(57)【要約】      （修正有）【課題】効率のよいペプチドの製造方法およびそのためのペプチド生成タンパク質等を提供する。【解決手段】下記（Ａ）および（Ｂ）に示すタンパク質のうち少なくとも一方の存在下で、アミン成分とカルボニル成分とを反応させてペプチドを生成させる。（Ａ）特定のアミノ酸配列を有するタンパク質（Ｂ）特定のアミノ酸配列における第２０番目のアミノ酸残基がアラニンであり、当該アラニン以外の領域に、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における第２０番目のアラニン以外の領域に、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質
【請求項２】
下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における第２０番目のアラニン以外の領域に、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質
【請求項３】
下記（ａ）または（ｂ）に示すポリヌクレオチド。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）塩基配列が配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における第２０番目のアミノ酸残基に相当する部位がアラニンをコードしており、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項４】
請求項２または３に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えポリヌクレオチドが導入され、ペプチド生成活性を有するタンパク質を発現する、形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物を培地中で培養し、培地中および／または微生物中に、ペプチド生成活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【請求項７】
請求項５に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物の培養物、当該培養物より分離した微生物菌体および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる１種または２種以上を用い、アミン成分とカルボニル成分とからペプチドを生成せしめる、ペプチドの製造方法。
【請求項８】
下記（Ａ）および（Ｂ）に示すタンパク質のうち少なくとも一方の存在下で、アミン成分とカルボニル成分とからペプチドを生成せしめる、ペプチドの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における第２０番目のアラニン以外の領域に、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド生成活性を有するタンパク質（以下、「ペプチド生成タンパク質」ともいう）に関し、より詳しくは、遺伝子発現性に優れた、ペプチド生成タンパク質およびこのタンパク質を用いたペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドは、医薬品、食品等のさまざまな分野で利用されている。例えば、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンはＬ−グルタミンに比べ安定かつ水溶性も高いことから、輸液や無血清培地の成分として広く用いられている。
【０００３】
ペプチドの製造法としては従来から化学合成法が知られているが、その製造法は必ずしも簡便さ、効率性の点で満足のいくものではなかった。
他方、酵素を用いたペプチドの製造方法も開発されてきた（例えば特許文献１、２など）。しかしながら、従来の酵素を用いたペプチドの製造方法では、ペプチド生成速度が極めて遅い、ペプチド生成収率が低いなどの点で改善の余地が残されるものであった。このような背景の下、これらペプチドの工業的にも効率の良い製造法の開発が望まれていた。
【０００４】
【特許文献１】EP 278787 A1公報
【特許文献２】EP 359399 B1公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、効率のよいペプチドの製造方法およびそのためのペプチド生成タンパク質等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意研究の結果、エンペドバクターに由来するペプチド生成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の単離に成功し、アミノ酸配列または塩基配列の特定部位を改変させることによりさらに発現効率が向上することを見出し本発明を完成させた。すなわち、本発明は、下記タンパク質およびこのタンパク質を用いたペプチドの製造方法等を提供するものである。
【０００７】
〔１〕  下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における第２０番目のアラニン以外の領域に、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質
〔２〕  下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における第２０番目のアラニン以外の領域に、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質
〔３〕  下記（ａ）または（ｂ）に示すポリヌクレオチド。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）塩基配列が配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における第２０番目のアミノ酸残基に相当する部位がアラニンをコードしており、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
〔４〕  請求項２または３に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド。
〔５〕  請求項４に記載の組換えポリヌクレオチドが導入され、ペプチド生成活性を有するタンパク質を発現する、形質転換体。
〔６〕  請求項５に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物を培地中で培養し、培地中および／または微生物中に、ペプチド生成活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の製造方法。
〔７〕  請求項５に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物の培養物、当該培養物より分離した微生物菌体および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる１種または２種以上を用い、アミン成分とカルボニル成分とからペプチドを生成せしめる、ペプチドの製造方法。
〔８〕  下記（Ａ）および（Ｂ）に示すタンパク質のうち少なくとも一方の存在下で、アミン成分とカルボニル成分とからペプチドを生成せしめる、ペプチドの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における第２０番目のアラニン以外の領域に、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、発現効率に優れたペプチド生成活性タンパク質および効率のよいペプチドの製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の実施の形態についてその最良の形態と共に説明する。
なお、以下に挙げる種々の遺伝子工学的な技法については、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)、細胞工学ハンドブック、黒木登志夫ら編、羊土社（1992）、新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版、村松ら編、羊土社（1999）など、多くの標準的な実験マニュアルがあり、これらの文献を参考にすることにより当業者であれば実施可能である。
【００１０】
１．本発明のペプチド生成活性を有するタンパク質
本発明のペプチド生成タンパク質は、下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質である。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における第２０番目のアラニン以外の領域に、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質
なお、以下、配列番号を示すものは、特に断りのない限り、配列表中の配列番号を示すものとする。
【００１１】
