(57)【要約】      （修正有）【課題】エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果の試験方法、ＨＤＬコレステロール、リン脂質、アンジオポエチン関連タンパク質３、アンジオポエチン関連タンパク質４の定量方法、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防用医薬組成物を提供する。【解決手段】以下の工程（１）乃至（２）を含む、エンドセリアルリパーゼ（Endothelial Lipase、以下、「ＥＬ」という。）の活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法等：（１）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、及びエンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；（２）ＥＬの活性が低下した物質を選択する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）乃至（２）を含む、エンドセリアルリパーゼ（Endothelial Lipase）の活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（１）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３（angiopoietin-like 3）又はアンジオポエチン関連タンパク質４（angiopoietin-like 4）、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（２）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。
【請求項２】
以下の工程（１）乃至（４）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（１）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（２）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。
（３）（２）で選択された被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、並びにその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する工程；
（４）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程。
【請求項３】
以下の工程（１）乃至（４）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（１）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する工程；
（２）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程；
（３）（２）で選択された被験物質、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（４）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。
【請求項４】
以下の工程（１）乃至（４）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（１）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する工程；
（２）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程；
（３）（２）で選択された被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（４）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。
【請求項５】
以下の工程（１）乃至（３）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（１）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程；
（２）（１）で選択された被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する工程；
（３）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程。
【請求項６】
以下の工程（１）乃至（３）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（１）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こす物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させない物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させない被験物質を選択する工程；
（２）（１）で選択された被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（３）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。
【請求項７】
以下の工程（１）乃至（４）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（１）被験物質、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（２）エンドセリアルリパーゼの活性が低下した被験物質を選択する工程；
（３）（２）で選択された被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロール、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールの活性を測定する工程；
（４）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程。
【請求項８】
以下の工程（１）乃至（４）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（１）被験物質と、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する工程：
（２）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程。
（３）（２）で選択された被験物質とエンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程：
（４）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。
【請求項９】
以下の工程（１）乃至（２）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（１）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、その基質、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性、及びエンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程：
（２）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質であって、かつ以下の性質を有する被験物質を選択する工程；
リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こす又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質。
【請求項１０】
以下の工程（１）及び（２）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（１）非ヒト哺乳動物に以下の(a)乃至(h)から選択されるアミノ酸配列を含むことからなる、１種又は２種以上のポリペプチド、及び被験物質を投与する工程；
(a)配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列、
(b)配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列、
(c)配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(d)配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列、
(e)配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列、
(f)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(g)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(h)上記(a)乃至(g)から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列；
（２）上記工程（１）の動物の血中の中性脂肪濃度、並びに、ＨＤＬコレステロール濃度及び／又はリン脂質濃度、を測定する工程。
【請求項１１】
以下の工程（１）乃至（３）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（１）非ヒト哺乳動物に以下の(a)乃至(f)のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含むことからなる、アデノウイルスベクターを保持するアデノウイルスを感染させる工程；
(a)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列においてヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号１４０７を３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(b)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した1つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６４５のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(c)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６０９のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(d)配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３を５’末端とし、ヌクレオチド番号１３９３を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(e)配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号６０１を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
(f)上記(a)乃至(f)から選択されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（２）上記工程（１）の動物に被験物質を投与する工程；
（３）上記工程（２）の動物の血中の中性脂肪濃度、並びに、ＨＤＬコレステロール濃度及び／又はリン脂質濃度、を測定する工程。
【請求項１２】
被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定することを特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法。
【請求項１３】
以下の（１）及び（２）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（１）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する；
（２）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する。
【請求項１４】
以下の（１）及び（２）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（１）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する；
（２）被験物質、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する。
【請求項１５】
エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定することを、特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法。
【請求項１６】
リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こす被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させない被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させない被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定することを特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法。
【請求項１７】
被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、その基質、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性、及びエンドセリアルリパーゼの活性を測定することを特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法。
【請求項１８】
下記の（１）及び（２）を含む、ＨＤＬコレステロール濃度及び／又はリン脂質濃度の定量方法：
（１）試料中のアンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４を定量する；
（２）（１）で定量されたアンジオポエチン関連タンパク質３及び／又はアンジオポエチン関連タンパク質４の濃度から試料中のＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質の濃度を計算する。
【請求項１９】
下記の（１）及び（２）を含む、ＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質の定量方法：
（１）試料中のアンジオポエチン関連タンパク質３を定量する；
（２）（１）で得られたアンジオポエチン関連タンパク質３の定量値から試料中のＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質の量を計算する。
【請求項２０】
下記の（１）及び（２）を含む、アンジオポエチン関連タンパク質３及び／又はアンジオポエチン関連タンパク質４の定量方法：
（１）試料中のＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質を定量する；
（２）（１）で得られたＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質の定量値から、試料中のアンジオポエチン関連タンパク質３及び／又はアンジオポエチン関連タンパク質４の量を計算する。
【請求項２１】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載されたスクリーニング方法によって高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有することが確認された選択されたエンドセリアルリパーゼの活性の低下を阻害する物質。
【請求項２２】
請求項１０乃至１７のいずれか１項に記載された方法によって、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有することが確認された物質。
【請求項２３】
請求項２１又は２２に記載された物質を有効成分として含有する、エンドセリアルリパーゼ阻害剤。
【請求項２４】
請求項２１又は２２に記載された物質を有効成分として含有する、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果用、医薬組成物。
【請求項２５】
以下の（１）乃至（５）から選択されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及びエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（１）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列においてヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号１４０７を３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（２）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した1つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６４５のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（３）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６０９のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（４）配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３を５’末端とし、ヌクレオチド番号１３９３を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（５）配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号６０１を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２６】
以下の（１）乃至（７）から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及びエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド。
（１）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列；
（３）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（４）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列；
（５）配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列；
（６）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（７）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列。
【請求項２７】
以下の（１）乃至（８）から選択されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドを１種又は２種以上含むことからなる、エンドセリアルリパーゼ阻害剤：
（１）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列；
（３）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（４）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列；
（５）配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列；
（６）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（７）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（８）上記（１）乃至（７）から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列。
【請求項２８】
以下の（１）乃至（８）から選択されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドを１種又は２種以上含むことからなる、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防用医薬組成物：
（１）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列；
（３）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（４）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列；
（５）配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列；
（６）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（７）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（８）上記（１）乃至（７）から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法、該方法によって得られる物質、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法、該方法によって得られる物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４又の定量方法等の技術分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清脂質の大部分はアポリポタンパク質と複合体をなして、血清リポタンパク質として存在しており、それらは密度の違いにより、カイロミクロン、ＶＬＤＬ（超低比重リポタンパク質）、ＬＤＬ（低比重リポタンパク質）、ＨＤＬ（高比重リポタンパク質）などに分類される。なかでもＨＤＬコレステロールは末梢組織の余剰なコレステロールを引き抜き肝臓へ転送する作用（所謂、コレステロール逆転送作用）を有し、抗動脈硬化作用のある脂質として広く認識されている。その血中ＨＤＬコレステロール濃度が臨床的に低い病態すなわち低HDLコレステロール血症は高ＬＤＬコレステロール血症と並び、虚血性心疾患などの動脈硬化性疾患を発症させる明確な危険因子として知られている。低HDLコレステロール血症と虚血性心疾患発症との関係については、その因果関係は明確にされており（例えば、非特許文献１参照。）、虚血性心疾患に対する独立した危険因子としての位置が確立され、その予防や治療が積極的に行なわれている。
【０００３】
