(57)【要約】  【課題】  ポアサイズの大きなゲルを保持した核酸固定化ゲルを、反応途中で不溶化させることなく製造する該核酸固定化ゲルの製造方法、及び該核酸固定化ゲルを配置したマイクロアレイを提供すること。  【解決手段】  不飽和結合を含む第１の官能基を導入した核酸と、不飽和結合を含む第２の官能基を導入した糖鎖を含むゲル形成性重合性化合物とを共重合させ、これをゲル化させることにより核酸固定化ゲルを得る方法、及び該核酸固定化ゲルを平面基盤片上に配置させ、あるいは、互いに平行に配置された複数の貫通孔を含むブロックの各貫通孔に該核酸固定化ゲルを保持させ、該ブロックを貫通孔を交叉する方向で切断することにより、核酸固定化ゲルマイクロアレイを得る。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
不飽和結合を含む第１の官能基を導入した核酸と、不飽和結合を含む第２の官能基を導入した糖鎖を含むゲル形成性重合性化合物とを共重合させる工程を含む、核酸固定化化合物の製造方法。
【請求項２】
糖鎖を含むゲル形成性重合性化合物がアガロースである、請求項１記載の核酸固定化化合物の製造方法。
【請求項３】
不飽和結合を含む第２の官能基を導入した糖鎖を含むゲル形成性重合性化合物は、アガロースとアリルグリシジルエーテルとを反応させて得られるものである、請求項１又は２記載の核酸固定化化合物の製造方法。
【請求項４】
不飽和結合を含む第１の官能基を導入した核酸が、５’末端に（メタ）アクリロイル基を導入した核酸である、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸固定化化合物の製造方法。
【請求項５】
不飽和結合を含む第１の官能基を導入した核酸と、不飽和結合を含む第２の官能基を導入した糖鎖を含むゲル形成性重合性化合物とを共重合させて、核酸固定化化合物を得る工程と、前記核酸固定化化合物をゲル化させる工程とを含む、核酸固定化ゲルの製造方法。
【請求項６】
糖鎖を含むゲル形成性重合性化合物がアガロースである、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
不飽和結合を含む第２の官能基を導入した糖鎖を含むゲル形成性重合性化合物は、アガロースとアリルグリシジルエーテルとを反応させて得られるものである、請求項５又は６記載の製造方法。
【請求項８】
不飽和結合を含む第１の官能基を導入した核酸が、５’末端に（メタ）アクリロイル基を導入した核酸である、請求項５〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれかに記載の方法で得られた核酸固定化ゲルが平面基盤片上に配置されている核酸固定化ゲルマイクロアレイ。
【請求項１０】
互いに平行に配置された複数の貫通孔を含むブロックの各貫通孔に、請求項５〜８のいずれかに記載の方法で得られた核酸固定化ゲルが保持されており、該ブロックを、貫通孔を交叉する方向で切断して得られる、核酸固定化ゲルマイクロアレイ。
【請求項１１】
ブロックが１ｃｍ2あたり１００以上の貫通孔を含むものである、請求項１０記載のマイクロアレイ。
【請求項１２】
貫通孔が管状体により形成されている請求項１０又は１１記載のマイクロアレイ。
【請求項１３】
管状体が中空繊維である、請求項１２記載のマイクロアレイ。
【請求項１４】
核酸の種類が、各管状体の全部又は一部において異なるものである、請求項１０〜１３のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ等の核酸を固定する方法及びそれを用いた核酸固定化ゲルマイクロアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、世界各国でゲノムプロジェクトが進められており、ヒトを中心とした各種生物の全塩基配列及び全遺伝子が急速に明らかにされつつある。これに伴い、多数遺伝子の一括発現解析を可能とする有力な方法としてDNAマイクロアレイ（DNAチップ）が用いられ始めている。
【０００３】
