(57)【要約】【課題】  本発明は、植物、特にイネのデンプンの特性を決定しているスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の活性を制御しているアミノ酸配列を特定し、これらのアミノ酸を他のアミノ酸に置換することによりＳＳIIａの活性を制御する方法、そのためのＳＳIIａの変異体を提供する。【解決手段】  本発明は、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目、６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性を制御する方法、並びにそのためのイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体及びそれをコードするＤＮＡに関する。また、本発明は、当該ＳＳIIａの変異体をコードする遺伝子で形質転換された植物、当該植物による改質されたデンプンを製造する方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目、６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性を制御する方法。
【請求項２】
イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性を制御する方法。
【請求項３】
イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目のアミノ酸を、アスパラギン酸（Ａｓｐ）又はグルタミン酸（Ｇｌｕ）のいずれかとする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の６０４番目のアミノ酸を、グリシン（Ｇｌｙ）又はセリン（Ｓｅｒ）のいずれかとする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の７３７番目のアミノ酸を、バリン（Ｖａｌ）又はメチオニン（Ｍｅｔ）のいずれかとする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の７８１番目のアミノ酸を、ロイシン（Ｌｕｅ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）のいずれかとする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
７３７番目のアミノ酸を、メチオニン（Ｍｅｔ）にしてスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の活性を失活型とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７におけるアミノ酸の変更が、遺伝子の塩基の変更によって行われる請求項１〜７に記載の方法。
【請求項９】
カサラス、ＩＲ３６、日本晴、及び金南風からなる群から選ばれた１種のイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の、８８番目、６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上が、他のアミノ酸に置換されてなるイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質。
【請求項１０】
カサラス、ＩＲ３６、日本晴、及び金南風からなる群から選ばれた１種のイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の、６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上が、他のアミノ酸に置換されてなるイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質。
【請求項１１】
イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の６０４番目のアミノ酸がグリシン（Ｇｌｙ）であり、７３７番目のアミノ酸がメチオニン（Ｍｅｔ）である請求項９又は１０に記載のイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質。
【請求項１２】
イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の６０４番目のアミノ酸がグリシン（Ｇｌｙ）であり、７３７番目のアミノ酸がバリン（Ｖａｌ）であり、かつ７８１番目のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）である請求項９又は１０に記載のイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質。
【請求項１３】
イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目のアミノ酸がグルタミン酸（Ｇｌｕ）であり、６０４番目のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）である請求項９又は１０に記載のイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質。
【請求項１４】
イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目のアミノ酸がアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、６０４番目のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）であり、７３７番目のアミノ酸がバリン（Ｖａｌ）であり、７８１番目のアミノ酸がロイシン（Ｌｅｕ）である請求項９又は１０に記載のイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質。
【請求項１５】
イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目のアミノ酸がアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、６０４番目のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）であり、７３７番目のアミノ酸がメチオニン（Ｍｅｔ）であり、７８１番目のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）である請求項９又は１０に記載のイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質。
【請求項１６】
請求項９〜１５のいずれかに記載のイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１７】
請求項１６に記載のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項１８】
請求項１６に記載のＤＮＡにより形質転換された植物。
【請求項１９】
宿主植物が内在性のＳＳIIａの遺伝子を欠損した変異体である請求項１８に記載の形質転換植物。
【請求項２０】
植物が高等植物である請求項１８又は１９に記載の形質転換された植物。
【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれかに記載の形質転換植物を用いて外来性のＳＳIIａの遺伝子に応じた特性を有するデンプンを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）のアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性を制御する方法、より詳細には、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目、６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性を制御する方法、並びにそのためのイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体及びそれをコードするＤＮＡに関する。また、本発明は、当該ＳＳIIａの変異体をコードする遺伝子で形質転換された植物、当該植物による改質されたデンプンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
米は穀物植物として全世界で広く栽培され、世界の人口の約１／３は米食によっている。米は栽培される地域により物理化学的な特性が異なっていることはよく知られており、そして米の味覚は米のデンプンの質に大きく依存しており、各地域によりその地域に応じた米の種類が選択されてきた。
米の栽培品種としては、オリザサティバ（Oryza sativa）とグラベリマステウド（glaberrima Steud）の２種類がある。前者はアジアで栽培され熱帯、亜熱帯及び温帯地域に広く分布しているが、後者は西アフリカ地域に極限されている。
【０００３】
雑種の花粉の不捻における遺伝学的分析に基づいて、加藤らはオリザサティバ（Oryza sativa）をジャポニカ（japonica）とインディカ（indica）に分類した（非特許文献１参照）。また、森永（非特許文献２参照）及びチャング（非特許文献３参照）は、インディカ（indica）、ジャポニカ（japonica）及びジャバニカ（javanica）の３種に分類することを提唱した。
