(57)【要約】【課題】  酵母でも選択マーカーとして利用できるネオマイシン耐性遺伝子、及び、その発現によるネオマイシン耐性、ゲネチシン耐性、及び/又は、Ｇ４１８耐性を利用することにより、酵母の形質転換株を選択する方法を提供する。【解決手段】  本発明では、大腸菌由来のネオマイシン耐性遺伝子のＣＴＧコドンをそれ以外のロイシンコドンに変換することにより、同遺伝子がキャンディダ属酵母で選択マーカーとして機能する事を見出した。この遺伝子の利用により、ネオマイシン、ゲネチシン及びＧ４１８耐性菌として野生株や既存の有用物質生産キャンディダ属酵母においても遺伝子組換え株を容易に取得することが可能になり、その遺伝子組換え株を用いた有用物質生産系での菌株の新たな育種方法を提供した。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の配列の内、少なくとも１つ以上のＣＴＧコドンをＣＴＧ以外のロイシンコドンに改変したネオマイシン耐性遺伝子。
【請求項２】
配列番号２に記載のネオマイシン耐性遺伝子。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の遺伝子の発現カセットを含有する発現ベクター。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の遺伝子の発現カセットを用いて酵母を形質転換した後に、ネオマイシン、ゲネチシン及び／又はＧ４１８を添加した培地を用いて形質転換後の菌体を培養することにより、酵母の形質転換株を選択する方法。
【請求項５】
酵母がキャンディダ・シリンドラッセ、キャンディダ・トロピカリス、キャンディダ・マルトーサ、キャンディダ・アルビカンス、キャンディダ・ルシタニエ又はキャンディダ・メリビオシカである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
酵母がキャンディダ・マルトーサである請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同種或いは異種遺伝子を導入して形質転換する際に利用される選択マーカーの一つであるネオマイシン耐性遺伝子、及び、当該遺伝子を用いて形質転換株を選択する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術の発展に伴い、微生物を用いて有用蛋白質、有用化学品等の生産が行われてきた。原核生物である大腸菌や枯草菌を用いた遺伝子組換え系の開発が積極的に進められ、その中でも、特に大腸菌の宿主・ベクター系を用いて様々な有用物質の生産が行われている。しかし、大腸菌において生産される蛋白質は菌体内で不溶性顆粒を形成することもあり、また、真核生物において特徴的な糖鎖付加を行うことができないなどの問題もあった。
【０００３】
これに対して真核生物である酵母を宿主とした系の開発も進められた。酵母は古くから醸造や製パンに利用されており、またかつて飼料用として生産された経緯もあり、高い安全性が保証されているものもある。また、生産される蛋白質に糖鎖付加を行うことも原核生物とは区別される特徴である。
【０００４】
遺伝学的知見が豊富なサッカロマイセス・セレビジェの他、シワニオマイセス属、クルイベロマイセス属、ピキア属、ハンセヌラ属、ヤロウィア属、キャンディダ属において、宿主・ベクター系が開発されている（非特許文献１参照）。
【０００５】
これらの酵母の中には、直鎖炭化水素（ｎ−アルカン）が唯一の炭素源であっても生育できるものがある。キャンディダ属のキャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）などや、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などである。これらの酵母はｎ−アルカンの末端を酸化する酵素系をもち、酸化によって生じた長鎖カルボン酸を、ペルオキシソームのβ酸化系によってクエン酸回路（ＴＣＡサイクル）の基質となるアセチル−補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）にまで分解し、エネルギー源として利用することができる。
【０００６】
ｎ−アルカン資化性酵母は直鎖炭化水素を炭素源として生育するばかりでなく、通常は酵母の生育を阻害する疎水性化学物質に耐性であり、疎水性化学物質の変換による有用物質の生産・反応の場を提供する宿主としても有望である。例えばキャンディダ属菌株が、アルカンを資化してジカルボン酸を生産するために用いられている（非特許文献２参照）。
