(57)【要約】      （修正有）【課題】２個の結合したユニットから構成され、特定順列を有した核酸を探知する化合物の提供。【解決手段】特定順列を有した核酸を探知する化合物であり、２個の結合したユニットから構成され、一方のユニットは天然核酸とは化学的に異なるが、ＲＮＡの単一または複ストランドＤＮＡ中の塩基または塩基対の特定の順列を認識する能力を具え、他方のユニットは核酸に結合されるとその探知可能な特性が変更される化合物。プローブ中にレポーター基（ＲＧ）として存在し、核酸（ＮＡ）に結合したときにその信号特性が大きく変化されることを特徴とする化合物。【選択図】図１
2005047901.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学構造を有しており、
【化１】
2005047901.tif 000015
ここでＲ1は水素または下記のように置換できる最大６個の炭素原子の窒素に複合していないアルキル基であり、
ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、Ｎ−Ｒ5であり、
Ｒ5は水素または下記のように置換できるアルキル基またはＣＲ6Ｒ7であり、
同じであってもよいＲ6とＲ7とは水素または下記のように置換できるアルキル基であり、
二つまたは三つ全てが同じであってもよいＲ2、Ｒ3、Ｒ4は水素、以下のように置換できる小さなアルキル基、アリルであり、
またはＲ2とＲ4およびＲ3とＲ4と対になって、かつ２個の環状原子と一緒になって、５または６員芳香族環を形成し、
該芳香族環はＯ、ＳまたはＮＲ5などの０−２異種原子を含むことができ、
Ｒ5は上記の定義のものであり、
ｎは０、１または２であり、
ＹはＨＣ＝ＣＨであり、
ＡとＢとはともに０または１、もしＡ＝０ならＢ＝１およびその逆であり、
同じであってもよいＲ9とＲ10とは水素または以下のように置換できる窒素に複合していないアルキル基であり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ9、Ｒ10は炭化水素鎖であり、
該炭化水素鎖はヒドロキシル基、アルコキシ基、カルボキシル基またはアミノ基などの極性残基を有しており、強固な帯電または嵩だか基を含んでおり、いずれかひとつが少なくともひとつのｓｐ3―交配炭素により芳香族システムから分離されたイソチオシアン、イミディル、スルフォニルクロライドまたはカルボキシル基を有しており、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ9、Ｒ10は炭化水素鎖であり、
該炭化水素鎖はヒドロキシル基、アルコキシ基、カルボキシル基およびアミノ基などの極性残基を有しており、
それらのひとつが少なくともひとつのｓｐ3―交配炭素により芳香族システムから分離されたカルボキシル酸基を有していることを特徴とする化合物。
【請求項２】
特にＴＯとＢＯおよびそれらの酸素類似体であって、カルボキシル酸基が炭化水素側鎖上、特に環状窒素に付加されたＲ1またはＲ2またはＲ9上にあることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
プローブ中にレポーター基（ＲＧ）として存在し、核酸（ＮＡ）に結合したときにその信号特性が大きく変化されることを特徴とする請求項１または２に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は別記の特殊な化学構造を有した化合物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
核酸（ＮＡ、デオキシリボ核酸＝ＤＮＡおよびリポ核酸＝ＲＮＡの両方をいう）のハイブリダイゼーションのためのプローブは複雑な混合物中における特定の目標順列（ＴＳ）の存在を示すのに用いられる。最初ＧｉｌｌｅｓｐｉｅおよびＳｐｅｉｇｅｌｍａｎにより提唱された従来のハイブリダイゼーションは通常放射性同位体であるレポーター基を伴ったオリゴ・オキシ・リポ・ヌクレオチドに基づいたプローブを用いており、つぎのような手順を含んでいる。すなわちテストされるべき核酸を紙、ガラスまたはプラスチックの面上に固定化し、目標順列に対して相補的なプローブを過剰に添加し、核酸を混成（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）し、非混成核酸を除き、固定化された目標順列に結合された残余のプローブを探知する。
【０００３】
非混成プローブは高度の洗浄により除かれる。これは通常非常に時間を要し、しかも作業が非常に厳密である。混成プローブと非混成プローブの特性は識別できないので、実質的に全ての非混成プローブを除去する必要がある。混成されたプローブはその目標順列との相互作用によってのみ接触されるので、その一部はおよび、ＴＳが充分に固定化されていない場合には、ＴＳとプローブとの間の混成体も洗浄により除かれる。加えて一部のプローブは面に付着してバックグラウンド信号を引き起こす。また非混成プローブは除去されなければならないという必要があるので、生体内探知とリアルタイム探知を不可能とする。
【０００４】
非混成プローブを除くことなしにハイブリダイゼーションを行う方法、いわゆる均質プローブ技術がいくつか提唱されている。
【０００５】
Ｂａｎｎｗａｒｔｈ他（Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、７１，２０８５，１９８８）はルテニウム錯体を有したオリゴ・オキシ・ヌクレオチドからなるプローブを用いた方法を開発した。ここでハイブリダイゼーションはプローブ蛍光寿命を測定することにより行われている。この方法はエレガントではあるが、その応用は秀れた装置を具えた特定の研究室に限定されるものであり、その実施には特別の訓練をした技術者を必要とする。しかもこの方法は混成プローブと非混成プローブを識別する能力が低く、特に蛍光寿命に影響を及ぼす成分を含んだサンプルの場合にはよくないのである。
【非特許文献１】Ｂａｎｎｗａｒｔｈ他（Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、７１，２０８５，１９８８）
【０００６】
Ｂａｒｔｏｎ  Ｊ．（ＵＳＰ５．１５７．０３２）は金属配位錯体により変態されたＤＮＡ鎖からなるプローブを紹介しており、これはハイブリダイゼーションに際して蛍光強度を増加している。これらのプローブはハイブリダイゼーションによりほどほどの蛍光を得ており（蛍光量子収量０．００７が報告されている。Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＆  Ｂａｒｔｏｎ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，８７３６，１９９２）、その感度は低かった。このプローブはジカチオン性で（帯電＋２）、相互作用に非特定貢献し、異なる順列を識別する能力が減少している。
【特許文献１】アメリカ特許第５１５７０３２号
【非特許文献２】Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＆  Ｂａｒｔｏｎ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，８７３６，１９９２
【０００７】
Ｙａｍａｎａ他（Ｎｕｃｌ．＆  Ｎｕｃｌ．１１（２−４），３８３，１９９２）はピレーネ（ｐｙｒｅｎｅ）により変態されたオリゴ・ヌクレオチドからなるプローブを紹介している。これは最適条件下でハイブリダイゼーションに際して蛍光の２０倍の増加を呈している。この方法はいくつかの欠点がある。ピレーネは複雑な写真物性（ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ）を有しており、その吸収と蛍光特性は周囲の環境により左右される。例えばエクシマーを形成する傾向がある（Ｊ．Ｍｉｃｈｌ＆  Ｅｒｉｋ  Ｗ．Ｔｈｕｌｓｔｒｕｐ  ｉｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｃｏｐｙ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  Ｌｉｇｈａｔ，１st  Ｅｄ．ＶＣＨ，１９８６，ＩＳＢＮ  ０−８９５７３−３４６−３）。
【非特許文献３】Ｙａｍａｎａ他（Ｎｕｃｌ．＆  Ｎｕｃｌ．１１（２−４），３８３，１９９２）
【非特許文献４】（Ｊ．Ｍｉｃｈｌ＆  Ｅｒｉｋ  Ｗ．Ｔｈｕｌｓｔｒｕｐ  ｉｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｃｏｐｙ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  Ｌｉｇｈａｔ，１st  Ｅｄ．ＶＣＨ，１９８６，ＩＳＢＮ  ０−８９５７３−３４６−３）
【０００８】
さらにピレーネは肉眼では見られない紫外線を発射する（４５０ｎｍ未満）。さらにピレーネは毒性である（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ他、Ｖｅｔ．Ｈｕｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２９，２５，１９８７）。
【非特許文献５】Ｙｏｓｈｉｋａｗａ他、Ｖｅｔ．Ｈｕｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２９，２５，１９８７
【０００９】
この発明の目的は上記のような従来技術に見られる制約を克服しかつ現行の均質な方法の制約を除くことにある。
【００１０】
この発明はさらに下記の諸点を目的とするものである。
より小さなフラグメントへの縮小などのサンプルの予備処理を必要なくする。
信号を発生するが非混成状態ではより小さな好ましくは無視できる信号を発生するプローブを用いてハイブリダイゼーションにより目標順列を探知する。
均質な溶液中でのプローブを可能とする。
ハイブリダイゼーションを遅滞なく迅速に提示する。
ＮＡの量をリアルタイムで定量する。
生体内での特定ＮＡの存在を提示する。
安価な装置を用いて生体内での特定ＮＡの存在を提示する。
いかなる順列でもその存在を選択的に提示する。
広い温度範囲に亙ってプローブを実施する。
