(57)【要約】【課題】  ヒトTFIIEα亜鉛結合ドメインの構造的特徴及び機能を見出すこと。【解決手段】  亜鉛結合ドメインを含むタンパク質または該タンパク質と該タンパク質に結合しうる物質との複合体の立体構造を予測する方法であって、(i)表Ａの原子座標または表Ａの原子座標により規定される三次元構造からの距離に関する根平均二乗偏差が0.0096±0.0012オングストロームであり、二面角に関する根平均二乗偏差が0.75±0.09°である原子座標により規定されるヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン又はその一部の三次元構造を用意する工程、及び(ii)(i)の工程で用意した三次元構造を鋳型とするホモロジーモデリングにより、亜鉛結合ドメインを含むタンパク質または該タンパク質と該タンパク質に結合しうる物質との複合体の三次元構造を構築する工程を含む前記方法。【選択図】  図１ｃ
2005245202.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜鉛結合ドメインを含むタンパク質または該タンパク質と該タンパク質に結合しうる物質との複合体の立体構造を予測する方法であって、
(i)表Ａの原子座標または表Ａの原子座標により規定される三次元構造からの距離に関する根平均二乗偏差が0.0096±0.0012オングストロームであり、二面角に関する根平均二乗偏差が0.75±0.09°である原子座標により規定されるヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン又はその一部の三次元構造を用意する工程、及び
(ii)(i)の工程で用意した三次元構造を鋳型とするホモロジーモデリングにより、亜鉛結合ドメインを含むタンパク質または該タンパク質と該タンパク質に結合しうる物質との複合体の三次元構造を構築する工程
を含む前記方法。
【請求項２】
亜鉛結合ドメインを含むタンパク質又はその一部の機能を予測する方法であって、
(i)表Ａの原子座標または表Ａの原子座標により規定される三次元構造からの距離に関する根平均二乗偏差が0.0096±0.0012オングストロームであり、二面角に関する根平均二乗偏差が0.75±0.09°である原子座標により規定されるヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン又はその一部の三次元構造を用意する工程、
(ii) 亜鉛結合ドメインを含むタンパク質の亜鉛結合ドメイン又はその一部の三次元構造を用意する工程、
(iii)
(i)の工程で用意した三次元構造と(ii)の工程で用意した三次元構造の構造アラインメントを行う工程、
(iv)(iii)の工程で行った構造アラインメントの結果、構造類似性があると判定された場合には、(ii)の亜鉛結合ドメインを含むタンパク質又はその一部が、(i)のヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン又はその一部と類似の機能を有すると予測する工程
を含む前記方法。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン又は該ドメインを含むタンパク質が、28位のグルタミン酸、52位のアスパラギン酸、17位のシステイン、20位のシステイン、42位のシステイン及び45位のシステインからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位で、被験物質と相互作用するか否かを解析し、相互作用する場合には、被験物質が転写活性を調節することができると判定することを含む、転写活性を調節することができる物質をスクリーニングする方法。
【請求項４】
亜鉛イオンの存在下で、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン又は該ドメインを含むタンパク質が、28位のグルタミン酸、52位のアスパラギン酸、17位のシステイン、20位のシステイン、42位のシステイン及び45位のシステインからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位で、被験物質と相互作用するか否かを解析する請求項３記載の方法。
【請求項５】
以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のいずれかのタンパク質であるTFIIEαの亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩。
(a)配列番号２のアミノ酸配列において、28位のグルタミン酸からアラニン又はリシンへの置換、17位のシステインからアラニンへの置換、20位のシステインからアラニンへの置換、42位のシステインからアラニンへの置換及び45位のシステインからアラニンへの置換からなる群より選択される少なくとも１つの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、28位のアミノ酸、17位のアミノ酸、20位のアミノ酸、42位のアミノ酸及び45位のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ転写活性が配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型TFIIEαの亜鉛結合ドメインよりも低いタンパク質
(c) 配列番号２のアミノ酸配列において、52位のアスパラギン酸からアラニン又はリシンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(d)(c)のタンパク質のアミノ酸配列において、52位のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ転写活性が配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型TFIIEαの亜鉛結合ドメインよりも高いタンパク質
【請求項６】
以下の(1)〜(8)のいずれかのタンパク質である請求項５記載のTFIIEαの亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩。
(1) 配列番号２のアミノ酸配列において、28位のグルタミン酸からアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(2) 配列番号２のアミノ酸配列において、28位のグルタミン酸からリシンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(3) 配列番号２のアミノ酸配列において、17位のシステインからアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(4) 配列番号２のアミノ酸配列において、20位のシステインからアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(5) 配列番号２のアミノ酸配列において、42位のシステインからアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(6) 配列番号２のアミノ酸配列において、45位のシステインからアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(7) 配列番号２のアミノ酸配列において、52位のアスパラギン酸からアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(8) 配列番号２のアミノ酸配列において、52位のアスパラギン酸からリシンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
【請求項７】
請求項５記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項９】
請求項８記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１０】
請求項７記載のＤＮＡで形質転換した宿主を培養し、培養物からTFIIEαの亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質を採取することを含むTFIIEαの亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質の製造方法。
【請求項１１】
請求項５記載のTFIIEαの亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトTFIIEαの新規な亜鉛結合ドメインの構造的特徴および機能に関し、より詳細には、ヒトTFIIEαの新規な亜鉛結合ドメインの構造的特徴および機能を利用した、タンパク質の立体構造を予測する方法、タンパク質の機能を予測する方法、転写活性を調節することができる物質をスクリーニングする方法、ヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメインの変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物においては、タンパク質をコードする遺伝子の転写開始にはRNAポリメラーゼ（RNA Pol II）および基本転写因子（GTF）であるTFIIA、TFIIB、TFIID、 TFIIE、TFIIFおよびTFIIHが必要である。RNA Pol IIおよびGTFはプロモーターDNA上でアセンブリングされ、前開始複合体(PIC)を形成する(非特許文献1,2)。In vitro転写の再構成系は、PIC形成のための段階的アセンブリーモデルを以下のように提案した。すなわち、TFIIDの構成要素の1つであるTATAボックス結合タンパク質（TBP）が転写開始部位より25-30 bp上流でTATAボックスを認識する。TBP (TFIID)-DNA複合体の形成後、TFIIAおよびTFIIBが入ってくる。その後、RNA Pol IIはTFIIFによって上記複合体中に取り込まれることができる。最終的には、TFIIEおよび TFIIHが上記複合体に組み込まれて、PIC形成が完了する。別のPIC形成モデルとしては、RNA Pol II、GTF、いくつかの転写因子およびメディエーターによってプレアセンブリーされた巨大なホロ酵素がプロモーターDNAに直接結合するというものがある（非特許文献3,4）。PICはプロモーター融解、生成しつつある転写物の最初のホスホジエステル結合の合成、およびプロモータークリアランスを経て活性化される(非特許文献5,6,7)。次に、生産性RNA Pol IIは鎖伸長段階へ進む。
【０００３】
TFIIEは種々のGTF、RNA Pol IIおよびプロモーターDNAと相互作用する（非特許文献8）。TFIIEはTFIIHをPIC中に取り込み(非特許文献9)、TFIIHの酵素活性、すなわちRNA Pol IIの最大サブユニット(CTD)のC末端ドメインのリン酸化、DNA依存性ATPアーゼ活性およびDNAヘリカーゼ活性を調節する（非特許文献5,6,10）。さらに、TFIIEはRNA Pol IIの活性部位の近くに位置し(非特許文献11)、プロモーター融解（非特許文献5,6,10）およびプロモータークリアランス（非特許文献12,13,14）に寄与する。これらのデータは、TFIIEが多機能タンパク質であること、そして転写の開始および開始から鎖伸長への遷移の両方において重要な役割を果たすことを示した。
【０００４】
ヒトTFIIEは、2つの大サブユニット（TFIIEα；57 kDa, 439 aa）および2つの小サブユニット（TFIIEβ; 34 kDa, 291 aa）からなるヘテロ四量体である(非特許文献15,16,17,18)。これらのサブユニットは両方とも数個の特徴的配列および推定上の構造モチーフを有する。非常に重要なタンパク質であるにもかかわらず、構造についての情報はほんの少ししかない。その理由は、構造研究に使用される高濃度ではTFIIEおよび各サブユニットの溶解度が低いということが主として挙げられる。
【非特許文献１】Orphanides, G., Lagrange, T. & Reinberg, D. The general transcription factors of RNA polymerase II. Genes Dev. 10, 2657-2683 (1996).
【非特許文献２】Roeder, R.G. The role of general initiation factors in transcription by RNA polymerase II. Trends Biochem. Sci. 21, 327-335 (1996).
【非特許文献３】Bjorklund, S. & Y.-J. Kim. Mediator of transcriptional regulation. Trends Biochem. Sci. 21, 335-337 (1996).
【非特許文献４】Koleske, A.J. & R.A.Young. The RNA polymerase II holoenzyme and its implication for gene regulation. Trends Biochem. Sci. 20, 113-116 (1995).
【非特許文献５】Lu, H., Flores, O., Weinmann, R. & Reinberg, D. The nonphosphorylated form of RNA polymerase II preferentially  associates with the preinitiation complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10004-10008 (1991).
【非特許文献６】Ohkuma, Y. & Roeder, R.G. Regulation of TFIIH ATPase and kinase activities by TFIIE during active initiation complex formation. Nature 368, 160-163 (1994).
【非特許文献７】Dvir, A., K. et al. A role for ATP and TFIIH in activation of the RNA polymerase II preinitiation complex prior to transcription initiation. J. Biol. Chem. 271, 7245-7248 (1996).
【非特許文献８】Maxon, M.E., Goodrich, J.A. & Tjian, R. Transcription factor IIE binds preferentially to RNA polymerase IIa and recruits TFIIH: a model for promoter clearance. Genes Dev. 8, 515-524 (1994).
【非特許文献９】Flores, O., Lu, H. & Reinberg, D. Factors involved in specific transcription by mammalian RNA polymerase II. J. Biol. Chem. 267, 2786-2793 (1992).
【非特許文献１０】Drapkin, R. et al. Dual role of TFIIH in DNA excision repair and in transcription by RNA polymerase II. Nature 368, 769-772 (1994).
【非特許文献１１】Leuther, K.K., Bushnell, D.A. & Kornberg, R.D. Two-dimensional crystallography of TFIIB- and IIE-RNA polymerase II complexes : Implications for start site selection and initiation complex formation. Cell 85, 773-779 (1996).
【非特許文献１２】Goodrich, J.A. & Tjian, R. Transcription factors IIE and IIH and ATP hydrolysis direct promoter clearance by RNA polymerase II. Cell 77, 145-156 (1994).
【非特許文献１３】Dvir, A., Conaway, R.C. & Conaway, J.W. A role for TFIIH in controlling the activity of early RNA polymerase II elongation complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA  94, 9006-9010 (1997).
【非特許文献１４】Kumar, K.P., Akoulitchev, S. & Reinberg, D. Promoter-proximal stalling results from the inability to recruit transcription factor IIH to the transcription complex and is a regulated event. Proc. Natl. Acad. Sci. USA  95, 9767-9772 (1998).
【非特許文献１５】Ohkuma, Y., Sumimoto, H., Horikoshi, M. & Roeder, R. G. Factors involved in specific transcription by mammalian RNA polymerase II: Purification and characterization of general transcription factor TFIIE. Proc. Natl. Acad. Sci. USA  87, 9163-9167 (1990).
【非特許文献１６】Ohkuma, Y. et al. Structural motifs and potential σ homologies in the large subunit of human general transcription factor TFIIE. Nature 354, 398-402 (1991).
【非特許文献１７】Peterson, M.G. et al. Structure and functional properties of human general transcription factor IIE. Nature 354, 369-373 (1991).
【非特許文献１８】Sumimoto, H. et al. Conserved sequence motifs in the small subunit of human general transcription factor TFIIE. Nature 354, 401-404(1991).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明者らはこのタンパク質の多重機能に焦点をあて、各サブユニット内の構造／機能ドメインを同定しようと試みた。プロテアーゼ限定分解実験は、TFIIEα内にC-x2-C-xn-C-x2-C（xは任意のアミノ酸）配列を含む高度に保存された亜鉛結合領域を見出した（図1a）。この領域は、保存された、基本転写および活性化された転写の両方に十分なN末端側の半分に存在している (Ohkuma, Y., Hashimoto, S., Wang, C.K, Horikoshi,M. & Roeder, R.G. Analysis of the Role of TFIIE in basal transcription and TFIIH-mediated carboxy-terminal domain phosphorylation through structure-function studies of TFIIE-α. Mol. Cell. Biol. 15, 4856-4866 (1995).)。亜鉛リガンドの第3システイン残基が点突然変異したものを分析したところ、TFIIEの転写活性は亜鉛結合に依存することが示された(Maxon, M.E. & Tjian, R. Transcriptional activity of transcription factor IIE is dependent on zinc binding. Proc.Natl.Acad.Sci.USA  91, 9529-9533 (1994).)。同様に、亜鉛結合ドメインの欠失突然変異体は、転写に関してドミナントネガティブ効果を示す（Ohkuma, Y., Hashimoto, S., Wang, C.K, Horikoshi,M. & Roeder, R.G. Analysis of the Role of TFIIE in basal transcription and TFIIH-mediated carboxy-terminal domain phosphorylation through structure-function studies of TFIIE-α. Mol. Cell. Biol. 15, 4856-4866 (1995).）。距離幾何学に基づくホモロジーモデリングは、亜鉛結合ドメインは亜鉛リボン構造をとるであろうと予測した(Qian, X. et al. Novel zinc finger motif in the basal transcriptional machinery: Three-dimensional NMR studies of the nucleic acid binding domain of transcriptional e longation factor TFIIS. Biochemistry  32, 9944-9959 (1993).)。本研究において、本発明者らはヒトTFIIEα亜鉛結合ドメインの溶液構造を決定し、そしてTFIIE機能におけるその役割について構造上の洞察を提供した。
【０００６】
本発明は、ヒトTFIIEαの新規な亜鉛結合ドメインの構造的特徴および機能を見出すことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
基本転写因子TFIIEは、2つの大サブユニット（TFIIEα）および2つの小サブユニット（TFIIEβ）からなるヘテロ四量体である。Cx2CxnCx2Cモチーフを有する高度に保存されたTFIIEα亜鉛結合ドメインは、転写活性に必要である。このドメインは亜鉛リボン構造を形成することが予測されていた。しかし、本発明者らが決定した構造は、亜鉛リボンとも他の亜鉛結合構造とも驚くほど違っている。新規な構造の機能を明らかにするため、本発明者らは転写活性ならびにTFIIEβおよび他の基本転写因子との結合能について全長TFIIEαの突然変異分析を実施した。興味深いことに、システイン→アラニン点突然変異、すなわち亜鉛結合部位のC129A、C132A、C154AおよびC157Aは、両方のアッセイにおいて非対称性を示した。Zn2+-リガンドを突然変異させた亜鉛結合ドメインのCD、NMRおよびEDTA滴定実験は、これらのドメインが、Zn2+と配位結合することのできるそれら自身の部分的に折りたたまれた構造を有していて、これがランダムコイル構造と様々な程度に平衡化していることを明らかにした。構造の安定性がリガンドの位置に依存することは、上記の非対称性を説明する。本発明者らの生化学的データおよび構造データ、ならびに以前に報告された結果を総合的に考えて、本発明者らは亜鉛結合ドメインの役割を関連づけた。本発明はこれらの知見に基づいて、完成されたものである。
【０００８】
本発明の要旨は以下の通りである。
〔１〕  亜鉛結合ドメインを含むタンパク質または該タンパク質と該タンパク質に結合しうる物質との複合体の立体構造を予測する方法であって、
(i)表Ａの原子座標または表Ａの原子座標により規定される三次元構造からの距離に関する根平均二乗偏差が0.0096±0.0012オングストロームであり、二面角に関する根平均二乗偏差が0.75±0.09°である原子座標により規定されるヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン又はその一部の三次元構造を用意する工程、及び
(ii)(i)の工程で用意した三次元構造を鋳型とするホモロジーモデリングにより、亜鉛結合ドメインを含むタンパク質または該タンパク質と該タンパク質に結合しうる物質との複合体の三次元構造を構築する工程
を含む前記方法。
〔２〕  亜鉛結合ドメインを含むタンパク質又はその一部の機能を予測する方法であって、
(i)表Ａの原子座標または表Ａの原子座標により規定される三次元構造からの距離に関する根平均二乗偏差が0.0096±0.0012オングストロームであり、二面角に関する根平均二乗偏差が0.75±0.09°である原子座標により規定されるヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン又はその一部の三次元構造を用意する工程、
(ii) 亜鉛結合ドメインを含むタンパク質の亜鉛結合ドメイン又はその一部の三次元構造を用意する工程、
(iii) (i)の工程で用意した三次元構造と(ii)の工程で用意した三次元構造の構造アラインメントを行う工程、
(iv)(iii)の工程で行った構造アラインメントの結果、構造類似性があると判定された場合には、(ii)の亜鉛結合ドメインを含むタンパク質又はその一部が、(i)のヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン又はその一部と類似の機能を有すると予測する工程
を含む前記方法。
〔３〕  配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン又は該ドメインを含むタンパク質が、28位のグルタミン酸、52位のアスパラギン酸、17位のシステイン、20位のシステイン、42位のシステイン及び45位のシステインからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位で、被験物質と相互作用するか否かを解析し、相互作用する場合には、被験物質が転写活性を調節することができると判定することを含む、転写活性を調節することができる物質をスクリーニングする方法。
〔４〕  亜鉛イオンの存在下で、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン又は該ドメインを含むタンパク質が、28位のグルタミン酸、52位のアスパラギン酸、17位のシステイン、20位のシステイン、42位のシステイン及び45位のシステインからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位で、被験物質と相互作用するか否かを解析する〔３〕記載の方法。
〔５〕  以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のいずれかのタンパク質であるTFIIEαの亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩。
(a)配列番号２のアミノ酸配列において、28位のグルタミン酸からアラニン又はリシンへの置換、17位のシステインからアラニンへの置換、20位のシステインからアラニンへの置換、42位のシステインからアラニンへの置換及び45位のシステインからアラニンへの置換からなる群より選択される少なくとも１つの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、28位のアミノ酸、17位のアミノ酸、20位のアミノ酸、42位のアミノ酸及び45位のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ転写活性が配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型TFIIEαの亜鉛結合ドメインよりも低いタンパク質
(c) 配列番号２のアミノ酸配列において、52位のアスパラギン酸からアラニン又はリシンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(d)(c)のタンパク質のアミノ酸配列において、52位のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ転写活性が配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型TFIIEαの亜鉛結合ドメインよりも高いタンパク質
〔６〕  以下の(1)〜(8)のいずれかのタンパク質である〔５〕記載のTFIIEαの亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩。
(1) 配列番号２のアミノ酸配列において、28位のグルタミン酸からアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(2) 配列番号２のアミノ酸配列において、28位のグルタミン酸からリシンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(3) 配列番号２のアミノ酸配列において、17位のシステインからアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(4) 配列番号２のアミノ酸配列において、20位のシステインからアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(5) 配列番号２のアミノ酸配列において、42位のシステインからアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(6) 配列番号２のアミノ酸配列において、45位のシステインからアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(7) 配列番号２のアミノ酸配列において、52位のアスパラギン酸からアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(8) 配列番号２のアミノ酸配列において、52位のアスパラギン酸からリシンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
〔７〕  〔５〕記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
〔８〕  〔７〕記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
〔９〕  〔８〕記載の組換えベクターを含む形質転換体。
〔１０〕  〔７〕記載のＤＮＡで形質転換した宿主を培養し、培養物からTFIIEαの亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質を採取することを含むTFIIEαの亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質の製造方法。
〔１１〕  〔５〕記載のTFIIEαの亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩に対する抗体。
【０００９】
本明細書において、「TFIIE」とは、真核生物おいて、タンパク質をコードした遺伝子の転写を行うRNAポリメラーゼIIの補助因子である６種の基本転写因子とよばれるタンパク質のうちの１つをいう。
【００１０】
「TFIIEα」とは、２種のサブユニット、α、βの各２個からなるα２β２のヘテロ４量体であるTFIIEの構成サブユニットのうち、大きなαサブユニットをいう。
【００１１】
「TFIIEαの亜鉛結合ドメイン」及び「TFIIEα亜鉛結合ドメイン」とは、TFIIEα内で亜鉛イオンを配位する４つのシステインのシステイン-x2-システイン-xn-システイン-x2-システイン（xは任意のアミノ酸）配列を含み特定の立体構造を有する領域をいう。
【００１２】
「変異体タンパク質」とは、基準となるタンパク質と異なるが、基準となるタンパク質の不可欠な性質を保持しているタンパク質を意味する。典型的な変異体タンパク質は、基準となるタンパク質とアミノ酸配列が相違する。
【００１３】
「抗体」とは、抗原刺激の結果、免疫反応によって生体内に誘導されるタンパク質で、免疫原（抗原）と特異的に結合する活性を有するものを意味し、これには、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらには、Fab又はFabフラグメントなどが含まれる。
【００１４】
「相互作用」とは、２つ以上の物体（例えば、原子、分子）の間に力が働きあうことをいう。相互作用としては、親水性の相互作用（例えば、水素結合、塩橋）、疎水性の相互作用（例えば、疎水結合）、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用などを例示することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、TFIIEαの亜鉛結合ドメインと類似の配列及び／又は構造を有するタンパク質の立体構造及び機能が予測できるようになった。
【００１６】
また、本発明により、転写活性を調節することができる物質をスクリーニングすることができるようになった。
【００１７】
