(57)【要約】【課題】トレハロース産生能とパンの製造に必要な発酵性を有する新規融合酵母を提供する。【解決手段】 発酵能が優れているワイン酵母とトレハロース産生野生酵母を親株とし、細胞融合法によって新規融合酵母を融合した。この融合酵母は、トレハロースを多量に産生し、またパン生地または冷凍パン生地製造時に添加した際に、十分な発酵性能を有するため、従来パン用酵母と同等の発酵力を有し、かつトレハロースを多量に含むパン生地、冷凍パン生地およびパンを得られる。得られた冷凍パン生地は新規融合酵母の産生するトレハロ−スの効果で従来のパン酵母を使用した場合よりも長期間の冷凍保存が可能となった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トレハロース産生能とパンを製造するために必要な発酵性との双方の性質を有する融合酵母。
【請求項２】
親株としてワイン酵母とトレハロース産生野生酵母を用い、細胞融合法によって融合させてなることを特徴とするトレハロース産生能とパンを製造するために必要な発酵性の双方の性質を有する融合酵母。
【請求項３】
乾燥した菌体にトレハロースを０．１〜７重量％含有し、低糖生地膨張力試験（パン用酵母試験法、日本イースト工業会）に使用して調製したパン生地の体積が２５０〜５００ｍｌである請求項１または２に記載の融合酵母。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合酵母を使用することを特徴とするパン生地とパンの製造方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合酵母を使用することを特徴とする冷凍パン生地とパンの製造方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合酵母を使用し、トレハロースを０．１重量％から５．０重量％含有することを特徴とするパン生地の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合酵母を使用し、トレハロースを０．１重量％から５．０重量％含有することを特徴とする冷凍パン生地の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合酵母を使用し、トレハロースを０．１重量％から５．０重量％含有することを特徴とするパンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規融合酵母及びそれを用いるパン生地、冷凍パン生地とパンの製造法に関する。更に詳細には、本発明に係る新規融合酵母は、トレハロース産生能にすぐれているだけでなくパンの製造に必要な発酵性にもすぐれているため、トレハロースを高濃度に含み、従来の酵母を使用した場合と同等の性能を有するパン生地、冷凍パン生地やパンの製造が可能となる。
【背景技術】
【０００２】
トレハロースはでんぷんの老化抑制効果、たんぱく質の変性抑制効果等のような機能をもち、スポンジ、麺類、卵焼き等に添加され、その用途が拡大されてきた。先行技術としては特許文献１〜５が知られている。
パンを製造する際の発酵性に優れた酵母としてはサッカロミセス ロゼイ（特許文献６）、サッカロミセス セレビシエＦＴＹ（ＦＲＹ−４１３）（特許文献７）、サッカロミセス セレビシエＩＡＭ４７２４（特許文献８）、サッカロミセス セレビシエＦＴＹ−３（特許文献９）、サッカロミセス セレビシエＫＹＦ（特許文献１０）等が知られているが、トレハロース産生能とパンを製造するために必要な発酵性の両方を有する酵母は知られていないのが現状である。
【特許文献１】特開平１１−４２０５７
【特許文献２】特開平１１―１８７０１
【特許文献３】特開平９−１０７８９９
【特許文献４】特開平７−７９６８９
【特許文献５】特表２００１−１９０２４８
【特許文献６】特公昭５９−２５５８４号
【特許文献７】特公昭５９−４８６０７号
【特許文献８】特公昭６３−５８５３６号
【特許文献９】特表２００１−５００４８０
