(57)【要約】【課題】  本発明は、近縁種の米品種を、検体数に関わらず、簡単な操作で、迅速に、且つ正確に識別が可能な米の品種識別方法を提供することを目的とする。【解決手段】  米の品種を識別する方法であって、米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列の存在を、該配列もしくはその相補鎖のうちの連続する８塩基以上の配列を有する少なくとも３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群を使用し検出することを特徴とする米の品種識別方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
米の品種を識別する方法であって、米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列の存在を、該配列もしくはその相補鎖のうちの連続する８塩基以上の配列を有する少なくとも３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群を使用し検出することを特徴とする米の品種識別方法。
【請求項２】
特定の塩基配列が、配列表の配列番号１〜１８に示される塩基配列若しくはその一部からなる塩基配列より選択されるものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
単鎖ヌクレオチド群を構成する単鎖ヌクレオチドのうち２つを、核酸増幅法の増幅用対合プライマーとして使用することを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
核酸増幅法の増幅用対合プライマーとして用いられる単鎖ヌクレオチドが、配列表の配列番号１９と配列番号２０にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号２２と配列番号２３にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号２５と配列番号２６にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号２８と配列番号２９にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号３１と配列番号３２にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号３４と配列番号３５にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号３７と配列番号３８にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号４０と配列番号４１にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号４２と配列番号４３にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号４４と配列番号４５にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号４６と配列番号４７にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号４８と配列番号４９にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号５０と配列番号５１にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号５２と配列番号５３にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号５４と配列番号５５にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号５６と配列番号５７にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号５８と配列番号５９にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、及び、配列番号６０と配列番号６１にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチドからなる群から選択される、少なくとも１つの組み合わせである請求項３記載の方法。
【請求項５】
単鎖ヌクレオチド群を構成する単鎖ヌクレオチドのうち１つを、核酸増幅法による増幅物の検出用プローブとして用いることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
増幅物の検出用プローブとして用いられる単鎖ヌクレオチドが、米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列もしくはその相補鎖にハイブリダイズ可能なものである請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
単鎖ヌクレオチド群を構成する単鎖ヌクレオチドのうち１つが適当な担体上に固定されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
単鎖ヌクレオチド群を構成する単鎖ヌクレオチドのうち１つが、蛍光物質で修飾されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
配列表の配列番号１９〜２１にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号２２〜２４にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号２５〜２７にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号２８〜３０にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号３１〜３３にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号３４〜３６にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、及び、配列番号３７〜３９にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群から選択される、少なくとも１つの単鎖ヌクレオチド群を用いることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
配列表の配列番号１〜１８に示される塩基配列もしくはその一部からなる塩基配列を有するＤＮＡ断片を特異的に検出するためのヌクレオチド群であって、配列番号１〜１８に示される塩基配列のいずれかもしくはその相補鎖のうちの連続する８塩基以上の配列を有する少なくとも３つの単鎖ヌクレオチドを含むことを特徴とする単鎖ヌクレオチド群。
【請求項１１】
配列表の配列番号１９〜２１にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号２２〜２４にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号２５〜２７にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号２８〜３０にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号３１〜３３にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号３４〜３６にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、及び、配列番号３７〜３９にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群から選択される請求項１０記載の単鎖ヌクレオチド群。
【請求項１２】
配列表の配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３６、及び配列番号３９にそれぞれ示される塩基配列からなる単鎖ヌクレオチドのうちから選ばれる少なくとも１つを増幅物の検出用プローブとして、適当な担体に固定させてなる米の品種識別用ＤＮＡチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農業分野において有用な、米の品種に特徴的なＤＮＡ断片の検出によって米品種を識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、穀粒の価格は、穀粒の加工適性や食味に応じて決定され、良質の穀粒ほど高価格で取り引きされている。例えば、米において、平成１２年度におけるわが国の作付け上位４品種である「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」及び「あきたこまち」に代表される良食味米は、消費者の良食味米志向を受けて高値で取り引きされている。
しかし、一部では、これらの良食味品種以外の米を混米しながら、表示を偽って販売されている不正混米が行われ、問題となっており、平成１３年４月から施行された改正ＪＡＳ法の下では、米の包装での品種、産地、産年の表示が義務づけられている。
このような状況下、穀物、特に米の内容と表示が一致しているかどうかを科学的に検査する技術の開発が必要とされている。
【０００３】
従来、米等の穀物の品種については、植物体の草型、穀粒の粒型、葉や米の酵素多型などによって識別されてきた。しかし、現在のように、わが国の米における「コシヒカリ」とその類縁系統が全体の７割を越えるような近縁系統の多い状況下では、前述の方法によって品種混合の有無を識別することは不可能である。
本発明者らは、これまでに、ＲＡＰＤ法やＳＴＳ化プライマー法等の、米ゲノムＤＮＡとＰＣＲを用いて品種を判別する技術を開発し、非特許文献１、並びに特許文献１及び２に開示してきた。
【０００４】
【非特許文献１】日本食品科学工学会誌４６巻３号（ｐ．１１７−１２２）
【特許文献１】特許第３０４８１４９号公報
