(57)【要約】      （修正有）【課題】  プロテオグリカンからの糖鎖遊離などに有用なエキソ−１，３−ガラクタナーゼの活用を図るため、該酵素の遺伝的情報を解明し、これを活用して該酵素の工業的な生産に寄与する。【解決手段】  特定の塩基配列からなるエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子、該遺伝子を含むプラスミド、及び該プラスミドで形質転換された大腸菌（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６４９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５０）を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子。
【請求項２】
請求項１記載のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子を含むプラスミド。
【請求項３】
請求項２記載のプラスミドで形質転換された大腸菌（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５２）。
【請求項４】
配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子。
【請求項５】
請求項４記載のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子を含むプラスミド。
【請求項６】
請求項５記載のプラスミドで形質転換された大腸菌（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５１）。
【請求項７】
配列表の配列番号５記載の塩基配列からなるエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子。
【請求項８】
請求項７記載のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子を含むプラスミド。
【請求項９】
請求項８記載のプラスミドで形質転換された大腸菌（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６４９）。
【請求項１０】
配列表の配列番号７記載の塩基配列からなるエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子。
【請求項１１】
請求項１０記載のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子を含むプラスミド。
【請求項１２】
請求項１１記載のプラスミドで形質転換された大腸菌（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５０）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子、該遺伝子を含むプラスミドベクター及び形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
エキソ−１，３−ガラクタナーゼは、ガラクトースがβ−１，３−結合で繋がった多糖である１，３−ガラクタンの非還元末端から順にガラクトースを遊離するエキソ型の酵素であり、正式な名称はガラクタン１，３−β−ガラクトシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１４５）である。本酵素は高等植物の細胞表層プロテオグリカンであるアラビノガラクタン−プロテインの糖鎖部分に作用する。
【０００３】
アラビノガラクタン−プロテインは、高等植物の細胞表層に存在するプロテオグリカンで、ヒドロキシプロリンを多く含むタンパク部分とアラビノース、ガラクトースを主成分とする糖鎖（アラビノ１，３−、１，６−ガラクタン）とで構成されている。このアラビノガラクタン−プロテインは、時期、器官特異的に発現することが知られ、植物の生長や分化と深く関わると考えられている（非特許文献１の総説参照）。増粘剤として食品に使われているアカシアの樹液由来のガムアラビックは、アラビノガラクタン−タンパク質の一種である。
【０００４】
アラビノガラクタン−プロテインを分解する酵素としては、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．５５）、β−ガラクトシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２２）、エンド−β−１，６−ガラクタナーゼ（ＥＣ番号なし）、及びエキソ−１，３−ガラクタナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１４５）が知られている。
【０００５】
エキソ−１，３−ガラクタナーゼは、これまで２種類の起源のもの、すなわち、イルペックス（Ｉｒｐｅｘ）属微生物及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物のそれぞれの培養液である市販の酵素製剤から精製されたとの報告がある（非特許文献２及び非特許文献３参照）。しかしながら、両文献ともアミノ酸配列の情報はもちろん、遺伝的情報に関して全く記載されていない。
【０００６】
様々なグリコシダーゼがその特異性を利用して多糖やオリゴ糖などの構造解析に広く利用されている。その中で、エキソ−１，３−ガラクタナーゼは、側鎖が結合しているガラクトースの結合を加水分解するバイパス反応を触媒するという性質を有することから、非常にヘテロで複雑な構造を持つアラビノガラクタン−プロテインの糖鎖構造の解析に有用である。
しかしながら、上記の通りエキソ−１，３−ガラクタナーゼに関する遺伝的情報は全く知られていなかったため、アラビノガラクタン−プロテインの糖鎖構造の解析は進展せず、その用途の開発も進んでいなかった。
【０００７】
【非特許文献１】Ｙ．Ｇａｓｐａｒら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７巻，１６１−１７６頁，２００１年
【非特許文献２】Ｙ．Ｔｓｕｍｕｒａｙａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５巻，７２０７−７２１５頁，１９９０年
【非特許文献３】Ｐ．Ｐｅｌｌｅｒｉｎら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．２６４巻，２８１−２９１頁，１９９４年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、エキソ−１，３−ガラクタナーゼの活用を図るため、該酵素の遺伝的情報を解明し、これを活用して該酵素の工業的な生産に寄与することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、その結果、種々の生物のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子を解明するに至った。