DNAマイクロアレイとしては、リソグラフィー技術を応用して区画化されたセル上にDNA合成を行ったもの（Science 251 p767-773 (1995年)：非特許文献１）、基盤上に溝又は穴で区画を形成し、該区画の内壁にプローブを固定化したもの（特開平11-108928号公報：特許文献１、特開2000-78998号公報：特許文献２）、アクリルアミド、アガロース等のゲルにＤＮＡ（プローブ）を固定したマイクロアレイ（米国特許第5,770,721号公報：特許文献３、特開2000-60554号公報：特許文献４）等、多数の形状物が知られている。複数の管状体を配列させ、その管状体の内部にＤＮＡが固定化されたＤＮＡマイクロアレイも知られている。（WO99／03341：特許文献５，WO99／13313：特許文献６）そして本発明者らの一部が提案している繊維型マイクロアレイも知られている（特開2000-270878号公報：特許文献７、特開2000-270879号公報：特許文献８）。このマイクロアレイは、核酸固定化ゲルを保持する核酸固定化ゲル保持管状体束を作成し、この管状体束を繊維の長手方向と交叉する方向に切断する事により得られる。
【０００４】
これらのＤＮＡマイクロアレイは、検体ＤＮＡとプローブＤＮＡのハイブリッドの形成量を多くするため、即ちハイブリダイゼーション反応の効率を向上させるために、一区画内に固定するＤＮＡの量を増やす検討が行われている。本発明者らの一部は、区画として管状体（中空繊維）を使用し、その内部にゲルを充填し、ゲルにＤＮＡを固定化する方法を実施している。充填するゲルとしては、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミドなどの不飽和結合を有するモノマーとメチレンビスアクリルアミドなどの不飽和結合を２個以上有する架橋剤を共重合することによって得られるゲル、アガロース、デキストランなどの糖鎖が水素結合を形成することによって得られるゲルなどが挙げられる。
【０００５】
ゲルを利用したＤＮＡマイクロアレイは、プローブＤＮＡが３次元構造体（ゲル）に保持されている。よって、検体がゲル内部にまで浸透し、プローブＤＮＡとハイブリッド形成するため、２次元表面にプローブＤＮＡが固定されたマイクロアレイと比較して、検出感度が向上する。
ゲルに固定されたプローブＤＮＡを有効に利用する観点から、ゲルのポアサイズが大きいことが好ましい。
【０００６】
ゲルのポアサイズは、アクリルアミド系ゲルよりも、アガロースなどの糖鎖からなるゲルの方が大きいことが知られている。たとえば、特許文献７には、アガロースを利用したマイクロアレイが開示されている。プローブＤＮＡをアガロースゲルへ固定するには、まずアガロースを臭化シアンでイミドカルボネート化しておき、末端アミノ化した核酸のアミノ基と結合させてからゲル化する例が記載されている。しかしながら、当該方法では、反応途中にアガロースが不溶化する場合がある。
また、アガロースにプローブＤＮＡを固定する方法として、アビジン化アガロースにビオチン化した核酸を固定する方法も知られている。しかし、アビジン化アガロースビーズはアガロースと異なり加熱により溶解しない。よって、マイクロアレイを作成する際、基盤へのスポッティングや管状体内部への充填が困難である。
【非特許文献１】Science 251 p767-773 (1995年)
【特許文献１】特開平11-108928号公報
【特許文献２】特開2000-78998号公報
【特許文献３】米国特許第5,770,721号公報
【特許文献４】特開2000-60554号公報
【特許文献５】WO99／03341
【特許文献６】WO99／13313
【特許文献７】特開2000-270878号公報
【特許文献８】特開2000-270879号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って本発明の目的は、ＤＮＡ等の核酸とアガロース等の糖鎖を含むゲル形成性重合性化合物とが反応途中で不溶化することなく化学的に結合した、マイクロアレイを作成する際、基盤へのスポッティングや管状体内部への充填が容易である核酸固定化化合物、該核酸固定化化合物をゲル化した核酸固定化ゲルが平面基盤片上に配置された核酸固定化ゲルマイクロアレイ、および、核酸固定化ゲルが充填された管状体集束物を切断することにより得られる核酸固定化ゲルマイクロアレイを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、アガロースとアリルグリシジルエーテルを反応させ、反応性アガロースとし、末端に（メタ）アクリロイル基が導入されたＤＮＡと共重合することによりＤＮＡが化学的に結合したアガロースが得られることを見出し、更に該アガロースゲルを管状体内部に充填したマイクロアレイが得られることを見出し本発明に至った。
【０００９】
