(57)【要約】【課題】  化学的方法による大量の副産物の生成などの問題を解決すべく、酵素、微生物を利用した生化学的手法による温和な条件での効率的なグリオキサールの製造方法を提供する事を目的とする。【解決手段】  上記課題に鑑み、グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する活性を有する微生物を探索した結果、グリコールアルデヒドに高い選択性を示し、グリオキサールへと変換する活性を有する微生物を見出した。さらに本微生物より上記反応を触媒する酵素を単離、精製した。本発明酵素を用いることによりグリコールアルデヒドから効率的にグリオキサールを製造する事が可能となった。さらには本発明酵素とメタノールオキシダーゼなどのエチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酵素を同時に用いれば、安価に入手可能なエチレングリコールから効率的にグリオキサールを製造することが可能となった。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）から（２）の理化学的性質を有する酸化酵素。
（１）作用：グリコールアルデヒドに作用し、グリオキサールを生成する。
（２）基質特異性：グリコールアルデヒドに対し高い活性を示し、メタノール、グリセリンには実質的に活性を示さない。
【請求項２】
さらに、下記（３）の理化学的性質を有する請求項１記載の酸化酵素。
（３）基質特異性：エチレングリコールには実質的に活性を示さない。
【請求項３】
さらに、下記（４）〜（５）の理化学的性質を有する請求項１から２のいずれか１項記載の酸化酵素。
（４）熱安定性：ｐＨ７で４０℃、３０分間処理したとき、処理前の９０％以上の活性が残存する。
（５）分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約６２０００Ｄａである。
【請求項４】
リゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）目に属する微生物より得られる請求項１から３のいずれか１項記載の酸化酵素。
【請求項５】
リゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）目に属する微生物がリゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）ＫＮＫ０５４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５６）である請求項４記載の酸化酵素。
【請求項６】
さらに、下記（６）から（７）の理化学的性質を有する請求項１〜２のいずれか１項記載の酸化酵素
（６）熱安定性：ｐＨ７で３０℃、３０分間処理したとき、処理前の８５％以上の活性が残存する。
（７）分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約４４０００Ｄａである。
【請求項７】
アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物より得られる請求項１から２および６のいずれか１項記載の酸化酵素。
【請求項８】
アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物がアースロバクター・スピーシーズ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＮＫ１５４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５３）である請求項７記載の酸化酵素。
【請求項９】
グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する能力を有する酸化酵素、あるいは該酸化酵素の産生能を有する微生物の菌体及び／または菌体処理物をグリコールアルデヒドに作用させ、グリオキサールへ変換することを特徴とするグリオキサールの製造方法。
【請求項１０】
前記酸化酵素が請求項１から８のいずれか１項記載の酸化酵素であるところの請求項９記載のグリオキサールの製造方法。
【請求項１１】
エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酵素、あるいは該酵素の産生能を有する微生物の菌体及び／または菌体処理物とグリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する能力を有する酸化酵素、あるいは該酸化酵素の生産能を有する微生物の菌体及び／または菌体処理物を用いる事を特徴とするエチレングリコールからのグリオキサールの製造方法。
【請求項１２】
エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酵素が酸化酵素である請求項１１記載のグリオキサールの製造方法。
【請求項１３】
エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酵素がアルコールオキシダーゼまたはグリセロールオキシダーゼである請求項１１記載のグリオキサールの製造方法。
【請求項１４】
該アルコールオキシダーゼがＰｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属からなる群から選ばれる少なくとも１つの微生物から得られる酵素である請求項１３記載のグリオキサールの製造方法。
【請求項１５】
グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する能力を有する酵素が請求項１から８記載のいずれか１項記載の酸化酵素であるところの請求項１１から１４のいずれか記載のグリオキサールの製造方法。
