(57)【要約】【目的】  目的とする標的領域の相同的組換えを正確に行うことができる核酸組換え方法、目的とする標的領域の相同的組換えを正確に行うことができる宿主細胞、及び、これら核酸組換え方法や宿主細胞に利用できる発現ベクターを提供すること。【構成】  宿主細胞内で核酸の相同的組換えを行う核酸組換え方法は、RecA様タンパク質が発現可能で組換え能を有すると共に、RecX様タンパク質が発現可能に構成された宿主細胞を利用する。そして、宿主細胞内で発現されたRecA様タンパク質により、核酸の相同的組換えを行う核酸組換え工程と、RecX様タンパク質を発現させて、RecA様タンパク質の活性を阻害するRecA阻害工程とを備える。【選択図】        図１
2005245320.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞内で核酸の相同的組換えを行う核酸組換え方法であって、
前記宿主細胞は、RecA様タンパク質が発現可能で組換え能を有すると共に、RecX様タンパク質が発現可能に構成されてなり、
前記宿主細胞内で発現された前記RecA様タンパク質により、前記核酸の相同的組換えを行う核酸組換え工程と、
前記RecX様タンパク質を発現させて、前記RecA様タンパク質の活性を阻害するRecA阻害工程と、
を備える核酸組換え方法。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸組換え方法であって、
前記宿主細胞は、前記RecA様タンパク質を発現するRecA様タンパク質遺伝子を元来自身のゲノムに有する細胞から調製されてなる
核酸組換え方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の核酸組換え方法であって、
前記宿主細胞は、RecX様タンパク質遺伝子が挿入された発現ベクターを有し、
前記RecA阻害工程では、このRecX様タンパク質遺伝子から前記RecX様タンパク質を発現させる
核酸組換え方法。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸組換え方法であって、
前記発現ベクターは、前記RecX様タンパク質遺伝子を誘導する誘導プロモータを有し、
前記RecA阻害工程では、前記宿主細胞を誘導することにより、このRecX様タンパク質遺伝子を誘導し、前記RecX様タンパク質を発現させる
核酸組換え方法。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の核酸組換え方法であって、
前記核酸組換え工程では、
組換えたい標的領域を含む標的核酸と、前記標的領域との相同的組換えが可能な相同的組換え領域を含む組換えベクターとを前記宿主細胞内に導入し、前記標的領域を前記組換えベクター内に組換える
核酸組換え方法。
【請求項６】
請求項３または請求項４に記載の核酸組換え方法であって、
前記発現ベクターは、pBR系ベクターからなり、
前記核酸組換え工程では、
組換えたい標的領域を含む標的核酸と、前記標的領域との相同的組換えが可能な相同的組換え領域を含み、pUC系ベクターからなる組換えベクターとを前記宿主細胞内に導入し、前記標的領域を前記組換えベクター内に組換える
核酸組換え方法。
【請求項７】
請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の核酸組換え方法であって、
前記RecA阻害工程よりも後に、前記宿主細胞を培養する培養工程を備える
核酸組換え方法。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸組換え方法であって、
前記発現ベクターは、前記宿主細胞に第１毒性物質に対する耐性を与える第１毒性物質耐性遺伝子を有し、
前記培養工程は、前記第１毒性物質の存在下で行う第１培養工程を含む
核酸組換え方法。
【請求項９】
請求項７または請求項８に記載の核酸組換え方法であって、
前記組換えベクターは、前記宿主細胞に第２毒性物質に対する耐性を与える第２毒性物質耐性遺伝子を有し、
前記培養工程は、前記第２毒性物質の存在下で行う第２培養工程を含む
核酸組換え方法。
【請求項１０】
請求項７〜請求項９のいずれか一項に記載の核酸組換え方法であって、
前記培養工程は、
前記宿主細胞をプレート培地上で培養し、プレート培地上に複数のコロニーを形成させるプレート培養工程と、
前記プレート培地から採取した各々の前記コロニーを別々に培養する単一コロニー培養工程と、
を含み、
前記単一コロニー培養工程で培養された前記宿主細胞から、少なくとも前記組換えベクターを含む前記核酸を抽出する核酸抽出工程と、
抽出された前記核酸を電気泳動する電気泳動工程と、を備える
核酸組換え方法。
【請求項１１】
自身の細胞内で核酸の相同的組換えが可能な宿主細胞であって、
RecA様タンパク質が発現可能で組換え能を有すると共に、RecX様タンパク質が発現可能に構成されてなる
宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の宿主細胞であって、
前記RecA様タンパク質を発現するRecA様タンパク質遺伝子を元来自身のゲノムに有する細胞から調製されてなる
宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１１または請求項１２に記載の宿主細胞であって、
前記RecX様タンパク質を発現するRecX様タンパク質遺伝子が挿入された発現ベクターを有する
宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の宿主細胞であって、
前記発現ベクターは、前記RecX様タンパク質遺伝子を誘導する誘導プロモータを有し、
この宿主細胞を誘導することにより、このRecX様タンパク質遺伝子が誘導され、前記RecX様タンパク質を発現する
宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１３または請求項１４に記載の宿主細胞であって、
前記発現ベクターは、pBR系ベクターからなる
宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１３〜請求項１５のいずれか一項に記載の宿主細胞であって、
前記発現ベクターは、前記宿主細胞に第１毒性物質に対する耐性を与える第１毒性物質耐性遺伝子を有する
宿主細胞。
【請求項１７】
宿主細胞内に導入して、この宿主細胞内でタンパク質を発現させる発現ベクターであって、
RecX様タンパク質を発現するRecX様タンパク質遺伝子を有する
発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載の発現ベクターであって、
前記RecX様タンパク質遺伝子を誘導し、前記RecX様タンパク質を発現させる誘導プロモータを有する
発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内で核酸の組換えを行う核酸組換え方法、自身の細胞内で核酸の組換えが可能な宿主細胞、及び、これら核酸組換え方法や宿主細胞に利用可能な発現ベクターに関し、特に、核酸の相同的組換えを行う核酸組換え方法、核酸の相同的組換えが可能な宿主細胞、及び、これら核酸組換え方法や宿主細胞に利用可能な発現ベクターに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、遺伝子やプロモータ領域などの標的領域をベクターにクローニングする様々な方法が提案されている。
例えば、非特許文献１には、制限酵素を利用したクローニング方法が記載されている。この方法では、図８に概略を示すように、ベクター（Vector）を適当な制限酵素で切断すると共に、クローニングしたい標的領域（図中にInsertと記す）を有するDNAを適当な制限酵素で切断する。そして、ライゲースにより、標的領域とベクターの接合（ライゲーション）を行い、組換え体DNA（Recombinant）を形成する。その後、この組換え体DNAを大腸菌に導入（トランスフォーメーション）する。
【０００３】
また、非特許文献２には、PCR反応を利用したクローニング方法が記載されている。この方法では、図９に概略を示すように、ベクター（Vector）を適当な制限酵素で切断する。また一方で、クローニングしたい標的領域（図中にInsert PCR productと記す）をPCR反応を利用して増幅させる。そして、ライゲースにより、標的領域とベクターの接合（ライゲーション）を行い、組換え体DNA（Recombinant）を形成する。その後、この組換え体DNAを大腸菌に導入（トランスフォーメーション）する。
【０００４】
また、非特許文献３には、核酸の相同的組換えを利用したクローニング方法が記載されている。この方法では、図１０に概略を示すように、クローニングしたい標的領域（図中にInsertと記す）の両端の配列（配列Ａ及び配列Ｂ）に相同的な相同配列（相同配列Ａ及び相同配列Ｂ）をそれぞれベクターに挿入しておく。なお、本明細書では、相同配列Ａ及び相同配列Ｂと、図中に示すようにこれらに挟まれた領域がある場合にはその領域とを併せた領域を、「相同的組換え領域」と言う。次に、大腸菌内に標的領域を含むDNAとベクターとを導入し、大腸菌内において、RecAタンパク質等により、標的領域とベクターの相同的組換え領域との間で相同的組換えを行わせて、ベクター内に相同的組換え領域の代わりに標的領域を組み込み、組換え体DNA（Recombinant）を形成する。
【０００５】
【非特許文献１】Joseph Sambrook & Davis W. Russel (2001) Molecular Cloning: ALaboratory Manual, third edition. Cold Spring Harbor loboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, pp 1.84-1.87
【非特許文献２】In vivo cloning of PCR products in E.coli. Nucleic Acids Research 1993 Vol.21 No.22 5192-5197
