(57)【要約】    【課題】  細胞膜に親和性を有する化合物を所望のパターンで固相表面に固定化する方法を提供すること。    【解決手段】  細胞に親和性を有する第一の化合物１４を用いて、固相表面１０に所望のパターンで細胞２０を固定化する固定化方法であって、第一の化合物１４に結合しうる結合部位を有し、かつ第一の化合物１４より固相表面１０に固定化しやすい第二の化合物１２を、前記パターンに従って固相表面１０に固定化する固定化工程を少なくとも含む、方法を提供する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に親和性を有する第一の化合物を用いて、固相表面に所望のパターンで細胞を固定化する固定化方法であって、
前記第一の化合物に結合しうる分子結合部位を有し、かつ前記第一の化合物より前記固相表面に固定化しやすい第二の化合物を、前記パターンに従って前記固相表面に固定化する固定化工程を少なくとも含む、方法。
【請求項２】
前記第二の化合物が、前記第一の化合物に結合しうる分子結合部位と、固相基板表面に自己組織化単分子膜を形成しうる基板結合部位を有する化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第二の化合物が、前記第一の化合物に結合しうる分子結合部位と、固相基板表面に物理吸着して不溶性の薄膜を形成しうる高分子部位を有する化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記分子結合部位がアミノ基である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記固定化工程が、前記第二の化合物を含む液滴を、前記固相表面に前記パターンに従って吐出することによって行われる、請求項１から４のいずれか１項に記載の固定化方法。
【請求項６】
前記固定化工程が、
前記第二の化合物を前記固相表面全体に固定化する工程と、
前記パターンを残して、前記第二の化合物の分子結合部位を不活性化する工程と、を含む請求項１から４のいずれか１項に記載の固定化方法。
【請求項７】
前記第二の化合物の分子結合部位を不活性化する工程が、前記第二の化合物に放射エネルギー線を照射することによって行われる、請求項６に記載の固定化方法。
【請求項８】
前記固定化工程の後、前記パターンを除く領域に細胞付着防止膜を形成する、請求項１から７のいずれか１項に記載の固定化方法。
【請求項９】
前記固定化工程が、
前記パターンを除く領域に細胞付着防止膜を形成する工程と、
前記パターンに従って、前記第二の化合物を固定化する工程と、を含む請求項１から４のいずれか１項に記載の固定化方法。
【請求項１０】
前記パターンを除く領域に細胞付着防止膜を形成する工程が、
細胞付着防止化合物を含む液滴を、前記パターンを除く領域に吐出することによって行われる請求項９に記載の固定化方法。
【請求項１１】
前記パターンを除く領域に細胞付着防止膜を形成する工程が、
前記固相表面全体に細胞付着防止膜を形成する工程と、
前記パターンに従って、前記細胞付着防止化合物を除去する工程と、を含む、請求項９に記載の固定化方法。
【請求項１２】
前記細胞付着防止膜を除去する工程が、前記細胞付着防止膜に放射エネルギー線を照射することによって行われる、請求項１１に記載の固定化方法。
【請求項１３】
前記細胞付着防止膜が、ポリエチレングリコール、糖、ポリエステル、ポリイソシアネートをふくむ、請求項８から１２のいずれか１項に記載の固定化方法。
【請求項１４】
前記固定化工程が、
前記結合部位に保護基が結合された前記第二の化合物を、前記固相表面全体に固定化する工程と、
前記パターンに従って、前記保護基を脱離させる工程と、を含む請求項１から４のいずれか１項に記載の固定化方法。
【請求項１５】
前記保護基を脱離させる工程が、
前記パターンに従って、前記第二の化合物に脱保護誘発化合物を含む液滴を吐出することによって行われる、請求項１４に記載の固定化方法。
【請求項１６】
前記保護基を脱離させる工程が、
前記パターンを除く領域に放射エネルギー線を照射して、前記第二の化合物を除去する工程と、
前記パターン状に残された第二の化合物に脱保護誘発化合物を反応させる工程と、を含む請求項１４に記載の固定化方法。
【請求項１７】
前記放射エネルギー線が、紫外線などの電磁波、電子線、イオンビームである、請求項７、１２および１６のいずれか１項に記載の固定化方法。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか１項に記載の固定化方法を用いて細胞が固定化された、細胞アレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相表面に、所望の微細なパターンに従って、細胞を固定化する方法に関する。より詳しくは、細胞に親和性を有する物質を前記パターンに従って固定化し、該物質に細胞を固定化することによって、細胞を前記パターンに固定化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、固相表面に細胞を迅速かつ正確に固定化するCell Immobilization技術が注目されている。生きたまま固定化された細胞は固相表面上での培養が可能であり、バイオセンサや再生医療分野での利用が期待されている。
