(57)【要約】【課題】  インスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合蛋白複合体の酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）の特徴付け。【解決手段】  XaaAspProGlyThrProGlyGluAlaGluGlyProAlaCysProAlaAlaCys−［XaaはGlyまたはAla］（配列番号：１）で表される部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有し、生物学的に純粋な形態のインスリン様成長因子結合蛋白複合体の酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列
XaaAspProGlyThrProGlyGluAlaGluGlyProAlaCysProAlaAlaCys−（配列番号：１）
[式中、該最初のアミノ酸ＸａａはＧｌｙまたはＡｌａであってよい] 
を有するインスリン様成長因子の酸不安定サブユニット(ＡＬＳ)の部分的なＮ末端アミノ酸配列をコードする配列を含む組換え核酸。
【請求項２】
請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含有する発現ベクター。
【請求項３】
請求の範囲第２項記載の発現ベクターで形質転換した原核生物または真核生物である宿主細胞。
【請求項４】
ｃＤＮＡである請求の範囲第１項記載の組換え核酸配列。
【請求項５】
請求の範囲第３項記載の宿主細胞によって生産された配列  XaaAspProGlyThrProGlyGluAlaGluGlyProAlaCysProAlaAlaCys−（配列番号：１） [式中、該最初のアミノ酸ＸａａはＧｌｙまたはＡｌａであってよい] 
を有するインスリン様成長因子の酸不安定サブユニット(ＡＬＳ)の部分的なＮ末端アミノ酸配列を含むポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、従来知られておらず、特徴付けされたことがないポリペプチド（以下、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合蛋白複合体の酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）という）に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）族のペプチド類は、その構造およびその多くの作用の双方においてインスリンに類似する。該ＩＧＦ族はＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ（ＩＧＦ類）と命名された２種のメンバーよりなる。該ＩＧＦ類は同化性インスリン様作用（例えばアミノ酸輸送およびグリコーゲン合成の刺激）、細胞分裂誘起活性および細胞分化の刺激を含めた生物学的活性の広範囲なスペクトルを呈する。
【０００３】
ヒトＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、広範に特徴付けがされており、ほぼ７．６Ｋｄ（ＩＧＦ−Ｉ）および７．４７Ｋｄ（ＩＧＦ−ＩＩ）の分子量を有することが判明している。
ほとんどのペプチドホルモン類と異なり、ＩＧＦ類は１種またはそれ以上の結合蛋白と連結して循環系(ｉｎ  ｖｉｖｏ)および細胞培養培地で見い出される。
ＩＧＦ類と連結した結合蛋白または結合蛋白類の性質は論争の主題であった。ウィルキンズ・ジェイ・ァールおよびデルコール・エイ・ジェイ（Wilkins, J.R. and D'Ercole, A.J.)は、（１９８５、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション(J. Clin. Invest., ７５, １３５０〜１３５８)、ＩＧＦのｉｎ ｖｉｖｏ形態は２４Ｋｄないし２８Ｋｄの分子量を有する６個の同一サブユニットと連結したＩＧＦよりなる複合体であることを提唱している。第２の提唱において、ＩＧＦのｉｎ ｖｉｖｏ形態は酸安定結合蛋白および酸不安定蛋白と連結してほぼ１５０Ｋｄの複合体を生成すると言われている（フルランネット・アール・ダブリュー（Furlanetto,R.W.）（１９８０）、ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム（J. Clin. Endocrinol. Metab.), ５１，１２〜１９）。
【０００４】
本発明者らは、以前、分子当たり単一のＩＧＦ−結合部位を有し、ＩＧＦの１５０Ｋｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ形態に免疫学に関連し、かつほぼ５３Ｋｄの見掛けの分子量を有する酸安定血清蛋白を同定した（バクスター・アール・シイおよびマーチン・ジェイ・エル（Baxter, R.C., and Martin, J. L.)(１９８６)、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J. Clin. Invest.），７８，１５０４〜１５１２；およびマーチン・ジェイ・エルおよびバクスター・アール・シイ（Martin, J. L. and Baxter, R.C.)(１９８６)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.)，２６１，８７５４〜８７６０）。この５３Ｋｄ  ＩＧＦ結合蛋白（ＢＰ５３）はフルラネット（Furlanetto）によって提唱されている酸安定結合蛋白に対応するらしい。該５３Ｋｄ蛋白は酸安定ＩＧＦ結合蛋白の族のうち最高の分子量のメンバーである。この族の他のメンバーはほぼ２０、３４、３６、３０および４７Ｋｄの分子量を有し、かつ集合的に「酸安定ＩＧＦ結合蛋白」の定義内に入る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、今回、酸不安定蛋白を同定したが、驚くべきことに、ＩＧＦによって占められた５３Ｋｄ酸安定蛋白と共にインキュベートした場合、それを１ＧＦのｉｎ ｖｉｖｏ形態に対応する高分子量複合体に変換する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の１の態様において、好ましくは、以下の部分的Ｎ−末端アミノ酸配列：
XaaAspProGlyThrProGlyGluAlaGluGlyProAlaCysProAlaAlaCys−（配列番号：１）
[式中、該最初のアミノ酸ＸａａはＧｌｙまたはＡｌａを意味する]
を有する、生物学的に純粋な形態のインスリン様成長因子結合蛋白複合体の酸不安定サブユニットが（ＡＬＳ）が提供される。
【０００７】
本発明のもう１つの態様において、実質的にインスリン様成長因子結合複合体の酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）よりなる組成物(Composition of matter)が提供される。
【０００８】
本発明のもう１つの態様において、３種のポリペプチド成分、即ちＩＧＦ、ＢＰ‐５３およびＡＬＳから復元した組成物が提供される。該組成物は１種またはそれ以上の医薬上許容される担体または添加剤と組み合わせて処方できる。
【０００９】
さらに、本発明のもう１つの態様において、
（ａ）酸不安定ＩＧＦ結合蛋白に結合したまたはそれと連結したＩＧＦを付着させて有する支持マトリックスにＡＬＳ源を適用し、それにより、適用された物質におけるＡＬＳは該酸安定結合蛋白に結合し、非結合物質は該支持マトリックスから分離され；次いで、
（ｂ）該ＡＬＳ蛋白を該ＩＧＦ蛋白複合体から選択的に溶出させ、回収する工程よりなることを持徴とするＡＬＳの製法が提供される。
【００１０】
好ましくは、ＡＬＳは、
（ａ）ＩＧＦを支持マトリックスに結合させ；
（ｂ）酸安定ＩＧＦ結合蛋白を支持マトリックスに、それがＩＧＦに結合しまたはＩＧＦと連結するように添加し；
（ｃ）ＡＬＳ源を支持マトリックスに適用し、それにより適用された物質におけるＡＬＳは酸安定蛋白に結合し、非結合物質は該支持マトリックスから分離され；
（ｄ）該ＡＬＳ蛋白を該ＩＧＦ蛋白複合体から選択的に溶出させ；次いで、
（ｅ）所望により、さらに、ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣによって回収されたＡＬＳを分画する工程よりなる。
【００１１】
本発明のさらなる態様により、体液をサイズ分画マトリックス上で分画して遊離ＡＬＳをインスリン成長因子結合複合体の他の成分から分離し、しかる後分画された試料中のＡＬＳのレベルを定量することを特徴とする体液中のＡＬＳレベルを検出する方法が提供される。