このようにオリザサティバ（Oryza sativa）（以下、イネという。）の分類については種々の意見が提案され、遺伝学的な分析やイネの種子に含まれているデンプンや脂質の違いなどに基づくイネの分類が報告されてきている。本明細書においては、エステラーゼのアイソザイムの分析、並びに生理学的及び生化学的特性からイネをインディカ（Indica）及び中国インディカ（Chinese Indica）、並びに、温帯ジャポニカ（Temperate Japonica）及び熱帯ジャポニカ（Tropical Japonica）の４種に分類することにする。
【０００４】
イネの味覚は主としてそのデンプンによるものであり、ジャポニカのねっとりとした味覚や、インディカのパサパサとした味覚は、それらのデンプンの質の相違によるものであることがわかってきている。
そもそもデンプンは植物のエネルギー貯蔵物質であり、α−ポリグルコースからなる多糖類の１種で、アミロースとアミロペクチンからなっている。グリコーゲンもデンプンと同様にα−ポリグルコースからなる多糖類であるが、グリコーゲンは主として動物のエネルギー貯蔵物質として利用されている。
デンプンは穀物の主成分として食品や飼料として使用されるだけでなく、デキストリン、オリゴ糖、異性化糖などに加工されて加工食品などにも利用され、また、糊や添加剤などとして工業製品やその原材料としても利用されている。
【０００５】
デンプンと一言でいっても、稲のデンプン、じゃがいものデンプン、小麦のデンプン、とうもろこしのデンプンなど、植物の種類や品種によりデンプンの形、味、糊化したときの物性などが微妙に異なり、我々はその用途に応じて各種の植物由来のデンプンを使い分けてきている。このようなデンプンの性質の違いはデンプンの微細な化学構造による違いから来ていると説明されてきている。
デンプンは主としてアミロース（Amylose）とアミロペクチン（Amylopectin）からできているものであり、これらによって植物のデンプン粒が形成さているが、デンプン粒の形成にはアミロースは必須ではないとされている。
アミロースは、貯蔵デンプン中の２０〜３０％を占め、グルコース・ユニットがα−１，４グルコシド結合で繋がり、少量のα‐１，６グルコシド結合の枝を含む線状のらせん状の分子である。一方、アミロペクチンはデンプン粒中の７０‐８０％を占め、グルコース・ユニットがα‐１，４グルコシド結合で伸び、主鎖と平行にα‐１，６グルコシド結合で枝が繋がった構造をとっている。アミロペクチンのこの特徴的な構造は”クラスター”構造と呼ばれている。
また、動物やバクテリアの貯蔵エネルギーであるグリコーゲン(Glycogen)もデンプンと同じくグルコース・ホモポリマーで構成されているが、アミロペクチンのようなクラスター構造は持っておらず、グリコーゲンは”tree like”や”bush like”構造と呼ばれる不規則な枝分かれ構造であると報告されている。
【０００６】
図１にアミロース、アミロペクチン、及びグリコーゲンの構造を示す。図１に示される線はα−グルコースの連鎖であり、アミロース（図１の（Ｃ））は枝分かれがほとんど無くα−１，４−グルコースのほぼ１本鎖の構造をしている。アミロペクチン（図１の（Ｂ））は規則正しい枝分かれ構造を有し、α−１，４−グルコースの連鎖とα−１，６−グルコースの枝分かれ構造（クラスター）を一定の間隔で規則正しく有している。また、動物などのエネルギー貯蔵物質であるグリコーゲン（図１の（Ａ））は、全く不規則な枝分かれ構造からなるものである。グリコーゲンはアミロペクチンに比べて分子も小さく、枝も短く、その多くは水溶性の物質である。これに対してアミロペクチンは、枝も長く、かつグルコースが高密度で充填されており、一般に水不溶性の物質である。
【０００７】
このようなアミロペクチンのクラスター構造は、結晶構造を造る際に有利であり、結晶構造によるデンプン粒が形成される。アミロペクチンのクラスター構造は、ほぼ９ｎｍの規則正しい繰り返し構造であり、この９ｎｍのサイズは組織や種が異なっても余りばらつきが見られない。
アミロペクチンの構造をさらに詳細に見てゆくと、３タイプのα‐１，４−グルコシド鎖を持っている（図２参照）。Ａ鎖は最も外側の鎖で鎖の中に分岐結合を持たない鎖である。Ｂ鎖は一つの鎖あたり１つ以上の鎖が分岐結合している鎖であり、Ｂ鎖はさらに、１つのクラスターにとどまるＢ１鎖、２つのクラスターに及んでいるＢ２鎖、３つのクラスターに及ぶＢ３鎖などがある。Ｃ鎖は還元末端を持っている鎖であり、アミロペクチン１分子あたり１つのＣ鎖を持っている。
【０００８】
このように、アミロペクチンの構造はほぼ一定ではあるが、植物の種類や品種によりアミロペクチンの構造も微妙に異なってきている。最近の研究によれば、ねっとりとしたデンプンを有するジャポニカと、パサパサとしたデンプンを有するインディカのアミロペクチンの構造上の相違が報告されている。図３の上段（図３の（ａ））はジャポニカ米のアミロペクチン、図３の下段（図３の（ｂ））はインディカ米のアミロペクチンの構造を模式的に示したものである。クラスターの枝の長さを比べるとインディカ米の方が比較的長く、その密度も比較的密になっている。このためにインディカ米のデンプンの方が糊化が難しくなっていると考えられている。
このようなアミロペクチンの微細な構造上の相違は、アミロペクチンを合成する際の合成方法の相違により生起してくると考えられている。
【０００９】
アミロペクチンは次の４つのクラスの酵素の連続反応で合成されると考えられている。
（１）ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ADPglucose pyrophosphorylase（ＡＧＰ      ａｓｅ））、
（２）デンプン合成酵素（Starch synthase（ＳＳ））、
（３）デンプン枝作り酵素（Starch  branching enzyme（ＢＥ））、
（４）デンプン枝切り酵素（Starch debranching enzyme（ＤＢＥ））
である。
ＡＧＰａｓｅは、デンプン・ポリマーの原材料であるＡＤＰグルコースを合成する酵素である。ＳＳは、アミロペクチンの非還元末端にＡＤＰグルコースをα‐１，４グルコシド結合で繋ぎ、鎖を伸ばす役割をする。ＳＳがアミロペクチンの鎖を伸ばすのに対し、ＢＥは、アミロペクチンのα‐１，６グルコシド結合を形成する酵素であり、枝分かれ構造の枝分かれ部分を形成させる酵素である。
図４にアミロース、アミロペクチン、及びグリコーゲンの合成過程をまとめた。図４の左側のグリコーゲンの合成は主として動物や細菌類の場合であり、ＵＧＰａｓｅはグリコーゲンの材料となるリン酸化グルコースの合成酵素であり、ＧＳはグリコーゲン合成酵素であり、ＧＢＥはグリコーゲン枝作り酵素である。
図４の中側は、高等植物の場合のアミロペクチンの合成過程を示すものであり、図中のＳＳＳは水溶性ＳＳのことである。図４の右側は高等植物におけるアミロースの合成過程を示すものであり、ＧＢＳＳは粒結合デンプン合成酵素Ｉ（granule‐bound starch synthaseＩ（ＧＢＳＳＩ））のことである。
このように、高等植物においては、前記した４種類の酵素群により植物の種類に応じたアミロペクチンを産生している。そして、植物の種類によるアミロペクチンの構造の相違は、これらの酵素の種類の違いによるところが大きいと考えられる。
【００１０】
本発明者らは、ジャポニカの日本晴（品種名）及び金南風（品種名）と、インディカのカサラス（品種名）及びＩＲ３６（品種名）との胚乳のアミロペクチンの構造を比較し、後者ではα‐１，４−グルコシド鎖におけるα−１，４−グルコースの数（ＤＰ）が１１以下のものが著しく少なく、かつＤＰが１２以上で２４以下のものに富むことを報告してきた（非特許文献４及び５参照）。また、本発明者らは、この２グループのアミロペクチンの構造の相違の原因となっている遺伝子が、スターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａと略す。）の遺伝子と同じ位置である第６染色体上にちょうど位置していることを見出した。このことはアミロペクチンのＤＰ（α‐１，４−グルコシド鎖におけるα−１，４−グルコースの数）が１０以下という短いα‐１，４−グルコシド鎖を伸長して長い鎖を形成することに、ＳＳIIａが極めて重要な役割を果たしていることを示している。
【００１１】
デンプン合成酵素（Starch synthase（ＳＳ））には、図４に示されるように３種類のサブタイプが知られており、それぞれスターチシンターゼＩ（ＳＳＩと略す。）、スターチシンターゼII（ＳＳIIと略す。）、及びスターチシンターゼIII（ＳＳIIIと略す。）と呼ばれている。ＳＳIIａはスターチシンターゼII（ＳＳII）のさらにサブタイプである。
一般にイネの胚乳における各スターチシンターゼのサブタイプの含有率は、全スターチシンターゼの約７０％がＳＳＩであり、約２５％がＳＳIIIであり、残りの約５％がそれ以外のＳＳ（ＳＳIIａを含む）であるとされており、アミロペクチンのα‐１，４−グルコシド鎖は主としてＳＳＩ及びＳＳIIIにより形成されるものであると考えられていたのであるが、ジャポニカとインディカのアミロペクチンの微細な構造上の相違がＳＳII、特にＳＳIIａの機能の相違に起因していたとする本発明者らの知見は驚くべきことである。
本発明者らは、さらに各種のイネについてアミロペクチンの微細構造を比較検討し、その原因となる遺伝子を見出してきた（特許文献１参照）。
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ  ０３／０２３０２４
【非特許文献１】S. Kato, et al., Rep. Bul. Fak. Terkult, Kyushu Imper. Univ. 1928, 3, 132-147.
【非特許文献２】T. Morinaga., In Studies on Rice Breeding (A separate volume of Japan. J. Breed.) 1954, 4, 1-14.
【非特許文献３】T. T. Chang., Euphytica 1976, 25, 425-441.
【非特許文献４】T. Umemoto, Y. Nakamura, H. Satoh, K. Terashima., Starch, 1999, 51, 58-62.