【請求項１６】
反応時にカタラーゼを共存させることを特徴とする請求項９から１５のいずれか１項記載のグリオキサールの製造方法。
【請求項１７】
酸素存在下で反応を行うことを特徴とする請求項９から１５のいずれか１項記載のグリオキサールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はグリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する能力を有する新規酸化酵素、ならびにこの酵素の産生能を有する微生物の菌体及び／または菌体処理物を用いたグリオキサールの生化学的製造方法に関する。グリオキサールは繊維加工剤、紙加工剤、土壌硬化剤、農薬、医薬中間体の原料として有用な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
従来、グリオキサールの製造方法としては、アセトアルデヒドの硝酸酸化法、エチレングリコールの銀触媒を使用した高温での気相酸化法などの化学的手法が知られている。しかしながら硝酸酸化法では、有機酸などが大量に生じ、その処理が問題となっている。また、銀触媒を使用した気相酸化法では、高価な銀触媒が必要なことや収率が低いなどの多くの課題を有している。
【０００３】
グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する酵素としては、メタノール酵母由来のアルコールオキシダーゼやカビの産生するグリセロールオキシダーゼが報告されている。また、これらの酵素はエチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する活性も同時に有しており、従って、エチレングリコールをこれらの酵素と接触させた場合、生成したグリコールアルデヒドの一部が更に酸化されてグリオキサールが生成することが知られている（特許文献１、２、非特許文献１、２）。しかし我々が、これらエチレングリコールとグリコールアルデヒドの双方に活性を有する各種アルコールオキシダーゼを用いて、高濃度のエチレングリコールの酸化反応を実際に反応を行ったところ、反応系に初発基質として高濃度に存在するエチレングリコールのグリコールアルデヒドへの酸化（第1反応）が優先的に進行した。その結果、グリコールアルデヒドが主生成物となり、グリオキサールの生成は微量であった。
【０００４】
また、エチレングリコールをグリオキサールへ変換する反応としては、上記酵素を用いる方法の他に、ノイロスポラ属、アセトバクター属、シュードモナス属、アルカリゲネス属細菌の菌体を用いる反応が報告されている（特許文献１）。しかし、これらの反応に関与する酵素などに関する記載はない。また、これら反応におけるグリオキサールの生成量も低く、実用的な方法とは言いがたい。
【特許文献１】特開平７−６７６７０
【特許文献２】特開平８−８４５９２
【非特許文献１】Biosci. Biotech. Biochem., 58(1), 170-173, (1994)
【非特許文献２】Biosci. Biotech. Biochem., 59(4), 576-581, (1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明では酵素、微生物を利用した生化学的手法による効率的なグリオキサールの製造方法を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らはグリコールアルデヒドのグリオキサールへの変換方法について鋭意検討を行った結果、グリコールアルデヒドに高い選択性を示し、グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する活性を有する微生物を見出した。さらにその微生物から該活性を有する酵素を単離、精製し、その酵素の理化学的性質について詳細な検討を行なうと共に、これら微生物および酵素を用いたグリオキサールの製造方法について詳細な検討を行うことにより本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の第1発明はグリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する新規酸化酵素に関し、下記（１）から（２）の理化学的性質を有する酸化酵素である。
（１）作用：グリコールアルデヒドに作用し、グリオキサールを生成する。
（２）基質特異性：グリコールアルデヒドに対し高い活性を示し、メタノール、グリセリンには実質的に活性を示さない。
【０００８】
好ましい態様は、上記性質に加えさらに、下記（３）の理化学的性質を有する酸化酵素である。
（３）基質特異性：エチレングリコールには実質的に活性を示さない。
【０００９】
より好ましい態様は、上記性質に加えさらに、下記（４）〜（５）の理化学的性質、または下記（６）から（７）の理化学的性質を有する酸化酵素である。
（４）熱安定性：ｐＨ７で４０℃、３０分間処理したとき、処理前の９０％以上の活性が残存する。
（５）分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約６２０００Ｄａである。
（６）熱安定性：ｐＨ７で３０℃、３０分間処理したとき、処理前の８５％以上の活性が残存する。
（７）分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約４４０００Ｄａである。
【００１０】
また、第２発明はグリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する能力を有する酸化酵素、あるいは該酸化酵素の産生能を有する微生物の菌体および／または菌体処理物をグリコールアルデヒドに作用させ、グリオキサールへと変換することを特徴とするグリオキサールの製造方法に関する。