【特許文献２】特開２００１−９５５８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、前述の技術は、ＰＣＲにより得られる品種の識別に用いるＤＮＡ断片をその長さで同定しているため、近接した長さのＤＮＡ断片を識別に用いる場合、識別を誤る可能性がある。また、電気泳動写真を目視で確認しながらの判別では、複数のデータを基に品種を識別する場合、検体数が多いと検体データを取り違え識別を誤る可能性もある。
このような状況に鑑みて、本発明は、近縁種の米品種を、検体数に関わらず、簡単な操作で、迅速に、且つ正確に識別が可能な米の品種識別方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、米品種の識別に用いることのできる米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列を解析し、その情報を元に、該配列の存在を検出するために有用な単鎖ヌクレオチドを設計し、構築した。その結果、少なくとも３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群を用いることにより、米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列を簡単な操作で、迅速に、且つ正確に識別することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
請求項１記載の本発明は、米の品種を識別する方法であって、米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列の存在を、該配列もしくはその相補鎖のうちの連続する８塩基以上の配列を有する少なくとも３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群を使用し検出することを特徴とする米の品種識別方法である。
請求項２記載の本発明は、特定の塩基配列が、配列表の配列番号１〜１８に示される塩基配列若しくはその一部からなる塩基配列より選択されるものである請求項１記載の方法である。
請求項３記載の本発明は、単鎖ヌクレオチド群を構成する単鎖ヌクレオチドのうち２つを、核酸増幅法の増幅用対合プライマーとして使用することを特徴とする請求項１又は２記載の方法である。
【０００８】
請求項４記載の本発明は、核酸増幅法の増幅用対合プライマーとして用いられる単鎖ヌクレオチドが、配列表の配列番号１９と配列番号２０にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号２２と配列番号２３にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号２５と配列番号２６にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号２８と配列番号２９にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号３１と配列番号３２にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号３４と配列番号３５にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号３７と配列番号３８にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号４０と配列番号４１にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号４２と配列番号４３にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号４４と配列番号４５にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号４６と配列番号４７にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号４８と配列番号４９にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号５０と配列番号５１にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号５２と配列番号５３にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号５４と配列番号５５にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号５６と配列番号５７にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号５８と配列番号５９にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、及び、配列番号６０と配列番号６１にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチドからなる群から選択される、少なくとも１つの組み合わせである請求項３記載の方法である。
【０００９】
請求項５記載の本発明は、単鎖ヌクレオチド群を構成する単鎖ヌクレオチドのうち１つを、核酸増幅法による増幅物の検出用プローブとして用いることを特徴とする請求項３記載の方法である。
請求項６記載の本発明は、増幅物の検出用プローブとして用いられる単鎖ヌクレオチドが、米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列もしくはその相補鎖にハイブリダイズ可能なものである請求項４又は５記載の方法である。
【００１０】
請求項７記載の本発明は、単鎖ヌクレオチド群を構成する単鎖ヌクレオチドのうち１つが適当な担体上に固定されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法である。
請求項８記載の本発明は、単鎖ヌクレオチド群を構成する単鎖ヌクレオチドのうち１つが、蛍光物質で修飾されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法である。
【００１１】
請求項９記載の本発明は、配列表の配列番号１９〜２１にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号２２〜２４にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号２５〜２７にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号２８〜３０にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号３１〜３３にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号３４〜３６にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、及び、配列番号３７〜３９にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群から選択される、少なくとも１つの単鎖ヌクレオチド群を用いることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法である。
【００１２】
請求項１０記載の本発明は、配列表の配列番号１〜１８に示される塩基配列もしくはその一部からなる塩基配列を有するＤＮＡ断片を特異的に検出するためのヌクレオチド群であって、配列番号１〜１８に示される塩基配列のいずれかもしくはその相補鎖のうちの連続する８塩基以上の配列を有する少なくとも３つの単鎖ヌクレオチドを含むことを特徴とする単鎖ヌクレオチド群である。
請求項１１記載の本発明は、配列表の配列番号１９〜２１にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号２２〜２４にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号２５〜２７にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号２８〜３０にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号３１〜３３にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号３４〜３６にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、及び、配列番号３７〜３９にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群から選択される請求項１０記載の単鎖ヌクレオチド群である。
【００１３】
請求項１２記載の本発明は、配列表の配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３６、及び配列番号３９にそれぞれ示される塩基配列からなる単鎖ヌクレオチドのうちから選ばれる少なくとも１つを増幅物の検出用プローブとして、適当な担体に固定させてなる米の品種識別用ＤＮＡチップである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、米の品種を、検体数に関わらず簡単な操作で、迅速に、且つ正確に識別することができる。
従って、本発明を利用すれば、近縁系統が多い国内主要品種はもちろん、国内外に関わらず全ての種類の米品種の識別が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明が対象とする米とは、食用とする種子（米粒）のほか、苗なども包含される。また種子としては、食用として市場に流通する、精米、玄米、などのほか、精米粉、玄米粉、更には、米飯、餅等なども包含される。
【００１６】
本発明は、上述のような米の品種を識別する方法を提供する。すなわち、本発明の米の品種識別方法は、請求項１に記載するように、米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列の存在を、該配列もしくはその相補鎖のうちの連続する８塩基以上の配列を有する少なくとも３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群を使用し検出することを特徴とする。
【００１７】
