(57)【要約】      （修正有）【課題】日本産のウリ科黒点根腐病菌モノスポルラスカス・キャノンバルスのrDNA遺伝子から、より特異性の高い配列を見い出し、本病原菌を特異的に検出するためのプライマー及びそれを用いた検出方法を提供すること。【解決手段】日本産のウリ科黒点根腐病菌モノスポルラスカス・キャノンバルス由来の特定の塩基配列から選ばれたプライマーの組み合わせからなるプライマーセット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列を有するプライマー。
【請求項２】
配列番号２の塩基配列を有するプライマー。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとの組み合わせからなるプライマーセット。
【請求項４】
配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含む、日本産ウリ類黒点根腐病菌モノスポルラスカス・キャノンバルスの検出用キット。
【請求項５】
日本産ウリ類黒点根腐病菌モノスポルラスカス・キャノンバルスのリボゾームＤＮＡのITS-1及びITS-2における日本産モノスポルラスカス・キャノンバルスに特異的な配列に基づいて設計したプライマーを用いて、ITS-1とITS-2及びこれらの間にある5.8S rDNAを含むＤＮＡ断片を増幅することを含む、日本産ウリ類黒点根腐病菌モノスポルラスカス・キャノンバルスの検出方法。
【請求項６】
配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを用いる、請求項５に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、土壌病原菌である黒点根腐病菌モノスポルラスカス・キャノンバルス（Monosporascus cannonballus）の日本産菌株を特異的に検出するためのプライマーセット、並びに上記プライマーセットを使用して上記菌株を特異的に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノスポルラスカス・キャノンバルスは、スイカ、メロン、キュウリなどのウリ科植物の根に寄生して黒点根腐病を引き起こす土壌伝染性病原糸状菌である。本病は、高温期に収穫近くなった株が根の腐敗により地上部が萎凋するもので、発病初期は昼間に萎凋し、夕方には回復することを繰り返しながら、次第に株全体が萎凋枯死する。根は初め細根が水浸状に褐変し、その後、細根は消失し、太い根まで褐変する。さらに枯死した根の表面には300μmほどの肉眼で確認できる黒点、すなわち本菌の子のう殻が形成される。
【０００３】
本病害への対処法としては、現在のところ土壌くん蒸剤による防除法が有効であるとされている（植松ら，1988，日植病報54：372）。しかし、本病害のように病徴の発現までに時間を要する病害には、病原菌の分離およびその接種試験から病徴を確認するという従来の診断法は、病害の同定までに時間がかかり過ぎる点で不都合であり、本病を早期に診断できる方法は防除対策を講じる上で極めて重要である。
【０００４】
モノスポルラスカス・キャノンバルスは、1970年にTroutmanとMatejkaによってアメリカ合衆国アリゾナ州で、カンタロープ系メロンの根から初めて分離された（Troutman, J. and Matejka, J. C. 1970. Phytopathology 60:1317）。日本では1979年にWatanabeが山形県でメロンの根から分離、記載したのが最初であり（Watanabe, T. 1979. Mycol. Soc. Japan 20:312-316）、1985年に植松らによって初めてマスクメロン及び他のウリ科植物に対する病原性が報告された（植松ら，1985，日植病報  58：354-359）。
【０００５】
本菌は独特な特徴を持つ子のう菌で、菌糸は根部組織内を蔓延し、表皮上または表皮内に子のう殻を形成するが、分生子の形成は認められない。子のう殻は球形をしたものから偏平なものまであり、大きさは高さ240〜520μm、幅320〜530μmで、嘴状の突起が見られることもある。子のうは無色で、丸底フラスコ型〜卵型をし、柄のような部分があり、長さが55.5〜131μm、幅が45〜64.5μmである。子のう胞子は子のうの中に1個認められ、ごく稀に2個の場合もある。子のう胞子は未熟なものは無色で、褐色を経て、成熟すると黒色になる。また、子のう殻中に100個以上形成され、大きさは36〜50μmである。したがって、子のう胞子の成熟に伴い、子のう殻も黒色化する。
【０００６】
本病害の伝染源は土壌中に残存するモノスポルラスカス・キャノンバルスの子のう胞子であり、宿主植物の幼苗期から既に感染が始まり、徐々に根が腐敗する。子のう胞子は土壌中で耐久生存体として5年以上生存する。また、本菌は比較的高温性の糸状菌で、生育最適温度は30度付近である（岸  国平，1998.  日本植物病害大事典. 全国農村教育協会）。
【０００７】
