(57)【要約】      （修正有） 【課題】植物の半矮性化に関与するd11遺伝子、および該遺伝子を標的とした植物の矮性化の方法、並びに該方法に用いられる分子の提供を課題とする。【解決手段】マップベースクローニングの手法を用いることにより、イネに半矮性の異常をもたらすd11変異の原因となる単一の遺伝子d11を、広大な染色体領域より同定し、単離した。単離したd11遺伝子の塩基配列を決定し、これと構造的に関連した遺伝子を特定するため、データベース検索を行った。その結果、d11遺伝子は、ブラシノステロイド生合成経路に関与する新規サイトクロームP450であるd11タンパク質をコードすることを見いだした。本発明者らは、d11遺伝子を利用することにより、植物を矮性化させることが可能であることを見いだした。【選択図】図２
2005278636.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の矮性化のために用いる、以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）植物の内因性のd11遺伝子の転写産物と相補的なRNAをコードするDNA
（ｂ）植物の内因性のd11遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA
（ｃ）植物の内因性のd11遺伝子の発現を共抑制効果により阻害するRNAをコードするDNA
【請求項２】
植物のd11遺伝子がイネのd11遺伝子である、請求項１に記載のDNA。
【請求項３】
請求項１または２に記載のDNAを含むベクター。
【請求項４】
請求項１または２に記載のDNAを発現可能に保持する形質転換植物細胞。
【請求項５】
植物がイネである、請求項４に記載の形質転換植物細胞。
【請求項６】
請求項４または５に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項８】
植物がイネである、請求項６または７に記載の形質転換植物体。
【請求項９】
矮性化している、請求項６または７に記載の形質転換植物体。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項１１】
請求項６〜９のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法であって、請求項１または２に記載のDNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
【請求項１２】
植物体の細胞内における、内因性のd11遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、植物を矮性化させる方法。
【請求項１３】
請求項１または２に記載のDNAを植物に導入することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
植物がイネである、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は,植物の半矮性化に関与するブラシノステロイド生合成遺伝子、並びに該遺伝子を標的とした植物の矮性化に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物体を小型化することは、農業や園芸において様々な意義を有する。例えば、草丈またはかん長を小型化することで、新たな美的価値を有する観賞用植物を作出することが可能であり、また、野菜や果実を小型化することで一口サイズなどの新たな商品価値を有する作物を作ることもできる。また、このような産業上の利用以外でも、例えば、実験用植物の小型化は、その取り扱いやすさのみならず、植物の栽培空間の減少による実験空間の有効利用の観点から重要である。
【０００３】
植物の小型化において、特に植物の草丈あるいはかん長が野生型（正常型）より短くなる特性は矮性と呼ばれる。この特性を示すイネ品種や系統はγ-線や化学物質による突然変異誘起処理において数多く見い出されており、それらの遺伝解析も古くから進められてきた。これまでに60種類以上の遺伝子がこの矮性に関与することが知られている(非特許文献１)。しかしながら、なぜ矮性形質を表現するのかについての知見は少なく、少数の矮性変異体が、植物成長ホルモンであるブラシノステロイドの生合成に関与するタンパク質の遺伝子における変異によって生じていることが明らかになっているにすぎない(非特許文献２、３)。
【０００４】
イネ矮性変異体のなかでもdwarf11(d11)は、特に第2節間の伸長を抑制し、その結果として草丈を正常型の半分以下にするばかりでなく、粒が小円型になる特徴があることが知られている（非特許文献４−６）。また、このd11は遺伝解析の結果、イネ第4染色体上の単一の劣性遺伝子d11によって支配されていることが明らかとなっている（非特許文献７）。
【０００５】
d11遺伝子の変異体においては、植物ホルモンの一種であるブラシノステロイド情報伝達経路または生合成経路変異体が示す矮性、濃緑葉、直立葉、穂首の伸長などの表現型とよく似た表現型を示すことから、d11遺伝子は植物体内でのブラシノステロイド情報伝達経路または生合成経路に関与するタンパク質の遺伝子座であることが推定される。
【０００６】
このため、d11遺伝子を単離し、その遺伝子産物の機能を明らかにすることは、植物における形態形成過程を明らかにする上で重要となるばかりでなく、その知見を利用して植物の大きさの人工的な制御をおこなう上で極めて重要であると考えられる。
【０００７】
【非特許文献１】Rice Genetic Newsletter Vol.12：30-32 (1995)
【非特許文献２】BRD1:The Plant Journal vol.32:495-508 (2002)
【非特許文献３】D2:The Plant Cell vol.15: 2900-2910 (2003)
【非特許文献４】明峰正夫、日本学術会報告1巻：  108-314 (1925)
【非特許文献５】中山 包、信州大文理学部紀要 4巻：1-31(1954)
【非特許文献６】高橋萬右衛門・武田和義、北大農邦文紀要7巻：32-43 (1969)
【非特許文献７】Yoshimura et al., Plant. Mol. Biol., 35: 49-60 (1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、植物の半矮性化に関与するd11遺伝子を同定し、単離することを課題とする。さらに本発明は、内因性のd11遺伝子の発現を制御することにより植物を矮性化する方法、および内因性のd11遺伝子の発現を制御するための分子を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