さらに、本発明により、転写活性が野生型ヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメインよりも低い、あるいは高い変異体が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明をより詳細に説明する。
１．ホモロジーモデリングによる、亜鉛結合ドメインを含むタンパク質又はその複合体の立体構造の予測
本発明は、亜鉛結合ドメインを含むタンパク質または該タンパク質と該タンパク質に結合しうる物質との複合体の立体構造を予測する方法であって、
(i)表Ａの原子座標または表Ａの原子座標により規定される三次元構造からの距離に関する根平均二乗偏差が0.0096±0.0012オングストロームであり、二面角に関する根平均二乗偏差が0.75±0.09°である原子座標により規定されるヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン又はその一部の三次元構造を用意する工程、及び
(ii)(i)の工程で用意した三次元構造を鋳型とするホモロジーモデリングにより、亜鉛結合ドメインを含むタンパク質または該タンパク質と該タンパク質に結合しうる物質との複合体の三次元構造を構築する工程
を含む前記方法を提供する。
【００１９】
ホモロジーモデリングとは、構造未知のタンパク質の構造を、類似の配列を持つ構造既知のタンパク質（鋳型）を元に予測する手法である。
【００２０】
ホモロジーモデリングでは、まず、構造データベースから類似の配列を検索し、配列のアラインメントを行う。次に、アラインメントした鋳型の配列から、対応する部分の構造を選び出して予測構造を構築する。ホモロジーモデリングには、フラグメントに基づく方法と制約条件に基づく方法がある。
【００２１】
ホモロジーモデリングを実施するためのウェブサイトとしては、MODELLER(ウェブアドレス：http://guitar.rockefeller.edu/moduller/moduller.html、文献：Sali et al. (1995) Proteins 23:318-326)、SWISS-MODEL(ウェブアドレス：http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html、文献：Peitsch (1996) Biochem. Soc. Trans. 24:274-279)、WHAT IF(ウェブアドレス：http://www.cmbi.kun.nl/whatif/、文献：Rodriguez et al. (1998) Bioinfomatics 14: 523-528)があり、これらを利用することができる。
【００２２】
さらに、これらのウェブサイトによって解析され、重ね合わされた配列の分子の距離、角度、スレッディング、エネルギーの最小化の計算をSwiss-PdbViewer(ウェブアドレス：http://www.expasy.ch/spdbv/mainpage.html、文献：Guex and Peitsch, 1977, Electrophoresis 18: 2714-2723)により行ない、タンパク質モデルを作成することができる。
【００２３】
ホモロジーモデリングは、構造既知のタンパク質と２５〜３０％程度以上の配列の類似性があると有効である。
【００２４】
従って、本発明の立体構造予測法は、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、２５〜３０％程度以上の配列の類似性があるタンパク質又はその複合体の立体構造の予測に有効である。
【００２５】
亜鉛結合ドメインを含むタンパク質としては、TFIIEα、TFIIB、RNAポリメラーゼII、TFIISなどを例示することができる。TFIIEαに結合しうる物質としては、TFIIEβ、TFIIF、TFIIH、RNAポリメラーゼIIなどを例示することができる。TFIIBやTFIISの亜鉛結合ドメインは、RNAポリメラーゼIIに結合しうる。
【００２６】
２．亜鉛結合ドメインを含むタンパク質又はその一部の機能の予測
本発明は、亜鉛結合ドメインを含むタンパク質又はその一部の機能を予測する方法であって、
(i)表Ａの原子座標または表Ａの原子座標により規定される三次元構造からの距離に関する根平均二乗偏差が0.0096±0.0012オングストロームであり、二面角に関する根平均二乗偏差が0.75±0.09°である原子座標により規定されるヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン又はその一部の三次元構造を用意する工程、
(ii) 亜鉛結合ドメインを含むタンパク質の亜鉛結合ドメイン又はその一部の三次元構造を用意する工程、
(iii) (i)の工程で用意した三次元構造と(ii)の工程で用意した三次元構造の構造アラインメントを行う工程、
(iv)(iii)の工程で行った構造アラインメントの結果、構造類似性があると判定された場合には、(ii)の亜鉛結合ドメインを含むタンパク質又はその一部が、(i)のヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン又はその一部と類似の機能を有すると予測する工程
を含む前記方法を提供する。
【００２７】
以下、(i)のヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン又はその一部を「参照タンパク質」、(ii)の亜鉛結合ドメインを含むタンパク質の亜鉛結合ドメイン又はその一部を「問い合わせタンパク質」と記すこともある。
【００２８】
問い合わせタンパク質の三次元構造座標は、X線結晶構造解析や核磁気共鳴（NMR)などの手法により得られたものであってもよいし、既にデータベース（ブルックヘブンタンパク質データバンク（PDB)）に登録されているものであってもよい。PDBファイルはPDBのウェブサイト（http://www.rcsb.org/pdb/）から容易に入手できる。
【００２９】
構造アラインメントを行う際には、１つのタンパク質ドメインの三次元構造を別のタンパク質ドメインの三次元構造の上に重ね合わせ、原子同士をできるだけ近くに合わせてそれらの間のずれの平均が最小になるようにする。タンパク質の構造比較を行うための方法は、Blundel and Johonson, 1993, Protein Sci. 2:877-883; Holm and Sander, 1994, J. Mol. Biol. 233: 123-138; Holm and Sander,1996, Science 273: 595-603; Alexandrov and Fischer, 1996, Proteins 25: 354-365; Gibrat et al. 1996, Curr. Opin. Struct. Biol. 6:377-385; Orengo and Taylor, 1996, Methods Enzymol. 266:617-635に紹介されている。また、タンパク質の構造比較を行うためのプログラムとしては、SSAP（Orengo and Taylor, 1996, Methods Enzymol. 266:617-635）, DALI（Vriend and Sander, 1991, Proteins 11: 52-68）などがある。構造アラインメントの結果、一致した領域の座標が得られる。アラインメントされた領域は、RasMol, Cn3D, Swiss-PbdViewerなどの分子表示プログラムで表示するとよい。
【００３０】
構造アラインメントの結果、参照タンパク質（すなわち、(i)のヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン又はその一部）と構造類似性があると判定された場合には、問い合わせタンパク質（すなわち、(ii)の亜鉛結合ドメインを含むタンパク質又はその一部）が、参照タンパク質と類似の機能を有すると予測する。
【００３１】
参照タンパク質（すなわち、(i)のヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン又はその一部）の機能としては、転写活性を制御する作用、他因子との相互作用などの他、抗原としての活性、免疫原としての活性などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００３２】
亜鉛結合ドメインを含むタンパク質としては、TFIIEα、TFIIB、RNAポリメラーゼII、TFIISなどを例示することができる。
【００３３】
３．スクリーニング方法
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン又は該ドメインを含むタンパク質が、28位のグルタミン酸、52位のアスパラギン酸、17位のシステイン、20位のシステイン、42位のシステイン及び45位のシステインからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位で、被験物質と相互作用するか否かを解析し、相互作用する場合には、被験物質が転写活性を調節することができると判定することを含む、転写活性を調節することができる物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明の方法において、亜鉛イオンの存在下で、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン又は該ドメインを含むタンパク質が、28位のグルタミン酸、52位のアスパラギン酸、17位のシステイン、20位のシステイン、42位のシステイン及び45位のシステインからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位で、被験物質と相互作用するか否かを解析してもよい。
【００３４】
配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメインを含むタンパク質としては、ヒトTFIIEαを例示することができる。野生型ヒトTFIIEαのアミノ酸配列を配列番号１９に示す。
【００３５】
配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン又は該ドメインを含むタンパク質が、28位のグルタミン酸、52位のアスパラギン酸、17位のシステイン、20位のシステイン、42位のシステイン及び45位のシステインからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位で、被験物質と相互作用するか否かを解析するには、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、中性子回折などの立体構造解析、電子顕微鏡や原子間力顕微鏡などの複合体の形状を観察する方法や配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメインの立体構造に対する任意の構造の被験物質との安定な結合様式をコンピュータでシュミレートするドッキングスタディなどの手法、本発明者らがこの明細書において開示するヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメインの立体構造との類似性に基づく判断を用いることができる。
【００３６】
転写活性を調節することができる物質は、転写が関与する疾患（例えば、癌、リウマチ、生活習慣病、遺伝病など）の予防及び／又は治療に利用することができる。
【００３７】
４．TFIIEαの亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質
本発明は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のいずれかのタンパク質であるTFIIEαの亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩を提供する。
(a)配列番号２のアミノ酸配列において、28位のグルタミン酸からアラニン又はリシンへの置換、17位のシステインからアラニンへの置換、20位のシステインからアラニンへの置換、42位のシステインからアラニンへの置換及び45位のシステインからアラニンへの置換からなる群より選択される少なくとも１つの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質。
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、28位のアミノ酸、17位のアミノ酸、20位のアミノ酸、42位のアミノ酸及び45位のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ転写活性が配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型TFIIEαの亜鉛結合ドメインよりも低いタンパク質。
(c) 配列番号２のアミノ酸配列において、52位のアスパラギン酸からアラニン又はリシンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質。
(d)(c)のタンパク質のアミノ酸配列において、52位のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ転写活性が配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型TFIIEαの亜鉛結合ドメインよりも高いタンパク質。
【００３８】
(a)及び(c)のTFIIEαの亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質としては、以下の(1)〜(8)のタンパク質を例示することができる。
(1) 配列番号２のアミノ酸配列において、28位のグルタミン酸からアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質。
(2) 配列番号２のアミノ酸配列において、28位のグルタミン酸からリシンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質。
(3) 配列番号２のアミノ酸配列において、17位のシステインからアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質。
(4) 配列番号２のアミノ酸配列において、20位のシステインからアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質。
(5) 配列番号２のアミノ酸配列において、42位のシステインからアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質。
(6) 配列番号２のアミノ酸配列において、45位のシステインからアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質。
(7) 配列番号２のアミノ酸配列において、52位のアスパラギン酸からアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質。
(8) 配列番号２のアミノ酸配列において、52位のアスパラギン酸からリシンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質。
【００３９】
(1)のタンパク質（以下、「E140A」と記すこともある。）のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００４０】
(2)のタンパク質（以下、「E140K」と記すこともある。）のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００４１】
(3)のタンパク質（以下、「C129A」と記すこともある。）のアミノ酸配列を配列番号１２に示す。
【００４２】
(4)のタンパク質（以下、「C132A」と記すこともある。）のアミノ酸配列を配列番号１４に示す。
【００４３】
(5)のタンパク質（以下、「C154A」と記すこともある。）のアミノ酸配列を配列番号１６に示す。
【００４４】
(6)のタンパク質（以下、「C157A」と記すこともある。）のアミノ酸配列を配列番号１８に示す。
【００４５】
(7)のタンパク質（以下、「D164A」と記すこともある。）のアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【００４６】
(8)のタンパク質（以下、「D164K」と記すこともある。）のアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
【００４７】
(b)及び(d)のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質としては、ヒト以外の生物（例えば、ヒト以外の哺乳類（例えば、マウス）、両生類（例えば、アフリカツメガエルなど）、昆虫（例えば、ショウジョウバエなど）、線形動物（例えば、線虫など）などの動物、菌類（例えば、分裂酵母、出芽酵母など）など）に由来するTFIIEα亜鉛結合ドメインの変異体、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のアミノ酸配列のN末端（すなわち、1位）にメチオニンが付加したアミノ酸配列、２個以上の余分なアミノ酸残基が付加したアミノ酸配列又はHisタグなどの余分なアミノ酸配列が付加したアミノ酸配列を有するタンパク質などを例示することができる。
【００４８】
本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質は、ヒト由来の野生型TFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体の変異体であっても、ヒト以外の生物（例えば、ヒト以外の哺乳類（例えば、マウス）、両生類（例えば、アフリカツメガエルなど）、昆虫（例えば、ショウジョウバエなど）、線形動物（例えば、線虫など）などの動物、菌類（例えば、分裂酵母、出芽酵母など）など）由来の野生型TFIIEα亜鉛結合ドメインの変異体であってもよい。
【００４９】
野生型ヒトTFIIEαのアミノ酸配列を配列番号１９に示す。配列番号１９のアミノ酸配列において、113位から174位までが亜鉛結合ドメインである。配列番号２のアミノ酸配列は、配列番号１９のアミノ酸配列における113位のアルギニンから174位のアルギニンまでの断片である。配列番号２のアミノ酸配列における17, 20, 28, 42, 45及び52位のアミノ酸部位は、それぞれ、配列番号１９のアミノ酸配列における129, 132, 140, 154, 157及び164位のアミノ酸部位に相当する。
【００５０】
本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質及びその塩は、公知の方法によって製造することができる。例えば、後述の５に記載のようにして、TFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質をコードするＤＮＡを得、得られたＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込んだ後、適当な宿主に導入し、組換え蛋白質として生産させることにより、TFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質を製造することができる（例えば、西郷薫、佐野弓子共訳、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳコンパクト版、分子生物学実験プロトコール、Ｉ、II、III、丸善株式会社：原著、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【００５１】
あるいはまた、本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質及びその塩は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
【００５２】
本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質は公知の方法により塩の形で得ることもできる。
【００５３】
本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質の塩は、薬理学的に許容される塩であるとよく、特に、薬理学的に許容される酸付加塩が好ましい。薬理学的に許容される酸付加塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などを例示することができる。
【００５４】
５．TFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質をコードするＤＮＡ
本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質をコードするＤＮＡは、本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７のいずれかの塩基配列を有するＤＮＡを例示することができる。
【００５５】
本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、以下のようにして製造することができる。
【００５６】
野生型ヒトTFIIEαは、ヒト培養細胞であるHeLa細胞から転写活性を指標に精製したTFIIE(Ohkuma, Y. et al., Proc Natl Acad Sci USA. 87, 9163-9167, 1990)から逆相高速液体クロマトグラフィーにより２つのサブユニットαとβを分離精製し、そのうちαサブユニットの方を限定分解して得られたペプチド断片のアミノ酸配列を基に、PCRでcDNAの部分配列を増幅した後に、ヒトNAM細胞cDNAライブラリーをスクリーニングすることでその全長cDNAを単離する(Ohkuma, Y. et al., Nature, 354, 398-401, 1991) 。このヒトTFIIEαcDNAは、pBluescriptII-SK(-)に組み込まれており、そのタンパク質コード領域の289番目と290番目のコドンにまたがってNdeI切断部位を持っているため、アミノ酸に変異を入れない形でこの部位を潰して、N末端に新たにNdeI認識部位を、またC末のストップコドンの3'下流にBamHI認識部位を作成する目的で、Mutan-K変異導入キット(TaKaRa)を用い、変異を導入する。これをNdeI認識部位とBamHI認識部位で切り出し、N末側に6個のヒスチジン残基を付加した6Hisタグ融合蛋白質を発現できるpET-11dベクター（Novagen）に組み込み、野生型ヒトTFIIEα発現プラスミドとする。
【００５７】
亜鉛結合ドメインの変異体（E140A, E140K, D164A, D164K, C129A, C132A, C154A, C157A）も、各々のアミノ酸に変異を入れるためのオリゴDNAを合成し、これらと上記のMutan-K変異導入キット(TaKaRa)を用い、pBluescriptII-SK(-)に組み込まれた形の野生型ヒトTFIIEαに変異を導入して、これも上記のようにNdeI認識部位とBamHI認識部位で切り出し、N末側に6個のヒスチジン残基を付加した6Hisタグ融合蛋白質を発現できるpET-11dベクター（Novagen）に組み込む。
【００５８】
配列番号２のアミノ酸配列において、28位のグルタミン酸からアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質（E140A）をコードするＤＮＡの塩基配列の一例を配列番号３に示す。配列番号２のアミノ酸配列において、28位のグルタミン酸からリシンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質(E140K)をコードするＤＮＡの塩基配列の一例を配列番号５に示す。配列番号２のアミノ酸配列において、17位のシステインからアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質(C129A)をコードするＤＮＡの塩基配列の一例を配列番号１１に示す。配列番号２のアミノ酸配列において、20位のシステインからアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質(C132A)をコードするＤＮＡの塩基配列の一例を配列番号１３に示す。配列番号２のアミノ酸配列において、42位のシステインからアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質(C154A)をコードするＤＮＡの塩基配列の一例を配列番号１５に示す。配列番号２のアミノ酸配列において、45位のシステインからアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質(C157A)をコードするＤＮＡの塩基配列の一例を配列番号１７に示す。配列番号２のアミノ酸配列において、52位のアスパラギン酸からアラニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質(D164A)をコードするＤＮＡの塩基配列の一例を配列番号７に示す。配列番号２のアミノ酸配列において、52位のアスパラギン酸からリシンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質(D164K)をコードするＤＮＡの塩基配列の一例を配列番号９に示す。
【００５９】
６．組換えベクター
本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターは、公知の方法（例えば、Molecular Cloning２nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法）により、本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入することにより得られる。
【００６０】
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫病原ウイルスなどを用いることができる。
【００６１】
発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジンなどを付加してもよい。
【００６２】
また、発現ベクターは、融合タンパク質発現ベクターであってもよい。種々の融合タンパク質発現ベクターが市販されており、pGEXシリーズ（アマシャムファルマシアバイオテク社）、pET CBD Fusion System 34b-38b（Novagen社）、pET Dsb Fusion Systems 39b and 40b（Novagen社）、pET GST Fusion System 41 and 42（Novagen社）などを例示することができる。
【００６３】
７．形質転換体
本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターを宿主に導入することにより、形質転換体を得ることができる。
【００６４】
宿主としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、S2細胞、Sf細胞など）、動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、HEK293細胞など）、植物細胞などを例示することができる。
【００６５】
組換えベクターを宿主に導入するには、Molecular Cloning２nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法（例えば、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、トランスベクション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、エレクロトポレーション法、形質導入法、スクレープローディング法、ショットガン法など）または感染により行うことができる。
【００６６】
形質転換体を培地で培養し、培養物からTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質を採取することができる。TFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質が培地に分泌される場合には、培地を回収し、その培地からTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質を分離し、精製すればよい。TFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質が形質転換された細胞内に産生される場合には、その細胞を溶解し、その溶解物からTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質を分離し、精製すればよい。
【００６７】
TFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質が別のタンパク質（タグとして機能する）との融合タンパク質の形態で発現される場合には、融合タンパク質を分離及び精製した後に、FactorXaや酵素（エンテロキナーゼ）処理をすることにより、別のタンパク質を切断し、目的とするTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質を得ることができる。
【００６８】
TFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質の分離及び精製は、公知の方法により行うことができる。公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００６９】
８．抗体
本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩に対する抗体は、本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩の検出及び／又は定量に利用することができる。
【００７０】
本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩またはそのエピトープを含む断片を動物に投与することにより得られる。
【００７１】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体のいずれであってもよい。
【００７２】
ポリクローナル抗体を作製するには、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、動物に投与（免疫）を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、免疫動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。ポリクローナル抗体の分離精製は、免疫グロブリンの分離精製法（例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法）に従って行なうことができる。
【００７３】
モノクローナル抗体は、Nature (1975) 256: 495、Science (1980) 208: 692-に記載されている、G. Koehler及びC. Milsteinのハイブリドーマ法により作製することができる。すなわち、動物を免疫した後、免疫動物の脾臓から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞と融合させることによりモノクローナル抗体産生細胞を調製する。さらに、インターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩と特異的に反応するが、他の抗原タンパク質とは実質的に交差反応しない抗体を産生する細胞系を単離するとよい。この細胞系を培養し、培養物から所望のモノクローナル抗体を取得することができる。モノクローナル抗体の精製は、上記の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００７４】
一本鎖抗体を作製する技法は、米国特許第4,946,778号に記載されている。
【００７５】
ヒト化抗体を作製する技法は、Biotechnology 10, 1121-, 1992; Biotechnology 10, 169-, 1992に記載されている。
【００７６】
９．TFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩の用途
本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質及びその塩は、TFIIEαが関与する事象（例えば、転写活性、TFIIEβ及び他の基本転写因子への結合など）の制御に利用することができる。例えば、本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質及びその塩を利用して、転写が関与する疾患（例えば、癌、リウマチ、生活習慣病、遺伝病など）の予防及び／又は治療を行うことができるかもしれない。また、本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質及びその塩を利用して、転写のメカニズムを解明することができるかもしれない。
【００７７】
