(57)【要約】      （修正有）【課題】ＲＮＡｉ誘導ベクターを効果的に産生できる新規なＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法を提供する。【解決手段】標的遺伝子を含む二本鎖ＤＮＡ断片を鋳型とし、ＰＣＲにより第１、第２及び第３、第４のプライマーよりそれぞれ第１及び第２の遺伝子断片取得と、第１及び第２の遺伝子断片がそれぞれ連結されるプロモーター及びミネーター部とを有するベクター構成用遺伝子取得と、その両末端に前記第１及び第２の遺伝子断片とをそれぞれ結合させる工程と、該工程で得られた遺伝子を鋳型として第１及び第４のプライマーを用いたＰＣＲにより第３の遺伝子断片を増幅し、前記第１、第２遺伝子断片の第１、第４プライマーに由来するリンカー部分には同じ制限酵素での切断部位を含み、第３の遺伝子断片のうちリンカー部分に由来する部分を制限酵素で切断し、切断された部位同士を結合させ環状ポリヌクレオチド取得工程とを含む、ＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子を含む二本鎖ＤＮＡ断片を鋳型とし、フォワードプライマーである第１のプライマー、及びリバースプライマーである第２のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、第１の遺伝子断片を増幅する第１の遺伝子断片取得工程と、
前記標的遺伝子を含む遺伝子断片を鋳型として、フォワードプライマーである第３のプライマー、及びリバースプライマーである第４のプライマーを用いたＰＣＲにより、第２の遺伝子断片を増幅する第２の遺伝子断片取得工程と、
前記第１の遺伝子断片が連結されるプロモーター部と、前記第２の遺伝子断片が連結されるターミネーター部とを有するベクター構成用ポリヌクレオチドを得るベクター構成用ポリヌクレオチド取得工程と、
前記ベクター構成用ポリヌクレオチド取得工程で得られたベクター構成用ポリヌクレオチドの両末端に、前記第１の遺伝子断片と、前記第２の遺伝子断片とをそれぞれ結合させる遺伝子断片連結工程と、
前記遺伝子断片連結工程で得られたポリヌクレオチドを鋳型として、前記第１のプライマー、及び前記第４のプライマーを用いたＰＣＲにより、第３の遺伝子断片を増幅する工程と、
前記第１の遺伝子断片の第１のプライマーに由来するリンカー部分と、前記第２の遺伝子断片の第４のプライマーに由来するリンカー部分には同じ制限酵素で切断される部位を含み、前記第３の遺伝子断片を得る工程で得られた第３の遺伝子断片のうち前記リンカー部分に由来する部分を当該制限酵素で切断し、制限酵素で切断された部位同士を結合させ、環状ポリヌクレオチドを得る環状ポリヌクレオチド取得工程とを含む、
ＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法。
【請求項２】
前記プロモーター部はｎｍｔ１プロモーターを含み、前記ターミネーター部はｎｍｔ１ターミネーターを含む、請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法。
【請求項３】
ベクター構成用ポリヌクレオチド取得工程で取得されたベクター構成用ポリヌクレオチドが、配列番号６に記載のポリヌクレオチドである請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法。
【請求項４】
前記環状ポリヌクレオチドが、ステムループを有する請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法。
【請求項５】
請求項１又は請求項２に記載のＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法により製造された環状ポリヌクレオチドを導入した宿主と、前記環状ポリヌクレオチドを導入しない宿主の生理的挙動を比較する工程を含む、標的遺伝子の機能の解析方法。
【請求項６】
前記の宿主が分裂酵母である請求項５に記載の標的遺伝子の機能の解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の機能を解明するために、標的遺伝子の発現を配列特異的に阻害する方法が研究されてきた。近年、このようなアンチセンス技術として、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ interference：ＲＮＡ干渉）が着目されている。ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ：double stranded ＲＮＡ）が、同一の配列を持つ標的ＲＮＡの分解を促進することにより、標的タンパク質の発現を配列特異的に抑制する現象である。
【０００３】
