(57)【要約】【課題】  子宮内膜癌や乳癌のようなＳＴＳ酵素活性によって引き起こされる疾病の予防、治療のための、ＳＴＳ酵素活性の抑制方法、及び該ＳＴＳ酵素活性の抑制に用いる抑制物質を提供すること。【解決手段】  ステロイドスルファターゼ（ＳＴＳ）のＣ末端又はＮ末端のアミノ酸配列を欠失させたＳＴＳの変異体はＳＴＳ酵素活性を低下し、しかも、ＳＴＳ酵素活性に対するドミナントネガティブ効果を示し、ＳＴＳ酵素活性抑制効果を示す。本発明は、ＳＴＳの変異体を用いるＳＴＳ酵素活性の抑制方法、該ＳＴＳ酵素活性の抑制方法において、ＳＴＳ酵素活性のインフィビター（抑制物質）として用いるＳＴＳの変異体、該ＳＴＳの変異体をコードする遺伝子、該遺伝子を組込んだベクター、及び、該ＳＴＳ変異体やその遺伝子を用いたＳＴＳ酵素活性によって引き起こされる疾病の予防及び／又は治療剤等からなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステロイドスルファターゼの変異体を用いることを特徴とするステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法。
【請求項２】
ステロイドスルファターゼの変異体が、ステロイドスルファターゼのＣ末端欠失酵素タンパク質であることを特徴とする請求項１記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法。
【請求項３】
ステロイドスルファターゼのＣ末端欠失酵素が、Ｃ末端のアミノ酸の２４個を欠失させた酵素タンパク質であることを特徴とする請求項２記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法。
【請求項４】
ステロイドスルファターゼの変異体が、ステロイドスルファターゼのＮ末端欠失酵素タンパク質であることを特徴とする請求項１記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法。
【請求項５】
ステロイドスルファターゼのＣ末端欠失酵素が、Ｎ末端のアミノ酸の５２個を欠失させた酵素タンパク質であることを特徴とする請求項４記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載のステロイドスルファターゼの変異体と野生型のステロイドスルファターゼとの複合体を用いることを特徴とする請求項１記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法。
【請求項７】
ステロイドスルファターゼ変異体の酵素活性の抑制が、ステロイドスルファターゼのドミナントネガティブ変異によって引き起こされることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか記載のステロイドスルファターゼの変異体をコードする遺伝子を導入し、発現することを特徴とするステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか記載のステロイドスルファターゼの変異体をコードする遺伝子と野生型のステロイドスルファターゼをコードする遺伝子を、共に導入することを特徴とするステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制作用を有するステロイドスルファターゼ変異体。
【請求項１１】
請求項１０記載のステロイドスルファターゼ変異体からなるステロイドスルファターゼ酵素活性のインヒビター。
【請求項１２】
ステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制作用を有するステロイドスルファターゼの変異体をコードする請求項８記載の遺伝子。
【請求項１３】
請求項９記載のステロイドスルファターゼの変異体をコードする遺伝子と野生型のステロイドスルファターゼをコードする遺伝子とからなるステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制作用を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１４】
請求項１２又は１３記載の遺伝子を組込んだ遺伝子発現用ベクター。
【請求項１５】
ステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制作用を有するステロイドスルファターゼの変異体をコードする遺伝子と野生型のステロイドスルファターゼをコードする遺伝子を共に組込んだ、ステロイドスルファターゼ変異体及び野生型ステロイドスルファターゼ遺伝子発現用ベクター。
【請求項１６】
請求項１２或いは請求項１３記載の遺伝子、又は請求項１４或いは１５記載のベクターからなることを特徴とするステロイドスルファターゼ酵素活性のインヒビター。
【請求項１７】
請求項１０記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制作用を有するステロイドスルファターゼ変異体、請求項１２或いは請求項１３記載の遺伝子、又は請求項１４或いは１５記載のベクターを含有することを特徴とするステロイドスルファターゼ酵素活性によって引き起こされる疾病の予防及び／又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ステロイドスルファターゼ（ＳＴＳ）の変異体、該変異体酵素タンパク質をコードする遺伝子、及びそれらを用いたステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロイドスルファターゼ（ＳＴＳ：ＥＣ  ３．１．６．２．）は、肝臓、卵巣及び睾丸等の様々な哺乳動物組織に存在し、特に胎盤に多く存在する（. J Clin Endocrinol Metab 25:278-282, 1965）。この酵素は、膜結合タンパク質であり、小胞体（ＥＲ）に局在し、コレステロール サルフェート（cholesterol sulfate）、プロゲステロン サルフェート（progesterone sulfate）、ジヒドロエピアンドロステロン サルフェート（dihydroepiandrosterone sulfate）、及び硫酸エストロン(estrone sulfate)等の、３β−ハイドロキシステロイド サルフェートの脱硫酸化を触媒する（Ann NY Acad Sci 390:16-26, 1982；J Biol Chem 264:13865-13872, 1989；Histochem J 20:41-51, 1988）。
【０００３】
ステロイドホルモンの硫酸化形態は、レセプターと結合することができないために不活性となっているが、ＳＴＳによる脱リン酸化後には活性となる（J Clin Endocrinol Metab 25:278-282, 1965）。海面活性剤を使用して、組織由来のミクロソームの画分からＳＴＳが精製されてきた（Steroids 31: 783-798, 1978）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定では、ＳＴＳの分子の大きさは約６３ｋＤａであるが、ゲル濾過分析によるＳＴＳの活性化された状態では外見上、ＳＴＳは１２６ｋＤａタンパク質であると考えられる（J Steroid Biochem 19:1591-1598）。エンドグリコシダーゼＨによるＳＴＳの消化によって、ＳＴＳは２つのＮ−グリコシル化部位を有することが明らかとなった(J Biol Chem 264:13865-13872, 1989)。
