(57)【要約】【課題】物質が有するネプリライシン活性発現制御能力を有する物質を探索するために簡便であり、かつ、効果的である、物質が有するネプリライシン活性発現制御能力の検定方法等を提供可能にすること。【解決手段】物質が有するネプリライシン活性発現制御能力の検定方法であって、（１）アンドロゲンレセプターと被験物質との接触系内における前記アンドロゲンレセプターと前記被験物質との結合状態に応じて生じる表現指標によって、当該被験物質が有するアンドロゲンレセプター活性発現調節能力を測定する第一工程、及び（２）第一工程により測定された能力と対照における能力とを比較することにより得られる差異に基づき前記被験物質が有するネプリライシン活性発現制御能力を評価する第二工程、を有することを特徴とする物質が有するネプリライシン活性発現制御能力の検定方法等。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質が有するネプリライシン活性発現制御能力の検定方法であって、
（１）アンドロゲンレセプターと被験物質との接触系内における前記アンドロゲンレセプターと前記被験物質との結合状態に応じて生じる表現指標によって、当該被験物質が有するアンドロゲンレセプター活性発現調節能力を測定する第一工程、及び
（２）第一工程により測定された能力と対照における能力とを比較することにより得られる差異に基づき前記被験物質が有するネプリライシン活性発現制御能力を評価する第二工程、
を有することを特徴とする物質が有するネプリライシン活性発現制御能力の検定方法。
【請求項２】
アンドロゲンレセプターが哺乳動物由来であることを特徴とする請求項１記載の検定方法。
【請求項３】
第一工程における接触系が、神経細胞内における接触系であることを特徴とする請求項１又は２記載の検定方法。
【請求項４】
神経細胞が、下記のいずれかの神経細胞であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかの請求項記載の検定方法。
＜神経細胞群＞
（ａ）神経由来の初代細胞
（ｂ）神経由来の培養細胞株
（ｃ）CHP212細胞
（ｄ）IMR32細胞
【請求項５】
アンドロゲンレセプターが、下記のいずれかのアンドロゲンレセプターであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかの請求項記載の検定方法
＜蛋白質群＞
（ａ）配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるアンドロゲンレセプター
（ｂ）配列番号1で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されたアミノ酸配列からなるアンドロゲンレセプター
（ｃ）配列番号1で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるアンドロゲンレセプター
（ｄ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるアンドロゲンレセプター
（ｅ）GenBank Accession No.M20132に記載されるアミノ酸配列からなるアンドロゲンレセプター
【請求項６】
物質が有するネプリライシン活性発現制御能力を評価するための指標を提供する試薬としての、アンドロゲンレセプターの使用。
【請求項７】
請求項１乃至５のいずれかの請求項記載の検定方法により評価された物質が有するネプリライシン活性発現制御能力に基づき、ネプリライシン活性発現制御能力を有する物質を選抜することを特徴とするネプリライシン活性発現制御物質の探索方法。
【請求項８】
請求項７記載の探索方法により選抜された物質又はその薬学的に許容される塩を含有してなる組成物。
【請求項９】
請求項７記載の探索方法により選抜された物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とするネプリライシン活性発現制御剤。
【請求項１０】
アンドロゲンレセプター活性発現制御能力を有する物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とするネプリライシン活性発現制御剤。
【請求項１１】
アンドロゲンレセプター活性発現制御能力を有する物質が、アンドロゲンレセプターアゴニスト活性を有する物質であることを特徴とする請求項１０記載のネプリライシン活性発現制御剤。
【請求項１２】
神経細胞に、ネプリライシンの活性発現を制御するために薬理学上有効な量のアンドロゲンレセプター活性発現制御能力を有する物質を接触させる工程を有することを特徴とするネプリライシン活性発現制御方法。
【請求項１３】
アンドロゲンレセプターとアンドロゲンレセプター活性発現制御能力を有する物質との結合を促進させる工程を有することを特徴とするネプリライシン活性発現制御方法。
【請求項１４】
請求項１２又は１３記載のネプリライシン活性発現制御方法により、ネプリライシンの活性発現を制御する工程を有することを特徴とするアミロイドβタンパク質関連疾患を予防又は治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質が有するネプリライシン活性発現制御能力の検定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病の患者の脳の病理学的特徴として、神経細胞の脱落に加えて、老人斑、神経原線維変化の蓄積が知られている。これらのうち、アルツハイマー病における最初期の病理変化は老人斑の形成であり、その主要構成成分がアミロイドβタンパク質（以下、Ａβと記すこともある。）であることから、Ａβの産生又は分解の異常がアルツハイマー病の発症・進展に深くかわっていると考えられている。
Ａβは、約４０のアミノ酸残基からなる不溶性のペプチド性タンパク質であり、前駆体タンパク質（以下、βＡＰＰと記すこともある。）からβ−セクレターゼとγ-セクレターゼとの両者により切断されることにより生じるものである。因みに、β−セクレターゼについては、既に新規アスパラギン酸プロテアーゼであることが同定されており（例えば、非特許文献１参照）、一方、γ-セクレターゼについては、家族性アルツハイマー病（FAD）原因遺伝子、プレセニリン又はプレセニリンを含む複合体が、その活性発現に関与していることが明らかにされている（例えば、非特許文献１参照）。
当該Ａβとアルツハイマー病との関わりにおいて、前述の如く、老人斑の出現は疾患特異性が高く、また神経原線維変化よりも早期に認められることから、Ａβの蓄積は発症に至るまでの複雑なカスケードの上流に位置する共通経路において発生するものとして注目されている。また、老人斑の形成が正常な老化脳においても観察されることから、アルツハイマー病の患者では脳の老化が加速された結果寿命前に神経細胞の変性が起こり、逆に正常人では脳の老化がゆっくりと起きていると考えられる。即ち、アルツハイマー病の患者では、Ａβの分解能力が低下しているために正常人よりもＡβの蓄積が早くなると考えられている。
Ａβの分解は、主要な分解酵素として様々な組織で発現している中性エンドペプチダーゼの一つであるネプリライシンがすでに同定されている。従って、神経細胞においてネプリライシン遺伝子発現を上昇させる方法又はネプリライシン酵素活性を上昇させる方法（以下、総じてネプリライシン活性発現を上昇させる方法と記すこともある。）がアルツハイマー病の治療方法の一つとして考えられている。例えば、培養神経細胞において神経ペプチド（ソマトスタチン）処理によりネプリライシンの酵素活性が約２倍程度増加したという報告されていることから、ソマトスタチン受容体を標的にした薬剤はアルツハイマー病に対する有効な原因療法になりうると考えられている（例えば、非特許文献２参照）。ネプリライシンの遺伝子発現はプロモーター解析により多くの転写因子により制御されていることがすでに知られているが、特に神経変性疾患の標的細胞である神経細胞でのネプリライシンの遺伝子発現の制御については未だ明らかにされていなかった。
【０００３】
【非特許文献１】Neuron、27、419−422、2000
【非特許文献２】医学のあゆみ、207、p51-54、2003、医歯薬出版
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このような知見に基づけば、物質が有するネプリライシン活性発現制御能力を検定することによって当該能力を有する物質を探索し特定できれば、当該物質をアミロイドβタンパク質関連疾患を治療又は予防するための薬剤（即ち、具体的には例えば、アルツハイマー病の治療剤又は予防剤）として利用することができ、前記疾患の治療又は予防が可能となる。
そこで、本発明の目的は、物質が有するネプリライシン活性発現制御能力を有する物質を探索するために簡便であり、かつ、効果的である、物質が有するネプリライシン活性発現制御能力の検定方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、かかる状況のもと鋭意検討した結果、例えば、ＰＲ（ステロイドホルモン：プロゲステロン）、ＧＲ（ステロイドホルモン：デキサメタソン）、ＭＲ（ステロイドホルモン：アルドステロン）等の各種のステロイドホルモンレセプター活性発現調節能力のうち、アンドロゲンレセプター活性発現調節能力を有する物質だけがネプリライシン活性発現制御に顕著な影響を与え、そして物質が有するアンドロゲンレセプター活性発現調節能力のみがネプリライシン活性発現制御能力と密接に関係していることを見出した。具体的には例えば、神経細胞においてアンドロゲンレセプターアゴニストがネプリライシン遺伝子発現を上昇させること、神経細胞においてアンドロゲンレセプターアゴニストがネプリライシン酵素活性を上昇させること、神経細胞においてアンドロゲンレセプターアゴニストがアミロイドβタンパク質（Ａβ）の細胞外分泌量を抑制すること等の新規知見を見出し、当該知見に基づき本発明に至った。
【０００６】
即ち、本発明は、
１．物質が有するネプリライシン活性発現制御能力の検定方法であって、
（１）アンドロゲンレセプターと被験物質との接触系内における前記アンドロゲンレセプターと前記被験物質との結合状態に応じて生じる表現指標によって、当該被験物質が有するアンドロゲンレセプター活性発現調節能力を測定する第一工程、及び
（２）第一工程により測定された能力と対照における能力とを比較することにより得られる差異に基づき前記被験物質が有するネプリライシン活性発現制御能力を評価する第二工程、
を有することを特徴とする物質が有するネプリライシン活性発現制御能力の検定方法（以下、本発明検定方法と記すこともある。）；
２．アンドロゲンレセプターが哺乳動物由来であることを特徴とする前項１記載の検定方法；
３．第一工程における接触系が、神経細胞内における接触系であることを特徴とする前項１又は２記載の検定方法；
４．神経細胞が、下記のいずれかの神経細胞であることを特徴とする前項１乃至３のいずれかの前項記載の検定方法
＜神経細胞群＞
（ａ）神経由来の初代細胞
（ｂ）神経由来の培養細胞株
（ｃ）CHP212細胞
（ｄ）IMR32細胞；
５．アンドロゲンレセプターが、下記のいずれかのアンドロゲンレセプターであることを特徴とする前項１乃至４のいずれかの請求項記載の検定方法
＜蛋白質群＞
（ａ）配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるアンドロゲンレセプター
（ｂ）配列番号1で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されたアミノ酸配列からなるアンドロゲンレセプター
（ｃ）配列番号1で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるアンドロゲンレセプター
（ｄ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるアンドロゲンレセプター
（ｅ）GenBank Accession No.M20132に記載されるアミノ酸配列からなるアンドロゲンレセプター；
６．物質が有するネプリライシン活性発現制御能力を評価するための指標を提供する試薬としての、アンドロゲンレセプターの使用；
７．前項１乃至５のいずれかの請求項記載の検定方法により評価された物質が有するネプリライシン活性発現制御能力に基づき、ネプリライシン活性発現制御能力を有する物質を選抜することを特徴とするネプリライシン活性発現制御物質の探索方法（以下、本発明探索方法と記すこともある。）；
８．前項７記載の探索方法により選抜された物質又はその薬学的に許容される塩を含有してなる組成物；
９．前項７記載の探索方法により選抜された物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とするネプリライシン活性発現制御剤；
１０．アンドロゲンレセプター活性発現制御能力を有する物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とするネプリライシン活性発現制御剤（以下、本発明ネプリライシン活性発現制御剤と記すこともある。）；
１１．アンドロゲンレセプター活性発現制御能力を有する物質が、アンドロゲンレセプターアゴニスト活性を有する物質であることを特徴とする前項１０記載のネプリライシン活性発現制御剤；
１２．神経細胞に、ネプリライシンの活性発現を制御するために薬理学上有効な量のアンドロゲンレセプター活性発現制御能力を有する物質を接触させる工程を有することを特徴とするネプリライシン活性発現制御方法；
１３．アンドロゲンレセプターとアンドロゲンレセプター活性発現制御能力を有する物質との結合を促進させる工程を有することを特徴とするネプリライシン活性発現制御方法；
１４．前項１２又は１３記載のネプリライシン活性発現制御方法により、ネプリライシンの活性発現を制御する工程を有することを特徴とするアミロイドβタンパク質関連疾患を予防又は治療する方法；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、物質が有するネプリライシン活性発現制御能力を有する物質を探索するために簡便であり、かつ、効果的である、物質が有するネプリライシン活性発現制御能力の検定方法等が提供可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に本発明を詳細に説明する。
ネプリライシン（Neprilysin）は、動物の各種組織に存在する中性エンドペプチダーゼ（EC 3.4.24.11）であり、細胞外酵素である。ラットの脳中ではエンケファリン分解ペプチダーゼとして再発見され、エンケファリナーゼと命名されている。インビボにおいて、ネプリライシンの基質になるものは多くあることが知られており、例えば、エンケファリン、サブスタンスＰ、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、エンドセリン等を挙げられる。
本発明では、このようなネプリライシンの活性発現を制御する能力、特に促進する能力を物質が有するか否かを検定するための方法等を提供している。
【０００９】
本発明でいうアンドロゲンレセプター（ＡＲ）とは、アンドロゲン（ＡＲの典型的なリガンド）の作用機作においてキーとなるタンパク質であって、ステロイドホルモンレセプターの一種である。アンドロゲンレセプターは、アンドロゲンの存在を認識することにより種々の生体内での反応を制御することが可能となるものであり、詳細には、細胞内でアンドロゲンがアンドロゲンレセプターに結合すると、該レセプターが活性化され、染色体上の標的遺伝子の転写調節領域に存在するアンドロゲンレセプター応答配列（ARE）に結合し、標的遺伝子の転写を促進する。
