(57)【要約】【課題】発現効率に優れた組み換えポリヌクレオチドを提供することを課題とする。また、発現効率に優れた組換えポリヌクレオチドを用いた形質転換体および、タンパク質の製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】腸内細菌（Enterobacteriaceae）科に属する細菌の酸性フォスファターゼのＮ末端領域に由来するシグナルペプチドをコードする塩基配列と、前記シグナルペプチドをコードする塩基配列の下流に、タンパク質をコードする塩基配列とが組み込んだ組換えポリヌクレオチドを導入した形質転換微生物を作製し、この微生物を培養して所望のタンパク質を製造する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸内細菌（Enterobacteriaceae）科に属する細菌の酸性フォスファターゼのＮ末端領域に由来するシグナルペプチドをコードする塩基配列が組み込まれた組換えポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記腸内細菌（Enterobacteriaceae）科に属する細菌が、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae）、クレブジエラ・プランティコラ（Klebsiella planticola）、モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）、プロビデンシア・スチュアルティ（Providencia stuartii）およびシゲラ・フレクスナ(Shigella flexneri)からなる群より選ばれるいずれかの細菌である、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列表の配列番号１に記載のシグナルペプチドをコードする塩基配列が組み込まれた、組換えポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記シグナルペプチドをコードする塩基配列の下流に、タンパク質をコードする塩基配列とが組み込まれた、請求項１から３のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）で示されるタンパク質である、請求項４に記載の組換えポリヌクレオチド。
（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質
【請求項６】
前記タンパク質が、下記（Ｃ）または（Ｄ）で示されるタンパク質である、請求項４に記載の組換えポリヌクレオチド。
（Ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルギニンラセマーゼ活性を有するタンパク質
【請求項７】
請求項４から６のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドが導入されて、前記タンパク質を発現する、形質転換微生物。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および／または微生物中に、前記タンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えポリヌクレオチドに関し、より詳しくは、タンパク質を高発現させることができる組換えポリヌクレオチドに関する。また、本発明は、この組換えポリヌクレオチドを利用した形質転換体、タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子工学の急速な発展において、外来遺伝子を導入して形質転換を行い、外来遺伝子を形質転換体で発現させるという操作は最も基本的な操作の一つである。このような遺伝子工学的手法において、外来遺伝子を効率よく発現させるためにさまざまな発現ベクターなどの組換え体が作製されてきた。例えば、発現効率を向上させるという観点からは、プロモータなどの遺伝子発現領域といわれる部位について研究が進められ、新たなプロモータの発見やプロモータの改変などが試みられている。
【０００３】
通常では発現しにくいタンパク質を、菌体外に分泌されるタンパク質のシグナルペプチドを利用して、高発現できる場合があることが知られている。大腸菌ではOmpAのシグナルペプチドを利用する方法（例えば非特許文献１）、枯草菌ではα−アミラーゼのシグナルペプチドを利用する方法（例えば非特許文献２）などが報告されている。
【０００４】
【非特許文献１】Ghrayeb et. al., Secretion cloning vectors in Escherichia coli., EMBO J., 3, 2437-2442 (1984)
【非特許文献２】Palva I et. al., Secretion of Escherichia coli β-lactamase from Bacillus subtilis by the aid of α−amylase signal sequence., Biotechnology., 24, 344-348 (1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
遺伝子発現のための組換え体は既にさまざまな種類のものが開発されている。しかし、実際には、効率の良い遺伝子発現のための組換え体は、既存の技術の組み合わせのみによって必ずしも満足のいくものではなく、常にさらなる効率化を求められている。
【０００６】
以上のような状況の下、本発明は、発現効率に優れた組み換えポリヌクレオチドを提供することを課題とするものである。また、本発明は、発現効率に優れた組換えポリヌクレオチドを用いた形質転換体、および、タンパク質の製造方法を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、所定のシグナルペプチドを用いることなどにより、発現効率に優れた組み換えポリヌクレオチドとすることができることを見いだし、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、下記組換えポリヌクレオチド等を提供する。
【０００８】
〔１〕  腸内細菌（Enterobacteriaceae）科に属する細菌の酸性フォスファターゼのＮ末端領域に由来するシグナルペプチドをコードする塩基配列が組み込まれた、組換えポリヌクレオチド。
〔２〕  前記腸内細菌（Enterobacteriaceae）科に属する細菌が、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae）、クレブジエラ・プランティコラ（Klebsiella planticola）、モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）、プロビデンシア・スチュアルティ（Providencia stuartii）およびシゲラ・フレクスナ(Shigella flexneri)からなる群より選ばれるいずれかの細菌である、上記〔１〕に記載の組換えポリヌクレオチド
〔３〕  配列表の配列番号１に記載のシグナルペプチドをコードする塩基配列が組み込まれた、組換えポリヌクレオチド。
〔４〕  前記シグナルペプチドをコードする塩基配列の下流に、タンパク質をコードする塩基配列とが組み込まれた、上記〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
〔５〕  前記タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）で示されるタンパク質である、請求項４に記載の組換えポリヌクレオチド。
