(57)【要約】【課題】  少量を摂取することで、乳酸菌による効果を得ることができる乳酸菌生産物質を提供することである。【解決手段】  ラクトバチルス（Lactobacillus）菌属に属する乳酸菌、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）菌属に属する乳酸菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）菌属に属する３属の乳酸菌を用いるとともに、それら３属の乳酸菌から選択した１種または２種以上の乳酸菌を用いて複数のグループを形成し、それらグループ毎に継代培養して共棲状態を維持し、この継代培養されたグループ単位の乳酸菌同士をさらに共棲培養して得た乳酸菌培養液をろ過して得る。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス（Lactobacillus）菌属に属する乳酸菌、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）菌属に属する乳酸菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）菌属に属する乳酸菌を用いるとともに、それら３属の乳酸菌から選択した１種または２種以上の乳酸菌を用いて複数のグループを形成し、それらグループ毎に継代培養して共棲状態を維持し、この継代培養されたグループ単位の乳酸菌同士をさらに共棲培養して得た乳酸菌培養液をろ過して得たろ液からなる乳酸菌生産物質。
【請求項２】
ラクトバチルス（Lactobacillus）菌属に属する乳酸菌として、Ｌ．アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、Ｌ．ブレビス（Lactobacillus brevis）、Ｌ．ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）、Ｌ．パラカゼイ（Lactobacillus paracasei subsp． paracasei）、Ｌ．ガセリー（Lactobacillus gasseri）、Ｌ．ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp．bulgaricus）、Ｌ．ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、Ｌ．カゼイ（Lactobacillus casei subsp． casei）、Ｌ．ラモナウサス（Lactobacillus rhamnosus）、Ｌ．デルブリッキィ（Lactobacillus delbrueckii subsp． delbrueckii）の１種または２種以上を用いた請求項１に記載の乳酸菌生産物質。
【請求項３】
ストレプトコッカス（Streptococcus）菌属に属する乳酸菌として、Ｓ．サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、Ｅ．フェシウム（Enterococcus faecium）、Ｌ．ラクチス（Lactococcus lactis）の１種または２種以上を用いた請求項１に記載の乳酸菌生産物質。
【請求項４】
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）菌属に属する乳酸菌として、Ｂ．ロンガム（Bifidobacterium longum）、Ｂ．ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、Ｂ．アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）の１種または２種以上を用いた請求項１に記載の乳酸菌生産物質。
【請求項５】
Ｌ．アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、Ｌ．ブレビス（Lactobacillus brevis）、Ｌ．ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）、Ｌ．パラカゼイ（Lactobacillus paracasei subsp． paracasei）、Ｌ．ガセリー（Lactobacillus gasseri）、Ｌ．ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp．bulgaricus）、Ｌ．ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、Ｌ．カゼイ（Lactobacillus casei subsp． casei）、Ｌ．ラモナウサス（Lactobacillus rhamnosus）、Ｌ．デルブリッキィ（Lactobacillus delbrueckii subsp． delbrueckii）、Ｓ．サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、Ｅ．フェシウム（Enterococcus faecium）、Ｌ．ラクチス（Lactococcus lactis）、Ｂ．ロンガム（Bifidobacterium longum）、Ｂ．ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、Ｂ．アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）の１６種の乳酸菌を用いた請求項１に記載の乳酸菌生産物質。
【請求項６】
