(57)【要約】【課題】新規な生理活性作用を探索するための、新規硫酸化ポリフコースを提供する。【解決手段】棘皮動物よりクロロホルムとメタノールとの混合液を用いて抽出した画分から溶媒を除去し、水に溶解させる過程を含む工程により調製される、下記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）で示される糖残基から構成され、（Ａ）を２８〜３８モル％、（Ｂ）を２８〜３８モル％及び（Ｃ）を２８〜３８モル％含有する分岐を有する硫酸化ポリフコース。【化１】2005036031.tif 000016【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）で示される糖残基から構成され、（Ａ）を２８〜３８モル％、（Ｂ）を２８〜３８モル％及び（Ｃ）を２８〜３８モル％含有する分岐を有する硫酸化ポリフコース。
【化１】
2005036031.tif 000014
ＲはＨ又はＳＯ３Ｈを示す。
【請求項２】
下記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）で示される糖残基から構成され、分子中の下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の構成モル比が下記の（１）及び（２）の条件である分岐を有する硫酸化ポリフコース。
（１）（Ａ）／（Ｂ）＝１．３６〜０．７４
（２）（Ｂ）／（Ｃ）＝１．３６〜０．７４
【化２】
2005036031.tif 000015
ＲはＨ又はＳＯ３Ｈを示す。
【請求項３】
脱硫酸化反応に付した後、部分メチル化アルジトールアセテイトに変換し、これをガスクロマトグラフィー−質量スペクトル分析で分析することにより、２，３，４−ｔｒｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｆｕｃｉｔｏｌ、２，４−ｄｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｆｕｃｉｔｏｌ及び２−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｆｕｃｉｔｏｌが各々３３±５モル％の割合で検出される、分岐を有する硫酸化ポリフコース。
【請求項４】
フコース１分子に対する硫酸基の割合が平均０．４〜１．０分子である請求項１〜３記載の分岐を有する硫酸化ポリフコース。
【請求項５】
棘皮動物よりクロロホルムとメタノールとの混合液を用いて抽出した画分から溶媒を除去し、水に溶解させた水溶液より得ることが出来る分岐を有する硫酸化ポリフコース。
【請求項６】
請求項１〜５記載の分岐を有する硫酸化ポリフコースを有効成分とする破骨細胞形成抑制剤。
【請求項７】
棘皮動物よりクロロホルムとメタノールとの混合液を用いて抽出した画分から溶媒を除去し、水に溶解させる過程を含む分岐を有する硫酸化ポリフコースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規構造を有する硫酸化ポリフコース及びその製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、硫酸化ポリフコースは、一般的にはフコイダンとも呼称され、その生理活性作用が注目されており、例えば、海洋褐藻類から熱水抽出により得られ、抗凝固、抗血栓、抗炎症、抗腫瘍、避妊、抗ウィルス等の作用を有するものが数々報告されている。
【０００３】
中でも褐藻類であるＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来の硫酸化ポリフコースは最も良く研究されており、構成糖であるフコースのＯ−４位が部分的に硫酸化されているα（１→３）結合フコピラノース残基の繰り返し構造を基本骨格（主鎖）とし、基本骨格を構成するフコース残基のＯ−２位及び／又はＯ−４位にフコース残基から成る側鎖を有する下記分子構造の繰り返し構造を有する。また、血管内皮へのセレクチンを介するロイコサイトの吸着を阻害する等の特異的な細胞吸着阻害作用を持つことが報告されている（非特許文献１）。なお、既にＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来の硫酸化ポリフコースは市販もされている。以下、分子構造を表す式においてフコース残基をＦｕｃで、硫酸基はＳで、グリコシド結合は→で表すこともある。
【０００４】
【化３】
2005036031.tif 000002
【０００５】
同じく褐藻類のＡｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ由来の硫酸化ポリフコースは直鎖構造である事が報告されており、また、Ｃｈｏｒｄａ  ｆｉｌｕｍ由来硫酸化ポリフコースの分子構造は分岐を有する下記分子構造の繰り返し構造を有することが報告されている（非特許文献２）。これら硫酸化ポリフコースは構成糖としてフコースのみを含んでいる。
【０００６】
【化４】
2005036031.tif 000003
【０００７】
また、構成糖としてフコース以外の糖を含む硫酸化ポリフコースも報告されており、中でも褐藻類のＳａｒｇａｓｓｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ由来やＥｃｋｌｏｎｉａ  ｋｕｒｏｍｅ由来の硫酸化ポリフコースの分子構造について研究されているが、いずれも、構造が高度にヘテロジーナスである為、部分構造のみが報告されている（非特許文献３、非特許文献４）。
【０００８】
一方、抗凝固活性などの作用を有する海産無脊椎動物由来の硫酸化ポリフコースも報告されているが、現在までにはいずれも直鎖構造のものしか報告されていない。例えば、ナマコ（Ｌｕｄｗｉｇｏｔｈｕｒｅａ  ｇｒｉｓｅａ）由来の硫酸化ポリフコースの分子構造は、α（１→３）結合フコピラノース残基の繰り返し構造から成る基本骨各を有し、基本骨格を構成しているフコース残基一つおきにフコース残基のＯ−２位が硫酸化している直鎖構造である。ウニ（Ａｒｂａｃｉａ  ｌｉｘｕｌａ）由来の硫酸化ポリフコースの分子構造は、基本骨格を構成するフコースのＯ−２位が部分的に硫酸化されているα（１→４）結合フコピラノース残基の繰り返し構造から成る下記構造を有する。
