(57)【要約】【課題】  フルクトシルペプチドオキシダーゼ凍結乾燥製剤の安定化方法および安定化されたフルクトシルペプチドオキシダーゼ凍結乾燥製剤を提供すること。【解決手段】  キレート試薬、糖アルコール類、アミノ酸類、金属塩類から選ばれる１種以上の試薬を共存させることにより、フルクトシルペプチドオキシダーゼ凍結乾燥製剤を安定化することができる。この安定化方法を用い、安定化されたフルクトシルペプチドオキシダーゼ凍結乾燥製剤を製造することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キレート試薬、糖アルコール類、アミノ酸類、金属塩類から選ばれる１種以上の試薬を、フルクトシルペプチドオキシダーゼと共存させることを特徴とするフルクトシルペプチドオキシダーゼ凍結乾燥製剤の安定化方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法により得られるフルクトシルペプチドオキシダーゼ凍結乾燥製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床診断に用いられるフルクトシルペプチドオキシダ−ゼ（以下「ＦＰＯＸ」と言う）凍結乾燥製剤の安定化方法および安定化されたＦＰＯＸ凍結乾燥製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化蛋白質は、蛋白質が非酵素的に糖化された蛋白質であり、糖、すなわちアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体）側のアルデヒド基と、蛋白質側のアミノ基が非酵素的に共有結合した結果、生成したものである。蛋白質のアミノ基としては、Ｎ末端アミノ酸のαアミノ基、内部リジン残基側鎖のεアミノ基があげられる。これらの糖化蛋白質は、反応中間体として生じたシッフ塩基がアマドリ転移を受けて形成されることから、いわゆるアマドリ化合物とも呼ばれる。
【０００３】
糖化蛋白質は、生体内の血液などの体液や、毛髪などの生体試料中に含有されている。血液中に存在する糖化蛋白質の濃度は、血清中に溶解しているグルコースなどの糖類の濃度に強く依存している。糖尿病状態では糖化蛋白質の生成が亢進しており、赤血球に含まれる糖化ヘモグロビンや血清中の糖化アルブミンの濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映していることから、それらの糖化蛋白質を測定することは、糖尿病の症状の診断や症状管理に重要となっている。
【０００４】
従来糖化蛋白質を定量する方法として、例えば、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法（例えば、非特許文献１参照。）、硼酸を結合させた固体を詰めたカラムを用いる方法（例えば、非特許文献２参照。）、電気泳動を用いる方法（例えば、非特許文献３参照。）、抗原抗体反応を利用する方法（例えば、非特許文献４参照。）、還元能をテトラゾリウム塩を用いて比色定量する方法（例えば、非特許文献５参照。）、チオバルビツール酸を用いて酸化後比色定量する方法（例えば、非特許文献６参照。）、糖化アミノ酸オキシダーゼ等の酵素を用いる方法（例えば、特許文献１〜１６参照。）等が知られている。また最近、上記方法より精度良く糖化蛋白質を測定する方法として、新しい糖化蛋白質の測定法が開示された（例えば、特許文献１７参照。）。この測定方法は、糖化蛋白質を含む試料をプロテアーゼで処理し、糖化蛋白質からフルクトシルペプチドを遊離させ、遊離したフルクトシルペプチドにＦＰＯＸを作用させ、生成物を測定することにより糖化蛋白質を測定する方法であり、短時間かつ簡単な操作で、精度の良い測定方法として注目されている。
【０００５】
保存・輸送などの際、酵素を長期間安定に保つためには、酵素を凍結乾燥し製剤の状態にすることが多い。この凍結乾燥を行う時、酵素溶液にグルコースなどの糖を加えることで、酵素が安定化することは一般によく知られているが、酵素がＦＰＯＸなどの糖化物を基質とする酵素の場合、糖の使用は適当ではない。なぜなら、凍結乾燥時に添加した糖は反応系に共存するアミノ酸、ペプチド、タンパク質などとアマドリ反応を起こし、糖化物を生成してしまい、それが糖化蛋白質測定時にバックグラウンドの上昇の原因となってしまうためである。このような理由から、ＦＰＯＸを凍結乾燥する際の安定化剤として糖はふさわしくないと考えられているが、糖以外の物質を用いたＦＰＯＸの安定化方法は知られていない。
【０００６】
【特許文献１】特公平０５−３３９９７号公報
【特許文献２】特開平１１−１２７８９５号公報
