(57)【要約】【目的】  キトサンを使用し水中下オレフィン化合物を重合させて無界面活性剤のラテックス溶液を調整し、ＤＮＡ，ＲＮＡを細胞に送り込むベクタ−を得る。【構成】  キトサンに水中下オレフィン化合物を重合させてなる重合体から成るラテックス溶液。  またこれに各種のＤＮＡ，ＲＮＡを反応させて得られる複合体。【効果】  このような非ウイルス性ベクタ−を用いると危険性のあるウイルス類のベクタ−と異なり安全にかつ人工物である事から安定して使用される事になる。ベクタ−として形質変換効率を高める為に細胞膜の選択性は重要である。  さらに形質変換効率を高める為には疎水親水ドメインを有する事が必要であり、具体的にはキトサンとビニル単量体の共重合体材料からなるラテックスを形成さす事が重要である。  本発明によりこの事が実証された。【選択図】      なし     【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
2005036219.tif 000007
において、キトサンの単位の式が、
【化２】
2005036219.tif 000008
で表され、式中オレフィン化合物重合体の単位の式が、
【化３】
2005036219.tif 000009
で表され、キトサンを幹ポリマ−とし、オレフィン化合物がグラフト鎖として成る、（化２）とこの（化３）よりなる、上記（化１）で表わされる、キトサンにオレフィン単量体をグラフト重合して得られる共重合体。
【請求項２】
【化１】
2005036219.tif 000010
において、キトサンの単位の式が、
【化２】
2005036219.tif 000011
で表され、式中オレフィン化合物重合体の単位の式が、
【化３】
2005036219.tif 000012
で表され、キトサンを幹ポリマ−とし、オレフィン化合物がグラフト鎖として成る、（化２）とこの（化３）よりなる、上記（化１）で表わされる、キトサンにオレフィン単量体をグラフト重合して得られる共重合体よりなる、遺伝子ベクタ−。
【請求項３】
【化１】
2005036219.tif 000013
において、キトサンの単位の式が、
【化２】
2005036219.tif 000014
で表され、式中オレフィン化合物重合体の単位の式が、
【化３】
2005036219.tif 000015
で表され、キトサンを幹ポリマ−とし、オレフィン化合物がグラフト鎖として成る、（化２）とこの（化３）よりなる、上記（化１）で表わされる、キトサンにオレフィン単量体をグラフト重合して得られる共重合体と核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）よりなる複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明のキトサン−オレフィン単量体グラフト共重合体は水酸基を有する水部分可溶性キトサンに水中下オレフィン単量体をグラフト重合させ、遺伝子組み替えベクタ−材料として有用なラテックス重合生成物を製造するものである。  本発明は遺伝子組み替えベクタ−材料として有用なキトサンのラテックス重合生成物を製造出来る事を示唆するものである。  
【背景技術】
【０００２】
本発明のキトサン−オレフィン共重合体の出発原材料キトサンは生物界に豊富に存在しているキチンを脱アセチル化して得られる。  キチンは魚介類を中心に動物、植物に広く存在する。  カニやエビの甲羅のキチンは工業的に脱アセチル化されてキトサンとして利用されておりバイオマス資源として期待されている。  現在は水処理用の凝集剤として多用されているが、生体適合材料としての特性を持ち、人工皮膚や止血剤あるいは坑菌材料としての用途が注目されている。
ある遺伝子を他の生物へ移植する際にその遺伝子を運ぶ、いわば運びやが必要でありこれをベクタ−と称している。  現在ベクタ−として使用されている物は各種のウイルスであり、細菌に寄生するプラスミドや細菌に感染するファ−ジである。  これらに移植する遺伝子をくっつけて感染させれば細菌に遺伝子を送りこめ。  現在実用化されているベクタ−はこれらウイルスベクタ−であるが、使用するウイルス自体の形質が細胞に移植する際に組み込まれる恐れがあり、安全性に疑問が指摘されている。  キトサンは非ウイルスベクタ−としての可能性が報告されているがウイルスベクタ−と比較すると発現が低く、実用上問題がある。  