【０００４】
Ｘ染色体性魚鱗癬（ＸＬＩ）は、ＳＴＳ酵素活性の欠損によって発症する遺伝性の皮膚障害である。ＳＴＳ酵素活性が欠如すると、表皮に過剰な量のコレステロール硫酸が生じ、角質細胞の物性が変質する（J Clin Invest 74:1414-1421, 1984；J Invest Dermatol 111:784-790, 1998）。ＸＬＩは、暗褐色で多角形の大きな鱗屑で全身の皮膚が鱗屑化することを特徴とする。ＸＬＩは、患者の母親の胎盤又は生後の患者のリンパ球でのＳＴＳ活性を分析することによって診断されてきた（Hum Mutat (Online) 15:296, 2000）。ＳＴＳ遺伝子をクローニングし、ほとんどのＸＬＩ患者にＳＴＳ遺伝子の大きな欠失があることが明らかとなった（Recent Prog Horm Res 54:369-394, 1999；Proc Natl Acad Sci USA 92:4778-4782, 1995；. Clin Chim Acta 226:13-20, 1994）。しかし、ＳＴＳ遺伝子における点突然変異が、ＳＴＳが完全に欠損した数名のＸＬＩ患者から報告されている。
【０００５】
ＳＴＳは、上記するように３β−ハイドロキシステロイド サルフェートの脱硫酸化を触媒するが、ステロイド核の３−位に硫酸基を有するステロイド前駆体又はプロホルモン（ステロイド硫酸）は、ヒト体内におけるステロイド代謝の中間体として重要な役割を果たすことが知られている。例えば、エストロン硫酸及びデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＡ）硫酸は、体内においてエストロン及びエストラジオールのようなエストロゲンの生成における中間体として重要な役割を果たすことが知られている。例えば、エストロン硫酸は、特に、閉経後の女性に特有な主要な循環エストロゲン前駆体の1つの例であることが知られており、そして乳房の腫瘍におけるエストロンスルファターゼ活性は、エストロゲン形成に関わる他の酵素より１００〜１０００倍大きいことが報告されている（Steroids,50,269-279,1987）。
【０００６】
エストロゲン硫酸は、硫酸基のためにレセプターに結合されない。したがって、エストロゲン硫酸が局所でホルモン作用を発揮するためにはＳＴＳにより、脱硫酸化を受けないと作用が発揮されない。近年、子宮内膜癌および乳癌の発育と増殖はエストロゲン依存性であることが報告されている、即ち、エストロンやエストラジオールのようなエストロゲン、特にそれらの過剰生成は、乳癌のような悪性腫瘍に強く関係していることが報告されている。乳癌での高いエストロゲンレベルは、ＳＴＳ（エストロンスルファターゼ）によって、エストロンスルフェートがエストロンへ加水分解されることに起因しているものと考えられている。最近の報告では、ＳＴＳ酵素活性は、エストロン依存性乳癌だけでなく、エストロン類が関与すると考えられる他の疾病、例えば、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮内膜症及び子宮腺筋症等、或いはアンドロゲン類が関与すると考えられる疾病、例えば、前立腺癌等にも関与すると考えられている。
【０００７】
子宮内膜癌や乳癌等のエストロン類が関与すると考えられる疾病の癌の発育と増殖が、エストロゲン依存性であることから、局所のホルモン環境の形成にＳＴＳが重要な役割を演じていると考えられ、該腫瘍増殖の抑制にＳＴＳ酵素活性の抑制が、化学療法として検討されてきた。今までに、ＳＴＳ酵素活性の抑制には、各種のステロイド系（Cancer Research, 53, 298,1993；Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 3, 313,1993）及び非ステロイド系（Exoert opinion on therapeutic patents, 9,1083,1999）のインフィビター（阻害物質）が見い出されてきた。
【０００８】
近年においても、数多くのＳＴＳ酵素活性のインフィビターが開示されている。例えば、非ステロイド系インフィビターとしては、特開２００２−２９３７６８号公報、特開２００２−２０３６２号公報、特表２００３−５１４８０６号公報、特表２００２−５１１４５９号公報、及び特表２０００−５０４７１７号公報等の化合物が挙げられ、ステロイド系インフィビターとしては、特開２００３−２３８４１３号公報、特開２００３−１７６２９７号公報、特開２００２−２５５９９３号公報、特開２０００−３５５５９８号公報、特開２０００−３８３４１号公報、特表２００４−５０６７４２号公報、特表２００３−５０８５４２号公報、特表２００２−５１７４４９号公報、特表２００１−５２４５２５号公報等の化合物が挙げられる。しかしながら、これらはいずれも低分子化学物質を阻害物質（インフィビター）とするものであるから、ヒト等への投与にあたっての化学療法としてのリスクを有し、しかも、阻害物質の酵素活性の抑制は十分ではなく、また、代謝された阻害物質がホルモン様の作用を生じたりして、その抗腫瘍効果は十分ではないという問題があった。
【特許文献１】特開２００３−２３８４１３号公報。
【特許文献２】特開２００３−１７６２９７号公報。
【特許文献３】特開２００２−２９３７６８号公報。
【特許文献４】特開２００２−２５５９９３号公報。
【特許文献５】特開２００２−２０３６２号公報。
【特許文献６】特開２０００−３５５５９８号公報。
【特許文献７】特開２０００−３８３４１号公報。
【特許文献８】特表２００４−５０６７４２号公報
【特許文献９】特表２００３−５１４８０６号公報。
【特許文献１０】特表２００３−５０８５４２号公報。
【特許文献１１】特表２００２−５１７４４９号公報。
【特許文献１２】特表２００２−５１１４５９号公報。
【特許文献１３】特表２００１−５２４５２５号公報。
【特許文献１４】特表２０００−５０４７１７号公報。
【非特許文献１】Warren, J.C., et al. J Clin Endocrinol Metab 25:278-282, 1965。
【非特許文献２】Choe, B.K., et al. Ann NY Acad Sci 390:16-26, 1982。
【非特許文献３】Stein, C., et al. J Biol Chem 264:13865-13872, 1989。
【非特許文献４】Willemsen, R., et al. Histochem J 20:41-51, 1988。
【非特許文献５】Gauthier, R., et al. Steroids 31: 783-798, 1978。
【非特許文献６】Noel, H., et al. J Steroid Biochem 19:1591-1598。
【非特許文献７】Elias, P.M., et al. J Clin Invest 74:1414-1421, 1984。
【非特許文献８】Zettersten, E., et al. J Invest Dermatol 111:784-790, 1998。