【非特許文献５】T, Umemoto, M. Yano, A. Shomura, Y. Nakamura., Theor. Appl. Genet. 2002, 104, 1-8.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、植物、特にイネのデンプンの特性を決定しているスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の活性を制御しているアミノ酸配列を特定し、これらのアミノ酸を他のアミノ酸に置換することによりＳＳIIａの活性を制御する方法、そのためのＳＳIIａの変異体を提供する。さらに、本発明はＳＳIIａの活性を制御することによりアミロペクチンによるデンプンのクラスター構造を制御し、もって新規なクラスター構造を有する改質デンプンを製造する方法、及びそのための形質転換された植物に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
お米には大きく分けてインディカ米とジャポニカ米があり、両者の食味、食感の違いには日本人は特に敏感である。これらの違いは、いくつかの要因が絡んでいると考えられるが、従来はアミロース含量の違いばかりが着目されてきた。
本発明者らは、米デンプンの約７０−８０％を占めるアミロペクチンの構造に着目し、これまで以下のことを明らかにしてきた。
１）両者の胚乳アミロペクチンの構造は全く異なっており、その単位構造であるクラスタ  ーのタイプによって区別される。インディカ米品種の多くが生産するアミロペクチンは  クラスターを構成する鎖の長さが長いＬ型、ジャポニカ米品種の多くが生産するアミロ  ペクチンは鎖長の短いＳ型と分類できる（図５）。
２）両者のアミロペクチンの構造の違いはスターチシンターゼIIａ型(ＳＳIIａ)が関わっ  ており、この酵素が正常であれば、アミロペクチンクラスター内の鎖長を伸長できるた  めにＬ型、異常であれば伸長できないためにＳ型アミロペクチンになる（図５）。
３）アミロペクチンの構造は、糊化温度の違いに影響を与え、Ｌ型アミロペクチンの糊化  開始温度はＳ型アミロペクチンより１０〜１５℃高い。
以上の結果から、ＳＳIIａのアミノ酸配列の置換が原因で、ＳＳIIａ活性が低下し、それが胚乳アミロペクチンの構造変化とそれに伴う糊化温度の低下を引き起こしていると考えられる。
【００１５】
そこで、本発明者らは、ジャポニカ品種である日本晴と金南風のＳＳIIａ活性の低下を引き起こす原因となるアミノ酸配列を同定するため、まず、各イネのＳＳIIａのアミノ酸配列を比較した。また、インディカ品種ＩＲ３６のＳＳIIａ遺伝子をジャポニカ品種金南風に形質転換した。その結果、
４）Ｌ型アミロペクチンを持つインディカ品種（Kasalath, IR36）のＳＳIIａ遺伝子に対  してＳ型アミロペクチンを持つジャポニカ品種である日本晴と金南風のＳＳIIａ遺伝子  は、アミノ酸が置換している箇所が、４カ所存在していた（図６参照）。
５）インディカ品種ＩＲ３６のＳＳIIａ遺伝子をジャポニカ品種金南風に形質転換したと  ころ、胚乳アミロペクチン構造がＳ型からＬ型に変更し、それに伴って糊化温度も上昇  した。
即ち、本発明者ら、ＳＳIIａの４カ所のアミノ酸の相違がＳＳIIａの活性に大きな影響を与えていることを明らかにした。そこで、これらの４カ所のアミノ酸の相違がＳＳIIａの活性にどのような影響を与えるのかと言うことを検討するために、これらの４カ所のアミノ酸の置換部位をシャッフリングしたコンストラクトを作成し、それらを大腸菌に形質転換して人工的にＳＳIIａタンパク質を生産させ、それらのＳＳIIａ活性を測定した。その結果、どのアミノ酸置換が活性低下を引き起こす原因であるかが明らかにした。そして、驚くべきことに、インディカ品種のＳＳIIａの活性とジャポニカ品種ＳＳIIａの活性の中間の活性を有するＳＳIIａを創生することができることを見出した。即ち、本発明者らは、ＳＳIIａのポイントとなるアミノ酸を置換することによってＳＳIIａ活性をさまざまに制御する技術を確立することができたのである。
【００１６】
即ち、本発明は、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）のアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性を制御する方法、詳細には、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目、６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性を制御する方法、より詳細には、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性を制御する方法に関する。
また、本発明は、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）のアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性が制御されたＳＳIIａの変異体タンパク質に関する。詳細には、本発明は、カサラス、ＩＲ３６、日本晴、及び金南風からなる群から選ばれた１種のイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の、８８番目、６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上が、他のアミノ酸に置換されてなるイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質に関する。より詳細には、本発明は、（１）イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の６０４番目のアミノ酸がグリシン（Ｇｌｙ）であり、７３７番目のアミノ酸がメチオニン（Ｍｅｔ）である、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質、（２）イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の６０４番目のアミノ酸がグリシン（Ｇｌｙ）であり、７３７番目のアミノ酸がバリン（Ｖａｌ）であり、かつ７８１番目のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であるイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質、（３）イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目のアミノ酸がグルタミン酸（Ｇｌｕ）であり、６０４番目のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）である、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質、（４）イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目のアミノ酸がアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、６０４番目のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）であり、７３７番目のアミノ酸がバリン（Ｖａｌ）であり、７８１番目のアミノ酸がロイシン（Ｌｅｕ）である、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質、又は（５）イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目のアミノ酸がアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、６０４番目のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）であり、７３７番目のアミノ酸がメチオニン（Ｍｅｔ）であり、７８１番目のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）である、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質に関する。
さらに、本発明は、前記してきた本発明のイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質をコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含有するベクター、当該ＤＮＡにより形質転換された植物、及び当該形質転換植物を用いて外来性のＳＳIIａの遺伝子に応じた特性を有するデンプンを製造する方法に関する。
【００１７】
本発明者らは、デンプンの特性や構造と、これを合成する酵素との関係を解明するために、ジャポニカイネとインディカイネのデンプンの主成分であるアミロペクチンの構造の差異は、両者のＳＳIIａ遺伝子の構造と機能の違いが原因であると考えられることから、インディカイネの１種であるカサラスと、ジャポニカイネの１種である日本晴のＳＳIIａの遺伝子をクローニングしてきた（特許文献１参照）。
