(57)【要約】  【課題】従来報告されている細菌よりも塩素置換数の多いＰＣＢ異性体をも分解できる特性を備え、かつ、低温度条件下でも生育可能な細菌を提供すると共に、該細菌を用いたＰＣＢ汚染の浄化方法を提供することを目的とする。  【解決手段】ポリ塩化ビフェニル類の分解能を備えた、Paenibacillus属に属する細菌および、ポリ塩化ビフェニル類によって汚染された汚染土壌又は汚染水をポリ塩化ビフェニル類の分解能を備えた、Paenibacillus属に属する細菌と接触させて、ポリ塩化ビフェニル類を分解することを特徴とする、汚染土壌又は汚染水の浄化処理方法。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ塩化ビフェニル類の分解能を備えたPaenibacillus属に属する細菌。
【請求項２】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３６として寄託されている請求項１に記載のPaenibacillus属に属する細菌。
【請求項３】
配列認識番号１に示す塩基配列からなる１６ＳリボソームＤＮＡを有する請求項１又は２に記載のPaenibacillus属に属する細菌。
【請求項４】
多環芳香族炭化水素類の分解能を備えた請求項１〜３のいずれかに記載のPaenibacillus属に属する細菌。
【請求項５】
ポリ塩化ビフェニル類を請求項１〜４のいずれかに記載のPaenibacillus属に属する細菌と接触させて前記ポリ塩化ビフェニル類を分解するポリ塩化ビフェニル類の分解処理方法。
【請求項６】
前記ポリ塩化ビフェニル類が、ビフェニルの骨格の水素を５〜９個の塩素によって置換したポリ塩化ビフェニル異性体を含む請求項５に記載のポリ塩化ビフェニル類の分解処理方法。
【請求項７】
ポリ塩化ビフェニル類および多環芳香族炭化水素類を、請求項４に記載のPaenibacillus属に属する細菌と接触させて前記ポリ塩化ビフェニル類および前記多環芳香族炭化水素類を分解するポリ塩化ビフェニル類および多環芳香族炭化水素類の分解処理方法。
【請求項８】
ポリ塩化ビフェニル類によって汚染された汚染土壌又は汚染水を請求項１〜４のいずれかに記載のPaenibacillus属に属する細菌と接触させて、前記ポリ塩化ビフェニル類を分解することにより浄化する汚染土壌又は汚染水の浄化処理方法。
【請求項９】
前記ポリ塩化ビフェニル類が、ビフェニルの骨格の水素を５〜９個の塩素によって置換したポリ塩化ビフェニル異性体を含む請求項８に記載の汚染土壌又は汚染水の浄化処理方法。
【請求項１０】
ポリ塩化ビフェニル類および多環芳香族炭化水素類によって汚染された汚染土壌又は汚染水を、請求項４に記載のPaenibacillus属に属する細菌と接触させて、前記ポリ塩化ビフェニル類および前記多環芳香族炭化水素類を分解することにより浄化する汚染土壌又は汚染水の浄化処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規細菌およびその利用方法に関し、更に詳しくは、ポリ塩化ビフェニル類、特に、ポリ塩化ビフェニル類の高塩素置換体をも分解可能なPaenibacillus属に属する新規細菌および該細菌を用いた汚染土壌又は汚染水の浄化方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年の産業発達に伴い、様々な有害化学物質が環境中に放出、漏洩される等して、地球環境の破壊が進行しており、大きな社会問題を招いている。なかでも、芳香族塩素化合物に分類されるポリ塩化ビフェニル類（以下、ＰＣＢと称する。）は、生物体および環境中でも化学的に極めて安定な化合物であり、また、親油性化合物である。このため、土壌から地下水系、海洋へと拡散した場合に、その間に生息する生物体内の脂肪組織に蓄積し、食物連鎖を通して濃縮されていく性質があることから、長期に渡って環境に悪影響をもたらす。また、最近の研究において、ＰＣＢの内分泌撹乱物質としての毒性が報告され、極微量な汚染についても環境への悪影響が懸念される。このため、ＰＣＢを分解、無害化する浄化技術を早急に確立することが不可欠であった。
【０００３】
これまでにＰＣＢ分解処理技術として、熱処理技術、化学的処理技術、微生物処理技術等が開発されてきた。なかでも、微生物処理技術は、細菌が有する物質変換能を活用することによりＰＣＢを分解、無害化する技術である。そして、分解に際して有害な分解生成物を産生することなくＰＣＢを低濃度化でき、かつ、コストや処置設備面において有利な条件で処理することが可能であることから、その実用化に向けて研究が進められている。しかしながら、芳香族塩素化合物であるＰＣＢは、自然界の微生物による分解を受けにくいため、ＰＣＢに対して高い分解能力を発現できる有用微生物の積極的な利用が必要となる。
【０００４】