【特許文献３】国際公開第９７／１３８７２号パンフレット
【特許文献４】特公平０６−６５３００号公報
【特許文献５】特開平０２−１９５９００号公報
【特許文献６】特開平０３−１５５７８０号公報
【特許文献７】特開平０４−４８７４号公報
【特許文献８】特開平０５-１９２１９３号公報
【特許文献９】特開平０６−４６８４６号公報
【特許文献１０】特開平１１−１５５５９６号公報
【特許文献１１】特開平１０−３１３８９３号公報
【特許文献１２】特開平１１−５０４８０８号公報
【特許文献１３】特開２０００−３３３６９６号公報
【特許文献１４】特開２００１−５４３９８号公報
【特許文献１５】特開２００１−２０４４９５号公報
【特許文献１６】特開２００１−２０４４９４号公報
【特許文献１７】特開２００１−９５５９８号公報
【非特許文献１】コール(Cole RA)、外３名，「高速液体クロマトグラフィーを用いた糖化ヘモグロビンの迅速測定法 (A rapid method for the determination of glycosylated hemoglobins using high pressure liquid chromatography)」，メタボリズム(Metabolism) ，１９７８年５月，第２７巻，第３号，ｐ.２８９−３０１
【非特許文献２】クレンク（Klenk DC）、外９名, 「アフィニティークロマトグラフィーによる糖化ヘモグロビンの定量法：比色分析法とイオン交換法の比較、共通の阻害物質の影響(Determination of glycosylated hemoglobin by affinity chromatography: comparison with colorimetric and ion-exchange methods, and effects of common interferences)」，クリニカル・ケミストリー(Clin Chem)，１９８２年１０月，第２８巻，第１０号，ｐ.２０８８−２０９４
【非特許文献３】メナード（Menard L）、外５名，「寒天ゲル電気泳動によるヘモグロビンA1の量的測定法(Quantitiative determination of glycosylated hemoglobin A1 by agar gel electrophoresis)」，クリニカル・ケミストリー(Clin Chem)，１９８０年１０月，第２８巻，第１１号，ｐ.１５９８−１６０２
【非特許文献４】日本臨床検査自動化学会会誌，１９９３年，第１８巻，ｐ.６２０
【非特許文献５】ジョンソン（Johnson RN）、外２名，「フルクトサミン：血清糖化タンパク質定量のための新たな手がかり、糖尿病コントロール指標(Fructosamine: a new approach to the estimation of serum glycosylprotein. An index of diabetic control)」，クリニカ・ケミカ・アクタ(Clin Chim Acta)，１９８３年１月７日，第１２７巻，第１号，ｐ．８７−９５
【非特許文献６】ドルホファー（Dolhofer R） 、外１名，「血清糖化タンパク質定量のためのチオバルビツール酸測定法の改良(Improvement of the thiobarbituric acid assay for serum glycosylprotein determination)」，クリニカ・ケミカ・アクタ(Clin Chim Acta)，１９８１年５月５日，第１１２巻，第２号，ｐ．１９７−２０４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、ＦＰＯＸ凍結乾燥製剤の安定化方法および安定化されたＦＰＯＸの凍結乾燥製剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、キレート試薬、糖アルコール類、アミノ酸類、金属塩類を共存させることにより、ＦＰＯＸ凍結乾燥製剤の安定性が極めて向上することなどを見出し、これらの知見に基づき本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、キレート試薬、糖アルコール類、アミノ酸類、金属塩類から選ばれる１種以上の試薬を、ＦＰＯＸと共存させることを特徴とするＦＰＯＸ凍結乾燥製剤の安定化方法に関する。さらに、この安定化方法により得られる安定化されたＦＰＯＸ凍結乾燥製剤に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、キレート試薬、糖アルコール類、アミノ酸類、金属塩類を共存させることにより、ＦＰＯＸ凍結乾燥製剤を安定化することができる。