(57)【要約】【課題】  安価な装置構成とすることが可能で化学発光と蛍光との間の微妙な関係をより充分に検出することができる装置および方法を提供する。【解決手段】  被測定試料９で発生した蛍光および化学発光それぞれの光子は、光選択部２０を経て光電子増倍管３１により検出される。光電子増倍管３１から出力されたパルス電気信号は、高速アンプ４１により増幅されて、フォトンカウンタ４２によりパルスが計数される。切替部４３により、励起光が被測定試料９に照射されていない第１期間におけるフォトンカウンタ４２による第１計数値が第１記憶部４４に記憶され、励起光が被測定試料９に照射されているときを含む第２期間におけるフォトンカウンタ４２による第２計数値が第２記憶部４５に記憶される。解析部４６により、第１計数値に基づいて化学発光の経時変化が測定され、第１計数値および第２計数値に基づいて蛍光の経時変化が測定される。【選択図】  図１
2005207886.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被測定試料に励起光をパルス的に繰り返し照射する励起光源部と、
前記励起光源部により前記励起光が前記被測定試料に照射されることにより前記被測定試料で発生した蛍光および前記被測定試料で発生した化学発光を選択して透過させる光選択部と、
前記光選択部により選択されて透過された前記蛍光および前記化学発光それぞれの光子を検出し、この光子検出事象に応じたパルス電気信号を出力する光検出部と、
前記光検出部から出力されたパルス電気信号を入力して当該パルスを計数するフォトンカウンタと、前記励起光源部により前記励起光が前記被測定試料に照射されていない第１期間内における前記フォトンカウンタによる第１計数値を記憶する第１記憶部と、前記励起光源部により前記励起光が前記被測定試料に照射されているときを含む第２期間内における前記フォトンカウンタによる第２計数値を記憶する第２記憶部とを有し、前記第１計数値に基づいて前記化学発光の経時変化を測定し、前記第１計数値および前記第２計数値に基づいて前記蛍光の経時変化を測定する経時変化測定部と、
を備えることを特徴とする化学発光および蛍光の経時変化測定装置。
【請求項２】
前記励起光源部が、連続光を出力する光源と、この光源から出力される光に対して通過または遮断の制御を行って前記励起光を生成する強度変調部とを有し、
前記経時変化測定部が、前記強度変調部における光の通過または遮断のタイミングを表す信号に基づいて、前記フォトンカウンタによる計数値を前記第１記憶部または前記第２記憶部に記憶させる、
ことを特徴とする請求項１記載の化学発光および蛍光の経時変化測定装置。
【請求項３】
前記励起光源部から出力される前記励起光の強度の経時変化を測定して、被測定試料への励起光の照射または停止のタイミングを表すタイミング信号を出力する励起光検出部を更に備え、
前記経時変化測定部が、前記励起光検出部から出力されるタイミング信号に基づいて、前記フォトンカウンタによる計数値を前記第１記憶部または前記第２記憶部に記憶させる、
ことを特徴とする請求項１記載の化学発光および蛍光の経時変化測定装置。
【請求項４】
前記励起光検出部が、前記タイミング信号に基づいて前記励起光のパルス幅を検出して、その検出結果を表すパルス幅信号を出力し、
前記経時変化測定部が、前記励起光検出部から出力されるタイミング信号およびパルス幅信号に基づいて、前記フォトンカウンタによる計数値を前記第１記憶部または前記第２記憶部に記憶させる、
ことを特徴とする請求項３記載の化学発光および蛍光の経時変化測定装置。
【請求項５】
前記光選択部が、前記被測定試料から到達した光を分光する分光器を有し、
前記光検出部が、この分光器により分光された光を受光する受光面の各位置における光子検出事象に応じたパルス電気信号を出力するカメラを有し、
前記経時変化測定部の前記フォトンカウンタが、前記カメラから出力されたパルス電気信号に基づいて前記受光面上の光子検出事象の計数値分布を求め、
前記経時変化測定部の前記第１記憶部が、前記第１期間内における前記フォトンカウンタによる第１計数値分布を記憶し、
前記経時変化測定部の前記第２記憶部が、前記第２期間内における前記フォトンカウンタによる第２計数値分布を記憶して、
前記経時変化測定部が、前記第１計数値分布に基づいて前記化学発光のスペクトルの経時変化を測定し、前記第１計数値分布および前記第２計数値分布に基づいて前記蛍光のスペクトルの経時変化を測定する、
ことを特徴とする請求項１記載の化学発光および蛍光の経時変化測定装置。
【請求項６】
被測定試料に励起光をパルス的に繰り返し照射し、
前記励起光が前記被測定試料に照射されることにより前記被測定試料で発生した蛍光および前記被測定試料で発生した化学発光を光選択部により選択して透過させ、
前記光選択部により選択されて透過された前記蛍光および前記化学発光それぞれの光子を光検出器により検出して、この光子検出事象に応じたパルス電気信号を前記光検出部から出力し、
前記光検出部から出力されたパルス電気信号を入力して当該パルスを計数するフォトンカウンタと、前記励起光源部により前記励起光が前記被測定試料に照射されていない第１期間内における前記フォトンカウンタによる第１計数値を記憶する第１記憶部と、前記励起光源部により前記励起光が前記被測定試料に照射されているときを含む第２期間内における前記フォトンカウンタによる第２計数値を記憶する第２記憶部とを用いて、前記第１計数値に基づいて前記化学発光の経時変化を測定し、前記第１計数値および前記第２計数値に基づいて前記蛍光の経時変化を測定する、
