(57)【要約】【課題】細胞表層に目的タンパク質が固定された酵母であって工業的環境下でも高効率で目的タンパク質を発現できるものを提供する。【解決手段】  5'末端側から、酵母SED1プロモーター、GAPDHプロモーター、PGK1プロモーター、及びADH1プロモーターからなる群より選ばれる高活性プロモーター、酵母細胞で機能する分泌シグナル配列、目的タンパク質をコードする配列、並びにGPIアンカリングタンパク質の細胞膜結合領域をコードする配列を備える染色体組み込み型の発現ベクターが、染色体DNA中に組み込まれた実用酵母。【選択図】図１
2005245335.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
5'末端から順に、酵母SED1プロモーター、GAPDHプロモーター、PGK1プロモーター、及びADH1プロモーターからなる群より選ばれる高活性プロモーター、酵母細胞で機能する分泌シグナル配列、目的タンパク質をコードする配列、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列、並びにGPIアンカー付着シグナル配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
高活性プロモーターが酵母SED1プロモーターである請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを含む染色体組み込み型の発現ベクター。
【請求項４】
請求項１若しくは２のポリヌクレオチド又は請求項３の発現ベクターが染色体DNA中に組み込まれた酵母。
【請求項５】
実用酵母である請求項４に記載の酵母。
【請求項６】
目的タンパク質が糖加水分解酵素である請求項４又は５に記載の酵母の存在下で植物性バイマス由来の多糖類を分解する工程と、生成する単糖を回収する工程とを含む単糖の製造方法。
【請求項７】
目的タンパク質がアミラーゼである請求項４又は５に記載の酵母の存在下でデンプンを分解する工程と、生成するグルコースを回収する工程とを含むグルコースの製造方法。
【請求項８】
アミラーゼがグルコアミラーゼである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
目的タンパク質がアラビノフラノシダーゼである請求項４又は５に記載の酵母、並びにキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下でキシランを分解する工程と、生成するキシラン分解物を回収する工程とを含むキシラン分解物の製造方法。
【請求項１０】
目的タンパク質がアラビノフラノシダーゼである請求項４又は５に記載の酵母の存在下でキシランを分解する工程(a)と、工程(a)により得られたキシラン部分分解物をキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下で分解する工程(b)と、生成するキシラン分解物を回収する工程とを含むキシラン分解物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞表層に有用タンパク質を保持する酵母、このような酵母を作製するための発現ベクター、並びに、この酵母を用いたグルコース、キシラン分解物のような植物バイオマス由来の多糖類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子組み換えされた大腸菌、酵母のような微生物を用いた有用タンパク質の生産が工業的に行われている。微生物を利用したタンパク質生産方法としては、目的タンパク質を組換え体の菌体内に蓄積させる方法、及び、菌体外に分泌させる方法の２方法が一般的である。
【０００３】
目的タンパク質が酵素である場合は、組み換え体から抽出された酵素を基質に作用させることにより目的物質を生産したり、酵素を生産する組み換え体を基質に作用させたりすることにより目的物質を生産することが行われる。単離、精製した酵素を用いる方法は、抽出操作が煩雑で、酵素回収率が低いため、コスト高になり工業利用には適さない。一方、酵素を生産する組み換え体を用いて基質から目的物質を生産する方法には、以下のような難点がある。
【０００４】
菌体内に目的タンパク質である酵素を蓄積する組み換え体を用いると、基質の細胞膜透過が酵素反応の律速となる。即ち、菌体内で酵素反応が行われるためには、基質が細胞膜を透過して細胞内に入ることが必要であるため、細胞膜を透過しないような高分子の基質を反応に用いることができない、又は反応速度が遅くなる。また、生産するタンパク質の種類によっては宿主の生育を阻害することがあり、この方法の適用には一定の制限がある。
【０００５】
一方、目的タンパク質を菌体外に分泌する組み換え体を用いる場合は、一般に、反応系中の酵素濃度が低くなり、試験管レベルでは十分量の生成物が得られても、工業規模のスケールでは実用上十分な量の生成物を得ることができない傾向にある。また、反応系に存在するプロテアーゼのようなタンパク質分解酵素の作用により酵素が分解される場合がある。
【０００６】
上記難点を解消する方法として、酵母の細胞表層に酵素などの目的タンパク質を提示させる「酵母細胞表層提示工学」が注目されている。これは、目的タンパク質をGPIアンカリングタンパク質のような細胞表面への固定が可能なタンパク質との融合蛋白質として発現させることにより、酵母の細胞表面上に目的タンパク質を高密度に提示する手法である。
【０００７】
この細胞表層提示酵母は、以下のような利点を有するために、酵素を生産する菌体を用いた物質生産に適している。
【０００８】
第１に、この酵母は、目的タンパク質である酵素が細胞表面に存在するため、基質の細胞膜透過が問題にならず、また酵素により細胞が損傷を受け難い。
【０００９】
第２に、この酵母は、酵素を高密度に菌体に固定化することができるため、反応槽内に菌体を高密度で充填又は懸濁することにより、反応系内の酵素濃度を高くすることができ、その結果スケールアップが比較的容易である。また、酵素が菌体外に固定されているため菌体内に存在するタンパク質分解酵素の作用を受け難い。また、酵素が細胞表面に高密度で存在する等の理由により、菌体外に存在するタンパク質分解酵素の作用も受け難くなることが期待される。
【００１０】
第３に、この酵母を増殖させることにより大量の目的酵素を容易に取得することができ、さらに遠心分離により極めて簡単に菌体ごと酵素を回収及び濃縮できる。
【００１１】
このような「酵母細胞表層提示工学」は新しい研究分野であり、現在実験室レベルで種々の検討がなされている状況である。現在は、研究段階として、一般的な遺伝子操作素材である自律増殖型ベクター、解糖系酵素のプロモーター及び実験室酵母が使用されている。詳述すれば、解糖系プロモーターの下流に目的タンパク質をコードする配列及びGPIアンカリングタンパク質のような細胞表層局在蛋白質の一部をコードする配列を連結した自立複製ベクターを用いて、実験室酵母の形質転換を行うことにより、この酵母の細胞表層に目的タンパク質を固定させている。
【００１２】
しかし、これらの素材を用いた酵母細胞表層提示システムは、工業的な物質生産を行う上で以下のような難点がある。
【００１３】
自律増殖型ベクターとしては、通常、１細胞内に複数個存在することができるマルチコピー型自律複製プラスミドベクターを使用している。自律増殖型プラスミドベクターは、細胞増殖の進行と共にプラスミドが脱落するため、実験室では、選択マーカーに対応する物質を含む培地を用いて選択圧をかけることによりプラスミドの脱落を防いでいる。しかし、工業的生産において選択圧を持続的にかけながら酵母を培養することは、手間がかかり、またコスト高になるため、現実的ではない。
【００１４】
また、実験室酵母は主として研究目的で育種された株であり、一般的に多くの栄養要求性が付与されている。このため、要求される多種類の栄養分を含む培地を用い、十分に酸素を供給しつつ、30℃程度の一定温度下で、培地ｐHを７程度に保ちつつ培養する場合は、十分な増殖速度が得られるが、これらの条件を満たさない工業環境では実用上十分な増殖速度が得られない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、細胞表層に目的タンパク質が固定された酵母であって工業的環境下でも高効率で目的タンパク質を生産できるもの、この酵母の作製のためのポリヌクレオチド及び発現ベクター、並びにこの酵母を用いて効率的に目的物質を製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を得た。
(1) 5'末端側から、特定の高活性プロモーターと、これにより発現できるように連結された、酵母細胞で機能する分泌シグナル配列、目的タンパク質をコードする配列、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列、及びGPIアンカー付着シグナル配列を備えるユニットとを含む発現ベクター又はポリヌクレオチドが、染色体DNA中に組み込まれた酵母は、特定の高活性プロモーターを使用しているため、ストレス環境下でも安定的に目的タンパク質を高発現できる。また、目的タンパク質をコードする配列が染色体中に組み込まれているため、選択圧をかけなくても安定的に目的タンパク質を高効率で生産できる。
