(57)【要約】【課題】  あらゆるサブタイプのノロウイルスを迅速かつ高感度に検出する遺伝子検査試薬を構成するのに好適なオリゴヌクレオチドの組み合わせを提供すること。【解決手段】  ノロウイルスに特異的かつサブタイプによる変異の少ない位置にある塩基配列と相同的あるいは相補的な配列を有するプライマーを用いることにより、ノロウイルスのみを特異的に増幅させて検出する方法と、ノロウイルスの特定部位に結合するオリゴヌクレオチドによって、前記課題を解決する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノロウイルスのゲノムＲＮＡを検出するために有用なオリゴヌクレオチドであって、ノロウイルスのゲノムＲＮＡに結合可能である、配列番号１から５および２０に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されたオリゴヌクレオチド、または該オリゴヌクレオチドの相補鎖。
【請求項２】
ノロウイルスの検出において利用するための検出試薬であって、
ノロウイルスのゲノムＲＮＡ中の特定配列を鋳型として、該特定配列に相同的な配列を有する第一のプライマーおよび該特定配列に相補的な配列を有する第二のプライマーを用い、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成し、ここで該第一または第二のプライマーのいずれか一方のプライマーは５’ 末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加した配列を有するものであり、
リボヌクレアーゼＨ作用により該ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、
該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより前記ＲＮＡ配列または前記ＲＮＡ配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして
該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるｃＤＮＡ合成の鋳型となる、
といった段階を含んで成るＲＮＡ増幅工程を利用したノロウイルスの検出試薬で、
ここで前記第一のプライマーが、配列番号１から３のいずれかの少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチド、または配列番号１から３のいずれかの少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加され且つ前記特定配列に相補的な配列に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドであり、
前記第二のプライマーが、配列番号４または２０のいずれかの少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチド、または配列番号４または２０のいずれかの少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加され且つ前記特定配列に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドである、
ことを特徴とするノロウイルスの検出試薬。
【請求項３】
前記第一のプライマーが配列番号１から３のいずれかのオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項２の検出試薬。
【請求項４】
前記第二のプライマーが配列番号４または２０のいずれかのオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項２の検出試薬。
【請求項５】
前記ＲＮＡ増幅工程がインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド存在下で実施され、反応液の蛍光強度を測定することによりノロウイルスの検出が行われ、ここで該オリゴヌクレオチドの配列はＲＮＡ転写産物の少なくとも一部の配列と相補的であり、該オリゴヌクレオチドがＲＮＡ転写産物と相補結合によって、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するものである、請求項２〜４のいずれか１項記載の検出試薬。
【請求項６】
前記インターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチドが配列番号５に示したオリゴヌクレオチドの少なくとも連続した１０塩基からなることを特徴とする請求項５に記載の検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ノロウイルスは、一般にウイルス性食中毒の原因ウイルスとして知られている。本発明は、臨床検査、公衆衛生、食品検査、食中毒検査におけるノロウイルス検出試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ノロウイルスはヒトカリシウイルス科に属するウイルスで、約７０００塩基の１本鎖ＲＮＡをゲノムにもつ。ノロウイルスは、小型球形ウイルス（Ｓｍａｌｌ Ｒｏｕｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＳＲＳＶ）とも呼ばれている。
【０００３】
