(57)【要約】【課題】  安全性に優れ、日常的に長期間にわたり服用・摂取が可能であって、ヒトを含めた動物の感染症の原因となる病原性ウイルスに対して抗ウイルス作用を有する抗ウイルス剤を提供する。【解決手段】  ラクトフェリンのペプシン加水分解物を有効成分とする抗ウイルス剤であって、特にＲＳウイルスに対して抗ウイルス作用を示す抗ウイルス剤、及び配列番号１に記載のペプチドを有効成分とする抗ウイルス剤であって、特にＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスに対して抗ウイルス作用を示す抗ウイルス剤。並びに、前記抗ウイルス剤を含有する飲食品又は飼料。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリンのペプシン加水分解物を有効成分とする抗ウイルス剤。
【請求項２】
ＲＳウイルスに対して抗ウイルス作用を示すことを特徴とする請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の抗ウイルス剤を含有する飲食品又は飼料。
【請求項４】
ラクトフェリンのペプシン加水分解物を含有し、ＲＳウイルスに対して抗ウイルス作用を有するものであることを特徴とし、ＲＳウイルスに対して抗ウイルス作用促進のために用いられる旨の表示を付した飲食品又は飼料。
【請求項５】
配列番号１に記載のペプチドを有効成分とする抗ウイルス剤。
【請求項６】
ＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスに対して抗ウイルス作用を示すことを特徴とする請求項５に記載の抗ウイルス剤。
【請求項７】
請求項５又は請求項６に記載の抗ウイルス剤を含有する飲食品又は飼料。
【請求項８】
配列番号１に記載のペプチドを含有し、ＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスに対して抗ウイルス作用を有するものであることを特徴とし、ＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスに対して抗ウイルス作用促進のために用いられる旨の表示を付した飲食品又は飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトフェリンのペプシン加水分解物又は配列番号１に記載のペプチドを有効成分として含有する抗ウイルス剤に関する。さらに詳しくは、本発明は、ウイルスに感染したヒトおよび動物の感染症による症状を改善させる作用を有する抗ウイルス剤、及び該抗ウイルス剤を含有する飲食品又は飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然界には、ヒトや動物に感染症を引き起こす種々の微生物が存在する。それらの微生物は、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、真菌、原虫、ウイルスに分類される。ウイルスの遺伝物質はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）であるが、細菌やその他の微生物がエネルギー代謝系を持ち、従属栄養で増殖するのに対し、ウイルスは、宿主細胞に寄生することによってのみ増殖が可能である（例えば、非特許文献１）。
【０００３】
インフルエンザウイルス感染症は、冬期に流行するが、悪性腫瘍、心疾患、脳血管疾患等を基礎疾患に持つ患者、老人、乳幼児はインフルエンザ感染のハイリスク群であり、命にかかわる重篤な感染につながることも多い。また、ＲＳ（Respiratory Syncytial）ウイルスは、通常、健康な成人には感染しないが、小児では上部呼吸器感染の主要な原因となる。
【０００４】
微生物による感染症の中でも、特に細菌感染症に対しては、有効な抗生物質が開発されており、効果的な治療が行なわれているが、ウイルス感染症には抗生物質が有効に作用しない。抗生物質による化学療法の急速な進歩に比べると、ウイルス感染症の治療薬としての抗ウイルス剤の開発は、現在でもそれほど進んでいないのが現状である。いままでに開発された抗ウイルス剤には、ウイルス核酸の複製をターゲットとする核酸類似体のアシクロビル、アジドチミジン、リバビリン、ノイラミニダーゼ阻害剤のザナミビル（４−グアニジノノイラミン酸）、プロテアーゼ阻害剤のインジナビル等がある。これらの医薬品である抗ウイルス剤は薬効が強いものの、投与による副作用は臨床上の大きな問題を有している。このような状況から、安全で副作用が少なく、長期間にわたって摂取することが可能な抗ウイルス作用を示す有効成分の探索が続けられてきた。
【０００５】
ラクトフェリンの加水分解物は、乳汁をはじめ、唾液、涙液等の哺乳類の分泌液に含有される鉄結合性糖蛋白質であるラクトフェリンを、酵素または酸で加水分解することによって得られる（例えば、非特許文献２又は非特許文献３）。ラクトフェリンの加水分解物に関しては、抗菌活性、抗がん作用、免疫調節作用、細胞増殖作用等の多様な生物機能が報告されている（例えば、非特許文献２、非特許文献４、非特許文献５、又は非特許文献６）。また、ラクトフェリンの加水分解物については、経口がん転移抑制剤（例えば、特許文献１）、ＩｇＡ産生促進剤（例えば、特許文献２）、抗酸化剤（例えば、特許文献３）など、すでに多様な用途への応用が開示されている。
【０００６】
ラクトフェリンの加水分解物から単離されるペプチド類にも、抗菌活性、抗ウイルス活性、抗がん作用等の多様な生物機能が報告されている（例えば、非特許文献７、非特許文献８、又は非特許文献９）。また、該ペプチド類に関しては、抗菌ペプチドおよび抗菌剤（例えば特許文献４）、経口がん転移抑制剤（例えば、特許文献５）、アポトーシス誘導剤（例えば、特許文献６）、抗潰瘍剤（例えば、特許文献７）など、すでに多様な用途への応用が開示されている。
