(57)【要約】【課題】  高密度で効率良くプローブを固相表面にスポッティングする方法を提供する。【解決手段】  プローブを含む液体をインクジェット法により液滴として固相に付着させて、プローブを含むスポットを固相上に形成する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相表面の複数の箇所に独立して、標的物質に対して特異的に結合可能であるプローブを有するプローブアレイの製造方法であって、
表面にパターン状に配置された遮光性のマトリクスで区画され、パターン状に露出してなる表面の部位を複数備えた固相を準備し、該プローブを含む複数種類の異なる液体をインクジェット法を用いて前記露出してなる表面部位にそれぞれ供給し、付着させる工程
を有することを特徴とするプローブアレイの製造方法。
【請求項２】
該マトリクスが樹脂を含む請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
該マトリクスの表面が疎水性である請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
該ウェルの底面が親水性である請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
該ウェルの最長幅が２００μｍである請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
該マトリクスの幅が、該ウェルの最長幅の１／２〜２倍である請求項１記載の製造方法。
【請求項７】
該マトリクスの厚さが１〜２０μｍである請求項１記載の製造方法。
【請求項８】
該マトリクスパターンを、フォトリソグラフィー法によって形成する請求項１記載の製造方法。
【請求項９】
該フォトリソグラフィー法が、該基板の第１の表面に樹脂層を形成し、該樹脂層上にフォトレジスト層を形成し、該フォトレジスト層を該マトリクスパターンに対応するようにパターン状に露光し、現像してフォトレジストのパターンを該樹脂層上に形成する工程；及び該フォトレジストのパターンをマスクとして該樹脂層をパターニングした後、該フォトレジストのパターンを除去する工程、を有する請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
該フォトリソグラフィー法が、該基板の第１の表面に感光性樹脂層を形成し、該感光性樹脂層を該マトリクスパターンに対応するようにパターン状に露光し、現像する工程を有する請求項８記載の製造方法。
【請求項１１】
該感光性樹脂層が、ＵＶレジスト、ＤＥＥＰ−ＵＶレジスト、または紫外線硬化樹脂を含むものである請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
該ＵＶレジストが、環化ポリイソプレン−芳香族ビスアジド系レジスト、フェノール樹脂−芳香族アジド化合物系レジスト、またはノボラック樹脂−ジアゾナフトキノン系レジストである請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
該ＤＥＥＰ−ＵＶレジストが放射線分解型レジストまたは溶解抑制剤系レジストである請求項１１記載の製造方法。
【請求項１４】
該放射線分解型ポリマーレジストが、ポリメチルメタクリレート、ポリメチレンスルホン、ポリヘキサフルオロブチルメタクリレート、ポリメチルイソプロペニルケトンまたは臭化ポリ−１−トリメチルシリルプロピンから選ばれる少なくとも１つである請求項１３記載の製造方法。
【請求項１５】
該溶解抑制剤系レジストが、コール酸ｏ−ニトロベンジルエステルである請求項１３記載の製造方法。
【請求項１６】
該ＤＥＥＰ−ＵＶレジストがポリビニルフェノール−３，３’−ジアジドジフェニルスルホンまたはメタクリル酸グリシジルである請求項１１記載の製造方法。
【請求項１７】
該感光性樹脂層のパターニングによって形成したマトリクスパターンを、更にポストベークして該マトリクスパターンの撥水性を向上させる請求項１記載の製造方法。
【請求項１８】
該プローブが有する官能基と共有結合を形成可能な官能基を該固相表面に、該ウェルの形成に先立って導入する請求項１記載の製造方法。
【請求項１９】
該プローブが有する官能基と共有結合を形成可能な官能基を該固相表面に、該ウェルの形成後に導入する請求項１記載の製造方法。
【請求項２０】
該固相表面に、該官能基を導入するための化合物を含む溶液を該ウェルに付与する請求項１９記載の製造方法。
【請求項２１】
表面がパターン状に配置された遮光性のマトリクスで区画され、パターン状に露出してなる表面の部位を複数備える固相と、前記露出してなる表面部位のそれぞれに固着され、互いに種類が異なる複数のプローブと、を有することを特徴とするプローブアレイ。
【請求項２２】
該固相が光学的に透明である請求項２１記載のプローブアレイ。
【請求項２３】
該マトリクスが樹脂を含む請求項２１記載のプローブアレイ。
【請求項２４】
前記パターン状に露出してなる表面の部位にのみ該プローブが付着している請求項２１記載のプローブアレイ。
【請求項２５】
該マトリクスの厚さが１〜２０μｍである請求項２１記載のプローブアレイ。
【請求項２６】
前記パターン状に露出してなる表面の部位の最長幅が２００μｍである請求項２１記載のプローブアレイ。
【請求項２７】
前記パターン状に露出してなる表面の部位の間隔が、該部位の最長幅の１／２〜２倍である請求項２１記載のプローブアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプローブを固相にスポッティングする方法、プローブアレイ、その製造方法、そしてプローブアレイを用いた標的一本鎖核酸の検出方法、及び標的一本鎖核酸の塩基配列の特定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の塩基配列の決定やサンプル中の標的核酸の検出、各種細菌の同定を迅速、正確に行ない得る技術の一つとして、例えば該標的核酸と特異的に結合し得る物質、いわゆるプローブを固相上に多数並べたプローブアレイの使用が提案されている。
【０００３】
このようなプローブアレイの一般的な製造方法としては、例えばヨーロッパ特許第３７３２０３号公報（ＥＰ０３７３２０３Ｂ１）に記載されている様に（１）固相上で核酸プローブを合成していく方法、や（２）予め合成した核酸プローブを固相上に供給する方法等が知られている。上記の（１）の方法の詳細が開示されている先行技術としては例えば米国特許第５４０５７８３号公報（ＵＳＰ５４０５７８３）が挙げられる。
【０００４】
また上記（２）の方法としては、例えば米国特許第５６０１９８０号公報（ＵＳＰ５６０１９８０）や「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、第２７０巻、４６７頁、（１９９５）にはマイクロピペッティングを用いてｃＤＮＡをアレイ状に並べる方法が開示されている。
【特許文献１】欧州特許第３７３２０３号明細書
【特許文献２】米国特許第５４０５７８３号明細書
【特許文献３】米国特許第５６０１９８０号明細書
【非特許文献１】サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２７０巻、４６７頁、（１９９５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで上記（１）の方法は、固相上で直接核酸プローブを合成させている為、予め核酸プローブを合成する必要がない。しかし固相上で合成されたプローブ核酸を精製することは困難である。プローブアレイを用いた核酸塩基の配列決定や、サンプル中の標的核酸の検出等の精度は、核酸プローブの塩基配列の精度に大きく依存する。従って上記（１）の方法は、より高品質なプローブアレイの製法としては核酸プローブの精度の向上に更なる改良が求められるところである。
【０００６】
一方、上記（２）の方法は、核酸プローブの固相への固定に先立って核酸プローブの合成ステップが必要となる反面、固相への結合に先立って核酸プローブを精製することができる。この理由により現段階においては、より高品質なプローブアレイの製法としては上記（２）の方法は、上記（１）の方法よりも好ましいと考えられる。しかし上記（２）の方法の課題は、核酸プローブを固相に高密度にスポッティングする方法にある。例えばプローブアレイを用いて核酸の塩基配列決定を行なう場合、できる限り多種の核酸プローブを固相上に配置しておくことが好ましい。また遺伝子の変異の検出を効率的に行なう場合には、それぞれの変異に対応した配列を有する核酸プローブを固相上に配置させておく事が好ましい。さらに、サンプル中の標的核酸の検出や、遺伝子の変異、欠損の検出に当たっては、被験者からのサンプルの採取、具体的には血液等の採取はできる限り少量に止めておくことが好ましく、よって少量の検体でできる限り多くの塩基配列の情報を獲得できることが好ましい。これらの点から考えるとプローブアレイには例えば、１インチ角に１００００以上の核酸プローブが配置されていることが好ましい。
【０００７】
本発明者らはこのような状況の下で種々検討を行なった結果、インクジェット吐出技術を用いて、極めて高密度にプローブをスポッティングすることが出来ることを見出し本発明を為すに至った。そして本発明の目的は、極めて微量のプローブを、該プローブに損傷を与える事なく且つ効率的に固相上に正確にスポッティングする方法を提供することにある。また本発明の他の目的は、少量の検体からでも核酸に関するより多くの情報をより正確に検査可能なプローブアレイを提供することにある。また本発明の更に他の目的は、プローブが固相上に多数結合しているプローブアレイを、プローブを損傷することなく、また効率良く製造する方法を提供することにある。更に本発明の他の目的は、サンプル中に含まれている可能性のある標的物質を効率的に検出する方法を提供することにある。更にまた本発明の他の目的は、少量の検体からでも標的物質の構造に関する情報を獲得可能な標的物質の構造の特定化方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のプローブアレイの製造方法は、固相表面の複数の箇所に独立して、標的物質に対して特異的に結合可能であるプローブを有するプローブアレイの製造方法であって、
表面にパターン状に配置された遮光性のマトリクスで区画され、パターン状に露出してなる表面の部位を複数備えた固相を準備し、該プローブを含む複数種類の異なる液体をインクジェット法を用いて前記露出してなる表面部位にそれぞれ供給し、付着させる工程
を有することを特徴とするプローブアレイの製造方法である。
【０００９】
また、本発明のプローブアレイは、表面がパターン状に配置された遮光性のマトリクスで区画され、パターン状に露出してなる表面の部位を複数備える固相と、前記露出してなる表面部位のそれぞれに固着され、互いに種類が異なる複数のプローブと、を有することを特徴とするプローブアレイである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によればインクジェット技術を用いることによって固相上にプローブを含むスポットを、該プローブにダメージを与えることなしに、且つサテライトスポットを生じさせることなしにスポッティングすることができる。またこの方法を用いることによってプローブスポットを互いに独立に、且つ高密度に備えた高品質なプローブアレイを効率良く製造することができる。更に本発明によれば少量の検体からでも標的物質に関するより多くの情報を、より正確に検査可能なプローブアレイを得ることができ、またそれを用いることでサンプル中に標的物質が存在するか否かをより正確、且つ迅速に判定できる。同様にこのプローブアレイを用いることでサンプル中の標的物質の構造をより正確に、且つ迅速に特定することができる。
【００１１】
また本発明によれば、プローブアレイの固相として表面にマトリクスパターンを形成し、ウェルを設けた固相を用いることで、固相へのプローブ溶液の供給、若しくは固相へのサンプルの供給の多少の位置ずれにも対処することができる。またマトリクスに種々の機能を担持させることで標的物質の検出、構造の特定等のより一層の高精度化が可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
上記の目的を達成することのできる、本発明のプローブの製造方法に利用されるスポッティング方法は、標的物質に対して特異的に結合可能であるプローブを含む液体をインクジェット法により固相表面に供給し、該固相表面に付着させる工程を有し、該固相表面と該プローブとは、各々官能基を有し、該官能基同士は互いに反応するものであるスポティング方法である。
【００１３】
上記態様にかかるスポッティング方法を用いることによってプローブを固相上に正確に、且つ効率的に付与することができ、プローブアレイを効率的に製造することが出来るものである。
【００１４】
従って、本発明にかかるプローブアレイの製造方法は、固相表面の複数の箇所に独立して、標的物質に対して特異的に結合可能であるプローブを有するプローブアレイの製造方法であって、表面にパターン状に配置された遮光性のマトリクスで区画され、パターン状に露出してなる表面の部位を複数備えた固相を準備し、該プローブを含む複数種類の異なる液体をインクジェット法を用いて前記露出してなる表面部位にそれぞれ供給し、付着させる工程を有することを特徴とするプローブアレイの製造方法である。
【００１５】
更に、本発明のプローブアレイは、本発明のプローブアレイは、表面がパターン状に配置された遮光性のマトリクスで区画され、パターン状に露出してなる表面の部位を複数備える固相と、前記露出してなる表面部位のそれぞれに固着され、互いに種類が異なる複数のプローブと、を有することを特徴とするプローブアレイである。
【００１６】
