(57)【要約】      （修正有）【課題】コラーゲン分解物の製造方法、コラーゲン分解物、コラーゲン分解物を含有する食品または化粧料、コラーゲン分解酵素活性増強剤などを提供する。【解決手段】コラーゲンにコラーゲン分解酵素を作用させてコラーゲン分解物を製造する方法であって、該酵素反応時に以下の(a), (b)及び(c)からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を存在させるコラーゲン分解物の製造方法。(a) Aneurinibacillus sp. strain AM-1由来のアミノペプチダーゼ、(b) 特定のアミノ酸配列を含有するタンパク質、(c) 該アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、コラーゲン分解活性増強活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンにコラーゲン分解酵素を作用させてコラーゲン分解物を製造する方法であって、該酵素反応時に以下の(a), (b)及び(c)からなる群から選択される少なくとも１種のタ
ンパク質を存在させることを特徴とするコラーゲン分解物の製造方法。
(a) Aneurinibacillus sp. strain AM-1由来のアミノペプチダーゼ、
(b) 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、
(c) 該アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、アミノペプチダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
コラーゲン分解酵素が、Clostridium histolyticum JCM1403 （ATCC19401）由来のコラーゲン分解酵素及びGeobacillus collagenovorans（FERM P-19230）由来のコラーゲン分解
酵素からなる群から選択される少なくとも１種の酵素である、請求項１に記載のコラーゲン分解物の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２によって製造されたコラーゲン分解物。
【請求項４】
請求項３に記載のコラーゲン分解物を含有する食品。
【請求項５】
請求項３に記載のコラーゲン分解物を含有する化粧料。
【請求項６】
以下の(a), (b)及び(c)からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含有す
るコラーゲン分解活性増強剤。
(a) Aneurinibacillus sp. strain AM-1由来のアミノペプチダーゼ、
(b) 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、
(c) 該アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、アミノペプチダーゼ活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲンにコラーゲン分解酵素と特定のアミノペプチダーゼを作用させてコラーゲン分解物を製造する方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸の一種であるプロリンを多量に含む機能性タンパク質として代表的なものはコラーゲンとカゼインである。そのうちコラーゲンは、動物の結合組織を構成する主要タンパク質成分で、全タンパク質のほぼ30%をコラーゲンが占めている（非特許文献１）。コ
ラーゲンはGly-Pro-ProやGly-Pro-hydroxyproline（hydroxyprolineは翻訳後修飾されて
生成する）などの3つのアミノ酸からなるトリペプチドリピートを分子内に多数持ち、強
固な三重らせん構造をとるので通常のタンパク質分解酵素では分解されにくく、生体内の特異的なコラゲナーゼにより分解される。コラーゲンの分解は生体内では胎児期の骨形成、リュウマチ、悪性腫瘍の浸潤、腸の潰瘍形成、歯周部の炎症など様々な生理現象や疾患と関わり合っている。また、最近コラーゲンの分解物が、化粧料材料として、あるいは消化吸収の良い高純度タンパク質源、消化管粘膜保護作用、骨形成促進作用、血圧上昇抑制作用などを有する機能性食品として注目を集めており、産業界においてコラーゲン分解物の需要が高まっている。コラーゲン分解物を工業レベルで生産するためには、微生物等由来のコラゲナーゼとその分解物であるプロリン含有ペプチドを分解するペプチダーゼが現在主流である（非特許文献２）。
【０００３】