【０００７】
従来、ラクトフェリンの加水分解物、特にラクトフェリンのペプシン加水分解物によるＲＳウイルスに対する抗ウイルス活性については全く知られていなかった。また、ラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドによるＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性についても全く知られていなかった。
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−５９８６４号公報
【特許文献２】特開平６−３２７４３号公報
【特許文献３】特開平６−１９９６８７号公報
【特許文献４】特許第２７７１０６８号公報
【特許文献５】特開平１０−５９８６４号公報
【特許文献６】特開平１０−４５６１８号公報
【特許文献７】特開平８−１４３４６８号公報
【０００９】
【非特許文献１】医科ウイルス学、改訂第２版、大里外誉郎編、南江堂発行、２０００年、ｐ．１５−２４
【非特許文献２】ジャーナル・オブ・デイリー・サイエンス（Journal of Daily Science）、アメリカ、第７４巻、１９９１年、ｐ．４１３７−４１４２
【非特許文献３】ジャーナル・オブ・デイリー・サイエンス（Journal of Daily Science）、アメリカ、第７４巻、１９９１年、ｐ．３７２４−３７３０
【非特許文献４】クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・メタステイシス（Clinical and experimental metastasis）、オランダ、第１７巻、１９９９年、ｐ．３５−４０
【非特許文献５】ジャーナル・オブ・デイリー・リサーチ（Journal of Daily Research）、アメリカ、第８０巻、１９９７年、ｐ．２３３０−２３３９
【非特許文献６】バイオサイエンス、バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry）、日本、第５９巻、１９９５年、ｐ．１８７５−１８８１
【非特許文献７】カレント・ファーマスーティカル・デザイン（Current Pharmaceutical Design）、オランダ、第９巻、２００３年、ｐ．１２７７−１２８７
【非特許文献８】アンチバイラル・リサーチ（Antiviral Research）、オランダ、第５１巻、２００１年、ｐ．１４１−１４９
【非特許文献９】アンチキャンサー・リサーチ（Anticancer Research）、ギリシャ、第２２巻、２００２年、ｐ．２７０３−２７１０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者等は、ラクトフェリンの加水分解物と抗ウイルス作用との関係を明らかにするため、ラクトフェリンの加水分解物の中でも汎用性が高い成分について、その機能の解明を行っていたところ、ラクトフェリンのペプシン加水分解物、又はラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドに、ヒトや動物の感染症の原因となるＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を見出し、本発明を完成した。
【００１１】
本発明の目的は、安全性に優れ、日常的に長期間にわたり服用・摂取が可能であって、ヒトを含めた動物の感染症の原因となる病原性ウイルスに対して抗ウイルス作用を有する抗ウイルス剤を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記抗ウイルス剤を含有する飲食品および飼料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記課題を解決する本発明の第一の発明は、ラクトフェリンのペプシン加水分解物を有効成分とする抗ウイルス剤であって、ＲＳウイルスに対して抗ウイルス作用を示すことを好ましい態様としている。
【００１４】
前記課題を解決する本発明の第二の発明は、第一の発明の抗ウイルス剤を含有する飲食品又は飼料である。
【００１５】
前記課題を解決する本発明の第三の発明は、ラクトフェリンのペプシン加水分解物を含有し、ＲＳウイルスに対して抗ウイルス作用を有するものであることを特徴とし、ＲＳウイルスに対して抗ウイルス作用促進のために用いられる旨の表示を付した飲食品又は飼料である。
【００１６】
前記課題を解決する本発明の第四の発明は、配列番号１に記載のペプチドを有効成分とする抗ウイルス剤であって、ＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスに対して抗ウイルス作用を示すことを好ましい態様としている。
【００１７】
前記課題を解決する本発明の第五の発明は、第四の発明の抗ウイルス剤を含有する飲食品又は飼料である。
【００１８】
