(57)【要約】  【課題】ストレプトミセス（Streptomyces）属の微生物が生産するトランスグルタミナーゼを工業的規模で簡便に結晶化する方法及びこの方法を利用して結晶化されたトランスグルタミナーゼに添加剤を含ませてトランスグルタミナーゼ製剤を製造する方法を提供すること。  【解決手段】ストレプトミセス（Streptomyces）属の微生物が生産するトランスグルタミナーゼの粗酵素又は粗酵素を部分精製したものに塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムを添加して塩析を行うことを特徴とするトランスグルタミナーゼの工業的結晶化方法。  この発明において、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムを飽和量まで徐々に添加しても良い。また、ストレプトミセス（Streptomyces）属の微生物は、ストレプトミセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis)又はストレプトミセス・ラベンデュラエ（Streptomyces lavendulae）でも良い。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトミセス（Streptomyces）属の微生物が生産するトランスグルタミナーゼの粗酵素又は粗酵素を部分精製したものに塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムを添加して塩析を行うことを特徴とするトランスグルタミナーゼの工業的結晶化方法。
【請求項２】
塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムを飽和量まで徐々に添加することを特徴とする請求項１に記載のトランスグルタミナーゼの工業的結晶化方法。
【請求項３】
ストレプトミセス（Streptomyces）属の微生物がストレプトミセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis)又はストレプトミセス・ラベンデュラエ（Streptomyces lavendulae）である請求項１又は請求項２に記載のトランスグルタミナーゼの工業的結晶化方法。
【請求項４】
結晶化に供される粗酵素又は粗酵素を部分精製したものの比活性が、２ｕ／Ａｂ２８０ｎｍ以上である請求項１〜請求項３のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの工業的結晶化方法。
【請求項５】
ストレプトミセス（Streptomyces）属の微生物が夾雑蛋白の少ないトランスグルタミナーゼを生産するものである請求項１〜請求項４のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの工業的結晶化方法。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの工業的結晶化方法を利用し、結晶化されたトランスグルタミナーゼに添加剤を含ませることを特徴とするトランスグルタミナーゼ製剤の製造方法。
【請求項７】
添加剤がトランスグルタミナーゼの安定化に寄与する物質であることを特徴とする請求項６に記載のトランスグルタミナーゼ製剤の製造方法。
【請求項８】
トランスグルタミナーゼの安定化に寄与する物質がグルタミンペプチド、ペプチーノなどの蛋白質部分分解物、トレハロース、システィン、グルタチオン、亜硫酸水素ナトリウム、クエン酸塩及びリン酸塩から選ばれた１種又は２種以上であることを特徴とする請求項７に記載のなるトランスグルタミナーゼ製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主として食品用途に利用できるトランスグルタミナーゼを工業的規模で結晶化する方法及びこの方法を利用するトランスグルタミナーゼ製剤を製造する方法に関する。  
【背景技術】
【０００２】