Ｅ．フェシウムおよびＬ．ヘルベティカスを第１グループ、Ｅ．フェシウムおよびＬ．アシドフィラスを第２グループ、Ｅ．フェシウムおよびＬ．ガセリーを第３グループ、Ｅ．フェシウム、Ｌ．アシドフィラスおよびＬ．ブレビスを第４グループ、Ｅ．フェシウム、Ｌ．アシドフィラスおよびＬ．ブレビスを第５グループ、Ｅ．フェシウム、Ｌ．アシドフィラス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．パラカゼイを第６グループ、Ｂ．アドレセンティス単体を第７グループ、Ｌ．デルブリッキィおよびＬ．ガセリーを第８グループ、Ｌ．デルブリッキィ単体を第９グループ、Ｅ．フェシウム、Ｌ．ジェンセニイ、Ｌ．パラカゼイおよびＬ．ブレビスを第１０グループ、Ｌ．アシドフィラス単体を第１１グループ、Ｅ．フェシウムおよびＬ．ガセリーを第１２グループ、Ｌ．パラカゼイ単体を第１３グループ、Ｌ．ガセリー、Ｅ．フェシウムおよびＢ．ビフィダムを第１４グループ、Ｂ．ロンガム、Ｓ．サーモフィラスおよびＥ．フェシウムを第１５グループ、Ｌ．ガセリーを単体で第１６グループ、Ｌ．ブルガリクスおよびＳ．サーモフィラスを第１７グループ、Ｌ．ガセリー、Ｌ．ラクチス、Ｌ．ガセリーおよびＥ．フェシウムを第１８グループ、Ｌ．ガセリー、Ｓ．サーモフィラスおよびＬ．ブルガリクスを第１９グループ、Ｌ．ラクチスを単体で第２０グループ、Ｌ．ガセリーおよびＥ．フェシウムを第２１グループ、Ｌ．ラモナウサスを単体で第２２グループ、Ｌ．カゼイを単体で第２３グループ、Ｂ．ロンガムを単体で第２４グループとし、それぞれのグループ毎に継代培養して共棲状態を維持するとともに、それら培養液のうち、第１，２グループ同士、第３，４グループ同士、第５，６グループ同士、第７，８グループ同士、第９，１０グループ同士、第１１，１２グループ同士、第１３，１４グループ同士、第１５，１６グループ同士、第１７，１８グループ同士、第１９，２０グループ同士、第２１，２２グループ同士、第２３，２４グループ同士で１次培養し、さらに、第１，２グループと第３，４グループ、第５，６グループと第７，８グループ、第９，１０グループと第１１，１２グループ、第１３，１４グループと第１５，１６グループ、第１７，１８グループと第１９，２０グループ、第２１，２２グループと第２３，２４グループ同士とで２次培養し、さらに、これら各２次培養液を混合して３次培養した請求項５に記載の乳酸菌生産物質。
【請求項７】
３次培養した乳酸菌培養液を加熱滅菌してからろ過して得たろ液からなる請求項６に記載の乳酸菌生産物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、乳酸菌を培養して得られる乳酸菌生産物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、腸内で腸内微生物の生育に大きな影響を与え、腸内環境を良好に保つことが知られている。この乳酸菌は人の腸内に、腸内良性菌いわゆる善玉菌として生息し、上記腸内環境を維持している。従って、この乳酸菌数が低下したり、活性が低下したりすることによって上記腸内環境が崩れる原因になる。
上記腸内環境を整えることによって、免疫力が向上し、様々な病気に罹りにくくなったり、病状が改善されたりすることが期待されている。
そこで、近年乳酸菌の生菌を腸内に補給するために、その生菌を含むヨーグルトや飲料などが販売されている。そして、これらのヨーグルトや飲料を直接体内に取り入れて、腸内の乳酸菌量を増加させるようにしている。
なお、本願出願人は、先行技術調査を行うことなく、公知の技術を基に本願発明を開発したので、本件に係る先行技術文献情報はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、上記生菌を含むヨーグルトや飲料などの食料品を摂取したとしても、その生菌が腸に到達するまでに、胃酸で分解されたり、消化されたりして、生菌のほとんどが死滅してしまう。つまり、ヨーグルトや飲料などから生菌を摂取したとしても、生きたまま腸に到達する乳酸菌はほんのわずかな量になってしまう。
従って、乳酸菌による期待通りの整腸作用が得られないことが多い。
【０００４】
上記のように生菌の死滅を考慮して、生菌を腸内に届けるためには、上記乳酸菌を含む食品を大量に摂取しなければならない。しかしながら、ヨーグルトなどの飲食単位（ヨーグルト一瓶）に含まれている乳酸菌の量に限りが有るので、大量の乳酸菌を一度に摂取することは、かなり難しくなる。
一方で、近年、その因果関係は、明らかになっていない部分が多いが、摂取した乳酸菌が死滅したとしても、様々な、体に良い作用が表れることが分かってきている。この効果は、乳酸菌の生産物質によるものと考えられる。
この発明の目的は、少量を摂取することで、乳酸菌による効果を得ることができる乳酸菌生産物質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の発明は、ラクトバチルス（Lactobacillus）菌属に属する乳酸菌、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）菌属に属する乳酸菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）菌属に属する３属の乳酸菌を用いるとともに、それら３属の乳酸菌から選択した１種または２種以上の乳酸菌を用いて複数のグループを形成し、それらグループ毎に継代培養して共棲状態を維持し、この継代培養されたグループ単位の乳酸菌同士をさらに共棲培養して得た乳酸菌培養液をろ過して得たろ液からなる点に特徴を有する。
上記３属の乳酸菌を用いるとは、各菌属に属する乳酸菌を少なくとも１種ずつは用いるということである。
【０００６】
第２の発明は、上記ラクトバチルス（Lactobacillus）菌属に属する乳酸菌として、Ｌ．アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、Ｌ．ブレビス（Lactobacillus brevis）、Ｌ．ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）、Ｌ．パラカゼイ（Lactobacillus paracasei subsp． paracasei）、Ｌ．ガセリー（Lactobacillus gasseri）、Ｌ．ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp．bulgaricus）、Ｌ．ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、Ｌ．カゼイ（Lactobacillus casei subsp． casei）、Ｌ．ラモナウサス（Lactobacillus rhamnosus）、Ｌ．デルブリッキィ（Lactobacillus delbrueckii subsp． delbrueckii）の１種または２種以上を用いた点に特徴を有する。