代表的な低ＨＤＬコレステロール血症治療剤としては、ニコチン酸誘導体、例えば、アシピモクスなどが医薬に供されているが、フラッシング等の副作用を高頻度で生じる。血中ＬＤＬコレステロール値を低下させ、ＨＤＬコレステロールを上昇させる薬剤として、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ  ＣｏＡ）還元酵素を阻害するプラバスタチン、シンバスタチン等が医薬に供されている。またフィブリン酸系化合物、例えば、クロフィブラート、フェノフィブラートなども血中ＬＤＬコレステロール値を低下させ、ＨＤＬコレステロールを上昇させる薬剤として医薬に供されているが、これら薬剤のＨＤＬ上昇作用は十分ではなく、またフィブリン酸系化合物と一部のスタチン系化合物との併用は横紋筋融解のリスクが増加することが知られている。したがって、より副作用が少なく、かつ効果的なHDLコレステロール上昇作用を示す薬剤を得ることは、動脈硬化の治療及び・または予防により有用な薬剤を提供することになる。
【０００４】
エンドセリアルリパーゼ（Endothelial Lipase、以下「ＥＬ」ということもある。）は、主として血管内皮細胞にて産生され、細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合しているリパーゼで、主としてＨＤＬコレステロール中のリン脂質を加水分解する活性を有しており、HDLコレステロールの代謝調節に関与している(例えば、特許文献１、２、３、４、非特許文献２及び３参照。)。本酵素の遺伝子を欠失させたモデルマウスは血中のＨＤＬコレステロールおよびそのアポタンパク質であるApo-AIが上昇すること(例えば、非特許文献４及び５参照。)、中和抗体投与により本酵素活性を阻害するとHDLコレステロールおよびApo-AIが上昇すること(例えば、非特許文献６参照。)、逆に本酵素の遺伝子を過剰発現させたモデルマウスはHDLコレステロールおよびApo-AIが低下すること(例えば、非特許文献４参照。)、アデノウィルス投与によって本酵素の発現を上昇させるとHDLコレステロールおよびApo-AIが低下すること等が知られている(例えば、非特許文献３参照。)。さらに、ヒト臨床検体の解析においてＥＬの遺伝子変異とＨＤＬコレステロールとの関連をつける報告も存在し(例えば、非特許文献５参照。)、ＥＬは抗動脈硬化作用のあるＨＤＬコレステロールの代謝調節に関与し、冠動脈硬化症の発症に寄与している可能性がある。
【０００５】
「アンジオポエチン関連タンパク質３」（以下、「ＡＮＧＰＴＬ３」ということもある。）及び「アンジオポエチン関連タンパク質４」（以下、「ＡＮＧＰＴＬ４」、ということもある。）は血中の中性脂肪の濃度を上昇させる機能を有する蛋白質である（例えば、特許文献５参照。）。
【０００６】
また、リポタンパク質リパーゼ（以下、ＬＰＬという）および／または肝性リパーゼ（以下、ＨＴＧＬ）のリパーゼ活性がＡＮＧＰＴＬ３により阻害されることが報告されている（例えば、特許文献６参照。）。ＡＮＧＰＴＬ３及びＡＮＧＰＴＬ４はアミノ末端側のコイル構造、カルボキシル末端側のフィブリノーゲン様ドメインを有し、ＬＰＬ阻害活性はアミノ末端側のコイル構造を有する部分ポリペプチドだけでよいことも報告されている（例えば、特許文献６参照。）。
【０００７】
一方、ＡＮＧＰＴＬとＥＬとの関係は明らかになっていない。
【特許文献１】国際公開第９８／２４８８８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９／３２６１１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０２／１６３９７号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０２／７９４９２パンフレット
【特許文献５】国際公開第０１／４２４９９号パンフレット
【特許文献６】国際公開第０２／１０１０３９号パンフレット
【非特許文献１】「アメリカン・ジャーナル・オブ・メディスン（American Journal of Medicine）」、１９７７年、第６２、ｐ.７０７−７１４
【非特許文献２】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）」、１９９９年、第２７４巻、ｐ.１４１７０−１４１７５
【非特許文献３】「ネイチャー・ジェネティックス（Nature Genetics）」、１９９９年、第２１巻、ｐ．４２４−４２８
【非特許文献４】「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（The Journal of Clinical Investigation）」、２００３年、第１１１巻、ｐ．３４７−３５５
【非特許文献５】「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・ザ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）」、２００３年、第１００巻、ｐ．２７４８−２７５３
【非特許文献６】「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（The Journal of Clinical Investigation）」、２００３年、第１１１巻、ｐ．３５７−３６２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はＥＬ阻害剤の新規スクリーニング方法、脂質代謝改善剤のスクリーニング方法及びＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を含むＥＬ阻害剤、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を含む脂質代謝改善剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究を行ったところ、ヒト血漿においてアンジオポエチン関連タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）の量とＨＤＬコレステロールの量に正の相関があることを見出した。また、本発明者らはアンジオポエチン関連タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）及びアンジオポエチン関連タンパク質４（ＡＮＧＰＴＬ４）がＥＬ阻害活性を有することを見出し、ＥＬ阻害活性を促進する物質は脂質代謝改善剤（高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防剤）となり得ることを見出し本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）以下の工程（ａ）乃至（ｂ）を含む、エンドセリアルリパーゼ（Endothelial Lipase）の活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３（angiopoietin-like 3）又はアンジオポエチン関連タンパク質４（angiopoietin-like 4）、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（ｂ）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程、
（２）以下の工程（ａ）乃至（ｄ）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（ｂ）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。
（ｃ）（ｂ）で選択された被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、並びにその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する工程；
（ｄ）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程、
（３）以下の工程（ａ）乃至（ｄ）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する工程；
（ｂ）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程；
（ｃ）（ｂ）で選択された被験物質、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（ｄ）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程、
（４）以下の工程（ａ）乃至（ｄ）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する工程；
（ｂ）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程；
（ｃ）（ｂ）で選択された被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（ｄ）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程、
（５）  以下の工程（ａ）乃至（ｃ）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程；
（ｂ）（ａ）で選択された被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する工程；
（ｃ）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程、
（６）  以下の工程（ａ）乃至（ｃ）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こす物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させない物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させない被験物質を選択する工程；
（ｂ）（ａ）で選択された被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（ｃ）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程、
（７）  以下の工程（ａ）乃至（ｄ）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（ｂ）エンドセリアルリパーゼの活性が低下した被験物質を選択する工程；
（ｃ）（ｂ）で選択された被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロール、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールの活性を測定する工程、
（ｄ）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程、
（８）  以下の工程（ａ）乃至（ｄ）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質と、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する工程：
（ｂ）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程、
（ｃ）（ｂ）で選択された被験物質とエンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程：
（ｄ）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程、
（９）  以下の工程（ａ）乃至（ｂ）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、その基質、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性、及びエンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程：
（ｂ）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質であって、かつ以下の性質を有する被験物質を選択する工程；
リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こす又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質、
（１０）  以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（ａ）非ヒト哺乳動物に以下の(i)乃至(viii)から選択されるアミノ酸配列を含むことからなる、１種又は２種以上のポリペプチド、及び被験物質を投与する工程；
(i)配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列、
(ii)配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列、
(iii)配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(iv)配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列、
(v)配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列、
(vi)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(vii)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(viii)上記(i)乃至(vii)から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列；
（ｂ）上記工程（ａ）の動物の血中の中性脂肪濃度、並びに、ＨＤＬコレステロール濃度及び／又はリン脂質濃度、を測定する工程。
（１１）  以下の工程（ａ）乃至（ｃ）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（ａ）非ヒト哺乳動物に以下の(i)乃至(vi)のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含むことからなる、アデノウイルスベクターを保持するアデノウイルスを感染させる工程；
(i)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列においてヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号１４０７を３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(ii)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した1つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６４５のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(iii)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６０９のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(iv)配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３を５’末端とし、ヌクレオチド番号１３９３を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(v)配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号６０１を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
(vi)上記(i)乃至(v)から選択されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）上記工程（ａ）の動物に被験物質を投与する工程；
（ｃ）上記工程（ｂ）の動物の血中の中性脂肪濃度、並びに、ＨＤＬコレステロール濃度及び／又はリン脂質濃度、を測定する工程、
（１２）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定することを特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法、
（１３）以下の（ａ）及び（ｂ）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（ａ）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する；
（ｂ）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する、
（１４）以下の（ａ）及び（ｂ）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（ａ）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する；
（ｂ）被験物質、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する、
（１５）  エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定することを、特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法、
（１６）  リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こす被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させない被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させない被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定することを特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法、
（１７）  被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、その基質、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性、及びエンドセリアルリパーゼの活性を測定することを特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法、
（１８）  下記の（ａ）及び（ｂ）を含む、ＨＤＬコレステロール濃度及び／又はリン脂質濃度の定量方法：
（ａ）試料中のアンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４を定量する；
（ｂ）（ａ）で定量されたアンジオポエチン関連タンパク質３及び／又はアンジオポエチン関連タンパク質４の濃度から試料中のＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質の濃度を計算する。
（１９）  下記の（ａ）及び（ｂ）を含む、ＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質の定量方法：
（ａ）試料中のアンジオポエチン関連タンパク質３を定量する；
（ｂ）（ａ）で得られたアンジオポエチン関連タンパク質３の定量値から試料中のＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質の量を計算する。
（２０）  下記の（ａ）及び（ｂ）を含む、アンジオポエチン関連タンパク質３及び／又はアンジオポエチン関連タンパク質４の定量方法：
（ａ）試料中のＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質を定量する；
（ｂ）（ａ）で得られたＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質の定量値から、試料中のアンジオポエチン関連タンパク質３及び／又はアンジオポエチン関連タンパク質４の量を計算する、
（２１）  （１）乃至（９）のいずれか１つに記載されたスクリーニング方法によって高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有することが確認された選択されたエンドセリアルリパーゼの活性の低下を阻害する物質、
（２２）  （１０）乃至（１７）のいずれか１つに記載された方法によって、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有することが確認された物質、
（２３）  （２１）又は（２２）に記載された物質を有効成分として含有する、エンドセリアルリパーゼ阻害剤、
（２４）（２１）又は（２２）に記載された物質を有効成分として含有する、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果用、医薬組成物、
（２５）以下の（ａ）乃至（ｅ）から選択されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及びエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（ａ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列においてヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号１４０７を３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した1つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６４５のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６０９のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３を５’末端とし、ヌクレオチド番号１３９３を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号６０１を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（２６）  以下の（ａ）乃至（ｇ）から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及びエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列；
（ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（ｄ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列；
（ｅ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（ｇ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
（２７）  以下の（ａ）乃至（ｈ）から選択されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドを１種又は２種以上含むことからなる、エンドセリアルリパーゼ阻害剤：
（ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列；
（ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（ｄ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列；
（ｅ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（ｇ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（ｈ）上記（ａ）乃至（ｇ）から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列、