すなわち、本発明の第１態様では、不飽和結合を含む第１の官能基を導入した核酸と、不飽和結合を含む第２の官能基を導入した糖鎖を含むゲル形成性重合性化合物とを共重合させる工程を含む、核酸固定化化合物の製造方法が提供される。
【００１０】
本発明の第２態様では、不飽和結合を含む第１の官能基を導入した核酸と、不飽和結合を含む第２の官能基を導入した糖鎖を含むゲル形成性重合性化合物とを共重合させて、核酸固定化化合物を得る工程と、前記核酸固定化化合物をゲル化させる工程とを含む、核酸固定化ゲルの製造方法が提供される。
【００１１】
本発明の第１態様および第２態様において、糖鎖を含むゲル形成性重合性化合物がアガロースであることが好ましい。また、不飽和結合を含む第２の官能基を導入した糖鎖を含むゲル形成性重合性化合物は、アガロースとアリルグリシジルエーテルとを反応させて得られるものであることが好ましい。また、不飽和結合を含む第１の官能基を導入した核酸が、５’末端に（メタ）アクリロイル基を導入した核酸であることが好ましい。
【００１２】
本発明の第３態様では、本発明の第２態様にかかる方法で得られた核酸固定化ゲルが平面基盤片上に配置されている核酸固定化ゲルマイクロアレイが提供される。
【００１３】
また、本発明の第４態様では、互いに平行に配置された複数の貫通孔を含むブロックの各貫通孔に、本発明の第２態様にかかる方法で得られた核酸固定化ゲルが保持されており、該ブロックを、貫通孔を交叉する方向で切断して得られる、核酸固定化ゲルマイクロアレイが提供される。
【００１４】
本発明の第４態様において、ブロックが１ｃｍ2あたり１００以上の貫通孔を含むものであることが好ましい。また、貫通孔が管状体により形成されていることが好ましく、管状体が中空繊維であることが更に好ましい。また、核酸の種類が、各管状体の全部又は一部において異なるものであってもよい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、マイクロアレイを作成する際、基盤へのスポッティングや管状体内部への充填が容易である核酸固定化化合物を、反応途中で不溶化させることなく得ることができる。また、本発明により、ポアサイズの大きなゲルを保持した核酸固定化ゲルを得ることができ、この核酸固定化ゲルを配置したマイクロアレイを用いることにより、高いハイブリダイゼーション効率が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の第１態様では、核酸と糖鎖を含むゲル形成性重合性化合物とが反応途中で不溶化することなく化学的に結合した核酸固定化化合物を製造する方法が提供される。
【００１７】
本発明において、プローブとして使用する核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの核酸が挙げられる。当該核酸は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法により実施される。ＤＮＡの抽出については、Blinらの方法（Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2303 (1976)）等により実施される。また、ＲＮＡの抽出については、Favaloroらの方法（Favaloro et al., Methods Enzymol.65: 718 (1980)）等により実施される。固定化する核酸としては、プラスミドＤＮＡや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ、あるいは、化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
【００１８】
上記の核酸には、不飽和結合を含む第１の官能基が導入される。不飽和結合を含む第１の官能基としては、メタクリロイル基、アクリロイル基等を挙げることができる。
核酸に官能基を導入する方法としては、たとえば、ＷＯ98/39351に記載の方法や、ＤＮＡ等の核酸の５'末端にアミノ基が導入された核酸とグリシジルメタクリレート、無水メタクリル酸等を反応させる方法が挙げられる。
【００１９】
本発明において、プローブＤＮＡが固定されるゲルとしては、ポアサイズが比較的大きい、糖鎖を含むゲル形成性重合性化合物が用いられる。糖鎖を含むゲル形成性重合性化合物としては、特に制限なく用いることができる。たとえば、アガロース、カラギーナン、ヒドロキシエチルセルロース等を挙げることができ、アガロースであることが好ましい。アガロースは市販のいずれのものを用いてもよい。アガロースゲルの濃度は特に限定はされないが、0.3〜２％の範囲で調製するのが好ましい。より好ましくは0.5〜1％の範囲である。
