(57)【要約】【課題】  被検試料中に存在する標的塩基配列を高い感度および特異性をもって検出する簡便な方法、標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出する簡便な方法、およびこれらの方法に用いられるプローブを提供すること。【解決手段】  標的塩基配列と塩基対形成したときに、第１、第２および第３のステム構造を含むマルチウェイジャンクション構造を形成しうる核酸プローブであって、標的塩基配列の第１のアームと塩基対形成して第１のステム構造を形成しうる配列；分子内で塩基対形成して、制限酵素認識配列を含む第３のステム構造を形成しうる配列；および標的塩基配列の第２のアームと塩基対形成して第２のステム構造を形成しうる配列、の各配列を順に含むことを特徴とするプローブ。【選択図】図５
2005118031.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的塩基配列と塩基対形成したときに、第１、第２および第３のステム構造を含むマルチウェイジャンクション構造を形成しうる核酸プローブであって、
標的塩基配列の第１のアームと塩基対形成して第１のステム構造を形成しうる配列；
分子内で塩基対形成して、制限酵素認識配列を含む第３のステム構造を形成しうる配列；および
標的塩基配列の第２のアームと塩基対形成して第２のステム構造を形成しうる配列
の各配列を順に含むことを特徴とするプローブ。
【請求項２】
標的塩基配列と塩基対形成したときに、第１、第２および第３のステム構造を含むマルチウェイジャンクション構造を形成しうる１対の核酸プローブであって、
第１のプローブは、標的塩基配列の第１のアームと塩基対形成して第１のステム構造を形成しうる配列を含み、
第２のプローブは、標的塩基配列の第２のアームと塩基対形成して第２のステム構造を形成しうる配列を含み、
第１のプローブおよび第２のプローブは、互いに塩基対形成して、制限酵素認識配列を含む第３のステム構造を形成しうる配列を含む
ことを特徴とするプローブ。
【請求項３】
標的塩基配列と塩基対形成したときに、第１、第２および第３のステム構造を含むマルチウェイジャンクション構造を形成しうる１対の核酸プローブであって、
第１のプローブは、
標的塩基配列の第１のアームと塩基対形成して第１のステム構造を形成しうる配列；
制限酵素により認識される二本鎖配列の（＋）鎖配列；
スペーサー配列；および
制限酵素により認識される二本鎖配列の（−）鎖配列の一部
の各配列を順に含み、
第２のプローブは、
標的塩基配列の第２のアームと塩基対形成して第２のステム構造を形成しうる配列；および
制限酵素により認識される二本鎖配列の（−）鎖配列の一部
の各配列を順に含み、
第１のプローブおよび第２のプローブは、互いに塩基対形成して、ニックを有する制限酵素認識配列を含む第３のステム構造を形成することができる、
ことを特徴とするプローブ。
【請求項４】
蛍光分子および消光分子を有しており、前記蛍光分子および前記消光分子は、第３のステム構造が制限酵素により切断されたときに、前記蛍光分子を含むフラグメントと前記消光分子を含むフラグメントとが分離されるような位置に修飾されていることを特徴とする、請求項１−３のいずれかに記載のプローブ。
【請求項５】
被検試料中の標的塩基配列を検出する方法であって、
（ａ）被検試料と、請求項１−３のいずれかに記載の核酸プローブまたは１対の核酸プローブとを接触させ；
（ｂ）前記制限酵素認識配列を認識して切断しうる制限酵素を作用させ；そして
（ｃ）切断産物の存在または量を測定することにより標的塩基配列を検出する；
の各工程を含む方法。
【請求項６】
被検試料中の標的塩基配列を検出する方法であって、
（ａ）被検試料と、請求項４記載の核酸プローブまたは１対の核酸プローブとを接触させ；
（ｂ）前記制限酵素認識配列を認識して切断しうる制限酵素を作用させ；そして
（ｃ）蛍光強度の変化を測定することにより標的塩基配列を検出する；
の各工程を含む方法。
【請求項７】
請求項１−４のいずれかに記載の核酸プローブを含む、標的塩基配列を検出するためのキット。
【請求項８】
前記制限酵素認識配列を認識して切断しうる制限酵素をさらに含む、請求項７記載のキット。
【請求項９】
標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出するための１対の核酸プローブであって、
前記プローブは、標的塩基配列と塩基対形成したときに、第１、第２および第３のステム構造を含むマルチウェイジャンクション構造を形成することができ、
第１のプローブは、標的塩基配列の標的塩基を含まない第１のアームと塩基対形成して第１のステム構造を形成しうる配列を含み、
第２のプローブは、標的塩基配列の標的塩基を含む第２のアームと塩基対形成して第２のステム構造を形成しうる配列を含み、
第１のプローブおよび第２のプローブは、互いに塩基対形成して、制限酵素認識配列を含む第３のステム構造を形成しうる配列を含む
ことを特徴とするプローブ。
【請求項１０】
標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出するための１組の核酸プローブであって、
前記プローブは、標的塩基配列と塩基対形成したときに、第１、第２、第３および第４のステム構造を含むマルチウェイジャンクション構造を形成することができ、
第１のプローブは、標的塩基配列の標的塩基を含まない第１のアームと塩基対形成して第１のステム構造を形成しうる配列を含み、
第２のプローブは、標的塩基配列の標的塩基を含む第２のアームと塩基対形成して第２のステム構造を形成しうる配列を含み、
第３のプローブは、第１のプローブと互いに塩基対形成して制限酵素認識配列を含む第３のステム構造を形成しうる配列、および第２のプローブと互いに塩基対形成して第４のステム構造を形成しうる配列を含む、
ことを特徴とするプローブ。
【請求項１１】
標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出するための１組の核酸プローブであって、
前記プローブは、標的塩基配列と塩基対形成したときに、第１、第２、第３および第４のステム構造を含むマルチウェイジャンクション構造を形成することができ、
第１のプローブは、標的塩基配列の標的塩基を含まない第１のアームと塩基対形成して第１のステム構造を形成しうる配列を含み、
第２のプローブは、標的塩基配列の標的塩基を含む第２のアームと塩基対形成して第２のステム構造を形成しうる配列を含み、
第３のプローブは、第１のプローブと互いに塩基対形成して第３のステム構造を形成しうる配列、および第２のプローブと互いに塩基対形成して制限酵素認識配列を含む第４のステム構造を形成しうる配列を含む、
ことを特徴とするプローブ。
【請求項１２】
標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出するための１対の核酸プローブであって、
前記プローブは、標的塩基配列と塩基対形成したときに、第１、第２および第３のステム構造を含むマルチウェイジャンクション構造を形成することができ、
第１のプローブは、
標的塩基配列の標的塩基を含まない第１のアームと塩基対形成して第１のステム構造を形成しうる配列；
制限酵素により認識される二本鎖配列の（＋）鎖配列；
スペーサー配列；および
制限酵素により認識される二本鎖配列の（−）鎖配列の一部
の各配列を順に含み、
第２のプローブは、
標的塩基配列の標的塩基を含む第２のアームと塩基対形成して第２のステム構造を形成しうる配列；および
制限酵素により認識される二本鎖配列の（−）鎖配列の一部
の各配列を順に含み、
第１のプローブおよび第２のプローブは、互いに塩基対形成して、ニックを有する制限酵素認識配列を含む第３のステム構造を形成することができる、
ことを特徴とするプローブ。
【請求項１３】
蛍光分子および消光分子を有しており、前記蛍光分子および前記消光分子は、第３または第４のステム構造が制限酵素により切断されたときに、前記蛍光分子を含むフラグメントと前記消光分子を含むフラグメントとが分離されるような位置に修飾されていることを特徴とする、請求項９−１２のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１４】
標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出する方法であって、
（ａ）被検試料と、請求項９−１２のいずれかに記載の核酸プローブとを接触させ；
（ｂ）前記制限酵素認識配列を認識して切断しうる制限酵素を作用させ；そして
（ｃ）切断産物の存在または量を測定することにより一塩基変異を検出する；
の各工程を含む方法。
【請求項１５】
標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出する方法であって、
（ａ）被検試料と、請求項１３に記載の核酸プローブとを接触させ；
（ｂ）前記制限酵素認識配列を認識して切断しうる制限酵素を作用させ；そして
（ｃ）蛍光強度の変化を測定することにより一塩基変異を検出する；
の各工程を含む方法。
【請求項１６】
請求項９−１３のいずれかに記載の核酸プローブを含む、標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出するためのキット。
【請求項１７】
前記制限酵素認識配列を認識して切断しうる制限酵素をさらに含む、請求項１６記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検試料中に存在する標的塩基配列を検出する方法、および標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出する方法、ならびにこれらの方法に用いるプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
被検試料中に存在する標的塩基配列を検出する方法としては、標的塩基配列に特異的なプローブを用いてハイブリダイゼーションにより検出する方法、標的塩基配列に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ等による増幅反応を行い、増幅産物を検出する方法、特定の配列の二本鎖ＤＮＡを特異的に認識しうる蛋白質を用いる方法など、多くの方法が知られている。また、核酸アプタマーを用いて標的塩基配列を検出する方法も開示されている（WO01/44509）。この方法においては、標的塩基配列とプローブとをハイブリダイゼーションさせて核酸アプタマーを生成させ、標的塩基配列の有無によってアプタマーとリガンドとの結合親和性が相違することに基づいて標的塩基配列を検出する。
【０００３】
しかし、被検試料中に少量で存在する特定の標的塩基配列を高い感度で特異的に検出することは依然として困難である。したがって、当該技術分野においては、標的塩基配列の検出に用いることができるさらに別の方法が求められている。
