(57)【要約】【課題】予測外の波長において吸光度に変化が見られるような現象があった場合に、これを見逃すことなく確実に捉えて構造解析の参考に供する。【解決手段】昇温又は降温を行う過程で、所定温度ステップ毎に所定波長範囲の波長走査を実行し、サンプルの吸光スペクトルを測定する。この測定をＤＮＡの２重鎖構造が完全に解れる温度の範囲で繰り返し行い、温度、波長、吸光度の３つのディメンジョンを有するデータを取得し、これを３次元グラフ化して画面上に表示する。【選択図】  図３
2005010049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液の温度と該試料溶液による吸光度との関係を分光測定により求め、その測定結果に基づいてＤＮＡの融解温度又はそれに相当する指標値を算出する融解温度測定装置において、
ａ）測定対象である試料溶液の温度を上昇又は下降させるための温調手段と、
ｂ）前記温調手段により試料溶液の温度を上昇又は下降させる過程で、その試料溶液に対し、所定温度ステップ毎に所定波長範囲での吸光スペクトルを測定する測定実行手段と、
ｃ）前記測定実行手段により取得されたデータに基づいて、温度、波長、及び吸光度の３つのディメンジョンを有する３次元グラフを作成して表示手段の画面上に表示する表示制御手段と、
を備えることを特徴とする融解温度測定装置。
【請求項２】
ｄ）波長を外部より指定するための波長指定手段と、
ｅ）前記測定実行手段により取得されたデータに基づいて、前記指定波長における温度と吸光度との関係を表す熱融解曲線を求め、その熱融解曲線から融解温度を算出する融解温度算出手段と、
をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の融解温度測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、紫外可視分光光度計による分光測定を利用してＤＮＡの融解温度（Ｔｍ値）を測定するための融解温度測定装置に関する。但し、本発明に係る融解温度測定装置は必ずしもＤＮＡの融解温度の測定のみにしか利用できないものではなく、例えば温度の上昇又は下降の過程で物性が変化して吸光度が変化するポリマー等の高分子材料など、融解温度測定と同様の手順で以てその物性の変化温度を測定するものに利用することも可能である。
【０００２】
【従来の技術】
近年、人間やそのほかの生物のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の構造解析が各種の研究機関で非常に盛んに行われている。一般に、ＤＮＡは、２本のＤＮＡ分子の間でアデニンとチミン、又はグアニンとシトシンとが相補的塩基対を形成した２本鎖構造を有している。このような２本鎖構造は、ＤＮＡを溶解させた試料溶液の温度を上昇させてゆくことによって徐々に解れてゆき、８０〜１００℃程度の高温溶液中では完全に解れて１本鎖構造になる。こうしたＤＮＡの２重鎖構造の安定性を示す指標値の１つが融解温度（以下「Ｔｍ値」という）であり、このＴｍ値は、ＤＮＡの２重鎖が温度上昇に伴って融解してゆく過程で鎖状状態がちょうど５０％である状態を示す温度である。
【０００３】
従来の一般的なＴｍ値の測定手順は次の通りである（例えば特許文献１など参照）。すなわち、測定対象であるサンプルは蒸発を防止するために密栓セルに収容される。このサンプルはまず完全な２本鎖状態に戻すために約０℃の温度雰囲気で数分間維持され、その後、一定の昇温レート（例えば１℃／分）で昇温される。そして、１℃上昇する毎に、紫外光領域にある所定波長λでサンプルの吸光度を測定する。当初、吸光度は比較的小さい値を示すが、サンプルの温度上昇に伴って２重鎖が溶解してくると吸光度は上昇する。２重鎖が完全に解れて１本鎖状態になる約１００℃まで、吸光度の測定は継続される。こうした測定により、横軸を温度、縦軸を吸光度とした図５に示すような熱融解曲線が作成される。この熱融解曲線に対し接線法又は微分法を適用して、Ｔｍ値を求める。