ＲＮＡｉ技術として、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量のｄｓＲＮＡを線虫(C. elegance)の細胞に導入し、標的遺伝子の発現を阻害する方法が知られている（例えば、特許文献１（特表2002-516062号公報）参照）。
【０００４】
分裂酵母に対するＲＮＡｉについても報告例がある。例えば、長鎖の二本鎖のＲＮＡを発現するプラスミドを分裂酵母に導入すると、siＲＮＡ（small interfering ＲＮＡ）が産生され、ＲＮＡｉに起因するｍＲＮＡの分解が誘導される（例えば、非特許文献１（川崎広明、多比良和誠著  「生物種別ＲＮＡｉ実験プロトコール  酵母」）参照。）。
【０００５】
上記のような従来技術においては、ＲＮＡｉ誘導ベクターを、大腸菌などにトランスフェクト（移入）して増幅していた。すなわち、従来は、プラスミドなどのベクターに標的遺伝子を導入して増幅し、次の標的遺伝子を先に導入した標的遺伝子と逆向きになるように導入して２度目の増幅をしていた。このようなＲＮＡｉ誘導プラスミドの製造方法では、大腸菌による増幅工程を２回経なければならないという問題がある。
【０００６】
さらには、標的遺伝子部分（センス部）と、センス部分と逆向きに導入された標的遺伝子の部分（アンチセンス部）とを含むプラスミドを、大腸菌によって増幅しようとしても、うまく増幅されないという問題がある。
【０００７】
2001年には、マックスプランク研究所が、21塩基からなる二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が哺乳動物細胞においてもｍＲＮＡを破壊することを発表した。そして、東京大学の多比良教授らは、ｓｉＲＮＡを効率よく安定に細胞内で発現させることのできるｓｉＲＮＡ発現ベクターを開発した。それ以来、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉの基本技術として多々研究されている。しかしながら、ｓｉＲＮＡは、配列特異性がとても高いため、ノックアウト動物を製作しようとした場合に、機能が確実にわかっている標的遺伝子でなければノックアウト動物を製作できないなどの問題がある。
【特許文献１】特表2002-516062号公報
【非特許文献１】川崎広明、多比良和誠著  「生物種別ＲＮＡｉ実験プロトコール  酵母」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＲＮＡｉ誘導ベクターを効果的に産生できる新規なＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明は、上記のようなＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法を用いて製造されるプラスミドなどを利用した、標的遺伝子の発現抑制による遺伝子機能の解析方法を提供することを別の目的とする。本発明は、特に分裂酵母における遺伝子機能の解析方法を提供することを別の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（１）上記の課題の少なくともひとつ以上を解決するため、本発明のＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法は、標的遺伝子を含む二本鎖ＤＮＡ断片を鋳型とし、フォワードプライマーである第１のプライマー、及びリバースプライマーである第２のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、第１の遺伝子断片を増幅する第１の遺伝子断片取得工程と、前記標的遺伝子を含む遺伝子断片を鋳型として、フォワードプライマーである第３のプライマー、及びリバースプライマーである第４のプライマーを用いたＰＣＲにより、第２の遺伝子断片を増幅する第２の遺伝子断片取得工程と、前記第１の遺伝子断片が連結されるプロモーター部と、前記第２の遺伝子断片が連結されるターミネーター部とを有するベクター構成用ポリヌクレオチドを得るベクター構成用ポリヌクレオチド取得工程と、前記ベクター構成用ポリヌクレオチド取得工程で得られたベクター構成用ポリヌクレオチドの両末端に、前記第１の遺伝子断片と、前記第２の遺伝子断片とをそれぞれ結合させる遺伝子断片連結工程と、前記遺伝子断片連結工程で得られたポリヌクレオチドを鋳型として、前記第１のプライマー、及び前記第４のプライマーを用いたＰＣＲにより、第３の遺伝子断片を増幅する工程と、前記第１の遺伝子断片の第１のプライマーに由来するリンカー部分と、前記第２の遺伝子断片の第４のプライマーに由来するリンカー部分には同じ制限酵素で切断される部位を含み、前記第３の遺伝子断片を得る工程で得られた第３の遺伝子断片のうち前記リンカー部分に由来する部分を当該制限酵素で切断し、制限酵素で切断された部位同士を結合させ、環状ポリヌクレオチドを得る環状ポリヌクレオチド取得工程とを含む。
【００１１】
