(57)【要約】 【課題】  本発明の目的は、哺乳動物の神経系の発達を促進するための組成物、方法、又は使用等を供することである。【解決手段】  哺乳動物の神経系の発達を促進するための、脂肪酸結合タンパク質（FABP）画分を活性成分として含む、組成物、哺乳動物にFABP画分を投与することを含む、哺乳動物の神経系の発達を促進する方法、及び神経系発達促進組成物を製造するためのFABP画分の使用等を供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の神経系の発達を促進するための、脂肪酸結合タンパク質（FABP）画分を活性成分として含む、組成物。
【請求項２】
前記FABP画分が、心臓型脂肪酸結合タンパク質（H-FABP）画分である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記FABP画分が、H-FABPである請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、スプレー、粉体、液体、ゲル、クリーム、泡状体、ゼリー状体、結晶体、リポソーム、又は懸濁液の形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
乳児に投与するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
食品に添加するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物を含む人口乳。
【請求項８】
哺乳動物にFABP画分を投与することを含む、哺乳動物の神経系の発達を促進する方法。
【請求項９】
神経系発達促進組成物を製造するためのFABP画分の使用。
【請求項１０】
哺乳動物のフェロモン受容体の発現を促進するための、FABP画分を活性成分として含む、組成物。
【請求項１１】
前記フェロモン受容体がV2R型フェロモン受容体である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記フェロモン受容体がV2R型フェロモン受容体のVR1、VR4、又はVR1及びVR4である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記FABP画分がH-FABP画分である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記FABP画分がH-FABPである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、スプレー、粉体、液体、ゲル、クリーム、泡状体、ゼリー状体、結晶体、リポソーム、又は懸濁液の形態である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
乳児に投与するための、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
食品に添加するための、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の組成物を含む、人工乳。
【請求項１９】
哺乳動物にFABP画分を投与することを含む、哺乳動物のフェロモン受容体の発現を促進する方法。
【請求項２０】
前記フェロモン受容体がV2R型フェロモン受容体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記フェロモン受容体がV2R型フェロモン受容体のVR1、VR4、又はVR1及びVR4である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
フェロモン受容体の発現を促進するための組成物を製造するためのFABP画分の使用。
【請求項２３】
フェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防又は治療するために有効な量のFABP画分を含む、フェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防又は治療するための組成物。
【請求項２４】
前記FABP画分がH-FABP画分である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記FABP画分がH-FABPである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記フェロモン受容体がV2R型フェロモン受容体である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記フェロモン受容体がV2R型フェロモン受容体のVR1、VR4、又はVR1及びVR4である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物が、スプレー、粉体、液体、ゲル、クリーム、泡状体、ゼリー状体、結晶体、リポソーム、又は懸濁液の形態である請求項２３に記載の組成物。
【請求項２９】
フェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防又は治療するのに有効な量のFABP画分を、必要な対象者に投与することを含む、フェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防又は治療する方法。
【請求項３０】
噴霧によりエーロゾルとして投与する請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
フェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防又は治療するための組成物を製造するためのFABP画分の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経系の発達を促進するための組成物、神経系の発達を促進するための方法、及び神経系の発達を促進するための組成物の製造のための特定化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸の細胞内輸送に関与するタンパク質として、脂肪酸結合タンパク質（FABP）がある。FABPは、長鎖脂肪酸に結合する分子量１４kDa〜１６kDaの細胞質タンパク質である。このタンパク質には、配列相同性を有するいくつかのタイプが存在し、最初に単離された場所に従って、肝臓型 (L-FABP)、小腸型 (I-FABP)、心臓型（H-FABP）などの型がある。
【０００３】
特に、心臓型脂肪酸結合タンパク質（H-FABP）は、心臓、骨格筋、胃、精巣、腎臓及び乳腺など広範な組織に分布する、分子量約１５ｋDのタンパク質である。このタンパク質は、ポリ不飽和脂肪酸(リノール酸、アラキドン酸及びリノレン酸)の細胞内輸送に関与することが知られている（非特許文献１〜４）。また、H-FABPは、心筋細胞内の含有量が多いため、心筋梗塞等、心筋障害のマーカーとして利用されている（特許文献１〜３）。
【０００４】
一方、情動障害、例えばADHDの治療薬として、中枢刺激薬としてのatomoxetine(非特許文献５)や向精神薬としてのmethylphenidate (非特許文献６)、amphetamine(非特許文献７)などがある。
【０００５】
【非特許文献１】J. H. Veerkamp, R. A. Peeters, R. G. Maatman, Biochim Biophys Acta 1081, 1 (1991).
【非特許文献２】J. H. Veerkamp, T. H. van Kuppevelt, R. G. Maatman, C. F. Prinsen, Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 49, 887 (1993).
【非特許文献３】D. A. Bernlohr, M. A. Simpson, A. V. Hertzel, L. J. Banaszak, Annu Rev Nutr 17, 277 (1997).
【非特許文献４】T. Hanhoff, C. Lucke, F. Spener, Mol Cell Biochem 239, 45 (2002).
【非特許文献５】Caballero J, Nahata MC., Clin Ther. 2003 Dec;25(12):3065-83.
【非特許文献６】Aron AR, Dowson JH, Sahakian BJ, Robbins TW., Biol Psychiatry. 2003 Dec 15;54(12):1317-29.
【非特許文献７】Kollins SH., J Clin Psychiatry. 2003;64 Suppl 11:14-8.
【特許文献１】米国特許第5,690,103号明細書(Groth , et al.)
【特許文献２】米国特許第6,099,469号明細書(Armstrong , et al.)