コラーゲン分解酵素により得られるコラーゲン分解物はオリゴペプチドが中心であり、水に難溶性であるか、可溶性であるが粘度が高いため、工業的利用に制限があった。また、生体への吸収を考慮すると、コラーゲン分解物のより低分子化が求められていた。このため、様々なペプチダーゼによってコラーゲン分解物を分解する試みがなされてきたが、適当なペプチダーゼは得られていなかった。
【０００４】
また牛乳中の主要タンパク質の一つであるカゼインも約15%以上の多量のプロリンを含
んでいる。牛乳の加工産物であるチーズの製造過程での一つの問題点は、副産物として生成される苦み成分である（非特許文献３及び４）。苦み成分はカゼインが乳酸菌などのプロテアーゼにより分解して生じた、プロリン含有ペプチドである。これらの苦み成分の分解のため、プロリン含有ペプチドを分解するペプチダーゼは有用である。ところが、プロリン含有ペプチドに対して強い分解活性をもち、また熱に安定なペプチダーゼを生産する微生物は報告例が少ない。
【非特許文献１】Ozbek, S., Pertz, O., Schwager, M., Lustig, A., Holstein, T., and Engel, J. (2002) Structure/function relationships in the minicollagen of Hydra nematocysts. J. Biol. Chem., 277, 49200-49204
【非特許文献２】Watanabe, K. (2004) Collagenolytic protease from bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 63, 520-526
【非特許文献３】Bouchier, P.J., FitzGerald, R.J., and O'Cuinn, G. (1999) Hydrolysis of αs1-and β-casein-derived peptides with a broad specificity aminopeptidase and proline specific aminopeptidases from Lactococcus lactis subsp. cremoris AM2. FEBS Lett., 445, 321-324
【非特許文献４】Motoshima, H., Shiraishi, T., Tsukasaki, F., and Kaminogawa, S. (2003) Purification, characterization, and gene cloning of lysyl aminopeptidase from Streptococcus thermophilus YRC001. Biosci Biotechnol Biochem., 67, 772-782
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、コラーゲン分解酵素により得られるコラーゲン分解物より低分子化されたコラーゲン分解物を製造する方法などの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、Prolyl-p-nitroanilide(Pro-pNA)を合成基質として用い、ペプチド中のPro残基を特異的に認識・加水分解するペプチダーゼを生産する好熱菌をスクリーニングし
て得られた公知のBacillus属のグラム陽性細菌（Aneurinibacillus sp. strain AM-1）（村井陽、辻本善之、松井裕、渡部邦彦，(2002)，「プロリルアミノペプチダーゼを生産する好熱菌Bacillus sp. AM-1株の単離と酵素の諸性質について」，日本農芸化学会関西支
部大会第427回講演会，平成14年12月7日神戸大学）の生産するペプチダーゼが、該酵素自身はコラーゲンを直接分解する活性を有していないが、コラーゲン分解酵素（コラーゲン分解活性を有するプロテアーゼ、コラーゲン分解性プロテアーゼ）存在下でコラーゲンと反応させると、コラーゲン分解酵素により生成するコラーゲン分解物より低分子化されたコラーゲン分解物が得られること、並びにコラーゲン分解酵素のコラーゲン分解活性を増強することを見出し、また、コラーゲン分解酵素のアミノ酸配列（配列番号１）及びDNA
配列（配列番号２）を見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
即ち、本発明は下記のコラーゲン分解物の製造方法、コラーゲン分解物、食品、化粧料、コラーゲン分解酵素活性増強剤などを提供するものである。
【０００８】
項１．コラーゲンにコラーゲン分解酵素を作用させてコラーゲン分解物を製造する方法であって、該酵素反応時に以下の(a), (b)及び(c)からなる群から選択される少なくとも１
種のタンパク質を存在させることを特徴とするコラーゲン分解物の製造方法。
(a) Aneurinibacillus sp. strain AM-1由来のアミノペプチダーゼ、
