(57)【要約】【課題】食品等に含まれるタウマチンを高感度かつ簡便に分析できる方法を提供する。【解決手段】ＥＬＩＳＡ法を使うことにより、食品等に含有されるタウマチンを高感度かつ簡便に分析する。より詳細には、１または複数の抗タウマチン抗体、特に抗タウマチンポリクローナル抗体を使用して、ＥＬＩＳＡ法を使って食品等に含有されるタウマチンを分析する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
製品中のタウマチンを、１または複数の抗タウマチン抗体を用いた抗原−抗体反応により分析する方法であって、検出限界が少なくとも１〜１０ｐｐｂの範囲であることを特徴とするタウマチンの分析方法。
【請求項２】
抗タウマチンポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によりタウマチンを分析する方法である、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記製品が食品である、請求項１または２に記載のタウマチンの分析方法。
【請求項４】
前記食品が加熱処理した食品である、請求項３に記載のタウマチンの分析方法。
【請求項５】
前記加熱処理した食品がレトルト殺菌を行った食品である、請求項４に記載のタウマチンの分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食品等に含まれるタウマチンを分析する方法に関する。より詳細には、本発明は、１または複数の抗タウマチン抗体を用いた免疫測定法、特にＥＬＩＳＡ法により食品等に含まれるタウマチンを分析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タウマチン（ソーマチン）は、Ｍａｒａｎｔａｃｅａｅ（くずうこん）科に属する植物（Ｔｈａｕｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄａｎｉｅｌｌｉｉ  Ｂｅｎｔｈ）（しびれくずうこん）の果実の仮種皮から得られる非常に強い甘味を呈するタンパク質である。この植物は、シェラレオネからザイールにかけての西アフリカの熱帯多雨森林地帯に自生している多年生植物である。この果実は、西アフリカでは古くからココナツワイン、トウモロコシパン、および酸味の強い果実の甘味増強剤として用いられている。
【０００３】
この植物が西洋に紹介されたのは１８５５年である（例えば、非特許文献１等参照のこと）。その後、１９７２年にＶａｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｌらによって甘味蛋白質（タウマチン）が単離され、１９７２年にはＶａｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｌらによって構造式も決定されている。また１９７０年代には植物の人工栽培技術、タウマチンの抽出・精製方法も確立されている。
【０００４】
こうした背景のもと、タウマチンは各国で医薬品添加物並びに食品添加物として使用が許可されている。例えば、イギリスでは１９８１年にＣＳＭ（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）により医薬品への使用が許可され、今では安全な医薬品用添加物として制限なしに使用が認められている。また１９８３年には食品添加物としての使用も認められている。米国においてはＦＥＭＡ（Ｆｌａｖｏｒ  ａｎｄ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｓ’  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）において、「一般的に安全と認められる物質」、すなわち「ＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ａｓ  Ｓａｆｅ）」にチューインガムのフレーバー添加剤として登録され、医薬品にも使用が許可されている。さらに、カナダ、オーストラリア、ニュージーランド等でも食品、飼料及び医薬品への使用が許可されている。わが国に於いては、１９７９年に導入されて以来、甘味性と風味増強性の両分野で用途研究が進められ、平成元年１１月２８日付厚生省告示第２０７号による「化学合成品以外の食品添加物リスト」に収録されるに至っている。現在、清涼飲料水、菓子パン及び菓子等に広く使用されるほか、動物用の混合飼料にも使用されている（例えば、非特許文献２〜４等参照のこと）。
【０００５】
ところで、昨今の食品業界においては、製品の品質管理が重要な関心事の一つとなっている。そのために、食品中の成分については、高感度でかつ簡便に分析できる方法の開発が望まれている。上記のようにタウマチンは多種多様な食品に使用されているので、食品中のタウマチンの有無並びにその配合量を高感度かつ簡便に分析するための方法が望まれる。
【０００６】
従来、食品分野においてタウマチンは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって定性並びに定量分析されている。しかしながら、この方法は、サンプル調製の際に、遠心分離やフィルターろ過といった細かい作業が必須であり操作が煩雑であること、大型の測定機器が必要であること、さらに分析に時間がかかるなど、必ずしも簡便な分析方法ではなかった。加えて、ＨＰＬＣによる分析では検出限界がせいぜい１０ｐｐｍであり、検出感度が低いという問題がある。この検出感度では、タウマチンが明らかに甘味の付与のために食品などに添加されている場合には検出可能であるが、例えばマスキング目的等のためにタウマチンが微量にしか配合されていない場合にはタウマチンの存在を見逃してしまう可能性がある。
【０００７】
また、タンパク質を分析する方法としては、他にもＭＳスペクトルをベースとする方法等があるが、この方法では、同じ分子量のものが存在する場合には両者を区別して測定することが難しい等の問題がある。特に、食品中には多くの夾雑タンパク質が存在するため、タウマチンのみを特異的に分析するという目的には、必ずしも適したものではなかった。
【０００８】
一般的に高感度なタンパク質の分析手法としては、例えばＥＬＩＳＡ法があることが知られている。しかし、食品分野では食品中の特定成分の分析にＥＬＩＳＡ法を用いることはあまり行われておらず、抗タウマチンモノクローナル抗体を開示する特許文献１にも、該抗タウマチンモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡ法に適用して、食品中のタウマチンを定性もしくは定量分析することについてはまったく述べていない。
【０００９】
食品中のアレルゲンを該アレルゲンに対するモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によって分析するという方法が最近開発され、実用化されている。しかし、この方法によると、加熱処理された食品中のアレルゲンが、実際には含まれているにも関わらず検出できないという問題が起きている。非特許文献５には、ＥＬＩＳＡ法によってアレルゲンを分析するための市販キットの使用に際して、偽陰性を引き起こす食品のリストとして、レトルト食品が例示されている。しかし、食品を加熱殺菌することは日常的に行われていることであるので、加熱殺菌した食品についてもアレルゲンを精度良く分析する必要性があり、その方法の開発が望まれている。
【００１０】
前述するように、従来、食品中のタウマチンを簡便且つ高感度に分析する方法は確立されていないのに加えて、特に加熱処理した食品中のタンパク質を簡便かつ正確に分析することは難しい問題であるとされている中で、上記目的に適う新たな分析方法の開発が望まれていた。
【００１１】
【非特許文献１】Ｗ．Ｆ．Ｄａｎｉｅｌｌ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４，  １５８  （１８５５）
【００１２】
【非特許文献２】Ｈｉｇｇｅｎｂｏｔｈａｍ等、食物の感覚的特性（Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｆｏｏｄｓ）（Ｂｉｒｃｈ等，編）Ｌｏｎｄｏｎ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｐｐ．１２９〜１４９（１９７７）