ペプチド生成活性とは、２つ以上の物質から、ペプチド結合を形成させてペプチド結合を有する新たな化合物を生成する活性であり、より具体的には、例えば２つのアミノ酸またはそのエステルなどから、少なくとも１つペプチド結合を増やしたペプチド化合物を生成する活性をいう。
【００１２】
上記（Ａ）のタンパク質において、Ｎ末端から第２０番目のアミノ酸残基はアラニンである。上記（Ａ）のタンパク質は、配列番号８に示すアミノ酸配列の成熟タンパク質部位における第２０番目のアミノ酸残基である（配列番号８においては、第４２番目に相当する）バリンがアラニンに置換された配列を有するものである（なお、本明細書においては、このように第２０番目のバリンがアラニンに置換されたことを「Ｖ２０Ａ」のように、「元のアミノ酸、配列番号、改変後のアミノ酸」の順に並べ、記号化して表示する場合がある）。配列番号８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質は、エンペドバクター・ブレビスに由来のペプチド生成活性を有するタンパク質である。本発明のペプチド生成タンパク質は、エンペドバクター・ブレビスに由来する元のペプチド生成タンパク質よりも、微生物などの形質転換体において発現効率が優れている。
【００１３】
第２０番目のアミノ酸残基をバリンからアラニンに置換するような変異の導入は、例えば部位特異的変異法によって、本タンパク質をコードする遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換されるように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変された塩基配列を有するポリペプチドは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、例えば（Ａ）のタンパク質をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、Error-prone PCRにより変異を導入する方法、及び変異修復系の欠損した宿主中で該ＤＮＡを増幅し、変異の導入されたＤＮＡを回収する方法などが挙げられる。
【００１４】
また、本発明により、上記（Ａ）に示すタンパク質と実質的に同じタンパク質も提供される。具体的には、（Ｂ）に示すタンパク質が提供される。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。ただし、（Ｂ）タンパク質のアミノ酸配列において１または数個の置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で、（Ａ）のタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００１５】
（Ｂ）のタンパク質においても、配列番号２に示すアミノ酸配列における、Ｎ末端のアミノ酸残基を第１番目としたときの第２０番目のアミノ酸残基がアラニンである。すなわち、（Ｂ）のタンパク質における変異の導入は、配列番号２に示すアミノ酸の第２０番目のアミノ酸残基であるアラニン以外の部位における変異を許容するものである。したがって、第２０番目のアラニン以外の部位に欠失、挿入などの変異が導入された場合、第２０番目からのアラニンからのＮ末端またはＣ末端までのアミノ酸残基数は、変異導入前の状態とは異なることがあり得る。
【００１６】
上記（Ｂ）に示されるようなアミノ酸の変異も、例えば部位特異的変異法によって、本タンパク質をコードする遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加などされるように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変された塩基配列を有するポリペプチドは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、（Ａ）をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び（Ａ）をコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００１７】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、および逆位等の変異には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べることにより、配列番号２に記載のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
【００１８】
２．本発明のポリヌクレオチド
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号１に記載の塩基配列は配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする。
【００１９】
コドンの縮重により、１つのアミノ酸配列を規定する塩基配列は複数あり得る。すなわち、本発明のポリヌクレオチドには下記のタンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における第２０番目のアラニン以外の領域に、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質
【００２０】
さらに、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡと実質的に同一のポリヌクレオチドとして次のようなポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれを保持する細胞などから、配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離することによって、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドと実質的に同一のポリヌクレオチドが得られる。
【００２１】
すなわち、本発明のポリヌクレオチドとしては、下記（ａ）または（ｂ）に示すポリヌクレオチドが挙げられる。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）塩基配列が配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における第２０番目のアミノ酸残基に相当する部位がアラニンであり、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００２２】
（ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、配列番号１に記載のアミノ酸配列における第２０番目のアミノ酸残基に相当する部位がアラニンをコードしている。上記のように、本発明のタンパク質においては、所定の活性を有する範囲で、配列番号２のアミノ酸配列において第２０番目のアミノ酸残基に以外の部位に変異が導入されていてもよい。同様に、本発明のポリヌクレオチドにおいては、配列番号２のアミノ酸配列における第２０番目のアミノ酸残基であるアラニンをコードする領域以外の部位において、（ｂ）に記載の他の要件を満たす範囲で、配列番号１の塩基配列に変異が含まれていてもよい。
【００２３】
プローブは、例えば配列番号１に記載の塩基配列に基づいて定法により作製することができる。また、プローブを用いてこれとハイブリダイズするポリヌクレオチドをつり上げ、目的とするポリヌクレオチドを単離する方法も、定法に従って行えばよい。例えば、ＤＮＡプローブはプラスミドやファージベクターにクローニングされた塩基配列を増幅し、プローブとして用いたい塩基配列を制限酵素により切り出し、抽出して調製することができる。切り出す箇所は、目的とするＤＮＡに応じて調節することができる。
【００２４】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の発現ベクターにつなぎ、適当な宿主で発現させて、発現産物の酵素活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００２５】
なお、上記のように、（Ｂ）のタンパク質をコードする塩基配列を有するポリペプチドおよび上記（ｂ）のポリペプチドの場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で、配列番号１の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上のペプチド生成活性を保持していることが望ましい。
【００２６】
上記のとおり、（Ａ）のタンパク質は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を改変することにより得ることができる。以下、本発明のタンパク質の元となったタンパク質について説明する。なお、本発明のタンパク質が、元となったタンパク質によって限定されるものではない。
【００２７】
