(57)【要約】  【課題】  γ−グルタミルシステインを高含有するキャンディダ・ユティリスを作製し、それを用いてグルタチオン、γ−グルタミルシステイン、システイン、又はシステニルグリシン含有食品を製造する。  【解決手段】  グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を用いて改変されたキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養し、得られる培養物もしくはその分画物、又は加熱処理した前記培養物又は分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することにより、γ−グルタミルシステイン、システイン又はシステニルグリシン含有食品を製造する。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(A)又は(B)に示すタンパク質をコードするDNA。
(A)  配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B)  配列番号２に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記(a)又は(b)に示すDNAである請求項１に記載のDNA。
（a）  配列番号１の塩基番号58〜1485の塩基配列を含むDNA。
（b）  配列番号１の塩基番号58〜1485の塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項３】
請求項１又は２記載のDNAを用いてグルタチオン合成酵素活性が0.003μｍｏｌＧＳＨ／ｍｇタンパク質／時間以下になるように改変されたキャンディダ・ユティリス。
【請求項４】
請求項１又は２記載のDNAを用いてグルタチオン合成酵素活性が上昇するように改変されたキャンディダ・ユティリス。
【請求項５】
下記(c)又は(d)に示すDNAを用いてグルタチオン合成酵素活性が0.003μｍｏｌＧＳＨ／ｍｇタンパク質／時間以下になるように改変されたキャンディダ・ユティリス。
(c)配列番号１の塩基番号58〜981の塩基配列を含むDNA、又は
(d)配列番号１の塩基番号58〜981の塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
【請求項６】
配列番号3記載のDNAを用いてγ−グルタミルシステイン合成酵素活性が上昇するように改変された請求項３〜５のいずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリス。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養して得られる培養物、若しくはグルタチオン及び/又はγ−グルタミルシステインを含む前記培養物の分画物、又は熱処理或は酵素処理によりガンマ位のグルタミン酸が遊離したこれらの培養物もしくは分画物を含む飲食品。
【請求項８】
請求項３〜６のいずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養して得られる培養物を用いて製造された酵母エキス。
【請求項９】
請求項３〜６のいずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養し、得られる培養物もしくはその分画物、又は加熱処理した前記培養物又は分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することを特徴とする、γ−グルタミルシステイン又はシステイン含有食品の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子及び同遺伝子を用いて細胞内グルタチオン含有量を上昇または減少させたキャンディダ・ユティリス、及びそれを利用した食品に関するものである。γ−グルタミルシステイン、及びそれから製造されるシステイン或はグルタチオン、及びそれから製造されるシステニルグリシンは、食品分野で有用である。
【背景技術】
【０００２】
システインは、食品の風味改善などを目的に用いられている。システインの製法については蛋白分解法や半合成法などが知られているが、現在主に用いられている方法は蛋白分解法と半合成法である。システインを食品の風味改善に用いることを目的として、システイン含量の高い天然食品素材が求められているが、そのような天然食品素材は従来ほとんど知られていなかった。一方、γ−グルタミルシステインを含む酵母エキスを加熱または酵素処理すれば、システインを高含有する食品素材を得ることが可能であると報告されている（例えば、特許文献1参照）。
【０００３】
また、システニルグリシンはシステインとグリシンがペプチド結合したジペプチドであり、糖を加えて加熱させることにより良好なミートフレーバー増強素材となることが報告されている。システニルグリシンの製法はペプチド合成法がしられているが、天然素材より得る製法は従来ほとんど知られていなかった。一方、グルタチオンを含む酵母エキスを加熱または酵素処理すればシステニルグリシンを高含有する食品素材を得ることが可能であると報告されている。（例えば、特許文献２参照）
γ−グルタミルシステインは、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）では、γ−グルタミルシステイン合成酵素の働きによりシステインとグルタミン酸を基質にして合成される。また、グルタチオンはグルタチオン合成酵素の働きによりγ−グルタミルシステインとグリシンを基質にして合成される。γ−グルタミルシステインを高含有する酵母は、特許文献１、非特許文献１〜３などで報告されている。しかし、これらの報告は全てサッカロマイセス・セレビシエを用いてなされた検討であり、キャンディダ・ユティリスを用いた報告例はない。
【０００４】
キャンディダ・ユティリスは、グルタチオンやある種のアミノ酸・酵素など生物学的に重要な物質の生産に用いられている工業上重要な微生物である。（例えば、非特許文献４参照）しかし、キャンディダ・ユティリスは、サッカロマイセス・セレビシエと比較してピリジン塩基を生産するペントース燐酸経路でエネルギーの大部分を得るという特徴や、カタボライト制御が弱いという特徴等を有している（例えば、非特許文献５参照）。また、研究用酵母としては、通常サッカロマイセス・セレビシエが用いられているため、キャンディダ・ユティリスに関する知見は数少ない。そのような状況から、キャンディダ・ユティリスがどの様にしてグルタチオンを生合成しているか報告例がなく、わずかに、亜鉛耐性等を利用して取得された特定のキャンディダ・ユティリスにおいて、グルタチオンを高生産する温度が通常の温度より5℃以上低いとの報告例（例えば、特許文献３参照）などがあるのみである。
【０００５】
このように、キャンディダ・ユティリスにおいては、グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子は報告されておらず、細胞内グルタチオン含有量を制御することにより、産業上有用な物質生産を行う方法は知られていなかった。
【特許文献１】国際公開第00/30474号パンフレット
【特許文献２】特開2001-321117号明細書
【特許文献３】特公平03-18872号明細書
【非特許文献１】Agri. Biol. Chem., 1990, vol. 54, No. 12, p3145-3150
【非特許文献２】Molecular Biology of the Cell., 1997, vol. 8, No. 9, p1699-1707
【非特許文献３】Biochimica et Biophysica Acta, 1998, vol. 1395, No. 3, p315-320
【非特許文献４】Journal of Bacteriology, 1995, vol. 177, No .24, p7171-7177
【非特許文献５】Biotechnolgy, vol.3, 1983, p30
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、グルタチオン又は/及びγ−グルタミルシステインを高含有するキャンディダ・ユティリス、及びそれを用いた酵母エキス、並びにそれらを用いたグルタチオン、γ−グルタミルシステイン、システイン、又はシステニルグリシン含有食品及びその製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
キャンディダ・ユティリスは単位糖あたりの生育がサッカロマイセス・セレビシエよりよいと報告されている（Biotechnolgy, vol.3 p30,  1983年）。また、厳格な好気条件下ではエタノールの副生が生じない為（Kondo et al ( JOURNAL OF BACTERIOLOGY, DEC. 1995, p7171-7177)）、培養上エタノールの副生に注意する必要性が低い。そこで、本発明者は、γ−グルタミルシステインを高含有するキャンディダ・ユティリスを用いて製造した酵母エキスは、サッカロマイセス・セレビシエを用いて製造した酵母エキスよりも安価になり、工業生産には望ましいと考えた。
【０００８】