(b) 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、
(c) 該アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、アミノペプチダーゼ活性を有するタンパク質。
項２．コラーゲン分解酵素が、Clostridium histolyticum JCM1403 （ATCC19401）由来のコラーゲン分解酵素及びGeobacillus collagenovorans（FERM P-19230）由来のコラーゲ
ン分解酵素からなる群から選択される少なくとも１種の酵素である、項１に記載のコラーゲン分解物の製造方法。
項３．項１又は２によって製造されたコラーゲン分解物。
項４．項３に記載のコラーゲン分解物を含有する食品。
項５．項３に記載のコラーゲン分解物を含有する化粧料。
項６．以下の(a), (b)及び(c)からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を
含有するコラーゲン分解活性増強剤。
(a) Aneurinibacillus sp. strain AM-1由来のアミノペプチダーゼ、
(b) 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、
(c) 該アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、アミノペプチダーゼ活性を有するタンパク質。
【０００９】
本発明のコラーゲン分解物を製造する方法は、コラーゲンにコラーゲン分解酵素を作用させ、該酵素反応時に、(a) Aneurinibacillus sp. strain AM-1由来のペプチダーゼ、(b) 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、及び(c) 該アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からな
り、コラーゲン分解活性増強活性を有するタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を存在させることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明のコラーゲン分解物は、上記のコラーゲン分解物を製造する方法により得られることを特徴とし、コラーゲンにコラーゲン分解酵素を作用させて得られるコラーゲン分解物より低分子化したものである。
【００１１】
さらに、本発明の食品及び化粧料は、上記のコラーゲン分解物を含有することを特徴とする。また、本発明のコラーゲン分解活性増強剤は、(a) Aneurinibacillus sp. strain AM-1由来のアミノペプチダーゼ、(b) 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、及び(c) 該アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若し
くは付加されたアミノ酸配列からなり、コラーゲン分解活性増強活性を有するタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含有することを特徴とする。
【００１２】
(a)タンパク質である、Aneurinibacillus sp. strain AM-1由来のアミノペプチダーゼ
は、Aneurinibacillus sp. strain AM-1（村井陽、辻本善之、松井裕、渡部邦彦，(2002)，「プロリルアミノペプチダーゼを生産する好熱菌Bacillus sp. AM-1株の単離と酵素の
諸性質について」，日本農芸化学会関西支部大会第427回講演会，平成14年12月7日神戸大学）（以下、AM-1株と称することがある）の培養物から単離されるアミノペプチダーゼである。AM-1株は本発明者が、兵庫県神戸市北区有馬温泉付近の土壌を中心に、コラーゲンを熱変性し可溶化したタンパク質であるゼラチンを含む最小培地（1% (w/v) ゼラチン、0.1% (w/v) 酵母エキスを含むpH6.5の培地）を用い55℃の温度で生育する好熱菌をスクリ
ーニングし、Prolyl-p-nitroanilide(Pro-pNA)を合成基質として用い、ペプチド中のPro
残基を特異的に認識・加水分解するペプチダーゼを生産する好熱菌を選択して得られたBacillus属のグラム陽性細菌であり、既に報告している（村井陽、辻本善之、松井裕、渡部邦彦，(2002)，「プロリルアミノペプチダーゼを生産する好熱菌Bacillus sp. AM-1株の
単離と酵素の諸性質について」，日本農芸化学会関西支部大会第427回講演会，平成14年12月7日神戸大学）。このグラム陽性細菌がAM-1株であることは16SrRNAの解析結果から同
