(57)【要約】【課題】一酸化窒素産生促進剤を提供すること、およびその一酸化窒素産生促進剤を配合した皮膚外用剤を提供すること。【解決手段】有効成分としてリゾホスファチジン酸及び／又はその塩、或いはホスファチジン酸及び／又はその塩からなる一酸化窒素産生促進剤。また、有効成分としてリゾホスファチジン酸及び／又はその塩、或いはホスファチジン酸及び／又はその塩を含有する一酸化窒素産生促進剤。さらに、前記一酸化窒素産生促進剤を含有した皮膚外用剤。【選択図】「なし」【特許請求の範囲】
【請求項１】
リゾホスファチジン酸及び／又はその塩からなる一酸化窒素産生促進剤。
【請求項２】
リゾホスファチジン酸及び／又はその塩を有効成分として含有する一酸化窒素産生促進剤。
【請求項３】
ホスファチジン酸及び／又はその塩からなる一酸化窒素産生促進剤。
【請求項４】
ホスファチジン酸及び／又はその塩を有効成分として含有する一酸化窒素産生促進剤。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の一酸化窒素産生促進剤を含有した、表皮角化調整用皮膚外用剤。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の一酸化窒素産生促進剤を含有した、表皮保湿機能改善用皮膚外用剤。
【請求項７】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の一酸化窒素産生促進剤を含有した、抗老化用皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分としてリゾホスファチジン酸及び／又はその塩、或いはホスファチジン酸及び／又はその塩を含有することが特徴の一酸化窒素産生促進剤に関する事であり、更には、その一酸化窒素産生促進剤を含有する皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
一酸化窒素は、大気汚染の原因である窒素酸化物の一つとして、環境に悪影響を及ぼす物質として扱われてきたが、いまや一酸化窒素は、生理活性物質としての重要さが認識され、医学、生物学、生化学、薬学、化学など広い分野で研究されている。一酸化窒素は、当初、血管内皮細胞、一部の神経細胞、マクロファージといった特定の細胞で産生されると考えられてきたが、一酸化窒素合成酵素は体内の多くの細胞にあることが明らかになり、その作用も、細胞内のグアニル酸シクラーゼを活性化してサイクリックＧＭＰを産生するだけでなく、一酸化窒素自身が酵素やイオンチャネルに作用したり、活性酸素と反応して強力な酸化物質であるペルオキシナイトライトとなって作用したりと、多様であることが明らかとなってきた。つまり一酸化窒素は、生体機能の維持・調節に深く関係しており、生物にとって不可欠な物質であると言え、その主な機能は生体に対する種々の保護的作用であると考えられる。
【０００３】
過剰な一酸化窒素の存在は、組織の炎症や障害を引き起こしたり過度のメラニン産生を惹起する作用が報告されていることから（例えば、非特許文献１及び非特許文献２参照）、従来は産生阻害剤の検討がなされてきた。しかしながら、上述のように一酸化窒素は、生体維持には必須なガス分子であるにもかかわらず、生体機能を回復・改善する目的でその産生量を促進する検討はなされてこなかった。一酸化窒素は、多岐にわたる作用の一つとして顕著な血管拡張作用を有することから、その産生促進剤は、既にインポテンツの改善薬としてＦＤＡ（Ｆｏｏｄ&Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ＝米国食品・医薬品認可局）により販売認可されており、また、化粧品では肌色改善の化粧料組成物として応用されている（例えば特許文献１参照）。そこで、一酸化窒素の他の機能にも注目し、生体機能回復と改善を目的とした一酸化窒素合成促進剤の開発を試みた。
【非特許文献１】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｌｌｅｒｇｙ、２００２年３月、第１巻、第１号、ｐ５３−６３
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  &  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２年２月、第５０巻、第２号、ｐ１２５−１３３
【特許文献１】特公２００２−２２０３３５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者等は、皮膚の恒常性を維持する上で、血管拡張作用のある一酸化窒素は、血流を改善するなど皮膚に対して良好な効果が期待でき、適度の一酸化窒素を産生することは重要な意味があると考え、皮膚に対して刺激が少ない一酸化窒素産生促進剤を開発することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、皮膚に対して刺激が少なく、血流を改善する血管拡張作用のある一酸化窒素産生促進剤を提供すべく、鋭意研究した結果、生体内成分であるリゾホスファチジン酸及び／又はその塩、並びにホスファチジン酸及び／又はその塩に、安全に使用できる一酸化窒素産生促進剤としての機能を見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のリゾホスファチジン酸及び／又はその塩、並びにホスファチジン酸及び／又はその塩は、一酸化窒素産生促進効果を有し、更には、セラミド合成律速酵素遺伝子発現効果による表皮角化調整作用、フィラグリン遺伝子発現効果による表皮保湿機能改善作用、コラーゲン合成促進効果による抗老化作用を有する。