【０００９】
【化５】
2005036031.tif 000004
【００１０】
また、ウニ（Ｌｙｔｅｃｈｉｎｕｓ  ｖａｒｉｅｇａｔｕｓ）由来の硫酸化ポリフコースの分子構造は、前述のナマコ（Ｌｕｄｗｉｇｏｔｈｕｒｅａ  ｇｒｉｓｅａ）由来の硫酸化ポリフコースとは基本骨格を構成するフコースの硫酸化の位置が異なり、α（１→３）結合フコピラノース残基の繰り返し構造から成る下記構造を有していると報告されている（非特許文献５）。
【００１１】
【化６】
2005036031.tif 000005
【００１２】
【非特許文献１】Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６８（１９９３），  ２１７７０−２１７７６
【非特許文献２】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．，  ３２０（１９９９）  ，  １０８−１１９
【非特許文献３】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．，  ３３３（２００１），  ２８１−２９３
【非特許文献４】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．，  ２１１（１９９１），  ７７−９０
【非特許文献５】Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７４（１９９０），  ７６５６−７６６７
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
近年、その多様な生理活性作用により注目されている硫酸化ポリフコースについて、特異な構造を有する硫酸化ポリフコースを探し出し、その生理活性を応用することが期待されていた。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、特定の原料を選択し、従来から用いられている抽出方法とは異なる新たな抽出方法の検討を行い、当該抽出方法にて得られた物質の構造及び作用について鋭意研究を行った。その結果、本発明者は、クロロホルム／メタノール混合液を用いる抽出方法により、棘皮動物、特にナマコ体壁より抽出される硫酸化ポリフコースが新規構造を有し、更に、当該硫酸化ポリフコースが破骨細胞の形成を抑制する作用を有することを見出し、本発明に至った。
【００１５】
すなわち、本発明は以下（１）〜（７）の通りである。
（１）下記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）で示される糖残基から構成され、（Ａ）を２８〜３８モル％、（Ｂ）を２８〜３８モル％及び（Ｃ）を２８〜３８モル％含有する分岐を有する硫酸化ポリフコース。
【化７】
2005036031.tif 000006
ＲはＨ又はＳＯ３Ｈを示す。
（２）下記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）で示される糖残基から構成され、分子中の下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の構成モル比が下記の（ｉ）及び（ｉｉ）の条件である分岐を有する硫酸化ポリフコース。
（ｉ）（Ａ）／（Ｂ）＝１．３６〜０．７４
（ｉｉ）（Ｂ）／（Ｃ）＝１．３６〜０．７４
【化８】
2005036031.tif 000007
ＲはＨ又はＳＯ３Ｈを示す。
（３）脱硫酸化反応に付した後、部分メチル化アルジトールアセテイトに変換し、これをガスクロマトグラフィー−質量スペクトル分析で分析することにより、２，３，４−ｔｒｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｆｕｃｉｔｏｌ、２，４−ｄｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｆｕｃｉｔｏｌ及び２−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｆｕｃｉｔｏｌが各々３３±５モル％の割合で検出される、分岐を有する硫酸化ポリフコース。
（４）フコース１分子に対する硫酸基の割合が平均０．４〜１．０分子である（１）〜（３）記載の分岐を有する硫酸化ポリフコース。
（５）棘皮動物よりクロロホルムとメタノールとの混合液を用いて抽出した画分から溶媒を除去し、水に溶解させた水溶液より得ることが出来る分岐を有する硫酸化ポリフコース。
（６）（１）〜（５）記載の分岐を有する硫酸化ポリフコースを有効成分とする破骨細胞形成抑制剤。
（７）棘皮動物よりクロロホルムとメタノールとの混合液を用いて抽出した画分から溶媒を除去し、水に溶解させる過程を含む分岐を有する硫酸化ポリフコースの製造方法。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
本発明の硫酸化ポリフコースとは、実質的に下記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）で示される構造を有するフコース残基で構成され、部分的に構成糖であるフコースの水酸基が硫酸化されている分岐を有する硫酸化ポリフコース（以下、本発明物質ともいう）である。
【００１７】
【化９】
2005036031.tif 000008
【００１８】
ＲはＨ又はＳＯ３Ｈを示す。
【００１９】
本発明物質は、構成糖である上記式（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）で示される糖残基をそれぞれ、好ましくは２８〜３８モル％ずつ含有し、より好ましくは３０〜３６％ずつ含有し、最も好ましくは３１〜３５モル％ずつ含有する。