我が国で届け出されている食中毒の約２０％はウイルスが原因と推定されている。これらのウイルス性食中毒例の約８０％以上からノロウイルスが検出される。おもな感染源は食品で、しばしば生カキが問題となっている。また、乳幼児の（散発性の）急性胃腸炎からもノロウイルスが検出され、ヒトからヒトへ伝播する可能性も示唆されている。以上から、ノロウイルスの検査は、公衆衛生上および食品の品質管理上大きな課題となっており、遺伝子増幅法を用いた、高感度かつ迅速でしかもあらゆるサブタイプの検出が可能もしくは検出率の高い検査法の開発が望まれている。これに対し、現在、ノロウイルスの検出は、電子顕微鏡による観察が基本である。この方法では、あらゆるサブタイプの検出か可能であるが、検出するには１０6個／ｍＬ以上のウイルス量が必要で感度が低いために、検体は患者の糞便に限られている。
【特許文献１】特開２００２−５１７７８号公報
【特許文献２】特開２００２−１５３２８９号公報
【特許文献３】特開２００２−２１８９９９号公報
【特許文献４】特開２０００−３００２９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ノロウイルスは遺伝子型によりジェノグループＩ（ＧＩ）とジェノグループII（ＧII）の２種に大別される。さらに遺伝子型により、ＧＩは、Ｃｈｉｂａ、Ｄｅｓｅｒｔ  Ｓｈｉｅｌｄ、Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎを代表とする複数のサブタイプに、ＧIIは、Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌ、Ｈａｗａｉｉ、Ｍｅｘｉｃｏ、Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎを代表とする複数のサブタイプに区別される。ＧＩに属するサブタイプ間、およびＧIIに属するサブタイプ間の塩基配列の相同性は約７０％である。また、ＧＩとＧIIの塩基配列の相同性は４０〜５０％である。
【０００５】
遺伝子増幅法を用いたノロウイルス検出試薬で高い検出率をあげるためには、プライマー結合領域として使用するために、各種サブタイプ間で塩基配列が同じである２０塩基以上の領域が、少なくとも２箇所は必要である。しかしながら、ＧｅｎＢａｎｋ上のノロウイルスの配列として、以下の６配列（Ｃｈｉｂａ（Ｎｏ．ＡＢ０４２８０８）、Ｎｏｒｗａｌｋ（Ｎｏ．ＮＣ  ００１９５９）、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ（Ｎｏ．Ｌ０７４１８）、Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌ（Ｎｏ．ＡＦ１４５８９６）、Ｈａｗａｉｉ（Ｎｏ．Ｕ０７６１１）、ＨｕＣＶ（Ｎｏ．ＡＹ０３２６０５））の相同性を調べただけでも、サブタイプ間で塩基配列が同じである２０塩基以上の領域は存在しない。
【０００６】
このような背景のもと、本発明者らは、ノロウイルスの検出法を提供した（特開２００２−５１７７８号公報、特開２００２−１５３２８９号公報、特開２００２−２１８９９９号公報）が、プライマーの塩基配列は特定のサブタイプの塩基配列に基づいており、他のサブタイプを検出することはできない。また、特開２０００−３００２９７号公報で開示される、ＰＣＲを用いたノロウイルス検出試薬は、Ｎｏｒｗａｌｋ検出用とＳｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ検出用だけである。これまでのところ、遺伝子増幅法を用いるノロウイルス検出試薬で、ＧＩのあらゆるサブタイプ、あるいはＧIIのあらゆるサブタイプの検出が可能もしくは検出率の高いもの（例えば８０％以上の検出率を示すもの）は知られていない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この問題点を解決するために、本発明者らは、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているノロウイルスの塩基配列と自ら決定したノロウイルスの塩基配列を解析し、プライマー結合領域を決定し、ＧＩのあらゆるサブタイプを検出するノロウイルス検出試薬、およびＧIIのあらゆるサブタイプを検出するノロウイルス検出試薬を開発した。
【０００８】
すなわち、本願発明は、ノロウイルスの検出試薬に使用するプライマーおよび該プライマーを用いたノロウイルス検出試薬を提供する。このようにして、前記目的を達成するためになされた本発明の第一の観点は、ノロウイルスのゲノムＲＮＡを検出するために有用なオリゴヌクレオチドであって、ノロウイルスのゲノムＲＮＡに結合可能である、配列番号１から５および２０に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチド、またはノロウイルスのゲノムＲＮＡに結合可能である該オリゴヌクレオチドの変異体、例えば配列番号１から５および２０に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されたオリゴヌクレオチド、または配列番号１から５および２０に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチドと高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、または以上の各オリゴヌクレオチドの相補鎖を提供する。
第二の観点において、本発明は、ノロウイルスの検出において利用するための検出試薬であって、
ノロウイルスのゲノムＲＮＡ中の特定配列を鋳型として、該特定配列に相同的な配列を有する第一のプライマーおよび該特定配列に相補的な配列を有する第二のプライマー（ここで第一または第二のプライマーのいずれか一方のプライマーは５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加した配列を有する）を用い、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成し、