(2)  また、上記の発現ベクターが染色体DNA中に組み込まれた酵母が実用酵母である場合は、ストレス環境下での増殖が容易に行われるようになる。また、実用酵母はエタノールに高耐性を示すため、単糖の生産の後、反応系ごとそのままエタノール発酵に供することができる。
【００１７】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下のポリヌクレオチド、発現ベクター、酵母、並びに、この酵母を用いたグルコースの生産方法及びキシラン分解物の製造方法を提供する。
【００１８】
項１．  5'末端から順に、酵母SED1プロモーター、GAPDHプロモーター、PGK1プロモーター、及びADH1プロモーターからなる群より選ばれる高活性プロモーター、酵母細胞で機能する分泌シグナル配列、目的タンパク質をコードする配列、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列、並びにGPIアンカー付着シグナル配列を含むポリヌクレオチド。
【００１９】
項２．  高活性プロモーターが酵母SED1プロモーターである項１に記載のポリヌクレオチド。
【００２０】
項３．  項１又は２に記載のポリヌクレオチドを含む染色体組み込み型の発現ベクター。
【００２１】
項４．  項１若しくは２のポリヌクレオチド又は項３の発現ベクターが染色体DNA中に組み込まれた酵母。
【００２２】
項５．  実用酵母である項４に記載の酵母。
【００２３】
項６．  目的タンパク質が糖加水分解酵素である項４又は５に記載の酵母の存在下で植物性バイマス由来の多糖類を分解する工程と、生成する単糖を回収する工程とを含む単糖の製造方法。
【００２４】
項７．  目的タンパク質がアミラーゼである項４又は５に記載の酵母の存在下でデンプンを分解する工程と、生成するグルコースを回収する工程とを含むグルコースの製造方法。
【００２５】
項８．  アミラーゼがグルコアミラーゼである項７に記載の方法。
【００２６】
項９．  目的タンパク質がアラビノフラノシダーゼである項４又は５に記載の酵母、並びにキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下でキシランを分解する工程と、生成するキシラン分解物を回収する工程とを含むキシラン分解物の製造方法。
【００２７】
項１０．  目的タンパク質がアラビノフラノシダーゼである項４又は５に記載の酵母の存在下でキシランを分解する工程(a)と、工程(a)により得られたキシラン部分分解物をキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下で分解する工程(b)と、生成するキシラン分解物を回収する工程とを含むキシラン分解物の製造方法。
【発明の効果】
【００２８】
本発明のポリヌクレオチド及び発現ベクターは、特定の高活性プロモーターを用いているため、工業スケールの培養条件下でも、目的タンパク質を安定的に高発現させることができる。
【００２９】
また、本発明の発現ベクターは宿主染色体組み込み型のベクターであることから、選択圧をかけなくても発現ユニットが脱落し難い。このため、コストの点で選択圧をかけ難い工業スケールでの培養においても、目的タンパク質を高発現させることができる。本発明のポリヌクレオチドを宿主染色体中に直接組み込む場合も同様の効果が得られる。
【００３０】
さらに、本発明の発現ベクター又はポリヌクレオチドを実用酵母に導入することにより、過酷な培養条件になる場合もある工業規模での培養においても、高い増殖速度が得られる。また実用酵母は多倍体であるため、相同染色体に本発明の発現ベクターを複数組み込むことが可能であり、その結果一倍体であることが多い実験室酵母に組み込む場合に較べて、目的タンパク質の発現量が高くなる。さらに、実用酵母はエタノールに極めて高い耐性を有するため、単糖を生産した後、そのままエタノール発酵に供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、5'末端側から、酵母SED1プロモーター、GAPDHプロモーター、PGK1プロモーター、ADH1プロモーターからなる群より選ばれる１種の高活性プロモーター、酵母細胞で機能する分泌シグナル配列、目的タンパク質をコードする配列、細胞表層局在タンパク質の一部、及びGPIアンカー付着シグナル配列を含むポリヌクレオチド（即ち、発現ユニット）である。
【００３２】
分泌シグナル配列、目的タンパク質をコードする配列、細胞表層局在タンパク質の一部、及びGPIアンカー付着シグナル配列を備える断片は、高活性プロモーターにより発現可能な位置に連結されている。
【００３３】
また、このポリヌクレオチドは、染色体組み込み型の発現ベクター中に挿入されているものであってもよい。染色体組み込み型の発現ベクター中に挿入された、この発現ユニットの構成を図１に示す。
高活性プロモーター
本発明においては、特定の高活性プロモーターを使用する。特定の高活性プロモーターは、酵母SED1プロモーター(特開2003-265177号)、GAPDHプロモーター（特公平07-24594）、PGK1プロモーター（EMBO J.(1982),1,603- Tuite,M.F. et al）、及びADH1プロモーター（Nature(1981),293,717- Hitzeman,R.A.et al）からなる群より選ばれるプロモーターである。これらのプロモーターは、酵母細胞において高いプロモーター活性を示す。
【００３４】
中でも、本発明者らは、酵母の細胞壁タンパク質をコードするSED1遺伝子のプロモーターであるSED1プロモーターが非常に強いプロモーター活性を示すことを証明した(特開2003-265177号)。
【００３５】
酵母SED1プロモーターは、通常の培養条件で高い転写活性を示すだけでなく、高温、高浸透圧又は低浸透圧、貧栄養状態、アルコールの存在などの各種ストレス環境下においても安定した高いプロモーター活性を示す。また、pHの変動による影響も受け難い。
【００３６】
工業スケールで培養する場合は、様々な成分が溶け込んだ反応系、即ち高浸透圧環境となる場合が多い。また、実験室で培養する場合と較べて、温度やpHを厳密に制御することが難しく、またコスト等の面で栄養リッチな培養液を使用し難い。このように、工業スケールでの培養環境は酵母にとってストレス環境であるため、上記特定の高活性プロモーターを含むポリヌクレオチド又は発現ベクターは、組み換え酵母を用いた工業的な物質生産に好適に使用できるものとなる。
【００３７】
上記の特定の高活性プロモーターは、高いプロモーター活性を示していれば、その全領域であってもよく、その一部の領域であってもよい。
分泌シグナル配列
本発明のポリヌクレオチドに含まれる分泌シグナル配列は、分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。
【００３８】
分泌シグナルペプチドは、ペリプラズムを含む細胞外に分泌される分泌性タンパク質のＮ-末端に通常結合しているペプチドである。このペプチドは、生物間で類似した構造を有しており、20個程度のアミノ酸からなり、N末端付近に塩基性アミノ酸配列を有し、その後に疎水性アミノ酸を多く含んでいる。分泌シグナルは、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際にシグナルペプチダーゼにより分解されることにより除去される。
【００３９】
本発明においては、アラビノフラノシダーゼを酵母の細胞外に分泌させることができる分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であれば、どのようなものでも用いることができ、その起源は問わない。例えば、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）等のグルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド配列、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）のグルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド配列、酵母（Saccharomyces serevisiae）のα−またはａ−アグルチニンの分泌シグナルペプチド配列、酵母（Saccharomyces serevisiae）由来のα因子の分泌シグナルペプチド配列等を好適に用いることができる。特に、分泌効率の点で、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド配列が好ましい。また、アスペルギルス・オリゼ由来グルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド配列も好ましいものとして挙げられる。