【００１２】
本発明のなおさらなる態様において、インスリン様成長因子の酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）をコード付けする組換え核酸配列が提供される。該組換え核酸配列は、好ましくは、以下の部分的Ｎ−末端アミノ酸配列：
XaaAspProGlyThrProGlyGluAlaGluGlyProAlaCysProAlaAlaCys−（配列番号：１）
[式中、最初のアミノ酸ＸａａはＧｌｙまたはＡｌａを意味する]
を有する、ポリペプチドをコード付けする。
また、本発明はＡＬＳをコード付けする組換え核酸配列を含有する発現ベクター、かかるベクターで形質転換した宿主細胞、およびかかる宿主細胞によって生産された場合のＡＬＳに関する。
【００１３】
本発明のさらにもう１つの態様において、ＡＬＳの断片よりなるポリペプチド、およびそれをコード付けする配列よりなる核酸を提供し、それらはＡＬＳの残基１〜５、２〜７、５〜９、７〜１１、８〜１４、１１〜１５、１３〜１７、３〜９、２〜８、４〜１０、６〜１２、８〜１４、１０〜１６、１２〜１８、１〜６、３〜９、５〜１１、７〜１３、９〜１５、１１〜１７、４〜９、６〜１１、８〜１３、１０〜１５、または１２〜１７を包含またはコード付けする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、従来知られておらず、特徴付けされたことがないインスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合蛋白複合体の酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）を同定し、それを該ＡＬＳＩＧＦによって占められた５３ｋｄ酸安定蛋白と共にインキュベートした場合、それをＩＧＦのin vivo 形態に対応する高分子複合体に変換することが分った。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、ＡＬＳ、ＩＧＦとその酸安定結合蛋白ＢＰ―５３の間の複合体に結合し、かつそれをｉｎ ｖｉｖｏで安定化するポリペプチド関する。
ＢＰ−５３は糖蛋白である。即ち、１種またはそれ以上の炭水化物鎖はＢＰ−５３ポリペプチド配列と連結する。酸安定ＩＧＦ結合蛋白またはＢＰ‐５３について言及する場合、インスリン様成長因子に結合でき、かつＡＬＳとＩＧＦとの複合体を形成できる酸安定蛋白をいうと理解されたい。該酸安定ＩＧＦ結合蛋白またはＢＰ−５３がこれらの機能を満足する限り、それはグリコシル化されていなくても、部分的にグリコシル化されているものであっても、アノ酸欠失または置換または挿入によって修飾されていてもよく、２０、３０、３４、３６、４７および５３Ｋｄの分子量を有し得る。この成分の正確な分子量は一般に重要ではない。
【００１６】
本発明により、本明細書に記載した方法を用いると、該ＡＬＳは生物学的に純粋である。生物学的に純粋とは、少なくとも６５重量％のＡＬＳ、好ましくは少なくとも７５％重量％のＡＬＳよりなる組成物を意味する。さらに好ましくは、該組成物は少なくとも８０％のＡＬＳよりなる。従って、該組成物は均質なＡＬＳを含有し得る。本明細書中では、「生物学的に純粋」なる語は「本質的にまたは実質的に純粋」と同一の意味を有する。
【００１７】
本発明が本質的にＡＬＳよりなる組成物(composition of matter)に関する場合、該組成物は広い文脈で理解されるべきである。該組成物はＡＬＳ自体、または１種またはそれ以上の医薬上または獣医学上許容される担体または添加剤と組み合わせたＡＬＳであってよい。適当な担体は水、グリセロール、スクロース、緩衝液またはアルブミン等のごとき他の蛋白を包含することができる。「本質的に〜よりなる」なる語句は前記「生物学的に純粋」と同一の意味である。
ＩＧＦに結合するとは、ＩＧＦが酸安定成分ＢＰ−５３に結合または連結する場合に形成される複合体に結合するＡＬＳの能力を意味する。
【００１８】
ＡＬＳは糖蛋白である。即ち、１種またはそれ以上の炭水化物鎖が該ＡＬＳポリペプチド配列と連結している。本発明は十分にグリコシル化され、部分的にグリコシル化され、または非グリコシル化形態のＡＬＳまで拡張され、それらは当該分野でよく知られた方法によって容易に調製することができる。例えば、本明細書中で開示する方法により調製したＡＬＳはエンドグリコシダーゼのごとき酵素と反応してＮ−結合炭水化物を部分的にまたは全部を除去することができる。Ｏ−結合炭水化物も当該分野でよく知られた方法によって同様に除去できる。
【００１９】
先に述べたように、ＡＬＳは、好ましくは、以下の部分的Ｎ−末端アミノ酸配列： 
XaaAspProGlyThrProGlyGluAlaGluGlyProAlaCysProAlaAlaCys−（配列番号：１）
[式中、最初のアミノ酸ＸａａはＧｌｙまたはＡｌａを意味する]
を有する。
しかしながら、本発明のＡＬＳは前記Ｎ−末端アミノ酸配列を占有することに限定されないと理解されるべきである。むしろ、ＡＬＳは、機能的に、ＩＧＦが前記定義の酸安定結合蛋白ＢＰ−５３に結合しまたはそれと連結できる場合に形成される複合体に結合または連結できる酸不安定ポリペプチドと定義される。該定義ＡＬＳは、当業者に容易に理解されるごとく、ＡＬＳの天然配列に対する合成または天然に生じるアミノ酸置換、欠失および／または挿入を含むまで拡張される。例えば、公知の技術を用い、遺伝子工学を容易に使用してアミノ酸置換、欠失および／または挿入することができる。
【００２０】
一般に、本発明を限定する意味ではないが、ＡＬＳは以下の点で特徴付けられる：
（ｉ）酸不安定である。即ち、４未満のｐＨで不安定である。
（ii）ＩＧＦによって占められる酸安定ＩＧＦ結合蛋白に対し結合する。
（iii）ＳＤＳ一ＰＡＧＥによって測定するとほぼ８０Ｋｄおよび１５Ｋｄの間の分子量を有する。
本明細書中でいうＡＬＳはヒトＡＬＳである。動物ＩＧＦとで複合体を形成できる動物ＡＬＳもまたＡＬＳなる語の範囲内に入ると理解されるべきである。
ＡＬＳはＩＧＦ、ＢＰ−５３およびＡＬＳよりなる生理学的ＩＧＦ複合体の調製で有用であると考えられる。かかる複合体は結合組織、皮膚および骨のごとき組織の再成長に関連する傷の治癒および関連治療に；ヒトおよび動物における身体の成長を促進するのに；および他の成長関連過程を刺激するのに有用である。また、該ＡＬＳ蛋白はＩＧＦのｉｎ ｖｉｖｏ半減期の顕著な増加を付与する。結合蛋白を伴わないＩＧＦの半減期自体は数分に過ぎない。ＩＧＦを酸安定ＩＧＦ結合蛋白、およびＡＬＳとの複合体の形態にすると、その半減期は数時間まで増大し、かくして、その付随する治療作用を有するＩＧＦの生物学的利用性を増大させる。さらに、純粋なＡＬＳは、ラジオイムノアッセイまたはＡＬＳについての他のアッセイを確立するために、特異的単クローンまたは多クローン抗体を生じさせるのに用いることができる。ヒト血清におけるＡＬＳの測定は成長障害を持つ患者の成長ホルモン状態を診断するのに有用であり得る。
【００２１】
各成分が好ましくは生物学的に純粋な形態であるＡＬＳ、ＩＧＦおよび酸安定蛋白ＢＰ−５３を混合することによって形成されるＩＧＦ結合蛋白複合体は適当な医薬上許容されるおよび／または治療的にまたは獣医学的に許容される担体と一緒に処方でき、例えば、ヒトおよび非ヒト動物における成長促進または傷の治療に使用できる。医薬上許容される担体の例は生理食塩水、血清アルブミン、または血漿調製物を包含する。意図した投与の態様に応じて、ＩＧＦ結合蛋白複合体の組成物は、例えば錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤等のごとき固体、半固体または液体の投与製剤の形態とできる。別法として、ＩＧＦ結合蛋白複合体は、長期間にわたる物質の放出用浸透圧ポンプのごとき徐放埋込剤に一体化できる。
治療目的でヒト患者または動物に投与するＩＧＦ結合蛋白複合体の量は治療されるべき個々の障害または病気、投与方法、および処方する医者または獣医の判断による。
【００２２】
ＡＬＳはヒト血清または血漿、またはコーン（Ｃｏｈｎ）画分ＩＶのごとき血漿画分から精製できる。全血清からの精製が好ましく、これは物質の最も経済的かつ豊富な源であって、最高の効率を与える。
ＡＬＳからの精製はＩＧＦ、ＢＰ−５３およびＡＬＳの間の生理学的相互作用を利用する。ＡＬＳは、それに結合または連結したＩＧＦ−ＢＰ−５３を有する支持マトリックスに血清を通すことによってヒト血清から回収される。連結とは静電的付着または疎水性相互作用のごとき非共有結合相互作用を意味する。次いで、ＡＬＳとアフィニティーマトリックスとの相互作用を破壊することによって、例えばイオン強度の増大（例えば、少なくとも０．３Ｍ ＮａＣｌ、または他の同等塩）またはアルカリ性ｐＨ（ｐＨ８を超える）の条件によってＩＧＦ−ＢＰ−５３アフィニティーマトリックスに結合したＡＬＳを溶出させることができる。
