(57)【要約】  【課題】魚に対するノダウイルス感染またはノダウイルス感染によるウイルス性神経壊死症などの病気の予防または治療する方法を提供すること。  【解決手段】  アクアビルナウイルスを魚に注射などによって経皮接種するかまたはアクアビルナウイルス含有液中に魚を浸漬またはアクアビルナウイルス混合飼料を給餌することによって、魚がノダウイルス感染することを防止またはノダウイルス感染によるウイルス性神経壊死症などの病気の発症を予防または治療する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクアビルナウイルスを魚に投与することによってノダウイルス感染またはノダウイルス感染による病気の発症または該病気を予防または治療することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記病気がウイルス性神経壊死症であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項1または2に記載の方法において、前記アクアビルナウイルスが注射または経口によって投与されることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項1ないし３のいずれか１項に記載の方法において、前記経口投与が、前記アクアビルナウイルスを含有する液中に魚を浸漬することまたは前記アクアビルナウイルスを混合した飼料を魚に食餌することによって行なうことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項1ないし３のいずれか１項に記載の方法において、前記アクアビルナウイルスが注射による経皮投与される場合、前記アクアビルナウイルスが、注射液１ｍｌに対して、約１０７〜１０８ＴＣＩＤ５０の割合で添加されること、前記アクアビルナウイルスが飼料によって給餌される場合、全飼料１ｍｇに対して、一般的には約１０７〜１０８ＴＣＩＤ５０の割合で混合すること、または、前記アクアビルナウイルスが浸漬によって投与される場合、液１ｍｌに対して、一般的には約１０５〜１０６ＴＣＩＤ５０の割合で混合するのがよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ノダウイルスの感染、特にウイルス性神経壊死症などの予防法および治療法に関するものである。更に詳細には、この発明は、病原性が認められないアクアビルナウイルスを用いて、特に、ノダウイルスの感染によるウイルス性神経壊死症などの予防法および治療法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、海産魚資源を保護ならびに確保するために、約４０種類の海産魚が国内で養殖されている。また、数種類の稚魚も養殖の種苗として生産されている。かかる魚に対する種苗生産技術ならびに養殖技術も開発されてきているが、感染、特にウイルス感染によって引き起こされる病気に対する制御はしばしば困難に直面している。例えば、ブリなどに対するＹＡＶ（Ｙｅｌｌｏｗｔａｉｌ ａｓｃｉｔｅｓ ｖｉｒｕｓによるビルナウイルス（ｂｉｒｎａｖｉｒｕｓ）感染、マハタやヒラメなどに対するノダウイルス（ｎｏｄａｖｉｒｕｓ）感染によるＶＮＮ（ｖｉｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｎｅｃｒｏｓｉｓ：ウイルス性神経壊死症）などが報告されている（非特許文献１、２）。
【０００３】
そのうちでも、特にノダウイルス感染によるウイルス性神経壊死症は、１９９０年以降世界各地で海産魚に発生し、致死性が極めて高いことから、種苗生産業および養殖業において脅威となっている。またその罹病魚種も３０種を超えている（非特許文献２）。
【０００４】
従来、ウイルス性神経壊死症に対しては、ワクチン療法が有効とされているが（試験的）、このワクチン療法は注射接種であるために仔魚や稚魚に対しては適用することができない。また、公表されている遺伝子組換え外被タンパク質ワクチンでは、そのワクチンが効果を発現するまでに３週間という長い期間を要する（非特許文献３、４）。
【０００５】
また、魚類ノダウイルスには３つの異なる血清型があるために、それぞれの血清型ごとのワクチンを作製することが必要である（非特許文献５）。
【０００６】