【非特許文献３】DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli. Nature Biotechnology 2000 december Vol.18 1314-1317
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、これら従来のクローニング方法には、それぞれ問題点が存在する。
非特許文献１に開示された方法では、クローニングしたい標的領域内に、使用する制限酵素に対する切断部位があると、そこで標的領域が切断されてしまい、標的領域全体をクローニングすることができない。特に、クローニングしたい標的領域が長い場合には、標的領域内部を切断しない制限酵素が見当たらないことが多く、標的領域全体をクローニングすることが難しい。また、適当な制限酵素を選択することによって、標的領域全体をクローニングできる場合でも、一般に、クローニングしたい標的領域以外に、その上流領域や下流領域も一緒にクローニングされてしまうので、標的領域のみを過不足なくクローニングすることができない。例えば、遺伝子の領域のみ、あるいは、そのプロモータ領域のみをクローニングしたくても、遺伝子とプロモータ領域の両方がクローニングされてしまうなどの問題が生じる。
【０００７】
一方、非特許文献２に開示された方法では、PCRを使用するため、標的領域のみを過不足なくクローニングできる。しかし、この方法では、PCR反応の性質上、反応エラーによって、クローニングしたい標的領域に変異が入ることがある。そうすると、例えば、クローニングした遺伝子の発現解析を行う場合に、正確なタンパク質を発現させることが不可能となるなどの問題が生じる。また、例えば、クローニングした標的領域の塩基配列をシークエンスする場合にも、正確な塩基配列を決定できないなどの問題も生じる。
【０００８】
他方、非特許文献３で開示された方法は、非特許文献１や非特許文献２に記載の方法が有する問題点を解決ができる。しかし、このクローニング方法は、未だ実用化に至っていないのが現状である。その主たる理由としては、大腸菌の有する組換え能によって、目的とするDNA領域間の組換えだけでなく、望まないDNA領域間でも頻繁に組換えが起こり、標的領域をそのままの無傷の状態でベクターにクローニングできないからである。また、クローニング効率が非常に悪いという欠点も有する。
【０００９】
本発明は、かかる現状に鑑みてなされたものであって、宿主細胞内で目的とする標的領域の相同的組換えを正確に行うことができる核酸組換え方法、自身の細胞内で目的とする標的領域の相同的組換えを正確に行うことができる宿主細胞、及び、これら核酸組換え方法や宿主細胞に利用できる発現ベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
その解決手段は、宿主細胞内で核酸の相同的組換えを行う核酸組換え方法であって、前記宿主細胞は、RecA様タンパク質が発現可能で組換え能を有すると共に、RecX様タンパク質が発現可能に構成されてなり、前記宿主細胞内で発現された前記RecA様タンパク質により、前記核酸の相同的組換えを行う核酸組換え工程と、前記RecX様タンパク質を発現させて、前記RecA様タンパク質の活性を阻害するRecA阻害工程と、を備える核酸組換え方法である。
【００１１】
従来の相同的組換えを利用したクローニング方法において、望まないDNA領域間でも頻繁に組換えが起こるのは、RecAタンパク質が活発に働き、望まない組換えを促進するためであると考えられる。従って、RecAタンパク質の活性を自在に制御できれば、即ち、必要なときだけRecAタンパク質の活性を利用できるようにすれば、目的とするDNA領域間の組換えだけを行わせ、望まないDNA領域間の組換えを抑制することが可能になると考えられる。
一方、最近になって、その機能や性質が未知であったRecXタンパク質というタンパク質が、RecAタンパク質の活性を阻害する性質を有することが明らかにされた（詳しくは、Escherichia coli RecX inhibits recA recombinase and coprotease activities in vitro and in vivo. J Biol Chem. 2003 Jan 24;278(4):2278-2285 を参照されたい）。
そこで、本発明者らは、宿主細胞内においてRecXタンパク質の発現を自在に制御することで、RecAタンパク質の活性を制御することを鋭意検討した。その結果、目的とするDNA領域間の組換えだけを行わせ、望まないDNA領域間の組換えを抑制する方法を開発し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
しかるに、本発明は、RecA様タンパク質が発現可能で組換え能を有すると共に、RecX様タンパク質が発現可能に構成された宿主細胞を利用する。そして、本発明の核酸組換え方法は、この宿主細胞内で発現されたRecA様タンパク質により、核酸の相同的組換えを行う核酸組換え工程と、RecX様タンパク質を発現させて、RecA様タンパク質の活性を阻害するRecA阻害工程とを備える。
このような核酸組換え方法では、RecA様タンパク質が必要なときには、RecA様タンパク質を利用でき、RecA様タンパク質が不要なときには、RecX様タンパク質によりその活性を阻害できるので、目的とする核酸領域間の組換えだけを行わせ、望まない核酸領域間の組換えを抑制できる。従って、宿主細胞内で目的とする標的領域の相同的組換えを正確に行うことができる。しかも、理由は必ずしも定かでないが、従来に比して、組換え効率を向上させることもできる。
よって、例えば、この核酸組換え方法をクローニングに利用すれば、クローニングしたい標的領域をそのままの無傷の状態でベクターにクローニングすることが可能となる。勿論、この方法では、非特許文献１に開示された方法を用いた場合に生じる、標的領域全体をクローニングできないなどの問題点や、非特許文献２に開示された方法を用いた場合に生じる、標的領域に変異が入るなど問題点も解決できる。
【００１３】
ここで、「宿主細胞」は、RecA様タンパク質が発現可能で組換え能を有すると共に、RecX様タンパク質が発現可能に構成されているものであれば、いかなるものを用いてもよい。従って、宿主細胞は、原核生物の細胞でも、真核生物の細胞でもよい。例えば、宿主細胞として、大腸菌（Escheridhia coli）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）、枯草菌（Bacillus subtilis）、動物や植物の細胞などが挙げられる。
【００１４】
「RecA様タンパク質」は、相同的組換えにおいて大腸菌のRecAタンパク質と類似する機能を有するものであれば、いかなるものでもよい。従って、原核生物のRecA様タンパク質も真核生物のRecA様タンパク質も利用できる。例えば、RecAタンパク質と相同性が高い原核生物由来のRecA様タンパク質や、酵母に見られるRad51やDmc1などのRecA様タンパク質が挙げられる。また、天然に存在するRecA様タンパク質の他、RecA様タンパク質を改変したタンパク質でもよい。このような改変タンパク質としては、例えば、RecA様タンパク質をコードする遺伝子から、部位特異的変位誘発等により作出された遺伝子の産物であって、1または数個のアミノ酸が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、RecA様タンパク質と類似する機能を有するものが挙げられる。また、RecA様タンパク質のタンパク質断片であって、RecA様タンパク質と類似する機能を有するもの（RecA様フラグメント）などでもよい。なお、大腸菌のRecAタンパク質は、相同的組換えにおける中心酵素であり、相同領域を有するDNA分子間の対合やストランドエクスチェンジを触媒し、DNA修復及びDNA組換えの双方に機能するタンパク質であることが知られている。
【００１５】
また、RecA様タンパク質を発現するRecA様タンパク質遺伝子は、宿主細胞のゲノム上に存在していてもよいし、プラスミドやファージ、コスミドなどのベクター上に存在していてもよい。また、RecA様タンパク質遺伝子は、元来その宿主細胞が有するものである必要はなく、外来遺伝子でも構わない。例えば、大腸菌に、大腸菌以外の細胞由来のRecA様タンパク質遺伝子が導入されていてもよい。
【００１６】
「RecX様タンパク質」は、RecA様タンパク質の活性を阻害する点において大腸菌のRecXタンパク質と類似する機能を有するものであれば、いかなるものでもよい。従って、原核生物のRecX様タンパク質も真核生物のRecX様タンパク質も利用できる。例えば、RecXタンパク質と相同性が高い原核生物由来のRecX様タンパク質などが挙げられる。また、天然に存在するRecX様タンパク質の他、RecX様タンパク質を改変したタンパク質でもよい。このような改変タンパク質としては、例えば、RecX様タンパク質をコードする遺伝子から、部位特異的変位誘発等により作出された遺伝子の産物であって、1または数個のアミノ酸が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、RecX様タンパク質と類似する機能を有するものが挙げられる。また、RecX様タンパク質のタンパク質断片であって、RecX様タンパク質と類似する機能を有するもの（RecX様フラグメント）などでもよい。
【００１７】
また、RecX様タンパク質を発現するRecX様タンパク質遺伝子は、宿主細胞のゲノム上に存在していてもよいし、プラスミドやファージ、コスミドなどのベクター上に存在していてもよい。また、RecX様タンパク質遺伝子は、元来その宿主細胞が有するものである必要はなく、外来遺伝子でも構わない。例えば、大腸菌に、大腸菌以外の細胞由来のRecX様タンパク質遺伝子が導入されていてもよい。
【００１８】