すなわち、ファネロキーテ属微生物由来ｃＤＮＡをイルペックス属微生物のエキソ−１，３−ガラクタナーゼの部分アミノ酸配列を基に設計したプライマーを用いたＰＣＲにより増幅して部分塩基配列を得て、得られたＰＣＲ産物の前後の塩基配列をＲＡＣＥ−ＰＣＲにより更に増幅することにより、第一のエキソ−１，３−ガラクタナーゼをコードする遺伝子の全長をクローニングすることに成功した。
また、クロストリディウム属微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とし、目的とするＤＮＡ全長を得るべくデザインしたプライマーを用いてＰＣＲを行い、第二のエキソ−１，３−ガラクタナーゼをコードする遺伝子の全長をクローニングすることにも成功した。
更にアラビドプシス属植物由来ｃＤＮＡを鋳型とし、目的とするそれぞれのＤＮＡ全長を得るべくデザインしたプライマーを用いてＰＣＲを行い、第三及び第四のエキソ−１，３−ガラクタナーゼをコードする遺伝子の全長をクローニングすることにも成功した。
本発明は、係る知見に基づくものである。
【００１０】
請求項１記載の本発明は、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子である。
請求項２記載の本発明は、請求項１記載のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子を含むプラスミドである。
請求項３記載の本発明は、請求項２記載のプラスミドで形質転換された大腸菌（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５２）である。
【００１１】
請求項４記載の本発明は、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子である。
請求項５記載の本発明は、請求項４記載のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子を含むプラスミドである。
請求項６記載の本発明は、請求項５記載のプラスミドで形質転換された大腸菌（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５１）である。
【００１２】
請求項７記載の本発明は、配列表の配列番号５記載の塩基配列からなるエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子である。
請求項８記載の本発明は、請求項７記載のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子を含むプラスミドである。
請求項９記載の本発明は、請求項８記載のプラスミドで形質転換された大腸菌（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６４９）である。
【００１３】
請求項１０記載の本発明は、配列表の配列番号７記載の塩基配列からなるエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子である。
請求項１１記載の本発明は、請求項１０記載のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子を含むプラスミドである。
請求項１２記載の本発明は、請求項１１記載のプラスミドで形質転換された大腸菌（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５０）である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、エキソ−１，３−ガラクタナーゼの遺伝的情報が提供されるので、エキソ−１，３−ガラクタナーゼの工業的な生産が可能となる。
エキソ−１，３−ガラクタナーゼは、アラビノガラクタン−プロテインに作用することから、本発明は、アラビノガラクタン−プロテインの糖鎖構造解析用の試薬として、該糖タンパク質の構造解析の進展に寄与するものである。また、アラビノガラクタン−プロテインの物性を改変し、増粘剤としての用途を切り開くことも可能である。
更に、エキソ−１，３−ガラクタナーゼは、動物のプロテオグリカンにも作用する可能性があることから、本発明は、動物のプロテオグリカン糖鎖遊離用酵素としても利用が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、第一に、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子を提供するものであり、第二に、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子を提供するものであり、第三に、配列表の配列番号５記載の塩基配列からなるエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子を提供するものであり、第四に、配列表の配列番号７記載の塩基配列からなるエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子を提供するものである。
【００１６】
まず、第一の本発明について説明する。
第一の本発明のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子は、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるものであり、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものである。
この本発明の遺伝子の入手方法について、特に限定はないが、ファネロキーテ属微生物から得ることが好ましい。
【００１７】
ファネロキーテ属微生物からの入手方法の一例としては、ファネロキーテ属微生物由来ｃＤＮＡをイルペックス属微生物のエキソ−１，３−ガラクタナーゼの部分アミノ酸配列を基に設計したプライマーを用いたＰＣＲにより増幅して部分塩基配列を得て、得られた部分配列の前後の塩基配列をＲＡＣＥ−ＰＣＲにより更に増幅し、得られる塩基配列をつなぎ合わせる方法を挙げることができる。
【００１８】
すなわち、まず、エキソ−１，３−ガラクタナーゼをイルペックス属微生物から高度に精製し、得られる精製酵素のＮ末端のアミノ酸配列を決定する（配列表の配列番号９参照）。また、この精製酵素をＶ８プロテアーゼで消化し、得られる断片のＮ末端アミノ酸配列（すなわち、精製酵素の内部アミノ酸配列）についても解読する（配列表の配列番号１０参照）。
一方、ファネロキーテ属微生物から全ＲＮＡを抽出後、３´ＲＡＣＥアダプタープライマーを用いる逆転写反応を行って一本鎖ｃＤＮＡを得る。
【００１９】
次に、上記Ｎ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列を基に、１対のプライマー（それぞれ配列表の配列番号１１及び１２記載の塩基配列からなる。）を作成し、このプライマーを用いて、ファネロキーテ属微生物から調製したｃＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を行なう。その結果得られるＰＣＲ産物は、エキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子の一部を構成する５０４ｂｐのＤＮＡ断片（配列表の配列番号１３記載の塩基配列からなる。）である。
