(57)【要約】      （修正有）【課題】  メタンの浄化技術として、メタン発生または放出を抑制しうる資材およびその製造方法を提供する。【解決手段】  メタンを酸化分解する、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｓｐｈａｅｒａ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｉｃ属等の細菌を木炭、活性炭、パーライト、軽石材またはゼオライトのような多孔質担体に付着・繁殖させる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質担体にメタン酸化能を有する細菌を保持することを特徴とするメタン酸化菌保持担体。
【請求項２】
前記細菌が、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｓｐｈａｅｒａ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ属およびＭｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｉｃ属の細菌であり、且つメタン酸化能を有する請求項１記載のメタン酸化菌保持担体。
【請求項３】
Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｍ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｒｉｕｍ  ｆａｃｉｌｉｓ、これらと同じクラスターに属するＨｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｓ４として単離された菌株、タイプＩＩ  メタン酸化細菌と分類されるＴ２−０６株、Ｔ２−０７株、Ｔ２−１７株およびこれらと系統的に近縁であり、且つメタン酸化能を有する細菌から選択される請求項２記載のメタン酸化菌保持担体。
【請求項４】
前記多孔質担体が、木炭、活性炭、パーライト、軽石材またはゼオライトから選択される請求項１〜３のいずれかに記載のメタン酸化菌保持担体。
【請求項５】
多孔質担体に培養液を吸収させ、これにメタン酸化能を有する細菌を含有する培養液を混合（散布あるいは添加）し、次いでメタンを含有する空気を前記多孔質担体を通過させるように循環させて前記細菌を多孔質に付着させ、繁殖させることからなるメタン酸化菌保持担体の製造方法。
【請求項６】
前記多孔質担体が、木炭、活性炭、パーライト、軽石材またはゼオライトから選択される請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記多孔質担体は、木質材料を粒径１〜１００ｍｍ程度にチップ化し、４００℃以上で炭化して得られる木炭である請求項６記載の方法。
【請求項８】
内側容器と外側容器との２重容器から成り、前記内側容器は導入口と排気口とを備えると共に前記導入口にメタンを含む空気を当該内側容器内に導入し前記排気口から排出させる送風手段を備え、前記外側容器は前記内側容器との間に前記内側容器から排出されたメタンを含む空気を前記導入口へ還流させる流路を形成し、前記内側容器内にメタン酸化菌を含む養液を散布した多孔質担体を収納すると共に、前記内側容器内の前記多孔質担体を通過するメタンを含む空気の循環流を形成することを特徴とするメタン酸化菌保持担体製造装置。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載のメタン酸化菌保持担体あるいは請求項５〜７のいずれかに記載のメタン酸化菌保持担体の製造方法により製造されたメタン酸化菌保持担体を、メタン発生源に散布または配置させることからなるメタン発生抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、地球温暖化ガスの一つであるメタンを酸化分解する細菌を保持する担体およびその製造方法、製造装置並びにメタン発生抑制方法に関する。