（２８）  以下の（ａ）乃至（ｇ）から選択されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドを１種又は２種以上含むことからなる、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防用医薬組成物：
（ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列；
（ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（ｄ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列；
（ｅ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（ｇ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（ｈ）上記（ａ）乃至（ｇ）から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列、
からなる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を用いたＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法、該方法によって得られる物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を用いた、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法、該方法によって得られる物質、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４、ＨＤＬ−コレステロール及びリン脂質の定量方法、ＥＬ阻害剤、及び、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防用医薬組成物が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書中における、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びそのｃＲＮＡも含まれるものとする。本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれている。本明細中においては、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。また、本明細書中において、「ＲＮＡ画分」とは、ＲＮＡを含んでいる画分をいう。また、本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。
【００１３】
本明細書中における、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社製）中、６８℃でハイブリダイズすること、または、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて０．７−１．０ＭのＮａＣｌ存在下６８℃でハイブリダイゼーションを行なった後、０．１−２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件またはそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
【００１４】
１．アンジオポエチン関連タンパク質
アンジオポエチン関連タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）及びアンジオポエチン関連タンパク質４（ＡＮＧＰＴＬ４）はアミノ末端側のコイル構造、カルボキシル末端側のフィブリノーゲン様ドメインを特徴とする分泌タンパク質である。
【００１５】
ヒト・ＡＮＧＰＴＬ３のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は国立遺伝学研究所（ＧｅｎＢａｎｋ）にアクセッション番号ＡＦ１５２５６２で登録されており、また、配列表の配列番号１にはヌクレオチド配列が示されており、配列番号２にはアミノ酸配列が示されている。
【００１６】
ヒト・ＡＮＧＰＴＬ４のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は国立遺伝学研究所（ＧｅｎＢａｎｋ）のデータベースにアクセッション番号ＡＦ２０２６３６で登録されており、また、配列表の配列番号３にはヌクレオチド配列が示されており、配列番号４にはアミノ酸配列が示されている。
【００１７】
ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４及びその部分ポリペプチドは、例えば、国際公開０２／１０１０３９号パンフレットに記載の方法によって取得することができる。
【００１８】
本発明で用いるＡＮＧＰＴＬ３及びＡＮＧＰＴＬ４はその全長ポリペプチドの他、シグナル配列が切断されたポリペプチド、カルボキシル末端側のフィブリノーゲン様ドメインが切断された部分ポリペプチドも用いることができる。
【００１９】
なお、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の一部を他のヌクレオチドへの置換やヌクレオチドの欠失、付加などの改変により、天然型の、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４及びその部分ポリペプチドと同等に、ＬＰＬ阻害活性及びＥＬ阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製することが可能である。このように天然型のヌクレオチド配列においてヌクレオチドが置換、欠失、もしくは付加したヌクレオチド配列を有し、天然型の、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４及びその部分ポリペプチドと同等のＬＰＬ阻害活性及びＥＬ阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明のポリヌクレオチドに含まれる。ヌクレオチド配列の改変は、例えば、制限酵素あるいはＤＮＡエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法によるヌクレオチド配列の改変、合成変異ＤＮＡの直接導入などの方法により行うことができる。
【００２０】
本発明におけるＡＮＧＰＴＬ３とは具体的には以下の(a)乃至(d)から選択されるアミノ酸配列を含むことからなる、ポリペプチドである。
(a)配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列；
(b)配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列；
(c)配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
(d)上記(a)乃至(c)から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＬＰＬ阻害活性及びＥＬ阻害活性を有するポリペプチドコードするアミノ酸配列。
【００２１】
本発明におけるＡＮＧＰＴＬ４とは具体的には以下の(e)乃至(i)から選択されるアミノ酸配列を含むことからなる、ポリペプチドである。
(e)配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列；
(f)配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列；
(g)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
(h)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(i)上記(e)乃至(h)から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＬＰＬ阻害活性及びＥＬ阻害活性を有するポリペプチドコードするアミノ酸配列。
上記、(a)乃至(i)に記載のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドは例えば、以下の(a)乃至(ｆ)のいずれかに記載のポリヌクレオチドを取得し、次いで該ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドを通常の遺伝子組換えの手法を用いて宿主細胞に生産させることにより得ることができる：
(a)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列においてヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号１４０７を３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(b)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した1つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６４５のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(c)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６０９のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(d)配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３を５’末端とし、ヌクレオチド番号１３９３を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(e)配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号６０１を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
(f)上記(a)乃至(e)から選択されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＬＰＬ阻害活性及びＥＬ阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２２】
なお、配列表の、配列番号１に示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸番号１−１６に示されるアミノ酸配列は哺乳動物細胞では翻訳後にシグナルペプチドとして除去される（国際特許出願国際公開番号ＷＯ０１／４２４９９号公報）ので、上記生産方法において、宿主が哺乳動物細胞由来である場合は、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７をアミノ末端とするポリペプチドを得ることができる。配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号４のアミノ酸配列においても、宿主が哺乳動物細胞由来である場合は、シグナル配列が除去されたポリペプチドを得ることができる。配列表の配列番号４のアミノ酸配列においてアミノ酸番号１−２５に示されるアミノ酸配列は哺乳動物細胞では翻訳後にシグナルペプチドとして除去されると推定されるので、上記生産方法において、宿主が哺乳動物細胞由来である場合は、配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６をアミノ末端とするポリペプチドを得ることができる。
【００２３】
また、原核細胞のような、哺乳動物のタンパク質のシグナルペプチドを切断する機能を有さない宿主を用いて本発明のポリペプチドを生産する方法としては、例えば、(a)配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号４６０をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、(b)配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、(c)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号４０６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、(d)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、(e)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、(f)上記(a)乃至(f)から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＬＰＬ阻害活性及びＥＬ阻害活性を有するポリペプチドコードするアミノ酸配列、(a)〜(f)のいずれかのアミノ酸配列のアミノ末端側に、該アミノ酸配列を切断しないプロテアーゼによって特異的に切断されるアミノ酸配列が連結し、さらにそのアミノ末端側に特定の化合物と特異的な親和性を有するタンパク質のアミノ酸配列が連結している、アミノ酸配列からなる融合タンパク質を大腸菌に生産させ、次いで該融合タンパク質を、特定の化合物との親和性を利用して精製した後に、前記プロテアーゼによって、アミノ末端側の上記特定の化合物との親和性を有するタンパク質のアミノ酸配列を除去する方法を挙げることができる。このような特定の化合物との親和性を利用した精製例としては、例えば、グルタチオン・Ｓ−トランスフェラーゼ（以下「ＧＳＴ」という）のアミノ酸配列が連結している融合タンパク質を大腸菌に生産させ、次いで該融合タンパク質をグルタチオンとＧＳＴとの親和性を利用して精製した後、プロテアーゼによってＧＳＴ配列を除去する方法を挙げることができる。また、アミノ末端側(シグナルペプチド内)に、精製を容易にするためのヒスチジンタグが挿入されたポリペプチドを用いることもできる。
【００２４】
配列表の配列番号１のヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６４５のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチドは、例えばヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーからクローニングしたヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードするｃＤＮＡ、または独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センターに国際寄託されている組換え大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１  ＳＡＮＫ  ７２２９９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９４１）が保持する組換えファージミドを鋳型とし、所望のヌクレオチド配列からなるＤＮＡが増幅されるように設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）を行うことにより得ることができる。あるいは、組換え大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１  ＳＡＮＫ  ７２２９９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９４１）が保持する組換えファージミドｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１（国際特許出願国際公開番号ＷＯ０１／４２４９９号公報参照）に挿入されているｃＤＮＡのヌクレオチド配列中の所望の位置に、該ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームと同一のリーディングフレーム上で終止コドンとなるヌクレオチド配列が挿入されるような部位特異的人工突然変異を施すことにより得ることもできる。
【００２５】
なお、大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１  ＳＡＮＫ  ７２２９９は平成１１年（１９９９）年１１月１９日付で独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９４１で国際寄託されている。
【００２６】
ヒトの適当な臓器由来のｃＤＮＡライブラリーからクローニングしたヒト・ＡＮＧＰＴＬ４をコードするｃＤＮＡ、または、市販のｃＤＮＡクローン（例えばＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍより購入できる）を鋳型とし、所望のヌクレオチド配列からなるＤＮＡが増幅されるように設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲを行なうことにより得ることができる。
【００２７】
しかしながら、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡはこれらに限定されず、例えば上記した遺伝子組換えの手法において用いられる宿主のコドン使用頻度を考慮して適宜改変したＤＮＡでもよい。
【００２８】
そのような、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを、適当なベクターＤＮＡに組み込んで得られた組換えベクターは、原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換することができる。さらにこれらのベクターに適当なプロモーター、および形質発現に関わる配列を導入することにより、それぞれの宿主において導入した遺伝子を発現することが可能である。
【００２９】
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtilis）などが挙げられる。
【００３０】
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Urlaub, G. and Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【００３１】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を具えたものを用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Graham, F. L. and van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456-457）、および電気パルス穿孔法（Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845）などによりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。
【００３２】
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Sambrook, J. et al. (1989) : “Molecular Cloning A Laboratory Manual“ Cold Spring Harbor Laboratory, NY）やｐＳＶ２−ｎｅｏ（Southern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341）などをコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【００３３】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ改変イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。
【００３４】
上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換え蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。該方法としては、具体的には例えば、通常の蛋白沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。また、発現させる組換え蛋白質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で上記ポリペプチドを大量に製造できる。
【００３５】
また、該ポリペプチドは、上記の方法に従って得られる他、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを組み込んだアデノウイルスベクターを利用して動物細胞に産生させることもできる。そのような組換えアデノウイルスベクターを構築する方法として、市販のキット（例えば、アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キット、宝酒造（株）社製）を用いる方法を例示できる。本発明のポリペプチドが哺乳動物の血中中性脂肪濃度と密接に相関していることは、例えば上記のようにして得られる組換えアデノウイルスベクターを有する組換えアデノウイルスを哺乳動物、例えばマウスに感染させて、該組換えアデノウイルスベクターが保持する遺伝子を発現させると、血中中性脂肪（トリグリセリド）濃度の上昇が観察されることから証拠付けられる。
【００３６】
２．血中コレステロール量とＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４の量との関連
ヒトの血漿中のＡＮＧＰＴＬ３濃度、ＨＤＬコレステロール濃度、リン脂質濃度を測定すると、ＡＮＧＰＴＬ３の濃度とＨＤＬコレステロール濃度の間に正の相関があることが確認できる。同様にＡＮＧＰＴＬ３の濃度とリン脂質濃度にも正の相関があることが確認できる。
【００３７】
同様にＡＮＧＰＴＬ４の濃度とＨＤＬコレステロール濃度の間に正の相関があることが確認できる。同様にＡＮＧＰＴＬ４の濃度とリン脂質濃度も相関する傾向が観察される。
【００３８】
以下、ヒト血漿中のＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＨＤＬコレステロール、総コレステロール及びリン脂質の濃度を測定する方法を具体的に説明する。
【００３９】
（１）ヒト血漿の取得
適正な実験指針の下にヒトより採取された血液より血漿を調製することができる。食事による影響を避けるために絶食状態の被験者より採取した血漿を用いるのが好ましい。
【００４０】
（２）ヒト血漿中のＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４濃度の測定
血漿中のＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４の定量方法はＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４の量を測定することができる限りにおいて特に制限はない。例えば、ＡＮＧＰＴＬ３の定量はＡＮＧＰＴＬ３に対する抗体を利用したＥＬＩＳＡ法を挙げることができる（国際公開０２／１０１０３９パンフレット及び参考例４参照）。本方法を用いればＡＮＧＰＴＬ３の定量ができる。ＡＮＧＰＴＬ４についても同様の方法によって定量することができる。
【００４１】
（３）ヒト血漿中のＨＤＬコレステロール、総コレステロール及びリン脂質濃度の測定
ヒト血漿中のＨＤＬコレステロール、総コレステロール及びリン脂質濃度は当業者が通常行う方法によって測定することができるが、例えば、以下の方法によっても測定することができる。
【００４２】
ＨＤＬコレステロール濃度はＬタイプワコーＨＤＬ−Ｃ（和光純薬工業社製）を用いて測定することができる。総コレステロール濃度はＬタイプワコーＣＨＯ・Ｈ（和光純薬工業社製）を用いて測定することができる。リン脂質濃度はＬタイプワコーリン脂質（和光純薬工業社製）を用いて測定することができる。
【００４３】
（４）ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４の量とＨＤＬコレステロール及びリン脂質との関係