【０００７】
第３の発明は、上記ストレプトコッカス（Streptococcus）菌属に属する乳酸菌として、Ｓ．サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、Ｅ．フェシウム（Enterococcus faecium）、Ｌ．ラクチス（Lactococcus lactis）の１種または２種以上を用いた点に特徴を有する。
【０００８】
第４の発明は、上記ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）菌属に属する乳酸菌として、Ｂ．ロンガム（Bifidobacterium longum）、Ｂ．ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、Ｂ．アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）の１種または２種以上を用いた点に特徴を有する。
【０００９】
第５の発明は、第１の発明を前提とし、Ｌ．アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、Ｌ．ブレビス（Lactobacillus brevis）、Ｌ．ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）、Ｌ．パラカゼイ（Lactobacillus paracasei subsp． paracasei）、Ｌ．ガセリー（Lactobacillus gasseri）、Ｌ．ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp．bulgaricus）、Ｌ．ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、Ｌ．カゼイ（Lactobacillus casei subsp． casei）、Ｌ．ラモナウサス（Lactobacillus rhamnosus）、Ｌ．デルブリッキィ（Lactobacillus delbrueckii subsp． delbrueckii）、Ｓ．サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、Ｅ．フェシウム（Enterococcus faecium）、Ｌ．ラクチス（Lactococcus lactis）、Ｂ．ロンガム（Bifidobacterium longum）、Ｂ．ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、Ｂ．アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）の１６種の乳酸菌を用いた点に特徴を有する。
【００１０】
第６の発明は、第５の発明を前提とし、Ｅ．フェシウムおよびＬ．ヘルベティカスを第１グループ、Ｅ．フェシウムおよびＬ．アシドフィラスを第２グループ、Ｅ．フェシウムおよびＬ．ガセリーを第３グループ、Ｅ．フェシウム、Ｌ．アシドフィラスおよびＬ．ブレビスを第４グループ、Ｅ．フェシウム、Ｌ．アシドフィラスおよびＬ．ブレビスを第５グループ、Ｅ．フェシウム、Ｌ．アシドフィラス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．パラカゼイを第６グループ、Ｂ．アドレセンティス単体を第７グループ、Ｌ．デルブリッキィおよびＬ．ガセリーを第８グループ、Ｌ．デルブリッキィ単体を第９グループ、Ｅ．フェシウム、Ｌ．ジェンセニイ、Ｌ．パラカゼイおよびＬ．ブレビスを第１０グループ、Ｌ．アシドフィラス単体を第１１グループ、Ｅ．フェシウムおよびＬ．ガセリーを第１２グループ、Ｌ．パラカゼイ単体を第１３グループ、Ｌ．ガセリー、Ｅ．フェシウムおよびＢ．ビフィダムを第１４グループ、Ｂ．ロンガム、Ｓ．サーモフィラスおよびＥ．フェシウムを第１５グループ、Ｌ．ガセリーを単体で第１６グループ、Ｌ．ブルガリクスおよびＳ．サーモフィラスを第１７グループ、Ｌ．ガセリー、Ｌ．ラクチス、Ｌ．ガセリーおよびＥ．フェシウムを第１８グループ、Ｌ．ガセリー、Ｓ．サーモフィラスおよびＬ．ブルガリクスを第１９グループ、Ｌ．ラクチスを単体で第２０グループ、Ｌ．ガセリーおよびＥ．フェシウムを第２１グループ、Ｌ．ラモナウサスを単体で第２２グループ、Ｌ．カゼイを単体で第２３グループ、Ｂ．ロンガムを単体で第２４グループとし、それぞれのグループ毎に継代培養して共棲状態を維持するとともに、それら培養液のうち、第１，２グループ同士、第３，４グループ同士、第５，６グループ同士、第７，８グループ同士、第９，１０グループ同士、第１１，１２グループ同士、第１３，１４グループ同士、第１５，１６グループ同士、第１７，１８グループ同士、第１９，２０グループ同士、第２１，２２グループ同士、第２３，２４グループ同士で１次培養し、さらに、第１，２グループと第３，４グループ、第５，６グループと第７，８グループ、第９，１０グループと第１１，１２グループ、第１３，１４グループと第１５，１６グループ、第１７，１８グループと第１９，２０グループ、第２１，２２グループと第２３，２４グループ同士とで２次培養し、さらに、これら各２次培養液を混合して３次培養した点に特徴を有する。
【００１１】
第７の発明は、上記３次培養した乳酸菌培養液を加熱滅菌してからろ過して得たろ液からなる点に特徴を有する。
【発明の効果】
【００１２】
第１〜第７の発明によれば、複数種の乳酸菌を培養して乳酸菌生産物質を得ることができ、この乳酸菌生産物質には多くの種類の代謝産物を大量に含有させることができる。
特に、３つの菌属に属する乳酸菌を組み合わせて共棲培養するので単一属、単一種の乳酸菌の代謝産物よりも多くの種類の代謝産物が生成される。