配列番号８のアミノ酸配列は、例えば配列番号７に示される塩基配列によりコードされる。配列番号７に記載の塩基番号６１〜１９０８の塩基配列からなるＤＮＡは、エンペドバクター・ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）より単離されたものである。
【００２８】
配列番号７に記載の塩基番号６１〜１９０８の塩基配列からなるＤＮＡは、コードシーケンス（ＣＤＳ）部分である。塩基番号６１〜１９０８の塩基配列には、シグナル配列領域と成熟タンパク質領域とが含まれている。シグナル配列領域は塩基番号６１〜１２６の領域であり、成熟タンパク質領域は塩基番号１２７〜１９０８の領域である。すなわち、本発明は、シグナル配列を含むペプチド酵素タンパク質遺伝子と、成熟したタンパク質としてのペプチド酵素タンパク質遺伝子の双方を提供する。配列番号７に記載の配列に含まれるシグナル配列は、リーダー配列の類であり、リーダー配列がコードするリーダーペプチドの主たる機能は、細胞膜内から細胞膜外に分泌させることにあると推定される。塩基番号１２７〜１９０８でコードされるタンパク質、すなわちリーダーペプチドを除く部位が成熟タンパク質であり、高いペプチド生成活性を示すと推定される。
【００２９】
配列番号７の塩基配列を有するＤＮＡは、エンペドバクター・ブレビスの染色体ＤＮＡ、もしくはＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ（polymerase chain reacion、White,T.J. et al ;Trends Genet., 5, 185(1989)参照）またはハイブリダイゼーションによって取得することができる。ＰＣＲに用いるプライマーは、例えばペプチド生成活性を有する精製タンパク質に基づいて決定された内部アミノ酸配列に基づいて設計することができる。また、配列番号１３および１９に記載された塩基配列に基づいてプライマーまたはハイブリダイゼーション用のプローブを設計することもでき、あるいはプローブを使って単離することもできる。ＰＣＲ用のプライマーとして、５'非翻訳領域及び３'非翻訳領域に対応する配列を有するプライマーを用いると、本タンパク質のコード領域全長を増幅することができる。配列番号１３に記載された、リーダー配列および成熟タンパク質コード領域の双方を含む領域を増幅する場合を例にとると、具体的には、５'側プライマーとしては配列番号１３において塩基番号６１よりも上流の領域の塩基配列を有するプライマーが、３'側プライマーとしては塩基番号１９０８よりも下流の領域の塩基配列に相補的な配列を有するプライマーが挙げられる。
【００３０】
プライマーの合成は、例えば、Applied Biosystems社製DNA合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）常法に従って合成できる。PCR反応は、例えばGene Amp PCR System 9600（PERKIN ELMER社製）及びTaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit（宝酒造社製）を用い、各メーカーなど供給者により指定された方法に従って行うことができる。
【００３１】
３．本発明のタンパク質の製造方法
次に本発明のタンパク質の製造方法、並びにこれに用いられる組換え体および形質転換体の作製方法について説明する。
【００３２】
上記（Ａ）のタンパク質を発現する形質転換体は、例えば配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡを、適切な宿主に導入し、発現させることによってペプチド生成活性を有するタンパク質を生成することができる。配列番号１の塩基配列を有するポＤＮＡにより特定されるタンパク質を発現させるための宿主としては、例えばエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌、エンペドバクター属細菌、スフィンゴバクテリウム属細菌、フラボバクテリウム属細菌、及びバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピヒア・スティピティス（Pichia stipitis）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。
【００３３】
配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡを宿主に導入するために用いる組換えＤＮＡは、発現させようとする宿主の種類に応じたベクターに、これらのＤＮＡを、該ＤＮＡがコードするタンパク質が発現可能な形態で挿入することで調製可能である。タンパク質を発現させるためのプロモータとしては、エンペドバクター・ブレビスのペプチド生成タンパク質をコードする遺伝子固有のプロモータが宿主細胞で機能する場合には、そのプロモータを使用することができる。また、必要に応じて宿主細胞で働く他のプロモータを、配列番号１のＤＮＡに連結し、そのプロモータ制御下で発現させるようにしてもよい。
【００３４】
組換えＤＮＡを宿主細胞に導入するための形質転換法としては、D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等が挙げられる。
【００３５】
タンパク質を組換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、該タンパク質を生産する形質転換体内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（inclusion body）を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
【００３６】
このようにして得られるタンパク質封入体は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
【００３７】
タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
【００３８】
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
【００３９】
以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いてペプチド生成酵素を製造する方法を例として、より具体的に説明する。なお、大腸菌などの微生物にペプチド生成酵素を作製させる場合、タンパク質のコード配列として、リーダー配列を含む前駆タンパク質をコードするＤＮＡを組み込こんでも、リーダー配列を含まない成熟タンパク質領域のＤＮＡのみを組み込んでもよく、作製しようとする酵素の製造条件、形態、使用条件などにより適宜選択することができる。
【００４０】
ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、T7プロモータ、lacプロモータ、trpプロモータ、trcプロモータ、tacプロモータ、ラムダファージのPRプロモータ、PLプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。また、ベクターとしては、pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等を用いることができる。他にもファージDNAのベクターも利用できる。さらに、プロモータを含み、挿入DNA配列を発現させることができる発現ベクターを使用することもできる。
【００４１】
ペプチド生成酵素を融合タンパク質封入体として生産させるためには、ペプチド生成酵素遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよく、例えば、T7gene 10、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
【００４２】
これらの遺伝子とペプチド生成酵素をコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよい。
【００４３】
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネータを連結することが好ましい場合がある。このターミネータとしては、T7ターミネータ、fdファージターミネータ、T4ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌trpA遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
【００４４】
ペプチド生成活性を有するタンパク質またはペプチド生成活性を有するタンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ColE1由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばpUC系のプラスミドやpBR322系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている（pUC系（宝酒造（株）製）、pPROK系（クローンテック製）、pKK233-2（クローンテック製）ほか）。
【００４５】