イネ矮性遺伝子d11は、イネの矮性に関与するタンパク質をコードする遺伝子として、これまでイネ第4染色体という広大な領域のいずれかの場所に存在するものとして知られていた。本発明者らは、d11遺伝子を広大な染色体の領域から単離するために、マップベースクローニングの手法を利用して鋭意研究を行い、d11遺伝子の存在領域を解明し、遂に所期の遺伝子を単離することに成功した。具体的には、まず、分子マーカーを用いた連鎖解析を行い、d11遺伝子が存在する染色体上の領域を特定の分子マーカーで挟まれる領域に絞り込んだ。次いで、絞り込んだ遺伝子周辺の領域につき、PACクローンの整列化による物理的地図の作成を行い、候補となる領域内の塩基列の解読を行った。d11変異体と正常なイネの塩基配列を比較することにより、１つのｃDNAクローン(002-107-G06)をd11遺伝子として同定することに成功した。
【００１０】
同定されたクローンの塩基配列（2031塩基対）はイネゲノム解析研究において解析されている。データベースに対して類似性検索を行なった結果、同定されたクローンの塩基配列は、アラビドピシスとイネのブラシノステロイド生合成に関与するサイトクロームP450（cytochromeP450）をコードする遺伝子に対し、相同性を有することが明らかとなった。これらのことから、本発明者らは、同定された遺伝子は新規サイトクロームP450遺伝子であることを見出した。
【００１１】
植物において、数多くのサイトクロームP450は、植物ホルモンであるオーキシン、ジベレリン、ブラシノステロイドの生合成に関与している。本発明により単離されたd11遺伝子は、ブラシノステロイド生合成経路に関与する新規なサイトクロームP450をコードする遺伝子である。このことから本発明者らは、d11遺伝子の発現を抑制することにより、幅広く植物の矮性化を行うことが可能であることを見出したものである。
【００１２】
即ち、本発明は、植物の矮性に関与するd11遺伝子若しくはその相同遺伝子の発現を抑制することによる植物を矮性化する方法、およびこれら遺伝子の発現を抑制するために用いられる分子に関する。より具体的には、下記発明を提供するものである。
［１］  植物の矮性化のために用いる、以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のDNA
（ａ）植物の内因性のd11遺伝子の転写産物と相補的なRNAをコードするDNA
（ｂ）植物の内因性のd11遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA
（ｃ）植物の内因性のd11遺伝子の発現を、共抑制効果により阻害するRNAをコードするDNA
［２］  植物のd11遺伝子がイネのd11遺伝子である、［１］に記載のDNA
［３］  ［１］または［２］に記載のDNAを含むベクター
［４］  ［１］または［２］に記載のDNAを発現可能に保持する形質転換植物細胞
［５］  植物がイネである、［４］に記載の形質転換植物細胞
［６］  ［４］または［５］に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体
［７］  ［６］に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体
［８］  植物がイネである、［６］または［７］に記載の形質転換植物体
［９］  矮性化している、［６］または［７］に記載の形質転換植物体
［１０］  ［６］〜［９］のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料
［１１］  ［６］〜［９］のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法であって、［１］または［２］に記載のDNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法
［１２］  植物体の細胞内における、内因性のd11遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、植物を矮性化させる方法
［１３］  ［１］または［２］に記載のDNAを植物に導入することを特徴とする、［１２］に記載の方法
［１４］  植物がイネである、［１１］〜［１３］のいずれかに記載の方法
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、植物のd11遺伝子および該遺伝子を標的とした植物の矮性化の方法、並びに植物の矮性化のための分子が提供された。植物のd11遺伝子の利用によって、有用農作物および鑑賞用植物等の植物の高収量化や矮性化による美的価値の付加、さらに、マーカー選抜による高収量化や矮性化した植物の効率的育種等が可能になるものと大いに期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、d11遺伝子の発現を抑制することによる植物を矮性化する方法、および該遺伝子の発現を抑制するために用いられる分子に関する。本発明者らにより矮性との関係が明らかにされた、イネのd11遺伝子のcDNAの塩基配列を配列番号：2に、ゲノムDNAの塩基配列を配列番号：3に、これら遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：1に示す。
【００１５】
イネのd11遺伝子は、これまでイネに矮性の表現型を付与する遺伝子として、イネ第4染色体という広大な領域のいずれかの場所に存在するものとして知られていた。本発明者らは、マップベースクローニングの手法を利用することにより、イネ第4染色体におけるd11遺伝子の存在領域の絞り込みを行い、遂に単一の遺伝子として同定することに成功した。
【００１６】
本明細書において「d11遺伝子」とは、ブラシノステロイド生合成経路において、後期C6-オキシデーション経路の3-デハイドロ-6-デオキソテァステロンから6-デハイドロテファステロールへのステップと早期C6-オキシデーション経路の3-デハイドロテァステロンからテファステロールへのステップを触媒する、サイトクロームP450であるd11タンパク質をコードする遺伝子を意味する。
【００１７】
