(57)【要約】【課題】芳香族カルボン酸を合成する機能を有する酵素及びそれをコードする遺伝子、並びに前記遺伝子を含むベクター及び形質転換体を提供する。【解決手段】フェノール化合物のＣ２位へのカルボキシル基導入反応を触媒する新規な好気性の微生物としてリゾビウム・ラジオバクター（Rhizobium radiobacter（旧名：アグロバクテリウム・ツメフェイシェンス（Agrobacterium tumefaciens））ＷＵ−０１０８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９６１）を用いて酵素を産生させ、効率良く芳香族カルボン酸を製造する酵素を見出し、分離精製し、当該酵素であるタンパク質をコードする遺伝子を単離し、その構造を特定する芳香族化合物のベンゼン環への炭酸固定反応を触媒する酵素を分離し、この酵素をコードする遺伝子を単離する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつ炭酸固定反応によりレゾルシノールからγ−レゾルシン酸を選択的に合成する機能を有するタンパク質
【請求項２】
請求項１記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項３】
請求項２記載のベクターを含有する形質転換体。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつ炭酸固定反応によりレゾルシノールからγ−レゾルシン酸を選択的に合成する機能を有するタンパク質
【請求項５】
以下の性質を有するタンパク質。
（１）作用：炭酸固定反応によりレゾルシノールからγ−レゾルシン酸を選択的に合成する
（２）至適温度：３０〜５５℃、安定温度：５０℃以下
（３）分子量：約１３０ｋDa（ゲルろ過クロマトグラフィーによる）、かつ約３４ｋDa（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）の４量体
（４）活性阻害：AgNO３によって阻害される
（５）補酵素の要求性：補酵素の添加を必要としない
【請求項６】
以下の性質を有するタンパク質。
（１）作用：脱炭酸反応によりγ−レゾルシン酸からレゾルシノールを選択的に合成する
（２）至適温度：５０℃〜６５℃、安定温度：６０℃以下
（３）分子量：約１３０ｋDa（ゲルろ過クロマトグラフィーによる）、かつ約３４ｋDa（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）の４量体
（４）活性阻害：ＳＨ阻害剤によって阻害される
（５）補酵素の要求性：補酵素の添加を必要としない
【請求項７】
以下の性質を有するタンパク質。
（１）作用：炭酸固定反応によりカテコールから２，３−ジヒドロキシ安息香酸を選択的に合成する
（２）至適温度：３０〜５５℃、安定温度：５０℃以下
（３）分子量：約１３０ｋDa（ゲルろ過クロマトグラフィーによる）、かつ約３４ｋDa（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）の４量体
（４）活性阻害剤：AgNO３によって阻害される
（５）補酵素の要求性：補酵素の添加を必要としない
【請求項８】
配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質、又は該タンパク質をコードする遺伝子、又は前記遺伝子を含有するベクター又は形質転換体を用いて芳香族カルボン酸を合成することを特徴とする芳香族カルボン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱炭酸反応の逆反応による芳香族化合物への炭酸固定反応により芳香族カルボン酸を合成する酵素および当該酵素をコードする遺伝子に関する。並びに、当該酵素あるいは遺伝子を利用した芳香族カルボン酸の新規合成プロセスに関する。さらに詳しくは、炭酸イオンの存在下で芳香族化合物の分子内に位置選択的にカルボキシル基を導入する特異的な反応を触媒する酵素又は、当該酵素をコードする遺伝子を保有する形質転換体により変換生成され選択的に生産された芳香族カルボン酸を採取することよりなる芳香族カルボン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
芳香族化合物へのカルボキシル基導入反応に関して、最も一般的なものとしてはフェノ−ル化合物へのカルボキシル基導入反応であるコルベ−シュミット反応が提案されている。この反応は多くのフェノ−ル誘導体や縮合多環芳香族化合物、複素環化合物で広く利用されているが、通常１８０〜２００℃の高温条件を必要とし、さらに高収率を得るためには高圧の反応条件を必要とする場合が多い。
【０００３】
たとえばレゾルシン酸はレゾルシノ−ルを原料としてコルベ−シュミット反応により合成されるが、反応は通常１００〜２００℃の温度範囲、常圧または３０ｋｇ／ｃｍ程度までの炭酸ガス圧下において行なわれる（特許文献１）。さらにこのような方法においては、カルボキシル基の導入部位により位置異性体（α−体，β−体，γ−体）が生成し、高純度の製品を得るためには合成後に分離、精製工程を必要とする。
【０００４】
