(57)【要約】【課題】    簡便に免疫細胞のクローンの拡大の有無を判定することができる方法を提供すること。【解決手段】  抗原に応答した免疫細胞クローンの拡大の有無の判定方法は、生体から採取された免疫細胞の抗原レセプター遺伝子群又は免疫グロブリン遺伝子群中の、多様性の高い領域の隣接領域にプライマーを設定し、多様性の高い領域を鋳型として、ダイデオキシ法による伸長反応を行なう工程と、前記伸長反応により生成された核酸断片を質量分析にかける工程と、質量分析の結果から、特定の免疫細胞クローンの拡大が起きたか否かを判定する工程とを含む。【選択図】  図１
2005245381.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から採取された免疫細胞の抗原レセプター遺伝子群又は免疫グロブリン遺伝子群中の、多様性の高い領域の隣接領域にプライマーを設定し、多様性の高い領域を鋳型として、ダイデオキシ法による核酸の伸長反応を行なう工程と、前記伸長反応により生成された核酸断片を質量分析にかける工程と、質量分析の結果から、特定の免疫細胞クローンの拡大が起きたか否かを判定する工程とを含む、抗原に応答した免疫細胞クローンの拡大の有無の判定方法。
【請求項２】
前記免疫細胞がＴ細胞又はＢ細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記多様性の高い領域がCDR領域である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記免疫細胞がＴ細胞であり、前記多様性の高い領域がレセプターβ鎖CDR3領域である請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記プライマーを設定する領域が、V領域の下流部分又はJ領域の上流部分である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原に応答した免疫細胞クローンの拡大の有無の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の免疫系は非自己を排除し自己を防護する。中でも獲得免疫は抗原特異性を特徴とし、主にＴ細胞とＢ細胞が担当する。これらの細胞はそのレセプターに莫大な多様性を持つことにより高い特異性をもって抗原を認識する。生体の免疫系において、特定のクローンの拡大が重要な役割を果している場合が報告されており（非特許文献１)、免疫細胞のクローンレベルでの解析は有意義である。
【０００３】
【非特許文献１】Maverakis, E. et al., 2002, J. Exp. Med., 191: 695
【非特許文献２】Pannetier, C. et al., 1993, Proc. Nat. Acad. Sci., 90: 431
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、これまで免疫細胞のクローンレベルでの解析には正確で簡便な方法がなく、クローンレベルで論じられている報告は数少ない。
【０００５】
従って、本発明の目的は、簡便に免疫細胞のクローンの拡大の有無を判定することができる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、免疫細胞の抗原レセプター遺伝子群中の、多様性の高い領域の隣接領域にプライマーを設定し、多様性の高い領域を鋳型として、ダイデオキシ法による伸長反応を行ない、前記伸長反応により生成された核酸断片を質量分析にかけることにより、特定の免疫細胞クローンの拡大が起きたか否かを判定することができることに想到した。