(57)【要約】  【課題】  使用可能なメディエータの種類や酸化還元酵素の種類の選択幅を拡大できる分析方法を提供する。  【解決手段】  メディエータをシクロデキストリンで包接した包接メディエータを調製し、酸化還元酵素により、分析対象物から、前記包接メディエータを介して、還元により発色する基質に電子を伝達し、その結果生じる前記基質の発色を測定することにより、前記分析対象物の定性若しくは定量を行う分析方法を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象物に対して酸化還元酵素によって酸化還元反応を行い、酸化還元反応検出手段によって前記酸化還元反応を検出することにより、前記分析対象物の定性若しくは定量を行う分析方法であって、
前記酸化還元反応が、電子授受を行うメディエータの存在下で行われ、かつ、前記メディエータが、シクロデキストリンで包接されていることを特徴とする分析方法。
【請求項２】
前記シクロデキストリンが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンおよびγ-シクロデキストリンからなる群から選択された少なくとも一つである請求項１記載の分析方法。
【請求項３】
前記メディエータが、１モルあたり、１〜４０モルのシクロデキストリンによって包接されている請求項１または２記載の分析方法。
【請求項４】
前記メディエータが、α−ナフトキノン、ＴＴＦ（テトラチアフルバレン：Tetrathiafulvalene）、メチルフェロセン、フェロセンおよびフェロセンジカルボン酸からなる群から選択された少なくとも一つである請求項１〜３のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項５】
分析対象物が、クレアチニン、クレアチン、尿酸、ビリルビン、血液尿素窒素（ＢＵＮ）、グルタミック−オキサロアセティックトランスアミナーゼ（ＧＯＴ）およびグルタミック−ピルビックトランスアミナーゼ（ＧＰＴ）からなる群から選択された少なくとも一つである請求項１〜４のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項６】
酸化還元酵素が、サルコシンオキシダーゼ、ウリカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよびグリセロールオキシダーゼからなる群から選択された少なくとも一つである請求項１〜５のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項７】
前記分析対象物がクレアチニンであり、前記酸化還元酵素がサルコシンオキシダーゼであり、メディエータがα-ナフトキノンおよびＴＴＦの少なくとも一方である請求項１〜６のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項８】
前記酸化還元反応検出手段が、前記酸化還元反応により発色する基質を用いた比色法であって、前記比色法が、前記酸化還元反応により、前記分析対象物からメディエータを介して還元により発色する基質に電子を伝達し、その結果生じる前記基質の発色を測定する方法である請求項１〜７のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項９】
前記酸化還元反応により発色する基質が、テトラゾリウム塩である請求項８記載の分析方法。
【請求項１０】
前記テトラゾリウム塩が、ニトロフェニル基、チアゾリル基およびベンゾチアゾリル基の少なくとも一つの基を有する請求項９記載の分析方法。
【請求項１１】
前記テトラゾリウム塩が、ＭＴＴ、ＩＮＴ、Neo-ＴＢ、Nitro-ＴＢ）、ＴＢ、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３、ＷＳＴ−４、ＷＳＴ−５、ＷＳＴ−８、2-(2-Benzothiazolyl)-3,5-diphenyltetrazolium Bromide、2-(2-Benzothiazolyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium Bromide、2,3-Bis(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium Chloride、2,3-Di(4-nitrophenyl)tetrazolium Perchlorate、3-(3-Nitrophenyl)-5-methyl-2-phenyltetrazolium Chloride、および、3-(4-Nitrophenyl)-5-methyl-2-phenyltetrazolium Chlorideからなる群から選択された少なくとも一つの発色剤である請求項９記載の分析方法。
