(57)【要約】【課題】ハイブリダイゼーションを高速に行う。【解決手段】ハイブリダイゼーション用基板１は、ＣＤ等の光ディスクと同様の主面が円形の平板状の形状を呈している。基板１は、中心孔２を中心に回転駆動される。基板１は、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応の場となるウェル８が表面１ａに複数個形成されている。基板１の表面は、例えば、ポリビニルカルバゾール又はポリフェナザシリン等のπ共役ユニットを含むポリマーによりコーティングされている。このため、プローブＤＮＡが伸張した状態でウェル内に固定される。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド鎖に対する化学反応を行なう基板である化学反応用基板において、
上記化学反応を行なう反応領域が基板表面に形成され、上記反応領域はπ共役ユニットを含むポリマーがコートされていること
を特徴とする化学反応用基板。
【請求項２】
上記化学反応は、上記ヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーション反応であることと特徴とする請求項１に記載の化学反応用基板。
【請求項３】
上記反応領域は、上記化学反応を検出する検出表面をさらに有し、
上記検出表面は、上記π共役ユニットを含むポリマーがコートされていることを特徴とする請求項１に記載の化学反応用基板。
【請求項４】
上記基板表面には、ヌクレオチド鎖に対する化学反応を行なう反応領域となる複数のウェルが形成され、上記ウェルの底面がπ共役ユニットを含むポリマーによりコートされていること
を特徴とする請求項１記載の化学反応用基板。
【請求項５】
上記π共役ユニットを含むポリマーは、ポリビニルカルバゾール又はポリフェナザシリンであること
を特徴とする請求項１記載の化学反応用基板。
【請求項６】
ヌクレオチド鎖に対する化学反応を行なう基板である化学反応用基板を製造する基板製造方法において、
上記化学反応を行なう反応領域を基板表面に形成し、
上記反応領域にπ共役ユニットを含むポリマーをコートすること
を特徴とする基板製造方法。
【請求項７】
プローブ用ヌクレオチド鎖とサンプル用ヌクレオチド鎖とのハイブリダイゼーションをするハイブリダイゼーション方法において、
π共役ユニットを含むポリマーがコートされた基板上に上記プローブ用ヌクレオチド鎖を含む溶液を滴下し、
滴下した溶液を乾燥させて上記ポリマー上に上記プローブ用ヌクレオチド鎖を固定し、
プローブ用ヌクレオチド鎖とサンプル用ヌクレオチド鎖とをハイブリダイゼーションをさせること
を特徴とするハイブリダイゼーション方法。
【請求項８】
上記基板には、プローブ用ヌクレオチド鎖とサンプル用ヌクレオチド鎖とのハイブリダイゼーションの場となる複数のウェルが形成され、上記ウェルの底面がπ共役ユニットを含むポリマーによりコートされていること
を特徴とする請求項７記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項９】
上記π共役ユニットを含むポリマーは、ポリビニルカルバゾール又はポリフェナザシリンであること
を特徴とする請求項７記載のハイブリダイゼーション方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えばＤＮＡチップ等の化学反応用基板及びその製造方法並びにヌクレオチド鎖をハイブリダイゼーションするハイブリダイゼーション方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡ（デオキシリボ核酸の全長又は一部）が微細配列されたいわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、ＤＮＡチップと総称する。）と呼ばれる基板が、遺伝子の突然変異、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範に活用され始めている。
【０００３】
ＤＮＡチップを用いたＤＮＡ解析手法は、細胞、組織等から抽出したｍＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ）を逆転写ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応等によって蛍光プローブｄＮＴＰを組み込みながらＰＣＲ増幅してサンプルＤＮＡを生成し、そのサンプルＤＮＡをＤＮＡチップ上に固相化（固定化）されたプローブＤＮＡに対して滴下して、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる。そして、ＤＮＡの２重らせん内に蛍光標識剤を挿入し、所定の検出器でその蛍光測定を行う。このことにより、サンプルＤＮＡとプローブＤＮＡとの塩基配列が同一であるか否かを判別する。
【０００４】
【特許文献１】