すなわち、一定のクローン拡大が起きていなければ、ダイデオキシ法による伸長反応によって様々な断片がアットランダムに作製されるが、特定のクローンの拡大が起きていれば、それに由来する産物だけが通常の分布からはずれて高く検出されると考え、これを利用して免疫細胞のクローンの拡大の有無を判定することに想到し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、生体から採取された免疫細胞の抗原レセプター遺伝子群又は免疫グロブリン遺伝子群中の、多様性の高い領域の隣接領域にプライマーを設定し、多様性の高い領域を鋳型として、ダイデオキシ法による伸長反応を行なう工程と、前記伸長反応により生成された核酸断片を質量分析にかける工程と、質量分析の結果から、特定の免疫細胞クローンの拡大が起きたか否かを判定する工程とを含む、抗原に応答した免疫細胞クローンの拡大の有無の判定方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、簡便に免疫細胞の多様性を解析できる方法が初めて提供された。本発明によれば、免疫細胞クローンの拡大の有無のみならず、拡大が起きたクローンに特徴的な遺伝子の部分配列も同時に決定することが可能であり、免疫細胞のクローンレベルでの解析に大いに寄与するものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の方法では、先ず、生体から採取された免疫細胞の抗原レセプター遺伝子群中の、多様性の高い領域の隣接領域にプライマーを設定し、多様性の高い領域を鋳型として、ダイデオキシ法による伸長反応を行なう。対象となる免疫細胞としては、Ｔ細胞及びＢ細胞が好ましい。Ｔ細胞及びＢ細胞は、リンパ節、脾臓、血液等から周知の方法により分離することができる。また、免疫細胞からのゲノミックＤＮＡまたはメッセンジャーRNAの抽出も、フェノール抽出とエタノール沈殿もしくは核酸吸着カラムを用いるような常法により行うことができる。
【００１０】
ダイデオキシ法による伸長反応は、基本的にダイデオキシ法によるＤＮＡの塩基配列の決定の場合と同様な伸長反応である。すなわち、鋳型となる遺伝子内の一領域にプライマーをハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で鋳型の相補鎖を伸長させる。伸長反応は、通常の４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dATP, dGTP, dCTP及びdTTP、４種類を総称してdNTP)の他に、４種類のダイデオキシリボヌクレオシド三リン酸(ddATP, ddGTP, ddCTP及びddTTP、４種類を総称してddNTP)を加えて行なう。伸長中のＤＮＡ鎖の末端にddNTPが取り込まれると、ddNTPには、次のヌクレオチドとのリン酸エステル結合に必要な酸素原子が存在しないため、鎖の伸長は停止する。
【００１１】
ダイデオキシ法による伸長反応は、二本鎖の変性工程、プライマーと鋳型ＤＮＡとのアニーリング工程、相補鎖の伸長工程から成り、これらの工程から成るサイクルを繰り返す。アニーリング、伸長、変性から成るサイクルを繰り返すことから、この反応は、ダイデオキシＰＣＲと呼ばれることもある。このようなサイクルの繰返しは、ＰＣＲ用のサーマルサイクラー（商品名）を用いて容易に行うことができる。また、伸長反応に必要な試薬類は全て市販されており、また、伸長反応自体は周知のダイデオキシ法によるものであるから当業者が容易に実施することができ、下記実施例にも反応条件が詳細に記載されている。
【００１２】
本発明の方法は、ダイデオキシ法による伸長反応によって生成される核酸断片の塩基配列が、各免疫細胞のクローンごとに異なることを利用してクローンの拡大の有無を判定しようというものであるから、伸長反応の鋳型となる遺伝子領域は、多様性の高い領域、すなわち、クローンごとに塩基配列が異なる可能性が高い領域である。このような領域として、CDR領域が知られており、特にＴ細胞の抗原レセプターβ鎖のCDR3領域が好ましい。また、Ｂ細胞では、CDR1, CDR2またはCDR3領域が好ましい。一方、プライマーを設定すべき領域は、各クローンにできるだけ共通する配列が好ましいので、上記高多様性領域の隣接領域が好ましい。すなわち、該隣接領域にプライマーを設定し、高多様性領域を鋳型として鎖の伸長が起きるようにすることが好ましい。なお、遺伝子を構成する二本鎖は、センス鎖でもアンチセンス鎖でも鋳型として用いることができるので、前記隣接領域は、高多様性領域の上流側でも下流側でもよい。プライマーを設定する領域としては、より具体的には、V領域の下流部分又はJ領域の上流部分が好ましい。プライマーを設定する好ましい具体例として、次の領域を挙げることができる。