ことを特徴とする化学発光および蛍光の経時変化測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被測定試料における化学反応に伴い発生する化学発光の経時変化と、その被測定試料への励起光の照射に伴い発生する蛍光の経時変化とを測定する装置および方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
白血球の一種であるヒト好中球により産生されるスーパーオキサイド（Ｏ２−）は、人体に侵入した細菌やウイルス等を殺傷するものであり、生体防御において重要な役割を担っている。このスーパーオキサイドの産生には、好中球細胞内のカルシウムが関与していると考えられているが、このカルシウムの役割については不明な点が多い。しかし、スーパーオキサイド産生機能を欠いた慢性肉芽腫症患者の好中球は、好中球遊走性ペプチドｆＭＬＰ（formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine）により刺激されても細胞膜の脱分極が観察されないという特徴がある。このことは、同患者の好中球が細胞外液中のカルシウムを細胞内に動員することができないことを意味しており、好中球がスーパーオキサイド産生に必要な細胞内カルシウム濃度上昇を得ることができないと考えられている。
【０００３】
ここで、好中球遊走性ペプチドｆＭＬＰは、好中球細胞表面上のｆＭＬＰ受容体に特異的に結合し、細胞内カルシウム濃度を高めるような刺激を伝達させるものであり、このカルシウム応答から幾つかの細胞機能（その１つがスーパーオキサイド産生）の発現に向けて細胞内で更に刺激が伝達される。また、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ： Chronic Granulomatous Disease）は感染細菌が人体内で殺傷されずに留まることから、その患者は、非常に細菌感染症にかかり易い状態にあり、細菌を殺傷できない好中球の死骸が膿として蓄積したような症状が多くの組織で見られる。
【０００４】
このスーパーオキサイド産生を担う細胞内カルシウム濃度上昇の実体が解明されれば、慢性肉芽腫症患者の治療につながる新たな細胞機能診断法が確立されるものと期待される。ところで、スーパーオキサイド産生の測定は、例えば、好中球における化学反応に伴い発生する化学発光を検出することにより可能である。また、細胞内カルシウム濃度変化の測定は、例えば、好中球にカルシウム蛍光指示薬を予め導入しておき、これに励起光を照射して発生した蛍光を検出することにより可能である。
【０００５】
特許文献１には、蛍光および化学発光それぞれを測定することができる発明が開示されている。しかし、この特許文献１に開示された発明は、被測定試料に励起光を照射して蛍光のみを測定する一方、この蛍光の測定とは別に励起光の照射を停止して化学発光のみを測定するものであり、被測定試料での同一現象における蛍光および化学発光それぞれの経時変化を同時に測定することができない。よって、スーパーオキサイド産生と細胞内カルシウム濃度変化との間の微妙な関係を検出することができないという問題を有する。
【０００６】
特許文献２には、蛍光測定用の光検出器と化学発光測定用の光検出器とを用いて、被測定試料での同一現象における蛍光および化学発光それぞれの経時変化を同時に測定することができる発明が開示されている。この特許文献２に開示された発明を用いれば、スーパーオキサイド産生と細胞内カルシウム濃度変化との間の微妙な関係を検出することができる。
【特許文献１】特開平１１−１４８９００号公報
【特許文献２】特許第３１８３８６３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献２に開示された発明では、蛍光を検出するためのフォトンカウンタと、化学発光を検出するためのフォトンカウンタと、を用いる必要がある。したがって、高価なフォトンカウンタを２個も必要とすることから、この発明の測定装置も高価なものとなる。
【０００８】
また、フォトンカウンタを構成するパルス整形用のディスクリミネータやパルス計数用の高速カウンタは、性能や設定の個体差に因り、入力するパルス電気信号が同じであってもカウンタによる計数値が異なる場合がある。したがって、特許文献２に開示された発明では、被測定試料での同一現象における化学発光および蛍光それぞれの経時変化を同時に測定することができるとしても、各々の測定の精度は互いに異なる場合があり、よって、スーパーオキサイド産生と細胞内カルシウム濃度変化との間の微妙な関係の検出が充分でない場合がある。
【０００９】
本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、安価な装置構成とすることが可能で化学発光と蛍光との間の微妙な関係をより充分に検出することができる装置および方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置は、(1) 被測定試料に励起光をパルス的に繰り返し照射する励起光源部と、(2) 励起光源部により励起光が被測定試料に照射されることにより被測定試料で発生した蛍光および被測定試料で発生した化学発光を選択して透過させる光選択部と、(3) 光選択部により選択されて透過された蛍光および化学発光それぞれの光子を検出し、この光子検出事象に応じたパルス電気信号を出力する光検出部と、(4) 光検出部から出力されたパルス電気信号を入力して当該パルスを計数するフォトンカウンタと、励起光源部により励起光が被測定試料に照射されていない第１期間内におけるフォトンカウンタによる第１計数値を記憶する第１記憶部と、励起光源部により励起光が被測定試料に照射されているときを含む第２期間内におけるフォトンカウンタによる第２計数値を記憶する第２記憶部とを有し、第１計数値に基づいて化学発光の経時変化を測定し、第１計数値および第２計数値に基づいて蛍光の経時変化を測定する経時変化測定部と、を備えることを特徴とする。