使用者を毒性の化学物に暴露することなく、かつプローブを使用するのに特別の技術や訓練を必要としない。
【００１１】
診療や研究の分野でハイブリダイゼーション法をフルに利用するには、低いまたは無視可能な信号を発生するが目標順列へのハイブリダイゼーションに際しては観測可能な応答を発生するプローブを用いてハイブリダイゼーションを探知する技術が必要である。また組織や細胞に有毒な効果を及ぼすことなく生体内でプローブを使用できることが望ましい。またリアルタイム探知が可能でなければならない。勿論従来のハイブリダイゼーションにもプローブは使用できるべきである。さらにプローブは肉眼で探知できる信号を発生すべきである。この発明はこれらの要求をかなりのレベルで満たすものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
この発明の化合物は下記の化学構造を有しており、
【化２】
2005047901.tif 000003
ここでＲ1は水素または下記のように置換できる最大６個の炭素原子の窒素に複合していないアルキル基であり、
ＸはＯ，Ｓ，Ｓｅ、Ｎ−Ｒ5であり、
Ｒ5は水素または下記のように置換できるアルキル基またはＣＲ6Ｒ7であり、
同じであってもよいＲ6とＲ7とは水素または下記のように置換できるアルキル基であり、
二つまたは三つ全てが同じであってもよいＲ2，Ｒ3，Ｒ4は水素、以下のように置換できる小さなアルキル基、アリルであり、
またはＲ2とＲ4およびＲ3とＲ4と対になって、かつ２個の環状原子と一緒になって、５または６員芳香族環を形成し、
該芳香族環はＯ，ＳまたはＮＲ5などの０−２異種原子を含むことができ、
Ｒ5は上記の定義のものであり、
ｎは０，１または２であり、
ＹはＨＣ＝ＣＨであり、
ＡとＢとはともに０または１、もしＡ＝０ならＢ＝１およびその逆であり、
同じであってもよいＲ9とＲ10とは水素または以下のように置換できる窒素に複合していないアルキル基であり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ9、Ｒ10は炭化水素鎖であり、
該炭化水素鎖はヒドロキシル基、アルコキシ基、カルボキシル基またはアミノ基などの極性残基を有しており、強固な帯電または嵩だか基を含んでおり、いずれかひとつが少なくともひとつのｓｐ3―交配炭素により芳香族システムから分離されたイソチオシアン、イミディル、スルフォニルクロライドまたはカルボキシル基を有しており、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ9、Ｒ10は炭化水素鎖であり、
該炭化水素鎖はヒドロキシル基、アルコキシ基、カルボキシル基およびアミノ基などの極性残基を有しており、
それらのひとつが少なくともひとつのｓｐ3―交配炭素により芳香族システムから分離されたカルボキシル酸基を有している
ことを要旨とするものである。
【００１３】
ＳＲＥは順列が特にＮＡに結合し、ＲＧとの相互作用を最小とするまたはその信号特性に最小の影響を及ぼすようなＲＧとの相互作用を結果するような構造を有することを特徴とする、分子である。ＲＧが付加されている端部における塩基が、ＲＧが最小の親和性を有するかその信号特性を最小に影響するようにＲＧが相互作用するような、ＮＡであってもよい。ＳＲＥはＮＡ：ｓとは構造的に異なってもよい。それはオリゴデオキシ・リポ・核酸相似体（ＮＡＡ）であってもよく、変態または置換背柱、非天然砂糖部分、異なる構造、および／または異なる立体化学を有するものである。またそれはペプチドまたはタンパクであってもよく、順列を特に核酸に結合する。重要なことはＲＧおよびＳＲＥが、結合したときに、ハイブリダイゼーションに際して互いに相互反応してＲＧとは実質的に異なるように目標と相互反応する事である。
【００１４】
ここに発明されたプローブはＴＳへの結合に際して観測可能な異なる特性（信号特性ともいわれる）を呈し、均質のアッセイにおいて使用することができる。すなわち混成されないプローブを除くことなしに、特定のＮＡの存在が探知可能なのである。ここに発明されたプローブはプローブが固定化さらたアッセイ中で使用することができる。例えば表面につなぐことにより、従来のプローブに比べて、混成されないプローブを除くのに必要な洗浄処理がほとんど必要なくなるという利点がある。
【００１５】
この発明のプローブは単ストランド（ｓｓ）ＮＡ中のＴＳおよび複ストランド（ｄｓ）ＮＡ中のＴＳを認識できる。
【００１６】
この発明のプローブはｓｓＮＡとともにｄｓＮＡよりより安定な錯体を形成するし、ストランドが分離する温度においてｄｓＮＡをプローブするのに用いられる。
【００１７】
この発明のプローブは生体中（培養された細胞中および総器官中）でプローブするのに用いられる可能性を具えており、酵素に抵抗する従来のＮＡ基プローブに比べて有利である。
【００１８】
この発明のプローブはＴＳの両に比例して信号を発生し、サンプル中の特定のＮＡの量を定量するのに用いられる。これは例えば錯体混合物中の特定のＰＣＲ生成物の量を決定するのに用いることができる。また例えば細胞抽出物中における特定のＲＮＡの量や、２個の遺伝子の相対濃度などを決定するのに用いられる。後者の場合例えば癌の進行に従うのに用いられる。
【００１９】
この発明においてはハイブリダイゼーションが行われると直ちに信号が発生されて、特定ＮＡの量をリアルタイムで決定するのに用いられる。これにより例えばＰＣＲ反応や試験管内転写などにリアルタイムで従うことが可能となる。または細胞中の特定のＮＡの量の変化をリアルタイムでモニターすることも可能となり、例えば染色体またはプラスミドなどの反復、または特定のＲＮＡの産出などに従うことができる。
【００２０】
この発明は突然変異の探知にも用いることができる。１個または数個において異なる順列よりも完全に相補的な順列により効果的に混成するようにプローブを構成することもできる。
【００２１】
この発明は「蛍光インシチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）」技術により染色体中の特定の順列を局在化するのに用いられることを前提とする。この場合ハイブリダイゼーションに際して蛍光が増加するという点が従来のＦＩＳＨプローブに比べて有利である。充分な信号強度を得るには、いくつかのプローブを目標順列に混成するおよび／またはプローブに多くのＲＧ：ｓを具える必要がある。
【００２２】
この発明はさらに
外部器官に特定な順列を探知することにより、患者中の伝染性要素（ウイルス、バクテリア、パラサイトなど）を識別すること、および
遺伝的な材料をテストすることにより個々が病気に繋がりやすい傾向かまたは増加する痛みに苦しんでいるか否かをテストすること、および
胚およびフォスター中の遺伝的欠陥を発見する、および例えば出産に関連しての合併症を予見するための出生前診断、および
父系試験や裁判試験などにおいて個々を識別すること、および
クローニング、トランスフェクションおよび「遺伝子ノックアウト」などの遺伝し技術実験の結果をテストすること
などに使用されるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
題名に示されているように、この発明のプローブは特定の目標順列（ＴＳ）を含んだ核酸（ＮＡｓ）を探知し定量するために用いられるものである。従来の方法と対照的に、この発明は均質プローブに使用できるもので、非混成プローブを除去することなしにＴＳの存在が示すことができるのである。現存する均質プローブ方法に比べて、この発明は高度の敏感さ、高度の正確さ、迅速な探知のうち少なくともひとつの利点を有しているのである。
【００２４】
この発明のプローブはリンクされた順列認識要素（ＳＲＥ）とレポーター基（ＲＧ）とから構成されるものである（図１）。
【００２５】
ＳＲＥ−ＲＧ概念に基づいた従来のプローブには高いバックグラウンド信号に問題がある。ＲＧがフルオロホルムであるときには、プローブは多量の背景ルミネセンスを有しており、ＴＳへのハイブリダイゼーションに際しての蛍光強度の増加はほどほどである（４倍未満、ＥＰ  ０７１０  ６６８Ａ２、Ｉｓｈｉｇｕｒｏ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４，４９９２，１９９６）。この大きなバックグラウンド信号は主としてＲＧがＳＲＥ上に折り返して相互反応することによる（図２）。
【００２６】
従来のプローブがかかる問題を抱えている理由は、それらがＮＡに基づいたＳＲＥを持っているからであり、その順列構造はＲＧからの信号を最小化するように最適化されていないからである。ＲＧはＮＡ：ｓに親和性を有した分子であるから（でなければハイブリダイゼーションに際してＴＳに結合しない）、よほど注意しない限りは、いかなるＮＡ基プローブにおいてもＳＲＥに折り返して相互反応する傾向が大きいのである。
【００２７】
従来この種の全てのプローブ用いられているように（ＥＰＯ  ７１０６６８：ＵＳ  ５１５７０３２：Ｉｓｈｉｇｕｒｏ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４，４９９２，１９９６）、ＲＧが陽イオンである場合には、ＲＧがＮＡに静電的に付加されているので、これは特に重要な問題である。
【００２８】
信号特性の如何に拘わらず、上記の問題は全てのＮＡ−ＲＧプローブに共通のものである。それは電磁放射との相互作用である。これは着実な状態または時間解決状での吸収またはルミネセンス（蛍光、リン光）の変化、またはｎｍｒ反応、酸化還元電位、伝導率、反応性などの変化である。全ての場合において、最適化されてない順列を有したＮＡ：ｓ基プローブはＲＧのバック結合の問題があり、好ましくないバックグラウンド信号を有している。
【００２９】
この発明はＳＲＥ−ＲＧプローブについてのもので、そこではＲＧがＳＲＥの折り返してバックグラウンド信号を発生するという問題が最小化されている。またこの発明ではプローブの順列とプローブ計画とがいかに最適化されて、プローブの観測可能な特性の変化が改良されるかについて記載されている。さらにＴＳに結合した際に対応するＮＡ−ＲＧプローブより強い信号を発生するＳＲＥ−ＲＧプローブについても記載されている。
【００３０】