γ−レゾルシン酸を選択性よく高純度で合成する場合、コルベ−シュミット反応に替わる方法として、２，６−ジメトキシ安息香酸を塩化アルミニウムにて脱メチル化してγ−レゾルシン酸を得る方法（非特許文献１）や、２，６−ジクロロ安息香酸を銅化合物と第二級アミン類の存在下で加水分解反応させてγ−レゾルシン酸を得る方法（特許文献２）が提案されている。また、合成したレゾルシン酸の混合物からγ−レゾルシン酸のみを効率的に分離、精製する方法として、レゾルシン酸混合物を含有するｐＨ４．０以上の水溶液を加熱処理してβ−体を分解し、γ−レゾルシン酸を分離、精製する手法が近年報告されている（特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、これらの既存の化学プロセスは一般に高温、高圧を必要とする環境負荷の高いプロセスであり、副生成物の生産を避けられないことも欠点である。
【０００６】
一方、従来の微生物による酵素反応を利用した物質変換プロセスは、常温、常圧下で進行する環境負荷の少ない環境調和型のプロセスであるが、嫌気的条件下での反応を必要とするものである。微生物反応を用いた芳香族化合物へのカルボキシル基の導入に関しては、クロストリジウム・ヒドロキシベンゾイカム（Clostridium hydroxybenzoicum）による、１価のアルコ−ルであるフェノ−ル系化合物に対するカルボキシル化反応が報告されている（非特許文献２）。しかし、当該方法は反応効率が低く、また嫌気的条件での反応を必要するため工業的な芳香族カルボン酸の製造には不適当である。また、芳香族多価アルコ−ルからの芳香族カルボン酸の製造方法も報告されている（特許文献３）。しかし、当該方法も気相部を１００%二酸化炭素で置換する嫌気的条件下反応であり工業的に不適当であるとともに、位置異性体との判別に十分な反応生成物の同定がなされていない。
【０００７】
他方、嫌気的条件を必要としない二酸化炭素固定反応としては、含窒素へテロ環式化合物に対するピロ−ル環のＣ２位へのカルボキシル基の導入が報告されているが（特許文献４）、これは本発明が目的とする芳香族環、厳密にはベンゼン環へのカルボキシル化反応を触媒するものではない。
【０００８】
また、これらの炭酸固定反応に関する酵素であるタンパク質をコードする遺伝子については、クロストリジウム・ヒドロキシベンゾイカム（Clostridium hydroxybenzoicum）の４−ヒドロキシ安息香酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子のみが報告されている（非特許文献３）。しかし、この酵素は前述の通り、工業的な芳香族カルボン酸の製造には不適当であった。
【特許文献１】特開平５−１９４３１３号公報
【特許文献２】特開平１０−３１６６１６号公報
【特許文献３】特開２００１−４６０９３号公報
【特許文献４】特開２０００−１９７４９５号公報
【非特許文献１】J. Chem. Soc., 3499 (1952)
【非特許文献２】J. Bacteriol., vol.178, 3539−3548 (1996)
【非特許文献３】J. Bacteriol., vol.181, 5119−5122 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
すなわち、本発明の解決すべき課題は、芳香族化合物のベンゼン環への炭酸固定反応を触媒し、選択的に芳香族カルボン酸を合成する酵素を分離し、この酵素であるタンパク質をコードする遺伝子を単離して、その構造（特に塩基配列）を特定し、また、これらの遺伝子をそれが単離されたのとは異なる微生物に導入し、芳香族カルボン酸合成能を賦与することにより、新規な芳香族カルボン酸合成微生物を創製することである。また、このような微生物を実際に芳香族化合物のベンゼン環に作用させて、これらの化合物への炭酸固定反応を触媒することにより、これを利用した常温、常圧の環境調和型プロセス及び酸素存在下で芳香族カルボン酸を製造する新規な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、フェノール化合物のＣ２位へのカルボキシル基導入反応を触媒する新規な好気性の微生物としてリゾビウム・ラジオバクター（Rhizobium radiobacter（旧名：アグロバクテリウム・ツメフェイシェンス（Agrobacterium tumefaciens））ＷＵ−０１０８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９６１）を用いて酵素を産生させ、効率良く芳香族カルボン酸を製造する酵素を見出し、分離精製し、当該酵素であるタンパク質をコードする遺伝子を単離し、その構造を特定することにより、本発明を完成した。
【００１１】
本発明の請求項１は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつ炭酸固定反応によりレゾルシノールからγ−レゾルシン酸を選択的に合成する機能を有するタンパク質
【００１２】
本発明の請求項２は、請求項１記載の遺伝子を含むベクターである。
【００１３】
本発明の請求項３は、請求項２記載のベクターを含有する形質転換体である。
【００１４】
本発明の請求項４は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質である。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつ炭酸固定反応によりレゾルシノールからγ−レゾルシン酸を選択的に合成する機能を有するタンパク質
【００１５】
本発明の請求項５は、以下の性質を有するタンパク質である。