【００２０】
硫酸化ポリフコースの硫酸化されうる部位としては、基本的に結合に関与していないヒドロキシル基が挙げられるが、本発明物質としては、構成糖である上記式（Ａ）及び（Ｂ）で示される糖残基に於いてはＯ−２位のヒドロキシル基、上記式（Ｃ）で示される糖残基に於いてはＯ−２位及び／又はＯ−４位のヒドロキシル基が挙げられる。また、本発明物質では、構成するフコース１分子に対する硫酸基の割合は平均０．４〜１．０分子が好ましく、平均０．６〜０．８５分子がより好ましく、更には平均０．６５〜０．７５が最も好ましい。
【００２１】
本発明物質は、脱硫酸化させた本発明物質から自体公知の方法によるメチル化、加水分解、還元した後、アセチル化して、部分メチル化アルジトールアセテイト（以下、ＰＭＡＡともいう）に変換し、得られたＰＭＡＡについてガスクロマトグラフィー−質量スペクトル分析（以下ＧＣ−ＭＳともいう）を行うと（以下、ＰＭＡＡを合成し、当該ＰＭＡＡについてＧＣ−ＭＳ分析を行うことをメチル化分析ともいう）、２，３，４−ｔｒｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ  ｆｕｃｉｔｏｌ（以下、Ｔ−Ｆｕｃｉｔｏｌともいう）、２，４−ｄｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｆｕｃｉｔｏｌ（以下、３−Ｆｕｃｉｔｏｌともいう）及び２−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｆｕｃｉｔｏｌ（以下、３，４−Ｆｕｃｉｔｏｌともいう）の３種類のＰＭＡＡが検出される。なお、検出されるＴ−Ｆｕｃｉｔｏｌ、３−Ｆｕｃｉｔｏｌ及び３，４−Ｆｕｃｉｔｏｌは好ましくは各々２８〜３８モル％の割合であり、より好ましくは各々３０〜３６モル％の割合であり、更に好ましくは３１〜３５モル％の割合である。
【００２２】
上述の脱硫酸化された本発明物質から合成されるＰＭＡＡについてＧＣ−ＭＳ分析を行う上述のメチル化分析は、後述の実施例に記載の方法にて行うことが可能であるが、脱硫酸化された本発明物質から常法に従ってＰＭＡＡを合成し得る方法であれば特に限定されず、得られたＰＭＡＡについて通常用いられているＧＣ−ＭＳ分析を行うことができる。
【００２３】
一例としては、本発明物質をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ−１２０の様な陽イオン交換クロマトグラフィーに付し、溶出画分の酸性画分に対しピリジン等を添加し中和した後、一般的に行われる脱硫酸化反応、例えばジメチルスルホキシド等を用いたソルボリシス反応を行い、本発明物質の脱硫酸化物を得る。次に、当該物質からＰＭＡＡが合成出来る方法であれば特に限定はされないが、Ｈａｋｏｍｏｒｉの方法（Ｈａｋｏｍｏｒｉ，  Ｓ．（１９６４）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （Ｔｏｋｙｏ），５５，  ２０５−２０８）を一部改変したＳａｎｆｏｒｄとＣｏｎｒａｄの方法（Ｓａｎｆｏｒｄ，  Ｐ．Ａ．  ＆  Ｃｏｎｒａｄ，  Ｈ．Ｅ．（１９６６）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ５，  １５０８−１５１７）にてメチル化誘導体を合成し、続いてＷａｅｇｈｅらの方法（Ｗａｅｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．，  １２３，  ２８１−３０４）で脱塩、トリフルオロ酢酸等を用いて加水分解、重水素化ホウ素ナトリウム等を用いて還元した後、アセチル化を行う方法を用いてＰＭＡＡを得、得られたＰＭＡＡについてＧＳ−ＭＳ分析を行う方法が挙げられる。この方法により本発明物質のグリコシド結合様式が解析できる。
【００２４】
一方、前述の方法と同様に、脱硫酸化を行わない本発明物質からＰＭＡＡを合成し、ＧＣ−ＭＳ分析を行うメチル化分析においては、Ｔ−Ｆｕｃｉｔｏｌ、３，４−ｄｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｆｕｃｉｔｏｌ（以下２−Ｆｕｃｉｔｏｌともいう）、３−Ｆｕｃｉｔｏｌ、２，３−ｄｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｆｕｃｉｔｏｌ（以下４−Ｆｕｃｉｔｏｌともいう）、４−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｆｕｃｉｔｏｌ（以下２，３−Ｆｕｃｉｏｌともいう）、３−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｆｕｃｉｔｏｌ（以下２，４−Ｆｕｃｉｔｏｌともいう）、３，４−Ｆｕｃｉｔｏｌ及びｆｕｃｉｔｏｌ（以下２，３，４−Ｆｕｃｉｔｏｌともいう）の８種類のＰＭＡＡが検出される。
【００２５】
本発明物質から合成されるＰＭＡＡと脱硫酸化された本発明物質から合成されるＰＭＡＡに基づくメチル化分析の結果から、本発明物質は、フコース同士がα１→３グリコシド結合している構造とフコース同士がα１→４グリコシド結合している構造をもつことが確認された。また、後述の実施例に詳説の通り、本発明物質に関する分析結果を考察すると、本発明物質は、フコース同士がα１→３グリコシド結合（Ｆｕｃα１→３Ｆｕｃ）により伸長した直鎖構造を基本骨格（主鎖）とし、基本骨格を構成するフコースのほぼ１つおきにフコースからなる側鎖がα１→４グリコシド結合（Ｆｕｃα１→４Ｆｕｃ）により存在し分岐構造を形成している硫酸化ポリフコースであり、下記構造を有すると考えらる。
【００２６】
【化１０】
2005036031.tif 000009
【００２７】
ＲはＨ又はＳＯ３Ｈを示し、ｎは８〜１６を示す。
【００２８】
中でも、本発明物質は下記構造が特に好ましく挙げられる。
【００２９】
【化１１】
2005036031.tif 000010
【００３０】