上記の製造方法により得られるプローブアレイの一実施態様は、固相表面の複数の部位に互いに独立しているプローブのスポットを１平方インチ内に１００００個以上の密度で備えていることを特徴とするものである。上記態様にかかるプローブアレイによればスポットを極めて高密度に有していることから、少量の検体からでも多くの情報を得ることができる。
【００１７】
また本発明のプローブアレイの製造方法では、固相表面の複数の箇所に独立して、標的物質に対して特異的に結合可能であるプローブを含むスポットを有するプローブアレイを製造するに際して、該プローブを含む液体をインクジェット法を用いて該固相表面の所定の位置に供給し、付着させる工程を有する。この方法によればプローブを損なうことなしにスポットが高密度に配置されたプローブアレイを効率的に製造することができるものである。
【００１８】
また上記の目的を達成することのできる、本発明の一実施態様にかかる標的物質の検出方法は、サンプル中に含まれている可能性のある標的物質に対して特異的に結合するプローブを固相上に互いに独立した複数のスポットとして有するプローブアレイの各々のスポットと該サンプルとを接触させ、該固相上にて該標的物質及びプローブとの反応物を検出して該サンプル中の該標的物質の有無を検出する方法において、該スポットの各々が、該プローブを含む液体をインクジェット法によって固相上にスポッティングすることによって形成されたものであることを特徴とするものである。この態様によれば標的物質を効率的に検出することができるものである。
【００１９】
更に上記の目的を達成することのできる標的物質の構造の特定化方法は、試料中に含まれる標的物質の構造を特定する方法であって、固相表面に該特定の物質に対して特異的に結合するプローブのスポットを備えたプローブアレイを用意する工程；該試料を該スポットに接触させる工程；及び該標的物質と該プローブとの結合を検出する工程、を有することを特徴とするものである。この態様を用いることによって少量の検体からでも該検体中の標的物質の構造、例えば標的物質が一本鎖核酸の場合にはその塩基配列の特定を効率的に行なうことができるものである。
【００２０】
なおＵＳＰ５６０１９８０号公報には核酸プローブのスポッティングにはコンベンショナルなインクジェット技術を用いることは適当でないと認定されている。即ちＵＳＰ５６０１９８０号公報の第２欄の第３１行〜第５２行目には、圧力波（pressure wave）によって少量のインクを吐出させるインクジェットプリンタ技術の利用が適当でないと記載され、その理由としてインク吐出の為の圧力波がインク温度の急激な温度上昇を招き、核酸プローブに損傷を与える可能性が有り、また吐出時のインクの飛び散りが隣接する核酸プローブのスポット同士のコンタミネーションを引き起こす危険性を挙げている。その上でＵＳＰ５６０１９８０号公報においては、ガス圧を利用してマイクロピペットの先端に核酸プローブを含む液体の滴を、該滴のサイズをモニターしつつ形成させ、所定のサイズに達した時点で圧力印加を止め、該滴を固相上に供給してプローブアレイを製造する方法を開示している。
【００２１】
またＵＳＰ５４７４７９６号公報には、固相表面に疎水性及び親水性のマトリクスを形成し、その親水性部分に４種類の塩基をピエゾエレクトリックインパルスジェットポンプ装置（Piezoelectric Impulse Jet Pump Apparatus）を用いて順次吐出せしめて、オリゴヌクレオチドアレイを製造すること、そしてそれを用いて標的核酸の塩基配列を決定する方法が開示されている。
【００２２】
しかしこれらの先行技術には、予め所定の長さの塩基配列を有する核酸プローブをインクジェット技術を用いて吐出させて、核酸プローブを高密度に、且つ正確に配列せしめる技術については何ら開示されていない。
（プローブアレイ製法概略）
図１及び図２は本発明に係るプローブアレイ、例えば核酸プローブアレイの製造方法の概略説明図である。図１において１０１は吐出液としてのプローブ、例えば核酸プローブを含む液体を吐出可能に保持している液体供給系（ノズル）、１０３は該核酸プローブが結合されるべき固相（例えば透明ガラス板等）、１０５はインクジェットヘッドの一種である、該液体に熱エネルギーを付与して吐出させる機構を備えるバブルジェットヘッドである。１０４はバブルジェットヘッド１０５から吐出された核酸プローブを含む液体である。また図２は、図１のバブルジェットヘッド１０５のＡ−Ａ線断面図であり、図２において１０５はバブルジェットヘッド、１０７は吐出されるべき核酸プローブを含む液体、そして１１７は該液体に吐出エネルギーを付与する発熱部を有する基板部分である。基板部分１１７は、酸化シリコン等で形成されている保護膜１０９、アルミニウム等で形成されている電極１１１−１、１１１−２、ニクロム等で形成されている発熱抵抗体層１１３、蓄熱層１１５及び放熱性の良好なアルミナ等で形成されている支持体１１６を含んでいる。
【００２３】
核酸プローブを含む液体１０７は吐出オリフィス（吐出口）１１９まできており、所定の圧力によってメニスカス１２１を形成している。ここで電極１１１−１、１１１−２に電気信号が加わると、１２３で示す領域（発泡領域）が急激に発熱し、ここに接している液体１０７に気泡が発生し、その圧力でメニスカスが吐出し、オリフィス１１９から液体１０７が吐出し、固相１０３の表面に向って飛翔する。このような構造を備えるバブルジェットヘッドを用いて吐出可能な液体の量は、そのノズルのサイズ等によって異なるが、例えば４〜５０ピコリットル程度に制御することが可能であり、高密度に核酸プローブを配置させる手段として極めて有効である。
【００２４】
（吐出液と固相の関係）
（固相上でのスポット直径）
核酸プローブの固相上での密度を上記した様な値（例えば１インチ各に１００００個以上、上限としては１×１０6 個程度）にするためには各々の核酸プローブのスポット径は、例えば２０〜１００μｍ程度であることが好ましく、また互いのスポットが互いに独立していることが好ましい。そしてこのようなスポットは、バブルジェットヘッドから吐出される液体の特性、及び該液体が付着する固相の表面特性等によって決定される。
【００２５】
（吐出液の特性）
吐出用の液体としては、バブルジェットヘッドから吐出可能であって、且つヘッドから吐出された該液体が固相上の所望の位置に着弾し、更に核酸プローブとの混合状態、及び吐出時において該核酸プローブが損傷を受けなければいかなる液体でも用いることができる。
【００２６】
そしてバブルジェットヘッドからの吐出性という観点からは、該液体の特性としては例えば、その粘度が１〜１５ｃｐｓ、表面張力が３０ｄｙｎ／ｃｍ以上が好ましい。また粘度を１〜５ｃｐｓ、表面張力を３０〜５０ｄｙｎ／ｃｍとした場合、固相上での着弾位置が極めて正確なものとなり特に好適に用いられる。
【００２７】
次に該液体のインクジェット吐出特性、及び液体中及びバブルジェット吐出時の核酸プローブの安定性を考慮すると、液体中には例えば２ｍｅｒ〜５０００ｍｅｒ、特には２ｍｅｒ〜６０ｍｅｒの核酸プローブを、０．０５〜５００μＭ、特には２〜５０μＭの濃度で含有させることが好ましい。
【００２８】
（吐出液組成）
バブルジェットヘッドから吐出される液体の組成としては、上記した様に核酸プローブと混合したとき、及びバブルジェットヘッドから吐出させたときに核酸プローブに対して影響を実質的に与えないものであって、且つバブルジェットヘッドを用いて固相に対して正常に吐出可能である液体組成が好ましい条件を満たせば、特に限定されるものでないが、例えばグリセリン、尿素、チオジグリコール又はエチレングリコール、イソプロピルアルコール及び下記式（Ｉ）で示されるアセチレンアルコールを含む液体は好ましいものである。
【００２９】
【化１】
2005118049.tif 000002
【００３０】
（上記式（Ｉ）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4はアルキル基、具体的には例えば炭素数１〜４の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基を表わし、ｍ及びｎは各々整数を表わし、ｍ＝０且つｎ＝０、もしくは１≦ｍ＋ｎ≦３０であって、ｍ＋ｎ＝１の場合はｍまたはｎは０である。）
更に具体的には尿素を５〜１０ｗｔ％、グリセリンを５〜１０ｗｔ％、チオジグリコールを５〜１０ｗｔ％、及び上記式（Ｉ）で示されるアセチレンアルコールを０．０２〜５ｗｔ％、より好ましくは０．５〜１ｗｔ％を含む液体が好適に用いられる。
【００３１】
この液体を用いた場合、バブルジェットヘッドから核酸プローブを含む液体を吐出させて固相上に付着させたときのスポットの形状が円形で、また吐出された範囲が広がることがなく、高密度に核酸プローブをスポッティングした場合にも、隣接するスポットとの連結を有効に抑えることができる。更に固相上にスポッティングされた核酸プローブの変質も認められない。なお本発明の核酸プローブアレイの製造に用いる液体の特性は上記のものに限定されるものではない。例えば固相表面に、バブルジェットヘッドで固相上に付与した液体が、該固相上で広がり、そして隣接するスポットとの間で混合してしまうのを防ぐような、ウェルのような構造を設けた場合には、液体の粘度や表面張力、更には核酸プローブの塩基長や濃度も上記の範囲外であっても用いることができる。
【００３２】
（固相と核酸の官能基の種類）
固相上に付着せしめた核酸プローブのスポットを更に限定された位置に止めさせ、隣接するスポットとのコンタミネーションをより確実に防ぐ為に有効であり、かつ核酸プローブを固相上に強固に結合させるのに有効な手段として、核酸プローブと固相との双方に互いに反応可能な官能基を結合させる方法が挙げられる。
【００３３】
（ＳＨ基とマレイミド基）
好ましい例としては例えば、マレイミド基とチオール（−ＳＨ）基との組合わせを用いる例が挙げられる。即ち核酸プローブの末端にチオール（−ＳＨ）基を結合させておき、固相表面がマレイミド基を有するように処理しておくことで、固相表面に供給された核酸プローブのチオール基と固相表面のマレイミド基とが反応して核酸プローブを固定化し、その結果核酸プローブのスポットを固相上の所定の位置に形成することができる。特に末端にチオール基を有する核酸プローブを上記した組成の液体に溶解させたものをバブルジェットヘッドを用いてマレイミド基を導入した固相表面に付与した場合、核酸プローブ溶液は固相上に極めて小さなスポットを形成する。その結果、核酸プローブの小さなスポットを固相表面の所定の位置に形成することができる。この場合、固相表面に例えば親水性及び疎水性のマトリクスからなるウェルを形成し、スポット間の連結を防止する様な構成を予め設けておく必要性は認められない。
【００３４】
例えば塩基長１８ｍｅｒの核酸プローブを濃度８μＭで含む、粘度や表面張力が前記した範囲内となるように調整した液体を、バブルジェットプリンタ（商品名：ＢＪＣ６２０；キヤノン（株）社製、但し平板に印字可能に改造したもの）を用いて、固相とバブルジェットヘッドのノズルの間隔を１．２〜１．５ｍｍ程度に設定し、該ノズルから吐出させた場合（吐出量は約２４ピコリットル）、固相上には直径約７０〜１００μｍ程度のスポットを形成することができ、また液体が固相表面に着弾したときの飛沫に由来するスポット（以降「サテライトスポット」と称する）は目視では全く認められなかった。該固相上のマレイミド基と核酸プローブ末端のＳＨ基との反応は、吐出される液体の条件にもよるが、室温（２５℃）下で３０分程度で完了する。なおこの時間は液体の吐出にピエゾジェットヘッドを用いた場合と比較して短い。その理由は明らかでないが、バブルジェット法ではその原理によりヘッド内の核酸プローブを含む液体の温度が上昇し、その結果マレイミド基とチオール基の反応効率が上昇して反応時間が短縮されるものと考えられる。
【００３５】
なお、マレイミド基とチオール基との組合せを用いる場合、核酸プローブを含む溶液にチオジグリコールを含有させることが好ましい。チオール基は中性及び弱アルカリ性条件下ではジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を形成し、二量体をなることがある。しかし、チオジグリコールを加えることで、二量体形成によるチオール基とマレイミド基との反応性の低下を防ぐことができる。
【００３６】
固相表面へのマレイミド基の導入方法としては、種々の方法が利用できるが、例えばガラス基板にアミノシランカップリング剤を反応させ、次にそのアミノ基と下記構造式で示されるＮ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシイミド（N-(6-Maleimidocaproyloxy）succinimide）を含む試薬（ＥＭＣＳ試薬：Ｄｏｊｉｎ社製）とを反応させることで可能である。
【００３７】
【化２】
2005118049.tif 000003
【００３８】
またチオール基が結合した核酸プローブは、例えばＤＮＡ自動合成機を用いてＤＮＡを自動合成する際に５'末端の試薬として５'−Ｔｈｉｏｌ−ＭｏｄｉｆｉｅｒＣ６（Glen Research社製）を用いる事により合成することができ、通常の脱保護反応の後、高速液体クロマトグラフィーにより精製することで得られる。
【００３９】
（アミノ基とエポキシ基）
固定化に利用する官能基の組合わせとしては、上記したチオール基とマレイミド基の組合わせ以外にも、例えばエポキシ基（固相上）とアミノ基（核酸プローブ末端）の組合わせ等が挙げられる。固相表面へのエポキシ基の導入は、例えばエポキシ基を有するポリグリシジルメタクリレートを樹脂からなる固相表面に塗布したり、エポキシ基を有するシランカップリング剤をガラス製の固相表面に塗布してガラスと反応させる方法等が挙げられる。
【００４０】
