(57)【要約】【課題】  ヒト上皮細胞の培養に適した培地の提供。【解決手段】  組織培養用のMCDB153基礎培地において、Ｌ−アスパラギン酸又はその塩を１．５〜４倍、Ｌ−イソロイシン又はその塩を２２〜２６倍、Ｌ−グルタミン又はその塩を１．５〜３倍、Ｌ−グルタミン酸又はその塩を１．１〜２倍、Ｌ−チロシン又はその塩を３〜６倍、Ｌ−トリプトファン又はその塩を５〜７倍、Ｌ−バリン又はその塩を０．４〜０．７倍、Ｌ−ヒスチジン又はその塩を２〜４倍、Ｌ−プロリン又はその塩を０．４〜０．７倍、Ｌ−フェニルアラニン又はその塩を４〜７倍、Ｌ−メチオニン又はその塩を４〜６倍、Ｌ−リジン又はその塩を１．１〜２倍になるようにアミノ酸構成比率を改変し、総アミノ酸量中のＬ−グルタミン又はその塩の含有量を６５重量％以上にしたことを特徴とするヒト上皮細胞培養用基礎培地。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織培養用のMCDB153基礎培地において、Ｌ−アスパラギン酸又はその塩を１．５〜４倍、Ｌ−イソロイシン又はその塩を２２〜２６倍、Ｌ−グルタミン又はその塩を１．５〜３倍、Ｌ−グルタミン酸又はその塩を１．１〜２倍、Ｌ−チロシン又はその塩を３〜６倍、Ｌ−トリプトファン又はその塩を５〜７倍、Ｌ−バリン又はその塩を０．４〜０．７倍、Ｌ−ヒスチジン又はその塩を２〜４倍、Ｌ−プロリン又はその塩を０．４〜０．７倍、Ｌ−フェニルアラニン又はその塩を４〜７倍、Ｌ−メチオニン又はその塩を４〜６倍、Ｌ−リジン又はその塩を１．１〜２倍になるようにアミノ酸構成比率を改変し、総アミノ酸量中のＬ−グルタミン又はその塩の含有量を６５重量％以上にしたことを特徴とするヒト上皮細胞培養用基礎培地。
【請求項２】
Ｌ−アスパラギン酸又はその塩を１．５〜３倍、Ｌ−イソロイシン又はその塩を２３〜２５倍、Ｌ−グルタミン又はその塩を１．５〜２倍、Ｌ−グルタミン酸又はその塩を１．１〜２倍、Ｌ−チロシン又はその塩を４〜５倍、Ｌ−トリプトファン又はその塩を５〜６．５倍、Ｌ−バリン又はその塩を０．４〜０．６倍、Ｌ−ヒスチジン又はその塩を２〜３倍、Ｌ−プロリン又はその塩を０．４〜０．６倍、Ｌ−フェニルアラニン又はその塩を５〜６倍、Ｌ−メチオニン又はその塩を４〜５倍、Ｌ−リジン又はその塩を１．１〜２倍になるようにアミノ酸構成比率を改変し、総アミノ酸量中のＬ−グルタミン又はその塩の含有量を６５〜７５重量％にしたものである請求項１記載の基礎培地。
【請求項３】
請求項１又は２記載の基礎培地成分、及びヒト上皮細胞の増殖に必要な成長促進物質を含有するヒト上皮細胞培養用培地。
【請求項４】
動物組織抽出物を含まないものである請求項３記載の培地。
【請求項５】
請求項３又は４記載の培地中でヒト上皮細胞を培養することを特徴とする培養ヒト上皮の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト上皮細胞の培養に適した基礎培地及び培養用培地、並びに培養ヒト上皮の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト上皮細胞のヒトでの最大の組織は皮膚である。体の表面に位置する皮膚は細菌などの感染防止を施すことにより危害を及ばさずに入手出来ることから研究も活発に行われ、培養技術も進んでいる。ヒト上皮細胞は、皮膚などの表皮細胞や、角膜の上皮細胞を含むものであり、皮膚の培養技術が他の上皮細胞の培養に応用されている。
皮膚は第三の臓器とも言われ生体最外層に位置し、重層化した表皮細胞からなる表皮層と線維芽細胞を多く含む結合組織からなる真皮層及び皮下組織から構成されており、生体内の保護と外部からの異物の侵入を防止する上で重要な役割を担っている。従って、皮膚に火傷や切り傷などの損傷等が発生した生体は、体液の漏出や細菌感染等の危険にさらされることとなり、特に重度の熱傷や火傷等により皮膚損傷が深く広範囲に及ぶ場合には皮膚呼吸の低下などで生体内に異常をきたし、場合によっては人命を失うことになる。
【０００３】