本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質及びその塩は、疾患の予防及び／又は治療を目的とする医薬品として、あるいは、実験用の試薬として利用することができる。
【実施例】
【００７８】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７９】
構造の記述
N末端の12残基およびC末端の11残基は、距離制限が少なかっため収束しなかった。実際、1H-15N ヘテロ核NOE および15N-T1、T2 値は、これらの領域における主鎖のフレキシビリティーを明らかにした（データ省略）。しかし、残りの40個のアミノ酸だけで、6本のβ鎖および1本の短いαヘリックスからなるコンパクトな構造を設計することが可能である（図1bおよび1c）；S1鎖 (126-129aa)、t1 ターン (130-133aa)、S2 鎖 (134-136aa)、αヘリックス (138-142aa)、S3鎖 (144-146aa)、ループ (147-150aa)、S4鎖(151-154aa)、 t2ターン (155-158aa)、S5 鎖 (159-161aa)、S6 鎖 (162-164aa)。S1、S2、S6 鎖およびS3、S4、S5鎖は、それぞれ逆平行βシートを形成する。αヘリックスによって隔てられた2つのβシートは、トポロジー図(図1d)におけるシステイン残基の位置も含めて等しい。このコンホメーションにおいて6本のβ鎖はαヘリックスを直径として半円を描く。Zn2+は、t1ターンで129Cおよび132Cと、t2ターンで154Cおよび157Cと配位結合する。H-D交換実験において、131V、132C、156Fおよび157Cのアミドプロトンの交換速度は比較的遅かった。構造から判断すると、おそらく129C:Sγ-131V:HN, -132 C:HN および 154C:Sγ-156F:HN, -157C:HN にそれぞれ水素結合が形成されているのであろう（図1e）。これらの二またに分かれる水素結合は、多くのジンクフィンガードメインに観察される、i残基のSγとi+2, i+3残基のHNとの間の水素結合パターンと一致している(Qian, X. et al. Novel zinc finger motif in the basal transcriptional machinery: Three-dimensional NMR studies of the nucleic acid binding domain of transcriptional elongation factor TFIIS. Biochemistry  32, 9944-9959 (1993).; Zhu, W. et al. The N-terminal domain of TFIIB from Pyrococcus furiosus forms a zinc ribbon. Nat. Struct. Biol. 3, 122-124 (1996).; Wang, B., Jones, D.N., Kaine, B.P. & Weiss, M.A. High-resolution structure of an archaeal zinc ribbon defines a general architectural motif in eukaryotic RNA polymerases. Structure 6, 555-569 (1998).; Chen, H.T., Legault, P., Glushka, J., Omichinski, J.G. & Scott, R.A. Structure of a (Cys3His) zinc ribbon, a ubiquitous motif in archaeal and eucaryal transcription. Protein Sci. 9, 1743-1752 (2000).)。アミドプロトンの殆ど全部が40分以内にジュウテリウムと交換された。そのため、H-D交換実験では水素結合の情報は殆ど得られなかった。幸運なことに、本発明者らはトランス水素結合3hJNC’結合を測定することによって、βシート中のより多数の水素結合を直接観察することができた(Cordier, F. & Grzesiek, S. Direct observation of hydrogen bonds in proteins by interresidue 3hJNC' Scalar Couplings. J. Am. Chem. Soc. 121, 1601-1602 (1999).; Cornilescu, G., Hu, J-S. & Bax, A. Identification of the hydrogen bonding network in a protein by scalar couplings. J. Am. Chem. Soc. 121, 2949-2950(1999).)。
現在の構造は、このような短い領域であるにもかかわらず、いかに構造が維持されうるかを説明することができる。Zn2+と4つのシステインとの配位結合、および補助的な2つの分岐した水素結合は、t1およびt2ターンを厳密に固定する。これが、2つの逆平行βシートをαヘリックスの片側に近づける。各二次構造中の疎水性アミノ酸によって疎水性コアが形成される（図1f）。この疎水性コア内では、5個のフェニルアラニン残基が相互に積み重ねられ、L字形に配置されている。芳香族-芳香族相互作用ネットワークは、構造の安定化に著しく寄与する。それらの他に、141A、144L および161V等の疎水性アミノ酸もまた疎水性コアの形成に重要である。TFIIEα亜鉛結合ドメインは、疎水性コアに関与する残基および亜鉛結合部位の4つのシステイン残基も含めて、高度に保存されている（図1a）。分子表面の静電ポテンシャルは、この亜鉛結合ドメインが、保存された138D、160E、162E、163E、164Dおよび165E（これらは亜鉛結合部位の反対側のくぼんだ表面の広い範囲に位置している）からなる陰性ポテンシャルクラスターを有することを示している（図1g）。これらの観察は、ホモローグ中の亜鉛結合ドメインの構造がヒトTFIIEαのそれと類似しているであろうことを強く示唆している。
【００８０】
亜鉛結合モチーフの新規な構造
TFIIEα亜鉛結合ドメインは、転写伸長因子TFIIS (TFIISc)のC末端ドメイン（Qian, X. et al. Novel zinc finger motif in the basal transcriptional machinery: Three-dimensional NMR studies of the nucleic acid binding domain of transcriptional elongation factor TFIIS. Biochemistry  32, 9944-9959 (1993).; Olmsted, V.K. et al. Yeast transcript elongation factor (TFIIS), structure and function. J. Biol. Chem. 273, 22589-22594 (1998).）、 TFIIB (TFIIBn) のN末端ドメイン（Zhu, W. et al. The N-terminal domain of TFIIB from Pyrococcus furiosus forms a zinc ribbon. Nat. Struct. Biol. 3, 122-124 (1996).; Chen, H.T., Legault, P., Glushka, J., Omichinski, J.G. & Scott, R.A. Structure of a (Cys3His) zinc ribbon, a ubiquitous motif in archaeal and eucaryal transcription. Protein Sci. 9, 1743-1752 (2000).）およびRNA Pol IIのRPB9サブユニットのC末端ドメイン(RPB9c)( Wang, B., Jones, D.N., Kaine, B.P. & Weiss, M.A. High-resolution structure of an archaeal zinc ribbon defines a general architectural motif in eukaryotic RNA polymerases. Structure 6, 555-569 (1998).; Cramer, P., Bushnell, D.A. & Kornberg, R.D. Structural basis of transcription: RNA polymerase II at 2.8 angstrom resolution. Science 292, 1863-1875 (2001).; Gnatt, A.L., Cramer, P., Fu, J., Bushnell, D.A., & Kornberg, R.D. Structural basis of transcription: An RNA polymerase II elongation complex at 3.3 Å resolution. Science 292, 1876-1882 (2001).)に観察されるように、亜鉛リボン構造を形成していると予測されていた。驚くべきことに、TFIIEα亜鉛結合ドメインは亜鉛リボン構造とは全く異なっている（図2a）。TFIISc、TFIIBnおよび RPB9cのトポロジーは、それぞれβββ、βββおよびββββ（β：β鎖）であり、これらは逆平行βシートを形成している。他方、TFIIEα亜鉛結合ドメインのトポロジーはより複雑である。それはββαββββ（α：αヘリックス）で、2つの逆平行βシートおよび1つのαヘリックスを形成している。他方、これらの亜鉛結合部位は互いによく似ている（図2b）。2つのターン（CxxCxxおよびCxxCxx、12aa領域）の主鎖を比較すると、TFIIEα亜鉛結合ドメインのTFIISc、TFIIBnおよび RPB9cに対する根平均二乗偏差（rmsd）はそれぞれ0.87Å、1.05Åおよび0.72Åである。本発明者らは類似構造の検索を試みたが、DALIサーバーを用いた検索では類似構造は検出されなかった(Holm, L. & Sander, C. Protein structure comparison by alignment of distance matrices. J. Mol. Biol. 233, 123-138 (1993).)。したがって、TFIIEα亜鉛結合ドメインは新しい種類の亜鉛結合構造に分類されるべきである。
【００８１】
突然変異分析
亜鉛結合ドメインの機能を明らかにするために、陰性ポテンシャル表面に位置する高度に保存された2つのアミノ酸、すなわち140Eおよび164Dをそれぞれアラニンまたはリシンに突然変異させ（E140A、E140K、D164A、D164K)、そして4つのZn2+リガンドのそれぞれをシステインからアラニンへ突然変異させた (C129A、C132A、 C154A、C157A)。本発明者らは超コイル鋳型を用いて、突然変異させた全長TFIIEαの基本転写活性に対する影響をアッセイした（図3a）。E140A突然変異体は転写活性が軽度に増大し、またE140K突然変異体の転写活性は野生型の転写活性の50％まで低下した。驚くべきことに、D164AおよびD164Kの場合、転写活性は約200から250％まで増大した。他方、全てのZn2+リガンド突然変異体において活性は劇的に低下したが、その程度はそれぞれ違っていた。本発明者らは全てのZn2+リガンド突然変異体が等しく転写活性を失うであろうと予測していた。なぜなら、それらは配位結合していたZn2+を失い、亜鉛結合部位が破壊され、ランダムコイル構造になると思われたからである。実際には、C154A およびC157Aはほぼ完全に活性を失ったが、C129AおよびC132Aは12-25%の活性を保持していた。
次に、本発明者らはGSTプルダウンアッセイによって、これらの突然変異がTFIIEβおよび他のGTFとの結合に及ぼす影響を調べた（図3b）。転写活性は突然変異の影響を受けたにもかかわらず、C154A およびC157Aを含む殆ど全ての突然変異体が野生型の結合能と同一の結合能を有していた。対照的に、C129AおよびC132Aは野生型よりも強くTFIIFβに結合した。したがって、これらのアッセイは、各Zn2+リガンド（すなわち、システイン）の構造への寄与の非対称性を示唆していた。
【００８２】
Zn2+リガンドの非対称性
この非対称性の原因について、本発明者らは最初C154A およびC157Aの構造は完全に破壊されてランダムコイル構造になるが、C129AおよびC132Aの構造は部分的に変化するのだと推定した。この考えを試験するため、野生型およびZn2+リガンド点突然変異体の亜鉛結合ドメインについて遠紫外CDスペクトルを記録した（図4a）。CDスペクトルから計算した二次構造は、ランダムコイル構造の相対量がC129A > C132A > C157A > C154Aの順番であることを示唆し、これは本発明者らの推定に反していた。それらの構造をより詳細に検討するため、本発明者らは1H NMRスペクトルを記録した(図4b)。野生型とのスペクトルの比較は、全ての構造が顕著に変化していることを示した。特にC129Aにおいては、シグナル分散が劇的に減少していた。これは、酵母TFIIEαの亜鉛結合部位における点突然変異体分析の結果と一致している(Kuldell, N.H., & Buratowski, S. Genetic analysis of the large subunit of yeast transcription factor IIE reveals two regions with distinct functions. Mol. Cell. Biol. 17, 5288-5298 (1997).)。この分析では、C124F（ヒトでは129C）置換を有する株は致死性であったが、C127F（ヒトでは132C）突然変異体は温度感受性であった。しかし、C129Aスペクトルは、EDTAで変性させた野生型のスペクトルと同一ではなく、そのシグナルはより広幅化していた。このことは、C132A、C154Aおよび C157Aと同様に部分的に折りたたまれた構造を示唆していた。また、それぞれの異なるスペクトルは、それら突然変異体がおのおの異なる構造を有することを示していた。
全てのZn2+リガンド点突然変異体は、4個のシステインのうち1個を欠いている。これらの突然変異体は残りの3個のシステインによってZn2+と配位結合することが可能であろうか？これを突き止めるため、本発明者らはNMR 1H-15N HSQCをモニターしながらEDTA滴定実験を行った。EDTA添加は、まず全ての突然変異体および野生型のスペクトルを変化させた。次に、等量のEDTAはシグナル分散を完全に消し去り、折り畳み構造がランダムコイル構造へ広がったことを示した。2倍過剰のEDTAを添加する前および後のスペクトルを図4cに示す。EDTA添加前のC129Aのスペクトルでは、全部ではないが殆どのシグナルがZn2+を除去したランダムコイル構造のシグナルと一致していた。亜鉛結合ドメインは2個のアスパラギンと1個のグルタミンを有し、したがってそれら側鎖シグナルの3対が1H-15N HSQCスペクトルに観察される。しかし、C129Aスペクトルは4対の側鎖シグナルを有し、そのうち2対はランダムコイル構造のそれと一致していた（図4d）。これらの結果は、C129Aにおいてランダムコイル構造は優勢であるが、Zn2+と配位結合した、部分的に折りたたまれた構造と平衡化していることを示している。C132Aの場合、野生型では57個のシグナルが観察されるのに対し、104個の主鎖シグナルが観察された。注目すべきことに、C132AスペクトルはC129Aスペクトルと類似していた。実際、C132Aスペクトルは多数の同一シグナルを含んでいた（図4d）。これらのシグナルに加えて、C132Aスペクトルは多数の分散シグナルおよびランダムコイル構造に対応する集中したシグナルをも有していた（図4c、4d）。アスパラギンおよびグルタミンの側鎖シグナルは6対観察され、そのうち2対および他の2対は、それぞれランダムコイル構造のそれ、およびC129Aにおける部分的に折り畳まれた構造のそれと一致していた（図4d）。C132AとC129Aのスペクトルの比較は、C129Aの部分的に折り畳まれた構造と同一または非常によく似た構造、およびZn2+と配位結合した、他の部分的に折り畳まれた構造、ならびにランダムコイル構造の間でC132Aが平衡化していることを明らかにした。C154AおよびC157Aのスペクトルもまた、多数の分散シグナルおよびC129A、C132A スペクトルと比較するとより少ない集中したシグナルという点を含めて相互に類似していた（図4c）。アスパラギンおよびグルタミンの側鎖シグナルについては、C154Aでは5対が観察された。そのうち2対はランダムコイル構造のものと一致し、また他の対は部分的に折り畳まれた構造のそれと対応していた（図4d）。したがって、C154Aは、Zn2+と配位結合し、部分的に折り畳まれた構造、およびランダムコイル構造（これはC129AおよびC132Aのランダムコイル構造ほど優勢ではない）の間で平衡化されている。C157Aのスペクトルについては、5対の側鎖シグナルが観察された。そのうち2対はランダムコイル構造のものと一致し、また他の2対はC154Aのそれと一致した。主鎖については、77個のシグナルが観察された。これらのシグナルはランダムコイル構造、C154Aの部分的に折り畳まれた構造、および他の部分的に折り畳まれた構造のシグナルと対応していた（図4c、4d）。これらの結果は、C157AがC154Aと同一または非常に類似した構造、および他のZn2+と配位結合し、部分的に折り畳まれた構造、およびランダムコイル構造と平衡化していることを示す。EDTA滴定実験後、��析によってEDTAおよびZnCl2を除去したサンプルを用いて、本発明者らは逆にZnCl2滴定実験を行った。ZnCl2添加はシグナルを大幅に分散させ、そして等量のZnCl2添加は、各サンプルのスペクトルをEDTA添加前と同じスペクトルに戻した（データ省略）。
要約すると、亜鉛結合部位の4つのシステインのうちいずれの1個を失っても、Zn2+との配位結合は可能である。しかし、構造は部分的に破壊され、不安定となる。第1または第2のシステインが置換された場合は特にそうである。全ての構造はZn2+と配位結合していないランダムコイル構造と平衡化していた。ランダムコイル構造の優勢は、C129A>C132A>C154A≒C157Aの順番である。C129A とC132Aの構造は相互に類似している。C154A とC157Aの構造も類似している。さらに、C132A およびC157Aもまた、他の部分的に折り畳まれた構造と平衡化していた。全ての構造は、Zn2+結合に依存して構造形成の可逆性を示す。
【００８３】
機能との関係
亜鉛結合ドメインの機能を明らかにするために、Zn2+を配位するシステイン(C129、C132、C154、C157)に変異を導入したヒトTFIIEα(hTFIIEα)を用いることによって亜鉛結合ドメイン構造の崩壊に対する転写活性の影響をみた。転写アッセイにはDNA鋳型としてアデノウィルス主要後期プロモーターのスーパーコイル型と直鎖型を用いた。プロモーターメルティングの際の基本転写因子TFIIEとTFIIHの必要性は、プロモーターの種類およびトポロジーに依存する。アデノウィルス主要後期プロモーターの鋳型の場合、スーパーコイル型ではTFIIHを必ずしも必要とせず、TFIIEがプロモーターメルティングを行うことができるが、鋳型が直鎖型ではTFIIHが必須となる。転写アッセイの結果、鋳型がスーパーコイル型での転写ではC129AやC132Aでは活性が約15〜30％に減少したのみであったのに対し、C154AやC157Aではほぼ完全に失活した。一方で、直鎖型ではC129A、C132A、C154A、C157Aで転写が完全に失活した。このようにスーパーコイル型と直鎖型を用いた場合で、転写活性に対し亜鉛結合ドメイン構造のN末側の２個のシステインとC末側の２個との非対称性が見られた。これまで報告された解析から明らかになった、スーパーコイル型の鋳型での転写が見られない時は転写開始活性を持っておらず、スーパーコイル型の鋳型で転写が見られて直鎖型では見られない時は転写開始から伸長への移行（トランジッション）活性に欠損があるという結果から考慮すると、C154AとC157Aは転写開始がだめになっており、一方でC129AとC132Aは転写開始にも影響を与えるがトランジッションの方により重要な欠陥があることが考えられる。これらの結果は、Znドメインの欠損が転写にドミナントネガティブであることとも対応する。
次に、亜鉛結合ドメイン構造の非対称性と機能の原因を探るために、in vitroの転写再構成反応に関わるhTFIIEβサブユニットを含む基本転写因子とRNAポリメラーゼII(Pol II)の各因子との結合特異性を解析した。基本転写因子の各サブユニットとの結合は、これらサブユニットのN末のGSTとの融合タンパク質を用いたGSTプルダウンアッセイにより検討した。その結果、hTFIIEαが強く結合することが分っているhTFIIEβとTFIIHのp62サブユニットに対しては、どの変異体も同じように強く結合した。ところが、これらに次いで強く結合するTFIIFβとTFIIHのXPBサブユニットとの結合は、C129AとC132AがTFIIFβとより強く結合し、一方でC154AとC157AはXPBとの結合が非常に弱くなっていることが明らかになった。
そこで本発明者らは、転写活性に対するZn2+リガンドシステイン残基の非対称性に興味をもち、それらの構造を調べた。いずれの変異体も構造が壊れていたが、Zn2＋とは配位しており、部分的な構造は有していた。NMRシグナルからみると、C129AとC132Aが類似し、C154AとC157Aがそれぞれ互いに類似した構造であることが示された。構造解析の結果、スーパーコイル型での転写系で活性が残存したC129AやC132Aの方がほぼ完全に変性していることが示唆された。一方、C154AやC157Aの構造は、ランダムコイル構造とネイテイブ構造とは異なっている特徴的なZn2+が配位した構造との平衡になっている事が示された。従ってスーパーコイル型の鋳型ではプロモーターメルティングからトランジッションには亜鉛結合ドメインの完全な立体構造が絶対に必要というわけではないということになる。むしろ、C154AやC157Aのような特徴的なネイテイブ構造と異なる部分構造が逆に妨げとなることが明らかとなった。
【００８４】
以下分子機構について考察してみる。亜鉛結合ドメインはその分子表面の負電荷クラスターから、DNAには結合しない。TFIIEの1本鎖、２本鎖DNA結合ドメインはTFIIEβに見出されている。プロモーターメルティングの際に直接DNAとコンタクトするのはTFIIEβであろう。スーパーコイル型と直鎖型での転写系の違いは前述したようにプロモーターメルティングやトランジッションを通じたTFIIH等の因子との関わり合いの必要性である。TFIIHと直接相互作用するのはTFIIEαのC末端領域である。実際、TFIIHのp62サブユニットと強く結合し、その結合能は野生型とすべての変異体で変化しなかった。従って、亜鉛結合ドメインは直接DNAとコンタクトしメルティングを推し進めたり、その状態を安定化したり、また、TFIIHをリクルートしている役割を持っているわけではない。このことは全ての変異体でGTFとの相互作用にほとんど変化がみられなかったことと一致する。しかしC129AやC132Aではもともと野生型では弱いTFIIFβとの結合能が３倍程度増していた。このことは亜鉛結合ドメインの構造が壊れて相互作用が逆に強くなったと考えられる。このことが、構造が壊れているにも関わらず、C129AやC132Aでは転写開始活性が約15〜30％見られることを説明する。一方、亜鉛結合ドメインのC末側の変異であるC154AやC157Aは転写開始の際のプロモーターメルティングの際にDNAをそのヘリカーゼ活性で開裂させて機能しているXPBとの結合ができなくなることで転写開始活性が全く無くなっていることが良く説明できる。また、データは示していないが、PolIIをリガンドとしたカラムを用いた結合アッセイからPol IIはTFIIEβとは結合するが、TFIIEαとはできないことが明らかになった。つまり、亜鉛結合ドメインはプロモーターメルティングやトランジッションの際に、それらを行うドメインのポジショニングに寄与している可能性がある。PIC形成に続くプロモーターメルティングやトランジッションでは、亜鉛結合ドメインの構造が崩れたことで、TFIIE分子内のドメインの配置は影響を受ける。TFIIHと直接相互作用するC末端ドメインもPICにおける正確なポジションにつくことができなくなっているかもしれない。しかしながら、スーパーコイル型DNAを鋳型として用いた転写系では、TFIIHのプロモーターメルティング能やトランジッションが必ずしも必要でない為、TFIIEのプロモーターメルティング能やトランジッション能が完全に不能でなければ、効率は低いもののこの段階をクリアすることができるのではないであろうか。ところが、直鎖型での転写では、プロモーターメルティングやトランジションの段階で、TFIIHや他の因子との正確な位置での協調的な作業が重要となるため、亜鉛結合ドメインの完全な構造でないとC129AやC132Aでも完全に失活するのであろう。
【００８５】
一方で、亜鉛結合ドメインが他のタンパク質との相互作用ドメインである可能性は、別の変異体から示唆された。ヒトから酵母まで高度に保存されている２つの酸性残基E140とD164に対し、アラニンおよびリジン残基への置換を行った。その結果、スーパーコイル型鋳型での転写においてE140Aでは野生型とほぼ変わらず、E140Kでは50％程度に減少した。直鎖型ではE140A でも活性の減少がみられ、E140Kでは更に減少した。興味深いのはD164である。スーパーコイル型においてD164AやD164Kの活性は野生型よりもどちらも約２倍上昇した。直鎖型ではD164Kは2倍程度に活性が上昇したが、D164Aでは活性上昇は著しく野生型の3.5倍以上の活性に達した。E140やD164の変異が立体構造に影響を及ぼしているはずがない。D164は亜鉛イオン結合部位の窪んだ反対面上の負ポテンシャルクラスターからつづく亜鉛結合面に位置している。Kにすると活性が上昇しAにすると更に上昇することからこの負電荷周辺が他因子との相互作用表面になっている可能性がある。本発明者らはGTFやPol IIとの結合を解析し、野生型と変異体とで結合能の変化を殆ど確認できなかったが、転写開始段階ではPICが活性化するにつれて大きな構造変化が予想される。従って、ある段階の複合体構造に特異的に亜鉛結合ドメインが結合することも考えられる。また、in vivoではユビキタスに機能しているクロマチンリモデリング因子、メディエーター、転写調節因子、転写伸長因子など多くの因子が転写装置に相互作用し転写を制御しているので、それらとの相互作用ドメインとしての機能も考えられる。以上から、TFIIEαの亜鉛結合ドメインは、その構造が今までにない特徴的であるのに加えて非常に微妙な転写の調節に関与している重要な機能ドメインであることが変異体実験から示された。
【００８６】
方法
サンプル調製
プラスミドを大腸菌 BL21(DE3) pLysS (Novagen)に導入して形質転換した。得られた大腸菌細胞を、LB液体培地または[15N]塩化アンモニウム含有M9最小培地で、37℃で、[13C]グルコースの存在下または非存在下で培養した。OD600が0.3-0.4になった時点で1 mM IPTGを添加した。4-7時間増殖させた後、集菌した。細胞ペレットをバッファーA（20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 10 % グリセリン, 30 μM ZnCl2, 1 mM PMSF, 1 mM ベンズアミジンおよび0.1 M NaCl）に再懸濁した。細胞を氷上で超音波処理して溶解し、遠心し、上清を20 mMイミダソール含有バッファーAで平衡化したNi-ニトリロ三酢酸(NTA)アガロース（Qiagen）カラムに導入した。20 mMから0.35 Mのイミダゾール線勾配によってタンパク質サンプルを溶出した。ピーク画分をプールし、バッファーを50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 30 μM ZnCl2, 2.5 mM CaCl2および0.15 M NaClに交換した。トロンビンプロテアーゼを用いてサンプルを室温で16時間切断した。次に、バッファーB (20 mM リン酸カリウムバッファー, pH 7.0, 30μM ZnCl2および0.2 M NaCl)で平衡化したNi-NTAアガロース  (Qiagen)カラムにこれを導入し、バッファーBで洗浄した。N末端の6個のヒスチジンタグを除去したサンプルを上記カラムに通した。カットオフがMW3000のCentriprep Membrane (Amicon)を用いて容量が2.5 ml以下になるまでサンプルを濃縮し、これを20 mM リン酸カリウムバッファー, pH 7.0, 30μM ZnCl2, 5.0 mM DTT および 50 mM NaClで平衡化したSuperdex 30カラム(Amersham Pharmacia Biotech)に導入した。最終サンプル画分を回収した。
【００８７】
NMR分光法
NMR実験用のタンパク質濃度は、90% H2O/10% D2O または 99.9% D2Oに溶解した 20 mM リン酸カリウムバッファー, pH 6.0, 30 μM ZnCl2, 5.0 mM 過重水素化1,4-ジチオトレイトール, 50 mM NaCl中で約3-4 mMである。全てのNMR実験は、三重共鳴勾配プローブを備えたBruker DRX-500 または DRX-600分光測定装置を用いて32℃で実施した。以下のNMR実験を用いて、主鎖および側鎖共鳴の帰属を決定した：3D CBCA(CO)NH, 3D CBCANH, 3D HN(CA)CO, 3D HNCO, 2D DQF-COSY, 2D TOCSY, 3D HBHA(CO)NH, 3D 15Nでエディットした TOCSY-HSQC, 3D HCCH-COSY, 3D HCCH-TOCSY (Cavanagh, J., Fairbroher, W.J., Palmer III, A.G. & Skelton, N.J. Protein NMR spectroscopy (Academic Press, San Diego; 1996).), 2D (Hβ)Cβ(CγCδ)Hδ, 2D (Hβ)Cβ(CγCδCε)Hε(Yamazaki, T., Forman-Kay, J.D. & Kay, L.E. Two-dimensional NMR experiments for correlating 13Cβ and 1Hδ/ε chemical shifts of aromatic residues in 13C-labeled proteins via scalar coupling. J. Am. Chem. Soc. 115, 11054-11055 (1993).), 2D CG(CB)H, 2D CG(CD)Hおよび2D CG(CDCE)H（Prompers, J.J., Groenewegen, A., Hilbers, C.W. & Pepermans, H.A.M. Two-dimensional NMR experiments for the assignment of aromatic side chains in 13C-labaled proteins. J. Magn. Reson. 130, 68-75 (1998).）実験。立体特異的帰属は3D HNHB, 3D HN(CO)HB, 3D HNCG, 3D HN(CO)CG(Krichna, N.R & Berliner, L.J. Biological Magnetic Resonance 16 (Kluwer Academic / Plenum Publishers, New York; 1998)), 2D DQF-COSYおよび3D 15NでエディットしたNOESY-HSQC (混合時間50 ms)（Yamazaki, T., Forman-Kay, J.D. & Kay, L.E. Two-dimensional NMR experiments for correlating 13Cβ and 1Hδ/ε chemical shifts of aromatic residues in 13C-labeled proteins via scalar coupling. J. Am. Chem. Soc. 115, 11054-11055 (1993).）実験の組合せから得られた。距離情報は2D NOESY, 3D 15Nでエディットした NOESY-HSQC (混合時間50 ms および 150 ms)および 3D 13CでエディットしたNOESY-HSQC（Yamazaki, T., Forman-Kay, J.D. & Kay, L.E. Two-dimensional NMR experiments for correlating 13Cβ and 1Hδ/ε chemical shifts of aromatic residues in 13C-labeled proteins via scalar coupling. J. Am. Chem. Soc. 115, 11054-11055 (1993).）実験から得た。主鎖ねじれ角度φは3D HNHA および3D HNCA-J（Yamazaki, T., Forman-Kay, J.D. & Kay, L.E. Two-dimensional NMR experiments for correlating 13Cβ and 1Hδ/ε chemical shifts of aromatic residues in 13C-labeled proteins via scalar coupling. J. Am. Chem. Soc. 115, 11054-11055 (1993).）から得た。また、側鎖ねじれ角度χ1およびχ2は、3D HNHB, 3D HN(CO)HB, 3D HNCG, 3D HN(CO)CG（Lui, A., Hu, W., Majumdar, A., Rosen, M.K. & Patel, D.J. Detection of very weak side chain-main chain hydrogen bonding interactions in medium-size 13C/15N-labeled proteins by sensitivity-enhanced NMR spectroscopy. J.Biomol.NMR 17, 79-82 (2000).）, 3D 15NでエディットしたNOESY-HSQC および 3D 13CでエディットしたNOESY-HSQC （Yamazaki, T., Forman-Kay, J.D. & Kay, L.E. Two-dimensional NMR experiments for correlating 13Cβ and 1Hδ/ε chemical shifts of aromatic residues in 13C-labeled proteins via scalar coupling. J. Am. Chem. Soc. 115, 11054-11055 (1993).）実験の組合せから得た。水素結合拘束は、主鎖アミドH/D交換実験およびトランス水素結合3hJNC’結合を検出するための2D CPD-H(N)CO 実験（Lui, A., Hu, W., Majumdar, A., Rosen, M.K. & Patel, D.J. Detection of very weak side chain-main chain hydrogen bonding interactions in medium-size 13C/15N-labeled proteins by sensitivity-enhanced NMR spectroscopy. J.Biomol.NMR 17, 79-82 (2000).）によって得た。NMRPipe（Delaglio, F.et al. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR 6, 277-293 (1995)）を用いてスペクトルをプロセシングし、プログラムPIPP、 CAPP、 STAPP（Garrett, D.S., Powers, R., Gronenborn, A.M. & Clore, G.M. A common sense approach to peak picking in two-, three-, and four-dimensional spectra using automatic computer analysis of contour diagrams. J. Magn. Reson. 95, 214-220 (1991).）および NMRView(Johnson, B.A. & Blevins, R.A. NMRView: a computer program for the visualization and analysis of NMR data. J.Biomol.NMR 4, 603-614 (1994).)を用いて分析した。