【０００４】
従来より、Ｔｍ値を求めるには２６０ｎｍ付近の波長での吸光度が適当であることが一般に知られている。そのため、上記のような測定では、測定波長λは２６０ｎｍ近辺に設定されることが多い。また場合によっては、サンプルに含まれるバッファ溶媒のバックグラウンドを補正するために、２６０ｎｍと２８０ｎｍとの２波長での測定を行う場合もある。但し、その場合でも、サンプルの吸光度として求まるのは、２６０ｎｍの波長に対するものである。
【０００５】
【特許文献１】
特開２００３−１２１３４４号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上述のようにＴｍ値を測定する目的は、多くの場合、サンプルに含まれるＤＮＡの構造推定であり、そのためには、１つのサンプルについてその濃度を変えながら繰り返し測定を実行する必要がある。また、多数のサンプルを迅速に測定することも要求される。そのため、従来のこの種の装置では、上記のように或る定められた波長における各温度での吸光度測定を、できるだけ短時間で且つ精度良く行うように考慮されている。
【０００７】
しかしながら、サンプルの構造が全く不明であるようなものを測定する場合、上記のような２６０ｎｍとは全く異なる予測しない波長で以て構造解析に有用な情報が得られる、ということも考えられないことはない。しかしながら、従来の融解温度測定装置ではこうしたことは考慮されていないため、仮に、こうした未知の構造解析に有用な情報を充分に得たい場合には、測定波長λを順次変更しながら、厖大な回数の測定を繰り返し行わなければならず、たいへんな労力と時間とが掛かる。また、そうして収集したデータを解析して、未知の構造解析に有用な情報が有るか否かを判断するのも面倒な作業である。
【０００８】
本発明はこのような課題に鑑みて成されたものであり、その主たる目的は、ＤＮＡ等のサンプルに対し、これまで予測していなかったような波長での有益な情報があるか否かを簡便に判断し、もしそうした情報がある場合にこれを効率よく収集することができる融解温度測定装置を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段、及び効果】
上記課題を解決するために成された本発明は、試料溶液の温度と該試料溶液による吸光度との関係を分光測定により求め、その測定結果に基づいてＤＮＡの融解温度又はそれに相当する指標値を算出する融解温度測定装置において、
ａ）測定対象である試料溶液の温度を上昇又は下降させるための温調手段と、
ｂ）前記温調手段により試料溶液の温度を上昇又は下降させる過程で、その試料溶液に対し、所定温度ステップ毎に所定波長範囲での吸光スペクトルを測定する測定実行手段と、
ｃ）前記測定実行手段により取得されたデータに基づいて、温度、波長、及び吸光度の３つのディメンジョンを有する３次元グラフを作成して表示手段の画面上に表示する表示制御手段と、
を備えることを特徴としている。
【００１０】
本発明の一態様として、前記測定実行手段は、試料溶液に照射する光の波長を順次走査する分光器を備え、その分光器から取り出す単色光の波長を所定波長範囲で順次走査することより吸光スペクトルを測定する構成とすることができる。また、別の態様として、前記測定実行手段は、試料溶液を透過した光を波長分散させる分光器と、その波長分散方向の光を同時に検出するフォトダイオードアレイ型の検出器とを備え、波長走査を行うことなく所定波長範囲内の吸光スペクトルデータを同時に取得する構成とすることができる。
【００１１】