【００２０】
次に、ＲＡＣＥ−ＰＣＲ法により、エキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子の全長を構成する塩基配列を決定する。
先に得られたエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子の部分配列（ＰＣＲ産物）を基に、２対のプライマーを新たに作成し（それぞれ、配列表の配列番号１４及び１５記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号１６及び１７記載の塩基配列からなるプライマー）、これらを用いて上記ファネロキーテ属微生物から調製したｃＤＮＡを鋳型とした５´−ＲＡＣＥ、及び３´−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを行い、それぞれ１０５０ｂｐ、６２２ｂｐのＰＣＲ産物を得る。
得られたＰＣＲ産物の塩基配列を解読し（配列表の配列番号１８及び１９参照）、これらをつなぎ合わせて、ファネロキーテ属微生物由来のエキソ−１，３−ガラクタナーゼの全長をコードする遺伝子（配列表の配列番号１記載の塩基配列からなる。）を得ることができる。
【００２１】
本発明の第一の遺伝子をファネロキーテ属微生物から得る場合の方法は、上記例に限定されず、例えば、ファネロキーテ属微生物のｃＤＮＡを適当なファージベクターにパッケージングし、これを適当なファージに感染させｃＤＮＡライブラリーを得て、続いて、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に基づいて作製したプローブをプラークハイブリダイゼーションさせて、目的とするＤＮＡを特定し、回収して取得することもできる。
また、本発明の第一の遺伝子は、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるものであれば、ファネロキーテ属微生物以外の他の生物から得ることもできる。更に、ＤＮＡ自動合成機等を利用して配列表の配列番号１記載の塩基配列を合成しても良い。
【００２２】
このような、第一の本発明のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子は、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（プロメガ）等の適当なプラスミドベクターに含ませることにより、プラスミドとすることができ、更に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版”１．７４章、Ｖｏｌ．１（１９８９）に記載された方法等に従い、該プラスミドで大腸菌を形質転換することにより、形質転換大腸菌を得ることができる。
本発明の第一の遺伝子を含むプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ／Ｐｃ１，３−Ｇａｌを用いて形質転換して得られた形質転換大腸菌は、日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５２である。
【００２３】
次に、第二の本発明について説明する。
第二の本発明のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子は、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるものであり、配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものである。
この本発明の遺伝子の入手方法について、特に限定はないが、クロストリディウム属微生物から得ることが好ましい。クロストリディウム属微生物としては、後述の実施例２で用いるクロストリディウム  サーモセラム（ＡＴＣＣ  ２７４０５株）を例示することができる。
クロストリディウム属微生物からの入手方法の一例としては、クロストリディウム属微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とし、目的とするＤＮＡ全長を得るべくデザインしたプライマー（配列表の配列番号２０及び２１参照）を用いてＰＣＲを行い、第二のエキソ−１，３−ガラクタナーゼをコードする遺伝子の全長をクローニングする方法を挙げることができる。
【００２４】
本発明の第二の遺伝子をクロストリディウム属微生物から得る場合の方法は、上記例に限定されず、例えば、クロストリディウム属微生物のゲノム又はｃＤＮＡを適当なファージベクターにパッケージングし、これを適当なファージに感染させＤＮＡライブラリーを得て、続いて、配列表の配列番号３に記載の塩基配列に基づいて作製したプローブをプラークハイブリダイゼーションさせて、目的とするＤＮＡを特定し、回収して取得することもできる。
また、本発明の第二の遺伝子は、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるものであれば、クロストリディウム属微生物以外の他の生物から得ることもできる。更に、ＤＮＡ自動合成機等を利用して配列表の配列番号３記載の塩基配列を合成しても良い。
【００２５】
このような、第二の本発明のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子は、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（プロメガ）等の適当なプラスミドベクターに含ませることにより、プラスミドとすることができ、更に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，J．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版”１．７４章、Ｖｏｌ．１（１９８９）に記載された方法等に従い、該プラスミドで大腸菌を形質転換することにより、形質転換大腸菌を得ることができる。
本発明の第二の遺伝子を含むプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ／Ｃｔ１，３−Ｇａｌを用いて形質転換して得られた形質転換大腸菌は、日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５１である。
【００２６】
更に、第三の本発明及び第四の本発明について説明する。
第三の本発明のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子は、配列表の配列番号５記載の塩基配列からなるものであり、配列表の配列番号６記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものである。また、第四の本発明のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子は、配列表の配列番号７記載の塩基配列からなるものであり、それぞれ、配列表の配列番号８記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものである。