【請求項１２】
前記酸化還元反応検出手段が、前記酸化還元反応による電子の授受に伴う電流の変化を検出する電気化学的検出方法である請求項１〜７のいずれか一項に記載の記載の分析方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の分析方法に使用する試薬であって、シクロデキストリンで包接されたメディエータを含むことを特徴とする試薬。
【請求項１４】
前記シクロデキストリンが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンおよびγ-シクロデキストリンからなる群から選択された少なくとも一つである請求項１３記載の試薬。
【請求項１５】
前記メディエータが、１モルあたり、１〜４０モルのシクロデキストリンによって包接されている請求項１３または１４記載の試薬。
【請求項１６】
前記メディエータが、α−ナフトキノン、ＴＴＦ（テトラチアフルバレン：Tetrathiafulvalene）、メチルフェロセン、フェロセンおよびフェロセンジカルボン酸からなる群から選択された少なくとも一つである請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１７】
さらに、酸化還元酵素を含む請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１８】
さらに、還元により発色する基質を含む請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の分析方法に使用する分析用試験片であって、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の試薬を含む分析用試験片。
【請求項２０】
多孔質材に前記試薬を保持させた請求項１９記載の分析用試験片。
【請求項２１】
基材上に前記試薬を含む試薬層が形成された請求項２０記載の分析用試験片。
【請求項２２】
さらに酸化還元電位を検知するための電極を備える請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の分析用試験片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化還元反応を用いた分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査や生化学検査等の分野において、グルコース、コレステロール等の成分分析が行われており、その一手法として、比色分析やバイオセンサ等による電気化学的分析がある。例えば、グルコースの比色分析では、まず第１の酵素であるグルコースオキシダーゼをグルコース（基質）に作用させて、グルコノラクトンおよび過酸化水素を発生させ、前記過酸化水素を、第２の酵素であるペルオキシダーゼの存在下、トリンダー試薬等の発色剤により検出するのが一般的である。このように、過酸化水素を介して間接的に基質濃度を測定するという手法は、グルコースに限らず、コレステロール等の他の成分分析にも適用されている。
【０００３】
さらに近年では、前述のように二段階の酵素反応を行うことなく、メディエータの存在下、一段階の酵素反応により比色分析を行う方法が実現されている。具体的には、分析対象物を酸化還元酵素により酸化することによって、放出される電子が前記メディエータを介して発色基質に伝達され、前記第２の酵素が非存在の条件下で、前記発色基質が発色するのである。このように酵素反応が１段階であるため、反応系が簡単で安定性にも優れ、酵素反応から発色反応までの時間も極めて短縮できる（例えば、特許文献１、非特許文献１等）。
【特許文献１】特許第２８２５７５４号明細書
【非特許文献１】ナカムラ  セツコら（Setsuko Nakamura et al.）、クリニカ ケミカ アクタ(Clinica Chimica Acta)、１９８０年、第１０１、第３２７〜３２６頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そして、現在では、このような比色分析方法に使用できる様々なメディエータが求められていることから、本発明者らは、例えば、バイオセンサ等を用いた電気化学的分析方法に使用されるメディエータに着目した。しかしながら、比色分析方法においては、一般に吸光度測定を行うため、使用するメディエータは水溶性であることが望まれているのに対し、前記電気化学的分析方法に使用されるメディエータは難溶解性のものが多く、適用できないという問題があった。さらに、従来使用されているメディエータには、酸化還元酵素の種類によってはメディエータとしての機能を果たさず、酸化還元反応が起らないという問題を生じるものもあった。
