(57)【要約】【課題】  本発明は、メディエーターを用いて酵素を修飾することにより、酵素特性の改変を行うものである。また、本発明は、メディエーターを用いてピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を修飾することにより、酵素特性の改変を行うものである。【解決手段】  タンパク質レベルでの改変方法に着目し、酵素タンパク質を構成するアミノ酸を他の化合物で修飾することにより酵素特性を改善できるのではないかと考えた。種々検討を実施した結果、酵素のアミノ基をフェロセンカルボキシアルデヒドを用いて修飾することにより、基質特異性の向上を見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メディエーターで修飾することにより、酵素の特性を改変する方法
【請求項２】
酵素が、ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素である、請求項１に記載の方法
【請求項３】
酵素の特性が基質特異性である、請求項１あるいは２記載の方法
【請求項４】
基質特異性がグルコースに対する基質特異性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法
【請求項５】
メディエーターがフェロセンまたはフェロセン誘導体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により、特性が改変された酵素
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により、特性が改変されたグルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により、特性が改変されたグルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサー
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メディエーターを用いて酵素を修飾することにより、酵素特性の改変を行うものである。また、本発明は、メディエーターを用いてピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を修飾することにより、酵素特性の改変を行うものである。    
【背景技術】
【０００２】
酵素は、古くから食品業界や化学業界等、数多くの産業において生体触媒として利用されてきた。そして、自然界から得られる天然型の酵素は、その産業上の求めにより、安定性や基質特異性等が向上するよう人為的な改変が加えられてきた。産業用途上不十分な特性を改変する努力は、酵素の種類に限定されるものではない。酵素特性改変の手段としては、例えば、タンパク質レベルでの改変手段として、タンパク質を構成する特定のアミノ酸を他の化合物で修飾する方法がある。また、遺伝子レベルでの改変手段としては、酵素をコードする遺伝子ＤＮＡの塩基配列を改変することにより、アミノ酸の置換、付加、欠失を行う方法がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性グルコース脱水素酵素（以下ＰＱＱＧＤＨとも記載）は、Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを生成する反応を触媒する点、及び反応系の溶存酸素の影響を受けず、補酵素添加を必要としない酵素特性を有する点より、血糖の生化学診断薬はもちろん血糖センサー等幅広い用途が期待されてきた。しかしながら、マルトース等他の糖に対する反応性を有し、グルコースに対する基質特異性が低いという問題点があった。これまで遺伝子レベルでの改変手段を用いて種々の特性改良が実施されてきたが、酵素特性の改変効果は限定的なものであり、基質特異性の改変に関して不十分であった（例えば、特許文献１〜４参照。）。
【特許文献１】特開２００１−３４６５８７号公報
【特許文献２】特開２０００−３５０５８８号公報
【特許文献３】特開２０００−３１２５８８号公報
【特許文献４】特開２００１−１９７８８８号公報
【０００４】
なお、フェロセン及びフェロセン誘導体を用いて酵素を修飾した例はあるが、我々が見出したような酵素自身の特性が改変されたという記載はない。まして、ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を修飾することにより酵素特性を改変したという報告はない（例えば、特許文献５参照。）。
【特許文献５】特開平６−９０７５４号公報
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで、我々はタンパク質レベルでの改変方法に着目し、酵素タンパク質を構成するアミノ酸を他の化合物で修飾することにより酵素特性を改善できるのではないかと考えた。種々検討を実施した結果、酵素のアミノ基をフェロセンカルボキシアルデヒドを用いて修飾することにより、基質特異性の向上を見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．
メディエーターで修飾することにより、酵素の特性を改変する方法
項２．
酵素が、ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素である、項１に記載の方法
項３．
酵素の特性が基質特異性である、項１あるいは２記載の方法
項４．
基質特異性がグルコースに対する基質特異性である、項１〜３のいずれか１項に記載の方法
項５．
メディエーターがフェロセンまたはフェロセン誘導体である、項１〜４のいずれか１項に記載の方法
項６．
項１〜５のいずれか１項に記載の方法により、特性が改変された酵素
項７．
項１〜５のいずれか１項に記載の方法により、特性が改変されたグルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット
項８．
項１〜５のいずれか１項に記載の方法により、特性が改変されたグルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサー
【発明の効果】
【０００７】
