(57)【要約】【課題】  従来の方法より短時間かつ網羅的にタンパク質の機能改変をスクリーニングすることが可能なタンパク質の機能改変スクリーニング方法および当該スクリーニング方法を実施するためのキットを提供する。【解決手段】  変異導入遺伝子に基づくタンパク質合成にコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いること。遺伝子への変異導入および転写鋳型ＤＮＡの作製にＰＣＲ法を用いること。さらに、遺伝子への変異導入と転写鋳型ＤＮＡの作製とを一連の工程として行うことにより、ハイスループット化を実現できる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能を改変するために人為的に導入した変異を有するタンパク質のスクリーニング方法であって、
目的のタンパク質をコードする遺伝子に少なくとも１以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されるように変異を導入する変異導入工程と、
得られた変異遺伝子に基づいてコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて変異タンパク質を合成するタンパク質合成工程と、
得られたタンパク質の機能をスクリーニングするスクリーニング工程とからなるタンパク質の機能改変スクリーニング方法。
【請求項２】
上記タンパク質合成工程は、in vitro 転写によりｍＲＮＡを合成するための鋳型ＤＮＡを作製する転写鋳型ＤＮＡ作製工程と、
得られた転写鋳型ＤＮＡに基づいてin vitro 転写によりｍＲＮＡを合成するｍＲＮＡ合成工程と、
得られたｍＲＮＡに基づいてコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いてタンパク質に翻訳する翻訳工程とからなることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の機能改変スクリーニング方法。
【請求項３】
上記変異導入工程において、ＰＣＲ法を用いることを特徴とする請求項１または２に記載のタンパク質の機能改変スクリーニング方法。
【請求項４】
上記タンパク質合成工程の転写鋳型ＤＮＡ作製工程において、ＰＣＲ法を用いることを特徴とする請求項２または３に記載のタンパク質の機能改変スクリーニング方法。
【請求項５】
上記変異導入工程およびタンパク質合成工程の転写鋳型ＤＮＡ作製工程のいずれの工程においてもＰＣＲ法を用い、両工程を一連の工程として行うことを特徴とする請求項２に記載のタンパク質の機能改変スクリーニング方法。
【請求項６】
上記変異導入工程およびタンパク質合成工程の転写鋳型ＤＮＡ作製工程において、
目的のタンパク質をコードする遺伝子が挿入されたベクターを鋳型とし、
目的のタンパク質をコードする遺伝子の変異を導入しようとする部分の配列に基づくセンス鎖の変異導入用オリゴヌクレオチドとその相補配列からなるアンチセンス鎖の変異導入用オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、
目的のタンパク質をコードする遺伝子の翻訳を開始する部分の塩基配列の５’末端にリンカー配列を結合したセンスプライマーと上記アンチセンス鎖の変異導入用オリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲと、上記センス鎖の変異導入用オリゴヌクレオチドと目的のタンパク質をコードする遺伝子の下流に位置するベクター配列に基づくアンチセンスプライマーとの組み合わせによるＰＣＲを行い、
上記２組のＰＣＲ産物を混合してＤＮＡ合成酵素による伸長反応により、上記リンカー配列から目的のタンパク質をコードする遺伝子の下流に位置するベクター配列までのＤＮＡ断片を作製し、
上記ＤＮＡ断片を鋳型として、in vitro 転写用プロモーター配列および上記リンカー配列を含むセンスプライマーと、上記鋳型ＤＮＡ断片に含まれるベクター配列に基づくアンチセンスプライマーとの組み合わせによるＰＣＲを行うことにより、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系で変異タンパク質を合成するために用いるｍＲＮＡを合成するための転写鋳型ＤＮＡを作製することを特徴とする請求項５に記載のタンパク質の機能改変スクリーニング方法。
【請求項７】
上記in vitro 転写用プロモーター配列および上記リンカー配列を含むセンスプライマーには、さらに上記両配列の中間の位置に翻訳増強配列を含むことを特徴とする請求項６に記載のタンパク質の機能改変スクリーニング方法。
【請求項８】
in vitro 転写用プロモーター配列、翻訳増強配列、およびリンカー配列を含むセンスプライマーは、上流側プライマーと下流側プライマーとに分割したプライマーであり、上流側プライマーの３’末端の配列が下流側プライマーの５’末端の配列と重複するプライマーであることを特徴とする請求項７に記載のタンパク質の機能改変スクリーニング方法。
【請求項９】
コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系で変異タンパク質を合成するために用いるｍＲＮＡを合成するための転写鋳型ＤＮＡを作製する方法であって、
目的のタンパク質をコードする遺伝子が挿入されたベクターを鋳型とし、
目的のタンパク質をコードする遺伝子の変異を導入しようとする部分の配列に基づくセンス鎖の変異導入用オリゴヌクレオチドとその相補配列からなるアンチセンス鎖の変異導入用オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、
目的のタンパク質をコードする遺伝子の翻訳を開始する部分の塩基配列の５’末端にリンカー配列を結合したセンスプライマーと上記アンチセンス鎖の変異導入用オリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲと、上記センス鎖の変異導入用オリゴヌクレオチドと目的のタンパク質をコードする遺伝子の下流に位置するベクター配列に基づくアンチセンスプライマーとの組み合わせによるＰＣＲを行い、
上記２組のＰＣＲ産物を混合してＤＮＡ合成酵素による伸長反応により、上記リンカー配列から目的のタンパク質をコードする遺伝子の下流に位置するベクター配列までのＤＮＡ断片を作製し、
上記ＤＮＡ断片を鋳型として、in vitro 転写用プロモーター配列および上記リンカー配列を含むセンスプライマーと、上記鋳型ＤＮＡ断片に含まれるベクター配列に基づくアンチセンスプライマーとの組み合わせによるＰＣＲを行うことを特徴とする転写鋳型ＤＮＡの作製方法。
【請求項１０】
上記in vitro 転写用プロモーター配列および上記リンカー配列を含むセンスプライマーには、さらに上記両配列の中間の位置に翻訳増強配列を含むことを特徴とする請求項９に記載の転写鋳型ＤＮＡの作製方法。
【請求項１１】
in vitro 転写用プロモーター配列、翻訳増強配列、およびリンカー配列を含むセンスプライマーは、上流側プライマーと下流側プライマーとに分割したプライマーであり、上流側プライマーの３’末端の配列が下流側プライマーの５’末端の配列と重複するプライマーであることを特徴とする請求項１０に記載の転写鋳型ＤＮＡの作製方法。
【請求項１２】
請求項８に記載のタンパク質の機能改変スクリーニング方法を実施するためのキットであって、少なくとも目的遺伝子を挿入するためのベクター、in vitro 転写用プロモーター配列および翻訳増強配列を含み上流側プライマーと下流側プライマーとに分割され上流側プライマーの３’末端の配列が下流側プライマーの５’末端の配列と重複する２種類のセンスプライマー、ベクター配列に基づくアンチセンスプライマー、ＰＣＲ反応用緩衝液、デオキシリボヌクレオシド三リン酸混合液、耐熱性ＤＮＡ合成酵素、in vitro 転写用緩衝液、ＲＮＡ合成酵素、リボヌクレオシド三リン酸混合液、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成液、エネルギー／アミノ酸混合液、in vitro 翻訳用緩衝液、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を含むことを特徴とするタンパク質の機能改変スクリーニングキット。
【請求項１３】
請求項１１に記載の転写鋳型ＤＮＡの作製方法を実施するためのキットであって、少なくとも目的遺伝子を挿入するためのベクター、in vitro 転写用プロモーター配列および翻訳増強配列を含み上流側プライマーと下流側プライマーとに分割され上流側プライマーの３’末端の配列が下流側プライマーの５’末端の配列と重複する２種類のセンスプライマー、ベクター配列に基づくアンチセンスプライマー、ＰＣＲ反応用緩衝液、デオキシリボヌクレオシド三リン酸混合液、耐熱性ＤＮＡ合成酵素を含むことを特徴とする転写鋳型ＤＮＡ作製キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異タンパク質の機能変化のスクリーニング方法およびその利用に関するものであり、具体的には新規機能獲得タンパク質創出のためコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いてハイスループットに変異タンパク質の機能変化をスクリーニングする方法および当該スクリーニング方法を実施するためのキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子工学のめざましい進歩から、機能性タンパク質の機能改変が実現可能になり、利用価値の高い数多くの有用タンパク質が誕生してきている。また、タンパク質の機能改変は、新しい機能性材料の開発だけでなく、生命機能の改良やタンパク質を原因とする疾病の克服にもつながる。