目的タンパク質をコードする配列
目的タンパク質の種類は特に限定されない。本発明の目的は主にエタノール発酵の基質となる単糖の生産であることから、目的タンパク質としては糖分解酵素を好適に挙げることができる。糖分解酵素としては、エキソ-1,4-α-D-グルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）、β−アミラーゼ、エキソイソマルトトリオヒドロラーゼ、エキソマルトテトラオヒドロラーゼ、エキソマルトヘキソオヒドロラーゼ、α−グルコシダーゼのようなエキソ型のアミラーゼ（デンプン加水分解酵素）；α−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼのようなエンド型のアミラーゼ（デンプン加水分解酵素）；エンド-1,4-β-グルカナーゼ（セルラーゼ）のようなセルロース分解酵素；アラビノフラノシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼのようなキシラン分解酵素などを例示できる。
【００４０】
中でも、高い分解活性を示すことから、アミラーゼを好ましく使用できる。アミラーゼの中では、α1→4グルコシド結合のみならずα1→6グルコシド結合も分解できるためにデンプンを完全又はほぼ完全にグルコースまで分解できる点で、グルコアミラーゼがより好ましい。
【００４１】
これらの酵素は、細菌、真菌、植物及び動物などのいずれの生物に由来するものであってもよい。これらの酵素をコードするポリヌクレオチドは当業者であれば、容易に入手できるが、アスペルギルス・オリゼのグルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを例に挙げれば、例えば特開平10-84968に記載された塩基配列に基づき設計されたプライマーを使用したPCRなどにより簡単に入手できる。
【００４２】
目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、その全長をコードする配列であってもよく、目的タンパク質の活性を示すものであれば目的タンパク質の一部領域をコードする配列であってもよい。また、目的タンパク質の活性を示す限り、天然型タンパク質をコードする配列において、１又は２以上のヌクレオチドが欠失、付加又は置換された配列であってもよい。
細胞表層局在タンパク質
＜細胞表層局在タンパク質＞
本発明方法では、細胞表層に固定化され又は付着ないしは接着して、そこに局在するタンパク質であればよく、公知のものを制限なく使用できる。
【００４３】
細胞膜に局在するタンパク質としては、膜貫通タンパク質や細胞表層局在タンパク質が挙げられる。膜貫通タンパク質は、疎水性アミノ酸領域部分で脂質二重膜を貫通しているタンパク質であり、受容体タンパク質に多く見られる。一方、細胞表層局在タンパク質としては、脂質で修飾されたタンパク質が知られており、この脂質が膜成分と共有結合することにより細胞膜に固定される。その他に、固定化の機構が明らかにされていない細胞表層局在タンパク質もあり、本発明方法ではそれらも使用できる。細胞表層局在タンパク質としては、後述する各種GPIアンカリングタンパク質やBGL2などが知られている。BGL2は、酵母のβ−グルカナーゼで細胞壁に強く結合することは分かっているが、その機構は不明のタンパク質である。また、BGL2は、GPIアンカリングタンパク質に共通するモチーフは有さない。
＜GPIアンカリングタンパク質＞
細胞表層局在タンパク質の代表例として、GPI（glycosylphosphatidylinositol：エタノールアミンリン酸-6マンノースα1-2マンノースα1-6マンノースα1-4グルコサミンα1-6イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質)アンカリングタンパク質を挙げることができる。GPIアンカリングタンパク質は、そのC末端に糖脂質であるGPIを有しており、このGPIが細胞膜中のPI（phosphatidylinositol)と共有結合することによって細胞膜表面に結合する。
【００４４】
GPIアンカリングタンパク質のC末端へのGPIの結合は以下のようにして行われる。即ち、GPIアンカリングタンパク質は、転写及び翻訳の後、N末端側に存在する分泌シグナルの作用により小胞体内腔に分泌される。GPIアンカリングタンパク質のC末端又はその近傍の領域には、GPIアンカーがGPIアンカリングタンパク質と結合する際に認識されるGPIアンカー付着シグナルと呼ばれる領域が存在する。小胞体内腔及びゴルジ体において、このGPIアンカー付着シグナル領域が切断され、新たに生じるC末端にGPIが結合する。
【００４５】
GPIが結合したタンパク質は、分泌小胞により細胞膜まで運ばれ、GPIが細胞膜のPIに共有結合することにより、細胞膜に固定される。さらに、ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼC(PI-PLC)によりGPIアンカーが切断され、細胞壁に組み込まれることにより細胞壁に固定された状態で、細胞表面に提示される。
【００４６】
GPIアンカリングタンパク質のプロセッシング及び細胞内輸送の様子を図２に示す。
＜本発明の細胞表層局在タンパク質の１例としてのGPIアンカリングタンパク質＞
このように、GPIアンカリングタンパク質は、本発明にいう細胞表層局在タンパク質の１種であって、しかもGPIアンカー付着シグナルを有するものである。本発明においては、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列及びGPIアンカー付着シグナル配列からなる配列として、GPIアンカー付着シグナル領域を含むGPIアンカリングタンパク質の細胞膜結合領域をコードするポリヌクレオチドを好適に用いることができる。
【００４７】
GPIアンカリングタンパク質の細胞膜結合領域は、GPIアンカー付着シグナル領域を含む、通常C末端の領域である。この細胞膜結合領域は、GPIアンカー付着シグナル領域を含んでいればよく、アラビノフラノシダーゼ活性を阻害しない限り、その他GPIアンカリングタンパク質のどのような部分を含んでいてもよい。
【００４８】
GPIアンカリングタンパク質は、酵母細胞で機能するタンパク質であればよく、公知のGPIアンカリングタンパク質を制限なく使用できる。公知のGPIアンカリングタンパク質としては、例えば、酵母の性凝集タンパク質であるα−又はa−アグルチニン、Flo1タンパク質、大腸菌の外膜タンパク質OmpA（Georgiou,G.et.al.Trends Biotechnol.,11,6-10,1993) 、大腸菌マルトーストランスポーターLamB、大腸菌鞭毛タンパク質flagellin、枯草菌細胞壁溶解酵素CwlB等が挙げられる。
【００４９】
特に、酵母のα−アグルチニンを好適に使用できる。α−アグルチニンのC末端側から320ないしは600個のアミノ酸からなる領域（即ち、C末端から320個のアミノ酸からなる領域、C末端から321個のアミノ酸からなる領域、……C末端から599個のアミノ酸からなる領域、又はC末端から600個のアミノ酸からなる領域）を用いることが好ましく、C末端側から320個のアミノ酸からなる領域をコードするポリヌクレオチド配列を用いることがより好ましい。α−アグルチニンのC末端側から320個のアミノ酸からなる配列には、４カ所の糖鎖結合部位が存在する。GPIアンカーがPI-PLCにより切断された後、この糖鎖と細胞壁を構成する多糖類とが共有結合することにより、α−アグルチニンの細胞壁への固定を増強する。
【００５０】
α−アグルチニンのようなGPIアンカリングタンパク質の細胞膜結合領域をコードする配列は、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列とGPIアンカー付着シグナル配列との双方を本来的に含んでいるが、本発明においては、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列とGPIアンカー付着シグナル配列とが、別々の起源から調製されたものであってもよい。
発現ベクター
前述したように、本発明のポリヌクレオチドは染色体組み込み型の発現ベクターに組み込まれていてもよい。発現ベクターは、酵母に導入された場合にその染色体DNAに組み込まれる発現ベクターである。発現ベクターは、酵母の自律複製配列を含んでいないものであれば、通常、酵母の染色体DNA組込み型のものとなる。
【００５１】
この発現ベクターは、高活性プロモーターとこれに発現可能に連結されたポリヌクレオチド断片とを含み、このポリヌクレオチド断片は、上記分泌シグナル配列、目的タンパク質コード配列、細胞表層局在タンパク質の一部、及びGPIアンカー付着シグナル配列を備える。
【００５２】