トランスグルタミナーゼ（以下、ＴＧａｓｅと記載することがある）は、ペプチド鎖内にあるグルタミン残基のγ−カルボキシルアミド基のアシル転換反応を触媒する酵素で、アシル受容体としてタンパク質中のリジン残基のε−アミノ基が作用すると、タンパク質分子の分子内あるいは分子間においてε-(γ-Gln)-Lys架橋結合を形成させる。したがって、ＴＧａｓｅの作用を利用すればタンパク質又はペプチドの改質を行うことができるため、ストレプトミセス属由来の微生物酵素を部分精製したＴＧａｓｅ（特許文献１参照）が肉の結着、ソーセージ、豆腐、パン、麺類の製造に使用されている。  
【０００３】
ところで、酵素の結晶化は、一般的には、多段階で複雑な精製操作により均一にまで精製された酵素を用いて行われ、従来、様々な方法がある。しかし、酵素の結晶化は、均一にまで精製された酵素を用いても簡単に成功するものではなく、結晶化が成功するか否かは非常に経験的な要素が強く働くことが知られている。したがって、これまでに結晶化が成功していない多くの酵素がある。ＴＧａｓｅについても、結晶化されたものが既に報告されているが（特許文献２参照）、その調製法はハンギングドロップ法による超微量の実験室規模の調製法によるものであり、しかも結晶化剤が食品用途には不向きな物質が使われている。ＴＧａｓｅの場合、工業的規模で簡便に結晶化することは酵素を均一に精製することが必要なこと等製造工程の煩雑さ、収率の低さ、コストが高くなる等の理由から困難と言われ、未だ成功していないのが実情である。
したがって、現在、工業的に製造されているＴＧａｓｅは、発酵混合物から菌体等を除いた粗酵素液を限外濾過膜により脱塩濃縮後、アルコール分画沈殿等により部分精製されたものであるが、部分精製酵素であることに起因して以下のような様々な問題点があったため、ＴＧａｓｅの工業的な結晶化が強く望まれていた。
（１）プロテアーゼやアミラーゼ等の夾雑酵素や着色物質を含むため、使用目的により好ましくない影響を受けることがあり、厳格な品質管理を設定した製品の製造管理が必要で煩雑であった。また、これらの夾雑物を除き品質を上げようとすると収率が悪くコストも高くなるという問題があった。
（２）比活性の低下等の理由で安定化剤の種類や添加量に限界があり、乾燥時における失活などによる収率の低下の問題があった。
（３）結晶酵素であれば液状や高濃度懸濁液などの製剤化が容易であるが、部分精製では粉末以外、例えば、液状にするとプロテアーゼ等の夾雑酵素による失活の虞があり、また、沈殿剤等を添加して懸濁状又はペースト状にすると比活性が低いことから使用量が多くなり、最終製品への安定化剤や沈殿剤の添加の影響が大きくなるという問題があり、事実上粉末以外の製剤化は困難であった。
（４）上記（３）の理由から、現在、ＴＧａｓｅは粉末品として供給されているが、粉末を水に溶解する等の取り扱い時に粉末が飛散し易く、特に目、鼻にプロテアーゼと同様の軽い炎症を招く虞があった。    
【特許文献１】特許第２８４９７７３号明細書
【特許文献２】特開２００２−２５３２７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、ストレプトミセス（Streptomyces）属の微生物が生産するトランスグルタミナーゼを工業的規模で簡便に結晶化する方法及びこの方法を利用して結晶化されたトランスグルタミナーゼに添加剤を含ませてトランスグルタミナーゼ製剤を簡便に製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、上記課題を解決するために種々検討を重ねた結果、塩化ナトリウム又は塩化カリウムを用いて塩析を行えば、ＴＧａｓｅ以外の夾雑蛋白の沈殿が少ないことを見出し、本発明を完成するに至った。  
すなわち、本発明は、ストレプトミセス（Streptomyces）属の微生物が生産するトランスグルタミナーゼの粗酵素又は粗酵素を部分精製したものに塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムを添加して塩析を行うことを特徴とするトランスグルタミナーゼの工業的結晶化方法を要旨とする。ここで、粗酵素とは、ストレプトミセス（Streptomyces）属の微生物が生産するＴＧａｓｅを含む培養濾液をいう。また、粗酵素を部分精製したものとは、粗酵素に簡便な精製操作を加え、ＴＧａｓｅが均一になるまで精製されないＴＧａｓｅをいう。
【０００６】