更に、親魚からの垂直感染を防止するためのウイルスフリー親魚の選別には、ウイルス遺伝子の検出技術と、そのための装置が必要であり、受精卵の消毒も必要となる。また、水平感染を防止するために飼育水の殺菌をするためのオゾンあるいは紫外線装置が必要である。これらの防止対策には、非常な手間と莫大な費用がかかるという欠点がある（非特許文献６、７）。
【０００７】
その上、ウイルス性神経壊死症については、特に幼魚期以降の発症に対して有効な予防・治療方法は全く実用化されていないのが現状である。そこで、幼魚期以降のウイルス性神経壊死症に対しても有効な予防および治療方法を開発することが強く要望されている。
【０００８】
一方、非致死性アクアビルナウイルス（ａｑｕａｂｉｒｎａｖｉｒｕｓ：ＡＢＶ）による一次感染したヒラメが、腎臓などの内臓諸器官を標的にするウイルス出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ: viral haemorrhagic septicaemia virus）による二次感染に対して抵抗性を増加されたとの報告がある（非特許文献８、９）。しかしながら、このＶＨＳＶは腎臓などの内臓諸器官を標的にするウイルスであるところから、ＡＢＶが、ノダウイルスが原因である中枢神経系が冒される病気であるウイルス性神経壊死症に対しても効果があるとの報告は皆無である。
【非特許文献１】Takano, R., et al., Fish Pathology, 36(3), 153-169, 2001.9
【非特許文献２】Munday, B. L., et al., Journal of Fish Diseases, 25, 127-142, 2002
【非特許文献３】Tanaka, S., et al., Journal of Fish Diseases, 24, 15-22, 2001
【非特許文献４】Yuasa, K., et al.;., Journal of Fish Diseases, 25, 53-56, 2002
【非特許文献５】Mori, K., et al., Diseases of Aquatic Organisms, 57, 19-26, 2003
【非特許文献６】養殖，１０, pp. 21-22,２００１
【非特許文献７】Tsuchihashi, Y., et al., SUISANZOSHOKU 50(3), 355-361, 2002
【非特許文献８】Pakingking, R. Jr., et al. Fish & Shellfish Immunology、印刷中 (2004)
【非特許文献９】Pakingking, R. Jr., et al. Fish Pathology, 38, 15-21, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
かかる先行技術を背景にして、本発明者らは、病原性が認められない不顕性感染のアクアビルナウイルス（ＡＢＶ）について鋭意研究をした結果、ＡＢＶが、ノダウイルス感染によるウイルス性神経壊死症に対して有効であることを見出して、この発明を完成した。
【００１０】
したがって、この発明は、病原性が認められないアクアビルナウイルスを用いてノダウイルスの感染を予防および治療する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、この発明は、病原性が認められない不顕性感染であるアクアビルナウイルスを用いてノダウイルスの感染に起因する病気を予防する予防方法を提供する。
この発明はまた、病原性が認められない不顕性感染であるアクアビルナウイルスを用いてノダウイルスの感染による病気を治療する治療方法を提供する。
【００１２】
更に、この発明は、アクアビルナウイルスを経口投与することによるノダウイルス感染による病気の発症を予防する予防方法および病気を治療する治療方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
この発明に係る予防方法ならびに治療方法は、幅広い魚種に対して、ノダウイルス感染によるウイルス性神経壊死症ばかりではなく、ノダウイルス感染が原因となるその他の感染症に対しても有効である。
また、この発明に係る予防方法ならびに治療方法は、経口投与ばかりではなく、浸漬法による投与も可能であるところから、これまでのワクチン治療ではできなかった稚魚や仔魚に対しても投与することができるという効果も有している。