本発明の方法において、米由来のＤＮＡを調製するにあたり、米粒自体を試料とすることができ、また、必要に応じて適当な粉砕機器、例えば超遠心粉砕機（レッチェ社製）、サイクロンミル（ユーディ社製）、ミルサー（イワタニ社製）、乳鉢等によって粉砕して得られる粉末を試料とすることもできる。また、葉からＤＮＡを調製する場合は、葉自体のほか、液体窒素などで凍結後、乳鉢等によって粉砕して得られる粉末を試料としても良い。
【００１８】
上記試料からのゲノムＤＮＡの抽出には、公知のＤＮＡ抽出法を適用することができ、例えばフェノール抽出法、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）などが挙げられる。また、適当な市販のＤＮＡ抽出キットを用いても良い。
また、試料が米飯や餅等の場合には、特許第３０４８１４９号公報に記載されているように、粉末試料を耐熱性アミラーゼによって処理した後にゲノム遺伝子を抽出する酵素法によって抽出することもできる。
【００１９】
ＤＮＡの抽出後、必要に応じてクロロホルム／イソアミルアルコール処理、イソプロパノール沈殿、フェノール／クロロホルムによる除蛋白、エタノール沈殿等の精製工程を加えても良い。これらの工程の中では、クロロホルム／イソアミルアルコール処理が好ましい。この処理は、例えばＤＮＡ抽出液にクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加えて攪拌、遠心分離して得られる上清に、ＤＮＡ沈殿液を加えて更にＤＮＡを沈殿させた後、遠心分離を行って得られたＤＮＡ沈殿物を１Ｍ  ＮａＣｌで抽出し、イソプロピルアルコール、エタノールによる洗浄、沈殿の後、ＴＥ緩衝液に溶解するもので、これによりＤＮＡ試料液を得ることができる。
【００２０】
本発明の方法においては、上記のようにして抽出した米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列、すなわち、品種間の識別性の現れるＤＮＡ断片の存在、具体的には、請求項２に記載するように、配列表の配列番号１〜１８に示される塩基配列若しくはその一部からなる塩基配列の存在を検出する。
、配列表の配列番号１〜１８に示される塩基配列とは、Ｍ１１（配列表の配列番号１参照）、Ｇ２２（配列表の配列番号２参照）、Ｂ４３（配列表の配列番号３参照）、Ｓ１３（配列表の配列番号４参照）、Ｆ６（配列表の配列番号５参照）、Ｅ３０（配列表の配列番号６参照）、ＷＫＡ０９（配列表の配列番号７参照）、Ｇ４（配列表の配列番号８参照）、Ａ６（配列表の配列番号９参照）、Ｂ１（配列表の配列番号１０参照）、Ｇ２８（配列表の配列番号１１参照）、Ｇ４９（配列表の配列番号１２参照）、Ｍ２ＣＧ（配列表の配列番号１３参照）、Ｂ７（配列表の配列番号１４参照）、Ａ７（配列表の配列番号１５参照）、Ｐ３（配列表の配列番号１６参照）、Ｐ５（配列表の配列番号１７参照）、及びＴ１６（配列表の配列番号１８参照）の各塩基配列を意味する。各塩基配列の由来品種名は、後述の表２に示す通りである。
【００２１】
本発明においては、上記特定の塩基配列の存在を検出するに当たり、該配列もしくはその相補鎖のうちの連続する８塩基以上を有する少なくとも３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群を使用する。
ここで、ヌクレオチドとは、ヌクレオシドの糖部分がリン酸とエステルを作っている化合物を意味する。核酸塩基が結合したデオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡや核酸塩基が結合したリボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡに特に限定されず、核酸塩基が結合したデオキシリボヌクレオチドと核酸塩基が結合したリボヌクレオチドの重合体であっても良く、また、適当な位置に蛍光物質が結合していても良い。機能の面から分類したヌクレオチドの例としては、ＰＣＲ法やＩＣＡＮ法（ＷＯ００／５６８７７号国際公開パンフレット参照）における増幅用の対合プライマーや、サザンハイブリダーゼーションにおける核酸検出用プローブなどが挙げられる。
そして、本発明において用いる単鎖ヌクレオチドとは、相補的な塩基配列を有する異なるヌクレオチド分子が核酸塩基間の水素結合により形成する２本鎖分子ではないことを意味する。
【００２２】
このような単鎖ヌクレオチド群を使用し米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列の存在を検出するには、例えば請求項３に記載するように、単鎖ヌクレオチド群を構成する単鎖ヌクレオチドのうち２つを、核酸増幅法の増幅用対合プライマーとして使用することができる。
【００２３】
核酸増幅法の増幅用対合プライマーとは、米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列、すなわち品種間の識別性の現れるＤＮＡ断片、具体的には配列表の配列番号１〜１８に示される塩基配列もしくはその一部を有するＤＮＡ断片を核酸増幅法により増幅させることができる１対のプライマーを意味する。
核酸増幅法については、特に限定はなく、検出しようとするＤＮＡ断片を増幅可能な種々の核酸増幅法を使用することができる。例えば、上記のＰＣＲ法やＩＣＡＮが本発明には好適である。
尚、ＰＣＲ法の一種として、１度の反応に複数の対合プライマーを組み合わせて用いるマルチプレックスＰＣＲ法を用いても良い。この場合、組み合わせる対合プライマーは、互いにプライマーダイマーを生成したり、識別バンドが互いに干渉したり、重複したりすることがない、融解温度の近い複数の対合プライマー（８〜３０量体）を選定して用いる。その結果、ＰＣＲ回数を減らすことができ、更に、ＰＣＲ増幅物をアガロースゲル電気泳動により検出する場合には、電気泳動・染色回数をも減らすことができる。
【００２４】
増幅用対合プライマーとして使用される単鎖ヌクレオチドとしては、前記のＤＮＡ断片にハイブリダイズ可能なヌクレオチドもしくは前記のＤＮＡ断片の相補鎖にハイブリダイズ可能なヌクレオチドが例示される。例えば前記ＤＮＡ断片の塩基配列もしくはその相補鎖の塩基配列のうちの連続する８塩基以上、好ましくは１２塩基以上、更に好ましくは１５塩基以上からなる塩基配列を有するヌクレオチドを使用することができる。プライマーの鎖長には特に上限はないが、その合成のコストなどの観点から、通常は５０塩基以下、例えば４０塩基以下のものが本発明には好適である。
【００２５】
このような増幅用対合プライマーとして使用される単鎖ヌクレオチドは、増幅しようとするＤＮＡ断片、すなわち、米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列、具体的には配列表の配列番号１〜１８に示される塩基配列もしくはその一部を有するＤＮＡ断片の塩基配列情報に基づいて任意に設計、作製することができる。
【００２６】
特に本発明を限定するものではないが、増幅用対合プライマーとして使用される単鎖ヌクレオチドの一例をあげると、請求項４に記載するように、配列表の配列番号１９と配列番号２０にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号２２と配列番号２３にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号２５と配列番号２６にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号２８と配列番号２９にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号３１と配列番号３２にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号３４と配列番号３５にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号３７と配列番号３８にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号４０と配列番号４１にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号４２と配列番号４３にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号４４と配列番号４５にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号４６と配列番号４７にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号４８と配列番号４９にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号５０と配列番号５１にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号５２と配列番号５３にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号５４と配列番号５５にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号５６と配列番号５７にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、配列番号５８と配列番号５９にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、及び、配列番号６０と配列番号６１にそれぞれ記載される塩基配列からなる２本の単鎖ヌクレオチド、の各組み合わせを用いることができる。
【００２７】
前段で例示列挙した、増幅用対合プライマーとして使用される単鎖ヌクレオチドの組み合わせは、配列表の配列番号１〜１８に記載された塩基配列で表されるＤＮＡ断片の全長を増幅させることができる対合プライマーであるが、塩基配列データを基に適当なプライマー設計ソフトを使用すれば、米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列、すなわち品種間の識別性の現れるＤＮＡ断片、具体的には配列表の配列番号１〜１８に示される塩基配列全体ではなく、その一部を有する短い長さのＤＮＡ断片を増幅させることができる１対のプライマーを設計することも可能である。
【００２８】