本発明検定方法において用いられるアンドロゲンレセプターとしては、本発明検定方法において効果を有するものであれば如何なるアンドロゲンレセプター（尚、当該アンドロゲンレセプターと同等な効果を有するものを含む。）であってもよいが、例えば、哺乳動物由来のアンドロゲンレセプター等を好ましく挙げることができる。また具体的には例えば、下記のいずれかのアンドロゲンレセプターを好ましいものとして挙げることができる。
＜蛋白質群＞
（ａ）配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるアンドロゲンレセプター
（ｂ）配列番号1で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されたアミノ酸配列からなるアンドロゲンレセプター
（ｃ）配列番号1で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるアンドロゲンレセプター
（ｄ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるアンドロゲンレセプター
（ｅ）GenBank Accession No.M20132に記載されるアミノ酸配列からなるアンドロゲンレセプター
【００１０】
ここで、前記（ｂ）にある「アミノ酸の欠失、付加若しくは置換」や前記（ｃ）にある「８０％以上の配列同一性」には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が細胞内で受けるプロセシング、該蛋白質が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。
前記（ｂ）にある「アミノ酸の欠失、付加若しくは置換」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res.,12,9441-9456(1984)）、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には1若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、アンドロゲンレセプター活性を見出すことのできる範囲であれば良い。
また前記欠失、付加又は置換のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、（１）グリシン、アラニン；（２）バリン、イソロイシン、ロイシン；（３）アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、（４）セリン、スレオニン；（５）リジン、アルギニン；（６）フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
本発明において「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
本発明における配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。
前記（ｄ）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×SSC（１．５M  NaCl、０．１５M  クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×SSCとする）、50％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、2×SSCで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×SSCで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×SSCで５０℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）までの温度から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
【００１１】
アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子は、例えば、ヒトやラット等の哺乳動物の組織から、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory発行、1989年）等に記載の遺伝子工学的方法に準じて取得することができる。
例えば、まず、哺乳動物の組織由来の全RNAを調製する。具体的には、哺乳動物の肝臓等の組織を塩酸グアニジンやグアニジンチオシアネート等の蛋白質変性剤を含む溶液中で粉砕し、さらに当該粉砕物にフェノール、クロロホルム等を加えることにより蛋白質を変性させる。変性された蛋白質を遠心分離等により沈殿画分として除去した後、回収された上清画分から塩酸グアニジン／フェノール法、SDS−フェノール法、グアニジンチオシアネート／CsCl法等の方法により全RNAを抽出する。なお、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えばISOGEN（ニッポンジーン製）がある。
抽出された全RNAを鋳型として、オリゴdTアダプタープライマー、ランダムプライマー又はカスタムプライマー等を鋳型にアニールさせ、逆転写酵素により一本鎖cＤＮＡを合成する。これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えばTaKaRa RNA LA ＰＣＲTM Kit(AMV)Ver.1.1（宝酒造社製）やTaKaRa RNA ＰＣＲ Kit(AMV)Ver.2.1（宝酒造社製）等があげられる。カスタムプライマーとしては、例えば、約20bpから約40bp程度の長さのオリゴヌクレオチドであって、具体的には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一部である部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。
次いで、合成された一本鎖cＤＮＡを鋳型として、例えば、大腸菌RNaseHを用いてRNA鎖にニックとギャップを入れることにより得られるRNAをプライマーとして大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩを用いて二本鎖cＤＮＡを合成する。得られた二本鎖cＤＮＡの両末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化する。末端が平滑化された二本鎖cＤＮＡは、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿等の通常の方法により精製、回収する。更に、回収された二本鎖cＤＮＡを、例えばプラスミドpUC118やファージλgt10などのベクターとリガーゼを用いて連結することによりcＤＮＡライブラリーを作製してもよい。尚、これらの二本鎖cＤＮＡ又はcＤＮＡライブラリーは商業的に入手できるものを用いてもよい。
【００１２】
上記のようにして得られた二本鎖cＤＮＡ又はcＤＮＡライブラリーを鋳型として、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）を行うことにより、目的とするアンドロゲンレセプター遺伝子を取得することができる。ＰＣＲに用いられるプライマーとしては、例えば、約20bpから約40bp程度の長さのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の5'末端領域から選択した塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の3'末端領域から選択した塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。具体的には、例えば、フォワードプライマーとしては、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の塩基番号1〜25で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。また、リバースプライマーとしては、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の塩基番号2744〜2764で示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
ＰＣＲの条件としては、例えば、反応液50μl中に、10 x LA ＰＣＲ 緩衝液II（Mg2+不含）（宝酒造社製）5μl、25mM MgCl2 5μl、2.5mM dNTP混合液（各2.5mMのdATP, dGTP, dCTP, dTTPを含む。）8μl（dATP, dGTP, dCTP,及びdTTP各々の終濃度が0.4mM）、10μMプライマー 各1μl（終濃度が0.2μM）、鋳型1本鎖cＤＮＡ 0.1〜0.5μg及びTaKaRa LA Taq（宝酒造社製）2.5ユニットを含む組成の反応液にて、94℃で2分間次いで50℃で5分間の保温を行った後、94℃で1分間次いで50℃で30秒間更に72℃で2.5分間の保温を1サイクルとしてこれを全30サイクル行う等の条件が挙げられる。
また、上記のようにして得られたcＤＮＡライブラリーから、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、アンドロゲンレセプター遺伝子を取得することもできる。また、ハイブリダイゼーションの条件としては、ストリンジェントな条件、具体的には、例えば、6×SSC（0.9M NaCl、0.09Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液（0.1(w/v)フィコール400、0.1(w/v)ポリビニルピロリドン、0.1(w/v)BSA）、0.5(w/v)SDS及び100μg/ml変性サケ精子ＤＮＡの存在下に、又は100μg/ml変性サケ精子ＤＮＡを含むDIG EASY Hyb溶液（ベーリンガーマンハイム社）中にて、65℃で保温し、次いで１×SSC（0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5(w/v)SDSの存在下に、室温で15分間の保温を2回行い、さらに0.1×SSC（0.015M NaCl、0.0015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5(w/v)SDSの存在下に、68℃で30分間保温する条件等をあげることができる。
このようにして得られたアンドロゲンレセプター遺伝子は、例えば、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング ハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、1989年等に記載の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。具体的には例えば、TAクローニングキット（Invitrogen社）やpBluescriptII（Stratagene社）などの市販のプラスミドベクターを用いてクローニングすることができる。
尚、アンドロゲンレセプター遺伝子は、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする公知の塩基配列に基づいて、ホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310, 105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製することもできる。
得られたアンドロゲンレセプター遺伝子の塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M & W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 560, 1977 等に記載される)やSanger法（例えば、Sanger,F. & A.R.Coulson, J.Mol.Biol., 94, 441, 1975、Sanger,F, & Nicklen and A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 5463, 1977等に記載される）等により確認することができる。
そして、得られたアンドロゲンレセプター遺伝子を用いることにより、通常の遺伝子工学的方法に準じてアンドロゲンレセプターを製造・取得すればよい。このようにしてアンドロゲンレセプターを調製することができる。
【００１３】
アンドロゲンレセプター遺伝子を、当該遺伝子が導入される宿主細胞において利用可能なベクター（以下、基本ベクターと記す。）、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖でき、宿主細胞からの単離、精製が可能であり、検出可能なマーカーをもつベクターに、通常の遺伝子工学的手法に準じて組み込むことにより、アンドロゲンレセプター遺伝子を含有するベクター（以下、本ベクターと記すこともある。）を構築することができる。
本ベクターの構築に用いることができる基本ベクターとしては、具体的には大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、プラスミドpUC119(宝酒造社製)やファージミドpBluescriptII(Stratagene社製)等をあげることができる。出芽酵母を宿主細胞とする場合には、プラスミドpGBT9、pGAD424、pACT2(Clontech社製)等をあげることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合には、pRc/RSV、pRc/CMV(Invitrogen社製)等のプラスミド、ウシパピローマウイルスプラスミドpBPV(アマシャムファルマシアバイオテク社製)若しくはEBウイルスプラスミドpCEP4(Invitrogen社製)等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイルス等のウイルス等をあげることができる。さらに、昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスをあげることができる。自律複製起点を含むベクター、例えば、上記の酵母用プラスミドpACT2や、ウシパピローマウイルスプラスミドpBPV、EBウイルスプラスミドpCEP4等を用いて本ベクターを構築すると、当該ベクターは宿主細胞に導入された際にエピソームとして細胞内に保持される。
バキュロウイルスやワクシニアウイルス等のウイルスにアンドロゲンレセプター遺伝子を組み込むには、使用しようとするウイルスのゲノムと相同な塩基配列を含有するトランスファーベクターを用いればよい。このようなトランスファーベクターとしては、例えば、Pharmingen社から市販されているpVL1392,pVL1393(Smith,G.E.,Summers M.D.et al.:Mol.Cell.Biol.,3,2156-2165(1983))、pSFB5(Funahashi,S.et al.:J.Virol.,65,5584-5588(1991))等のプラスミドをあげることができる。アンドロゲンレセプター遺伝子を前記のようなトランスファーベクターに挿入し、当該トランスファーベクターとウイルスのゲノムとを同時に宿主細胞に導入すると、トランスファーベクターとウイルスのゲノムとの間で相同組換えが起こり、アンドロゲンレセプター遺伝子がゲノム上に組み込まれたウイルスを得ることができる。ウイルスのゲノムとしては、Baculovirus,Adenovirus,Vacciniavirusなどのゲノムを用いることができる。