かかる皮膚損傷の対処法の一つとして従来より培養皮膚移植が知られており、近年特に再生医療として培養表皮細胞を利用した培養皮膚移植が注目を集めている（非特許文献１〜５）。上記培養皮膚移植は、既に臨床の場においてその有用性が確認されてはいるものの、移植に利用するヒト表皮細胞の培養技術には未だいくつかの問題点が残されている。
【０００４】
このヒト上皮細胞の培養は困難とされていたが、1975年にJames G. RheinwaldとHoward Greenによりマウス３Ｔ３細胞フィーダーレイヤー（支持細胞層）法が発表され体外で初めてヒト表皮角化細胞の連続培養が可能となった（非特許文献６）。この方法は、放射線処理により増殖を抑制したマウス３Ｔ３線維芽細胞をヒト表皮細胞のフィーダーレイヤーとし、ダルベッコ変法イーグルＭＥＭ培地などの高カルシウム濃度下での培養法に用いることを特徴としている（特許文献１参照）。この培養方法は、培地にコレラトキシンと上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）の添加により体外培養での細胞寿命を５０から１４０世代まで延ばせ得ることが示され、またその培地は現在でもさらに改良されている。
【０００５】
一方、培地の改良検討により、Henry HenningsとStuart H. Yuspaらは培養液中のカルシウム濃度を低くすると表皮細胞が未分化の状態で増殖が亢進することを示した（非特許文献７）。さらに、Steven T. BoyceとRichard G. Hamにより低カルシウム濃度（0.03mM）の培地でヒト表皮細胞のクローン増殖を可能としたヒト上皮角化細胞用の基礎培地であるMCDB153基礎培地が発表され、該基礎培地からなるヒト表皮細胞の増殖用に調製された培地、すなわち、インスリン５μg／mL、ハイドロコーチゾン０．５μg／mL、エタノールアミン０．１mM、Ｏ−ホスホエタノールアミン０．１mM、ＥＧＦ５μg／mL、及び牛脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）７０μg／mLを添加したMCDB153培地が発表されている（非特許文献８）。
【０００６】
さらに、Mark R. PittelkowとRobert E. Scottにより上記MCDB153からなる増殖用培地において、イソロイシンが約５１倍、ヒスチジンが４倍、メチオニンが４倍、フェニルアラニンが４倍、トリプトファンが４倍及びチロシンが６倍になるようにこれ等のアミノ酸を強化配合した培地でフェーズＩとしてヒト皮膚角化細胞をクローン増殖し、フェーズＩＩとして、ダルベッコ変法イーグルＭＥＭ培地に１０％ＦＢＳを添加しカルシウム濃度を１．８mMol（約２００mg/L）とした培地に交換し培養を続け培養皮膚角化シートを得たと報告している（非特許文献９）。
【０００７】
さらに、橋本らは、上記MCDB153培地において、イソロイシンを約１００倍、ヒスチジンを約３倍、メチオニンを約１２倍、フェニルアラニンを約１２倍、トリプトファンを約６倍及びチロシンを約２０倍になるようにこれ等のアミノ酸を強化配合した基礎培地を報告している（特許文献２）。この基礎培地を用いたヒト表皮細胞増殖用に調製された培地は、インスリン０．２μM、ハイドロコーチゾン０．５μg／mL、エタノールアミン１００μM、Ｏ−ホスホエタノールアミン１００μM、牛大脳視床下部抽出物（ＢＨＥ）或いは牛脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）１００μgタンパク量／mL及び硫酸カナマイシン０．１g／Lが添加配合されている。
【０００８】
しかしながら、これらいずれのヒト上皮細胞培養用培地も、増殖能、細胞寿命等の点で十分満足できるものではない。
【０００９】