ｎは２〜４を示す。
【００３１】
本発明物質の分子量は特に限定されるものでは無いが、その重量平均分子量は、３，０００〜６０，０００が好ましく、５，０００〜４０，０００がより好ましく、更には７，０００〜３５，０００が最も好ましい。
【００３２】
本発明物質を天然資源から単離精製する場合に用いられる原料としては、棘皮動物が挙げられ、中でもナマコ類が好ましく、マナマコ（Ｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）が特に好ましい。なお、現在、これらナマコ類動物は、ごく一部が食用に供されてはいるが、殆ど利用されていない未利用資源である。
また、本発明物質を抽出する棘皮動物の部位、臓器、組織についても、本発明物質が抽出される形態で含まれる限り限定されないが、特に体壁部が好ましい。
【００３３】
本発明物質は、クロロホルムとメタノールとから成る混合液による抽出方法を用いる事により棘皮動物から抽出することが出来る。つまり、本発明物質は、棘皮動物からクロロホルムとメタノールとからなる混合液により抽出した画分につき、当該画分の有機溶媒を除去し乾固させ、得られた乾固物を蒸留水に溶解させることにより得られる水溶液より得る事が可能である。
なお、本発明物質を抽出する溶媒は上記のクロロホルム／メタノールに限定されず、同様の機能を有する溶媒を用いることが出来る。
【００３４】
更に、得られた水溶性画分に３倍量〜１０倍量のエタノールを添加する事により本発明物質を含む沈殿を得、得られた沈殿を硫酸化フコースの様な多糖類の精製に一般的に用いられるセファロースＣＬ−６Ｂ、セファデックスＧ−１００、セルロファインＧＣＬ−９０、ＤＥＡＥ−セルロースの様な担体を用いたクロマトグラフィー等を利用することにより精製を行い、本発明物質を精製することが出来る。尚、ゲル濾過などによる精製の際、目的とする本発明物質を含有する溶出画分であるかどうかを検出する方法としては、本発明物質を特異的に検出する方法であれば特に限定されないが、本発明物質を構成しているフコース、つまり中性糖の検出方法の利用が考えられ、通常知られている中性糖の検出方法を適用することが可能である。
【００３５】
例えば、フェノール硫酸法、オルシノール硫酸法、システイン硫酸法及びアンスロン法等が挙げられるが、中でも好ましくは、中性糖と硫酸及びアンスロン試薬との反応により生成する発色物質の吸光度を６２０ｎｍで検出する事に基づくアンスロン法（Ｔｓｉｇａｎｏｓ，  Ｃ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｍｕｉｒ，  Ｈ．  （１９６６）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １７，  ４９５−５０１やＤｉｍｌｅｒ，  Ｒ．Ｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９５２）  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２４，  １４１１−１４１４）が挙げられる。
【００３６】
尚、本発明物質の物性は、クロロホルム／メタノール／蒸留水混合液及び蒸留水に溶解性を有し、エタノールには不溶である。
【００３７】
棘皮動物より本発明物質を得る一例を記載する。原料となるナマコ類の体壁を細分化した後、ホモジナイズし、クロロホルム／メタノール混合液（２：１）を加え、本発明物質を含むクロロホルム／メタノール画分を得る。次に、当該画分をロータリーエバポレーターにより濃縮乾固させ、得られた乾固物に蒸留水を加え放置し、表層に浮遊した脂肪を除去した後、冷却下にて３倍量のエタノールを添加し、遠心分離により本発明物質を含有する沈殿を得る。
【００３８】
引き続き行う精製方法の一例としては、セファロースカラムを用い０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムにより溶出し、アンスロン法による比色定量（６２０ｎｍ）による吸光度を測定することにより溶出曲線を描き、アンスロン法陽性の画分を得る。次いで、得られた画分を脱塩する為、セルロファインカラムに付し蒸留水により溶出し、アンスロン法による比色定量（６２０ｎｍ）及び２１０ｎｍ（脱塩処理完了を判別の為）による吸光度を測定することにより溶出曲線を描き、目的である本発明物質を含むアンスロン法陽性の画分を得、当該画分を凍結乾燥する。更に精製を行う為、凍結乾燥した画分を緩衝液に溶解し、ＤＥＡＥセルロースカラムに付し、１．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含まない酢酸緩衝液と１．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む酢酸緩衝液の直線的濃度勾配により溶出を行い、アンスロン法による比色定量（６２０ｎｍ）による吸光度を測定することにより溶出曲線を描き、現れた２本のピークのうち溶出順が早いピークの画分を合一し、前述と同様にセルロファインカラムにより脱塩する事により精製された本発明物質を得ることが出来る。
【００３９】
本発明物質は、後述の実施例に記載の通り、マウス骨髄細胞を用いた破骨細胞形成の実験系において、破骨細胞の形成を有意に抑制する。これより、本発明物質は骨粗鬆症に代表される代謝性骨疾患やリウマチ、歯周病の様な炎症性骨疾患等、特に破骨細胞の機能が異常に亢進することにより引き起こされる疾患の予防と治療に用いることが出来る。
【００４０】
尚、本発明物質は、上述の様に天然資源から抽出、精製したものでも構わないが、本発明物質が有する構造上及び生理活性状の特性を満たすものであれば、天然資源から得られた物質を原料として化学的手法により改変したもの、人工的に化学合成したもの、遺伝子工学的に動物細胞、植物細胞及び微生物等により合成させたものでも構わない。
【００４１】
