(57)【要約】【課題】核酸塩基とヘリカーゼとの反応を、簡便かつ短時間で精度よく検出する方法を提供する。【解決手段】（１）PCRを利用して、蛍光標識核酸塩基の溶液を作る。（２）蛍光標識核酸塩基の溶液とヘリカーゼを混合して混合液を作り、生体内の温度条件、例えば３７℃で反応させる。また、核酸塩基とヘリカーゼとの反応生成物に作用する酵素を加えて混合液を作ってもよい。（３）反応させた混合液をFCS測定し、測定値に基づいて、反応の有無を検出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸塩基またはヘリカーゼに蛍光標識するステップと、
前記核酸塩基と前記ヘリカーゼとを混合し混合溶液をつくるステップと、
蛍光解析法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の大きさ、明るさまたは数を求めるステップと
を有することを特徴とする核酸塩基とヘリカーゼとの反応を検出する方法。
【請求項２】
前記蛍光解析法は、蛍光相関分光法(FCS)、蛍光相互相関分光法(FCCS)、蛍光強度分布解析法（FIDA）、多項目蛍光強度分布解析法（FIMDA）または蛍光偏光解析法(FIDA- polarization)であることを特徴とする請求項１の核酸塩基とヘリカーゼとの反応を検出する方法。
【請求項３】
前記蛍光標識するステップは、核酸塩基に蛍光標識するステップを含み、
前記核酸塩基は二本鎖DNAであり、前記ヘリカーゼはDNAヘリカーゼＩＩであることを特徴とする請求項１の核酸塩基とヘリカーゼとの反応を検出する方法。
【請求項４】
前記混合溶液をつくるステップは、
前記核酸塩基と前記ヘリカーゼとの反応生成物に対して反応する酵素を混合するステップを含むことを特徴とする請求項１の核酸塩基とヘリカーゼとの反応を検出する方法。
【請求項５】
蛍光標識された核酸塩基、へリカーゼおよびサンプルを混合し混合溶液をつくるステップと、
蛍光解析法により混合溶液中の反応生成物の大きさ、明るさまたは数を求めるステップと、
求められた前記物質の大きさ、明るさまたは数と、核酸塩基とへリカーゼとの反応生成物の大きさ、明るさまたは数、もしくは、未反応の核酸塩基の大きさ、明るさまたは数とを比較するステップと
を有することを特徴とするヘリカーゼ阻害剤を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸塩基とヘリカーゼとの反応を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１（特表2002-540800号公報）は、核酸塩基とヘリカーゼとを混合して反応させ、核酸塩基とヘリカーゼとの反応を、放射の測定、表面プラズモンの測定または核磁気共鳴の測定を行って検出することを開示している。  
特許文献２（特開2000-197483号公報）は、核酸塩基とヘリカーゼとを混合して反応させ、核酸塩基とヘリカーゼとの反応を、抗体反応実験を行って検出することを開示している。  
特許文献３（特表2000-508521号公報）は、支持体に固定された核酸塩基または支持体に固定されたヘリカーゼとアガロースビーズとを用い、核酸塩基とヘリカーゼとの反応を検出することを開示している。  
特許文献４（特開2000-166600号公報）は、ヘリカーゼ遺伝子の発現量の抑制を指標として、化合物をスクリーニングする方法を開示している。
【０００３】
特許文献５（特開2003-88369号公報）は、蛍光相関分光法(FCS)を利用してDNAエンドヌクレアーゼ活性を検出する方法、および分子量の大小と並進拡散時間(translational diffusion time)の大小との関係を開示している。
【０００４】
特許文献６（特表2002-543414号公報）は、試料中の蛍光分子又は他の粒子を特徴付ける方法、および蛍光強度多重(multiple)分布分析(FIMDA)および蛍光自己たたみ込み(autoconvoluted)強度分布分析(FACID)から並進拡散時間が得られることを開示している。
【特許文献１】特表2002-540800号公報
【特許文献２】特開2000-197483号公報
【特許文献３】特表2000-508521号公報
【特許文献４】特開2000-166600号公報
【特許文献５】特開2003-88369号公報