【００８８】
構造計算
NOE強度に由来するプロトン間距離拘束は、強いNOE、中程度のNOEおよび弱いNOEにそれぞれ対応する3つの距離範囲1.8-3.0Å、1.8-4.0Åおよび 1.8-5.0Åに分類された。メチル基を含む距離には、メチル共鳴のより高い見掛け強度を考慮して、上限にさらに0.5Åが加えられた。また、2.0オングストロームの偽原子(pseudoatom)補正は縮重したフェニルアラニン環プロトンに加えた。3JHNα結合定数から推定されたφ角度は、3JHNα<7.0 Hzの場合は-90 o< φ <-40oで、3JHNα >10.0 Hzの場合は-160 o< φ <-80oであった。χ1角度は、3つの側鎖回転異性体について±30°拘束された。亜鉛は4個のシステイン残基によって正四面体配位結合するよう、下記のように拘束された。すなわち、Zn-SγおよびSγ-Sγ結合長は 2.3Åおよび3.8Åに、そしてZn-Sγ-CβおよびSγ-Zn-Sγ角度が108°および109°に設定された。精密化の最終段階で、正規の二次構造領域において水素結合拘束を導入した。構造計算は、距離幾何学およびプログラムX-PLOR (Brunger, A.T. X-PLOR Version 3.1: A system for X-ray crystallography and NMR (Yale University Press, New Haven, Connecticut; 1993).)を用いたシミュレーションされたアニーリングによって実施した。合計100個の構造を計算した。そのうち20個は、0.5Åより大きいNOEバイオレーション(violation)も5°以上の二面角バイオレーションも有さなかった。構造統計の要約を表Iに示す。PROCHECK-NMR (Laskowski, R.A., Rullmann, J.A.C., MacArthur, M.W., Kaptein, R. & Thornton, J.M. AQUA and PROCHECK-NMR : Programs for checking the quality of protein structures solved by NMR. J. Biomol. NMR 8, 477-486 (1996).), GRASP (Nicholls, A., Sharp, K. A. & Honig, B. Protein folding and association: insights from the interfacial and thermodynamic properties of hydrocarbons. Prot. Struct. Funct. Genet. 11, 281-296 (1991).), MOLMOL (Koradi, R., Billeter, M. & Wuthrich, K. MOLMOL: A program for display and analysis of macromolecular structures. J. Mol. Graphics 14, 51-55 (1996).) およびSYBYL (Tripos Inc., St. Louis)を用いて構造を分析し、表示した。
【００８９】
部位特異的突然変異体の作製
野生型ヒトTFIIEαは、ヒト培養細胞であるHeLa細胞から転写活性を指標に精製したTFIIE(Ohkuma, Y. et al., Proc Natl Acad Sci USA. 87, 9163-9167, 1990)から逆相高速液体クロマトグラフィーにより２つのサブユニットαとβを分離精製し、そのうちαサブユニットの方を限定分解して得られたペプチド断片のアミノ酸配列を基に、PCRでcDNAの部分配列を増幅した後に、ヒトNAM細胞cDNAライブラリーをスクリーニングすることでその全長cDNAを単離した(Ohkuma, Y. et al., Nature, 354, 398-401, 1991) 。このヒトTFIIEαcDNAは、pBluescriptII-SK(-)に組み込まれており、そのタンパク質コード領域の289番目と290番目のコドンにまたがってNdeI切断部位を持っているため、アミノ酸に変異を入れない形でこの部位を潰して、N末端に新たにNdeI認識部位を、またC末のストップコドンの3'下流にBamHI認識部位を作成する目的で、Mutan-K変異導入キット(TaKaRa)を用い、変異を導入した。これをNdeI認識部位とBamHI認識部位で切り出し、N末側に6個のヒスチジン残基を付加した6Hisタグ融合蛋白質を発現できるpET-11dベクター（Novagen）に組み込み、野生型ヒトTFIIEα発現プラスミドとした。
亜鉛結合ドメインの変異体（E140A, E140K, D164A, D164K, C129A, C132A, C154A, C157A）も、各々のアミノ酸に変異を入れるためのオリゴDNAを合成し、これらと上記のMutan-K変異導入キット(TaKaRa)を用い、pBluescriptII-SK(-)に組み込まれた形の野生型ヒトTFIIEαに変異を導入して、これも上記のようにNdeI認識部位とBamHI認識部位で切り出し、N末側に6個のヒスチジン残基を付加した6Hisタグ融合蛋白質を発現できるpET-11dベクター（Novagen）に組み込んだ。
【００９０】
In vitro転写アッセイ
（スーパーコイル型）
DNA鋳型のプロモーターはアデノウイルス主要後期プロモーター(AdML)の-50から+10領域までを有し、その下流にG塩基の入っていない鋳型(Gフリーカセット)を挿入したpML(C2AT)Δ-50のスーパーコイル型DNAと直鎖型DNAのものを鋳型として用いた。プロモーター下流のGフリーカセットは、G塩基の入っていない約390ヌクレオチドの転写産物を生じ、G塩基が現れると3’-O-methyl GTPが取り込まれて、それ以降の転写が停止する。これを利用して、一定長の転写産物の有無で基本転写活性を測定した。
基本転写因子とRNAポリメラーゼII(Pol II)を加えた反応液25μl中で30℃、45分、転写反応を行った。このとき、TFIIEα野生型または点変異体を6,12,18 ngと加えた。フェノール/クロロフォルム抽出後、エタノール沈殿をして転写反応を停止し、4％アクリルアミド-尿素変性ゲル（4%acrylamide，50%urea,1xTBE）に展開した。ゲル乾燥後、[α-32P]CTPの取り込みをオートラジオグラフィーで検出し、BAS2000にて活性を測定した。
鋳型； 100 ng pML(C2AT)Δ-50（スーパーコイル型）
因子；Pol II，TFIIB 20 ng，TBP 10 ng，TFIIEβ 8 ng，TFIIF 16 ng
反応液；12 mM Tris-HCl (pH 7.9 at 4℃)，12%Glycerol，60 mM KCl，0.12 mM EDTA，0.12 mM PMSF，0.6 mM β-mercaptothanol，12 mg/ml BSA，125 μM ATP，125 μM UTP，25μM CTP，40 mM Hepes(pH8.4)，8mM MgCl2，5.6 mM  DTT，50μM 3’-O-methyl GTP，0.8 U RNasin，0.15 URNaseT1，0.5μCi[α-32P]CTP
（直鎖型）
スーパーコイル型の鋳型を用いたときと同様に転写反応を行い、[α-32P]CTPの取り込みをオートラジオグラフィーで検出し、BAS2000にて活性を測定した。ここでは、TFIIEα野生型または点変異体を12,18 ngと２点とって加えた。
鋳型； 100 ng pML(C2AT)Δ-50（直鎖型）
因子；Pol II，TFIIB 20 ng，TBP 10 ng，TFIIEβ 8 ng，TFIIF 16 ng，TFIIH 78 ng
反応液；スーパーコイル型の鋳型を用いたときと同様である。
【００９１】
GSTプルダウンアッセイ
ヒトTFIIEαの野生型と点変異体の各基本転写因子との相互作用の検討を行った。Glutathione-S-transferase(GST)-基本転写因子[TFIIB，TBP，RAP74，RAP30，TFIIAα,β,γ，TFIIH(XPB，XPD，p62，p52，p44，p34，cdk7/MO15，cyclinH，MAT1)]融合蛋白質300ngとヒトTFIIEαの野生型または点変異体200 ngにGlutathion-sepharose (Amersham Pharmacia Biotech)7.5 μlとSepharoseCL-4B(Amersham Pharmacia Biotech)7.5 μlをBuffer C(0.1)+BSA  500 μl中で4℃、4時間反応した。レジンを回収し、Buffer C(0.2)で二回、Buffer C(0.1)で一回レジンを洗い、Glutathion-sepharoseに結合した蛋白質をSDS-PAGEで分離し、PVDF膜（Immobion-P,Millipore）にブロットし、ブロッキングを行った。一次抗体は抗TFIIEα抗体（MBL）をRinse Bufferで5000倍希釈し、4℃で一晩反応させ、二次抗体は抗マウスIg G goat Fab-PODをRinse Bufferで5000倍希釈し、室温で30分間反応させた。検出はECL（Amersham Pharmacia Biotech）により化学発光させ、Fuji New RX Filmに感光させた。
Buffer C(0.1)+BSA：20 mM Tris-HCl(pH7.9 at 4℃)，20%Glycerol，0.1 M KCl，0.2 mM EDTA，0.2 mM PMSF，10 mM β-mercaptoethanol，0.1%NP40，0.2 mg/ml BSA
Buffer C(0.2)：20 mM Tris HCl(pH7.9 at 4℃)，20%Glycerol，0.2 M KCl，0.2 mM EDTA，0.2 mM PMSF，10 mM β-mercaptoethanol
ブロッキング溶液：5%nonfat skim milk，25 mM Tris-HCl(pH 7.5 at r.t)，150 mM NaCl
Rinse Buffer：10 mM Tris-HCl(pH 7.5 at r.t)，1 mM EDTA，150 mM NaCl，0.1%NP40，0.4% nonfat skim milk
【００９２】
CD分光法
15μMの野生型および突然変異体亜鉛結合ドメインを10 mM リン酸カリウムバッファー, pH 6.0, 30 μM ZnCl2, 1.0 mM 1,4-ジチオトレイトールに溶解した。1 mmの路長セルを有するJasco J-720W分光旋光計を用いて25°でCDスペクトルを得た。各スペクトルは、185-260 nmの波長範囲で16回スキャンした結果の平均である。
【００９３】
EDTA滴定
20 mM リン酸カリウムバッファー, pH 6.0, 30 μM ZnCl2, 5.0 mM 過重水素化1,4-ジチオトレイトール, 50 mM NaCl, 90% H2O/10% D2O中の1 mMの野生型または突然変異体亜鉛結合ドメインに、EDTAを0.5 mMずつ増加させながら2.0 mMまで添加した。各EDTA添加後、1H-15N HSQCスペクトルを記録した。
【００９４】
座標
TFIIEα亜鉛結合ドメイン構造の座標を表Ａに示す。
【００９５】
【表１】
2005245202.tif 000003
【００９６】
〔表Ａ〕
野生型ヒトTFIIEα亜鉛結合ドメイン構造の座標
MODEL        1
ATOM      1  CA  ARG     1     -13.547    .248 -24.620  1.00   .00
ATOM      2  HA  ARG     1     -12.896   -.589 -24.815  1.00   .00
ATOM      3  CB  ARG     1     -12.761   1.378 -23.954  1.00   .00
ATOM      4  HB1 ARG     1     -13.423   1.954 -23.323  1.00   .00
ATOM      5  HB2 ARG     1     -12.338   2.019 -24.714  1.00   .00
ATOM      6  CG  ARG     1     -11.637    .785 -23.101  1.00   .00
ATOM      7  HG1 ARG     1     -11.923   -.200 -22.763  1.00   .00
ATOM      8  HG2 ARG     1     -11.460   1.422 -22.247  1.00   .00
ATOM      9  CD  ARG     1     -10.359    .683 -23.937  1.00   .00
ATOM     10  HD1 ARG     1     -10.140   1.629 -24.408  1.00   .00
ATOM     11  HD2 ARG     1     -10.458   -.097 -24.680  1.00   .00
ATOM     12  NE  ARG     1      -9.288    .341 -22.959  1.00   .00
ATOM     13  HE  ARG     1      -9.526    .091 -22.042  1.00   .00
ATOM     14  CZ  ARG     1      -8.035    .372 -23.324  1.00   .00
ATOM     15  NH1 ARG     1      -7.249   1.313 -22.876  1.00   .00
ATOM     16 HH11 ARG     1      -7.608   2.010 -22.254  1.00   .00
ATOM     17 HH12 ARG     1      -6.289   1.338 -23.154  1.00   .00
ATOM     18  NH2 ARG     1      -7.568   -.539 -24.134  1.00   .00
ATOM     19 HH21 ARG     1      -8.170  -1.260 -24.476  1.00   .00
ATOM     20 HH22 ARG     1      -6.608   -.516 -24.412  1.00   .00
ATOM     21  C   ARG     1     -14.723   -.181 -23.739  1.00   .00
ATOM     22  O   ARG     1     -15.720    .505 -23.641  1.00   .00
ATOM     23  N   ARG     1     -14.049    .828 -25.899  1.00   .00
ATOM     24  HT1 ARG     1     -14.781    .206 -26.299  1.00   .00
ATOM     25  HT2 ARG     1     -13.261    .915 -26.573  1.00   .00
ATOM     26  HT3 ARG     1     -14.457   1.766 -25.718  1.00   .00
ATOM     27  N   ILE     2     -14.614  -1.313 -23.098  1.00   .00
ATOM     28  HN  ILE     2     -13.801  -1.852 -23.191  1.00   .00
ATOM     29  CA  ILE     2     -15.727  -1.785 -22.226  1.00   .00
ATOM     30  HA  ILE     2     -16.643  -1.855 -22.791  1.00   .00
ATOM     31  CB  ILE     2     -15.297  -3.175 -21.756  1.00   .00
ATOM     32  HB  ILE     2     -15.162  -3.819 -22.614  1.00   .00
ATOM     33  CG1 ILE     2     -16.375  -3.761 -20.840  1.00   .00
ATOM     34 HG11 ILE     2     -17.324  -3.293 -21.056  1.00   .00
ATOM     35 HG12 ILE     2     -16.109  -3.578 -19.809  1.00   .00
ATOM     36  CG2 ILE     2     -13.979  -3.071 -20.987  1.00   .00
ATOM     37 HG21 ILE     2     -14.186  -2.925 -19.937  1.00   .00
ATOM     38 HG22 ILE     2     -13.409  -2.234 -21.361  1.00   .00
ATOM     39 HG23 ILE     2     -13.413  -3.981 -21.119  1.00   .00
ATOM     40  CD1 ILE     2     -16.486  -5.268 -21.080  1.00   .00
ATOM     41 HD11 ILE     2     -16.141  -5.797 -20.205  1.00   .00
ATOM     42 HD12 ILE     2     -15.879  -5.543 -21.930  1.00   .00
ATOM     43 HD13 ILE     2     -17.516  -5.527 -21.274  1.00   .00
ATOM     44  C   ILE     2     -15.904   -.841 -21.033  1.00   .00
ATOM     45  O   ILE     2     -15.218   -.948 -20.036  1.00   .00
ATOM     46  N   GLU     3     -16.820    .084 -21.129  1.00   .00
ATOM     47  HN  GLU     3     -17.362    .153 -21.943  1.00   .00
ATOM     48  CA  GLU     3     -17.043   1.037 -20.003  1.00   .00
ATOM     49  HA  GLU     3     -16.238   1.752 -19.949  1.00   .00
ATOM     50  CB  GLU     3     -18.352   1.750 -20.344  1.00   .00
ATOM     51  HB1 GLU     3     -19.157   1.324 -19.764  1.00   .00
ATOM     52  HB2 GLU     3     -18.564   1.629 -21.397  1.00   .00
ATOM     53  CG  GLU     3     -18.225   3.238 -20.017  1.00   .00
ATOM     54  HG1 GLU     3     -17.253   3.593 -20.325  1.00   .00
ATOM     55  HG2 GLU     3     -18.342   3.383 -18.953  1.00   .00
ATOM     56  CD  GLU     3     -19.309   4.019 -20.763  1.00   .00
ATOM     57  OE1 GLU     3     -19.277   5.237 -20.710  1.00   .00
ATOM     58  OE2 GLU     3     -20.154   3.384 -21.373  1.00   .00
ATOM     59  C   GLU     3     -17.175    .276 -18.681  1.00   .00
ATOM     60  O   GLU     3     -18.069   -.528 -18.504  1.00   .00
ATOM     61  N   THR     4     -16.292    .522 -17.752  1.00   .00
ATOM     62  HN  THR     4     -15.578   1.174 -17.915  1.00   .00
ATOM     63  CA  THR     4     -16.368   -.189 -16.443  1.00   .00
ATOM     64  HA  THR     4     -17.314   -.700 -16.348  1.00   .00
ATOM     65  CB  THR     4     -15.225  -1.208 -16.469  1.00   .00
ATOM     66  HB  THR     4     -14.591  -1.059 -15.608  1.00   .00
ATOM     67  OG1 THR     4     -14.460  -1.038 -17.656  1.00   .00
ATOM     68  HG1 THR     4     -13.745   -.427 -17.463  1.00   .00
ATOM     69  CG2 THR     4     -15.801  -2.624 -16.429  1.00   .00
ATOM     70 HG21 THR     4     -15.231  -3.225 -15.737  1.00   .00
ATOM     71 HG22 THR     4     -15.748  -3.062 -17.415  1.00   .00
ATOM     72 HG23 THR     4     -16.831  -2.584 -16.107  1.00   .00
ATOM     73  C   THR     4     -16.177    .798 -15.288  1.00   .00
ATOM     74  O   THR     4     -16.248   1.998 -15.465  1.00   .00
ATOM     75  N   ASP     5     -15.933    .300 -14.107  1.00   .00
ATOM     76  HN  ASP     5     -15.880   -.671 -13.987  1.00   .00
ATOM     77  CA  ASP     5     -15.736   1.205 -12.938  1.00   .00
ATOM     78  HA  ASP     5     -15.260   2.122 -13.247  1.00   .00
ATOM     79  CB  ASP     5     -17.146   1.495 -12.423  1.00   .00
ATOM     80  HB1 ASP     5     -17.100   1.763 -11.379  1.00   .00
ATOM     81  HB2 ASP     5     -17.761    .614 -12.543  1.00   .00
ATOM     82  CG  ASP     5     -17.753   2.654 -13.219  1.00   .00
ATOM     83  OD1 ASP     5     -18.624   2.395 -14.033  1.00   .00
ATOM     84  OD2 ASP     5     -17.337   3.779 -13.000  1.00   .00
ATOM     85  C   ASP     5     -14.903    .502 -11.862  1.00   .00
ATOM     86  O   ASP     5     -15.418    .067 -10.851  1.00   .00
ATOM     87  N   GLU     6     -13.620    .387 -12.072  1.00   .00
ATOM     88  HN  GLU     6     -13.224    .743 -12.895  1.00   .00
ATOM     89  CA  GLU     6     -12.757   -.290 -11.061  1.00   .00
ATOM     90  HA  GLU     6     -13.345   -.952 -10.446  1.00   .00
ATOM     91  CB  GLU     6     -11.747  -1.096 -11.878  1.00   .00
ATOM     92  HB1 GLU     6     -10.797   -.584 -11.883  1.00   .00
ATOM     93  HB2 GLU     6     -12.106  -1.201 -12.892  1.00   .00
ATOM     94  CG  GLU     6     -11.574  -2.480 -11.250  1.00   .00
ATOM     95  HG1 GLU     6     -12.350  -2.642 -10.518  1.00   .00
ATOM     96  HG2 GLU     6     -10.608  -2.539 -10.771  1.00   .00
ATOM     97  CD  GLU     6     -11.671  -3.552 -12.337  1.00   .00
ATOM     98  OE1 GLU     6     -11.854  -4.707 -11.988  1.00   .00
ATOM     99  OE2 GLU     6     -11.560  -3.201 -13.500  1.00   .00
ATOM    100  C   GLU     6     -12.039    .749 -10.197  1.00   .00
ATOM    101  O   GLU     6     -12.513   1.852 -10.013  1.00   .00
ATOM    102  N   ARG     7     -10.897    .405  -9.665  1.00   .00
ATOM    103  HN  ARG     7     -10.531   -.490  -9.826  1.00   .00
ATOM    104  CA  ARG     7     -10.150   1.374  -8.813  1.00   .00
ATOM    105  HA  ARG     7     -10.418   2.387  -9.071  1.00   .00
ATOM    106  CB  ARG     7     -10.591   1.067  -7.380  1.00   .00
ATOM    107  HB1 ARG     7     -11.654   1.232  -7.288  1.00   .00
ATOM    108  HB2 ARG     7     -10.066   1.716  -6.695  1.00   .00
ATOM    109  CG  ARG     7     -10.275   -.393  -7.046  1.00   .00
ATOM    110  HG1 ARG     7      -9.621   -.432  -6.188  1.00   .00
ATOM    111  HG2 ARG     7      -9.790   -.859  -7.892  1.00   .00
ATOM    112  CD  ARG     7     -11.574  -1.136  -6.726  1.00   .00
ATOM    113  HD1 ARG     7     -12.070  -1.435  -7.636  1.00   .00
ATOM    114  HD2 ARG     7     -12.224   -.513  -6.127  1.00   .00
ATOM    115  NE  ARG     7     -11.151  -2.339  -5.957  1.00   .00
ATOM    116  HE  ARG     7     -11.420  -2.441  -5.021  1.00   .00
ATOM    117  CZ  ARG     7     -10.422  -3.257  -6.531  1.00   .00
ATOM    118  NH1 ARG     7     -10.994  -4.227  -7.190  1.00   .00
ATOM    119 HH11 ARG     7     -11.991  -4.267  -7.256  1.00   .00
ATOM    120 HH12 ARG     7     -10.436  -4.931  -7.630  1.00   .00
ATOM    121  NH2 ARG     7      -9.121  -3.206  -6.444  1.00   .00
ATOM    122 HH21 ARG     7      -8.682  -2.464  -5.937  1.00   .00
ATOM    123 HH22 ARG     7      -8.563  -3.909  -6.885  1.00   .00
ATOM    124  C   ARG     7      -8.642   1.164  -8.969  1.00   .00
ATOM    125  O   ARG     7      -8.049    .335  -8.308  1.00   .00
ATOM    126  N   ASP     8      -8.017   1.911  -9.838  1.00   .00