【特許文献１０】特公平６−８７７７２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、機能性を有するトレハロースを大量に産生するとともにパン生地、冷凍パン生地およびパンを製造するために必要な発酵能を有する融合酵母を開発し、これを用いたパン生地およびパンの製造法を提供することにある。 
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記の問題点を解決すべく鋭意検討した結果、ワイン酵母とトレハロース産生野生酵母を親株とし、細胞融合法によって融合した融合酵母がトレハロースを多量に産成し、パン生地または冷凍パン生地に添加した際に十分な発酵性を有するため、従来酵母を用いた場合と同等の性能を有し、かつトレハロースを多量に含むパン生地、冷凍パン生地およびパンが得られることを見いだした。すなわち、本発明は次の［１］〜［６］である。
【０００５】
［１］ トレハロース産生能とパンを製造するために必要な発酵性との双方の性質を有する融合酵母。
【０００６】
［２］ 親株としてワイン酵母とトレハロース産生野生酵母を用い、細胞融合法によって融合させてなることを特徴とするトレハロース産生能とパンを製造するために必要な発酵性の双方の性質を有する融合酵母。
【０００７】
［３］  乾燥した菌体にトレハロースを０．１〜７重量％含有し、低糖生地膨張力試験（パン用酵母試験法、日本イースト工業会）に使用して調製したパン生地の体積が２５０〜５００ｍｌである［１］または［２］のいずれか１項に記載の融合酵母。
【０００８】
［４］  ［１］〜［３］のいずれか１項に記載の融合酵母を使用することを特徴とするパン生地とパンの製造方法。
【０００９】
［５］  ［１］〜［３］のいずれか１項に記載の融合酵母を使用することを特徴とする冷凍パン生地とパンの製造方法。
【００１０】
［６］  ［１］〜［３］のいずれか１項に記載の融合酵母を使用し、トレハロースを０．１重量％から５．０重量％含有することを特徴とするパン生地の製造方法。
【００１１】
［７］  ［１］〜［３］のいずれか１項に記載の融合酵母を使用し、トレハロースを０．１重量％から５．０重量％含有することを特徴とする冷凍パン生地の製造方法。
【００１２】
［８］  ［１］〜［３］のいずれか１項に記載の融合酵母を使用し、トレハロースを０．１重量％から５．０重量％含有することを特徴とするパンの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ワイン酵母とトレハロース産生野生酵母を親株とし、細胞融合法によって融合することを特徴とする、トレハロースを多量に産成し、パン生地または冷凍パン生地に添加した際に十分な発酵性有し、従来酵母を用いた場合と同等の性能を有し、かつトレハロースを多量に含むパン生地、冷凍パン生地およびパンを製造することができる融合酵母とその利用法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明に用いるワイン酵母としては、（財）日本醸造協会が保有するワイン用酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅＯＣ−２（協会１号）、清酒用酵母協会７号等を用いることができるが、最も適したものはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅＷ３（協会４号）である。
【００１５】
本発明に用いるトレハロース産生野生酵母は自然界から分離して使用する。すなわち、自然落下した果物、果樹園内の土壌、湖水を分離源にして、下記の方法で、酵母を単離した。すなわち分離源を滅菌水にて適宜希釈後、改変ＹＭプレ−ト(グルコ−ス１％、酵母エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、麦芽エキス０．３％、クロラムフェニコ−ル０．０１％、プロピオン酸ナトリウム０．０２５％)へ塗抹し、２０℃で３日間培養した後、発生したコロニ−から釣菌した。ＬＦ培地(グルコ−ス１．０％、シュ−クロ−ス３．０％、マルト−ス3.0%、硫酸アンモニウム０．２５％、尿素０．５％、リン酸カリウム１．６％、リン酸ナトリウム１２水０．５％、硫酸マグネシウム０．０６％、ニコチン酸２２．５ppm、パントテン酸５．０ppm、チアミン２．５ppm、ピリドキシン１．２５ppm、リボフラビン１．０ppm、葉酸０．５ppm)にて３０℃で３時間培養し、遠心分離後ホモジナイザ−で菌体を破砕し、凍結乾燥後に７０℃にて環流抽出した。結果、菌体中のトレハロースが２．０重量％以上含有する野生酵母を本発明に用いることができる。