より具体的には、例えば、バキュロウイルスにアンドロゲンレセプター遺伝子を組み込む場合には、まずトランスファーベクターpVL1393,pVL1392等のマルチクローニング部位にアンドロゲンレセプター遺伝子を挿入した後、該トランスファーベクターのＤＮＡとBaculovirus genome ＤＮＡ(Baculogold;Pharmingen社製)とを昆虫細胞Sf21株（ATCCから入手可能）にリン酸カルシウム法等によって導入することにより、得られる細胞を培養する。次いで培養液から遠心分離等により、アンドロゲンレセプター遺伝子が挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を回収し、回収されたウィルス粒子をフェノール等で除蛋白処理することにより、アンドロゲンレセプター遺伝子を含有するウイルスのゲノムを得ることができる。さらに、得られたウイルスのゲノムを、昆虫細胞Sf21株等のウイルス粒子形成能力を有する宿主細胞にリン酸カルシウム法等によって導入することにより、得られる細胞を培養する。このようにしてアンドロゲンレセプター遺伝子を含有するウイルス粒子を増やすことができる。
一方、マウス白血病レトロウイルス等の比較的小さなゲノムにアンドロゲンレセプター遺伝子を組み込むには、トランスファーベクターを利用せずに、アンドロゲンレセプター遺伝子を直接組み込むこともできる。例えば、ウイルスベクタ-DC(X)（Eli Gilboa et al.,BioTechniques,4,504-512(1986)）等は、当該ベクター上のクローニング部位にアンドロゲンレセプター遺伝子を組み込む。得られたアンドロゲンレセプター遺伝子の組み込れたウイルスベクターを、例えば、Ampli-GPE（J.Virol.,66,3755(1992)）等のパッケージング細胞に導入することにより、アンドロゲンレセプター遺伝子の挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を得ることができる。
【００１４】
アンドロゲンレセプター遺伝子の上流に、宿主細胞で機能可能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これを上述のような基本ベクターに組み込むことにより、アンドロゲンレセプター遺伝子を宿主細胞で発現させることの可能な本ベクターを構築することができる。ここで、「機能可能な形で結合させる」とは、アンドロゲンレセプター遺伝子が導入される宿主細胞において、プロモーターの制御下にアンドロゲンレセプター遺伝子が発現されるように、当該プロモーターとアンドロゲンレセプター遺伝子とを結合させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモーターとしては、導入される宿主細胞内でプロモーター活性を示すＤＮＡをあげることができる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター（lacP）、トリプトファンオペロンのプロモーター(trpP)、アルギニンオペロンのプロモーター(argP)、ガラクトースオペロンのプロモーター(galP)、tacプロモーター、T7プロモーター、T3プロモーター、λファージのプロモーター(λ-pL、λ-pR)等をあげることができ、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、シミアンウイルス(SV40)の初期又は後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス(MMTV)プロモーター等をあげることができる。宿主細胞が出芽酵母である場合には、ADH1プロモーター等あげることができる。
また、宿主細胞において機能するプロモーターをあらかじめ保有する基本ベクターを使用する場合には、前記プロモーターとアンドロゲンレセプター遺伝子とが機能可能な形で結合するように、前記プロモーターの下流にアンドロゲンレセプター遺伝子を挿入すればよい。例えば、前述のプラスミドpRc/RSV、pRc/CMV等には、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられている。当該クローニング部位にアンドロゲンレセプター遺伝子を挿入することによって得られるベクターを動物細胞へ導入することにより、当該動物細胞においてアンドロゲンレセプター遺伝子を発現させることができる。これらのプラスミドにはあらかじめSV40の自律複製起点（ori）が組み込まれているため、oriを欠失したSV40ゲノムで形質転換された培養細胞、例えば、COS細胞等に当該プラスミドを導入すると、細胞内でプラスミドのコピー数が非常に増大し、結果として当該プラスミドに組み込まれたアンドロゲンレセプター遺伝子を大量発現させることもできる。また前述の酵母用プラスミドpACT2はADH1プロモーターを有しており、当該プラスミド又はその誘導体のADH1プロモーターの下流にアンドロゲンレセプター遺伝子を挿入すれば、アンドロゲンレセプター遺伝子を、例えば、CG1945(Clontech社製)等の出芽酵母内で大量発現させることが可能な本ベクターが構築できる。
【００１５】
構築された本ベクターを宿主細胞に導入することにより、本ベクターを含有する形質転換体（以下、本形質転換体と記すこともある。）を取得することができる。本ベクターを宿主細胞へ導入する方法としては、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用することができる。例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著；「 モレキュラー・クローニング  第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory発行、1989年）等に記載される塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等の通常の方法を用いることができる。また、哺乳類動物細胞又は昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法又はリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法に準じて前記細胞に導入することができる。酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、リチウム法を基にしたYeast transformation kit(Clontech社製)などを用いて導入することができる。
尚、ウイルスをベクターとして用いる場合には、上述のように一般的な遺伝子導入法によりウイルスのゲノムを宿主細胞に導入できるほか、アンドロゲンレセプター遺伝子の挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を、宿主細胞へ感染させることによっても、当該ウイルスのゲノムを宿主細胞に導入することができる。
【００１６】
本形質転換体を選抜するには、例えば、本ベクターと同時にマーカー遺伝子が導入された宿主細胞を、マーカー遺伝子の性質に応じた方法によって培養すればよい。例えば、マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子である場合には、当該選抜薬剤が添加された培地を用いて、本ベクターが導入された宿主細胞を培養すればよい。薬剤耐性を付与する遺伝子と選抜薬剤との組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせ等をあげることができる。また、マーカー遺伝子が宿主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、当該栄養要求性に対応する栄養素を含まない最少培地を用いて、本ベクターが導入された細胞を培養すればよい。またアンドロゲンレセプター遺伝子を宿主細胞で発現させることが可能な本ベクターを導入した場合には、アンドロゲン結合活性に基づく検出方法を用いることもできる。
アンドロゲンレセプター遺伝子が宿主細胞の染色体内に位置する本形質転換体を取得するには、例えば、まず本ベクターとマーカー遺伝子を有するベクターとを制限酵素等で消化することにより直鎖状にした後、これらを前述の方法で宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を通常数週間培養した後、導入されたマーカー遺伝子の発現量に基づき目的とする形質転換体を選抜し取得すればよい。また、例えば、まず上記のような選抜薬剤を付与する遺伝子をマーカー遺伝子として有する本ベクターを前述の方法によって宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を選抜薬剤が添加された培地で数週間以上継代培養した後、コロニー状に生き残った選抜薬剤耐性クローンを純化培養することにより、アンドロゲンレセプター遺伝子が宿主細胞の染色体に導入されてなる本形質転換体を選抜し取得することもできる。導入されたアンドロゲンレセプター遺伝子が宿主細胞の染色体に組み込まれたことを確認するには、当該細胞のゲノムＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、調製されたゲノムＤＮＡから、導入されたアンドロゲンレセプター遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマーやプローブとしたＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション等の方法を利用して、前記アンドロゲンレセプター遺伝子の存在を検出すればよい。当該形質転換体は、凍結保存が可能であり必要に応じて起眠して使用することができるので、実験毎の形質転換体作製の手間を省くことができ、また、あらかじめ性質や取扱い条件の確認された形質転換体を用いて試験を実施することが可能となる。
【００１７】
上述のようにして得られた本形質転換体を培養し、培養物から産生されたアンドロゲンレセプターを回収することにより、アンドロゲンレセプターを製造することができる。
【００１８】
本形質転換体の培養は、微生物培養、昆虫細胞若しくは哺乳動物細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。
例えば、本形質転換体が微生物である場合には、当該形質転換体は、一般微生物における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養することができる。培養は、一般微生物における通常の方法に準じて行い、固体培養、液体培養（旋回式振とう培養、往復式振とう培養、ジャーファーメンター（JarFermenter）培養、タンク培養等）等が可能である。培養温度及び培地のｐＨは、微生物が生育する範囲から適宜選ぶことができ、例えば、約15℃〜約40℃の培養温度にて、ｐＨが約６〜約８の培地で培養するのが一般的である。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通常約１日間〜約5日間である。温度シフト型やIPTG誘導型等の誘導型のプロモーターを有する発現ベクターを用いた場合には、誘導時間は1日間以内が好ましく、通常数時間である。
また、上記形質転換体が哺乳動物、昆虫類等の動物細胞である場合には、当該形質転換体は一般の培養細胞における通常の培養に使用される培地を用いて培養することができる。選抜薬剤を利用して当該形質転換体を作製した場合には、当該選抜薬剤の存在下に培養することが好ましい。哺乳動物細胞の場合には、例えば、終濃度が10％となるようFBSが添加されたDMEM培地（ニッスイ社製等）を用いて37℃、5％CO2存在下等の条件で数日毎に新しい培養液に交換しながら培養すればよい。細胞がコンフルエントになるまで増殖したら、例えば、0.25(w/v)程度となるようトリプシンが添加されたPBS溶液を加えて個々の細胞に分散させ、数倍に希釈して新しいシャーレに播種し培養を続ける。昆虫類動物細胞の場合も同様に、例えば、10％(v/v)FBS及び2％(w/v)Yeastlateを含むGrace's medium等の昆虫細胞用培養液を用いて培養温度25℃から35℃で培養すればよい。この際、Sf21細胞等のシャーレからはがれやすい細胞の場合には、トリプシン液を用いずピペッテイングにより分散させ継代培養を行なうことができる。また、バキュロウイルス等のウイルスベクターを含む形質転換体の場合には、培養時間は細胞質効果が現れて細胞が死滅する前、例えば、ウイルス感染後72時間までとすることが好ましい。
アンドロゲンレセプターの取得は、一般の蛋白質の単離・精製に通常使用される方法を組み合わせて実施すればよい。例えば、前記の培養により得られた形質転換体を遠心分離等で集め、該形質転換体を破砕又は溶解せしめ、必要であれば蛋白質の可溶化を行い、イオン交換、疎水、ゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた工程を単独で、若しくは組み合わせることにより精製すればよい。また、例えば、前記の培養により得られた形質転換体を遠心分離などで除去し、培養上清から本酵素を前記と同様にして精製してもよい。必要であれば、精製された蛋白質の高次構造を復元する操作をさらに行ってもよい。
具体的には例えば、培養物から、本形質転換体により産生されるアンドロゲンレセプターの回収は、適宜、通常の単離、精製の方法を組み合わせて行えばよく、例えば、まず培養終了後、形質転換体の細胞を遠心分離等で集め、集められた細胞を通常のバッファー、例えば、20mM HEPES pH7,1mM EDTA,1mM DTT,0.5mM PMSFからなるバッファーに懸濁した後、ポリトロン、超音波処理、ダウンスホモジナイザー等で破砕する。得られた破砕液を数万xgで数十分間から1時間程度超遠心分離し、上清画分を回収することにより、アンドロゲンレセプターを含む画分を得ることができる。さらに、前記上清画分をイオン交換、疎水、ゲルろ過、アフィニティ等の各種クロマトグラフィーに供することにより、より精製されたアンドロゲンレセプターを回収することもできる。この際、アンドロゲンレセプター応答配列（以下、ＡＲＥと記すこともある。）、即ちアンドロゲンレセプターが結合する塩基配列を含む約15bpから約200bp程度の長さのオリゴヌクレオチドをプローブとしたＤＮＡ結合アッセイ等により、アンドロゲンレセプターを含む画分を見分けることもできる。
【００１９】
本発明検定方法は、（１）アンドロゲンレセプターと被験物質との接触系内における前記アンドロゲンレセプターと前記被験物質との結合状態に応じて生じる表現指標によって、当該被験物質が有するアンドロゲンレセプター活性発現調節能力を測定する第一工程、及び
（２）第一工程により測定された能力と対照における能力とを比較することにより得られる差異に基づき前記被験物質が有するネプリライシン活性発現制御能力を評価する第二工程、を有する。
本発明検定方法では、ネプリライシン活性発現制御能力の直接的な測定を行なうことなく、例えば、アンドロゲンレセプターと被験物質との接触系内における前記アンドロゲンレセプターと前記被験物質との結合状態（具体的には例えば、結合能力・結合量）に応じて生じる表現指標によって、アンドロゲンレセプター活性発現調節能力を測定することに基づいて物質が有するネプリライシン活性発現制御能力を評価することができるために簡便でかつ効果的であり、１次スクリーニング等に最適である。
【００２０】
本発明検定方法における第一工程における接触系としては、例えば、神経細胞内における接触系等を好ましく挙げることができる。より好ましいものとしては、当該神経細胞が、例えば、（ａ）神経由来の初代細胞、（ｂ）神経由来の培養細胞株、（ｃ）CHP212細胞、（ｄ）IMR32細胞等の神経細胞が挙げられる。
【００２１】