前記のように、ヒト表皮角化細胞の増殖においては牛脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）が有効であることが知られており（非特許文献１０）、増殖培地中に動物由来成分を含有することになる。細胞を体外で培養するには天然物質である血清又は血清成分や脳又は胚抽出物等を含めた動物由来成分は細胞増殖には欠かせない有効な成分である。しかし、近年、医療用具であるヒト乾燥硬膜移植患者からクロイツフェルト・ヤコブ病が発症している事例が知られており、感染症対策上大きな社会問題となっている。また、日本国内の牛からも牛海面状脳症（BSE；Bovine Spongiform Encephalopathy、別名狂牛病（mad cow disease））の感染が確認されており、ＢＳＥの発症した牛の肉や骨を食べることで人間がクロイツフェルト・ヤコブ病に感染するとされる学説もあり、感染症対策上大きな社会問題となっている。
【非特許文献１】Ｈ．グリーン，日経サイエンス，84-92(1992.1）
【非特許文献２】上田実，医学の歩み，180，508-509(1997)
【非特許文献３】朝比奈泉，週間医学界新聞，第2485号(2002.5.13）
【非特許文献４】許南浩，日本再生医療学会誌，Vol.2 No.3，47-52(2003.8)
【非特許文献５】黒柳能光，日本再生医療学会誌，Vol.2 No.3，39-45(2003.8)
【非特許文献６】Cell, 6：331-344(1975)
【非特許文献７】Cell, 19：245-254 (1980)
【非特許文献８】The Journal of Investigative Dermatology, 81：33s-40s(1983)
【非特許文献９】Mayo Clin Proc., Vol 61, 771-777(1986)
【非特許文献１０】Journal of Tissue Culture Methods, Vol.9(2), p.83(1985)
【特許文献１】特開昭５２−８７２９１号公報
【特許文献２】特許第３０６６６２４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ヒトを含む動物組織抽出物を配合しなくても、優れた増殖能、細胞寿命を有するヒト上皮細胞増殖用培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、組織培養用のMCDB153基礎培地に着目し、その組成について種々検討したところ、当該基礎培地のアミノ酸構成比率をある特定範囲に改変し、かつＬ−グルタミン量を総アミノ酸量の６５重量％以上にすれば、動物組織抽出物を添加しない場合であっても、ヒト上皮細胞の増殖能、細胞寿命に優れ、移植に利用できる培養ヒト上皮が製造できる培地になることを見出し本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、組織培養用のMCDB153基礎培地において、Ｌ−アスパラギン酸又はその塩を１．５〜４倍、Ｌ−イソロイシン又はその塩を２２〜２６倍、Ｌ−グルタミン又はその塩を１．５〜３倍、Ｌ−グルタミン酸又はその塩を１．１〜２倍、Ｌ−チロシン又はその塩を３〜６倍、Ｌ−トリプトファン又はその塩を５〜７倍、Ｌ−バリン又はその塩を０．４〜０．７倍、Ｌ−ヒスチジン又はその塩を２〜４倍、Ｌ−プロリン又はその塩を０．４〜０．７倍、Ｌ−フェニルアラニン又はその塩を４〜７倍、Ｌ−メチオニン又はその塩を４〜６倍、Ｌ−リジン又はその塩を１．１〜２倍になるようにアミノ酸構成比率を改変し、総アミノ酸量中のＬ−グルタミン又はその塩の含有量を６５重量％以上にしたことを特徴とするヒト上皮細胞培養用基礎培地を提供するものである。
また本発明は、上記ヒト上皮細胞培養用基礎培地成分、及びヒト上皮細胞の増殖に必要な成長促進物質を含有するヒト上皮細胞培養用培地を提供するものである。
さらに、本発明は、このヒト上皮細胞培養用培地中でヒト上皮細胞を培養することを特徴とする培養ヒト上皮の製造法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の培地を用いれば、動物組織抽出物を添加しなくても、ヒト上皮細胞が効率良く増殖し、移植に適用できる培養ヒト上皮を安定して、かつ安全に製造することができる。従って、安全性の高い移植用培養ヒト上皮を安定して供給可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の基礎培地は、MCDB153基礎培地のアミノ酸構成比率を、Ｌ−アスパラギン酸又はその塩を１．