詳細には、メタンを酸化分解する細菌群を保持する多孔質担体、および該細菌群を多孔質担体に付着・繁殖させることからなるメタン酸化菌保持担体の製造方法、製造装置並びにメタン発生抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタン（ＣＨ４）は地球温暖化を引き起こす温室効果ガスであるが、大気中に約１.７ｐｐｍ存在し、その主要な発生源は、自然湿地や海洋の他に、水田などの農地、廃棄物処分場、反芻動物、バイオマス燃焼などであると考えられている。メタンは一分子あたりの温暖化ポテンシャルでは二酸化炭素の約２１倍であり、わずかな濃度の上昇が温暖化に大きく作用するといわれている。このため、国連気候変動枠組条約第３回締約国会議（ＣＯＰ３）において採択された京都議定書では、メタンは基準年を１９９０年として二酸化炭素換算での総排出量を少なくとも５ｗｔ％削減することが数値目標として定められ、工業、農林業など主な排出源での対応策が求められている。
【０００３】
メタン発生を抑制する技術は主に水田で検討されており、メタンの原料となる稲藁の施用法、中干しなど水管理などが提案されている。また、メタンを活性炭や木炭などの多孔質剤に吸着させること（特許文献１）、鋼業の産業副産物である転炉スラグや使用済みの使い捨てカイロ等の含鉄資材を水田に施用してメタン放出を抑制することが提案されている（非特許文献１）。しかし、湿地や廃棄物最終処分場などの広大な面積の発生源や高濃度のメタンが発生する堆肥化施設などに適用してメタン発生を抑制するには、中長期的に十分な効果が得られなかったり、残留する含鉄資材の問題があり、実用的な技術はほとんど知られていない。
【０００４】
一方、近年、微生物の分解能を利用した環境修復技術（バイオレメディエーション）が注目されており、石油類や農薬、重金属などの汚染物質で実用化されている。また、トリクロロエチレンやＰＣＢなどの有害な化学物質などに付いても実証研究に対する取り組みがなされており、これら汚染物質の除去に微生物が利用可能であることが報告されている。しかし、従来は単一の細菌を使用することがほとんどであり、さらに土壌などの汚染源に直接、分解微生物を散布することから、環境中に存在する多くの捕食者により捕食され、十分な浄化効果が得られないことが多い。このため、有用な細菌を多孔質材に吸着させて、増殖させること（特許文献２）、さらに農薬などの汚染物質に汚染された土壌から汚染物質を分解しうる微生物を集積し、多孔質材に保持させることが提案されている（特許文献３）。
【０００５】
しかし、これらの微生物を用いる先行技術は液状物質に対するものであり、メタンなどのガス状の汚染物質に適用することができない。また、メタンについては、酸化・分解する微生物の分離・同定する方法が報告されているに過ぎず（非特許文献１）、これらの微生物を用いて自然環境や人工施設からのメタンの発生を抑制することは全く知られていない。
【特許文献１】特開２００１−１７８５９号公報
【特許文献２】特開平８−２５２０８６号公報
【特許文献３】特開平１１−３１８４３５号公報
【非特許文献１】Nutrient Cycling in Agroecosystems, Vol.64, pp.193-201 (2002)
【非特許文献２】Appl. Environ. Microbiol., Vol.65 (11), pp.4887-4897 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の課題は、メタンの発生源が広範囲であったり、高濃度のメタン発生が起こるなどの、メタンの発生抑制が困難な環境に対しても適用可能であり、メタン発生または放出を抑制しうる資材、その製造方法および製造装置並びにメタン発生抑制方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を行ったところ、本発明は、メタンを酸化分解する細菌を多孔質担体に付着・繁殖させて該担体に保持させ得ることを見出し、本発明を完成させた。従って、本発明は、多孔質担体にメタンを酸化分解する細菌群を保持することを特徴とするメタン酸化菌保持担体に関する。なお、本発明において、メタンの酸化および酸化分解は、いずれもメタンを二酸化炭素と水に分解することを意味する。故に、メタンを酸化分解する細菌、およびメタン酸化菌は同じ細菌群を意味する。