（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質
〔６〕  前記タンパク質が、下記（Ｃ）または（Ｄ）で示されるタンパク質である、請求項４に記載の組換えポリヌクレオチド。
（Ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルギニンラセマーゼ活性を有するタンパク質
〔７〕  上記〔４〕から〔６〕のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドが導入されて、前記タンパク質を発現する、形質転換微生物。
〔８〕  上記〔８〕に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および／または微生物中に、前記タンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、発現効率の高い組み換えポリヌクレオチド、形質転換体が提供される。また、本発明により、効率の良いタンパク質の製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態についてその最良の形態と共に説明する。
なお、以下に挙げる種々の遺伝子工学的な技法については、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)、細胞工学ハンドブック、黒木登志夫ら編、羊土社（1992）、新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版、村松ら編、羊土社（1999）など、多くの標準的な実験マニュアルがあり、これらの文献を参考にすることにより当業者であれば実施可能である。
【００１１】
１．本発明の組み換えポリヌクレオチドおよび形質転換体
本発明の組換えポリヌクレオチドは、所定のシグナルペプチドをコードする塩基配列を有する組換え体である。所定のシグナルペプチドとして、腸内細菌（Enterobacteriaceae）科に属する細菌の酸性フォスファターゼのＮ末端領域に由来するシグナルペプチドが挙げられる。より具体的には、本発明で用いられるシグナルペプチドとしては、腸内細菌が有する酸性フォスファターゼの前駆タンパク質に含まれるシグナルペプチドを用いることができる。
【００１２】
シグナルプチドは、成熟タンパク質となる前の前駆タンパク質のＮ末端領域にある１０〜５０程度、または１５〜３０程度のアミノ酸配列からなるペプチドである。一般に、シグナルペプチドは、分泌型のタンパク質が膜を通過することを指令する機能などに関わると考えられている。
【００１３】
本発明で用いられるシグナルペプチドは、腸内細菌における、前駆タンパク質としての酸性フォスファターゼから見いだされたものである。腸内細菌としては、例えば、エンテロバクター（Enterobacter）属、エシェリヒア（Escherichia）属、クレブジエラ（Klebsiella）属、モルガネラ（Morganella）属、プロビデンシア（Providencia）属またはシゲラ（Shigella）属に属する細菌などが例示され、より具体的には、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae）、クレブジエラ・プランティコラ（Klebsiella planticola）、モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）、プロビデンシア・スチュアルティ（Providencia stuartii）およびシゲラ・フレクスナ（Shigella flexneri）などの細菌が例示される。
【００１４】
本発明で利用されるシグナルペプチドとしてより具体的には、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドなどが例示される。、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドを利用する場合、本発明の組換えポリヌクレオチドには、配列表の配列番号１に記載のシグナルペプチドをコードする塩基配列が組み込まれる（以下、特に断らない限り、配列番号は配列表に示される配列番号を指すもととする）。配列番号１に記載のシグナルペプチドをコードする塩基配列は、コドン表に従って配列番号１のアミノ酸配列に翻訳される複数の塩基配列を用い得る。一例として、配列番号２に、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
【００１５】
本明細書においていうポリヌクレオチドには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらのハイブリッドおよびキメラなどが含まれる。またポリヌクレオチドは、一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。本発明の組換えポリヌクレオチドとしては、安定性、取り扱いの容易性などからＤＮＡが好適である。
【００１６】
本発明の組換えポリヌクレオチドの好ましい他の形態として、上記のシグナルペプチドをコードする塩基配列の下流に、所望のタンパク質をコードする塩基配列とを組み込んだ組換えポリヌクレオチドが挙げられる。本発明の組換えポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードする塩基配列の下流に組み込まれるタンパク質を高発現させることができる。すなわち、本発明の組換えポリヌクレオチドは、発現ベクターとして好適である。
【００１７】
ベクターとしての形態は特に限定されないが、プラスミド、ウイルスなど一般に用いられるものを採用してよい。ベクターとしては、例えば、pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等を用いることができる。他にもファージDNAのベクターも利用できる。
【００１８】
また、本発明の組換えポリヌクレオチドには、発現ベクターに用いられる他の配列を組み込んでもよい。例えば、本発明のポリヌクレオチドには、プロモータ、ターミネータ、コザック配列、マルチクローニングサイト、形質転換体を識別するための薬剤耐性遺伝子などを必要に応じて組み込むことができる。プロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、T7プロモータ、lacプロモータ、trpプロモータ、trcプロモータ、tacプロモータ、ラムダファージのPRプロモータ、PLプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。また、ターミネータとしては、T7ターミネータ、fdファージターミネータ、T4ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌trpA遺伝子のターミネータ等が例示される。
【００１９】
発現させようとするタンパク質としては、例えば、以下の（Ａ）〜（Ｄ）に示すタンパク質が、好適な組み合わせとして例示される。
（Ａ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルギニンラセマーゼ活性を有するタンパク質
【００２０】
ペプチド生成活性とは、２つ以上の物質から、ペプチド結合を形成させてペプチド結合を有する新たな化合物を生成する反応を促進する活性であり、より具体的には、例えば２つのアミノ酸またはそのエステルなどから、少なくとも１つペプチド結合を増やしたペプチド化合物を生成する活性をいう。アルギニンラセマーゼ活性とは、アルギニンをラセミ化する反応を促進する活性のことをいう。
【００２１】