５〜４倍、Ｌ−イソロイシン又はその塩を２２〜２６倍、Ｌ−グルタミン又はその塩を１．５〜３倍、Ｌ−グルタミン酸又はその塩を１．１〜２倍、Ｌ−チロシン又はその塩を３〜６倍、Ｌ−トリプトファン又はその塩を５〜７倍、Ｌ−バリン又はその塩を０．４〜０．７倍、Ｌ−ヒスチジン又はその塩を２〜４倍、Ｌ−プロリン又はその塩を０．４〜０．７倍、Ｌ−フェニルアラニン又はその塩を４〜７倍、Ｌ−メチオニン又はその塩を４〜６倍、Ｌ−リジン又はその塩を１．１〜２倍になるように改変したものである。これらのアミノ酸以外のアミノ酸の含量は、MCDB153基礎培地と同様である。より好ましい改変は、Ｌ−アスパラギン酸又はその塩を１．５〜３倍、Ｌ−イソロイシン又はその塩を２３〜２５倍、Ｌ−グルタミン又はその塩を１．５〜２倍、Ｌ−グルタミン酸又はその塩を１．１〜２倍、Ｌ−チロシン又はその塩を４〜５倍、Ｌ−トリプトファン又はその塩を５〜６．５倍、Ｌ−バリン又はその塩を０．４〜０．６倍、Ｌ−ヒスチジン又はその塩を２〜３倍、Ｌ−プロリン又はその塩を０．４〜０．６倍、Ｌ−フェニルアラニン又はその塩を５〜６倍、Ｌ−メチオニン又はその塩を４〜５倍、Ｌ−リジン又はその塩を１．１〜２倍になるようにしたものである。
【００１５】
ここで、MCDB153基礎培地のアミノ酸組成は、下記表１のとおりである。
【００１６】
【表１】
2005269923.tif 000002
【００１７】
本発明におけるアミノ酸には、一水塩、無水物等のいずれも含まれる。また、塩としては、塩酸塩、ナトリウム塩、酢酸塩、硫酸塩などが挙げられる。
【００１８】
また本発明の基礎培地においては、総アミノ酸量中のＬ−グルタミン又はその塩の含有量が６５重量％以上であることが、ヒト上皮細胞の増殖能、動物組織抽出物を不要とする点から好ましく、その含有量は６５〜７５重量％であるのがより好ましい。
【００１９】
本発明の基礎培地には、前記アミノ酸以外に、ビタミン類、核酸類、アミン類、糖類、有機酸、微量元素、塩類、pH指示薬などを含有させることができる。ビタミン類としては、塩化コリン、シアノコバラミン、ニコチン酸アミド、Ｄ−パントテン酸又はその塩、塩酸ピリドキシン又は塩酸ピリドキサール、Ｄ−ビオチン、塩酸チアミン、リボフラビン、葉酸、ＤＬ−α−リポ酸、ミオ−イノシトール等が挙げられる。核酸類としては、アデニン又はその塩、チミジン等が挙げられる。アミン類としては、プトレッシン又はその塩等が挙げられる。
【００２０】
また微量元素としては、亜セレン酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸銅、硫酸亜鉛、ケイ酸ナトリウム、バナジン酸アンモニウム、モリブデン酸アンモニウム、塩化ニッケル（II）、塩化第一スズ、硫酸マンガンなどが挙げられる。また有機酸としてはピルビン酸又はその塩等が挙げられ、糖としてはブドウ糖が挙げられる。
【００２１】
また塩類としては、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、リン酸一水素二ナトリウム等が挙げられる。pH指示薬としては、フェノールレッド又はその塩等が挙げられる。これらのアミノ酸以外の成分の含有量は、MCDB153基礎培地又は特許第３０６６６２４号と同量程度で十分であるが、その量の１／３〜３倍程度の増減が可能である。なお、塩類濃度は浸透圧が３００〜３８０mOsm／Kg H2Oの範囲で増減可能である。
【００２２】
本発明の基礎培地に、ヒト上皮細胞の増殖に必要な成長促進物質を含有させることによりヒト上皮細胞培養用培地が得られる。このような成長促進物質としては、リコンビナント・ヒト・インスリン、ハイドロコーチゾン、エタノールアミン、Ｏ−ホスホエタノールアミン、プロスタグランジン、リコンビナント・ヒト・ケラチノサイト成長因子、リコンビナント・ヒト・インシュリン様成長因子、リコンビナント・ヒト・上皮細胞成長因子等が挙げられる。さらに、酢酸レチノール、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、イソプロテレノール及びそれらの塩等を配合することもできる。ここで、本発明培養用培地には、通常用いられる牛脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）、牛大脳視床下部抽出物（ＢＨＥ）などの動物組織抽出物は含まないのが好ましい。本発明の培養用培地が動物組織抽出物を配合することなく、効率の良いヒト上皮細胞培養を達成できるのは、前記アミノ酸組成によるものと考えられる。