【０００８】
本発明はまた、多孔質担体に培養液を吸収させ、これにメタン酸化能を有する細菌を含有する培養液を混合し、次いでメタンを含有する空気を循環させて前記細菌を多孔質に付着させ、繁殖させることからなるメタン酸化菌を保持する担体の製造方法に関する。
【０００９】
また、本発明は、内側容器と外側容器との２重容器から成り、前記内側容器は導入口と排気口とを備えると共に前記導入口にメタンを含む空気を当該内側容器内に導入し前記排気口から排出させる送風手段を備え、前記外側容器は前記内側容器との間に前記内側容器から排出されたメタンを含む空気を前記導入口へ還流させる流路を形成し、前記内側容器内にメタン酸化菌を含む養液を散布した多孔質担体を収納すると共に、前記内側容器内の前記多孔質担体を通過するメタンを含む空気の循環流を形成することを特徴とするメタン酸化菌保持担体製造装置に関する。
【００１０】
さらに本発明は、上述のメタン酸化菌保持担体あるいは上述のメタン酸化菌保持担体の製造方法により得られたメタン酸化菌を保持する担体を、散布または配置させることからなるメタン発生を抑制する方法に関する。
【００１１】
１．メタン酸化菌
メタンを酸化分解する細菌は、メタン酸化菌（Ｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈ）またはメタン資化菌と称される微生物であり、陸域の湖沼や河川、牧草地、広葉樹の森林の土壌や水中に広く生息していることが知られている。本発明においてはメタンを炭素源として用いることができ、メタンを最終的に二酸化炭素と水に分解しうる細菌であれば特に限定されない。そのような微生物は、非特許文献２に記載されており、例えばＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｓｐｈａｅｒａ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ属およびＭｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｉｃ属の細菌が挙げられ、好ましくはＨｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｍ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｒｉｕｍ  ｆａｃｉｌｉｓ、これらと同じクラスターに属するＨｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｓ４として単離された菌株、タイプＩＩ  メタン酸化細菌と分類されるＴ２-０６株、Ｔ２-０７株、Ｔ２-１７株およびこれらと系統的に近縁であり、且つメタン酸化能を有する細菌などである。
【００１２】
２．メタン酸化菌の取得
これらのメタン酸化菌は、湿地、湖沼や河川、水田、畑地、牧草地、広葉樹の森林の土壌や水中に広く生息しており、陸域に比べて種類は少ないものの海水や海底の泥土中でも生息が確認されている。メタン酸化菌は、メタン発生量の多い水田、湖沼の湿地、農業用水路の河岸湿地などから土壌を採取し、メタンを唯一の炭素源として培養することにより得ることができるが、本発明の目的のためにはよりメタン酸化分解能の高いメタン酸化菌または適用する場所の土壌から得られたメタン酸化菌を選択することが好ましい。
【００１３】