また、共棲状態を維持する乳酸菌のグループを生成してそのグループ同士を共棲培養しているので、多数の菌種の共棲培養を、短時間で安定的に行うことができる。その結果、多くの種類の有用な代謝産物を含有した乳酸菌生産物質を短時間で安定的に生成することができる。
【００１３】
この乳酸菌生産物質を摂取した場合には、上記代謝産物によって、腸内良性菌が活性化し、腸内環境を良好にすることができる。つまり、乳酸菌の生菌を直接摂取することなく、乳酸菌の効果を得ることができる。
また、上記乳酸菌生産物質には大量の代謝産物が含まれているので、これを摂取するときにも、生菌を摂取するときのように、たくさんの量を摂取する必要がない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本願出願人は、乳酸菌の代謝産物に着目し、この乳酸菌の代謝産物が腸内環境の調整に役立つものと考えた。すなわち、上記乳酸菌の代謝産物が腸内に供給されることによって、これら代謝産物に含まれる成分が、腸内良性菌の栄養源となって、それら良性菌が活性化されるものとの仮説を立て、いろいろな実験を繰り返した。
【００１５】
そこで、まず、多数の乳酸菌の中から、複数種の乳酸菌を共存させたグループを形成し、これらのグループ同士あるいは、単菌を組み合わせて共棲培養し、乳酸菌生産物質を得た。なお、後で説明する１次共棲培養を行う際の単位をこの発明のグループというので、単菌もその単菌からなるグループと考えている。
【実施例】
【００１６】
以下に、この発明の乳酸菌生産物質を生成する方法を説明する。
この実施形態における乳酸菌生産物質を生成するために、ラクトバチルス（Lactobacillus）菌属に属する乳酸菌、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）菌属に属する乳酸菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）菌属に属する乳酸菌のいずれかに属する複数の乳酸菌を用いた。
【００１７】
そして、上記ラクトバチルス（Lactobacillus）菌属に属する乳酸菌として、Ｌ．アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、Ｌ．ブレビス（Lactobacillus brevis）、Ｌ．ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）、Ｌ．パラカゼイ（Lactobacillus paracasei subsp． paracasei）、Ｌ．ガセリー（Lactobacillus gasseri）、Ｌ．ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp．bulgaricus）、Ｌ．ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、Ｌ．カゼイ（Lactobacillus casei subsp． casei）、Ｌ．ラモナウサス（Lactobacillus rhamnosus）、Ｌ．デルブリッキィ（Lactobacillus delbrueckii subsp． delbrueckii）、Ｌ．ラクチス（Lactococcus lactis）を１種または２種以上用いた。
【００１８】
上記ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）菌属に属する乳酸菌として、Ｂ．ロンガム（Bifidobacterium longum）、Ｂ．ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、Ｂ．アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）を１種または２種以上用いた。
【００１９】
また、ストレプトコッカス（Streptococcus）菌属に属する乳酸菌として、Ｓ．サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、Ｅ．フェシウム（Enterococcus faecium）、Ｌ．ラクチス（Lactococcus lactis）の１種または２種以上を用いた。
【００２０】
そして、以上の乳酸菌を次のようにして培養した。
まず、複数の乳酸菌を、２４のグループに分け、それらをグループ毎に継代培養したが、そのグループ分けは次の通りである。すなわち、図１に示すように、第１グループはＥ．フェシウムおよびＬ．ヘルベティカスで構成し、第２グループは、Ｅ．フェシウムおよびＬ．アシドフィラスで構成している。第３グループはＥ．フェシウムおよびＬ．ガセリーで構成し、第４グループは、Ｅ．フェシウム、Ｌ．アシドフィラスおよびＬ．ブレビスで構成している。
【００２１】
第５グループは、Ｅ．フェシウム、Ｌ．アシドフィラスおよびＬ．ブレビスで構成し、第６グループは、Ｅ．フェシウム、Ｌ．アシドフィラス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．パラカゼイで構成し、第７グループは、Ｂ．アドレセンティス単体で構成している。
【００２２】
第８グループは、Ｌ．デルブリッキィおよびＬ．ガセリーで構成し、第９グループはＬ．デルブリッキィ単体で構成し、第１０グループは、Ｅ．フェシウム、Ｌ．ジェンセニイ、Ｌ．パラカゼイおよびＬ．ブレビスで構成し、第１１グループは、Ｌ．アシドフィラス単体で構成している。
【００２３】
第１２グループは、Ｅ．フェシウムおよびＬ．ガセリーで構成し、第１３グループは、Ｌ．パラカゼイ単体で構成し、第１４グループは、Ｌ．ガセリー、Ｅ．フェシウムおよびＢ．ビフィダムで構成し、第１５グループは、Ｂ．ロンガム、Ｓ．サーモフィラスおよびＥ．フェシウムで構成している。第１６グループは、Ｌ．ガセリー単体で構成し、第１７グループは、Ｌ．ブルガリクスおよびＳ．サーモフィラスで構成している。
【００２４】
