(57)【要約】【課題】ニワトリ個体が持つMx遺伝子型と当該ニワトリ個体のトリインフルエンザウイルス抵抗性との関係を明らかにし、得られた知見を基に、被検トリについて、トリインフルエンザウイルス抵抗性か否かの判定方法の提供を課題とする。【解決手段】ニワトリ個体が持つMx遺伝子型と当該ニワトリ個体のインフルエンザウイルス抵抗性との関係について研究を行い、トリMxタンパク質のアミノ酸配列の第631位のアミノ酸がアスパラギンのホモ及びアスパラギンとセリンのヘテロである場合に、セリンのホモである場合に比べRNAウイルス抵抗性であることを明らかにした。ニワトリについて上記部位のアミノ酸をコードするDNAを検出することにより、インフルエンザウイルス等のRNAウイルスに対する抵抗性の判定を行うことができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリMx遺伝子上のDNAであって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における６３１位のアミノ酸をコードするDNAの塩基種を決定する工程を含む、被検トリについてRNAウイルス抵抗性か否かを判定する方法。
【請求項２】
前記塩基種がアスパラギンをコードする塩基である場合に、被検トリはRNAウイルス抵抗性であるものと判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記塩基種がセリンをコードする塩基であり、該塩基がホモで検出された場合に、被検トリはRNAウイルス感受性であるものと判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
トリMx遺伝子上のDNAであって、配列番号：１に記載の塩基配列における2032位の塩基種を決定する工程を含む、被検トリについてRNAウイルス抵抗性か否かを判定する方法。
【請求項５】
前記塩基種がアデニンである場合に、被検トリはRNAウイルス抵抗性であるものと判定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記塩基種がグアニンであり、該塩基がホモで検出された場合に、被検トリはRNAウイルス感受性であるものと判定される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
トリがニワトリである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
RNAウイルスがトリインフルエンザウイルスである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
以下の（ａ）または（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含む、トリ用RNAウイルス抵抗性判定試薬。
（ａ）トリMx遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における2032位の部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドプローブ
（ｂ）トリMx遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における2032位の部位を含むDNAを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー
【請求項１０】
RNAウイルスがトリインフルエンザウイルスである、請求項９に記載の試薬。
【請求項１１】
以下の工程（ａ）〜（ｅ）を含む、RNAウイルスワクチンの製造方法。
（ａ）請求項７に記載の方法により、RNAウイルス抵抗性ではない、もしくはRNAウイルス感受性であると判定されるニワトリを選択する工程
（ｂ）工程（ａ）によって選択されたニワトリの発育鶏卵を取得する工程
（ｃ）前記発育鶏卵の将尿液へRNAウイルスを注入する工程
（ｄ）工程（ｃ）で得られる鶏卵を孵卵する工程
（ｅ）工程（ｄ）で得られる鶏卵から将尿液を回収する工程
【請求項１２】
RNAウイルスがトリインフルエンザウイルスである、請求項１１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニワトリまたはアヒル等の家禽についてトリインフルエンザウイルス抵抗性の個体を選抜する方法、並びに、該方法を用いたRNAウイルスワクチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
1997年に、香港ではトリインフルエンザウイルスが猛威をふるい、ヒトにも感染して死者を出したことから大問題となった。トリインフルエンザウイルス症は、その後もアメリカやヨーロッパで流行を繰り返し、家禽産業上大問題となっている。ところで、強毒株のインフルエンザウイルスにより引き起こされる感染症を家禽ペストと呼び、日本でこれが流行した場合、パニックに陥ると恐れられてきたが、2004年の初めにそれが現実となった。これまで、ウイルス感染症対策にはワクチンの開発が第一に考えられてきた。しかし、新たに流行する感染症に対しては有効な既存のワクチンは存在しない場合が多い。
【０００３】
一方、感染症の発症率には個体差や品種差があることが経験的によく知られており、このような表現型の差の存在や表現型の差をもたらす遺伝子レベルでの差異を科学的に明らかにすることができれば、インフルエンザ抵抗性品種を作出することができる。しかし、これまでに、ニワトリに特異的な遺伝子型とニワトリ個体のインフルエンザウイルス抵抗性を明らかにした知見は無かった。そこで、これまで本発明者らのグループは、マウスにおいてインターフェロン（IFN）誘導性タンパクとしてRNAウイルスの増殖を抑制することが知られているMx1遺伝子についてニワトリを用いて実験を開始した。
【０００４】
上記本発明者らのニワトリに関する研究以前に、以下のような知見が得られていた。代表的なRNAウイルスの一つであるインフルエンザウイルスを実験用近交系マウスに対する感染実験に用いたところ、ほとんどのマウスは致死性であったが、わずかにA2GマウスとSLマウスの２系統だけが抵抗性を示した。その原因はMx1遺伝子のゲノム構造の違いであることが報告されていた（非特許文献１および２参照）。すなわち、インフルエンザウイルスに対して致死的な実験用近交系マウスは、Mx1遺伝子においていくつかのエクソンが欠失しているか、あるいは途中でストップコドンを引き起こす塩基置換を伴っていることが同定された。
【０００５】
そこで、本発明者らは、世界各地の野生マウス由来の系統を調べた結果、それらは全て抵抗性のMx1遺伝子を有していることを確認した。さらに、野生マウス由来の系統を調べる過程で、これまで発見されていなかった機能的Mx2遺伝子を世界に先がけて検出した。Mx1遺伝子の発現は核に局在し、インフルエンザウイルス増殖抑制作用を示すのに対して、Mx2遺伝子の発現は細胞質に局在し、水疱性口内炎ウイルスやハンタウイルスに対して増殖抑制作用を示した。従って、Mx1と2遺伝子は、互いに担当するウイルスを分担していると推定された。
【０００６】
ニワトリにおいてはMx遺伝子は1種類であり、Mx1、Mx2のような区別はない。このことから、抗ウイルス活性を明確に担っているかどうか不明であった。例えば、ドイツの研究グループは、Mx cDNAのクローニングを行ったが（非特許文献３参照）、抗ウイルス活性のない感受性遺伝子であると報告している。しかし、その報告では一つの品種（ドイツの白色レグホーン種だけ）の一例についてしか調べられていなかった。
【０００７】
そこで、本発明者らは、白色レグホーン種やロードアイランドレッド種などの実用鶏（コマーシャル鶏）や、シャモ、ナゴヤ種などの日本在来種を含む25品種以上からニワトリMx cDNAをクローニングし、それらの全塩基配列を決定した。その結果、ニワトリMx遺伝子は非常に多様性で、計25箇所で塩基置換が観察された。その中でアミノ酸置換は、全アミノ酸706のうち15箇所で検出された。続いて、いくつかのニワトリMx cDNAを発現ベクターに組み込み、Mx遺伝子の発現が欠損しているマウス3T3培養細胞に遺伝子導入した後、GFP発現変異型水庖性口内炎ウイルス（VSV）や一部トリインフルエンザウイルスを用いてin vitro感染実験を行ったところ、ナゴヤ種由来Mx遺伝子は上記のドイツの白色レグホーン種と同様に抗ウイルス活性を示さなかったのに対して、シャモ由来Mx遺伝子などは明らかに高い抗ウイルス活性を示した。さらに、多くの遺伝子導入細胞感染実験を行い、アミノ酸置換について整理した結果、15箇所のアミノ酸置換のうち、１箇所だけが抵抗性・感受性形質の決定的な差異を担っている可能性が考えられた。すなわち、631位のアミノ酸がAsn（アスパラギン）（塩基配列ではAAT）の場合は抵抗性で、Ser（セリン）（塩基配列ではAGT）の場合は感受性であると考えられた（非特許文献４参照）。
【０００８】
しかし、実際に生きているニワトリの場合、Mx遺伝子のアミノ酸631位相当部分1箇所が異なるだけで、ニワトリ個体としてのインフルエンザ抵抗性が異なるか否かは大きな疑問であった。抗ウイルスのメカニズムは、Mx遺伝子だけが担うのではなく、一般の液性免疫も関与している。また、Mx遺伝子と同様にタイプIインターフェロン（IFN）によって細胞内に発現しウイルス増殖を妨げる作る遺伝子には、ウイルスに感染した細胞にアポトーシスを起こさせるPKR（Protein Kinase R）、ウイルス由来の単鎖RNAを分解する2-5A(2’, 5’- Oligoadenilates) synthetaseがあり、Mx遺伝子のエクソン配列の異なりによるウイルス増殖抑制能力の変化よりもこれら他の遺伝子の影響がずっと大きいことも予想された。もしMxタンパク質のアミノ酸組成の違いにより、インフルエンザ抵抗性に強弱があったとしても、その強弱の程度はMx以外の免疫機構の影響に比べれば非常に微弱で、生体のインフルエンザ抵抗性においてはMx遺伝子の配列の差は表現型としては何の意味ももたらさないことも考えられる。また、Mx遺伝子のエクソン部分の配列が同じであっても遺伝子の発現量が異なるため、個体によって抗病性能力が大きく異なる場合もあると考えられる。例えば、インターフェロンを投与するとMx遺伝子が発現しウイルスの増殖が抑制されるが、ヒトではインターフェロン投与のウイルス増殖抑制への効果の強弱はMx遺伝子の発現制御部分の塩基配列の違いにあり、cDNA部分の配列の違いでは説明できなかった、と言われている。すなわち、Mx遺伝子のアミノ酸631位の違いがインフルエンザ抵抗性の個体を選抜するために有用な情報となるかならないかは、Mx遺伝子のアミノ酸631位が遺伝的に異なる個体複数に対し、トリインフルエンザウイルスを直接感染させる試験を経なければ不明であった。
【０００９】
【非特許文献１】Jin, H. K.外４名著、「Characterization and expression of the Mx1 gene in wild mouse species.」、Biochem. Genet、1998年、Vol 36、p. 311-322.
【非特許文献２】Jin, H. K.外４名著、「Identification of the murine Mx2 gene: Interfern-induced expression of the Mx2 protein from the fetal mouse gene confers resistance to vesicular stomatitis virus.」、J. Virol.、1999年、Vol.73、p．4925-4930.
【非特許文献３】Bernasconi, D.外２名著、「The interferon-induced Mx protein of chickens lacks antiviral activity.」、J. Interferon Res.、1995年、Vol.15、p.47-53.