リボヌクレアーゼＨ作用により該ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、
該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより前記ＲＮＡ配列または前記ＲＮＡ配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして
該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるｃＤＮＡ合成の鋳型となる、
といった段階を含んで成るＲＮＡ増幅工程において利用するノロウイルスの検出試薬であって、
ここで前記第一のプライマーが、配列番号１から３のいずれかの少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチド、または配列番号１から３のいずれかの少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加され且つ前記特定配列に相補的な配列に特異的に結合できるオリゴヌクレオチド、または配列番号１から３のいずれかの少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチドと高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし且つ前記特定配列に相補的な配列に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドであり、
前記第二のプライマーが、配列番号４または２０のいずれかの少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチド、または配列番号４または２０のいずれかの少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加され且つ前記特定配列に特異的に結合できるオリゴヌクレオチド、または配列番号４または２０のいずれかの少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチドと高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし且つ前記特定配列に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドである、
ことを特徴とするノロウイルスの検出試薬を提供する。
【０００９】
高ストリンジェント条件とは、例えば以下の実施例に示すような、６０ｍＭのＴｒｉｓ、１７ｍＭの塩化マグネシウム、１２０ｍＭの塩化カリウム、１ｍＭのＤＴＴの存在下、４３℃でのハイブリダイゼーション条件であってよい。
【００１０】
尚、ノロウイルスに由来するＲＮＡに対して相補的であるＲＮＡを検出の対象とする場合には、第一のプライマー及び第二のプライマーとして、それぞれ、それらの５’末端と３’末端が逆となるものと相補的なプライマーを用いればよい。
【００１１】
好ましくは、前記ＲＮＡ増幅工程は前記標的ＲＮＡを前記特定配列の５’末端で切断する、該特定配列の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有する切断用オリゴヌクレオチドの存在下で実施される。
【００１２】
好ましくは、前記第一のプライマーは配列番号１から３のいずれかの配列からなるオリゴヌクレオチドである。
更に好ましくは、前記第二のプライマーは配列番号４または２０のいずれかの配列からなるオリゴヌクレオチドである。
【００１３】
別の好適な態様において、前記ＲＮＡ増幅工程はインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド存在下で実施され、反応液の蛍光強度を測定することによりノロウイルスの検出が行われる。ここで該オリゴヌクレオチドの配列は前記ＲＮＡ転写産物の少なくとも一部の配列と相補的であり、該オリゴヌクレオチドの該ＲＮＡ転写産物との相補結合によって、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するものである。
好ましくは、前記インターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチドは配列番号５に示した少なくとも連続した１０塩基以上からなる。以下、本発明を詳細に説明する。
【発明の効果】
【００１４】
本願発明の検出法はＧＩのあらゆるサブタイプ、あるいはＧIIのあらゆるサブタイプのノロウイルスを迅速にかつ高感度に検出するのに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明において、配列番号１から５および２０に示した配列中の少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチドまたはその変異体は、いずれもプライマーとして用いることができる。ここで配列番号１から３、および４と２０はそれぞれ近接した領域である。従って、例えば、ＰＣＲを行う場合は、配列番号１から３のいずれかと配列番号４または２０のいずれかとの組み合わせ、配列番号１から３のいずれかと配列番号５との組み合わせ、配列番号５の相補鎖と配列番号４または２０のいずれかとの組み合わせを例示することができる。ＰＣＲ以外の他のＤＮＡ増幅法においても同様である。
【００１６】