プロモータ、ペプチド生成活性を有するタンパク質またはペプチド生成活性を有するタンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、場合によってはターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。
【００４６】
得られた組換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質が発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、大腸菌Ｋ１２株亜種のエシェリヒア  コリ JM109株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はMolecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)等に記載されている。
【００４７】
融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、ペプチド生成酵素内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてペプチド生成酵素を切り出せるようにしてもよい。
【００４８】
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
【００４９】
ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。ペプチド生成酵素あるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりペプチド生成酵素あるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、ペプチド生成酵素あるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
【００５０】
タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパク質とともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
【００５１】
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
【００５２】
再生工程時のタンパク質濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したペプチド生成酵素が自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
【００５３】
４．ペプチドの製造方法
本発明のペプチドの製造方法は、上記本発明のタンパク質を用いて、ペプチドを生成させるものである。すなわち、本発明のペプチド製造方法では、下記（Ａ）および（Ｂ）に示すタンパク質のうち少なくとも一方の存在下で、アミン成分とカルボニル成分とを反応させてペプチドを生成せしめる。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における第２０番目のアミノ酸残基がアラニンであり、当該アラニン以外の領域に、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質
【００５４】
本発明のペプチドの製造方法では、上記タンパク質は、例えば、生化学的に許容される媒体中に（Ａ）および／または（Ｂ）タンパク質を含有する混合物（以下、「ペプチド生成タンパク質含有物」という）として供給されてもよい。さらに具体的には、例えば、本発明のタンパク質を発現するように形質転換された微生物の培養物、当該培養物より分離した微生物菌体および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる１種または２種以上を用い、アミン成分とカルボニル成分とからペプチドを生成せしめてもよい。
【００５５】
ペプチド生成タンパク質またはその含有物を、カルボキシ成分とアミン成分に作用せしめる方法としては、当該ペプチド生成タンパク質またはその含有物、カルボキシ成分、およびアミン成分を混合すればよい。より具体的には、本発明のペプチド生成タンパク質またはその含有物を、カルボキシ成分とアミン成分を含む溶液中に添加して反応せしめる方法を用いてもよいし、ペプチド生成タンパク質を生産する微生物を用いる場合には、ペプチド生成タンパク質を生産する微生物を培養し、微生物中または微生物の培養液中に当該酵素を精製・蓄積せしめ、培養液中にカルボキシ成分とアミン成分を添加する方法などを用いてもよい。生成されたペプチドは、定法により回収し、必要に応じて精製することができる。
【００５６】
微生物の菌体（すなわち、微生物の細胞）を得るには、微生物の種類に応じて適当な培地で培養増殖せしめるとよい。このための培地はその微生物が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
【００５７】
例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭水化物類あるいはこれらの混合物などを使用することができる。
【００５８】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機塩のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができる。
【００５９】
他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。
【００６０】
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてｐＨ５〜８、温度約１５〜４０℃の範囲でｐＨおよび温度を適当に制限しつつ１２〜４８時間程度培養を行えばよい。
【００６１】
「ペプチド生成タンパク質含有物」とは、本発明のペプチド生成タンパク質を含有するものであればよく、具体的形態としては、ペプチド生成タンパク質を生産する微生物の培養物、当該培養物から分離された微生物菌体、菌体処理物などが含まれる。微生物の培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的には、微生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生成された物質の混合物などのことをいう。また、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体として用いてもよい。また、菌体処理物には、菌体を破砕、溶菌、凍結乾燥したものなどが含まれ、さらに菌体などを処理して回収される粗精製タンパク質、さらに精製した精製タンパク質なども含まれる。精製処理されたタンパク質としては、各種精製法によって得られる部分精製タンパク質等を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化タンパク質を使用してもよい。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清もペプチド生成タンパク質含有物として利用できる。
【００６２】
また、本発明のペプチド生成タンパク質を含む微生物としては、ペプチド生成タンパク質を発現した遺伝子組換え株を用いてもよいし、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体等の菌体処理物を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化菌体、固定化菌体処理物を使用してもよい。
【００６３】
なお、培養物、培養菌体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物を用いる場合には、ペプチドの生成に関与せずに生成ペプチドを分解する酵素が存在することが多く、この場合には、エチレンジアミン四酢酸 （ＥＤＴＡ）のような金属プロテアーゼ阻害剤を添加するほうが好ましい場合がある。添加量は、０．１ｍＭから３００ｍＭ の範囲で、好ましくは１ｍＭから１００ｍＭである。
【００６４】
本発明のペプチド製造方法の好ましい形態としては、上記、形質転換された微生物を培地中で培養し、培地中および／または微生物中に、ペプチド生成酵素を蓄積させる方法が挙げられる。形質転換体を用いることにより、ペプチド生成酵素を簡便に大量生成できるため、ジペプチドの生成も大量に速く行うことができる。
【００６５】
ペプチド生成タンパク質またはその含有物の使用量は、目的とする効果を発揮する量（有効量）であればよく、この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば酵素を用いる場合には、０．０１から１００ユニット（Ｕ）程度、洗浄菌体を用いる場合は０．１〜５００ｇ／Ｌ程度である。
【００６６】