上記したように固相表面と一本鎖核酸プローブの末端とに互いに反応して共有結合を形成するような官能基を導入した場合、該核酸プローブと固相とがより強固に結合される。また該核酸プローブの固相との結合部位を常に末端とすることができる為、各々のスポットでの核酸プローブの状態を均一にすることができる。その結果各々のスポットにおける核酸プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションの条件が揃うこととなり、より一層精度の向上した標的核酸の検出や塩基配列の特定が可能となるものと考えられる。更に末端に官能基のついた核酸プローブと固相とを共有結合させる事は、非共有結合（例えば静電的な結合等）によって固相上に固定した核酸プローブに比べ、配列や長さの違いによるプローブＤＮＡの結合量の差を生じることなく定量的にプローブアレイを作製できる。更にまた核酸の塩基配列部分が全てハイブリダイゼーション反応に寄与する為、ハイブリダイゼーション反応の効率を著しく上昇させる事ができる。また一本鎖核酸プローブの標的核酸とのハイブリダイゼーションに関与する部分と固相との反応に関与する官能基との間にリンカー部分として例えば炭素数１〜７程度のアルキレン基を導入しておいても良い。これによって固相に核酸プローブを結合させたときに該固相表面と該核酸プローブとの間に所定の距離を設けることができ、核酸プローブと標的核酸との反応効率のより一層の向上が期待できる。
【００４１】
（アレイの製法）
次に本発明に係るプローブアレイの製造方法の、現状における最も好ましい態様の一つについて説明する。まず核酸プローブを分散させる液体としてグリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、上記一般式（Ｉ）で示される構造のアセチレンアルコール（例えば商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１ｗｔ％を含む液体を用意する。次に末端にチオール基が結合している、長さが例えば２〜５０００ｍｅｒ程度、特には２〜６０ｍｅｒ程度の一本鎖核酸プローブをＤＮＡ自動合成機を用いて合成する。次いでこの核酸プローブを上記液体に、例えば濃度が０．０５〜５００μＭ、特には２〜５０μＭの範囲で、該液体の粘度が１〜１５ｃｐｓ、特には１〜５ｃｐｓ、また表面張力が３０ｄｙｎ／ｃｍ以上、特には３０〜５０ｄｙｎ／ｃｍとなるように混合し、吐出用の液体とする。そしてこの吐出用液体を例えばバブルジェットヘッドのノズル内に充填する。また固相には上記の方法に従って表面にマレイミド基を導入しておく。そして該固相と該バブルジェットヘッドを、該固相のマレイミド基が結合している面とバブルジェットヘッドのノズル面との距離が１．２〜１．５ｍｍ程度にまで近接させ、該バブルジェットヘッドを駆動させて該液体を吐出させる。ここで吐出条件としては固相上のスポットが互いに連結することがないような印字パターンに設定することが好ましい。例えばスポッティングに用いるバブルジェットヘッドの解像度が３６０×７２０ｄｐｉの場合には、３６０ｄｐｉの方向には１回吐出後２回空吐出させ、７２０ｄｐｉの方向には１回吐出後５回空吐出させるという条件でスポッティングした場合、各々のスポット間のスペースは約１００μｍとなり、隣接するスポットとのコンタミネーションを十分に防ぐことが可能である。
【００４２】
次いで固相上のマレイミド基と液体中の核酸プローブのチオール基の反応が進み、該核酸プローブが固相に確実に固定されるまで該固相を例えば加湿チャンバー内に静置する。この時間は上記したように例えば室温（約２５℃）で３０分程度で十分である。その後固相上にあって未反応の核酸プローブを洗い流して核酸プローブアレイが得られる。
【００４３】
ここでこの核酸プローブアレイを用いて、例えば標的核酸の検出等を行なう場合の検出精度（Ｓ／Ｎ比）の向上を図ることを目的として、該核酸プローブを固相表面に固定した後、該固相の核酸プローブ非結合部分がサンプル中に含まれる標的核酸等と結合しないようにブロッキングを行なうことが好ましい。ブロッキングは例えば、該固相を２％ウシ血清アルブミン水溶液中に、例えば２時間程度浸したり、固相表面の核酸プローブと結合していないマレイミド基を分解させることによって可能である。例えばＤＴＴ（ジチオスレイトール）、β−メルカプトエタノール等を用いても可能である。しかし、標識ＤＮＡの吸着を防ぐ効果からすると、ウシ血清アルブミン水溶液が最も適する。尚このブロッキングの工程は必要に応じて行なえば良く、例えばサンプルの該プローブアレイへの供給を各々のスポットに対して限定的に行ない、スポット以外の部位へのサンプルの付着が実質的にない場合には行なわなくても良い。また固相に予めウェルが形成され、そのウェル以外の部分が核酸プローブが付着し難い様に加工されている場合にもブロッキングの工程を省略することができる。
【００４４】
この様にして作製するプローブアレイはその用途に応じて、例えば同じ核酸プローブを含む複数のスポットを有するように構成してもよく、また異種の核酸プローブを各々含む複数のスポットを有する様に構成してもよい。そしてこの様な方法によって核酸プローブが高密度に配置されたプローブアレイは、その後標的一本鎖核酸の検出や、塩基配列の特定等に用いられる。例えばサンプル中に含まれている可能性のある、塩基配列が既知の標的一本鎖核酸の検出に用いる場合には、該標的一本鎖核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸をプローブとして用い、該プローブを含む複数のスポットが固相上に配置されているプローブアレイを用意し、該プローブアレイの各々のスポットに、サンプルを供給して該標的一本鎖核酸と核酸プローブとがハイブリダイズするような条件下に置いた後、各々のスポットにおけるハイブリッドの有無を蛍光検出等の既知の方法で検出する。それによってサンプル中の標的物質の有無の検出を行なうことができる。またサンプル中に含まれている標的一本鎖核酸の塩基配列の特定に用いる場合には、該標的一本鎖核酸の塩基配列の複数の候補を設定し、該塩基配列群に対して各々相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸をプローブとして該固相にスポッティングする。次いで各々のスポットにサンプルを供給して該標的一本鎖核酸と核酸プローブとがハイブリダイズするような条件下に置いた後、各々のスポットにおけるハイブリッドの有無を蛍光検出等の既知の方法で検出する。これにより標的一本鎖核酸の塩基配列の特定を行なうことができる。また本発明に係わるプローブアレイの他の用途としては、例えばＤＮＡ結合蛋白質が認識する特異的な塩基配列のスクリーニングやＤＮＡに結合する性質を有する化学物質のスクリーニングへの適用が考えられる。
【００４５】
（インクジェットヘッドの種類）
なお上記の説明においては、核酸プローブの固相への付与をバブルジェットヘッドで行なう構成のみを説明したが、本発明においてはピエゾ素子の振動圧を利用してノズル内の液体を吐出せしめるピエゾジェットヘッドを用いることも可能である。しかし前記した様にバブルジェットヘッドを用いた場合、固相への結合反応が短時間で完了し、またＤＮＡの二次構造も熱により解消されるため、次に続くハイブリダイゼーション反応の効率をも上昇させることができるという点で、バブルジェットヘッドは本発明にとってより好適に用いられるインクジェットヘッドである。
【００４６】
更に２以上のスポット間で含有される核酸プローブが異なる様に複数のヘッドを備えたインクジェットヘッドを用いて複数のスポットを同時に固相上に形成しても良い。
（ＰＮＡ／ＤＮＡ）
ここまで、プローブの一例として核酸プローブを用いて本発明を説明した。核酸プローブの例としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）プローブ、リボ核酸（ＲＮＡ）プローブ及びペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを含むものである。ＰＮＡはＤＮＡに含まれる４種の塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン）が糖−リン酸エステル主鎖ではなくてペプチド主鎖に結合し、下記式（ＩＩ）に示される様な構造を有する合成オリゴヌクレオチドである。
【００４７】
【化３】
2005118049.tif 000004
【００４８】
（式中「Ｂａｓｅ」はＤＮＡを構成する４種類の塩基（アデニン、シトシン、チミン、グアニン）の何れかを示す。またｐはＰＮＡの塩基長を表わす。）
ＰＮＡは、例えばｔＢＯＣ型固相合成法やＦｍｏｃ型固相合成法として知られている方法によって合成することができる。そしてＰＮＡはＤＮＡやＲＮＡ等の天然のオリゴヌクレオチドと比較してヌクレアーゼやプロテアーゼ等の酵素に対する強い耐性を有し、血清中でも酵素的開裂が殆ど、若しくは全く起らず安定である。また糖部やリン酸基を有していない為、溶液のイオン強度の影響を殆ど受けず、従ってＰＮＡと標的一本鎖核酸とを反応させる際の塩濃度等の調整を行なう必要がなく、更には静電的な反発が無いためにＤＮＡプローブと標的一本鎖核酸とのハイブリッドやＲＮＡプローブと標的一本鎖核酸とのハイブリッドと比較してＰＮＡと標的一本鎖核酸とのハイブリッドのほうが熱安定性に優れているとも考えられている。そしてこれらの特性から標的核酸の検出や塩基配列の決定に用いるプローブとして有望なものである。そして前記した本発明に係る核酸プローブアレイの製造方法は、核酸プローブとしてＰＮＡプローブを適用した場合にも有効であり、ＰＮＡプローブが高密度に、且つ高精度に配置されたＰＮＡプローブアレイを容易に製造することができる。具体的には、例えばＰＮＡプローブを固相上の限定された位置に止めさせてプローブアレイの高密度化を図る方法としてはＤＮＡプローブやＲＮＡプローブと同様に、ＰＮＡプローブの末端と固相表面との各々に互いに反応性を有する官能基を導入する方法を用いることができ、反応性の基の好ましい組合わせの一つは上述したのと同様のチオール基（ＰＮＡ末端）とマレイミド基（固相表面）の組合わせである。ＰＮＡ末端へのチオール基の導入は、例えばＰＮＡプローブのＮ末端（ＤＮＡの５'末端に相当）にチオール基を含むシステイン（CH(NH2)(COOH)CH2SH）基等を導入することで達成される。ＰＮＡプローブのＮ末端へのシステインの導入は、例えばＰＮＡプローブのＮ末端のアミノ基とシステインのカルボキシル基を反応させることによって行なうことができる。またＰＮＡプローブのＮ末端のアミノ基と例えばN2H(CH2)2O(CH2)2OCH2COOHのようにアミノ基及びカルボキシル基を有している様な適当なリンカーのカルボキシル基とを反応させ、次いで該リンカーのアミノ基とシステインのカルボキシル基とを反応させることでリンカーを介してＰＮＡプローブのＮ末端にシステインを結合させることもできる。この様にリンカーを介して固相との結合基を導入した場合、ＰＮＡプローブの標的物質との反応部位を固相から所定の距離だけ離間させることができ、ハイブリダイゼーション効率のより一層の向上が期待される。
【００４９】
またＰＮＡはその塩基長によっては水に対する溶解性が同じ塩基長のＤＮＡと比較すると低い場合があり、インクジェット吐出用の液体を調製する際にはＰＮＡを予めトリフルオロ酢酸（例えば０．１ｗｔ％トリフルオロ酢酸水溶液等）等に溶解させた後、前記した種々の溶媒を用いてインクジェット吐出に適合する特性に調製することが好ましい。特にトリフルオロ酢酸に溶解させておくことは、ＰＮＡ末端のシステイン残基中のチオール基の酸化によるシスチンへの変性を防ぎ、ＰＮＡのチオール基と固相表面のマレイミド基との反応効率のより一層の向上を図る上で好ましい。またＤＮＡプローブやＲＮＡプローブの末端に導入したチオール基と固相表面のマレイミド基の反応時間は前記した様に３０分（バブルジェットヘッドを用いた場合）で十分であるが、ＰＮＡの場合にはバブルジェットヘッドを用いた場合であっても２時間程度反応させることが好ましい。
【００５０】
更にプローブとしては核酸プローブに限定されず、検出・分析対象となるサンプル中の標的物質と特異的に結合し得る物質、例えばレセプターと特異的に結合可能なリガンド、リガンドと特異的に結合可能なレセプター、特定のアミノ酸配列を有するオリゴペプチドまたはポリペプチドと結合可能なオリゴペプチドやポリペプチド、更にはタンパク質（例えば抗体、抗原、酵素等）等をプローブとして用いることができる。この場合、いずれも蛋白質に含まれているシステイン残基のＳＨ基を反応に利用することができる。
【００５１】
以上説明した様にインクジェット吐出プロセスを用いてプローブ溶液を固相に供給する工程を含むプローブアレイの製造方法によれば、プローブアレイを極めて容易に形成することができる。特に核酸プローブと固相表面との間で共有結合が形成される様に各々に官能基を導入した場合には、固相表面に予めウェル等を有しない、即ち実質的に平坦で且つ表面特性（水に対する濡れ易さ等）が均一な固相を用いても隣接するスポット同士が連結してしまうことがない。その結果核酸プローブが精度良く、且つ高密度に配列された核酸プローブアレイを極めて効率的に、しかも低コストで製造することができる。
【００５２】
なおこのことは本発明において表面にウェルを備えた固相を用いることを何ら排除するものではない。例えばプローブ溶液が供給されるウェルの間に光不透過性のマトリクスパターン（以降「ブラックマトリクス」と称する）を予め形成しておいた場合、固相上でのプローブと標的物質とのハイブリダイゼイションを光学的に検出（例えば蛍光の検出）する様な場合の検出精度（ＳＮ比）をより一層向上させることができる。また隣接するウェルの間に、表面がプローブ溶液に対する親和性の低いマトリクスを設けておいた場合、プローブ溶液のウェルへの供給にあたって多少の位置ずれが生じたとしても所望のウェルにスムーズにプローブ溶液を供給することができる。このような効果を利用することを目的として表面にウェルを備えた固相を用いてもよい。以下に表面にマトリクスを有する固相、その製造方法及び該固相の本実施態様における使用方法について説明する。