【００１１】
さらに、第３発明はエチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酵素、あるいは該酸化酵素の産生能を有する微生物の菌体および／または菌体処理物と、グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する能力を有する酸化酵素、あるいは該酸化酵素の産生能を有する微生物の菌体および／または菌体処理物を用いることによるエチレングリコールからのグリオキサールの製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する能力を有する新規酸化酵素、およびそれを用いたグリオキサールの製造に関するものである。本発明酵素を用いれば、グリコールアルデヒドから温和な条件でグリオキサールが製造される一方で、本発明酵素とアルコールオキシダーゼなどのエチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酵素を同時に用いることにより、温和な条件でエチレングリコールから効率的にグリオキサールを製造することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のグリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する酸化酵素の起源として用いられる微生物としては特に限定しないが、例えばリゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）目に属する微生物やアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物が挙げられ、好ましくは、本発明者によって初めて土壌より単離され、同定されたリゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）ＫＮＫ０５４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５６）およびアースロバクター・スピーシーズ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＮＫ１５４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５３）が挙げられる。これら微生物は、それぞれ上記寄託番号にて独立法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託されている。
【００１４】
前記リゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）ＫＮＫ０５４（以下、単にＫＮＫ０５４という場合もある）およびアースロバクター・スピーシーズ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＮＫ１５４（以下、単にＫＮＫ１５４という場合もある）の菌学的性質を表１に示す。
【００１５】
【表１】
2005245236.tif 000002
前記ＫＮＫ０５４株およびＫＮＫ１５４株酵素は、例えば以下のようにして単離、精製することができる。まず、上記微生物を適当な培地で培養する。この際に用いる培地としては特に限定しないが、例えば、エチレングリコール１０ｇ、酵母エキス０．１ｇ、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）８ｇ、リン酸二水素カリウム３ｇ、リン酸水素二カリウム７ｇ（いずれも１Ｌあたり）の組成よりなる培地（ｐＨ７）を好ましく用いることができる。得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）などに懸濁し、ダイノミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ社製）などで破砕し、遠心分離により菌体破砕残渣を除き、上清液（無細胞抽出液）を得る。得られた上清液に硫酸プロタミンを添加し、生じた不溶物を遠心分離により除き、核酸を除去し、粗酵素液を得ることができる。
【００１６】
目的の活性を有する酵素は、上記粗酵素液より塩析（硫酸アンモニウム沈殿など）、イオンクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどの代表される各種クロマトグラフィーにより精製され得る。
【００１７】
本発明における酸化反応の活性測定法は図１に示すように、酸化反応により発生する過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）をペルオキシダーゼ（以下ＰＯＤ）存在下に４−アミノアンチピリン（以下４−ＡＡ）とＮ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジン（以下ＴＯＯＳ）と反応させ、生成するキノンイミン色素の吸収を測定することにより行う。
【００１８】
基本的には下記組成を有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）０．９ｍｌに、菌体懸濁液または酵素液０．１ｍｌを添加し、３０℃での波長５５５ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行う。
（組成）
基質                    ２０ｍＭ
４−ＡＡ            ０．６７ｍＭ
ＴＯＯＳ            １．０９ｍＭ
ワサビ由来ＰＯＤ      ２Ｕ／ｍＬ