一方従来イムノアッセイ材料としてラテックス重合生成物が製造されていたが、製造する方法は界面活性剤存在下水溶液中で乳化重合して成された物が大部分であり、界面活性剤の存在しないソ−プレスの物が望まれている。  これは水溶液中に存在する界面活性剤がラテックス診断薬としての作用に影響するからである。  この為、問題点を解決するための手段として、水酸基を有する水可溶性リニア多糖類の陽イオン性誘導体に水中下オレフィン単量体をグラフト重合させ、ソ−プレスのイムノアッセイ材料として有用なラテックス重合生成物を製造される、水可溶性リニア多糖類の陽イオン性誘導体−オレフィン単量体グラフト共重合体ラテックスおよびラテックス診断薬の特許が成立している。  乳化重合とは水溶液中にオレフィン単量体を懸濁し通常は界面活性剤などを用いて乳化される重合法で、詳細に述べれば単量体あるいは成長鎖と水素結合、ク−ロン力、電荷移動相互作用、ファンデルワ−ルス力などによって水溶媒界面で相互作用して高分子鎖が重合成長して水溶液中に微粒子を形成さす重合方法である。  通常、重合生成物は重合させた単量体と界面活性剤との混合物として存在する。  この不純物として考えられる界面活性剤はラテックス診断薬に使用される時に妨害する事があり問題と成っていた。  思いもかけずキトサンに水中下オレフィン単量体をグラフト重合させ、ソ−プレスの遺伝子組み替えベクタ−材料として有用なソ−プレスのキトサンのラテックス重合生成物を製造するものである。
【特許文献１】昭和５９年特許願第２４８４７６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
遺伝子工学で、ある遺伝子を他の生物へ移植する際にその遺伝子を運ぶ、いわば運びやが必要でありこれをベクタ−と称している。
現在ベクタ−として使用されている物は各種のウイルスであり、細菌に寄生するプラスミドや細菌に感染するファ−ジである。  これらに移植する遺伝子をくっつけて感染させれば細菌に遺伝子を送りこめる。  使用するウイルス自体の形質が細胞に移植する際に組み込まれる恐れがあり、安全性に問題がある。  
【課題を解決するための手段】
【０００４】
このプラスミドやファ−ジの替りに陽イオン性高分子体と核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）との複合体をもちいると複合体のＲＮＡ、ＤＮＡ  （遺伝子）を直接にあらかじめ準備された細胞に送りこめる事に成る。  この非ウイルス性ベクタ−を用いると危険性のあるウイルス類のベクタ−と異なり安全にかつ人工物である事から安定して使用される事になる。  更に重要な事は癌治療にこの遺伝子治療を用いる場合、現在マクロファ−ジへの遺伝子ＤＮＡ導入がこのキトサンやＤＥＡＥデキストランなどの多糖類の陽イオン性高分子体が有効である事である。  しかしＲＮＡ、ＤＮＡ導入率はいまだかなり低く、実用にはさらなるハ−ドルを越えねばならい。  この遺伝子治療は個々のマクロファ−ジを用いるテイラ−メイド治療法であり癌治療に安全かつもつとも有効な治療法と考えられる。  陽イオン性高分子体としては陽イオン性多糖類が有望であるが、それはその複合体が細胞膜を容易にとうり抜ける事が出来るからであり、  その事は細胞膜表面の多糖類と複合体との相互作用に係っている。  ベクタ−としての細胞膜の選択性にかんして高分子生体親和性は重要であり、さらにその為にもちいる陽イオン性高分子体の非ウイルス性ベクタ−は疎水親水ドメインを有する事が必要であり、具体的にはキトサンなどの陽イオン性多糖類とビニル単量体の共重合体材料からなるラテックスを形成さす事が重要である。  即ちこの生じる複合体ラテックスの生体適合性が重要であり、キトサンとビニル単量体の共重合体にする事でキトサンの遺伝子キャリヤーとしての細胞への低ＤＮＡ、低ＲＮＡ導入率を改善できる事を発見した。
【発明の効果】
【０００５】