メタン酸化菌の選択は、メタン酸化菌がメタンを二酸化炭素と水に分解することから、メタンの消費と二酸化炭素の発生を指標として行うことができる。また、メタン酸化菌の培養は、八木ら（国立環境研究所特別研究報告ＳＲ−３１−２０００、２０００年）によるクロロエチレンおよびクロロエタン分解菌の分離方法に準じて行うことができる。具体的には、次のように実施することができる。ガスバイアルビンにメタン酸化菌の培養に適する無機塩液体培地を入れ、さらに土壌を添加し、バイアルビンをで密閉する。次いで、ガスバイアルビンのヘッドスペースの空気を一部引き抜いた後、炭素源としてメタンを添加する。これを３０℃の定温恒温器内で振とう培養する。一定期間培養した後、ヘッドスペースから空気を採取し、メタン濃度をガスクロマトグラフで測定する。メタン濃度の減少が認められたものについて、その液体培地を液体培地を含むガスバイアルビンに添加して、２回目の振とう培養を行う。この培養において、メタン濃度の減少が大きいメタン酸化菌を選び、さらに新しい液体培地に植え継いで３回目の集積培養を行い、メタン濃度の減少が大きいメタン酸化菌を選ぶ。
【００１４】
３．多孔質担体
本発明において、多孔質担体は、前述のメタン酸化菌を保持しうる、すなわちメタン酸化菌を吸着させ、増殖させうるものであれば特に限定されないが、例えば木炭、活性炭などの他に、パーライト、軽石材、ゼオライトなどの多孔質鉱石が挙げられるが、木炭、活性炭が好ましい。本発明の多孔質担体を環境に適用する場合、循環型社会構築の一環として、ダム流木や建築廃材などの木質廃棄物、間伐材などを有効利用することが求められているため、本発明ではこれら木質廃棄物や間伐材を原料とした木炭を用いてもよい。この場合、例えばこれらの木質を粒経１〜１００ｍｍ、好ましくは粒径５〜１０ｍｍ程度にチップ化し、通常３００〜１０００℃、好ましくは４００℃以上で炭化することにより多孔質資材を得ることができる。また、本発明の多孔質担体をウシなどの反芻動物に適用する場合、生体に影響を与えないもの、例えば木炭やゼオライトなどの多孔質担体を用いることが好ましい。
【００１５】
４．メタン酸化菌を保持する多孔質担体
メタン酸化菌が繁殖する多孔質担体を製造する際には、コストなどの実用化の観点から、できるだけ少量のメタン酸化菌を効率的に多孔質全体に付着させ、繁殖させることが好ましい。そこで、多孔質担体チップ状とし、その上部にメタン酸化菌を含む養液を加え、メタンを含む空気を循環することで、木炭への付着と繁殖を促進させる。多孔質担体として木炭を例にしてその方法を説明する。
（１）木炭に無機塩類培地を噴霧し、含水率８０％程度まで十分に湿らせる。
（２）密閉可能な容器に（１）の木炭を入れ、上部からメタン酸化菌を含む培養液を添加する。
（３）真空ポンプで内部の空気を抜き、メタンと空気の割合が１：９の混合ガスを注入する。
（４）ファン等を稼動させ、メタンを含む空気を循環させる。
（５）容器内の温度を３０℃程度に維持して静置する。
尚、メタン酸化菌の繁殖においては、初期メタン濃度が５〜４５ｖｏｌ％、雰囲気温度が２０〜４０℃の範囲、酸素濃度が少なくとも５ｖｏｌ％望ましくは８ｖｏｌ％以上に維持される環境が適しており、上述の条件に限られるものではない。
【００１６】
以上の操作終了後、内部のメタン濃度と二酸化炭素を経時的に測定し、メタン濃度が検出限界以下まで低下した時点で空気の循環を停止する。ここで、容器から取り出した木炭を用いて、以下の方法でメタン酸化菌の付着と繁殖の状態、メタン除去能力を確認することができる。
【００１７】
まず、容器から取り出した木炭を十分に混合し、一定量を無作為にピックアップしてガスバイアルビンに入れて密閉する。次に空気を一部引き抜いた後、その代わりにメタンを注入し、ガスバイアルビンは３０℃の恒温器内に静置する。２４時間問隔でサンプリングし、ガスクロマトグラフでメタンと二酸化炭素の濃度を測定することにより確認することができる。例えば、所望されるメタン除去能が得られない場合、用いたメタン酸化菌のメタン分解能はその分離の際に確認されているため、メタン酸化菌の付着と繁殖の状態が不十分であることが考えられる。
【００１８】
５．メタン発生の抑制
