(57)【要約】      （修正有）【課題】癌を治療する方法およびそれに使用する薬学的組成物を提供する。【解決手段】ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストとメバロン酸経路阻害剤またはメバロン酸アンタゴニストとを用いて、細胞周期を調節し、癌を治療する。ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストとして、たとえば、トログリタゾンまたはピオグリタゾンを用いること、メバロン酸経路阻害剤として、ロバスタチンまたはシンバスタチン等の３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を適用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療する方法であって、投与を必要とする被検体に、有効量のメバロン酸経路阻害剤および有効量のペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストを投与する工程を含む方法。
【請求項２】
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストがトログリタゾンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストがピオグリタゾンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
メバロン酸経路阻害剤が３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素阻害剤がスタチン化合物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
スタチン化合物がロバスタチンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストがトログリタゾンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストがピオグリタゾンである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
スタチン化合物がシンバスタチンである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストがトログリタゾンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストがピオグリタゾンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
癌が、神経膠腫、血管肉腫、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮頚癌、または肺癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
癌を治療する方法であって、投与を必要とする被検体に、有効量のメバロン酸アンタゴニストおよび有効量のペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストを投与する工程を含む方法。
【請求項１４】
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストがトログリタゾンまたはピオグリタゾンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
癌が、神経膠腫、血管肉腫、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮頚癌、または肺癌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
メバロン酸経路阻害剤、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニスト、およびその薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１７】
抗癌剤をさらに含む、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストがトログリタゾンまたはピオグリタゾンである、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
メバロン酸経路阻害剤が３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素阻害剤である、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素阻害剤がスタチン化合物である、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
スタチン化合物がロバスタチンまたはシンバスタチンである、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
メバロン酸アンタゴニスト、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニスト、およびその薬学的に許容可能な担体を含む、癌を治療するための薬学的組成物。
【請求項２３】