【０００３】
従来、タンパク質の機能改変をスクリーニングする方法としては、目的のタンパク質をコードする遺伝子に変異を導入し、当該変異遺伝子を組み込んだ発現ベクターを構築し、大腸菌や培養細胞等の宿主に当該発現ベクターを導入して変異タンパク質を発現させ、変異タンパク質を精製した後に機能をスクリーニングする方法が用いられている。
【０００４】
例えば、非特許文献１には、ＰＣＲによるランダム変異導入法(進化分子工学)を用いてピロリン酸−ヌクレオシドリン酸基転移酵素のリン酸転移反応の効率を上げ、逆にヌクレオチドの分解活性を抑える機能を付加したタンパク質の改変例について記載されている。
【０００５】
例えば、非特許文献２には、20μM Mn2+イオン存在下でＰＣＲを行いランダムな変異を導入し、酵母での生物学的スクリーニングを組み合わせる手法を用いて酵母 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthaseのフェニルアラニンによるフィードバック阻害活性をチロシンによるフィードバック阻害を受けるように改変した実験例について記載されている。
【非特許文献１】Y. Mihara, T. Utagawa, H. Yamada, and Y. Asano、Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella morganii、Applied and Environmental Microbiology、2000、Vol. 66 (7)、2811-2816
【非特許文献２】Hartmann M, Schneider TR, Pfeil A, Heinrich G, Lipscomb WN, Braus GH.、Evolution of feedback-inhibited beta /alpha barrel isoenzymes by gene duplication and a single mutation.、Proc Natl Acad Sci U S A.、 2003、Vol.100(3)、862-7
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記従来のスクリーニング方法では、変異導入に数日〜１週間程度、発現ベクター構築に数日〜１週間程度、大腸菌等の宿主によるタンパク質発現に２〜３日程度、タンパク質精製に数日〜１週間程度を要するため、短期間でタンパク質の機能改変を評価することは困難であり、また、同時に扱うことができるサンプル数も限られている。したがって、変異タンパク質の機能変化を短時間かつ網羅的にスクリーニングできる、いわゆるハイスループットスクリーニング方法の開発が期待されている。タンパク質の機能改変スクリーニングのハイスループット化の実現により、今まで以上に多様な機能を有する産業上、医療的にも有用なタンパク質の創出が可能となる。
【０００７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、タンパク質の機能変化を短時間かつ網羅的にスクリーニングすることが可能なタンパク質の機能改変スクリーニング方法および当該スクリーニング方法を実施するためのキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、変異タンパク質の合成に多数のタンパク質合成を短時間に合成可能なコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いること、および目的遺伝子への変異導入とコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系により合成する変異タンパク質のｍＲＮＡを合成するための転写鋳型ＤＮＡの作製を、ＰＣＲ法を用いて一連の工程として行うことにより、タンパク質の機能改変スクリーニングをハイスループット化できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明に係るタンパク質の機能改変スクリーニング方法は、機能を改変するために人為的に導入した変異を有するタンパク質のスクリーニング方法であって、目的のタンパク質をコードする遺伝子に少なくとも１以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されるように変異を導入する変異導入工程と、得られた変異遺伝子に基づいてコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて変異タンパク質を合成するタンパク質合成工程と、得られたタンパク質の機能をスクリーニングするスクリーニング工程とからなることを特徴としている。
【００１０】
また、上記タンパク質合成工程は、in vitro 転写によりｍＲＮＡを合成するための鋳型ＤＮＡを作製する転写鋳型ＤＮＡ作製工程と、得られた転写鋳型ＤＮＡに基づいてin vitro 転写によりｍＲＮＡを合成するｍＲＮＡ合成工程と、得られたｍＲＮＡに基づいてコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いてタンパク質に翻訳する翻訳工程とからなるものであってもよい。
【００１１】
上記変異導入工程においてはＰＣＲ法を用いることが好ましく、また、上記タンパク質合成工程の転写鋳型ＤＮＡ作製工程においてもＰＣＲ法を用いることが好ましい。さらに、上記変異導入工程およびタンパク質合成工程の転写鋳型ＤＮＡ作製工程のいずれの工程においてもＰＣＲ法を用い、両工程を一連の工程として行うことが特に好ましい。
【００１２】
上記のように変異導入工程およびタンパク質合成工程の転写鋳型ＤＮＡ作製工程のいずれの工程においてもＰＣＲ法を用い、両工程を一連の工程として行う場合には、上記変異導入工程およびタンパク質合成工程の転写鋳型ＤＮＡ作製工程において、目的のタンパク質をコードする遺伝子が挿入されたベクターを鋳型とし、目的のタンパク質をコードする遺伝子の変異を導入しようとする部分の配列に基づくセンス鎖の変異導入用オリゴヌクレオチドとその相補配列からなるアンチセンス鎖の変異導入用オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、目的のタンパク質をコードする遺伝子の翻訳を開始する部分の塩基配列の５’末端にリンカー配列を結合したセンスプライマーと上記アンチセンス鎖の変異導入用オリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲと、上記センス鎖の変異導入用オリゴヌクレオチドと目的のタンパク質をコードする遺伝子の下流に位置するベクター配列に基づくアンチセンスプライマーとの組み合わせによるＰＣＲを行い、上記２組のＰＣＲ産物を混合してＤＮＡ合成酵素による伸長反応により、上記リンカー配列から目的のタンパク質をコードする遺伝子の下流に位置するベクター配列までのＤＮＡ断片を作製し、上記ＤＮＡ断片を鋳型として、in vitro 転写用プロモーター配列および上記リンカー配列を含むセンスプライマーと、上記鋳型ＤＮＡ断片に含まれるベクター配列に基づくアンチセンスプライマーとの組み合わせによるＰＣＲを行うことにより、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系で変異タンパク質を合成するために用いるｍＲＮＡを合成するための転写鋳型ＤＮＡを作製する方法を好適に用いることができる。
【００１３】
上記in vitro 転写用プロモーター配列および上記リンカー配列を含むセンスプライマーには、さらに上記両配列の中間の位置に翻訳増強配列を含むことが好ましく、さらに当該in vitro 転写用プロモーター配列、翻訳増強配列、およびリンカー配列を含むセンスプライマーは、上流側プライマーと下流側プライマーとに分割したプライマーであり、上流側プライマーの３’末端の配列が下流側プライマーの５’末端の配列と重複するプライマーであることが特に好ましい。
【００１４】
ここで、「センスプライマー」とはＰＣＲにより増幅しようとする断片の５’末端の塩基配列を規定するオリゴヌクレオチドを意味し、「アンチセンスプライマー」とはＰＣＲにより増幅しようとする断片の３’末端の塩基配列を規定するオリゴヌクレオチドを意味する。
【００１５】