したがって、このような酵母における遺伝子発現系を構築することによって、有害な副産物を生み出さず、エネルギーを浪費しない、新たな有用物質生産系を構築することができる。
【０００７】
ｎ−アルカン資化性酵母のうちキャンディダ・マルトーサにおいても、外来遺伝子発現系の構築が積極的に行われてきた。Ｍ．Ｋａｗａｍｕｒａらは、キャンディダ・マルトーサより高効率形質転換の原因領域（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｂｉｌｉｔｙ：以下ＴＲＡと略す）を見出した（非特許文献３参照）。この領域にはキャンディダ・マルトーサにおいて自律的複製に関わる配列（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ：以下ＡＲＳと略す）およびセントロメア配列（以下ＣＥＮと略す）を含んでいることが判った。現在までに ＴＲＡ全領域を有する低コピーベクターと、ＣＥＮ領域を除いた高コピー数ベクターが開発されている（非特許文献４参照）。
【０００８】
キャンディダ属酵母の形質転換システムとしては、ウラシル要求性やアデニン要求性等の栄養要求性を形質転換体の選択マーカーとして用いる方法が知られている（特許文献１参照）。しかしながら、キャンディダ属酵母は、サッカロマイセス・セレビジェとは異なり有性世代が知られておらず、多くは２倍体ゲノムを有しているため、栄養要求性株を作出するのが難しく、既存の有用物質生産酵母を容易に形質転換できないといった問題点があった。
【０００９】
一方、パン酵母をはじめとするいくつかの酵母では、抗生物質耐性を選択マーカーに利用した形質転換が知られている(非特許文献５、６及び特許文献２参照)。抗生物質耐性を選択マーカーとして利用する形質転換方法は、宿主が制限されないといった利点があり、非常に有効且つ簡便な方法である。しかし、例えばサッカロマイセス属酵母で選択マーカーとして用いられる蛋白質合成阻害剤であるシクロヘキシミドは、その作用点であるリボソーマル蛋白質のアミノ酸配列が異なるキャンディダ属酵母においては、抗菌活性を示さないことが知られている（非特許文献７参照）。また、キャンディダ属酵母の中にはその遺伝暗号読みとりに異常があることも報告されている（非特許文献８参照）。例えば、キャンディダ・シリンドラッセ（非特許文献９参照）やキャンディダ・マルトーサ（非特許文献１０参照）は、通常ロイシンをコードするＣＴＧコドンをセリンとして読むことが報告されている。
このように、キャンディダ属酵母はサッカロマイセス・セレビジェとは大きく異なる性質を有しているといえるため、サッカロマイセス・セレビジェで利用可能な抗生物質耐性遺伝子がキャンディダ属酵母内では正常な機能を示さないことが多い。
【００１０】
ＣＴＧのロイシンコドンをそれ以外のコドンに改変した遺伝子により、キャンディダ・トロピカリスでハイグロマイシン耐性の形質転換株を選択する方法が示されている（特許文献３参照）。しかしながら、そのハイグロマイシン耐性度は、培地中のハイグロマイシンの濃度が５００μｇ/ｍｌ以上の高濃度でしか利用できない。また、形質転換に使用される遺伝子は、操作上からも遺伝子の導入頻度上からもできるだけ短い遺伝子であることが望ましいが、ハイグロマイシン耐性遺伝子は１０００塩基以上である。
【００１１】
【特許文献１】特表平４−５０５５５７号公報
【特許文献２】特開平８−３２２５７８号公報
【特許文献３】特開２０００−３４２２６３号公報
【非特許文献１】Ｋｌａｕｓ  Ｗｏｌｆ著，Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ出版，１９９６年
【非特許文献２】植村、発酵と工業、１９８５年発行、４３、４３６〜４４１頁
【非特許文献３】Ｍ．Ｋａｗａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，（１９８３），ｖｏｌ２４，１５７
【非特許文献４】Ｍ．Ｏｈｋｕｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，（１９９５），ｖｏｌ２４９，４４７
【非特許文献５】Ｇｒｉｔｚ，Ｌ．ら，Ｇｅｎｅ，１９８３，２５，１７９−１８８