本発明のメタン酸化能を有する細菌を保持多孔質担体を水田、湿地、廃棄物処分場または堆肥化施設に配置、散布あるいは埋設する。埋設する場合、メタン酸化菌は好気性細菌であるため、該担体中が好気的条件になるようにする必要がある。配置、散布または埋設する量は、メタンの発生を抑制すべき条件、該細菌のメタン酸化・分解能によって異なるが、例えば１ｍ２あたり、１００ｇ〜５０ｋｇ、好ましくは２ｋｇ〜２５ｋｇ程度である。例えば水田や湿地の場合、１００ｇ／ｍ２程度でも十分なメタン抑制効果を得られるが、廃棄物処分場などでは約１〜２０ｃｍ、好ましくは約５〜１０ｃｍの層を形成させるため、層の厚さに応じて必要量は多くなる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、メタン分解能に優れたメタン酸化菌を保持することを特徴とする多孔質担体が提供される。メタン酸化菌のうち、特にＨｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｍ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｒｉｕｍ  ｆａｃｉｌｉｓと同じクラスターに属し、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｓ４として単離された株と系統的に非常に近い菌株およびタイプII  メタン酸化菌と分類されているグループのＴ２−０６株、Ｔ２−０７株やＴ２−１７株と近縁である菌株からなるメタンを酸化分解する細菌群により、メタンを効率的に分解・除去することが可能になる。このため、メタン発生源が広範囲にわたる廃棄物最終処分場や湿地、水田などからのメタン発生を効率よく、低コストで抑制することができる。さらに、多孔質材として木炭という自然素材、特にダム流木や建築廃材などの木質廃棄物、間伐材を原料とした木炭が利用できることから環境への負荷が小さい。
【００２０】
また、メタン酸化菌保持担体の製造方法並びに装置によれば、少量のメタン酸化菌を効率的に木炭あるいはその他の多孔質担体の全体に付着・繁殖させることができ、低コストでメタン酸化菌保持担体を大量生産可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
下記の実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
１．メタン酸化菌の採取および培養
本実施例におけるメタン酸化菌群は、水田、手賀沼湿地、農業用水路の河岸湿地の土壌（黒色の表層から約５ｃｍの深さまで１０ｃｍ×１０ｃｍ程度）から以下の方法で採取・集積培養し、メタン分解能力の高いものを選択した。
３０ｍＬのガスバイアルビンに表１に示すメタン酸化菌用無機塩液体培地を入れ、さらに土壌を０.１ｇ添加し、ブチルゴム栓をアルミシールで密閉し、炭素源としてメタンを１０ｍＬ添加した。それぞれのガスバイアルビンは、３０℃の定温恒温器内で振とう培養（回転数：１２０ｒｐｍ）した。１週間後に、その液体培地を１ｍＬ採取し、新しい液体培地１０ｍＬを入れたガスバイアルビンに添加して、再度メタンを添加して振とう培養を行った。この操作を繰り返して、４回目の集積培養を行った。集積したメタン酸化細菌群のメタン分解能力を図１に示す。これらのメタン酸化菌のメタン除去能力では、手賀沼湿地Ａ区で実験開始から３日目に検出限界以下までメタン濃度が低下し、水田区と用水湿地Ａ、Ｂ区、手賀沼湿地Ｂ区のメタン濃度が約５０％しか低下していないのに比べ、高い除去効果を示した。同様に、二酸化炭素濃度でも、手賀沼湿地Ａ区は他の区に比べ高い濃度を示した。
【表１】
2005118009.tif 000002
【実施例２】
【００２３】
２．木炭を用いたメタン酸化細菌群の付着・繁殖
実施例１で得られた５種類のメタン酸化菌の中で除去能力の高かった手賀沼湿地Ａ区のメタン酸化菌群を用いて、木炭への付着・繁殖を試みた。木炭はダム流木（広葉樹と針葉樹の割合が７：３）のチップを原料とした木炭を用いた。木炭の比表面積を表２に示す。実験に使用した木炭は、篩で粒径５ｍｍ〜１０ｍｍに選別し、蒸留水で十分に洗浄した後、１００℃で２４時間乾燥した。木炭への付着・繁殖実験の接種源として、メタン酸化菌が集積した液体培地１ｍＬを新しい液体培地１０ｍＬに入れ、３ｍＬのメタンを加えて１週間増殖させた養液を作成した。作成した養液中の生菌数（ｃｆｕで表す）は、０.１４×１０１０ｃｆｕ  ＭＰＮ／ｍＬと推定された。