本発明に係る転写鋳型ＤＮＡの作製方法は、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系で変異タンパク質を合成するために用いるｍＲＮＡを合成するための転写鋳型ＤＮＡを作製する方法であって、目的のタンパク質をコードする遺伝子が挿入されたベクターを鋳型とし、目的のタンパク質をコードする遺伝子の変異を導入しようとする部分の配列に基づくセンス鎖の変異導入用オリゴヌクレオチドとその相補配列からなるアンチセンス鎖の変異導入用オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、目的のタンパク質をコードする遺伝子の翻訳を開始する部分の塩基配列の５’末端にリンカー配列を結合したセンスプライマーと上記アンチセンス鎖の変異導入用オリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲと、上記センス鎖の変異導入用オリゴヌクレオチドと目的のタンパク質をコードする遺伝子の下流に位置するベクター配列に基づくアンチセンスプライマーとの組み合わせによるＰＣＲを行い、上記２組のＰＣＲ産物を混合してＤＮＡ合成酵素による伸長反応により、上記リンカー配列から目的のタンパク質をコードする遺伝子の下流に位置するベクター配列までのＤＮＡ断片を作製し、上記ＤＮＡ断片を鋳型として、in vitro 転写用プロモーター配列および上記リンカー配列を含むセンスプライマーと、上記鋳型ＤＮＡ断片に含まれるベクター配列に基づくアンチセンスプライマーとの組み合わせによるＰＣＲを行うことを特徴とするものである。
【００１６】
上記in vitro 転写用プロモーター配列および上記リンカー配列を含むセンスプライマーには、さらに上記両配列の中間の位置に翻訳増強配列を含むことが好ましく、さらに当該in vitro 転写用プロモーター配列、翻訳増強配列、およびリンカー配列を含むセンスプライマーは、上流側プライマーと下流側プライマーとに分割したプライマーであり、上流側プライマーの３’末端の配列が下流側プライマーの５’末端の配列と重複するプライマーであることが特に好ましい。
【００１７】
本発明に係るタンパク質の機能改変スクリーニングキットは、上記本発明に係るタンパク質の機能改変スクリーニング方法を実施するためのキットであって、少なくとも目的遺伝子を挿入するためのベクター、in vitro 転写用プロモーター配列および翻訳増強配列を含み上流側プライマーと下流側プライマーとに分割され上流側プライマーの３’末端の配列が下流側プライマーの５’末端の配列と重複する２種類のセンスプライマー、ベクター配列に基づくアンチセンスプライマー、ＰＣＲ反応用緩衝液、デオキシリボヌクレオシド三リン酸混合液、耐熱性ＤＮＡ合成酵素、in vitro 転写用緩衝液、ＲＮＡ合成酵素、リボヌクレオシド三リン酸混合液、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成液、エネルギー／アミノ酸混合液、in vitro 翻訳用緩衝液、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を含むことを特徴とするものである。
【００１８】
本発明に係る転写鋳型ＤＮＡ作製キットは、上記本発明に係る転写鋳型ＤＮＡの作製方法を実施するためのキットであって、少なくとも目的遺伝子を挿入するためのベクター、in vitro 転写用プロモーター配列および翻訳増強配列を含み上流側プライマーと下流側プライマーとに分割され上流側プライマーの３’末端の配列が下流側プライマーの５’末端の配列と重複する２種類のセンスプライマー、ベクター配列に基づくアンチセンスプライマー、ＰＣＲ反応用緩衝液、デオキシリボヌクレオシド三リン酸混合液、耐熱性ＤＮＡ合成酵素を含むことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係るタンパク質の機能改変スクリーニング方法は、短時間で多数の変異タンパク質を網羅的にスクリーニングすることを可能とする。すなわち、タンパク質の機能改変スクリーニングのハイスループット化を実現できる。これにより、今まで以上に多様な機能を有する産業上有用なタンパク質を創出できるという効果を奏する。
【００２０】
具体的には、本発明に係るタンパク質の機能改変スクリーニング方法は、目的のタンパク質をコードする遺伝子に変異を導入した変異遺伝子に基づくタンパク質の合成を、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて行うものであるので、タンパク質合成を短時間で行うことができる。また、多数の変異タンパク質の合成を同時に行うことができる。さらに合成するタンパク質の種類によっては、合成後のタンパク質を精製することなく合成反応後の合成液をそのままスクリーニングに供することができる。したがって、タンパク質の機能改変スクリーニングのハイスループット化を実現でき、多様な機能を有する産業上有用なタンパク質を創出できるという効果を奏する。
【００２１】
また、目的のタンパク質コードする遺伝子への変異導入およびコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系により合成する変異タンパク質のｍＲＮＡを合成するための転写鋳型ＤＮＡの作製においてＰＣＲ法を用いることにより要する時間を短縮することができる。さらに遺伝子への変異導入から転写鋳型ＤＮＡまでをＰＣＲ法を用いて一連の工程として行うことにより、多数の転写鋳型ＤＮＡを同時に短時間で作製することが可能となる。したがって、タンパク質の機能改変スクリーニングをさらにハイスループット化でき、多様な機能を有する産業上有用なタンパク質を創出できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００２３】
本発明に係るタンパク質の機能改変スクリーニング方法（以下、適宜「本スクリーニング方法」と略記する。）は、機能を改変するために人為的に導入した変異を有するタンパク質のスクリーニング方法であって、目的のタンパク質をコードする遺伝子にアミノ酸が置換されるように変異を導入する変異導入工程と、得られたＤＮＡを鋳型としてコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて変異タンパク質を合成するタンパク質合成工程と、得られたタンパク質の機能をスクリーニングするスクリーニング工程とからなるものである。ここで、タンパク質の機能改変スクリーニングとは、新規機能獲得タンパク質創出のため、人為的に変異を導入した変異タンパク質の機能変化を評価し、目的の機能に改変された変異タンパク質を見出すことを意味する。以下に本スクリーニング方法および当該スクリーニング方法を実施するためのキットについて、その特徴を詳細に説明する。
【００２４】
１．タンパク質の機能改変スクリーニング方法
（１）変異導入工程
本スクリーニング方法における変異導入工程は、目的のタンパク質をコードする遺伝子に少なくとも１以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されるように変異を導入する工程である。ここで、遺伝子は目的のタンパク質をコードするものであればよく、ｃＤＮＡであることが好ましい。また、目的のタンパク質の全長をコードするものに限定されず、目的のタンパク質の一部のみをコードするものであってもよい。また、目的のタンパク質としては、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて合成可能なタンパク質であれば特に限定されるものではない。
【００２５】
本スクリーニング方法における変異導入工程において用いる方法は、遺伝子（ＤＮＡ）レベルで部位特異的に変異を導入できる方法であれば特に限定されるものではなく、公知の方法を好適に用いることができる。当該方法の１例として、Kunkel法を挙げることができる。Kunkel法では、大腸菌CJ236株を宿主菌として、変異導入の目的タンパク質をコードする遺伝子をクローニングしたM13 ファージの一本鎖ＤＮＡを調製する。CJ236株は、F’、dut-、ung-の大腸菌で、dUTPase（Dut）とUracil-DNA glycosylase（Ung）を欠損している。そのため、ＤＮＡ中のチミン（T）の一部がデオキシウラシル（dU）に置き換わったＤＮＡを合成する。続いて、これに変異導入用の合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、ポリメラーゼ反応とリガーゼ反応により相補鎖を合成する。このＤＮＡをung＋のmutS株にトランスフェクションすると、ＤＮＡのミスマッチを抑えながら、もとのdUの含まれている側のＤＮＡはUng によって分解を受けるが、in vitroで合成された相補鎖の側は分解されずに複製される。このようにしてＤＮＡが選択を受け、変異の導入されたファージが得られる（参考文献：Kunkel, T. A. (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Science of the USA, 82: 488-492. 、Kunkel, T. A., Bebenek, K. and McClary, J. (1991) Efficient site-directed mutagenesis using uracil-containing DNA. Methods in Enzymology, 204: 125-139. 参照）。
【００２６】