第１８グループは、Ｌ．ガセリー、Ｌ．ラクチス、Ｌ．ガセリーおよびＥ．フェシウムで構成し、第１９グループは、Ｌ．ガセリー、Ｓ．サーモフィラスおよびＬ．ブルガリクスで構成し、第２０グループは、Ｌ．ラクチス単体で構成し、第２１グループは、Ｌ．ガセリーおよびＥ．フェシウムで構成し、第２２グループは、Ｌ．ラモナウサス単体で構成し、第２３グループは、Ｌ．カゼイ単体で構成し、第２４グループは、Ｂ．ロンガム単体で構成している。
【００２５】
それらのグループ毎に継代培養するとともに、それら培養液のうち、第１，２グループ同士、第３，４グループ同士、第５，６グループ同士、第７，８グループ同士、第９，１０グループ同士、第１１，１２グループ同士、第１３，１４グループ同士、第１５，１６グループ同士、第１７，１８グループ同士、第１９，２０グループ同士、第２１，２２グループ同士、第２３，２４グループ同士で１次培養した。
【００２６】
さらに、上記第１，２グループと第３，４グループ、第５，６グループと第７，８グループ、第９，１０グループと第１１，１２グループ、第１３，１４グループと第１５，１６グループ、第１７，１８グループと第１９，２０グループ、第２１，２２グループと第２３，２４グループ同士とで２次培養し、さらに、これら各２次培養液を混合して３次培養した。
そして、上記のようにして得た３次培養液を、加熱して乳酸菌を滅菌し、それをろ過して、ろ液を得た。
【００２７】
なお、上記各グループの乳酸菌は次のようにして継代培養したものである。すなわち、各グループのそれぞれの乳酸菌は、それらを継代培養した場合にも、共棲状態を維持できるであろうことを予測しながら集合させたものである。
複数の乳酸菌が共棲状態を維持するとは、複数の種類の乳酸菌が同時に存在し、それぞれが生きていける共棲状態が存在することである。特に、一方が、他方に影響を及ぼしたり、一方だけが生き残ったりする状態ではない。
【００２８】
上記各乳酸菌グループは、様々な菌の組み合わせの中から、共存可能な組み合わせを選択することによって形成した。
また、上記２４のグループを構成する乳酸菌の中には、同時に複数のグループに属する菌種も有る。これは、３次までの共棲培養の過程で共棲状態が維持されることを考慮して菌種を組み合わせたためである。また、同一種の乳酸菌でも、株が異なるものも含まれている。
【００２９】
そして、各乳酸菌グループの培養培地は、日水製薬株式会社製のＧＡＭ半流動高層培地、ＢＬ寒天培地あるいは変法ＧＡＭ寒天培地からなる３種類の培地を、乳酸菌に応じて使い分けるとともに、これらの培地において、３２℃で１２時間培養した。その後、３７℃で１２時間培養し、さらに４０℃で２４時間培養した。グループ化した乳酸菌を上記のようにして継代培養するとともに、その培養液を５℃で冷蔵保存しておいた。
なお、第２４グループのＢ．ロンガムは、森永乳業株式会社製の菌株である森永ＢＢ５３６を用いた。
【００３０】
このようにして乳酸菌のグループを継代培養するとともに、グループ毎に同定をしたが、その同定試験は社団法人日本食品分析センターに依頼した。そして、その同定試験の概要は、各グループの検体を寒天平板培地に直接接種・培養し、優勢に生育した形状の異なる集落を釣菌してグループ毎に乳酸菌を分離し、この分離菌について形態観察、生理的性状試験および菌体内DNAのGC含有量の測定を行い、次の文献を参考に同定したものである。
【００３１】
１．Sneath,P．H．A.,Mair,N．S.,Sharpe,M．Ｅ．and Holt,J．G． ： “Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology” Vol．2, （1986） Williams & Wilkins．
２．Holt,J．G., Krieg,N．R., Sneath,P．H．A., Staley,J．T． and Williams,S．T． ： “Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology”Ninth Edition（1994）Williams & Wilkins．
３．光岡知足：“腸内菌の世界”,（1984）叢文社．
４．辨野義巳：微生物6,3-14（1990）．
５．厚生省生活衛生局監修：“食品衛生検査指針-微生物編-”（1990）日本食品衛生協会．
６．Schleifer,K．H．and Kilpper-Balz,R. : Int.J.Syst.Bacteriol.,34,31-34（1984）．
【００３２】
上記同定の結果、図１に示すように、上記森永乳業株式会社製のＢ．ロンガム（ＢＢ５３６）以外に３４種類の菌株が特定されるとともに、それらが各グループ内で共棲状態を維持していることが確認された。
上記のようにして継代培養した各グループの培養液を１次共棲培養したが、図１においては、（1）〜（12）までが、１次共棲培養に当たる。そして、この１次共棲培養では、日水製薬株式会社製のＧＡＭ半流動高層培地、ＢＬ寒天培地あるいは変法ＧＡＭ寒天培地からなる３種類の培地を、１次共棲培養用培地として使用するとともに、これら１次共棲培養用培地を、乳酸菌に応じて使い分けた。
【００３３】
そして、上記３種類のいずれかの１次共棲培養用培地に対して、グループ化した乳酸菌を添加して１次培養を行ったが、例えば、上記のようにグループ化した乳酸菌の培地が、流動性が高い培地の場合であって、しかも、乳酸菌にビフィズス菌を含んでいる場合には、１次共棲培養用培地に対して１０％の乳酸菌を添加した。ビフィズス菌を含んでいないグループの場合には、同じく１次共棲培養用培地に対して３％の乳酸菌を添加した。
【００３４】
また、グループ化した乳酸菌の培地が、固形性の高い培地の場合には、白金耳でつり上げた１回の量を１次共棲培養用培地に添加した。
そして、これらの培地において、３７℃でpH４．６になるまで約６〜１２時間培養した。
【００３５】
２次共棲培養では、培地として豆乳と脱脂乳とを４：１の割合で混合し、この混合液に、ブドウ糖0.5％（w/w）、酵母エキス0.4％（w/w）および既生成分である３次共棲培養液を１％（w/w）添加した。そして、この培地を３７℃でpH４．５５になるまで約６〜１０時間培養を行った。なお、この２次共棲培養において、その培地や添加要素は、どの菌についても全て同じにした。