【特許文献１】WO01/44509
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、被検試料中に存在する標的塩基配列を高い感度および特異性をもって検出する簡便な方法、およびこの方法に用いられるプローブを提供することを目的とする。本発明はまた、標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出する簡便な方法、およびこの方法に用いられるプローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、標的塩基配列と塩基対形成したときに、第１、第２および第３のステム構造を含むマルチウェイジャンクション構造を形成しうる核酸プローブを提供する。該プローブは、
標的塩基配列の第１のアームと塩基対形成して第１のステム構造を形成しうる配列；
分子内で塩基対形成して、制限酵素認識配列を含む第３のステム構造を形成しうる配列；および
標的塩基配列の第２のアームと塩基対形成して第２のステム構造を形成しうる配列
の各配列を順に含むことを特徴とする。１つの態様においては、該プローブは蛍光分子および消光分子を有しており、該蛍光分子および該消光分子は、第３のステム構造が制限酵素により切断されたときに、該蛍光分子を含むフラグメントと該消光分子を含むフラグメントとが分離されるような位置に修飾されている。
【０００６】
別の観点においては、本発明は、標的塩基配列と塩基対形成したときに、第１、第２および第３のステム構造を含むマルチウェイジャンクション構造を形成しうる１対の核酸プローブであって、
第１のプローブは、標的塩基配列の第１のアームと塩基対形成して第１のステム構造を形成しうる配列を含み、
第２のプローブは、標的塩基配列の第２のアームと塩基対形成して第２のステム構造を形成しうる配列を含み、
第１のプローブおよび第２のプローブは、互いに塩基対形成して、制限酵素認識配列を含む第３のステム構造を形成しうる配列を含む
ことを特徴とするプローブを提供する。１つの態様においては、第１のプローブは蛍光分子および消光分子を有しており、該蛍光分子および該消光分子は、第３のステム構造が制限酵素により切断されたときに、該蛍光分子を含むフラグメントと該消光分子を含むフラグメントとが分離されるような位置に修飾されている。
【０００７】
また別の観点においては、本発明は、標的塩基配列と塩基対形成したときに、第１、第２および第３のステム構造を含むマルチウェイジャンクション構造を形成しうる１対の核酸プローブであって、
第１のプローブは、
標的塩基配列の第１のアームと塩基対形成して第１のステム構造を形成しうる配列；
制限酵素により認識される二本鎖配列の（＋）鎖配列；
スペーサー配列；および
制限酵素により認識される二本鎖配列の（−）鎖配列の一部
の各配列を順に含み、
第２のプローブは、
標的塩基配列の第２のアームと塩基対形成して第２のステム構造を形成しうる配列；および
制限酵素により認識される二本鎖配列の（−）鎖配列の一部
の各配列を順に含み、
第１のプローブおよび第２のプローブは、互いに塩基対形成して、ニックを有する制限酵素認識配列を含む第３のステム構造を形成することができる、
ことを特徴とするプローブを提供する。１つの態様においては、第１のプローブは蛍光分子および消光分子を有しており、該蛍光分子および該消光分子は、第３のステム構造が制限酵素により切断されたときに、該蛍光分子を含むフラグメントと該消光分子を含むフラグメントとが分離されるような位置に修飾されている。
【０００８】
また別の観点においては、本発明は、被検試料中の標的塩基配列を検出する方法を提供する。該方法は、
（ａ）被検試料と、本発明の核酸プローブまたは１対の核酸プローブとを接触させ；
（ｂ）該制限酵素認識配列を認識して切断しうる制限酵素を作用させ；そして
（ｃ）切断産物の存在または量を測定することにより標的塩基配列を検出する；
の各工程を含む。別の態様においては、被検試料中の標的塩基配列を検出する本発明の方法は、
（ａ）被検試料と、本発明の核酸プローブまたは１対の核酸プローブとを接触させ；
（ｂ）該制限酵素認識配列を認識して切断しうる制限酵素を作用させ；そして
（ｃ）蛍光強度の変化を測定することにより標的塩基配列を検出する；
の各工程を含む。
【０００９】
さらに別の態様においては、本発明は、上述の本発明の核酸プローブを含む、標的塩基配列を検出するためのキットを提供する。好ましくは、該キットは該制限酵素認識配列を認識して切断しうる制限酵素をさらに含む。
【００１０】
また別の観点においては、本発明は、標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出するための１対の核酸プローブであって、
前記プローブは、標的塩基配列と塩基対形成したときに、第１、第２および第３のステム構造を含むマルチウェイジャンクション構造を形成することができ、
第１のプローブは、標的塩基配列の標的塩基を含まない第１のアームと塩基対形成して第１のステム構造を形成しうる配列を含み、
第２のプローブは、標的塩基配列の標的塩基を含む第２のアームと塩基対形成して第２のステム構造を形成しうる配列を含み、
第１のプローブおよび第２のプローブは、互いに塩基対形成して、制限酵素認識配列を含む第３のステム構造を形成しうる配列を含む
ことを特徴とするプローブを提供する。１つの態様においては、第１のプローブは蛍光分子および消光分子を有しており、該蛍光分子および該消光分子は、第３のステム構造が制限酵素により切断されたときに、該蛍光分子を含むフラグメントと該消光分子を含むフラグメントとが分離されるような位置に修飾されている。
【００１１】
また別の観点においては、本発明は、標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出するための１組の核酸プローブであって、
前記プローブは、標的塩基配列と塩基対形成したときに、第１、第２、第３および第４のステム構造を含むマルチウェイジャンクション構造を形成することができ、
第１のプローブは、標的塩基配列の標的塩基を含まない第１のアームと塩基対形成して第１のステム構造を形成しうる配列を含み、
第２のプローブは、標的塩基配列の標的塩基を含む第２のアームと塩基対形成して第２のステム構造を形成しうる配列を含み、
第３のプローブは、第１のプローブと互いに塩基対形成して制限酵素認識配列を含む第３のステム構造を形成しうる配列、および第２のプローブと互いに塩基対形成して第４のステム構造を形成しうる配列を含む、
ことを特徴とするプローブを特徴とする。１つの態様においては、第３のプローブは蛍光分子および消光分子を有しており、該蛍光分子および該消光分子は、第３のステム構造が制限酵素により切断されたときに、該蛍光分子を含むフラグメントと該消光分子を含むフラグメントとが分離されるような位置に修飾されている。
【００１２】
また別の観点においては、本発明は、標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出するための１組の核酸プローブであって、
前記プローブは、標的塩基配列と塩基対形成したときに、第１、第２、第３および第４のステム構造を含むマルチウェイジャンクション構造を形成することができ、
第１のプローブは、標的塩基配列の標的塩基を含まない第１のアームと塩基対形成して第１のステム構造を形成しうる配列を含み、
第２のプローブは、標的塩基配列の標的塩基を含む第２のアームと塩基対形成して第２のステム構造を形成しうる配列を含み、
第３のプローブは、第１のプローブと互いに塩基対形成して第３のステム構造を形成しうる配列、および第２のプローブと互いに塩基対形成して制限酵素認識配列を含む第４のステム構造を形成しうる配列を含む、
ことを特徴とするプローブを提供する。１つの態様においては、第３のプローブは蛍光分子および消光分子を有しており、該蛍光分子および該消光分子は、第３のステム構造が制限酵素により切断されたときに、該蛍光分子を含むフラグメントと該消光分子を含むフラグメントとが分離されるような位置に修飾されている。
【００１３】
また別の観点においては、本発明は、標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出するための１対の核酸プローブであって、
該プローブは、標的塩基配列と塩基対形成したときに、第１、第２および第３のステム構造を含むマルチウェイジャンクション構造を形成することができ、
第１のプローブは、
標的塩基配列の標的塩基を含まない第１のアームと塩基対形成して第１のステム構造を形成しうる配列；
制限酵素により認識される二本鎖配列の（＋）鎖配列；
スペーサー配列；および
制限酵素により認識される二本鎖配列の（−）鎖配列の一部
の各配列を順に含み、
第２のプローブは、
標的塩基配列の標的塩基を含む第２のアームと塩基対形成して第２のステム構造を形成しうる配列；および
制限酵素により認識される二本鎖配列の（−）鎖配列の一部
の各配列を順に含み、
第１のプローブおよび第２のプローブは、互いに塩基対形成して、ニックを有する制限酵素認識配列を含む第３のステム構造を形成することができる、
ことを特徴とするプローブを提供する。１つの態様においては、第１のプローブは蛍光分子および消光分子を有しており、該蛍光分子および該消光分子は、第３のステム構造が制限酵素により切断されたときに、該蛍光分子を含むフラグメントと該消光分子を含むフラグメントとが分離されるような位置に修飾されている。
【００１４】
さらに別の観点においては、本発明は、標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出する方法を提供する。該方法は、
（ａ）被検試料と、上述の核酸プローブとを接触させ；
（ｂ）該制限酵素認識配列を認識して切断しうる制限酵素を作用させ；そして
（ｃ）切断産物の存在または量を測定することにより一塩基変異を検出する；
の各工程を含む。別の態様においては、標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出する本発明の方法は、
（ａ）被検試料と、上述の本発明の核酸プローブとを接触させ；
（ｂ）該制限酵素認識配列を認識して切断しうる制限酵素を作用させ；そして
（ｃ）蛍光強度の変化を測定することにより一塩基変異を検出する；
の各工程を含む。
【００１５】