順列認識要素。この発明のプローブは、ＳＲＥ要素がＲＧとの相互作用を最小とするかまたはその信号特性の変化が最小となるようにＲＧと相互作用するような構造を有している、という特徴を有している。このＳＲＥは特定の塩基をＲＧ付加端部に具えたＮＡであるか、または化学的および／または構造的にＮＡ：ｓと異なるかである。それは核酸相似体（ＮＡＡ、ここではオリゴ・ヌクレオチド相似体と同じである）であってもよいが、ヌクレオチド間の特定の対合を認識するものである。それはまた、順列を特にＮＡ：ｓに結合する（図３）ようなペプチドであってもよく、それはペプチドとＮＡＡとの組合せであってもよく、パプチドとＮＡとの組合せであってもよい。またそれは特にＮＡ：ｓ順列に結合する有機合成分子であってもよい。
【００３１】
好ましい一実施例においては、ＳＲＥはＮＡＡである。ここでＮＡＡとはウクレオチド塩基を含むユニットから構成される線状重合体をいうが、変態または置換されたリン酸エステルまたは変態または置換された砂糖部分を有している点で、または異なる立体化学を有しているが塩基対形成されにより順列を特にＮＡと相互反応させる点で、天然ＮＡとは異なっている。このＮＡＡはＮＡとは充分に異なっていて、ＲＧと実質的に異なる相互作用をしなければならない。かくして市販のオリゴ・ヌクレオチド合成装置で今日合成できるようなＮＡ誘導体（すなわち１個または数個の水素原子が他の基により置換されているＮＡ：ｓ）は充分に異なることは期待できないのである。
【００３２】
全てのＳＲＥがＮＡＡ建築ブロックにより構成されてる場合には最少のバック結合を期待できる。しかしＲＧが折り返されてＮＡステップと相互作用するように設計された混合ＮＡＡ／ＮＡ重合体もよい。例えば主としてＮＡステップを含んだ混合重合体中においてＲＧの折り返しを妨げるようにＮＡＡステップを配置することもできる。事実適切に選ばれたＮＡＡステップは、もしＮＡＡ／ＮＡ共重合体中の端部に配置されれば、ＲＧの折り返しを止めるのに充分である。以下の記載においてＮＡＡ基プローブとは、ＮＡＡ／ＮＡ混合重合体に基づいたＳＲＥを有したプローブをもいうものである。これは少なくとも１個のＮＡＡステップを有しており、ＲＧはＮＡＡステップに付加されている。ＳＲＥ中の全てのＮＡＡステップは同じであってはならない。このＳＲＥはＮＡＡ：ｓ、ＮＡＡ：ｓおよびＮＡの混合重合体であっても、ＮＡＡ誘導体（１個または数個の水素置換）の混合重合体であってもよい。
【００３３】
使用できるＮＡＡ：ｓは多く入手可能である。新規なものはアンチセンスやアンチゲン治療の分野で有効であるという可能性から急速に開発されている（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４，１６７，１９９５；Ｄｅ，Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ他，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５，３４３，１９９５）。
【００３４】
ＮＡＡの例としては変態リン酸エステル（フォスフルオチオエート、メチル・フォスフォネート、ボラノフォスフェート、フォスフォルアミデート、フォスフォルオセレノエート、フォスフォトリエステルなど）を有するもの、非天然砂糖部分（ホモ−ＤＮＡ、カルボサイクリック・リング・システムを伴なったもの、バイシクロ−ＤＮＡなど）を有するもの、リン酸エステル相似体（アルカン、エーテル、チオエーテル、アミノ、ケトン、フォルマセタル、チオフォルマセタル、アミド、カルバメート、尿素、ヒドロキシアミン、スルファメート、スルフアミド、グリシニル  アミド、スルフォンなど）を有するもの、完全置換背柱（バイサイクリック  リポアセタル相似体、モルフォリノ  誘導体、ペプチド核酸（ＰＮＡ））を伴なったもの、オリゴヌクレオチドリンク２’、５’を伴なったもの、およびαヌクレオチド・アノマーを伴なったものがある。
【００３５】
ＮＡＡ：ｓに共通なのは、化学的かつ構造的かつ静電的（少なくとも電化分布において）にＮＡｓとは異なるということであり、故にＲＧとして用いるのに興味のある化合物とは異なる相互作用をするということである。これを化合物ＢＯで図４に示す。ＢＳはそれ自身実質的にルミネセンスを有さず、ＮＡに結合されたときに輝くようになる。ＳＲＥ−ＲＧプローブにおいてＲＧとして用いられるには、ルミネセンスを高めるようにＳＲＥと相互作用してはならないのである。図４に見られるように、帯電していないＮＡＡ：ｓ、ＰＮＡおよびメチル・フォスフォネートの存在下ではＢＯは極度に低いルミネセンスを有している。フォスフォルオチエートの存在下では、それはｓｓＮＡとほぼ同じルミネセンスを有している。
【００３６】
これは、プローブ中でＮＡをＮＡＡに置換するとＲＧからの信号が低減すること、を示している。しかしこれは、いかなるＮＡＡも行わない、ことをも示している。
【００３７】
ＮＡＡが最善に働くのはＲＧがなにであるかに左右される。例えばもしＲＧがＢＯなどのカチオンだと、帯電されてなカチオン性ＮＡＡは最前に働くものと期待される。一般にＲＧはＮＡ（ハイブリダイゼーションの際に結合しなければならない）に対してあまりに低い親和性はもつことができないので、ＲＧが低い親和性を有しているＮＡＡが常に存在するのである。もしこのＮＡＡがＳＲＥとして使用されると、プローブは対応するＮＡ−ＲＧプローブより低いバックグラウンド信号を発生する。
【００３８】
小さなアニオン性分子は静電的な反発の故に通常ＮＡに結合しない。正帯電分子はＮＡに高い親和性を有している。かくして興味のあるＲＧは殆どがカチオン性であり、ときに中性の場合もあり、アニオン性の場合は殆どないのである。ＰＮＡ：ｓやメチル・フォスフォネートやモルフォィノ誘導体や一部のリン酸エステル相似体などの非帯電ＮＡＡ：ｓはしたがってＳＲＥとして用いるのには特に興味がある。これらはカチオン性ＲＧを静電的に引き寄せることなく、ＮＡ基ＳＲＥよりは少ないバック結合を呈するのである。
【００３９】
さらに興味のあることには、中性ＮＡＡ：ｓなどある程度の正帯電を有するＮＡＡ：ｓには例えば残基の変態によりまたは正帯電された置換基の添加などにより正電荷が導入されのである。非帯電カチオン性ＮＡＡ：ｓの共重合体も興味がある。勿論正電荷は、ＮＡとの非特定静電的相互作用の故に、プローブ特性を低減させる。したがってＮＡＡ中の正電荷の数はあまりに高いものであってはならない。
【００４０】
最善に特性化されたＮＡＡ：ｓはＮ−（２−アミノエチル）グリシンユニットに基づいたＰＮＡである。これは特定ＰＮＡに言及した際に考えていたＰＮＡである。その核酸との錯体はｄｓＮＡ（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ＆  Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｏｉｌ．，３，４１０，１９９６  ）とは非常に異なっている。、またＰＮＡデュプレックス（Ｈ．Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｏｉｌ．，４，９８−１０１，１９９７）もそうである。ｄｓＰＮＡは左右のヘリセを形成するが、ＰＮＡ：ＤＮＡおよびＤＮＡは右のみであり、ｄｓＰＮＡは１ターン当たりに１８塩基対を有しており、ＰＮＡ：ＤＮＡは１３有しており、ＤＮＡは１０有しており、ｄｓＰＮＡ中における塩基ねじれは１９．８度であり、ＰＮＡ：ＤＮＡ中では２８度であり、ｄｓＤＮＡ中では３４度である。したがってｓｓＮＡと特別な相互作用を行う化合物はｓｓＰＮＡとは全く異なる相互作用を行うものと考えられ、同様にｄｓＮＡと特別な相互作用を行う化合物はＰＮＡ：ＮＡ混成体とは異なる相互作用を行い易い。したがってＮＡに対して高い親和性を有すべく選択された化合物はＰＮＡに対しては親和性が低く、他の殆どのＮＡＡ：ｓについてもそうである（図４）。もしそのような化合物がプローブ中においてＲＧとして用いられると、少ないバック結合を呈する。もしＮＡの代わりにＳＲＥがＮＡＡだと、よりバック結合信号を呈する。
【００４１】
プローブ中にＳＲＥとして用いられたとき、ＮＡ：ｓに比べてＮＡＡ：ｓは他の利点も有している。ＮＡＡ：ｓは天然ではないので、酵素に対して抵抗があり、ＮＡＡ基プローブは細胞抽出物および酵素活性を有した他のサンプル中に用いることができる。ＮＡＡ基プローブはＴＳと一緒になってＮＡ基プローブより安定名混成体を形成し、高温度でのプローブが可能となる。
【００４２】
ＮＡＡ基プローブを用いると、ＮＡ基プローブより高い信号をハイブリダイゼーション時に得ることができる。ＴＳとのハイブリダイゼーションに際して、ＲＧはＴＳに近いｓｓＮＡ領域またはＳＲＥとＴＳとの間に（図３Ａ）形成された複ストランド領域結合することができる。もしＳＲＥがＮＡＡならば、ｄｓＮＡは複ハイブリダイゼーション（図６）によりＲＧに役立つようにすることができる。かくしてＮＡＡ基プローブを用いて、ＲＧは常にＮＡ基プローブのように同種のＮＡ構造と結合できる。
【００４３】
しかしＮＡＡ基プローブを用いても、ＲＧはＮＡＡ／ＮＡ混成体に結合できる。この混成体は異なる構造を有しており、そこではＲＧはより強い信号を得る。これはＰＮＡ（図１８）についてもいえることを発見した。このように信号が大きくなる理由は不明であるが、非帯電ＰＮＡがＮＡおよびｄｓＮＡとより強いデユプレックスを形成するからであろう。このデユプレックスは結合したＲＧ中での内部運動をより効果的に制約し、その蛍光信号を増加させるのだろう。この仮説が正しければ、他の多くのＮＡＡ：ｓについても同様な効果が期待できることになる。
【００４４】
この発明の他の実施例においては、ＳＲＥはタンパクまたはペプチドである。これらはともに核酸とは化学的に非常に異なり、ＮＡ順列を特定的に結合するだろう。今日ごく一部の順列特定核酸結合タンパクのみが知られている。しかしＴＳを特に認識できるペプチドを形成する方法が開発されている（Ｃｈｏｏ他，Ｎａｔｕｒｅ，３７２，６４２，１９９４）。ＲＧ：ｓはタンパクおよびペプチドに付加され得るものである（実験例１０）。
【００４５】
他の実施例においては、ＳＲＥはぺプチドとに結合されたＮＡＡであり、ＲＧはペプチドまたはＮＡＡにリンクされている。この構造により両化合物の利点が選られるのである。すなわちＮＡＡによる任意の順列を認識する能力、ＲＧのペプチドとの最少の相互作用などがそれである。ペプチドとＰＮＡとの組合せは特に興味がある。なぜならそれらは同じ固相化学により合成され、いかなる種類の共重合体も容易に形成できるからである。例えば帯電アミノ酸（実験例２）を用いて、溶解度を改善する帯電および／また撥水帯電ＲＧ：ｓを導入できる。