d11タンパク質をコードしうるものであれば、その形態に特に制限はなく、「d11遺伝子」には、cDNAの他、ゲノムDNA、化学合成DNAなども含まれる。また、d11タンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するDNAが含まれる。特に「内因性のd11遺伝子」という場合には、植物細胞内に天然の状態で存在するゲノムDNAを意味する。
【００１８】
ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、植物からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できる）を作成し、これを展開して、d11遺伝子（例えば、配列番号：２）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、d11遺伝子（例えば、配列番号：２）に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRをおこなうことによって調製することも可能である。また、cDNAは、例えば、植物から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。
【００１９】
「d11遺伝子」には、イネのd11遺伝子のみならず、そのホモログが含まれ、また、それらの変異体やバリアントも含まれる。
【００２０】
さらに、d11遺伝子は広く植物界に存在すると考えられるため、「d11遺伝子」には、イネのみならず、種々の植物に存在する相同遺伝子も含まれる。ここで「相同遺伝子」とは、種々の植物において、イネにおけるd11遺伝子産物と同様の生理機能を有するタンパク質をコードする遺伝子をさす。
【００２１】
相同遺伝子を単離するための当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E. M., Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, R. K., et al. Science, vol. 230, 1350-1354, 1985, Saiki, R. K. et al. Science, vol.239, 487-491,1988）が挙げられる。即ち、当業者にとっては、イネd11遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号：２）もしくはその一部をプローブとして、またd11遺伝子（例えば、配列番号：２）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、種々の植物からd11遺伝子の相同遺伝子を単離することは通常行いうることである。
【００２２】
このような相同遺伝子をコードするDNAを単離するためには、通常ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、6M 尿素、0.4%SDS、0.5 x SSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M 尿素、0.4%SDS、0.1 x SSCの条件を用いれば、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。単離したDNAの配列の決定は、公知の方法で行うことができる。単離されたDNAの相同性は、アミノ酸配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%, 96%, 97%, 98%, 99%以上）の配列の同一性を有する。配列の相同性は、BLASTN（核酸レベル）やBLASTX（アミノ酸レベル）のプログラム(Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990)を利用して決定することができる。該プログラムは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) に基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 100、wordlength =12とする。また、BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 50、wordlength = 3とする。また、Gapped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら（Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【００２３】
単離されたDNAが、d11タンパク質をコードするDNAであるか否かは、配列の相同性の高さ、および、単離されたd11遺伝子に対応する内因性遺伝子の発現を抑制することによる植物の矮性化、により評価することができる。
【００２４】
本発明のd11遺伝子には、より具体的には、（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、（ｂ）配列番号：２または３に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、（ｃ）配列番号：２または３に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、（ｄ）配列番号：２または３に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、が含まれる。
【００２５】
本明細書において「矮性化」とは、野生型植物と比較して草丈あるいはかん長が短くなることを意味する。本発明において、内因性のd11遺伝子の発現を抑制して矮性化形質を導入する植物には特に制限はなく、矮性化させたい所望の植物を用いることができるが、産業的な観点からは農作物や鑑賞用植物が好適である。有用農作物としては、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ等の単子葉植物や、ナタネ、ダイズ、ワタ、トマト、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げられる。また、観賞用植物としては、例えばキク、バラ、カーネーション、シクラメン等の花卉植物が挙げられる。d11遺伝子は広く植物界に存在すると考えられるため（図３，４参照）、d11遺伝子を標的として幅広い植物を矮性化することが可能である。
【００２６】