血漿中におけるＨＤＬコレステロール濃度、総コレステロール濃度、およびリン脂質濃度とＡＮＧＰＴＬ３の濃度との相関をThe SAS(R) System Release 6.12 (TS045) for Windowsを用いて解析する。ピアソンの相関係数(r)および相関係数１に対する検定p値で調べると、ＨＤＬコレステロール濃度とＡＮＧＰＴＬ３の濃度との間に有意な正の相関が認められる。また、リン脂質濃度とＡＮＧＰＴＬ３との間にも有意な正の相関が得られる。
【００４４】
同様に、ＡＮＧＰＴＬ４についてもＨＤＬコレステロール濃度、総コレステロール濃度、およびリン脂質濃度との相関を調べることができる。
【００４５】
（５）ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を使用したＨＤＬコレステロール濃度及び／又はリン脂質濃度の定量
血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３とＨＤＬコレステロールの濃度には正の相関があるので、血漿中のＡＮＧＰＴＬ３の濃度を測定することによって血漿中のＨＤＬコレステロール濃度を計算することができる。逆に血漿中のＨＤＬコレステロールの濃度を測定すれば、ＡＮＧＰＴＬ３の濃度を計算することもできる。
【００４６】
例えば、下記実施例１で示すように日本人１００名から得られた血漿中のＨＤＬコレステロール濃度とＡＮＧＰＴＬ３濃度の相関をThe SAS(R) System Release 6.12 (TS045) for Windowsを用いて、ピアソンの相関係数(r)および相関係数１に対する検定p値で調べたところ、ＨＤＬコレステロール濃度とＡＮＧＰＴＬ３濃度との間に、r=0.52,p=0.0001の正の相関が得られた。得られた１００名分のデータに基づいて線型回帰直線を求めると以下の式が得られる。
{HDLコレステロール濃度（mg/dl)｝=0.0617x{ANGPTL3濃度（ng/ml)}+32.865
本計算式を用いれば、例えば、ＡＮＧＰＴＬ３の濃度が400ng/mlのときHDLコレステロールの濃度は57.5mg/dlと計算できる。
【００４７】
また、同様に、血漿中のＡＮＧＰＴＬ３の濃度については、以下の線型回帰直線が得られる。
{ANGPTL3濃度（ng/ml）}=4.44x{HDLコレステロール濃度（mg/dl）}+197.44
本計算式を用いればHDLコレステロール濃度が50mg/dlのときANGPTL3濃度は419ng/mlと計算できる。
【００４８】
同様に、リン脂質濃度とＡＮＧＰＴＬ３濃度とのThe SAS(R) System Release 6.12 (TS045) for Windowsを用いて、ピアソンの相関係数(r)および相関係数１に対する検定p値で調べたところ、r=0.28,p=0.0052という値が得られた。得られた１００名分のデータの基づいて、血漿中のＡＮＧＰＴＬ３の濃度から、リン脂質の濃度は、線型回帰直線を求めると、以下の計算式が得られる。
{リン脂質濃度（mg/dl）}=0.0715x{ANGPTL3濃度（ng/ml）}+169.58
本計算式を用いれば、ANGPTL3濃度が400ng/mlのとき、リン脂質濃度は198.2mg/dlと計算できる。  
【００４９】
また、血漿中のＡＮＧＰＴＬ３の濃度は以下の計算式で求めることができる。
{ANGPTL3濃度（ng/ml）}=1.08x{リン脂質濃度（mg/dl）}+253.87
本計算式を用いれば、リン脂質濃度が200mg/dlのとき、ANGPTL3濃度は470ng/mlと計算できる。
【００５０】
同様にＨＤＬコレステロールの濃度とＡＮＧＰＴＬ４濃度との相関を調べれば、ＨＤＬコレステロール濃度からＡＮＧＰＴＬ４の濃度を計算することができるし、ＡＮＧＰＴＬ４の濃度からＨＤＬコレステロール濃度を計算することができる。
【００５１】
また、リン脂質の濃度とＡＮＧＰＴＬ４濃度との相関を調べれば、同様に、リン脂質の濃度からＡＮＧＰＴＬ４の濃度を計算することができるし、ＡＮＧＰＴＬ４の濃度からリン脂質の濃度を計算することができる。
【００５２】
本発明による、測定方法の例を示すと以下の（Ａ）又は（Ｂ）のようになるが、本発明はこれらに限定されない。
【００５３】
（Ａ）下記の（a）及び（b）を含む、ＨＤＬコレステロール濃度及び／又はリン脂質濃度の定量方法：
（a）試料中のアンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４を定量する；
（b）（a）で定量されたアンジオポエチン関連タンパク質３及び／又はアンジオポエチン関連タンパク質４の濃度から試料中のＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質の濃度を計算する。
【００５４】
（Ｂ）下記の（a）及び（b）を含む、アンジオポエチン関連タンパク質３及び／又はアンジオポエチン関連タンパク質４の定量方法：
（a）試料中のＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質を定量する；
（b）（a）で得られたＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質の定量値から、試料中のアンジオポエチン関連タンパク質３及び／又はアンジオポエチン関連タンパク質４の量を計算する。
【００５５】
３．エンドセリアルリパーゼ（ＥＬ）
エンドセリアルリパーゼ（ＥＬ）は主として血管内皮細胞で発現しているので、血管内皮細胞より取得することができる。また、ＥＬは以下の方法によって、ＥＬ遺伝子をクローニングした後、動物細胞等で発現させ、組換え蛋白質として取得することもできる。
【００５６】
本発明におけるＥＬの活性とは、エンドセリアルリパーゼが有する活性をいい、具体的には、リン脂質またはトリアシルグリセロールを加水分解する活性として測定することができる。
【００５７】
（１）ＥＬの取得
本発明で用いるヒト・ＥＬのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＡＦ１１８７６７で登録されている。
【００５８】
ヒト・ＥＬ遺伝子は例えば、ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、上記データベースに登録されているヌクレオチド配列に基づいて設計したセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ反応を行うことによって取得することができる。
【００５９】
例えば、ＰＣＲセンスプライマーとして、
5'-aagctagcatgagcaactccgttcctctgctctgt-3'（hEL-ms1：配列表の配列番号５）;
アンチセンスプライマーとして、
5'- ttaagcttgggaagctccacagtgggact -3'（hEL-mas2：配列表の配列番号６）
を用いてヒトｃＤＮＡライブラリー（（Marathon-Ready human testis（クロンテック社製））を用いてＰＣＲ反応を行い、アガロースゲル電気泳動を行うと、、約１５００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が観察される。このバンドをｐｃＤＮＡ３．１（−）／Myc-His(A)ベクター（インビトロゲン社）等の適当なベクター挿入しＥＬ遺伝子をクローニングすることができる。
【００６０】
発現するベクターとして動物細胞で発現するベクターを用いれば、ＥＬ遺伝子は動物細胞で発現することが可能となる。
【００６１】
（２）ＥＬの動物細胞での発現
例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（−）／Myc-His(A)ベクターにＥＬ遺伝子を挿入したベクターをヒト胚子腎臓細胞ＨＥＫ２９３にトランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することによってＥＬ蛋白質を発現する形質転換細胞株を得ることができる。
【００６２】
（３）ＥＬの活性測定
ＥＬの活性測定方法はＥＬの活性を測定できる限りにおいて特に制限はないが具体的には以下の方法を挙げることができる。
【００６３】
ａ）ＥＬ蛋白質
活性測定に用いるＥＬはＥＬを含んでいるサンプルであれば特に制限はないが、例えば、血管細胞、血管細胞の抽出液、血管細胞より精製したＥＬ蛋白質のほか、ＥＬ蛋白質を発現する形質転換細胞株、該形質転換細胞の細胞抽出液、ＥＬを分泌している培養上清等を用いることができる。
【００６４】
ｂ）放射標識基質を用いたＥＬの活性測定
ＥＬの活性は放射標識基質を使用した方法で測定することができる。放射標識基質を使用した活性測定方法としては、例えば、以下の文献（Nilsson-Ehle, P. and Schotz, M. C.(1976) J. Lipid Res. 17, 536-541）を挙げることができる。
【００６５】
例えば、ＥＬと基質溶液（例えば、グリセロール・トリオレイン酸、1,2−ジ[1-14C]オレオイル・ホスファチジルコリン、ウシ血清アルブミン、グリセロールを適当量含む、Tris-塩酸バッファー）にＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を加え以下に記載する条件でＥＬの活性測定を行う：
温度条件：２７℃〜４２℃、好適には３７℃；
反応液のｐＨ７．５〜８．５、好適には８．０
反応時間：１５〜１２０分、好適には９０分
反応終了後、反応液に有機溶媒を添加、混合してから遊離脂肪酸を含む層と未反応の基質を含む層とを分離させ、前者の遊離脂肪酸の量を放射活性で測定する。
【００６６】
ＥＬの活性は例えば以下のように定義できる。単位時間（min）、単位蛋白質量（mg）あたりに産生される生成物（遊離脂肪酸）由来の放射活性(dpm)より、dpm/min/mgと定義できる。生成する遊離脂肪酸の放射活性が高いときにはＥＬの活性も高いと判断でき、逆に生成する遊離脂肪酸の放射活性が低下しているときにはＥＬの活性が低下していると判断できる
放射性標識基質に代わるものとして、他のクラスの標識基質（例えば蛍光性の基質またはチオ含有基質等）をスクリーニング方法で使用することが出来る。蛍光性基質の例として、ホスファチジルコリンの蛍光標識体、具体的にはC6NBD-PC{1-アシル-2-[6-(ニトロ-2,1,3-ベンズオキサジアゾール-4-イル)アミノ]カプロイルホスファチジルコリン：N-3786,モレキュラー・プローブ社製}が挙げられる。またチオ含有基質には1,2-ビス（ヘキサノイチルチオ）-1,2-ジデオキシ-sn-グリセロ-3-ホスホリルコリンが含まれる。しかしながら、エンドセリアルリパーゼの活性を測定できる限りにおいて、これらの基質に制限されない。
【００６７】
４．ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４のＥＬ阻害活性
上記１で取得されたＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４及びそれらの部分ポリペプチドはＥＬの活性を用量依存的に阻害する。
【００６８】
ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４及びそれらの部分ポリペプチドのＥＬ阻害活性は具体的には以下のように調べることができる。
【００６９】
ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４としては以下の(a)〜(e)のアミノ酸配列を含むポリペプチドを挙げることができる。
(a)配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号４６０をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
(b)配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
(c)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号４０６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
(d)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
(e)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
(f)(a)〜(e)のいずれかのアミノ酸配列のアミノ末端側に、該アミノ酸配列を切断しないプロテアーゼによって特異的に切断されるアミノ酸配列が連結し、さらにそのアミノ末端側に特定の化合物と特異的な親和性を有するタンパク質のアミノ酸配列が連結している、アミノ酸配列。
【００７０】
これらのポリペプチドを添加したバッファーを用いて上記３に記載したＥＬの活性の測定を行うことによってＥＬの活性に対する、上記ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４又はそれらの部分ポリペプチドの影響を調べると、ポリペプチドの濃度依存的にＥＬの活性が阻害されることが確認される。
【００７１】
５．ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性の測定方法
ＬＰＬの活性は例えば、以下の方法で測定することができるが、ＬＰＬの活性を測定することができる限りにおいて本測定方法に制限されない。
【００７２】
（１）ＬＰＬを含む材料
ＬＰＬを含む材料としては、ＬＰＬを産生している、哺乳動物脂肪細胞由来または脂肪細胞の前駆細胞由来の細胞株の培養上清を用いることができる。細胞株が未分化である場合は、脂肪細胞に分化させてから材料を調製することが好ましい。ＬＰＬを産生している細胞株としては例えば、マウス細胞株３Ｔ３−Ｌ１（大日本製薬（株）より購入可能）、同３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ、同Ｏｂ１７等を挙げることができる。あるいは、ラット白色前駆脂肪細胞（初代培養細胞）を脂肪細胞に分化させた細胞も好適に用いることができるが、本発明はこれらに限定されない。
【００７３】
また、ＬＰＬを含む材料として、精製ＬＰＬや組換えＬＰＬ（Methods Enzymol. (1996) 263, 319-26参照）を使用することもできる。例えば、牛乳由来のＬＰＬ（シグマ社製）を本発明の方法に使用することが可能である。
【００７４】
（２）ＬＰＬ及びＨＴＧＬを含む材料
ＬＰＬ及びＨＴＧＬを含む材料としては、体重１ｋｇあたり１０乃至１００単位のヘパリンを静注して１０乃至１００単位のヘパリンを静注して１０分乃至１５分経過後の哺乳動物から採取した末梢血由来の血漿が好適である。
【００７５】
（３）ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの基質を含む材料
ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの基質を含む材料は、これらリパーゼの触媒により脂肪酸を遊離することが知られている物質を含み、かつこれらリパーゼの活性を阻害したり不活性化する成分が含まれていないものであればよいが、例えばグリセロール・トリ［９，１０（ｎ）−3Ｈ］オレイン酸のようにＬＰＬの触媒により遊離される脂肪酸が放射性同位元素で標識してある化合物や、同様に特定の励起波長下で蛍光を発する物質で標識された化合物が特に好適である。また、遊離脂肪酸の量を生化学的な方法で測定する場合には、標識されていない基質（例えばグリセロール・トリオレイン酸）も用いられ得る。
【００７６】
その他、反応液には、必要に応じ、ｐＨ調整のための緩衝液や、アルブミンなどのタンパク質成分が添加され得る。
【００７７】
（４）ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性の測定
これらの材料を混合し、以下に記載する条件でＬＰＬ及び／ＨＴＧＬの反応を行うことによってＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を測定することができる：
温度条件：  ２７〜３７℃、好適には３７℃；
反応液のｐＨ：  ８．０〜８．５、好適には８．０；
反応液中の塩化ナトリウム濃度：  ０．１〜０．１５Ｍ、好適には０．１５Ｍ；
反応時間：  １５〜１２０分、好適には１２０分。
【００７８】
なお、ヘパリン投与した哺乳動物由来の血漿のように、ＬＰＬとＨＴＧＬの両方を含む材料を用いる場合は、上記条件でＬＰＬとＨＴＧＬとを合わせたリパーゼ活性が測定できる。ＨＴＧＬ活性のみを測定する場合は、他の条件を変えずに塩化ナトリウム濃度を１Ｍにすることによリ、ＬＰＬが不活性化された条件でリパーゼ反応を進行させる。ＬＰＬ活性は総リパーゼ活性からＨＴＧＬ活性を差し引いた値となる。
【００７９】
反応終了後、反応液に有機溶媒を添加、混合してから遊離脂肪酸を含む層と未反応の基質を含む層とを分離させ、前者に集まった遊離脂肪酸の量を測定する。
【００８０】
また、標識されていない基質を用いた場合の試験方法の例を以下に示す（Clin.Chem. 30,748(1984)）。
【００８１】
基質溶液０．５ｍｌ（７．５μｍｏｌ  グリセロール・トリオレイン酸、２２．５ｍｇ  アラビアゴム、１００μｍｏｌ  トリス−塩酸（ｐＨ８．２）、５０μｍｏｌ  塩化ナトリウム、２５ｍｇ  アルブミン、１４０μｌ  ヒト血漿）を３７℃で８０分間インキュベートした後、脂肪細胞培養上清を加え、また同時に本発明のポリペプチドと被験物質を添加して、２８℃で６０分間反応させる。次に反応液に２．５ｍｌのイソプロパノール：ヘプタン：硫酸（２．５ｍｏｌ／Ｌ）＝４０：１０：２（ｖ／ｖ）を加え、１０分間混合し、室温で４０分放置後、有機層を１ｍｌ採取し、窒素乾固する。得られたものを５％  トリトン  Ｘ−１００溶液にて溶解し、市販の脂肪酸測定キット（例えばＮＥＦＡ−テストワコー（和光純薬（株）社製））等を利用して脂肪酸量を測定する。
【００８２】
ＬＰＬの活性は例えば、以下のように定義できる。単位時間（min）、単位蛋白質量（mg）あたりに産生される生成物（遊離脂肪酸）由来の放射活性(dpm)より、dpm/min/mgと定義できる。生成する脂肪酸量が多いときにはＬＰＬの活性が高く、逆に脂肪酸量が低いときにはＬＰＬの活性が低いと判断できる。
【００８３】
６．ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法
ＡＮＧＰＴＬ３及びＡＮＧＰＴＬ４はＥＬの活性を阻害する。本方法によって取得されるＥＬの活性の低下を起こす物質は、ＨＤＬコレステロール濃度の低下を抑える作用を有する物質となり、脂質代謝異常、例えば、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防剤となり得る。
【００８４】
なお、各スクリーニング方法においては、必要に応じてコントロールとして被験物質を入れない実験を同時にあるいは別に行い、被験物質を入れた場合と入れない場合の差に基づいて被験物質の作用を判断することが望ましい。
【００８５】
ＥＬの活性の低下を起こす物質は、ＡＮＧＰＴＬ３またはＡＮＧＰＴＬ４を利用した以下の（１）乃至（４）のいずれかに記載の方法によって取得することができる。
【００８６】
（１）以下の工程（ａ）乃至（ｂ）を含む、ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４及びその基質を接触させ、ＥＬの活性を測定する工程；
（ｂ）ＥＬの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。
。
【００８７】
以下、詳しく説明する。
【００８８】
（ａ）について
（i）被験物質
本発明のスクリーニング方法における被験物質は、特に限定されず、微生物の培養液や動植物の組織からの抽出物、培養細胞の培養液からの抽出物、人工的に合成された無機または有機化合物、組換えタンパク質、抗体またはその断片、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ等の核酸、それらの塩、それらの誘導体、もしくはそれらの中の複数種類の物質を混合した組成物などがいずれも用いられ得る。
【００８９】
被験物質の添加量および濃度は、適宜設定するかまたは希釈系列を作成する等により複数種の添加量を設定することができる。
【００９０】
（ii）ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４
ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４はその全長ポリペプチドの他、シグナル配列が切断されたポリペプチド、カルボキシル末端側のフィブリノーゲン様ドメインが切断された部分ポリペプチドも用いることができ、上記、「１．アンジオポエチン関連タンパク質」の項に記載した方法によって取得したものを用いることができる。
【００９１】
ＡＮＧＰＴＬ３は具体的には以下の(a)乃至(d)から選択されるアミノ酸配列を含むことからなる、ポリペプチドである。
(a)配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列；
(b)配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列；
(c)配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
(d)上記(a)乃至(c)から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＬＰＬ阻害活性及びＥＬ阻害活性を有するポリペプチドコードするアミノ酸配列。
【００９２】
ＡＮＧＰＴＬ４は具体的には以下の(e)乃至(i)から選択されるアミノ酸配列を含むことからなる、ポリペプチドである。
(e)配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列；
(f)配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列；
(g)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
(h)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(i)上記(e)乃至(h)から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＬＰＬ阻害活性及びＥＬ阻害活性を有するポリペプチドコードするアミノ酸配列。
【００９３】
ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を含む材料としては、例えば、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を産生している、哺乳動物由来の細胞株の培養上清を用いることができる。また、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を発現している細胞を直接用いても良い。ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を含む材料として、精製したＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４や組換えＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を使用することもできる。
【００９４】
(iii)ＥＬ
ＥＬは上記、「３．エンドセリアルリパーゼ（ＥＬ）」の項に記載した方法によって取得したものを用いることができる。ＥＬを含む材料としては、ＥＬを産生している、哺乳動物由来の細胞株の培養上清を用いることができる。また、ＥＬを発現している細胞を直接用いても良い。ＥＬを含む材料として、精製したＥＬや組換えＥＬを使用することもできる。ＥＬの活性は上記「３．エンドセリアルリパーゼ（ＥＬ）」の項に記載した方法によって測定することができる。
【００９５】
（iv）基質
ＥＬの基質は、上記「３．エンドセリアルリパーゼ」の項に記載したものを用いることができる。例えば、放射標識基質としてはグリセロール・トリオレイン酸、1,2−ジ[1-14C]オレオイル・ホスファチジルコリン、蛍光基質としてはC6NBD-PC[1-アシル-2-[6-(ニトロ-2,1,3-ベンズオキサジアゾール-4-イル)アミノ]カプロイルホスファチジルコリン：N-3786,モレキュラー・プローブ社製]を用いることができるが、エンドセリアルリパーゼの活性を測定できる限りにおいて、これらの基質に制限されない。