【００２３】
また本発明の培地には、硫酸ゲンタマイシン、硫酸カナマイシン、硫酸ストレプトマイシン、ペニシリンＧナトリウム、ファンギゾン（アンフォテリンＢ）、ハイグロマイシンＢ、アクチノマイシンＤ等の抗生物質を配合することもできる。
【００２４】
本発明の培養培地を用いてヒト上皮細胞を培養するには、自体公知の方法で行えばよい。例えば、培養基材がコーティングされた培養容器中、３７℃、５％炭酸ガス気相下で行えばよい。培養基材としては、コラーゲンが好ましい。
【００２５】
より具体的には、培養基材としてタイプＩコラーゲンがコーティングされた培養皿で、播種時の細胞密度が約２．５〜５×１０3細胞／cm2程度となる条件下で実施されるのが好ましく、１〜３日に一度の培地交換により行うことができる。
【００２６】
このような培養によりヒト上皮細胞から移植可能な培養ヒト上皮角化を効率良く製造できる。すなわち、例えば培養ヒト表皮角化は、増殖ヒト表皮角化細胞をシート状に形成させることにより得られる。該シートは、例えば上記のようにして得られるコンフルエント（confluent）にまで増殖した単層のヒト表皮角化細胞を、重層化培地でさらに培養して表皮細胞を層状に重層化し、生体表皮と同様の組織形態に分化させて行うことができる。該重層化培地は、本発明の基礎培地から調製でき、そのカルシウム濃度は約０．４〜２．０mMに調整される。上記重層化培地で１週間程度培養することにより、表皮角化細胞は５〜６層に多層化し、下層には増殖能を有する基底細胞、上層には分化した角化細胞が観察される。このようにして作成されるヒト表皮角化細胞シートは、既に知られているこの種のシートと同様にして培養皮膚移植に利用できる。また同様にして、角膜上皮細胞から培養ヒト角膜上皮も効率良く製造できる。
【実施例】
【００２７】
次に、本発明をさらに具体的に説明するため実施例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２８】
実施例１（本発明基礎培地の調製）
（１）最適なアミノ酸構成比率に改変した本発明基礎培地の成分組成を以下に例示する。
【００２９】
【表２】
2005269923.tif 000003
【００３０】
この１リットル分の個々の成分の組成量の数１００リットル分の秤量をして、特に、塩類の結晶水は乾燥により含まれる水分を除き混合粉砕機にて微粉末化する。すなわち、１リットル分の個々の成分の組成量の３００リットル分をアミノ酸類、ビタミン類、核酸類、アミン類、有機酸、微量元素、糖類、塩類別に秤量する。秤量出来ない微量成分については倍散法にて添加する。混合粉砕機にて微粉末の本発明基礎粉末培地を調製した。
【００３１】
（２）本発明基礎粉末培地を１１．４ｇ秤取して１０００mLの蒸留水或いは超純水にて溶解し、塩化カルシウムを６．６６mg／Ｌ加え、さらに６６００mg／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝剤を加えてpHが３７℃で７．２になるように１Ｎ−水酸化ナトリウム溶液で補正をしてから１２００mg／Ｌの炭酸水素ナトリウムを添加し、溶解後０．２μm以下のポアサイズのフィルターにてろ過滅菌して調製した。以下、これを「基礎液体培地１」という。
【００３２】
実施例２（本発明培養培地の調製）
実施例１で調製された基礎液体培地１を用いて、次の通りにヒト上皮細胞増殖培地を調製した。すなわち、以下の成長促進物質及び抗生物質を添加配合して増殖培地を調製した。以下、用いた基礎培地に対応させて、これ等を「増殖液体培地１」と言う。
【００３３】
【表３】
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【００３４】