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。ただし、（Ｂ）および（Ｄ）のタンパク質のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で、変異を含まない状態でのタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％、特に好ましくは９５％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。例えば、（Ｂ）の場合について説明すると、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００２２】
上記（Ｂ）および（Ｄ）などに示されるようなアミノ酸の変異は、例えば部位特異的変異法によって、本酵素遺伝子の特定部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されるように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変された塩基配列を有するポリペプチドは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、（Ａ）または（Ｃ）をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び（Ａ）または（Ｃ）をコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００２３】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位等には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べることにより、配列番号２または３に記載のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
【００２４】
配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質は、例えば、エンペドバクター・ブレビス FERM BP-8113株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）より単離されたものである。配列番号２に示すアミノ酸配列は、配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の成熟タンパク質領域である。
【００２５】
配列番号１２のアミノ酸配列は、例えば配列番号１１に示される塩基配列によりコードされる。配列番号１１に記載の塩基番号６１〜１９０８の塩基配列からなるＤＮＡは、コードシーケンス（ＣＤＳ）部分である。塩基番号６１〜１９０８の塩基配列には、シグナルペプチドをコードする領域と成熟タンパク質領域とが含まれている。シグナルペプチドをコードする配列は塩基番号６１〜１２６の領域であり、成熟タンパク質領域は塩基番号１２７〜１９０８の領域である。塩基番号６１〜１９０８の塩基配列でコードされるシグナルペプチドは、上記菌株が元来有していたシグナルペプチドである。配列番号１１に記載の配列に含まれるシグナルペプチドをコードする塩基配列は、リーダー配列の類であり、リーダー配列がコードするペプチドの主たる機能は、細胞膜内から細胞膜外に分泌させることにあると推定される。塩基番号１２７〜１９０８でコードされるタンパク質、すなわちリーダーペプチド（シグナルペプチド）を除く部位が成熟タンパク質であり、配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、高いペプチド生成活性を示すと推定される。
【００２６】
また、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、例えば、シュードモナス・テトロレンス（Pseudomonas taetrolents）ATCC 4683株などから単離することができる。なお、ATCC番号が記載されているものは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（P.O.Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America）に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。
【００２７】
所望のタンパク質を有する微生物から、そのタンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを単離し、ベクターなどの組換え体に組み込むことは、公知の手法により実施可能である。
【００２８】
２．本発明の形質転換微生物
本発明の形質転換微生物は、上記本発明の組換えポリヌクレオチドが導入された形質転換体である。
【００２９】
タンパク質を発現させるための宿主としては、例えばエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア（Escherichia）属細菌等の微生物を用いることができる。
【００３０】
組換えＤＮＡを宿主細胞に導入するための形質転換法としては、D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等が挙げられる。
【００３１】
３．本発明のタンパク質製造方法
本発明のタンパク質の製造方法は、上記本発明の形質転換微生物に、所望のタンパク質を生産させることによるものである。すなわち、本発明のタンパク質の製造方法は、上記本発明の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および／または微生物中に、前記タンパク質を蓄積させることを特徴とする。蓄積したタンパク質は、必要に応じて、定法に従い回収し、精製等してもよい。
【００３２】
微生物の菌体（すなわち、微生物の細胞）を得るには、微生物の種類に応じて適当な培地で培養増殖させるとよい。このための培地はその微生物が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
【００３３】
例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭水化物類あるいはこれらの混合物などを使用することができる。
【００３４】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機塩のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができる。
【００３５】
他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。
【００３６】
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてｐＨ５〜８、温度約１５〜４０℃の範囲でｐＨおよび温度を適当に制限しつつ１２〜４８時間程度培養を行えばよい。
【００３７】
その他、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択してよい。
【００３８】
また、タンパク質を組換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、該タンパク質を生産する形質転換体内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（inclusion body）を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
【実施例】
【００３９】