特開２００１−１６５８４０号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、一本鎖ＤＮＡは、通常の状態においては直鎖状とはならずにランダムコイル状となるので、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる場合に立体障害が大きく、効率的にハイブリダイゼーションを行うことが困難である。
【０００６】
そこで、本発明では、このような従来の課題を解決するため、簡易な構成で効率的にハイブリダイゼーションを行うことができる化学反応用基板及びその製造方法並びにハイブリダイゼーション方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
π共役ユニットを含むポリマーがコートされた基板にＤＮＡを含有した溶液を滴下して乾燥させると、ヌクレオチド鎖が基板上に伸張した状態で固定される。このように伸張して固定するのは、ポリマーのπ共役ユニットとＤＮＡの塩基対との間のπスタッキングによる作用であるものと考えられる。本発明者は、このように伸張した状態でＤＮＡが固定されることを利用して、以下のような化学反応用基板及びその製造方法並びにハイブリダイゼーション方法の発明を行った。
【０００８】
本発明に係る化学反応用基板は、ヌクレオチド鎖に対する化学反応を行なう基板である化学反応用基板であって、上記化学反応を行なう反応領域が基板表面に形成され、上記反応領域はπ共役ユニットを含むポリマーがコートされていることを特徴とする。
【０００９】
本発明に係る基板製造方法は、ヌクレオチド鎖に対する化学反応を行なう基板である化学反応用基板を製造する基板製造方法であって、上記化学反応を行なう反応領域を基板表面に形成し、上記反応領域にπ共役ユニットを含むポリマーをコートすることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明に係るハイブリダイゼーション方法は、π共役ユニットを含むポリマーがコートされた基板上に上記プローブ用ヌクレオチド鎖を含む溶液を滴下し、滴下した溶液を乾燥させて上記ポリマー上に上記プローブ用ヌクレオチド鎖を固定し、プローブ用ヌクレオチド鎖とサンプル用ヌクレオチド鎖とをハイブリダイゼーションをさせる。
【００１１】
上記の発明において、π共役ユニットを含むポリマーは、例えばポリビニルカルバゾール又はポリフェナザシリンである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態として、本発明を適用したＤＮＡ解析用のハイブリダイゼーション用基板及びこのハイブリダイゼーション用基板を用いてＤＮＡ解析を行うハイブリダイゼーション方法について説明をする。
【００１３】
（ハイブリダイゼーション用基板）
図１に本発明の実施の形態のハイブリダイゼーション用基板１の上面を模式的に表した図を示し、図２に本発明の実施の形態のハイブリダイゼーション用基板１の断面を模式的に表した図を示す。
【００１４】
ハイブリダイゼーション用基板１の全体形状は、例えばＣＤ（Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｄｉｓｋ）、ＤＶＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｄｉｓｋ）等の光ディスクと同様に、主面が円形とされた平板状となっている。ハイブリダイゼーション用基板１の主面の中心には、中心孔２が形成されている。中心孔２には、当該ハイブリダイゼーション用基板１がＤＮＡ解析装置に装着されたときに、当該ハイブリダイゼーション用基板１を保持及び回転させるためのチャッキング機構が挿入される。
【００１５】
ハイブリダイゼーション用基板１は、図２に示すように、下層側から、基板層３と、ウェル形成層４とから形成されている。なお、ハイブリダイゼーション用基板１ウェル形成層４側の表面を上面１ａ、基板層３側の表面を下面１ｂというものとする。
【００１６】
基板層３は、石英ガラス、シリコン、ポリカーボネート、ポリスチレン等の材料で形成されている。
【００１７】
ウェル形成層４は、基板層３上に形成された層である。ウェル形成層４は、ハイブリダイゼーション用基板１の上面１ａ側に開口したくぼみ状の複数のウェル８が形成された層である。
【００１８】
ウェル８は、その内部空間が、プローブＤＮＡ（検出用ヌクレオチド鎖）とサンプルＤＮＡ（標的ヌクレオチド鎖）との相互反応の場、具体的には、ハイブリダイゼーション反応の場となる。ウェル８は、サンプルＤＮＡが含まれた溶液等の液体が滴下されたときにその液体を保留することができる程度の深さ及び大きさとなっている。例えば、ウェル８は、開口部が１００μｍ四方の大きさに形成され、深さが５μｍ程度とされている。
【００１９】
このようなウェル形成層４は、図３に示すように、基板層３の上に感光性ポリミイド１１をスピンコート等で５μｍ程度の厚さに塗布する（ステップＳ１）。続いて、塗布した感光性ポリミイド１１上に所定のパターンのフォトマスク１２を形成し、このフォトマスク１２を用いて感光性ポリミイド１１を露光及び現像する（ステップＳ２）。このことにより、ウェル形成層４に複数のウェル８が形成される（ステップＳ３）。
【００２０】