【特許文献６】特表2002-543414号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記従来技術のうち、特開2000-197483号公報、特表2000-508521号公報および特開2001-321199号公報に記載される各検出方法は、ヘリカーゼの反応を検出する際に、放射の測定、表面プラズモンの測定または核磁気共鳴の測定を行ったり、抗体反応を利用したり、核酸塩基またはヘリカーゼを支持体に固定したり、アガロースビーズを用いたりするので、操作が煩雑で検出結果を得るまでに時間がかかるという問題がある。また、抗体のないヘリカーゼや基板に固定できないヘリカーゼについては反応を検出することが難しい。
【０００６】
特開2000-197483号公報、特表2000-508521号公報、特開2001-321199号公報および特開2000-166600号公報は、ヘリカーゼの解析のために、蛍光相関分光法(FCS)、蛍光強度多重(multiple)分布分析(FIMDA)および蛍光自己たたみ込み(autoconvoluted)強度分布分析(FACID)を用いることは開示していない。
【０００７】
特開2003-88369号公報および特表2002-543414号公報は、ＤＮＡとヘリカーゼとの反応を検出する方法については開示していない。
【０００８】
本発明の目的は、核酸塩基とヘリカーゼとの反応を、簡便かつ短時間で精度よく検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成する本発明の特徴は、核酸塩基またはヘリカーゼを蛍光標識し、核酸塩基とヘリカーゼとを混合し、蛍光解析法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の大きさ、明るさまたは数を求めることにある。
【００１０】
この特徴によれば、各溶液の混合と蛍光解析法によって蛍光標識を有する物質の大きさ、明るさまたは数を求めることができるので、放射の測定、表面プラズモンの測定または核磁気共鳴の測定、支持体への固定などの煩雑な操作を行わずに、核酸塩基とヘリカーゼとの結合や作用などの反応の有無、ヘリカーゼの反応活性、反応生成物の大きさの変化、明るさの変化、数の変化などの検出結果を簡便に短時間で精度良く得ることができる。
【００１１】
また、固体支持体を用いないので、固定できないヘリカーゼでも反応させ解析することができる。また、抗体反応を利用しないので、抗体のないヘリカーゼでも反応させ解析することができる。
【００１２】
また、各溶液の混合と、蛍光相関分光法(FCS)、蛍光相互相関分光法(FCCS)、蛍光強度分布解析法（FIDA）、多項目蛍光強度分布解析法（FIMDA）または蛍光偏光解析法(FIDA-polarization)の利用により、浮遊系における反応生成物の大きさの変化、明るさの変化、数の変化をｎＭオーダーという非常に良い感度で検出することができる。
【００１３】
また、核酸塩基として蛍光標識された二本鎖DNAを、ヘリカーゼとしてDNAヘリカーゼＩＩを用いてもよい。この場合、反応生成物の並進拡散時間が未反応の蛍光標識二本鎖DNAのものより顕著に小さくなっていれば、二本鎖DNAとDNAヘリカーゼＩＩとの反応を検出できたことになる。
【００１４】
二本鎖DNAとDNAヘリカーゼＩＩとの混合溶液にさらにエキソヌクレアーゼＩを混合してもよい。この場合、反応生成物の並進拡散時間が未反応の蛍光標識二本鎖DNAの並進拡散時間より1桁小さくなっていれば、二本鎖DNAとDNAヘリカーゼＩＩとの反応を検出できたことになる。
【００１５】
また、核酸塩基とヘリカーゼとの混合液にさらに酵素を混合してもよい。この酵素は、核酸塩基とヘリカーゼとの反応生成物に対して反応するものがよい。この酵素によって、蛍光標識を有する物質は2段階の反応を経てから、物質の大きさ、明るさまたは数を求められるので、物質の大きさの変化、明るさの変化または数の変化が顕著に現れて、これらの結果をより精度良く得ることができる。
【００１６】
本発明の他の特徴は、蛍光標識された核酸塩基、へリカーゼおよびサンプルを混合し、蛍光解析法により混合溶液中の反応生成物の大きさ、明るさまたは数を求め、この値と
核酸塩基とへリカーゼとの反応生成物の大きさ、明るさまたは数、もしくは未反応の核酸塩基の大きさ、明るさまたは数とを比較することにある。反応生成物の並進拡散時間が未反応の蛍光標識二本鎖DNAのものより顕著に小さくなっていれば、もしくは蛍光標識一本鎖DNAの並進拡散時間と顕著な差が無ければ、二本鎖DNAとDNAヘリカーゼＩＩとの反応が行われたことになり、サンプル中にヘリカーゼ阻害剤が存在しないと言える。