これらの本発明の遺伝子の入手方法について、特に限定はないが、アラビドプシス属植物から得ることが好ましい。アラビドプシス属植物としては、後述の実施例３で用いるシロイヌナズナを例示することができる。
アラビドプシス属植物からの入手方法の一例としては、アラビドプシス属植物由来ｃＤＮＡを鋳型とし、目的とするそれぞれのＤＮＡ全長を得るべくデザインしたプライマー（それぞれ、配列表の配列番号２２及び２４記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号２６及び２８記載の塩基配列からなるプライマー。）を用いてＰＣＲを行い、第三及び第四のエキソ−１，３−ガラクタナーゼをコードする遺伝子の全長をクローニングする方法を挙げることができる。
【００２７】
本発明の第三及び第四の遺伝子をアラビドプシス属植物から得る場合の方法は、上記例に限定されず、例えば、アラビドプシス属植物のｃＤＮＡを適当なファージベクターにパッケージングし、これを適当なファージに感染させｃＤＮＡライブラリーを得て、続いて、配列表の配列番号５及び７に記載の塩基配列に基づいて作製したプローブをプラークハイブリダイゼーションさせて、目的とするＤＮＡを特定し、回収して取得することもできる。
また、本発明の第三及び第四の遺伝子は、それぞれ配列表の配列番号５及び７記載の塩基配列からなるものであれば、アラビドプシス属植物以外の他の生物から得ることもできる。更に、ＤＮＡ自動合成機等を利用して配列表の配列番号５及び７のそれぞれに記載の塩基配列を合成しても良い。
【００２８】
このような、第三の本発明及び第四の本発明のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子は、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（プロメガ）等の適当なプラスミドベクターに含ませることにより、プラスミドとすることができ、更に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版”１．７４章、Ｖｏｌ．１（１９８９）に記載された方法等に従い、該プラスミドで大腸菌を形質転換することにより、形質転換大腸菌を得ることができる。
本発明の第三及び第四の遺伝子をそれぞれ含むプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ／Ａｔ１，３−Ｇａｌ１及びｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ／Ａｔ１，３−Ｇａｌ２を用いて形質転換して得られた形質転換大腸菌は、日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、それぞれＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６４９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５０である。
【実施例】
【００２９】
実施例１
イルペックス  ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ）の培養液であるドリセラーゼ（協和発酵）より、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（Ｔｏｓｏｈ）及びＨｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅ（Ｂｉｏ−ｒａｄ））を活用して高度に精製し、エキソ−１，３−ガラクタナーゼを得た。この精製酵素のＮ末端のアミノ酸配列を、プロテインシークエンサーＧ１００５Ａ型（ヒューレットパッカード）を用いて決定したところ、配列表の配列番号９に記載するアミノ酸配列からなることが分かった。
【００３０】
また、「遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析」平野  久  著、東京化学同人、に記載の方法に従い、上記精製酵素を、Ｖ８プロテアーゼ（Ｖ８  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（和光純薬工業））により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で室温、１５分の条件下で部分分解した。この分解産物のＮ末端アミノ酸配列（すなわち、精製酵素の内部アミノ酸配列）を、上記の同様に決定したところ、配列表の配列番号１０に記載するアミノ酸配列からなることが分かった。
一方、ファネロキーテ  クライソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ：Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）を、セルロース２％、２，２−ジメチルスクシネート０．２２％、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４０．２６％、ＫＨ２ＰＯ４０．１１％、ＭｇＳＯ４・７水和物０．０５％、ＣａＣｌ２・２水和物０．００７４％、ＦｅＳＯ４・７水和物０．００１％、ＭｎＳＯ４・７水和物０．０００５％、ＺｎＳＯ４・７水和物０．０００５％、ＣｏＣｌ２・６水和物０．０００１％、チアミン−ＨＣｌ０．００００１％、及び尿素０．００００６％を含む培地で３日間培養した。得られた菌体から全ＲＮＡを抽出した後、このうちのｍＲＮＡを鋳型にして、３´ＲＡＣＥ  アダプタープライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写反応を行い、一本鎖ｃＤＮＡ（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃＤＮＡ）を合成した。逆転写反応は、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  Ｙｏｕ−Ｐｒｉｍｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  Ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、予め６５℃で１０分間インキュベートして高次構造を崩した後、３７℃で１時間インキュベートして行った。
【００３１】
次いで、すでに公開されているＰ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍのゲノム情報に対して、上記Ｎ末端アミノ酸配列を用いたＢＬＡＳＴ検索を行い、得られた情報を基にフォワードプライマー（配列表の配列番号１１に記載する塩基配列からなる。）を設計した。また、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍのゲノム情報に対して、上記内部アミノ酸配列を用いたＢＬＡＳＴ検索を行い、得られた情報を基に、上記フォワードプライマーに対応するリバースプライマー（配列表の配列番号１２に記載する塩基配列からなる。）を設計した。