本発明物質を上記疾患の予防や治療に用いる場合、本発明物質の有する破骨細胞形成抑制作用を実質的に損なわず、又、投与対象に対し悪影響を示さない限りにおいて、本発明物質はその薬理学的に許容されうる塩の形で用いる事も可能である。薬理学的に許容されうる塩としては前述の条件を満たしていれば特に限定されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またピリジン塩、ジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩などのうち薬理学的に許容されるものが挙げられ、特にナトリウム塩が好ましい。
【００４２】
また同様に、本発明物質を上記疾患の予防や治療に用いる場合、本発明物質の有する破骨細胞形成抑制作用を実質的に損なわず、投与対象に対し悪影響を示さない限りにおいて、他の薬効成分や製剤時に通常用いられる賦形剤、結合剤、保存剤、安定化剤などを適宜用いる事が可能である。本発明物質を含有する骨疾患治療剤の剤型及び投与経路としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、注射剤、液剤、リポ化剤、ゲル化剤、軟膏剤等に製剤化して、経口、注射、塗布等の投与経路のうち、治療対象となる疾患の性質や重篤度に応じて適宜選択することが可能である。
【００４３】
尚、本発明物質を含有する骨疾患治療剤の投与量は、その製剤の投与方法、投与形態、投与対象患者の体重や具体的症状等に応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定はされないが、本発明物質として１日当たり概ね０．１ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ程度を、１日１回〜数回に分けて投与する事が考えられる。
更に、本発明物質は、破骨細胞形成抑制剤としてｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの系でも用いる事が出来る。
【００４４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
実施例１  硫酸化ポリフコースの製造
マナマコ（Ｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）体壁背部（１０ｋｇ、水分含量９０％ｗ／ｗ）をミンチ状に処理した後、ホモジナイズし、クロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）抽出により脂溶性画分を得た。この画分をロータリーエバポレーターを用い減圧下で濃縮・乾固させた。得られた乾固物に蒸留水（３００ｍＬ）を加えて水溶液とした後、４℃にて一晩放置した。次いで、表層に浮遊した脂肪を除去した水溶液に対し冷却下にて３倍量のエタノールを添加し、遠心分離にかけ沈殿物を得た。この沈殿物を少量の蒸留水に溶解した後、凍結乾燥を行い、低極性と目される多糖類の粗画分（２．４６ｇ）を得た。
【００４５】
この粗画分から１ｇを取り、０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液７ｍＬに溶解し、０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液で平衡化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂカラム（内径３．４×１１０ｃｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に付した。０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液を用いて溶出を行い、１２ｍＬ毎に分画した。得られた１００画分につき、アンスロン法による比色定量（６２０ｎｍで測定）及び２１０ｎｍ（ペプチドの検出）、２８０ｎｍ（タンパク質の検出）の両波長における吸光度の測定を行い、溶出曲線を描いた（図１）。
【００４６】
アンスロン法が陽性であった画分番号４２〜６９を合一した後、ロータリーエバポレーターにて１０ｍＬまで濃縮した。濃縮した溶液を蒸留水で平衡化したＣｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ  ＧＣＬ−２５カラム（内径３．３×３６ｃｍ、生化学工業（株）販売）に付し、蒸留水による溶出にて１０ｍＬ毎に分画した。得られた４０画分につき、アンスロン法による比色定量（６２０ｎｍ）及び２１０ｎｍ（脱塩完了を確認の為、脱塩された塩化ナトリウムの検出）の波長における吸光度の測定を行い、溶出曲線を描き、脱塩が達成している事を確認し、アンスロン法による検出結果に基づき目的物質を含む画分である画分番号１１〜２０を合一して凍結乾燥を行い、中性糖を含む多糖と目される乾燥物を得た（収量１３５．４ｍｇ）。
【００４７】
更に精製する為、得られた乾燥物１００ｍｇを０．１ｍｏｌ／Ｌの酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０ｍＬに溶解し、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＤＥ５２、Ｗｈａｔｍａｎｎ社製）カラム（内径２．３×１８ｃｍ）に付し、同緩衝液５０ｍＬでカラムを洗浄後、同緩衝液３００ｍＬと１．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む同緩衝液３００ｍＬを用いた塩化ナトリウムの直線的濃度勾配により溶出を行い、７ｍＬ毎に分画した。得られた１００画分につき、アンスロン法による比色定量（６２０ｎｍ）及び２８０ｎｍ（タンパク質の検出）における吸光度を測定し、溶出曲線を描いた（図２）。
【００４８】
その結果、ピークが２本出現したが、先に溶出した画分番号７５〜８１のピークを合一し、前述と同様にＣｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ  ＧＣＬ−２５を用い脱塩を行い、凍結乾燥に付し、本発明物質である硫酸化ポリフコース（以下、硫酸化ポリフコースＩという、収量１４．２ｍｇ）を得た。