これまで、ＰＣＢの基本骨格であるビフェニル等の多環芳香族炭化水素類（以下、ＰＡＨと称する。）を分解することができる細菌として、Paenibacillus validus PR-P9株（例えば、非特許文献１を参照）が単離されてきた。また、置換塩素数が４以下のＰＣＢに対して優れた分解力を示す細菌として、Rhodococcus erythropolis TA421株（例えば、特許文献１を参照。）、及びBacillus sp. JF8株（例えば、特許文献２、非特許文献２を参照。）が単離されてきた。
【０００５】
しかしながら、Paenibacillus validus PR-P9株は、ＰＣＢ等の塩素体化合物の分解に関する知見はない。また、ＰＣＢは、様々な置換塩素数および置換塩素位置からなる異性体の混合体であることが知られているが、Rhodococcus erythropolis TA421は、様々な塩素置換位置異性体から構成される２〜４塩素置換体ＰＣＢ混合液と共に培養した場合に、２塩素置換体に対して１００％の分解能を示した。しかし、３〜４塩素置換体に対しては塩素置換位置により、１００％の分解能を示す異性体が存在する一方で、異性体によっては１１．４％までＰＣＢ分解能が低下することが報告されている。更に、５塩素置換体の分解に対しては明確な開示がない（0.5%ビフェニルおよび33ppmのPCB(2〜4塩素化PCBを含む混合液)を含有するC培地において、Rhodococcus erythropolis TA421株(FERMP-14247)を30℃で１週間培養し分解をGC/MSで測定した結果を示す表１を参照のこと。）。そして、Bacillus sp. JF8株は、５塩素置換体に対しては、２０％程度の低い分解能を示すのみであった。したがって、上記したＰＣＢ分解菌のいずれもが、塩素置換数の多い（例えば、５塩素置換体以上）ＰＣＢに対する分解能力が低く、限られた構造のＰＣＢを分解できるのみであった。
【０００６】
【表１】
2005245280.tif 000002
【０００７】
また、８塩素置換体までのＰＣＢを分解可能な細菌として、Rhodococcus sp. RHA1株（特許文献３、非特許文献３を参照。）が単離、同定されている。該細菌によっても、５塩素置換体程度であっても異性体によっては、分解率が２０％程度まで減少し、処理されない残存成分が貯留するという問題点があった。したがって、従来報告されているＰＣＢ分解菌のいずれもが、ＰＣＢ、特に、高塩素置換体ＰＣＢの分解能の観点から、環境浄化への適用においては依然として不十分であり、高塩素置換体ＰＣＢをも効率的に分解可能なＰＣＢ分解菌の出現が要望されていた。
【０００８】
そして、微生物を用いた浄化技術の分野において、浄化効率の向上のためには、浄化対象化合物に対する高い分解活性を微生物が保持した状態で、浄化対象化合物で汚染された汚染物質と接触させることが必要であり、中でも、温度条件は微生物の増殖並びに分解活性に密接な関連を有する。したがって、温度条件は、微生物を用いた浄化技術においては重要な要素である。微生物は、各微生物毎に生育最低温度を有し、温度がそれ以下となると、微生物はその生物活性を停止する。例えば、上記で説明したＰＣＢ分解菌Bacillus sp. JF8株の生育温度は３５〜７０℃であり、３５度以下の温度においては、その生物分解活性を発揮することができない。一般に、ＰＣＢの汚染が問題となる土壌、地下水等の温度は、微生物の至適生育温度より低い場合が多く、微生物処理能力の確保が困難となるという問題点があった。かかる問題点を解消すべく、微生物の生物活性を保持するために汚染箇所の加温手段が種々提案されているが、温度制御には設備投資、ランニングコストを含めた多大なコストを要するため、広範囲な温度領域、特に低温領域で生育が可能な分解微生物の出現が要望されているという現状もあった。
【０００９】
また、高塩素置換体ＰＣＢを分解できる技術として、嫌気性微生物処理および好気性微生物処理を繰り返す嫌気／好気処理方式（例えば、特許文献４を参照。）が報告されている。該方式は、嫌気条件、および好気条件下において、それぞれ異なる種類の微生物（群）が関与するため、嫌気／好気の環境を切り替えた後、浄化対象化合物に対して分解能を有する嫌気性または好気性の目的分解微生物が活動しはじめるまでに長時間を要するのが実状であり、現在の技術は、分解時間の短縮化、分解効率の向上の要素を十分に満足させるものではないという問題点があった。
【００１０】
【特許文献１】特開平７−２６５０６２号公報
【特許文献２】特開平１１−１０１２２号公報
【特許文献３】特開平８−２３９６４号公報
【特許文献４】特開２００３−１６４８５０号公報