【表２】
2005118009.tif 000003
【００２４】
メタン酸化菌が繁殖する木炭を作成する場合、実用化の観点から、できるだけ少量のメタン酸化菌を効率的に木炭全体に付着・繁殖させることが望ましい。そこで、木炭はチップ状とし、その上部にメタン酸化菌を含む養液を加え、メタンを含む空気を循環することで、木炭への付着と繁殖を促進できると考え、実験的規模のメタン酸化菌保持担体製造装置（図２）を試作した。
【００２５】
このメタン酸化菌保持担体製造装置は、内側容器１と外側容器２との２重容器から成り、内側容器１は導入口３と排気口４とを備えると共に導入口３にメタンを含む空気５を当該内側容器１内に導入し排気口４から排出させる送風手段６を備え、外側容器２は内側容器１との間に内側容器１から排出されたメタンを含む空気５を導入口３へ還流させる流路７を形成し、内側容器１内にメタン酸化菌を含む養液８を散布した多孔質担体９を収納すると共に、内側容器１内の多孔質担体９を通過するメタンを含む空気５の循環流を形成するようにしている。ここで、内側容器１の大きさは、１００ｍｍ（Ｗ）×１００ｍｍ（Ｄ）×２００ｍｍ（Ｈ）で、導入口３を塞ぐ蓋部分に送風手段６としての１２Ｖのシロッコファンを取り付けてあり、容器１の下部に５ｍｍ２の穴からなる排気口４を４個設けた構造とした。この内側容器１を外側容器２としての真空ポリカーボネイトデシケータ（容量２．４Ｌ）に収めて二重容器とし、デシケータ２と内側容器１との間にメタンを含む空気の循環流を形成可能とする流路・スペースを形成する。このメタン酸化菌保持担体製造装置を用いて、以下の手順で実験を実施した。
（１）木炭に無機塩類培地を噴霧し、含水率８０％程度まで十分に湿らせる。
（２）内側容器１に多孔質担体９としての木炭チップを２０ｇ入れ、上部からメタン酸化菌を含む養液８を１ｍＬを滴下させて加える。
（３）内側容器１をデシケータ２内に静置する。
（４）図示していない真空ポンプでデシケータ２内の空気を抜き、メタンと空気の割合が１：９の混合ガスを注入する。
（５）シロッコファン６を稼動させ、メタンを含む空気５を内側容器１内に送り込む。
（６）デシケータ２を３０℃の恒温器（図示省略）内に静置する。
【００２６】
以上の操作終了後、デシケータ２内のガスを採取口１０から抽出して、メタン濃度と二酸化炭素濃度を経時的に測定し、メタン濃度が検出限界以下まで低下した時点でシロッコファン６を止めて空気５の循環を停止し、内側容器１をデシケータ２から取り出した。内側容器１から取り出した木炭９を用いて、メタン除去能力を調べた結果を図３に示す。容器１から木炭（多孔質担体）９をランダムに１ｇずつ採取し５サンプルを作成した。そして、３ｍＬのメタンを含む空気と木炭を３０ｍＬのガスバイアルビンに入れ、密閉後３０℃の恒温器内に静置した。メタンと二酸化炭素濃度をガスクロマトグラフで経時的に測定した。その結果、いずれの木炭においても、実験開始からメタン濃度は急速に低下し、２日目には１％以下、７日目には検出限界以下になることが判明した。また、二酸化炭素濃度もメタン濃度の低下に伴って、２日目には約４％、７日目には５％に達した。このことから、ガスバイアルビンに注入したメタンは、木炭に付着・繁殖したメタン酸化菌によって除去されたことが確認された。さらに、ＳＥＭ電子顕微鏡による分解木炭の写真撮影にいより、木炭の孔隙内にメタン酸化菌が繁殖しているのが確認された（図４）。また、木炭の含水率は、実験開始時には約８０％であったが、終了時には４０％に低下し、空気の循環により乾燥したことで取り扱いが容易になった。
【実施例３】
【００２７】
３．メタン酸化・分解能の評価
実施例２で得られた木炭の重量を変えて、メタンの除去効果を調べた結果を図５に示す。３ｍＬのメタンを含む空気と重量を変えた木炭を３０ｍＬのガスバイアルビンに入れ、密閉した後３０℃の恒温器内に静置した。メタン濃度をガスクロマトグラフで測定し、検出されなくなった場合は再びメタンを含む空気を入れる操作を濃度の減少が認められなくなるまで継続した。その結果、木炭によって除去されたメタン量は、木炭の重量に比例して増加することが判明した。すなわち、分解木炭は、１ｇあたり約６．１ｍｇのメタン除去能力を有することが示された。木炭のみによる重量１ｇあたりのメタン除去量は約４．７×１０-４ｍｇ／ｇであったことから、メタン酸化菌の繁殖により木炭の除去能力が約１３,０００倍に高まった。