前記課題を解決する本発明の第六の発明は、配列番号１に記載のペプチドを含有し、ＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスに対して抗ウイルス作用を有するものであることを特徴とし、ＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスに対して抗ウイルス作用促進のために用いられる旨の表示を付した飲食品又は飼料である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、日常的に摂取可能な安全性の高いラクトフェリンのペプシン加水分解物又はラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドを有効成分として含有することを特徴とする抗ウイルス剤、および該抗ウイルス剤を含有する飲食品又は飼料に関するものであり、ヒトに対する安全性が高く、日常的に摂取することによってウイルスに対する感染防御効果を高めることができることから、ヒトを含む動物の感染症の原因となる病原性ウイルス、例えばＲＳウイルスやインフルエンザウイルス等の感染性を不活性化することが可能である。また、本発明の抗ウイルス剤の有効成分は、牛乳等の比較的安価な原料から得られることから、大量生産することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００２１】
本発明において、抗ウイルス作用とは、ヒトや動物の感染症の原因となる病原性ウイルスの感染性を不活性化する作用、あるいは既に宿主細胞に感染したウイルスの細胞内における増殖を抑制する作用を意味する。本発明において、抗ウイルス剤は、ヒトや動物に感染症を引き起こす病原性ウイルスの感染性を不活性化させる作用を持ち、あるいは既に宿主細胞に感染したウイルスの細胞内における増殖を抑制する作用を持ち、ヒトに対する安全性が高く、日常的に摂取することによってウイルスに対する感染防御効果が発揮される特徴を持つ。
【００２２】
本発明の抗ウイルス剤は、ラクトフェリンのペプシン加水分解物、又はラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドそれ自体であってもよいし、それら以外の成分を含有していてもよい。ラクトフェリンのペプシン加水分解物あるいはラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチド以外の成分は、抗ウイルス剤の形態に応じて適宜選択できる。尚、本発明において、ラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドは具体的に配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。
【００２３】
本発明においてラクトフェリンの加水分解物に使用する出発物質としては、ウシ、ヒト、ヤギ、ヒツジ、ウマ等の哺乳類の初乳、移行乳、常乳、末期乳又はこれらの乳の処理物である脱脂乳、ホエー等から常法（例えば、イオンクロマトグラフィー等）によって分離されたラクトフェリン、遺伝子操作によって微生物、動物細胞、トランスジェニック動物等が生産する組換えラクトフェリン（本発明では各種ラクトフェリンを一括して「ラクトフェリン類」と表記する場合がある。）を、例えば既報の方法、すなわち前記非特許文献２又は非特許文献３に記載された方法によって、ペプシン等の蛋白質分解酵素又は塩酸等の酸で加水分解して得たラクトフェリンの加水分解物を使用できる。尚、本発明においては、ラクトフェリンの加水分解物を調製する際に、蛋白質分解酵素としてペプシンを使用することにより、加水分解物による抗ウイルス作用は効果的に発揮される。
【００２４】
尚、加水分解の際の加水分解反応時間は、酵素反応の分解率をモニターしながら、好ましい分解率に達するまで反応を続ける。本発明の抗ウイルス剤の有効成分であるラクトフェリンの加水分解物を得るためには、分解率は６〜２０％が好ましく、８〜１２％が特に好ましい。
【００２５】
尚、蛋白質の分解率の算出方法は、ケルダール法（日本食品工業学会編、「食品分析法」、第１０２頁、株式会社光琳、昭和５９年）により試料の全窒素量を測定し、ホルモール滴定法（満田他編、「食品工学実験書」、上巻、第５４７ページ、養賢堂、１９７０年）により試料のホルモール態窒素量を測定し、これらの測定値から分解率を次式により算出する。
【００２６】
分解率（％）＝（ホルモール態窒素量／全窒素量）×１００
【００２７】
酵素反応の停止は、加水分解液中の酵素の失活により行われ、常法による加熱失活処理により実施することができる。加熱失活処理の加熱温度と保持時間は、使用した酵素の熱安定性を考慮し、十分に失活できる条件を適宜設定することができるが、例えば、８０〜１３０℃の温度範囲で３０分間〜２秒間の保持時間で行うことができる。尚、ラクトフェリンのペプシン加水分解物に不溶物がある場合は遠心するか、または濾過するかの方法によりそれらを除去する。
【００２８】
本発明に使用されるラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドとしては、例えば、公知の方法（特開平５−２３８９４８）あるいは文献の方法〔（バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica Acta.）、オランダ、第１１２１巻、１９９２年、ｐ．１３０〜１３６）、（ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー・Ａ（Journal of Chromatography A）、オランダ、第８３１巻、１９９９年、ｐ．１９１〜２０１）〕で単離される、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを例示することができる。配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドは、そのまま本発明の薬剤の有効成分として利用することが可能であり、また常法により凍結乾燥または噴霧乾燥して粉末として保存することもできる。