【００１１】
本発明に係る化学発光および蛍光の経時変化測定方法は、(1) 被測定試料に励起光をパルス的に繰り返し照射し、(2) 励起光が被測定試料に照射されることにより被測定試料で発生した蛍光および被測定試料で発生した化学発光を光選択部により選択して透過させ、(3) 光選択部により選択されて透過された蛍光および化学発光それぞれの光子を光検出器により検出して、この光子検出事象に応じたパルス電気信号を光検出部から出力し、(4) 光検出部から出力されたパルス電気信号を入力して当該パルスを計数するフォトンカウンタと、励起光源部により励起光が被測定試料に照射されていない第１期間内におけるフォトンカウンタによる第１計数値を記憶する第１記憶部と、励起光源部により励起光が被測定試料に照射されているときを含む第２期間内におけるフォトンカウンタによる第２計数値を記憶する第２記憶部とを用いて、第１計数値に基づいて化学発光の経時変化を測定し、第１計数値および第２計数値に基づいて蛍光の経時変化を測定する。
【００１２】
この測定装置または測定方法では、励起光源部から出力された励起光は被測定試料に繰り返し照射される。この励起光照射により被測定試料で発生した蛍光および化学発光それぞれの光子は、光選択部により選択的に透過させて光検出部に入力する。この光検出器による光子検出事象は光検出器からパルス電気信号として出力され、このパルス電気信号は経時変化測定部に入力する。そして、経時変化測定部では、このパルス電気信号がフォトンカウンタに入力して当該パルスが計数され、励起光源部により励起光が被測定試料に照射されていない第１期間内におけるフォトンカウンタによる第１計数値が第１記憶部に記憶され、励起光源部により励起光が被測定試料に照射されているときを含む第２期間内におけるフォトンカウンタによる第２計数値が第２記憶部に記憶されて、第１計数値に基づいて化学発光の経時変化が測定され、第１計数値および第２計数値に基づいて蛍光の経時変化が測定される。
【００１３】
本発明に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置は、(1) 励起光源部が、連続光を出力する光源と、この光源から出力される光に対して通過または遮断の制御を行って励起光を生成する強度変調部と、を有し、(2) 経時変化測定部が、強度変調部における光の通過または遮断のタイミングを表す信号に基づいて、フォトンカウンタによる計数値を第１記憶部または第２記憶部に記憶させるのが好適である。
【００１４】
この場合には、励起光源部において、光源から出力された連続光は、強度変調部（例えばオプティカルチョッパ）により通過または遮断の制御を受けて、パルス励起光とされる。そして、経時変化測定部においては、強度変調部における光の通過または遮断のタイミングを表す信号に基づいて、フォトンカウンタによる計数値が第１記憶部または第２記憶部に記憶される。
【００１５】
本発明に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置は、(1) 励起光源部から出力される励起光の強度の経時変化を測定して、被測定試料への励起光の照射または停止のタイミングを表すタイミング信号を出力する励起光検出部を更に備え、(2) 経時変化測定部が、励起光検出部から出力されるタイミング信号に基づいて、フォトンカウンタによる計数値を第１記憶部または第２記憶部に記憶させるのが好適である。さらに、(3) 励起光検出部が、タイミング信号に基づいて励起光のパルス幅を検出して、その検出結果を表すパルス幅信号を出力し、(4) 経時変化測定部が、励起光検出部から出力されるタイミング信号およびパルス幅信号に基づいて、フォトンカウンタによる計数値を第１記憶部または第２記憶部に記憶させるのが好適である。
【００１６】
この場合には、励起光検出部により、励起光源部から出力される励起光の強度の経時変化が測定されて、被測定試料への励起光の照射または停止のタイミングを表すタイミング信号が出力される。また、励起光検出部により、タイミング信号に基づいて励起光のパルス幅が検出されて、その検出結果を表すパルス幅信号が出力される。そして、経時変化測定部において、この励起光検出部から出力されるタイミング信号（およびパルス幅信号）に基づいて、フォトンカウンタによる計数値が第１記憶部または第２記憶部に記憶される。
【００１７】
本発明に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置は、(1) 光選択部が、被測定試料から到達した光を分光する分光器を有し、(2) 光検出部が、この分光器により分光された光を受光する受光面の各位置における光子検出事象に応じてパルス電気信号を出力するカメラを有し、(3) 経時変化測定部のフォトンカウンタが、カメラから出力されたパルス電気信号に基づいて受光面上の光子検出事象の計数値分布を求め、(4) 経時変化測定部の第１記憶部が、第１期間内におけるフォトンカウンタによる第１計数値分布を記憶し、(5) 経時変化測定部の第２記憶部が、第２期間内におけるフォトンカウンタによる第２計数値分布を記憶して、(6) 経時変化測定部が、第１計数値分布に基づいて化学発光スペクトルの経時変化を測定し、第１計数値分布および第２計数値分布に基づいて蛍光スペクトルの経時変化を測定する、のが好適である。
