(57)【要約】      （修正有）【課題】ＤＮＡを大きく切断する多塩基認識エンドヌクレアーゼを提供する。【解決手段】二本鎖ＤＮＡ配列の特定箇所を切断し、ＣＴＡＣ、またはその相補鎖においてはＧＴＡＧの４塩基の３’突出の切断部位を生成する超好熱始原菌ＫＯＤ１株由来のエンドヌクレアーゼ２および該酵素をコードするアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する遺伝子、該遺伝子を挿入した組換えベクター、該遺伝子を発現ベクターに挿入した発現組換えベクター、該発現組換えベクターで形質転換された宿主細胞、該宿主細胞からエンドヌクレアーゼ２を製造する方法および該酵素の精製法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の二本鎖ＤＮＡ配列の矢印で示した箇所で切断し、ＣＴＡＣ、またはその相補鎖においては、ＧＴＡＧの４塩基の３’突出の切断部位を生成する、超好熱始原菌から調製された、分子量が約６２Ｋｄａであるエンドヌクレアーゼ２を用いて、次の二本鎖ＤＮＡ配列の矢印で示した箇所で切断し、ＣＴＡＣ、またはその相補鎖においては、ＧＴＡＧの４塩基の３’突出の切断部位を生成する方法。
↓
５’  ＡＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣ      ＧＧＴＴＡＣＴＡＣＧＧ
３’  ＴＴＧＴＣＧＡＴ      ＧＡＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣ
↑
【請求項２】
組換え宿主細胞を用いて生産されたエンドヌクレアーゼ２を用いる請求項１記載の方法。
【請求項３】
次の（１）（２）のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するエンドヌクレアーゼ２を用いる請求項１記載の方法。
（１）配列表・配列番号３に記載されるアミノ酸配列
（２）配列番号３のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
【請求項４】
パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）  ＫＯＤ１株から調製された、分子量が約６２Ｋｄａであるエンドヌクレアーゼ２を用いる請求項１記載の方法。
【請求項５】
次の二本鎖ＤＮＡ配列の矢印で示した箇所で切断し、ＣＴＡＣ、またはその相補鎖においては、ＧＴＡＧの４塩基の３’突出の切断部位を生成する、超好熱始原菌から調製された、分子量が約６２Ｋｄａであるエンドヌクレアーゼ２をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入した組換え発現ベクターで形質転換された組換え宿主細胞を用いて生産された分子量が約６２Ｋａであるエンドヌクレアーゼ２を用いる請求項１記載の方法。
↓
５’  ＡＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣ      ＧＧＴＴＡＣＴＡＣＧＧ
３’  ＴＴＧＴＣＧＡＴ      ＧＡＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣ
↑
【請求項６】
次の（１）（２）のいずれかに記載の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含有するエンドヌクレアーゼ２を用いる請求項１記載の方法。
（１）配列表・配列番号２に記載される塩基配列
（２）配列番号２の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列であって、配列表・配列番号３に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号３のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
【請求項７】
次の二本鎖ＤＮＡ配列の矢印で示した箇所で切断し、ＣＴＡＣ、またはその相補鎖においては、ＧＴＡＧの４塩基の３’突出の切断部位を生成するエンドヌクレアーゼ２をコードする単離されたＤＮＡをベクターに挿入したＤＮＡ組換えベクター。
↓
５’  ＡＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣ      ＧＧＴＴＡＣＴＡＣＧＧ
３’  ＴＴＧＴＣＧＡＴ      ＧＡＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣ
↑
【請求項８】
次の二本鎖ＤＮＡ配列の矢印で示した箇所で切断し、ＣＴＡＣ、またはその相補鎖においては、ＧＴＡＧの４塩基の３’突出の切断部位を生成するエンドヌクレアーゼ２をコードする単離されたＤＮＡを発現ベクターに挿入したＤＮＡ組換え発現ベクター。
↓
５’  ＡＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣ      ＧＧＴＴＡＣＴＡＣＧＧ
３’  ＴＴＧＴＣＧＡＴ      ＧＡＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣ
↑
【請求項９】