上述した本発明において、実施例から明らかなように、メディエーターを用いてピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を修飾することにより、酵素特性の改変を行うものである。  
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明でいう酵素とは生体内において種々の化学反応を触媒する蛋白質を指し、由来や構造に関しては特に限定するものではない。また、触媒としての本質が失なわれない範囲で、少なくとも１つのアミノ酸を付加、欠失、挿入される等の改変が行なわれたものであっても良い。
【０００９】
本発明でいうピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素とは、ピロロキノリンキノンを補酵素として配位し、Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを生成するという反応を触媒する酵素であり、由来や構造に関しては特に限定するものではない。また、触媒としての本質が失なわれない範囲で、少なくとも１つのアミノ酸を付加、欠失、挿入される等の改変が行なわれたものであっても良い。
【００１０】
本発明でいうメディエーターとは、特に限定されないが、フェロセン、フェロセン誘導体、ｐ−ベンゾキノン、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、フェリシアン化カリウム、１−メトキシ−ＰＭＳ、があげられ、特にフェロセン、フェロセン誘導体が好ましい。フェロセン誘導体としては、特に限定されるものではないが、例えばフェロセンカルボキシアルデヒド、フェロセンモノカルボン酸、フェロセン酢酸、１，１’−ジメチルフェロセン、ヒドロキシエチルフェロセン、フェロセン１，１’−ジカルボン酸、１，１’−ビス（ヒドロキシメチル）フェロセン、クロロフェロセン、メチルトリメチルアミノフェロセンが挙げられる。
【００１１】
本発明でいう「酵素特性」とは、特に限定されないが、実用上考慮すべき特性として、反応性、安定性、Ｋｍ値、基質特異性、至適ｐＨ、至適温度からなる群より選ばれる、少なくとも一つが、代表的なものとして挙げられる。
本発明でいう「酵素特性の向上」とは、本発明を実施した場合に、適当な方法で特性を評価した結果が、本発明を実施していない場合と比べて優位なことをいう。
特性評価の方法については、当業者における常識の範囲内であり、かつ、両者の差が明らかになる条件であれば任意に設定してよいし、目的に応じて、さらに好ましい条件を選択することもできる。代表的な酵素特性については、次のような方法で評価することが好ましい。
【００１２】
本発明における反応性とは、一定条件における酵素の触媒能の程度を示す。酵素タンパク質量を基準にして考えた場合の比活性や酵素１分子を基準として考えた場合の分子活性と同義で用いる。また、反応性の向上とは一定条件における酵素の触媒能の向上を意味する。反応性は、活性測定を行ったときの測定感度等種々の公知の方法で評価することができる。
【００１３】
本発明における安定性とは、一定状態における保存後の酵素活性の残存割合で評価される。例えば、本発明を実施した場合の活性残存率が、本発明を実施していない場合と比べて高い場合、安定性が向上したと判断される。通常、安定性は低下するより向上するほうが、使用形態（キットやセンサーなど）を考えた場合、好ましい。
本発明においては、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％ＢＳＡを含むＰＩＰＥＳ―ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）中で３５℃、７日間保存を行うことが好ましい。なお、保存における、酵素の濃度は、特に限定されないが、酵素の使用目的に応じて、その酵素が本来の性能を保持できる範囲に設定されていればよい。  ＰＱＱＧＤＨの場合、好ましくは０．１〜１０  ＩＵ／ＭＬの範囲内、より好ましくは２〜５  ＩＵ／ＭＬの範囲内である。
【００１４】
本発明におけるある物質に対するＫｍ値（ミカエリス定数）は、酵素の基質となりうる物質との親和性に関連する指標の１つであり、公知の方法で測定することができる。例えばＰＱＱＧＤＨのグルコースに対するＫｍ値は、実施例２に記載の方法においてグルコースの濃度をいくつかの水準で変更した各基質濃度におけるＰＱＱＧＤＨ活性をそれぞれ測定し、ラインウィーバー  バークの式（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）よりＫｍ値を算出した。
【００１５】
本発明における比活性とは、単位重量の酵素分子あたりの活性であり、より詳しくは精製酵素１ｍｇあたりの酵素活性の単位である。
【００１６】
本発明における基質特異性とは、酵素の基質に対する選択性の幅のことである。「基質特異性が改変された」という場合、ある基質と他の１つ以上の基質に対する反応性の相対比が、改変の前後で異なることをいう。
【００１７】
本発明の、メディエーターで修飾することにより酵素の特性を改変する方法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で行なうことが可能である。
精製した未修飾のホロ型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を、フェロセン誘導体で反応しやすくするために、適当なアルカリバッファー、例えばピロリン酸溶液、リン酸溶液で、アルカリ溶液条件にする。ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素溶液に対して、メディエーター、特にフェロセン誘導体、例えばフェロセンカルボキシアルデヒドを添加し、さらに反応を固定するため還元剤、例えば水素化ホウ酸ナトリウムを添加し、酵素とシッフ塩を形成させる。反応後、適当な中性条件のバッファー、例えばリン酸溶液で透析することにより、未反応のメディエーターや還元剤を除く。このようにしてメディエーターで修飾されたピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を得ることが出来る。