【特許文献３】米国特許第6,443,889号明細書(Groth , et al.)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、神経系の発達を促進するための組成物、神経系の発達を促進するための方法、及び神経系の発達を促進するための組成物を製造するための特定化合物の使用等を供することである。また、本発明の目的は、フェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防又は治療するための組成物、フェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防又は治療するための方法、及びフェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防又は治療するための組成物を製造するための特定化合物の使用等を供することでもある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様において、本発明は、哺乳動物の神経系の発達を促進するための、脂肪酸結合タンパク質（FABP）画分を活性成分として含む、組成物を供する。好ましくは、前記FABP画分は、心臓型脂肪酸結合タンパク質（H-FABP）画分であり、より好ましくは前記FABP画分は、H-FABPである。好ましくは、前記組成物は、経鼻もしくは経口による投与、又は噴霧による投与に適した形態のものである。また、好ましくは前記組成物は、スプレー、粉体、液体、ゲル、クリーム、泡状体、ゼリー状体、結晶体、リポソーム、又は懸濁液の形態である。好ましくは、前記組成物は、乳児、より好ましくは新生児に投与するための組成物である。また、好ましくは前記組成物は食品に添加するための組成物である。他の態様において、本発明は、前記組成物を含む食品、特に人口乳を供する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、哺乳動物にFABP画分を投与することを含む、哺乳動物の神経系の発達を促進する方法に関する。好ましくは、前記FABP画分は、心臓型脂肪酸結合タンパク質（H-FABP）画分であり、より好ましくは前記FABP画分は、H-FABPである。好ましくは、前記投与は、経鼻もしくは経口による投与、又は噴霧による投与である。また、好ましくは前記FABP画分は、スプレー、粉体、液体、ゲル、クリーム、泡状体、ゼリー状体、結晶体、リポソーム、又は懸濁液の形態で投与される。好ましくは、投与は、乳児、より好ましくは新生児に対して行われる。また、好ましくは前記FABP画分は食品に添加して投与される。
【０００９】
別の態様において、本発明は、神経系発達促進組成物を製造するためのFABP画分の使用に関する。好ましくは、前記FABP画分は、心臓型脂肪酸結合タンパク質（H-FABP）画分であり、より好ましくは前記FABP画分は、H-FABPである。好ましくは、前記神経系発達促進組成物は、経鼻もしくは経口による投与、又は噴霧による投与に適した形態のものである。また、好ましくは前記神経系発達促進組成物は、スプレー、粉体、液体、ゲル、クリーム、泡状体、ゼリー状体、結晶体、リポソーム、又は懸濁液の形態である。好ましくは、前記神経系発達促進組成物は、乳児、より好ましくは新生児に投与するためのものである。また、好ましくは前記神経系発達促進組成物は食品に添加して投与される。
【００１０】
別の態様において、本発明は、哺乳動物のフェロモン受容体の発現を促進するための、FABP画分を活性成分として含む、組成物を供する。好ましくは、前記フェロモン受容体はV2R型フェロモン受容体、より好ましくはV2R型フェロモン受容体のVR1、VR4、又はVR1及びVR4である。好ましくは、前記FABP画分は、心臓型脂肪酸結合タンパク質（H-FABP）画分であり、より好ましくは前記FABP画分は、H-FABPである。好ましくは、前記組成物は、経鼻もしくは経口による投与、又は噴霧による投与に適した形態のものである。また、好ましくは前記組成物は、スプレー、粉体、液体、ゲル、クリーム、泡状体、ゼリー状体、結晶体、リポソーム、又は懸濁液の形態である。好ましくは、前記組成物は、乳児、より好ましくは新生児に投与するための組成物である。また、好ましくは前記組成物は食品に添加するための組成物である。他の態様において、本発明は、前記組成物を含む食品、特に人口乳を供する。
【００１１】
他の態様において、本発明は、哺乳動物にFABP画分を投与することを含む、哺乳動物のフェロモン受容体の発現を促進する方法を供する。好ましくは、前記フェロモン受容体はV2R型フェロモン受容体、より好ましくはV2R型フェロモン受容体のVR1、VR4、又はVR1及びVR4である。好ましくは、前記FABP画分は、心臓型脂肪酸結合タンパク質（H-FABP）画分であり、より好ましくは前記FABP画分は、H-FABPである。好ましくは、前記投与は、経鼻もしくは経口による投与、又は噴霧による投与である。また、好ましくは前記FABP画分は、スプレー、粉体、液体、ゲル、クリーム、泡状体、ゼリー状体、結晶体、リポソーム、又は懸濁液の形態で投与される。好ましくは、投与は、乳児、より好ましくは新生児に対して行われる。また、好ましくは前記FABP画分は食品に添加して投与される。
【００１２】
別の態様において、本発明は、フェロモン受容体の発現を促進するための組成物を製造するためのFABP画分の使用に関する。好ましくは、前記フェロモン受容体はV2R型フェロモン受容体、より好ましくはV2R型フェロモン受容体のVR1、VR4、又はVR1及びVR4である。好ましくは、前記FABP画分は、心臓型脂肪酸結合タンパク質（H-FABP）画分であり、より好ましくは前記FABP画分は、H-FABPである。また、好ましくは前記組成物は、スプレー、粉体、液体、ゲル、クリーム、泡状体、ゼリー状体、結晶体、リポソーム、又は懸濁液の形態である。好ましくは、前記組成物は、経鼻もしくは経口による投与、又は噴霧による投与に適した形態のものである。好ましくは、前記組成物は、乳児、より好ましくは新生児に投与するためのものである。また、好ましくは前記組成物は食品に添加して投与される。
【００１３】
別の態様において、本発明は、フェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防又は治療するために有効な量のFABP画分を含む、フェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防又は治療するための組成物に関する。好ましくは、前記フェロモン受容体はV2R型フェロモン受容体、より好ましくはV2R型フェロモン受容体のVR1、VR4、又はVR1及びVR4である。好ましくは、前記FABP画分は、心臓型脂肪酸結合タンパク質（H-FABP）画分であり、より好ましくは前記FABP画分は、H-FABPである。また、好ましくは前記組成物は、スプレー、粉体、液体、ゲル、クリーム、泡状体、ゼリー状体、結晶体、リポソーム、又は懸濁液の形態である。好ましくは、前記組成物は、経鼻もしくは経口による投与、又は噴霧による投与に適した形態のものである。また、好ましくは前記組成物は食品に添加するための組成物である。他の態様において、本発明は、前記組成物を含む食品、特に人口乳を供する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、フェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防又は治療するのに有効な量のFABP画分を、必要な対象者に投与することを含む、フェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防又は治療する方法を供する。好ましくは、前記方法は、噴霧によりエーロゾルとして投与する。好ましくは、前記フェロモン受容体はV2R型フェロモン受容体、より好ましくはV2R型フェロモン受容体のVR1、VR4、又はVR1及びVR4である。好ましくは、前記FABP画分は、心臓型脂肪酸結合タンパク質（H-FABP）画分であり、より好ましくは前記FABP画分は、H-FABPである。また、また、好ましくは前記FABP画分は、スプレー、粉体、液体、ゲル、クリーム、泡状体、ゼリー状体、結晶体、リポソーム、又は懸濁液の形態で投与される。また、好ましくは前記FABP画分は食品に添加して投与される。