【０００５】
そこで、本発明の目的は、使用できるメディエータの種類や酸化還元酵素の種類の選択幅を拡大できる分析方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の分析方法は、分析対象物に対して酸化還元酵素によって酸化還元反応を行い、酸化還元反応検出手段によって前記酸化還元反応を検出することにより、前記分析対象物の定性若しくは定量を行う分析方法であって、
前記酸化還元反応が、電子授受を行うメディエータの存在下で行われ、かつ、前記メディエータが、シクロデキストリンで包接されていることを特徴とする。
【０００７】
つぎに、本発明の試薬は、前記本発明の分析方法に使用するメディエータ試薬であって、シクロデキストリンで包接されたメディエータ（以下、「包接メディエータ」という）を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
このように、シクロデキストリンによってメディエータを包接することによって、例えば、従来、比色分析に使用できなかったメディエータを使用でき、また、メディエータを介した電子授受を触媒できなった酸化還元酵素の使用が可能になった。このため本発明の分析方法によれば、各種メディエータや各種酸化還元酵素の選択の幅が広がり、また、使用できるメディエータの選択幅も広がることにより、例えば、発色を測定する際の波長範囲が選択し易くなる。したがって、様々な分析対象物の定量または定性分析が可能になるという効果を奏する。また、電気化学的分析においても包接メディエータは有用である。
【０００９】
また、前記包接メディエータを含む本発明の試薬を使用すれば、前述のような本発明の分析方法が、より一層簡便となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において、前記シクロデキストリンとしては、特に制限されないが、例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンやγ-シクロデキストリン等が使用できる。また、化学修飾されたシクロデキストリンであってもよく、例えば、ヒドロキシシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、ジメチル-β-シクロデキストリン、カルボキシメチル-β-シクロデキストリン等の化学修飾体があげられ、中でも、ヒドロキシシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンである。これらはいずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。また、市販品を使用してもよいし、例えば、デンプンをアミラーセ゛処理する等の公知の方法によっても調製できる。
【００１１】
本発明において、前記メディエータとしては、例えば、α−ナフトキノン、ＴＴＦ（テトラチアフルバレン：Tetrathiafulvalene）、メチルフェロセン、フェロセン、1,1’-フェロセンジカルボン酸等のフェロセンジカルボン酸等が使用できる。これらの中でも、好ましくはα−ナフトキノン、ＴＴＦ等である。これらはいずれか一種類でもよいし、二種類以上の混合物であってもよい。
【００１２】
前記メディエータは前記シクロデキストリンで包接されているが、前記メディエータが、１モルあたり、例えば、１〜４０モルのシクロデキストリンによって包接されていることが好ましく、より好ましくは８〜１８モルであり、特に好ましくは１０〜１４モルである。
【００１３】
前記包接メディエータの調製は、例えば、シクロデキストリンを用いた従来公知の包接方法によって行うことができる。一例としては、例えば、シクロデキストリンを水性溶媒に溶解したシクロデキストリン溶液と、メディエータを水性溶媒に懸濁したメディエータ懸濁液とを準備し、両者を混合することによって包接メディエータを形成できる。包接メディエータが形成されたか否かは、例えば、目視観察によって確認でき、すなわち、前記シクロデキストリン溶液とメディエータ懸濁液とを混合した際に、混合液に透明性が確認できれば前記包接メディエータが形成されたと判断できる。これは、本来、難溶解性を示す物質が包接されると、前記シクロデキストリンの環状部分に入り込み水和状態になり、溶解するためと考えられます。
