(57)【要約】【課題】  本発明は、（ａ）細胞におけるＣＤＫ４Ｉ遺伝子の欠失および（ｂ）多型性を検出する方法に向けられ、前記欠失および多型性は或る種の癌に対する感受性を示す。【解決手段】  ＣＤＫ４Ｉ遺伝子の点突然変異もしくは欠失を検出する方法、生物学的細胞試料におけるＣＤＫ４Ｉタンパク質およびその生物学上活性な断片（総合して「ＣＤＫ４Ｉ」）の検出方法、癌の発生に関連した多型性の検出に基づく特定癌に対する感受性のスクリーニング法を含む。また、他の態様において本発明は、ＣＤＫ４ＩおよびＭＴＡｓｅの両者の遺伝子の多型性もしくは欠失の検出に基づく特定の癌に対する感受性のスクリーニング法と、遺伝子の産物における欠損の検出とを含む。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図７の変異サイクリン依存性キナーゼ阻害物質（ＣＤＫ４Ｉ）ポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列のＣＤＫ４Ｉポリヌクレオチド。
【請求項２】
ヒト細胞集団における前癌性症状又は癌症状を検出する方法であって、ヒトからの生物学的細胞試料中におけるサイクリン依存性キナーゼ阻害物質（ＣＤＫ４Ｉ）の喪失を検出することを含む当該方法。
【請求項３】
ヒト細胞集団における前癌性症状又は癌症状を検出する方法であって、
ヒトからの生物学的細胞試料中におけるサイクリン依存性キナーゼ阻害物質（ＣＤＫ４Ｉ）ポリヌクレオチドの喪失を検出すること、ここで、前記ポリヌクレオチドがないこと又はこのポリヌクレオチドにおける多型が、前記細胞が前癌性症状又は癌症状であり得ることを示すものである；
前記試料においてメチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡｓｅ）をコードするポリヌクレオチドを検出すること、
を含む当該方法。
【請求項４】
ＣＤＫ４Ｉポリヌクレオチドがないことによって、ＣＤＫ４Ｉの機能の喪失が検出される請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
ＣＤＫ４Ｉポリヌクレオチドの配列の一部が欠失している請求項２又は３記載の方法。
【請求項６】
ＣＤＫ４Ｉポリヌクレオチドが少なくとも１つの多型を有する請求項２又は３記載の方法。
【請求項７】
ヒトからの生物学的細胞試料中におけるＣＤＫ４Ｉポリヌクレオチドの喪失を検出すること、ここで、その機能の喪失が、細胞集団の過剰成長を促進しうるものである；
メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡｓｅ）をコードするポリヌクレオチドの喪失を検出すること、
を含む請求項２又は３記載の方法。
【請求項８】
ヒトからの生物学的細胞試料中における少なくとも１つのＣＤＫ４Ｉポリヌクレオチド多型を検出すること、ここで、この多型が、ＣＤＫに対する結合親和性を有するＣＤＫ４Ｉタンパク質のコード化を無能し、細胞集団の過剰成長を促進しうるものである；
メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡｓｅ）をコードするポリヌクレオチドの喪失を検出すること、
を含む請求項２又は３記載の方法。
【請求項９】
ヒトからの生物学的細胞試料中において競合的ＰＣＲによってＣＤＫ４Ｉポリヌクレオチドを検出することを含む請求項２又は３記載の方法。
【請求項１０】
ＣＤＫ４Ｉポリヌクレオチドの喪失が検出される請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＣＤＫ４Ｉの機能の喪失が、少なくとも１つのＣＤＫ４Ｉポリヌクレオチド多型を検出することによって検出され、ここで多型が、ＣＤＫに対する結合親和性を有するＣＤＫ４Ｉタンパク質のコード化を無能し、細胞集団の過剰成長を促進しうるものである請求項９記載の方法。
【請求項１２】
細胞試料が生殖系細胞試料であること請求項２〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記多型が、ＣＤＫに対する結合親和性を有するＣＤＫ４Ｉタンパク質のコード化を無能し、細胞集団の過剰成長を促進しうるものであり、また前記多型がＣＤＫ４Ｉ遺伝子エクソンにおけるヌクレオチド置換または欠失からなる請求項６記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞集団が前癌性症状又は癌症状に見出され、ヒトにおけるその存在が異形成型母斑症候群に関連する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞集団が前癌性症状又は既癌症状に見出され、ヒトにおけるその存在が白血病に関連する請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
ヒトにおける癌症状を検出する方法であって、
ヒトからの生物学的細胞試料中におけるサイクリン依存性キナーゼ阻害物質（ＣＤＫ４Ｉ）及びメチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡｓｅ）を検出し、ここでこの試料が、前悪性細胞又は悪性細胞を含む疑いがあるものである
ことを含む当該方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトにおける或る種の癌に対する感受性を付与する遺伝子異常性の検出に関する。より詳細には本発明は、腫瘍サプレッサをコードする新たに見出された遺伝子における欠失もしくは多型性の検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、或る種の腫瘍の発育は細胞増殖を阻害する遺伝子産物（「腫瘍サプレッサ」）により抑圧されるという理論を裏付ける多くの証拠が拡大している［たとえば非特許文献１参照］。逆に、一般に細胞に存在する腫瘍サプレッサが存在しなければ（たとえば遺伝子欠失に基づき）或いは活性が低ければ（たとえば遺伝子突然変異に基づく）、そうでなければ、抑制されるであろう腫瘍成長は妨害されずに進行する。しかしながら、或る種の腫瘍の成長は腫瘍サプレッサ発現遺伝子の欠失に関連することが積極的に示されているが、同じ遺伝子における突然変異が異常な細胞増殖を生ぜしめることはまだ示されていない。
【０００３】
真核性細胞の成長サイクルは、サイクリン依存性キナーゼ（「ＣＤＫ」）として知られるプロテインキナーゼファミリーにより調整される。図１に示したように、サイクリンおよびその関連ＣＤＫは、細胞を有糸分裂期（Ｍ）での分裂を導く成長サイクルの３つの期間（それぞれＧ1 、ＳおよびＧ2 ）に移動させる。細胞増殖における役割が現在まで最も明瞭に規定されているサイクリン／ＣＤＫ複合体はサイクリンＤ／ＣＤＫ酵素であって、Ｇ1 成長サイクル期の進行を支援すると思われる。これら酵素のうちサイクリンＤ１はオンコジーンであると思われ、その過剰発現はキナーゼの連続産生を介し過度の細胞分裂を刺激し、したがってたとえば乳癌および食道癌の発達に関与する。サイクリンＤ１は、ｐ２１として知られるタンパク質と細胞核抗原とで構成されるマルチタンパク質複合体の一部分としてＣＤＫ４により特異的に結合される。
【０００４】
この種のサイクリン／ＣＤＫ過剰発現の公知阻害物質は腫瘍サプレッサタンパク質ｐ５３および網膜芽細胞（Ｒｂ）遺伝子のタンパク質産生物を包含する。最近、他の推定阻害物質（ｐ１６）が単離され、この阻害物質のためのｃＤＮＡがセラノ等により部分的に配列決定された［非特許文献２］。著者等は、ｐ１６がＣＤＫ４を結合してＣＤＫ４／サイクリンＤ酵素の活性を阻害することを示した。ｐ１６が或る種のＲｂ成長サイクルタンパク質のＣＤＫ／サイクリンＤによるリン酸化を妨げることを示すデータに基づき、著者等はｐ１６がＲｂの上流および下流にてインビボで作用して細胞増殖を調整するネガティブフィードバックループを形成することを提唱している。
【０００５】
しかしながら、上記非特許文献２では、ｐ１６と特定癌の発生もしくは阻害との関連については何も示唆されず、ｐ１６をコードする遺伝子のゲノム構造に関し何らの情報も開示されていない。
【非特許文献１】マルクス(Marx)、Science 、第２６３巻、第３１９〜３２０頁（１９９４）
【非特許文献２】Nature、第３６６巻、第７０４〜７１０頁（１９９３）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記セラノ等の論文が刊行される前、本発明者等は腫瘍サプレッサ遺伝子（以下「ＣＤＫ４Ｉ」と称する）を見出し、そのゲノム構造（配列番号１〜２参照）を同定した。非悪性細胞にてＣＤＫ４Ｉは染色体９ｐ２１に対してマップされ、メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡｓｅ）の遺伝子に物理的に隣接する（図４（ｂ）参照）。ＭＴＡｓｅのための遺伝子の欠失またはその突然変異から生ずるＭＴＡｓｅ欠損は、或る種の癌の発生に直接関係することが示されている［ノボリ等、Cancer Res.、第５３巻、第１０９８〜１１０１頁（１９９３）参照］。その開示を癌発達におけるＭＴＡｓｅの役割に関する引例として援用する。また、配列番号１４、すなわちゲノムＭＴＡｓｅのヌクレオチド配列を参照のこと) 。
【０００７】
現在までＣＤＫ４Ｉを欠如し或いはＣＤＫ４Ｉ遺伝子の突然変異もしくは再編成（総合して「多型性」）を有すると同定されている全腫瘍細胞の約半数は、ＭＴＡｓｅを欠如する。さらに本発明者等は、或る種の癌を有する患者の腫瘍細胞に存在するＣＤＫ４Ｉ遺伝子における突然変異をも同定した。したがって本発明は、（ａ）細胞におけるＣＤＫ４Ｉ遺伝子の欠失および（ｂ）多型性を検出する方法に向けられ、前記欠失および多型性は或る種の癌に対する感受性を示す。
【０００８】
より詳細には、ある態様において本発明は、ＣＤＫ４Ｉ遺伝子の点突然変異もしくは欠失を検出する方法を含む。この種の方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイ、一本鎖コンフォーメーション多型性のゲル電気泳動、直接的配列決定および制限エンドヌクレアーゼ切断を包含する。ＣＤＫ４Ｉ遺伝子欠失の検出は好ましくは独特な競合性ＰＣＲ技術によって行われる。
【０００９】
他の態様において本発明は、生物学的細胞試料におけるＣＤＫ４Ｉタンパク質およびその生物学上活性な断片（総合して「ＣＤＫ４Ｉ」）の検出方法を含む。
他の態様において本発明は、癌の発生に関連した多型性の検出に基づく特定癌に対する感受性のスクリーニング法をも含む。
他の態様において本発明は、ＣＤＫ４ＩおよびＭＴＡｓｅの両者の遺伝子の多型性もしくは欠失の検出に基づく特定の癌に対する感受性のスクリーニング法と、遺伝子の産物における欠損の検出とを含む。
他の態様において本発明はゲノムＣＤＫ４Ｉ、ＣＤＫ４Ｉ遺伝子の発現産物、ＣＤＫ４Ｉおよびその断片、並びにＣＤＫ４Ｉ遺伝子発現産物、ＣＤＫ４ＩおよびＣＤＫ４Ｉ断片を特異的に結合する抗体をも含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
Ｉ．  ゲノムＣＤＫ４Ｉの同定および特性化
ここに添付する配列リストにおいて、ヒトＣＤＫ４Ｉ遺伝子の全長ゲノムヌクレオチド配列を配列番号１および２に示す（さらに図２（ａ〜ｂ）に再掲する）。配列番号３〜５はＣＤＫ４Ｉ遺伝子エクソンのヌクレオチド配列を含む。これらエクソンには図２（ａ〜ｂ）にて下線を施し、したがって各エクソン（以下「ＣＤＫ４Ｉ’」、「ＣＤＫ４Ｉ３’」および「ＣＤＫ４Ｉ５’」）間の境界、並びに遺伝子の各イントロンを示す。ＣＤＫ４Ｉ’エクソンは、発現されたＣＤＫ４Ｉタンパク質の構造安定性に寄与すると思われる４個の逆方向繰り返しのパリンドローム領域を有する。報告されたｐ１６ｃＤＮＡ配列（セラノ(Serrano) 等、Nature、上記）に対する比較は、報告された配列が大腸菌(E.Coli)のタンパク質をコードする領域を有し、また、ＣＤＫ４Ｉ遺伝子とは数個の塩基対だけ５’領域にて相違することを示し、５’コード化領域の中間に停止コドンを形成する１つ間違ったヌクレオチドを含む［図３に含まれる比較参照；ゲノムＣＤＫ４Ｉの該当部分を下側ラインに沿って示し、セラノ等の部分配列（５’領域）を上側ラインに沿って示す。これら配列における相違を縦線がないことにより示す］。
【００１１】
ゲノムＣＤＫ４Ｉを下記するように同定および特性化した。ＣＤＫ４Ｉ遺伝子はＭＴＡｓｅの座とα−インターフェロン（「ＩＮＦ−α」）遺伝子クラスターの座との間の染色体９ｐ上に存在すると思われた。この位置は、染色体９ｐに欠失を伴う多くの悪性細胞株がＭＴＡｓｅを欠如し或いはＩＮＦ−αのヘミ接合型もしくはホモ接合型の欠失を有するという事実により示唆される。特にＩＮＦ−α座に対し動原体的であるＴ９８Ｇ膠腫細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ  １６９０）で同定された小９ｐ欠失はＣＤＫ４Ｉのための可能性のある位置として注目された。
【００１２】
実施例１に一層詳細に説明するように、ＣＤＫ４Ｉの推定位置をＭＴＡｓｅｃＤＮＡで探索した。これはヒト胎盤λファージライブラリをプローブ処理するために用いられた（配列番号５はＭＴＡｓｅのゲノムヌクレオチド配列を含む；ＡＴＣＣ受託番号５５５３６〜５５４０号をも参照）。２キロベースＨｉｎｄＩＩＩ断片（ＭＴＡｓｅ  クローン７−２；ＡＴＣＣ受託番号５５５４０号）から開始して、染色体歩行を行い、その後のλファージライブラリのスクリーニングによって、Ｔ９８Ｇ細胞内の欠失領域を包含するクローンを単離した。ＭＴＡｓｅ遺伝子座とＩＮＦ−α遺伝子座との間における染色体９ｐ２１の領域を、Ｔ９８Ｇにおける欠失セグメントに注目して配列決定した。この配列を図４（ａ）に示す。
【００１３】
４５種の癌細胞株をスクリーニングして、推定の腫瘍サプレッサ遺伝子および図４（ａ）で同定された領域における他の部位での欠失頻度を決定した。このアッセイから得られたデータを図８に示す。２種の最も頻繁に欠失した部位からのイントロンを配列標識部位（ＳＴＳ）５４ＦおよびＳＴＳ  ５ＢＳとして図４（ｂ）に同定した。これらの部位は５０キロベース領域で離れている。各プローブはＳＴＳ  ５４ＦおよびＳＴＳ  ５ＢＳ（配列番号６〜７）の間の５０キロベース領域の部分に特異的に結合するよう設計した。最も頻繁に欠失した領域を１９キロベースλファージクローン（１０Ｂ１−１０）により同定した（図４（ａ）参照）。実施例１に説明するように、ＣＤＫ４Ｉ遺伝子はクローン１０Ｂ１〜１０（ＣＤＫ４Ｉ３’およびＣＤＫ４Ｉ’）並びに関連クローン１０Ａ１（ＣＤＫ４Ｉ５’）に対応する染色体９の領域に存在するとわかった。
【００１４】
ＣＤＫ４Ｉ遺伝子は、１９９４年４月１４日付けで寄託されて受託番号 を受けたアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（「ＡＴＣＣ」）に対する寄託物における２種の大腸菌株（それぞれ１０Ｂ１−１０および１０Ａ１を有する）に含まれる。しかしながら、本発明の開示に、この寄託物を必要とすると言う要請は認められない。
【００１５】
図２および配列番号３〜５に示したように、ＣＤＫ４Ｉ遺伝子のＣＤＫ４Ｉエクソンは３０６塩基対のオープンリーディングフレームを有し、ＣＤＫ４Ｉ３’エクソンはＣＤＫ４Ｉのコード化領域における最後の１５塩基対に対応する短いオープンリーディングフレームを有し、さらにＣＤＫ４Ｉ５’エクソンは１３９塩基対のオープンリーディングフレームを有する。
【００１６】
ＩＩ．  癌細胞株におけるＣＤＫ４Ｉ遺伝子の欠失頻度
多くの癌は家族性に密集する。たとえば米国にて年間に診断される約３０，０００種の皮膚黒色腫の新たな症例のうち、約５〜１０％が家族性に由来する［キャノン−アルブライト(Cannon-Albright) 等、Science 、第２５８巻、第１１４８〜１１５２頁参照］。家族性黒色腫の位置は染色体９ｐ２１、すなわち散発性黒色腫で再現的に欠失する領域として従来同定されている［ファウンテン(Foutain)等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.、第８９巻、第１０５５７〜１０５６１頁（１９９２）］。さらに、たとえば紫外線に対する露出および喫煙のような環境因子も先の症例における黒色腫、並びに肺、膀胱、頭部、首および喉頭の各癌の発達の主たる危険因子と同定されている。たとえば染色体９ｐ２１の異常は肺癌細胞にて極めて一般的である［ノボリ(Nobori)等、Cancer Res. 、第５３巻、第１０９８〜１１０１頁（１９９３）］。
【００１７】
実施例ＩＩに説明するように、ＣＤＫ４Ｉ遺伝子が既知の癌細胞株に存在するか或いはそこから欠失しているかどうかを判定するため、ＣＤＫ４Ｉ遺伝子に対応するプローブを用いて上記４５種の癌細胞株を再スクリーニングした。このアッセイの結果を図９に示す（ハイブリダイゼーションブロットによる）。参考のためＭＴＡｓｅ、ＩＮＦ−αおよびＩＮＦ−β遺伝子、並びに染色体９における３．２１、２Ｆ、５４Ｆ、７１Ｆおよび３．３Ｂの各領域に対応するプローブ（図４（ｂ）および図５参照）を用いて、同じ細胞株におけるこれら領域の存在につきスクリーニングした。試験した全ての遺伝子の領域に関する本アッセイの完全な結果を下表１に欠失％によって示し、黒色腫の６１％、膠腫の８７％、非小型肺細胞癌の３６％および白血病の６４％がＣＤＫ４Ｉ遺伝子のホモ接合欠失を有すると同定された。これらデータは、ヒト細胞が黒色腫、膠腫および白血病の大部分にて並びに非小型細胞肺癌の１／３以上において、欠失もしくは再編成した単一のＣＤＫ４Ｉ遺伝子を有することを示す。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
ＩＩＩ．  腫瘍細胞におけるＣＤＫ４Ｉ遺伝子の点突然変異の頻度および同一性
上記背景にて検討したように、腫瘍サプレッサｐ５３をコードする遺伝子は或る種の癌で欠失して、妨害されない細胞増殖を起こすことが判明した。理論的に、腫瘍サプレッサをコードする遺伝子がこのサプレッサの活性を相殺する多型性を有すれば、腫瘍はサプレッサをコードする遺伝子の欠失がなくても、経時的に発達し得る。ＣＤＫ４Ｉ遺伝子の特定例において、染色体９ｐ２１におけるその存在は、遺伝子の欠失および多型性の両方が特定の家族性および環境の各癌の発生に関与し得ることを示唆する。
【００２０】
より詳細には、ＣＤＫ４に結合して、阻害する際のＣＤＫ４Ｉの役割は、過剰レベルのキナーゼが、ＣＤＫ４を阻害するＣＤＫ４Ｉの能力を相殺するＣＤＫ４Ｉ遺伝子の欠失もしくは多型性を有する細胞内で見出されると予想しうることを示す。したがって、ＣＤＫ４Ｉ遺伝子の欠失は前癌性もしくは悪性を示唆する一方、遺伝子における多型性（特に９ｐ２１−関連癌の家族性を有する人間の生殖系細胞における多型性）は「癌症状」（すなわちＣＤＫ４の過剰細胞レベルに起因する症状）を発生する感受性を示唆する。
【００２１】