【００１３】
【非特許文献３】坂上和之、竹内昌則、「ソーマチンの多目的用途とその利用」月刊フードケミカル１９９８年２月号
【００１４】
【非特許文献４】ＦＦＩジャーナル、Ｎｏ．１９５、２００１、第６１−６３頁
【００１５】
【非特許文献５】「偽陽性又は偽陰性を示す食品リスト」平成１４年１１月６日版、食発第１１０６００１号「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」別添資料４）
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｈｏｕｒｅｉ．ｍｈｌｗ．ｇｏ．ｊｐ／ｈｏｕｒｅｉ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｔ＃ｄｏｃｆｒａｍｅ２．ｃｇｉ？ＭＯＤＥ＝ｔｓｕｃｈｉ＆ＤＭＯＤＥ＝ＳＥＡＲＣＨ＆ＳＭＯＤＥ＝ＮＯＲＭＡＬ＆ＫＥＹＷＯＲＤ＝％８３％４１％８３％８ｃ％８３％８ｂ％８３％４ｄ％８１％５ｂ％９５％ａ８％８ｅ％ｂｆ％８２％ｆ０％８ａ％ｄｃ％８２％ｄｅ＆ＥＦＳＮＯ＝４６７３＆ＦＩＬＥ＝ＦＩＲＳＴ＆ＰＯＳ＝０＆ＨＩＴＳＵ＝４）。
【００１６】
【特許文献１】特表昭６３−５０１１９２号公報
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような実情において、従来食品分野では達成できなかったｐｐｂオーダーでの高感度な検出方法であって、なおかつ簡便に行うことができるタウマチンの検出方法を提供することを課題とするものである。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行っていたところ、タウマチンを抗原として作成したポリクローナル抗体を用いて免疫測定を行うことにより、上記目的であるｐｐｂオーダーでのタウマチンの検出が可能となり、かつ当該方法が操作性においても簡便で優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１９】
本発明は、製品中のタウマチンを、１または複数の抗タウマチン抗体を用いて抗原−抗体反応（免疫測定法）により分析する方法であって、検出限界が少なくとも１〜１０ｐｐｂの範囲であることを特徴とするタウマチンの分析方法である。
【００２０】
好ましくは、前記抗タウマチン抗体として、ポリクローナル抗体が用いられる。
【００２１】
また、前記抗タウマチン抗体としては、抗タウマチンモノクローナル抗体を用いることができる。上記抗タウマチンモノクローナル抗体としては、具体的にはハイブリドーマ細胞３Ａ２Ｈまたはハイブリドーマ細胞３Ｂ５Ｈにより産生される抗タウマチンモノクローナル抗体を例示することができる。
【００２２】
タウマチンを分析する製品としては、経口的に用いられるものまたは口腔内で用いられるもののいずれもが含まれるが、好ましくは食品、より好ましくは加熱処理した食品を挙げることができる。当該前記加熱処理した食品としては、具体的にはレトルト殺菌を行った食品を例示することができる。
【００２３】
なお、抗原−抗体反応（免疫測定法）として、好適にはＥＬＩＳＡ法が採用される。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明は、任意の組成物中に混在するタウマチンを、１または複数の抗タウマチン抗体を用いた抗原−抗体反応（免疫測定法）により分析する方法である。
【００２５】
本発明が分析対象とするタウマチンは、重量ベースで蔗糖の約５０００倍もの甘味を呈する蛋白質である。これは大きく分けてタウマチンＩ、ＩＩ、０の３種に分類されている。中でもタウマチンＩおよびＩＩは、低カロリーで虫歯を起こさないため、砂糖代用品（甘味料：食品添加物）として有用である。
【００２６】
これらのタウマチンＩおよびＩＩは２０７アミノ酸残基、タウマチン０は２０３アミノ酸残基からなり、いずれも約２２キロダルトンの分子量を有していることが知られている（なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の見掛け上の分子量は約２４キロダルトンである）。またこれらのアミノ酸配列はいずれも公知である〔例えば、非特許文献２〜４等参照のこと〕。
【００２７】
現在、タウマチンは、Ｍａｒａｎｔａｃｅａｅ（くずうこん）科に属する植物（Ｔｈａｕｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄａｎｉｅｌｌｉｉ  Ｂｅｎｔｈ）（しびれくずうこん）の種子の仮種皮から精製取得されている。具体的には、タウマチンは水易溶性の蛋白質であるから、まず上記植物の種子から取り出した仮種皮を水に浸漬してタウマチンを水に抽出溶解させ、得られた水溶液を限外濾過して溶液中に存在する高分子量の蛋白質を濾別し、得られた濾液を凍結乾燥若しくは噴霧乾燥することにより精製取得することができる。
【００２８】
本発明において採用される免疫測定法は、当業界で周知の方法を同様に使用することができる。特に好ましくはサンドイッチ法である。具体的なサンドイッチ法の原理は、プレートやビーズ等の固相（Ｓ）上に分析したい対象の物質（被験抗原：Ａｇ）に対する抗体（Ａｂ）を固定化して（Ｓ−Ａｂ）、該固定化抗体に上記被験抗原を結合させた後（Ｓ−Ａｂ：Ａｇ）、更にこれに被験抗原に対する抗体であって任意の標識剤で標識されたもの（Ｅ−Ａｂ）（標識抗体）を反応させて、形成された「Ｓ−Ａｂ：Ａｇ：Ａｂ−Ｅ」を、該標識剤に応じた検出方法を用いて定性若しくは定量分析するというものである。
【００２９】
上記免疫測定法に用いられる抗体（上記固定化用抗体、及び一次抗体）は、分析対象の物質（抗原：タウマチン）に対して特異的に反応して結合する抗体であればよく、好ましくは、当該抗原に対するポリクローナル抗体が用いられる。
【００３０】
ポリクローナル抗体の作成は周知であり、本発明で用いる抗タウマチンポリクローナル抗体も、常法に従って調製することができる（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ    Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：第２章（１９９１））。また、抗体作成業者（例えば、旭テクノグラス（株）（千葉県船橋市）など）に委託して作成することも可能である。具体的には、後述する実施例において詳細に説明する。
【００３１】
モノクローナル抗体の作成は周知であり、本発明で用いる抗タウマチンモノクローナル抗体も、常法に従って調製することができる（Ｗａｎｄｓ，Ｊ．Ｒ．，＆  Ｚｕｒａｗｓｋｉ，Ｖ．Ｒ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８０：２２５（１９８１）；Ｍａｒｓｈａｋ−Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２２：２４９１（１９７９）；および、Ｏｉ，Ｖ．Ｔ．＆  Ｌ．Ａ．Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，「免疫グロブリンを産生するハイブリッド（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｈｙｂｒｉｄ）”」Ｍｉｓｈｅｌｌ，Ｂ．Ｂ．＆  Ｓ．Ｍ．Ｓｈｉｉｇｉ（編），細胞免疫学における方法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９７９等）。
【００３２】
具体的には、モノクローナル抗体は細胞融合を利用して調製されるハイブリドーマを用いて作成することができる。この方法は、分析した対象の物質（抗原；本発明ではタウマチン）で免疫した動物、多くの場合はマウスまたはラットのリンパ球とマウス骨髄腫細胞をウイルスまたは界面活性剤の一種であるポリエチレングリコールで融合するものであり、特異抗体産生能を有するリンパ球と、試験管内での増殖能を有する骨髄腫細胞との融合によって作成されたハイブリッドな細胞（ハイブリドーマ）は、抗原特異的な抗体分子を産生分泌しながら試験管内で増殖し続ける。この場合、１個の骨髄腫細胞と融合するのは１個のリンパ球であるから、ハイブリドーマは単一クローン由来のリンパ球の遺伝子のみを有することになり、ただ一種の抗原特異性を有する抗体分子を産生分泌することになる。