【００１４】
前記シクロデキストリン溶液に対するメディエータの割合は、メディエータが溶解できれば特に制限されないが、例えば、以下のような割合に設定できる。メディエータがα-ナフトキノンであり、シクロデキストリンがハイドロキシ-β-シクロデキストリンの場合、例えば、ハイドロキシ-β-シクロデキストリン濃度が２４０ｍＭ以上（好ましくは２４０〜３６０ｍＭ、より好ましくは２８０〜３６０ｍＭ）の溶液に、α-ナフトキノンを２０ｍＭとなるように溶解させることができる。また、メディエータがＴＴＦであり、シクロデキストリンがハイドロキシ-β-シクロデキストリンの場合、例えば、ハイドロキシ-β-シクロデキストリン濃度が１２０ｍＭ以上（好ましくは１２０〜３６０ｍＭ、より好ましくは１６０〜３６０ｍＭ）の溶液に、ＴＴＦを２０ｍＭとなるように溶解させることができる。
【００１５】
本発明において、前記酸化還元酵素としては、例えば、分析対象物およびメディエータと酸化還元反応するものであれば特に制限されず、分析対象物の種類等に応じて適宜決定できる。
【００１６】
前記酸化還元酵素としては、例えば、脱水素酵素や酸化酵素があげられ、具体的には、例えば、サルコシンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ピラノースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピリルビン酸オキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、４−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼ等があげられる。
【００１７】
前記酸化還元酵素と前記メディエータとの組み合わせとしては、特に制限されないが、例えば、サルコシンオキシダーゼとＴＴＦ、サルコシンオキシダーゼとα-ナフトキノン、ウリカーゼと、1,1’-フェロセンジカルボン酸、ビリルビンオキシダーゼと、1,1’-フェロセンジカルボン酸の組み合わせ等があげられる。
【００１８】
本発明において、前記酸化還元反応検出手段は、比色法であっても電気化学的検出方法であってもよい。
【００１９】
前記比色法は、前記酸化還元反応により発色する基質を用いた方法であって、例えば、前記酸化還元反応により、前記分析対象物からメディエータを介して還元により発色する基質に電子を伝達し、その結果生じる前記基質の発色を測定する方法である。一方、電気化学的検出方法は、例えば、前記酸化還元反応による電子の授受に伴う電流の変化を検出する方法である。なお、電気化学的検出方法によれば、比色法における前述のような発色基質が不要である。
【００２０】
本発明において、前記分析対象物は、例えば、クレアチニン、コレステロール、グルコース、乳酸、尿酸、ピルビン酸、クレアチン、血液尿素窒素（ＢＵＮ）、グルタミック−オキサロアセティックトランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミック−ピルビックトランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、ビリルビンが好ましく、これらの物質に応じて前記酸化還元酵素を選択できる。具体的な組み合わせとしては、例えば、クレアチニンに対してサルコシンオキシダーゼ、グルコースに対してグルコースデヒドロゲナーゼ、乳酸に対してラクテートオキシダーゼ、尿酸に対してウリカーゼ、コレステロールに対してコレステロールオキシダーゼ等の組み合わせがあげられる。
【００２１】