【００５３】
図５に、本態様におけるプローブアレイの一例を示す。図５（Ａ）は平面図であり、図５（Ｂ）はそのＢＢ断面図である。このプローブアレイは、固相１０３上にマトリクス状に配置された凹部（ウェル）１２７を形成した枠体構造を有するマトリクスパターン１２５を設けた構造を有する。マトリクス１２５（凸部）によって互いに隔離されたウェル１２７は、マトリクスパターン中の貫通孔（くり抜き部）として設けられたもので、その側壁は凸部からなり、その底面１２９には固相１０３の表面が露出した状態にある。固相１０３の表面露出部分は、プローブと結合可能な表面を形成しており、所定の凹部にプローブ（不図示）が固定されている。
【００５４】
マトリクスパターンを形成する材料は、プローブと標的物質との反応物を光学的に検出、例えば、反応物の発する蛍光を測定して検出する方法を用いる場合には、検出感度、Ｓ／Ｎ比及び信頼性の向上を考慮すると遮光性を有するものが望ましい。そのような材料としては、例えば金属（クロム、アルミ、金等）及び黒色の樹脂等が挙げられる。該黒色の樹脂としては、アクリル、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリイミド、アクリル酸モノマー、ウレタンアクリレート等の樹脂や、フォトレジスト等の感光性の樹脂に黒色の染料や黒色の顔料を含有させたものが挙げられる。感光性樹脂の具体例としては、例えばＵＶレジスト、ＤＥＥＰ−ＵＶレジスト、紫外線硬化樹脂等を用いることができる。ＵＶレジストとしては、環化ポリイソプレン−芳香族ビスアジド系レジスト、フェノール樹脂−芳香族アジド化合物系レジスト等のネガレジスト、ノボラック樹脂−ジアゾナフトキノン系レジスト等のポジレジストを挙げることができる。
【００５５】
ＤＥＥＰ−ＵＶレジストとしては、ポジ型レジストとして、例えば、ポリメチルメタクリレート、ポリメチレンスルホン、ポリヘキサフルオロブチルメタクリレート、ポリメチルイソプロペニルケトン、および、臭化ポリ１−トリメチルシリルプロピン等の放射線分解型ポリマーレジスト、コール酸ｏ−ニトロベンジルエステル等の溶解抑制剤系レジスト等を挙げることができ、ネガ型レジストとして、ポリビニルフェノール−３，３'−ジアジドジフェニルスルホン、および、ポリメタクリル酸グリシジル等を挙げることができる。
【００５６】
紫外線硬化樹脂としては、ベンゾフェノン、および、その置換誘導体、ベンゾイン、および、その置換誘導体、アセトフェノン、および、その置換誘導体、ベンジル等のオキシム系化合物等のなかから選ばれる、１種、または、２種以上の光重合開始剤を２〜１０重量％程度含有した、ポリエステルアクリレート、エポキシアクリレート、および、ウレタンジアクリレート等を挙げることができる。黒色の顔料としては、カーボンブラックや黒色有機顔料を用いることができる。
【００５７】
なお、プローブと標的物質の反応物の検出を、光学的に行なわない場合や、マトリクスからの光が反応物の光学的検出に影響を与えない場合には、マトリクスパターン形成材料として非遮光性の物を用いる事は何ら妨げられるものではない。
【００５８】
次に上記した様な材料を用いてマトリクスパターンを形成する一つの方法としては基板表面にコートした樹脂や金属上にフォトレジストをコートしパターニングの後に樹脂をエッチング等の工程によりパターニングする方法が挙げられる。また、感光性の樹脂であれば、樹脂そのものをフォトマスクを用いたフォトリソグラフィーのプロセスにより露光、現像、必要に応じて硬化することによりパターニングすることも可能である。
【００５９】
ここでマトリクス１２５を樹脂製とした場合、マトリクス１２５の表面は疎水性となる。この構成はウェルに供給するプローブを含む溶液として水系の溶液を用いる場合に好ましいものである。即ちウェルにプローブ溶液をインクジェット法を用いて供給する際に多少の位置ずれを伴ってプローブ溶液が供給されたとしても、所望のウェルにプローブ溶液が極めてスムーズに供給されることになる。また、同時に隣接するウェル間で、異なる種類のプローブを供給した場合でも、これらウエル間に供給された異なるプローブ溶液間での交じり合い（クロスコンタミネーション）を防ぐことも可能となる。
【００６０】
通常、ペプチド、核酸等の生体関連物質のプローブ溶液は水系の溶液であることが多いので、このような場合にはマトリクスパターンが撥水性となるこの構成を好適に利用できる。
【００６１】
次にウェルの底面（固相表面の露出部）をプローブと結合可能な構成とする方法について説明する。ウェルの底面に保持させる官能基は、プローブに担持させる官能基との組合わせによって異なる。例えばプローブとして末端にチオール基を導入した核酸プローブを用いる場合には、前述したように固相表面にマレイミド基を導入しておくことでウェルに供給した核酸プローブのチオール基は固相表面のマレイミド基と共有結合を形成し、核酸プローブが固相表面に固定される。同様にアミノ基を核酸プローブ末端に有する核酸プローブに対しては固相表面へのエポキシ基の導入が好ましい。この様な官能基の他の組合わせとしては、例えばカルボキシル基（スクシンイミド誘導体の核酸プローブ末端への導入による）を末端に有する核酸プローブに対しては固相表面へのアミノ基の導入が好ましい。このアミノ基とエポキシ基の組合わせは、チオール基とマレイミド基の組合わせと比較すると核酸プローブ溶液をインクジェット吐出方法で吐出した際の固相上への定着性は良好でないが、固相にウェルを設けてある場合には無視し得る程度のものである。
【００６２】
アミノ基やエポキシ基の固相表面への導入は、前述した様に固相としてガラス板を用いる場合には、まず水酸化カリウムや水酸化ナトリウム等のアルカリで該ガラス板表面を処理して水酸基（シラノール基）を表面に露出させた後、アミノ基を導入したシラン化合物（例えばＮ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン等）やエポキシ基を導入したシラン化合物（例えばγ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン等）を含むシランカップリング剤を該ガラス板表面の水酸基と反応させることによって行なうことができる。またマレイミド基は、上記の方法によってガラス板表面にアミノ基を導入した後にＮ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミドやスクシイミジル−４−（マレイミドフェニル）ブチレート等を該アミノ基と反応させることでガラス板表面に導入することができる。
【００６３】
なお、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン及びスクシイミジル−４−（マレイミドフェニル）ブチレートの構造は下記の通りである。
（１）Ｎ−β（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン：（ＣＨ3Ｏ）2ＳｉＣ3Ｈ6ＮＨＣ2Ｈ4ＮＨ2
（２）γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン：
【００６４】
【化４】
2005118049.tif 000005
【００６５】
（３）スクシイミジル−４−（マレイミドフェニル）ブチレート：
【００６６】
【化５】
2005118049.tif 000006
【００６７】
上記した固相の表面処理においてエポキシ基を固相表面に導入した場合、該エポキシ基とプローブとを結合させた後、未反応のエポキシ基をエタノールアミン水溶液等を用いて開環させて水酸基に変えることにより、ウェルの底面を親水性にすることができる。この操作はプローブを結合させたウェルに該プローブと特異的に反応する標的物質を含む水系溶媒を供給する場合に好ましいものである。
【００６８】
また固相として樹脂基板を用いる場合、例えばOrganic Thin Films and Surface, Vol.20, Academic Pressの第５章に記載の方法により樹脂基板表面に水酸基、カルボキシル基またはアミノ基等を導入することができる。或いはこの方法により水酸基を導入した後に上記したガラス板の場合と同様にアミノ基やエポキシ基を有するシラン化合物を用いてアミノ基やエポキシ基を導入したり、更にはマレイミド基を導入することも可能である。ところで上記した固相への官能基の導入は、固相表面へのマトリクスの形成前に行なってもよく、或いはマトリクス形成後に行なってもよい。マトリクス形成前であれば固相表面にスピンコートやディップコート等の方法によって官能基の導入に必要な反応溶液を固相表面に供給すればよく、またマトリクス形成後であればインクジェット法等によって各ウェルに反応溶液を供給すればよい。
【００６９】
また、樹脂基板にプローブを結合する方法としては例えば、特開昭６０−０１５５６０号公報に記載されている様に、樹脂基板表面を酸化処理して水酸基を導入し、次いでアミノ基を有するシラン化合物を含むシランカップリング剤と該水酸基とを反応させてアミノ基を導入し、このアミノ基とプローブの官能基を反応させる方法が挙げられる。
【００７０】
また、前処理後の基板が親水性の場合、他方の、マトリクスパターンを形成する相対的に撥水性の材料は、先に延べた樹脂製のマトリクス形成用の樹脂をそのまま用いることができる。また、さらなる撥水性が必要とされる場合にはマトリクス材料中に撥水剤を添加しておくこともできる。また、マトリクスパターンがフォトレジスト等の感光性樹脂で形成される場合には、露光、現像後にポストベークを適当な条件で行なうことによりマトリクスパターンにより強い撥水性を付与することも可能である。
【００７１】
ここまでは、どちらかといえばプローブ溶液が親水性の場合について述べたが、プローブ溶液が親油的な場合には逆の処理をすればよいことになる。
【００７２】
マトリクスパターンのウエルのサイズや形状は、基板のサイズ、最終的に作製されるアレイ全体のサイズ、アレイを構成するプローブ種類数、あるいは、マトリクスパターンの形成方法、マトリクスパターン間隙へのプローブ溶液等の供給方法、検出方法等によって適宜選択することができる。
【００７３】
形状としては、図５に示す基板と平行な面の断面が正方形形状のものに加えて、長方形、各種多角形、円形、楕円形等種々の形状とすることができる。
【００７４】
ウェルのサイズとしては、反応種の数、アレイ全体のサイズを考慮した場合、その最長幅が３００μｍ以下が望ましい。例えば、図５に示すように、ウエルの基板と平行な方向での断面を正方形とする場合にはその１辺の長さを２００μｍ以下とすることができる。更に、ウェルを長方形とする場合には、その長辺を２００μｍ以下、円形とする場合はその直径を２００μｍ以下とするのがより望ましい。その大きさの下限は例えば１μｍ程度とすることができる。
【００７５】
各ウェルの配列形態は、図５のように平面図における上下方向で等間隔で配置する態様、隣り合う列でウェルの位置をずらして配置する態様等所望に応じて適宜変更可能である。
【００７６】
隣接するウェル間の距離は、例えばインクジェット法でプローブ溶液をウェルに供給する際に吐出位置と供給されるべきウェルとの間に多少の位置ずれが生じてもそれがクロスコンタミネーションを生じさせないような間隔に設定することが好ましく、またアレイ全体のサイズ等とクロスコンタミネーションや、各種溶液の供給の際における操作性を考慮すると、隣接するウェル間の距離がウェルの最長幅の１／２〜２倍の範囲にあることが好ましい。
【００７７】
例えば、ウェルを正方形形状とする場合で、基板の大きさを、プローブ固定、試料供給、検出等の操作を自動化する場合に好適な大きさ（１インチ×１インチ、あるいは１ｃｍ×１ｃｍ）とすると、コンビナトリアルケミストリーとしての機能を十分に果たす必要性から１００個×１００個、あるいは、１０００個×１０００個以上のプローブ種類が存在することが望ましいので、マトリクス自体のサイズをも考慮して、ウェルの正方形形状の一辺を１〜２００μｍ、隣接するウェル間の距離を２００μｍ以下とするのが望ましい。
【００７８】
またマトリクスの厚さ（固相表面からの高さ）は、マトリクスパターンの形成方法やウェルの容量、供給するプローブ溶液の量等を考慮して決定されるが、好ましくは１〜２０μｍとすることが好ましい。即ちこのような厚さとすることによって、例えばインクジェット吐出法を用いてプローブ溶液を各ウェルに供給する場合、インクジェット吐出条件との関連においてプローブ溶液の特性を、該プローブ溶液が該固相表面上に小さなスポットを形成することが困難な特性にしか調整し得ない場合であっても、該プローブ溶液を固相上の所定の位置に止めさせることができ、クロスコンタミネーションを極めて有効に防止することができる。
【００７９】
仮に、上記の望ましい範囲の上限でのウェルの容積は、２００μｍ×２００μｍ×２０μｍ、すなわち、８００ｐｌとなる。また、このサイズで、隣接するウェル間の距離（図１のｘ）も同様に２００μｍとすると６２５個／ｃｍ2のウェル密度が得られる。すなわちオーダーとして１０2個／ｃｍ2以上のウェル密度を有するアレイが得られる。また、ウエルを１辺が５μｍの正方形形状とし、隣接するウェル間の距離も５μｍとし、マトリクスパターンの厚さを４μｍとすると、ウェルの容積は０．１ｐｌとなり、その数は１００００００個／ｃｍ2となる。５μｍ×５μｍ×４μｍのパターニングは現在の微細加工技術では現実的なサイズであるのでオーダーとして１０6個／ｃｍ2以上のウエル密度のアレイも本発明の発明の範囲となりうる。
【００８０】