このような考えに基づいて、本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、他の生物との相同性から、キャンディダ・ユティリスからグルタチオン合成酵素をコードしている遺伝子及びγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードしている遺伝子を取得することに成功し、該遺伝子を用いて改変したキャンディダ・ユティリスがγ−グルタミルシステインを高含有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）下記(A)又は(B)に示すタンパク質をコードするDNA。
【００１０】
(A)配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
【００１１】
(B)配列番号２に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質。
（２）下記(a)又は(b)に示すDNAである（１）のDNA。
【００１２】
(a)配列番号１の塩基番号58〜1485の塩基配列を含むDNA。
【００１３】
(b)配列番号１の塩基番号58〜1485の塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
（３）（１）又は（２）のDNAを用いてグルタチオン合成酵素活性が0.003μmolGSH/mgタンパク質/時間以下になるように改変されたキャンディダ・ユティリス
（４）（１）又は（２）のDNAを用いてグルタチオン合成酵素活性が上昇するように改変されたキャンディダ・ユティリス。
（５）  下記(c)又は(d)に示すDNAを用いてグルタチオン合成酵素活性が0.003μｍｏｌＧ
ＳＨ／ｍｇタンパク質／時間以下になるように改変されたキャンディダ・ユティリス。
【００１４】
(c)配列番号１の塩基番号58〜981の塩基配列を含むDNA、又は
(d)配列番号１の塩基番号58〜981の塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
（６）配列番号３のDNAを用いてγ−グルタミルシステイン合成酵素活性が上昇するように改変された（３）〜（５）のいずれかのキャンディダ・ユティリス。
（７）（３）〜（６）のいずれかのキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養して得られる培養物、若しくはグルタチオン及び/又はγ−グルタミルシステインを含む前記培養物の分画物、又は熱処理或は酵素処理によりガンマ位のグルタミン酸が遊離したこれらの培養物もしくは分画物を含む飲食品。
（８）（３）〜（６）のいずれかのキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養して得られる培養物を用いて製造された酵母エキス。
（９）（３）〜（６）のいずれかのキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養し、得られる培養物もしくはその分画物、又は加熱処理した前記培養物又は分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することを特徴とする、γ−グルタミルシステイン又はシステイン含有食品の製造法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素及びγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子が提供される。本発明の遺伝子を用いることにより育種されるキャンディダ・ユティリスを用いることにより、食品の風味改善等の用いることのできる酵母エキスを、安価に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子
本発明のDNAは、下記の(A)又は(B)のタンパク質をコードするDNAである。
【００１７】
（A）  配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（B）  配列番号２に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質。
【００１８】
グルタチオン合成酵素活性とは、γ−グルタミルシステインとグリシンからグルタチオンを生成する反応を触媒する活性をいう。本発明のDNAがコードするグルタチオン合成酵素は、同酵素活性が損なわれない限り、配列番号２に示すアミノ酸配列において1若しくは複数の位置での1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含んでもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、2〜25個、好ましくは、2〜12個、より好ましくは2〜7個である。
【００１９】
上記の（A）で示すタンパク質をコードするDNAとしては、例えば、配列番号１の配列の塩基番号58〜1485の塩基配列を含むDNA（CGSH2 DNA）が挙げられる。また、上記（B）で示すようなキャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素と実質的に同一のタンパク質をコードするDNAは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むようにCGSH2 DNAを改変することによって得られる。また、上記のような改変されたDNAは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、CGSH2 DNAをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びCGSH2 DNAを保持する微生物、例えばエシェリア属細菌を、紫外線照射またはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（NG）もしくはEMS等の通常に変異処理に用
いる変異剤によって処理する方法が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等をもたらす変異には、グルタチオン合成酵素を保持するキャンディダ・ユティリスの菌株の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutationまたはvariation）も含まれる。上記のような変異を有するDNAを、サッカロミセス・セレビシエ等の適当な細胞で発現させ、その細胞のグルタチオン合成酵素活性を調べることにより、グルタチオン合成酵素と実質的に同一のタンパク質をコードするDNAが得られる。
【００２０】
また、CGSH2 DNAの塩基配列もしくはその一部を有するプローブとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA、又はCGSH2 DNAの塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有し、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のDNAに含まれる。ここでいう「ストリジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いDNAどうし、例えば75%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは95%以上の相同性を有するDNAどうしがハイブリダイズし、それより相同性が低いDNAどうしがハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1XSSC、0.1%SDS、好ましくは、0.1XSSC、0.1%SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２１】
プローブとして、CGSH2 DNAの塩基配列の一部の配列を用いる場合、そのようなプローブは、CGSH2 DNAの塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、CGSH2 DNAの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。プローブとして、300bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2XSSC、0.1%SDSが挙げられる。上記のような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、発現産物の酵素活性を調べることによって選択することができる。
【００２２】
CGSH2 DNAは、後記実施例に示すように、グルタチオン合成酵素が弱化したサッカロマイセス・セレビシエに導入したところ、グルタチオン合成が促進されたことから、グルタチオン合成酵素をコードしていることが確認された。配列番号２に示すアミノ酸配列を、データベースで相同性検索したところ、サッカロマイセス・セレビシエのグルタチオン合成酵素のアミノ酸配列と48%の相同性が認められた。
＜２＞本発明のキャンディダ・ユティリス
本発明のキャンディダ・ユティリスは、本発明のDNAの全部又はその一部を用いることにより、グルタチオン合成酵素活性が野生株より上昇又は減少するように改変されたものであり、より望ましくは、さらに配列番号3記載のDNAを併用することにより、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が上昇するように改変されたものである。キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素活性が野生株より減少するように改変するために用いるDNAは、配列番号１の塩基番号58〜981の塩基配列を含むDNA、または配列番号１の塩基番号58〜981の塩基配列もしくは同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。