この安定化方法を用いて、安定化されたＦＰＯＸの凍結乾燥製剤を、簡単な方法でかつ安価に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に用いられるＦＰＯＸは、酸素存在下でフルクトシルペプチドに作用し、α−ケトアルデヒド、ペプチド及び過酸化水素を生成するオキシダーゼであり、この作用を有する酵素であれば、如何なるオキシダーゼも含まれる。本発明に用いられるＦＰＯＸの起源は如何なるものであってもよく、例えば、糸状菌、酵母、放線菌、バクテリア、古細菌など特に制限されないが、好ましくは、例えば、コニオカエタ（Coniochaeta）、ユーペニシリウム（Eupenicillium）、アカエトミエラ（Achaetomiella）などを起源とするＦＰＯＸなどを挙げることができる。また、これらのＦＰＯＸは、遺伝子組み換え体によって製造されたものを用いることもできる。
【００１２】
本発明において、ＦＰＯＸ凍結乾燥製剤とは、上記ＦＰＯＸを通常用いられる凍結乾燥機を用いて凍結乾燥し、得られた乾燥物を粉砕した粉末状の酵素標品をいう。ＦＰＯＸの凍結乾燥は、例えば、東西通商（株）製の真空凍結乾燥機（FREEZVAC-1 CM型）を用いて行う。この真空凍結乾燥機の乾燥棚には、ＦＰＯＸを入れるトレイを載せて予め−５０℃に冷却しておき、ＦＰＯＸ（キッコーマン社製）３００ｍｌをメンブランフィルターで無菌濾過してから、前記のトレイに流し込む。真空凍結乾燥機内の温度は、−５０℃に保ちながら試料を凍結（２４時間）する。試料が凍結したら、真空凍結乾燥機のコールドトラップを−５０℃まで冷却し、３０分間経過後に真空ポンプを稼働して、真空度４．５４ PASCALで乾燥を開始する。乾燥を開始してから２４時間後に、真空凍結乾燥機の乾燥棚の棚温度を２５℃に設定して棚加熱する。この状態でさらに７２時間乾燥すると、ＦＰＯＸ凍結乾燥製剤が得られる。
【００１３】
本発明において、ＦＰＯＸ凍結乾燥製剤の安定性を向上させるために共存させるキレート試薬とは、金属イオンに配位しキレート化合物を与えるような化合物であり、そのような作用を有する化合物であれば如何なる化合物でも用いることができる。例えばエチレンジアミン４酢酸（以下「ＥＤＴＡ」と言う）、ｔｒａｎｓ−１，２−ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（以下「ＣｙＤＴＡ」と言う）、ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＤＴＰＡ）、グリコールエーテルジアミン４酢酸（ＥＧＤＴＡ）、１，６−ｈｅｘａｍｅｔｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン６酢酸（ＴＴＨＡ）、アスパラギン酸などのポリアミンカルボン酸系のキレート試薬や、クエン酸、リンゴ酸、イソクエン酸などのオキシカルボン酸系のキレート試薬等が挙げられる。好ましくは、ポリアミンカルボン酸系のキレート試薬としては、ＥＤＴＡやＣｙＤＴＡなどが、オキシカルボン酸系のキレート試薬としては、クエン酸やリンゴ酸などが挙げられる。本発明においては、上記キレート試薬に配位する塩の有無、種類や数については何ら限定されるものではないが、例えば、遊離酸化合物やナトリウム塩化合物が好ましく用いられる。また上記キレート試薬は、それぞれ単独でも複数組み合わせても用いることができる。
【００１４】
本発明において、ＦＰＯＸ凍結乾燥製剤の安定性を向上させるために共存させる糖アルコール類は、如何なる糖アルコール類でも用いることができる。例えば、トレハロース、キシリトール、ソルビトール、イノシトール、マンニトール、アラビトール、ズルシトール、エリスリトール等が挙げられる。本発明においては、上記糖アルコール類に何ら限定されるものではないが、例えば、トレハロースが好ましく用いられる。また上記糖アルコール類は、それぞれ単独でも複数組み合わせても用いることができる。
【００１５】
本発明において、ＦＰＯＸ凍結乾燥製剤の安定性を向上させるために共存させるアミノ酸類は、如何なるアミノ酸類でも用いることができる。例えば、グルタミン酸ナトリウム、グリシン、リジン塩酸塩、アスパラギン、アラニン、メチオニン、トレオニン等が挙げられる。本発明においては、上記アミノ酸類に何ら限定されるものではないが、例えば、グルタミン酸ナトリウムが好ましく用いられる。また上記アミノ酸類は、それぞれ単独でも複数組み合わせても用いることができる。
【００１６】