これらの中でも、クレアチンに対してサルコシンオキシダーゼを使用する組み合わせが特に好ましい。従来のクレアチン分析は、例えば、1)クレアチンをクレアチナーゼで処理してサルコシンを生成させ、2)前記サルコシンをサルコシンオキシダーゼで処理して過酸化水素を生成させ、3)前記過酸化水素をさらにペルオキシダーゼで処理し、過酸化水素量からクレアチン量を換算するという、多段階の酵素反応によって行われていた。しかしながら、例えば、比色法において前述のように包接メディエータを使用すれば、サルコシンを生成させた後、サルコシンオキシダーゼ反応により、サルコシンから電子が放出され、前記電子が後述するようにメディエータに授与され、この電子が前記メディエータから前記発色基質に伝達されることによって、前記基質の発色が生じる。すなわち、少なくともサルコシンオキシダーゼで処理した後は、さらなる酵素反応（例えば、POD反応）が不要になるのである。そして、この酵素反応に使用するメディエータとしては、本発明における「前記包接メディエータ」が必須であり、例えば、α−ナフトキノン、ＴＴＦ、α-ナフトキノン、メチルフェロセン、フェロセン、フェロセンジカルボン酸、ｍ-ＰＭＳ、Meldra Blue、[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl、[Ru(NH3)6]Cl、 [Cu(bpy)3]Cl2、Fe(nitroso-PSAP)3、 Fe(nitroso-ESAP)3、K3[Fe(CN)6]、[Cu(bpy)2]Cl2等の「未包接メディエータ」では発色反応が起らないことは、本発明者らにより確認ずみである。なお、クレアチニンをクレアチニナーゼで処理することによってクレアチンが生成されるため、クレアチニンに対してサルコシンオキシダーゼを組み合わせることも好ましい。また、ＧＯＴの測定においては、オキサロ酢酸脱水粗酵素で処理することによってピルビン酸が生成されるため、ＧＯＴに対してピルビン酸オキシダーゼを組み合わせることも好ましい。
【００２２】
また、分析する検体としては、特に制限されず、例えば、血液、尿、唾液等の体液等があげられる。
【００２３】
前記比色法を利用した本発明の分析方法において、前記発色基質としては、テトラゾリウム塩が好ましい。前記テトラゾリウム塩は、ニトロフェニル基、チアゾリル基およびベンゾチアゾリル基の少なくとも一つの基を有することが好ましい。前記テトラゾリウム塩の具体例としては、例えば、2-(4-iodopheenyl)-3-(4-nitorophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride（ＩＮＴ）、3-(4,5,-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide（ＭＴＴ）、3,3´-(1,1´-Biphenyl-4,4´-diyl)-bis(2,5-diphenyl-2H-tetrazolium chloride)（Neo-ＴＢ）、3,3´-［3,3´-Dimethoxy-(1,1´-biphenyl)-4,4´-diyl］-bis［2-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride（Nitro-ＴＢ）、3,3´-［3,3´-Dimethoxy-(1,1´-biphenyl)-4,4´-diyl］-bis（2,5-diphenyl-2H-tetrazolium chloride）（ＴＢ）、2-(4-lodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodium salt（ＷＳＴ−１）、2-(4-lodophenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodium salt（ＷＳＴ−３）、2-Benzothiazoyl-3-(4-carboxy-2-methoxyphenyl)-5-[4-(2-sulfoethylcarbamoyl)phenyl]-2H-tetrazolium（ＷＳＴ−４）2,2´-Dibenzothiazolyl-5,5´-bis[4-di(2-sulfoethyl)carbamoylphenyl]-3,3´-(3,3´-dimethoxy-4,4´-biphenylene)ditetrazolium,disodium salt（ＷＳＴ−５）、2-(2-Methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt（ＷＳＴ−８）、2-(2-Benzothiazolyl)-3,5-diphenyltetrazolium Bromide、2-(2-Benzothiazolyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium Bromide、2,3-Bis(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium Chloride、2,3-Di(4-nitrophenyl)tetrazolium Perchlorate、3-(3-Nitrophenyl)-5-methyl-2-phenyltetrazolium Chloride、3-(4-Nitrophenyl)-5-methyl-2-phenyltetrazolium Chloride、鉄錯体、銅錯体があげられる。前記銅錯体としては、例えば、ビピリジル銅錯体、イミダゾール銅錯体、アミノ酸（例えば、アルギニン等）銅錯体、イミダゾール・ビピリジル銅錯体、イミダゾール・アミノ酸銅錯体等があげられ、電子の伝達により、青色（Ｃｕ2+）から赤褐色（Ｃｕ+）に色調が変化する。