本発明のＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法は、従来のように大腸菌によらず、ＰＣＲを用いてセンス部分をその端部領域に有する遺伝子断片と、アンチセンス部分をその端部領域に有する遺伝子断片をそれぞれＰＣＲにより増幅し、これらをベクターとしての必要な構成要素を有するポリヌクレオチド配列の両端に結合し、これらの両末端を制限酵素で消化して結合部を作り、この結合部を連結することで、従来に比べて容易にかつ大量にＲＮＡｉ誘導ベクターを製造することができる。本発明のＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法は、確かに製造できるＤＮＡの量は、大腸菌を用いて作成する場合に比べて少量かもしれない。しかしながら、本発明のＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法により製造できるＤＮＡの量は、実験等には十分である。また、ＲＮＡｉは、標的遺伝子の色々な部分のｄｓＲＮＡを作り、うまく機能するものを探すことが多い。また、本発明のＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法は、ＰＣＲを用いるので、発現させるｄｓＲＮＡの長さや配列（例えば、標的遺伝子のどの部分のｄｓＲＮＡを作るかなど）のバリエーションを比較的容易に作り出すことができる。したがって、本発明はこの点で、大腸菌を用いてプラスミドを増幅する方法に比べ優れている。
【００１２】
なお、第１の遺伝子断片は、本発明のベクターのセンス部（図１の３）となり、第２の遺伝子断片は、本発明のベクターのアンチセンス部（図１の５）となる。第３の遺伝子断片は、本発明のベクターのセンス部、及びアンチセンス部となる部位をその両端部に有し（図２（ａ））、その両端部が結合されることにより（図２（ｂ）、図２（ｃ））、本発明のベクター（図１）となるものである。
【００１３】
（２）本発明のＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法は、好ましくは、プロモーターがｎｍｔ１プロモーターであり、ターミネーターがｎｍｔ１ターミネーターである。このｎｍｔ１プロモーター、及びｎｍｔ１ターミネーターを含むことで、特に本発明のＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法によって製造されるプラスミド（ベクター）は、シザサッカロマイセス・ポンベ（Shizosaccharomyces pombe）などの分裂酵母の機能を解明することに役立つ。
【００１４】
（３）本発明のＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法は、好ましくは、ベクター構成用ポリヌクレオチド取得工程で取得されたベクター構成用ポリヌクレオチドが、配列番号６に記載のポリヌクレオチドである。
【００１５】
（４）本発明のＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法は、好ましくは、前記環状ポリヌクレオチドが、ステムループを有する。
【００１６】
（５）上記の課題の少なくとも一つ以上を解決するため、本発明の標的遺伝子の機能の解析方法は、上記のＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法により製造されたベクターを宿主に導入する工程を含む。この本発明の標的遺伝子の機能の解析方法によれば、宿主に導入されたプラスミド（ベクター）がｓｉＲＮＡを産出し、ＲＮＡｉに起因する配列特異的なｍＲＮＡの分解を誘導する。このようにして、本発明の標的遺伝子の機能の解析方法によれば、標的遺伝子が関与するｍＲＮＡが分解し、発現が抑えられた標的遺伝子の機能を解析することができる。
【００１７】
（６）標的遺伝子の機能の解析方法は、好ましくは、前記の宿主が分裂酵母である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法によれば、ＲＮＡｉ誘導ベクターを、ＰＣＲを利用して効果的に量産できる。
【００１９】
本発明によれば、上記のようなＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法を用いて製造されるプラスミド（ベクター）などを利用した標的遺伝子の発現抑制による遺伝子機能の解析方法を提供することができる。特に本発明は、分裂酵母における遺伝子機能の解析方法を提供することができる。
【００２０】
標的遺伝子のどの配列を用いてｄｓＮＲＡを作成した場合にＲＮＡｉが有効に働くかを事前に予測することが困難な場合がある。このような場合でも、本発明によれば、産生するｄｓＲＮＡの長さや配列のバリエーションを容易に設計し、合成することができるので、有効なＲＮＡｉを誘起するｄｓＲＮＡを速やかに探索できる。
【００２１】