本発明において、ＦＰＯＸ凍結乾燥製剤の安定性を向上させるために共存させる金属塩類は、如何なる金属塩類でも用いることができる。例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マンガン、塩化マグネシウム、塩化第一鉄、塩化カルシウム、塩化バリウム、塩化銅等が挙げられる。本発明においては、上記金属塩類に何ら限定されるものではないが、例えば、塩化カルシウムが好ましく用いられる。また上記金属塩類は、それぞれ単独でも複数組み合わせても用いることができる。
【００１７】
本発明の安定化方法は、上記ＦＰＯＸと前記の試薬類を共存させる。このとき、必要により、その他の試薬が共存していてもよい。通常、ＦＰＯＸ、試薬などの固体粉末もしくはそれらの溶解液をそれぞれ適宜混合することにより共存させることができる。  
【００１８】
本発明の安定化方法に用いられるＦＰＯＸの濃度は特に制限されないが、好ましくは０．０５〜１０００Ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．１０〜４００Ｕ／ｍｌである。なお、ここでの酵素力価は、フルクトシルバリルヒスチジンを基質として測定したとき、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義している。また、キレート試薬、糖アルコール類、アミノ酸類、金属塩類の濃度は、ＦＰＯＸの安定化効果が発揮され、かつ酵素を含む試薬を取り扱う上で不都合のない範囲内であれば、如何なる濃度でも調製することができる。例えば、上記キレート試薬の好ましい濃度としては５ｍＭ以上、より好ましくは１０〜２００ｍＭが挙げられる。糖アルコール類の好ましい濃度としては５ｍＭ以上、より好ましくは２０〜５００ｍＭが挙げられる。アミノ酸類の好ましい濃度としては２５ｍＭ以上、より好ましくは５０〜５００ｍＭが挙げられる。金属塩類の好ましい濃度としては０．２ｍＭ以上、より好ましくは２〜５０ｍＭが挙げられる。
【００１９】
一般に酵素は、保存時のｐＨによりその安定性が大きく影響を受けるため、その他の試薬として、安定なｐＨ域の種々の緩衝液を同時に用いることが好ましい。本発明において用いられる緩衝液の種類及びその濃度、ｐＨは特に限定されるものではないが、例えば、ｐＨ６〜１０の間で緩衝能を有し、かつ必要十分な緩衝能を保つ濃度に設定されていることが望ましい。この様な緩衝液として、例えば、汎用的なトリス緩衝液やリン酸緩衝液を挙げることもできるし、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ビシン、トリシン等のグッドバッファー、グリシン−ＮａＯＨなどのアミノ酸系緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐｒｏｐａｎｅ緩衝液、イミダゾール緩衝液などを使用することもできる。緩衝液の濃度については、例えば、好ましくは５〜５００ｍＭ、さらに好ましくは１０〜１００ｍＭである。本発明では、トリス緩衝液若しくはリン酸緩衝液が好ましく用いられる。本発明のキレート試薬、糖アルコール類、アミノ酸類、金属塩類を緩衝液に添加する場合は、直接添加するか、又は、例えば、ｐＨ５〜９、好ましくは６〜８に調整したそれらの水溶液を添加すればよい。前記の試薬類を添加することにより、ｐＨが目的とする範囲からはずれるときは、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水等の添加でｐＨが目的の範囲内におさまるように調整するのが好適である。
【００２０】
さらに、その他の試薬として、必要により、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、アジ化ナトリウム等の各種無機塩、デキストラン等の多糖類、ボバインセーラムアルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）、グリセロール、界面活性剤、抗生物質、サルファ剤等の化学療法剤等を共存させてもよい。これらの試薬は、あらかじめ緩衝液に添加しておいてもよい。
【００２１】
安定性の評価は、実際に用いる酵素の保存条件、輸送条件及び測定条件などに即した種々の条件下に、ＦＰＯＸ凍結乾燥製剤を保存、放置して、経時的にその変化を測定することにより行なわれるが、一般に、短時間で評価を行なうために、通常、虐待試験が用いられる。例えば、一定の高温下にＦＰＯＸ凍結乾燥製剤を保温して、経時的に残存活性を測定する方法などが挙げられる。
【００２２】