【００１７】
この特徴によれば、各溶液の混合と蛍光解析法によって蛍光標識を有する物質の大きさ、明るさまたは数を求めることができるので、放射の測定、表面プラズモンの測定または核磁気共鳴の測定、支持体への固定などの煩雑な操作を行わずに、ヘリカーゼ阻害剤の有無を簡便に短時間で精度良く得ることができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、各溶液の混合と蛍光解析法によって蛍光標識を有する物質の大きさ、明るさまたは数を求めることができるので、放射の測定、表面プラズモンの測定または核磁気共鳴の測定、支持体への固定などの煩雑な操作を行わずに、核酸塩基とヘリカーゼとの結合や作用などの反応の有無、ヘリカーゼの反応活性、反応生成物の大きさの変化、明るさの変化、数の変化などの検出結果を簡便に短時間で精度良く得ることができる。
【００１９】
また、各溶液の混合と、蛍光相関分光法(FCS)、蛍光相互相関分光法(FCCS)、蛍光強度分布解析法（FIDA）、多項目蛍光強度分布解析法（FIMDA）または蛍光偏光解析法(FIDA-polarization)の利用により、浮遊系における反応生成物の大きさの変化、明るさの変化、数の変化をｎＭオーダーという非常に良い感度で検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本実施の形態では、以下の手順で核酸塩基とヘリカーゼの反応の解析を行う。図１に手順の例を示す。
【００２１】
（１）核酸塩基の蛍光標識と調整
ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction：PCR）を利用して、蛍光標識された核酸塩基（以下、蛍光標識核酸塩基と呼ぶ）を作り、約10nMの蛍光標識核酸塩基の溶液を作る。
【００２２】
（２）蛍光核酸塩基とヘリカーゼとの反応実験
蛍光標識核酸塩基の溶液とヘリカーゼを混合して混合液を作り、生体内の温度条件、例えば３７℃で反応させる。また、核酸塩基とヘリカーゼとの反応生成物に作用する酵素を加えて混合液を作ってもよい。
【００２３】
（３）ＦＣＳ解析
反応させた混合液をFCS測定用のガラスボトムプレート、例えばマイクロプレートに移し、FCS測定を行う。FCS測定での測定値に基づいて、反応の有無を検出する。
【００２４】
FCS測定では、微小領域内の蛍光分子の揺らぎを測定し、求められた値に基づいて並進拡散時間(Diffusion Time)を求める。並進拡散時間の大小は分子量の大小を示すので、反応の前後で並進拡散時間を比較することにより、分子量の増加または減少がわかる。分子量の増加は生体分子間の結合反応を、分子量の減少は生体分子の分解反応を、分子量の維持は生体分子に結合も分解も無かったことを示す。従って、蛍光標識核酸塩基とヘリカーゼとの反応の前後で、蛍光標識された物質の並進拡散時間の増加を検出することにより、蛍光標識核酸塩基とヘリカーゼとの反応を検出することができる。
【００２５】
上述した手順では、（３）で反応生成物の並進拡散時間を求めるために蛍光相関分光法(fluorescence correlation spectroscopy：FCS)を用いたが、蛍光相関分光法(FCS)の代わりに、蛍光相互相関分光法(fluorescence cross correlation spectroscopy)、蛍光強度分布解析法（Fluorescence Intensity Distribution Analysis）、多項目蛍光強度分布解析法（Fluorescence Intensity Multiple Distribution Analysis）または蛍光偏光解析法(FIDA-polarization)を用いてもよい。これらの解析法から、反応後の核酸塩基の大きさ、数、明るさに関連するデータを求める。これらのデータから、反応前後での核酸塩基の大きさの変化、数の変化、明るさの変化を得ることができる。例えば、FCS測定の結果、反応の前後で核酸塩基の大きさに顕著な差はないが、1分子あたりの蛍光の明るさに変化がある場合には、蛍光強度分布解析法（FIDA）を行うことによって、反応の有無を知ることができる。
【００２６】
[実施例]
（蛍光標識二本鎖DNAとDNAヘリカーゼＩＩとの反応実験）
本実施例では以下のものを用いる。特に、核酸塩基として蛍光標識二本鎖DNAを、ヘリカーゼとしてDNAヘリカーゼＩＩを、さらに核酸塩基とヘリカーゼとの反応生成物に作用する酵素として、エキソヌクレアーゼＩを用いる。