【００２８】
メタン酸化菌を保持する木炭によるメタン除去速度を調べた結果を図６に示す。２ｍＬのメタンを含む空気と木炭１ｇを２０ｍＬの試験管に入れ、密閉した後３０℃の恒温器内に静置した。メタン濃度をガスクロマトグラフで経時的に測定した。この結果、実験開始時のメタン濃度は約２.５ｍｇ  ＣＨ４（容量比：１５％）であったが、６時間後には初期濃度の７５％、１５時間後には約４０％、２６時間後にはほぼ検出限界以下に低下したことが判明した。メタン濃度は、時間に反比例して減少することから、メタン酸化菌を保持する木炭によるメタンの除去速度は、０.０９１ｍｇＣＨ４／ｈｒ／ｇと算出された。また、メタン酸化菌を保持する木炭の異なる温度条件におけるメタン除去率を図７に示す。実験開始から７日目のメタン除去率は、温度が５℃では約５％で、温度が高くなると除去率も増加し、１０℃で約３０％、１５℃で約５０％であった。実験開始５日目に比べて、７日目のメタン除去率が増加したことから、メタン酸化菌は活動していると考えられる。一方、温度が２０℃から４０℃では、メタン除去率は５日目で１００％に達し、注入したメタンはすべて除去された。しかし、温度を５０℃に設定するとメタンの除去率は小さく、ほとんど除去されなかった。以上のことから、木炭で繁殖したメタン酸化菌は２０〜４０℃が生育適温と考えられ、１５℃以下ではメタン除去能力が低下し、５０℃以上では分解能力を失うと推測された。尚、異なる温度条件におけるメタン酸化菌繁殖木炭のメタン除去に関する実験は、３ｍＬのメタンを含む空気と木炭１ｇを２０ｍＬの試験管に入れ、密閉した後、５，１０，１５，２０，３０，４０，５０℃の恒温器内に静置した。メタン濃度を５日目と７日目にガスクロマトグラフで測定し、初期濃度に対する減少した割合を除去率とした。
【実施例４】
【００２９】
４．メタン酸化細菌群の同定
木炭に付着・繁殖したメタン酸化菌群の菌種を同定するために、この木炭をすりつぶし、表１の液体培地で培養したものからゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子領域を増幅した。プライマーには、細菌全般に保存性の高い２７Ｆ（5’-GAGTTTGATCMTGGCTCA-3’；配列番号１）と１５４４Ｒ（5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’；配列番号２）というプライマーを用いた。アガロースゲル電気泳動にて、目的領域の増幅を確認後、このＰＣＲ産物のクローニングを行った。ベクターには、ｐＧＥＭＴ-ｅａｓｙ（プロメガ）を用い、常法にて、ＴＡクローニングを行い、大腸菌にエレクトロポレーションによって、導入した。
【００３０】
出現したコロニーは、ベクターに存在するＭ１３のプライマーセット
Ｍ１３前方プライマー：5’-GTTTTCCCAGTCACGACGTT-3’（配列番号３）
Ｍ１３後方プライマー：5’-GGAAACAGCTATGACCATGA-3’；（配列番号４）
で直接増幅し、インサートの確認を行った。目的産物の増幅が確認できたものについて、Ｍ１３前方プライマーを用いて、シーケンスを行い、メタン酸化菌と考えられるＭｅｔ１６、２１、３１という３検体を選択し、全長をカバーするようなシークエンスを行った。得られた配列データを元にアッセンブルを行い、全長の配列を決定し、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いて、相同性検索、系統樹の作製を行い、非特許文献２の方法に準じて菌種の推定を行った。相同性検索は、ＧｅｎＢａｎｋのデータベースに対するＢＬＡＳＴ検索を用た。マルチプルアライメントおよび系統樹の作製には、ＣｌｕｓｔａｌＸとＴｒｅｅｖｉｅｗを用いた。