【００１６】
細胞融合は、常法によって行えばよく、好ましい細胞融合促進剤としては、例えば、平均分子量が１０００〜６０００程度のポリエチレングリコールを浸透圧調整剤に対して２０〜５０％、好ましくは２５〜５０％の濃度で添加し、室温〜３７℃、ｐＨ５．５〜８．０の条件下で、プロトプラスト化した親株を加えて約１時間攪拌融合し、次いで各酵母の栄養要求性を利用した選択培地、例えばビタミンフリ−培地（Ｄｉｆｃｏ社製品）を用いてトレハロース産生能とパンを製造するために必要な発酵性の両方の性質を有する融合株を選択、育種すればよい。なお、細胞融合処理は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法によるほか、電気パルスによる融合も可能である。
【００１７】
本発明の融合酵母は菌体内に乾燥物換算で０．５〜１０重量％のトレハロースを蓄積する。蓄積量が０．５重量％未満では、生地に添加した際に機能性や冷凍耐性を付与することができない。また、蓄積量が１０重量％より大きくなると発酵能が落ちたり、酵母の発育が遅くなり好ましくない。
【００１８】
本発明の融合酵母を用いたパン生地およびパンの調製法は、例えば以下の通りである。すなわち、小麦粉、砂糖、食塩、ショートニング、イーストフード、本発明の融合酵母を混捏後、発酵した生地を分割し、ベンチタイムをとってパン生地とする。パン生地を成形後、ホイロで発酵したのち、オーブンで焼成する。融合酵母の添加法としてストレート法、中種法のいずれを用いても、本発明の融合酵母は機能性を付与するために必要なトレハロースの産生能とパンを製造するために十分な発酵能を有する。
【００１９】
本発明の融合酵母は、上記の方法以外に、冷凍生地に添加して利用することができる。冷凍生地への使用方法として、通常ストレート法と中種法がある。ストレート法では生地を調整後、一次発酵、分割、成形した後冷凍する（例えば−２０〜−３０℃）。中種法では、一部の生地材料で生地を調製後中種発酵を行い、残りの生地材料を加えて生地を調製し、分割、成形した後冷凍する。この生地を解凍後最終発酵し焼成してパンとする。パンの製造法については、種々の資料があり「各種製パン法」（雁瀬大二郎著）、「冷凍生地の理論と実際」（田中康夫著）、「製パンプロセスの科学」（田中康夫著）などの成書を参考にすることができる。本発明の融合酵母は、冷凍生地に使用した場合も、パン生地中に十分なトレハロースを産生し、十分な発酵性を示すので、できあがったパン生地、パンの性能は従来の酵母を用いた場合と同等である。
【００２０】
本発明の融合酵母は、冷凍生地に添加したときに、０．１〜５．０重量％のトレハロースを産生する。トレハロース含量が０．１重量％未満では冷凍耐性を付与することができない。また、トレハロース含量が５．０重量％以上になると、当該パン生地を用いて製造したパンの食味が変化するので好ましくない。
【００２１】
本発明の融合酵母を添加してパン生地を調製したときに以下の冷凍耐性が得られる。すなわち、市販冷凍耐性パン酵母を用いて調製したパン生地を−２０℃で１４日間保存し、焼成したパンの冷凍耐性能（貯蔵冷凍生地で焼成したパンの体積／非冷凍生地で焼成したパンの体積×１００）が８０であるのに対し本発明の融合酵母を用いて調製したパンの冷凍耐性能は８９であり、冷凍耐性が認められる。
【００２２】
本発明の融合酵母を用いて、上記の方法でパンは０．１〜５．０重量％のトレハロースを含有する。トレハロース含量が０．１重量％未満では目的とする機能性を付与することができない。また、トレハロース含量が５．０重量％以上になると、パンの食味が変化するので好ましくない。
【００２３】
次に試験例、実施例、比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明する。以下の記載において、「％」は特に断らない限り「重量％」を意味する。