「核酸組換え工程」は、前記のように、細胞内で発現されたRecA様タンパク質により、核酸の相同組換えを行う工程である。RecA様タンパク質は、少なくともこの工程時に発現していればよく、宿主細胞内で恒常的に発現していもよいし、恒常的ではないがこの工程時に発現するものでもよい。例えば、宿主細胞がもとより恒常的にRecA様タンパク質を発現するものである場合には、RecA様タンパク質遺伝子に関しては、この宿主細胞の遺伝子をそのまま利用できる。また、RecA様タンパク質遺伝子に適当な誘導プロモータを付けてもよい。このようにすれば、宿主細胞を誘導することにより、RecA様タンパク質遺伝子を誘導し、RecA様タンパク質を発現させることが可能になる。
【００１９】
「RecA阻害工程」は、前記のように、RecX様タンパク質を発現させて、RecA様タンパク質の活性を阻害する工程である。RecX様タンパク質は、この工程で発現できるようにされていればよい。例えば、RecX様タンパク質遺伝子に適当な誘導プロモータを付けることが考えられる。このようにすれば、宿主細胞を誘導することで、RecX様タンパク質遺伝子を誘導し、RecX様タンパク質を発現させることが可能になる。
【００２０】
なお、本発明において、「核酸の相同的組換え」は、例えば、組換えたい標的領域を含む標的核酸と、標的領域を組み込むための組換えベクターとを宿主細胞に導入し、これらの間で行うことができる。また、この組換えは、組換えたい標的領域を含む標的核酸を宿主細胞に導入し、この標的核酸と宿主細胞のゲノムとの間で行うこともできる。更に、この組換えは、宿主細胞のゲノム内における異なる領域同士の間で行うこともできる。
【００２１】
更に、上記の核酸組換え方法であって、前記RecA様タンパク質は、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質である核酸組換え方法とするのが好ましい。
【００２２】
前述したように、RecA様タンパク質は、相同的組換えにおいて大腸菌のRecAタンパク質と類似する機能を有するものであれば、いかなるものでもよい。しかし、大腸菌のRecAタンパク質をコードするRecAタンパク質遺伝子は、入手が容易であり、また、大腸菌のRecAタンパク質は、その機能や性質に関し研究が最も進んでいるなどの観点から、大腸菌のRecAタンパク質を用いるのが最も好ましい。
【００２３】
更に、上記のいずれかに記載の核酸組換え方法であって、前記RecX様タンパク質は、大腸菌（Escherichia coli）のRecXタンパク質である核酸組換え方法とするのが好ましい。
【００２４】
前述したように、RecX様タンパク質は、RecA様タンパク質の活性を阻害する点において大腸菌のRecXタンパク質と類似する機能を有するものであれば、いかなるものでもよい。しかし、大腸菌のRecXタンパク質をコードするRecXタンパク質遺伝子は、入手が容易であり、また、現在のところ、大腸菌のRecXタンパク質以外のRecX様タンパク質については、その機能や性質に関する詳しい研究があまり進んでいないなどの観点から、大腸菌のRecXタンパク質を用いるのが最も好ましい。
【００２５】
更に、上記のいずれかに記載の核酸組換え方法であって、前記宿主細胞は、大腸菌（Escherichia coli）である核酸組換え方法とするのが好ましい。
【００２６】
前述したように、宿主細胞は、RecA様タンパク質が発現可能で組換え能を有すると共に、RecX様タンパク質が発現可能に構成されているものであれば、いかなるものを用いてもよい。しかし、入手容易性や取り扱い易さを考慮すると、大腸菌を利用するのが最も好ましい。特に、本発明の核酸組換え方法を利用してクローニングを行う場合には、クローニング効率やその後の解析の容易さなどの点から、大腸菌が好適である。
【００２７】
更に、上記のいずれかに記載の核酸組換え方法であって、前記宿主細胞は、前記RecA様タンパク質を発現するRecA様タンパク質遺伝子を、元来自身のゲノムに有する細胞から調製されてなる核酸組換え方法とするのが良い。
【００２８】
前述したように、RecA様タンパク質は、少なくとも核酸組換え工程で発現していれば、恒常的に発現していても構わない。宿主細胞のゲノムに元来存在するRecA様タンパク質遺伝子は、通常、RecA様タンパク質を恒常的に発現しているので、このRecA様タンパク質遺伝子をそのまま利用できる。このように、元来自身のゲノムに有するRecA様タンパク質遺伝子を利用すれば、RecA様タンパク質遺伝子に関しては、宿主細胞を特別に形質転換する必要がないので、宿主細胞を構築する手間が掛からない。
【００２９】
更に、上記のいずれかに記載の核酸組換え方法であって、前記宿主細胞は、RecX様タンパク質遺伝子が挿入された発現ベクターを有し、前記RecA阻害工程では、このRecX様タンパク質遺伝子から前記RecX様タンパク質を発現させる核酸組換え方法とすると良い。
【００３０】
前述したように、RecX様タンパク質は、RecA阻害工程で発現するように制御できなければならない。一方、宿主細胞が元来有するRecX様タンパク質遺伝子は、一般に、外部から自由にその発現を制御できない。従って、宿主細胞を形質転換し、RecX様タンパク質の発現を外部から制御可能にする必要がある。RecX様タンパク質の発現を制御可能にするためには、前述したように、例えば、その宿主細胞が元来ゲノムに有するRecX様タンパク質遺伝子のプロモータを、外来の制御可能なプロモータに変える方法が考えられる。また、制御可能なプロモータが付けられた外来のRecX様タンパク質遺伝子のカセットを宿主細胞のゲノムに導入する方法も考えられる。しかし、このように宿主細胞のゲノムを形質転換するのは、技術的に困難である場合が多い。また、多大な時間と労力を必要とすることも少なくない。これに対し、宿主細胞内で増幅可能な発現ベクターにRecX様タンパク質遺伝子を挿入し、これを宿主細胞に導入すれば、RecX様タンパク質を制御可能な宿主細胞を、比較的容易に構成できる。
【００３１】
更に、上記のいずれかに記載の核酸組換え方法であって、前記発現ベクターは、前記RecX様タンパク質遺伝子を誘導する誘導プロモータを有し、前記RecA阻害工程では、前記宿主細胞を誘導することにより、このRecX様タンパク質遺伝子を誘導し、前記RecX様タンパク質を発現させる核酸組換え方法とすると良い。
【００３２】
本発明によれば、前記の発現ベクターは、RecX様タンパク質遺伝子を誘導する誘導プロモータを有する。このような発現ベクターであれば、宿主細胞を誘導することにより、RecX様タンパク質遺伝子からRecX様タンパク質を発現させることができる。このため、RecA阻害工程において、宿主細胞を誘導するだけで、容易にRecX様タンパク質を発現させることができる。
なお、「誘導プロモータ」は、宿主細胞を誘導することにより、RecX様タンパク質の発現できるものであれば、いずれのものを用いてもよい。誘導プロモータとしては、ＩＰＴＧによって誘導されるＩＰＴＧ誘導プロモータや、糖によって誘導される糖誘導プロモータ、アルコールによって誘導されるアルコール誘導プロモータ、加熱によって誘導される加熱誘導プロモータなどが挙げられる。
【００３３】
更に、上記のいずれかに記載の核酸組換え方法であって、前記核酸組換え工程では、組換えたい標的領域を含む標的核酸と、前記標的領域との相同的組換えが可能な相同的組換え領域を含む組換えベクターとを前記宿主細胞内に導入し、前記標的領域を前記組換えベクター内に組換える核酸組換え方法とすると良い。
【００３４】
前述したように、本発明の核酸組換え方法は、外来の標的核酸と宿主細胞のゲノムとの間で行うことも可能であるし、宿主細胞のゲノム内の異なる領域同士の間で行うこともできる。しかし、この核酸組換え方法を利用して、標的領域をクローニングしたい場合には、標的核酸をゲノム内に組み込んだのでは、クローンニング後の解析、例えば、シークエンスや発現解析などが困難になることが多い。
これに対し、本発明では、組換えたい標的領域を含む標的核酸と共に、この標的領域との相同的組換えが可能な相同的組換え領域を含む組換えベクターを宿主細胞内に導入し、標的領域を組換えベクター内に組換える。このようにすれば、組換え体（組換えが行われた組換えベクター）を容易に抽出できるので、その後の解析に利用しやすい。また、ベクターに相同的組換え領域を形成することは、ゲノムに相同的組換え領域を形成するよりも容易であるという利点もある。
【００３５】
ここで、「標的核酸」は、いかなるものを用いてもよい。即ち、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、また、それらの鎖長に上限は存在しない。従って、例えば、3000Mbpといわれるヒトゲノムの全長を持つような巨大なDNAであっても構わない。勿論、その由来は問われない。従って、ウィルスや微生物、動植物のゲノム由来のDNAやそれらを改変したDNAであっても、微生物等のもつプラスミド等やプラスミド等に異種のDNA断片を挿入したキメラDNA等であっても、あるいは、人工的に合成したオリゴヌクレオチドなどであっても構わない。また、cDNAも利用できる。
【００３６】
「相同的組換え領域」は、組み換えたい標的領域の両端の領域対し相同性が高い一対の相同領域を有するものであればよい。従って、相同的組換え領域は、一対の相同領域だけを有するものでもよいし、一対の相同領域の間に他の領域が介在していてもよい。一対の相同領域は、標的領域の両端の領域とそれぞれ相当数の配列が、組換え可能な程度に実質的に相同的であればよい。但し、相同性が高いほど確実に組換えを行うことが可能になるため、相同領域は、できるだけ相同性が高いのが好ましく、100％の相同性を有するのが最適である。
【００３７】
更に、上記のいずれかに記載の核酸組換え方法であって、前記発現ベクターは、pBR系ベクターからなり、前記核酸組換え工程では、組換えたい標的領域を含む標的核酸と、前記標的領域との相同的組換えが可能な相同的組換え領域を含み、pUC系ベクターからなる組換えベクターとを前記宿主細胞内に導入し、前記標的領域を前記組換えベクター内に組換える核酸組換え方法とすると良い。
【００３８】