これらのプライマーを用いて、上述したＰ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの条件は、Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を使い、９５℃・３０秒、６０℃・３０秒，７２℃・１分を３０サイクルとした。
こうして得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動にかけた結果、５０４ｂｐの明瞭なバンドを得た。また、このＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いてクローニングし（尚、ライゲーションは１６℃、３０分の反応で行った。）、ＤＮＡシークエンサーで分析して、塩基配列を決定したところ、配列表の配列番号１７記載の塩基配列からなることが明らかとなった。
更に、この塩基配列をアミノ酸に翻訳して、得られたアミノ酸配列を用いてホモロジー検索を行ったところ、先に得られたＮ末端のアミノ酸配列（配列表の配列番号９及び１０参照）と高い相同性が見出された。このことから、該ＰＣＲ産物は、エキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子の一部であると判断した。
【００３２】
そこで、ＲＡＣＥ−ＰＣＲ法により、エキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子の全長を構成する塩基配列の決定を試みた。
まず、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍのゲノム情報に対して、先に得られたエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子の部分配列（ＰＣＲ産物）を用いたＢＬＡＳＴ検索を行い、該ＰＣＲ産物の５´上流に位置するようにフォワードプライマー（配列表の配列番号１４記載の塩基配列からなる。）を設計すると共に、先に得られたエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子の部分配列からリバースプライマー（配列表の配列番号１５記載の塩基配列からなる。）を設計した。
これらを用いてＰ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃＤＮＡを鋳型とした５´ＲＡＣＥ  ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を使い、９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・１分３０秒を３０サイクルとした。
こうして得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動にかけた結果、１０５０ｂｐの明瞭なバンドを得た。また、このＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いてクローニングし（尚、ライゲーションは１６℃、３０分の反応で行った。）、ＤＮＡシークエンサーで分析して、塩基配列を決定したところ、配列表の配列番号１８記載の塩基配列からなることが明らかとなった。
【００３３】
一方、先に得られたエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子の部分配列（ＰＣＲ産物）からフォワードプライマー（配列表の配列番号１６記載の塩基配列からなる。）を新しく設計した。また、前記の３´ＲＡＣＥアダプタープライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）部分に相補的な配列を持つプライマー（配列表の配列番号１７記載の塩基配列からなる。）を設計した。ＰＣＲの条件は、Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を使い、９５℃・３０秒、５５℃・３０秒，７２℃・１分３０秒を３０サイクルとした。
これらを用いてＰ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃＤＮＡを鋳型とした３´ＲＡＣＥを行った。
こうして得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動にかけた結果、６２２ｂｐの明瞭なバンドを得た。また、このＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いてクローニングし（尚、ライゲーションは１６℃、３０分の反応で行った。）、ＤＮＡシークエンサーで分析して、塩基配列を決定したところ、配列表の配列番号１９記載の塩基配列からなることが明らかとなった。
【００３４】
ＲＡＣＥ−ＰＣＲの結果得られた塩基配列の情報（配列表の配列番号１８及び１９参照）をつなぎ合わせて、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡが得られた。
この塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、そのアミノ酸配列は配列表の配列番号２に示す通りであり、分子量４５，６３２のタンパク質を構成することが明らかとなった。また、該タンパク質は、Ｎ型糖鎖付加可能サイトを３カ所（配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の７９番目、１９４番目及び３８９番目のアスパラギン）有するため、一般的に言われている糖鎖の分子量約２，０００が３つ付加された場合の分子量は５１，０００〜５２，０００であるものと推定された。これは、ファネロキーテ属微生物の培養上清から得られた活性型エキソ−１，３−ガラクタナーゼの分子量が約５１，０００であるのと良く一致していた。
このことから、得られた塩基配列は、ファネロキーテ属微生物由来のエキソ−１，３−ガラクタナーゼの全長をコードする遺伝子である可能性が高いことが明らかとなった。
【００３５】
次に、このようにして得られたファネロキーテ属微生物由来のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子を、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲの条件は、Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を使い、９８℃・１０秒、６０℃・１分，７２℃・２分を２５サイクルとした。
こうして得られたＰＣＲ産物をプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（ＰＲＯＭＥＧＡ）にＴＡクローニングして、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ／Ｐｃ１，３−Ｇａｌを調製した。