発現ベクターが、ｐＥＴ−８ｃ由来のベクターであることを特徴とする請求項８記載のＤＮＡ組換え発現ベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載されるＤＮＡ組換え発現ベクターを用いて形質転換された組換え宿主細胞。
【請求項１１】
宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項１０記載の組換え宿主細胞。
【請求項１２】
エンドヌクレアーゼ２をコードするＤＮＡをベクターに挿入したＤＮＡ組換え発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、得られた組換え宿主細胞を培養し、培養物からエンドヌクレア−ゼ２を採取することを特徴とするエンドヌクレアーゼ２の製造方法。
【請求項１３】
エンドヌクレアーゼ２をコードするＤＮＡが配列表・配列番号３に記載されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有することを特徴とする請求項１２記載のエンドヌクレアーゼ２の製造法。
【請求項１４】
エンドヌクレアーゼ２をコードするＤＮＡが配列表・配列番号２に記載される塩基配列を含有することを特徴とする請求項１２記載のエンドヌクレアーゼ２の製造法。
【請求項１５】
下記工程を含むことを特徴とするエンドヌクレアーゼ２の精製方法。
（ａ）エンドヌクレアーゼ２をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入したＤＮＡ組換え発現ベクターを用いて形質転換した組換え宿主細胞を培養する。
（ｂ）組換え宿主細胞を集めた後、破砕し、細胞抽出物を調製する。
（ｃ）宿主細胞由来の不純蛋白質を除去する。
【請求項１６】
エンドヌクレアーゼ２をコードするＤＮＡが配列表・配列番号３に記載されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有することを特徴とする請求項１５記載のエンドヌクレアーゼ２の精製法。
【請求項１７】
エンドヌクレアーゼ２をコードするＤＮＡが配列表・配列番号２に記載される塩基配列を含有することを特徴とする請求項１５記載のエンドヌクレアーゼ２の精製法。
【請求項１８】
宿主細胞破砕方法が、超音波処理であることを特徴とする請求項１５記載のエンドヌクレアーゼ２の精製方法。
【請求項１９】
不純蛋白質を除去する工程が高温熱処理であることを特徴とする請求項１５記載のエンドヌクレアーゼ２の精製方法。
【請求項２０】
高温熱処理条件が、７０℃以上、好ましくは９０℃以上であることを特徴とする請求項１９記載のエンドヌクレアーゼ２の精製方法。
【請求項２１】
次の二本鎖ＤＮＡ配列の矢印で示した箇所で切断し、ＣＴＡＣ、またはその相補鎖においては、ＧＴＡＧの４塩基の３’突出の切断部位を生成する、超好熱始原菌から調製された、分子量が約６２Ｋｄａであるエンドヌクレアーゼ２を用いる、次の二本鎖ＤＮＡ配列の矢印で示した箇所で切断し、ＣＴＡＣ、またはその相補鎖においては、ＧＴＡＧの４塩基の３’突出の切断部位を有する核酸の製造方法。
↓
５’  ＡＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣ      ＧＧＴＴＡＣＴＡＣＧＧ
３’  ＴＴＧＴＣＧＡＴ      ＧＡＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣ
↑
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な超好熱始原菌（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）  ＫＯＤ１由来の新規エンドヌクレアーゼ２および該エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子ならびに該遺伝子を使用するエンドヌクレアーゼ２を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドヌクレアーゼとはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）のヌクレオチド鎖を途中から切断する酵素の総称である。特に制限酵素と称されるエンドヌクレアーゼは特定の塩基配列を認識し、特定の様式で二本鎖ＤＮＡを切断する酵素である。その特異性的切断能は、遺伝子操作を容易にならしめ、現在の遺伝子工学を始めとする分子生物学分野の研究に極めて有用な酵素となっている。これまでに制限酵素は細菌、放線菌、藍藻などから単離されており、その認識塩基配列、切断様式の異なるものが約１５０種類程知られている。
【０００３】
一般に制限酵素は塩基配列を認識してその箇所で切断する。例えばＳａｕ３ＡＩは下記配列を認識して矢印の箇所で切断するため、４塩基認識と称されている。
↓
ＧＡＴＣ
ＣＴＡＧ
↑
【０００４】
またＢａｍＨＩ  は下記配列を認識して矢印の箇所で切断するため、６塩基認識と称されている。
↓
Ｇ      ＧＡＴＣ
Ｃ      ＣＴＡ      Ｇ
↑
さらにＮｏｔＩは下記配列を認識して矢印の箇所で切断するため、８塩基認識と称されている。
↓
ＧＣ      ＧＧＣＣＧＣ
ＣＧ      ＣＣＧＧ      ＣＧ
↑
【０００５】