そして、ジャポニカイネのＳＳIIａ遺伝子の機能が、何らかの変異によって、劣っていると考えられる。その原因としては、遺伝子の発現量が顕著に低下したか、酵素としての触媒能が低下したかのいずれかであろうと思われる。前者はプロモーターの変異によって、後者はアミノ酸置換による変異によって引き起こされる可能性が高い。
そこで、両者の遺伝子のプロモーター部分を比較したが、全配列のうちのプロモーター部分は、日本晴では１〜１，３４１ｂｐであり、カサラスでは１〜１，３３１ｂｐであった。このプロモーター部分では、カサラスには、中ほどに（７０２ｂｐ）９塩基のギャップがある程度で、両者のサイズや塩基配列の相同性はかなり高かった。このことから、プロモーターの変異に起因しているのではなく、ＳＳIIａのアミノ酸配列に起因している可能性が極めて高いと考えられた。
【００１８】
両者のＳＳIIａのアミノ酸配列を比較すると、共に８１０個のアミノ酸からなる点では同じであるが、８８番目、９９番目、６０４番目、及び７３７番目の４箇所において、アミノ酸の種類が異なっていた。これらの違いによって酵素機能の違いが生じる可能性が考えられる。
この４箇所のアミノ酸置換のうち、７３７番目のアミノ酸配列が、カサラスではＶ（バリン）のところ、日本晴ではＭ（メチオニン）となっている。スターチシンターゼのアミノ酸配列中にはいくつかの保存領域が知られているが、そのうちの１つがＶＧＧＬＲＤＴＶ（アミノ酸配列７３０−７３７）で植物のスターチシンターゼにおいて高度に保存されていて、リージョン７（Region 7）と命名されている（Li et al., (1999）Plant Physiol. 120: 1147-1155）。イネＳＳIIａにおいて、７３７番目のアミノ酸がカサラスではＶで保存されているのに対して日本晴ではＭに変化している。この変化がＳＳIIａの機能の低下に関係している可能性があ極めて高いと考えられた。
【００１９】
そこで、さらに他の品種についてもＳＳIIａの遺伝子のクローニングを試みた。インディカイネとしてＩＲ３６と、ジャポニカイネとして金南風のＳＳIIａの遺伝子をクローニングし、そのアミノ酸配列を検討した。その結果、カサラスとＩＲ３６のＳＳIIａのアミノ酸配列は同じであったが、金南風は７３７番目のアミノ酸がバリンであるにもかかわらず、ジャポニカタイプのＬ型のデンプンを産生する。そして、金南風は７８１番目のアミノ酸がカサラス、ＩＲ３６、及び日本晴のロイシンとは異なりフェニルアラニンとなっていた。そこで、本発明者らは、ＳＳIIａの８１０個のアミノ酸のうち次の４箇所のアミノ酸に着目することにした。これらのアミノ酸の番号と各品種のアミノ酸の種類をまとめてアミノ酸の３文字表記で以下に示す。
【００２０】
インディカ                   ジャポニカ      
カサラス      ＩＲ３６          日本晴        金南風    
８８番目    Ｇｌｕ(gag)   Ｇｌｕ(gag)       Ａｓｐ(gac)   Ａｓｐ(gac)
６０４番目    Ｇｌｙ(ggc)   Ｇｌｙ(ggc)       Ｓｅｒ(agc)   Ｓｅｒ(agc)
７３７番目    Ｖａｌ(gtg)   Ｖａｌ(gtg)       Ｍｅｔ(atg)   Ｖａｌ(gtg)
７８１番目    Ｌｅｕ(ctc)   Ｌｅｕ(ctc)       Ｌｅｕ(ctc)   Ｐｈｅ(ttc) 
【００２１】
これらの関係を図示したのが、図６Ａ（図６上段）である。図６Ａは各バーがＳＳIIａの全長のアミノ酸配列を示しており、上からカサラス、ＩＲ３６、日本晴、金南風である。カサラスの上に示す＃記号が付されている数字はメチオニン（Ｍｅｔ）を１番にしたときのアミノ酸の番号であり、金南風の下に示す＃記号が付されている数字は翻訳開始点のメチオニン（Ｍｅｔ）をコードする塩基を１番にしたときの塩基の番号を示している。アミノ酸の番号で８８番、６０４番、７３７番、及び７８１番のいずれか又はこれらの組合せがＳＳIIａの活性に大きな影響を与えると予想され、その部分の各アミノ酸及びそれをコードする塩基を記載している。上側のカサラスとＩＲ３６はインディカイネで、ＳＳIIａの活性がある。下側の日本晴と金南風はジャポニカイネで、ＳＳIIａの活性が無いものである。
【００２２】
本発明者らは、当初リージョン７（Region 7）のアミノ酸配列ＶＧＧＬＲＤＴＶ（アミノ酸配列７３０−７３７）に基づいて、７３７番目のアミノ酸であるバリンがメチオニンに変更することにより、ＳＳIIａの活性の有無が決定されると予想していた。しかし、金南風のアミノ酸配列を見ると、７３７番目のアミノ酸は、活性を有すると予想されるバリンであった。したがって、７３７番目のアミノ酸のバリンからメチオニンへの変更のみがＳＳIIａの活性を左右しているのではなく、ＳＳIIａの活性は多くのアミノ酸の組み合わせによって決定されていることがわかった。
そこで、さらに、金南風のＳＳIIａのアミノ酸配列を検討してみると、７８１番目のアミノ酸がロイシンからフェニルアラニンに変更されている。そして、８８番目と６０４番目はジャポニカイネの日本晴と同じアスパラギン酸とセリンであった。そうすれば、この８８番目と６０４番目もジャポニカとなる要因であることが予想された。しかし、７８１番目がフェニルアラニンになっている意義については、これだけのデータからは確定することができなかった。
そこで、本発明者らは、アミノ酸の番号で８８番、６０４番、７３７番、及び７８１番のアミノ酸の種類とＳＳIIａの活性についてさらに検討するために、これらのアミノ酸のすべての組み合わせを合成し、これらのＳＳIIａの活性を測定して、アミノ酸配列とＳＳIIａの関連性を解明することにした。
【００２３】
イネのＳＳIIａの塩基配列を検討すると、翻訳開始点（agt）から２０４番目に制限酵素ＰｓｈＡＩのサイトがあり、１１７３番目に制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉのサイトがあり、２１６０番目に制限酵素ＢｓｉＷＩのサイトがあり、さらに２３０２番目に制限酵素ＸｈｏＩのサイトがあることがわかる（図６Ｂ参照）。ＳＳIIａをコードするＤＮＡを、これらの制限酵素で切断することにより、図６Ｂの下側に示される４つのフラグメントとすることができ、これらの各フラグメントは、それぞれ８８番、６０４番、７３７番、及び７８１番のアミノ酸をコードする部分を含有している。
そして、これらの制限酵素で切断される４種類のフラグメントを、５’領域から順にフラグメント１〜４(図６Ｂ中のFrag.1-4)と名付け、これらの各フラグメントがカサラス、ＩＲ３６、日本晴、及び金南風のＳＳIIａに出現したアミノ酸のすべての組み合わせになるようなコンストラクトを設計した（図７参照）。
【００２４】
即ち、各フラグメントについて次の２種類のアミノ酸が存在するように設計した。
フラグメント１：  ８８番目のアミノ酸が、Ｇｌｕ又はＡｓｐ、
フラグメント２：６０４番目のアミノ酸が、Ｇｌｙ又はＳｅｒ、
フラグメント３：７３７番目のアミノ酸が、Ｖａｌ又はＭｅｔ、
フラグメント４：７８１番目のアミノ酸が、Ｌｅｕ又はＰｈｅ、
これらの全ての組み合わせは、図７に示すように１６通りとなる。図の左側は各フラグメントを１〜４の順に並べて示しており、その右側の＋や−の記号はＳＳ活性を示し、その右側の＃印の付いた番号は、各ＳＳIIａの識別番号を示している。図７では上記に示した各フラグメントの左側のアミノ酸を灰色で、右側のアミノ酸を白色で示す。ただし、フラグメント４のＰｈｅのみ灰色で斜線を付して示す。ＳＳ活性は、後記する活性試験の結果を示し、＋印は高活性であることを示し、−印は失活であることを示し、±はそれらの中間の活性を有していることを示している。＃印の付された識別番号の４桁の数字は、各桁が４個のフラグメントのそれぞれを示し、それらの各フラグメントのアミノ酸が上記した左側のアミノ酸であるときを１とし、右側のアミノ酸であるときを２として識別している。各識別番号の右側のカッコ内はイネの品種を示している。
【００２５】
各フラグメントは、インディカ種のＩＲ３６、日本晴、又は金南風のＳＳIIａ遺伝子を、制限酵素ＰｓｈＡＩ及び制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉで切断して、切断された断片からフラグメント１を得ることができ、制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ及び制限酵素ＢｓｉＷＩで切断して、切断された断片からフラグメント２を得ることができ、制限酵素ＢｓｉＷＩ及び制限酵素ＸｈｏＩで切断して、切断された断片からフラグメント３をえることができ、そして、フラグメント４は制限酵素ＸｈｏＩのサイトからストップコドンまでの領域と定義されるが、制限酵素ＸｈｏＩとストップコドンの下流の適当な制限酵素、例えばＳａｌＩで切断して制限酵素ＸｈｏＩのサイトからストップコドンまでの領域からなるフラグメント４を含有する断片を得ることができる。そして、得られた各フラグメントを任意にライゲーションして、必要に応じてコドンが一致するように調整して、それぞれの目的のアミノ酸となるコンストラクトを構築することができる。