【非特許文献４】Joe-Hon Ko外11名著、「Polymorphysms and the differential anitiviral activity of the chicken Mx gene.」、Genome Research、2002年、Vol.12、p.595-601.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、トリ個体が持つMx遺伝子型と該トリ個体のインフルエンザウイルス抵抗性との関係を明らかにし、トリ、特にニワトリまたはアヒル等の家禽類についてトリインフルエンザウイルス抵抗性の個体を選抜する方法を提供することにある。さらに本発明は、該方法を用いたRNAウイルスワクチンの製造方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らはこれまでニワトリの品種別にMx遺伝子を取り出し、マウス細胞へ当該遺伝子を導入し、これに対し種々のRNAウイルスを感染させるin vitroでの実験を行ってきた。しかし個体の抗病性あるいは感受性が、Mx遺伝子型、特にアミノ酸631位の型をコードする塩基配列の違いによってのみ異なるのかを明らかにする必要があった。
【００１２】
そこで本発明者らは、Mxタンパクのアミノ酸631位が病害性RNAウイルスに対する抵抗性と感受性とを分けているかを明らかにするべく実験を行った。すなわち、コシャモ（ＫＳ）とナゴヤ（Ｎ）は631位のアミノ酸にセリンを持つことからRNAウイルス感受性、サツマドリ−２（Ｓ２）、ホッカイドウシャモ（ＨＳ）は631位にアスパラギンを持つことから抵抗性と考えた。そして、当該631位のアミノ酸が入れ替わるようにミュータントのcDNAを構築し、これらの遺伝子を導入したインフルエンザウイルス感受性のマウス3T3細胞間で感受性と抵抗性が入れ替わるかを調べた。
【００１３】
その結果、ウイルス感受性と考えられたＫＳあるいはＮのそのままのMx遺伝子を導入した細胞は、感受性であることが確認され、抵抗性と考えられたＳ２は相対的に抵抗性であることが確認された。一方、感受性のMx蛋白でもアミノ酸631位のみがセリンからアスパラギンに入れ替わることにより、VSV抵抗性に変わることが示された。さらに抵抗性のMx蛋白でもアミノ酸631位がアスパラギンからセリンに入れ替わるだけで、VSV感受性に替わることが示された。
【００１４】
これらのことから、病害性ＲＮＡウイルスであるVSVに対するニワトリ遺伝子導入細胞の抵抗性の一つは少なくともMx蛋白が担っており、その中でもニワトリMx蛋白の第６３１位が入れ替わるだけで、感受性と抵抗性が入れ替わることが明らかになった。
インフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルスはVSVと同様にＲＮＡウイルスであり、Mx蛋白がこれらの病害性ＲＮＡウイルスの増殖抑制を担っている可能性が高い。さらに、ここで示したように、Mx蛋白の中でもアミノ酸631位の変異が、ＲＮＡウイルスに対する増殖抑制能の強弱を決定している可能性が高い。
【００１５】
また本発明者らは、Mx遺伝子のアミノ酸第631位の型で同一品種のニワトリ群をあらかじめ分けておき、香港で流行したトリインフルエンザウイルス強毒株のA/Hong Kong/483/97(H5N1)株を用い、これらMx遺伝子型の異なる個体に対して感染試験を行った。なお、2004年現在、日本や韓国、東南アジアで流行が確認されているトリンフルエンザウイルスもこれと同じH5N1型である。
その結果、Mxタンパク質のアミノ酸631位をAsn型ホモで持つ個体あるいはヘテロで持つ個体は、Ser型ホモの個体に比べトリインフルエンザに抵抗性であることが判明した。
【００１６】
以上から、ニワトリMx遺伝子のアミノ酸631位に相当する遺伝子部分の型を知ることにより、当該ニワトリ個体がインフルエンザ抵抗性であるか否かを知ることができる。
本遺伝マーカー選抜法を種鶏群に適用することにより、インフルエンザ抵抗性のニワトリを短時間のうちに育種することができる。
【００１７】
米国、韓国、東南アジアそして日本でもH5N1トリインフルエンザウイルスが猛威をふるい、多くのニワトリを死に至らしめている。しかし、１つの農場内で一時に全部のニワトリが斃死しているわけではない。インフルエンザウイルスが蔓延し、相当数の個体が斃死するが、一方である数の個体は斃死していない。これらの現象は、同じ系統の中でも遺伝的な抵抗性が個体により異なることによる、すなわち同じニワトリ群内でも、当該遺伝子の型に違いがあることに由来すると考えられる。
【００１８】
実際、本発明者らが本発明に提示する遺伝情報を基に家畜改良センター岡崎牧場の集団を試験的に判別したところ、以下のようであった。用いた系統は、白色レグホーン６系統、ロードアイランドレッド２系統、白色プリマスロック１系統、黄斑プリマスロック１系統、ライトサセックス１系統、三河１系統、名古屋１系統、鳥骨鶏１系統、アローカナ１系統の合計16系統である。
【００１９】
白色レグホーン種のMA系統では抵抗性ホモが９羽、ヘテロが１羽、S52系統では抵抗性ホモが２羽、ヘテロが２羽、感受性ホモが６羽、11系統では抵抗性ホモが３羽、ヘテロが２羽、MK系統では抵抗性ホモが４羽、ヘテロが５羽、感受性ホモが１羽、LA系統では抵抗性ホモが６羽、ヘテロが２羽、感受性ホモが１羽、そしてMC系統では抵抗性ホモが４羽、ヘテロが３羽、感受性ホモが３羽であった。
【００２０】
次にロードアイランドレッド種のYS系統では10羽全てが感受性ホモ、YA系統においても10羽全てが感受性ホモであった。白色プリマスロック種では抵抗性ホモが６羽、ヘテロが２羽、感受性ホモが２羽、横斑プリマスロック種では10羽全てが感受性ホモ、ライトサセックス種では５羽全てが感受性ホモ、三河種では抵抗性ホモが４羽、ヘテロが１羽、名古屋種ではヘテロが３羽、感受性ホモが２羽、鳥骨鶏種では５羽全てが感受性ホモ、アローカナ種では抵抗性ホモが３羽、ヘテロが２羽であった。
【００２１】
系統により多少の片寄りがみられたが、全体として、抵抗性Mx遺伝子、感受性遺伝子ともにほぼ50％ずつであった。これらの観察結果は、「生産現場で相当数が斃死する条件下でも、同時期には全ては斃死しないという現象は遺伝子型の違いを反映している。」ことを裏付けるものと考えられる。
【００２２】
上記の如く本発明者らは、トリ個体が持つMx遺伝子型と該トリ個体のインフルエンザウイルス抵抗性との関係を、初めて明らかにすることに成功し、本発明を完成するに至った。
上述のようにトリMxタンパク質の631位のアミノ酸の種類によって、RNAウイルス、特にトリインフルエンザウイルスに対する感受性が劇的に変わる事実は、本発明者らによって初めて証明されたものであり、この新たに見出された知見によって、実際に、インフルエンザイ抵抗性についての判定方法の実施が可能となった。即ち、本発明者らによる鋭意研究によって見出された知見が無ければ、依然として、RNAウイルス、特にトリインフルエンザウイルスに対する抵抗性の判定を行うことは到底困難な状況であり、さらには、トリインフルエンザウイルスワクチン、ヒト並びに他の家畜のためのインフルエンザワクチンを効率的に製造することも難しい状況であったと言える。
【００２３】
本発明は、トリ、特にニワトリまたはアヒル等の家禽類についてトリインフルエンザウイルス抵抗性の個体を選抜する方法に関し、より具体的には、
〔１〕  トリMx遺伝子上のDNAであって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における６３１位のアミノ酸をコードするDNAの塩基種を決定する工程を含む、被検トリについてRNAウイルス抵抗性か否かを判定する方法、
〔２〕  前記塩基種がアスパラギンをコードする塩基である場合に、被検トリはRNAウイルス抵抗性であるものと判定される、〔１〕に記載の方法、
〔３〕  前記塩基種がセリンをコードする塩基であり、該塩基がホモで検出された場合に、被検トリはRNAウイルス感受性であるものと判定される、〔１〕に記載の方法、
〔４〕  トリMx遺伝子上のDNAであって、配列番号：１に記載の塩基配列における2032位の塩基種を決定する工程を含む、被検トリについてRNAウイルス抵抗性か否かを判定する方法、
〔５〕  前記塩基種がアデニンである場合に、被検トリはRNAウイルス抵抗性であるものと判定される、〔４〕に記載の方法、
〔６〕  前記塩基種がグアニンであり、該塩基がホモで検出された場合に、被検トリはRNAウイルス感受性であるものと判定される、〔４〕に記載の方法、
〔７〕  トリがニワトリである、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法、
〔８〕  RNAウイルスがトリインフルエンザウイルスである、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法、
〔９〕  以下の（ａ）または（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含む、トリ用RNAウイルス抵抗性判定試薬、
（ａ）トリMx遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における2032位の部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドプローブ
（ｂ）トリMx遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における2032位の部位を含むDNAを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー
〔１０〕  RNAウイルスがトリインフルエンザウイルスである、〔９〕に記載の試薬、
を提供するものである。
【００２４】
また、本発明の好ましい態様においては、以下の方法を提供する。
〔Ａ〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、上記の判定方法。
（ａ）被検トリからDNAを調製する工程
（ｂ）トリMx遺伝子上のDNAであって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における６３１位のアミノ酸をコードするDNA（例えば、配列番号：１に記載の塩基配列における2032位のDNA）を含むDNAを増幅する工程
（ｃ）増幅したDNAの塩基配列を決定する工程
〔Ｂ〕  以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、上記の判定方法。
（ａ）被検トリからDNAを調製する工程
（ｂ）トリMx遺伝子上のDNAであって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における６３１位のアミノ酸をコードするDNA（例えば、配列番号：１に記載の塩基配列における2032位のDNA）を含むDNAを増幅する工程
（ｃ）増幅したDNAを一本鎖に解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を対照と比較する工程
〔Ｃ〕  以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、上記の判定方法。
（ａ）被検トリからDNAを調製する工程
（ｂ）トリMx遺伝子上のDNAであって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における６３１位のアミノ酸をコードするDNA（例えば、配列番号：１に記載の塩基配列における2032位のDNA）を含むDNAを増幅する工程
（ｃ）ヌクレオチドプローブが固定された基板を提供する工程
（ｄ）工程（ｂ）のDNAと工程（ｃ）の基板を接触させる工程
（ｅ）該DNAと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する工程
（ｆ）工程（ｅ）で検出された強度を対照と比較する工程
