40およびＡβ1-42の両方についてＴＴＲの添加による蛍光シグナルの減少が観察され、これはＴＴＲがＡβの凝集を防ぐことを示唆している。本発明者らの結果は、ＴＴＲがＡβフラグメント（Ａβ1-40の１−２８アミノ酸残基（Ａβ1-28））を結合し且つｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＡβ1-28のアミロイド線維形成を阻害することを示す以前のデータと矛盾しない（Ｓｃｈｗａｒｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）。
【００１８】
二次元（２Ｄ）の1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣ（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  ｓｉｎｇｌｅ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）スペクトルを使用し、ＴＴＲ上のＡβ−結合表面を同定した。2Ｈ／15Ｎ−標識ＴＴＲおよび未標識Ａβ  （Ａβ1-40およびＡβ1-42）を使用した。それにより、1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルは、Ａβと複合体を形成しているＴＴＲからのシグナルを選択的に観測した。遊離ＴＴＲおよびＡβと複合体を形成しているＴＴＲのＨＳＱＣスペクトルの重なり合いを図６中に示す。Ａβ−結合によって誘導されるＴＴＲの骨格1ＨN  および15Ｎ共鳴に対する化学シフト変化は、化学シフト摂動法（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｈｉｆｔ  ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ）を用いて分析された。特異的な化学シフト変化は通常、タンパク質とリガンドとの間の特異的な相互作用と相関関係がある（Ｓｈｕｋｅｒ  ｅｔ  ａ．，  １９９６）。化学シフト変化（Δδ  ＝  ［（５Δ1ＨN）2  ＋  （Δ15Ｎ）2］0.5、ここで、Δ1ＨN  およびΔ15Ｎは、それぞれアミド1ＨN  および  15Ｎ化学シフトにおける変化量である）は、ＴＴＲの１０６個の帰属する残基のうち１００個の十分に分解された残基について計算された（図２）。Ａβ1-42−結合から生じるＴＴＲの化学シフト変化は、ＴＴＲ配列の限られた領域においてのみ顕著な変化を示した。大きな化学シフト変化を示す残基（Δδ＞０．３）は、残基Ｌｅｕ１７、およびＬｅｕ１１０であり、残基Ｃｙｓ１０、  Ａｌａ１９、Ｇｌｙ２２、Ａｌａ２５、Ｈｉｓ３１、Ａｒｇ１０４およびＳｅｒ１１５は中程度の化学シフト変化（０．３＞Δδ＞０．２）を示す。これらの残基は、ＴＴＲ配列のＮ末端およびＣ末端部分に存在する。Ａβ1-42への結合時に有意な化学シフト変化を示す残基は、ＴＴＲのテトラマー構造において色付けされている（図３）。図３は、Ａβ1-42−結合表面がサイロキシン結合チャンネル内の残基およびチャンネルの外側の残基を含むことを示す（Ｗｏｊｔｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２：  Ｗｏｊｔｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１：  図７）。サイロキシン結合チャンネル中の疎水性残基Ｌｅｕ１７およびＬｅｕ１１０は、大きな化学シフト変化（Δδ＞０．３）を示し、これによりこれらの残基がＴＴＲとＡβ1-42との間の相互作用にとって重要であることが示唆される（図２および３、図７）。Ａβ1-40がＡβ1-42よりも非常に小さい化学シフト変化を引き起こすにも関わらず、Ａβ1-40との複合体形成時に、ＴＴＲの1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルにおいて、特異的な化学シフト摂動が観測された（図２）。Ａβ1-40に対するＴＴＲの低い親和性は、観測される小さな化学シフト変化の原因であるかも知れない（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。顕著な化学シフト変化を示す残基は、Ｍｅｔ１３、Ｌｅｕ１７およびＬｅｕ１１０であり、これらは、サイロキシン結合チャンネルの周りに位置する（図３およびＳ２）。ＴＴＲのテトラマーは、可能性のある２つのリガンド結合部位（すなわち、サイロキシン結合チャンネル  （Ｗｏｊｔｃｚａｋ  ｅｔ  ａ．，  １９９２：  Ｗｏｊｔｃｚａｋ  ｅｔ  ａ．，  ２００１）  およびＲＢＰ−結合部位（Ｍｏｎａｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５：  Ｎａｙｌｏｒ  ＆  Ｎｅｗｃｏｍｅｒ，  １９９９））を有する。発明者らの結果によって、ＴＴＲとＡβとの間の相互作用する界面が、ＰＢＲ−結合部位ではなく、サイロキシン結合チャンネルであることが示される（図３およびＳ２）。