【００９６】
（v）接触
本工程における被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、及びＥＬの接触とは、被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、及びＥＬが接触している状態であれば特に制限はないが、例えば、被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、及びＥＬをそれぞれ適当な濃度で適当なバッファーに溶解して混合状態とすることを挙げることができる。
【００９７】
（ｂ）について
被験物質を添加しないコントロールに比べ、被験物質を添加した場合に、ＥＬの活性が低下している場合、被験物質はＥＬの活性を阻害する物質と判断することができる。
【００９８】
例えば、放射性ラベルした基質を用いてＥＬの活性を測定したときに、コントロールに比べて生成する遊離脂肪酸の放射活性が増加しているときにはＥＬの活性が増加していると判断でき、逆に生成する遊離脂肪酸の放射活性が低下しているときにはＥＬの活性が低下していると判断できる。
【００９９】
蛍光基質を用いたときには、コントロールに比べて蛍光強度が強ければＥＬの活性が増加していると判断でき、蛍光強度が低いときにはＥＬの活性が低下していると判断できる。
【０１００】
本方法によって取得されるＥＬの活性の低下を起こす物質は、ＨＤＬコレステロール濃度の低下を抑える作用を有する物質となり、脂質代謝改善剤となり得る。
【０１０１】
以下の（２）乃至（９）に示すスクリーニング方法によって、
(a)ＥＬの活性の低下を起こす性質とともに、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性が増加した物質として選択された被験物質は、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を増加する性質を有し、しかも、ＥＬの活性の低下を起こす性質を有する物質である。
また、
(b)また、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性が変化しなかった物質として選択された被験物質は、ＬＰＬ及び／又ＨＴＧＬの活性に影響を及ぼさず、しかも、ＥＬの活性の低下を起こす性質を有する物質である。
【０１０２】
（２）以下の工程（ａ）乃至（ｄ）を含む、ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＥＬ、及びその基質を接触させ、ＥＬの活性を測定する工程；
（ｂ）ＥＬの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。
（ｃ）（ｂ）で選択された被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、及びその基質を接触させ、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を測定する工程；
（ｄ）ＬＰＬの活性の増加を起こした被験物質又はＬＰＬの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、ＨＴＧＬの活性の増加を起こした被験物質又はＨＴＧＬの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程。
【０１０３】
以下、詳しく説明する。
本方法において、（ａ）及び（ｂ）は前記（１）と同様である。（ｃ）におけるＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの調製、基質、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性測定、は上記、「５．ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性の測定方法」の項にしたがって行うことができる。
【０１０４】
（３）以下の工程（ａ）乃至（ｄ）を含む、ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、及びその基質を接触させ、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を測定する工程；
（ｂ）ＬＰＬの活性の増加を起こした被験物質又はＬＰＬの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、ＨＴＧＬの活性の増加を起こした被験物質又はＨＴＧＬの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程；
（ｃ）（ｂ）で選択された被験物質、ＥＬ、及びその基質を接触させ、ＥＬの活性を測定する工程；
（ｄ）ＥＬの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。
【０１０５】
本方法における工程（ａ）乃至（ｄ）は、上記（１）又は（２）の記載に準じて行うことができる。
【０１０６】
（４）以下の工程（ａ）乃至（ｄ）を含む、ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、及びその基質を接触させ、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を測定する工程；
（ｂ）ＬＰＬの活性の増加を起こした被験物質又はＬＰＬの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、ＨＴＧＬの活性の増加を起こした被験物質又はＨＴＧＬの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程；
（ｃ）（ｂ）で選択された被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＥＬ、及びその基質を接触させ、ＥＬの活性を測定する工程；
（ｄ）ＥＬの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。
【０１０７】
本方法における工程（ａ）乃至（ｄ）は、上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の方法に準じて行うことができる。
【０１０８】
（５）以下の工程（ａ）乃至（ｃ）を含む、ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＥＬの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程；
（ｂ）（ａ）で選択された被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、及びその基質を接触させ、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を測定する工程；
（ｃ）ＬＰＬの活性の増加を起こした被験物質又はＬＰＬの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、ＨＴＧＬの活性の増加を起こした被験物質又はＨＴＧＬの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程。
【０１０９】
上記、工程（ａ）において用いるＥＬの活性の低下を起こした物質としては、ＥＬの活性の低下を起こすことが確認されていうる物質であればどの様な物質でも用いることができ、そのような物質としては例えば、Orlistat (Biochem. J. 368, p69-79, 2002)を挙げることができる。
【０１１０】
本方法における工程（ａ）乃至（ｃ）は、上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の方法に準じて行うことができる。
【０１１１】
（６）以下の工程（ａ）乃至（ｃ）を含む、ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＬＰＬの活性の増加を起こす物質又はＬＰＬの活性を変化させない物質、及び／又は、ＨＴＧＬの活性の増加を起こした被験物質又はＨＴＧＬの活性を変化させない被験物質を選択する工程；
（ｂ）（ａ）で選択された被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＥＬ、及びその基質を接触させ、ＥＬの活性を測定する工程；
（ｃ）ＥＬの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。
【０１１２】
本方法における工程（ａ）における、ＬＰＬの活性の増加を起こす物質又はＬＰＬの活性を変化させない物質、及び／又は、ＨＴＧＬの活性の増加を起こした被験物質又はＨＴＧＬの活性を変化させない被験物質はこのような性質が既に知られているものを任意に選択することができる。（ｂ）及び（ｃ）は、上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法に準じて行なうことができる。
【０１１３】
（７）以下の工程（ａ）乃至（ｄ）を含む、ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、ＥＬ、及びその基質を接触させ、ＥＬの活性を測定する工程；
（ｂ）ＥＬの活性が低下した被験物質を選択する工程；
（ｃ）（ｂ）で選択された被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、及びその基質を接触させ、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を測定する工程；
（ｄ）ＬＰＬの活性の増加を起こした被験物質又はＬＰＬの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、ＨＴＧＬの活性の増加を起こした被験物質又はＨＴＧＬの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程。
【０１１４】
本方法における工程（ａ）乃至（ｄ）は、上記（１）乃至（６）のいずれかに記載の方法に準じて行うことができる。
【０１１５】
（８）  以下の工程（ａ）乃至（ｄ）を含む、ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質と、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、及びその基質を接触させ、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を測定する工程：
（ｂ）ＬＰＬの活性の増加を起こした被験物質又はＬＰＬの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、ＨＴＧＬの活性の増加を起こした被験物質又はＨＴＧＬの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程。
（ｃ）（ｂ）で選択された被験物質とＥＬ、及びその基質を接触させ、ＥＬの活性を測定する工程：
（ｄ）ＥＬの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。
【０１１６】
（９）  以下の工程（ａ）乃至（ｂ）を含む、ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、その基質、ＥＬ、及びその基質を接触させ、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性、及びＥＬの活性を測定する工程：
（２）ＥＬの活性の低下を起こした被験物質であって、かつ以下の性質を有する被験物質を選択する工程；
ＬＰＬの活性の増加を起こす又はＬＰＬの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、ＨＴＧＬの活性の増加を起こした被験物質又はＨＴＧＬの活性を変化させなかった被験物質。
【０１１７】
７．高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法
以下の方法によって、被験物質の脂質代謝改善効果、より具体的には、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験することができる。そのような物質は具体的には、以下の（１）乃至（８）のいずれかに記載の方法によって取得することができる。なお、下記の（１）乃至（８）の各方法は、上記、「６．ＥＬの活性を阻害する物質のスクリーニング方法」に記載の方法に準じて行うことができる。また、各試験方法においては、必要に応じてコントロールとして被験物質を入れない実験を同時にあるいは別に行い、被験物質を入れた場合と入れない場合の差に基づいて被験物質の作用を判断することが望ましい。
【０１１８】
なお、被験物質は上記「６．ＥＬの活性を阻害する物質のスクリーニング方法」の項に記載したもののほか、上記「６．ＥＬの活性を阻害する物質のスクリーニング方法」の項のスクリーニング方法によってＥＬの活性の低下を起こす物質として取得されたものや、すでに脂質代謝改善効果、例えば高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果が知られているものも用いることができる。
【０１１９】
以下の（１）または（２）においては、被験物質を投与しない場合に比べ、血中の中性脂肪濃度が上昇せずにＨＤＬコレステロール濃度が上昇している被験物質、被験物質を投与しない場合に比べ血中の中性脂肪濃度が低下しＨＤＬコレステロール濃度が低下していない被験物質、及び、被験物質を投与しない場合に比べ血中の中性脂肪濃度が低下しＨＤＬコレステロール濃度が上昇している被験物質から選択される被験物質は脂質代謝改善効果、より具体的には、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有する物質であると判断できる。
【０１２０】
（１）  以下の（ａ）乃至（ｃ）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（ａ）非ヒト哺乳動物に以下の(i)乃至(viii)から選択されるアミノ酸配列を含むことからなる、１種又は２種以上のポリペプチド、及び被験物質を投与する工程；
(i)配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列、
(ii)配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列、
(iii)配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(iv)配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列、
(v)配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列、
(vi)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(vii)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(viii)上記(i)乃至(vii)から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列；
（ｂ）上記工程（ａ）の動物の血中の中性脂肪濃度、並びに、ＨＤＬコレステロール濃度及び／又はリン脂質濃度、を測定する工程。
【０１２１】
（ｂ）の工程において、被験物質を投与しない場合に比べ、血中の中性脂肪濃度が上昇せずにＨＤＬコレステロール濃度が上昇している被験物質、被験物質を投与しない場合に比べ血中の中性脂肪濃度が低下しＨＤＬコレステロール濃度が低下していない被験物質、及び、被験物質を投与しない場合に比べ血中の中性脂肪濃度が低下しＨＤＬコレステロール濃度が上昇している被験物質から選択される被験物質は脂質代謝改善効果、より具体的には、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有する物質であると判断できる。
【０１２２】
（２）  以下の工程（ａ）乃至（ｃ）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（ａ）非ヒト哺乳動物に以下の(i)乃至(vi)のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含むことからなる、アデノウイルスベクターを保持するアデノウイルスを感染させる工程；
(i)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列においてヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号１４０７を３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(ii)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した1つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６４５のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(iii)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６０９のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(iv)配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３を５’末端とし、ヌクレオチド番号１３９３を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(v)配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号６０１を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
(vi)上記(i)乃至(v)から選択されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）上記工程（ａ）の動物に被験物質を投与する工程；
（ｃ）上記工程（ｂ）の動物の血中の中性脂肪濃度、並びに、ＨＤＬコレステロール濃度及び／又はリン脂質濃度、を測定する工程。
【０１２３】
以下の、（３）においては、被験物質を添加しない場合に比べＥＬの活性の低下を起こす物質は、ＨＤＬコレステロール濃度の低下を抑える作用を有する物質となり、脂質代謝改善効果、より具体的には、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有する物質であると判断できる。
【０１２４】
（３）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定することを特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法。
【０１２５】
以下の（４）乃至（８）においては、
(a)ＥＬの活性の低下を起こす性質とともに、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性が増加した物質として選択された被験物質は、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を増加する性質を有し、しかも、ＥＬの活性の低下を起こす性質を有する物質である。
(b)また、本方法によってＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性が変化しなかった物質として選択された被験物質は、ＬＰＬ及び／又ＨＴＧＬの活性に影響を及ぼさず、しかも、ＥＬの活性の低下を起こす性質を有する物質である。
そして、(a)及び(b)の物質はともに、脂質代謝改善効果、より具体的には、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有する物質であると判断できる。
【０１２６】
（４）以下の（ａ）乃至（ｂ）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（ａ）被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＥＬ、及びその基質を接触させ、ＥＬの活性を測定する；
（ｂ）被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、及びその基質を接触させ、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を測定する。
【０１２７】
（５）以下の（ａ）乃至（ｂ）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（ａ）被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する；
（ｂ）被験物質、ＥＬ、及びその基質を接触させ、ＥＬの活性を測定する。
【０１２８】
（６）  ＥＬの活性の低下を起こした被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、及びその基質を接触させ、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を測定することを、特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法。
【０１２９】
（７）  ＬＰＬの活性の増加を起こす被験物質又はＬＰＬの活性を変化させない被験物質、及び／又は、ＨＴＧＬの活性の増加を起こした被験物質又はＨＴＧＬの活性を変化させない被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＥＬ、及びその基質を接触させ、ＥＬの活性を測定することを特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法。
【０１３０】
（８）  被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、その基質、ＥＬ、及びその基質を接触させ、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性、及びＥＬの活性を測定することを特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法。
【０１３１】
８．エンドセリアルリパーゼ（ＥＬ）阻害剤
「６．ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法」の項に記載された方法によって選択された物質、「７．高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法」の項によって、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有することが確認された物質、ＡＮＧＰＴＬ３、及び、ＡＮＧＰＴＬ４はＥＬ阻害剤となり得る。また、これらの物質は、ＨＤＬコレステロール濃度の低下抑制及び／又は増加作用を有し、脂質代謝改善効果、具体的には、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防用医薬組成物となり得る。
【０１３２】
上記、「６．ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法」の項に記載された方法によって選択された物質、「７．高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法」のに項よって、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有することが確認された物質を含むＥＬ阻害剤並びに高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防用医薬組成物としては、微生物の培養液や動植物の組織からの抽出物、培養細胞の培養液からの抽出物、人工的に合成された無機または有機化合物、組換えタンパク質、抗体またはその断片、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ等の核酸、それらの塩、それらの誘導体、もしくはそれらの中の複数種類の物質を混合した組成物などを挙げることができる。