【０００３】
特に、再生医療分野での利用を目的として、細胞を固相表面上で増殖させ、生体組織の代替物を得ようとする場合は、細胞を傷つけずに固定化するだけでなく、固相表面の特定の位置に固定化することが重要である。組織、臓器の重要な特徴は、必要な細胞が適当な個所に配置され機能を発揮している点にあり、特定の位置に配置された個性をもった細胞を、それぞれ増殖させて組織として組み立てることは、複雑な組織構造を持った生体組織の構築につながる。
【０００４】
一方、基板上に細胞を規則正しく固定した細胞アレイも開発されつつあり、特定の遺伝子を用いてこの細胞を形質転換することによる発現解析や、薬物の毒性や安全性評価等に用いることができると考えられている。基板上で発現解析や薬物のスクリーニング等ができれば、サンプルが少量ですみ、反応時間を短縮でき、分析コストを低減することができるというメリットがある。
【０００５】
細胞を固相表面の所定位置に固定化する手段として、細胞の接着等に関与した細胞培養制御用物質を含む液体を、微小液滴吐出手段によって基体表面に吐出することにより、該細胞培養制御用物質を所望のパターンで固定化した後、この細胞培養制御用物質が固定化された領域が培養液と接触している状態において細胞を培養して、該細胞を基体表面の所望の位置に固定化する方法について報告がある（例えば、特許文献１を参照）。
【特許文献１】特開２００２−３５５０２６
【特許文献２】特開２００３−１１６５２９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ある化合物を含む溶液を固相表面に供給することによって、該化合物を所望のパターンで固相表面に固定化する場合、まず該溶液をこのパターンに従って固相表面に配置しなければならない。しかし、細胞培養制御用物質などの細胞に親和性を有する化合物は、リン脂質からなる細胞膜に親和性を有しなくてはならないため、疎水性の高い炭化水素鎖をもち、一方で固体表面への反応を担う官能基を分子末端の反対側に持つことが多く、これらを溶解できる表面張力の高い溶媒は収縮する傾向が強い。一般的に、水などの極性が高く表面張力が大きな有機溶剤は、表面自由エネルギーを最小限にとどめるように張力がはたらき、相対的に表面自由エネルギーの低い固体表面上の溶媒の液滴は、蒸発に伴い球状の形状を保ちながら収縮する。かかる場合、例えば、微小液滴吐出手段によって固相表面にライン状に溶液を供給すると、乾燥するまでに液体の収縮により短く切れてしまうなど形状に乱れが生じる。その結果、溶質である化合物もきれいなパターンで固定化できず、これに細胞を固定化しても、所望のパターンとならない。
【０００７】
そこで、本発明は、細胞膜に親和性を有する化合物を所望のパターンで固相表面に固定化する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、細胞を固相表面に所望のパターンで固定化する際、該細胞の細胞膜に親和性を有する化合物を固定化するのに先立って、該化合物と結合しうる分子結合部位を有し、かつきれいなパターンで固相表面に固定化しやすい化合物を、上記パターンに従って予め固相表面に固定化しておくことにより、上記細胞に親和性を有する化合物および細胞を上記パターンに従って好適に固定化できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、［１］細胞膜に親和性を有する第一の化合物を用いて、固相表面に所望のパターンで細胞を固定化する固定化方法であって、前記第一の化合物に結合しうる分子結合部位を有し、かつ前記第一の化合物より前記固相表面に固定化しやすい第二の化合物を、前記パターンに従って前記固相表面に固定化する固定化工程を少なくとも含む、方法；[２]前記第二の化合物が、前記第一の化合物に結合しうる分子結合部位と、固相基板表面に自己組織化単分子膜を形成しうる基板結合部位を有する化合物である、上記[１]に記載の方法；[３]前記第二の化合物が、前記第一の化合物に結合しうる分子結合部位と、固相基板表面に物理吸着して不溶性の薄膜を形成しうる高分子部位を有する化合物である、上記[１]記載の方法；[４]前記分子結合部位がアミノ基である、上記[１]から[３]のいずれか１項に記載の方法；[５]前記固定化工程が、前記第二の化合物を含む液滴を、前記固相表面に前記パターンに従って吐出することによって行われる、上記[１]から[４]のいずれか１項に記載の固定化方法[６]前記固定化工程が、前記第二の化合物を前記固相表面全体に固定化する工程と、前記パターンを残して、前記第二の化合物の分子結合部位を不活性化する工程と、を含む上記[１]から[４]のいずれか１項に記載の固定化方法；[７]前記第二の化合物の分子結合部位を不活性化する工程が、前記第二の化合物に放射エネルギー線を照射することによって行われる、上記[６]に記載の固定化方法；[８]前記固定化工程の後、前記パターンを除く領域に細胞付着防止膜を形成する、上記[１]から[７]のいずれか１項に記載の固定化方法；[９]前記固定化工程が、前記パターンを除く領域に細胞付着防止膜を形成する工程と、前記パターンに従って、前記第二の化合物を固定化する工程と、を含む上記[１]から[４]のいずれか１項に記載の固定化方法；[１０]前記パターンを除く領域に細胞付着防止膜を形成する工程が、細胞付着防止化合物を含む液滴を、前記パターンを除く領域に吐出することによって行われる上記[９]に記載の固定化方法；[１１]前記パターンを除く領域に細胞付着防止膜を形成する工程が、前記固相表面全体に細胞付着防止膜を形成する工程と、前記パターンに従って、前記細胞付着防止化合物を除去する工程と、を含む、上記[９]に記載の固定化方法；[１２]前記細胞付着防止膜を除去する工程が、前記細胞付着防止膜に放射エネルギー線を照射することによって行われる、上記[１１]に記載の固定化方法；[１３]前記細胞付着防止膜が、ポリエチレングリコール、糖、ポリエステル、ポリイソシアネートをふくむ、上記［８］から［１２］のいずれか１項に記載の固定化方法；[１４]前記固定化工程が、前記結合部位に保護基が結合された前記第二の化合物を、前記固相表面全体に固定化する工程と、前記パターンに従って、前記保護基を脱離させる工程と、を含む上記[１]から[４]のいずれか１項に記載の固定化方法；[１５]前記保護基を脱離させる工程が、前記パターンに従って、前記第二の化合物に脱保護誘発化合物を含む液滴を吐出することによって行われる、上記[１４]に記載の固定化方法；[１６]前記保護基を脱離させる工程が、前記パターンを除く領域に放射エネルギー線を照射して、前記第二の化合物を除去す���工程と、前記パターン状に残された第二の化合物に脱保護誘発化合物を反応させる工程と、を含む上記[１４]に記載の固定化方法；[１７]前記放射エネルギー線が、電磁波、電子線、またはイオンビームである、上記［７］、［１２］および［１６］のいずれか１項に記載の固定化方法、および；[１８]上記[１]から[１７]のいずれか１項に記載の固定化方法を用いて細胞が固定化された、細胞アレイ、に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、まず、固相表面に固定化しやすい第二の化合物を固定化するので、細胞を固定化しようとするパターンどおりに、正確な膜パターンを形成することができる。これにより、第二の化合物上に第一の化合物を、さらに第一の化合物上に細胞を、所望のパターン通りに正確に固定化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明に係る「固定化方法」は、細胞に親和性を有する第一の化合物に結合しうる結合部位を有し、かつ前記第一の化合物より固相表面に固定化しやすい第二の化合物を、上記パターンに従って固相表面に固定化する固定化工程を含むことを特徴とする
本発明において「固相表面に固定化しやすい」とは、固相表面に、所望のパターンに従って容易に固定化できることを意味する。従って、第二の化合物としては、例えば、第一の化合物よりも固相表面に対して反応する速度が早く、緻密な薄膜を形成するような分子構造をもった化合物を用いることができる。
【００１２】
このような化合物の一例として、固相基板表面に自己組織化単分子膜（Self Assembled Monolayer; ＳＡＭ）を形成しうる基板結合部位を有する化合物が挙げられる。第二の化合物に自己組織化単分子膜を形成するための基板結合部位があれば、固相表面に該溶液を配置した場合に、第二の化合物は速やかに固相表面に緻密な薄膜を形成する。その結果、溶液の収縮によって液滴の位置が移動したり、ライン状のパターンに配置した液滴が途中で途切れたりしても、その前に固相基板表面に前記第一の化合物が反応するための第一の化合物に結合しうる結合部位のパターンを形成することができる。
【００１３】
ＳＡＭを形成しうる基板結合部位としては、固相基板が金属である場合には、チオール基（−ＳＨ）、ジスルフィド基（−ＳＳ−）、スルフィド基（−Ｓ−）等が挙げられる。これらの基板結合部位は、例えば金蒸着された固相表面とＡｕ−Ｓ結合してＳＡＭを形成する。
【００１４】
一方、固相基板がガラスやポリマー樹脂、半導体、金属酸化物などである場合は、ＳＡＭを形成しうる基板結合部位を含む第二の化合物として、シラン系やチタネート系のカップリング剤が挙げられる。シラン系のカップリング剤は、一般にＹnＳｉＸ(4-n)［ここで、Ｙはアルキル基、フルオロアルキル基、ビニル基、アミノ基、フェニル基またはエポキシ基等を表し；Ｘはアルコキシル基またはハロゲンを表し；ｎは１〜３の整数を表す］で表される。シランカップリング剤の場合、Ｘ部分が加水分解によりシラノールを形成し、固相表面の水酸基と結合する。