最も広義において本発明は、診断もしくは治療適性におけるＣＤＫ４Ｉ標的核酸配列の多型性または欠失を可能にし、ここで標的核酸配列はたとえば光学顕微鏡の治療を用いて組織病理学検査を受けたような生物学的細胞試料（たとえば一次腫瘍もしくは局部的リンパ結接の境界部）に存在する。たとえば標的核酸配列は突然変異ヌクレオチド、制限断片長さ多型性（ＲＦＬＰ）、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド置換またはこの種の組織試料にて対象となる他の哺乳動物の核酸配列とすることができる。ここで用いる標的ＣＤＫ４Ｉヌクレオチド配列に適用される「多型性」という用語は突然変異制限断片長さ多型性、核酸欠失または核酸置換を包含すると了解すべきである。
【００２２】
たとえば家族性黒色腫（特に異形成母斑症候群）に罹患したと診断されたヒト患者からの細胞は、ＣＤＫ４Ｉ  ｍＲＮＡの１６６位にナンセンス突然変異（すなわちＣ→Ｔ移行）を有すると同定された。さらに、既知の白血病細胞株（Ｕ９３７；ＡＴＣＣ受託番号１５９３）からの細胞をスクリーニングして、ＣＤＫ４Ｉ５’エクソンに１８塩基対の遺伝子内微小欠失を有することが判明した（図７および実施例ＶＩ参照）。配列番号１〜２に含まれる情報および当業界で周知であり、本文で説明される遺伝子の点突然変異を同定する技術を用いて、当業者は、特定の９ｐ２１関連腫瘍からの細胞試料をＣＤＫ４Ｉの再現可能な多型性および／または欠失につきスクリーニングして、上記癌症状に対する遺伝的感受性および存在を判定することができる（特に黒色腫、膠腫、非小型細胞肺癌および白血病）。
【００２３】
欠失および多型性の場合、この情報を用いて前癌症状または現存する癌症状を診断することができる。さらに、人体における別々の位置でおよび／または経時的に、欠失もしくは多型性を生じまたは獲得した連続する細胞試料中の細胞数を定量することにより、癌症状の進行をモニタすることもできる。同様に、欠失もしくは多型性が未だに癌症状が発症していない患者（特に生殖系細胞に異常性を有するおよび／または特定癌症状の家族歴を有する者）に見られる場合、欠失もしくは多型性は癌症状を発生する遺伝的感受性の指標となる。このような感受性はさらに、もしあるならば、患者の家族歴における癌罹患率および他の危険因子の存在（たとえば環境因子へ晒されること、並びに患者がさらにＭＴＡｓｅの遺伝子が欠失している細胞を有するかどうか）の存在に関する情報に基づいて定性的に評価することもできる。
この目的で好適診断技術につき下記に説明し、その使用につき後記の実施例で例示する。
【００２４】
ＩＶ．  ＣＤＫ４Ｉ遺伝子における欠失および多型性の検出方法
生物学的細胞試料に存在する検出可能な量の遺伝子を産生させるには、一般にＣＤＫ４Ｉ遺伝子の増幅が必要とされる。たとえば生殖系細胞の試料（たとえば血液、皮膚もしくは毛髪小泡から）または悪性もしくは前癌性病巣における体細胞の試料（たとえば組織バイオプシー、啖もしくは尿試料から）を包含する液体もしくは組織試料を生物学的試料とする。増幅の後、点突然変異はたとえば直接的配列決定または１つの塩基対の変化を検出することができる条件下でのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのような当業者に知られた手段により検出することができる。さらに、一本鎖コンフォーメーション多型性のゲル電気泳動（「ＳＳＣＰ」として当業界で知られる；たとえばオリタ(Orita) 等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.、第８６巻、第２７６６〜２７７０頁（１９８９）参照］、二本鎖ＤＮＡの間のミスマッチを検出するヘテロデュープレックス分析（この方法に適するキットはAT Biochem. of Malvern、ＰＡにより販売される「ＭＤＥヘテロデュープレックス  キット」がある）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ［たとえばウー(Wu)等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.、第８６巻、第２７５７〜２７６０頁参照］および制限断片長さ多型性分析［「ＲＦＬＰ」として当業界で知られる；たとえばノールトン(Knowlton)等、Nature、第３１８巻、第３８０〜３８２頁（１９８５）参照］のための技術も適している。ＣＤＫ４Ｉ遺伝子における多型性を検出するためのこれら技術の適用例を以下に示す。一層詳細には、先の説明で挙げた引例の開示を援用して本文の一部とする。
【００２５】
ＣＤＫ４Ｉ遺伝子のホモ接合型欠失の検出は、下記に例示する公知のＰＣＲ技術により容易に検出することができる。しかしながら、ＣＤＫ４Ｉ遺伝子につきヘミ接合型とすることも可能であり、この場合は各エクソンに対する遺伝子投与量分析を行う。当業界で知られた定量的ＰＣＲ技術を用いて、この分析を行うことができる。好適技術は下記するようにコーサカ(Kohsaka) 等、Nuc.Acids Res.、第２１巻、第３４６９〜３４７２頁（１９９３）に記載されている。ＣＤＫ４Ｉ遺伝子における点突然変異を検出する好適技術の使用を示す例を以下に参考のため示し、コウサカ等の論文および上記に挙げた同時出願の開示を援用して本文の一部とする。
【００２６】
ＣＤＫ４Ｉ遺伝子の欠失および多型性を検出するための定性的ＰＣＲを行うのに最も好適な方法は、以下説明しかつコウサカ等（上記）に記載されたＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ技術の使用を含む。この種のＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ法が感度および簡便のため好適であるが、当業者は他の適するＰＣＲ分析を十分に知り、または容易に確認しうるであろう［たとえば「ＰＣＲ法」、イニス(Innis) 等編、アカデミック・プレス社（１９９０）に記載］。
【００２７】
Ａ．  ＰＣＲおよびＰＣＲ系分析に使用する一般的方法
検出前にＣＤＫ４Ｉ標的ヌクレオチド配列、たとえば多型性を有するＣＤＫ４Ｉヌクレオチド配列を増幅することを所望する場合、これは増幅用のプライマーであるオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。これら独特のオリゴヌクレオチドプライマーは、多型性を有するＣＤＫ４Ｉヌクレオチド配列に隣接する整列領域の同定に基づいている。
【００２８】
一般に、ＰＣＲ系アッセイに使用するプライマーは、プライマーを用いる反応に対して厳密な条件下で、標的核酸を含有する有意な量の核酸分子の重合を特異的に開始させるのに、充分な長さおよび適する配列を持ったオリゴヌクレオチドを包含する。このようにして、対象となる核酸を持った特定の標的核酸配列を選択的に増幅することができる。特に、ここで用いる「プライマー」という用語は２個もしくはそれ以上（好ましくは少なくとも８個）のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなる配列を意味し、この配列は標的となる核酸のストランド（鎖) に対し実質的に相補性であるプライマー伸長産物の合成を開始することができる。オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には１５〜２２個もしくはそれ以上のヌクレオチドを含有するが、それ以下のヌクレオチドを含有することもでき、ただしプライマーは特に所望の標的ヌクレオチド配列の増幅のみを実質的に可能にするのに充分な特異性を有するものとする（すなわちプライマーは実質的に相補性である）。
【００２９】
合成を行う実験条件はヌクレオシド三リン酸および重合用試薬、たとえばＤＮＡポリメラーゼの存在、並びに好適な温度およびｐＨが含まれる。好ましくはプライマーは最大の増幅効率のため一本鎖とするが、二本鎖とすることもできる。二本鎖の場合は、先ず最初にプライマーを処理して各ストランドを分離させた後、伸長産物を作製するために使用する。好ましくはプライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。重合誘発剤の存在下で伸長産物の合成を開始させるために、プライマーは充分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは多くの因子、たとえば温度、緩衝剤およびヌクレオチド組成に依存する。
【００３０】
本発明のＰＣＲ系アッセイに使用するためのプライマーは、増幅すべき突然変異ヌクレオチド配列の各ストランドに対し「実質的」に相補的となるよう設計される。実質的に相補的という用語は、プライマーがその各ストランドに対し重合用薬剤が機能しうる条件下でハイブリダイズするよう充分な相補性を持たねばならないことを意味する。換言すれば、プライマーはハイブリダイズするのに充分な整列（フランキング）配列との相補性を有し、突然変異ヌクレオチド配列を増幅させるべきである。好ましくは、延長されるプライマーの３’末端は相補性整列ストランドに対し完全に塩基対相補性を有する。
【００３１】
本発明により使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸を増加させて生成する任意の増幅法で用いられる。典型的には一方のプライマーを突然変異ヌクレオチド配列のマイナス（−）ストランドに対し相補性にすると共に、他方のプライマーをプラス（＋）ストランドに対し相補性にする。変性した核酸に対してプライマーをアニーリングして、酵素たとえばＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ）またはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのラージ断片およびヌクレオチドもしくはリガーゼを用いて伸長することにより、標的核酸を含有する新たに合成された＋および−ストランドが得られる。これら新たに合成された核酸もテンプレートであるため、変性、プライマーアニーリングおよび伸長の繰り返しサイクルの結果、プライマーにより規定される領域（すなわち標的突然変異ヌクレオチド配列）の対数的な生成が得られる。増幅反応の産物は、用いた特定プライマーの端部に対応する各末端を持った個々の核酸デュープレックスである。当業者は、標的核酸のコピー数を増大させるべく用いうる他の増幅法を分かるだろう。
【００３２】
本発明に使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーは、全ての好適な方法、たとえば慣用のホスホトリエステルおよびホスホジエステル法もしくはその自動化形態を用いて作製しうる。この種の自動化形態では、ボウケージ(Beaucage)等［Tetrahedron Letters 、第２２巻、第１８５９〜１８６２頁（１９８１）］により記載されたように、ジエチルホスホルアミダイトを出発物質として使用し、合成することができる。改良固相支持体にてオリゴヌクレオチドを合成する方法の１つが米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。本発明により使用することができる増幅法の１つはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であって、米国特許第４，６８３，２０２号および第４，６８３，１９５号に記載されている。
【００３３】
精製形態または非精製形態の全ての生物学的細胞試料からの核酸を、出発核酸として用いることができる。ただしこれは標的核酸を含有する特定の核酸配列を含むかまたは含むと思われるものとする。従ってこの方法は、たとえばＤＮＡまたは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むＲＮＡを用いることができ、ここでＤＮＡまたはＲＮＡは一本鎖もしくは二本鎖としうる。ＲＮＡをテンプレートとして使用すべき場合は、ＤＮＡまでテンプレートを逆転写するのに最適な酵素および／または条件を用いることができる。さらに、それぞれの１ストランドを有するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを用いることもできる。核酸の混合物も使用することができ、或いは前の増幅反応で同一もしくは異なるプライマーを用いて生成された核酸も使用することができる。増幅すべき突然変異ヌクレオチド配列は大型分子のフラクションとすることができ、或いは最初に個々の分子として存在させて特定配列を全核酸で構成することもできる。増幅すべき配列を最初に純粋な形で存在させることは必ずしも必要でない；これは、全ヒトＤＮＡに含有されるような複合混合物の小フラクションとすることもできる。
【００３４】
試料の標的腫瘍性(neoplastic)ヌクレオチド配列が２本のストランドを含有する場合は、テンプレートとして使用する前に核酸の各ストランドを分離させることが必要である。ストランド分離は別途の工程として或いはプライマー伸長産物の合成と同時に行うことができる。このストランド分離は種々の好適な変性条件、たとえば物理的、化学的もしくは酵素的手段を用いて行うことができる。「変性」という用語はこれら全ての手段を包含する。核酸ストランドを分離する１つの物理的方法は、核酸を変性するまで加熱することを含む。典型的な加熱変性は約８０〜１０５℃の範囲の温度および約１〜１０分間の範囲の時間を含む。ストランド分離はさらに、ヘリカーゼとして知られた種類の酵素から得られた酵素またはヘリカーゼ活性を有する酵素ＲｅｃＡによって、また、ＤＮＡを変性させることが知られているリボＡＴＰの存在下で、誘発させることもできる。ヘリカーゼによる核酸のストランド分離に適する反応条件はクーン・ホフマン−ベルリング(Kuhn Hoffmann-Berling) 、CSH-Quantitative Biology、第４３巻、第６３頁（１９７８）に記載され、さらにＲｅｃＡの使用技術はＣ．ラジング(Radding) 、Ann.Rev.Genetics、第１６巻、第４０５〜４３７頁（１９８２）］に記載されている。
【００３５】
増幅すべき標的核酸を含有する核酸が一本鎖であれば、１種もしくは２種のオリゴヌクレオチドプライマーを添加して相補体を合成する。単一プライマーを使用する場合は、プライマー伸長産物をプライマーと重合用試薬と後述する４種のヌクレオシド三リン酸との存在下で合成する。この産物は一本鎖核酸に対し相補性であり、一本鎖核酸とハイブリダイズして、不揃いな長さのストランドの二重物（デュープレックス）を形成する。これは、次いで一本鎖に分離して２本の分離された単一相補性ストランドを生成しうる。或いは、２種のプライマーを一本鎖核酸に添加して、反応を上記のように行うこともできる。
【００３６】
核酸の相補性ストランドを分離する場合は、核酸が最初に二本鎖であるか或いは一本鎖であるかに拘らず、分離されたストランドは直ちにさらに核酸ストランドを合成するためのテンプレートとしてすぐにでも用いられる。この合成はプライマーをテンプレートにハイブリダイズさせることができる条件下で行われる。一般に合成は緩衝水溶液にて、好ましくは７〜９、特に好ましくは約８のｐＨにて行われる。好ましくは過剰モル（ゲノム核酸に対して一般に約１０8 ：１のプライマー：テンプレート）の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、分離されたテンプレート鎖を含有する緩衝液に添加する。しかしながら本発明の方法を診断用途に使用する場合は相補性ストランドの量はわかっていなくても良く、相補性ストランド量に対するプライマー量は正確に決定することができなくても良い。しかしながら実用上、プライマーの添加量は一般に、増幅すべき配列が複雑な長鎖の核酸ストランドの混合物に含有される場合は、相補性ストランド（テンプレート）の量よりも過剰モルとする。この方法の効率を向上させるには、かなりの過剰モルであることが好適である。
【００３７】
幾つかの増幅具体例においては、基質、たとえばデオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを合成混合物に別々に或いはプライマーと一緒に充分量で添加し、得られた溶液を約９０〜１００℃まで約１〜１０分間、好ましくは１〜４分間にわたり加熱する。この加熱時間の後、溶液を室温まで冷却させる。この温度はプライマーハイブリダイゼーションに好適である。冷却混合物にプライマー伸長反応を行うのに適する薬剤（ここでは「重合用薬剤」と称する）を添加し、反応を当業界で知られた条件下で行わせる。重合用薬剤は、熱安定性であれば他の試薬と一緒に添加することもできる。この合成（もしくは増幅）反応は室温から重合用薬剤がもはや作用しない温度に至る範囲で行うことができる。したがって、たとえばＤＮＡポリメラーゼを薬剤として使用する場合、温度は一般に約４０℃以下である。
【００３８】
重合用薬剤は、プライマー伸長産物の合成を行うよう機能する任意の化合物もしくはシステムとすることができ、酵素が含まれる。この目的に適する酵素はたとえば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、他の入手しうるＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼムテイン、逆転写酵素、リガーゼおよび他の酵素、たとえば熱安定性酵素（すなわち変性が生じるように充分に高くされた温度に付された後、プライマー伸長を行うような酵素）を包含する。適する酵素は適切にヌクレオチドの結合を容易化させて、各突然変異ヌクレオチド鎖に対し相補性であるプライマー伸長産物を形成する。一般に合成は各プライマーの３’末端で開始され、テンプレート鎖に沿って５’方向に合成が終了するまで進行して種々異なる長さの分子を生成する。しかしながら、合成を５’末端で開始させると共に他方向に進行する上記と同じ方法を用いる重合用薬剤も存在する。いずれにせよ、本発明の方法はここに説明した増幅の具体例のみに限定されない。
【００３９】
新たに合成された突然変異ヌクレオチド鎖およびその相補的核酸ストランドは上記ハイブリダイゼーション条件下で二本鎖分子を形成し、このハイブリッドをその後の工程で使用する。次の工程にて、新たに合成された二本鎖分子を、上記した任意の方法を用いて一本鎖分子を生成させるために変性条件に付す。
【００４０】
上記過程を一本鎖分子につき反復する。重合用の他の薬剤、すなわちヌクレオシドおよびプライマーを必要に応じ添加して上記条件下で反応を進行させることができる。この場合も合成は各オリゴヌクレオチドプライマーの一端で開始して、１つのテンプレート鎖に沿って進行し、さらに核酸を得る。この工程の後、伸長産物の半数は、２つのプライマーが結合した特定核酸配列で構成される。
【００４１】
変性および伸長産物合成の各工程は、必要とされるたびに繰り返されて、検出に必要な程度まで標的突然変異ヌクレオチド配列を増幅することができる。生成される突然変異ヌクレオチド配列の量は対数的に蓄積する。
【００４２】
増幅された産物は、放射性プローブを用いることなくサザン・ブロット分析により検出することができる。この種の方法においては、たとえば極めて低レベルの突然変異ヌクレオチド配列を含有するＤＮＡのわずかな試料を増幅させ、サザン・ブロッティング技術によって分析する。非放射性プローブもしくは標識の使用は、高レベルの増幅シグナルによって容易化される。
【００４３】
