(57)【要約】【課題】  安定でしかも増殖効率の高いトマトセルラインおよびその生産方法、並びにトマトセルライン培養用培地を提供する。【解決手段】  トマト細胞を、ゼアチンを含む培地、好ましくはさらに、α−ナフタレン酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、およびスクロースを含む培地で培養する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トマト細胞を、ゼアチンを含む培地で培養することを特徴とするトマトセルラインの生産方法。
【請求項２】
トマト細胞を、ゼアチンと、オーキシン、サイトカイニン、および糖類の少なくとも１つの化合物とを含む培地で培養することを特徴とするトマトセルラインの生産方法。
【請求項３】
振れ幅が３ｃｍ以上の条件で、震盪培養することを特徴とする請求項１または２に記載のトマトセルラインの生産方法。
【請求項４】
上記培地は、α−ナフタレン酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、およびスクロースを含むものであることを特徴とする請求項１または２に記載のトマトセルラインの生産方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のトマトセルラインの生産方法によって得られたトマトセルライン。
【請求項６】
Ｔｍ−１様形質を有する請求項５に記載のトマトセルライン。
【請求項７】
ゼアチンを含むことを特徴とするトマトセルライン培養用培地。
【請求項８】
ゼアチンと、オーキシン、サイトカイニン、および糖類の少なくとも１つの化合物とを含むことを特徴とするトマトセルライン培養用培地。
【請求項９】
さらに、α−ナフタレン酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、およびスクロースを含むことを特徴とする請求項７または８に記載のトマトセルライン培養用培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、持続的に継代培養可能なトマトセルラインおよびその生産方法、並びに、トマトセルライン培養用培地に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来からＴｍ−１形質は、トマトにおいて、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ、以下ＴｏＭＶと略称する；トバモウィルスの１種）の増殖を抑制する形質として知られている。Ｔｍ−１形質は、トマトの野生種（Lycopersicon hirsutum）を起源とし、育種上、栽培種に広く利用されているものの、Ｔｍ−１遺伝子がクローニングされ、塩基・アミノ酸配列が特定されるまでには至っていない。
【０００３】
Ｔｍ−１形質は半優性形質であり、ホモ接合体（Ｔｍ−１／Ｔｍ−１）では、ヘテロ接合体（Ｔｍ−１／＋）よりも、ＴｏＭＶの増殖が抑制される程度は大きい。しかしながら、ＴｏＭＶの増殖抑制メカニズムについてはよくわかっていない。
【０００４】
このようなＴｍ−１形質の機能解析（例えば、Ｔｍ−１遺伝子クローニング，塩基配列・アミノ酸配列の特定，ＴｏＭｖの増殖抑制メカニズムの解析等）を行うには、持続的に継代可能な安定なＴｍ−１様機能を有するセルライン（細胞株）を樹立することが必須となる。
【０００５】
例えば、非特許文献１では、Ｔｍ−１トマトセルラインをカルス誘導し、成長したカルスの継代培養が行われている。具体的には、非特許文献１では、カイネチン（kinetine）スクロース、イースト抽出物を添加したＢ５培地で、Ｔｍ−１形質を有するホモ接合体、それとニアアイソジェニックでＴｍ−１形質を有さないセルライン、および両者を交配して得たヘテロ接合体由来のセルラインの培養を行い、成長したカルスの継代培養が行われている。