【００２３】
全血漿またはそのＣｏｈｎ画分IVのごときＡＬＳ源はイオン性樹脂で分画してアフィニティーマトリックスに適用する前にＡＬＳ量を富化することができる。カチオン交換樹脂が好ましい。所望により、アフィニティークロマトグラフィーによって精製したＡＬＳをＨＰＬＣまたはＦＰＬＣ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の商標）のごときさらなる精製工程に付すとができる。例えば、ＨＰＬＣ工程は逆相マトリックス、ゲルパーミエーションマトリックスまたはイオン性マトリックスを用いることによって行うことができる。
【００２４】
本発明がＡＬＳに結合することができる抗体に関する場合、該抗体は単クローン抗体または多クローン抗体であってよい。かかる抗体は血清中のＡＬＳレベルを測定するのに用いることができ、成長関連障害をテストするための診断キットの一部を形成できる。ＡＬＳに対する抗体は、常法（ゴウディング・ジェイ・ダブリュー（Goding, J. W.（１９８６）,単クローン抗体；原理および実践(Monoclonal Antibodies; Principles and Practices)，第２版、アカデミック・フ゜レス(Academic Press)により精製したＡＬＳで動物（例えば、マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、ウマ、ヒツジまたはヒトさえ）を免疫化することによって調製できる。例えば、血清蛋白を支持マトリックスに付着させ、ＡＬＳを検出するためのレポーター基(例えば、蛍光基、酵素またはコロイド状基)で標識できる抗−ＡＬＳ抗体と共にインキュベートできる。別法として、ＡＬＳに結合した非標識抵−ＡＬＳ抗体を（抗−ＡＬＳまたは抗−免疫グロブリン抗体に対し指向される抗体のごとき）適当な剤と反応させて抗体結合、かくして定量的ＡＬＳレベルを検出することができる。
【００２５】
本発明が組換え核酸分子に関する場合、該分子はここではＡＬＳまたはその一部をコード付けするＤＮＡまたはＲＮＡであると定義される。１の具体例において、組換え核酸分子は哺乳動物、好ましくはヒトＡＬＳをコード付けする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、あるいは塩基欠失、挿入または置換あるいはヌクレオチド配列または化学組成（例えばメチル化）に関する他の変更を含めたその部分である。本明細書中におけるｃＤＮＡによってコード付けされるＡＬＳとは、組換えＤＮＡをいう。
【００２６】
ＡＬＳをコード付けする核酸（ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ）と少なくとも６０％の配列相同性またはより好ましくは８０ないし９９％の相同性を示す、あるいはＡＬＳの生物学的活性を有する蛋白をコード付けする組換え核酸はＡＬＳをコード付けする核酸とみなされる。
【００２７】
組換えＡＬＳｃＤＮＡを得るにおいて有用と考えられる方法は、マニアティスら（Maniatis et al），１９８２、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning： A Laboratory Manual）、コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク、１〜５４５頁に含まれている。簡単に言えば、ポリアデニル化ｍＲＮＡを肝臓のごとき適当な細胞または組織源から得る。所望により、ｍＲＮＡをアガロースゲル、または密度勾配遠心で分画し、翻訳させ、例えば免疫沈降によってＡＬＳについて検定する。富化または非富化ｍＲＮＡをｃＤＮＡ合成の鋳型として使用する。ｃＤＮＡクローンのライブラリーは（ホモポリマーテイリング法を用い）ｐＢＲ３２２または他のベクターのごときベクターのＰｓｔＩ部位に構築し；あるいは（ＥｃｏＲＩリンカーのごとき）リンカーをｃＤＮＡ末端に結び、次いで該リンカーに相補的な部位を有するベクターにクローン化することによって構築される。次いで、ライブラリーにおけるベクター中の特異的ｃＤＮＡ分子を、ＡＬＳの前記Ｎ−末端アミノ酸に基づく特異的オリゴヌクレオチドを用いて選択する。別法として、商業的に入手可能なヒト・ラムダライブラリーをオリゴヌクレオチドでスクリーニングできる。別法アプローチにおいて、ラムダｇｔ１１のごとき発現ベクターにｃＤＮＡを挿入し、精製したＡＬＳに対し生じた特異性抗体と発現蛋白との反応に基づいて選択する。いずれにせよ、同定したならば、次いで、ＡＬＳのすべてまたは一部をコード付けするｃＤＮＡ分子を発現ベクターに結ぶ。さらに遺伝子操作をルーチン的に行って使用する特定の宿主におけるｃＤＮＡの発現を最大化することができる。
【００２８】
従って、ＡＬＳは、該ｃＤＮＡ配列を発現ベクターに挿入し、得られた組換え分子を適当な宿主に形質転換し、次いで、該分子の合成に必要な条件下で培養または増殖させることによってｉｎ ｖｉｖｏにて合成される。本明細書中で定義する組換え分子は、所望の宿主中で機能するプロモーターの下流に挿入された所望のポリペプチドをコード付けする核酸配列、真核生物または原核生物レプリコンおよび抗生物質に対する耐性のごとき適当な選択マーカーよりなるべきである。また、組換え分子は合成されたポリペプチドを細胞外環境に輸送するのを容易とするシグナル配列を必要とし得る。別法として、ポリペプチドは、超音波処理、圧力崩壊または洗剤処理のごとき種々の技術によってまず宿主細胞を溶解することによって回収できる。本発明で考えられる宿主は、原核生物（例えば、エシェリヒア・コリ  (Escherichia coli)、バチラス(Bacillus)種、シウドモナス（Pseudomonas）種）および真核生物（例えば、哺乳動物細胞、酵母および菌類培養、昆虫細胞および植物培養）よりなる群から選択できる。また、当業者ならば、所与のアミノ酸配列はヌクレオチドまたはトリプレットヌクレオチド（コドン）の欠失、置換および付加を受け得ることを認識するであろう。かかる変異はすべて本発明の範囲内にある。さらに、組換えＳＬＡを発現する宿主に応じ、該ＡＬＳはグリコシル化されていてよく、またされていなくてもよい。一般には、真核生物、例えば、哺乳動物細胞等は組換えＡＬＳをグリコシル化する。原核生物、例えばエシェリヒア・コリのごとき細菌は組換えＡＬＳをグリコシル化しない。グリコシル化または非グリコシル化ＡＬＳは前記したごとく本発明に含まれる。
【００２９】
省略法
ＩＧＦ−    インスリン様成長因子
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−  ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＫｄまたはＫ−  キロダルトン
ＧＨ−  成長ホルモン
【実施例】
【００３０】
以下の図面および実施例は本発明を説明するものであるが、本発明を限定するものではない。
【００３１】
実施例１
材料：
ＡＬＳ調製のために新鮮なヒト血清を実験室任意提供者から得た。コモンウェルス・セラム・ラボラトリーズ（Commonwealth Serum Laboratories)、メルボーン(Melbourne)、オーストラリア国によって提供されたヒト血漿のＣｏｈｎ画分ＩＶを出発材料として用いてヒトＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩならびにＩＧＦ−結合蛋白ＢＰ−５３を調製した。 ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０、ＳＰ−セファデックスＣ−２５、電気泳動標品、およびスーパーローズ１２ＨＲ１０／３０カラムはファルマシア（Pharmacia）、シドニーから；Affi-Gel 10およびAffi−Ge１ 15はバイオラド(Bio-Rad)から;およびPoly WAX LP（ポリエチレンイミン）アニオン交換ＨＰＬＣカラム（２００×４．６ｍｍ）はＰｏｌｙＬＣ、コロンビア、マディソン州から入手した。すべての他の試薬は少なくとも分析グレードであった。
【００３２】
ヒトＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを単離し、従前に記載されている（バキスター・アール・シイおよびデ・メロウ・ジェイ・エス・エム（Baxter,R.C.,and De Mellow,J.S.M.）、クリニカル・エンドクリノロジー（Clin.Endicrinol．）２４，２６７〜２７８；およびバキスター・アール・シイおよびブラウン・エイ・エス（Baxter,R.C and Brown, A.S.（１９８２）クリニカル・ケミストリー（Clin. Chem.）２８，４８５）ごとくにヨウ素化した。従前に記載されている（マーチン・ジェイ・エルおよびバクスター・アール・シイ（Martin,J.Ｌ., and Baxter,R.C.）（１９８６）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem)，２６１，８７５４〜８７６０）ごとくに５３Ｋ  ＩＧＦ−結合蛋白ＢＰ−５３をＣｏｈｎ画分IVから精製し、ジスクシンイミジル基質を用いて架橋させた［１２５ Ｉ 〕ＩＧＦ−Ｉを持つ共有結合複合体を訓製し、バキスター・アール・シイおよびマーチン・ジェイ・エル（Baxter,R.C. and Martin,J.Ｌ.）１９８６）ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション(J. Clin. Invest.), ７８，１５０４〜１５１２の方法に従ってゲルクロマトグラフィーによって精製した。２８Ｋ  ＩＧＦ−結合蛋白ＢＰ−２８は、バキスター・アール・シイ、マーチン・ジェイ・エルおよびウッド・エム・エイチ（Baxter,R.C., Martin,J.Ｌ. and Wood, M.H.）（１９８７）、ジャーナル・オブ・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム(J. Clin. Endocrinol. Metab)，６５,４２３〜４３１に従って、アフィニティークロマトグラフィーおよび逆相高圧液体クロマトグラフィーによってヒト羊水から精製した。
【００３３】
ＡＬＳヨウ素化およびラジオイムノアッセイ
［１２５Ｉ］−標識ＡＬＳは、５０μｌＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４中の５μｇＡＬＳを１ｍＣｉＮａ１２５Ｉおよび１０μｇクロルアミン−Ｔと２０秒間反応させ、次いで５０μｇメタ重亜硫酸ナトリウムで反応を停止させることによって調製した。ほぼ１００μｇの精製したＡＬＳの４用量で７週間にわたってウサギを免疫化することによってＡＬＳに対する抗血清を生じさせた。最終容量０．５ｍｌにおけるラジオイムノアッセイインキュベーションは１：５００００最終希釈の抗血清、［１２５Ｉ］−標識ＡＬＳ（試験管当たりほぼ１００００ｃｐｍ）、および０．５〜１００ｎｇ／試験管の範囲のＡＬＳを含有していた。２２℃における１６時間のインキュベーションの後、遠心し、続いてヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（２μｌ）、キャリア正常ウサギ血清（０．５μｌ）を添加し、３０分後、０．１５Ｍ ＮａＣｌ中の６％ポリエチレングリコール１ｍｌを添加することによって結合トレーサーおよび遊離トレーサーを分離した。
【００３４】
ＡＬＳについてのアッセイ
ＡＬＳの存在下でほぼ６０Ｋの共有結合ＢＰ−５３−ＩＧＦ−Ｉ複合体の１５０Ｋ形態への変換に基づき、ＡＬＳ活性についてのルーチンアッセイを行った。
ＡＬＳ活性についてテストすべき試料を、５０ミリモル／Ｌリン酸ナトリウム、０．１５モル／ＮａＣｌ、および０．２ｇ／Ｌアジ化ナトリウム、ｐＨ６．５をウシ・アルブミンと共に含有する緩衝液２００μＬ中に希釈した。架橋ＢＰ−５３−ＩＧＦ−Ｉトレーサー（〜８００００ｃｐｍ；４ｎｇ）を同緩衝液５０μＬ中に添加した。 ２２℃における２５〜３０分間のインキュベーションの後、Ｖ−７インジェクターバルブ（ファルマシア（Pharmacia））を用いて混合物２００μＬをスーパーローズ−１２ゲルパーミエーションカラムに適用し、無アルブミンアッセイ緩衝液中１．０ｍＬ／分（〜２メガパスカル圧力）で溶出した。主として画分２２〜２４に溶出し、画分２３にピークが出現するウサギ免疫グロブリンＧ（ペンテックス（Pentex）；〜１５０Ｋ））；主として画分２５〜２７に溶出し、画分２６にピークが出現するＢＰ−５３−ＩＧＦ−Ｉトレーサー（〜６０Ｋ）；ＢＰ一２８に結合したＩＧＦ−Ｉトレーサー（〜３５Ｋ、画分２８にピーク）；およびＩＧＦ−Ｉトレーサー（７．５Ｋ、画分３３にピーク）でカラムの検量線を作成した。１ｏｇ（分子量）対溶出容量をプロットし、これらの４種のマーカーより、直線状の検量線が得られた（図示せず）。ＡＬＳ活性の定量インデックス（即ち、ＢＰ−５３から１５０Ｋ複合体への変換度）として、画分２２〜２４における放射能活性を画分２５〜２７の放射能活性で除して１５０Ｋ／６０Ｋ比を得た。典型的には、この比の値は０．１と２．０の間で変動する。広範囲の値をカバーする８の複数測定値の変動分析に基づき、１５０Ｋ／６０Ｋ比の変動係数は３．２％であった。各クロマトグラフィー泳動は３０分を要し、かつアッセイの精度は高かったので、各決定は一般に各実験内単独で行った。
【００３５】
ＡＬＳの不存在下において、放射能活性は圧倒的に画分２５〜２７で見い出され、これは６０Ｋの分子量に対応し、典型的には０．１０またはそれ以下の１５０Ｋ／６０Ｋ比を与える。プレインキュベーションにおけるＡＬＳ濃度の増加は６０Ｋトレーサーの１５０Ｋ形態（画分２２〜２４）への変換の増大を引き起こし、１５０Ｋ／６０Ｋ比について高い値を与えた。純粋なＢＰ−５３と共にプレインキュベートしたが共有結合架橋しなかったＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両トレーサーもまたＡＬＳとのインキュベーションによって１５０Ｋに変換することができた。他のＩＧＦ酸安定結合蛋白は、（２０、２４、２６、３０および４７Ｋのもののごとき）小サイズのうちこの反応で対応する小さな複合体を形成する沈殿以外は、構造的にＢＰ−５３に関連するものであった。架橋したＢＰ−５３−ＩＧＦ−ＩＩトレーサーはテストしなかった。実施例２に従って製造した精製ＡＬＳ調製物を用いる用量依存性曲線は架橋ＢＰ−５３−ＩＧＦ−Ｉトレーサーを用いて作成した。高い再現性のあるシグモイド状半対数プロットが得られ、これは（例えば精製の間の）未知試料中のＡＬＳを定量するための標準曲線として用いることができた。ＡＬＳへ複合体化したトレーサーをスーパーローズ−１２カラム上で分画する代わりに抗ＡＬＳ抗血清と共にプレインキュベートすると、同様の結果が得られる。
【００３６】
実施例２
ＡＬＳの精製
新鮮なヒト血清またはヒト血漿のＣｏｈｎ因子IVペーストをＡＬＳ源として用いた。新鮮なヒト血清（１００〜１３０ｍｌ）を２℃にて、ｐＨ８．２の０．０５Ｍトリス−ＨＣｌの２×５０容量に対して透析し、次いで、２２℃で透析緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファデックスＡ−５０（５×２３ｃｍ）のカラムに負荷した。該カラムを透析緩衝液２リットル、次いで０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含有する同緩衝液２〜２．５リットルで洗浄した。この工程によりすべての免疫反応性ＢＰ−５３がカラムから除去された。１ｍｌ／分でポンプ送液する０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、０．６Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．２の１リットルを適用することによってＡＬＳを溶出させた。１０ｍｌずつの画分を収集し、ＡＬＳ活性および２８０ｎｍにおける吸収についてアッセイを行った。活性画分を合し（全量ほぼ１４０ｍｌ）、２℃にて、５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ６．５の５リットルに対して透析した。
【００３７】
Ｃｏｈｎ因子IVがＡＬＳ源である場合、凍結ペースト（６００ｇ）を粉砕して小片とし、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ８．２の３リットルと共に撹拌することによって２℃にて１６時間抽出した。混合物をSorvall RC5C遠心機のＧＳＡローター中、１２０００ｒｐｍで３０分間遠心し、濁った緑〜茶色の上澄み画分（２．８リットル）を得た。これを２の等容量に分け、抽出緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファデックスＡ−５０（５×２２ｃｍ）の２のカラムに重力供給によって負荷し、各カラムを緩衝液２リットルで洗浄した。この段階で、顕著な青〜緑色バンドがカラムの上半分に濃縮された。時々、洗浄工程の間にこのバンドはカラムを通って移動を開始し；これらの場合には、洗浄容量は１リットルに減少した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ８．２（合計２リットル容量）における直線状０．１５〜０．３５Ｍ  ＮａＣｌグラジエントによってＡＬＳをカラムから溶出させた。１０ｍｌずつの画分を収集し、ＡＬＳ活性および２８０ｎｍにおける吸収（またはビウレット法による蛋白）についてアッセイを行った。２の平行カラムからの活性画分を合し（合計ほぼ１リットル）、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５で２倍希釈し、ｐＨを１Ｍ ＨＣｌのゆっくりとした添加によって６．５に調整した。活性画分は溶出画分における青〜緑色蛋白に対応するので、イオン交換手法を通じての活性物の進行用の便利な肉眼で見えるマーカーがこれにより提供された。