このような本発明検定方法には、勿論、所謂、アンドロゲンレセプターを用いたレポータージーンアッセイ、アンドロゲンレセプターを用いたツーハイブリッドアッセイ及びアンドロゲンレセプターを用いたバインディングアッセイ等が含まれており、以下により詳細に述べる。
【００２２】
まず、アンドロゲンレセプターを用いたレポータージーンアッセイに関して説明する。当該方法は、（１）アンドロゲンレセプター応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子とアンドロゲンレセプター遺伝子とが宿主細胞に導入されてなる形質転換体と、被験物質とを接触させる工程、（２）前記形質転換体が有する前記レポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する工程、及び、（３）測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記被験物質が有するアンドロゲンレセプター活性発現調節能力を測定する工程、を有する。
アンドロゲンレセプター活性発現調節能力としては、アンドロゲンレセプターに対するアゴニスト活性、アンタゴニスト活性等があげられる。
【００２３】
上記方法における「アンドロゲンレセプター応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子」としては、例えば、アンドロゲンレセプター応答配列を含むヒトアンドロゲンレセプター遺伝子の転写制御領域等の下流に連結されたレポーター遺伝子、又はアンドロゲンレセプター応答配列のコンセンサス配列と転写開始に必要な塩基配列とを含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子等をあげることができ、宿主細胞内でのアンドロゲンレセプター活性発現調節能力をモニターするために用いることができる。
ここで「アンドロゲン応答配列」とは、アンドロゲンレセプターによって発現量が調節される標的遺伝子の転写調節領域に存在する特定の塩基配列である。例えば、アンドロゲンとアンドロゲンレセプターとの複合体が、該配列を認識しここに結合すると、その下流に存在する標的遺伝子の転写が促進される。尚、十分な転写制御能を得るには、前記のようなコンセンサス配列は通常2〜5程度タンデムに連結されていることが好ましい。かかる塩基配列を有するＤＮＡは、化学合成するか、又はポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）などにより増幅しクローニングすること等により調製することができる。
また「転写開始に必要な塩基配列」としては、TATAボックス及び転写開始のリーダー配列を有する塩基配列をあげることができる。具体的には、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のチミジンキナーゼ遺伝子（tk）の5'上流領域の塩基配列、マウスのメタロチオネインI遺伝子の5'上流領域の−３３番目（転写開始点を＋１番目とする。以下、同様。）の塩基から＋１５番目の塩基までの塩基配列（Genbank Accession No.J00605）や、チキンオボアルブミン遺伝子の5'上流領域の−４０番目の塩基から＋１０番目の塩基までの塩基配列（Genbank accession No.J00895）等があげられる。このような塩基配列を有するＤＮＡは、例えば、その塩基配列に基づいて化学合成することにより調製することができる。また、前記のような領域をコードするＤＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチドを、既知の塩基配列に基づいて設計して作製し、作製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲを行うことなどにより調製することもできる。
また「レポーター遺伝子」としては、ルシフェラーゼ遺伝子、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、成長ホルモン遺伝子などを利用することができ、宿主細胞における安定性が比較的高いレポータータンパク質をコードする遺伝子が好ましい。
【００２４】
まず、アンドロゲンレセプター応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子とアンドロゲンレセプター遺伝子とを、例えば、アンドロゲンレセプター非内在性宿主細胞、具体的には例えばHeLa細胞、CV-1細胞、Hepa1細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、COS1細胞、BF-2細胞、CHH-1細胞等の宿主細胞に導入することによって形質転換体を作製する。ここで、アンドロゲンレセプター遺伝子は、例えば、上述のように、宿主細胞で機能可能なプロモーターと機能可能な形で結合された基本ベクターに組み込まれた形で宿主細胞へ導入するとよい。また、例えば、アンドロゲンレセプター内在性宿主細胞、具体的には例えばLNCaP細胞、CHP212細胞、IMR32細胞の場合には、アンドロゲン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子を導入し、形質転換体を作製する。また、例えば、アンドロゲンレセプター内在性宿主細胞又はアンドロゲンレセプター遺伝子が導入された非内在性細胞を用いて、レポーター遺伝子として内在性のアンドロゲン応答遺伝子を用いてもよい。内在性のアンドロゲン応答遺伝子としては、例えば、PSN（Prostate Specific Antigen）遺伝子、PSMA（prostate specific membrane antigen）遺伝子、プロバシン遺伝子、hK2 (kallikrein 2) 遺伝子、ネプリライシン遺伝子等を挙げることができる。アンドロゲンレセプター応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子も、基本ベクターに組み込まれた形で用いるとよい。また例えば、アンドロゲンレセプター応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子が組み込まれたベクターと、宿主細胞で機能可能なプロモーターと機能可能な形で結合されたアンドロゲンレセプター遺伝子を保有するベクターとを、マーカー遺伝子を有するベクターとともに宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を通常数週間培養した後、導入されたマーカー遺伝子の発現量に基づき目的とする形質転換体を選抜することにより、アンドロゲンレセプター応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子及び宿主細胞で機能可能なプロモーターと機能可能な形で結合されたアンドロゲンレセプター遺伝子とが宿主細胞の染色体に導入されてなる形質転換体を取得することができる。尚、導入されたアンドロゲンレセプター遺伝子が宿主細胞の染色体に組み込まれたものであってもよく、これを確認するには、当該細胞のゲノムＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、調製されたゲノムＤＮＡから、導入された本発明遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマーやプローブとしたＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション等の方法を利用して、前記アンドロゲンレセプター遺伝子の存在を検出すればよい。当該形質転換体は、凍結保存が可能であり必要に応じて起眠して使用することができるので、実験毎の形質転換体作製の手間を省くことができ、またあらかじめ性質や取り扱い条件の確認された形質転換体を用いて試験を実施することが可能となる。これは、例えば、自動化されたロボットによる大規模スクリーニングを実施する際にも有用である。
上述のように作製された形質転換体を、例えば1日間から数日間培養する間に、被験物質を培地中に加えて前記形質転換体と、例えば、数時間から数日間接触させた後、具体的には、被験物質が添加された培地中で２４時間から数日間培養した後、当該形質転換体が有する前記レポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する。当該形質転換体が産生するアンドロゲンレセプターが被験物質（アンドロゲン様活性物質：即ち、アゴニスト）の結合により活性化された場合には、レポーター遺伝子の転写が促進され、当該レポーター遺伝子にコードされるレポーター蛋白質が前記形質転換体の細胞内等に蓄積されるか若しくは培地中に分泌される。このレポーター蛋白質の量又はその量と相関関係を有する指標値を測定することにより、当該形質転換体の細胞あたりのレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値を測定する。具体的には、例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合には、被験物質を接触させた形質転換体から調製された細胞粗抽出物にルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを加えると、当該細胞粗抽出物中のルシフェラーゼ量に比例した強度で発光する。従って、この発光強度をルミノメーター等の測定装置で測定することにより、ルシフェラーゼ量、ひいては、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を知ることができる。同様にして、当該形質転換体と被験物質とを接触させない条件下におけるレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値を測定し、当該測定値と被験物質とを接触させた条件下におけるレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値とを比較することにより、被験物質が有するアンドロゲンレセプター活性発現調節能力（この場合には、アンドロゲンレセプターに対するアゴニスト活性）を評価することができる。一方、例えば、上記の形質転換体にジヒドロテストステロン（以下、ＤＨＴと記すこともある。）等のアンドロゲンを接触させた条件下、及び、当該アンドロゲンと被験物質とを同時に接触させた条件下の各々において、上記と同様な方法でレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値を測定する。形質転換体にアンドロゲンを接触させた条件下におけるレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値と比較して、アンドロゲンと被験物質とを接触させた条件下におけるレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値が低ければ、前記被験物質はアンドロゲンレセプター活性発現調節能力（この場合には、アンドロゲンレセプターに対するアンタゴニスト活性）を有すると評価することができる。
このような評価方法により評価されたアンドロゲンレセプター活性発現調節能力に基づいてネプリライシン活性発現制御物質を有する物質を容易に選抜することが可能となり、さらに当該物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するネプリライシン活性発現制御剤を提供する。
【００２５】
次いで、アンドロゲンレセプターを用いたツーハイブリッドアッセイに関して説明する。当該方法は、被験物質が有するアンドロゲンレセプター活性発現調節能力を、２種の融合タンパク質（ツーハイブリッド；two-hybrid）の複合体形成能及び形成された複合体の転写調節能力を細胞内のレポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき検出する試験系（ツーハイブリッドシステム； Nishikawa et al.,Toxicol. Appl. Pharmacol.,154,76-83(1999)）である。
【００２６】
例えば、（１）アンドロゲンレセプターと転写共役因子との複合体を形成させるために、被験物質をアンドロゲンレセプター及び転写共役因子に接触させ第一工程（例えば、アンドロゲンレセプター複合体遺伝子導入形質転換体と被験物質とを接触させる第一工程）、（２）前記第一工程後に、前記複合体が有するレポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、及び、（３）前記第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記被験物質のアンドロゲンレセプター活性発現調節能力を評価する第三工程、を有する。
アンドロゲンレセプター活性発現調節能力としては、アンドロゲンレセプターに対するアゴニスト活性、アンタゴニスト活性等があげられる。
【００２７】
アンドロゲンレセプターと転写共役因子との複合体は、リガンドによる制御下において結合してなる下記の構成要素Ｉのうちのいずれか一方の構成要素（Ａ又はＢ）及び下記の構成要素ＩＩのうちのいずれか一方の構成要素（Ｘ又はＹ）を有するタンパク質と、下記の構成要素Ｉのうちの他方の構成要素（Ｂ又はＡ）及び下記の構成要素ＩＩのうちの他方の構成要素（Ｙ又はＸ）を有するタンパク質とが結合してなる複合体である。
＜構成要素Ｉ＞
（Ａ）リガンドによる制御下においてアンドロゲンレセプターに結合する転写共役因子に由来し、アンドロゲンレセプターに結合する領域、又は
（Ｂ）アンドロゲンレセプターに由来し、リガンドによる制御下においてアンドロゲンレセプターに結合する転写共役因子が結合する領域
＜構成要素ＩＩ＞
（Ｘ）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子のＤＮＡ結合領域、又は
（Ｙ）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子の転写活性化領域
【００２８】
当該発明において、構成要素Ｉの（Ａ）を有する転写共役因子は、アンドロゲンレセプターとリガンドとの結合体を認識してこれに結合可能な転写共役因子であって、具体的にはSRC1/NCoA1（Onate,S.A.ら、Science,1995,270, 1354）、TIF2/GRIP1（Voegel,J.J.ら、EMBO,J.,1996,15, 3667）等があげられる。一方、構成要素Ｉの（Ｂ）を有するアンドロゲンレセプターとしては、例えば、上記のような転写共役因子に結合可能なアンドロゲンレセプターをあげることができる。尚、この場合には、当該アンドロゲンレセプターは、リガンドとの複合体を形成するために、前記リガンドが結合する領域を有している。このような領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡとしては、アンドロゲンレセプター遺伝子の部分塩基配列であり、例えば、アンドロゲンレセプター遺伝子の塩基配列のうちのアンドロゲンレセプターのリガンド結合領域をコードする塩基配列を含み、構成要素ＩＩの（Ｘ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含まない塩基配列からなるＤＮＡ等をあげることができる。