【非特許文献９】Sugawara, T., et al. Hum Mutat (Online) 15:296, 2000。
【非特許文献１０】Strauss, J. F., et al. Recent Prog Horm Res 54:369-394, 1999。
【非特許文献１１】Sugawara, T., et al. Proc Natl Acad Sci USA 92:4778-4782, 1995。
【非特許文献１２】Sugawara, T., et al. Clin Chim Acta 226:13-20, 1994。
【非特許文献１３】James, et al. Steroids,50,269-279,1987。
【非特許文献１４】Cancer Research, 53, 298,1993。
【非特許文献１５】Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 3, 313,1993。
【非特許文献１６】Exoert opinion on therapeutic patents, 9,1083,199９。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、子宮内膜癌や乳癌のようなステロイドスルファターゼ（ＳＴＳ）酵素活性によって引き起こされる疾病の予防、治療に有効で、かつ安全なＳＴＳ酵素活性の抑制方法、及び該ＳＴＳ酵素活性の抑制に用いるインフィビター（抑制物質）を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく、鋭意研究する中で、ステロイドスルファターゼ（ＳＴＳ）のＣ末端のアミノ酸配列、或いは、ＳＴＳのＮ末端のアミノ酸配列を欠失させたＳＴＳの変異体が、ＳＴＳ酵素活性を低下し、しかも、ＳＴＳの変異体は、野生型のＳＴＳと複合体を形成し、ＳＴＳ酵素活性に対するドミナントネガティブ効果を示して、野生型のＳＴＳに対して有効なＳＴＳ酵素活性抑制効果を示すことを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、ＳＴＳの変異体を用いるＳＴＳ酵素活性の抑制方法からなり、更には、該ＳＴＳ酵素活性の抑制方法において、ＳＴＳ酵素活性のインフィビター（抑制物質）として用いられるＳＴＳの変異体、該ＳＴＳの変異体の酵素タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を組込んだベクター、及び、該ＳＴＳ変異体やその遺伝子からなるＳＴＳ酵素活性によって引き起こされる疾病の予防及び／又は治療剤等からなる。本発明において、ＳＴＳのＣ末端のアミノ酸配列を欠失させたＳＴＳの変異体としては、Ｃ末端のアミノ酸の２４個を欠失させた酵素タンパク質を挙げることができ、ＳＴＳのＮ末端のアミノ酸配列を欠失させたＳＴＳの変異体としては、Ｎ末端のアミノ酸の５２個を欠失させた酵素タンパク質を挙げることができる。また、本発明においては、ＳＴＳの変異体と野生型のＳＴＳとを、例えば、それらの遺伝子のような形で共に導入して、ＳＴＳ酵素活性に対するドミナントネガティブ効果を発揮することができる。
【００１２】
本発明の開発の経緯について説明すると、本発明者は以前に、ＳＴＳの遺伝子で１塩基が変化した２つの事例について報告したが、アミノ酸変異体Ｈ４４４Ｒ及びＱ５６０Ｐは、これらの事例で見出されたものである（Hum Mutat (Online) 15:296, 2000）。ＳＴＳのＣ末端領域であるＱ５６０Ｐ突然変異体でＳＴＳ酵素活性が損なわれたことから、ＳＴＳ酵素のＣ末端領域はＳＴＳの酵素機能にとって重要であることが推測された（Hum Mutat (Online) 15:296, 2000）。この研究において、ＳＴＳ末端領域の重要性及び酵素活性に対する変異体ＳＴＳの影響について、分子解析を行った。末端を切断されたＳＴＳを調べるために、Ｎ末端とＣ末端とを切断されたＳＴＳ発現ベクターを、ＣＯＳ−１細胞に遺伝子導入した。Ｎ末端領域を欠如した切断されたＳＴＳの活性は低下したが、切断されたＣ末端が長くなることによって、Ｃ末端領域を切断されたＳＴＳの活性は更に低下した。
【００１３】
パルス−チェイス実験によると、１塩基変異体ＳＴＳ（Ｑ５６０Ｐ）及びＣ末端を切断したＳＴＳ（Ｍ１Ａ６）は、タンパク質の合成や分解に対する効果を及ぼさないが、切断されたＳＴＳタンパク質と野生のＳＴＳタンパク質とが細胞内に存在する場合、Ｃ末端を切断されたＳＴＳはＳＴＳ酵素活性に対するドミナントネガティブ効果を有することを見い出した。この研究において、Ｎ末端領域、Ｃ末端領域の両方がＳＴＳ酵素活性に対して重要性であることが明らかとなった。Ｃ末端を切断された変異体は、野生のＳＴＳに対するドミナントネガティブ効果を有するので、この現象を利用することにより、ＳＴＳの酵素活性を有効に抑制することが可能であることが確認された。本発明は、これらの知見によりなされたものである。
【００１４】
すなわち具体的には本発明は、ステロイドスルファターゼの変異体を用いることを特徴とするステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法（請求項１）や、ステロイドスルファターゼの変異体が、ステロイドスルファターゼのＣ末端欠失酵素タンパク質であることを特徴とする請求項１記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法（請求項２）や、ステロイドスルファターゼのＣ末端欠失酵素が、Ｃ末端のアミノ酸の２４個を欠失させた酵素タンパク質であることを特徴とする請求項２記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法（請求項３）や、ステロイドスルファターゼの変異体が、ステロイドスルファターゼのＮ末端欠失酵素タンパク質であることを特徴とする請求項１記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法（請求項４）や、ステロイドスルファターゼのＣ末端欠失酵素が、Ｎ末端のアミノ酸の５２個を欠失させた酵素タンパク質であることを特徴とする請求項４記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法（請求項５）からなる。
【００１５】
また本発明は、請求項１〜５のいずれか記載のステロイドスルファターゼの変異体と野生型のステロイドスルファターゼとの複合体を用いることを特徴とする請求項１記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法（請求項６）や、ステロイドスルファターゼ変異体の酵素活性の抑制が、ステロイドスルファターゼのドミナントネガティブ変異によって引き起こされることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法（請求項７）や、請求項１〜５のいずれか記載のステロイドスルファターゼの変異体をコードする遺伝子を導入し、発現することを特徴とするステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法（請求項８）や、請求項１〜５のいずれか記載のステロイドスルファターゼの変異体をコードする遺伝子と野生型のステロイドスルファターゼをコードする遺伝子を、共に導入することを特徴とするステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法（請求項９）からなる。
