(57)【要約】【課題】  従来のバイオアッセイは主として細胞の生育阻害や特定の生体反応を指標としておりその情報量が限られている。このようなバイオアッセイ系では環境中の化学物質による毒性の有無は評価できるが、その毒性の性質やどのような化学物質に起因する毒性であるかを判断するための情報が得られない。【解決手段】  評価すべき化学物質の存在環境下で、それぞれ異なる遺伝子を欠損した細胞を培養し、該細胞の増減を観察することによって該環境の毒性を評価するもの。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
評価すべき化学物質の存在環境下で、それぞれ異なる遺伝子を欠損した細胞を培養し、該細胞の増減を観察することによって該環境の毒性を評価することを特徴とする環境の毒性評価方法。
【請求項２】
ＤＮＡマイクロアレイ又はマクロアレイを用いるものである請求項１記載の環境の毒性評価方法。
【請求項３】
該微生物が酵母である請求項１又は２記載の環境の毒性評価方法。
【請求項４】
該細胞の増減の評価は、該化学物質の存在環境下での培養と同じ条件で該化学物質の存在しない状態で細胞を培養し、該細胞の増加量との比較でなされるものである請求項１、２又は３記載の環境の毒性評価方法。
【請求項５】
既知の化学物質の存在環境下で、それぞれ異なる遺伝子を欠損した細胞を培養し、該それぞれの細胞の増減状態を標準パターンとして記憶し、被評価環境下で同様の細胞を培養し、そのときの細胞の増減状態を標準パターンと比較することによって、被評価環境の毒性を評価することを特徴とする環境の毒性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境の毒性評価法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、化学物質のデーターベース Chemical abstractには約１７００万件の化学物質が登録されている。そのうち、１万種類以上の合成化学物質が環境中に蓄積しているものと推定され、その数は年々増加している。合成物質の中には、直接又は環境中で形を変えた後に生態や人体に悪影響を与える物質も含まれている。そのため、それぞれの化学物質について、生態や人体に与える影響を迅速に評価する必要がある。また、環境汚染問題が国民の不安をあおるような社会問題となっている状況の下、種々の高度な測定システムで、環境中に存在する化学物質を同定しようとする試みがなされている。
【０００３】
しかしながら、どのような高度な技術を用いても、このような方法では約１０％の化学物質を同定できるにすぎず、その環境がどのような毒性を有するかを簡単に評価できる評価方法が要望されていた。
【０００４】
また、多くの機関でバイオアッセイを用いた簡易毒性評価試験による毒性の指標化がなされている。これは、動植物細胞や微生物を用いて「化学物質による生物的応答の変化」を測定し、「毒性」を評価するものである。
これらの１つとして、特許文献１のように遺伝子の発現状態を観察することによって、化学物質の毒性を評価する方法も知られている。
【特許文献１】特開２００１−２８６２８１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、この特許文献１に記載の方法は、細胞を化学物質に暴露し、その影響を遺伝子の発現によって評価するものであるため、細胞の生育期間が最大の処理時間となる。例えば、酵母の場合では１日程度である。これをすぎると、応答しにくくなる。勿論、理論的には長くすることは可能であるが、遺伝子の発現は一過性であるため、発現したときに迅速に取らないと、元の状態に戻るか、第三の状態に入るため、正しい判断ができなくなるのである。
即ち、環境への長期暴露試験ができなかったということである。
【０００６】
そこで、この環境への長期暴露試験を可能にした環境の毒性評価方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以上のような現状に鑑み本発明者は鋭意研究の結果本発明を完成させたものであり、その特徴とするところは、評価すべき化学物質の存在環境下で、それぞれ異なる遺伝子を欠損した細胞を培養し、該細胞の増減を観察することによって該環境の毒性を評価する点にある。
【０００８】
細胞は、特定の遺伝子を欠損すると、化学物質に対して特異的に感受性又は耐性となることが知られている。その際の各種化学物質に対する感受性や耐性はその欠損した遺伝子により異なる。例えば、メタロチオネインというタンパク質をコードする遺伝子を欠損すると、カドミウムなどの重金属に特異的に弱くなる。一方、ＡＢＣトランスポーターといわれる遺伝子を欠損すると各種有機化合物に弱くなる。このように欠損する遺伝子と化学物質には、それぞれ毒性学的に意味のある関係にあると考えてよい。
【０００９】
そこで、数種類から数万種類の遺伝子欠損細胞を予め用意し、これらを一定割合で混合し、連続的に環境サンプルに暴露し、これらの遺伝子欠損細胞の増減から、化学物質や環境サンプルの毒性評価を行なうことが可能となるのである。
【００１０】
ここで評価すべき化学物質の存在環境とは、環境サンプル（川や池の水等）で調整した細胞用培地や化学物質含有細胞用培地等である。化学物質がどのようなものであるか、単数か複数か等は問題ではない。
【００１１】
その環境下で培養するとは、その培地で暴露期間として数日から数ヶ月培養する。培養法は、用いる細胞の通常の培養方法でよく、ＹＰＤ培地やその他の培地でよい。
【００１２】
細胞としては、ヒト細胞が好ましいのは当然であるが、マウスその他の細胞でもよい。更に、培養が容易であること、遺伝子の機能がよく研究されていることから細胞として微生物を用いることも好適である。また、微生物の中でも酵母が好適であった。これは、取り扱いが容易であるうえ、ヒト進化の過程にある生物と考えられ、ヒトに対する毒性等と同じように機能する遺伝子が多いと考えられているためである。
【００１３】
遺伝子を欠損した細胞とは、その細胞の特定遺伝子を破壊したものや、ターゲッティングして効果をなくしたもの、実際にないもの等である。その細胞としては、１つの遺伝子が欠損したものがよい。勿論、同じものを用いる限り、複数の遺伝子が欠損しているものでもよいが、判定や評価が複雑になる。
【００１４】
暴露培養した後、どの遺伝子欠損細胞が増加し、どの遺伝子欠損細胞が減少したかを測定する。増減の判定は、それぞれの遺伝子欠損株に遺伝子又はタンパク質マーカーを付与することで検出が可能となる。例えば、ある遺伝子を破壊する際に、ある特徴的な遺伝子配列を持った遺伝子を導入しておけば、当該遺伝子破壊株の特異的標識となる。細胞に環境サンプルを暴露後にその配列の定量を行なえばどの細胞が増減したか判定できる。定量法としては、サザンブロット法やＤＮＡマイクロアレイ法などが考えられるが、それら限定するものではない。
また、タンパク質を指標とする際は、遺伝子破壊の際に特異的なアミノ酸配列を持つ遺伝子を導入し、特異的なタンパク質を生産させることで可能となる。この際の細胞の増減は、それぞれの遺伝子欠損株に導入したタンパク質を、電気泳動や免疫抗体法で定量すればよい。
【００１５】
遺伝子欠損細胞をどの程度用意するかは、上記した通り自由であるが、例えば、酵母ではおよそ６０００個の遺伝子があると言われるが、実用としては５００程度で十分と考えられる。
【００１６】
本発明方法では、種々の遺伝子が欠損した酵母の集団に、化学物質というストレスを加えるため、特定の遺伝子が欠損した細胞は死滅していくか、生育が悪くなる。これは、前記した遺伝子発現法とは異なり、化学物質がある限りもとに戻ることは無い。よって、長期に培養を続けても結果が変わることはない。
【００１７】
更に、１回の培養（例えば、２４時間）を行なった細胞群をもう一度同じ条件で生育させることも可能である。例えば、一度培養した物の一部を取り、化学物質の入った新しい培地に移せば、もう一度培養ができ、同じストレスの結果より信頼のできるデータが出る可能性もある。この操作は、理論的には永遠に続けられるため、長期暴露試験ができることとなる。また、連続培養系を用いると、数ヶ月程度は培養が可能である。