実施例１．エンテロバクター・アエロゲネス由来酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモータ配列の改変
Journal of Bioscience and Bioengineering (2001) Vol.92, No.1, 50-54記載の通り（もしくは特開平１０−２０１４８１号公報、実施例２４など）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）IFO 12010菌株の染色体ＤＮＡより、酸性フォスファターゼ遺伝子領域を含む、制限酵素SalIと制限酵素KpnIで切り出される1.6kbpのDNA断片を単離し、pUC118に連結したプラスミドＤＮＡを構築し、pEAP120と命名した。pEAP120は、酸性フォスファターゼのプロモータ及びシグナルペプチドをコードする塩基配列が組み込まれたプラスミドである。なお、ＩＦＯ番号が記載されているものは、財団法人発酵研究所（日本国大阪市淀川区十三本町２丁目１７−８５）に寄託されたものであるが、平成１４年６月３０日以降、その業務は独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）・バイオテクノロジー本部（ＤＯＢ）・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）に移管され、ＮＢＲＣより上記ＩＦＯ番号を参照して分譲を受けることができる。
【００４０】
続いて、本遺伝子の上流に存在するプロモータ配列を一部改変し、活性向上を試みた。Quikchange site Directed Mutagenesis Kit （STRATAGENE社製）を用いて部位特異的変異を導入し、酸性フォスファターゼ遺伝子推定プロモータ配列の−１０領域をAAAAATからTATAATへ置換した。変異導入用にデザインしたＰＣＲ用オリゴヌクレオチプライマーEM1(5'-CTT ACA GAT GAC TAT AAT GTG ACT AAA AAC；配列番号５)およびEMR1(5'-GTT TTT AGT CAC ATT ATA GTC ATC TGT AAG；配列番号６)を合成した。説明書の方法に従って、pEAP120を鋳型に変異導入を行った。DNA Sequencing kit Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction(PERKIN ELMER社製)を用いたDye Terminator法により、310 Genetic analyzer(ABI)にて塩基配列を決定し、目的の変異が導入されていることを確認し、本プラスミドをpEAP130と命名した。pEAP130は、酸性フォスファターゼのＮ末端領域に由来するシグナルペプチドをコードする塩基配列、および、改変されたプロモータを有するプラスミドである。
【００４１】
各プラスミドで形質転換したエシェリヒア・コリ JM109/ pEAP120及びエシェリヒア・コリ JM109/ pEAP130を及びアンピシリン100mg/lを含むＬＢ培地（10g/l トリプトン、5g/l 酵母エキス、10g/l 塩化ナトリウム、ｐH7.0）50mlを入れた500ml坂口フラスコに接種し、３７℃で16時間培養した。ＩＰＴＧを添加する場合は1mMを培養の初めから添加した。
【００４２】
培養して得られた該培養液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗浄した。菌体を５mlの100mMリン酸カリウムバッファー（pH7.0）に懸濁し、４℃で20分間超音波処理を行い破砕した。処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、上清を粗酵素抽出液とした。
【００４３】
粗酵素抽出液のタンパク質濃度の定量は、BSAを標準タンパク質として、プロテインアッセイキット（Bio-Rad社製）を用いBradford法に従って定量した。本酸性フォスファターゼはフォスファターゼ活性以外にもヌクレオシドに対するリン酸基転移活性を示すため（Journal of Bioscience and Bioengineering (2001) Vol.92, No.1, 50-54）、リン酸基転移活性を次の条件で測定し、発現量を比較した。イノシン40μmol/ml、ピロリン酸ナトリウム100μmol/ml、酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）100μmol/ml及び酵素を含む反応液（1ml）でpH5.0、３０℃で10分反応を行った。2Ｎ塩酸200μlを添加して反応を停止した後、遠心分離により沈澱を除き、リン酸基転移反応により生成した５’−イノシン酸を定量した。この標準反応条件にて1分間に1μmolの５’−イノシン酸を生成する酵素量を１unitと定めた。
【００４４】
なお、イノシン及び５’−イノシン酸は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、下記の条件にて分析した。
カラム：Cosmosil 5Ｃ18-AR （4.6×150mm）〔ナカライテスク社製品〕、移動相：5mM リン酸カリウムバッファー（pH 2.8）／メタノール ＝ 95／5、流速：1.0ml/min、温度：室温検出：ＵＶ245nm。
【００４５】
各プラスミドで形質転換したエシェリヒア・コリ JM109より調製した無細胞抽出液の活性を測定した結果を表１に示した。エシェリヒア・コリ JM109／pEAP120はIPTGを添加しない条件では活性が低かったのに比べ、エシェリヒア・コリ JM109／pEAP130はIPTG無添加で、ほぼ同等の活性を示し、−１０領域のプロモータ改変が有効であることが解った。以降の実施例では、IPTG無添加でも高発現可能な本改変プロモータの制御下にシグナル配列の下流に異種遺伝子を連結した発現プラスミドを構築した。
【００４６】
【表１】
2005269904.tif 000002
【００４７】
実施例２．エンペドバクター属由来のペプチド生成酵素遺伝子高発現プラスミドの構築
［調製例１］エンペドバクター・ブレビス由来のペプチド生成酵素遺伝子の単離
以下、ペプチド生成酵素遺伝子の単離について述べるが、微生物はエンペドバクター・ブレビス FERM BP-8113株を用いた。遺伝子の単離にはエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）JM-109株を宿主に用い、ベクターはpUC118を用いた。
【００４８】
（１）決定内部アミノ酸配列に基づいたＰＣＲプライマーの作製
前述のエンペドバクター・ブレビス FERM BP-8113株由来のペプチド生成酵素のリジルエンドペプチダーゼによる消化物をエドマン分解法により決定したアミノ酸配列（配列番号７及び８）をもとに、配列番号９及び１０にそれぞれ示す塩基配列を有するミックスプライマーを作成した。
【００４９】
（２）菌体の取得
エンペドバクター・ブレビス FERM BP-8113株をＣＭ２Ｇ寒天培地（50g/l グルコース、10g/l 酵母エキス、10g/l ペプトン、5g/l 塩化ナトリウム、20g/l 寒天、ｐＨ７．０））上で３０℃、２４時間培養した。この菌体を、５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地（上記培地より寒天を除いた培地）を張り込んだ５００ｍｌの坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃で振盪培養した。
【００５０】