【００１５】
別の態様において、本発明は、フェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防又は治療するための組成物を製造するためのFABP画分の使用を供する。好ましくは、前記フェロモン受容体はV2R型フェロモン受容体、より好ましくはV2R型フェロモン受容体のVR1、VR4、又はVR1及びVR4である。好ましくは、前記FABP画分は、心臓型脂肪酸結合タンパク質（H-FABP）画分であり、より好ましくは前記FABP画分は、H-FABPである。また、好ましくは前記組成物は、スプレー、粉体、液体、ゲル、クリーム、泡状体、ゼリー状体、結晶体、リポソーム、又は懸濁液の形態である。好ましくは、前記組成物は、経鼻もしくは経口による投与、又は噴霧による投与に適した形態のものである。また、好ましくは前記組成物は食品に添加して投与される。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物の神経系の発達を促進するため、哺乳動物のフェロモン受容体の発現を促進するため、またはフェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防もしくは治療するための、母乳抽出物を含む組成物を供する。好ましくは、前記フェロモン受容体はV2R型フェロモン受容体、より好ましくはV2R型フェロモン受容体のVR1、VR4、又はVR1及びVR4である。好ましくは、前記母乳抽出物は、１００ｋDa未満のタンパク質を含む画分、より好ましくは１０ｋDa〜１００ｋDaのタンパク質を含む画分である。好ましくは、前記組成物は、経鼻もしくは経口による投与、又は噴霧による投与に適した形態のものである。また、好ましくは前記組成物は、スプレー、粉体、液体、ゲル、クリーム、泡状体、ゼリー状体、結晶体、リポソーム、又は懸濁液の形態である。好ましくは、前記組成物は、乳児、より好ましくは新生児に投与するための組成物である。また、好ましくは前記組成物は食品に添加するための組成物である。他の態様において、本発明は、前記組成物を含む食品、特に人口乳を供する。また、本発明は、前記組成物を製造するための母乳抽出物の使用、または母乳抽出物を投与することを含む、哺乳動物の神経系の発達を促進するため、哺乳動物のフェロモン受容体の発現を促進するため、もしくはフェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防もしくは治療するための方法も供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明による組成物、方法、又は使用によれば、哺乳動物の神経系の発達を促進することができる。また、本発明による組成物、方法、又は使用によれば、フェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防又は治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
１．定義
本明細書において、用語「FABP画分」とは、脂肪酸結合タンパク質（FABP）又はそのフラグメント、変異体、誘導体もしくは類似体、又はFABPに結合もしくは会合する物質を意味し、これらの１又は複数の混合物も含むことを意図する。例えば、FABPの機能的誘導体や、FABPとこれに結合している物質との結合体・複合体も「FABP画分」に含まれる。
【００１９】
用語「H-FABP画分」とは、心臓型脂肪酸結合タンパク質（H-FABP）又はそのフラグメント、変異体、誘導体もしくは類似体、又はH-FABPに結合もしくは会合する物質を意味し、これらの１又は複数の混合物も含むことを意図する。例えば、H-FABPの機能的誘導体や、H-FABPとこれに結合している物質との結合体・複合体も「H-FABP画分」に含まれる。
【００２０】
用語「FABP」は、低分子量（１４〜１５ｋDa）の細胞内脂質結合タンパク質のファミリーである脂肪酸結合タンパク質（FABP）に属するタンパク質をいい、例えば心臓型脂肪酸結合タンパク質（H-FABP）、肝臓型脂肪酸結合タンパク質(L-FABP)、脂肪細胞型脂肪酸結合タンパク質(A-FABP)、ミエリン型脂肪酸結合タンパク質（M-FABP）、小腸型脂肪酸結合タンパク質(I-FABP)、上皮型脂肪酸結合タンパク質（E-FABP）、脳型脂肪酸結合タンパク質（B-FABP）、等を含む（Veerkamp JH., Proc Nutr Soc. 1995 Mar;54(1):23-37.; Banaszak L, Winter N, Xu Z, Bernlohr DA, Cowan S, Jones TA., Adv Protein Chem. 1994;45:89-151.;これらの内容の全ては引用により本明細書に組み込まれる）。これらは、天然、合成、又は半合成のものであってよい。さらに、本明細書中に用いる場合、「FABP」は、天然に存在するものと完全に同一な形態・構成を有するFABPのみを指すのではなく、FABPのフラグメント、すなわち任意のFABPアミノ酸配列の一部分からなる分子、及び任意のFABPのアミノ酸配列中の１又は複数個(好ましくは１〜５個)のアミノ酸残基が欠失・置換及び/又は付加されたアミノ酸配列を有するもの、任意のFABPのアミノ酸配列に対して少なくとも90％以上の同一性を有する配列からなるタンパク質、任意のFABPに何らかの化合物による修飾を施したものなどを含む、FABPの変異体、誘導体、類似体をも包含する。
【００２１】
用語「H-FABP」は、心臓型脂肪酸結合タンパク質（H-FABP）又はこの等価物、例えばFABP3、心筋型脂肪酸結合タンパク質、骨格筋型脂肪酸結合タンパク質、乳腺由来成長インヒビター（MDGI）(Bohmer FD, Kraft R, Otto A, Wernstedt C, Hellman U, Kurtz A, Muller T, Rohde K, Etzold G, Lehmann W, et al., J Biol Chem. 1987 Nov 5;262(31):15137-43.；これらの内容の全ては引用により本明細書に組み込まれる)をいう。これらは、天然、合成、又は半合成のものであってよい。
【００２２】
用語「乳児」とは、出生直後から完全に離乳するまでの間にある子供をいい、ヒトの場合、通常、２歳以下の子供を意味する。また、用語「新生児」は、１ヶ月未満の子供を意味する。
【００２３】
用語「人工乳」は、母乳そのもの以外の母乳擬似物をいい、経口摂取用乳加工品又は乳調整品を含む。
【００２４】
用語「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、又はペット用動物を含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００２５】
用語「対象者」は、治療又は予防を必要とするすべての者を含み、現在、病気にかかっている者に加えて、将来、病気にかかるおそれのある者、病気にかかる可能性が高いと診断されている者、又は健康な者を含む。
【００２６】
予防又は治療に「有効な量」、又は「有効量」とは、予防的又は治療的効果を得るために必要な量を意味し、例えば神経系の発達を促進するのに必要な量、特にフェロモン受容体の発現を促進するのに必要な量、フェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防又は治療するのに必要な量を意味する。
【００２７】
用語「フェロモン受容体の発現が関与する疾患」は、フェロモン受容体の発現の変化を原因として生じ得る全ての疾患を含み、たとえば情動関連障害を含む。用語「情動関連障害」は、広義に解釈し、いわゆる行動障害、例えば、注意欠陥/多動性障害（ＡＤＨＤ）、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、不安、パニック障害、うつ病、自閉症、睡眠障害、並びにツレット症候群等を含む。