【非特許文献１】Watanabe, Y., Kishibayashi, N., Motoyoshi, F. and Okada, Y. (1987) Characterization of Tm-1 gene action on replication of common isolates and a resistance-breaking isolate of TMV. Virology 161:527-532.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献１の技術によって得られたセルラインは、褐変して不安定な上、増殖効率も低いという問題がある。実際、前述したＴｍ−１形質のホモ接合体、ヘテロ接合体、Ｔｍ−１形質を有さないセルラインは、すでに絶えてしまっている。
【０００７】
このように、従来の培養技術では、トマトセルラインを樹立すること自体困難である。このため、安定で増殖効率の高いトマトセルラインを樹立できず、均一なセルラインを大量に生産することができない。それゆえ、安定でしかも増殖効率の高いトマトセルラインを確立することが強く望まれている。
【０００８】
本発明は、上記従来の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、安定でしかも増殖効率の高いトマトセルラインおよびその生産方法、並びに、そのようなトマトセルラインの培養・生産に特に適したトマトセルライン培養用培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を鑑み鋭意検討した結果、ゼアチン（サイトカイニンの１種）を含有する培地でトマト細胞を培養することによって、安定かつ増殖効率の高いトマトセルラインを作製できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明のトマトセルラインの生産方法は、上記の課題を解決するために、トマト細胞を、ゼアチンを含む培地で培養することを特徴としている。
【００１１】
また、本発明のトマトセルラインの生産方法は、上記の課題を解決するために、トマト細胞を、ゼアチンと、オーキシン、サイトカイニン、および糖類の少なくとも１つの化合物とを含む培地で培養することを特徴としている。
【００１２】
本発明のトマトセルラインの生産方法では、振れ幅が３ｃｍ以上の条件で、震盪培養することが好ましい。
本発明のトマトセルラインの生産方法では、上記培地が、さらに、α−ナフタレン酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、およびスクロースを含むものであることが好ましい。
【００１３】
本発明のトマトセルラインは、上記した本発明のトマトセルラインの生産方法によって得られたものである。
【００１４】
本発明のトマトセルラインは、Ｔｍ−１様形質を有するものであってもよい。
【００１５】
本発明のトマトセルライン培養用培地は、ゼアチンを含むことを特徴としている。
【００１６】
また、本発明のトマトセルライン培養用培地は、ゼアチンと、オーキシン、サイトカイニン、および糖類の少なくとも１つの化合物とを含むことを特徴としている。
【００１７】
本発明のトマトセルライン培養用培地は、さらに、α−ナフタレン酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、およびスクロースを含むものであってもよい。
【００１８】
上記各構成および方法によれば、従来困難であった、褐変せず、安定でしかも増殖効率の高いトマトセルラインの樹立が可能となる。すなわち、持続的に継代培養可能なトマトセルラインを提供できる。従って、均一なトマトセルラインを大量に得ることができるため、トマトの各種機能解析や、形質の判定（例えば、Ｔｍ−１形質の判定など）に有用である。
【発明の効果】
【００１９】