モノスポルラスカス・キャノンバルスの分子生物学的な特徴として、Lovicら（Lovic, B. R. et al. 1995. Phytopathology 85:655-661）は世界各地から得られたモノスポルラスカス属菌12菌株のITS領域の塩基配列を決定し、それが属特異的であり、他の糸状菌との相同性が非常に低いことを示した。さらに、Lovicらはアメリカ産モノスポルラスカス・キャノンバルスのITS-1及びITS-2の配列を基に5つのモノスポルラスカス属菌に特異的と想定されるプライマーを設計し、これらを用いたモノスポルラスカス・キャノンバルスの検出、同定についても検討した（Lovic et al. 1995. Plant dis. 79:1169-1175）。その結果、それらの特異的プライマーを用いたPCRによる同菌の検出は、分離株、植物根、子のう胞子、土壌試料を用いた場合にも可能であったことを報告している。
【０００８】
しかし、上記Lovicらの用いたアメリカ産菌株と日本産菌株のITS領域における塩基配列は6箇所に相異が認められ、そのためにプライマーBの結合部位は日本産菌株には存在しなかった。また、Lovicらの報告にあるプライマーの向きはすべて5′末端からの配列であるため、それらの組合せではDNAの増幅は起こりえない。上記の通り、Lovicらのプライマーでは日本菌株を選択的に検出することはできなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
日本産のウリ科黒点根腐病菌モノスポルラスカス・キャノンバルスに特異的な配列を有するリボソームDNA遺伝子群のITS領域の遺伝子配列を基に、本菌により特異性の高い配列を設計・構築することができれば、PCR法により同配列を増幅、検出することによって、従来の方法に比べて迅速、高感度かつ特異的に病害菌を検出することが可能となる。本発明は、日本産のウリ科黒点根腐病菌モノスポルラスカス・キャノンバルスのrDNA遺伝子から、より特異性の高い配列を見い出し、本病原菌を特異的に検出するためのプライマー及びそれを用いた検出方法を提供することを課題すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記したLovicらが報告したアメリカ産モノスポルラスカス・キャノンバルスの検出・同定のためのPCRプライマー（Lv-AからE）を基に日本産モノスポルラスカス・キャノンバルスの検出・同定用に設計・構築したMcITS−AからMcITS−Eのうち、日本産菌株の検出にも有効であったMcITS-Aを、さらに特異性を高めるために7塩基を加えて30bpの長さに増大したプライマーCMc-2を設計・構築した。また、他の糸状菌に結合部位が存在しないプライマーMcITS-Cを、増幅の効率を高めるためにその方向を逆転させ、さらにその特異性を高めるために8塩基を加えて30bpの長さに塩基配列を増やしたCMc-1を設計・構築した。この改良型モノスポルラスカス・キャノンバルス検出・同定用のPCRプライマーCMc-2とCMc-1の組合せを用いて研究を重ねた結果、黒点根腐病の病原菌分離株、罹病植物根、病原菌汚染土壌の各試料から抽出したDNAを鋳型としてPCRを行った場合、65℃のアニーリング温度で、供試した全ての日本産モノスポルラスカス・キャノンバルス菌分離株、罹病植物根、ほとんどの病原菌汚染土壌の試料において、想定されたサイズ（392bp）の断片が増幅されることを確認した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１１】
即ち、本発明によれば、配列番号１の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号２の塩基配列を有するプライマーが提供される。
本発明の別の側面によれば、配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとの組み合わせからなるプライマーセットが提供される。
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含む、日本産ウリ類黒点根腐病菌モノスポルラスカス・キャノンバルスの検出用キットが提供される。
【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、日本産ウリ類黒点根腐病菌モノスポルラスカス・キャノンバルスのリボゾームＤＮＡのITS-1及びITS-2における日本産モノスポルラスカス・キャノンバルスに特異的な配列に基づいて設計したプライマーを用いて、ITS-1とITS-2及びこれらの間にある5.8S rDNAを含むＤＮＡ断片を増幅することを含む、日本産ウリ類黒点根腐病菌モノスポルラスカス・キャノンバルスの検出方法が提供される。
【００１４】