本態様においてプローブ溶液、あるいは、プローブと反応すべき物質のウェルへの供給液量は、例えばウェルの容積とほぼ同量とする場合には、上記の計算から、概ね０．１ピコリットル（ｐｌ）から１ナノリットル（ｎｌ）となる。また、マトリクスを供給される溶液に対して非親和性とした場合に、液種によっては、その表面張力によりウェルの容積を上回る量の液をウェルの開口上部に留めることが可能となる。そのような場合、例えば、ウェルの１０倍から数１０倍の液量を供給し、保持させることができる。すなわち、数ｐｌから数１０ｎｌの液を供給することになる。いずれの場合にも、このような少量の液のウェルへの供給は、一般的なマイクロディスペンサーやマイクロピペットでも可能であるが、位置精度と供給量精度を良好に供給することのできるインクジェット法を用いてプローブ溶液をウェルに供給することが好ましい。インクジェットプリントではμｍオーダーで高精度に位置決めをしてインクを吐出するので、ウェルへの溶液の供給にはきわめて適しているといえる。また、吐出されるインクの量は一般的に数ｐｌから数１０ｎｌであるので、この点でもウェルへの溶液の供給に適しているといえる。
【００８１】
本態様によれば、液滴の広がりは、核酸プローブと固相表面との反応とウェルにより定量的に制御され、また、吐出方向に多少の乱れがあっても、ウェルを含む領域に液滴が付着すれば、液滴のマトリクスにかかる部分は、マトリクスが吐出液に対して非親和性となっていることによって、その部分がはじかれ、ウェル内にスムーズに収納される。
【００８２】
本発明に用いるインクジェット法は特に制限されないが、例えばピエゾジェット法、熱的な発泡を利用するバブルジェット法等が利用できる。
【００８３】
ところで本発明において固相１０３として用いることのできる材料としては、固相表面に上記した様な種々の官能基を導入できるものであれば良く、更には第２の態様においては表面にマトリクスを形成できるものが好ましい。そしてプローブと標的物質との反応物の検出を光学的に行なう場合、固相を介した検出系を組む場合には固相を光学的に透明な固相とすることが好ましい。そのような材料としては例えば、合成石英、溶融石英等を含むガラス、シリコン、アクリル樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリスチレン樹脂、塩化ビニル樹脂等が挙げられる。また該反応物の光学的な検出を固相を介さないで検出する場合には光学的に黒色の固相を用いることが好ましく、カーボンブラック等の黒色の染顔料を含む樹脂基板等が用いられる。
【００８４】
本発明ではこれらプローブアレイに反応すべき物質の溶液を供給し、適当な反応条件に置き、反応を行なう。個別のウェルに異なる反応すべき物質の溶液を供給する必要がある場合には、プローブアレイの複数のウェルのそれぞれに、プローブに反応させるべき少なくとも１種の物質が溶解した溶液を少なくとも１種供給する。この場合、上述のように、供給される溶液が、すでに形成されているプローブアレイのプローブが結合されているウェルに対して親和的であり、マトリクスパターンに非親和的であれば、供給領域を限定した、クロスコンタミネーションのない、定量的な液の供給が可能となる。表１に示した物質のように生体関連の物質の多くは水溶性なので、この場合にはウェルは親水性、マトリクスパターンは撥水性となる。また、これら反応すべき物質の供給にも、上述のように、インクジェット法を用いれば、微量な液量を、定量的に供給可能となる。
【００８５】
本発明では、基板に結合するために供給するプローブの液量、または、反応すべき物質の液量が微量であるので、双方の反応条件が、供給された溶液の蒸発、気散を防ぐ条件を含んでいることが望ましい。
【実施例】
【００８６】
以下実施例をもって本発明を更に詳細に説明する。
【００８７】
実施例１（バブルジェットプリンターを用いた核酸プローブアレイの製法、及びそのプローブアレイの評価）
（１）基板洗浄１インチ角のガラス板をラックに入れ、超音波洗浄用洗剤に一晩浸した。その後、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。蒸留水ですすいだ後、蒸留水の入った容器中でさらに超音波処理を２０分間行った。次に、予め８０℃に加温した１Ｎ水酸化ナトリウム溶液にガラス板を１０分間浸した。引き続き水洗、蒸留水洗浄を行って、プローブアレイ用のガラス板を用意した。
【００８８】
（２）表面処理アミノ基を結合したシラン化合物（Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン）を含むシランカップリング剤（商品名：ＫＢＭ６０３；信越化学工業（株）社製）の１ｗｔ％水溶液を室温下で２時間攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。次いでこの溶液に上記（１）で得た基板を室温（２５℃）で２０分間浸した後、引き上げて、窒素ガスをガラス板の両面に吹き付けて乾燥させた。次にガラス板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークしてシランカップリング処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いでＮ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide；Ｄｏｊｉｎ社製）（以降ＥＭＣＳと略）を２．７ｍｇ秤量し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１溶液に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなる様に溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。シランカップリング処理を行ったガラス板をこのＥＭＣＳ溶液に室温で２時間浸して、シランカップリング処理によってガラス板表面に担持されているアミノ基とＥＭＣＳ溶液のカルボキシル基を反応させた。この状態でガラス板表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が表面に存在することになる。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス板はＤＭＳＯ及びエタノールの混合溶媒及びエタノールで順次洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００８９】
（３）プローブＤＮＡの合成ＤＮＡ自動合成機を用いて配列番号１の一本鎖核酸を合成した。なお配列番号１の一本鎖ＤＮＡ末端にはＤＮＡ自動合成機での合成時にチオールモディファイア（Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（グレンリサーチ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）社製）を用いる事によってチオール（ＳＨ）基を導入した。続いて通常の脱保護を行いＤＮＡを回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、以下の実験に用いた。
配列番号：１5'HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3'（４）ＢＪプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合上記配列番号１の一本鎖ＤＮＡを最終濃度が約４００ｍｇ／ｍｌになるようにＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）／１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液）に溶解し、一本鎖ＤＮＡ溶液を調製した（正確な濃度は吸収強度から算出）。
【００９０】
グリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、及び上記一般式（Ｉ）で示されるアセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１ｗｔ％を含む水溶液を用意し、上記ＤＮＡ溶液に加え、一本鎖ＤＮＡの最終濃度が８μＭとなるように調整した。この液体の表面張力は３０〜５０ｄｙｎｅ／ｃｍの範囲内であり、また粘度は１．８ｃｐｓ（Ｅ型粘度計：東京計器（株）社製）であった。この液体をバブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＣ６２０；キヤノン（株）社製）用インクタンクに充填しバブルジェットヘッドに装着した。なおここで用いたバブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＣ６２０；キヤノン（株）社製）は平板への印刷が可能な様に改造を施したものである。またこのバブルジェットプリンターは３６０×７２０ｄｐｉの解像度で印字可能である。次いでこのプリンターに上記（２）で処理したガラス板を装着し、プローブ核酸を含む液体をガラス板上にスポッティングした。ここでバブルジェットヘッドの液体吐出面とガラス板の液体付着面との距離は１．２〜１．５ｍｍであった。またスポッティングは、３６０ｄｐｉの方向には１回のスポッティングの後２回の空吐出を行ない、７２０ｄｐｉの方向には１回のスポッティングの後５回の空吐出を行なう様に条件設定した。スポッティング終了後、ガラス板を３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。なお上記プリンタの１吐出動作あたりのＤＮＡプローブ溶液の吐出量は約２４ｐｌであった。
【００９１】
（５）ブロッキング反応マレイミド基とチオール基との反応終了後、ガラス板を１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液で洗浄し、ガラス板表面のＤＮＡを含む液体を完全に洗い流した。次いでガラス板を２％ウシ血清アルブミン水溶液中に浸して２時間放置し、ブロッキング反応を行った。
【００９２】
（６）ハイブリダイゼーション反応配列番号１のＤＮＡと相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡをＤＮＡ自動合成機で合成し、５'末端にローダミンを結合させて標識化した一本鎖ＤＮＡを得た。この標識化一本鎖ＤＮＡを１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に最終濃度１μＭとなるように溶解し、この溶液中に上記（５）で得たブロッキング処理したプローブアレイを浸漬し、室温（２５℃）で３時間ハイブリダイゼーション反応を行った。その後、プローブアレイを１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液で洗浄してプローブ核酸とハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡを洗い流した。次に該プローブアレイのスポットの蛍光量を、画像解析装置（商品名：ＡＲＧＵＳ ５０；浜松ホトニクス（株）社製）を接続し、ローダミンＢに適するフィルターセットを装着した倒立型蛍光顕微鏡を用いて定量した。
【００９３】
（７）結果標識化一本鎖ＤＮＡと完全マッチである配列番号１の核酸プローブのスポットでは４６００の蛍光量であった。またハイブリダイゼーション後の、各スポットが蛍光発光している状態のプローブアレイを蛍光顕微鏡（ニコン（株）社製）を用いて観察した。その結果本実施例にかかるプローブアレイでは、ａ）各々のスポットがほぼ円形であって、またその直径が約７０〜１００μｍの範囲内にあること、ｂ）隣接するスポットとの間には各々のスポットの直径と略等しい、約１００μｍのスペースが有り、各々のスポットが互いに明確に独立していること、ｃ）スポットの行と列が揃っていることが明らかとなった。
【００９４】
このことはプローブアレイ上でハイブリダイズしたスポットの自動検出等を行わせる上で極めて有効である。
【００９５】
実施例２（バブルジェットプリンタを用いた核酸プローブアレイの製造、及びそのプローブアレイを用いた標的核酸の検出）
（１）上記実施例１の（１）及び（２）と全く同様にしてプローブアレイ用の表面処理を施したガラス板を用意した。
【００９６】
（２）プローブＤＮＡの合成ＤＮＡ自動合成機を用いて配列番号１〜４の一本鎖核酸を合成した。なお配列番号１〜４の一本鎖核酸は、実施例１で用いた配列番号１を基本とし、１塩基変化させたものを配列番号２、３塩基変化させたものを配列番号３、そして６塩基変化させたものを配列番号４とした。また配列番号１〜４の一本鎖ＤＮＡ末端にはＤＮＡ自動合成機での合成時にＴｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いる事によってチオール（ＳＨ）基を導入した。続いて通常の脱保護を行いＤＮＡを回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、以下の実験に用いた。配列番号２〜４の配列を以下に示す。
配列番号：２5'HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTTGTTTTACA3'
配列番号：35'HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGCTTTTTTACA3'
配列番号：45'HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCATCTTGTTTACA3'
（３）ＢＪプリンターによるＤＮＡプローブの吐出、および基板への結合上記配列番号１〜４の一本鎖ＤＮＡを用いて、上記実施例１の（４）に記載した方法と同様の方法で４種類の吐出用液体を調製し、実施例１で用いたバブルジェットプリンタ用の４つのインクタンクに各々の液体を充填し、各々のインクタンクをバブルジェットヘッドに装着した。次いで該プリンタに上記（１）と同じ方法で作成したガラス板を装着し、該ガラス板上に４種の核酸プローブの各々を該ガラス板の３×３ｍｍの４つのエリアの各々にスポッティングした。なお各エリア内でのスポッティングのパターンは実施例１と同様とした。スポッティング終了後、ガラス板を３０分間加湿チャンバー内に静置し、マレイミド基とチオール基とを反応させた。
