(57)【要約】【課題】  1.加熱殺菌を施さずに発酵することで従来問題となっていた原料培地中の有効成分分解や発酵阻害物質生成を回避すると同時に発酵の高度な集中管理と殺菌設備を不要とする乳酸液の製造方法の開発。2.各種物性を与えるポリ乳酸の原料となる任意の光学純度の乳酸発酵液を得るための発酵制御法の開発。【解決手段】本発明は、糖質とその他の栄養成分等を含有するバイオマス原料を培養基とし、これを殺菌することなく、ＤＬ乳酸生産菌（Lactobacillus plantarum ）及びＬ乳酸生産菌（Bacillus coagulans）を植菌した後、４５℃未満でｐＨの間欠的中和を行うかあるいは４５℃以上でｐＨの中和一定制御 (6.5) を行う乳酸液の製造方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖質とその他の栄養成分等を高く含有するバイオマス原料を、殺菌することなく直接培養基として用い、ＤＬ乳酸生産菌（Lactobacillus plantarum）及び/あるいはＬ乳酸生産菌（Bacillus coagulans）を植菌した後、４５℃未満でｐＨの間欠的中和を行うかあるいは４５℃以上でｐＨの中和一定制御 （６.５）を行うことを特徴とする乳酸液の製造方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖質を高く含有すると共にその他の栄養成分を同時に含有する等、内容物が複雑で、雑菌、自然乳酸菌が多数生存している生ゴミや農産バイオマスを原料として、設備、エネルギーコストがかからず、かつ高圧蒸気滅菌などによる栄養成分の分解や発酵阻害物質の生成が回避できる非殺菌開放系で、ＤＬ乳酸（Lactobacillus plantarum）生産菌あるいはＬ乳酸（Bacillus coagulans）生産菌の選択的増殖を制御することで、廉価でかつ用途に応じた光学純度の乳酸を高収率で生産する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
乳酸は種々の食品添加物や工業用原料として重要な物質である。特に乳酸を化学的に重合することで得られる高分子ポリ乳酸はバイオマス由来プラスチック素材として近年大きく注目されている。３炭素化合物である乳酸の２位の炭素はメチル基、水酸基、カルボキシル基と結合する不斉炭素であり、その立体配座からＤ乳酸およびＬ乳酸の２種類の光学異性体（鏡像異性体）が存在する。世界的には現在、全生産量の90％が発酵法により、残り10％が化学的合成法により生産されている。
【０００３】
発酵法による乳酸生産では、グルコースや可溶性デンプンなどの炭素源と共にアミノ酸、ビタミン、無機質などを含む生産用培地を調製し、１２０℃以上の加熱・加圧と、密閉系による無菌的操作と培養が可能な装置を用い、１２０℃、２気圧で２０分間保つことで殺菌を施した後、乳酸生産菌を無菌的に植菌し、主に３０〜３７℃で発酵が行なわれていた。
【０００４】
発酵菌として使用される微生物には、Ｌ乳酸を主に生成する多くのラクトバチルス属の常温細菌（Lactobacillus rhamnosus，Lactococcus lactisなど）や、カビの一種Rhizopus oryzaeなどが用いられる事が総説にまとめられている（非特許文献１、非特許文献２）。また、Bacillus 属の細菌を用いることによるＬ乳酸の生産方法に関して特許が取得されている（特許文献１）。これとは別に、Bacillus coagulansを用いて膜分離を行いながら50℃にて連続的に乳酸を生産する方法が特許化されている（特許文献２）。これらの方法により光学純度 [（Ｌ乳酸-Ｄ乳酸）/（Ｌ乳酸＋Ｄ乳酸）×100(％)]が約90〜98％の乳酸が生産されていた。