また、上記の発明において、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムを飽和量まで徐々に添加しても良い。上記の発明において、ストレプトミセス（Streptomyces）属の微生物をストレプトミセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis)又はストレプトミセス・ラベンデュラエ（Streptomyces lavendulae）のいずれかとしても良い。上記の発明において、結晶化に供される粗酵素又は粗酵素を部分精製したものの比活性を２ｕ／Ａｂ２８０ｎｍ以上としても良い。ここでいう比活性とは、波長２８０ｎｍにおける紫外線の吸光度を測定し、その吸光度当たりの酵素活性で表したものをいう。また、上記の発明において、ストレプトミセス（Streptomyces）属の微生物を夾雑蛋白の少ないトランスグルタミナーゼが生産するものとしても良い。
【０００７】
また、本発明は、上記のトランスグルタミナーゼの工業的結晶化方法を利用し、結晶化されたトランスグルタミナーゼに添加剤を含ませることを特徴とするトランスグルタミナーゼ製剤の製造方法を要旨とする。この発明において、添加剤をトランスグルタミナーゼの安定化に寄与する物質としても良く、このような物質はグルタミンペプチド、ペプチーノなどの蛋白質部分分解物、トレハロース、システィン、グルタチオン、亜硫酸水素ナトリウム、クエン酸塩及びリン酸塩から選ばれた１種又は２種以上としても良い。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、以下の効果を奏する。粗酵素又は粗酵素を部分精製したＴＧａｓｅを工業的規模でかつ高い回収率で結晶化できるので、コストの低減化と製造管理の簡便化を図ることができる。また、結晶化されたＴＧａｓｅにより、液状、懸濁状、ペースト状など液体状の製品を容易に製造でき、また、ＴＧａｓｅによるプロテアーゼと同様な目、鼻の炎症などの問題を回避できる。さらに、結晶化されたＴＧａｓｅは比活性が高いので、十分量の安定化剤を添加でき、保存安定性に優れたＴＧａｓｅ製剤を提供できる。また、工業的な規模で結晶化されるトランスグルタミナーゼを用いることにより高品質のトランスグルタミナーゼ製剤を容易に製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
ＴＧａｓｅ生産能を有する菌株の発酵により製造される発酵混合物から菌体等を除去した培養濾液からなるＴＧａｓｅの粗酵素溶液を調製する。ＴＧａｓｅは、ストレプトミセス（Streptomyces）属の微生物が生産するものを用いることができる。ストレプトミセス属に属する微生物としては、ストレプトミセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis)（旧ストレプトベルチシリウム・モバラエンセ）、ストレプトミセス・ラベンデュラエ（Streptomyces lavendulae）などを挙げることができる。ストレプトミセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis)はS-8112株（Agric.Biol.Chem.,53(10),2613-2617,1989、FERM P-18980）、ストレプトミセス・ラベンデュラエ（Streptomyces lavendulae）は、No.466（特許文献１参照、FERM P-11657）などを例示できる。また、紫外線照射やＮＴＧ（N-methyl-N'-nitrosoguanidine）等の常法を用いて生産性を高めたり、プロテアーゼやアミラーゼなどの夾雑蛋白の生産を減らしたり、抗生物質などの生理活性物質を抑制又は欠如させたようなストレプトミセス（Streptomyces）属の微生物の変異株を使用することもでき、更には、遺伝子組換え菌等の使用もできる。既述のストレプトミセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis)S-8112株を変異させたものとして、ストレプトミセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis)No.140226株及びストレプトミセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis)No.W42228株を例示でき、これらは本出願人によりブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ、〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されており、受託番号はそれぞれをFERM P-19448、FERM P-19449である。