【００１５】
ここで、本発明に用いられる「固相表面」の材料は、上記のほか、他の金属（例えば、銀、銅、アルミニウム、白金、酸化アルミニウム、ＳｒＴｉＯ3、ＬａＡｌＯ3、ＮｄＧａＯ3、ＺｒＯ2）、シリコン（例えば、酸化ケイ素）、ポリマー樹脂（例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート）、等からも選ぶことができる。尚、これらの材料の固相表面を用いる場合も、それぞれ適切な官能基を有する第二の化合物を用いることによって、好適にＳＡＭを形成することが可能である。また、固相表面は平面であることが好ましく、基板状、テープ状、フィルム状等の形状の固相が用いられる。
【００１６】
また、本発明に係る方法では、「固相表面に固定化しやすい」第二の化合物として、固相基板表面に物理吸着して不溶性の薄膜を形成しうる高分子部位を有する化合物を用いることができる。高分子の溶液は高分子の重合度、溶液の濃度調整、吸着の温度等を制御することで、高分子薄膜の吸着速度や析出時の形状を変えることが可能であり、高濃度の溶液を用いて高分子の薄膜を形成することができる。従って、第二の化合物が、固相表面に物理吸着しうる高分子部位を有していれば、固相表面に該溶液を配置した場合に、乾燥に伴う溶液の収縮によって液滴の位置が移動したり、ライン状のパターンに配置した液滴が途中で途切れたりすることなく、固相基板表面に第二の化合物の堆積膜を形成することができる。
【００１７】
本発明に用いられる、第二の化合物が高分子部位を有する場合、第二の化合物は固相表面に対して化学的な結合をせず、物理吸着により固相表面上に吸着して薄膜を形成する。分子量が大きいために、溶液中に溶け込むことなく基板表面に残留するため、この第二の化合物をパターン状に配置しておけば第一の化合物を介して、細胞が固定化することができる。
【００１８】
高分子の構造に特に限定はないが、細胞の吸着過程において水溶液中で第二の化合物が溶出しないことが必要である。第二の化合物を薄膜にする工程では水を主成分とする緩衝溶液またはその緩衝溶液の中に有機溶剤を含むものを用いることができる。特に、ポリペプチドや蛋白質はそれ自体がアミノ基を大量に表面に有しているため第一の化合物を固定化するためにアミノ基を導入するなどの特別な処理を必要としない。蛋白質の中でも、アルブミンは凝固しやすい蛋白質でありながら、中性から弱アルカリ性において可溶な蛋白質であり、熱やアルコールなどで容易に変性して凝固するため、本発明に用いられる第二の化合物として適している。
【００１９】
ここで、本発明で用いられる「第一の化合物」は、細胞に親和性を有する限り特に限定されず、生体由来であるか合成されたものであるかを問わない。例えば、細胞外マトリックスの構成成分である蛋白質（例えば、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン等）や、細胞表面に露出した官能基を特異的に認識して結合する化合物、抗体、サイトカイン、また、細胞膜に挿入されるように結合する化合物等が挙げられる。
【００２０】
中でも、細胞膜に挿入されるように結合する脂肪族炭化水素基を備えたＢＡＭ（Biocompatible Anchor for Membrane）（例えば、特許文献２を参照）は、非共有結合によって細胞を傷つけることなく効率的に固定化できて好ましい。
【００２１】
本発明に係る「第二の化合物」は、上記「第一の化合物に結合しうる結合部位」を有する。このような化合物として、例えば、第一の化合物に含まれる官能基と共有結合する、アミノ基、カルボキシル基、ジスルフィド基、エポキシ基、カルボジイミド基、マレイミド基等の官能基を、結合部位として備えた化合物が挙げられる。特に、第一の化合物として上記ＢＡＭを用いる場合には、結合部位としてアミノ基を備えた第二の化合物が好ましい。また、第一の化合物が蛋白質等の生体分子である場合は、該生体分子に生物学的親和性を有する、抗体、抗原、その他の蛋白質を「第二の化合物」として用いることも可能である。
【００２２】
なお、第一の化合物に適当な結合部位がない場合は、予めアミノ基、カルボキシル基、ジスルフィド基、エポキシ基、カルボジイミド基、マレイミド基等の官能基を第一の化合物に導入しておいたり、アビジン、ビオチンといった生物学的親和性を有する分子を結合させておいてもよい。この場合、第二の化合物として、上記官能基に親和性を有する官能基（例えば、アミノ基、カルボキシル基、ジスルフィド基、エポキシ基、カルボジイミド基、マレイミド基等）を有する化合物や、上記分子に親和性を有する分子（例えば、ビオチン、アビジン等）を結合させた化合物を用いれば、第一の化合物を好適に固定することができ、かかる構成も本発明に含まれる。
【００２３】