本願発明は水酸基を有する部分水可溶性キトサンに水中下オレフィン単量体をグラフト重合させた物である。対するオレフィン単量体成長鎖や生じた共重合体鎖の構造はそれぞれ（化２）、（化1）として記載されている。それぞれの結合関係は、部分水可溶性キトサンの水酸基の水素原子（開始剤の酸化によりプロトンとして）の引き抜きによるラジカル発生に起因するオレフィン単量体二重結合の連鎖移動による共有結合であることは明白である。  これは４価のセリウムイオンなどを開始剤として用いて行い、一切の界面活性剤を使用しない事から抗体吸着ラテックス診断薬などに使用される時に妨害される事が無く大変有用である。  本願発明の一部である部分水可溶性キトサン−オレフィン単量体のグラフト共重合体ラテックスはラテックス診断薬である抗体吸着ラテックス診断薬にも使用される可能性を有する。  このようなソ−プフリ−と言われる溶媒と溶質との界面で成長するグラフト共重合体は種々用途の広い有用な物質である。  特にイムノアッセイ材料以外にも濾過膜やバイオマテリアルとして注目されている。  又その親水性に注目して、人口腎臓膜、コンポ−ネント、代用血管、コンタクトレンズへの応用が考えられてきたが、今回は新たに非ウイルス性ベクタ−として極めて有望な事が解った。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、この発明のキトサン−オレフィン単量体グラフト共重合体について、詳細に説明する。  キトサン−オレフィン単量体グラフト共重合体は、次の２つのステップを経て得る。  又この重合体は核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）と複合体を形成し、この複合体は細胞内に取りこまれ、細胞の核に至って細胞の形質変換を生じるものである。
キトサンの調整
キトサンの単位の式が、
【化２】
2005036219.tif 000002
で表される。  対するグラフト重合させられるオレフィン単量体としては、一般式が（化３）で示されるものが考えられる。
【化３】
2005036219.tif 000003
具体的に言うと、アクリル酸、メタアクリル酸のごときα、β−不飽和酸のアルキルエステル、シクロヘキシルエステルのごとき低級アルキル置換シクロヘキシルエステル、２−ヒドロキシエチルエステル、２−ヒドロキシプロピルエステル、２−ヒドロキシブチルエステル；アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリルアミド、アクリル−もしくはメタクリル−ジメチルアミド、上記α、β−不飽和酸のＣ1〜Ｃ3 のアミノアルキルエステル、Ｃ1〜Ｃ3 のジアルキルアミノアルキルエステル、グリシジルエステル、テトラヒドロフルフリルエステル、ベンジルエステル、ポリエチレングリコ−ルモノエステル類；アクリロニトリル、メタアクリロニトリルのごときα、β−不飽和酸のニトリル基；ビニルアルコ−ル、メチルビニルアルコ−ル、ジメチルビニルアルコ−ル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ビニルブチレ−トのごときビニルアルコ−ル及びそのメチル置換ビニルアルコ−ルのＣ1〜Ｃ3
アルキルエステル；スチレン、ビニルトルエン；ビニルピロリドン；ビニルメチルピロリドンなどが考えられる。
グラフト共重合体の調整
反応は通常水溶液中で行われる。  すなわちキトサンの水溶液中、上記オレフィン単量体を加え、開始剤を添加して反応する。  開始剤としては４価のセリウム塩、４価のマンガン塩、第二鉄塩−過酸化水素が通常用いられるが、他に過硫酸カリウム（ＫＰＳ）、アゾビスイソブチルニトリル（ＡＩＢＮ）、過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）等ラジカル開始剤も用いられる。  反応温度は常温より８０℃まで幅広く選択出来る。  必要なら窒素置換して反応を続行させる事も行われる。  それぞれの結合関係は、キトサンのプロトンの引き抜きによるラジカル発生によるオレフィン単量体二重結合の連鎖移動による共有結合である。  この反応では生成物は水溶液中ではラテックスを生じる。  このラテックス重合体は一般的には水、アルコ−ル、又はアセトン、テトラヒドロフラン等有機溶媒に不溶であるがキヤステイング法などにより、容易に成膜出来る。  