【００２９】
本発明の抗ウイルス剤の有効成分であるラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドは、化学合成によって合成ペプチドを製造する方法、及び遺伝子組換え技術等を利用した遺伝子工学的手法を用いて組換え体ペプチドを合成することによって製造する方法、などによっても調製することが可能である。例えば、遺伝子工学的手法を用いた方法としては、該領域を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を基に適当なプライマーを作製し、該プライマーを用いて、目的の塩基配列を含むｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によって塩基配列を増幅し、得られた塩基配列を適当な発現系を用いて発現させることにより得ることができる。
【００３０】
本発明の抗ウイルス剤の抗ウイルス活性は、常法により、例えば動物培養細胞を用いたプラーク抑制法により測定することができる。例えば、ウイルスを加えない培養系、およびウイルスを加えるが抗ウイルス剤を加えない培養系をコントロールとし、プラーク形成数を測定して、コントロールに対する割合（％）が５０％以下に抑制された場合に、抗ウイルス活性ありと判定することが可能である〔［アンチバイラル・リサーチ（Antiviral Research）、オランダ、第２２巻、第１７５〜１８８ページ、１９９３年］、［ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（Journal of General Virology）、イギリス、第７１巻、第２１４９〜２１５５ページ、１９９０年］〕。
【００３１】
本発明の製剤中に含まれるラクトフェリンのペプシン加水分解物又はラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドの量は特に限定されず適宜選択すればよいが、例えばいずれも通常製剤中に０．００１質量％以上、好ましくは０．０１〜１０質量％とするのがよい。本発明の製剤の投与方法は特に限定されず、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、患者の症状の程度等に応じて決定される。本発明の製剤の有効成分の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件等により適宜選択される。通常有効成分としてのラクトフェリンのペプシン加水分解物又はラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドの量は、０．０２〜２００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．２〜２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲となる量を目安とするのが良く、１日１回又は複数回に分けて投与することができる。
【００３２】
また、本発明の抗ウイルス剤は、種々のウイルスに対して抗ウイルス効果を示すが、ラクトフェリンのペプシン加水分解物はＲＳウイルスに特に抗ウイルス作用を示し、ラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドはＲＳウイルス及びインフルエンザウイルスに特に抗ウイルス作用を示し、ウイルスが原因の感染症による症状を改善させる作用を有する。
【００３３】
本発明による抗ウイルス剤としては、例えば、ラクトフェリンのペプシン加水分解物又はラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドを、薬学的に許容され得る賦形剤等の任意の添加剤を用いて製剤化することにより製造できる。製剤化する場合、製剤中のラクトフェリンのペプシン加水分解物又はラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドの含有量は、通常０．００１〜１０質量％、好ましくは０．０１〜１０質量％である。製剤化にあたっては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。
【００３４】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられ、結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マグロゴール等が挙げられ、崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられ、滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ビーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸類塩；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられ、安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられ、矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられ、注射剤用溶剤としては、例えば、水、エタノール、グリセリン等が挙げられる。
【００３５】