さらに別の態様においては、本発明は、上述の本発明の核酸プローブを含む、標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出するためのキットを提供する。好ましくは、該キットは該制限酵素認識配列を認識して切断しうる制限酵素をさらに含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明において、「マルチウェイジャンクション構造」とは、３本以上の核酸鎖が相互に二本鎖を形成することによって生ずる交差構造をいい、スリーウェイジャンクション構造、フォーウェイジャンクション構造、ファイブウェイジャンクション構造等が含まれる。図１はスリーウェイジャンクションの一般的な構造を示す。「スリーウェイジャンクション」とは、３本の核酸鎖が相互に二本鎖を形成することによって、３つの二本鎖核酸が１ヶ所で交差した構造をいう。すなわち、３本のステム（二本鎖）が１ヶ所で交差しており、６つの塩基による３組の相補塩基対がジャンクション部分を構成する。標的塩基配列とプローブとがスリーウェイジャンクション構造を形成するとリガンドとの結合親和性が高まることに基づいて標的塩基配列を検出する方法が報告されているが（WO01/44509）、本発明は、この方法とは全く異なる原理に基づくものである。すなわち、本発明は、リガンドを使用せず、制限酵素による切断を指標として、マルチウェイジャンクション構造の形成を検出することを特徴とする。以下に、スリーウェイジャンクション構造を例として、図面を参照しながら本発明の構成および効果を詳細に説明するが、フォーウェイジャンクション構造、ファイブウェイジャンクション構造等のマルチウェイジャンクション構造についても、本明細書の教示にしたがって、第１、第２および第３のステム構造を設計しうることが明らかであろう。
【００１７】
図２は本発明の核酸プローブの第１の態様を示す。本発明において「核酸プローブ」とは、天然の核酸または非天然の核酸からなり、標的核酸と相補的塩基対形成により結合することができるプローブを意味し、例えば、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ＰＮＡプローブが含まれる。本発明の核酸プローブ１０は、被検試料中の標的塩基配列１００と塩基対形成したときに、第１のステム構造１２、第２のステム構造１４および第３のステム構造１６からなるスリーウェイジャンクション構造を形成する。「被検試料」とは、標的塩基配列が存在するか否かを判定することが望まれる試料を指し、代表的には、生体試料（例えば全血、血漿、血清、尿、体液、唾液など）や、動物又は植物の細胞又は組織の培養物など、核酸を含有するものであれば特に限定されない。被検試料は、当技術分野で周知の方法を適宜使用して調製することができる。一般的には、被検試料はＤＮＡを抽出して調製する。例えば、フェノール抽出及びエタノール沈殿を行う方法、ガラスビーズを用いる方法などによりＤＮＡを抽出することができる。あるいは、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、又はＡＧＰＣ法などを利用してＲＮＡを抽出した後に、これをテンプレートとして逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成してもよい。「標的塩基配列」とは、検出が望まれる特定の配列を含む塩基配列を指し、そのような検出が望まれる特定の配列としては、例えばウイルス、細菌、真菌、動物、植物などのゲノムＤＮＡ中の特定の配列、ヒトのゲノムＤＮＡ中の多型配列、ならびに、被検試料中で発現されているＲＮＡ中の特定の配列などが挙げられる。本発明においては、標的塩基配列は、ジャンクション部分に位置すべき部位から上流側および下流側にそれぞれアームを有する構造として表され、本明細書においては、これらのアームを「第１のアーム」および「第２のアーム」と称する。「塩基対形成」とは、２本の相補的な核酸配列が互いに水素結合によりワトソン−クリック結合を形成することをいう。
【００１８】
第１の態様においては、本発明の核酸プローブ１０は、３’から５’方向に、標的塩基配列１００の第１のアーム１０２と塩基対形成して第１のステム構造１２を形成しうる配列、分子内で塩基対形成して制限酵素認識配列１８を含む第３のステム構造１６を形成しうる配列、および標的塩基配列の第２のアーム１０４と塩基対形成して第２のステム構造１４を形成しうる配列、の各配列を順に含むよう設計される。この配列の順序は５’から３’方向であってもよいことが理解されるであろう。標的塩基配列１００が存在するとき、特定の温度において、本発明の核酸プローブ１０と標的塩基配列１００のそれぞれのアームとが塩基対形成して、第１のステム構造１２および第２のステム構造１４が形成され、さらに、核酸プローブの分子内塩基対形成により第３のステム構造１６が形成され、このことによりスリーウェイジャンクション構造が形成される。好ましくは、核酸プローブの分子内塩基対形成により、第３のステム構造を含むヘアピン構造が形成される。スリーウェイジャンクション構造が形成される温度は、第１、第２および第３のステム構造を形成する塩基対の融解温度（Ｔｍ）により決定される。Ｔｍとは、２本の相補的な核酸配列の５０％に塩基対が形成される温度であり、核酸配列の長さおよび構成塩基の種類によって決定される。所定の核酸配列についてＴｍを計算する方法は当該技術分野においてよく知られている。本発明の核酸プローブは、第１および第２のステム構造のＴｍが第３のステム構造のＴｍより高くなるよう設計される。このことにより、標的塩基配列が存在しない場合に核酸プローブの分子内で第３のステム構造が形成される確率を低下させ、検出のバックグラウンドを低下させることができる。
【００１９】
第３のステム構造１６は制限酵素認識配列１８を含むよう設計する。すなわち、図３に示されるように、制限酵素認識配列の（＋）鎖配列２０と（−）鎖配列２２とを適当な長さのスペーサー配列を挟んで配置する。好ましくはこのスペーサー配列はスリーウェイジャンクション構造が形成されたときにループを形成する。標的塩基配列が存在せず、スリーウェイジャンクション構造が形成されないときは、（＋）鎖と（−）鎖は安定に塩基対形成することができない。被検試料中に標的塩基配列が存在し、標的塩基配列と本発明の核酸プローブとの間でスリーウェイジャンクション構造が形成されると、（＋）鎖と（−）鎖が安定に塩基対形成して、制限酵素により認識される二本鎖構造を形成する。
【００２０】
本発明の核酸プローブは、被検試料中の標的塩基配列の検出に有用である。したがって、本発明の別の観点においては、本発明の核酸プローブを用いる標的核酸配列の検出方法が提供される。図３にこの方法の概要を示す。本発明の方法の第１工程においては、溶液中で被検試料を本発明の核酸プローブと接触させる。第２工程においては、この溶液に、第３ステム構造上の制限酵素認識配列を認識して切断しうる制限酵素を加える。「制限酵素」とは、特定の配列の二本鎖ＤＮＡを認識して切断することができる酵素をいう。当該技術分野においては、多様な生物に由来する多数の制限酵素およびその認識配列・切断部位が知られており、そのいずれも本発明において用いることができる。なお、「制限酵素認識配列」は、所定の制限酵素についてその認識配列として一般に知られているすべての塩基対を有していなくてもよく、本発明において用いられる反応条件下で制限酵素がその配列を認識して検出可能な程度に切断することができる限り、塩基対の一部が欠失または置換されていてもよい。第２工程は、第３のステム構造のＴｍより高い温度で行う。このことにより、測定のバックグラウンドを低くすることができる。したがって、このような温度において高い切断活性を有する制限酵素を用いることが好ましい。第３工程においては、切断されたＤＮＡフラグメントの存在または量を測定することにより、被検試料中の標的塩基配列を検出する。切断産物の測定は、電気泳動等の慣用の方法により容易に行うことができる。
【００２１】
本発明の方法においては、標的塩基配列は、スリーウェイジャンクション構造の形成により本発明の核酸プローブが制限酵素により切断された後、その切断断片から解離して、次の核酸プローブと塩基対形成することができる。すなわち、１分子の標的塩基配列の存在により、多数の核酸プローブが切断される。したがって、本発明の方法はまた、標的塩基配列のシグナルの増幅方法であると見なすことができる。増幅比は、好ましくは１０２倍、より好ましくは１０３倍、さらに好ましくは１０４倍である。このような増幅系は、ＰＣＲのような、ＤＮＡ増幅を伴う既存の種々の検出方法に適用することができる。具体的には、病原性ウイルスや細菌のゲノムＤＮＡの一部を標的塩基配列とすることにより、ヒト、家畜などの動物や植物におけるウイルス・細菌感染の診断や、輸血用血液、食品、飲料、畜産物における病原体汚染の検査に用いることができる。さらに、癌や遺伝病、薬剤応答性の診断に利用することができる。また、種特異的な塩基配列を標的塩基配列にすることにより、農作物および家畜の品種の検査に用いることができる。また、本発明の核酸プローブは、異なる標的塩基配列を検出しうるプローブを複数組み合わせて用いてもよい。
【００２２】
図４は本発明の核酸プローブの第２の態様を示す。この態様においては、核酸プローブ１０は制限酵素認識配列１８を挟む位置にそれぞれ蛍光分子２４および消光分子２６を有しており、この状態では、蛍光分子２４からの蛍光シグナルは消光分子２６の作用により検出されない。スリーウェイジャンクション構造が形成されると、制限酵素により第３ステム構造中の制限酵素認識配列１８が切断され、蛍光分子２４を含むフラグメントと消光分子２６を含むフラグメントが分離される。このことにより蛍光分子２４と消光分子２６との距離が大きくなり、蛍光信号が発生する。この蛍光強度の変化を測定することにより、被検試料中の標的塩基配列の存在を検出することができる。蛍光強度の変化は、例えば、蛍光分光光度計やプレートリーダー等を用いて慣用の方法により測定することができる。また、別の検出手段として、蛍光強度の偏光依存性を測定（蛍光偏光法）し、スリーウェイジャンクション構造形成の有無を判断することもできる。蛍光分子としては、例えば、フルオレセイン、ダンシル、カスケードイエロー、フルオレスカミン、オレゴングリーン、ピレン、テキサスレッド、パシフィックブルー、マリンブルー、アレクサ、テキサスレッド、カスケードイエロー、ルシファーイエロー、ダブシル、ボディパイ（BODIPY）、クーマリン、ピンポ（PyMPO）、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、ROX、FAM、VIC、HEX、TAMRA、SYBR Green、NBD等を用いることができる。消光分子としては、例えば、ダブシル、QSY-7、QSY-21、QSY-35、BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、Eclipse等の蛍光を発しない物質（ダーククエンチャーと言われる）を用いてもよいし、上記蛍光分子が発する波長領域に吸収帯を持つ蛍光物質を消光分子として利用してもよい。蛍光分子および消光分子をＤＮＡに結合させる方法、ならびに蛍光強度の変化を検出する方法は当該技術分野においてよく知られている。蛍光分子と消光分子は、本発明の核酸プローブの両末端に配置されていてもよく、あるいは、いずれか一方が制限酵素認識配列の（＋）鎖配列と（−）鎖配列との間のスペーサー配列中に配置されていてもよい。また、いずれか一方がジャンクション部に配置されていてもよい。