例えば、図７に示す＃１１１２のコンストラクトの場合では、ＩＲ３６から得られたフラグメント１〜３と金南風から得られたフラグメント４とをライゲーションして、目的のコンストラクトを得ることができる。このようにして製造されたコンストラクトの塩基配列を配列表の配列番号７に示し、そのアミノ酸配列を配列番号８に示す。この配列表の配列番号７に示される塩基配列の１番目は、配列表の配列番号１の塩基配列の２０５番目の塩基に相当するものである。なお、配列番号１の２０５番目からは、ｃｇｃｃｇｃｇｃｇ・・・・・となっているが、末端に制限酵素サイトを作るために、配列番号７では、ｃｇｔｃｇｃｇｃｇ・・・・・と変更されているが、アミノ酸には変更はない。この＃１１１２のコンストラクトはフラグメント４が金南風に由来しているから、塩基の２１３６〜２１４０番目が、ｔｔｔｃｃとなっている。
同様にして製造された＃２１１２のコンストラクトの塩基配列を配列表の配列番号９に示し、そのアミノ酸配列を配列番号１０に示す。この＃２１１２のコンストラクトもフラグメント４が金南風に由来するために、塩基の２１３６〜２１４０番目が、ｔｔｔｃｃとなっている。
【００２６】
このようにして１６通りのコンストラクトを製造し、それらの両末端に作成したＰｓｈＡＩおよびＳａｌＩサイトを用いて、内部配列を大腸菌発現用ベクターであるｐＥＴ４３ｂ（Novagen）のタグタンパク質の下流にクローニングした。このベクターは、ＩＰＴＧの存在下で下流側に挿入された遺伝子が発現できるように設計されている。インサートの入ったクローンを大腸菌発現用宿主であるＡＤ４９４  ｐＬｙｓＳ（Novagen）に形質転換し、それぞれのインサートを含むコロニーを単離した。
得られた形質転換大腸菌を培養して、培養液からサンプリングして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、目的タンパク質の発現を確認した。結果を図８に図面に代わる写真で示す。図８のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、左から日本晴のＤＮＡを導入した場合、ＩＲ３６のＤＮＡを導入した場合、右側はコントロールを示す。コントロールは、ベクターのみを挿入した大腸菌を用いた。各場合は１ｍＭのＩＰＴＧ（大腸菌にインサートした遺伝子を発現させるための試薬）を添加した場合を＋記号でそれぞれの左側に示し、添加しない場合を−印でそれぞれの右側に示す。それぞれの場合についてサンプルのアプライ量が１０μＬと５μＬの場合を示している。日本晴とＩＲ３６における矢印（原図では赤色）は、ＩＰＴＧの添加により発現した目的のタンパク質を示している。ＳＳIIａの分子量は８８．９ｋＤａであるが、ここで発現させたタンパク質はタグが付着しているために約１６０ｋＤａのところにバンドが出現している。コントロールにおける矢印（原図では赤色）はタグタンパク質（Ｎｕｓタグ、Ｈｉｓタグ、Ｓタグ）を示している。
【００２７】
目的のタンパク質が発現している大腸菌のけん濁液から後述する試験法によりＳＳ活性を測定した。大腸菌に人工的に発現させたタンパク質は、使用した発現ベクターのｐＥＴ４３ｂの構造上、ＳＳＩＩａタンパク質の上流域にＮｕｓ−Ｔａｇ、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、Ｓ−Ｔａｇが付着している。これらが付着したままＳＳ活性の測定を試みた。ＳＳ活性測定法としては、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法により定性的な活性を確認し、試験管内で行うＡＤＰ遊離法により定量化を行った。
Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法では、ヨードヨードカリ液で染色した。ＳＳIIａ活性が正常であると予想されるＩＲ３６では、ゲル上に茶色い帯が生じ、この方法でＳＳＩＩａ活性によって得られたポリグルカンを検出できることを確認した。一方、ＳＳＩＩａ遺伝子を含まないベクターを形質転換したもの（Control）では、ＩＲ３６で見られた茶色い帯が得られなかった（図９参照）。したがって、この方法でＳＳIIａ活性を測定できることが確認できた。
試験管内で行うＡＤＰ遊離法では、ＳＳ活性は、鎖長を伸長したときに基質ＡＤＰ−グルコースからＡＤＰが遊離するため、遊離したＡＤＰを定量することで、ＳＳ活性を測定することができる(Nishi et al., 2001 Plant Physiol., 127; 459-472)。
【００２８】
結果を図９にまとめて図面に代わる写真で示す。図９の上段はＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法の結果を示し、図９の下段はＡＤＰ遊離法の結果をグラフ化して示したものである。図９のＡ〜Ｅは、それぞれ実験を行った日別に示されている。Ａ〜Ｃで１６通りの全てが実験されており、Ａの左側末端はベクターのみを導入した大腸菌を用いたものをコントロールとして示している。図９のＤは、中間型の＃２１１２及び＃１１１２、並びにやや中間型に近い＃１１２２と対照としての＃１１１１（ＩＲ３６）を行ったものである。Ｅは高活性型の＃２２１１、＃２１１１、＃１２１１、及び＃１１１１（ＩＲ３６）を行ったものである。
ＡＤＰ遊離法では、大腸菌に内在するグリコーゲンシンターゼ（ＧＳ）による活性が図９におけるグラフで約０．１程度現れる。したがって、図９の下段のグラフでＳＳ相対活性が０．１程度のものは導入したＳＳIIａの活性ではなく、宿主の大腸菌の内在性のＧＳの値だけが示されていることになる。
図９の上段のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法では、ＳＳ活性が存在すれば茶色のバンドとして染色される。その濃さによりＳＳ活性の強弱を判定することができる。なお、大腸菌による発現では、イネのような明瞭なバンドとはならなくて、図９に示されるようなテーリングが生じる。
これらの結果から、インディカイネのＩＲ３６のような高い活性を示すもの（図７では＋印で示される高活性型）を白色に、コントロールと同程度の活性しか示さないもの（図７では−印で示される失活型）を黒色に、それらの中間の活性を示すもの（図７では±印で示される中間型）を灰色にしたグラフで示している。
【００２９】
以上の結果をまとめると次のようになる（図７参照）。
（１）７３７番目と７８１番目のアミノ酸が正常（それぞれＶａｌとＬｅｕ）であれば、８８番目と６０４番目の変異の有無によらず、ＳＳIIａは高活性型（タイプ１）となる。
（２）７３７番目のアミノ酸がＶａｌがＭｅｔに変異した場合、７８１番目のアミノ酸の変異の有無にかかわらず、ＳＳIIａは失活型（タイプ２）となる。
（３）７８１番目のアミノ酸がＰｈｅに変異した場合、６０４番目のアミノ酸が正常（Ｇｌｙ）であれば、ＳＳIIａの活性は、若干の活性を有し前記タイプ１とタイプ２の中間の活性を有する中間型（タイプ３）となる。
（４）７８１番目のアミノ酸がＰｈｅに変異した場合、６０４番目のアミノ酸が変異（Ｓｅｒ）していれば、ＳＳIIａは失活型（タイプ２）となる。
即ち、７８１番目のアミノ酸が変異した場合は、６０４番目のアミノ酸の変異の有無に影響される。言い換えると、７８１番目のアミノ酸と６０４番目のアミノ酸の間には相互作用が存在し、７８１番目のアミノ酸が変異しても、６０４番目のアミノ酸に変異がなければ（インディカ型であれば）、ＳＳIIａ活性はある程度レスキューされる。このような相互作用の例は今まで知られておらず、極めて興味深いものであり、本発明により初めてあきらかにされたものである。
【００３０】
以上の結果を総合すると、ＳＳIIａの活性に重要なサイトは一カ所ではなく、しかも複数の箇所が優先順位をもっていることが判明した。即ち、最もＳＳIIａ活性に必須な箇所は７３７番目のアミノ酸のバリン（Val）であり、ここがメチオニン（Met）に変異すれば例外なく活性が低下する。第２に重要な変異箇所は７８１番目のロイシン（Leu）である。７８１番目のアミノ酸がフェニルアラニン（Phe）に変異するとＳＳIIａ活性に影響が出るが、６０４番目のアミノ酸によって活性低下の度合いが異なる。６０４番目のアミノ酸がセリン（Ser）（変異型）の場合には完全に失活するが、グリシン（Gly）（正常型）の場合には、中間型程度の活性を示すようになる。また、８８番目の変異サイトは重要ではないことが明らかになった。
以上、本発明によって、人工的に作成したＳＳIIａの遺伝子にさまざまな性質を付与でき、こうした遺伝子を植物に導入するなどによって、形質転換植物に新規デンプンを作らせる技術が確立された。特に、７８１番目のアミノ酸と６０４番目のアミノ酸の相互作用によって、自然には存在しない中間型の活性を有する人工ＳＳIIａ遺伝子は、ジャポニカ型とインディカ型の中間型の新規デンプンを作成する上で利用価値が高い。
【００３１】