ATOM    127  HN  ASP     8      -8.514   2.575 -10.360  1.00   .00
ATOM    128  CA  ASP     8      -6.547   1.757 -10.036  1.00   .00
ATOM    129  HA  ASP     8      -6.181   2.493 -10.734  1.00   .00
ATOM    130  CB  ASP     8      -5.935   1.997  -8.655  1.00   .00
ATOM    131  HB1 ASP     8      -5.182   1.248  -8.459  1.00   .00
ATOM    132  HB2 ASP     8      -6.708   1.937  -7.903  1.00   .00
ATOM    133  CG  ASP     8      -5.291   3.384  -8.615  1.00   .00
ATOM    134  OD1 ASP     8      -5.532   4.154  -9.531  1.00   .00
ATOM    135  OD2 ASP     8      -4.568   3.653  -7.670  1.00   .00
ATOM    136  C   ASP     8      -6.222    .344 -10.527  1.00   .00
ATOM    137  O   ASP     8      -6.033    .112 -11.704  1.00   .00
ATOM    138  N   SER     9      -6.154   -.601  -9.630  1.00   .00
ATOM    139  HN  SER     9      -6.309   -.392  -8.686  1.00   .00
ATOM    140  CA  SER     9      -5.840  -2.000 -10.041  1.00   .00
ATOM    141  HA  SER     9      -6.506  -2.322 -10.825  1.00   .00
ATOM    142  CB  SER     9      -4.405  -1.947 -10.562  1.00   .00
ATOM    143  HB1 SER     9      -4.213   -.970 -10.986  1.00   .00
ATOM    144  HB2 SER     9      -4.267  -2.698 -11.322  1.00   .00
ATOM    145  OG  SER     9      -3.506  -2.197  -9.489  1.00   .00
ATOM    146  HG  SER     9      -3.388  -1.377  -9.004  1.00   .00
ATOM    147  C   SER     9      -5.940  -2.936  -8.833  1.00   .00
ATOM    148  O   SER     9      -6.598  -2.636  -7.857  1.00   .00
ATOM    149  N   THR    10      -5.291  -4.066  -8.891  1.00   .00
ATOM    150  HN  THR    10      -4.765  -4.290  -9.687  1.00   .00
ATOM    151  CA  THR    10      -5.349  -5.018  -7.744  1.00   .00
ATOM    152  HA  THR    10      -5.963  -4.618  -6.953  1.00   .00
ATOM    153  CB  THR    10      -5.987  -6.290  -8.310  1.00   .00
ATOM    154  HB  THR    10      -5.384  -7.144  -8.041  1.00   .00
ATOM    155  OG1 THR    10      -6.066  -6.194  -9.726  1.00   .00
ATOM    156  HG1 THR    10      -5.172  -6.139 -10.070  1.00   .00
ATOM    157  CG2 THR    10      -7.391  -6.463  -7.728  1.00   .00
ATOM    158 HG21 THR    10      -8.094  -5.884  -8.307  1.00   .00
ATOM    159 HG22 THR    10      -7.400  -6.121  -6.703  1.00   .00
ATOM    160 HG23 THR    10      -7.668  -7.506  -7.762  1.00   .00
ATOM    161  C   THR    10      -3.937  -5.313  -7.232  1.00   .00
ATOM    162  O   THR    10      -3.755  -5.996  -6.244  1.00   .00
ATOM    163  N   ASN    11      -2.937  -4.806  -7.900  1.00   .00
ATOM    164  HN  ASN    11      -3.106  -4.262  -8.697  1.00   .00
ATOM    165  CA  ASN    11      -1.537  -5.062  -7.455  1.00   .00
ATOM    166  HA  ASN    11      -1.523  -5.756  -6.630  1.00   .00
ATOM    167  CB  ASN    11       -.850  -5.685  -8.671  1.00   .00
ATOM    168  HB1 ASN    11        .079  -5.169  -8.864  1.00   .00
ATOM    169  HB2 ASN    11      -1.496  -5.597  -9.533  1.00   .00
ATOM    170  CG  ASN    11       -.563  -7.161  -8.395  1.00   .00
ATOM    171  OD1 ASN    11      -1.149  -8.031  -9.008  1.00   .00
ATOM    172  ND2 ASN    11        .320  -7.483  -7.490  1.00   .00
ATOM    173 HD21 ASN    11        .793  -6.781  -6.996  1.00   .00
ATOM    174 HD22 ASN    11        .511  -8.426  -7.306  1.00   .00
ATOM    175  C   ASN    11       -.851  -3.750  -7.065  1.00   .00
ATOM    176  O   ASN    11        .234  -3.447  -7.519  1.00   .00
ATOM    177  N   ARG    12      -1.475  -2.969  -6.226  1.00   .00
ATOM    178  HN  ARG    12      -2.349  -3.231  -5.870  1.00   .00
ATOM    179  CA  ARG    12       -.855  -1.678  -5.810  1.00   .00
ATOM    180  HA  ARG    12        .172  -1.631  -6.134  1.00   .00
ATOM    181  CB  ARG    12      -1.678   -.602  -6.521  1.00   .00
ATOM    182  HB1 ARG    12      -2.162    .024  -5.787  1.00   .00
ATOM    183  HB2 ARG    12      -2.426  -1.074  -7.141  1.00   .00
ATOM    184  CG  ARG    12       -.758    .256  -7.392  1.00   .00
ATOM    185  HG1 ARG    12        .194    .379  -6.900  1.00   .00
ATOM    186  HG2 ARG    12      -1.212   1.224  -7.547  1.00   .00
ATOM    187  CD  ARG    12       -.545   -.431  -8.744  1.00   .00
ATOM    188  HD1 ARG    12      -1.462   -.436  -9.312  1.00   .00
ATOM    189  HD2 ARG    12       -.183  -1.440  -8.600  1.00   .00
ATOM    190  NE  ARG    12        .480    .398  -9.438  1.00   .00
ATOM    191  HE  ARG    12        .201   1.117 -10.043  1.00   .00
ATOM    192  CZ  ARG    12       1.749    .166  -9.242  1.00   .00
ATOM    193  NH1 ARG    12       2.186  -1.062  -9.172  1.00   .00
ATOM    194 HH11 ARG    12       1.548  -1.826  -9.268  1.00   .00
ATOM    195 HH12 ARG    12       3.159  -1.239  -9.023  1.00   .00
ATOM    196  NH2 ARG    12       2.582   1.163  -9.116  1.00   .00
ATOM    197 HH21 ARG    12       2.248   2.104  -9.170  1.00   .00
ATOM    198 HH22 ARG    12       3.555    .986  -8.965  1.00   .00
ATOM    199  C   ARG    12       -.949  -1.510  -4.290  1.00   .00
ATOM    200  O   ARG    12      -2.008  -1.267  -3.747  1.00   .00
ATOM    201  N   ALA    13        .152  -1.638  -3.598  1.00   .00
ATOM    202  HN  ALA    13        .997  -1.835  -4.054  1.00   .00
ATOM    203  CA  ALA    13        .121  -1.486  -2.114  1.00   .00
ATOM    204  HA  ALA    13       -.658  -2.087  -1.690  1.00   .00
ATOM    205  CB  ALA    13       1.483  -1.982  -1.628  1.00   .00
ATOM    206  HB1 ALA    13       1.625  -1.690   -.598  1.00   .00
ATOM    207  HB2 ALA    13       2.262  -1.547  -2.235  1.00   .00
ATOM    208  HB3 ALA    13       1.524  -3.058  -1.706  1.00   .00
ATOM    209  C   ALA    13       -.080   -.023  -1.733  1.00   .00
ATOM    210  O   ALA    13       -.256    .831  -2.580  1.00   .00
ATOM    211  N   SER    14       -.044    .273   -.463  1.00   .00
ATOM    212  HN  SER    14        .106   -.435    .198  1.00   .00
ATOM    213  CA  SER    14       -.225   1.681   -.012  1.00   .00
ATOM    214  HA  SER    14        .553   2.309   -.416  1.00   .00
ATOM    215  CB  SER    14      -1.583   2.107   -.568  1.00   .00
ATOM    216  HB1 SER    14      -1.525   2.176  -1.646  1.00   .00
ATOM    217  HB2 SER    14      -1.852   3.068   -.166  1.00   .00
ATOM    218  OG  SER    14      -2.565   1.151   -.193  1.00   .00
ATOM    219  HG  SER    14      -2.415    .916    .726  1.00   .00
ATOM    220  C   SER    14       -.224   1.745   1.517  1.00   .00
ATOM    221  O   SER    14      -1.104   2.322   2.123  1.00   .00
ATOM    222  N   PHE    15        .758   1.151   2.145  1.00   .00
ATOM    223  HN  PHE    15       1.455    .691   1.634  1.00   .00
ATOM    224  CA  PHE    15        .813   1.176   3.639  1.00   .00
ATOM    225  HA  PHE    15        .153    .430   4.054  1.00   .00
ATOM    226  CB  PHE    15       2.264    .860   4.016  1.00   .00
ATOM    227  HB1 PHE    15       2.317    .632   5.071  1.00   .00
ATOM    228  HB2 PHE    15       2.882   1.720   3.806  1.00   .00
ATOM    229  CG  PHE    15       2.766   -.322   3.225  1.00   .00
ATOM    230  CD1 PHE    15       4.108   -.372   2.831  1.00   .00
ATOM    231  HD1 PHE    15       4.778    .432   3.094  1.00   .00
ATOM    232  CD2 PHE    15       1.896  -1.364   2.885  1.00   .00
ATOM    233  HD2 PHE    15        .860  -1.324   3.189  1.00   .00
ATOM    234  CE1 PHE    15       4.581  -1.464   2.097  1.00   .00
ATOM    235  HE1 PHE    15       5.616  -1.501   1.795  1.00   .00
ATOM    236  CE2 PHE    15       2.370  -2.457   2.150  1.00   .00
ATOM    237  HE2 PHE    15       1.699  -3.262   1.887  1.00   .00
ATOM    238  CZ  PHE    15       3.713  -2.507   1.756  1.00   .00
ATOM    239  HZ  PHE    15       4.080  -3.349   1.189  1.00   .00
ATOM    240  C   PHE    15        .439   2.565   4.150  1.00   .00
ATOM    241  O   PHE    15        .671   3.558   3.492  1.00   .00
ATOM    242  N   LYS    16       -.129   2.647   5.319  1.00   .00
ATOM    243  HN  LYS    16       -.303   1.833   5.838  1.00   .00
ATOM    244  CA  LYS    16       -.506   3.980   5.866  1.00   .00
ATOM    245  HA  LYS    16       -.240   4.759   5.169  1.00   .00
ATOM    246  CB  LYS    16      -2.025   3.930   6.035  1.00   .00
ATOM    247  HB1 LYS    16      -2.309   2.985   6.475  1.00   .00
ATOM    248  HB2 LYS    16      -2.496   4.031   5.068  1.00   .00
ATOM    249  CG  LYS    16      -2.478   5.075   6.946  1.00   .00
ATOM    250  HG1 LYS    16      -1.625   5.674   7.226  1.00   .00
ATOM    251  HG2 LYS    16      -2.939   4.668   7.835  1.00   .00
ATOM    252  CD  LYS    16      -3.488   5.952   6.201  1.00   .00
ATOM    253  HD1 LYS    16      -3.811   5.447   5.304  1.00   .00
ATOM    254  HD2 LYS    16      -3.024   6.892   5.940  1.00   .00
ATOM    255  CE  LYS    16      -4.699   6.212   7.100  1.00   .00
ATOM    256  HE1 LYS    16      -4.586   5.699   8.042  1.00   .00
ATOM    257  HE2 LYS    16      -5.608   5.899   6.604  1.00   .00
ATOM    258  NZ  LYS    16      -4.704   7.685   7.319  1.00   .00
ATOM    259  HZ1 LYS    16      -5.682   8.013   7.453  1.00   .00
ATOM    260  HZ2 LYS    16      -4.289   8.160   6.491  1.00   .00
ATOM    261  HZ3 LYS    16      -4.146   7.912   8.166  1.00   .00
ATOM    262  C   LYS    16        .185   4.211   7.211  1.00   .00
ATOM    263  O   LYS    16        .269   3.326   8.040  1.00   .00
ATOM    264  N   CYS    17        .685   5.396   7.432  1.00   .00
ATOM    265  HN  CYS    17        .609   6.094   6.748  1.00   .00
ATOM    266  CA  CYS    17       1.376   5.687   8.719  1.00   .00
ATOM    267  HA  CYS    17       1.941   4.829   9.045  1.00   .00
ATOM    268  HB1 CYS    17       1.757   7.758   8.329  1.00   .00
ATOM    269  HB2 CYS    17       2.822   6.652   7.463  1.00   .00
ATOM    270  C   CYS    17        .360   6.104   9.788  1.00   .00
ATOM    271  O   CYS    17       -.437   6.995   9.572  1.00   .00
ATOM    272  ZN  CYS    17       4.829   8.852   9.299  1.00   .00
ATOM    273  CB  CYS    17       2.321   6.842   8.401  1.00   .00
ATOM    274  SG  CYS    17       3.547   6.992   9.720  1.00   .00
ATOM    275  N   PRO    18        .423   5.438  10.910  1.00   .00
ATOM    276  CA  PRO    18       -.504   5.737  12.027  1.00   .00
ATOM    277  HA  PRO    18      -1.514   5.845  11.666  1.00   .00
ATOM    278  CB  PRO    18       -.398   4.503  12.916  1.00   .00
ATOM    279  HB1 PRO    18      -1.168   3.791  12.663  1.00   .00
ATOM    280  HB2 PRO    18       -.473   4.786  13.957  1.00   .00
ATOM    281  CG  PRO    18        .952   3.921  12.628  1.00   .00
ATOM    282  HG1 PRO    18        .904   2.844  12.673  1.00   .00
ATOM    283  HG2 PRO    18       1.668   4.288  13.349  1.00   .00
ATOM    284  CD  PRO    18       1.352   4.352  11.239  1.00   .00
ATOM    285  HD2 PRO    18       2.373   4.710  11.235  1.00   .00
ATOM    286  HD1 PRO    18       1.232   3.538  10.541  1.00   .00
ATOM    287  C   PRO    18       -.061   6.990  12.794  1.00   .00
ATOM    288  O   PRO    18       -.710   7.410  13.731  1.00   .00
ATOM    289  N   VAL    19       1.039   7.589  12.417  1.00   .00
ATOM    290  HN  VAL    19       1.559   7.240  11.663  1.00   .00
ATOM    291  CA  VAL    19       1.501   8.806  13.152  1.00   .00
ATOM    292  HA  VAL    19        .921   8.935  14.052  1.00   .00
ATOM    293  CB  VAL    19       2.961   8.529  13.520  1.00   .00
ATOM    294  HB  VAL    19       3.451   8.026  12.699  1.00   .00
ATOM    295  CG1 VAL    19       3.685   9.845  13.814  1.00   .00
ATOM    296 HG11 VAL    19       4.007  10.293  12.886  1.00   .00
ATOM    297 HG12 VAL    19       4.544   9.652  14.438  1.00   .00
ATOM    298 HG13 VAL    19       3.013  10.519  14.324  1.00   .00
ATOM    299  CG2 VAL    19       3.006   7.644  14.768  1.00   .00
ATOM    300 HG21 VAL    19       2.522   8.154  15.587  1.00   .00
ATOM    301 HG22 VAL    19       4.035   7.441  15.029  1.00   .00
ATOM    302 HG23 VAL    19       2.495   6.714  14.570  1.00   .00
ATOM    303  C   VAL    19       1.383  10.055  12.271  1.00   .00
ATOM    304  O   VAL    19       1.123  11.137  12.758  1.00   .00
ATOM    305  N   CYS    20       1.557   9.927  10.982  1.00   .00
ATOM    306  HN  CYS    20       1.753   9.047  10.587  1.00   .00
ATOM    307  CA  CYS    20       1.433  11.131  10.111  1.00   .00
ATOM    308  HA  CYS    20        .966  11.933  10.663  1.00   .00
ATOM    309  HB1 CYS    20       3.504  11.408  10.611  1.00   .00
ATOM    310  HB2 CYS    20       2.885  12.559   9.430  1.00   .00
ATOM    311  C   CYS    20        .586  10.789   8.881  1.00   .00
ATOM    312  O   CYS    20        .547  11.515   7.907  1.00   .00
ATOM    313  CB  CYS    20       2.869  11.526   9.744  1.00   .00
ATOM    314  SG  CYS    20       3.487  10.487   8.402  1.00   .00
ATOM    315  N   SER    21       -.113   9.691   8.951  1.00   .00
ATOM    316  HN  SER    21       -.069   9.145   9.763  1.00   .00
ATOM    317  CA  SER    21      -1.002   9.264   7.834  1.00   .00
ATOM    318  HA  SER    21      -1.443   8.312   8.073  1.00   .00
ATOM    319  CB  SER    21      -2.093  10.330   7.772  1.00   .00
ATOM    320  HB1 SER    21      -2.203  10.788   8.746  1.00   .00
ATOM    321  HB2 SER    21      -3.027   9.876   7.485  1.00   .00
ATOM    322  OG  SER    21      -1.735  11.313   6.810  1.00   .00
ATOM    323  HG  SER    21      -2.542  11.640   6.406  1.00   .00
ATOM    324  C   SER    21       -.261   9.176   6.495  1.00   .00
ATOM    325  O   SER    21       -.876   9.061   5.453  1.00   .00
ATOM    326  N   SER    22       1.041   9.213   6.496  1.00   .00
ATOM    327  HN  SER    22       1.534   9.298   7.338  1.00   .00
ATOM    328  CA  SER    22       1.773   9.112   5.200  1.00   .00
ATOM    329  HA  SER    22       1.449   9.886   4.522  1.00   .00
ATOM    330  CB  SER    22       3.246   9.304   5.550  1.00   .00
ATOM    331  HB1 SER    22       3.858   8.834   4.792  1.00   .00
ATOM    332  HB2 SER    22       3.454   8.853   6.505  1.00   .00
ATOM    333  OG  SER    22       3.533  10.693   5.613  1.00   .00
ATOM    334  HG  SER    22       3.592  11.024   4.713  1.00   .00
ATOM    335  C   SER    22       1.543   7.728   4.584  1.00   .00
ATOM    336  O   SER    22       1.813   6.716   5.199  1.00   .00
ATOM    337  N   THR    23       1.041   7.672   3.380  1.00   .00
ATOM    338  HN  THR    23        .823   8.497   2.898  1.00   .00
ATOM    339  CA  THR    23        .793   6.345   2.743  1.00   .00
ATOM    340  HA  THR    23        .493   5.626   3.487  1.00   .00
ATOM    341  CB  THR    23       -.351   6.576   1.751  1.00   .00
ATOM    342  HB  THR    23        .020   6.480    .743  1.00   .00
ATOM    343  OG1 THR    23       -.887   7.879   1.936  1.00   .00
ATOM    344  HG1 THR    23      -1.593   8.003   1.297  1.00   .00
ATOM    345  CG2 THR    23      -1.448   5.535   1.984  1.00   .00
ATOM    346 HG21 THR    23       -.997   4.591   2.252  1.00   .00
ATOM    347 HG22 THR    23      -2.028   5.413   1.081  1.00   .00
ATOM    348 HG23 THR    23      -2.094   5.865   2.784  1.00   .00
ATOM    349  C   THR    23       2.052   5.863   2.013  1.00   .00
ATOM    350  O   THR    23       2.986   6.612   1.810  1.00   .00