【００２５】
また本発明の上記方法を利用することにより、RNAウイルスワクチンの製造を行うことができる。RNAウイルスワクチンの製造は、一般的に、ニワトリの受精卵が用いられる。この受精卵は、RNAウイルス抵抗性のニワトリのものよりも、RNAウイルス感受性のニワトリのものの方が、より高い効率でワクチンを生産することができるものと考えられる。従って、RNAウイルス感受性のニワトリを効率的に選抜することができれば、ワクチンの製造において、非常に有益である。しかしながら、任意のニワトリについて、RNAウイルス抵抗性か否かを知る方法は、これまでのところ知られていなかった。
【００２６】
本発明者らによって、上記の如く、RNAウイルス抵抗性か否かのトリの判定方法が提供されたことにより、今回初めて、RNAウイルスワクチンの非常に効率的かつ有効な製造方法が開発された。即ち本発明は、さらに、
〔１１〕  以下の工程（ａ）〜（ｅ）を含む、RNAウイルスワクチンの製造方法、
（ａ）〔７〕に記載の方法により、RNAウイルス抵抗性ではない、もしくはRNAウイルス感受性であると判定されるニワトリを選択する工程
（ｂ）工程（ａ）によって選択されたニワトリの発育鶏卵を取得する工程
（ｃ）前記発育鶏卵の将尿液へRNAウイルスを注入する工程
（ｄ）工程（ｃ）で得られる鶏卵を孵卵する工程
（ｅ）工程（ｄ）で得られる鶏卵から将尿液を回収する工程
〔１２〕  RNAウイルスがトリインフルエンザウイルスである、〔１１〕に記載の製造方法、を提供するものである。
【発明の効果】
【００２７】
〔インフルエンザ抵抗性ニワトリあるいはアヒルの育種〕
現在すでに飼養されているニワトリ系統には、多くの場合同一系統内でもMx遺伝子型にばらつきがある。このことは、本発明で開示する遺伝情報を用いて容易にインフルエンザ抵抗性のニワトリを選抜し、これを育種することが可能であることを示している。すなわち、原種鶏あるいは種鶏の段階で、抵抗性型（Asn型）ホモを選抜し、これをコマーシャル鶏（実用鶏）の生産に用いればよい。また、原種鶏に抵抗性型ホモが見当たらない場合でも、ヘテロ型同士を組み合わせれば抵抗性型ホモを得ることができる。
【００２８】
〔ウイルスワクチン生産用トリ受精卵の生産〕
ウイルスワクチン作成にはニワトリの受精卵が用いられている。抗ウイルス活性の高い受精卵を用いるよりも低い受精卵を用いた方が、より高い効率でワクチンが生産できると考えられるが、ニワトリ受精卵内の胎仔及びこれを生産する親鳥について、抗ウイルス性が高いか低いかを知る方法は無かった。しかし、本発明により、「より高い効率でワクチンを生産することができる受精卵を生産することができるニワトリ等の家禽類」を選別することが出来、ヒト及び動物の効率的ワクチン生産に貢献することができる。
【００２９】
〔鶏肉、鶏卵の消費の維持〕
インフルエンザウイルスの蔓延を防止するため、同一場所で飼養されていた多くのニワトリが殺処分されている。これらは、最終的にはヒトへの感染を防止するためにとられた措置である。しかし、消費者はヒトへのウイルス感染を危惧し、鶏肉および鶏卵の購入を控えることになる。このようなことによる、養鶏産業の経済的被害は総計では莫大なものと考えられる。ニワトリへの遺伝的抵抗性の導入は、インフルエンザの発生を防止することになり、その養鶏産業への恩恵は計り知れない。
【００３０】
〔ヒトに対して〕
ニワトリ群内でのインフルエンザウイルスの蔓延期間が長ければ、ヒトに容易に感染するような変異を獲得する確率も上昇し、人類の出合ったことのない新たなインフルエンザウイルス出現の可能性も増す。インフルエンザ感受性であるニワトリの群はインフルエンザに感染しやすく、斃死までの期間インフルエンザウイルスを体内で増殖させ、その間に次の個体へウイルスを感染させる。この際、インフルエンザウイルスは遺伝的変異を伴いながら、時には新種のインフルエンザウイルスとなり増殖する。1917年から1918年に流行し、世界で４千万人以上、日本国内だけでも30万人以上の命を奪ったスペイン風邪におけるインフルエンザウイルス（H1N1）ような新種のインフルエンザウイルスが出現する可能性もある。トリインフルエンザウイルスがヒトに対して高い感染性を獲得した場合、未曾有の被害をもたらすことになる。本発明によって、インフルエンザウイルス増殖抑制能の高いニワトリやアヒルが選抜されることにより、群内でのインフルエンザウイルス増殖が抑制され新種インフルエンザウイルス発生の可能性が減少する。このことにより、「新種のインフルエンザウイルス出現」という人類への脅威の１つを回避できる可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明者らによって、トリMx遺伝子の631位のアミノ酸をAsn型ホモで持つ個体あるいはヘテロで持つ個体が、Ser型ホモの個体に比べRNAウイルス、特にトリインフルエンザウイルスに対して抵抗性を示すことが判明した。従って、該遺伝子における631位のアミノ酸をコードする塩基種を決定することによって、被検トリがRNAウイルスに対して抵抗性か否かの判定を行うことができる。本発明の方法によって、被検トリがRNAウイルスに対して抵抗性か否かを簡便に判定することができ、これにより、RNAウイルスに抵抗性であるトリを選抜（選択）することが可能であり、本発明は、養鶏産業における育種等に有効利用されると考えられる。
また、ウイルス感受性のトリから生産された受精卵はワクチンの効率的生産に適することから、本発明は、ヒト及び家畜・家禽向けのワクチン生産に有効利用されると考えられる。
【００３２】
本発明において「トリ」とは、通常、鳥類であり、好ましくは家禽類である。家禽類としては例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ハト、アヒル、ガチョウ等が挙げられるが、本発明において最も好ましくはニワトリとアヒルである。
【００３３】
本発明において「RNAウイルス抵抗性」とは、例えば、「RNAウイルス由来の疾病に対する抵抗性」等を意味する。本発明における「RNAウイルス」とは、例えば、ミクソウイルスを挙げることができる。本発明においてRNAウイルスとは、好ましくは、インフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス等を挙げることができる。本発明におけるRNAウイルスとは、特に制限されるものではないが、通常、インフルエンザウイルスであり、好ましくはトリインフルエンザウイルスである。
また、インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルス科に属し、ニューカッスル病ウイルスはパラミクソウイルス科に属し、どちらも同属のミクソウイルスである。本発明のトリMx遺伝子の多型（Mxタンパク質上のアミノ酸の変異）とインフルエンザウイルス抵抗性／感受性との関連性は、そのまま、ニューカッスル病ウイルスに対するトリの抵抗性／感受性にも当てはまるものと考えられる。従って、本発明においては、被検トリについて、ニューカッスル病ウイルスに対して抵抗性か否かの判定を好適に実施することができる。
【００３４】
インフルエンザは、急性の感染性呼吸器疾患であり、インフルエンザウイルスによって引き起こされる。インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルス科インフルエンザ属に属するウイルスであり、上気道粘膜に侵入し呼吸器を冒す。
【００３５】
本発明におけるトリMx遺伝子の一例として、ニワトリMx遺伝子のcDNAの塩基配列を配列番号：１に、該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
なお、本発明のトリMx遺伝子の全塩基配列、もしくは任意の部分配列、および該遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸に関するデータは、当業者においては、公共の遺伝子バンクもしくは文献データベース等を利用して、適宜、取得することが可能である。例えば、ニワトリMx遺伝子については、PubMedからアクセッション番号：Z23168によって容易に取得することが可能である。ニワトリ以外の家禽類として、例えばアヒルにおけるMxタンパク質およびエクソン配列は、GenBankアクセッション番号Z21549、および文献（Bazzigher,L., Schwarz,A. and Staeheli,P.,"No enhanced influenza virus resistance of murine and avian cells expressing cloned duck Mx protein", Virology 195 (1), 100-112 (1993)）に記載がある。
【００３６】
なお、DNAは通常、互いに相補的な二本鎖DNA構造を有している。従って、本明細書においては、便宜的に一方の鎖におけるDNA配列を示した場合であっても、当然の如く、当該配列（塩基）に相補的な配列も開示したものと解釈される。当業者にとって、一方のDNA配列（塩基）が判れば、該配列（塩基）に相補的な配列（塩基）は自明である。
【００３７】
一般に染色体は、二本ずつ対をなして存在することから、被検DNA部位に相当するDNA部位も、一組の染色体において通常、二箇所存在する。本発明の「トリMx遺伝子上のDNAであって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における６３１位のアミノ酸をコードするDNAの塩基種」の決定とは、この中の少なくとも一箇所を決定することを指す。
【００３８】
なお、当業者においては、本明細書において開示された配列番号：１で示される塩基配列についての情報から、適宜、トリMx遺伝子上のDNAであって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における６３１位に相当する実際のゲノム上の位置を知ることは容易である。例えば、公開されているゲノムデータベース等と照会することにより、本発明のトリMx遺伝子上のDNAであって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における６３１位のゲノム上の位置を知ることができる。即ち、配列表に掲げた塩基配列とゲノム上の実際の塩基配列との間に若干の塩基配列の相違（塩基の置換、欠失、挿入等）がみられた場合であっても、配列表に掲げた塩基配列を基にゲノム配列と相同性検索等を行うことにより、本発明のトリMx遺伝子上のDNAであって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における６３１位のアミノ酸をコードするDNAについて、実際のゲノム上の位置を正確に知ることが可能である。また、ゲノム上の位置が特定できない場合でも、本明細書に記載の配列表の情報から、本発明を実施することは可能である。
【００３９】
本発明は、被検トリにおけるMxタンパク質（例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列）の６３１位のアミノ酸の種類を決定することを特徴とする、被検トリについてRNAウイルス抵抗性か否かを判定する方法である。
本発明の方法においては、該６３１位のアミノ酸がアスパラギンである場合に、被検トリはRNAウイルス抵抗性であるものと判定される。即ち、該６３１位のアミノ酸をコードするMx遺伝子上のDNA部位の塩基種を決定することにより、本発明の判定方法を行うことができる。
【００４０】
本発明の好ましい態様においては、トリMx遺伝子上のDNAであって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における６３１位のアミノ酸をコードするDNA（本明細書においては、該DNAに相当するMx遺伝子上の部位を「被検DNA部位」と記載する場合あり。また、「被検DNA部位を含むDNA」とは、通常、被検DNA部位を含むMx遺伝子DNAもしくはその断片を指す。）の塩基種を決定する工程を含む、被検トリについてRNAウイルス抵抗性か否かを判定する方法を提供する。