【００４６】
さらに他の実施例においては、ＳＲＥがペプチド−ＮＡ複合体であって、ＲＧがペプチドに付加されている。ＲＧとＮＡとの間の相互作用を妨げるようにペプチドを設計しなければならない。通常はより多くのアミノ酸残基が必要ではあるが、単一の嵩高いまたは適宜帯電された（すなわちＲＧのような帯電）アミノ酸で充分である。
【００４７】
さらに他の実施例においては、ＳＲＥは、ＲＧが付加された端部における塩基がＲＧが最少の親和性を有するものであるかおよび／またはその信号特性に最少の影響を及ぼすように相互作用するような、ＮＡである。
【００４８】
レポーター基。ＲＧは、ＳＲＥにリンクされてＴＳを結合したとき、容易に探知できる信号を引き出す分子である。この信号はＴＳなしにＳＲＥにリンクされたＲＧからのいかなる信号よりも顕著に大きいものである。構造的に異なるＮＡＡ：ｓの数は非常に大きいので、相互作用しないものまたは天然ＮＡがするのと同じに観測可能なＲＧ特性の変化を起こさないようなやり方で相互作用するものを発見するよい機会がある。結果全てのＮＡへの結合に際してその観測可能な特性が変更された全ての化合物はこの発明によるプローブ中で適宜なＳＲＥと組み合わせてＲＧとして用いることができる。
【００４９】
この発明はＮＡｓへの結合に際してそのスペクトル特性が変更されるＲＧにより特徴付けられるものである。このスペクトル特性は総蛍光強度の変化として測定される。実施例にあってはプローブ結合に際して蛍光が増加する。これは勿論この発明を制約するものではない。その信号特性がＴＳへの結合に際して減少するＲＧ：ｓを伴なったプローブも使用できる。
【００５０】
ＲＧとして用いられる化合物はＮＡへの親和性を持つべきであり、この親和性は化合物を混成状態させるのに充分であるが、高すぎてもよくない。なぜなら高すぎるとプローブがＮＡと非特定相互作用してしまうからである。ほとんどの配位子のＮＡ：ｓへの親和性は溶液のイオン組成と温度に左右され（Ｒｅｃｏｒｄ他、Ｊ．Ｍｏｌ．，Ｂｉｏｌ．１０７，１４５，１９７６）、しばしば数オーダーの大きさに亙って（図１２）緩和され得る。この発明におけるＲＧとして適切であるためには、化合物のＮＡへの親和性は、室温下１００ｍＭイオン強度で０．１〜１０8Ｍ-1（−１＜ｌｏｇＫ＜８）、であるべきである。
【００５１】
ルミネセンスが非常に高い感度で探知できるので、ＮＡ：ｓへの結合に際して蛍光が増加する化合物はＲＧとして適切である。これらのルミネセンス量子収量はＮＡ結合に際して少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも５００倍は増加すべきである。そのような化合物は多く知られている。そのような増加の大きな一例はチアゾール・オレンジである（５００倍を越える、Ｒｙｅ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，２８０３，１９９２）。
【００５２】
その化合物は溶液中でフリーでなければならない。すなわちＮＡｓがないときには非常に低いルミネセンスを有していなければならない。なぜならこれがバックグラウンド信号を起こすからである。フリーな化合物のルミネセンス量子収量は０．０５未満、好ましくは０．０１未満、より好ましくは０．００１未満でなければならない。
【００５３】
また該化合物はＵＶ／ＶＩＳ領域において光を効果的に吸収しなければならない。最大吸収でのその分子吸収度は少なくとも１０００Ｍ-1ｃｍ-1、好ましくは少なくとも１０，０００Ｍ-1ｃｍ-1、より好ましくは少なくとも５０，０００Ｍ-1ｃｍ-1でなければならない。
【００５４】
上記のような特性は通常環状または多環状リングを含んだ化合物（少なくとも２個、通常は５個未満が芳香族であって、結合してもよい）に観察される。このリングはカルボ環状またはヘテロ環状であって通常１〜２個の窒素原子を伴なっている。これらのシステムにおける他の共通のヘテロ原子は酸素と硫黄である。リングは通常１〜４個の炭素原子を伴なうアルキル基、ヒドロキシやアルコキシやカルボキシエステルなどの通常１〜４根炭素原子を伴なったオキシ基、通常０〜６個の炭素原子を伴なった通常モノおよびデアルキルアミノであるものおよび非置換アミノなどのアミノ基基、通常１〜４個の炭素原子を伴なった通常アルキルチオなどのチオ基、通常１〜７個の炭素原子を伴なった通常カルボキシアミドやカルボキシアルキルなどであるカルボキシ基およびその誘導体のようなチアノ基、非尾糞カルボニル基、通常１〜４個の炭素原子を伴なったオクソカルボニルおよびアシル、通常芳香族数が９〜３５の水素などで置換されてもよい。
【００５５】
さらに興味のある化合物としては、結合により互いに結合された２個の芳香族システムを含んだものがあり、該結合としては例えばエチレン基、リン酸基、アミン、カルボニルおよびカルボキシルエステルなどがあり、芳香族システムに複合していてある程度の強さを有している。これらの化合物は通常結合の周りでの回転の故に溶液中でフリーな低いルミネセンスを有しており、これにより刺激された状態からの非放射性非活性化を引き起こす。これらは核酸に結合されると蛍光が高くなるが、これは層間または小さな溝への結合によるものである。結合部位における平坦な配座に保持されることにより複合結合の周りに回転できないことによるものである。この回転は粘性の溶液中でも制約され、したがって化合物が適切な特性ならば（Ｃａｒｌｓｓｏｎ他、Ｊ．，Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，９８，１０３１３，１９９４）テストすることができる。
【００５６】
より興味があるのは非対称シアニン染料である（Ｆ．Ｍ．Ｈａｍｅｒ，ｉｎ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｖｏｌ．１８  ‘Ｃｙａｎｉｎｅ  ｄｙｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ’，１９６４，Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ）。これは（ＵＳ  ４８８３８６７，ＵＳ  ５３１２９２１，ＵＳ  ５３２１１３０，ＵＳ  ５４０１８４７，ＵＳ  ５４１００３０，ＵＳ  ５４３６１３４，ＵＳ  ５４８６６１６）に記載されており、特に下記の化学構造を有したものである。
【００５７】
【化３】
2005047901.tif 000004
【００５８】
ここでＲ1は水素または少なくとも６炭素原子の窒素非複合アルキル基であり、ヒドリキシ基、アルコキシ基、カルボキシル基、アミノ基などの極性残基で置換可能であり、
ＸはＯ，Ｓ（Ｓｅ）、Ｎ−Ｒ5であり、このＲ5は水素または小さなアルキル基、またはＣＲ6Ｒ7であり、このＲ6およびＲ7は水素またはアルキル基である。
【００５９】
これらの場合最初のリングシステムはそれぞれベンゾクサゾール、ベンンゾチアゾール、インドリンである。多の芳香族リングシステムは単または複芳香族リング、通常キノリンまたはピリジンである。
【００６０】
側基Ｒ2、Ｒ3およびＲ4（同じであってもよい）は水素、小さなアルキル基、アリル、または対でＲ2とＲ4またはＲ3とＲ4は、２個のリング原子と一緒になって、５または６体芳香族リングを形成し、これらはＯ、ＳおよびＮ−Ｒ8などの０−２異核原子を含んでもよい。ここでＲ8はアルキル基である。２個の芳香族システムを連結するメチン基結合中のｎは０，１または２である。これはリングシステム間の複合の距離と程度に影響し、したがって吸収および発散の波長にも影響する（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、“ＣＯＬＯＵＲ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９７６）。
【００６１】
ＹはＨＣ＝ＣＨでありその位置は指数ＡおよびＢで与えられ、これらは０または１であって、Ａ＝０ならＢ＝１でありその逆でもある。Ａ＝０でＢ＝１のときには、
【化４】
2005047901.tif 000005
となり、
Ａ＝１でＢ＝０ならば
【化５】
2005047901.tif 000006
および
【化６】
2005047901.tif 000007
および
【化７】
2005047901.tif 000008
となる。
【００６２】
ここでＲ1、Ｒ2およびｎは上記の通り。Ｒ9とＲ10とは窒素に付加された非複合アルキル基であり、ヒドロキシル基、アルコキシ基、カルボキシ基およびアミノ基などの極性残基で置換できるものである。
【００６３】
染料のホモおよびヘテロダイマーもこの発明に使用することができる。
これらの化合物はすでに確立された方法で合成できる（Ｓｐｒａｇｕｅ、ＵＳ  ２２６９２３４，１９４２；Ｂｒｏｏｋｅｒ他，Ｈｏｕｂｅｎｗｅｙｌ  ｍｅｔｈｏｄｅｎ  ｄｅｒ  ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  ｃｈｅｍｉｅ，ｂａｎｄ  Ｖ／１ｄ、１９７２；Ｌｅｅ他、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ７，５０８，１９８６；Ｌｅｅ  ＆  Ｍｉｚｅ、ＥＰ  ０４１０８０６，０９８９）。核酸に結合した際のこれらのルミネセンスの大きな向上はよく知られており（Ｌｅｅ  ＆  Ｃｈｅｎ，ＥＰ  ０２２６２７２）、網状赤血球（Ｌｅｅ  ＆  Ｃｈｅｎ，ＵＳＰ  ４８８３８６７）や血液中の寄生虫（Ｌｅｅ  ＆  Ｍｉｚｅ，ＵＳＰ  ４９３７１９８）の探知や、電気泳動中の核酸の着色（Ｑｕｅｓａｄａ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １０，６１６，１９９１；ＭａｔｈｉｅｓとＨｕａｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５９，１６７，１９９２）、毛管電気泳動中の核酸の超感度探知（ＳｃｈｗａｒｚとＵｈｌｆｅｌｄｅｒ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ。６４，１７３７，１９９２）などに利用されている。ポリカチオンと置換されて（ＧｌａｚｅｒとＢｅｎｓｏｎ、ＵＳＰ５３１２９２１；Ｙｕｅ他、ＵＳＰ５３２１１３０）およびホモおよびヘテロダイマーとして（ＹｕｅとＨａｕｇｌａｎｄ、ＵＳＰ５４１００３０），これらの化合物は核酸を着色するもっとも普通の染料である。
