(57)【要約】【課題】  哺乳類における流産、新生児死、先天性感染及び脳炎性疾病の主要原因であるネオスポラに対するワクチンの生成及び診断試薬の開発に関する。【解決手段】  ネオスポラからのＧＲＡ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を用いてのワクチンの生成及び診断試薬の製造に関する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４の約nt２５〜約nt６６０のＯＲＦのヌクレオチド配列、及びプラスミドｐＲＣ５（ＡＴＣＣ  ２０９６８６）のＧＲＡ２をコードするＯＲＦのヌクレオチド配列から成る群から選択された、ネオスポラＧＲＡ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
配列番号４のヌクレオチド配列を含んで成る請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
請求項１記載のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して相同であるヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４】
配列番号５のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドに対して相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項５】
請求項１，３又は４記載のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列の実質的な部分であるヌクレオチド配列から成る単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項６】
配列番号４の約nt１〜約nt２４、及び配列番号４の約nt６６１〜約nt１０３１から成る群から選択されたヌクレオチド配列、又はその実質的な部分を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項７】
配列番号１４又は１５、並びにそれらの相補体から成る群から選択されたオリゴヌクレオチド分子。
【請求項８】
（ａ）Ｎ．カニナム(N.Caninum）のＧＲＡ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成るか；（ｂ）前記（ａ）のヌクレオチド配列に対して相同であるヌクレオチド配列を含んで成るか；又は前記（ａ）もしくは（ｂ）のヌクレオチド配列の実質的な部分であるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子を含んで成る、組換えベクター。
【請求項９】
プラスミドｐＲＣ５（ＡＴＣＣ  ２０９６８６）である請求項８記載の組換えベクター。
【請求項１０】
前記組換えベクターの発現が、請求項８記載の組換えベクターによりコードされるポリペプチドに融合されるキャリヤー又は融合パートナーを含んで成る融合タンパク質の生成をもたらすようにそのキャリヤー又は融合パートナーをコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子をさらに含んで成る請求項８記載の組換えベクター。
【請求項１１】
請求項８，９又は１０記載の組換えベクターを含んで成る、形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
（ａ）Ｎ．カニナムＧＲＡ２タンパク質；（ｂ）Ｎ．カニナムＧＲＡ２タンパク質に対して相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｃ）Ｎ．カニナムＧＲＡ２タンパク質の実質的な部分又はそれに対して相同であるポリペプチドから成るポリペプチド；（ｄ）前記（ａ），（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質又はポリペプチドを含んで成る融合タンパク質；並びに（ｅ）前記（ａ），（ｂ），（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質又はポリペプチドの類似体又は誘導体、から成る群から選択された、実質的に精製され又は単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
前記ＧＲＡ２タンパク質が配列番号５のアミノ酸配列を含んで成る、請求項１２記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ＧＲＡ２であるＮ．カニナムタンパク質に対して特異的に反応する単離された抗体。
【請求項１５】
ネオスポラ遺伝子を無力化するために使用され得る、（ａ）Ｎ．カニナムからのＧＲＡ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は前記ヌクレオチド配列の実質的な部分と同じであるが、しかし１もしくは複数の無力化突然変異をさらに含んで成るヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子、あるいは（ｂ）ネオスポラＧＲＡ２遺伝子のＯＲＦの末端に天然において接するヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を含んで成る遺伝子構造体であって、前記（ａ）又は（ｂ）の遺伝子構造体によるネオスポラ細胞の形質転換がＧＲＡ２遺伝子の無力化をもたらすことを特徴とする遺伝子構造体。
【請求項１６】
選択マーカーをさらに含んで成る請求項１５記載の遺伝子構造体。
【請求項１７】
前記それぞれの遺伝子が相同組換え現象の結果として無力化される請求項１５記載の遺伝子構造体。
【請求項１８】
ＧＲＡ２遺伝子が無力化されるよう、請求項１５記載の遺伝子構造体による形質転換により修飾されているネオスポラ細胞。
【請求項１９】
修飾されたネオスポラ細胞を調製するための方法であって、請求項１５記載の遺伝子構造体によりネオスポラ細胞を形質転換し、そして前記形質転換の結果として、ＧＲＡ２- の変異体表現型を発現することにより、形質転換された細胞を選択することを含んで成る方法。
【請求項２０】
（ａ）請求項１２記載のポリペプチド；（ｂ）請求項１２記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；又は（ｃ）請求項１８記載の修飾されたネオスポラ細胞を含んで成る成分の免疫学的有効量；及び獣医学的に許容できるキャリヤーを含んで成る、ネオスポロシスに対するワクチン。
【請求項２１】
前記修飾されたネオスポラ細胞が生存細胞である請求項２０記載のワクチン。
【請求項２２】
前記修飾されたネオスポラ細胞が不活性化された細胞である請求項２０記載のワクチン。
【請求項２３】
アジュバント又はサイトカインをさらに含んで成る請求項２０記載のワクチン。
【請求項２４】
前記アジュバントが、ＲＩＢＩアジュバント系、みょうばん、鉱物ゲル、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、ブロックコポリマー、ＱＳ−２１，ＳＡＦ−Ｍ，ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、ＱｕｉｌＡ、モノホスホリル脂質Ａ、Avridine脂質−アミンアジュバント、ＳＥＡＭ６２及びＳＥＡＭ１／２から成る群から選択される請求項２３記載のワクチン。
【請求項２５】
哺乳類を苦しめる疾病又は病理学的状態に対する保護応答を誘発することができる第２成分の免疫学的有効量をさらに含んで成る請求項２０記載のワクチン。
【請求項２６】
前記第２成分が、ウシヘルペスウィルス、ウシＲＳウィルス、ウシウィルス性下痢性ウィルス、パラインフルエンザウィルス型Ｉ，II、又はIII 、レプトスピラｓｐｐ．(Leptospira spp.）、カンピロバクターｓｐｐ．（Campylobacter spp.）、スタフィロコーカス・アウレウス(Staphylococcus aureus）、ストレプトコーカス・アガラクチアエ（Streptococcus agalactiae）、マイコプラズマｓｐｐ．(Mycoplasma spp.）、クレブシエラｓｐｐ．(Klebsiella spp.）、サルモネラｓｐｐ．(Salmonella spp.）、ロタウィルス、コロナウィルス、狂犬病、パステウレラ・ヘモライチカ（Pasteurella hemolytica）、パステウレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida）、クロストリジアｓｐｐ．(Clostridia spp.）、破傷風トキソイド、Ｅ．コリ（E.coli）、クリプハスポリジウムｓｐｐ．（Cryptosporidium spp.）、エイメリアｓｐｐ．（Eimeria spp.）及びトリコモナスｓｐｐ．（Trichomonas spp.）から成る群から選択された病原体に対する保護応答を誘発することができるか、又はその誘発に寄与することができる請求項２５記載のワクチン。
【請求項２７】
ネオスポロシスに対するワクチンを調製するための方法であって、（ａ）請求項１２記載のポリペプチド；（ｂ）請求項１２記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子；又は（ｃ）請求項１８記載の修飾されたネオスポラ細胞の免疫学的有効量と獣医学的に許容できるキャリヤーとを組合せることを含んで成る方法。
【請求項２８】
請求項２０記載のワクチンを哺乳類に投与することを含んで成る、ネオスポロシスに対して哺乳類を予防接種する方法。
【請求項２９】
（ａ）請求項１２記載のポリペプチド；（ｂ）請求項１２記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；又は（ｃ）請求項１８記載の修飾されたネオスポラ細胞の免疫学的有効量を含んで成る容器を含んで成る、ネオスポロシスに対して哺乳類を予防接種するためのキット。
【請求項３０】
獣医学的に許容できるキャリヤー又は希釈剤を含んで成る第２容器をさらに含んで成る請求項２９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、動物健康の分野に関し、そして疾病のためのワクチン組成物及び診断に向けられうる。より具体的には、本発明は、ネオスポラ（Neospora）からのＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１及びＭＡＧ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子に関し、ここで前記ポリヌクレオチド分子及びタンパク質は、ネオスポロシス(neosporosis）に対するワクチンの生成において、及び診断試薬として有用である。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
ネオスポラは、哺乳類における流産、新生児死、先天性感染及び脳炎性疾患の主要原因として認識されて来た動物の病原性原虫寄生体である。Dubey and Lindsay, 1996, Vet. Parasitol. 67 : 1-59 ; Dubey and Lindsay, 1993, Parasitology Today, 9 : 452-458 。ネオスポラ・カニナムは、犬に感染し、そして先天的に子犬に感染し、しばしば麻痺を導びく。Ｎ．カニナムのタキゾイト（tachyzoite）が自然において感染された子犬から単離されている(Lindsay and Dubey, 1989, J. Parasitol. 75 : 163-165）。ネオスポラは、乳牛及び肉牛における流産の主要因子である。ネオスポラ−関連疾病、すなわちネオスポロシスの症例がまた、ヤギ、羊及び馬においても報告されている。
【０００３】
Ｎ．カニナムは、表面上は病原体、すなわちトキソプラズマゴンジ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）に類似するが、Ｎ．カニナム及びＴ．ゴンジは、抗原的に及び超構造的にお互い区別されて来た（Dubey and Lindsay, 1993 、上記）。さらに、流産したウシ胎児の脳から単離され、そしてインビトロで連続して培養されたネオスポラ−株原虫寄生体は、Ｔ．ゴンジ及びハモンジア  ハモンジ（Ｈａｍｍｏｎｄｉａ  ｈａｍｍｏｎｄｉ）の両者と抗原的に及び超構造的に異なることが示され、そしてＮ．カニナムに最とも類似した（Conradなど., 1993, Parasitology 106 : 239-249)。さらに、核の小さなサブユニットであるリボソームＲＮＡ遺伝子の分析は、畜牛及び犬から単離されたネオスポラ株間にヌクレオチドの差異が存在しないことを示したが、しかし、ネオスポラとＴ．ゴンジとの間に一定の差異を示した（Marsh など., 1995, J. Parasitol. 81 : 530-535)。
【０００４】
ウシ流産及び先天性疾患におけるネオスポラのウシ単離物の病因役割が確かめられている（Barrなど., 1994, J. Vet. Diag. Invest. 6 : 207-215）。中枢系ネオスポロシスのゲッ歯動物モデルが、Ｎ．カニナムにより感染された近交系ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて、開発されている（Lindsay など., 1995, J. Parasitol. 81 : 313-315)。さらに、妊娠した遠縁系及び近交系マウスにおけるＮ．カニナムの経胎盤伝達を研究するためのモデルが、Coleなど., 1995, J. Parasitol. 81 : 730-732 、及びLongなど., 1996, J. Parasitol. 82 : 608-611 により記載されている。天然において獲得されたネオスポラ−誘発性畜牛流産に密接に類似する実験用Ｎ．カニナム・ピグミーヤギモデルが示されている。Lindsay など., 1995, Am. J. Vet. Res. 56 : 1176-1180。天然において獲得されたネオスポラ−誘発性畜牛流産に密接に類似する実験用Ｎ．カニナム羊モデルもまた示されている（Buxtonなど., 1997, J. Comp. Path. 117 : 1-16）。
【０００５】
Ｔ．ゴンジにおいて、抗原の排出−分泌グループを含んで成る電子密集粒状物がタキゾイトの細胞質に存在する。それらは抗原は、ＧＲＡタンパク質として示されている。Ｔ．ゴンジのＧＲＡ１タンパク質は、約２２〜２７KDa の範囲の分子量を有することが報告されており、そしてＴ．ゴンジのＧＲＡ２タンパク質は約２８KDa の範囲の分子量を有することが報告されている（Sam-Yellowe, 1996, Parasitol. Today 12 : 308-315）。類似する電子密集粒状物がＮ．カニナム  タキゾイドの細胞質に存在する（Bjerkas など., 1994, Clin. Diag. Lab. Immunol. 1 : 214-221 ; Hemphill など., 1998, Inti. J. Parasitol. 28 : 429-438 ）。
【０００６】
Ｔ．ゴンジ細胞はまた、ＳＡＧとして示されて来た主要表面抗原群を含んで成ることも示されている。Ｔ．ゴンジのＳＡＧ１タンパク質は、約３０KDa の分子量を有することが報告されている（Kasperなど., 1983, J. Immunol. 130 : 2407-2412）。Ｔ．ゴンジＳＡＧ１タンパク質に対して向けられたモノクローナル抗体は、組織培養条件下でウシ腎臓細胞を侵入するＴ．ゴンジ  タキゾイドの能力を阻止した（Grimwood and Smith, 1996, Intl. J. Parasitol. 26 : 169-173）。
【０００７】
Ｔ．ゴンジＳＡＧ１は侵入過程において役割を演じるように思えるので、ＳＡＧ１はビルレンス表現型を支持するために必要であることが仮定される（Windeck and Gross, 1996, Parasitol. Res. 82 : 715-719)。Ｔ．ゴンジＳＡＧ１タンパク質により免疫化され、そして次に、Ｔ．ゴンジにより挑戦されたマウスが対照マウスよりもそれらの脳においてトキソプラズマノウ胞形成を減じた観察がこの仮定と一致する（Debardなど., 1996, Infect. Immun., 64 : 2158-2166)。Ｔ．ゴンジＳＡＧ１は、Hemphillなど., 1997, Parasitol. 115 : 371-380 に記載されるＮＣ−ｐ３６として示される、Ｎ．カニナムにおける類似する分子に機能的に関係している。
【０００８】
短系(microneme）は、Ｔ．ゴンジ及びネオスポラの両者のタキゾイトの先端に位置する細胞内オルガネラであり、そして侵入の間、宿主細胞認識、及び宿主細胞表面への結合において役割を演じることができる（Formaux など., 1996, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219 : 55-58)。少なくとも４種の異なった短系−関連（ＭＩＣ）タンパク質がＴ．ゴンジにおいて同定されている。Ｔ．ゴンジのＭＩＣ１タンパク質は約６０KDa であり、宿主細胞の表面に結合し、そしてヒト肝細胞に結合するプラスモジウム  ファルシパラム(Plasmodium falciparum）からのトロンボスポンジン関連付着タンパク質（ＴＲＡＰ）に対して部分的に相同であることが報告されている。
Robsonなど., 1995, ENBO J. 14 : 3883-3894 。
【０００９】
タキゾイトからブラディゾイトへの寄生体の転換は、Ｔ．ゴンジの慢性感染及び存続のために決定的である。ＭＡＧ１として示される、免疫優性ブラディゾイト−特異的６５KD抗原を発現する遺伝子が、Ｔ．ゴンジにおいて同定されている。Parmley など., 1994, Mol. Biochem. Parasitol. 66 : 283-296。ＭＡＧ１はブラディゾイトノウ胞において特異的に発現されるが、しかしタキゾイト段階においては発現されないことが報告されている。発現のこの特異性は、寄生体の生活環のタキゾイト段階とブラディゾイト段階との間での転換におけるＭＡＧ１の包含を示すことができる。Bohne など., 1996, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 219 : 81-91 。
【００１０】
Ｔ．ゴンジＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１及びＭＡＧ１タンパク質のタンパク質相同体のネオスポラにおける同定、及び前記ネオスポラタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列の同定は、ネオスポロシスに対するワクチン及び診断試薬の開発を促進するよう作用するであろう。
【００１１】
３．発明の要約
本発明はＮ．カニナムからのＧＲＡ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様においては、ＧＲＡ１タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を有する。さらなる好ましい態様においては、本発明の単離されたＧＲＡ１−コードポリヌクレオチド分子は、配列番号１の約nt２０５〜約nt７７７のヌクレオチド配列、配列番号３の約nt６０５〜約nt１３０４において示される、ＧＲＡ１遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列、及びプラスミドｐＲＣ７７（ＡＴＣＣ  ２０９６８５）のＧＲＡ１をコードするＯＲＦのヌクレオチド配列から成る群から選択されたヌクレオチド配列を含んで成る。非制限態様においては、本発明の単離されたＧＲＡ１−コードポリヌクレオチド分子は、配列番号１及び配列番号３のヌクレオチド配列から成る群から選択されたヌクレオチド配列を含んで成る。
【００１２】
本発明はさらに、本発明のＧＲＡ１−コードポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して相同であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、Ｎ．カニナムのＧＲＡ１タンパク質に対して相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、前述のＧＲＡ１関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的部分であるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１３】
本発明はＮ．カニナムからのＧＲＡ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様においては、ＧＲＡ２タンパク質は配列番号５のアミノ酸配列を有する。さらなる好ましい態様においては、本発明の単離されたＧＲＡ２をコードするポリヌクレオチド分子は、配列番号４の約nt２５〜約nt６６０であるＯＲＦのヌクレオチド配列、及びプラスミドｐＲＣ５（ＡＴＣＣ  ２０９６８６）のＧＲＡ２をコードするＯＲＦのヌクレオチド配列から成る群から選択されたヌクレオチド配列を含んで成る。
【００１４】
非制限態様においては、本発明の単離されたＧＲＡ２をコードするポリヌクレオチド分子は、配列番号４から選択されたヌクレオチド配列を含んで成る。本発明はさらに、本発明のＧＲＡ２−コードポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して相同であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、Ｎ．カニナムのＧＲＡ２タンパク質に対して相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、前述のＧＲＡ２関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的部分であるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１５】
本発明はＮ．カニナムからのＳＡＧ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様においては、ＳＡＧ１タンパク質は配列番号７のアミノ酸配列を有する。さらなる好ましい態様においては、本発明の単離されたＳＡＧ１をコードするポリヌクレオチド分子は、配列番号６の約nt１３０〜約nt１０８９であるＯＲＦのヌクレオチド配列、及びプラスミドｐＲＣ１０２（ＡＴＣＣ  ２０９６８７）のＳＡＧ１をコードするＯＲＦのヌクレオチド配列から成る群から選択されたヌクレオチド配列を含んで成る。
【００１６】
非制限態様においては、本発明の単離されたＳＡＧ１をコードするポリヌクレオチド分子は、配列番号６のヌクレオチド配列を含んで成る。本発明はさらに、本発明のＳＡＧ１をコードするポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して相同であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、Ｎ．カニナムのＳＡＧ１タンパク質に対して相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、前述のＳＡＧ１関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的部分であるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１７】