【００１３】
Ｂ細胞（B細胞レセプター遺伝子すなわち免疫グロブリン遺伝子と抗原認識部位の遺伝子配列を共通にする）であれば、例えば以下の配列の全部もしくは一部のようなものが用いられる。
Vhの配列の一部に相補的な配列
cagcttcaggagtcagg
cagctgaagcagtcagg
Vkの配列の一部に相補的な配列
attgtgatgacacagtctcc
gttgatgacccaaact
その他
tgtgatattgtgctaactcagtct
gggccctctgggctcaatttt
【００１４】
T細胞（抗原認識レセプター遺伝子）であれば、例えば以下の配列の全部もしくは一部のようなものが用いられる
Jbの配列の一部に相補的な配列
actgtgagtctggttggtttacc
cctggtccctgacgggaag
Vbの配列の一部に相補的な配列
ctgaatgcccagacagctccaagc
cattattcatatggtgctggc
その他
tctgcagcctgggaatcacaa
ctgctaagaaaccatgtacca
【００１５】
Ｔ細胞の抗原レセプター遺伝子及びＢ細胞の免疫グロブリン遺伝子のＶ領域やＪ領域は、種々のものが知られており、プライマーを設定するのに適したＶ領域及びＪ領域の部分は、具体的に配列を例示した上記Ｖ領域及びＪ領域に限定されるものではない。ヒトもしくはマウスの免疫グロブリン遺伝子のＶ領域やＪ領域の塩基配列は、種々のものが周知であり、例えば、GenBank Accession No. XM356615, XM127172, K02790, BC021860, X58645, XM359391等が知られている。これらのＶ領域やＪ領域の、CDRに隣接する部分にプライマーを設定することも好ましい。
【００１６】
Ｖ領域やＪ領域は種々のものが知られているので、免疫細胞の多様性を徹底的に解析する場合には、種々の、最も好ましくは公知の全てのこれらの領域にプライマーを設定して調べる必要がある。もっとも、簡略化する場合には、サンプリングした数個ないし十数個程度の免疫細胞のＶ領域又はＪ領域をダイレクトシーケンシングにより塩基配列を決定し、それらに含まれるＶ領域又はＪ領域にプライマーを設定してもよい（下記実施例参照）。
【００１７】
プライマーのサイズは特に限定されないが、通常、10mer（ヌクレオチド数が１０という意味、以下同様）〜50mer程度であり、好ましくは12merから40mer、さらに好ましくは18merから30mer程度である。
【００１８】
ダイデオキシ法による伸長反応後、生成した核酸断片を質量分析にかける。生成した核酸断片の回収は、周知の方法により行うことができ、例えば、用いるプライマーを予めビオチンで標識しておき、反応後、生成核酸をストレプトアビジン結合磁気ビーズと接触させてビーズに結合し、ビーズを磁力で集めること等により簡便に行うことができる。また、核酸やタンパク質のような高分子物質の質量分析方法は周知であり、好ましくはMALDI-TOF MS等を、市販の装置を用いて常法により容易に行うことができる。
【００１９】
次に本発明の方法の原理を説明する。ダイデオキシ法による伸長反応は、上記の通り、ddNTPが伸長中の鎖に取り込まれると、そこで停止する。伸長中の鎖にdNTPが取り込まれるか、ddNTPが取り込まれるかは単なる確率の問題であるから、生成する鎖としては、プライマーの末端から伸長した長さがアットランダムなものが種々生成される。もちろん、ddNTPが全く取り込まれずに鎖が延々と伸びていくということは確率的にまずないことであり、通常、プライマーの長さの＋１〜＋1000程度の鎖が生成されるが、とりわけ＋１〜＋１０程度の鎖は効率的に生成される。伸長反応により生成したこれらの複数の核酸断片をそのまま質量分析にかける。そうすると、生成した核酸断片のサイズ及び配列に従って、分離したピークが観察される。核酸のサイズが異なれば、質量が異なるので、質量分析においては、当然、異なった位置にピークが観察される。さらに、質量分析は非常に鋭敏な解析手法であり、核酸を構成する４種類の塩基はそれぞれ分子量が異なるので、サイズが同じでも、塩基配列が異なれば、異なる位置にピークが観察される。ちなみに、隣接するピーク間の質量差から、末端の塩基を特定することもでき、すなわち、この方法により生成した核酸断片の塩基配列も決定することができる。