分泌シグナル配列と目的タンパク質コード配列との間には、分泌シグナルペプチドによる融合タンパク質の分泌を阻害しない程度であれば、任意のオリゴヌクレオチド配列が挿入されていてもよい。一般に30b程度までの挿入配列が許容される。また、目的タンパク質コード配列とGPIアンカリングタンパク質の細胞膜結合領域をコードする配列との間には、一般に30b程度までであれば、任意のオリゴヌクレオチド配列が挿入されていてもよい。さらに、高活性プロモーターと、分泌シグナル配列、目的タンパク質コード配列、細胞表層局在タンパク質の一部、及びGPIアンカー付着シグナル配列を備えるポリヌクレオチド断片との間にも、プロモーターによるこのユニットの発現を阻害しない範囲で任意のヌクレオチド配列が挿入されていてもよい。
【００５３】
発現ベクターは、プラスミドベクターであってもよく、あるいは人工染色体であってもよい。ベクターの調製が容易であり、また酵母細胞の形質転換が容易である点で、プラスミドベクターであることが好ましい。
【００５４】
また発現ベクターの構築を大腸菌を用いて簡単に行うことができるように、発現ベクターは大腸菌の複製開始点(ColE1)を有していることが望ましい。また、通常、酵母選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、URA3、TRP、LEU2等）及び大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子等）を備えていればよい。また目的遺伝子の発現を調節するために、SED1プロモーターの他に、オペレーター、エンハンサー、ターミネーター等も含んでいればよい。ターミネーターとしては、ADH1（アルデヒドデヒドロゲナーゼ）ターミネーター、GAPDH（グリセルアルデヒド3'-リン酸デヒドロゲナーゼ）ターミネーター等が挙げられる。
【００５５】
SED1プロモーターを備える発現ベクターであって、酵母染色体DNAに組み込まれるものとしては、pRS406にSED1プロモーターと分泌シグナル配列、目的タンパク質の構造遺伝子配列及びα-アグルチニンのＣ末端から３２０個のアミノ酸からなる領域をコードする配列からなるポリヌクレオチド断片を挿入して構築したpRS406  Psed1−CAS1（本明細書の実施例参照）等が挙げられる。
【００５６】
また、GAPDHプロモーターを備える発現ベクターであって、酵母染色体DNAに組み込まれるものとしては、pICAS1（京都大学大学院農学研究科の植田充美教授より分譲）等が挙げられる。PGK1プロモーター又はADH1プロモーターを含む発現ベクターは、これらのプロモーターをPCRにより増幅してプラスミドpRS406に連結することにより作製できる。
【００５７】
(II)酵母
本発明の酵母は、本発明のポリヌクレオチド又は発現ベクターを保持する酵母であり、好ましくはこのポリヌクレオチド又は発現ベクターが染色体DNA中に組み込まれている。
【００５８】
本発明の酵母は、本発明のポリヌクレオチド又は発現ベクターを宿主となる酵母に導入することにより得られる。導入方法は特に限定されず、公知の方法を採用できる。代表的には、上記説明した本発明の発現ベクターを用いて酵母を形質転換する方法が挙げられる。形質転換方法は、特に限定されず、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法、酢酸リチウム法、プロトプラスト法などのトランスフェクション法やマイクロインジェクション法のような公知の方法を制限なく使用できる。
【００５９】
本発明のポリヌクレオチドが導入された酵母は、常法に従い、例えばURA3のような選択マーカーによる形質又は目的タンパク質の活性等を指標として選択することができる。発現ベクター由来の発現ユニットが複数導入された形質転換体は、目的タンパク質の活性を指標にしてその活性が高いものを選択することにより容易に得ることができる。また、選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子を使用する場合は、段階的又は漸次的に変化させた薬剤濃度で選択することにより、発現ベクターが複数導入された形質転換体を容易に選択できる。例えば、選択マーカーとしてKanMX4を用いる場合は、ジェネティシン濃度に勾配又は段階を設けた培地を用いることにより、より高コピー数の発現ベクターが導入された形質転換体を選択することができる。
【００６０】
得られた酵母の細胞表層に目的タンパク質が固定されていることは、常法により確認できる。例えば、被験酵母に、このタンパク質に対する抗体と、FITCのような蛍光標識２次抗体またはアルカリフォスファターゼのような酵素標識２次抗体等とを作用させる方法、このタンパク質に対する抗体とビオチン標識２次抗体とを反応させた後さらに蛍光標識ストレプトアビジンを作用させる方法などが挙げられる。
＜宿主＞
宿主として用いる酵母は、子のう菌酵母（Ascomycetou yeast）に属するものであればよく、特に限定されない。その中でもSaccharomycetaceaeに属するものが好ましく、Saccharomyces属であるものがより好ましい。
【００６１】
中でも、各種培養ストレスに強いことから、厳密な制御が難しい工業生産においても安定した細胞増殖を示す点で、実用酵母が好ましい。実用酵母としては清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母、パン酵母など、発酵食品に深く関与する酵母が挙げられる。実用酵母の中でも、高い発酵能と高いエタノール耐性を有し、遺伝学的にも安定した清酒酵母が好ましい。
【００６２】
一般に、微生物にとってエタノールは有毒である。エタノール発酵する酵母も例外ではなく、エタノール濃度が8％(v/v)を超えると自身が生産したエタノールにより徐々に死滅してしまう。ここで、清酒酵母はエタノール濃度が20%にも達する清酒モロミで長年選抜及び育種されてきた株であり、一般的な酵母に比べ極めて高いエタノール耐性を持っている。
【００６３】
本発明においては、酵母を用いてキシランの分解により、キシロースやアラビノースを製造するが、これらの５炭糖はエタノール発酵原料に供される。エタノール発酵では、系のエタノール濃度を究極まで高めることが重要であることから、そこに用いられる酵母にはエタノール耐性能が高いことが求められる。
【００６４】
清酒酵母としては、日本醸造協会頒布の「きょうかい酵母」およびこれらを親株とした突然変異株などが挙げられる。また他にも、清酒醸造で使用されている酵母であればいずれも有用である。形質転換マーカーとして栄養要求性遺伝子を用いる場合は、これら清酒酵母に突然変異などの手法を用いて栄養要求性を付与した株を用いればよく、そのような栄養要求性としてはウラシル要求性、トリプトファン要求性、ロイシン要求性、ヒスチジン要求性、アデニン要求性などが挙げられる。清酒酵母にウラシル要求性を付与した例としては「きょうかい９号酵母」を宿主として突然変異法により取得したSaccharomyces cerevisiae  GRI−117-Uが挙げられる。
（III）グルコースの製造方法
本発明のグルコースの製造方法は、デンプンを本発明の酵母の存在下で分解する工程と、生成するグルコースを回収する工程とを含む方法である。酵母としては、目的タンパク質としてのアミラーゼをコードするポリヌクレオチドが染色体DNA中に組み込まれたものを使用する。アミラーゼはデンプン加水分解酵素を指す。酵母は１種を単独で使用することができ、また互いに異なる種類のアミラーゼを産生している異種酵母を組み合わせて用いることもできる。また、複数種のアミラーゼをコードするポリヌクレオチドが染色体DNA中に組み込まれることにより複数種のアミラーゼを産生するようになった酵母を用いることもできる。
【００６５】
アミラーゼとしてグルコアミラーゼを用いる場合は、アミラーゼを産生する１種の酵母を用いることにより、デンプンをグルコースに分解できる。また例えば、α1→4グルコシド結合を分解するエンド型のα−アミラーゼを産生する酵母と、α1→6グルコシド結合を分解するエンド型のプルラナーゼ又はイソアミラーゼを産生する酵母とを組み合わせて使用することによっても、デンプンからグルコースを生成することができる。さらに、まずα―アミラーゼを産生する酵母を用いてデンプンを液化し、次いでグルコアミラーゼを産生する酵母とプルラナーゼを産生する酵母とを用いてグルコースを生成させることもできる。
デンプン
原料デンプンとしては入手が容易な植物由来のデンプンを好適に用いることができる。例えば米、麦、トウモロコシ、粟、稗のような穀類；芋等から、搗精、浸漬、遠心分離などの常法でデンプンを抽出すればよい。デンプンの原料としては、安価な原料である点でトウモロコシが好ましい。蒸煮したデンプンを分解反応に供することにより、アミラーゼによる加水分解効率が向上する。
酵母
反応液中の酵母密度は、酵母１細胞当たりに固定されているアミラーゼの数及び活性により異なるが、反応液中のアミラーゼ活性が0.1〜200U/ml程度となる密度とすることが好ましく、0.5〜100U/ml程度となる密度とすることがより好ましい。