本発明の別の態様として、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの協奏的作用によって（逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼが協奏的に作用するような条件下で反応させ）ノロウイルスのＲＮＡ配列を増幅させるＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法、ＴＲＣ法（例えば特開２０００−１４４００号公報参照）等を挙げることができる。ここで温度については特に制限はないが３５〜５０℃が好ましい。
【００１７】
上記本願発明の一態様において、標的ＲＮＡは、特定配列の５’末端で切断される必要がある。このように標的ＲＮＡを切断する方法としては、特定配列の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（切断用オリゴヌクレオチド）を添加することによって、標的ＲＮＡをリボヌクレアーゼＨ作用により切断する方法が好ましい。該切断用オリゴヌクレオチドは、３’末端側からの伸長反応をおさえるために、３’末端水酸基が化学的に修飾されたもの、例えばアミノ化等されているものを使用することが望ましい。
【００１８】
以上の核酸増幅方法で得られた増幅産物は既知の核酸検出方法で検出することができるが、好適な態様では前記核酸増幅をインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測定することが望ましい。該オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中のリンにリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合させたもので、標的核酸（相補的核酸）と２本鎖を形成するとインターカレーター部分が２本鎖部分にインターカレートして蛍光特性が変化するため、分離分析を必要としないことを特徴とする(Ｉｓｈｉｇｕｒｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（２４）、４９９２−４９９７（１９９６）)。
【００１９】
該オリゴヌクレオチドが結合する配列は、ノロウイルスのゲノムＲＮＡ中の増幅される配列のいずれであってもよく、特に限定はないが、配列番号５に示した配列中の少なくとも連続した１０塩基からなる配列であることが望ましい。また、該オリゴヌクレオチドをプライマーとした伸長反応を抑えるために該オリゴヌクレオチドの３’末端の水酸基は化学的に修飾（たとえばグリコール酸付加）することが望ましい。
【００２０】
これにより、ノロウイルスＲＮＡを、一チューブ内、一定温度、一段階で、迅速および高感度に増幅し、検出することが可能となり、自動化への適用も容易となる。
【００２１】
以下、本願発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
表１に示す組み合わせ（ａ）がＧＩのあらゆるサブタイプの検出が可能であること、および組み合わせ（ｂ）と（ｃ）がＧIIのあらゆるサブタイプの検出が可能であることを示すために、下記の（１）から（８）に示す方法でＧＩのサブタイプ４種およびＧIIのサブタイプ４種にそれぞれ相当するＤＮＡ（以下人工標準ＤＮＡとする）とＲＮＡ（以下人工標準ＲＮＡとする）を調製した。そして人工標準ＲＮＡを（９）から（１２）に示す方法で測定した。
【００２３】
（１）  ノロウイルスのＣｈｉｂａサブタイプの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０４２８０８）を基に、組み合わせ（ａ）から（ｃ）で使用するオリゴヌクレオチドの結合領域を含むように人工標準ＤＮＡを設計し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により９０塩基の人工標準ＲＮＡ（ＮＶ１ＡＲＴ−Ｃ、配列番号６）を調製した。この標準ＲＮＡを試料とし、２６０ ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）、１ ｍＭ  ＥＤＴＡ、５  ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ製））を用い１０6 コピー／５  μＬとなるように希釈した。
【００２４】
（２）  ノロウイルスのＤｅｓｅｒｔ  Ｓｈｉｅｌｄサブタイプの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｕ０４４６９）を基に、組み合わせ（ａ）から（ｃ）で使用するオリゴヌクレオチドの結合領域を含むように人工標準ＤＮＡを設計し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により９０塩基の人工標準ＲＮＡ（ＮＶ１ＡＲＴ−Ｄ、配列番号７）を調製した。この標準ＲＮＡを試料とし、２６０ ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）、１ ｍＭ  ＥＤＴＡ、５  ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ製））を用い１０6 コピー／５  μＬとなるように希釈した。
【００２５】
（３）  ノロウイルスのＮｏｒｗａｌｋサブタイプの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ  ００１９５９）を基に、組み合わせ（ａ）から（ｃ）で使用するオリゴヌクレオチドの結合領域を含むように人工標準ＤＮＡを設計し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により９０塩基の人工標準ＲＮＡ（ＮＶ１ＡＲＴ−Ｎ、配列番号８）を調製した。この標準ＲＮＡを試料とし、２６０ ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）、１ ｍＭ  ＥＤＴＡ、５  ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ製））を用い１０6 コピー／５  μＬとなるように希釈した。