【非特許文献６】Ｏｔｅｒｏ，Ｒ  Ｃ．ら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６，４６，１４３−１４８
【非特許文献７】Ｈ．Ｔａｋａｋｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，（２００１），２８４，１９４
【非特許文献８】Ｍａｓｓｅｙら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，（２００３），１３，５４４
【非特許文献９】Ｙ．Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（１９８９），ｖｏｌ３４１，１６４
【非特許文献１０】Ｈ．Ｓｕｇｉｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，ｖｏｌ１１，（１９９５），４３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、酵母でも選択マーカーとして利用できるネオマイシン耐性遺伝子及びその発現によるゲネチシン耐性を利用することにより、酵母の形質転換株を選択する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、動植物細胞における形質転換の選択マーカーとして広く利用されているネオマイシン耐性遺伝子をキャンディダ属酵母の形質転換時の選択マーカーとして利用することを検討したが、キャンディダ・マルトーサではその機能を発現させることが出来なかった。
上記課題を解決するための手段としての本発明は、ＣＴＧコドンをＣＴＧ以外のロイシンコドンに改変したネオマイシン耐性遺伝子、前記ネオマイシン耐性遺伝子発現カセット、及び、同発現カセットを含有する発現ベクターに関するものである。
すなわち本発明は、配列番号１に記載の配列の内、少なくとも１つ以上のＣＴＧコドンをＣＴＧ以外のロイシンコドンに改変したネオマイシン耐性遺伝子である。
本発明は、また、配列番号２に記載のネオマイシン耐性遺伝子である。
本発明は、また、上記遺伝子の発現カセットを含有する発現ベクターである。
本発明は、また、上記遺伝子の発現カセットを用いて酵母を形質転換した後に、ネオマイシン、ゲネチシン及び／又はＧ４１８を添加した培地を用いて形質転換後の菌体を培養することにより、酵母の形質転換株を選択する方法である。
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明にいうネオマイシン耐性遺伝子とは、ネオマイシン、ゲネチシン或いはＧ４１８をリン酸化して無毒化するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｎｅｏｍｙｃｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）酵素をコードしている遺伝子であるため、この酵素が機能するとアミノグリコシド系抗生物質であるネオマイシン、ゲネチシン及びＧ４１８に対して耐性が発現する。ネオマイシン耐性遺伝子としては、特には、大腸菌由来のものが好適である。大腸菌由来のネオマイシン耐性遺伝子の塩基配列を、配列番号１に示す。この塩基配列には、１１カ所にＣＴＧコドンが存在しており、本発明の遺伝子は、配列番号１に記載の配列の内、少なくとも１つ以上のＣＴＧコドンを他のロイシンコドン、すなわち、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ又はＣＴＡのいずれかで改変したものである。好ましくは全てのＣＴＧコドンを改変したものである。また、配列番号１に記載のアミノ酸配列のみを、配列番号５に示す。
【００１５】
これらのコドン変換は、いずれを用いても全く支障はないが、例えば宿主がキャンディダ・マルトーサの場合、コドンの使用頻度からＴＴＡ、ＴＴＧが好ましく、ＴＴＡコドンが特に好ましい。キャンディダ・マルトーサにおける各コドンの使用頻度はＫｌａｕｓ  Ｗｏｌｆ著のＮｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ出版、１９９６年）に記載されている。
【００１６】
本発明のネオマイシン耐性遺伝子は、配列番号１に記載の配列の内、少なくとも１つ以上のＣＴＧコドンを他のロイシンコドンに改変したものであれば、ＣＴＧ以外のコドンを改変していないものであってもよいし、ＣＴＧ以外のコドンをそのコドンと同じアミノ酸をコードするコドンに改変したものであってもよい。