ATOM    351  N   PHE    24       2.085   4.618   1.619  1.00   .00
ATOM    352  HN  PHE    24       1.322   4.028   1.794  1.00   .00
ATOM    353  CA  PHE    24       3.287   4.092    .906  1.00   .00
ATOM    354  HA  PHE    24       3.721   4.856    .282  1.00   .00
ATOM    355  CB  PHE    24       4.265   3.703   2.016  1.00   .00
ATOM    356  HB1 PHE    24       5.141   3.246   1.579  1.00   .00
ATOM    357  HB2 PHE    24       3.789   3.001   2.685  1.00   .00
ATOM    358  CG  PHE    24       4.675   4.935   2.787  1.00   .00
ATOM    359  CD1 PHE    24       5.617   5.819   2.248  1.00   .00
ATOM    360  HD1 PHE    24       6.048   5.623   1.277  1.00   .00
ATOM    361  CD2 PHE    24       4.117   5.190   4.046  1.00   .00
ATOM    362  HD2 PHE    24       3.390   4.508   4.462  1.00   .00
ATOM    363  CE1 PHE    24       6.000   6.958   2.967  1.00   .00
ATOM    364  HE1 PHE    24       6.727   7.640   2.551  1.00   .00
ATOM    365  CE2 PHE    24       4.499   6.329   4.764  1.00   .00
ATOM    366  HE2 PHE    24       4.068   6.526   5.735  1.00   .00
ATOM    367  CZ  PHE    24       5.442   7.213   4.225  1.00   .00
ATOM    368  HZ  PHE    24       5.738   8.091   4.780  1.00   .00
ATOM    369  C   PHE    24       2.916   2.862    .071  1.00   .00
ATOM    370  O   PHE    24       2.575   1.823    .599  1.00   .00
ATOM    371  N   THR    25       2.983   2.968  -1.227  1.00   .00
ATOM    372  HN  THR    25       3.262   3.813  -1.638  1.00   .00
ATOM    373  CA  THR    25       2.634   1.799  -2.087  1.00   .00
ATOM    374  HA  THR    25       1.759   1.296  -1.704  1.00   .00
ATOM    375  CB  THR    25       2.333   2.393  -3.464  1.00   .00
ATOM    376  HB  THR    25       2.045   1.604  -4.142  1.00   .00
ATOM    377  OG1 THR    25       3.491   3.049  -3.960  1.00   .00
ATOM    378  HG1 THR    25       4.253   2.503  -3.752  1.00   .00
ATOM    379  CG2 THR    25       1.187   3.398  -3.346  1.00   .00
ATOM    380 HG21 THR    25        .657   3.452  -4.285  1.00   .00
ATOM    381 HG22 THR    25       1.586   4.371  -3.100  1.00   .00
ATOM    382 HG23 THR    25        .508   3.081  -2.568  1.00   .00
ATOM    383  C   THR    25       3.810    .824  -2.165  1.00   .00
ATOM    384  O   THR    25       4.777    .938  -1.437  1.00   .00
ATOM    385  N   ASP    26       3.727   -.140  -3.037  1.00   .00
ATOM    386  HN  ASP    26       2.931   -.215  -3.606  1.00   .00
ATOM    387  CA  ASP    26       4.831  -1.136  -3.162  1.00   .00
ATOM    388  HA  ASP    26       4.959  -1.671  -2.235  1.00   .00
ATOM    389  CB  ASP    26       4.375  -2.100  -4.258  1.00   .00
ATOM    390  HB1 ASP    26       3.373  -2.440  -4.044  1.00   .00
ATOM    391  HB2 ASP    26       5.044  -2.948  -4.291  1.00   .00
ATOM    392  CG  ASP    26       4.391  -1.384  -5.610  1.00   .00
ATOM    393  OD1 ASP    26       3.364   -.841  -5.983  1.00   .00
ATOM    394  OD2 ASP    26       5.430  -1.392  -6.250  1.00   .00
ATOM    395  C   ASP    26       6.139   -.447  -3.563  1.00   .00
ATOM    396  O   ASP    26       7.205   -.811  -3.107  1.00   .00
ATOM    397  N   LEU    27       6.072    .540  -4.415  1.00   .00
ATOM    398  HN  LEU    27       5.206    .819  -4.777  1.00   .00
ATOM    399  CA  LEU    27       7.321   1.238  -4.840  1.00   .00
ATOM    400  HA  LEU    27       8.014    .533  -5.271  1.00   .00
ATOM    401  CB  LEU    27       6.872   2.243  -5.908  1.00   .00
ATOM    402  HB1 LEU    27       6.122   1.786  -6.536  1.00   .00
ATOM    403  HB2 LEU    27       7.721   2.528  -6.512  1.00   .00
ATOM    404  CG  LEU    27       6.282   3.487  -5.240  1.00   .00
ATOM    405  HG  LEU    27       5.904   3.225  -4.263  1.00   .00
ATOM    406  CD1 LEU    27       7.370   4.553  -5.098  1.00   .00
ATOM    407 HD11 LEU    27       7.607   4.958  -6.070  1.00   .00
ATOM    408 HD12 LEU    27       8.256   4.109  -4.668  1.00   .00
ATOM    409 HD13 LEU    27       7.016   5.345  -4.455  1.00   .00
ATOM    410  CD2 LEU    27       5.142   4.037  -6.101  1.00   .00
ATOM    411 HD21 LEU    27       4.694   4.885  -5.605  1.00   .00
ATOM    412 HD22 LEU    27       4.396   3.269  -6.244  1.00   .00
ATOM    413 HD23 LEU    27       5.531   4.345  -7.060  1.00   .00
ATOM    414  C   LEU    27       7.964   1.950  -3.644  1.00   .00
ATOM    415  O   LEU    27       9.135   2.275  -3.659  1.00   .00
ATOM    416  N   GLU    28       7.208   2.190  -2.607  1.00   .00
ATOM    417  HN  GLU    28       6.267   1.917  -2.614  1.00   .00
ATOM    418  CA  GLU    28       7.774   2.874  -1.409  1.00   .00
ATOM    419  HA  GLU    28       8.609   3.497  -1.687  1.00   .00
ATOM    420  CB  GLU    28       6.633   3.737   -.867  1.00   .00
ATOM    421  HB1 GLU    28       7.004   4.371   -.076  1.00   .00
ATOM    422  HB2 GLU    28       5.853   3.097   -.480  1.00   .00
ATOM    423  CG  GLU    28       6.070   4.606  -1.992  1.00   .00
ATOM    424  HG1 GLU    28       5.005   4.448  -2.070  1.00   .00
ATOM    425  HG2 GLU    28       6.544   4.337  -2.924  1.00   .00
ATOM    426  CD  GLU    28       6.344   6.079  -1.686  1.00   .00
ATOM    427  OE1 GLU    28       5.745   6.591   -.756  1.00   .00
ATOM    428  OE2 GLU    28       7.148   6.669  -2.389  1.00   .00
ATOM    429  C   GLU    28       8.200   1.836   -.368  1.00   .00
ATOM    430  O   GLU    28       8.860   2.148    .605  1.00   .00
ATOM    431  N   ALA    29       7.825    .603   -.566  1.00   .00
ATOM    432  HN  ALA    29       7.293    .376  -1.357  1.00   .00
ATOM    433  CA  ALA    29       8.201   -.462    .406  1.00   .00
ATOM    434  HA  ALA    29       7.957   -.160   1.414  1.00   .00
ATOM    435  CB  ALA    29       7.356  -1.671    .003  1.00   .00
ATOM    436  HB1 ALA    29       7.078  -2.227    .885  1.00   .00
ATOM    437  HB2 ALA    29       7.928  -2.305   -.657  1.00   .00
ATOM    438  HB3 ALA    29       6.465  -1.333   -.506  1.00   .00
ATOM    439  C   ALA    29       9.692   -.789    .286  1.00   .00
ATOM    440  O   ALA    29      10.374   -.996   1.268  1.00   .00
ATOM    441  N   ASN    30      10.200   -.843   -.914  1.00   .00
ATOM    442  HN  ASN    30       9.629   -.678  -1.693  1.00   .00
ATOM    443  CA  ASN    30      11.644  -1.165  -1.104  1.00   .00
ATOM    444  HA  ASN    30      11.837  -2.193   -.843  1.00   .00
ATOM    445  CB  ASN    30      11.895   -.954  -2.597  1.00   .00
ATOM    446  HB1 ASN    30      12.957   -.951  -2.788  1.00   .00
ATOM    447  HB2 ASN    30      11.471   -.008  -2.903  1.00   .00
ATOM    448  CG  ASN    30      11.239  -2.087  -3.388  1.00   .00
ATOM    449  OD1 ASN    30      11.215  -3.218  -2.944  1.00   .00
ATOM    450  ND2 ASN    30      10.702  -1.831  -4.549  1.00   .00
ATOM    451 HD21 ASN    30      10.721   -.920  -4.908  1.00   .00
ATOM    452 HD22 ASN    30      10.279  -2.551  -5.063  1.00   .00
ATOM    453  C   ASN    30      12.528   -.228   -.273  1.00   .00
ATOM    454  O   ASN    30      13.371   -.667    .484  1.00   .00
ATOM    455  N   GLN    31      12.354   1.058   -.414  1.00   .00
ATOM    456  HN  GLN    31      11.675   1.395  -1.036  1.00   .00
ATOM    457  CA  GLN    31      13.198   2.015    .361  1.00   .00
ATOM    458  HA  GLN    31      14.240   1.759    .265  1.00   .00
ATOM    459  CB  GLN    31      12.938   3.378   -.280  1.00   .00
ATOM    460  HB1 GLN    31      13.156   3.328  -1.336  1.00   .00
ATOM    461  HB2 GLN    31      13.571   4.121    .185  1.00   .00
ATOM    462  CG  GLN    31      11.470   3.764   -.083  1.00   .00
ATOM    463  HG1 GLN    31      11.363   4.318    .837  1.00   .00
ATOM    464  HG2 GLN    31      10.866   2.869   -.037  1.00   .00
ATOM    465  CD  GLN    31      11.009   4.631  -1.255  1.00   .00
ATOM    466  OE1 GLN    31      10.905   5.836  -1.131  1.00   .00
ATOM    467  NE2 GLN    31      10.727   4.066  -2.396  1.00   .00
ATOM    468 HE21 GLN    31      10.812   3.095  -2.496  1.00   .00
ATOM    469 HE22 GLN    31      10.430   4.613  -3.154  1.00   .00
ATOM    470  C   GLN    31      12.787   2.035   1.838  1.00   .00
ATOM    471  O   GLN    31      13.584   2.327   2.707  1.00   .00
ATOM    472  N   LEU    32      11.551   1.740   2.128  1.00   .00
ATOM    473  HN  LEU    32      10.919   1.516   1.414  1.00   .00
ATOM    474  CA  LEU    32      11.095   1.757   3.549  1.00   .00
ATOM    475  HA  LEU    32      11.642   2.498   4.110  1.00   .00
ATOM    476  CB  LEU    32       9.620   2.148   3.476  1.00   .00
ATOM    477  HB1 LEU    32       9.196   2.151   4.468  1.00   .00
ATOM    478  HB2 LEU    32       9.090   1.436   2.859  1.00   .00
ATOM    479  CG  LEU    32       9.496   3.545   2.865  1.00   .00
ATOM    480  HG  LEU    32       9.967   3.555   1.893  1.00   .00
ATOM    481  CD1 LEU    32       8.019   3.911   2.719  1.00   .00
ATOM    482 HD11 LEU    32       7.743   4.611   3.494  1.00   .00
ATOM    483 HD12 LEU    32       7.417   3.019   2.808  1.00   .00
ATOM    484 HD13 LEU    32       7.854   4.361   1.751  1.00   .00
ATOM    485  CD2 LEU    32      10.184   4.564   3.778  1.00   .00
ATOM    486 HD21 LEU    32       9.449   5.256   4.162  1.00   .00
ATOM    487 HD22 LEU    32      10.929   5.107   3.215  1.00   .00
ATOM    488 HD23 LEU    32      10.658   4.049   4.600  1.00   .00
ATOM    489  C   LEU    32      11.252    .375   4.192  1.00   .00
ATOM    490  O   LEU    32      11.183    .231   5.396  1.00   .00
ATOM    491  N   PHE    33      11.458   -.641   3.402  1.00   .00
ATOM    492  HN  PHE    33      11.508   -.506   2.432  1.00   .00
ATOM    493  CA  PHE    33      11.612  -2.012   3.973  1.00   .00
ATOM    494  HA  PHE    33      10.706  -2.314   4.472  1.00   .00
ATOM    495  CB  PHE    33      11.867  -2.916   2.766  1.00   .00
ATOM    496  HB1 PHE    33      12.791  -2.625   2.289  1.00   .00
ATOM    497  HB2 PHE    33      11.054  -2.816   2.065  1.00   .00
ATOM    498  CG  PHE    33      11.968  -4.354   3.218  1.00   .00
ATOM    499  CD1 PHE    33      13.178  -4.846   3.721  1.00   .00
ATOM    500  HD1 PHE    33      14.036  -4.195   3.794  1.00   .00
ATOM    501  CD2 PHE    33      10.854  -5.198   3.126  1.00   .00
ATOM    502  HD2 PHE    33       9.919  -4.819   2.741  1.00   .00
ATOM    503  CE1 PHE    33      13.276  -6.181   4.131  1.00   .00
ATOM    504  HE1 PHE    33      14.210  -6.560   4.519  1.00   .00
ATOM    505  CE2 PHE    33      10.951  -6.533   3.537  1.00   .00
ATOM    506  HE2 PHE    33      10.092  -7.184   3.466  1.00   .00
ATOM    507  CZ  PHE    33      12.162  -7.025   4.039  1.00   .00
ATOM    508  HZ  PHE    33      12.238  -8.055   4.355  1.00   .00
ATOM    509  C   PHE    33      12.798  -2.063   4.942  1.00   .00
ATOM    510  O   PHE    33      13.842  -1.493   4.693  1.00   .00
ATOM    511  N   ASP    34      12.642  -2.747   6.043  1.00   .00
ATOM    512  HN  ASP    34      11.791  -3.201   6.219  1.00   .00
ATOM    513  CA  ASP    34      13.756  -2.846   7.031  1.00   .00
ATOM    514  HA  ASP    34      14.537  -2.142   6.793  1.00   .00
ATOM    515  CB  ASP    34      13.123  -2.491   8.378  1.00   .00
ATOM    516  HB1 ASP    34      13.238  -3.320   9.060  1.00   .00
ATOM    517  HB2 ASP    34      12.071  -2.285   8.237  1.00   .00
ATOM    518  CG  ASP    34      13.813  -1.256   8.959  1.00   .00
ATOM    519  OD1 ASP    34      14.509  -1.402   9.950  1.00   .00
ATOM    520  OD2 ASP    34      13.632   -.184   8.405  1.00   .00
ATOM    521  C   ASP    34      14.307  -4.275   7.057  1.00   .00
ATOM    522  O   ASP    34      13.556  -5.229   7.025  1.00   .00
ATOM    523  N   PRO    35      15.608  -4.372   7.108  1.00   .00
ATOM    524  CA  PRO    35      16.272  -5.698   7.131  1.00   .00
ATOM    525  HA  PRO    35      15.886  -6.332   6.349  1.00   .00
ATOM    526  CB  PRO    35      17.737  -5.369   6.859  1.00   .00
ATOM    527  HB1 PRO    35      17.952  -5.451   5.806  1.00   .00
ATOM    528  HB2 PRO    35      18.380  -6.027   7.429  1.00   .00
ATOM    529  CG  PRO    35      17.908  -3.952   7.308  1.00   .00
ATOM    530  HG1 PRO    35      18.645  -3.458   6.696  1.00   .00
ATOM    531  HG2 PRO    35      18.213  -3.931   8.346  1.00   .00
ATOM    532  CD  PRO    35      16.573  -3.269   7.147  1.00   .00
ATOM    533  HD2 PRO    35      16.378  -2.619   7.990  1.00   .00
ATOM    534  HD1 PRO    35      16.540  -2.714   6.222  1.00   .00
ATOM    535  C   PRO    35      16.114  -6.369   8.501  1.00   .00
ATOM    536  O   PRO    35      15.994  -7.573   8.599  1.00   .00
ATOM    537  N   MET    36      16.119  -5.602   9.559  1.00   .00
ATOM    538  HN  MET    36      16.223  -4.632   9.461  1.00   .00
ATOM    539  CA  MET    36      15.978  -6.206  10.919  1.00   .00
ATOM    540  HA  MET    36      16.924  -6.603  11.250  1.00   .00
ATOM    541  CB  MET    36      15.551  -5.056  11.837  1.00   .00
ATOM    542  HB1 MET    36      16.419  -4.482  12.116  1.00   .00
ATOM    543  HB2 MET    36      15.089  -5.461  12.726  1.00   .00
ATOM    544  CG  MET    36      14.553  -4.144  11.118  1.00   .00
ATOM    545  HG1 MET    36      14.285  -4.576  10.167  1.00   .00
ATOM    546  HG2 MET    36      15.003  -3.175  10.958  1.00   .00
ATOM    547  SD  MET    36      13.068  -3.956  12.136  1.00   .00
ATOM    548  CE  MET    36      13.364  -2.247  12.652  1.00   .00
ATOM    549  HE1 MET    36      14.357  -1.947  12.348  1.00   .00
ATOM    550  HE2 MET    36      13.280  -2.173  13.724  1.00   .00
ATOM    551  HE3 MET    36      12.630  -1.601  12.190  1.00   .00
ATOM    552  C   MET    36      14.916  -7.309  10.912  1.00   .00
ATOM    553  O   MET    36      15.070  -8.335  11.544  1.00   .00
ATOM    554  N   THR    37      13.843  -7.106  10.202  1.00   .00
ATOM    555  HN  THR    37      13.740  -6.272   9.700  1.00   .00
ATOM    556  CA  THR    37      12.772  -8.141  10.154  1.00   .00
ATOM    557  HA  THR    37      13.185  -9.121  10.334  1.00   .00
ATOM    558  CB  THR    37      11.808  -7.762  11.278  1.00   .00
ATOM    559  HB  THR    37      12.314  -7.839  12.228  1.00   .00
ATOM    560  OG1 THR    37      10.694  -8.643  11.260  1.00   .00
ATOM    561  HG1 THR    37      11.026  -9.542  11.320  1.00   .00
ATOM    562  CG2 THR    37      11.330  -6.324  11.077  1.00   .00
ATOM    563 HG21 THR    37      11.053  -5.901  12.032  1.00   .00
ATOM    564 HG22 THR    37      10.475  -6.319  10.419  1.00   .00
ATOM    565 HG23 THR    37      12.125  -5.738  10.640  1.00   .00
ATOM    566  C   THR    37      12.064  -8.095   8.799  1.00   .00
ATOM    567  O   THR    37      11.769  -9.113   8.205  1.00   .00
ATOM    568  N   GLY    38      11.797  -6.918   8.302  1.00   .00
ATOM    569  HN  GLY    38      12.051  -6.110   8.795  1.00   .00
ATOM    570  CA  GLY    38      11.117  -6.804   6.981  1.00   .00
ATOM    571  HA1 GLY    38      10.773  -7.778   6.668  1.00   .00
ATOM    572  HA2 GLY    38      11.816  -6.418   6.254  1.00   .00
ATOM    573  C   GLY    38       9.919  -5.857   7.087  1.00   .00
ATOM    574  O   GLY    38       8.952  -5.986   6.361  1.00   .00
ATOM    575  N   THR    39       9.970  -4.903   7.976  1.00   .00