【００１６】
さらに本発明は、請求項１〜６のいずれか記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制作用を有するステロイドスルファターゼ変異体（請求項１０）や、請求項１０記載のステロイドスルファターゼ変異体からなるステロイドスルファターゼ酵素活性のインヒビター（請求項１１）や、ステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制作用を有するステロイドスルファターゼの変異体をコードする請求項８記載の遺伝子（請求項１２）や、  請求項９記載のステロイドスルファターゼの変異体をコードする遺伝子と野生型のステロイドスルファターゼをコードする遺伝子とからなるステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制作用を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子（請求項１３）や、請求項１２又は１３記載の遺伝子を組込んだ遺伝子発現用ベクター（請求項１４）や、ステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制作用を有するステロイドスルファターゼの変異体をコードする遺伝子と野生型のステロイドスルファターゼをコードする遺伝子を共に組込んだ、ステロイドスルファターゼ変異体及び野生型ステロイドスルファターゼ遺伝子発現用ベクター（請求項１５）や、請求項１２或いは請求項１３記載の遺伝子、又は請求項１４或いは１５記載のベクターからなることを特徴とするステロイドスルファターゼ酵素活性のインヒビター（請求項１６）や、請求項１０記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制作用を有するステロイドスルファターゼ変異体、請求項１２或いは請求項１３記載の遺伝子、又は請求項１４或いは１５記載のベクターを含有することを特徴とするステロイドスルファターゼ酵素活性によって引き起こされる疾病の予防及び／又は治療剤（請求項１７）からなる。
【発明の効果】
【００１７】
子宮内膜癌や乳癌等のエストロン類が関与すると考えられる疾病の癌の発育と増殖が、エストロゲン依存性であることから、局所のホルモン環境の形成にＳＴＳが重要な役割を演じていると考えられ、該腫瘍増殖の抑制のために、低分子化化学物質によるＳＴＳ酵素活性の抑制が、化学療法として検討されてきた。そして、今までに、ＳＴＳ酵素活性の抑制には、各種のステロイド系及び非ステロイド系のインフィビター（阻害物質）が見い出されてきた。しかしながら、これらはいずれも低分子化学物質を阻害物質（インフィビター）とするものであるから、ヒト等への投与にあたっての化学療法としてのリスクを有し、しかも、阻害物質の酵素活性の抑制は十分ではなく、また、ステロイド系のインフィビター等においては、代謝された阻害物質がホルモン様の作用を生じたりして、その抗腫瘍効果は十分ではないという問題があった。
【００１８】
そこで、本発明により、ＳＴＳの変異体を用いることにより、子宮内膜癌や乳癌等のエストロン類が関与すると考えられる疾病におけるＳＴＳ酵素活性を効果的に抑制することができる。本発明においては、ＳＴＳ酵素活性のインフィビター（抑制物質）として、ＳＴＳの変異体の導入により、或いは該ＳＴＳの変異体の酵素タンパク質をコードする遺伝子、又は該遺伝子を組込んだベクター等を、遺伝子の形で導入し、発現することにより、ＳＴＳ変異体の野生型のＳＴＳに対するドミナントネガティブ効果の発揮により、安全かつ効果的な方法でＳＴＳ酵素活性の抑制を行うことができる。また、本発明のＳＴＳ変異酵素自体には、ステロイドスルファターゼの酵素活性はないため、遺伝子導入しても、従来のステロイド系のインフィビター（阻害物質）が有していたＳＴＳ酵素活性の亢進作用はない。
【００１９】
したがって、本発明の方法は、子宮内膜癌や乳癌等のエストロン類が関与すると考えられる疾病の予防又は治療のために、従来、開発されてきた低分子化学物質による化学療法に代えて、これらの疾病の予防又は治療のための安全で、かつ効果的な新しい疾病の予防又は治療方法を提供するものである。例えば、ＳＴＳ変異体と野生型のＳＴＳとの遺伝子を、共導入することにより、ＳＴＳ変異体の野生型のＳＴＳに対するドミナントネガティブ作用を発揮して、ＳＴＳ酵素活性を抑制することが可能であり、ＳＴＳ酵素活性が関与する疾病に対する遺伝子治療が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、ステロイドスルファターゼ（ＳＴＳ）の変異体を用いることによりＳＴＳ酵素活性の抑制を行う方法よりなる。ＳＴＳは、肝臓、卵巣及び睾丸等の様々な哺乳動物組織に存在し、特に、特に胎盤に多く存在する公知の酵素タンパク質であり（J Clin Endocrinol Metab 25:278-282, 1965）、該ＳＴＳタンパク質のアミノ酸配列及び該タンパク質をコードする塩基配列は、配列表の配列番号１及び２に示される（J. Biol. Chem. 264:13865-13872,1989）。また、該ＳＴＳタンパク質のアミノ酸配列及び該タンパク質をコードする塩基配列についての情報は、ＮＣＢＩのデーターベースにおいて、アクセッションＮｏ．：ＮＰ０００３４２によってアクセスすることができる。
本発明において、ＳＴＳの酵素活性を抑制するためのＳＴＳの変異体としては、特に、ＳＴＳのＣ末端欠失酵素タンパク質、或いはＮ末端欠失酵素タンパク質のようなＳＴＳのトランケートタイプのものが用いられる。該ＳＴＳのＣ末端欠失酵素タンパク質としては、特に好ましくは、Ｃ末端のアミノ酸の２４個を欠失させた酵素タンパク質を用いることができる。また、該ＳＴＳのＮ末端欠失酵素タンパク質としては、特に好ましくは、Ｎ末端のアミノ酸の５２個を欠失させた酵素タンパク質を用いることができる。
【００２１】
本発明で用いられるＳＴＳの変異体の調製は、ＳＴＳをコードする遺伝子から公知の遺伝子工学手法を用いて行うことができる。例えば、ＳＴＳをコードする遺伝子の５´末端或いは３´末端から、所定のアミノ酸配列に対応する塩基配列を削除し、ＳＴＳの変異体のアミノ酸配列に対応する遺伝子を構築し、該遺伝子を適当な発現ベクターに組込んで、宿主細胞に導入し、発現することにより、取得することができる。本発明で用いられるＳＴＳの変異体は、野生型のＳＴＳと複合体を形成し、野生型のＳＴＳに対するドミナントネガティブ作用により、ＳＴＳの酵素活性の抑制を行うことが見い出されているので、本発明の実施の態様の1つとしてＳＴＳの変異体と野生型のＳＴＳとを共に導入して、ＳＴＳの酵素活性の抑制を行うことが可能である。
【００２２】
本発明のＳＴＳ酵素活性の抑制作用を有するＳＴＳの変異体は、ＳＴＳのインフィビターとして用いて、子宮内膜癌や乳癌のようなＳＴＳ酵素活性が関与する疾病の予防及び／又は治療を行うことができる。ＳＴＳ酵素活性が関与する疾病としては、子宮内膜癌や乳癌の他に、エストロン類が関与すると考えられる他の疾病、例えば、卵巣癌、子宮内膜症及び子宮腺筋症等、或いはアンドロゲン類が関与すると考えられる疾病、例えば、前立腺癌等が挙げられる。
【００２３】