本発明の方法において矮性化した植物を作製する場合には、d11遺伝子の発現を抑制するためのDNAを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。該DNAおよびベクターは、植物を矮性化するための薬剤となる。
【００２７】
本明細書における「d11遺伝子の発現を抑制」には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
【００２８】
植物における特定の内在性遺伝子の発現の抑制は、例えば、内因性のd11遺伝子の転写産物と相補的なRNAをコードするDNAを利用して行なうことができる。
【００２９】
「本発明のタンパク質をコードするDNAの転写産物と相補的なRNAをコードするDNA」の一つの態様は、本発明のタンパク質をコードするDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNAである。植物細胞におけるアンチセンス効果は、一時的遺伝子発現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスRNAが植物においてアンチセンス効果を発揮することにより、初めて実証された(Ecker and Davis, Proc. Natl. Acad. USA, 83: 5372, 1986)。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンスRNAの発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており(Krol et. al., Nature 333: 866, 1988)、現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
【００３０】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(Ａ)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する(平島および井上「新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現」,日本生化学会編,東京化学同人, pp.319-347, 1993)。
【００３１】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。
【００３２】
アンチセンスDNAは、例えば、配列番号：2に記載のDNAの配列情報を基にホスホロチオネート法（Stein, Nucleic Acids Res., 16: 3209-3221, 1988）などにより調製することが可能である。調製されたDNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNAの配列は、形質転換する植物が持つ内因性遺伝子の転写産物と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上（例えば、95%, 96%, 97%, 98%, 99%以上）の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNAの長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。
【００３３】
「本発明のタンパク質をコードするDNAの転写産物と相補的なRNAをコードするDNA」の他の一つの態様は、内因性のd11遺伝子の転写産物と相補的なdsRNA（二重鎖RNA）をコードするDNAである。標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するdsRNAを細胞内に導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内因性遺伝子の発現がいずれも抑制される、RNAi（RNA干渉、RNA interference）と呼ばれる現象を引き起こすことができる。細胞に約40〜数百塩基対のdsRNAが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー(Dicer)と呼ばれるRNaseIII様のヌクレアーゼがATP存在下で、dsRNAを3'末端から約21〜23塩基対ずつ切り出し、siRNA（short interference RNA）を生じる。このsiRNAに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（RISC： RNA-induced silencing complex）が形成される。この複合体はsiRNAと同じ配列を認識して結合し、RNaseIII様の酵素活性によってsiRNAの中央部で標的遺伝子の転写産物（mRNA）を切断する。また、この経路とは別にsiRNAのアンチセンス鎖がmRNAに結合してRNA依存性RNAポリメラーゼ(RsRP)のプライマーとして作用し、dsRNAが合成される。このdsRNAが再びダイサーの基質となって、新たなsiRNAを生じて作用を増幅する経路も考えられている。
【００３４】
RNAiは当初、線虫において発見されたが（Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811, 1998）、現在では、線虫のみならず、植物、線形動物、ショウジョウバエ、原生動物などの種々の生物において観察されている（Fire, A. RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363 (1999)、Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001)、Hammond, S. M., Caudy, A. A. & Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nature Rev. Genet. 2, 110-119 (2001)、Zamore, P. D. RNA interference: listening to the sound of silence. Nat Struct Biol. 8, 746-750 (2001)）。これら生物では、実際に外来よりdsRNAを導入することにより標的遺伝子の発現が抑制されることが確認され、さらにはノックアウト個体を創生する方法としても利用されつつある。
【００３５】