構成要素ＩＩの（Ｘ）を有する転写調節因子としては、例えば、Ｇａｌ４蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（配列番号２）、Ｌｅｘ蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（配列番号３）、Ｌａｃ  Ｉ受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（配列番号４）、テトラサイクリン受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（配列番号５）、ＺＦＨＤ−１蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（配列番号６）等のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡに結合する転写調節因子であって、かつ宿主細胞内で機能可能な転写調節因子をあげることができる。一方、構成要素ＩＩの（Ｙ）を有する転写調節因子としては、例えば、Ｇａｌ４蛋白質、Ｌｅｘ蛋白質、Ｌａｃ  Ｉ受容体蛋白質、テトラサイクリン受容体蛋白質、ＺＦＨＤ−１蛋白質、Ｂ４２蛋白質、本ＡＲＮＴ属転写共役因子である蛋白質、ＶＰ１６蛋白質等の宿主細胞内で機能可能な転写調節因子をあげることができる。
【００２９】
このような各構成要素からなるタンパク質は、各構成要素の遺伝子導入形質転換体等により産生される。
各構成要素の遺伝子導入形質転換体に関して、構成要件ｉの（ａ）は、構成要素Ｉの（Ａ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを意味し、当該ＤＮＡは構成要素Ｉの（Ａ）を有する転写共役因子の遺伝子から通常の遺伝子工学的手法により調製すればよい。一方、構成要件ｉの（ｂ）は、構成要素Ｉの（Ｂ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを意味し、当該ＤＮＡは構成要素Ｉの（Ｂ）を有するアンドロゲンレセプターの遺伝子から通常の遺伝子工学的手法により調製すればよい。
構成要件ｉｉの（ｘ）は、構成要素ＩＩの（Ｘ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを意味し、当該ＤＮＡは構成要素ＩＩの（Ｘ）を有する転写調節因子の遺伝子から通常の遺伝子工学的手法により調製すればよい。一方、構成要件ｉｉの（ｙ）は、構成要素ＩＩの（Ｙ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを意味し、当該ＤＮＡは構成要素ＩＩの（Ｙ）を有する転写調節因子の遺伝子から通常の遺伝子工学的手法により調製すればよい。
構成要素ｉｉｉは、構成要素ＩＩの（Ｘ）が結合可能なＤＮＡと、構成要素ＩＩの（Ｙ）により活性化されうるプロモーターの下流に接続されたレポーター遺伝子のＤＮＡとを意味する。構成要素ＩＩの（Ｘ）結合可能なＤＮＡとしては、例えば、Ｇａｌ４蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（配列番号２）、Ｌｅｘ蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（配列番号３）、Ｌａｃ  Ｉ受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（配列番号４）、テトラサイクリン受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（配列番号５）、ＺＦＨＤ−１蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（配列番号６）等のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。また構成要素ＩＩの（Ｙ）により活性化されうるプロモーターとしては、具体的には、構成要素ＩＩの（Ｙ）がＧａｌ４蛋白質由来である場合には、例えば、酵母由来の最小ＴＡＴＡボックス配列があげられる。レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、成長ホルモン遺伝子等の通常のレポーターアッセイに用いられるレポーター遺伝子をあげることができ、宿主細胞における安定性が比較的高いレポーター蛋白質をコードする遺伝子であることが好ましい。
【００３０】
このような各構成要素が発現されるように適切に組み合わせながらベクターに挿入し、通常の遺伝子工学的手法を用いて同一の宿主細胞に導入することにより、当該形質転換体を作製することができる。例えば、構成要素ｉのうちのいずれか一方の構成要素（ａ又はｂ）と、構成要素ｉｉのうちのいずれか一方の構成要素（ｘ又はｙ）とを、その塩基配列の読み枠を合わせて連結させることによりキメラ遺伝子（キメラ遺伝子１）を作製する。また、構成要素ｉのうちの他方の構成要素（ｂ又はａ）と、構成要素ｉｉのうちの他方の構成要素（ｙ又はｘ）とを、その塩基配列の読み枠を合わせて連結させることによりキメラ遺伝子（キメラ遺伝子２）を作製する。これらキメラ遺伝子１及び２をそれぞれ宿主細胞内で機能可能なプロモーター、例えば、宿主細胞が出芽酵母細胞である場合には、GAL1プロモーターのような誘導型プロモーターや、ADHプロモーターのような恒常的に発現するプロモーター等の下流に接続された状態で同一の宿主細胞内に導入するとよい。構成要素ｉｉｉは、通常、「構成要素ｉｉの（ｘ）の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合領域が結合可能なＤＮＡ」の下流に「構成要素ｉｉの（ｙ）の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有する転写活性化領域により活性化されうるプロモーターの下流に接続されたレポーター遺伝子のＤＮＡ」が接続された状態で、上記の２種のキメラ遺伝子と同一の宿主細胞内に導入される。尚、宿主細胞が、利用可能な内在性のレポーター遺伝子を有する場合には、それを利用してもよく、この場合にはレポーター遺伝子の導入を省略することができる。
【００３１】
各構成要素の遺伝子導入形質転換体を作製するために使用される宿主細胞としては、例えば、出芽酵母Y190株(Clontech社製)等の出芽酵母細胞、HeLa細胞等の哺乳類動物細胞等があげられる。尚、アンドロゲンレセプターに対する被験物質のアンドロゲン活性調節能力を精度よく測定するためには、宿主細胞がアンドロゲンレセプター非内在性の細胞であることが好ましい。
尚、ツーハイブリッドシステムを調製するには、市販のキット、例えば、Matchmaker Two-hybrid System（Clontech社製）、CheckMate Mammalian Two-Hybrid System（Promega）等を利用してもよい。
【００３２】
当該方法では、形質転換体と被験物質とを、例えば、数時間から数日間接触させた後、具体的には、被験物質が添加された培地中で数時間から数日間培養した後、当該形質転換体が有する前記レポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する。当該形質転換体が産生するアンドロゲンレセプターが被験物質（アンドロゲン様活性物質）の結合により活性化された場合には、レポーター遺伝子の転写が促進され、当該レポーター遺伝子にコードされるレポータータンパク質が前記形質転換体の細胞内等に蓄積されるか若しくは培地中に分泌される。このレポータータンパク質の量又はその量と相関関係を有する指標値を測定することにより、当該形質転換体の細胞あたりのレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値を測定する。
具体的には、例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合には、被験物質を接触させた形質転換体から調製された細胞粗抽出物にルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを加えると、当該細胞粗抽出物中のルシフェラーゼ量に比例した強度で発光する。従って、この発光強度をルミノメーター等の測定装置で測定することにより、ルシフェラーゼ量、ひいては、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を知ることができる。同様にして、当該形質転換体と被験物質とを接触させない条件下におけるレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値を測定し、当該測定値と被験物質とを接触させた条件下におけるレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値とを比較することにより、被験物質が有するアンドロゲンレセプター活性発現調節能力（この場合には、アンドロゲンレセプターに対するアゴニスト活性）を評価することができる。一方、例えば、上記の形質転換体にジヒドロテストステロン（以下、ＤＨＴと記すこともある。）等のアンドロゲンを接触させた条件下、及び、当該アンドロゲンと被験物質とを同時に接触させた条件下の各々において、上記と同様な方法でレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値を測定する。形質転換体にアンドロゲンを接触させた条件下におけるレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値と比較して、アンドロゲンと被験物質とを接触させた条件下におけるレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値が低ければ、前記被験物質はアンドロゲン活性調節能力（この場合には、アンドロゲンレセプターに対するアンタゴニスト活性）を有すると評価することができる。
このような評価方法により評価されたアンドロゲンレセプター活性発現調節能力に基づいてネプリライシン活性発現制御物質を容易に選抜することが可能となり、さらに当該物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するネプリライシン活性発現制御剤を提供する。
【００３３】
次いで、アンドロゲンレセプターを用いたバインディングに関して説明する。
当該方法は、アンドロゲンレセプターに対する化学物質の結合能力の測定や結合量の定量のほか結合特異性、結合力の分析などが可能な試験方法である。例えば、前記のようにして本形質転換体から回収されたアンドロゲンレセプターに、標識されたリガンド（以下、標識リガンドと記す。）が予め結合しているところへ、被験物質を共存させると、被験物質と標識リガンドとの競合から、両者のアンドロゲンレセプターへの親和性に応じて、標識リガンドがアンドロゲンレセプターから遊離し、アンドロゲンレセプターに結合した標識リガンドの量が減少し、よってアンドロゲンレセプターに結合した標識量が減少する。従って、遊離型の標識リガンドの標識量又は結合型の標識リガンドの標識量をモニターすることにより、アンドロゲンレセプターと前記被験物質との結合状態を間接的に確認することができ、例えば、アンドロゲンレセプターに対する被験物質の結合能力の測定等が可能となる。
標識リガンドとしては、例えば、トリチウム標識されたＤＨＴ等を用いることができる。標識リガンドの結合型／遊離型の分離は、ヒドロキシアパタイト法やグリセロール密度勾配超遠心法等で行うことができる。反応系は大きく３群に分けられる。第一の群は、アンドロゲンレセプターに標識リガンドが結合しているところへ溶媒のみが添加される系であり、被験物質の添加濃度がゼロである系に相当する。当該系における結合型の標識リガンドの標識量は、標識リガンドのアンドロゲンレセプターに対する総結合量を示す。第二の群は、アンドロゲンレセプターに標識リガンドが結合しているところへ、例えば、標識されていないリガンドが、アンドロゲンレセプターを十分飽和し標識リガンドが結合できなくなるだけの添加濃度（例えば10μＭ）となるよう添加された系であり、当該系における結合型の標識リガンドの標識量は、標識リガンドのアンドロゲンレセプターに対する非特異的結合量と判断される。従って、アンドロゲンレセプターへの標識リガンドの特異的結合量は、総結合量から非特異的結合量を引いた値となる。第三の群は、アンドロゲンレセプターに標識リガンドが結合しているところへ、被験物質が、例えば、最終添加濃度10μＭ（この濃度は目的により任意に変更する。）となるよう添加された系である。被験物質がアンドロゲンレセプターへの結合能力を有する場合には、この系から得られる結合型の標識リガンドの標識量は、上記のようにして求めた被験物質の添加濃度がゼロの時のアンドロゲンレセプターへの標識リガンドの特異的結合量より小さくなる。このようにしてアンドロゲンレセプターと前記被験物質との結合状態を間接的に確認する。当該方法を行うことにより、アンドロゲンレセプターに対する被験物質の結合能力を調べることができ、被験物質が複数の物質を含む場合にはその中にアンドロゲンレセプターに親和性を示す物質が存在するかどうかを調べることもできる。さらに、アンドロゲンレセプターに対する被験物質の結合能力をより詳細に評価するには、例えば、前記の第三の群における被験物質の添加濃度を変えて同様にアンドロゲンレセプターバインディングアッセイを行えばよい。例えば、結合型の標識リガンドの標識量を測定し、得られた測定値に基づき、結合型のリガンド量と遊離型のリガンド量とを算出した後、得られた結果を、例えば、スキャッチャード解析することにより、被験物質とアンドロゲンレセプターとの結合親和性、結合特異性、結合容量等を評価することができる。
このようなアンドロゲンレセプターを用いたレポータージーンアッセイ、アンドロゲンレセプターを用いたツーハイブリッドアッセイ及びアンドロゲンレセプターを用いたバインディングアッセイ等は、ネプリライシン活性発現制御物質を容易に選抜することを可能とし、さらにネプリライシン活性発現制御剤の有効成分となる当該物質又はその薬学的に許容される塩を検索すること等に利用することができる。
【００３４】
ネプリライシン活性発現制御物質を探索するには、本発明検定方法により評価された物質が有するネプリライシン活性発現制御能力に基づき、ネプリライシン活性発現制御能力を有する物質を選抜すればよい（本発明探索方法）。
例えば、アンドロゲンレセプターアゴニストとしての評価に適する系の場合には、対照としてネガティブコントロールを用いた場合には、被験物質の物質が有するネプリライシン活性発現制御能力を評価するための指標となるアンドロゲンレセプター活性発現調節能力が、統計学的に有意な値を示す物質、具体的に好ましくは、例えば、当該対照を１００とした場合における被験物質におけるアンドロゲンレセプター活性発現調節能力が１３０％以上を示す物質、より好ましくは１５０％以上を示す物質を、物質が有するネプリライシン活性発現促進能力を有する物質として選抜する。一方、アンドロゲンレセプターアンタゴニストとしての評価に適する系の場合には、対照として物質が有するネプリライシン活性発現制御能力を有する物質（基準物質）を用いた場合には、測定（被験物質）値が対照（基準物質）値よりも低い値を示す物質を物質が有するネプリライシン活性発現抑制能力を有する物質として選抜する。尚、当該物質は、物質が有するネプリライシン活性発現制御能力を有する限り、低分子化合物、蛋白質又はペプチド等のいかなる物質であってもよい。
【００３５】
上記のように、アンドロゲンレセプターは、物質が有するネプリライシン活性発現制御能力を評価するための指標を提供する試薬として使用することができる。
【００３６】
本発明探索方法によって選抜された物質又はその薬学的に許容される塩は物質が有するネプリライシン活性発現制御能力を有しており、このような物質はネプリライシン活性発現制御剤の有効成分として使用してもよい。
【００３７】
ここで「薬学的に許容される塩」としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例アルカリ金属）等との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、或いは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が用いられる。
【００３８】