【００２３】
本発明のグルタチオン合成酵素活性が減少するように改変されたキャンディダ・ユティリスは、グルタチオン合成酵素活性が親株より減少していること、例えば0.003μmolGSH/mgタンパク質/時間以下であることが好ましく、0.001μmolGSH/mgタンパク質/時間以下であることがより好ましい（「GSH」はグルタチオンを示す）。更には、グルタチオン合成
酵素活性が検出限界以下であることが好ましい。
【００２４】
本発明のグルタチオン合成酵素活性が上昇するように改変されたキャンディダ・ユティリスは、グルタチオン合成酵素活性が親株より上昇していることが好ましく、具体的には0. 450μmolGSH/mgタンパク質/時間以上であることがより好ましい。更には、グルタチオン合成酵素活性が0.600μmolGSH/mgタンパク質/時間以上であることが好ましい。グルタチオン合成酵素活性は、Gushimaらの方法(Gushima, T. et al., J.Appl.Biochem., 5, 210 (1983))によって測定することができる。
【００２５】
本発明のキャンディダ・ユティリスは、キャンディダ・ユティリスの適当な菌株、例えば野生株を遺伝子組換え技術（例えば、以下の文献等に開示されている技術が利用できる。FEMS Microbiology Letters 165(1998) 335-340、 Journal of Bacteriology Dec. 1995, p7171-7177、Curr Genet 1986;10(8):573-578、国際公開第98/14600号パンフレット）により、細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下又は上昇するように改変することにより取得することができる。グルタチオン合成酵素活性が低下するとは、グルタチオン合成酵素活性が消失することを含む。
【００２６】
具体的に、遺伝子組換え技術を利用してグルタチオン合成酵素活性を低下させるには、グルタチオン合成酵素活性が低下するようにグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を改変する方法が挙げられる。キャンディダ・ユティリスATCC15239株のグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号2に示す。従来、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子は知られていなかったが、本発明者は、各種生物のグルタチオン合成酵素のアミノ酸配列から、保存性の高い領域を検索し、配列番号５〜１１の領域を見出した。そして、それらのうち配列番号６，１０及び１１に示すアミノ酸配列に対応するプライマーを用いてPCRを行うことにより、キャンディダ・ユティリス染色体DNAから、グルタチオン合成酵素をコードすると予想される遺伝子断片を増幅することに成功した。さらに同遺伝子断片を用いて、5'RACE及び3'RACEを行うことによりキャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子を単離することに成功した。同遺伝子を回収する為のプライマーとしては、配列番号１２〜１９に示すプライマーが挙げられる。また、キャンディダ・ユティリスの菌株としては特に制限されないが、例えばATCC15239株が挙げられる。同菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)、住所10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, United States of America)から入手することができる。
【００２７】
グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を改変してグルタチオン合成酵素活性を低下させるには、例えば、グルタチオン合成酵素の発現量が低下するように前記遺伝子の発現調節配列を改変するか、または、活性を有するグルタチオン合成酵素が発現しないように、コード領域を改変する方法が挙げられる。具体的には例えば、５’末端部及び３’末端部を欠失した変異型グルタチオン合成酵素遺伝子を含む組換えＤＮＡでキャンディダ・ユティリスを形質転換し、変異型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子との間で組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を破壊することができる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。また、前記組換えＤＮＡは、制限酵素で切断する等により直鎖状にしておくと、染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株を効率よく取得することができる。
【００２８】
また、グルタチオン合成酵素遺伝子の内部の配列を欠失し、正常に機能するグルタチオン合成酵素を産生しないように改変した変異型遺伝子を含む組換えＤＮＡをキャンディダ・ユティリスに導入し、変異型遺伝子と染色体上の正常な遺伝子との間で組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を破壊することができる。
【００２９】
上記のようにして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在するグルタチオン合成酵素遺伝子配列との組換えを起こし、野生型グルタチオン合成酵素遺伝子と変異型グルタチオン合成酵素遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分及びマーカー遺伝子）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。したがって、この状態では野生型グルタチオン合成酵素遺伝子が機能する。
【００３０】
次に、染色体ＤＮＡ上に変異型グルタチオン合成酵素遺伝子のみを残すために、２個のグルタチオン合成酵素遺伝子の組換えにより１コピーのグルタチオン合成酵素遺伝子を、ベクター部分（マーカー遺伝子を含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる。その際、野生型グルタチオン合成酵素遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、変異型グルタチオン合成酵素遺伝子が切り出される場合と、反対に変異型グルタチオン合成酵素遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、野生型グルタチオン合成酵素遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合もマーカー遺伝子が脱落するので、２回目の組換えが生じたことは、マーカー遺伝子に対応する表現形質によって確認することができる。また、目的とする遺伝子置換株は、PCRによりグルタチオン合成酵素遺伝子を増幅し、その構造を調べることによって、選択することができる。
【００３１】
遺伝子破壊に用いるグルタチオン合成酵素遺伝子又はその断片としては、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡの他に、同塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、又は配列番号１に示す塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００３２】
尚、サッカロマイセス・セレビシエのグルタチオン合成酵素遺伝子の破壊については、国際公開第00/30474号パンフレットに開示されている。キャンディダ・ユティリスに組換えＤＮＡを導入する方法としては、エレクトロポレーション法（Luisら, FEMS Microbiology Letters 165(1998)335-340）が挙げられる。
グルタチオン合成酵素活性が低下した菌株は、メチルグリオキサールに対する感受性を指標として選択することができる（Ohtake, Y. et al., Agri. Biol. Chem., 54(12), 3145-3150, 1990）。グルタチオンを一定量生合成できる合成酵素活性を有する菌株（グルタチオン合成酵素活性及びγ-GC（グルタミルシステイン）合成酵素活性を有する菌株）は、メチルグリオキサールに耐性を示す。また、グルタチオンを含有しない培地での生育を調べることによっても、グルタチオン合成酵素活性が低下していることを確認することができる。更に、グルタチオン合成酵素活性が低下した菌株は、MNNG（N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン）濃度勾配プレートを利用することにより効率的に取得することができる。（国際公開第03/046154号パンフレット）