塩基配列が全くランダムであると仮定して、Ｓａｕ３Ａ  の配列の表われる確率は（４4＝２５６）塩基に１回、ＢａｍＨＩ  は（４6＝４０９６）塩基に１回、ＮｏｔＩは（４8＝６５５３６）塩基に１回の割合になる。したがってＳａｕ３Ａ  の切断断片は、平均  ２５６塩基、ＢａｍＨＩ  は４０９６塩基、ＮｏｔＩは  ６５５３６塩基の大きさになる。
【０００６】
他方、レアカッターと称されるものは認識塩基の大きさに関係なく、ゲノムＤＮＡ  配列内の稀な塩基配列を切断する酵素であり、それ故、切断断片が大きい。またここに述べるイントロン  （介在配列）  由来の酵素は認識部位は不明とされており、切断の形のみが報告されているに過ぎない研究途上の酵素ばかりである。
【０００７】
ところで、近年の遺伝子研究の研究対象として、ヒト・ゲノムに代表されるような、巨大ＤＮＡを取り扱うようになってきた。かかる場合、ＤＮＡを比較的大きい断片とする方が取扱い易い。そのため、ＤＮＡを大きく切断する多塩基認識、またはレア・カッターと称されるエンドヌクレアーゼの開発、提供が必要になってきた。一方、最近、ミトコンドリア、クロロプラスト、Ｔ偶数ファージの遺伝子にはイントロン（介在配列）が存在し、そのイントロン（介在配列）がエンドヌクレアーゼをコードしていることが報告されるようになった。これらイントロンのコードするエンドヌクレアーゼは一般的にレア・カッターであり、ＤＮＡを大きく切断することが知られている。従って、色々な切断様式の異なるイントロンのコードするエンドヌクレアーゼが切望されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は従来公知のイントロンのコードするエンドヌクレアーゼのいずれとも異なる切断様式を示すイントロンのコードするエンドヌクレアーゼを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち本発明は次の二本鎖ＤＮＡ配列の矢印で示した箇所で切断し、ＣＴＡＣ、またはその相補鎖においては、ＧＴＡＧの４塩基の３’突出の切断部位を生成するエンドヌクレアーゼ２である。
↓
５’  ＡＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣ      ＧＧＴＴＡＣＴＡＣＧＧ
３’  ＴＴＧＴＣＧＡＴ      ＧＡＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣ
↑
具体例としては超好熱始原菌、例えばパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＫＯＤ１株から調製されたエンドヌクレアーゼ２がある。また超好熱始原菌、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＫＯＤ１株由来の遺伝子を挿入した発現ベクターで形質転換された組換え宿主細胞を用いて生産されエンドヌクレアーゼ２がある。本発明のエンドヌクレアーゼ２は配列表・配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含有することが好ましい。これらのエンドヌクレアーゼ２は分子量が約６２Ｋｄａである。
【００１０】
また本発明は上記エンドヌクレアーゼ２をコードする単離されたＤＮＡであり、具体的には配列表・配列番号３に記載されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する。また該ＤＮＡは配列表・配列番号２に記載される塩基配列を含有することが好ましい。
【００１１】
本発明は上記エンドヌクレアーゼ２をコードする単離されたＤＮＡをベクターに挿入したＤＮＡ組換えベクターである。
【００１２】
本発明はまた上記エンドヌクレアーゼ２をコードする単離されたＤＮＡを発現ベクターに挿入したＤＮＡ組換え発現ベクターである。
【００１３】
また本発明はエンドヌクレアーゼ２をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入したＤＮＡ組換え発現ベクターを用いて形質転換された組換え宿主細胞である。
【００１４】
さらに本発明はエンドヌクレアーゼ２をコードするＤＮＡをベクターに挿入したＤＮＡ組換え発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、得られた組換え宿主細胞を培養し、培養物からエンドヌクレアーゼ２を採取することを特徴とするエンドヌクレアーゼ２の製造方法である。
【００１５】
また本発明は下記工程を含むことを特徴とするエンドヌクレアーゼ２の精製方法である。
（ａ）エンドヌクレアーゼ２をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入したＤＮＡ組換え発現ベクターを用いて形質転換した組換え宿主細胞を培養する。
（ｂ）組換え宿主細胞を集めた後、破砕し、細胞抽出物を調製する。
（ｃ）宿主細胞由来の不純蛋白質を除去する工程。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のエンドヌクレアーゼ２は、高い熱安定性を有し、レア・カッターであり、ＤＮＡを大きく切断することに適した新規な酵素である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の遺伝子起源として使用した超好熱始原菌の１種であるパイロコッカス・フリオサスＫＯＤ１株は、鹿児島県小宝島の硫気抗から単離した菌株である。該菌株の菌学的性質を以下に記載する。