抗ウイルス剤の投与経路としては、例えば、経口投与、経腸投与等の非経口投与が挙げられ、本発明の抗ウイルス剤の投与剤形としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。また、本発明の抗ウイルス剤は、飲食品、飼料等に配合して投与することもできる。
【００３６】
本発明の抗ウイルス剤を含有する飲食品としては、例えば、ラクトフェリンのペプシン加水分解物又はラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドに、デキストリン、デンプン等の糖類；ゼラチン、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、アラビアゴム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類等を配合することにより製造できる。飲食品組成物の形態としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物、パン；経腸栄養食；機能性食品等が挙げられる。
【００３７】
本発明の飲食品における用途としては、日常的に摂取することによってウイルスに対する感染防御効果を高めることができることから、ヒトを含む動物の感染症の原因となる病原性ウイルス、例えばＲＳウイルスやインフルエンザウイルス等の感染性を不活性化する等の効果を利用するような種々の用途をとることが可能である。
【００３８】
本発明の飲食品は、ＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスに対して抗ウイルス作用を有するものであることを特徴とし、ＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスに対して抗ウイルス作用促進のために用いられる旨の表示を付した飲食品である。具体的には、「ＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスに対して抗ウイルス作用促進用と表示された、抗ウイルス剤を含有する飲食品」、または「ＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスに対して抗ウイルス作用促進用と表示された、ラクトフェリンのペプシン加水分解物を含有する飲食品」、若しくは「ＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスに対して抗ウイルス作用促進用と表示された、ラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドを含有する飲食品」等として、さらに、「ラクトフェリンのペプシン加水分解物を含んでおり、根拠は必ずしも確立されていないが、ＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスに対して抗ウイルス作用促進等に適していることが示唆されている」、若しくは「ラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドを含んでおり、根拠は必ずしも確立されていないが、ＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスに対して抗ウイルス作用促進等に適していることが示唆されている」等の旨の表示を飲食品に付して、本発明の飲食品を販売する態様を例示することが可能である。
【００３９】
前記「表示」とは、需要者に対して上記用途を知らしめるための全ての行為を意味し、上記用途を想起・類推させうるような表示であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、すべて本発明の「表示」に該当する。しかしながら、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により表示することが好ましい。具体的には、本発明の飲食品に係る商品又は商品の包装に上記用途を記載する行為、商品又は商品の包装に上記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的（インターネット等）方法により提供する行為、等が例示できる。
【００４０】
一方、表示としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示）であることが好ましく、特に包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ等の販売現場における宣伝材、その他の書類等への表示が好ましい。
【００４１】
また、例えば、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、栄養機能食品、医薬用部外品等としての表示を例示することができ、その他厚生労働省によって認可される表示、例えば、特定保健用食品、これに類似する制度にて認可される表示を例示できる。後者の例としては、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク低減表示等を例示することができ、詳細にいえば、健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）、及びこれに類する表示が、典型的な例として列挙することが可能である。
【００４２】