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストがトログリタゾンまたはピオグリタゾンである、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
抗癌剤の効力を高める方法であって、投与を必要とする被検体に、有効量の抗癌剤、有効量のメバロン酸経路阻害剤、および有効量のペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストを投与する工程を含む方法。
【請求項２５】
メバロン酸経路阻害剤が３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素阻害剤である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素阻害剤がスタチン化合物である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
スタチン化合物がロバスタチンまたはシンバスタチンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストがトログリタゾンまたはピオグリタゾンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
抗癌剤の効力を高める方法であって、投与を必要とする被検体に、有効量の抗癌剤、有効量のメバロン酸アンタゴニスト、および有効量のペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストを投与する工程を含む方法。
【請求項３０】
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストがトログリタゾンまたはピオグリタゾンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
癌化学療法剤の効力を高める方法であって、投与を必要とする被検体に、有効量の癌化学療法剤および有効量のペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストを投与する工程を含む方法。
【請求項３２】
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストがトログリタゾンまたはピオグリタゾンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
細胞周期をダウンレギュレートする方法であって、細胞をメバロン酸経路阻害剤およびペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストと接触させる工程、または細胞をメバロン酸アンタゴニストおよびペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストと接触させる工程を含む方法。
【請求項３４】
メバロン酸経路阻害剤がスタチン化合物である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
スタチン化合物がロバスタチンまたはシンバスタチンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γアゴニストがトログリタゾンまたはピオグリタゾンである、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連出願）
本願は、２００４年１月１６日に出願された米国特許仮出願第６０／５３７，２３５号の優先権を主張する。米国特許仮出願第６０／５３７，２３５号の内容は参照により本明細書に援用される。
【０００３】
（背景）
高コレステロール血症を管理するために用いられるスタチン系薬物は、コレステロール合成のメバロン酸経路をブロックする。この経路は、細胞の増殖および形質転換の調節に重要な役割を果たすことも知られている。最近の研究から、スタチン系薬物はｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのいずれにおいても腫瘍細胞の増殖を阻害したことが分かっている（例えば、非特許文献１を参照）。しかしながら、これらの研究で示された総合的な有効性は意味を持つものでなかった。
【０００４】
チアゾリンジオン（thiazolinedione ）型ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ（ＰＰＡＲγ）アゴニストであるトログリタゾンは、抗ＩＩ型糖尿病薬である。ＰＰＡＲγアゴニストがヒト悪性腫瘍に由来する細胞株の分化を誘導するので、トログリタゾンは潜在的な抗癌剤として研究されてきた。それにもかかわらず、様々な癌に対する臨床試験の結果は満足のゆくものではなかった（例えば、非特許文献２；非特許文献３を参照）。
【非特許文献１】ウォン、ダブリュダブリュ（Ｗｏｎｇ  ＷＷ）ら、リューケミア誌（Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、２００２年、第１６巻、ｐ．５０８−１９
【非特許文献２】クルケ、エムエイチ（Ｋｕｌｋｅ  ＭＨ）ら、ザ・キャンサー・ジャーナル誌（Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ）、２００２年、第８巻、ｐ．３９５−９