（１）作用：炭酸固定反応によりレゾルシノールからγ−レゾルシン酸を選択的に合成する
（２）至適温度：３０〜５５℃、安定温度：５０℃以下
（３）分子量：約１３０ｋDa（ゲルろ過クロマトグラフィーによる）、かつ約３４ｋDa（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）の４量体
（４）活性阻害：AgNO３によって阻害される
（５）補酵素の要求性：補酵素の添加を必要としない
【００１６】
本発明の請求項６は、以下の性質を有するタンパク質である。
（１）作用：脱炭酸反応によりγ−レゾルシン酸からレゾルシノールを選択的に合成する
（２）至適温度：５０℃〜６５℃、安定温度：６０℃以下
（３）分子量：約１３０ｋDa（ゲルろ過クロマトグラフィーによる）、かつ約３４ｋDa（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）の４量体
（４）活性阻害：ＳＨ阻害剤によって阻害される
（５）補酵素の要求性：補酵素の添加を必要としない
【００１７】
本発明の請求項７は、以下の性質を有するタンパク質である。
（１）作用：炭酸固定反応によりカテコールから２，３−ジヒドロキシ安息香酸を選択的に合成する
（２）至適温度：３０℃〜５５℃、安定温度：５０℃以下
（３）分子量：約１３０ｋDa（ゲルろ過クロマトグラフィーによる）、かつ約３４ｋDa（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）の４量体
（４）活性阻害：AgNO３によって阻害される
（５）補酵素の要求性：補酵素の添加を必要としない
【００１８】
本発明の請求項８は、配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質、又は該タンパク質をコードする遺伝子、又は前記遺伝子を含有するベクター又は形質転換体を用いて芳香族カルボン酸を合成することを特徴とする芳香族カルボン酸の製造方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の請求項１は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつ炭酸固定反応によりレゾルシノールからγ−レゾルシン酸を選択的に合成する機能を有するタンパク質
ので、この遺伝子を利用することにより常温、常圧の穏和な反応条件及び酸素存在下で芳香族カルボン酸を高選択的かつ高収率に合成することができる。
【００２０】
本発明の請求項２は、請求項１記載の遺伝子を含むベクターであるので、このベクターを利用することにより常温、常圧の穏和な反応条件及び酸素存在下で芳香族カルボン酸を高選択的かつ高収率に合成することができる。
【００２１】
本発明の請求項３は、請求項２記載のベクターを含有する形質転換体であるので、この形質転換体を利用することにより常温、常圧の穏和な反応条件及び酸素存在下で芳香族カルボン酸を高選択的かつ高収率に合成することができる。
【００２２】
本発明の請求項４は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質である
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつ炭酸固定反応によりレゾルシノールからγ−レゾルシン酸を選択的に合成する機能を有するタンパク質
ので、このタンパク質である酵素を利用することにより常温、常圧の穏和な反応条件及び酸素存在下で芳香族カルボン酸を合成することができ、また酵素反応の特徴である基質特異性及び反応特異性により位置選択的なカルボキシル基導入反応が可能となり、高選択的かつ高収率で特定の基質から目的とする芳香族カルボン酸を合成することができる。
【００２３】
本発明の請求項５は、以下の性質を有するタンパク質である
（１）作用：炭酸固定反応によりレゾルシノールからγ−レゾルシン酸を選択的に合成する
（２）至適温度：３０〜５５℃、安定温度：５０℃以下
（３）分子量：約１３０ｋDa（ゲルろ過クロマトグラフィーによる）、かつ約３４ｋDa（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）の４量体
（４）活性阻害：AgNO３によって阻害される
（５）補酵素の要求性：補酵素の添加を必要としない
ので、このタンパク質である酵素を利用することにより常温、常圧の穏和な反応条件及び酸素存在下で芳香族カルボン酸を高選択的かつ高収率に合成することができる。
【００２４】
本発明の請求項６は、以下の性質を有するタンパク質である
（１）作用：脱炭酸反応によりγ−レゾルシン酸からレゾルシノールを選択的に合成する
（２）至適温度：５０℃〜６５℃、安定温度：６０℃以下
（３）分子量：約１３０ｋDa（ゲルろ過クロマトグラフィーによる）、かつ約３４ｋDa（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）の４量体
（４）活性阻害：ＳＨ阻害剤によって阻害される
（５）補酵素の要求性：補酵素の添加を必要としない
ので、このタンパク質である酵素を利用することにより常温、常圧の穏和な反応条件及び酸素存在下で芳香族化合物を合成することができる。
【００２５】
本発明の請求項７は、以下の性質を有するタンパク質である
（１）作用：炭酸固定反応によりカテコールから２，３−ジヒドロキシ安息香酸を選択的に合成する
