(57)【要約】【課題】  本発明は、新たな表皮特異的ＵＶ防御メカニズムを解明し、新規かつ有効なＵＶ防御手段を提供することを課題とする。【解決手段】  本発明は、表皮細胞のＳＣＣＡ−１及び／−２の発現を亢進させることで、表皮細胞の紫外線照射誘導アポトーシスを抑制し、肌の紫外線照射による皮膚障害の発症に対する抵抗力を高める方法を提供する。さらに、本発明は肌の紫外線照射による皮膚障害に対する抵抗力を評価する肌検査方法であって、表皮細胞中のＳＣＣＡ−１及び／又は−２の発現を測定し、表皮細胞における発現と比べて低下している場合、表皮のＵＶ抵抗力が弱いと判断することを特徴とする方法を提供する。さらに、本発明は肌の紫外線照射による皮膚障害に対する抵抗力を高める薬剤をスクリーニングする方法であって、ＳＣＣＡ−１及び／又は−２の発現を亢進する薬剤をＵＶ抵抗強化剤として選定することを特徴とする方法を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表皮細胞のＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現を亢進させることで、表皮細胞のアポトーシスを抑制する方法。
【請求項２】
前記アポトーシスが紫外線照射により誘導され、そして前記方法により肌の紫外線照射による皮膚障害の発症に対する抵抗力が高まる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
肌の紫外線照射による皮膚障害に対する抵抗力を評価する肌検査方法であって、表皮細胞中のＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現を測定し、表皮細胞における発現と比べて低下している場合、表皮のＵＶ抵抗力が弱いと判断することを特徴とする方法。
【請求項４】
ＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現をＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２のそれぞれに特異的な抗体を利用するELISA法又はRIA法により測定する、請求項３記載の検査方法。
【請求項５】
ＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現を、表皮細胞から抽出されたＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２をコードするmRNAの量を測定することにより測定する、請求項３記載の検査方法。
【請求項６】
肌の紫外線照射による皮膚障害に対する抵抗力を高める薬剤をスクリーニングする方法であって、ＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現を亢進する薬剤をＵＶ抵抗強化剤として選定することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、扁平上皮細胞癌関連抗原（ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２）の発現の亢進により肌の紫外線（ＵＶ）防御メカニズムを強化する手段を提供する。
【背景技術】
【０００２】
表皮は紫外線（ＵＶ）照射により様々な障害を受けることで知られる。皮膚に紫外線が照射されると色素沈着が生じるが、継続的に反復照射されると表皮は肥厚化し、弾力性を失う。表皮の紫外線障害の症状として、炎症、肌荒れ、しわ、たるみ、色素沈着、斑の着色、土色化、ほくろ、紫斑病の発症、毛細管拡張などが知られているのに加え、それらは悪性腫瘍の発症につながることもある。紫外線障害は、一般に顔面、首筋、手足など、日光に習慣的に曝される皮膚にて往々にして起こる。特にオゾン層の破壊により、紫外線照射による皮膚障害は問題視されている。
【０００３】
表皮の生理学的なＵＶ防御メカニズムに関する知見は基底層のメラノサイトが産生するメラニンに関する研究や、抗酸化物質の探索・開発が中心となっている。また、放射線・紫外線照射がアポトーシスを誘導することも知られ（三浦正幸、山田武編：実験医学別冊「用語ライブラリーアポトーシス」１９９６）、基底細胞における抗アポトーシスタンパク質ｂｃｌ−２についての研究もなされている（Fangら、J. Immunol. 1994, 153, 4388-4398； Takahashiら、Photochem. Photobiol. 2001, 74(4) 579-586）。ｂｃｌ−２はアポトーシスを遮断又は遅延させることでＵＶ防御機能を発揮するものと考えられている。しかしながら、表皮上層における内存性ＵＶ防御タンパク質などに関する解明はほとんどなされていない。
【０００４】
【非特許文献１】三浦正幸他編：実験医学別冊「用語ライブラリーアポトーシス」19996
【非特許文献２】J. Immunol. 1994, 153, 4388-4398
【非特許文献３】Photochem. Photobiol. 2001, 74(4) 579-586
【非特許文献４】British Journal of Dermatology (1983) 109, 77-85
【非特許文献５】J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002)
【非特許文献６】J. Biol. Chem. (1997) 27213, 1849-55
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新たな表皮特異的ＵＶ防御メカニズムを解明し、新規かつ有効なＵＶ防御手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