【００３６】
３次共棲培養は、豆乳と脱脂乳を８：１の割合で混合し、この混合液にブドウ糖0.5％（w/w）、酵母エキス0.4％（w/w）および既生成分である３次共棲培養液を１％（w/w）添加した。このようにした培地を用いて、最初に３２℃で２４時間培養し、次に４０℃で４８時間培養し、さらに３７℃で２４時間培養した。
【００３７】
上記のようにして３次共棲培養した混合培養液を、高圧蒸気滅菌法を用いて乳酸菌を滅菌した。つまり、１２０℃程度に加熱した滅菌装置内で、上記３次共棲培養液を６５℃に保って４０分間加熱し、３次共棲培養液中の乳酸菌を滅菌した。そして、この滅菌した最終培養液を１５℃まで冷却して、脂肪分等の不要物を凝固させた。このように脂肪分を凝固させたのは、その脂肪分をろ過によって除去しやすくするためである。このように脂肪分を除去すれば、ろ過したときのろ液が懸濁するのを防ぐことができる。また、脂肪分が酸化することによって、ろ液の中に酸化物が増加することも防止できる。
【００３８】
上記のように冷却した最終培養液は、それに１２％の無水エタノールを添加して、高速ホモジナイザーで破砕したが、このように最終培養液を破砕することによって、この後で実行するろ過が短時間にできることになる。また、上記無水エタノールの添加によって、上記乳酸菌の菌体内の成分を抽出することができる。
【００３９】
そして、上記滅菌した最終培養液を、３μｍのろ紙を用いて自然ろ過した後、それに１０ｋｇのウエイトをかけてさらに搾るとともに、この搾った液を0.1〜0．2μｍの中空糸膜でろ過して不純物を取り除きろ液を得た。
なお、上記ろ液は、その生成プロセスで、上記したように滅菌のために加熱されるが、このように加熱処理をすることによって、乳酸菌中に含まれている成分を熱抽出させることができる。また、熱によって滅菌されるので、上記乳酸菌生産物質を用いた製品内で生菌が活動して、品質を変化させることがない。
【００４０】
上記のように３次共棲培養を終えた最終培養液から、ろ過によって脂肪分や死菌を除去したものが、この発明の乳酸菌生産物質となる。
なお、上記のようにして生成した乳酸菌生産物質の分析結果を表１、表２および表３に示す。
【表１】
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【００４１】
【表２】
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【００４２】
【表３】
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【００４３】
表１、表２に示すように、この乳酸菌生産物質には、非常に多くの乳酸菌の代謝産物が含まれている。
また、表２にはアミノ酸の分析結果を示しているが、この表２から明らかなように、この発明の乳酸菌生産物質には、多くのアミノ酸が含まれている。
これらは、微生物の栄養因子である。
さらに、この乳酸菌生産物質からは、表３に示すような生理活性物質も検出されている。
【００４４】
上記表１〜３で示したように、上記乳酸菌生産物質に多くの種類の栄養因子や、生理活性物質が含まれているのは、多種の乳酸菌を用いた結果であると考えられる。１種の乳酸菌からも、種々の代謝産物が生産されるが、乳酸菌の種類が多くなれば、その種類も増えることが考えられるし、共棲培養を行うことによって、菌の増殖も促進されるので、上記栄養因子や生理活性物質の量も多くなることが考えられる。
従って、生の乳酸菌を摂取する場合と比べて、少量の上記乳酸菌生産物質を摂取すれば、多くの上記栄養因子および生理活性物質を体内に取り込むことができる。その結果、腸内では、腸内良性菌が活性化し、その量も増えて、腸内環境が改善されることが期待できる。
【００４５】
特に、この発明の乳酸菌生産物質は、複数種の乳酸菌をグループにしてグループ同士で共棲培養を行っているので、最終的に、非常に多くの種類の乳酸菌から生成される代謝産物を含有する乳酸菌生産物質を得ることができる。
特に、共棲状態を維持し易い菌を複数組み合わせてグループを作っているので、多数の菌種の中から、共棲培養に適した２種ずつを組み合わせて共棲培養を繰り返していく場合と比べて、少ない次数で、最終培養にたどり着くことができるというメリットも有る。
【００４６】
（実験例１）
上記のようにして得た乳酸菌生産物質を次の条件の下で１００人に経口摂取させた。すなわち、各人に、７mlずつ、朝、昼、夜の食間空腹時に、８週間継続的に摂取させた。その結果、表４に示すように、体のしびれ、便秘、腹部膨満、頭痛などの自覚感覚に対して、効果ありと答えた人が８６％と、ほとんどの人に自覚感覚の好転が見られた。
【表４】
2005269968.tif 000006
【００４７】
このように自覚感覚に好転が見られたのは、菌の生存に関わりなく、上記乳酸菌生産物質内の多くの代謝産物が腸内に供給され、それが腸内良性菌の栄養源となって、腸内良性菌が活性化されたためと考えられる。
なお、上記実験例１は、北京中日友好医院中医内科に依頼したものである。
【００４８】
（実験例２）
実験例２においては、５０人の糖尿病患者に対して、実験例１と同様の乳酸菌生産物質を次の条件下で経口摂取させた。すなわち、各人に、７mlずつ、朝、昼、夜の食間空腹時に、１６週間継続的に経口摂取させた。その結果、血糖値の顕著な低下が見られたが、その実験結果を示したのが表５である。なお、この表５は、上記５０人の平均値を示したものである。実験結果は、「参照値±標準値」で表示した。
【００４９】
【表５】
2005269968.tif 000007
【００５０】
上記表５に示したように、乳酸菌生産物質を経口摂取させることによって、静脈血糖値（GLU）および糖化ヘモグロビン値（HbA1c）ともに明らかに低下したことが分かる。従って、上記乳酸菌生産物質は、静脈血糖値（GLU）および糖化ヘモグロビン値（HbA1c）に対して著しい効果作用が有るといえる。
また、乳酸菌生産物質の摂取を止めてから１ヶ月後でも、これが再び上昇することがなく、さらに下がった人もいた。
【００５１】