ウェル形成層４は、さらに、図４に示すように、π共役ユニットを含むポリマー１５により表面がコーティングされている。π共役ユニットを含むポリマー１５は、例えば、ポリビニルカルバゾール又はポリフェナザシリン等の芳香族アミンを有するポリマーである。π共役ユニットを含むポリマー１５を例えば適切な有機溶液に溶かし、その溶液をスピンコート方式で塗布することで、ウェル形成層４上にπ共役ユニットを含むポリマー１５をコーティングすることができる。このようにウェル形成層４上を処理すると、少なくともウェル８の底面１６がπ共役ユニットを含むポリマー１５によりコートされる。
【００２１】
ここで、バッファ溶液に溶かされた一本鎖ＤＮＡを、π共役ユニットを含むポリマーによりコートされたガラス上に滴下すると、一本鎖ＤＮＡを伸張した状態でガラス上に固定することができることが知られている（参照文献：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ７ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｎａｎｏｍｅｔｅｒ−Ｓｃａｌｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＴＵ−Ｐ−１２０，  ２４−２８，  Ｊｕｎｅ  ２００２，  Ｓｗｅｄｅｎ）。ＤＮＡを伸張した状態で固定することができる理由は、ポリマーのπ共役ユニット（例えば芳香族アミン）とＤＮＡの塩基対との間のπスタッキングによる作用であるものと考えられている。
【００２２】
従って、ポリビニルカルバゾール又はポリフェナザシリン等のπ共役ユニットを含むポリマー１５によりウェル８の底面１６をコートし、溶液に含有したヌクレオチド鎖を底面１６上に滴下してその後に乾燥させると、ヌクレオチド鎖を伸張した状態で底面１６に固定させることができる。
【００２３】
また、ハイブリダイゼーション用基板１では、図１に示すように、複数のウェル８が、主面の中心から外周方向に放射状に向かう複数の列上に、例えば４００μｍ程度の間隔で等間隔に並んで配置されている。
【００２４】
また、ハイブリダイゼーション用基板１には、レーザ光を照射することにより読み取り可能なアドレスピットが形成されている。アドレスピットは、ハイブリダイゼーション用基板１の平面上における各ウェル８の位置を特定するための情報である。アドレスピットから情報を光学的に読み取ることによって、複数存在するウェル８のうち、現在レーザ光を照射している位置の１つのウェル８がどれであるかを特定することが可能となる。このようなアドレスピットが設けてあることによって、後述する滴下装置による溶液の滴下位置の制御や、対物レンズによる蛍光検出位置の特定を行うことができる。
【００２５】
以上のようなハイブリダイゼーション用基板１では、円板状に形成されているため、光ディスクシステムと同様の再生システムを利用することにより、レーザ光のフォーカシング位置を制御するためのフォーカシングサーボ制御、半径方向に対するレーザ光の照射位置や滴下装置による滴下位置の制御のための位置決めサーボ制御、並びに、アドレスピットの情報検出処理をすることができる。つまり、アドレスピットに記録してある情報内容と、そのアドレスピットの近傍にあるウェル８とを対応させておくことにより、アドレスピットの情報を読み出すことで、特定の１つのウェル８に対してのみレーザ光を照射して蛍光が発光しているウェル８の位置を特定したり、特定の１つのウェル８の位置と滴下装置との相対位置を制御して、その特定の１つのウェル８に対して溶液を滴下したりすることができる。
【００２６】
さらに、以上のようなハイブリダイゼーション用基板１では、ウェル８の底面１６がπ共役ユニットを含むポリマー１５によりコートされている。そのため、ランダムコイル状のＤＮＡを伸張して固定することができるので、ハイブリダイゼーションを高速に行うことが可能となる。
【００２７】
（ＤＮＡ解析方法）
つぎに、以上のようなハイブリダイゼーション用基板１を用いたＤＮＡ解析方法について説明をする。
【００２８】
まず、ハイブリダイゼーション用基板１をＤＮＡ解析装置に装填し、ハイブリダイゼーション用基板１を上面１ａ側が上方向となるように水平に保持するとともに、ハイブリダイゼーション用基板１を回転可能な状態にする。
【００２９】
ハイブリダイゼーション用基板１の保持及び回転は、光ディスクドライブと同様のチャッキング機構を用いて行う。
【００３０】
続いて、ハイブリダイゼーション用基板１を保持した状態で、プローブＤＮＡが含有した溶液Ｓを、図５に示すように、例えば滴下用ノズル２０を用いて所定のウェル８に対して滴下する。このとき、１つのハイブリダイゼーション用基板１を回転駆動して、特定のウェル８と滴下ノズル２０との相対位置を制御しながらプローブＤＮＡを滴下する。さらに、複数種類のプローブＤＮＡをハイブリダイゼーション用基板１のそれぞれのウェル８に滴下する。だたし、１つのウェル８内には１種類のプローブＤＮＡが入るようにする。なお、各ウェル８にいずれの種類のプローブＤＮＡを滴下するかは、予めウェルとプローブＤＮＡとの対応関係を示す配置マップ等を生成しておき、その配置マップに基づき滴下制御する。
【００３１】