皮膚病の一つに、表皮細胞の増殖・分化異常と炎症細胞浸潤を特徴とする慢性、再発性の炎症性不全角化症である乾癬がある（Hopso-Havu et al. British Journal of Dermatology (1983) 109, 77-85）。乾癬は遺伝的素因に種々の環境因子が加わって発症すると考えられる。乾癬の発症した表皮と正常表皮とを比較すると、乾癬表皮の上層において扁平上皮癌関連抗原（Squamous Cell Carcinoma Antigen、以下「ＳＣＣＡ」と称す)の発現の亢進が認められることが知られる（Takeda A.ら、 J. Invest. Dermatol. (2002) 118(1), 147-154）。ＳＣＣＡは子宮頚部扁平上皮癌細胞から見出された抗原であり、子宮頚部、肺、食道、皮膚の扁平上皮癌で高い血中濃度を示し、扁平上皮癌の診断や治療効果の判定によく利用されている。ＳＣＣＡは皮膚扁平上皮癌の診断にも利用されるが、本発明者の研究においては、皮膚における扁平上皮癌においてＳＣＣＡ発現は高くないことが認められた。ＳＣＣＡは染色体18ｑ21.3上にタンデムに並んでいる二つの遺伝子ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２によりコードされる。ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２共に分子量約45,000のタンパク質であり、非常に相同性が高いが、反応部位のアミノ酸配列が異なり、異なる機能を有していると考えられている（Schick et al. J. Biol. Chem. (1997) 27213, 1849-55）。
【０００７】
本発明者はＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２に注目して皮膚ＵＶ防御メカニズムの検討を行った。免疫組織的方法や、in situ ハイブリダイゼーションの結果、露光部位皮膚のＳＣＣＡの発現は非露光部位と比較して顕著に亢進していることが明らかとなった。さらに、ヒト皮膚へのＵＶ照射により有棘層及び顆粒層においてＳＣＣＡの発現が強力に亢進することが明らかになった。基底層におけるタンパク質発現は認められなかった。また、三次元皮膚モデル、培養ヒト角化細胞でも同様にＵＶ照射によるＳＣＣＡ発現の亢進は確認された。
本発明者は次にＳＣＣＡ発現の認められない３Ｔ３細胞にヒトＳＣＣＡ−１及びＳＣＡＡ−２遺伝子を導入し、安定発現系を確立した。アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ−ＦＩＴＣ及びプロピジウムイオダイン（ＰＩ）をアポトーシス指標にＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）で解析した結果、いずれのＳＣＣＡ安定発現系においてもＵＶ照射によるアポトーシスが有意に減少することが明らかになった。
さらに、ＳＣＣＡを高発現するＨａＣａｔ細胞にｐＳｉｌｅｎｃｅｒベクターで恒常的にｓｉＲＮＡを発現させるＲＮＡ干渉法によりＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２のノックダウン（ｓｉＳＣＣＡ）細胞株を樹立した。定量的ＰＣＲによりｓｉＳＣＣＡ細胞株におけるＳＣＣＡ発現が９０％以上抑制されていることが確認された。５０ｍＪ／ｃｍ2のＵＶ照射をした結果、コントロール株では３８％の細胞がアポトーシスを生じるのに対し、ｓｉＳＣＣＡ細胞株では約８０％の細胞がアポトーシスを引き起こすことが明らかとなった。
以上の結果をまとめると、ＳＣＣＡがＵＶ防御メカニズムを担う主要タンパク質であることが明らかである。
【０００８】
本発明は、上記の知見に基づいて完成されたものであり、その第一の観点において、表皮細胞のＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現を亢進させることで、表皮細胞のアポトーシスを抑制する方法を提供する。好適な態様において、アポトーシスは紫外線照射により誘導されるアポトーシスであり、従って、当該方法により、肌の紫外線照射による皮膚障害の発症に対する抵抗力を高めることができる。表皮細胞には、角化細胞、顆粒細胞、有棘細胞等が含まれる。
【０００９】
別の観点において、本発明は肌の紫外線照射による皮膚障害に対する抵抗力（以下、「ＵＶ抵抗力」と称する場合もある）を評価する肌検査方法を提供する。この方法は、表皮細胞中のＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現が表皮細胞の発現と比べて低下している場合、表皮のＵＶ抵抗力が弱いと判断することを特徴とする。
【００１０】
好ましくは、表皮細胞中のＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現の亢進は、細胞中のＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の量を測定することにより決定する。かかる測定は、例えばＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２に特異的な抗体を利用するＥＬＩＳＡ法又はＲＩＡ法により実施することができる。他に、表皮細胞中のＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現の亢進は、表皮細胞から抽出されたＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２をコードするmRNAの量を測定することにより決定してよい。かかるmRNAの測定はポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、好ましくはリアルタイムＰＣＲにより行うことができる。