【非特許文献１】L.L.Daane他著、Isolation and Characterization of Polycyclic Aromatic Hydrocarbon-Degrading Bacteria Associated with the Rhizosphere of Salt Marsh Plants.（塩湿地植物の根圏に関連した多環芳香族炭化水素類分解細菌の単離と特徴付け。）APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY、米国、２００１年６月、第６７巻、第６号、第２６８３頁〜第２６９１頁
【非特許文献２】Minoru Shimura他著、Isolation and characterization of a thermophilic Bacillus sp. JF8 capable of degrading polychlorinated biphenyls and naphthalene.（ポリ塩化ビフェニル類おけるナフタレンを分解する能力を有する好熱性バシラス属ＪＦ８の単離および特徴付け。）、FEMS Microbiology Letters １９９９年９月１日、第１７８巻、第１号、第８７頁〜第９３頁
【非特許文献３】Masashi SETO他著、A Novel Transformation of Polychlorinated Biphenyls by Rhodococcussp. Strain RHA1（新規な、ロドコッカス属ＲＨＡ１株によるポリ塩化ビフェニル類形質転換。）、APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY、米国、１９９５年９月、第６１巻、第９号、第３３５３頁〜第３３５８頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで、本発明は、上記実状を鑑みて、従来報告されている細菌よりも塩素置換数の多いＰＣＢ異性体をも分解できる特性を備え、かつ、低温度条件下でも生育可能な細菌を提供すると共に、該細菌を用いたＰＣＢ汚染の浄化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解消すべく、従来報告されている細菌よりも塩素置換数の多いＰＣＢ異性体をも分解できる特性を備え、かつ、低温度条件下でも生育可能な細菌をスクリーニングすべく鋭意研究を行った。その結果、上記所望の特性を備えた新規細菌を単離することに成功した。そして、該細菌がＰＡＨをも分解する特性を備えていることを見出した。更に、鋭意研究を行った結果、該細菌の利用方法を構築するに至り、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、上記目的を達成するための本発明は、下記の通りである。
本発明は、ポリ塩化ビフェニル類の分解能を備えた、Paenibacillus属に属する細菌を提供する。そして、本発明の細菌の好ましい具体例は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３６として寄託されている細菌であり、また、配列認識番号１に示す塩基配列からなる１６ＳリボソームＤＮＡを有するものである。そして、より好ましくは、多環芳香族炭化水素類の分解能を備えた細菌である。
【００１４】
本発明の別の側面によれば、ポリ塩化ビフェニル類を上記した本発明の細菌と接触させて、前記ポリ塩化ビフェニル類を分解する、ポリ塩化ビフェニル類の分解処理方法が提供される。好ましくは、前記ポリ塩化ビフェニル類が、ビフェニルの骨格の水素を５〜９個の塩素によって置換されたポリ塩化ビフェニル異性体を含む。
【００１５】
本発明は更に、ポリ塩化ビフェニル類および多環芳香族炭化水素類を、上記した本発明の細菌と接触させて、前記ポリ塩化ビフェニル類および前記多環芳香族炭化水素類を分解する、ポリ塩化ビフェニル類および多環芳香族炭化水素類の分解処理方法を提供する。
【００１６】
本発明のさらに別の側面によれば、ポリ塩化ビフェニル類によって汚染された汚染土壌又は汚染水を本発明の細菌と接触させて、前記ポリ塩化ビフェニル類を分解することによって浄化する、汚染土壌又は汚染水の浄化処理方法が提供される。好ましくは、前記ポリ塩化ビフェニル類が、ビフェニルの骨格の水素を５〜９個の塩素によって置換されたポリ塩化ビフェニル異性体を含む。
【００１７】
本発明は更に、ポリ塩化ビフェニル類および多環芳香族炭化水素類によって汚染された汚染土壌又は汚染水を、本発明の細菌と接触させて、前記ポリ塩化ビフェニル類および前記多環芳香族炭化水素類を分解することにより浄化する、汚染土壌又は汚染水の浄化処理方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の実施の形態について、以下に詳細に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施の形態により限定的に解釈されるものではない。
【００１９】