【００１０】
ストレプトミセス（Streptomyces）属の微生物の発酵に使用する培地としては、デンプン、蔗糖、乳糖、グリセロール、グルコース等の炭素源、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等の窒素源、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等の微量金属塩など一般的に用いられる培地原料を使用できる。また、発泡を抑えるために消泡剤の添加も必要に応じて行うことができる。培養は、２５℃〜３５℃の範囲が一般的であり、各種発酵容器により実施され、通常３日間〜６日間の通気撹拌が行われる。菌株や発酵培地培養条件によってはこの限りでなく、例えば、培地原料をフイーヂングしたり、高濃度の培地原料を含む場合は、一般的に培養時間が更に長くなることもある。また、培地ｐＨの制御も必要に応じて行われる。
【００１１】
培養終了後における発酵混合物からの菌体等の除去は、珪藻土を用いる濾過やメンブレンあるいはセラミックフイルターなどを用いる濾過あるいは遠心分離により行うことができる。濾過の場合、珪藻土を加えた加圧濾過が好ましく、また、室温以下で実施することが好ましい。得られた培養濾液、すなわちＴＧａｓｅの粗酵素液は、必要に応じて冷却が行われる。また、Eur,.J,Biochem.,257,570-576(1998)に記載されているように、ＴＧａｓｅは前駆体として生産されることが知られており、成熟体への変換のため発酵混合物を一定時間そのまま、あるいは他のプロセッシングに使用可能なトリプシン等の酵素を添加して保温しても良い。
【００１２】
粗酵素液の部分精製は、濃縮処理により行うことができる。濃縮方法は、特に限定されるものではないが、濃縮と精製が同時に可能な限外濾過膜の利用が好ましい。濃縮は、１０倍〜１００倍程度まで行うことができるが、次の工程の他の精製操作や塩析結晶化における沈殿の生成、回収に可能な濃度に達していれば特に問題がなく、作業性や回収率等を考慮すれば高い方が好ましい。なお、限外濾過膜は、ＴＧａｓｅの分子量約38,000を考慮すれば、それ以下の例えば分子量13,000の平均孔径を有する旭化成社製ACP等の使用が好ましいと言えるが、必ずしもこれに限定されることはなく、分子量50,000の孔径を有する膜を使用してもほとんど酵素が漏れることがないので、必要に応じて膜の選択を行うことで精製度を高めることも可能である。脱塩濃縮において沈殿を生じることもあるが、適切な緩衝液あるいは塩類溶液等を加えることにより溶解させ、回収率を高めることが可能である。また、濃縮時の温度は、特に限定されるものではないが、１０℃〜３０℃が好ましい。温度が高い程濃縮は効率的に実施できるが、失活を考慮する必要がある。また、濃縮は２回以上行うことができ、濃縮液には、予め活性炭による脱色を行っても良い。
【００１３】
また、粗酵素液の部分精製は、上記のように単なる脱塩濃縮や活性炭による脱色の他にも、吸着剤やイオン交換樹脂あるいはエタノール、ポリエチレングリコール等の沈殿剤を用いて行うこともできる。特に、酵素濃度が低い場合には、回収率を高めるために沈殿性が高い硫安等を併用することも有効である。
【００１４】
ＴＧａｓｅは、ＴＧａｓｅの粗酵素あるいは粗酵素を部分精製したものに塩化ナトリウム又は塩化カリウムを添加する塩析により結晶化することができる。酵素の結晶化は、一般的に多段階で複雑な精製操作を経て均一にまで精製し濃縮した酵素溶液を用いて行うものであるが、本発明によれば、塩化ナトリウム又は塩化カリウムはＴＧａｓｅの粗酵素あるいは粗酵素を部分精製したものへ添加すると他の夾雑蛋白の沈殿が少なく、結晶化が容易となり、また高い収率で結晶化できるので、工業的規模で結晶化されたＴＧａｓｅを製造できる。ＴＧａｓｅの粗酵素あるいは粗酵素を部分精製したものにおけるＡｂ２８０ｎｍの吸光度当たりの酵素単位（ｕ）が２単位以上であれば、塩化ナトリウム又は塩化カリウムの添加で確実に結晶化ができる。尤も、粗酵素に塩析を行うことは、部分精製した酵素に比べ、夾雑蛋白が多いことや酵素濃度が低く、酵素の回収率が低いことあるいは多量の塩類の添加が必要となることから好ましい方法ではないが、生産菌株の改良や生産培地培養条件等の改良により生産性が高くなればその限りでない。なお、塩化ナトリウムと塩化カリウムは併用しても良い。