RNAiの登場当初は、dsRNAはある程度の長さ(40塩基)以上でなければ効果がないと考えられていたが、米ロックフェラー大のTuschlらは21塩基対前後の単鎖dsRNA(siRNA)を細胞に導入すれば、哺乳動物細胞においてもPKRによる抗ウイルス反応を起こさず、RNAiの効果があることを報告し（Tuschl, Nature, 411, 494-498 (2001)）、RNAiは分化したヒトなどの哺乳動物細胞に応用可能な技術として俄然注目を集めることになった。
【００３６】
本発明のDNAは、標的遺伝子の転写産物（mRNA）のいずれかの領域に対するアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記mRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードしたセンスコードDNAを含み、前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAより前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAを発現させることができる。また、これらのアンチセンスRNAおよびセンスRNAよりdsRNAを作成することもできる。
【００３７】
本発明のdsRNAの発現システムをベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合がある。例えば、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれpolIII系のような短いRNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入することにより構成することができる。
【００３８】
また、異なる鎖上に対向するように、アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAとを逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスRNAコード鎖とセンスRNAコード鎖とが対となった一つの二本鎖DNA（siRNAコードDNA）が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスRNA、センスRNAとを発現し得るようにプロモータを対向して備えられる。この場合には、センスRNA、アンチセンスRNAの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスRNAコード鎖、センスRNAコード鎖）の３'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、A（アデニン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモータの種類は異なっていることが好ましい。
【００３９】
また、異なるベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれpolIII系のような短いRNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させることにより構成することができる。
【００４０】
RNAiにおいては、dsRNAとしてsiRNAが使用されたものであってもよい。「siRNA」は、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖RNAを意味し、Tuschlら（前掲）により報告された全長21〜23塩基対に限定されるものではなく、毒性を示さない範囲の長さであれば特に限定はなく、例えば、15〜49塩基対と、好適には15〜35塩基対と、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。あるいは、発現されるsiRNAが転写され最終的な二重鎖RNA部分の長さが、例えば、15〜49塩基対、好適には15〜35塩基対、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。
【００４１】
本発明のDNAとしては、標的配列のインバーテッドリピートの間に適当な配列（イントロン配列が望ましい）を挿入し、ヘアピン構造を持つダブルストランドRNA(self-complementary 'hairpin' RNA(hpRNA))を作るようなコンストラクト（Smith, N.A., et al. Nature, 407: 319, 2000、Wesley, S. V. et al. Plant J. 27: 581, 2001、Piccin, A. et al. Nucleic Acids Res. 29:E55, 2001）を用いることもできる。
【００４２】
RNAiに用いるDNAは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%, 96%, 97%, 98%, 99%以上）の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。
【００４３】
dsRNAにおけるRNA同士が対合した二重鎖RNAの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、dsRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。
【００４４】
内因性のd11遺伝子の発現の抑制は、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子、蛋白質核酸酵素, 35: 2191, 1990)。
【００４５】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が９位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にＡまたはUでも切断されることが示されている(Koizumi et. al., FEBS Lett. 228: 225, 1988)。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である(Koizumi et. al., FEBS Lett. 239: 285,1988、小泉誠および大塚栄子, 蛋白質核酸酵素,35: 2191, 1990、Koizumi et. al., Nucleic. Acids. Res. 17: 7059, 1989)。
【００４６】