本発明に係る融解温度測定装置では、従来、ＤＮＡの溶解状態を把握するために適当であった２６０ｎｍ等の或る１波長のみならず、所定温度ステップ毎に例えば２６０ｎｍを含む所定の波長範囲の吸光スペクトルを取得する。そして、表示制御手段は、昇温又は降温の過程における各温度で得られた吸光スペクトルデータにより、温度、波長、及び吸光度の３つのディメンジョンを有する３次元グラフを作成し、これを表示手段の画面上に表示する。
【００１２】
これにより、分析作業者は、２６０ｎｍ近傍以外つまり通常予測される波長以外の波長で吸光度に何らかの変化が生じている場合に、これを容易に認識してサンプルの構造解析の情報として利用することができる。具体的には、試料溶液にＤＮＡ以外の重要な物質が含まれる場合、或いは全く予想していない波長で吸光度が変化するような新規の構造のＤＮＡが存在した場合などにおいて、こうした構造解析に有益な情報を多大な労力と時間とを費やすことなく取得することができる。したがって、ＤＮＡの構造解析等の作業を効率的に進めることができる。
【００１３】
また、本発明に係る融解温度測定装置では、
ｄ）波長を外部より指定するための波長指定手段と、
ｅ）前記測定実行手段により取得されたデータに基づいて、前記指定波長における温度と吸光度との関係を表す熱融解曲線を求め、その熱融解曲線から融解温度を算出する融解温度算出手段と、
をさらに備える構成とすることができる。
【００１４】
この構成によれば、例えば分析作業者は上記のような３次元グラフを画面上で確認した後に、熱融解曲線を切り出すのに最も適切な波長を判断し、その波長を波長指定手段により指定することができる。それによって、従来の融解温度測定装置と同様に融解温度を算出することができるほか、より確からしい波長を利用して精度の高い融解温度を得ることができる。
【００１５】
なお、上述したように分光器の波長走査を行うことで吸光スペクトルを測定する構成においては、通常、波長走査には或る程度の時間を必要とするため、その波長走査の期間中に温度が変化すると誤差が生じる。そこで、温調手段により昇温又は降温は階段（ステップ）状に行い、試料溶液の温度が安定している期間に波長走査を行うようにするとよい。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の一実施例による融解温度測定装置について図面を参照して説明する。
【００１７】
図１は本実施例の融解温度測定装置の全体構成図である。この装置は、主要部として、いわゆるダブルビーム方式の紫外可視分光光度計の測光部１と、各種の演算処理や制御処理を行うコンピュータ（ＰＣ）２０と、対照セル３１及び試料セル３２を備えた試料ユニット３０と、を含む。コンピュータ２０には所定の制御プログラムがインストールされており、ＣＰＵ上でその制御プログラムを実行することにより後述するような各種の処理が実行される。
【００１８】
測光部１にあっては、光源２から発した光は回折格子を内蔵した分光器３に入射され、ここで後述する主制御部２１で設定される波長λを有する単色光が取り出される。分光器３での設定可能な波長範囲は例えば１９０〜１１００ｎｍであり、その波長範囲を例えば最小０．１ｎｍピッチで波長走査できるようになっている。分光器３から取り出された単色光は反射鏡４によりセクタ鏡５に送られ、セクタ鏡５により試料側光束Ｓと対照側光束Ｒの２光束に時分割される。また、セクタ鏡５には光の遮蔽部が設けられており、試料側光束Ｓ及び対照側光束Ｒの発生期間と交互に遮光期間が発生するようにしている。
【００１９】
試料側光束Ｓは反射鏡６を介して、試料ユニット３０に備えられた試料セル３２に照射され、その試料セル３２を通過した光は反射鏡８、１０を介して光検出器１１の受光面に送られる。他方、対照側光束Ｒは反射鏡７を介して試料ユニット３０内の対照セル３１に照射され、対照セル３１の透過光が反射鏡９を介して同じく光検出器１１の受光面に送られる。
【００２０】