【００３８】
前記にて詳細に記載したごとく血漿またはＣｏｈｎ因子IVから得られた画分を含有するＡＬＳを、（１）従前記載されている（マーチン・ジェイ・エルおよびバクスター・アール・シイ（Martin,J.Ｌ., and Baxter,R.C.）（１９８６）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem)，２６１，８７５４〜８７６０）ように３ｍｇＩＧＦ−ＩＩを正確にカップリングさせたAffi-Gel１５カラム（１×１２ｃｍ）、（２）同一手法によってほぼ５ｍｇＩＧＦ−Ｉおよび２ｍｇＩＧＦ−ＩＩを含有する混合物をカップリングさせたAffi-Gel１０カラム（１×１５ｃｍ）の２のＩＧＦアフィニティーカラムのうちいずれか一方に適用した。従前記載されている（マーチン・ジェイ・エルおよびバクスター・アール・シイ（Martin, J.Ｌ., and Baxter,R.C.）（１９８６）前掲）ごとくに正確に調製したＢＰ−５３を該アフィニティーカラムに負荷した。簡単に述べると、６００ｇＣｏｈｎペーストを２Ｍ酢酸、７５ｍＭ ＮａＣｌの５倍容量と共にホモジネートし、混合物を速心し、ｐＨ３．０のホモジネート緩衝液中で予め平衡化したＳＰ−セファデックスＣ−２５のほぼ４００ｍｌ充填容量と共に２〜３日間撹拌することによって内因性ＩＧＦを上澄みから欠乏させた。混合物を遠心してゲルを除去し、従前記載されている（マーチン・ジェイ・エル、およびバクスター・アール・シイ（Martin,J.Ｌ., and Baxter,R.C.）（１９８６）前掲）ごとくに上澄みを２工程でｐＨ６．５に調整した。次いで、該ｐＨ６．５上澄みをほぼ０．５ｍｌ／分でアフィニティーカラムにポンプで送液し、該カラムを５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５の２５０ｍｌ、および５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．５の１００ｍｌで１〜２ｍｌ／分で洗浄した。
【００３９】
ＤＥＡＥ−セファデックスクロマトグラフィーからのＡＬＳ含有画分を０．１〜０．１５ｍｌ／分でＢＰ−５３を負荷したＩＧＦアフィニティーカラムにポンプで送液した。典型的には、これにより、ＡＬＳ活性の９０％以上が保持される。該カラムを１ｍｌ／分にて５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５の１５０ｍｌ、および５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５の５０ｍｌで洗浄して該カラムの緩衝能力を低下させた。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５を０．５ｍｌ／分でカラムに適用することによってＡＬＳを溶出させた。これを第１図に示し、それは、ＡＬＳ（μｇ／ｍｌ）に対するアフィニティーカラムからの溶出容量および２８０ｎｍにおける吸収のプロットを示す。２ｍｌずつの画分をシリコン化ガス試験管に収集し、ＡＬＳ活性についてアッセイを行った。
還元雰囲気下、免疫精製したＡＬＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）により、分子量ほぼ９０Ｋの接近したバンドのダブレットが得られた。該ダブレットはＡＬＳのグリコシル化の変動によるものであろう。それ以外のバンドは存在せず、これによりＡＬＳは均質であることが示された。
【００４０】
任意の最終精製工程として、高効率アニオン交換クロマトグラフィーによってアフィニティー精製ＳＬＡを分画した。泳動当たり０．５ｍｌの試料負荷を、０．０５Ｍ炭酸水素アンモニウム中１．５ｍｌ／分で平衡化したＰｏ１ｙＷＡＸ高効率アニオン交換カラムに適用した（非調整ｐＨ＝７．８）。０．０５Ｍないし０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ調整）の直線状塩グラジエント（モデル６８０グラジエント・コントローラー、ウォーターズ（Waters）、ミルフォード(Milford)、マサチューセッツ州)を１．５ｍｌ／分で１５分間にわたって適用することによってＡＬＳを溶出させた。いくつかの調製において、同濃度範囲にわたって凹状グラジエントを用い（グラジエントＮｏ．７、モデル６８０グラジエント・コントローラー）、匹敵する結果が得られた。ウォーターズ（Waters）モデル４４１アブソーバンス・ディテクターを用いて２８０ｎｍにおける吸収をモニターした。０．７５ｍｌずつの画分を収集し、ＡＬＳ活性についてアッセイを行った。直線グラジエントを用い１．５ｍｌ／分の溶出９〜１０分後、または凹状グラジエントを用いる１１〜１２分後、単一の主要蛋白ピークがカラムから出現した。 ＲＩＡによって決定した検出可能なＡＬＳ活性のすべてはこのピークに関連しており、評価した適用活性の回収は７５％以上で、さらに特異的活性は１．６倍に増加していた。該ＡＬＳ活性は常に単一ピークに関連していた。
図２は、還元および非還元両条件下での直線１０〜１５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動させたＨＰＬＣ分画後の精製ＡＬＳを示す。調製物は、非還元（左パネル）または還元いずれかの条件下の見掛け分子量８４および８６ＫＤａのダブレットとして出現した。活性の実質的喪失をもたらした（１Ｍ酢酸２０μｌで０，０５Ｍ炭酸水素アンモニウム５０μｌ中のＡＬＳをｐＨ３に調整し、２２℃で１５分間インキュベートし、２Ｍトリス塩基１０μｌで中和することによって調製した）蛋白の酸性化は非還元または還元いずれかで泳動させた場合、ＤＳＤ−ＰＡＧＥ上の蛋白移動度に影響を与えなかった。しかしながら、Ｎ−グリカナーゼ（０．５％ＳＤＳ４０μｌ中で沸騰させ、次いで、０．５５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ８．６およびNonidetＰ−４０で各々０．２Ｍおよび１．２５％の最終濃度まで希釈し；次いで、Ｎ−グリカナーゼ（ゲンジーン・コーポレーション（Genzyme Corp.）, ボストン、マサチューセッツ州）を添加して最終濃度６０ユニット／ｍｌとした２５μｇＡＬＳ、および２７℃で１６時間インキュベートした混合物）でＮ−結合炭水化物を除去する処理により、見掛け分子量が８０ｋＤａの非還元（左側パネル）および６６ｋＤＡ（右側パネル）までかなり減少する。注目すべきは、該蛋白はＮ−グリカナーゼでの脱グリコシル化の後、単一のバンドとして移動し、これは、天然調製物に観察されるダブレットは少なくとも２のグリコシル化変異体によるものであることを示唆した。還元条件下、脱グリコシル化調製物は範囲５０〜６０ｋＤａにいくつかのバンドを示し、これは、さらに脱グリコシル化が可能なことを示唆する。
【００４１】
表１は典型的なＡＬＳ精製の結果をまとめ、同様なスケールで行い、同様の結果が得られたった４の試行のうちの１つである。０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、０．６Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．２によってＤＥＡＥ−セファデックスカラムから溶出させた画分（ＤＥＡＥ溶出物Ｎｏ２）は、適用したＡＬＳ免疫活性の６０％および合計蛋白の１３％を超えて含有し、一方、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝液で溶出させた画分（ＤＥΛＥ溶出物Ｎｏ１）は、ＡＬＳ活性の１５％しか含有しなかったが、蛋白の７９％を含有していた。アガロース−ＩＧＦに共有結合していないＢＰ−５３のカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによるＤＥＡＥ溶出物Ｎｏ２画分のさらなる精製により、２００倍に増大したＡＬＳ特異的活性が得られた。