好ましくは、上記検出方法では、配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを用いる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のプライマーを用いることにより、ウリ科野菜の土壌病原菌である黒点根腐病菌モノスポルラスカス・キャノンバルス（Monosporascus cannonballus）の日本産菌株を特異的に検出することが可能になる。さらに本発明の特異的プライマーを用いたPCRによる同菌の検出は、スイカの根試料のみならず子のう胞子や土壌試料から抽出したDNAを用いた場合にも有用であることが示された。したがって、本研究によって設計されたプライマーMc-A＋Mc-Cを用いても、PCR法による土壌からの同菌の検出が可能であることが期待される。この検出法の有用性が確かなものとなれば、スイカを定植する前に本病原菌による汚染状態の圃場診断が可能となるため、早期に病害対策を施すことができる。そのことは、スイカ生産農家の経営を安定させるだけでなく、より計画的な土壌くん蒸剤の使用や耕種的防除との組み合わせによる総合防除が可能となることから、農業環境保全の向上にも結びつくであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の方法は、日本産モノスポルラスカス・キャノンバルスを同定又は検出する方法である。日本産モノスポルラスカス・キャノンバルスの同定又は検出とは、被検対象の微生物を日本産モノスポルラスカス・キャノンバルス又はそれ以外の微生物と判定すること、又は被検対象中の日本産モノスポルラスカス・キャノンバルスの有無を判定することをいう。
【００１７】
本発明の方法は、被検対象中の微生物染色体のリボゾームＤＮＡ中に存在するITS領域のDNA配列が日本産モノスポルラスカス・キャノンバルスに特異的な配列を有するか否かを検出することによって行われる。
【００１８】
リボゾームＤＮＡのITS領域中のモノスポルラスカス・キャノンバルスに特異的な配列とは、モノスポルラスカス・キャノンバルスのリボゾームＤＮＡのITS領域中に含まれ、他の糸状菌のリボゾームＤＮＡのITS領域中には含まれない配列をいう。
【００１９】
リボソームRNAは、すべての生物の生命活動に不可欠な蛋白合成に関わっており,これをコードする遺伝子であるリボソームDNA（rDNA）はほとんどの生物でゲノム内に複数コピー存在し、真核生物では数百から数千コピー存在することが知られている。rDNAは、真核生物では一般に18S rRNA, 5.8S rRNA, 28S rRNAをコードする領域（それぞれ、18SrDNA, 5.8S rDNA, 28S rDNAという）が連続して存在し、反復配列を繰り返している。この場合、18Sと5.8Sの間、5.8Sと28Sの間にITS領域（それぞれITS-1,ITS-2）が存在する。
【００２０】
このITS領域（ITS-1, ITS-2）は、近縁種あるいは種内系統群を識別する指標としても用いられている。例えば、糸状菌類の報告として、デルモシベ（Dermocybe）属、コルチナリウス（Cortinarius）属（Liu,Y. J. et al., 1997, Can. J. Bot. 75:519-532）、アルミラリア（Armillaria）属（Chillali, M. et al., 1998, New Phytol. 138: 553-561）等がある。
【００２１】
一方、モノスポルラスカス属は、世界的にもキャノンバルス（M. cannonballus）の他、数種のみが報告されている独立性の高い属の糸状菌であり、本邦ではキャノンバルスのみが報告されている（小林ら, 1992. 植物病原菌類図説. 全国農村教育協会）。
【００２２】
以上の背景から、Lovicら（1995aおよび1995b）の報告にあるモノスポルラスカス・キャノンバルスの検出・同定のためのPCRプライマーのうち、日本産菌株の検出の有効性を高めるために（１）McITS-Aを7塩基追加して30bpの長さに増大したプライマーMc-Aを設計・構築すると共に（CMc-2）、（２）他の糸状菌に結合部位が存在しないプライマーMcITS-Cの向きを逆転し、さらにその特異性を高めるために8塩基追加して30bpの長さに塩基配列を増やしたMc-Cを設計・構築することに成功した（CMc-1）。
【００２３】
すなわち、本発明において、モノスポルラスカス・キャノンバルスに特異的な配列を検出するリボゾームＤＮＡのITS領域としては、１８Ｓ ｒＤＮＡと５．８Ｓ ｒＤＮＡとの間に存在するITS領域（ITS-1）および５．８Ｓ ｒＤＮＡと２８Ｓ ｒＤＮＡとの間に存在するITS領域（ITS-2）が挙げられる。
【００２４】
リボゾームＤＮＡのITS領域中のモノスポルラスカス・キャノンバルスに特異的な配列の検出は、この配列をＰＣＲ法により特異的に増幅するのに適したプライマーを用い、モノスポルラスカス・キャノンバルスの染色体ＤＮＡ又は部分断片を鋳型とする増幅反応により行うことができる。
【００２５】
上記Lovicらの報告にあるプライマーLv-A〜E、その配列に基づいて設計した日本産モノスポルラスカス・キャノンバルスに対応するプライマーMcITS-A〜McITS-E、及び本発明者らが改良したプライマーCMc-2とCMc-1を以下に示す。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