【００３３】
本発明で用いる抗タウマチンモノクローナル抗体並びにそれを産生するハイブリドーマの作成方法は、後述する実施例において詳細に説明する。なお、斯くして作成された、抗タウマチンモノクローナル抗体を産生する細胞（ハイブリドーマ）は、２００３年６月２０日現在、大阪府豊中市三和町１−１−１１三栄源エフ・エフ・アイ株式会社内に、ハイブリドーマ細胞３Ａ２Ｈ、並びにハイブリドーマ細胞３Ａ５Ｈとして分譲可能な状態で保管されている。
【００３４】
本発明の免疫測定法（サンドイッチ法）において、上記抗体は、固定化抗体として、また一次抗体として使用することができる。
【００３５】
固定化抗体は、常法に従って各種の任意の固相に固定化することによって調製することができる。当該固相としては、この技術分野において慣用の各種の固相が利用でき、例えばガラス、セルロース粉末、セファデックス、セファロース、ポリスチレン、濾紙、カルボキシメチルセルロース、イオン交換樹脂、デキストラン、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ナイロン、ガラスビーズ、絹、ポリアミン−メチルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合体、エチレン−マレイン酸共重合体等の種々の素材からなるスティック、ビーズ、プレート（ポリスチレンもしくはポリプロピレン等のプラスチック製のマイクロプレートを含む）、試験管等を広く例示できる。
【００３６】
固定化方法についても特に制限はなく、物理的結合及び化学的結合のいずれをも使用できる。例えば、共有結合法としてジアゾ法、ペプチド法（酸アミド誘導体法、カルボキシルクロライド樹脂法、カルボジイミド樹脂法、無水マレイン酸誘導体法、イソシアナート誘導体法、臭化シアン活性化多糖体法、セルロースカルボナート誘導体法、縮合試薬を使用する方法等）、アルキル化法、架橋試薬による担体結合法（例えば架橋試薬としてグルタールアルデヒド、ヘキサメチレンイソシアナート等を用いるもの）、Ｕｇｉ反応による担体結合法等の化学的反応：或いはイオン交換樹脂のような担体を用いるイオン結合法：ガラスビーズ等の多孔性ガラス、またはポリスチレンもしくはポリプロピレン等のプラスチックプレートを担体として用いる物理的吸着法等が例示できる。好ましくは、抗体を固相に固定化する方法は、ポリスチレンもしくはポリプロピレン等のプラスチックプレートを担体として用いる物理的吸着法である。
【００３７】
また、上記抗体を一次抗体として使用する場合、当該抗体は、「抗体−抗原」複合体の検出の為に、直接的にまた間接的に任意の標識剤によって修飾されていることが好ましい。
【００３８】
かかる標識剤としては、特に制限はされず、従来公知のもの又は将来使用され得るいずれのものをも用いることができるが、具体的には１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ等の放射性同位元素類；アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等の酵素類、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）等の蛍光物質類；及び１Ｎ−（２，２，６，６−テトラメチル−１−オキシル−４−ピペリジル）−５Ｎ−（アスパルテート）−２，４−ジニトロベンゼン（ＴＯＰＡ）等が例示され、これらを標識剤として使用する免疫測定法は、それぞれラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、フルオロイムノアッセイ及びスピンイムノアッセイと称されている。本発明において採用される好適な免疫測定法は、酵素を標識剤として使用するエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、特にＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法である。
【００３９】
尚、これらの標識剤による標識方法や間接的な標識化による修飾方法、並びにそれらの検出方法等は、自体公知の方法に従って行うことができる（「単クローン抗体」岩崎辰夫  他著、講談社サイエンティフィク、１９８４；「酵素免疫測定法」第２版、石川栄治  他著、医学書院、１９８２等）。
【００４０】
上記一次抗体は、好ましくは「抗体−抗原」複合体の検出の為に、抗体検出試薬を介して上記標識剤で標識されることが好ましい。ここで抗体検出試薬（二次抗体）としては、特に制限されることなく、一般に当業界で用いられている各種の試薬を広く用いることができる。例えば、上記一次抗体（イムノグロブリン）と結合し得る抗マウスイムノグロブリン抗体（抗ＩｇＧ抗体）、抗ラットイムノグロブリン抗体（抗ＩｇＧ抗体）、抗ニワトリイムノグロブリン抗体（抗ＩｇＹ抗体）、および抗ウサギイムノグロブリン抗体（抗ＩｇＧ抗体）等を挙げることができる。なお、該抗マウスイムノグロブリン抗体には、測定対象である各クラスのイムノグロブリンを免疫源として免疫された任意の被免疫動物から得られる抗血清又はその精製物（ポリクローナル抗体）或いはモノクローナル抗体が包含される。当該抗体検出試薬は、例えば前述する標識剤によって修飾されていることが好ましく、かかる抗体検出試薬は常法に従い調製することができ、また市販品としても入手することができる。
【００４１】
本発明は、好適にはサンドイッチ法に従い実施することができる。例えば、固相化サンドイッチ法によれば、測定対象である試料中のタウマチンの存在の有無並びにその量は例えば次のようにして分析することができる。
【００４２】
まず、測定対象であるタウマチン（抗原）と特異的に抗原−抗体反応する抗タウマチン抗体を固相化してなる固相化抗体（Ｓ−Ａｂ）に、タウマチン（Ａｇ）を含み得る被験試料を加えて、抗原−抗体反応を行わせる。次いで、未結合物質を例えば洗浄により除去して、得られた「抗体−抗原」結合物（Ｓ−Ａｂ：Ａｇ）に一次抗体としての抗タウマチン抗体を反応させる。この場合、一次抗体が予め任意の標識剤で標識されてなるものであれば（Ｅ−Ａｂ）、該標識剤に応じた検出手段によって「抗体−抗原−抗体」結合物（Ｓ−Ａｂ：Ａｇ：Ａｂ−Ｅ）を測定することによって、試料中のタウマチンの存在の有無、又はその含有量を求めることができる。また、上記で用いる一次抗体が標識されていないものであれば（Ａｂ）、一次抗体を反応させた後、未結合物質を洗浄により除去して、標識された抗体検出試薬（二次抗体）（Ｅ−ａＢ）を加えて、「抗体−抗原」結合物（Ｓ−Ａｂ：Ａｇ）に結合した一次抗体と反応させ、該抗体検出試薬（二次抗体）の標識剤に応じた検出手段によって「抗体−抗原−抗体−二次抗体」結合物（Ｓ−Ａｂ：Ａｇ：Ａｂ：ａｂ−Ｅ）を測定することによって、試料中のタウマチンの存在の有無、又はその含有量を求めることができる。
【００４３】
これらの測定手法における各種手段の選択やそれらの改変等はいずれも当業者のよく知るところであり、本発明においてはそれら各手法のいずれによることもできる。
【００４４】
本発明の方法は、前記工程で採用される抗原−抗体反応（免疫反応）において抗タウマチン抗体、好ましくは抗タウマチンポリクローナル抗体を用いることを必須とするものであって、その限りにおいて、他の基本的操作等は特に制限されることなく、通常の免疫測定法における方法及び慣用の方法等を広く採用することができる。故に、上記の免疫反応（抗原抗体反応、並びに抗原抗体結合物と抗体検出試薬との反応）条件も特に制限されず、通常の免疫反応における条件が採用される。一般には４５℃以下、好ましくは約４〜４０℃、より好ましくは２５〜４０℃程度の温度条件下、ｐＨが約５〜９程度の下で、約０．５〜４０時間、好ましくは１〜２０時間程度、放置もしくはインキュベーションする方法を挙げることができる。また、反応に使用される溶媒も、当該反応に悪影響を与えないものであれば特に制限されず、常法に従って若しくはそれに準じて、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液を用いることができる。
【００４５】