本発明で取得された細菌は、ＰＣＢの分解性能を有する細菌をスクリーニングすることにより単離されたものであり、塩素置換数の多いＰＣＢをも分解できる新規細菌株である。特に、９塩素置換体までのＰＣＢを効率良く分解できることが確認された。また、この細菌は、ＰＡＨに対する分解能をも有することが確認された。
【００２０】
本発明の新規細菌の更なる、生物学的特徴を特定するために、この細菌が有する菌学的性質、すなわち、Ｉ．形態的性質、ＩＩ．培地における生育状況、ＩＩＩ．生理学的性質、ＩＶ．遺伝子学的性質に関する検定結果を以下に示す。
【００２１】
Ｉ．形態的性質
Ａ．細胞の形及び大きさ
培地として、Nutrient Agarにおいて３０℃にて培養を行ったところ、０．５〜０．６×２〜３μｍの桿菌が観察された。  
Ｂ．運動性の有無：＋
Ｃ．胞子の有無：＋
Ｄ．コロニーの形成：Nutrient Agarにおいて、３０℃にて４８時間培養を行ったところ、クリーム色の光沢のある、円形状で周縁部がやや波状で、低凸状のコロニーが観察された。
ＩＩ．培養的性質
Ａ．液体培養
ａ．表面発育の有無：−
ｂ．培地の混濁状態：＋
Ｂ．ゼラチン穿刺培養
ａ．生育の状態：−
ｂ．ゼラチン液化：−
Ｃ．リトマス・ミルク
ａ．凝固：−
ｂ．液化：−
ＩＩＩ．生理学的性質
Ａ．グラム染色性：＋（不定）
Ｂ．硝酸塩の還元：−
Ｃ．ＭＲテスト：−
Ｄ．ＶＰテスト（アセトイン産生）：＋
Ｅ．インドールの生成：−
Ｆ．硫化水素の生成：−
Ｇ．デンプンの加水分解：−
Ｈ．クエン酸の利用
ａ．Koser培地：−
ｂ．Christensen培地：−
Ｉ．無機窒素源の利用
ａ．硝酸塩：＋
ｂ．アンモニウム塩：＋
Ｊ．色素の生成：−
Ｋ．酵素活性
ａ．酵素活性：＋
カタラーゼ、β−ガラクトシダーゼ
ｂ．酵素活性：−
ウレアーゼ、オキシダーゼ、アルギニンジヒドロラーゼ、リシンデカルボキシラーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、トリプトファンデアミナーゼ、ゼラチナーゼ、
Ｌ．生育の範囲
ａ．ｐＨ：ｐＨ６（＋）、ｐＨ８（＋）、ｐＨ１０（−）
ｂ．温度：２０℃（＋）、３０℃（＋）、３７℃（＋）、４５℃（−）
Ｍ．酸素に対する態度：好気性（＋）、嫌気性（−）
Ｎ．Ｏ／Ｆ テスト:−／−
Ｏ．下記の糖類から酸及びガスの生成の有無
ａ．糖類から酸の生成：＋
シュークロース（＋Ｗ）、グリセリン（＋Ｗ）
ｂ．糖類から酸の生成：−
Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース（ブドウ糖）、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、マルトース、ラクトース、トレハロース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、イノシトール、
ｃ．糖類からガスの生成：＋
今回検討した糖類からは確認されなかった。
ｄ．糖類からガスの生成：−
Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース（ブドウ糖）、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、マルトース、シュークロース、ラクトース、トレハロース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、イノシトール、グリセリン
Ｐ．基質発酵性
ａ．基質発酵性：＋
グリセロール、Ｄ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシロース、ガラクトース、グルコース、フラクトース、マンノース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、α−メチル−Ｄ−グルコース、エスクリン、マルトース、メリビオース、白糖、トレハロース、ラフィノース、ゲンチオビオース、Ｄ−ツラノース
ｂ．基質発酵性：−
エリスリトール、Ｌ−アラビノース、Ｌ−キシロース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロース、ソルボース、ラムノース、ソルビトール、α−メチル−Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン、サリシン、セロビオース、乳糖、イヌリン、メレチトース、澱粉、グリコーゲン、キシリトース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、グルコネート、２−ケトグルコン酸、５−ケトグルコン酸
【００２２】
ＶＩ．遺伝子学的性質
本発明で取得された細菌は、例えば、配列表の配列認識番号１に示す塩基配列からなる１６ＳリボソームＤＮＡを有する。この、塩基配列に基づいて、相同検索を行なったところ、Paenibacillus validusと９９％の相同性であった。
【００２３】