細胞形態  球菌・二連球菌、鞭毛あり生育温度範囲  ６５〜１００℃最適生育温度  ９５℃生育ｐＨ範囲  ５〜９最適ｐＨ  ６最適塩濃度  ２〜３％栄養要求性  従属栄養酸素要求性  嫌気性細胞膜脂質  エーテル型ＤＮＡのＧＣ含量  ３８％
【００１８】
超好熱始原菌・パイロコッカス・フリオサスＫＯＤ１株は、直径約１μｍの球菌であり、複数の極鞭毛を有していた。この菌株は、菌学的性質よりＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ生産菌（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、およびＴｌｉ（Ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼ生産菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）との菌縁関係が示唆された。
【００１９】
本発明のエンドヌクレアーゼ２の遺伝子のクローニングは、以下の方法により行う。超好熱始原菌の一種、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）  はそのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子内にイントロンを有しており、そのイントロンがエンドヌクレアーゼをコードしていることが報告されている（Ｆｒａｎｃｉｎｅ  Ｂ  Ｐｅｒｌｅｒ  ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  １９９２）  。超好熱始原菌であるパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＫＯＤ１株が、そのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子内にイントロンを有し、そのイントロンがエンドヌクレアーゼをコードしているかを調べるために、まず該菌のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を取得する。そのため、イントロンの存在が報告されていないが、既知である同種のパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のＰｆｕ・ＤＮＡポリメラーゼの保存領域のアミノ酸配列に基づき、プライマーを設計し合成する（例えば配列番号４，５参照）。
【００２０】
まず超好熱始原菌ＫＯＤ１株の染色体ＤＮＡを鋳型に、上記方法にて調製したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ断片を増幅させる。増幅されたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を決定し、当初設定したアミノ酸配列をコードしていることを確認する。その後、該ＤＮＡ断片をプローブとし、ＫＯＤ１株の染色体の制限酵素分解産物に対し、サザンハイブリダイゼーションを実施する。目的とするＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む断片のおおよその大きさを限定する（約４〜７Ｋｂｐ）。
【００２１】
更に限定された４〜７ＫｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収し、これを用いて、大腸菌にてＤＮＡライブラリーを作製し、上記記載のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をプローブにしてコロニーハイブリダイゼーションを行い、目的ＤＮＡ断片を含有するクローン株を取得する。
【００２２】
クローン化したＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を解析したところ、該遺伝子は５０１０塩基（推定アミノ酸配列１６７０個）から構成されていた（配列表・配列番号１参照）。他のＤＮＡポリメラーゼと比較したところ、該遺伝子には真核生物型であるα−ＤＮＡポリメラーゼの保存領域、Ｒｅｇｉｏｎ１〜５が存在していた。また該遺伝子のＮ末端側に３’→５’エキソヌクレアーゼモチーフであるＥＸＯ１〜３が存在していた。超好熱始原菌ＫＯＤ１株由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の保存領域、Ｒｅｇｉｏｎ１、２の内には、既知のパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｒｉｏｓｕｓ）と異なり、各々イントロン（介在配列）、ＩＶＳ−Ａ，ＩＶＳ−Ｂが存在している。これらの介在配列はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を保存する形でつながっている。
【００２３】