なお、測定系に使用される抗体の量は、特に制限されず、採用する測定系において任意に決定することができる。例えば、固定化抗体は、通常、測定対象抗原に対して過剰量の抗体が使用され、例えば１００μｌ容量で反応させる場合を例に挙げると、通常１〜１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは１〜１０μｇ／ｍｌ程度の使用を例示することができる。また一次抗体は、通常、測定対象抗原に対して過剰量の抗体が使用され、例えば１００μｌ容量で反応させる場合を例に挙げると、通常１〜１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは１〜１０μｇ／ｍｌ程度の使用を例示することができる。
【００４６】
上記本発明の分析方法を実施するに際しては、この測定の為の試薬キットを利用することによって、簡便に実施することができる。
【００４７】
従って本発明はまた、製品中のタウマチンの存在の有無またはその量を分析するための試薬キット、好ましくはタウマチン定性分析用の試薬キットを提供するものでもある。すなわち、本発明は、製品中に存在するタウマチンを抗原抗体反応（免疫反応）、好ましくはＥＬＩＳＡ法を利用して検出測定するための試薬キットである。
【００４８】
当該試薬キットは、測定対象であるタウマチンと特異的に反応する、固相化もしくは標識されていてもよい抗タウマチン抗体（例えば、抗タウマチンポリクローナル抗体）、又は任意の標識剤（好ましくは酵素）で標識されていてもよい抗体検出試薬（二次抗体）等を含有していてもよい。好ましくは、当該試薬キットは固定化されている抗タウマチン抗体（例えば、抗タウマチンポリクローナル抗体）、酵素で標識されている抗体検出試薬（二次抗体：抗タウマチン抗体と結合する抗体）を含む。
【００４９】
さらに当該試薬キットには、測定の実施の便益のために、更に適当な反応液、希釈液、洗浄液、反応停止液、標識活性測定試薬等が含まれていてもよい。
【００５０】
本発明の方法によって分析対象となる製品には、タウマチンが含まれ得る製品が全て含まれる。例えば、食品、医薬品（錠剤、丸剤、うがい薬、ドリンク等）、医薬部外品及び口腔用衛生品（うがい液、洗口液、歯みがき剤等）等の経口的に用いられる製品もしくは口腔内で用いられる製品を挙げることができる。好ましくは食品である。
【００５１】
食品としては、例えば乳飲料、乳酸菌飲料、果汁入り清涼飲料、炭酸飲料、果汁飲料、野菜飲料、野菜・果実飲料、アルコール飲料、コーヒー飲料、粉末飲料、スポーツ飲料、サプリメント飲料等の飲料類；紅茶飲料、緑茶、ブレンド茶等の茶飲料類（以上、飲料）；カスタードプリン、ミルクプリン、果汁入りプリン等のプリン類、ゼリー、ババロア及びヨーグルト等のデザート類；ミルクアイスクリーム、果汁入りアイスクリーム及びソフトクリーム、アイスキャンディー等の冷菓類；チューインガムや風船ガム等のガム類（板ガム、糖衣状粒ガム）；マーブルチョコレート等のコーティングチョコレートの他、イチゴチョコレート、ブルーベリーチョコレート及びメロンチョコレート等の風味を付加したチョコレート等のチョコレート類；ハードキャンディー（ボンボン、バターボール、マーブル等を含む）、ソフトキャンディー（キャラメル、ヌガー、グミキャンディー、マシュマロ等を含む）、ドロップ、タフィ等のキャラメル類；ハードビスケット、クッキー、おかき、煎餅等の焼き菓子類（以上、菓子類）；コンソメスープ、ポタージュスープ等のスープ類；浅漬け、醤油漬け、塩漬け、味噌漬け、粕漬け、麹漬け、糠漬け、酢漬け、芥子漬、もろみ漬け、梅漬け、福神漬、しば漬、生姜漬、梅酢漬け等の漬物類；セパレートドレッシング、ノンオイルドレッシング、ケチャップ、たれ、ソースなどのソース類；ストロベリージャム、ブルーベリージャム、マーマレード、リンゴジャム、杏ジャム、プレザーブ等のジャム類；赤ワイン等の果実酒；シロップ漬のチェリー、アンズ、リンゴ、イチゴ、桃等の加工用果実；ハム、ソーセージ、焼き豚等の畜肉加工品；魚肉ハム、魚肉ソーセージ、魚肉すり身、蒲鉾、竹輪、はんぺん、薩摩揚げ、伊達巻き、鯨ベーコン等の水産練り製品；バター、マーガリン、チーズ、ホイップクリーム等の酪農・油脂製品類；うどん、冷麦、そうめん、ソバ、中華そば、スパゲッティ、マカロニ、ビーフン、はるさめ及びワンタン等の麺類；その他、各種総菜及び麩、田麩等の種々の加工食品を制限することなく挙げることができる。
【００５２】
【実施例】
以下、本発明の内容を、参考例及び実施例を用いて具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に何ら制限されるものではない。
【００５３】
実施例１  抗タウマチンポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法による、試料中に含まれるタウマチンの定量
（１）抗タウマチンポリクローナル抗体の作成
抗タウマチンポリクローナル抗体として下記の２種類の抗体を作成した。
【００５４】
▲１▼  ウサギ抗タウマチン抗体（ＩｇＧ）
ウサギ（ニュージーランドホワイト種；雄８週齢）を２週間予備飼育した後、Ｔｈａｕｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄａｎｉｅｌｌｉｉ  Ｂｅｎｔｈの果実の仮種皮由来タウマチン（ＳＳＴ）４００μｇ（フロイント完全アジュバント含有：Ｄｉｆｃｏ社製）による免疫化を１回、次いでＳＳＴ２００μｇ（フロイント不完全アジュバント含有：Ｄｉｆｃｏ社製）による免疫化を４回（１〜２週間間隔をおいて投与、計８週間）行い、抗体を惹起させた。当該ウサギの全血から得た抗血清（６９ｍＬ）のうち１０ｍＬをプロテインＡカラム（ＫＰＬ社製）にかけて、ＩｇＧを精製取得した（４．１ｍｇ／ｍＬの標品を２８．８ｍＬ取得、収量１１８．１ｍｇ）。以下、これをウサギ抗タウマチン抗体（ＩｇＧ）として用いた。
【００５５】
▲２▼  ニワトリ抗タウマチン抗体（ＩｇＹ）
ニワトリ（白色レグホン：雌８週齢）を１か月間予備飼育した後、ＳＳＴ４００μｇ（フロイント完全アジュバント含有：Ｄｉｆｃｏ社製）による免疫化を１回、次いでＳＳＴ２００μｇ（フロイント不完全アジュバント含有：Ｄｉｆｃｏ社製）による免疫化を３回（１〜２週間間隔をおいて投与、計６週間）行い、抗体を惹起させた。当該ニワトリが産卵した卵黄（１５個）からＩｇＹを硫安沈殿法を用いて精製し取得した（２３．１ｍｇ／ｍＬの標品を５５ｍＬ取得、収量１２７１ｍｇ）。以下、これをニワトリ抗タウマチン抗体（ＩｇＹ）として用いた。
【００５６】
（２）抗タウマチンポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティング
▲１▼  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（１）で得られた抗タウマチンポリクローナル抗体（ウサギ抗タウマチン抗体［ＩｇＧ］、ニワトリ抗タウマチン抗体［ＩｇＹ］）のそれぞれについて、タウマチンとの反応性を確認するためにウェスタンブロッティングを行った。
【００５７】
まず、ＳＳＴ（タウマチン）溶液（サンプル溶液中のタウマチン濃度：１０ｐｐｍ、１ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ、０．０１ｐｐｍ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付して分離した。具体的には、下記処方からなるサンプル溶液を１０分間沸騰水中で加熱し、冷却したものを電気泳動用の試料として、電気泳動用ゲル（ゲル濃度１５％：レディーゲルＪ：ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）に２０μＬ供して、電気泳動を行った（２０ｍＡ；定電流、７０分間、装置；パワーサプライ［ＢＩＯ  ＲＡＤ社トランスブロットＳＤセル］）。
【００５８】
＜サンプル溶液＞
０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）          ２５μＬ
１０％  ＳＤＳ溶液                    ４０μＬ
９８％  ２−メルカプトエタノール      １０μＬ
７０％  グリセリン                  ２０μＬ