他のPaenibacillus属に属する細菌、具体的にはP.validus、P.polymyxaとの生理学的特性の比較を表２に示すと共に、他のPaenibacillus属に属する細菌、具体的にはP.validus、P.polymyxa、P.pabuli、P.alveiとの脂肪酸組成の比較を表３に示す。なお、P.validus、P.polymyxa、P. pabuli、P.alveiに関するデーターは、Bosshard PP, Zbinden R, Altwegg M.著、Paenibacillus turicensis sp. nov., a novel bacterium harbouring heterogeneities between 16S rRNA genes. Int J Syst Evol Microbiol. 2002年11月、第５２巻、第６号、第2241-9頁から引用した。
【００２４】
【表２】
2005245280.tif 000003
【００２５】
【表３】
2005245280.tif 000004
【００２６】
表２に示した通り、本発明で得られた細菌は、カタラーゼが陽性であり、また、オキシダーゼ、アルギニンジヒドロラーゼ、クエン酸の利用、インドールの産生が陰性である点で、P.validus、P.polymyxa と共通するが、糖からの酸の産生能が顕著に相違し、また、表３に示した通り、細菌に固有である脂肪酸組成が、P.validus、P.polymyxa、P. pabuli、P.alveiと同様、１５：０ ante-isoが主要脂肪酸である点で共通するが、その組成比は、これらとは相違し、更に、本発明以前において、Paenibacillus属に属する細菌が、ＰＣＢを分解する能力を有することは報告されていなかったことから、本発明の細菌は、公知のPaenibacillus属に属する細菌とは異なる新規な細菌であることが明白である。このことから、Paenibacillus sp. ＫＢＣ−１０１株（以下、ＫＢＣ−１０１株と略する場合がある。）と命名した。ＫＢＣ−１０１株は、本出願人によって、茨城県つくば市に所在の独立行政法人産業技術総合研究所、生命工学工業技術研究所、特許生物寄託センターにて寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３６が付与されている。本発明は、この寄託細菌自体は勿論のこと、前記生物活性を保持するその変異体および子孫をも含むものである。なお、変異体は自然発生、人工的手段による変異体を問わず、いずれをも含むものである。上記生物活性を有する細菌であるか否かは、例えば、ビフェニルを炭素源とした培地にＰＣＢを添加して低温条件下でスクリーニングすることができる。単離された菌株のＰＣＢ分解能は、ガスクロマトグラフィー等の常用手段を用いて経時的にＰＣＢ量を分析することにより評価することができる。ここで、生物活性とは、少なくともＰＣＢ分解能を発揮することを意味するものとする。
【００２７】
上記で示した菌学的性質の解析を含めた本発明の細菌の性質に関する解析結果から以下の事項が判明した。
【００２８】
１．ＰＣＢ分解能
本発明の細菌は、ＰＣＢ分解能を有し、Paenibacillus属において初めてＰＣＢを分解可能な細菌株として単離された新規な細菌株であり、Paenibacillus属に属する細菌に関する、新たな知見を開示するものである。また、以下の実施例において開示する通り、本発明の細菌は、５〜９塩素置換体という高塩素置換体ＰＣＢをも効率的に分解可能であることが認められた。そして、従来報告されたＰＣＢ分解菌よりも、より置換塩素数の多いＰＣＢ異性体をも効率的に分解できる有用な細菌であることから、ＰＣＢ汚染の浄化技術への適用に実用的価値を有するものである。
【００２９】
２．広範囲な生育温度領域
また、本発明の細菌は、２０℃においても生育可能であることから、低温領域を含む幅広い温度領域での生育が可能であることが認められた。一般に、ＰＣＢ汚染が問題となる土壌、地下水等の温度は外気温の影響を受け、また、各細菌のもつ至適生育温度を下回っている。しかしながら、本発明の細菌を用いて浄化方法を構築することにより、低温領域下においても実用的なＰＣＢ分解能を維持できる。このため汚染対象物の温度が生物活性の阻害因子とならずに広範囲に渡る適用が可能となると共に、加温設備等による温度制御が不要となり、設備コストおよびランニングコストを削減することが可能となる。
【００３０】
３．ＰＡＨ分解能
本発明の細菌は、ＰＣＢ分解能に加えて、ビフェニル、ジベンゾフラン、キサンテン、フェナントレン、フルオレン等のＰＡＨを資化できる能力を有する。したがって、本発明の細菌は、ＰＣＢ汚染の浄化技術へ適用に実用的価値を有するものであり、特に、ＰＣＢ／ＰＡＨとの複合汚染系に、特に好適に利用できる。
【００３１】