また、エチレングリコール、グリコールアルデヒドおよびグリオキサールの定量は、高速液体クロマトグラフィーで行うことができる。高速液体クロマトグラフィーによる分析は、例えばバイオラッド・アミネックスＨＰＸ−８７（７．８ｍｍ  ×  ３００ｍｍ）カラムを用い、溶媒として５ｍＭの硫酸水溶液を用い、流速０．４ｍｌ／ｍｉｎで行った。検出は２３０ｎｍの吸光度または示差屈折率を測定することにより行った。本条件により、エチレングリコールは２４ｍｉｎ、グリコールアルデヒドは１８ｍｉｎ、グリオキサールは１６ｍｉｎに溶出される。
【００１９】
本発明の酸化酵素の基質特異性を表２に示す。表２においてはグリコールアルデヒドに対する活性を１００％とし、他の基質のグリコールアルデヒドに対する相対活性を示した。本発明酵素はメタノール、エタノール、グリセリン、エチレングリコールには実質的に活性を示さず、従来グリコールアルデヒドに活性を有する事が知られているメタノール酵母由来のアルコールオキシダーゼやカビ由来のグリセロールオキシダーゼとは明らかに異なる酵素である。ここで言う「メタノール、エタノール、グリセリン、エチレングリコールには実質的に活性を示さず」とは、グリコールアルデヒドに対する活性に対し、５％以下程度の活性しか示さない事を意味する。
【００２０】
【表２】
2005245236.tif 000003
本発明によるグリオキサールの製造方法は、グリコールアルデヒドに前記酸化酵素を産生する微生物の培養液、該培養液より分離した微生物菌体、微生物菌体処理物のいずれかをグリコールアルデヒドに作用させ、グリコールアルデヒドをグリオキサールへと変換蓄積せしめることを１つの大きな特徴とする。一方で、メタノールオキシダーゼなどのエチレングリコールをグリコールアルデヒドに変換する能力を有する酵素を産生する微生物の培養液、該培養液より分離した微生物菌体、微生物菌体処理物のいずれかと本発明のグリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する酸化酵素を生産する微生物の培養液、該培養液より分離した微生物菌体、微生物菌体処理物のいずれかを用いて反応することによりエチレングリコールをグリオキサールへ効率良く変換蓄積することを特徴とする。ここで、微生物菌体処理物とは、例えば凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、それら菌体の破砕物、または粗酵素液などを意味する。用語「粗酵素液」には、例えば、菌体のグラスビーズなどを用いる物理的破砕方法、酵素などを用いる生化学的手法などにより破砕または溶解した溶液、さらには遠心分離などにより該溶液中の固形物を除去して得た無細胞抽出液が含まれる。また、さらには、当業者が通常用いる方法、例えば、透析、硫酸アンモニウム沈殿、クロマトグラフィーを単独でまたは組み合わせて用い前記無細胞抽出液を部分的に精製した酵素も「粗酵素液」に含まれる。さらには微生物菌体処理物は、公知の手段で固定化して用いることもできる。固定化は当業者に周知の方法（たとえば、架橋法、物理的吸着法、包括法など）で行い得る。
【００２１】
反応条件は使用する酵素、微生物またはその処理物により異なるが、反応温度は１０〜８０℃、好ましくは２０〜５０℃の範囲、ｐＨはｐＨ４〜１２、好ましくは６〜１０の範囲で行う。また、本反応には酸素が必要な為、反応液が空気または比較的純粋な酸素と接触下で行われることが好ましい。また、酸素の反応液への溶解を促進するため、反応は振とう、攪拌条件下で行われることが好ましい。さらに反応液への酸素の溶解度を向上させるため、大気圧以上の加圧下で反応することが好ましい。酸素圧の上限は知られていないが、約５０気圧までの酸素圧、好ましくは２０気圧までの酸素圧が好ましい。
【００２２】
また、酸化酵素を用いて反応を行う場合、反応系に過酸化水素が生成し、この過酸化水素は酵素を失活させたり、また生成したグリオキサールを酸化することなどによりグリオキサールの収率を低下させる場合があるが、反応系にカタラーゼを添加することにより、反応により生じたカタラーゼを分解除去し、グリオキサールの収率低下を防ぐことが可能である。
【００２３】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
（実施例１）
以下の方法に従って、リゾビアレス  ＫＮＫ０５４株より、グリコールアルデヒドを酸化しグリオキサールを生成する酸化酵素の精製を行った。
【００２５】
エチレングリコール１０ｇ、酵母エキス０．１ｇ、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）８ｇ、リン酸二水素カリウム３ｇ、リン酸水素二カリウム７ｇ（いずれも１Ｌあたり）の組成よりなる培地（ｐＨ７）を調製し、５Ｌジャーファーメンターに同培地を４Ｌ分抽し、高圧蒸気滅菌を行った（１２０℃、２０分）。
【００２６】
これらの培地に予め同培地で前培養しておいたリゾビアレス  ＫＮＫ０５４の培養液を４０ｍＬを植菌し、３０℃、通気０．５ｖｖｍ、攪拌６００ｒｐｍで３日間培養を行う。本ジャーファーメンター培養を繰り返し９６Ｌの培養液を取得し、ついで得られた培養液９６Ｌから遠心分離により菌体を集め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）にて洗浄後、同緩衝液８００ｍＬに懸濁した。得られた菌体懸濁液をダイノミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ社製）で破砕後、遠心分離により菌体残渣を除き、無細胞抽出液２３５０ｍＬを得た。さらに本無細胞抽出液２３５０ｍＬに攪拌しながら、５％硫酸プロタミン溶液を５５．２ｍＬ加え、その後遠心分離により沈殿物を除き、粗酵素液を得た。この粗酵素液に冷却したスターラーで攪拌しながら所定量の硫酸アンモニウムを添加し、硫酸アンモニウム濃度５０−６５％で沈殿するタンパク質を遠心分離により集めた。
【００２７】