【００３１】
以上の結果、Ｍｅｔ１６は、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｍ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｒｉｕｍ  ｆａｃｉｌｉｓと同じクラスターに属する菌株で、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｓ４として単離された株と系統的に非常に近い株と同定された。さらに、Ｍｅｔ２１株とＭｅｔ３１株は、タイプII  メタン酸化細菌［Ｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈ］と分類された配列データが高い相同性を持っており、Ｍｅｔ２１株は、Ｔ２−０６株と近縁、Ｍｅｔ３１株は、Ｔ２−０７株やＴ２−１７株と近縁であると判断された。
【００３２】
尚、上述の実施形態は本発明の好適な実施の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、図２に例示するメタン酸化菌保持担体製造装置は、便宜上実験に適した構造を採っているが、工業的実施に際してはこれに限られない。即ち、外側容器２は実験上メタン濃度を正確に測定する必要があるのでデシケータを利用しているが、必ずしもデシケータでなくとも良く、単にメタンを含む空気が漏洩しない程度の密封容器であれば足りるし、繁殖のための温度も恒温器などを使って３０℃一定に保温する必要はなく、２０℃〜４０℃の範囲であればその間で変動しても、あるいは任意の温度で一定温度に管理されていても効率的に繁殖させ得る。また、メタンを含む空気の酸素濃度も、少なくとも５ｖｏｌ％程度あれば繁殖可能であり、望ましくは８ｖｏｌ％以上に維持することであるが、空気には通常２４ｖｏｌ％の酸素が含まれているので５〜４５ｖｏｌ％の範囲でメタンを含めての密閉状態下での循環使用に際しても酸素濃度は８ｖｏｌ％以上に維持することが可能である。さらに、内側容器１の大きさや導入口３および排気口４の位置や大きさ、数などは図示の実施例のものに限られず、メタン酸化菌保持担体の製造規模に応じて適宜選定される。また、送風手段６として、本実施例ではシロッコファンを用いているがこれに限られずメタン酸化菌の繁殖に適した送風量を確保できる手段であればどのようなものでも実施可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】水田、手賀沼湿地、農業用水路の河岸湿地から採取した土壌から得られたメタン酸化菌群のメタン分解能力を示すグラフであり、（Ａ）はメタン濃度の変化を、（Ｂ）は二酸化炭素濃度の変化をそれぞれ示す。
【図２】メタン酸化菌群を木炭に付着・繁殖させるための装置の概略図である。
【図３】メタン酸化菌群を付着・繁殖させた木炭のメタン分解能力を示すグラフであり、（Ａ）はメタン濃度の変化を、（Ｂ）は二酸化炭素濃度の変化をそれぞれ示す。
【図４】メタン酸化菌が木炭の孔隙で繁殖しているＳＥＭ写真である。
【図５】分解木炭の重量とメタン分解量との関係を示すグラフである。
【図６】分解木炭によるメタンの分解速度を表すグラフである。
【図７】異なる温度条件下での分解木炭のメタン分解能力を示すグラフである。
【符号の説明】
【００３４】
１  内側容器
２  外側容器
３  導入口
４  排気口
５  メタンを含む空気
６  送風手段
７  還流路
８  メタン酸化菌を含む養液
９  多孔質担体
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図２】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年10月22日(2003.10.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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