以上のように、本発明トマトセルラインの生産方法は、少なくともゼアチンを含む培地でトマト細胞を培養するものであり、また、本発明のトマトセルライン培養用培地は、少なくともゼアチンを含むものである。また、本発明のトマトセルラインは、少なくともゼアチンを含む培地で培養されたものである。それゆえ、安定かつ増殖効率の高いトマトセルラインを作製でき、持続的に継代培養可能な均一なトマトセルラインを提供できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の一形態について説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
【００２１】
（１）トマト培養用培地
まず、本発明のトマト培養用培地（以下、本培地）について説明する。本培地は、トマトの培養に好適な培地であって、特に、従来困難であったトマトセルライン安定かつ増殖効率の高いトマトセルラインの樹立に利用可能な培地である。すなわち、本培地は、トマトの細胞、組織、器官をなどを取り出して、無菌的に培養するトマトの組織培養に特に適した培地である。
【００２２】
組織培養において、特に重要な要素となるのが、培地である。培地の組成によって、細胞分裂や分化の状態が異なるからである。本培地の最大の特徴点は、必須成分として、植物ホルモンであるゼアチン（Zeatin）を含んでいることである。
【００２３】
植物ホルモンは、根や葉の分化や成長に必要不可欠であるためであるため、組織培養において、植物ホルモンは、必須の試薬である。また、組織培養に限らず、通常の栽培下でも、挿し木時の根の発育を促すオーキシン系の発根促進剤や、脇芽誘発のベンジルアデニン製剤、種子の発芽を促すジベレリンなどの各種植物ホルモンが使用されている。特に、セルラインをカルスや不定芽に誘導し、植物個体を大量増殖させようとするには、植物ホルモンの使用が必要となる。
【００２４】
組織培養では、植物ホルモンをはじめとする各種添加物（培地成分）の種類や添加量が、セルライン等の細胞分裂や分化に、大きく影響を及ぼす。例えば、前述のように、非特許文献１に記載の培養方法で得られるトマトセルラインは、褐変してしまい不安定であり、しかも増殖効率も低い。褐変した部分の細胞が、死んでいる（あるいは略死んでいる）細胞であり、増殖できない。すなわち、褐変の程度が大きいほど、増殖効率も悪くなる。褐変の程度（セルラインの状態）は、顕微鏡等により、視覚的に確認できる。
【００２５】
このように、増殖効率が高く安定したトマトセルラインを樹立するためには、各種添加物、特に植物ホルモンを、充分に検討する必要がある。
【００２６】
そこで、本培地では、植物ホルモンとして、ゼアチンを含むことを特徴としている。ゼアチンは、天然に存在する植物ホルモン（植物成長ホルモン）の１種であり、より詳細には、植物の細胞分裂を促進する植物ホルモンであるサイトカイニンの１種である。
【００２７】
ゼアチンの添加量は、トマト細胞が、褐変せず安定して増殖する範囲であれば特に限定されるものではない。例えば、ゼアチンは、培地１Ｌあたり、０．１〜２．０ｍｇの割合（ゼアチンの一般的な使用量）で添加することができる。なお、後述の実施例では、培地１Ｌあたり、０．２ｍｇのゼアチンを使用している。
【００２８】
このような、ゼアチンをはじめとする各種添加物は、植物細胞培養用の基本培地に添加すればよい。この基本培地は、植物細胞の培養が可能であればよい。基本培地には、植物植物の培養に広く用いられるものがあり、予め無機物等が所定量混合されている。基本培地としては、特に限定されるものではないが、例えば、ムラシゲ・スグーグ培地（ＭＳ培地）、Ｂ５培地（ガンボーグＢ５培地とも称される）、Hyponex培地（Ｈ培地）、Knudson C培地(KC培地)、これらの改変培地（例えば組成比の改変等）などが挙げられる。
【００２９】
すなわち、本培地には、トマト細胞の安定性、細胞分裂に影響を及ぼさない範囲で、一般に植物培養用培地に使用される、植物ホルモン、無機塩類、炭素源、窒素源、ビタミン類、ミネラル（リン、カルシウム、マグネシウム、鉄など）、アミノ酸、ペプトン、糖類、成長促進剤（ココナッツミルクや酵母の抽出液）等の栄養成分などの種々の添加物を加えてもよい。なお、これらの添加物は、単独でも複数の混合物でもよい。
【００３０】