【００１１】
更なる別の観点において、本発明は、肌の紫外線照射による皮膚障害に対する抵抗力を高める薬剤（以下、「ＵＶ抵抗強化剤」と称する場合がある）をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現を亢進する薬剤をＵＶ抵抗強化剤として選定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、肌のＵＶ抵抗力を高める方法、肌のＵＶ抵抗力を検査する方法や、新規ＵＶ抵抗強化剤の提供が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
前述のとおり、ＳＣＣＡと紫外線照射との間での関係の存在を示唆する報告はなく、ＳＣＣＡが紫外線誘導アポトーシスを抑制できることは本発明者がはじめて見出した驚くべき事実である。
【００１４】
本発明は、第一の観点において、表皮細胞のＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現を亢進させることで、表皮細胞のアポトーシス、好ましくは紫外線照射により誘導されるアポトーシスを抑制する方法を提供する。当該方法により、肌の紫外線照射による皮膚障害の発症に対する抵抗力を高めることができる。
【００１５】
ＳＣＣＡは上述のとおり扁平上皮癌細胞や乾癬表皮に存在する分子量約45,000のタンパク質である。ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２のアミノ酸配列及びそれらをコードする核酸配列はTakeda A et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002)（前掲）に記載されている。表皮細胞のＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現の亢進は、例えばその発現を亢進させる薬剤を適用することにより達成できる。薬剤としては、ＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２自体を使用してもよい。
【００１６】
被験体におけるＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２をコードする遺伝子が不活性状態又は沈黙状態にあり、その結果細胞がＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２欠損状態にあるときは、ＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２遺伝子自体を表皮細胞に導入することで、あるいはＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２遺伝子の発現を亢進させる調節配列、例えばプロモーターやエンハンサーをそれらの遺伝子に対し作用可能な位置に配置することにより達成することもできる。
【００１７】
ＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２をコードする遺伝子を細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法、あるいは非ウイルス性の遺伝子導入方法（日経サイエンス、1994年4月号、20-45頁、実験医学増刊、12(15)(1994)、実験医学別冊「遺伝子治療 の基礎技術」、羊土社（1996））のいずれの方法も適用することができる。ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルス、又はＲＮＡウイルスに、ＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２をコードするＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。このうち、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が、特に好ましい。非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。また、上記遺伝子を実際に医薬として作用させるには、ＤＮＡを直接体内に導入する in vivo法、およびヒトからある種の細胞を取り出し体外でＤＮＡを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すex vivo法がある（日経サイエンス、1994年4月号、20-45頁、月刊薬事、36(1), 23-48（1994）、実験医学増刊、12(15)(1994)）。in vivo法がより好ましい。in vivo法により投与される場合は、疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。in vivo法により投与する場合は、一般的には注射剤等とされ、必要に応じて慣用の担体を加えてもよい。また、リポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（HVJ）−リポソーム等）の形態にした場合は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることができる。
【００１８】
第二の観点において、本発明は肌のＵＶ抵抗力を評価する肌検査方法を提供する。この方法は、表皮細胞中のＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現が表皮細胞の発現と比べて低下している場合、表皮のＵＶ抵抗力が弱いと判断することを特徴とする。