一方、遺伝子組換え技術を利用してグルタチオン合成酵素活性を上昇させるには、グルタチオン合成酵素活性が上昇するようにグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子が改変されていてもよいし、グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子の発現量が上昇するように改変されていてもよい。例えば、グルタチオン合成酵素活性は、配列番号１記載のグルタチオン合成酵素遺伝子を発現可能な形態でキャンディダ・ユティリスに導入することによって、増強することができる。
【００３３】
キャンディダ・ユティリスへのグルタチオン合成酵素遺伝子の導入する方法としては、例えば、同遺伝子と、キャンディダ・ユティリス染色体上に存在するＤＮＡ配列とを含む組換えＤＮＡで、キャンディダ・ユティリスを形質転換し、染色体中に組換えＤＮＡを組
み込む方法がある（Kondo, K. et al., J. Bacteriol., 177, 7171-7177 (1995)）。具体的には、前記遺伝子置換と同様にして行うことができる。
【００３４】
さらに、本発明のキャンディダ・ユティリスは、グルタチオン合成酵素活性が改変されることに加えて、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が増強されていてもよい。γ−グルタミルシステイン合成酵素活性は、γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子を発現可能な形態でキャンディダ・ユティリスに導入することによって、増強することができる。γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子としては、配列番号3記載のキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子が挙げられる。
【００３５】
キャンディダ・ユティリスへのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の導入する方法としては、例えば、同遺伝子と、キャンディダ・ユティリス染色体上に存在するＤＮＡ配列とを含む組換えＤＮＡで、キャンディダ・ユティリスを形質転換し、染色体中に組換えＤＮＡを組み込む方法がある（Kondo, K. et al., J. Bacteriol., 177, 7171-7177 (1995)）。具体的には、前記遺伝子置換と同様にして行うことができる。
【００３６】
また、キャンディダ・ユティリスへの目的遺伝子の導入は、染色体ＤＮＡ中に存在する自律複製配列（ARS）を含むプラスミドを用いて行うこともできる。キャンディダ・ユティリスのARS、及び、それを用いた形質転換は、国際公開WO95/32289号パンフレットに記載されている。
＜３＞本発明の酵母エキス、飲食品及びその製造法
上記のようにして得られるグルタチオン合成酵素活性を改変した酵母を好適な条件で培養して得られた培養物又はその分画物は、グルタチオン或はγ−グルタミルシステインを含有する。培養物は、酵母菌体を含む培養液であってもよいし、それから採取された酵母菌体、菌体破砕物、又は菌体抽出物（酵母エキス）であってもよい。菌体破砕物又は酵母エキスから、グルタチオンあるいはγ−グルタミルシステインを含む画分を得てもよい。
【００３７】
上記γ−グルタミルシステインを含む培養物又はその分画物を加熱することにより、γ−グルタミルシステインがシステインとピロリドンカルボン酸に分解するため、システインを遊離させることができる。具体的には、培養物又はその分画物を、水の存在下で、酸性から中性、具体的にはｐＨ１〜７において５０〜１２０℃に３〜３００時間保持することにより、システインを生成させることができる。
【００３８】
また、γ−グルタミルシステインを含む培養物又はその分画物をｐＨ３〜９に調整した後、γ−グルタミルペプチド分解酵素（γ−グルタミルトランスフェラーゼ、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ、グルタミナーゼ等）を加え、１５〜７０℃で１〜３００分作用させることによっても、システインを生成させることができる。
【００３９】
上記グルタチオンを含む培養物又はその分画物を加熱することにより、グルタチオンがシステニルグリシンとピロリドンカルボン酸に分解するため、システニルグリシンを遊離させることができる。具体的には、培養物又はその分画物を、水の存在下で、酸性から中性、具体的にはｐＨ１〜７において５０〜１２０℃に３〜３００時間保持することにより、システニルグリシンを生成させることができる。
【００４０】
また、グルタチオンを含む培養物又はその分画物をｐＨ３〜９に調整した後、γ−グルタミルペプチド分解酵素（γ−グルタミルトランスフェラーゼ、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ、グルタミナーゼ等）を加え、１５〜７０℃で１〜３００分作用させることによっても、システニルグリシンを生成させることができる。
【００４１】
培養に用いる培地は、本発明の酵母が良好に生育し、かつ、グルタチオン或はγ−グルタミルシステインを効率よく産生するものであれば特に制限されない。尚、必要に応じて、用いる酵母の形質にしたがって必要な栄養素を培地に添加する。
【００４２】
培養条件及び酵母エキス等の調製は、通常の酵母の培養、及び酵母エキスの調製と同様にして行えばよい。酵母エキスは、酵母菌体を熱水抽出したものでもよいし、酵母菌体を消化したものでもよい。また、本発明の酵母エキスは、熱処理又は酵素処理によりシステニルグリシン或はシステインを生成させたものであってもよいし、他の飲食品原料とともに飲食品に加工する際、又は加工後に熱処理されるものであってもよい。
【００４３】
具体的には、酵母エキスの熱処理は、例えば、次のようにして行うことができる。酵母エキス粉末に水を加え、塩酸でｐＨを５に調整し、濃度１０％の水溶液を作製し、これを９８℃で１８０分間加熱する。
【００４４】
上記γ−グルタミルシステイン、システイン、グルタチオン、又はシステニルグリシンを含む培養物又はその分画物は、飲食品の製造に用いることができる。飲食品としては、アルコール飲料、パン食品、又は発酵食品調味料が挙げられる。熱処理によるγ−グルタミルシステインからシステインの生成、熱処理によるグルタチオンからシステニルグリシンの生成は、飲食品の製造中、又は製造の後に行われてもよい。また、飲食品の製造に先立って、酵母の培養物又はその分画物を熱処理してもよい。
【００４５】
上記飲食品は、γ−グルタミルシステイン、システイン、グルタチオン、又はシステニルグリシンを含む培養物又はその分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することによって製造される。本発明の飲食品は、前記培養物又は分画物を使用すること以外は、通常の飲食品と同様の原料を用い、同様の方法によって製造することができる。このような原料としては、例えばアルコール飲料では、米、大麦、コーンスターチ等、パン食品では小麦粉、砂糖、食塩、バター、発酵用酵母菌等が、発酵食品調味料では大豆、小麦等が挙げられる。また、酵母エキスもしくはその濃縮物、またはそれらを乾燥したものは、それ自体で発酵食品調味料として用いることができる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
（１）キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素をコードすると予測される遺伝子の取得
キャンディダ・ユティリスATCC15239株をYPD試験管培地で30℃で振とう培養し、Genとるくん酵母用（宝酒造(株)、Code9084）を用いて、菌体から染色体を回収した。
〔YPD培地組成〕
グルコース     ２％
ペプトン       １％
酵母エキス     1％
(pH5.0)
サッカロマイセス・セレビシエ（クリスら、Molecular Biology of the Cell., 8, 1699-1707, 1997）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（クリスら、Molecular Biology of the
Cell., 8, 1699-1707, 1997）、及びラット（クリスら、Molecular Biology of the Cell., 8, 1699-1707, 1997）のグルタチオン合成酵素のアミノ酸配列から、以下の相同性が高い配列を選定した。
（i）QEVAVVYYR（配列番号５）
（ii）GSKKIQQ（配列番号６）
（iii）VLKPOREGGGNNVLKPQREGGGNN（配列番号７）
（iv）ISELGIYG（配列番号８）
（v）GGVAAGF（配列番号９）
各々のアミノ酸配列から縮重プライマーを設計し、（i）と（ii）、（i）と（iii）、（i）と（iv）、（i）と（v）、（ii）と（iii）、（ii）と（iv）、（ii）と（v）、（iii）と（iv）、（iii）と（v）、及び（iv）と（v）の各々の組み合わせに対応する宿重プライマーを用いて、degenerated PCRを行なった。PCR産物をアガロースゲルで電気泳動し、予想される大きさの領域を切り出し、DNAを回収した。さらに、この回収DNAを鋳型としてnested PCRを行なったが、目的の断片を取得することはできなかった。
【００４７】
次に、以下のアミノ酸配列に対応するプライマーを、キャンディダ・ユティリスのコドン使用頻度を参考に設定した。
（vi）GSKKIQQ（配列番号６）