ＳＳＴ溶液                      １０５μＬ。
【００５９】
電気泳動後、得られたゲルをシルバーステインキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて銀染色した。結果を図１の（ａ）に示す。なお、図１（ａ）の各レーンは次の通りである。Ｍ：分子量マーカー（上から３１．０ｋＤａ、２１．５  ｋＤａ）、レーン１：１０ｐｐｍタウマチン溶液、レーン２：１ｐｐｍタウマチン溶液、レーン３：０．１ｐｐｍタウマチン溶液、レーン４：０．０１ｐｐｍタウマチン溶液。
【００６０】
その結果、レーン１（タウマチン濃度１０ｐｐｍ）及び２（タウマチン濃度１ｐｐｍ）において約２４ｋＤａの位置にバンドが確認された（検出感度：１ｐｐｍ）。
【００６１】
▲２▼  ウェスタンブロッティング
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、トランスブロット装置（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ  Ｃｅｌｌ，ｓｅｍｉ  ｄｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ；ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて、セミドライ方式により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでゲル上で分離した蛋白質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ  ＰＶＤＦメンブレン、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にブロッティングした。具体的には、予めメタノールで親水処理し、更にブロッティング緩衝液で３０分間浸漬処理したＰＶＤＦ膜に、上記泳動処理したゲルを定電圧２０Ｖで２０分間ブロッティングした。次いで、転写されたＰＶＤＦ膜を脱脂粉乳液（Ｎｏｎ−Ｆａｔ  Ｄｒｙ  Ｍｉｌｋ［ＢＩＯ−ＲＡＤ社製］をＴＢＳ［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ，  ｐＨ７．５］を用いて５％溶液に調整）に４℃で１晩浸漬して、ブロッキング処理した。
【００６２】
ブロッキング処理の後、得られたＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ，  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０，  ｐＨ７．５）で１０分間、室温で２回洗浄し、ポリ容器に移した。この中に一次抗体としてＴＢＳＴ緩衝液で１００００倍希釈して０．４μｇ／ｍｌに調整したウサギ抗タウマチンポリクローナル抗体（ＩｇＧ）またはニワトリ抗タウマチン抗体（ＩｇＹ）をそれぞれ２５ｍＬ入れ、室温で１時間振盪した。次いで、得られたＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴ緩衝液で２回洗浄し、その後、二次抗体として、取扱説明書に従ってＴＢＳＴ緩衝液で３０００倍希釈したビオチン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カタログ番号１７０−６４０１）（一次抗体がウサギ抗タウマチンポリクローナル抗体［ＩｇＧ］の場合）またはビオチン標識ウサギ抗ニワトリＩｇＧ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）（一次抗体がニワトリ抗タウマチンポリクローナル抗体［ＩｇＹ］の場合）を加え、室温で１時間静置した。更に、これをＴＢＳＴ緩衝液で２回洗浄した後、ストレプトアビジン−ビオチン化アルカリホスファターゼ（ＡＰ）複合体溶液（ＢＩＯ−ＲＡＤ社、カタログ番号１７０−６４０８および１７０−６４０３）を取扱説明書に従って作製した１０００倍希釈物を加え、室温で２時間静置した後、ＴＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した。これに発色試薬（アルカリホスファターゼｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔ、カタログ番号１７２−６４３２）を入れて１０分間インキュベーションし、超純水で洗浄して反応を停止した。アルカリホスファターゼによる発色の程度から、一次抗体として使用したウサギ抗タウマチンポリクローナル抗体（ＩｇＧ）またはニワトリ抗タウマチン抗体（ＩｇＧ）のタウマチンへの結合性を評価した。
【００６３】
ウサギ抗タウマチンポリクローナル抗体（ＩｇＧ）を一次抗体として用いて行ったウェスタンブロッティング像を図１の（ｂ）に、ニワトリ抗タウマチンポリクローナル抗体（ＩｇＹ）を一次抗体として用いて行ったウェスタンブロッティング像を図１の（ｃ）に示す（各レーンの意味は電気泳動像（図１の（ａ））と同じ）。
【００６４】
その結果、ウサギ抗タウマチンポリクローナル抗体（ＩｇＧ）またはニワトリ抗タウマチン抗体（ＩｇＧ）は共に１ｐｐｍ〜０．１ｐｐｍ濃度のタウマチン溶液に対して、約２４ｋＤａの分子量バンド位置に反応が見られた。これはタウマチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で観察された分子量と一致しており、このことからこれらの抗体はタウマチンと特異的に反応していることが確認された。
【００６５】
（３）タウマチンの抗タウマチンポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ分析タウマチンをＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）を用いて定量分析するにあたって、まず下記に従ってＥＬＩＳＡ法の最適条件を決定した。
【００６６】
具体的には、プレート上に固定化するニワトリ抗タウマチンポリクローナル抗体（ＩｇＹ）の濃度を１０，０００倍希釈（２．３１μｇ／ｍｌ）、二次抗体として用いるビオチン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）の濃度を３，０００倍希釈に保った条件で、一次抗体として用いるウサギ抗タウマチンポリクローナル抗体（ＩｇＧ）の濃度を１，０００倍希釈（４．１ｍｇ／ｍｌ）、１０，０００倍希釈（０，４１ｍｇ／ｍｌ）、及び１００，０００倍希釈（０，０４１ｍｇ／ｍｌ）の３段階に設定し、抗タウマチンポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法における検出感度を検討した。
【００６７】
ＥＬＩＳＡ法は以下の手順に従って行った。
１）ニワトリ抗タウマチンポリクローナル抗体（ＩｇＹ）によるプレートのコーティング
ニワトリ抗タウマチンポリクローナル抗体（ＩｇＹ）をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｔｓ）（タカラバイオ）で、１０，０００倍に希釈し（２．３１μｇ／ｍｌ）、これをプレートの各ウェルに１００μＬ／ウェルの割合で分注した。これを３０分間振盪した後、２時間静置した。プレートウォッシャーを使用して洗浄を行った（３５０μｌ×４回）。
【００６８】
２）ブロッキング
脱脂粉乳（Ｎｏｎ−Ｆａｔ  Ｄｒｙ  Ｍｉｌｋ［ＢＩＯ−ＲＡＤ社製］）をＰＢＳ（タカラバイオ）（９．５７ｍＭリン酸ｐＨ７．３５−７．６５）を用いて５％溶液に調製した脱脂粉乳液を１５０μＬずつ上記各ウェルに分注した。これを３０分間振盪した後、３０分間静置した。プレートウォッシャーを使用して洗浄を行った（３５０μｌ×４回）。
【００６９】
３）抗原（タウマチン試料）の添加
検量線を作成するために、１０−７〜１０５ｐｐｍのタウマチン溶液を上記各ウェルに１００μＬずつ添加し、３０分間振盪後、３０分間静置した。プレートウォッシャーを使用して洗浄を行った（３５０μｌ×４回）。
【００７０】
４）一次抗体（ウサギ抗タウマチン抗体（ＩｇＧ））の添加