このような単鎖ヌクレオチド群のうち２つを核酸増幅法の増幅用対合プライマーとして使用して核酸増幅法による増幅を行った後、例えば請求項５に記載するように、単鎖ヌクレオチド群を構成する単鎖ヌクレオチドのうちの１つを核酸増幅法による増幅物の検出用プローブとして用いることによって、米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列の存在を検出することができる。
具体的には、請求項６に記載するように、増幅物の検出用プローブとして用いられる単鎖ヌクレオチドとして、米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列もしくはその相補鎖にハイブリダイズ可能なものを用いることにより、増幅断片とのハイブリダイゼーションによって米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列の存在を検出することができる。
【００２９】
このような増幅物の検出用プローブとして使用される単鎖ヌクレオチドとしては、検出しようとするＤＮＡ断片、例えば配列番号１〜１８に記載された塩基配列もしくはその相補鎖とハイブリダイズ可能なものであれば良い。例えば配列番号１〜１８に記載された塩基配列もしくはその相補鎖の塩基配列を有するヌクレオチド、又はそれらの一部を使用することができる。
例えば前記ＤＮＡ断片の塩基配列もしくはその相補鎖の塩基配列のうちの連続する８塩基以上、好ましくは１５塩基以上、更に好ましくは２０塩基以上からなる塩基配列を有するヌクレオチドを使用することができる。また、１００塩基以上の鎖長のヌクレオチド（ポリヌクレオチド）も本発明に使用することができる。
増幅物の検出用プローブとして使用される単鎖ヌクレオチドは、前記のＤＮＡ断片を鋳型とした核酸増幅反応や、前記ＤＮＡ断片を適当な制限酵素で消化した後、プローブとして使用できる断片を単離することによって調製することができる。
【００３０】
増幅物の検出用プローブとして使用される単鎖ヌクレオチドは、検出しようとするＤＮＡ断片、例えば配列番号１〜１８に記載された塩基配列もしくはその相補鎖とハイブリダイズ可能なものを用いることができる。具体的には、前記プローブを固定化したＤＮＡチップを検出に使用する場合、例えば２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を示す）中、５５℃で、好ましくは６５℃で検出しようとするＤＮＡ断片にハイブリダイズ可能なヌクレオチドが検出用プローブとして好適である。
このような増幅物の検出用プローブとして使用される単鎖ヌクレオチドとしては、特に本発明を限定するものではないが、配列表の配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３６、及び配列番号３９にそれぞれ示される塩基配列からなるものが例示される。
【００３１】
増幅物の検出用プローブとして使用される単鎖ヌクレオチドは、検出しようとするＤＮＡとハイブリダイズする際に単鎖ヌクレオチドの状態であれば良い。
従って、二本鎖を形成したヌクレオチド、例えばＰＣＲ法により増幅された二本鎖ＤＮＡ断片であっても、目的のＤＮＡが含まれている可能性のある試料と接触させる際に単鎖（一本鎖）の状態となるものであれば、本発明において使用される単鎖ヌクレオチドに包含される。
【００３２】
核酸増幅法、例えばＰＣＲにより得られる増幅ＤＮＡ断片を、該ＤＮＡ断片にハイブリダイズ可能な単鎖ヌクレオチドを用いて検出する方法としては、プローブとのハイブリダイゼーションに基づく種々のＤＮＡ検出手法を利用することができる。
例えば、適当な担体上に該増幅断片とハイブリダイズ可能なヌクレオチドを固定化したマイクロタイタープレート、メンブレン、スライドグラス等を使用する方法や、リアルタイム定量ＰＣＲ法のような溶液中での検出反応系が挙げられる。硬質の担体表面にプローブ（ヌクレオチド）が高密度に固定化されたＤＮＡチップ（ＤＮＡアレイ）は複数種のＤＮＡ断片を同時に検出可能な手法であり、微量のＤＮＡを感度良く検出することができる。従って、本発明の方法にはＤＮＡチップを使用することが特に好適である。
【００３３】
ＤＮＡチップを使用して検出する場合は、請求項７に記載するように、単鎖ヌクレオチド群を構成する単鎖ヌクレオチドの１つ、好ましくは増幅物の検出用プローブとして用いられる単鎖ヌクレオチド（例えば、請求項１２に記載するように、配列表の配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３６、及び配列番号３９にそれぞれ示される塩基配列からなる単鎖ヌクレオチドの内から選ばれる少なくとも１つ）が適当な担体上に固定されている状態のＤＮＡチップを用いることが好ましい。
適当な担体としては、例えばスライドグラスを挙げることができるが、ガラス製に限定されるものではなく、金属、プラスチック、セラミックス等、ＤＮＡチップの担体として使用可能な材質であれば良い。ヌクレオチドの固定化に適した表面処理がなされた担体は本発明に好適である。
【００３４】
単鎖ヌクレオチドの担体上への固定化の方法としては、静電結合を利用する方法、共有結合を介する方法等、公知の方法を利用できる。
増幅物の検出用プローブとして用いられる単鎖ヌクレオチドとして、前述したような二本鎖を形成したヌクレオチドを使用する場合、これをそのまま担体上に固定化し、検出（ハイブリダイゼーション）に先立ってヌクレオチドの一本鎖への変性（例えば熱変性、アルカリ変性）を施すことにより、本発明の方法を実施することができる。また、二本鎖ヌクレオチドを一本鎖に変性した後に担体への固定化を行っても良い。
尚、単鎖（一本鎖）ヌクレオチドを増幅物の検出用プローブとして用いる場合には上記のような固定化前、固定化後の変性操作は不要である。
【００３５】
ここで、請求項８に記載するように、単鎖ヌクレオチド群を構成する単鎖ヌクレオチドのうち１つが、蛍光物質で修飾されていることにより、増幅物がハイブリダイズしたか否かの判定を容易に行うことができる。
蛍光物質（例えば、Ｃｙ５等）による修飾は、増幅用対合プライマーとして用いられる単鎖ヌクレオチド側に行っても、増幅物の検出用プローブとして用いられる単鎖ヌクレオチド側に行っても良く、単鎖ヌクレオチドを適当な担体に固定してＤＮＡチップとして検出する場合にも、固定されている方の単鎖ヌクレオチドでも、固定されていない方の単鎖ヌクレオチドでも良い。
【００３６】
蛍光物質による修飾を、増幅用対合プライマーとして用いられる単鎖ヌクレオチドについて行う場合には、増幅物の検出用プローブとして用いられる単鎖ヌクレオチドを設計する際に、増幅用対合プライマー領域を含まないように配慮すれば、未反応のＰＣＲ用対合プライマーによる陽性シグナルの発生を避けることができる。
増幅物の検出用プローブとして用いられる単鎖ヌクレオチドを適当な担体に固定して得られるＤＮＡチップを使用した増幅物の検出の一例を挙げると、以下の通りである。
まず、増幅用対合プライマーとして用いられる単鎖ヌクレオチドの少なくとも一方を予め蛍光物質により修飾しておいたものを用意し、該対合プライマーを用いて、米由来のＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行う。次に、得られた増幅ＤＮＡ断片と、検出したい米品種に対応する増幅物の検出用プローブが固定ＤＮＡチップとのハイブリダイゼーションを行ない、ＤＮＡチップ上の蛍光を検出する。その結果、チップに固定化された単鎖ヌクレオチドとＰＣＲ増幅断片がハイブリダイズしたか否か判定することができる。
尚、ハイブリダイズしたか否かの判定にあたり、蛍光物質による修飾の他にも、電気的検出など公知のＤＮＡチップ検出原理を利用することが可能である。
【００３７】
一方、蛍光物質による修飾を、増幅物の検出用プローブとして用いられる単鎖ヌクレオチドについて行う場合には、増幅ＤＮＡ断片の検出原理として、ＴａｑＭａｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｈｙｂｒｉ  Ｐｒｏｂｅ法、Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ法、Ｓｃｏｐｅｏｎ  Ｐｒｏｂｅ法などを利用することができる。このうち、Ｈｙｂｒｉ  Ｐｒｏｂｅ法は、検出に蛍光標識（修飾）したヌクレオチドを２種類用いるという特徴がある。
また、蛍光検出装置としては、リアルタイム定量ＰＣＲ用装置を利用でき、例えば、Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（タカラバイオ株式会社製）、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（日本ロシュ社製）、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＲ７７００（アプライドバイオシステムズ社製）などが挙げられる。
【００３８】
核酸増幅法としてマルチプレックスＰＣＲを利用する場合に、増幅物の検出用プローブとして用いられる単鎖ヌクレオチドを予め既知の位置に固定したＤＮＡチップを用いて得られる増幅物を検出すれば、増幅物を修飾する蛍光色素が単一であっても、蛍光を検出するスポット位置からどのような塩基配列を有するＤＮＡ断片が増幅されたかを容易に確認することができる。
また、各対合プライマーの標識蛍光色素を変えておくことにより、蛍光色素種により、どのＤＮＡ断片が得られたか判断することもできる。
一方、複数の蛍光色素を分別して検出可能なリアルタイム定量ＰＣＲ装置を用いれば、増幅物の検出用プローブとして用いられる単鎖ヌクレオチド種毎に蛍光色素の種類を変えて標識しておくことにより、蛍光色素の種類からどのＰＣＲ増幅物が得られたか、検出することが可能である。増幅物であるＤＮＡ断片の長さが近接していてアガロースゲル電気泳動では十分な分離ができず、どの特徴を有するＤＮＡ断片の判断が困難である場合であっても、上記手段により検出することにより明確に分析可能である。
【００３９】
本発明の方法における単鎖ヌクレオチド群は、判別の対象である米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列、すなわち、請求項２、或いは請求項１０に記載されるように、配列表の配列番号１〜１８に示される塩基配列もしくはその一部からなる塩基配列を有するＤＮＡ断片を特異的に検出するためのヌクレオチド群であって、配列番号１〜１８に示される塩基配列のいずれかもしくはその相補鎖のうちの連続する８塩基以上の配列を有する少なくとも３つの単鎖ヌクレオチドを含むことを特徴とする単鎖ヌクレオチド群であり、中でも、判別の対象である米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列から設計された増幅用対合プライマー２種と検出用プローブ１種から構成されることが好ましく、特に、前記した通り、検出用プローブが増幅用対合プライマー領域を含まないものであることが好ましい。