（２）至適温度：３０℃〜５５℃、安定温度：５０℃以下
（３）分子量：約１３０ｋDa（ゲルろ過クロマトグラフィーによる）、かつ約３４ｋDa（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）の４量体
（４）活性阻害：AgNO３によって阻害される
（５）補酵素の要求性：補酵素の添加を必要としない
ので、このタンパク質である酵素を利用することにより常温、常圧の穏和な反応条件及び酸素存在下で芳香族カルボン酸を高選択的かつ高収率に合成することができる。
【００２６】
本発明の請求項８は、配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質、又は該タンパク質をコードする遺伝子、又は前記遺伝子を含有するベクター又は形質転換体を用いて芳香族カルボン酸を合成することを特徴とする芳香族カルボン酸の製造方法であるので、このタンパク質である酵素を利用することにより常温、常圧の穏和な反応条件及び酸素存在下で芳香族カルボン酸を合成することができ、また酵素反応の特徴である基質特異性及び反応特異性により位置選択的なカルボキシル基導入反応が可能となり、高選択的かつ高収率で特定の基質から目的とする芳香族カルボン酸を合成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．芳香族カルボン酸合成酵素であるタンパク質をコードする遺伝子
請求項１記載の遺伝子は、（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質又は（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ炭酸固定反応によりレゾルシノールからγ−レゾルシン酸を選択的に合成する機能を有するタンパク質をコードするものである。
【００２８】
上記芳香族カルボン酸合成酵素をコードする遺伝子は、ゲノムプロジェクトで決定されたアグロバクテリウム・ツメフェイシェンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｃ５８株由来のAtu２５２９（Science vol.294（5550），2323-2328（2001））の塩基配列と９２％の相同性を示すが、Atu２５２９がコードするタンパク質の機能は未だ知られていない。また、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来の２，３−ジヒドロキシ安息香酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子（米国特許第６，４４０，７０４号、受託番号：AR224196）の塩基配列とも５４％の相同性を示すが、この遺伝子がコードする２，３−ジヒドロキシ安息香酸脱炭酸酵素は脱炭酸活性については示すが炭酸固定活性の報告はなく、本発明の芳香族カルボン酸合成酵素とはその性質において異なる。一方、芳香族化合物への炭酸固定反応に関する酵素をコードする遺伝子について唯一報告されている前述のクロストリジウム・ヒドロキシベンゾイカム（Clostridium hydroxybenzoicum）の４−ヒドロキシ安息香酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子の塩基配列とは本発明の芳香族カルボン酸合成酵素をコードする遺伝子は明確な相同性を示さなかった。さらに、FASTA及びBLASTプログラムによりデータベース検索を行ったが、上記芳香族カルボン酸合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列と４０％以上の相同性を示す塩基配列は検出されなかった。
【００２９】
請求項１記載の遺伝子のうち、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子については、後述する実施例１に記載された方法により得ることができる。また、これらの遺伝子の塩基配列は、配列番号１に示すように、既に決定されているので、これらの配列を基に適当なプライマーを合成し、たとえば、リゾビウム・ラジオバクター（Rhizobium radiobacter）ＷＵ−０１０８株から調製されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことによっても得ることができる。なお、リゾビウム・ラジオバクター（Rhizobium radiobacter）ＷＵ−０１０８株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９６１として寄託されている。
【００３０】
配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子は、本願の出願時において常用される技術、例えば、部位特異的変異誘発法（Zoller et al., Nucleic Acids Res.10 6487-6500, 1982）により配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子を改変することにより得ることができる。本発明の遺伝子は、芳香族カルボン酸合成に関与する酵素をコードするので、芳香族カルボン酸の生産に利用することができる。
【００３１】