【００１５】
ＴＧａｓｅの結晶化は、予め結晶種を添加しても良いが、添加しなくても可能である。  また、塩化ナトリウム又は塩化カリウムの添加方法によっては、結晶ではなく不定形の沈殿が生成することがあるので（酵素の純度と塩化ナトリウム濃度又は塩化カリウム濃度の変化が微妙に影響することによると思われる）、塩化ナトリウム又は塩化カリウムを一時に飽和させるのではなく徐々に添加して飽和させることが好ましい。なお、不定形の沈殿は、再溶解して塩析を行えば容易に結晶化できる。通常、酵素の結晶化は、僅かに不定形の沈殿を生成する過飽和状態から時間をかけて塩濃度を高めたり、何らかの刺激を酵素液に与えて行われるが、塩化ナトリウム又は塩化カリウムの場合は既述のように他の夾雑蛋白の沈殿が少ないことから結晶化が容易に行えるものと思われる。また、塩化ナトリウム又は塩化カリウムを用いて得られる結晶懸濁液の安定性は、結晶状態であることと塩濃度が高いことにより非常に優れており、長期保存も可能である。従って、必要があれば結晶懸濁液そのまま、あるいは適切な安定化剤を加えた製剤とすることも可能となった。
【００１６】
また、粗酵素又は粗酵素を部分精製したものからのＴＧａｓｅの結晶化後に得られた結晶母液の温度を高めたり、pHを変えたり、微量のリン酸塩や硫酸塩等の塩類を加えることにより結晶母液からのＴＧａｓｅの結晶化を行え、ＴＧａｓｅの回収率を高めることができる。
【００１７】
結晶の回収は、濾過や遠心分離など一般的な方法により実施できる。いずれの場合も結晶母液に含まれる夾雑蛋白を十分に除くため洗浄を行うことが好ましい。また、得られた結晶（粗結晶）は、水あるいは塩類溶液等を用いて溶解した後、再度塩類を用いて結晶化を行ういわゆる再結晶化操作を行うことで、更に不純物の除去が可能である。
【００１８】
得られた結晶は、水あるいは塩類溶液等を用いて溶解した後、塩析に使用した塩類を除くため、限外濾過膜その他の方法を用いて脱塩濃縮を行い、凍結乾燥などの方法により粉末化できる。乾燥方法は、他に噴霧乾燥、減圧乾燥、フイルム乾燥、あるいはアルコール等の有機溶媒により沈殿させた後、真空乾燥すること等で可能である。脱塩濃縮は、乾燥効率を考慮すればできる限り濃度を高めることが好ましいが、濃度を高めることによりＴＧａｓｅが沈殿として析出することもあるので、この場合、低濃度の塩類溶液を添加して溶解性を高めることができる。
【００１９】
回収率を高めるなどの目的のためにＴＧａｓｅの安定化に寄与する効果の高い物質を添加することが好ましく、例えば、グルタミンペプチド、ペプチーノなどの蛋白質部分分解物、トレハロース、システィン、グルタチオン、亜硫酸水素ナトリウム、クエン酸塩及びリン酸塩からなる１種又は２種以上を添加剤として加え製剤化することができる。また、糖類などの賦形剤などを添加剤として加え製剤化することができる。これらの添加剤は、いずれの部分精製工程においても可能であるが、好ましくは、結晶化後に行うのが好ましい。
【実施例】
【００２０】
次いで、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。  
【００２１】
〔実施例１〕（結晶化に用いる塩類の検討）
ＴＧａｓｅを結晶化する塩類の種類について検討を行った。    
市販品のＴＧａｓｅ（味の素社製ActivaTG、ストレプトミセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）が生産するＴＧａｓｅの部分精製酵素製剤）から賦形剤等を除く目的で、0.2Mトリス−塩酸緩衝液pH6.0に溶解後、硫安塩析を行い、得られた沈殿物を同緩衝液に溶解した。この溶解液を限外濾過膜（旭化成社製ACP1010）を用いて脱塩濃縮した。この操作で賦形剤等が除かれたＴＧａｓｅの部分精製酵素液を得た。なお、本酵素液のＴＧａｓｅ活性は、326u/ml、比活性は8.7u/Ab280nmであった。
【００２２】