【００１４】
更に、この発明におけるＡＢＶの抗ウイルス作用は、非特異的であるから血清型にかかわらず使用することができるので、従来のワクチン治療のように、魚類ノダウイルスの３つの異なる血清型に対して、血清型ごとのワクチンを作製することが必要がないという利点を有している。
その上、この発明によるアクアビルナウイルス（ＡＢＶ）の接種によって、ノダウイルス感染に対する予防効果ばかりではなく、ノダウイルスが不顕性感染している親魚などに対しても、治療効果が期待できるという大きな利点がある。
【００１５】
さらにまた、この発明による予防方法ならびに治療方法においては、ＡＢＶと共にワクチンも併用投与することによって、非特異的防御ばかりではなく、特異的防御も誘導できると考えられる。
【００１６】
上記の利点に加えて、この発明は、特別の装置などを要しないので、本発明に使用するＡＢＶの調製ならびに投与に要する経費も、従来のワクチン治療に比べて大幅に減少させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
この発明に係るノダウイルス感染防止法およびその感染に起因する病気の治療方法は、適用対象魚種に対して、病原性が認められない不顕性感染であるアクアビルナウイルス（ＡＢＶ）を適用することにより、ノダウイルス感染を予防することおよび／またはノダウイルス感染による病気を治療することを特徴とする。
【００１８】
アクアビルナウイルス（ＡＢＶ）は、非病原性あるいは弱毒性であり、環境に対して無害ではあるけれども、数多くの天然魚に不顕性感染していることが知られている。
したがって、この発明で使用するＡＢＶは、ヒラメなどの不顕性感染海産魚などの自然界からから容易に分離することができる。このように自然界から分離した無毒性もしくは弱毒性ＡＢＶは、その宿主魚ばかりではなく、その他の魚類の細胞に接種して培養し容易に増殖させることができる。
【００１９】
上記のようにして培養して増殖したアクアビルナウイルス（ＡＢＶ）を魚類に適用するには、ＡＢＶ液の注射による投与ばかりではなく、ＡＢＶを混合した飼料の給餌やＡＢＶを含有する液に浸漬などすることによる投与も可能である。
【００２０】
この発明において、アクアビルナウイルス（ＡＢＶ）を飼料に混合して給餌する場合には、例えば、全飼料１ｇに対して、一般的には約１０７〜１０８ＴＣＩＤ５０の割合で混合するのがよい。ＡＢＶ液に浸漬する場合には、液１ｍｌに対して、一般的には約１０５〜１０６ＴＣＩＤ５０の割合で混合するのがよい。ＡＢＶ注射液を使用する場合には、注射液１ｍｌに対して、一般的には約１０７〜１０８ＴＣＩＤ５０の割合で混合するのがよい。
【００２１】
また、この発明の予防方法ならびに治療方法が適用できる魚種としては、特に限定されるものではなく、ノダウイルスが感染している魚種または感染の可能性のある魚種であればいずれでもよい。更に、種苗から稚魚、親魚を含む育成魚まで魚の大きさ（成長段階）にかかわらず使用することができる。
【００２２】
以下、この発明について実施例によってより詳細に説明するが、この発明は、下記実施例によって一切限定されると解釈すべものではなく、下記実施例はこの発明をより具体的に説明する目的のためだけに例示的に記載するものである。
【実施例１】
【００２３】
（アクアビルナウイルス（ＦＢＶ株）の性状）
この実施例で使用するアクアビルナウイルス（ＦＢＶ株）は、ビルナウイルス科アクアビルナウイルス属に属し、エンベロープを持たない直径約６０ｎｍの球形ウイルスであって、核酸として２本鎖のＲＮＡを有している。このＦＢＶ株は、同じくビルナウイルス科アクアビルナウイルス属に属し、ブリの病原ウイルスとして知られるＹＴＡＶ（yellowtail ascites virus）で作製されたウサギ抗血清により完全に中和されたことから、ＹＴＡＶと同じ血清型と分類した。なお、このＦＢＶ株は、ビルナウイルス科に属するサケ科魚類の病原ウイルスとして知られるＩＰＮＶ（infectious pancreatic necrosis virus）とは血清学的に異なっていた。また、このＦＢＶ株は、魚類由来株化細胞のＲＴＧ−２細胞でよく増殖した。
【実施例２】
【００２４】
（ヒラメに対するアクアビルナウイルス（ＦＢＶ株）の安全性試験）