【０１３３】
ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を含む、ＥＬ阻害剤及びＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を含む高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防用医薬組成物は具体的には、以下の（１）乃至（８）から選択されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドを１種又は２種以上有効成分として含む：
（１）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列；
（３）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（４）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列；
（５）配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列；
（６）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（７）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（８）上記（１）乃至（７）から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列。
【０１３４】
本発明の医薬組成物において許容される製剤に用いる物質としては好ましくは投与量や投与濃度において、医薬組成物を投与される者に対して非毒性のものが好ましい。
【０１３５】
本発明の医薬組成物は、ｐH、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、色、無菌性、安定性、溶解率、徐放率、吸収率、浸透率を変えたり、維持したり、保持したりするための製剤用の物質を含むことができる。製剤用の物質として以下のものを挙げることができるが、これらに制限されない：グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素、トリス−塩酸（Tris-Hcl）溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β−シクロデキストリンやヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノースまたはデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類やグルコース、マンノースやデキストリン等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸または過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレン・グリコールまたはポリエチレン・グリコール等の溶媒、マンニトールまたはソルビトール等の当アルコール、懸濁剤、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルビテート20やポリソルビテート80等ポリソルビテート、トリトン（triton）、トロメタミン（tromethamine）、レシチンまたはコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウムやマンニトール・ソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、希釈剤、賦形剤、及び／又は薬学上の補助剤。これらの製剤用の物質の添加量は、抗ヒト・カルシンテンイン−２抗体の重量にたいして０．０１〜１００倍、特に０．１〜１０倍添加するのが好ましい。製剤中の好適な医薬組成物の組成は当業者によって、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜決定することができる。
【０１３６】
医薬組成物中の賦形剤や担体は液体でも固体でもよい。適当な賦形剤や担体は注射用の水や生理食塩水、人工脳脊髄液や非経口投与に通常用いられている他の物質でもよい。中性の生理食塩水や血清アルブミンを含む生理食塩水を担体に用いることもできる。医薬組成物にはｐH7.0−8.5のTrisバッファーやpH4.0-5.5の酢酸バッファーやそれらにソルビトールや他の化合物を含むこともできる。本発明の医薬組成物は選択された組成で必要な純度で適当な薬剤として、凍結乾燥品あるいは液体として準備される。
【０１３７】
本発明の医薬組成物は非経口投与用に調製することもできるし、経口による消化管吸収用に調製することもできる。製剤の組成及び濃度は投与方法によって決定することができるし、本発明の医薬組成物に含まれる、「６．ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法」の項に記載された方法によって選択された物質、「７．高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法」の項によって、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有することが確認された物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４に対する親和性、即ち、「６．ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法」の項に記載された方法によって選択された物質、「７．高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法」の項によって、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有することが確認された物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４に対する解離定数（Ｋｄ値）に対し、親和性が高い（Ｋｄ値が低い）ほど、ヒトへの投与量を少なく薬効を発揮することができるので、この結果に基づいて本発明の医薬組成物の人に対する投与量を決定することもできる。投与量は、「６．ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法」の項に記載された方法によって選択された物質、「７．高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法」の項によって、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有することが確認された物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４をヒトに対して投与する際には、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇを１〜３０日間に１回投与すればよい。
【０１３８】
本発明の医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などが挙げられる。
【実施例】
【０１３９】
以下、参考例及び実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において、遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Molecular Cloning）」［Sambrook, J.,Fritsch, E.F.およびManiatis, T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊］に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【０１４０】
参考例１  モノクローナル抗体の精製
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００２年３月１３日付で、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９６３として寄託されている、抗アンジオポエチン関連タンパク質３モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ４５Ｂ１株を１０％ＦＣＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）を含むＴＩＬ培地（免疫生物研究所社製）で培養した。培養上清を回収して、０．２２μｍのフィルター(ミリポア社)にて濾過滅菌した後、ＭＡｂＴｒａｐ  ＧＩＩ（ファルマシア社）を用いて抗体を精製した。以上の工程を経て抗アンジオポエチン関連タンパク質３モノクローナル抗体ＭＡｂ４５Ｂ１を得た。この抗体は、ＩｇＧ１サブクラスの抗体であると同定されている。
【０１４１】
参考例２  ＡＮＧＰＴＬ３  ｃＤＮＡのクローニング
１）プローブの調製
ＡＮＧＰＴＬ３  ｃＤＮＡを取得するため、下記のヌクレオチド配列：
5'- tcctctagtt atttcctcca g -3'（配列表の配列番号２０）；および
5'- tggtttgcca gcgatagatc -3'（配列表の配列番号２１）
を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
【０１４２】
次に、ヒトゲノムＤＮＡ（ベーリンガーマンハイム社製、２００ｍｇ／ｍｌ）１μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（ｒＴａｑ、宝酒造（株）社製、５単位／μｌ）１μｌ、１０×ＰＣＲ用緩衝液（宝酒造（株）社製）１０μｌ、ｄＮＴＰ混合液（各２．５ｍＭ）１６μｌ、２０μＭのプライマー各２μｌ、および滅菌水６８μｌを混合した。この反応液を、９４℃で５分間加熱した後、引き続き９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の温度サイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温してから、４℃に保存した。この反応液を２％  アガロースゲルにて電気泳動した後、増幅されたＤＮＡバンド部分のゲルを切り出して精製した。このようにして得られたＤＮＡをＤＮＡ標識キット（BcaBestラベリングキット、宝酒造（株）社製）を用いて３２Ｐで標識したものを下記２）においてプローブとして用いた。
【０１４３】
２）ｃＤＮＡライブラリーの１次スクリーニング
市販のヒト肝臓由来ｃＤＮＡライブラリー（Human Liver 5'-STRETCH cDNA Library、クロンテック社製）のうち、１×１０６プラークのＤＮＡをナイロンメンブレンに固定した。すなわち、ｃＤＮＡライブラリーを感染させた大腸菌を直径９ｃｍの培養シャーレに作製した寒天培地プレート２０枚に、１枚あたり５×１０４個のプラークが形成されるように分散させ、３７℃で８時間培養した。このプラーク形成された寒天培地上に、シャーレ内径に合わせた円形のナイロンメンブレン（アマシャム・ファルマシア社製、ハイボンドＮ＋）をのせて、４℃にて５分間放置することによりプラークを移しとった。１８Ｇの注射針を用いてメンブレンの３ヶ所を寒天培地まで貫通することにより位置合わせ用の目印をつけた後、メンブレンを剥がしてアルカリ溶液（１．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．５Ｍ  水酸化ナトリウム）に２分間、次いで中和溶液（１．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．５Ｍ  トリス−塩酸（ｐＨ８．０））に５分間、さらに２×ＳＳＣ、０．２Ｍ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）を含む溶液に３０秒間浸した後、室温で完全に風乾させた。次いで、クロスリンク用紫外線照射装置（スペクトロリンカーＸＬ−１０００、トミー精工（株）社製）で紫外線を照射（１２００Ｊ／ｃｍ２）してＤＮＡを固定した。
【０１４４】
このようにして調製されたメンブレンを、上記１）で得られた標識プローブを含むハイブリダイゼーション溶液（ExpressHyb solution、クロンテック社製）中で６５℃で一晩インキュベーションした。その後、メンブレンを２×ＳＳＣ、０．０５％  ＳＤＳを含む溶液で１５分ずつ３回、室温で洗浄してから、さらに０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳを含む溶液で３０分ずつ３回、５０℃で洗浄した後、オートラジオグラフィーを行った。
【０１４５】
その結果判明した陽性のシグナルの位置にあったプラークを、上記寒天培地プレートから培地ごと採取し、それぞれ１００μｌのＳＭ緩衝液（０．１Ｍ  塩化ナトリウム、８ｍＭ  硫酸マグネシウム、５０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．０１％  ゼラチン）中に入れてよく懸濁してから４℃で２時間放置した後、１２０００×ｇで５分間遠心分離して上清を回収した。
【０１４６】
このようにして得られた１次陽性ファージ液を再び大腸菌に感染させたものを、直径９ｃｍの培養用シャーレに作製した寒天培地上に、シャーレ１枚あたり５００個のプラークが形成されるように培養し、上記の手法を繰り返すことにより２次スクリーニングを行った。得られた２次陽性クローンファージを大腸菌株ＢＭ２５．８（クロンテック社製）に感染させたものを寒天培地上で３７℃で培養して、ファージミドを含む大腸菌コロニーを形成させた。コロニーを単離し、液体培地で少量培養してファージミドを抽出し、制限酵素消化による挿入断片の解析を行った結果、１．６ｋｂｐの挿入断片を有する、クローン＃ｈ５−１を有する大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１  ＳＡＮＫ  ７２２９９を単離した。なお、このファージミド＃ｈ５−１を保持する形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１  ＳＡＮＫ  ７２２９９は、１９９９年１１月１９日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現・独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９４１が付されている。
【０１４７】
３）  ｐＭＥｈ５５−１の取得
上記２）で得られた＃ｈ５−１ファージミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って、ｃＤＮＡを含む約１．６ｋｂの断片を単離、精製した。一方、高発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ（Hara, T. et al.(1992) EMBO.J. 11, 1875-、横田崇、新井賢一編集、バイオマニュアルシリーズ３、遺伝子クローニング実験法、羊土社、p18-20）を同様にＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、末端を脱リン酸化した後、上記ｃＤＮＡ断片とＤＮＡライゲーションキット（バージョン２、宝酒造（株）社製）を用いて連結した。このＤＮＡで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換株についてそれが保有するプラスミドＤＮＡの制限酵素による解析を行い、１．６ｋｂのＤＮＡ断片を有する株を選択してｐＭＥｈ５５−１と命名した。
【０１４８】
参考例３  アンジオポエチン関連タンパク質３の調製
１）アンジオポエチン関連タンパク質３生産ＣＨＯ細胞株の作製
参考例２によって取得されているＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を含むプラスミドｐＭＥｈ５５−１とｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ）を１０％ＦＣＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）−ＭＥＭα（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）−１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン-１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）培地でジヒドロ葉酸還元酵素欠損ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ）に共導入し、核酸除去培地において定常株を取得した。次に、本定常株をメトトレキセート０．０８μＭ濃度で生育可能な耐性株を取得し、遺伝子重複による発現量の増加が確認された株を取得した。以後、１．２８、３０、６０μＭのメトトレキセート入り核酸除去ＭＥＭα培地で生育可能な株を取得していき、最終的にコンフルエントな無血清培養の細胞培養用フラスコ上で、５乃至１０ｍｇ／ｌ／３日の生産能を有するＡＮＧＰＴＬ３生産ＣＨＯ細胞株を取得した。
【０１４９】
このように作製したＡＮＧＰＴＬ３生産ＣＨＯ細胞株をコンフルエントまで培養後、無血清ＭＥＭα（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）培地に交換し、３日間培養して無血清培養上清を得た。
【０１５０】
２）脱塩、小分子除去
１）で得られた培養上清をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）１.６リットルのゲルに対して６００ｍｌの割合で２０ｍｌ／ｍｉｎで１０回に分けてチャージして、脱塩と小分子の除去を行い、次いでＦＰＬＣ（Ｂｉｏｐｉｌｏｔ ｓｙｓｔｅｍ、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーで分画した。
【０１５１】
３）分画ＳｔｅｐＩ
カラム：Ｑｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）をＸＫ５０（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に１００ｍｌ充填した。
溶離緩衝液：
Ａ）２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）−０.０１％  ＮａＮ3（ＳＩＧＭＡ社製）−０.００５％  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０.００５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）
Ｂ）２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７.５）−０.０１％ ＮａＮ3（ＳＩＧＭＡ社製）−０.００５％  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０.００５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）
流速：１０ｍｌ／ｍｉｎ
フラクション溶液：１０ml／ｔｕｂｅ
温度：４℃
溶出条件：溶離液Ａ→  溶離液Ｂ（直線濃度勾配、６０分間）
得られたフラクションについて、各々０.３乃至０．４５Ｍ  ＮａＣｌ濃度で溶出されてくる画分を回収した後、一つの溶液にまとめた。まとめた溶液をサンプルとして、以下の条件で、ＦＰＬＣ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて、群特異的アフィニティークロマトグラフィーを以下の条件で実施した。
【０１５２】
４）分画ＳｔｅｐＩＩ
カラム：Ａｆｆｉ  Ｇｅｌ  Ｂｌｕｅ（ＢｉｏＲａｄ）をＫＸ１６（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に１０ｍｌ充填した。
溶離緩衝液：
Ｃ）２０  mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）−０.０１％ＮａＮ3（ＳＩＧＭＡ社製）−０.００５％  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）
Ｄ）２０  mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）−０.０１％ＮａＮ3（ＳＩＧＭＡ社製）−０.００５％  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）
流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ
温度：４℃
サンプルをアプライ後、Ｃ）液を６０ｍｌを流す。
溶出条件：Ｄ）液を１００ｍｌ流し、一つの溶液として回収した。回収した溶液を等量（１００ｍｌ）のＡ）液と混濁し、作製した２００ｍｌの溶液をサンプルとして以下の条件で、ＦＰＬＣ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いた群特異的アフィニティークロマトグラフィーを以下の条件で実施した。
【０１５３】
５）分画ＳｔｅｐＩＩＩ
カラム：Ｌｅｎｔｉｌ  ｌｅｃｔｉｎ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅTM（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）をＫＸ１６（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に１０ｍｌ充填した。
溶離緩衝液：
Ｃ）２０  mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）−０.０１％ＮａＮ3（ＳＩＧＭＡ社製）−０.００５％  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製））
Ｆ）２０  mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−０．５Ｍ  ＮａＣｌ−０．３M  Ｍｅｔｈｙｌｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ｐＨ７．５）−０．０１％  ＮａＮ3（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製））
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
温度：４℃
サンプルをアプライ後、Ｃ）液を５０ｍｌ流す。
溶出条件：Ｆ）液を５０ｍｌ流し、一つの溶液として回収した。
【０１５４】
６）透析
回収した液をＤｉａｌｙｓｉｓ  ｔｕｂｉｎｇ−１−７／８  ｉｎ  Ｄｕａｍｅｔｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）に移し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  ＰＢＳ（−）（日水製薬社製）、０．０１％  ＮａＮ3（ＳＩＧＭＡ社製）−０．１％  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）溶液２リットルで一晩、４℃で透析した。
【０１５５】
７）ＡＮＧＰＴＬ３の確認
透析後、回収したＡＮＧＰＴＬ３溶液の濃度は、ＤＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社）で測定した。またＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタン解析を行った。なお、ＡＮＧＰＴＬ３溶液中のエンドトキシン濃度はエンドトキシン測定キット（生化学工業）により測定し、ＡＮＧＰＴＬ３  １ｍｇあたり０．２μｇ以下であることを確認した。