【００６６】
酵母は、そのまま反応液中に含まれていてもよく、又は、固定化されていてもよいが、連続反応、回分式反応又は半回分式反応により連続使用できる点で、固定化されていることが好ましい。「固定化」とは、酵母が遊離の状態ではない状態を意味し、例えば、酵母が担体に結合、付着又は担体内部に取り込まれた状態を指す。固定化方法は特に限定されず、公知の微生物固定化方法を採用できる。このような公知の固定化方法としては、細孔を有する担体に酵母を保持させる方法、格子やマイクロカプセルにより酵母を包括する方法などが挙げられる。
【００６７】
担体としては、反応液中の水又は溶媒に対して不溶性の物質からなるものを用いる。具体的には、例えば、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルフォルマール、セルロース等の樹脂からなる多孔質体を好適に使用できる。また、ポリウレタンフォーム、ポリスチレンフォーム、シリコンフォームのような発泡体も多孔質体として使用できる。担体内で良好に酵母を増殖させることができ、さらに活性が低下した酵母や死滅した酵母を脱離させずに長期間保持することができる点で、多孔質の担体が望ましい。
【００６８】
多孔質体の細孔（開口部）の直径は、酵母の種類によっても異なるが、通常50〜1000μm程度が好ましく、50〜100μm程度がより好ましい。上記開口部直径の範囲であれば、酵母の侵入及び増殖が容易であるとともに、高密度で酵母を保持することができる。
【００６９】
また担体の外形は、特に限定されず、球状、立方体状又は不定形などの粒状；網目状、シート状などのいずれの形状であってもよい。調製が容易である点で、粒状であることが好ましい。粒子の大きさは、例えば球状の場合直径が２〜５０ｍｍ程度、立方体状の場合２〜５０ｍｍ角程度とすればよい。
【００７０】
包括による酵母の固定化方法としては、ポリアクリルアミド、アルギン酸カルシウム、κ−カラギーナン、合成プレポリマー（光架橋性樹脂プレポリマー、ウレタンプレポリマー等）などを用いて格子状に酵母を包括する方法；相分離法、界面重合法、水中乾燥法などの手法で高分子半透膜からなるマイクロカプセルで酵母を覆うことによりこれを包括する方法が挙げられる。また、酵母を互いに架橋する方法も挙げられる。
反応
デンプンの分解反応は、反応容器内の反応液中に遊離の酵母又は固定化された酵母を懸濁した状態で行うことができる。また、カラムのような反応容器内に遊離又は固定化された酵母を充填したバイオリアクターを用いて行うこともできる。また、反応は連続式、回分式（バッチ式）又は半回分式のいずれの方式で行ってもよい。
【００７１】
反応液中には、基質となるデンプンのみ含まれていてもよく、又はこれに加えてpH調整のための緩衝剤や酵母の生存に必要な公知の物質が含まれていてもよい。
【００７２】
反応液中の基質の濃度は、通常５〜80重量％程度とすることが好ましく、10〜30重量％程度とすることがより好ましい。基質濃度が余りに低いとグルコース製造効率が悪く、逆に余りに高いと、反応液の粘度が上がり、攪拌や温度制御等が難しくなったり、反応液の浸透圧が上がり、酵母に多大なストレスがかかったりする状態になる場合がある。極度のストレスは細胞増殖の悪化又は細胞の死滅(破壊)の引き金となり、その結果、理想的な反応効率が得られなくなる。しかし、上記の範囲であれば、このような問題は生じない。
【００７３】
反応液のpHは、使用するアミラーゼの至適pHを考慮して定めればよいが、概ねpH４〜８程度が好ましい。反応の進行とともに反応液のpHが低下するため、上記pH範囲になるように調整することが望ましい。
【００７４】
反応温度は、酵母が保持するアミラーゼが活性を示す温度であればよく、通常２０〜６０℃程度が好ましい。耐熱性酵素を用いる場合は、さらに高温で行うことができる。この場合、酵母が生育できなくても、表層のアミラーゼは活性を有したまま固定されているため、分解反応には支障がない。
【００７５】
反応液中の各成分濃度を、例えば、ガスクロマトグラフィーやHPLCなどを用いて経時的にモニターすることにより、デンプンの追加量、反応時間、pH調整剤の添加量などを決定すればよい。
グルコースの回収
上記の反応により反応液中にグルコースが生成するため、反応終了後の反応液から限外ろ過及び濃縮などによりグルコースを回収することができる。得られるグルコースは、そのまま、エタノール発酵の基質として用いることができる。
（ＩＶ）第１のキシラン分解物の製造方法
本発明の第１のキシラン分解物の製造方法は、キシランを、本発明の酵母と、キシロシダーゼ又はさらにキシラナーゼとの存在下で分解する工程と、キシラン分解物を回収する工程とを含む方法である。酵母としては、目的タンパク質としてアラビノフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチドが染色体DNA中に組み込まれたものを使用する。
キシラン
例えばスギ、ブナ、竹のような木材；雑草；籾殻、ふすまのような種子殻；稲藁；とうもろこしかす、サトウキビの絞りかす（バガス）のような植物かす；大豆ミールのような穀類等の植物性バイオマスから、爆砕、溶媒抽出、水蒸気蒸留、超臨海炭酸ガス抽出、加圧熱水抽出などの方法で、キシランおよびアラビノキシランを主成分とするヘミセルロースを抽出することができる。
【００７６】
本発明方法では、キシランをヘミセルロースそのままの形で分解に供することもでき、又はヘミセルロースから分離されたキシランを分解に供することもできる。
酵母
使用する酵母は、上記説明した本発明の酵母である。反応液中の酵母密度は、酵母１細胞当たりに固定されているアラビノフラノシダーゼ活性によっても異なるが、反応液中のアラビノフラノシダーゼ活性が0.001〜10U/ml程度となる密度が好ましく、0.005〜5U/ml程度となる密度がより好ましい。その他の酵母に関する条件はデンプンの製造方法について説明した通りである。
キシラナーゼ・キシロシダーゼ
キシランの主鎖のキシロース間のβ-1,4結合を分解するために、反応液中にキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼを添加する。キシラナーゼ及びキシロシダーゼは、いずれもキシラン主鎖のβ-1,4結合を切断する活性を有する。この中で、キシラナーゼは、エンド型酵素であり、キシラン主鎖の部位に関係なく切断する活性を有する。一方、キシロシダーゼは、エキソ型酵素であり、キシラン主鎖の末端から順番にキシロースを一つずつ切断する。従って、キシラナーゼ単独ではキシランからキシロースを製造することはできない。また、キシロシダーゼはキシラン末端から分解するという性質上、反応速度が遅くなる。本発明方法では、キシラナーゼとキシロシダーゼとを組み合わせて使用することが好ましい。
【００７７】
これらの酵素は、どのような生物に由来するものであってもよい。例えば、バクテリアやカビ等の起源のものを使用できる。中でも、酵素の大量調製が容易である等の点でカビ(Aspergillus属)起源のものを使用することが好ましい。
【００７８】
キシラナーゼの使用量及びキシロシダーゼの使用量は、それぞれ反応液中の活性が、通常0.001 〜200U/ml程度、好ましくは0.01 〜200U/ml程度となるようにすればよい。これらの酵素活性は実施例に記載の方法により測定された値である
反応
アラビノフラノシダーゼ並びにキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼによるキシランの分解反応は、反応容器内の反応液中に遊離の酵母又は固定化された酵母を懸濁した状態で行うことができる。また、カラムのような反応容器内に遊離又は固定化された酵母を充填したバイオリアクターを用いて行うこともできる。また、反応は連続式、回分式（バッチ式）又は半回分式のいずれの方式で行ってもよい。
【００７９】
反応液中には、基質のみ含まれていてもよく、又はこれに加えてpH調製のための緩衝剤や酵母の生存に必要な公知の物質が含まれていてもよい。
【００８０】
反応液中の基質（キシラン）の濃度は、通常1〜50重量％程度とすることが好ましく、1〜30重量％程度とすることがより好ましい。基質濃度が余りに低いと、実用的なキシロース製造効率が得られない。逆に、基質濃度が余りに高いと、反応液の粘度が上がり、攪拌や温度制御等が難しくなったり、反応液の浸透圧が上がり、酵母に多大なストレスがかかったりする状態になる場合がある。極度のストレスは細胞増殖の悪化や細胞の死滅(破壊)の引き金となり、その結果、理想的な反応効率が得られなくなる。しかし、上記範囲であれば、このような問題は生じない。
【００８１】
反応液のpHは、アラビノフラノシダーゼ並びにキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの至適pHを含む４〜８程度が好ましい。反応の進行とともに反応液のpHが低下するため、上記pH範囲になるように調整することが望ましい。
【００８２】