これらの効果、作用により、本発明のリゾホスファチジン酸及び／又はその塩、並びにホスファチジン酸及び／又はその塩は、表皮角化調整用皮膚外用剤、抗老化用皮膚外用剤、表皮保湿機能改善用皮膚外用剤の有効成分として安全に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明のホスファチジン酸は、大豆や卵黄などから得ることができ、また、大豆や卵黄などから得られるホスファチジルコリンをホスホリパーゼDにより加水分解して容易に得られる。本発明のリゾホスファチジン酸は、ホスファチジン酸をホスホリパーゼA２で位置選択的に加水分解することにより容易に得られる。他にも、本発明のリゾホスファチジン酸及びホスファチジン酸は、有機化学的に合成することが可能で、例えば、グリセロールリン酸に塩基存在下、脂肪酸クロライドを反応させたり、脂肪酸モノグリセリドおよび／または脂肪酸ジグリセリドに各種リン酸化剤を作用させたりして、目的のリゾホスファチジン酸及びホスファチジン酸を得ることができる。特に、合成法を制限する必要はない。
【０００８】
本発明のリゾホスファチジン酸及びホスファチジン酸の構成脂肪酸は、特定はしないが、大豆や卵黄などから得た場合は、レシチン由来の混合脂肪酸であり、また、酸化安定性の向上を目的に水素添加反応をして飽和の脂肪酸にしても良く、更には、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の混合脂肪酸でも良い。
【０００９】
本発明のリゾホスファチジン酸塩及びホスファチジン酸塩の対イオンは、一般的に使われる塩基性物質であれば特に限定する必要はなく、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、トリエタノールアミン、アルギニンなどで使用の目的に合わせてｐHを調整したものであれば良い。
【００１０】
本発明のリゾホスファチジン酸塩及びホスファチジン酸塩は、リゾホスファチジン酸又はホスファチジン酸をイソプロピルアルコールやアセトンやヘキサンなどの適当な溶媒に溶解させ、水酸化ナトリウムのエタノール溶液や水酸化カリウムのエタノール溶液やトリエタノールアミンやアルギニン水溶液などで中和し、溶媒を減圧留去することにより得られる。
【００１１】
本発明のリゾホスファチジン酸及び／又はその塩、並びにホスファチジン酸及び／又はその塩は、いずれも後で証明するように、一酸化窒素産生促進作用、セラミド合成律速酵素遺伝子発現作用、フィラグリン遺伝子発現作用、コラーゲン合成促進作用等の機能を有する。したがって、一酸化窒素産生促進剤、セラミド合成律速酵素遺伝子発現剤、フィラグリン遺伝子発現剤、コラーゲン合成促進剤として有用である。
【００１２】
本発明のリゾホスファチジン酸及び／又はその塩、並びにホスファチジン酸及び／又はその塩は、いずれも皮膚外用剤に配合して、一酸化窒素産生促進作用、セラミド合成律速酵素遺伝子発現作用を発揮して、セラミド合成律速酵素遺伝子発現作用による表皮角化調整作用、フィラグリン遺伝子発現作用を発揮して、フィラグリン遺伝子発現作用による表皮保湿機能改善作用、コラーゲン合成促進作用を発揮して、コラーゲン合成促進作用による抗老化作用などの機能を持つ、一酸化窒素産生促進用皮膚外用剤、表皮角化調整用皮膚外用剤、表皮保湿機能改善用皮膚外用剤、抗老化用皮膚外用剤などに調製することができる。
【００１３】
本発明のリゾホスファチジン酸及び／又はその塩、並びにホスファチジン酸及び／又はその塩を皮膚外用剤に配合して使用する場合のリゾホスファチジン酸及び／又はその塩、或いはホスファチジン酸及び／又はその塩の配合量は、０．０００１重量％から３０重量％、好ましくは、０．００１重量％から２０重量％である。
【００１４】
本発明のリゾホスファチジン酸及び／又はその塩、並びにホスファチジン酸及び／又はその塩は、いずれも外用剤基剤に通常用いられる油脂類、エステル類、炭化水素類、ロウ類、低級アルコール類、高級アルコール類、多価アルコール類、脂肪酸類、界面活性剤、水溶生高分子類、香料、水等と併用することができ、更にその外用剤には、他の老化防止剤、保湿剤、育毛剤、発毛剤、経皮吸収促進剤、紫外線吸収剤、細胞賦活剤、抗炎症剤、美白剤、防腐防カビ剤などを配合することが出来る。
【実施例】
【００１５】
以下、本発明の内容を実施例により更に説明する。
（実施例１）
【００１６】
表皮細胞の一酸化窒素産生促進作用評価
正常ヒト表皮角化細胞を、牛脳下垂体抽出物含有ＫＧ２培地（クラボウ）を用いて粗な細胞密度にて培養した。但しフェノールレッド無添加の培地とした。この培地で２４時間培養した後に、リゾホスファチジン酸ナトリウムおよびホスファチジン酸ナトリウムを下記表１に示すように添加量を変えて添加し、さらに２４時間培養した。その後の培養上清中の二酸化窒素を測定することにより、一酸化窒素の産生量を求めた。二酸化窒素はＧｒｉｅｓｓ法を用いて測定した。培養細胞の総蛋白質量をＢＣＡ法により測定して単位蛋白質量当たりの一酸化窒素生成量をｎＭで表した。なお、陽性対照としてはカルシウムイオノフォアを用いた。