その評価基準として、例えば表皮細胞中のＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現がコントロール値と比べ10％以上、又は20％以上、又は30％以上、又は50％以上、又は70％以上、又は100％低下していたなら「肌のＵＶ抵抗力が弱い」と判断する、としてよい。コントロール値としては、例えば統計学的に有意な数（例えば１０人分以上、好ましくは１００人分以上）の健常人の対応の部位における表皮細胞のＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現量の平均値であってよい。
【００１９】
表皮細胞中のＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の亢進は、例えば表皮細胞中のＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の量を直接測定することにより決定することができる。好ましくは、この測定はＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２に特異的な抗体を利用し、当業界において周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素などを利用する免疫染色法、ウェスタンブロット法、免疫測定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法など、様々な方法により実施できる。また、皮膚からRNAを抽出し、ＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２をコードするmRNAの量を測定することにより決定することもできる。mRNAの抽出、その量の測定も当業界において周知であり、例えばRNAの定量は定量ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）により行われる。以上の他、ＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の既知の生物活性を測定することによりＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現量を測定することもできる。他に、ＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現はin situハイブリダイゼーション法やその生物活性の測定を通じて決定することができる。
【００２０】
本発明はさらに、肌の紫外線照射による皮膚障害に対する抵抗力を高めるＵＶ抵抗強化剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現を亢進する薬剤をＵＶ抵抗強化剤として選定することを特徴とする。ＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現の亢進は、上述のとおり、細胞中のＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の量の測定、表皮細胞から抽出されたＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２をコードするmRNAの量の測定などにより実施することができる。
【００２１】
好適な態様において、上記スクリーニング方法は更に、上記亢進能力を有する候補薬剤をモデル動物、好ましくはＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２欠損動物に適用し、ＵＶ抵抗力を強化する候補薬剤を選定することを含んで成る。
表皮細胞のＵＶ抵抗力の評価は、例えば表皮細胞に紫外線を照射することにより誘導されるアポトーシスを抑制する活性を検討することで行うことができる。アポトーシス評価は、当業者周知の方法により実施することができる。例えば、アポトーシス評価はＦＡＣＳ  ＣＯＵＬＴＥＲ（EPIX XL-MCL, Beckman Coulter）を用い、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びプロピジウムイオダイン（ＰＩ）二重染色法(Annexin V-FITC kit, Immunotech）を指標とするＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソータ）解析により行うことができる。その評価基準として、例えば表皮細胞のアポトーシスを30％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは70％以上、最も好ましくは90％以上抑制したなら、「肌のＵＶ抵抗力を高める」と判断する、としてよい。
【００２２】
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
免疫組織化学的検査
表皮生検をＡＭｅＸ手順（Sato Y. et al. Am. J. Pathol., 125, 431-435(1986)）に従い、冷却アセトンで固定してからパラフィンの中に包埋した。切片をキシレンで脱パラフィン処理し、アセトン、次いでＰＢＳで洗浄した。次にその切片の非特異的結合部位を１０％正常ウサギ血清(Histofine, Tokyo, Japan)でブロックした。