【非特許文献３】バースタイン、エイチジェイ（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ  ＨＪ）ら、ブレストキャンサー・リサーチ・アンド・トリートメント誌（Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．）、２００３年、第７９巻、ｐ．３９１−７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、癌治療法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（概要）
本発明は、ＰＰＡＲγアゴニストとメバロン酸経路阻害剤またはメバロン酸アンタゴニストが共同して、いくつかの周期周期調節タンパク質（cycle cycle-regulating protein）の調節に対して協力作用を示すという驚くべき発見に基づいている。詳細に述べると、これらの２種類の活性薬剤は、サイクリン依存性キナーゼ−２（ＣＤＫ−２）およびサイクリンＡのレベルを効果的に低下させ、ｐ２７ｋｉｐ１（癌抑制因子）のレベルを上昇させ、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）タンパク質のリン酸化を減少させる。驚くべきことに、これらの２種類の活性薬剤は協力して多くの種類の癌細胞を阻害することも発見されている。
【０００７】
従って、本発明の１つの態様は、細胞をメバロン酸経路阻害剤およびＰＰＡＲγアゴニストと接触させることによって、または細胞をメバロン酸アンタゴニストおよびＰＰＡＲγアゴニストと接触させることによって細胞周期をダウンレギュレートする方法である。
メバロン酸経路阻害剤は、スタチン化合物（例えば、ロバスタチンまたはシンバスタチン）などの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤でもよい。ＰＰＡＲγアゴニストはトログリタゾンまたはピオグリタゾンでもよい。メバロン酸アンタゴニストはロバスタチンまたはシンバスタチンでもよい。
【０００８】
本発明の別の態様は、癌（例えば、神経膠腫、血管肉腫、膵臓癌、前立腺癌、子宮頚癌、または肺癌）を治療する方法である。この方法は、投与を必要とする被検体に、有効量のＰＰＡＲγアゴニストおよび有効量のメバロン酸経路阻害剤またはメバロン酸アンタゴニストを投与する工程を含む。
【０００９】
前記方法はまた、治療しようとする被検体に有効量の抗癌剤を投与する工程を含んでもよい。
本発明のさらなる態様は癌化学療法剤の効力を高める方法である。この方法は、投与を必要とする被検体に、有効量の癌化学療法剤および有効量のＰＰＡＲγアゴニストを投与する工程を含む。この方法はまた、被検体に、有効量のメバロン酸経路阻害剤またはメバロン酸アンタゴニストを投与する工程を含んでもよい。
【００１０】
メバロン酸経路阻害剤またはメバロン酸アンタゴニスト、ＰＰＡＲγアゴニスト、および薬学的に許容可能なその担体を含む組成物、ならびに癌治療用の医薬品を製造するための、このような組成物の使用も本発明の範囲内にある。組成物は、さらに抗癌剤を含んでもよい。
【００１１】
本発明の他の特徴、目的、および利点は発明を実施するための最良の形態および特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（詳細な説明）
本発明は、癌を治療する方法または細胞周期を調節する方法を特徴とする。前記方法は、投与を必要とする被検体に、有効量のＰＰＡＲγアゴニストおよび有効量のメバロン酸経路阻害剤またはメバロン酸アンタゴニストを投与する工程を含む。用語「メバロン酸経路阻害剤」は、メバロン酸経路の任意の酵素（例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）を阻害し、それにより経路をブロックする化合物を意味する。メバロン酸経路阻害剤は、酵素に結合して阻害活性を発揮してもよいし、メバロン酸経路の酵素を間接的に阻害してもよい。このような阻害剤の一例はスタチン化合物（例えば、ロバスタチンまたはシンバスタチン）である。メバロン酸経路は当該分野で周知である。例えば、「生化学的経路：生化学および分子生物学のアトラス（Biochemical pathways:An atlas of biochemistry and molecular biology ）」、ゲルハルト・ミカル（Gerhard Michal）編、ワイリー・スペクトルム（Wiley-Spektrum）、１９９８年を参照のこと。メバロン酸アンタゴニストは、メバロン酸による効果に拮抗する、またはメバロン酸のレベルを低下させる化合物である。ＰＰＡＲγアゴニストは、ＰＰＡＲγの活性を刺激する物質を意味する。適切なＰＰＡＲγアゴニストの例としてトログリタゾンおよびピオグリタゾンが挙げられるが、これに限定されない。
【００１３】
本明細書で使用する用語「治療する」は、活性薬剤を含む組成物を、癌、癌の症状、または癌素因を治す、いやす、緩和する、軽減する、変化させる、治癒する、良くする、改善する、または影響を及ぼすことを目的として、癌、癌の症状、または癌素因を有する被検体に適用または投与することを意味する。本明細書で使用する「有効量」は、それぞれの薬剤が投与を必要とする被検体に一または複数の他の活性薬剤と共に投与される時に、被検体に治療効果をもたらすのに必要とされる各活性薬剤の量を意味する。当業者には当然のことであるが、投与経路、賦形剤の使用、および他の活性薬剤との併用に応じて、有