なお、精製した未修飾のホロ型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素は予め公知の方法で取得すればよい。
【００１８】
メディエーターで修飾することにより、酵素の特性が改変される理由としては、次のような推論が可能である。
フェロセン誘導体を例として考えた場合、アミノ基修飾により、活性中心も含めた酵素表面にフェロセン誘導体が結合する。未修飾のＰＱＱＧＤＨの場合は、基質の酸化により伝達される電子が、酵素のＰＱＱから直接メディエーターのフェリシアン化物に伝達されなくてはならず、電位差が大きいため、電子が伝達されにくく、反応性が低い。一方、フェロセン誘導体で修飾することにより、ＰＱＱとメディエーターのフェリシアン化物との間に、中間電位のフェロセン誘導体を経ることが可能になり、電子の流れがスムーズになり、反応性が向上する。また、基質特異性については、修飾により活性中心を含めた酵素表面がメディエーターで覆われるため、基質結合などにおける立体的な制約がより厳密になる可能性が考えられる。このために、フェロセン修飾により反応性や基質特異性の向上が生じたと考えられる。
【００１９】
上記の推論より、本発明において、修飾は酵素表面において直接行なわれることが好ましい。より好ましくは活性中心付近において行なわれることが好ましい。あるいは別の見方では、本発明において、修飾は酵素表面から修飾するメディエーター分子の大きさを超えない距離以内で行なわれることが望ましい。したがって、酵素およびメディエーター以外に由来するスペーサーを介して修飾を行なった場合や、糖鎖などの側鎖を持つ酵素の場合にその側鎖に修飾を行った場合は、活性中心とメディエーター間で距離があるため、電子が伝達されにくく反応性が低いと考えられるので、この様な方法は選択しないことが好ましい。また、酵素およびメディエーター以外に由来するスペーサーを介して修飾を行なう場合は、工程が増えることにより操作が煩雑となる、修飾酵素を得る全工程の収率が低下する、などの問題点があると考えられるので、この様な方法は選択しないことが好ましい。
【００２０】
さらに、本願発明の酵素の特性を改変する方法において、例えば、尿素処理により立体構造をほどいた上で、中性条件下でフェロセン誘導体を反応させた場合（例えば、特許文献５を参照。）では、立体構造内部のアミノ基を修飾するために、酵素活性に必要なアミノ酸残基までも修飾する可能性が高く、修飾後に活性を有する立体構造を形成できず、酵素失活を引き起こす。すなわち、フェロセン誘導体反応後に活性を有する修飾酵素を得る可能性は低い。
【００２１】
１つの好ましい方法として、修飾後に酵素失活を引き起こすことのないように、立体構造を保ったままフェロセン誘導体を反応させる方法が挙げられる。すなわちフェロセン誘導体が反応しやすいアルカリ条件下（弱アルカリ、ｐＨ１０付近）にすることで、酵素の立体構造を保ったまま反応させる。
【００２２】
反応させる酵素濃度は、５０ｍｇ/ｍｌ以下が望ましい。酵素濃度が濃すぎると不溶化の原因となる。また、修飾させるフェロセン誘導体としては、フェロセンカルボキシアルデヒド、フェロセンモノカルボン酸、フェロセン酢酸、１，１’−ジメチルフェロセン、ヒドロキシエチルフェロセン、フェロセン１，１’−ジカルボン酸、１，１’−ビス（ヒドロキシメチル）フェロセン、クロロフェロセン、メチルトリメチルアミノフェロセンが挙げられるが、特にフェロセンカルボキシアルデヒドを用いることが望ましい。反応に添加するフェロセン誘導体は、反応する酵素の酵素濃度とアミノ基数から判断して、アミノ基を充分修飾する量であればよい。例えば、配列番号１記載のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素の場合、１０ｍｇ/mlの酵素濃度は約０．１ｍＭ相当であり、また反応対象のリジン残基が全４５５アミノ酸中３３残基存在する。１０ｍｇ/mlの酵素濃度を例とすると、少なくとも１．５ｍＭ（０．１×４５５/３３≒１．５）のフェロセン誘導体、望ましくはそれ以上、出来れば５ｍＭ濃度のフェロセン誘導体、を反応させればよい。その際、バッファー条件としては、ｐＨ１０付近のアルカリ条件が望ましく、ピロリン酸バッファーが例として挙げられる。バッファー濃度は、充分な緩衝能を示すバッファー濃度でなくてはならず、１０ｍＭ〜１００ｍＭが望ましい。
反応条件は、厳格に規定しなくてもよく、反応温度は室温、一般的には１５℃〜３０℃であればよく、反応時間は、５〜３０分、望ましくは５分以上１５分以下、で充分である。
修飾反応後、反応を固定化するために、還元剤を添加する必要性があるが、一般的には反応に使用したフェロセン誘導体と等量の還元剤を添加する。固定化の反応は速やかに終了するため、特に規定する必要性もないが、１分程度で充分である。
固定化反応後、未反応のフェロセン誘導体や還元剤を除去する必要性があるが、中性条件のバッファー、例えばｐＨ７．０のリン酸バッファーやＰＩＰＥＳバッファーを用いて透析を行えばよい。その際、温度条件は低温、特に１０℃以下が望ましい。
【００２３】
この条件においてもなお、活性中心も含めた酵素表面のアミノ基すべてが外部に提示されているが、変性を加えないマイルドな条件であるので、できるだけ酵素失活を引き起こさず好ましいと考えられる。さらにこの条件では、アミノ基の電位の高いリジン残基のアミノ基が優先的に修飾されると考えられるので、高収率で特性が改変された酵素を得ることができ好ましいと考えられる。なお、修飾反応の程度のコントロールは、メディエーターと酵素それぞれの濃度およびその比率、バッファー（種類、反応ｐＨ、濃度など）、還元剤（種類、反応ｐＨ、濃度など）、および各工程の温度、時間などを適宜選択できる。
【００２４】