【００２８】
２．脂肪酸結合タンパク質（FABP）
脂肪酸結合タンパク質は、細胞質内で疎水性化合物の輸送媒介物質として機能する物質である。それは、特に脂質輸送及び代謝に関与し、細胞質内に豊富に存在する。このタンパク質は、遊離脂肪酸や、これらのCoA誘導体に結合することが知られている。このタンパク質ファミリーには、肝臓型脂肪酸結合タンパク質(L-FABP)、小腸型脂肪酸結合タンパク質(I-FABP)、心臓型脂肪酸結合タンパク質（H-FABP）、脂肪細胞型FABP(A-FABP)、上皮型脂肪酸結合タンパク質（E-FABP）などが知られている。
【００２９】
以下、H-FABPについて説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。例えば他のFABPの製造についても、H-FABP同様の方法で行うことができる。
【００３０】
３．心臓型脂肪酸結合タンパク質（H-FABP）
H-FABPは、心臓、骨格筋、胃、精巣、腎臓及び乳腺など広範な組織に分布する、分子量約１５ｋDのタンパク質である。このタンパク質は、ポリ不飽和脂肪酸(リノール酸、アラキドン酸及びリノレン酸)の細胞内輸送に関与することが知られている。
【００３１】
H-FABPは、心臓組織から精製されているが（van Nieuwenhoven FA, Vork MM, Surtel DA, Kleine AH, van der Vusse GJ, Glatz JF., J Chromatogr. 1991 Sep 18;570(1):173-9.）、母乳から当業者に周知の方法で精製することができる(Grosse R, Boehmer FD, Langen P, Kurtz A, Lehmann W, Mieth M, Wallukat G., Methods Enzymol. 1991;198:425-40; Vitaly L. Spitsberg and R.C.Gorewit, Pakistan Journal of Nutrition 1(1): 43-48, 2002；これらの内容の全ては、引用により本明細書に組み込まれる)。例えば、分子サイズに基づいて遠心分離もしくはカラムクロマトグラフィにより分画するか、又は抗体を用いてアフィニティ精製することで、H-FABPを得ることができる。
【００３２】
また、H-FABPは、遺伝子組換え技術を用いて大腸菌又は酵母等から発現させ、これを精製することで大量生産することができる(Peeters RA, Veerkamp JH, Geurts van Kessel A, Kanda T, Ono T., Biochem J. 1991 May 15;276 ( Pt 1):203-7. ; Peeters RA, Ena JM, Veerkamp JH., Biochem J. 1991 Sep 1;278 ( Pt 2):361-4.; Schaap FG, Specht B, van der Vusse GJ, Borchers T, Glatz JF., J Chromatogr B Biomed Appl. 1996 Apr 26;679(1-2):61-7.；これらの内容の全ては、引用により本明細書に組み込まれる)。これらの方法はすでに公知であり、当業者であれば容易に実施することができる。H-FABPをコードするヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えばGENBANK等の遺伝子配列のデータベース等から容易に得ることができる。例えば、DBGETのデータベースでは、ウシH-FABPは登録番号[P10790]として、ヒトH-FABPは登録番号[P05413]として、マウスH-FABPは登録番号[P11404]として、ブタH-FABPは登録番号[O02772]として、ラットH-FABPは登録番号[P07483]として登録されている。また、上記以外の動物種のH-FABPをコードするヌクレオチド配列は、上記の既知の配列をプローブとして、対象とする動物種のゲノムDNA又はcDNAサンプルからクローニングして配列決定するなど、周知の方法で得ることができる。
【００３３】
４．組成物
このようにして得られたFABP画分を含む組成物は、哺乳動物の神経系の発達を促進するため、哺乳動物のフェロモン受容体の発現を促進するため、又はフェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防又は治療するための組成物として用いることができる。
【００３４】
５．食品添加物としての使用
本発明によるFABP画分を含む組成物は、食品添加物として、食品に、例えば人工乳に添加することができる。
【００３５】
特に、本発明による組成物等を人工乳、特に粉ミルクに添加し、それを通常の人工乳又は粉ミルクを調製するのと同様に調製して、供することが好ましい。H-FABPは可溶性タンパク質であるため、人工乳に混合することが容易であるという利点がある。
【００３６】
添加する量は、対象となる動物種、体重、摂取量によりさまざまであるが、望ましくは、母乳中に含まれる量と同等になる程度に混合することがよい。一般的には、食品、好ましくは人口乳、特に粉ミルクに対して0.1〜10％好ましくは、0.5〜2％程度（W/W）とすることができる。
【００３７】
本発明による組成物は、食品に添加し得る形態、例えば凍結乾燥粉体、又は液体等であってよく、これらを食品に添加することができる。また、これら組成物を添加した食品、特に人口乳も本発明の対象である。これは、例えば粉ミルクに予め凍結乾燥粉体を混合しておき、H-FABP含有粉ミルクという形態で供することができる。
【００３８】
特に人口乳に用いる場合、H-FABPは必須脂肪酸であるリノール酸、アラキドン酸及びα-リノレン酸と結合することが知られている。特に、α-リノレン酸は、ドコサヘキサ塩酸(DHA)を生合成するための原材料であり、有益性が認められている物質である。脂肪酸は水溶液への可溶性が低いため、経口摂取乳加工品として摂取できる量には限度がある。水溶性タンパク質であるH-FABPと必須脂肪酸を混合することにより、H-FABPが必須脂肪酸の輸送担体として働き、水溶液への必須脂肪酸の可溶性を増加させるという更なる利点もある。
【００３９】
６．医薬組成物としての使用
さらに、得られたH-FABP又はH-FABPを含む画分もしくは組成物は、医薬組成物として供することもできる。好ましくは、本組成物は、医薬として又は生理学的に許容され得る担体を含む。さらに、本発明による組成物に、一又は複数の他の活性成分と組み合わせて、例えば他の神経系作用物質等と組み合わせて用いることもできる。
【００４０】
「担体」には、医薬として許容される担体 、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる量又は濃度の範囲内で対象者又は哺乳動物に対して非毒性のものである。担体は、有機酸緩衝液、たとえばリン酸塩もしくはクエン酸塩；酸化防止剤、たとえばアスコルビン酸；ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、たとえばポリビニルピロリドン；アミノ酸、たとえばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジン；炭水化物、たとえば単糖類、たとえばグルコース、アラビノースもしくはマンノース、二糖類、たとえばラクトース、サッカロース、マルトース、多糖類、たとえばデキストラン；キレート剤、たとえばＥＤＴＡ；糖アルコール、たとえばキシリトール、マンニトール、もしくはソルビトール；塩類、たとえば塩化ナトリウム、炭酸カルシウム；又は非イオン性界面活性剤、たとえばポリエチレングリコール、TWEEN(商標)、もしくはPLURONIC(商標)等を含む。これらを組み合わせて用いてもよい。
【００４１】
本発明による組成物の投与方法は、所望の効果が得られればいかなる方法でもよいが、経口により、経鼻により、経粘膜により、又は吸入法により、例えば噴霧により投与することができる。特に、経口投与もしくは経鼻投与、又は吸入法により投与することが好ましい。