【００２３】
図５は本発明の核酸プローブの第３の態様を示す。この態様においては、本発明の核酸プローブ２８および３０は、標的塩基配列１００と塩基対形成したときに、第１、第２および第３のステム構造からなるスリーウェイジャンクション構造を形成しうる１対のプローブからなる。第１のプローブ２８は、標的塩基配列１００の第１のアームと塩基対形成して第１のステム構造を形成しうる配列、および制限酵素認識配列の（＋）鎖配列を含み、第２のプローブ３０は、標的塩基配列１００の第２のアームと塩基対形成して第２のステム構造を形成しうる配列、および制限酵素認識配列の（−）鎖配列を含む。すなわち、この核酸プローブは、第１の態様の核酸プローブが２つの部分に分離した構造を有すると考えることができる。標的塩基配列１００が存在しないときは、スリーウェイジャンクション構造が形成されないため、第１のプローブ上に存在する制限酵素認識配列の（＋）鎖と第２のプローブ上に存在する制限酵素認識配列の（−）鎖は安定に塩基対形成することができない。標的塩基配列が存在し、スリーウェイジャンクション構造が形成されると、（＋）鎖と（−）鎖が安定に塩基対形成して、二本鎖の制限酵素認識配列１８を含む第３のステム構造が形成される。被検試料中に標的塩基配列が存在するとき、制限酵素により制限酵素認識配列１８が切断され、切断されたＤＮＡフラグメントの存在または量を測定することにより、被検試料中の標的塩基配列を検出することができる。さらに、第２の態様と同様に、このいずれかのプローブの両端に蛍光分子および消光分子を結合させることにより、蛍光強度の変化を指標として被検試料中の標的塩基配列を検出することができる。
【００２４】
図６は、本発明の核酸プローブの第４の態様を示す。この態様においては、本発明の核酸プローブは、標的塩基配列１００と塩基対形成したときに、第１、第２および第３のステム構造からなるスリーウェイジャンクション構造を形成しうる１対の核酸プローブ３２および３４からなる。第１のプローブ３２は、３’から５’方向に、（ａ）標的塩基配列の第１のアーム１０２と塩基対形成して第１のステム構造を形成しうる配列；（ｂ）制限酵素により認識される二本鎖配列の（＋）鎖配列；（ｃ）スペーサー配列；および（ｄ）制限酵素により認識される二本鎖配列の（−）鎖配列の一部、の各配列を順に含む。第２のプローブは、５’から３’方向に、（ｅ）標的塩基配列の第２のアーム１０４と塩基対形成して第２のステム構造を形成しうる配列；および（ｆ）制限酵素により認識される二本鎖配列の（−）鎖配列の一部、の各配列を順に含む（図７）。第１のプローブの配列（ｂ）および（ｄ）と第２のプローブの配列（ｆ）とは、互いに塩基対形成して、第３のステム構造中に、ニックを有する二本鎖の制限酵素認識配列３６を形成するよう設計される。ここで、ニックとは、第１のプローブの配列（ｄ）の５’末端と第２のプローブの配列（ｆ）の３’末端とがホスホジエステル結合していないことを意味する。なお、これらの配列の順序は、第１のプローブが５’から３’方向に配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を有し、第２のプローブが３’から５’方向に配列（ｅ）および（ｆ）を有していてもよいことが理解されるであろう。標的塩基配列が存在せず、スリーウェイジャンクション構造が形成されないときは、配列（ｂ）と配列（ｄ）および（ｆ）とは安定に塩基対形成することができない。スリーウェイジャンクション構造が形成されると、配列（ｂ）と配列（ｄ）および（ｆ）とは、一緒になってニックを有する二本鎖の制限酵素認識配列３６を形成し、この二本鎖構造が制限酵素により認識されて切断されることができる。多くの制限酵素がニックを有する制限酵素認識配列をも認識し切断することを本発明により見いだしたが、ニックを有しない場合と比較して切断効率が低い場合もある。さらに、第２の態様と同様に、第１のプローブの配列（ａ）と配列（ｃ）とに蛍光分子および消光分子を結合させることにより、蛍光強度の変化を指標として被検試料中の標的塩基配列を検出することができる。
【００２５】
図８は、本発明の第５の態様であって、標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出するための核酸プローブを示す。「一塩基変異」とは、所定の遺伝子のある領域中で、塩基配列中の１つの塩基が置換、挿入、または欠失されていることをいう。特に、塩基配列中の１つの塩基が置換され、この位置について少なくとも２つの異なる塩基が存在しうる遺伝子多型は一塩基多型（ＳＮＰ）と称される。本明細書においては、一塩基変異を検出すべき塩基を「標的塩基」と称し、本発明の核酸プローブと完全に相補的なジャンクション部分を形成する標的塩基を有する標的塩基配列を「ポジティブ標的塩基配列」、標的塩基において一塩基変異を有し、本発明の核酸プローブと完全に相補的なジャンクション部分を形成しない標的塩基配列を「ネガティブ標的塩基配列」と称する。これらの用語は、単に本発明の核酸プローブの構成および作用を説明するために用いられ、一塩基変異により何らかの活性または作用についてポジティブ／ネガティブであることを意味するものではない。
【００２６】
この態様においては、本発明のプローブは、標的塩基配列１００と塩基対形成したときに、第１、第２および第３のステム構造からなるスリーウェイジャンクション構造を形成することができる核酸プローブ１０からなる。核酸プローブの基本的な構造は上述の第１の態様（図２）において説明したとおりである。図８（ａ）および（ｂ）の態様においては、一塩基変異を検出すべき標的塩基１０６または１０８がジャンクション部に位置し、プローブと塩基対形成するように設計する。すなわち、ポジティブ標的塩基配列１１０は核酸プローブとともに６塩基による３組の相補的塩基対からなるジャンクション部分を形成し、ネガティブ標的塩基配列１１２はプローブとの間に塩基対を形成せず、ジャンクション部分を構成しない。このため、被検試料中にポジティブ標的塩基配列１１０が存在する場合とネガティブ標的塩基配列１１２が存在する場合とで、制限酵素によるプローブの切断効率が異なる。核酸プローブ１０の適当な位置に蛍光分子および消光分子を結合させることにより、蛍光強度の変化の相違を指標として、被検試料中にポジティブ標的塩基配列とネガティブ標的塩基配列のいずれの標的塩基配列が存在するかを検出することができる。あるいは、制限酵素の切断効率は電気泳動により測定してもよい。また、図８（ｃ）および（ｄ）の態様においては、一塩基変異を検出すべき標的塩基１０６または１０８はステム部においてプローブと塩基対形成するように設計する。この場合もやはり、制限酵素によるプローブの切断効率が異なるため、これを測定することにより、被検試料中にポジティブ標的塩基配列とネガティブ標的塩基配列のいずれの標的塩基配列が存在するかを検出することができる。図８（ｅ），（ｆ）および（ｇ）は、標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出するための１組の核酸プローブであって、標的塩基配列１００と塩基対形成したときに、第１、第２、第３および第４のステム構造を含むフォーウェイジャンクション構造をとることができるプローブの例を示す。
【００２７】
図９は、本発明の第６の態様であって、標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出するための核酸プローブを示す。この態様においては、本発明のプローブは、標的塩基配列１００と塩基対形成したときに、第１、第２および第３のステム構造からなるスリーウェイジャンクション構造を形成することができる１対の核酸プローブ３８および４０からなる。核酸プローブの基本的な構造は上述の第４の態様（図６）において説明したとおりであるが、一塩基変異を検出すべき標的塩基１０６または１０８がジャンクション部に位置し、第２のプローブと塩基対形成するように設計する。すなわち、ポジティブ標的塩基配列１１０は核酸プローブとともに６塩基による３組の相補的塩基対からなるジャンクション部分を形成し、ネガティブ標的塩基配列１１２は第２のプローブとの間に塩基対を形成せず、ジャンクション部分を構成しない。
【００２８】
第１のプローブ３８は、３’から５’方向に、（ａ）標的塩基配列の標的塩基より５’側の配列と塩基対形成して第１のステム構造を形成しうる配列；（ｂ）制限酵素により認識される二本鎖配列の（＋）鎖配列；（ｃ）スペーサー配列；および（ｄ）制限酵素により認識される二本鎖配列の（−）鎖配列の一部、の各配列を順に含む。第２のプローブ４０は、５’から３’方向に、（ｅ）標的塩基配列の標的塩基およびその３’側の配列と塩基対形成して第２のステム構造を形成しうる配列；および（ｆ）制限酵素により認識される二本鎖配列の（−）鎖配列の一部、の各配列を順に含む。これらの配列の順序は、第１のプローブが５’から３’方向に配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を有し、第２のプローブが３’から５’方向に配列（ｅ）および（ｆ）を有していてもよいことが理解されるであろう。第１のプローブの配列（ｂ）および（ｄ）と第２のプローブの配列（ｆ）とは、互いに塩基対形成して、第３のステム構造中に、ニックを有する二本鎖の制限酵素認識配列４２を形成するよう設計される。ポジティブ標的塩基配列１１０が存在し、スリーウェイジャンクション構造が形成されると、配列（ｂ）、（ｄ）および（ｆ）はニックを有する二本鎖の制限酵素認識配列４２を形成し、この二本鎖構造が制限酵素により認識されて切断される。ネガティブ標的塩基配列１１２が存在し、安定したスリーウェイジャンクション構造が形成されないときは、配列（ｆ）は配列（ｂ）と安定に塩基対形成することができず、二本鎖の制限酵素認識配列３６が形成されにくくなる。すなわち、ネガティブ標的塩基配列の存在下で制限酵素を作用させると、制限酵素による切断の効率が低くなる。したがって、制限酵素切断産物の量を測定して比較することにより、被検試料中にポジティブ標的塩基配列とネガティブ標的塩基配列のいずれの標的塩基配列が存在するかを検出することができる。さらに、第２の態様と同様に、第１のプローブの配列（ａ）と配列（ｃ）とに蛍光分子および消光分子を結合させることにより、蛍光強度の変化を指標として被検試料中の標的塩基配列を検出することができる。
【００２９】
本発明の核酸プローブは、標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異の検出に有用である。したがって、本発明の別の観点においては、本発明の核酸プローブを用いる一塩基変異の検出方法が提供される。本発明の方法は、溶液中で被検試料を本発明の核酸プローブと接触させる工程、この溶液に、第３ステム構造上の制限酵素認識配列を認識して切断しうる制限酵素を加える工程、および切断されたＤＮＡフラグメントの存在または量を測定することにより、標的塩基配列中の一塩基変異を検出する工程を含む。本発明にしたがう一塩基変異の検出は、癌や遺伝病、薬剤応答性の診断に利用することができる。