あるいはアルコ−ルなど不溶溶媒を過剰に加え沈殿として得た後、熱プレス法などにより容易に成型品を作る事が出来る。  上記目的の為に、グラフト重合体中、幹ポリマ−とグラフトポリマ−の比率あるいはその重合度比率は目的に合わせて種々選択出来る。  グラフト重合はその重合率をグラフト率（％）で定められる。  これはグラフト率（％）＝（グラフト重合した単量体量／グラフト共重合体中の幹ポリマ−量）×１００で定義される。  本発明においてはオレフィン化合物がグラフト鎖として成り、グラフト率が２％から５０００％の範囲が適当と考えられる。  本願発明は水酸基を有する部分水可溶性キトサンに水中下オレフィン単量体をグラフト重合させた物である事は繰り返し述べているが、生じた共重合体鎖の構造は特許請求の範囲に記載されている様に（化２）と（化３）よりなる、（化１）式で表わされる。
【化１】
2005036219.tif 000004
それぞれの結合関係は、キトサンの水酸基のプロトンの引き抜きによるラジカル発生によるオレフィン単量体二重結合の連鎖移動による共有結合である。
キトサン共重合体と核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）との複合体
本発明のキトサン共重合体の陽イオン性部分と核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）のリン酸部分は静電的ク−ロン力により容易に結合してポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）のキトサン共重合体−核酸複合体を生じる。
具体的にはその複合体は
【化４】
2005036219.tif 000005
で示されるデオキシリボヌクレオチドを繰り返し単位とする、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を反応させ生じることを特徴とする、キトサンにオレフィン単量体をグラフト重合して得られる共重合体と、核酸よりなる複合体であり、
【化５】
2005036219.tif 000006
で示されるリボヌクレオチドを繰り返し単位とする、リボ核酸（ＲＮＡ）を反応させ生じることを特徴とする、キトサンにオレフィン単量体をグラフト重合して得られる共重合体と、核酸よりなる複合体である。
即ち、キトサンを幹ポリマ−とし、オレフィン化合物がグラフト鎖として成る、望ましくはグラフト率が２％から５０００％の範囲の（化２）とこの（化３）よりなる、上記（化１）で表わされる、キトサンにオレフィン単量体をグラフト重合して得られる共重合体に、（化４）および（化５）で示されるデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを繰り返し単位とする、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を反応させ生じることを特徴とする、キトサンにオレフィン単量体をグラフト重合して得られる共重合体と、核酸よりなる複合体である。
（化4）、（化5）式はヌクレオチドの構成を示し、式中Ｂでしめされるプリンまたはピリミジン塩基と糖およびリン酸からなっている。  また式中Ｂで、具体的にはプリン塩基としてはアデニン、グアニンの２種であり、ピリミジン塩基としてはシトシン、ウラシル、チミンの３種であるが、ＤＮＡの繰り返し単位であるデオキシリボヌクレオチドではアデニン、グアニンの２種と、ピリミジン塩基としてはシトシン、チミンが選択され、ＲＮＡの繰り返し単位であるリボヌクレオチドではアデニン、グアニンの２種と、ピリミジン塩基としてはシトシン、ウラシルが選択される。  構成される糖はそれぞれデオキシリボヌクレオチドではデオキシリボースであり、リボヌクレオチドではリボースである。