本発明に係る固定化工程は、第二の化合物を含む液滴を、固相表面に吐出することによって行われることが好ましい。液滴を吐出する方法としては、例えば、少量の液滴を精度よく供給することが可能なインクジェット法を用いることができる。インクジェット法には、溶液を吐出する方法として、ピエゾ素子を用いたピエゾジェット法、サーマル素子を用いたサーマルジェット法、振動板と電極間の静電力を利用した静電アクチュエータ法があり、いずれの方法を用いてもよい。温度に敏感な生体試料が含まれる場合には、吐出された液滴に高温がかからないピエゾジェット法または静電アクチュエータ法を用いることができる。
【００２４】
第二の化合物を含む液滴は、細胞を固定化するパターンに従って吐出する。インクジェット装置を用いる場合は、固相を載置したステージを動かすことにより、任意のパターンに液滴を吐出することができる。細胞を固定化するパターンは、細胞の種類、大きさを考慮し、培養量等に応じて任意に決定することができる。
【００２５】
第二の化合物は、第一の化合物と異なり、細胞への親和性が必要とされないので、第一の化合物よりも高い自由度で選択することができる。従って、第一の化合物が、液滴の吐出に適さない溶媒にしか溶解しない場合にも、第二の化合物として、吐出に適した溶媒に溶解できる化合物を選択し、これを固相表面に吐出して供給できる。第二の化合物がきれいにパターニングされていれば、第二の化合物が吸着した固相表面を第一の化合物の溶液に充分な時間浸漬することによって細胞への親和性を有した第一の化合物のパターンが固相表面に形成できる。
【００２６】
また、本発明に係る固定化工程は、まず、第二の化合物を固相表面全体に固定化し、続いて細胞を固定化するパターンのみを残して、第二の化合物の結合部位を不活性化することによって行われることも好ましい。例えば、まず固相表面に第二の化合物によるＳＡＭを形成し、上記パターン以外の部分に開口が設けられたマスクを用いて放射エネルギー線を照射することにより、ＳＡＭを構成する分子の原子間結合の一部を切断して不活性化することができる。放射エネルギー線としては紫外線が好ましく、マスクを用いて照射することにより、微細なパターンを正確に残すことができる。この結果、第二の化合物上に、第一の化合物を所望のパターン通りに精度よく固定化することができる。
【００２７】
なお、本発明に係る固定化方法では、上述した固定化工程後、固相表面において第二の化合物が固定化された領域以外の領域に細胞付着防止膜を形成しておくことが好ましい。細胞付着防止膜は、細胞に親和性を有しない、細胞付着防止化合物を含む。細胞付着防止化合物は、特に限定されないが、例えば、水酸基など、親水性の高い官能基を含む化合物を用いることができ、このような化合物としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等が挙げられる。
【００２８】
ＰＥＧの末端に、固相表面でＳＡＭを形成しうる官能基（例えば、固相表面に金薄膜が形成されている場合、チオール基）を結合させておくことによって、ＰＥＧが表面に並んだＳＡＭを形成することができ、これを細胞付着防止膜とすることができる。ＳＡＭは、第二の化合物を固定化した後、チオール基を結合させたＰＥＧ（以下「ＰＥＧ−チオール」という）を含む溶液に、固相表面を接触させることによって形成することができる。また、固相表面における第二の化合物が固定化されていない領域に、ＰＥＧ−チオールを含む液滴を吐出することによっても、ＳＡＭを形成することが可能である。
【００２９】
細胞付着防止膜を形成しておくことにより、細胞が固定化したいパターン以外の領域にはみ出して固定化されるのを防ぐことができるので、より精度よく細胞を固定化することが可能と成る。また、その後固相表面上で、細胞を培養し増殖させた場合にも細胞が付着する領域を制御可能となる。
【００３０】
本発明に係る固定化方法では、第二の化合物の固定化と、細胞付着防止膜の形成とは、いずれを先に行ってもよいが、正確なパターニングが容易に行える方を先に行うことが好ましい。以下、細胞付着防止膜を先に形成する場合について説明する。
【００３１】
細胞付着防止膜の材料は上述の通りであり、説明を省略する。かかる細胞付着防止膜の形成方法は特に限定されないが、例えば、細胞付着防止化合物を含む液滴を、細胞を固定化するパターンを除く領域に吐出する方法によって行うことができる。また、細胞付着防止膜を、まず固相表面全体に形成し、その後、細胞を固定化するパターン状に、細胞付着防止膜を除去することによって行うこともできる。
【００３２】
後者の方法の場合、例えば、上述の方法によって細胞付着防止膜を固相表面全体に形成し、細胞を固定化するパターン状に開口を設けたマスクを用いて、放射エネルギー線、好ましくは紫外線を照射することによって、細胞付着防止化合物の原子間結合を切断し、細胞付着防止膜を除去することが可能である。
【００３３】
上記方法によって細胞付着防止膜のパターンを形成した後、第二の化合物を、固相表面に固定化する。第二の化合物を含む液滴を、細胞を固定化するパターンに従って固相表面に吐出してもよいし、第二の化合物を含む溶液に、細胞付着防止膜をパターンにそって形成した固相表面を接触させてもよい。
【００３４】