【００４１】
より詳しくは、本発明は、トリMx遺伝子上のDNAであって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における631位のアミノ酸をコードするDNAの塩基種がアスパラギン（Asn）をコードする塩基である場合に、被検トリはRNAウイルス抵抗性であるものと判定する方法である。
【００４２】
アスパラギンをコードする遺伝子コドンは、「aat」または「aac」であることから、例えば、該６３１位のアミノ酸をコードするDNA（コドン）として、「aat」または「aac」が検出された場合に、被検トリはRNAウイルス抵抗性であるものと判定される。より具体的には、配列番号：１に記載の塩基配列において（ｉ）2032位の塩基種が「a」である、または、（ｉｉ）2032位の塩基種が「a」であり2033位の塩基種が「c」である、場合に、被検トリはRNAウイルス抵抗性であるものと判定される。
【００４３】
また、本発明における「感受性」とは、被検トリがRNAウイルスに起因する疾患に罹患し易い体質であることをいう。
本方法においては、塩基種が被検トリについてヘテロ（ヘテロ型）で検出されればよい。即ち、本発明においては、被検トリの一方の染色体について上記DNA部位における塩基種を決定し、該塩基がアスパラギンをコードする塩基であればよい。その場合、被検トリはウイルス抵抗性であるものと判定される。また、本発明においては、被検トリの対となる二本の染色体について、上記DNA部位における塩基種を決定することによって、検査を行うこともできる。
【００４４】
また本発明の方法の別の態様においては、トリMx遺伝子上のDNAであって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における631位のアミノ酸をコードするDNAの塩基種がセリン（Ser）をコードする塩基であり、該塩基がホモで検出された場合に、被検トリはRNAウイルス感受性であるものと判定する。
【００４５】
セリンをコードする遺伝子コドンは、「agt」、「agc」等が知られているが、好ましくは、「agt」が検出された場合に、被検トリはRNAウイルス感受性であるものと判定される。より具体的には、配列番号：１に記載の塩基配列において2032位の塩基種が「g」である場合に、被検トリはRNAウイルス感受性であるものと判定される。
【００４６】
上記方法においては、好ましくは、ホモ（ホモ型）で上記塩基種が検出された被検トリについて、ウイルス感受性であるものと判定される。例えば、被検トリの対となる二本の染色体の両方について配列番号：２に記載のアミノ酸配列における631位のアミノ酸をコードするDNAの塩基種が、セリンである場合、被検トリはRNAウイルス感受性であるものと判定される。
【００４７】
上述のように本発明においては、トリMx遺伝子上のDNAであって、配列番号：１に記載の塩基配列における2032位の塩基種を決定することによって、被検トリについてRNAウイルス抵抗性か否かを判定することが可能である。従って、本発明は、トリMx遺伝子上のDNAであって、配列番号：１に記載の塩基配列における2032位の塩基種を決定する工程を含む、被検トリについてRNAウイルス抵抗性か否かを判定する方法を提供する。
【００４８】
上記方法においては例えば、上述のように前記塩基種がアデニン（A）である場合、被検トリは、RNAウイルス抵抗性であるものと判定される。あるいは、前記塩基種がグアニン（G）であり、該塩基種がホモで検出された場合、被検トリはRNAウイルス感受性であるものと判定される。
【００４９】
本発明の上記方法においては、上記トリMx遺伝子上のDNAであって、配列番号：１に記載の塩基配列における2032位の塩基種もしくは遺伝子型(genotype)を決定する。一般的に「遺伝子型」とは、対立遺伝子、あるいは、注目している遺伝子座の対立遺伝子の存在状態を言う。即ち、「遺伝子型」とは、ある遺伝子座における遺伝子（塩基種）の組み合わせを指す。本明細書においては遺伝子型を表現する場合、x／x（xは塩基種）のように記載する。本発明においては、二本の染色体において対をなして存在するトリMx遺伝子上のDNAであって、配列番号：１に記載の塩基配列における2032位について、塩基種を決定する（即ち、「遺伝子型」を決定する）ことが好ましく、例えば、配列番号：１に記載の塩基配列における2032位の遺伝子型がA／AあるいはA／Gである場合は被検トリはRNAウイルス抵抗性であり、G／Gである場合、被検トリはRNAウイルス感受性であると判定される。
【００５０】
本発明の方法において「塩基種の決定」は、当業者においては種々の方法によって行うことができる。一例を示せば、本発明の被検DNA部位を含むDNAの塩基配列を直接決定することによって行うことができる。
この方法においては、まず、被検トリからDNA試料を調製する。本発明においてDNA試料は、例えば被検トリの血液、皮膚、口腔粘膜、切除した組織または細胞、検査等の目的で採取された体液等から抽出した染色体DNA、cDNA、RNA等を基に調製することができる。
本方法においては、次いで、被検DNAを含むDNAを単離する。該DNAの単離は、被検DNAを含むDNAにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体DNA、cDNAあるいはRNAを鋳型としたPCR等によって行うことも可能である。
本方法においては、次いで、単離したDNAの塩基配列を決定する。単離したDNAの塩基配列の決定は、当業者においては、DNAシークエンサー等を用いて容易に実施することができる。本発明においては上述のように、2032位がAである場合に、被検トリはウイルス抵抗性であるものと判定され、Gである場合に被検トリはウイルス感受性であるものと判定される。
【００５１】
また、塩基種を決定するための様々な方法が公知である。本発明の塩基種の決定のための方法は、特に限定されない。例えば、PCR法を応用した解析方法として、TaqMan PCR法、Acyclo Prime法、およびMALDI-TOF/MS法等が実用化されている。またPCRに依存しない塩基種の決定法としてInvader法やRCA法が知られている。更にDNAアレイを使って塩基種を決定することもできる。以下にこれらの方法について簡単に述べる。ここに述べた方法は、いずれも本発明における塩基種の決定に応用できる。
【００５２】
［TaqMan PCR法］
TaqMan PCR法の原理は次のとおりである。TaqMan PCR法は、アレルを含む領域を増幅することができるプライマーセットと、TaqManプローブを利用した解析方法である。TaqManプローブは、このプライマーセットによって増幅されるアレルを含む領域にハイブリダイズするように設計されてる。
TaqManプローブのTmに近い条件で標的塩基配列にハイブリダイズさせれば、１塩基の相違によってTaqManプローブのハイブリダイズ効率は著しく低下する。TaqManプローブの存在下でPCR法を行うと、プライマーからの伸長反応は、いずれハイブリダイズしたTaqManプローブに到達する。このときDNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によって、TaqManプローブはその5'末端から分解される。TaqManプローブをレポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、TaqManプローブの分解を、蛍光シグナルの変化として追跡することができる。つまり、TaqManプローブの分解が起きれば、レポーター色素が遊離してクエンチャーとの距離が離れることによって蛍光シグナルが生成する。１塩基の相違のためにTaqManプローブのハイブリダイズが低下すればTaqManプローブの分解が進まず蛍光シグナルは生成されない。
【００５３】
本発明の被検DNA部位に対応するTaqManプローブをデザインし、更に各プローブの分解によって異なるシグナルが生成されるようにすれば、同時に遺伝子型を判定することもできる。たとえば、レポーター色素として、あるアレルのアレルＡのTaqManプローブに6-carboxy-fluorescein(FAM)を、アレルＢのプローブにVICを用いる。プローブが分解されない状態では、クエンチャーによってレポーター色素の蛍光シグナル生成は抑制されている。各プローブが対応するアレルにハイブリダイズすれば、ハイブリダイズに応じた蛍光シグナルが観察される。すなわち、FAMまたはVICのいずれかのシグナルが他方よりも強い場合には、アレルＡまたはアレルＢのホモであることが明らかになる。他方、アレルをヘテロで有する場合には、両者のシグナルがほぼ同じレベルで検出されることになる。TaqMan PCR法の利用によって、ゲル上での分離のような時間のかかる工程無しで、ゲノムを解析対象としてPCRと遺伝子型決定を同時に行うことができる。そのため、TaqMan PCR法は、大量の被検者の遺伝子型決定方法として有用である。
【００５４】
［Acyclo Prime法］
PCR法を利用した遺伝子型決定方法として、Acyclo Prime法も実用化されている。Acyclo Prime法では、ゲノム増幅用のプライマー１組と、SNPs検出用の１つのプライマーを用いる。まず、ゲノムのSNPsを含む領域をPCRで増幅する。この工程は、通常のゲノムPCRと同じである。次に、得られたPCR産物に対して、SNPs検出用のプライマーをアニールさせ、伸長反応を行う。SNPs検出用のプライマーは、検出対象となっているSNPsに隣接する領域にアニールするようにデザインされている。
このとき、伸長反応のためのヌクレオチド基質として、蛍光偏光色素でラベルし、かつ3'-OHをブロックしたヌクレオチド誘導体（ターミネータ）を用いる。その結果、SNPsに相当する位置の塩基に相補的な塩基が１塩基だけ取りこまれて伸長反応が停止する。ヌクレオチド誘導体のプライマーへの取りこみは、分子量の増大による蛍光偏光(Fluorescence polarization;FP)の増加によって検出することができる。蛍光偏光色素に波長の異なる２種類のラベルを用いれば、特定のSNPsが２種類の塩基のうちのいずれであるのかを特定することができる。蛍光偏光のレベルは定量することができるので、１度の解析でアレルがホモかヘテロかを判定することもできる。
【００５５】
［MALDI-TOF/MS法］
PCR産物をMALDI-TOF/MSで解析することによって遺伝子型を解析することもできる。MALDI-TOF/MSは、分子量をきわめて正確に知ることができるため、タンパク質のアミノ酸配列や、DNAの塩基配列のわずかな相違を明瞭に識別することができる解析手法として様々な分野で利用されている。MALDI-TOF/MSによる遺伝子型決定のためには、まず解析対象であるアレルを含む領域をPCRで増幅する。次いで増幅産物を単離してMALDI-TOF/MSによってその分子量を測定する。アレルの塩基配列は予めわかっているので、分子量に基づいて増幅産物の塩基配列は一義的に決定される。具体的には、まず被検トリからDNAを調製し、次いで被検DNA部位を含むDNAを増幅する。次いで増幅したDNAを質量分析器にかけ分子量を測定する。次いで測定した分子量を対照と比較する。
MALDI-TOF/MSを利用した遺伝子型決定には、PCR産物の分離工程などが必要となる。しかし標識プライマーや標識プローブを使わないで、正確な遺伝子型決定が期待できる。
【００５６】
［IIs型制限酵素を利用したSNPs特異的な標識方法］
PCR法を利用した更に高速で遺伝子型決定が可能な方法も報告されている。例えば、IIs型制限酵素を利用してSNPsの遺伝子型決定が行われている。この方法においては、PCRにあたり、IIs型制限酵素の認識配列を有するプライマーが用いられる。遺伝子組み換えに利用される一般的な制限酵素（II型）は、特定の塩基配列を認識して、その塩基配列中の特定部位を切断する。これに対してIIs型の制限酵素は、特定の塩基配列を認識して、認識塩基配列から離れた部位を切断する。酵素によって、認識配列と切断個所の間の塩基数は決まっている。従って、この塩基数の分だけ離れた位置にIIs型制限酵素の認識配列を含むプライマーがアニールするようにすれば、IIs型制限酵素によってちょうどSNPsの部位で増幅産物を切断することができる。