【００４９】
尚、アンスロン法の比色定量は下記の通り行った。
（１）アンスロン粉末６００ｍｇを３００ｍＬの硫酸溶液（蒸留水１５ｍＬ＋濃硫酸２８５ｍＬ）に溶解し、この溶液を６０ｍＬの蒸留水に氷冷下で添加した。尚、調製したアンスロン試薬は冷暗所に保存する。
（２）１００μＬの試料溶液（尚、検量線範囲を考慮し、試料溶液が５〜５０μｇ／ｍＬヘキソース含量となるように設定）に、氷冷下にて、５００μＬのアンスロン溶液を添加した。試料溶液を入れた試験管にガラス球をのせ、１０分間沸騰水浴中で加熱し、その後、冷水にて速やかに冷却した。３０分以内に６２０ｎｍの吸光度を測定した。
尚、１０、２０、３０、４０及び５０μｇ／ｍＬのＬ−フコース溶液に基づく検量線を作成した。
【００５０】
実施例２  物理化学的性状解析
実施例１で製造した硫酸化ポリフコースＩにつき、化学組成分析法を実施した。ＭＢＴＨ法（Ｈｕｒｓｔ  ＆  Ｓｅｔｔｉｎｅ（１９８１）  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１５，８８−９２）にてヘキソサミン含量を、カルバゾール法（Ｂｉｔｔｅｒ＆Ｍｕｉｒ（１９６２）  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４，３３０−３３４）、イオンクロマトグラフィー並びにアンスロン法（Ｄｉｍｌｅｒ，Ｒ．Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９５２）  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２４，１４１１−１４１４）にて各々ウロン酸含量、硫酸イオン含量並びに中性糖含量を測定し、各構成成分の重量存在比を算出した（表１）。また、各構成成分のモル存在量（ｍｍｏｌ／ｇ）を算出し、中性糖を１として各成分のモル比を算出した（表２）。
【００５１】
次いで、ゲル濾過―高速液体クロマトグラフィーにより分子量の測定を行った。その結果、硫酸化ポリフコースＩの分子量は９，０００であった。
【００５２】
各構成成分の重量存在比（重量％）
【００５３】
【表１】
2005036031.tif 000011
【００５４】
各構成成分のモル存在量（ｍｍｏｌ／ｇ）
（カッコ内の数値は中性糖含量のモル存在量を１とした場合の各構成成分のモル比を示す）
【００５５】
【表２】
2005036031.tif 000012
【００５６】
この結果、硫酸化ポリフコースＩは、硫酸基と中性糖は含有しているが、ヘキソサミンを含有せず、また、ウロン酸も痕跡量のみであり実質的には含有していないと推測され、中性糖を側鎖として有するグリコサミノグリカンでは無い、すなわち、中性糖骨格に硫酸基が配位した硫酸化多糖であることが確認された。また、硫酸化ポリフコースＩの中性糖に対する硫酸基の割合（モル比）は０．６９であり、硫酸化の割合は高いことが判明した。
【００５７】
更に、Ｙａｓｕｎｏ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３，１３５３−１３５９に記載された方法に従い、中性糖の同定を行った。すなわち、１０ｍｇ／ｍＬに調製した硫酸化ポリフコースＩの水溶液から５０μＬを取り、８ｍｏｌ／Ｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）５０μＬを添加し封管した。反応混液を１００℃にて３時間加熱することにより、グリコシド結合ならびに硫酸エステル結合を開裂させた。冷却後、遠心分離により反応混液を反応管底部に集め、開管した。ドライエアーを吹き付け溶媒を除去し、２−プロパノール４０μＬを添加し攪拌した。更に、ドライエアーを吹きつけ溶媒を除去することにより、単糖試料を得た。得られた単糖試料につき、２０μＬの蒸留水及び８０μＬの４−アミノ安息香酸エチルエステル（ＡＢＥＥ）試薬を添加した後、封管し、８０℃にて１時間加温し還元アミノ化反応を進行させ、還元末端がＡＢＥＥにて標識された単糖誘導体を作成した。反応終了後、開管し２００μＬの蒸留水並びに２００μＬの塩化メチレンを添加し、激しく攪拌した後、遠心分離を行い上澄み中に還元末端がＡＢＥＥにて標識された上記単糖誘導体を得た。７％アセトニトリルを含む０．２ｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．９）で平衡化したＨｏｎｅｎｐａｋ−Ｃ１８カラム（内径４．６  ×  ７５ｍｍ、Ｈｏｎｅｎ社製）を装着した高速液体クロマトグラフィーに、得られたＡＢＥＥ標識化単糖試料を付し、同溶媒のアイソクラティック溶出条件により分析を実施した。尚、用いた単糖標品は、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｕ）、アラビノース（Ａｒａ）、リボース（Ｒｉｂ）、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）、キシロース（Ｘｙｌ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、フコース（Ｆｕｃ）、ラムノース（Ｒｈａ）、及び、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）（溶出順）である。結果を図３に示す。この結果、実施例１で得られた硫酸化ポリフコースＩが含有する単糖はフコースであることが判明した。尚、精製当初、硫酸化ポリフコースＩが脂溶性画分であった理由としては、硫酸化されてはいるが、低極性のメチル基を有するフコース残基を構成成分として多数有している為と考えられる。
【００５８】
実施例３  硫酸化ポリフコースＩの構造解析