（vii）EGGGNN（配列番号１０）
（viii）PQREGGG（配列番号１１）
上記（vi）のアミノ酸配列に対応するプライマー（GGT TCY AAG AAG ATY CAR CA（配列番号１２））と、（vii）のアミノ酸配列に対応するプライマー（CCA CCA CCY TCT CTY TGT GG（配列番号１３））を用いてPCRを行った。PCRは、KOD dash（TOYOBO社 コードLDP-101）を使用して、製造者の指示に従い、次の条件で行った。94℃ 2分 → 94℃1分、55℃（1サイクル毎に0.5℃づつ温度減少）1分、74℃ 40秒を22サイクル →  94℃1分、50℃1分、74℃40秒を15サイクル。
【００４８】
PCR産物をアガロースゲル（Nusieve3:1アガロース3%、1×TAE溶液（宝酒造（株）、CodeF5180A））にて電気泳動を行なった。ゲルをエチジウムブロマイド溶液で染色後、100bp〜300bpに相当する領域を切り出し、MagExtractor（TOYOBO社、CodeNPK-601）を用いてゲルからDNAを回収した。
【００４９】
この回収DNAを鋳型として、（vi）の領域に対応するプライマー（配列番号１２）と（viii）の領域に対応するように設定したプライマー（GTT GTT ACC ACC ACC YTC（配列番号１４））を用いてnested PCRを行なったところ、100bp〜300bpに相当する領域に、３本のバンドが検出された。PCRは、前記と同様の条件で行った。これらの３本のバンドを各々切り出し、ゲルからDNAを回収した。各々のバンドを、pGEM-T Easy vector（Promega社）に、DNA ligation Kit ver.2 （宝酒造(株)）を用いて連結し、大腸菌JM109コンピテントセル（宝酒造(株)、Code9052）を形質転換した。得られた形質転換体の一つからキャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素をコードしていると予測される遺伝子断片を含んでいると予測される形質転換体を取得した。形質転換体が持つインサートの塩基配列を常法に従い、決定した。
【００５０】
上記のようにして決定した塩基配列をもとに3’RACE（3’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（GIBCOBRL社、Cat.No 18373-027）を使用）を行なった。キャンディダ・ユティリスから、Rneasy Mini Kit（QIAGEN社、Cat.No 74104）を用いて調製したmRNAから、cDNA一次鎖を調製した後、3回のPCRを行った。用いたプライマーは以下のとおりである。
１回目PCR：AAG ATA TAC CCA TTG GAT GG（配列番号１５）及び3’RACEキット付属のAUAPプライマー
２回目PCR：TCA GAT CTT GGT AAA GAG GC（配列番号１６）及び3’RACEキット付属のAUAPプライマー
３回目PCR：AGA CTG GCA TTT GAG TCT CC（配列番号１７）及び3’RACEキット付属のAUAPプライマー
PCRは、KOD dash（TOYOBO社 コードLDP-101）を使用し、製造者の指示に従い、次の条件で行った。94℃2分 1サイクル → 94℃1分、50℃30秒、74℃40秒を30サイクル。
【００５１】
PCR産物をpGEM-T Easy vectorに連結し、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体が持つインサートの塩基配列を解析し、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素を含んでいると予測される遺伝子断片情報を取得した。
【００５２】
上記のようにして決定した塩基配列をもとに５’RACE（GeneRacer Kit（Invitrogen社、Cat.No L1502-01）を使用、逆転写にはkit付属のSuperScriptIIRTに代えてSuperSucriptIIIRT（Invitrogen社、Cat.No 18080-044）を用いた）を行なった。キャンディダ・ユティリスから、Rneasy Mini Kit（QIAGEN社、Cat.No 74104）を用いて調製したmRNAから、cDNA一次鎖を調製した後、1回のnested PCRを行った。用いたプライマーは以下のとおりである。
cDNA調製用プライマー：TTG ACA CCA ACT CGG AGA CAT CAG A（配列番号１８）
nested PCR：GAG AGT ACC TTC TCA TCC GTC AAG A（配列番号１９）及びキット付属のGeneRacer 5'Nested Primerを用いた。
【００５３】
上記のようにして得られた増幅産物をキット付属のベクターpCR4-TOPOにTOPO TAクローニング法にてライゲンションし、大腸菌に形質転換した。得られた形質転換体がもつインサートの塩基配列を解析し、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子を含んでいると予想される遺伝子断片を取得した。
【００５４】
これまでに判明した情報から、プライマーを設計し、PCRを行い増幅産物の塩基配列を決定した。PCRはPyrobest（宝酒造）を使用して、製造者の指示に従い、次の条件で行った。98℃2分を1サイクル→98℃20秒、55℃30秒、72℃2分を40サイクル。
【００５５】
用いたプライマーは以下の通りである。
プライマーF1：TAG CCA ATA CAA CCA GCA ACA C（配列番号２０）
プライマーR1：GAA GGA ATT CTA ATT CGT GAG G（配列番号２１）
このようにして増幅したPCR産物の塩基配列を常法に従って決定したところ配列番号１に示す塩基配列と一致した。また、この塩基配列によりコードされると予想されるグルタチオン合成酵素のアミノ酸配列を配列番号２に示す。このようにして、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子ホモログを取得した。
（２）キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードすると予測される遺伝子の取得
サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベのγ−グルタミルシステイン合成酵素のアミノ酸配列（Ohtake et al (Yeast 1991 Dec;7(9):953-961)、Mutoh et al (J Biochem(Tokyo) 1995 Feb;117(2):283-288)）から、以下の相同性が高い配列を選定した。
（ix）MGFGMG（配列番号２２）
（x）GWRVEFR（配列番号２３）
各々のアミノ酸配列から縮重プライマーを設計し、degenerated PCRを行なった。（ix）の領域に相当するプライマーとして、プライマーF1（ATG GGN TTY GGN ATG GG） （配
列番号２４）を、（x）の領域に相当するプライマーとしてプライマーR1（RAA YTC NAC NCK CCA）（配列番号２５）を設計した。DNA polymeraseとしてKOD dash(TOYOBO社)を用いて製造者の指示に従ってPCRを行なった。PCRの条件は94℃3分を1サイクル→94℃1分, 52℃1分, 74℃1分を30サイクルで行なった。
【００５６】
PCR産物をアガロースゲルで電気泳動し、予想される大きさの約700bpに相当する領域を切り出し、MagExtractor（TOYOBO社、CodeNPK-601）を用いてゲルからDNAを回収した。さらに、この回収DNAを鋳型としてnested PCRを行なった。PCRは前述と同様にして行った。増幅産物をアガロースゲルにて電気泳動後エチジウムブロマイド溶液で染色し、約700bpに相当する領域を切り出し、MagExtractorを用いてゲルからDNAを回収した。回収したDNAをDNA ligation kit ver.2（宝酒造(株)）を用いてpGEM-T Easy vectorに連結し、大腸菌JM109コンピテントセルを形質転換した。得られた形質転換体の一つから、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードすると予想される遺伝子断片を含んでいると推測される形質転換体を取得した。形質転換体が持つインサートの塩基配列を常法に従い、決定した。
【００５７】
上記のようにして決定した塩基配列をもとに3’RACE（3’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends (GIBCOBRL社)）を行なった。キャンディダ・ユティリスから、Rneasy Mini Kitを使用して調製したmRNAから、cDNA一次鎖を合成した後、３回のPCRを行なった。
【００５８】
用いたプライマーは以下の通りである。
1回目のPCR：TGA ACA GAG CTC GTT ACC TC（配列番号２６）
及び3’RACEキット付属のAUAPプライマー
2回目のPCR：TCA TGG GCT AAT TTT GCA CC（配列番号２７）
及び3’RACEキット付属のAUAPプライマー
3回目のPCR：TTC CTA GCA TTG ACG GCA GC（配列番号２８）
及び3’RACEキット付属のAUAPプライマー