【００４２】
本発明による組成物は、これら投与方法に適した投与形態、例えば、スプレー、粉体、液体、ゲル、クリーム、泡状体、ゼリー状体、結晶体、リポソームもしくは他のミセル、溶液、懸濁液等とすることができる。これらを、液剤、分散剤、乳剤、懸濁剤、生物接着性ゲル又は非生物接着性ゲル、散剤、ミクロスフェア、トローチ剤、錠剤、チューインガム剤、錠剤、カプセル、ドレジェー、除放製剤等として投与することができる。これらを組み合わせて投与することもできる。
【００４３】
特に、経鼻投与又は吸入による投与の場合には、スプレー、エーロゾル、通気器、又は吸入器等を用いて、液体製剤、半固体製剤又は粉末製剤等の乾燥製剤として投与することができる。また、噴霧されるスプレー容器から出る液体もしくは懸濁剤の形態で、又は適切な噴射剤等を用いて加圧容器等から噴霧されるエーロゾルスプレーとして投与することができる。
【００４４】
エーロゾルによる投与の場合には、製剤は、小粒子の形態、例えば５ミクロン以下の小粒子の形態であることが好ましい。このような粒子は、当該技術分野で周知の方法を用いて得ることができる。活性成分は、適切なプロペラント（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタンもしくはジクロロテトラフルオロエタン等のクロロフルオロカーボン、又は二酸化炭素等のガス）を用いて投与することができる。エーロゾル剤に、レクチン等の界面活性剤を含めてもよい。乾燥粉末の場合には、例えば乾燥基剤（例えば、ラクトース、デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等のデンプン誘導体）の粉末状混合物として投与することができる。これらの投与形態は、当該技術分野で周知の技術を用いて調製することができる。
【００４５】
本発明による組成物の投与量は、所望の効果が得られる量、例えば治療又は予防に有効な量であればいかなる量であってもよい。
【００４６】
また、H-FABPは、可溶性タンパク質であり、冷凍保存、凍結乾燥保存等により、簡便に保存することができる。このため、粉体として製造して、投与前に、水溶性担体又は水で懸濁又は溶解して投与することができる。また、1回用量ずつ、小分けして保存できる形態としてもよい。
【００４７】
７．本発明による方法及び使用
以上及び後述の定義及び説明等は、主に本発明による組成物、特に哺乳動物の神経系の発達を促進するための組成物、哺乳動物のフェロモン受容体の発現を促進するための組成物、フェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防又は治療するための組成物に関するものであるが、これらは、このまま本発明による方法、特に哺乳動物の神経系の発達を促進する方法、哺乳動物のフェロモン受容体の発現を促進する方法、及びフェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防又は治療する方法、ならびに、本発明による使用、特に神経系発達促進組成物を製造するための使用、フェロモン受容体の発現を促進するための組成物を製造するための使用、及びフェロモン受容体の発現が関与する疾患を予防又は治療するための組成物を製造するための使用等にも同様に適用される。
【００４８】
以下、H-FABPの例、マウスの鋤鼻器（VNO）に存在するフェロモン受容体VR1及びVR4の例、並びに乳児もしくは新生児に投与する例について記載するが、本発明はこれに限られるものではない。また、以下、必要に応じて他の文献を引用するが、これらの内容の全ては、引用により本明細書に組み込まれる。
【００４９】
哺乳類の鋤鼻器
哺乳類の鋤鼻器 (VNO)は鼻中隔に存在し、細管により鼻腔へと繋がっている。VNO中の感覚ニューロンは嗅球(AOB)へと軸索を投影している。VNOからAOBへの経路に傷害又は遺伝的不活性因子がある場合、性認識及び交配行動に異常を示す場合があることが、マウスにおいて報告されている(E. B. Keverne, Trends in Neurosciences 6, 381 (1983); L. Stowers, T. E. Holy, M. Meister, C. Dulac, G. Koentges, Science 295, 1493 (2002); B. G. Leypold et al., Proc Natl Acad Sci U S A 99, 6376 (2002); K. Del Punta et al., Nature 419, 70 (2002).)。従って、VNO-AOBは、社会コミュニケーション、生殖行動及び内分泌腺の反応に影響するフェロモンの検知に必要な領域であると考えられている。さらに母体とその子供は、フェロモンによって互いにコミュニケートすることも明らかにされており、母体-子供間の結びつき（絆）と母乳による子育ての間に関連があることが定説となってきている(R. H. Porter, J. Winberg, Neurosci Biobehav Rev 23, 439 (1999); B. Schaal et al., Nature 424, 68 (2003))。
【００５０】
近年の研究で、推定上のフェロモン受容体が、VNO(C. Dulac, R. Axel, Cell 83, 195 (1995);G. Herrada, C. Dulac, Cell 90, 763 (1997);H. Matsunami, L. B. Buck, Cell 90, 775 (1997);N. J. Ryba, R. Tirindelli, Neuron 19, 371 (1997))からクローニングされたことが報告された。これらのフェロモン受容体は、受容体のG-タンパク質共役型レセプターファミリーのメンバーで、2つのグループに大別された(R. Tirindelli, C. Mucignat-Caretta, N. J. Ryba, Trends Neurosci 21, 482 (1998);E. B. Keverne, Science 286, 716 (1999);C. Dulac, A. T. Torello, Nat Rev Neurosci 4, 551 (2003))。1つのタイプはV1Rと命名され、これらはN末端に、短い細胞外領域を有しており、もう一方のタイプであるV2Rタイプは、N末端の細胞外領域が非常に長いという特徴を有している。V1Rは揮発性のフェロモン分子に応答するのに対し、V2Rはリポカリンのような不揮発性のフェロモンの分子に応答する(R. Tirindelli, C. Mucignat-Caretta, N. J. Ryba, Trends Neurosci 21, 482 (1998);E. B. Keverne, Science 286, 716 (1999);C. Dulac, A. T. Torello, Nat Rev Neurosci 4, 551 (2003)) 。これらのフェロモン受容体は母体とその子供の間のフェロモンによるコミュニケーションに関与すると考えられている。
【００５１】
哺乳動物と母乳
一方、哺乳動物は、出生後ある程度の期間、母体より授乳を受ける必要があるが、現代社会においては、動物園や畜産業用施設等の人工的飼育環境で産まれる非ヒト哺乳動物も多く、これらの哺乳動物は、その環境や母体の状態などにより、母体から授乳を受けられない場合も多い。
【００５２】
また、ヒトの場合でも、様々な要因により母体からの授乳を全く又は充分に受けることができない乳児も多く、またその数は近年増加傾向にあると推測される。かかる乳児は、人工乳により栄養を受けて育てられる場合が多い。かかる人工乳には、各種ミネラル等の微量栄養素、エネルギー源としての乳糖、及びタンパク質等の乳児の健全な発育に必要と考えられる栄養素が含まれている。
【００５３】