実施例３（凍結ヒト表皮角化細胞の培養）
実施例１及び２に従って、本発明培地及びMCDB153培地を調製して凍結ヒト表皮角化細胞増殖能の比較試験を実施した。
液体窒素に凍結保存している凍結ヒト表皮角化細胞を急速融解して、１０００回転で約５分間遠心分離して得られた細胞を用いてコラーゲン・タイプＩをコーティングした100mmコラーゲンコートディッシュ（旭テクノグラス（株）製、コード番号：４０１０−０１０）に５×１０5細胞／１０．０mLとなるように播種し、増殖液体培地１を用いて１代目の培養を開始した。同様に、MCDB153培地を用いて１代目の培養を開始した。該培養は３７℃、飽和水蒸気下５％炭酸ガス気相下で行い、培養開始後２０から２４時間後及び以後１日おきに培地交換を行った。ヒト表皮角化細胞は５日間位でディッシュ面一杯にまで良好に増殖したので、次いで継代処理を行い、２代目の継代培養を行った。
【００３５】
継代処理は、液体培地を除きダルベッコＰＢＳ（−）（日水製薬（株）製）１０mLで１回細胞表面を洗った後、０．１２５％トリプシン及び０．０１％ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液を３mL加えて細胞付着面を下にして３７℃のインキュベータで５分間静置し、ヒト表皮角化細胞が付着面から剥がれた状態であることを確認した後、３mLの０．０２５％トリプシンインヒビター溶液（トリプシンインヒビター（インビトロジェン（株）製（GIBCO-BRL）、大豆由来トリプシンインヒビター、コード番号：17075-029）２５mgをリン酸緩衝液100mLに溶解してろ過滅菌した溶液）を添加してトリプシンの効果を中和した後、増殖液体培地１を１０mL加え１０００回転で約５分間遠心分離して得た沈殿物を１０mLの増殖液体培地１を加えて細胞を再浮遊して懸濁させることにより行った。また、MCDB153培地で、培養している細胞も同様の操作をした。
継代培養は、植込細胞数が５×１０5細胞／１０．０mLになるように植え込む以外は、上記の凍結融解後の培養と同様にして実施した。
【００３６】
本発明培地を用いた場合、ヒト表皮角化細胞は、５日間でディッシュ一杯にまで良好に増殖した。更に、同様にして継代処理と継代培養とを繰り返すことにより、ヒト表皮角化細胞を良好に増殖させることが出来た。また、ロットの異なる凍結ヒト表皮角化細胞でも良好に増殖させることが出来た。
細胞数の計数には、改良ノイバウエル血球計算盤により顕微鏡観察による計数を実施した。また、細胞の写真は位相差顕微鏡によるデジタル写真撮影装置を使用して撮影した画像である。
図１に増殖能の比較を、図２に培養後細胞の位相差顕微鏡写真を示す。その結果、本発明培地によるヒト表皮角化細胞の増殖率は、MCDB153培地の場合に比べて顕著に優れていることが判る。
異なるロットでも本発明培地は、細胞核の巨大化やスピンドル細胞などのない、細胞核の小さなヒト表皮角化細胞を活発に増殖していることが判る。
【００３７】
実施例４（初代ヒト表皮角化細胞の培養比較試験）
実施例１及び実施例２に従って、本発明培地及びMCDB153培地を調製して初代ヒト表皮角化細胞の増殖能の比較試験を実施した。
インフォームドコンセントの得られた患者からの手術時で得られた余剰正常皮膚を用いて初代培養を行った。ハサミで皮膚片から脂肪組織と真皮をできる限り取り除き、ダルベッコＰＢＳ（−）（日水製薬（株）製、コード番号：05913、ＰＢＳと表記する）１０mLにて２回洗浄した。７０％エタノールに１分間浸し滅菌し、ＰＢＳを１０mLにて洗浄後、メスを用いて幅３mm長さ１０mm程度の短冊状に切り、ディスパーゼ液５mL（ディスパーゼII（合同酒精（株）製）を２５０単位/mLとなる様にダルベッコ変法MEM培地（DMEM）で溶解しろ過滅菌した溶液）に浸し、４℃で一晩（１８−２４時間）静置し酵素処理した。翌日、ピンセットを用いて表皮を真皮から剥離し、表皮をDMEM  ５mLにて洗浄、続いて、ＰＢＳ  ５mLにて洗浄後、０．２５％トリプシン溶液５mLの溶液中に浸し、３７℃で１０分間の酵素処理を行った。