後述の実施例２で得られる配列番号２に示す塩基配列は、本発明の遺伝子の一つである。
【００１７】
本発明のネオマイシン耐性遺伝子は、発現することによりネオマイシン、ゲネチシン及びＧ４１８への耐性が機能する。従って、本発明のネオマイシン耐性遺伝子を含むベクターを用いて形質転換された酵母のみがネオマイシン、ゲネチシン及び／又はＧ４１８を含む培地中で生育するので、形質転換されていない酵母と選別することができる。
【００１８】
上記ネオマイシン耐性遺伝子は、ベクター上のプロモーターとターミネーターとの間に挿入し、得られたベクターをキャンディダ属等の酵母に導入して酵母を形質転換させる。この場合のベクターとしては、通常用いられているベクターでも特に支障なく用いることができる。特には、自律複製可能なキャンディダ属酵母用のｐＵＴＡ１等のプラスミドを改変して（特開２００２−２０９５７４号公報に記載）用いると良い。
【００１９】
本発明の発現ベクターは、配列番号１に記載の配列の内、少なくとも１つ以上のＣＴＧコドンをＣＴＧ以外のロイシンコドンに改変したネオマイシン耐性遺伝子、又は、配列番号２に記載のネオマイシン耐性遺伝子の発現カセットを含有することを特徴とするものである。本発明において、上記発現カセットは、プロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子、ターミネーター等からなるものを意味する。
【００２０】
本発明のネオマイシン耐性遺伝子は、酵母内でプラスミドとして存在させず、相同的組換えを利用して染色体ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に組み込む事も可能である。その場合には、塩基配列が既知の適当な配列、特にはＡＤＥ１遺伝子やＵＲＡ３遺伝子等の配列内部にプロモーター及びターミネーターを連結したネオマイシン耐性遺伝子を用いればよい。転写活性の低いプロモーター或いは酵素活性を低下させたネオマイシン耐性遺伝子を用いれば、選択するゲネチシン濃度により、ｇＤＮＡに多コピー数で組み込まれた形質転換株を選択することも可能である。
【００２１】
本発明の酵母の形質転換株を選択する方法は、配列番号１に記載の配列の内、少なくとも１つ以上のＣＴＧコドンをＣＴＧ以外のロイシンコドンに改変したネオマイシン耐性遺伝子、又は、配列番号２に記載のネオマイシン耐性遺伝子の発現カセットを用いて酵母を形質転換した後に、ネオマイシン、ゲネチシン及び／又はＧ４１８を添加した培地を用いて形質転換後の菌体を培養することを特徴とするものである。
次に、酵母としてキャンディダ属酵母を用いる場合を例に挙げ、本発明によるＣＴＧコドンを改変することにより、キャンディダ属酵母でも発現するようになったネオマイシン耐性遺伝子と、そのネオマイシン耐性遺伝子を利用したキャンディダ属酵母の形質転換株取得方法の実施態様を説明する。
【００２２】
ネオマイシン耐性遺伝子の改変は、ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法によってもコドンの改変を行うことができるが、その改変した配列の遺伝子を全合成することも可能である。このコドンの改変がうまく行われたかどうかは、シークエンスを行って確認するとよい。
【００２３】
キャンディダ属酵母でネオマイシン耐性遺伝子を発現させるための発現カセットは、次のように作製することができる。ネオマイシン耐性遺伝子は、酵母以外の細菌由来の遺伝子であり、そのままでは酵母細胞で発現しないことが多い。このためキャンディダ属酵母由来のプロモーターとターミネーター領域を利用することが好ましい。キャンディダ属酵母由来のプロモーターとしては、例えば、Ｌ４１Ｐ１ｂ遺伝子プロモーター、アクチン遺伝子プロモーター、Ａｌｋ１遺伝子プロモーター等が挙げられ、キャンディダ属酵母由来のターミネーターとしては、例えば、Ａｌｋ１遺伝子ターミネーター、ＧＣＮ４遺伝子ターミネーター等が挙げられる。
【００２４】