効量は変化する。
【００１４】
用語「癌」は、自律的増殖能（すなわち、急速な細胞増殖を特徴とする異常な状況または状態）を有する細胞を意味する。用語「癌」は、組織病理学的な種類または侵襲性の段階に関係なく、全ての種類の癌増殖または発癌プロセス、転移組織または悪性に形質転換した細胞、組織、もしくは器官を含むことを意味する。
【００１５】
前記の用語は、組織病理学的な種類または侵襲性の段階に関係なく、全ての種類の癌増殖または発癌プロセス、転移組織または悪性に形質転換した細胞、組織、もしくは器官を含むことを意味する。癌の例として、癌腫、血液新生物、および肉腫（例えば、白血病、肉腫、骨肉腫、リンパ腫、黒色腫、卵巣癌、皮膚癌、精巣癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、乳癌、前立腺結腸直腸癌、頭部および頚部の癌、脳の癌、食道癌、膀胱癌、副腎皮質癌、肺癌、気管支癌、子宮内膜癌、鼻咽頭癌、子宮頚癌もしくは肝癌、または原発部位が未知の癌）が挙げられるが、これに限定されない。さらに、癌は、癌細胞がＰ糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質、肺癌の耐性関連タンパク質、乳癌の耐性タンパク質、または抗癌剤耐性に関連する他のタンパク質を発現する、薬物耐性の表現型でもよい。
【００１６】
前記方法を実施するために、活性薬剤は同時に適用されてもよいし、異なる時間に適用されてもよい。活性薬剤は、経口、非経口、吸入スプレー、または埋め込み式のリザーバによって投与することができる。本明細書で使用する用語「非経口」は、皮下の、皮内の、静脈内の、筋肉内の、関節内の、動脈内の、滑液嚢内の、胸骨内の、くも膜下腔内の、病巣内の、および頭蓋内の注射法または注入法を含む。
【００１７】
前記方法では、前記の２種類の活性薬剤および薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物を使用することができる。用語「薬学的に許容可能な担体」は、それぞれの活性薬剤に適合し（好ましくは、活性薬剤を安定化することができ）、治療しようとする被検体に有害でない担体を意味する。例えば、活性薬剤を送達するための薬学的賦形剤として、シクロデキストリンなどの可溶化剤を使用することができる。他の担体の例として、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、およびディーアンドシー（Ｄ＆Ｃ）黄色１０号が挙げられる。
【００１８】
経口投与用組成物は経口投与可能な任意の剤形でよい。このような剤形として、錠剤、カプセル、エマルジョンおよび水性懸濁液、分散液および溶液が挙げられるが、これに限定されない。一般的に用いられる錠剤用担体としてラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。一般的に、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も錠剤に添加される。カプセルの形態で経口投与する場合、有用な希釈剤としてラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁液またはエマルジョンが経口投与される場合、活性成分は、乳化剤または懸濁剤と共に油相に懸濁または溶解することができる。所望であれば、ある特定の甘味剤、着香剤、または着色剤を添加することができる。
【００１９】
注射用滅菌組成物（例えば、水性懸濁液または油性懸濁液）は、適切な分散剤または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）および懸濁剤を用いて、当該分野で周知の技法に従って処方することができる。注射用滅菌製剤はまた、非経口投与可能な無毒の希釈剤または溶媒（例えば、１，３−ブタンジオ−ル）中の溶液または懸濁液で、滅菌した注射可能なものでもよい。使用することができる許容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、マンニトール、水、リンガー溶液、および等張食塩液がある。さらに、滅菌した固定油（例えば、合成モノグリセリドまたはジグリセリド）が溶媒または懸濁媒体として従来より用いられている。オレイン酸などの脂肪酸およびそのグリセリド誘導体が注射液の調製に有用であり、オリーブ油またはヒマシ油などの薬学的に許容可能な天然の油（特に、そのポリオキシエチル化物）も有用である。これらの油性の溶液または懸濁液はまた、長鎖
アルコール希釈剤もしくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロースもしくは同様の分散剤を含んでもよい。
【００２０】
吸入用組成物は、調剤分野において周知の技法に従って調製することができ、ベンジルアルコールもしくは他の適切な防腐剤、バイオアベイラビリティーを高める吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当該分野で周知の他の可溶化剤もしくは分散剤を用いて、食塩水に溶解した溶液として調製することができる。
【００２１】