【０１５６】
参考例４  ＭＡｂ４５Ｂ１を用いたＡＮＧＰＴＬ３定量系の確立
１）ウサギ抗ＡＮＧＰＴＬ３ポリクローナル抗体の作製
アジュバントとしてフロインド完全アジュバント（ディフコ社）０．５ｍｌを参考例３で精製した０．５ｍｌ(１００μｇ相当)のＡＮＧＰＴＬ３に加え、連結針のついた注射筒内でエマルジョンを形成させた後、雄ウサギの皮下に接種した。２回目以降の免疫ではアジュバントとしてフロインド不完全アジュバント（ディフコ社）を用いた。免疫は、約２週間おきに８回行った。接種後、経時的に部分採血し、抗体価の上昇を調べた。８回目の免疫後７日後に麻酔下で全採血し、５３．５ｍｌの免疫血清を得た。該血清２０ｍｌを、ＭＡｂＴｒａｐ  ＧIIキットを用いて精製し、１１５ｍｌの１．６４ｍｇ／ｍｌ  ＩｇＧが得られた。
【０１５７】
以上の工程を経て、ウサギ抗ＡＮＧＰＴＬ３ポリクローナル抗体（以下「No.1抗体」という）を得た。
【０１５８】
２）  ＨＲＰ標識Ｆａｂ´化ポリクローナル抗体の作成
ａ）Ｆ（ａｂ´）2の調製
１．６４ｍｇ／ｍｌの濃度の  Ｎｏ．１抗体３０ｍｌを０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５  ０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む）で透析した。透析後にＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０（アミコン社）を用いて濃縮し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５  ０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む）でＮｏ．１抗体の濃度を６ｍｇ／ｍｌに合わせた。
【０１５９】
このＮｏ．１抗体溶液０．５ｍｌに０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む）で１０ｍｇ／ｍｌに溶解したブタ胃・ペプシン（シグマ社）２０μｌ(０．２ｍｇ)を添加し、３７℃で６時間反応させた。反応液を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した後、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ  ＡｃＡ ４４（インビトロジェン社）カラム（１．５ｃｍ×４５ｃｍ）−０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、流速０．３５ｍｌ／ｍｉｎ、１画分０．５乃至１．０ｍｌでゲル濾過した。Ｎｏ．１抗体Ｆ（ａｂ´）2画分を２８０ｎｍの吸光度により確認し、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０（アミコン社）を用いて濃縮した。
【０１６０】
これらの操作を繰り返し、２．５ｍｇ／ｍｌの濃度の Ｎｏ．１ Ｆ（ａｂ'）2抗体溶液１１．２ｍｌが得られた。
【０１６１】
ｂ）Ｆａｂ'の調製
２．５ｍｇ／ｍｌの濃度のＮｏ．１  Ｆ(ａｂ´)2抗体１１．２ｍｌを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６．０)で透析した。透析後にＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０(アミコン社)を用いて濃縮し、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６．０)で濃度を５ｍｇ／ｍｌに合わせた。
【０１６２】
このＮｏ．１  Ｆ(ａｂ´)2抗体溶液０．４５ｍｌに０．１Ｍ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６．０)５０μｌを加え、３７℃、９０分間反応させた。反応液をＵｌｔｒｏｇｅｌ  ＡｃＡ  ４４(インビトロジェン社)カラム(１．５×４５ｃｍ)−０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６．０，５ｍＭ ＥＤＴＡを含む)、流速０．３５ｍｌ／ｍｉｎ、１画分０．５乃至１．０ｍｌでゲル濾過した。Ｎｏ．１  Ｆａｂ´抗体の存在を２８０ｎｍの吸光度により確認した後、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０(アミコン社)を用いて濃縮した。
【０１６３】
これらの操作を繰り返し、１．４ｍｇ／ｍｌの濃度のＮｏ．１  Ｆａｂ´抗体１１．４ｍｌが得られた。
【０１６４】
ｃ）マレイミドペルオキシダーゼの調製
西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ(シグマ社)３６．８ｍｇを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７．０)に６．６６ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した。また、Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅに  Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−(Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ)  ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−１ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ(シグマ社)を７０ｍＭの濃度になるように溶解した。
【０１６５】
この西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ溶液３００μｌに７０ｍＭの濃度のＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−(Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ)  ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−１ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ溶液を３０μｌ加え、３０℃、３０分間反応させた。反応液から沈殿を遠心除去した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５のカラム(１×３０ｃｍ)−０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６．０)，流速０．４乃至０．６ｍｌ／ｍｉｎ，１画分０．５乃至１．０ｍｌでゲル濾過した。ペルオキシダーゼを含む画分を４０３ｎｍの吸光度により確認し、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０（アミコン社）を用いて濃縮した。
【０１６６】
これらの操作を繰り返し、６．５ｍｇ／ｍｌの濃度のマレイミドペルオキシダーゼ溶液が５．２ｍｌ得られた。
【０１６７】
ｄ）マレイミド化ペルオキシダーゼとＦａｂ´の反応
１．４ｍｇ／ｍｌの濃度のＮｏ．１  Ｆａｂ´抗体溶液０．７１ｍｌに６．５ｍｇ／ｍｌの濃度のマレイミド化ペルオキシダーゼ溶液０．２８ｍｌを添加し、４℃、２０時間反応させた。反応後、５０ｍＭ  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅを１０μｌ添加した。Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ４４(インビトロジェン社)カラム(１．５×４５乃至１００ｃｍ)−０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６．５)、流速０．３５ｍｌ／ｍｉｎ、１画分１．０ｍｌでゲル濾過した。各画分の２８０ｎｍ及び４０３ｎｍにおける吸光度を測定し、さらに各画分のペルオキシダーゼ活性を測定した。各画分に０．２％(ｗ／ｖ) ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ(シグマ社)を終濃度０．００２％になるように、１０％(ｗ／ｖ)ウシ血清アルブミンを終濃度０．１％になるようにそれぞれ添加した後、４℃で保存した。ペルオキシダーゼ標識Ｆａｂ´の濃度はペルオキシダーゼ活性あるいは４０３ｎｍの吸光度から計算した。
【０１６８】
これらの操作を繰り返し、０．７８ｍｇ／ｍｌの濃度のＨＲＰ標識化Ｎｏ．１  Ｆａｂ´抗体８．６ｍｌを得た。
【０１６９】
３）ＡＮＧＰＴＬ３定量系の作製
参考例１で培養上清より得られた精製ＭＡｂ４５Ｂ１を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で２μｇ／ｍｌの濃度になるように希釈し、これを１００μｌずつ９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート(マキシソープ；ヌンク社製)の各ウェルに分注し、４℃で一晩保温して抗体をプレートのウェル底面に吸着させた。各ウェルをＰＢＳで３回洗浄した後、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳを２００μｌ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩保温した。次に０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで各ウェルを２回洗浄し、これに、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで段階希釈した精製ＡＮＧＰＴＬ３を１００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩保温した。０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで各ウェルを７回洗浄し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで０．５μｇ／ｍｌに希釈したＨＲＰ標識化Ｎｏ．１  Ｆａｂ´抗体を１００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で３０分間反応させた。０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで各ウェルを９回洗浄し、ＴＭＢパーオキシダーゼ基質液（バイオラッド社  ＴＭＢパーオキシダーゼキット）を１００μｌ／ウェルずつ添加し、室温で３０分間保温した後、１Ｎ硫酸を１００μｌ／ウェルずつ分注し、ペルオキシダーゼ反応を停止させてから、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）で４５０ｎｍの吸収を測定した。
【０１７０】
その結果、精製ＡＮＧＰＴＬ３濃度と測定結果が正比例したことから、このＥＬＩＳＡ系によりＡＮＧＰＴＬ３を直線性良く定量可能であることが判明した（図１）。
【０１７１】
参考例５  ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓの精製
１）ＫｈＡＰ５  ＣＣ／Ｈｉｓ発現プラスミドの構築
ANGPTL3のシグナルペプチドを含むアミノ酸配列中のＮ末端から２０番目のアミノ酸残基（アスパラギン酸）をコードするコドンの直後にヒスチジンタグが挿入され、かつＮ末端から２０８番目以降のアミノ酸配列を欠失したポリペプチド（「ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓ」という。）（配列表の配列番号８）は、以下の方法に従って調製した。
【０１７２】
ｉ）コザック配列の挿入
ＡＮＧＰＴＬ３のｃＤＮＡに、コザックのコンセンサス配列が付加されたｃＤＮＡクローンを得るため、下記のヌクレオチド配列：
5'- gccaccatggtcacaattaagctccttctttttattg -3'（配列表の配列番号９）
および、制限酵素ＸｈｏＩの特異的認識配列が付加された下記のヌクレオチド配列：
5'- tctagagcctcgttcattcaaagctttctgaatctg -3'（配列表の配列番号１０）
からなるオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
【０１７３】
次に、参考例１に記載の方法で得られた組換えファージミドｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１  約０．４μｇ／ｍｌを鋳型とし、上記プライマー（それぞれ０．４ｍＭ）、Ｔｂｒ  ＥＸＴ  ＤＮＡポリメラーゼ（フィンザイム社製）、１×ＰＣＲ反応緩衝液（ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液を１０分の１量）、２ｍＭの塩化マグネシウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰＣＲを行った。ＰＣＲは上記サンプルを９４℃で３分間加熱した後に、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分の温度サイクル３０回、最後に６８℃で２分間保温の条件で行なった。
【０１７４】
ＰＣＲの結果得られた増幅断片（約１．４ｋｂｐ）を、ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）に添付されたプラスミドベクターｐＣＲ２．１へ挿入し、挿入断片を含むプラスミドクローン（ｐＣＲ／ＫｈＡＰ５）を単離した。ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００、アプライドバイオシステムズ社製）で挿入断片の配列を解析して、ＰＣＲの際に該挿入断片内に変異が生じていないことを確認した。
【０１７５】
次に、ｐＣＲ／ＫｈＡＰ５を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化して、生成した断片のうち、ヒト・ＡＮＧＰＴＬ３をコードするｃＤＮＡを含む断片を、予め制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化した哺乳動物細胞発現ベクターｐＭＥ１８Ｓに挿入することにより、組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５を得た。
【０１７６】
ｉｉ）ヒスチジンタグの挿入
ＡＮＧＰＴＬ３の前駆体のアミノ酸配列のアミノ末端から２０番目（成熟体のアミノ酸配列の4番目）に相当するアミノ酸（アスパラギン酸）のカルボキシル末端側に、ヒスチジンタグ（配列表の配列番号８のアミノ酸番号２２乃至２７に示されるアミノ酸配列）が挿入されるように、組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５を改変した。
【０１７７】
まず、一部が相補的な、下記のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
5'- gatccgcatcatcaccatcaccat -3'（配列表の配列番号１１）及び
5'- gatcatggtgatggtgatgatgcg -3'（配列表の配列番号１２）
を合成し、さらに合成ＤＮＡ末端リン酸化試薬フォスファリンク（アプライドバイオシステム社製）を用いて５’末端をリン酸化した。これらをアニーリングさせたものを、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５を制限酵素ＢｃｌＩで完全に消化して得られた約４．２ｋｂの断片に挿入した。その結果として、上記のアニーリングさせたオリゴヌクレオチドが３単位連結したＤＮＡが、ＢｃｌＩ切断部位に挿入されたプラスミドクローンが得られた。次に、このクローンをＢｃｌＩで消化したものに、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５をＢｃｌＩで完全に消化して得られる約１８０ｂｐの断片を挿入することにより、プラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓ＋１６を得た。
【０１７８】
プラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓ＋１６には、ヒスチジンタグをコードする配列が３単位含まれており、その中の３’末端側の２単位は、目的とは逆の方向に連結された余分な配列である。この配列を省いた断片をＰＣＲにより増幅するために、センス／アンチセンス兼用プライマーとして、以下のヌクレオチド配列：
5'-gaattgatcagcatcatcaccatcaccacgatc-3'（配列表の配列番号１３）
からなるオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。次いで、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓ＋１６（０．４μｇ／ｍｌ）を鋳型とし、上記プライマー（０．４ｍＭ）、Ｔｂｒ  ＥＸＴ  ＤＮＡポリメラーゼ（フィンザイム社製）、１×ＰＣＲ反応緩衝液（ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液を１０分の１量）、２ｍＭの塩化マグネシウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、まず９４℃で２分加熱した後に、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒の温度サイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で７分間保温するという条件で行なった。
【０１７９】
ＰＣＲの結果得られた増幅断片（２６８ｂｐ）をＢｃｌＩで消化した後、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５をＢｃｌＩで完全に切断して得られた約４．２ｋｂの断片に挿入した。以上の操作により、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５に挿入されているｃＤＮＡ配列中に存在する２ヶ所のＢｃｌＩ切断部位のうち、上流側の切断部位に、ヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列が挿入されたＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓを得た。
【０１８０】
プラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓを制限酵素ＳｐｅＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで切断末端を平滑化した後に、ＤＮＡリガーゼ反応を行って再び両端を連結することにより、ＡＮＧＰＴＬ３のシグナルペプチドを含むアミノ酸配列中のアミノ末端から２０７番目のアミノ酸残基（セリン）をコードするコドン（atc）の後に終止コドン（tag）が挿入され、またアミノ末端から２０番目のアミノ酸残基（アスパラギン酸）をコードするコドンの直後にヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列が挿入されたＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５  ＣＣ／Ｈｉｓを構築した。
【０１８１】
２）ＣＯＳ−１細胞での発現
直径１５０ｍｍ組織培養用シャーレ（コーニング社製）に、ＣＯＳ−１細胞（０．５×１０6細胞）を懸濁した１０％  ウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という。ギブコ社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という。ギブコ社製）３０ｍｌを入れて、３７℃、５％炭酸ガス下で３日間培養した。その後、培地を除去してから、トランスフェクション試薬（リポフェクタミン２０００  １８０μｌとＯＰＴＩＭＥＭ−Ｉ溶液（いずれもギブコ社製）  ３ｍｌとを混濁したもの）に３６μｇのｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５  ＣＣ／Ｈｉｓを加えて混ぜたものをＣＯＳ−１細胞に加えることにより、トランスフェクションを行った。トランスフェクション後、３７℃、５％炭酸ガス下で３日間静置した。以上の操作をシャーレ１３０枚分のＣＯＳ−１細胞に対して実施し、総計約４．４Ｌの培養上清を集めた。この培養上清を、０．２２μｍセルロースアセテート製ボトルトップフィルター（コーニング社製）を用いて吸引ろ過して、ろ液を回収した。
【０１８２】
３）発現量、濃度の確認
上記２）で回収されたろ液の一部と、精製済のＡＮＧＰＴＬ３（国際特許出願国際公開番号ＷＯ０１／４２４９９号公報）についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、ゲル内のタンパク質をニトロセルロース膜（バイオラッド社製）にウェット法で転写した（０．２Ａ、９０分、４℃）。このニトロセルロース膜を、５％  スキムミルク（雪印乳業（株）社製）を含むＰＢＳ−０．０５％  ツイーン２０溶液（以下「ＰＢＳ−Ｔ」という）に一晩浸してブロッキングを行った。次いで、ニトロセルロース膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、ウエスタンブロットを行った。一次抗体には国際特許出願国際公開番号ＷＯ０１／４２４９９号公報に記載の５５−Ｎ１抗体を、二次抗体には西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された抗ウサギポリクローナルＩｇＧ抗体（アマシャム社製）を使用した。５５−Ｎ１抗体が特異的に結合したバンドの検出には、ＥＣＬ試薬（アマシャム社製）を用いた。その結果、上記３）で得られたろ液中には約１．０〜１．５ｍｇ／リットル（全ろ液中に４．４〜６．６ｍｇ）のＫｈＡＰ５  ＣＣ／Ｈｉｓが含まれていることが明らかになった。
【０１８３】
４）ＫｈＡＰ５  ＣＣ／Ｈｉｓの精製
上記３）で得られたろ液の全量について、限外ろ過装置（ＴＩＦＦラボスケールおよび３０ＫＤａ孔径の限外ろ過膜（いずれもミリポア社製））を用いて、４４０ｍｌとなるまで限外濃縮した。さらに、得られた試料に、限外ろ過装置中で２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．１％  アジ化ナトリウムおよび０．０５％  プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）を含む緩衝液（ｐＨ７．４）４リットルを徐々に加えながら限外ろ過を続行することにより、溶媒が該緩衝液に置換された試料を得た（液量６００ｍｌ）。
【０１８４】
一方、キレーティングカラム（ＨｉＴｒａｐキレーティング  ５ｍｌカラム。アマシャム社製）に０．１Ｍの硫酸ニッケル  ５ｍｌを約５ｍｌ／分の流速で流すことにより、担体にニッケルイオンを結合させた。このカラムに超純水を流して洗浄した後、ＨＰＬＣ送液システム（アマシャム社製）に装着して、以下に記載する条件で試料のアフィニティー精製を行った。
【０１８５】
溶媒：
Ａ液：  ２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．５Ｍ  塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．１％  アジ化ナトリウム、０．０５％  プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）
Ｂ液：  ２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．５Ｍ  イミダゾール（ｐＨ７．４）、０．１％  アジ化ナトリウム、０．０５％  プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）
流速：  ５ｍｌ／分