具体的には、請求項９或いは請求項１１に記載するように、配列表の配列番号１９〜２１にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号２２〜２４にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号２５〜２７にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号２８〜３０にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号３１〜３３にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、配列番号３４〜３６にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群、及び、配列番号３７〜３９にそれぞれ記載される塩基配列からなる３つの単鎖ヌクレオチドからなる単鎖ヌクレオチド群が挙げられ、このうちから選択される、少なくとも１つの単鎖ヌクレオチド群を用いることが好ましい。
【００４０】
尚、加工度の高い食品の場合、検査に必要なＤＮＡが低分子化されている可能性があり、長鎖長のＤＮＡを増幅して検出する方法では品種の識別が不能となる場合もある。その場合は、より短い鎖長の増幅断片が得られるような単鎖ヌクレオチドを設計して調製し、増幅用対合プライマーとして用いれば良い。尚、特異性が高い試料の場合は、増幅用対合プライマー２種で得られる増幅断片をアガロースゲル電気泳動により分析することで品種識別を行うことも可能となる。
以上に記載した方法により、米の品種に特徴的な塩基配列のＤＮＡの存在を確認し、米の品種識別を簡便かつ迅速に行うことが可能となる。
【実施例】
【００４１】
以下に実施例をもって本発明を更に詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
【００４２】
実施例１〔米由来ＤＮＡの調製〕
「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「日本晴」、「ヒノヒカリ」、「きらら３９７」、「ほしのゆめ」、「はえぬき」、及び「つがるロマン」の８品種の精米試料をレッチェ社製超遠心粉砕機を用いて粉砕し、得られた粉末０．４ｇからＣＴＡＢ法によってゲノムＤＮＡを抽出した。
【００４３】
すなわち、６５℃の２％ＣＴＡＢ溶液（０．１Ｍ  トリス塩酸、２ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）０．６ｍＬ及び滅菌蒸留水０．２ｍＬを加えて攪拌し、６５℃の恒温槽に入れ、３０分間ＤＮＡを抽出した。
その後、ＤＮＡ抽出液にクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を０．８ｍＬ加えて攪拌した後、遠心分離して最上層を新しいチューブに移した。次いで、、６５℃の０．７ＭＮａＣｌ含有１０％  ＣＴＡＢ溶液を１／１０容量、ＣＩＡ（クロロホルム／イソアミルアルコール（２４／１、ｖ／ｖ））を０．８ｍＬ加えて攪拌した後、遠心分離して上層を新しいチューブに移した。ＤＮＡ沈澱液（１％ＣＴＡＢ、２０ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を３倍量加えて４℃で６０分間放置してＤＮＡを沈澱させた。その後、遠心分離して得られたＤＮＡ沈澱物を１Ｍ  ＮａＣｌ／ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）によって溶解し、イソプロピルアルコール２００μＬを加え、転倒混和し、１５，０００ｒｐｍ、４℃、２０分間の遠心を行った。
上清を除去し、−２０℃冷却７０％エタノール５０μＬにより沈殿を洗浄した。１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間の遠心を行い、上清を除去した後、沈澱を自然乾燥させた。得られた沈殿をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  トリス塩酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）２００μＬに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を１μＬ加え、５５℃で６０分間放置した。
【００４４】
次いで、２００μＬの中性フェノール２００μＬを加え転倒混和後、１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間の遠心を行い、上層を新しいチューブに移した。得られた上層にＰＣＩ（中性フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５／２４／１，ｖ／ｖ／ｖ））を加え転倒混和後、１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間の遠心を行い、上層を新しいチューブに移した。
得られた上層に対し、１／２５容量の５Ｍ  ＮａＣｌ及び、２．５倍容量の−２０℃冷却エタノールを加え、転倒混和後、氷中に３０分間放置した。１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間の遠心を行い、上清を除去した後、−２０℃冷却７０％エタノールを５０μＬ加え、沈殿の洗浄をおこなった。１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間の遠心を行い、上清を除去した後、エタノール臭がしなくなるまで沈殿を自然乾燥させた。
得られた沈殿を１／１０ＴＥ（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を３０μＬにて溶解し、該溶液の２６０ｎｍ、２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４５】
実施例２〔プローブクローンの作製〕
実施例１で調製した、８種の米由来ゲノムＤＮＡ、及び、ＴＯＰＯＲＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、プローブクローン（すなわち、米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列を含むＤＮＡ断片）を作成した。
クローニング用ＰＣＲ増幅物を得るための１反応あたりＰＣＲ反応液組成は、表１に示す通りである。
【００４６】
【表１】
2005245244.tif 000002
【００４７】
ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ溶液は、Ｆｏｒｗａｒｄ側プライマーとＲｅｖｅｒｓｅ側プライマーを等モルずつ混合した後、ＤＮＡ量で０．２μｇ／μＬとなるよう調整した。尚、ＥｌｏｎｇａｓｅＴＭｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｍｉｘについては、該成分を除く４９μＬからなる溶液を９６℃で３０秒間加温してから添加した。
Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒは、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＭＰ（タカラバイオ社製）を用いた。反応は、まず９６℃で２分間過熱後、９６℃で１５秒間、５０℃で３０秒間、６０℃で４分間の温度サイクルを２５サイクル繰り返すことにより行った。
各増幅物を得るために使用した増幅用対合プライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ側及びＲｅｖｅｒｓｅ側）と、米由来ゲノムＤＮＡの由来品種とを、表２に示す。
【００４８】
【表２】
2005245244.tif 000003
【００４９】
アガロースゲル電気泳動による増幅物の分離には、Ｍｕｐｉｄ−２電気泳動装置（コスモバイオ社製）を用いた。電気泳動緩衝液として１／１０ＴＡＥを使用し、アガロースゲルとして２％  Ｕｌｔｒａ−ｐｕｒｅ  Ａｇａｒｏｓｅ（サワディーテクノロジー社製）を使用した。尚、アガロースゲルにはＴＯＰＯＲＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ添付のＣｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔを終濃度１μｇ／ｍＬとなるように添加した。
アガロースゲル電気泳動は、ＰＣＲ反応終了液１２．５μＬに対し、ＴＯＰＯＲＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ添付の６×Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２．５μＬを添加し、計１５μＬを１ウェルあたり注入して、５０Ｖ定電圧で行った。
目的とする増幅物の分離を確認後、該増幅物を含む領域を切り出し、ＥＡＳＹＴＲＡＰＴＭ  Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用い、増幅物を回収した。
上記操作で得られた各増幅物をＴＯＰＯＲＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ添付のマニュアルに従い、各種形質転換体を得た。
【００５０】
実施例３〔増幅物の塩基配列の決定〕
実施例２にて得られた各種形質転換体Ｓをそれぞれ培養し、集菌後、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。
続いて、プラスミドＤＮＡのインサートの塩基配列を決定するために、シーケンスを行った。シーケンス反応には、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  シークエンス試薬キット（アプライド  バイオシステムズ社）を用いた。シーケンス装置はＡＢＩ３７７オートシーケンサー（アプライド  バイオシステムズ社）を使用し、当該シークエンサーの取扱説明書に従い操作を行った。尚、シークエンスは、１増幅物あたり、１〜５個のクローンについて行った。