【００２０】
上記、糖鎖を含むゲル形成性重合性化合物には、不飽和結合を含む官能基が導入される。糖鎖を含むゲル形成性重合性化合物に官能基を導入する方法としては、たとえば、ゲル形成性重合性化合物にアリルグリシジルエーテルを反応させる方法を挙げることができ、得られた生成物を更に任意の官能基によって修飾させてもよく、その鎖長を更に伸ばしてもよい。より具体的には、ゲル形成性重合性化合物がアガロースである場合には、アルカリ性の水溶液にアガロース粉末を懸濁させ、水素化ホウ素ナトリウム，アリルグリシジルエーテルを添加し、撹拌下で４〜８時間反応させる。反応後、アガロース粉末を水で洗浄し、ろ過する。得られた粉末をメタノールで脱水し、乾燥するといった方法を挙げることができる。この場合、下記式で示される反復単位を有するアガロースを得ることができると考えられる。
【化１】
2005134257.tif 000002
【００２１】
次に、前記第１の官能基が導入された核酸と、前記第２の官能基が導入されたゲル形成性重合性化合物とを共重合させて、核酸固定化化合物を得る。共重合においては、通常の共重合方法を挙げることができ、たとえば、重合開始剤と共に共重合させる方法などが挙げられる。具体的には、例えば第２の官能基が導入されたアガロースを水に添加し、９５℃に温度を上げてアガロースを溶解する。その後、2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオンアミジン)ジヒドロクロリド（Ｖ−５０）、2,2'-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン]ジヒドロクロリド（ＶＡ−０４４）、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム等の重合開始剤、またはレドックス系（過硫酸アンモニウムとテトラエチルエチレンジアミンの組み合わせ等）の重合開始剤とアクリロイル基等の第１の官能基が導入されたＤＮＡ等の核酸を添加し、共重合させることができる。このような方法によって、ゲル形成性重合性化合物と核酸とを共重合させることにより、ゲル形成性重合性化合物と核酸とを共有結合で結合させることができる。
【００２２】
以上説明した方法で得られた核酸固定化化合物は、たとえば、温度を室温まで下げることによって、ゲル化し、核酸固定化ゲルを得ることができる（第２態様）。
【００２３】
前記核酸固定化ゲルは、マイクロアレイの構成として使用される。その一例として、核酸固定化ゲルの複数が平面基盤片上に配置されたマイクロアレイを例示することができる。平面基盤片としては、ガラス、シリコン基盤、ナイロンやニトロセルロースの膜等を挙げることができる（第３態様）。
核酸固定化ゲルを基盤上に配置させる方法としては、従来知られている方法を挙げることができ、たとえば、ゲルをスポッティング法によりガラス、シリコン等の基盤に点着する方法、ノーザン法同様、ナイロンシート等の上に高密度に固定化する方法等が挙げられる。
【００２４】
また、他の例としては、大量生産により適したマイクロアレイとして、互いに平行に配置された複数の貫通孔を含むブロックを準備し、ブロックの貫通孔を交叉する方向で切断を繰り返すことによって得られるマイクロアレイを例示することができる（第４態様）。
【００２５】
上記のマイクロアレイの各貫通孔には、核酸固定化ゲルが保持されている。貫通孔を含むブロックは、ブロックにレーザー等で穴を穿つことにより製造することができる。ブロックの材質は、特に限定されるものではない。好ましくは、プラスチック等の樹脂材料で構成されている。前記貫通孔を含むブロックの貫通孔に、核酸固定化ゲルを保持するには、各貫通孔にシリンジ等によりゲル等を導入すればよい。
【００２６】
このようにして得られた各貫通孔内に核酸固定化ゲルを保持したブロックは、貫通孔の長手方向と交差する方向、好ましくは長手方向に対して垂直方向に切断することにより、任意に配列された核酸固定化ゲル保持貫通孔集束物の断面を有する薄片（核酸固定化ゲルマイクロアレイ）を得ることができる。この際の切断方法としては、例えば、ミクロトームを用いて集束物から薄片を切り出す方法等が挙げられる。薄片の厚みに関しては任意に調整することができるが、通常１〜５,０００μｍ、好ましくは１０〜２,０００μｍである。