本発明によれば、発現ベクターはpBR系ベクターからなり、組換えベクターはpUC系ベクターからなる。pBR系ベクターやpUC系ベクターは、ファージやコスミドなどのベクターに比べ非常に扱いやすいので、発現ベクターや組換えベクターにこれらのベクターを利用すると便利である。但し、発現ベクター、組換えベクター共に、pBR系ベクターにする、あるいは、pUC系ベクターにすると、宿主細胞内で発現ベクターと組換えベクターが共存できない場合がある。従って、発現ベクターをpBR系ベクター、組換えベクターをpUC系ベクターとするか、あるいは、発現ベクターをpUC系ベクター、組換えベクターをpBR系ベクターとするのが好ましい。また、一般に、pBR系ベクターよりもpUC系ベクターの方が宿主細胞内でコピー数が多くなる。組換えベクターは、相同的組換えを行った後、組換え体を抽出して解析する場合が多いことから、なるべくコピー数が多い方が収量を確保できるので好ましい。従って、本発明のように、組換えベクターをpUC系ベクターとし、発現ベクターはpBR系ベクターとするのが好ましい。
【００３９】
更に、上記のいずれかに記載の核酸組換え方法であって、前記RecA阻害工程よりも後に、前記宿主細胞を培養する培養工程を備える核酸組換え方法とすると良い。
【００４０】
本発明によれば、RecA阻害工程よりも後に、宿主細胞を培養する培養工程を備える。このような培養工程を行うことで、宿主細胞を多量に増殖させることができるので、組み換えられた領域（例えば、クローニングした標的領域）のシークエンスや発現解析などの解析を行うのに都合がよい。
【００４１】
更に、上記の核酸組換え方法であって、前記発現ベクターは、前記宿主細胞に第１毒性物質に対する耐性を与える第１毒性物質耐性遺伝子を有し、前記培養工程は、前記第１毒性物質の存在下で行う第１培養工程を含む核酸組換え方法とすると良い。
【００４２】
宿主細胞に導入された発現ベクターは、培養を行っているうちに宿主細胞から抜け落ちてしまうことがある。これに対し、本発明では、発現ベクターは、宿主細胞に第１毒性物質に対する耐性を与える第１毒性物質耐性遺伝子を有する。そして、第１毒性物質の存在下で行う第１培養工程を有する。このように、第１毒性物質存在下で培養を行えば、発現ベクターが抜け落ちると宿主細胞が生存できなくなる、あるいは増殖できなくなるため、宿主細胞に常に発現ベクターが存在するようになる。従って、発現ベクターの抜け落ちを防止できる。
【００４３】
ここで、「第１毒性物質」は、発現ベクターを有しない状態の宿主細胞を死滅させたり、その生育を停止させることができるものであれば、いずれのものを使用することもできる。例えば、ストレプトマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、ペニシリン、セファロスポリン、エリスロマイシン、ロイコマイシンなどの抗生物質を利用できる。
また、「第１毒性物質耐性遺伝子」は、宿主細胞に第１毒性物質に対する耐性を与えることが可能なものであれば、いずれの遺伝子を利用することもできる。
なお、培養工程に関しては、培養工程の全てが第１毒性物質の存在下で行う第１培養工程であってもよいし、培養工程の一部に第１培養工程を行っても良い。但し、発現ベクターの抜け落ちを確実に防止するためには、培養工程の全てが第１培養工程であるのが好ましい。
【００４４】
更に、上記のいずれかに記載の核酸組換え方法であって、前記組換えベクターは、前記宿主細胞に第２毒性物質に対する耐性を与える第２毒性物質耐性遺伝子を有し、前記培養工程は、前記第２毒性物質の存在下で行う第２培養工程を含む核酸組換え方法とすると良い。
【００４５】
宿主細胞に導入された組換えベクターについても、培養を行っているうちに宿主細胞から抜け落ちてしまうことがある。これに対し、本発明では、組換えベクターは、宿主細胞に第２毒性物質に対する耐性を与える第２毒性物質耐性遺伝子を有する。そして、第２毒性物質の存在下で行う第２培養工程を有する。このように、第２毒性物質存在下で培養を行えば、組換えベクターが抜け落ちると宿主細胞が生存でくなくなる、あるいは増殖できなくなるため、宿主細胞に常に組換えベクターが存在するようになる。従って、組換えベクターの抜け落ちを防止できる。
【００４６】
ここで、「第２毒性物質」は、前記第１毒性物質と同様、組換えベクターを有しない状態の宿主細胞を死滅させたり、その生育を停止させることができるものであれば、いずれのものを使用することもできる。
また、「第２毒性物質耐性遺伝子」は、宿主細胞に第２毒性物質に対する耐性を与えることが可能なものであれば、いずれの遺伝子を利用することもできる。
但し、宿主細胞が発現ベクターと組換えベクターの双方を有する場合には、第１毒性物質と第２毒性物質が同じものであると、一方のベクターが存在するだけで、宿主細胞が生存、増殖できるので、他方のベクターが宿主細胞から抜け落ちることになる。従って、宿主細胞が発現ベクターと組換えベクターの双方を有する場合には、第１毒性物質と第２毒性物質を異なるものにするのが好ましい。
【００４７】
なお、培養工程に関しては、培養工程の全てが第２毒性物質の存在下で行う第２培養工程であってもよいし、培養工程の一部に第２培養工程を行ってもよい。但し、組換えベクターの抜け落ちを確実に防止するためには、培養工程の全てが第２培養工程であるのが好ましい。更に、第１培養工程がある場合には、第１培養工程と第２培養工程を同時に行う、即ち、第１毒性物質と第２毒性物質の双方の存在下で培養を行うこともできる。このように同時に行うことで、作業工程を少なくできるし、また、培養の途中でいずれか一方のベクターが抜け落ちることも防止できる。
【００４８】
更に、上記のいずれかに記載の核酸組換え方法であって、前記培養工程は、前記宿主細胞をプレート培地上で培養し、プレート培地上に複数のコロニーを形成させるプレート培養工程と、前記プレート培地から採取した各々の前記コロニーを別々に培養する単一コロニー培養工程と、を含み、前記単一コロニー培養工程で培養された前記宿主細胞から、少なくとも前記組換えベクターを含む前記核酸を抽出する核酸抽出工程と、抽出された前記核酸を電気泳動する電気泳動工程と、を備える核酸組換え方法とすると良い。
【００４９】
本発明によれば、培養工程は、宿主細胞をプレート培地上で培養し、複数のコロニーを形成させるプレート培養工程と、このプレート培地から採取した各々のコロニーを別々に培養する単一コロニー培養工程とを含む。このような培養を行うことで、宿主細胞を容易に分別できる。更に、本発明では、単一コロニー培養工程で培養された宿主細胞から、少なくとも組換えベクターを含む核酸を抽出する核酸抽出工程と、抽出された核酸を電気泳動する電気泳動工程とを備える。従って、分別した宿主細胞が、目的とする組換えが行われたものであるか否かを容易に確認できる。例えば、目的とするクローニングができたか否かを容易に確認できる。
なお、プレート培養工程は、前述の第１培養工程や第２培養工程がある場合には、これらの工程と同時に行うのが好ましい。また、単一コロニー培養工程も、前述の第１培養工程や第２培養工程がある場合には、これらの工程と同時に行うのが好ましい。このようにすることで、発現ベクターや組換えベクターが、プレート培養工程や単一コロニー培養工程の間に抜け落ちることを防止できる。
【００５０】
また、他の解決手段は、自身の細胞内で核酸の相同的組換えが可能な宿主細胞であって、RecA様タンパク質が発現可能で組換え能を有すると共に、RecX様タンパク質が発現可能に構成されてなる宿主細胞である。
【００５１】
本発明の宿主細胞は、RecA様タンパク質が発現可能で組換え能を有すると共に、RecX様タンパク質が発現可能に構成されている。
このような宿主細胞では、RecA様タンパク質が必要なときには、RecA様タンパク質を利用でき、RecA様タンパク質が不要なときには、RecX様タンパク質によりその活性を阻害できるので、目的とする核酸領域間の組換えだけを行わせ、望まない核酸領域間の組換えを抑制できる。従って、宿主細胞内で目的とする標的領域の相同的組換えを正確に行うことができる。しかも、理由は必ずしも定かでないが、従来に比して、組換え効率を向上させることもできる。
よって、例えば、この宿主細胞をクローニングに利用すれば、クローニングしたい標的領域をそのままの無傷の状態でベクターにクローニングすることが可能となる。勿論、この方法では、非特許文献１に開示された方法を用いた場合に生じる、標的領域全体をクローニングできないなどの問題点や、非特許文献２に開示された方法を用いた場合に生じる、標的領域に変異が入るなどの問題点も解決できる。
【００５２】
なお、「宿主細胞」、「RecA様タンパク質」、「RecX様タンパク質」等については、核酸組換え方法のところで説明した通りである。
また、RecA様タンパク質は、少なくとも核酸の相同組換え時に発現していればよく、宿主細胞内で恒常的に発現していもよいし、恒常的ではないが組換え時に発現するものでもよい。例えば、宿主細胞がもとより恒常的にRecA様タンパク質を発現するものである場合には、RecA様タンパク質遺伝子に関しては、この宿主細胞の遺伝子をそのまま利用できる。また、RecA様タンパク質遺伝子に適当な誘導プロモータを付けてもよい。このようにすれば、宿主細胞を誘導することにより、RecA様タンパク質遺伝子を誘導し、RecA様タンパク質を発現させることが可能となる。
また、RecX様タンパク質は、RecA様タンパク質の活性を阻害したいときに発現できるようにされていればよい。例えば、RecX様タンパク質遺伝子に適当な誘導プロモータを付ければよい。このようにすれば、宿主細胞を誘導することにより、RecX様タンパク質遺伝子を誘導し、RecX様タンパク質を発現させることが可能となる。
【００５３】
更に、上記の宿主細胞であって、前記RecA様タンパク質は、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質である宿主細胞とするのが好ましい。
【００５４】
前述したように、RecA様タンパク質は、相同的組換えにおいて大腸菌のRecAタンパク質と類似する機能を有するものであれば、いかなるものでもよい。しかし、大腸菌のRecAタンパク質をコードするRecAタンパク質遺伝子は、入手が容易であり、また、大腸菌のRecAタンパク質は、その機能や性質に関し研究が最も進んでいるなどの観点から、大腸菌のRecAタンパク質を用いるのが最も好ましい。