【０００５】
１９９０年頃より再生可能なバイオマス原料から得られ、生分解性を有するプラスチックとしてポリ乳酸が注目され、その生産量は年々増加している。ポリ乳酸はＬまたはＤ乳酸あるいはそれらの混合物を脱水重合して得られるが、原料の光学活性が高い乳酸と光学活性が低い乳酸で、前者からは結晶性が高く堅いプラスチックが、後者からは結晶性が低く解けやすいポリ乳酸が得られる。例えば堅さが要求されるエンジニアリングプラスチックなどではポリＬ乳酸が主に用いられている。即ち光学純度の異なる乳酸はポリ乳酸プラスチックに求められる物性に応じた原料として使い分けられる。
【０００６】
一方、アセトニトリルを出発原料とする化学合成法では光学純度０%のＬ乳酸とＤ乳酸の混合物即ちラセミ乳酸が得られている。また、前述の総説にはＤＬ乳酸を生成するLactobacillus helveticus, Lactobacillus aminovorusによるラセミ乳酸の発酵生産の例も報告されている。ラセミ乳酸やそのエステルなどは食品添加物として用いられるが、このような用途では光学純度の高低はその効能と無関係である。
【０００７】
前記発酵法による乳酸液の製造においては、これまで均質に溶解可能な成分を適量混合溶解した後，高圧蒸気殺菌した培地で行われていた。しかしながら、乳酸菌やカビの増殖に必要な糖質、アミノ酸、ビタミンなどは高温処理に対して不安定で分解しやすく、それらが共存するとさらに分解反応が促進される。また、廃液の着色の原因となる褐変物質や発酵を阻害するフルフラールなどの望ましくない物質がこの殺菌工程で生じる。
従来のように、糖質、タンパク分解物、アミノ酸、ビタミンなど培養の各原料が純度高く精製されている場合にはそれぞれを個別に高圧蒸気滅菌した後混和する、あるいは熱を加えない濾過滅菌によって除菌する方法をとることで前述のような望ましくない分解を避けることができるが、その場合には前もって原料を精製する必要があり、また殺菌操作が煩雑で必要な設備も増加する。さらに、生ゴミや農産バイオマスなどのように必要な成分がその中に混在する原料を直接の発酵基質とする場合にはこのような個別の殺菌は不可能である。加えて、半固形あるいは懸濁物の形態をしているバイオマスでは上記のような濾過滅菌は適用できない。
【０００８】
これに対し、製造のための経済性を改善する試みとして、設備費や殺菌エネルギーを必要としない生ゴミの開放系発酵についても検討されている。粉砕した半固形生ゴミのpＨを間欠的に中和しながら保温すること（ｐＨ振幅変動制御）によって、特に乳酸生産微生物を植菌しない場合でも乳酸が高収率で高選択的 (>95%/全有機酸) に蓄積する事が申請者らにより見いだされている（非特許文献３）。
【０００９】
【非特許文献１】J. H. Litchfield著    「Microbiological production of lactic acid」Advances in Applied Microbiology 42巻45-95頁 １９９６年
【非特許文献２】K. Hofvendahl, B. H-Hagerdal著    「Factors affecting the fermentative lactic acid production from renewable resources」Enzyme and Microbial Technology ２６巻８７−１０７頁 ２０００年26:87-107 (2000).