（３）菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離（12,000rpm、４℃、15分間）し、集菌した。QIAGEN Genomic-tip System（Qiagen社製）を用いて、説明書の方法に基づき、この菌体から染色体ＤＮＡを取得した。
【００５１】
（４）ＰＣＲ法によるペプチド生成酵素遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片の取得エンペドバクター・ブレビス FERM BP-8113株由来のペプチド生成酵素遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を、LA-Taq（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により取得した。エンペドバクター・ブレビス FERM BP-8113株から取得した染色体ＤＮＡに対し、配列番号９及び１０に示す塩基配列を有するプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。
【００５２】
ＰＣＲ反応は、Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL（宝酒造社製）を用いて行い、以下の条件の反応を３０サイクル行った。
【００５３】
９４℃      ３０秒
５２℃      １分
７２℃      １分
【００５４】
反応後、反応液３μｌを0.8％アガロース電気泳動に供した。その結果、約1.5ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されていることが確認された。
【００５５】
（５）遺伝子ライブラリーからのペプチド生成酵素遺伝子のクローニング
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、まず、上記ＰＣＲにおいて増幅されたＤＮＡ断片をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーションの操作は、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)に説明されている。
【００５６】
上記ＰＣＲで増幅された約1.5kbＤＮＡ断片を、0.8％アガロース電気泳動により分離した。目的のバンドを切り出し、精製した。このＤＮＡ断片をDIG High Prime（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づきプローブのジゴキシニゲンによる標識を行った。
【００５７】
本調製例１（３）で取得したエンペドバクター・ブレビスの染色体ＤＮＡを制限酵素HindIIIで37℃、16時間反応させて完全に消化した後、0.8％アガロースゲルで電気泳動した。電気泳動後のアガロースゲルからナイロンメンブレンフィルターNylon memebranes positively charged（ロシュ・ダイアグノティクス社製）にブロッティングし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはEASY HYB（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを５０℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記で作製した、ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで室温、２０分間洗浄した。さらに0.1％ＳＤＳを含む0.1×ＳＳＣで６５℃、１５分間洗浄を２回行った。
【００５８】
プローブとハイブリダイズするバンドの検出は、DIG Nucleotide Detection Kit（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、プローブとハイブリダイズする約４ｋｂのバンドが検出できた。
【００５９】
本調製例１（３）で調製した染色体ＤＮＡ５μｇをHindIIIで完全に消化した。0.8％アガロースゲル電気泳動により約４ｋｂのＤＮＡを分離し、Gene Clean II Kit（フナコシ社製）を用いてＤＮＡを精製し、１０μｌのＴＥに溶解した。このうち４μｌと、pUC118 HindIII/BAP（宝酒造社製、BAP;大腸菌アルカリフォスファターゼ）とを混合し、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造社製）を用いて連結反応を行った。このライゲーション反応液５μｌとEscherichia coli JM109株のコンピテント・セル（東洋紡績社製）１００μｌとを混合して、Escherichia coliを形質転換した。これを適当な固形培地に塗布し、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
【００６０】
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、上記プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによる染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。コロニーハイブリダイゼーションの操作は、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)に説明されている。
【００６１】
染色体ＤＮＡライブラリーのコロニーをナイロンメンブレンフィルターNylon Membranes for Colony and Plaque Hybridization（ロシュ・ダイアグノティクス社製）に移し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはEASY HYB（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを３７℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで室温、２０分間洗浄した。さらに０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで６５℃、１５分間洗浄を２回行った。
【００６２】
標識プローブとハイブリダイズするコロニーの検出は、DIG Nucleotide Detection Kit（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、標識プローブとハイブリダイズするコロニーを２株確認できた。
【００６３】
（６）エンペドバクター・ブレビス由来ペプチド生成酵素遺伝子の塩基配列
標識プローブとハイブリダイズしたことが確認された上記２菌株から、エシェリヒア・コリ  JM109株が保有するプラスミドを、Wizard Plus Minipreps DNA Purification System（プロメガ社製）を用いて調製し、プローブとハイブリダイズした近傍の塩基配列を決定した。シーケンス反応はCEQ DTCS-Quick Start Kit（ベックマン・コールター社製）を用いて、説明書に基づき行った。また、電気泳動はCEQ 2000-XL（ベックマン・コールター社製）を用いて行った。
【００６４】