カルボキシ成分としては、もう一つの基質であるアミン成分と縮合してペプチドを生成できるものであれば、いかなるものを使用してよい。カルボキシ成分としては、例えば、Ｌ−アミノ酸エステル、Ｄ−アミノ酸エステル、Ｌ−アミノ酸アミド、Ｄ−アミノ酸アミド、更にはアミノ基の有さない有機酸エステル等が挙げられる。また、アミノ酸エステルとしては、天然型のアミノ酸に対応するアミノ酸エステルだけでなく、非天然型のアミノ酸もしくはその誘導体に対応するアミノ酸エステルなども例示される。また、アミノ酸エステルとしては、α−アミノ酸エステルの他、アミノ基の結合位置の異なる、β−、γ−、ω−等のアミノ酸のエステルなども例示される。アミノ酸エステルの代表例としては、アミノ酸のメチルエステル、エチルエステル、n-プロピルエステル、iso-プロピルエステル、n-ブチルエステル、iso-ブチルエステル、tert-ブチルエステル等が例示される。
【００６７】
アミン成分としては、もう一つの基質であるカルボキシ成分と縮合してペプチドを生成できるものであれば、いかなるものも使用してよい。アミン成分としては、例えば、Ｌ−アミノ酸、Ｃ保護Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｃ保護Ｄ−アミノ酸、アミン等が挙げられる。また、アミンとしは、天然型アミンだけでなく、非天然型のアミンもしくはその誘導体などが例示される。また、アミノ酸としては、天然型アミノ酸だけではなく非天然型アミノ酸もしくはその誘導体も例示される。α−アミノ酸の他、アミノ基の結合位置の異なる、β−、γ−、ω−等のアミノ酸なども例示される。
【００６８】
出発原料であるカルボキシ成分およびアミン成分の濃度は各々１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍであるが、カルボキシ成分に対してアミン成分を等量以上添加したほうが好ましい場合がある。また、基質が高濃度だと反応を阻害するような場合には、反応中にこれらを阻害しない濃度にして逐次添加することができる。
【００６９】
反応温度は０〜６０℃でペプチド合成可能であり、好ましくは５〜４０℃である。また反応ｐＨはｐＨ６．５〜１０．５でペプチド合成可能であり、好ましくはｐＨ７．０〜１０．０である。
【実施例】
【００７０】
以下、本発明について実施例を示しより詳細に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。
【００７１】
［調製例１］エンペドバクター・ブレビス由来のペプチド生成酵素遺伝子の単離
以下、ペプチド生成酵素遺伝子の単離について述べるが、微生物はエンペドバクター・ブレビス FERM BP-8113株を用いた。遺伝子の単離にはエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）JM-109株を宿主に用い、ベクターはpUC118を用いた。
【００７２】
（１）決定内部アミノ酸配列に基づいたＰＣＲプライマーの作製
前述のエンペドバクター・ブレビス FERM BP-8113株由来のペプチド生成酵素のリジルエンドペプチダーゼによる消化物をエドマン分解法により決定したアミノ酸配列（配列番号３及び４）をもとに、配列番号５及び６にそれぞれ示す塩基配列を有するミックスプライマーを作成した。
【００７３】
（２）菌体の取得
エンペドバクター・ブレビス FERM BP-8113株をＣＭ２Ｇ寒天培地（50g/l グルコース、10g/l 酵母エキス、10g/l ペプトン、5g/l 塩化ナトリウム、20g/l寒天，ｐＨ7.0））上で３０℃、２４時間培養した。この菌体を、５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地（上記培地より寒天を除いた培地）を張り込んだ５００ｍｌの坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃で振盪培養した。
【００７４】
（３）菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離（12,000rpm、４℃、１５分間）し、集菌した。QIAGEN Genomic-tip System（Qiagen社）を用いて、説明書の方法に基づき、この菌体から染色体ＤＮＡを取得した。
【００７５】
（４）ＰＣＲ法によるペプチド生成酵素遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片の取得
エンペドバクター・ブレビス FERM BP-8113株由来のペプチド生成酵素遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を、LA-Taq（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により取得した。エンペドバクター・ブレビス FERM BP-8113株から取得した染色体ＤＮＡに対し、配列番号１１及び１２に示す塩基配列を有するプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。
【００７６】
ＰＣＲ反応は、Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL（宝酒造製）を用いて行い、以下の条件の反応を３０サイクル行った。
【００７７】
９４℃      ３０秒
５２℃      １分
７２℃      １分
【００７８】
反応後、反応液３μｌを０．８％アガロース電気泳動に供した。その結果、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されていることが確認された。
【００７９】
（５）遺伝子ライブラリーからのペプチド生成酵素遺伝子のクローニング
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、まず、上記ＰＣＲにおいて増幅されたＤＮＡ断片をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーションの操作は、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)に説明されている。
【００８０】
上記ＰＣＲで増幅された約１．５ｋｂＤＮＡ断片を、０．８％アガロース電気泳動により分離した。目的のバンドを切り出し、精製した。このＤＮＡ断片をDIG High Prime（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づきプローブのジゴキシニゲンによる標識を行った。
【００８１】
本調製例１（３）で取得したエンペドバクター・ブレビスの染色体ＤＮＡを制限酵素HindIIIで３７℃、１６時間反応させて完全に消化した後、０．８％アガロースゲルで電気泳動した。電気泳動後のアガロースゲルからナイロンメンブレンフィルターNylon memebranes positively charged（ロシュ・ダイアグノティクス社製）にブロッティングし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはEASY HYB（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを５０℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記で作製した、ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで室温、２０分間洗浄した。さらに０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで６５℃、１５分間洗浄を２回行った。
【００８２】
プローブとハイブリダイズするバンドの検出は、DIG Nucleotide Detection Kit（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、プローブとハイブリダイズする約４ｋｂのバンドが検出できた。
【００８３】
本調製例１（３）で調製した染色体ＤＮＡ５μｇをHindIIIで完全に消化した。０．８％アガロースゲル電気泳動により約４ｋｂのＤＮＡを分離し、Gene Clean II Kit（フナコシ社製）を用いてＤＮＡを精製し、１０μｌのＴＥに溶解した。このうち４μｌと、pUC118  HindIII/BAP（宝酒造製、BAP:大腸菌アルカリフォスファターゼ）とを混合し、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造製）を用いて連結反応を行った。このライゲーション反応液５μｌとEscherichia coli JM109株のコンピテント・セル（東洋紡績製）１００μｌとを混合して、Escherichia coliを形質転換した。これを適当な固形培地に塗布し、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
【００８４】
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、上記プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによる染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。コロニーハイブリダイゼーションの操作は、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)に説明されている。