アンドロゲンレセプター活性発現制御能力を有する物質又はその薬学的に許容される塩を含有してなる組成物は、ネプリライシン活性発現制御剤として有用であり、その有効量を経口的又は非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。例えば、経口的に投与する場合には、本発明ネプリライシン活性発現制御剤は錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁液等の通常の形態で使用することができる。また、非経口的に投与する場合には、本発明ネプリライシン活性発現制御剤を溶液、乳剤、懸濁液等の通常の液剤の形態で使用することができる。前記形態の本発明ネプリライシン活性発現制御剤を非経口的に投与する方法としては、例えば注射する方法、坐剤の形で直腸に投与する方法等を挙げることができる。
前記の適当な投与剤型は許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等にアンドロゲンレセプター活性発現制御能力を有する物質又はその薬学的に許容される塩を配合することにより製造することができる。また注射剤型で用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明ネプリライシン活性発現制御剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常、経口の場合には成人（例えば、体重６０ｋｇとして）で１日あたり有効成分量として約０．０１ｍｇ〜約１ｇ、好ましくは有効成分量として約０.１〜１ｇ、さらに好ましくは有効成分量として約１．０〜２００ｍｇ、より好ましくは有効成分量として約１．０〜５０ｍｇ投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回又は数回に分けて投与することができる。また、非経口の場合には成人（例えば、体重６０ｋｇとして）で１日あたり有効成分量として約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与すればよい。他の哺乳動物の場合にも、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００３９】
本発明ネプリライシン活性発現制御剤の適用可能な疾患としては、例えば、アミロイドβタンパク質関連疾患（即ち、具体的には例えば、アルツハイマー病）等の疾患等をあげることができる。
因みに、アミロイドβタンパク質関連疾患とは、アミロイドβタンパク質が臓器や組織細胞の外に沈着してこれらの臓器や組織細胞の働きを阻害する病気であり、一般的にはアミロイドーシスとも呼ばれる。本発明では、アルツハイマー病もアミロイドβタンパク質関連疾患の一つとして含まれるものである（後述参照）。アミロイドーシスは、全身の様々な部分にアミロイド沈着が起こる「全身性アミロイドーシス」と一部の臓器のみに沈着が起こる「限局性アミロイドーシス」とが存在している。因みに、限局性アミロイドーシスとしては、例えば、アルツハイマー病、狂牛病（牛海綿状脳症、ＢＳＥ）や新型クロイツフェルト・ヤコブ病（vCJD）等を挙げることができる。全身性アミロイドーシスとしては、例えば、家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)等が挙げられる。他にも高齢で非遺伝的に発症する老人性アミロイドーシスや、透析患者の治療で使用する透析膜では除去できないタンパク質が変化したアミロイドが引き起こす透析アミロイドーシス、リウマチで発現するタンパク質が切れて出来るアミロイドによる二次性アミロイドーシス等を挙げることができる。
【００４０】
尚、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるＡβ４０、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるβ４２、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるβ４３等のアミロイドβタンパク質の量は、種々の方法によって測定することができるが、例えば、アミロイドβタンパク質特異的抗体を用いる免疫化学的方法を用いる方法を好ましく挙げることがことができる。当該方法には、免疫沈降法、ウエスタンブロッテイング、酵素免疫測定法、サンドイッチ型酵素免疫測定法又はそれらの組み合わせ方法が含まれる。アミロイドβタンパク質特異的抗体としては、ポリクローナル抗体を用いてもよいが、例えば、ＢＡＮ５０、ＢＮＴ７７、ＢＳ８５、ＢＡ２７、ＢＣ０５（Biochemistry, 34, 10272-10278, 1995）又は６Ｅ１０、４Ｇ８等のモノクローナル抗体を用いてもよい。とりわけ、ＢＡ２７及びＢＣ０５は、それぞれＡβ４０及びＡβ４２／４３に選択的な抗体であるため、これらの抗体又は同様な選択性を有する抗体を用いれば、Ａβ４０のタンパク質の量、Ａβ４２／４３のタンパク質の量、或いは、Ａβ４０及びＡβ４２／４３のいずれのタンパク質の量も測定することができる。そして、このような方法を用いることにより、本発明検定方法等を検証することも可能となる。
【００４１】
アルツハイマー病は、アミロイドβタンパク質（Ａβ）が脳内に蓄積されることを引き金に、細胞内タンパク質の蓄積や炎症反応、神経細胞の機能不全や変性等といった複雑な経路を経て、痴呆発症へと至る理解されている。優性遺伝する「家族性アルツハイマー病」は、アミロイドβタンパク質の合成・分泌が過度に行われることから発症し、その原因遺伝子も特定されている。しかしながら、全アルツハイマー病の殆どを占める「孤発性アルツハイマー病」では、アミロイドβタンパク質合成の上昇が認められないことから、当該タンパク質に係る分解酵素の活性発現低下が原因であると考えられている。そこでアミロイドβタンパク質に係る分解酵素としてネプリライシンが着目されており、ハーバード大学で作製したネプリライシンノックアウトマウスを用いて、脳内のアミロイドβタンパク質分解が詳細に調べられた。まず、放射性標識したアミロイドβタンパク質を脳内に投与し、その分解過程が高速液体クロマトグラフィーでモニターされた。また、非常に感度の高い酵素抗体法を用いて、内在性のアミロイドβタンパク質の量が測定された。当該実験の結果、放射性標識アミロイドβタンパク質分解がノックアウトマウスで顕著に減速することから、ネプリライシンが主要なアミロイドβタンパク質に係る分解酵素であることを明らかにされた。また、ネプリライシンノックアウトマウスにおいて、内在性のアミロイドβタンパク質の量が約２倍に上昇していることから、ネプリライシンが内在性のアミロイドβタンパク質の分解を担うことを示された。さらに、ネプリライシン遺伝子が半分だけ欠損しているヘテロのノックアウトマウスでも同様に分解を抑制していることが確認された。そしてアミロイドβタンパク質分解の抑制がネプリライシン遺伝子の発現産物量に負の相関関係を有していることが明らかにされている。
【００４２】
本発明は、勿論、（１）神経細胞に、ネプリライシンの活性発現を制御するために薬理学上有効な量のアンドロゲンレセプター活性発現制御能力を有する物質を接触させる工程を有することを特徴とするネプリライシン活性発現制御方法、（２）アンドロゲンレセプターとアンドロゲンレセプター活性発現制御能力を有する物質との結合を促進させる工程を有することを特徴とするネプリライシン活性発現制御方法、（３）前項（１）又は（２）記載のネプリライシン活性発現制御方法により、ネプリライシンの活性発現を制御する工程を有することを特徴とするアミロイドβタンパク質関連疾患を予防又は治療する方法等の発明も提供している。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００４４】
実施例１  （応答性レポーター遺伝子と選抜マーカー遺伝子とを含むプラスミドの作製）
プラスミドｐＭＳＧ（ファルマシア社製）を制限酵素Hind III及びSmaIで消化し、ＭＭＴＶ−ＬＴＲ由来のアンドロゲン応答配列を含む１４６３ｂｐのＤＮＡを取得した。得られたＤＮＡをBluntingキット（宝酒造社製）で処理してその末端を平滑化した。以下、得られたＤＮＡをARE ＤＮＡと記すこともある。
また、ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むプラスミドpGL３（プロメガ社製）を制限酵素Bgl II及びHind IIIで消化した後、当該消化物にBacterial alkaline phosphatase(BAP)を加えて６５℃で１時間保温し、さらにこれをBluntingキット（宝酒造社製）で処理してその末端を平滑化した。得られたＤＮＡを低融点アガロース（AgaroseL；ニッポンジーン社製）を用いた電気泳動に供し、バンド部分のゲルからＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡ約100ngと、上記ARE ＤＮＡ１μｇとを混合し、これにＴ４リガーゼを反応させた。得られた反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれが保有するプラスミドのＤＮＡを精製し、これらを制限酵素Kpn I及びClaIで消化した後、当該消化物をアガロースゲル電気泳動で分析した。得られた分析結果に基づいてプラスミドpGL3のBgl II部位とHind III部位との間にARE ＤＮＡが正しい方向で１コピー導入された構造を有するプラスミドを選択し、これをプラスミドpGL3−MMTVと名づけた。
次いで、プラスミドpUCSV-BSD（フナコシ社から購入）をBamHIで消化し、ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子発現カセットを含有するＤＮＡを調製した。調製されたＤＮＡと、上記プラスミドpGL3−MMTVをBamHIで消化しBAP処理して得られたＤＮＡとを混合して、Ｔ４リガーゼを反応させた。得られた反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれが保有するプラスミドのＤＮＡを精製し、これらを制限酵素Bam HIで消化した後、当該消化物をアガロースゲル電気泳動で分析した。得られた分析結果に基づいてブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子発現カセットがBam HIサイトに導入された構造を有するプラスミドを選択し、これをプラスミドpGL3-MMTV-BSDと名づけた。
【００４５】
実施例２  （アンドロゲンレセプター発現プラスミドの作製）
ヒト由来の標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するcＤＮＡを取得するために、配列番号１０で示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１１で示される塩基配列からなるリバースプライマーをＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ社製モデル３９４）を用いて合成した。
ヒトProstate cＤＮＡ １０ｎｇ（クロンテック社製クイッククローンcＤＮＡ no.７１２３−１）を鋳型にし、上記プライマーをそれぞれ１０pmol、LA-Taqポリメラーゼ（宝酒造社製）及び該酵素に添付されたバッファーを用いて、反応液量を５０μｌとした後ＰＣＲを行った。該ＰＣＲは、ＰＣＲsystem９７００（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、９５℃１分間次いで６８℃３分間の保温を１サイクルとしてこれを３５サイクルという条件で行われた。
ＰＣＲ後、反応液全量を低融点アガロース（アガロースL：ニッポンジーン）を用いたアガロースゲル電気泳動に供した。エチジウムブロマイド染色により、既知の塩基配列から予想される大きさのＤＮＡが増幅されていることを確認した後、該ＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡの一部とダイターミネーターシークエンスキットFS（アプライドバイオシステムズ社製）とを用いてダイレクトシークエンス用のサンプルを調製し、これを、オートシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製、モデル３７００）を用いた塩基配列解析に供した。その結果、回収されたＤＮＡは、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することが確認された。
上記のようにして回収されたＤＮＡ約１００nｇを鋳型にして、配列番号１２で示される塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号１３で示される塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、コザックのコンセンサス配列の直後にヒト標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列が連結されてなる構造を有するＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。即ち、鋳型とするＤＮＡ ０．１μｇを鋳型とし、上記プライマー各１０pmol 、LA-Taq ポリメラーゼ（宝酒造社製）及び該酵素に添付された反応バッファーを用いて、反応液量を５０μｌとした後にＰＣＲを行った。該ＰＣＲは、ＰＣＲsystem９７００（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、９５℃１分間次いで６８℃にて３分間の保温を１サイクルとしてこれを２０サイクルという条件で行われた。ＰＣＲ後、反応液全量を低融点アガロースゲルを用いた電気泳動法に供することにより分離回収した。回収されたＤＮＡの約１μｇを、ＤＮＡ bluntingキット（宝酒造社製）で処理してその末端を平滑化した後、これに次いでＴ４ポリヌクレオチドカイネースを反応させることにより、その末端をリン酸化した。得られたＤＮＡをフェノール処理した後、さらにエタノール沈殿により精製した。精製されたＤＮＡの全量を以下の発現プラスミド作製用のインサートＤＮＡとして用いた。
プラスミドpRc/RSV（Invitrogen社製）を制限酵素Hind IIIで消化した後、当該消化物にBAPを加えて６５℃で１時間保温した。保温後の混合物をフェノール処理した後、さらにエタノール沈殿により精製した。精製されたＤＮＡをBluntingキット（宝酒造社製）で処理してその末端を平滑化した後、これを低融点アガロース(ニッポンジーン社製；アガロースL)を用いた電気泳動に供し、バンド部分のゲルからＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡ約100 ngと、上記インサートＤＮＡ全量とを混合し、これにＴ４ リガーゼを添加して反応させた。得られた反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれが保有するプラスミドのＤＮＡを調製し、調製されたＤＮＡの塩基配列をABIモデル３７００型オートシークエンサーを用いてダイターミネーター法で決定した。決定された塩基配列と、前述のダイレクトシークエンスで得られた塩基配列とを比較して、翻訳領域の塩基配列が完全に一致していることが確認されたプラスミドを選択し、これをpRc/RSV-hARコザックと名づけた。
【００４６】
実施例３  （レポータージーンアッセイ法による被験物質のアンドロゲンレセプターアゴニスト活性の測定）
アンドロゲンアゴニスト活性を有する化合物を、アンドロゲンレセプター活性発現調節能力の測定用細胞を用いたレポータージーンアッセイ法により同定した。