上記操作で得られた増幅物（Ｍ１１、Ｇ２２、Ｂ４３、Ｓ１３、Ｆ６、Ｅ３０、ＷＡＫ０９、Ｇ４、Ａ６、Ｂ１、Ｇ２８、Ｇ４９、Ｍ２ＣＧ、Ｂ７、Ａ７、Ｐ３、Ｐ５、Ｔ１６）のＤＮＡ配列を、それぞれ配列表の配列番号１〜配列番号１８に示す。
【００５１】
実施例４〔固定化用ＤＮＡ断片の作製〕
ＤＮＡチップに固定するための固定化用ＤＮＡ断片（すなわち、増幅物の検出用プローブとしての単鎖ヌクレオチド）を得るために、実施例２で得られた増幅物（クローン）のうちＭ１１、Ｇ２２、Ｂ４３、Ｓ１３、Ｆ６、Ｅ３０、Ｇ４、及びＷＫＡ０９を、ＰＣＲ反応により増幅させた。一方、ポジティブコントロールとして、アクチン（Ａｃｔｉｎ：Ａｃｔ１）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ユビキチン(Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ：Ｕｂｉ２)の増幅も行なった。
尚、ポジティブコントロールの増幅に関しては、鋳型として、後述の実施例７にて調製した米ゲノムＤＮＡを用いた。
【００５２】
（増幅プライマーの設計）
まず、前記した実施例３において得られた増幅物の塩基配列を基に、ＤＮＡチップに固定化する固定化用ＤＮＡ断片の増幅用プライマーの設計を行なった。
プライマーの設計には、無償配布プライマー設計ソフト、Ｐｒｉｍｅｒ３を用いた。各増幅物の塩基配列を基に設計した増幅プライマーの名称と、配列表の配列番号の対応関係を、下記の表３に示す。
尚、増幅プライマーの名称中、Ｆはフォワードプライマーを、Ｒはリバースプライマーを示す。すなわち、例えば、プライマー、Ｍ１１−Ｆ１−ＰＣＲは、Ｍ１１由来の固定化用ＤＮＡ断片を増幅するためのフォワードプライマーを示し、Ｍ１１−Ｒ１−ＰＣＲは、Ｍ１１由来の固定化用ＤＮＡ断片を増幅するためのリバースプライマーであることを示す。
【００５３】
【表３】
2005245244.tif 000004
【００５４】
（プライマーの合成と調製）
増幅用プライマーの合成は、９６穴ウェルプレート合成対応のＤＮＡ合成機、Ｍａｒｍａｉｄ（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて行なった。合成されたプライマーは、その後、一律１００μＬの滅菌水にて溶解させた。これを測定用９６穴マイクロタイタープレート（グライナー社）に分注し、９６穴マイクロタイタープレート吸光度測定用プレートリーダー（テカン社）を用いて、２５４ｎｍにおける紫外吸光度を測定し、ＤＮＡ濃度を定量した。この定量値を元に、各ウェルのプライマー濃度が２０ｐｍｏＬ／μＬになるように滅菌水を添加した。
【００５５】
（ＰＣＲ増幅）
次に、ＰＣＲ反応液を調製した。増幅の条件検討の結果、以下に示す条件により増幅をおこなった。
【００５６】
（１）鋳型ＤＮＡが、実施例３で得られたプラスミドクローン（すなわち、米由来ゲノムＤＮＡ：Ｍ１１、Ｇ２２、Ｂ４３、Ｓ１３、Ｆ６、Ｅ３０、Ｇ４、ＷＫＡ０９）の場合
【００５７】
【表４】
2005245244.tif 000005
【００５８】
（２）鋳型ＤＮＡがゲノム（すなわち、ポジティブコントロールとしてのゲノム：Ａｃｔ１、ＧＡＰＤＨ、Ｕｂｉ２）の場合
【００５９】
【表５】
2005245244.tif 000006
【００６０】
上記表４及び５記載の組成の調製済みＰＣＲ反応液を、サーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰ：タカラバイオ社）にセットした。反応は、まず９６℃で２分間過熱後、９４℃で１分間、６２℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３５サイクル繰り返した後、４℃にて反応を停止させた。
収量を確保するため、各サンプルごとに、鋳型ＤＮＡがプラスミドの場合は１３ウェル分のＰＣＲ反応を、鋳型ＤＮＡがゲノムの場合には１０ウェル分のＰＣＲ反応を行った。
【００６１】
（ＤＮＡ断片の精製とアレイ用サンプルの調製）
上述のＰＣＲ反応物（１００μＬ）の各ウェルに、イソプロパノール１００μＬと、３Ｍ  酢酸ナトリウム溶液１０μＬを加えて良く攪拌し、室温で１時間放置した。これを１５，０００ｒｐｍ、２５℃で１０分間遠心し、遠心終了後、沈殿を確認し、注意深く上清を取り除いた。ここに、８０％エタノールを１００μＬを加え、１５，０００ｒｐｍ、４℃で２分間遠心した。再度沈殿を確認し、注意深く上清を取り除いた後、滅菌蒸留水を適量加え、沈殿物を十分に溶解した。
この後、同じサンプルを同一のウェルにまとめた。上記作業後、９６穴ウェルプレート対応吸光度測定器（テカン社）を用いて、２５４ｎｍにおける紫外吸光度を測定し、ＤＮＡ濃度を定量化した。この定量値を元に、各ウェルのＤＮＡ濃度が０．３６μｇ／μＬになるように滅菌水を添加した。
【００６２】
濃度調整したＤＮＡサンプルは、Ｔｈｅｒｍｏｗｅｌｌ  ９６−ｗｅｌｌ  ｔｈｉｎ−ｗａｌｌ  ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｐｌａｔｅ（コーニング社）に、各ウェル  ２０μＬずつ分注し、そこにＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔ（タカラバイオ社）を、４μＬずつ加え、良く攪拌した。こうして得られた固定化用ＤＮＡ断片（ＤＮＡチップ用サンプル）のうち、米由来ゲノムＤＮＡから得られたものは、配列表の配列番号２１、２４、２７、３０、３３、３６、及び３９にそれぞれ示される塩基配列からなる単鎖ヌクレオチドであったので、それぞれをＭ１１プローブ、Ｇ２２プローブ、Ｂ４３プローブ、Ｓ１３プローブ、Ｆ６プローブ、Ｅ３０プローブ、及びＷＫＡ０９プローブとして、これらの固定化用ＤＮＡ断片について、後述の実施例５におけるＤＮＡチップの作製を行うまでの間、−２０℃で保管した。
【００６３】
実施例５〔ＤＮＡチップの作製（アレイヤーによるスポッティング）〕
ＤＮＡチップを作製するために、前記した実施例４にて調製した固定化用ＤＮＡ断片（ＤＮＡチップ用サンプル）のプレートを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１７Ａｒｒａｙｅｒ（アフィメトリクス社）にセットした。
この時、装置のパラメーターを、Ｄｏｔ  Ｓｐａｃｅ  Ｘ：３００ｕｍ  Ｙ：３００ｕｍ、Ｒｅｐｌｉｃａ：２、Ｐａｔｔｅｒｎ：Ａｒｒａｙ、Ｓｌｉｄｅ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｘ０：９ｍｍ  Ｙ０：１０ｍｍ、Ｘ１：９ｍｍ  Ｙ０：１１．６ｍｍ、Ｘ１：９ｍｍ  Ｙ０：１３．２ｍｍに設定した。
上記の作業終了後、ＤＮＡチップ用スライドガラス（ＴａＫａＲ  Ｓｌｉｄｅ  Ｇｌａｓｓ：タカラバイオ社）を、アレイヤーにセットし、実施例４で調製した固定化用ＤＮＡ断片の内、Ｍ１１プローブ、Ｇ２２プローブ、Ｂ４３プローブ、Ｓ１３プローブ、Ｆ６プローブ、Ｅ３０プローブ、Ｇ４プローブ、ＷＫＡ０９プローブ、Ａｃｔ１、ＧＡＰＤＨ、Ｕｂｉ２の各断片について、スポットを開始した。尚、ポジションマーカーとして、ラムダＤＮＡ（ｌａｍｄａ）を、ネガティブコントロールとして、ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ１９）（いずれもタカラバイオ社製）をスポットした。尚、各固定化用ＤＮＡ断片のスポットポジションは、後述の表１１に示す通りである。
【００６４】
（固定化処理）
アレイヤーでのスポット終了後、スライドガラスを恒温恒湿機（温度３７℃、湿度９０％）に入れ、１時間保温した。その後、ＵＶクロスリンカー（フナコシ社  Ｆｕｎａ−ＵＶ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ  ＸＬ−１０００）で、６０ｍＪｏｕｌｅ／ｃｍ２の紫外線を照射し、スライドガラス上にＤＮＡ断片を共有結合させた。
上記操作後、０．２％ＳＤＳ中で室温、２分間、続いて滅菌超純水で室温、２分間、２回洗浄した。次に、無水コハク酸溶液中（無水コハク酸５．５ｇを１−Ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅ  ３２５ｍＬに溶解し、１Ｍ  ホウ酸ナトリウムを２５ｍＬ加えて良く撹拌して調製したもの）で室温、２０分間洗浄した後、滅菌超純水中で室温、２分間、２回洗浄した。更に、沸騰超純水中で２分間洗浄後、４℃の１００％エタノール中に１分間浸して急冷した。
チップを冷却後、圧縮窒素ガスを勢い良く吹き付けることにより、水分を飛ばして乾燥させＤＮＡチップを完成させた。尚、作製したＤＮＡチップは使用するまで遮光下、デシケーター中で保存した。
【００６５】
実施例６〔判別用プライマーの作製〕
実施例５で作製したＤＮＡチップを用いた品種判別を実施するため、検体のＤＮＡを特異的に増幅するプライマー（以下、判別用プライマーという。）を設計した。判別用プライマーは、バックグラウンド軽減のために、ＤＮＡチップに固定したＤＮＡ断片の外側に位置するようにデザインした。
本実施例においては、実施例２においてプローブクローン作成のための増幅反応に使用されたプライマーを判別用プライマーとして使用した。検出対象であるＤＮＡ断片の名称と、これに対応する２つの判別用プライマーの名称と、配列表の配列番号との対応関係を表６に示す。尚、判別用プライマーには、検出のためフォワード、リバースどちらかのプライマーにＣｙ５標識が導入されているため、Ｃｙ５標識したプライマーはプライマー名を（プライマー名）−Ｃｙ５と表記してある。
【００６６】
【表６】
2005245244.tif 000007
【００６７】
判別用プライマーの合成は、９６穴ウェルプレート合成対応のＤＮＡ合成機、Ｍａｒｍａｉｄ（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）を用いて行なった。プライマー合成後、一律１００μＬの滅菌水にて溶解した。これを測定用９６穴マイクロタイタープレート（グライナー社）に分注し、９６穴マイクロタイタープレート吸光度測定用プレートリーダー（テカン社）を用いて、２５４ｎｍにおける紫外吸光度を測定し、ＤＮＡ濃度を定量した。この定量値を元に、各ウェルのプライマー濃度が２０ｐｍｏＬ／μＬになるように滅菌水を添加した。
【００６８】
実施例７〔マルチプレックスＰＣＲ法によるサンプルＤＮＡの増幅〕