本発明の方法で検出された突然変異を有する核酸に対して、溶液にて或いは固相支持体に結合させた後に、たとえばＰＣＲ、オリゴマー制限［サイキ（Saiki)等、Bio/Technology、第３巻、第１００８〜１０１２頁（１９８５）］、対立遺伝子特異性オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ分析［コナー(Conner)等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.、第８０巻、第２７８頁（１９８３）］、オリゴヌクレオチド連結分析（ＯＬＡｓ）［ランデグレン(Landegran) 等、Science 、第２４１巻、第１０７７頁（１９８８）］などの特定ＤＮＡ配列の検出につき一般に用いられる任意の方法により、さらに評価、検出、クローン化、配列決定などを行うことができる。ＤＮＡ分析のための分子技術についても検討されている［ランデグレン等、Scinece 、第２４１巻、第２２９〜２３７頁（１９８８）］。
【００４４】
Ｂ．  標識プローブを用いたハイブリダイゼーション
本発明の他の診断方法においては、介入配列または１０〜５０塩基対のオリゴヌクレオチド配列を有する精製された核酸断片を放射能標識する。標識された調製物を使用して、サザン・ハイブリダイゼーション技術により生物学的細胞試料からの核酸をプローブ処理する。増幅前もしくは増幅後の生物学的試料からのヌクレオチド断片を異なる分子量の断片までゲル電気泳動によって分離し、核酸を結合するフィルタに移す。標的核酸配列を含有するヌクレオチド断片にハイブリダイズする標識プローブに晒した後、標的核酸断片に対する放射性プローブの結合をオートラジオグラフィ［Genetic Enfineering 、第１版、ロバート・ウィリアムソン、アカデミック・プレス（１９８１）、第７２〜８１頁参照］により同定する。或いは、試料からの核酸を直接結合させ、対象となる配列を含む核酸に結合することによって、放射性プローブをこのフィルタに選択的に付着させることができる。特定配列および結合程度は放射能放出を直接に計測して定量される。
【００４５】
標的核酸が増幅されない場合は、適するハイブリダイゼーションプローブを用いる検出を分離された哺乳動物核酸において直接に行いうる。標的核酸が増幅されるような場合は、適するハイブリダイゼーションプローブを用いた検出を増幅の後に行う。
本発明のプローブは、検出される特定断片の分布および特定の強結合の（ハイブリダイズしている）配列の発生を決定するためのプローブの定量的（相対的）結合程度の検査に用いることができ、したがって、個人が家族性黒色腫のような癌症状に対する低い危険性または高い危険性となる傾向が示される。
【００４６】
大抵の場合、プローブは原子もしくは無機のラジカルで検出可能に標識され、これには最も一般的には放射性核を用いるが、重金属も使用することができる。都合上、放射性標識を用いることができる。放射性標識は32Ｐ、 125Ｉ、 3Ｈ、14Ｃ、 111Ｉｎ、 99mＴｃなどを包含する。充分なシグナルを与えると共に充分な半減期を有する任意の放射性標識を用いることができる。他の標識は、標識されたリガンドにつき特異的結合対メンバーとして作用しうるリガンドなどを包含する。免疫分析に一般的に用いられる広範な種類の標識を本発明の分析に容易に用いることができる。
【００４７】
標識の選択は、ハイブリダイゼーションの速度および標的ヌクレオチド配列へのプローブの結合に対する標識の作用によって支配される。標識は、ハイブリダイゼーションに有効な標的ヌクレオチド配列の量を検出するのに充分な感度を与えることが必要である。他の配慮はプローブの合成の容易さ、機器の入手性、自動化の可能性、利便性などである。
標識をプローブに結合させる方法は、標識の性質に応じて変化する。放射性標識の場合、広範な種類の技術を用いることができる。32Ｐ−ｄＮＴＰを用いたニックトランスレーションまたはアルカリホスファターゼを用いた末端リン酸加水分解に続く放射性32Ｐでの32Ｐ−ＮＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いる標識が一般的に用いられる。或いは、存在する元素の１種もしくはそれ以上が放射性同位元素で置換されたヌクレオチド、たとえば水素をトリチウムで置換されたヌクレオチドを合成することもできる。所望ならば、相補的な標識済ストランドをプローブとして用いることにより、ハイブリダイズされる標識の濃度を増大させることもできる。
【００４８】
他の放射性ヌクレオチド標識を含む場合は、各種の連結基を用いることができる。末端ヒドロキシルを無機酸、たとえば32Ｐリン酸塩もしくは14Ｃ有機酸でエステル化したり、或いは各連結基を標識に付与するようエステル化することができる。或いは、中間体塩基を活性化可能な連結基で置換し、次いでこれを標識に結合させることもできる。
レポータ基としての対象の酵素は主としてヒドロラーゼ、特にエステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシドレダクターゼ、特にペルオキシダーゼである。蛍光性化合物はフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンジル、ウムベリフェロンなどを包含する。化学発光剤はルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン（たとえばルミノール）を包含する。
【００４９】
このプローブを用いて、水不溶性の多孔質支持体に固体されたヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることができる。核酸の供給源に応じ、核酸を支持体に固定させる方法を変更しうる。当業者は、本発明の方法に使用しうる種々異なる支持体を既に知っており或いは容易に確認することができる。
【００５０】
生物学的細胞試料からの核酸をクローン化させ、次いでフィルタ上にスポット化もしくは広げて複数の個々の部分（プラーク）を得る。フィルタは不活性な多孔質固体支持体、たとえばニトロセルロースである。試料に存在する如何なる細胞（もしくはファージ）をも処理して、その核酸を放出させる。核酸の溶解および変性、並びにその後の洗浄は、細胞を溶解し、核酸を変性するのに充分な時間にわたり適する溶液で行うことができる。溶解には溶解緩衝液について既述ような化学溶解が便利に用いられる。他の変性作用因子には、高温度、有機試薬、たとえばアルコール、アミド、アミン、尿素、フェノールおよびスルホキシドまたは或る種の無機イオン、たとえばチオシアンネートおよび過塩酸が含まれる。
【００５１】
変性の後、フィルタを水性緩衝溶液、たとえば一般に約６〜８のｐＨであり、通常ｐＨ７のトリスで洗浄する。１回もしくはそれ以上の洗浄を行うことができ、便利には溶解および変性に用いられた場合と同じ手順を用いる。溶解、変性および洗浄が行われた後、核酸をスポットしたフィルタを、高温度、一般に約５０〜７０℃で乾燥させる。この過程で、核酸は所定位置に固定され、都合よければプローブを用いてアッセイすることができる。
【００５２】
プレハイブリダイゼーションは、フィルタをプローブなしのハイブリダイゼーション溶液と共に若干高められた温度にてフィルタをすっかり濡らすのに充分な時間にわたりインキュベートすることにより行うことができる。各種のハイブリダイゼーション溶液を用いることができ、これは約２０〜６０容量％、好ましくは３０％の不活性な極性有機溶剤を含む。一般的なハイブリダイゼーション溶液は約５０％のホルムアミドと約０．５〜１Ｍの塩化ナトリウムと約０．０５〜０．１Ｍのクエン酸ナトリウムと約０．０５〜０．２％のドデシル硫酸ナトリウムと少量のＥＤＴＡとフィコール（約３００〜５００ｋＤ）とポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋＤ）と血清アルブミンとを用いる。さらに、ハイブリダイゼーション溶液には一般に約０．５〜５ｍｇ／ｍＬの音波処理して変性されたＤＮＡ、たとえば牛胸腺もしくは鮭精子と必要に応じ約０．５〜２％ｗｔ／ｖｏｌのグリシンとをも含ませる。さらに、たとえば約１００〜１，０００ｋＤの硫酸デキストランのような他の添加剤をもハイブリダイゼーション溶液に対し約８〜１５重量％の量にて含ませることもできる。
【００５３】
特定ハイブリダイゼーション技術は本発明に必須でない。他のハイブリダイゼーション技術についてはゴール(Gall)およびパルジュー(Pardue)により記載されている［Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.、第６３巻、第３７８頁（１９６９）；およびジョーン(John)等、Nature、第２２３巻、第５８２頁（１９６９）］。ハイブリダイゼーション技術にて改良がなされると、これらは本発明の方法に容易に適用することができる。
ハイブリダイゼーション溶液に存在させる標識プローブの量は、この標識性質、フィルタに程よく結合することができる標識プローブの量、およびハイブリダイゼーションの厳密度（ストリンジェンシー）に応じ広範に変化する。一般に、化学量論的濃度よりも相当過剰のプローブを用いて、固定標的核酸に対するプローブの結合の割合を増大させる。
【００５４】
ハイブリダイゼーションの種々の厳密度を用いることができる。条件が苛酷になる程、プローブと一本鎖標的核酸配列との間のデュープレックス形成のためのハイブリダイゼーションに必要とされる相補性も大となる。厳密度は、温度、プローブ濃度、プローブ長さ、イオン強度、時間などにより制御することができる。都合上、ハイブリダイゼーションの厳密度は、ホルムアミドの濃度を２０〜５０％の範囲に操作することにより反応物溶液の極性を変化させて変動させる。用いられる温度は一般に約２０〜８０℃、通常３０〜７５℃の範囲である［一般にはCurrent Protocols in Molecular Biology、アウスウーベル(Ausubel) 編、ウィリー・アンド・サンズ（１９８９）参照］。
【００５５】
フィルタを中程度の温度にてハイブリダイズさせるのに充分な時間でハイブリダイゼーション溶液と接触させた後、フィルタを同様濃度の塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウムとドデシル硫酸ナトリウムとを有する上記ハイブリダイゼーション溶液で用いたような第２溶液に導入する。フィルタを第２溶液中に維持する時間は５分間〜３時間もしくはそれ以上の範囲で変化することができる。第２溶液は厳密度を決定し、クロスデュープレックスおよび短い相補性配列を溶解させる。フィルタを希クエン酸ナトリウム−塩化ナトリウム溶液で洗浄した後、このフィルタは標識の性質に応じてデュープレックスの存在についてアッセイすることができる。標識が放射性であれば、フィルタを乾燥させてＸ線フィルムに露光する。
【００５６】
さらに標識は蛍光性部分を含むこともでき、次いでこれを特定の抗蛍光抗体で調べることができる。たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素をこの抗体に結合させて、化学発光性反応を触媒することができる。次いで、光の発生をフィルムに対する急速露光で見ることができる。
【００５７】
Ｃ．  好適な競合性ＰＣＲ系アッセイ
本発明における定量的ＰＣＲの好適実施方法は、標的ＣＤＫ４Ｉ遺伝子テンプレートとは配列が異なる（サイズは異ならない）競合体をもたらす１個以上の塩基対の誘発突然変異を含んだ競合体テンプレートを用いて行われる競合性ＰＣＲ技術である。一方のプライマーのをビオチン化し或いは好ましくはアミノ化して、得られるＰＣＲ産物の一方のストランド（一般にアンチセンス鎖）をアミノ−カルボキシル結合、アミノ−アミノ結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合または他の適する緊密結合によって、予め適する反応体が緊密結合している固相支持体に固定化することができる。特に好ましくは、ＰＣＲ産物と固相支持体と反応体との間の結合は共有結合であって、確実に変性条件下で各結合を結合解除に対し耐性にする。
【００５８】
ＰＣＲ産物のアミノ化もしくはビオチン化されたストランドを固定化した後、未結合の相補性ストランドをアルカリ変性洗浄で分離し、反応環境から除去する。標的核酸および競合体核酸に対応する配列特異性オリゴヌクレオチド(「ＳＳＯ」)を検出タグで標識する。次いでＳＳＯを、除去された未結合センス鎖に由来する競合物がない状態でアンチセンス鎖にハイブリダイゼーションさせる。適する分析試薬を添加し、ハイブリダイゼーションの程度を検出タグおよび使用する固相支持体手段に適するＥＬＩＳＡ測定手段、好ましくはＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーによって測定する。測定値を比較して標的核酸含有量を知り、これには標的テンプレートと競合体テンプレートとを含むテンプレートを増幅するＰＣＲ反応から別途に得られた標準曲線を用いる。
この方法は、定量的であってＰＣＲサイクルの回数には依存せず、しかもＳＳＯプローブとＰＣＲ産物における相補性ストランドとの間の競合により影響されない点で有利である。
【００５９】
或いは、重合工程の１部およびハイブリダイゼーション工程の全部を固相支持体にて行うこともできる。この方法では、固相支持体に捕獲されるのは、ＰＣＲ産物のストランドでなくヌクレオチド重合プライマー（好ましくはオリゴヌクレオチド）である。次いで、標的および競合体核酸ＰＣＲ産物を溶液として固相支持体に添加し、重合工程を行う。重合生成物の未結合センス鎖を上記の変性条件下で除去する。
標的と競合体核酸との比は、適当な測定手段（好ましくはＥＬＩＳＡリーダー）および上記標準曲線を用いて標識オリゴヌクレオチドＳＳＯプローブを検出することにより決定することができる。この方法の効率は、重合工程における連鎖反応が不必要となって方法を実施するのに要する時間を短縮するように、大とすることができる。この方法の精度も増大させることができる。何故なら、最終重合生成物は反応チューブから重合用の固相支持体まで移す必要がなく、したがって損失もしくは損傷の可能性を制限するからである。しかしながら特定試料につき必要であれば、ＰＣＲを別途の反応チューブにて標的および競合体核酸を増幅すべく使用し、次いで固相支持体にて最終的重合を行うこともできる。
【００６０】
上記技術の他の代案は、重合工程を固相支持体にて単一工程で行う。この方法においては、ＰＣＲを標的（および定量的分析が望ましければ競合体）核酸を固相支持体上で増幅させるよう行う。ＰＣＲを行う前、プライマー（これは標的および競合体核酸に対応する）を固相支持体に緊密結合させる。他の２つのプライマーを標的核酸（または競合性テンプレートが存在すれば３つのプライマー）と共に溶液に入れる。
ＰＣＲが開始する際、テンプレートは相当程度まで結合プライマーと相互作用することはなく、これは、テンプレート濃度が比較的低く、結合プライマーが容易には接近しえないからである。しかしながら、テンプレートが増幅されるにつれてＰＣＲ産物の多くが結合プライマーとのハイブリダイゼーションにより固相に結合されるようになる。したがって、要するに結合プライマーは、標的核酸および競合体核酸の処理により形成されたＰＣＲ産物のためのハイブリダイゼーションプローブとして作用する。ハイブリダイゼーションが生ずると、ハイブリダイゼーションプライマーはＰＣＲを介して伸長する。
【００６１】
当業者に知られた結合ＰＣＲ産物の形成を示唆する種々異なる検出可能なシグナル（たとえば上記標識、並びに標的および競合体ＰＣＲ産物の成形を示唆する種々異なる色を形成する標識ヌクレオチド発色団）を与えうる分子を、最後の数サイクルの反応に際し反応溶液に添加することができる。標的核酸と競合体核酸との比も、ＥＬＩＳＡもしくは他の適する測定手段および固定化ハイブリダイゼーションプライマーの３’末端に結合した検出タグに対し反応性の試薬を用いて決定することができる。この方法は、特定遺伝子が試料中に存在するかどうか（定量でない）につき慣用の非競合性ＰＣＲ法を行って検出するにも適用することができる。
当業者はどのように上記方法で使用するのに適するプライマーを選択するかを良く知っており、或いは容易に確認することができる。たとえばＣＤＫ４Ｉ遺伝子を増幅しかつＣＤＫ４Ｉ’、ＣＤＫ４Ｉ３’およびＣＤＫ４Ｉ５’エクソンに対応するプライマーを配列番号８〜１３に記載する。
【００６２】
Ｄ．  一本鎖コンフォーメーション多型性分析
制限断片長さ多型性分析（ＲＦＬＰ）および一本鎖ＤＮＡにおける単一ヌクレオチド置換（ＳＳＣＰ）により生じた電気泳動ゲル移動性シフトに基づきＤＮＡ多型性を検出する技術は、染色体座における対立遺伝子変動を区別するのに有用な方法であることが判明した。たとえばＲＦＬＰを用いて、嚢胞性繊維症および他の遺伝障害に存在する遺伝的異常［たとえばノールトン等、Nature、第３１８巻、第３８０〜３８２頁（嚢胞性繊維症を検出するためのＲＦＬＰの使用）、並びにシライシ等、Jpn.J.Cancer Res. 、第７８巻、第１３０２〜１３０８頁（１９８７）（一般的なＲＦＬＰの実施）、これらの開示をＲＦＬＰの使用に関する当業界の知識を例示するためここに援用する］を検出している。しかしながらＲＦＬＰは、対象となる多型性が対応する制限エンドヌクレアーゼのための認識配列内に存在することを必要とし、或いは短い配列の欠失もしくは挿入が特定プローブにより検出される領域内に存在する場合を必要とする。したがって、ＳＳＣＰは対立遺伝子特異性の多型性を検出するのに好適な技術である。
【００６３】
ＳＳＣＰを行う技術は当業界で周知である［たとえばオリタ(Orita) 等、Genetics、第８６巻、第２７６６〜２７７０頁（１９８９）を参照のこと、その開示をＳＳＣＰの使用に関する当業界の知識を例示すべくここに援用する）］。一般に、対象となる遺伝子断片もしくは対立遺伝子を変性させ、中性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動にかける。一本鎖ＤＮＡ（またはそのＲＮＡコピー）をメンブレンに移動させ（ブロッティングによる）、次いで対象となる断片／対立遺伝子のための検出可能に標識されたＤＮＡプローブにハイブリダイズさせる。対象となる断片／対立遺伝子がゲル中を移動する相対速度（「移動度シフト」）が塩基置換の存在または不存在を示す。
特に適するＳＳＣＰ技術はＰＣＲを使用するものであり、これは、標的配列を増幅すると同時にこれを放射性同位元素または好ましくはフルオレセイン分子で標識する（ＰＣＲでは標識プライマーを使用する。すなわち「Ｆ−ＰＣＲ−ＳＳＣＰ」である）。特に好ましくはポリアクリルアミドゲルにおけるＤＮＡバンドの検出を自動ＤＮＡ配列決定装置で行い、これは如何なる所望温度においてもゲルの厳密な制御を可能にし、得られるデータの定量的解析を可能にする（標識ＤＮＡにより発生した蛍光の強度に対するフルオログラムにおけるピークの高さの比例性に基づく）。Ｆ−ＰＣＲ−ＳＳＣＰを実施するための公知方法の要約については、当業者はマキノ(Makino)等、PCR Methods and Applns. 、第２巻、第１０〜１３頁（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）（１９９２）を参照することができ、その開示をＦ−ＰＣＲ−ＳＳＣＰに関する当業界での知識を例示するためここに援用する。
【００６４】
Ｅ．  ゲノムＤＮＡの対立遺伝子特異的酵素的増幅