【００９７】
（４）ブロッキング反応マレイミド基とチオール基との反応終了後、ガラス板を１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液で洗浄し、ガラス板表面のＤＮＡ溶液を完全に洗い流した。次いでガラス板を２％ウシ血清アルブミン水溶液中に浸して２時間放置し、ブロッキング反応を行った。
【００９８】
（５）ハイブリダイゼーション反応配列番号１のＤＮＡと相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡをＤＮＡ自動合成機で合成し、５'末端にローダミンを結合させて標識化一本鎖ＤＮＡを得た。この標識化一本鎖ＤＮＡを１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に最終濃度１μＭとなるように溶解し、（４）で得られたプローブアレイとハイブリダイゼーション反応を３時間行った。その後、プローブアレイを１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にて洗浄してプローブ核酸とハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡを洗い流した。次に該プローブアレイの各々のスポットを蛍光顕微鏡（ニコン（株）社製）で観察し、その蛍光量を、画像解析装置（商品名：ＡＲＧＵＳ ５０；浜松ホトニクス（株）社製）を接続し、ローダミンＢに適するフィルターセットを装着した倒立型蛍光顕微鏡を用いて定量した。
【００９９】
（６）結果標識化一本鎖ＤＮＡと完全マッチである配列番号１のＤＮＡプローブのスポットでは４６００の蛍光量であるのに対し、１塩基のミスマッチ配列を有する配列番号２のＤＮＡプローブのスポットでは、２８００の蛍光量が得られた。また、３塩基ミスマッチを有する配列番号３のＤＮＡプローブのスポットでは、２１００と完全マッチの半分以下の蛍光量しか得られず、６塩基ミスマッチの配列番号４のＤＮＡでは蛍光は観測されなかった。以上の事から、ＤＮＡアレイ基板上で完全相補性の一本鎖ＤＮＡを特異的に検出することができた。
【０１００】
実施例３（液体中のＤＮＡプローブの濃度とバブルジェット吐出特性）
（１）ＤＮＡプローブの合成以下に示す配列番号５の配列を有する一本鎖ＤＮＡをＤＮＡ自動合成機を用いて合成し、それを濃度が各々約０．２ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌになるようにＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）／１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液）に溶解し、濃度の異なる３種類のＤＮＡプローブ溶液を調製した（正確な濃度は吸収強度から算出した）。
配列番号：５5'GCCTGATCAGGC3'
（２）ＢＪプリンターによる吐出グリセリン７．５％、尿素７．５％、チオジグリコール７．５％、上記一般式（Ｉ）で示される構造を有するアセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１％を含む水溶液を用意し、この水溶液を上記（１）で調整した濃度０．２ｍｇ／ｍｌのプローブ溶液に加えて、最終濃度が約０．０２ｍｇ／ｍｌ（３μＭ）に希釈した。この液体を上記実施例１で用いたバブルジェットプリンタ用のインクタンクに充填し、このインクタンクを実施例１で用いたバブルジェットプリンタのヘッドに装着した。
【０１０１】
次に該プリンタにＡ４サイズのアルミ板を装着し、該アルミ板の３×５平方インチのエリアに対してスポッティングを行った。ここでのスポッティングは、上記エリアに３６０×７２０ｄｐｉの密度でスポッティングされるように設定した。また最初にコントロールとしてＢＪ６２０用の市販のインクを該アルミ板上に印字した。この操作を計４枚のアルミ板に対して行った。
【０１０２】
次に各々のアルミ板上にスポットされた核酸プローブをＴＥ溶液を用いて回収し、ゲル濾過法により精製し、精製された回収核酸プローブの量を吸収スペクトルにより測定した。ここで理論的に求められる核酸プローブの回収量は以下の通りである。即ち本実施例に用いたプリンターのヘッドから吐出される液滴１つあたりの体積は２４ピコリットルである。そして３６０×７２０ｄｐｉの密度で３×５平方インチのエリアにスポッティングしたアルミ板が４枚であるから、２４（ピコリットル）×（７２０×３６０）×（３×５）×４枚＝３７３μｌとなる。この量のプローブ核酸が示す２６０ｎｍにおける吸光度と回収された核酸プローブの２６０ｎｍにおける吸光度を図３に示す。
【０１０３】
上記（２）と全く同様の操作を、濃度２ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ各々のプローブ溶液について行った。なお各々の吐出用液体の核酸プローブの最終濃度は３０μＭ（０．２ｍｇ／ｍｌ）及び２２５μＭ（１．５ｍｇ／ｍｌ）とした。各溶液から回収されたプローブ核酸が示す吸光度及び理論的に求められたプローブ核酸量が示す吸光度の結果を図３に示す。
【０１０４】
（３）結果
図３から分かるように核酸プローブの実際の吐出量は理論的に予想される値に近い値であった。この事からバブルジェット法を用いての核酸プローブの吐出において、バブルジェットヘッドのヒータ部への核酸プローブの焦げ付きなどによる核酸プローブの量的損失は認められない。また各々の濃度の液体を用いてのアルミ板へのスポッティング工程中、ヘッドのトラブル、例えば不吐出等は一切発生しなかった。またコントロールとしてアルミ板にスポッティングしたバブルジェットプリンター用インクのスポットと核酸プローブのスポットを目視にて対比したところ、濃度３μＭ及び３０μＭの液体を用いて作成したスポットのスポッティング状況は、インクスポットのそれと殆ど同様であった。また濃度２２５μＭの液体を用いて作成したスポットはインクスポットと比較して若干の乱れが認められた。
【０１０５】
実施例４
（バブルジェットプロセスが核酸プローブに与える影響の検討）
（１）核酸プローブの合成アデニン（以降「Ａ」と記載）からなる塩基長１０ｍｅｒ（合成品）、ｏｌｉｇｏＡ（４０−６０ｍｅｒ；ファルマシア社製）、ｐｏｌｙ（ｄＡ）（３００〜４００ｍｅｒ；ファルマシア社製）をそれぞれＴＥ溶液で希釈して最終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるよう調製し、長さの異なる核酸プローブ溶液を用意した。なお１０ｍｅｒの塩基配列（配列番号：６）は以下の通りである。
配列番号：６5'AAAAAAAAAA3'
（２）バブルジェットプリンターによるＤＮＡ溶液の吐出グリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％及び上記一般式（Ｉ）で示されるアセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル）１ｗｔ％を含む水溶液を用意し、この水溶液で上記（１）で作成した各々の核酸プローブ溶液を最終濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌとなるように希釈した。
【０１０６】
実施例３と同様カートリッジに充填した各々の核酸プローブ溶液をアルミ板上に吐出させ、スポッティング状況を目視にて観察した。その結果塩基長１０ｍｅｒ及び４０〜６０ｍｅｒの核酸プローブに関しては、アルミ板上に独立したスポットが整然と並んだプローブアレイが得られた。また３００〜４００ｍｅｒの核酸プローブに関しても、基本的には同様のプローブアレイが得られたが、隣接するスポット同士が繋がっている部分が認められた。これは核酸プローブの塩基鎖が長いことに起因する液体の物性変化が生じ、バブルジェットヘッドからの吐出の方向性が若干不正確になった為と考えられる。
【０１０７】
次に各々の核酸プローブ溶液を用いて作成したプローブアレイ上のスポットを実施例３と同様にして回収した。回収した核酸プローブ溶液１００μｌを逆相ＨＰＬＣで分析し、吐出前の溶液との比較によって核酸プローブの切断の有無を調べた。なお逆相ＨＰＬＣの溶出は１Ｍトリエチルアミンアセテートを含む７〜７０％アセトニトリル濃度勾配により行った。その結果、切断されたと考えられる様なＤＮＡ断片は観測されず、よって核酸プローブはバブルジェット法での吐出によっても変質を受けなかったことが確認できた。また回収した核酸プローブの定量を実施例３と同様にして行った結果、図４に示すように３種類の長さの核酸プローブはほぼ理論値通りの量が回収された。
【０１０８】
実施例５（反応時間の検討）実施例１の（４）において、核酸プローブがスポッティングされた表面処理ガラス板を加湿チャンバー中に１０分、９０分、一晩室温（２５℃）放置した以外は実施例１と同様にしてプローブアレイを製造し、各々のプローブアレイをハイブリダイゼーション反応に供した。その結果９０分、及び一晩反応させたプローブアレイについては、全て実施例１で得られたプローブアレイが示す蛍光強度と同程度の蛍光強度を与えた。このことからガラス板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基との結合反応は３０分でほぼ終了している事が明らかになった。一方反応時間が１０分のプローブアレイは実施例１のそれに比べて、７０％程度の蛍光量であった。
【０１０９】
実施例６
（バブルジェットプリンタを用いたＰＮＡプローブアレイの製造、及びそのプローブアレイを用いた標的核酸の検出）
（１）上記実施例１の（１）及び（２）と全く同様にしてプローブアレイ用の表面処理を施したガラス板を用意した。
【０１１０】
（２）プローブＰＮＡの合成下記配列番号７及び８の塩基配列を有するプロテイン核酸（ＰＮＡ）（日本パーセプティブ（株）社製）を用意した。このＰＮＡはＮ末端（ＤＮＡの５'末端に相当）にシステイン残基（Ｃｙｓと表記）が結合され、その結果としてＮ末端にチオール基が導入されている。また配列番号８のＰＮＡプローブは配列番号７のＰＮＡプローブを一塩基変化させたものである。
配列番号：７NCys-NH(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2CONH-ACTGGCCGTCGTTTTACAC
配列番号：８NCys-NH(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2CONH-ACTGGCCGTTGTTTTACAC
（３）ＢＪプリンターによるＰＮＡプローブの吐出、および基板への結合上記各々のＰＮＡプローブを１００μｌの０．１ｗｔ％トリフルオロ酢酸に最終濃度が８０μＭとなる様に溶解し、次いでグリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、及び上記一般式（Ｉ）で示されるアセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１ｗｔ％を含む水溶液を上記ＰＮＡのトリフルオロ酢酸溶液に加えて、ＰＮＡプローブの最終濃度が８μＭとなるように調整した。この液体の表面張力は３０〜５０ｄｙｎ／ｃｍの範囲内であり、また粘度は１〜５ｃｐｓの範囲内であった。
【０１１１】
このＰＮＡプローブ溶液各々を、実施例２の（３）に記載したのと同様にして上記（１）で作成したガラス板上の各々のエリアにスポッティングした。スポッティング終了後、３時間加湿チャンバー内に静置し、マレイミド基とチオール基とを反応させた。
【０１１２】
なお、上記プリンタの１吐出動作あたりのＰＮＡプローブ溶液の吐出量は約２４ｐｌであった。
【０１１３】
（４）ブロッキング反応マレイミド基とチオール基との反応終了後、ガラス板を１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液で洗浄し、ガラス板表面のＰＮＡを含む液体を完全に洗い流した。次いでガラス板を２％ウシ血清アルブミン水溶液中に浸して３時間放置し、ブロッキング反応を行った。
【０１１４】
（５）ハイブリダイゼーション反応配列番号７のＰＮＡと相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡをＤＮＡ自動合成機で合成し、５'末端にローダミンを結合させて標識化した一本鎖ＤＮＡを得た。この標識化一本鎖ＤＮＡを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に最終濃度５ｎＭとなるように溶解し（溶液量１ｍｌ）、このＤＮＡ溶液中に上記（４）で得たブロッキング処理したＰＮＡプローブアレイを浸漬し、室温（２５℃）で１２時間ハイブリダイゼーション反応を行った。その後、プローブアレイを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液で洗浄してＰＮＡプローブとハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡを洗い流した。次に該プローブアレイのスポットの蛍光量を、画像解析装置（商品名：ＡＲＧＵＳ ５０；浜松ホトニクス（株）社製）を接続し、ローダミンＢに適するフィルターセットを装着した倒立型蛍光顕微鏡を用いて定量した。
【０１１５】
（６）結果標識化一本鎖ＤＮＡと完全マッチである配列番号７のＰＮＡプローブでは２４００の蛍光量であったのに対して１塩基ミスマッチ配列を有する配列番号８のＰＮＡプローブでは約半分の１１００であった。以上のことからＰＮＡアレイ上で完全相補性の一本鎖ＤＮＡを特異的に検出することができた。