前記の癌治療法はまた、癌を有する被検体に有効量の抗癌剤を投与する工程も含む。用語「抗癌剤」は、癌治療には認可されていなかったメバロン酸経路阻害剤およびＰＰＡＲγアゴニストを除く、癌を治療するために用いられる薬物を意味する。抗癌剤の例として、レチノイド、非ステロイド系（ＮＳＡＩＤ）、シスプラチン、タキソール、ドキソルビシン、および５−フルオロウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。抗癌剤は、ＰＰＡＲγアゴニストおよびメバロン酸経路阻害剤（またはメバロン酸アンタゴニスト）の投与前または投与後に投与することができる。
【００２２】
本発明はまた、癌化学療法剤の効力を高める方法を特徴とする。この方法は、投与を必要とする被検体に、有効量の癌化学療法剤および有効量のＰＰＡＲγアゴニストを投与する工程を含む。用語「癌化学療法剤」は、癌細胞を選択的に殺傷することによって癌を治療する化合物を意味するが、癌細胞の分化を誘導することによって癌を治療する化合物（例えば、レチノイドおよび非ステロイド系抗炎症薬）を意味しない。癌化学療法剤の例として、シスプラチン、タキソール、ドキソルビシン、およびフルオロウラシルが挙げられる。この方法はまた、被検体に、有効量のメバロン酸経路阻害剤（メバロン酸アンタゴニスト）を投与する工程を含んでもよい。この方法を実施するために、活性薬剤は同時に適用されてもよく、異なる時間に適用されてもよい。活性薬剤は、経口、非経口、吸入スプレー、または埋め込み式のリザーバによって投与することができる。
【００２３】
ある特定の細胞周期調節タンパク質（例えば、ＣＤＫ−２、サイクリンＡ、Ｒｂ、Ｅ２Ｆ１、およびｐ２７ｋｉｐ１）のレベルの調節および癌細胞の増殖阻害における活性薬剤の組み合わせの効力を予備評価するために、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用することができる。併用指数（combination index ：ＣＩ）は、チョウ、ティー．シー．（Chou,T.C. ）ら、アドバンシズ・イン・エンザイム・レギュレーション誌（Adv.Enzyme Regul. ）、１９８４年、第２２巻、ｐ．２７−５５に示されたメジアンエフェクト（median
effect ）式に従って計算される。ＣＩは２種類以上の薬物の組み合わせ効果（例えば、協力作用、拮抗作用、または相加作用）を表すことに注意されたい。ＣＩが１未満の時、組み合わせ効果は協力作用である。ＣＩが１に等しい時、組み合わせ効果は相加作用である。ＣＩが１を超える時、組み合わせ効果は拮抗作用である。
【００２４】
ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイによって、癌治療における効力について活性薬剤の組み合わせをさらにスクリーニングすることができる。例えば、活性薬剤の組み合わせを動物（例えば、マウスモデル）に注射してもよく、次いで、その治療効果を評価する。この結果に基づいて、適切な投与量範囲および投与経路を決定することもできる。
【００２５】
本願において用いられるメバロン酸経路阻害剤、メバロン酸アンタゴニスト、ＰＰＡＲγアゴニスト、抗癌剤、および癌化学療法剤は市販されているか、または当該分野で周知の方法によって合成することができる。
【００２６】
さらに捕捉説明しなくとも、以上の説明によって本発明は十分に実施可能になったと考えられる。従って、以下の具体例は単なる例示と解釈されるべきであり、いかようにも本開示の残りの部分を限定しない。本明細書で引用された全ての刊行物および米国仮特許出
願第６０／５３７，２３５号は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００２７】
（ヒトグリア芽細胞腫細胞の抑制に対するロバスタチンおよびトログリタゾンの協力作用）
ＤＢＴＲＧ  ０５ＭＧ細胞（ヒトグリア芽細胞腫細胞）を、０．５μＭロバスタチン（カルビオケム（Clabiochem））単独、および１０μＭトログリタゾン（カルビオケム）単独で６日間処理した。次いで、細胞数をスルホローダミン法（例えば、ルビンスタイン、エル．ブイ．（Rubinstein, L.V.）ら，ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート誌（J. Natl. Cancer Institute ）、１９９０年、第８２巻、ｐ．１１３を参照）で測定した。その結果、細胞数はそれぞれ９．７％および１１％減少したことが分かった。対照的に、ＤＢＴＲＧ  ０５ＭＧ細胞をロバスタチン（０．５μＭ）およびトログリタゾン（１０μＭ）で同時に６日間処理した時、細胞数は８２％減少した。
【００２８】
同じ細胞を、ロバスタチンおよびトログリタゾンの様々な比の組み合わせでも処理した。併用指数値を計算した。これらの併用指数値は全て、協力作用を示す１未満であった。
さらに、顕微鏡観察からも、ヒトグリア芽細胞腫細胞の抑制に対するロバスタチンおよびトログリタゾンの協力作用が確かめられた。
【００２９】
（他の癌細胞に対するロバスタチンおよびトログリタゾンの協力作用）
同様に、ロバスタチンのみ、トログリタゾンのみ、ならびにロバスタチンおよびトログリタゾンの組み合わせを、他の多くの種類の細胞株、すなわち、Ｃ６（ラット神経膠腫細胞株）、ＣＬ１−０、ＣＬ１−５、およびＣＬ１−５Ｆ４（ヒト肺癌細胞株）、ＭＩＡ−ＰａＣａ２（ヒト膵臓癌細胞株）、Ｈｅｌａ（ヒト子宮頚癌細胞株）、Ｈｅｐ  Ｇ２（ヒト肝芽腫細胞株）、ＰＣ３（ヒト前立腺癌細胞株）、ＳＶＲ（マウス内皮細胞株）、ならびにＭＳ１（マウス内皮細胞株）に対して試験した。結果から、この組み合わせは試験細胞株を協力作用的に抑制したことが分かった。