定した。培地条件を検討したところ、AM-1株は2.0%カゼインを含むLB培地上清で最も高いPro-pNA分解性ペプチダーゼ活性を示した。また1%のコラーゲンを培地に添加したところ
、1%のカゼインと同程度のPro-pNA分解性ペプチダーゼ活性を示した。そこで培養上清よ
りPro-pNA分解活性をもつペプチダーゼ（Aneurinibacillus sp. strain AM-1由来のペプ
チダーゼ）を精製したところ、分子量約51000 Da（SDS-PAGE）、N末端10アミノ酸配列はAla-Pro-Ile-Gln-His-Glu-His-Thr-Ala-Pro（APIQHEHTAP）（配列番号３）であった。また、この酵素は、2.0mMのo-フェナンスロリンにより酵素活性が阻害される金属依存性アミ
ノペプチダーゼであった。
【００１３】
上記のアミノペプチダーゼの公知の性質を以下に示す。
作用：ペプチド結合の加水分解
基質特異性：ジペプチドのうち、アミノ末端（Ｎ末端）側に、L-プロリン、L-ロイシン、L-リジンがあるものをジペプチドの中央のペプチド結合で加水分解する。ペプチドが３つ以上のものには活性をもたない。
至適pH：pH 8.0〜10.5
安定pH：pH 8.0
力価の測定法：反応溶液（1.0 ml中に次のものを含む。50 mM Tris-HCl buffer, 12.5 mM
Pro-pNA）をキュベットにいれ、分光光度計中で50℃に保持して酵素を添加することで、410 nmの吸収の増大を1-2分程度測定し、その速度を求めて活性とする。酵素活性（力価
）１ユニットは50℃1分間で1 μmolのp-ニトロアニリンが遊離される酵素量である。
作用適温の範囲：45〜55℃（至適温度50℃）
温度による失活の条件：85℃で失活
阻害：o-フェナントロリン（2 mM）でほぼ100%阻害される。
【００１４】
(a) Aneurinibacillus sp. strain AM-1由来のアミノペプチダーゼは、上記のアミノペ
プチダーゼであり、要求される活性を有するものであれば特に制限なく使用でき、例えば、微生物培養物から精製して得られた酵素、微生物培養物の酵素活性を有する粗精製物、遺伝子工学的に製造された酵素などが使用できる。微生物培養物としては、培養液、培養菌体などが挙げられ、培養液が好ましい。遺伝子工学的な製造では、配列番号１で表されるアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいは配列番号２のDNA配列を用いて組換えDNA技術で生産する方法などにより、(b)  配列番号１で表され
るタンパク質、 (c)  該アミノ酸配列において、1若しくは数個（好ましくは1〜9個、よ
り好ましくは1〜5個、よりいっそう好ましくは1〜3個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、アミノペプチダーゼ活性を有するタンパク質を、取得することもできる。例えば、組換えDNA技術によって上記のペプチダーゼを取得する場合
には、この配列又はその断片を有するベクターからインビトロ転写によってRNAを調製し
、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことによりインビトロで発現できる。また翻訳領域を公知の方法により適当な発現ベクターに組換えてやれば、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等で、cDNAがコードする上記ペプチダーゼを大量に発現させることができる。上記ペプチダーゼを大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、cDNAクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明のcDNAの翻訳領域を挿入結合して組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養してやれば、cDNAがコードしている上記ペプチダーゼを微生物内で大量生産することができる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。得られた融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによって、cDNAがコードするタンパク質部分のみを取得することもできる。
【００１５】
また、AM-1株の培養物からアミノペプチダーゼを調製する場合は、常法によればよく、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過法、吸着クロマトグラフィー等を適宜組み合わせることによって、調製できる。
【００１６】