【０１１６】
またハイブリダイゼーション後の、各スポットが蛍光発光している状態のプローブアレイを蛍光顕微鏡（ニコン（株）社製）を用いて観察した。その結果本実施例にかかるプローブアレイでは、ａ）各々のスポットがほぼ円形であって、またその直径が約２００μｍの範囲内にあること、ｂ）隣接するスポットとの間には、約５０μｍのスペースが有り、各々のスポットが互いに明確に独立していること、ｃ）スポットの行と列が揃っていることが明らかとなった。
【０１１７】
このことはプローブアレイ上でハイブリダイズしたスポットの自動検出等を行わせる上で極めて有効である。
【０１１８】
更にハイブリダイゼーション反応時、及びその後の未反応の一本鎖ＤＮＡの除去に用いる溶液に塩化ナトリウムを含有させる必要が無いため、蛍光の観察中に塩化ナトリウムの析出に注意する必要がなく、プローブアレイ上のハイブリッドの検出をより容易に行うことができた。また保存上も密封の必要がなく、取扱いが容易であった。
【０１１９】
なおＰＮＡプローブのスポット径が実施例１で得たプローブアレイのスポットよりも大きい理由は明らかでないが、本発明者らはＰＮＡプローブはＤＮＡプローブと比較して若干水溶性が劣るとの知見を得ており、両者の水溶性の差が各々のインクジェット吐出液の表面張力に差異を生じさせる結果、スポット径が異なっているものと推測される。
【０１２０】
実施例７
（表面にエポキシ基を導入したプローブアレイ用ブラックマトリクス付ガラス基板の調製及びその評価）
（１）合成石英からなるガラス基板（５０ｍｍ×５０ｍｍ）を、２ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液を用いて超音波洗浄し、次いでＵＶオゾン処理を行なって表面を清浄化した。エポキシ基を結合したシラン化合物（γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン）を含むシランカップリング剤（商品名：ＫＢＭ４０３；信越化学工業株式会社製）を１ｗｔ％含有する５０ｗｔ％メタノール水溶液を室温下で３時間攪拌し、上記シラン化合物中のメトキシ基を加水分解した。ついでこの溶液を上記基板表面にスピンコーターで塗布し、１００℃で５分間加熱、乾燥して基板表面にエポキシ基を導入した．
（２）次にカーボンブラックを含有するＤＥＥＰ−ＵＶレジスト（ブラックマトリクス用ネガ型レジスト）（商品名：ＢＫ−７３９Ｐ；新日鉄化学株式会社製）をスピンコータで硬化後の膜厚が５μｍとなるように塗布し、この基板をホットプレートで８０℃で５分間加熱して硬化させた。ＤＥＥＰ−ＵＶ露光装置を用いて１ｃｍ×１ｃｍの領域に、図５における隣接ウェル間の距離（Ｘ）が１００μｍ、及びウェルの形状が１００μｍ×１００μｍの正方形となるようにパターニングされたマスクを用いてプロキシミティ露光し、次いで無機アルカリ水溶液の現像液で、スピン現像機を用いて現像し、更に純水で洗浄して現像液を完全に除去した。次にスピン乾燥機を用いて簡単に乾燥し、その後クリーンオーブン中で１８０℃で３０分間加熱してレジストを本硬化させ、所定の配列でウェルが２５００個配置され、隣接するウェルがブラックマトリクスで隔離された基板を得た。なお各ウェルの容積は５０ピコリットル（ｐｌ）と計算される。この時点でブラックマトリクス表面の水に対する接触角は９３°と濡れにくく、またウェル底面の水に対する接触角は３５°と濡れやすかった。
【０１２１】
（３）１０μＭのローダミンＢ水溶液をバブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＣ６２０：キヤノン（株）社製）用インクタンクに充填し、前記実施例１で用いたバブルジェットプリンタのバブルジェットヘッドに装着した。そして上記（１）及び（２）で用意した固相をプリンタに装着し、該固相のウェルに、市松パターン（ひとつおき）にローダミンＢ水溶液を供給した。なお１ウェルあたりの供給量は約５０ｐｌである。またこのプリンタの吐出位置決め精度は±２．５μｍである。次に１０μＭのアミノＦＩＴＣの水溶液を別のインクタンクに充填し、上記プリンタのバブルジェットヘッドに装着して、先にローダミンＢ水溶液を
（３）１０μＭのローダミンＢ水溶液をバブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＣ６２０：キヤノン（株）社製）用インクタンクに充填し、前記実施例１で用いたバブルジェットプリンタのバブルジェットヘッドに装着した。そして上記（１）及び（２）で用意した固相をプリンタに装着し、該固相のウェルに、市松パターン（ひとつおき）にローダミンＢ水溶液を供給した。なお１ウェルあたりの供給量は約５０ｐｌである。またこのプリンタの吐出位置決め精度は±２．５μｍである。次に１０μＭのアミノＦＩＴＣの水溶液を別のインクタンクに充填し、上記プリンタのバブルジェットヘッドに装着して、先にローダミンＢ水溶液を供給したウェルに隣接する別のウェルに供給した。ここでローダミンＢ及びアミノＦＩＴＣを用いたのは水溶性でありインクジェットヘッドからの吐出が容易に行なえること、及び蛍光の観察によってウェルに供給された液体の状態やクロスコンタミネーションを確認できる為である。
【０１２２】
（４）蛍光顕微鏡（ニコン（株）社製）にＧ励起フィルター（ローダミンＢ用）、Ｂ励起フィルター（アミノＦＩＴＣ用）を装着し、倍率１００倍にてウェルに供給された各々の水溶液の状態を蛍光で観察した。その結果各々の水溶液とも、液滴を形成することなくウェル内に均一に供給されていた。また各々のウェルからは互いに他の色素の蛍光は観察されず、クロスコンタミネーションは認められなかった。
【０１２３】
実施例８
（実施例７の基板を用いたプローブアレイの調製及びそれを用いた標的核酸の検出）
（１）実施例７と同様の方法によりブラックマトリクス（ＢＭ）付の基板を作成した。
（２）ＤＮＡプローブとして５'末端の水酸基にリン酸基とヘキサメチレンを介してアミノ基を結合した１８量体のオリゴマー（配列番号：９）、配列番号９のオリゴマーに対して１個のヌクレオチドがミスマッチのプローブ（配列番号：１０）、及び配列番号９のオリゴマーに対して２個のヌクレオチドがミスマッチのプローブ（配列番号：１１）（全て日本製粉株式会社製、ＨＰＬＣグレード）を用意した。配列番号９のオリゴマーの塩基配列は、一本鎖ＤＮＡであるＭ１３ｍｐ１８−ｓｓＤＮＡのマルチプルクローニングサイトの一部の塩基配列に相補的な配列である。以下に配列番号：９〜１１の塩基配列とリンケージの構造を示す。
配列番号：９5'NH2-(CH2)6-O-PO2-O-TGTAAAACGACGGCCAGT3'
配列番号：１０5'NH2-(CH2)6-O-PO2-O-TGTAAAACCACGGCCAGT3'
配列番号：１１5'NH2-(CH2)6-O-PO2-O-TGTATAACCACGCCCAGT3'
（３）上記配列番号９〜１１のＤＮＡプローブに対して完全相補的な一本鎖ＤＮＡを合成した。次にＮａＣｌを５０ｍＭの濃度で含むＴＥ溶液（ｐＨ８）に、各ＤＮＡプローブ及び一本鎖ＤＮＡを最終濃度が１００μＭとなるように溶解し、ＤＮＡプローブ溶液及び一本鎖ＤＮＡ溶液を調製した。そしてＤＮＡプローブを含む溶液１００μｌに対して各々のＤＮＡプローブに相補的な一本鎖ＤＮＡを含む溶液を１００μｌ加えて混合し、各々の混合溶液を９０℃から２５℃まで直線的に２時間かけて冷却し、各々のＤＮＡプローブと各々の一本鎖核酸とのハイブリッドを形成させた。次に上記配列番号：９〜１１の各ＤＮＡプローブのハイブリッドを含む溶液を、グリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、及び前記一般式（Ｉ）で示されるアセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１ｗｔ％を含む水溶液に加え、ハイブリッドの最終濃度が８μＭとなるように調整した。各々のＤＮＡプローブのハイブリッドを含むこれらの液体の表面張力は何れも３０〜５０ｄｙｎｅ／ｃｍの範囲内であり、また粘度も１〜５ｃｐｓ（Ｅ型粘度計：東京計器（株）社製）の範囲内であった。
【０１２４】
次にバブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＣ６２０；キヤノン（株）社製）用インクタンクを３個用意し、各々のインクタンクに上記の３種のハイブリッド溶液を充填し、実施例１で用いたバブルジェットプリンタのヘッドに装着した。また上記（１）及び（２）で作成したＢＭ付ガラス基板をセットし、まず配列番号９のＤＮＡプローブのハイブリッドを含む溶液を１列目のウェル（図６の１３１）に供給した。次に配列番号１０のＤＮＡプローブのハイブリッドを含む溶液を上記１列目のウェルに隣接する２列日目ウェル（図６の１３３）に供給し、更に配列番号１１のＤＮＡプローブのハイブリッドを含む溶液を上記２列目のウェルに隣接する３列目のウェル（図６の１３５）に供給した。なお１つのウェルに対して何れのハイブリッド溶液を４回吐出して約１００ｐｌ供給した。この量は１つのウェルの容積の約２倍であるが、顕微鏡で各ウェルを観察したところ、供給されたハイブリッド溶液はウェルの開口部からは盛り上がって存在しているが、疎水性のマトリクスによってウェル内に止まっており、ウェル間でのクロスコンタミネーションは観察されなかった。
【０１２５】
次に基板を２５℃、湿度１００％の恒温恒湿槽に１２時間置き、プローブのアミノ基とウェルのエポキシ基とを反応させた。なおプローブの塩基のアミノ基は完全相補的な一本鎖ＤＮＡとハイブリッドを形成しているため、各ウェルのエポキシ基と反応することはない。
【０１２６】
（４）次に基板を８０℃の純水で１０分間洗浄し、基板に結合しているプローブとハイブリッドを組んでいる相補鎖をプローブから解離させると共に洗い流した。次いで基板を１％エタノールアミン水溶液で室温下で１時間処理し、各ウェル内の未反応のエポキシ基を開環させた。次に基板を純水で洗浄、乾燥した。
【０１２７】
上記（４）の繰作によってウェル内のＤＮＡプローブと反応しなかったエポキシ基は開環して水酸基となり、また反応させたエタノールアミンにも水酸基が存在するためウェルの底面はより親水性が高くなり、後述の標的一本鎖ＤＮＡを含む溶液のウェルへの供給の際に有利となる。
【０１２８】
（５）次にＮａＣｌを５０ｍＭの濃度で含むＴＥ溶液（ｐＨ８）に配列番号９のＤＮＡプローブに対する完全相補性の一本鎖ＤＮＡを最終濃度が１０μＭとなるように溶解し、この溶液に上記（４）で得たウェルにエポキシ基を導入したプローブアレイを浸漬し、８０℃から２５℃まで２時間かけて降温しハイブリタイゼーション反応を行なった。ついで２０℃で１０ｍＭのＮａＣｌを含むＴＥ緩衝液（ｐＨ８）で基板を２０分間洗浄したのちスピン転燥機で表面の洗浄液を除去した。
【０１２９】
（６）次にＮａＣｌを５０ｍＭの濃度で含むＴＥ溶液（ｐＨ８．０）に、二本鎖核酸にインターカレートして初めて蛍光を発する、２−メチル−４、６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウムアイオタイド（以下「Ｐ２」と略）をその濃度が１０μＭとなるように溶解し、この溶液を上記インクジェットプリンタ用のインクタンクに充填して上記インクジェットプリンタのヘッドに取り付けた。また上記（５）にてハイブリダイゼーションを行なった基板を上記プリンタにセットし、各々のウェルに対してＰ２溶液を１００ｐｌづつ供給したのち、乾燥を防止するために湿度１００％の専用チャンバー内で５分間放置し、チャンバー内に保持したまま倒立型の顕微鏡（商品名：ＩＭＴ２；オリンパス光学株式会社製、倍率：１００倍、蛍光顕微鏡用のフィルターキューブ（励起用フィルター４５５ｎｍから５９５ｎｍ（透過）、ダイクロイックミラー６２０ｎｍ、蛍光用バリアーフィルター６１０ｎｍから７２５ｎｍ（透過））を使用）にＩＣＣＤカメラ（商品名：Ｃ２４００−８７；浜松ホトニクス社製）とイメージプロセッサ（商品名：ＡＲＧＵＳ ５０；浜松ホトニクス社製）を接続し、蛍光を観察定量した。なお観察エリアは２５μｍ×２５μｍ、インテグレーション×６４、ＡＲＧＵＳ ５０の増幅レベルは適宜設定した。
【０１３０】
その結果、配列番号１１のＤＮＡプローブを結合させたウェルからは、バックグラウンドとほぼ同様の、１２００〜１５００の蛍光強度が観察された。一方配列番号９のＤＮＡプローブを結合させたウェルからは、９８００〜１０３００の蛍光強度が観察され、また配列番号１０のＤＮＡプローブを結合させたウェルからは、３５００〜３９００の蛍光強度が観察された。更に各固相をＴＥ緩衝液を用いて３５℃で１０分間洗浄して再度蛍光強度を測定したところ、配列番号１０のＤＮＡプローブを結合させたウェルからはバックグラウンドと同程度の蛍光強度しか観察されなくなった。
【０１３１】
これらの結果から、本実施例に係るプローブアレイを用いることで、各ウェルにおいてハイブリダイゼーション反応を行なうことができ、更に配列番号９と完全相補的な標的核酸を特異的に検出できることが分かった。
【０１３２】
実施例９
（実施例８のプローブアレイの各ウェルへの反応物質の選択的供給及びプローブとの反応）
（１）実施例８と同様にして配列番号９〜１１のＤＮＡプローブを結合させた基板を用意した。
【０１３３】
（２）配列番号９〜１１のＤＮＡプローブに対して完全相補的な３種類の一本鎖ＤＮＡを合成した。ＮａＣｌを５０ｍＭの濃度で含むＴＥ溶液（ｐＨ８）に上記３種類の一本鎖ＤＮＡを各々の濃度が１００μＭとなるように溶解した。バブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＣ６２０；キヤノン（株）社製）用インクタンクを３個用意し、各々のインクタンクに上記の３種の一本鎖ＤＮＡ溶液を充填し、実施例１で用いたバブルジェットプリンタのヘッドに装着した。また上記（１）で用意した基板もプリンタにセットし、配列番号９〜１１のＤＮＡプローブが結合しているウェルに対して各々完全相補的な一本鎖ＤＮＡを含む溶液を１つのウェルにつき１００ｐｌづつ供給した。この時点で各ウェルの状態を顕微鏡で観察したところ、液のにじみ、クロスコンタミネーションは観察されず、またプローブアレイの各ウェルに個別に反応させるべき物質の溶液を供給できることが分かった。