【００２０】
免疫細胞クローンの拡大（すなわち、ある免疫細胞クローンが、その遺伝子情報を保存したまま細胞分裂により増殖すること）が起きていなければ、プライマーから伸長した領域の塩基配列は、アットランダムであり、ピークも似たような高さのものが種々観察される。ところが、ある免疫細胞クローンの拡大が起きていた場合には、伸長の鋳型となる核酸のうち、そのクローン由来の鋳型の割合が大きくなるので、その鋳型に対応した塩基配列のピークが、通常の分布のピークよりも高く観察される。このため、このような高いピークの有無により、免疫細胞クローンの拡大が起きたか否かを判定することができる。また、拡大したクローンの鋳型となった部分の塩基配列を特定することもできる。
【００２１】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
Vβ8.2を有するT細胞ハイブリドーマであるDO11.10（文献又は入手先：Eur J Immunol. 1990 Oct;20(10):2359-62）のCDR3領域の近傍の塩基配列を調べた。これは具体的に次のようにして行なった。DO11.10細胞からtotal RNAをIsogen（ニッポンジーン社製）により抽出した後、CTTGGGTGGAGTCACATTTCTCとCATTATTCATATGGTGCTGGCとで増幅し、pCRベクター（Invitrogen）を用いてクローニングし、M13プライマーを用いてApplied Biosystems社製ABI PRISM 310を用いてシークエンス解析を行った。得られた塩基配列から、CDR3領域とその隣接領域にまたがる、下記塩基配列の領域（DO11.10(59 mer)）を鋳型として用いるべく、ＤＮＡ合成機により化学合成した。
合成鋳型ＤＮＡである#59(59 mer)の塩基配列
gcc agc agc ccc ggg aca gac aca gaa gtc ttc ttt ggt aaa gga acc aga ctc aca gt
【００２３】
上記DO11.10中の一部とハイブリダイズするビオチン標識プライマー１(10mer)（act tct gtg t)を化学合成し、プライマーとして用いた。伸長反応の反応液の組成は、420 mM (NH4)2SO, 2 mM MgCl2,75 mM  Tris pH9.5, 19μM dNTP, 0.25μM ddNTP, 0.2μM鋳型, 1μMプライマー, 0.4 U/μＬ  ＤＮＡポリメラーゼ(Thermo Sequenase)であった。94℃ 20秒間（又は２分間）の変性工程、26℃ (又は60℃) 20秒間のアニーリング工程及び72℃ 20秒間の伸長工程から成るサイクルを３０回繰り返した。
【００２４】
増幅を行った産物はDynapure Dye Terminator Removal Kit (Dynal社製)キットのマニュアルに従って精製を行った（ストレプトアビジンが結合した磁気ビーズを用いた方法）。
【００２５】
次に回収した核酸断片を、MALDI/TOF MSにかけた。MALDI/TOF MS(Ultraflex（商品名）, Bruker社製)を用いた測定は以下の通り行った。
マトリックス用3-ヒドロキシピコリニックアシッド(3-hydroxypicolinic acid for a matrix) 
ポジティブモード、リニアモード
イオン源1: 20.1kV, イオン源2: 18.7 kV
【００２６】
結果を図１に示す。図１（後述の図２及び図３も同じ）の横軸はm/z、縦軸は相対強度である。図１は、未反応のプライマーが、m/z 3416.1のピークとして観察され、プライマーにｃ（シトシン）（正確に言えばシチジル酸）が付加された断片のピークが3689.8として観察され、それにｔ（チミン）が付加された断片のピークが3994.2として観察され、さらに図示の塩基が順次付加された複数のピークが観察されたことを示している。これらの結果から、本発明の方法により、伸長反応の生成物である各種核酸断片を質量分析のピークとして観察することができ、伸長部分の塩基配列も決定できることが確認された。