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(Buzayan, Nature 323: 349,1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている(Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res. 19: 6751, 1992, 及び菊池洋,化学と生物 30: 112, 1992)。
【００４７】
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である (Taira et. al., Protein Eng. 3: 733, 1990、Dzianott and Bujarski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 4823, 1989、Grosshans and Cech, Nucleic Acids Res. 19: 3875, 1991、Taira et. al., Nucleic Acids Res. 19: 5125, 1991)。
【００４８】
また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる(Yuyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 1271, 1992)。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００４９】
内在性遺伝子の発現の抑制はさらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNAの形質転換によってもたらされる「共抑制」によっても達成されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においてはしばしば観察される(Curr. Biol. 7: R793, 1997、Curr. Biol. 6: 810, 1996)。
【００５０】
例えば、d11遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、d11遺伝子若しくはこれと類似した配列を有するDNAを発現できるように作製したベクターDNAを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体からd11変異体の形質を有する植物、即ち矮性化した植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%, 96%, 97%, 98%, 99%以上）の配列の同一性を有する。
【００５１】
さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによっても達成することができる。ドミナントネガティブの形質を有する遺伝子とは、該遺伝子を発現させることによって、植物体が本来持つ内在性の野生型遺伝子の活性を消失もしくは低下させる機能を有する遺伝子のことをいう。
【００５２】
また本発明は、上記の内在性遺伝子の発現の抑制に用いるDNAを含むベクター、該DNAを発現可能に保持する形質転換植物細胞、該形質転換植物細胞を含む形質転換植物体、該形質転換植物体の子孫またはクローンである形質転換植物体、該形質転換植物体の繁殖材料を提供する。
【００５３】
さらに、本発明は、上記の形質転換植物体の製造方法であって、内在性遺伝子の発現の抑制に用いるDNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法に関する。
【００５４】
本発明のDNAの植物細胞への導入は、当業者においては、公知の方法、例えばアグロバクテリウム法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション法）、パーティクルガン法により実施することができる。
【００５５】
上記アグロバクテリウム法を用いる場合、例えばNagelらの方法（Microbiol. Lett. 67: 325, 1990）が用いられる。この方法によれば、組み換えベクターをアグロバクテリウム細菌中に形質転換して、次いで形質転換されたアグロバクテリウムを、リーフディスク法等の公知の方法により植物細胞に導入する。上記ベクターは、例えば植物体に導入した後、本発明のDNAが植物体中で発現するように、発現プロモーターを含む。一般に、該プロモーターの下流には本発明のDNAが位置し、さらに該DNAの下流にはターミネーターが位置する。この目的に用いられる組み換えベクターは、植物への導入方法、または植物の種類に応じて、当業者によって適宜選択される。上記プロモーターとして、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のCaMV35S、トウモロコシのユビキチンプロモーター（特開平2-79983号公報）等を挙げることができる。
【００５６】
また、上記ターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を例示することができるが、植物体中で機能するプロモーターやターミネーターであれば、これらに限定されない。
【００５７】
また、本発明のDNAを導入する植物は、外植片であってもよく、これらの植物から培養細胞を調製し、得られた培養細胞に導入してもよい。本発明の「植物細胞」は、例えば葉、根、茎、花および種子中の胚盤等の植物の細胞、カルス、懸濁培養細胞等が挙げられる。
【００５８】
また、本発明のDNAの導入により形質転換した植物細胞を効率的に選択するために、上記組み換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターと共に植物細胞へ導入するのが好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
【００５９】
組み換えベクターを導入した植物細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。これにより形質転換された植物培養細胞を得ることができる。
【００６０】