上記のような乳酸菌生産物質は、腸内環境を良好に保つとともに、腸内環境が整うことによって、腸内の栄養の吸収効率が上昇して、体内の恒常性を維持するものと考えられる。
なお、上記実験例２は、北京中日友好医院中医内科に依頼したものである。
【００５２】
（実験例３）
実験例３は、１００人の糖尿病患者に対して、上記実験例２と同様の条件で、この発明の乳酸菌生産物質を経口摂取させ、経口摂取前後の静脈血糖値（GLU）および糖化ヘモグロビン値（HbA1c）を、測定した。その結果を図２，図３のグラフに示す。そして、図２は、静脈血糖値（GLU）を示したグラフであり、図３は糖化ヘモグロビン値（HbA1c）を示したグラフである。
なお、上記１００人の糖尿病患者は、Ｉ型糖尿病（インシュリン依存型糖尿病）患者５人と、II型糖尿病（インシュリン非依存型糖尿病）患者９５人であった。
【００５３】
図２，図３のグラフから、上記乳酸菌生産物質を経口摂取することによって、静脈血糖値（GLU）および糖化ヘモグロビン値（HbA1c）が明らかに低下することが分かる。従って、上記乳酸菌生産物質は、静脈血糖値（GLU）および糖化ヘモグロビン値（HbA1c）に対して著しい効果作用が有るといえる。
上記糖化ヘモグロビン値（HbA1c）は、長期の血糖状態を表す指標であり、この値が改善されるということは、糖尿病の治療分野において非常に画期的なことである。
なお、上記実験例３は、北京中日友好医院中医内科に依頼したものである。
【００５４】
（実験例４）
実験例４においては、５０人の消化系腫瘍患者に対して、実験例１と同様の乳酸菌生産物質を次の条件の下で経口摂取させた。すなわち、各人に、一日一回７mlを経口摂取させた。摂取期間は４０日を１クールとした。その結果、食欲増加の自覚症状が２３例有り、全体の４６％を占めた。また、精神疲労が好転したという自覚症状が２４例有り、全体の４８％を占めた。
【００５５】
さらに、足、腰の虚脱感が改善した例は２４例であり、全体の４８％を占めた。体重増加は２２例で、全体の４４％を占めた。また、生活の質（ＱＯＬ）が向上したと観察された例は２６例で全体の５２％を占めた。口の渇き改善例が１７例であり全体の３４％を占めた。
これらの結果は、乳酸菌生産物質が肝臓、脾臓に対しても有益であることを示していると考えられる。
また、血液検査の結果を表６に示している。
【００５６】
【表６】
2005269968.tif 000008
【００５７】
表６に示したように、血色素（Ｈｂ）の上昇、ＮＫ細胞活性の上昇、T細胞亜群ＣＤ３の上昇、ＣＤ４/ＣＤ８値の上昇が確認された。いずれの上昇率も著しいものであった。
さらに、白血球（ＷＢＣ）、血小板（ＢＰＣ）の値も一定の上昇が確認できた。また、血糖値にも改善の傾向が有った。
なお、表６中のＢＵＮ（尿素窒素）、Ｃｒ（クアチン）は、いずれも腎機能の指標であり、その値が大きすぎると問題となる指標である。
この実験例４は、北京中西医結合学会南陽腫瘍医、癌研究基金会興腫瘍医院、北京中日友好医院中医腫瘍科に依頼したものである。
【００５８】
（実験例５）
実験例５においては、３０人の慢性腎炎患者に対して、実験例１と同様の乳酸菌生産物質を次の条件の下で経口摂取させた。すなわち、各人に、一回７mlずつ、朝、昼、晩の食事の前に経口摂取させた。実験期間は２ヶ月とした。この結果を表７および表８に示した。
【００５９】
【表７】
2005269968.tif 000009
【００６０】
【表８】
2005269968.tif 000010
【００６１】
上記表７は、腫れ、高血圧、腰痛、脱力感、夜尿の各症状について、その症状が現れている人の人数を示したものである。この表７から明らかなように、上記乳酸菌生産物質の摂取によって上記各症状が表れている人の人数が減っている。すなわち、症状の改善が見られた。また、上記表８は尿蛋白定量を参照値±標準差で表示している。この表８のように、明らかに尿蛋白定量が低減された。
なお、上記実験例５は、北京中日友好医院、河北省玉田具医院、北京慧忠医院、北京中医薬開発協会問診部に依頼したものである。
【００６２】
（実験例６）
実験例６においては、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発糖尿病ラットに対して、実験例１と同様の乳酸菌生産物質を次の条件の下で経口投与した。まず、ラット１５匹にストレプトゾトシンを1ml/kgとなるようにクエン酸緩衝液で溶解した後、尾静脈より投与し、ラットの血糖値が１８０mg/dl以上であることを確認した。そして、これを５匹ずつ３つのグループに分け、これらをグループ１〜３とした。
【００６３】
上記グループ１には蒸留水４mlを、グループ２には乳酸菌生産物質２ml＋蒸留水２mlを、グループ３には乳酸菌生産物質を４mlを経口投与した。経口投与は１日１回２８日間行った。そして、これらのラットの血漿中グルコース濃度を測定した。測定結果は、平均値および標準誤差で示した。
【００６４】
上記実験例６の結果、グループ１では試験期間を通して、200mg/dl以上という高い値を維持した。これに対して、乳酸菌生産物質を投与したグループ２では投与前の274.4±17.4に比べ、投与１週目には３０％以上低下し178.2±27.6となり、２週目以降は、159.3±9.8とグループ１に対して優位な差が見られた。
また、乳酸菌生産物質を投与したグループ３では、投与１週目では153.8±7.6で、グループ１と比較して優位な差が見られた。２週目では160.1±5.5とその効果が持続された。さらに、３週目では95.2±2.2、試験最終日には103.2±11.1であった。これは、ストレプトゾトシン処理していない健常のラットとほぼ同じ値であった。
以上のことから、乳酸菌生産物質は明らかに高血糖を正常値に改善することが分かった。
【００６５】
また、上記試験の後、各グループの肝臓と十二指腸とをホルマリン固定して、組織切片を作成し、組織学的評価を行った。
その結果、グループ１ではランゲルハンス島β細胞の脱顆粒すなわち、顆粒の減少が見られ、細胞の空洞化などが確認された。またβ細胞数はストレプトゾトシン処理しないラットでは１９以上であったが、このグループ１では7.0±2.0であり、β細胞数の減少も確認された。