本発明で用いるプライマーとしては、日本産モノスポルラスカス・キャノンバルスのITS領域を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されないが、具体的には図２を参照し、モノスポルラスカス・キャノンバルスに特異的な領域を設定し、該領域に対応する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成すればよい。合成されたオリゴヌクレオチドの適性は、モノスポルラスカス・キャノンバルスの染色体ＤＮＡ又は部分断片を鋳型としたときにのみ特異的に増幅産物が得られ、近縁種では増幅されないことがポイントとなる。しかし、日本ではモノスポルラスカス・キャノンバルス以外にモノスポラスカス属の報告がないことから、生息場所を共有する他の土壌病原菌や糸状菌の染色体ＤＮＡ又は部分断片を鋳型としたときに増幅産物が得られないことを確認することによって、実用的なレベルでのオリゴヌクレオチドの適性を調べることができる。
【００２８】
本発明で用いるプライマーとして具体的には、リボゾームDNAのITS−2領域中の塩基番号479〜508に対応するプライマー（CMc−2；3'側プライマー）とリボゾームDNAのITS−1領域中の塩基番号120〜149に対応するプライマー（CMc−1；5'側プライマー）が挙げられる。これらのプライマーの組合せによってプライマーに挟まれた領域の配列を増幅すると、ITS-1とITS-2、及びこれらの間にある5.8S rDNAを含む392bpのＤＮＡ断片が得られる。
【００２９】
本発明において、染色体ＤＮＡの調製、プライマーの合成、ＰＣＲ反応及びＰＣＲ産物の解析等の手法は、当業者によく知られた方法を採用することができる。
【００３０】
例えば、ウリ類黒点根腐病菌（モノスポルラスカス・キャノンバルス）を含むと思われる被検体サンプル溶液の調製は、ウリ類黒点根腐病菌の感染が疑われる根、土壌、培養菌、土壌から、フェノール、クロロホルム及び／又はエタノール等を使用する通常の方法に従ってDNAを抽出して精製することにより、被検体サンプル溶液とすることができる。また、本発明で用いる配列番号１及び配列番号２に記載の塩基配列を有するプライマーは、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機により人工的に合成することができる。
【００３１】
ウリ類黒点根腐病菌の検出は、配列番号１に記載の塩基配列を有するプライマーと配列番号２に記載の塩基配列を有するプライマーから成るプライマーセットを用いたＰＣＲにより5.8S rDNAを含むＤＮＡ断片を増幅させ、増幅断片をアガロースゲル電気泳動法やポリアクリミドゲル電気泳動法などにより分画した後、ゲルをエチジウムブロマイドなどを用いて染色し、UVランプ下で増幅断片の有無を確認することにより行うことができる。
【００３２】
ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅は、当業者に公知の方法（例えば、Sambrook,Jら、Molecular Cloning, ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)に記載の方法）に従って行うことができる。ＰＣＲ法により、少量のサンプルから目的のＤＮＡ断片を特異的に増幅することができる。ＰＣＲ法では、目的のDNA配列の一方の鎖の５'側に相補的な５'側プライマー、及び他方の鎖の３'側に相補的な３'側プライマー、鋳型として用いるDNA配列、４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（dATP, dCTP, dGTP, およびdTTP又はdUTP）及びDNAポリメラーゼを含有する反応系を用いる。先ず、ＤＮＡサンプルを変性して一本鎖にし（変性工程）、次いで、鋳型DNAに上記２種のプライマーをアニーリングさせ（アニーリング工程）、最後にDNAポリメラーゼと４種のデオキシヌクレオシド三リン酸によって鋳型上に相補鎖を合成させる（伸長工程）。以下、生成した二本鎖を用いて、変性工程、アニーリング工程及び伸長工程から成るサイクルを繰り返すことにより、プライマーに挟まれた領域を指数関数的に増幅させることができる。なお、ＰＣＲ法で用いるDNAポリメラーゼは耐熱性ポリメラーゼが好ましく、例えば、Taq, Tthポリメラーゼなどを用いることができる。
【００３３】
本発明において増幅されるＤＮＡ断片は、日本産ウリ類黒点根腐病菌が保有する5.8sリボソームDNA遺伝子及びその隣接領域の一部分を含むＤＮＡ断片である。なお、ＰＣＲ法においてはプライマーに挟まれる部分のＤＮＡ配列が増幅されるため、そのＤＮＡ断片の大きさは用いるプライマーの種類に依存する。本発明の一例では、配列番号１に記載の塩基配列を有するプライマーと配列番号２に記載の塩基配列を有するプライマーから成るプライマーセットを用いた場合には、392bpのＤＮＡ断片が増幅される。
【００３４】
本発明によれば、配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含む、日本産ウリ類黒点根腐病菌モノスポルラスカス・キャノンバルスの検出用キットが提供される。該キットには、上記プライマーセット以外に、例えば、４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（dATP, dCTP, dGTP, およびdTTPもしくはdUTP）、DNAポリメラーゼ、PCR反応用の緩衝液などを含めてもよい。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３５】