得られたタンパク質を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で溶解し、同緩衝液に対し透析を行った後、同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（２６０ｍＬ）にチャージし、０−０．３Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた。この活性画分に終濃度１Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加し、予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（１６０ｍＬ）にチャージし、１−０．２Ｍの硫酸アンモニウム直線濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた後、硫酸アンモニウムを６０％飽和になるまで添加し、遠心分離により、沈殿したタンパク質を集め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で溶解し、同緩衝液に対し透析を行った。本透析後の酵素液を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨＲ１６／６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（１２０ｍＬ）にチャージし、同緩衝液で溶出を行ったところ、分子量１１５０００Ｄａに相当する画分に、２８０ｎｍのタンパク吸収と活性が一致する溶出ピークを得た。得られた酵素液を未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、単一バンドを形成した。また、得られた酵素液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、分子量約６２０００Ｄａに単一のタンパクバンドを形成した。
【００２８】
（実施例２）
以下の方法に従って、アースロバクター・スピーシーズ  ＫＮＫ１５４より、グリコールアルデヒドを酸化しグリオキサールを生成する酸化酵素の精製を行った。
【００２９】
エチレングリコール１０ｇ、酵母エキス０．１ｇ、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）８ｇ、リン酸二水素カリウム３ｇ、リン酸水素二カリウム７ｇ（いずれも１Ｌあたり）の組成よりなる培地（ｐＨ７）を調製し、５Ｌジャーファーメンターに同培地を４Ｌ分抽し、高圧蒸気滅菌を行った（１２０℃、２０分）。
【００３０】
これらの培地に予め同培地で前培養しておいたアースロバクター・スピーシーズ  ＫＮＫ１５４の培養液を４０ｍＬを植菌し、３０℃、通気０．５ｖｖｍ、攪拌５００ｒｐｍで３日間培養を行う。本ジャーファーメンター培養を繰り返し３２Ｌの培養液を取得し、ついで得られた培養液３２Ｌから遠心分離により菌体を集め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）にて洗浄後、同緩衝液９３０ｍＬに懸濁した。得られた菌体懸濁液をダイノミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ社製）で破砕後、遠心分離により菌体残渣を除き、無細胞抽出液１６００ｍＬを得た。この無細胞抽出液に冷却したスターラーで攪拌しながら所定量の硫酸アンモニウムを添加し、硫酸アンモニウム濃度４０−６０％で沈殿するタンパク質を遠心分離により集めた。
【００３１】
得られたタンパク質を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で溶解し、同緩衝液に対し透析を行った後、同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（２６０ｍＬ）にチャージし、０−０．３Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた。この活性画分に終濃度１Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加し、予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（１６０ｍＬ）にチャージし、１−０．３Ｍの硫酸アンモニウム直線濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた。活性画分を限外ろ過により濃縮さらに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）にてブッファー交換を行った後、同緩衝液で予め平衡化したＲｅｓｏｕｃｅ  Ｑ（ Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（６ｍｌ）にチャージし、０−１．０Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出したところ、２８０ｎｍのタンパク吸収と活性が一致する溶出ピークを得た。得られた酵素液を未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、単一バンドを形成した。また、得られた酵素液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、分子量約４４０００Ｄａに単一のタンパクバンドを形成した。
【００３２】
（実施例３）
実施例１および２で得たＫＮＫ０５４株、ＫＮＫ１５４株由来の酵素の酵素化学的性質について検討した。
【００３３】
酵素活性の測定は基本的には１００ｍＭリン酸緩衝液またはトリス−塩酸緩衝液中、グリコールアルデヒドなどの基質  ２０ｍＭ、４−ＡＡ  ０．６７ｍＭ、ＴＯＯＳ  １．０９ｍＭ、ＰＯＤ  ５Ｕ／ｍＬ、および酵素液０．０５ｍＬを含む０．５ｍＬの反応液を３０℃で反応させ、波長５５５ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行った。