【００４２】
使用した精製戦略は、サブユニットは低ｐＨで不可逆的に不活性化されるという事実が余儀ないが、高ｐＨでは可逆的にＢＰ−ＵＧＦ複合体から解離するという事実の利点がある。精製におけるポイントとなる工程は、アフィニティークロマトグラフィーの通常でない適用であり、そこでは、アフィニティーリガンド（ＢＰ―５３）は共有結合によってアガロースマトリックスに結合しないが、アガロース−ＩＧＦビーズとＡＬＳの間の非共有結合架橋として作用するらしい。惟うに、ＢＰ−５３非占有ＩＧＦ−Ｉ またはＩＧＦ−ＩＩはＡＬＳを結合させ得ないので、共有結合アガロース−ＢＰ―５３マトリックスの使用は働かなかったことが明瞭である。任意の最終工程、塩グラジエント溶出でのＰｏ１ｙＷＡＸ(弱アニオン交換）カラム上の高効率クロマトグラフィーは、高分解能以外では、実質的にＤＥＡＥ−セファデックスクロマトグフィーの最初の工程を繰り返す。
【００４３】
実施例３
ＡＬＳのアミノ末端配列
標準的なＰＴＨプログラムを用い、１２０Ａ  ＰＴＨアナライザーにカップリングしたアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）４７０Ａ自動気相蛋白シーケンサーを用いて、エドマン分解により、ＡＬＳのＮ−末端配列をＨＰＬＣ精製物質の３５μｌ試料で決定した。メルカプトエタノールでの還元およびヨード酢酸でのカルボキシメチル化の後、Ｃｙｓ残基は第２の試料で確認された。
【００４４】
２の決定において、アミノ末端分析は、分析した調製物は単一提供者の血清からのものであったという事実に拘わらず、第１残基についてほぼ等モル量のＧｌｙおよびＡｌａを示した。最初の１８残基の分析により、配列 Ｇｌｙ（Ａｌａ）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−（配列番号：１）が得られ、１４および１８位における該Ｃｙｓ残基は還元されかつカルボキシメチル化された試料で確認された。このアミノ酸配列は他のＩＧＦ蛋白またはレセプターに対し明白な相同性を示さなかった。
【００４５】
実施例４
血清のＤＥＡＥ−セファデックス分画
出発物質は、従前に公表されているテーブル（グリーン・エイ・エイおよびフゲス・ダブリュー−エル（Green,A.A.,and Hughes, W.L．）、メソッズ・オブ・エンザイモロジー（Methods of Emzymol.），１．６７に従って調製した３０〜５０％飽和からの血清の硫酸アンモニウム画分であった。過剰の５０ミリモル／Ｌトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．２に対して透析し得られた沈殿は全血清のほぼ７５％のＢＰ−５３免疫反応性を含有していた。続いての実験において、硫酸アンモニウム画分は不必要であることが判明し、トリスーＨＣｌ緩衝液に対して透析した全血清を用いた。５０ミリモル／Ｌトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．２で平衡化したＤＥＡＥ―セファデックスＡ−５０の１×１７．５ｃｍカラムに１ｍＬ透析試料を負荷し、３５ｍＬ出発緩衝液、５０ｍＬ出発緩衝液＋０．１５モル／Ｌ  ＮａＣｌ、および５０ｍＬ出発緩衝液＋０．６モル／Ｌ  ＮａＣｌで溶出した。大規模のプロトコルにおいて、１０ｍＬ透析試料を１．５×２０ｃｍカラムに負荷し、各々３種の緩衝液５０、１００および１００ｍＬで溶出させた。 ０．１５モル／Ｌ  ＮａＣｌの存在下で溶出させた主要蛋白ピークをピークＡ、０．６モル／Ｌ  ＮａＣｌに出現したピークをピークＢと命名した（図３）。
【００４６】
大部分の免疫反応性ＢＰ−５３が最初のピーク（ピークＡ）に見い出され、一方、第２のピーク（ピークＢ）はＡＬＳ活性を含有していたが、ＢＰ−５３免疫反応はほとんど含有していなかった（図３ボトム）。少量のＡＬＳ活性はピークＡの下降側に対応する画分に検出された（図示せず）。同様の結果が６の別々の実験で得られた。
【００４７】
３の同様の実験の代表である図４は、スーパーローズ−１２クロマトグラフィーによって分画した場合、別々のおよび一緒にしたプレインキュベーションの後、これらの蛋白ピークについてのＢＰ−５３免疫反応性プロフィールを示す。ピークＡからのＢＰ−５３免疫反応性物は、分子量範囲ほぼ３０〜６０Ｋに対応する画分２５と３０の間のブロードなピークにて最初に溶出し、１５０Ｋに対応する画分２２〜２４の小さなピートが出現した（図４）。ピークＢからなんとか検出できるＢＰ−５３活性はスーパーローズ−１２からほとんど画分２３〜２５で溶出した（図４ｂ）。ピークＡおよびＢを混合し、２２℃で６０分間プレインキュベートした後、５０％を越えるピークＡ  ＢＰ−５３活性が３０〜６０Ｋから１５０Ｋにシフトし、３０〜６０Ｋになお残存する（図４ｃ）。これは、９０％以上の活性が１５０Ｋにおけるものであって５〜１０％のみが３０〜６０Ｋ領域におけるものである全血清におけるＢＰ−５３プロフィールと比較することができる（図４ｄ）。図４ｃで示したごとく、ピークＢのＡＬＳ活性は、ＮａＣｌを含まないまたは０．６モル／Ｌ  ＮａＣｌを含むトリス緩衝液に対するピークＢ画分の透析によって影響されず、高塩またはいずれの他の透折可能分子もピークＢではＢＰ−５３とＡＬＳとの間の反応に関与しないことが示される。
【００４８】
血清のスーパーローズ１２画分
常健被験者からの血清を５０ミリモル／Ｌリン酸ナトリウム、０．１５モル／Ｌ  ＮａＣl、および０．２ｇ／Ｌアジ化ナトリウム、ｐＨ６．５で１:１希釈し、２００μＬをスーパーローズ−１２カラムに適用し、ルーチンＡＬＳアッセイについて記載されたごとくに溶出させた。次いで、各画分をＢＰ−５３およびＡＬＳ活性についてテストを行った。
【００４９】
図４ｄに示したごとく、ＢＰ−５３免疫反応性は１５０Ｋに対応する画分２３にピークを持つ（図５）。対照的に、３の実験において、ピークＡＬＳ活性は９０〜１１０Ｋに対応する画分２４（図５）に再現性よく溶出し、血清にはＢＰ−５３を越える過剰のＡＬＳがあること、および遊離サブユニットは９０〜１１０Ｋの見掛け分子量を有することが示唆される。ＡＬＳ活性の同様のピークが、９９％を超える免疫反応性ＢＰ−５３（即ち、実質的にすべての１５０Ｋ複合体）がアガロースにカップリングした抗−ＢＰ−５３抗体のカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによって除去された血清に見い出され（図示せず）、９０〜１１０Ｋにて検出可能なＡＬＳはＢＰ−５３に複合体化しなかったことが確認された。血清を第３に示すごとくにイオン交換クロマトグラフィーによって分画し、ピークＢをスーパーローズ−１２クロマトグラフィーに忖した場合に匹敵する結果が得られた。
【００５０】
ルーチンＡＬＳァッセイでテストした場合、血清容量の増加は、１５０Ｋ／６０Ｋ比における用量依存性増加を与えた（図示せず）。高活性が５人の末端肥大被験者からの血清に見い出され、かつ５人のＧＨ−欠損被験者からの血清における活性が常健者からの試料で検出可能なものよりも低いので、全血清における検出可能ＡＬＳはＧＨ依存性のようである。このＧＨ依存性は血清におけるＧＨレベルを測定する診断アッセイについての基礎を与え、例えばＡＬＳに対して指向される抗体を用いる成長障害の診断で利用できるであろう。
【００５１】
実施例５
ＡＬＳの酸不安定性
(実施例２の手法による）全血清における精製ＡＬＳまたはＡＬＳの酸不安定性は低ＰＨへの暴露による不可逆的不活性化により明らかであった。蛋白は５もの低いｐＨ値でかなり安定に見えたが、これより下がると、急速に活性を失い（図７）；１５０Ｋ／６０Ｋ比はｐＨ３で８０％以上減少する。１５０Ｋ／６０Ｋ比におけるこの減少は９９％以上の見掛けＡＬＳ活性の減少と同等である。対照的に、高ｐＨ値（ｐＨ１０まで）での暴露は全血清または精製調製物におけるＡＬＳ活性に影響を与えなかった。
【００５２】
実施例６
機能についての実験