光検出器１１の出力信号は、サンプルホールド回路やＡ／Ｄ変換器などを含むインタフェイス部（Ｉ／Ｆ）１２を介してコンピュータ２０によって具現化される演算処理部２２に入力される。演算処理部２２は、吸光度算出部２３、Ｔｍ値算出部２４、３次元グラフ作成部２５などを機能として含む。同じくコンピュータ２０によって具現化される主制御部２１は、測光部１や試料ユニット３０内の各部の動作を制御する機能を有する。また、コンピュータ２０に接続された入力部２６は例えばキーボードやポインティングデバイスなどであり、測定に関連する各種パラメータの設定や各種測定、処理の指示を行うためのものである。更にまた、表示部２７は操作のための補助的情報や測定結果等を画面に表示するものである。
【００２１】
対照セル３１及び試料セル３２は小容量の石英製セルであるが、複数のサンプルを順次測定したい場合には、１個の試料セル３２に代えて多数のセルを一列に並べて配置した多連装セルを使用してもよい。対照セル３１及び試料セル３２は恒温ブロック３３に保持されており、該恒温ブロック３３はペルチエ素子などを利用した温調ユニット３４で迅速に加温又は冷却されるようになっている。恒温ブロック３３には１乃至複数の温度センサ３５が付設され、それによる検出温度が温度制御部３６に与えられている。温度制御部３６は主制御部２１より温度の制御目標値Ｔｃを受け取り、検出温度がその制御目標値Ｔｃになるように、つまりその差がゼロになるように温調ユニット３４に供給する電力を制御する。
【００２２】
次に、本実施例の装置における測定手順と動作について説明する。測定の開始に先立って、分析作業者は測定条件として温度プログラムと波長走査条件とを入力部２６から設定する。例えば、温度プログラムを設定するためのパラメータとしては、昇温開始温度Ｔ１、昇温終了温度Ｔ２、昇温速度ΔＴなどを定めておく。また、波長走査条件として、波長走査範囲λ１〜λ２、波長間隔Δλ、波長走査実行温度間隔ΔＴｐなどを定めておく。これらの値は適宜に設定することが可能であるが、一例としては、昇温開始温度Ｔ１を０℃、昇温終了温度Ｔ２を１００℃、昇温速度ΔＴを１℃／分、波長走査範囲λ１〜λ２を２００〜５００ｎｍ、波長間隔Δλを１ｎｍ、波長走査実行温度間隔ΔＴｐを１℃とすることができる。
【００２３】
なお、測定温度範囲毎に波長走査実行温度間隔ΔＴｐの設定を変更できるようにしてもよい。例えば、通常、熱融解曲線は温度が２５〜５０℃位の範囲でその傾きが大きくなるので、２０〜２５℃及び５０℃以上の範囲ではΔＴｐを１℃とし、２５〜５０℃の範囲ではΔＴｐを０．５℃と細かくすれば、精度の高い熱融解曲線を作成することができる。
【００２４】
分析作業者は、溶媒のみのブランク試料溶液を対照セル３１に収容する一方、測定対象であるＤＮＡ等が溶媒に溶解した測定試料溶液を試料セル３２に収容する。そして、測定開始を指示する。
【００２５】
測定の開始の指示を受けて、主制御部２１は上述したように設定された温度プログラムに従って温度の制御目標値Ｔｃを温度制御部３６へと送る。実際の温度プログラムは、連続的に昇温が行われるのではなく、波長走査実行時には温度が一定に維持されるように階段状に温度が上昇するものとなる。すなわち、本装置の分光器３では、回折格子を機械的に回動させることで波長走査を行うため、波長走査範囲及び波長間隔が決まると、１回の波長走査（波長λ１からλ２までの間をΔλずつ走査する）に必要な時間が割り出される。実際には、対照セル３１内の溶媒及び試料セル３２内のサンプルの温度が安定するのに要する時間を見越して温度一定維持の時間を設定する。
【００２６】
こうしたことから、実際の温度プログラムと波長走査（つまり吸光スペクトル測定）との関係は図２に示すようになる。すなわち、温調ユニット３４により恒温ブロック３３の温度が１℃上昇した後、温度は一定に維持され、その間に主制御部２１から分光器３に対して波長走査の指示が行われ、それに応じて分光器３の回折格子がステップ状に回動することで対照セル３１及び試料セル３２に照射される単色光の波長がλ１からλ２まで順次変化する。セクタ鏡５の回転に同期して対照側光束Ｒと試料側光束Ｓとが交互に光検出器１１に到達し、さらにセクタ鏡５による光の断続的な遮蔽によってそれぞれの光束Ｒ、Ｓに対応したゼロ信号も得られるから、吸光度算出部２３では、光源２の光量変動や溶媒による吸光度の変化の影響を除いた、サンプルによる吸光スペクトルデータを算出することができる。