一例としてＬ４１Ｐ１ｂ遺伝子プロモーターの使用例を示す。リボソーマル蛋白Ｌ４１Ｐ１ｂ遺伝子のプロモーターは、炭素源の種類にかかわらず構成的に転写する強力なプロモーターであることが知られている。Ｌ４１Ｐ１ｂ遺伝子は、パン酵母やキャンディダ・マルトーサで既にクローニングされているので、そのプロモーター領域もこれらの配列をもとにＰＣＲ法でクローニングすることができる（Ｋａｗａｉ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７４（１），２５４−２６２，１９９２）。ＰＣＲ法で増幅されたＬ４１Ｐ１ｂ遺伝子は、ベクターにサブクローニング後、シークエンスし、Ｌ４１Ｐ１ｂプロモーター領域遺伝子かどうか確認する。次に、制限酵素部位へネオマイシン耐性遺伝子断片を挿入し、キャンディダ属酵母用の選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子発現カセットを作製することができる。
【００２５】
このようにして作製したネオマイシン耐性遺伝子発現カセットを、キャンディダ属酵母用のベクターに導入する。作製したベクターは、大腸菌に導入後、大量調製して、キャンディダ属酵母の形質転換に用いる。
【００２６】
キャンディダ属酵母の形質転換法として、一般に用いられているリチウム法、スフェロプラスト法、電気導入法等を本発明でも用いることができる。これらの方法は、形質転換効率や操作の煩雑さ等に若干の違いがあるが、いずれの方法でも効率よく形質転換できる。
【００２７】
ネオマイシン、ゲネチシン及び／又はＧ４１８による形質転換株の選択は、本発明の遺伝子の発現カセットを用いて酵母を形質転換した後に、通常酵母の培養で用いられるＹＰＤプレート（１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％ペプトン、２ｗ／ｖ％グルコース、２ｗ／ｖ％寒天）にネオマイシン、ゲネチシン及び／又はＧ４１８を添加した培地を用いて形質転換後の菌体を培養することにより、直接行うことができる。ゲネチシンを用いる場合、培地中のゲネチシンの濃度は、２００μｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌが好ましい。培養温度は、２０〜４０℃が好ましく、培養時間は、２４〜９６時間が好ましい。
【００２８】
また、ベクターとしてｐＵＴＡ１を用いた場合には、アデニン要求性を一次選択マーカーとしてＹＮＢプレート（０．６７ｗ／ｖ％アミノ酸不含の窒素ベースの酵母、２ｗ／ｖ％グルコース、２ｗ／ｖ％寒天）で形質転換株を選択し、次に得られた形質転換株をゲネチシン含有ＹＰＤプレートに引き延ばし、ネオマイシン耐性遺伝子の発現を確認することもできる。
【００２９】
ネオマイシン耐性遺伝子は、その長さが８００塩基以下と比較的短く、ハイグロマイシン耐性遺伝子が１０００塩基以上あるのに対し、操作上、遺伝子の導入頻度上等から有利である。また、ハイグロマイシン耐性を利用した場合は、ハイグロマイシン濃度が５００μｇ/ｍｌ以上と高濃度でしか形質転換株を選択できないが、ネオマイシン耐性を利用した本発明の方法では、キャンディダ・マルトーサにおいては２００μｇ/ｍｌの濃度で選択可能であるので、この点でも有利である。
【００３０】
本発明の方法において、酵母の種類としては特に限定されないが、キャンディダ属が好ましい。上記キャンディダ属のなかでも、キャンディダ・シリンドラッセ、キャンディダ・トロピカリス、キャンディダ・マルトーサ、キャンディダ・アルビカンス、キャンディダ・ルシタニエ、キャンディダ・メリビオシカが好ましく、キャンディダ・マルトーサがより好ましい。
【発明の効果】
【００３１】
本発明により、宿主側に予め何ら栄養要求性などを付与せずに形質転換を行うこと、すなわち形質転換株を選択することが可能になり、野生株や有用物質生産株に対しても遺伝子組換えによる育種を容易に行うことが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例にその技術範囲を限定するものではない。
【００３３】
（実施例１）ゲネチシン感受性の確認
ＹＰＤ液体培地で一晩培養した、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されているキャンディダ・マルトーサＡＣ１６（アデニン要求性）株（受託日：平成１２年１１月１５日、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３６６、特開２００２−２０９５７４号公報）の培養液を、同培地で１０万分の１に希釈後、その０．１ｍｌをそれぞれ、ゲネチシン不含、ゲネチシン濃度１００μｇ/ｍｌ、ゲネチシン濃度２００μｇ/ｍｌの３種のＹＰＤプレートにまいた。３０℃で３日間培養後、観察したところ、ゲネチシンが入ってないプレートには、約４５４個のコロニーが出現した。また、１００μｇ/ｍｌの濃度でゲネチシンを含むプレートには、約１００個のコロニーが出現した。それに対し、２００μｇ/ｍｌのゲネチシンを含むプレートでは、コロニーは観察されず、完全にコロニー形成が抑制された。これにより、ゲネチシンがキャンディダ・マルトーサの生育を抑制し、ゲネチシン耐性を発現する遺伝子がキャンディダ属酵母の形質転換の選択マーカーとして利用できる可能性が明らかとなった。