本発明のＳＴＳ変異体タンパク質を、ＳＴＳ酵素活性の抑制作用を有する医薬として投与する場合には、公知の製剤形態に製剤化し、公知の投与方法を用いて投与することができる。すなわち、その医薬組成物の製剤に当っては薬理上許容される担体又は希釈剤とともに医薬組成物に製剤化することができる。本発明の医薬組成物の剤型としては、外用剤、経口投与剤、注射剤などが挙げられ、それぞれの剤型にあった投与方法で投与される。投与方法としては、注射による投与が好ましい。注射による投与には全身投与と局所投与がある。全身投与としては静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、皮内注射などが挙げられ、局所投与としては腫瘍内注射などが挙げられる。本発明の医薬組成物は、いずれの方法にも用いることができるが、各種癌種への適用性を考慮して全身投与或いは局部投与を検討するのが好ましい。また、薬剤の性質から静脈内注射を選択することもできる。
【００２４】
本発明のＳＴＳ変異体タンパク質は、該ＳＴＳ変異体タンパク質をコードする遺伝子の形で、生体細胞内に導入し、発現してＳＴＳ酵素活性を抑制することができる。該遺伝子の導入は、公知の遺伝子導入手段を用いることができる。該遺伝子の導入に際しては、適当な発現ベクターを用いることが望ましい。本発明においては、ＳＴＳの変異体と野生型のＳＴＳとのドミナントネガティブ効果によるＳＴＳ酵素活性の抑制効果を誘発するために、ＳＴＳ酵素活性の抑制作用を有するＳＴＳの変異体をコードする遺伝子と野生型のＳＴＳをコードする遺伝子を共に組込んだ、ＳＴＳ変異体及び野生型ＳＴＳ遺伝子発現用ベクターを用いることが好ましい態様として挙げることができる。
【００２５】
本発明において、ＳＴＳ酵素活性の抑制作用を有するＳＴＳの変異体をコードする遺伝子を、遺伝子治療の形で生体内に導入するには、本発明で用いる遺伝子を含有する遺伝子治療用の導入用ベクターまたは該ベクターにより本発明で用いる遺伝子を導入した細胞を用いて実施することができる。該遺伝子治療用の導入用ベクターを用いて遺伝子を導入する場合には、本発明で用いる遺伝子を染色体外に維持するようなベクターを用いて細胞に導入することができる。この場合において当該遺伝子は、染色体外の位置から細胞により発現できる。遺伝子導入用ベクターとしては、当該分野において既に知られている各種のベクターをもちいることができる。遺伝子導入用ベクターの標的とする細胞への導入は、当該分野において既に知られている各種の細胞にＤＮＡを導入する方法、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈、ウイルス形質導入などに従い容易に実施することができる。
【００２６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
（ＳＴＳ変異体のＳＴＳ酵素活性の解析）
［方法］
（プラスミドの構築）
ヒトＳＴＳ ｃＤＮＡからのＥｃｏＲＩフラッグメントをｐＳＶ・ＳＰＯＲＴ １に挿入することにより、フルレングスのＳＴＳタンパク質をコードするヒトＳＴＳ  ｃＤＮＡ（２．０ｋｂ）発現ベクター（ｐＳＴＳ）を調製した（Stein,C., et al ,J. Biol. Chem.,264:13865-13872,1989）。「Transformer Site Directed Mutagenesis kit 」（CLONTECH Laboratories. Inc.社製、Palo Alto, CA）を用いて、Ｘ染色体性魚鱗癬の原因となるＱ５６０ＰとＨ４４４Ｒの変異体を生成し、プラスミドｐＱ５６０Ｐ及びｐＨ４４４Ｒを前述のように産生した（Sugawara, T., et al. Proc Natl Acad Sci USA 92:4778-4782, 1995）。ＰＣＲによりヒトＳＴＳ ｃＤＮＡをテンプレートとして用いて様々なトランケートＳＴＳ発現コンストラクト（truncated STS expression constructs）を調製し、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位でｐＳＶ×ＳＰＯＲＴ１にクローンした。切断されたＳＴＳタンパク質を図１に示す。
【００２８】
ＳＴＳ遺伝子の５’−及び３’−非翻訳領域を欠如するＭ１Ａ４は、ＳＴＳタンパク質のフルレングスをコードする。Ｍ１Ａ５（Ｃ−１１）はＣ末端１１アミノ酸を欠如し、Ｍ１Ａ６（Ｃ−２４）は同様に、グルタミン５６０を含むＣ末端２４アミノ酸を欠如する。Ｍ２Ａ４（Ｎ−２４）は、ミクロソームに対するシグナルペプチドをコードする初めの２４Ｎ末端アミノ酸を欠如し、Ｍ３Ａ４（Ｎ−５２）は、Ｎ−グリコシル化部位であるコドン４７（Ａｓｎ）を含む初めの５２Ｎ末端アミノ酸を欠如する。Ｍ２Ａ６（Ｎ−２４ Ｃ−２４）は、Ｎ末端２４アミノ酸とＣ末端２４アミノ酸を欠如し、Ｍ３Ａ６（Ｎ−５２ Ｃ−２４）は、Ｎ末端５２アミノ酸とＣ末端２４アミノ酸とを欠如する。
【００２９】
（細胞の培養及び遺伝子導入）
サル腎臓ＣＯＳ−１細胞をRIKEN BANK社（筑波、日本）より入手した。ＣＯＳ−１細胞を３５ｍｍのプラスチックシャーレで育て、１０％ＦＣＳとゲンタマイシン（gentamicin）、５０μｇ／ｍｌを補充したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）で培養した。前述のように、ＦｕＧＥＮＥ ６（Roche Molecular Biochemicals社製、Mannheim, Germany）を用いて、野生型のＳＴＳ ｃＤＮＡ及び切断された変異体ＳＴＳ ｃＤＮＡ発現ベクターでＣＯＳ−１細胞に遺伝子導入した（Stein,C. ,et al, J. Biol. Chem.,264:13865-13872,1989）。
【００３０】
野生型のＳＴＳ ｃＤＮＡ及び切断された突然変異体ＳＴＳで、いくつかの培養物を共遺伝子導入した。４００μｌの溶解緩衝液（Promega Corp.社製、Madison, WI）中で細胞抽出物を調製し、細胞を４８時間培養した。培養の終わりに、ＳＴＳ酵素活性を評価するために培養液を回収し、ウエスタンブロット法を行った。リン酸緩衝食塩水で細胞を２度洗浄し、２００μｌのＳＴＳ溶解緩衝液［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １０ ｍＭ、Ｔｒｉｒｏｎ−Ｘ １%、プロテイナーゼ阻害剤（Roche Molecular Biochemicals社製） １ｘ］中で細胞抽出物を調製した。BCA protein assay kit（Pierce社製、Rockford, IL）を用いてタンパク質濃度を測定した。検出事項の一般性を確かめるために、細胞の調製が異なる３つの別個の場合において各実験を行った。
【００３１】
（ＳＴＳ酵素活性）
ＳＴＳ酵素活性を前述の方法で分析した（Stein,C. ,et al, J. Biol. Chem.,264:13865-13872,1989）。Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．０）２０ｍＭ、５０，０００ｄｐｍの７−［3Ｈ］dehydroepiandrosterone サルフェート（ＤＨＥＡＳ）（１６Ｃｉ／ｍｍｏｌ, New England Nuclear社製、Boston）、ＤＨＥＡＳ １０ｎｍｏｌ、１％ Ｔｒｉｒｏｎ−Ｘ−１００及び２５μｌの酵素源(enzyme source)を含む反応混合物を３７℃で１時間培養した。培養の終わりに、ベンゼンを加えて脱リン酸化したＤＨＥＡを抽出し、３ｍｌのシンチレーション混合物を加えて液体シンチレーションカウンターで分析した。１時間、１ｍｇで、１ｐｍｏｌのＤＨＥＡＳ加水分解を触媒する酵素の量を活性の１単位として定義した。