表皮切片を抗−ＳＣＣＡ−１モノクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology, CA, USA）（1：500に希釈）、抗−ＳＣＣＡ−２モノクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology, CA, USA）（1：500に希釈）又は抗−ＳＣＣＡポリクローナル抗体（Takeda A. et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002)に記載のとおりにして精製）のそれぞれとインキュベーションした。ＰＢＳで洗浄後、切片をヘマトキシリンでカウンター染色し、ＤＡＫＯ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ(DAKO Corp., CA, USA)で観察を行った。
【００２４】
図１は、表皮検体として、非露光部位である上腕部（ヒト24歳）、臀部（ヒト46歳）、太腿部（ヒト75歳）由来の表皮、及び露光部位である頬部（ヒト20歳、76歳）、目瞼（ヒト82歳）由来の表皮を採取し、抗体としてＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の両者に結合する抗−ＳＣＣＡポリクローナル抗体を用い、顕微鏡観察した結果である。図１から、非露光部位と比べ、露光部位の表皮上層でＳＣＣＡが顕著に亢進していることがわかる。しかしながら、露光部位でも、基底層ではＳＣＣＡの発現の亢進は認められなかった。
【００２５】
図２は、表皮検体として、ＵＶ照射（トランスルミネーターＴＯＲＥＸ  ＦＬ２０５−Ｅ−３０／ＤＭＲ（Toshiba Medical Supply)を用い、２ＭＥＤ（Minimum Erythema Dose）の照射量にて照射）を施したヒト表皮及び照射を施していないコントロール表皮におけるＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２のそれぞれの発現の顕微鏡観察結果である。抗体として、抗−ＳＣＣＡ−１モノクローナル抗体及び抗−ＳＣＣＡ−２モノクローナル抗体それぞれを使用した。図２から、ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２共に、ヒト表皮にＵＶを照射することで発現が亢進されることが明らかとなった。また、発現の亢進は皮膚有棘層及び顆粒層において顕著であった。
【００２６】
以上により、表皮にＵＶが照射されると、表皮、特にその有棘層及び顆粒層においてＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の発現が亢進されることが明らかとなった。
【００２７】
定量ＰＣＲ実験
次に、表皮におけるＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の発現がＵＶ照射により亢進されることを遺伝子レベルで確認する実験を行った。
ヒト角化細胞をケラチノサイト−ＳＦＭ培地（GIBCO, Invitrogen)中、Ｌ−グルタミン及び上皮細胞成長因子の存在下で高湿、ＣＯ2５％の雰囲気において、３７℃にて培養した。集密度６０〜７０％の細胞にＵＶＢを０〜４８時間にわたり、照射した。ＵＶＢ照射はトランスルミネーターＴＯＲＥＸ  ＦＬ２０５−Ｅ−３０／ＤＭＲ（Toshiba Medical Supply)を用い、５０ｍＪ／ｃｍ2の強度で行った。コントロール細胞にはＵＶＢ照射を施さなかった。
【００２８】
上記培養細胞から総ＲＮＡを、Ｉｓｏｇｅｎ（Nippon Gene)を用い、添付の説明書に従い、単離精製した。ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２それぞれの発現レベルを定量リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により決定した。簡単には、総ＲＮＡをSuperscript II（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用い、ｃＤＮＡへと変換させた。その試料をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ(Applied Biosystems, Foster City, CA)を用い、２−ステップＰＣＲを４０サイクル行い、増幅させた。内部標準としてＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）を用いた。
【００２９】
使用したプライマーは下記のとおりである。
ＳＣＣＡ−１：
順方向プライマー
5'-GTGCTATCTGGAGTCCT-3'（配列番号１）
逆方向プライマー
5'-CTGTTGTTGCCAGCAA-3'（配列番号２）
Taq Man プローブ
5'-CATCACCTACTTCAACT-3'(配列番号３）
【００３０】
ＳＣＣＡ−２：
順方向プライマー
5'-CTCTGCTTCCTCTAGGAACACAG-3'（配列番号４）
逆方向プライマー
5'-TGTTGGCGATCTTCAGCTCA-3'（配列番号５）
Taq Man プローブ
5'-AGTTCCAGATCACATCGAGTT-3'(配列番号６）
【００３１】
ＧＡＰＤＨ：
順方向プライマー
5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'（配列番号７）
逆方向プライマー
5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'（配列番号８）
Taq Man プローブ
5'-AGGCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3'(配列番号９）
【００３２】