その結果、ペプチド生成酵素の内部アミノ酸配列（配列番号７及び８）を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが存在し、ペプチド生成酵素をコードする遺伝子であることを確認した。ペプチド生成酵素遺伝子全長の塩基配列とこれに対応するアミノ酸配列を配列番号１１に示した。得られたオープンリーディングフレームをＢＬＡＳＴＰ．プログラムで相同性解析した結果、二つの酵素に相同性が見出され、Acetobacter pasteurianusのα−アミノ酸エステルハイドロラーゼ（Appl. Environ. Microbiol., 68(1), 211-218(2002) とは、アミノ酸配列で３４％、Brevibacillus laterosporum (J. Bacteriol., 173(24), 7848-7855(1991) のグルタリル-７ＡＣＡアシラーゼとは、アミノ酸配列で２６％の相同性を示した。
【００６５】
（７）エンペドバクター属由来のペプチド生成酵素遺伝子の大腸菌における発現
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）W3110染色体ＤＮＡ上のtrpオペロンのプロモータ領域を配列番号１３、１４に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子領域を増幅し、得られたＤＮＡ断片をpGEM―Teasyベクター（プロメガ社製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coli JM109株を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からtrpプロモータの方向がlacプロモータと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをEcoO109I/EcoRIにて処理して得られるtrpプロモータを含むＤＮＡ断片と、pUC19（Takara製）のEcoO109I/EcoRI処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア・コリ  JM109株を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをHindIII/PvuIIにて処理して得られるＤＮＡ断片と、pKK223-3(Amersham Pharmacia製）をHindIII/HincIIにて処理し、得られたrrnBターミネータを含むＤＮＡ断片とをライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coli JM109株を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをpTrpTと命名した。
【００６６】
エンペドバクター・ブレビス FERM BP-8113株の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号１５、１６に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。このＤＮＡ断片をNdeI/PstIにて処理し、得られたＤＮＡ断片とpTrpTのNdeI/PstI処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア・コリ  JM109株を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをpTrpT_Gtg2と命名した。
【００６７】
pTrpT_Gtg2を有するエシェリヒア・コリ  JM109株を１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含むＬＢ培地で、３０℃、２４時間シード培養した。得られた培養液１ｍｌを、５０ｍｌの培地（2 g/l Ｄ−グルコース、10g/l 酵母エキス、10g/l カザミノ酸、5g/l 硫酸アンモニウム、3g/l リン酸二水素カリウム、1g/l リン酸水素二カリウム、0.5g/l 硫酸マグネシウム七水和物、100mg/l アンピシリン）を張り込んだ500ml坂口フラスコにシードし、２５℃、２４時間の本培養を行った。培養液１ｍｌあたり0.11Ｕのα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル生成活性を有しており、クローニングした遺伝子がE.coliで発現したことを確認した。なお、対照としてpTrpTのみを導入した形質転換体には、活性は検出されなかった。
【００６８】
実施例２．高発現プラスミドの構築
（１）エンペドバクター属由来のペプチド生成酵素高発現プラスミドの構築
ＰＣＲにより、エンテロバクター・アエロゲネス由来酸性フォスファターゼの改変プロモータおよびシグナル配列の下流にエンペドバクター属由来の成熟型ペプチド生成酵素遺伝子を連結した発現プラスミドを構築した。
【００６９】
鋳型として調製例１のpTrpT_Gtg2プラスミド、プライマーとしてＣＡＰ１（5'- CGT TAA CGC TTT CGC GCA AGA TGC AAA AGC AGA TTC；配列番号１７）及びＣＡＰ２（5'- CGC CTG CAG CAT ACT TGT ACG GTT TCG CCC；配列番号１８）オリゴヌクレオチド各０．４ｍＭ並びにKOD plus用緩衝液（TOYOBO社製）、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各０．２ｍＭ、硫酸マグネシウム１ｍＭ、及びKOD plusポリメラーゼ（TOYOBO社製）１ユニットを含む５０μlの反応液で、９４℃、３０秒の熱処理の後、９４℃を１５秒、５５℃を３０秒、６８℃を２分３０秒のサイクルを２５回繰り返すＰＣＲを行い、成熟型ペプチド生成酵素遺伝子部分を増幅した。また、鋳型として実施例１のpEAP130プラスミド、プライマーとしてＣＡＰ３（5'- CGC TCT AGA ATT TTT TCA ATG TGA TTT；配列番号１９）及びＣＡＰ４（5'- GCT TTT GCA TCT TGC GCG AAA GCG TTA ACG GAA AAC；配列番号２０）オリゴヌクレオチドを用い同条件にてＰＣＲを行い、酸性フォスファターゼのプロモータ及びシグナル配列部分を増幅した。反応液をアガロース電気泳動に供し、増幅された各ＤＮＡ断片をMicrospin column（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて回収した。
【００７０】
次いで、該増幅断片混合物を鋳型とし、プライマーとしてＣＡＰ２及びＣＡＰ３オリゴヌクレオチドを用い、同様の組成の反応液で９４℃を１５秒、５５℃を３０秒、６８℃を２分３０秒のサイクルを２５回繰り返すＰＣＲを行い、キメラ型酵素遺伝子を構築した。増幅された各ＤＮＡ断片をMicrospin column（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて回収し、これをXba IとPst I で消化した。これをpUC19プラスミドのXba I−Pst Iサイトに連結した。DNA Sequencing kit Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PERKIN ELMER社製)を用いたDye Terminator法により、310 Genetic analyzer(ABI)にて塩基配列を決定し、目的の変異が導入されていることを確認し、本プラスミドをpAF110プラスミドと命名した。
【００７１】