【００１８】
この場合には、被測定試料から光選択部内の分光器に到達した光は分光器により分光され、この分光された光は光検出部内のカメラにより受光されて、カメラの受光面の各位置における光子検出事象に応じたパルス電気信号がカメラから出力される。カメラから出力されたパルス電気信号に基づいて受光面上の光子検出事象の計数値分布が２次元フォトンカウンタにより求められ、第１期間内におけるフォトンカウンタによる第１計数値分布が第１記憶部により記憶され、第２期間内におけるフォトンカウンタによる第２計数値分布が第２記憶部により記憶されて、第１計数値分布に基づいて化学発光スペクトルの経時変化が測定され、第１計数値分布および第２計数値分布に基づいて蛍光スペクトルの経時変化が測定される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置および方法は、安価な装置構成とすることが可能であり、また、化学発光と蛍光との間の微妙な関係をより充分に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための最良の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一または同等の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
【００２１】
（第１実施形態）
先ず、本発明の第１実施形態について説明する。図１は、第１実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置１の構成図である。この図に示される測定装置１は、励起光源部１０、光選択部２０、光検出部３０および経時変化測定部４０を備え、被測定試料９で発生する蛍光および化学発光それぞれの経時変化を同時に測定するものである。
【００２２】
測定対象物である被測定試料９は、サンプルホルダに容れられて測定装置１における所定位置に置かれる。この被測定試料９に対して励起光源部１０から励起光が照射される。この被測定試料９で発生した化学発光および蛍光は、光選択部２０、光検出部３０および経時変化測定部４０により測定される。また、好適には、被測定試料９を容れるサンプルホルダは、サーモバスと配管を介して接続されており、被測定試料９の温度を所定温度に制御することができる。また、好適には、サンプルホルダは、被測定試料９を攪拌するマグネティックスターラを備える。さらに、好適には、サンプルホルダは、被測定試料９や蛍光指示薬を導入するためのサンプルディスペンサと接続されている。
【００２３】
励起光源部１０は、光源１１、オプティカルチョッパ１２、フィルタ１３およびチョッパコントローラ１４を有し、被測定試料９に励起光をパルス的に繰り返し照射する。光源１１は、被測定試料９に導入される蛍光指示薬を励起して蛍光を発生させ得る波長の励起光を連続出力する。オプティカルチョッパ１２は、チョッパコントローラ１４により制御されて回転し、光源１１から出力された光に対して通過または遮断の制御を行ってパルス励起光を生成する強度変調部として作用する。フィルタ１３は、光源１１から出力される光のうち必要な励起波長の光のみを透過させ、また、被測定試料９に照射される励起光の強度を調整する。なお、この励起光源部１０は、被測定試料９へのパルス励起光の照射または停止を選択的に行うシャッタを更に有しているのが好適である。
【００２４】
光選択部２０は、レンズ２１、フィルタ２２およびレンズ２３を有し、被測定試料９で発生した蛍光および化学発光を選択して透過させる。レンズ２１は、被測定試料９から到達した光を平行光とし、レンズ２３は、その平行光を入力し、光検出部３０内の光電子増倍管３１の受光面に光を集光して入射させる。フィルタ２２は、バンドリジェクションフィルタ等が好適に用いられ、レンズ２１とレンズ２３との間に設けられていて、励起光の波長成分を選択的に遮断するとともに、被測定試料９で発生した蛍光および化学発光を選択的に透過させる。
【００２５】
光検出部３０は、光電子増倍管３１および高圧電源３２を有し、光選択部２０により選択されて透過された蛍光および化学発光それぞれの光子を検出し、この光子検出事象に応じたパルス電気信号を出力する。光電子増倍管３１は、高圧電源３２から供給される高電圧により駆動され、光選択部２０から光子が受光面に入射する度に、この光子検出事象を表すパルス電気信号を出力する。
【００２６】
経時変化測定部４０は、高速アンプ４１、フォトンカウンタ４２、切替部４３、第１記憶部４４、第２記憶部４５および解析部４６を有する。高速アンプ４１は、光電子増倍管３１から出力されたパルス電気信号を入力し、このパルス電気信号を適当な強度に増幅して出力する。フォトンカウンタ４２は、ディスクリミネータおよび高速カウンタを有しており、高速アンプ４１から出力されたパルス電気信号をディスクリミネータにより波形整形し、この波形整形したパルス電気信号に基づいて高速カウンタによりパルスを計数する。
【００２７】