まず、マルチプレックスＰＣＲの実施のために、実施例６で設計・合成した判別用プライマーを表７〜１０に示す容量で混合し、４種のプライマーミックスを作製した。
【００６９】
【表７】
2005245244.tif 000008
【００７０】
【表８】
2005245244.tif 000009
【００７１】
【表９】
2005245244.tif 000010
【００７２】
【表１０】
2005245244.tif 000011
【００７３】
次に、下記方法により、検出対象であるゲノムＤＮＡを、「コシヒカリ」、「ヒノヒカリ」、及び「あきたこまち」よりそれぞれ調製した。
すなわち、まず、精米粉約１ｇを１４ｍＬ容量の丸底チューブに量り採り、該米粉を６５℃で１０分間保温後、６５℃に温めたＡＰ１（ＱＩＡＧＥＮ社製）４ｍＬを添加し、Ｖｏｒｔｅｘにて混和した。
次いで、１００ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡ溶液（ＱＩＡＧＥＮ社製）４０μＬを添加しＶｏｒｔｅｘにて混和後、１０分毎に２〜３回転倒混和しながら６５℃で３０分間放置した。その後、２０ｍｇ／ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（タカラバイオ社製）を１００μＬ添加し、２０分毎に２〜３回転倒混和しながら６０℃で６０分間放置した。
【００７４】
該液に１４５０μＬのＡＰ２（ＱＩＡＧＥＮ社製）を添加し、Ｖｏｒｔｅｘにて混和後、氷中で十分に液が冷却されるまで放置した。続いて、ローター１１１５０（ＱＩＡＧＥＮ社製）で４０００ｒｐｍ、５分間遠心後、上清をＭａｘｉ  ＱＩＡ  Ｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に添加した。ローターＴＳ−７（ＴＯＭＹ社製）で３０００ｒｐｍ、３分間遠心することにより濾液を得た。該濾液を更に、ローターＴＡ−２３（ＴＯＭＹ社製）で４９００Ｇ、５分間遠心し、得られた上清を新しい５０ｍＬ遠沈菅に移した。
該上清に１．５倍量のＡＰ３／ＥｔＯＨ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を添加、転倒混和後、Ｍａｘｉ  ＱＩＡ  Ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に添加した。ローターＴＳ−７で３０００ｒｐｍ、１分間遠心後、更にローターＴＡ−２３で４９００Ｇ、５分間遠心した。
【００７５】
次いで、Ｍａｘｉ  ＱＩＡ  Ｃｏｌｕｍｎに１２ｍＬのＡＷ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を添加し、ローターＴＳ−７で３０００ｒｐｍ、３分間遠心後、更にローターＴＡ−２３で４９００Ｇ、７分間遠心した。Ｍａｘｉ  ＱＩＡ  Ｃｏｌｕｍｎを新しいチューブに移した後、７０℃に温めた１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）７５０μＬを添加し、室温で５分間放置した。ローターＴＡ−２３で４９００Ｇ、５分間遠心後、再度７０℃に温めた１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）７５０μＬをＭａｘｉ  ＱＩＡ  Ｃｏｌｕｍｎに添加した。室温で５分間放置後、ローターＴＡ−２３で４９００Ｇ、５分間遠心し、溶出液を回収した。
得られた溶出液に１００ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡ溶液１μＬを添加し、混和後、６５℃にて１０分間放置した。室温冷却後、０．２Ｍ  ＮａＣｌ含有１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液にて１００ｍｇ／ｍＬとなるように溶解したα−Ａｍｙｌａｓｅ（ＳＩＧＭＡ社製）溶液を５０μＬ添加し、３７℃で６０分間放置した。
【００７６】
前記処理液を７５０μＬずつ２ｍＬの鍵付チューブに２本に移した後、各チューブに７５０μＬのＴＥ飽和フェノールを添加した。１５ｒｐｍで１５分間転倒混和した後、ローターＴＭＡ−２４（ＴＯＭＹ社製）で１２，０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行った。中間層を吸わないように得られた上層を新しい２ｍＬチューブに移した後、ＰＣＩ７５０μＬを添加し、１５ｒｐｍ、５分間転倒混和した。ローターＴＭＡ−２４で１２，０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行った後、得られた上層を新しい２ｍＬチューブに移した。
続いて、ＣＩＡ７５０μＬを添加後、１５ｒｐｍ、５分間転倒混和した。ローターＴＭＡ−２４で１２，０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行った後、得られた上層を新しい２ｍＬチューブに移し、再度、７５０μＬのＣＩＡ処理を行った。
【００７７】
得られた上層を１まとめにして５０ｍＬの遠沈菅に移し、上層に対し１／１０容量の５Ｍ  ＮａＣｌ、２．５倍容量の−２０℃冷却エタノールを添加、充分に混和後、−２０℃にて１時間以上、放置した。ローターＴＡ−２３で４９００Ｇ、１０分間遠心後、上清を除去し、次いで、冷却エタノールと等量の−２０℃冷却７０％エタノールを添加した。軽く混和後、ローターＴＡ−２３で４９００Ｇ、１０分間遠心し、上清を除去した。エタノール臭がなくなるまで室温にて放置後、１５０μＬの１／１０ＴＥ（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））にて沈殿を溶解した。本溶解液について２６０ｎｍ、２８０ｎｍ、３２０ｎｍの紫外吸光度を測定し、該吸光度値を基に１０ｎｇ／μＬとなるように各溶解液を稀釈した。
【００７８】
こうして調製された検出対象であるゲノムＤＮＡについて、上記した各プライマーミックスを用いたマルチプレックスＰＣＲを、以下の条件及び手順により行った。
すなわち、各ゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）１μＬに、１０ｘＥｘＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社）１０μＬ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）８μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．５μＬを加えた後、（ｉ）すべてのプライマーによるマルチプレックスＰＣＲの場合  Ａｌｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ（表７参照）を２μＬ加え、（ｉｉ）Ｐｏｓｉ  Ｋｉｔ  ＰｒｉｍｅｒによるマルチプレックスＰＣＲの場合、Ｐｏｓｉ  Ｋｉｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ（表８参照）を６．５μＬとＣｏｎｔｒｏｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ（表１０参照）を４μＬ加え、（ｉｉｉ）Ｎｅｇａ  Ｋｉｔ  Ｐｒｉｍｅｒによるマルチプレックス  ＰＣＲの場合、Ｎｅｇａ  Ｋｉｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ（表９参照）を１１．９μＬとＣｏｎｔｒｏｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ（表１０参照）を４μＬ加え、最終的に全体の液量が１００μＬになるように滅菌蒸留水で調整した。
調製した反応溶液は、サーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰ：タカラバイオ社）にセットし、まず９６℃で２分間過熱後、９４℃で１分間、６２℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３５サイクル繰り返した後、４℃にて反応を停止させた。
【００７９】
上述のマルチプレックスＰＣＲ反応後、反応の成否を確認するために、アガロース電気泳動にて確認した。
アガロース電気泳動の方法は以下に示す通りである。まず、マルチプレックスＰＣＲ反応後の反応液から５μＬを抜き取り、ここに５ｘＬｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（滅菌蒸留水２４５ｇ、ＢＰＢ０．１ｇ、ＳＤＳ５ｇ、グリセロール２５０ｇを良く混合して作製したもの）を１μＬを加え、電気泳動用サンプルを調製した。
次に、この調製サンプルを、緩衝液として１ｘＴＡＥ（０．０５Ｍ  ＥＤＴＡを含む０．０４Ｍ  Ｔｒｉｓ酢酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いた３％アガロース（タカラバイオ社）ゲルに注入し、１ｘＴＡＥ緩衝液中にて、３Ｖ／ｃｍにてＢＰＢが約５ｃｍ移動するまで電気泳動をおこなった。
泳動後、ゲルを取り出し、エチジウムブロマイド液（１μｇ／ｍＬ）に室温で１０分間浸漬した。染色終了後ゲルを取り出し、紫外線照射下でゲルを観察し、目的とする増幅物と同等の長さのバンドが検出されることを確認した。
こうして得られた増幅物を、下記の実施例８に示すようにＤＮＡチップを用いた品種判別に供した。
【００８０】
実施例８〔ＤＮＡチップによる品種判別〕
（ターゲットＤＮＡの調製）
前記した実施例７において判別用プライマーを用いて調製した増幅物について、以下の操作を行い精製した後、前記した実施例５において作製したＤＮＡチップ用のターゲットＤＮＡとして調製した。
まず、Ｃｅｎｔｒｉ  ｓｅｐカラム（ミリポア社）の上蓋をはずし、８００μＬの１００ｍＭ  ＮａＣｌを加えて再度ふたをし、軽く攪拌した後、室温にて３０分間樹脂の膨潤を行なった。ここで、膨潤したカラム中の気泡をぬいた後、カラムの上下蓋をはずし、２ｍＬマイクロチューブにセットして、７５０ｘｇにて２分間遠心した。この操作ののち、カラムを新しい１．５ｍＬマイクロチューブにセットしなおし、実施例７で調製した増幅物の反応液（各１００μＬ）をカラムの中央部に１滴ずつ全量滴下し、７５０ｘｇにて２分間遠心してＤＮＡをマイクロチューブ回収した。
【００８１】