【実施例２】
【００２７】
Vβ8.2を有するT細胞ハイブリドーマであるH1.110（文献又は入手先：E. Maverakisらによって樹立されたT細胞ハイブリドーマ（Unpublished）. HEL (Hen egg lysozyme)で免疫したBALB/cマウスの脾臓細胞から調製したリンパ球より樹立したT細胞株をBW5147と融合したもの。）のCDR3領域の近傍の塩基配列を実施例１と同様にして調べ、常法により、CDR3領域とその隣接領域にまたがる、下記塩基配列の領域（H1.110) (62 mer)）から成るcDNAを調製した。
鋳型として用いるH1.110(62mer)の塩基配列
gcc agc ggt gag aga cac cta aac aca gaa gtc ttc ttt ggt aaa gga acc aga ctc aca gt
【００２８】
得られたH1.110と、実施例１で用いたAF043168とを１：１に混合し、実施例１と同様にしてダイデオキシ法による伸長反応を行ない、生成核酸を精製し、MALDI/TOF MSにかけた。ただし、実施例１と同様な磁気ビーズによる精製後、さらにBioRad社の50W-X8という脱塩ビーズを用いて精製した。すなわち、以上により調製された資料を、脱塩ビーズ数粒上に滴下し、２、３回ピペッッティングを行った上清を測定に用いた。
【００２９】
結果を図２に示す。図２に示されるように、両方の鋳型に由来する種々のサイズの核酸断片のピークが観察された。
【実施例３】
【００３０】
AF043168：H1.110の混合比率を10:1に変えたことを除き、実施例２と同じ操作を行った。質量分析の結果は図１と同様であった。この実施例は、DO11. 10がH1.110の１０倍含まれており、クローン拡大が起きた場合のモデルである。この結果は、10:1程度のクローン拡大が起きた場合、主たる鋳型由来の核酸断片のピークが主として観察され、少ない方の鋳型由来の核酸断片のピークはほとんど観察されないことを示しており、本発明の方法によりクローンの拡大の有無を判定できることが確認された。
【実施例４】
【００３１】
マウスのT細胞レセプター遺伝子をpCRIIベクター(Invitrogen社製)にクローニングしたpEMAKI（H1.110より上記と同様に調製した。）を鋳型として用い、プライマーとして下記の塩基配列を有するビオチン標識プライマー２(23mer)を用いたことを除き実施例１と同じ操作を行なった。
act gtg agt ctg gtt cct tta cc
【００３２】
結果を図３に示す。サイズの大きなプラスミドDNAを鋳型とし、特異的な伸長反応により適した23merのプライマーを用いて伸長反応を行った場合でも、複数の生成核酸断片のピークが観察されており、現実の細胞由来のゲノミックＤＮＡを鋳型として用いた場合でも本発明の方法が有効に働くことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の方法は、効果的な抗体を産生するようなB細胞クローンのスクリーニングなどに利用可能であり、ひいては、抗体医薬の開発等に利用可能である。疾患には特定の免疫系のクローンが深く関わっているものがあるということが示唆されている。特定のクローンの拡大を特定することにより、有効な医薬品を作るに用いられる。これらをキット化して医薬開発のための研究者に向けて販売されうる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】合成ＤＮＡであるAF043168を鋳型として用いて本発明の方法を行なった場合の質量分析の結果を示す図である。
【図２】合成ＤＮＡであるAF043168と、cDNAであるH1.110の１：１混合物を鋳型として用いて本発明の方法を行なった場合の質量分析の結果を示す図である。
【図３】マウスのT細胞レセプター遺伝子をプラスミドベクターにクローニングした組換えプラスミドを鋳型として用いて本発明の方法を行なった場合の質量分析の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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