超好熱始原菌ＫＯＤ１株の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を、既知酵素であるパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子、及びサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来のＴｌｉ（Ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子と比較したところ、ＫＯＤ１株由来の遺伝子には介在配列、ＩＶＳ−Ａ、ＩＶＳ−Ｂが存在するが、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子には介在配列は存在せず、またＴｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子には、２種の介在配列が存在するものの、その存在箇所は各々保存領域であるＲｅｇｉｏｎ２、３の内であり、本発明のＫＯＤ１株の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子内の介在配列の位置とは大きく異なっている。
【００２４】
超好熱始原菌ＫＯＤ１株のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が二つのイントロンを有し、それらがエンドヌクレアーゼをコードしていることが確認される。これらのイントロン由来のエンドヌクレアーゼを大腸菌で発現させるため、配列表・配列番号１の１３７４〜２４５３ｂｐ（ＩＶＳ−Ａ）、２７０８〜４３１６ｂｐ（ＩＶＳ−Ｂ）の介在配列をＰＣＲ遺伝子融合法によりそれぞれ取り除き、一方のイントロンのみを含有する遺伝子を構築する。具体的には、介在配列を含むクローン化した遺伝子を３組のプライマー（例えば、配列番号８〜１３参照）の組み合わせによりＰＣＲ反応を行い、二つのイントロンのうちどちらか一方のイントロンを含む２断片を増幅する。ここで使用するプライマーを設計する際、その末端に結合すべき断片の一部をその５’端に含ませておく。次いで、結合すべき断片同士を用いてその末端の重複する配列を利用してＰＣＲ反応を行い、各々断片を結合する。次いで、Ｔ７プロモーターで誘導発現が可能なプラスミドベクター、例えばｐＥＴ−８ｃにクロ−ニングする。更に、この組換えプラスミドにて宿主細胞、例えば大腸菌を形質転換し、この組換え大腸菌にてＫＯＤ１株イントロン由来のエンドヌクレアーゼ遺伝子を誘導発現させる。
【００２５】
本発明のエンドヌクレアーゼ２をコードするＤＮＡは具体的には配列表・配列番号３に記載されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する。さらに配列表・配列番号２に記載される塩基配列を含有することが好ましい。これらのＤＮＡはエンドヌクレアーゼ２活性を有する酵素をコードするかぎり、ＤＮＡの一部が削除または置換されてもよい。またＤＮＡに他のＤＮＡが挿入されてもよい。本発明のエンドヌクレアーゼ２をコードするＤＮＡのクローニング法は前記した通りである。ＤＮＡの調製法はこれらのクローニング法に限らず、ＩＶＳ−Ａ  またはＩＶＳ−Ｂ  のみを含有するＤＮＡ  断片を適当な制限酵素で切り出し、またＩＶＳ−Ａ  またはＩＶＳ−Ｂ  のみをＰＣＲ  で増幅させる方法などがある。
【００２６】
本発明の組換えベクターは上記ＤＮＡをベクターに挿入したものである。ベクターとしては、ファージおよびプラスミドが挙げられる。ファージの例としてはＭ１３  系ベクター、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λ−ＤＡＳＨ  、λＺＡＰ−ＩＩなどが挙げられる。プラスミドの例としてはｐＵＣ１８  、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  、ｐＳＰ  、ｐＧＷ  などが挙げられる。また本発明の組換え発現ベクターは上記ＤＮＡを発現ベクターに挿入したものである。発現ベクターとしては、ファージおよびプラスミドが挙げられる。ファージの例としてはλｇｔ１１、λＺＡＰ−ＩＩなどが挙げられる。プラスミドの例としてはｐＵＣ１８  、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  、ｐＥＴ−８ＣなどのｐＥＴ  系が挙げられる。ベクターへの挿入法は、従来公知の方法に従う。例えば挿入遺伝子同端の切断形状と相補的な切断を行う制限酵素で上述のようなベクターを切断した後、遺伝子を挿入し、ライゲース  （連結酵素）  を用いて結合する。
【００２７】
さらに本発明の組換え宿主細胞は上記ＤＮＡ組換え発現ベクターを用いて形質転換されたものである。宿主細胞としては、大腸菌、バチルス属、例えばバチルス・ズブチルス、各種のシュードモナス属細菌などが挙げられる。形質導入法は、従来公知の方法に従う。例えばファージ感染法あるいは各細胞のコンピテントセルを用いる。また電気穿孔法によってＤＮＡを導入することもできる。
【００２８】
本発明のエンドヌクレアーゼ２の製造方法は、エンドヌクレアーゼ２をコ−ドするＤＮＡを発現ベクターに挿入したＤＮＡ組換え発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、得られた組換え宿主細胞を培養し、培養物からエンドヌクレア−ゼ２を採取する方法である。具体例としては、ＫＯＤ１株由来の一つのイントロンを含む遺伝子を含むＤＮＡ組換え発現ベクター、例えばｐＥＴ−８ｃプラスミドにより形質転換された宿主細胞、例えば大腸菌を培地で培養し、誘導処理後に菌体を遠心分離等にて回収する。回収した菌体は、適当な緩衝液に懸濁後破砕し、熱処理を施し不純蛋白質の除去を行う。
【００２９】
