(57)【要約】【課題】  試料中のクレアチニンを、簡便な手法により正確に測定できるようにする。【解決手段】  pH指示薬、緩衝剤および試料を含む反応液を用いて、光学的手法によりクレアチニンを測定する。pH指示薬としては、典型的には、キサンテン系色素またはトリフェニルメタン系色素を用いる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
pH指示薬、緩衝剤および試料を含む反応液を用いて、光学的手法によりクレアチニンを測定することを特徴とする、クレアチニンの測定方法。
【請求項２】
上記pH指示薬は、キサンテン系色素またはトリフェニルメタン系色素である、請求項１に記載のクレアチニンの測定方法。
【請求項３】
上記キサンテン系色素は、下記化学式１で示される化学構造を有するハロゲン化キサンテン系色素である、請求項２に記載のクレアチニンの測定方法。
【化１】
2005207949.tif 000012
（化学式１においては、X1はハロゲン、ニトロ基またはニトロソ基、X2はハロゲン、X3はハロゲンまたは水素、X4は水酸基またはその塩、X5はカルボキシル基またはその塩である。）
【請求項４】
上記ハロゲン化キサンテン系色素は、下記化学式２〜６で示される化学構造を有するものから選択される１種である、請求項３に記載のクレアチニンの測定方法。
【化２】
2005207949.tif 000013
【化３】
2005207949.tif 000014
【化４】
2005207949.tif 000015
【化５】
2005207949.tif 000016
【化６】
2005207949.tif 000017
【請求項５】
上記トリフェニルメタン系色素は、ブロモクロロフェノールブルー（BCPB）、ブロモフェノールブルー（BPB）、またはテトラブロモフェノールブルー（TBPB）である、請求項２に記載のクレアチニンの測定方法。
【請求項６】
上記緩衝剤は、フタル酸塩またはクエン酸塩である、請求項２ないし５のいずれかに記載のクレアチニンの測定方法。
【請求項７】
クレアチニンを測定するために使用される試験片であって、pH指示薬および緩衝剤を含んでいることを特徴とする、クレアチニン測定用試験片。
【請求項８】
上記pH指示薬は、キサンテン系色素またはトリフェニルメタン系色素である、請求項７に記載のクレアチニン測定用試験片。
【請求項９】
上記キサンテン系色素は、下記化学式７で示される化学構造を有するハロゲン化キサンテン系色素である、請求項８に記載のクレアチニン測定用試験片。
【化７】
2005207949.tif 000018
（化学式７においては、X1はハロゲン、ニトロ基またはニトロソ基、X2はハロゲン、X3はハロゲンまたは水素、X4は水酸基またはその塩、X5はカルボキシル基またはその塩である。）
【請求項１０】
上記ハロゲン化キサンテン系色素は、下記化学式８〜１２で示される化学構造を有するものから選択される１種である、請求項９に記載のクレアチニン測定用試験片。
【化８】
2005207949.tif 000019
【化９】
2005207949.tif 000020
【化１０】
2005207949.tif 000021
【化１１】
2005207949.tif 000022
【化１２】
2005207949.tif 000023
【請求項１１】
上記トリフェニルメタン系色素は、ブロモクロロフェノールブルー（BCPB）、ブロモフェノールブルー（BPB）、またはテトラブロモフェノールブルー（TBPB）である、請求項８に記載のクレアチニン測定用試験片。
【請求項１２】
上記緩衝剤は、フタル酸塩またはクエン酸塩である、請求項８ないし１１のいずれかに記載のクレアチニン測定用試験片。
【請求項１３】
上記pH指示薬および上記緩衝剤は、乾燥状態で担体に担持されている、請求項７ないし１２のいずれかに記載のクレアチニン測定用試験片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるクレアチニンを測定するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中のクレアチニンを測定する方法としては、ヤッフェ法あるいは酵素法が一般的に用いられている。
【０００３】
ヤッフェ法は、強アルカリ条件下において、クレアチニンをピクリン酸に結合させたときの褐色の呈色を測定することによりクレアチニンを測定する方法である。この方法では、クレアチニンを強アルカリ条件下で加温しなければ十分な反応速度を得られないため、加熱機構を備えた測定装置が必要となる。そのため、測定装置の製造コストが高くなって測定装置が高価となるばかりか、加熱が必要な分だけランニングコストが高くなる。ヤッフェ法ではさらに、クレアチニンが種々の共存物質と反応する虞があるため、測定結果に誤差が生じる虞がある。
【０００４】
一方、酵素法は、クレアチニンを酵素に作用させたときの生成物の量からクレアチニンを測定する方法である。酵素としては、クレアチニンデアミナーゼあるいはクレアチニンアミドヒドロラーゼ(クレアチニナーゼ)を使用することができる。前者の酵素を使用する場合、クレアチニンにクレアチニンデアミナーゼを作用させてアンモニアを生成させ、アンモニア量からクレアチニンの量を測定することができる。一方、後者の酵素を使用する場合、クレアチニンにクレアチニンアミドヒドロラーゼ(クレアチニナーゼ)を作用させてクレアチンを生成させ、クレアチン量からクレアチニン量を測定することができる。クレアチン量は、クレアチンにクレアチンアミジノヒドラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼを作用させて、生成した過酸化水素を発色系に導いてクレアチンの量を測定することにより測定される。