本発明によれば、上記のようなＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法を用いて製造されるプラスミド（ベクター）などを利用し、標的遺伝子の機能を阻害した植物、昆虫、真核微生物、原核微生物、ヒト、及び非ヒト哺乳動物やなどが挙げられるが、好ましくは真核微生物であり、より好ましくは菌類であり、特に好ましくは分裂酵母などの酵母を含む真菌である。
【００２２】
本発明によれば、上記のようなＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法を用いて製造されるプラスミド（ベクター）などを利用し、標的遺伝子である疾患関連遺伝子の機能を阻害した、遺伝子治療剤、遺伝子治療方法などを提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（１．ＲＮＡｉ誘導ベクター）
本発明の方法により得られるＲＮＡｉ誘導ベクター（本発明のベクター）を図１を用いて説明する。図１は、本発明のベクターの概略図である。図１に示されるように、本発明のベクター１は、プロモーター部２と、プロモーター部の下流に位置するセンス部３と、センス部とアンチセンス部とを連結する連結部４と、連結部の下流に位置するアンチセンス部５と、（任意要素としての）ターミネーター部６とを含む。このような本発明のベクターは、宿主に導入されることにより、標的遺伝子の発現を阻害する。
【００２４】
（標的遺伝子）
標的遺伝子は、ＲＮＡｉを用いてその発現を抑えることで、機能を解析する対象となる遺伝子である。標的遺伝子としては、細胞由来の遺伝子（即ち、細胞性遺伝子）、内部遺伝子（即ち、ゲノムに存在する細胞性遺伝子）、導入遺伝子（即ち、細胞のゲノムの異所部位に挿入された遺伝子構造）、或いは感染後に細胞に存在する病原体の遺伝子などが挙げられ、特に限定されない。標的遺伝子の具体例としては、発生遺伝子、がん遺伝子、がん抑制遺伝子、酵素関連遺伝子などが挙げられるが特に限定されない。標的遺伝子となる発生遺伝子としては、接着分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Ｗｎｔファミリー群、Ｐａｘファミリー群、Ｗｉｎｇｅｄらせんファミリー群、ホックスファミリー群、サイトカイン／リンホカインおよびそれらのレセプターなどが挙げられる。また、標的遺伝子となるがん遺伝子としては、ＡＢＬ１、ＢＣＬ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＩ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、およびＹＥＳが挙げられる。また、標的遺伝子となるがん抑制遺伝子としては、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＤＨ４、ＭＣＣ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＲＢ１、ＴＰ５３、およびＷＴ１などが挙げられる。また標的遺伝子となる酵素としては、ＡＣＣシンターゼおよびオキシダーゼ、ＡＣＰデサチュラーゼおよびヒドロキシラーゼ、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコンシンターゼ、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、顆粒結合スターチシンターゼ、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物生長調節シンターゼ、ポリガラクチュロナーゼ、プロテイナーゼおよびペプチダーゼ、プラナーゼ（プルラナーゼ）、組換え酵素、逆転写酵素、ＲＵＢＩＳＣＯｓ、トポイソメラーゼ、およびキシラナーゼなどが挙げられる。
【００２５】
標的遺伝子の長さとしては、ＲＮＡｉを惹起しうる長さであれば特に限定されるものではなく、センス部、アンチセンス部の長さとしては、１０〜１００００ｂｐが挙げられ、好ましくは２００〜１０００ｂｐであり、より好ましくは５００〜１０００ｂｐである。
【００２６】
（プロモーター）
本発明において用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。プロモーターとしては、２型ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターが挙げられる。プロモーターとしては、プラスミドが導入される宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰ（ＧＬＤ）プロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｎｍｔ１プロモーターなどが好ましく、特にｎｍｔ１プロモーターが好ましい。場合によっては、標的遺伝子自身のプロモーターを用いることも可能である。
【００２７】