【００３０】
本発明のさらに別の観点においては、本発明の核酸プローブを含むことを特徴とする、標的塩基配列を検出するためのキット、ならびに標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出するためのキットが提供される。好ましくは、これらのキットは制限酵素認識配列を認識して切断しうる制限酵素をさらに含む。
【００３１】
以上、スリーウェイジャンクション構造を例として、本発明の特徴を説明してきたが、図１０に示されるような、フォーウェイジャンクション構造、ファイブウェイジャンクション構造、ダブルスリーウェイジャンクション等のマルチウェイジャンクション構造を有するプローブについても、本明細書の教示にしたがって容易に設計し、用いることができることが明らかであろう。
【００３２】
以下の実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
スリーウェイジャンクション構造と制限酵素を用いた蛍光強度による標的塩基配列の検出
本実施例においては、スリーウェイジャンクション構造を形成後、制限酵素を作用させることによって、蛍光強度を用いて微量の標的塩基配列を検出した。図１１に標的塩基配列とプローブAおよびBにより形成されるスリーウェイジャンクション構造を示す。四角で囲まれた配列は制限酵素BstPIの認識配列、太矢印は切断部位を示す。図１２に示される標的塩基配列と、標的塩基配列に対して適切に設計した2本1組のプローブにより、スリーウェイジャンクション構造を含む立体構造を形成させた。プローブAの3’末端にはクエンチャーとなるTAMRAが修飾してあり、5’末端に修飾されたFAMの蛍光が、蛍光共鳴エネルギー転移によりクエンチングされるように設計されている。
【００３４】
２種類のプローブと標的塩基配列がスリーウェイジャンクションを形成すると、2本のプローブ上の制限酵素BstP Iの認識配列（BstP Iは7塩基認識で、認識配列は5'-
ggtnacc-3'）をBstP Iが切断するため、プローブAを5’末端側（25塩基）と3’末端側（16塩基）に分離させることができる。プローブAが切断されると、FAMがクエンチャーであるTAMRAから離れるため、FAMの蛍光が検出できるようになる。すなわち、5’末端に修飾された蛍光色素FAMの蛍光が回復するのを蛍光光度計を使って検出することにより、標的配列の存在の有無を高感度に測定することができる。
【００３５】
具体的には、標的塩基配列（80pmol,8pmol, 800fmol）と、80pmolずつのプローブAとプローブBを含む反応溶液(反応時組成：50mM Tris-HCl (pH7.5), 10mM MgCl2,1mM ジチオスレイトール, 100mM NaCl）を16μlずつ作製した。また標的塩基配列を含まない反応液も２本用意した（それぞれの反応溶液の組成については表１参照）。これらの反応溶液中のDNAを95℃で5分間加熱することによって変性させ、60℃まで徐冷後、スリーウェイジャンクション構造を含む立体構造を形成させた。
【００３６】
【表１】
2005118031.tif 000003
【００３７】
次に、制限酵素BstP Iを4μl(32U)添加し（ただし標的塩基配列を含まない1本には代わりに水を添加）、60℃で2時間インキュベート後、ドデジル硫酸ナトリウムを添加して反応を停止させた。反応が停止した反応液を50倍に希釈し、そのうちの100μl（プローブ量8pmol）を取り出し、その蛍光強度を蛍光光度計で測定（励起波長495nm、測定波長520nm）した。図１３に、種々の量の標的塩基配列の検出をプローブの制限酵素による切断量（蛍光強度）で表すグラフを示す。図中、Iは酵素なし、IIは標的塩基配列なし、IIIは標的塩基配列80pmol、IVは8pmol、Vは800fmolである。
【００３８】
酵素を含まないサンプル（I）の蛍光強度はバックグラウンドに相当する。サンプル（II）は標的塩基配列を含まない陰性のサンプルに該当する。サンプル（II）では、プローブAがほとんど切断されておらず、酵素反応を行わなかったサンプル（I）と同程度に蛍光強度が低い。一方、標的塩基配列を含む陽性のサンプル（III, IV, V）は、いずれもバックグラウンド（I）及び陰性のサンプル（II）より高い蛍光強度を示しており、本実施例のプローブAとプローブBを使うことによって、標的塩基配列の有無を検出できることが示された。
【００３９】
標的塩基配列の量が多いほど蛍光強度が高くなる傾向が図１３のグラフに現れており、標的塩基配列の量が多いほど制限酵素による切断が効率的に行われることが示している。さらに、サンプルVのデータより、標的塩基配列がプローブより２桁低い量（800fmol）でも検出が可能であることは明らかであり、本発明のプローブが微量の標的塩基配列の検出に適していることが示された。
【実施例２】
【００４０】
スリーウェイジャンクション構造と制限酵素を用いた電気泳動による標的塩基配列の検出
本実施例においては、スリーウェイジャンクション構造を形成後、制限酵素を作用させることによって、電気泳動を用いて標的塩基配列を検出した。すなわち、図１４に記載される標的塩基配列と、標的塩基配列に対して適切に設計した2本1組のプローブにより、スリーウェイジャンクション構造を含む立体構造を形成させた。２種類のプローブと標的塩基配列がスリーウェイジャンクションを形成すると、2本のプローブ上の制限酵素Tli Iの認識配列（Tli Iは6塩基認識で、認識配列は5'-ctcgag-3'）をTli Iが切断するため、プローブAを5’末端側（25塩基）と3’末端側（16塩基）に、プローブBを5’末端側（20塩基）と3’末端側（30塩基）に分離させることができる。これらを変性剤を含むゲル上で電気泳動することにより切断された断片をバンドとして検出できるようになる。
【００４１】
具体的には、表２に従ってプローブA、プローブB、標的塩基配列の全部または一部を80pmolずつ含む反応溶液(反応時組成：50mM Tris-HCl (pH7.9), 10mM MgCl2,1mM ジチオスレイトール, 100mM NaCl,100μg/ml BSA）を1７μlずつ作製した。
【００４２】
【表２】
2005118031.tif 000004
【００４３】
これらの反応溶液中のDNAを95℃で5分間加熱することによって変性させ、60℃まで徐冷後、スリーウェイジャンクション構造を含む立体構造を形成させた。その後、制限酵素Tli Iを3μl(30U)添加し（ただしサンプルIには代わりに水を添加）、60℃で2時間インキュベート後、ドデジル硫酸ナトリウムを添加して反応を停止させた。反応用液の一部（プローブ量8pmol）を取り出し、20%変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、ゲルを染色したところ、図１５に示す結果が得られた。図中、Iは酵素なし、IIは標的塩基配列なし、IIIは標的塩基配列ありを示す。Mは60, 40, 20塩基のサイズマーカーである。標的塩基配列を含まないサンプルIIでは、切断片が存在しないが、標的塩基配列を含むサンプルIIIでは25塩基の切断片が認められる。よって、標的塩基配列の有無を検出できることが示された。
【実施例３】
【００４４】
スリーウェイジャンクション構造と制限酵素を用いた1塩基ミスマッチ（SNP）の検出
図１６に、プローブAとB、標的塩基配列の3分子により形成されるスリーウェイジャンクション構造を示す。(a)はポジティブ標的塩基配列1 の場合、(b)はネガティブ標的塩基配列2の場合を示す。図１７に示す標的塩基配列（下線部分がSNP部位）と、制限酵素認識配列にニックを含むように設計した別々の分子（２分子）であるプローブA及びプローブBを用いてスリーウェイジャンクション構造を形成させた(イタリックの小文字部分が制限酵素の認識部位)。制限酵素によるプローブの切断効率がポジティブ標的塩基配列とネガティブ標的塩基配列とで異なることを利用し、1塩基ミスマッチ（SNP）を検出する実験を行った。ここで、ポジティブ標的塩基配列とは、プローブA及びBと相補的にスリーウェイジャンクションを形成する配列を持った標的塩基配列であり、ネガティブ標的塩基配列とは、プローブA及びBとスリーウェイジャンクションを形成する際、１塩基分だけミスマッチの生じる塩基配列を持つ標的塩基配列のことである。
【００４５】
まずプローブとなる配列A (53 塩基、制限酵素による切断で26塩基 と 27塩基 に分離)及びB (24 塩基、制限酵素による切断で1塩基 と 23塩基 に分離)と、上記ポジティブ標的塩基配列あるいはネガティブ塩基配列を含む溶液とを、表３に示される最終濃度(1 チューブ / 20 μl)となるように調整し、95℃で5分間DNAを変性後、30分間で20℃まで徐冷し、スリーウェイジャンクション構造を形成させた。ここで、A1は制限酵素が入っていないサンプル、A2とA3は、制限酵素は入っているが標的塩基配列が入っていないサンプルとして準備した。A4とA５には、濃度がプローブと同じ４μMの標的塩基配列を持つ核酸を混合した。
【００４６】
【表３】
2005118031.tif 000005
【００４７】
この核酸混合溶液に制限酵素Aor13H(タカラバイオ社製、5'-tccgga-3')を30U添加し、即座に45℃に加温し、Aor13Hによるプローブの切断反応を行った。この反応液には、他にマーカーとなる40塩基のDNA2.5μMを加え、KCl濃度が100mM、MgCl2が10 mM 、Tris-バッファーの濃度が25mM、全量が20μlとなるように調整した。2時間後及び12時間後、10 ％ ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を反応液に加え制限酵素を変性し、反応を停止させた。反応停止後、20 ％ 変性ポリアクリルアミドゲルにアプライして電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルを染色し、プローブAが切断されたときに生ずるDNA断片のバンドを確認した。反応2時間後の電気泳動パターンを図１８ａ、12時間後のパターンを図１８ｂに示す。電気泳動槽の緩衝液はTBEを用いた。電気泳動の蛍光強度を数値化したところ、表４のような結果となった（ここでマーカーの強度を1.00とした）。
【００４８】
【表４】
2005118031.tif 000006
【００４９】
表４のマーカー、プローブA、プローブAが切断された断片、標的塩基配列は、それぞれ40塩基、53塩基、26塩基+27塩基、20塩基の長さに相当する。表４のA4とA５の「プローブAが切断された断片」の蛍光強度を比較することにより、ポジティブ標的塩基配列とネガティブ標的塩基配列についてプローブＡの切断の割合に相違があることが明らかである。すなわち、A4とA５の制限酵素による切断効率に大きな差があることが、蛍光強度の違いによって明確であることから、本発明にしたがって、１塩基のミスマッチの違いを制限酵素を用いて区別することができる。「切断された断片/プローブA」の蛍光強度のデータには、こうした１塩基の違いがより一層明確に現れている。