実施例１：ＩＴＳ領域の塩基配列の決定
（１）供試菌株
供試したMonosporascus cannonballus １１菌株は以下に示した。これらは改変YPS (Yeast Extract 1g、ペプトン1g、ショ糖5g、K2HPO4 1g、KH2PO41g、寒天15g、蒸留水1000ml)の斜面培地に植菌し、室温で保存した。
【００３６】
【表２】
2005269966.tif 000003
【００３７】
（２）M. cannonballus分離株からのDNA抽出
M. cannonballus供試菌株のうち3菌株（W99481、W99642、W9982）からのDNAの抽出は、以下の通り行った。50ml容三角フラスコに入れた約25mlの改変YPS（Yeast Extrast 1g、ペプトン1g、ショ糖5g、K2HPO4 1g、KH2PO4 1g、蒸留水1000ml）の液体培地に菌叢小片を移し、25℃で7日間前後培養を行った。その後、培養菌体を濾過により回収した。菌体を乳鉢に入れて石英砂と混合し、−20℃で静置した。凍結した菌体を乳棒で粉砕し、これに抽出バッファー（0.5M NaCl、10mM Tris-HCl (pH7.5)、10mM EDTA、1% SDS）を10ml/菌体1g加えて混合し、遠心管に移して65℃ウォーターバス中に10分間静置した。これにTE飽和フェノールとクロロホルムを等量ずつ加え、混合した。これを4℃、8,000×gで10分間遠心分離し、水層を新しい遠心管に移した。回収した水層に、0.7容量のイソプロパノールを加え、−20℃に10分間静置した。4℃、11,000×gで15分間遠心分離し、得られたペレットをTEバッファーに再溶解し、RNase(10mg/ml)1μlを加え、37℃にて30分間静置した。これに3M酢酸ナトリウムを0.1容量加え、さらに等量の2‐プロパノールを加えた。これを4℃、11,000×gで15分間遠心分離した。得られたペレットを70％エタノールで精製した後、70％エタノールを除去して乾燥させ、適当量のTEバッファーに溶解した。
【００３８】
菌株数が多いため、残り８菌株からのDNAの抽出には、ミニビードビーター（Biospec社）を用いた。改変YPS液体培地で上記の3菌株と同様に培養した菌体をピンセットで回収し、キムタオルで余剰な水分を除いた。ビードビーター用マイクロチューブに菌体と等量のビーズ（直径0.1mm:0.5mm:1.0mm=1:1:1）を入れ、菌体を押し入れた。リン酸ナトリウムバッファー（1%SDS、50mM NaH2PO4・2H2O）を600μl加え、ミニビードビーターで菌体を粉砕した。得られた懸濁液は16,000×gで10分間遠心分離し、上清を1.5ml容マイクロチューブに移した。これに等量のフェノールを加えてよく混合し、65℃で20分間保温した。さらに16,000×gで10分間遠心分離し、上清を1.5ml容マイクロチューブに移した。これに等量のクロロホルム:イソミルアルコール(24:1)を加えて、ボルテックスにて攪拌し、16,000×gで10分間遠心分離した。この上清を1.5ml容マイクロチューブに移し、RNase(10mg/ml)を2μl加えて、37℃にて30分間静置した後、0.1容量の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）と等量の2-プロパノールを加え−20℃で15分静置した。これを16,000×gで10分間遠心分離し、上清を取り除いてペレットを70％エタノールで精製した後、70％エタノールを除去して乾燥させ、40μlのTEバッファーに溶解した。
【００３９】
（３）ITS領域の増幅
Lovicら(Lovic, B. R.,他、(1995)Phytopathology 85:655-661)によって、Monosporascus spp. のITS領域は属レベルで保存性が高く、さらにその配列は他の糸状菌とは相同性が低いことが報告されているため、本実施例でもITS領域をM. cannonballus特異的プライマー構築のターゲットにした。PCRプライマーには、Glassら(1)が設計した子のう菌類のITS領域を増幅するITS保存プライマーITS1及びITS4 (図１)を用いた。反応液の組成は、鋳型DNA 2μl、1×Ex Taq Buffer (Takara)、dNTP Mixture各250μM、プライマー各100 pmol、Ex Taq polymerase  (Takara) 2.5ユニットである。また、反応条件は、熱変性反応94℃ 5分、（熱変性反応94℃ 30秒、アニーリング反応58℃ 30秒、伸長反応72℃ 30秒）30サイクル、伸長反応72℃ 5分とした。50μlの反応液を用い、増幅反応はサーマルサイクラー（Takara）にて行った。PCR終了後、増幅産物は0.7％アガロースゲルin 1×TAE (40mM Tris-acetate  pH8.0、1mM EDTA)にて電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドで染色し、紫外線照射下でITS領域の増幅を確認した。