【００３４】
（実施例２）キャンディダ属酵母用ネオマイシン耐性遺伝子の全合成
配列番号１に示した大腸菌由来のネオマイシン（Ｎｅｏ）耐性遺伝子のアミノ酸配列が変化しないように、キャンディダ・マルトーサ細胞内でネオマイシンホスホトランスフェラーゼ蛋白質が機能するようにその塩基配列を設計し、全合成を行った。設計にあたり、キャンディダ・マルトーサにおける各コドンの使用頻度はＫｌａｕｓ  Ｗｏｌｆ著のＮｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ出版、１９９６年）に記載されているので、それを参考にＣＴＧコドンをＴＴＡ或いはＴＴＧを中心に改変して設計した。改変したネオマイシン耐性遺伝子（以下ＣｍＮｅｏと略す）の５‘末端側は開始コドンＡＴＧが含まれるように制限酵素ＮｄｅＩ部位とし、３’側は停止コドンＴＡＡの下流が制限酵素ＰｓｔＩ部位となるようにした。その塩基配列を配列番号２に示した。また、配列番号２に記載のアミノ酸配列のみを、配列番号６に示した。
【００３５】
（実施例３）Ｌ４１Ｐ１ｂ遺伝子プロモーター領域のクローニング
ＣｍＮｅｏ遺伝子の発現に用いるキャンディダ・マルトーサ由来のＬ４１Ｐ１ｂ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄ１０５７７）プロモーター領域は以下のようにしてクローニングした。
キャンディダ・マルトーサの染色体ＤＮＡは市販のＥ．Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｙｅａｓｔ  ＤＮＡ  Ｋｉｔｓ（ＯＭＥＧＡ  ＢＩＯＴＥＫ社製）を用いて調製した。調製方法は、同Ｋｉｔに付属する説明書に従った。分離した染色体ＤＮＡをＰＣＲの鋳型とし、配列番号３及び配列番号４のＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行った。酵素はＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いた。その条件は、同Ｋｉｔに付属する説明書に従ったが、詳しくは、鋳型ＤＮＡ１μｇ、それぞれ終濃度１μＭの２種類のプライマー、２．５ＵのＥｘ  Ｔａｑ  ポリメラーゼ、付属するＢｕｆｆｅｒを０．０１ｍｌ、付属するｄＮＴＰ混合液０．００８ｍｌに水を加えて０．１ｍｌとした。これを、９８℃１５秒−５５℃１分−７２℃１分を１サイクルとして２５サイクルのＰＣＲを行って、約０．８ｋｂのＬ４１Ｐ１ｂ遺伝子プロモーター領域断片を増幅させた。この断片のシークエンスを行い、Ｌ４１Ｐ１ｂ遺伝子プロモーター領域断片であることを確認した。
【００３６】
（実施例４）ＣｍＮｅｏ耐性遺伝子発現カセット及びそれを含む発現ベクターの構築
キャンディダ・マルトーサで機能するＣｍＮｅｏ耐性遺伝子発現カセットを構築するため、５‘上流側にプロモーターとして実施例３でクローニングしたＬ４１Ｐ１ｂプロモーターを、３’下流側にターミネーターとしてキャンディダ・マルトーサ由来のＡｌｋ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄ００４８１）ターミネーター（以下Ａｌｋ１ｔと略す）を連結した。
キャンディダ・マルトーサ由来のＡｌｋ１遺伝子プロモーター及びターミネーターが挿入されたｐＵＡＬ１（ＷＯ０１／８８１４４）をＥｃｏＲＩで切断後、平滑末端化しライゲーションを行うことによりＥｃｏＲＩ切断部位を除去したｐＵＡＬ２を作成した。ｐＵＡＬ２をＰｖｕＩＩ／ＰｖｕＩで切断し、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）のＳｍａＩ／ＰｖｕＩサイトに結合させｐＳＴＶ―ＡＬＫ１を作成した。このｐＳＴＶ―ＡＬＫ１をＥｃｏＲＩ／ＮｄｅＩで切断し、先に述べたＬ４１Ｐ１ｂ遺伝子プロモーターと結合させ、ｐＳＴＶ−Ｌ４１を作成した。その構築方法の模式図を図１に示した。