以上のように、本発明は、イネのデンプンにおける味覚や糊化温度などの特性の相違が生じる原因となっているイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の活性が変化する原因をアミノ酸配列に基づいて解明することができた。即ち、スターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の４種、より詳細には３種のアミノ酸がＳＳIIａの活性を決定するものであることを本発明が明らかにした。さらに、各種のＳＳIIａの変異体タンパク質の活性を試験した結果、ジャポニカイネ（失活型ＳＳIIａ（タイプ２））やインディカイネ（高活性型（タイプ１））とは異なる中間型の活性を有するＳＳIIａ（タイプ３）が存在することが明らかになった。この型のＳＳIIａは、天然では未だ確認されておらず、人工的な変異体タンパク質であり、このＳＳIIａによりジャポニカイネのデンプンとインディカイネのデンプンの中間の特性（例えば、糊化温度など）を有するデンプンが産生されるものと期待され、食糧としてだけでなく、産業用デンプンとしても新種のデンプンとして期待される。
【００３２】
したがって、本発明は、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）のアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性を制御する方法を提供するものであり、この方法は天然のＳＳIIａのいずれかのアミノ酸を他のアミノ酸に変更してＳＳIIａの活性を変化させるものであり、ＳＳIIａの活性が変化するのであればアミノ酸の種類、数は特に限定はない。例えば、配列表の配列番号８又は１０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質のように、天然のＳＳIIａの６９番目のアミノ酸から８１０番目のアミノ酸に相当するアミノ酸配列からなるものであってもよい。
ここで、他のアミノ酸に置換するとは、１：１で弛緩する場合に限定されるものではなく、１：２以上の付加的置換や、１：０のような削除的置換を包含している。より詳細には、本発明は、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目、６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性を制御する方法、さらに詳細には、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性を制御する方法を提供するものである。この方法における「他のアミノ酸に置換」するとは、前記したような付加的置換及び削除的置換を包含するものである。
【００３３】
本発明における置換するアミノ酸としては、天然型のα−アミノ酸が好ましいがこれに限定されるものではなく、デンプンを産生する植物において発現可能であり、ＳＳIIａの活性を変更することができるものであれば任意のアミノ酸を使用することができる。
本発明の好ましい置換の態様としては、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目のアミノ酸を、アスパラギン酸（Ａｓｐ）又はグルタミン酸（Ｇｌｕ）のいずれかとする方法、６０４番目のアミノ酸を、グリシン（Ｇｌｙ）又はセリン（Ｓｅｒ）のいずれかとする方法、７３７番目のアミノ酸を、バリン（Ｖａｌ）又はメチオニン（Ｍｅｔ）のいずれかとする方法、７８１番目のアミノ酸を、ロイシン（Ｌｕｅ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）のいずれかとする方法、及びこれらの任意の２種以上の組み合わせからなる方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
例えば、ＳＳIIａの７３７番目のアミノ酸を、メチオニン（Ｍｅｔ）にしてスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の活性を失活型とする方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３４】
本発明の方法におけるアミノ酸を変更する手段としては、特に制限はないが、ＳＳIIａをコードする遺伝子の塩基の変更によって行う方法が例示される。ここで、塩基を変更するとは、存在している塩基を他の塩基に１：１で置換する方法、１：２以上、好ましくはコドンを形成できるように３塩基単位での付加的置換をする方法、及び当該塩基の属するコドンを削除する削除的置換をする方法が包含されている。
このような塩基を置換する手法としては、特に制限はなく、目的の塩基配列を導入することができる各種の手法を採用することができる。例えば、ポイントミューテーションのような変異によってもよく、また置換使用とする塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを作成し、適当な制限酵素部位でＳＳIIａの遺伝子を切断した後、当該オリゴヌクレオチドを導入する方法によることもできる。
【００３５】
本発明は、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）のアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性が制御されたＳＳIIａの変異体タンパク質、より詳細には、本発明は、カサラス、ＩＲ３６、日本晴、及び金南風からなる群から選ばれた１種のイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の、８８番目、６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上が、他のアミノ酸に置換されてなるイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質を提供する。カサラスとＩＲ３６のＳＳIIａのアミノ酸配列は全く同じであるから、結局、ＩＲ３６、日本晴、及び金南風の３品種からなる群から選ばれた１種のイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）、即ち公知になっているイネのＳＳIIａのアミノ酸配列に基づいて、当該ＳＳIIａ類のいずれかの、８８番目、６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上が、他のアミノ酸に置換されてなるイネのＳＳIIａの新規なアミノ酸配列を有する変異体タンパク質を提供するものである。ここで、他のアミノ酸に置換されてなるとは、前記した置換の態様と同じである。
本発明のＳＳIIａの変異体タンパク質の好ましい例としては、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の６０４番目のアミノ酸がグリシン（Ｇｌｙ）であり、７３７番目のアミノ酸がメチオニン（Ｍｅｔ）である、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の６０４番目のアミノ酸がグリシン（Ｇｌｙ）であり、７３７番目のアミノ酸がバリン（Ｖａｌ）であり、かつ７８１番目のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であるイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目のアミノ酸がグルタミン酸（Ｇｌｕ）であり、６０４番目のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）である、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目のアミノ酸がアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、６０４番目のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）であり、７３７番目のアミノ酸がバリン（Ｖａｌ）であり、７８１番目のアミノ酸がロイシン（Ｌｅｕ）である、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目のアミノ酸がアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、６０４番目のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）であり、７３７番目のアミノ酸がメチオニン（Ｍｅｔ）であり、７８１番目のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）である、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質、及びこれらの任意の２種以上の組み合わせからなる変異体タンパク質が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３６】