【００５０】
さらに、表４から、ポジティブ標的塩基配列の蛍光強度が標的塩基配列が存在しないA2及びA3の値よりはるかに大きく、明確に区別できることから、１塩基のミスマッチが認識できることが示された。
【実施例４】
【００５１】
スリーウェイジャンクション構造と制限酵素を用いた1塩基ミスマッチ（SNP）の検出
図１９に、プローブCとD、標的塩基配列の3分子により形成されるスリーウェイジャンクション構造を示す。(a)はポジティブ標的塩基配列3の場合、(b)はネガティブ標的塩基配列4 の場合を示す。図２０に示す標的塩基配列（下線部分がSNP）と、制限酵素認識配列にニックを含むように設計した別々の分子(２分子)であるプローブC及びプローブDとを用いてスリーウェイジャンクション構造を形成させた(イタリック体の小文字部分が制限酵素の認識部位)。制限酵素であるBstPIによるプローブの切断効率がポジティブ標的塩基配列とネガティブ標的塩基配列とで異なることを利用しSNPを検出する実験を行った。
【００５２】
操作は実施例３と同様に、まずプローブとなる配列A(54
塩基、制限酵素による切断で27塩基と27塩基に分離)及びB(20 塩基、制限酵素による切断で2 塩基と18塩基に分離)と、上記ポジティブ標的塩基配列あるいはネガティブ塩基配列を含む溶液とを、表５に示される最終濃度(1 チューブ / 20 μl)となるよう調整し、95℃で5分間DNAを変性後、30分間で20℃まで徐冷し、スリーウェイジャンクション構造を形成させた。ここでA１は制限酵素が入っていないサンプル、A4は、制限酵素は入っているが標的塩基配列が入っていないサンプルとして準備した。
【００５３】
【表５】
2005118031.tif 000007
【００５４】
この核酸混合溶液に制限酵素BstPI (タカラバイオ社製)を30U添加し、即座に60℃に加温し、BstPIによるプローブの切断反応を行った。この反応液には、他にマーカーとなる96塩基のDNA 2.5μMを加え、NaCl濃度が100 mM、MgCl2が10 mM、Tris-バッファーの濃度が50mM、全量が20μlとなるように調整した。12時間後、10 ％ ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を反応液に加え制限酵素を変性し、反応を停止させた。反応停止後、20 ％ 変性ポリアクリルアミドゲルにアプライして電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルを染色し、プローブCが切断されたときに生ずるDNA断片のバンドを確認した。反応12時間後の電気泳動図を図２１に示す。電気泳動槽の緩衝液はTBEを用いた。電気泳動の蛍光強度を数値化したところ、表６のような結果となった(ここでマーカーの強度を1.00とした)。
【００５５】
【表６】
2005118031.tif 000008
【００５６】
表６のマーカー、プローブC、プローブCが切断された断片、標的塩基配列は、それぞれ96 塩基、54 塩基、27 塩基+27 塩基、36 塩基の長さに相当する。表６のA2とA3の「プローブCが切断された断片」の蛍光強度を比較することにより、ポジティブ標的塩基配列とネガティブ標的塩基配列について、プローブＣの切断の割合に違いがあることが明らかである。すなわち、A2とA3の制限酵素による切断効率に大きな差があることが蛍光強度の違いによって明確であることから、本発明にしたがって、１塩基のミスマッチの違いを制限酵素BstPIを用いて区別することができる。
【実施例５】
【００５７】
ヒトB型肝炎ウイルスのゲノムDNA配列の検出
本実施例においては、ヒトB型肝炎の病原ウイルスであるヒトB型肝炎ウイルス（HBV）を検出するためのモデル実験を示す。HBVはゲノムとして約3,200塩基対の環状二本鎖DNAを持つウイルスであるからHBVを検出するためには、HBVのゲノムDNA配列の一部を標的塩基配列としてプローブを設計し、標的塩基配列を検出できれば良い。
【００５８】
具体的には図２２に示すようにHBVのゲノムDNA配列から一部を標的塩基配列として選び、標的塩基配列に対して適切な2本1組のプローブA、プローブBを設計した。そしてプローブA、プローブB、標的塩基配列を表７に示す分量だけ含む反応溶液(反応時組成：50mM Tris-HCl(pH7.9), 10mM MgCl2, 1mM ジチオスレイトール, 100mM NaCl）を17μlずつ3本作製した。
【００５９】
【表７】
2005118031.tif 000009
【００６０】
次にこれらを95℃で5分間加熱することによって反応溶液中のDNAを変性させ、75℃まで徐冷することによりスリーウェイジャンクション構造を含む立体構造を形成させた（図２３）。その後、制限酵素Tli Iを3μl (30U)添加し（ただし表７のサンプルIには替わりに水を添加）、75℃で2時間インキュベート後、EDTAを添加して反応を停止させた。反応溶液の一部を20%変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、ゲルを染色したところ、図２４に示す結果が得られた。図２４の結果から各プローブの切断率を求めた（表８）。標的塩基配列を含まないサンプルIIでは、プローブはほとんど切断されていないが、標的塩基配列を含むサンプルIIIでは2本のプローブは共に切断が進んでいる。よって、標的塩基配列の有無を検出でき、HBVの検出の可能性が示された。
【００６１】
【表８】
2005118031.tif 000010
【実施例６】
【００６２】
RNA標的塩基配列の検出
本実施例においては標的塩基配列としてDNAのみならずRNAをも検出可能なことを示す。RNAのDNAとの構造上の違いは糖の2位がヒドロキシル基となっていることと塩基としてチミンの替わりにウラシルが使われることだけである。DNA同士の二重螺旋と多少性質が異なるがRNAはDNAと二重螺旋を形成することができるので、DNAをプローブとしてRNAの標的塩基配列を検出することが可能である。
【００６３】
具体的には図２５に示すようなRNA標的塩基配列と、標的塩基配列に対して適切な2本1組の核酸プローブA、核酸プローブBを設計した。そして核酸プローブA、核酸プローブB、RNA標的塩基配列を表９に示す分量だけ含む反応溶液(反応時組成：50mM Tris-HCl (pH7.9), 10mM MgCl2,1mM ジチオスレイトール, 100mM NaCl）を17μlずつ3本作製した。
【００６４】
【表９】
2005118031.tif 000011
【００６５】
次にこれらを95℃で5分間加熱することによって反応溶液中のDNAとRNAを変性させ、60℃まで徐冷することによりスリーウェイジャンクション構造を含む立体構造を形成させた（図２６）。その後、制限酵素TliIを3μl(30U)添加し（ただし表９のサンプルIには替わりに水を添加）、60℃で2時間インキュベート後、EDTAを添加して反応を停止させた。反応溶液の一部を20%変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、ゲルを染色したところ、図２７に示す結果が得られた。図２７の結果から各プローブの切断率を求めた（表１０）。RNA標的塩基配列を含むサンプルIIIは、RNA標的塩基配列を含まないサンプルIIに比べて高いプローブ切断率である。よって本発明はRNAの標的塩基配列の有無をも検出できることが示された。
【００６６】
【表１０】
2005118031.tif 000012
【実施例７】
【００６７】
微量ヒトゲノムDNA中の標的塩基配列の検出
本実施例においては標的塩基配列としてヒトゲノム上の塩基配列を微量のヒトゲノムDNAから検出できることを示す。微量のDNAを検出する際にしばしばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が用いられるが、通常PCRでは標的塩基配列を二本鎖DNAの形状で増幅する。しかしながら、一本鎖に比べて二本鎖DNAは標的塩基配列としては必ずしも適切ではない。なぜなら、標的塩基配列がその相補鎖と二本鎖DNAを形成してしまうと、標的塩基配列とプローブとの結合率が減少し、反応効率が低下してしまうからである。本実施例ではPCRのプライマー濃度を調整することにより、一本鎖状態の標的塩基配列を増幅して、微量の標的塩基配列を検出した。
【００６８】
具体的には、図２８に示すヒトゲノム上の標的塩基配列に対して、2本1組のPCRプライマーと2本1組の検出用プローブを設計した。ヒトゲノムDNA 10ngに対し、PCRを行った（液量100μl、フォワードプライマー0.5uM、リバースプライマー0.1uM、dNTP 各0.2mM、酵素Taq DNAポリメラーゼ 2.5U、10mM Tris-HCl (pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、プログラム94°C 5min → (94°C 30sec → 56°C 30sec → 72°C 30sec)×60サイクル → 72°C 5min）。PCR産物の一部を3%アガロースゲルにて電気泳動した結果を図２９に示す。レーンSがサンプル、レーンCはフォワードプライマー・リバースプライマーともに0.5uMのコントロール用PCR産物、レーンＭは20塩基対ラダーマーカー。121塩基対の二本鎖DNAのバンドの下に121塩基の一本鎖DNAのバンドが確認できる。
【００６９】
次にこの標的塩基配列のPCR産物を用いて表１１に示す成分の反応溶液(反応時組成：50mM Tris-HCl (pH7.5), 10mM MgCl2,1mM ジチオスレイトール, 100mM NaCl）を20μlずつ氷上で3本作製した。
【００７０】
【表１１】
2005118031.tif 000013
【００７１】
これらを95℃で5分間加熱することによって反応溶液中のDNAを変性させ、次に75℃まで冷やすことによりスリーウェイジャンクション構造を含む立体構造を形成させた（図３０）。続いて75℃で2時間インキュベート後、反応を停止させた。反応溶液の一部を20%変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、ゲルを染色したところ、図３１に示す結果が得られた。
【００７２】
図３１の結果から各プローブの切断率を求めた（表１２）。標的塩基配列のPCR産物を含まないサンプルIIに比べて、標的塩基配列のPCR産物を含むサンプルIIIではプローブＢの切断が特に進んでいる。よって、ヒトゲノムDNA 10ng中の標的塩基配列の有無を検出可能である。
【００７３】
【表１２】
2005118031.tif 000014
【実施例８】
【００７４】
スリーウェイジャンクション構造と制限酵素を用いた1塩基ミスマッチ（SNP)の検出