２．芳香族カルボン酸合成酵素であるタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター
請求項２記載のベクターは、上記１．の芳香族カルボン酸合成酵素であるタンパク質をコードする遺伝子を含む。このようなベクターは、本発明の芳香族カルボン酸合成酵素であるタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、公知のベクターに挿入することにより作製することができる。
【００３２】
ＤＮＡ断片を挿入するベクターは、形質転換する宿主に応じて決めればよい。例えば、本発明に係るベクターとしては、プラスミド、ベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター及び酵母ベクターなどが挙げられる。宿主として大腸菌を使用するのであれば、以下のようなベクターを使用するのが好ましい。強力なプロモーターとして、例えば、lac、lacUV5、trp、tac、trc、λpL、T7、rrnBなどを含むpUR系、pGEX系、pUC系、pET系、pT7系、pBluescript系、pKK系、pBS系、pBC系、pCAL系などのベクターを使用するのが好ましい。
【００３３】
３．芳香族カルボン酸合成酵素であるタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有する形質転換体
請求項３記載の形質転換体は、上記２．のベクターを含有する。形質転換体の宿主とする細胞は、植物細胞や動物細胞などであってもよいが、大腸菌などの微生物が好ましい。代表的な菌株としては、Sambrookらの成書Molecular Cloning Laboratory Mannual 2nd ed.に記載されている、71/18、BB4、BHB2668、BHB2690、BL21(DE3)、BNNl02(C600hflA)、C-1a、C600(BNN93)、CES200、CES201、CJ236、CSH18、DH1、DH5、DH5α、DP50supF、ED8654、ED8767、HB101、HMS174、JM101、JM105、JM107、JM109、JM110、K802、KK2186、LE392、LG90、M5219、MBM7014.5、MC1061、MM294、MV1184、MV1193、MZ-1、NM531、NM538、NM539、Q358、Q359、R594、RB791、RR1、SMR10、TAP90、TG1、TG2、XL1-Blue、XS101、XS127、Y1089、Y1090hsdR、YK537などが挙げられる。
【００３４】
本発明の形質転換体は、電気パルス法、コンピテントセル法、接合伝達法、プロトプラスト法など当技術分野において公知の技術を用いて宿主細胞を形質転換又は形質導入することにより取得することができる。これらの方法は、例えば、Sambrookらの成書（前掲）に記載されている。
【００３５】
４．芳香族カルボン酸合成酵素であるタンパク質
請求項４記載の酵素であるタンパク質には、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質が含まれる。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ炭酸固定反応によりレゾルシノールからγ−レゾルシン酸を選択的に合成する機能を有するタンパク質
【００３６】
上記芳香族カルボン酸合成酵素のアミノ酸配列は、アグロバクテリウム・ツメフェイシェンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｃ５８株由来のAtu２５２９がコードするタンパク質（Science vol.294（5550），2323-2328（2001））のアミノ酸配列と９６％の相同性を示すが、前述するようにAtu２５２９がコードするタンパク質の機能は未だ知られていない。また、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来の２，３−ジヒドロキシ安息香酸脱炭酸酵素（米国特許第６，４４０，７０４号、受託番号：AR224196）のアミノ酸配列とも４２％の相同性を示すが、この２，３−ジヒドロキシ安息香酸脱炭酸酵素は脱炭酸活性については示すが炭酸固定活性の報告はなく、本発明の芳香族カルボン酸合成酵素とはその性質において異なる。一方、芳香族化合物への炭酸固定反応に関する酵素をコードする遺伝子について唯一報告されている前述のクロストリジウム・ヒドロキシベンゾイカム（Clostridium hydroxybenzoicum）の４−ヒドロキシ安息香酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列とは本発明の芳香族カルボン酸合成酵素のアミノ酸配列は明確な相同性を示さなかった。さらに、FASTA及びBLASTプログラムによりデータベース検索を行ったが、本発明の芳香族カルボン酸合成酵素のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を示すタンパク質は検出されなかった。
【００３７】
本発明の芳香族カルボン酸合成酵素は、上述の本発明の芳香族カルボン酸合成酵素であるタンパク質をコードする遺伝子を利用して製造することができる。また、配列番号２に記載のアミノ酸配列により表される芳香族カルボン酸合成酵素であるタンパク質は、リゾビウム・ラジオバクター（Rhizobium radiobacter）ＷＵ−０１０８株から常法に従って調製することも可能である。