【０００５】
この方法では、クレアチニンに対して特異的に反応する酵素を用いるために、共存物質の影響を受けにくく、正確な測定を行うことができる。その反面、酵素法では、加熱が必要なためにヤッフェ法と同様な問題が生じるばかりか、複数種の酵素を必要とするために測定コストが高くなってしまう。
【０００６】
近年においては、クレアチニンを測定する方法として、第二銅イオンに対するクレアチニンのキレート作用を利用してクレアチニン−銅キレート物質を生成させ、このキレート物質の過酸化作用を利用する方法も用いられている（たとえば特許文献１、２参照）。この方法は、クレアチニン−銅キレート物質によって、ヒドロペルオキシドと被酸化性色素との間の過酸化反応を起こさせ、被酸化性色素を発色させる方法である。この方法では、クレアチニンがpH6〜8付近で反応し、かつ環境温度が25℃程度、反応時間が60秒程度で測定が行えるといった利点がある。しかしながら、この方法は、反応が遅いために測定時間を短くするためにはレートアッセイを採用する必要があり、その場合には、クレアチニンが尿中に共存する物質や薬物の影響や環境温度の影響を受けやすくなる。さらに、より精度良く測定を行うためには、測定時間を正確にしなければならないといった煩わしさがある。
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−１０５２３８号公報
【特許文献２】特開２０００−２１４１６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、試料中のクレアチニンを、簡便手法により精度良く測定できるようにすることを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記した課題を解決するために、本発明者らが研究を重ねた結果、意外にも、特定のpH指示薬がクレアチニンと反応することを見出し、本発明に至った。
【００１０】
すなわち、本発明では、pH指示薬、緩衝剤および試料を含む反応液を用いて、光学的手法によりクレアチニンを測定するクレアチニンの測定方法、およびpH指示薬および緩衝剤を含んだクレアチニン測定用試験片が提供される。
【００１１】
本発明においては、pH指示薬としてキサンテン系色素またはトリフェニルメタン系色素を用いるのが好ましい。
【００１２】
キサンテン系色素としては、たとえば下記化学式１で示される化学構造を有するハロゲン化キサンテン系色素を使用することができる。
【００１３】
【化１】
2005207949.tif 000002
（化学式１においては、X1はハロゲン、ニトロ基またはニトロソ基、X2はハロゲン、X3はハロゲンまたは水素、X4は水酸基またはその塩、X5はカルボキシル基またはその塩である。）
【００１４】
ハロゲン化キサンテン系色素としては、典型的には、下記化学式２〜６で示される化学構造を有するものから選択される１種を使用することができる。
【００１５】
【化２】
2005207949.tif 000003
【００１６】
【化３】
2005207949.tif 000004
【００１７】
【化４】
2005207949.tif 000005
【００１８】
【化５】
2005207949.tif 000006
【００１９】
【化６】
2005207949.tif 000007
【００２０】
化学式２〜６として例示したハロゲン化キサンテン系色素は、下記表１に示した製造元から、容易に入手できるものである。
【００２１】
【表１】
2005207949.tif 000008
【００２２】
一方、トリフェニルメタン系色素としては、典型的には、ブロモクロロフェノールブルー（BCPB）、ブロモフェノールブルー（BPB）、またはテトラブロモフェノールブルー（TBPB）を使用することができる。
【００２３】
反応液におけるpH指示薬の濃度は、特に限定されないが、典型的には、0.1〜10mM、好ましくは0.5〜2mM、最も好ましくは0.3〜0.1mMとなるように設定される。
【００２４】
緩衝剤としては、クレアチニンとpH指示薬との反応を阻害せず、使用するpH指示薬の変色範囲において緩衝作用を有するものが使用され、たとえばフタル酸塩、クエン酸塩、グリシン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、あるいはリン酸塩が挙げられる。
【００２５】
反応液における緩衝剤の濃度は、特に限定されないが、典型的には、0.1〜1.5M、好ましくは0.3〜1Ｍとなるように設定される。反応液のpHは、たとえば使用するpH指示薬のpKa値付近のpHとされる。たとえば、pH指示薬として、酸性指示薬として作用するキサンテン系色素またはトリフェニルメタン系色素を用いる場合には、反応液のpHは2〜5とされ、好ましくはpH3〜4とされる。この場合、緩衝剤としては、フタル酸塩またはクエン酸塩を使用するのが好ましい。
【００２６】