表皮をトリプシン中和液５mL入れたプラスチックシャーレに移しピンセットにて表皮片をほぐし、５０mLの滅菌チューブに移した。ディッシュに残存している細胞をＰＢＳ  １０mLにて回収し、表皮角化細胞浮遊液を調製した。細胞数を数え、１０００回転で５分間遠心し細胞を沈殿させた。上清を吸引し、沈殿物の細胞を増殖液体培地１にて懸濁し、１００mmコラーゲンコートディッシュ（旭テクノグラス（株）製、Ｉ型コラーゲンコートディッシュ、コード番号：4010-010）当たり３×１０6細胞／１０．０mL培養液の割合で播種した。同様に、MCDB153培地にも懸濁し播種した。該培養は３７℃、飽和水蒸気下５％炭酸ガス気相下で行い、培養開始後２０から２４時間後及び以後１日おきに培地交換を行った。ヒト表皮角化細胞は７日間位でディッシュ面一杯にまで良好に増殖したので、次いで継代処理を行い、２代目の継代培養を行った。
【００３８】
継代処理は、液体培地を除きＰＢＳ  １０mLで１回細胞表面を洗った後、０．１２５％トリプシン及び０．０１％ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液３mLを加えて細胞付着面を下にして３７℃のインキュベータで５分間静置し、表皮細胞が付着面から剥がれた状態であることを確認した後、３mLの０．０２５％トリプシンインヒビター溶液（トリプシンインヒビター（インビトロジェン（株）製（GIBCO-BRL）、大豆由来トリプシンインヒビター、コード番号：17075-029）２５mgをリン酸緩衝液１００mLに溶解してろ過滅菌した溶液）を添加してトリプシンの効果を中和した後、増殖液体培地１を１０mL加え１０００回転で約５分間遠心分離して得た沈殿物を１０mLの増殖液体培地１を加えて細胞を再浮遊して懸濁させることにより行った。同様に、MCDB153培地に細胞を再浮遊して懸濁させることにより行った。
本発明培地を用いた場合、ヒト表皮角化細胞は、５日間でディッシュ一杯にまで良好に増殖した。更に、同様にして継代処理と継代培養とを繰り返すことにより、ヒト表皮角化細胞を良好に増殖させることが出来た。
図３に増殖能の比較を、図４に培養後の細胞の位相差顕微鏡写真を示す。その結果、本発明培地によるヒト表皮角化細胞の増殖率は、MCDB153培地の場合に比べて顕著に優れていることが判る。
本発明培地は、細胞核の巨大化やスピンドル細胞などのない、細胞核の小さなヒト表皮角化細胞を活発に増殖していることが判る。
【００３９】
実施例５（初代ヒト表皮角化細胞の培養比較試験その２）
実施例１及び実施例２に従って、MCDB153培地、橋本らの報告する改良培地（特許文献２）、及び本発明培地を調製して、実施例４と同様にして、初代ヒト表皮角化細胞の増殖能の比較試験を実施した。
図５に増殖能の比較を、図６に培養後の細胞の位相差顕微鏡写真を示す。その結果、本発明培地によるヒト表皮角化細胞の増殖率は、MCDB153培地及び特許文献２の培地（図６中、MCDB153  Type-II培地）の場合に比べて、顕著に優れていることが判る。
本発明培地は、細胞核の巨大化やスピンドル細胞などのない、細胞核の小さなヒト表皮角化細胞を活発に増殖していることが判る。
【００４０】
実施例６（初代ヒト角膜上皮細胞の培養試験）
実施例１及び実施例２に従って、本発明培地である増殖液体培地１を調製して初代ヒト角膜上皮細胞の増殖能の試験を実施した。
インフォームドコンセントの得られた患者からの手術時で得られた余剰正常角膜を用いて初代培養を行った。ハサミで角膜から角膜実質細胞をできる限り取り除き、ダルベッコＰＢＳ（−）（日水製薬（株）製、コード番号：05913、ＰＢＳと表記する）５mLにて２回洗浄した。７０％エタノールに１分間浸し滅菌し、ＰＢＳを１０mLにて洗浄後、メスを用いて幅３mm長さ１０mm程度の短冊状に切り、ディスパーゼ液５mL（ディスパーゼII（合同酒精（株）製）を２５０単位／mLとなる様にダルベッコ変法MEM培地（DMEM）で溶解しろ過滅菌した溶液）に浸し、４℃で一晩（１８−２４時間）静置し酵素処理した。翌日、ピンセットを用いて角膜上皮細胞を角膜実質から剥離して、角膜上皮細胞をDMEM５mLにて洗浄、続いて、ＰＢＳ５mLにて洗浄後、０．