【００３２】
（ウエスタンブロット法による解析）
３５ｍｍ組織培養皿が同数の細胞を受け取ることができるように、サブコンフルエントなＣＯＳ−１細胞の培養物を播種した。遺伝子導入の後、ウエスタンブロット法で解析を行うために、ＣＯＳ−１細胞抽出物を収集した。次に、１０μｇの細胞抽出物に１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。先述のように、電気泳動法の後、ヒトＳＴＳでウサギを免疫化することによって調製したウサギ抗ＳＴＳ血清(rabbit anti-STS serum)で免疫検出するために、ゲルをニトロセルロース膜に転移させた（Sugawara, T., et al. Clin Chim Acta 226:13-20, 1994）。
【００３３】
ウサギポリクローナル抗ＳＴＳを、１：１０００の希釈で第一抗体（primary antibody）として使用した。２５℃で１時間培養を行った後、１：１０，０００で希釈したぺルオキシダーゼ結合抗ウサギヤギ抗体(horse radish-peroxidase-conjugated affinity pure goat anti-rabbit antibody)（Roche Molecular Biochemicals社製）で、ブロットを更に２５℃で６０分培養した。ＥＣＬウェスタンブロット法検出試薬（Amersham Pharmacia Biotech社製、Uppsala, Sweden）を用いて、シグナルを化学発光によって検出した。続いて、その膜をFuji RX-Uフィルム（Fuji Co.社製、東京、日本）に露出した。
【００３４】
（ノーザンブロットによる解析とｃＤＮＡプローブの調製）
１００ｍｍプラスチックシャーレで継代培養した１日後にＣＯＳ−１細胞を培養し、次に様々な種類のｐＳＴＳで遺伝子導入し、ＦｕＧＥＮＥ ６を用いて変異体ＳＴＳ ｃＤＮＡ発現ベクターを切断した。ＣＯＳ−１細胞からの全ＲＮＡの調製、培養及び単離の手順は、詳細に先述されている（Stein,C. ,et al, J. Biol. Chem.,264:13865-13872,1989）。ノーザンブロットによる解析については、各シャーレから３０μｇの全ＲＮＡを電気泳動法で分離し、ナイロン膜に転移させた（Biodyne, ICN, Glen Cove, NY）。核酸検出キットの標準的なプロトコールに従って、シグナルの検出を行った（Roche Molecular Biochemicals社製）。ヒトＳＴＳ ｃＤＮＡでノーザンブロットのプローブをした（probe）。ｐＳｐｏｒｔ−１におけるヒトＳＴＳ ｃＤＮＡをＳａIIで直線化した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡ標識キット（Roche Molecular Biochemicals社製）を用いたインビトロ転写によって、ジゴキシゲニン標識ヒトＳＴＳプローブ(Digoxigenin-labeled human STS probes)を産生した。
【００３５】
（インビトロ転写）
インビトロで、Ｓｐ６ ＲＮＡポリメラーゼに基づくＴＮＴ結合網状赤血球溶解システム（Sp6 RNA polymerase-based TNT-coupled reticulocyte lysate system）（Promega Corp.社製）を用いて、製造者の説明書に従ってＳＴＳタンパク質を合成した。５００ナノグラムのｐＳＴＳ又は切断された発現ベクターを、インビトロ転移反応混合物と混合した。３０度で９０分間、ＳＰ６ ＴＮＴ ＲＮＡポリメラーゼで転移反応を行った。１０μｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液(sample buffer)を添加し、５分間加熱し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、次にウエスタンブロット法による解析を行った。
【００３６】
（パルス−チェイス実験）
標識化(metabolic labeling)１日前に、ｐＳＴＳ（２．０μｇ）又は突然変異体ＳＴＳ発現ベクターでＣＯＳ−１細胞に遺伝子導入した。メチオニンを含まないＤＭＥＭでＣＯＳ−１細胞を１５分間培養し、［35Ｓ］メチオニン（０．４ｍＣｉ／ｍｌ）で３０分間標識した。標識した後、メチオニン４ｍＭを含む放射性培地をＤＭＥＭと置換し、細胞を表示された時間培養した。次にリン酸緩衝食塩水で細胞を洗浄し、４００μｌのＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ ５０ｍＭ、ノデットＰ−４０ １％、デオキシコール酸  ０．１％、ＳＤＳ ０．１％、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ジチオスレイトール １ｍＭ、ＰＭＳＦ ０．１ｍＭ及びプロテイナーゼ阻害剤 １ｘ）中に掻き落とした。
【００３７】
２０μｌのプロテインＧセファロース（Amersham Pharmacia Biotech社製）で、３０分間４℃で細胞抽出物からの同分割量のタンパク質で事前に処理した。遠心分離後、上清を１μｌの抗ＳＴＳ血清で３時間４℃で培養し、ロッキングプラットフォーム上で、２０μｌのプロテインＧセファロースで一晩４℃で培養した。５００μｌのＲＩＰＡ緩衝液中で再懸濁することにより、免疫複合体を洗浄し、遠心分離によって回収した。１０μｌの２×ＳＤＳ標本緩衝液にペレットを再懸濁し、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルを乾燥し、Fuji RX-U filmに露出した。
【００３８】
［結果］
ＳＴＳは、Ｎ−末端領域のアスパラギン４７残基で、メチオニン及びＮ−グリコシル化部位で始まる、２３アミノ酸のＮ末端シグナルペプチドを有する。本発明者らは、ＳＴＳ遺伝子の１塩基が変化したＸＬＩの事例や、ＳＴＳの酵素活性を欠如した変異体であるアミノ酸変異体Ｑ５６０Ｐについて先に報告した（Sugawara, T., et al. Hum Mutat (Online) 15:296, 2000）。哺乳動物細胞でＳＴＳ変異体を発現させるために、ＳＴＳ変異体発現ベクターを調製した。変異体がメチオニンから翻訳するように、切断されたＳＴＳ変異体のＮ末端領域にＡＴＧを加え、同様に、切断されたＳＴＳ変異体のＣ末端領域にターミナルコドンＴＡＧを加えた（図１）。
【００３９】