【００６４】
この発明において特に興味があるのは非対称染料であって（実験例５）、それは単一のカルボキシル酸基を有しており、該カルボキシル酸基は複合システムの一部ではなく、固相ペプチド合成の分野で公知のカップリング剤により活性化され得るものである。そのような染料はペプチドおよびＰＮＡ：ｓなどのペプチド基ＮＡＡ：ｓに、上記の固相ペプチド合成の分野で公知の方法で、付加または組込みされ得るものである。これは例えばＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  ９７／９８  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ＆  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｈａｎｄｂｏｏｋに記載された方法である。
【００６５】
この発明にいう染料はＴＯおよびＢＯといわれるもので、下記の化学構造を有している。
【化８】
2005047901.tif 000009
【００６６】
それらは種々のＳＲＥ：ｓに液相（実験例３）または固相化学による付加を可能とする種々の側鎖（実験例１）で合成されるものである。
【００６７】
それらの酸素相似体（すなわち同じ化合物であるが、硫黄の代りに酸素を有している）およびセレニウム相似体は非常に近い特性を有していることが分かった。
【００６８】
非対称シアニン染料の親和性およびルミネセンス特性はそれらが相互作用するＮＡの塩基順列により左右される（図１２）。それは多くは層間によりＤＮＡと非常に高い親和性を持って結合する（Ｊａｃｏｂｓｅｎ他、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，７５３，１９９５；Ｈａｎｓｅｎ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ。２４，８５９，１９９６）。それらは単ストランド・ポリピュリンには若干弱く（＜１０倍）結合し、単ストランド・ポリピリミジンには非常に弱く（〜１００倍）結合する。染料の蛍光特性も塩基順列に左右される。ポリピリミジンに結合された場合よりもＤＮＡおよびポリピュリンに結合された場合の方が蛍光は１０倍近く強くなる。結合染料の吸収特性にも差が認められる。ＮＡ：ｓに結合した非対称シアニン染料の諸特性は明らかにそれらが相互作用する塩基により非常に左右される。
【００６９】
ｄｓＮＡ：ｓさらにはｓｓＮＡＡ：ｓおよびＮＡＡ：ｓにつながれた分子は主として１−３最外側塩基と相互作用する（Ｃｉｅｐｅｋ他、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．，Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ．，５，３６１，１９８７）。したがってＲＧが付加される端部に最も近い塩基を選ぶことにより、ＮＡ基およびＮＡＡ基プローブのＨＳを最小とすることができる。これらの塩基はＲＧＦが最少の親和性を有するか、信号特性に最少の影響を及ぼすようにＲＧが相互作用するようなものでなければならない。
【００７０】
ＮＡまたはＮＡＡ基ＳＲＥの最端部の塩基がＣＴ−ＲＧまたはＴＴ−ＲＧであるとき（図１９）には、非対称シアニン染料には非常に低いバックグラウンド・ルミネセンスが得られる。
【００７１】
その他のＲＧの場合には事情が全く異なる。例えば最小溝バインダー４’−６、ジアミヂノ−２−フェニル  インドール（ＤＡＰＩ）は、少なくとも３個のＡ：Ｔ対の領域に結合したときに、かなりのルミネセンスを有しているが、他の順列の場合にはルミネセンスがかなり低いものとなる（Ｊａｎｓｅｎ他、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１１５，１０５２７，１９９３）。したがってＳＲＥとしてＤＡＰＩに基づいたプローブはつながれた染料にアクセスできる３個のＡ：Ｔ塩基対を有してはならないのである。
【００７２】
ＳＲＥとＲＧの複合。結合されるにはＳＲＥＴＯＲＧとは適切な反応基を有しなければならない。多くの組合わせが可能である。システンなどのチオールは他のチオールおよびイオドアセトアミド、種々のマレイミド、アクリル酸の誘導体などのアルカレート基に結合可能である。ペプチドおよびＰＮＡ中のアミノ端末および塩基性アミノ酸残基などのアミノ基はサクシニミド・エステルおよびフタリミド・エステルなどのイソチルシアネート、スルフォンハライド、グリオクサル、アルデヒドおよびケトンにより反応されるものである。
【００７３】
ペプチド端末中のカルボキシル端末や酸性アミノ酸残基などのカルボン酸はアミン、ハイドラジン誘導体などにより反応される。これらの対反応は当業者公知であり、例えばＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  ９７／９８  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ＆  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｈａｎｄｂｏｏｋおよびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ｓｉｘｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．ｅｄ．  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｈａｕｇｌａｎｄ）などに記載されている。
【００７４】
染料の誘導体を構成する際には、そのスペクトル特性を損なわないように、複合されたシステムが影響されないことが重要である。これは通常、反応基が少なくとも１個の非複合単一結合により芳香族システムから分離されなければならないということ、を意味するものである。上記のシアニン化合物の場合、少なくとも１個のＳＰ3−混成炭素により芳香族システムから分離されている限りは、反応基はＲ基のいずこにも配置可能である。勿論ＲＧ誘導体が対反応と干渉する側基その他の置換物を有していないということも重要である。
【００７５】
ＳＲＥとＲＧとの複合は２通りのアプローチで記載されており、そのひとつは溶液化学に他は固相化学（実験例１）に基づいている。
【００７６】
液状溶液中におけるＲＧとＳＲＥの複合は非対称シアニン染料およびＳＲＥ：ｓとアミノ基とのサクシニミディル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）エステルを用いて例示されている。実施例４に覆い手はＴＯ（実験例３で合成された）のサクシニミディル・エステルがＰＮＡに付加されており、実施例１０ではＢＯのサクシニミディル・エステルがタンパクに付加されている。この溶液アプローチは非常に一般的なものであって、適宜な誘導体を用いて、いかなるＲＧをいかなるＳＲＥに付加するにも使用できる。
【００７７】
ＲＧのＳＲＥへの液相複合は我々が開発した（実験例５）非対称シアニン染料の新規なカルボン酸誘導体をアミノ基を有したＳＲＥ：ｓに付加することにより例示されている。実施例６ではＴＯのカルボン酸誘導体がＰＮＡ種の固定ＳＲＥに付加され、実施例７ではＴＯの異なるカルボン酸誘導体が固定ＳＲＥリンカー複合体に付加されている。固相アプローチは特にＳＲＥペプチドおよびＰＮＡ種のＳＲＥ：ｓに興味がある。なぜならこの染料はアミノ酸残基およびＰＮＡ塩基と同じ手順で付加され、市販のペプチド合成剤を用いて完全なプローブが合成され得るのである。
【００７８】
リンカー。リンカーの主たる機能はハイブリダイゼーションに際してＲＧとＴＳとの間の相互作用を妨げないユニットを一緒に保持することにある。このリンカーは化学的単一結合などのように複雑でなくてよいが、例えば官能基を含んだ錯体であってもよい。またそれはＳＲＥとＲＧとの間の相互作用を妨げるように構成されてもよい。我々の得た結果によると、これは短く強いリンカーを用いることにより達成され、嵩高な基を含んだリンカーによっても達成される。ＲＧが帯電されると、同様な電荷がリンカー中に導入されて、バック結合を抑制する。
【００７９】
ＳＲＥをＲＧの適切な誘導体に結合することにより多くのリンカーを構成することができる（実験例１）。ＳＲＥまたはＲＧに、それらを一緒にする前に、追加的なユニットを添加することによりより複雑なリンカーを構成することもできる。
【００８０】
リンカーの設計いかんにより、プローブのＮＡへの親和性を適度なものとすることができる。リンカー中の負電荷はＮＡへの親和性を低減させるが、正電荷はより安定な混成体を生み出す。プローブが高温で行われる場合には、後者は特に興味がある。極性基もリンカー中に導入して、プローブ可溶性を増加させることができる。ＲＧ：ｓが付加され得るいくつかの反応性基とともにリンカーを構成することも可能である。そのようなリンカーは分岐している。
【００８１】
非対称シアニン染料に基づいたＲＧ：ｓとの複合においてペプチド・リンカーは特に興味がある。なぜなら、ペプチド鎖（図１６）に付加されたときに、それらは非常に低いルミネセンスを有しているからである。ＰＮＡはペプチド化学により合成されるので、いずれの端部においてもアミノ酸により延長できるのである。事実我々が用いた多くのＰＮＡ：ｓはＲＧの反対の端部に付加されてプローブ可溶性を増加させる１または２個のリジンを有している。ＰＮＡユニットの間にアミノ酸を導入することもできる。いかなる種類のペプチド・リンカーも構成することができる。強いリンカーはαへライス（ｈｅｌｉｃｅｓ）の形で構成することもでき、電荷も導入でき、官能性も導入できる。勿論固相ペプチド合成（実験例７）によりカルボン酸側鎖を伴った他の基をフィンカーに挿入することもできる。
【００８２】
ペプチド・リンカーはまたＲＧをＮＡ基ＳＲＥ：ｓに付加するのにも使用できる。適切に設計すれば、ペプチド・リンカーはＲＧがＮＡ塩基と相互作用するのを妨げることができる。
【００８３】