本発明はＮ．カニナムからのＭＩＣ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様においては、ＭＩＣ１タンパク質は配列番号９のアミノ酸配列を有する。さらなる好ましい態様においては、本発明の単離されたＭＩＣ１−コードポリヌクレオチド分子は、配列番号８の約nt１３８〜約nt１５２０のＯＲＦのヌクレオチド配列、配列番号１０として表わされる、ＭＩＣ１遺伝子のＯＲＦのヌクレオチド配列、及びプラスミドｐＲＣ３４０（ＡＴＣＣ  ２０９６８８）のＭＩＣ１をコードするＯＲＦのヌクレオチド配列から成る群から選択されたヌクレオチド配列を含んで成る。
【００１８】
非制限態様においては、本発明の単離されたＭＩＣ１−コードポリヌクレオチド分子は、配列番号８及び配列番号１０のヌクレオチド配列から成る群から選択されたヌクレオチド配列を含んで成る。本発明はさらに、本発明のＭＩＣ１をコードするポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して相同であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、Ｎ．カニナムのＭＩＣ１タンパク質に対して相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、前述のＭＩＣ１関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的部分であるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、Ｎ．カニナムからのＭＡＧ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。前記ＭＡＧ１タンパク質は配列番号１３に示される推定上のアミノ酸配列を有する。好ましい態様においては、本発明の単離されたＭＡＧ１をコードするポリヌクレオチド分子は、配列番号１１の約nt１３０５〜約nt２７８６で表わされるヌクレオチド配列、それから調製されるｃＤＮＡ分子、たとえば配列番号１２の約nt１２２〜約nt１３８１のＯＲＦを有するｃＤＮＡ分子、及びプラスミドｂｄ３０４（ＡＴＣＣ  ２０３４１３）に存在するＭＡＧ１をコードするＯＲＦのヌクレオチド配列から成る群から選択されたヌクレオチド配列を含んで成る。本発明はさらに、配列番号１１に存在するいづれかのＯＲＦのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を提供する。
【００２０】
非制限態様においては、本発明の単離されたＭＡＧ１−コードポリヌクレオチド分子は、配列番号１１及び１２から成る群から選択されたヌクレオチド配列を含んで成る。本発明はさらに、本発明のＭＡＧ１をコードするポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して相同であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、Ｎ．カニナムのＭＡＧ１タンパク質に対して相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、前述のＭＡＧ１−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的部分であるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、配列番号１１の約nt１２７〜約nt７０３に示され、及びその相補的配列を含む、Ｎ．カニナムＧＲＡ１及びＭＡＧ１遺伝子のプロモーターのヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を提供する。
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子のいづれかに対してハイブリダイズし、又は本発明のポリヌクレオチド分子のいづれかの相補体であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に対してハイブリダイズするオリゴヌクレオチド分子を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子のいづれかをクローニングし、そして発現するための組成物及び方法を提供し、そして組換えクローニングベクター、組換え発現ベクター、前記ベクターのいづれかを含んで成る形質転換された宿主細胞、及びそれらに由来する新規株又は細胞系も包含する。より具体的には、本発明は、Ｎ．カニナムのＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１又はＭＡＧ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含んで成る組換えベクターを提供する。特に非制限態様においては、本発明は、ＧＲＡ１をコードするプラスミドｐＲＣ７７（ＡＴＣＣ  ２０９６８５）；ＧＲＡ２をコードするプラスミドｐＲＣ５（ＡＴＣＣ  ２０９６８６）；ＳＡＧ１をコードするプラスミドｐＲＣ１０２（ＡＴＣＣ  ２０９６８７）；ＭＩＣ１をコードするプラスミドｐＲＣ３４０（ＡＴＣＣ  ２０９６８８）；及びＭＡＧ１遺伝子配列及びＭＡＧ１／ＧＲＡ１二方向プロモーター領域を含んで成るプラスミドｂｄ３０４（ＡＴＣＣ  ２０３４１３）を提供する。
【００２３】
本発明はさらに、ＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１及びＭＡＧ１タンパク質から成る群から選択された、実質的に精製されたか又は単離されたＮ．カニナムポリペプチドを提供する。好ましい態様においては、前記Ｎ．カニナムＧＲＡ１タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。もう１つの好ましい態様においては、Ｎ．カニナムＧＲＡ２タンパク質は配列番号５のアミノ酸配列を有する。もう１つの好ましい態様においては、Ｎ．カニナムＳＡＧ１タンパク質は配列番号７のアミノ酸配列を有する。もう１つの好ましい態様においては、Ｎ．カニナムＭＩＣ１タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を有する。さらにもう１つの好ましい態様においては、Ｎ．カニナムＭＡＧ１タンパク質は配列番号１３のアミノ酸配列を有する。
【００２４】
本発明はさらに、前述のＮ．カニナムタンパク質のいづれかに対して相同である実質的に精製され又は単離されたポリペプチドを提供する。本発明はさらに、当業界において知られているようなキャリヤー又は融合パートナーに融合される前述のポリペプチドのいづれかを含んで成る融合タンパク質であるポリペプチドを提供する。本発明はさらに、前述のポリペプチドのいづれかの実質的な部分から成るポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、ネオスポロシスに対して哺乳類を保護するためのワクチン組成物において及び診断試薬として有用である。
【００２５】
本発明はさらに、前述のポリペプチドのいづれかをコードし、１又は複数の調節要素に作用可能に関連して存在するヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を含んで成る組換え発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現の助けとなる条件下で培養し、そして前記細胞培養物から発現されたポリペプチドを回収することを含んで成る、前述のポリペプチドのいづれかを調製するための方法を提供する。
本発明はさらに、Ｎ．カニナムＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１又はＭＡＧ１タンパク質に対して特異的に向けられた抗体を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、修飾されたネオスポラ細胞を生成するために、ネオスポラＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１又はＭＡＧ１遺伝子の突然変異誘発に使用するための遺伝子構造体を提供する。そのような修飾されたネオスポラ細胞は、ネオスポロシスに対して哺乳類を保護するためのワクチン組成物において有用である。好ましい非制限態様においては、本発明の遺伝子構造体は、Ｎ．カニナムからのＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１又はＭＡＧ１をコードするヌクレオチド配列又はその実質的な部分と同じであるが、しかし、さらに、１又は複数の突然変異誘発、すなわち遺伝子を突然変異するように作用することができる１又は複数のヌクレオチド欠失、挿入及び／又は置換を含んで成るヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を含んで成る。
【００２７】
ネオスポラの細胞が形質転換されると、遺伝子構造体のポリヌクレオチド分子は、特定のネオスポラ遺伝子に、たとえば相同組換えにより特異的に標的化され、そして前記遺伝子又はその一部を欠失し、又は置換し、又は前記遺伝子中に挿入する。この組換え現象の結果として、ネオスポラ遺伝子が突然変異誘発される。得られる突然変異誘発された遺伝子は、それが部分的に欠損性の又は完全に欠損性のタンパク質をコードし、又はタンパク質をコードするのに失敗するよう、好ましくは部分的に又は完全に無能化される。本発明はさらに、１又は複数の前記遺伝子突然変異により修飾されたネオスポラ細胞、及び本発明の遺伝子構造体を用いて、修飾されたネオスポラ細胞を調製するための方法を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、免疫学的に有効な量の本発明のポリペプチド、免疫学的に有効な量の本発明のポリヌクレオチド分子、又は免疫学的に有効な本発明の修飾されたネオスポラ細胞；及び獣医学的に許容できるキャリヤーを含んで成る、ネオスポロシスに対するワクチンを提供する。好ましい態様においては、本発明のワクチンは、ＧＲＡ１- ，ＧＲＡ２- ，ＳＡＧ１- ，ＭＩＣ１- 又はＭＡＧ１- 表現型、又は前記表現型の組合せを発現するＮ．カニナムの修飾された生存細胞を含んで成る。非制限態様においては、前記ワクチンは、ネオスポロシス、及び任意には、哺乳類を苦しめ得る１又は複数の他の疾病又は病理学的状態に対して哺乳類を保護するための組合せワクチンであり、ここで前記ワクチンは、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド分子又は修飾されたネオスポラ細胞を含んで成る免疫学的に有効な量の第１成分；第１成分とは異なっており、そして哺乳類を苦しめることができる疾病又は病理学的状態に対する保護応答を誘発することができ、又はその誘発に寄与することができる免疫学的に有効な量の第２成分；及び獣医学的に許容できるキャリヤーを含んで成る。
【００２９】
本発明はさらに、免疫学的に有効な量の本発明のＮ．カニナムポリペプチド、免疫学的に有効な量の本発明のポリヌクレオチド分子、又は免疫学的に有効な量の本発明の修飾されたネオスポラ細胞と、獣医学的に許容できるキャリヤーとを、哺乳類への投与のために適切な形で組合すことを含んで成る、ネオスポロシスに対するワクチンを調製するための方法を提供する。
【００３０】
本発明はさらに、免疫学的に有効な量の本発明のワクチンを、哺乳類に投与することを含んで成る、ネオスポロシスに対して哺乳類を予防接腫するための方法を提供する。
本発明はさらに、免疫学的に有効な量の本発明のポリペプチド、免疫学的に有効な量の本発明のポリヌクレオチド分子、又は免疫学的に有効な量の本発明の修飾されたネオスポラ細胞を有する第１容器；及び獣医学的に許容できるキャリヤー又は希釈剤を有する第２容器を含んで成る、ネオスポロシスに対して哺乳類を予防接腫するためのキットを提供する。
【００３１】
４．発明の特定の記載
４．１．ポリヌクレオチド分子
本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、ネオスポラのいづれかの種又は株に由来するが、しかし好ましくは、ネオスポラの病原種、たとえばＮ．カニナムからであるヌクレオチド配列を有することができる。本発明のポリヌクレオチド分子が単離され又は誘導され得るＮ．カニナムの株の非制限例は、12301 Parktawn Dive, Rockville, MD20852, USAに位置するAmerican Type Calture Collection（ＡＴＣＣ）から受託番号ＣＲＬ−１２２３１として宿主ＭＡＲＣ−１４５モンキー腎細胞から入手できるＮＣ−１株である。ＮＣ−１株はまた、引用により本明細書に組込まれる Dubeyなど., 1988, J. Am. Vet. Med. Assoc. 193 : 1259-63にも記載される。他方では、本発明の実施への使用のためのネオスポラの病原体株又は種は、上記出版物に記載されるような標準の単離技法を用いて、感染された動物の器官、組織又は体液から単離され得る。
【００３２】
本明細書において使用される場合、用語“ポリヌクレオチド分子”、“ポリヌクレオチド配列”、“コード配列”、“読み取り枠”、及び同様のものは、一本鎖又は二本鎖のいづれかであり得、そして１又は複数の原核配列、ｃＤＮＡ配列、エキソン及びイントロンを包含するゲノムＤＮＡ配列、及び化学的に合成されたＤＮＡ及びＲＮＡ配列、並びにセンス及び対応するアンチセンス鎖の両者を包含するＤＮＡ及びＲＮＡ分子の両者を言及することを意味する。用語“ＯＲＦ”とは、本明細書において使用される場合、特定のネオスポラタンパク質、すなわちいづれの介在終結コドンも有さないＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１又はＭＡＧ１をコードするために必要とれさる最小ヌクレオチド配列を意味する。
【００３３】
本明細書に開示されるポリヌクレオチド分子及びオリゴヌクレオチド分子の生成及び操作は、当業者に知られており、そして中でも次の文献に記載される組換え技法に従って実施され得る：Maniatisなど., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ; Ausubel など., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pnblishing Associates & Wiley Interscience, NY ; Sambrook など., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ; Innisなど. (eds), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego；及びErlich (ed), 1992, PCR Technology, Oxford University Press, New York (すべては引用により本明細書に組込まれる）。
【００３４】
４．１．１．ＧＲＡ１−関連ポリヌクレオチド分子
配列番号１及び３に示されるヌクレオチド配列及びその実質的な部分に関する表示は、特にことわらない限り、プラスミドｐＲＣ７７（ＡＴＣＣ  ２０９６８５）に存在するような、それぞれ、対応するヌクレオチド配列及びその実質的な部分をまた言及することを意味する。さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列及びその実質的な部分及びペプチドフラグメントに関する表示は、特にことわらない限り、プラスミドｐＲＣ７７（ＡＴＣＣ  ２０９６８５）に存在するその対応するＧＲＡ１−コードヌクレオチド配列によりコードされる、それぞれその対応するアミノ酸配列及びその実質的な部分及びペプチドフラグメントを言及することを意味する。
【００３５】
本発明は、Ｎ．カニナムからのＧＲＡ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様においては、ＧＲＡ１タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を有する。さらに好ましい態様においては、本発明の単離されたＧＲＡ１−コードポリペプチド分子は、配列番号１の約nt２０５〜約nt７７７のヌクレオチド配列、配列番号３の約nt６０５〜約nt１３０４に示される、ＧＲＡ１遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列、及びプラスミドｐＲＣ７７（ＡＴＣＣ  ２０９６８５）のＧＲＡ１をコードするＯＲＦのヌクレオチド配列から成る群から選択されたヌクレオチド配列を含んで成る。
【００３６】
非制限態様においては、本発明の単離されたＧＲＡ１−コードポリヌクレオチド分子は、配列番号１及び配列番号３のヌクレオチド配列から成る群から選択されたヌクレオチド配列を含んで成る。配列番号３に示されるＧＲＡ１遺伝子は、nt８５６〜nt９８２の介在イントロンと共に、nt６０５〜nt８５５及びnt９８３〜nt１３０４のＯＲＦを含んで成る。さらに、推定上のプロモーターモチーフは、Ｔ．ゴンジＧＲＡ遺伝子に見出される開始部位に類似する、ａｎＫＮＡ開始部位の５’側１５０bp内に同定されている（下記セクション５．３を参照のこと）。
【００３７】
本発明はさらに、本発明のＧＲＡ１−コードポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して相同であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。用語“相同”とは、ＧＲＡ１−関連ポリヌクレオチド分子を言及するために使用される場合、（ａ）本発明の前述のＧＲＡ１−コードポリヌクレオチド分子のタンパク質と同じタンパク質をコードするが、しかし遺伝子コードの縮重によりヌクレオチド配列に対する１又は複数のサイレント変化を包含するか、又は（ｂ）中程度の緊縮条件下で、すなわち０．５ＭのＮａＨＰＯ4 ，７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１mMのＥＤＴＡ（６５℃）におけるフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション及び４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳでの洗浄（Ausubel など., (eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., 及びJohn Wiley & Sons, Inc., New York, p. 2, 10.3 を参照のこと）の条件下で、Ｎ．カニナムＧＲＡ１タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、且つ本発明の実施において有用であるポリヌクレオチド分子を意味する。
【００３８】
好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下、すなわち６５℃で０．５ＭのＮａＨＰＯ4 ，７％のＳＤＳ、１mMのＥＤＴＡにおけるフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション及び６８℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳにおける洗浄（Ausubel など., 1989 、前記）の条件下で、Ｎ．カニナムＧＲＡ１タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の相補体に対してハイブリダイズし、そして本発明の実施において有用である。より好ましい態様においては、相同ポリヌクレオチド分子は、配列番号１の約nt２０５〜約nt７７７であるＯＲＦ、及び配列番号３の約nt６０５〜約nt１３０４に示され、そして本発明の実施において有用である、ＧＲＡ１遺伝子のＯＲＦから成る群から選択されたヌクレオチド配列から成るヌクレオチド分子の相補体に対して高い緊縮条件下でハイブリダイズする。
【００３９】
本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチド分子は、本発明の実施において有用であり、ここで前記ポリヌクレオチド分子は、標準の技法を用いてネオスポラ−特異的ポリヌクレオチド分子を増幅するために、又はネオスポラに感染された動物からの体流又は組織サンプルにおけるネオスポラ−特異的ポリヌクレオチドの存在を検出するための診断試薬として使用され得る。
本発明のＧＲＡ１をコードするポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して相同であるヌクレオチド配列を有する本発明のポリヌクレオチド分子は、Ｔ．ゴンジＧＲＡタンパク質をコードするＴ．ゴンジの生来のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含まず、そしてそのようなＴ．ゴンジポリヌクレオチド分子に対して、約９０％よりも高くない、及び好ましくは約８０％よりも高くない配列同一性を有し、ここで前記配列同一性は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（Gen Bank, National Center for Biotechnology Information ）の使用により決定される。
【００４０】
本発明はさらに、Ｎ．カニナムＧＲＡ１タンパク質に対して相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。Ｎ．カニナムＧＲＡ１タンパク質に対して相同であるポリペプチドに関して本明細書において言及するために使用される場合、用語“相同”とは、Ｎ．カニナムＧＲＡ１タンパク質のアミノ酸配列を有するが、しかし１又は複数のアミノ酸残基が異なったアミノ酸残基により保存的に置換されているポリペプチドを意味し、この場合、その得られるポリペプチドは本発明の実施において有用である。保存性アミノ酸置換は、当業界において良く知られている。そのような置換を製造するための規則は、中でも、Dayhof, M. D., 1978, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D. C., Vol. 5, Sup. 3  により記載される規則を包含する。より特定には、保存性アミノ酸置換は、側鎖の酸性度、極性度又は崇高性に関連するアミノ酸のファミリー内で一般的に生じる置換である。
【００４１】
一般的にコードされるアミノ酸は一般的に次の４つのグループに分けられる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（４）荷電されていない極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンはまた、芳香族アミノ酸としてうまく分類される。いづれか特定基内の、たとえばロイシンのイソロイシンもしくはバリンによる、又はアスパラギン酸のグルタミン酸による、又はトレオニンのセリンによる、又はいづれか他のアミノ酸残基の構造的に関連するアミノ酸残基、たとえば側鎖の類似する酸性度、極性度、崇高性を有すか又はそのいくつかの組合せにおける類似性を有するアミノ酸残基による１又は複数の置換は一般的に、ポリペプチドの機能又は免疫原性に対して取るに足らない効果を有するであろう。
【００４２】