【００４０】
（４）ITS領域の塩基配列の決定
ITS領域のPCR増幅産物をRAPID PCR PURIFICATION SYSTEMS (MARLIGEN)を用いて純化した。手順はメーカー(MARLIGEN) に従って行った。増幅産物に400μlのBinding solutionを加えて混合し、2ml wash tubeにセットしたcartridgeに移した。これを12,000×ｇで1分間遠心分離し、wash tube内の排液を除去した。これに700μlのWash bufferを加えてから、再度12,000×ｇで1分間遠心分離し、同様に排液を除去した。さらに12,000×ｇで1分間遠心分離し、Wash bufferを完全に取り除いた。cartridgeを1.5ml recovery tubeにセットし、予め65〜70℃に加温したTE Buffer 50μlをcartridgeの中央に加えた。室温に１分間静置後、12,000×ｇで2分間遠心分離した。純化した増幅産物(20ng/μl) を北海道システム・サイエンス株式会社に依頼して、ITS領域の塩基配列を決定した。
【００４１】
（５）結果
ITS保存プライマーITS1及びITS4を用いて増幅したITS1、ITS2、5.8S遺伝子を含む増幅産物の全長は、アガロースゲル電気泳動に基づくと約560bpであり、シーケンス結果では514bpであった。決定された塩基配列を図２及び図３（各々の塩基配列は配列番号１３〜２４に記載する）に示す。また、他の糸状菌とのアライメントの結果、日本産M. cannonballus のITS領域の配列と比較的相同性の高い配列（約75％〜80％の相同性）を持つ糸状菌が存在する可能性が示唆された。しかし、これらの中で最も土壌中に存在すると考えられる糸状菌Rosellinia necatrix (相同性75％)の結合部位の配列とプライマーの配列を比較したところ、比較的高いアニーリング温度（例えば65℃）でPCRを行えば、本実験で設計したプライマーではいずれも結合しないと考えられた。
【００４２】
実施例２：日本産M. cannonballusに特異的なプライマーの設計
シーケンスによって決定された塩基配列（図２及び図３）に基づき、５つのプライマーMcITS-A、McITS-B、McITS-C、McITS-D、McITS-Eを設計した。プライマーの結合部位と増幅の方向は、Lovicら（Lovic, B. R., 他(1995) Phytopathology 85:655-661;及び、Lovic, B. R.,他(1995) Plant Dis. 79:1169-1175）によって報告されている部位、方向を参考にした。また、プライマーMcITS-A、McITS-Cを基に、特異性をさらに高めたCMc-2、CMc-1（本明細中上記した表１に記載）の2プライマーをそれぞれ設計した。それぞれのプライマーの配列は本明細中上記の表１に記載し、また、位置及び増幅の向きは図１に示した。
【００４３】
実施例３：設計したプライマーによる増幅反応
（方法）
設計した５つのプライマーMcITS-A、McITS-B、McITS-C、McITS-D、McITS-Eの全ての可能な組み合わせ（McITS-A+McITS-B、McITS-A+McITS-D、McITS-A+McITS-E、McITS-C+McITS-D、McITS-C+McITS-E）を用いて、反応液の組成を鋳型DNA （図４及び図５に示す菌体のDNA）1μl、1×Ex Taq Buffer (Takara)、dNTP Mixture各250μM (Takara)、プライマー各100 pmol、Ex Taq polymerase (Takara) 2.5ユニットとし、また、反応条件を熱変性反応94℃ 5分、（熱変性反応94℃ 1分、アニーリング反応  McITS-55℃／Mc-70℃ 1分、伸長反応72℃ 1分）30サイクル、伸長反応72℃ 7分とした条件で増幅を行った。PCR終了後の増幅産物は2.0％アガロースゲル（1×TAE）で電気泳動を行った後、エチジウムブロマイドで染色し、紫外線照射下で増幅状況を確認した。なお、特異性を高めたプライマーであるCMc-2＋CMc-1の組み合わせにおいては、Tm（オリゴヌクレオチドの50％がその相補鎖と解離する温度）値が高いため、同様の反応液組成でアニーリング温度を70℃に上げて行った。
【００４４】
（結果）
プライマーMcITS-A+McITS-D、McITS-A+McITS-Eを用いた場合のPCRでは、想定されたサイズの断片（それぞれ417bp、464bp）が確認された(図４)。しかし、McITS-A+McITS-B、McITS-C+McITS-D、McITS-C+McITS-Eを用いた場合では、増幅反応は起こっていたと思われるが、増幅される断片サイズが小さく（それぞれ133bp、66bp、113bp）、2.0%アガロースゲルでは明確に検出できなかった。一方、McITS-A+McITS-D、McITS-A+McITS-Eによって十分検出が可能なことが示された。しかし、プライマーMcITS-DはM. cannonballusのITS領域に異なるTm値の結合部位が２箇所存在すること、また、プライマーMcITS-Eは他の糸状菌にも結合部位が存在することから、より特異性の高いプライマーを設計をした方が良いと考えられた。