本発明の抗ウイルス剤を含有する飼料としては、例えば、ラクトフェリンのペプシン加水分解物又はラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドに、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、マイロ等の穀類；大豆油粕、ナタネ油粕、ヤシ油粕、アマニ油粕等の植物性油粕類；フスマ、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類；コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類；魚粉、脱脂粉乳、ホエー、イエローグリース、タロー等の動物性飼料類；トラル酵母、ビール酵母等の酵母類；第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料；油脂類；単体アミノ酸；糖類等を配合することにより製造できる。飼料の形態としては、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。
【００４３】
本発明の抗ウイルス剤は、それのみで使用してもよいが、その他の抗ウイルス剤と併用してもよい。併用によって、抗ウイルス作用を高めることができる。併用する抗ウイルス剤は、本発明の抗ウイルス剤中に有効成分として含有させてもよいし、本発明の抗ウイルス剤中には含有させずに別個の薬剤として組み合わせて商品化してもよい。
【００４４】
［参考例１］ラクトフェリンのペプシン加水分解物の製造
牛乳から分離した市販のウシラクトフェリン（森永乳業社製）１ｋｇを精製水９Ｌに溶解し、１規定の塩酸を添加してｐＨを３．０に調整した。市販の豚ペプシン（１：１００００、和光純薬工業社製）３０ｇを添加して均一に混合し、３７℃で４時間保持し、８５℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。ついで１規定の水酸化ナトリウムを添加してｐＨを７．０に調整し、不溶物を濾過して除去し、ウシラクトフェリンのペプシン加水分解物溶液を得た。このウシラクトフェリンのペプシン加水分解物溶液を凍結乾燥し、ウシラクトフェリンのペプシン加水分解物の粉末約９６０ｇを得た。尚、製造したラクトフェリンのペプシン加水分解混合物の分解率は１０％であった。
【００４５】
［参考例２］ラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドの製造
参考例１と同一の方法により製造した出発物質（ラクトフェリンのペプシン加水分解物）の粉末８００ｇを精製水２０Ｌに溶解し、ブチルトヨパール（商標、東ソー社製）６５０Ｍを充填し、あらかじめ精製水で平衡化したカラム（直径３７ｃｍ×高さ１５ｃｍ）に流速０．２Ｌ／分で通液した。このカラムに、精製水を０．７Ｌ／分の流速で通液し、流出液の吸光度が０．０１以下になるまで洗浄した。さらに、ｐＨ７．０のマッキルベイン緩衝液（クエン酸３４０ｇとリン酸二ナトリウム２３３７ｇを精製水１００Ｌに溶解したもの）を０．７Ｌ／分の流速で通液し、流出液の吸光度が０．０１になるまで洗浄した。
【００４６】
このカラムに、精製水を０．７Ｌ／分の流速で通液し、精製水で平衡化した。次に、ｐＨ５．０のマッキルベイン緩衝液（クエン酸９３２ｇとリン酸水素二ナトリウム１４６２ｇを精製水１００Ｌに溶解したもの）を０．７Ｌ／分の流速で通液し、ペプチドを溶出した。このペプチド溶出液５０Ｌにリン酸水素二ナトリウムの粉末を３．３Ｋｇ添加して溶解し、ｐＨを７．０に調整した。また、溶出後のカラムは０．０２規定の塩酸で洗浄し、さらに０．１規定の水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した後、精製水で平衡化した。このカラムにペプチド溶出液を流速０．７Ｌ／分で通液した。次に、流出液の吸光度が０．０１以下になるまで精製水で洗浄した。カラムに吸着したペプチドを０．０１規定の塩酸１０リットルで溶出し、逆浸透装置（三井東圧社製）で濃縮、脱塩した後、常法によって凍結乾燥し、ペプチド１５ｇを得た。
【００４７】
このペプチドを常法によりマトリックス支援レーザ脱離イオン化法−飛行時間型質量分析装置（プロテインチップ・リーダー、サイファージェン・バイオシステムズ社製）を使用し、マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシけい皮酸を使用して測定したところ、ｍ／ｚ（質量電荷比）＝３１２３．８のペプチドが検出され、他のペプチドはほとんど検出されなかった。したがって、参考例１と同一の方法により製造した出発物質（ラクトフェリンのペプシン加水分解物）から配列番号１のペプチドが単離された。尚、念のためアミノ酸配列を測定した結果、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有することが確認された。
【００４８】
次に試験例を示して本発明を詳細に説明する。
［試験例１］
本試験は、本発明の抗ウイルス剤の有効成分であるラクトフェリンのペプシン加水分解物又はラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドの病原性ウイルスに対する抗ウイルス作用を調べるために行った。
【００４９】
（１）試料の調製
参考例１で製造したラクトフェリンのペプシン加水分解物、又は参考例２で製造した配列番号１のペプチドを、リン酸緩衝生理食塩水に２０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、ポアサイズ０．２μｍのフィルターで濾過滅菌して、それぞれ試験試料１又は試験試料２として調製した。供試ウイルスとして、オルソミクソウイルス科（エンベロープを有する一本鎖ＲＮＡウイルス）に属するインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）株およびパラミクソウイルス科（エンベロープを有する一本鎖ＲＮＡウイルス）に属するＲＳウイルスＡ２株を使用した〔アンチバイラル・リサーチ（Antiviral Research）、オランダ、第２２巻、第１７５〜１８８ページ、１９９３年〕。培養動物細胞として、インフルエンザウイルスにはＭＤＣＫ細胞、ＲＳウイルスにはＨｅｐ２細胞を使用した。これらの培養動物細胞は、血清添加イーグルＭＥＭ培地（日水製薬社製）を用いて直径６０ｍｍのディッシュ中で単層になるまで培養した。