【００２４】
試験例１、トレハロースの測定
酵母を遠心分離後ホモジナイザ−で破砕し、凍結乾燥後に７０℃にて環流抽出した。パン生地とパンは凍結乾燥後に７０℃にて環流抽出した。各サンプル中のトレハロース量を高速液体クロマトグラフ（カラム:Ｆｉｎｅｐａｋ  ＳＩＬ ＮＨ２（４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／リン酸＝８０／１７／３、流量：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出器：示差屈折計検出器  Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＥ−３１）を用いて定量した。あらかじめ作成した検量線と測定値を比較して、菌体、パン生地、パン中のトレハロース含量（重量％）を求めた。
【００２５】
試験例２、トレハロース産生野生酵母の分離
群馬県箕郷町の梅林の土を殺菌水にて１０００倍に希釈後、改変ＹＭプレ−ト(グルコ−ス１％、酵母エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、麦芽エキス０．３％、クロラムフェニコ−ル０．０１％、プロピオン酸ナトリウム０．０２５％)へ塗抹し、２０℃で３日間培養した。出てきたコロニ−の中から約７０００株を釣菌し、ＬＦ培地(グルコ−ス１．０％、シュ−クロ−ス３．０％、マルト−ス3.0%、硫酸アンモニウム０．２５％、尿素０．５％、リン酸カリウム１．６％、リン酸ナトリウム１２水０．５％、硫酸マグネシウム０．０６％、ニコチン酸２２．５ppm、パントテン酸５．０ppm、チアミン２．５ppm、ピリドキシン１．２５ppm、リボフラビン１．０ppm、葉酸０．５ppm)にて３０℃で３時間培養した酵母を遠心分離後ホモジナイザ−で破砕し、凍結乾燥後に７０℃にて環流抽出した。結果、菌体中のトレハロースが３．５重量％以上含有する野生酵母を本発明に用いることができる。
【００２６】
試験例３  融合株の作製
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅＷ３（協会４号）と試験例２の株をそれぞれ５ｍｌのＹＰＤ培地（ペプトン２％、酵母エキス１％、グルコース２％）に接種し、３０℃で２４時間、振とう培養し培養液を調製した。培養液０．１ｍｌをそれぞれ５ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、３０℃で１７時間、振とう培養した。培養したそれぞれの酵母を集菌洗浄後、２．５％ベータ−メルカプトエタノール、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、塩化カリウム０．４５Ｍを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．５)１０ｍｌに酵母菌数が２ｘ１０7ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁し、３５℃で３０分間振とう処理した。振とう処理後、集菌し、２．５％ベータ−メルカプトエタノール、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ザイモリエース２０Ｔ（キリンビール（株）製）５ｍｇ／ｍｌ、グルコ−ス２．５ｍｇ／ｍｌ、および塩化カリウム０．４５Ｍを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０ml中で３５℃、６０分間反応させ、それぞれの酵母のプロトプラスト化を行った。反応後、融合緩衝液（０．７Ｍソルビトール、塩化カルシウム０．１ｍＭ、塩化マグネシウム０．１ｍＭを含む０．２ｍＭトリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．５)）で洗浄し、融合緩衝液に再懸濁し、プロトプラスト化した両酵母を遠心分離した。次に、それぞれのプロトプラストの濃度を５×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍｌに融合緩衝液で調整した懸濁液を１：１に混合して細胞融合装置（島津製作所（株））にて細胞融合処理を行った。処理菌体を融合緩衝液を含む選択培地（Ｄｉｆｃｏ社：ビタミンフリ−培地、グルコース２％、寒天２％）に塗布し、同培地を重層した。３０℃で１０日間培養し、生育したコロニーを融合体とした。