上記各ウェルに、一次抗体（ウサギ抗タウマチンポリクローナル抗体［ＩｇＧ］）の１，０００希釈物（４．１μｇ／ｍｌ）、１０，０００希釈物（０．４１ｍｇ／ｍｌ）、または１００，０００希釈物（０．０４１ｍｇ／ｍｌ）を１００μＬ添加し、３０分間振盪した後、３０分間静置した。
【００７１】
５）二次抗体（酵素標識ヤギ抗ウサギ抗体（ＩｇＧ））の添加
上記処理した各ウェルに、二次抗体（ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体［ＩｇＧ］：ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）の３，０００倍希釈物を取扱説明書に従って作製したものを１００μＬずつ添加し、３０分間振盪した後、３０分間静置した。
【００７２】
６）発色
ＴＭＢパーオキシダーゼ発色液（ＴＭＢパーオキシダーゼ基質キット：ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を上記各ウェルに１００μＬずつ添加し、１０分間振盪した。次いで、１Ｎ硫酸を各ウェルに１００μＬずつ添加し、振盪して反応を停止した。
【００７３】
７）定量データ（検量線）の作成
プレートリーダー（ＳＵＮＲＩＳＥ  ＣＬＡＳＳＩＣ：  ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、各ウェルのサンプル１００μＬの吸光度を４５０ｎｍにて測定した。その前にタウマチンの標準液を用いて検量線を作成した。具体的にはタウマチン１ｇ／１００μＬ溶液（原液）をリン酸緩衝液を用いて１０倍系列で希釈して調製した標準溶液１００μＬを上記ＥＬＩＳＡ法で測定し、吸光度から検量線を作成した。
【００７４】
次いで、サンプル１００μＬについて得られた吸光度から、上記で作成した検量線に基づいて４パラメーター式を用いて当該サンプル中のタウマチン濃度を算出し、希釈倍率を乗じてタウマチン含量（ｍｇ／ｋｇ）を求めた。タウマチンの用量／反応曲線を図２に示す。なお、図中、−◆−は一次抗体（ウサギ抗タウマチンポリクローナル抗体［ＩｇＧ］）として、１，０００（１０−３）希釈物、−■−は１０，０００（１０−４）希釈物、及び−▲−は１００，０００（１０−５）希釈物をそれぞれ使用してＥＬＩＳＡを行った結果を示す。
【００７５】
この結果からわかるように、一次抗体濃度を１０−５まで希釈した試験系では、抗原（タウマチン）が１０ｐｐｍに達するまで吸光度の増加が見られなかったのに対して、１０−４、１０−３に希釈した試験系では、抗原がそれぞれ１０ｐｐｂ、１ｐｐｂの濃度から検出可能であった。
【００７６】
実施例２  食品中のタウマチンの抗タウマチンポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ分析
市販加工食品では実際のタウマチン含量が不明なため、既知の含量のタウマチンを含むモデル加工食品を作製し、実施例１の方法が市販加工食品にどの程度利用できるかの検討を行った。また、いくつかの市販加工食品においても分析を試みた。ＥＬＩＳＡ法の手順は実施例１と同様にして行った。
【００７７】
濃度既知のモデル加工食品を分析した結果、１２１℃で３０分のレトルト殺菌を行った食品（表１）並びに９３℃達温処理のビタミンドリンク（表２）においても、測定が可能であった。またタウマチンのラベル表示がある市販の製
品（表３）についても検出することができた。
【００７８】
【表１】
2005010104.tif 000002
【００７９】
【表２】
2005010104.tif 000003
【００８０】
【表３】
2005010104.tif 000004
【００８１】
従来、食品中のタンパク質の分析においては、理論値よりもはるかに低い値が出たり、検出されないことが多く、理論値の５〜１０％程度の量しか検出されないことも珍しくない。特に、加熱殺菌の工程を経た食品においては、検出すべきタンパク質が変性することによって、存在しているはずのタンパク質が検出されない場合が多い。例えば、レトルトパウチ製品等の食品を対象としてアレルギー性物質を検出するための市販キットを用いた場合に偽陰性が出ることが多く報告されている（例えば、非特許文献５参照）。
【００８２】
本発明の分析方法によると、表１に示すようにレトルト食品を対象とした場合でも６０〜２０％の残存率（理論値の６０〜２０％）を示していることから、食品業界における当該分析結果としてはかなり良好な結果であるといえる。
【００８３】
実施例３  抗タウマチンポリクローナル抗体を用いた食品中のタウマチンのウェスタンブロッティング分析
タウマチンが含まれていることが明示されている各種の市販飲料（「アイチャージ」：ロート製薬（株）製、「きになる野菜〜パインキャロット〜」：Ｙａｋｕｌｔ製、「黒酢２０」：江崎グリコ（株）製、「ストライカー〜ＡｑｕａＢｌｕｅ〜」：Ｙａｋｕｌｔ製、「ドリカップ」：ロート製薬（株）製、「ヴァームウォーター」：明治乳業）について（各１０μＬずつ使用）、実施例１の方法に従って電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）し、その後一次抗体としてウサギ抗タウマチンポリクローナル（ＩｇＧ）を用いたウェスタンブロッティングにより各飲料に含まれているタウマチンを分析した。
【００８４】
結果を図３に示す。なお、図３中の各レーンは次の通りである。レーンＭ：分子量マーカー、レーン１：陽性コントロール（１  ｐｐｍ  タウマチン溶液）、レーン２：アイチャージ（ロート製薬）、レーン３：きになる野菜〜パインキャロット〜（Ｙａｋｕｌｔ）、レーン４：黒酢２０（江崎グリコ）、レーン５：ストライカー〜ＡｑｕａＢｌｕｅ〜（Ｙａｋｕｌｔ）、レーン６：  ドリカップ（ロート製薬）、レーン７：ヴァームウォーター（明治乳業）、レーン８：陽性コントロール（１  ｐｐｍ  タウマチン溶液）、レーン９：陽性コントロール（０．１  ｐｐｍ  タウマチン溶液）。図３からわかるように、約２４ｋＤａの分子量領域にバンドが検出され、タウマチンの存在が確認された。但し、レーン２，３及び７は検出限界以下のためバンドが見えなかった。
【００８５】
実施例４
（１）抗タウマチンモノクローナル抗体の作成
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ種；雌４週齢）を２週間予備飼育した後、Ｔｈａｕｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄａｎｉｅｌｌｉｉ  Ｂｅｎｔｈの果実の仮種皮由来タウマチン（ＳＳＴ）４００μｇ（フロイント完全アジュバント含有：Ｄｉｆｃｏ社製）による免疫化を１回、次いでＳＳＴ２００μｇ（フロイント不完全アジュバント含有：Ｄｉｆｃｏ社製）による免疫化を４回（１〜２週間間隔をおいて投与、計８週間）行い、抗体を惹起させた。抗血清でのタウマチンに対するポリクローナル抗体の産生を確かめた後、採血し、屠殺した後、脾臓を摘出した。得られた脾臓を、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、２ｍＭのグルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＧＩＢＣＯ）で２度洗浄し、２５ゲージ針で灌流した。一方、骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ／ＡＧ８）を、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、２ｍＭのグルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０−５Ｍ  β−メルカプトエタノール及び１０％のウマ血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＧＩＢＣＯ）中で増殖させ、次いで遠心分離で増殖した骨髄腫細胞を灌流して培地から分けた。次いで、上記脾細胞（６×１０６）を、２．４×１０６の骨髄腫細胞と共に５０ｍＬの円錐チューブに入れ、１０分間、１，０００ｒｐｍの回転速度で遠心分離した。上清を吸引除去し、チューブ内に残留した細胞を５分間、３７℃の湯浴中に入れた。次いで、これに３４％のポリエチレングリコール１ｍＬを、１分間以上かけて滴下し、脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させた。次に３分間かけて３ｍＬの無血清ＲＰＭＩ培地を添加した。さらに、無血清ＲＰＭＩ培地を２ｍＬ／分の割合で５分間添加した。引き続き、無血清ＲＰＭＩ培地を総量が４０ｍＬになるまで添加した。次いで、得られた混合物をＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ−７の遠心分離機を用いて、１５００ｒｐｍの回転速度で７分間遠心分離にかけて、得られた上清を吸引除去し、チューブ内に残留した細胞をＨＡＴ培地に再懸濁した。得られた細胞を、０．００８ｍｇ／ｍＬのアミノプテリン、１．９４ｍｇ／ｍＬのチミジン、及び６．８ｍｇ／ｍＬのヒポキサンチンを含むＲＰＭＩ培地に移し、９６ウェルの培養プレートの各ウェルに２Ｃｅｌｌずつ入れた。これを３７℃、ＣＯ２７％、空気３７％の条件で培養した。