【００２６】
（４）  ノロウイルスのＳｏｕｔｈａｍｐｔｏｎサブタイプの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ
Ｎｏ．Ｌ０７４１８）を基に、組み合わせ（ａ）から（ｃ）で使用するオリゴヌクレオチドの結合領域を含むように人工標準ＤＮＡを設計し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により９０塩基の人工標準ＲＮＡ（ＮＶ１ＡＲＴ−Ｓ、配列番号９）を調製した。この標準ＲＮＡを試料とし、２６０ ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）、１ ｍＭ  ＥＤＴＡ、５  ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ製））を用い１０6 コピー／５  μＬとなるように希釈した。
【００２７】
（５）  ノロウイルスのＣａｍｂｅｒｗｅｌｌサブタイプの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＦ１４５８９６）を基に、組み合わせ（ａ）から（ｃ）で使用するオリゴヌクレオチドの結合領域を含むように人工標準ＤＮＡを設計し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により９０塩基の人工標準ＲＮＡ（ＮＶ２ＡＲＴ−Ｃ、配列番号１０）を調製した。この標準ＲＮＡを試料とし、２６０ ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）、１ ｍＭ  ＥＤＴＡ、５  ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ製））を用い１０6 コピー／５  μＬとなるように希釈した。
【００２８】
（６）  ノロウイルスのＨａｗａｉｉサブタイプの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｕ０７６１１）を基に、組み合わせ（ａ）から（ｃ）で使用するオリゴヌクレオチドの結合領域を含むように人工標準ＤＮＡを設計し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により９０塩基の人工標準ＲＮＡ（ＮＶ２ＡＲＴ−Ｈ、配列番号１１）を調製した。この標準ＲＮＡを試料とし、２６０ ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）、１ ｍＭ  ＥＤＴＡ、５  ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ製））を用い１０6 コピー／５  μＬとなるように希釈した。
【００２９】
（７）  ノロウイルスのＭｅｘｉｃｏサブタイプの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｕ２２４９８）を基に、組み合わせ（ａ）から（ｃ）で使用するオリゴヌクレオチドの結合領域を含むように人工標準ＤＮＡを設計し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により９０塩基の人工標準ＲＮＡ（ＮＶ２ＡＲＴ−Ｍ、配列番号１２）を調製した。この標準ＲＮＡを試料とし、２６０ ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）、１ ｍＭ  ＥＤＴＡ、５  ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ製））を用い１０6 コピー／５  μＬとなるように希釈した。
【００３０】
（８）  ノロウイルスのＳｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎサブタイプの塩基配列を基に、組み合わせ（ａ）から（ｃ）で使用するオリゴヌクレオチドの結合領域を含むように人工標準ＤＮＡを設計し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により９０塩基の人工標準ＲＮＡ（ＮＶ２ＡＲＴ−Ｓ、配列番号１３）を調製した。この標準ＲＮＡを試料とし、２６０ ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）、１ ｍＭ  ＥＤＴＡ、５  ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ製））を用い１０6 コピー／５  μＬとなるように希釈した。
【００３１】
（９）  以下の組成の反応液２０ μＬを０．５ ｍＬ容ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに（１）から（８）で調製したＲＮＡ試料５ μＬを添加した。なお、第一プライマー・第二プライマー・切断用オリゴヌクレオチドの組み合わせが表１に示す組み合わせになるよう溶液を調製した。
【００３２】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
６０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．６）