次に実施例２で示したＣｍＮｅｏ遺伝子をＮｄｅＩ／ＰｓｔＩで切り出してｐＳＴＶ−Ｌ４１のＮｄｅＩ／ＰｓｔＩに挿入してｐＳＴＶ−Ｌ４１−ＣｍＮｅｏを構築した。最終的にＣｍＮｅｏ遺伝子を発現させるベクターにはｐＵＴＡ１（ＷＯ０１／８８１４４に記載）を使用した。ｐＳＴＶ−Ｌ４１−ＣｍＮｅｏより、ＳａｌＩ／ＸｈｏＩでＣｍＮｅｏ遺伝子発現カセットを切り出し、ｐＵＴＡ１のＳａｌＩサイトに挿入しｐＵＴＡ−Ｌ４１−ＣｍＮｅｏを構築した。その構築方法の模式図を図２に示した。
【００３７】
（実施例５）キャンディダ・マルトーサＡＣ１６株の形質転換
酵母菌の培養用に使用した試薬は、特に断らない限り和光純薬から販売されているものを用いた。宿主には、ＡＤＥ１遺伝子破壊株であるキャンディダ・マルトーサＡＣ１６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３６６）を使用し、上記の本発明の遺伝子発現カセットを含むｐＵＴＡ−Ｌ４１−ＣｍＮｅｏ発現ベクターを導入した。宿主に構築したプラスミドを導入する方法は、電気導入法で行った。遺伝子導入装置はＢＴＸ社製のＥＬＥＣＴＲＯ  ＣＥＬＬ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＯＲ  ６００を用いた。キュベットはＢＩＯ  ＭＥＤＩＣＡＬ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製のＢＭ６２００を用いた。コンピテント細胞１００μｌにプラスミド１μｌに加え、調製したコンピテント細胞／プラスミド溶液を１００μｌ取りキュベットに注入し、パルス装置にセットした。続いて、静電容量４０μＦ、抵抗値２４６ｏｈｍ、電圧１．９ＫＶの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベットに１Ｍソルビトールを１ｍｌ加え、穏やかに混合し、室温で１時間放置した。プラスミドを導入後、ＹＮＢ選択プレート（０．６７ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２ｗ／ｖ％グルコース、２ｗ／ｖ％寒天）にて３０℃で３日間培養し、形質転換株を取得した。
【００３８】
（実施例６）形質転換株のゲネチシン耐性の確認
実施例５で得た形質転換株を種々の濃度のゲネチシン含有ＹＰＤプレートに蒔き、ゲネチシン耐性の発現を確認した。０．２ｍｇ/ｍｌ、２ｍｇ/ｍｌ、５ｍｇ/ｍｌ、１０ｍｇ/ｍｌの濃度のゲネチシン含有ＹＰＤプレートに形質転換株を植継ぎ、３０℃で３日間培養した。
その結果、全てのゲネチシン濃度において形質転換株の生育が認められ、キャンディダ・マルトーサＡＣ１６株の細胞内で導入したＣｍＮｅｏ耐性遺伝子が発現し、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼが機能していることが確認された。
【００３９】
（比較例１）
比較のため、ＣｍＮｅｏ耐性遺伝子の代わりに、コドンを改変していないＮｅｏ耐性遺伝子を用いる以外は実施例４と同様にしてｐＵＴＡ−Ｌ４１−Ｎｅｏ発現ベクターを作製し、実施例５と同様にしてキャンディダ・マルトーサＡＣ１６株に形質転換し、まずアデニン要求性で選択した。得られた形質転換株をゲネチシンプレート(ゲネチシン濃度０．２ｍｇ/ｍｌ)に引き延ばし、ゲネチシン耐性の発現を調べた。その結果、コドンを改変しなかったＮｅｏ耐性遺伝子を導入した形質転換株では生育が認められず、ゲネチシン耐性は発現しなかった。このことから、コドン改変がゲネチシン耐性の発現に必須であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明により、宿主側に予め何ら栄養要求性などを付与せずに形質転換を行うこと、すなわち形質転換株を選択することが可能になり、野生株や有用物質生産株に対しても遺伝子組換えによる育種を容易に行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】実施例４で作製したｐＳＴＶ−Ｌ４１の構築模式図である。
【図２】実施例４で作製したｐＵＴＡ−Ｌ４１−ＣｍＮｅｏの構築模式図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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