プローブ計画と設計。ｓｓＴＳを結合するＳＲＥを伴ったプローブを用いてｓｓＮＡをプローブすることができる（図３ＡおよびＣ）。このＳＲＥは通常ＮＡＡであるが（実験例２）、ペプチド、ペプチド−ＮＡＡ複合体、ＮＡ−ＮＡＡ混合重合体またはＮＡ−ペプチド複合体であってもよい。プローブされるシステムによってＴＳの寸法は変動する。例えば他のＮＡ：ｓ（すなわちＰＣＲ反応の生成物）を全然含まないか極少し含んだサンプル中の特定のＮＡの量の定量に際しては、安定な混成体と形成しかつ充分な順列特性を具えているとすると、プローブは５〜６塩基くらいの長さである。他方例えばゲノムＤＮＡに対する外部ＮＡなどの他のＮＡｓを過剰に含んだサンプル中の特定のＮＡの存在をプローブする場合は、ＴＳはより長くなければならない。１５〜４０の塩基を認識するプローブは多くの場合具合よく、１５〜２５塩基の長さが全んどの人体サンプルについて充分である。
【００８４】
バクテリアまたはリラウゲノムなどの長いＮＡフラグメントの存在、またはプラスミドや特定の挿入物の存在をプローブする場合には、プローブはこのＮＡにユニークな多くのセグメントに対して設計される。例えば５００塩基長ＮＡフラグメントは５００−２０＋１＝４８１セグメントを有しており、２０塩基長である。これはこのＮＡにユニークである。特異性の点から、プローブはそれらのいかなるセグメントも認識するように設計できる。ＮＡＡまたはＮＡＡ基プローブを用いるときには、混成状態でＲＧに最も近い端部において最小の親和性を有するかおよび／または存在ＲＧが最小の信号を得るようなＲＧと相補的な塩基を有しているようなＴＳ、を選ぶ。
【００８５】
ＴＯおよびＢＯなどの非対称シアニン染料に基づいたＲＧ：ｓについては、ＴＳはＡＡまたはＧＡで終わるべきである。ＴＳが部位に近いか、またはプローブが部位を形成するか（混成状態のＲＧの到達する）、それに対してＴＲＧが高い親和性を有するかそれに結合した場合、強い信号が得られる（図２０）のは有利である。特定の突然変異に敏感なプローブの信号応答を最適化するのにも同様な圭角を用いることができる。
【００８６】
例えば温度が高くてイオン強度が低く、相補的なＮＡよりも安定名混成体を形成するＳＲＥを伴なったプローブを用いてそのストランドが分離されている状態において、ｄｓＮＡはプローブされ得る。そのようなＳＲＥとは例えば多くの非帯電カチオン性ＮＡＡ：ｓである。
【００８７】
ＳＲＥとして順列特定トリプレックスまたは順列特定Ｄループを形成するＮＡＡ、またはタンパクまたはＳＲＥ（実験例１０）としてｄｓＮＡを結合するペプチド、またはタンパク／ペプチド−ＮＡＡ／ＮＡ複合物をともなったプローブを用いての（ｎａｔｉｖｅ）ｄｓＮＡはプローブされ得る。
【００８８】
この発明のプローブ（ＮＡＡ、ペプチド／タンパク、ペプチド−ＮＡＡ複合体またはペプチド複合体に基づいた）およびオリゴ・ヌクレオチド（オリゴ・ヌクレオチドがＲＧが結合できるデユプレックスを形成するなど（実験例９）、ＴＳの横たわっている領域と相補的である）の同時ハイブリダイゼーションによってもｓｓＮＡはプローブされ得るのである。
【００８９】
ＴＳの２個のストランドを認識する２個の相補的なプローブを用いてもｄｓＮＡはプローブされ得る。このアプローチは再生と相互作用してより大なる信号応答を生じる。
【００９０】
固体支持に固定されたプローブを用いてもプローブを、好ましくはＲＧの反対の端部でＳＲＥにつないで、実施できる。そのようなアプローチは容易に自動化でき、固定されたプローブは再利用さえもできるのである。
【００９１】
多くの従来のアプローチのように、固定されたサンプルＮＡでもプローブすることができる。ここで発明されたプローブは非混成プローブを除くための洗浄ステップが厳密でないという利点を有する。
【００９２】
２個の異なるＲＧ：ｓによりプローブを構成することもできる。これらの組み合わされた観測可能な特性はハイブリダイゼーションにより変更される。このプローブは２個のピレーネを伴なったＮＡ基プローブとして形成されるものである（Ｙａｍａｎａ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１（２−４）３８３，１９９２）。ここで発明されたプローブはより安定な錯体を形成し、ヌクレアーゼに対して抵抗性である。特に興味のあるプローブは１個のＲＧがフルロフォーレ（ｆｌｕｒｏｐｈｏｒｅ）であり他のＲＧが急冷剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）であるようなプローブである。このような構成において急冷剤はフリープローブのいかなる残基蛍光をも急冷して、ハイブリダイゼーションに際しての蛍光向上をさらに改良する。
【００９３】
プローブはさらにフリープローブの残留蛍光を低減するような第３の成分の存在の下に行うこともできる。この第３の成分は急冷剤、すなわちフリープローブ中でＲＧの蛍光を急冷する分子であってもよい。この急冷剤は溶液中でフリーであってもよく、また上記のようにＳＲＥに付加することもでき、またはＳＲＥの一部に相補的なＮＡまたはＮＡＡに付加することもできる。このＮＡ／ＮＡＡ急冷剤は、急冷剤をＲＧの近傍に持ってくるようなやり方で、フリープローブに付加する。相補性が部分的な場合には、プローブはＴＳに対してより高い親和性を持ち、ＴＳが存在するならばＮＡ／ＮＡＡ急冷剤から分離するだろう。第３の成分はまたＲＧに結合してそれをＳＲＥのバック結合位置から隔離するようなものであってもよい。異なるＲＧ：ｓには異なるものがよい。例えばカリクサレーン（Ｃａｌｉｘａｒｅｎｅ）はＴＯに対して大きな親和性を有しており、ＳＲＥ−ＴＯプローブのバックグランド・ルミネセンスを緩和するのに用いられる（実験例１２）。
【００９４】
この発明のプローブはサンプル中の数個の異なるＮＡ：ｓの存在を、識別可能なスペクトル応答を有するＲＧ：ｓとともにそれらを構成すことにより、同時に探知定量するのに用いられる。それらは例えば異なる波長の発光である。
【００９５】
この発明は、蛍光それ自身のハイブリダイゼーションにより、染色体中の順列を局在化するのにも用いられる（ＦＩＳＨ）。ここで発明されたプローブは従来のプローブに比べて、非混成プローブからのＨＳが非常に低い、という利点がある。特に興味があるのは、数個のＲＧ：ｓを有したプローブであり、例えば分岐リンカーや他のＳＲＥ（背柱、砂糖部分およびＮＡＡｓのヌクレオチド塩基）に付加されたものである。
【００９６】
ハイブリダイゼーションの探知。ＴＳへのプローブの結合はプローブのいかなる観測可能な特性（結合に際して変更される）によってもモニターできる。比較的安価な装置により非常に高い感度で蛍光強度を測定できるので、蛍光探知は通常は選択の方法である。しかし他の観測可能な特性もモニターできる。蛍光寿命の変化および蛍光分極も測定でき、さらに吸収の変化（図９）、ｎｍｒ応答および導電率なども測定できる。
【００９７】
ＮＡＡ−ＲＧ基プローブと一般のＮＡ−ＲＧ基プローブとの比較。一般のプローブに比べてここに発明したプローブの利点は、この発明のＮＡＡ−ＲＧ基プローブのひとつを同じ順列とＲＧであるＮＡ−ＲＧ基プローブと比較すると最もよく認識できる。ここでは順列には内構造特性のみを比較する。この比較にはＮＡＡとしてはＰＮＡを、ＲＧとしてはＴＯを用いた。すなわちこのＮＡ−ＲＧプローブは実質的にはＬｉｎｎ他（ＥＰ  ０７１０  ６６８  Ａ２，ＵＳ５５９７６９６）により記載されたものと同じであり、Ｉｓｈｉｇｕｒｏ他（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４，４９９２，１９９６）により記載されたものに非常に近いものである。染料オクサゾールイェローを思い出すと、後者により使用されたＹＯは全ての点においてチアゾール・オレンジに最も等しい。
【００９８】
実施例１４からしてつぎのように言える。
・ＰＡＡ基プローブはＮＡ基プローブより低いＨＳを有している。
・ＴＳに混成された場合、ＰＮＡ基プローブはＮＡ基プローブより高い信号を得る。
・ＰＮＡ基プローブの信号応答の増加はＮＡ基プローブのそれより非常に高い。
【００９９】
加えてＮＡ基プローブに比べてＰＮＡ基プローブはつぎのような利点を有している。
・ＰＮＡ基プローブはＮＡ基プローブより高い温度で使用できる。なぜならそれらはＴＳとより安定な錯体を形成するからである。ＰＰ８−ＧＣＴ−ＴＯプローブは例えば４５℃においてさえも３５倍の信号増加を呈する（実験例１１）。対応するＮＡ基プローブはこの温度ではデュプレックスを形成しない。
・ＰＮＡ基プローブはいかなるイオン強度でも使用できる。一方ＮＡ基プローブによるプローブはイオン強度に非常に敏感である。事実実施例１４の比較においては、５００ｍＭのＮａＣｌでＴＳに結合されたＮＡ−ＲＧプローブを安定化した。
・ＰＮＡ基プローブはヌクレアーゼに対して抵抗性がある。
・ＰＮＡ基プローブはある種の条件下ではｄｓＤＮＡを侵し（ＮＡ基プローブはそうではないが）、Ｄループ形成によりＤＮＡストランドのひとつとトリプレックスを形成する（Ｎｉｅｌｓｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，１４９７，１９９１）。
【０１００】
実験例。実験例１、合成ＲＧ：ｓ。
【表１】
2005047901.tif 000010
Ｒ1はＲＧをＳＲＥに付加する反応基を含んだ側鎖である。
【０１０１】
実験例２、プローブ合成。
【表２】
2005047901.tif 000011
【０１０２】
１．（Ｈ）はフリーアミノ基を表し、（ＮＨ2）は端末カルボキシアミドを表す。
２．強いリンカー
３．アミノリンカーを伴なったオリゴ・デオキシ・ヌクレオチドはＳｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓより購入された。ＴＯのサクシニミディル・エステルが付加され、プローブは実験例４におけるＰＮＡ基プローブと同じ手順で精製された。ただしＴＦＡは０．１Ｍ  ＴＥＡＡ（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）ｐＨ７．０で置換された。
【０１０３】
実験例３、チアゾール・オレンジのサクシニミディル・エステル合成。合成は４段階で行われた。
【０１０４】
Ｎ−メチル−２−、メチルベンゾチアゾリウム  ｐ−トルエン・スルホナート（Ｉ、図７）。ｐ−トルエン・メチルスルホナート（３．５ｇ、１８．８ｍｏｌｅ）をゆっくりとエタノール（１０ｍｌ）中の２．１ｇ（１４．０ｍｏｌｅ）２−メチルベンゾチアゾリウムに添加した。混合物を３時間還流させた後、室温で１５時間攪拌した。溶媒を蒸発させた後、メタノール／アセトン中で生成物を再結晶させた。収量：４．２ｇ、１２．６ｍｍｏｌ、９１％