【００５５】
更に、上記のいずれかに記載の宿主細胞であって、前記RecX様タンパク質は、大腸菌（Escherichia coli）のRecXタンパク質である宿主細胞とするのが好ましい。
【００５６】
前述したように、RecX様タンパク質は、RecA様タンパク質の活性を阻害する点において大腸菌のRecXタンパク質と類似する機能を有するものであれば、いかなるものでもよい。しかし、大腸菌のRecXタンパク質をコードするRecXタンパク質遺伝子は、入手が容易であり、また、現在のところ、大腸菌以外のRecX様タンパク質については、その機能や性質に関する詳しい研究が進んでいないなどの観点から、大腸菌のRecXタンパク質を用いるのが最も好ましい。
【００５７】
更に、上記のいずれかに記載の宿主細胞であって、前記宿主細胞は、大腸菌（Escherichia coli）である宿主細胞とするのが好ましい。
【００５８】
前述したように、宿主細胞は、RecA様タンパク質が発現可能で組換え能を有すると共に、RecX様タンパク質が発現可能に構成されているものであれば、いかなるものを用いてもよい。しかし、入手容易性や取り扱い易さを考慮すると、大腸菌を利用するのが最も好ましい。特に、この宿主細胞を利用してクローニングを行う場合には、クローニング効率やその後の解析の容易さなどの点から、大腸菌が好適である。
【００５９】
更に、上記のいずれかに記載の宿主細胞であって、前記RecA様タンパク質を発現するRecA様タンパク質遺伝子を元来自身のゲノムに有する細胞から調製されてなる宿主細胞とすると良い。
【００６０】
前述したように、RecA様タンパク質は、少なくとも組換え時に発現していれば、恒常的に発現していても構わない。宿主細胞のゲノムに元来存在するRecA様タンパク質遺伝子は、通常、RecA様タンパク質を恒常的に発現しているので、このRecA様タンパク質遺伝子をそのまま利用できる。このように、元来自身のゲノムに有するRecA様タンパク質遺伝子を利用すれば、RecA様タンパク質遺伝子に関しては、宿主細胞を特別に形質転換する必要がないので、宿主細胞を構築する手間が掛からない。
【００６１】
更に、上記のいずれかに記載の宿主細胞であって、前記RecX様タンパク質を発現するRecX様タンパク質遺伝子が挿入された発現ベクターを有する宿主細胞とすると良い。
【００６２】
前述したように、RecX様タンパク質は、RecA様タンパク質の活性を阻害したいときに発現するように制御できなければならない。一方、宿主細胞が元来有するRecX様タンパク質遺伝子は、一般に、外部から自由にその発現を制御できない。従って、宿主細胞を形質転換し、RecX様タンパク質の発現を外部から制御可能にする必要がある。RecX様タンパク質の発現を制御可能にするためには、前述したように、例えば、その宿主細胞が元来ゲノムに有するRecX様タンパク質遺伝子のプロモータを、制御可能な外来のプロモータに変える方法が考えられる。また、制御可能なプロモータが付けられた外来のRecX様タンパク質遺伝子のカセットを宿主細胞のゲノムに導入する方法も考えられる。しかし、このように宿主細胞のゲノムを形質転換するのは、技術的に困難である場合が多い。また、多大な時間と労力を必要とすることも少なくない。これに対し、宿主細胞内で増幅可能な発現ベクターにRecX様タンパク質遺伝子を挿入し、これを宿主細胞に導入すれば、RecX様タンパク質を制御可能な宿主細胞を、比較的容易に構成できる。
【００６３】
更に、上記の宿主細胞であって、前記発現ベクターは、前記RecX様タンパク質遺伝子を誘導する誘導プロモータを有し、この宿主細胞を誘導することにより、このRecX様タンパク質遺伝子を誘導し、前記RecX様タンパク質を発現させる宿主細胞とすると良い。
【００６４】
本発明によれば、前記の発現ベクターは、RecX様タンパク質遺伝子を誘導する誘導プロモータを有する。このような発現ベクターであれば、宿主細胞を誘導することにより、RecX様タンパク質遺伝子からRecX様タンパク質を発現させることができる。このため、RecA様タンパク質の活性を阻害したいときに、宿主細胞を誘導するだけで、容易にRecX様タンパク質を発現させることができる。
なお、「誘導プロモータ」については、核酸組換え方法のところで説明した通りである。
【００６５】
更に、上記のいずれかに記載の宿主細胞であって、前記発現ベクターは、pBR系ベクターからなる宿主細胞とすると良い。
【００６６】
本発明によれば、発現ベクターはpBR系ベクターからなる。pBR系ベクターは、ファージやコスミドなどのベクターに比べ非常に扱いやすいので、発現ベクターにこのベクターを利用すると便利である。更に、この宿主細胞に組換えベクターを導入して組換えを行う場合には、組換えベクターにpUC系ベクターを利用することで、宿主細胞内で発現ベクターと組換えベクターを容易に共存させることができる。また、一般に、pBR系ベクターよりもpUC系ベクターの方が宿主細胞内でコピー数が多くなる。組換えベクターは、相同的組換えを行った後、組換え体を抽出し解析をする場合が多いことから、なるべくコピー数が多い方が収量を確保できるので好ましい。従って、発現ベクターをpBR系ベクターとし、組換えベクターをpUC系ベクターとするのが好ましい。
【００６７】
更に、上記のいずれかに記載の宿主細胞であって、前記発現ベクターは、前記宿主細胞に第１毒性物質に対する耐性を与える第１毒性物質耐性遺伝子を有する宿主細胞とすると良い。
【００６８】
宿主細胞に導入された発現ベクターは、培養を行っているうちに宿主細胞から抜け落ちてしまうことがある。これに対し、本発明では、発現ベクターは、宿主細胞に第１毒性物質に対する耐性を与える第１毒性物質耐性遺伝子を有する。このため、第１毒性物質の存在下で培養を行えば、発現ベクターが抜け落ちると宿主細胞が生存できなくなる、あるいは増殖できなくなるため、宿主細胞に常に発現ベクターが存在するようになる。従って、発現ベクターの抜け落ちを防止できる。
なお、「第１毒性物質」や「第１毒性物質耐性遺伝子」については、核酸組換え方法のところで説明した通りである。
【００６９】
また、他の解決手段は、宿主細胞内に導入して、この宿主細胞内でタンパク質を発現させる発現ベクターであって、RecX様タンパク質を発現するRecX様タンパク質遺伝子を有する発現ベクターである。
【００７０】
このような発現ベクターを、RecA様タンパク質が発現可能で組換え能を有する宿主細胞に導入すれば、RecA様タンパク質が必要なときには、RecA様タンパク質を利用でき、RecA様タンパク質が不要なときには、RecX様タンパク質によりその活性を阻害できるようになる。このため、発現ベクターを導入した宿主細胞において、目的とする核酸領域間の組換えだけを行わせ、望まない核酸領域間の組換えを抑制できる。従って、宿主細胞内で目的とする標的領域の相同的組換えを正確に行うことができる。しかも、従来に比して、組換え効率を向上させることもできる。よって、このような発現ベクターを導入した宿主細胞をクローニングに利用すれば、クローニングしたい標的領域をそのままの無傷の状態でベクターにクローニングすることが可能となる。
なお、「宿主細胞」、「RecX様タンパク質」、「RecX様タンパク質遺伝子」等は、核酸組換え方法のところで説明した通りである。
【００７１】
更に、上記の発現ベクターであって、前記RecX様タンパク質遺伝子を誘導し、前記RecX様タンパク質を発現させる誘導プロモータを有する発現ベクターとすると良い。
【００７２】
本発明によれば、前記の発現ベクターは、RecX様タンパク質遺伝子を誘導する誘導プロモータを有する。このような発現ベクターを宿主細胞に導入すれば、宿主細胞を誘導することにより、RecX様タンパク質遺伝子からRecX様タンパク質を発現させることができるようになる。このため、RecA様タンパク質の活性を阻害したいときに、宿主細胞を誘導するだけで、容易にRecX様タンパク質を発現させることができる。
なお、「誘導プロモータ」については、核酸組換え方法のところで説明した通りである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７３】
（実施例１）
以下、本発明の実施例を、図面を参照しつつ説明する。
まず、自身の細胞内で核酸の相同的組換えが可能な宿主細胞を構築するために、大腸菌（Escherichia coli）JC8679株（インビトロジェン社製キット）を用意し、そのプロトコルに従ってDE3化した。この大腸菌JC8679株は、RecAタンパク質を発現するRecAタンパク質遺伝子を、元来自身のゲノムに有する野生株である。そして、この大腸菌JC8679株は、恒常的にRecAタンパク質を発現しており、相同的組換え能を有する。
なお、大腸菌のRecAタンパク質遺伝子の塩基配列については、GenBank ACCESSION No.: V00328 J01672 を参照されたい。
【００７４】
一方、図１に示すように、宿主細胞内に導入して、宿主細胞内でタンパク質を発現させる発現ベクターとして、pBR系プラスミドベクターからなる pET14b ベクター（NOVAGEN社）を改変した pET14b 改変ベクターを用意した。このpET14b 改変ベクターは、pET14b ベクターに、大腸菌（Escherichia coli）のRecXタンパク質遺伝子を挿入したものである。具体的には、この pET14b 改変ベクターは、宿主細胞となる大腸菌JC8679株にアンピシリン（第１毒性物質）に対する耐性を与えるアンピシリン耐性遺伝子（第１毒性物質耐性遺伝子）を有する。また、この pET14b 改変ベクターは、IPTGによって誘導されるIPTG誘導プロモータ（Ｔ７）を有する。更に、この pET14b 改変ベクターは、IPTG誘導プロモータの下流に、RecXタンパク質を発現する大腸菌のRecXタンパク質遺伝子を有する。
なお、この発現ベクターは、公知の手法により調製できる。また、大腸菌のRecXタンパク質遺伝子の塩基配列については、De Mot, R., Schoofs, G. & Vanderleyden, J. (1994) Nucleic Acids Res. 22,1313-1314. 及び Vierling, S., Weber, T., Wohlleben, W. & Muth, G. (2000) J. Bacteriol. 182,4005-4011. を参照されたい。