プロモーターの長さとしては、ＲＮＡｉを惹起しうる長さであれば特に限定されるものではなく、３〜５０００ｂｐが挙げられ、好ましくは１０〜１０００ｂｐであり、より好ましくは２００〜１０００ｂｐである。
【００２８】
（ターミネーター）
ターミネーターとしては、例えば、短いポリウリジン配列が挙げられる。ターミネーターの長さとしては、ＲＮＡｉを惹起しうる長さであれば特に限定されるものではなく、３〜５０００ｂｐが挙げられ、好ましくは１０〜１０００ｂｐである。
【００２９】
（連結部）
連結部は、センス部とアンチセンス部とを連結する部位である。連結部は、制限酵素により消化される部分を含んでいるものが挙げられ、連結部の長さは３〜１００ｂｐが挙げられ、好ましくは４〜５０ｂｐである。好ましくは、この連結部がステムループを作る。これにより、転写産物が折れ曲がり、ｄｓＲＮＡになる。連結部としては、好ましくはステムループを作る塩基配列を用いればよく、例えばｔＲＮＡにみられるステムループ配列を転用してもよい。第３の遺伝子断片を得る工程で得られた第３の遺伝子断片のうち前記第１の遺伝子断片の第１のプライマーに由来するリンカー部分と、前記第２の遺伝子断片の第４のプライマーに由来するリンカー部分とを制限酵素で切断し、制限酵素で切断された部位同士を結合させることによって得ることができる。
【００３０】
その他、本発明のベクターは、マーカー遺伝子やレポーター遺伝子など様々な遺伝子を含んでいても良い。本発明においては、ＰＣＲを用いて増幅するので、大腸菌で増殖するためのオリジンや大腸菌で働くマーカー遺伝子は特に必要とされない。マーカー遺伝子としては、薬品耐性遺伝子や栄養要求性遺伝子が挙げられ、具体的にはｌｙｓ１−Ｎなどが挙げられる。ｌｙｓ１−Ｎは、染色体上のｌｙｓ１座位に組み込まれた時にのみリジン要求性を相補できるものであり、組み込みのためのターゲット配列にもなる。本発明のベクターは、例えば環状のポリヌクレオチド（プラスミド）であるので、様々な機能をもたせることができ、また細胞内で増殖させることもできる。
【００３１】
（２．本発明のベクターの製造方法）
以下、本発明のＲＮＡｉ誘導ベクターの製造方法（以下、本発明のベクターの製造方法ともいう）の例を説明する。本発明のベクターの製造方法は、第１次ＰＣＲ工程と、ベクター構成用ポリヌクレオチド取得工程と、遺伝子断片連結工程と、第２次ＰＣＲ工程と、プラスミド取得工程とを含む。
【００３２】
（第１次ＰＣＲ工程）
第１次ＰＣＲ工程は、標的遺伝子を含む遺伝子断片を２種類（フォワード遺伝子断片と、リバース遺伝子断片になるもの）増幅する工程である。センス部（図１の３）となる第１の遺伝子断片を増幅する第１の遺伝子断片取得工程と、アンチセンス部（図１の５）となる第２の遺伝子断片を増幅する第２の遺伝子断片取得工程とを含む。なお、ＰＣＲは、公知の条件、及びプロトコルに従って行うことができる。
【００３３】
第１の遺伝子断片取得工程では、標的遺伝子を含む二本鎖ＤＮＡ断片を鋳型とし、フォワードプライマーである第１のプライマー、及びリバースプライマーである第２のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、第１の遺伝子断片を増幅する。
第１の遺伝子断片は、本発明の標的遺伝子のセンス部を含み、片端に第１のプライマーに由来する連結部を含み、反対の端に第２のプライマーに由来するプロモーター配列末端に相同な配列を２０ｂｐ程度含む。
【００３４】
一方、第２の遺伝子断片取得工程では、前記標的遺伝子を含む遺伝子断片を鋳型として、フォワードプライマーである第３のプライマー、及びリバースプライマーである第４のプライマーを用いたＰＣＲにより、第２の遺伝子断片を増幅する。第２の遺伝子断片は、本発明の標的遺伝子のアンチセンス部を含み、片端に第４のプライマーに由来する連結部を含み、反対の端に、第３のプライマーに由来するターミネーター配列末端に相同な配列を２０ｂｐ程度有する。
【００３５】
第１の遺伝子断片取得工程、及び第２の遺伝子断片取得工程では、ともに標的遺伝子を含む遺伝子断片を増幅するようにプライマーを設計する。さらに、第１の遺伝子断片の第１のプライマーに由来するリンカー部分と、前記第２の遺伝子断片の第４のプライマーに由来するリンカー部分には同じ制限酵素で切断される部位を含むように設計する。さらに連結部の配列は、好ましくは、連結後に適切なステムループ構造を形成できるものとする。
【００３６】
（ベクター構成用ポリヌクレオチド取得工程）
ベクター構成用ポリヌクレオチド取得工程は、第１の遺伝子断片が連結されるプロモーター部を有するプロモーター末端と、第２の遺伝子断片が連結されるターミネーター部を有するターミネーター末端とを有するベクター構成用ポリヌクレオチドを得る工程である。ベクター構成用ポリヌクレオチド取得工程の例としては、例えば、プロモーター部とターミネーター部を含むポリヌクレオチドを用意し、そのプロモーター部とターミネーター部とを連結する部分を、制限酵素により切断するものが挙げられる。
【００３７】