ＴＧａｓｅの活性の測定は、特開昭６４−２７４７１号公報に記載の方法により行った。すなわち、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニルグリシンとヒドロキシルアミンを基質としてCa２＋非存在下で反応を行い、生成したヒドロキサム酸をトリクロロ酢酸共存下で鉄錯体を形成させ、525nmの吸収を測定し、ヒドロキサム酸の量を検量線より求め算出する。以下、具体的に示す。
試薬Ａ：0.2Mトリス塩酸緩衝液（pH6.0）、0.1Mヒドロキシルアミン、0.01M還元型グルタチオン、0.03Mベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニルグリシン  
試薬Ｂ：3N塩酸、12%トリクロロ酢酸、5%FeCl3・6H2O（O.1N−HClに溶解）
これらの溶液の1：1：1の混合液を試薬Ｂとした。
酵素液の0.05mlに試薬Ａを0.5mlを加えて混合し、37℃で10分間反応後、試薬Ｂを加えて反応停止とFe錯体の形成を行った後、525nmの吸光度を測定する。対照として予め熱失活させた酵素液を用いて同様に反応させたものの吸光度を測定し、酵素液との吸光度差を求める。別に酵素液のかわりにＬ−グルタミン酸−γ−モノヒドロキサム酸を用いて検量線を作成し、前記吸光度差より生成されたヒドロキサム酸の量を求め、1分間に1μモルのヒドロキサム酸を生成する酵素活性を1単位とした。
また、比活性は、波長280nmにおける紫外線の吸光度を測定し、その吸光度当たりの酵素活性で表した。ＴＧａｓｅの活性の測定及び比活性の測定は、後記の各実施例においても同様に行った。
【００２３】
試験管に上記で得た部分精製酵素液を各5ml分注して各種塩類を固体のまま添加溶解して飽和とした後、4℃１日間保存後、遠心分離を行い、沈殿物を0.2Mトリス−塩酸緩衝液pH6.0に溶解した。この溶解液を7mlとした後、ＴＧａｓｅ活性とAb280nmにおける吸光度を測定してそれぞれの回収率と比活性を求め、使用可能な塩類について検討を行った。結果は、表１に示した。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
表１から、塩化ナトリウムと塩化カリウムは、対照に比べ沈殿の比活性が上昇し、この沈殿は既に結晶性の沈殿となっていることも確認されたので、ＴＧａｓｅを容易かつ高度に結晶化できることが明らかとなった。塩化カリウムの場合、沈殿からの回収率は４８％と低いが、結晶母液から高い回収率でＴＧａｓｅを結晶化できるので、全体として高い回収率で結晶化ができる。一方、硫酸アンモニウム、酒石酸ナトリウム・カリウム、リン酸一カリウムとリン酸二カリウムの混合物では、対照に比べ比活性の上昇は認められないが沈殿の回収が高いため、分画沈殿を行うなど煩雑な操作を加えれば塩析に使用が可能かと思われる。また、これらの塩類は、塩化ナトリウムや塩化カリウムを用いる塩析において補助的に添加することも可能である。塩化ナトリウムと塩化カリウムでは本酵素液のような部分精製酵素液から結晶化が可能であったが、他の塩類では分画沈殿など煩雑な操作を行った後の酵素であることが必要であった。なお、結果は示さないが、塩化ナトリウムあるいは塩化カリウムによる結晶化はバッチ法の他にも、微量結晶の調製に有用なハンギングドロップ法においても採用できる。
【００２６】
〔実施例２〕（ＴＧａｓｅの結晶化１）
ＴＧａｓｅ生産菌のストレプトミセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）S-8112株とストレプトミセス・ラベンデュラエ（Streptomyces lavendulae）No.466株を使用して可溶性デンプン2%、ショ糖5%、ポリペプトン2%、酵母エキス0.2%、硫酸マグネシウム0.1%、リン酸二カリウム0.2%、アデカノール0.05%を含む培地を用い、500ml容坂口フラスコに入れ、4日間30℃にて振とう培養しそれぞれ粗酵素液450mlと930mlを得た。なお、%は重量%で以下の各実施例においても同様である。
【００２７】