【００４５】
そこで、他の糸状菌に結合部位が存在しないプライマーMcITS-Cの向きを逆転し、特異性を高めるために30bpの長さに増やしたCMc-1を設計し、さらに、プライマーAを30bpの長さに増やしたプライマーCMc-2を設計した。プライマーCMc-2＋CMc-1の組み合わせを用いてPCRを行った結果、65℃のアニーリング温度で、図５に示すM. cannonballus供試菌株から抽出したDNAを鋳型とした場合に、想定されたサイズ（392bp）の断片が増幅された(図５)。以上の結果から、プライマーCMc-2＋CMc-1の組み合わせを用いることにより、日本産M. cannonballus菌を識別・同定できることが実証された。
【００４６】
実施例４：M. cannonballusを接種したスイカ根からのからのPCRによる菌の検出
（方法）
（１）DNA抽出
2つの素焼き鉢(直径15cm)にクロルピクリンくん蒸殺菌土、培養土、バーミキュライトを約1:1:1に混合した土壌を入れ、催芽後のスイカ（品種:乙女）種子を播種した。同時に１cmの深さにM. cannonballus (98-62) 培養寒天小片を混ぜ込んでM. cannonballusを接種し、汚染土壌とした。スイカ苗を40日間温室内で育てた後、根を採取した。採取した根を水道水でよく洗い、蒸留水で2回すすいでから、キムタオルで根表面の余分な水分を取り除いた。根の試料は使用するまで、−40℃で冷凍保存した。根からのDNA抽出は、Lovicら(5)のsmall-scale DNA extractionを改変して行った。3cm程に切ったの根試料を1.5ml容マイクロチューブに入れ、抽出バッファー（1％SDS、0.5M NaCl、10mM Tris-HCl （pH7.5）、10mM EDTA）300μlを加え、ホモジナイズ用乳棒で摩砕した。得られた懸濁液をボルテックスにて攪拌後、65℃ウォーターバス中に10分静置した。これを12,000×gで10分間遠心分離し、上清300μlを1.5ml容マイクロチューブに移して等量(300μl)のイソプロパノールを加えた後、よく混合して−40℃で10分間静置した。さらに12,000×gで5分間遠心分離し、上清を排棄後、300μlの70％エタノールを加えた。70％エタノールを除去後、得られた試料を50μlのTEバッファーに溶解した。
【００４７】
（２）M. cannonballusを接種したスイカ根からのPCRによる菌の検出
M. cannonballusを接種したスイカ根から抽出したDNAを鋳型として、本菌に特異的なプライマーとして設計したCMc-1とCMc-2を用いてPCR反応を行った。増幅のためのPCR反応液組成は、鋳型DNA 10μl、1×Ex Taq Buffer (Takara)、dNTP Mixture各250μM (Takara)、プライマー各100 pmol、Ex Taq polymerase (Takara) 2.5ユニットとし、反応条件は熱変性反応94℃ 5分、（熱変性反応94℃ 1分、アニーリング反応65℃ 1分、伸長反応72℃ 1分）40サイクル、伸長反応72℃ 7分とした。
【００４８】
（結果）
プライマーCMc-2＋CMc-1及び、M. cannonballus汚染土壌で育てたスイカ根から抽出したDNAを用いてPCRを行った。増幅反応の結果を図６に示す。スイカ苗6株のうち2株からの根抽出DNAにおいて想定されるサイズの断片（392bp）が増幅された。このことから、プライマーCMc-2＋CMc-1の組み合わせは、罹病植物体から抽出したDNAを鋳型とした場合にも増幅反応を起こすことが示された。
【００４９】
実施例５：本発明のプライマー（CMc-2＋CMc-1）による日本産M. cannonballusの特異的検出
本発明のプライマー（CMc-2＋CMc-1）を用いて日本産M. cannonballusを特異的に検出できることを以下の実験で実証した。なお、DNA抽出及びPCRによる検出は特に明示しない限り、実施例４と同様に行った。
【００５０】
（１）スイカ根に着生する一般糸状菌のDNAを鋳型とした場合のPCR
プライマーCMc-2＋CMc-1を用い、スイカ根に着生する一般糸状菌のDNAを鋳型とした場合のPCR（鋳型DNA： 1μl, 1×PCR buffer, dNTP 250μM, プライマー 各100pmol, Taq DNA polymerase 2.5U；反応条件：94℃ 5min,（94℃ 1min, 70℃ 1min, 72℃ 1min）30サイクル, 72℃ 7min）を行った。結果を図７に示す。レーン１：ネガティブコントロール，レーン２〜９：スイカ根から分離した一般糸状菌の菌体DNA，レーン10：ポジティブコントロール（M. cannonballusの菌体DNA ）。レーン10のみに392bpの特異的なDNA断片の増幅が起こっている。図７の結果から、CMc-2＋CMc-1はスイカ根に着生する一般糸状菌のDNAを鋳型としてもPCR増幅を起こさないことが実証された。
【００５１】
（２）ウリ類の他の主な土壌病原菌のDNAを鋳型とした場合のPCR