しかし、近年の研究により、母乳には、細菌やウィルスが体内に侵入して感染するのを防ぐ免疫グログリン（IgA）、腸内細菌を育てるビフィズス因子、殺菌作用を有するラクトフェリン、リゾチーム及び白血球など、さらにはアレルギーの発症を抑えると考えられるポリアミン等、種々の乳幼児の生体防御を助長するための物質が含まれていることがわかってきた。この知見が示すように、母乳中には、単に一般的栄養素のみならず、種々の機能的物質が含まれている。しかしながら、未だ同定されていない母乳成分及びその機能が多くあると考えられる。母乳に特有の機能的成分を人工乳に添加して乳児に投与することは、人工乳を与えられる乳児の、充分な、すなわち母乳を受けられなかったことによる影響のない発育を促すことができると考えられる。
【００５４】
本発明による組成物等
本発明による組成物を与えることにより、母乳を与えられない乳児においても、その鋤鼻器におけるフェロモン受容体(特に、V2R型受容体)の発現誘導が、母乳を与えられた新生児と同様の分布及びレベルで認められる。これは、母乳を与えられない乳児でも好適なフェロモン受容を行うことを可能にし、正常な発育を促進することができる。
【００５５】
フェロモン刺激の受容は、神経系の発達誘導を促進させると考えられている。したがって、本発明による組成物等は、フェロモン受容体発現誘導剤、神経系発達促進剤、又は、親子間での絆の形成促進剤等として用いることができる。ここで、親子間の絆の形成とは、親子間での精神的な絆の形成をいい、神経刺激により形成が誘導される。これが不十分な場合、自己の親を他の個体と識別できない、親に対する愛情が湧かないというような症状が起こり得る。また、かかる絆形成が不十分であった乳児が成長すると、性認識能力及び生殖行動等に異常が認められる場合がある。さらには、かかる乳児が成長し、自己の子供を有した場合、その子供に対する親子間の絆の形成が充分に発達し難い場合がある。したがって、フェロモン受容体の発現が時期的に遅いか又は量的に不十分であると、次世代以降にも及ぶ障害となり得る。
【００５６】
このようなフェロモン刺激は、情緒の発達にも関与していると考えられる。本発明による組成物等は、フェロモン受容体の発達を促進することにより、その後の情緒の発達を促進し、フェロモン受容体が関与する疾患、特に情動関連疾患を治療又は予防することができる。
【００５７】
また、非ヒト哺乳動物は、ペットとして又は動物園等で人工的な環境下に置かれる場合が多い。このような場合、母親から授乳を受けることができない場合がある。かかる場合において、人工乳を与えると共に、本発明による組成物を投与することが好ましい。
【００５８】
かかるH-FABPの投与により、母乳を与えられた場合と同様に、フェロモン受容体の発現誘導が起こり、その後の神経系の発達が母乳を投与された動物と同様にもたらされ、情緒の発達、親子間の絆の形成が促進され、上述のような障害を予防又は低減することができる。
【実施例】
【００５９】
材料と方法
VR1、VR4及びH-FABPに対する抗体の作製
マウスの鋤鼻器 (VNO)のV2R型フェロモン受容体VR1のCOOH-末端(NH2-CPDSNFIKNHKGKLLY-COOH：配列番号１)、及びVR4のCOOH-末端(NH2-CPERNSTQKIREKSYF-COOH：配列番号２)、並びにH-FABPのCOOH-末端(NH2-CGSVVSTRTYEKEA-COOH：配列番号３)のペプチドを合成し、常法に従ってキーホールリンペットヘモシアニンとコンジュゲートさせた。これらを抗原としてウサギに免疫し、その抗血清から、それぞれのアフィニティカラム(Sulfolink column: PIERCE)によりそれぞれについての特異的抗体をアフィニティ精製した。
【００６０】
アデノウイルスベクターの構築
マウスフェロモン受容体VR1及びVR4の全長コード配列を、VR1及びVR4をそれぞれクローニングしたベクターからPCR法により増幅した。VR1のプライマーは、フォワードプライマー；5’-CCGGATCCTCGCCACCATGAAGCAGCTCTGCGC-3’(配列番号４)及びリバースプライマー；5’-gcctcgagtcaataaagcaatttacctttgtgg-3’ (配列番号５)、VR4のプライマーは、フォワードプライマー；5’-CCCTCGAGCGCCACCATGTTCATTTTCATGGGAGTC-3’ (配列番号６)及びリバースプライマー；5’-GCTCTAGATCAAAAATATGATTTTTCTCTGATCTTTTGGG-3’ (配列番号７)を用いた。増幅産物をpBluescript II(KS-)(Stratagene)にクローニングして配列決定により配列を確認した。VR1 cDNAのBamHI-XhoI断片VR1 cDNA及びVR4 cDNAのXhoI-XbaI断片アデノウイルス発現ベクターに挿入してこれを、HeLaS3細胞にリポフェクトアミン2000(Invitrogen)を用いて導入した。
【００６１】
新生児の人工的授乳
ICR(Slc: ICR; NipponSLC, Japan)及びH-FABP欠損マウス(B. Binas, H. Danneberg, J. McWhir, L. Mullins, A. J. Clark, FASEB J 13, 805 (1999))を、明暗サイクルを12時間とする制御下で飼育した。膣栓が検出された日を胎生0.5日齢として、胎生19.5日齢時に生後0日（P0）となるよう計画した。マウス母乳は、ICR及びH-FABP欠損マウスの生後14日齢の子に母乳を授乳中の母親マウス(生後14日齢母乳)から採取した。母乳の分画はUltrafree 0.5[100kDa nominal molecular weight limits (NMWL): Millipore]を用いて超遠心分離による分子量分画を行い、100kDa以上の画分とそれ以下の画分（画分１）を得た。さらに画分１をUltrafree 0.5(10kDa NMWL: Millipore)により分離し、画分2及び画分３を得た。それぞれの画分は-80℃で保存した。
【００６２】
ICRマウスの新生児を胎生18.5日齢にて帝王切開により得、すぐに母親から離してコットン上に置いた。新生児を37°Cで管理し、呼吸するまで拭き取る作業を行った。鼻で呼吸することを確認後すぐに、母親ICRマウスの出生後14日齢母乳、20%(w/v)スキムミルク(SM: Wako)、20%(w/v)母乳の画分１を1:10の割合で添加したSM又はH-FABP欠損マウスの母親マウスから得た出生後14日齢母乳を新生児の口に約50〜100μlを飲むまで滴下して人工的に与え、胃中に飲み込んだことを目視により確認した。そして、翌日（出生後0日齢）まで管理下で保育した。これらの実験は、全て同腹のマウスに対して行った。
【００６３】
SDS-PAGE及びウェスタンブロット
成熟ICRマウスの組織及びVR1又はVR4の発現アデノウイルスベクターをトランスフェクトしたHeLaS3細胞を、250mMスクロース、10mM EDTA(pH8.0)、1mM 2-メルカプトエタノール、0.2mMフェニルメチルスルホニルフッ化物を含有する20mM Tris-HClバッファー(pH7.5)中で氷上にてホモジネートした。ホモジネートしたサンプル中のタンパク濃度はタンパク質アッセイキット(Bio-Rad)を用いて定量した。各ホモジェネートを(10μgタンパク質/レーン)10%SDS-PAGEに供した。出生後14日齢の子をもつ母親の母乳ろ過物又はそのビオチン化ろ過物は16.5%トリシン-SDS-PAGEに供した。クマシー染色にて検出した。
【００６４】
ゲルをPVDF膜(Immobilon: Millipore)に転写して、1%スキムミルク(Becton Dickinson)及び0.1%Tween 20(Nacalai Tesque, Inc.)含有PBS(-)中で一晩4℃にてブロッキングした。膜をVR1(1μg/ml)又はVR4(0.5μg/ml)に対する抗体で2時間反応させ、洗浄後、二次抗体にて反応を検出した(ECL kit: Amersham)。
【００６５】
免疫染色
VR1又はVR4の発現アデノウイルスベクターでトランスフェクトした2日後、HeLaS3細胞を4%(w/v)パラフォルムアルデヒド(PFA)/0.1Mリン酸バッファー(pH7.4)で固定し、PBS(-)で洗浄した。E18齢胚及びP0新生児を麻酔し、4%PFAで心内パーフュージョンにより固定した。5週齢のICRマウスのVNOを摘出し、4℃にて一晩固定した。サンプルを文献（M. Hashimoto et al., Hum Gene Ther 7, 149 (1996)）にしたがって単離し、切片(厚さ10μm、間隔100μm毎)をクライオスタットにて作製した。