【００２７】
また、貫通孔を含むブロックとして複数本の管状体を集束した管状体集束物を好ましい例として挙げることがきる。
【００２８】
この場合、管状体としては、特に限定されることはなく、ガラス管、ステンレス管、中空繊維などが挙げられるが、取扱性の点から中空繊維を好ましく挙げることができる。
【００２９】
本発明において、管状体として用いることができる中空繊維としては、合成繊維、半合成繊維、再生繊維、天然繊維等が挙げられる。
【００３０】
合成繊維の代表例としては、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系の各種繊維、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等のポリエステル系の各種繊維、ポリアクリロニトリル等のアクリル系の各種繊維、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系の各種繊維、ポリビニルアルコール系の各種繊維、ポリ塩化ビニリデン系の各種繊維、ポリ塩化ビニル系繊維、ポリウレタン系の各種繊維、フェノール系繊維、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系繊維、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系の各種繊維などが挙げられる。
【００３１】
半合成繊維の代表例としては、ジアセテート、トリアセテート、キチン、キトサン等を原料としたセルロース系誘導体系各種繊維、プロミックスと呼称される蛋白質系の各種繊維などが挙げられる。再生繊維の代表例としては、ビスコース法や銅−アンモニア法、あるいは有機溶剤法により得られるセルロース系の各種再生繊維（レーヨン、キュプラ、ポリノジック等）などが挙げられる。天然繊維の代表例としては、亜麻、苧麻、黄麻などが挙げられる。これらの植物繊維は、中空状の繊維形態を示すので本発明に用いることができる。
【００３２】
天然繊維以外の中空繊維は、特殊なノズルを用いて公知の方法で製造することができる。ポリアミド、ポリエステル、ポリオレフィン等は溶融紡糸法が好ましく、ノズルとしては馬蹄型やC型ノズル、２重管ノズルなどを使用することができる。本発明においては、連続した均一な中空部を形成させることができる点で２重管ノズルを用いるのが好ましい。溶融紡糸ができない合成高分子、半合成繊維又は再生繊維に用いられる高分子の紡糸は溶剤紡糸が好ましく用いられる。この場合も、溶融紡糸と同じく２重管ノズルを用いて、中空部に芯材として適切な液体を充填しながら紡糸することにより連続した中空部を有する中空繊維を得ることができる。
【００３３】
本発明に用いる中空繊維は、無処理の状態でそのまま用いてもよいが、必要に応じて、反応性官能基を導入したものであってもよく、また、プラズマ処理やγ線、電子線などの放射線処理を施したものであってもよい。
【００３４】
核酸固定化ゲルを保持させた管状体（核酸固定化ゲル保持管状体）は、例えば、管状体の中空部に不飽和結合を含む第１の官能基を導入した核酸と、不飽和結合を含む第２の官能基を導入した糖鎖を含むゲル形成性重合性化合物とを含む溶液を導入し、中空部内で共重合、ゲル化を実施することにより製造できる。
【００３５】
また、先に核酸等を固定化したアガロース等の核酸固定化化合物を作成し、９５℃程度で加熱溶解し、該溶液を管状体の中空部へ導入し、冷却ゲル化させる方法等が挙げられる。
核酸固定化ゲルの管状体への充填方法は加圧条件下または吸引条件下のどちらでも可能である。
【００３６】
上述の方法により得られた核酸固定化ゲル保持管状体は、ゲルが破壊されない限りにおいて適当な処理をすることができる。例えば、熱処理、アルカリ処理、界面活性剤処理などを行うことにより、固定化された核酸を変成させる。あるいは、細胞、菌体などの生材料から得られた核酸を使用する場合は、不要な細胞成分などを除去する。処理後の核酸固定化ゲル保持管状体は、核酸を検出する材料として用いることができる。なお、これらの処理は別々に実施してもよく、同時に実施してもよい。また、核酸を含む試料を管状体内部に保持する前に、適宜実施してもよい。
【００３７】