ゲノムＤＮＡにおける多型性を検出する簡単かつ好適な方法は、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳＰＣＲ）に基づく技術である。ＡＳＰＣＲにおいては、２つの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー（たとえば配列番号８〜１３に記載されたもの）、即ち、一方が予想および／または既知の突然変異対立遺伝子に対して特異的であり、他方が「正常」対立遺伝子に対して特異的であるものを、ゲノムＤＮＡテンプレートおよび両方の対立遺伝子に対し相補的である他のプライマーと共にＰＣＲで使用する。適正なアニール温度およびＰＣＲ条件の下で、これらプライマーはその相補的対立遺伝子の増幅のみに向けられて、ヒト組織から得られた核酸試料における遺伝子型の判定を可能にする。より詳細には、このＰＣＲに適する温度はアニーリングサイクルにつき約５５℃、重合サイクルにつき約７２℃および熱変性サイクルにつき約９４℃である。
ＡＳＰＣＲの実施に関する詳細については、当業者はウー等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA. 、第８６巻、第２７５７〜２７６７頁（１９８９）を参照することができ、その開示を参考のためここに援用する。
【００６５】
Ｆ．  生物学的細胞試料におけるＣＤＫ４Ｉの不存在に基づく遺伝子欠失の間接的検出
正常な非悪性細胞においても、ＣＤＫ４Ｉは、一般には結合型、すなわちＣＤＫ４Ｉ、ＣＤＫ４、サイクリンＤおよび他の分子、たとえば細胞核抗原の複合体で存在すると予想することができる。ＣＤＫ４タンパク質の不存在（好ましくは免疫アッセイにより決定）に基づいたＣＤＫ４Ｉの遺伝子の欠失を間接的に検出する方法についてはセクションＶＩＩＩにて以下詳細に説明する。
【００６６】
Ｖ．  ＣＤＫ４Ｉの単離および精製
ここで用いる「実質的に純粋」という用語は、一般にインビボにて結合しうる他の化合物を実質的に含まないタンパク質を意味する。本発明の意味で、この用語はホモ接合型ＣＤＫ４Ｉを意味し、その相同性(homogenicity)は当業者に知られた純度標準を参照して決定される（たとえばタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列を得るのに充分な純度）。
実質的に純粋なＣＤＫ４Ｉは組織ホモジネート物（「正常」細胞、すなわちＣＤＫ４Ｉ遺伝子を含有するような細胞を含む）から微生物的発現により、合成により或いは当業者に知られた精製手段、たとえば親和性クロマトグラフィーにより得ることができる。この種の技術を用いてＣＤＫ４Ｉの生物学上活性なペプチド断片を得ることができる。本明細書において、「生物学上活性なペプチド断片」と言う用語は、ＣＤＫ４のための結合ドメインを有する断片を意味する。
【００６７】
ＣＤＫ４Ｉ断片がＣＤＫ４結合ドメインを有するという判定は、当業者に知られた数種の方法のうちのいずれかを用いて行うことができ、これには、たとえば結合動態(binding kinetics)およびＣＤＫ４に対する断片の親和性の決定、並びに抗ＣＤＫ４抗体を用いる阻害試験が含まれる［たとえばキシオング(Xiong) 等、Genes Dev.、第７巻、第１５７２〜１５８３頁（１９９３）参照；その開示を抗ＣＤＫ４抗体を産生させるための標準的方法を例示すべくここに援用し、抗ＣＤＫ４抗体を産生させるのに適用しうる抗体産生の他の適する方法については以下説明する］。
ＣＤＫ４Ｉの一次アミノ酸配列の僅かな改変（これは配列番号１〜２から容易に得ることができる）は、ここに説明した特定ＣＤＫ４Ｉタンパク質と比較して、実質的に同等な活性を有する変種をもたらしうる。この種の改変は、たとえば部位指向性の突然変異によるように故意とすることができ、或いは自然的とすることもできる。これら改変により生成される変種は全て、最初のタンパク質に存在する生物学活性がまだ存在する限り本発明に包含される。この開示の目的において、この種の変種は一般に「機能的変種」と考えるべきである。ＣＤＫ４Ｉの機能的アミノ酸配列変種は３種類、すなわち置換、挿入もしくは欠失変種の１種もしくはそれ以上に分別しうる。一般に、この種の変種は、ＣＤＫ４ＩをコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異性突然変異によって作製され、これにより、変種をコードするＤＮＡを生成し、次いでＤＮＡを組換え細胞培養物中で発現させる。しかしながら、変種ＣＤＫ４Ｉおよび約１００〜１５０残基までを有するＣＤＫ４Ｉ断片を、都合上、インビボ合成により作製することができる。
【００６８】
アミノ酸配列変種は一般に変動の所定の性質により特性化されるが、この種の変種はＣＤＫ４Ｉアミノ酸配列の天然対立遺伝子もしくは種類間変動をも包含する。これら変種は典型的には天然由来(naturally-occuring)アナログと同じ性質の生物学活性を示すが、これらはさらに以下詳細に説明するようにＣＤＫ４Ｉの特性を改変すべく選択することもできる。
アミノ酸配列変化を導入する部位を予備決定することもできるが、突然変異自体は予備決定する必要がない。たとえば所定部位における突然変異の性能を最適化させるには、ランダム突然変異を標的コドンもしくは領域に指向させ、発現したＣＤＫ４Ｉ変種を所望活性の最適な組合せについてスクリーニングすることができる。既知配列を有するＤＮＡ中の特定部位において置換突然変異を行う技術は、たとえばＭ１３プライマー突然変異のように周知である。アミノ酸置換は典型的には１つの残基であり、挿入は一般に約１〜１０アミノ酸残基の程度であり、さらに欠失は一般に約１〜３０残基の範囲である。欠失もしくは挿入は好ましくは隣接する対で行われ、すなわち２残基の欠失または２残基の挿入である。置換、欠失、挿入またはその任意の組合せを併用して、最終構築物（コンストラクション）に到達することができる。明かに、変種ＣＤＫ４ＩをコードするＤＮＡで行われる突然変異は配列をオープンリーディングフレームから外してはならない（配列番号１〜２参照）。
【００６９】
置換変種は、配列番号２における少なくとも１個の残基を除去されると共に異なる残基がその位置に挿入されたものである。これらは、配列内のグリコシル化部位を除去し、ｐＨを変化させ、タンパク質の安定性を増大させ、或いはタンパク質における他の所望の改変を行うためにすることができ、これら改変は当業者に明かである。たとえばＣＤＫ４Ｉの酸化安定性は、システイン残基または他の不安定残基の欠失により達成することができる。有力なタンパク質分解部位の欠失もしくは置換も、この種の残基の欠失またはグルタミニルもしくはヒスチジル残基の置換によって達成することができる。
ＣＤＫ４Ｉの挿入アミノ酸配列変種は、アミノ酸残基の１個もしくはそれ以上が標的リセプタにおける所定部位に導入されたものである。最も一般的には、変化させるべきタンパク質のアミノもしくはカルボキシル末端に対する異型タンパク質もしくはポリペプチドの融合体である。たとえば免疫原性ＣＤＫ４Ｉ誘導体は、免疫原性ポリペプチドを標的配列にインビトロ架橋により或いは融合をコードするＤＮＡで形質転換された組換細胞培養物により融合させて作製することができる。この種の免疫原性ポリペプチドは好ましくはたとえばｔｒｐＬＥ、β−ガラクトシダーゼなどの細菌ポリペプチドであり、その免疫原性断片をも含む。
【００７０】
本発明のＣＤＫ４Ｉはさらにアミノ酸配列突然変異体、グリコシル化変種、並びに他の化学的成分との共有もしくは凝集結合体を包含する。ＣＤＫ４Ｉの共有誘導体は、リセプタのアミノ酸側鎖に存在する或いはＮもしくはＣ−末端における各基に当業界で知られた手段により官能基を結合させて作製することもできる。これら誘導体はたとえばカルボキシル末端もしくはカルボキシル側鎖を有する残基の脂肪族エステルもしくはアミド、ヒドロキシル基含有残基のＯ−アシル誘導体およびアミノ末端アミノ酸もしくはアミノ基含有残基のＮ−アシル誘導体、たとえばリジンもしくはアルギニンを包含する。
他の誘導体の群はＣＤＫ４ＩおよびＣＤＫ４Ｉ断片と他のタンパク質もしくはポリペプチドとの共有結合体である。これら誘導体は組換え培養における当業者によりＮもしくはＣ−末端融合体として、或いは反応性側鎖基を介して不溶性マトリックスに対しタンパク質を架橋させる際に使用するとしてそれ自体知られている機能障害剤を用いて合成することができる。共有もしくは凝集誘導体は免疫原、免疫アッセイにおける試薬として或いはＣＤＫ４Ｉの親和性精製につき有用である。たとえば公知方法により臭化シアノゲン活性化「セファロース」（アガロースの商標）に対する共有結合によって、或いはポリオレフィン表面への吸着によって不溶化されたＣＤＫ４Ｉを、抗ＣＤＫ４Ｉ抗体もしくはＣＤＫ４Ｉリガンドのアッセイもしくは精製に使用することができる。
【００７１】
配列番号１〜２を参照して、ＣＤＫ４Ｉタンパク質およびペプチドは、α−アミノ基のｔ−ＢＯＣもしくはＦＭＯＣ保護のような一般的に使用される方法により同定および合成することができる。これら両方法は、ペプチドのＣ−末端から出発して、１つのアミノ酸を各工程で添加する段階的合成を含む［コリガン(Coligan) 等、Current Protocols in Immunology 、ウィリー・インターサイエンス（１９９１）、ユニット９参照］。本発明のペプチドは各種の周知された固相ペプチド合成法、たとえばメリーフィールド(Merrifield)［J.Am.Cehm.Soc.、第８５巻、第２１４９頁（１９６２）］、並びにスチュアート(Stewart) およびヤング(Young) ［Solid Phase Pepetides Synthesis 、フリーマン、サンフランシスコ（１９６９）、第２７〜６２頁］に記載されたように合成することができ、これは、０．１〜１．０ｍＭｏｌのアミン／ｇポリマーを含有するコポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）を用いる。化学合成が完了した後、ペプチドを保護解除し、液体ＨＦ−１０％アニソールで０℃にて約１／４〜１時間にわたり処理してポリマーから切除することができる。試薬を蒸発させた後、ペプチドを１％酢酸溶液によりポリマーから抽出し、次いでこれを凍結乾燥して粗製物質を得る。一般に、これは「セファデックスＧ−１５」もしくは「セファロース」親和性カラムでのゲル濾過のような技術で精製することができる。カラムにおける適するフラクションの凍結乾燥は均質なペプチドもしくはペプチド誘導体をもたらし、次いでこれをたとえばアミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、紫外線吸収分光測定、分子旋光度、溶解性のような標準技術により特性化することができ、固相エドマン分解により定量することができる。
ＣＤＫ４Ｉを含む組成物はたとえば下記する安定剤および賦形剤のような物質、ＣＤＫ４Ｉ遺伝子の供給源として作用する細胞もしくは生物からの予定量のタンパク質、ＣＤＫ４Ｉ供給源細胞もしくは生物以外からのタンパク質、並びにたとえばポリ−Ｌ−リジンのような合成ポリペプチドなどを含むことができる。勿論、異種異型宿主で発現される組換えＣＤＫ４Ｉは、遺伝子供給源タンパク質を完全に全く含まずに発現される。たとえばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または他の非ヒト高等哺乳動物細胞におけるヒトＣＤＫ４Ｉの発現は、リセプタが汚染物質およびヒトタンパク質を含まない組成物をもたらす。
【００７２】
ＶＩ．  ＣＤＫ４Ｉ  ＤＮＡ配列および発現産物
さらに本発明は、ＣＤＫ４Ｉをコードするポリヌクレオチドをも提供する。ここで用いる「ポリヌクレオチド」とは、独立した断片の形態で或いは大型の構築物の成分として、一本鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖を包含する）および二本鎖の両者でのデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのポリマーを意味する。本発明のペプチドをコードするＤＮＡは、ｃＤＮＡ断片からまたは、組換え転写ユニット中で発現することができる合成遺伝子を提供するオリゴヌクレオチドから組立てることができる。本発明のポリヌクレオチド配列はゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡの各配列を包含する。ポリヌクレオチド配列は遺伝子コードから推定しうるが、コードの縮退を考慮せねばならない。本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子コードの結果として縮退する配列を包含する。
【００７３】
以下詳細に説明するように、ＣＤＫ４Ｉをコードするポリヌクレオチド配列は原核生物もしくは真核生物のいずれかで発現させることができる。宿主は微生物酵母、昆虫および哺乳動物の各生物を包含する。原核生物における真核性もしくはウィルス性配列を有するＤＮＡ配列の発現方法は当業界で周知である。宿主にて発現および複製しうる生物学上機能的なウィルス性およびプラスミドＤＮＡベクターも当業界にて公知である。この種のベクター（すなわち「組換え発現ベクター」）を用いて本発明のＤＮＡ配列を組み込む。さらに、これら配列は「宿主細胞」（すなわち、たとえばＣＨＯ細胞およびＣＯＳ細胞（たとえばＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ  １６５１））のような遺伝子発現に使用する形質転換（トランスフォーム）細胞にも含まれる。
【００７４】
ＣＤＫ４ＩをコードするＤＮＡは、（ａ）哺乳動物組織からＤＮＡライブラリを得、（ｂ）ヒト成長ホルモンリセプタをコードする標識ＤＮＡおよびその結合タンパク質もしくはその断片（一般に１００ｂｐより大）を用いてハイブリダイゼーション分析を行い、相同配列を含むｃＤＮＡライブラリ中のクローンを検出し、次いで（ｃ）これらクローンを制限酵素分析および核酸配列決定により分析して全長クローンを同定することによって、ヒト以外の供給源から得られる。全長クローンがライブラリに存在しなければ、適する断片を各種のクローンから回収し、クローンに共通の制限部位で連結させて全長クローンを組立て得る。
ＣＤＫ４ＩをコードするＤＮＡは、化学合成により或いは胎盤細胞もしくは細胞株培養物からのｍＲＮＡの逆転写物をスクリーニングすることにより或いは任意の細胞からのゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。さらにＣＤＫ４Ｉをコードしないが低厳密度条件下でＣＤＫ４ＩをコードするＤＮＡとハイブリダイズすることができる核酸（たとえば「プライマー」もしくは「プローブ」）も本発明の範囲に包含される。本発明のプローブおよびプライマーは一般にオリゴヌクレオチドであり、すなわち、化学合成されうる一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは、２本の相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖である。この種の合成オリゴヌクレオチドは５’ホスフェートを持たず、したがってホスフェートをキナーゼの存在下でＡＴＰと共に添加しなければ他のオリゴヌクレオチドに連結しない。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化されていない断片に連結する。この種のオリゴヌクレオチドはたとえば蛍光性基、放射性原子または化学発光性基のような検出可能な物質を用いて公知方法で検出可能に標識して慣用のハイブリダイゼーションアッセイに使用することができる。この種のアッセイは、たとえば組織試料中のＣＤＫ４Ｉ  ＤＮＡもしくはｍＲＮＡの検出のようなインビトロ診断で使用される。
【００７５】
一般に、ＣＤＫ４Ｉを発言する組換え発現ベクターを構築する際に、ＤＮＡ配列をクローン化するには原核生物が使用される。たとえば大腸菌Ｋ１２菌株２９４（ＡＴＣＣ受託番号３１４４６）が特に有用である。さらに発現には原核生物も使用される。上記菌株、並びに大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ受託番号２７３２５）、たとえばBacillus subtilus のようなバチルス属および、たとえばSalmonella typhimuriumもしくはSeratia marcescansのような他の腸内細菌科、並びに各種のpseudomonas 種も発現に用いることができる。
一般に本発明に使用しうるプラスミドベクターは、宿主細胞に対し適合しうる生物種類から得られるプロモータおよび制御配列を含む。一般にベクターは複製部位、並びにトランスフォームされた細胞にて表現型選択を行うことができるマーカー配列を有する。たとえば大腸菌は典型的にはｐＢＲ３２２、すなわち大腸菌種から得られるプラスミド［ボリバー(Bolivar) 等、Gene、第２巻、第９５頁（１９７７）］を用いてトランスフォームされる。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリンの耐性遺伝子を有し、したがってトランスフォームされた細胞を同定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２プラスミドまたは他の微生物プラスミドも、組換えＤＮＡ構築に一般的に使用されるプロモータおよび他の制御要素を含有せねばならず或いは含有するよう改変せねばならない。
【００７６】
例示すれば原核性宿主と共に使用するのに適したプロモータには、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモータシステム［チャング(Chang) 等、Nature、第２７５巻、第６１５頁（１９７８）；およびゲデル(Goeddel) 等、Nature、第２８１巻、第５４４頁（１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系［ゲデル、Nucleic Acids Res.、第８巻、第４０５７頁（１９８０）］および、たとえばｔａｑプロモータのようなハイブリッドプロモータ［デボア(de Boer) 等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.、第８０巻、第２１〜２５頁（１９８３）］が含まれる。しかしながら、他の機能的細菌プロモータも適している。そのヌクレオチド配列は一般に当業界にて公知であり、したがって当業者はこれらを任意の必要な制限部位を供給するためのリンカーもしくはアダプタを用いて、ＣＤＫ４ＩをコードするＤＮＡに結合させることができる［シーベンリスト(Siebenlist)等、Cell、第２０巻、第２６９頁（１９８０）］。
【００７７】
原核性生物の他に、たとえば酵母培養物のような真核性微生物も使用することができる。Saccharobyces cerebisiaeまたは一般的なパン酵母が最も一般的に使用される真核性微生物であるが、多数の他の菌株も一般的に入手しうる。