本発明のコラーゲン分解物の製造方法では、上記の(a)〜(c)のタンパク質を、コラーゲン分解酵素によるコラーゲン分解の際に存在させる。ここで存在させるとは、(a)〜(c)のタンパク質によりコラーゲン分解酵素によるコラーゲン分解物がさらに分解される限り特に制限されない。例えば、コラーゲンを含む水溶性懸濁液に、コラーゲン分解性酵素と上記の(a)〜(c)のタンパク質を水溶液または粉末で添加し、50℃で振とうさせながら分解する方法などである。
【００１７】
本発明の製造方法における、(a)、(b)及び(c)からなる群から選択される少なくとも１
種のタンパク質の使用量は、コラーゲン分解酵素1mgに対して、約0.1〜10mg、好ましくは約1〜4mgである。
【００１８】
本発明の製造方法におけるコラーゲンは、例えば、コラーゲンであれば何でも使用でき、好ましくは、動物由来のコラーゲンである。また、コラーゲン分解酵素としては、例えば、Clostridium histolyticum JCM1403（ATCC19401）（Matsushita, O, Jung, C., Minami, J., Katayama, S., Nishi, N. Okabe, A. (1998) A study of the collagen-binding
domain of a 116-kDa Clostiridium histolyticum collagenase.  J Biol. Chem. 273, 3643-3648）由来のコラーゲン分解酵素、Geobacillus collagenovorans（FERM P-19230）由来のコラーゲン分解酵素を挙げることができる。好ましくはGeobacillus collagenovorans（FERM P-19230）由来のコラーゲン分解酵素である。これらの微生物からコラーゲン
分解酵素を単離する方法は公知であり、例えば、Okamotoらの方法（Okamoto, M., Yonejima, Y., Tsujimoto, Y., Suzuki, Y. and Watanabe, K. (2001) A thermostable collagenolytic protease with a very large molecular mass produced by thermophilic Bacillus sp. strain MO-1. Appl. Microbiol. Biotechnol., 57, 103-108）に従って行うこと
ができる。
コラーゲン分解酵素の使用量は、コラーゲン1gに対して、約0.1〜5mg、好ましくは約0.2
〜1mgである。また、反応温度は、通常、約40℃〜約60℃、好ましくは約45℃〜約55℃で
あり、反応pHは、通常、約8〜約10、好ましくは約8〜約8.5である。反応時間は、原料、
酵素、(a)〜(c)タンパク質の種類、量や、反応温度、pHなどの条件に応じて適宜決定すればよい。
【００１９】
上記のような反応により、コラーゲンは分解されて本発明のコラーゲン分解物となる。本発明のコラーゲン分解物は、通常、アミノ酸が複数（例えば２〜６個、好ましくは２〜３個）つながったオリゴペプチド混合物、該オリゴペプチドとアミノ酸の混合物などである、好ましくはジペプチド、トリペプチド及びアミノ酸の混合物である。
【００２０】
本発明の製造方法により製造されたコラーゲン分解物は、コラーゲン分解酵素により得られるコラーゲン分解物（大抵は水に難溶性或いは一部だけ溶ける）と比較して、生体での吸収性が向上するため食品として有用であり、また、水溶性となるため、化粧料として利用しやすいものである。
【００２１】
本発明の食品は、本発明の製造方法により製造されたコラーゲン分解物を含有するものである。本発明の食品は、本発明の製造方法により製造されたコラーゲンを含有する食品は全て包含され、固体、液体、半固形、流動食などの形態は問わない。食品としては特に制限されず、食品添加物、栄養食品、栄養補助食品、機能食品、保健用食品なども包含される。飲料も食品に包含され、例えばスポーツ飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料、アルコール飲料、栄養補給飲料、機能性飲料、乳飲料などが挙げられる。本発明の食品は、本発明のコラーゲン分解物を使用して、食品を製造する常法に従って製造され、可食性の添加物、賦形剤、甘味剤、増粘剤、ビタミン類、着色剤、香料等が含まれていても良く、その量は特に限定されない。本発明の食品中の本発明のコラーゲン分解物の含有量は、通常、約0.00001〜100重量％、好ましくは約0.001〜100重量％である。また、本発明の食品の摂取量は、食品の形態、摂取する人の年齢、体重、性別、摂取の目的等に応じて適宜決定でき、特に限定されるものではないが、本発明のコラーゲン分解物の量として、成人（体重60kg）１日当たり、通常、約0.001〜1000g、好ましくは約0.01〜800gである。
【００２２】