【００３０】
（細胞周期の調節に対するロバスタチンおよびトログリタゾンの協力作用）
細胞周期の調節に対するロバスタチンおよびトログリタゾンの効果を確かめるために、細胞周期調節タンパク質であるサイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ−２）、サイクリンＡ、Ｒｂタンパク質、およびｐ２７ｋｉｐ１を試験した。ｐ２７ｋｉｐ１は普遍的なＣＤＫ阻害剤であり、癌細胞の薬物耐性を調節できることに注意されたい（リロイド、アール．ブイ．（Lloyd, R.V. ）、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー誌（Am. J. Pathol.）、１９９９年、第１５４巻、ｐ．３１３−３２３）。Ｒｂは、いくつかの重要な遺伝子調節タンパク質を含む多くのタンパク質に結合する。この結合能力はＲｂのリン酸化状態に左右される。Ｒｂは脱リン酸化されると、細胞増殖を促進する一連の調節タンパク質（例えば、Ｅ２Ｆ−１）に結合し、リン酸化されると、これらのタンパク質を解離させるので同タンパク質が作用できるようになる。
【００３１】
ＤＢＴＲＧ  ０５ＭＧ細胞を、ロバスタチン（１μＭ）単独、トログリタゾン（１０μＭ）単独、ならびにロバスタチン（１μＭ）およびトログリタゾン（１０μＭ）の組み合わせで３日間処理した。サイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ−２）、サイクリンＡ、ｐ２７ｋｉｐ１、Ｒｂタンパク質、およびＥ２Ｆ−１の濃度をウェスタンブロッティング法で測定した。簡単に述べると、全細胞の溶解産物を、プロテアーゼインヒビター（シグマ（Sigma ））を添加した放射性免疫沈降用の緩衝液で調製した。溶解産物をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、エレクトロブロッティングによってポリ二フッ化ビニリデン膜（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に転写した。膜を室温で１時間ブロックした後、一次抗体をプローブとして４℃で一晩処理し、次いで、西洋ワサビ結合ペルオキシダーゼ二次抗体をプローブとして１時間処理した。ルミノール試薬（サンタクルーズ（Santa Cruz））を使用し、製造業者により提供されたプロトコールに従っ
て、免疫複合体を視覚化した。ＣＤＫ−２を検出する一次抗体（ｓｃ−１６３）、サイクリンＡを検出する一次抗体（ｓｃ−２３９）、Ｅ２Ｆ−１を検出する一次抗体（ｓｃ−２５１）、およびＲｂを検出する一次抗体（ｓｃ−１０２）はサンタクルーズバイオテクノロジーから購入し、ｐ２７ｋｉｐ１を検出する一次抗体（＃６１０２４１）はＢＤトランスダクションラボラトリーズ（BD Transduction Laboratories）から購入し、リン酸化Ｒｂ（Ｓｅｒ８０７／８１１）を検出する一次抗体はセルシグナリングテクノロジー（Cell
Signaling Technology ）から購入した。
【００３２】
結果から、ロバスタチン単独、またはトログリタゾン単独では、ＣＤＫ−２、サイクリンＡ、ＲＢ、ｐ２７ｋｉｐ１、Ｒｂ、およびＥ２Ｆ−１のレベルを全くといってよいくらい変えなかったことが分かる。対照的に、ロバスタチンおよびトログリタゾンの組み合わせは、ＣＤＫ−２、サイクリンＡ、およびＥ２Ｆ−１のレベルを有意に低下させ、ｐ２７ｋｉｐ１のレベルを上昇させ、ＲｂのＳｅｒ８０７／８１１をほぼ完全に脱リン酸化した。
【００３３】
（ロバスタチンおよびトログリタゾンのメバロノルアセトン（mevalonolacetone）経路依存性効果）
ＤＢＴＲＧ  ０５ＭＧ細胞をロバスタチン（０．５μＭ）、トログリタゾン（１０μＭ）、およびＨＭＶ−Ｃｏ還元酵素の下流産物であるメバロノルアセトン（１００μＭ）で６日間処理した。細胞数をスルホローダミン法（例えば、ルビンスタイン、エル．ブイ．（Rubinstein, L.V.）ら，ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート誌（J. Natl. Cancer Institute ）、１９９０年、第８２巻、ｐ．１１３を参照）で測定した。結果から、メバロノルアセトンの添加によって、ロバスタチンおよびトログリタゾンの協力作用が有意に弱まったことが分かる。
【００３４】
（他の実施態様）
本明細書に開示された全ての特徴を任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されたそれぞれの特徴は、同じ、等価な、または類似の目的にかなう別の特徴に置き換えることができる。従って、別途明記されていない限り、開示されたそれぞれの特徴は、包括的な一連の等価な特徴または類似の特徴の一例にすぎない。
【００３５】
前記の説明から、当業者であれば本発明の必須の特徴を容易に確かめることができ、また、本発明を様々な用途および条件に合うようにするために、本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明に様々な変更および修正を加えることができる。従って、他の実施態様も特許請求の範囲の範囲内にある。
【外国語明細書】
2005200419.tif 000002
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