pAF110プラスミドは酸性フォスファターゼプロモータでペプチド生成酵素を発現させているが、pTrpT_Gtg2ではtrpプロモータで発現させている。そこで次にシグナル配列置換の効果を明確に比較するため、pAF110プラスミドのプロモータをtrpプロモータに置換した発現プラスミドを構築した。鋳型として上記pAF110プラスミド、プライマーとしてＣＡＰ５（5'- GGG GAT CCC ATA TGA AAA AGC GCG TTC TCG CCC；配列番号２１）及びＣＡＰ６（5'- CGC CTG CAG CAT ACT TGT ACG GTT TCG CCC；配列番号２２）オリゴヌクレオチド各0.4mM並びにKOD plus用緩衝液（TOYOBO社製）、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各０．２ｍＭ、硫酸マグネシウム１ｍＭ、及びKOD plusポリメラーゼ（TOYOBO社製）１ユニットを含む５０μlの反応液で、９４℃、３０秒の熱処理の後、９４℃を１５秒、５５℃を３０秒、６８℃を２分３０秒のサイクルを２５回繰り返すＰＣＲを行い、プロモータ配列を含まないキメラ遺伝子を増幅した。増幅された各ＤＮＡ断片をMicrospin column（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて回収し、これをNde IとPst I で消化した。これを上記調製例１のpTrpTプラスミドのNde I−Pst Iサイトに連結したプラスミドを構築し、pAF150プラスミドと命名した。
【００７２】
（２）形質転換体のペプチド生成酵素活性測定
参考例１のpTrpT_Gtg2並びに上記プラスミドpAF110及びpAF150をE. coli JM109に各々形質転換し、各形質転換体を、アンピシリン100mg/lを含む3mlのLB液体培地（Bacto tryptone 10 g/L, Bacto yeast extract 5 g/l, NaCl 10 g/l）に植菌し、22℃、8h シード培養を行った。続いてこのシード培養液2.5 ml を及びアンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むAet発現培地（カザミノ酸 10 g/l, Bacto yeast extract 10 g/l, (NH4)2SO4 5 g/l, KH2PO4 3 g/l, K2HPO4 1 g/l,グルコース 2 g/l, MgSO4 7H2O 0.5 g/l）50 mlを入れた500ml坂口フラスコに接種し、22℃、20h 振とう培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄した菌体を添加し、アラニルグルタミン生成活性を測定した。
【００７３】
アラニルグルタミン生成活性は以下の条件で測定した。100μmol/ml アラニン−ｏ−メチルエステル(国産化学社製)、200μmol/ml グルタミン、100μmol/ml mM ホウ酸-水酸化ナトリウム緩衝液（pH9.0）および菌体を含む反応液（1ml）でpH9.0、２５℃ で10分反応を行った。1.7% (w/v) リン酸で10mlを添加して反応を停止した後、遠心分離により沈澱を除き、、本反応で生じたアラニルグルタミンを定量した。この標準反応条件にて1分間に1μmolのアラニルグルタミンを生成する酵素量を１unitと定めた。なおアラニルグルタミンは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、下記の条件にて分析した。
【００７４】
カラム：Inertsil ODS-2（ジーエルサイエンス社製、4.6×250mm）、移動層：5mM 1-オクタンスルホン酸ナトリウム / メタノール= 1000/165 (リン酸でpH2.1 に調整)、流速：1.0ml/min、温度：40℃ 、検出：ＵＶ210nm。
【００７５】
各プラスミドで形質転換したエシェリヒア・コリのアラニルグルタミン生成活性を測定した結果を表２に示した。シグナル配列を酸性フォスファターゼのものに置換したpAF150導入株では、プロモータを置換していない発現プラスミドpTrpT_Gtg2に比べ4.7倍にアラニルグルタミン生成活性が向上し、該酸性フォスファターゼ由来のシグナル配列への置換が、高発現に有効であった。さらに酸性フォスファターゼ由来プロモータの制御下に連結することで、さらに活性向上が可能であった。
【００７６】
【表２】
2005269904.tif 000003
【００７７】
実施例３．シュードモナス・テトロレンス由来のアルギニンラセマーゼ遺伝子高発現プラスミドの構築
（１）アルギニンラセマーゼ遺伝子の単離
既知のシュードモナス・テトロレンスのアルギニンラセマーゼ遺伝子の塩基配列（EMBL Accession number AB096176）を基に、該アルギニンラセマーゼ遺伝子を増幅するようにデザインしたＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマーPRP1及びPRP2を合成した。シュードモナス・テトロレンス ATCC 4683株を、５０ｍｌのLB液体培地を含む500mlの坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃で振盪培養した。遠心分離（12,000rpm、４℃、１５分間）により集菌した菌体より、QIAGEN Genomic-tip System（Qiagen社製）を用いて、説明書の方法に基づき、染色体ＤＮＡを取得した。
【００７８】
鋳型としてこの染色体ＤＮＡ 0.1ng、プライマーとしてＡＲ１(5'-GGA ATT CCA TAT GCC CTT CTC CCG TAC CCT GC；配列番号２３)及びＡＲ２（5'- CGG GAT CCC TGA TCT TTC AGG ATT TTA GGG TTG；配列番号２４）オリゴヌクレオチド各2.5μmol並びにタックＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）2.5ユニットをdATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウム50mM及び塩化マグネシウム1.5mMを含む100mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.3）100μlに添加し、94℃を30秒、55℃を２分、72℃を３分のサイクルを30回繰り返すＰＣＲ反応を行った。反応液をアガロース電気泳動に供し、増幅されたＤＮＡ断片をMicrospin column（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて回収した。この遺伝子断片をNdeIとBamHIで切断後、pET28aベクター（Novagen社製）のNdeI-BamHIサイトに連結した。ライゲーション反応液でエシェリヒア・コリ JM109株を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをpArgr100と命名した。その結果、本菌はリン酸エステル加水分解活性だけでなく、ヌクレオシドへのリン酸転移活性も示した。続いてpETベクター上にクローニングしたアルギニンラセマーゼ遺伝子を発現させるため、エシェリヒア・コリ JM109株の形質転換体から調整したpArgr100プラスミドでエシェリヒア・コリ BL21株コンピテント・セル（Novagen社製）を形質転換し、エシェリヒア・コリ BL21/pArgr100株を構築した。
【００７９】
（２）アルギニンラセマーゼ遺伝子高発現プラスミドの構築