リポーター色素（６−カルボキシ−フルオレセイン）をＴａｑ  Ｍａｎプローブ配列の５’末端に結合させ、そしてクエンチャー色素（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）をその３’末端に組み込ませた。
【００３３】
図３に培養ヒト角化細胞におけるＳＣＣＡの発現についてのＵＶＢ照射の影響の結果を示す。ＳＣＣＡ−１、ＳＣＣＡ−２、共にＵＶ照射により発現が亢進されることが明らかとなった。従って、表皮細胞はＵＶ照射により、遺伝子レベルでＳＣＣＡ−１、ＳＣＣＡ−２の発現が亢進されることが明らかとなった。
【００３４】
ＵＶ照射におけるＳＣＣＡの役割の検討
以上により、表皮細胞では、ＵＶ照射を受けることでＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の発現が亢進することが解明された。次に、ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２がＵＶ照射を受けた表皮細胞においてどのような役割を担っているかを検討した。
【００３５】
ＳＣＣＡ−１及び２高発現細胞の樹立
３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣより入手）はＳＣＣＡ−１及び２を発現しないマウス胎児由来の細胞である。この細胞に、下記のとおりにしてＳＣＣＡ−１又は２をコードする遺伝子を導入した。
ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２のｃＤＮＡ（Takeda A et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002)）をBam HI及びKpn Iで二重消化した。それらをｐＴａｒｇｅｔ ベクターの中にサブクローニングし、次いでＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（GIBCO, Invitrogen Corp.）を用い、３Ｔ３細胞に導入した。簡単に述べると、無血清ＤＭＥＭ培地（Invitrogen Corp.) ６７５μｌ中のｃＤＮＡ  ２０μｇを７５μｌのＰｌｕｓ試薬と混合し、２５℃にて１５分放置した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（１００μｌ）を６５０μｌの無血清ＤＭＥＭ培地に添加し、次いでそれを上記ｃＤＮＡ−Ｐｌｕｓ混合物に加え、そして２５℃にて１５分放置した。このｃＤＮＡ混合物を１０ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地に添加し、そして３Ｔ３細胞をその中で３７℃にて４時間、５％のＣＯ2雰囲気下でインキュベーションした。その培地を１０％のＦＣＳ（Invitrogen Corp.）含有のＤＭＥＭ培地と交換し、そして一晩インキュベーションした。翌日、Ｇ４１８（Calbiochem）を最終濃度５００μｇ／ｍｌとなるように添加した。Ｇ４１８は培養期間中この濃度に保っておいた。培地は２〜３日ごとに交換した。培養４週間後、いくつかのＧ４１８耐性コロニーを単離することができ、ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２発現細胞系が樹立された。
【００３６】
ＳＣＣＡ−１をコードするｃＤＮＡが導入された細胞（ＳＣＣＡ−１導入細胞）はＳＣＣＡ−１を特異的且つ安定的に発現し、そしてＳＣＣＡ−２をコードするｃＤＮＡが導入された細胞（ＳＣＣＡ−２導入細胞）はＳＣＣＡ−２を特異的且つ安定的に発現することが確認された。また、同様の操作で非特異的な配列の導入された３Ｔ３細胞（コントロール細胞）はＳＣＣＡ−１、ＳＣＣＡ−２のいずれも発現しなかった。
【００３７】
上記ＳＣＣＡ−１導入細胞、ＳＣＣＡ−２導入細胞及びコントロール細胞を用い、ＵＶ照射を与えたときのＳＣＣＡ−１、ＳＣＣＡ−２が果たす役割について検討した。詳しくは、表皮細胞におけるＵＶ誘導アポトーシスに対するＳＣＣＡ−１、ＳＣＣＡ−２の役割について検討した。
【００３８】
上記各種細胞を１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地中で高湿、ＣＯ2５％の雰囲気において、３７℃にて培養した。集密度６０〜７０％の細胞にＵＶＢを０〜４８時間にわたり、照射した。ＵＶＢ照射はトランスルミネーターＴＯＲＥＸ  ＦＬ２０５−Ｅ−３０／ＤＭＲ（Toshiba Medical Supply)を用い、５０ｍＪ／ｃｍ2の強度で行った。
【００３９】
これらの細胞についてのアポトーシス評価はＦＡＣＳ  ＣＯＵＬＴＥＲ（EPIX XL-MCL, Becjman Coulter）を用い、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びプロピジウムイオダイン（ＰＩ）二重染色法(Annexin V-FITC kit, Immunotech）を指標とするＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソータ）解析により行った。
【００４０】
その結果を図４に示す。図４から明らかなとおり、ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２導入細胞のいずれもＵＶ照射によるアポトーシスが有意に減少することが認められた。従って、ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２共に、ＵＶによる誘導されるアポトーシスを抑制できるものと推定された。
このことを確認するため、本発明者は次にＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２ノックダウン細胞株をＲＮＡ干渉法により樹立し、ＵＶ照射における表皮細胞内でのＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の役割についてさらに検討した。