【００２７】
Human DNA；
Nonラベルプライマー(F)  19mer；
EvoBlue(633nm)ラベルプライマー(R)  20mer（TAMRAラベリングでもよい）；
TITANIUM TaQ DNAポリメラーゼ；
QIAquick PCR Purification Kit；
エキソヌクレアーゼＩ(Exonuclease I:EPICENTRE X40501K)  20U/μl；
DNAヘリカーゼＩＩ(DNA Helicase II E coli:Wako)  200μg/ml；および、
Helicase Buffer（25mM Tris HCl(pH7.4)、20mM NaCl、3mM MgCl2、2mMβ-MEおよび2mM ATP、水(H2O)）
（１）二本鎖DNA溶液の調整
表１の試薬を用いてポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction：PCR）を行い、蛍光標識された二本鎖DNA（以下、蛍光標識二本鎖DNAと呼ぶ）を得た。蛍光標識二本鎖DNAの長さは160bpである。PCRの温度制御は、94℃2分の後、94℃30秒と74℃30秒を30サイクル、そして74℃5分の後、4℃で保存した。
【表１】
2005080535.tif 000003
【００２８】
溶液中から未反応プライマーや一本鎖DNAを除去するために、PCR溶液25μlに対してエキソヌクレアーゼＩを3〜5μl加えた。同時にMgCl2を最終濃度が10mMになるように添加し(Mg++が反応に必要なため)、37℃で1時間程度反応させた。その後、QIAquick PCR Purification Kitを用いて、未反応のプライマー、ヌクレオチド、酵素(Enzyme)、塩(salt)などを取り除いた。そして蛍光標識二本鎖DNAを精製した後、3%アガロース/TAEで電気泳動してバンドを確認した。
【００２９】
精製して得られた蛍光標識二本鎖DNAを蛍光相関分光法(FCS)で測定し、粒子数(n)が10程度になるようにHelicase Bufferで希釈し、蛍光標識二本鎖DNAの溶液(約10nM)を作った。粒子数(n)が10程度の蛍光標識二本鎖DNA溶液を用いて各実験を行うと、FCS測定の際にコンフォーカルボリュームにおける粒子数は0.3〜2となり、精度よくFCS測定が行え、蛍光標識二本鎖DNAとヘリカーゼとの反応が精度良く検出できる。
【００３０】
（２）反応実験とFCS測定
図１に反応実験の手順を示す。FCS測定は各反応後に、波長633nm、出力400μWのレーザー光を1回に15秒照射する条件で3回行った。FCS測定には、MF20（オリンパス光学工業株式会社製）を用いた
（反応実験１：蛍光標識二本鎖DNAのみ）
表２に示した試薬を混合し、37℃で15分間反応させた。反応させた混合液をFCS測定用のガラスボトムプレート、例えばマイクロプレートに移し、FCS測定して並進拡散時間を求めた。
【表２】
2005080535.tif 000004
【００３１】
（反応実験２：蛍光標識二本鎖DNAとDNAヘリカーゼＩＩとの反応）
表３に示した試薬を混合し、37℃で15分間反応させた。反応させた混合液をFCS測定用のガラスボトムプレート、例えばマイクロプレートに移し、FCS測定して並進拡散時間を求めた。
【表３】
2005080535.tif 000005
【００３２】
（反応実験３：蛍光標識二本鎖DNA、DNAヘリカーゼＩＩおよびエキソヌクレアーゼＩの反応）
表４に示した試薬を混合し、37℃で15分間反応させた。反応させた混合液をFCS測定用のガラスボトムプレート、例えばマイクロプレートに移し、FCS測定して並進拡散時間を求めた。
【表４】
2005080535.tif 000006
【００３３】
（反応実験４：蛍光標識二本鎖DNAとエキソヌクレアーゼＩとの反応）
表５に示した試薬を混合し、37℃で15分間反応させた。反応させた混合液をFCS測定用のガラスボトムプレート、例えばマイクロプレートに移し、FCS測定して並進拡散時間を求めた。
【表５】
2005080535.tif 000007
【００３４】
反応実験１〜４のFCS測定の結果を表６に示す。蛍光色素のみでのFCS測定結果も合わせて示す。
【表６】
2005080535.tif 000008
【００３５】
図２に反応実験１〜４における生成物の並進拡散時間のグラフを示す。  