【００３６】
次に、ファネロキーテ属微生物のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子の発現を行った。
すなわち、シグナル配列部分（配列表の配列番号２の１〜２０番目のアミノ酸部分）を除いた部分をＰＣＲにより増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで分解したｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入し、プラスミドｐＰＩＣＺαＡ／Ｐｃ１，３−Ｇａｌを調製した。ｐＰＩＣＺαＡ／Ｐｃ１，３−Ｇａｌは酵母菌ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１Ｈ株に形質転換した。形質転換体は、１００μｇ／ｍｌの濃度でゼオシンを含むＹＰＧ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、１％グリセロール）で３０℃、３日間培養した後、遠心により菌体を回収し、ＹＰＭ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、１％メタノール）に懸濁し、更に２日間培養することでタンパクの発現を行った。
続いて、発現させたタンパク質の性質について調べた。
【００３７】
（１）分子量
まず、発現させたタンパク質の分子量について調べた。
ＳＤＳ電気泳動により発現させたタンパク質の分子量をＳＤＳ電気泳動により調べたところ、約５１,０００であり、前述したファネロキーテ属微生物の培養上清から得られた活性型エキソ−１，３−ガラクタナーゼの分子量とほぼ同じであった。
そこで、発現させたタンパク質を１，３−ガラクタンに対して実際に作用させたところ、非還元末端からガラクトースを遊離するエキソ−１，３−ガラクタナーゼとしての作用が確認されたことから、得られた遺伝子はエキソ−１,３−ガラクタナーゼをコードするものであることが実際に確認された。
【００３８】
（２）至適ｐＨおよびｐＨ安定性
次に、発現させたエキソ−１，３−ガラクタナーゼの作用における至適ｐＨ及びｐＨ安定性を確認した。
すなわち、発現させたエキソ−１，３−ガラクタナーゼを、３７℃においてｐＨを変えて１，３−ガラクタンに対して作用させたところ、エキソ−１，３−ガラクタナーゼ作用はｐＨ４．５近傍でピークに達した。
また、３０℃で１時間放置した後に１，３−ガラクタンに対してｐＨを変えて作用させたところ、ｐＨ３．０〜６．０の範囲で安定に作用した。
これらの結果から、発現させたエキソ−１，３−ガラクタナーゼの至適ｐＨはｐＨ４．５近傍にあると共にｐＨ３．０〜６．０の範囲で安定であることが分かった。
【００３９】
（３）至適温度および温度安定性
更に、発現させたエキソ−１，３−ガラクタナーゼの作用における至適温度及びｐＨ安定性を確認した。
一方、発現させたエキソ−１，３−ガラクタナーゼタンパク質を、ｐＨ４．５で１５分間１，３−ガラクタンに対して作用させたところ、エキソ−１,３−ガラクタナーゼの作用は、５０℃近傍でピークに達した。
また、ｐＨ４．５で１時間放置した後に１，３−ガラクタンに対して作用させたところ、５５℃以下で安定に作用した。
これらの結果から、発現させたエキソ−１，３−ガラクタナーゼの至適温度は５０℃近傍にあると共に、５５℃以下で安定であることが分かった。
【００４０】
（４）基質特異性
発現させたエキソ−１,３−ガラクタナーゼを、種々の多糖類（基質）に対して作用させ、基質特異性を調べた。
すなわち、１０ｍｇ／ｍｌ基質５０μｌ及びマクイルバイン（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ４．５）４０μｌに、酵素液１０μｌを加えて３７℃で２４時間反応させた。Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法にて還元力を測定し、分解率（％）に換算した。
各基質の反応液における濃度、及び分解率（％）を、表１に示した。
【００４１】
【表１】
2005245303.tif 000002
【００４２】
続いて、発現させたエキソ−１,３−ガラクタナーゼを、種々のｐ−ニトロフェニル基質に対して作用させ、ｐ−ニトロフェニル基質に対する特異性を調べた。
すなわち、２ｍＭ基質（表２参照）２５μｌ及びマクイルバイン緩衝液（ｐＨ４．５）２０μｌに、酵素液５μｌを加えて３７℃で１０分間反応させた。０．２Ｍ炭酸ナトリウム１００μｌを加えることにより反応を停止し、４００ｎｍの吸光度を測定して、分解率（％）に換算した。
各基質の分解率（％）を、表２に示した。
【００４３】
【表２】
2005245303.tif 000003
【００４４】
表１及び表２に示すように、発現させたエキソ−１,３−ガラクタナーゼは、β−１,３−ガラクタンのみを１００％分解したことから、β−１，３−ガラクタンに対し基質特異性を有することが確認された。
【００４５】
さらに、このプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ／Ｐｃ１，３−Ｇａｌを用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版”１．７４章Ｖｏｌ．１（１９８９）に記載された方法に従い、大腸菌を形質転換した。こうして得られた形質転換大腸菌は、日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５２である。
【００４６】
実施例２
前記実施例１において得られたファネロキーテ属微生物のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子のアミノ酸配列を用いてホモロジー検索を行ったところ、クロストリディウム  サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ：ＡＴＣＣ  ２７４０５株）の機能未知な配列と約３０．７％の相同性が見出された。
そこで、この機能未知な配列を基に一対のプライマー（配列表の配列番号２０及び２１に記載する塩基配列からなる。）を化学合成した。
【００４７】
一方、クロストリディウム  サーモセラムから、Ｋ．Ｓａｋｋａらの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.（日本農芸化学会欧文誌）５３巻９０５−９１０頁，１９８９年）に従い、ゲノムＤＮＡを調製した。
これらのゲノムＤＮＡを鋳型として、上述のプライマーを用いたＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの条件は、Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を加え、９８℃、３分の前処理でＤＮＡを変性させた後、９８℃・１０秒、５７℃・１分、７２℃・２分で２５サイクル行った後、さらに７２℃で５分間の伸長反応を行うものとした。