酵母宿主と共に使用するのに適したプロモータ配列には、３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモータ［ヒッツェマン(Hitzeman)等、J.Biol.Chem.、第２５５巻、第２０７３頁（１９８０）］または他のグリコール分解酵素［ヘェス(Hess)等、J.Adv.Enzyme Reg. 、第７巻、第１４９頁（１９６８）；およびホーランド(Holland) 、Biochemistry、第１７巻、第４９００頁（１９７８）］であり、たとえばエノラーゼ、グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのプロモータが含まれる。
【００７８】
成長条件により制御される他の転写の利点をも有する誘発性プロモータである他の酵母プロモータはアルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素(degraded enzyme) 、メタロチオニン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびマルトースとガラクトースとの利用に寄与するプロモータ領域である。酵母エンハンサーも酵母プロモータと共に有利に使用される。
「制御領域」とは、転写もしくは翻訳のいずれかの制御に関与しうる真核性遺伝子の５’末端および３’末端における特定配列を意味する。ほぼ全ての真核性遺伝子は、転写が開始する部位から約２５〜３５塩基の上流に位置するＡＴリッチな領域を有する。多くの遺伝子の転写開始部から７０〜８０塩基上流に存在する他の配列はＣＣＡＡＴ領域であり、ここでＸは任意のヌクレオチドとすることができる。大抵の真核性遺伝子における３’末端にはＡＡＴＡＡＡ配列が存在し、これは転写ｍＲＮＡの３’末端に対しポリＡテールを付加するためのシグナルとなりうる。
【００７９】
哺乳動物宿主細胞にてベクターからの転写を制御する好適プロモータは各種の供給源から得ることができ、これには、たとえばポリオーマ、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、アデノウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルスおよび特に好ましくはサイトメガロウィルスのようなウィルスのゲノムであり、或いは異種哺乳動物プロモータ、たとえばβアクチンプロモータ由来のものがある。ＳＶ４０ウィルスの早期および後期プロモータは、都合上、ＳＶ４０ウィルスの複製起源をも有するＳＶ４０制限断片として得られる［ファイエルス(Fiers) 等、Nature、第２７３巻、第１１３頁（１９７８）］。ヒトサイトメガロウィルスの早期プロモータは便利にはＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として得られる［グリーンアウェイ(Greenaway) 等、Gene、第１８巻、第３５５〜３６０頁（１９８２)］。宿主細胞もしくは関連生物からのプロモータもここでは有用である。
高等真核生物によるＣＤＫ４ＩをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクター中に挿入することにより増大される。エンハンサーはＤＮＡのｃｉｓ−作用性エレメントであり、これは一般に約１０〜３００ｐｂであって、転写を増大させるようプロモータに作用する。エンハンサーは比較的、方向および一非依存性であって、転写ユニットに対し５’［レイミンス(leimins) 等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.、第７８巻、第９９３頁（１９８１）］および３’［ラスキー(Lusky) 等、Mol.Cell Bio. 、第３巻、第１１０８頁（１９８３）］、並びにイントロン内［バネルジー(Banarji) 等、Cell、第３３巻、第７２９頁（１９８３）］、さらにコード化配列自身の内部［オスボーン(Osborne) 等、Mol.Cell Bio. 、第４巻、第１２９３頁（１９８４）］に位置することが判明した。多くのエンハンサー配列が哺乳動物遺伝子から知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェト−タンパク質およびインシュリン）。しかしながら、典型的には真核細胞ウィルスからのエンハンサーが使用される。その例には、複製起源の後期側におけるＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウィルス早期プロモータエンハンサー、複製起源の後期側におけるポリオーマエンハンサーおよびアデノウィルスエンハンサーが含まれる。
【００８０】
真核性宿主細胞（酵母、真菌類、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物からの核形成細胞）に使用される発現ベクターは、ｍＲＮＡ発現に影響を与えうる転写の停止に必要な配列をも有する。さらに発現ベクターは選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子をも含有することができる。当業界で知られた哺乳動物細胞のための適する選択マーカーの例には、ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼまたはネオマイシンが含まれる。この種の選択マーカーが哺乳動物宿主細胞に首尾よく移行すれば、トランスフォームされた哺乳動物宿主細胞は選択圧力下に置かれると生存することができる（すなわち薬物耐性または宿主細胞の栄養要求を変化させる遺伝子が付与されることによる）。
高等真核生物にてＣＤＫ４Ｉをコードする本発明のベクターのトランスフォーメーションおよび発現に適する宿主細胞には次のものが含まれる：ＳＶ４０によりトランスフォームされたサル腎ＣＶ１株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎株［Ｆ．Ｌ．グラハム(Graham)等、J.Gen Viro. 、第３６巻、第５９頁（１９７７）；ベビーハムスター腎細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞−ＤＨＦＲ［ウルラウブ(Urlaub)およびチャシン(chasin)、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.、第７７巻、第４２１６頁（１９８０）］；マウスセルトリ細胞［Ｊ．Ｐ．マザー(Mather)、Biol.Reprod.、第２３巻、第２４３〜２５１頁（１９８０）］；サル腎細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカ  ミドリザル腎細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頚部癌細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファロー・ラット肝細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腫瘍（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ５１）；およびＴＲＩ細胞［マザー等、Annals N.Y.Acad.Sci.、第３８３巻、第４４〜６８頁（１９８２）］。
【００８１】
「トランスフォーメーション（形質転換）」とは、ＤＮＡを生物に導入してＤＮＡが染色体外の要素として或いは染色体移入（インテグレーション）により複製可能にすることを意味し、たとえばグラハム(Graham)等、Virology、第５２巻、第４５６〜４５７頁（１９７３）に記載されている。しかしながら、たとえば核注入により或いはプロトプラスト融合によりＤＮＡを細胞中へ導入する他の方法も使用することができる。原核細胞または実質的な細胞壁構造を有する細胞を使用する場合は、たとえばＦ．Ｎ．コーヘン(Cohen) 等［Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.、第６９巻、第２１１０頁（１９７２）］により記載されたように、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理のような当業界で周知の手段によりトランスフェクションを達成することができる。宿主細胞をトランスフォームさせる特に便利な方法は、たとえばリポソーム物質またはＤＯＴＭＡ［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリース、ガイサースベルグ、ＭＤの登録商標製品である］を用いるリポフェクションである。
「トランスフェクション」とは、コード化配列が実際に発現されてもされなくても、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。トランスフェクションの多くの方法が当業者に知られ、たとえばＣａＰＯ4 もしくはエレクトロポレーションを用いる。有利なトランスフェクションは一般に、トランスフェクトされたベクターの操作の指標が宿主細胞内で生ずる場合に認められる。
【００８２】
所望のコード化配列と制御配列とを含む好適なベクターの構築は標準的な連結（ライゲーション）技術を用いる。単離されたプラスミドもしくはＤＮＡ断片を切断し、処理し、次いで所要のプラスミドを形成するよう所望された形態まで再連結させる。
たとえば、構築されるプラスミド中の正確な配列を確認する分析については、連結混合物を用いて宿主細胞をトランスフォームさせ、成功したトランスフォーマント（トランスフォームしたもの）を必要に応じアンピシリン耐性もしくはテトラサイクリン耐性により選択することができる。トランスフォーマントからのプラスミドを調製し、たとえばメッシング(Mssing)等の方法［Nucleic Acids Res.、第９巻、第３０９頁（１９８１）］、マキシム(Maxam) 等の方法［Methodsin Enzymology 、第６５巻、第４９９頁（１９８０）］または当業者に知られる他の適する方法によって調製し、制限により分析し、かつ／または配列決定する。切断された断片のサイズ分離は、たとえばマニアチス(Maniatis)等により記載されたような慣用のゲル電気泳動［Molecular Cloning 、第１３３〜１３４頁（１９８２）］を用いて行われる。
【００８３】
宿主細胞は本発明の発現ベクターでトランスフォームすることができ、必要に応じ改変された慣用の栄養培地で培養してプロモータを誘発させ、トランスフォーマントを選択し或いは遺伝子を増幅させることができる。たとえば温度、ｐＨなどの培養条件は、発現につき選択される宿主細胞と共に従来使用されているものであり、当業者には明かである。
配列番号１〜２を参照し、上記技術によるポリヌクレオチドの生成は当業者の知識の範囲内である。したがって本発明は、この種の技術により得られるＣＤＫ４Ｉポリヌクレオチドを包含する。
【００８４】
ＶＩＩ．  ＣＤＫ４Ｉ抗体
さらに本発明は、ＣＤＫ４Ｉに特異的に結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体をも包含する。この種の抗体は、ＣＤＫ４Ｉ（その抗原性断片および融合タンパク質を包含する）（以下、これを「免疫原性ＣＤＫ４Ｉ」と称する）の免疫化によって生物学的に産生させることができる。
動物を免疫原性ＣＤＫ４Ｉで免疫処理する際に使用するには多段注入免疫化法が好適である［たとえばランゴーン(Langone) 等編、「少量の免疫原による抗血清の産生：多段皮膚内注射」、Methods of Enzymology 、アカデミック・プレス（１９８１）参照］。たとえば、完全フロイントアジュバントに乳化された１ｍｇの免疫原性ＣＤＫ４Ｉを皮膚内注射してから数週間後に不完全フロイントアジュバントにおける同じ抗原を１回以上ブーストして、良好な抗体反応をウサギで得ることができる。
【００８５】
所望するならば、免疫原性ＣＤＫ４Ｉ分子を当業界で周知の技術を用いる結合によりキャリヤタンパク質にカップリングさせることができる。分子に化学的にカップリングされるこのような一般的に使用されるキャリヤはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、サイログロブリン、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）および破傷風毒素を包含する。次いで、結合した分子を用いて動物（たとえばマウスもしくはウサギ）を免疫処理する。
免疫処理された動物により産生されるポリクローナル抗体を、たとえば抗体を生じさせるペプチドが結合されたマトリックスに結合して、溶出させることにより、さらに精製することができる。当業者はポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の精製および／または濃縮に関する免疫技術に共通の各種の技術を周知している［たとえばコリガン(Coligan) 等、Current Protocols in Immunology 、ユニット９、ウィリー・インターサイエンス（１９９１）参照］。
【００８６】
特異性および産生容易性のため、分析物試料（たとえば組織試料および細胞株）にてＣＤＫ４Ｉを検出する際に使用するにはモノクローナル抗体が好適である。モノクローナル抗体の作製には、マウスもしくはラットの免疫処理が好適である。本発明で用いる「抗体」という用語は、たとえばＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2 のようなエピトープ決定基を結合することができる無傷な（ｉｎｔａｃｔ）分子およびその断片を包含する。さらに、この意味で「本発明のｍＡｂ’」という表現はＣＤＫ４Ｉに対する特異性を持ったモノクローナル抗体を意味する。
モノクローナル抗体（「ｍＡｂ’」）を分泌するハイブリドーマの作製につき使用される一般的方法は周知である［コーラーおよびミルスタイン、Nature、第２５６巻、第４９５頁（１９７５）］。要するに、コーラーおよびミルスタインにより記載されたように、この技術は黒色腫、奇形癌または頚部、グリオーマもしくは肺の癌を有する５人の別々の癌患者における局部排液リンパ節からリンパ球を単離することからなっている。リンパ球は外科試料から得られ、収集し、次いでＳＨＦＰ−１と融合させた。ハイブリドーマを、癌細胞株に結合した抗体の産生につきスクリーニングした。同等な技術を用いてＣＤＫ４Ｉに対し特異性を持ったｍＡｂを産生および同定することができる。
【００８７】
本発明のｍＡｂにおけるＣＤＫ４Ｉ特異性の確認は、対象となるｍＡｂの基本的反応パターンを決定するための比較的日常的なスクリーニング技術（たとえば酵素結合免疫収着アッセイ、すなわち「ＥＬＩＳＡ」）を用いて行うことができる。
さらにｍＡｂを評価して、無用な実験をすることなく、試験されているｍＡｂが、本発明のｍＡｂがＣＤＫ４Ｉに対して結合することを妨げるかどうかを決定することにより、本発明のｍＡｂと同じ特異性を有するかどうかを判定することも可能である。試験されているｍＡｂが本発明のｍＡｂに対し競合すれば、これは本発明のｍＡｂによる結合の低下によって示されるが、２種のモノクローナル抗体は同一もしくはかなり関連したエピトープに結合すると思われる。
【００８８】
ｍＡｂが本発明のｍＡｂの特異性を有するかどうかを判定する他の方法は、本発明のｍＡｂを、一般に反応性である抗原と共にプレインキュベートし、試験されているｍＡｂが、この抗原を結合する能力について阻害されるかどうかを判定することである。試験されているｍＡｂが阻害されれば、恐らくこれは本発明のｍＡｂと同じ或いはかなり関連したのエピトープ特異性を有する。以下説明するようにこの同じ一般的技術を、有力なＣＤＫ４Ｉリガンドをスクリーニングするため使用することもできる。
当業界で既知の方法は、所定のリガンドを特異的に結合する抗体を同定し、抗体発現ライブラリから単離することを可能にする。たとえば、本発明のペプチドに対する結合を示す抗体結合性ドメインの同定および単離の方法はバクテリオファージγベクター系である。このベクター系は、大腸菌におけるマウス抗体レパートリー［ヒユース(Huse)等、Science 、第２４６巻、第１２７５〜１２８１頁（１９８９）］から、およびヒト抗体レパートリー［ムリナックス(Mullinax)等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.、第８７巻、第８０９５〜８０９９頁（１９９０）］からＦａｂ断片の組合せライブラリを発現すべく使用されている。ここに説明したように、所定のリガンドを結合した抗体をこれら抗体発現ライブラリから同定し、単離した。この方法は、所定リガンドに結合するモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞株にも適用することができる。
【００８９】
さらに本発明は、上記ＣＤＫ４Ｉ特異的抗体またはその生物学上活性な断片のキメラ抗体をも提供する。ここで用いる「キメラ抗体」という用語は、１種類の生物から得られた抗体の可変領域を他の生物から得られた抗体の定常領域と組合せた抗体を意味し、或いはＣＤＲグラフト化抗体を意味する。キメラ抗体は組換えＤＮＡ技術により構築され、たとえばショー(Shaw)等、J.Immun.、第１３８巻、第４５３４頁（１９８７）およびＬ．Ｋ．サン(Sun) 等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.、第８４巻、第２１４〜２１８頁（１９８７）に記載されている。
さらに「ヒト適合化」抗体の種々の組合せを有するキメラ抗体分子を産生させる方法は当業界で公知であり、マウス可変領域とヒト定常領域との組合せ［キャビリー(Cabily)等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.、第８１巻、第３２７３頁（１９８４）］またはヒトフレームワークに対するマウス−抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）のグラフト化［リーチマン(Riechmann) 等、Nature、第３２２巻、第３２３頁（１９８８）］を包含する。
【００９０】
上記抗体またはその生物学上活性な抗体断片を用いて、ＣＤＲグラフト化抗体およびキメラ抗体を創製することができる。「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」もしくは「超可変域」はそれぞれ、抗原結合性部位の形成に寄与する三次元のループ構造を形成する抗体の軽鎖および重鎖におけるアミノ酸配列として規定される。
ここで用いる「ＣＤＲグラフト化」抗体という用語は、軽ドメインおよび／または可変ドメインにおける１つ以上のＣＤＲ配列の少なくとも１部が、所定の抗原もしくはリセプタに対して異なる結合特異性を有する抗体からのＣＤＲ配列のアナログ部分により置換されているアミノ酸配列を持った抗体を意味する。
【００９１】
「軽鎖可変領域」および「重鎖可変領域」という用語は、各抗体の変化した一次アミノ酸配列を有するそれぞれ軽鎖および重鎖のＮ−末端部分の領域もしくはドメインを意味する。抗体の可変領域は軽鎖および重鎖のアミノ末端ドメインで構成される。何故なら、これらは互いに折り畳まれて、抗体に対する三次元結合部位を形成するからである。