【００１９】
いくつかの残基のピーク強度は、Ａβ1-42への結合時に顕著に減少しており、一方  Ａβ1-40は複合体形成時のＴＴＲのピーク強度を変化させない（図４）。ＮＭＲによってタンパク質とリガンドとの間の相互作用表面を同定するために使用されるもっとも良く知られる方法は、化学シフト変化を観測することであるが（Ｓｈｕｋｅｒ  ｅｔ  ａ．，  １９９６）、ピーク強度における変化の測定もまた、タンパク質とリガンドとの間の相互作用表面をマッピングするための有用な方法である（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００：  Ｂｏｏｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。ピーク強度変化対残基数のプロットを図４に示し、大きなピーク強度変化を示す残基をＴＴＲの構造において色付けする（図５）。図４および５は、Ａβ1-42が主にサイロキシン結合チャンネル中の残基と相互作用することを示している。これらの変化は、Ａβ1-42とＴＴＲの複合体形成における化学シフト摂動のデータと矛盾しない。図４中に示すように、Ａβ1-40の結合はピーク強度を変化させず、このことは、恐らく化学シフト法の方がピーク強度法よりも感度が高いことを示唆する（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。
【００２０】
Ａβのアミノ酸配列のなかでＴＴＲへの結合にとって重要であることを調べるために、本発明者らは、化学シフトおよびピーク強度法を用いて、Ａβ1-16およびＡβ25-35（それぞれ、Ａβ1-40の残基１−１６および２５−３５）のＴＴＲへの結合を調査した（図２および４）。Ａβ1-16およびＡβ25-35の結合によって引き起こされる化学シフトおよびピーク強度変化は、ＴＴＲ構造上にマッピングされる（図３および５）。Ａβ25-35の結合は、Ｃｙｓ１０、Ｍｅｔ１３、Ｖａｌ１６、Ｌｅｕ１７、Ａｌａ１９、Ａｌａ２５、Ａｌａ１０８、Ｌｅｕ１１０およびＶａｌ１２２の化学シフトに影響を及ぼし、またこれらの残基は、サイロキシン結合チャンネルの周りに位置づけられる（図２および３）。一方、Ａβ1-16の結合は、Ｇｌｙ２２、Ｈｉｓ９０およびＴｈｒ９６の化学シフトへ変化をもたらす（図２）。Ｇｌｙ２２はサイロキシン結合部位中に存在するが、Ｈｉｓ９０およびＴｈｒ９６はサイロキシン結合チャンネルの外側に位置する（図３）。また、ＮＭＲピーク強度変化によって、Ａβ25-35−結合がサイロキシン結合チャンネルの周り残基の共鳴に影響を与え、それと同時にＡβ1-16がイオンチャンネルにおける残基およびイオンチャンネルの外側の残基のピーク強度に影響をもたらすことが示される（図４および５）。これらの結果は、ＴＴＲのサイロキシン結合チャンネルが、主としてＡβ1-40の残基２５−３５と相互作用することを示す。
【００２１】
Ａβは、数多くの形態（モノマー、ダイマー、高次オリゴマーおよびアミロイド線維をふくむ）で存在しているらしい（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。Ａβは、膜環境においてα−へリックス構造をとるらしい；しかしながら、モノマーＡβは、一連のループ、鎖、および折り返し（ｔｕｒｎｓ）を含むコンパクトな形状に折りたたまれ、溶液中で明瞭なα−へリックスまたはβ−シート構造をとらない（Ｓｈａｏ，  Ｈ．，  Ｊａｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９：  Ｚｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００：  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。