本明細書において使用される場合、ネオスポラにより現在感染されているか又は感染されたことがある動物からの血液又は血清サンプルにおけるネオスポラ−特異的抗体の存在を検出するための診断試薬として使用され得るポリペプチドは、“本発明の実施において有用”である。
本発明はさらに、本発明の前述のネオスポラＧＲＡ１−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的な部分から成るポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において使用される場合、ＧＲＡ１−関連ポリヌクレオチド分子の“実質的な部分”とは、ＧＲＡ１−関連ポリヌクレオチド分子の完全なヌクレオチド配列以下から成るが、しかしＧＲＡ１−関連ポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列の少なくとも約５％、及びより好ましくは少なくとも約１０％を含んで成り、そしてその有用性がポリヌクレオチド分子について上記のように定義される場合、本発明の実施において有用であるポリヌクレオチド分子を意味する。
【００４３】
前述のＧＲＡ１−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかのヌクレオチド配列の他に、本発明のポリヌクレオチド分子はさらに、Ｎ．カニナムにおいてもとの場所にＧＲＡ１遺伝子又はＯＲＦを本来、端に有し、そして配列番号１の約nt１〜約nt２０４及び約nt７７８〜約nt１２６５に示され、又は配列番号３の約nt１〜約nt６０４及び約nt１３０５〜約nt１７７４に示されるヌクレオチド配列、あるいはその実質的な部分を含むそれらのヌクレオチド配列から選択されたヌクレオチド配列を含んで成り、又は他方では、それらから成ることができる。
【００４４】
４．１．２．ＧＲＡ２−関連ポリヌクレオチド分子
配列番号４に示されるヌクレオチド配列及びその実質的な部分に関する下記表示は、特にことわらない限り、プラスミドｐＲＣ５（ＡＴＣＣ  ２０９６８６）に存在するような、それぞれ、その対応するヌクレオチド配列及びその実質的な部分をまた言及することを意味する。さらに、配列番号５に示されるアミノ酸配列及びその実質的な部分及びペプチドフラグメントに関する表示は、特にことわらない限り、プラスミドｐＲＣ５（ＡＴＣＣ  ２０９６８６）に存在するその対応するＧＲＡ２−コードヌクレオチド配列によりコードされる、それぞれその対応するアミノ酸配列及びその実質的な部分及びペプチドフラグメントを意味することを意味する。
【００４５】
本発明は、Ｎ．カニナムからのＧＲＡ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様においては、ＧＲＡ２タンパク質は配列番号５のアミノ酸配列を有する。さらに好ましい態様においては、本発明の単離されたＧＲＡ２−コードポリペプチド分子は、配列番号４の約nt２５〜約nt６６０であるＯＲＦのヌクレオチド配列、及びプラスミドｐＲＣ５（ＡＴＣＣ  ２０９６８６）のＧＲＡ２をコードするＯＲＦのヌクレオチド配列から成る群から選択されたヌクレオチド配列を含んで成る。非制限態様においては、本発明の単離されたＧＲＡ２をコードするポリヌクレオチド分子は、配列番号４のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００４６】
本発明はさらに、本発明のＧＲＡ２をコードするポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して相同であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。用語“相同”とは、ＧＲＡ２−関連ポリヌクレオチド分子を言及するために使用される場合、（ａ）本発明の前述のＧＲＡ２をコードするポリヌクレオチド分子のタンパク質と同じタンパク質をコードするが、しかし遺伝子コードの縮重によりヌクレオチド配列に対する１又は複数のサイレント変化を包含するか、又は（ｂ）適度な緊縮条件下、すなわち０．５ＭのＮａＨＰＯ4 ，７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１mMのＥＤＴＡ（６５℃）におけるフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション及び４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳでの洗浄（Ausbelなど., 1989 、前記）の条件下で、Ｎ．カニナムＧＲＡ２タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、そして本発明の実施において有用であるポリヌクレオチド分子を意味する。
【００４７】
好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下、すなわち６５℃で０．５ＭのＮａＨＰＯ4 ，７％のＳＤＳ，１mMのＥＤＴＡにおけるフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション及び６８℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳにおける洗浄（Ausbelなど., 1989 、前記）の条件下で、Ｎ．カニナムＧＲＡ１タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の相補体に対してハイブリダイズし、そして有用性がポリヌクレオチド分子について上記で定義されたように、本発明の実施において有用である。より好ましい態様においては、相同ポリヌクレオチド分子は、配列番号４のＯＲＦの約nt２５〜約nt６６０であるヌクレオチド配列から成り、そして本発明の実施において有用であるポリヌクレオチド分子の相補体に対して高い緊縮条件下でハイブリダイズする。
【００４８】
本発明のＧＲＡ２−コードポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して相同であるヌクレオチド配列を有する本発明のポリヌクレオチド分子は、Ｔ．ゴンジＧＲＡタンパク質をコードするＴ．ゴンジの生来のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含まず、そしてさらにそのようなＴ．ゴンジポリヌクレオチド分子に対して、約９０％よりも高くない、及び好ましくは約８０％よりも高くない配列同一性を有し、ここで前記配列同一性は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（Gen Bank, National Center for Biotechnology Information ）の使用により決定される。
【００４９】
本発明はさらに、Ｎ．カニナムＧＲＡ２タンパク質に対して相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。Ｎ．カニナムＧＲＡ２タンパク質に対して相同であるポリペプチドに関して本明細書において言及するために使用される場合、用語“相同”とは、Ｎ．カニナムＧＲＡ２タンパク質のアミノ酸配列を有するが、しかし１又は複数のアミノ酸残基が異なったアミノ酸残基により保存的に置換されているポリペプチドを意味し、この場合、その得られるポリペプチドは本発明の実施において有用である。
【００５０】
本発明はさらに、本発明の前述のネオスポラＧＲＡ２−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的な部分から成るポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において使用される場合、ＧＲＡ２−関連ポリヌクレオチド分子の“実質的な部分”とは、ＧＲＡ２−関連ポリヌクレオチド分子の完全なヌクレオチド配列以下から成るが、しかしＧＲＡ２−関連ポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列の少なくとも約５％、及びより好ましくは少なくとも約１０％を含んで成り、そしてその有用性がポリヌクレオチド分子について上記のように定義される場合、本発明の実施において有用であるポリヌクレオチド分子を意味する。
前述のＧＲＡ２−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかのヌクレオチド配列の他に、本発明のポリヌクレオチド分子はさらに、Ｎ．カニナムにおいて天然にＧＲＡ２  ＯＲＦ又は遺伝子の端に接し、そして配列番号４の約nt１〜約nt２４及び約nt６６１〜約nt１０３１に示されるヌクレオチド配列、又はその実質的な部分を含むヌクレオチド配列を含んで成り、又は、それから成ることができる。
【００５１】
４．１．３．ＳＡＧ１−関連ポリヌクレオチド分子
配列番号６に示されるヌクレオチド配列及びその実質的な部分に関する表示は、特にことわらない限り、プラスミドｐＲＣ１０２（ＡＴＣＣ  ２０９６８７）に存在するような、それぞれ、対応するヌクレオチド配列及びその実質的な部分をまた言及することを意味する。さらに、配列番号７に示されるアミノ酸配列及びその実質的な部分及びペプチドフラグメントに関する表示は、特にことわらない限り、プラスミドｐＲＣ１０２（ＡＴＣＣ  ２０９６８７）に存在するその対応するＳＡＧ１−コードヌクレオチド配列によりコードされる、それぞれその対応するアミノ酸配列及びその実質的な部分及びペプチドフラグメントを言及することを意味する。
【００５２】
本発明は、Ｎ．カニナムからのＳＡＧ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様においては、ＳＡＧ１タンパク質は配列番号７のアミノ酸配列を有する。さらに好ましい態様においては、本発明の単離されたＳＡＧ１−コードポリペプチド分子は、配列番号６の約nt１３０〜約nt１０８９であるＯＲＦのヌクレオチド配列、及びプラスミドｐＲＣ１０２（ＡＴＣＣ  ２０９６８７）のＳＡＧ１をコードするＯＲＦのヌクレオチド配列から成る群から選択されたヌクレオチド配列を含んで成る。非制限態様においては、本発明の単離されたＳＡＧ１をコードするポリヌクレオチド分子は、配列番号６のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００５３】
本発明はさらに、本発明のＳＡＧ１−コードポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して相同であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。用語“相同”とは、ＳＡＧ１−関連ポリヌクレオチド分子を言及するために使用される場合、（ａ）本発明の前述のＳＡＧ１−コードポリヌクレオチド分子のタンパク質と同じタンパク質をコードするが、遺伝子コードの縮重によりヌクレオチド配列に対する１又は複数のサイレント変化を包含するか、又は（ｂ）中程度の緊縮条件下、すなわち０．５ＭのＮａＨＰＯ4 ，７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１mMのＥＤＴＡ（６５℃）におけるフィルター結合ＤＮＡとのハイブリダイゼーション及び４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳにおける洗浄（Ausubel など., 1989 、前記）の条件下で、Ｎ．カニナムＳＡＧ１タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、そしてその有用性がポリヌクレオチド分子について上記で定義されたように、本発明の実施において有用であるポリヌクレオチド分子を意味する。
【００５４】
好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下、すなわち６５℃で０．５ＭのＮａＨＰＯ4 ，７％のＳＤＳ、１mMのＥＤＴＡにおけるフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション及び６８℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳにおける洗浄（Ausubel など., 1989 、前記）の条件下での、Ｎ．カニナムＳＡＧ１タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の相補体に対してハイブリダイズし、そして本発明の実施において有用である。より好ましい態様においては、相同ポリヌクレオチド分子は、配列番号６の約nt１３０〜約nt１０８９であるＯＲＦのヌクレオチド配列から成り、そして本発明の実施において有用であるヌクレオチド分子の補体に対して高い緊縮条件下でハイブリダイズする。
【００５５】
本発明のＳＡＧ１−コードポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して相同であるヌクレオチド配列を有する本発明のポリヌクレオチド分子は、Ｔ．ゴンジＳＡＧ１タンパク質をコードするＴ．ゴンジの生来のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含まず、そしてそのようなＴ．ゴンジポリヌクレオチド分子に対して、約９０％よりも高くない、及び好ましくは約８０％よりも高くない配列同一性を有し、ここで前記配列同一性は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（Gen Bank, NCBI）の使用により決定される。
【００５６】
本発明はさらに、Ｎ．カニナムＳＡＧ１タンパク質に対して相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。Ｎ．カニナムＳＡＧ１タンパク質に対して相同であるポリペプチドに関して本明細書において言及するために使用される場合、用語“相同”とは、Ｎ．カニナムＳＡＧ１タンパク質のアミノ酸配列を有するが、しかし１又は複数のアミノ酸残基が異なったアミノ酸残基により保存的に置換されているポリペプチドを意味し、この場合、その得られるポリペプチドは本発明の実施において有用である。
【００５７】
本発明はさらに、本発明の前述のネオスポラＳＡＧ１−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的な部分から成るポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において使用される場合、ＳＡＧ１−関連ポリヌクレオチド分子の“実質的な部分”とは、ＳＡＧ１−関連ポリヌクレオチド分子の完全なヌクレオチド配列以下から成るが、しかしＳＡＧ１−関連ポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列の少なくとも約５％、及びより好ましくは少なくとも約１０％を含んで成り、そしてその有用性がポリヌクレオチド分子について上記のように定義される場合、本発明の実施において有用であるポリヌクレオチド分子を意味する。
【００５８】
前述のＳＡＧ１−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかのヌクレオチド配列の他に、本発明のポリヌクレオチド分子はさらに、Ｎ．カニナムにおいて天然にＳＡＧ１遺伝子又はＯＲＦの端に接し、そして配列番号６の約nt１〜約nt１２９及び約nt１０９０〜約nt１２６３に示されるフランキングヌクレオチド配列、又はその実質的な部分を含むヌクレオチド配列を含んで成り、又は、それらから成ることができる。
【００５９】
４．１．４．ＭＩＣ１−関連ポリヌクレオチド分子
配列番号８及び１０に示されるヌクレオチド配列及びその実質的な部分に関する表示は、特にことわらない限り、プラスミドｐＲＣ３４０（ＡＴＣＣ  ２０９６８８）に存在するような、それぞれ、対応するヌクレオチド配列及びその実質的な部分をまた言及することを意味する。さらに、配列番号９に示されるアミノ酸配列及びその実質的な部分及びペプチドフラグメントに関する表示は、特にことわらない限り、プラスミドｐＲＣ３４０（ＡＴＣＣ  ２０９６８８）に存在するその対応するＭＩＣ１−コードヌクレオチド配列によりコードされる、それぞれその対応するアミノ酸配列及びその実質的な部分及びペプチドフラグメントを言及することを意味する。
【００６０】
本発明は、Ｎ．カニナムからのＭＩＣ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様においては、ＭＩＣ１タンパク質は配列番号９のアミノ酸配列を有する。さらに好ましい態様においては、本発明の単離されたＭＩＣ１−コードポリペプチド分子は、配列番号８の約nt１３８〜約nt１５２０であるＯＲＦのヌクレオチド配列、配列番号１０として示される、ＭＩＣ１遺伝子のＯＲＦのヌクレオチド配列、及びプラスミドｐＲＣ３４０（ＡＴＣＣ  ２０９６８８）のＭＩＣ１をコードするＯＲＦのヌクレオチド配列から成る群から選択されたヌクレオチド配列を含んで成る。非制限態様においては、本発明の単離されたＭＩＣ１−コードポリヌクレオチド分子は、配列番号８及び配列番号１０のヌクレオチド配列から選択されたヌクレオチド配列を含んで成る。
【００６１】
本発明はさらに、本発明のＭＩＣ１−コードポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して相同であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。用語“相同”とは、ＭＩＣ１−関連ポリヌクレオチド分子を言及するために使用される場合、（ａ）本発明の前述のＭＩＣ１−コードポリヌクレオチド分子のタンパク質と同じタンパク質をコードするが、しかし遺伝子コードの縮重によりヌクレオチド配列に対する１又は複数のサイレント変化を包含するか、又は（ｂ）適度な緊縮条件下、すなわち０．５ＭのＮａＨＰＯ4 ，７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１mMのＥＤＴＡ（６５℃）におけるフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション及び４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳにおける洗浄（Ausubel など., 1989 、前記）の条件下で、Ｎ．カニナムＭＩＣ１タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有しそして有用性がポリヌクレオチド分子について上記で定義されたように、本発明の実施において有用であるポリヌクレオチド分子を意味する。
【００６２】
好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下、すなわち６５℃で０．５ＭのＮａＨＰＯ4 ，７％のＳＤＳ，１mMのＥＤＴＡにおけるフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション及び６８℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳにおける洗浄（Ausubel など., 1989 、前記）の条件下で、Ｎ．カニナムＭＩＣ１タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の相補体に対してハイブリダイズし、そして本発明の実施において有用である。より好ましい態様においては、相同ポリヌクレオチド分子は、配列番号８の約nt１３８〜約nt１５２０のＯＲＦ、及び配列番号１０に示され、ＭＩＣ１遺伝子のＯＲＦから成る群から選択されたヌクレオチド配列から成るヌクレオチド分子の相補体に対して高い緊縮条件下でハイブリダイズし、そして本発明の実施において有用であるものである。
【００６３】
本発明のＭＩＣ１−コードポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して相同であるヌクレオチド配列を有する本発明のポリヌクレオチド分子は、Ｔ．ゴンジＭＩＣ１タンパク質をコードするＴ．ゴンジの生来のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含まず、そしてそのようなＴ．ゴンジポリヌクレオチド分子に対して、約９０％よりも高くない、及び好ましくは約８０％よりも高くない配列同一性を有し、ここで前記配列同一性は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（Gen Bank, NCBI）の使用により決定される。
【００６４】
本発明はさらに、Ｎ．カニナムＭＩＣ１タンパク質に対して相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。Ｎ．カニナムＭＩＣ１タンパク質に対して相同であるポリペプチドに関して本明細書において言及するために使用される場合、用語“相同”とは、Ｎ．カニナムＭＩＣ１タンパク質のアミノ酸配列を有するが、しかし１又は複数のアミノ酸残基が異なったアミノ酸残基により保存的に置換されているポリペプチドを意味し、この場合、その得られるポリペプチドは、有用性がポリペプチドについて前記で定義されるように、本発明の実施において有用である。
【００６５】
本発明はさらに、本発明の前述のネオスポラＭＩＣ１−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的な部分から成るポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において使用される場合、ＭＩＣ１−関連ポリヌクレオチド分子の“実質的な部分”とは、ＭＩＣ１−関連ポリヌクレオチド分子の完全なヌクレオチド配列以下から成るが、しかしＭＩＣ１−関連ポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列の少なくとも約５％、及びより好ましくは少なくとも約１０％を含んで成り、そしてその有用性がポリヌクレオチド分子について上記のように定義される場合、本発明の実施において有用であるポリヌクレオチド分子を意味する。
【００６６】
前述のＭＩＣ１−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかのヌクレオチド配列の他に、本発明のポリヌクレオチド分子はさらに、Ｎ．カニナムにおいて天然にＭＩＣ１  ＯＲＦ又は遺伝子の端に接し、そして配列番号８の約nt１〜約nt１３７及び約nt１５２１〜約nt２０６９に示されるヌクレオチド配列、又はその実質的な部分を含むそれらのヌクレオチド配列から選択されたヌクレオチド配列を含んで成り、又は、それらから成ることができる。
【００６７】
４．１．５．ＭＡＧ１−関連ポリヌクレオチド分子
配列番号１１に示されるヌクレオチド配列及びその実質的な部分に関する表示は、特にことわらない限り、プラスミドｂｄ３０４（ＡＴＣＣ  ２０３４１３）に存在するような、それぞれ、対応するヌクレオチド配列及びその実質的な部分をまた言及することを意味する。さらに、配列番号１３に示されるアミノ酸配列及びその実質的な部分及びペプチドフラグメントに関する表示は、特にことわらない限り、プラスミドｂｄ３０４（ＡＴＣＣ  ２０３４１３）に存在するその対応するＭＡＧ１−コードヌクレオチド配列によりコードされる、それぞれその対応するアミノ酸配列及びその実質的な部分及びペプチドフラグメントを言及することを意味する。
【００６８】