ベクター構成用ポリヌクレオチド取得工程において用いられるポリヌクレオチドは、公知のプラスミドを制限酵素で切断することによって容易に得ることができる。このようなプラスミドとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ptrp ７８１）、枯草菌由来プラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＭ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）及びこれらに所定の遺伝子を導入したもの、ｎｍｔ１プロモーターを含む発現ベクターｐＲＥＰ１、ｐＣＳＴ３などが挙げられる。ベクター構成用ポリヌクレオチドとしては、プロモーターや分裂酵母で働くマーカー遺伝子を含むものなどが挙げられる。ｐＲＥＰ１は、プロモーター、ターミネーターや分裂酵母で働くマーカー遺伝子の他に、複製起点としてはたらくＡＲＳを含む。ｐＣＳＴ３は、染色体上にターゲットできるｌｙｓ１−Ｎマーカー遺伝子を含む。ベクター構成用ポリヌクレオチド取得工程で、所定のベクターを構築することで、ライゲーション後のプラスミドには、プロモーター部位の下流かつターミネーター部位の上流には、標的遺伝子のセンス部位とアンチセンス部位を含むことになり、ＲＮＡｉ誘導ベクターを好適に製造できることとなる。
【００３８】
（遺伝子断片連結工程）
遺伝子断片連結工程は、ベクター構成用ポリヌクレオチド取得工程で得たベクター構成用ポリヌクレオチドの両末端に、第１の遺伝子断片と、第２の遺伝子断片とをそれぞれ結合させる工程である。遺伝子断片連結工程は、好ましくは、ベクター構成用ポリヌクレオチドのプロモーター部位を有するプロモーター末端に第１の遺伝子断片を連結し、ベクター構成用ポリヌクレオチドのターミネーター部位を有するターミネーター末端に第２の遺伝子断片を連結する。この遺伝子断片連結工程は、通常、後述の第２次ＰＣＲ工程において、ＰＣＲと同時に行う。この場合は、第１の遺伝子断片と、第２の遺伝子断片とベクター構成用ポリヌクレオチドとを含む溶液を用いてＰＣＲを行えばよい。
【００３９】
（第２次ＰＣＲ工程）
第２次ＰＣＲ工程は、遺伝子断片連結工程で連結したポリヌクレオチドを鋳型として、前記第１のプライマー、及び前記第４のプライマーを用いたＰＣＲにより、第３の遺伝子断片（ポリヌクレオチド）を増幅する工程である。ＰＣＲの条件は、公知の条件に適宜変更を加えればよい。
【００４０】
（環状ポリヌクレオチド取得工程）
環状ポリヌクレオチド取得工程は、第３の遺伝子断片のうち前記第１の遺伝子断片の第１のプライマーに由来するリンカー部分と、前記第２の遺伝子断片の第４のプライマーに由来するリンカー部分を制限酵素で切断し、制限酵素で切断された部位同士を結合させ、プラスミドなどの環状ポリヌクレオチドを得る工程である。
【００４１】
図２は、プラスミド取得工程を説明するための図である。図２（ａ）は、第３の遺伝子断片の概略図を示す。図２（ｂ）は、第３の遺伝子断片を制限酵素により消化した遺伝子断片の概略図を示す。図２（ｃ）は、第３の遺伝子断片の制限酵素により消化した部分同士を結合させ、プラスミドを得る様子を示す図である。
【００４２】
すなわち、プラスミド取得工程では、第３の遺伝子断片（図２（ａ））のうち前記第１の遺伝子断片７の第１のプライマーに由来するリンカー部分と、前記第２の遺伝子断片８の第４のプライマーに由来するリンカー部分を制限酵素で切断する（図２（ｂ））。この制限酵素で切断された部分（９ａ、９ｂ）同士を、リガーゼを用いてライゲーションすると、環状のプラスミドを得ることができる。
【００４３】
（３．標的遺伝子の機能の解析方法）
以下に、本発明のベクターを用いた標的遺伝子の機能を解析する方法の例を説明する。本発明のベクターを用いて標的遺伝子の機能を解析するためには、本発明のベクターを、標的遺伝子を発現する細胞に導入すればよい。プラスミドを宿主に導入する方法は、公知の方法を採用することができる。本発明のベクターを、標的遺伝子を発現する細胞に導入すると、ＲＮＡｉを惹起し、標的遺伝子の発現が阻害され、標的遺伝子のもつ機能が阻害される。このようにして、標的遺伝子のもつ機能を解析できる。
【００４４】
本発明のベクターが導入される宿主としては、酵母、カビ、動物細胞などの真核生物や、大腸菌、枯草菌、放線菌などの原核生物などが挙げられ、これらの中でも好ましくは酵母である。酵母としては、出芽酵母（サッカロマイセス・セレビシエ：Saccharomyces cerevisiae） ＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ-、ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、分裂酵母（シザサッカロマイセス・ポンベ：Schizosaccharomyces pombe）あるいはこれらの変異株などが挙げられ、好ましくは分裂酵母である。分裂酵母を宿主に導入するには、例えば、プロシーディングス オブ ナショナルアカデミー オブ サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）USA，第７５巻，第１９２９頁（１９７８年）に記載の方法に従って行えばよい。