次いで、本発明のDNAを導入した形質転換細胞から植物体を再生する。植物体の再生は植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki et. al., Plant Physiol. 100: 1503-1507, 1995）。例えば、イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta et. al., In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp66-74, 1995）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Toki et. al., Plant Physiol. 100: 1503-1507, 1992）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou et. al., Bio/technology, 9: 957-962, 1991）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei et. al., Plant J. 6: 271-282, 1994）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００６１】
形質転換細胞から再生させた植物体は、次いで順化用培地で培養する。その後、順化した再生植物体を、通常の栽培条件で栽培すると、矮性化した植物体が得られ、成熟して結実して種子を得ることができる。
【００６２】
なお、このように再生され、かつ栽培した形質転換植物体中の導入された外来DNAの存在は、公知のPCR法やサザンハイブリダイゼーション法によって、または植物体中のDNAの塩基配列を解析することによって確認することができる。
【００６３】
この場合、形質転換植物体からのDNAの抽出は、公知のJ.Sambrookらの方法（Molecular Cloning、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に準じて実施することができる。
【００６４】
再生させた植物体中に存在する本発明のDNAよりなる外来遺伝子を、PCR法を用いて解析する場合には、上記のように再生植物体から抽出したDNAを鋳型として増幅反応を行う。また、本発明のDNA、あるいは本発明により改変されたDNAの塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合させた反応液中において増幅反応を行うこともできる。増幅反応においては、DNAの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、本発明のDNA配列を含むDNA断片の増幅生成物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のDNA断片が分画されて、そのDNA断片が本発明のDNAに対応することを確認することが可能である。
【００６５】
一旦、染色体内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNAが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
【００６６】
本発明においては、上記の如く、植物のd11遺伝子の発現を抑制することで、植物を矮性化することができる。本発明の方法で作製した植物は、例えば有用農作物では高い収量が安定的に得られ、鑑賞用植物では新たな美的価値が付加されることが大いに期待される。
【００６７】
さらに、外来性のd11遺伝子を植物に導入することにより、植物の生長の促進、特に、茎葉伸長の上昇を図ることが考えられる。外来性のd11遺伝子が導入された植物の形質転換体の作製は、上記した方法により行うことができる。即ち、植物細胞内で機能するベクターに該遺伝子を挿入し、該ベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させることにより、目的の形質転換植物体を作出することができる。
【００６８】
さらに、d11遺伝子の配列情報を基に、植物の内因性のd11遺伝子の発現を抑制するために用いる、アンチセンスRNAをコードするDNA、dsRNAをコードするDNA、リボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、さらに共抑制効果を有するRNAをコードするDNA等を作製することも可能である。作製されたDNAは、植物を矮性化させるために使用できる。
【実施例】
【００６９】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００７０】
[実施例１]
イネインド型品種カサラス(Kasalath)に、d11遺伝子をもつ日本型遺伝子系統HO556を交配したF2集団450個体を育成し、各個体毎にDNAを抽出した。d11遺伝子は第4染色体に座乗することが明らかにされていたことから、d11遺伝子と第4染色体に座乗するRFLPマーカーとの連鎖解析を行い、連鎖地図を作成した。その結果、d11遺伝子はRFLPマーカーW390、L353と組換え頻度約1.8%で連鎖していることが明らかとなった。これらの連鎖地図より高密度連鎖地図を作成するために４種類のCAPSマーカー（S10628、R1721、R278、C３７７）を設計した。
【００７１】
[実施例2]
矮性遺伝子d11の高精度連鎖地図の作成を行った。DNAマーカーの多型を確実に得るために、分離集団の親系統にSL14を選定した。この系統は水稲品種日本晴の遺伝的背景（12種類の染色体）のうち、第4染色体のみをインド型品種カサラス(Kasalath)の染色体に置換した系統である。SL14とHO556を交配して得られたF2種子約15000個を播種した後、幼苗期に3020個の矮性個体（劣性ホモ型）からCAPSマーカーを用いて選抜して圃場に移植した。葉のサンプリングを行い、330個の植物体からDNAを抽出し、RFLP分析に供した。その結果、d11遺伝子は、第4染色体のd11座近傍に位置づけられたRFLPマーカーG7008またはC559、W390またはL353に挟まれた領域(0.02cM)に位置づけられた（図2）。
【００７２】
[実施例3]
矮性遺伝子d11を含むPACクローンの選定とそれらの物理地図の作成、さらにd11座を含むゲノミッククローンの同定を行うために、G7008、L353を用いてPACライブラリーをスクリーニングした。その結果、G7008、L353の塩基配列を含むPACクローンをそれぞれ6および４種類選定することができた。またカセット-PCR法を用いて調製した各PACクローンの末端DNA断片を用いて、PACクローンの重複の確認と染色体歩行を行うとともに連鎖地図上へのマッピングを行った。しかしながら、これらのPACクローンではd11遺伝子をカバーできないことが判明したため、さらなるPACクローンのスクリーニングを行った。上記記載の方法により同様にPACクローンを整列化した。その結果、d11遺伝子は、２つのPACクローン（P424E6、及びP471B10）の間に位置づけられることが判明した。