反応実験１では、DNAヘリカーゼＩＩもエキソヌクレアーゼＩも混合していないので、蛍光標識二本鎖DNAは変化しない。したがって、反応実験１の並進拡散時間は、未反応の蛍光標識二本鎖DNAのものである。
【００３６】
反応実験２では、反応生成物の並進拡散時間が未反応の蛍光標識二本鎖DNAの並進拡散時間より顕著に小さい。これは、二本鎖DNAがDNAヘリカーゼＩＩによって一本鎖になったことを示す。したがって、反応実験２の並進拡散時間は、蛍光標識された一本鎖DNAのものである。
【００３７】
反応実験３では、反応生成物の並進拡散時間が蛍光標識された一本鎖DNAの並進拡散時間よりもさらに顕著に小さくなった。これは、二本鎖DNAがDNAヘリカーゼＩＩによって一本鎖になり、そして一本鎖DNAがエキソネクレアーゼＩによって特異的に分解されて、短い塩基配列になったことを示す。したがって、反応実験３の並進拡散時間は、蛍光標識された短い塩基配列Aのものである。
【００３８】
反応実験４の並進拡散時間は、未反応の蛍光標識二本鎖DNAの並進拡散時間と顕著な差はなかった。これは、エキソヌクレアーゼＩが二本鎖DNAには反応しないことを示す。
【００３９】
従って、サンプル中にDNAヘリカーゼＩＩが存在するか否か検出する場合には、蛍光標識された二本鎖DNAとサンプルとを混合し、反応生成物をFCS測定して並進拡散時間を求め、その値を未反応の蛍光標識二本鎖DNAの並進拡散時間と比較するとよい。反応生成物の並進拡散時間が未反応の蛍光標識二本鎖DNAのものより顕著に小さくなっていれば、サンプル中にDNAヘリカーゼＩＩが存在していると言える。
【００４０】
また、サンプル中にDNAヘリカーゼＩＩが存在するか否か検出する場合に、蛍光標識された二本鎖DNAとサンプルとの混合液に、さらにエキソヌクレアーゼＩを混合してもよい。反応生成物の並進拡散時間が1桁小さくなっていれば、サンプル中にDNAヘリカーゼＩＩが存在してすると言える。
【００４１】
また、サンプル中にヘリカーゼ阻害剤が存在するか否か検出する場合には、蛍光標識された二本鎖DNA、DNAヘリカーゼＩＩおよびサンプルを混合し、反応生成物をFCS測定して並進拡散時間を求め、その値を未反応の蛍光標識二本鎖DNAの並進拡散時間または蛍光標識一本鎖DNAの並進拡散時間と比較するとよい。反応生成物の並進拡散時間が未反応の蛍光標識二本鎖DNAのものより顕著に小さくなっていれば、または蛍光標識一本鎖DNAの並進拡散時間と顕著な差が無ければ、二本鎖DNAとDNAヘリカーゼＩＩとの反応が行われたことになり、サンプル中にヘリカーゼ阻害剤が存在しないと言える。
【００４２】
本実施例によれば、蛍光標識二本鎖DNAとDNAヘリカーゼＩＩとの反応を、各溶液を混合して反応させ、反応生成物をFCS測定することにより、精度良く検出することができる。また、二本鎖DNA以外にゲノム、一本鎖DNA、RNAなどの核酸塩基と、DNAヘリカーゼＩＩ以外のヘリカーゼを用いて反応の有無を検出することもできる。
【００４３】
また、各溶液の混合と、蛍光相関分光法(FCS)、蛍光相互相関分光法(FCCS)、蛍光強度分布解析法（FIDA）、多項目蛍光強度分布解析法（FIMDA）または蛍光偏光解析法(FIDA-polarization)の利用により、浮遊系における反応生成物の大きさの変化、明るさの変化、数の変化をｎＭオーダーという非常に良い感度で検出することができる。
【００４４】
また、放射の測定、表面プラズモンの測定または核磁気共鳴の測定、支持体への固定などの煩雑な操作を行わずに、検出結果を簡便に短時間で得ることができる。また、固体支持体を用いないので、固定できないヘリカーゼでも反応させ解析することができる。また、抗体反応を利用しないので、抗体のないヘリカーゼでも反応させ解析することができる。
【００４５】
また、本実施例では、二本鎖DNAに蛍光標識したが、二本鎖DNAには蛍光標識せずにDNAヘリカーゼＩＩに蛍光標識して、反応実験を行ってもよい。
【００４６】
また、本発明は、自動分注機、プレートスタッカーを用いれば、大量のサンプルのスクリーニング作業にも応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本実施形態におけるタンパク質解析手順の例を示す図。
【図２】反応実験１〜４での各反応生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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