上記細菌を培養する培地としては、特別な培地を使用することなく、当該細菌株が生育し得る培地であれば、天然培地、合成培地を問わず、いずれをも使用することができ、培養目的、培養条件等に応じて適宜選択される。具体的には、培養培地は本発明の細菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン類を適宜組み合わせて組成できる。炭素源として、例えば、グリセロール、グルコース、ガラクトース、フラクトース、などが使用でき、窒素源として、例えば、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、カゼイン加水分解物、硫酸アンモニウム、尿素などが使用でき、無機塩類として、例えば、リン酸塩、炭酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩等が使用でき、その他、チアミン、ニコチン酸、ピリドキシン等のビタミン類等が必要に応じて使用される。また、例えば、Nutrient Broth、Nutrient Agarなどの市販の栄養培地をも好適に利用可能である。
【００３２】
本発明の細菌の培養方法は、培養の目的等に応じて、常法に従って実施すればよく、培養の形態は固体培養、液体培養いずれでもよく、また、培地の液性、培養温度等についても、本細菌株が良好に生育する条件であれば特に制限されないが、例えば、ｐＨ６〜８、温度２０〜３７℃で、通気条件下で好気的に行われる。
【００３３】
次に、本発明の分解処理方法について説明する。
本発明の細菌は、ＰＣＢに対する分解能を有することから、本発明の細菌を用いてＰＣＢの分解処理方法を構築できる。具体的には、本発明の細菌をＰＣＢと接触させることにより行なわれ、本発明の細菌の有するＰＣＢ分解酵素により、ＰＣＢを酸化分解するものであり、ＰＣＢの基本骨格であるビフェニルをも好気的に分解処理することを含む。ここで、分解の対象となるＰＣＢとは、ベンゼン環が２個つながったビフェニル骨格の水素が１〜１０個の塩素で置換されたものの総称であり、置換塩素の数と位置によって理論上２０９種の異性体が存在し、そのすべての異性体およびその混合物が含まれる。本発明の細菌はＰＣＢを分解する能力を備え、従来公知の細菌では分解が困難であった置換塩素数（特には、５塩素置換以上）の多いＰＣＢ異性体をも効率的に分解できることから、これまで、微生物処理では困難とされてきた高塩素置換体ＰＣＢの分解処理にも適用することが可能である。
【００３４】
また、上記したように本発明の細菌はＰＡＨに対する分解能をも有することから、ＰＣＢとＰＡＨの双方を同時に分解処理できる分解処理方法をも構築できる。具体的には、ＰＣＢおよびＰＡＨを本発明の細菌と接触させて培養することにより行なわれ、本発明の細菌の有するＰＣＢおよびＰＡＨ分解酵素の作用により、ＰＣＢおよびＰＡＨを酸化分解し、ＰＣＢの基本骨格であるビフェニルを含めたＰＡＨを好気的に分解することにより行なわれる。ここで、本発明でＰＡＨとは、芳香族環を２個以上有する化合物の総称であり、窒素原子、酸素原子、硫黄原子と複素環を形成する化合物をも含み、具体的には、ビフェニル、ジベンゾフラン、キサンテン、フェナントレン、フルオレン等が含まれる。
【００３５】
本発明の細菌をＰＣＢに適用する方法は、細菌を培養して得られる培養物自体を接触させる方法、遠心分離等の手段を用いて該培養物から分離した菌体を接触させる方法、もしくは、該菌体を担体に結合、架橋、及び、包括固定して接触させる方法等、いずれの方法をも好ましく用いることができる。また、固定化担体として、本発明の細菌の生物活性を保持して固定化できるものであれば、いずれをも使用でき、例えば、セルロース、アガロース、多孔質ガラス、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、グルタルアルデヒド、シリカゲル、アルギン酸、カラーギナン、ナイロン等を使用することが可能である。
【００３６】
次に、本発明の汚染土壌又は汚染水の浄化方法について説明する。
本発明の汚染土壌又は汚染水の浄化方法は、本発明で取得された細菌を、ＰＣＢで汚染された汚染媒体である汚染土壌又は汚染水に接触させ、該汚染土壌又は汚染水中に含まれるＰＣＢを生物分解することを特徴とするものである。ここで、本発明の浄化処理対象となる汚染土壌又は汚染水は、特に制限されるものではなく、ＰＣＢで汚染された土壌、底質、地下水、河川水、湖沼水、工場等からの排水等を含むものであり、本発明の浄化方法は、これらに好適に利用可能である。
【００３７】