【００２７】
波長走査の期間中、対照セル３１及び試料セル３２の温度はほぼ一定に維持されるため、吸光度算出部２３により取得される吸光スペクトルデータはその温度に対応した高精度なものとなる。このような測定を、昇温を階段状に行う各段階においてそれぞれ実行すると、温度、波長、及び吸光度の３つのディメンジョンを有する多数のデータが得られる。そこで、３次元グラフ作成部２５はこれらデータに基づいて、図３に示すような３次元グラフを作成し、これを表示部２７の画面上に表示する。このグラフでは、波長方向の情報が含まれるので、従来のように２６０ｎｍの波長近傍以外でも、例えば図３中にＰで示すように吸光度の変化がある箇所が一目で確認できる。なお、この３次元グラフを空間内で回転できるようなソフトウエアを利用すれば、吸光度の変化の生じている箇所を一層容易に確認することができる。
【００２８】
また、分析作業者は入力部２６から、Ｔｍ値算出用の波長値として２６０ｎｍを設定するか、或いは、上記３次元グラフからＴｍ値を算出するのに適当な波長を読み取ってこれを設定する。すると、Ｔｍ値算出部２４は上記３次元グラフ内の曲面をその設定波長で切り出した熱融解曲線を作成し、この熱溶融曲線に基づいてＴｍ値を算出し、これを表示部２７に表示する。これによって、従来の装置と同様に、Ｔｍ値も求めることができる。
【００２９】
なお、上記実施例では、分光器３で取り出した波長λの単色光を試料セル３２に照射し、その透過光を光検出器１１に導入する構成であるが、分光していない光を試料に照射し、その透過光を分光器により波長分散し、その分散光をフォトダイオードアレイ型の検出器で同時に測定する構成としてもよい。この場合には、上記のような波長走査に相当する複数の波長光に対する情報が同時に得られるので、吸光スペクトルの測定に時間が掛からない。そこで、上記のように階段状に変化する温度プログラムとする必要はなく、図４に示すように単純に昇温を行う過程で、波長走査実行温度間隔ΔＴｐ毎に測定を実行すればよい。
【００３０】
また、上記実施例は本発明の一例であるから、上記記載の点以外においても、本発明の趣旨の範囲で適宜に変更、修正、追加を行えることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例による融解温度測定装置の要部の構成図。
【図２】本実施例の融解温度測定装置における実際の温度プログラムと吸光スペクトル測定との関係を示す図。
【図３】本実施例の融解温度測定装置において作成される３次元グラフの一例を示す図。
【図４】本発明の他の実施例における温度プログラムと吸光スペクトル測定との関係を示す図。
【図５】一般的な熱融解曲線を示す図。
【符号の説明】
１…測光部
２…光源
３…分光器
４、６、７、８、９、１０…反射鏡
５…セクタ鏡
１１…光検出器
１２…インタフェイス部（Ｉ／Ｆ）
２０…コンピュータ
２１…主制御部
２２…演算処理部
２３…吸光度算出部
２４…Ｔｍ値算出部
２５…３次元グラフ作成部
２６…入力部
２７…表示部
３０…試料ユニット
３１…対照セル
３２…試料セル
３３…恒温ブロック
３４…温調ユニット
３５…温度センサ
３６…温度制御部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2005010049.tif 000006
【図５】
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