本発明のキトサン共重合体と（化4）、（化5）式中に示されるヌクレオチドを繰り返し単位とする、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）のリン酸部分は静電的ク−ロン力により容易に結合してポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）のキトサン共重合体−核酸複合体を生じる。  この複合体形成が遺伝子デリバリーシステムの重要な最初のステップである。  その為、用いる陽イオン性高分子体のベクタ−は疎水親水ドメインを有する事が必要であると思われ、具体的にはキトサンなどの陽イオン性多糖類とビニル単量体の共重合体からなるラテックスを形成し、ビニル単量体の重合部分による疎水部分と陽イオン性多糖類による親水部分をあわせ持たす事が重要であると考えられる。
実施例５のごとく、キトサン共重合体の溶液を鮭の精子由来のＤＮＡ溶液に加えたところ、完全に沈澱してキトサン共重合体とＤＮＡの複合体が得られた。
同様な操作をキトサンで行なうとキトサン共重合体と比較して完全に沈澱するのには長時間を要した。
すなわち、キトサン−ＭＭＡ共重合体／ＤＮＡの複合体の沈殿時間は重量増加率１８０％で３０分であつた。  一方その同様な操作を実施例１の原料キトサンの塩酸塩で行なうと完全に沈澱するのに４３分を要した。ここで重量増加率は加えたＭＭＡの重量にたいする使用したキトサンの重量との比である。
即ち，重量増加率＝加えたＭＭＡの重量／使用したキトサン塩酸塩の重量。
同様に実施例６のごとく、キトサン共重合体の溶液を酵母由来のＲＮＡ溶液に加えたところ、完全に沈澱して陽イオン性多糖類共重合体とＲＮＡの複合体が得られた。
この場合は同様な操作をキトサンで行なうとキトサン共重合体と比較して、完全に沈澱する時間に差はなかった。  
しかしこれらの事はキトサン共重合体がキトサンと比較して核酸との高い反応性を有する事を示している。
この複合体は細胞膜を透過し、エンドサイト−シスで細胞内に容易に導入されエンドソ−ム（輸送小胞体）に取り込まれる。  複合体はさらにエンドソ−ムから細胞室内へ放出され、核膜を透過して核に至り、複合体として核内へ集積する。最終的に核内で複合体から核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）が分離され、転写・遺伝子発現する。      
キトサン共重合体ベクタ−によるトランスフェクション
１。トランスフェクションの１日前より被形質変換細胞を１００ｍｍシャ−レ中で培養する。  被形質変換細胞の１００ｍｍ培養シャ−レ中の細胞密度は８×１０5 個を目安にする。    今回はＣＯＳ−１細胞（ＳＶ４０で形質転換されたアフリカ緑ザル腎細胞）をＤＭＥＭ培地（牛胎児血清を１０％含む）を用い３７℃、５％ＣＯ２下で培養を行った。
２。洗液のリン酸塩緩衝液１×ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  (Dulbecco & Vogt(1954))）を準備する。  この洗液の１×ＰＢＳ液とキトサン共重合体液を３７℃に加温する。
３。１０×ＰＢＳ液を使用して、１×ＰＢＳ液に希釈する。  トランスフェクション液を次のような手順で準備する。
１００ｍｍ培養シャ−レを用いて、滅菌チュ−ブ中に組み替えＤＮＡとしてルシフェラ−ゼをコ−ドしたプラスミド（ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ（プロメガPromega Madison WI））２０μｇを１×ＰＢＳ液で５４０μｌに希釈する。    そしてキトサン共重合体液（キトサンとして１０ｍｇ／ｍｌ）の２８μｌを加える。  よく混ざるように滅菌チュ−ブを指でたたくようにする。
４。被形質変換細胞のＣＯＳ−１細胞が存在する培養シャ−レから培養液を除く、  １００ｍｍ培養シャ−レでは被形質変換細胞を洗液の１×ＰＢＳの１０ｍｌで２回洗浄する。  
５。３。で調整されたＤＮＡ−キトサン共重合体複合体液をこの被形質変換細胞に加える。  よく行き渡るように培養シャ−レでは被形質変換細胞をかきまぜる。
６。培養シャ−レを３７℃で３０分間インキュベイトする。  ときどき培養シャ−レをゆらしてみる。
７。１００ｍｍ培養シャ−レでは成長培地（ＤＭＥＭ培地）６ｍｌを培養シャ−レに加える。  培養シャ−レを３７℃で２時間３０分間インキュベイトして、細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を発現させる。  成長培地を取換え、さらに３７℃で４８−７２時間インキュベイトする。