本発明の細菌と汚染媒体中のＰＣＢとの接触は、本発明の細菌がＰＣＢの分解能を発揮し得る条件下であれば、いずれをも採用することが可能である。例えば、汚染媒体がＰＣＢで汚染された汚染土壌の場合には、現場で掘削を伴わないで汚染土壌等の修復処理を行う原位置バイオレメディエーション法、汚染土壌等を掘削してオンサイト若しくはオフサイトの土壌処理プラントで修復処理を行うオンサイト／オフサイトバイオレメディエーション法、スラリーリアクター法を含む、一般的なバイオレメディエーション技術のいずれのケースにおいても適用可能である。本発明の細菌の投入形態としては、例えば、上記原位置バイオレメディエーション法を採用して浄化する場合、例えば、地下汚染箇所の近傍の飽和層に２本以上の井戸を掘削し、地下水流の下流側に掘削された揚水井戸から揚水した地下水の少なくとも一部に本発明の細菌を投入し、これを上流側に掘削された注入井戸に注入し循環する方法、また、オンサイト／オフサイトバイオレメディエーション法を採用する場合、例えば、本発明の細菌を、土壌に直接散布する方法、土壌中に埋設した配管を通して投入する方法等、当該分野において公知の投入方法のいずれをも好適に利用できる。また、本発明の細菌を汚染媒体に適用する方法は、上記で説明した分解処理方法と同様、細菌を培養して得られる培養物自体を接触させる方法、遠心分離等の手段を用いて該培養物から分離した菌体を接触させる方法、もしくは、該菌体を担体に結合、架橋、及び、包括固定して接触させる方法等、いずれの方法を好ましくも用いることができる。
【００３８】
また、汚染媒体がＰＣＢで汚染された汚染水の場合には、例えば、通水可能なリアクターを構築して、該リアクター内で汚染水と本発明の細菌とを、本発明の細菌が膜に付着された状態で接触させる生物膜法、担体に固定化された状態で接触させる固定化法、細菌が浮遊状態で接触させる浮遊法等、いずれにも適用することが可能であり、固定化法として、固定床方式、流動床方式のいずれを利用可能である。また、リアクターの形態に関しても特に制限はなく、バッチ方式、連続方式、いずれをも採用することが可能である。
【００３９】
細菌投入量はＰＣＢの汚染度合い、汚染媒体の種類等によって適宜設定されるものであるが、汚染土壌又は汚染水当たり０．０１〜１０％程度の本発明の細菌を投与することが好ましく、任意のＰＣＢ汚染レベルに低減するまで処理を継続することが好ましい。
【００４０】
処理温度は、本発明の細菌の生物活性を保持できる限り、特に制限はないが、好ましくは、２０〜３７℃である。本発明の細菌は低温領域を含めた広範な温度領域でその生物活性を発揮することから、特別な温度制御手段を講じなくとも、実用に即した生物処理効果を得ることができる。
【００４１】
そして、本発明の細菌は単一菌として分離されたものであり、その１６ＳリボソームＤＮＡの塩基配列が判明していることから、この塩基配列を基に、この塩基配列を特異的に増幅可能なプライマー、塩基配列に特異的にハイブリダイズできるプローブを設計し、ＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション法等を用いて本発明の細菌を検出することが可能である。したがって、浄化過程における本発明の細菌の動態をモニタリングすることにより、細菌投与量の制御等の、浄化反応系の制御が容易となり浄化処理時間を短縮することが可能となる。ここで、使用されるプライマー、プローブ等の設計、調製方法は、当該分野において周知であり、例えば、１６ＳリボソームＤＮＡの塩基配列情報に基づいて化学合成する方法、１６ＳリボソームＤＮＡの鋳型として相補的なＤＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成する方法等を利用できる。プライマー、プローブは好ましくは、放射性同位体元素、蛍光色素等で標識される。
【００４２】
また、本発明の細菌は、上記した通り、ＰＣＢのみならず、ビフェニル、ジベンゾフラン、キサンテン、フェナントレン、フルオレン等のＰＡＨを資化できる能力を有することも判明している。したがって、本発明は、ＰＡＨで汚染された汚染土壌、汚染水を浄化する方法をも提供し、特に、ＰＣＢ／ＰＡＨとの複合汚染系に、特に好適に利用される。
【００４３】
以上のように構成することで、高塩素置換異性体を含めたＰＣＢを効果的に分解処理でき、かつ、ＰＡＨをも分解処理できる本発明の細菌を、ＰＣＢ、ＰＣＢおよびＰＡＨにより汚染された土壌若しくは水域に投与することにより、効果的な浄化処理効果を達成することが可能となる。また、本発明の細菌は、従来より公知の他の細菌と比較して、より置換塩素数の多いＰＣＢを分解できることから、より効果的なＰＣＢ、ＰＣＢおよびＰＡＨ汚染の浄化処理が達成されると共に、本発明の細菌は広範囲な温度領域で生物活性を維持できる。このことから、浄化対象物の温度に影響されることない利便性の高いＰＣＢ、ＰＣＢおよびＰＡＨ汚染の浄化処理が可能となる。
【００４４】
（別実施の形態）