ヒト由来のＨｅＬａ細胞に、マウスパピローマウイルスのAREの下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子が接続された塩基配列を有するプラスミドpGL3-MMTV-BSDのＤＮＡ（実施例１参照）及びプラスミドpRC/RSV-hARコザックのＤＮＡ（実施例２参照）を導入して作製された細胞を、フェノールレッドフリーのＭＥＭ培地（日水製薬社製）にチャコールデキストラン処理済みＦＢＳが終濃度１０％となるよう加えられた培地を用いて、ルシフェラーゼ発光測定用兼培養用９６穴プレート（コーニングコースター社製＃３９０３）に約２×１０4細胞／穴ずつ播種した後、これを一晩培養した。培養後、該細胞に、ＤＭＳＯに溶解させたＤＨＴ（即ち、アンドロゲンレセプターアゴニスト）を添加した。尚、ＤＨＴの終濃度が試験区毎に10倍ずつ高くなるように、また、全ての試験区の培養液中の最終ＤＭＳＯ量が０．１％に揃うように溶解液を調製し添加した。ＤＨＴが添加されていない系として、溶媒（ＤＭＳＯ）のみを加えた対照区を設けた。
これらの細胞を培養し、ＤＨＴ添加から３６時間後に培地を除き、ＰＢＳ（−）で２回細胞を洗浄した後、５倍に希釈したＰＧＣ５０（東洋インキ社製）を２０μｌずつ加えて室温に３０分間放置した。このプレートを、酵素基質自動インジェクター付きルミノメーターＬＢ９６Ｐ（ベルトールド製）にセットし、５０μｌの基質液ＰＧＬ１００（東洋インキ製）を自動分注した後、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を図１に示した。
アンドロゲンレセプター活性調節能力の測定用細胞において、細胞に添加されたＤＨＴ濃度の増加に伴うルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。
上記方法と同様にして、ＤＨＴに代えて被験物質を各試験区に添加して試験することにより、アンドロゲンレセプターに対する被験物質のアゴニスト活性を測定できる。その結果を図２及び図３に示す。
被験物質Ａ及び被験物質Ｂは、アンドロゲンレセプター転写活性調節能力の測定用細胞において、細胞に添加された被験物質の濃度の増加に伴うルシフェラーゼ活性の上昇が認められる。つまり、被験物質Ａ及び被験物質Ｂには、いずれもアンドロゲンレセプター転写活性調節能力が認められることから、当該被験物質にはネプリライシン活性発現制御能力が存在すると評価できる。これらの被験物質は、アミロイドβタンパク質関連疾患を予防又は治療するための薬剤（即ち、具体的には例えば、アルツハイマー病の治療剤又は予防剤）として利用することができ、前記疾患の治療又は予防が可能となる。
尚、当該実施例（後述の実施例も含めて）において記載されている被験物質Ａ及び被験物質Ｂは実際に存在する有機合成化合物であり、当該化合物を用いた試験も実際に実施されているが、その構造が現時点では必ずしも確定できていないために、実施例中では現在形による表現に基づきその試験結果を記載している。
【００４７】
実施例４  （各種のステロイドホルモンレセプター活性発現調節能力を有する物質による、海馬初代培養細胞におけるネプリライシン遺伝子の発現量の変動）
ＳＤ系ラット１８日齢胎仔より無菌的に取り出した全脳から海馬を切り分けた後、当該海馬をメスを用いて細切した後、０.２５％ トリプシン及び０.００２％ ＤＮase Iを含むリン酸緩衝生理食塩水中で３７℃、２０分間インキュベートすることにより酵素処理した。牛胎児血清を添加することにより酵素反応を停止させた後、プラスチック製チップを付けたピペットで細胞液を吸い上げて吐き出す操作を３回繰り返すことにより細胞を分散させた。消化されなかった組織片を除くために、得られた細胞分散液をレンズペーパーが２枚重ねされたフィルターを用いてろ過した後、当該ろ液を１０００rpmで５分間遠心した。回収された細胞を、イーグル最小必須培地（EMEM、ギブコＢＲＬ社製）を用いて洗浄した後、これを１０％牛胎児血清を含むＥＭＥＭ培地を入れたポリＬリジン（Sigma社）でコーティングされた４８ウエルプレート（イワキグラス社製）に１×１０５細胞／ウェルの割合で播き込み、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。培養後、培地全量を２％Ｂ２７添加ニューロベーサル(Neurobasal)培地（ギブコＢＲＬ社製）に交換し、さらに３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養を継続した。この間、培地は３乃至４日間後に交換された。培養７乃至８日間後、培地全量をニューロベーサル(Neurobasal)培地に交換し、１×１０5細胞／ｃｍ２の割合で播き込んだ。
このようにして得られた培養細胞に、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯに溶解させたＤＨＴ、ＤＭＳＯに溶解させたＤＨＴ、ＤＭＳＯに溶解させたプロゲステロン、ＤＭＳＯに溶解させたデキサメタソン、又は、ＤＭＳＯに溶解させたアルドステロンを添加した。これら細胞を培養し、ＤＭＳＯ、当該ＤＨＴ、当該ＤＨＴ、当該プロゲステロン、当該デキサメタソン又は当該アルドステロン添加から２４時間後に、RNeasy Mini Kit ( QIAGEN社製 ) を用いてＲＮＡを調製した。調製されたＲＮＡの純度を2100 Bioanalyzer ( Agilent社製 ) でRNA 6000 Nano Reagent & Supplies ( Agilent社製 )を用いて確認した後、当該ＲＮＡ(1μg/20μl) をSuper ScriptII RNaseH−Reverse Transriptaseを用いて逆転写反応に供した。当該反応後に抽出されたＲＮＡは使用するまで−80℃で保存された。
総ＲＮＡ １μg、オリゴ（dT）15プライマー（15μg/ml）1μl、dNTP Mixture 2.5mM each 1μl 及びddH2Oの混合物（全量12 μl）を65℃で5分間加熱した。次に、当該混合物を氷中に入れて、５×逆転写酵素緩衝液（250 mMトリス塩酸、pH 8.3、375 mM KCl、15 mM MgCl２）4μl、RNasin Plus RNase Inhibitor 40ｕ/μl ( Promega社製 ) 1μl及び0.1 Mジチオスレイトール2μl を混合した後、 42℃で2分間加熱した。加熱後、当該混合物にSuper Script II RTを1μl混合し、これを42℃で50分間加熱した後、さらに70℃で15分間加熱し、これを4℃に冷却した。このようにして得られるcＤＮＡは使用するまで−20℃で保存された。
配列番号１４で示されるオリゴヌクレオチド及び配列番号１５で示されるオリゴヌクレオチドを用いてラットネプリライシン遺伝子のＲＴ−ＰＣＲを行った。
ＲＴ−ＰＣＲの反応条件を下記に示した。
ラットネプリライシン遺伝子のＲＴ−ＰＣＲの場合：1 cycle (95℃,5min), 38 cycles (95℃,30sec, 55℃,1min, 72℃,1min), 1 cycle (72℃,7min, 4℃)
当該ＤＮＡをローディング緩衝液と混合した後、これを２％アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供した。電気泳動後、ＤＮＡをエチジウムブロマイド染色した。その結果を図４に示した。ＤＭＳＯに溶解させたＤＨＴ(100pM)が処理された系でのネプリライシン遺伝子の発現量のみが顕著に増加することが確認された。
【００４８】
実施例５  （アンドロゲンレセプター遺伝子の発現量及びネプリライシン遺伝子の発現量に基づいた神経培養細胞株の選択）
神経培養細胞（ヒトNeuroblastoma CHP212（以下、CHP212細胞と記すこともある。）、ヒトNeuroblastoma IMR32（以下、IMR32細胞と記すこともある。）、ラットPC12細胞（以下、PC12細胞と記すこともある。））を、フェノールレッドfree DＭＥＭ培地（日水製薬社製）にチャコールデキストラン処理済みＦＢＳが終濃度10％となるよう加えらた培地を用いて、6穴プレート（Falcon社）に約２ｘ１０5細胞／穴ずつ播種した後、これを一晩培養した。２４時間培養後、total RNAをMicro-To-Midi Total RNA Purification (Invitrogen社)を用いて抽出し、抽出されたtotal RNA(1μg/20μl)をReady-To-Go You-Prime First-Strand Beads (Amersham Biosciences社) を用いて逆転写反応を供した。
配列番号１６で示されるオリゴヌクレオチド及び配列番号１７で示されるオリゴヌクレオチドを用いてヒトネプリライシン遺伝子のＲＴ−ＰＣＲを行った。
配列番号１４で示されるオリゴヌクレオチド及び配列番号１５で示されるオリゴヌクレオチドを用いてラットネプリライシン遺伝子のＲＴ−ＰＣＲを行った。
配列番号１８で示されるオリゴヌクレオチド及び配列番号１９で示されるオリゴヌクレオチドを用いてヒト及びラットアンドロゲンレセプター遺伝子のＲＴ−ＰＣＲを行った。
各ＲＴ−ＰＣＲの反応条件を下記に示した。
（１）ヒト及びラットネプリライシン遺伝子のＲＴ−ＰＣＲの場合：1 cycle (95℃,5min), 38 cycles (95℃,30sec, 55℃,1min, 72℃,1min), 1 cycle (72℃,7min, 4℃)
（２）ヒト及びラットアンドロゲンレセプター遺伝子のＲＴ−ＰＣＲの場合：1 cycle (95℃,5min), 40 cycles (95℃,30sec, 57℃,1min, 72℃,45sec), 1 cycle (72℃,7min, 4℃)
該ＤＮＡをローディング緩衝液と混合した後に２％アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供した後、ＤＮＡをエチジウムブロマイド染色した。その結果を図５に示した。
CHP212細胞及びIMR32細胞の場合には、ヒトネプリライシン遺伝子の発現及びヒトアンドロゲンレセプター遺伝子の発現が認められたが、一方、PC12細胞の場合には、ラットネプリライシン遺伝子の発現及びラットアンドロゲンレセプター遺伝子の発現が認められなかった。尚、CHP212細胞の場合は、IMR32細胞の場合に比較してネプリライシン遺伝子の発現量及びアンドロゲンレセプター遺伝子の発現量が高かった。
【００４９】
実施例６  （アンドロゲンレセプター活性発現調節能力を有する被験物質による神経培養細胞におけるネプリライシン遺伝子の発現量の変動：ＲＴ−ＰＣＲ（Taqman）によるネプリライシンmRNAの定量）
IMR32細胞の場合には１％チャコールFBSフェノールレッドfree DMEM培地 ( 日水製薬社製 ) を、またCHP212細胞の場合には１％チャコールFBSフェノールレッドfree RPMI Medium 1640 ( GIBCO社製 )を用いて、 どちらの場合にも６穴プレート（Falcon社）に約２ｘ１０5細胞／穴ずつ播種した後、これを一晩培養した。培養後、該細胞に、ＤＭＳＯ又はＤＭＳＯに溶解させたＤＨＴを添加した。これら細胞を培養し、ＤＭＳＯ又は当該ＤＨＴの添加から、IMR32細胞の場合には４８時間後、またCHP212細胞の場合には２４時間後に、RNeasy Mini Kit ( QIAGEN社製 ) を用いてRNAを調製した。調製されたＲＮＡの純度を2100 Bioanalyzer ( Agilent社製 ) でRNA 6000 Nano Reagent & Supplies ( Agilent社製 )を用いて確認した後、当該ＲＮＡ(1μg/20μl) をSuper ScriptII RNaseH−Reverse Transriptaseを用いて逆転写反応に供した。当該反応後に抽出されたＲＮＡは使用するまで−80℃で保存された。
総ＲＮＡ １ μg、オリゴ（dT）15プライマー（15μg/ml）1μl、dNTP Mixture 2.5mM each 1μl 及びddH2Oの混合物（全量12 μl）を65℃で5分間加熱した。次に、当該混合物を氷中に入れて、５×逆転写酵素緩衝液（250 mMトリス塩酸、pH 8.3、375 mM KCl、15 mM MgCl２）4μl、RNasin Plus RNase Inhibitor 40u /μl ( Promega社製 ) 1μl及び0.1 Mジチオスレイトール2μl を混合した後、 42℃で2分間加熱した。加熱後、当該混合物にSuper Script II RTを1μl混合し、これを42℃で50分間加熱した後、さらに70℃で15分間加熱し、これを4℃に冷却した。このようにして得られるcＤＮＡは使用するまで−20℃で保存された。
TaqMan プローブ及びTaqMan MGBプローブを用いたリアルタイムＰＣＲは、Human GAPDH ( Applied Biosystems社製 cat.no4310884E ) プライマー&プローブセットを内部対照として用いて、加えたcＤＮＡの量を標準化した。ヒトネプリライシンのプライマー&プローブセットはApplied Biosystems社のAssay-on-Demand（product,No Hs00153510 ）を使用した。定量的ＰＣＲは、2×TaqMan Universal ＰＣＲ Master Mix (Applied Biosystems)12.5μl、ddH2O 9.25μl、20×プライマー&プローブセット1.25μl及び鋳型cＤＮＡ 2μlからなる成分を総反応容量25μlとした後に行われた。該定量的ＰＣＲは、Applied Biosystems社 ABI PRISM 7900HT 及びOptical 96-Well Reaction Plateを用いて行われた。ＰＣＲは、（１）50℃で２分、（２）95℃で10分、（３）95で15秒、（４）60℃で60秒、からなるサイクルを40サイクルという条件で行われた。
ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを蛍光強度に基づいて定量的に検出した他に、該ＤＮＡをローディング緩衝液と混合した後に３％アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供した後、ＤＮＡをエチジウムブロマイド染色した。その結果を図６（IMR32細胞、1.29）及び図７（CHP212細胞、2.49）に示した。
【００５０】
実施例７  （アンドロゲンレセプター活性発現調節能力を有する物質による、神経培養細胞におけるネプリライシン活性発現量の変動測定）
ネプリライシン活性発現量の測定は、H.J.Vincentら、Cytokine 10 : 55-65 (1998)に記載された方法に従って行った。
具体的には、培養神経細胞(ヒトNeuroblastoma CHP212)をフェノールレッドfree DＭＥＭ培地（日水製薬社製）にチャコールデキストラン処理済みＦＢＳが終濃度１％となるよう加えられた培地を用いて、６穴プレート（Falcon社）に約２ｘ１０5細胞／穴ずつ播種した後、これを一晩培養した。培養後、該細胞にＤＭＳＯ又はＤＭＳＯに溶解させたＤＨＴを添加した。また同様にして被験物質Ｂ（即ち、実施例３により、アンドロゲンレセプター転写活性調節能力が認められることから、当該被験物質にはネプリライシン活性発現制御能力が存在すると評価できる物質である。）を添加する。これら細胞を培養し、ＤＭＳＯ又は当該ＤＨＴ添加から４８時間後に、50 mM Tris-HCl（pH7.4）液で６穴プレートを洗浄した。当該文献に記載される方法に準じて、600μlのネプリライシン基質（N-dansyl-D-alanyl-glycil-p-nitro-phenylalanyl-glycine; DAGNPG、25μM in Tris-HCl、Sigma社）をそれぞれのウェルに加えた後、37℃で２時間保温した。保温後、反応液500μlをチューブに移し、これに500μのDMSO液を加えた後、当該混合物を15000 rpmにて5分遠心した。遠心後、得られた上清の蛍光強度を329nm excitation, 531nm emissionという条件にて測定した。その結果を図８に示した。また同様にして被験物質Ｂが添加された系での結果も図８に併せて示す。