ATOM    576  HN  THR    39      10.757  -4.807   8.551  1.00   .00
ATOM    577  CA  THR    39       8.827  -3.954   8.107  1.00   .00
ATOM    578  HA  THR    39       7.921  -4.406   7.737  1.00   .00
ATOM    579  CB  THR    39       8.696  -3.673   9.606  1.00   .00
ATOM    580  HB  THR    39       8.790  -2.612   9.785  1.00   .00
ATOM    581  OG1 THR    39       9.714  -4.366  10.314  1.00   .00
ATOM    582  HG1 THR    39       9.345  -4.664  11.149  1.00   .00
ATOM    583  CG2 THR    39       7.324  -4.143  10.088  1.00   .00
ATOM    584 HG21 THR    39       7.168  -5.167   9.782  1.00   .00
ATOM    585 HG22 THR    39       6.558  -3.517   9.655  1.00   .00
ATOM    586 HG23 THR    39       7.279  -4.077  11.164  1.00   .00
ATOM    587  C   THR    39       9.126  -2.662   7.343  1.00   .00
ATOM    588  O   THR    39      10.251  -2.392   6.976  1.00   .00
ATOM    589  N   PHE    40       8.123  -1.864   7.099  1.00   .00
ATOM    590  HN  PHE    40       7.223  -2.103   7.402  1.00   .00
ATOM    591  CA  PHE    40       8.346   -.592   6.357  1.00   .00
ATOM    592  HA  PHE    40       9.320   -.592   5.895  1.00   .00
ATOM    593  CB  PHE    40       7.259   -.570   5.282  1.00   .00
ATOM    594  HB1 PHE    40       7.369    .315   4.675  1.00   .00
ATOM    595  HB2 PHE    40       6.287   -.568   5.753  1.00   .00
ATOM    596  CG  PHE    40       7.398  -1.797   4.414  1.00   .00
ATOM    597  CD1 PHE    40       6.575  -2.908   4.634  1.00   .00
ATOM    598  HD1 PHE    40       5.837  -2.886   5.422  1.00   .00
ATOM    599  CD2 PHE    40       8.354  -1.827   3.392  1.00   .00
ATOM    600  HD2 PHE    40       8.990   -.970   3.222  1.00   .00
ATOM    601  CE1 PHE    40       6.708  -4.048   3.832  1.00   .00
ATOM    602  HE1 PHE    40       6.073  -4.905   4.001  1.00   .00
ATOM    603  CE2 PHE    40       8.487  -2.966   2.590  1.00   .00
ATOM    604  HE2 PHE    40       9.223  -2.988   1.801  1.00   .00
ATOM    605  CZ  PHE    40       7.664  -4.076   2.809  1.00   .00
ATOM    606  HZ  PHE    40       7.767  -4.955   2.191  1.00   .00
ATOM    607  C   PHE    40       8.202    .602   7.302  1.00   .00
ATOM    608  O   PHE    40       7.155    .832   7.874  1.00   .00
ATOM    609  N   ARG    41       9.250   1.360   7.476  1.00   .00
ATOM    610  HN  ARG    41      10.087   1.155   7.010  1.00   .00
ATOM    611  CA  ARG    41       9.174   2.534   8.390  1.00   .00
ATOM    612  HA  ARG    41       8.397   2.390   9.124  1.00   .00
ATOM    613  CB  ARG    41      10.537   2.587   9.081  1.00   .00
ATOM    614  HB1 ARG    41      10.794   3.615   9.291  1.00   .00
ATOM    615  HB2 ARG    41      11.286   2.153   8.435  1.00   .00
ATOM    616  CG  ARG    41      10.475   1.802  10.393  1.00   .00
ATOM    617  HG1 ARG    41       9.829    .946  10.270  1.00   .00
ATOM    618  HG2 ARG    41      10.084   2.439  11.173  1.00   .00
ATOM    619  CD  ARG    41      11.879   1.329  10.777  1.00   .00
ATOM    620  HD1 ARG    41      12.604   2.104  10.586  1.00   .00
ATOM    621  HD2 ARG    41      12.133    .429  10.233  1.00   .00
ATOM    622  NE  ARG    41      11.803   1.050  12.238  1.00   .00
ATOM    623  HE  ARG    41      11.061    .520  12.598  1.00   .00
ATOM    624  CZ  ARG    41      12.723   1.512  13.041  1.00   .00
ATOM    625  NH1 ARG    41      13.850    .870  13.179  1.00   .00
ATOM    626 HH11 ARG    41      14.010    .024  12.671  1.00   .00
ATOM    627 HH12 ARG    41      14.555   1.223  13.795  1.00   .00
ATOM    628  NH2 ARG    41      12.514   2.615  13.707  1.00   .00
ATOM    629 HH21 ARG    41      11.649   3.107  13.602  1.00   .00
ATOM    630 HH22 ARG    41      13.219   2.969  14.321  1.00   .00
ATOM    631  C   ARG    41       8.928   3.818   7.595  1.00   .00
ATOM    632  O   ARG    41       9.385   3.969   6.479  1.00   .00
ATOM    633  N   CYS    42       8.211   4.743   8.168  1.00   .00
ATOM    634  HN  CYS    42       7.857   4.596   9.070  1.00   .00
ATOM    635  CA  CYS    42       7.931   6.027   7.463  1.00   .00
ATOM    636  HA  CYS    42       7.178   5.895   6.704  1.00   .00
ATOM    637  HB1 CYS    42       8.256   7.321   9.130  1.00   .00
ATOM    638  HB2 CYS    42       6.757   6.398   9.207  1.00   .00
ATOM    639  C   CYS    42       9.215   6.600   6.868  1.00   .00
ATOM    640  O   CYS    42      10.284   6.045   7.023  1.00   .00
ATOM    641  CB  CYS    42       7.419   6.949   8.558  1.00   .00
ATOM    642  SG  CYS    42       6.524   8.341   7.834  1.00   .00
ATOM    643  N   THR    43       9.124   7.715   6.198  1.00   .00
ATOM    644  HN  THR    43       8.259   8.155   6.086  1.00   .00
ATOM    645  CA  THR    43      10.346   8.316   5.612  1.00   .00
ATOM    646  HA  THR    43      11.168   7.625   5.688  1.00   .00
ATOM    647  CB  THR    43      10.018   8.570   4.141  1.00   .00
ATOM    648  HB  THR    43       9.981   9.632   3.957  1.00   .00
ATOM    649  OG1 THR    43       8.761   7.988   3.825  1.00   .00
ATOM    650  HG1 THR    43       8.679   7.960   2.869  1.00   .00
ATOM    651  CG2 THR    43      11.107   7.945   3.269  1.00   .00
ATOM    652 HG21 THR    43      11.704   8.726   2.823  1.00   .00
ATOM    653 HG22 THR    43      10.649   7.352   2.491  1.00   .00
ATOM    654 HG23 THR    43      11.738   7.313   3.878  1.00   .00
ATOM    655  C   THR    43      10.697   9.623   6.325  1.00   .00
ATOM    656  O   THR    43      11.826  10.069   6.275  1.00   .00
ATOM    657  N   PHE    44       9.764  10.247   7.003  1.00   .00
ATOM    658  HN  PHE    44       8.850   9.885   7.058  1.00   .00
ATOM    659  CA  PHE    44      10.135  11.514   7.704  1.00   .00
ATOM    660  HA  PHE    44      11.207  11.635   7.663  1.00   .00
ATOM    661  CB  PHE    44       9.478  12.660   6.928  1.00   .00
ATOM    662  HB1 PHE    44       9.846  12.654   5.912  1.00   .00
ATOM    663  HB2 PHE    44       9.744  13.597   7.392  1.00   .00
ATOM    664  CG  PHE    44       7.977  12.531   6.912  1.00   .00
ATOM    665  CD1 PHE    44       7.344  11.861   5.859  1.00   .00
ATOM    666  HD1 PHE    44       7.933  11.410   5.073  1.00   .00
ATOM    667  CD2 PHE    44       7.215  13.114   7.930  1.00   .00
ATOM    668  HD2 PHE    44       7.705  13.629   8.743  1.00   .00
ATOM    669  CE1 PHE    44       5.949  11.776   5.824  1.00   .00
ATOM    670  HE1 PHE    44       5.460  11.259   5.011  1.00   .00
ATOM    671  CE2 PHE    44       5.820  13.025   7.899  1.00   .00
ATOM    672  HE2 PHE    44       5.232  13.472   8.686  1.00   .00
ATOM    673  CZ  PHE    44       5.187  12.357   6.844  1.00   .00
ATOM    674  HZ  PHE    44       4.111  12.297   6.815  1.00   .00
ATOM    675  C   PHE    44       9.698  11.485   9.171  1.00   .00
ATOM    676  O   PHE    44      10.319  12.103  10.013  1.00   .00
ATOM    677  N   CYS    45       8.674  10.750   9.508  1.00   .00
ATOM    678  HN  CYS    45       8.193  10.223   8.834  1.00   .00
ATOM    679  CA  CYS    45       8.284  10.685  10.947  1.00   .00
ATOM    680  HA  CYS    45       8.840  11.424  11.506  1.00   .00
ATOM    681  HB1 CYS    45       6.482  11.473  10.064  1.00   .00
ATOM    682  HB2 CYS    45       6.596  11.715  11.800  1.00   .00
ATOM    683  C   CYS    45       8.628   9.276  11.466  1.00   .00
ATOM    684  O   CYS    45       8.132   8.823  12.479  1.00   .00
ATOM    685  CB  CYS    45       6.774  11.015  10.999  1.00   .00
ATOM    686  SG  CYS    45       5.760   9.538  11.282  1.00   .00
ATOM    687  N   HIS    46       9.501   8.608  10.749  1.00   .00
ATOM    688  HN  HIS    46       9.875   9.031   9.950  1.00   .00
ATOM    689  CA  HIS    46       9.969   7.231  11.106  1.00   .00
ATOM    690  HA  HIS    46      10.106   6.656  10.204  1.00   .00
ATOM    691  CB  HIS    46      11.332   7.453  11.755  1.00   .00
ATOM    692  HB1 HIS    46      11.672   6.536  12.212  1.00   .00
ATOM    693  HB2 HIS    46      11.255   8.228  12.504  1.00   .00
ATOM    694  CG  HIS    46      12.300   7.873  10.684  1.00   .00
ATOM    695  ND1 HIS    46      13.274   7.021  10.186  1.00   .00
ATOM    696  HD1 HIS    46      13.449   6.104  10.484  1.00   .00
ATOM    697  CD2 HIS    46      12.429   9.043   9.976  1.00   .00
ATOM    698  HD2 HIS    46      11.817   9.921  10.109  1.00   .00
ATOM    699  CE1 HIS    46      13.936   7.683   9.219  1.00   .00
ATOM    700  HE1 HIS    46      14.744   7.262   8.638  1.00   .00
ATOM    701  NE2 HIS    46      13.463   8.920   9.052  1.00   .00
ATOM    702  C   HIS    46       9.017   6.480  12.043  1.00   .00
ATOM    703  O   HIS    46       9.428   5.918  13.039  1.00   .00
ATOM    704  N   THR    47       7.761   6.423  11.707  1.00   .00
ATOM    705  HN  THR    47       7.454   6.855  10.887  1.00   .00
ATOM    706  CA  THR    47       6.798   5.662  12.549  1.00   .00
ATOM    707  HA  THR    47       7.217   5.464  13.523  1.00   .00
ATOM    708  CB  THR    47       5.566   6.561  12.672  1.00   .00
ATOM    709  HB  THR    47       5.290   6.929  11.697  1.00   .00
ATOM    710  OG1 THR    47       5.867   7.656  13.527  1.00   .00
ATOM    711  HG1 THR    47       6.524   7.364  14.164  1.00   .00
ATOM    712  CG2 THR    47       4.401   5.755  13.257  1.00   .00
ATOM    713 HG21 THR    47       3.466   6.213  12.970  1.00   .00
ATOM    714 HG22 THR    47       4.478   5.742  14.334  1.00   .00
ATOM    715 HG23 THR    47       4.434   4.744  12.883  1.00   .00
ATOM    716  C   THR    47       6.442   4.354  11.834  1.00   .00
ATOM    717  O   THR    47       6.176   4.342  10.648  1.00   .00
ATOM    718  N   GLU    48       6.439   3.252  12.535  1.00   .00
ATOM    719  HN  GLU    48       6.659   3.274  13.489  1.00   .00
ATOM    720  CA  GLU    48       6.102   1.957  11.873  1.00   .00
ATOM    721  HA  GLU    48       6.872   1.685  11.169  1.00   .00
ATOM    722  CB  GLU    48       6.043    .929  13.003  1.00   .00
ATOM    723  HB1 GLU    48       5.024    .596  13.135  1.00   .00
ATOM    724  HB2 GLU    48       6.398   1.378  13.918  1.00   .00
ATOM    725  CG  GLU    48       6.925   -.270  12.647  1.00   .00
ATOM    726  HG1 GLU    48       6.912   -.421  11.578  1.00   .00
ATOM    727  HG2 GLU    48       6.548  -1.154  13.141  1.00   .00
ATOM    728  CD  GLU    48       8.360   -.001  13.104  1.00   .00
ATOM    729  OE1 GLU    48       9.059   -.959  13.391  1.00   .00
ATOM    730  OE2 GLU    48       8.736   1.158  13.159  1.00   .00
ATOM    731  C   GLU    48       4.748   2.064  11.165  1.00   .00
ATOM    732  O   GLU    48       3.718   2.224  11.791  1.00   .00
ATOM    733  N   VAL    49       4.745   1.980   9.862  1.00   .00
ATOM    734  HN  VAL    49       5.589   1.854   9.380  1.00   .00
ATOM    735  CA  VAL    49       3.464   2.080   9.106  1.00   .00
ATOM    736  HA  VAL    49       2.891   2.928   9.445  1.00   .00
ATOM    737  CB  VAL    49       3.883   2.281   7.651  1.00   .00
ATOM    738  HB  VAL    49       3.003   2.408   7.037  1.00   .00
ATOM    739  CG1 VAL    49       4.766   3.526   7.541  1.00   .00
ATOM    740 HG11 VAL    49       5.488   3.387   6.751  1.00   .00
ATOM    741 HG12 VAL    49       5.282   3.685   8.477  1.00   .00
ATOM    742 HG13 VAL    49       4.150   4.385   7.320  1.00   .00
ATOM    743  CG2 VAL    49       4.669   1.057   7.176  1.00   .00
ATOM    744 HG21 VAL    49       5.492   1.376   6.554  1.00   .00
ATOM    745 HG22 VAL    49       4.018    .408   6.609  1.00   .00
ATOM    746 HG23 VAL    49       5.053    .522   8.033  1.00   .00
ATOM    747  C   VAL    49       2.652    .789   9.258  1.00   .00
ATOM    748  O   VAL    49       2.988   -.078  10.040  1.00   .00
ATOM    749  N   GLU    50       1.586    .658   8.516  1.00   .00
ATOM    750  HN  GLU    50       1.333   1.370   7.892  1.00   .00
ATOM    751  CA  GLU    50        .751   -.575   8.616  1.00   .00
ATOM    752  HA  GLU    50       1.367  -1.431   8.839  1.00   .00
ATOM    753  CB  GLU    50       -.212   -.306   9.774  1.00   .00
ATOM    754  HB1 GLU    50      -1.064   -.964   9.694  1.00   .00
ATOM    755  HB2 GLU    50       -.545    .721   9.733  1.00   .00
ATOM    756  CG  GLU    50        .503   -.560  11.103  1.00   .00
ATOM    757  HG1 GLU    50       1.088    .308  11.369  1.00   .00
ATOM    758  HG2 GLU    50       1.154  -1.417  11.003  1.00   .00
ATOM    759  CD  GLU    50       -.531   -.828  12.198  1.00   .00
ATOM    760  OE1 GLU    50       -.465   -.169  13.223  1.00   .00
ATOM    761  OE2 GLU    50      -1.373  -1.688  11.994  1.00   .00
ATOM    762  C   GLU    50       -.024   -.795   7.313  1.00   .00
ATOM    763  O   GLU    50       -.492    .139   6.694  1.00   .00
ATOM    764  N   GLU    51       -.161  -2.023   6.891  1.00   .00
ATOM    765  HN  GLU    51        .226  -2.764   7.404  1.00   .00
ATOM    766  CA  GLU    51       -.905  -2.299   5.626  1.00   .00
ATOM    767  HA  GLU    51       -.284  -2.089   4.770  1.00   .00
ATOM    768  CB  GLU    51      -1.237  -3.792   5.678  1.00   .00
ATOM    769  HB1 GLU    51      -2.274  -3.921   5.946  1.00   .00
ATOM    770  HB2 GLU    51       -.611  -4.275   6.414  1.00   .00
ATOM    771  CG  GLU    51       -.987  -4.420   4.305  1.00   .00
ATOM    772  HG1 GLU    51       -.346  -3.775   3.724  1.00   .00
ATOM    773  HG2 GLU    51      -1.929  -4.550   3.792  1.00   .00
ATOM    774  CD  GLU    51       -.310  -5.781   4.481  1.00   .00
ATOM    775  OE1 GLU    51        .022  -6.390   3.478  1.00   .00
ATOM    776  OE2 GLU    51       -.137  -6.191   5.617  1.00   .00
ATOM    777  C   GLU    51      -2.188  -1.465   5.575  1.00   .00
ATOM    778  O   GLU    51      -3.000  -1.503   6.478  1.00   .00
ATOM    779  N   ASP    52      -2.378   -.714   4.523  1.00   .00
ATOM    780  HN  ASP    52      -1.711   -.699   3.804  1.00   .00
ATOM    781  CA  ASP    52      -3.611    .119   4.417  1.00   .00
ATOM    782  HA  ASP    52      -3.667    .814   5.241  1.00   .00
ATOM    783  CB  ASP    52      -3.459    .883   3.100  1.00   .00
ATOM    784  HB1 ASP    52      -3.079    .218   2.340  1.00   .00
ATOM    785  HB2 ASP    52      -2.769   1.702   3.240  1.00   .00
ATOM    786  CG  ASP    52      -4.818   1.432   2.661  1.00   .00
ATOM    787  OD1 ASP    52      -5.519   1.968   3.504  1.00   .00
ATOM    788  OD2 ASP    52      -5.133   1.311   1.489  1.00   .00
ATOM    789  C   ASP    52      -4.853   -.781   4.391  1.00   .00
ATOM    790  O   ASP    52      -4.751  -1.990   4.328  1.00   .00
ATOM    791  N   GLU    53      -6.021   -.203   4.449  1.00   .00
ATOM    792  HN  GLU    53      -6.083    .773   4.508  1.00   .00
ATOM    793  CA  GLU    53      -7.264  -1.028   4.440  1.00   .00
ATOM    794  HA  GLU    53      -7.128  -1.918   5.033  1.00   .00
ATOM    795  CB  GLU    53      -8.330   -.137   5.078  1.00   .00
ATOM    796  HB1 GLU    53      -9.265   -.674   5.130  1.00   .00
ATOM    797  HB2 GLU    53      -8.458    .755   4.482  1.00   .00
ATOM    798  CG  GLU    53      -7.888    .251   6.490  1.00   .00
ATOM    799  HG1 GLU    53      -8.309   1.210   6.749  1.00   .00