２５％トリプシン溶液５mLの溶液中に浸し、３７℃で１０分間の酵素処理を行った。角膜上皮細胞をトリプシン溶液５mL入れたプラスチックシャーレに移しピンセットにて角膜上皮片をほぐし、１５mLの滅菌チューブに移した。ディッシュに残存している細胞をＰＢＳ５mLにて回収し、角膜上皮細胞浮遊液を調製した。細胞数を数え、１０００回転で５分間遠心し細胞を沈殿させた。上清を吸引し、沈殿物の細胞を増殖液体培地１にて懸濁し、３５mmコラーゲンコートディッシュ（旭テクノグラス（株）製、Ｉ型コラーゲンコートディッシュ、コード番号：4000-010）当たり１×１０6細胞／３．０mL培養液の割合で播種した。該培養は３７℃、飽和水蒸気下５％炭酸ガス気相下で行い、培養開始後２０から２４時間後及び以後１日おきに培地交換を行った。ヒト角膜上皮細胞は１０日間位でデイッシュ面一杯にまで良好に増殖したので、次いで継代処理を行い、２代目の継代培養を行った。
【００４１】
継代処理は、液体培地を除きＰＢＳ３mLで１回細胞表面を洗った後、０．１２５％トリプシン及び０．０１％ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液３mLを加えて細胞付着面を下にして３７℃のインキュベータで５分間静置し、角膜上皮細胞が付着面から剥がれた状態であることを確認した後、３mLの０．０２５％トリプシンインヒビター溶液（トリプシンインヒビター（インビトロジェン（株）製（GIBCO-BRL）、大豆由来トリプシンインヒビター、コード番号：17075-029)２５mgをリン酸緩衝液１００mLに溶解してろ過滅菌した溶液）を添加してトリプシンの効果を中和した後、増殖液体培地１を１０mL加え１０００回転で約５分間遠心分離して得た沈殿物を１２mLの増殖液体培地１を加えて細胞を再浮遊して懸濁させることにより行った。
継代培養は、細胞浮遊液を４分割して、３mLづつ、４枚の３５mmコラーゲンコートディッシュに植え込んで継代培養をする。
ヒト角膜上皮細胞は、７日間でディッシュ一杯にまで良好に増殖した。更に、同様にして継代処理と継代培養とを繰り返すことにより、ヒト角膜上皮細胞を５代まで良好に増殖させることが出来た。
その結果、図７に示すように、本発明培地でヒト角膜上皮細胞を、良好に増殖できることが判る。
本発明培地は、培養翌日の一日目の培養で敷石状の付着細胞が確認され、培養５日目で敷石状の細胞で比較的均一な細胞が多く、上皮様で敷石状に増殖していることが判る。
本発明培地は、ヒト表皮角化細胞のみならず角膜上皮細胞まで増殖できる。このようにヒト上皮細胞の培養技術に応用できる画期的な技術である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】立体棒グラフのＺ軸に到達細胞数、Ｘ軸にロット番号、Ｙ軸に培地を示す。
【図２】位相差顕微鏡写真の倍率を４０倍、１００倍、２００倍で示す（上段が増殖培地１で左側から４０倍、１００倍、２００倍の顕微鏡倍率、下段がMCDB153培地で左側から４０倍、１００倍、２００倍の顕微鏡倍率）。
【図３】立体棒グラフのＺ軸に到達細胞数、Ｘ軸に継代数、Ｙ軸に培地を示す。
【図４】位相差顕微鏡写真の倍率を４０倍、１００倍、２００倍で示す（上段が増殖液体培地１で左側から４０倍、１００倍、２００倍の顕微鏡倍率、下段がMCDB153培地で左側から４０倍、１００倍、２００倍の顕微鏡倍率）。
【図５】立体棒グラフのＺ軸に到達細胞数、Ｘ軸に継代数、Ｙ軸に培地を示す。
【図６】位相差顕微鏡写真の倍率を４０倍、１００倍、２００倍で示す（上段が増殖液体培地１で左側から４０倍、１００倍、２００倍の顕微鏡倍率、中段がMCDB153  Ｔｙｐｅ−ＩＩで左側から４０倍、１００倍、２００倍の顕微鏡倍率、下段がMCDB153培地で左側から４０倍、１００倍、２００倍の顕微鏡倍率）。
【図７】位相差顕微鏡写真の倍率を１００倍で示す（上段が培養１日目、下段が培養５日目）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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