こうして得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動にかけた結果、１７１６ｂｐの明瞭なバンドを得た。また、このＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いてクローニングし（尚、ライゲーションは１６℃、１時間の反応で行った。）、ＤＮＡシークエンサーで分析して、塩基配列を決定したところ、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなることが明らかとなった。
この塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、分子量６３，８９４のタンパク質を構成し、そのアミノ酸配列は配列表の配列番号４に示す通りであった。分泌シグナル配列（配列番号４記載のアミノ酸配列のうち、１〜３０番目の部分）を除いた成熟タンパクの分子量は６０，９９４であることが明らかとなった。
【００４８】
次に、このようにして得られたＤＮＡを、実施例１と同様にしてプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（ＰＲＯＭＥＧＡ）にＴＡクローニングして、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ／Ｃｔ１，３−Ｇａｌを調製した。
さらに、このプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ／Ｃｔ１，３−Ｇａｌを用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版”１．７４章、Ｖｏｌ．１（１９８９）に記載された方法に従い、大腸菌を形質転換した。こうして得られた形質転換大腸菌は、日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５１である。
【００４９】
このクロストリディウム属微生物のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子を大腸菌で発現させた。
すなわち、シグナル配列部分（配列表の配列番号４の１〜３０番目のアミノ酸部分）を除いた部分をＰＣＲにより増幅し、制限酵素ＭｓｃＩとＸｈｏＩで分解し、同様に制限酵素ＭｓｃＩとＸｈｏＩで分解したｐＥＴ２７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入し、プラスミドｐＥＴ２７／Ｃｔ１，３−Ｇａｌを調製した。ｐＥＴ２７／Ｃｔ１，３−Ｇａｌは大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）株に形質転換した。形質転換体は、５０μｇ／ｍｌの濃度のカナマイシンおよび３４μｇ／ｍｌの濃度のクロラムフェニコールを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。培養液５ｍｌを、同じく５０μｇ／ｍｌの濃度のカナマイシンおよび３４μｇ／ｍｌの濃度のクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１００ｍｌに移し、５００ｍｌのフラスコで３７℃でＯＤ６００が０．５になるまで培養した後、終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、更に２５℃で２４時間培養することでタンパクの発現を行った。
続いて、発現させたタンパク質の性質について調べた。
【００５０】
（１）分子量
まず、発現させたタンパク質の分子量について調べた。
ＳＤＳ電気泳動により発現させたタンパク質の分子量をＳＤＳ電気泳動により調べたところ、約６５,０００であり、これは前記成熟タンパクの分子量と良く一致していた。
そこで、発現させたタンパク質を１，３−ガラクタンに対して実際に作用させたところ、非還元末端からガラクトースを遊離するエキソ−１，３−ガラクタナーゼとしての作用が確認されたことから、得られた遺伝子はエキソ−１,３−ガラクタナーゼをコードするものであることが実際に確認された。
【００５１】
（２）至適ｐＨおよびｐＨ安定性
次に、発現させたエキソ−１，３−ガラクタナーゼの作用における至適ｐＨ及びｐＨ安定性を確認した。
すなわち、発現させたエキソ−１，３−ガラクタナーゼを、３７℃においてｐＨを変えて１，３−ガラクタンに対して作用させたところ、エキソ−１，３−ガラクタナーゼ作用はｐＨ６．０近傍でピークに達した。
また、３０℃で１時間放置した後に１，３−ガラクタンに対してｐＨを変えて作用させたところ、ｐＨ２．０〜１０．０の範囲で安定に作用した。
これらの結果から、発現させたエキソ−１，３−ガラクタナーゼの至適ｐＨはｐＨ６．０近傍にあると共にｐＨ２．０〜１０．０の範囲で安定であることが分かった。
【００５２】
（３）至適温度および温度安定性
更に、発現させたエキソ−１，３−ガラクタナーゼの作用における至適温度及びｐＨ安定性を確認した。
一方、発現させたエキソ−１，３−ガラクタナーゼを、ｐＨ６．０で１０分間１，３−ガラクタンに対して作用させたところ、エキソ−１,３−ガラクタナーゼの作用は、５０℃近傍でピークに達した。
また、ｐＨ６．０で１時間放置した後に１，３−ガラクタンに対して作用させたところ、７０℃以下で安定に作用した。
これらの結果から、発現させたエキソ−１，３−ガラクタナーゼの至適温度は５０℃近傍にあると共に、７０℃以下で安定であることが分かった。
【００５３】
（４）基質特異性
発現させたエキソ−１,３−ガラクタナーゼを、種々の多糖類（基質）に対して作用させ、基質特異性を調べた。
すなわち、１０ｍｇ／ｍｌ基質５０μｌ及びマクイルバイン緩衝液（ｐＨ６．０）４０μｌに、酵素液１０μｌを加えて３７℃で２４時間反応させた。Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法にて還元力を測定し、分解率（％）に換算した。
各基質の反応液における濃度、及び分解率（％）を、表３に示した。
【００５４】
【表３】
2005245303.tif 000004
【００５５】
続いて、発現させたエキソ−１,３−ガラクタナーゼを、種々のｐ−ニトロフェニル基質に対して作用させ、ｐ−ニトロフェニル基質に対する特異性を調べた。
すなわち、２ｍＭ基質（表４参照）５０μｌ及びマクイルバイン緩衝液（ｐＨ４．５）２０μｌに、酵素液５μｌを加えて３７℃で１０分間反応させた。０．２Ｍ炭酸ナトリウム１００μｌを加えることにより反応を停止し、４００ｎｍの吸光度を測定して、分解率（％）に換算した。
各基質の分解率（％）を、表４に示した。
【００５６】
【表４】
2005245303.tif 000005
【００５７】
表３及び表４に示すように、発現させたエキソ−１,３−ガラクタナーゼは、β−１,３−ガラクタンのみを１００％分解したことから、β−１，３−ガラクタンに対し基質特異性を有することが確認された。
【００５８】
実施例３