ここで、上記変異導入用の合成オリゴヌクレオチドとは、例えば１つのアミノ酸を置換しようとする場合に、目的アミノ酸に対応する配列を含む20〜50塩基のオリゴヌクレオチドであって目的のアミノ酸の塩基配列を置換しようとするアミノ酸の塩基配列に変更したオリゴヌクレオチドを意味する。なお、当該オリゴヌクレオチドに遺伝子がコードするアミノ酸が変化しない適当な位置に制限酵素サイトを導入することで変異導入の有無の確認作業ができる。制限酵素サイトを導入することにより、上記変異の導入されたファージを鋳型として、挿入された遺伝子部分をＰＣＲで増幅し、合成オリゴヌクレオチドに導入された制限酵素で切断して電気泳動で切断パターンを確認することにより、変異が導入されたクローンであるか否かを確認することができる。
【００２７】
上記Kunkel法以外の遺伝子（ＤＮＡ）レベルの部位特異的変異導入方法としては、ＰＣＲを用いる方法を挙げることができる。例えば、変異導入の目的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されたベクターを鋳型とし、上記Kunkel法で用いた変異導入用の合成オリゴヌクレオチドと同様のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより変異を導入することができる。この場合も変異導入用プライマーに、遺伝子がコードするアミノ酸が変化しない適当な位置に制限酵素サイトを導入することなどで変異導入の有無を確認することも可能である。ただし、この工程は必ずしも必要とはされない。
【００２８】
上記Kunkel法を用いて変異導入を行う場合、通常約３日〜１週間を要するが、ＰＣＲを用いる場合は半日〜１日程度で変異導入を行うことができる。したがって、本スクリーニング方法に用いる変異導入方法としては、ＰＣＲを用いる方法がより好ましい。
【００２９】
（２）タンパク質合成工程
本スクリーニング方法におけるタンパク質合成工程は、上記変異導入工程で得られた変異遺伝子に基づいてコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系（以下、適宜「コムギ胚芽無細胞システム」とも称する。）を用いて変異タンパク質を合成する工程である。本タンパク質合成工程は、原則としてin vitro 転写によりｍＲＮＡを合成するための鋳型ＤＮＡを作製する転写鋳型ＤＮＡ作製工程と、得られた転写鋳型ＤＮＡに基づいてin vitro 転写によりｍＲＮＡを合成するｍＲＮＡ合成工程と、得られたｍＲＮＡに基づいてタンパク質に翻訳する翻訳工程とからなる。ただし、上記変異導入工程において、目的のタンパク質をコードする遺伝子がin vitro 転写に利用可能なＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するベクターに挿入されている場合等であれば、転写鋳型ＤＮＡ作製工程は必要でない場合があり、また、in vitro 転写の鋳型となる転写鋳型ＤＮＡを添加すれば合成反応液中でｍＲＮＡに転写されそのままタンパク質が翻訳されるコムギ胚芽無細胞システムを用いる場合等であれば、ｍＲＮＡ合成工程は必要でない場合がある。
【００３０】
〔転写鋳型ＤＮＡ作製工程〕
コムギ胚芽無細胞システムに添加するｍＲＮＡを合成する方法としては、特に限定されるものではなく、公知のin vitro転写系を好適に使用することができる。したがって、転写鋳型ＤＮＡは公知のin vitro転写系によりｍＲＮＡを合成できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、上記変異導入工程で得られた変異遺伝子をin vitro 転写に利用可能なＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列（例えば、ＳＰ６プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター等）を有するベクターに挿入することにより、転写鋳型ＤＮＡを作製することができる。また、上記変異導入工程で得られた変異遺伝子のうちタンパク質合成に必要な部分を増幅するようにプライマーをデザインし、センスプライマーの５’側にin vitro 転写に利用可能なＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列および開始コドン（ATG）を付加すれば、当該プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより転写鋳型ＤＮＡを作製することができる。ただし、転写鋳型ＤＮＡの作製方法はこれらに限定されるものではない。
【００３１】
また、コムギ胚芽無細胞システムにおいて、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの上流に翻訳増強配列を付加することにより、タンパク質合成効率が向上することが知られている（参考文献：Sawasaki et al. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99, 14652-14657）このような翻訳増強配列としてはタバコモザイクウイルス由来のオメガ配列またはオメガ配列の類似配列を挙げることができるが、これに限定されるものではない。したがって、転写鋳型ＤＮＡを作製する際に、プロモーター配列と変異遺伝子の間に翻訳増強配列を付加することが好ましい。上記翻訳増強配列を付加することにより、ｍＲＮＡの５’末端のキャップ構造および３’末端のポリＡ構造が不要となる。また、コムギ胚芽無細胞システム添加するｍＲＮＡの指摘濃度の幅がキャップ構造およびポリＡ構造を有するｍＲＮＡの指摘濃度より広くなり、扱いが容易となる。例えば、プロモーターおよび翻訳増強配列をあらかじめ組み込んだベクターを構築しておき、これに上記変異導入工程で得られた変異遺伝子を挿入すれば、容易に翻訳増強配列を有するｍＲＮＡを合成するための転写鋳型ＤＮＡを作製することができる。また、上記変異導入工程で得られた変異遺伝子のうちタンパク質合成に必要な部分を増幅するようにプライマーをデザインし、センスプライマーの５’側にin vitro 転写に利用可能なＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列、翻訳増強配列および開始コドン（ATG）を付加すれば、当該プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより翻訳増強配列を有するｍＲＮＡを合成するための転写鋳型ＤＮＡを作製することができる。ただし、翻訳増強配列を有する転写鋳型ＤＮＡの作製方法はこれらに限定されるものではない。
【００３２】
ＰＣＲ法を用いてより簡便に転写鋳型ＤＮＡを作製する方法として、Sawasakiらの方法（Sawasaki et al. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99, 14652-14657）を応用することができる。図１にその手順を示した。図１に基づいてSawasakiらの方法について説明する。
【００３３】
まず、目的のタンパク質をコードする遺伝子がクローニングされたベクターをＰＣＲの鋳型とし、目的のタンパク質をコードする遺伝子の５’末端の配列（約13〜約30塩基）とその５’末端側にリンカー配列付加したセンスプライマー（図中１で示す）と、ベクター上の適当な位置に設定したアンチセンスプライマー（図中２で示す）との組み合わせで１回目のＰＣＲを行う。ここで、合成（翻訳）するタンパク質がＮ末端を欠失したタンパク質である場合等、遺伝子の５’末端に開始コドン（ATG）がない場合は、リンカー配列の直後に開始コドン（ATG）を付加したセンスプライマーを用いる。なお、鋳型に用いるベクターとしては、精製したベクターＤＮＡが使用可能であることはいうまでもないが、当該ベクターで形質転換した宿主大腸菌等の培養液を直接使用することも可能である。
【００３４】
次に、１回目のＰＣＲ産物を鋳型とし、２種類のセンスプライマー（図中３および４で示す）と上記１回目のＰＣＲで用いたアンチセンスプライマー（図中２で示す）との組み合わせで２回目のＰＣＲを行う。２種類のセンスプライマーは、一方は最終増幅産物の５’末端（上流側）の配列を有するものであり、プロモーター配列の５’側の配列を有するように設計する（図中３で示す）。他方のプライマーは５’側から順にプロモーター配列の３’側、翻訳増強配列および上記１回目のＰＣＲで用いたプライマーに含まれるリンカー配列を含むプライマーを設計する（図中４で示す）。なお、上流側プライマーの３’末端と下流側プライマーの５’末端とは配列が一部重複（約10塩基程度）するように設計する（このようなプライマーを「Split primer」と称する。）。この２回目のＰＣＲによりプロモーター、翻訳増強配列、目的タンパク質をコードする遺伝子およびベクター配列の一部からなるＤＮＡ断片が増幅され、これを転写鋳型ＤＮＡとして好適に用いることができる。なお、本明細書においては、上記２回目のＰＣＲ、すなわちプロモーターおよび翻訳増強配列を付加するためのSplit primerを用いたＰＣＲを「Split-PCR」と称する。
【００３５】