ＢＰ−５３へのＡＬＳの結合動力学を測定するために、［１２５Ｉ］−標識ＡＬＳおよび種々の濃度のＢＰ−５３ならびにＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを含有するインキュベーションを設定した。遊離および複合体化形態双方においてＢＰと反応することが予め示されているＢＰ−５３に対する抗血清を用い、ＡＬＳトレーサーのＢＰ−５３との複合体を免疫沈降の後に検出した（バキスサー・アール・シイおよびマーチン・ジェイ・エル（Baxter,R.C. and Martin,J.Ｌ.）（１９８６）ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション(J. Clin. Invest.), ７８，１５０４〜１５１２)。図７（左）は０．２５ないし１００ｎｇ／試験管（０．０１６ないし６．５ｎＭ）の範囲にわたるＢＰ−５３濃度増加が複合体形成に与える影響を示す。ＩＧＦ―ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの不存在下で、ＡＬＳトレーサーとＢＰ−５３の間で反応はほとんどないか、または全然なかった。モル過剰のＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ（５０ｎｇ／試験管または２２ｎＭ）の存在下、ＡＬＳトレーサー結合における用量依存性増加が観察され、１００ｎｇ／試験管のＢＰ−５３に対する５０％特異的結合まで増加した。高濃度のＢＰ−５３は免疫沈降系の制限のためテストできなかった。複合体形成はＩＧＦ−ＩＩよりもＩＧＦ−Ｉの存在下で終始高かった。
【００５３】
ＡＬＳとＢＰ−ＩＧＦ複合体の間での結合アフィニティーは競合結合実験から評価した。図７（右）における典型的実験で示したごとく、［１２５Ｉ］標識ＡＬＳの結合はＩＧＦ−ＩＩよりもＩＧＦ−Ｉの存在下で再度高かった。３つの同様の実験において、１０ｎｇ／試験管ＢＰ−５３に対する平均特異的結合（±標準偏差）(即ち、ＢＰ−５３の存在下で沈殿した放射能活性について補正したもの）は過剰のＩＧＦ−Ｉの存在下で２４．３±４．４％、過剰のＩＧＦ−ＩＩの存在下では１９．６±３．９％（ペアのｔ−テストによりＰ＝０．００９）であった。非標識ＡＬＳの濃度増加は、［１２５Ｉ］−標識ＡＬＳの免疫沈降可能複合体からの用量依存性置き換えを引き起こした。スカチャード（Scatchard）プロットによる結合データの解析は、非特異的結合成分（解離定数＜１０６Ｍ−１）およびＢＰ−ＩＧＦ−ＩＩよりもＢＰ−ＩＧＦ−Ｉについてのわずかに高いアフィニティーをもつ単一の特異的結合成分を明らかとした。３の同様の実験において、ＢＰ−ＩＧＦ−Ｉに対するＡＬＳ結合についての平均解離定数（±標準偏差）は６．０６±０．７１×１０８Ｍ−１、ＢＰ−ＩＧＦ−ＩＩに対するＡＬＳ結合については４．１２±０．２９×１０８Ｍ−１であった。結合部位濃度はＩＧＦ−Ｉの存在下で１．２８±０．４６モルＡＬＳ／モルＢＰ−５３、ＩＧＥ−ＩＩの存在下で．１．１８±０．２９モル／モルであり、ＡＬＳおよびＢＰ−５３の分子量は各々８６ｋＤａおよび５３ｋＤａであることが推定された。計算をＢＰ−５６３についての４３ｋＤａの減少した分子量に基づけば、結合部位濃度は各々１．０４±０．３７モル／モルおよび０．９６±モル／モルである。この結果はＢＰ−５３の分子当たりのＡＬＳについての単一の結合部泣に合致する。
【００５４】
ＢＰ−５３とＩＧＦとの間の相互作用に与えるＡＬＳ影響の欠落は図８に示す。［１２５ Ｉ ］−標識ＩＧＦ−ＩＩは、［１２５ Ｉ ］−標識ＩＧＦ−Ｉよりも、増大した濃度のＢＰ−５３に対する高い結合を終始示す。いずれかのトレーサーの結合は、試験管当たり１００ｎｇの純粋なＡＬＳの添加によって影響されなかった（図８、左）。非標識ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの濃度を増加させることによってＢＰ−５３から［１２５ Ｉ ］−標識ＩＧＦ−ＩＩに置き換えた競合結合曲線を図８（右）に示す。ＢＰ−５３からトレーサーを置き換えるにおいて、ＩＧＦ−ＩＩはＩＧＦ−Ｉよりも矛盾なく優れており、置き換え曲線はいずれも１００ｎｇ／試験管のＡＬＳの添加によって影響を受けなかった。［１２５ Ｉ ］−標識ＩＧＦ−Ｉをトレーサーとして用いた場合、同様の結果が観察された（図示せず）。
【００５５】
純粋なＡＬＳはＢＰ−５３を１５０ｋＤａ形態に変換できることを確認するために、図８に示した競合結合実験で用いたものと同様なインキュベーション混合物をスーパーローズ１２上のゲルクロマトグラフィーに付した。
［１２５ Ｉ ］−標識ＩＧＦ−ＩＩは放射能活性の単一ピークのように見え、画分３４にピークが出現する。分画前におけるこのトレーサーと純粋ＡＬＳ（１００ｎｇ／２００μｌ）とのインキュベーションは放射能活性プロフィールに影響を与えず、ＡＬＳ単独ではＩＧＦ−ＩＩトレーサー（図９、左）を結合させることができないことが示される。Ｉｎｇ／２００μｌ純粋ＢＰ−５３とのＩＧＦ−ＩＩトレーサーのインキュベーションの結果、放射能活性の７０％が６０ｋＤａ形態に、即ちＢＰ―５３−ＩＧＦ−Ｉに変換される。このインキュベーションが１００ｎｇ／２００μｌ純粋ＡＬＳも包含する場合、６０ｋＤａ複合体は実質的に１５０ｋＤａ形態に変換され（図４、右）、複合体形成には純粋ＩＧＦ、純粋ＢＰ−５３、および純粋ＡＬＳ以外の成分は必要でないことが示される。
【００５６】
実施例７
ＢＰ−５３−ＩＧＦ−ＩへのＡＬＳ結合の抑制
ＡＬＳに結合するトレーサーＢＰ−５３−ＩＧＦ−Ｉを抑制するその能力について種々の物質をテストした。酸性化し、再中和してその内因性ＡＬＳ活性を破壊し、その酸安定ＢＰ―５３を無疵で遊離した場合、ヒト血清は優れた競合活性を含有していた。正常、末端肥大、およびＧＨ−依存性被験者からの試料を３の別々の実験でこのように比較すると、競合活性は、かかる試料において内因性ＢＰ−５３について予測されるごとく、強力なＧＨ−依存性を示した。これを図１０ａにかかる実験について説明する。図８ａの曲線を各試料の免疫反応性ＢＰ−５３含量項にて再度プロットすると、それらは、重ねることが可能となり（図１０ｂ）、酸性化全血清における内因性ＢＰ―５３はＡＬＳ反応において架橋トレーサーと競合できることを示す。本アッセイで使用した条件下、ほぼ１μｇＢＰ−５３／ｍＬ反応容積（即ち、２５０ｎｇ／２５０μＬ）はＢＰ−ＡＬＳ複合体から架橋トレーサーを十分に置き換え、２００〜２５０ｎｇ／ｍＬＢＰ−５３で半最大置換された。
【００５７】
酸性化血清における内囚性ＢＰ−５３とは対照的に、０．８μｇ／ｍＬまでテストした場合、純粋なＢＰ−５３はＡＬＳ反応で架橋トレーサーと競合できなかった(図１１)。しかしながら、３．５倍モル過剰の純粋なヒトＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ（即ち、５００ｎｇ  ＩＧＦ／μｇＢＰ−５３）での２２℃における３０分間のプレインキュベーションの後、精製したＢＰ−５３は架橋トレーサーをＢＰ−５３―ＡＬＳ複合体からを十分に置き換えた。以下の；粋な羊水ＢＰ−２８（０．８μｇ／ｍＬ）、過剰のＩＧＦ―ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ（０．５μｇ／ｍＬ）でプレインキュベートしたＢＰ−２８、またはヒトＧＨ（２０μｇ／ｍＬ）もテストし、ＡＬＳ反応において競合しないことが判明した。これらの実験は、再度、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩで占められたＢＰ−５３のみがＡＬＳとの反応に参画できることを示し、占有されているか否かに拘わらず、ＢＰ−２８はＡＬＳと反応できないことを示唆する。
これまでに言及した科学文献はその全体を本明細書中にて一体化する。
請求の範囲は記載の一部を形成する。
【００５８】
第１表  ヒト血清からの酸不安定サブユニットの精製
精製工程は実施例２に記載した通り。ラジオイムノアッセイによって測定したＡＬＳは純粋な標品調製項にて表す。ＤＥＡＥ溶出物Ｎｏ１とは０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する緩衝液によるＤＥＡＥ―セファデックスから溶出した画分のプールをいう。ＤＥＡＥ溶出物Ｎｏ２とは０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝液により溶出した画分のプールをいい；このプールはアッセイ前に透析した。アフィニティー溶出物はアフィニティーカラムから溶出し、次いで限外濾過によって濃縮した画分のプールである。ＨＰＬＣプールはＨＰＬＣ工程から回収した活性画分のプールである。
【００５９】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ＡＬＳのアフィニティークロマトグラフィー。ＤＥＡＥ−セファデックスクロマトグラフィーによって不完全精製した画分のプール１３２ｍｌを、アガロースによって共有結合したＩＧＥ―ＩおよびびＩＧＥ−ＩＩの混合物を含有し、ＢＰ−５３を非共有結合的に吸着した１×１５ｃｍのアフィニティーカラムに０．１３ｍｌ／分で負荷した。該カラムを５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ６．５（洗浄Ｎｏｌ）１５０ｍｌおよび５ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ（洗浄Ｎｏ２）５０ｍｌで１ｍｌ／分にて洗浄した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０，３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５を０．５ｍｌ／分で適用することによって溶出させた。