【００７５】
次に、DE3化した大腸菌JC8679株（以下、大腸菌JC8679(DE3)とも言う）に、前記の発現ベクターを導入し、核酸の相同的組換えを行うための宿主細胞を調製した。このような宿主細胞は、恒常的にRecAタンパク質が発現可能で組換え能を有すると共に、外部からRecXタンパク質を発現可能に構成されている。即ち、この宿主細胞は、恒常的にRecAタンパク質を発現し、細胞内で核酸の相同的組換えを行うことができる。また、IPTGで宿主細胞を誘導することにより、発現ベクター上のRecXタンパク質遺伝子を誘導し、RecXタンパク質を発現させ、RecAタンパク質の活性を阻害できる。
【００７６】
また、図２に示すように、組換えたい標的領域を含む標的核酸として、cDNAクローンを用意した。この標的核酸（cDNAクローン）は、ヒトの脳細胞から作成したcDNAクローンの一つである。ベクターは、pBuluscriptII SK+（東洋紡社）である。このクローンの挿入断片（cDNA）の塩基配列については、Human p53 gene for transformation related protein p53 GenBank ACCESSION No.: X54156 のエキソン１１に相当する部分を参照されたい。なお、クローニングしたい標的領域の両端の配列（配列Ａ及び配列Ｂ）は、後に組換え反応で相同的組換えに関わる領域である。
【００７７】
また一方で、図３に示すように、標的領域を組み込むための組換えベクターとして、pUC系ベクターからなる pDONR201 ベクター（インビトロジェン社製）を改変した pDONR201 改変ベクターを用意した。この pDONR201 改変ベクターは、pDONR201 ベクターに、標的核酸（cDNAクローン）のうち標的領域の両端の配列（配列Ａ及び配列Ｂ）と相同的な配列（相同配列Ａ及び相同配列Ｂ）が所定の位置に挿入されている。具体的には、この pDONR201 改変ベクターは、pDONR201 ベクターを元に、下記に示す一対のプライマーDNA（オリゴヌクレオチド１及びオリゴヌクレオチド２）を用いて、PCR反応を利用して形成されたものである。従って、このpDONR201 改変ベクターは、既に線状化されている。相同領域Ａ及び相同領域Ｂは、cDNAクローンの標的領域の領域Ａ及び領域Ｂとそれぞれ100％相同的な配列からなる。本実施例では、これら相同領域Ａ及び相同領域Ｂが、標的領域との相同的組換えが可能な相同的組換え領域である。
【００７８】
なお、pDONR201 改変ベクターを作成するためのPCR反応は、94℃5分間、94℃30秒間、40℃30秒間を5サイクル、72℃2分間、94℃30秒間、55℃30秒間を20サイクル、72℃2分間、その後、4℃で保温とした。本実施例では、プライマーのうち pDONR201 ベクターにアニールできる配列が短いため（具体的には、フォワード側については 5'-tttagcttccttagc-3' が、リバース側については 5'-atgtcaggctccctt-3' が、それぞれベクターにアニール可能な配列である）、このように２段階でPCR反応を行っている。
また、この pDONR201 改変ベクターは、宿主細胞となる大腸菌JC8679株にカナマイシン（第２毒性物質）に対する耐性を与えるカナマイシン耐性遺伝子（第２毒性物質耐性遺伝子）を有する。
【００７９】
相同領域Ａ（配列１）：
5'-acaataaaactttgctgcca-3'
相同領域Ｂ（配列２）：
5'-cctttttggacttcaggtgg-3'
オリゴヌクレオチド１（配列３）：
5'-acaataaaactttgctgcca tttagcttccttagc-3'
オリゴヌクレオチド２（配列４）：
5'-cctttttggacttcaggtgg atgtcaggctccctt-3'
【００８０】
次に、前記の大腸菌JC8679(DE3) をコンピテントセル化した。その後、30μlの溶解液にこのコンピテントセルを溶解し、1μlの標的核酸（cDNAクローン）と、1μlの組換えベクター（ pDONR201 改変ベクター）とを混合し、直ぐに０℃で２０分間保持した。その後、エレクトロポレーションを行い、０℃に２分間保持した。
本実施例では、これらの操作が核酸組換え工程に相当する。従って、この段階で、大腸菌JC8679(DE3) 内で発現されたRecAタンパク質により、核酸の相同的組換え、具体的には、標的核酸（cDNAクローン）の標的領域と、組換えベクター（pDONR201 改変ベクター）の相同的組換え領域（相同領域Ａ及び相同領域Ｂ）との間で、組換えが行われる。その結果、標的領域が組換えベクターに組み込まれ、組換え体プラスミドDNAが形成される。
【００８１】
次に、RecA阻害工程と培養工程を行う。まず、IPTGを添加した300μlのSOC培地を加え、37℃で１時間振盪し、形質転換させた大腸菌JC8679(DE3) の前培養を行った。
本実施例では、この操作がRecA阻害工程と培養工程の一部に相当する。従って、この段階で、IPTGによって大腸菌JC8679(DE3)が誘導され、RecXタンパク質遺伝子が誘導されて、RecXタンパク質を発現し、RecAタンパク質の活性を阻害する。
【００８２】
次に、LB-Amp,Kmプレート培地（アンピシリンとカナマイシンを添加したLBプレート培地）に前培養した大腸菌懸濁液を適量プレーティングし、37℃で20時間培養した。即ち、本実施例では、第１毒性物質（カナマイシン）の存在下で培養を行う第１培養工程と、第２毒性物質（アンピシリン）の存在下で培養を行う第２培養工程と、宿主細胞をプレート培地上で培養しプレート培地上に複数のコロニーを形成させるプレート培養工程とを同時に行っている。培養後は、４℃で約３日間放置した。
【００８３】
その後、プレート培地から採取した形質転換株の各々のコロニーを、別々にLB-Amp,Km液体培地（アンピシリンとカナマイシンを添加したLB液体培地）で20時間培養した。即ち、本実施例では、第１毒性物質（カナマイシン）の存在下で培養を行う第１培養工程と、第２毒性物質（アンピシリン）の存在下で培養を行う第２培養工程と、単一コロニーを培養する単一コロニー培養工程とを同時に行っている。
【００８４】
次に、この培養液からプラスミドDNAを分離精製した（核酸抽出工程）。なお、プラスミドDNAの分離精製は、公知の手法により行えばよい。
次に、抽出したプラスミドDNAを1.2％のアガロースゲルで電気泳動を行い（電気泳動工程）、そのゲルをEt-Brで染色し、UV照射して写真に記録した。その結果を図４に示す。
【００８５】
レーン１〜レーン４は、前述した反応を行った結果であるが、それぞれ別の大腸菌コロニーから分離精製したプラスミドDNAを電気泳動したものである。
レーン５〜レーン８は、比較例であり、形質転換の宿主細胞として、大腸菌JC8679株をそのまま用いた。即ち、RecAタンパク質遺伝子を有するが、RecXタンパク質遺伝子を含む発現ベクター（pET14b 改変ベクター）を有しない大腸菌を用いた。それ以外の操作は、レーン１〜レーン４と同様である。レーン５〜レーン８も、それぞれ別の大腸菌コロニーから分離精製したプラスミドDNAを電気泳動したものである。
【００８６】
図４において矢印で示した位置に見えるシグナルは、組換えベクター（pDONR201 改変ベクター）に、標的核酸（cDNAクローン）の標的領域が組み込まれた組換え体プラスミドDNAである。
図４の結果から明らかなように、実施例であるレーン１〜レーン４では、いずれのレーンにおいても組換え体プラスミドDNAが安定して得られている。その上、この電気泳動の結果を見る限りでは、望まない組換えは起こっていないと推測される。
なお、矢印で示した位置に見えるシグナルよりも上方に見える複数のシグナルは、組換え体プラスミドDNAのダイマー、トリマーなどのマルチマーと考えられる。これらのDNAを分離抽出して適当な制限酵素で切断し、電気制動で確認すると、いずれのシグナル由来のものも同じ大きさのシグナルとして検出されるからである。また、適当なプローブを利用したサザンハイブリダイゼションの結果からも、制限酵素で処理したものは、いずれのシグナル由来のものも同じ結果を示すからである。
【００８７】
一方、比較例のレーン５〜レーン８では、組換え体プラスミドDNAが得られなかったり、量が著しく減少したものが多く（レーン５〜レーン７参照）、不安定である。なお、矢印で示した位置に見えるシグナルよりも上方に見える複数のシグナルは、実施例のレーン１〜レーン４と同様、組換え体プラスミドDNAのマルチマーと考えられる。
【００８８】
このような結果から、RecXタンパク質を発現させることで、組換え体プラスミドDNAを安定に得られることが判る。更に、RecXタンパク質を発現させることで、望まない組換えを抑制できることが判る。一方、RecXタンパク質が発現しない場合には、組換え体プラスミドDNAが安定に得られないことが判る。
なお、比較例において、組換え体プラスミドDNAが安定に得られないのは、プレート培養後の放置時間（約３日）が長すぎたため（組換え体プラスミドDNAが宿主細胞内に存在する時間が長すぎたため）、組換え体プラスミドDNAが宿主細胞内から抜け落ちたものと考えられる。後述する実施例２，３のように、プレート培養後の放置時間を短くすれば（組換え体プラスミドDNAが宿主細胞内に存在する時間を短くすれば）、組換え体プラスミドDNAを比較的安定に得ることができる。しかし、プラスミド自動分離装置を利用して、多数のサンプルについて大腸菌からプラスミドを抽出する場合には、組換え体プラスミドDNAが宿主細胞内に存在する時間が装置の都合上長くなるため、本比較例のように組換え体プラスミドDNAが十分に得られないことになる。
一方、実施例の方は、培養時間を長くしたり、培養後長時間放置などして、組換え体プラスミドDNAが宿主細胞内に存在する時間が長くなっても、組換え体プラスミドDNAの抜け落ちることがない。従って、プラスミド自動分離装置を利用して、多数のサンプルについて大腸菌からプラスミドを抽出する場合にも、組換え体プラスミドDNAを安定に得ることができる。