上記の粗酵素液を限外濾過膜（旭化成社製ACP1010）を用いて脱塩濃縮し、最終的に194mlと255mlの濃縮液を得た。この濃縮液を予め50mMのリン酸緩衝液pH7.0で透析し、同緩衝液で平衡化した約40mlのブルーセファロースCL-6Bカラム（アマシャム バイオサイエンス社製）に通して酵素を吸着した後、塩化ナトリウム0.5Mを含む同緩衝液による一段階のみで溶出した。硫安飽和として酵素蛋白を沈殿として回収し、約10mlの0.2Mトリス塩酸緩衝液pH6.0に溶解して部分精製酵素液を得た。その後、この部分精製酵素液に塩化ナトリウムを徐々に添加してＴＧａｓｅの結晶化を行った（粗結晶）。回収率は、酵素濃度が低いために約10%であった。部分精製後の酵素液（表２の各カラム溶出液を参照）の比活性がそれぞれ6.2u/Ab280nmと1.74u/Ab280nmであったが、粗結晶の比活性はそれぞれ13.08u/Ab280nmと6.86u/Ab280nmであった。結晶化における各工程の結果を表２に示した。また、結晶は、図１の光学顕微鏡写真像で示されるように、長さ数十μmの針状結晶であった。
【００２８】
【表２】
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【００２９】
〔実施例３〕（ＴＧａｓｅの結晶化２）
実施例２に記載のＴＧａｓｅ生産菌のストレプトミセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）S-8112株を使用して、可溶性澱粉４%、極東ペプトン2%、酵母エキス0.2%、肉エキス 0.2%、リン酸１カリウム 0.5%、リン酸２カリウム0.５%、硫酸マグネシウム0.05%、アデカノール0.04%を含む培地を用いて3L容ミニジャーファーメンターにより培養を行い、珪藻土を用いる濾過により粗酵素液を2800ml得た。
【００３０】
限外濾過膜（旭化成社製ACP1010）による１次脱塩濃縮を行い液量を270mlとした後、活性炭2%添加による脱色処理を行ない、さらに珪藻土を用いる濾過により活性炭を除去して澄明な酵素液 310mlを得た。濃縮を行うと同時にリン酸塩緩衝液を含む酵素液とするため限外濾過膜（旭化成社製ACP1010）により２次脱塩濃縮を行い液量が54mlの部分精製酵素液を得た。この部分精製酵素液に塩化ナトリウムを飽和に達するまで徐々に添加すると同時に微量の種結晶を加えて塩析結晶化を行った。実施例２がストレプトミセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）S-8112株が生産する粗酵素液をブルーセファロースクロマトグラフィーを行い部分精製化したものを結晶化したものであるのに対し、本実施例は同じストレプトミセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）S-8112株が生産する粗酵素を濃縮と活性炭による脱色処理のみで部分精製化し、結晶化を行ったものである点で異なる。回収率は、結晶母液からの回収を含めれば結晶化工程のみでは約34%、全行程収率では約18%であった。また、部分精製後の酵素液（表３の２次限外濾過膜処理液を参照）の比活性は2.03u/Ab280nmであったが、粗結晶酵素の比活性は4.37u/Ab280nm（１回目と２回目の結晶溶解液の結果より算出）であった。結晶化における各行程の結果を表３に示した。
【００３１】
【表３】
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【００３２】
〔実施例４〕（ＴＧａｓｅの結晶化３）
実施例２に記載のストレプトミセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）S-8112株の変異により得たNo.140226株を使用して、可溶性デンプン4%、極東ペプトン2%、酵母エキス0.2%、肉エキス0.2%、リン酸一カリウム0.5%、リン酸二カリウム0.5%、硫酸マグネシウム0.05%、アデカノール0.04%含む培地を用い、3L容ミニジャーファーメンターにより培養を行い、珪藻土を用いる濾過により粗酵素液3800mlを得た。
【００３３】
上記の粗酵素液を限外濾過膜（旭化成社製ACP1010）による１次脱塩濃縮を行い液量を750mlとした後、活性炭2%添加による脱色処理を行い、さらに珪藻土を用いる濾過により活性炭を除去して澄明な酵素液950mlを得た。濃縮を行うと同時にリン酸塩緩衝液を含む酵素液とするため、限外濾過膜（旭化成社製ACP1010）による２次脱塩濃縮を行い液量が180mlの部分精製酵素液を得た。この部分精製酵素液に塩化ナトリウムを飽和に達するまで添加すると同時に微量の種結晶を加え、４℃で３日間放置して塩析結晶化を行った。また、２回目の結晶化は、結晶母液にリン酸一カリウムを加え、室温で７時間放置して行った。  回収率は、結晶母液からの回収を含めれば、結晶化工程のみでは約68%、全工程の回収率は約28%であった。また、部分精製酵素液（表４の２次限外濾過膜処理液を参照）の比活性は2.67u/Ab280nmであったが、粗結晶酵素の比活性は9.03u/Ab280nm（１回目と２回目の結晶溶解液の結果より算出）であった。結晶化における各工程の結果を表４に示した。