【００８５】
染色体ＤＮＡライブラリーのコロニーをナイロンメンブレンフィルターNylon Membranes for Colony and Plaque Hybridization（ロシュ・ダイアグノティクス社製）に移し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはEASY HYB（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを３７℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで室温、２０分間洗浄した。さらに０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで６５℃、１５分間洗浄を２回行った。
【００８６】
標識プローブとハイブリダイズするコロニーの検出は、DIG Nucleotide Detection Kit（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、標識プローブとハイブリダイズするコロニーを２株確認できた。
【００８７】
（６）エンペドバクター・ブレビス由来ペプチド生成酵素遺伝子の塩基配列
標識プローブとハイブリダイズしたことが確認された上記２菌株から、エシェリヒア・コリ  JM109株が保有するプラスミドを、Wizard Plus Minipreps DNA Purification System（プロメガ社製）を用いて調製し、プローブとハイブリダイズした近傍の塩基配列を決定した。シーケンス反応はCEQ DTCS-Quick Start Kit（ベックマン・コールター社製）を用いて、説明書に基づき行った。また、電気泳動はCEQ 2000-XL（ベックマン・コールター社製）を用いて行った。
【００８８】
その結果、ペプチド生成酵素の内部アミノ酸配列（配列番号３及び４）を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが存在し、ペプチド生成酵素をコードする遺伝子であることを確認した。ペプチド生成酵素遺伝子全長の塩基配列とこれに対応するアミノ酸配列を配列表配列番号７に示した。得られたオープンリーディングフレームをＢＬＡＳＴＰ．プログラムで相同性解析した結果、二つの酵素に相同性が見出され、Acetobacter pasteurianusのα−アミノ酸エステルハイドロラーゼ（Appl. Environ. Microbiol., 68(1), 211-218(2002) とは、アミノ酸配列で３４％、Brevibacillus laterosporum (J. Bacteriol., 173(24), 7848-7855(1991) のグルタリル-７ＡＣＡアシラーゼとは、アミノ酸配列で２６％の相同性を示した。
【００８９】
（７）エンペドバクター属由来のペプチド生成酵素遺伝子の大腸菌における発現
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）W３１１０染色体ＤＮＡ上のtrpオペロンのプロモータ領域を配列番号９、１０に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子領域を増幅し、得られたＤＮＡ断片をpGEM-Teasyベクター（プロメガ製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coli JM109株を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からｔｒｐプロモータの方向がｌａｃプロモータと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをEcoO109I及びEcoRIにて処理して得られるｔｒｐプロモータを含むＤＮＡ断片と、pUC19（Takara製）のEcoO109I及びEcoRI処理物とライゲーションした。
【００９０】
このライゲーション溶液でエシェリヒア・コリ  JM109株を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをHindIII及びPvuIIにて処理して得られるＤＮＡ断片と、pKK223-3（Amersham Pharmacia製）をHindIII及びHincIIにて処理し、得られたｒｒｎＢターミネーターを含むＤＮＡ断片とをライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coli JM109株を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐＴと命名した。
【００９１】
エンペドバクター・ブレビス FERM BP-8113株の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号１１、１２に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。このＤＮＡ断片をNdeI及びPstIにて処理し、得られたＤＮＡ断片とpTrpTのNdeI及びPstI処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア・コリ  JM109株を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをpTrpT_Gtg2と命名した。
【００９２】
pTrpT_Gtg2を有するエシェリヒア・コリ  JM109株を１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含むＬＢ培地で、３０℃、２４時間シード培養した。得られた培養液１ｍｌを、５０ｍｌの培地（2 g/l Ｄ−グルコース、10g/l 酵母エキス、10g/l カザミノ酸、5g/l 硫酸アンモニウム、3g/l リン酸二水素カリウム、1g/l リン酸水素二カリウム、0.5g/l 硫酸マグネシウム七水和物、100mg/l アンピシリン）を張り込んだ５００ｍｌ坂口フラスコにシードし、２５℃、２４時間の本培養を行った。培養液１ｍｌあたり０．１１Ｕのα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル生成活性を有しており、クローニングした遺伝子がＥ．ｃｏｌｉで発現したことを確認した。なお、対照としてｐＴｒｐＴのみを導入した形質転換体には、活性は検出されなかった。
【００９３】
（８）エンペドバクター属由来のペプチド生成酵素高発現プラスミドの構築
Journal of Bioscience and Bioengineering (2001) Vol.92, No.1, 50-54記載の通り（もしくは特開平１０−２０１４８１号公報、実施例２４など）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）IFO 12010菌株の染色体ＤＮＡより、酸性フォスファターゼ遺伝子領域を含む、制限酵素SalIと制限酵素KpnIで切り出される1.6kbpのDNA断片を単離し、pUC118に連結したプラスミドＤＮＡを構築し、pEAP120と命名した。pEAP120は、酸性フォスファターゼのプロモータ及びシグナルペプチドをコードする塩基配列が組み込まれたプラスミドである。
【００９４】
なお、ＩＦＯ番号が記載されているものは、財団法人発酵研究所（日本国大阪市淀川区十三本町２丁目１７−８５）に寄託されたものであるが、平成１４年６月３０日以降、その業務は独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）・バイオテクノロジー本部（ＤＯＢ）・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）に移管され、ＮＢＲＣより上記ＩＦＯ番号を参照して分譲を受けることができる。
【００９５】
続いて、本遺伝子の上流に存在するプロモータ配列を一部改変し、活性向上を試みた。Quikchange site Directed Mutagenesis Kit （STRATAGENE社製）を用いて部位特異的変異を導入し、酸性フォスファターゼ遺伝子推定プロモータ配列の−１０領域をAAAAATからTATAATへ置換した。変異導入用にデザインしたＰＣＲ用オリゴヌクレオチプライマーEM1(5'-CTT ACA GAT GAC TAT AAT GTG ACT AAA AAC；配列番号２５)およびEMR1(5'-GTT TTT AGT CAC ATT ATA GTC ATC TGT AAG；配列番号２６)を合成した。説明書の方法に従って、pEAP120を鋳型に変異導入を行った。DNA Sequencing kit Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction(PERKIN ELMER社製)を用いたDye Terminator法により、310 Genetic analyzer(ABI)にて塩基配列を決定し、目的の変異が導入されていることを確認し、本プラスミドをpEAP130と命名した。pEAP130は、酸性フォスファターゼのＮ末端領域に由来するシグナルペプチドをコードする塩基配列、および、改変されたプロモータを有するプラスミドである。