本発明は、Ｎ．カニナムからのＭＡＧ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様においては、ＭＡＧ１タンパク質は配列番号１３のアミノ酸配列を有する。さらに好ましい態様においては、本発明の単離されたＭＡＧ１をコードするポリペプチド分子は、配列番号１１の約nt１３０５〜約nt２７８６に示されるヌクレオチド配列、それから調製されるｃＤＮＡ分子、たとえば配列番号１２の約nt１２２〜約nt１３８１のＯＲＦを有するｃＤＮＡ分子、及び本発明のプラスミドｂｄ３０４（ＡＴＣＣ  ２０３４１３）のＭＡＧ１をコードするＯＲＦのヌクレオチド配列から成る群から選択されたヌクレオチド配列を含んで成る。本発明はさらに、配列番号１１に存在するいづれかのＯＲＦのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を提供する。非制限態様においては、本発明の単離されたＭＡＧ１−コードポリヌクレオチド分子は、配列番号１１のヌクレオチド配列及び推定上のエキソン／イントロン境界に基づいてそれから推定されるｃＤＮＡから成る群から選択されたヌクレオチド配列を含んで成る。
【００６９】
本発明はさらに、本発明のＭＡＧ１−コードポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して相同であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。用語“相同”とは、ＭＡＧ１−関連ポリヌクレオチド分子を言及するために使用される場合、（ａ）本発明の前述のＭＡＧ１−コードポリヌクレオチド分子のタンパク質と同じタンパク質をコードするが、しかし遺伝子コードの縮重によりヌクレオチド配列に対する１又は複数のサイレント変化を包含するか、又は（ｂ）適度な緊縮条件下、すなわち０．５ＭのＮａＨＰＯ4 ，７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１mMのＥＤＴＡ（６５℃）におけるフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション及び４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳにおける洗浄（Ausubel など., 1989 、前記）の条件下で、Ｎ．カニナムＭＡＧ１タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有しそして本発明の実施において有用であるポリヌクレオチド分子を意味する。
【００７０】
好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下、すなわち６５℃で０．５ＭのＮａＨＰＯ4 ，７％のＳＤＳ，１mMのＥＤＴＡにおけるフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション及び６８℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳにおける洗浄（Ausubel など., 1989 、前記）の条件下で、Ｎ．カニナムＭＡＧ１タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の相補体に対してハイブリダイズしそして本発明の実施において有用である。より好ましい態様においては、相同ポリヌクレオチド分子は、配列番号１１の約nt１３０５〜約nt２７８６に示される、ＭＡＧ１遺伝子のＯＲＦのヌクレオチド配列、及び推定上のエキソン／イントロン境界に基づいてそれらから調製されるｃＤＮＡ分子、たとえば配列番号１２の約nt１２２〜約nt１３８１のＯＲＦを有するｃＤＮＡ分子から成る群から選択されたヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子の補体に対して高い緊縮条件下でハイブリダイズする。
【００７１】
本発明のＭＡＧ１−コードポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して相同であるヌクレオチド配列を有する本発明のポリヌクレオチド分子は、Ｔ．ゴンジＭＡＧ１タンパク質をコードするＴ．ゴンジの生来のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含まず、そしてそのようなＴ．ゴンジポリヌクレオチド分子に対して、約９０％よりも高くない、及び好ましくは約８０％よりも高くない配列同一性を有し、ここで前記配列同一性は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（Gen Bank, NCBI）の使用により決定される。
【００７２】
本発明はさらに、Ｎ．カニナムＭＡＧ１タンパク質に対して相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。Ｎ．カニナムＭＡＧ１タンパク質に対して相同であるポリペプチドに関して本明細書において言及するために使用される場合、用語“相同”とは、Ｎ．カニナムＭＡＧ１タンパク質のアミノ酸配列を有するが、しかし１又は複数のアミノ酸残基が異なったアミノ酸残基により保存的に置換されているポリペプチドを意味し、この場合、その得られるポリペプチドは、有用性がポリペプチドについて上記で定義されるように、本発明の実施において有用である。
【００７３】
本発明はさらに、本発明の前述のネオスポラＭＡＧ１−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的な部分から成るポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において使用される場合、ＭＡＧ１−関連ポリヌクレオチド分子の“実質的な部分”とは、ＭＡＧ１−関連ポリヌクレオチド分子の完全なヌクレオチド配列以下から成るが、しかしＭＡＧ１−関連ポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列の少なくとも約５％、及びより好ましくは少なくとも約１０％を含んで成り、そしてその有用性がポリヌクレオチド分子について上記のように定義される場合、本発明の実施において有用であるポリヌクレオチド分子を意味する。たとえば、配列番号１１のポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、約nt７０４〜約nt８２０の推定上のエキソン、又は約nt１３０１〜約nt１３９９の推定上のエキソン２、又は約nt１５１０〜約nt１８０８の推定上のエキソン３、又は約nt１９２１〜約nt３２９７の推定上のエキソン４を含むことができる。
【００７４】
前述のＭＡＧ１−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかのヌクレオチド配列の他に、本発明のポリヌクレオチド分子はさらに、Ｎ．カニナムにおいて天然にＭＡＧ１遺伝子又はＯＲＦの端に接し、そして配列番号１１の約nt１〜約nt１３０４及び約nt２７８７〜約nt４２４２に示されるヌクレオチド配列、又は推定上のエキソン／イントロン境界に基づいてそれらから調製されるｃＤＮＡ分子のＯＲＦを有し、そして配列番号１２の約nt１〜約nt１２１及び約nt１３８２〜約nt１８９２のＯＲＦを有するｃＤＮＡ分子のＯＲＦのフランキング配列、その実質的な部分を含むヌクレオチド配列を含んで成り、又は、それらから成ることができる。
【００７５】
４．２．Ｇｒａ１／Ｍａｇ１プロモーター領域
本発明はさらに、Ｎ．カニナムＧＲＡ１及びＭＡＧ１遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書に開示される実験作業の実施の間、本明細書に開示されるＮ．カニナムＧＲＡ１及びＭＡＧ１遺伝子は約５７７ntの長さの介在ヌクレオチド配列と共に頭対頭（head-to-head）の配向で天然において現場配列されることが決定された。配列番号１１のnt１２７〜nt７０３に示されるこの介在ヌクレオチド配列は、Ｎ．カニナムＧＲＡ１及びＭＡＧ１遺伝子の両者のプロモーターを含んで成る推定上の二方向性プロモーター領域を表わす。
【００７６】
本発明のＧＲＡ１／ＭＡＧ１二方向性プロモーター領域は、Ｎ．カニナムの宿主細胞において、又はネオスポラのいづれか他の種又はアピコムプレキサ（Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ）の他のメンバーの宿主細胞において、又はいづれか他の適切な宿主細胞において、ＧＲＡ１又はＭＡＧ１遺伝子のいづれか、又は両遺伝子、又は１又は複数の他の遺伝子又はコード配列の組換え発現を制御することを包含する種々の目的のために有用である。そのような他の遺伝子又はコード配列は、組換え宿主細胞に対して生来のものであり、又は異種のものであり得る。
【００７７】
プロモーター配列は、当業界において知られているような標準の組換え技法を用いて特定の遺伝子又はコード配列に融合され得、その結果、前記プロモーター配列は、“作用可能な関連”として下記に定義されるように、それらとの作用可能な関連状態で存在する。プロモーターを用いることによって、組換え発現システムが構成され、そしてネオスポラ、又はアピコムプレキサの他のメンバーのＧＲＡ１及びＭＡＧ１遺伝子の発現を和らげることができる化合物及び転写因子についてスクリーンするために使用され得る。さらに、そのような構造体は、ネオスポラ、又はアピコムプレキサの他のメンバーにおいて異種ポリペプチドを発現するために使用され得る。
【００７８】
４．３．オリゴヌクレオチド分子
本発明はさらに、本発明の前述のポリヌクレオチド分子のいづれか１つに対してハイブリダイズし、又は本発明の前述のポリヌクレオチド分子のいづれか１つの補体であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に対してハイブリダイズするオリゴヌクレオチド分子を提供する。そのようなオリゴヌクレオチド分子は好ましくは、少なくとも約１０個の長さのヌクレオチド、及びより好ましくは約１５〜約３０個の長さのヌクレオチドであり、そして高い緊縮条件、すなわち約１４塩基のオリゴに関して約３７℃で、約１７塩基のオリゴに関して約４８℃で、約２０塩基のオリゴに関して約５５℃で、及び約２３塩基のオリゴに関して約６０℃で、６×ＳＳＣ／０．５％ピロリン酸ナトリウムでの洗浄条件下で、１又は複数の前述のポリヌクレオチド分子に対してハイブリダイズする。
【００７９】
本発明のより長いオリゴヌクレオチド分子のための他のハイブリダイゼーション条件は、標準の技法を用いて当業者により決定され得る。好ましい態様においては、本発明のオリゴヌクレオチド分子は、本発明の前述のポリヌクレオチド分子の少なくとも１つの部分に対して相補的である。
本発明の実施において有用なオリゴヌクレオチド分子の特定の非制限態様は、配列番号１４〜２６及び２８〜３４から成る群から選択されたオリゴヌクレオチド分子及びその補体を包含する。
【００８０】
本発明のオリゴヌクレオチド分子は、種々の目的のために、たとえば分別疾病診断への使用のためのネオスポラ特異的ポリヌクレオチド分子の増幅におけるプライマーとして、又は遺伝子調節において有用なアンチセンス分子としてコードし又は作用するために有用である。診断に関しては、適切に企画されたプライマーは、動物組織又は体液、たとえば脳組織、肺組織、胎盤組織、脳脊髄液、粘膜、尿、羊水、等のサンプルにおけるネオスポラ特異的ポリヌクレオチド分子の存在を検出するために使用され得る。
【００８１】
特定の増幅生成物の生成は、ネオスポラ感染の診断を支持することができ、ここで増幅された生成物の欠乏が感染の欠乏を示すことができる。増幅、たとえばポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を実施するための方法は、中でもInnis など. (eds), 1995 、前記；及びErlich (ed), 1992 、前記に記載されている。当業界において知られている他の増幅技法、たとえばリガーゼ鎖反応が、他方では使用され得る。本明細書に開示されるポリヌクレオチド分子の配列は、ネオスポラの他の種又は株、又はアピコムプレキサの他のメンバーからの相同遺伝子の単離への使用のためのプライマーを企画するために使用され得る。
【００８２】
４．４．組換え発現系
４．４．１．クローニング及び発現ベクター
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子のいづれかをクローニングし、そして発現するための組成物、たとえばクローニングベクター、発現ベクター、前記ベクターのいづれかを含んで成る形質転換された宿主細胞、及びそれらに由来する新規株又は細胞系を提供する。好ましい態様においては、本発明は、Ｎ．カニナムのＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１又はＭＡＧ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含んで成る組換えベクターを提供する。
【００８３】
特定の非制限態様においては、本発明は、Ｎ．カニナムＧＲＡ１タンパク質をコードするプラスミドｐＲＣ７７（ＡＴＣＣ  ２０９６８５）；Ｎ．カニナムＧＲＡ２タンパク質をコードするプラスミドｐＲＣ５（ＡＴＣＣ  ２０９６８６）；Ｎ．カニナムＳＡＧ１タンパク質をコードするプラスミドｐＲＣ１０２（ＡＴＣＣ  ２０９６８７）；Ｎ．カニナムＭＩＣ１タンパク質をコードするプラスミドｐＲＣ３４０（ＡＴＣＣ  ２０９６８８）；及びＮ．カニナムＭＡＧ１タンパク質をコードし、そしてまた、上記二方向性プロモーター領域を含んで成るプラスミドｂｄ３０４（ＡＴＣＣ  ２０３４１３）を提供する。
【００８４】
本発明の組換えベクター、特に発現ベクターは、好ましくは、本発明のポリヌクレオチド分子のためのコード配列がポリペプチドを生成するために前記コード配列の転写及び翻訳のために必要な１又は複数の調節要素と作用可能に関連して存在するよう構成される。本明細書において使用される場合、用語“調節要素”とは、ポリヌクレオチドコード配列の発現を誘導し、そして／又は調節するよう作用する、誘発性及び非誘発性プロモーター、エンハンサー、オペレーター及び当業界において知られている他の要素をコードするヌクレオチド配列を包含するが、但しそれらだけには限定されない。また、本明細書において使用される場合、コード配列は、１又は複数の調節要素と“作用可能に関連”して存在し、ここで前記調節要素は、コード配列の転写又はそのｍＲＮＡの翻訳、又は両者を効果的に調節し、そして可能にする。
【００８５】
適切な調節要素と作用可能に関連して特定のコード配列を含む組換えベクターを構成するための方法は、当業界において良く知られており、そしてそれらは本発明を実施するために使用され得る。それらの方法は、インビトロ組換え技法、合成技法及びインビボ遺伝子組換えを包含する。たとえば、Maniatisなど., 1989 、前記；Ansubel など., 1989 、前記；Sambrookなど., 1989 、前記；Innis など., 1995 、前記；及びErlich, 1992、前記における組換え技法を参照のこと。
【００８６】
本発明のＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１及びＭＡＧ１コード配列を発現するために使用され得る種々の発現ベクター、たとえば特定のコード配列を含む、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、及びコスミドＤＮＡ発現ベクターは、当業界において知られている。本発明のポリヌクレオチド分子を含むように構築され得る典型的な原核発現ベクタープラスミドは、中でも、ｐＵＣ８，ｐＵＣ９，ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９（Biorad Laboratories, Richmond, CA ）、ｐＰＬ及びｐＫＫ２２３（Pharmacia, Piscataway, NJ ）、ｐＱＥ５０（Qiagen, Chatsworth, CA）、及びｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹ（Promega, Madison, WI）を包含する。本発明のポリヌクレオチド分子を含むよう構築され得る典型的な真核発現ベクターは、中でも、エクダイソン−誘発性哺乳類発現システム（Invitrogen, Carlsbad, CA）、サイトメガロウィルスプロモーターエンハンサー基礎のシステム（Promega, Madison, WI ; Stratagene, La Jolla, CA ; Invitrogen）、及びバキュロウィルス基礎の発現系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を包含する。
【００８７】
それらの及び他のベクターの調節要素は、それらの強度及び特異性において異なることができる。使用される宿主／ベクター系に依存して、多くの適切な転写及び翻訳要素のいづれかが使用され得る。たとえば、哺乳類細胞系においてクローニングする場合、哺乳類細胞のゲノムから単離されるプロモーター、たとえばマウスメタロチオネインプロモーター、又はそれらの細胞において増殖するウィルスから単離されるプロモーター、たとえばワクシニアウィルスの７．５Ｋプロモーター又はＭｏｌｏｎｅｙネズミ肉腫ウィルスの長い末端反復体が使用され得る。組換えＤＮＡ又は合成技法により得られるプロモーターはまた、挿入された配列の転写を提供するために使用され得る。さらに、一定のプロモーターからの発現は、特定のインジューサー、たとえばメタロチオネインプロモーターのための亜鉛及びカドニウムイオンの存在下で高められ得る。
【００８８】
転写調節領域又はプロモーターの非制限的例は、細菌に関して、β−ｇａｌプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＴＡＣプロモーター、λ左及び右プロモーター、ｔｒｐ及びｌａｃプロモーター、ｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーター、等；酵母に関しては、解糖酵素プロモーター、たとえばＡＤＨ−Ｉ及び−IIプロモーター、ＧＰＫプロモーター、ＰＧＩプロモーター、ＴＲＰプロモーター、等；及び哺乳類細胞に関しては、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、アデノウィルス主要後期プロモーター、を包含する。本発明はさらに、ネオスポラ、又はアピコムプラキサの他のメンバーにおいて本発明のコード配列のいづれかを発現するために使用され得る、Ｎ．カニナムのＧＲＡ１及びＭＡＧ１遺伝子の両者のプロモーターのヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００８９】
特定の開始シグナルが、挿入されたコード配列の十分な翻訳のために必要とされる。それらのシグナルは典型的には、ＡＴＧ開始コドン及び隣接する配列を包含する。それ自体の開始コドン及び隣接する配列を包含する本発明のポリヌクレオチド分子が適切な発現ベクター中に挿入される場合、追加の翻訳制御シグナルは必要とされない。しかしながら、コード配列の一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを包含する外因性翻訳制御シグナルが必要とされる。それらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、種々の源、天然及び合成源から得られる。さらに、開始コドンは、完全な挿入体のイン−フレーム翻訳を確保するためにコード領域と読み取り枠を整合して存在すべきである。
【００９０】
本発明のタンパク質又はポリペプチドを含んで成る融合タンパク質を発現するであろう発現ベクターもまた構成され得る。そのような融合タンパク質は、たとえばネオスポラタンパク質に対する抗血清を高めるために、ネオスポラタンパク質の生化学性質を研究するために、異なった免疫学的又は官能的性質を示すネオスポラタンパク質を構築するために、又は同定又は精製を助けるために、又は組換え的に発現されたネオスポラタンパク質の安定性を改良するために使用され得る。可能な融合タンパク質発現ベクターは、β−ガラクトシダーゼ、及びｔｒｐＥ融合体、マルトース−結合タンパク質融合体、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合体及びポリヒスチジン融合体（キャリヤー領域）をコードする配列を組込むベクターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。それらの及び他の融合タンパク質をコードする発現ベクターを構成するために使用され得る方法は、当業界において良く知られている。
【００９１】
融合タンパク質は、発現されたタンパク質の精製を助けるために有用である。非制限態様においては、ＧＲＡ１−マルトース−結合融合タンパク質はアミロース樹脂を用いて精製され得；ＧＲＡ１−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質はグルタチオン−アミロースビーズを用いて精製され得；そしてＧＲＡ１−ポリヒスチジン融合タンパク質は二価のニッケル樹脂を用いて精製され得る。他方では、キャリヤータンパク質又はペプチドに対する抗体が、融合タンパク質の親和性クロマトグラフィー精製のために使用され得る。
【００９２】
たとえば、モノクローナル抗体の標的エピトープをコードするヌクレオチドコードが、調節要素と作用可能に関連して発現ベクター中に構築され、そして発現されるエピトープが本発明のネオスポラタンパク質に融合されるよう位置決定され得る。非制限態様においては、親水性マーカーペプチドである、ＦＬＡＧTMエピトープ標識（International Biotechnologies Inc.）をコードするヌクレオチド配列が、ＧＲＡ１タンパク質のアミノ又はカルボキシル末端に対応する点で発現ベクター中に、標準技法により挿入され得る。次に、発現されたＧＲＡ１タンパク質−ＦＬＡＧTMエピトープ融合生成物が、市販の抗−ＦＬＡＧTM抗体を用いて検出され、そして親和性−精製され得る。
【００９３】
発現ベクターはまた、特定のプロテアーゼ切断部位をコードするポリリンカー配列を含むよう構築され得、その結果、発現されたネオスポラタンパク質が特定のプロテアーゼによる処理によりキャリヤー領域又は融合パートナーから開放され得る。たとえば、融合タンパク質は、中でも、トロンビン又は第Ｘａ因子切断部位をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
ネオスポラコード配列の上流にあり、そしてその配列と読み取り枠を整合して存在するシグナル配列は、発現されたタンパク質の取得及び分泌を方向づけるために、既知の方法により発現ベクター中に構築され得る。シグナル配列の非制限的例は、中でも、α−因子、免疫グロブリン、外層膜タンパク質、ペニシリナーゼ、及びＴ−細胞受容体からの配列を包含する。
【００９４】
本発明の組換えベクターにより形質転換され又はトランスフェクトされた宿主細胞の選択を助けるためには、ベクターは、レポーター遺伝子生成物又は他の選択マーカーのためのコード配列をさらに含むよう構築され得る。そのようなコード配列は好ましくは、上記のように、調節要素と作用可能に関連して存在する。本発明の実施において有用であるレポーター遺伝子は、当業界において良く知られており、そして中でも、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、グリーン螢光タンパク質、ホタルルシフェラーゼ、及びヒト成長ホルモンをコードする遺伝子を包含する。選択マーカーをコードするヌクレオチド配列は、当業界において良く知られており、そして抗体又は抗−代謝物に対する耐性を付与する遺伝子生成物をコードし、又は栄養要求必要条件を提供する配列を包含する。そのような配列の例は、中でも、チミジンキナーゼ活性、又はメトトレキセート、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、ピリメタミン、アミノグリコシド又はヒグロマイシンに対する耐性をコードする配列を包含する。