上記の通り調製された核酸固定化ゲル保持管状体は、集束した後に接着して、核酸固定化ゲル保持管状体集束物（以下、管状体集束物）とする。この際、核酸固定化ゲル保持管状体を規則的に配列し、樹脂接着剤等で接着することにより、例えば、縦横に核酸固定化ゲル保持管状体が整然と規則的に配列した管状体集束物を得ることができる。管状体集束物の形状は特に限定されるものではないが、通常は、繊維を規則的に配列させることにより正方形又は長方形に形成される。
【００３８】
「規則的に」とは、一定の大きさの枠の中に含まれる核酸固定化ゲル保持管状体の本数が一定となるように順序よく配列させることをいう。例えば、直径１ｍｍの核酸固定化ゲル保持管状体を束にして断面が縦１０ｍｍ、横１０ｍｍの正方形となるように配列させようとする場合は、その正方形の枠内（１ｃｍ2）における１辺に含まれる核酸固定化ゲル保持管状体の数を10本とし、この10本の核酸固定化ゲル保持管状体を1列に束ねて1層のシートとした後、このシートが10層になるように重ねる。その結果、縦に10本、横に10本、合計100本の核酸固定化ゲル保持管状体を配列させることができる。但し、核酸固定化ゲル保持管状体を規則的に配列させる手法は、上記のようにシートを重層するものに限定されるものではない。
【００３９】
なお、本発明において束にする核酸固定化ゲル保持管状体の本数は１０本以上、好ましくは１０〜１０,０００本であり、目的に応じて適宜設定することができる。但し、管状体集束物における核酸固定化ゲル保持管状体の密度が、１ｃｍ2当たり１００〜１,０００,０００本となるように調製することが好ましい。そして、高密度に核酸が固定化された管状体集束物の薄片を得るべく核酸固定化ゲル保持管状体を配列させるためには、核酸固定化ゲル保持管状体の太さは細い方が好ましい。本発明の好ましい実施態様においては、核酸固定化ゲル保持管状体１本の太さは１ｍｍ以下であることが必要である。
【００４０】
例えば、核酸固定化ゲル保持管状体が直径５０μｍの中空繊維で構成される場合、１ｃｍあたり２００本の繊維を配列させることができるため、１ｃｍ2の正方形内に配列させることのできる繊維の本数は４０,０００本である。したがって、この場合は１ｃｍ2あたり最高４０,０００種類の核酸を固定化することができる。ゲルに固定化されている核酸の種類は、管状体集束物中の各管状体にそれぞれ異なるものとすることが可能であり、また、同一の核酸が固定化された管状体から任意の本数の管状体を選択し、その選択された管状体を束ねて適宜配列させることも可能である。即ち、本発明によれば、固定化された核酸の種類と配列の順序に関しては、目的に応じて任意に設定することが可能である。
【００４１】
本発明においては、上述の管状体集束物を管状体の長手方向と交差する方向、好ましくは長手方向に対して垂直方向に切断することにより、任意に配列された核酸固定化ゲル保持管状体集束物断面を有する薄片（核酸固定化ゲルマイクロアレイ）を得ることができる。この際の切断方法としては、例えば、ミクロトームを用いて管状体集束物から薄片を切り出す方法等が挙げられる。薄片の厚みに関しては任意に調整することができるが、通常１〜５,０００μｍ、好ましくは１０〜２,０００μｍである。
【００４２】
これら薄片は、固定化された核酸をプローブとして、検体と反応させてハイブリダイゼーションを行うことにより、検体中の特定の塩基配列を有する核酸の検出に用いることができる。本発明にかかる薄片では、ポアサイズの大きな核酸固定化ゲルを使用していることから、高いハイブリダイゼーション効率を得ることができる。
【００４３】
固定化された核酸とハイブリッドを形成する核酸や、固定化された核酸と特異的に結合する各種生体成分の検出には、公知の手段を用いることができる。例えば、検体中の核酸、タンパク質又は低分子化合物等に、蛍光物質、発光物質、ラジオアイソトープなどの標識体を作用させ、この標識体を検出することができる。これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、何ら制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。
【実施例】
【００４４】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。
＜実施例１＞
（１）ポリメチルメタクリレート（PMMA）製中空繊維の作製
単量体組成比：メチルメタクリレート（MMA）/メチルアクリレート（MA）＝82/18からなる、質量分子量約９万のアクリル樹脂を原料として、環状吐出口を有する紡糸ノズルから押出機を使用して溶融押出を行った。その結果、外径が0.3mm、内径が0.2mm、長さが600mmの中空繊維を得た。