PCRは、KOD dashを使用し、製造者の指示に従い、次の条件で行なった。94℃2分1サイクル→94℃1分、50℃30秒、74℃40秒を30サイクル。PCR産物をpGEM-T Easy vectorに連結し、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体がもつインサートの塩基配列を解析し、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子を含んでいると予測される遺伝子断片情報を取得した。
【００５９】
次に、これまでに判明している塩基配列を元に、5’RACEを行った。キットは5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Reagent Assembly version 2.0（GIBCOBRL社）を用いた。cDNA一次鎖調製のためのRT（逆転写）に用いたプライマーは以下の通りである。
AGC ACC AGA AAT GAC GTT C（配列番号２９）
製造者の指示に従って作製したcDNAライブラリーより、以下のプライマーを用いて３回のPCRを行なった。PCRは、KOD dashを使用し、製造者の指示に従い、次の条件で行なった。94℃2分1サイクル→94℃1分、50℃30秒、74℃40秒を30サイクル。
【００６０】
用いたプライマーは以下の通りである。
1回目のPCR：CCA TCT GAC GAC ATC CTG CTG（配列番号３０）及びキットに付属のAUAPプライマー
2回目のPCR：GTC AGC TAA GTG GCC TTT G（配列番号３１）及びキットに付属のAUAPプライマー
3回目のPCR：CAC TGG CGC TGC TGC CGT C（配列番号３２）及びキットに付属のAUAPプライマー
PCR産物をpGEM-T Easy vectorに連結し、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体がもつインサートの塩基配列を解析し、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子を含んでいると予測される遺伝子断片情報を取得した。他の生物の相同性より全長をクローニングしていないと考え、更に5’RACEを行なった。
cDNA一次鎖調製のためのRTに用いたプライマーは以下の通りである。
TGA TCT TCT GCT GTT CAT GTT（配列番号３３）
製造者の指示に従って作製したcDNAライブラリーより、以下のプライマーを用いて３回のPCRを行なった。
【００６１】
用いたプライマーは以下の通りである。
1回目のPCR：CTC CAC GTA CAA GTA GTT CTC（配列番号３４）及びキットに付属のAUAPプライマー
2回目のPCR：CAG CGA ATC ACC GTT GTA CGG（配列番号３５）及びキットに付属のAUAPプライマー
3回目のPCR：AGC CAG CGG TGT CGC CTC（配列番号３６）及びキットに付属のAUAPプライマー
PCR産物をpGEM-T Easy vectorに連結し、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体がもつインサートの塩基配列を解析し、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子を含んでいると予測される遺伝子断片情報を取得した。
【００６２】
以上のようにして判明した情報から、プライマーを設計し、PCRを行い、増幅産物の塩基配列を決定した。PCRはPyrobest（宝酒造）を使用して、製造者の指示に従い、次の条件で行なった。98℃2分→98℃20秒、55℃30秒、72℃2分を40サイクル。
【００６３】
用いたプライマーは以下のとおりである。
プライマーF2：GGG TTT GTT GTC TAT CGG CTT AAG（配列番号３７）
プライマーR2：AGC TGT CTT GGT CGT CAT ATC CAT（配列番号３８）
このようにして増幅したPCR産物の塩基配列を常法に従って決定した。結果を配列番号3に示す。また、この塩基配列によりコードされると予測されるγ−グルタミルシステイン合成酵素のアミノ酸配列を配列番号４に示す。このようにして、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子ホモログを取得した。
上記のようにして判明したキャンディダ・ユティリス由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子及びグルタチオン合成酵素遺伝子ホモログをサッカロマイセス・セレビシエにおいて発現させその機能を調べた。各遺伝子ホモログのサッカロマイセス・セレビシエにおける発現ベクターを作成し、グルタチオン合成酵素活性を弱化させたサッカロマイセス・セレビシエ又はγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を弱化させたサッカロマイセス・セレビシエに導入し、各々のホモログの機能を調べた。
【００６４】
グルタチオン合成酵素活性が低下したサッカロマイセス・セレビシエとして、国際公開WO 2001/090310号パンフレットに記載のサッカロマイセス・セレビシエNα3株を用いた。Nα3株は、サッカロマイセス・セレビシエのウラシル要求性酵母一倍体であるNα1株（国際公開WO 2001/090310号パンフレットに記載）を親株として、弱化型グルタチオン合成酵素遺伝子置換株として構築された菌株である。
＜２＞γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が低下したサッカロマイセス・セレビシエの取得
（１）GSH1遺伝子置換カセットの作製
まず、前記Nα1株の染色体DNAを鋳型として、サッカロマイセス・セレビシエのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子（GSH1）（配列番号３９）の中流領域から末端領域までをPCR法により増幅した。PCR反応は、KOD dash（TOYOBO社）を使用して、製造者の指示に従い、次の条件で行った。下記に示す組成の反応液を用いて、94℃1分の後、94℃30秒、60℃40秒、74℃1分を30サイクル繰り返すことにより行った。プライマーはGF1（gtg gac gac cgt act ccg aag）（配列番号４１） 及びGR1（acc caa atc gat aat gtc aac）（配列番号４２） を用いた。
【００６５】
上記のようにして増幅したGSH1遺伝子断片を、製造者の指示に従ってプラスミドpGEM-T
Easy（Promega社）に連結し、GSH1dash/pGEMを得た。次に、部位特異的変異法により、GSH1dash/pGEMに含まれるγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子（配列番号３９）の、同遺伝子がコードするγ−グルタミルシステイン合成酵素（配列番号４０）の372番目、373番目に対応するアミノ酸セリン及びリジンに対応するコドンを終止コドンに置換した。この操作は、QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE社)を用い、製造者のプロトコルに従って行った。プライマーはQCF1（ctt ttc ttg ggt ggg tag taa ttt ttc aat agg act）（配列番号４３）、QCR1（agt cct att gaa aaa tta cta ccc acc caa
gaa aag）（配列番号４４）を用いた。このようにしてプラスミドGSH1Mdash/pGEMを作製した。
【００６６】
上記のようにして変異が導入されたγ−グルタミルシステイン合成酵素（弱化型グルタチオン合成酵素）は、微弱な酵素活性を保持している。次に、国際公開WO2001/090310号パンフレットに記載のプラスミドpYES2dash（プラスミドpYES2（Invitrogen社）から2μoriを除去したプラスミド）、及び前記GSH1Mdash/pGEMを、いずれも制限酵素SacI及びSphIで切断し、pYES2dashからはURA3遺伝子を含む断片を、GSH1Mdash/pGEMからはγ−グルタミルシステイン合成酵素の部分遺伝子配列を含む領域を切り出し、これらを連結した。このようにしてプラスミドGSH1Mdash/pYES2dashを作製した。GSH1Mdash/pYES2dashを制限酵素BbeIで切断し、遺伝子置換カセットを得た(図１)。
（２）GSH1遺伝子置換カセットのサッカロマイセス・セレビシエへの導入
上記のようにして作製した遺伝子置換カセットを用いて、Nα1株のγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の遺伝子置換を行った。Nα1株を前培養した後に、培養物を50mlのYPD培地に植え継ぎ、対数増殖期まで培養した。培養菌体を1Mソルビトールに懸濁し、遺伝子置換カセットを混和して、エレクトロポレーションにより形質転換を行った。形質転換株を1mMのグルタチオンを含むSDプレートで培養し、生育する株を選択した。遺伝子置換カセットが染色体上の目的の位置に組み込まれたことをPCRによって確認し、得られた株をNα4中間体とした。次に、変異型γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子のみを染色体上に残す為、以下の操作を行った。Nα4中間体を1mMのグルタチオンを添加したYPD培地で培養し、培養産物を1mMのグルタチオンを含むSDFOAプレートに蒔いた。プレート上に生育してきた株のグルタチオン合成酵素遺伝子の配列を決定し、目的の部位の配列が正しく置換されていることを確認し、Nα4株を得た（図２）。