【００９５】
４．４．２．宿主細胞の形質転換
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子又は組換えベクターを含んで成る形質転換された宿主細胞、及びそれに由来する細胞系を提供する。本発明の実施において有用な宿主細胞は、真核又は原核細胞であり得る。そのような形質転換された宿主細胞は、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡベクターにより形質転換された微生物、たとえば細菌、又は組換えベクターにより形質転換された酵母、又は組換えウィルスベクター、たとえばバキュロウィルスにより感染された動物細胞、たとえば昆虫細胞、又は組換えウィルスベクター、たとえばアデノウィルス又はワクシニアウィルスにより感染された哺乳類細胞を包含するが、但し、それらだけには限定されない。
【００９６】
たとえば、Ｅ．コリの株、たとえばATCC, Rockville, MD, USA（受託番号３１３４３）、又はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（La Jolla, CA）から入手できるＤＨ５α株が使用され得る。真核宿主細胞は酵母細胞を包含するが、但しマウス、ハムスター、牛、サル又はヒト細胞系からの哺乳類細胞もまた、効果的に使用され得る。本発明の組換えタンパク質を発現するために使用され得る真核宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（たとえばＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−６１），ＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３（たとえばＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１６５８）及びＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−２２）を包含する。
【００９７】
本発明の組換えベクターは好ましくは、実質的に均質な細胞培養物の１又は複数の宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトする。ベクターは、既知の技法、たとえばプロトプラスト形質転換、リン酸カルシウム沈殿、塩化カルシウム処理、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、組換えされたウィルスとの接触によるトランスフェクション、リポソーム−仲介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、トランスダクション、接合、又はマイクロプロジェクティル衝撃に従って、宿主細胞中に導入される。形質転換体の選択は、標準の方法により、たとえば組換え発現ベクターに関連する選択マーカー、たとえば抗生物質耐性を発現する細胞を選択することによって実施され得る。
【００９８】
発現ベクターが宿主細胞中に導入されると、宿主細胞ゲノムへの又はエピソーム的に、本発明のポリヌクレオチド分子の組込み及び維持が、標準の技法、たとえばサザンハイブリダイゼーション分析、制限酵素分析、ＰＣＲ分析、たとえば逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）により、又は予測されるタンパク質生成物を検出するための免疫学的アッセイにより確かめられ得る。本発明のポリヌクレオチド分子を含み、そして／又は発現する宿主細胞は、当業界において良く知られている次の少なくとも４種の一般的アプローチのいづれかにより同定され得る：（ｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡ，ＤＮＡ−ＲＮＡ、又はＲＮＡ−アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーション；（ii）“マーカー”遺伝子機能の存在の検出；（iii ）宿主細胞における特定のｍＲＮＡ転写体の発現により測定されるような転写のレベルの評価；又は（iv）たとえば当業界において知られているようなイムノアッセイによる成熟ポリペプチド生成物の存在の検出。
【００９９】
４．４．３．組換えポリペプチドの発現及び精製
本発明のポリヌクレオチド分子が適切な宿主細胞中に安定して導入されると、形質転換された宿主細胞がクローン的に増殖され、そして得られる細胞がコードされたポリペプチドの最大の生成の助けとなる条件下で増殖される。そのような条件は典型的には、高い密度に形質転換された細胞を増殖することを包含する。発現ベクターが誘発性プロモーターを含む場合、適切な誘発条件、たとえば温度シフト、栄養物の消耗、必要のないインジューサー（たとえば炭水化物の類似体、たとえばイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ））の添加、過剰の代謝副生成物の蓄積又は同様のことが、発現を誘発するために必要とされる場合に使用される。
【０１００】
ポリペプチドが宿主細胞の内部に保持される場合、細胞は収穫され、そして溶解され、そして生成物が、タンパク質分解を最少にするために当業界において知られている抽出条件下で、たとえば４℃で、又はプロテアーゼインヒビターの存在下で、又は両者下で前記溶解物から実質的に精製され、又は単離される。ポリペプチドが宿主細胞から分泌される場合、消耗される栄養培地が単純に集められ、そしてポリペプチドがそれから実質的に精製され又は単離される。
【０１０１】
ポリペプチドは、必要な場合、次の方法のいづれか１又は複数の方法（但し、それらだけには限定されない）を包含する標準の方法を用いて、細胞溶解物又は培養培地から実質的に精製され又は単離される：硫酸アンモニウム沈殿、サイズ分別、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、密度遠心分離、及びアフィニティークロマトグラフィー。ポリペプチドが生物学的活性を欠いている場合、それは、たとえばサイズ、又はポリペプチド−特異的抗体との反応性に基づいて、又は融合標識の存在下で検出され得る。本発明の実施に使用するためには、ポリペプチドは、培養流体中に分泌される場合、又は細胞溶解物に存在する場合、精製されていない状態で存在することができるが、しかし好ましくは、それらから実質的に精製され又は単離される。本明細書において使用される場合、ポリペプチドは、ポリペプチドが特定の調製物において少なくとも約２０重量％のタンパク質を構成するよう“実質的に精製される”。また、本明細書において使用される場合、ポリペプチドは、特定の調製物において少なくとも約８０重量％のタンパク質を構成するよう“単離される”。
【０１０２】
従って、本発明は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる実質的に精製され又は単離されたポリペプチドを提供する。非制限態様においては、前記ポリペプチドは、ＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１及びＭＡＧ１タンパク質から成る群から選択されたＮ．カニナムタンパク質である。好ましい態様においては、Ｎ．カニナムＧＲＡ１タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。もう１つの好ましい態様においては、Ｎ．カニナムＧＲＡ２タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を有する。もう１つの好ましい態様においては、Ｎ．カニナムＳＡＧ１タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を有する。もう１つの好ましい態様においては、Ｎ．カニナムＭＩＣ１タンパク質は配列番号９のアミノ酸配列を有する。もう１つの好ましい態様においては、Ｎ．カニナムＭＡＧ１タンパク質は配列番号１３のアミノ酸配列を有する。
【０１０３】
本発明はさらに、用語“相同”がポリペプチドについて上記に定義される場合、前述のＮ．カニナムタンパク質のいづれかに対して相同であるポリペプチドを提供する。Ｎ．カニナムの前述のＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１又はＭＡＧ１タンパク質のいづれかに対して相同である本発明のポリペプチドは、Ｔ．ゴンジＧＲＡ，ＳＡＧ，ＭＩＣ又はＭＡＧタンパク質の生来のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含まず、そしてさらに、そのようなＴ．ゴンジポリペプチドに対して、わずか約９０％、及び好ましくはわずか約８０％のアミノ酸同一性を有し、ここで配列同一性はＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（Gen Bank, NCBI）の使用により、決定される。
【０１０４】
本発明はさらに、本発明の前述のポリペプチドのいづれか１つの実質的な部分から成るポリペプチドを提供する。本明細書に使用される場合、本発明のポリペプチドの“実質的な部分”又は“ペプチドフラグメント”は、その対応する十分な長さのポリペプチドの完全なアミノ酸配列よりも少ない配列から成るが、しかしそのアミノ酸配列の少なくとも約１０％より好ましくは、少なくとも約２０％を含んで成り、そしてポリペプチドについて上記に定義されるように、本発明の実施において有用であるポリペプチドを意味する。免疫原性であり、すなわちその対応する十分な長さのネオスポラポリペプチドに対して特異的に反応する抗体の生成をもたらす免疫応答を誘発できるペプチドフラグメントが特に好ましい。
【０１０５】
本発明はさらに、当業界において知られているようなキャリヤー又は融合パートナーに対して融合される前述のポリペプチドのいづれかを含んで成る融合タンパク質を提供する。
本発明はさらに、特定のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る、１又は複数の調節要素と作用可能に関連して存在するポリヌクレオチド分子を含んで成る組換え発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現の助けとなる条件下で増殖せしめ、そして細胞培養物から発現されたポリペプチドを回収することを含んで成る、前述のポリペプチドのいづれかを調製するための方法を提供する。
【０１０６】
４．５．ポリペプチドの使用
十分な純度の本発明のポリペプチドが得られると、それは、標準の方法、たとえばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー、アミノ酸配列分析、免疫学的活性、生物学的活性、等により特徴づけられ得る。ポリペプチドは、疎水性及び親水性領域を同定するために、親水性分析（たとえば、Hopp and Woods, 1981, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 78 : 3824を参照のこと）、又は類似するソフトウェアアルゴリズムを用いて、さらに特徴づけられ得る。構造分析は、特定の二次構造を想定する、ポリペプチドの領域を同定するために実施され得る。
【０１０７】
生物物理学的方法、たとえばＸ−線結晶学（Engstrom, 1974, Biochem. Exp. Biol. 11 : 7-13 ）、コンピューターモデリング（Fletterick and Zoller (eds), 1986, Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY ）、及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）が、ポリペプチドと他の推定上の相互作用性タンパク質／受容体／分子との間の相互作用の可能性ある部位をマッピングし、そして研究するために使用され得る。それらの研究から得られる情報は、欠失変異体及びワクチン組成物を企画し、そしてインビボでポリペプチドの生物学的機能を特異的に阻止することができる治療用又は薬理学的化合物を企画し、又は選択するために使用され得る。
【０１０８】
本発明のポリペプチドは、種々の目的のために、たとえばネオスポロシスに対して哺乳類を保護するためのワクチン組成物の成分として；又は動物からの血液又は血清サンプルにおけるネオスポラ特異的抗体をスクリーンするために、標準の技法、たとえばＥＬＩＳＡアッセイを用いての診断試薬として；又は動物からの細胞、組織又は流体におけるネオスポラ特異的タンパク質をスクリーンするために、標準の技法、たとえばウェスターンブロットアッセイを用いての診断試薬として有用である下記のようなポリクローナル又はモノクローナル抗体を生ぜしめるための抗原として有用である。
【０１０９】
４．６．ポリペプチドの類似体及び誘導体
本発明のいづれかのポリペプチドが、その生物学的又は免疫学的特徴を改良し、又は他方では、変更するためにタンパク質レベルで修飾され得る。ポリペプチドの１又は複数の化学的修飾が、次のいづれかを包含する（但し、それらだけには限定されない）既知の技法を用いて、それらから類似体を調製するために実施され得る：たとえばカルバゼート又は三次センターを生成するために、ポリペプチドの１又は複数のＬ−アミノ酸の対応するＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体又はアミノ酸擬似体による置換；又はトリプシン、キモトリプシン、パパイン又はＶ８プロテアーゼによる特定の化学的修飾、たとえばタンパク質分解切断、又はＮａＢＨ4 又は臭化シアン、又はアセチル化、ホルミル化、酸化又は還元、等による処理。他方では、又はさらに、本発明のポリペプチドは、遺伝子組換え技法により修飾され得る。
【０１１０】
本発明のポリペプチドは、１又は複数の化学基、たとえばアセチル基、硫黄架橋基、グリコシル基、脂質及びリン酸塩（但し、それらだけには限定されない）のそれらへの接合により、及び／又は本発明の第２ポリペプチドへの、又は他のタンパク質、たとえば血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、又は市販の活性化されたＢＳＡへの、又はポリアミノ酸（たとえばポリリシン）への、又は多糖（たとえば、セファロース、アガロース、又は変性された又は変性されていないセルロース）への接合により誘導体化され得る。そのような接合は、好ましくは、ポリペプチドのアミノ酸側鎖での及び／又はＮ−末端又はＣ−末端での共有結合による。そのような接合反応を実施するための方法は、タンパク質化学の分野においては良く知られている。
【０１１１】
本発明を実施するのに有用な誘導体はまた、水溶性ポリマー、たとえばポリエチレングリコールが本発明のポリペプチド、又はその類似体又は誘導体に接合されている誘導体も包含し、それにより、ポリペプチドの免疫原性を少なくとも一部、保持しながら、追加の所望する性質を提供する。それらの追加の所望する性質は、たとえば高められた水溶液溶解性、高められた貯蔵安定性、高められたタンパク質加水分解耐性、及び高められたインビボ半減期を包含する。本発明のポリペプチドへの接合のために適切な水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー（ここで、前記ホモポリマー及びコポリマーは置換されておらず、又は一端でアルキル基により置換される）、ポリオキシエチル化されたポリオール、ポリビニルアルコール、多糖、ポリビニルエチルエーテル、及びα，β−ポリ〔２−ヒドロキシエチル〕−ＤＬ−アスパルタミドを包含するが、但しそれらだけには限定されない。ポリエチレングリコールが特に好ましい。
【０１１２】
ポリペプチドの水溶性ポリマー接合体を製造するための方法は、当業界において知られており、そして中でも、アメリカ特許第３，７８８，９４８号；アメリカ特許第３，９６０，８３０号；アメリカ特許第４，００２，５３１号；アメリカ特許第４，０５５，６３５号；アメリカ特許第４，１７９，３３７号；アメリカ特許第４，２６１，９７３号；アメリカ特許第４，４１２，９８９号；アメリカ特許第４，４１４，１４７号；アメリカ特許第４，４１５，６６５号；アメリカ特許第４，６０９，５４６号；アメリカ特許第４，７３２，８６３号；アメリカ特許第４，７４５，１８０号；ヨーロッパ特許（ＥＰ）第１５２，８４７号；ＥＰ第９８，１１０号；及び日本特許第５，７９２，４３５号に記載されており、ここで前記特許は引用により本明細書中に組込まれる。
【０１１３】
４．７．抗体
本発明はさらに、本発明のポリペプチドに対して向けられた、単離された抗体を提供する。好ましい態様においては、抗体は、既知の方法を用いて、Ｎ．カニナムからのＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１又はＭＡＧ１タンパク質に対して生ぜしめられ得る。ブタ、牛、馬、ウサギ、ヤギ、羊、又はマウスから選択された種々の宿主動物は、部分的に又は実質的に精製され又は単離されたＮ．カニナムタンパク質により、又はその相同体、融合タンパク質、実質的な部分、類似体又は誘導体により、上記のようにして免疫化され得る。たとえば下記アジュバントが、抗体生成を高めるために使用され得る。
【０１１４】
ポリクローナル抗体は、免疫化された動物の血清から得られ、そして単離され得、そして標準の技法を用いて、抗原に対する特異性について試験され得る。他方では、モノクローナル抗体は、培養物における連続した細胞系による抗体分子の生成を提供するいづれかの技法を用いて調製され、そして単離され得る。それらは、Kohler and Milstein (Nature, 1975, 256 : 495-497）により記載されるハイブリドーマ技法；ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技法（Kosborなど., 1983, Immunology Today 4 : 72；Coteなど., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 2026-2030）；及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Coleなど., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. Inc., p77-96 ）を包含するが、しかしそれらだけには限定されない。他方では、一本鎖抗体の生成について記載される技法（たとえば、アメリカ特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）は、Ｎ．カニナム抗原−特異的一本鎖抗体の生成に適合され得る。前記出版物は引用により本明細書中に組込まれる。
【０１１５】
本発明のポリペプチドのための特異的結合部位を含む抗体フラグメントもまた、本発明内に包含され得、そして既知の技法により生成され得る。そのようなフラグメントは、損なわれていない抗体分子のペプシン消化により生成され得るＦ（ａｂ′）2 、及びＦ（ａｂ′）2 フラグメントのジスルフィド架橋の還元により生成され得るＦａｂフラグメントを包含するが、しかしそれらだけには限定されない。他方では、Ｆａｂ発現ライブラリーは、Ｎ．カニナムタンパク質に対する所望する特異性を有するＦａｂフラグメントの急速な同定を可能にするために構成され得る（Huseなど., 1989, Science 246 : 1275-1281）。
【０１１６】
モノクローナル抗体及び抗体フラグメントの生成及び単離のための技法は、当業界において良く知られており、そして中でも、Harlow and Lane, 1988, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory、及びJ. W. Goding, 1986, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, Academic Press, London （それらは、引用により本明細書中に組込まれる）にさらに記載されている。
【０１１７】
４．８．ネオスポラ遺伝子の標的化された突然変異誘発
本発明のポリヌクレオチド分子の開示に基づいて、遺伝子構造体は、ネオスポラＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１又はＭＡＧ１遺伝子（それらの遺伝子は集合的又は個々には、“ネオスポラ遺伝子”として言及される）の無能化又は他方では、変異誘発への使用のために調製され得る。ネオスポラ遺伝子の個々は、現在知られている遺伝子技法と組合して、又は将来に開発されるべき遺伝子技法と組合して、適切に企画された遺伝子構造体を用いて突然変異誘発され得る。
【０１１８】
たとえば、ネオスポラ遺伝子は、（ａ）ネオスポラ遺伝子のコード配列又は調節配列のすべて又は一部を欠失し；又は（ｂ）異なったヌクレオチド配列によりネオスポラ遺伝子のコード配列又は調節配列のすべて又は一部を置換し；又は（ｃ）ネオスポラ遺伝子のコード配列又は調節配列中に、ネオスポラ又は異種源からのヌクレオチド配列を含むことができる、１又は複数のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド分子、又はポリヌクレオチド分子を挿入し；又は（ｄ）（ａ），（ｂ）及び（ｃ）のいくつかの組合せを実施するよう機能する本発明の遺伝子構造体を用いて突然変異誘発され得る。
【０１１９】
ネオスポラ遺伝子が突然変異誘発されているネオスポラ細胞は、遺伝子の突然変異誘発が、遺伝子がそのように突然変異誘発されていないネオスポラの同じ株の細胞に比較して、突然変異誘発された遺伝子を担持するネオスポラ細胞の病原性を減じ、そして無能化された遺伝子を担持するそのようなネオスポラ細胞が、ネオスポロシスに対して哺乳類における保護応答を誘発し、又はその誘発に寄与するために、ワクチン組成物、特に変性された生存ワクチンに使用され得る、本発明の実施において有用である。好ましい態様において、突然変異誘発は、ネオスポラ遺伝子を部分的に又は完全に無能にするよう作用し、又はネオスポラ遺伝子によりコードされるタンパク質を部分的に又は完全に無能にするよう作用する。
【０１２０】
この場合、ネオスポラ遺伝子又はタンパク質は、次の場合、部分的に又は完全に無能化されると思われる：タンパク質生成物が製造されない場合（たとえば、遺伝子が欠失される場合）、又はその正常な生物学的機能をもはや実施できないか又はその正常な細胞位置にもはや輸送され得ないタンパク質生成物が製造される場合、又はその正常な生物学的機能を実施するが、しかし有意に低められた割合で実施する生成物が製造される場合、又はそのような突然変異誘発がネオスポラ病原株の細胞の病原性における検出できる低下をもたらす場合、ここでは、遺伝子が、同じ株の細胞ではあるが、遺伝子は突然変異されていない細胞に比較して、突然変異誘発されている。
【０１２１】