１７ ｍＭ  塩化マグネシウム
１２０ ｍＭ  塩化カリウム
６ Ｕ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
１ ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ ｍＭ  ＩＴＰ
各３．０ ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
０．１６ μＭの切断用オリゴヌクレオチド
１．０ μＭの第一プライマー
１．０ μＭの第二プライマー
２５ ｎＭのインターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＮＶ−Ｓ−Ｇ、配列番号５、５’末端から１２番目の「Ｃ」と１３番目の「Ａ」との間のリンにインターカレーター性蛍光色素が標識されている。また３’末端の水酸基はグリコール基で修飾されている。）
１３％  ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
【００３３】
（１０）  上記の反応液を４３℃で２分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４３℃で２分間保温した酵素液５ μＬを添加した。
【００３４】
酵素液の組成（各数値は最終反応液量３０ μＬにおける値）
２．０％  ソルビトール
３．６ μｇ  牛血清アルブミン
１４２ Ｕ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン製）
６．４ Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス製）
容量調整用蒸留水
【００３５】
（１１）  引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で保温して、励起波長４７０ ｎｍ、蛍光波長５２０ ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
【００３６】
（１２）  各オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いたときの、ノロウイルス人工標準ＲＮＡの立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値の１．２倍になるまでの時間）の結果を表２に示した。組み合わせ（ａ）ではＧＩの標準ＲＮＡ４試料を、組み合わせ（ｂ）および（ｃ）ではＧIIの標準ＲＮＡ４試料をそれぞれ３０分以内に検出していることが示された。
【００３７】
【表１】
2005245434.tif 000002
【００３８】
表１は本実験系で用いた第一プライマー・第二プライマー・切断用オリゴヌクレオチドの組み合わせを示す。ノロウイルス検出用オリゴヌクレオチドの組み合わせでの、切断用オリゴヌクレオチドの塩基配列のうち、３’末端の水酸基はアミノ化されている。第一プライマーの塩基配列のうち、５’末端側第１番目の「Ａ」から第２２番目の「Ａ」までの領域はＴ７プロモーター領域であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から第２８番目の「Ａ」までの領域はエンハンサー配列である。なお、組み合わせ（ａ）はおもにＧＩのノロウイルスを標的として設計しており、組み合わせ（ｂ）および（ｃ）はおもにＧIIのノロウイルスを標的として設計している。
【００３９】
切断用オリゴヌクレオチド
ＮＶ１−３ＳＭ−９（配列番号１４）
ＮＶ２−３ＳＭ（配列番号１５）
ＮＶ２−３Ｓ２０＋３（配列番号１６）
第一プライマー
ＮＶ１−３ＦＭ−９（配列番号１７）
ＮＶ２−３ＦＭ（配列番号１８）
ＮＶ２−３Ｆ２０＋３（配列番号１９）
第二プライマー
ＮＶ２−７ＲＭ（配列番号４）
【００４０】
【表２】
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【００４１】
表２は表１に示したオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、ノロウイルス人工標準ＲＮＡ（ＧＩ、ＧII各４試料）を測定した結果である。表１に示したオリゴヌクレオチドの組み合わせのうち、組み合わせ（ａ）はＧＩの標準ＲＮＡ４試料を、組み合わせ（ｂ）および（ｃ）はＧIIの標準ＲＮＡ４試料をそれぞれ３０分以内に検出できた。
【００４２】
実施例２
本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせのうちの１つがＧＩのあらゆるサブタイプの検出が可能であることを示すために、下記の（１）から（８）に示す方法でＧＩのサブタイプ４種の人工標準ＲＮＡを測定した。
【００４３】
（１）  実施例１と同様のＣｈｉｂａサブタイプの人工標準ＲＮＡ（ＮＶ１ＡＲＴ−Ｃ、配列番号６）を試料とし、２６０ ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）、１ ｍＭ  ＥＤＴＡ、５  ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ製））を用い１０6 コピー／５  μＬとなるように希釈した。
【００４４】
（２）  実施例１と同様のＤｅｓｅｒｔ  Ｓｈｉｅｌｄサブタイプの人工標準ＲＮＡ（ＮＶ１ＡＲＴ−Ｄ、配列番号７）を試料とし、２６０ ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）、１ ｍＭ  ＥＤＴＡ、５  ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ製））を用い１０6 コピー／５  μＬとなるように希釈した。