実施例１で得られた硫酸化ポリフコースＩから５ｍｇをとり、蒸留水で平衡化したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ−１２０カラム（オルガノ（株）社販売、内径１．５×１２ｃｍ）に供した。得られた溶出画分のうちの酸性画分につき、適量のピリジンを添加して中和した後、凍結乾燥に付して硫酸化ポリフコースＩのピリジン塩を得た。１ｍＬの１０％蒸留水を含むジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加し、９０℃にて６日間ソルボリシス反応を進行させることにより脱硫酸化された硫酸化ポリフコースＩを調製した。反応は、室温まで冷却することにより停止させ、３倍量の蒸留水を添加した後、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を適量添加してｐＨを９〜９．５に調整した。これを流水に対し一晩透析した後、凍結乾燥することにより、硫酸化ポリフコースＩの脱硫酸化物３．０ｍｇを得た。
【００５９】
硫酸化ポリフコースＩ及びその脱硫酸化物から各々１ｍｇをとりＨａｋｏｍｏｒｉの方法（Ｈａｋｏｍｏｒｉ，  Ｓ．（１９６４）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （Ｔｏｋｙｏ），５５，  ２０５−２０８）を一部改変したＳａｎｆｏｒｄとＣｏｎｒａｄの方法（Ｓａｎｆｏｒｄ，  Ｐ．Ａ．  ＆  Ｃｏｎｒａｄ，  Ｈ．Ｅ．（１９６６）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ５，  １５０８−１５１７）に従ってメチル化誘導体を合成した。得られたメチル化誘導体は、Ｗａｅｇｈｅらの方法（Ｗａｅｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．，  １２３，  ２８１−３０４）に従って脱塩した。さらに、これらを２ｍｏｌ／Ｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用い１２１℃で加水分解した後、重水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＤ４）を用いて還元した。最後に、還元処理により出現した水酸基をアセチル化して、部分メチル化アルジトールアセテイト（ＰＭＡＡ）を合成した。得られたＰＭＡＡを５０μＬのアセトンに溶解し、そのうち１μＬをガスクロマトグラフィ−ー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）に付した。ＧＣ−ＭＳ分析は、Ｓｕｐｅｌｃｏ社製ＳＰ２３３０キャピラリーカラム（内径０．２５ｍｍ×３０ｍ）を装着したＪＥＯＬ社製ＨＸ１１０Ａ型マススペクトロメーターを用いて、スプリットレスモードで行った。カラムオーブンは、５０℃に２分間保ち、次いで３０℃／分の勾配で１７０℃まで昇温、さらに４℃／分の勾配で２３５℃まで昇温させ、この温度に１５分間保った。（尚、ＰＭＡＡを合成し、ＧＣ−ＭＳを行う分析をメチル化分析とも言う。）
【００６０】
硫酸化ポリフコースＩ由来のＰＭＡＡのクロマトグラムに於いては、８種類のＰＭＡＡが全て観察された（表３）。それらは、２，３，４−ｔｒｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｆｕｃｉｔｏｌ（Ｔ−Ｆｕｃｉｔｏｌ）、３，４−ｄｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｆｕｃｉｔｏｌ（２−Ｆｕｃｉｔｏｌ）、２，４−ｄｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｆｕｃｉｔｏｌ（３−Ｆｕｃｉｔｏｌ）、２，３−ｄｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｆｕｃｉｔｏｌ（４−Ｆｕｃｉｔｏｌ）、４−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｆｕｃｉｔｏｌ（２，３−Ｆｕｃｉｔｏｌ）、３−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｆｕｃｉｔｏｌ（２，４−Ｆｕｃｉｔｏｌ）、２−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｆｕｃｉｔｏｌ（３，４−Ｆｕｃｉｔｏｌ）及びｆｕｃｉｔｏｌ（２，３，４−Ｆｕｃｉｔｏｌ）である。以下の記載に於いては、上記（  ）内に示したＰＭＡＡの略称を用いて説明を進める。また、硫酸化ポリフコースＩの脱硫酸化物由来のＰＭＡＡのクロマトグラムに於いては、硫酸化ポリフコースＩの場合とは異なり、ほぼ等量のＴ−Ｆｕｃｉｔｏｌ、３−Ｆｕｃｉｔｏｌ及び３，４−Ｆｕｃｉｔｏｌの三種類が検出された。
【００６１】
【表３】
2005036031.tif 000013
【００６２】
なお、実施例１の硫酸化ポリフコースＩの製造におけるＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム溶出のグラフ（図２）において、硫酸化ポリフコースＩを得た溶出画分と極めて近くに検出された２本目のピーク（後から溶出したピーク）の画分を合一し、硫酸化ポリフコースＩと同様の方法で精製して得た硫酸化ポリフコース（以下、硫酸化ポリフコースＩＩという）についても、硫酸化ポリフコースＩと同様に実施例２の物理化学的性状解析及び実施例３の構造解析を行った。その結果、硫酸化ポリフコースＩＩも中性糖であるフコースのみを構成糖とし、高い割合で硫酸化されているポリフコースであった。またメチル化分析の結果は、硫酸化ポリフコースＩＩに於いてはＴ−Ｆｕｃｉｔｏｌ（４．２モル％）、３−Ｆｕｃｉｔｏｌ（２６．５モル％）、２，３−Ｆｕｃｉｔｏｌ（１７．４モル％）、３，４−Ｆｕｃｉｔｏｌ（２０．８モル％）及び２，３，４−Ｆｕｃｉｔｏｌ（３１．１モル％）が検出され、硫酸化ポリフコースＩＩの脱硫酸化物に於いてはＴ−Ｆｕｃｉｔｏｌが４．８モル％、３−Ｆｕｃｉｒｏｌが９５．２モル％検出された。これより、硫酸化ポリフコースＩＩはフコース同士がα１→３グリコシド結合により伸長している直鎖構造を有する硫酸化ポリフコースである事がわかる。