【００９６】
鋳型として上記調製例１のpTrpT_Gtg2プラスミド、プライマーとしてＣＡＰ１（5'- CGT TAA CGC TTT CGC GCA AGA TGC AAA AGC AGA TTC；配列番号１３）及びＣＡＰ２（5'- CGC CTG CAG CAT ACT TGT ACG GTT TCG CCC；配列番号１４）オリゴヌクレオチド各０．４ｍＭ並びにKOD plus用緩衝液（TOYOBO社製）、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各０．２ｍＭ、硫酸マグネシウム１ｍＭ、及びKOD plusポリメラーゼ（TOYOBO社製）１ユニットを含む５０μlの反応液で、９４℃、３０秒の熱処理の後、９４℃を１５秒、５５℃を３０秒、６８℃を２分３０秒のサイクルを２５回繰り返すＰＣＲを行い、成熟型ペプチド生成酵素遺伝子部分を増幅した。
【００９７】
また、鋳型として実施例１のpEAP130プラスミド、プライマーとしてＣＡＰ３（5'- CGC TCT AGA ATT TTT TCA ATG TGA TTT；配列番号１５）及びＣＡＰ４（5'- GCT TTT GCA TCT TGC GCG AAA GCG TTA ACG GAA AAC；配列番号１６）オリゴヌクレオチドを用い同条件にてＰＣＲを行い、酸性フォスファターゼのプロモータ及びシグナル配列部分を増幅した。反応液をアガロース電気泳動に供し、増幅された各ＤＮＡ断片をMicrospin column（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて回収した。
【００９８】
次いで、該増幅断片混合物を鋳型とし、プライマーとしてＣＡＰ２及びＣＡＰ３オリゴヌクレオチドを用い、同様の組成の反応液で９４℃を１５秒、５５℃を３０秒、６８℃を２分３０秒のサイクルを２５回繰り返すＰＣＲを行い、キメラ型酵素遺伝子を構築した。増幅された各ＤＮＡ断片をMicrospin column（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて回収し、これをXba IとPst I で消化した。これをpUC19プラスミドのXba I−Pst Iサイトに連結した。DNA Sequencing kit Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PERKIN ELMER)を用いたDye Terminator法により、310 Genetic analyzer(ABI)にて塩基配列を決定し、目的の変異が導入されていることを確認し、本プラスミドをpAF110プラスミドと命名した。
【００９９】
［実施例１］  エンペドバクター属由来のペプチド生成酵素遺伝子の改変
上記調製例１に従って、エンペドバクター属由来の成熟型ペプチド生成酵素遺伝子をエンテロバクター・アエロゲネス由来酸性フォスファターゼの改変プロモータおよびシグナル配列の下流に連結した発現プラスミドpAF110を構築した。変異導入のため、ｐAF110プラスミドでエシェリヒア・コリ XL-1Red コンピテントセル(Strategene製)を形質転換し、アンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地（１０ｇ／lトリプトン、５ｇ／ｌ酵母エキス、１０ｇ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｇ／ｌ寒天ｐH７．０）にプレーティングし30℃で18h培養した。生育したエシェリヒア・コリ XL-1Red形質転換体をアンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＬＢ培地（10g/l トリプトン、5g/l 酵母エキス、10g/l 塩化ナトリウム、ｐＨ 7.0）50mlを入れた500ml坂口フラスコに接種し、30℃で16h振とう培養した。収菌した菌体から、High Plasmid Midi Kit (Qiagen製)を用いてプラスミドを調整し、ランダム変異が導入されたプラスミドを得た。本プラスミドを用いてエシェリヒア・コリ JM109 コンピテントセル(宝酒造製)を形質転換し、アンピシリン１００ｍｇ／ｌを含む発現寒天培地（10 g/lカゼミノ酸、10 g/l 酵母エキス、5g/l (NH4)2SO4、3 g/l KH2PO4、1 g/l K2HPO4、2 g/lグルコース, 0.5 g/l MgSO4 7H2O、1.5g/l寒天）にプレーティングし、30℃で18h培養した。
【０１００】
上記寒天培地に10 mM アラニン−ｐ−ニトロアニリド、 10 mM O-フェナンソロリンおよび100 mM リン酸緩衝液 (pH 7.0)を含む0.8 ％寒天溶液を重層し、室温で静置して反応させた。ペプチド生成酵素活性の高い形質転換体はアラニン−ｐ−ニトロアニリドを分解してｐ−ニトロアニリンを遊離するため、黄色を呈するので、これを指標として、これを指標としてペプチド生成酵素活性が高くなった株をスクリーニングした。約20万株の形質転換体からスクリーニングを行い、活性の向上した株45株を選抜した。
【０１０１】
次いで、これらの候補株をアンピシリン100ｍｇ／ｌを含む発現培地3mlを入れた試験管に接種して、30℃、18h培養し、アラニルグルタミン生成活性を測定した。アラニルグルタミン生成活性は以下の条件で測定した。100μmol/ml アラニン−ｏ−メチルエステル(国産化学製)、200μmol/ml グルタミン、100μmol/ml mM ホウ酸-水酸化ナトリウム緩衝液（pH9.0）および菌体を含む反応液（1ml）でpH9.0、30℃で10分反応を行った。1.7% (w/v) リン酸で１０ｍｌを添加して反応を停止した後、遠心分離により沈澱を除き、、本反応で生じたアラニルグルタミンを定量した。この標準反応条件にて1分間に1μmolのアラニルグルタミンを生成する酵素量を１unitと定めた。
【０１０２】
なお、アラニルグルタミンは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、下記の条件にて分析した。
カラム：Inertsil ODS-2（ジーエルサイエンス社製、4.6×250mm）、移動層：5mM 1-オクタンスルホン酸ナトリウム / メタノール= 1000/165 (リン酸でpH2.1 に調整)、流速：1.0ml/min、温度：40℃ 、検出：ＵＶ210nm。
【０１０３】
その結果、最も高い活性を示したNo.15株を選抜した。エシェリヒア・コリJM109/ｐAF110株は30℃培養で培養すると0.85U/mlの活性しか得られなかったが、PAF110-M15株は2.52 U/mlと約３倍の高活性を示した。
【０１０４】
続いてNo.15株よりプラスミドを調整し、変異型ペプチド生成酵素の塩基配列を決定した。以下本プラスミドをpAF110-M15と命名した。塩基配列を決定の決定はDNA Sequencing kit Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction(PERKIN ELMER)を用いたDye Terminator法により、310 Genetic analyzer(ABI)にて行った。pAF110-M15中のペプチド生成酵素遺伝子には３アミノ酸残基の置換を伴う４塩基の置換が認められた。アミノ酸置換は成熟体ペプチド生成酵素で２０番目のＶａｌ残基（GTA）がアラニン残基（GCA）へ、２６４番目のアスパラギン残基（AAC）がセリン残基（AGC）へ、４１６番目のセリン残基（TCA）がグルタミン残基（CCA）への置換であった。
【０１０５】
［実施例２］  エンペドバクター属由来のペプチド生成酵素遺伝子のアミノ酸置換効果および変異型酵素の性質検討
（１）Maltose binding protein融合型ペプチド生成酵素遺伝子および単独変異型遺伝子の構築
次に、このアミノ酸置換効果と酵素活性の変化を明らかにするため、pMALTM Protein Fusion and Purification System（NewEngland Biolab社製）を使用し、ペプチド生成酵素をMaltose binding protein（MBP）との融合タンパクとして発現させるためのベクターを構築した。鋳型として実施例１のpAF110プラスミドまたは変異が導入されたpAF110-M15プラスミド、プライマーとしてAETN（5'-CGC GAA TTC CAA GAT GCA AAA GCA GAT TCT GCT；配列番号１７）及びAETC（5'-CGC CTG CAG CAT ACT TGT ACG GTT TCG CCC；配列番号１８）オリゴヌクレオチド各０．４ｍＭ並びにKOD plus用緩衝液（TOYOBO社製）、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各０．２ｍＭ、硫酸マグネシウム１ｍＭ、及びKOD plusポリメラーゼ（TOYOBO社製）１ユニットを含む５０μlの反応液で、９４℃、３０秒の熱処理の後、９４℃を１５秒、５５℃を３０秒、６８℃を２分のサイクルを２５回繰り返すＰＣＲを行い、成熟型ペプチド生成酵素遺伝子部分を増幅した。増幅された各ＤＮＡ断片をMicrospin column（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて回収し、これをEco RIとPst I で消化した。これをpMAL-p2xプラスミド（NewEngland Biolab社製）のEco RI-Pst Iサイトに連結した。野生型ペプチド生成酵素遺伝子を連結したプラスミドをｐMF200、三アミノ酸残基が置換されたペプチド生成酵素遺伝子を連結したプラスミドをｐM15と命名した。