【００６７】
次に、上記のように取得したNα4株のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性が弱化しているか否か調べた。大竹らは、サッカロマイセス・セレビシエYNN27株より変異処理により取得したYH1株のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を測定しており(Agric.Biol.Chem54(12) 3145-3150,1990)、その方法に準じて活性を測定した。その結果、Nα4株のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性は検出限界以下であった。次に、Nα4株をSD培地
で培養し、対数増殖期の細胞内のγ−グルタミルシステイン及びグルタチオン含有量を測定したが、γ−グルタミルシステインは検出されず、グルタチオンは0.01%であった。また、Nα4株は2mMのメチルグリオキサールに感受性を示したことから、YH1株と同様にγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子が置換されていることが確認された。
＜３＞キャンディダ・ユティリス由来のグルタチオン合成酵素ホモログの発現ベクターの構築
キャンディダ・ユティリスの染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子ホモログ（CGSH2）のORF領域を増幅した。 PCRは、Pyrobest (宝酒造)を用いて製造者の指示に従って次の条件で行った。98℃2分→98℃20秒、55℃30秒、72℃2分を40サイクル。N末端側には制限酵素KpnI切断部位を付加したプライマーCGSH2F1（AGA TTG GGT ACC ATG AGT ATT CCT CAG TTA TCT G）（配列番号４５）を、C末端側にはXbaI切断部位CGSH2R1（ATC CGG TCT AGA CTA TTG GAG AGC AAC ACC ATC）（配列番号４６） をそれぞれ用いて以下の条件でPCRを行い、増幅産物をQIAquick PCR purification Kitを用いて精製した。精製したPCR産物及びpAUR123ベクター（宝酒造）を、各々制限酵素KpnI、XbaIで切断した後連結し、大腸菌JM109コンピテントセルを形質転換した。このようにしてCGSH2/pAUR123ベクターを作製した。次に、CGSH2/pAUR123ベクター及びpYES2ベクターを制限酵素BamHIで切断した。CGSH2/pAUR123ベクターからはCGSH2のORFとpAUR123ベクター由来のプロモーターを含む領域を回収し、切断末端を脱リン酸化したpYES2ベクターと連結し、大腸菌JM109コンピテントセルを形質転換した。このようにして、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素ホモログの発現ベクターCGSH2/pYES2ベクタベクターを作製した（図３）。
＜４＞キャンディダ・ユティリス由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素ホモログの発現ベクターの構築
キャンディダ・ユティリスの染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子ホモログ（CGSH1）のORF領域を増幅した。 PCRは、Pyrobest (宝酒造)を用いて製造者の指示に従って次の条件で行った。98℃2分→98℃20秒、55℃30秒、72℃2分を40サイクル。N末端側には制限酵素KpnI切断部位を付加したプライマーCGSH1F1（GAG TAC GGT ACC ATG GGG CTG CTA TCA TTA GGG AC）（配列番号４７）を、C末端側にはXbaI切断部位CGSH1R1（CCC TTA TCT AGA TTA AGC CTT TGG GTT GTT TAT C）（配列番号４８） をそれぞれ用いて以下の条件でPCRを行い、増幅産物をQIAquick PCR purification Kitを用いて精製した。精製したPCR産物及びpAUR123ベクター（宝酒造）を、各々制限酵素KpnI、XbaIで切断した後連結し、大腸菌JM109コンピテントセルを形質転換した。このようにしてCGSH1/pAUR123ベクターを作製した。次に、CGSH1/pAUR123ベクター及びpYES2ベクターを制限酵素BamHIで切断した。CGSH1/pAUR123ベクターからはCGSH1のORFとpAUR123ベクター由来のプロモーターを含む領域を回収し、切断末端を脱リン酸化したpYES2ベクターと連結し、大腸菌JM109コンピテントセルを形質転換した。このようにして、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素ホモログの発現ベクターCGSH1/pYES2ベクターを作製した（図４）
＜３＞相補実験
次に、CGSH1/pYES2ベクター又はCGSH2/pYES2ベクターをNα3株及びNα4株に導入した形質転換体を取得した。Nα3株又はNα4株を前培養した後に、培養物を50mlの液体培地（1mMのグルタチオンを含有するYPD培地）に植え継ぎ、対数増殖期まで培養した。培養菌体を1Mソルビトールに懸濁し、CGSH1/pYES2ベクターを混和して、エレクトロポレーションにより形質転換した。形質転換株を1mMのグルタチオンを含むSDプレートで培養し、生育する株を選択した。Nα3株及びNα4株はウラシル要求性を示し、CGSH1/pYES2ベクター又はCGSH2/pYES2ベクターを含有する場合のみSD培地で生育することができる。得られた形質転換体がCGSH1/pYES2ベクター又はCGSH2/pYES2ベクターを含有することを常法により確認し
た。
【００６８】
このようにして、形質転換体Nα3/CGSH1株、Nα4/CGSH1株、Nα3/CGSH2株、及びNα4/CGSH2株を取得した。Nα3/CGSH1は2mMのメチルグリオキサールに感受性を示したが、Nα4/CGSH1株は2mMのメチルグリオキサールに感受性を示さなかった。Nα3/CGSH2株は2mMのメチルグリオキサールに感受性を示さなかったが、Nα4/CGSH2株は2mMのメチルグリオキサールに感受性を示した。また、SD培地で培養したとき、その対数増殖期にNα3/CGSH1株及びNα4/CGSH2株はグルタチオンをほとんど含有しなかったが、Nα4/CGSH1株及びNα3/CGSH２株はグルタチオンを凡そ0.4%含有していた。Nα3株はサッカロマイセス・セレビシエのグルタチオン合成酵素に変異が生じグルタチオン合成力が低下しているが、Nα4株はサッカロマイセス・セレビシエのγ−グルタミルシステイン合成酵素に変異が生じグルタチオン合成力が低下していることから、CGSH1はサッカロマイセス・セレビシエのγ−グルタミルシステイン合成酵素を相補し、CGSH2はサッカロマイセス・セレビシエのグルタチオン合成酵素を相補することが示された。
【００６９】
以下に、グルタチオン合成酵素をコードするDNAの一部を用いたグルタチオン合成酵素活性の低下したキャンディダ・ユティリスの作製の例を、参考例として示す。配列番号１の塩基番号58〜981の塩基配列を含むDNA、または配列番号１の塩基番号58〜981の塩基配列もしくは同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを用いたグルタチオン合成酵素活性の低下したキャンディダ・ユティリスの作製も、同様の手順で行うことができる。
［参考例１］キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子破壊カセットの作製
キャンディダ・ユティリスATCC15239より回収した染色体DNAを鋳型として、配列番号４９及び５０のプライマーを用いてPCRを行った。PCRは、Pyrobest（宝酒造(株)）を用いて、製造者の指示にしたがい、次の条件で行った。98℃2分 → 98℃20秒、55℃30秒、72℃2分を40サイクル。
【００７０】
増幅産物をQIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社、Cat.No 28106)を用い精製し、精製産物の末端にアデニンを付加した後、pGEM-T Easyベクターに連結した。アデニンの付加は、AmpliTaq（ABI社、Code N808-0161）を用い、dNTPの代わりに2.5mMのdATPを使用し、72℃で10分間反応させることにより行った。続いて、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社、Catalog#200518）を用いて、部位特異的組換えによりクローニング断片の２箇所の塩基配列を置換し、HindIII及びKpnI切断部位を導入し、CGSH2Ctermi/pGEMT-Easyベクターを得た。部位特異的組換えに使用したプライマーは以下のとおりである。
〔１度目の変異導入（HindIII切断部位の導入）〕
GAA GCC TCA GCA TGA AGC TTG TGG TAA TAA CAT TTA C（配列番号５１）