【００４１】
ＳＣＣＡノックダウン細胞の樹立
ＨａＣａｔ細胞（H. Hans. et al. Experimental Cell Research 239, 399-410 (1998)）はＳＣＣＡを高発現するヒト角化細胞である。この細胞に、ＲＮＡ干渉法に従い、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒベクター（Ambion）で恒常的にｓｉＲＮＡ（short interference RNA）を発現させることにより、ＳＣＣＡ−１及び２のノックダウン細胞株を樹立した。
ｓｉＲＮＡはｐＳｉｌｅｎｃｅｒベクターを用い、添付の説明書に従い、構築した。詳しくは、ＳＣＣＡをコードする遺伝子のヌクレオチド番号４６〜６６位に相補性な２１ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ACATGAACTT GGTGTTGGCT T：配列番号１０）を含む６５ｍｅｒのセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１１）と、ヌクレオチド番号４６〜６６位に相同な２１ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（AAGCCAACAC CAAGTTCATG T；配列番号１２）を含む６５ｍｅｒのアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１３）とから成る二本鎖オリゴヌクレオチドをｐＳｉｌｅｎｃｅｒベクターのＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位及びＢａｍ  ＨＩ部位にクローニングした。ＨａＣａｔ細胞へのトランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Invitrogen)を用い、添付の説明書に従って行った。コントロール細胞は、哺乳動物の遺伝子配列と有意な相同性、相補性をもたない二本のオリゴヌクレオチドから成る二本鎖オリゴヌクレオチドを用い、作製した。安定な細胞系はトランスフェクション細胞をハイグロマイシン−Ｂ選択培地の中で４〜６週間培養して選択を行うことにより獲得した。ＳＣＣＡの発現が抑制されていることを確認するため、上述のとおりにして、リアルタイムＰＣＲによりＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の発現を測定した。
センスオリゴヌクレオチド（配列番号１１）
GATCCCGGCCAACACCAAGTTCATGTTTCAAGAGA ACATGAACTTGGTGTTGGCTT TTTTGGAAA
（下線部が相同領域）
アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１３）
AGCTTTTCCAAAA AAGCCAACACCAAGTTCATGT TCTCTTGAAACATGAACTTGGTGTTGGCCGG
（下線部が相補性領域）
【００４２】
その結果を図５に示す。上記ｓｉＲＮＡの導入された細胞では、コントロールに比べ、ＳＣＣＡ−１及び２ともに発現が９０％以上抑制（ノックダウン）されていることが確認された。
【００４３】
上記ノックダウン細胞及びコントロール細胞を用い、表皮細胞におけるＵＶ誘導アポトーシスに対するＳＣＣＡ−１、２の役割について検討した。
上記各種細胞をケラチノサイト−ＳＦＭ培地（GIBCO, Invitrogen)中、Ｌ−グルタミン及び上皮細胞成長因子の存在下で高湿、ＣＯ2５％の雰囲気において、３７℃にて培養した。集密度６０〜７０％の細胞にＵＶＢを照射した。ＵＶＢ照射はトランスルミネーターＴＯＲＥＸ  ＦＬ２０５−Ｅ−３０／ＤＭＲ（Toshiba Medical Supply)を用い、５０ｍＪ／ｃｍ2の強度で行った。
【００４４】
これらの細胞についてのアポトーシス評価をＦＡＣＳ  ＣＯＵＬＴＥＲを用い、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びプロピジウムイオダイン（ＰＩ）二重染色法を指標とするＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソータ）解析により行った。
その結果を図６に示す。ノックダウン細胞にＵＶ照射を行った結果、コントロール細胞では３８％の細胞がアポトーシスを生じるのに対し、ノックダウン細胞では約８０％もの細胞がアポトーシスを引き起こすことが明らかになった。従って、ＳＣＣＡはＵＶ照射により誘導される表皮細胞のアポトーシスを有意に抑制することがわかった。よって、ＳＣＣＡは表皮細胞のＵＶ防御機構を担うものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】露光及び非露光部位の表皮におけるＳＣＣＡの発現。
【図２】ＵＶ照射による表皮におけるＳＣＣＡの発現の変動。
【図３】培養ヒト角化細胞におけるＳＳＣＡ発現に対するＵＶ照射の影響。
【図４】ＳＣＣＡ高発現細胞とＳＣＣＡ非発現細胞との、ＵＶ照射により誘導されるアポトーシス率の比較。
【図５】ＳＳＣＡノックダウン細胞株の樹立を示す。
【図６】ＳＣＣＡノックダウン細胞とコントロール細胞との、ＵＶ照射により誘導されるアポトーシス率の比較。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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