アクアビルナウイルス（ＦＢＶ株）は、ＲＴＧ−２細胞を培地（イーグルＭＥＭ、牛胎児血清）で培養して得た。このようにして得たＦＢＶ株は−８０℃で保存した。この凍結保存株は、６ヶ月以上経過しても有効であった。
このように凍結保存したＦＢＶ株を平均体重１８ｇのヒラメ（人工生産）の筋肉内に接種した（接種量：１０６．９ＴＣＩＤ５０／尾；供試尾数：２０）。水温２０℃で３週間観察した結果、死亡魚、異常魚は認められなかった。なお、このＦＢＶ株はヒラメ仔魚（０．５ｇ）に対する病原性も認められなかった。
【実施例３】
【００２５】
（マハタに対するアクアビルナウイルス（ＦＢＶ株）の安全性試験）
アクアビルナウイルス（ＦＢＶ株）は、実施例２と同様に、ＲＴＧ−２細胞（イーグルＭＥＭ、牛胎児血清）で培養して得た。得られたＦＢＶ株は凍結（−８０℃）で保存した。この凍結保存株は、６ヶ月以上経過しても有効であった。
このように凍結保存したＦＢＶ株を平均体重１２ｇのマハタ（人工生産）の筋肉内に接種した（接種量：１０７．１ＴＣＩＤ５０／尾；供試尾数：２０）。水温２５℃で３週間観察した結果、死亡魚、異常魚は認められなかった。
【実施例４】
【００２６】
（ヒラメに対するアクアビルナウイルス（ＦＢＶ株）のノダウイルス感染阻止効果）
アクアビルナウイルス（ＦＢＶ株）は、実施例２と同様に、ＲＴＧ−２細胞を用いて培地（イーグルＭＥＭ、牛胎児血清）で培養することによって得た。得られたＦＢＶ株は凍結（−８０℃）で保存した。この凍結保存株は、６ヶ月以上経過しても有効であった。
このように凍結保存したＦＢＶ株を平均体重１２ｇのヒラメ（人工生産）の筋肉内に接種して（接種量：１０６．６ＴＣＩＤ５０／尾）、水温２０℃で７日間飼育した後、Ｅ−１１細胞で培養した魚類ノダウイルスＲＧＮＮＶ（ＳＧＷａｋ９７株）を筋肉内に接種し（接種量：１０８．６ＴＣＩＤ５０／尾）、３日、７日、１４日後に腎臓および脳のＲＧＮＮＶ量を測定した。
なお、ＦＢＶ株を接種せず、ＲＧＮＮＶの単独感染魚を対照区とした。また、本実施例では、ＦＢＶ株接種の有無にかかわらず、ＲＧＮＮＶによる感染死亡は認められなかった。
図１に示すように、いずれの測定時においても、あらかじめＡＢＶを接種した魚の腎臓および脳内ＲＧＮＮＶ量は対照区のそれに比べて有意に低かった。
【実施例５】
【００２７】
（マハタに対するアクアビルナウイルス（ＦＢＶ株）のノダウイルス感染阻止効果）
アクアビルナウイルス（ＦＢＶ株）は、実施例２と同様に、ＲＴＧ−２細胞（イーグルＭＥＭ、牛胎児血清）で培養して得た。このようにして得たＦＢＶ株は同様に凍結保存した。凍結保存したＦＢＶ株を平均体重１２ｇのマハタ（人工生産）の筋肉内に接種して（接種量：１０７．１ＴＣＩＤ５０／尾）、水温２５℃で７日間飼育した後、Ｅ−１１細胞で培養した魚類ノダウイルスＲＧＮＮＶ（ＳＧＷａｋ９７株）を筋肉内に接種した（接種量：１０５．１ＴＣＩＤ５０／尾）。なお、ＦＢＶ株を接種せず、ＲＧＮＮＶの単独感染魚を対照区とした。
本実施例では、ＦＢＶ株接種後２週間観察し、死亡率を求めると共に、３日、７日、１４日後に腎臓および脳のＲＧＮＮＶ量を測定した。
その結果、図２に示すように、ＦＢＶ株を接種しなかった対照区の死亡率は、８０％であったのに対して、予めＦＢＶ株を接種した魚の場合は、その死亡率が０％であった。
また、図３に示すように、いずれの測定時においても、あらかじめＡＢＶを接種した魚の腎臓および脳内ＲＧＮＮＶ量は対照区のそれに比べて有意に低かった。なお、データには示していないが、ＦＢＶ株を接種した魚の脳からＲＧＮＮＶは８週間後に消失した。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
この発明に係る予防方法および治療方法は、幅広い魚種の種苗生産ならびに養殖に対して適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ヒラメの腎臓および脳におけるノダウイルス力価の変化を示すグラフ。
【図２】ノダウイルスによるマハタの累積死亡率を示すグラフ。
【図３】マハタの腎臓および脳におけるノダウイルス力価の変化を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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