本発明は前記してきたイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。本発明のＤＮＡは発現可能な形態であってもよいし、そうでなくても、前記した本発明のＳＳIIａの変異体タンパク質の全長又は変異部分を含む部分長をコードするものであってもよい。本発明のＤＮＡは１本鎖であっても、２本鎖であってもよく、前記した本発明のＳＳIIａのの変異体を発現させるためのものだけでなく、これらのＤＮＡの存在を特異的に検出・同定または定量するためのプローブや、ＰＣＲなどの増幅用のプライマーとして使用可能な部分長のものであってもよい。
さらに、本発明のＤＮＡをプラスミドなどのベクターに組み込んだものであってもよい。したがって、本発明は本発明のＤＮＡを含有するベクターを提供するものである。本発明のベクターは発現可能なものであってもよいが、かならずしも発現可能である必要はない。使用されるベクターとしては、プラスミドやウイルスなどが挙げられる。
このようなベクターには必要に応じて、各種のプロモーター、レポーター遺伝子、タグ、耐性遺伝子などを含有させることもできる。
【００３７】
前記した本発明のＤＮＡを用いて、各種の生物、例えば、大腸菌のような微生物、イネなどの高等植物を形質転換することも可能である。形質転換する手法としては、公知の各種の手法、例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法などの手法を使用することもできる。
したがって、本発明はこのような手法により、形質転換された植物を提供するものである。本発明における宿主となる植物としては、デンプンを産生することができる植物、好ましくは高等植物であれば特に制限はないが、使用する遺伝子がイネ由来のものであることから、イネ科植物が好ましいがこれに限定されるものではない。
宿主植物は、内在性のＳＳIIａの遺伝子を有したままでもよいが、内在性のＳＳIIａの遺伝子を欠損した変異体であるのが好ましい。内在性の遺伝子を欠損させる方法としてはジーンターゲンッティング法などによってもよいが、発現を抑制できればよいと意味でＲＮＡｉ法なども使用することが可能である。
【００３８】
また、本発明は、前記した形質転換植物を用いて外来性のＳＳIIａの遺伝子に応じた特性を有するデンプンを製造する方法を提供する。本発明のこの方法におけるＳＳIIａの遺伝子に応じた特性を有するデンプンとは、元の宿主となる植物が産生するデンプンとは異なるアミロペクチンのクラスター構造、特にグルコースの鎖長の分布が異なるデンプンのことである。
デンプンの味覚や糊化温度などの特性の多くは、このクラスター構造に依存しており、本発明のこの方法により製造されるデンプンは、デンプン合成におけるＳＳIIａの活性が制御されているために、その制御下でのクラスター構造を有するものとなり、使用目的に応じた特性を有するデンプンの製造が可能となる。
したがって、本発明は、食糧用としてのデンプンだけでなく、各種の特性を有する産業用デンプンを産生させるための基本技術を提供するものである。
【発明の効果】
【００３９】
本発明は、植物におけるデンプンの合成、特にイネにおけるデンプンの合成において、その味覚や糊化温度などの特性を決定する重要な因子としてのＳＳIIａの活性を調節できることを明らかにするものであり、本発明は、目的の特性を有するデンプンを得るための手法として遺伝子の操作により可能であることを具体的に示すものである。また、本発明は、イネのデンプンとしてインディカイネの作るデンプンやジャポニカイネの作るデンプンの他に、これらの中間型の特性を有するデンプンを製造させることを可能とする中間型の活性を有するＳＳIIａの存在を初めて明らかにしたものである。
ＳＳIIａなどの酵素の活性低下に関わるアミノ酸置換は、同時に活性に重要な部位であることは言うまでもない。これらの部位をさまざまなアミノ酸に変更することで、酵素活性をさまざまなレベルに変えることができる。即ち、ＳＳIIａの活性を増強させることができたなら、既存のインディカ米よりも高い糊化温度をもつデンプンを開発することができることになる。また、インディカ型の活性型ＳＳIIａと、ジャポニカ型の不活性型ＳＳIIａの中間の活性をもつ人工ＳＳIIａ遺伝子をジャポニカ型イネに導入することによって新規な特性を有するデンプンを作成することができる。このように、本発明によるＳＳIIａの活性の制御により、目的に応じた特性を有するデンプンの製造が可能となる。
また、植物、特にイネにおける他のＳＳのアイソザイム、特にＳＳIIａと相同性の高いＳＳIIｂ、ＳＳIIｃの機能は現在まで全く未解明であり、本発明によるＳＳIIａの活性部位と比較することでこれらの機能解明の手がかりになるものである。
【００４０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
イネの３品種からのコンストラクトの作成
インディカ品種であるＩＲ３６、ジャポニカ品種である日本晴、金南風の３品種のそれぞれに由来するＳＳIIａのｍＲＮＡからｃＤＮＡを作成し、これを鋳型に、ＳＳＩＩａのＮ末端と予想される位置より２残基上流に制限酵素ＰｓｈＡＩサイト含むようにプライマーを設計し、これと終始コドンとＳａｌＩサイトを含むプライマーを用いてＰＣＲを行った。それぞれのプライマーの配列は以下の通りである。
フォーワードプライマー：  5’-ATGAATTCATAGACAAACGTCGCGCGGATGATATCTAGTCG-3’
リバースプライマー    ：  5’-CTCTTCTACCGCAGGAATAGGGGAAGGGGGAGAACG-3’
得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターにクローニングし、それぞれ３品種のコンストラクトを作成した。
【実施例２】
【００４２】
シャッフリングコンストラクトの作成
日本晴と金南風のＳＳＩＩａ遺伝子は、インディカ種のカサラスやＩＲ３６の遺伝子に比べてアミノ酸置換を生じる変異がそれぞれ３カ所、即ち日本晴では、アミノ酸の８８番目、６０４番目、及び７３７番目であり、金南風では８８番目、６０４番目、及び７８１番目に変異が存在し、このうち２カ所が共通した変異であった（図６Ａ参照）。したがって、これらの変異の箇所を合わせると合計４カ所（塩基配列で、２６４番目、  １８１０番目、２２０９番目、及び２３４１番目）にアミノ酸の置換が生じる変異があり、これらの箇所をそれぞれ独立に組み換えることができるように、これらの箇所をそれぞれ１箇所づつ含むフラグメント化するために、制限酵素部位として、塩基配列で２０４番目のＰｓｈＡＩ、１１７３番目のＥｃｏＴ２２Ｉ、２１６０番目のＢｓｉＷＩ、及び２３０２番目のＸｈｏＩを選んだ（図６Ａ参照）。
これらの制限酵素で切断されて形成される４種類の断片を、５’領域から順にフラグメント１〜４と名付け、これらがすべての組み合わせになるようなコンストラクトを設計した（図７参照）。
これらのコンストラクトの製造方法を図に示す＃１２２２を例として簡単に説明する。まず、ＩＲ３６のＳＳIIａ遺伝子を制限酵素ＰｓｈＡＩ及びＥｃｏＴ２２Ｉで切断して、アガロースゲル電気泳動により分離して切り出して抽出してフラグメント１とした。同様に、日本晴れのＳＳIIａ遺伝子をＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢｓｉＷＩで切断して抽出してフラグメント２とし、また、これをＢｓｉＷＩ及びＸｈｏＩで切断して抽出してフラグメント３とした。さらに、金南風のＳＳIIａ遺伝子をＸｈｏＩ及びＳａｌＩで切断して抽出してフラグメント４を含有する断片とした。これらをライゲーションして、目的の＃１２２２のコンストラクトを製造した。
【実施例３】
【００４３】
形質転換大腸菌の作成
実施例１及び実施例２で作成したコンストラクトのＰｓｈＡＩおよびＳａｌＩサイトを用いて、これらのコンストラクトを大腸菌発現用ベクターであるｐＥＴ４３ｂ（Novagen）のタグタンパク質の下流にそれぞれクローニングした。インサートの入ったクローンを大腸菌発現用宿主であるＡＤ４９４  ｐＬｙｓＳ（Novagen)にそれぞれ形質転換し、インサートを含むコロニーを単離した。
大腸菌のコロニーを２ｍｌのカベニシリン５０μg/ml、クロラムフェニコール３４μg/mlを含むＬＢ培地(LBCbCm)で３７℃で回転培養し、ＯＤ６００ｎｍ＝０．６〜１．０になったところで、４℃で終夜保存した。
翌日、４℃で９５００ｒｐｍで１分間遠心分離することで沈殿を得て、これを２ｍｌの前記と同じＬＢ培地でけん濁して、５０ｍｌのＬＢ培地で希釈し、ＯＤ６００ｎｍ＝０．６〜１．０になるまで３７℃で振とう培養した。
５分間氷上に放置して冷却した後、１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で２時間、振とう培養した。
培養液から４ｍｌを取り、５分間氷上に置き、４℃で１５０００ｒｐｍで２分間遠心分離することで沈殿を集め、８００μｌのＰＢＳでけん濁した。
これに電気泳動用サンプルバッファー（０．１Ｍ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、１２％２−メルカプトエタノール、０．２％ＢＰＢ(Bromo Phenol Blue)、２０％グリセリン）を加え、超音波を5秒を２回かけ、４℃で１５０００ｒｐｍで１分間遠心分離した上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、目的タンパク質の発現を確認した。結果を図８に示す。