植物ホルモンとしては、例えば、オーキシン（インドール酢酸、および、それと同等の作用を示す化合物；インドール酢酸，インドール酪酸，ナフタレン酢酸，２，４−ジクロロフェノキシ酢酸など）、サイトカイニン（カイネチンおよび、それと同等の作用を示す化合物；カイネチン，ベンジルアデニンなど）、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ジャスモン酸、チジアズロン（TDZ）、ブラシノステロイド、フロリゲンなどが例示される。なお、上記植物ホルモンには、天然に存在する天然型植物ホルモンのみではなく、天然型植物ホルモンと同等の作用を示す化学合成された合成型植物ホルモンも含まれるものとする。また、植物ホルモンは、トマト細胞の増殖（成長）を促進するものであることが好ましい。
【００３１】
なお、本培地は、後述の実施例に示すように、ゼアチン以外の添加物として、例えば、植物ホルモンとして、さらに、α−ナフタレン酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を含有する培地（ＮＤＺ培地）であることが好ましく、このＮＤＺ培地に、スクロース等の糖類を添加した、糖類添加ＮＤＺ培地がより好ましい。
【００３２】
また、本培地は、固形培地であっても、液体培地でもよい。本培地は、上記各種添加物（培地材料）をを混合し、培養容器に入れ、水を加えて攪拌し、加熱滅菌を行って作製できる。なお、培養容器としては、例えば、加熱滅菌に耐えうる、一般に用いられるガラスやポリカーボネート製の、透明または半透明容器でを用いることができ、特に制限されるものではない。また、加熱滅菌の時間は、培養の規模、滅菌機の種類により異なり、特に限定されるものではない。
【００３３】
なお、本培地をキット化することによって、そのキットに無菌的にトマトの一部を接種するだけで、簡便にトマトセルラインの樹立が可能となる。
【００３４】
このような本培地を用いれば、安定かつ増殖効率の高いトマトセルラインを作製でき、持続的に継代培養可能な均一なトマトセルラインを提供できる。
【００３５】
（２）本発明のトマトセルラインおよびその生産方法
本発明のトマトセルラインの生産方法（本生産方法）は、上記本培地を用いて、トマト細胞を培養することを特徴とし、本発明のトマトセルラインは、本生産方法によって得られるものであり、褐変せず安定なトマトセルラインである。
【００３６】
すなわち、本生産方法は、トマトセルライン培養用培地で、無菌的にトマト細胞を培養する工程を含んでいる。
【００３７】
この工程における、温度、光、湿度、培養期間などの培養条件は、用いるトマト細胞の種類や、形質によって異なるため、特に限定されるものではない。培養条件としては、例えば、固形培地上での静置培養、液体培地中での震盪培養などを適用できる。なお、固形培地で培養後、液体培地で培養するなど、固形培地での培養と、液体培地での培養とを組み合わせてもよい。
【００３８】
震盪培養では、培地容器の往復の振れ幅が２ｃｍ程度であるのが一般的である。このため、本生産方法でも、一般的な震盪培養条件下で行えばよい。しかしながら、本生産方法では、一般的な往復の振れ幅を越えた条件で、震盪培養することが好ましい。例えば、通常の振れ幅が３ｃｍ以上の条件（後述の実施例では、通常の３倍以上の振れ幅７ｃｍ）で震盪することが好ましい。これにより、より一層安定したトマトセルラインが得られる。なお、振れ幅を大きくしすぎると、容器の側壁に培養細胞が付着してしまう。このため、培養細胞が側壁に付着しすぎないように、振れ幅の上限を設定する必要がある。
【００３９】
本生産方法において、培養対象となるトマト細胞は、トマト個体の一部（例えば、茎、根、葉、芽など）であればよい。また、用いるトマト細胞は、どのような形質を有していてもよい。トマト細胞の形質は、特に限定されるものではないが、後述の実施例のように、特に、Ｔｍ−１様形質を有するトマト細胞（例えば、ＧＣＲ２３７（Ｔｍ−１／Ｔｍ−１）ライン，あるいは、Ｔｍ−１／＋ラインなど））、ＧＣＲ２３７とニアアイソジェニックでＴｍ−１をもたないＧＣＲ２６（＋／＋）ラインが好適である。すなわち、トマト細胞の形質（トマトセルラインの形質）は、特に限定されるものではないが、例えば、Ｔｍ−１様形質が好適である。