溶液Ｓの滴下制御は、光ディスクの駆動システムと同様にハイブリダイゼーション用基板１を駆動制御することにより行う。すなわち、図５に示すように、ハイブリダイゼーション用基板１を上面１ａを上にして平行に保持しながら回転駆動するとともに、レーザ光Ｖをハイブリダイゼーション用基板１の例えば下側（下面１ｂ側）から照射してアドレスピットを検出することによりウェル８の位置を特定しながら、滴下位置の制御を行えばよい。
【００３２】
続いて、溶液Ｓを滴下したのちハイブリダイゼーション用基板１を乾燥させる。１つのウェル８内に滴下する溶液は微量となるので短時間で水分を蒸発させることが可能である。ウェル８内の水分を蒸発させると、ウェル８の底面１６にコートされたπ共役ユニットを含むポリマー１５上に、伸張した状態で、プローブＤＮＡが固定される。
【００３３】
続いて、生体から抽出したサンプルＤＮＡが含有した溶液Ｓ´を滴下ノズル２０を用いてハイブリダイゼーション用基板１上の各ウェル８に滴下する。
【００３４】
続いて、サンプルＤＮＡの滴下後、周囲の温度を６０度Ｃ程度に維持して、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる。
【００３５】
このような処理をすると、プローブＤＮＡが伸張して固定されている状態から、立体障害が少ない状態で溶液Ｓ´中に溶け出すので、サンプルＤＮＡとのハイブリダイゼーションを効率的に行うことが可能となる。この結果、互いの塩基配列が相補的な関係にあるサンプルＤＮＡとプローブＤＮＡとが同一のウェル８内にある場合には、それらがハイブリダイゼーションを起こす。
【００３６】
続いて、ハイブリダイゼーションを起こさせた後に、蛍光標識インターカレータ等（例えば、ＰＯＰＯ−１，ＴＯＴＯ−１）をハイブリダイゼーション用基板１のウェル８内に滴下する。このような蛍光標識剤は、ハイブリダイゼーションを起こしたプローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとの二重らせん間に挿入して結合する。
【００３７】
続いて、光ディスクの駆動システムと同様にハイブリダイゼーション用基板１を駆動制御することにより、ウェル８からの蛍光の検出を行う。すなわち、ハイブリダイゼーション用基板１を保持しながら回転駆動するとともに、レーザ光Ｖをハイブリダイゼーション用基板１の下側（下面１ｂ側）から照射してアドレスピットを検出することによりウェル８の位置を特定する。それと同時に、励起光をハイブリダイゼーション用基板１の下側（下面１ｂ側）から照射して、その励起光に応じて生じる蛍光をやはり下面１ｂ側から検出する。そして、どのウェル８から蛍光が発生されているか否かを検出する。
【００３８】
続いて、ハイブリダイゼーション用基板１上の蛍光が発生していたウェル８の位置を示すマップ作成する。そして、その作成したマップ、並びに、各ウェル８にどのような塩基配列のプローブＤＮＡが滴下されていたかを示す配置マップに基づき、サンプルＤＮＡの塩基配列の解析を行う。
【００３９】
以上のようなハイブリダイゼーション用基板１を用いたＤＮＡ解析方法では、π共役ユニットを含むポリマー１５にプローブＤＮＡを滴下して伸張させるので、サンプルＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションを高速に行うことが可能となる。
【００４０】
【発明の効果】
本発明に係るハイブリダイゼーション用基板は、プローブ用ヌクレオチド鎖とサンプル用ヌクレオチド鎖とのハイブリダイゼーションの場が基板表面に形成され、その場にπ共役ユニットを含むポリマーがコートされている。また、本発明に係るハイブリダイゼーション方法は、π共役ユニットを含むポリマーがコートされた基板上に上記プローブ用ヌクレオチド鎖を含む溶液を滴下し、滴下した溶液を乾燥させて上記ポリマー上に上記プローブ用ヌクレオチド鎖を固定し、プローブ用ヌクレオチド鎖とサンプル用ヌクレオチド鎖とをハイブリダイゼーションをさせる。
【００４１】
このことにより本発明では、プローブ用ヌクレオチド鎖を上記ポリマー上に伸張して固定し、その後にサンプル用ヌクレオチド鎖とハイブリダイゼーションさせる。従って、本発明では、簡易な構成で効率的にハイブリダイゼーションを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態のハイブリダイゼーション用基板の平面図である。
【図２】本発明の実施の形態のハイブリダイゼーション用基板の断面図である。
【図３】ハイブリダイゼーション用基板のウェルを形成する工程を示した図である。
【図４】π共役ユニットを有するポリマーが表面にコーティングされたウェルを示す図である。
【図５】ハイブリダイゼーション用基板に対して溶液の滴下制御を説明するための図である。
【符号の説明】
１  ハイブリダイゼーション用基板、２  中心孔、３  基板層、４  ウェル形成層、８  ウェル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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