この様にして、キレート試薬、糖アルコール類、アミノ酸類、金属塩類を共存させることにより、ＦＰＯＸ凍結乾燥製剤を安定化することができる。この安定化方法を用いて、ＦＰＯＸとキレート試薬、糖アルコール類、アミノ酸類、金属塩類を含有する安定化されたＦＰＯＸ凍結乾燥製剤を製造することができる。例えば、糖アルコールを５％以上の濃度で含有する、ｐＨ６〜１０の緩衝液を調製し、この緩衝液にＦＰＯＸ（キッコーマン社製）を濃度が０．１〜４００Ｕとなるように添加する。さらに、一般的に基質を共存させることにより酵素の凍結乾燥製剤を安定化できることが知られているので、必要によりフルクトシルペプチドを１〜２００ｍＭとなるように加えてもよい。この混合液を撹拌し、前記凍結乾燥製剤の製造方法により、ＦＰＯＸ凍結乾燥製剤を製造することができる。このようにして得られた本発明のＦＰＯＸ凍結乾燥製剤は、従来の方法により製造された製剤に比べて著しく安定化されており、本発明の方法により、簡単な方法でかつ安価に、安定化されたＦＰＯＸ凍結乾燥製剤を製造することができる。
【００２３】
以下、実験例及び実施例により、本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲は、これらの例により、何ら限定されるものではない。
＜実験例１＞
【００２４】
（ＦＰＯＸの活性測定法及び安定性試験）
過酸化水素量を測定する方法について示す。以下、本発明オキシダーゼ等の活性測定には、ことわりのない限り、フルクトシルバリルヒスチジンを基質として用いる。なお、酵素力価は、フルクトシルバリルヒスチジンを基質として測定したとき、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。
Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：ＰＯＤ−４-アミノアンチピリン溶液
１．０ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマン社製）、１００ｍｇの４-アミノアンチピリン（東京化成社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、１Ｌに定容する。
（２）試薬２：２，４−ジクロロフェノールサルフェート溶液
市販２％溶液（ナカライ社製）２５ｍｌをイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
（３）試薬３：基質溶液（１５０ｍＭ；終濃度  ５ｍＭ）
フルクトシルバリルヒスチジン６２４ｍｇをイオン交換水に溶解して１０ｍｌに定容する。フルクトシルバリンヒスチジンは特開２００１−９５５９８号公報記載の方法により調製した。
Ｂ．測定法
２．７ｍｌの試薬１、１００μｌの試薬２、および１００μｌのＦＰＯＸ酵素液（キッコーマン社製）を混和し、３０℃で５分間予備加温する。その後１００μｌの試薬３を加えて良く混ぜた後、分光光度計（Ｕ−２０００Ａ、日立社製）により、５１０ｎｍにおける吸光度を測定する。測定値は、５１０ｎｍにおける１分後から３分後の１分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にした。これをあらかじめ作製しておいた過酸化水素の標準溶液を試薬３の代わりに、また酵素液の代わりにイオン交換水を用い、その生成色素量との関係を調べたグラフを用意した。このグラフを用いて、３０℃、１分間当たりに生成される過酸化水素のマイクロモルを計算し、この数値を酵素液中の活性単位とした。なお活性測定用のＦＰＯＸ酵素液の希釈には、０．１５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有する１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いた。ＦＰＯＸ凍結乾燥製剤の安定性試験は、虐待試験後の残存活性を比較して行なった。虐待試験を行った後の該酵素溶液の残存活性は、該酵素溶液調製時における吸光度変化量を１００％としたときの相対量（％）として表わした。
【実施例１】
【００２５】
（キレート試薬であるＥＤＴＡ・２Ｎａの共存効果）
まず、安定化剤無添加（コントロール）の試験として、２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌにＦＰＯＸ−ＣＥ（キッコーマン社製）を３３７Ｕ添加して凍結乾燥した。この凍結乾燥粉末を３７℃、２週間の虐待を行い、虐待後の酵素活性を測定した。結果は表１、ｅｎｔｒｙ１に示す通り、虐待前の酵素活性と比較して、虐待後の活性は４８％まで低下することがわかった。
【００２６】