本発明のエンドヌクレアーゼ２の精製法は、下記工程を含む。
（ａ）エンドヌクレアーゼ２をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入したＤＮＡ組換え発現ベクターを用いて形質転換した組換え宿主細胞を培養する。
（ｂ）組換え宿主細胞を集めた後、破砕し、細胞抽出物を調製する。
（ｃ）宿主細胞由来の不純蛋白質を除去する。
【００３０】
培地としては宿主細胞により、それぞれ異なるが、例えばＬＢ培地、Ｙ  培地、２ＹＴ  培地、ＴＢ培地などがよく用いられる。培養条件としては宿主細胞、使用培地により、それぞれ異なるが、例えば約２４時間以内で最大培養力価を示すような条件であればよい。誘導処理としては、物理的条件の変化、例えば温度の上昇または下降、光の照射等または化学処理、例えば糖の添加、イソプロピルチオ−  β−Ｄ−ガラクトシドの添加等によっておこなうことができる。菌体を回収する方法としては、遠心分離、濾過などが用いられる。菌体の破砕方法としては、物理的破砕法として、ホモジナイザー、超音波処理、ダイノミル、フレンチプレンス等、化学処理法として、界面活性剤、例えばＳＤＳ  、酵素、たとえばリゾチーム等で処理する方法がある。熱処理条件は７０℃以上、好ましくは９０℃以上である。
【００３１】
このようにして取得したエンドヌクレアーゼ２は分子量が約６２ＫＤａである。該エンドヌクレアーゼ２は次の二本鎖ＤＮＡ配列の矢印で示した箇所で切断し、ＣＴＡＣ、またはその相補鎖においては、ＧＴＡＧの４塩基の３’突出の切断部位を生成するエンドヌクレアーゼ２であることが確認された。
↓
５’  ＡＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣ      ＧＧＴＴＡＣＴＡＣＧＧ
３’  ＴＴＧＴＣＧＡＴ      ＧＡＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣ
↑
【００３２】
本発明のエンドヌクレアーゼ２は９４℃、２０分間の熱処理後も十分にその活性を有し、図２に示されるように熱処理後も酵素タンパクの存在は確認され、耐熱性であることが示された。
【実施例】
【００３３】
次に本発明を実施例を用いて説明する。
実施例１超好熱始原菌、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクロ−ニング鹿児島県小宝島より単離した超好熱始原菌ＫＯＤ１株を９５℃にて培養後、菌体を回収した。得られた菌体より、常法に従い、超好熱始原菌ＫＯＤ１株の染色体ＤＮＡを調製した。この調製した染色体ＤＮＡを鋳型に、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕポリメラーゼ）をコードする塩基配列に基づき設計・合成した２種のプライマー（配列番号４，５）を用いて、ＰＣＲを行った。
【００３４】
このＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の塩基配列（配列番号６）を決定し、アミノ酸配列（配列番号７）を決定した後、この増幅断片をプローブとして、ＫＯＤ１株染色体ＤＮＡ制限酵素処理産物に対しサザンハイブリダイゼーションを行い、ＤＮＡポリメラーゼをコードする断片のサイズを求めた（約４〜７Ｋｂｐ）。
【００３５】
更に、この大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収し、プラスミドｐＢＳに挿入し、これらの混合物により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９）を形質転換し、ライブラリ−を作製した。先にサザンハオブリダイゼーションで使用したプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーションを行い、ライブラリーより、ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有すると考えられるクローン株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＢＳＫＯＤ１）を取得した。
【００３６】
実施例２クローンされたＤＮＡ断片の塩基配列の決定実施例１で取得したクローン株、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＢＳＫＯＤ１よりプラスミドｐＢＳＫＯＤ１  を回収し、常法に従い塩基配列の決定を行った  （配列番号１）。更に、求められた塩基配列よりアミノ酸配列を推定した（配列番号１）。ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、５０１０塩基からなり、１６７０個のアミノ酸がコードされていた。
【００３７】