モノマーのレベルが正常な濃度以上に上昇する場合に、ダイマーおよび高次オリゴマーを好み、これらのオリゴマー型が最終的にアミロイド線維を形成する（Ｓｅｌｋｏｅ，  ２０００）。最近、Ａβ1-40線維の固体ＮＭＲ研究によって、線維中のＡβ1-40が１８０°の屈折（残基２５−２９）により繋がっている２つのβ−鎖（残基１２−２４および３０−４０）からなる逆平行β−シートをとり、ペプチドが線維の中で平行に配置されていることが示された（Ｐｅｔｋｏｖａ，  ＡＴ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。Ａβ1-40は、中心（残基１７−２１、ＬＶＦＦＡ）およびＣ末端（残基３０−４０、ＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ）疎水性セグメントを有する。これらのセグメントはβ−シート構造中に含まれ、そして側鎖疎水性パッキングがアミロイド線維の分子内および分子間構造（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）に大きく寄与する。本発明におけるＮＭＲデータは、化学シフトおよびピーク強度変化を示す残基の半数以上が疎水性であることを示す（図３および５）。それゆえ、ＴＴＲおよびＡβの複合体形成は、主として、電気的相互作用よりもむしろ疎水性相互作用によってなされる。発明者らは、サイズふるいクロマトグラフィー（ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって、発明者らの実験条件において、Ａβを溶解した直後にＡβがモノマー型として存在していることを確かめた（データは示さない）。それゆえ、ＴＴＲは、サイロキシン結合チャンネル中のモノマーＡβを疎水性相互作用によって結合し、そしてクロスβ−シートへの構造変化を妨げ、アミロイドーシスの速度を遅らせる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する
（方法）
ＡβおよびヒトＴＴＲの調製
全ての合成Ａβ（Ａβ1-40、Ａβ1-42、Ａβ1-16およびＡβ25-35）を、ＰＥＰＴＩＤＥ  ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ，  ＩＮＣから購入した。ヒトＴＴＲを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  株  Ｍ１５  （ＱＩＡＧＥＮ）において、Ｎ末端でポリヒスチジンヘ連結された融合タンパク質として発現させ、その後Ｎｉキレーションアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した（Ｍａｔｓｕｂａｒａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．）。１７．８×１０3ｃｍ-1・Ｍ-1のモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度により、ＴＴＲ濃度を推定した。適切な標識化合物（15Ｎ−ＮＨ4Ｃｌおよび／または13Ｃ−グルコース）を含み且つＨ2Ｏの代わりに2Ｈ2Ｏを用いて作製したＭ９培地においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  を培養することにより、2Ｈ／15Ｎ／13Ｃ−標識ＴＴＲおよび2Ｈ／15Ｎ−標識ＴＴＲを作製した。この培地に基本培地イーグルビタミン溶液（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）およびミネラル混合物を添加した。
【００２３】
チオフラビン−Ｔ蛍光発光によってモニターされるＡβのアミロイド線維形成
ストック溶液として、各合成Ａβをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に１０ｍｇ  ｍｌ-1の濃度で溶解した。Ａβストック溶液を、様々な濃度のＴＴＲを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）および１５０ｍＭ  ＫＣｌ溶液で２５倍希釈した。Ａβの最終濃度を０．４ｍｇ  ｍｌ-1とした。この溶液を攪拌せずに３７℃にてインキュベートた後、５０μｌ溶液を６５０μｌの２０μＭチオフラビン−Ｔ溶液と混合した。ＨＩＴＡＣＨＩ蛍光分光光度計で、２ｍｍの光学キュベット（ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｕｖｅｔｔｅ）を用いて、蛍光強度を測定した。励起は４５０ｎｍ（５ｎｍのバンドパス（ｂａｎｄｐａｓｓ）で行った）にて、発光は４８２ｎｍ（２０ｎｍのバンドパスで行った）にてモニターされた。