【非特許文献３】K. Sakai, M. Yoshihiro, H. Yamazumi, Y. Tau, M. Mori, M. Moriguchi, Y. Shirai著    「Selective Proliferation of Lactic Acid Bacteria And Accumulation of Lactic Acid during Open Fermentation of Kitchen Refuse with Intermittent pH Adjustment.」Food Science and Technology Research ６巻１４０−１４５頁  ２０００年
【特許文献１】H. Ohara, M.Yahata, US Patent 5801025 １９９６年Method for producing L-lactic acid with high optical purity using bacillus strains (JP 7-280660, JP-280661)
【特許文献２】Van Nispen, Joannes G. M., Jonker, Ronald, US Patent 5002881  １９８９年Process for the fermentative preparation of organic acids.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで本発明の解決しようとする課題は、主に次の二つである。
1. 原料に加熱殺菌を施さずに培地として用いることで従来問題となっていた原料培地中の有効成分分解や発酵阻害物質生成を回避すると同時に発酵の高度な集中管理と殺菌設備を不要とする乳酸液の製造方法の開発。
2. 各種物性を与えるポリ乳酸の原料となる任意の光学純度の乳酸発酵液を得るための発酵制御法の開発。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、前記課題を解決するためになされたものでありその特徴とするところは、糖質とその他の栄養成分等を高く含有するバイオマス原料を、殺菌することなく直接培養基として用い、ＤＬ乳酸生産菌（Lactobacillus plantarum）及び/あるいはＬ乳酸生産菌（Bacillus coagulans）を植菌した後、４５℃未満でｐＨの間欠的中和を行うかあるいは４５℃以上でｐＨの中和一定制御 （６.５）を行う乳酸液の製造方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、食品生ゴミや農産物あるいはその搾汁液さらにはこれをアミラーゼなどで糖化処理した糖化液などの、糖質と共に多くの栄養成分を高く含有するバイオマス原料を、高圧蒸気滅菌などの殺菌を施さない無殺菌の状態で、３０〜３７℃で加温しながら一定時間毎に原料を中和することでｐＨを中性〜酸性の領域で振幅変動させる。また無殺菌の状態で、ＤＬ乳酸生産菌（Lactobacillus plantarum）及び/あるいはＬ乳酸生産菌（Bacillus coagulans ）もしくはそれと同等の好熱性Ｌ-乳酸生産菌の培養菌体を一定量植菌し、所定のｐＨを保ちながら３０〜６５℃の温度で加温することでＬ-乳酸の光学純度が0〜96％の発酵液を得ることができるものである。
これにより従来、高圧蒸気滅菌などにより天然発酵基質中に含有される糖質やビタミンなどの有効成分の分解、培地の褐変、フルフラールなどの発酵阻害物質の生成が避けられなかった高圧蒸気滅菌などの煩雑な工程を省略することができる。また、生ゴミや農産バイオマスなど常温の腐敗性微生物が多数生息する低品質の糖質バイオマスからも後段の用途に応じた種々の光学純度の乳酸を無菌操作に関する集中管理なしで容易に生産することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明を実施するための最良の形態は、次の３つに集約される。
(1). 生ゴミや農産廃棄物の破砕懸濁物、あるいはその搾汁液さらにはこれをアミラーゼなどで糖化処理した糖化液などの糖質と共に他の栄養成分を含有するバイオマス原料を、高圧蒸気滅菌などの殺菌を施さずに培養基として用い、この培養基にＤＬ乳酸生産菌（Lactobacillus plantarum）を104〜107となるように植菌した後、一定時間間隔、好ましくは6〜12時間毎にアルカリ剤を間欠添加して中和することを繰り返して、培養基のｐＨ環境を3.5〜7.0の弱酸性領域で振幅変動させながら、30〜40℃で保温することで、生成有機酸当たりの乳酸割合が高く、ほぼラセミ体に近い、低い光学純度の乳酸液を製造する方法。