【００６６】
HeLaS3細胞及び切片をPBS(-)で洗浄し、1%スキムミルク及び0.1%Triton X-100(Sigma)含有PBS(-)で1時間ブロッキングした後、VR1(2μg/ml)又はVR4(1μg/ml)抗体を反応させた。隣接切片を抗Gα0 IgG(1:200;MBL)で反応させた。陽性の免疫反応は、ローダミン標識抗ウサギIgG(1:200; CAPPEL)にて検出した。
【００６７】
フェロモン受容体の発達を検討するために、V2Rタイプのフェロモン受容体である、VR1及びVR4をそれぞれ特異的に認識する抗体を用いて免疫染色を行った。VR1とVR4のそれぞれのC末端の細胞内の領域に対する特異的抗体を、免疫化ウサギの抗血清よりアフィニティ精製し、免疫学的な分析(データは示していない)、ウェスタンブロット、及び免疫組織化学によって解析した。
【００６８】
VR1とVR4を発現するベクターをトランスフェクションしたHeLaS3細胞のホモジネート後のサンプルについて、ウェスタンブロットを行った(図1A、B)。このHeLaS3細胞は内因性VR1及びVR4を発現しない(図1A、Bの中の「HeLaS3」参照)。抗VR1及び抗VR4抗体は、VR1(図1Aの中の「VR1」)及びVR4(図1Bの中の「VR4」)を発現するHeLaS3細胞においてのみ特異的な反応を示した。抗VR1及び抗VR4抗体は、VR4とVR1でそれぞれ交差反応は示さなかった。
【００６９】
V2Rタイプのフェロモン受容体の生体内の局在を決定するために、アダルトICRマウスに由来する種々の組織ホモジェネートについてウェスタン分析を行った(図1C)。抗VR4免疫反応性は、VNO(図1Cの中のレーン3)においてのみ検出された。該サンプルでは、3本の免疫反応性のバンドが観察されたが(図1A、C中の矢印)、最も低分子のメジャーバンドはVR1とVR4のモノマーの予期されたサイズ(約100kDa)と一致した。それより高分子側に検出された2本のバンドの分子量は、それぞれが、モノマーの2及び4倍の分子量に該当する。
【００７０】
推定上の受容体二量体に該当するバンドは最も強く検出された。これらの結果は、V2Rタイプフェロモン受容体(VR1とVR4)が多量体構造で存在することを示す。更に、アダルトマウスVNOの切片を、抗VR1(図1D、E)、抗VR4(図1F、G)及び抗Gα0(図1H、I)抗体で免疫染色したところ、抗VR1及びVR4免疫反応性は、VNOの樹状突起の先端(図1E、Gの矢印)、樹状突起(図1Gの中の矢印)及び細胞体で観察された。VR1(またはVR4)陽性VNOニューロンの細胞体はVNO感覚上皮の基底部に認められ、これらはGα0(図1H、I)についても陽性であった。抗VR1及び抗VR4免疫反応性は、アダルトマウス(データは示していない)の嗅球又はAOB内では観察されなかった。免疫化したペプチドエピトープ(データは示していない)による抗体吸収で、上記抗VR1及び抗VR4免疫反応性は認められなくなったので、免疫反応は特異的反応によるものであることが証明された。
【００７１】
出生後におけるVR1とVR4の発現誘導
これらの特異的抗体を使用して、胎仔及び新生児のVNO内のVR1とVR4のフェロモン受容体の局在を検討した。胎生15.5日齢、胎生17.5日齢(データは示していない)及び胎生18.5日齢(図2A、B)のVNOでは、VR1及びVR4は検出されなかったが、Gα0(図2C)を発現していたことから、これらのニューロンは成熟していることが示唆される。母乳を与えられた新生児(出生後０日)のVNOニューロンは、VR1(図2D中の矢印)及びVR4(図2E中の矢印)の両方の発現が検出された。したがって、VR1とVR4のフェロモン受容体の発現は、出生から1日以内に急速に誘導されることがわかった。最近の研究では、VNO感覚軸索とAOBニューロンの樹状突起のシナプスの関係が出生後に急速に起こること(L. F. Horowitz, J. P. Montmayeur, Y. Echelard, L. B. Buck, Proc Natl Acad Sci U S A 96, 3194 (1999))；Trp2タンパク質(フェロモン受容体シグナリング中の下流に位置するチャンネル)は出生後に検出されること(E. R. Liman, D. P. Corey, C. Dulac, Proc Natl Acad Sci U S A 96, 5791 (1999))が示された。M10とβ2-ミクログロブリンの発現（これらもまたフェロモン応答に関与するものである）も出生後に誘導されることも示されている（J. Loconto et al., Cell 112, 607 (2003)）。従って、胚ではVNOニューロンはフェロモン刺激を受けることが不可能であり、フェロモン受容は出生直後に発生する。
【００７２】
母乳によるVR1及びVR4発現誘導
VR1及びVR4発現のアップレギュレーションを急速に誘導する要因は同定されていない。しかし、次の6つの要因:出産、最初の呼吸、母体がなめることによる刺激、母体の唾液、母体の臭い、及び母乳による子育てのいずれかが、VR1及びVR4発現のアップレギュレーションを誘導する刺激となっている可能性が考えられる。この命題を解決するために、ICRマウス胎仔を、胎生18.5日齢の時点で帝王切開により取り出し、コットン上で37℃にて管理し、母体がなめるのと同じような方法で拭き取ることにより呼吸するための刺激を与えた。最初の呼吸後に、母親マウスから離したまま、スキムミルク、又は出生後14日齢の子供マウスを保育中のマウス母乳(出生後１４日齢母乳)のいずれかを新生児に与えた。
【００７３】
その翌日(出生後０日齢)、各新生児マウスを、4%のパラホルムアルデヒドで心内パーフュージョンにより固定し、クリオスタットで切片を作製した。切片を抗VR1及び抗VR4抗体で染色し、スキムミルクで保育された新生児マウスでは、VNOニューロン上の抗VR1及び抗VR4免疫反応性(図2G、H)が、母親の母乳を授乳させた新生児マウス(図2D、E)のVNOと比較して著しく低減されていた。一方、抗Gα0免疫反応性（図2F、I）には相違は認められなかった。出生後１４日齢母乳(データは示していない)で人工的に授乳させた新生児マウスのVNOは、母親による授乳を受けた母乳育ちの新生児マウスのVNOとVR1及びVR4発現の同様の分布を示した(図2D、E)。スキムミルクと出生後１４日齢母乳との差への影響を明確にするために、一連の横断面切片(100μｍ厚；11切片)のVR1陽性及びVR4陽性のVNOニューロンを計数した(図3C、D)。母親から授乳されたマウス(図3C、D中の「母乳」)と比較して、スキムミルク(図3C、D中の「SM」)を与えられたマウスのVR1陽性及びVR4陽性のVNO中のニューロンの数は、それぞれ、母親から授乳されたマウスの9％(P<0.001)及び16.1％(P<0.001)と著しく減少していた。人工的に授乳させる課程で、マウスは、出生、最初の呼吸及び母体がなめるのを模倣した拭き取りによる刺激を経験したが、母体の唾液あるいは臭いに曝されることはなかった。従って、これらの結果は、出生、最初の呼吸及び母体がなめる刺激が、VR1及びVR4の発現を誘導するのではないこと、母体の唾液及び臭いはVR1及びVR4の発現誘導には必要ではないことを示唆する。母乳はVR1及びVR4発現を誘導する最も有望な要因である可能性がある。
【００７４】
母乳中の誘導因子；H-FABP