IIs型制限酵素で切断された増幅産物の末端には、SNPsの塩基を含む付着末端(conhesive end)が形成される。ここで、増幅産物の付着末端に対応する塩基配列からなるアダプターをライゲーションする。アダプターは、SNPsに対応する塩基を含む異なる塩基配列からなり、それぞれ異なる蛍光色素で標識しておくことができる。最終的に、増幅産物はSNPs部位の塩基に対応する蛍光色素で標識される。
前記IIs型制限酵素認識配列を含むプライマーに、捕捉プライマー(capture primer)を組み合せてPCR法を行えば、増幅産物は蛍光標識されるとともに、捕捉プライマーを利用して固相化することができる。たとえばビオチン標識プライマーを捕捉プライマーとして用いれば、増幅産物はアビジン結合ビーズに捕捉することができる。こうして捕捉された増幅産物の蛍光色素を追跡することにより、遺伝子型を決定することができる。
【００５７】
［磁気蛍光ビーズを使った多重化SNPsタイピング］
多型部位(SNPs)タイピングのための以下の方法もまた、本発明の被検DNA部位における塩基種の決定に応用することができる。
複数のアレルを単一の反応系で並行して解析することができる技術も公知である。複数のアレルを並行して解析することは、多重化と呼ばれている。一般に蛍光シグナルを利用したタイピング方法では、多重化のために異なる蛍光波長を有する蛍光成分が必要である。しかし実際の解析に利用することができる蛍光成分は、それほど多くない。これに対して、樹脂等に複数種の蛍光成分を混合した場合には、限られた種類の蛍光成分であっても、相互に識別可能な多様な蛍光シグナルを得ることができる。更に、樹脂中に磁気で吸着される成分を加えれば蛍光を発するとともに、磁気によって分離可能なビーズとすることができる。このような磁気蛍光ビーズを利用した、多重化SNPsタイピングが考え出された(バイオサイエンスとバイオインダストリー, Vol.60 No.12, 821-824)。
【００５８】
磁気蛍光ビーズを利用した多重化SNPsタイピングにおいては、各アレルの多型部位に相補的な塩基を末端に有するプローブが磁気蛍光ビーズに固定化される。各アレルにそれぞれ固有の蛍光シグナルを有する磁気蛍光ビーズが対応するように、両者は組み合せられる。一方、磁気蛍光ビーズに固定されたプローブが相補配列にハイブリダイズしたときに、当該アレル上で隣接する領域に相補的な塩基配列を有する蛍光標識オリゴDNAを調製する。
アレルを含む領域を非対称PCRによって増幅し、上記の磁気蛍光ビーズ固定化プローブと蛍光標識オリゴDNAをハイブリダイズさせ、更に両者をライゲーションする。磁気蛍光ビーズ固定化プローブの末端が、SNPsに相補的な塩基配列であった場合には効率的にライゲーションされる。逆にもしも多型のために末端の塩基が異なれば、両者のライゲーション効率は低下する。その結果、各磁気蛍光ビーズには、試料が当該磁気蛍光ビーズに相補的な遺伝子型であった場合に限り、蛍光標識オリゴDNAが結合する。
磁気によって磁気蛍光ビーズを回収し、更に各磁気蛍光ビーズ上の蛍光標識オリゴDNAの存在を検出することにより、遺伝子型が決定される。磁気蛍光ビーズは、フローサイトメーターでビーズ毎に蛍光シグナルを解析できるので、多種類の磁気蛍光ビーズが混合されていてもシグナルの分離は容易である。つまり、多種類のSNPsを単一の反応容器で並行して解析する「多重化」が達成される。
【００５９】
［Invader法］
多型部位(SNPs)タイピングのための以下の方法もまた、本発明の被検DNA部位における塩基種の決定に応用することができる。
PCR法に依存しない遺伝子型決定のための方法も実用化されている。たとえばInvader法では、アレルプローブ、インベーダープローブ、およびFRETプローブの３種類のオリゴヌクレオチドと、cleavaseと呼ばれる特殊なヌクレアーゼのみで、遺伝子型決定を実現している。これらのプローブのうち標識が必要なのはFRETプローブのみである。
アレルプローブは、検出すべきアレルに隣接する領域にハイブリダイズするようにデザインされる。アレルプローブの5'側には、ハイブリダイズに無関係な塩基配列からなるフラップが連結されている。アレルプローブは多型部位の3'側にハイブリダイズし、多型部位の上でフラップに連結する構造を有する。
一方インベーダープローブは、多型部位の5'側にハイブリダイズする塩基配列からなっている。インベーダープローブの塩基配列は、ハイブリダイズによって3'末端が多型部位に相当するようにデザインされている。インベーダープローブにおける多型部位に相当する位置の塩基は任意で良い。つまり、多型部位を挟んでインベーダープローブとアレルプローブとが隣接してハイブリダイズするように両者の塩基配列はデザインされている。
【００６０】
多型部位がアレルプローブの塩基配列に相補的な塩基であった場合には、インベーダープローブとアレルプローブの両者がアレルにハイブリダイズすると、アレルプローブの多型部位に相当する塩基にインベーダープローブが侵入(invasion)した構造が形成される。cleavaseは、このようにして形成された侵入構造を形成したオリゴヌクレオチドのうち、侵入された側の鎖を切断する。切断は侵入構造の上で起きるので、結果としてアレルプローブのフラップが切り離されることになる。一方、もしも多型部位の塩基がアレルプローブの塩基に相補的でなかった場合には、多型部位におけるインベーダープローブとアレルプローブの競合は無く、侵入構造は形成されない。したがってcleavaseによるフラップの切断が起こらない。
【００６１】
FRETプローブは、こうして切り離されたフラップを検出するためのプローブである。FRETプローブは5'末端側に自己相補配列を有し、3'末端側に１本鎖部分が配置されたヘアピンループを構成している。FRETプローブの3'末端側に配置された１本鎖部分は、フラップに相補的な塩基配列からなっていて、ここにフラップがハイブリダイズすることができる。フラップがFRETプローブにハイブリダイズすると、FRETプローブの自己相補配列の5'末端部分にフラップの3'末端が侵入した構造が形成されるように両者の塩基配列がデザインされている。cleavaseは侵入構造を認識して切断する。FRETプローブのcleavaseによって切断される部分を挟んで、TaqMan PCRと同様のレポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、FRETプローブの切断を蛍光シグナルの変化として検知することができる。
なお、理論的には、フラップは切断されない状態でもFRETプローブにハイブリダイズするはずである。しかし実際には、切断されたフラップとアレルプローブの状態で存在しているフラップとでは、FRETに対する結合効率に大きな差が有る。そのため、FRETプローブを利用して、切断されたフラップを特異的に検出することは可能である。
【００６２】
Invader法に基づいて遺伝子型を決定するためには、アレルＡとアレルＢのそれぞれに相補的な塩基配列を含む、２種類のアレルプローブを用意すれば良い。このとき両者のフラップの塩基配列は異なる塩基配列とする。フラップを検出するためのFRETプローブも２種類を用意し、それぞれのレポーター色素を識別可能なものとしておけば、TaqMan PCR法と同様の考えかたによって、遺伝子型を解析することができる。
Invader法の利点は、標識の必要なオリゴヌクレオチドがFRETプローブのみであることである。FRETプローブは検出対象の塩基配列とは無関係に、同一のオリゴヌクレオチドを利用することができる。したがって、大量生産が可能である。一方アレルプローブとインベーダープローブは標識する必要が無いので、結局遺伝子型決定のための試薬を安価に製造することができる。
【００６３】
［RCA法］
PCR法に依存しない遺伝子型決定のための方法として、RCA法を挙げることができる。鎖置換作用を有するDNAポリメラーゼが、環状の１本鎖DNAを鋳型として、長い相補鎖を合成する反応に基づくDNAの増幅方法が、Rolling Circle Amplification(RCA)法である(Lizardri PM et al.,Nature Genetics 19, 225, 1998)。RCA法においては、環状DNAにアニールして相補鎖合成を開始するプライマーと、このプライマーによって生成する長い相補鎖にアニールする第２のプライマーを利用して、増幅反応を構成している。
RCA法には、鎖置換作用を有するDNAポリメラーゼが利用されている。そのため、相補鎖合成によって２本鎖となった部分は、より5'側にアニールした別のプライマーから開始した相補鎖合成反応によって置換される。たとえば環状DNAを鋳型とする相補鎖合成反応は、１周分では終了しない。先に合成した相補鎖を置換しながら相補鎖合成は継続し、長い１本鎖DNAが生成される。一方、環状DNAを鋳型として生成した長い１本鎖DNAには、第２のプライマーがアニールして相補鎖合成が開始する。RCA法において生成される１本鎖DNAは、環状のDNAを鋳型としていることから、その塩基配列は同じ塩基配列の繰り返しである。したがって、長い１本鎖の連続的な生成は、第２のプライマーの連続的なアニールをもたらす。その結果、変性工程を経ることなく、プライマーがアニールすることができる１本鎖部分が連続的に生成される。こうしてDNAの増幅が達成される。
【００６４】
RCA法に必要な環状１本鎖DNAがSNPsの塩基に応じて生成されれば、RCA法を利用してSNPsをタイピングすることができる。そのために、直鎖状で１本鎖のパドロックプローブが利用される。パドロックプローブは、5'末端と3'末端に検出すべきSNPsの両側に相補的な塩基配列を有している。これらの塩基配列は、バックボーンと呼ばれる特殊な塩基配列からなる部分で連結されている。SNPs部分がパドロックプローブの末端に相補的な塩基配列であれば、アレルにハイブリダイズしたパドロックプローブの末端をDNAリガーゼによってライゲーションすることができる。その結果、直鎖状のパドロックプローブが環状化され、RCA法の反応がトリガーされる。DNAリガーゼの反応は、ライゲーションすべき末端部分が完全に相補的でない場合には反応効率が著しく低下する。したがって、ライゲーションの有無をRCA法で確認することによって、SNPsの遺伝子型決定が可能である。
【００６５】
RCA法は、DNAを増幅することはできるが、そのままではシグナルを生成しない。また増幅の有無のみを指標とするのでは、アレル毎に反応を行わなければ遺伝子型を決定することができない。これらの点を遺伝子型決定用に改良した方法が公知である。たとえばモレキュラービーコンを利用して、RCA法に基づいて１チューブで遺伝子型決定を行うことができる。モレキュラービーコンは、TaqMan法と同様に、蛍光色素とクエンチャーを利用したシグナル生成用プローブである。モレキュラービーコンの5'末端と3'末端は相補的な塩基配列で構成されており、単独ではヘアピン構造を形成する。両端付近を蛍光色素とクエンチャーで標識しておけば、ヘアピン構造を形成している状態では蛍光シグナルが検出できない。モレキュラービーコンの一部を、RCA法の増幅産物に相補的な塩基配列としておけば、モレキュラービーコンはRCA法の増幅産物にハイブリダイズする。ハイブリダイズによってヘアピン構造が解消されるため、蛍光シグナルが生成される。
【００６６】
モレキュラービーコンの利点は、パドロックプローブのバックボーン部分の塩基配列を利用することによって、検出対象とは無関係にモレキュラービーコンの塩基配列を共通にできる点である。アレル毎にバックボーンの塩基配列を変え、蛍光波長が異なる２種類のモレキュラービーコンを組み合せれば、１チューブで遺伝子型決定が可能である。蛍光標識プローブの合成コストは高いので、測定対象に関わらず共通のプローブを利用できることは、経済的なメリットである。