発現効率
ＣＯＳ−１細胞の形質変換の発現効率は組み込まれている発現ルシフェラ−ゼ活性によった。  すなわちルシフェラ−ゼ  アッセイ  キット（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ））を使用し、ルミノメ−タ（Ｔｕｒｎｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ＴＤ−２０ｅ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ  ））により、  ＴＬＵ値（Ｔｕｒｎｅｒ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ（ＴＬＵ））を求め、キトサン（脱アセチル化度８８．５％  粘度１２０ｍｐａ．Ｓ（０．５％酢酸  ２０℃））のその値を１として各サンプルを比較した。        
【実施例】
【０００７】
実施例１
脱アセチル化度８８．５％  粘度１２０ｍｐａ．Ｓ（０．５％酢酸  ２０℃）のキトサン塩酸塩２ｇを水５０ｍｌに溶解し、ついでメタノ−ル５ｍｌ、メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）３ｍｌを加え、十分に反応溶液、反応容器中の空気を窒素ガスで置換した後よく攪拌しながら、０．１Ｎ硝酸１５ｍｌに溶かした硝酸第二セリウムアンモニウムニトレイト１９０ｍｇを加え反応を開始する。  反応は３０℃で１時間行いラテックスが生成する。  反応終了は停止剤としてハイドロキノン１％溶液３ｍｌを使用した。後、反応溶液を３倍量のメタノ−ル中に注入し沈殿を得た。  この沈殿を熱水で十分に洗浄し遠心分離後５０℃で減圧乾燥し、ついで乾燥物をソックスレ−抽出器に入れて２４時間アセトン抽出を行い、キトサン−ＭＭＡ共重合体の塩酸塩１．５ｇを得た。
グラフト率１５０％
対キトサン収率３０％
このものは、キトサン塩酸塩の良溶媒である水にもポリメタクリル酸メチルの良溶媒であるアセトンにも溶けない。  図１はそのものの赤外吸収スペクトルである。  
波数1000cm−１から1100cm−１にかけてキトサン由来のピラノーズ環の吸収がみられ、1670cm−１付近にはキトサン塩酸塩には見られないPMMA由来のカルボニル基の吸収がみられる。  
実施例２
実施例１と同様な反応を行った後、ラテックスの反応終了溶液をメタノ−ル中に注入せず、水中で透折を行い未反応物及び開始剤を除去して、キトサン−ＭＭＡ共重合体ラテックスを得た。  このものは遺伝子組み替えベクタ−として有用でありテスト結果を示す。
テスト方法は（発明の構成の詳細な説明の欄）の手順に従い行った。  即ちベクタ−の効果をみる形質変換の発現効率はＣＯＳ−１細胞に組み込まれている発現ルシフェラ−ゼ活性によった。  出発キトサン塩酸塩の値を１として実施例２のサンプルを比較したところ、１．５倍の発現ルシフェラ−ゼ活性が得られた。
実施例３
脱アセチル化度９０．５％  粘度６０ｍｐａ．Ｓ（０．５％酢酸  ２０℃）のキトサン塩酸塩２ｇを水５０ｍｌに溶解し、ついでメタノ−ル５ｍｌ、スチレンモノマ−３ｍｌを加え、十分に反応溶液、反応容器中の空気を窒素ガスで置換した後よく攪拌しながら、０．１Ｎ硝酸１５ｍｌに溶かした硝酸第二セリウムアンモニウムニトレイト１９０ｍｇを加え反応を開始する。  反応は３０℃で１時間行いラテックスが生成する。  反応終了は停止剤としてハイドロキノン１％溶液３ｍｌを使用した。後、反応溶液を３倍量のメタノ−ル中に注入し沈殿を得た。  この沈殿を熱水で十分に洗浄し遠心分離後５０℃で減圧乾燥し、ついで乾燥物をソックスレ−抽出器に入れて２４時間アセトン抽出を行い、キトサン−スチレン共重合体の塩酸塩１．５ｇを得た。
グラフト率１５０％
対キトサン収率３０％
このものは、キトサン塩酸塩の良溶媒である水にもポリスチレンの良溶媒であるアセトンにも溶けない。    
実施例４
実施例３と同様な反応を行った後、ラテックスの反応終了溶液をメタノ−ル中に注入せず、水中で透折を行い未反応物及び開始剤を除去して、キトサン−スチレン共重合体ラテックスを得た。  このものは遺伝子組み替えベクタ−として有用でありテスト結果を示す。