次に、５ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａを含有する２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を調製し、この緩衝液１ｍｌに対してＦＰＯＸ−ＣＥ（キッコーマン社製）を３３７Ｕ添加して凍結乾燥した。この凍結乾燥粉末についても同様に３７℃、２週間の虐待を行い、虐待後の酵素活性を測定した。結果は表１、ｅｎｔｒｙ２に示す通り、虐待前の酵素活性と比較して、７７％の活性を維持していた。すなわち、５ｍＭ濃度のＥＤＴＡ・２Ｎａ（キレート試薬）をＦＰＯＸ−ＣＥに添加し凍結乾燥することで、ＦＰＯＸ−ＣＥ凍結乾燥製剤の保存安定性が向上することがわかった。
【実施例２】
【００２７】
（オキシカルボン酸系のキレート試薬の共存効果）
オキシカルボン酸系のキレート試薬である、１７ｍＭクエン酸ナトリウム又は３７ｍＭリンゴ酸をそれぞれ含有する、２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を調製した。この緩衝液１ｍｌに対してＦＰＯＸ−ＣＥ（キッコーマン社製）を３３７Ｕ添加して凍結乾燥した。この凍結乾燥粉末について３７℃、２週間の虐待を行い、虐待前後の酵素活性を比較し、キレート試薬の安定化の効果を評価した。結果は、表１、ｅｎｔｒｙ３、４に示す通り、いずれのオキシカルボン酸系のキレート試薬もＦＰＯＸ−ＣＥに添加し凍結乾燥することで、ＦＰＯＸ−ＣＥ凍結乾燥製剤の保存安定性が向上することがわかった。
【実施例３】
【００２８】
（糖アルコール類であるトレハロースの共存効果）
２６、５３、１３２、および２６４ｍＭ 濃度のトレハロースを含有する２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）をそれぞれ調製した。この緩衝液１ｍｌに対してＦＰＯＸ−ＣＥ（キッコーマン社製）を３３７Ｕ添加して凍結乾燥した。この凍結乾燥粉末について３７℃、２週間の虐待を行い、虐待前後の酵素活性を比較し、糖アルコール類の安定化の効果を評価した。結果を表１、ｅｎｔｒｙ８〜１１に示す。２６ｍＭのトレハロースの添加では、７２％の残存活性率を有していたが（ｅｎｔｒｙ８）、１３２ｍＭ以上のトレハロースの添加では、残存活性は１００％だった（ｅｎｔｒｙ１０、１１）。すなわち、１３２ｍＭ以上の高濃度のトレハロースを添加することにより、ＦＰＯＸ−ＣＥ凍結乾燥製剤の保存安定性が顕著に向上することがわかった。
【実施例４】
【００２９】
（アミノ酸類であるL-グルタミン酸ナトリウムの共存効果）
１０７ｍＭのL-グルタミン酸ナトリウムを含有する、２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を調製した。この緩衝液１ｍｌに対してＦＰＯＸ−ＣＥ（キッコーマン社製）を３３７Ｕ添加し、凍結乾燥した。この凍結乾燥粉末について３７℃、２週間の虐待を行い、虐待前後の酵素活性を比較し、アミノ酸類の安定化の効果を評価した。結果は、表１、ｅｎｔｒｙ７に示す通り、虐待前の酵素活性と比較して、９８％の活性を維持していることがわかった。すなわち、L-グルタミン酸ナトリウムを添加し凍結乾燥することにより、ＦＰＯＸ−ＣＥ凍結乾燥製剤の保存安定性が顕著に向上することがわかった。
【実施例５】
【００３０】
（金属塩類の１種である塩化カルシウムの共存効果）
１０ｍＭの塩化カルシウムを含有する、２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を調製した。この緩衝液１ｍｌに対してＦＰＯＸ−ＣＥ（キッコーマン社製）を３３７Ｕ添加して凍結乾燥した。この凍結乾燥粉末について３７℃、２週間の虐待を行い、虐待前後の酵素活性を比較し、金属塩類の安定化の効果を評価した。結果は、表１、ｅｎｔｒｙ６に示す通り、虐待前の酵素活性と比較して、５７％の活性を維持していることがわかった。すなわち、塩化カルシウムを添加し凍結乾燥することにより、ＦＰＯＸ−ＣＥ凍結乾燥製剤の保存安定性がわずかではあるが向上することがわかった。
【実施例６】
【００３１】
（ＥＤＴＡ・２ＮａとL-グルタミン酸ナトリウムの共存効果）
５ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａと１０７ｍＭのL-グルタミン酸ナトリウムを含有する、２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を調製した。この緩衝液１ｍｌに対してＦＰＯＸ−ＣＥ（キッコーマン社製）を３３７Ｕ添加して凍結乾燥した。この凍結乾燥粉末について３７℃、２週間の虐待を行い、虐待前後の酵素活性を比較し、キレート試薬とアミノ酸類共存の安定化の効果を評価した。結果は、表１、ｅｎｔｒｙ１２に示す通り、虐待前の酵素活性と比較して、１００％の活性を維持していることがわかった。すなわち、ＥＤＴＡ・２ＮａとL-グルタミン酸ナトリウムを添加し凍結乾燥することにより、ＦＰＯＸ−ＣＥ凍結乾燥製剤の保存安定性が劇的に向上することがわかった。