【００４５】
（４．治療剤・治療方法）
本発明のベクターを細胞に導入することで、標的遺伝子の発現を抑えることができる。したがって、疾患関連の遺伝子を標的遺伝子として本発明のベクターを製造すれば、疾患関連の遺伝子の発現を抑えることができる。したがって、本発明のベクター等を利用すれば、標的遺伝子が関与する疾患の治療剤や治療方法を提供することができる。
【実施例１】
【００４６】
（実施例１）
実施例１では、ＲＮＡｉ誘導ベクターを製造し、本発明のベクターが標的遺伝子の発現を抑制することを確かめるため、標的遺伝子として機能が公知であるura4+を用いた。この遺伝子がコードするタンパク質は、orotidine 5'-phosphate decarboxylaseである。この遺伝子を標的にする理由は、ura4-( ura4+遺伝子の機能を失った)細胞を5FOA(5-Fluoroorotic  acid：5-フルオロオロチン酸)存在下で選択できるからである。すなわち、ura4+遺伝子をRNAiの標的遺伝子とすると、ura4+であった細胞がRNAiによってura4-になる。ura4+の細胞は、ウラシルを含まない培地中で増殖できるが、ura4-の細胞は、ウラシルを含まない培地中で増殖できない。一方、培地中にウラシルと5FOAが含まれていると、ura4-の細胞は増殖できるが、ura4+の細胞が増殖できなくなる。このシステムを使えば、RNAiが成功して、ura4+遺伝子がノックアウトされた細胞のみがウラシルと5FOAが含まれている培地中で生育可能になるので、RNAiがうまくいったかどうかを簡単に見分けられる。
【００４７】
（１．１次ＰＣＲ）
（１．１．ura4フォワードの製造）
配列番号１で表される塩基配列を有する遺伝子断片（ura4+）を鋳型とし、２個のプライマー、第１のプライマー（配列番号：２）および第２のプライマー（配列番号：３）を用いてＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応における反応液は、上記の遺伝子断片１μｌ（１０ｎｇ／μｌ）を鋳型として使用し、第１のプライマー５μｌ（１ｐｍｏｌ／μｌ）、第２のプライマーを５μｌ（１ｐｍｏｌ／μｌ）、１０倍バッファーを５μｌ、ｄＮＴＰｓミックスを１μｌ、および酵素（Ｅｘ ｔａｑ）を１μｌ、蒸留水３２μｌを加え、５０μｌの液量としたものを用いた。ＰＣＲ反応は、９４℃で５分処理した後、９４℃で１分、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃５分の伸長反応を行った。このようにして二本鎖のＤＮＡ断片であるura4フォワード（センス部になる第１の遺伝子断片）を増幅した。ura4フォワードは、本発明の標的遺伝子ura4+のセンス部を含み、片端に第１のプライマーに由来する連結部を含み、反対の端に第２のプライマーに由来するプロモーター配列末端に相同な配列を２０ｂｐ有していた。
【００４８】
第１のプライマー（フォワードプライマー）：
配列番号２  gggcccgcta gccactgcac tccaatgtct gcgaatttgc 
第２のプライマー（リバースプライマー）：
配列番号３  tcgctttgtt aaatcatatg gatgctagag tatttcaaag
【００４９】
（１．２．ura4リバースの製造）
配列番号１で表される塩基配列を有する遺伝子断片を鋳型とし、２個のプライマー、第３のプライマー（配列番号：４）および第４のプライマー（配列番号：５）を用いてＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応における反応液は、上記の遺伝子断片２μｌ（１０ｎｇ／μｌ）を鋳型として使用し、第３のプライマー５μｌ（１ｐｍｏｌ／μｌ）、第４のプライマーを５μｌ（１ｐｍｏｌ／μｌ）、１０倍バッファーを５μｌ、ｄＮＴＰｓミックスを１μｌ、および酵素（Ｅｘ ｔａｇ）を１μｌ、蒸留水３２μｌを加え、５０μｌの液量としたものを用いた。ＰＣＲ反応は、９４℃で５分処理した後、９４℃で１分、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃５分の伸長反応を行った。このようにして二本鎖のＤＮＡ断片であるura4フォワード（アンチセンス部分になる第２の遺伝子断片）を得た。なお、ura4フォワードと、ura4リバースとは同時に製造した。
【００５０】
第３のプライマー（フォワードプライマー）：
配列番号４  ttccttttac cctaagatct gatgctagag tatttcaaag 
第４のプライマー（リバースプライマー）：
配列番号５  gtcgacctcg aggctagcac tccaatgtct gcgaatttgc