アナログのＣＤＲ配列は、基質またはレシピエント抗体に「グラフト化」すると言われる。「ドナー」抗体はＣＤＲ配列を与える抗体であり、置換配列を受け入れる抗体は「基質」抗体である。当業者は、ここに示した教示を当業界で周知の方法［ボレベック(Borrebaeck)、Antibody Engineering:A Practical Giode、Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニー、ニューヨー（１９９２）参照］と組み合わせて、これらＣＤＲグラフト化抗体を容易に産生させることができる。
【００９２】
或る種の状況下で、あるアイソタイプのモノクローナル抗体はその診断もしくは治療効果の意味で他のアイソタイプの抗体よりも好適である。たとえば、抗体介在の細胞分解に関する研究から知られるように、アイソタイプγ−２ａおよびγ−３の未改変マウス  モノクローナル抗体は一般に標的細胞の溶解に際しγ−１アイソタイプの抗体よりも効果的である。この異なる効果は、γ−２αおよびγ−３アイソタイプが標的細胞の細胞破壊に一層活発に関与した能力に基づくと思われる。異なるアイソタイプのモノクローナル抗体における特定アイソタイプは、クラススイッチ変種を単離するｓｉｂ選択技術を用いて単離される［ステップレウスキー(Steplewski)等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.、第８２巻、第８６５３頁（１９８５）；スピラ(Spira) 等、J.Immunol.Methods 、第７４巻、第３０７頁（１９８４）］。
さらに本発明は、本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株をも包含する。本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株の単離は、対象となるモノクローナル抗体の基本的反応パターンの決定を可能にする日常のスクリーニング技術によって行うことができる。すなわち、試験されているモノクローナル抗体が特定ペプチドに結合してそれに関連する活性を中和し、たとえばＣＤＫ４Ｉを結合して、ＣＤＫ４Ｉ介在の生物学的活性をブロックすれば、試験されているモノクローナル抗体および本発明の細胞株により産生されるモノクローナル抗体は等価である。
【００９３】
本発明のモノクローナル抗体を使用することにより、モノクローナル抗体をスクリーニングして抗体が本発明のモノクローナル抗体と同じ結合特異性を有するかどうかを同定するため使用しうる抗イディオタイプ抗体を産生させることができる。これら抗体は免疫処理の目的にも使用することができる［ハーリン(Herlyn)等、Science 、第２３２巻、第１００頁（１９８６）］。この種の抗イディオタイプ抗体は、周知のハイブリドーマ技術を用いて産生させることができる［コーラーおよびミルスタイン、Nature、第２５６巻、第４９５頁（１９７５）］。
抗イディオタイプ抗体は、対象となる細胞株により産生されたモノクローナル抗体に存在する独特の決定基を認識する抗体である。これら決定基は、抗体の超可変領域に存在する。所定のエピトープに結合し、したがって抗体の特異性をもたらしうるのはこの領域（パラトープ）である。抗イディオタイプ抗体は、動物を対象となるモノクローナル抗体で免疫処理して作製することができる。免疫処理された動物は免疫処理用抗体のイディオタイプ決定基を認識して反応し、これらイディオタイプ決定基に対する抗体を産生する。第２の動物を免疫処理するために使用された細胞株により産生された、本発明のモノクローナル抗体に対し特異的である免疫処理動物の抗イディオタイプ抗体を使用することにより、免疫処理に使用されたハイブリドーマの抗体と同じイディオタイプを持った他のクローンを同定することが今や可能である。２種の細胞株におけるモノクローナル抗体間のイディオタイプ同一性は、２種のモノクローナル抗体が同じエピトープ決定基の認識に関し同一であることを示す。たとえば抗イディオタイプ抗体を使用することにより、同じエピトープ特異性を持ったモノクローナル抗体を発現する他のハイブリドーマを同定することができる。
【００９４】
さらに、抗イディオタイプ技術を用いてエピトープを模倣(mimic) するモノクローナル抗体を産生させることも可能である。たとえば、一次モノクローナル抗体に対して作製された抗イディオタイプモノクローナル抗体は、一次モノクローナル抗体により結合されたエピトープの「イメージ」である超可変域における結合ドメインを有する。かくして抗イディオタイプモノクローナル抗体は、その結合性ドメインが抗原として効果的に作用するので、免疫処理につき使用することができる。
【００９５】
ＶＩＩＩ．  抗ＣＤＫ４Ｉ抗体の免疫学的使用
上記のように産生された後、抗ＣＤＫ４Ｉ抗体を診断に使用することができる（たとえば生物学的細胞試料におけるＣＤＫ４Ｉを検出するため、或いはその発現レベルをモニタするため）。好ましくは前癌性体細胞におけるＣＤＫ４Ｉタンパク質を検出するには、適する細胞試料を皮膚バイオプシー、啖試料または尿試料から得る。生殖系細胞はたとえば皮膚、血液もしくは毛髪小胞のような任意便利な供給源から得ることができる。
ＣＤＫ４Ｉは液相もしくは固相の免疫アッセイ方式（キャリヤに結合させた場合）にて抗ＣＤＫ４Ｉ抗体を用いて検出しおよび／または結合させることができる。固相アッセイ方式の使用に周知なキャリヤの例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改質セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトが含まれる。キャリヤの性質は、本発明の目的には可溶性でも不溶性でも良い。当業者は抗体を結合させるための他の適するキャリヤを既に知っており、或いは日常の実験を用いて確認することもできる。本発明のモノクローナル抗体を用いうる種類の免疫アッセイの例は、直接的もしくは間接的方式における競合性および非競合性の免疫アッセイである。
【００９６】
この種の免疫アッセイの特定例は放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）およびサンドイッチ（免疫測定）分析である。本発明の抗ＣＤＫ４Ｉ抗体を用いるＣＤＫ４Ｉの結合は、生理学的試料に対する免疫組織化学分析を含む順、逆もしくは同時モードで行われる免疫アッセイを用いて行うことができる。当業者は、不用な実験を行うことなく、他の免疫アッセイ方式を容易に知ることができる。
【００９７】
本発明の抗ＣＤＫ４Ｉ抗体はさらに検出可能に標識することもできる。当業者に知られた多くの異なる標識および標識方法が存在する。本発明に使用しうる種類の標識の例は酵素、放射性同位元素、蛍光性化合物、コロイド金属、化学発光性化合物および生物発光性化合物を包含する。当業者は、本発明の抗ＣＤＫ４Ｉ抗体に結合させるための他の適する標識を既に知っており、或いは日常の実験を用いて確認することができる。さらに、本発明の抗ＣＤＫ４Ｉ抗体に対するこれら標識の結合は、当業者に一般的な標準技術を用いて行うことができる。一層高い感度をもたらしうる他の標識技術は、抗体を低分子量ハプテンに結合させることよりなっている。次いで、これらのハプテンを二次反応法により特異的に検出することができる。たとえば、この目的にはアビジンと反応するビオチンのようなハプテンを使用するのが一般的である。
本発明の抗ＣＤＫ４Ｉ抗体は、たとえば感染もしくは炎症の部位を同定し或いは特定の療法をモニタするようなインビボ診断に使用することもできる。本発明のペプチドを有する抗原のインビボ検出に本発明の抗ＣＤＫ４Ｉ抗体を使用する場合、検出可能に標識されたモノクローナル抗体を診断上有効な投与量で与える。「診断上有効」という用語は、検出可能に標識された抗ＣＤＫ４Ｉ抗体の量がＣＤＫ４Ｉを発現する細胞を有する部位の検出を可能にするのに充分な量で投与されることを意味する。
【００９８】
投与される検出可能に標識された抗ＣＤＫ４Ｉ抗体の濃度は、本発明のペプチドに対する結合をバックグランドと比較して検出しうるのに充分とすべきである。さらに、検出可能に標識された抗体は最良の標的とバックグランドとのシグナル比を与えるには循環系から急速に除去されることが望ましい。
一般に、インビボ診断につき検出可能に標識された抗ＣＤＫ４Ｉ抗体の投与量はたとえば個人の年令、性別および病気の程度のような因子に応じて変化する。抗体の投与量は約０．０１〜約５００ｍｇ／ｍ2 、好ましくは０．１〜約２００ｍｇ／ｍ2 、特に好ましくは約０．１〜約１０ｇ／ｍ2 の範囲で変化することができる。この種の投与量は、たとえば複数回の注射を行うかどうか或いは組織および当業者に知られた他の因子に応じて変化することができる。
【００９９】
インビボ診断画像形成には、入手可能な検出機器のタイプが所定の放射性同位元素を選択する際の主たる因子である。選択される放射性同位元素は、所定種類の機器につき検出可能である減衰のタイプを持たねばならない。インビボ診断につき放射性同位元素を選択する際の他の重要な因子は、放射性同位元素の半減期が、標的による取り込みが最大となるときにまだ検出可能であるよう充分長くすると共に、宿主に対する有害な照射が最小となるよう充分短くすることである。理想的には、インビボ画像形成につき使用される放射性同位元素は、粒子放出を欠如するが１４０〜２５０ｋｅＶ範囲にて多数のフォトンを発生するものであり、これは慣用のγカメラにより容易に検出することができる。
【０１００】
本発明の抗ＣＤＫ４Ｉ抗体は、病気治療の経過をモニタすべくインビトロおよびインビボにて使用することができる。たとえば、本発明のＣＤＫ４Ｉタンパク質およびペプチド断片を生物学的体液および組織で診断的に使用して下記するように治療的に使用した抗ＣＤＫ４Ｉ抗体の運命をモニタすることができる。
【０１０１】
ＩＸ．  ＣＤＫ４Ｉの治療的使用
Ａ．  医薬組成物の投与
ＣＤＫ４Ｉのための遺伝子の欠失またはその多型性に関する癌はＣＤＫ４Ｉの阻害活性の喪失または低下を原因とするので、治療上有効量のＣＤＫ４Ｉの投与はこの種の癌の進行もしくは発生をさらに妨げないとしても遅延させる。さらに、多くのＣＤＫ４Ｉ遺伝子の欠失および多型性はＭＴＡｓｅ産生能を遺伝的に欠如した細胞に存在するので、治療上有効量のＣＤＫ４ＩおよびＭＴＡｓｅの両者を患者に与えるよう指示される合併療法もこの種の癌の進行もしくは発生を、予防していなくても、遅延するのに有利である。
これら目的は精製、合成もしくは組換えＣＤＫ４Ｉおよび、適当ならばＭＴＡｓｅの直接的投与を介して行い得る。或いは、これら目的は遺伝子療法、特に遺伝子置換療法により達成することができる。
【０１０２】
精製、合成もしくは組換えＣＤＫ４Ｉおよび／またはＭＴＡｓｅの生成手段は、この開示（すなわち配列番号１〜５および１４；図２（ａ〜ｂ）も参照。（ＣＤＫ４Ｉ遺伝子に関するゲノムヌクレオチド配列を示し、エクソンには下線を施し、さらに図１０はＭＴＡｓｅ遺伝子のゲノムヌクレオチド配列を示し、エクソンには下線を施す）に示されたＣＤＫ４ＩおよびＭＴＡｓｅに関する情報と組合せて当業者に知られ、或いは容易に確認することができる。
ＣＤＫ４Ｉ組成物は、所望程度の純度を有するＣＤＫ４Ｉを生物学上許容しうるキャリヤと混合することにより、投与用に調製される。この種のキャリヤは、用いる投与量および濃度においてレシピエントに対し無毒である。通常、この種の組成物の調製は特定タンパク質を緩衝剤、たとえばアスコルビン酸のような酸化防止剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコースもしくはデキストリンを含む炭水化物、たとえばＥＤＴＡのようなキレート化剤、グルタチオン、並びに他の安定剤および賦形薬と組合せることを含む。この種の組成物は凍結乾燥することもでき、医薬上許容しうるものである。すなわち好適に調製され、所望用途に使用すべく承認することができる。
【０１０３】
ＣＤＫ４Ｉが悪性もしくは前癌性細胞に存在しない或いは効率が低下しているものであれば、この状態を有する細胞が本発明のＣＤＫ４Ｉ組成物の導入に好適な標的である。しかしながら処理すべきＣＤＫ４Ｉ異常性が他の検出可能な悪性徴候を持たない生殖系細胞もしくは体細胞に存在する場合は、投与を任意の経腸もしくは非経口ルートにより行うことができ、その投与量は患者の症状および達成すべき治療目的に応じて臨床医により変化させることができる。
この点に関し、ＣＤＫ４の「生物学的活性」という用語は、ヒト細胞の成長期のサイクリンＤおよび関連分子に対するＣＤＫ４の結合から生ずる酵素反応を意味する。さらに、ＣＤＫ４Ｉの「生物学的活性」とは、ＣＤＫ４ＩがＣＤＫ４に結合することから生ずるＣＤＫ４の生物学的活性の阻害をも意味する。
【０１０４】
したがって一般に、ＣＤＫ４Ｉ組成物の「治療上有効量」は、ＣＤＫ４Ｉが存在しないか或いはその生物学的活性が低下した（その結果、たとえばＣＤＫ４Ｉのための遺伝子における多型性の）ヒト細胞におけるＣＤＫ４の生物学的活性を阻害するのに充分な投与量である。この目的で、ＣＤＫ４Ｉの投与量は、１日あたり１回もしくはそれ以上で１日間〜数日間にわたり、約０．１〜約３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．２〜約２００ｍｇ／ｋｇの範囲で変えることができる。
【０１０５】
Ｂ．  遺伝子療法
本発明は、患者から単離された一次腫瘍および一次腫瘍から誘導された転移部位につき独特であるＣＤＫ４Ｉの標的配列における突然変異を同定する。腫瘍細胞にて、突然変異ヌクレオチド配列は正常細胞における発現と対比し、異なって発現される。したがって、この特定配列に向けられる適する治療（並びに診断）技術を設計することが可能である。たとえば細胞増殖障害が特定の突然変異腫瘍抑圧遺伝子核酸配列の発現に関連すれば、転写もしくは翻訳レベルにて突然変異遺伝子の特異的発現を阻害するヌクレオチド配列を使用することができる。たとえば、この手法はアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはリボザイムを用いて特定の突然変異ｍＲＮＡの転写もしくは翻訳を阻止し、これはｍＲＮＡをアンチセンス核酸でマスクし或いはリボザイムで切断して行われる。
【０１０６】
アンチセンス核酸は、特定ｍＲＮＡ分子の少なくとも１部に対し相補性であるＤＮＡもしくはＲＮＡ分子である［ワイントラウブ(Weintraub) 、Scientific American 、第２６２巻、第４０頁（１９９０）］。現在まで、数種の腫瘍サプレッサ遺伝子およびオンコジーンが抑圧またはダウンレギュレーションを目標としており、これには、ｐ５３［Ｖ．Ｓ．プラソロフ(Prasolov)等、Mol.Biol.(Moscow) 、第２２巻、第１１０５〜１１１２頁（１９８８）；ｒａｓ［Ｓ．Ｋ．アンダーソン(Anderson)等、Mol.Immunol.、第２６巻、第９８５〜９９１頁（１９８９）；Ｄ．ブラウン(Brown) 等、Oncogene Res. 、第４巻、第２４３〜２４９頁（１９８９）］；ｆｏｓ［Ｂ．レビ(Levi)等、Cell.Differ.Dev.、第２５巻（補遺）、第９５〜１０２頁（１９８８）；Ｄ．メルコーラ(Mercola) 等、Gene、第７２巻、第２５３〜２６５頁（１９８８）］；およびｍｙｃ［Ｓ．Ｏ．フレイタグ(Freytag) 、Mol.Cell.Biol.、第８巻、第１６１４〜１６２４頁（１９８８）；Ｅ．Ｖ．プロコウニック(Prochownik)等、Mol.Cell.Biol.、第８巻、第３６８３〜３６９５頁（１９８８）；Ｓ．Ｌ．ローク(Loke)等、Curr.Top.Microbiol.Immunol. 、第１４１巻、第２８２〜２８８頁（１９８８）］が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０７】
全ての場合、標的突然変異遺伝子の生成をブロックすることは充分でない。Ａ．Ｊ．レビン(Levine)等［Biochimica et Biophisica Acta.、第１０３２巻、第１１９〜１３６頁（１９９０）］に記載されたように、腫瘍表現型に寄与しうる少なくとも５種類の突然変異が存在する。要するに、タイプＩの突然変異は、積極的に優性作用する異常なタンパク質産生物をもたらすような遺伝子における突然変異である。この種の突然変異の例は、タンパク質における１２位もしくは６１位のアミノ酸変化をもたらすようなＨ−ｒａｓおよびＫ−ｒａｓ遺伝子に存在して、ＧＴＰを結合すると共に細胞成長に関する一定シグナルとなるタンパク質をもたらすものである。タイプＩＩの突然変異は、たとえば正常ｍｙｃタンパク質および変化したａｂｌタンパク質の過剰産生をもたらすｂｃｒ−ａｂｌトランスロケーションのようなオンコプロテインの過剰産生をもたらすものである。タイプＩＩＩの突然変異は機能突然変異の喪失であって、腫瘍は両方の対立遺伝子の喪失の結果として生じ、たとえばヒト染色体１３ｑ１４における網膜芽細胞腫感受性遺伝子（Ｒｂ）および１１ｑ１３に存在するウィルムス腫瘍感受性遺伝子によって生ずる。結腸癌の７５％においてはｐ５３遺伝子を有する染色体１７のｐ１２〜ｐ１３．３座における１つの対立遺伝子が共通して欠失し、或る場合には結腸癌細胞に残存する他のｐ５３対立遺伝子は恐らく腫瘍発生に寄与する突然変異体ｐ５３タンパク質を生成することが示されている。タイプＩＶの突然変異は、細胞の成長には直接的に寄与しないが癌細胞の生存能力を向上させるタンパク質の発現をもたらすものである。たとえば、ｖ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子に対する突然変異は、複製サイクル中に維持される変化した遺伝子によりトランスフォームされた赤芽球をもたらす。タイプＶの突然変異は腫瘍細胞への新たな遺伝情報の付加から生じ、一般にウィルスによりもたらされる。或る種の場合、ウィルスはそのＤＮＡを細胞ゲノムに組込んで、成長の細胞ネガティブレギュレータに結合するタンパク質（たとえばＲＢおよびｐ５３）を生成し、したがって効果的に機能突然変異メカニズムのタイプＩＩＩ喪失に類似する。
【０１０８】
たとえばタイプＩＩＩ、タイプＩＶおよびタイプＩＩＩに類似するタイプＶ型の突然変異のメカニズムにおけるような新形成細胞を生成する確率を増大するよう直接的に作用する突然変異タンパク質の生成をブロックするため、アンチセンス療法を使用することができる。アンチセンスは、突然変異が優性でない場合、たとえば適切なタンパク質をコードする非突然変異対立遺伝子が残存する場合に治療上有効である。しかしながら、突然変異がタイプＩの突然変異におけるように優性である場合およびたとえば或る種のタイプＩＩＩ型突然変異のように両対立遺伝子が欠失するか或いは一方が欠失して他方が突然変異体である場合、アンチセンス療法は好ましくは置換療法を伴う。置換療法においては、野生型遺伝子を突然変異腫瘍サプレッサ遺伝子もしくはプロトオンコジーンを有すると確認された標的細胞に導入して、同定された突然変異遺伝子に関連する新形成の発達に先回りするのに必要な野生型タンパク質の生成をもたらす。
【０１０９】
腫瘍サプレッサ遺伝子の場合、培養細胞への抑圧遺伝子の導入は細胞死滅をもたらすか或いは識別しえない変化をもたらすことも知られているが、細胞はもはや動物にて腫瘍形成性でない。たとえばリボザイムおよび／またはアンチセンス療法が遺伝子置換療法を伴う場合、リボザイムもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドが特異的な突然変異遺伝子を有する細胞集団が、処置される患者における新形成の発達にもはや寄与しないことが多くなる。