【発明の効果】
【００１８】
以上詳細に説明した本発明によれば、環境の毒性が、そこにどのような化学物質が含まれているか詳細に分析することなく評価することができる。人間やその他の動物にとっては、何が含まれているかより、生体にどのような影響があるかが重要であるため非常に有用である。
また、種々の遺伝子欠損細胞を種々の化学物質に暴露したデータを用意することによって、環境の毒性評価ばかりでなく、含まれている化学物質も予測又は評価できることもある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下実施例に沿って具体的に発明を詳細に説明するが、本発明がこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２０】
実施例１
細胞として酵母細胞を用いた。生育は、ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、ブドウ糖２％）を用いた。細胞群は化学物質の含有したこの培地で生育させた。生育法は、連続的に新しい培地を加えて、加えた量と同量を抜き取る、いわゆる連続培養法と培養液から一部の培養液を取り、新たな培地に接種するいわゆる連続バッチ法のいずれの手法も利用できるが、ここでは後者を用いた。連続バッチ法では、遺伝子欠損細胞群を化学物質含有培地に接種、育成させる工程を、数回行なった。
【００２１】
酵母細胞の遺伝子欠損株を作成する際に、特異的標識遺伝子配列を導入し、その遺伝子配列をＤＮＡマイクロアレイ法で測定し、増減する遺伝子欠損細胞群の各細胞を定量した結果を示す。
表１〜表８１は、それぞれのモデル化学物質によって増減する遺伝子欠損細胞の該当する遺伝子記号とその増減量を示した。増減量は、対照区（実験開始時）の遺伝子欠損細胞に比べて何倍に増幅されているかで示した。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
【表２】
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【００２４】
【表３】
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【００２５】
【表４】
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【００２６】
【表５】
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【００２７】
【表６】
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【００２８】
【表７】
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【００２９】
【表８】
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【００３０】
【表９】
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【００３１】
【表１０】
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【００３２】
【表１１】
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【００３３】
【表１２】
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【００３４】
【表１３】
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【００３５】
【表１４】
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【００３６】
【表１５】
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【００３７】
【表１６】
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【００３８】
【表１７】
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【００３９】
【表１８】
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【００４０】
【表１９】
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【００４１】
【表２０】
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【００４２】
【表２１】
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【００４３】
【表２２】
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【００４４】
【表２３】
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【００４５】
【表２４】
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【００４６】
【表２５】
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【００４７】
【表２６】
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【００４８】
【表２７】
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【００４９】
【表２８】
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【００５０】
【表２９】
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【００５１】
【表３０】
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【００５２】
【表３１】
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【００５３】
【表３２】
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【００５４】
【表３３】
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【００５５】
【表３４】
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【００５６】
【表３５】
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【００５７】
【表３６】
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【００５８】
【表３７】
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【００５９】
【表３８】
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【００６０】
【表３９】
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【００６１】
【表４０】
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【００６２】
【表４１】
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【００６３】
【表４２】
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【００６４】