非制限態様においては、本発明の遺伝子構造体は、野生型遺伝子のコード配列、又はそのプロモーター又は他の調節領域、又はその一部の、異なったヌクレオチド配列、たとえば突然変異誘発されたコード配列又は調節領域、又はその一部による置換により野生型ネオスポラ遺伝子を突然変異誘発するために使用される。そのような遺伝子構造体に使用するための突然変異誘発されたネオスポラ遺伝子配列は、いづれかの種々の既知方法により、たとえばエラープロンＰＣＲの使用により、又はカセット突然変異誘発により生成され得る。たとえば、オリゴヌクレオチド−方向づけされた突然変異誘発は、たとえばその配列内の特定の点でフレーム−シフト又は停止コドンを導入するために、定義された手段により、野生型ネオスポラ遺伝子のコード配列又はプロモーター配列を変更するために使用され得る。
【０１２２】
他方では又はさらに、本発明の遺伝子構造体に使用するための突然変異誘発されたヌクレオチド配列は、１又は複数のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド分子、又はポリヌクレオチド分子のコード配列又はプロモーター配列中への挿入により、又は１又は複数の異るヌクレオチド、オリゴヌクレオチド分子、又はポリヌクレオチド分子によるコード配列又はプロモーター配列の一部の置換により調製され得る。そのようなオリゴヌクレオチド分子又はポリヌクレオチド分子は、いづれかの天然に存在する源から得られ、又は合成することができる。その挿入された配列は、ネオスポラ遺伝子の読み取り枠を破壊するよう単純に作用し、又はさらに、異種遺伝子生成物、たとえば選択マーカーをコードすることができる。
【０１２３】
他方では又はさらに、ランダム突然変異誘発が、本発明の遺伝子構造体への使用のための突然変異誘発されたネオスポラ遺伝子配列を生成するために使用され得る。ランダム突然変異誘発は、いづれかの現在知られているか又は将来において開発されるべき技法により、たとえばネオスポラ遺伝子を担持する細胞を、紫外線又はＸ−線に、又は化学的突然変異誘発剤、たとえばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート、亜硝酸又は窒素マスタードに暴露し、そして次に、特定遺伝子に突然変異を担持する細胞について選択することによって実施され得る。突然変異誘発技法の再考のためには、たとえばAusubel, 1989 前記を参照のこと。
【０１２４】
上記で定義されたように、本発明の実施において有用である修飾されたネオスポラ細胞を生成するための突然変異は、ネオスポラ遺伝子のいづれかの場所で、たとえばＯＲＦにおいて、又はプロモーター又は他の調節領域において、又は天然において遺伝子又はＯＲＦを含むいづれか他の配列において生じ得る。そのようなネオスポラ細胞は、ネオスポラ遺伝子により通常コードされるタンパク質の修飾された形が生成されるか、又はネオスポラ遺伝子により通常コードされるタンパク質が生成されない変異体を包含し、そして又は、条件又は漏出変異体であり得る。
【０１２５】
他方では、本発明の遺伝子構造体は、もとの場所に、ネオスポラ遺伝子又はＯＲＦを本来、端に有するヌクレオチド配列、たとえば配列番号１，３，４，６，８，１０，１１及び１２に示される配列を含むと共に、遺伝子自体のコード領域からのヌクレオチド配列の一部のみを含むか又はそのヌクレオチド配列を含まない。そのような遺伝子構造体は、たとえば完全なネオスポラ遺伝子又はＯＲＦを欠失するために有用である。
【０１２６】
好ましい態様においては、本発明の遺伝子構造体は、（ａ）Ｎ．カニナムからのＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１又はＭＡＧ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列と同じであるが、しかし１又は複数の無能化突然変異をさらに含んで成るヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子、又は（ｂ）もとの場所に、ネオスポラ遺伝子のＯＲＦを本来、端に有するヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を含んで成る、ネオスポラ遺伝子を無能化するために使用され得るポリヌクレオチド分子を含んで成る。ネオスポラ株の細胞が形質転換されると、遺伝子構造体のポリヌクレオチド分子は、相同組換えにより特定のネオスポラ遺伝子に特異的に標的化され、そしてそれにより、前記遺伝子又はその一部を置換し、又は前記遺伝子中に挿入する。この組換え現象の結果として、ネオスポラのその特定株に生得のネオスポラ遺伝子が無能化される。
【０１２７】
寄生体原生動物において相同遺伝子置換を実施するための方法は、当業界において知られており、そして中でも、Cruz and Beverley, 1990. Nature 348 : 171-173 ; Cruzなど., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7170-7174 ; Donald and Roos, 1994, Mol. Biochem. Parasitol. 63 : 243-253；及びTitus など., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 10267-10271（それらのすべては、引用により本明細書中に組込まれる）に記載されている。
【０１２８】
相同組換えを通しての標的化された遺伝子突然変異のためには、遺伝子構造体は好ましくは、上記のような突然変異体誘発されたヌクレオチド配列を含んで成る、環状又は直鎖状のいづれかのプラスミドである。非制限態様においては、突然変異誘発された配列中の少なくとも約２００個のヌクレオチドが、相同組換えのために、本発明の遺伝子構造体を、特定の標的化されたネオスポラ遺伝子に特異的に方向づけるために使用され、ここでは、より短い長さのヌクレオチドがまた効果的である。さらに、プラスミドは好ましくは、破壊されるべき生来のネオスポラ遺伝子の調節要素配列と作用可能に関連してネオスポラゲノム中に挿入するであろうように構成される、レポーター遺伝子生成物又は他の選択マーカーをコードする追加のヌクレオチド配列を含んで成る。
【０１２９】
本発明の実施に使用され得るレポーター遺伝子は、当業界において良く知られており、そして中でも、ＣＡＴ、緑色螢光タンパク質、及びβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を包含する。選択マーカーをコードするヌクレオチド配列はまた、当業界において良く知られており、そして抗生物質又は抗−代謝物に対する耐性を付与する遺伝子生成物をコードするか、又は栄養要求必要条件を提供するヌクレオチド配列を包含する。そのような配列の例は、ピリメタミン耐性、又はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（アミノグリコシドに対する耐性を付与する）、又はヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ヒグロマイシンに対する耐性を付与する）をコードするものを包含する。
【０１３０】
本発明の遺伝子構造体を創造するために使用され得る方法は、当業界において良く知られており、そして中でも、Maniatisなど., 1989 、前記；Ausubel など., 1989 、前記；Sambrookなど., 1989 前記；Innis など., 1995 、前記；及びErich, 1992 、前記に記載されるように、インビトロ組換え技法、合成技法、及びインビボ遺伝子組換えを包含する。
【０１３１】
ネオスポラ細胞は、既知の技法、たとえばエレクトロポレーションに従って、本発明の遺伝子構造体により形質転換され又はトランスフェクトされ得る。形質転換体の選択は、標準の技法を用いて、たとえば遺伝子構造体と関係する選択マーカーを発現する細胞について選択することによって実施され得る。好都合な組換え現象が生じ、そして特定の標的遺伝子が無能にされた形質転換体の選択は、遺伝子分析により、たとえば、特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写体の欠失を検出するためのサザンブロット分析により、又はノザンブロット分析により、又は新規表現型、たとえば減じられた病原性、又はたとえば免疫学的分析により決定される場合、特定のタンパク質を欠失する細胞の出現により、又はそれらのいくつかの組合せにより実施され得る。
【０１３２】
本発明に従って修飾され得るネオスポラは好ましくは、タキゾイトであるが、しかし他方では、ブラディゾイト又は接合子ノウでもあり得る。ネオスポラ生活環のある段階での細胞は二倍体であるが、タキゾイトは一倍体である。従って、適切な変異体表現型を発現する修飾されたネオスポラ細胞の生成へのタキゾイトの使用は、タキゾイトが特定のネオスポラ遺伝子を破壊するために一回の好都合な組換え現象のみを必要とするので、好ましい。他方では、ネオスポラの二倍体細胞においては、２種の対立遺伝子が個々の遺伝子のために破壊されるべきである。これは、第１の対立遺伝子及び次に第２の対立遺伝子を、２種の異なった選択マーカーを担持する遺伝子構造体により連続的に、標的化することによって達成され得る。
【０１３３】
さらなる非制限態様においては、本発明の遺伝子構造体はさらに、ネオスポラからの、又はその遺伝子又はコード領域が本発明の修飾された生存ネオスポラ細胞による予防接種に基づいて動物における別の及び明確な保護免疫応答を誘発し、又はその誘発に寄与するために有用な抗原をコードする、動物を感染する異なった病原体からの異なった遺伝子又はコード領域を含んで成る。この追加の遺伝子又はコード領域はさらに、修飾された生存ネオスポラ細胞からのコードされた抗原の分泌を導びくシグナル配列を含むよう構築され、それにより、予防接種された動物の免疫系へのその抗原の表示を可能にする。
【０１３４】
従って、本発明は、ＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１又はＭＡＧ１遺伝子が突然変異誘発されている修飾された生存ネオスポラ細胞を提供する。本発明はさらに、ＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１及びＭＡＧ１遺伝子の複数の遺伝子の組合せが突然変異誘発され、そしてその細胞が上記一般的な方法を用いて調製され得る修飾された生存ネオスポラ細胞を提供する。さらに、本発明は、（ａ）ネオスポラの細胞を本発明の遺伝子構造体により形質転換し；（ｂ）ＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１又はＭＡＧ１遺伝子が前記遺伝子構造体により突然変異誘発されている形質転換された細胞を選択し；そして（ｃ）段階（ｂ）の細胞間から、ネオスポロシスに対して哺乳類を保護するためにワクチンに使用され得るそれらの細胞を選択することを含んで成る、修飾された生存ネオスポラ細胞を調製するための方法を提供する。
【０１３５】
４．９．ネオスポラ細胞の培養
本発明に使用するためのネオスポラ細胞は、当業界において知られている技法に従って、いづれかの受動宿主細胞系、好ましくは哺乳類細胞系をタキゾイトにより感染することによって、インビトロで培養され、そして維持され得る。ネオスポラのタキゾイトが培養され得る哺乳類細胞系は、たとえばヒト包皮繊維芽細胞（Lindsay など., 1993, Am. J. Vet. Res. 54 : 103-106）、ウシ心肺大動脈内皮細胞（Marsh など., 1995 、前記）、ウシ単球（Lindsay and Dubey, 1989 、前記）、及びサル腎細胞を中でも包含する。たとえば、Ｎ．カニナムのタキゾイトは、Ｈｓ６８ヒト包皮繊維芽細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１６３５）の単層において培養され得（Lindsay など., 1993 、前記）；そして本発明に使用するためのＮ．カニナム株ＮＣ−１のタキゾイトにより感染されたＭＡＲＣ１４５サル腎細胞はＡＴＣＣ（受託番号１２２３１）に寄託されている。ブラディゾイトは、同様に培養され、そして操作され得る。
【０１３６】
哺乳類細胞培養物は増殖され得、そしてネオスポラ細胞により感染された細胞培養物は、当業界において知られていないいくつかのタイプの培養培地のいづれかにおいて維持され得る。たとえば、Ｎ．カニナムのタキゾイトにより感染されたウシ心肺大動脈内皮細胞の静置単層培養物は、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活性化されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）又は成熟ウシ血清（ＥＳ）、２mMのＬ−グルタミン、５０Ｕ／mlのペニシリン及び５０μｇ／mlのストレプトマイシンにより補充されたダルベッコ最少必須培地（DMEM；Gibco Laboratories, N.Y.）において増殖され得る（Conradなど., 1993 、前記）。Ｈｓ６８ヒト包皮繊維芽細胞の単層は、２％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ，１．０mMのピルビン酸ナトリウム、１×１０4 Ｕ／mlのペニシリン、１×１０4 μｇ／mlのストレプトマイシン、５×１０-2mMの２−メルカプトエタノール及び０．３mg／mlのＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０（維持培地）において維持され得る。ネオスポラにより感染されたＨｓ６８ヒト包皮繊維芽細胞の単層培養物は、同一の培地であるが、しかしＦＢＳが１０％（ｖ／ｖ）に高められている培地（増殖培地）において維持され得る。
【０１３７】
哺乳類細胞のネオスポラ−感染された単層培養物は典型的には、標準の組織培養条件、たとえば３７℃及び５％ＣＯ2 下で維持される。タキゾイトは典型的には、標準の技法を用いて顕微鏡的に決定され得る、培養物における哺乳類細胞の７０〜９０％が感染するようになる場合、感染されていない単層培養物に通される。トラキゾイトは、宿主細胞をいづれかの標準技法を用いて溶解し、そしてトラキゾイトを、たとえば濾過又は遠心分離により集めることによって、感染された哺乳類細胞培養物から集められ得る。
本発明の修飾された生存ネオスポラ細胞はまた、上記のように、哺乳類細胞においても培養され得る。
【０１３８】
４．１０．抗−ネオスポラワクチン
本発明はさらに、免疫学的に有効な量の１又は複数の本発明のタンパク質又はポリペプチド、及び獣医学的に許容できるキャリヤーを含んで成る、ネオスポロシスに対するワクチンを提供する。好ましい態様においては、前記ワクチンは、ＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１及びＭＡＧ１から成る群から選択されたＮ．カニナムタンパク質を含んで成る。
本発明はさらに、免疫学的に有効な量の１又は複数の本発明のポリヌクレオチド分子、及び獣医学的に許容できるキャリヤーを含んで成る、ネオスポロシスに対するワクチンを提供する。好ましい態様においては、前記ワクチンは、ＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１、及びＭＡＧ１から成る群から選択されたＮ．カニナムタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含んで成る。
【０１３９】
本発明はさらに、免疫学的に有効な量の本発明の修飾されたネオスポラ細胞及び獣医学的に許容できるキャリヤーを含んで成る、ネオスポロシスに対するワクチンを提供する。好ましい態様においては、本発明のワクチンに使用するための修飾されたネオスポラ細胞は、ＧＲＡ１- ，ＧＲＡ２- ，ＳＡＧ１- ，ＭＩＣ１- 又はＭＡＧ１- 表現型を発現するＮ．カニナムの生存細胞である。他方では、本発明のワクチンは、不活性化されている本発明のそのような修飾されたネオスポラ細胞のいづれかを含むことができる。修飾されたネオスポラ細胞の不活性化は、当業界において知られているいづれかの技法を用いて、たとえば化学処理、たとえば二元エチレンイミン（ＢＥＩ）又はβ−プロピオラクトンにより、又は凍結−融解又は熱処理により、又は細胞の均質化により、又はそれらのタイプの技法の組合せにより実施され得る。均質化された、その修飾されたネオスポラ細胞から調製されたワクチンは、完全な分別化されていない細胞均質物、又はその免疫学的に有効な副画分のいづれかから成ることができる。
【０１４０】
本明細書において使用される場合、用語“免疫学的に有効な量”とは、一回の投与、又は複数回の投与で、哺乳類のメンバーに投与される場合、ネオスポロシスに対する保護応答を誘発することができる、抗原、たとえばタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド分子、又は修飾された細胞のその量を言及する。
句“保護応答を誘発できる”とは、ネオスポロシスに対して予防接種された動物を保護するよう作用する、抗体又は細胞−介在免疫応答のいづれか、又は両者を包含する、予防接種に対する応答において動物にいづれかの免疫に基づく応答の誘発又は増強を包含するよう本明細書において広く使用される。
【０１４１】
用語“保護応答”及び“保護する”とは、本明細書において使用される場合、同じ種の予防接種されていない感染された動物に比較して、予防接種された動物において、ネオスポロシスの絶対的保護又はネオスポロシスが引き起こす病原体による感染の絶対的予防のみならず、またそのような病原体による感染の程度又は速度の検出できる低下、又は病原体による感染に起因する疾病の重症度、又はいづれかの徴候又は病状の検出できる低下、たとえば１又は複数の組織に形成される病変の形成の速度又は絶対的数の検出できる低下、又は流産の発生、又は妊娠哺乳類からその胎児、又は哺乳類親からその子孫への感染の伝達の検出できる低下を言及する。
【０１４２】
さらに好ましい態様においては、本発明のワクチンは、ネオスポロシス、及び任意には、哺乳類を苦しめる１又は複数の他の疾病又は病理学的状態に対して哺乳類を保護するための組合せワクチンであり、前記組合せワクチンは、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド分子、又は修飾されたネオスポラ細胞を含んで成る、免疫学的に効果的な量の第１成分；第１成分とは異なり、そして哺乳類を苦しめる疾病又は病理学的状態に対する保護応答を誘発でき、又はその誘発に寄与する、免疫学的に有効な量の第２成分；及び獣医学的に許容できるキャリヤーを含んで成る。
【０１４３】
前記組合せワクチンの第２成分は、ネオスポロシス、又は当業界において知られているような、哺乳類種のメンバーお苦しめる他の疾病又は病理学的状態のいづれかに対する保護応答を誘発し、又はその誘発に寄与するその能力に基づいて選択される。当業界において現在知られているか、又は将来において決定されるべきか、又は特定の哺乳類種におけるワクチン組成物において有用であるべきいづれかの抗原性成分が、組合せワクチンの第２成分として使用され得る。そのような抗原性成分は、中でも、ウシヘルペスウィルス（感染性ウシ鼻腔気管炎）、ウシＲＳウィルス、ウシウィルス性下痢ウィルス、パラインフルエンザウィルス型Ｉ，II、又はIII 、レプトスピラｓｐｐ．，カシピルドクターｓｐｐ．，スタフィロコーカスアウレウス、ストレプトコーカスアガラクチアエ、マイコプラズマｓｐｐ．，クレブシエラｓｐｐ．，サルモネラｓｐｐ．，ロタウィルス、コロナウィルス、狂犬病、パステウレラヘモリチカ、パステウレラムルトシダ、クロストリジアｓｐｐ．，破傷風トキソイド、Ｅ．コリ、クリプトスポリジウムｓｐｐ．，エイメリアｓｐｐ．，トリコモナスｓｐｐ．及び他の真核寄生体から成る群から選択された病原体に対する保護を提供する成分であるが、但しそれらだけには限定されない。
【０１４４】
非制限態様においては、本発明の組合せワクチンは、免疫学的に有効な量の本発明のタンパク質又はポリペプチド、免疫学的に効果的な量の本発明のポリヌクレオチド分子、及び免疫学的に効果的な量の本発明の修飾されたネオスポラ細胞から成る群から選択された複数成分の組合せを含んで成る。好ましい態様においては、本発明の組合せワクチンは、Ｎ．カニナムＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１及びＭＡＧ１タンパク質、Ｎ．カニナムＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１及びＭＡＧ１タンパク質のいづれかをコードするポリヌクレオチド分子、及びＧＲＡ１- ，ＧＲＡ２- ，ＳＡＧ１- ，ＭＩＣ１- 又はＭＡＧ１- 表現型のいづれかを示す修飾された生存ネオスポラ細胞から成る群から選択された複数成分の組合せを含んで成る。
本発明のワクチンはさらに、たとえば、下記に記載されるようなアジュバント又はサイトキンを包含する１又は複数の追加の免疫調節成分を含んで成る。
【０１４５】
本発明はさらに、免疫学的に効果的な量の本発明のＮ．カニナムタンパク質又はポリペプチド、又はポリヌクレオチド分子、又は修飾されたネオスポラ細胞と獣医学的に許容できるキャリヤーを、哺乳類への投与のために適切な形で組合すことを含んで成る、ネオスポロシスに対するワクチンを調製するための方法を提供する。好ましい態様においては、前記タンパク質はＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１、及びＭＡＧ１から成る群から選択されたＮ．カニナムタンパク質であり；前記ポリヌクレオチド分子は好ましくは、ＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１及びＭＡＧ１から成る群から選択されたＮ．カニナムタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成り；そして前記修飾されたネオスポラ細胞は好ましくは、ＧＲＡ１- ，ＧＲＡ２- ，ＳＡＧ１- ，ＭＩＣ１- 及びＭＡＧ１- から成る群から選択された表現型を示す生存細胞である。
【０１４６】
本発明の修飾された生存ネオスポラ細胞を含んで成るワクチンは、培地において自由であるか、又は哺乳類宿主に存在するか、又は両者である前記ネオスポラ細胞を含む培養流体のアリコートを用いて調製され得、そして哺乳類に直接的に又は濃縮された形で投与され得る。他方では、修飾された生存ネオスポラ細胞が、獣医学的に許容できるキャリヤーと共に、当業界において知られており、そして投与の選択された経路に適切であるものから選択された免疫調節剤を伴って又はそれを伴わないで組合され得、好ましくはここで、ワクチン組成物における修飾された生存ネオスポラ細胞の生存性の少なくともいくらかな程度が維持される。本発明のワクチンに使用され得る修飾されたネオスポラ細胞は好ましくは、タキゾイトであるが、しかし他方では、ブラディゾイト又は接合ノウ、又はそれらのいくらかの組合せであり得る。
【０１４７】
本発明のワクチン組成物は、獣医学的に許容できるキャリヤー、たとえば標準の緩衝液、安定剤、希釈剤、保存剤及び／又は溶解剤を含むよう、許容される慣習に従って配合され得、そしてまた、特効性を促進するよう配合され得る。希釈剤は、水、塩溶液、デキストロース、エタノール、グリセロール及び同様のものを包含する。等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースを包含する。安定剤は、中でもアルブミンを包含する。修飾された生存ワクチンの配合において特に有用である適切な他のワクチン用ビークル及び添加剤は、当業者に知られており、又は明らかである。たとえば、Remington's Pharmaceutical Science, 18th ed., 1990, Mack Publishing （引用により本明細書中に組込まれる）を参照のこと。
【０１４８】