経時変化測定部４０内の切替部４３は、フォトンカウンタ４２から出力される計数値を入力する。切替部４３は、第１記憶部４４および第２記憶部４５それぞれに記憶されている計数値を初期化することができ、また、フォトンカウンタ４２からの出力に基づいて、第１記憶部４４および第２記憶部４５それぞれに記憶されている計数値を更新することができる。切替部４３は、チョッパコントローラ１４から出力されるオプティカルチョッパ１２における光の通過または遮断のタイミング（すなわち、被測定試料９への励起光の照射または停止のタイミング）を表すタイミング信号を入力して、この信号に基づいて、フォトンカウンタ４２による計数値を第１記憶部４４または第２記憶部４５に記憶させる。すなわち、一方の第１記憶部４４は、励起光源部１０により励起光が被測定試料９に照射されていない第１期間内におけるフォトンカウンタ４２による第１計数値を記憶する。他方の第２記憶部４５は、励起光源部１０により励起光が被測定試料９に照射されているときを含む第２期間内におけるフォトンカウンタ４２による第２計数値を記憶する。
【００２８】
経時変化測定部４０内の解析部４６は、第１記憶部４４により記憶された第１計数値を入力するとともに、第２記憶部４６により記憶された第２計数値をも入力する。第１計数値は、被測定試料９で発生した化学発光の強度を表すものである。また、第２計数値は、被測定試料９で発生した蛍光および化学発光の強度を表すものである。そこで、解析部４６は、第１計数値に基づいて化学発光の経時変化を求め、第１計数値および第２計数値に基づいて蛍光の経時変化を求める。
【００２９】
次に、図２を用いて、第１実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置１の動作を説明するとともに、本実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定方法について説明する。図２は、第１実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置１の動作を説明するタイミングチャートである。この図には、励起光源部１０から被測定試料９への励起光の照射、第１記憶部４５による第１計数値の加算、および、第２記憶部４６による第２計数値の加算、それぞれの動作タイミングが示されている。
【００３０】
被測定試料９は例えばヒト好中球様細胞である。ここで、ヒト好中球様細胞は、ヒト単球系株細胞ＴＨＰ−１を０.５ｍＭのＢｔ２ｃＡＭＰ（ジブチリル環状アデノシンリン酸）を含む１０％血清入りＲＰＭＩmediumで細胞密度を３×１０５細胞／ｍｌに合わせ、これを３日間３７℃で５％ＣＯ２存在下で培養したものである。被測定試料９である好中球様細胞は、予め、カルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ-３（1-[2-amino-5-(2,7-dichloro-6-hydroxy-3-oxy-9-xanthenyl)phenoxyl]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid ）で処理され、また、化学発光試薬ＣＬＡ（ウミホタルルシフェリン誘導体、2-methyl-6-phenyl-3,7-dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-3-one）が添加されて、懸濁液とされる。この被測定試料９は、石英セルに容れられてサンプルホルダにセットされる。サンプルホルダにセットされた被測定試料９は、サーモバスにより一定温度３７℃に維持され、マグネティックスターラコントローラにより制御されたマグネティックスターラにより攪拌される。
【００３１】
励起光源部１０では、光源１１から出力された連続光に対してオプティカルチョッパ１２により通過または遮断の制御が為されてパルス光が生成され、そのパルス光のうち励起波長成分がフィルタ１３を透過して適当な強度とされて出力される。そして、励起光源部１０から出力された励起光が被測定試料９にパルス的に繰り返し照射される。図２（ａ）に示されるように、被測定試料９に励起光が照射される期間をＴｅとし、被測定試料９に励起光が照射されない期間をＴｎとすると、励起光照射の周期（Ｔｅ＋Ｔｎ）は一定であって例えば数百μ秒〜数十ｍ秒の程度であり、励起光照射のデューティ比（Ｔｅ／(Ｔｅ＋Ｔｎ)）も一定であって例えば１／５程度である。これら周期およびデューティ比それぞれは、必要に応じて適宜変更され得る。光源１１は、励起光として波長４８８ｎｍのレーザ光を出力することができるアルゴンレーザ光源や、励起光として波長４７３ｎｍのレーザ光を出力することができるＮｄ:ＹＡＧレーザ光源が、好適に用いられる。
【００３２】
被測定試料９からは、励起光照射により蛍光（波長５２３ｎｍ）が発生し、また、化学発光（波長３８５ｎｍ）が発生する。蛍光は、好中球様細胞内の遊離カルシウムイオンとカルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ-３とが結合して生成された錯体に励起光が照射されて発生するものであり、蛍光強度は、好中球様細胞内の遊離カルシウムイオンの濃度を表している。化学発光は、スーパーオキサイドと化学発光試薬ＣＬＡとが化学反応してＣＬＡ酸化物が生成される際に発生するものであり、化学発光強度は、スーパーオキサイド産生量を表している。
【００３３】