【００１７】
結果を下記表１に示す。表中リゾＰＡＮａ、ＰＡＮａ、ＮＯおよびＰＣは、それぞれリゾホスファチジン酸ナトリウム、ホスファチジン酸ナトリウム、一酸化窒素およびカルシウムイオノフォアを意味する。
【００１８】
表１に示した結果から、リゾホスファチジン酸ナトリウムを培地に添加した場合には、一酸化窒素の産生量はリゾホスファチジン酸ナトリウム添加濃度依存的に増加し、最大で通常状態の１０倍以上に達した。一方ホスファチジン酸ナトリウムを培地に添加した場合にも、未添加と比較して５倍以上の一酸化窒素産生量の増加が認められた。いずれも陽性対照であるカルシウムイオノフォアと比較して、一酸化窒素の産生量は明らかに増大した。
（実施例２）
【００１９】
表皮ケラチノサイトのセラミド合成律速酵素遺伝子発現作用およびフィラグリン遺伝子発現作用評価
正常ヒト表皮角化細胞を、１０％牛胎児血清含有ダルベッコ型変法ＭＥＭ培地およびＨａｍ’Ｓ  Ｆ１２培地の混合培地を用いて粗な細胞密度にて培養した。この培地で２４時間培養した後に、リゾホスファチジン酸ナトリウムおよびホスファチジン酸ナトリウムを下記表１に示すように添加量を変えて添加し、さらに２４時間培養した。培養後の細胞よりＲＮＡを抽出し、逆転写キット（Ｇｉｂｃｏ製）を用いてｃＤＮＡを作成し、フィラグリンおよびセラミド合成律速酵素であるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）に対するＰＣＲに供した（ＲＴ-ＰＣＲ）。ＰＣＲにより得られた産物を１％アガロースゲルにて電気泳動後に定量し、ＳＰＴおよびフィラグリンの発現量の指標とした。ＳＰＴおよびフィラグリンの発現量変化は、リゾホスファチジン酸ナトリウム未処理細胞由来のSPTに対する相対値にて表した。
【００２０】
表１に示すように、リゾホスファチジン酸ナトリウムを培地に添加した場合には、ＳＰＴおよびフィラグリンの発現量はリゾホスファチジン酸ナトリウム添加濃度依存的に増加し、それぞれ最大で通常状態の１．８倍および１．９倍に達した。陽性対照であるカルシウムイオノフォアと比較しても、フィラグリンおよびＳＰＴ発現量は明らかに増大した。一方ホスファチジン酸ナトリウムを培地に添加した場合には、未添加と比較してそれぞれ１．２９倍および１．１５倍のｍＲＮＡ発現増加が認められた。
（実施例３）
【００２１】
コラーゲン合成促進作用評価
正常ヒト線維芽細胞を、５％牛胎児血清含有ダルベッコ型変法ＭＥＭ培地にて培養した。この培地で２４時間培養した後に、リゾホスファチジン酸ナトリウムおよびホスファチジン酸ナトリウムを下記表１に示すように添加量を変えて０．５％牛胎児血清含有ダルベッコ型変法ＭＥＭ培地に添加し、さらに４８時間培養した。その後の培養上清中のＩ型コラーゲン量をＥＬＩＳＡ法により実際に定量することにより、Ｉ型コラーゲンの産生量を求めた。培養細胞の総蛋白質量をＢＣＡ法により測定して単位蛋白質量当たりのI型コラーゲン産生量をｎｇ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎで表した。なお、陽性対照としてはアスコルビン酸リン酸マグネシウム塩を用いた。
【００２２】
表２に示すように、リゾホスファチジン酸ナトリウムを培地に添加した場合には、I型コラーゲンの産生量はリゾホスファチジン酸ナトリウム添加濃度依存的に増加し、最大で通常状態の１．５倍程度に達した。一方ホスファチジン酸ナトリウムを培地に添加した場合にも、未添加と比較して１．３倍程度のコラーゲン合成量の増加が認められた。いずれも陽性対照であるアスコルビン酸リン酸マグネシウム塩と比較して、I型コラーゲンの産生量は明らかに増大した。
（実施例４）
【００２３】
一酸化窒素処理による表皮ケラチノサイトのセラミド合成律速酵素遺伝子発現作用およびフィラグリン遺伝子発現作用評価
正常ヒト表皮角化細胞を、１０％牛胎児血清含有ダルベッコ型変法ＭＥＭ培地およびＨａｍ’Ｓ  Ｆ１２培地の混合培地を用いて粗な細胞密度にて培養した。この培地で２４時間培養した後に、ＮＯＣ  １２（一酸化窒素供与体）を下記表３に示すように添加量を変えて添加し、さらに２４時間培養した。培養後の細胞よりＲＮＡを抽出し、逆転写キット（Ｇｉｂｃｏ製）を用いてｃＤＮＡを作成し、フィラグリンおよびセラミド合成律速酵素であるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）に対するＰＣＲに供した（ＲＴ−ＰＣＲ）。ＰＣＲにより得られた産物を１％アガロースゲルにて電気泳動後に定量し、ＳＰＴおよびフィラグリンの発現量の指標とした。ＳＰＴおよびフィラグリンの発現量変化は、ＮＯＣ  １２未処理細胞由来のＳＰＴに対する相対値にて表した。
【００２４】
表３に示すように、ＮＯＣ  １２を培地に添加した場合には、ＳＰＴおよびフィラグリンの発現量はＮＯＣ  １２添加濃度依存的に増加し、それぞれ最大で通常状態の１．５１倍および１．６９倍に達した。つまり、適度の一酸化窒素産生促進剤の添加は、セラミド合成律速酵素遺伝子発現作用およびフィラグリン遺伝子発現作用に有効的である。