【００２４】
つぎに、本発明の試薬は、前述のように、前記本発明の分析方法に使用する試薬であって、前記包接メディエータを含むことを特徴とし、さらに、前記酸化還元酵素および前記発色基質を含むことが好ましい。なお、前記試薬における前記包接メディエータの割合は、特に制限されない。
【００２５】
つぎに、本発明の分析方法について、前記酸化還元反応検出手段が比色法である一例について説明する。なお、本発明の分析方法は、この方法には限定されない。
【００２６】
まず、酸化還元酵素、包接メディエータ、発色基質を溶媒に溶解・分散して、試薬液を調製する。
【００２７】
前記溶媒としては、例えば、水、緩衝液等が使用できる。前記前記緩衝液としては、特に制限されないが、例えば、リン酸緩衝液、グッドの緩衝液等があげられ、その濃度は、例えば、５０〜４００ｍＭであり、好ましくは７５〜３００ｍＭ、より好ましくは１００〜３００ｍＭである。また、前記溶媒のｐＨは、例えば、６〜９であることが好ましい。
【００２８】
前記試薬液における各成分の濃度は、その種類や性質等に応じて適宜決定できるが、例えば、前記包接メディエータの濃度は、例えば、１〜５００ｍＭであり、好ましくは５０〜３５０ｍＭであり、特に好ましくは１００〜２００ｍＭである。
【００２９】
前記試薬液における酸化還元酵素の濃度は、例えば、１〜５００Ｕ／ｍｌであり、反応溶液における前記酸化還元酵素の終濃度は、例えば、５〜１０Ｕ／ｍｌであることが好ましい。前記試薬液における発色基質の濃度は、例えば、１〜１００mol/Lであり、反応溶液における前記発色基質の濃度は、例えば、１〜５mol/Lであることが好ましい。具体的に、反応溶液における各成分の終濃度は、包接メディエータがシクロデキストリンで包接されたＴＴＦの場合、例えば、４０ｍＭであり、酸化還元酵素がサルコシンオキシダーゼの場合、例えば、１〜５Ｕ／ｍｌであり、前記発色基質がテトラゾリウム塩の場合、例えば、１〜５mol/Lである。
【００３０】
そして、この試薬液に分析対象物を含む検体を添加することによって、前記酸化還元酵素による酸化還元反応によって、メディエータを介して、分析対象物と発色基質との間で電子授受が行われる。具体的には、前記酵素反応によって、前記分析対象物が酸化されて電子を放出すると、前記メディエータがこの放出された電子を受け取る。そして、この電子が、前記メディエータから前記発色基質にさらに伝達され、前記発色基質が還元されることによって発色する。この発色は、検体中の分析対象物の濃度と相関関係を示すため、前記発色の程度を測定することによって、前記分析対象物を定性または定量分析できるのである。
【００３１】
前記反応溶液は、例えば、前記試薬溶液への前記検体の添加から５秒以内の短時間に、分析対象物の濃度に応じて発色する。この変化は目視で確認しても良いし、分光光度計等の光学系測定装置を用いて測定してもよい。
【００３２】
なお、このような本発明の比色分析方法は、前述のような液系での実施には限定されず、後述するような本発明の比色分析用試験片を使用して行うこともできる。
【００３３】
本発明の分析用試験片は、前記本発明の分析方法に使用する試験片であって、前記本発明の試薬含むことを特徴とする。このような試験片によれば本発明の比色分析方法が、迅速かつ簡便に実施できる。
【００３４】
試験片の形態としては、本発明の試薬を含有していればその形態は特に制限されず、例えば、多孔質材に前記試薬を保持させた試験片、ガラス等の基材上に、前記試薬を含む試薬層が形成された試験片等があげられる。このような試験片は、例えば、従来公知の比色分析用の試験片と同様に製造できる。前記多孔質材に前記試薬を保持させた試験片は、例えば、前記試薬を含む試薬液を準備し、この試薬液を多孔質材に含浸させ、乾燥することによって作製でき、基材上に前記試薬層が形成された試験片は、例えば、前記基材上に、前記試薬液を塗布し乾燥することによって作製できる。また、前記試薬における各成分を一種類は二種以上含む数種の成分液を準備し、各成分液について、多孔質材への含浸および乾燥を繰り返し行ってもよい。