前記実施例１において得られたファネロキーテ属微生物のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子のアミノ酸配列を用いてホモロジー検索を行ったところ、アラビドプシス  タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の２種類の機能未知な配列とそれぞれ約３７．９％、約３８．６％の相同性が見いだされた。
そこで、これらの機能未知な配列を基に、それぞれについて一対のプライマー（配列表の２２と２４及び２６と２８に記載する塩基配列からなる。）を化学合成した。
【００５９】
一方、アラビドプシス属植物から、全ＲＮＡを抽出した後、このＲＮＡを鋳型にしてＲｅｖｅｒＴｒａ  Ｄａｓｈ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、４２℃で１時間反応させｃＤＮＡを調製した。
このｃＤＮＡを鋳型として、上述のプライマーを用いたＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの条件は、ＬＡ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を用い、９８℃・１分、６５℃・１分、７２℃・２分のサイクルのサイクルを２５サイクルとした。
こうして得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動にかけた結果、それぞれ１４１３ｂｐ、１４２８ｂｐの明瞭なバンドを得た。また、このＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いてＴＡクローニングし、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ／Ａｔ１，３−Ｇａｌ１及びｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ／Ａｔ１，３−Ｇａｌ２を調製した。ＤＮＡシークエンサーで分析して、それぞれの塩基配列を決定したところ、配列表の配列番号５及び７記載の塩基配列からなることが明らかとなった。
この塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、分子量５３，２５０及び５３，７８５のタンパク質を構成し、そのアミノ酸配列は配列表の配列番号６及び８に示す通りであった。また、該アミノ酸配列のＮ末端領域には、いずれも膜結合領域（配列表の配列番号６記載のアミノ酸配列の１５〜３７番目、及び配列表の配列番号８記載のアミノ酸配列の２３〜４５番目）が観察されたことから、該アミノ酸配列は、膜結合タンパク質をコードするものであることが示唆された。
【００６０】
次に、このようにして得られたＤＮＡを、実施例１と同様にしてプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（ＰＲＯＭＥＧＡ）にＴＡクローニングして、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ／１，３−Ｇａｌを調製した。
このようにして得られたアラビドプシス属植物のエキソ−１，３−ガラクタナーゼ遺伝子の発現を行った。
すなわち、得られたｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ／Ａｔ１，３−Ｇａｌ１及びｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ／Ａｔ１，３−Ｇａｌ２をそれぞれ鋳型とし、配列表の配列番号２３及び２４記載の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号２７及び２８記載の塩基配列からなるプライマーをそれぞれ用いてＰＣＲを行い、膜結合領域を含まない部分のみをそれぞれ増幅した。
【００６１】
各ＰＣＲ産物（それぞれ配列表の配列番号２５及び２９記載の塩基配列からなる。）を、制限酵素ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで分解し、同様に制限酵素ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで分解したｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入し、プラスミドｐＰＩＣＺαＡ／Ａｔ１，３−Ｇａｌ１及びｐＰＩＣＺαＡ／Ａｔ１，３−Ｇａｌ２を調製した。ｐＰＩＣＺαＡ／Ａｔ１，３−Ｇａｌ１及びｐＰＩＣＺαＡ／Ａｔ１，３−Ｇａｌ２は、それぞれ酵母菌ピキア・パストリス  ＫＭ７１Ｈ株に形質転換した。形質転換体は、１００μｇ／ｍｌの濃度でゼオシンを含むＹＰＧ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、１％グリセロール）で３０℃、３日間培養した後、遠心により菌体を回収し、ＹＰＭ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、１％メタノール）に懸濁し、更に２日間培養することでタンパクの発現を行った。
発現タンパクを１，３−ガラクタンに作用させたところガラクトースを遊離した。このことから、得られた塩基配列は、シロイヌナズナ由来のエキソ−１，３−ガラクタナーゼの全長をコードする遺伝子であることが明らかとなった。
【００６２】
さらに、このプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ／Ａｔ１，３−Ｇａｌ１及びｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ／Ａｔ１，３−Ｇａｌ２を用いて、実施例１と同様にしてＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版”１．７４章、Ｖｏｌ．１（１９８９）に記載された方法に従い、大腸菌を形質転換した。こうして得られた形質転換大腸菌は、日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、それぞれＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６４９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５０である。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明によれば、エキソ−１，３−ガラクタナーゼの遺伝的情報が提供されるので、エキソ−１，３−ガラクタナーゼの工業的な生産が可能となる。
エキソ−１，３−ガラクタナーゼは、アラビノガラクタン−プロテインに作用することから、本発明は、アラビノガラクタン−プロテインの糖鎖構造解析用の試薬として、該糖タンパク質の構造解析の進展に寄与するものである。また、アラビノガラクタン−プロテインの物性を改変し、増粘剤としての用途を切り開くことも可能である。
更に、エキソ−１，３−ガラクタナーゼは、動物のプロテオグリカンにも作用する可能性があることから、本発明は、動物のプロテオグリカン糖鎖遊離用酵素としても利用が期待される。
【配列表】
2005245303000001.app