上記２種類のセンスプライマー（Split primer）の切断部位は特に限定されるものではないが、上述のようにプロモーター配列を切断するように設計することが特に好ましい。このように設計することにより、２種類のセンスプライマーの両方を用いて増幅されたＤＮＡ断片のみが完全長のプロモーター配列を有する転写鋳型ＤＮＡとなり得るが、いずれか一方のセンスプライマーのみで増幅されたＤＮＡ断片および非特異的に増幅されたＤＮＡ断片は完全長のプロモーター配列を持たないため転写鋳型ＤＮＡとなり得ず、翻訳におけるバックグラウンドノイズを低く抑えることができる点が挙げられる。
【００３６】
〔ｍＲＮＡ合成工程〕
上述したように、コムギ胚芽無細胞システムに添加するｍＲＮＡを合成する方法としては、特に限定されるものではなく、公知のin vitro転写系を好適に使用することができる。したがって、例えば、上記転写鋳型ＤＮＡ作製工程で作製されたin vitro 転写に利用可能なＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する転写鋳型ＤＮＡを、適当な基質とプロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼ含む合成反応液に添加することにより、目的の変異タンパク質をコードするｍＲＮＡを合成することができる。
【００３７】
in vitro転写反応終了後、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供することにより転写効率を検定することができる。また、エタノール沈殿によりｍＲＮＡを精製し、適当量の滅菌水（RNase free）に溶解した後、260nmの吸光度を測定してＲＮＡ量を算出することができる。
【００３８】
〔翻訳工程〕
翻訳工程は、上記ｍＲＮＡ合成工程で得られたｍＲＮＡに基づいてコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系（特開２０００−２３６８９６号公報参照）を用いてタンパク質に翻訳する工程である。
【００３９】
コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系には、透析膜を介して基質を供給する透析膜法、翻訳液の上に基質溶液を重層して反応を進める重層法を用途により使い分けている。コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系は活性が高いため、全てを混合して閉じた反応系で反応を進めると、基質を消費し尽くして数時間内に反応が終結してしまう。そこで、ここに緩やかに新たな基質を添加することにより、反応時間を延長するのが重層法である。粘性の高い小麦胚芽抽出液を下層に、そして粘性の低い基質混合液を上層に置くことで、両液は拡散により徐々に混合され、その間に必要な物質が反応液に供給され不要な物質が希釈されることで連続的にタンパク質合成が進行する。この反応は16〜24時間持続し、高収量が期待できる（Sawasaki, T., Hasegawa, Y., Tsuchimochi, M., Kamura, N., Ogasawara, T., Kuroita, T., Endo, Y.、FEBS Lett.、2002、Vol. 514、102-105）。重層法は多検体の試料をハイスループットにスクリーニングする場合に適しており、分注ロボットを活用した自動化システムに特に有効である。
【００４０】
透析法は、透析膜を介した拡散により、タンパク質合成に必要なアミノ酸、ATP、GTP等の基質が供給され不要な物質が希釈されることで連続的にタンパク質合成が進行する方法である（Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y. & Alakhov, Y. B.、Science、1988、Vol. 242、1162-1164.）。大量のタンパク質を合成する目的のためには透析法が適している。
【００４１】
（３）変異導入および転写鋳型ＤＮＡ作製を一連に行う方法
本発明者らは、タンパク質の機能改変スクリーニングをよりハイスループットに行うために、目的タンパク質をコードする遺伝子にＰＣＲを用いて変異を導入する場合に、上記Sawasakiらの方法を応用することにより簡便かつ迅速に転写鋳型ＤＮＡを作製する方法を考案した。図２にその手順を示した。図２（ａ）〜（ｅ）にしたがってその手順を説明する。
【００４２】
（ａ）変異を導入しようとするタンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を適当なクローニングベクター、例えばpBluescript SK+ (ストラタジーン社)等に挿入する。挿入する遺伝子はｃＤＮＡであることが好ましい。ただし、完全長のｃＤＮＡでなくてもよく、オープンリーディングフレームの全長またはオープンリーディングフレームの一部でもよい。
【００４３】
目的のタンパク質をコードする遺伝子の５’末端の配列（約13〜約30塩基）とその５’末端側にリンカー配列（例えば、CCTCTTCCAGGGCCCA、配列番号１）付加したセンスプライマー（図中１で示す）を設計し、合成する。ここで、合成（翻訳）するタンパク質がＮ末端を欠失したタンパク質である場合等、遺伝子の５’末端に開始コドン（ATG）がない場合は、リンカー配列の直後に開始コドン（ATG）を付加したセンスプライマーを設計する。なお、リンカー配列は上記の配列（配列番号１）に限定されるものではない。また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が挿入されているベクター上の異なる位置に２種類のアンチセンスプライマー（図中４および５で示す）を設計し、合成する。アンチセンスプライマーは、ｍＲＮＡの安定性向上の理由から３’非翻訳領域の長さが1.0〜1.5kbp程度になるようなベクター上の位置に設計することが好ましい。ただし、これに限定されるものではない。
【００４４】
変異を導入したい位置にセンスおよびアンチセンスのオリゴヌクレオチド（図中２（アンチセンス）および３（センス）で示す。以下、「変異導入用プライマー」と称する。）を合成する。変異導入用プライマーについては、上記Kunkel法の説明中に記載したように、例えば１つのアミノ酸を置換しようとする場合に、目的アミノ酸に対応する配列を含む20〜50塩基のオリゴヌクレオチドであって目的のアミノ酸の塩基配列を置換しようとするアミノ酸の塩基配列に変更したオリゴヌクレオチドであればよい。したがって、当該変異導入用プライマーの一方は、上記Kunkel法に用いた変異導入用オリゴヌクレオチドと同一のものを使用することができる。この際、遺伝子がコードするアミノ酸が変化しない適当な位置に制限酵素サイトを導入することで変異導入の有無の確認作業ができる。
【００４５】
（ｂ）目的の遺伝子が変異導入用プライマー領域でオーバーラップするように５’側領域と３’側領域に分けてＰＣＲを行う。すなわち、５’側領域はプライマー１およびプライマー２の組み合わせ、３’側領域はプライマー３およびプライマー４の組み合わせによりＰＣＲを行う。これにより、目的の遺伝子が変異導入用プライマー領域でオーバーラップした２種類のＤＮＡ断片が得られる。
【００４６】
ここで、ＰＣＲによる塩基の誤った取り込みや、３’末端へのアデニン(A)の付加を避けるために、ＰＣＲのサイクル数を２０〜２５サイクルに抑え、ＰＣＲに用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは高い増幅効率と高い正確性を持ったものを用いることが好ましい。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Pyrobest DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、KOD DNA polymerase （TOYOBO）、KOD Dash （TOYOBO）、Pfu DNA polymerase （TOYOBO）等を好適に用いることができる。
【００４７】
（ｃ）上記（ｂ）のＰＣＲにより得られた２種類のＰＣＲ反応液を適当な濃度に希釈（例えば２０倍希釈）し、両者を混合して、プライマー非存在下でＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を行う。これにより、プライマー１からプライマー４まで連結された断片が合成される。
【００４８】
（ｄ）上記（ｃ）で得られたＤＮＡ断片を鋳型とし、センスプライマーに２種類のSplit primer（図中、SP6およびΩ）を用い、アンチセンスプライマーに上記プライマー５を用いてSplit-PCRを行う。図２ではプロモーターとしてＳＰ６プロモーターを用いているがこれに限定されるものではなく、他のプロモーター、例えばＴ７プロモーター、Ｔ３プロモーター等を用いることができる。また、センスプライマーとしてはSplit primerに限定されるものではなく、in vitro 転写用プロモーター配列および上記リンカー配列を含む１種類のセンスプライマーまたはin vitro 転写用プロモーター配列、翻訳増強配列、およびリンカー配列を含む１種類のセンスプライマーを用いてもよい。ただし、Split primerを用いることが特に好ましい。