【００５０】
（２）試験方法
病原性ウイルスの感染性に対する影響は、下記の方法で調べた。インフルエンザウイルスは、２％ウシ血清アルブミン添加リン酸緩衝生理食塩水０．１ｍｌ中に１００プラーク形成単位（ＰＦＵ）となるように添加した。ＲＳウイルスは、リン酸緩衝液０．１ｍｌ中に同じく１００ＰＦＵとなるように添加した。これらの溶液に、リン酸緩衝生理食塩水０．０８ｍｌを添加し、さらに試験試料１又は試験試料２を０．０２ｍｌ（終濃度０．２％）添加して、３７℃で１時間保温した。コントロールには、リン酸緩衝生理食塩水０．１ｍｌのみを添加し、同じく３７℃で１時間保温した。このウイルス処理液の全量を直径６０ｍｍのディッシュで単層に培養した動物細胞に添加し、３７℃で１時間保温した。次に、リン酸緩衝生理食塩水でディッシュを洗浄した。インフルエンザウイルス処理液を添加したＭＤＣＫ細胞には、０．８％アガロース添加イーグルＭＥＭ培地５ｍｌを重層して３日間培養した。ＲＳウイルス処理液を添加した培養細胞には、０．８％メチルセルロース添加イーグルＭＥＭ培地５ｍｌを重層して５日間培養した。
【００５１】
病原性ウイルスの細胞内における増殖に対する影響は、以下の方法で調べた。インフルエンザウイルスは、１％ウシ血清アルブミン添加リン酸緩衝生理食塩水０．２ｍｌ中に１００プラーク形成単位（ＰＦＵ）となるように添加した。ＲＳウイルスは、リン酸緩衝液０．２ｍｌ中に同じく１００ＰＦＵとなるように添加した。このウイルス処理液の全量を直径６０ｍｍのディッシュで単層に培養した動物細胞に添加し、３７℃で１時間保温した。インフルエンザウイルスを感染させたＭＤＣＫ細胞には、０．８％アガロース添加イーグルＭＥＭ培地４．５ｍｌと試験試料１又は試験試料２を０．５ｍｌ（終濃度０．２％）混合したものを重層して３日間培養した。ＲＳウイルス処理液を添加した培養細胞には、０．８％メチルセルロース添加イーグルＭＥＭ培地４．５ｍｌと試験試料１又は試験試料２を０．５ｍｌ（終濃度０．２％）混合したものを重層して５日間培養した。コントロールには、それぞれの培地にリン酸緩衝生理食塩水０．５ｍｌのみを混合したものを用いた。
【００５２】
培養終了後の単層培養動物細胞は、５％ホルマリン溶液で固定し、０．０３％メチレンブルー溶液で染色した。単層培養動物細胞に検出されたプラーク形成数を測定し、試験試料１又は試験試料２のコントロールに対する割合（％）を求めた〔（アンチバイラル・リサーチ（Antiviral Research）、オランダ、第２２巻、第１７５〜１８８ページ、１９９３年）、(ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（Journal of General Virology）、イギリス、第７１巻、第２１４９〜２１５５ページ、１９９０年)〕。尚、これらの実験操作は、２回実施して平均値を算出した。
【００５３】
（３）試験結果
本試験の結果は表１に示すとおりである。病原性ウイルスの感染性に対する影響について、試験試料１のコントロールに対するプラーク形成率は、インフルエンザウイルスに対して８０．３％、ＲＳウイルスに対して３１．５％を示した。したがって、ラクトフェリンのペプシン加水分解物は、ＲＳウイルスの感染性を不活性化する作用を持つことが明らかになった。試験試料２のコントロールに対するプラーク形成率は、インフルエンザウイルスに対して４８．０％、ＲＳウイルスに対して０．０％を示した。したがって、ラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドは、ＲＳウイルスおよびインフルエンザウイルスの感染性を不活性化する作用を持つことが明らかになった。
【００５４】
病原性ウイルスの細胞内における増殖に対する影響については、試験試料１のコントロールに対するプラーク形成率は、インフルエンザウイルスに対して９６．６％、ＲＳウイルスに対して２１．２％を示した。したがって、ラクトフェリンのペプシン加水分解物は、ＲＳウイルスの細胞内における増殖を抑制する作用を持つことが明らかになった。試験試料２のコントロールに対するプラーク形成率は、インフルエンザウイルスに対して９９．０％、ＲＳウイルスに対して０．０％を示した。したがって、ラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドは、ＲＳウイルスの細胞内における増殖を抑制する作用を持つことが明らかになった。
【００５５】
【表１】
2005272438.tif 000002
【００５６】
［試験例２］
本試験は、試験例１でＲＳウイルスに対する顕著な効果を示したラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドの抗ウイルス作用について、さらに詳細に検討を行った。
【００５７】
（１）試料の調製