【００８９】
また、実施例と比較例とで、プレート培養工程を行った後のコロニー数を比較すると、同一条件にも拘わらず、実施例の方が比較例に比べおよそ２０倍多いという結果が得られた。このことからも、RecXタンパク質を発現させることで、組換え体プラスミドDNAを安定に得られることが判る。従来よりも形質転換効率（組換え効率）が大幅に向上することが判る。
【００９０】
以上で説明したように、本実施例の核酸組換え方法（クローニング方法）は、大腸菌JC8679(DE3) で発現されたRecAタンパク質により、核酸の相同的組換えを行う核酸組換え工程と、RecXタンパク質を発現させて、RecAタンパク質の活性を阻害するRecA阻害工程とを備える。このような方法では、RecA様タンパク質が必要なときには、RecA様タンパク質を利用でき、RecA様タンパク質が不要なときには、RecX様タンパク質によりその活性を阻害できるので、目的とする核酸領域間の組換えだけを行わせ、望まない核酸領域間の組換えを抑制できる。従って、目的とする標的領域の相同的組換えを正確に行うことができる。しかも、従来に比して、組換え効率を向上させることができる。よって、クローニングしたい標的領域をそのままの無傷の状態で組換えベクター（pDONR201 改変ベクター）にクローニングできる。また、従来技術の有していた問題点も解消される。
【００９１】
更に、本実施例では、RecA様タンパク質として、大腸菌のRecAタンパク質を用いている。大腸菌のRecAタンパク質は、その機能や性質に関し研究が最も進んでいるなどの観点から、大腸菌のRecAタンパク質を用いるのが最も好ましいと考えられる。
また、本実施例では、RecX様タンパク質として、大腸菌のRecXタンパク質を用いている。大腸菌のRecXタンパク質をコードするRecXタンパク質遺伝子は、入手が容易であり、また、現在のところ、大腸菌のRecXタンパク質以外のRecX様タンパク質については、その機能や性質に関する詳しい研究が進んでいないなどの観点から、大腸菌のRecXタンパク質を用いるのが最も好ましいと考えられる
また、本実施例では、宿主細胞として、大腸菌を利用している。入手容易性や取り扱い易さを考慮すると、大腸菌を利用するのが最も好ましい。特に、本実施例のように核酸組換え方法を利用してクローニングを行う場合には、クローニング効率やその後の解析の容易さなどの観点から、大腸菌が好適である。
【００９２】
また、本実施例では、宿主細胞は、RecAタンパク質を発現するRecAタンパク質遺伝子を、元来自身のゲノムに有する大腸菌JC8679(DE3)から調製されてなる。大腸菌JC8679(DE3)のゲノムに元来存在するRecAタンパク質遺伝子は、RecAタンパク質を恒常的に発現しているので、このRecAタンパク質遺伝子をそのまま利用できる。このように、元来自身のゲノムに有するRecAタンパク質遺伝子を利用すれば、RecAタンパク質遺伝子に関しては、大腸菌JC8679(DE3)を特別に形質転換する必要がないので、宿主細胞を構築する手間が掛からない。
【００９３】
また、本実施例では、宿主細胞は、RecXタンパク質遺伝子が挿入された発現ベクター（pET14b 改変ベクター）を有し、このRecXタンパク質遺伝子からRecXタンパク質を発現させている。このようにすることで、比較的容易に、RecXタンパク質を制御可能な宿主細胞を構成できる。
また、本実施例では、発現ベクター（pET14b 改変ベクター）は、RecXタンパク質遺伝子を誘導する誘導プロモータ（IPTG誘導プロモータ）を有する。このような発現ベクターであれば、宿主細胞を誘導することにより、RecXタンパク質遺伝子からRecXタンパク質を発現させることができる。このため、RecA阻害工程において、宿主細胞を誘導するだけで、容易にRecXタンパク質を発現させることができる。
【００９４】
また、本実施例では、組換えたい標的領域を含む標的核酸（cDNAクローン）と共に、この標的領域との相同的組換えが可能な相同的組換え領域（相同領域Ａ及び相同領域Ｂ）を含む組換えベクター（pDONR201 改変ベクター）を宿主細胞内に導入し、標的領域を組換えベクター内に組換えている。このようにすれば、組換え体プラスミドDNAを容易に抽出できるので、その後の解析に利用しやすい。また、組換えベクターに相同的組換え領域を形成することは、大腸菌のゲノムに相同的組換え領域を形成するよりも容易である。
【００９５】
また、本実施例では、発現ベクターをpBR系ベクターとし、組換えベクターをpUC系ベクターとしている。pBR系ベクターやpUC系ベクターは、非常に扱いやすいので、発現ベクターや組換えベクターにこれらのベクターを利用すると便利である。また、このようにすることで、大腸菌内で発現ベクターと組換えベクターが共存させることができる。更に、pUC系ベクターは細胞内でのコピー数が多いので、組換えベクターをpUC系ベクターとすることで、核酸抽出工程で組換え体DNAの収量を確保しやすい。
【００９６】
また、本実施例では、RecA阻害工程よりも後に、宿主細胞を培養する培養工程を備える。このような培養工程を行うことで、宿主細胞を多量に増殖させることができるので、クローニングした標的領域の解析等を行うのに都合がよい。
また、本実施例では、発現ベクター（pET14b 改変ベクター）は、大腸菌にアンピシリンに対する耐性を与えるアンピシリン耐性遺伝子を有する。そして、アンピシリンの存在下で行う第１培養工程を有する。このようにすれば、発現ベクターが抜け落ちると大腸菌が生存あるいは増殖できなくなるため、大腸菌に常に発現ベクターが存在するようになる。従って、発現ベクターの抜け落ちを防止できる。
【００９７】
また、本実施例では、組換えベクター（pDONR201 改変ベクター）は、大腸菌にカナマイシンに対する耐性を与えるカナマイシン耐性遺伝子を有する。そして、カナマイシンの存在下で行う第２培養工程を有する。このようにすれば、組換えベクターが抜け落ちると大腸菌が生存あるいは増殖できなくなるため、大腸菌に常に組換えベクターが存在するようになる。従って、組換えベクターの抜け落ちを防止できる。
更に、第１毒性物質と第２毒性物質を異なるものにしているので、発現ベクター、組換えベクターの一方が抜け落ちるのを防止できる。また、培養工程の全てを第１培養工程及び第２培養工程としているので、培養の途中でいずれか一方のベクターが抜け落ちることを防止できる。
【００９８】
また、本実施例では、培養工程は、大腸菌をプレート培地上で培養し、複数のコロニーを形成させるプレート培養工程と、このプレート培地から採取した各々のコロニーを別々に培養する単一コロニー培養工程とを含む。このような培養を行うことで、大腸菌を容易に分別できる。更に、単一コロニー培養工程で培養された大腸菌から、プラスミドを抽出する核酸抽出工程と、このプラスミドを電気泳動する電気泳動工程とを備える。従って、分別した大腸菌が、目的とする組換えが行われたものであるか否かを容易に確認できる。即ち、目的とするクローニングができたか否かを容易に確認できる。
【００９９】
（実施例２）
次いで、第２の実施例について説明する。なお、上記実施例１と同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
まず、上記実施例１と同様にして、RecXタンパク質が発現可能に pET14b 改変ベクターを導入した大腸菌JC8679(DE3) を調製する。この大腸菌JC8679(DE3) は、前述したように、RecAタンパク質が発現可能で組換え能を有すると共に、IPTGで誘導することによりRecXタンパク質を発現可能に構成されている。
また、上記実施例１と同様なcDNAクローンを用意した、更に、標的領域を組み込むための組換えベクターとして、上記実施例１と同様な pDONR201 改変ベクターを用意した。
【０１００】
次に、基本的に上記実施例１と同様にして、形質転換を行い、更に、培養工程を行った。但し、プレート培養後の放置時間は、４℃で約２日間とした。そして、上記実施例１と同様に、単一コロニー由来のプラスミドDNAを抽出し（核酸抽出工程）、アガロースゲル電気泳動を行って（電気泳動工程）、それを写真に記録した。その結果を図５に示す。
【０１０１】
レーン５〜レーン８は、前述した反応を行った結果であるが、それぞれ別の大腸菌コロニーから分離精製したプラスミドDNAを電気泳動したものである。
レーン１〜レーン４は、比較例であり、形質転換の宿主細胞として、大腸菌JC8679株をそのまま用いた。即ち、RecXタンパク質遺伝子を含む発現ベクターを有しない大腸菌JC8679株を用いた。それ以外の操作は、レーン５〜レーン８と同様である。レーン１〜レーン４も、それぞれ別の大腸菌コロニーから分離精製したプラスミドDNAを電気泳動したものである。
レーン９〜レーン１２も、比較例であり、レーン１〜レーン４と同様、宿主細胞として、大腸菌JC8679株をそのまま用いた。更に、これらのレーンでは、標的核酸を加えず、前記の組換えベクター（ pDONR201 改変ベクター）の代わりに pUC19 ベクターを導入した。それ以外の操作は、実施例レーン５〜レーン８と同様である。
【０１０２】
図５において矢印で示した位置に見えるシグナルは、組換えベクター（pDONR201 改変ベクター）に、標的核酸（cDNAクローン）の標的領域が組み込まれた組換え体プラスミドDNAである。
図５の結果から明らかなように、実施例であるレーン５〜レーン８では、いずれのレーンにおいても組換え体プラスミドDNAが得られている。その上、この電気泳動の結果を見る限りでは、望まない組換えは起こっていないと推測される。なお、矢印で示した位置に見えるシグナルよりも上方に見える複数のシグナルは、上記実施例１と同様に、組換え体プラスミドDNAのマルチマーと考えられる。
【０１０３】
一方、比較例のレーン１〜レーン４では、レーン３を除いて、目的とする組換え体プラスミドDNAが得られず、望まない組換えが起きたと考えられる組換え体プラスミドが多数確認される。