ＰＣＲにより、エンテロバクター・アエロゲネス由来酸性フォスファターゼの改変プロモータおよびシグナル配列の下流にアルギニンラセマーゼの成熟型ペプチド生成酵素遺伝子を連結した発現プラスミドを構築した。鋳型として上記のpArgr100プラスミド、プライマーとしてＣＡＲ１（5' - TCC GTT AAC GCT TTC GCG GCG CCA CCC CTG TCG ATG ACC；配列番号２５）及びＣＡＲ２（5'- TTG ACG TCT TAC TGA TCT TTC AGG ATT TTA GGG；配列番号２６）オリゴヌクレオチド各０．４ｍＭ並びにＫＯＤ ｐｌｕｓ用緩衝液（TOYOBO社製）、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各０．２ｍＭ、硫酸マグネシウム１ｍＭ、及びKOD plusポリメラーゼ（TOYOBO社製）１ユニットを含む５０μlの反応液で、９４℃、３０秒の熱処理の後、９４℃を１５秒、５５℃を３０秒、６８℃を２分３０秒のサイクルを２５回繰り返すＰＣＲを行い、成熟型ペプチド生成酵素遺伝子部分を増幅した。また、鋳型として実施例１のpEAP130プラスミド、プライマーとしてＣＡＲ３（5'- GCT CTA GAA TTT TTT CAA TGT GAT TT；配列番号２７）及びＣＡＲ４（5'- CAT CGA CAG GGG TGG CGC CGC GAA AGC GTT AAC GGA AAA C；配列番号２８）オリゴヌクレオチドを用い同条件にてＰＣＲを行い、酸性フォスファターゼのプロモータ及びシグナル配列部分を増幅した。反応液をアガロース電気泳動に供し、増幅された各ＤＮＡ断片をMicrospin column（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて回収した。
【００８０】
次いで、該増幅断片混合物を鋳型とし、プライマーとしてＣＡＲ２及びＣＡＲ３オリゴヌクレオチドを用い、同様の組成の反応液で９４℃を１５秒、５５℃を３０秒、６８℃を２分３０秒のサイクルを２５回繰り返すＰＣＲを行い、キメラ型酵素遺伝子を構築した。増幅された各ＤＮＡ断片をMicrospin column（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて回収し、これをXba IとPst I で消化した。これをｐＵＣ１９プラスミド（宝酒造社製）およびpTWV229プラスミド（宝酒造社製）のXba I−Pst Iサイトに連結した。DNA Sequencing kit Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction(PERKIN ELMER)を用いたDye  Terminator法により、310 Genetic analyzer(ABI)にて塩基配列を決定し、目的の変異が導入されていることを確認した。pUC19プラスミドに連結したものをpArgr200、pTWV229プラスミドに連結したものをpArgr300と命名した。
【００８１】
（３）形質転換体のアルギニンラセマーゼ活性測定
シュードモナス・テトロレンス ATCC 4683株、pArgr100プラスミドで形質転換したエシェリヒア・コリ BL21株およびpArgr200並びにpTWV229プラスミドで形質転換したエシェリヒア・コリ JM109株を3mlのLB液体培地（Bacto tryptone 10 g/L, Bacto yeast extract 5 g/l, NaCl 10 g/l）に植菌し、30℃、8h シード培養を行った。エシェリヒア・コリの形質転換体は培地にアンピシリン100 mg/lを添加した。
【００８２】
続いてこのシード培養液2.5 ml をアルギニンラセマーゼ発現培地（酵母エキス 10 g/l, トリプトン 10 g/l, (NH4)2SO4 5 g/l, KH2PO4 5 g/l, K2HPO4 1 g/l、MgSO4 7H2O 0.5 g/l、FeSO4 7H2O 0.01 g/l、MnSO4 7H2O 0.01 g/l、チアミン塩酸塩 0.1g/l）50 mlを入れた500ml坂口フラスコにに接種し、30℃で20h 振とう培養を行った。エシェリヒア・コリの形質転換体の培養においては培地にアンピシリン100 mg/lを添加し、さらにエシェリヒア・コリ ＢＬ２１株の培養においては１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。培養終了後、集菌、洗浄した菌体を添加し、アルギニンラセマーゼ活性を測定した。
【００８３】
アルギニンラセマーゼ活性はL-アルギニンを基質として以下の条件で測定した。L-アルギニン100mg/ml、ピリドキサルリン酸 200μg/ml、トリス−塩酸緩衝液（pH8.0）100μmol/ml及び菌体を含む反応液（１ml）において、30℃で10分反応を行った。過塩素酸溶液（pH1.0）の9mlを添加して反応を停止した後、遠心分離により沈澱を除き、生成したD-アルギニンを定量した。この標準反応条件にて1分間に1μmolのD-アルギニンを生成する酵素量を１unitと定めた。なお、L-アルギニン及びD-アルギニンは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、下記の条件にて分析した。
【００８４】
カラム：Crownpak（＋） （4.0×150mm）〔ダイセル化学工業社製品〕、移動相：過塩素酸溶液（pH1.0）、流速：0.4 ｍｌ／ｍｉｎ、温度：40℃、検出：ＵＶ２１０ｎｍ。
【００８５】
各プラスミドで形質転換したエシェリヒア・コリのアルギニンラセマーゼ活性を測定した結果を表３に示した。pETベクター上にアルギニンラセマーゼ遺伝子をクローニングしたpArgr100導入株エシェリヒア・コリDE21 /pArgr100でも、親株よりも低い活性しか発現できなかった。一方シグナル配列を酸性フォスファターゼ由来のものに置換したpArgr200並びにpArgr300導入株では、いずれも親株の100倍以上の活性を発現することができ、該酸性フォスファターゼ由来のシグナル配列への置換が、高発現に有効であった。
【００８６】
【表３】
2005269904.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明は、バイオテクノロジーの分野において有用であり、例えば、遺伝子工学的な手法を用いたタンパク質の生産などの分野において好適である。
【配列表フリーテキスト】
【００８８】
配列番号１；シグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号２；シグナルペプチドの塩基配列
配列番号３；ペプチド生成酵素（成熟体）のアミノ酸配列
配列番号４；アルギニンラセマーゼ（成熟体）のアミノ酸配列
配列番号５；Primer EM1
配列番号６；Primer EMR1
配列番号７；エンペドバクター由来のペプチド生成タンパク質をエドマン分解して決定したアミノ酸配列
配列番号８；エンペドバクター由来のペプチド生成タンパク質をエドマン分解して決定したアミノ酸配列
配列番号９；Mix Primer
配列番号１０；Mix Primer
配列番号１１；エンペドバクター・ブレビス由来のペプチド生成タンパク質の塩基配列
配列番号１２；エンペドバクター・ブレビス由来のペプチド生成タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３；pTrpT調製用プライマー
配列番号１４；pTrpT調製用プライマー
配列番号１５；pTrpT_Gtg2調製用プライマー
配列番号１６；pTrpT_Gtg2調製用プライマー
配列番号１７；Primer CAP1
配列番号１８；Primer CAP2
配列番号１９；Primer CAP3
配列番号２０；Primer CAP4
配列番号２１；Primer CAP5
配列番号２２；Primer CAP6
配列番号２３；Primer AR1
配列番号２４；Primer AR2
配列番号２５；Primer CAR1
配列番号２６；Primer CAR2
配列番号２７；Primer CAR3
配列番号２８；Primer CAR4
【配列表】
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