【００３４】
【表４】
2005073628.tif 000006
【００３５】
〔実施例５〕（ＴＧａｓｅの結晶化４）
実施例２に記載のストレプトミセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）S-8112株の変異により得たNo.W42228株を使用して、可溶性澱粉４%、極東ペプトン2%、酵母エキス0.2%、肉エキス 0.2%、リン酸１カリウム 0.5%、リン酸２カリウム0.５%、硫酸マグネシウム0.05%、アデカノール0.04%を含む培地を用いて3L容ミニジャーファーメンターにより培養を行い、珪藻土を用いる濾過により粗酵素液を3600ml得た。
【００３６】
上記の粗酵素液を限外濾過膜（旭化成社製ACP1010）による１次脱塩濃縮を行い液量を320mlとした後、活性炭2% 添加による脱色処理を行ない、珪藻土を用いる濾過により活性炭を除去して澄明な酵素液 390mlを得た。濃縮を行うと同時にリン酸塩緩衝液を含む酵素液とするため、限外濾過膜（旭化成社製ACP1010）による第２次脱塩濃縮を行い液量が58mlの部分精製酵素液を得た。この部分精製酵素液に塩化ナトリウムを飽和に達するまで添加すると同時に微量の種結晶を加え、４℃で３日間放置して塩析結晶化を行った。また、２回目の結晶化は、１回目の結晶化で得た結晶母液を室温で７時間放置して行った。回収率は、結晶母液からの回収を含めれば、結晶化工程のみでは約48%、全工程の回収率は約19%であった。また、部分精製酵素液（表５の２次限外濾過膜処理液を参照）の比活性は2.10u/Ab280nmであったが、粗結晶酵素の比活性は4.75u/Ab280nm（１回目と２回目の結晶溶解液の結果より算出）であった。結晶化における各工程の結果を表５に示した。
【００３７】
【表５】
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【００３８】
〔実施例６〕（ＴＧａｓｅの結晶化５）
市販品のＴＧａｓｅ（味の素社製ActivaTG、ストレプトミセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）が生産するＴＧａｓｅの部分精製酵素製剤）200gを0.2Mトリス−塩酸緩衝液pH6.0 1000mlに溶解した後、賦形剤等を除く目的で不溶物を珪藻土を用いた濾過により除き（濾液：1000ml）、硫安を450g加えて塩析した。4℃、3時間放置後、遠心分離により沈殿を集め、約1000mlの上記緩衝液に溶解後、限外濾過膜（旭化成社製ACP1010）を用いて脱塩濃縮して500mlとした。この部分精製酵素液に塩化ナトリウムを徐々に加え塩析結晶化を行った。得られた粗結晶の比活性は、結晶化前が8.7u/Ab280nmであったのに対し、10.9u/Ab280nmであった。また、珪藻土で濾過した製品溶解濾液の比活性は、7.1u/Ab280nmであった。回収率は、部分精製酵素液（表６の限外濾過膜処理液を参照）からは66％で、製品溶解濾液（表６の珪藻土濾過処理液を参照）からは60%であった。結晶化における各工程の結果を表６に示した。
【００３９】
【表６】
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【００４０】
以上説明した実施例２〜実施例６において、結晶化されたＴＧａｓｅの比活性が結晶化前に比べいずれも顕著に上昇している（表２〜表６参照）ことから、結晶化前のＴＧａｓｅは均一にまで精製されない部分精製酵素であることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明によるトランスグルタミナーゼの結晶の光学顕微鏡写真像である。
【図１】
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