被測定試料９で発生した蛍光および化学発光のうち光選択部２０に入射した光は、光選択部２０内のレンズ２１により平行光とされ、フィルタ２２を透過し、レンズ２３により光電子増倍管３１の受光面に集光される。なお、励起光の散乱成分は、フィルタ２２により遮断されて、光電子増倍管３１の受光面への入射が阻止される。光検出部３０の光電子増倍管３１の受光面に光子が入射すると、この光子検出事象に応じたパルス電気信号が光電子増倍管３１から出力される。
【００３４】
光電子増倍管３１から出力されたパルス電気信号は、経時変化測定部４０内の高速アンプ４１により適当な強度に増幅されて、フォトンカウンタ４２に入力する。フォトンカウンタ４２に入力したパルス電気信号は、フォトンカウンタ４２内のディスクリミネータにより波形整形されて、フォトンカウンタ４２内の高速カウンタによりパルスが計数される。このフォトンカウンタ４２から出力された計数値は、切替部４３に入力する。また、切替部４３には、チョッパコントローラ１４から出力されるオプティカルチョッパ１２における光の通過または遮断のタイミングを表すタイミング信号も入力する。
【００３５】
そして、このタイミング信号に基づいて、切替部４３により、フォトンカウンタ４２による計数値は第１記憶部４４または第２記憶部４５に記憶される。より具体的には、図２（ｂ）に示されるように、一方の第１記憶部４４には、励起光源部１０により励起光が被測定試料９に照射されていない第１期間Ｔ１内におけるフォトンカウンタ４２による第１計数値が記憶される。また、図２（ｃ）に示されるように、他方の第２記憶部４５には、励起光源部１０により励起光が被測定試料９に照射されているときを含む第２期間Ｔ２内におけるフォトンカウンタ４２による第２計数値が記憶される。
【００３６】
以上のように励起光照射、第１計数値記憶および第２計数値記憶を行いながら、サンプルディスペンサから刺激薬が被測定試料（好中球様細胞）９へ滴下される。刺激薬として例えば好中球遊走性ペプチドｆＭＬＰが用いられる。そして、解析部４６により、刺激薬の被測定試料への滴下、化学発光強度（スーパーオキサイド産生量）および蛍光強度（細胞内カルシウム濃度）の間の因果関係や時間的関係が解析される。
【００３７】
第１期間Ｔ１（図２（ｂ））は、励起光が被測定試料９に照射されていない期間である。第１期間Ｔ１の開始時刻は、好適には、励起光がオプティカルチョッパ１２により遮断された後であって、被測定試料９に導入された蛍光指示薬の蛍光寿命時間（数ｎ秒）および測定装置１の応答時間（数十ｎ秒）が経過した後である。第１期間Ｔ１の終了時刻は、オプティカルチョッパ１２が回転することにより次に励起光がオプティカルチョッパ１２を通過し始める時刻より前である。したがって、フォトンカウンタ４２による第１計数値が第１記憶部４４により記憶される第１期間Ｔ１は、被測定試料９に励起光が照射されていない期間Ｔｎより短い。このように第１期間Ｔ１が設定されることにより、第１記憶部４４により記憶される第１計数値は、蛍光の影響を受けることなく、化学発光強度のみを反映した値となる。
【００３８】
一方、第２期間Ｔ２（図２（ｃ））は、励起光が被測定試料９に照射されているときを含む期間である。この第２期間Ｔ２は、被測定試料９に励起光が照射される期間Ｔｅのうちの一部を含めばよいが、この励起光照射期間Ｔｅの全体を含むのが好適である。このように第２期間Ｔ２が設定されることにより、第２記憶部４５により記憶される第２計数値は、蛍光強度および化学発光強度の双方を反映した値となる。
【００３９】
第１期間Ｔ１と第２期間Ｔ２とは互いに同じ時間であるのが好適である。この場合には、励起光照射の各パルスについて、第１期間に第１記憶部４４により記憶される第１計数値に含まれる化学発光強度成分と、第２期間に第２記憶部４５により記憶される第２計数値に含まれる化学発光強度成分とは、互いに等しくなる。したがって、励起光照射の各パルスについて、第２計数値から第１計数値を減算することで、蛍光強度のみを反映した計数値を得ることができる。
【００４０】
なお、第１期間Ｔ１と第２期間Ｔ２とは互いに同じ時間でなくてもよい。例えば、第１期間Ｔ１が第２期間Ｔ２のｋ倍であるとすると、励起光照射の各パルスについて、第１期間に第１記憶部４４により記憶される第１計数値に含まれる化学発光強度成分は、第２期間に第２記憶部４５により記憶される第２計数値に含まれる化学発光強度成分のｋ倍となる。したがって、励起光照射の各パルスについて、第２計数値のｋ倍の値から第１計数値を減算することで、蛍光強度のみを反映した計数値を得ることができる。
【００４１】
第１記憶部４４により記憶された第１計数値、および、第２記憶部４６により記憶された第２計数値は、経時変化測定部４０内の解析部４６に入力される。そして、以上のような解析が解析部４６により為されて、第１計数値に基づいて化学発光の経時変化が求められ、第１計数値および第２計数値に基づいて蛍光の経時変化が求められる。
【００４２】
以上のように、第１実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置１および方法によれば、フォトンカウンタ４２を１つのみ用いればよいので、安価な装置構成とすることが可能であり、しかも、化学発光と蛍光との間の微妙な関係をより充分に検出することができる
（第２実施形態）
次に、本発明の第２実施形態について説明する。図３は、第２実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置２の構成図である。この図に示される測定装置２は、励起光源部１０、光選択部２０、光検出部３０、経時変化測定部４０および励起光検出部５０を備え、被測定試料９で発生する蛍光および化学発光それぞれの経時変化を同時に測定するものである。