参考例２で製造したラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されるペプチドを、リン酸緩衝生理食塩水に２ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、ポアサイズ０．２μｍのフィルターで濾過滅菌して試験試料３を調製した。供試ウイルスとして、ＲＳウイルスＡ２株を使用した〔（アンチバイラル・リサーチ（Antiviral Research）、オランダ、第２２巻、第１７５〜１８８ページ、１９９３年）〕。培養動物細胞として、Ｈｅｐ２細胞を使用した。この培養動物細胞は、血清添加イーグルＭＥＭ培地（日水製薬社製）を用いて直径６０ｍｍのディッシュ中で単層になるまで培養した。
【００５８】
（２）試験方法
ＲＳウイルスの感染性に対する影響は、下記の方法で調べた。ＲＳウイルスは、リン酸緩衝液０．２ｍｌ中に１００ＰＦＵとなるように添加した。試験試料３を０．０１ｍｌ（終濃度０．０１％）添加して、３７℃で１時間保温した。コントロールには、何も添加せず、同じく３７℃で１時間保温した。このウイルス処理液の全量を直径６０ｍｍのディッシュで単層に培養した動物細胞に添加し、３７℃で１時間保温した。次に、リン酸緩衝生理食塩水でディッシュを洗浄した。ＲＳウイルス処理液を添加した培養細胞には、０．８％メチルセルロース添加イーグルＭＥＭ培地５ｍｌを重層して５日間培養した。
【００５９】
ＲＳウイルスの細胞内における増殖に対する影響は、下記の方法で調べた。ＲＳウイルスは、リン酸緩衝液０．２ｍｌ中に１００ＰＦＵとなるように添加した。このウイルス処理液の全量を直径６０ｍｍのディッシュで単層に培養した動物細胞に添加し、３７℃で１時間保温した。ＲＳウイルスを感染させた培養細胞には、０．８％メチルセルロース添加イーグルＭＥＭ培地４．７５ｍｌと試験試料３を０．２５ｍｌ（終濃度０．０１％）混合したものを重層して５日間培養した。コントロールには、培地とリン酸緩衝生理食塩水０．２５ｍｌのみを混合したものを用いた。
【００６０】
培養終了後の単層培養動物細胞は、５％ホルマリン溶液で固定し、０．０３％メチレンブルー溶液で染色した。単層培養動物細胞に検出されたプラーク形成数を測定し、試験試料３のコントロールに対する割合（％）を試験例１の方法と同様に求めた。なお、これらの操作は、２回実施して平均値を算出した。
【００６１】
（３）試験結果
本試験の結果は表２に示すとおりである。試験試料３のコントロールに対するプラーク形成率は、感染性については１３８．２％、細胞内における増殖については３８．５％を示した。したがって、ラクトフェリンのペプシン加水分解物から単離されたペプチドは、０．０１％においてＲＳウイルスの細胞内における増殖を抑制する作用を示すことが明らかになった。
【００６２】
【表２】
2005272438.tif 000003
【００６３】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６４】
参考例１で製造したラクトフェリンのペプシン加水分解物５０ｇ、ラクチュロース粉末（森永乳業社製）１００ｇ、マルツデキストリン（松谷化学工業社製）７３５ｇ、脱脂粉乳（森永乳業社製）８５ｇ、ステビア甘味料（三栄源エフ・エフ・アイ社製）１ｇ、ヨーグルト・フレーバー（三栄源エフ・エフ・アイ社製）５ｇ、グリセリン脂肪酸エステル製剤（理研ビタミン社製）２４ｇの各粉末を添加して均一に混合し、打錠機（畑鉄鋼所社製）を使用して、錠剤１錠当り０．５ｇとし、１２錠／分の打錠速度、９．８ＫＰａの圧力で前記混合粉末を連続的に打錠し、ラクトフェリンのペプシン加水分解物を含有するタブレット１８００錠（約９００ｇ）を製造した。
【実施例２】
【００６５】
参考例２で製造した配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド１０ｇ、ラクチュロース粉末（森永乳業社製）２０ｇ、マルツデキストリン（松谷化学工業社製）１４７ｇ、脱脂粉乳（森永乳業社製）１７ｇ、ステビア甘味料（三栄源エフ・エフ・アイ社製）０．２ｇ、ヨーグルト・フレーバー（三栄源エフ・エフ・アイ社製）１ｇ、グリセリン脂肪酸エステル製剤（理研ビタミン社製）４．８ｇの各粉末を添加して均一に混合し、打錠機（畑鉄鋼所社製）を使用して、錠剤１錠当り０．５ｇとし、１２錠／分の打錠速度、９．８ＫＰａの圧力で前記混合粉末を連続的に打錠し、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを含有するタブレット３６０錠（約１８０ｇ）を製造した。
【実施例３】
【００６６】
参考例１で製造したラクトフェリンのペプシン加水分解物５０ｇを、マウス・ラット・ハムスター用粉末飼料（オリエンタル酵母工業社製）１９．９５ｋｇに添加し、混合攪拌機（ダルトン社製）を使用して均一に混合し、ラクトフェリンのペプシン加水分解物を含有する小動物用飼料２０ｋｇを製造した。
【実施例４】
【００６７】
参考例２で製造した配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド１０ｇを、ニワトリ用粉末飼料（オリエンタル酵母工業社製）１９．９９ｋｇに添加し、混合攪拌機（ダルトン社製）を使用して均一に混合し、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを含有する養鶏用飼料２０ｋｇを製造した。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明により、安全性に優れ、日常的に長期間にわたり服用・摂取が可能であって、ヒトを含めた動物の感染症の原因となる病原性ウイルスに対して抗ウイルス作用を有する抗ウイルス剤を提供することが可能である。また、前記抗ウイルス剤を含有する飲食品および飼料を提供することが可能である。
【配列表】
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