【実施例４】
【００４４】
ＳＳ活性の測定（Native-PAGE/SS活性染色法）
実施例３において大腸菌で人工的に発現させたタンパク質は、使用した発現ベクターのｐＥＴ４３ｂの構造上、ＳＳＩＩａタンパク質の上流域にＮｕｓ−Ｔａｇ、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、Ｓ−Ｔａｇが付着している。これらが付着したままＳＳ活性の測定を試みた。
目的のタンパク質が発現している大腸菌けん濁液４ｍｌを採取した。この大腸菌けん濁液に１００μｌの抽出バッファー（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０％グリセリン、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｎａ、５ｍＭ  ジチオスレイトール、０．４  ｍＭ  ＰＭＳＦ／ＥｔＯＨ）を加えて超音波で破砕し、１５０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心分離して得た上清にＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（０．３Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．１％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール）を１／２体積加えて電気泳動に用いた。電気泳動には７．５％アクリルアミドゲルを用いた。フロントが濃縮ゲルを通過するまで７．５ｍＡ、通過してから１５ｍＡの定常電流で４℃下で電気泳動し、フロントが出てから３０分で電流を止めた。その後、洗浄液（クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５、０．５Ｍ  クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ  バイシン−ＮａＯＨ（Bicine-NaOH）、ｐＨ７．５、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、２ｍＭ  ジチオスレイトール）で２回洗浄し（各１５分）、洗浄液にＡＤＰＧを１ｍＭになるように加えた反応液中で２０時間３０℃で振とうしながら反応させた。反応後、ヨードヨードカリ液（１％ＫＩ／０．１％Ｉ２）で染色した。
結果を図９上段に示す。ＳＳIIａの活性が正常であると予想されるＩＲ３６では、ゲル状に茶色い帯が生じ、ＳＳIIａの遺伝子を含まないベクターを形質転換したもの（コントロール）では、ＩＲ３６で見られた茶色い帯が生じなかった。
【実施例５】
【００４５】
ＳＳ活性の測定（ＡＤＰ遊離法）
ＳＳ活性は、鎖長を伸長したときに基質ＡＤＰ−グルコースからＡＤＰが遊離するため、遊離したＡＤＰを定量することで、ＳＳ活性を測定することができる(Nishi et al., 2001)。反応液（５０ｍＭバイシン−ＮａＯＨ(Bicine-NaOH)、ｐＨ７．４、５００ｍＭクエン酸−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、２０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＡＤＰグルコース、２ｍｇ／ｍｌ牡蛎グリコーゲン(oyster glycogen)）に、大腸菌のけん濁液４ｍｌに抽出バッファー（(５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｎａ、５ｍＭ  ジチオスレイトール、０．４ｍＭ  ＰＭＳＦ／ＥｔＯＨ）を加えて超音波で破砕し、１５０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心分離して得た上清を加え、２０分間、３０℃で反応させた。煮沸することで反応を停止し、これに第２反応液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  クレアチンホスファート(Creatin phosphate)、２００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍｇ／ｍｌクレアチンホスホキナーゼ(Creatin phosphokinase)）を１００μｌ加え、３０℃で３０分反応させた。煮沸することで反応を停止し、遠心分離した上清１５０μｌに第３反応液（１２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  グルコース、１ｍＭ  ＮＡＤＰ＋）を加え、ヘキソキナーゼ（hexokinase）とＧ６Ｐデヒドロゲナーゼ（dehydrogenase）を加える前と加えた後、１時間後の３４０ｎｍの吸光度の差を測定し、ＳＳ活性値とした。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、植物におけるデンプンの合成、特にイネにおけるデンプンの合成において、その味覚や糊化温度などの特性を決定する重要な因子としてのＳＳIIａの活性を調節できることを明らかにするものであり、本発明は、目的の特性を有するデンプンを得るための手法として遺伝子の操作により可能であることを具体的に示すものである。また、本発明は、イネのデンプンとしてインディカイネの作るデンプンやジャポニカイネの作るデンプンの他に、これらの中間型の特性を有するデンプンを製造させることを可能とする中間型の活性を有するＳＳIIａを提供するものである。
したがって、本発明によれば、本発明で開示された部位のアミノ酸をさまざまなアミノ酸に変更することで、酵素活性をさまざまなレベルに変えることができ、植物のデンプン合成に関与するＳＳIIａの活性を増強させたり、失活させたり、またその中間的な活性にすることを可能とし、既存のインディカ米よりも高い糊化温度をもつデンプンや、さまざまな糊化温度を有するデンプンを開発することが可能となる。また、インディカ型の活性型ＳＳIIａと、ジャポニカ型の不活性型ＳＳIIａの中間の活性をもつ人工ＳＳIIａの遺伝子をジャポニカ型イネに導入することによってインディカ−ジャポニカ中間型のデンプンを製造することができ、デンプン産業のみならず、食糧問題においても本発明の寄与は大きく、産業上極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、生物における貯蔵性ポリグルカンの構造を示す概念図である。
【図２】図２は、アミロペクチンのクラスター構造を示すものである。
【図３】図３は、イネ胚乳におけるジャポニカとインディカとのアミロペクチンのクラスター構造の相違を示すものである。
【図４】図４は、生物における貯蔵性ポリグルカンである、アミロース、アミロペクチン、及びグリコーゲンの生合成経路の概要を示すものである。
【図５】図５は、Ｌ型アミロペクチンとＳ型アミロペクチンのクラスター構造と、ＳＳIIａの活性の関係を模式的に示したものである。
【図６】図６は、イネの種々の品種のＳＳIIａのアミノ酸配列をにおける主要な部位のアミノ酸を模式的に示し（図６Ａ）、その遺伝子における制限酵素部位と本発明により分けられた各フラグメントの構造を模式的に示したものである（図６Ｂ）。
【図７】図７は、本発明により作成されたＳＳIIａの４つのフラグメントにおける全ての組み合わせによるイネＳＳIIａのアミノ酸配列の構造を模式的に示し、それらにおけるＳＳIIａの活性の試験結果、及び各ＳＳIIａ識別番号のそれぞれ示す。
【図８】図８は、本発明の方法によりＳＳIIａの遺伝子で形質転換された大腸菌における、当該遺伝子の発現を確認する試験の結果を示す図面に代わる写真である。
【図９】図９は、本発明の方法により製造されたイネＳＳIIａの変異体タンパク質のＳＳ活性を測定した結果を示す図面に代わる写真である。図９の上段はNative-PAGE/SS活性染色法による結果を示し、下段はＡＤＰ遊離法による結果をグラフ化したものである。
【配列表フリーテキスト】
【００４８】
配列番号１；  ＩＲ３６のＳＳIIａの翻訳領域の塩基配列
配列番号２；  ＩＲ３６のＳＳIIａのアミノ酸配列
配列番号３；  金南風のＳＳIIａの翻訳領域の塩基配列
配列番号４；  金南風のＳＳIIａのアミノ酸配列
配列番号５；  フォーワードプライマー
配列番号６；  リバースプライマー
配列番号７；  ＃１１１２の構築物の塩基配列
配列番号８；  ＃１１１２の構築物のアミノ酸配列
配列番号９；  ＃２１１２の構築物の塩基配列
配列番号１０；  ＃２１１２の構築物のアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2005269928.tif 000009
【図９】
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【配列表】
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