図３２および図３４にプローブAとB、標的塩基配列の3分子により形成されるスリーウェイジャンクション構造を示し、図３３および図３５にそれぞれのジャンクション部の拡大図を示す。制限酵素によるプローブの切断効率が標的塩基配列の１塩基の違いにより変化することを利用し、1塩基ミスマッチを検出する実験を行った。ここでは、プローブと相補的な標的塩基配列をポジティブ標的塩基配列、プローブと１塩基だけ配列が異なる標的塩基配列をネガティブ標的塩基配列と定義する。下記配列から明らかなように、ポジティブ標的塩基配列とネガティブ標的塩基配列は、ジャンクションを形成する際のジャンクション近傍の１塩基が異なっている（下記例ではCがGに置換されている）。
【００７５】
プローブA1：5’-GACGGTCGGCAGTTTCCACCGCTCCc↓tcgagTCATT-3’
(鎖長：36塩基、↓制限酵素切断部位、切断されると26塩基と10塩基に分離)
プローブB1：
5’-(FAM-)TTTTTTTTTTTTTGAc↓tcgagCGCTGCTAGGATGCCTCGGCTCGGA-3’
(鎖長：46塩基、↓制限酵素切断部位、5’末端にFAMが修飾されている、切断されると30塩基と16塩基に分離)
ポジティブ標的塩基配列1(P1)：
5’-TGCGTACCGAGCTCCGAGCCGAGGCATCCTAGCAGCGGGAGCGGTGGAAACTGCCGACCGTCCCTGCACGGACCCTGGTGCCATGGGTAGGTTGACCAC-3’
ネガティブ標的塩基配列1(N1)：
5’-TGCGTACCGAGCTCCGAGCCGAGGGATCCTAGCAGCGGGAGCGGTGGAAACTGCCGACCGTCCCTGCACGGACCCTGGTGCCATGGGTAGGTTGACCAC-3’
【００７６】
操作を説明すると、まずプローブとなる配列A1(36塩基、制限酵素による切断で26塩基と10塩基に分離)及びB1(46塩基、制限酵素による切断で36塩基と10塩基に分離)と上記ポジティブ標的塩基配列またはネガティブ塩基配列を含む溶液の最終濃度を表１３に示すように調整し、95℃で5分間かけてDNAを変性した後徐冷し、スリーウェイジャンクション構造を形成させた。この反応液の塩濃度は、NaCl濃度が100 mM、MgCl2が10 mM、Tris-バッファー(pH=7.9)の濃度が50 mM、ジチオスレイトールが1 mM、BSAが100 μg/ml、全量が40μｌとなるように調整した。 ここでC1は、制限酵素が入っていないサンプル、C2は制限酵素は入っているが標的塩基配列が入っていないサンプルとして準備した。この核酸溶液に制限酵素Tli I (ctcgag)を30 U添加し、プローブの切断反応を行った。2時間後 0.5 M EDTAを反応液に加え反応を停止させ、サンプルを20 ％ 変性ポリアクリルアミドゲルにアプライして電気泳動を行った。泳動後、ゲル中のDNAを染色し、プローブが切断されて生じたDNA断片のバンドを蛍光光度計で数値化したところ、表１４のような結果となった。
【００７７】
【表１３】
2005118031.tif 000015
【００７８】
【表１４】
2005118031.tif 000016
【００７９】
表１４の結果から、ポジティブ標的塩基配列とネガティブ標的塩基配列の違いは、C3とC4、又はC5とC6、あるいはC7とC8を比較することにより明らかである。プローブB1が切断された割合は標的塩基配列上の１塩基の違いにより大きく異なっていることから、制限酵素によるプローブの切断により生じるDNA断片量は１塩基の違いを敏感に反映することがわかる。すなわち、標的塩基配列の１塩基の違いを制限酵素を用いて明確に区別できることが示された。
【００８０】
以上の結果から、標的塩基配列中の１塩基の差異を本プローブを使い検出し、SNPタイピング等に利用できることは明らかである。
【実施例９】
【００８１】
スリーウェイジャンクション部分に標識分子を有するプローブを用いた標的塩基配列の検出
図３６にプローブAとB、標的塩基配列の3分子により形成されるスリーウェイジャンクション構造を示し、図３７にそのジャンクション部の拡大図を示す。プローブの配列中に色素(dT-QSY)が修飾されたプローブB2について、標的塩基配列の存在下または非存在下で制限酵素による切断効率を調べた。
【００８２】
プローブA1：5’-GACGGTCGGCAGTTTCCACCGCTCCc↓tcgagTCATT-3’
(鎖長：36塩基、↓制限酵素切断部位、切断されると26塩基と10塩基に分離)
プローブB2：
5’-TTTTTTTTTTTTGAc↓tcgagA(dT-QSY)ACGCTGCTAGGATGCCTCGGCTCGGAT
TTTTTTTTTT-3’
(鎖長：59塩基、↓制限酵素切断部位、22塩基目のdTにQSYが修飾されている、切断されると44塩基と15塩基に分離)
ポジティブ標的塩基配列2(P2)：
5’-TCCGAGCCGAGGCATCCTAGCAGGCGGAGCGGTGGAAACTGCCGACCGTC-3’
【００８３】
操作を説明すると、まずプローブとなる配列A1(36塩基、制限酵素による切断で26塩基と10塩基に分離)及びB2(59塩基、制限酵素による切断で44塩基と15塩基に分離)と上記ポジティブ標的塩基配列を含む溶液の最終濃度を表１５に示すように調整し、95℃で5分間かけてDNAを変性した後徐冷し、スリーウェイジャンクション構造を形成させた。この反応液の塩濃度は、NaCl濃度が100 mM、MgCl2が10 mM、Tris-バッファー(pH=7.9)の濃度が50 mM、ジチオスレイトールが1 mM、BSAが100 μg/ml、全量が40μｌとなるように調整した。 ここでC9は、制限酵素が入っていないサンプル、C10は制限酵素は入っているが標的塩基配列が入っていないサンプルとして準備した。この核酸溶液に制限酵素TliＩ (ctcgag)を30 U添加し、プローブの切断反応を行った。2時間後 0.5 M EDTAを反応液に加え反応を停止させ、サンプルを20 ％ 変性ポリアクリルアミドゲルにアプライして電気泳動を行った。泳動後、ゲル中のDNAを染色し、プローブが切断されて生じたDNA断片のバンドを蛍光光度計で数値化したところ、表１６のような結果となった。
【００８４】
【表１５】
2005118031.tif 000017
【００８５】
【表１６】
2005118031.tif 000018
【００８６】
表１６の結果から、制限酵素認識配列の近傍にQSYが修飾されたプローブB2を用いた場合、標的塩基配列の有無によりプローブが切断される度合いが大きく異なる事が示された。
【実施例１０】
【００８７】
フォーウェイジャンクション構造と制限酵素を用いた1塩基ミスマッチ(SNP)の検出
図３８および図４０にプローブLとH、U、標的塩基配列の4分子により形成されるフォーウェイジャンクション構造を示し、図３９および図４１にそれぞれのジャンクション部の拡大図を示す。制限酵素によるプローブの切断効率が標的塩基配列の１塩基の違いにより変化することを利用し、1塩基ミスマッチを検出する実験を行った。ここでは、プローブと相補的な標的塩基配列をポジティブ標的塩基配列、プローブと１塩基だけ配列が異なる標的塩基配列をとネガティブ標的塩基配列とで異なることを定義する。下記配列から明らかなように、ポジティブ標的塩基配列とネガティブ標的塩基配列は、ジャンクションを形成する際のジャンクション近傍の１塩基が異なっている（下記例ではGがCに置換されている）。
【００８８】
プローブU1：5’-TTTTTTTTTTGAc↓tcgagATACGCTGCTAGGATGCCTCGGCTCGGA -3’
(鎖長：46塩基、↓制限酵素切断部位、切断後33塩基と13塩基に分離)
プローブL1：5’-CGACCGCTTGGCACGGTGTGCGAACc↓tcgag TCATTT-3’
(鎖長：37塩基、↓制限酵素切断部位、切断後26塩基と11塩基に分離)
プローブH1：
5’-TGCGTACCGAGCTCCGAGCCGAGGCATCCTAGCAGCGGGAGCGGTGGAAACTGCCGACCGTCCCTGCACGGACCCTGGTGCCATGGGTAGGTTGACCAC-3’
ポジティブ標的塩基配列3(P3)：
5’-CCCATGGCACCAGGGTCCGTGCAGGGACGGTCGGCAGTTTCCACCGCTCCGTTCGCACACCGTGCCAAGCGGTCG
-3’
ネガティブ標的塩基配列2(N2)：
5’-CCCATGGCACCAGGGTCCGTGCAGGGACGGTCGGCAGTTTCCACCGCTCCCTTCGCACACCGTGCCAAGCGGTCG
-3’
（ネガティブ標的塩基配列２が、ポジティブ標的塩基配列３と配列が異なる部位に下線を引いた）
【００８９】
操作を説明すると、まずプローブとなるプローブU及び プローブL、プローブHの3配列と上記ポジティブ標的塩基配列またはネガティブ塩基配列を含む溶液の最終濃度を表１７に示すように調整し、95℃で5分間かけてDNAを変性した後徐冷し、フォーウェイジャンクション構造を形成させた。この反応液の塩濃度は、NaCl濃度が100 mM、MgCl2が10 mM、Tris-バッファー(pH=7.9)の濃度が50 mM、ジチオスレイトールが1 mM、BSAが100 μg/ml、全量が40μｌとなるように調整した。ここでD1は制限酵素が入っていないサンプル、D2は制限酵素は入っているが標的塩基配列が入っていないサンプルとして準備した。図３８はD1とD3、図４０はD4の反応溶液中でジャンクションを形成する際の推定される構造にそれぞれ該当している。
【００９０】
この核酸溶液に制限酵素Tli I (ctcgag)を30U添加し、プローブの切断反応を行った。2時間後 0.5 M EDTAを反応液に加え反応を停止させた。反応停止後サンプルを20 ％ 変性ポリアクリルアミドゲルにアプライして電気泳動を行った。電気泳動後、ゲル中のDNAを染色し、プローブが切断されて生じたDNA断片のバンド強度を確認した。電気泳動の結果は、蛍光光度計により解析を行い数値化したところ、表１８のような結果となった。
【００９１】
【表１７】
2005118031.tif 000019
【００９２】
【表１８】
2005118031.tif 000020
【００９３】
表１８の結果から、ポジティブ標的塩基配列またはネガティブ標的塩基配列を用いた場合の切断片の量、すなわち、D3とD4のプローブU1が切断された割合には大きな差があることが明らかである。このことは、標的塩基配列の１塩基の違いにより制限酵素によるプローブの切断効率に大きな影響を与えることを示している。以上の結果から、標的塩基配列中の１塩基の差異を本プローブを使い検出し、SNPタイピング等に利用できることが示された。
【実施例１１】
【００９４】
フォーウェイジャンクション構造またはダブルスリーウェイジャンクション構造を用いた標的塩基配列の検出