【００６７】
［1分子蛍光分析システム(Single molecule fluorescence spectroscopy)］
1fL(femtoliter)という微小領域の蛍光分析を可能とするシステムが実用化されている。このシステムを用いれば、蛍光標識プライマーの伸長を、並進拡散時間(translational diffusion time)の増大として検出することができる。タイピングの対象となるアレルに対してそれぞれ相補的な塩基配列を有するプライマーを用意する。各プライマーには、それぞれ識別可能な蛍光標識を結合しておく。このプライマーを使ってPCRを行い、増幅産物を蛍光相関分析法(Fluorescence Correlation Spectroscopy)によって蛍光測定する。サンプルがプライマーに相補的な塩基配列を有していれば、PCRによってプライマーは伸長する。伸長したプライマーは分子が大きくなるために、蛍光の揺らぎを生じる。この蛍光の揺らぎが並進拡散時間(translational diffusion time)の増大として検出される。プライマーに相補的な塩基配列がサンプル中に含まれなければ、PCRの増幅産物が生成しないので、蛍光変化は起きない。
具体的には、２つのアレルＡとＢに対して、それぞれ異なる蛍光標識を有するプライマーを用いて、同じ反応液中でPCRを行う。増幅産物の蛍光測定において、ＡまたはＢのいずれか一方の蛍光シグナルの変化が観察されれば、いずれかのホモ、両方の蛍光シグナルが変化すればヘテロであることが確認できる(PharmaGenomics, July/August 46-48, 2003)。正確で迅速な解析方法として評価されている。
【００６８】
これらの方法はいずれも多量のサンプルを高速に遺伝子型決定するために開発された方法である。MALDI-TOF/MSを除けば、いずれの方法にも何らかの形で標識プローブなどを用意する必要がある。これに対して、標識プローブなどに頼らない遺伝子型決定も古くから行われている。
【００６９】
このような方法の一つとして、例えば、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism／RFLP）を利用した方法やPCR-RFLP法等が挙げられる。これらの方法もまた、本発明の被検DNA部位における塩基種の決定に応用することができる。
RFLPは、制限酵素の認識部位の変異、あるいは制限酵素処理によって生じるDNA断片内における塩基の挿入または欠失が、制限酵素処理後に生じる断片の大きさの変化として検出できることを利用している。検出対象となる多型を含む塩基配列を認識する制限酵素が存在すれば、RFLPの原理によって多型部位の塩基を知ることができる。
【００７０】
具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をPCR法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動差として検出することができる。あるいは染色体DNAをこれらの制限酵素によって処理し電気泳動後、プローブDNAを用いてサザンブロッティングを行なうことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの種類に応じて適宜選択することができる。この方法ではゲノムDNA以外にも被検トリから調整したRNAを逆転写酵素でcDNAにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行なうことも可能である。また、このcDNAを鋳型としてPCRで本発明の被検DNA部位を含むDNAを増幅し、それを制限酵素で消化した後、移動度の差を調べることもできる。
【００７１】
標識プローブを必要としない方法として、DNAの二次構造の変化を指標として塩基の違いを検出する方法も公知である。PCR-SSCPでは、１本鎖DNAの二次構造がその塩基配列の相違を反映することを利用している(Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.、Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313-1318.、Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling.、PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275-282.)。この方法は操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のDNA試料をスクリーニングするのに好適である。PCR-SSCP法の原理は次の通りである。二本鎖DNA断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したDNA鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖DNAが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖DNAの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりDNA断片に欠損等による変異が存在することを検出することができる。
具体的にはまず、被検トリからDNA試料を調製する。次いで、本発明の被検DNA部位を含むDNAをPCR法等によって増幅する。増幅される範囲としては、通常200〜400bp程度の長さが好ましい。PCRは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。PCRの際に、32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅DNA産物を標識することができる。あるいはPCR反応液に32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてPCRを行うことにより、増幅DNA産物を標識することも可能である。さらに、PCR反応後にクレノウ酵素等を用いて、32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅DNA断片に付加することによっても標識を行うことができる。こうして得られた標識DNA断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（5から10％程度）のグリセロールを添加することにより、DNA断片の分離の条件を改善することができる。また、泳動条件は各DNA断片の性質により変動するが、通常、室温（20から25℃）で行い、好ましい分離が得られないときには4から30℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、DNA断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、PCRによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。また、標識したDNAを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。
【００７２】
その他、標識プローブを必要としない方法として、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（denaturant gradient gel electrophoresis： DGGE法）等を例示することができる。DGGE法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、DNA断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってDNA断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なDNA断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のDNA配列はその不安定さのために、部分的に１本鎖へと解離する。部分的に解離したDNA断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖DNAの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。
具体的には、まずPCR法等によって本発明の被検DNA部位を含む領域を増幅する。増幅産物に、塩基配列がわかっているプローブDNAをハイブリダイズさせて２本鎖とする。これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。プローブDNAとのハイブリダイズによってミスマッチを生じたDNA断片では、より低い変性剤濃度位置でDNA断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなる。こうして生じた移動度の差を検出することによりミスマッチの有無を検出することができる。
【００７３】
更にDNAアレイを使って遺伝子型を決定することもできる（細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新PCR法」,秀潤社,2000.4/20発行,pp97-103「オリゴDNAチップによるSNPの解析」,梶江慎一）。DNAアレイは、同一平面上に配置した多数のプローブに対してサンプルDNA（あるいはRNA）をハイブリダイズさせ、当該平面をスキャンすることによって、各プローブに対するハイブリダイズが検出される。多くのプローブに対する反応を同時に観察することができることから、たとえば、多数のSNPsを同時に解析するには、DNAアレイは有用である。
一般にDNAアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのDNAは非透過性(non- porous)の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性(porous)の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することもできる。
【００７４】
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Affymetrix社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ(in situ)で合成される。例えば、photolithographicの技術（Affymetrix社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット(Rosetta Inpharmatics社)技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
オリゴヌクレオチドは、検出すべきSNPsを含む領域に相補的な塩基配列で構成される。基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常10〜100ベースであり、好ましくは10〜50ベースであり、さらに好ましくは15〜25ベースである。更に、一般にDNAアレイ法においては、クロスハイブリダイゼーション（非特異的ハイブリダイゼーション）による誤差を避けるために、ミスマッチ(MM)プローブが用いられる。ミスマッチプローブは、標的塩基配列と完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとのペアを構成している。ミスマッチプローブに対して、完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドはパーフェクトマッチ（PM)プローブと呼ばれる。データ解析の過程で、ミスマッチプローブで観察されたシグナルを消去することによって、クロスハイブリダイゼーションの影響を小さくすることができる。