ATOM    800  HG2 GLU    53      -6.809    .308   6.525  1.00   .00
ATOM    801  CD  GLU    53      -8.376   -.803   7.485  1.00   .00
ATOM    802  OE1 GLU    53      -9.393   -.568   8.116  1.00   .00
ATOM    803  OE2 GLU    53      -7.724  -1.828   7.600  1.00   .00
ATOM    804  C   GLU    53      -7.661  -1.397   3.006  1.00   .00
ATOM    805  O   GLU    53      -8.690  -2.002   2.776  1.00   .00
ATOM    806  N   SER    54      -6.858  -1.043   2.041  1.00   .00
ATOM    807  HN  SER    54      -6.032   -.556   2.242  1.00   .00
ATOM    808  CA  SER    54      -7.202  -1.382    .629  1.00   .00
ATOM    809  HA  SER    54      -8.268  -1.510    .522  1.00   .00
ATOM    810  CB  SER    54      -6.736   -.182   -.194  1.00   .00
ATOM    811  HB1 SER    54      -6.825    .717    .401  1.00   .00
ATOM    812  HB2 SER    54      -7.349   -.087  -1.075  1.00   .00
ATOM    813  OG  SER    54      -5.384   -.377   -.585  1.00   .00
ATOM    814  HG  SER    54      -5.381   -.764  -1.464  1.00   .00
ATOM    815  C   SER    54      -6.466  -2.652    .194  1.00   .00
ATOM    816  O   SER    54      -6.113  -2.812   -.959  1.00   .00
ATOM    817  N   ALA    55      -6.228  -3.558   1.104  1.00   .00
ATOM    818  HN  ALA    55      -6.518  -3.412   2.029  1.00   .00
ATOM    819  CA  ALA    55      -5.513  -4.813    .734  1.00   .00
ATOM    820  HA  ALA    55      -5.236  -4.793   -.308  1.00   .00
ATOM    821  CB  ALA    55      -4.256  -4.827   1.604  1.00   .00
ATOM    822  HB1 ALA    55      -4.363  -5.572   2.379  1.00   .00
ATOM    823  HB2 ALA    55      -4.119  -3.856   2.055  1.00   .00
ATOM    824  HB3 ALA    55      -3.397  -5.065    .994  1.00   .00
ATOM    825  C   ALA    55      -6.384  -6.038   1.030  1.00   .00
ATOM    826  O   ALA    55      -6.441  -6.969    .251  1.00   .00
ATOM    827  N   MET    56      -7.060  -6.052   2.148  1.00   .00
ATOM    828  HN  MET    56      -7.003  -5.296   2.768  1.00   .00
ATOM    829  CA  MET    56      -7.917  -7.228   2.476  1.00   .00
ATOM    830  HA  MET    56      -7.736  -8.025   1.773  1.00   .00
ATOM    831  CB  MET    56      -7.451  -7.665   3.865  1.00   .00
ATOM    832  HB1 MET    56      -8.311  -7.870   4.485  1.00   .00
ATOM    833  HB2 MET    56      -6.865  -6.875   4.312  1.00   .00
ATOM    834  CG  MET    56      -6.598  -8.930   3.748  1.00   .00
ATOM    835  HG1 MET    56      -6.019  -9.058   4.650  1.00   .00
ATOM    836  HG2 MET    56      -5.933  -8.838   2.902  1.00   .00
ATOM    837  SD  MET    56      -7.676 -10.365   3.515  1.00   .00
ATOM    838  CE  MET    56      -8.286 -10.470   5.216  1.00   .00
ATOM    839  HE1 MET    56      -8.119 -11.468   5.597  1.00   .00
ATOM    840  HE2 MET    56      -9.341 -10.252   5.235  1.00   .00
ATOM    841  HE3 MET    56      -7.761  -9.751   5.830  1.00   .00
ATOM    842  C   MET    56      -9.425  -6.884   2.509  1.00   .00
ATOM    843  O   MET    56     -10.190  -7.626   3.093  1.00   .00
ATOM    844  N   PRO    57      -9.830  -5.792   1.890  1.00   .00
ATOM    845  CA  PRO    57     -11.272  -5.436   1.893  1.00   .00
ATOM    846  HA  PRO    57     -11.688  -5.529   2.883  1.00   .00
ATOM    847  CB  PRO    57     -11.287  -3.979   1.448  1.00   .00
ATOM    848  HB1 PRO    57     -11.277  -3.324   2.305  1.00   .00
ATOM    849  HB2 PRO    57     -12.157  -3.785    .835  1.00   .00
ATOM    850  CG  PRO    57     -10.035  -3.798    .652  1.00   .00
ATOM    851  HG1 PRO    57      -9.650  -2.800    .793  1.00   .00
ATOM    852  HG2 PRO    57     -10.238  -3.970   -.395  1.00   .00
ATOM    853  CD  PRO    57      -9.029  -4.803   1.153  1.00   .00
ATOM    854  HD2 PRO    57      -8.517  -5.269    .322  1.00   .00
ATOM    855  HD1 PRO    57      -8.325  -4.327   1.816  1.00   .00
ATOM    856  C   PRO    57     -12.037  -6.312    .893  1.00   .00
ATOM    857  O   PRO    57     -12.591  -5.826   -.072  1.00   .00
ATOM    858  N   LYS    58     -12.070  -7.597   1.115  1.00   .00
ATOM    859  HN  LYS    58     -11.615  -7.971   1.898  1.00   .00
ATOM    860  CA  LYS    58     -12.796  -8.500    .174  1.00   .00
ATOM    861  HA  LYS    58     -12.566  -9.531    .394  1.00   .00
ATOM    862  CB  LYS    58     -14.281  -8.234    .435  1.00   .00
ATOM    863  HB1 LYS    58     -14.519  -7.218    .157  1.00   .00
ATOM    864  HB2 LYS    58     -14.494  -8.380   1.484  1.00   .00
ATOM    865  CG  LYS    58     -15.127  -9.200   -.397  1.00   .00
ATOM    866  HG1 LYS    58     -14.487  -9.754  -1.067  1.00   .00
ATOM    867  HG2 LYS    58     -15.852  -8.641   -.972  1.00   .00
ATOM    868  CD  LYS    58     -15.854 -10.175    .532  1.00   .00
ATOM    869  HD1 LYS    58     -16.898  -9.904    .593  1.00   .00
ATOM    870  HD2 LYS    58     -15.412 -10.132   1.516  1.00   .00
ATOM    871  CE  LYS    58     -15.731 -11.595   -.023  1.00   .00
ATOM    872  HE1 LYS    58     -14.703 -11.922    .002  1.00   .00
ATOM    873  HE2 LYS    58     -16.118 -11.638  -1.032  1.00   .00
ATOM    874  NZ  LYS    58     -16.557 -12.436    .889  1.00   .00
ATOM    875  HZ1 LYS    58     -17.559 -12.179    .786  1.00   .00
ATOM    876  HZ2 LYS    58     -16.256 -12.276   1.872  1.00   .00
ATOM    877  HZ3 LYS    58     -16.431 -13.438    .645  1.00   .00
ATOM    878  C   LYS    58     -12.416  -8.170  -1.279  1.00   .00
ATOM    879  O   LYS    58     -11.291  -8.376  -1.689  1.00   .00
ATOM    880  N   LYS    59     -13.334  -7.663  -2.063  1.00   .00
ATOM    881  HN  LYS    59     -14.238  -7.501  -1.726  1.00   .00
ATOM    882  CA  LYS    59     -13.002  -7.333  -3.480  1.00   .00
ATOM    883  HA  LYS    59     -13.885  -7.013  -4.010  1.00   .00
ATOM    884  CB  LYS    59     -11.999  -6.183  -3.393  1.00   .00
ATOM    885  HB1 LYS    59     -11.361  -6.195  -4.264  1.00   .00
ATOM    886  HB2 LYS    59     -11.397  -6.297  -2.503  1.00   .00
ATOM    887  CG  LYS    59     -12.752  -4.852  -3.336  1.00   .00
ATOM    888  HG1 LYS    59     -13.679  -4.985  -2.799  1.00   .00
ATOM    889  HG2 LYS    59     -12.961  -4.513  -4.340  1.00   .00
ATOM    890  CD  LYS    59     -11.894  -3.814  -2.614  1.00   .00
ATOM    891  HD1 LYS    59     -11.314  -3.261  -3.337  1.00   .00
ATOM    892  HD2 LYS    59     -11.229  -4.315  -1.926  1.00   .00
ATOM    893  CE  LYS    59     -12.797  -2.849  -1.843  1.00   .00
ATOM    894  HE1 LYS    59     -12.622  -2.935   -.782  1.00   .00
ATOM    895  HE2 LYS    59     -13.836  -3.045  -2.072  1.00   .00
ATOM    896  NZ  LYS    59     -12.403  -1.493  -2.317  1.00   .00
ATOM    897  HZ1 LYS    59     -12.464  -1.457  -3.354  1.00   .00
ATOM    898  HZ2 LYS    59     -11.427  -1.293  -2.019  1.00   .00
ATOM    899  HZ3 LYS    59     -13.044   -.783  -1.909  1.00   .00
ATOM    900  C   LYS    59     -12.370  -8.544  -4.172  1.00   .00
ATOM    901  O   LYS    59     -12.082  -9.547  -3.549  1.00   .00
ATOM    902  N   ASP    60     -12.152  -8.459  -5.457  1.00   .00
ATOM    903  HN  ASP    60     -12.391  -7.641  -5.940  1.00   .00
ATOM    904  CA  ASP    60     -11.538  -9.606  -6.188  1.00   .00
ATOM    905  HA  ASP    60     -10.770 -10.068  -5.588  1.00   .00
ATOM    906  CB  ASP    60     -12.686 -10.591  -6.416  1.00   .00
ATOM    907  HB1 ASP    60     -12.598 -11.024  -7.401  1.00   .00
ATOM    908  HB2 ASP    60     -13.629 -10.069  -6.334  1.00   .00
ATOM    909  CG  ASP    60     -12.623 -11.701  -5.365  1.00   .00
ATOM    910  OD1 ASP    60     -13.672 -12.087  -4.877  1.00   .00
ATOM    911  OD2 ASP    60     -11.526 -12.146  -5.068  1.00   .00
ATOM    912  C   ASP    60     -10.962  -9.134  -7.526  1.00   .00
ATOM    913  O   ASP    60     -10.732  -7.959  -7.733  1.00   .00
ATOM    914  N   ALA    61     -10.725 -10.040  -8.435  1.00   .00
ATOM    915  HN  ALA    61     -10.917 -10.983  -8.249  1.00   .00
ATOM    916  CA  ALA    61     -10.162  -9.641  -9.758  1.00   .00
ATOM    917  HA  ALA    61      -9.865  -8.605  -9.744  1.00   .00
ATOM    918  CB  ALA    61      -8.936 -10.534  -9.949  1.00   .00
ATOM    919  HB1 ALA    61      -8.233 -10.356  -9.148  1.00   .00
ATOM    920  HB2 ALA    61      -8.468 -10.306 -10.895  1.00   .00
ATOM    921  HB3 ALA    61      -9.240 -11.570  -9.937  1.00   .00
ATOM    922  C   ALA    61     -11.187  -9.891 -10.868  1.00   .00
ATOM    923  O   ALA    61     -12.380  -9.879 -10.639  1.00   .00
ATOM    924  N   ARG    62     -10.729 -10.117 -12.070  1.00   .00
ATOM    925  HN  ARG    62      -9.763 -10.121 -12.232  1.00   .00
ATOM    926  CA  ARG    62     -11.673 -10.368 -13.198  1.00   .00
ATOM    927  HA  ARG    62     -12.066  -9.437 -13.575  1.00   .00
ATOM    928  CB  ARG    62     -10.827 -11.052 -14.272  1.00   .00
ATOM    929  HB1 ARG    62     -11.065 -12.105 -14.302  1.00   .00
ATOM    930  HB2 ARG    62      -9.780 -10.925 -14.040  1.00   .00
ATOM    931  CG  ARG    62     -11.127 -10.426 -15.636  1.00   .00
ATOM    932  HG1 ARG    62     -12.003  -9.799 -15.560  1.00   .00
ATOM    933  HG2 ARG    62     -11.305 -11.209 -16.360  1.00   .00
ATOM    934  CD  ARG    62      -9.933  -9.579 -16.082  1.00   .00
ATOM    935  HD1 ARG    62      -9.472  -9.100 -15.232  1.00   .00
ATOM    936  HD2 ARG    62     -10.248  -8.841 -16.807  1.00   .00
ATOM    937  NE  ARG    62      -8.984 -10.546 -16.699  1.00   .00
ATOM    938  HE  ARG    62      -8.839 -10.540 -17.668  1.00   .00
ATOM    939  CZ  ARG    62      -8.344 -11.402 -15.950  1.00   .00
ATOM    940  NH1 ARG    62      -7.101 -11.180 -15.622  1.00   .00
ATOM    941 HH11 ARG    62      -6.638 -10.354 -15.944  1.00   .00
ATOM    942 HH12 ARG    62      -6.609 -11.837 -15.049  1.00   .00
ATOM    943  NH2 ARG    62      -8.948 -12.480 -15.529  1.00   .00
ATOM    944 HH21 ARG    62      -9.900 -12.651 -15.781  1.00   .00
ATOM    945 HH22 ARG    62      -8.457 -13.136 -14.955  1.00   .00
ATOM    946  C   ARG    62     -12.811 -11.286 -12.744  1.00   .00
ATOM    947  OT1 ARG    62     -13.909 -11.130 -13.251  1.00   .00
ATOM    948  OT2 ARG    62     -12.563 -12.130 -11.899  1.00   .00
ENDMDL
【００９７】
表Ａは、最初の行（すなわち、MODEL 1の表示）ならびに最後から１行（すなわち、ENDMDLの表示）を除いて、各原子の３次元座標を記述している。１列目のATOMはこの行が原子座標の行であることを示し、２列目は、その原子の順番を、３列目はアミノ酸残基等における原子の区別を、４列目はアミノ酸残基等を、５列目はその原子を含むアミノ酸残基の番号を、６、７、８列目はその原子の座標（Å単位）を示している。最終行は、この表の終わりの行であることを示している。なお、本表は当業者にとって一般的に用いられている表記法であるプロテイン・データ・バンクの形式に従って記述している。（９、１０列目はデータベースの形式に合わせるための数字であり、本発明においては特に意味のある数字ではなく、９列目はすべて1.00を、１０列目はすべて0.00を使用した。）
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明により、基本転写因子TFIIEα亜鉛結合ドメインの構造とその機能が解析され、転写活性を調節することができる物質のスクリーニングが可能となった。
【００９９】
また、本発明により、転写活性が野生型より高いあるいは低いTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体が提供された。本発明の変異体は、TFIIEαが関与する事象（例えば、転写活性、TFIIEβ及び他の基本転写因子への結合など）の制御に利用することができる。例えば、本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質及びその塩を利用して、転写が関与する疾患（例えば、癌、リウマチ、生活習慣病、遺伝病など）の予防及び／又は治療を行うことができるかもしれない。また、本発明のTFIIEα亜鉛結合ドメイン変異体タンパク質及びその塩を利用して、転写のメカニズムを解明することができるかもしれない。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１ａ】TFIIEα亜鉛結合ドメインの配列アライメント。保存されたアミノ酸を太字で示す。Zn2+に配位してキレートを形成するシステインを赤色（実線）の枠に囲んで示す。疎水性コアの形成に寄与する残基を黄色（点線）の枠で囲んで示す。配列の上にヒト亜鉛結合ドメインの二次構造を示す。矢印および長方形は、それぞれβ鎖およびαヘリックスを表す。
【図１ｂ】TFIIEα亜鉛結合ドメインの最終的な20個のNMR構造のファミリーの重ね合わせ。残基127-145および152-163の主鎖原子のr.m.s.d.を最小限にすることにより構造を重ね合わせた。
【図１ｃ】TFIIEα亜鉛結合ドメインの平均構造のリボン表示。6個のβ鎖、1個のαヘリックスおよび2個のターンをそれぞれS1〜S6、H1およびt1〜t2で示す。Zn2+をピンク色の球として示す。
【図１ｄ】TFIIEα亜鉛結合ドメインのトポロジー図。第1および第2のβシートを黄色および緑色で、αヘリックスを淡青色で示す。ターン上の4個のCはZn2+に配位してキレートを形成するシステインを示す。
【図１ｅ】TFIIEα亜鉛結合ドメインの亜鉛結合部位。ピンク色の球はZn2+を示す。Zn2+配位結合（赤色の点線で示す）および二股に分かれた水素結合（青色の点線で示す）に関与する残基を側鎖と共に示す。
【図１ｆ】TFIIEα亜鉛結合ドメインの疎水性コア。疎水性コアおよび亜鉛結合ドメインに関与する残基を側鎖と共に示す。Zn2+に配位してキレートを形成するシステインを緑色で示す。5個のフェニルアラニンを赤色で示す。その他を青色で示す。
【図１ｇ】TFIIEα亜鉛結合ドメインの分子表面の静電ポテンシャル。陽性ポテンシャルを青色で、陰性ポテンシャルを赤で示す。保存された陰性ポテンシャルクラスターがマークされている。
【図２ａ】TFIIEα亜鉛結合ドメインと亜鉛リボンドメインの構造比較。TFIIE：ヒトTFIIEαの亜鉛結合ドメイン、TFIISc：ヒト由来転写伸長因子TFIISのC末端ドメイン、TFIIBn：古細菌由来基本転写因子TFIIBのN末端領域、RPB9c：酵母RNAポリメラーゼII由来RPB9のC末端領域。Zn2+をピンク色の球として示す。
【図２ｂ】亜鉛結合ドメインの構造比較。最小限のr.m.s.d.で重ね合わせることによって2つのターンを示す。赤色：TFIIE、青緑色:TFIISc、緑色：TFIIBn、橙色：RPB9c。
【図３ａ】精製した野生型（IIEαwt）および点突然変異TFIIEαのSDS-ポリアクリルアミド電気泳動
【図３ｂ】スーパーコイルDNA鋳型を用いたIn vitro転写アッセイ。野生型（IIEαwt）およびシステイン点突然変異TFIIEα（C129A、C132A、C154A、C157A）の結果。
【図３ｃ】スーパーコイルDNA鋳型を用いたIn vitro転写アッセイ。野生型（IIEαwt）および高度に保存された酸性残基の点突然変異TFIIEα（E140A、E140K、D164A、C164K）の結果。
【図３ｄ】リニアDNA鋳型を用いたIn vitro転写アッセイ。野生型（IIEαwt）およびシステイン点突然変異TFIIEα（C129A、C132A、C154A、C157A）の結果。
【図３ｅ】リニアDNA鋳型を用いたIn vitro転写アッセイ。野生型（IIEαwt）および高度に保存された酸性残基の点突然変異TFIIEα（E140A、E140K、D164A、C164K）の結果。
【図４ａ】GSTプルダウンアッセイ。野生型（IIEαwt）および点突然変異TFIIEαの基本転写因子（TFIIHを除く。）との結合結果。
【図４ｂ】GSTプルダウンアッセイ。野生型（IIEαwt）および点突然変異TFIIEαの基本転写因子TFIIHサブユニットとの結合結果。
【図５ａ】野生型および点突然変異させた亜鉛結合ドメインの遠紫外CDスペクトル。野生型(WT)、および点突然変異亜鉛結合ドメインC129A、C132A、C154A、C157Aの遠紫外CDスペクトルを示す。
【図５ｂ】野生型および点突然変異させた亜鉛結合ドメインの1D 1H NMRスペクトル。2倍過剰のEDTAを野生型亜鉛結合ドメインに添加した後のスペクトルを一番下に示す（WT+EDTA）。
【図５ｃ】EDTA滴定実験。EDTA添加前(- EDTA)および2倍過剰のEDTAを15N標識化野生型および点突然変異体亜鉛結合ドメインに添加後（+ EDTA）の15N-1H HSQCスペクトルおよびシグナル分布をプロットしたグラフをそれぞれ右側および左側に示す。グラフ中、横軸の数字は以下のように規定されるスペクトル範囲を示す。
【０１０１】
【表２】
2005245202.tif 000004
縦軸は、規定された領域内で観察された主鎖シグナルの数を示す。右側のグラフにおいて、左側のグラフと同一の色は左側のスペクトルで観察されたシグナルと一致するシグナルを意味する。グラフの上に記載されている”N”、”Ave.”および”S.D.”は、それぞれ主鎖シグナルの数、平均ケミカルシフト、および標準偏差を示す。
【図５ｄ】亜鉛結合部位の点突然変異体間の構造的類似。  アスパラギンおよびグルタミンの側鎖シグナルを上段のパネルに示す。対をなすシグナルを線で結んである。黒色の線：EDTA添加後のスペクトル内のシグナルと一致するシグナル。赤色の線：C129AおよびC132Aの両方のスペクトルに観察された共通シグナル。青色の線：C132Aのスペクトルにのみ観察されたシグナル。橙色の線：C154AおよびC157Aに共通のシグナル。緑色の線：C157Aのスペクトルにのみ観察されたシグナル。分散した主鎖シグナルを中段パネルに示す。下段左側のグラフはC132Aについてプロットしたもので、ピンク色および赤色はC129Aのスペクトルのシグナルと一致したシグナルを意味する。下段右側のグラフはC157Aについてプロットしたもので、淡い橙色および橙色はC154Aのスペクトルのシグナルと一致したシグナルを意味する。軸と着色はパネルcと同じものを表す。
【配列表フリーテキスト】
【０１０２】
＜配列番号１＞
配列番号１は、野生型ヒトTFIIEα亜鉛結合ドメインのDNA配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、野生型ヒトTFIIEα亜鉛結合ドメインのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３＞
変異体E140AのDNA配列を示す。
＜配列番号４＞
変異体E140Aのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号５＞
変異体E140KのDNA配列を示す。
＜配列番号６＞
変異体E140Kのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号７＞
変異体D164AのDNA配列を示す。
＜配列番号８＞
変異体D164Aのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号９＞
変異体D164KのDNA配列を示す。
＜配列番号１０＞
変異体D164Kのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１１＞
変異体C129AのDNA配列を示す。
＜配列番号１２＞
変異体C129Aのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１３＞
変異体C132AのDNA配列を示す。
＜配列番号１４＞
変異体C132Aのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１５＞
変異体C154AのDNA配列を示す。
＜配列番号１６＞
変異体C154Aのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１７＞
変異体C157AのDNA配列を示す。
＜配列番号１８＞
変異体C157Aのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１９＞
野生型ヒトTFIIEαのアミノ酸配列を示す。
【図１ａ】
2005245202.tif 000005
【図１ｂ】
2005245202.tif 000006
【図１ｃ】
2005245202.tif 000007
【図１ｄ】
2005245202.tif 000008
【図１ｅ】
2005245202.tif 000009
【図１ｆ】
2005245202.tif 000010
【図１ｇ】
2005245202.tif 000011
【図２ａ】
2005245202.tif 000012
【図２ｂ】
2005245202.tif 000013
【図３ａ】
2005245202.tif 000014
【図３ｂ】
2005245202.tif 000015
【図３ｃ】
2005245202.tif 000016
【図３ｄ】
2005245202.tif 000017
【図３ｅ】
2005245202.tif 000018
【図４ａ】
2005245202.tif 000019
【図４ｂ】
2005245202.tif 000020
【図５ａ】
2005245202.tif 000021
【図５ｂ】
2005245202.tif 000022
【図５ｃ】
2005245202.tif 000023
【図５ｄ】
2005245202.tif 000024
【配列表】
2005245202000001.app