さらに、本発明に係る固定化工程は、第一の化合物との結合部位に保護基が結合された第二の化合物を固定化する工程と、細胞を固定化するパターンに従って、この保護基を脱離させる工程と、を含むものであってもよい。保護基が反応性の官能基を保護することによって、より多様な溶媒に化合物を溶解させることが可能となり、きれいにパターニングすることができる。また、第一の化合物を反応させる直前に脱保護誘発剤によって反応性の高い官能基を固相表面にもたせることで、第一の化合物との反応をすばやく、しかも再現性良く行うことが可能となる。その結果、きれいな形状で第一の化合物のパターンを形成することが出来る。
【００３５】
保護基としては、例えば、第一の化合物との結合部位がアミノ基の場合には、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）が好適である。Ｆｍｏｃを用いて保護する場合、まず上述の方法で、Ｆｍｏｃ付きの第二の化合物を固相表面全体に固定化した後、細胞を固定化するパターン通りに脱保護を行う。Ｆｍｏｃの場合、脱保護は、脱保護誘発剤として、エタノールアミン等の塩基性溶液を接触させることによって行うことができるので、例えば塩基性溶液の液滴を、細胞を固定化するパターンに従って吐出すればよい。
【００３６】
なお、保護基は、それ自体、固相表面で細胞付着防止膜の機能を果たすものが好ましく、これにより、脱保護しない領域をそのまま細胞付着防止膜とすることができる。
【００３７】
また、上記保護基を脱離させる工程は、細胞を固定化するパターンを除く領域に放射エネルギー線を照射して、保護基を有する第二の化合物を除去する工程と、除去した領域に細胞付着防止膜を形成する工程と、上記パターン状に残された第二の化合物に脱保護誘発化合物を反応させる工程と、を含んでもよい。
【００３８】
本発明に係る固定化方法では、上述した固定化工程後に、前記第一の化合物を含む液滴を第二の化合物のパターンに従って吐出することにより、第一の化合物を所望のパターン通りに固定化することができる。この場合、第一の化合物を含む液滴は、美しい細線状に吐出する必要がないので、比較的多い量の液滴を吐出でき、該液滴が乾燥するまでの時間を延ばすことができる。これにより第一の化合物と第二の化合物との反応時間をより長く確保することが可能となり、第一の化合物が好適に固定化される。
【００３９】
また、第一の化合物の固定化は、前記第一の化合物を含む溶液に、固相表面を接触させることによっても行うことができる。すでに第二の化合物が固相表面に固定化されているので、この固相表面を、第一の化合物を含む溶液に浸漬させることによって、容易に第一の化合物を固定化することができる。かかる方法によれば第一の化合物の供給方法が簡便であり、また第一の化合物と第二の化合物とが液相で反応できる時間を長く確保することができるという利点もある。
【００４０】
第一の化合物を固定化した後、例えば、細胞を含む溶液に固相表面を接触させることによって、細胞を固定化することができる。細胞を含む溶液に固相表面を浸漬させてもよく、細胞を含む溶液を固相表面に塗布しても良い。余分な細胞は、第一の化合物に結合しないので、洗浄除去することができる。
【００４１】
また、本発明は、上述の固定化方法を用いて細胞が固定化された、細胞アレイを提供する。かかる細胞アレイは、所望の微細なパターンに沿って生きたまま細胞が固定化され、このまま培養し、細胞を増殖させることができる。このような細胞アレイは、例えば、細胞を培養して生体組織の代替物を得る目的で用いることもできるし、また発現解析用バイオセンサとしても利用可能であり有用である。
【００４２】
以下に示す本発明の実施例は、例示的なものであり、本発明は以下の具体例に制限されるものではない。当業者は、以下に示す実施例に様々な変更を加えて本発明を最大限に実施することができ、かかる変更は本願特許請求の範囲に包含される。
【実施例１】
【００４３】
第二の化合物としてウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin：ＢＳＡ）を、第一の化合物としてＢＡＭのうち下記式（１）
【００４４】
【化１】
2005269902.tif 000003
で表される化合物Ｅ２９０を用いて、本発明に係る固定化方法に従って細胞を固相表面に固定化した。ＢＳＡは表面にアミノ基を有し、Ｅ２９０のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基と反応して、Ｅ２９０を固相表面に固定化することができる。
【００４５】
図１に本実施例における細胞固定化方法を説明する工程図を示す。固相表面としてガラス基板１０を用い、このガラス基板表面に２５４ｎｍのＵＶ光（１０ｍＷ／ｃｍ2）を１０分間照射して、基板表面のオゾン洗浄を行った。これにより基板１０表面の液体に対する濡れ性が高まり、ＢＳＡのパターンがきれいに作製できるようになる。ガラス基板の水に対する接触角は１０度以下となった。
【００４６】