また、比較例のレーン９〜レーン１２では、標的核酸を混合していないため、ベクターDNA(pUC19ベクター）のみが観察された。なお、図中に見えるシグナルは、最も低分子のものが、モノマーのベクターDNAで、それよりも高分子のものは、ダイマー、トリマーなどのマルチマーと考えられる。
【０１０４】
このような結果から、RecXタンパク質を発現させることで、組換え体プラスミドDNAを安定に得られることが判る。更に、RecXタンパク質を発現させることで、望まない組換えを抑制できることが判る。一方、RecXタンパク質が発現しない場合には、望まない組換えが頻繁に起こり、目的とする組換え体プラスミドDNAが得られない場合が多いことが判る。また、当然のことながら、相同組換え可能な標的核酸が存在しないと、組換え体プラスミドDNAが得られないことも判る。
【０１０５】
なお、比較例おいて、形質転換後の培養時間を長くしたり、プレート培養後の放置時間を更に長くするなど、組換え体プラスミドDNAが宿主細胞内に存在する時間を長くすると、上記実施例１で示したように、組換え体プラスミドDNAが宿主細胞から抜け落ちる。
一方、実施例の方は、培養時間を長くしたり、培養後長時間放置などして、組換え体プラスミドDNAが宿主細胞内に存在する時間が長くなっても、組換え体プラスミドDNAの抜け落ちることがなく、組換え体プラスミドDNAを安定に得ることができる。また、望まない組換えも起こらない。
なお、その他、上記実施例１と同様な部分は、上記実施例１と同様な効果を奏する。
【０１０６】
（実施例３）
次いで、第３の実施例について説明する。なお、上記実施例１または２と同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
まず、上記実施例１，２と同様にして、RecXタンパク質が発現可能に pET14b 改変ベクターを導入した大腸菌JC8679(DE3) を調製する。この大腸菌JC8679(DE3) は、前述したように、RecAタンパク質が発現可能で組換え能を有すると共に、IPTGで誘導することによりRecXタンパク質を発現可能に構成されている。
また、上記実施例１，２と同様なcDNAクローンを用意した、更に、標的領域を組み込むための組換えベクターとして、上記実施例１，２と同様な pDONR201 改変ベクターを用意した。
【０１０７】
次に、基本的に上記実施例１，２と同様にして、形質転換を行い、更に、培養工程を行った。但し、本実施例では、プレート培養後すぐに単一コロニーの培養を行った。そして、上記実施例１，２と同様に、単一コロニー由来のプラスミドDNAを抽出し（核酸抽出工程）、アガロースゲル電気泳動を行って（電気泳動工程）、それを写真に記録した。その結果を図６に示す。
【０１０８】
レーン１〜レーン１４は、前述した反応を行った結果であるが、それぞれ別の大腸菌コロニーから分離精製したプラスミドDNAを電気泳動したものである。
レーン１５〜レーン２８は、比較例であり、形質転換の宿主細胞として、大腸菌JC8679株をそのまま用いた。即ち、RecXタンパク質遺伝子を含む発現ベクターを有しない大腸菌JC8679株を用いた。それ以外の操作は、レーン１〜レーン１４と同様である。レーン１５〜レーン２８も、それぞれ別の大腸菌コロニーから分離精製したプラスミドDNAを電気泳動したものである。
なお、レーン２８の右側にあるレーンは、マーカーを電気泳動したものである。
【０１０９】
図６において矢印で示した位置に見えるシグナルは、組換えベクター（pDONR201 改変ベクター）に、標的核酸（cDNAクローン）の標的領域が組み込まれた組換え体プラスミドDNAである。
図６の結果から明らかなように、実施例であるレーン１〜レーン１４では、いずれのレーンにおいても組換え体プラスミドDNAが安定して得られている。その上、この電気泳動の結果を見る限りでは、望まない組換えは起こっていないと推測される。なお、矢印の位置よりも上方に見えるシグナルは、上記実施例１，２と同様、組換え体プラスミドDNAのマルチマーと考えられる。
一方、比較例であるレーン１５〜レーン２８でも、組換え体プラスミドDNAが安定して得られている。しかも、この電気泳動の結果を見る限りでは、望まない組換えは起こっていないと推測される。しかし、組換え体プラスミドDNAのマルチマーが実施例（レーン１〜レーン１４）に比べて非常に多くなっている。
【０１１０】
このような結果から、本発明を適用し、RecXタンパク質を発現させることで、組換え体プラスミドDNAを安定に得られることが判る。更に、RecXタンパク質を発現させることで、望まない組換えを抑制できることが判る。また、組換え体プラスミドDNAのマルチマーが減少することが判る。一方、RecXタンパク質を発現しない場合には、組換え体プラスミドDNAのマルチマーが増加することが判る。
【０１１１】
なお、実施例だけでなく、比較例においても、望まない組み換えた起きていないのは、プレート培養後すぐに単一コロニーの培養を行っているため、組換え体プラスミドDNAが宿主細胞内に存在する時間が短く、望まない組換えがまだ起きていないからと考えられる。この比較例おいて、形質転換後の培養時間を長くしたり、プレート培養後の放置時間を更に長くするなど、組換え体プラスミドDNAが宿主細胞内に存在する時間を長くすると、上記実施例１，２で示したように、組換え体プラスミドDNAが宿主細胞から抜け落ちたり、望まない組換えが頻繁に起こる。
一方、実施例の方は、培養時間を長くしたり、培養後長時間放置などして、組換え体プラスミドDNAが宿主細胞内に存在する時間が長くなっても、組換え体プラスミドDNAの抜け落ちることがなく、組換え体プラスミドDNAを安定に得ることができる。また、望まない組換えも起こらない。
なお、その他、上記実施例１または２と同様な部分は、上記実施例１または２と同様な効果を奏する。
【０１１２】
（実施例４）
次いで、第４の実施例について説明する。なお、上記実施例１〜３のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
まず、上記実施例１〜３と同様にして、RecXタンパク質が発現可能に pET14b 改変ベクターを導入した大腸菌JC8679(DE3) を調製する。この大腸菌JC8679(DE3) は、前述したように、RecAタンパク質が発現可能で組換え能を有すると共に、IPTGで誘導することによりRecXタンパク質を発現可能に構成されている。
【０１１３】
次に、アンピシリンナトリウム添加し、更に、0.1mMのIPTG を添加した2mlのLB液体培地で、発現ベクターを有する大腸菌JC8679(DE3)を一晩培養した。その後、遠心によって集菌し、これを100μlの細胞可溶化液に混ぜ、100℃で３分間保持した。次に、適量を12％のSDS-PAGEで電気泳動し、泳動後のゲルをCBB染色して、写真に記録した。その結果を図７に示す。
【０１１４】
レーン３は、前述した反応を行った結果である。
レーン４は、LB液体培地へのIPTGの添加量を0.5mMとした。それ以外の操作は、レーン３と同様である。
レーン１は、比較例であり、発現ベクターを有しない大腸菌JC8679株をそのまま用いて実験を行った結果である。それ以外の操作は、レーン３と同様である。
レーン２も、比較例であり、RecXタンパク質遺伝子が挿入されていない発現ベクター（pET14b ベクター）を導入した大腸菌JC8679株に対して実験を行ったものである。それ以外の操作は、レーン３と同様である。
なお、レーン１の左側にあるレーンＭは、マーカーを電気泳動したものである。
【０１１５】
図７において矢印で示した位置に見えるシグナルは、RecXタンパク質の存在を示すものである。
図７の結果から明らかなように、実施例であるレーン３，４では、RecXタンパク質の発現が認められる。一方、発現ベクターを有しない大腸菌JC8679株を用いたレーン１では、RecXタンパク質の発現が認められなかった。また、RecXタンパク質が挿入されていない発現ベクターを有する大腸菌JC8679株を用いたレーン２でも、RecXタンパク質の発現が認められなかった。
【０１１６】
このような結果から、RecX遺伝子を挿入した発現ベクターを大腸菌に導入することにより、宿主細胞を誘導することで、RecXタンパク質を容易に発現させることができることが判る。従って、前記実施例１〜３においても、大腸菌を誘導したときに、大腸菌内でRecXタンパク質が発現していることが判る。
なお、その他、上記実施例１〜３のいずれかと同様な部分は、上記実施例１〜３と同様な効果を奏する。
【０１１７】
以上において、本発明を実施形態を実施例に即して説明したが、本発明は上述の実施例に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で、適宜変更して適用できることは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】実施例１に関し、RecXタンパク質遺伝子を挿入した発現ベクターの構造を示す説明図である。
【図２】実施例１に関し、クローニングしたい標的領域を含む標的核酸の構造を示す説明図である。
【図３】実施例１に関し、標的領域を組み込むための相同的組換え領域を挿入した組換えベクターの構造を示す説明図である。
【図４】実施例１に関し、抽出したプラスミドDNAについて電気泳動を行った結果を示す図面に変わる写真である。
【図５】実施例２に関し、抽出したプラスミドDNAについて電気泳動を行った結果を示す図面に変わる写真である。
【図６】実施例３に関し、抽出したプラスミドDNAについて電気泳動を行った結果を示す図面に変わる写真である。
【図７】実施例４に関し、宿主細胞から抽出したタンパク質についてSDS-PAGEを行った結果を示す図面に変わる写真である。
【図８】従来技術に関し、制限酵素を利用して標的DNAをクローニングする方法を示す説明図である。
【図９】従来技術に関し、PCR反応を利用して標的DNAをクローニングする方法を示す説明図である。
【図１０】従来技術に関し、核酸の相同的組換えを利用して標的DNAをクローニングする方法を示す説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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