ＮＭＲ測定
ＮＭＲ測定のためのサンプルを記載のように調製した（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａ．，  ２０００）。ＴＴＲの骨格共鳴帰属（ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）について、１  ｍＭのタンパク質濃度にて、５０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ６．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＫＣｌおよび１０％  2Ｈ2Ｏ中の2Ｈ／15Ｎ／13Ｃ−標識ＴＴＲを用いて、全てのＮＭＲ実験を行った。これらの条件下において、４０℃にて、重水素デカップリング法（ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｃｏｕｐｌｉｎｇ）を用いて、３次元（３Ｄ）ＴＲＯＳＹ−ＨＮＣＡ、ＴＲＯＳＹ−ＨＮ（ＣＡ）ＣＢ、ＴＲＯＳＹ−ＨＮ（ＣＯ）ＣＡおよびＴＲＯＳＹ−ＨＮ（ＣＯ）ＣＡＣＢスペクトルを収集した  （Ｓａｌｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８：  Ｓａｌｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。  さらなる３Ｄ  ＴＲＯＳＹ−ＨＮＣＡおよびＨＮ（ＣＯ）ＣＡ  スペクトルを４５℃にて収集した。２Ｄ  1Ｈ−15Ｎ  ＴＲＯＳＹ−ｔｙｐｅ  ＨＳＱＣを、2Ｈ／15Ｎ−標識ＴＴＲ  を用いて収集した（Ｐｅｒｖｕｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。ＴＴＲおよびＡβの複合体のＮＭＲ測定のために、５０ｍＭ  リン酸カリウム、  １００ｍＭ  ＫＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ  ５．８５）を含む９０％  Ｈ2Ｏ／１０％  Ｄ2Ｏ中に溶解する2Ｈ／15Ｎ−標識ＴＴＲ  （１．６  ｍＭ）を調製した。凍結乾燥させたＡβへＴＴＲ溶液を添加することによって、ＡβとＴＴＲの混合溶液を調製した。遊離ＴＴＲおよびＡβと複合体を形成するＴＴＲについて、２Ｄ  1Ｈ−15Ｎ  ＴＲＯＳＹ−ｔｙｐｅ  ＨＳＱＣを測定した（Ｐｅｒｖｕｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。全てのＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ  ＤＭＸ−５００上で記録した。ＮＭＲＰｉｐｅ  （Ｄｅｌａｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）  を用いて全てのＮＭＲデータを処理し、そしてＮＭＲＶｉｅｗ  を用いて分析した（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｂｌｅｖｉｎｓ，  １９９４）。
参考文献および注釈
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【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】３７℃においてＴＴＲがＡβ1-40（左）およびＡβ1-42（右）の凝集に及ぼす影響。（Ａ）様々な濃度のＴＴＲの存在下におけるＡβ1-40およびＡβ1-40凝集のチオフラビン−Ｔ−ベース蛍光アッセイ（ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ−Ｔ−ｂａｓｅｄ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）。全てのサンプルを攪拌することなく１０日間インキュベートした。（Ｂ）６００μｇ／ｍｌ  ＴＴＲの存在下（白丸）および非存在下（黒丸）におけるＡβ1-40およびＡβ1-40凝集のチオフラビン−Ｔ蛍光経時的アッセイ（ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ−Ｔ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｔｉｍｅ−ｌａｐｓ  ａｓｓａｙｓ  ）である。