【００３２】
【表１】
2005245315.tif 000002
【実施例７】
【００３３】
（ＦＰＯＸ−ＥＥに対する各種安定化剤の共存効果）
５３、１３２、および２６４ｍＭ  トレハロースを含有する２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）と２ｍＭ  塩化カルシウムを含有する２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）をそれぞれ調製し、さらに２６４ｍＭ  トレハロースと２ｍＭ  塩化カルシウムを含有する２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を調製した。これらの緩衝液１ｍｌに対してＦＰＯＸ−ＥＥ（キッコーマン社製）を１００Ｕ添加したのち凍結乾燥した。この凍結乾燥粉末について３７℃、２週間の虐待を行い、虐待前後の酵素活性を比較し、各種安定化剤の効果を評価した。結果は、表２、ｅｎｔｒｙ２〜６に示した。一方、安定化剤無添加（コントロール）の試験として、２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌにＦＰＯＸ−ＣＥ（キッコーマン社製）を１００Ｕ添加して凍結乾燥した。この凍結乾燥粉末を３７℃、２週間の虐待を行い、虐待後の酵素活性を測定した。結果は表２、ｅｎｔｒｙ１に示した。
【００３４】
安定化剤無添加の場合（ｅｎｔｒｙ１）、上記と同様の虐待試験をしたところ、ＦＰＯＸ−ＥＥ（キッコーマン社製）の残存活性率は、わずか２４％であった。しかし、２ｍＭ  塩化カルシウム（ｅｎｔｒｙ２）を添加すると、虐待後の酵素活性はｅｎｔｒｙ１の約２倍向上し、またトレハロースを１３２ｍＭ以上添加すると（ｅｎｔｒｙ４、５）、８０％以上の残存活性を示し、ＦＰＯＸ−ＥＥ凍結乾燥製剤が安定化していることがわかった。さらにこれらの安定化剤を組み合わせたところ（ｅｎｔｒｙ６）、残存活性が９６％と、さらに良好な残存活性率を示した。すなわち、トレハロースと塩化カルシウムを同時に添加して凍結乾燥することにより、ＦＰＯＸ−ＥＥ製剤凍結乾燥の保存安定性が劇的に向上することがわかった。
【００３５】
【表２】
2005245315.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明によれば、ＦＰＯＸを凍結乾燥する際の安定化剤として糖以外の試薬を用いることにより、糖化蛋白質測定時に反応系でアマドリ反応を起こさず、バックグラウンドが上昇しない、ＦＰＯＸ凍結乾燥製剤を提供することができ、糖尿病の診断用酵素として測定用キットに容易に利用される。さらに保存・輸送などの際、酵素を長期間安定に保つ事が可能となり、安定性に優れた本発明と共に、保存安定性に優れた臨床診断用キットの開発が可能になる。
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月3日(2005.6.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
従来糖化蛋白質を定量する方法として、例えば、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法（例えば、非特許文献１参照）、硼酸を結合させた固体を詰めたカラムを用いる方法（例えば、非特許文献２参照）、電気泳動を用いる方法（例えば、非特許文献３参照）、抗原抗体反応を利用する方法（例えば、非特許文献４参照）、還元能をテトラゾリウム塩を用いて比色定量する方法（例えば、非特許文献５参照）、チオバルビツール酸を用いて酸化後比色定量する方法（例えば、非特許文献６参照）、糖化アミノ酸オキシダーゼ等の酵素を用いる方法（例えば、特許文献１〜１６参照）等が知られている。また最近、上記方法より精度良く糖化蛋白質を測定する方法として、新しい糖化蛋白質の測定法が開示された（例えば、特許文献１７参照）。この測定方法は、糖化蛋白質を含む試料をプロテアーゼで処理し、糖化蛋白質からフルクトシルペプチドを遊離させ、遊離したフルクトシルペプチドにＦＰＯＸを作用させ、生成物を測定することにより糖化蛋白質を測定する方法であり、短時間かつ簡単な操作で、精度の良い測定方法として注目されている。