【表１】
2005200370.tif 000002
【表２】
2005200370.tif 000003
【表３】
2005200370.tif 000004
【００２５】
以下に、本発明の一酸化窒素産生促進剤を配合した皮膚外用剤の応用例を示す。配合量は重量％である。
【００２６】
処方例１  乳液
（Ａ）
モノミリスチン酸デカグリセリル              ２．０％
精製水素添加大豆リン脂質                    ０．５％
ステアリン酸                                ０．５％
ベヘニルアルコール                          １．５％
パルミチン酸セチル                          １．０％
α-オレフィンオリゴマー                      ６．０％
２−エチルヘキサン酸セチル                  ６．０％
トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル          ６．０％
グリセリン                                  ５．０％
プロピルパラベン                            ０．２％
（Ｂ）
リゾホスファチジン酸カリウム                ０．１％
メチルパラベン                              ０．２％
精製水                                      ５６％
（Ｃ）
カルボキシビニルポリマー                    ０．１％
精製水                                      ９．９％
（Ｄ）
水酸化ナトリウム                            ０．０４％
精製水                                      ４．９６％
調製法
Ａ、Ｂをそれぞれビーカーに秤取し、８０℃に加温、混合する。８０℃を保持し、Ａをホモミキサーで撹拌しながらＢを徐々に添加する。添加終了後、パドルミキサーで撹拌しながら冷却し、Ｃ、Ｄを順次加え、３５℃で調製を終了する。
【００２７】
処方例２  保湿クリーム
（Ａ）
モノステアリン酸グリセリル                  １．０％
モノミリスチン酸デカグリセリル              ２．０％
デカオレイン酸デカグリセリル                ０．５％
ステアリン酸                                ３．０％
ベヘニルアルコール                          ２．０％
精製水素添加大豆リン脂質                    ０．５％
ヘキサメチルテトラコサン                    ２．０％
トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル          ５．０％
メチルポリシロキサン                        ２．０％
グリチルレチン酸ステアリル                  ０．１％
プロピルパラベン                            ０．２％
（Ｂ）
カルボキシビニルポリマー（２％水溶液）      ５．０％
１，３−ブチレングリコール                  ５．０％
グリセリン                                  ２．０％
リゾホスファチジン酸Ｌ-アルギニン            ０．１％
メチルパラベン                              ０．２％
精製水                                    ６４．４％
（Ｃ）
Ｌ−アルギニン                              ０．２％
精製水                                      ４．８％
調製法
Ａ、Ｂ、Ｃを８０℃に加熱溶解し、ＢをＡに加え、直ちにＣも加えホモミキサー５０００ｒｐｍ、１０分間撹拌乳化する。 次いで通常撹拌で冷却し、３５℃まで撹拌し、放置脱泡後、容器に充填する。
【００２８】
処方例３  保湿クリーム
（Ａ）
ペンタステアリン酸デカグリセリル              １．０％
ステアリン酸                                  ３．５％
ベヘニルアルコール                            ２．５％
パルミチン酸セチル                            ３．０％
ヘキサメチルテトラコサン                      ８．０％
マカデミアナッツ油                            ８．０％
メチルポリシロキサン                          ０．２％
ホスファチジン酸                              ０．５％