【０１３４】
（３）次に実施例８と同様にして各ウェルにおいてハイブリダイゼーション反応を行なわせた後、実施例８と同様にしてＰ２溶液を各ウェルに供給し、蛍光を観察することでハイブリッドの検出を行なった。その結果、全てのウェルから９８００〜１０３００の強度の蛍光が観察された。このことから固相プローブアレイの各ウェルに個別に反応物質を供給し、各ウェルにおいてプローブと反応物質を反応させ、そして反応の結果物を検出できることが確認された。
【０１３５】
実施例１０
（実施例７の基板のウェル底面の親水化処理）
（１）実施例７と同様にしてブラックマトリックスパターンを有するガラス基板を用意した。
【０１３６】
（２）この基板のブラックマトリックスが形成されている側の表面にＵＶオゾン処理を行なった。この時点でブラックマトリックス表面の水に対する接触角は９３°と濡れにくい状態であり、ウェル底面の水に対する接触角は２２°であって実施例７で得たブラックマトリクス付基板のウェル底面のそれと比較して濡れやすい状態であった。これは上記ＵＶオゾン処理による効果と考えられる。
【０１３７】
（３）次に実施例７と同様にしてローダミンＢ、及びアミノＦＩＴＣの水溶液を用いてウェルへのインクジェット吐出液の供給状況を観察したところ、各々の水溶液は共にウェル内で液滴を形成することなくウェル内に均一に供給されていた。プローブアレイの固相として表面にウェルを備えた固相を用いる場合には、表面にウェルを有しない、平坦且つ均一な表面特性を有する固相を用いる場合と異なり、インクジェット吐出液を出来るだけ限定された位置に留めなくてもよく、むしろウェル底面に十分にインクジェット吐出液を行き亘らせることが、後に行なうプローブと標的物質との反応の検出にはより有利となる。本実施例に記載したウェル底面の親水化処理はその一実施態様として好ましい方法である。また各々の色素が供給されるウェルからは互いに他の色素は観察されず、クロスコンタミネーションを生じさせることなしに、各々のウェルに各々の色素水溶液をインクジェットプロセスを用いて供給できたことが分かった。
【０１３８】
実施例１１
（ＢＭ形成基板の各ウェルにプローブ固定用官能基導入の為の液体をインクジェット法にて供給して得た固相を用いたプローブアレイの製法及びその使用）
（１）実施例７と同様にしてブラックマトリックスを備えた基板を用意した。
（２）アミノ基を結合したシラン化合物（Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン）を含むシランカップリング剤（商品名：ＫＢＭ６０３；信越化学工業株式会社製）を１ｗｔ％含有する１０ｗｔ％メタノール水溶液を室温下で３時間攪拌し、上記シラン化合物中のメトキシ基を加水分解した。ついでこの溶液をバブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＣ６２０；キヤノン（株）社製）用インクタンクに充填し、実施例１で用いたバブルジェットプリンタのヘッドに装着した。また上記（１）で用意した基板もプリンタにセットし、ウェルに対してメトキシ基が加水分解されたシラン化合物を含むシランカップリング剤溶液を実施例８と同様にして供給した。この基板を２５℃、湿度１００％の恒温恒湿槽に３０分放置したのち、純水で洗浄、スピン乾燥し、その後１００℃で３０分間ベークして、各ウェルの底面にアミノ基を導入した。
【０１３９】
（３）次にスクシイミジル−４−（マレイミドフェニル）ブチレート（アルドリッチ社製）を５ｗｔ％ＤＭＳＯ溶液に最終濃度が５ｗｔ％となるように溶解し、この溶液を上記（２）と同様にしてインクジェットプリンタで各ウェルに１００ｐｌづつ供給し、ついで３０℃、湿度１００％の恒温恒湿槽に基板を２時間放置した。次に基板を純粋で洗浄し、スピン乾燥させて各ウェルの底面にマレイミド基を導入した。
【０１４０】
（４）ＤＮＡプローブとして５'末端の水酸基にリン酸基とヘキサメチレンを介してチオール基を結合した１８量体のオリゴマー（配列番号：１２）、配列番号１２のオリゴマーに対して１個のヌクレオチドがミスマッチのプローブ（配列番号：１３）、及び配列番号１２のオリゴマーに対して２個のヌクレオチドがミスマッチのプローブ（配列番号：１４）（全て日本製粉株式会社製、ＨＰＬＣグレード）を用意した。以下に配列番号：１２〜１４の塩基配列とリンケージの構造を示す。
配列番号：１２5'HS-(CH2)6-O-PO2-O-TGTAAAACGACGGCCAGT3'
配列番号：１３5'HS-(CH2)6-O-PO2-O-TGTAAAACCACGGCCAGT3'
配列番号：１４5'HS-(CH2)6-O-PO2-O-TGTATAACCACGCCCAGT3'
（５）１０ｍＭのリン酸緩衝液に上記配列番号１２〜１４の各々のＤＮＡプローブを最終濃度が１０μＭとなるように溶解させた。各々のＤＮＡプローブ溶液を上記実施例８と同様にして上記（３）で作成した基板のウェルに供給した。各ウェルを顕微鏡で観察したところ、供給されたＤＮＡプローブ溶液は、ウェルの開口部から盛り上がって存在しているが疎水性のマトリクスによってウェル内に止まっており、クロスコンタミネーションは観察されなかった。この基板を３０℃、湿度１００％の恒温恒湿槽に２時間放直し、その後純水で洗浄、スピン乾燥を行ない、各々のＤＮＡプローブのチオール基を各ウェルのマレイミド基と反応させ、ＤＮＡプローブを基板に結合させた。
【０１４１】
（６）配列番号１２のＤＮＡプローブに対して完全相補的な一本鎖ＤＮＡを合成し、ＮａＣｌを５０ｍＭの濃度で含むＴＥ溶液に、この一本鎖ＤＮＡを最終浪度が１０μＭとなるように溶解した。この溶液に上記（５）で得たＤＮＡプローブ結合基板を浸漬し、８０℃〜２５℃まで２時間かけて降温し、ハイブリダイゼーションを行なった。次にＮａＣｌを１０ｍＭの濃度で含むＴＥ溶液（ｐＨ８）を用いて２０℃で２０分間基板を洗浄したのち、スピン乾燥機で基板表面の洗浄液を除去した。
【０１４２】
（７）ハイブリッドにインターカレートしてはじめて蛍光を発する試薬であるＹＯＹＯ−１をＮａＣｌを濃度５０ｍＭで含むＴＥ溶液に、最終濃度が１０μＭとなるように溶解した（ｐＨ８）。この溶液を上記（２）と同様にしてインクジェットプリンタを用いて上記（６）の処理を行なった基板の各ウェルに、１００ｐｌづつ供給し、実施例８と同様にして蛍光を観察定量した（Ｂ励起フィルターを使用）。なおＡｒｇｕｓ５０の信号増幅レベルは実施例８と同一である。
【０１４３】
その結果、配列番号１４のＤＮＡプローブを結合させたウェルからは、バックグラウンドとほぼ同様の、１８００〜２０００の蛍光強度が観察された。一方配列番号１２のＤＮＡプローブを結合させたウェルからは、７５００〜８０００の蛍光強度が観察され、また配列番号１３のＤＮＡプローブを結合させたウェルからは、３１００〜３３００の蛍光強度が観察された。更に固相をＴＥ緩衝液を用いて３５℃で１０分間洗浄して再度蛍光強度を測定したところ、配列番号１３のＤＮＡプローブを結合させたウェルからはバックグラウンドと同程度の蛍光強度しか観察されなくなった。
【０１４４】
これらの結果から、本実施例に係るプローブアレイを用いることで、各ウェルにおいてハイブリダイゼーション反応を行なうことができ、更に配列番号９と完全相補的な標的核酸を特異的に検出できることが分かった。
【０１４５】
実施例１２
（１）実施例１１と同様にして配列番号１２〜１４のＤＮＡプローブを結合させた基板を用意した。
【０１４６】
（２）配列番号１２〜１４のＤＮＡプローブに対して完全相補的な３種類の一本鎖ＤＮＡを合成した。ＮａＣｌを５０ｍＭの濃度で含むＴＥ溶液に上記３種類の一本鎖ＤＮＡを各々の濃度が１０μＭとなる様に溶解した。なお各々の一本鎖ＤＮＡ溶液のｐＨは８である。バブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＣ６２０；キヤノン（株）社製）用インクタンクを３個用意し、各々のインクタンクに上記の３種の一本鎖ＤＮＡ溶液を充填し、実施例１で用いたバブルジェットプリンタのヘッドに装着した。また上記（１）で用意した基板もプリンタにセットし、配列番号１２〜１４のＤＮＡプローブが結合しているウェルに対して各々完全相補的な一本鎖ＤＮＡを含む溶液を１つのウェルにつき１００ｐｌづつ供給した。この時点で各ウェルの状態を顕微鏡で観察したところ、液のにじみ、クロスコンタミネーションは観察されず、またプローブアレイの各ウェルに個別に反応させるべき物質の溶液を供給できることが分かった。
【０１４７】
（３）次に実施例１１と同様にして各ウェルにおいてハイブリダイゼーション反応を行なわせた後、実施例１１と同様にしてＹＯＹＯ−１溶液を各ウェルに供給し、蛍光を観察することでハイブリッドの検出を行なった。その結果、全てのウェルから７５００〜８０００の強度の蛍光が観察された。このことから固相プローブアレイの各ウェルに個別に反応物質を供給し、各ウェルにおいてプローブと反応物質を反応させ、そして反応の結果物を検出できることが確認された。
【０１４８】
実施例１３
（ＢＭ形成基板をエポキシ基導入用の溶液に浸漬してウェルにエポキシ基を導入した基板を用いたプローブアレイの製法）
（１）実施例７の（２）の記載に従ってブラックマトリックス付基板を作成した。
【０１４９】
（２）実施例７の（１）の記載に従って、エポキシ基を結合したシラン化合物（γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン）を含むシランカップリング剤（商品名：ＫＢＭ４０３；信越化学工業株式会社製）の１ｗｔ％水溶液を室温下で１時間攪拌して、該シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。次いでこの溶液中に上記（１）で用意した固相を室温下で３０分間浸漬し、その後純水で該固相を洗浄し、窒素ガス流で水を除去し、１２０℃で５分間ベークし、ウェル底面にエポキシ基を導入した。この時点でＢＭ表面の水に対する接触角は９５°と濡れにくい状態で有り、またウェル底部の水に対する接触角は３３°と濡れやすい状態であった。この様にＢＭ形成後の固相をシランカップリング剤で処理することによってもウェル底面へのエポキシ基の導入は可能である。
【０１５０】
（３）上記実施例８の（３）及び（４）に記載した方法に従って、配列番号：９〜１１のＤＮＡプローブをウェルの底面に結合させた。
【０１５１】
（４）配列番号９に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡをＤＮＡ自動合成橡で合成し、５'末端にヘキサノールアミンリンカーを介してテトラメチルローダミンを結合した標識化一本鎖ＤＮＡを得た。この標識化一本鎖ＤＮＡをＮａＣｌを５０ｍＭの濃度で含むＴＥ溶液（ｐＨ８）に最終濃度が２μＭとなるように溶解した。この溶液に上記（３）で得たＤＮＡプローブ結合基板を浸漬し、８０℃から２５℃まで２時間かけて降温してハイブリダイゼーション反応を行なった。その後プローブアレイを１０ｍＭ ＮａＣｌ／ＴＥ緩衝液（ｐＨ８）を用いて２９℃で２０分間洗浄してプローブ核酸とハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡを洗い流した。次に実施例８と同様にして各ウェルからの蛍光量を定量した。
【０１５２】
（５）結果標識化一本鎖ＤＮＡと完全マッチである配列番号９のＤＮＡプローブを結合させたウェルからは８５００〜９４００の蛍光量が確認された。また配列番号１０のＤＮＡプローブを結合させたウェルからは２８００〜３４００の蛍光量が観察されまた配列番号１１のＤＮＡプローブを結合させたウェルからは１２００〜１５００程度の蛍光量しか観察されなかった。また上記プローブアレイを１０ｍＭＮａＣｌ／ＴＥ緩衝液（ｐＨ８）を用いて更に３５℃で１０分間洗浄したところ、配列番号１０のＤＮＡプローブを結合させたウェルからの蛍光量は、バックグラウンドのレベルにまで低下した。よって本来施例にかかるプローブアレイを用いてもハイブリッドの標的物質の特異的な検出が可能であることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】バブルジェットヘッドを用いてプローブアレイを製造する方法の概略説明図である。
【図２】図１のバブルジェットヘッドのＡ−Ａ線断面図である。
【図３】実施例３においてバブルジェット法によってアルミ板上にスポッティングした核酸プローブの量の理論値と、実際の回収量とを対比するグラフである。
【図４】実施例４においてバブルジェット法によってアルミ板上にスポッティングした核酸プローブの量の理論値と、実際の回収量とを対比するグラフである。
【図５】（ａ）本発明にかかるプローブアレイの一実施態様の概略平面図である。  （ｂ）図５（ａ）のＢＢ線断面図である。
【図６】実施例８におけるスポッティング方法の説明図である。
【符号の説明】
【０１５４】
１０１  ノズル
１０３  固相
１０４  液滴
１０５  バブルジェットヘッド
１０７  核酸プローブを含む吐出される液体
１０９  保護膜
１１１−１、１１１−２  電極
１１３  発熱抵抗体層
１１５  蓄熱層
１１６  放熱性の良好なアルミナ等で形成されている基板
１１７  発熱ヘッド
１１９  吐出オリフィス
１２１  メニスカス
１２３  発泡領域
【図１】
2005118049.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005118049.tif 000011
【図６】
2005118049.tif 000012
【配列表】
2005118049000001.app