【００４０】
ここで、「Ｔｍ−１様形質」とは、植物が有する形質であって、トバモウイルスの増殖を抑制することができる形質という。このような、Ｔｍ−１様形質を有するトマトセルラインは、詳細が明らかとなっていないＴｍ−１様形質の機能解析（遺伝子配列やアミノ酸配列の解析、ウィルス増殖抑制メカニズムの解析など）に有用である。なお、トバモウイルスとは、トバモウイルス属に属するウイルスであり、トバモウイルス属とは、アルファ様ウイルススーパーグループに分類される、プラス鎖の一本鎖ＲＮＡウイルスグループである。
【００４１】
本生産方法によれば、従来のように褐変することなく安定であり、増殖効率も高いトマトセルラインを生産できる。このため、このセルラインを持続的に継代培養することが可能となる。すなわち、少量のトマトセルラインから、多くのカルス、プロトプラスト等への誘導や分かも可能となる。これにより、同一遺伝子型トマトセルラインの大量増殖、および、均一なセルラインの生産が可能である。
【００４２】
なお、増殖効率は、細胞の増殖をモニターすることによって、確認できる。細胞の増殖をモニターする方法としては、例えば、細胞の植え継ぎ後、一定時間毎に細胞濃度を顕微鏡で計数する方法、あるいは、培地除去後の細胞重量あるいは細胞体積を計測する方法などが例示される。また、細胞の安定性は、細胞を回収したときの色（着色状態）や、顕微鏡観察の形態によって判断できる。具体的には、褐色の細胞を、顕微鏡観察すると、ほとんど（あるいは全く）増殖できない細胞であることがわかる。従って、褐色の細胞（着色した細胞）は、死んだ細胞（増殖できない細胞）とみなすことができる。すなわち、着色していない細胞ほど、安定であり、増殖効率も高い細胞である。
【００４３】
以上のように、本生産方法によれば、褐変せず安定で、しかも、増殖効率の高いトマトセルラインの生産が可能である。また、このトマトセルラインを、カルス誘導や分化することにより、少ない材料から、多くの植物個体を得ることも可能となる。
【００４４】
また、本生産方法は、組織培養を行うため、セルラインを比較的均一な細胞集団（カルス）に誘導できるという利点がある。また、組織培養は、高精度の培養環境調節が可能であるため、本生産方法を、温度・光・湿度・各種物質などの、植物の成育・分化に及ぼす影響の解析にも応用可能である。さらに、本培地を用いた本生産方法は、少ない植物材料（植物細胞や組織）から、多くの植物個体を得ることも可能であるため、農業分野で特に有用な新種のトマトの育成期間を短縮したり、継代培養によってそのセルラインの保存も可能となる。
【００４５】
また、安定かつ増殖効率の高いトマトセルラインを作製し、均一なセルラインを大量に生産できるため、均一なセルラインを用いた同一条件下での実験が可能である。
【００４６】
また、Ｔｍ−１様形質の有無は、外見からは判定できないため、Ｔｍ−１形質を有するトマトセルラインは、野生型トマトにおけるＴｍ−１様形質の有無の判定を行うために利用できる。また、Ｔｍ−１遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列の解析、トバモウィルスの増殖抑制メカニズムの解明にも利用できる。なお、Ｔｍ−１形質を有するトマトセルラインに限らず、均一で安定なトマトセルラインを用いるあらゆる用途に利用可能である。
【００４７】
また、本生産方法や本培地は、トマト以外にも、トマトが属するナス科の植物にも適用し同様の効果を奏することが可能である。
【００４８】
このように、本発明によれば、カルス（細胞塊）への誘導や、種々の組織・器官・個体に分化することが可能な安定したセルラインの確立が可能となる。さらに、高等植物では得にくい増殖細胞を、均一かつ多量に得ることが可能となる。また、得られたセルラインは、安定した実験材料として用いることができる。また、セルラインを培養している培地に、物質を添加することにより、加えた物質のセルラインへの影響を直接観測する用途にも適用できる。このように、本発明は種々の用途に適用可能であり、基礎研究から応用研究まで、幅広い分野で利用できる。