【００７５】
DNAアレイ法による遺伝子型決定のための試料は、被検トリから採取された生物学的試料をもとに当業者に周知の方法で調製することができる。生物学的試料は特に限定されない。例えば被検トリの血液、皮膚、組織または細胞、糞便または羽毛から抽出した染色体DNAから、DNA試料を調製することができる。判定すべき被検DNA部位を含む領域を増幅するためのプライマーを用いて、染色体DNAの特定の領域が増幅される。このとき、マルチプレックスPCR法によって複数の領域を同時に増幅することができる。マルチプレックスPCR法とは、複数組のプライマーセットを、同じ反応液中で用いるPCR法である。複数の被検DNA部位を解析するときには、マルチプレックスPCR法が有用である。
【００７６】
一般にDNAアレイ法においては、PCR法によってDNA試料を増幅するとともに、増幅産物が標識される。増幅産物の標識には、標識を付したプライマーが利用される。たとえば、まず本発明の被検DNA部位を含む領域に特異的なプライマーセットによるPCR法でゲノムDNAを増幅する。次に、ビオチンラベルしたプライマーを使ったラベリングPCR法によって、ビオチンラベルされたDNAを合成する。こうして合成されたビオチンラベルDNAを、チップ上のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さや反応温度等の条件に応じて、適宜調整することができる。当業者は、適切なハイブリダイゼーションの条件をデザインすることができる。ハイブリダイズしたDNAを検出するために、蛍光色素で標識したアビジンが添加される。アレイをスキャナで解析し、蛍光を指標としてハイブリダイズの有無を確認する。
【００７７】
上記の方法以外にも、特定部位の塩基を検出するために、アレル特異的オリゴヌクレオチド（Allele Specific Oligonucleotide／ASO）ハイブリダイゼーション法が利用できる。アレル特異的オリゴヌクレオチド(ASO)は、検出すべき被検DNA部位が存在する領域にハイブリダイズする塩基配列で構成される。ASOを試料DNAにハイブリダイズさせるとき、多型（塩基変異）によって被検DNA部位にミスマッチが生じると、ハイブリッド形成の効率が低下する。ミスマッチは、サザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等によって検出することができる。また、リボヌクレアーゼAミスマッチ切断法によって、ミスマッチを検出することもできる。具体的には、本発明の被検DNA部位を含むDNAをPCR法等によって増幅し、これをプラスミドベクター等に組み込んだMx遺伝子のcDNA等から調製した標識RNAとハイブリダイゼーションを行なう。変異が存在する部分においてはハイブリッドが一本鎖構造となるので、この部分をリボヌクレアーゼAによって切断し、これをオートラジオグラフィー等で検出することによって変異の存在を検出することができる。
【００７８】
本発明の上記検査方法の別の態様は、トリMx遺伝子の発現産物を指標とすることによって検査を行う方法である。ここで「発現」とは、転写および翻訳が含まれる。従って、「発現産物」には、mRNAおよびタンパク質が含まれる。
【００７９】
本発明は、トリMx遺伝子の発現産物を検出することを特徴とする、RNAウイルス（例えば、トリインフルエンザウイルス等）抵抗性のトリを判定する方法を提供する。該方法の好ましい態様においては、まず、被検トリからタンパク質試料を調製し、該タンパク質試料に含まれる、６３１位がアスパラギンであるMxタンパク質の量、もしくは、６３１位がセリンであるMxタンパク質の量を測定する。
【００８０】
このような方法としては、SDSポリアクリルアミド電気泳動法、並びに、上記タンパク質を認識する抗体を用いた、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法(ELISA)、および免疫蛍光法を例示することができる。
上記の方法によって、６３１位がアスパラギンであるMxタンパク質が検出された場合に、被検トリはRNAウイルス（例えば、トリインフルエンザウイルス等）抵抗性であるものと判定される。一方、上記６３１位がアスパラギンであるMxタンパク質が検出されない場合（または６３１位がセリンであるMxタンパク質が検出された場合）に、被検トリはRNAウイルス（例えば、トリインフルエンザウイルス等）感受性であるものと判定される。
【００８１】
以上、種々の検出方法を例示したが、これらに特に限定されるものではない。また、当業者においては、上述の方法を適宜改変して、本発明の方法を実施することが可能である。
【００８２】
本発明はまた、本発明の方法のためのプローブまたはプライマーを提供する。本発明によって、トリMx遺伝子上のDNAで、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における631位のアミノ酸をコードするDNAの塩基種とRNAウイルス抵抗性の関連が明らかにされた。したがって、当該部位の塩基を明らかにするためのプローブ、あるいはプライマーは、本発明の方法に有用である。ある部位における塩基を明らかにするための手法には、上記のような様々な方法を応用することができる。これらの手法においては、一般的に、当該部位を含む領域を増幅するためのプライマー、あるいは当該部位にハイブリダイズするプローブが用いられる。
【００８３】
本発明はまた、本発明のRNAウイルス抵抗性のトリを判定する方法に用いるための判定用試薬を提供する。
本発明の上記試薬は、本発明の被検DNA部位を含むDNA領域とハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチド、または、本発明の被検DNA部位を含むDNAを増幅するためのプライマーを含有する試薬である。
【００８４】
本発明の試薬の好ましい態様としては、以下の（ａ）または（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含む、トリ用RNAウイルス抵抗性判定試薬である。
（ａ）トリMx遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における2032位の部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドプローブ
（ｂ）トリMx遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における2032位の部位を含むDNAを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー
【００８５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明の被検DNA部位を含むDNAに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第2版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、検出する遺伝子もしくは該遺伝子の近傍DNA領域における、上記（ａ）または（ｂ）に記載の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
【００８６】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、具体的には、通常「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度の条件を例示することができる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００８７】
該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、本発明の配列番号：１に記載の塩基配列における2032位の部位を含むDNAの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００８８】
本発明において、被検DNA部位を含む領域にハイブリダイズするプローブとは、上記部位を含む領域の塩基配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるプローブを言う。より具体的には、プローブの塩基配列中に被検DNA部位（例えば、配列番号：１に記載の塩基配列における2032位）を含むプローブは本発明のプローブとして好ましい。あるいは、該部位における塩基の解析方法によっては、プローブの末端が多型部位に隣接する塩基に対応するように、デザインされる場合もある。従って、プローブ自身の塩基配列には被検DNA部位が含まれないが、被検DNA部位に隣接する領域に相補的な塩基配列を含むプローブも、本発明における望ましいプローブとして示すことができる。
【００８９】
言いかえれば、ゲノムDNA上の本発明の被検DNA部位に隣接する領域にハイブリダイズすることができるプローブは、本発明のプローブとして好ましい。本発明のプローブには、プライマーと同様に、塩基配列の改変、塩基配列の付加、あるいは修飾が許される。例えば、Invader法に用いるプローブは、フラップを構成するゲノムとは無関係な塩基配列が付加される。このようなプローブも、被検DNA部位を含む領域にハイブリダイズする限り、本発明のプローブに含まれる。本発明のプローブを構成する塩基配列は、ゲノムにおける本発明の被検DNA部位の周辺DNA領域の塩基配列をもとに、解析方法に応じてデザインすることができる。
【００９０】
一方、本発明において、被検DNA部位を含む領域を増幅するためのプライマーには、被検DNA部位を含むDNAを鋳型として、被検DNA部位に向かって相補鎖合成を開始することができるプライマーも含まれる。該プライマーは、被検DNA部位を含むDNAにおける、被検DNA部位の3'側に複製開始点を与えるためのプライマーと表現することもできる。プライマーがハイブリダイズする領域と被検DNA部位との間隔は任意である。両者の間隔は、被検DNA部位の塩基の解析手法に応じて、好適な塩基数を選択することができる。たとえば、DNAチップによる解析のためのプライマーであれば、被検DNA部位を含む領域として、２０〜５００、通常５０〜２００塩基の長さの増幅産物が得られるようにプライマーをデザインすることができる。当業者においては、多型部位を含む周辺DNA領域についての塩基配列情報を基に、解析手法に応じたプライマーをデザインすることができる。本発明のプライマーを構成する塩基配列は、ゲノムの塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列のみならず、適宜改変することができる。
【００９１】
本発明のプライマーには、ゲノムの塩基配列に相補的な塩基配列に加え、任意の塩基配列を付加することができる。例えば、IIs型の制限酵素を利用した多型の解析方法のためのプライマーにおいては、IIs型制限酵素の認識配列を付加したプライマーが利用される。このような、塩基配列を修飾したプライマーは、本発明のプライマーに含まれる。更に、本発明のプライマーは、修飾することができる。例えば、蛍光物質や、ビオチンまたはジゴキシンのような結合親和性物質で標識したプライマーが各種の遺伝子型決定方法において利用される。これらの修飾を有するプライマーも本発明に含まれる。
【００９２】
本発明のプライマー、またはプローブは、それを構成する塩基配列をもとに、任意の方法によって合成することができる。本発明のプライマーまたはプローブの、ゲノムDNAに相補的な塩基配列の長さは、通常１５〜１００、一般に１５〜５０、通常１５〜３０である。与えられた塩基配列に基づいて、当該塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する手法は公知である。更に、オリゴヌクレオチドの合成において、蛍光色素やビオチンなどで修飾されたヌクレオチド誘導体を利用して、オリゴヌクレオチドに任意の修飾を導入することもできる。あるいは、合成されたオリゴヌクレオチドに、蛍光色素などを結合する方法も公知である。