ＤＨＴ又は被験物質Ｂが添加された神経培養細胞におけるネプリライシン活性発現量は、ＤＭＳＯのみが処理された系での活性発現量に対する％で示された結果を図８に示した。ＤＨＴが処理された系でのネプリライシン活性発現量は顕著に増加することが確認された。また被験物質Ｂが処理された系でのネプリライシン活性発現量も顕著に増加することが確認される。
【００５１】
実施例８  （アンドロゲンレセプター以外の各種のステロイドホルモンレセプター活性発現調節能力を有する物質による、神経培養細胞におけるネプリライシン活性発現量の変動測定）
ネプリライシン活性発現量の測定は、H.J.Vincentら、Cytokine 10 : 55-65 (1998)に記載された方法に従って行った。
具体的には、培養神経細胞(ヒトNeuroblastoma CHP212)をフェノールレッドfree DＭＥＭ培地（日水製薬社製）にチャコールデキストラン処理済みＦＢＳが終濃度１％となるよう加えられた培地を用いて、６穴プレート（Falcon社）に約２ｘ１０5細胞／穴ずつ播種した後、これを一晩培養した。培養後、該細胞にＤＭＳＯ、ＤＭＳＯに溶解させたＤＨＴ、ＤＭＳＯに溶解させたＤＨＴ及びＨＦＴ（当該物質は、アンドロゲンレセプターアンタゴニストである。）、ＤＭＳＯに溶解させたプロゲステロン、ＤＭＳＯに溶解させたデキサメタソン、又は、ＤＭＳＯに溶解させたアルドステロンを添加した。これら細胞を培養し、ＤＭＳＯ、当該ＤＨＴ、当該ＤＨＴ＆ＨＦＴ、当該プロゲステロン、当該デキサメタソン又は当該アルドステロン添加から４８時間後に、50 mM Tris-HCl（pH7.4）液で６穴プレートを洗浄した。当該文献に記載される方法に準じて、600μlのネプリライシン基質（N-dansyl-D-alanyl-glycil-p-nitro-phenylalanyl-glycine; DAGNPG、25μM in Tris-HCl、Sigma社）をそれぞれのウェルに加えた後、37℃で２時間保温した。保温後、反応液500μlをチューブに移し、これに500μのDMSO液を加えた後、当該混合物を15000 rpmにて5分遠心した。遠心後、得られた上清の蛍光強度を329nm excitation, 531nm emissionという条件にて測定した。その結果を図９に示した。
前記ＤＨＴ、前記ＤＨＴ＆ＨＦＴ、前記プロゲステロン、前記デキサメタソン又は前記アルドステロンが添加された神経培養細胞におけるネプリライシン活性発現量は、ＤＭＳＯのみが処理された系での活性発現量に対する％で示された結果を図９に示した。ＤＨＴが処理された系でのネプリライシン活性発現量（346％）のみが顕著に増加することが確認された。因みに、プロゲステロン、デキサメタソン又はアルドステロンが処理された系でのネプリライシン活性発現量は、123％、116％、142％であった。一方、ＤＨＴ＆ＨＦＴが処理された系でのネプリライシン活性発現量（86％）は、アンタゴニストの存在によって、逆に減少することも確認された。
【００５２】
実施例９  （ＤＨＴによる、神経培養細胞におけるアミロイドβタンパク質分泌量の変動測定）
培養神経細胞(ヒトNeuroblastoma CHP212)を、フェノールレッドfree DＭＥＭ培地（日水製薬社製）にチャコールデキストラン処理済みＦＢＳが終濃度１％となるよう加えられた培地を用いて、６穴プレート（Falcon社）に約２ｘ１０5細胞／穴ずつ播種した後、一晩培養した。培養後、該細胞に、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯに溶解させたＤＨＴ又はＤＭＳＯに溶解させたＤＨＴ及びＨＦＴ（当該物質は、アンドロゲンレセプターアンタゴニストである。）を添加した。これら細胞を培養し、ＤＭＳＯ、前記ＤＨＴ又は前記ＤＨＴ＆ＨＦＴ添加から７２時間後に、さらにプロテアーゼインヒビター(p1860,Sigma社)をそれぞれのウェルに加えた後、培養液中のアミロイドβ42ペプチド量をELISA法（Human Amyloidβ1-42測定キットCode.No.17711,免疫生物研究所）にて測定した。その結果を図１０に示した。
ＤＨＴ又はＤＨＴ＆ＨＦＴが添加された神経培養細胞におけるアミロイドβタンパク質分泌量は、ＤＭＳＯのみが処理された系での分泌量に対する％で示された結果を図１０に示した。ＤＨＴが処理された系でのアミロイドβタンパク質分泌量（49.0pg/ml, 59.6%）は顕著に減少することが確認された。一方、ＤＨＴ＆ＨＦＴが処理された系でのアミロイドβタンパク質分泌量（74.7pg/ml, 91.1%）は、アンタゴニストの存在によって、逆に減少が認められ無くなることが確認された。
【００５３】
実施例１０  （アンドロゲンレセプター活性発現調節能力を有する物質による、神経培養細胞におけるアミロイドβタンパク質分泌量の変動測定）
培養神経細胞(ヒトNeuroblastoma CHP212)を、フェノールレッドfree DＭＥＭ培地（日水製薬社製）にチャコールデキストラン処理済みＦＢＳが終濃度１％となるよう加えられた培地を用いて、６穴プレート（Falcon社）に約２ｘ１０5細胞／穴ずつ播種した後、一晩培養した。培養後、該細胞に、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯに溶解させたＤＨＴ、ＤＭＳＯに溶解させた被験物質Ａ（即ち、実施例３により、アンドロゲンレセプター転写活性調節能力が認められることから、当該被験物質にはネプリライシン活性発現制御能力が存在すると評価できる物質である。）又はＤＭＳＯに溶解させた被験物質Ｂ（即ち、実施例３により、アンドロゲンレセプター転写活性調節能力が認められることから、当該被験物質にはネプリライシン活性発現制御能力が存在すると評価できる物質である。）を添加した。これら細胞を培養し、ＤＭＳＯ、前記ＤＨＴ、前記被験物質Ａ又は前記被験物質Ｂ添加から７２時間後に、さらにプロテアーゼインヒビター(p1860,Sigma社)をそれぞれのウェルに加えた後、培養液中のアミロイドβ42ペプチド量をELISA法（Human Amyloidβ1-42測定キットCode.No.17711,免疫生物研究所）にて測定した。その結果を図１１に示した。
ＤＨＴ、被験物質Ａ又は被験物質Ｂが添加された神経培養細胞におけるアミロイドβタンパク質分泌量は、ＤＭＳＯのみが処理された系での分泌量に対する％で示された結果を図１１に示した。ＤＨＴが処理された系でのアミロイドβタンパク質分泌量（48.0pg/ml, 53.2%）は顕著に減少することが確認された。また被験物質Ａ又は被験物質Ｂが処理された系でのアミロイドβタンパク質分泌量（Ａ：56.0pg/ml, 62.1%、Ｂ：62.2pg/ml, 69.0%）も顕著に増加することが確認される。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明により、物質が有するネプリライシン活性発現制御能力を有する物質を探索するために簡便であり、かつ、効果的である、物質が有するネプリライシン活性発現制御能力の検定方法等が提供可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、プラスミドpGL3-MMTV-BSDのＤＮＡ及びプラスミドpRC/RSV-hARコザックのＤＮＡを導入して作製された細胞を用いたレポータージーンアッセイ法によって、ＤＨＴ（アンドロゲンアゴニスト活性を有する化合物）のアンドロゲンレセプター活性調節能力を測定した結果を示した図である。  図中のカラムは左から順に、ＤＨＴの溶媒に用いたＤＭＳＯのみが添加された区（DMSO）、終濃度1pMとなるようにＤＨＴが添加された区（1pM DHT）、終濃度1０pMとなるようにＤＨＴが添加された区（10pM DHT）、終濃度100pMとなるようにＤＨＴが添加された区（100pM DHT）、終濃度1nMとなるようにＤＨＴが添加された区（1nM DHT）、終濃度10nMとなるようにＤＨＴが添加された区（10nM DHT）、終濃度100nMとなるようにＤＨＴが添加された区（100nM DHT）、終濃度1μMとなるようにＤＨＴが添加された区、での測定結果を示している。
【図２】図２は、プラスミドpGL3-MMTV-BSDのＤＮＡ及びプラスミドpRC/RSV-hARコザックのＤＮＡを導入して作製された細胞を用いたレポータージーンアッセイ法によって、被験物質Ａ（アンドロゲンアゴニスト活性を有する化合物）のアンドロゲンレセプター活性調節能力を測定した結果を示した図である。  図中のカラムは左から順に、被験物質Ａの溶媒に用いたＤＭＳＯのみが添加された区（DMSO）、終濃度10nMとなるように被験物質Ａが添加された区（10nM 被験物質Ａ）、終濃度100nMとなるように被験物質Ａが添加された区（100nM 被験物質Ａ）、終濃度1μMとなるように被験物質Ａが添加された区（1μM 被験物質Ａ）、終濃度10μMとなるように被験物質Ａが添加された区（10μM 被験物質Ａ）、終濃度50μMとなるように被験物質Ａが添加された区（50μM 被験物質Ａ）、終濃度100μMとなるように被験物質Ａが添加された区（100μM 被験物質Ａ）、での測定結果を示している。
【図３】図３は、プラスミドpGL3-MMTV-BSDのＤＮＡ及びプラスミドpRC/RSV-hARコザックのＤＮＡを導入して作製された細胞を用いたレポータージーンアッセイ法によって、被験物質Ｂ（アンドロゲンアゴニスト活性を有する化合物）のアンドロゲンレセプター活性調節能力を測定した結果を示した図である。  図中のカラムは左から順に、被験物質Ｂの溶媒に用いたＤＭＳＯのみが添加された区（DMSO）、終濃度1nMとなるように被験物質Ｂが添加された区（1nM 被験物質Ｂ）、終濃度1０nMとなるように被験物質Ｂが添加された区（10nM 被験物質Ｂ）、終濃度100nMとなるように被験物質Ｂが添加された区（100nM 被験物質Ｂ）、終濃度1μMとなるように被験物質Ｂが添加された区（1μM 被験物質Ｂ）、終濃度10μMとなるように被験物質Ｂが添加された区（10μM 被験物質Ｂ）、終濃度50μMとなるように被験物質Ｂが添加された区（50μM 被験物質Ｂ）、での測定結果を示している。
【図４】図４は、各種のステロイドホルモンレセプター活性発現調節能力を有する物質による、海馬初代培養細胞におけるネプリライシン遺伝子の発現量の変動をＲＴ−ＰＣＲ法により比較した結果を示した図である。  図中のレーンは左から順に、１）ＤＭＳＯのみが添加された区、２）ＤＨＴが添加された区、３）プロゲステロンが添加された区、４）デキサメタソンが添加された区、５）アルドステロンが添加された区、におけるネプリライシン遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示している。レーン２におけるＤＮＡ量のみが顕著に増加することが確認される。
【図５】図５は、神経培養細胞株（CHP212細胞、IMR32細胞、PC12細胞）におけるアンドロゲンレセプター遺伝子の発現量及びネプリライシン遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲ法により比較した結果を示した図である。  図中のレーンは左から順に、CHP212細胞、IMR32細胞、PC12細胞におけるネプリライシン遺伝子（ＮＥＰ）のＲＴ−ＰＣＲの増幅産物、CHP212細胞、IMR32細胞、PC12細胞におけるアンドロゲンレセプター遺伝子（ＡＲ）のＲＴ−ＰＣＲの増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示している。
【図６】図６は、ＤＨＴ（アンドロゲンアゴニスト活性を有する化合物）による神経培養細胞（IMR32細胞）におけるネプリライシン遺伝子の発現量の変動（ＲＴ−ＰＣＲ（Taqman）によるネプリライシンmRNAの定量）を示した図である。  図中のカラムは左から順に、ＤＭＳＯのみが添加された区、ＤＨＴが添加された区、での測定結果を示している。
【図７】図７は、ＤＨＴ（アンドロゲンアゴニスト活性を有する化合物）による神経培養細胞（CHP212細胞）におけるネプリライシン遺伝子の発現量の変動（ＲＴ−ＰＣＲ（Taqman）によるネプリライシンmRNAの定量）を示した図である。  図中のカラムは左から順に、ＤＭＳＯのみが添加された区、ＤＨＴが添加された区、での測定結果を示している。
【図８】図８は、アンドロゲンレセプター活性発現調節能力を有する物質による、神経培養細胞（CHP212細胞）におけるネプリライシン活性発現量の変動測定結果を示した図である。  図中のカラムは左から順に、ＤＨＴが添加された区、被験物質Ｂが添加された区、での測定結果を示している。
【図９】図９は、アンドロゲンレセプター以外の各種のステロイドホルモンレセプター活性発現調節能力を有する物質による、神経培養細胞（CHP212細胞）におけるネプリライシン活性発現量の変動測定結果を示した図である。  図中のカラムは左から順に、ＤＨＴが添加された区、ＤＨＴ及びＨＦＴが添加された区、プロゲステロンが添加された区、デキサメタソンが添加された区、アルドステロンが添加された区、での測定結果を示している。
【図１０】図１０は、ＤＨＴによる、神経培養細胞（CHP212細胞）におけるアミロイドβタンパク質（Ａβ４２）分泌量の変動測定結果を示した図である。  図中のカラムは左から順に、ＤＭＳＯのみが添加された区、ＤＨＴ及びＨＦＴが添加された区、ＤＨＴが添加された区、での測定結果を示している。
【図１１】図１１は、アンドロゲンレセプター活性発現調節能力を有する物質による、神経培養細胞（CHP212細胞）におけるアミロイドβタンパク質（Ａβ４２）分泌量の変動測定結果を示した図である。  図中のカラムは左から順に、ＤＭＳＯのみが添加された区、ＤＨＴが添加された区、被験物質Ａが添加された区、被験物質Ｂが添加された区、での測定結果を示している。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列番号２
蛋白質が結合し得るDNA領域のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３
蛋白質が結合し得るDNA領域のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４
蛋白質が結合し得るDNA領域のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５
蛋白質が結合し得るDNA領域のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６
蛋白質が結合し得るDNA領域のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１４
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１５
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【図１】
2005245201.tif 000002
【図２】
2005245201.tif 000003
【図３】
2005245201.tif 000004
【図４】
2005245201.tif 000005
【図５】
2005245201.tif 000006
【図６】
2005245201.tif 000007
【図７】
2005245201.tif 000008
【図８】
2005245201.tif 000009
【図９】
2005245201.tif 000010
【図１０】
2005245201.tif 000011
【図１１】
2005245201.tif 000012
【配列表】
2005245201000001.app