酵素活性に対する切断された（トランケート）ＳＴＳの効果を調べるために、切断されたＳＴＳ発現ベクターを、内因性ＳＴＳ酵素を発現しないＣＯＳ−１細胞に遺伝子導入し、ＳＴＳ酵素活性を分析した（図２）。空(the mock)遺伝子導入におけるＳＴＳの酵素活性レベルは低く、ＣＯＳ−１細胞によって産生された、切断されたＳＴＳ酵素活性のレベルは、野生のＳＴＳ発現ベクターで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞によって産生されたものよりも低かった。ＣＯＳ−１細胞におけるＳＴＳの活性レベルは、切断されたＣ末端領域のアミノ酸の数によって大きく低下した。Ｃ−５２アミノ酸を欠如したＭ１Ａ６を切断された発現ベクターで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞が産生したＳＴＳ酵素活性は、野生のＳＴＳで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞と比較して６．４％であり、空遺伝子導入の場合とほぼ等しかった。切断されたＭ１Ａ６発現ベクターで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞が産生したＳＴＳ酵素活性は、野生のＳＴＳ発現ベクターで遺伝子導入されたＣＯＳ−１と比較して、６．４％であった。
【００４０】
Ｃ−５２アミノ酸を欠如したＭ１Ａ６ベクターを持つＣＯＳ−１細胞におけるＳＴＳ酵素活性は、疑似遺伝子導入の場合とほぼ等しかった。或いは、（Ｍ１Ａ６を切断された発現ベクターで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞におけるステロイドスルファターゼ酵素活性は、野生のＳＴＳ発現ベクターで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞における場合の６．４％であった。Ｃ末端の５２アミノ酸を欠如したＭ１Ａ６を導入するＣＯＳ−１細胞のＳＴＳ活性は、偽の遺伝子導入をされたＣＯＳ−１細胞の酵素活性とほぼ等しかった）。Ｎ末端領域を欠如した切断されたＳＴＳで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞におけるＳＴＳの活性レベルは低下したが、ＳＴＳ酵素活性レベルの低下率は、野生のＳＴＳ（Ｍ２Ａ４及びＭ３Ａ４）で遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞における場合と比較すると、中程度であった。
ｐＭ２Ａ４及びｐＭ３Ａ４で遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞における酵素活性は２７％であり、野生のＳＴＳ ｃＤＮＡで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞においては２５％であった。Ｃ末端領域を欠如した切断されたＳＴＳ発現ベクター（Ｍ１Ａ６、Ｍ２Ａ６及びＭ３Ａ６）をＣＯＳ−１細胞に遺伝子導入すると、ＳＴＳ酵素活性はＣＯＳ−１細胞において完全に損なわれた。
【００４１】
ＣＯＳ−１細胞における切断されたタンパク質の発現を調べるために、様々な種類の切断されたＳＴＳ発現ベクターが遺伝子導入されているＣＯＳ−１細胞由来の抽出物に、ウェスタンブロット法による解析を行った（図３−A）。Ｃ末端を切断されたＳＴＳ（Ｍ１Ａ５及びＭ１Ａ６）のタンパク質レベルは、ＣＯＳ−１細胞における野生のＳＴＳタンパク質のレベルとほぼ等しかった。Ｃ末端領域を欠如した切断されたＳＴＳをＣＯＳ−１細胞に遺伝子導入した場合は、タンパク質の翻訳は損なわれなかった。一方、Ｎ末端領域を欠如した切断されたＳＴＳ（Ｍ２Ａ４、Ｍ３Ａ４、Ｍ２Ａ６及びＭ３Ａ６）のタンパク質酵素レベルは低下した。検出された抗ヒトＳＴＳ血清によって検出された切断されたタンパク質の分子サイズは、野生のＳＴＳのものより小さく、タンパク質量も野生のＳＴＳのものより少なかった。切断されたＳＴＳの発現を調べるために、切断されたＳＴＳ発現プラスミドで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞からの全ＲＮＡを用いて、ノーザンブロット法による解析を行った（図３−B）。切断された発現ベクターで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞においては、ＳＴＳ ｍＲＮＡレベルは不変であった。このような観察から、切断されたＳＴＳの転写は、野生のＳＴＳの転写と等しい効果を有することが示される。
【００４２】
タンパク質合成プロセスに対する、Ｎ末端を切断されたＳＴＳ（Ｍ２Ａ４、Ｍ３Ａ４、Ｍ２Ａ６及びＭ３Ａ６）の効果を判定するために、インビトロ転写／翻訳を用いてプラスミド発現の効果を調べた（図４）。翻訳生成物にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、続いてウエスタンブロット法による解析を行った。インビトロ転写／翻訳反応混合物中のＳＴＳ翻訳生成物の量を測定した。ＳＴＳ（Ｍ２Ａ４及びＭ２Ａ６）のＮ末端領域シグナルペプチドを欠如した切断されたＳＴＳのタンパク質合成に対して、明らかな効果が示されなかった。ＳＴＳのＮ末端領域は、翻訳プロセスに対しては小さな効果を有するに過ぎない。
【００４３】
Ｃ末端１塩基変異体ＳＴＳ（Ｑ５６０Ｐ）及びＣ末端を切断されたＳＴＳ（Ｍ１Ａ６）が、ＳＴＳタンパク質の合成及び分解に対する効果を有するかどうかを判定するために、パルス−チェイス実験を行った。（図５）。ＣＯＳ−１細胞を野生のＳＴＳ、Ｍ１Ａ６及びＱ５６０Ｐ発現プラスミドで遺伝子導入し、続いて［35Ｓ］メチオニンで代謝的に標識した。パルス後（the pulse period）２４時間までの野生型のＳＴＳ、Ｍ１Ａ６及びＱ５６０Ｐ変異体の標識したタンパク質レベルは、時間の経過と共に低下した。１塩基変異体Ｑ５６０Ｐで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞とＮ末端領域を切断されたＳＴＳとに関するパルス−チェイス実験の結果を、野生のＳＴＳ発現ベクターで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞に関するパルス−チェイス実験の結果と比較した。Ｃ末端１塩突然変異体と切断された変異タンパク質の両方は、野生のＳＴＳと同程度に速やかにＣＯＳ−１細胞から消失することが、結果から明らかになった。ＳＴＳタンパク質の合成は、ＳＴＳのＣ末端変異体からは影響を受けない。Ｃ末端２４アミノ酸残基を欠如したＭ１Ａ６は、ＣＯＳ−１細胞におけるＳＴＳ酵素活性レベルを減少させた（表１）。
【００４４】
【表１】
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１μｇの野生のＳＴＳと１μｇのＭ１Ａ６を切断された発現ベクターの両方が導入されたＣＯＳ−１細胞によって産生される酵素活性レベルは低下する。野生のＳＴＳ及びＭ１Ａ６が共導入されたＣＯＳ−１細胞における酵素活性は、野生のＳＴＳだけが導入されたＣＯＳ−１の場合の４３．６±５．７％であった。１μｇのＨ４４４Ｒ ＳＴＳ変異体発現ベクターが導入されたＣＯＳ−１細胞によって産生された酵素活性は、野生のＳＴＳプラスミドが遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞によって産生された場合の、１１±０．２５％に過ぎなかった。野生型のＳＴＳ及びＨ４４４Ｒが遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞によって産生された酵素活性は、野生のＳＴＳ細胞だけを遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞によって産生された場合とほぼ等しかった。