本発明の化粧料は、本発明の製造方法により製造されたコラーゲン分解物を含有するものである。本発明の化粧料は、本発明の製造方法により製造されたコラーゲンを含有する化粧料は全て包含されるが、皮膚用化粧料が好ましい。本発明の化粧料中の本発明のコラーゲン分解物の含有量は、通常、約0.001〜80重量％、好ましくは約0.001〜50重量％である。本発明の化粧料には、上記のコラーゲン分解物の他に、化粧料に使用され得る他の成分を含有してもよい。例えば、油分、樹脂、シリコーンゴム、保湿剤、酸化防止剤、界面活性剤、防腐剤、消炎剤、紫外線吸収剤、ビタミン、ホルモンなどの薬剤、金属封鎖剤、粘度調整剤、香料などである。他の成分の配合量は、製造する化粧料の形態、用途、適用対象などに応じて適宜決定することができる。本発明の化粧料は、本発明のコラーゲン分解物を使用して、化粧料を製造する常法に従って製造することができる。
【００２３】
本発明において、コラーゲン分解活性増強剤とは、コラーゲン分解酵素によるコラーゲン分解の際に、該コラーゲン分解酵素のコラーゲン分解活性を増強、好ましくは2倍以上
増強するものをいい、コラーゲン分解活性が増強するとは、コラーゲン分解酵素による酵素反応速度が上昇することをいう。なお、コラーゲン分解活性の一つの指標として、コラーゲンが分解されて増加するアミノ末端の量を定量する方法がある。この定量方法としては、例えばニンヒドリンによりアミノ末端を修飾して発色させて、分光光度法で定量する方法が挙げられる。
【００２４】
本発明のコラーゲン分解活性増強剤は、上記の(a)、(b)及び(c)からなる群から選択さ
れる少なくとも１種のタンパク質以外に、任意の成分を含有       していても良い。コ
ラーゲン分解活性増強剤における上記の(a)、(b)及び(c)からなる群から選択される少な
くとも１種のタンパク質の含有量は、約0.0001〜100％、好ましくは約0.1〜100％である
。
【発明の効果】
【００２５】
本発明のコラーゲン分解物の製造法によれば、コラーゲン分解酵素によるコラーゲン分解物よりも低分子のコラーゲン分解物を製造することが可能である。この製造法により得られるコラーゲン分解物は、水溶性が大きいため、食品、化粧品、医薬品、工業材料などとしての用途が広く、また生体での吸収性も良い。従って、食品及び化粧料として有用である。本発明のコラーゲン分解活性増強剤によれば、コラーゲン分解酵素のコラーゲン分解活性が増強されるため、コラーゲン分解酵素の使用量を節約したり、反応時間を節約することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
【実施例】
【００２７】
製造例
（１）AM-1株の培養条件
AM-1株を、カゼイン添加Luria-Bertani's broth（LB）培地（1.0% (w/v)ペプトン、0.5% (w/v)酵母エキス、0.1% (w/v) NaCl、 pH 7.2）に2% (w/v) カゼインを添加）中、55℃
で８時間振盪培養した。
【００２８】
（２）トータルDNAの調製
菌体からトータルDNAの抽出はSambrookらの方法（Sambrook, J., and Russell, D.W. (2001) Molecular Cloning, a laboratory manual, third edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press）を参考に行った。
菌体1 gを20 ml の50 mM Tris-HCl (pH 8.0)に懸濁し、リゾチーム粉末20 mgを加えた
。37℃で10分間保持した後、（10%w/v）ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液を2 ml加えた
。37℃でさらに20分間保持した後、フェノール−クロロホルム（1：1(V/V)）溶液を等量
加え、撹拌した。10000 rpmで10分遠心した後、上清を回収した。フェノール−クロロホ
ルム（1：1(V/V)）溶液の添加、遠心を繰り返し、上清を回収した後、-20℃に冷却したエタノールを加えて析出する染色体DNAを、ガラス棒で巻き取り、10 mM Tris-HCl／1 mM EDTA（pH 8.0）溶液につけて、トータルDNA溶液とした。
【００２９】
（３）AM-1株由来アミノペプチダーゼ遺伝子のクローニング
AM-1株菌体から得たトータルDNAを制限酵素HindIIIで消化し、ベクタープラスミドpUC119のHindIIIサイトに連結することにより、さまざまな長さのDNA断片をもつ組換えプラスミドライブラリーを、大腸菌Escherichia coli MV1184株を用いて構築した。この組換え