クレアチニンの測定は、反応液に対して光を照射し、そのときの反応液から進行してくる光(反射光あるいは透過光)の光量に基づいて行われる。反応液に照射する光のピーク波長は、使用する指示薬の吸収特性に応じて選択すればよい。たとえば、pH指示薬としてキサンテン系色素あるいはトリフェニルメタン系色素を用いる場合には、反応液に対してピーク波長が550〜620nmの範囲にある光を照射し、クレアチニンを測定するのが好ましい。
【００２７】
本発明のクレアチニン測定用試験片は、たとえばpH指示薬および緩衝剤を含有する含浸液に吸収性担体をしみ込ませ、これを乾燥させることにより製造することができる。含浸液には、増感剤などの添加剤を含ませておいてもよい。試験片はそのまま使用することができるが、非吸収体に接着させて使用することもできる。
【００２８】
含浸液中のpH指示薬および緩衝剤の濃度は、特に限定されないが、先に説明した反応液におけるpH指示薬および緩衝剤の濃度と、同程度に設定される。
【００２９】
増感剤としては、たとえばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカーボネート、ポリビニルエーテルを使用することができ、好ましくはポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールが使用される。含浸液中の増感剤の濃度は、特に限定されないが、典型的には0.01〜5wt％、好ましくは0.01〜1wt％とされる。
【００３０】
吸収性担体としては、クレアチニンを含まない多孔性物質を使用でき、たとえばシート状または膜状の形態のものが使用される。多孔性物質としては、たとえば紙状物、発泡体、織布状物、不織布状物、編物状物が挙げられる。吸収性担体を形成するための材料としては、たとえば綿、麻、セルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ロックウール、ガラス繊維、シリカ繊維、カーボン繊維、ボロン繊維、ポリアミド、アラミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、レーヨン、ポリエステル、ナイロン、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリオレフィンが挙げられる。これらの吸収性担体の形状は、特に限定されないが、矩形、長矩形、楕円形が一般的である。
【００３１】
非吸収体としては、たとえばシート状または膜状の形態のものが使用される。非吸収体を形成するための材料としては、たとえばポリエチレンテレフタレート、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレンが挙げられる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明では、一般に使用されているpH指示薬、たとえばキサンテン系色素あるいはトリフェニルメタン系色素を用いて、常温において試料に含まれるクレアチニンを精度良く測定することができる。また、クレアチニンがpH指示薬と常温において反応することから、クレアチニンを測定するための装置に対して加熱機構を設ける必要はない。そのため、クレアチニンを測定するための装置を安価かつ小型に製造でき、しかも試料やpH指示薬を加熱する必要がない分だけ１回の測定に必要なコストを低く抑えることができる。
【実施例】
【００３３】
以下においては、pH指示薬および緩衝剤を含むドライ試験片を用いて、試料中のクレアチニンを測定できるか否かを検討した。
【００３４】
（ドライ試験片の作成）
ドライ試験片は、下記表２に示した組成の含浸液を濾紙（Whatman社製「3MMChr」）に含浸させた後に、40℃で15分乾燥させることにより形成した。
【００３５】
【表２】
2005207949.tif 000009
【００３６】
（クレアチニンの測定）
クレアチニンの測定は、下記表３に示した常温(25℃)の試料１−３をドライ試験片に点着して常温(25℃)においてpH指示薬と試料とを反応させた後、ドライ試験片での反射率を色差計において測定することにより行った。各試験片１，２での反射率の測定結果は、下記表４および図１に示した。下記表４および図１において、測定結果は３回の測定の平均値として示してあり、下記表４には、測定波長、参照波長および標準偏差(SD)を同時に示した。
【００３７】
【表３】
2005207949.tif 000010
【００３８】
【表４】
2005207949.tif 000011
【００３９】
表４および図１から明らかなように、各試験片１，２において測定した範囲(クレアチニン濃度が0〜300mg/dL)においては、反射率が単調かつ直線的に減少している。このことは、キサンテン系色素であるフロキシンＢやトリフェニルメタン系色素であるBCPBが常温においてクレアチニンと反応しており、少なくとも上記したクレアチニンの濃度範囲において、フロキシンＢやBCPBを用いてクレアチニンを定量できることを意味している。
【００４０】
また、表４から分かるように、今回の測定における標準偏差(SD)は比較的に小さなものであり、フロキシンＢやBCPBを用いて、常温において比較的に精度良くクレアチニンを定量できるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】クレアチニン濃度の異なる３種類の試料を用いて、試験片１，２によって反射率を測定した結果を示すグラフである。
【図１】
2005207949.tif 000024