【図２】精製したＡＬＳのＳＤＳ‐ポリアクリルアミド電気泳動  左側パネル：未処理、酸性化、およびＮ−グリカナーゼ処理試料（１５μｇ／レーン）を非還元状態で泳動させた。  右側パネル：同一試料を還元雰囲気下で逆の順序で泳動させた。ゲルをコーマシーブルーで染色した。還元ゲルについての右側レーンに示す標品蛋白の（ｋＤａ単位の）分子量もまた非還元ゲルで泳動させた標品について矢印で示す。
【図３】図３はＤＥＡＥ−セファデックス  Ａ−５０のカラムでのヒト血清の分画を示す。１リットルの透析血清を１×１７．５ｃｍゲルベッドに負荷し、該カラムを３５ｍＭ  ０．０５モルの／Ｌのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．２で洗浄し、０．１５モル／Ｌ  ＮａＣｌを含有する同一緩衝液５０ｍＬで溶出を開始する。次いで、０．６モル／Ｌ  ＮａＣｌを含有する同一緩衝液で溶出を継続する。１ｍＬずつの画分を収集し、２８０ｎｍにおける吸収について検定し、ＢＰ−５３はＲＩＡによる。 ＡＬＳをルーチンアッセイ法によってピークＢ画分の２０μＬ分で測定した。
【図４】図４はＤＥＡＥ−セファデックス分画血清からの１５０Ｋ複合体の生成を示す。図３に示すごとく、ピークＡおよびＢプールは、１０ｍＬ血清のＤＥＡＥ−セファデックスクロマトグラフィーによって調製し、次いで、スーパーローズ−１２クロマトグラフィーによって分画した。各々２００μＬの容量で注入した試料はピークＡ（ａ：１００μＬ）、ピークＢ（ｂ：１００μＬ）、混合し、負荷前に２２℃で１時間インキュベートしたピークＡおよびＢ（ｃ：各１００μｌ）、および全血清（ｄ：３３μＬ）であった。ＢＰ―５３免疫反応性を各０．５ｍＬ画分５０μＬで測定した。矢印は１５０Ｋ、６０Ｋおよび３５Ｋマーカーを示す。
【図５】図５はスーパーローズ−１２で分画した血清で示したごとく、ＢＰ−５３免疫反応性およびＡＬＳ活性の比較を示す。各画分は０．５ｍＬであった。矢印は１５０Ｋ、６０Ｋおよび３５Ｋマーカーを示す。ＡＬＳ蛋白を検出するのに用いた方法は１５０Ｋ複合体として存在しない蛋白のみを検出することに注意されたい。
【図６】図６はＡＬＳ活性の酸不安定性を示す。通常血清（ａ）または不完全精製ＡＬＳ（ｂ）をＡＬＳアッセイ緩衝液に希釈し、１モル／Ｌ  ＨＣｌまたはＮａＯＨで示したｐＨ値に調整した。２２℃での３０分後、試料を再度中和し、ルーチンアッセイ（１０μＬ血清または６００ｎｇＡＬＳ調製／インキュベーション)におけるＡＬＳ活性について検定した。
【図７】図７はＩＧＦ類がＡＬＳのＢＰ−５３への結合に与える影響を示す。左側パネル：ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ（５０ｎｇ／試験管）の存在下または不存在下において、［１２５Ｉ］−標識ＡＬＳトレーサーと共に３００μｌ反応容量にて、濃度を増加させてＢＰ−５３をインキュベートした。右側パネル：１０ｎｇＢＰ−５３＋１０ｎｇＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを、ＡＬＳトレーサーと共に、非標識ＡＬＳの濃度を増加させて、３００μｌ中でインキュベートした競合結合実験。 ＢＰ−５３に結合したトレーサーを抗−ＢＰ−５３抗血清Ｒ−７で免疫沈降させた。
【図８】図８はＡＬＳがＩＧＦのＢＰ−５３への結合に対する影響を示す。左側パネル：示すごとく、ＡＬＳ（５００ｎｇ／試験管）の不存在または存在下、［１２５Ｉ］−標識ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩトレーサー（ＩＧＦ−Ｉ＊またはＩＧＦ−ＩＩ＊）と共に、ＢＰ−５３の濃度を増加させて３００μｌの反応容量中でインキュベートした。１００ｎｇＡＬＳの存在下または不存在にて、０．２５ｎｇ  ＢＰ−５３をＩＧＦ−ＩＩトレーサーおよび増加させる濃度の非標識ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩと共に３００μｌ中でインキュベートした競合結合実験。ＢＰ−５３に結合したトレーサーを抗ＢＰ−５３抗血清Ｒ−７で免疫沈降させた。
【図９】図９はＢＰ−５３およびＡＬＳが［１２５Ｉ］−標識ＩＧＦ−ＩＩトレーサーのクロマトグラフィー像に与える影響を示す。ＢＰ−５３（１ｎｇ／２００μｌ）またはＡＬＳ（１００ｎｇ／２００μｌ）の存在下または不存在下にて、２２℃で２時間予めインキュベートした、５００００ｃｐｍＩＧＦ−ＩＩトレーサーを含有する２００μｌ試料を、５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２％アジ化ナトリウム、０．１％ウシ・アルブミン、ｐＨ６．５にてのスーパーローズ−１２高効率クロマトグラフィーカラム上のクロマトグラフィーに付した。０．５ｍｌずつの画分を１ｍｌ／分で収集し、各画分の放射能活性を測定した。各パネルで、左から右への３つの矢印は１５０ｋＤａ、６０ｋＤａおよび７．５ｋＤａの分子量マーカーを示す。左側パネル：実線標識、ＩＧＦ−ＩＩトレーサー；開いた標識、トレーサー＋ＡＬＳ。右側パネル：実線標識、トレーサー＋ＢＰ−５３：開いた標識、トレーサー＋ＢＰ−５３＋ＡＬＳ。
【図１０】図１０は、ルーチンＡＬＳアッセイにおける正常な、下垂体機能低下または先端肥大症の被験者からの酸性化〜中性化ヒト血清の濃度を増加させることによる競合を示し、そこでは、不完全精製ＡＬＳ／２５０μＬインキュベーション培地の６００ｎｇ（即ち、２．４μｇ／ｍＬ）が添加血清の不存在下でほぼ１の１５０Ｋ／６０Ｋ比を与えた。血清濃度は容量項（ａ）または免疫活性ＢＰ−５３含量項（ｂ）により表される。説明した酸性化〜中性化血清試料は、ＲＩＡによると４．４９μｇ／ｍＬ（正常）、０．９３μｇ／ｍＬ（下垂体機能低下）、または１ ０．４９μｇ／ｍＬ（先端肥大症）ＢＰ―５３を含有していた。
【図１１】図１１はルーチンＡＬＳアッセイにおける純粋なＢＰ−５３による競合、（ａ）ＩＧＦ類なくして、または３．５倍モル過剰の純粋なヒトＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩと共に行った行ったプレインキュベーションの後のＢＰ−５３濃度の増加の効果を示す。パネル（ｂ）は濃度を増大させたＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩと共にインキュベートする固定したＢＰ−５３濃度（０．８μｇ／ｍＬ）の効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年2月4日(2005.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、酸安定ＩＧＦ結合蛋白（ＢＰ５３）およびインスリン様成長因子結合蛋白複合体の酸不安定サブユニット(ＡＬＳ)より実質的になり、
該ＡＬＳが、以下の部分的末端アミノ酸配列：
XaaAspProGlyThrProGlyGluAlaGluGlyProAlaCysProAlaAlaCys−
[式中、XaaはGlyまたはAlaを表す]
を得るために必要な程度まで精製されることを特徴とする組成物。
【請求項２】
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、酸安定ＩＧＦ結合蛋白（ＢＰ５３）、インスリン様成長因子結合蛋白複合体の酸不安定サブユニット(ＡＬＳ)および医薬上または獣医学上許容される担体もしくは添加剤より実質的になり、
該ＡＬＳが、以下の部分的末端アミノ酸配列：
XaaAspProGlyThrProGlyGluAlaGluGlyProAlaCysProAlaAlaCys−
[式中、XaaはGlyまたはAlaを表す]
を得るために必要な程度まで精製されることを特徴とする該組成物。
【請求項３】
該ＩＧＦがＩＧＦ−１である請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
該ＡＬＳが、非複合体形成ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２またはＢＰ５３に結合するその無能力により特徴付けられる請求項１または２記載の組成物。
【請求項５】
該ＩＧＦ、ＢＰ５３およびＡＬＳが複合体を形成し、該複合体における該ＩＧＦの半減期がＩＧＦ自体の半減期よりも大きい請求項１または２記載の組成物。