プラスミドを有する大腸菌を、LB培地シャーレ上で培養し、コロニーを形成させた後、PVDF膜にトランスファーした。この膜について、AM-1株から精製純化したアミノペプチダーゼに対するウサギ抗体（ポリクローナル）を用いて、この抗体と結合するタンパク質を発現する大腸菌コロニーを、ウエスタンブロッテイング分析法でスクリーニングした。陽性シグナルを示すコロニーが１つ単離され、その大腸菌クローンから組換えプラスミドを単離し、4.1 kbの挿入DNA断片を有することを確認した。さらにこれをサブクローニングす
ることにより、2.5 kbの長さのDNA断片にAM-1株のアミノペプチダーゼ遺伝子があること
を見出した。
このDNA断片についてDNA塩基配列決定を行い、その結果を図１に示す。392bpの開始コ
ドン（メチオニン）から始まる1371 bpのオープンリーデイングフレーム（392〜1765bp）であった。この翻訳開始コドンの上流10 bpのところには、翻訳時に70Sリボゾームと結合する配列（376〜387bp）があり、その上流、190 bpのところには、転写のプロモーターとして機能する-35, -10コンセンサス配列（TTGATG-TAAGGT）が見られた。精製タンパク質
から得られたN末端アミノ酸配列に一致する10残基のアミノ酸配列（図２）は、29残基目
から完全に一致する形であり、始めの28残基は分泌のためのシグナル配列として機能し、プロセシングを受けるであろう。オープンリーデイングフレームから予想されるアミノ酸数は457、分子量は、49051 Da（シグナル配列を除くと約46 kDa）で、AM-1株からの精製
酵素のSDS-PAGEから得られている分子量（51 kDa）とよく対応する。
【００３０】
（４）AM-1株由来アミノペプチダーゼ遺伝子の発現
pUC119プラスミドをベクターにして、上記の2.5 kbのDNA断片をもつプラスミド（pAH-8）を大腸菌Escherichia coli MV1184に発現させたところ、可溶性画分に精製酵素の分子
量より約2-3 kDa大きい本酵素の発現が認められた。これは、N末端の28残基のアミノ酸配列が分泌のためのシグナルペプチドとして切断されず、プロセシングを受けない状態で菌体内に蓄積したものと考えられた。さらにこの可溶性画分を粗酵素として用いた酵素活性測定から、酵素の活性が精製酵素より著しく低かった。そこで、N末端の28残基のアミノ
酸配列を除き、29番目のアミノ酸のN末端に、新たに開始コドンとしてメチオニンを付加
した状態の遺伝子をPCRで増幅した。
そこで、二つのプライマー（プライマー1（配列番号４）及びプライマー2（配列番号５））をデザインし、KOD DNA polymerase（TOYOBO）を用いてPCR （94℃ 15秒, 50℃ 30秒, 68℃ 90秒を30サイクル）を行った。その後精製キットを用いて、PCR産物の精製を行い、NdeI, BamHIで切断後、発現ベクターpET-11a（Novagen社製）のBamHIとNdeIの認識サイトに組み込み、大腸菌BL21-(DE3) （Stratagene社製）をトランスフォーメーションした
。
プライマー1:TGCTGCGCATATGGCCCCGATCCAAC
プライマー2:CGCGGATCCGATGGAGATACCTGAG
トランスフォーメーションした大腸菌は0.1（mg/ml）アンピシリンを含むLB培地で、37℃でOD600=0.5に達するまで前培養を行った。前培養液0.15mlを5 mlの0.1（mg/ml）アン
ピシリンを含むLB培地に接種して37℃で2時間振とう培養後（本培養）、IPTGを終濃度で1
mM添加した。そして、37℃で1, 2, 3, 4, 5, 6, 8時間後に以下の方法でそれぞれ、培養上清、細胞質可溶性画分、細胞質不溶性画分を集めた。
(イ)培養液を遠心分離 (15000 rpm, 5 min)。上清は、培養上清として保存。
(ロ)沈殿を1.5 mlの生理食塩水で洗浄し、遠心分離。これを2回行った。
(ハ)沈殿を1 mlの50 mM Tris-HCl (pH 7.5)に懸濁し、超音波破砕にかけた。
(ニ)遠心分離し、上清は細胞質可溶性画分として保存。
(ホ)沈殿を50mM Tris-HCl(pH 7.5)で洗浄し遠心分離。これを2回行った。
(ヘ)沈殿を1 mlの50 mM Tris−HCl (pH 7.5)に懸濁。これを細胞質不溶性画分として保存。
【００３１】
（５）アミノペプチダーゼの活性測定
活性測定は、Pro-pNAを基質として行った。1 mlの反応溶液中（12.5 mM Pro-pNA, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)）を50℃で1分間プレインキュベーション後、アミノペプチダーゼを加え、反応を開始した。410 nmの吸光度の増加を測定し、アミノペプチダーゼ活性を測定した。なお、410 nmの吸光度は,遊離されるp-ニトロアニリドの量を示す。
【００３２】
pET-11aベクターでトランスフォーメーションした大腸菌BL21-(DE3)のアミノペプチダ