精製手順：  試料６００ｍｌをカラムに流した後、Ａ液  ８０％、Ｂ液  ２０％の緩衝液（０．１Ｍ  イミダゾール濃度に相当）５０ｍｌを流して非吸着物を洗浄除去した。その後、Ｂ液  ５０ｍｌをカラムに流し、ヒスチジンタグを有するポリペプチドを溶出させ、溶出液を回収した。この溶出液にＡ液２００ｍｌを加えて、イミダゾール濃度０．１Ｍの溶液としたものを、第２回のアフィニティー精製用試料とした。
【０１８６】
小スケールのキレーティングカラム（ＨｉＴｒａｐキレーティング  １ｍｌカラム。アマシャム社製）に０．１Ｍの硫酸ニッケル  ５ｍｌを約１ｍｌ／分の流速で流すことにより、担体にニッケルイオンを結合させ、次いで超純水を流して洗浄した後、カラムをＨＰＬＣ送液システムに装着し、試料を流してから、カラムをＨＰＬＣから取り外した。次いで、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．１Ｍ  イミダゾール、ｐＨ７．４の緩衝液を、１ｍｌ／分の流速で１ｍｌカラムに手動で流して、非吸着物を洗浄除去した。その後、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．３Ｍ  イミダゾール、ｐＨ７．４の緩衝液を同様に１ｍｌ／分の流速で流し、溶出液を１ｍｌずつ、５分画（計５ｍｌ）回収した。
【０１８７】
回収した溶出液をそれぞれ透析チューブ（ギブコ社製）に入れて、５００ｍＬのＰＢＳ（ギブコ社製）に対して透析を行った。透析膜外液であるＰＢＳは、３回交換した。最後の透析膜外液を一部採取して、ＬＰＬ活性評価の際の陰性対照試料とした。
【０１８８】
回収した試料中のタンパク質濃度を、プロテインアッセイ（ＤＣプロテインアッセイキット（バイオラッド社製）を使用）やＳＤＳ−ＰＡＧＥ等で見積もった結果、計１．８ｍｇのＫｈＡＰ５  ＣＣ／Ｈｉｓが得られたことが判明した。そして、下記のＬＰＬ活性評価には、第２回のアフィニティー精製により得られた第２および第３の分画をまとめたものを用いた。
【０１８９】
参考例６  ＡＮＧＰＴＬ４の精製
配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるヒトANGPTL4タンパク質のアミノ酸番号26乃至143のアミノ酸配列のN末およびC末にプラスミドベクターpAPtag-5（N末側に免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドを、C末側にヒスチジンタグをコードする配列を含む。ＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒ社製）由来のアミノ配列を含むタンパク質（以下、「ANGPTL4-CC」という。）を以下に記載する方法に従って調製した。なおヒスチジンタグのアミノ酸配列は配列表の配列番号１５のアミノ酸番号180乃至185のアミノ酸配列に相当する。
【０１９０】
また、ANGPTL4-CCはシグナル配列を有しており、シグナル配列予想プログラム
SignalP ver2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/）を用いた場合では、配列番号１５のアミノ酸番号20番と21番の間で切断されることが予測されている。
【０１９１】
ｉ）ＤＮＡの調製
まず、ＰＣＲ用プライマーとして、下記のヌクレオチド配列：
5'- cccaagcttttggacccgtgcagtccaag-3'（ANGPTL4-CC用センスプライマー：配列表の配列番号１６）；および
5'- ccgctcgagctggctttgcagatgctg-3'（ANGPTL4-CC用アンチセンスプライマー：配列表の配列番号１７）を合成した。
次に、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍより購入したｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ（ｃｌｏｎｅ  ４１４９０３９）を鋳型とし、センスプライマーおよびアンチセンスプライマー（それぞれ０．２μＭ）、Ｔｂｒ  ＥＸＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｔｂｒ  ＥＸＴ  ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液を１０倍希釈）、２ｍＭの塩化マグネシウムおよび各０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、上記サンプルを９４℃で３分加熱した後に、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の温度サイクルを３０回繰り返した後、最後に７２℃で７分間の条件で行なった。
【０１９２】
ＰＣＲで増幅した約３７０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化した。プラスミドベクターpAPtag-5をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化して、ウシ小腸アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）社製）を用いて切断末端の脱リン酸化処理した後、5.1kbのDNA断片を回収し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化したＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を挿入し、挿入断片を含むプラスミドクローンを単離した。このプラスミドクローンをpAPtag-5-ANGPTL4-CCと命名した。
【０１９３】
ｉｉ）ＣＯＳ−１細胞での発現
直径１５０ｍｍ組織培養用シャーレ（コーニング社製）に、ＣＯＳ−１細胞（０．５×１０6細胞）を懸濁した１０％  ウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という。ギブコ社製）および100 units/mlペニシリン-100 μg/mlストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という。ギブコ社製）３０ｍｌを入れて、３７℃、５％炭酸ガス下で３日間培養した。その後、培地を無血清の100 units/mlペニシリン-100 ug/mlストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ30mlに交換した。ＣＯＳ−１細胞にトランスフェクションするため、Ａ液（リポフェクトアミン２０００  ６０μｌとＯＰＴＩＭＥＭ−Ｉ溶液（いずれもギブコ社製）  ２ｍｌとを混濁したもの）とＢ液（24μｇのpAPtag-5-ANGPTL4-CCと2mlの無血清の100 units/mlペニシリンー100 μg/mlストレプトマイシンを含むＤＭＥＭとを混合したもの）を作製した。A液とＢ液を混濁し、20分間室温で静置した後、シャーレに加えることにより、トランスフェクションを行った。トランスフェクション後、３７℃、５％炭酸ガス下で３日間静置した。以上の操作をシャーレ６０枚分のＣＯＳ−１細胞に対して実施し、総計約２Ｌの培養上清を集めた。この培養上清を、０．２２μｍセルロースアセテート製ボトルトップフィルター（コーニング社製）を用いて吸引ろ過して、ろ液を回収した。
【０１９４】
ｉｉｉ）発現量、濃度の確認
上記ｉｉ）で回収されたろ液の一部と、濃度推定のスタンダードとしてヒスチジンタグ付きアンジオポエチン２タンパク質（Genzyme/Techne社製）を、マルチゲル4/20（第一化学薬品社）でＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、ゲル内のタンパク質をニトロセルロース膜（バイオラッド社製）にウェット法で転写した（０．２Ａ、2時間、４℃）。このニトロセルロース膜を、５％  スキムミルク（雪印乳業（株）社製）を含むＰＢＳ−０．０５％  ツイーン２０溶液（以下「ＰＢＳ−Ｔ」という）に一晩浸してブロッキングを行った。次いで、ニトロセルロース膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、ウエスタンブロットを行った。一次抗体には、抗ヒスチジンタグ抗体（アマシャム社製）を、二次抗体には西洋ワサビペルオキシダーゼ標識されたウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャム社製）を使用した。抗ヒスチジンタグ抗体が特異的に結合したバンドの検出には、ＥＣＬ試薬（アマシャム社製）を用いた。その結果、上記ii）で得られたろ液中には約１ｍｇ／Ｌ（全ろ液中に約２ｍｇ）のANGPTL4-CCが含まれていることが明らかになった。
【０１９５】
iv）ANGPTL4-CCの精製
上記ｉｉ）で得られたろ液の全量について、限外ろ過装置（ＴＩＦＦラボスケールおよび３０ＫＤａ孔径の限外ろ過膜（いずれもミリポア社製））を用いて、４４０ｍｌとなるまで限外濃縮した。さらに、得られた試料に、限外ろ過装置中で２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．１％  アジ化ナトリウムおよび０．０５％  プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）を含む緩衝液（ｐＨ７．４）４リットルを徐々に加えながら限外ろ過を続行することにより、溶媒が該緩衝液に置換された試料を得た（液量６００ｍｌ）。
【０１９６】
一方、キレーティングカラム（ＨｉＴｒａｐキレーティング  ５ｍｌカラム。アマシャム社製）に０．１Ｍの硫酸ニッケル  ５ｍｌを約５ｍｌ／分の流速で流すことにより、担体にニッケルイオンを結合させた。このカラムに超純水を流して洗浄した後、ＨＰＬＣ送液システム（アマシャム社製）に装着して、以下に記載する条件で試料のアフィニティー精製を行った。
【０１９７】
溶媒：
Ａ液：  ２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．５Ｍ  塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．１％  アジ化ナトリウム、０．０５％  プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）
Ｂ液：  ２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．５Ｍ  イミダゾール（ｐＨ７．４）、０．１％  アジ化ナトリウム、０．０５％  プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）
流速：  ５ｍｌ／分
精製手順：  試料６００ｍｌをカラムに流した後、Ａ液  ８０％、Ｂ液  ２０％の緩衝液（０．１Ｍ  イミダゾール濃度に相当）５０ｍｌを流して非吸着物を洗浄除去した。その後、Ｂ液  ５０ｍｌをカラムに流し、ヒスチジンタグを有するポリペプチドを溶出させ、溶出液を回収した。この溶出液にＡ液２００ｍｌを加えて、イミダゾール濃度０．１Ｍの溶液としたものを、第２回のアフィニティー精製用試料とした。
【０１９８】
小スケールのキレーティングカラム（ＨｉＴｒａｐキレーティング  １ｍｌカラム。アマシャム社製）に０．１Ｍの硫酸ニッケル  ５ｍｌを約１ｍｌ／分の流速で流すことにより、担体にニッケルイオンを結合させ、次いで超純水を流して洗浄した後、カラムをＨＰＬＣ送液システムに装着し、試料を流してから、カラムをＨＰＬＣから取り外した。次いで、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．１Ｍ  イミダゾール、ｐＨ７．４の緩衝液を、１ｍｌ／分の流速で１ｍｌカラムに手動で流して、非吸着物を洗浄除去した。その後、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．３Ｍ  イミダゾール、ｐＨ７．４の緩衝液を同様に１ｍｌ／分の流速で流し、溶出液を１ｍｌずつ、５分画（計５ｍｌ）回収した。
【０１９９】
回収した各分画の溶出液のうち、10 μlを用いて、SDS-PAGEを実施した。その結果、ANGPTL4-CCが２、３番目の分画に溶出されている事を確認した。各分画の溶出液をそれぞれ透析チューブ（ギブコ社製）に入れて、５００ｍＬのＰＢＳ（ギブコ社製）に対して透析を行った。透析膜外液であるＰＢＳは、３回交換した。最後の透析膜外液を一部採取して、ＥＬの活性評価の際の陰性対照試料とした。
【０２００】
回収した試料中のタンパク質濃度を、プロテインアッセイ（ＤＣプロテインアッセイキット（バイオラッド社製）を使用）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびウェスタンブロッティング等で見積もった結果、計0.7ｍｇのANGPTL4-CCが得られたことが判明した。そして、下記のＥＬの活性評価には、第２回のアフィニティー精製により得られた第２および第３の分画をまとめたものを用いた。
【０２０１】
参考例７  組換え体Endothelial Lipaseの調製
文献（The Journal of Biological Chemistry 274, 1999, 14170-14175）を参照し、エンドセリアルリパーゼ（Eendothelial Lipase（以下、「EL」という。））のC末端にミック・ヒスチジン（以下、Myc-His）タグが融合した組換え体ELを調製した。なお、本発明はMyc-Hisタグが融合しない該タンパク質によっても同様にもたらされる。
【０２０２】
１）EL遺伝子のクローニング
以下の２つのオリゴヌクレオチドプライマー：
5'-aagctagcatgagcaactccgttcctctgctctgt-3'（hEL-ms1：配列表の配列番号５）;および
5'- ttaagcttgggaagctccacagtgggact -3'（hEL-mas2：配列表の配列番号６）
を合成した。
【０２０３】
次いで、市販ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＬＡ  ＰＣＲキット・バージョン２．１（宝酒造（株）社製）を用いたＰＣＲを行なった。すなわち、５μｌのｃＤＮＡライブラリー（Marathon-Ready human testis（クロンテック社製））と、オリゴヌクレオチドプライマー（hEL-ms1およびhEL-mas2）各０．４μＭ、ならびにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各４００μＭ、２．５ｍＭ  塩化マグネシウムを含む１×ＬＡ  ＰＣＲ緩衝液、０．０５単位のＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（以上キットに添付）からなる５０μｌの反応液を調製した。この反応液を９４℃で２分間加熱した後、９４℃で30秒、６5℃で30秒、７２℃で２分の温度サイクルを３０サイクル繰り返してから、７２℃で１０分間保温したタカラＰＣＲサーマルサイクラー  ＭＰ（宝酒造（株）社製）を使用）。この反応液を１％アガロースゲル電気泳動で解析した結果、目的とする1500ｂｐに近い大きさのＤＮＡ断片のバンドが観察された。このバンド内のＤＮＡ断片をゲルよりＱＩＡクイックゲルエクストラクションキット(キアゲン社製)を用いて回収した。本DNA断片およびpcDNA3.1(-)/Myc-His(A)ベクター（動物細胞発現用ベクター、インビトロゲン社製）を制限酵素（Nhe IおよびHind III（ともに宝酒造（株）社製））で37℃、12時間処理した後、各々の反応液を１％アガロースゲル電気泳動で解析し、目的とする1500ｂｐおよび5500bpに近い大きさのＤＮＡ断片のバンドが観察された。この各々のバンド内のＤＮＡ断片をゲルよりＱＩＡクイックゲルエクストラクションキット(キアゲン社製)を用いて回収した。これらをSolution I（宝酒造（株）社製）を使用し連結し、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’株（真核生物用ＴＡクローニングキット（インビトロゲン社製）に添付）に導入した。得られた形質転換株よりプラスミドＤＮＡ  ｐcDNA3.1(-)/Myc-His−hELを抽出し、挿入されているｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法によりヌクレオチド配列を決定した。その結果、得られたヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１９に示されるアミノ酸配列をコードするものであった。
【０２０４】
２）動物細胞での発現
上記で作成した発現ベクターｐcDNA3.1(-)/Myc-His−hELをヒト胚子腎臓細胞ＨＥＫ２９３に、トランスアイティー試薬(ミラス社製)を用いて、添付のプロトコールにしたがって、トランスフェクションした。すなわち、１ウェルあたり10×１０5個のＨＥＫ２９３細胞を組織培養用ポリリジンコート６ウェルプレートに蒔いた２４時間後に、3μｇのｐcDNA3.1(-)/Myc-His−hELをトランスフェクションした。なお、ELが血清により阻害される（Journal of Lipid Research 43, 2002, 921-929）ことから、トランスフェクション時には血清なしで培養可能な培地であるオプティメム（インビトロジェン社製）を使用した。３７℃で3日間培養した後、培養上清にヘパリンナトリウム（ノボヘパリン注、ノバルティス社製）  20単位/mlを添加し、さらに３７℃で2時間培養した後に培養上清を回収した。本培養上清はＥＬの活性測定の酵素源としてそのまま用いることが可能であった。本培養上清は小分けにした後-80℃で保存し、必要に応じて凍結融解後に使用した。
また、ｐcDNA3.1(-)/Myc-His発現ベクター上には、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子があり、ｐcDNA3.1(-)/Myc-His−hELをトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞より、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、EL蛋白質を安定に産生する形質転換細胞を得ることができた。
【０２０５】
実施例１  血漿の分析
１）ＡＮＧＰＴＬ３の定量
約１１時間絶食した日本人１００名（男性５１名、女性４９名）から得られた血漿について、ＡＮＧＰＴＬ３の濃度を参考例４で確立したＥＬＩＳＡ系により定量した。測定したヒト血漿におけるＡＮＧＰＴＬ３の濃度の平均値は４７２±１２２ｎｇ／ｍｌ（Ｓ．Ｄ．）であった（表１）。
【０２０６】
【表１】
2005080508.tif 000002
２）ＨＤＬコレステロール、総コレステロール及びリン脂質の測定
１）で用いたのと同じヒト血漿について、ＬタイプワコーＨＤＬ−Ｃ（和光純薬工業）を用いてＨＤＬコレステロールを、ＬタイプワコーＣＨＯ・Ｈ（和光純薬工業）を用いて総コレステロールを、Ｌタイプワコーリン脂質（和光純薬工業）を用いてリン脂質を、それぞれ測定した（表１）。測定装置としては７２５０形自動分析装置（日立製作所）を用いた。
【０２０７】
３）測定結果の解析
血漿中におけるＨＤＬコレステロール濃度、総コレステロール濃度、およびリン脂質濃度とＡＮＧＰＴＬ３濃度との相関をThe SAS(R) System Release 6.12 (TS045) for Windowsを用いて解析した。ピアソンの相関係数(r)および相関係数１に対する検定p値で調べたところ、ＨＤＬコレステロール濃度とＡＮＧＰＴＬ３濃度との間に有意な正相関が得られた(r=0.52,p=0.0001、表２参照)。同様にリン脂質濃度とＡＮＧＰＴＬ３濃度との間にも有意な正相関が得られた（r=0.28,p=0.0052、表２）
【０２０８】
【表２】
2005080508.tif 000003
実施例２  放射標識基質を使用したＥＬの活性測定
放射標識基質を使用したＥＬの活性の測定法は、文献記載の方法（Nilsson-Ehle, P. and Schotz, M. C.(1976) J. Lipid Res. 17, 536-541）に従った。
【０２０９】
まず、上記参考例７記載の方法で調製した培養上清１００μｌを等量の基質溶液［0.4ｍＭ  グリセロール・トリオレイン酸（シグマ社製）、4μM  1,2−ジ[1-14C]オレオイル・ホスファチジルコリン（60mCi/mmol、アマシャムファルマシア社製）、2.8 ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン（シグマ社製）、28 ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、3 ％（ｖ／ｖ）グリセロール］と混合し、参考例３で精製したＡＮＧＰＴＬ３、参考例５で精製したＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓ及び参考例６で精製したＡＮＧＰＴＬ４−CCの各ポリペプチドのいずれか１種類のポリペプチドを加え、３７℃で90分間保温した。その後、１．０５ｍｌの０．１Ｍ  炭酸カリウム・ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）と３．２５ｍｌのメタノール：クロロホルム：ヘキサン＝１４１：１２５：１００（ｖ／ｖ）を加えて反応を停止させ、強く撹拌した後、３０００×ｇで１0分間遠心分離した。水−メタノール層の14Cカウントを液体シンチレーションカウンターにて測定した。
【０２１０】
ＡＮＧＰＴＬ３のＥＬの活性に与える結果を表３に示した。
【０２１１】
【表３】
2005080508.tif 000004
ＡＮＧＰＴＬ３はELの活性を用量依存的に抑制した。KhAP5 CC/HisおよびＡＮＧＰＴＬ４-ＣＣのＥＬの活性に与える結果を表４に示した。
【０２１２】
【表４】
2005080508.tif 000005
KhAP5 CC/HisおよびＡＮＧＰＴＬ４-ＣＣはELの活性を抑制した。
【０２１３】
製剤例
本発明の医薬組成物の例として  以下の（１）乃至（８）から選択されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドを水またはそれ以外の薬理学的に許容し得る溶液に溶解した無菌性溶液または懸濁液のアンプルを挙げることができる。具体的には、上記ポリペプチド０．５ｍｇを１リットルの注射用水に溶解し、無菌的にアンプルに分注、封入するか、ポリペプチドを凍結乾燥してアンプルに充填しておき、使用時に薬理学的に許容し得る溶液で希釈する：
（１）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列；
（３）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（４）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列；
（５）配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列；
（６）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（７）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（８）上記（１）乃至（７）から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列。
【図面の簡単な説明】
【０２１４】
【図１】精製ＡＮＧＰＴＬ３と４５０ｎｍの吸光度との相関を示す図。
【配列表フリーテキスト】
【０２１５】
配列番号７：ＫｈＡＰ５  ＣＣ／Ｈｉｓ
配列番号８：ＫｈＡＰ５  ＣＣ／Ｈｉｓ
配列番号９：コザックのコンセンサス配列を含むＰＣＲセンスプライマー
配列番号１０：コザックのコンセンサス配列を含むＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号１１：ＫｈＡＰ５  ＣＣ／Ｈｉｓ用ＰＣＲセンスプライマー
配列番号１２：ＫｈＡＰ５  ＣＣ／Ｈｉｓ用ＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号１３：ＫｈＡＰ  ＣＣ／Ｈｉｓ＋１６
配列番号１４：ＡＮＧＰＴＬ４−ＣＣ
配列番号１５：ＡＮＧＰＴＬ４−ＣＣ
配列番号１６：ＡＮＧＰＴＬ４−ＣＣ用ＰＣＲセンスプライマー
配列番号１７：ＡＮＧＰＴＬ４−ＣＣ用ＰＣＲアンチセンスプライマー
【図１】
2005080508.tif 000006
【配列表】
2005080508000001.app