【００７３】
[実施例4]
実施例３より、矮性遺伝子d11遺伝子は2つのPACクローン（P424E6、及びP471B10）の間に位置づけられた。さらにSTSマーカーやアンプリコンマーカーを用いることにより、d11遺伝子の候補領域を98kbにまで狭めることに成功した。遺伝子予測により、この98kbの候補領域内には18個の遺伝子の存在が予測された。d11変異体のゲノミックDNAを用いて98kbの候補領域をPCRで増幅し、塩基配列を解読した。この領域について、野生型とd11変異体の塩基配列を比較し、変異部位を探索した（図2）ところ、３個の候補遺伝子に変異が見られることが明らかとなった。
【００７４】
さらに詳細な変異部位を調べるために、イネ完全鎖長ｃDNAデータベースをサーチし、これら3個の候補遺伝子に対応するcDNAの塩基配列を得た。これらの塩基配列の情報を元に作成したプライマーを用いてRT-PCRを行い、PCR産物を得た。得られたPCR産物の塩基配列の比較を行い、詳細な変異部位を探索した。その結果、サイトクロームP450をコードすると思われるｃDNA内にすべてのd11アレルにおいて変異が見られた（図3）。このことより、d11遺伝子はサイトクロームP450をコードすることが明らかとなった。
【００７５】
タンパク質コード領域推定プログラムにより、98kbの候補領域内のゲノムDNAには、18種類のタンパク質をコードする領域が示された。この18種類の候補タンパク質の塩基配列を野生型（日本晴）と変異体（d11変異体）で比較した。本発明者らは8種類のd11変異体を収集し、これらd11変異体は、アレリズムテストにより、すべてアレルであることを検証していた。初めに、5種類のd11アレルをランダムに選別し、野生型と同一な塩基配列が得られた候補タンパク質を消去する手法で、塩基配列の解析を行った所、5種類のアレルに共通して、1個のタンパク質候補領域（d11遺伝子）に変異が検出された。さらに、残りの4種類のd11アレルにも、この領域に変異が観察された。最後に、これら8種類のアレルのｃDNAを用いてこの候補遺伝子の塩基配列を比較したところ、すべて野生型との塩基配列に違いが確認された（図3）。
【００７６】
8種類のd11変異体の変異原因遺伝子の変異は、以下のように、グループ１〜４として分類された。
グループ1（HO556とT65d11）：第2エキソンに1塩基の欠失が生じたことによる変異。
グループ2（Tos3220）：第3エキソンに5塩基の欠失が生じたことによる変異。
グループ3（TCM2410、TCM268、及びTCM269）：第4エキソンに1塩基置換によるアミノ酸変換による変異。この領域はP450の活性中心の1つ（ドメインA領域）である。
グループ4（Id11とN28d11）：第7エキソン内に1塩基挿入が生じたことによる変異。
グループ1、2、及び4はいずれも、フレーム枠のずれを生じてストップコドンを生じる変異である。このように、これらd11変異体において、正確な翻訳産物が翻訳されない、または活性中心のドメイン構造を形成するための必須配列が形成できないといった変異の原因が明らかにされた。
【００７７】
d11変異体における発現解析では、節間，開花前の組織において高い発現が確認されたことは、d11変異体が示す矮性，短粒の表現型と一致する（図1）。
【００７８】
[実施例5]
d11遺伝子のｃDNA塩基配列より予測したアミノ酸配列と、アラビドピシス、及びイネにおいて既知のサイトクロームP450のアミノ酸配列との比較を行い、どの植物ホルモンの生合成経路に関与するかを調べた。その結果、ブラシノステロイド生合成経路を触媒すると思われるサイトクロームP450と同じファミリーに属することが明らかとなった。さらに既知のサイトクロームP450と同じアミノ酸配列ではなかったことから、d11遺伝子がコードするサイトクロームP450はブラシノステロイド生合成経路に関与する新規遺伝子であることを示している（図4）。
【００７９】
[実施例6]
PACクローン(P424E6)を制限酵素XbaIとEcoRIで処理することにより、約2Kbのプロモーター領域を含む全鎖長d11遺伝子6.2Kb断片を得た。この6.2Kbp断片を、バイナリーベクターpPZP2H-lacのクローニングサイト（XbaIとEcoRI）に連結した。このベクターをアグロバクテリアEHE101に導入し、定法に従い、イネカルスを形質転換した。形質転換体(Transformant-D11)は、穂が伸長して垂れるとともに、種子型も野生型と同様の表現型を示した（図５）。したがって、d11遺伝子を含む6.2Kbの遺伝子断片が、d11変異を相補することが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】野生型およびd11変異体の表現型を示す写真である。A; 出穂期のイネを示す。B; 各変異体および野生型の第２節間を示す。C; 各変異体および野生型の登熟種子を示す。
【図２】（A）高密度連鎖解析によるd11座の推定領域と物理地図を示す図である。（B）d11遺伝子がコードするサイトクロームP450の構造とd11アレルにおける変異部位を示す図である。
【図３】d11遺伝子のアミノ酸配列と相同性があった他のサイトクロームP450のアミノ酸配列を示す図である。各種d11アレルで見いだされた変異部位を併記した。
【図４】d11遺伝子がコードするサイトクロームP450と既知のアラビドピシスおよびイネのサイトクロームP450の系統樹を示す図である。
【図５】野生型d11遺伝子の導入により、d11変異が相補されることを示す写真である。A; 出穂期のイネを示す。B; 野生型および変異体の登熟種子を示す。左：野生型イネ（ＷＴ、Ｔ６５）を示す。中央：d11変異体にd11遺伝子を導入した形質転換体(Transformant-D11)を示す。右：d11変異体にバイナリーベクターpPZP2H-lacを導入した形質転換体 (Transformant-control vector) を示す。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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