【０１１０】
合成アンチセンスオリゴヌクレオチドは一般に長さ１５〜２５塩基対の範囲である。ヒトゲノムのランダム構成を仮定して、統計は１７量体がヒトＤＮＡにおける細胞ｍＲＮＡにおける独特な配列を規定し、１５量体が細胞ｍＲＮＡ成分における独特な配列を規定することを示唆する。すなわち、選択された遺伝子標的に対する相当な特異性が、本発明の合成オリゴマーを用いて容易に得られる。
細胞において、アンチセンス核酸は対応のｍＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。アンチセンス核酸は、二本鎖であるｍＲＮＡを細胞が翻訳しないので、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好適である。何故なら、これらは容易に合成されると共に、標的ヌクレオチド突然変異体生産細胞に導入した際に大型分子よりも問題を起こす傾向が低いからである。遺伝子のインビトロ翻訳を阻害するアンチセンス法の使用は当業界にて周知である［マルクス−サクラ(Marcus-Sakura) 、Anal.Biochem. 、第１７２巻、第２８９頁（１９８８）］。大して一般的でないが、ＤＮＡに直接結合するアンチセンス分子も使用することができる。
【０１１１】
リボザイムは、他の一本鎖ＲＮＡをＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと同様に特異的に切断する能力を持ったＲＮＡ分子である。これらＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の改変により、ＲＮＡ分子における突然変異プロトオンコジーンもしくは腫瘍サプレッサ遺伝子の生成に関連した特定ヌクレオチド配列を認識する分子を処理してこれを切断することができる［セッチ(Cech)、J.Amer.Med.Assn.、第２６０巻、第３０３０頁（１９８８）］。この手法の主たる利点は、これらが配列特異性であるため特定の突然変異配列を有する標的ｍＲＮＡのみが失活される点にある。
２つの基本的種類のリボザイムが存在し、すなわちテトラヒメナ型［ハッセルホッフ(Hasselhoff)、Nature、第３３４巻、第５８５頁（１９８８）］および「ハンマーヘッド型」である。テトラヒメナ型リボザイムは長さ４塩基である配列を認識するのに対し、「ハンマーヘッド」型リボザイムは長さ１１〜１８塩基の塩基配列を認識する。認識配列が長いほど、配列が専ら標的ｍＲＮＡ種類で生ずる傾向も大となる。その結果、ハンマーヘッド型リボザイムは特定ｍＲＮＡ種類を失活させるのにテトラヒメナ型リボザイムよりも好適であり、１８塩基の認識配列はより短い認識配列よりも好適である。
【０１１２】
未改変のオリゴデオキシリボヌクレオチドは血清および細胞ヌクレアーゼにより容易に分解される。したがって当業界で周知であるように、リン酸骨格（バックボーン）の或る種の改変はアンチセンスＤＮＡに対するヌクレアーゼ耐性を付与する。たとえばホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびα−アノマー糖ホスフェート、骨格改変オリゴマーは血清および細胞ヌクレアーゼに対する向上した耐性を有する。さらに、メチルホスホネートは非イオン性であり、増大した脂質親和性を与えて、細胞膜を介しての取り込みを向上させる。アンチセンス剤としての改変オリゴヌクレオチドの使用は、分子構造における化学変化がハイブリダイゼーションに影響を与えるので、若干長いまたは短い配列を必要とする［Ｌ．Ａ．クリセイ(Chrisey) 等、BioPharm、第４巻、第３６〜４２頁（１９９１）］。これら骨格改変オリゴは標的配列に結合して、特定ＲＮＡに対する細胞翻訳機構の結合をブロックすることにより或いはＲＮＡ／ＤＮＡデュープレックス構造の形成によってリボヌクレアーゼＨ活性を誘発させることにより阻害作用を発揮する。
【０１１３】
さらに本発明は癌症状、すなわちＣＤＫ４Ｉ遺伝子の欠失または多型性により媒介される細胞増殖障害を処置するための遺伝子療法をも提供する。この種の療法は、突然変異遺伝子により生じた増殖障害を有すると本発明の方法により確認された細胞へ特定アンチセンスポリヌクレオチドおよび／または置換野生型遺伝子を導入して作用を達成する。細胞がＣＤＫ４Ｉ遺伝子をコードする野生型遺伝子の置換、および多型性を有するＣＤＫ４Ｉ遺伝子の複製を阻止するアンチセンス療法を必要とするかどうかはケースバイケースで決定せねばならず、突然変異が優性効果を有するかどうかに依存し、すなわち野生型遺伝子の両方の対立遺伝子が破壊されて遺伝子の完全な不存在が細胞増殖作用を有するかどうかに依存する。
【０１１４】
突然変異遺伝子に対して特異的なアンチセンス腫瘍サプレッサポリヌクレオチドおよび置換野生型遺伝子の供給（デリバリー）は、たとえばキメラウィルスまたはコロイド分散系のような組換え発現ベクターを用いて達成することができる。アンチセンス配列の治療供給にはリポソーム、特に目標とするリポソームの使用が好適である。
ここに教示した遺伝子療法につき用いうる各種のウィルスベクターはアデノウィルス、ヘルペスウィルス、ワクチンまたは好ましくはたとえばレトロウィルスのようなＲＮＡウィルスを包含する。好ましくはレトロウィルスベクターはマウスもしくは鳥類レトロウィルスの誘導体である。１つの外来遺伝子を挿入しうるレトロウィルス  ベクターの例には、これらに限定されないが、次のものが含まれる：モロニー・ネズミ白血病ウィルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイ・ネズミ肉腫ウィルス（ＨａＭｕＳＶ）、ネズミ乳腫瘍ウィルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）。他の多数のレトロウィルスベクターは複数の遺伝子を組み込むことができる。これらベクターは全て選択性マーカーに関する遺伝子を移動し或いは組込んで、移入（トランスデュース）された細胞を同定および発生させることができる。対象となる１個もしくはそれ以上の配列をウィルスベクター中へ、たとえば特定標的細胞上のリセプタに対するリガンドをコードする他の遺伝子と一緒に挿入することにより、ベクターは標的特異的となる。レトロウィルスベクターは、たとえば糖、糖脂質もしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することにより標的特異性にすることができる。好適な標的化はレトロウィルス  ベクターを標的とする抗体を使用して達成される。当業者は、不用な実験を行うことなく、レトロウィルスゲノム中に挿入して対象となるポリヌクレオチドを含有したレトロウィルスベクターの標的特異的な供給を可能にする特定ポリヌクレオチド配列を周知し、或いは容易に確認することができる。必要に応じ、細胞に対する置換遺伝子の目標供給につき別のベクターを用いることもでき、或いはアンチセンス  オリゴヌクレオチドおよび置換遺伝子を必要に応じ同じベクターを介して供給することもできる。何故なら、アンチセンス  オリゴヌクレオチドは多型性を有する標的遺伝子に対してのみ特異性であるからである。
【０１１５】
組換えレトロウィルスは欠点を有するので、これらは感染性ベクター粒子を生成するには援助を必要とする。この援助は、たとえばレトロウィルスの全構造遺伝子をＬＴＲ内の調整配列の制御下でコードするプラスミドを持ったヘルパー細胞株を用いて提供することができる。これらプラスミドはパッケージメカニズムをＲＮＡ転写物の包封のために認識しうるようなヌクレオチド配列を喪失している。パッケージングシグナルの欠失を有するヘルパー細胞株は、限定はしないがΨ２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２を包含する。これら細胞株はエンプティービリオンを生成する。何故なら、ゲノムが包封されないからである。パッケージングシグナルが無傷であるこの種のヘルパー細胞にレトロウィルスベクターが導入されても構造遺伝子が対象となる他の遺伝子により置換されれば、ベクターを包封すると共にベクタービリオンを生成させることができる。
【０１１６】
アンチセンスポリヌクレオチドのための他の目標とする供給システムはコロイド分散系である。コロイド分散系は巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズおよび脂質に基づく系、たとえば水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを包含する。本発明の好適コロイド系はリポソームである。リポソームは人工膜小胞であって、インビトロおよびインビボにて供給ベヒクルとして有用である。寸法０．２〜４．０μｍの範囲である大型単ラメラ小胞（ＬＵＶ）は、大型巨大分子を含有する水性緩衝剤の相当割合を包封することができる。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷ビリオンを水性内部に包封して、生物学上活性型にて細胞に供給することができる［フレーリー(Fraley)等、TrendsBiochem.Sci.、第６巻、第７７頁（１９８１）］。哺乳動物細胞の他、リポソームは植物、酵母および細菌の各細胞においてポリヌクレオチドの供給に使用されている。リポソームが効率的な遺伝子移動ベヒクルとなるには、次の特徴が存在せねばならない：（１) アンチセンス  ポリヌクレオチドを高効率にてコードするが、その生物学的活性を相殺しない遺伝子の包封；（２）非標的細胞と対比し標的細胞に対する優先かつ相当な結合；（３）高効率における標的細胞の細胞質に対する小胞の水性内容物の供給；および（４）遺伝子情報の正確かつ効果的な発現［マニノ(Mannino) 等、Biothechniques、第６巻、第６８２頁（１９８８）］。
【０１１７】
リポソームの組成は、一般にステロイド（特にコレステロール）と組合せたリン脂質、特に高い相転移温度のリン脂質の組合せ物である。他のリン脂質もしくは他の脂質も使用することができる。リポソームの物理的特性はｐＨ、イオン強度および二価陽イオンの存在に依存する。
リポソーム生成に有用な脂質の例はホスファチジル化合物、たとえばホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴリピド、セレブロシドおよびガングリオシドを包含する。脂質部分が１４〜１８個の炭素原子、特に１６〜１８個の炭素原子を有すると共に飽和されているジアシルホスファシジル  グリセロールが特に有用である。リン脂質の例は卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンを包含する。
【０１１８】
リポソームの標的化は、解剖的因子および機械的因子に基づいて分類することができる。解剖的分類は選択性、たとえば器官特異性、細胞特異性およびオルガネラ特異性のレベルに基づく。機械的標的化は、受動的または能動的のいずれであるかに基づいて区別することができる。受動的標的化は、リポソームが洞様毛細管を含む各器官における網膜内皮系（ＲＥＳ）の細胞に分布する自然傾向を利用する。他方、能動的標的化はたとえばモノクローナル抗体、糖、糖脂質もしくはタンパク質のような特定リガンドに結合させることにより或いはリポソームの組成もしくは寸法を変化させて天然の局在部位以外の器官および細胞の標的化を達成することにより、リポソームを変化させることを含む。
標的供給システムの表面は各種の方法で改変することができる。リポソーム標的供給系の場合、リピド基をリポソームの脂質二重層に組込んで、標的化リガンドをリポソーム二重層との安定関係に維持することができる。各種の結合基を用いて、リピド連鎖を目標リガンドに結合させることができる。
【０１１９】
遺伝子療法を行う他の手段は当業界で周知されている；たとえばフェルグナー(Felgner) 等、Science 、第２４７巻、第１４６５頁（１９９０）；スティブリング(Stibling)等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.、第８９巻、第１１２７７〜１１２８１頁（１９９２）；およびタング(Tang)等、Nature、第３５６巻、第１５２〜１５４頁（１９９２）（これらの開示を、遺伝子療法を実施する方法に関する当業界の知識を例示するため、ここに援用する）。しかしながら、本発明の遺伝子療法を実施する好適手段は、「裸」の非複製型（すなわちウィルス  ベクター、リポソーム、宿主細胞または核酸を発現させる均等手段と連携しない）における前記遺伝子の投与である。さらに、この種の裸ヌクレオチドの好適な投与ルートは骨格筋への注射、特に好ましくは比較的高濃度の抗原提供細胞を含有する組織への導入である。
【０１２０】
Ｘ．  ＣＤＫ４Ｉキットおよび製品
上記の診断研究および治療用途に使用するため、本発明によりキットも提供される。診断および研究の用途において、この種のキットは次のような全てのものを包含する：アッセイ試薬、緩衝剤、ＣＤＫ４Ｉタンパク質および／または断片、ＣＤＫ４Ｉ組換え発現ベクター、ＣＤＫ４Ｉオリゴヌクレオチドおよび他のハイブリダイゼーションプローブおよび／またはプライマー、および／または適するアッセイ装置。治療用製品は、凍結乾燥されたＣＤＫ４Ｉもしくは抗ＣＤＫ４Ｉ懸濁物の再編成に使用するための無菌塩水もしくは他の医薬上許容しうるエマルジョンおよび懸濁ベース、好適には標識および承認されたＣＤＫ４Ｉもしくは抗ＣＤＫ４Ｉ組成物の容器、並びにこれら物質を含むキットを上記診断キット部品に関連して使用するために含む。
【０１２１】
この種のキットはさらに１種もしくはそれ以上のたとえば小瓶、チューブなどの収容手段を狭い空間に収容すべく分室化されたキャリヤ手段を備え、これら収容手段のそれぞれはこの方法に使用すべき別々の手段の１つを備える。
たとえば収容手段の１つは検出可能に標識され或いは標識しうるハイブリダイゼーションプローブを含むことができる。第２容器は細胞溶解緩衝剤を含む。さらにキットは標的核酸配列を増幅するためのヌクレオチドを保持する容器および／または、たとえば酵素、蛍光もしくは放射性核標識のようなレポータ分子に結合された、たとえばビオチン結合性タンパク質、たとえばアビジンもしくはストレプトアビジンのような、レポータ手段を含む容器をも備えることができる。
以上、本発明を詳細に説明したが、以下の実施例によりさらに説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例のみに限定されないことが了解されよう。
【実施例】
【０１２２】
［実施例Ｉ］
ＣＤＫ４Ｉ遺伝子の同定および特性化
ＭＴＡｓｅ  ｃＤＮＡ（配列番号１４）を単離すると共に、ヒト胎盤λファージライブラリを検査すべく使用した。２キロベースのＨｉｎｄＩＩＩ断片は、配列分析によりＭＴＡｓｅ遺伝子の３’末端を有した。染色体操作を、ＭＴＡｓｅの３’末端から出発して行った。既知のＰ１ファージ［たとえばピアス(Pierce)等、Meth.Enzymol. 、第２１６巻、第５４９〜５７４頁（１９９２）］の数回のスクリーニングサイクルおよびその後のλファージライブラリのスクリーニングは、Ｔ９８Ｇにおける欠失領域を含むクローンの単離をもたらした。これらファージの制限断片をサブクローン化し、部分的に配列決定し、サザン・ブロッティングおよびパルス・フィールド・ゲル電気泳動により地図化した。図４は、ＭＴＡＰとインターフェロン−β（ＩＦＮＢ）遺伝子座との間のヒト染色体９ｐ２１の地図を示し、Ｔ９８Ｇグリオーマ細胞株における欠失セグメントに注目した。
【０１２３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、４６種の異なるヒト悪性細胞株における染色体９ｐからの数種の配列標識部位（ＳＴＳ）の欠失頻度を測定した（表１）。細胞種類に応じ、ＳＴＳ  ５４ＦもしくはＳＴＳ  ５ＢＳのいずれかが最も頻繁に欠失した。これらの結果は、ＳＴＳ  ５４ＦとＳＴＳ  ５ＢＳとの間の５０キロベース領域に注目を集めた。
５４Ｆと５ＢＳとの間に破断点を有する８種の悪性細胞株を次いでＳＴＳ−ＰＣＲにより分析し、これには介入領域からの新たなプローブを用いた。その欠失マップを図５に示す。１９キロベースのλファージクローン（１０Ｂ１）は最も頻繁に欠失された部位を確認した（図４（ａ）参照）。クローン１０Ｂ１のファージＤＮＡをＥＣＯ  ＲＩにより切断すると共にＥＣＯ−ＲＩ−カットｐブルーＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ  ＳＫ＋［ストラタジーン、ラ・ホイヤ、ＣＡ］にサブクローン化させた。ヒト胎盤および黒色腫細胞株からのＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、０．８％アガロースゲルで分け、次いでナイロン膜にトランスファーさせた。これらサブクローンを自動化ＤＮＡ配列決定にかけた。４．２ｋｂのサブクローン１０Ｂ１〜１０はＣＤＫ４１とＣＤＫ４１３’との両ヌクレオチド配列（配列番号１〜２および４〜５）を含有する一方、ＣＤＫ４１５’のヌクレオチド配列は１０Ａ１サブクローンに含まれる。
【０１２４】
クローン１０Ｂ１（図４（ａ））からの１０Ｂ１〜１０サブクローンの配列は３０６塩基対のオープンリーディングフレームを有する。コード化領域の３’末端および３’−非コード化領域はＭＴＡｓｅ遺伝子の方向に２．６キロベースにて位置するのに対し、遺伝子の５’末端はＴ９８Ｇにおける欠失領域に対しテロメア的である。
ＰＣＲ増幅反応を、０．１μｇのＤＮＡと１×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ）トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）と５０ｍＭのＫＣｌと１．５ｍＭのＭｇＣｌ2 と０．０１％のゼラチンと２００μＭの各ｄＮＴＰと２０ｎｇの各センスおよびアンチセンスプライマーと０．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとを含有する全容積２０μＬで行った。３５サイクルを行い（６４℃のアニールおよび７２℃の伸長）、次いでゲル電気泳動を行った。  ＣＤＫ４Ｉ５（配列番号３）は、センスプライマー（５’−ＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧＧＣＡＧＣＡＴ−３’）およびアンチセンスプライマー（５’−ＴＴＡＴＴＴＧＡＧＣＴＴＴＧＧＴＴＣＴＧ−３’）を用いて細胞株Ｈ６６１（ＡＴＣＣ受託番号 ）における逆転写酵素−ＰＣＲにより発生した１３９ｂｐの産物である。これらＰＣＲ産物をサブクローン化させると共に配列決定した。クローンｐ７−４（ＡＴＣＣ受託番号５５５４０）はＣＤＫ４阻害物質ｃＤＮＡの５’配列を有した。１３９ｂｐの産物をクローンｐ７−４からセンスプライマーおよび新たなアンチセンスプライマー（５’−ＴＣＧＧＣＣＴＣＣＧＡＣＣＧＴＡＡＣＴＡ−３’）により増幅させて、サザン・ブロッティングにつき使用した。これらブロットを６５℃にて１晩ハイブリダイゼーションさせ、６５℃にて０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣで洗浄し、次いでＸ線フィルムに露光させた。