これに対し、乳酸菌生産物質を投与したグループ２，３では容量依存的にβ細胞数減少の抑制が認められた。このときのβ細胞数は、10.3±2.3であった。
また、グループ２ではβ細胞の顆粒減少および細胞の空洞化が見られたが、グループ１に比べて少数であった。
【００６６】
以上の結果から、乳酸菌生産物質は血糖値を濃度依存的に優位に低下させ、正常値に改善させるが、その機序としては１つの作用機序ではなく、複数の作用機序が存在する。それは、組織学的にランゲルハンス島β細胞の変性を改善させたがこれだけでは血糖値をほぼ正常値に回復させるには不十分と思われるからである。つまり、乳酸菌生産物質の投与によって、糖代謝に何らかの作用をもたらし、結果的に血糖値を正常値に改善させたものと考えられる。
なお、上記実験例６は、株式会社薬物安全性試験センターに依頼したものである。
【００６７】
（実験例７）
実験例７では、この発明の乳酸菌生産物質を、糖尿病患者に与え、臨床観察をする実験を行った。
観察対象は、病院で、糖尿病と確実に診断された６０名の患者で、３２歳から７８歳の患者で、罹病期間は、それぞれ、２０例は１〜５年、２０例は６〜１０年、２０例は１０年以上である。
これら６０名の患者を３０名ずつ２グループに分け、一方のグループには、乳酸菌生産物質を１０ｍｌずつ、毎日２回、他方のグループには玉泉丸１５ｇを毎日２回、経口摂取させた。これを３ヶ月間続け、治療前後の効果を比較した。その結果を表９に示す。なお、各患者には、上記乳酸菌生産物質または玉泉丸以外を投与する以外にも、降圧剤の投与など、個々の患者の必要に応じた治療を同時に行っている。上記玉泉丸とは、糖尿病の症状を改善するための漢方薬である。
また、以下の表中、乳酸菌生産物質のグループを実験組、玉泉丸のグループを対照組と表している。
【００６８】
【表９】
2005269968.tif 000011
表９に示すように、上記乳酸菌生産物質、玉泉丸ともに改善が見られた。
特に、乳酸菌生産物質を摂取したグループでは、有効率が８６．７％と非常に高く、玉泉丸のグループの有効率６６．６％に比べても優位であった。
【００６９】
なお、表９に示す「効果顕著」とは、空腹時の静脈血糖値（GUL）が、１〜２（mmol/ｌ）下がり、かつ、糖化ヘモグロビン値（HbA1C）が、１％〜２％下がった状態である。つまり、上記各生物化学指数が明らかに改善した状態である。
また、「効果あり」とは、空腹時の血糖値が下がった値が１（mmol／ｌ）未満か、糖化ヘモグロビン値が１％未満だけ下がり、生物化学指数での改善は明確ではないが、自覚症状では改善した状態である。
一方、「効果なし」とは、生物化学指数と自覚症状ともに改善がなかった場合である。
つまり、上記表９から、この発明の乳酸菌生産物質は、糖尿病患者に対して玉泉丸よりも効果が有ることが証明された。
【００７０】
また、治療前後において、上記血糖値および糖化ヘモグロビン値以外の指数も測定したので、それらの測定結果を表１０に示す。
【表１０】
2005269968.tif 000012
【００７１】
上記表１０から、以下のことが分かった。
血糖値と糖化ヘモグロビン値については、両グループとも、治療前後に顕著な差を示している。つまり、上記表９の結果と同じであるが、乳酸菌生産物質、玉泉丸ともに、糖尿病に対する治療効果が有る。
また、乳酸菌生産物質を摂取したグループは、中性脂肪（TG）、コレステロール（CHO）が下がっているが、玉泉丸を摂取したグループは、これらの値が下がっていない。両者の差は、顕著な差とはいえないが、糖尿病の合併症として、中性脂肪やコレステロールが高い高脂血症を併発している患者には、上記乳酸菌の摂取が有効である可能性が有る。
【００７２】
さらに、血圧については、両グループとも、治療後に下がっているが、両グループとも、血圧降下剤を用いた患者が含まれているので、その影響と考えられる。
その他、乳酸菌生産物質は、体重を減少させる効果が有るのに対して、玉泉丸はその効果がない。
【００７３】
また、この発明の乳酸菌生産物質を摂取したグループと、玉泉丸を摂取したグループ別に、個々の患者の、血糖値の低下数値を対比した結果を表１１に示し、糖化ヘモグロビン値の低下数値の対比結果を表１２に示す。
【００７４】
【表１１】
2005269968.tif 000013
上記表１１に示すように、実験組、対照組ともに、血糖値が下がっているが、実験組の方が、より低下数値が大きく、その効果には差が有ることが分かる。
【００７５】
【表１２】
2005269968.tif 000014
上記表１２に示すように、実験組は対照組に比べて、糖化ヘモグロビン値を下げる効果が大きいことが分かる。
【００７６】
さらに、上記表９に示した治療前後の効果について発病年数との相関を調べた結果を表１３に示す。上記発病年数とは、糖尿病を発病してからの年数である。
【表１３】
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この表１３から、実験組では、発病年数による効果の現れ方には、特に差がないことが分かった。これに対し、実験組では、発病年数によって効果に差が有り、発病年数が長くなると顕著な効果が現れにくくなることが分かった。
この結果から、上記乳酸菌生産物質は、発病年数が長く、玉泉丸では明らかな効果が現れないような糖尿病患者に対しても有効であることが分かった。
なお、この実験例７は、中日友好医院および北京中医薬大学に依頼したものである。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】この発明の乳酸菌生産物質を生成するための共棲培養の順序を示した図である。
【図２】実験例３の実験結果における静脈血糖値の変化を示したグラフである。
【図３】実験例３の実験結果における糖化ヘモグロビン値（HbA1c）の変化を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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