【００４９】
（ｅ）以上の手順により、転写鋳型ＤＮＡとして用いることが可能な変異遺伝子を含むＤＮＡ断片が合成され、当該ＤＮＡ断片を転写鋳型としてin vitro転写系を用いてｍＲＮＡを合成し、コムギ胚芽無細胞システムを用いて目的の変異タンパク質を合成することができる。
【００５０】
上記（ａ）〜（ｅ）の手順により、変異導入および転写鋳型ＤＮＡ作製を一連に行うことにより、転写鋳型ＤＮＡを短時間で作製することが可能となる。具体的には、変異を導入しようとするタンパク質をコードする遺伝子が挿入されたベクター、変異導入用プライマーおよびその他の必要なプライマーがあらかじめ準備されていれば、１日程度で転写鋳型ＤＮＡを作製することが可能となり、従来変異導入後に大腸菌等の宿主への形質転換等に３〜５日程度要していたことと比較して、要する時間を顕著に短縮することができる。また、目的タンパク質の変異体を多数作製し、それらの機能改変をスクリーニングする場合、それぞれの変異導入用プライマーを設計すればその後のＰＣＲはすべて同一のプライマーを用いて行うことができるため、例えば９６サンプル用のＰＣＲチューブを用いれば、９６種類の変異タンパク質についての転写鋳型ＤＮＡを一度に作製することができる。
【００５１】
上記（ａ）〜（ｅ）の手順による転写鋳型ＤＮＡの作製方法を本スクリーニング方法に適用し、コムギ胚芽無細胞システムと組み合わることにより、多数の変異タンパク質を短時間で合成し、スクリーニングすることが可能となる。すなわち、タンパク質の機能改変スクリーニング方法の画期的なハイスループット化を実現することが可能となる。
【００５２】
なお、上記転写鋳型ＤＮＡの作製方法も本発明に含まれる。
【００５３】
（４）スクリーニング工程
本スクリーニング方法におけるスクリーニング工程は、上記タンパク質合成工程で得られたタンパク質の機能をスクリーニングする工程である。本スクリーニング方法はコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いるものであるので、当該タンパク質合成系を用いて合成可能なタンパク質であればどのようなものでも本スクリーニング方法の対象とすることが可能である。例えば、リパーゼ、グリコシダーゼ、アミノ酸合成系酵素、制限酵素等の各種酵素を好適に本スクリーニング方法の対象とすることができる。
【００５４】
さらに、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて合成されたタンパク質の種類によっては、反応液中のタンパク質を精製することなく、スクリーニングに供することが可能である。すなわち合成されたタンパク質を含む反応液をそのまま、または用いるスクリーニング方法に適した緩衝液に交換するのみで各種酵素アッセイ等のスクリーニングを行うことができる。
【００５５】
一方、コムギ胚芽抽出液の混在により機能解析が困難なため精製を要するタンパク質の場合は、スクリーニング工程の前段に精製工程を設ければよい。精製方法としては、特に限定されるものではなく、合成されたタンパク質の精製に適した公知の方法を適宜選択して用いることができるが、ハイスループット化を妨げないよう簡易かつ迅速に行うことができるものであることが好ましい。簡易精製法の一例として、予め目的のタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端に、ヒスチジン６残基からなるヒスタグや、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質等が付加された目的タンパク質が合成されるように転写鋳型ＤＮＡを作製しておき、合成後のタンパク質をアフィニティー担体を用いて精製する方法を挙げることができる。
【００５６】
本スクリーニング方法におけるスクリーニング工程に用いる方法は特に限定されるものではなく、目的の機能を評価することができる公知の方法を選択して用いればよい。例えば、ブタインターロイキン２(rpoIL-2)の生物活性を評価する場合は合成後の反応液を精製せずに培養液で希釈してIL-2依存性CTLL2細胞の培地に添加し、細胞の増殖性を測定する方法を用いることができる。また、Calf Rhodaneseの機能を評価する場合は合成後の反応液をそのまま常法(Methods Enzymol,77:285-91, 1981)に従って酵素活性を測定することができる。ただし、これに限定されるものではない。
【００５７】
２．本発明に係るキット
（１）タンパク質の機能改変スクリーニングキット
本発明に係るタンパク質の機能改変スクリーニングキット（以下、適宜「本スクリーニングキット」と略記する。）は本発明に係るタンパク質の機能改変スクリーニング方法を実施するためのキットである。本スクリーニングキットには少なくとも目的遺伝子を挿入するためのベクター、in vitro 転写用プロモーター配列および翻訳増強配列を含み上流側プライマーと下流側プライマーとに分割され上流側プライマーの３’末端の配列が下流側プライマーの５’末端の配列と重複する２種類のセンスプライマー、ベクター配列に基づくアンチセンスプライマー、ＰＣＲ反応用緩衝液、デオキシリボヌクレオシド三リン酸混合液、耐熱性ＤＮＡ合成酵素、in vitro 転写用緩衝液、ＲＮＡ合成酵素、リボヌクレオシド三リン酸混合液、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成液、エネルギー／アミノ酸混合液、in vitro 翻訳用緩衝液、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を含むことが好ましい。キットの構成としてはこれらに限定されるものではなく、使用者の便宜を考慮して種々の試薬や器具を加えればよい。例えば、ＰＣＲ用のチューブやプレート、ｍＲＮＡ合成用のチューブやプレート、タンパク質合成用のプレート等を挙げることができる。さらに、評価対象とする機能を特定することにより、本スクリーニング方法におけるスクリーニング工程に用いる試薬や器具をキットの構成として含ませることも可能である。このような構成とすることにより、評価する機能を特定した多数のキットとして、本発明に係るキットを実施することが可能となる。
【００５８】
本スクリーニングキットを用いることにより、本発明に係るタンパク質の機能改変スクリーニング方法を簡便かつ迅速に実施することが可能となり、ハイスループットなタンパク質の機能改変スクリーニングをより容易に行うことを実現できる。
【００５９】
（２）転写鋳型ＤＮＡ作製キット
本発明に係る転写鋳型ＤＮＡ作製キットは本発明に係る転写鋳型ＤＮＡの作製方法を実施するためのキットである。本転写鋳型ＤＮＡ作製キットには少なくとも目的遺伝子を挿入するためのベクター、in vitro 転写用プロモーター配列および翻訳増強配列を含み上流側プライマーと下流側プライマーとに分割され上流側プライマーの３’末端の配列が下流側プライマーの５’末端の配列と重複する２種類のセンスプライマー、ベクター配列に基づくアンチセンスプライマー、ＰＣＲ反応用緩衝液、デオキシリボヌクレオシド三リン酸混合液、耐熱性ＤＮＡ合成酵素を含むことが好ましい。キットの構成としてはこれらに限定されるものではなく、使用者の便宜を考慮して種々の試薬や器具を加えればよい。例えば、ＰＣＲ用のチューブやプレート等を挙げることができる。
【００６０】
本転写鋳型ＤＮＡ作製キットを用いることにより、本発明に係る転写鋳型ＤＮＡ作製方法を簡便かつ迅速に実施することが可能となる。
【００６１】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明に係るタンパク質の機能改変スクリーニング方法を、イネアントラニル酸シンターゼ第２アイソザイムαサブユニットの機能改変に適用した実施例を示す。
【００６３】
（１）ＰＣＲ法による変異導入
＜標的遺伝子のクローニングベクターへの挿入＞
イネアントラニル酸シンターゼ第２アイソザイムαサブユニット（以下「OASA2」と略記する）をコードする遺伝子（ACCESSION NO. AB022603）をクローニングベクターpBluescript SK+（Stratagene社製）のマルチクローニングサイトのEcoRIサイトに挿入し、pBS-OASA2を構築した。なお、挿入した遺伝子は、マルチクローニングサイトの制限酵素サイトKpnIからSacIの向きに挿入されている。
【００６４】
＜変異導入用プライマー＞
i）367番目のチロシンをアラニンに置換
OASA2の367番目のチロシン残基をアラニン残基にアミノ酸置換し、かつ、コードするアミノ酸が変化しない位置に制限酵素サイト（SnaBI:TACGTA）を導入するように変異導入プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記の通りである。なお、下線は制限酵素サイトを示し、小文字は変異導入コドンを示す。
Y367A-F：5'-GTGAACCCAAGTCCAgccATGGCATACGTACAGGCAAGAGGC-3'（配列番号２）
Y367A-R：5'-GCCTCTTGCCTGTACGTATGCCATggcTGGACTTGGGTTCAC-3'（配列番号３）