【００８６】
４日後に、各ウェルにＲＰＭＩ培地２滴及びＨＡＴ（ヒポキサンティンアミノプテリンチミジン）培地２滴を添加し、さらに上記条件で培養してから４日後、さらにＨＡＴ培地２滴を各ウェルに添加した。上記条件で培養１０〜３０日後にクローンが現れ始めた。
【００８７】
ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニング方法（下記参照）によって陽性であることが確認されたクローンを、２４ウェルプレートの各ウェル内のＲＰＭＩ培地（β−メルカプトエタノール、グルタミン、ウマ血清およびゲンタマイシンを含む）に移した。
【００８８】
クローンが塊になるほど増えると、上記ＥＬＩＳＡ法によって陽性反応を確認し、陽性が確認されたクローンを、次いで４８ウェル、２４ウェル、および６ウェルプレートに順次移した。処理の進行に伴っても生存しているこれらタウマチン陽性クローンを再びクローン化し、３ウェルに１つの細胞の割合になるように希釈して９６ウェルプレートに入れた。
【００８９】
最終的に、採取したクローンのうち２つを、抗タウマチンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、２００３年６月２０日現在、大阪府豊中市三和町１−１−１１三栄源エフ・エフ・アイ株式会社内に、ハイブリドーマ細胞３Ａ２Ｈ、並びにハイブリドーマ細胞３Ａ５Ｈとして分譲可能な状態で保管されている。
【００９０】
フラスコ培養にまで至ったとき、その培地を遠心分離によって細胞から分離し、硫酸アンモニウムによってタンパク質を沈殿させた。得られた沈殿は、１ｍＭ    ＰＭＳＦを含むＰＢＳに溶解し、同じ緩衝液に対して透析後、−８０℃で凍結させた。
【００９１】
＜モノクローナル抗体のスクリーニング＞
▲１▼タウマチンを、Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．６）で２μｇ／ｍＬに調製し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに７０μＬずつ分注した。
▲２▼Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０  ｉｎ  ＰＢＳ（−））で２回洗浄後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１％ゼラチン  ｉｎ  ＰＢＳ（−））を１２０μＬ／ウェルで分注し、３７℃で３０分間インキュベーションした。水で２回洗浄した。
【００９２】
▲３▼試験する培養液７０μＬ／ウェルを添加した。正常の融合していない骨髄腫細胞培地を陰性対象として、１：５００に希釈したマウス血清（抗タウマチン抗体含有）を陽性対照として（各々７０μＬ）用いた。３７℃で１時間インキュベートした。
▲４▼水で３回洗浄後、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで１５００倍に希釈した二次抗体（Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（γ−ｃｈａｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）−ＡＰ）を７０μＬ／ウェルで分注し、３７℃で１時間インキュベートした。
▲５▼水で５回洗浄後、発色基質（ＳＩＧＭＡ  ＦＡＳＴ  ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔａｂｌｅｔ）を７０μＬ／ウェルで分注し、３０分後に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定した。
【００９３】
得られた培養液を遠心分離（１５００ｒｐｍ、１０分間）し、上清を回収した。この培養上清を、抗タウマチンモノクローナル抗体として、以下の実験に使用した。
【００９４】
（２）抗タウマチンモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティング
（１）で得られたクローン（ハイブリドーマ）が産生する抗タウマチンモノクローナル抗体（マウス抗タウマチンモノクローナル抗体［ＩｇＧ］）について、タウマチンとの反応性を確認するためにウェスタンブロッティングを行った。
【００９５】
▲１▼  抗タウマチンモノクローナル抗体の取得
（１）で得られた培養上清（２ｍｇ／ｍＬ）を、抗タウマチンモノクローナル抗体として使用した。
【００９６】
▲２▼  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
実施例１（２）▲１▼に記載する方法に従って、ＳＳＴ（タウマチン）溶液（サンプル溶液中のタウマチン濃度：１０ｐｐｍ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付して分離した。
【００９７】
▲３▼ウェスタンブロッティング
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、参考例１（２）▲２▼に記載する方法に従ってゲル上に分離した蛋白質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ  ＰＶＤＦメンブレン、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にブロッティングした。次いで、転写されたＰＶＤＦ膜を実施例１（２）▲２▼と同様にブロッキング処理した。さらに一次抗体として上記▲１▼で調製したマウス抗タウマチンモノクローナル抗体（ＩｇＧ）（ハイブリドーマ細胞３Ａ２Ｈ、及びハイブリドーマ細胞３Ｂ５Ｈ）を、また二次抗体としてＴＢＳＴ緩衝液で３０００倍希釈したアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて、参考例１（２）▲２▼の方法に従って、ブロッティングを行った。これに発色試薬（ｐ−Ｎｐｐ）を入れて１０分間インキュベーションし、超純水で洗浄して反応を停止した。アルカリホスファターゼによる発色の程度から、一次抗体として使用したマウス抗タウマチンモノクローナル抗体（ＩｇＧ）（ハイブリドーマ細胞３Ａ２Ｈ、及びハイブリドーマ細胞３Ｂ５Ｈ）のタウマチンへの結合性を評価した。
【００９８】
ハイブリドーマ細胞３Ａ２Ｈを一次抗体として用いて行ったウェスタンブロッティング像を図４の（ａ）に、ハイブリドーマ細胞３Ｂ５Ｈを一次抗体として用いて行ったウェスタンブロッティング像を図４の（ｂ）に示す。
【００９９】
その結果、上記で得られたマウス抗タウマチンモノクローナル抗体（ハイブリドーマ細胞３Ａ２Ｈ、及びハイブリドーマ細胞３Ｂ５Ｈ）は共に１ｐｐｍ濃度のタウマチン溶液に対して、約２４ｋＤａの分子量バンド位置に反応が見られた。このことからこれらの抗体はタウマチンと特異的に反応していることが確認された。
【０１００】
（３）タウマチンの抗タウマチンモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ分析タウマチンをＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）を用いて定量分析するにあたって、まず下記に従ってＥＬＩＳＡ法の最適条件を決定した。
【０１０１】