次に、回収したサンプル（１００μＬ)に、クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）１００μＬを加え、１０秒間攪拌後、１５，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、上清を回収した。
回収した上清に、３Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）１０μＬと冷１００％エタノール３００μＬを加え、室温で２０分間放置した後、１５，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心を行った。沈殿を確認後、注意深く上清を取り除き、冷却７０％エタノール３００μＬを加え、１５，０００ｒｐｍ、４℃で２分間遠心した。再度沈殿を確認し、注意深く上清を取り除いた後、滅菌蒸留水３μＬを加え、十分に溶解した。
【００８２】
上記サンプル０．５μＬに、Ｃｙ５−ｌａｍｂｄａＡ（λＣｏｎｔｒｏｌ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ＆Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ‐Ａ  ：タカラバイオ社）  を用いて、ＰＣＲ増幅した産物を、ＬａｂｅｌＩＴ  Ｃｙ５  ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ  （タカラバイオ社）にて、Ｃｙ５標識しておいたもの）を濃度５０ｎｇ／μＬに調整して１μＬ加え、そこに滅菌蒸留水３μＬを添加し、合計４．５μＬに調整した。
ここに、Ｄ１  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＬａｂｅｌＩＴ  Ｃｙ５  ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ：タカラバイオ社）を０．４５μＬ加え、室温で５分放置した後、Ｎ１  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（タカラバイオ社）を０．４５μＬ加え、室温で５分間放置した。最後にＮＨ  Ｂｕｆｆｅｒ（６ｘＳＳＣ，０．２％ＳＤＳ，５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液，０．１ｍｇ／ｍＬ  ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ；０．２２μｍフィルターろ過済み）を５．４μＬ加えて、良く攪拌し、ターゲットＤＮＡ標品溶液を調製した。
【００８３】
（ＤＮＡチップへのハイブリダイゼーション）
まず、調製したターゲットＤＮＡ標品溶液を、９５℃で２分間加熱し変性させた後、室温に放置して冷却後、１５，０００ｒｐｍ、２５℃で１０分間遠心し、不溶物を除去した。
次に、ハイブリダイゼーションカセット（ＴａＫａＲａ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ：タカラバイオ社）の蓋を開け、使用するスライドセッティングエリアのくぼみに、必要量の２ｘＳＳＣを入れた後、ＤＮＡチップのＤＮＡがスポットされている面を上にして、スライドセッティングエリアに置き、その上にカバーガラス（ＴａＫａＲａ  Ｓｐａｃｅｄ  Ｃｏｖｅｒ  Ｇｌａｓｓ  Ｓ：タカラバイオ社）を注意深くセットした。
【００８４】
ここで、先ほど準備したターゲットＤＮＡ標品溶液１０μＬを、マイクロピペットを用いてカバーガラスとＤＮＡチップとの隙間に展開した後、カセットの蓋を閉じ、ネジを締めたのち、６５℃の恒温水槽にて１２〜１６時間保温し、ハイブリダイゼーションを行った。
上述のハイブリダイゼーション終了後、ＤＮＡチップを５５℃の２ｘＳＳＣ／０．２％ＳＤＳにて５分間の洗浄を３回繰り返した。洗浄操作終了後、室温の０．０５ｘＳＳＣでリンスし、圧縮窒素ガスを勢い良く吹き付けることにより、水分を飛ばしてＤＮＡチップを乾燥させた。
【００８５】
（スキャナーによる検出）
検出は、４１８アレイスキャナー（アフィメトリクス社）にて行なった。
洗浄、乾燥後のＤＮＡチップの上側を手前にし、アレイ面を上にして、スキャナーのステージにセットし、レーザー出力及びＰＭＴゲインを設定した後、読み取り範囲パラメーターを入力し、スキャニングを行なった。
スキャン後、データをＴｉｆ形式で保存し、画像解析に供した。解析にはＤＮＡチップ解析用ソフトウェア、ＩｍａＧｅｎｅ（バイオディスカバリー社）を用いた。
【００８６】
（結果）
前記実施例７において調製したサンプルＤＮＡのうち、「コシヒカリ」より調製したゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰｏｓｉ  Ｋｉｔ  ＰｒｉｍｅｒによるマルチプレックスＰＣＲを行なって得られる増幅物をハイブリダイズさせた後のＤＮＡチップの表面を、図１に示すと共に、図１に示したチップ上の各スポットに固定化されているＤＮＡ断片の名称を表１１に示す。尚、図１においては、各固定化用断片について、縦方向に３つずつスポット（３連スポット）されている
【００８７】
【表１１】
2005245244.tif 000012
【００８８】
図１ではやや不明瞭であるが、ポジションマーカーとして使用したラムダＤＮＡのスポットは、いずれのチップにおいても明瞭なシグナルを示し、ポジションマーカーとして有効であることが示された。
一方、ポジティブコントロールとして使用したアクチン、ＧＡＰＤＨ、ユビキチンのうち、アクチン、ＧＡＰＤＨのシグナルは非常に弱く、ポジティブコントロールとしては不適切であった。一方、ユビキチンのスポットは有効なシグナルを示し、ポジティブコントロールとして有効であった。
また、ネガティブコントロールとして使用したｐＵＣ１９のシグナルは、ポジティブコントロールとして使用したユビキチンのシグナルに比べ十分弱かったことから、ｐＵＣ１９がネガティブコントロールとして有効であることが示された。
以上の結果より、本実施例においては、ハイブリダイゼーションの成否をラムダＤＮＡのシグナルの有無で判定し、ＰＣＲ反応の成否をユビキチンのシグナルの有無で判断し、シグナルの有効性をｐＵＣ１９のシグナルとの比較で判断する、という検定方法がもっとも有効であることが示された。
【００８９】
また、「コシヒカリ」より調製したゲノムＤＮＡを検体とした場合の画像データをＩｍａＧｅｎｅにより解析し、各スポットのシグナル強度を数値化した結果を表１２及び１３に示す。
尚、表１２及び１３中の数値は、３連のスポットにおけるシグナル強度の平均値を示している。
【００９０】
【表１２】
2005245244.tif 000013
【００９１】
【表１３】
2005245244.tif 000014
【００９２】
表１３に示すように、各スポットシグナルとｐＵＣ１９のシグナルの差分をとることにより、データの評価を明確に行うことができた。すなわち、Ｍ１１、Ｇ２２、Ｂ４３、及びＷＫＡ０９の４種を増幅ターゲットとしたＰｏｓｉ  Ｋｉｔ  ＰｒｉｍｅｒによるマルチプレックスＰＣＲにおいては、「コシヒカリ」のゲノムＤＮＡを鋳型にしたＢ４３、Ｍ１１、Ｇ２２が陽性で、ＷＫＡ０９が陰性である、ということが表１３より一目瞭然となった。
このことから、本発明によれば、従来のＰＣＲとアガロース電気泳動との組み合わせに比べ、精度の高い識別が可能であることが示された。
【００９３】
実施例９〔５０種類の米品種の判別〕
前記した実施例４で作製したＭ１１、Ｇ２２、Ｂ４３、Ｓ１３、Ｆ６、Ｅ３０、及びＷＫＡ０９に対応する７種類の固定化用ＤＮＡ断片に加え、実施例４と同様の方法により作製したＭ２ＣＧ、Ｂ１、Ｐ３、Ｇ２８、Ｂ７、Ｔ１６、及びＡ６に対応する７種類の固定化用断片を合わせた１４種類の固定化用ＤＮＡ断片（表１４参照）を、前述の実施例５に示した方法によりスライドガラスに固定化してＤＮＡチップを作製した。
【００９４】
一方、前記した実施例６と同様に、Ｍ１１、Ｇ２２、Ｂ４３、Ｓ１３、Ｆ６、Ｅ３０、及びＷＫＡ０９に対応する判別用プライマーを作製し、これらの判別用プライマーについて、前述の実施例７に示した方法により４種のマルチプレックスプライマーミックスを調製した。
さらに、前記した表２に示すＭ２ＣＧ、Ｂ１、Ｐ３、Ｇ２８、Ｂ７、Ｔ１６、及びＡ６に対応する７種類の増幅用対合プライマーについても、前述の実施例７に示した方法により４種のマルチプレックスプライマーミックスを調製した。
【００９５】
前記した実施例７と同様の方法により、検出対象であるゲノムＤＮＡを、「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「あきたこまち」、「ヒノヒカリ」等、表１３に示す５０種類の主要な品種の精米よりそれぞれ調製した。こうして調製された検出対象であるゲノムＤＮＡについて、前述の実施例７に示した方法により、上記の各プライマーミックスを用いたマルチプレックスＰＣＲを行った。
前記した実施例８と同様の方法により、ＰＣＲによる増幅物を精製してターゲットＤＮＡとし、上記のＤＮＡチップにハイブリダイズさせて洗浄し乾燥した後、スキャナーによってスポットシグナルの検出を行った。スポットシグナル値とネガティブコントロールのシグナル値との差が３００００以上のものを陽性（＋）と判定した。
結果を表１４に示す。
【００９６】
【表１４】
2005245244.tif 000015
【００９７】
表１４に示すように、それぞれの品種についてスポットシグナルの有無は多種多様であったことから、本発明により、国内の主要な５０品種の米を、簡単な操作で、迅速に、且つ正確に識別することが可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明によれば、米の品種を、検体数に関わらず簡単な操作で、迅速に、且つ正確に識別することができる。
従って、本発明を利用すれば、近縁系統が多い国内主要品種はもちろん、国内外に関わらず全ての種類の米品種の識別が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】「コシヒカリ」より調製したゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、Ｐｏｓｉ  Ｋｉｔ  ＰｒｉｍｅｒによるマルチプレックスＰＣＲを行なって得られる増幅物をハイブリダイズさせた後のＤＮＡチップの表面を示す図である。
【図１】
2005245244.tif 000016
【配列表】
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