【００３５】
前記多孔質材としては、例えば、ろ紙、各種樹脂製多孔質膜等も使用できる。また、その孔径が厚み方向若しくは面方向において均一な対称多孔質膜でもよいし、厚み方向若しくはシート面方向にしたがって、連続的または段階的に変化する非対称多孔質膜であってもよい。
【００３６】
また、本発明の分析用試験片を、電気化学的検出方法を利用した本発明の分析方法に適用する場合は、例えば、さらに酸化還元電位を検知するための電極を備えることが好ましい。
【００３７】
つぎに、本発明の実施例について説明するが、本発明は、以下の実施例には限定されない。
【実施例１】
【００３８】
分析対象物をクレアチニンとして、包接メディエータを用いた本発明の比色分析を行い、吸光度の経時変化を確認した。
【００３９】
まず、包接メディエータを調製した。メディエータとしては、α−ＴＴＦを使用し、シクロデキストリンとしてはヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンを使用した。
【００４０】
ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンを蒸留水に溶解して、４０ｍＭのシクロデキストリン溶液を調製した。一方、α-ＴＴＦを蒸留水に懸濁して、２ｍＭのメディエータ懸濁液を調製した。前記シクロデキストリン溶液とメディエータ懸濁液とを、１：１（体積比）の割合で混合することによって、メディエータをシクロデキストリンで包接し、包接メディエータ溶液（２ｍＭ）を調製した。
【００４１】
下記サルコシンオキシダーゼ溶液８μｌと、緩衝液１００μｌとを混合し、さらに前記包接メディエータ溶液２００μｌおよび下記発色剤溶液５０μｌを添加して、３７℃でインキュベートを行った。そして、この混合液に下記基質溶液を５０μｌ添加して３７℃で反応を行い、前記基質溶液の添加時を０秒として、３７℃で反応させた際の吸光度の経時変化を測定した（実施例１）。なお、前記吸光度の測定波長は７００ｎｍとした。以下に使用した各種試薬の組成および反応液における各種試薬の終濃度（かっこ書き）を示す。なお、基質として使用したサルコシンは、クレアチニンと相関関係にあり、2ｍＭサルコシンは、濃度2.83ｍｇ/100ｍｌのクレアチンに相当する。
サルコシンオキシダーゼ溶液（4.9U/ml）
サルコシンオキシダーゼ        250U/ml 
ウシ血清アルブミン            0.1重量％
リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）  50mM
緩衝液（98mmol/l）
ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH7.5）      400mM
またはＣＨＥＳ緩衝液（ｐH9.0）       400mM
包接メディエータ溶液（0.98mmol/L）
包接メディエータ                 2mM
発色剤溶液（0.98mmol/l）
商品名WST-5（同仁化学社製）    8mmol/l
基質溶液（123μmol/lまたは245μmol/l）
サルコシン                     2mM
蒸留水
また、比較例１としては、前記包接メディエータに代えて、未処理α−ＴＴＦを使用した以外は、前述と同様にして吸光度測定を行った。なお、コントロールは、前記基質溶液無添加の混合液について測定を行った。
【００４２】
これらの結果を図１および図２に示す。図１および図２は、発色基質の発色程度を示す吸光度の経時変化を示すグラフであって、図１がｐＨ7.5の条件、図２がｐＨ9.0の条件であって、両図において（Ａ）が実施例１の結果、（Ｂ）が比較例１の結果であり、○が実施例１または比較例１の結果、●がコントロールを示す。また、図中における矢印は、基質溶液の添加時点を示す（以下同様）。
【００４３】
図１（Ｂ）および図２（Ｂ）に示すように、未処理のメディエータを使用した比較例１によると、基質添加によっても吸光度に変化がなかったことから、メディエータを介した電子授受がなされず、酸化還元反応が起らなかったことがわかる。これに対して、図１（Ａ）、図２（Ａ）に示すように、包接メディエータを使用した実施例１によれば、基質添加によって吸光度が上昇したことから、包接メディエータを介して電子授受が行われたことがわかる。つまり、メディエータ（α-ＴＦＦ）を包接することによって、サルコシンオキシダーゼを用いたサルコシンの比色分析が可能になったといえる。