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う修飾されたピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うグルコース脱水素酵素を少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のグルコース脱水素酵素に加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従うグルコース脱水素酵素は種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００２５】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従うピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明のグルコース脱水素酵素はホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ピロロキノリンキノンを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のグルコース脱水素酵素をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱおよび配位金属、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のグルコース脱水素酵素を固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。  
【実施例】
【００２６】
以下、フェロセンカルボキシアルデヒドを用いてピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を修飾した実施例により、本発明を具体的に説明する。言うまでもなく本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞修飾ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素の取得
アシネトバクター  バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）  ＮＣＩＭＢ１１５１７株由来のホロ型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素の精製標品約１０ｍｇ／ｍｌ（１０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ，ｐＨ７．０）を、１００ｍＭ  ピロリン酸溶液（ｐＨ１０．０）で４倍希釈後、１００ｍＭ  フェロセンカルボキシアルデヒド（５０％  エタノールで溶解）を１／２０量添加した。室温で１０分間ゆるやかに攪拌後、終濃度約５ｍＭとなるように水素化ホウ酸ナトリウムを添加し、反応を完了した。その後、５０ｍＭ  リン酸溶液（ｐＨ７．０）で透析を実施した。より具体的には、酵素溶液の１００倍量のバッファー中で、８時間ないし１６時間間隔で３度バッファーを交換した。このようにして未反応のフェロセンカルボキシアルデヒドを除去した後、修飾ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を回収した。
＜式１＞本反応を化学式で記載
Ｆｅ（Ｃ５Ｈ５）（Ｃ５Ｈ４）−ＣＨＯ  ＋  Ｈ２Ｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ
←→  Ｆｅ（Ｃ５Ｈ５）（Ｃ５Ｈ４）−ＣＨ＝Ｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＋  Ｈ２Ｏ
Ｆｅ（Ｃ５Ｈ５）（Ｃ５Ｈ４）−ＣＨ＝Ｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＋２Ｈ  
→  Ｆｅ（Ｃ５Ｈ５）（Ｃ５Ｈ４）−ＣＨ２−ＮＨ−Ｐｒｏｔｅｉｎ
（注）Ｈ２Ｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎとは酵素タンパクのアミノ基を指す。
なお、本反応に使用したピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に、ＤＮＡ配列を配列表の配列番号２に示す。
＜実施例２＞修飾ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素の酵素特性確認
修飾ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素の比活性、Ｋｍ値、基質特異性を確認した。以下に活性測定法、各特性確認法、及びその結果を示す。
ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素活性の測定方法
・  測定原理
（ＰＱＱＧＤＨ）
Ｄ−グルコース＋フェリシアン化物イオン→  
Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン  ＋  フェロシアン化物イオン
フェリシアン化物イオンの還元により生じたフェロシアン化物イオンの存在は、分光光度法により波長４２０ｎｍでの吸光度の減少を測定することで確認した。
・  単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たり１ミリモルのＤ−グルコースを酸化させるピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素の酵素量をいう。
（３）方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：１Ｍ（１．８ｇ  Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液，  ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ  ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加える。５Ｎ  ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．フェリシアン化カリウム溶液：５０ｍＭ（０．１６５ｇ  フェリシアン化カリウム（分子量３２９．２５）／  １０ｍｌ  Ｈ２Ｏ）
Ｄ．蒸留水
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ  ＣａＣｌ２，  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ０．１％  ＢＳＡを含む５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