次に、図１（Ａ）に示すように、インクジェット式吐出装置を用いて、ＢＳＡ溶液１２（１％リン酸バッファ溶媒）を基板１０表面に、ライン＆ピッチパターン（等間隔にラインが並んだパターン）に吐出した。ラインの幅は50μｍ、ピッチは50μｍとした。
【００４７】
ＢＳＡ溶液が乾燥した後、同図（Ｂ）に示すように、ＢＳＡのパターンに従って、ＢＡＭ溶液１４をインクジェット式吐出装置を用いて吐出し、ＢＳＡとＢＡＭを反応させた。ＢＡＭ溶液は、溶媒にＤＭＳＯを用いて、ＢＡＭ５４ｍＭとし、トリエチルアミンを少量添加した。ＢＡＭは、ＢＳＡのパターンが全てカバーされるように、十分な量吐出した。
【００４８】
ＢＡＭ溶液の乾燥後、同図（Ｃ）に示すように、ＢＡＭパターン上に細胞２０を分散させた溶液を接触させることにより、細胞がライン状に固定化された。
【００４９】
ＢＡＭとＢＳＡの反応はＳＡＭの形成よりもゆっくりと進行する。ＢＡＭ溶液の溶媒であるＤＭＳＯは、表面張力が高く、接触角のヒステリシスも小さいので、反応が終わらないうちに液体が移動しやすく液滴が収縮してしまうため、ライン状のパターンを描くのが難しい。一方、ＢＳＡ溶液は、高分子の溶液であるため濃度調節することによりパターンの形状や膜の厚みを制御することができ、１％の高濃度ＢＳＡ溶液を吐出することで、
途中で途切れないきれいなパターンを描くことができる。従って、ＢＡＭもきれいなパターンで固定化されるので、その結果、細胞も所望のパターンに固定化することができる。
【実施例２】
【００５０】
図２に本実施例における細胞固定化方法を説明する工程図を示す。
【００５１】
本実施例では、まず、図２（Ａ）に示すように、金を蒸着されたガラス基板１０上に、細胞付着防止膜として、ＰＥＧチオール［ＨＳ−ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）7−ＯＨ］膜１８を形成した。ＰＥＧチオールは、１ｍＭのエタノール溶液とし、基板１０表面における細胞を固定するパターンを除く領域に、インクジェット法により吐出した。これにより、ＰＥＧチオールのチオール基と金とが反応して、ＳＡＭが形成された。本実施例で用いた溶媒はエタノールであるため非常に揮発性が高いが、チオール化合物の金に対する反応性が非常に高いため、短時間でもＰＥＧチオールのパターンが形成できた。
【００５２】
次に、図２（Ｂ）に示すように、ＰＥＧチオールを吐出しなかった領域に、第二の化合物として、アミノＰＥＧ−チオール［ＨＳ−Ｃ2Ｈ4−ＣＯＮＨ−Ｃ2Ｈ4−（ＯＣＨ2ＣＨ2）7−ＮＨ2］１２を固定化した。アミノＰＥＧ−チオールは、１ｍＭのエタノール溶液として、インクジェット法により基板１０表面に吐出した。
【００５３】
乾燥後、図２（Ｃ）に示すように、アミノＰＥＧ−チオールのパターン１２に従って、ＢＡＭ溶液１４をインクジェット式吐出装置を用いて吐出し、アミノ基とＢＡＭを反応させた。ＢＡＭ溶液は、溶媒にＤＭＳＯを用いて、５４ｍＭとし、トリエチルアミンを少量添加した。ＢＡＭは、ＢＳＡのパターンが全てカバーされるように、十分な量吐出した。
【００５４】
ＢＡＭ溶液の乾燥後、図２（Ｄ）に示すように、ＢＡＭパターン１４に、細胞２０を分散させた溶液を接触させることにより、細胞がライン状に固定化された。
【００５５】
このような方法によれば、ＰＥＧ−チオールおよびアミノＰＥＧ−チオールは、金基板にすばやく反応してＳＡＭを形成するため、途中で途切れないきれいなパターンを描くことができる。従って、ＢＳＡパターン上に固定化されるＢＡＭも、よりきれいなパターンで固定化されるので、その結果、細胞も所望のパターンに固定化することができる。
【００５６】
また、高い親水性を示す付着保護膜を形成しておくことによって、細胞がこの領域に付着しなくなるので、より正確に細胞を固定化することができる。
【実施例３】
【００５７】
図３に本実施例における細胞固定化方法を説明する工程図を示す。
【００５８】
本実施例では、まず、ガラス基板１０表面に２５４ｎｍのＵＶ光（１０ｍＷ／ｃｍ2）を大気中で１０分間照射し、基板表面のオゾン洗浄を行った。これにより、ガラス表面の有機物が除去されて清浄な表面が得られた。このとき、基板表面は極めて親水的で、水の接触角は５度以下であった。
【００５９】
次に、基板１０を、１２０℃で、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＳ）の蒸気に２時間接触させ、図３（Ａ）に示すように緻密なアミノ基の表面膜３０を気相法によって得た。
【００６０】
続いて、同図（Ｂ）に示すように、表面膜３０に対して、マスク３２を通して図中の矢印の方向に１７２ｎｍのエキシマＵＶを１５分間照射し、基板表面のアミノ基を部分的に分解して不活性化した領域３４を得た。エキシマＵＶの照射は、アミノ基が酸化しないよう、Ｎ2雰囲気中で行った。
【００６１】
図３（Ｃ）に示すように、こうして得られた基板１０を、ＢＡＭのＤＭＳＯ溶液（５４ｍＭ）に５〜１０分浸漬することによって、アミノ基が活性な領域にのみＢＡＭ１４が固定化される。