図４２、図４４および図４６にプローブLとH、U、標的塩基配列の4分子により形成されるフォーウェイジャンクション構造またはダブルスリーウェイジャンクション構造を示し、図４３、図４５および図４７にそれぞれのジャンクション部の拡大図を示す。これらのプローブを用いて、標的配列の存在下または非存在下で制限酵素による切断効率を調べた。
【００９５】
プローブU2：5’-CGACCGCTTGGCACGGTGTGCGAACc↓tcgagTCATTT-3’
(鎖長：37塩基、↓制限酵素切断部位、切断後26塩基と11塩基に分離)
プローブL2：5’-TTTTTTTTTTTTTGAc↓tcgagCGCTGCTAGGATGCCTCGGCTCGGA-3’
(鎖長：46塩基、↓制限酵素切断部位、切断後30塩基と16塩基に分離)
プローブL3：
5’-TTTTTTTTGAc↓tcgagCCTACCGCTGCTAGGATGCCTCGGCTCGGATTTTTTTTT-3’
(鎖長：55塩基、↓制限酵素切断部位、切断後44塩基と11塩基に分離)
プローブL4：
5’-TTTTTTTTGAc↓tcgagCCATCCTACCGCTGCTAGGATGCCTCGGCTCGGATTT
TT-3’
(鎖長：55塩基、↓制限酵素切断部位、切断後44塩基と11塩基に分離)
プローブH2：
5’-CCCATGGCACCAGGGTCCGTGCAGGGACGGTCGGCAGTTTCCACCGCTCCGTTCGCACACCGTGCCAAGCGGTCG-3’
プローブH3：
5’-CCCATGGCACCAGGGTCCGTGCAGGGACGGTCGGCAGTTTCCACCGCTCCGTAGGGTTCGCACACCGTGCCAAGCGGTCG-3’
プローブH4：
5’-CCCATGGCACCAGGGTCCGTGCAGGGACGGTCGGCAGTTTCCACCGCTCCGTAGGATGGGTTCGCACACCGTGCCAAGCGGTCG-3’
ポジティブ標的塩基配列4(P4)：
5’-TGCGTACCGAGCTCCGAGCCGAGGCATCCTAGCAGCGGGAGCGGTGGAAACTGCCGACCGTCCCTGCACGGACCCTGGTGCCATGGGTAGGTTGACCAC-3’
【００９６】
操作を説明すると、まずプローブとなるプローブU及び プローブL、プローブHの3配列と上記ポジティブ標的塩基配列を含む溶液の最終濃度を表１９に示すように調整し、95℃で5分間かけてDNAを変性した後徐冷し、ジャンクション構造を形成させた。この反応液の塩濃度は、NaCl濃度が100 mM、MgCl2が10 mM、Tris-バッファー(pH=7.9)の濃度が50 mM、ジチオスレイトールが1 mM、BSAが100 μg/ml、全量が40μｌとなるように調整した。ここでD 5、D 8、D 11は、制限酵素が入っていないサンプル、D6、D9、D12は、制限酵素は入っているが標的塩基配列が入っていないサンプルとして準備した。図４２はD7、図４４はD10、図４６はD13の反応溶液中でジャンクションを形成する際の推定される構造にそれぞれ該当している。図４４および図４６は、フォーウェイジャンクションの構造が変化し、２つのスリーウェイジャンクションが組み合わさった形になる場合の推測図で、２つのスリーウェイジャンクションが連結している核酸の長さが図４４と図４６の場合では異なっており、前者が5mer、後者が9merになっている。
【００９７】
この核酸溶液に制限酵素Tli I (ctcgag)を30U添加し、プローブの切断反応を行った。2時間後 0.5 M EDTAを反応液に加え反応を停止させた。反応停止後サンプルを20 ％ 変性ポリアクリルアミドゲルにアプライして電気泳動を行った。電気泳動後、ゲル中のDNAを染色し、プローブが切断されて生じたDNA断片のバンド強度を確認した。電気泳動の結果は、蛍光光度計によりにて解析を行い数値化したところ、表２０のような結果となった。
【００９８】
【表１９】
2005118031.tif 000021
【００９９】
【表２０】
2005118031.tif 000022
【０１００】
表２０の結果から、D7、D10、D13の値から標的塩基配列存在下においてプローブUが切断されること、また、DNA切断片が確認できる。制限酵素認識部位と標的塩基配列の間にスペース（ここでいうスペースとは、図４４と図４６とで、２つのスリーウェイジャンクションを連結している塩基の長さ）が5塩基または9塩基挿入されてしても、標的塩基配列存在下でプローブが切断されることが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】スリーウェイジャンクションの一般的な構造を示す。
【図２】本発明の核酸プローブの第１の態様を示す。
【図３】本発明の核酸プローブを用いる標的核酸配列の検出方法の概要を示す。
【図４】本発明の核酸プローブの第２の態様を示す。
【図５】本発明の核酸プローブの第３の態様を示す。
【図６】本発明の核酸プローブの第４の態様を示す。
【図７】図６の核酸プローブの構造を示す。
【図８】標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出するための本発明の核酸プローブを示す。
【図９】標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出するための本発明の核酸プローブの別の態様を示す。
【図１０】本発明のマルチウェイジャンクション構造のいくつかの例を示す。
【図１１】実施例１においてプローブAおよびBにより形成されるスリーウェイジャンクション構造を示す。
【図１２】実施例１において用いられた標的塩基配列および2本1組のプローブの配列を示す。
【図１３】実施例１において得られた蛍光強度のグラフを示す。
【図１４】実施例２において用いられた標的塩基配列および2本1組のプローブの配列を示す。
【図１５】実施例２において得られた電気泳動の結果を示す。
【図１６】実施例３において、プローブAとB、標的塩基配列の3分子により形成されるスリーウェイジャンクション構造を示す。
【図１７】実施例３において用いられた標的塩基配列およびプローブA及びプローブBの配列を示す。
【図１８】実施例３において得られた電気泳動の結果を示す。
【図１９】実施例４において、プローブCとD、標的塩基配列の3分子により形成されるスリーウェイジャンクション構造を示す。
【図２０】実施例４において用いられた標的塩基配列およびプローブC及びプローブDの配列を示す。
【図２１】実施例４において得られた電気泳動の結果を示す。
【図２２】実施例5において用いられた標的塩基配列および2本1組のプローブの配列を示す。
【図２３】実施例5において形成されるスリーウェイジャンクション構造を示す。
【図２４】実施例5において得られた電気泳動の結果を示す。
【図２５】実施例6において用いられたRNA標的塩基配列および2本1組の核酸プローブの配列を示す。
【図２６】実施例6において形成されるスリーウェイジャンクション構造を示す。
【図２７】実施例6において得られた電気泳動の結果を示す。
【図２８】実施例7において用いられた標的塩基配列、PCRプライマー、プローブの配列を示す。
【図２９】実施例7において得られたPCR反応の電気泳動の結果を示す。
【図３０】実施例7において形成されるスリーウェイジャンクション構造を示す。
【図３１】実施例7において得られた検出反応の電気泳動の結果を示す。
【図３２】2種類のプローブと標的塩基配列の3分子、すなわち配列A1, B1, P1により形成されるスリーウェイジャンクション構造を示す図である。
【図３３】図３２のジャンクション部の拡大図である。
【図３４】2種類のプローブと標的塩基配列の3分子、すなわち配列A1, B1, N1により形成されるスリーウェイジャンクション構造を示す図である。
【図３５】図３４のジャンクション部の拡大図である。
【図３６】2種類のプローブと標的塩基配列の3分子により形成されるスリーウェイジャンクション構造を示す図である。配列A1, B2, P2で形成するスリーウェイジャンクション構造のジャンクション部に消光分子が結合している。
【図３７】図３６のジャンクション部の拡大図である。
【図３８】3種類のプローブと標的塩基配列の4分子、すなわち配列U1, L1, H1、P3により形成されるフォーウェイジャンクション構造を示す図である。
【図３９】図３８のジャンクション部の拡大図である。
【図４０】3種類のプローブと標的塩基配列の4分子、すなわち配列U1, L1, H1、N2により形成されるフォーウェイジャンクション構造を示す図である。
【図４１】図４０のジャンクション部の拡大図である。
【図４２】3種類のプローブと標的塩基配列の4分子、すなわち配列U2, L2, H2、P4により形成されるフォーウェイジャンクション構造を示す図である。
【図４３】図４２のジャンクション部の拡大図である。
【図４４】3種類のプローブと標的塩基配列の4分子、すなわち配列U2, L3, H3、P4により形成されるフォーウェイジャンクション構造を示す図である。
【図４５】図４４のジャンクション部の拡大図である。
【図４６】3種類のプローブと標的塩基配列の4分子、すなわち配列U2, L4, H4、P4により形成されるダブルスリーウェイジャンクション構造を示す図である。
【図４７】図４６のジャンクション部の拡大図である。
【符号の説明】
【０１０２】
１０  核酸プローブ
１８  制限酵素認識配列
３６  ニックを有する制限酵素認識配列
４２  ニックを有する制限酵素認識配列
１００  標的塩基配列
１１０  ポジティブ標的塩基配列
１１２  ネガティブ標的塩基配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２８】
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【図３０】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図１５】
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【図１８】
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【図２１】
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【図２４】
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【図２７】
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【図２９】
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【図３１】
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【配列表】
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