【００５１】
ura4リバースは、標的遺伝子のアンチセンス部を含み、片端に第４のプライマーに由来する連結部を含み、反対の端に、第３のプライマーに由来するターミネーター配列末端に相同な配列を２０ｂｐ程度有していた。
【００５２】
（２．２次ＰＣＲ）
図３は、ｐＣＳＴ３の制限酵素地図である。図３に示されるｐＣＳＴ３を制限酵素ＮｄｅＩと制限酵素ＢｇｄｌＩＩを用いて切断した。切断したｐＣＳＴ３（配列番号６）にura4フォワードとura4リバースとを結合させた。このｐＣＳＴ３を制限酵素ＮｄｅＩと制限酵素ＢｇｄｌＩＩを用いて切断したものを鋳型とし、第１のプライマー、及び第４のプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。このＰＣＲ反応における反応液は、上記の鋳型を２μｌ（１０ｎｇ／μｌ）、第１のプライマー１０μｌ（１ｐｍｏｌ／μｌ）、第４のプライマーを１０μｌ（１ｐｍｏｌ／μｌ）、１０倍バッファーを１０μｌ、ｄＮＴＰｓミックスを２μｌ、ura4フォワードと、ura4リバースとをそれぞれ２μｌ、酵素（Ｅｘ ｔａｑ）を２μｌ、及び蒸留水６０μｌを加え、１００μｌの液量としたものを用いた。ＰＣＲ反応は、９４℃で５分処理した後、９４℃で１０秒、４０℃で３０秒、６８℃で１分のサイクルを５回繰り返し、その後９４℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分のサイクルを２０回繰り返し、最後に６８℃５分の伸長反応を行った。このようにしてセンス部分、及びアンチセンス部分をその末端領域に含むポリペプチドを得た。
【００５３】
（３．連結工程）
上記のようにして得られたポリペプチドは、その両端に第１のプライマー、及び第４のプライマーに由来するリンカー配列部分を有している。このリンカー配列部分は、ともに制限酵素ＸｈｏＩによって切断される部分を有している。そこで、このポリペプチドをＱＩＡクイック（キアゲン社）により精製した後、末端付近をＮｈｅｌＩにより切断した。制限酵素反応は、ポリペプチド９０μｌ、１０倍バッファー２０μｌ、制限酵素Ｎｈｅｌ２μｌ、及び蒸留水８８μｌを用い、３７℃で２時間行った。その後、ＮｈｅｌＩを失活させるためにエタノールに沈殿させた。その後、７０％のエタノールで洗浄し、乾燥した。そして、ポリペプチド同士が結合することを防止するために、十分に希釈した状態でひとつのポリペプチドの切断された両方の末端部分同士を結合（ライゲーション）させた。この際に用いたリガーゼは、Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼであり、１６℃、一晩ライゲーションを行った。このようにして、環状のポリヌクレオチド（プラスミド）を大量に得た。図４は、実施例１で得られたプラスミドの制限酵素地図である。すなわち、本実施例により図４の制限酵素地図で示されるプラスミドをＰＣＲにより大量生産した。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明のベクターを用いれば、標的遺伝子の機能を阻害することにより、標的遺伝子の機能を解明することができる。したがって、本発明のベクターは、標的遺伝子の機能解明に有効に用いることができる。
【００５５】
本発明のベクター、及び本発明のベクターを用いて製造されたｄｓＲＮＡを細胞に導入することで、標的遺伝子の発現を抑えることができる。したがって、疾患関連の遺伝子を標的遺伝子として本発明のベクターを製造すれば、疾患関連の遺伝子の発現を抑えることができる。例えば、標的遺伝子として癌関連遺伝子を選択した場合、本発明のベクターを用いて製造されるｄｓＲＮＡは、癌関連遺伝子の発現を抑えることができるので、本発明のベクターは、ヒト、非ヒト哺乳類などの癌関連疾患の治療剤の製造や、遺伝子治療などに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、本発明のＲＮＡｉ誘導ベクターの概略図である。
【図２】図２は、プラスミド取得工程を説明するための図である。図２（ａ）は、第３の遺伝子断片の概略図を示す。図２（ｂ）は、第３の遺伝子断片を制限酵素により消化した遺伝子断片の概略図を示す。図２（ｃ）は、第３の遺伝子断片の制限酵素により消化した部分同士を結合させ、プラスミドを得る様子を示す図である。
【図３】図３は、ｐＣＳＴ３の制限酵素地図である。
【図４】図４は、実施例１で得られたプラスミドの制限酵素地図である。
【符号の説明】
【００５７】
１  ベクター
２  プロモーター部
３  センス部
４  連結部
５  アンチセンス部
６  ターミネーター部
７  第１の遺伝子断片
８  第２の遺伝子断片
９  制限酵素で切断された部分
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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