VR1及びVR4の発現を誘導する母乳中の因子を同定するために、超遠心による分子量分画法により、出生後１４日齢母乳を、2つの画分、100kDa未満のタンパク質からなる画分(画分1)、100kDa以上のタンパク質からなる画分へと分画した。画分1はラクトース、水、イオン、水溶性の分子及び乳漿タンパク質を含む液体で、他方はクリーム状であった。次に、帝王切開によって得た同腹に由来する新生児マウスを、4群に分け、母親による授乳、又は出生後１４日齢母乳による人工授乳、スキムミルク及び画分１を添加したスキムミルク(SM+Fr.1)による人工授乳のいずれかを行った。画分１を添加したスキムミルクを与えた群では、VR1及びVR4の発現が誘導されたのに対し、スキムミルクのみを与えた群ではVR1及びVR4の発現誘導はみとめられなかった(図2G、H;図3C、Dの中の「SM」)。SM+Fr.1(図2J、K;図3C、D中の"SM+Fr.1")でVR1及びVR4の発現分布は、母親による授乳を受けた群のものに類似していた(図2D、E;図3C、D中の「母親による授乳」)。VR1陽性及びVR4陽性のVNOニューロンの数は、SM+Fr.1を与えた群でわずかに増加していた(図3C、Dの中の"SM+Fr.1")。この結果は、VR1及びVR4の発現を誘導する活性が、画分1に存在することを示す。さらに画分1を、10kDa以上のタンパク質(画分2)と他の水溶性の分子を含む10kDa未満のタンパク質(画分3)とに画分した(図3A)。画分3を添加したスキムミルク(SM+Fr.3)を、帝王切開により得た新生児マウスに人工的に与えた。SM+Fr.3を与えたマウス(図3C、Dの中の"SM+Fr.3")のVR1陽性及びVR4陽性のVNOニューロンの数は、SM+Fr.1を与えられたマウス(図3C、Dの中の"SM+Fr.1")のレベルの約20%(VR1及びP<0.001;VR4及びP<0.001)と、著しく低減されていた。画分2は、SM+Fr.1に見られるのと同等のVR1及びVR4誘導活性を保持していた(データは示していない)。この結果は、VR1及びVR4の発現を誘導する分子が10kDa〜100kDaの分子量を持っていることを示唆するものである。
【００７５】
画分１に分画されたタンパク質成分を調べるために、画分1をSDS-PAGEによって分離した(図3B中のレーン１)。画分１は3つのバンド(図3Bの中のa、b及びc)を含んでいた。各バンドからタンパク質を抽出し、液体クロマトグラフィータンデムマススペクトル分析によって、各バンドに含まれるタンパク質の同定を行った(データは示していない)。バンド(a)はマウスαラクトアルブミン、バンド(b)はマウス心臓型脂肪酸結合タンパク質(H-FABP)、バンド(c)はマウスWDNM1タンパク質であった。この3種のタンパク質のうち、本発明者らは、H-FABPがフェロモン受容体発現の誘導因子ではないかと考え、H-FABPを欠損した母体由来の出生後１４日齢母乳を、帝王切開によって得た新生児マウスに人工的に与えて、母乳中に含まれるH-FABPの影響を確認した。
【００７６】
H-FABPを欠損した母体のP14母乳を人工的に与えた場合、VNO中のVR1陽性及びVR4陽性ニューロンの数は、コントロールの個体(図3C、D中の「母乳」)で観察されたレベルより、著しく減少していた(VR1、P<0.01; VR4、P<0.005)（図3C、D中の「母乳(H-FABP-/-)」）。H-FABPを欠損した母体の出生後１４日齢母乳の画分1は、H-FABP(図3Bのレーン3中のバンドb)を欠失していたが、αラクトアルブミン(バンドa)及びWDNM1(バンドc)の発現は維持されていた(データは示していない)。これらの結果は、母乳を与えることによるVR1及びVR4の急速な発現誘導には、H-FABPが作用していることを示す。すなわち、母乳中のH-FABPにより、出生後にV2R型フェロモン受容体の発現が急速に誘導されることが、本実験により示された。母乳による子育ては、V2R型フェロモン受容体を誘導することにより、フェロモン受容を促進し、母体とその子供の間のフェロモンコミュニケーションを助長する可能性がある。したがって、上記結果は、母乳の成分(例えばH-FABP)が、神経の組織の発達(例えばVNO中のフェロモン受容体の発現誘導)に影響を与えることを示唆するものである。母乳による子育ては、子供の神経発達において有意義な作用を有していると考えられる。
【００７７】
本発明は、その精神又は主要な特徴から逸脱することなく、他の様々な形態で実施することができる。このため、上述の実施例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。本発明の範囲は、特許請求の範囲によって示すものであって、明細書本文によっては何ら拘束されるものではない。さらに、特許請求の範囲の均等範囲に属する変形や変更は、全て本発明の範囲内のものである。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】VR1及びVR4遺伝子をコードする発現ベクターを感染させたHeLaS3細胞のホモジェネートの抗VR1(A)及び抗VR4(B)抗体によるウェスタンブロット解析結果、ならびに、アダルトICRマウスから摘出した各組識のホモジェネートの抗VR4抗体(C)を用いたウェスタンブロット解析結果を示す(C)。図１C中、VR4は、鋤鼻器にのみ発現されており（レーン３）、VR1及びVR4ともホモ多量体を形成していた(A-C中、矢印)。(C)1、全脳; 2、嗅上皮; 3、鋤鼻器; 4、胸腺; 5、心臓; 6、肺; 7、肝臓; 8、膵臓; 9、脾臓; 10、胃; 11、精巣; 12、小腸; 13、膀胱; 14、腎臓; 15、骨格筋; D-I：5週齢オスICRマウスのVNOをクライオスタットで切断して切片(厚さ10μm)を作製し、図中に示す抗体で染色した結果を示す。a、上端部; b、基底部; L、内腔; SE、感覚上皮; V、血管; 縮尺、100μm。
【図２】E18.5齢の胚及び出生後０日の新生児の横断切片の抗VR1、抗VR4、及び抗Gαo抗体による免疫染色の結果である。胎生18.5日齢の胚のVNO(A-C)；母乳を与えた後の出生後０日の新生児のVON(D-F); スキムミルクを人工的に与えた出生後０日の新生児；(G-I)；及びスキムミルクにP14齢の子を保育中の母マウスの母乳から分画した画分１（明細書中を参照のこと）を添加したものを人工的に与えた出生後０日の新生児(J-L)。矢印は、VR1-及びVR4-陽性VNO神経の細胞体を示す。縮尺、200μm。
【図３】母乳中のH-FABPによるVR1及びVR4の発現誘導を示す図である。出生後１４日齢の子に授乳中の母親マウスの母乳(出生後１４日齢母乳)を、分子量に基づいて画分した。その操作手順をAに示す。画分1（Fr.1）は、αラクトアルブミン（16.8kDaのバンド;a）、心臓型脂肪酸結合タンパク質(H-FABP:14.8kDaのバンド:b)、及びWDNM1タンパク質(8.2kDaのバンド;c)を含んでいた。出生後１４日齢母乳から分画した画分1(B中レーン１)、ICR母親マウスの出生後１４日齢母乳から得た画分１(B中レーン２)及びH-FABP欠損(H-FABP-/-)母親マウス出生後１４日齢母乳から得た画分１(B中レーン３)について、抗H-FABP抗体によるウェスタンブロットに供した。H-FABP欠損(H-FABP-/-)母親マウスの出生後１４日齢母乳(B中レーン３)ではH-FABP（バンドb）は欠損していた。新生児(出生後０日齢)の横断切片（11枚の連続切片、100μm間隔)VR1-及びVR4-陽性VNO神経の数を測り、それぞれC及びDにグラフとして表した。各数値を以下に示す：C；平均±標準偏差： 母親による授乳、8±1.84(n=7); 母乳の人工授乳、8.33±1.09(n=6)； スキムミルクの人工授乳、0.75±0.24(n=9)； スキムミルク+画分1（SM+Fr.1）の人工授乳、12.33±1.63(n=6)；スキムミルク+画分３（SM+Fr.３）の人工授乳、2.5±0.5(n=6)； 母乳(H-FABP-/-の母親由来)の人工授乳、2.8±1.1(n=5)：D；平均±標準偏差： 母親による授乳、123.8±12.7(n=6)； 母乳の人工授乳、127.8±10.6(n=11)； スキムミルクの人工授乳、20.6±4.1(n=8)； スキムミルク+画分1の人工授乳、141.7±13.9(n=6)； スキムミルク+画分３（SM+Fr.３）の人工授乳、28.4±8.5(n=5)； 母乳(H-FABP-/-の母親由来)の人工授乳、51.8±9.2(n=5)。グラフ中の誤差棒は、平均±標準偏差を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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