【００９３】
本発明の試薬には、遺伝子型決定方法に応じて、各種の酵素、酵素基質、および緩衝液などを組み合せることができる。酵素としては、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、あるいはIIs制限酵素などの、上記の遺伝子型決定のための方法として例示した各種の解析方法に必要な酵素を示すことができる。緩衝液は、これらの解析に用いる酵素の活性の維持に好適な緩衝液が、適宜選択される。更に、酵素基質としては、たとえば相補鎖合成用の基質等が用いられる。
【００９４】
更に本発明の試薬には、被検DNA部位における塩基が明らかな対照を添付することができる。対照は、予め遺伝子型が明らかなゲノム、あるいはゲノムの断片を用いることができる。ゲノムは、細胞から抽出されたものでもよいし、細胞あるいは細胞の分画を用いることもできる。細胞を対照として用いれば、対照の結果によってゲノムDNAの抽出操作が正しく行われたことを証明することができる。あるいは、被検DNA部位を含む塩基配列からなるDNAを対照として用いることもできる。具体的には、本発明の被検DNA部位における塩基が明らかにされたゲノム由来のDNAを含むYACベクターやBACベクターは、対照として有用である。あるいは被検DNA部位を含む数百bのみを切り出して挿入したベクターを対照として用いることもできる。
【００９５】
また本発明は、本発明の上記判定方法を用いた、RNAウイルスワクチンの製造方法を提供する。本発明の判定方法により、ワクチン生産に適したRNAウイルス感受性の高いニワトリを選抜し、該ニワトリの受精卵（好ましくは、発育鶏卵）を取得することができる。即ち本発明は、以下の工程（ａ）〜（ｅ）を含む、RNAウイルスワクチンの製造方法に関する。
（ａ）本発明の判定方法により、RNAウイルス抵抗性ではない、もしくはRNAウイルス感受性であると判定されるニワトリを選択する工程
（ｂ）工程（ａ）によって選択されたニワトリの発育鶏卵を取得する工程
（ｃ）前記発育鶏卵の将尿液へRNAウイルスを注入する工程
（ｄ）工程（ｃ）で得られる鶏卵を孵卵する工程
（ｅ）工程（ｄ）で得られる鶏卵から将尿液を回収する工程
【００９６】
本発明の上記ウイルスワクチンの製造方法における、RNAウイルスとは、好ましくは、トリインフルエンザウイルスである。
通常、ウイルスワクチンは、ニワトリの卵、より詳しくは、発育鶏卵を用いて製造することができる。発育鶏卵を用いたウイルスワクチンの製造、調製方法は、当業者においては、公知の技術である。本発明のワクチン製造方法の好ましい態様においては、上記の（ａ）〜（ｅ）の各工程を順に行う方法である。一例を示せば、具体的に以下のような方法によってワクチンの製造・調製を行うことが可能であるが、本発明のワクチン製造方法は必ずしも以下の方法に限定されない。
（１）本発明の判定方法によって、RNAウイルス感受性のニワトリを選抜し、該ニワトリの有精卵（受精卵）を孵卵器を用いて10日程度温める。その後、卵殻に穴を開け、卵中の将尿液へワクチンを作成すべきRNAウイルス（好ましくは、トリインフルエンザイウイルス）を注入し、穴を塞ぐ。次いで、再度、孵卵器を用いて、3日程度温める。
（２）卵中の将尿液を採取し、血液等の不純物を除き、遠心を行う。沈殿してペースト状になったウイルス溶液を、適宜、ホルマリン等で処理しウイルスを死滅させワクチン原液とする。
本発明の方法によって、例えば、RNAウイルス感受性のオスおよびメスのニワトリを選択し、交配させることにより、ワクチン製造に適した受精卵（発育鶏卵）を取得することができる。
【実施例】
【００９７】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕
本発明者らは、Mxタンパクのアミノ酸631位が病害性RNAウイルスに対する抵抗性と感受性とを分けているかを明らかにするべく、２種類のニワトリMx遺伝子cDNAのミュータントを構築し、これをインフルエンザウイルス感受性のマウス3T3細胞に導入し、GFPとのリコンビナントである水疱性口内炎ウイルス（R-VSV）を用いた感染実験を行った。すなわち、コシャモ（ＫＳ）とナゴヤ（Ｎ）は631位のアミノ酸にセリンを持つことからRNAウイルス感受性と考えた。サツマドリ−２（Ｓ２）、ホッカイドウシャモ（ＨＳ）は631位にアスパラギンを持つことから抵抗性と考えた。そして、当該631位のアミノ酸が入れ替わるようにミュータントのcDNAを構築し、これらの遺伝子を導入した細胞間で感受性と抵抗性が入れ替わるかを調べた。
【００９８】
ニワトリMx遺伝子は705個のアミノ酸をコードしている。631位を含む625個目から最終の707個目までのアミノ酸配列が入れ替わるようcDNAの2011番目から2016番目を入れ替えた。すなわち、ＫＳ、Ｎ、Ｓ２、ＨＳのcDNAを入れたp-CI-neoベクターを制限酵素AatIで消化し、6300bpと1716bpのフラグメントを得た。この1716bpのフラグメントがコードするアミノ酸は第631位を除いては（ＫＳ、Ｎ）と（Ｓ２、ＨＳ）間で同じであるが、631位はセリンとアスパラギンと異なっている。なお、ＫＳとＮ間では631位も同じセリンであり、Ｓ２とＨＳ間では631位も同じアスパラギンである。これらのフラグメントを、Ｔ４リガーゼシステム（Promega社）を用いて、由来の異なる6300bpのフラグメントにライゲーションして３つのミュータントｃＤＮＡを得た。すなわち、前半6300bpがＫＳ由来で後半1716bpがＳ２由来（ＫＳ／Ｓ２）、Ｎ/ＨＳ、Ｓ２/ＫＳの３種類である。なお、後半1716bpのうち、アミノ酸第631位をコードする塩基部分以外は全ての品種で同じ塩基配列であるので、アミノ酸631位のみが入れ替わったMxタンパクを作るｃＤＮＡミュータントを得たことになる。
【００９９】
これらミュータントｃＤＮＡあるいはミュータントでないｃＤＮＡを持つプラスミドpCI-neoをマウス３Ｔ３株化細胞に導入した。３Ｔ３細胞はMx遺伝子の機能に欠陥を持つマウスＢＡＬＢ/ｃ系統に由来するものであり、自分ではMxタンパクを作ることができない。
遺伝子導入した細胞は、10%の牛胎仔血清（Gibco-BRL）を含むＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）培養液内で培養した。なお、３Ｔ３への導入はFuGeneのloposome（Roche社）を用いて行い、導入された細胞の選別は500μｇ/ｍｌのＧ４１８を含む培養液を用いて行った。
細胞へのウイルス感染強度はGFP遺伝子が結合したRSV（上記非特許文献４参照）を感染させた後、GFPが発現している細胞数をカウントすることにより測定した。
【０１００】
その結果を図１に示した。ウイルス感受性である３Ｔ３細胞への感染割合を１００％としたとき、感受性と考えられたコシャモ（ＫＳ）あるいはナゴヤ（Ｎ）のそのままのMx遺伝子を導入した細胞では、それぞれ平均約７５％あるいは１１０％が感染し、感受性であることが確認された。また、抵抗性と考えられたサツマドリ−２（Ｓ２）では平均１０％程度の感染割合であり、Ｓ２は相対的に抵抗性であることが確認された。
【０１０１】
一方、感受性のＫＳであるがアミノ酸６３１位は抵抗性のＳ２であるミュータント（ＫＳ／Ｓ２）、同様に感受性のＮであるがアミノ酸631位は抵抗性のホッカイドウシャモ（ＨＳ）のミュータントを導入した３Ｔ３細胞では（Ｎ/ＨＳ）、どちらも感染率は１０％以下となった。このことから感受性のMx蛋白でもアミノ酸631位のみがセリンからアスパラギンに入れ替わることにより、VSV抵抗性に変わることが示された。
【０１０２】
さらに、抵抗性であるＳ２のアミノ酸第631位のみを感受性であるＫＳに入れ替えたミュータントｃＤＮＡ（Ｓ２/ＫＳ）を導入した３Ｔ３では、平均の感染率は約９５％であった。すなわち、抵抗性のMx蛋白でもアミノ酸631位がアスパラギンからセリンに入れ替わるだけで、VSV感受性に替わることが示された。
【０１０３】
これらのことから、病害性ＲＮＡウイルスであるVSVに対するニワトリ遺伝子導入細胞の抵抗性の一つは少なくともMx蛋白が担っており、その中でもニワトリMx蛋白の第６３１位が入れ替わるだけで、感受性と抵抗性が入れ替わることが明らかになった。
【０１０４】
〔実施例２〕
Mx遺伝子のアミノ酸第631番目の型で同一品種のニワトリ群をあらかじめ分けておき、香港で流行したトリインフルエンザウイルス強毒株のA/Hong Kong/483/97(H5N1)株を用い、これらMx遺伝子の型の異なる個体に対して感染試験を行った。
初めに、Mx遺伝子のアミノ酸第631位がSer性ホモ型の4週齢ロードアイランドレッドに対して、50％致死率（LD50値）を求めるためのin vivo感染実験を行った。ウイルスを感染させた鶏胚尿液を101〜106に希釈し、１羽につき100μlずつ経鼻接種した。各希釈につき4羽用いた。接種後、2週間観察し、ニワトリLD50値を求めた。その結果、LD50は3.5という数値を示した。
次に、５週齢ロードアイランドレッド種の集団から、アミノ酸第631位がAsn(塩基配列ではAAT)になる塩基配列を持つもの、同631位Ser(塩基配列ではAGT)になる塩基配列を持つもの、これらのヘテロのものそれぞれ3羽を選び出し、先に求めたLD50値である103.5/mlの感染鶏胚尿液100μlを経鼻接種することにより、in vivo感染実験を行い、２週間観察した。
その結果は表１（A/Hong Kong/483/97(H5N1)を感染させた５週齢ロードアイランドレッドの観察結果）のようであった。
【０１０５】
【表１】
2005245406.tif 000002
【０１０６】
すなわち、Asnホモ(Asn/Asn)、ヘテロ型（Asn/Ser）ともに全く異常はなかった。ところが、Serホモ（Ser/Ser）は、１羽は死亡、１羽は軽微な臨床症状（羽毛逆立）を示し、１羽は異常なしであった。このことから、Mx遺伝子第631位をAsn型ホモで持つ個体あるいはヘテロで持つ個体は、Ser型ホモの個体に比べ抵抗性であることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、ニワトリMx遺伝子及びミュータントMx遺伝子を導入したマウス３Ｔ３細胞のＶＳＶ感染性を表すグラフである。縦軸には細胞のＶＳＶ感染割合（％）、横軸には遺伝子導入細胞の種類を示す。３Ｔ３：遺伝子導入無しのマウス３Ｔ３細胞。ｐＣＩ：ベクターのみ導入したマウス３Ｔ３細胞。ＫＳ：コシャモのＭｘ遺伝子のmRNAを発現するマウス３Ｔ３細胞。Ｎ：ナゴヤのＭｘ遺伝子のmRNAを発現するマウス３Ｔ３細胞。Ｓ２：サツマドリ−２のＭｘ遺伝子のmRNAを発現するマウス３Ｔ３細胞。ＫＳ/Ｎ631：アミノ酸第631位がアスパラギンへと入れ替わったコシャモのＭｘ遺伝子のmRNAを発現するマウス３Ｔ３細胞。Ｎ/Ｎ631：アミノ酸第631位がアスパラギンへと入れ替わったナゴヤのＭｘ遺伝子のmRNAを発現するマウス３Ｔ３細胞。Ｓ２/Ｓ631：アミノ酸第631位がセリンへと入れ替わったサツマドリ−２のＭｘ遺伝子のmRNAを発現するマウス３Ｔ３細胞。カッコ内は試験回数を示す。
【図２】図２はニワトリのMxのアミノ酸配列（PubMed: Z23168）を示す図である。アミノ酸第631位は下線を施したS（Ser：セリン）部分。抵抗性ニワトリではN（Asn：アスパラギン）となる。
【図３】図３はニワトリMx遺伝子のcDNAの塩基配列（PubMed: Z23168）を示す図である。アミノ酸第631位に相当する部分（agt）に下線を付けた。抵抗性ニワトリではこの部分がaatとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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