本発明のワクチンはさらに、１又は複数の追加の免疫調節成分、たとえば中でもアジュバント又はサイトカインを含むことができる。本発明のワクチンに使用され得るアジュバントの非制限例は、ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ribi Inc., Hamilton, MT ）、みょうばん、鉱物ゲル、たとえば水酸化アルミニウムゲル、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、たとえばフロイント完全及び不完全アジュバント、ブロックコポリマー（CyfRx, Atlanta GA ）、ＱＳ−２１（Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA）、ＳＡＦ−Ｍ（Chiron, Emeryville CA ）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、ＱｕｉｌＡ又は他のサポニン画分、モノホスホリル脂質Ａ、及びアビジン脂質−アミンアジュバントを包含する。本発明のワクチンに有用な水中油エマルジョンの特定の非制限例は、修飾されたＳＥＡＭ６２及びＳＥＡＭ１／２配合物を包含する。
【０１４９】
修飾されたＳＥＡＭ６２は、５％（ｖ／ｖ）のスクアレン(Sigma）、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ登録商標８５界面活性剤(ICI Surfactants）、０．７％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０登録商標界面活性剤（ＩＣＩ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、２００μｇ／mlのＱｕｉｌＡ，１００μｇ／mlのコレステロール、及び０．５％（ｖ／ｖ）のレシチンを含む水中油エマルジョンである。修飾されたＳＥＡＭ１／２は、５％（ｖ／ｖ）のスクアレン、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ８５登録商標界面活性剤、０．７％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−８０界面活性剤、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、１００μｇ／mlのＱｕｉｌＡ及び５０μｇ／mlのコレステロールを含んで成る水中油エマルジョンである。ワクチンに含まれ得る他の免疫調節剤は、たとえば１又は複数のインターロイキン、インターフェロン、又は他の既知のサイトカインを包含する。ワクチンが修飾された生存ネオスポラ細胞を含む場合、アジュバントは好ましくは、その修飾された生存ネオスポラ細胞の生存性の少なくともいくらかの程度を維持するその得られるワクチン配合物の能力に基づいて選択される。
【０１５０】
ワクチン組成物が修飾された生存ネオスポラ細胞を含む場合、ワクチンは冷却又は凍結して貯蔵され得る。ワクチン組成物が代わりに本発明のタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド分子、又は不活性化された、修飾されたネオスポラ細胞を含む場合、ワクチンは、凍結して貯蔵され得、又は適切な希釈剤を用いて投与の前、再水和化されるよう凍結乾燥された形で貯蔵され得る。
本発明のワクチンは任意には、抗原の持効性のために配合され得る。そのような持効性配合物の例は、生物適合ポリマー、たとえばポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−コグリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲン及び同様のものの複合材料を組合して抗原を含む。薬物提供ビークルにおける分解ポリマーの構造、選択及び使用は、いくつかの出版物、たとえばA. Domb など., 1992, Polymers for Advanced Technologies 3 : 279-292 （引用により本明細書に組込まれる）に再考され得る。
【０１５１】
医薬製剤におけるポリマーの選択及び使用についての追加の説明は、M. Chasin and R. Langer (eds.), 1990, “Biodegradble Polymer as Drug Delivery Systems ”in Drugs and the Phaemaceutical Science, Vol. 45, M. Dekker, NY （引用により本明細書中に組込まれる）によるテキストに見出され得る。他方では又はさらに、抗原は、投与及び効率を改良するためにマイクロカプセル封入され得る。抗原をマイクロカプセル封入するための方法は、当業界において良く知られており、そしてたとえば、アメリカ特許第３，１３７，６３１号；アメリカ特許第３，９５９，４５７号；アメリカ特許第４，２０５，０６０号；アメリカ特許第４，６０６，９４０号；アメリカ特許第４，７４４，９３３号；アメリカ特許第５，１３２，１１７号；及び国際特許出願ＷＯ９５／２８２２７（それらは引用により本明細書中に組込まれる）に記載される技法を包含する。
【０１５２】
リポソームはまた、抗原の持効性を付与するために使用され得る。リポソーム配合物をいかにして製造し、そして使用するかに関する詳細は、中でも、アメリカ特許第４，０１６，１００号；アメリカ特許第４，４５２，７４７号；アメリカ特許第４，９２１，７０６号；アメリカ特許第４，９２７，６３７号；アメリカ特許第４，９４４，９４８号；アメリカ特許第５，００８，０５０号；及びアメリカ特許第５，００９，９５６号（それらすべては引用により本明細書中に組込まれる）に見出され得る。
【０１５３】
本発明はさらに、免疫学的に有効な量の本発明のワクチンを哺乳類に投与することを含んで成る、ネオスポロシスに対して哺乳類を予防接種するための方法を提供する。ワクチンは好ましくは、非経口的に、たとえば皮下又は筋肉内注射により投与される。しかしながら、ワクチンは、他方では、復腔内又は静脈内注射により、又は他の経路、たとえば経口、鼻腔内、直腸、膣内、眼内により、又はそれらの経路の組合せにより、及び又は、当業界において知られているような遅延される開放装置により投与され得る。当業者はワクチン投与の最とも最適な経路を決定することができ、そしてまた、投与の選択された経路に従って、ワクチン組成物のための許容できる配合を認識するであろう。
【０１５４】
効果的な用量は、従来の手段、すなわち低い用量の抗原から出発して、そして次に効果をモニターしながら、その用量を高くすることによって決定され得る。多くの因子が、動物当たりの最適用量を決定する場合、考慮され得る。それらの中で主要因子は、動物の種、大きさ、年齢及び一般的な状態、動物における他の薬物の存在、動物が予防接種されるネオスポラの特定種又は株のビルレンス、及び同様のものである。実際の用量は好ましくは、他の動物研究からの結果の考慮の後に選択される。
【０１５５】
本発明のワクチンにおける本発明のネオスポラタンパク質又はポリペプチドの用量は好ましくは、約１０μｇ〜約１０mg、より好ましくは、約５０μｇ〜約１mg、及び最とも好ましくは、約１００μｇ〜約０．５mgの範囲である。本発明のワクチンにおける本発明のネオスポラポリペプチド分子の用量は、約５０μｇ〜約１mgの範囲である。本発明のワクチンにおける本発明の修飾されたネオスポラ細胞の用量は好ましくは、約１×１０3 〜約１×１０5 個の細胞／ml、及びより好ましくは約１×１０5 〜約１×１０7 個の細胞／mlの範囲である。適切な用量サイズは、約０．５ml〜約１０ml、及びより好ましくは、約１ml〜約５mlの範囲である。それらの抗原の用量はまた、本発明の組合せワクチンにも適用できる。組合せワクチン中の第２成分が本発明のネオスポラタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド又は修飾された細胞以外の抗原である場合、その組合せワクチンに使用するための第２成分の用量は、当業界において知られているように、その第２成分のワクチン適用の前に決定され得る。
【０１５６】
本発明のワクチンは、ネオスポロシスに対して哺乳類を保護するために有用である。本明細書において使用される場合、用語“哺乳類”とは、本発明のワクチンを用いてネオスポロシスに対して保護され得るいづれかの哺乳類種、たとえば犬、牛、ヤギ、羊及び馬を言及する。本発明のワクチンは、いくつかの要因、たとえば他の動物間でのネオスポロシスの大発生のタイミング、等に依存して、特定動物の生命の間、いづれの時点でも投与され得る。ワクチンは、ネオスポラ関連の先天性疾病又は流産に対して保護するために、交配前ワクチンとして、離乳年齢又はより若い動物に、又は成熟した動物に投与され得る。効果的な保護は、一次予防接種のみを必要とし、又は１又は複数回の追加予防接種がまた必要とされる。適切な免疫保護が達成されたかどうかを決定する１つの方法は、予防接種の後、動物におけるセルコンバージョン及び抗体力価を測定することである。予防接種のタイミング及び追加予防接種（もし存在するなら）の回数が、好ましくは、すべての関連因子（このいくつかは、下記に示される）の分析に基づいて、獣医により決定されるであろう。
【０１５７】
本発明はさらに、免疫学的に有効な量の本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド分子、又は修飾されたネオスポラ細胞、又はそれらの組合せを有する容器を含んで成る、ネオスポロシスに対して哺乳類を予防接種するためのキットを提供する。キットは任意には、獣医学的に許容できるキャリヤー又は希釈剤を有する第２容器を含んで成る。好ましい態様において、ポリペプチドは、Ｎ．カニナムのＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１及びＭＡＧ１タンパク質から成る群から選択され；ポリヌクレオチド分子は好ましくは、ＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１，ＭＩＣ１、及びＭＡＧ１から成る群から選択されたＮ．カニナムタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有し；そして修飾されたネオスポラ細胞は好ましくは、ＧＲＡ１- ，ＧＲＡ２- ，ＳＡＧ１- ，ＭＩＣ１- 又はＭＡＧ１- 表現型を発現する生存細胞である。
次の例は、例示的であって、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０１５８】
５．例：Ｎ．カニナムｃＤＮＡの単離及び遺伝子配列
５．１．ＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１、及びＭＩＣ１  ｃＤＮＡを含むλクローンの 同定
Ｎ．カニナムタキゾイトのｃＤＮＡライブラリーを、Dr. T. Boszler, Washington State University, Pullman, WAから得た。手短には、このライブラリーを、Ｎ．カニナムＮＣ−１タキゾイトから精製されたＲＮＡを用いて構成した。ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ末端へのＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩリンカーの付加に続いて、バクテリオファージλＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ（Stratagene, La Jolla, CA) においてクローン化した。ライブラリーは、そのライブラリーのアリコートがＥ．コリＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＡ（Ｐ2 ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と共に混合され、そしてＩＰＴＧを含むＮＺＹ寒天プレート上にプレートされる場合、白色プラークの形成に基づいて、約９９％の組換え体を含むことが推定された。
【０１５９】
上記のようにして同定された個々の推定上のλＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓクローンの組換え挿入体ＤＮＡ配列を、Krishnanなど., 1991, Nucl. Acids. Res. 19 : 6177-6182 ; 及びKrishnanなど., 1993, Meth. Enzym. 218 : 258-279 （引用により本明細書に組込まれる）により実質的に記載されるようにして、ＰＣＲ分析にゆだねた。従って、十分に分離されたバクテリオファージλプラークを含む寒天のプラグを、殺菌したパスツールピペットを用いて回収し、そして無菌の水１００μｌに少なくとも１時間、含浸した。
【０１６０】
約１０μｌの拡散されたバクテリオファージλ粒子を用いて、次の成分を含む合計１００μｌの体積においてＰＣＲを実施した：（１）クローニング部位（すなわち、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ）に隣接する配列に対しての特異性を伴って、λバクテリオファージベクター、すなわちλＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓに対して特異的であり、そして挿入体ＤＮＡ配列に対して５’→３’方向に配向される、それぞれ１００ngのλＤＡＳＨ−Ｔ３及びλＤＡＳＨ−Ｔ７オリゴヌクレオチドプライマー；（２）２００μＭのｄＮＴＰ；（３）ＰＣＲ緩衝液（Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)；及び（４）１単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Life Technologies, Inc.)。λＤＡＳＨ−Ｔ３の配列は、5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG （配列番号１４）である。
【０１６１】
λＤＡＳＨ−Ｔ７の配列は、5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC （配列番号１５）である。熱サイクル条件は次の通りである：９４℃，５分、１サイクル；９４℃，１分、５５℃，１分、７２℃，１分、３０サイクル；７２℃，７分、１サイクル。反応混合物のアリコート（典型的には１０μｌ）を、標準のアガロースゲル電気泳動、臭化エチジウム染色、及びＵＶ対照下での可視化により試験した。ＰＣＲ混合物を、ＰＣＲ精製システム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてイオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製し、そして螢光ラベリング及びＳａｎｇｅｒジデオキシ鎖終結ＤＮＡ配列決定技法を使用し、λＤＡＳＨ−Ｔ３及びλＤＡＳＨ−Ｔ７プライマーを用いて直接的に配列決定した。配列を、National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Maryland, 20894, USA でのＤＮＡ配列データーベースへの比較により、他の既知配列に対する相同性について分析した。それぞれＴ．ゴンジＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１及びＭＩＣ１遺伝子に対する相同性を有する４種の配列を同定した。
【０１６２】
５．２．Ｎ．カニナムＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１及びＭＩＣ１  ｃＤＮＡのための 完全ＯＲＦの同定
それぞれ、Ｔ．ゴンジＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＳＡＧ１及びＭＩＣ１遺伝子に対する相同性を有するＮ．カニナム配列を含むものとして同定された上記バクテリオファージλＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ粒子を、製造業者の説明書（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従って、インビボ切断プロトコールにゆだね、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにおける挿入体配列を回収した。手短に言及すれば、前記ファージ粒子は、ＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により同時感染されたＥ．コリＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦの感染を可能にされた。この処理に続いて、上清液を集め、そしてＥ．コリＸＬＯＬＲ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と混合するために使用した。
【０１６３】
次に、前記細胞上清液のアリコートを、カナマイシン（約５０μｇ／ml）を含む培地上にプレートし、そしてカナマイシン耐性コロニーを、プラスミドプロフィールについて試験した。プラスミドＤＮＡを精製し、そして組換え部分を、Ｓａｎｇｅｒジデオキシ鎖終結ＤＮＡ配列決定技法を用いて配列決定した。得られたＤＮＡ配列を、ＤＮＡＳＴＡＲ（DNASTAR, Inc., Madison, WI）により分析し、ＯＲＦ及び他の特徴を同定した。配列をまた、公開データベースにおけるＤＮＡ配列に対する相同性比較について、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（National Center for Biotechnology Information ）を用いて分析した。
【０１６４】
完全なＮ．カニナムＧＲＡ１  ＯＲＦを含むものとして同定された組換えプラスミドクローンを、ｐＲＣ７７（ＡＴＣＣ  ２０９６８５）として命名した。ｐＲＣ７７におけるｃＤＮＡ挿入体配列の合計の長さは、１，２６５bpであり、そしてnt２０５〜７７７（配列番号１）から延長するＧＲＡ１  ＯＲＦを含んだ。Ｎ．カニナムＧＲＡ１タンパク質の推定されるアミノ酸配列は、配列番号２として表わされる。Ｎ．カニナムＧＲＡ１  ＯＲＦのヌクレオチド配列は、Ｔ．ゴンジＧＲＡ１  ＯＲＦのヌクレオチド配列に対して約５５％の類似性を有する。Ｎ．カニナムＧＲＡ１タンパク質の推定されるアミノ酸配列は、Ｔ．ゴンジＧＲＡ１タンパク質の推定されるアミノ酸配列に対して約５１％の類似性を有する。
【０１６５】
完全なＮ．カニナムＧＲＡ２  ＯＲＦを含むものとして同定された組換えプラスミドクローンを、ｐＲＣ５（ＡＴＣＣ  ２０９６８６）として命名した。ｐＲＣ５におけるｃＤＮＡ挿入体配列の合計の長さは、１．０３１bpであり、そしてnt２５〜６６０（配列番号４）から延長するＧＲＡ２  ＯＲＦを含んだ。Ｎ．カニナムＧＲＡ２タンパク質の推定されるアミノ酸配列は、配列番号５として表わされる。Ｎ．カニナムＧＲＡ２  ＯＲＦのヌクレオチド配列は、Ｔ．ゴンジＧＲＡ２  ＯＲＦのヌクレオチド配列に対して約３７％の類似性を有する。Ｎ．カニナムＧＲＡ２タンパク質の推定されるアミノ酸配列は、Ｔ．ゴンジＧＲＡ２タンパク質の推定されるアミノ酸配列に対して約２６％の類似性を有する。
【０１６６】
完全なＮ．カニナムＳＡＧ１  ＯＲＦを含むものとして同定された組換えプラスミドクローンを、ｐＲＣ１０２（ＡＴＣＣ  ２０９６８７）として命名した。ｐＲＣ１０２におけるｃＤＮＡ挿入体配列の合計の長さは、１，２６３bpであり、そしてnt１３０〜１，０８９（配列番号６）から延長するＳＡＧ１  ＯＲＦを含んだ。Ｎ．カニナムＳＡＧ１タンパク質の推定されるアミノ酸配列は、配列番号７として表わされる。Ｎ．カニナムＳＡＧ１  ＯＲＦのヌクレオチド配列は、Ｔ．ゴンジＳＡＧ１  ＯＲＦのヌクレオチド配列に対して約５８％の類似性を有する。Ｎ．カニナムＳＡＧ１タンパク質の推定されるアミノ酸配列は、Ｔ．ゴンジＳＡＧ１タンパク質の推定されるアミノ酸配列に対して約４９％の類似性を有する。
【０１６７】
完全なＮ．カニナムＭＩＣ１  ＯＲＦを含むものとして同定された組換えプラスミドクローンを、ｐＲＣ３４０（ＡＴＣＣ  ２０９６８８）として命名した。ｐＲＣ３４０におけるｃＤＮＡ挿入体配列の合計の長さは、２，０６９bpであり、そしてnt１３８〜１，５２０（配列番号８）から延長するＭＩＣ１  ＯＲＦを含んだ。Ｎ．カニナムＭＩＣ１タンパク質の推定されるアミノ酸配列は、配列番号９として表わされる。Ｎ．カニナムＭＩＣ１  ＯＲＦのヌクレオチド配列は、Ｔ．ゴンジＭＩＣ１  ＯＲＦのヌクレオチド配列に対して約５８％の類似性を有する。Ｎ．カニナムＭＩＣ１タンパク質の推定されるアミノ酸配列は、Ｔ．ゴンジＭＩＣ１タンパク質の推定されるアミノ酸配列に対して約４７％の類似性を有する。
【０１６８】
５．３．ＧＲＡ１遺伝子配列の同定
Ｎ．カニナム株ＮＣ−１のゲノムＤＮＡライブラリーを、従来の技法に従って、バクテリオファージλIIベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において構成した。ｐＲＣ７７（ＡＴＣＣ  ２０９６８５）に由来するｃＤＮＡ配列を次の通りにＰＣＲ増幅し、そして得られるＰＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメントをプローブとして使用し、Ｎ．カニナム株ＮＣ−１ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーンした。Ｎ．カニナムＧＲＡ１  ｃＤＮＡに対して特異的なプライマーｂｄ２１９及びｂｄ２２０を用いて、Ｎ．カニナムＧＲＡ１  ｃＤＮＡ（ｐＲＣ７７）のＯＲＦに対応する５６３bpのフラグメントを増幅した。ｂｄ２１９は5'-GCCGCGACTTCTTTTTCTCT （配列番号１６）であり、そしてｂｄ２２０は、5'-CTCGATCGCCTCCTTTACTG （配列番号１７）である。５６３bpのフラグメントを、ＳｅａＰｌａｑｕｅ低溶融アガロース（ＬＭＡ）（FMC Bioproducts ）を用いて、電気泳動により精製した。バンドをゲルから切り出し、そして続いて、ランダムプライムラベリング反応に使用し、ネオスポラゲノムライブラリーをスクリーンするための調製においてプローブを生成した。
【０１６９】
Ｎ．カニナムゲノムライブラリー（λＤＡＳＨ  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＃８４５２０１）からの２．５×１０5 pfu を、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にプラーク−リフトした。二重フィルターを、プローブとして５６３bpのＧＲＡ１  ｃＤＮＡを用いてスクリーンした。９つの二重pfu を陽性であると評価し、そして続いて１mlのＳＭ緩衝液にコアーした。それらのクローンの４つ（＃５〜８）を、二次スクリーニングに向けた。二次スクリーニング上では、５００〜１０００pfu ／クローンを二重フィルター上にプラーク−リフトした。すべての４つのＧｒａ１クローンは二次スクリーニング上で陽性であり、そして個々のプラークとして単離した。
【０１７０】
Ｇｒａ１＃８として命名されたλクローンをこの方法により同定し、そしてプライマーｂｄ２５６及びｂｄ２５４を用いてのＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。プライマーｂｄ２５６は、5'-TGCTAGTACTGGCGAGTGAA （配列番号１８）である。プライマーｂｄ２５４は、5'-CAGGTTTGCCACACATTTTT （配列番号１９）である。得られたＰＣＲフラグメントを、ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹベクター（Promega, Madison, WI）中にサブクローン化した。クローン化されたフラグメントを、螢光ラベリング及びＳａｎｇｅｒジデオキシ鎖終結配列決定技法を用いて配列決定した。配列の分析は、クローン化されたフラグメントがＧＲＡ１遺伝子を含むことを示した。