【表４３】
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【００６５】
【表４４】
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【００６６】
【表４５】
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【００６７】
【表４６】
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【００６８】
【表４７】
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【００６９】
【表４８】
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【００７０】
【表４９】
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【００７１】
【表５０】
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【００７２】
【表５１】
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【００７３】
【表５２】
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【００７４】
【表５３】
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【００７５】
【表５４】
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【００７６】
【表５５】
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【００７７】
【表５６】
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【００７８】
【表５７】
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【００７９】
【表５８】
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【００８０】
【表５９】
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【００８１】
【表６０】
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【００８２】
【表６１】
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【００８３】
【表６２】
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【００８４】
【表６３】
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【００８５】
【表６４】
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【００８６】
【表６５】
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【００８７】
【表６６】
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【００８８】
【表６７】
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【００８９】
【表６８】
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【００９０】
【表６９】
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【００９１】
【表７０】
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【００９２】
【表７１】
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【００９３】
【表７２】
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【００９４】
【表７３】
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【００９５】
【表７４】
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【００９６】
【表７５】
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【００９７】
【表７６】
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【００９８】
【表７７】
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【００９９】
【表７８】
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【０１００】
【表７９】
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【０１０１】
【表８０】
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【０１０２】
【表８１】
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【０１０３】
図１〜図４は、表１〜表８１の結果を化学物質ごとに図式化したものである。横軸には表で示した遺伝子をその順に並べており、縦軸には増減の数値を示している。従って、直線はそれぞれの遺伝子並びに増減量に対応している。４種類の化学物質を比較すれば、明らかなように、増減する遺伝子欠損細胞のスペクトルはまったく異なることがわかる。また、同じことを繰り返した場合、ほぼ同じスペクトルが得られることも分かった。
増減する遺伝子欠損細胞のパターンは、化学物質の毒性を反映しているものと考えられることから、スペクトルの違いは、毒性の違いを反映したものであると結論づけることができる。
【０１０４】
図１〜４に示したように、それぞれの化学物質の影響により増減する遺伝子欠損細胞の種類が異なる。この事を利用すれば、環境中の未知の有害化合物を推定することができる。即ち、予め図１に示したように既知の化学物質を用いて増減する遺伝子欠損細胞群のスペクトルをデータとして記録しておけば、未知の化学物質（環境水等）が特徴的に増減する遺伝子欠損細胞群と比較することで、その化合物を推定することができる。また、増減させる遺伝子欠損細胞群から未知化学物質がどの程度の危険性があるかを推定することができる。
【０１０５】
未知化学物質同様に、新規化学物質について増減する遺伝子欠損細胞群を測定すれば、その毒性を記述することができる。また、その遺伝子の性質を理解することで、新規化学物質の毒性を評価することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】砒素１．０ｍＭを添加したときの各遺伝子欠損細胞の増減パターンを示すグラフである。
【図２】ラウリル硫酸ナトリウム０．００５％を添加したときの各遺伝子欠損細胞の増減パターンを示すグラフである。
【図３】カドミウム０．３ｍＭを添加したときの各遺伝子欠損細胞の増減パターンを示すグラフである。
【図４】ジメチルスルホキサイド５％を添加したときの各遺伝子欠損細胞の増減パターンを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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