【００４３】
この第２実施形態に係る測定装置２における励起光源部１０、光選択部２０、光検出部３０および経時変化測定部４０それぞれは、前述の第１実施形態に係る測定装置１における同名の要素と同一の構成を有している。前述の第１実施形態に係る測定装置１と比較すると、この第２実施形態に係る測定装置２は、励起光検出部５０を更に備える点で相違する。
【００４４】
励起光検出部５０は、ビームサンプラ５１、フォトダイオード５２および波形整形部５３を有しており、励起光源部１０から出力される励起光の強度の経時変化を測定して、その光強度変化のタイミング（すなわち、被測定試料９への励起光の照射または停止のタイミング）を表すタイミング信号を出力する。
【００４５】
励起光検出部５０内のビームサンプラ５１は、励起光源部１０と被測定試料９との間の励起光の光路上に設けられていて、該励起光の一部を反射させてフォトダイオード５２へ入射させ、該励起光の残部を透過させて被測定試料９へ入射させる。フォトダイオード５２は、ビームサンプラ５１から到達した励起光を受光して、その受光強度に応じた電気信号を波形整形部５３へ出力する。波形整形部５３は、フォトダイオード５２から出力された電気信号を入力して、その電気信号を増幅し波形整形して出力する。
【００４６】
この波形整形部５３から出力される電気信号は、励起光源部１０から被測定試料９への励起光の照射または停止のタイミングを表すタイミング信号となる。経時変化測定部４０内の切替部４３は、この波形整形部５３から出力されるタイミング信号に基づいて、フォトンカウンタ４２による計数値を第１記憶部４４または第２記憶部４５に記憶させる。
【００４７】
この第２実施形態に係る測定装置２は、第１実施形態の場合と略同様に動作し、第１実施形態の場合と同様の効果を奏することができる。ただし、経時変化測定部４０内の切替部４３が入力するタイミング信号は、励起光源部１０内のチョッパコントローラ１４から出力されるのではなく、実際にパルス励起光を検出する励起光検出部５０内の波形整形部５３から出力されるので、タイミング精度がよい。また、励起光源部１０と他の要素との間に電気的な接続がないので、励起光源部１０の仕様や機種の変更が容易である。
【００４８】
（第３実施形態）
次に、本発明の第３実施形態について説明する。図４は、第３実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置３の構成図である。この図に示される測定装置３は、励起光源部１０、光選択部２０、光検出部３０、経時変化測定部４０および励起光検出部５０を備え、被測定試料９で発生する蛍光および化学発光それぞれの経時変化を同時に測定するものである。
【００４９】
この第３実施形態に係る測定装置３における光選択部２０、光検出部３０および経時変化測定部４０それぞれは、前述の第２実施形態に係る測定装置２おける同名の要素と同一の構成を有している。前述の第２実施形態に係る測定装置２と比較すると、この第３実施形態に係る測定装置３は、励起光源部１０および励起光検出部５０それぞれの構成の点で相違する。
【００５０】
励起光源部１０は、パルス励起光を出力する光源１１およびフィルタ１３を有している。したがって、励起光源部１０は、オプティカルチョッパおよびチョッパコントローラを有する必要が無い。
【００５１】
励起光検出部５０は、ビームサンプラ５１、フォトダイオード５２、波形整形部５３およびパルス幅計測部５４を有しており、励起光源部１０から出力される励起光の強度の経時変化を測定して、その光強度経時変化を表すタイミング信号を出力する。
【００５２】
励起光検出部５０内のビームサンプラ５１は、励起光源部１０と被測定試料９との間の励起光の光路上に設けられていて、該励起光の一部を反射させてフォトダイオード５２へ入射させ、該励起光の残部を透過させて被測定試料９へ入射させる。フォトダイオード５２は、ビームサンプラ５１から到達した励起光を受光して、その受光強度に応じた電気信号を波形整形部５３へ出力する。波形整形部５３は、フォトダイオード５２から出力された電気信号を入力して、その電気信号を増幅し波形整形して出力する。この波形整形部５３から出力される電気信号は、励起光源部１０から被測定試料９への励起光の照射または停止のタイミングを表すタイミング信号となる。
【００５３】
励起光検出部５０内のパルス幅計測部５４は、波形整形部５３から出力されるタイミング信号に基づいて、励起光のパルス幅（すなわち、被測定試料９への励起光の照射期間）Ｔｅおよび非照射期間Ｔｎを検出して、その検出結果を表すパルス幅信号を出力する。
【００５４】
経時変化測定部４０内の切替部４３は、波形整形部５３から出力されるタイミング信号と、パルス幅計測部５４から出力されるパルス幅信号とに基づいて、フォトンカウンタ４２による計数値を第１記憶部４４または第２記憶部４５に記憶させる。
【００５５】
特に、この第３実施形態では、切替部４３において、パルス幅計測部５４により測定された照射期間Ｔｅおよび非照射期間Ｔｎに基づいて、次のサイクルの第１期間Ｔ１および第２期間Ｔ２を決定することができる。例えば、最初のサイクルの非照射期間Ｔｎを計測し、第１期間Ｔ１および第２期間Ｔ２を「Ｔ１＝Ｔ２＝Ｔｎ−α」なる計算式で決定し、次のサイクルにおいて、この第１期間Ｔ１だけ第１記憶部４４に第１計数値を記憶させ、この第２期間Ｔ２だけ第２記憶部４５に第２計数値を記憶させる。ここで、αは、Ｔｎより小さい正の任意の値である。これをサイクル毎に繰り返す。