テスト方法は（発明の構成の詳細な説明の欄）の手順に従い行った。  即ちベクタ−の効果をみる形質変換の発現効率はＣＯＳ−１細胞に組み込まれている発現ルシフェラ−ゼ活性によった。  実施例１の出発キトサン塩酸塩の値を１として実施例４のサンプルを比較したところ、１．８倍の発現ルシフェラ−ゼ活性が得られた。  
実施例５
実施例２で得られたキトサン−ＭＭＡ共重合体のラテックスをキトサン換算で１０mｇ/mlの溶液に調整する。
この溶液の１mlを鮭の精子由来のＤＮＡ溶液（１０mｇ/ml）1mlに加えたところ、０．５時間で完全に沈澱して、20mgのキトサン−ＭＭＡ共重合体とＤＮＡの複合体が得られた。
同様な操作を原料キトサンの塩酸塩で行なうと完全に沈澱するのに４３分を要した。
図２はそのものの赤外吸収スペクトルである。  波数1000cm−１から1100cm−１にかけてキトサン由来のピラノーズ環の吸収がみられ、1220cm−１付近にはＤＮＡ由来のP−Oの伸縮振動による吸収がみられ、1730cm−１付近にはMMA由来によるカルボニル基C=Oの吸収が見られる。
実施例６
実施例２で得られたキトサン−ＭＭＡ共重合体のラテックスをキトサン換算で１０mｇ/mlの溶液に調整する。
この溶液の１mlを酵母由来のＲＮＡ溶液（１０mｇ/ml）1mlに加えたところ、１時間で完全に沈澱して、10mgのキトサン−ＭＭＡ共重合体とRＮＡの複合体が得られた。  同様な操作を原料キトサンの塩酸塩で行なうと完全に沈澱するのに１時間を要した。                              
赤外吸収スペクトルをみると、波数1000cm−１から1100cm−１にかけてキトサン由来のピラノーズ環の吸収がみられ、1230cm−１付近にはRＮＡ由来のP−Oの伸縮振動による吸収がみられ、1730cm−１付近にはMMA由来によるカルボニル基C=Oの吸収が見られる。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
現在実用化されているベクタ−は大部分がウイルスベクタ−であるが、使用するウイルス自体の形質が細胞に移植する際に組み込まれる恐れがあり、安全性に問題がある。
本発明のキトサンとビニル単量体との共重合体のような非ウイルス性ベクタ−を用いると危険性のあるウイルス類のベクタ−と異なり安全にかつ人工物である事から安定して使用される事になる。  本発明のキトサン共重合体は核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）のリン酸部分と静電的ク−ロン力により容易に結合してポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）のキトサン共重合体−核酸複合体を生じる。  この複合体形成が遺伝子デリバリーシステムの重要な最初のステップであり、疎水親水ドメインを有している事からこれが核酸との反応を高め、かつエンドサイト−シスで細胞内に容易に導入され、エンドソ−ム（輸送小胞体）に取り込まれる確率を高め、キトサンなどの既存の陽イオン性多糖類ベクタ−の細胞や細胞核への低ＤＮＡ、低ＲＮＡ導入率を改善できる。  さらに本発明のキトサン共重合体は化学的に安定である。  たとえばその溶液は１２０℃、１５分のオートクレーブ処理に十分に耐える。  遺伝子組み替えベクタ−を産業化のレベルまで高めるには細胞やバクテリアを大量に培養し、それに効率よく遺伝子導入する技術が必要である事から再現性が優れている事やコストの安い事,  特に化学的に安定している事は重要である。
これらの重要な特性を本発明のキトサン共重合体は具備しており産業上有望であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１で得られたキトサン−ＭＭＡ共重合体の赤外吸収スペクトルを示すグラフである。
【図２】実施例５で得られたキトサン−ＭＭＡ共重合体とDＮＡとの複合体の赤外吸収スペクトルを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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