【００４９】
なお、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５１】
〔実施例１〕ゼアチン含有培地によるトマトセルラインの作製
（１）トマトの培養細胞の作製
植物ホルモンとしてゼアチン（Zeatin）０．２ｍｇ／Ｌを含み、さらに、α-ナフタレン酢酸（α−ＮＡＡ）２ｍｇ／Ｌ，2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D)０．２ｍｇ／Ｌ，スクロース３％（ｗ／ｖ）を添加したムラシゲ＆スグーグ培地（この培地を、ＮＤＺ培地とする）をカルスの誘導に用いた。先ず、無菌的に播種、栽培した２系統のトマト（+/+、Tm-1/Tm-1）の茎断片を、NDZ寒天培地上に置床し、２３℃暗所にて静置培養した。誘導されたカルスを、NDZ液体培地に懸濁し、震盪培養（２３℃、７０〜８０ｒｐｍ（往復；振れ幅７ｃｍ））し、トマトセルラインＧＣＲ２６（＋／＋）及びＧＣＲ２３７（Ｔｍ−１／Ｔｍ−１）を樹立した。得られたセルラインは、いずれも、褐変せず安定であり、増殖効率も高いものであった。なお、ＧＣＲ２３７は、トマトの品種 Craigellaに対してバッククロスを繰り返した (Tm-1/Tm-1) ホモ接合体、ＧＣＲ２６は、Craigella に対してバッククロスを繰り返した (+/+) ホモ接合体である。
【００５２】
（２）トマト培養細胞からのプロトプラストの調製
上記ＧＣＲ２３７（Ｔｍ−１／Ｔｍ−１）培養細胞を、ＮＤＺ液体培地で、２３℃、７０〜８０ｒｐｍ（往復；振れ幅７ｃｍ）、暗黒下で、7日間、フラスコを用いて震盪培養した。これにより、定常状態にある細胞を取得した。この細胞を更に新鮮なＮＤＺ培地に継代し、同一条件で３日間培養した。遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、１分間）して上清を除去し、細胞を集めた。得られた細胞に０．７Ｍマンニトール（３０℃）を加えて、１０分間、室温に静置した。これを再び遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、１分間）して上清を除去した後、プロトプラスト調製液（１％セルラーゼ“ONOZUKA”RS（ヤクルト社製）、０．２％ペクトリアーゼ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．６Ｍマンニトールを、ＮＤＺ培地に溶解し、ｐＨを５．８に合わせた）を添加し、３０℃、２時間反応させ、プロトプラストを調製した。
【００５３】
〔実施例２〕
震盪培養の振れ幅を、２ｃｍとした以外は、実施例１と同様にして、２系統のトマト（＋／＋，Ｔｍ−１／Ｔｍ−１）の茎を無菌的に接種し、培養した。得られたセルラインは、褐変が軽度であったが、実施例１に比べると、増殖効率が低かった。
【００５４】
〔比較例１〕
培地の組成を非特許文献１に記載の培地とした以外、すなわち、植物ホルモンとしてカイネチン０．２ｍｇ／Ｌを含み、さらに、酵母抽出物５％（ｗ／ｖ）およびスクロース３％（ｗ／ｖ）を添加した０．９％寒天とした以外は、実施例１と同様にして、２系統のトマト（＋／＋，Ｔｍ−１／Ｔｍ−１）の茎を無菌的に接種し、培養した。得られたセルラインはすぐに褐変し、増殖効率も低かった。
【００５５】
〔比較例２〕
培地の組成を、植物ホルモンとして2,4-ジクロロフェノキシ酢酸０．５ｍｇ／ｍＬを含むムラシゲ＆スグーグ培地を用いた以外は、実施例１と同様にして、２系統のトマト（＋／＋，Ｔｍ−１／Ｔｍ−１）の茎を無菌的に接種し、培養した。得られたセルラインはすぐに褐変し、増殖効率も低かった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
以上のように、本発明によれば、褐変せず安定で、しかも増殖効率の高いトマトセルラインを提供することができるので、そのトマトセルラインを用いた各種形質の機能解析等に好適に用いることができる。