【実施例２】
【００４４】
メディエータとしてα−ナフトキノンを使用した以外は、前記実施例１と同様にして包接メディエータを調製し、同様にして吸光度測定を行った。また、メディエータとして未処理α-ナフトキノンを使用した以外は、前記比較例１と同様にして吸光度測定を行ったものを比較例２とした。
【００４５】
これらの結果を図３および図４に示す。図３および図４は、発色基質の発色程度を示す吸光度の経時変化を示すグラフであって、図３がｐＨ7.5の条件、図４がｐＨ9.0の条件であって、両図において（Ａ）が実施例２の結果、（Ｂ）が比較例２の結果であり、○が実施例２または比較例２の結果、●がコントロールを示す。
【００４６】
図３（Ｂ）および図４（Ｂ）に示すように、未処理のメディエータを使用した比較例１によると、基質添加によっても吸光度に変化が少なかったことから、メディエータを介した電子授受の効率が包接メディエータに比べて低く、酸化還元反応が起らなかったことがわかる。これに対して、図３（Ａ）、図４（Ａ）に示すように、包接メディエータを使用した実施例２によれば、基質添加によって吸光度が上昇したことから、包接メディエータを介して電子授受が行われたことがわかる。つまり、メディエータ（α-ナフトキノン）を包接することによって、サルコシンオキシダーゼを用いたサルコシンの比色分析が可能になったといえる。また、実施例２によれば、前記吸光度上昇が著しいことから、測定感度においても優れているといえる。
【実施例３】
【００４７】
分析対象物をクレアチンとして、包接メディエータを用いた本発明の比色分析を行い、クレアチニン濃度に対する吸光度の測定を行った。
【００４８】
包接メディエータとしては、前記実施例１と同じ包接α−ＴＴＦ、および実施例２と同じ包接α-ナフトキノンを使用した。
【００４９】
所定のクレアチニン濃度（0.1, 0.3, 0.5, 1, 5, 10, 20, 40mg/100ml）に相当する所定濃度（0.078, 0.23, 0.39, 0.78, 3.93, 7.87, 15.7, 31.5mg/100ml）のサルコシン溶液を調製した。この各種サルコシン溶液を基質溶液として使用した以外は、前記実施例１および実施例２と同様にして吸光度測定を行った。また、これらの結果を図５および図６に示す。図５および図６は、クレアチン濃度に対する吸光度の増加を示すグラフであって、図５は、包接ＴＴＦを使用した例、図６は包接α−ナフトキノンを使用した結果であり、両図において（Ａ）はpH7.5の条件、（Ｂ）はｐＨ9.0の条件における結果を示す。なお、両図において■が実施例であり、□がコントロールである。
【００５０】
図５（Ａ）および図６（Ａ）に示すように、包接ＴＴＦ包接α−ナフトキノンをメディエータとして使用した場合、クレアチンの増加によって吸光度の増加が見られた。このことより、本発明の比色分析方法によれば、定量的にクレアチニンの分析が行えることがわかる。
【００５１】
以上のように、本発明の分析方法によれば、例えば、従来、比色分析に適用できなかったメディエータを用いて、比色分析を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】（Ａ）は、本発明の一実施例における吸光度の経時変化を示すグラフであって、（Ｂ）は比較例における吸光度の経時変化を示すグラフである。
【図２】（Ａ）は、本発明の前記実施例における吸光度の経時変化を示すグラフであって、（Ｂ）は比較例における吸光度の経時変化を示すグラフである。
【図３】（Ａ）は、本発明のその他の実施例における吸光度の経時変化を示すグラフであって、（Ｂ）は比較例における吸光度の経時変化を示すグラフである。
【図４】（Ａ）は、本発明の前記実施例における吸光度の経時変化を示すグラフであって、（Ｂ）は比較例における吸光度の経時変化を示すグラフである。
【図５】（Ａ）は、本発明のさらにその他の実施例におけるクレアチニン濃度と吸光度との関係を示すグラフであって、（Ｂ）は比較例におけるクレアチニン濃度と吸光度との関係を示すグラフである。
【図６】（Ａ）は、本発明の前記実施例におけるクレアチニン濃度と吸光度との関係を示すグラフであって、（Ｂ）は比較例におけるクレアチニン濃度と吸光度との関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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