プライマーCMc-2＋CMc-1を用いて、ウリ類の他の主な土壌病原菌のDNAを鋳型としてPCRを行った。結果を図８に示す。図８に示す通り、392bpの断片は増幅されなかった(Ａ：レーン3〜13)。レーン９（Rhizoctonia solani T9620）で約700bp付近にバンドが見られるが、CMc-2＋CMc-1の増幅産物をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションではM. cannonballus（レーン1）だけが反応し、レーン９は反応しなかった（図８のＢ）。
図８では、特にウリ類黒点根腐病と地上部病徴が似ているために、農業現場で病害名の早期特定が困難となっているホモプシス根腐病（Phomopsis sp.）と区別することができることが重要である。
【００５２】
（３）メロンの罹病根と健全根から抽出したDNAを鋳型とした場合のPCR
メロン（千葉県多古町川島）の罹病根（レーン1〜3）と健全根（レーン4〜6）から抽出したDNAを鋳型にプライマーCMc-2＋CMc-1を用いてPCRを行った結果を図９に示す。図９の結果から分かるように、罹病根でのみM. cannonballusの特異的バンド（レーン７，392bp）が認められた。レーン８はマーカーである。
【００５３】
（４）日本産ウリ類黒点根腐病菌に汚染された圃場の土壌中（千葉県農業総合研究センター，キュウリ栽培圃場）から抽出したDNAを鋳型とした場合のPCR
プライマーCMc-2＋CMc-1を使って、ウリ類黒点根腐病菌に汚染された圃場の土壌中（千葉県農業総合研究センター，キュウリ栽培圃場）から抽出したDNAを鋳型にPCRを行った結果（レーン１〜６）を図１０に示す。すべての土壌試料でM. cannonballusの特異的バンド（レーン８，392bp）が認められる。レーン７はネガティブコントロールである。
【００５４】
（５）日本産ウリ類黒点根腐病菌に汚染された圃場（千葉県銚子市，メロン）の土壌から抽出したDNAを鋳型とした場合のPCR
日本産ウリ類黒点根腐病菌に汚染された圃場（千葉県銚子市，メロン）の土壌から抽出したDNAを鋳型としてプライマーLv-A＋Lv-D （レーン1〜5）およびCMc-2＋CMc-1（レーン7〜11）を用いてPCR（鋳型DNA： 1μl, 1×PCR buffer, dNTP 250μM, プライマー 各100pmol, Taq DNA polymerase 2.5U；反応条件：94℃ 5min,（94℃ 1min, 70℃ 1min, 72℃ 1min）40サイクル, 72℃ 7min）を比較した結果を図１１に示す。図１１から分かるように、CMc-2＋CMc-1は土壌サンプルのDNAでも特異的なPCR増幅を起こす（レーン7〜9）が、Lv-A＋Lv-Dは増幅反応を起さない（レーン1〜3）。以上の結果から、CMc-2＋CMc-1の方が日本産M. cannonballusの検出に優れていることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、リボソームＤＮＡ反復単位に沿った各プライマーの位置と方向を示す。A,B,C,D,EはそれぞれMcITS-A,B,C,D,Eを示す。
【図２】図２は、アメリカ産および日本産モノスポラスカス・キャノンバルスのITS領域の塩基配列（前半）を示す。
【図３】図３は、アメリカ産および日本産モノスポラスカス・キャノンバルスのITS領域の塩基配列（後半）を示す。
【図４】図４は、５つのプライマーMcITS-A、McITS-B、McITS-C、McITS-D、McITS-Eの組み合わせ（McITS-A+McITS-B、McITS-A+McITS-D、McITS-A+McITS-E、McITS-C+McITS-D、McITS-C+McITS-E）を用いて、M. cannonballus供試菌株から抽出したDNAを鋳型としたPCRを行った結果を示す。
【図５】図５は、本発明のプライマーを用いて、M. cannonballus供試菌株から抽出したDNAを鋳型としたPCRを行った結果を示す。
【図６】図６は、本発明のプライマーを用いて、M. cannonballusを接種したスイカ根からのからのPCRにより菌を検出した結果を示す。
【図７】図７は、本発明のプライマーを用いて、スイカ根に着生する一般糸状菌のDNAを鋳型としたPCRを行った結果を示す。
【図８】図８は、本発明のプライマーを用いて、ウリ類の他の主な土壌病原菌のDNAを鋳型としたPCRを行った結果を示す。
【図９】図９は、本発明のプライマーを用いて、メロンの罹病根と健全根から抽出したDNAを鋳型としたPCRを行った結果を示す。
【図１０】図１０は、本発明のプライマーを用いて、日本産ウリ類黒点根腐病菌に汚染された圃場の土壌中から抽出したDNAを鋳型としたPCRを行った結果を示す。
【図１１】図１１は、本発明のプライマー又は従来のプライマーを用いて、日本産ウリ類黒点根腐病菌に汚染された圃場の土壌から抽出したDNAを鋳型としたPCRを行った結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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