【０１０６】
次に、ｐMF200 にQuikchange site Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社製）を用いて部位特異的変異を導入し、実施例１で得られた変異体の３アミノ酸残基（V20A、N264SおよびS416Q）の変異のうち、それぞれひとつのアミノ酸残基が置換された単独変異型遺伝子を構築した。V20A変異導入用にEMP1 （5'-tac gaa aaa atg gaa caa gca att ccg atg cgc gat g；配列番号１９）およびEMP2 （5'-cat cgc gca tcg gaa ttg ctt gtt cca ttt ttt cgt a；配列番号２０）、N264S変異導入用にemp3（5'-gtt tta cca cat tta act agc gtg caa cct gct gta atg；配列番号２１）およびEMP4（5'-cat tac agc agg ttg cac gct agt taa atg tgg taa aac；配列番号２２）、S416Q変異導入用にEMP5（5'-caa att ctc cag ttc ctt atc aag gag gag ttt tag aaa ctc；配列番号２３）およびEMP6（5'-gag ttt cta aaa ctc ctc ctt gat aag gaa ctg gag aat ttg；配列番号２４）のプライマーをそれぞれ合成し、説明書の方法に従って、pEAP120を鋳型に変異導入を行った。DNA Sequencing kit Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction(PERKIN ELMER)を用いたDye Terminator法により、310 Genetic analyzer(ABI)にて塩基配列を決定し、目的の変異が導入されていることを確認した。V20A変異、N264S変異およびS416Q変異が導入されたプラスミドをそれぞれpM1、pM2およびpM3と命名した。
【０１０７】
（２）各変異型酵素遺伝子導入株の活性測定
各プラスミドで形質転換したエシェリヒア・コリ JM109株をアンピシリン１００ｍｇ／ｌおよびIPTG 0.1mMを含む発現培地50mlを入れた500ml坂口フラスコに接種し、22℃で20時間培養した。実施例１の方法で各菌株のアラニルグルタミン生成活性を測定した結果を表１.に示した。
【０１０８】
V20A/N264S/S416Q変異型遺伝子導入株は、MBP融合タンパクでも野生型遺伝子導入株に比べODあたりの活性が約２倍上昇していた。各単独変異型酵素遺伝子導入株の活性を野生型遺伝子導入株と比較すると、V20A変異型酵素遺伝子導入株はODあたりの活性で約1.5倍の活性向上が認められた。一方、N264SまたはS416Q変異型酵素遺伝子導入株の活性は野生型と同程度であった。これより、3残基置換のうち、V20Aの置換がペプチド生成酵素遺伝子活性の向上に寄与していると考えられた。
【０１０９】
【表１】
2005269905.tif 000002
【０１１０】
（３）変異型酵素の精製と性質検討
次に野生型酵素、V20A/N264S/S416Q変異型酵素およびV20A変異型酵素を精製し、性質検討を行った。エシェリヒア・コリJM109/pMF200、エシェリヒア・コリJM109/pM15およびエシェリヒア・コリJM109/pM1株をアンピシリン１００ｍｇ／ｌおよびIPTG 0.1mMを含む発現培地50mlを入れた500ml坂口フラスコに接種し、22℃で20時間培養した。各菌体の培養液（50 ml×6本）から8,000 rpm、１５ min遠心分離により集菌した菌体を30 mlの20 mM トリス−塩酸緩衝液(pH 7.4に懸濁し、20 minの超音波処理で破砕した。破砕液を遠心分離（8,000 rpm、30 min）して残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。
【０１１１】
得られた無細胞抽出液を、200 mM 塩化ナトリウムおよび 1 mM EDTAを含む20 mM トリス−塩酸緩衝液(pH 7.4),にて平衡化したアミロースレジンカラム（φ1×5 cm、5 ml）にアプライした。平衡化Buffer 60 mlにて洗浄した後、を含むMaltose 10 mM、20 mM 200 mM塩化ナトリウムおよび 1 mM EDTAを含むトリス−塩酸緩衝液(pH 7.4), 10 mlにて活性画分を溶出した。これに、FactorXa（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）をMBP-Aet融合タンパク100 mgに対して1 mgとなるよう添加し(1 ％(w/w))、15℃にて16 hインキュベートした。
【０１１２】
インキュベートして得られた活性画分を20 mM リン酸カリウム緩衝液(pH 7.2)にて平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（φ1×1 cm、1 ml）にアプライした。平衡化Buffer 10 mlにて洗浄した後、500 mM リン酸カリウム緩衝液(pH 7.2) 5 mlにて活性画分を溶出した。MBPを除去するため、活性画分をトリス−塩酸緩衝液(pH 7.4), 200 mM NaCl, 1 mM EDTAにて平衡化したアミロースレジンカラム（φ1×5 cm、5 ml）に再度アプライした。平衡化Buffer 5 mlにて溶出し、得られた素通り画分を活性画分として回収した。得られた活性画分をcentriprep10（アミコン社製）を用いて濃縮し、グリセロールを50 %(v/v)濃度となるように添加し、-20℃で保存した。
【０１１３】
この標品を用い、実施例１の方法で野生型酵素、V20A/N264S/S416Q変異型酵素およびV20A変異型酵素のアラニルグルタミン生成活性を測定した。タンパク質濃度の定量は、BSAを標準タンパク質として、プロテインアッセイキット（Bio-Rad社製）を用いBradford法に従って定量した。その結果野生型酵素、V20A/N264S/S416Q変異型酵素およびV20A変異型酵素の比活性は1,727 units/ml、1,535 units/mlおよび1,528 units/ml、と算出された。2種の変異型酵素の比活性は野生型酵素から向上していなかったことから、変異型酵素遺伝子導入株の活性向上は比活性の変化によるものではなく、発現しやすくなったことが原因であると推察された。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明は、ペプチドの製造法などに関する分野で有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１５】
配列番号１；エンペドバクター・ブレビスに由来するペプチド生成タンパク質をコードする塩基配列
配列番号２；エンペドバクター・ブレビスに由来するペプチド生成タンパク質のアミノ酸配列
配列番号３；エンペドバクター由来のペプチド生成タンパク質をエドマン分解して決定したアミノ酸配列
配列番号４；エンペドバクター由来のペプチド生成タンパク質をエドマン分解して決定したアミノ酸配列
配列番号５； Mix Primer
配列番号６； Mix Primer
配列番号７；エンペドバクター・ブレビス由来のペプチド生成タンパク質の塩基配列
配列番号８；エンペドバクター・ブレビス由来のペプチド生成タンパク質のアミノ酸配列
配列番号９；pTrpT調製用プライマー
配列番号１０；pTrpT調製用プライマー
配列番号１１；pTrpT_Gtg2調製用プライマー
配列番号１２；pTrpT_Gtg2調製用プライマー
配列番号１３；primer CAP1
配列番号１４；primer CAP2
配列番号１５；primer CAP3
配列番号１６；primer CAP4
配列番号１７；primer AETN
配列番号１８；primer AETC
配列番号１９；primer EMP1
配列番号２０；primer EMP2
配列番号２１；primer EMP3
配列番号２２；primer EMP4
配列番号２３；primer EMP5
配列番号２４；primer EMP6
配列番号２５；primer EM1
配列番号２６；primer EMR1
【配列表】
2005269905000001.app