(2).生ゴミや農産廃棄物の破砕懸濁物、あるいはその搾汁液さらにはこれをアミラーゼなどで糖化処理した糖化液などの糖質と共に他の栄養成分を含有するバイオマス原料を、高圧蒸気滅菌などの殺菌を施さずに培養基として用い、この培養基にＬ乳酸生産菌（Bacillus coagulans）を104〜107となるように植菌し、アルカリ剤を連続的に添加してｐＨを一定に、好ましくはｐＨ６.５に調整しながら５０〜６５℃、好ましくは５５℃に保つことで生成有機酸当たりの乳酸割合が高く、かつ９０％以上の高い光学純度のＬ乳酸液を製造する方法。
(3).生ゴミや農産廃棄物の破砕懸濁物、あるいはその搾汁液さらにはこれをアミラーゼなどで糖化処理した糖化液などの糖質と共に他の栄養成分を含有するバイオマス原料を、高圧蒸気滅菌などの殺菌を施さずに培養基として用い、この培養基にＤＬ乳酸生産菌（Lactobacillus plantarum）及びＬ乳酸生産菌（Bacillus coagulans）をそれぞれ104〜107となるように植菌し、一定時間間隔好ましくは６〜１２時間毎にアルカリ剤を間欠添加して中和し培養基のｐＨ環境を３.５〜７.０の弱酸性領域で振幅変動させながら４２〜４８℃で保つことで、生成有機酸当たりの乳酸割合が高く、20〜60％の光学純度を示すＬ乳酸液を製造する方法。
【００１４】
即ち本発明は、上記(1)の手段により無殺菌の該バイオマス原料から生成有機酸当たりの乳酸割合が高く、ほぼラセミ体に近い、低い光学純度の乳酸液が生産できる効果を得る。
また上記(2)の手段により無殺菌の該バイオマス原料から生成有機酸当たりの乳酸割合が高く、かつ９０%以上の高い光学純度のＬ乳酸液が生産できる効果を得る。
また上記(3)の手段により無殺菌の該バイオマス原料から生成有機酸当たりの乳酸割合が高く、２０〜６０%の光学純度を示すＬ-乳酸液が生産できる効果を得るものである。
【００１５】
これらの手段と効果は、図１〜図５に示すＤＬ乳酸生産菌（Lactobacillus plantarum）及びＬ乳酸生産菌（Bacillus coagulans）の培養実験により得た新知見によってもたらされたものである。
図１のグラフには、非殺菌実生ゴミ糖化液を５０℃でpHを一定に保ってＬ乳酸生産菌（Bacillus coagulans）を植菌した場合の発酵時間と生成した有機酸、全乳酸、Ｄ及びＬ乳酸量との関係を示すものである。これにより約３５g/lの可溶性糖質（内グルコース３０g/lを含む）と共に不溶性の基質を含む原料から、およそ４０g/lのＬ乳酸が９５%以上の光学純度で生成し、この際、Ｄ乳酸及び酢酸の生成がほとんど見られないことが判明した。
図２のグラフには、各pHに調整したMRS培地（１Ｌ中にグルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、肉エキス８ｇ、酢酸ナトリウム５ｇ、酵母エキス４ｇ、リン酸２カリウム２ｇ、クエン酸三アンモニウム２ｇ、硫酸マグネシウム０.２ｇ、硫酸マンガン０.０５ｇ、ソルビタンモノオレエート１ｍｌを含む）を用いてDＬ乳酸生産菌（Lactobacillus plantarum ）を静置培養した際の、培養時の初発ｐＨと生育度（６１０ｎｍにおける濁度）の関係を示し、図３のグラフには、Ｌ乳酸生産菌（Bacillus coagulans）を各pHに調整したMRS培地にて静置培養した際の、培養時の初発ｐＨと生育度（６１０ｎｍにおける濁度）の関係を示す。
これにより、両菌の最適ｐＨがそれぞれ６．５付近及び７．０付近であり、生育可能ｐＨ範囲がそれぞれ３．５〜８．５および５．０〜８．０ であることが判明したのである。
更に、図４のグラフには、pH６.２に調整したMRS培地を用いてDＬ乳酸生産菌（Lactobacillus plantarum ）を温度勾配培養装置を用いて各種温度にて静置培養した際の、その培養時の温度と生育度（６１０ｎｍにおける濁度）の関係を示し、図５のグラフには、pH６.２に調整したMRS培地を用いてＬ乳酸生産菌（Bacillus coagulans）を静置培養した際の、その培養時の温度と生育度（６１０ｎｍにおける濁度）の関係を示す。