・  遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用事調製）
０．９ｍｌ  Ｄ−グルコース溶液                            （Ａ）
２５．５ｍｌ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）      （Ｂ）
２．０ｍｌ  フェリシアン化カリウム溶液                    （Ｃ）
１．０ｍｌ  蒸留水                                        （Ｄ）
【００２７】
【表１】
2005073631.tif 000002
【００２８】
・  ３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
・  ０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに混合した。
・  ４２０ｎｍでの水に対する吸光度の減少を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分間当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト）
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
酵素溶液は、アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で１．０Ｕ／ｍｌ程度に希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
体積活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト−  ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（１．０４×１．０×Ｖｓ）
重量活性（Ｕ／ｍｇ）＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（０．１ｍｌ）
１．０４：フェリシアン化カリウムのミリモル分子吸光係数
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ  ｍｇ／ｍｌ）
【００２９】
比活性の測定
単位液量あたりのタンパク含量をＢｒａｄｆｏｒｄ法プロテインアッセイキット（Ｂｉｏｒａｄ社製）を用いて測定した。上記活性測定法により単位液量あたりの活性値を測定し、単位液量あたりの活性値を単位液量あたりのタンパク含量で割ることで、ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素の比活性を求めた。
なお、ｐＨ４．０条件での比活性の測定においては、上記（Ｂ）試薬をＡｃｅｔａｔｅ緩衝液，ｐＨ４．０に変更して、実施した。
結果：修飾ＰＱＱＧＤＨでの比活性向上、特に中性条件での比活性向上が確認された。
【００３０】
【表２】
2005073631.tif 000003
【００３１】
Ｋｍ値の測定
上記活性測定法において、反応試薬中のグルコース濃度を０．１ｍＭから１．７ｍＭへと段階的に変化させ、各基質濃度とその時の酵素活性値より、ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素のＫｍ値を測定した。
結果：修飾ＰＱＱＧＤＨと未修飾ＰＱＱＧＤＨとの差は認められない。
【００３２】
【表３】
2005073631.tif 000004
【００３３】
基質特異性の測定
上記活性測定法において、グルコースの代わりに種々の糖類を基質として用い、アッセイ混合物中の基質濃度を０．２ｍＭとした上で酵素活性を測定した。基質としてグルコースを用いた時の活性値と、各糖を基質として用いた時の活性値とを比較し、グルコースに対する作用性を１００％とした時の他の糖に対する作用性を求めた。
結果：修飾ＰＱＱＧＤＨでは、他の糖に対する作用性低下が確認された。すなわち、グルコースに対する基質特異性の向上が確認された。
【００３４】
【表４】
2005073631.tif 000005
【００３５】
＜実施例３＞アミノ基の修飾率確認
修飾ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素の修飾率を、アミノ基を定量することにより測定した。
単位液量あたりのタンパク含量を、塩基性アミノ酸を利用しないＬｏｗｒｙ法プロテインアッセイキット（Ｐｉｅｃｅ社製）を用いて測定した。一方、単位液量あたりのアミノ基定量は次の通り実施した。０．５ｍｌ  酵素希釈溶液（１．０ｍｇ／ｍｌ程度に希釈したもの）に対して、等量の４％  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５）と同じく等量の０．１％  ＴＮＢＳ（２，４，６−ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）を添加し、４０℃、２時間遮光して反応した。２時間後、０．５ｍｌの１０％  ＳＤＳと０．２５ｍｌの１Ｎ  ＨＣｌを添加して反応を停止し、３４４ｎｍの吸光度を測定することにより、アミノ基量を測定した。
単位液量あたりのタンパク含量とアミノ基量から、未修飾ＰＱＱＧＤＨ、修飾ＰＱＱＧＤＨ各々の単位タンパク量あたりのアミノ基量を求めることができ、その比より修飾ＰＱＱＧＤＨのアミノ基の修飾率を求めることが出来る。
結果：アミノ基の修飾を確認した。上述したＰＱＱＧＤＨの特性変化が本発明で主張する酵素修飾によるものであることを裏づけるものである。
【００３６】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明の酵素の特性を改変する方法は、その基質特異性などの酵素特性に優れ、かつ、簡便性、収率などの経済性にも優れるため、体外診断用医薬品などの用途分野に利用することができ、産業界に寄与することが大である。
【配列表】
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