反応温度は、酵母が保持するアラビノフラノシダーゼ並びにキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼが活性を示す温度であればよく、通常２０〜６０℃程度が好ましい。耐熱性酵素を用いる場合は、さらに高温で行うことができる。この場合、酵母が生育できなくても、表層のアラビノフラノシダーゼは活性を有したまま固定されているため、分解反応には支障がない。
【００８３】
反応液中にキシランの他にセルロースなどが混在する場合には、セルラーゼ等の各種糖加水分解酵素を併用してもよい。
【００８４】
反応液中の各成分濃度を、例えば、ガスクロマトグラフやＨＰＬＣなどで経時的に測定することによりモニターすることにより、基質の追加量、反応時間、pH調整剤の添加量などを決定すればよい。
キシラン分解物の回収
キシランの起源生物種によっても異なるが、上記の反応により反応液中に主にキシロース、アラビノース等が生成する。反応終了後の反応液から、遠心分離などにより単糖を分離すればよい。これによりキシラン分解物を回収できる。これらの単糖は、そのまま、エタノール発酵の基質として用いることができる。
（Ｖ）第２のキシラン分解物の製造方法
本発明の第２のキシラン分解物の製造方法は、キシランを本発明の酵母の存在下で分解する工程(a)と、工程(a)により得られたキシラン部分分解物をキシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼの存在下で分解する工程(b)と、キシラン分解物を回収する工程とを含む方法である。
アラビノフラノシダーゼによる分解工程（工程(a)）
基質、酵母及び反応方法については、第１のキシラン分解物の製造方法と同様である。反応液中のアラビノフラノシダーゼ活性についても第１の方法と同様である。反応終了後の反応液は、そのまま、又は遠心分離などによりアラビノースを回収して除去した後、次工程に供される。
キシロシダーゼ又はさらにキシラナーゼによる分解工程（工程(b)）
本発明の酵母を用いてキシランの側鎖のアラビノースを分解した後に、キシロシダーゼ、又はさらにキシラナーゼにより主鎖のキシロースを分解する。反応方法及びキシラン分解物の回収方法は第１の方法と同様である。また反応液中の酵素活性についても第１の方法と同様である。
（ＶＩ）単糖の製造方法
本発明の酵母は、キシランやデンプンの分解の他に、その他の多糖類の分解にも好適に使用できる。即ち、本発明の単糖の製造方法は、目的タンパク質が糖加水分解酵素である本発明の酵母の存在下で植物性バイマス由来の多糖類を分解する工程と、生成する単糖を回収する工程とを含む方法である。
【００８５】
酵母として実用酵母を用いる場合は、高エタノール耐性を有することから、反応液をそのままこの実用酵母の発酵能を利用してエタノールに変換することができる。
【００８６】
多糖類としては、上記のデンプンやキシラン（ヘミセルロースの主成分）の他に、木質系バイオマスの主成分であるセルロース、リグニンなどが挙げられる。
【００８７】
例えばスギ、ブナ、竹のような木材；雑草；籾殻、ふすまのような種子殻；稲藁；とうもろこしかす、サトウキビの絞りかす（バガス）のような植物かす；大豆ミールのような穀類等の植物性バイオマスから、爆砕、溶媒抽出、水蒸気蒸留、超臨界炭酸ガス抽出、加圧熱水抽出などの方法で、セルロースやリグニンを抽出することができる。
【００８８】
この場合、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、リグニンを分解するラッカーゼ遺伝子(Lac)、リグニンペルオキシダーゼ遺伝子(LiP)、マンガンペルオキシダーゼ遺伝子(MnP)；セルロースを分解するセルラーゼなどを用いればよい。分解条件は、前述したキシラン分解物の製造方法やグルコースの製造方法に準じて当業者であれば容易に定めることができる。
実施例
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００８９】
（高活性プロモーター、分泌シグナル配列、α-アグルチニンの一部の配列及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列をこの順で有するＤＮＡの作製）
掲題のＤＮＡを作製した手順を、図３を参照して説明する。
(A)  常法に従って、高活性プロモーター(SED1プロモーター)を取得した。簡単に述べると、5'-cccgggGAAAAACGACAACATTCCAC-3'（配列番号：１）及び5'-gaattcCTTAATAGAGCGAACGTATT-3'（配列番号：２）の２つのプライマーを用いて、酵母Saccharomyces cerevisiae X21801Aの染色体ＤＮＡを鋳型としてPCRを行った。PCRの条件としては、94℃/1分−52℃/1分−72℃/2分のサイクルを30回繰り返した。
【００９０】
得られたPCR産物をスピンカラム（キアゲン社製、PCR Purification Kit）により精製後、制限酵素SmaIとEcoRIとで消化して、SmaI - EcoRI断片を得た。このSmaI - EcoRI断片には、SED1遺伝子のプロモーター領域が含まれている。配列表の配列番号：７にその配列を示す。
(B)  常法に従って、Aspergillus oryzaeのグルコアミラーゼの分泌シグナル配列を取得した。簡単に述べると、5'-GAATTCATGCGGAACAACCTTCTTTTT-3'（配列番号：３）5'-CTCGAGGTTGAGATCCGACTGCCTCTT-3'（配列番号：４）を合成し、これらをプライマーとして、グルコアミラーゼ遺伝子が挿入されているプラスミドpNGB1(Gene 207 127-134 (1998))を鋳型としてPCRを行った。PCRの条件としては、94℃/1分−52℃/1分−72℃/30秒のサイクルを30回繰り返した。ここで、両プライマーの設計には、後に分泌シグナル配列を目的のタンパク質と融合させるため、制限酵素EcoRIとXhoIの認識部位を付加した。
【００９１】
得られたPCR産物をスピンカラム（キアゲン社製、PCR Purification Kit）により精製後、制限酵素EcoRI、XhoIで切断し、約100bpのグルコアミラーゼ分泌シグナル配列を取得した。配列表の配列番号：８にその配列を示す。
(C)  α-アグルチニンのC末端の一部をコードする配列及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列を有する遺伝子（320アミノ酸）を有する配列を取得するため、酵母Saccharomyces cerevisiae X21801Aから、常法により染色体DNAを単離し、5'-ctcgagAGCGCCAAAAGCTCTTTTATC-3'（配列番号：５）および5'-ggtaccTTTGATTATGTTCTTTCTAT-3'（配列番号：６）の２つのプライマーを用いて、PCRを行った。PCRの条件としては、94℃/1分−52℃/1分−72℃/2分のサイクルを30回繰り返した。
【００９２】
得られたPCR産物をスピンカラム（キアゲン社製、PCR Purification Kit）により精製後、制限酵素XhoIとKpnIとで消化して、XhoI -KpnI断片を得た。このXhoI -KpnI断片には、α-アグルチニンのＣ末端から320アミノ酸をコードする配列と、３'非コード領域の466bpとを含んでおり、この配列中にＧＰＩアンカー付着シグナル配列が含まれている。配列表の配列番号：９にその配列を示す。
【００９３】
目的のＤＮＡは、(A)で得られた高活性プロモーターと(B)で得られた分泌シグナル配列と(C)で得られたXhoI -KpnI断片を、常法どおりDNA連結酵素(T4 Ligase)等を用いて接続することより得られる。
【００９４】
得られた目的のＤＮＡをプラスミドpRS406のSmaIとKpnI切断部位に挿入して、目的のプラスミドpRS406 Psed1-CAS1を得た。
【実施例２】
【００９５】
（蛍光タンパク質による細胞表層提示効率の比較）
常法に従って、蛍光タンパク質遺伝子(EGFP)を取得した。簡単に述べると、5'-ctcgagATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3'（配列番号：10）5'-ctcgagCTTGTACAGCTCGTCCATG-3'（配列番号：11）を合成し、これをプライマーとして、プラスミドpEGFP(CLONTECH社から販売)を鋳型にPCRを行った。PCRの条件としては、94℃/1分−52℃/1分−72℃/1分のサイクルを30回繰り返した。ここで、両プライマーの設計には、後に蛍光タンパク質を分泌シグナル及びα-アグルチニンのC末端の一部をコードする配列と融合させるため、制限酵素XhoI認識部位を付加し、翻訳終止コドンを除去した。
【００９６】
得られたPCR産物をスピンカラム（キアゲン社製、PCR Purification Kit）により精製後、制限酵素XhoIで切断し、約0.7Kbpの蛍光タンパク質配列を取得した。配列表の配列番号：12にその配列を示す。