実施例３発現組換えプラスミドの構築超好熱始原菌ＫＯＤ１株イントロン由来のエンドヌクレアーゼ１、２をそれぞれ発現する遺伝子を作成するため、２箇所のイントロン部分（配列番号１、ＩＶＳ−Ａ：１３７４〜２４５３ｂｐ，ＩＶＳ−Ｂ：２７０８〜４３１６ｂｐ）をＰＣＲ融合法により取り除いた。このＰＣＲ融合法とは、クローン株より回収したプラスミドを鋳型に、３組のプライマーの組み合わせ（配列番号８〜１３）で各々ＰＣＲを行い、一方のイントロンを除いた２断片を増幅する。この際、ＰＣＲに用いるプライマーは、他の断片と結合する側に結合相手と同様な配列がくるように設計しておく。また、両端には別々の制限酵素サイト（Ｎ末端側：ＥｃｏＲＶ、Ｃ末端側：ＢａｍＨＩ）が、創出されるように設計した。次いで、ＰＣＲ増幅断片中、ＩＶＳ−Ａを含む断片と、Ｃ末端側に位置する断片を混合しＰＣＲ反応を各々の断片をプライマーとして行い、イントロンＩＶＳ−Ａを含む遺伝子断片（ｐｏｌ（△ｉｖｓ−ｂ））を取得した。これはエンドヌクレアーゼ１をコードする遺伝子を含む。また、同様にＩＶＳ−Ｂを含む断片と、Ｎ末端側に位置する断片を混合しＰＣＲ反応を各々の断片をプライマーとして行い、イントロンＩＶＳ−Ｂを含む遺伝子断片（ｐｏｌ（△ｉｖｓ−ａ））を取得した。これはエンドヌクレアーゼ２をコードする遺伝子を含む（配列番号２）。これらの遺伝子断片のＮ末端にＥｃｏＲＶ、Ｃ末端にＢａｍＨＩサイトを有する。
【００３８】
さらに、同遺伝子をＴ７プロモータで誘導可能な発現ベクターｐＥＴ−８ｃのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩサイト、先に創出した制限酵素サイトを利用しサブクローニングし、エンドヌクレアーゼ１を発現する発現ベクターとしてｐＥＴ−ｐｏｌ（△ｉｖｓ−ｂ）を、エンドヌクレアーゼ２を発現する発現ベクターとしてｐＥＴ−ｐｏｌ（△ｉｖｓ−ａ）を得た（図１）。
【００３９】
実施例４ＫＯＤ１株イントロン由来のエンドヌクレアーゼ１、２の発現と精製実施例３で取得した発現組換えベクターｐＥＴ−ｐｏｌ（△ｉｖｓ−ｂ）及びｐＥＴ−ｐｏｌ（△ｉｖｓ−ａ）を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体をＴＢ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ  （１９８２））培地で培養し、集菌１時間前にＴ７プロモーターの誘導処理をイソプロピルチオ−β−Ｄ−  ガラクトシドの添加により行った。培養液より菌体を遠心分離等により回収し、緩衝液に懸濁後、超音波処理によって菌体を破砕し、細胞抽出物を得た。更に、宿主細胞由来の不純蛋白質を除去するために、細胞破砕液を９４℃にて２０分処理し、宿主由来の不純蛋白質を不溶化した。不溶画分を遠心分離にて除去し、ＫＯＤ１株イントロン由来のエンドヌクレアーゼ１、２を得た。
【００４０】
実施例５ＫＯＤ１株イントロン由来エンドヌクレアーゼ１、２の分子量実施例４で得られたＫＯＤ１株イントロン由来エンドヌクレアーゼの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって求めたところ、エンドヌクレアーゼ１、２の分子量はそれぞれ約４１ｋＤａ、約６２ｋＤａであった（図２）。
【００４１】
ＫＯＤ１株イントロン由来エンドヌクレアーゼ１、２の切断形式ＫＯＤ１株イントロン由来エンドヌクレアーゼ１、２は、λ−ＤＮＡなどを基質としないため、以下のように基質を作製し、その切断断片の塩基配列を決定することにより、それぞれの切断形式を決定した（図４）。
【００４２】
該エンドヌクレアーゼ１の基質の一つとして、実施例３に記述した方法と同様にＰＣＲ融合法によりイントロンを含有しないＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子断片を構築した。即ち、イントロン（介在配列）を有するＤＮＡポリメラーゼ遺伝子から、３組のプライマー（配列番号８〜１３）の組み合わせによりＰＣＲ反応を行い、介在配列により分断される３断片を増幅した。ここで使用するプライマーを設計する際、その末端に結合すべき断片の一部をその５’端に含ませておいた。次いで、結合すべき断片同士を用いてその末端の重複する配列を利用してＰＣＲ反応を行い、各々断片を結合した。更に得られた２種の断片を用い同様にＰＣＲ反応を行い、介在配列を含まないＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子、ｐｏｌ（△ｉｖｓ−ａ，△ｉｖｓ−ｂ）を構築した（図３）。得られたｐｏｌ（△ｉｖｓ−ａ，△ｉｖｓ−ｂ）と、実施例３に示した、ｐｏｌ（△ｉｖｓ−ａ）を基質として用い、該エンドヌクレアーゼ１を作用させた時、いずれにおいてもイントロン（介在配列）ＩＶＳ−Ａが欠失して融合したＲｅｇｉｏｎ−１の部分で切断された断片を生じ、その断片の塩基配列より、その切断様式は下記の様に、二本鎖ＤＮＡ配列の矢印で示した箇所で切断し、ＡＧＡＴ、またはその相補鎖に於いてはＡＴＣＴの４塩基３’突出の切断部位を生成する事が判明した。
↓
５’  ＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＡＴ      ＣＣＣＴＧＴＡＣ
３’  ＡＴＣＴＡＡＡＡ      ＴＣＴＡＧＧＧＡＣＡＴＧ
↑
【００４３】
また、該エンドヌクレアーゼ２に関しても、同様にしてその切断様式を決定した。即ち、上述したｐｏｌ（△ｉｖｓ−ａ，△ｉｖｓ−ｂ）、及び実施例３で述べたｐｏｌ（△ｉｖｓ−ｂ）を基質としてエンドヌクレア−ゼ２を作用させた時、いずれに於いてもイントロン（介在配列）ＩＶＳ−Ｂが欠失して融合したＲｅｇｉｏｎ−２の部分で切断された断片を生じ、その断片の塩基配列よりその切断様式は下記の様に、二本鎖ＤＮＡ配列の矢印で示した箇所で切断し、ＣＴＡＣ、またはその相補鎖においてはＧＴＡＧの４塩基３’突出の切断部位を生成することが判明した。
↓