これにより、Ｌ乳酸、Ｄ乳酸両菌の最適生育温度が、それぞれ３３℃及び５０℃前後であり、生育上限温度がそれぞれ４２℃および６５℃前後であることが判明したのである。
【実施例１】
【００１６】
本例における、糖質その他の栄養成分等を高く含有するバイオマス原料としては、標準生ごみであり、野菜：果実：焼き魚：米飯：茶殻=40：30：14：10：6(w/w)の割合で混ぜたものに重量と同量の水を加え、ミキサーにかけたものを使用した。野菜と果実については、人参の皮：キャベツ：ジャカイモの皮=1：1：1および、バナナの皮：リンゴの皮と芯：みかんの皮=1：1：1の比で使用した。
この標準生ゴミを調製後、30mlずつ５個の50mlファルコンチューブに小分けしてサンプルNo１〜No５とし、それぞれpHを7に調整した後に、MRS培地を用いて前培養したDＬ乳酸生産菌（Lactobacillus plantarum ）及びL乳酸生産菌（Bacillus coagulans）の菌液を100μl加えて混和し、３７−５５℃で静置することで発酵を開始した。
以後全サンプルを、24時間おきに1mlずつサンプリングすると同時に、サンプルNo２、No４、No５は、10N NaOHもしくは7% アンモニアを用いてpHを7に調整し、調整前後はガラス棒を用いてよく攪拌し、調整時のｐＨが5.5以下に下がらなくなったところで発酵終了とした。サンプルNo３は、7% アンモニアを用いてpHを7に連続調整した。
発酵終了後、24時間ごとのサンプルの乳酸蓄積量g/l、全有機酸当たり乳酸比率％、光学純度％を測定し、その結果を表１に記載した。
【００１７】
【表１】
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【実施例２】
【００１８】
pH一定制御による生ごみの開放系乳酸発酵は、糖質その他の栄養成分を高く含有するバイオマス原料として、商業施設から回収した生ゴミに２０％（V/W）の水とグルコアミラーゼ（最終濃度0.03％）を加えて５０℃にて８時間回転撹拌した後、100ｍｍ２メッシュの篩にて得られた濾液（：実生ごみ糖化液）を用い、全容2L小型多目的培養装置、pH計測器及び6打点式記録計（ABLE製）で行った。
前述のMRS液体培地5mlに、L乳酸生産菌（Bacillus coagulans）を24hr、50℃で静置培養し、洗菌、集菌した菌液100μlを標準生ごみ30mlに添加し、50℃で、24hr静置培養した。その30mlを、全容2L小型多目的培養装置に殺菌を施さずに加えた1.5Lの前記実生ごみ糖化液に入れ、10%NH3でpH6.5の一定制御のもと、６０ｒｐｍで回転撹拌しながら５０℃に保った。
その結果、有機酸当たりの乳酸比率が97％と高く、かつ95％の高い光学純度の乳酸液を得ることができた。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
これにより生ゴミや農産物など常温の腐敗性微生物が生息するにもかかわらず、乳酸発酵のための糖質や微生物の増殖に必要な栄養物が混在して高圧蒸気滅菌などによる分解が避けられないバイオマスから、低設備費、低エネルギーで望まれる光学純度を示す乳酸を高収率で生産することが可能である。
また、固定化菌体や膜分離などを伴う連続発酵法で且つその殺菌法が難しいとされていた工程にも応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明における非殺菌実生ゴミ糖化液を５０℃でpHを一定に保ってBacillus coagulansを植菌した場合の発酵時間と生成した有機酸、全乳酸、Ｄ及びＬ乳酸量との関係を示すグラフ。
【図２】本発明におけるLactobacillus plantarum の、培養時の初発ｐＨと生育度（６１０ｎｍにおける濁度）の関係を示すグラフ。
【図３】本発明におけるBacillus coagulansの、培養時の初発ｐＨと生育度（６１０ｎｍにおける濁度）の関係を示すグラフ。
【図４】本発明におけるLactobacillus plantarum の、培養時の温度と生育度（６１０ｎｍにおける濁度）の関係を示すグラフ。
【図５】本発明におけるBacillus coagulansの、培養時の温度と生育度（６１０ｎｍにおける濁度）の関係を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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