【００９７】
蛍光タンパク質配列をプラスミドpRS406 Psed1-CAS1のXhoI切断部位に挿入して、目的のプラスミドpRS406 Psed1-EGFP-CAS1を得た。
【００９８】
プラスミドpRS406 Psed1-EGFP-CAS1を単離し、制限酵素StuIで一カ所を切断して線状としたDNAを、酢酸リチウム法で酵母Saccharomyces cerevisiae GRI-117-Uに導入した。0.67%Yeast nitrogen base w/o amino acids(Difco社)、0.077% CSM-URA(BIO101社)、2%グルコースを含むＳＤ寒天培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。本培地ではプラスミドpRS406 Psed1-EGFP-CAS1が染色体に導入され、ウラシル要求性が相補された株のみが生育できる。このようにして得られた株を、Saccharomyces cerevisiae GRI-117-U（EGFP）と名付けた（以下、単にGRI-117-U （EGFP）という）。
＜増殖速度の測定＞
GRI-117-U （EGFP）、及び、本発明と従来技術との比較のために作製した実験室酵母Saccharomyces cerevisiae MT8-1をpRS406 Psed1-EGFP-CAS1で形質転換した株（以下、単にMT8-1（EGFP）という）をそれぞれ、0.67%Yeast nitrogen base w/o amino acids(Difco社)、0.077% CSM-URA(BIO101社)、2%グルコースを含むSD液体培地に懸濁し、30℃で振盪培養し、経時的に600nmにおける吸光度を測定することにより、両株の増殖速度を比較した。
【００９９】
結果を図４に示す。実用酵母であるGRI-117-U （EGFP）は、実験室酵母であるMT8-1（EGFP）に較べて約２倍の菌体増殖を示した。
＜蛍光強度の測定＞
GRI-117-U （EGFP）、コントロールとしてのSaccharomyces cerevisiae GRI-117-U、及び、MT8-1（EGFP）をそれぞれ0.67%Yeast nitrogen base w/o amino acids(Difco社)、0.077% CSM-URA(BIO101社)、2%グルコースを含むＳＤ液体培地で培養し、遠心分離して培地と菌体とに分離した。
【０１００】
GRI-117-U （EGFP）及びMT8-1（EGFP）の菌体を適当量の水に懸濁した後、それらの蛍光強度を、市販の蛍光マルチプレートリーダー(TECAN社 Multi Plate Reader Optima Fluor等)を用いて測定した。
【０１０１】
結果を図５に示す。図５に示した蛍光強度は、各株の蛍光強度から親株(GRI-117-UまたはMT8-1)の蛍光強度をコントロールとしてそれぞれ差し引いた値である。この結果、GRI-117-U（EGFP）は、MT8-1（EGFP）より約１０％蛍光シグナルが強かった。
【実施例３】
【０１０２】
（細胞表層にグルコアミラーゼを有する酵母の作製）
常法に従って、Aspergillus oryzaeのグルコアミラーゼを取得した。簡単に述べると、5'-ctcgagCAGGCGACTGGTCTAGATACC-3'（配列番号：13）5'-ctcgagCCGCCAAACATCGCTCTGCAC-3'（配列番号：14）を合成し、これをプライマーとして、グルコアミラーゼ遺伝子が挿入されているプラスミドpYGA1 (Agric.Biol.Chem. 55 941-949 (1991))を鋳型としてPCRを行った。PCRの条件としては、94℃/1分−52℃/1分−72℃/2分のサイクルを30回繰り返した。ここで、両プライマーの設計には、後にグルコアミラーゼを分泌シグナル及びα-アグルチニンのC末端の一部をコードする配列と融合させるため、制限酵素XhoIの認識部位を付加し、翻訳終止コドンを除去した。
【０１０３】
得られたPCR産物をスピンカラム（キアゲン社製、PCR Purification Kit）により精製後、制限酵素XhoIで切断し、約1.8Kbpのグルコアミラーゼ配列を取得した。配列表の配列番号：15にその配列を示す。
【０１０４】
グルコアミラーゼＤＮＡをプラスミドpRS406 Psed1-CAS1のXhoI切断部位に挿入して、目的のプラスミドpRS406 Psed1-glaA-CAS1を得た。
【０１０５】
プラスミドpRS406 Psed1-glaA-CAS1を単離し、制限酵素StuIで一カ所を切断して線状としたDNAを、酢酸リチウム法で酵母Saccharomyces cerevisiae GRI-117-Uに導入した。0.67%Yeast nitrogen base w/o amino acids(Difco社)、0.077% CSM-URA(BIO101社)、2%グルコースを含むＳＤ寒天培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。本培地ではプラスミドpRS406 Psed1- glaA -CAS1が染色体に導入され、ウラシル要求性が相補された株のみが生育できる。このようにして得られた株を、Saccharomyces cerevisiae GRI-117-U（glaA）と名付けた（以下、単にGRI-117-U （glaA）という）。
【０１０６】
GRI-117-U （glaA）を0.67%Yeast nitrogen base w/o amino acids(Difco社)、0.077% CSM-URA(BIO101社)、2%グルコースを含むＳＤ液体培地で培養し、遠心分離して培地と菌体とに分離し、それぞれのグルコアミラーゼ活性を測定した。コントロールとして、Saccharomyces cerevisiae GRI-117-Uを用いた。その結果、コントロールは、培地および菌体にグルコアミラーゼ活性はみとめられなかった。形質転換された酵母GRI-117-U（glaA）の培地中にはほとんどグルコアミラーゼ活性はみられなかったが、酵母GRI-117-U（glaA）菌体はグルコアミラーゼ活性を有していた。
【０１０７】
また、GRI-117-U（glaA）菌体のグルコアミラーゼ活性は、1mg菌体あたり約5×10-3Uであった。
【０１０８】
グルコアミラーゼ活性は以下の方法により測定した。
＜グルコアミラーゼ活性の測定＞
グルコアミラーゼ活性の測定にはキッコーマン社「糖化力測定キット」を用いる。簡単に述べると、4-Nitrophenyl β-L-maltosideを含む酢酸緩衝液に菌体又は培養上清を適量添加した後、37℃、10分間、静置し、遊離してくる4-Nitrophenol量を415nmの吸光度から算出した。グルコアミラーゼ活性1U=4-Nitrophenyl β-L-maltoside から１分間に１μmolの4-Nitrophenolを生成するのに必要な酵素量と定義した。
【実施例４】
【０１０９】
（細胞表層にグルコアミラーゼを有する酵母の固定化）
0.67%Yeast nitrogen base w/o amino acids(Difco社)、0.077% CSM-URA(BIO101社)、2%グルコースを含むＳＤ培地3Ｌを含む気泡塔型培養槽に、6mm角のポリウレタンフォームBSPsを、1,000個/Lとなるように投入して、酵母GRI-117-U（glaA）とともに6〜20Ｌ／分の通気量で培養した。これにより、ポリウレタンフォームに酵母GRI-117-U（glaA）が固定された。
【０１１０】
この酵母のグルコアミラーゼ活性はポリウレタンフォーム1個当たり1Uであった。
【実施例５】
【０１１１】
（固定化された細胞表層にグルコアミラーゼを有する酵母によるデンプンの分解）
実施例４で得られたポリウレタンフォームに固定された酵母GRI-117-U（glaA）3,000個に新たに反応液：コーンスターチ50ｇ、および0.67%Yeast nitrogen base w/o amino acids(Difco社)、0.077% CSM-URA(BIO101社)を含む培地1Ｌを加え、3〜20Ｌ／分の通気量で気泡塔型培養槽内で30℃、24時間接触させた。反応中、KOHを用いて、ｐＨを5.0〜6.0にコントロールした。第１サイクルの反応液を回収した後、新たな反応液を加え、２サイクルの反応を行い、これを５サイクルまで行った。
＜エタノール生産量の測定＞
酵母GRI-117-U（glaA）を用いた場合の第１サイクル終了後の反応液組成を分析した結果、培養槽内に17ｇのエタノールが生産されていることがわかった。第１サイクル終了後の反応液中のエタノール濃度は約１．７容量％であった。
【０１１２】
第２サイクル以降も活性は落ちることなく、固定化された酵母GRI-117-U（glaA）はグルコアミラーゼ活性を発現した。固定化細胞から遊離してきた酵母を集め、活性を測定したところ、グルコアミラーゼ活性は、大きく低下していた。
【０１１３】