【００２７】
プロトプラスト融合の結果、融合体と思われる株が２０６株得られ、融合頻度は２．３ｘ１０-7となった。２０６株の内、トレハロース産成能と発酵能の高い酵母１株を最終的に選択した。
【実施例１】
【００２８】
トレハロースの製造
ＬＦ培地(グルコ−ス１．０％、シュ−クロ−ス３．０％、マルト−ス３．０％、硫酸アンモニウム０．２５％、尿素０．５％、リン酸カリウム１．６％、リン酸ナトリウム１２水０．５％、硫酸マグネシウム０．０６％、ニコチン酸２２．５ppm、パントテン酸５．０ppm、チアミン２．５ppm、ピリドキシン１．２５ppm、リボフラビン１．０ppm、葉酸０．５ppm)に本発明の融合酵母を接種し、３０℃で３時間培養した。増殖した融合酵母を遠心分離後ホモジナイザ−で破砕し、凍結乾燥後に７０℃で水にて環流抽出した。抽出液中のトレハロース含量は高速液体クロマトグラフにて分析した。酵母の乾燥重量あたりのトレハロース含量を表１に示した。
【実施例２】
【００２９】
パン用酵母試験法（日本イースト工業会）によるパン生地とパンの製造
以下の方法で本発明の融合酵母を用いたパン生地、パンを製造した。すなわち、小麦粉１Ｋｇ、砂糖５０ｇ、食塩２０ｇ、酵母２０ｇを混捏後、３０℃で２時間発酵した生地を分割し、３０分のベンチタイムをとった。生地を成形後、３８℃で生地が型から０．５ｃｍ出るまで発酵してから２００℃で３０分間焼成した。できあがったパンの体積、生地とパン中のトレハロース含量を表２に示した。また酵母の発酵力比較のために混捏後の生地を１５０ｇに分割し、５００ｍｌシリンダ−中において３０℃で１４０分間発酵後の体積を測定して表２に示した。
【実施例３】
【００３０】
本発明の融合酵母を用いて、次の方法で冷凍パン生地を調製した。すなわち、原料として小麦粉１Ｋｇ、砂糖１２０ｇ、食塩１７ｇ、脱脂粉乳３０ｇ、無塩マ−ガリン１５０ｇ、卵１５０ｇ、イ−ストフ−ド１ｇ、酵母 ３０ｇ、水 ４１５ｍｌを用い、ミキシング 低速１分間、中低速６分間、高速２分間、こね上げ温度 ３０℃でパン生地を調製した。調製したパン生地を３０℃、２時間発酵した後、２５０ｇに分割した。できあがった生地を−２０℃で冷凍した。冷凍開始後１、２、および４週間後に３０℃で２時間解凍し、ワンロ−フに成型した後３８℃で発酵してから２００℃で２０分間焼成して体積とトレハロース含量を測定した。表３に本発明の融合酵母の冷凍後の発酵力とトレハロース含量を示した。
【００３１】
比較例１〜３
実施例１と同じ方法で、本発明の融合酵母の代わりに（財）日本醸造協会保存ワイン酵母Ｗ３株、試験例３で分離したトレハロース産生野生酵母または市販の冷凍耐性パン酵母（冷凍耐性酵母ＦＴ−３、協和発酵工業（株）製品）を単独で用いてトレハロースの製造を行った。結果を表１に併せて示した。
【００３２】
比較例４〜６
醸造協会ワイン酵母Ｗ３、試験例２で得たトレハロース産生野生酵母、市販の冷凍耐性パン酵母（協和発酵工業（株）製）を用いて、実施例２と同じ方法でパン生地とパンを製造した。できあがったパンの体積、生地とパン中のトレハロース含量を表２に併せて示した。
【００３３】
比較例７〜９
醸造協会ワイン酵母Ｗ３、試験例２で得たトレハロース産生野生酵母、市販の冷凍耐性パン酵母（協和発酵工業（株）製）を用いて、実施例３と同じ方法で冷凍生地を製造した。表３に本発明の融合酵母の冷凍後の発酵力とトレハロース含量を示した。
【００３４】
【表１】
2005073622.tif 000002
【００３５】
【表２】
2005073622.tif 000003
【００３６】
【表３】
2005073622.tif 000004
【００３７】
表１〜３に示されるように、本発明の融合酵母は、親株や市販の冷凍耐性酵母と比較して優れたトレハロ−ス産生能と冷凍生地解凍後の充分な発酵能が認められる。