【００５６】
この第３実施形態に係る測定装置３は、第２実施形態の場合と略同様に動作し、第２実施形態の場合と同様の効果を奏することができる。また、第３実施形態に係る測定装置３は、被測定試料９への励起光の照射期間Ｔｅおよび非照射期間Ｔｎに追随させて第１期間Ｔ１および第２期間Ｔ２を決定することができるので、励起光源部１０の仕様や機種の変更が容易である。
【００５７】
（第４実施形態）
次に、本発明の第４実施形態について説明する。図５は、第４実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置４の構成図である。この図に示される測定装置４は、励起光源部１０、光選択部２０、光検出部３０、経時変化測定部４０および励起光検出部５０を備え、被測定試料９で発生する蛍光および化学発光それぞれの経時変化を同時に測定するものである。
【００５８】
この第４実施形態に係る測定装置４における光源部１０および励起光検出部５０それぞれは、前述の第３実施形態に係る測定装置３おける同名の要素と同一の構成を有している。前述の第３実施形態に係る測定装置３と比較すると、この第４実施形態に係る測定装置４は、光選択部２０、光検出部３０および経時変化測定部４０それぞれの構成の点で相違する。
【００５９】
光選択部２０は、レンズ２１、フィルタ２２およびレンズ２３を有する他、分光器２４をも有している。レンズ２１は、被測定試料９から到達した光を平行光とし、レンズ２３は、その平行光を入力し、分光器２４に光を集光して入射させる。フィルタ２２は、バンドリジェクションフィルタ等が好適に用いられ、レンズ２１とレンズ２３との間に設けられていて、励起光の波長成分を選択的に遮断するとともに、被測定試料９で発生した蛍光および化学発光を選択的に透過させる。分光器２４は、レンズ２３により集光された光を入力し、この光を分光する。
【００６０】
光検出部３０は、高感度カメラ３３およびコントローラ３４を有する。高感度カメラ３３は、コントローラ３４により制御されて、分光器２４により分光された光を受光する受光面の各位置における光子検出事象に応じてパルス電気信号を出力する。
【００６１】
経時変化測定部４０は、２次元のフォトンカウンタ４２、切替部４３、第１記憶部４４、第２記憶部４５および解析部４６を有する。２次元のフォトンカウンタ４２は、高感度カメラ３３から出力されたパルス電気信号に基づいて受光面上の光子検出事象の計数値分布を求め、第１記憶部４４は、第１期間Ｔ１内におけるフォトンカウンタ４２による第１計数値分布を記憶し、第２記憶部４５は、第２期間Ｔ２内におけるフォトンカウンタ４２による第２計数値分布を記憶する。そして、解析部４６は、第１計数値分布に基づいて化学発光スペクトルの経時変化を測定し、第１計数値分布および第２計数値分布に基づいて蛍光スペクトルの経時変化を測定する。
【００６２】
この第４実施形態に係る測定装置４は、第３実施形態の場合と略同様に動作し、第３実施形態の場合と同様の効果を奏することができる。ただし、第４実施形態に係る測定装置４は、蛍光および化学発光を分光器２４により分光し、この分光器２４により分光された光を高感度カメラ３３により撮像して、第１期間Ｔ１において撮像により得られた第１計数値分布を第１記憶部４４に記憶し、第２期間Ｔ２において撮像により得られた第２計数値分布を第２記憶部４５に記憶する。そして、解析部４６により、第１計数値分布に基づいて化学発光スペクトルの経時変化が測定され、第１計数値分布および第２計数値分布に基づいて蛍光スペクトルの経時変化が測定される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】第１実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置１の構成図である。
【図２】第１実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置１の動作を説明するタイミングチャートである。
【図３】第２実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置２の構成図である。
【図４】第３実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置３の構成図である。
【図５】第４実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定装置４の構成図である。
【符号の説明】
【００６４】
１〜４…化学発光および蛍光の経時変化測定装置、９…被測定試料、１０…励起光源部、１１…光源、１２…オプティカルチョッパ、１３…フィルタ、１４…チョッパコントローラ、２０…光選択部、２１…レンズ、２２…フィルタ、２３…レンズ、２４…分光器、３０…光検出部、３１…光電子増倍管、３２…高圧電源、３３…高感度カメラ、３４…コントローラ、４０…経時変化測定部、４１…高速アンプ、４２…フォトンカウンタ、４３…切替部、４４…第１記憶部、４５…第２記憶部、４６…解析部、５０…励起光検出部、５１…ビームサンプラ、５２…フォトダイオード、５３…波形整形部、５４…パルス幅計測部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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