ーゼ活性を測定したところ、活性はほとんど見いだせなかった。一方、N末端の28残基の
アミノ酸配列を除き、N末端に開始コドンとしてメチオニンを付加した状態の遺伝子を組
み込んだpET-11aのベクターでトランスフォーメーションした大腸菌BL21-(DE3)の培養上
清には特にアミノペプチダーゼ活性が認められたので、IPTGによる誘導実験を行った。IPTGで誘導をかけると、1時間後の培養上清に顕著な活性の上昇が認められた。そこで、IPTG 誘導後1, 2, 3, 4, 5, 6, 8時間後の培養上清サンプルを、SDSポリアクリルアミド電気泳動と精製純化したアミノペプチダーゼに対するポリクローナル抗体を用いて、Western blotを行った。その結果IPTG誘導後1, 2, 3, 4, 5, 6, 8時間後のいずれのサンプルにも
精製酵素とほぼ同じ位置の（51 kDa）濃いバンドが見られた。またWestern blottingを行った結果、精製酵素とほぼ同じ分子量のところにバンドが認められたことからIPTGの誘導で発現したタンパク質は培養上清に分泌され、そのタンパク質はAM-1株由来アミノペプチダーゼであることが確認された。
【００３３】
以上のことから2.5 kbの長さのDNA断片のメチオニンから始まる1371 bpのオープンリーデイングフレームの遺伝子は、AM-1株菌由来のアミノペプチダーゼの遺伝子であることが確認された。N末端28残基のアミノ酸は分泌のためのシグナル配列として機能することが
示唆され、29番目のアミノ酸に開始コドンとしてメチオニンを付加した状態の遺伝子を大腸菌に発現させた場合、迅速に及び多量に活性の強いほぼ精製酵素に匹敵する活性を持ったアミノペプチダーゼが生産されることが判明した。
【００３４】
実施例
コラーゲン（牛筋由来コラーゲン Type I, 5 mg）を含む5 mlの反応溶液（50 mM Tris-HCl (pH 8.0)）中に、Okamoto らの方法（Okamoto, M., Yonejima, Y., Tsujimoto, Y., Suzuki, Y. Watanabe, K. (2001) A thermostable collagenolytic protease with a very large molecular mass produced by thermophilic Bacillus sp. strain MO-1. Appl. Microbiol. Biotechnol. 57, 103-108）に従って調製したGeobacillus collagenovorans MO-1株由来のコラーゲン分解性酵素（精製品 2g, 10 Units）およびAM-1株のアミノペプ
チダーゼ（4.0g, 72 Units）を加え、50℃で振とうしながら反応を行わせた。なお、AM-1株のアミノペプチダーゼを加えないこと以外は、同様にして反応を行わせたものを、コントロールとした。0, 10, 20 分経過後に、300μlずつ抽出し、0.5 M EDTAを6μl加えて反応を停止させ、即座に氷冷した。氷冷遠心後、このうち200μlを用いて、ニンヒドリン反応（Doi, E, Shibata, D, Matoba, T (1981)  "Modified colorimetric ninhydrin methods for peptidase assay." Anal. Biochem. 118, 173-184）を行い、フリーのアミノ基量を定量した。そして、前もって用意しておいた既知量のロイシンとニンヒドリンを反応させて作った検量線を使用して、増加したフリーのアミノ基の量をロイシンの量に換算した。その結果、20分後で、２つの酵素を含む場合（約0.4μmol）は、MO−1株由来のコラー
ゲン分解性酵素のみで分解させた場合（約0.2μmol）に比べ、フリーのアミノ基量が2倍
となり、コラーゲン分解酵素によるコラーゲン分解物がさらにアミノペプチダーゼで分解されていることが示唆された。なお、ここで用いたコラーゲン分解酵素は、コラーゲンを、N末端にプロリン残基を有するペプチドに分解する作用を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、AM-1株由来のアミノペプチダーゼのDNA配列を示す。392〜1765位はコーディングリージョンであり、376〜381位はリボソーム結合部位であり、158〜163位及び181〜186位は想定されるプロモーターである。
【図２】図２は、AM-1株由来のアミノペプチダーゼのアミノ酸配列を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００３６】
配列番号４及び５はそれぞれプライマー1及び2のヌクレオチド配列を示す。
【図１】
2005245285.tif 000002
【図２】
2005245285.tif 000003
【配列表】
2005245285000001.app