【０１２５】
［実施例ＩＩ］
癌細胞株におけるＣＤＫ４１遺伝子の欠失または多型性
図９に示したように、最初にスクリーニングされた４６種の悪性細胞株（表１）を、ＣＤＫ４Ｉ’およびＣＤＫ４Ｉ３’エクソンに対応するＳＴＳ−ＰＣＲプライマー（配列番号８〜１１）で再スクリーニングした。黒色腫の６１％、膠腫の８７％、非−小細胞肺癌の４５％および白血病の６４％はＣＤＫ４１遺伝子断片のホモ接合型欠失を有する（表１）。
【０１２６】
黒色腫細胞株ＷＭ２２６−４はＣＤＫ４抑制遺伝子の５’末端のみを欠失した（配列番号３）。これはＣＤＫ４Ｉ’につき陽性、ＳＴＳ  ５ＢＳにつき陰性であり、ＥｃｏＲＩ切断、電気泳動およびＣＤＫ４阻害遺伝子の５’−領域からのプローブに対するハイブリダイゼーションの後、異常な７．０キロベースのバンドを形成した。他方、黒色腫細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−３１はＣＤＫ４Ｉ遺伝子の３’末端のみを欠失した（配列番号５）。デトロイト４６２細胞株（咽頭癌）はＣＤＫ４Ｉ遺伝子内に２９キロベースの欠失を有する。これは、ＣＤＫ４Ｉ３’につき陽性であり、ＣＤＫ４Ｉ’につき陰性であったが、ＳＴＳ−５ＢＳおよびＳＴＳ−７１Ｆにつき陽性であった。後者２種のＳＴＳはＣＤＫ４抑制遺伝子の５’末端に対しセントロメア的に配置していた。
【０１２７】
ヒト細胞における逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイは正常細胞にてＣＤＫ４阻害遺伝子転写物を示したが、ＣＤＫ４阻害遺伝子の確認された欠失を有する癌では示されなかった（図９）。
これら分析を行うため、ｍＲＮＡを「ファーストトラック」キット［インビトロゲン社、サンジエゴ、ＣＡ］で精製し、ＲＮアーゼフリーのＤＮアーゼ（ファルマシア社）で処理し、その際ヒト胎盤ＤＮＡを比較として用いることにより完全ＤＮアーゼＩ切断を確保した。ストラタスクリプトＲＴ−ＰＣＲキット［ストラタジーン・ラ・ホイヤ、ＣＡ］での第１ストランドｃＤＮＡ合成の後、ｃＤＮＡをＣＤＫ４Ｉ３’プライマーにより増幅させた（５８℃のアニールおよび７０℃の伸長）。
【０１２８】
比較Ｇ３ＰＤＨ遺伝子（５’−ＴＧＧＴＡＴＧＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＴＣＡＴＧＡＣ−３’および５’−ＡＴＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣ−３’）のプライマーは１９０ｂｐ産物を増幅した（５５℃のアニールおよび７２℃の伸長）。ＣＤＫ４Ｉ３’エクソンおよびＧ３ＰＤＨのＲＴ−ＰＣＲを別々に行い、２％アガロースゲルにて分けた。図９のレーン１、２および４で見られる３５５ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ産物がｃＤＮＡから得られた。これらの結果は、ヒト細胞が単一のＣＤＫ４阻害遺伝子を含有し、これが黒色腫、膠腫および白血病の大部分、並びに多くの非小型細胞肺癌にてホモ接合的に欠失もしくは再編成されることを示す。
【０１２９】
［実施例ＩＩＩ］
ＣＤＫ４Ｉ遺伝子の欠失の検出
Ａ．  ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡのための固体支持材料の作製
５０ｍＭの２−［Ｎ−モルフォリノ］エタンスルホン酸におけるＣＤＫ４Ｉ遺伝子に特異性の２．５ｐモル／ｍＬのアミノ化オリゴヌクレオチドと１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ５．５）との２０μＬをポリカーボネートで作成された９６穴マイクロタイター板（コスター・ケンブリッジ、ＭＡ）の各穴に入れた。次いで４ｍｇ／ｍＬの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸塩［ＥＤＣ、ピアス・ケミカル社］の２０μＬを添加し、プレートを３７℃にて２時間にわたりインキュベートした。次いで各穴をリン酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）により１回洗浄し、次いで１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）により１時間ブロッキングした。
【０１３０】
Ｂ．  トリプルプライマＰＣＲ増幅
配列番号８〜１３に記載したプライマーを用い、上記表１に同定した細胞株から得られたゲノムＤＮＡを次のように増幅させた。０．１μｇのゲノムＤＮＡを１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）と５０ｍＭのＫＣｌと１．５ｍＭのＭｇＣｌ2 と０．０１％のゼラチン（ＰＣＲ緩衝液）と２００μＭのそれぞれｄＮＴＰ、２０ｎｇの各プライマーおよび０．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとよりなる増幅混合物に添加した。パーキン・エルマー・セタスＤＮＡサーマル・サイクラーにて３０サイクルを行い、各サイクルは変性（９４℃、１分間とアニール（５０〜５５℃、１分間）と伸長（７２℃、１分間）とで構成した。
【０１３１】
Ｃ．  固定化プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長の検出
各穴をＨＷ緩衝液（３×ＳＳＣ、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン）で３回およびブロッキング用緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および８００ｍＭのＮａＣｌにおける０．５％のＧＥＮＩＵＳブロッキング試薬、ベーリンガー・マンハイム登録商標）で１回洗浄し、次いで８０μＬのテトラメチルベンチジンおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ［キケガード・アンド・ペリー・ラボラトリース］と共にインキュベートした。反応を８０μＬの１Ｍ  Ｏ−ホスフェートにより適する時点で停止させた。それぞれ１５０μＬを他のマイクロタイター板に移し、ＯＤをモレキュラ・デバイシス社、メンロ・パーク、ＣＡからのマイクロタイター解読装置により４５０ｎｍにて測定した。このアッセイの結果を表１に要約する。
【０１３２】
［実施例Ｖ］
形成不全母斑症候群細胞における生殖系ナンセンス突然変異の検出
ＣＤＫ４Ｉ’の各プライマー（配列番号８〜９）を作成すると共に逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いてＣＤＫ４Ｉ遺伝子転写物をヒトリンパ芽細胞株［ＧＭ０６９２１；ＡＴＣＣ受託番号 ）にて増幅させ、このリンパ芽細胞株は形成不全母斑症候群（家族性黒色腫）を有する患者から得た。オリタ等（上記）により記載された技術および／またはウー等（上記）により記載された技術を用い、ＣＤＫ４Ｉ遺伝子転写物の突然変異型をＧＭ０６９３２１細胞株にて同定した。転写物の配列分析はｍＲＮＡの１６６位にＣ→Ｔ転移を示し、これはナンセンス突然変異をもたらす（図６参照）。
【０１３３】
［実施例ＶＩ］
白血病細胞株におけるＣＤＫ４Ｉ５’遺伝子微小欠失の検出
ＣＤＫ４Ｉ５’の各プライマー（配列番号１２〜１３）を構築すると共に逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いてヒト白血病細胞株Ｕ９３７（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ  １５９３）にてＣＤＫ４Ｉ遺伝子転写物を増幅させた。オリタ等により記載された技術（上記）および／またはウー等により記載された技術（上記）を用い、突然変異型のＣＤＫ４Ｉ５’遺伝子転写物をＵ９３７細胞株にて同定すると共に配列決定し、１９塩基対の微小欠失を示した（図７参照）。
【０１３４】
配列の要約
配列番号１は、ヒトゲノムＣＤＫ４Ｉの５’領域のヌクレオチド配列及びＣＤＫ４Ｉの５’領域の対応する予想アミノ酸配列である。
配列番号２は、ヒトゲノムＣＤＫ４Ｉの内部領域及び３’領域のヌクレオチド配列である。
配列番号３〜５は、それぞれＣＤＫ４Ｉ５’、ＣＤＫ４Ｉ’およびＣＤＫ４Ｉ３’エクソンである。
配列番号６および７は、９ｐ２１染色体の５４Ｆと５ＢＳとの間の領域（すなわちクローン１０Ｂ１に対応する）のオリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号８〜１３は、それぞれＣＤＫ４Ｉ’、ＣＤＫ４Ｉ３’およびＣＤＫ４Ｉ５’、エクソンのオリゴヌクレオチドプライマーの配列である
配列番号１４は、ＭＴＡｓｅの全長ゲノムヌクレオチド配列である。
【０１３５】
【表２】
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【０１３６】
【表３】
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【０１３７】
【表４】
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【０１３８】
【表５】
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【０１３９】
【表６】
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【０１４０】
【表７】
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【０１４１】
【表８】
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【０１４２】
【表９】
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【０１４３】
【表１０】
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【０１４４】
【表１１】
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【０１４５】
【表１２】
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【０１４６】
【表１３】
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【０１４７】
【表１４】
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【０１４８】
【表１５】
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【０１４９】
【表１６】
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【０１５０】
【表１７】
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【０１５１】
【表１８】
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【０１５２】
【表１９】
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【０１５３】
【表２０】
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【０１５４】
【表２１】
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【０１５５】
【表２２】
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【０１５６】
【表２３】
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【０１５７】
【表２４】
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【０１５８】
【表２５】
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【０１５９】
【表２６】
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【０１６０】
【表２７】
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【０１６１】
【表２８】
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【０１６２】
【表２９】
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【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】哺乳動物細胞の成長サイクルにおけるＧ１から有糸分裂（Ｍ）までの各期間を示す。
【図２ａ】ヒトＣＤＫ４Ｉ遺伝子の全長ゲノム配列を示し、ここでエクソンＣＤＫ４Ｉ５’、ＣＤＫ４Ｉ’およびＣＤＫ４Ｉ３’には下線を施す。
【図２ｂ１】ヒトＣＤＫ４Ｉ遺伝子の全長ゲノム配列を示し、ここでエクソンＣＤＫ４Ｉ５’、ＣＤＫ４Ｉ’およびＣＤＫ４Ｉ３’には下線を施す。
【図２ｂ２】ヒトＣＤＫ４Ｉ遺伝子の全長ゲノム配列を示し、ここでエクソンＣＤＫ４Ｉ５’、ＣＤＫ４Ｉ’およびＣＤＫ４Ｉ３’には下線を施す。
【図２ｂ３】ヒトＣＤＫ４Ｉ遺伝子の全長ゲノム配列を示し、ここでエクソンＣＤＫ４Ｉ５’、ＣＤＫ４Ｉ’およびＣＤＫ４Ｉ３’には下線を施す。
【図２ｂ４】ヒトＣＤＫ４Ｉ遺伝子の全長ゲノム配列を示し、ここでエクソンＣＤＫ４Ｉ５’、ＣＤＫ４Ｉ’およびＣＤＫ４Ｉ３’には下線を施す。
【図３】図２（下側ライン）に示したゲノムＤＮＡ配列の５’領域をセラノ等、Nature、第３６６巻、第７０４〜７１０頁（１９９３）に報告されたｃＤＮＡ配列（上側ライン）と比較し、相違点は各配列間における縦線がないことによって示す。
【図４ａ】ＭＴＡｓｅおよびＩＮＦ−α遺伝子座の間の染色体９Ｐ２１の領域を示し、これはＴ９８Ｇにおいて欠失セグメントが集中している。図４（ａ）は、欠失セグメントのヌクレオチド配列を示す。
【図４ｂ】ＭＴＡｓｅおよびＩＮＦ−α遺伝子座の間の染色体９Ｐ２１の領域を示し、これはＴ９８Ｇにおいて欠失セグメントが集中している。図４（ｂ）は染色体９におけるＭＴＡｓｅに対する領域とＩＮＦ−α遺伝子との関係を示す。
【図５】ＭＴＡｓｅおよびＩＮＦ−αの各遺伝子座間の領域における５４Ｆ領域と５ＢＳ領域との間の欠失部位をマップ化する。ここでＣＤＫ４Ｉの遺伝子の部位は最も頻繁に欠失した領域内に存在する。
【図６】ＣＤＫ４Ｉ遺伝子の通常のＤＮＡ配列（下側ライン）と家族性的黒色腫を有するヒト患者からの細胞に見られる１つの塩基置換を有する遺伝子の突然変異配列（上側ライン）とを比較する。
【図７】ＣＤＫ４Ｉ遺伝子の通常のＤＮＡ配列（下側ライン）と白血病細胞株に見られる遺伝子内の微小欠失を有する遺伝子の突然変異配列（上側ライン）とを比較する。
【図８】数種のヒト悪性細胞株におけるＣＤＫ４Ｉ遺伝子に対するＰＣＲ系アッセイの結果を示す。ここでレーン１＝胎盤細胞、レーン２＝ＳＫ−ＭＥＬ−３１（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ７３；黒色腫細胞株）、レーン３＝ＷＭ２６６−４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６７６；黒色腫細胞株）、レーン４＝Ｔ９８Ｇ（膠腫細胞株）、レーン５＝ＢＶ１７３（ＡＴＣＣ ； ）、レーン６＝ＣＥＭ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １１９；リンパ芽球白血病細胞株）、レーン７＝ＭＯＬＴ−４（ＡＴＣＣ  １５８２；リンパ芽球白血病）、レーン８＝Ａ−５４９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １８５；非−小細胞肺癌細胞株）、レーン９＝ＳＫ−ＭＥＳ−１（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  ５８；非小型細胞肺癌細胞株）である。レーン１０はテンプレートがないものであり、レーン１１はＤＮＡマーカーである。
【図９】数種の悪性細胞株におけるＣＤＫ４Ｉ遺伝子に対応するｍＲＮＡにつき逆転写酵素ＰＣＲ系アッセイの結果を示す。レーン１＝ＷＩＬ２−ＮＳ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８１５５：正常リンパ芽球細胞株）、レーン２＝Ｕ９３７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５９３；白血病細胞株）、レーン３＝Ｔ  ９８Ｇ（ＡＴＣＣＣＲＬ  １６９０；膠腫細胞株）、レーン４＝Ｈ６６１（ＡＴＣＣ ；非小型細胞肺癌細胞株）、レーン５＝Ａ−５４９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １８５；非小型細胞肺癌細胞株）およびレーン６＝ＳＫ−ＭＥＳ−１（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ５８；非−小細胞肺癌細胞株）；Ｍ＝ＤＮＡマーカーである。
【図１０】ＭＴＡｓｅの全長ゲノムヌクレオチド配列であり、エクソンに下線を施す。
【図１】
2005245469.tif 000031
【図２ａ】
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【図２ｂ１】
2005245469.tif 000033
【図２ｂ２】
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【図２ｂ３】
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【図２ｂ４】
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【図３】
2005245469.tif 000037
【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年6月30日(2005.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
配列番号１５における８１位〜９８位が欠失している変異サイクリン依存性キナーゼ阻害物質（ＣＤＫ４Ｉ）ポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列のＣＤＫ４Ｉポリヌクレオチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
【表２９】
2005245469.tif 000046