γ−オリザノール                              １．０％
プロピルパラベン                              ０．１％
（Ｂ）
１，３−ブチレングリコール                    ３．０％
グリセリン                                    ３．０％
Ｌ-アルギニン                                  ０．２％
精製水                                        ６６％
調製法
Ａを８０℃に加熱溶解し、撹拌して均一化した。この均一化したＡを５０℃まで冷却し、５０００ｒｐｍの高速撹拌下、５０℃で加熱均一化したＢを徐々に添加して水中油型乳化組成物を得た。
【００２９】
処方例４  老化防止用クリーム
（Ａ）
モノステアリン酸グリセリル                      ２．０％
ＰＯＥ（８０）硬化ヒマシ油                      ３．０％
ステアリン酸                                    ２．０％
ステアリルアルコール                            ２．０％
パルミチン酸セチル                              ２．０％
ヘキサメチルテトラコサン                        ５．０％
テトラ２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリトール  ５．０％
マカデミアナッツ油                              ２．０％
メチルポリシロキサン                            １．０％
酢酸トコフェロール                              ０．１％
グリチルリチン酸ジカリウム                      ０．０５％
プロピルパラベン                                ０．１％
（Ｂ）
グリセリン                                      ５．０％
１，３−ブチレングリコール                      ５．０％
ホスファチジン酸トリエタノールアミン            １．０％
ポリエチレングリコール１５００                  １．０％
エデト酸二ナトリウム                            ０．０５％
メチルパラベン                                  ０．２％
精製水                                        ６３．５％
調製法
Ａ、Ｂを８０℃に加熱溶解し、ＡにＢを加え、攪拌乳化する。攪拌冷却を続け、３５℃まで攪拌し、放置脱泡後、容器に充填する。
【００３０】
処方例５  老化防止用クリーム
（Ａ）
モノステアリン酸グリセリル                      ２．０％
ＰＯＥ（８０）硬化ヒマシ油                      ３．０％
ステアリン酸                                    ２．０％
ステアリルアルコール                            ２．０％
パルミチン酸セチル                              ２．０％
ヘキサメチルテトラコサン                        ５．０％
テトラ２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリトール  ５．０％
マカデミアナッツ油                              ２．０％
メチルポリシロキサン                            １．０％
酢酸トコフェロール                              ０．１％
グリチルリチン酸ジカリウム                      ０．０５％
プロピルパラベン                                ０．１％
（Ｂ）
グリセリン                                      ５．０％
１，３−ブチレングリコール                      ５．０％
リゾホスファチジン酸                            １．０％
ポリエチレングリコール１５００                  １．０％
エデト酸二ナトリウム                            ０．０５％
Ｌ−アルギニン                                  ０．２％
メチルパラベン                                  ０．２％
精製水                                        ６３．３％
調製法
Ａ、Ｂを８０℃に加熱溶解し、ＡにＢを加え、攪拌乳化する。攪拌冷却を続け、３５℃まで攪拌し、放置脱泡後、容器に充填する。