G TAA ATG TTA TTA CCA CAA GCT TCA TGC TGA GGC TTC（配列番号５２）
〔２度目の変異導入（KpnI切断部位の導入）〕
CGA CCA ATC GAC TGG TAC CGT TAT CAA AAA CTC TG（配列番号５３）
CA GAG TTT TTG ATA ACG GTA CCA GTC GAT TGG TCG（配列番号５４）
一方、キャンディダ・ユティリスATCC15239より回収した染色体DNAを鋳型として、以下のプライマーを用いてPCRを行い、URA3遺伝子を含む断片を増幅した。PCRは、KOD dash（TOYOBO社 コードLDP-101）を使用して、製造者の指示に従い、次の条件で行った。94℃ 2分 → 94℃ 1分、54℃ 30秒、74℃40秒を30サイクル。
CCC AAG CTT CTC TAC TTG CTT CTG CTC AAC（配列番号５５）
GCA GGT ACC AAC TTC CGA AAA CAG TAA TGA AC（配列番号５６）
増幅産物をpGEMT-Easyベクターに導入し、CURA3/pGEMT-Easyベクターを得た。
【００７１】
CGSH2Ctermi/pGEMT-Easyベクター及びCURA3/pGEMT-Easyベクターを、各々HindIII及びKpnIにて切断した。CGSH2Ctermi/pGEMT-EasyベクターからはCGSH2及びpGEMT-Easy本体を含む断片を回収し、CURA3/pGEMT-EasyベクターからはCURA3を含む断片を回収した。これらの回収断片を連結し、大腸菌JM109を形質転換した。このようにして、CURA3ΔCGSH2/pGEMT-Easyベクターを作製した。
【００７２】
CURA3ΔCGSH2/pGEMT-Easyベクターを制限酵素NotIで切断したものを鋳型とし、配列番号１５及び１６に示すプライマーを用いてPCRにより増幅した。こうして、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子破壊カセットを作製した（図１、２）。
［参考例２］ウラシル要求性キャンディダ・ユティリス ATCC15239ura-株の取得
常法（Luisらの手法、FEMS Microbiology Letters 165(1998)335-340）に従い、ATCC15239由来のウラシル要求性株ATCC15239ura-株を取得した。ATCC15239ura-株は、後述するようにURA3遺伝子によって相補されたことから、ura3変異株であると推定される。
［参考例３］キャンディダ・ユティリス由来のγ−グルタミルシステイン産生酵母（ATCC15239Δgsh2株）の取得
まず、ATCC15239ura-株をYPD試験管培地で一晩30℃で培養した。培養産物をYPDフラスコ培地（坂口フラスコ500ml容、50ml張り込み）に植菌し、30℃で振とう培養した。対数増殖期に集菌し、４℃に冷やした1Mソルビトール溶液で、菌体を３回洗浄した。洗浄菌体を冷やした1Mソルビトール溶液に懸濁した。懸濁液に、50μl（2μg）の上記グルタチオン合成酵素遺伝子破壊カセットを加え、0.2cmキュベット中でよく混合し、エレクトロポレーション（Gene Pulser system（BioRad社）を使用、インピーダンス200Ω、キャパシタンス125μF、設定電圧1.5kVに設定）を行なった。キュベットに、1mlの冷やした1Mソルビトールを注ぎ、キュベットを10分間氷上で冷却した。菌体懸濁液をSDプレートにスプレッドし、30℃で静地培養した。
【００７３】
プレートに生育してきた株を、SDプレート及び10mMのメチルグリオキサールを含むSDプレートにレプリカし、30℃で静地培養した。メチルグリオキサールに感受性を示す株を７株選択した。このようにして、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子破壊株を取得した。得られた７株を各々YPD試験管培地で30℃で一晩振とう培養した。培養液をSD培地（坂口フラスコ500ml容、50ml張り込み）に2%植菌し、30℃で振とう培養した。対数増殖期に集菌し、滅菌水で２回菌体を洗浄した。洗浄菌体を70℃10分の熱水抽出を行い、酵母菌体内のγ−グルタミルシステインを抽出し、HPLCにより分離定量した。一方、酵母の乾燥菌体量は、一定培地中に含まれる洗浄酵母菌体を濾紙上に取り、105℃で4時間加熱後に残った菌体重量として測定した。上記7株のうち、乾燥酵母菌体あたり1%以上のγ−グルタミルシステインを含有するキャンディダ・ユティリス菌株として、ATCC15239Δgsh2株を選択した。
【００７４】
ATCC15239Δgsh2株をSD培地に植菌し、30℃で２日振とう培養した。培養物をSD培地に2%植菌し、30℃で振とう培養した。７時間後、及び９時間後のγ−グルタミルシステイン含有量を測定したところ、それぞれ1.08%、及び1.12%であった。グルタチオンは検出限界以下であった。
［参考例４］ATCC15239Δgsh2株のグルタチオン合成酵素活性の測定
ATCC15239Δgsh2株をYPD培地に植菌し、30℃で振とう培養した。培養物をSD培地（2L容フィン付三角フラスコに400ml張り込み）に2%植菌し、30℃で振とう培養した。対数増殖期に菌体を集菌し、4℃に冷やした1Mソルビトールで菌体を２回洗浄した。洗浄菌体を0.1
mMのPMSF（フェニルメタンスルフォニルフルオリド）を含む10mM Tris-HClバッファー（pH7.5）0.5mlに懸濁した。懸濁液にガラスビーズ（GLASS BEADS 425-600microns Acid-washed (SIGMA社、コードG-8772)）を加え、BEAD-BEATER（和研薬株式会社）を用いて細胞を破砕した。細胞の破砕は顕微鏡で確認した。その後、1mlの前記バッファーを加え、遠心操作により、ガラスビーズ及び細胞デブリを取り除いた。このようにして、細胞粗抽出液を得た。細胞粗抽出液をULTRAFREE-15 Biomax10（MILLIPORE社、Cat.No UFV2BGC40）を用いて精製し、酵素液を得た。酵素液の蛋白量は、Bradford法により定量した。発色はプロテインアッセイCBB溶液（ナカライ社、Code29449-15）を用いて行い、595nmの吸収を測定した。標準曲線はAlbumin standard（PIERCE社、No.23210）を用いて作成した。
【００７５】
このようにして得た、酵素液中のグルタチオン合成酵素活性を、Gushimaらの方法（Gushima, T. et al., J. Appl. Biochem., 5, 210 (1983)）にしたがって、以下のようにして測定した。
〔反応液〕
100mM γ−グルタミルシステイン   100μl
100mM MgCl２                     100μl
50mM ATP                        100μl
100mM Gly                        100μl
1M Tris-HCl(pH8.0)                85.5μl
160mM PEP                       12.5μl
1mg/ml PK                        2μl
酵素液（1〜10mg蛋白）
精製水
合計                               2ml
PEP：ホスホエノールピルビン酸（SIGMA社、Code P-7127）
PK ：ピルビン酸キナーゼ（SIGMA社、Code P-1903）
上記組成の反応液を、酵素量1〜10mg蛋白の範囲で30℃で0〜2時間反応させた。メタクリル酸を1/5当量加えて反応を停止させた後、反応液のpHを8.0に調整し、生成したGSH量を定量した。この時の酵素活性は検出限界以下であり、検出されなかった。次に、ATCC15239Δgsh2株の親株であるATCC15239株のグルタチオン合成酵素活性を同様にして測定した。その結果、ATCC15239株のグルタチオン合成酵素活性は0.383μmol-GSH/mg蛋白/時間であった。このように、本願発明に係る遺伝子を用いることにより、グルタチオン合成酵素活性が0.003μｍｏｌＧＳＨ／ｍｇタンパク質／時間以下になるように改変されたキャンディダ・ユティリスを得ることができた。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】サッカロマイセス・セレビシエのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子置換カセットの構築を示す図。
【図２】サッカロマイセス・セレビシエNα４株の構築を示す図。
【図３】キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子発現ベクターの構築を示す図。
【図４】キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子発現ベクターの構築を示す図。
【図５】キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子破壊カセットの構築（前半）を示す図。
【図６】キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子破壊カセットの構築（後半）を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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