具体的には、プレート上に固定化するマウス抗タウマチンモノクローナル抗体（ハイブリドーマ細胞３Ａ２Ｈ）の濃度を１０，０００希釈（１０μｇ／ｍｌ）に、また二次抗体として用いるビオチン化標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）の濃度を３，０００希釈に保った条件で、一次抗体として用いるマウス抗タウマチンモノクローナル抗体（ハイブリドーマ細胞３Ｂ５Ｈ）の濃度を０．４〜１００ｐｐｂの範囲に設定し、抗タウマチンモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によるタウマチンの検出感度を検討した。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡ法は以下の手順に従って行った。
１）一次抗体（マウス抗タウマチンモノクローナル抗体（ハイブリドーマ細胞３Ａ２Ｈ））によるプレートのコーティング
実施例１（２）▲２▼の方法により調製したマウス抗タウマチンモノクローナル抗体（ハイブリドーマ細胞３Ａ２Ｈ）をＰＢＳで、１０，０００倍に希釈し（１０μｇ／ｍｌ）、これをプレートの各ウェルに７０μＬ／ウェルの割合で分注した。これを３０分間振盪した後、２時間静置した。プレートウォッシャーを使用して洗浄を行った（３５０μｌ×４回）。
【０１０３】
２）ブロッキング
脱脂粉乳（Ｎｏｎ−Ｆａｔ  Ｄｒｙ  Ｍｉｌｋ［ＢＩＯ−ＲＡＤ社製］）をリン酸緩衝液（９．５７ｍＭリン酸ｐＨ７．３５−７．６５）を用いて５％溶液に調製した脱脂粉乳液を１２０μＬずつ上記各ウェルに分注した。これを３０分間振盪した後、３０分間静置した。プレートウォッシャーを使用して洗浄を行った（３５０μｌ×４回）。
【０１０４】
３）抗原（タウマチン試料）の添加
検量線を作成するために、１０−７〜１０５ｐｐｍ（１００  ｎｇ／ｍｌから２倍系列で１１段階に希釈）のタウマチン溶液を上記各ウェルに７０μＬずつ添加した。３０分間振盪後、１時間静置した。プレートウォッシャーを使用して洗浄を行った（３５０μｌ×４回）。
【０１０５】
４）二次抗体（ビオチン化標識３Ｂ５Ｈ）の添加
上記処理した各ウェルに、二次抗体をリン酸緩衝液（９．５７ｍＭリン酸ｐＨ７．３５−７．６５）を用いて５００倍に希釈し、各ウェル７０  ｍｌまき、１時間静置した。
【０１０６】
５）発色
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，  ＡＰ  Ｃｎｊｕｇａｔｅ  （ＶＥＣ）をＤｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを用いて５００倍に希釈し、各ウェル７０  ｍｌまき、３５℃で１時間静置した。次いで、ｐＮＰＰ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＥＩＡ（ＫＰＬ）  ｃｏｄｅ＃  ５０−８０−００，  Ｌｏｔ＃  ＹＭ０５５  を各ウェル７０  ｍｌ添加し、３０分間室温で静置した。
【０１０７】
６）定量データ（検量線）の作成
プレートリーダー（ＳＵＮＲＩＳＥ  ＣＬＡＳＳＩＣ：  ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、各ウェルのサンプル１００μＬの吸光度を４０５ｎｍにて測定した。その前にタウマチンの標準液を用いて検量線を作成した。具体的にはタウマチン１ｇ／１００μＬ溶液（原液）をリン酸緩衝液を用いて１０倍系列で希釈して調製した標準溶液７０μＬを上記ＥＬＩＳＡ法で測定し、吸光度から検量線を作成した。
【０１０８】
次いで、サンプル７０μＬについて得られた吸光度から、上記で作成した検量線に基づいて４パラメーター式を用いて当該サンプル中のタウマチン濃度を算出し、希釈倍率を乗じてタウマチン含量（ｍｇ／ｋｇ）を求めた。タウマチンの用量／反応曲線を図５に示す。
【０１０９】
この結果からわかるように、この試験系では、抗原（タウマチン）が１ｐｐｂの濃度から検出可能であった。
【０１１０】
実施例５    抗タウマチンモノクローナル抗体を用いた食品中タウマチンのＥＬＩＳＡ分析
ビタミン飲料（ストライカー、ヤクルト製）２０ｍＬおよびビタミンタブレット（ヤクルト製）の１０％（ｗ／ｖ）溶液２０ｍＬに、甘味料〔ネオサンマルク（三栄源エフ・エフ・アイ株式会社の登録商標）ＡＧ（三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製）〕を０．０１％（ｗ／ｖ）添加した（タウマチン換算１．５ｐｐｍ）。これらのサンプル中のタウマチンの分析を、本発明の抗タウマチンモノクローナル抗体を用いて、実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法によって行った。
【０１１１】
タウマチン含量の理論値は、タウマチン含有ストライカーでは１．５ｐｐｍとなり、タウマチン含有１０％ビタミンタブレット溶液では、溶液自体にもともと０．３ｐｐｍ含まれているので１．８ｐｐｍとなる。
【０１１２】
表４に示すとおり、測定値は、タウマチンの添加量にほぼ近い値となり、高感度でタウマチンの測定が可能であることが示された。
【０１１３】
【表４】
2005010104.tif 000005
【０１１４】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、従来食品分野では達成できなかったｐｐｂオーダーでの高感度な検出を簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の抗タウマチンポリクローナル抗体を一次抗体として用いたウェスタンブロッティング像を示す図である。レーンＭ：分子量マーカー上から３１．０ｋＤａ及び２１．５ｋＤａ、レーン１：  １０ｐｐｍ  タウマチン溶液、レーン２：  １  ｐｐｍ  タウマチン溶液、レーン３：  ０．１  ｐｐｍ  タウマチン溶液、レーン４：  ０．０１  ｐｐｍ  タウマチン溶液をそれぞれ泳動した像を示す。（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に銀染色した電気泳動像。（ｂ）ウサギ抗タウマチンポリクローナル抗体（ＩｇＧ）を一次抗体に用いたウェスタンブロッティング像。（ｃ）ニワトリ抗タウマチンポリクローナル抗体（ＩｇＹ）を一次抗体に用いたウェスタンブロッティング像。
【図２】ポリクローナル抗体（ニワトリ抗タウマチンポリクローナル抗体（ＩｇＹ）：プレートコーティング用抗体、抗タウマチンＩｇＧ：ビオチン化一次抗体）を使った場合の、本発明のＥＬＩＳＡ法の用量／反応曲線である。（◆）一次抗体１０−３；（▲）一次抗体１０−４；（■）一次抗体１０−５の希釈の場合の用量／反応曲線。
【図３】ウサギ抗タウマチンポリクローナル抗体（ＩｇＧ）を用いた、各種市販飲料中のタウマチンの分析結果を示すウェスタンブロッティング像である。レーンＭ：分子量マーカー、レーン１：  ＰＣ（１  ｐｐｍ  タウマチン溶液）、レーン２：アイチャージ（ロート製薬）、レーン３：きになる野菜〜パインキャロット〜（Ｙａｋｕｌｔ）、レーン４：黒酢２０（江崎グリコ）、レーン５：ストライカー〜ＡｑｕａＢｌｕｅ〜（Ｙａｋｕｌｔ）、レーン６：  ドリカップ（ロート製薬）、レーン７：ヴァームウォーター（明治乳業）、レーン８：ＰＣ（１  ｐｐｍ  タウマチン溶液）。レーン９：ＰＣ（０．１  ｐｐｍ
タウマチン溶液）。
【図４】本発明の抗タウマチンモノクローナル抗体を一次抗体に用いたウェスタンブロッティング像を示す図である。レーンＭ：分子量マーカー９７．４ｋＤａ、６６．３ｋＤａ、４５．０ｋＤａ、３１．０ｋＤａ、２１．５ｋＤａ、１４４．４ｋＤａ、レーン１：  １  ｐｐｍ  タウマチン溶液をそれぞれ泳動した像を示す。（ａ）モノクローナル抗体３Ａ２Ｈを一次抗体に用いたウェスタンブロッティング像。（ｂ）モノクローナル抗体３Ｂ５Ｈを一次抗体に用いたウェスタンブロッティング像。
【図５】モノクローナル抗体（３Ａ２Ｈ：プレートコーティング用抗体、３Ｂ５Ｈ：ビオチン化一次抗体）を使った場合の、本発明のＥＬＩＳＡ法の用量／反応曲線である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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