１．高塩素置換体ＰＣＢ（例えば、５塩素置換以上の異性体）による汚染の浄化処理に際して、本発明の細菌との接触に先立って浄化対象物である汚染土壌、汚染水に紫外線ランプを介して紫外線を照射し、予め高塩素置換体ＰＣＢを低塩素化した後、本発明の細菌と接触させてＰＣＢの分解処理を行なう、紫外線併用方式も好適に実施できる。特に、浄化処理対象として、地下水、排水等に特に好適に適用される。これにより、迅速かつ確実なＰＣＢ浄化処理が達成される。ここで、低塩素化とは、ＰＣＢの塩素数が減少すること、つまり、ＰＣＢのビフェニル骨格に結合した塩素数が減少することを意味し、例えば、ビフェニル骨格の水素が５個の塩素に置換された５塩素置換体ＰＣＢが、ビフェニル骨格の水素が４個の塩素に置換された４塩素置換体に変換されることを意味する。
【００４５】
２．浄化処理にあたって、本発明の細菌と、本発明の細菌とは分解できるＰＣＢが異なる他の好気性微生物とを併用したＰＣＢ分解処理も好適に実施され、特に、浄化処理対象として、土壌、底質等に特に好適に適用される。ここで、分解できるＰＣＢが異なる他の好気性微生物とは、細菌が保有する分解酵素（ジオキシゲナーゼ）のタイプには、大きく分けて３種類存在し（2,3-ジオキシゲナーゼ、3,4-ジオキシゲナーゼ、1,2-ジオキシゲナーゼ）、このタイプよって各ＰＣＢ異性体に対する分解性が決まることが知られており、このことから、本発明細菌と保有する酵素のタイプが異なる細菌を意味するものである。本発明の細菌と併用される好気性微生物の浄化対象である汚染媒体への投入は、本発明の細菌と同時に投入する同時処理、本発明の細菌により分解処理後に若しくは本発明の細菌の投入に先立って投入して処理を行なう段階処理のいずれをも好適に実施できる。ここで、使用される好気性微生物としては、Rhodococcus属、Bacillus属、Burkholderia属、Acinetobacter属等に属する好気性微生物の一種又は二種以上の組合わせが特に、好ましく例示される。
【実施例】
【００４６】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定的に解釈されるものではない。
【００４７】
ビフェニルおよびＰＣＢの２〜９塩素置換体を含んだＳ培地中で、ＫＢＣ−１０１株を３０℃にて、６日間培養した。ＫＢＣ−１０１株での処理前後における、ＰＣＢ量を塩素体毎にガスクロマトグラフィー−電子捕獲型検出器（ＧＣ／ＥＣＤ）で分析し、ＫＢＣ−１０１株のＰＣＢ分解能を評価した。
また、ここで使用したＳ培地は、下記表４（ａ）に示した組成に蒸留水を加えて１リットルにし、更に培地体積当たり０．２％（ｖ／ｖ）のＮ，Ｎ´−ジメチルホルムアミドを添加したものを使用した。尚、表４（ａ）中、金属塩溶液とは表４（ｂ）に示した組成に蒸留水を加えて１リットルとしたものであり、ビタミン溶液とは表４（ｃ）に示した組成に蒸留水を加えて1リットルとしたものである。プレートの作製には、１．５％の寒天を添加した。
【００４８】
【表４】
2005245280.tif 000005
【００４９】
比較例として、ＰＣＢを分解することが公知である細菌株、Pseudomonas sp. KF707株：ＤＳＭ−１００８６（比較例１）、Rhodococcus globerulus P6株：ＡＴＣＣ−５５２５５（比較例２）を用いた。なお、Rhodococcus globerulus P6株は、以前、Acinetobacter sp. P6として同定されていた細菌株であるが、Rhodococcus属に属する細菌として再同定されたものである。
また、ネガティブコントロールとして、ＫＢＣ−１０１株を滅菌処理した菌体を用いて上記と同様に処理した。この結果を表５に示す。
【００５０】
【表５】
2005245280.tif 000006
【００５１】
表５に示した分析結果より、実験を行なった３菌ともに２〜４塩素置換体ＰＣＢに対して７０％以上の高い分解能を有することが認められた。また、Pseudomonas sp. KF707株（比較例１）は６塩素置換以上のＰＣＢをほとんど分解できないのに対して、Rhodococcus globerulus P6株（比較例２）は、５塩素置換以上のＰＣＢを平均２９．６％、更に、ＫＢ−１０１株は平均３９．４％の分解率で分解できることが認められた。したがって、これらの実験により、ＫＢＣ−１０１株は５塩素置換以上のＰＣＢに対して少なくとも３３％以上の分解率を維持できることから、高塩素置換体ＰＣＢに対して優れた分解能を有する有用な細菌であることが判明した。
【００５２】
（発明の効果）
本発明によれば、ＰＣＢ汚染系およびＰＣＢとＰＡＨとによる複合汚染系の浄化において実用的価値の高い細菌を提供するものである。特に、本発明で提供される新規な細菌は、従来から公知のＰＣＢ分解菌によっては分解が困難であった塩素置換数が５以上の高塩素置換体ＰＣＢに対する高い分解能をも有し、かつ、適用温度範囲が広いことから、本発明の細菌の利用より、高効率、かつ、浄化対象となる汚染媒体の温度に影響されることのない利便性の高い、ＰＣＢ汚染系およびＰＣＢとＰＡＨとによる複合汚染系の浄化処理方法を提供できる。
【配列表】
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