【００６３】
実施例２及び実施例３の分析結果より、硫酸化ポリフコースＩには、フコース同士がα１→３グリコシド結合している構造とフコース同士がα１→４グリコシド結合している構造が存在している。また、製造過程におけるＤＥＡＥ−セルロースカラムによる溶出において硫酸化ポリフコースＩＩと極めて近くに検出されている事より、硫酸化ポリフコースＩの構造は、フコース同士のα１→３グリコシド結合により伸長する直鎖を基本骨格（主鎖）とし、主鎖を構成するフコースほぼ１つおきに、α１→４グリコシド結合によるフコース側鎖の枝分かれ構造をなしていると考えられる。硫酸基については、主鎖においてはＯ−２位、側鎖においてはＯ−２位且つ／又はＯ−４位に配位しているものと推定される（図４）。
【００６４】
実施例４  硫酸化ポリフコースＩの破骨細胞形成抑制実験
ｄｄＹマウス（六週齢雌）の頸骨、大腿骨を摘出し、両骨の遠心端より骨髄細胞を採取した。骨髄細胞は２４穴細胞培養用プレートに５×１０６細胞／穴となるように播種し、１０―６モル／ＬプロスタグランジンＥ２（以下、ＰＧＥ２という。ＳＩＧＭＡ社製）刺激下において、５０μｇ／ｍＬ濃度となるように実施例１で得られた硫酸化ポリフコースＩを添加し、１０％牛胎児血清（以下、ＦＣＳという。べーリンガー社製）含有Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ａｌｐｈａ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ社製、以下、αＭＥＭという。）培地中で７日間３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。培養中２、３日おきにＰＧＥ２と硫酸化ポリフコースＩを新たに添加した１０％ＦＣＳ含有αＭＥＭ培地にて培地交換を行った。７日間の培養の後、破骨細胞のマーカーである酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（以下、ＴＲＡＰという）をナフトールＡＳ−ＢＩフォスフェート及びｆａｓｔ  ｇａｒｎｅｔ  ＧＢＣ  ｓａｌｔを含有するアゾ色素法を用いた染色測定キット「Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ」（商品名：ＳＩＧＭＡ社製）を用いて染色し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した（図５）。
尚、結果は各穴内における破骨細胞の数によって示し、また、コントロールは被験物質の代わりに１０％ＦＣＳ含有αＭＥＭ培地を添加した。
【００６５】
図５の結果より、硫酸化ポリフコースＩにおいては、破骨細胞の形成が殆ど観察されず、極めて顕著な破骨細胞形成抑制効果を有する事が確認された。
【００６６】
【発明の効果】
本発明により、新しい構造を有する硫酸化ポリフコース、及び、当該硫酸化ポリフコースの製造方法を提供し、また、本発明物質が有する極めて顕著な破骨細胞形成抑制作用に基づき、骨粗鬆症などの代謝性骨疾患や炎症性骨破壊に起因する慢性関節リウマチ、歯周病などの疾患に対する治療に有効な骨疾患治療剤としての本発明物質の提供が可能である。
【００６７】
【図面の簡単な説明】
【図１】多糖類の粗画分のセファロースＣＬ−６Ｂカラム溶出液の各フラクションにおけるアンスロン法による比色定量（６２０ｎｍ）及び２１０ｎｍ（ペプチドの検出）、２８０ｎｍ（タンパク質の検出）において測定した吸光度による溶出曲線である。縦軸は吸光度、横軸はフラクション番号であり、黒丸による線は６２０ｎｍ、白丸による線は２１０ｎｍ及び四角による線は２８０ｎｍによる吸光度を示す。
【図２】ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム溶出液の各フラクションにおけるアンスロン法による比色定量（６２０ｎｍ）及び２８０ｎｍにおいて測定した吸光度による溶出曲線である。グラフ左側の縦軸は吸光度、横軸はフラクション番号であり、丸による線は６２０ｎｍ、四角による線は２８０ｎｍによる吸光度を示す。また、グラフ右側の目盛りは点線で記載されている塩化ナトリウムの濃度を示す。
【図３】硫酸化ポリフコースＩから得られた還元末端が４−アミノ安息香酸エチルエステルにて標識された単糖誘導体のＨｏｎｅｎｐａｋ−Ｃ１８カラムを装着した高速液体クロマトグラフィーに付し、得られたチャート（上段）である。
下段（Ｓｔｄ．）は単糖標品を付したチャート結果であり、各ピークは溶出順にガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｕ）、アラビノース（Ａｒａ）、リボース（Ｒｉｂ）、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）、キシロース（Ｘｙｌ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、フコース（Ｆｕｃ）、ラムノース（Ｒｈａ）、及び、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。尚、横軸は時間（分）を示す。
【図４】硫酸化ポリフコースＩの推定構造である。Ｆｕｃはフコースを示し、（４Ｓ）はフコースのＯ−４位の硫酸化、（２Ｓ）はフコースのＯ−２位の硫酸化及び（２Ｓ，４Ｓ）はフコースのＯ−２位及びＯ−４位の硫酸化を示す。
【図５】硫酸化ポリフコースＩによる破骨細胞形成抑制作用を示すグラフである。縦軸はマイクロプレートの１穴における破骨細胞の数である。（−）はコントロールの結果を示す。
【図１】
2005036031.tif 000017
【図２】
2005036031.tif 000018
【図３】
2005036031.tif 000019
【図４】
2005036031.tif 000020
【図５】
2005036031.tif 000021