また、本発明と従来技術との比較のために、実験室酵母Saccharomyces cerevisiae MT8-1にpRS406 Psed1-glaA-CAS1を形質転換した株も作製し、（以下、単にMT8-1（glaA）という）同様の操作を行った。第１サイクル終了後の反応液組成を分析した結果、反応液中のエタノール濃度は約０．６容量％であった。
【０１１４】
その結果を図６に示す。GRI-117-U（glaA）は、MT8-1（glaA）の約3倍のエタノールを生産した。
【実施例６】
【０１１５】
（細胞表層にアラビノフラノシダーゼを有する酵母の作製）
常法に従って、Aspergillus oryzaeのアラビノフラノシダーゼのｃDNAを取得した。簡単に述べると、まず、Aspergillus oryzaeから全ＲＮＡを抽出し、ついで、オリゴdTセルロースを用いてPoly(A)+RNAを取得した。
【０１１６】
次にPoly(A)+RNAを鋳型とし、GIBCO BRL社のRT-PCR KITを用いて逆転写反応を行い、cDNA混合物を取得した。詳述すれば、5'-ctcgagATGACTACCTTCACGAAAC-3'（配列番号：16）5'-ctcgagAGCCTTCCATCTCAGGAGA-3'（配列番号：17）を合成し、これをプライマーとして、上記cDNA混合物を鋳型にPCRした。PCRの条件としては、50℃/30分−94℃/2分の後、94℃/1分−52℃/1分−72℃/2分のサイクルを30回繰り返した。ここで、両プライマーの設計には、後にアラビノフラノシダーゼをα-アグルチニンのC末端の一部と融合させるため、制限酵素サイトXhoIの付加と翻訳終止コドンを除去した。
【０１１７】
得られたPCR産物をスピンカラム（キアゲン社製、PCR Purification Kit）により精製後、制限酵素XhoIで切断し、約1.5kbpのアラビノフラノシダーゼcDNA断片を得た。配列表の配列番号：18にその配列を示す。
【０１１８】
アラビノフラノシダーゼＤＮＡをプラスミドpRS406 Psed1-CAS1のXhoI切断部位に挿入して、目的のプラスミドpRS406 Psed1-abfA-CAS1を得た。
【０１１９】
プラスミドpRS406 Psed1-abfA-CAS1を単離し、制限酵素StuIで一カ所を切断して線状としたDNAを、酢酸リチウム法で酵母Saccharomyces cerevisiae GRI-117-Uに導入した。0.67%Yeast nitrogen base w/o amino acids(Difco社)、0.077% CSM-URA(BIO101社)、2%グルコースを含むＳＤ寒天培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。本培地ではプラスミドpRS406 Psed1- abfA -CAS1が染色体に導入され、ウラシル要求性が相補された株のみが生育できる。この酵母を、Saccharomyces cerevisiae GRI-117-U（abfA）と名付けた（以下、単にGRI-117-U （abfA）という）。得られた酵母GRI-117-U （abfA）を0.67%Yeast nitrogen base w/o amino acids(Difco社)、0.077% CSM-URA(BIO101社)、2%グルコースを含むＳＤ液体培地で培養し、遠心分離して培地と菌体とに分離し、それぞれのアラビノフラノシダーゼ活性を測定した。コントロールとして、Saccharomyces cerevisiae GRI-117-Uを用いた。その結果、コントロールは、培地および菌体にアラビノフラノシダーゼ活性はみとめられなかった。形質転換された酵母GRI-117-U（abfA）の培地中にはほとんどアラビノフラノシダーゼ活性はみられなかったが、酵母GRI-117-U（abfA）菌体はアラビノフラノシダーゼ活性を有していた。
＜アラビノフラノシダーゼ活性の検出＞
アラビノフラノシダーゼ活性の有無は、菌体又は培養上清を1mM 4-Nitrophenyl α-L-arabinofuranosideを含む50mM酢酸緩衝液(pH5.0)中に添加し、50℃で30分間静置した後、遊離した4-Nitrophenolを目視にて確認した。遊離4-Nitrophenolは黄色を呈するので、この呈色を確認する。
【実施例７】
【０１２０】
（細胞表層にアラビノフラノシダーゼを有する酵母の固定化）
0.67%Yeast nitrogen base w/o amino acids(Difco社)、0.077% CSM-URA(BIO101社)、2%グルコースを含むＳＤ培地３Ｌを含む気泡塔型培養槽に、6mm角のポリウレタンフォームBSPsを、1,000個/Lとなるように投入して、酵母GRI-117-U（abfA）とともに6〜20Ｌ／分の通気量で培養した。これにより、ポリウレタンフォームに酵母GRI-117-U（abfA）が固定された。
【０１２１】
この酵母のアラビノフラノシダーゼ活性はポリウレタンフォーム1個当たり0.01Uであった。
【実施例８】
【０１２２】
（固定化された細胞表層にアラビノフラノシダーゼを有する酵母によるキシランの分解）
実施例６で得られたポリウレタンフォームに固定された酵母GRI-117-U（abfA）3,000個に新たに反応液：粗キシラン１００ｇ、キシラナーゼ（総活性150U量）、キシロシダーゼ（総活性150U量）、および0.67%Yeast nitrogen base w/o amino acids(Difco社)、0.077% CSM-URA(BIO101社)、2%グルコースを含むＳＤ培地3Ｌを加え、3〜20Ｌ／分の通気量で気泡塔型培養槽内で３０℃、２４時間接触させた。反応中、KOHを用いて、ｐＨを5.0〜6.0にコントロールした。
【０１２３】
第１サイクルの反応液を回収した後、新たな反応液を加え、２サイクルの反応を行い、これを５サイクルまで行った。第１サイクル終了後の反応液組成を分析した結果、培養槽内に10ｇのキシロースが生産されていることがわかった。
【０１２４】
第２サイクル以降も活性は落ちることなく、固定化された酵母GRI-117-U（abfA）はアラビノフラノシダーゼ活性を発現した。
＜菌体のアラビノフラノシダーゼ活性の定量＞
アラビノフラノシダーゼ活性は、菌体又は培養上清を1mM 4-Nitrophenyl α-L-arabinofuranosideを含む50mM酢酸緩衝液(pH5.0)中に添加し、50℃で30分間静置した後、遊離した4-Nitrophenol量から求めた。アラビノフラノシダーゼ活性1U＝4-Nitrophenyl α-L-arabinofuranoside から1分間に1μmolの4-Nitrophenolを生成するのに必要な酵素量、と定義した。
＜キシラナーゼ活性の定量＞
キシラナーゼ活性の測定は、菌体又は培養上清又は精製酵素溶液を1％ birchwood glucuronoxylan（Sigma社）を含む50mM酢酸緩衝液(pH6.5)中に添加し、37℃で10分間静置した後、遊離した糖の還元力をソモギーネルソン法により定量した。キシラナーゼ活性1U＝bircwood glucuronoxylan から1分間に1μmolのキシロースに相当する還元力を生成する酵素量、と定義した。
＜キシロシダーゼ活性の定量＞
キシロシダーゼ活性は、菌体又は培養上清精製酵素溶液を1mM 4-Nitrophenyl β-D-xylosideを含む50mMクエン酸緩衝液(pH5.0)中に添加し、50℃で5分間静置した後、遊離した4-Nitrophenol量から求めた。キシロシダーゼ活性活性1U＝4-Nitrophenyl β-D-xyloside から1分間に1μmolの4-Nitrophenolを生成するのに必要な酵素量、と定義した。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】本発明の発現ベクター中の発現ユニットの構成を示す図である。
【図２】GPIアンカリングタンパク質のプロセッシング及び細胞内輸送の様子を説明する図である。
【図３】高活性プロモーター、分泌シグナル配列、α-アグルチニンの一部の配列及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列をこの順で有するＤＮＡの作製手順を示した図である。
【図４】GRI-117-U （EGFP）の増殖速度と、実験室酵母Saccharomyces cerevisiae MT8-1をpRS406 Psed1-EGFP-CAS1で形質転換した株MT8-1（EGFP）の増殖速度とを比較した図である。
【図５】GRI-117-U （EGFP）の蛍光強度とMT8-1（EGFP）の蛍光強度とを比較した図である。
【図６】GRI-117-U（glaA）のコーンスターチからのエタノール生産量と、MT8-1（glaA）のコーンスターチからのエタノール生産量とを比較した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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