【００４５】
（２）中空繊維集束物の作製
直径0.32 mmの孔を有し、孔の中心間距離が0.42 mmの多孔板であって、縦横各３列に合計９個配列された厚さ0.1 mmの多孔板（アルミ製）２枚を重ね、これらの多孔板の各孔に、前記中空繊維９本を通過させた。２枚の多孔板の間隔を50mmとし、糸を張った状態で中空繊維の一方の端部から50mmの位置と100mmの位置の２ヶ所を固定した。
固定した後、２枚の多孔板によりできた空間をアルミ板で囲い、その空間に樹脂を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン4276、コロネート4403）に、接着剤の総重量に対し、2.5質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。室温で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板及びアルミ板を取り除き、中空繊維集束物を得た。
【００４６】
（３）末端にメタクリロイル基を有するオリゴヌクレオチド（末端ビニル化オリゴヌクレオチド）の調製
オリゴヌクレオチドの合成は、自動合成機 DNA/RNA synthesizer（PEバイオシステムズ社製  model 394）を用いて行った。合成の最終ステップで、5’末端にアミノ基〔NH2(CH2)6-〕を導入し、以下に示すオリゴヌクレオチドA（配列番号１）を合成した。5’末端のアミノ基の導入は、アミノリンクII（商標名）（アプライドバイオシステム社製）を使用した。これらのオリゴヌクレオチドは、一般的手法により脱保護及び精製して使用した。
オリゴヌクレオチドA  :  caaccaacca caactacata cacatac （配列番号１）
次に、オリゴヌクレオチドA（500nmol/ml）5 μlとグリシジルメタクリレート 0.5μlを混合し、７０℃で２時間反応させた。反応終了後、水を加えて全量を２５μlとし、100nmol/mlの末端にメタクロイル基を有するオリゴヌクレオチド（GMA変性オリゴヌクレオチドA）を得た。
【００４７】
（４）アガロースとアリルグリシジルエーテルの反応
アリルグリシジル誘導体化アガロースの調製は、Electrophoresis 16. 1337-1344 (1995)の方法に従い行った。すなわち、0.3Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液33mlにアガロース1gと水素化ホウ素ナトリウム33mgを懸濁させ、そこにアリルグリシジルエーテル160μｌを添加し、室温下で６時間撹拌し、反応を行った。反応終了後、ろ過を行った。その後、蒸留水中に懸濁させ洗浄を行った。洗浄後、再度ろ過を行い得られたアガロース粉末をメタノール中に懸濁させで脱水した。ろ過を行い反応したアガロース粉末を回収した。真空乾燥機中で３５℃で一昼夜乾燥を行い、粉末状の反応物を得た。
【００４８】
（５）アガロースとオリゴヌクレオチドの共重合反応
（４）で得たアガロース0.1gと、（３）で得られたGMA変性オリゴヌクレオチドＡ（100nmol/ml）500μｌを滅菌水500μｌと混合し、90℃に加熱してアガロースを溶解させた。
その後、5%過硫酸アンモニウム水溶液5μｌ，10%N,N,N,N-テトラエチルメチレンジアミン水溶液10μｌを添加し、室温で１時間放置した。
【００４９】
（６）中空繊維集束物への核酸固定化ゲルの充填および薄片化
（５）で得られた化合物を９０℃に加熱して溶解させ、（２）で得た中空繊維集束物の繊維の末端に浸漬させ、吸引によって中空繊維の内部にアガロース溶液を充填させた。
その後、中空繊維集束物を室温で４時間放置し、管状体の内部のアガロース溶液をゲル化させた。
アガロースゲルが充填された中空繊維集束物をミクロトームを用いて中空繊維の長手方向と垂直に交差する方向で約500μｍの厚さで切断を繰り返した。以上により、核酸が固定化されたアガロースが充填された中空管状体からなるマイクロアレイが得られた。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明にかかる核酸固定ゲルマイクロアレイは遺伝子発現解析等に使用される。
【配列表フリーテキスト】
【００５１】
配列番号１：合成ＤＮＡ
【配列表】
2005134257000001.app