【０１０５】
Ｎ−（カルボキシペンチル）キノリン・ブロマイド（ＩＩ、図７）。チノリン（５．２ｇ、４０ｍｍｏｌ）と６−ブロモ−ヘキサニカシド（７．８ｇ、４０ｍｍｏｌ）とを３０ｍｌアセトニトリルに添加した。混合物を窒素雰囲気中で３時間還流させた後、室温で１５時間攪拌した。５０ｍｌのアセトンを添加して溶液を更に１時間攪拌した。白色沈殿をフィルターし、アセトン（２＊１０ｍｌ）で洗浄した後乾燥した。収量：８．４ｇ、２６ｍｍｏｌ、６５％
【０１０６】
Ｎ−カルボキシペンチル−４−［（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）メチル］−キノリンイオディーン（ＩＩＩ、図７）。エタノール（２０ｍｌ）中でＫＯＨ（０．８ｇ，１５ｍｍｏｌ）の存在の下でＩ（１．６ｇ、５ｍｍｏｌ）とＩＩ（４．８ｇ、１５ｍｍｏｌ）との縮合によりＩＩＩを合成した。室温まで冷やした後、生成物を３０％ＫＩ（ａｑ．）（２０ｍｌ）で沈殿させた。沈殿をフィルターした後、アセトンで洗浄してメタノール中で再結晶させた。収量：１．０ｇ，２ｍｍｏｌ、４０％
【０１０７】
ＩＩＩのＮ−ヒドロキシ・サクシニミディル・エステル（ＴＯ−５−Ｓ）（図７）ＩＩＩ（０．５ｇ、１ｍｍｏｌ）とヒドロキシサクシキド（０．１１ｇ、１ｍｍｏｌ）とを２５ｍｌ（乾燥）ジメトキシエタン中で溶解した。ジシクロ・ヘキシルカルボジイミド（０．２３ｇ、１．１ｍｍｏｌ）を冷溶液に添加した。溶液を０℃で２０時間攪拌し、尿素をフィルターにより除去した。濾過物を濃縮してサンプルをメタノール中で再結晶させた。収量：０．４ｇ，０．６５ｍｍｏｌ、６５％
【０１０８】
実験例４、ＰＮＡプローブ（ＰＰ１０−ＣＴＴ−ＴＯ）溶液の合成とその特性化。順列ＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴ−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ2のアミノ基を伴った３８ｍｍｏｌＰＮＡを１０μｌＨ2Ｏに溶解し、３１μｌの５００ｍＭ  Ｎａ3ＢＯ3緩衝液および１０μｌのジオキサンを添加した。この反応は２μｌの２個のアリコート中で１４０ｎｍｏｌＴＯ−５−Ｓ（ＤＭＳＯ中）の添加により開始された（５分の攪拌を含む）。この反応混合物を４時間放置した。２５℃に冷やした後、１０μｌのアセトニトリルを添加した。グラジエント配システム（ＬＫＢ２２４９）中で逆相Ｃ−１８（Ｗａｔｅｒｓ、対称Ｃ１８  ３．９ｘ１５０ｍｍ）を用いて、生成物をＨＰＬＣで精製した。２６０ｎｍ（ＬＫＢ２１５１）において吸収をモニターした。使用したグラジエントはアセトニトリルと水（０．０１−０．１％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸を伴う）の混合物であった。流量は１ｍｌ／ｍｉｎであり、グラジエントは９５−６０％Ｈ2Ｏ、２０ｍｉｎ．、６０−０％Ｈ2Ｏ，５ｍｉｎ．。プローブと過剰のＴＯ−５−Ｓはよく分離された。プローブを含むフラクションは液化窒素により冷凍され、１５時間フリーズドライして溶媒とトリフルオロ酢酸とを除去した。これにより緩やかな赤みを帯びた物質が得られ、非イオン化水中で溶解された。プローブはＴＳに混成されて、ＲＧ吸収に大きな変化が起きた（図９）。
【０１０９】
実験例５、ＢＯ−２−Ｏ（Ｒ１＝ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）の合成。合成は３通りの手順で行われた。
【０１１０】
ｐ−トルエン・メチルスルフォネート（３５ｇ、１８．８ｍｍｏｌ）および２−メチル・チオベンゾチアゾール（２．５ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）とを５時間還流させた。生成物（Ｉ）をメタノール／アセトン中で再結晶させた（図１４ａ）。収量４．８ｇ，１３．１ｍｍｏｌ，９４％
【０１１１】
４−ピコリン（３．７ｇ，４０ｍｍｏｌ）と３−ブロモプロピオ酸（６．１ｇ，４０ｍｍｏｌ）とを５時間還流させた。生成物（ＩＩ）をメタノール／アセトン中で再結晶させた（図１４ｂ）。収量：６．９ｇ、２８ｍｍｏｌ，７０％
【０１１２】
ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍｌ）中でＥｔ3Ｎ（２．０ｇ、２０ｍｍｏｌ）の存在下でＩ（１０．８ｇ，５ｍｍｏｌ）とＩＩ（１．２ｇ、５ｍｍｏｌ）との縮合により、Ｎ−カルボキシメチル−４［（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリジン）メチル・ピリジニウム・イオッダイドが合成された。生成物を３０％ＫＩ（ａｑ）（１５ｍｌ）により沈殿させ、フィルターしてメタノール／水中で再結晶させた。収量：０．７０ｇ，２．１ｍｍｏｌ、４３％
【０１１３】
実験例６、プローブＰＰ１５−ＴＧＴ−ＴＯの合成、劈開および精製。ＰＮＡ置換レベル０．１５ｍｍｏｌ／ｇの樹脂２０ｍｇをＤＣＭ中で一夜膨潤させた。ＰＮＡ順列はＲｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＡＴＣＡＡＣＡＣＴＧＣＡＴＧ−ＮＨ−Ｂｏｃであった。ここでＲｅは樹脂であり、Ｂｏｃはアミノ端末保護基ｔ−ブチルオキシカルボニルであった。固相合成は水吸収窒素攪拌を伴ってガラスファンネル上で行われた。洗浄と試薬溶液は１ｍｌであり、カップリング手順の場合には０３ｍｌである。Ｂｏｃは５％ｍ−クレゾールをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中に添加して４分間攪拌することにより除去された。この手順は３回繰り返され、３部のＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）で樹脂を洗浄した後、ピリジンで２回洗浄した。カイザーテストによりフリーアミノ基を探知した。
【０１１４】
ＰＮＡモノマーＢｏｃチミン（９．８ｍｇ、１８*１０-6ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中の０．３ｍｌ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−ｌ−ｙｌ）−１，１，３，３−テトラメチル・ウロニウム・へキサフルオロフォスフェート（ＨＢＴＵ、０．１５ｍＭ、１８*１０-6ｍｏｌ）中で溶解した。
【０１１５】
ジイソプロピイル・エチルアミン（６．３μｌ、３．４*１０-5ｍｏｌ）１分後に添加し、混合物を樹脂に施し、３０分間結合反応を行わせた。カイザーテストによると、反応の終わりにおいてフリーなアミノ基はなかった。反応しなかったモノマーはフィルター除去され、樹脂をＤＭＦで２回洗浄した。残余のアミノ基の結合はアセト・アンハイドライドとＤＭＦ中のコリジンにより２分間行われた。ついでＤＭＦ中で樹脂を洗浄し、ＤＤＭＦ中で５％ピペリジンで４分間攪拌した。最後に樹脂はＤＣＭ：ＤＤＭＦ（１：１）で３回、ＤＣＭで３回洗浄された。
【０１１６】
ＴＯ−５−Ｏ（Ｒ１＝ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ、９．６ｍｇ、１８*１０-6ｍｏｌ）をついでチミンと同じ方法でＲｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＡＴＣＡＡＣＡＣＴＧＣＡＴＧＴ−ＮＨ−Ｂｏｃに結合された（結合反応が４５分行われた点を除いて）。反応中に樹脂ビーズは赤く変化し、カイザーテストによるとフリーなアミノ基はなかった。
【０１１７】
乾燥樹脂をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に入れ、ＴＦＡ（０．２５ｍｌ）で洗浄した。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＡＴＣＡＡＣＡＣＴＧＣＡＴＧＴは樹脂から劈開されて、トリフロロ・メチルサルフォン酸（ＴＦＭＳＡ）：ＴＦＡ：ｍ−チアニソーレ（２：６：１：１，０．２５ｍｌ）を１時間添加することにより、脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔ）された。６０００ｒｐｍの遠心分離により混合物をその後樹脂から除去した後試験管に移した。劈開はもう１回繰り返され、ＴＦＡ（０．２５ｍｌ）で完全に洗浄した。窒素の流れにより溶媒の半分は組合わせ劈開フラクションから蒸発された。氷冷ジエチルエーテル（５ｍｌ）を試験管に添加し、白い結晶が沈殿した。６０００ｒｐｍで試験管を遠心分離し、上澄み液を除去した。プローブ（ＰＰ１５−ＴＧＴ−ＴＯ）を４部のエーテルで洗浄し、最後に０．２ｍｌの水に溶解した。水の添加によりプローブは赤く変化した。
【０１１８】
実験例４のごとくにプローブを逆相ＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで特性化した（図１５）。
【０１１９】
実験例７、プローブＰＰ１６−ＧＴＣ−１０ｃ（強いリンカーを伴ったプローブ）の固相合成、劈開および精製。ＰＮＡ置換レベル０．１５ｍｍｏｌ／ｇの２０ｍｇ樹脂をＴＨＦ中で４時間膨潤させ、ＤＣＭで洗浄した。ＰＮＡ順列はＲｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＡＴＣＡＡＣＡＣＴＧＣＡＴＧＴ−ＮＨ−Ｂｏｃであり、これにまず実験例６のようにチトシンを結合させた。次のステップで強いリンカーがつぎのように結合された。
【０１２０】
Ｂｏｃ保護Ｎ−カルボキシ・メチルピペラジン（３．３ｍｇ、１３．５ｘ１０-6ｍｏｌ）をＤＭＦ（０．５ｍｌ）中に溶解させ、ＨＢＴＵ（５．１ｍｇ、１３．５ｘ１０-6ｍｏｌ）とＤＩＥＡ（４．８μｌ、２．７５×１０-5ｍｏｌ）とをそれから添加した。この混合物をアミノ端末脱保護順列に添加した。結合は３０分続き、カイザーテストの結果フリーなアミノ基は探知されなかった。反応しないモノマーはフィルター除去され、ＤＭＦで樹脂を２回洗浄した。
【０１２１】