プライマーY367A-Fの16番目から18番目のgcc（アラニン、A）および25番目から30番目のTACGTA（SnaBIサイト）は、それぞれ野生型OASA2のTAC（チロシン、Y）およびTATGTAの塩基配列よりデザインした。TACをGCCとすることにより野生型OASA2の367番目のチロシン残基がアラニン残基へ置換される。また、TATGTAをTACGTAとすることによりアミノ酸置換を伴わずに（TAT、TACは共にチロシン）制限酵素サイト（SnaBI:TACGTA）が導入され、変異導入後の選抜が容易となる。プライマーY367A-RはプライマーY367A-Fの相補鎖である。
【００６５】
ii）367番目のチロシンをイソロイシンに置換
上記i）と同様に、OASA2の367番目のチロシン残基をアラニン残基にアミノ酸置換し、かつ、コードするアミノ酸が変化しない位置に制限酵素サイト（SnaBI:TACGTA）を導入するように変異導入プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記の通りである。なお、下線は制限酵素サイトを示し、小文字は変異導入コドンを示す。
Y367I-F：5'-GTGAACCCAAGTCCAatcATGGCATACGTACAGGCAAGAGGC-3'（配列番号４）
Y367I-R：5'-GCCTCTTGCCTGTACGTATGCCATgatTGGACTTGGGTTCAC-3'（配列番号５）
iii）367番目のチロシンをフェニルアラニンに置換
上記i）と同様に、OASA2の367番目のチロシン残基をフェニルアラニン残基にアミノ酸置換し、かつ、コードするアミノ酸が変化しない位置に制限酵素サイト（SnaBI:TACGTA）を導入するように変異導入プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記の通りである。なお、下線は制限酵素サイトを示し、小文字は変異導入コドンを示す。
Y367F-F：5'-GTGAACCCAAGTCCAttcATGGCATACGTACAGGCAAGAGGC-3'（配列番号６）
Y367F-R：5'-GCCTCTTGCCTGTACGTATGCCATgaaTGGACTTGGGTTCAC-3'（配列番号７）
iv）530番目のロイシンをアスパラギン酸に置換
上記i）と同様に、OASA2の530番目のロイシン残基をアスパラギン酸残基にアミノ酸置換し、かつ、コードするアミノ酸が変化しない位置に制限酵素サイト（NheI:GCTAGC）を導入するように変異導入プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記の通りである。なお、下線は制限酵素サイトを示し、小文字は変異導入コドンを示す。
L530D-F：5'-ACGGAGACATGgacATCGCGCTAGCACTCCGCACCATT-3'（配列番号８）
L530D-R：5'-AATGGTGCGGAGTGCTAGCGCGATgtcCATGTCTCCGT-3'（配列番号９）
v）367番目のチロシンをバリンに置換
上記i）と同様に、OASA2の367番目のチロシン残基をバリン残基にアミノ酸置換し、かつ、コードするアミノ酸が変化しない位置に制限酵素サイト（SnaBI:TACGTA）を導入するように変異導入プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記の通りである。なお、下線は制限酵素サイトを示し、小文字は変異導入コドンを示す。
Y367V-F：5'-GTGAACCCAAGTCCAgtcATGGCATACGTACAGGCAAGAGGC-3'（配列番号１０）
Y367V-R：5'-GCCTCTTGCCTGTACGTATGCCATgacTGGACTTGGGTTCAC-3'（配列番号１１）
＜Split-PCR用のプライマー＞
OASA2はイネの核ゲノム上にコードされている遺伝子であるが、合成されたタンパク質は葉緑体に移行して葉緑体内で機能していることが判っている。合成されたタンパク質のN末端領域には葉緑体へ移行するためのシグナル配列が存在し、その配列が除去されることで成熟型酵素となり、酵素活性を発揮する。したがって、OASA2を成熟型酵素としてコムギ胚芽無細胞合成系で合成するため、N末端領域に存在する49残基からなるシグナル配列を除去した形で合成されるようにプライマーをデザインした。すなわち、コムギ胚芽無細胞合成システムでSplit-PCRを可能とするリンカー配列の下流にATG開始コドンを配し、OASA2遺伝子の148から164番目の塩基配列からなる全長36merのプライマーをデザインした。また、OASA2が挿入されているベクター（pBluescript SK+）上に上記センスSplit-PCR用プライマーの相補鎖側の位置にSplit-PCR用アンチセンスプライマーを２種類設定した。挿入DNAの位置から遠い順にアンチセンスSplit-PCR用プライマー１およびアンチセンスSplit-PCR用プライマー２とした。Split-PCR用のプライマーの塩基配列は下記の通りである。
センスSplit-PCR用プライマー:5'-CCTCTTCCAGGGCCCAATGTGCTCCGCGGGGAAGCC-3'（配列番号１２、下線部分がリンカー配列）
アンチセンスSplit-PCR用プライマー１:5'-GGAGAAAGGCGGACAGGTAT-3'（配列番号１３）
アンチセンスSplit-PCR用プライマー２:5'-GGGGAAACGCCTGGTATCTT-3'（配列番号１４）
＜PCRによる変異導入用DNAの調製＞
OASA2遺伝子が変異導入用のプライマー領域でオーバーラップするように5'側領域と3'側領域に分けてPCRを行った。例えば、上記 i）に記載した367番目のチロシンをアラニンに置換するため変異導入用プライマーを用いる場合には、5'側領域はpBS-OASA2ベクターを鋳型とし、センスSplit-PCR用プライマーおよびプライマーY367A-Rの組み合わせでPCRを行い、3'側領域はpBS-OASA2ベクターを鋳型とし、プライマーY367A-FおよびアンチセンスSplit-PCR用プライマー１との組み合わせでPCRを行った。上記 ii）、iii）、iv）に記載の変異導入用プライマーを用いる場合も上記と同一の鋳型を用い、同様のプライマーの組み合わせによりPCRを行った。
【００６６】
上記 v）に記載の変異導入用プライマーを用いる場合は、鋳型としてpBS-OASA2ベクターに後述するKunkel法でOASA2の530番目のロイシン残基をアラニン残基にアミノ酸置換する変異を既に導入したプラスミドDNAを用いた。したがって、上記 v）に記載の変異導入用プライマー（Y367V-FおよびY367V-R）を用いてPCRを行うことにより、OASA2の367番目のチロシン残基をバリン残基にアミノ酸置換し、530番目のロイシン残基をアラニン残基にアミノ酸置換する２つの変異が導入された変異遺伝子が得られることになる。なお、プライマーの組み合わせは上記と同様である。
【００６７】
PCR反応液の組成は、1× Pyrobest buffer II (TaKaRa社)、0.2mM dNTP、0.5μM センス及びアンチセンスプライマー、0.025 units/μl Pyrobest DNA polymerase (TaKaRa社)、10ng 鋳型DNA (pBS-OASA2ベクター)とし、PCR反応装置（宝酒造社製、TaKaRa PCR Thermal Cycler MP TP3000型）を用いて、95℃で2分間保持した後、98℃で20秒間、60℃で35秒間、72℃で3分間の反応を25サイクル繰り返し、72℃で10分保持した後4℃に冷却した。
【００６８】
増幅したPCR産物(5'領域断片および3'領域断片)を20倍希釈し、PCR反応液[1× EX Taq buffer (TaKaRa社)、0.2mM dNTP、0.025 units/μl TaKaRa EX Taq (TaKaRa社)]に1μlずつ添加し、上記PCR反応装置を用いて、95℃で2分間保持した後、98℃で20秒間、60℃で35秒間、72℃で3分間の反応を5サイクル繰り返し、伸長反応を行った。この反応によりセンスSplit-PCR用プライマーからアンチセンスSplit-PCR用プライマー１まで連結されたDNA断片が合成された。
【００６９】
上記反応終了後すぐに、プライマーの終濃度がそれぞれ0.2μMになるようにセンスSplit-PCR用プライマーおよびアンチセンスSplit-PCR用プライマー１を添加し、上記PCR反応装置を用いて、95℃で2分間保持した後、98℃で20秒間、60℃で35秒間、72℃で3分間の反応を20サイクル繰り返し、72℃で10分保持した後4℃に冷却した。以上の反応により、上記センスSplit-PCR用プライマーからアンチセンスSplit-PCR用プライマー１まで連結されたDNA断片が増幅され、これを次に行うSplit-PCRの鋳型とした。
【００７０】
（２）Kunkel法による変異導入
Kunkel法は、下記の参考文献１−３に記載の方法にしたがって行った。
【００７１】
参考文献１：Kunkel, T. A. (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Science of the USA, 82: 488-492.