５’  ＡＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣ      ＧＧＴＴＡＣＴＡＣＧＧ
３’  ＴＴＧＴＣＧＡＴ      ＧＡＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣ
↑
【００４４】
［配列表］
配列番号１
配列の長さ：５３４２
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：２本鎖
配列の種類：ｃＤＮＡ
起源：超好熱始原菌株：ＫＯＤ１
配列の特徴
１５６−５１６５    Ｐ  ＣＤＳ
１３７４−２４５３  介在配列
２７０８−４３１６  介在配列
（配列は図５−図１２に記載）
【００４５】
配列番号２
配列の長さ：１６０８
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：２本鎖
配列の種類：ｃＤＮＡ
（配列は図１３に記載）
【００４６】
配列番号３
配列の長さ：５３７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
（配列は図１４−図１６に記載）
【００４７】
配列番号４
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
ggattagtgc caatggaagg cgac 24
【００４８】
配列番号５
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
gagggcgaag tttattccga gctt 24
【００４９】
配列番号６
配列の長さ：３２４
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
（配列は図１７に記載）
【００５０】
配列番号７
配列の長さ：１０８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
（配列は図１８に記載）
【００５１】
配列番号８
配列の長さ：４２
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
gccatcaaga tcctggcaaa cagctactac ggttactacg gc 42
【００５２】
配列番号９
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
gatggatcca acttctcaac gttgaaccct cg 32
【００５３】
配列番号１０
配列の長さ：４６
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
gaacatagtg tacctagatt ttagatccct gtacccctca atcatc 46
【００５４】
配列番号１１
配列の長さ：４２
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
gccgtagtaa ccgtagtagc tgtttgccag gatcttgatg gc 42
【００５５】
配列番号１２
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
atcgatatcc tcgacactga ctacataacc gag 33
【００５６】
配列番号１３
配列の長さ：４６
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
gatgattgag gggtacaggg atctaaaatc taggtacact atgttc 46
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、遺伝子操作を容易にならしめ、現在の遺伝子工学を始めとする分子生物学分野の研究に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】イントロンＩＶＳ−Ｂにコードされるエンドヌクレアーゼ２を発現するＤＮＡ組換え発現ベクターの構築を示す。
【図２】エンドヌクレアーゼ１および２の分子量測定結果を示す。
【図３】ｐｏｌ（Δｉｖｓ−ａ，Δｉｖｓ−ｂ）の構築を示す。
【図４】エンドヌクレアーゼ２の切断様式を示す。
【図５】配列番号１の配列（全体８分割のうちの１）を示す。
【図６】配列番号１の配列（全体８分割のうちの２）を示す。
【図７】配列番号１の配列（全体８分割のうちの３）を示す。
【図８】配列番号１の配列（全体８分割のうちの４）を示す。
【図９】配列番号１の配列（全体８分割のうちの５）を示す。
【図１０】配列番号１の配列（全体８分割のうちの６）を示す。
【図１１】配列番号１の配列（全体８分割のうちの７）を示す。
【図１２】配列番号１の配列（全体８分割のうちの８）を示す。
【図１３】配列番号２の配列を示す。
【図１４】配列番号３の配列（全体３分割のうちの１）を示す。
【図１５】配列番号３の配列（全体３分割のうちの２）を示す。
【図１６】配列番号３の配列（全体３分割のうちの３）を示す。
【図１７】配列番号６の配列を示す。
【図１８】配列番号７の配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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