残余のアミノ基の結合はアセトアンハイドとコリジンを用いてＤＭＦ（１：１：８）中で行った。樹脂をＤＭＦで３回洗浄し、ＤＭＦ中で５％ピペリジンで４分間攪拌した。樹脂は最終的にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）で３回洗浄し、ＤＣＭで３回洗浄した。実験例６と同じようにＢｏｃは除去され、カイザーテストの結果二次アミンの存在が探知された。ＴＯ−２−Ｏ（Ｒ1＝ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ、）６．６ｍｇ、１３．５×１０-6ｍｏｌ］をＤＭＦ（０．５ｍｌ）およびＨＢＴＵ（５．１ｍｇ、１３．５*１０-6ｍｏｌ）中で溶解させた。その後ＤＩＥＡ（４．８μｌ、２．７５*１０-5ｍｏｌ）を添加した。混合物を樹脂に添加した。結合４５分間続き、樹脂は赤く変化した。結合と洗浄は実験例６のように行った。プローブはついで劈開され実験例６のように脱保護された。
【０１２２】
プローブ（ＰＰ１６−ＧＴＣ−ＴＯｃ）は実験例４のように逆相ＨＰＬＣで精製され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより特性化された。
【０１２３】
実験例８、図３Ａの設計を用いてのプローブＰＰ１０−ＣＴＴ−ＴＯによるｓｓＤＮＡのプローブ。最初にプローブＰＰ１０−ＣＴＴ−ＴＯのバックグラウンド・ルミネセンスを測定した。ついで非相補的ｓｓＤＮＡ（５−ＴＣＣＴＴＣＡＴＴＣＧＣＴＴＣ−３）を過剰に添加したが、ルミネセンスには影響を及ぼさなかった。ついでＤＮＡを含んだＴＳ（５−ＡＧＣＧＧＴＣＧＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡ−３）を添加した。これによりルミネセンスが習慣的に増加した（図８）。サンプルは１．４μＭのプローブ、５ｍＭのホウ酸緩衝液および５０ｍＭのＮａＣｌを含んでいた。プローブ温度は５０℃であった。
【０１２４】
実験例９、図６の設計を用いてのプローブＰＰ１０−ＣＴＴ−ＴＯによるｓｓＤＮＡのプローブ。順列５−ＡＧＣＧＧＴＣＧＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡ−３のｓｓＤＮＡをプローブＰＰ−１０−ＣＴＴ−ＴＯおよびオリゴマー５−ＧＴＣがＣＣＧＣＴ−３を含むサンプルに添加した。これはｓｓＤＡＮＡの２個の近くにある部分に対して相補的である。これにより蛍光が４５倍に増加した（図１０）。実験は５０℃で５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）中で得イオン強度５００ｍＭで行われた。
【０１２５】
プローブ混合物は図１１において特性化されている。温度の関数として測定された２６０ｎｍにおける吸収によると、最初の反曲点で反映されるようにオリゴマーは６５℃で解離した。また第２反曲点で示されるようにＰＮＡ基プローブは８５℃であった。このし差異はｄｓＮＡに比べてＰＮＡ：ＮＡ混成体の安定性が高いことを反映している。
【０１２６】
フリ−なおよび混成プローブの蛍光はともに温度とともに減少する。前者は多分高温におけるバック結合の度合いが減少することにより、後者はＮＡデュプレックス中の塩基の熱変動によるものであり、これがＲＧ中における内部柔軟性を可能とし、低蛍光を可能とするのである。ハイブリダイゼーションに際しての蛍光の増加はそれらの信号の比であり、最大約６２℃である。
【０１２７】
混成プローブの蛍光は訳７５℃でバックグラウンドレベルに落下する。これはＰＮＡ：ＮＡデユプレックスの融点より下であるが、実質的にオリゴマーが結合しない温度である。これから混成状態の染料はＮＡ：ＮＡデュプレックス領域に結合するという仮説を支持するものである。
【０１２８】
実験例１０、タンパク−ＲＧプローブの構成。あるプローブは特に順列５−ＧＡＡＴＴＣ−３／３−ＣＴＴＡＡＧ−５を認識する制限酵素ＥｃｏＲＩにより構成され、ＤＭＳＯ中に溶解された２００ｎｍｏｌのＢＯサクシニミディル・エステルが１ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ８．０）中で１００ｎｍｏｌのＥｃｏＲＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより）に添加された。このＢＯ溶液に攪拌下で徐々に添加して、ＤＭＳＯによるタンパク変性を回避した。混合物を暗黒中４℃で１５時間攪拌し、１０Ｋ、４℃においてミクロ濃縮機でプローブを最終的にフリーな染料から分離した。フリーなＥｃｏＲＩのＳ蛍光スペクトル、ＥｃｏＲＩ認識部位を含むｄｓＤＮＡの存在下のプローブ、およびこの部位を欠いたｄｓＤＮＡ（ここでＤＮＡ重合体ポリ（ｄＡｄＴ）：ポリｄＡｄＴ））を図１６に示す。ＥｃｏＲＩプローブは特にＴＳ−含有ｄｓＤＡＮＡを認識する。参考として同じＤＮＡｓ存在下でのフリー染料の蛍光スペクトルも示す。
【０１２９】
実験例１１、ＳＲＥ−ＲＧプローブの蛍光向上。
【表３】
2005047901.tif 000012
【０１３０】
実験例１２、量子収量の決定。フルオレセインに対するフリーおよび混成プローブＰＰ８−ＧＣＴ−ＴＯの蛍光量子収量が決定された。ＰＰ８−ＧＣＴ−ＴＯを１０ｍＭのリン酸緩衝液中で溶解した（ｐＨ７．５、プローブ濃度０．８μＭ）。吸収測定はヴァリアンカリー（ｖａｒｉａｎｃａｒｙ）４上で行われ、蛍光測定はｓｐｅｘ  ｆｕｌｕｏｌｏｇｔ２上で行われた。全ての測定は同じ１ｃｍの細胞を使って行われた。サンプルは４７０ｎｍで攪拌され、スペクトルは４８０〜７００ｎｍで記録され、ｎｍ当たり５個のデータを集めた。蛍光量子収量（ΦF）は０．１ＭＮａＯＨ（量子収量を０．９３と仮定して）中のフルオレセイン・ジアニオンと比較して決定された。量子収量は下記の数式により計算された。
【０１３１】
【数１】
2005047901.tif 000013
【０１３２】
ここでＦ（ｖ）は波長ｖにおける蛍光発散強度、Ａλexは攪拌波長における吸収である。ハイブリダイゼーションはｓｓＤＮＡ５−ＡＴＣＧＡＣＧＡＧＡＧＡＡＴＡＴＣＡにより１：１比で行われた。結果を下記に示す。
【０１３３】
【表４】
2005047901.tif 000014
【０１３４】
ハイブリダイゼーションの際の蛍光量子収量の増加。フリーと混成プローブ日の吸収の差の故に、量子収量の増加は必ずしも蛍光強度の増加と同一ではない。
【０１３５】
実験例１３、ＨＳの減衰。プローブＰＰ１５−ＧＡＴ−ＢＯからのバックグラウンド蛍光信号はカリクサレーン（ｃａｌｉｘａｒｅｎｅ、図１７、ＲＧをＳＲＥから隔離する）の添加により減少する。ＰＰ１５−ＧＡＴ−ＢＯプローブの濃度は１μＭであり、温度は１５℃であった。１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５を用いた。
【０１３６】
実験例１４、ＮＡＡ−ＲＧおよびＮＡ−ＲＧプローブの比較。ＰＮＡ−ＴＯ（ＰＰ８−ＧＣＴ−ＴＯ）とＮＡ−ＴＯプローブ（ＰＤ−ＧＣＴ−ＴＯ）が同じ順列と類似のリンカーで合成された。フリープローブの蛍光が測定され、３通りの温度（図１８）でプローブがＮＡ含有ＴＳに混成された。全ての場合フリーＰＮＡ基プローブの蛍光はＮＡ基プローブより低かった。
【０１３７】
実験例１５、可視探知。プローブとＴＳとの間のハイブリダイゼーションの直接観察。図１３はブロードパスＵＶランプにより下側から照明された２個のポリプロピレン管を示しており、かつ側方から撮影（ＡＳＡ２００フィルムを用い、フィルターなし）された。両方の管とも３０μｌのサンプルと３．５×１０-10ｍｏｌプローブとを含んでいた。左側のサンプルはまた５倍過剰の非相補的ＮＡを含み、右側のサンプルは相補的ＮＡを含んでいた。実験例１２と同じオリゴマーが用いられた。条件は１０ｍＭのホウ酸緩衝液、ｐＨ８．５、塩無し、３０℃であった。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】図１はこの発明におけるＳＲＥ順列認識要素を示すもので、特に目標順列（ＴＳ）に結合したものであり、ハイブリダイゼーションされるとＲＧレポーター基は信号を発生し、リンカーはＳＲＥとＲＧとを連結する。
【図２】図２はＲＧのバック結合である。ＲＥがあまりに天然核酸に近いときには、ＲＧは折り返して信号を発生するようにそれと相互作用することがある。プローブは「短絡」である。
【図３】図３はプローブの設計とそのプローブ計画を示す。（Ａ）ｓｓＴＳ．ＲＧを認識したＮＡＡ基プローブはＮＡＡ／ＮＡデユプレックスまたはＴＳの近くのｓｓＮＡ領域と結合する。（Ｂ）ＮＡＡを形成するかＮＡＡ2：ＴＳを伴なったｄｓＮＡトリプレックスを形成するかまたはストランド変位を介してＮＡＡ2：ＮＡトリプレックスを形成するかしてＮＡＡ基プローブがｄｓＴＳを認識する（Ｃ）ペプチド基プローブがｓｓＴＳを認識（Ｄ）ペプチド基プローブがｄｓＴＳを認識する。
【図４】図４はＮＡおよび一部のＮＡＡ：ｓとともにプローブ中においてＲＧとして用いるのに適した適宜な特性を有する化合物の相互作用の比較である。
【図５】図５はＰＮＡの存在の下にある種の非対称シアニン染料により得られるルミネセンスの比較である。
【図６】図６はｓｓＮＡのプローブの他の計画を示す。
【図７】図７はＴＯ−５−Ｓの合成を示す。
【図８】図８は図３Ａの設計によるプローブのハイブリダイゼーションにおける蛍光強度の増加を示す。
【図９】図９は自由および混成されたプローブの吸収スペクトルを示す。
【図１０】図１０は図６の構成によるＴＳへのハイブリダイゼーションにおけるプローブ蛍光の増加を示す。
【図１１】図１１は図６の構成による混成錯体の特性化を示す。
【図１２】図１２は種々のＮＡｓに対する非対称シアニン染料の相互作用を示す。
【図１３】図１３はハイブリダイゼーションの直接観察を示す。
【図１４】図１４はＢＯ−２−Ｏの合成を示す。
【図１５】図１５（Ａ）ＨＰＬＣおよび（Ｂ）は固体相合成プローブＰＰ１５−ＴＧＴ−ＴＯのマススペクトルを示す。
【図１６】図１６は図３Ｄの構成によりプローブＥｃｏＲＩを用いたプローブを示す。
【図１７】図１７は錯化剤の効果を示す。
【図１８】図１８はＮＡＡおよびＮＡ基プローブの比較を示す。
【図１９】図１９は一番端の塩基の影響を示す。
【図２０】図２０はＴＳを選択する計画を示す。
【図２１】図２１は特定の突然変異に敏感なプローブの例を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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