（基質特異性）
表２に示す化合物を基質として反応を行った結果、各酵素は表２に示すような基質特異性を示した。
（温度安定性）
各酵素を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）中、０−３０℃の範囲で３０分間処理した後、グリコールアルデヒドを基質として活性測定を行った。その結果を図１に示す。ＫＮＫ０５４株酵素は４０℃で処理前の９２％の活性が残存していた。ＫＮＫ１５４株酵素は３０℃で、処理前の８８％の活性が残存していた。
（分子量）
各酵素を１％の２−メルカプトエタノール存在下、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（７．５％）電気泳動に供し、標準タンパクとの移動度よりその分子量を推定した。その結果、ＫＮＫ０５４株およびＫＮＫ１５４株由来の酵素はそれぞれ６２０００Ｄａと４４０００Ｄａに相当するところに単一バンドを形成した。
【００３４】
（実施例４）
実施例１で得たＫＮＫ０５４株由来の精製酵素１Ｕ、１００ｍＭグリコールアルデヒド、カタラーゼ４０００Ｕを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）１ｍｌを試験管中、２０℃、５時間振盪反応を行い、得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析した。その結果、４０ｍＭのグリオキサールが生成していた。
【００３５】
（実施例５）
実施例２で得たＫＮＫ１５４株由来の精製酵素を用い実施例４と同様に反応を行った。その結果、３６ｍＭのグリオキサールが生成していた。
【００３６】
（実施例６）
ＫＮＫ０５４株を実施例１で示した培地で３０℃、３日間培養を行い、得られた培養液５５０ｍｌより遠心分離により菌体を集め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で洗浄後、同緩衝液３０ｍｌに懸濁した。試験管中で、本菌体懸濁液０．８ｍＬに１００００Ｕのカタラーゼと終濃度１００ｍＭになるようにグリコールアルデヒドを添加後、１００ｍＭリン酸緩衝液により反応液を１ｍＬに調製し、２８℃、２０時間の振とう反応を行った。その結果、４１ｍＭのグリオキサールが生成していた。
【００３７】
（実施例７）
ＫＮＫ１５４株を実施例１で示した培地で３０℃、３日間培養を行い、得られた培養液５５０ｍｌより遠心分離により菌体を集め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で洗浄後、同緩衝液３０ｍＬに懸濁した。本菌体懸濁液を用いて、実施例６と同様に反応を行った結果、３０ｍＭのグリオキサールが生成していた。
【００３８】
（実施例８）
実施例６で得た菌体懸濁液１８ｍｌをビート・ビーター（ＢＩＯＳＰＥＣ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ社製）で破砕後、遠心分離により菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得た。本無細胞抽出液０．６ｍｌに１００００Ｕのカタラーゼと終濃度１００ｍＭになるようにグリコールアルデヒドを添加後、１００ｍＭリン酸緩衝液により反応液を１ｍＬに調製し、２８℃、２０時間の振とう反応を行った。その結果、３０ｍＭのグリオキサールが生成していた。
【００３９】
（実施例９）
２Ｍエチレングリコール、１Ｕのピキア属（Pichia pastris）由来のアルコールオキシダーゼ（シグマ社製）、５０００Ｕのカタラーゼおよび０−０．４ＵのＫＮＫ０５４株由来の酵素を含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）０．５ｍｌを試験管中で２８℃、３時間、振とうしながら反応を行った。本反応によって生成したグリコールアルデヒドおよびグリオキサールの生成濃度を表３に示す。
【００４０】
【表３】
2005245236.tif 000004
（実施例１０）
２Ｍエチレングリコール、４Ｕのシグマ社製ピキア属（Pichia pastris）由来またはキャンジダ属（Candida boidinii）由来またはハンセヌラ属（Hansenula sp.）由来のアルコールオキシダーゼ、５０００Ｕのカタラーゼおよび０．４ＵのＫＮＫ０５４株由来の酵素を含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）０．５ｍＬを試験管中で２８℃、６時間、振とうしながら反応を行った。本反応によって生成したグリコールアルデヒドおよびグリオキサールの生成濃度を表４に示す。
【００４１】
【表４】
2005245236.tif 000005
（実施例１１）
２Ｍエチレングリコール、１Ｕのピキア属（Pichia pastris）由来のアルコールオキシダーゼ（シグマ社製）、５０００Ｕのカタラーゼおよび０．４ＵのＫＮＫ１５４株由来の酵素を含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）０．５ｍｌを試験管中で２８℃、３時間、振とうしながら反応を行った結果、２０ｍＭのグリコールアルデヒドおよび５０ｍＭのグリオキサールが生成していた。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、本願発明のＫＮＫ０５４株およびＫＮＫ１５４株由来酵素の温度安      定性を示す図である。●はＫＮＫ０５４株由来酵素の温度安定性○はＫＮＫ１５４株由来酵素の温度安定性を示す。
【図１】
2005245236.tif 000006