【００６２】
ＢＡＭ溶液の乾燥後、図３（Ｄ）に示すように、ＢＡＭパターン１４に細胞２０を分散させた溶液を接触させることにより、細胞がライン状に固定化された。
【００６３】
このような方法によれば、マスクを使用して放射エネルギー線を照射することにより、アミノ基を有する膜を正確にパターニングすることができる。従って、アミノ基のパターン上に固定化されるＢＡＭも、よりきれいなパターンで固定化されるので、その結果、細胞も所望のパターンに固定化することができる。
【実施例４】
【００６４】
図４に本実施例における細胞固定化方法を説明する工程図を示す。
【００６５】
本実施例では、まず、金蒸着されたガラス基板１０表面に２５４ｎｍのＵＶ光（１０ｍＷ／ｃｍ2）を大気中で１０分間照射し、基板表面のオゾン洗浄を行った。これにより、ガラス表面の有機物が除去されて清浄な表面が得られた。
【００６６】
次に、図４（Ａ）に示すように、基板１０を、ＰＥＧチオールの１ｍＭエタノール溶液に１〜２４時間浸漬することによって、ＰＥＧチオールによる細胞付着防止膜４２を形成した。
【００６７】
続いて、同図（Ｂ）に示すように、Ｎ2雰囲気中で、付着防止膜４２に対して、マスク４４を用いて１７２ｎｍのエキシマＵＶを１５分間照射する。照射された領域ではＡｕ−Ｓ結合が切れてＰＥＧチオールが基板からはずれ、再び金表面が露出したので、図４（Ｃ）に示すように、基板１０をアミノＰＥＧチオールの１ｍＭエタノール溶液に３０分間浸漬し、露出した金表面にＳＡＭ４６を形成した。
【００６８】
一旦基板を乾燥させた後、図４（Ｄ）に示すように、この基板をＢＡＭのＤＭＳＯ溶液に浸漬することにより、アミノＰＥＧチオールにより形成されたＳＡＭ４６上に、ＢＡＭ１４が固定化される。
【００６９】
ＢＡＭ溶液の乾燥後、図４（Ｅ）に示すように、ＢＡＭパターン状に細胞２０を分散させた溶液を接触させることにより、細胞がライン状に固定化された。
【００７０】
このような方法によれば、マスクを使用して放射エネルギー線を照射することにより、付着防止膜、ひいてはアミノ基を有する膜を正確にパターニングすることができる。従って、アミノ基のパターン上に固定化されるＢＡＭも、より美しいパターンで固定化されるので、その結果、細胞も所望のパターンに固定化することができる。
【００７１】
基板を、ＢＡＭ溶液に浸漬させるので、ＢＡＭとアミノ基とを、液相で十分に反応させることができる。
【実施例５】
【００７２】
図５に本実施例における細胞固定化方法を説明する工程図を示す。
【００７３】
図５（Ａ）に示すように、金蒸着した基板１０を、N-Fmoc-Aminoundecanethiolの０．１ｍＭエタノール溶液に浸漬し、N-Fmoc-Aminoundecanethiolの薄膜５２を形成した。
【００７４】
続いて、同図（Ｂ）に示すように、インクジェット法によって、脱保護誘発溶液Tris(2-aminoethyl)amine1Ｍ/ dimethylformamide溶液）５４を、基板に対してライン状（50μｍ）に供給し、同図（Ｃ）に示すように、脱保護され、活性なアミノ基が露出した領域５６を得た。dimethylformamideは蒸気圧が高いために液滴が乾燥しやすく、５０μｍ程度の液滴であれば１分程度で乾燥してしまう。脱保護には５分程度の接触時間が必要であるため、１分置きに重ね打ちすることで活性なアミノ基表面を得た。
【００７５】
次に、基板１０をＢＡＭのＤＭＳＯ溶液に浸漬することにより、図５（Ｄ）に示すように、ＢＡＭ１４が固定化された。
【００７６】
ＢＡＭ溶液の乾燥後、図５（Ｅ）に示すように、ＢＡＭパターン状に細胞２０を分散させた溶液を接触させることにより、細胞がライン状に固定化された。
【００７７】
このような方法によれば、塩基性溶液は、ＢＡＭ溶液よりもインクジェット法によってきれいなパターンを描くことができる溶媒を用いているので、ＢＡＭ溶液を直接基板に吐出するよりも、より美しいパターンでＢＡＭを固定化できる。
【００７８】
また、基板をＢＡＭ溶液に浸漬させるので、ＢＡＭとアミノ基とが液相で反応する時間を十分に確保することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】本発明に係る細胞固定化方法の一例を説明する工程図を示す
【図２】本発明に係る細胞固定化方法の一例を説明する工程図を示す
【図３】本発明に係る細胞固定化方法の一例を説明する工程図を示す
【図４】本発明に係る細胞固定化方法の一例を説明する工程図を示す
【図５】本発明に係る細胞固定化方法の一例を説明する工程図を示す
【符号の説明】
【００８０】
１０…基板、１２、３０、４６、５６…第二の化合物、１４…第一の化合物、１８、４２…細胞付着防止膜、２０…細胞、５４…脱保護誘発液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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