【図２】化学シフト変化  対  Ａβ1-42（Ａ）、Ａβ1-40（Ｂ）、Ａβ25-35（Ｃ）およびＡβ1-16（Ｄ）との複合体形成に関与するＴＴＲの残基数のプロット。化学シフト変化（Δδ）は、［（５Δ1ＨN）2  ＋  （Δ15Ｎ）2］0.5の等式によって計算され、ここでΔ1ＨNおよびΔ15Ｎは、それぞれアミド1ＨNおよび15Ｎ化学シフトにおける変化量である。
【図３】Ａβ1-42（Ａ）、Ａβ1-40（Ｂ）、Ａβ25-35（Ｃ）およびＡβ1-16（Ｄ）との結合界面を示すテトラマーＴＴＲの構造。顕著な化学シフト変化（Δδ＞０．２）を示す残基を棒状モデルによって表し、アミノ酸の型に従って、疎水性（緑色）、親水性（オレンジ色）、正電荷（青色）、または負電荷（赤色）色付けした。この図において、サイロキシン分子はテトラマーＴＴＲの中心へ結合し、一方ＲＢＰ−レチノール複合体はＴＴＲテトラマーの左側および右側へ結合する（Ｗｏｊｔｃｚａｋ  ｅｔ  ａ．，  １９９２：  Ｗｏｊｔｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１：  Ｍｏｎａｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５：  Ｎａｙｌｏｒ  ＆  Ｎｅｗｃｏｍｅｒ，  １９９９）。
【図４】ピーク強度変化  対  Ａβ1-42（Ａ）、Ａβ1-40（Ｂ）、Ａβ25-35（Ｃ）およびＡβ1-16（Ｄ）との複合体形成に関与するＴＴＲの残基数のプロット。ピーク強度変化は、Ｉfree／Ｉcomplexで表され、それぞれ、Ｉfreeは遊離ＴＴＲからのピーク強度であり、ＩcomplexはＡβと複合体を形成しているＴＴＲからのものである。
【図５】Ａβ1-42  （Ａ）、Ａβ25-35（Ｂ）およびＡβ1-16（Ｃ）との結合界面を示すテトラマーＴＴＲの構造。顕著なピーク強度変化（Ｉfree／Ｉcomplex＞２．０）を示す残基を棒状モデルによって表し、それらの側鎖に従って、疎水性（緑色）、親水性（オレンジ色）、正電荷（青色）、または負電荷（赤色）に色付けした。この図において、サイロキシン分子はテトラマーＴＴＲの中心へ結合し、一方ＲＢＰ−レチノール複合体はＴＴＲテトラマーの左側および右側へ結合する  （Ｗｏｊｔｃｚａｋ  ｅｔ  ａ．，  １９９２：  Ｗｏｊｔｃｚａｋ  ｅｔ  ａ．，  ２００１：  Ｍｏｎａｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５：  Ｎａｙｌｏｒ  ＆  Ｎｅｗｃｏｍｅｒ，  １９９９）。
【図６】遊離ＴＴＲ（黒色）およびＡβと複合体を形成しているＴＴＲ（赤色）の５．８５および４０℃における1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣ  ＮＭＲ  スペクトルの重ね合わせ（ｓｕｐｅｒｐｏｓｉｔｉｏｎ）。2Ｈ／15Ｎ−標識ＴＴＲ  および未標識（Ａ）Ａβ1-40、（Ｂ）Ａβ1-42、（Ｃ）Ａβ1-16、または（Ｄ）Ａβ25-35を使用した。
【図７】ＴＴＲ−サイロキシン複合体（Ａ，ＰＤＢ  ＩＤ：  １ＩＣＴ）およびＴＴＲ−ＲＢＰ−レチノール複合体（Ｂ，ＰＤＢ  ＩＤ：  １ＲＬＢ）のリボン表示図。ＴＴＲおよびＲＢＰをそれぞれ緑色および青色で色付けした。サイロキシンおよびレチノール分子は、赤色で色付けしたＣＰＫモデルとして表される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６（Ａ）】
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【図６（Ｂ）】
2005097194.tif 000009
【図６（Ｃ）】
2005097194.tif 000010
【図６（Ｄ）】
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【図７】
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【配列表】
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