【００４５】
（３）  実施例１と同様のＮｏｒｗａｌｋサブタイプの人工標準ＲＮＡ（ＮＶ１ＡＲＴ−Ｎ、配列番号８）を試料とし、２６０ ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）、１ ｍＭ  ＥＤＴＡ、５  ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ製））を用い１０6 コピー／５  μＬとなるように希釈した。
【００４６】
（４）  実施例１と同様のＳｏｕｔｈａｍｐｔｏｎサブタイプの人工標準ＲＮＡ（ＮＶ１ＡＲＴ−Ｓ、配列番号９）を試料とし、２６０ ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）、１ ｍＭ  ＥＤＴＡ、５  ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ製））を用い１０6 コピー／５  μＬとなるように希釈した。
【００４７】
（５）  以下の組成の反応液２０  μＬを０．５ ｍＬ容ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに（１）から（４）で調製したＲＮＡ試料５ μＬを添加した。
【００４８】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
６０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．６）
１７．２ ｍＭ  塩化マグネシウム
１２０ ｍＭ  塩化カリウム
６ Ｕ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
１ ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ ｍＭ  ＩＴＰ
各３．０ ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
０．１６ μＭの切断用オリゴヌクレオチド（ＮＶ１−３ＳＭ−９、配列番号１４、    ３’末端の水酸基はアミノ化されている）
１．０ μＭの第一プライマー（ＮＶ１−３ＦＭ−９、配列番号１７）
１．０ μＭの第二プライマー（ＮＶ１−７ＲＭ１８−１、配列番号２０）
１５ ｎＭのインターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＮＶ−Ｓ−Ｇ、配列番号５、５’末端から１２番目の「Ｃ」と１３番目の「Ａ」との間のリンにインターカレーター性蛍光色素が標識されている。また３’末端の水酸基はグリコール基で修飾されている。）
１３％  ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
【００４９】
（６）  上記の反応液を４３℃で２分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４３℃で２分間保温した酵素液５ μＬを添加した。
酵素液の組成（各数値は最終反応液量３０ μＬにおける値）
２．０％  ソルビトール
３．６ μｇ  牛血清アルブミン
１４２ Ｕ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン製）
６．４ Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス製）
容量調整用蒸留水
【００５０】
（７）  引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で保温して、励起波長４７０ ｎｍ、蛍光波長５２０ ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
【００５１】
（８）  ノロウイルス人工標準ＲＮＡの立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値の１．２倍になるまでの時間）の結果を表３に示した。本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いることでＧＩの標準ＲＮＡ４試料を３０分以内に検出できることが示された。
【００５２】
【表３】
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【００５３】
表３は実施例２で使用したオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、ノロウイルス人工標準ＲＮＡ（ＧＩ４試料）を測定した結果である。実施例２で使用したオリゴヌクレオチドの組合せはＧＩの標準ＲＮＡ４試料を３０分以内に検出できた。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
以上のように、本願発明の検出法はＧＩのあらゆるサブタイプ、あるいはＧIIのあらゆるサブタイプのノロウイルスを迅速にかつ高感度に検出するのに有用である。
【００５５】
本願発明のオリゴヌクレオチドは、配列表に記載した塩基配列（１８塩基から２３塩基）のものに限られず、これら配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドであれば良い。これらは、比較的低温（好ましくは４３℃）条件下で、プライマーまたはプローブの標的核酸への特異性を確保するためには１０塩基程度の塩基配列があれば十分であることから明らかである。
【配列表】
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