参考文献２：Kunkel, T. A., Bebenek, K. and McClary, J. (1991) Efficient site-directed mutagenesis using uracil-containing DNA. Methods in Enzymology, 204: 125-139.
参考文献３：「Molecular Cloning (Third Edition)」 (J. Sambrook & D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)  Chapter 13
なお、用いた変異導入用プライマーは上記ＰＣＲ法による変異導入において用いたプライマーと同一である。さらに、配列番号２〜１１に示していない変異導入法プライマーとして以下のプライマーを使用した。なお、下線は制限酵素サイト（NheI: GCTAGC）を示し、小文字は変異導入コドンを示す。
L530A-F：5'-ACGGAGACATGgctATCGCGCTAGCACTCCGCACCATT-3'（配列番号１５）
L530A-R：5'-AATGGTGCGGAGTGCTAGCGCGATagcCATGTCTCCGT-3'（配列番号１６）
Kunkel法により変異が導入されたOASA2をコードする遺伝子をpBluescript SK+に挿入し、上記センスSplit-PCR用プライマーおよびアンチセンスSplit-PCR用プライマー１を用いてPCRを行い、増幅されたDNA断片を次に行うSplit-PCRの鋳型とした。
【００７２】
（３）Split-PCR法による転写鋳型ＤＮＡの合成
上記（１）ＰＣＲ法または（２）Kunkel法で得られた断片（Split-PCR用鋳型DNA）を転写鋳型ＤＮＡとするためには、断片の5'末端上流にSP6 RNAポリメラーゼのプロモーターとタバコモザイクウイルス(TMV)由来の翻訳増強配列(オメガ配列)を付加する必要がある。そのため、Sawasakiらの方法（Sawasaki et al. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99, 14652-14657）に従い、Split-PCRを行った。すなわち、上記（１）ＰＣＲ法または（２）Kunkel法で得られたSplit-PCR用鋳型DNAを50倍希釈し、PCR反応液[1× EX Taq buffer (TaKaRa社)、0.2mM dNTP、0.025 units/μl TaKaRa EX Taq (TaKaRa社)、0.2μM SP6 promoterプライマー、1nM TMV-Omegaプライマー、0.2μM アンチセンスSplit-PCR用プライマー2]に1μl添加し、上記PCR反応装置を用いて、95℃で2分間保持した後、98℃で20秒間、60℃で35秒間、72℃で3分間の反応を35サイクル繰り返し、72℃で10分保持した後4℃に冷却した。SP6 promoterプライマーおよびTMV-Omegaプライマーの塩基配列は下記の通りである。なお、下線はSP6プロモーター配列を示し、小文字は両プライマーの重複部分を示す。
SP6 promoterプライマー：5'-GCGTAGCATTTAggtgacact-3'（配列番号１７）
TMV-Omegaプライマー：5'-ggtgacactATAGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACCTCTTCCAGGGCCCAATG-3'（配列番号１８）
（４）コムギ胚芽無細胞システム用のmRNAの合成
上記（３）で得られたPCR産物を直接鋳型として用いてmRNAを合成(転写)した。すなわち、上記（３）で得られたPCR産物を、転写反応液[80mM HEPES-KOH (pH7.8)、16mM Mg(OAc)2、10mM spermidine、10mM DTT、3mM NTP、1 unit/μl RNasin RNase inhibitor (Promega社)、1 unit/μl SP6 RNA polymerase (Promega社)]に1/10量添加した。37℃で２時間反応後、エタノール沈殿、70% エタノール洗浄を行い、適当量の滅菌水に溶解した。260 nmの吸光度を測定してRNA量を算出した。
【００７３】
（５）コムギ胚芽無細胞システムによるタンパク質合成
Sawasakiらの方法（Sawasaki et al. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99, 14652-14657）に従って上記（６）で合成したmRNAを鋳型としてタンパク質を合成した。すなわち、50μlのコムギ胚芽無細胞タンパク質合成液を入れた透析カップに上記mRNA（約30-35μg）を添加し、１ウェルあたり１mlの基質液を入れた24穴プレートに上記透析カップを浸漬し、26℃で24時間インキュベートした。
【００７４】
（６）OASA2の活性測定
イネアントラニル酸シンターゼのαサブユニットであるOASA2は、βサブユニットが供給するグルタミンのアミド基由来のアンモニアを利用してコリスミン酸からアントラニル酸を生成する。生体内でOASA2は、βサブユニットが供給するアンモニアを利用してアントラニル酸合成活性（以下、適宜「AS活性」と略記する。）を発揮するが、外部よりアンモニア、例えばNH4Clを添加することでも酵素活性を示す。
【００７５】
OASA2の活性は、周知の通りトリプトファンによってフィードバック抑制がかかるので、上記（５）のタンパク質合成反応液中からトリプトファンの除去は必須であり、また発現させたタンパク質の環境をAS活性測定用の緩衝液成分に変える必要がある。したがって、タンパク質合成反応液の成分をMicrospin G-25 columns（Amersham Biosciences社製）を用いてbuffer A（50mM Tris-HCl, pH7.6; 0.05mM EDTA; 2mM MgCl2; 0.05mM DTT; 5% グリセロール）に置換した。
【００７６】
酵素活性は、90μlの反応液（20mM Tris-HCl, pH8.3; 100mM NH4Cl, 0.5mM コリスミン酸; 10mM MgCl2)にbuffer 置換した粗抽出液を2.5μl添加して、32℃で１時間反応させた。反応は10μlの1N HClを添加することで停止させ、300μlの酢酸エチルを添加して合成したアントラニル酸を抽出した。アントラニル酸の合成量は、Wallac 1420 ARVOsx-FL（パーキンエルマーライフサイエンスジャパン社製）を用いて励起波長355 nm/蛍光(emmision)460 nmで測定した。トリプトファンに対するフィードバック阻害活性を解析する場合、反応系に終濃度10μMまたは100μMになるようにトリプトファンを添加した。
【００７７】
（７）結果
結果を図３に示した。図３から明らかなように、変異導入方法がＰＣＲ法であっても、Kunkel法であっても、同一の変異が導入されたOASA2はほぼ同様の活性を示した。また、OASA2の367番目のチロシン残基をアラニン残基、イソロイシン残基、またはフェニルアラニン残基にアミノ酸置換したOASA2変異体は、OASA2野生型と比較して活性は低いがフィードバック阻害を受けない変異体であることが判った。OASA2の367番目の530番目のロイシン残基をアスパラギン酸残基にアミノ酸置換したOASA2変異体は、フィードバック阻害を受けるがOASA2野生型と比較して活性が高い変異体であることが判った。さらに、OASA2の367番目のチロシン残基をバリン残基にアミノ酸置換し、530番目のロイシン残基をアラニン残基にアミノ酸置換したOASA2変異体は、367番目のみに変異を有する変異体より活性が高くフィードバック阻害を受けない変異体であることが判った。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明に係るタンパク質の機能改変スクリーニング方法は、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて合成可能な全てのタンパク質に適用できる。したがって、全ての分野の生物学研究および生物関連産業に利用することができる。特に、医療・医薬関連産業、農業、畜産業、食品産業、化学産業等での利用により、利用価値の高い多数の有用タンパク質の誕生に貢献することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】Sawasakiら（Sawasaki et al. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99, 14652-14657）のSplit-PCR法の手順を示す図である。
【図２】本発明に係るタンパク質の機能改変スクリーニング方法において、変異導入および転写鋳型ＤＮＡ作製を一連に行う方法の手順を示す図である。
【図３】本発明に係るスクリーニング方法を用いて、イネアントラニル酸シンターゼ第２アイソザイムαサブユニットの機能改変をスクリーニングした結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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