【０１７１】
ＧＲＡ１遺伝子配列（配列番号３）は、nt２０５〜nt７７７のｐＲＣ７７（ＡＴＣＣ  ２０９６８５）のＧＲＡ１  ｃＤＮＡ配列（配列番号１）に対して完全な同一性を共有する、nt６０５〜nt８５５及びnt９８３〜nt１３０４のＯＲＦを含む。しかしながら、ＧＲＡ１遺伝子配列（配列番号３）は、ｐＲＣ７７のnt１２０１でグアニンの代わりにチミンが存在する、ＧＲＡ１遺伝子のnt１７２８で３′未翻訳領域において単一のヌクレオチド位置でｃＤＮＡ配列（配列番号１）とは異なる。この差異は、このヌクレオチド不一致がＧＲＡ１＃８λゲノムクローンからの２種の別のサブクローンにおいて確認されたので、ＲＦＬＰ、又はｐＲＣ７７における配列決定エラーのためであり得る。ＧＲＡ１遺伝子配列（配列番号３）はさらに、nt８５６〜nt９８２まで延長するイントロンを含んで成る。さらに、３種のプロモーターモチーフが、Ｔ．ゴンジＧＲＡ遺伝子に見出される部位に類似するｍＲＮＡ開始部位の１５０bp  ５′側内に同定されている（Mercier など., 1996, Mol. Microbiol. 21 : 421-428 ）。
【０１７２】
５．４．ＳＡＧ１遺伝子配列の同定
ＳＡＧ１遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを、ｐＲＣ１０２から得られたＤＮＡ配列のＳＡＧ１  ＯＲＦに基づいて合成した。ＮＣＳＡＧ１  ５′として命名された第１プライマーは、5'-ATGTTTCCTCCTCGGGCAGTG（配列番号２０）であり、そしてＮＣＳＡＧ１  ３′として命名された第２プライマーは、5'-TCACGCGACGCCAGCCGCTATCG（配列番号２１）であった。上記に示されるようなプライマーＮＣＳＡＧ１  ５′が追加の３個のヌクレオチド（ＣＣＴ）を含むように偶然に企画されたことが後で決定され、そしてそれらの３個の追加のヌクレオチドの存在が、実際のＳＡＧ１遺伝子配列を決定する場合に考慮された。
【０１７３】
ＰＣＲを、鋳型としてのＮ．カニナム株ＮＣ−１ゲノムＤＮＡに基づいて、プライマーＮＣＳＡＧ１  ５′（配列番号２０）及びＮＣＳＡＧ１  ３′（配列番号２１）を用いて実施した。製造業者の推薦に従って、プラスミドｐＣＲ２．１及びｐＢｌｕｎｔ（Invitrogen, Carisbad, CA）にクローン化される、約１kbの増幅されたフラグメントを得た。ゲノムＳＡＧ１  ＰＣＲフラグメントを含むことが同定された組換えプラスミドを、螢光ラベリング及びＳａｎｇｅｒジデオキシ鎖終結配列決定技法、並びに標準の“普通”、“逆”及び次のオリゴヌクレオチド：ＮＣＳＡＧ１２００：5'-GCCCTGACAATTCGACCGCC （配列番号２２）；ＮＣＳＡＧ１５００：5'-CCCACAACATCCAAGTCGTTC（配列番号２３）；ＮＣＳＡＧ１６６０：5'-GTTTTGCACCATCCTTAGTG （配列番号２４）、及びＮＣＳＡＧ１３２０：5'-GAGAGTTTGCTTTGCACCG（配列番号２５）を用いて配列決定した。得られたＤＮＡ配列を、ＤＮＡＳｔａｒソフトウェアパッケージを用いてアセンブリーし、そしてｐＲＣ１０２から推定されるＳＡＧ１  ＯＲＦの配列に対して同一であることを見出した。従って、ＳＡＧ１遺伝子のゲノム配列は、ｃＤＮＡ配列決定から得られたその配列に対して同一である。
【０１７４】
５．５．ＭＩＣ１遺伝子配列の同定
約２．２kbのＤＮＡフラグメントを、ＭＩＣ１  ｃＤＮＡフラグメント（ｐＲＣ３４０の配列を参照のこと）の５′及び３′末端に対して特異的なオリゴヌクレオチドを用いてＮ．カニナムゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。熱サイクル条件は次の通りであった：９４℃，１分、１サイクル；９４℃，４５秒、５４℃，４５秒、７２℃，２分、２９サイクル；７２℃，５分、１サイクル。この２．２kbのフラグメントを、ｐＣＲ２．１及びｐＺＥＲＯＢＬＵＮＴ（Invitrogen, Carisbad, CA）中にクローン化した。組換えプラスミドを標準の制限分析により同定し、そして代表的なクローンを、螢光ラベリング及びＳａｎｇｅｒジデオキシ鎖終結技法を用いて配列決定した。エキソン及びイントロンの位置を、ｐＲＣ３４０からのＭＩＣ１  ｃＤＮＡ配列との比較により同定した。
ＭＩＣ１遺伝子の全体の長さは２２７８bpであり（配列番号１０）、これはnt１〜nt７３，nt３４５〜nt８１１，nt１１８７〜nt１２６５及びnt１５１５〜nt２２７８のＯＲＦ、及び３種の介在イントロンを含んで成る。
【０１７５】
５．６．ＭＡＧ１遺伝子配列の同定
ＢｓｐＤＩ，ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII Ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅライブラリー（Ｇｅｎｏｓｙｓ）を、製造者のプロトコールに従って、鋳型ＤＮＡとしてゲノムクローンＧｒａ１＃８を用いて調製した。５′ＧＲＡ１  ｃＤＮＡに対して特異的なアンチセンスプライマーｂｄ２３４、及びＶｅｃｔｏｒｅｔｔｅプライマーII（ＥＲ−７０）を用いて、約２kbのフラグメントを、ＨｉｎｄIII Ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅライブラリーから、Ｋｌｅｎｔａｑ（ＡＢ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｃ．）及びＰＦＵ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ポリメラーゼを用いて増幅した。プライマーｂｄ２３４は、5'-CCAGCCGAGTTCGTGTTCAGA（配列番号２６）であり、そしてプライマーＥＲ−７０は、CAACGTGGATCCGATTCAAGCTTC（配列番号２７）である。生成物を、１％  ＬＭＡゲル上で移動せしめ、切り出し、そしてｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹベクターとのクローニング反応に直接使用した。
【０１７６】
Ｅ．コリＤＨ５αの形質転換は、いくつかの白色コロニーを生成した。２０の異なった白色クローンからのＤＮＡのＮｏｔＩ制限分析は、２０のクローンのうち１８のクローンが適切なサイズの挿入体を含んだことを示した。サブクローン２を選択し、ストックとして増殖し、そしてこのプラスミドをｂｄ２４５と改名した。Ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅ  ２kb  Ｇｒａ１プロモーターフラグメントからのＰＣＲ生成物を、ネスティドプライマーｂｄ２１８及びＶｅｃｔｏｒｅｔｔｅ配列決定プライマーを用いて両端から配列決定した。プライマーｂｄ２１８の配列は、5'-AAAGCTCTTCGGCAGTTCAA （配列番号２８）である。プラスミドｂｄ２４５の完全な配列は、Ｓａｎｇｅｒ螢光ジデオキシ鎖終結配列決定技法を用いて、標準のプライマーウォーキングにより生成した。
【０１７７】
プライマーｂｄ２５２を、クローンＧｒａ１＃８の一端をマッピングするために、ＰＣＲにおいて、鋳型としてプライマーＴ７の変異体及びＧｒａ１＃８ＤＮＡと組合して使用した。プライマーｂｄ２５２は、5'-CCGCGCTACCACTTTCCA （配列番号２９）である。Ｔ７プライマーの変異体は、5'-GTAATACGACTCACTATA （配列番号３０）である。約２．５kbのフラグメントを、プライマーｂｄ２５２及びＴ７変異体を用いて増幅し、この生成物をｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹベクター中にサブクローン化し、そしてこのプラスミドをｂｄ２８２と命名した。螢光ラベリング及びＳａｎｇｅｒジデオキシ鎖終結配列決定技法を用いてのプライマーウォーキングを用いて、プラスミドｂｄ２８２の完全な配列を完結した。
【０１７８】
プラスミドｂｄ２４５及びｂｄ２８２からの配列が、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ２（Washington University BLAST version 2 ）を用いて同定されたＭＡＧ１遺伝子をコードする、配列番号１１に示される連続配列を生成するために使用された。結果は、この配列がＴ．ゴンジＭＡＧ１遺伝子（受託番号Ｕ０９０２９）に対しての相同性を有することを示す。推定上のエキソン／イントロン境界を、イントロンスライス部位コンセンサス配列及びＴ．ゴンジＭＡＧ１配列との整合により同定し、これがnt７０４〜nt８２０（エキソン１）、nt１３０１〜nt１３９９（エキソン２）、nt１５１０〜nt１８０８（エキソン３）及びnt１９２１〜nt３２９７（エキソン４）のｍＲＮＡ転写体及び介在イントロン示唆した。
【０１７９】
それらの推定上のエキソン／イントロン境界に基づいて、提案されたｃＤＮＡ配列は配列番号１２として表わされ、そしてそれから推定されるアミノ酸配列は配列番号１３として提供される。Ｔ．ゴンジとＮ．カニナムとの間のエキソン及びイントロン境界の比較は、ＭＡＧ１遺伝子のエキソン１〜３及びイントロン１〜２がそれらの２種の生物間に比較的位置決定して保存されることを示す。イントロン３及びエキソン４スプライス部位は、Ｎ．カニナムＭＡＧ１に対してユニークである。配列番号１１はまた、nt１〜nt１２６の、ＧＲＡ１のＧＲＡ１遺伝子配列の一部、及びnt１２７〜nt７０３の完全な介在性の推定上の二方向性ＧＲＡ１／ＭＡＧ１プロモーター領域を含んで成る。
【０１８０】
λＧｒａ１＃８クローンからのＤＮＡをＮｏｔＩにより消化し、挿入体ＤＮＡを開放し、これを続いて、フェノール／クロロホルムにより抽出し、沈殿せしめ、そして水に再懸濁した。この調製からのＤＮＡを、精製されたＮｏｔＩ消化ＢＳ  ＫＳ+ ベクターＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結し、そしてその後、Ｅ．コリＤＨ５α細胞を形質転換した。クローンを、ＧＲＡ１及びＭＡＧ１遺伝子に対して特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲによりスクリーンし、そしてさらに、約１６kbのλＧＲＡ１＃８  ＮｏｔＩ挿入体の存在についてＮｏｔＩ制限消化により確かめた。ＰＣＲのために使用されるプライマーは、ＧＲＡ１プライマー２１９（配列番号１６）及び２２０（配列番号１７）、並びにＭＡＧ１プライマー２６１及び２７０であった。プライマー２６１は、5'-CCGCAACGTGCTGTTCCTA（配列番号３１）であり；そしてプライマー２７０は、5'-CATCAGAGAAACTGGAGT （配列番号３２）である。λＧｒａ１＃８からのＮｏｔＩ挿入体に連結されるＢＳＫＳ＋ベクターを含む陽性プラスミドクローンを同定し、そしてｂｄ３０４（ＡＴＣＣ  ２０３４１３）と命名した。
【０１８１】
５．７．ネオスポラのＭＡＧ１及びＧＲＡ１プロモーターの同定
５．７．１．Ｔ．ゴンジＧＲＡ１プロモーター要素に対する背景
Ｔ．ゴンジＧＲＡ１プロモーターの機能的突然変異分析、及びもう１つの十分に定義されたＴ．ゴンジプロモーター（ＳＡＧ１）への配列比較が、配向−独立性態様で基本的なＧＲＡ１プロモーター活性を付与するヘプタヌクレオチドモチーフ（TGAGACG ）を同定した（Mercier など., 1996, Mol. Micro. 21 : 421-428 ）。ＧＲＡ１プロモーターにおける２つの追加のヘプタヌクレオチドモチーフが、追加の転写活性を付与する。Ｔ．ゴンジＧＲＡ１プロモーターは、ＧＲＡ１転写開始部位に対して−１２９〜−４７上流の隣接した領域内に含まれる。Ｔ．ゴンジＧＲＡ１領域における有意なプロモーター要素は、１つのＣＡＡＴボックス、前方配向での１つのヘプタヌクレオチドモチーフ、及び逆配向での２つのヘプタヌクレオチドモチーフを含む。３個の追加のヘプタヌクレオチドモチーフは、Ｔ．ゴンジＧＲＡ１プロモーターの上流（−３４９〜−２０４）に同定されるが、しかし−１２９〜−４７のプロモーター要素に有意な上昇を付与しない。
【０１８２】
５．７．２．ネオスポラＭＡＧ１−ＧＲＡ１プロモーター要素
Ｎ．カニナム株ＮＣ−１の完全なＭＡＧ１−ＧＲＡ１領域のゲノム配列分析は、２つの遺伝子が接近した配置で配列されていることを示す。推定上のＭＡＧ１／ＧＲＡ１二方向性プロモーターを含む、ＭＡＧ１及びＧＲＡ１遺伝子（配列番号１１、nt１２７〜nt７０３）のための推定上の翻訳開始部位間に５７７bpの領域が存在する。この５７７bpの領域の配列分析は、Ｔ．ゴンジＧＲＡ１プロモーターについて記載されるように、３つの逆転されたヘプタヌクレオチドモチーフ（CGTCTCA 又はCGTCTCT ）を同定した。２つのＣＡＡＴボックスは、それらのヘプタヌクレオチドモチーフを端に有し、その１つのＣＡＡＴボックスはＧＲＡ１遺伝子に向かって配向され、そして第２のＣＡＡＴボックスはＭＡＧ１遺伝子に向かって配向される。下記表は、Ｎ．カニナムＭＡＧ１／ＧＲＡ１二方向性プロモーター領域に見出されるプロモーター要素を列挙する。
【０１８３】
【表１】
2005245456.tif 000002
【０１８４】
ａ：ヌクレオチド位置は、ＧＲＡ１  ｃＤＮＡ（ｐＲＣ７７）の５′端により定義される    推定上の転写開始部位に対して存在する。
* ：このＣＡＡＴボックスは補体鎖から読取られ、そしてＭＡＧ１遺伝子（６５KDa ）に    向かって配向される。
**：Mercier など., 1996 、前記により定義されるような逆方向ヘプタヌクレオチドプロモーターモチーフ。
【０１８５】
５．７．３．ネオスポラＧＲＡ１プロモーター構造体の構成
２つのヘプタヌクレオチドモチーフ及び２つのＣＡＡＴボックスを含む５７７bpの推定上のＭＡＧ１／ＧＲＡ１二方向性プロモーターの機能性を、この定義された配列の下流にＬａｃＺレポーター遺伝子を含むプラスミドを構築し、そして次に、このプラスミドをＮＣ−１タキゾイト中にトランスフェクトすることによって試験した。ＬａｃＺ発現を駆動するＴ．ゴンジＧＲＡ１プロモーターを含み、そしてＴ．ゴンジＳＡＧ１  ３′末端を含む、ＧＬＳと称するＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドは、D. David Sibley, Washington University School of Medicine, St. Louis, Mo., USAにより提供された。プラスミドＧＬＳのＨｉｎｄIII ／ＮｓｉＩ消化が、Ｔ．ゴンジＧＲＡ１プロモーターフラグメントを除去し、そして続くＬＭＡ精製がプロモーターのないＬａｃＺレポーターベクターを生成するために実施された。
【０１８６】
プライマーＨｉｎｄIII −ｂｄ２５６（5'-GGCCAAGCTTGCTAGTACTGGCGA ；配列番号３３）及びｂｄ２６０−ＮｓｉＩ（5'-ATCCAATGCATCTTGCTGAATGCCTTAAAAG；配列番号３４）を、鋳型としてλクローンｇｒａ１＃８、及びＰＦＵ及びＫｌｅｎｔａｑポリメラーゼと共に増幅反応に使用し、ネオスポラＧＲＡ１遺伝子からの５′未翻訳領域を含む−６００bpのプロモーターフラグメントを生成した。そのフラグメントをＨｉｎｄIII ／ＮｓｉＩにより消化し、ＬＭＡ上で精製し、そして続いて、上記プロモーターのないＬａｃＺレポーターベクターとの連結反応に使用し、プラスミドクローンｂｄ２６６を生成した。プライマーＨｉｎｄIII −ｂｄ２５６及びｂｄ２６０−ＮｓｉＩとのＰＣＲ反応を、プラスミドクローンｂｄ２６６により実施し、Ｎ．カニナムＧＲＡ１プロモーターの挿入を確かめた。
【０１８７】
Ｎ．カニナムＮＣ−１タキゾイト（１×１０7 ）を、Howeなど., 1997, Methods : A Companion to Methods in Enzymology 13 : 1-11 により記載されるように、細胞混合物緩衝液において、５μｇ又は５０μｇの切断されていないｂｄ２６６又はプラスミドＧＬＳと共に１０μＦ，１．４Ｖでのエレクトロポレーションすることによりトランスフェクトした。エレクトロポレートされたＮＣ−１細胞を、β−ガラクトシダーゼアッセイのために収穫する前、３日間、Ｔ２５フラスコにおけるＭＡＲＣ−１４５サル腎細胞（８０％の集密度）の感染を可能にした。３mlの培地を除去し、そしてフラスコから細胞を集めるために残る１mlの培地を用いることによって細胞を収穫した。収穫された細胞を、マイクロ遠心分離機に移し、そして回転せしめた。上清液を捨て、そしてペレット化された細胞を、１００μｌの溶解緩衝液に再懸濁した（Howeなど., 1997 、上記）。管を、β−ガラクトシダーゼアッセイを実施するまで、−２０℃で貯蔵した。
【０１８８】
β−ガラクトシダーゼアッセイを実施するために、管を融解し、混合し、５０℃で１時間インキュベートし、そして次に、マイクロ遠心分離機により回転せしめた。５０μｌの上清液がサンプル当たり使用された。β−ガラクトシダーゼアッセイを、Howeなど., 1997 、前記により記載のようにして実施した。標準曲線を、Dr. David Sibleyにより提供されるようにして、プラスミドＧＬＳにより安定してトランスフェクトされたＮ．カニナム株を用いて調製した。タキゾイトを収穫し、計数し、１０4 寄生体／ｍｌで溶解緩衝液に再懸濁し、そして続いて、上記のようにして処理した（すなわち、５０℃で１時間インキュベートした）。この調製物から１２の連続した希釈を、ウェル当たり約２０，０００〜約１０の寄生体の範囲で行ない、そしてβ−ガラクトシダーゼアッセイにおける標準曲線を創造するために使用した。
【０１８９】
５．７．４．結果
プラスミドｂｄ２６６によりトランスフェクトされたＮ．カニナム株ＮＣ−１からの細胞溶解物を含むサンプルは、プラスミドＧＬＳによりトランスフェクトされたＮ．カニナム株ＮＣ−１からの細胞溶解物を含むサンプルと比較して、最高のβ−ガラクトシダーゼ読み取りを付与した。ｂｄ２６６（５０μｇのプラスミド）に関する標準曲線からの抽出された値を用いれば、β−ガラクトシダーゼ読み取りは、上記プラスミドＧＬＳにより安定して形質転換されたＮ．カニナム細胞系からの７０１３個の寄生体に等しかった。それらの実験は、Ｎ．カニナムＧＲＡ１プロモーターが機能的であり、そしてそのプロモーター要素がプライマーＨｉｎｄIII −ｂｄ２５６及びｂｄ２６０−ＮｓｉＩにより定義される約６００bpゲノムフラグメント内に存在する最初の証拠を提供する。
【０１９０】
６．組換えＮ．カニナムＭＩＣ１タンパク質の発現及び免疫反応性
ＭＩＣ１  ＯＲＦを表わすＤＮＡ配列を、ＰＣＲ−増幅し、そしてクローン化された配列の誘発性高レベル発現を促進する組換えシステムであるｐＱＥ５０（Ｑｉａｇｅｎ）中にクローン化した。その組換えプラスミドをｐＱＥｍｉｃ１として命名した。ｐＱＥｍｉｃ１を含む、誘発されていない及び誘発されたＥ．コリ細胞からの全細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブルータンパク質染色により試験した。約５７KDa の分子量を有するポリペプチドが、ｐＱＥｍｉｃ１を担持する、誘発されたＥ．コリ細胞においては同定されたが、しかし誘発されていないＥ．コリ細胞においては誘発されなかった。ＭＩＣ１（配列番号９）の推定されるアミノ酸配列から推定されるようなＭＩＣ１ポリペプチドの分子量は、約４９KDa である。
【０１９１】
ｐＱＥｍｉｃ１を担持する、誘発された及び誘発されていないＥ．コリの完全な細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で試験し、そしてタンパク質を標準の方法によりＰＶＦ膜（Ｎｏｖｅｘ）に移した。次に、膜を、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中、１％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を用いてブロックした。これに続いて、膜を、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）により３度すすいだ。次に、膜を、Ｎ．カニナムにより天然において感染された家畜牛からのプールされたポリクローナル抗血清を含む溶液（Dr. Jhon Ellis, University of Technology, Sydney, Australia からの贈与物）において、又はＴ．ゴンジにより実験的に感染されたウサギからのポリクローナル抗血清を含む溶液（Dr. R. A. Cole, National Wildlife Health Center, Madison, WIからの贈与物）において約１時間インキュベートした。
【０１９２】
次に、膜を、ＰＢＳＴにより３度、洗浄し、そして適切な場合、製造業者の推薦に従って１：５００に希釈された、ヤギ抗−ウシ又は抗−ウサギＩｇＧ／アルカリホスフェート接合体と反応せしめた。膜をＰＢＳＴにより再び洗浄し、そして膜をＢＣＩＰ／ＮＢＴ試薬（Kirkegaard and Perry Labs ）において短時間インキュベートし、続いてｄＨ2 Ｏによりすすぐことによってバンドを検出した。組換え的に発現されたＭＩＣ１タンパク質は、Ｎ．カニナム及びＴ．ゴンジポリクローナル抗血清に対する特異的反応性を有することが見出された。
【０１９３】
７．例：ワクチン配合物
ネオスポロシスに対するワクチンを、本発明のＮ．カニナムタンパク質、たとえばＳＡＧ１を、１００μｇ／mlで、等量の修飾されたＳＥＡＭ６２アジュバントと共に組合し、続いて軽く混合することによって配合し、そして一次及び追加予防接種のために４℃で貯蔵した。約２ml（合計１００μｇ）の一次用量を家畜の皮下に投与し、続いて、３週間後、追加接種した。追加接種の２週間後、家畜から採血する。本発明のＧＲＡ１，ＧＲＡ２，ＭＩＣ１又はＭＡＧ１タンパク質を含んで成るワクチンをまた配合し、そしてこの態様で投与した。
【０１９４】
生物学的材料の寄託
次の生物学的材料を、１９９８年３月１９日、12301 Parktawn Drive, Rockville, MD. 20852, USA でのAmerican Type Culture Collection (ＡＴＣＣ) に寄託し、そして次の受託番号を割り当てられた：
プラスミド ＡＴＣＣ受託番号
ｐＲＣ７７          ２０９６８５
ｐＲＣ５            ２０９６８６
ｐＲＣ１０２        ２０９６８７
ｐＲＣ３４０        ２０９６８８
【０１９５】
次の追加の生物学的材料が、１９９８年１１月９日、10801 University Blud. Manassas, VA, 20110, USA で、ＡＴＣＣに寄託され、そして次の受託番号が割り当てられた：
プラスミド ＡＴＣＣ受託番号
ｂｄ３０４          ２０３４１３
上記に引用されるすべての特許、特許出願、及び出版物は、それらの全体を、引用により本明細書中に組込まれる。
本発明は、本発明の個々の観点の単一の例示として意図される、記載される特定の態様により本発明の範囲を限定されない。機能的に同等の組成物及び方法は、本発明の範囲内にある。実際、本明細書に示され、そして記載されるそれらの他に、本発明の種々の修飾は、次の記載から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾は、本発明の請求の範囲内にある。
【配列表】
2005245456000001.app