【００４５】
野生のＳＴＳの産生に対するＭ１Ａ６の用量依存性の効果について測定するために、０．０１μｇから３μｇのＭ１Ａ６を１μｇの野生のＳＴＳ発現ベクターでＣＯＳ−１細胞に共導入し、ＳＴＳ酵素活性における低下率を分析した（図６）。０．０１μｇ、０．０５μｇ、０．１μｇ、及び０．５μｇのＭ１Ａ６と１μｇの野生のＳＴＳを共遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞によって産生されたＳＴＳ酵素活性のレベルは、それぞれ９１％、８７％、７１％、及び５０％低下した。切断されたＳＴＳタンパク質又は野生のタンパク質が細胞に存在する場合に、切断されたＳＴＳの効果には、野生のＳＴＳに対してドミナントネガティブ効果が見られた。ＳＴＳタンパク質レベルに対する切断されたＳＴＳの効果を調べるために、切断されたＳＴＳと野生のＳＴＳプラスミドとが遺伝子導入された細胞由来の抽出物のウェスタンブロット解析を行った（図７）。野生のＳＴＳと切断されたＳＴＳで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞中の切断されたＳＴＳを含むＳＴＳのレベルは、切断されたＳＴＳタンパク質の量から影響を受けなかった。
【００４６】
［図の説明］
図１、人工的な切断されたＳＴＳタンパク質。
切断されたＳＴＳ変異体タンパク質を図に示す。Ｎ−Ｘ又はＣ−Ｙは、野生のＳＴＳタンパク質のそれぞれＮ末端又はＣ末端からのアミノ酸残基が示す数を欠如する。Ｘ及びＹはペプチドの数を示す。Ｎ−２４は野生のＳＴＳからのシグナルペプチドをコードする、最初のＮ末端２４アミノ酸残基を欠如する。Ｎ−５２は、残基がアスパラギンコドン４７であるＮグリコシル化部位を含む、最初の５２Ｎ末端アミノ酸を欠如する。Ｃ−２４は、コドン５６０のグルタミンを含むＳＴＳタンパク質のＣ末端領域を欠如する。数字は、各画分のＮ又はＣ末端の境界を規定するアミノ酸を表す。野生のＳＴＳは５８３アミノ酸を有する。ＳＴＳ ｃＤＮＡ及び変異体ＳＴＳ ｃＤＮＡをｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１発現ベクターに挿入して、切断されたＳＴＳタンパク質を発現した。
【００４７】
図２、切断されたＳＴＳのＳＴＳ酵素活性。
ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１（偽）、ｐＳＴＳｃＤＮＡ、ｐＳＴＳ−Ｍ１Ａ４、ｐＳＴＳ−Ｍ１Ａ５、ｐＳＴＳ−Ｍ１Ａ６、ｐＳＴＳ−Ｍ２Ａ４、ｐＳＴＳ−Ｍ３Ａ４、ｐＳＴＳ−Ｍ２Ａ６及びｐＳＴＳ−Ｍ３Ａ６をＣＯＳ−１細胞に遺伝子導入した。ＳＴＳ溶解緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １％、プロテイナーゼ阻害剤 １ｘ）中の遺伝子導入された細胞抽出物におけるＳＴＳ活性を分析した。切断されたＳＴＳ酵素活性を、野生のＳＴＳのＳＴＳ酵素活性に対するパーセントとして表した。
【００４８】
図３、切断されたＳＴＳタンパク質及びＳＴＳ遺伝子の発現。
ＦｕＧＥＮＥ ６を用いて、切断されたＳＴＳ発現ベクターをＣＯＳ−１細胞に遺伝子導入した。（Ａ）抗ヒトＳＴＳ血清を用いて、１０μｇの細胞抽出物にウエスタンブロット解析を行った。（Ｂ）共遺伝子導入処理の２４時間後に、ＲＮＡをＣＯＳ−１細胞から抽出した。野生のヒトＳＴＳ ＲＮＡプローブを用いて、全ＲＮＡ（３０μｇ）にノーザンブロット解析を行った。
【００４９】
図４、インビトロ翻訳システムにおける、切断されたＳＴＳタンパク質。
翻訳されたタンパク質をインビトロシステムで合成した。１０μｌのインビトロで翻訳された生成物に、抗ヒトＳＴＳ血清を用いてウエスタンブロット解析を行った。
【００５０】
図５、野生のＳｔＡＲ（ｐＳＴＳ）、変異体ＳＴＳ（ｐＱ５６０Ｐ）及び切断されたＳＴＳ（ｐＳＴＳＭ１Ａ６）発現プラスミドでの遺伝子導入に関するパルス−チェイス実験の結果。
ＦｕＧＥＮＥ ６を用いて、ｐＳＴＳ、ｐＱ５６０Ｐ及びｐＳＴＳＭ１Ａ６（２μｇ／プレート）でＣＯＳ−１細胞を遺伝子導入した。遺伝子導入後、ＣＯＳ−１細胞を［35Ｓ］メチオニンで３０分間パルスラベルし(pulse-labeled)、過剰量の冷たいメチオニンで追跡し、続いてタンパク質の抗ヒトＳＴＳ血清とＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて免疫沈降を行った。野生のＳＴＳ（Ａ）、突然変異体ＳＴＳ（Ｂ）、及び切断されたＳＴＳ（Ｃ）のオートラジオグラムを示す。各実験は、２つの別々な状況で行われた。
【００５１】
図６、切断されたＳＴＳのＳＴＳ酵素活性に対するドミナントネガティブ効果。
ｐＳＴＳ １μｇと切断されたＳＴＳ発現ベクターの増加量とでＣＯＳ−１細胞を共遺伝子導入した。示された値は、野生のＳＴＳ活性のパーセンテージとして表された、各処理グループが３つの同型培養を含む少なくとも３つの別個の実験からのＳＴＳ酵素活性の平均値±標準誤差である。
【００５２】
図７、切断されたＳＴＳのＳＴＳ酵素活性に対するドミナントネガティブ効果。
抗ＳＴＳ抗体を用いてＣＯＳ−１細胞抽出物にウエスタンブロット解析を行った。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明の実施例において構築された、人工的に切断されたＳＴＳ変異体タンパク質の構造を示す図である。
【図２】本発明の実施例において、切断されたＳＴＳのそれぞれのＳＴＳ酵素活性について示す図である。
【図３Ａ】本発明の実施例において、切断されたＳＴＳタンパク質及びＳＴＳ遺伝子の発現について、ウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図３Ｂ】本発明の実施例において、切断されたＳＴＳタンパク質及びＳＴＳ遺伝子の発現について、ノーザンブロット解析の結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例において、インビトロ翻訳システムにおける、切断されたＳＴＳタンパク質について、インビトロで翻訳された生成物に、抗ヒトＳＴＳ血清を用いてウエスタンブロット解析を行った結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例において、野生のＳｔＡＲ（ｐＳＴＳ）、突然変異体ＳＴＳ（ｐＱ５６０Ｐ）及び切断されたＳＴＳ（ｐＳＴＳＭ１Ａ６）発現プラスミドでの遺伝子導入に関するパルス−チェイス実験の結果を示す図である。。
【図６】本発明の実施例において、切断されたＳＴＳのＳＴＳ酵素活性に対するドミナントネガティブ効果について、ｐＳＴＳと切断されたＳＴＳ発現ベクターの増加量とでＣＯＳ−１細胞を共遺伝子導入した結果を示す図である。
【図７】本発明の実施例において、切断されたＳＴＳのＳＴＳ酵素活性に対するドミナントネガティブ効果について、抗ＳＴＳ抗体を用いてＣＯＳ−１細胞抽出物にウエスタンブロット解析を行った結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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