【００３８】
５．請求項５記載の芳香族カルボン酸合成酵素に包含されるタンパク質の性質を以下（１）〜（５）に示す。
（１）作用：炭酸固定反応によりレゾルシノールからγ−レゾルシン酸を選択的に合成する。
（２）至適温度：３０〜５５℃、安定温度：５０℃以下。
（３）分子量：約１３０ｋDa（ゲルろ過クロマトグラフィーによる）、かつ約３４ｋDa（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）の４量体。
（４）活性阻害：AgNO３によって阻害される。
（５）補酵素の要求性：補酵素の添加を必要としない。
【００３９】
６．請求項６記載の芳香族化合物合成酵素に包含されるタンパク質の性質を以下（１）〜（５）に示す。
（１）作用：脱炭酸反応によりγ−レゾルシン酸からレゾルシノールを選択的に合成する。
（２）至適温度：５０℃〜６５℃、安定温度：６０℃以下
（３）分子量：約１３０ｋDa（ゲルろ過クロマトグラフィーによる）、かつ約３４ｋDa（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）の４量体。
（４）活性阻害：ＳＨ阻害剤によって阻害される。
（５）補酵素の要求性：補酵素の添加を必要としない。
【００４０】
７．請求項７記載の芳香族カルボン酸合成酵素に包含されるタンパク質の性質を以下（１）〜（５）に示す。
（１）作用：炭酸固定反応によりカテコールから２，３−ジヒドロキシ安息香酸を選択的に合成する。
（２）至適温度：３０℃〜５５℃、安定温度：５０℃以下
（３）分子量：約１３０ｋDa（ゲルろ過クロマトグラフィーによる）、かつ約３４ｋDa（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）の４量体。
（４）活性阻害：AgNO３によって阻害される
（５）補酵素の要求性：補酵素の添加を必要としない
【００４１】
本明細書において、芳香族カルボン酸合成酵素の「至適温度」とは、特定のｐＨ（例えば、ｐＨ８．０）において酵素活性を測定したときに、最も高い活性レベルを１００％として、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、最も好ましくは８０％以上の活性レベルを示す温度範囲を指す。
【００４２】
また、本明細書において、芳香族カルボン酸合成酵素の「安定温度」とは、該酵素溶液を種々の温度に一定時間（例えば、３０分間）放置した後、特定の温度（例えば、５０℃）に再調整し、特定のｐＨ（例えば、ｐＨ８．０）において残存する酵素活性を測定したときに、最も高い活性レベルを１００％として、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、最も好ましくは８０％以上の活性レベルを示す温度範囲を指す。
【００４３】
８．芳香族カルボン酸の製造方法
請求項８記載の芳香族カルボン酸の製造方法は、炭酸イオンの存在下で、芳香族化合物の芳香族環にカルボキシル基を導入して芳香族カルボン酸を合成する能力を有する配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質を有する酵素、又は該酵素をコードする遺伝子、又は前記遺伝子を含有するベクター又は形質転換体を用いて芳香族カルボン酸を合成するものである。
【００４４】
したがって、本発明の実施の形態の芳香族カルボン酸を合成する機能を有する酵素及びそれをコードする遺伝子、並びに前記遺伝子を含むベクター及び形質転換体を利用することによって、従来の高温、高圧の反応条件を必要とした化学合成法に代わり、常温、常圧の穏和な反応条件下で芳香族カルボン酸を合成することができる。さらに、酸素存在下で芳香族カルボン酸を合成できるため、嫌気的条件下の反応と比べ二酸化炭素等で置換する必要がなく製造工程を簡略化できる。また、化学合成法よりも省エネルギー的な環境調和型の芳香族カルボン酸合成プロセスの構築が可能になるものと期待できる。さらに、酵素反応の特徴である基質特異性及び反応特異性により位置選択的なカルボキシル基導入反応が可能となり、高選択的かつ高収率で特定の基質から目的とする芳香族カルボン酸合成を可能とすることができる。
【００４５】
以下、本発明の実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
芳香族カルボン酸合成酵素の精製
芳香族カルボン酸合成酵素の産生にはリゾビウム・ラジオバクター（Rhizobium radiobacter）ＷＵ−０１０８株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９６１）を用いた。本株を、以下のようにして培養し、産生酵素をＤＥＡＥトヨパールクロマトグラフィー、HiprepブチルFFクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィーで分画して、約１４倍に精製した。
【００４７】
１．培養操作
表１に示した組成に０．７６ｇ／ｌになるようにγ−レゾルシン酸を加えた合成培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量の坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブ殺菌を行った。これにＬＢ培地に１．５％の寒天を加えたスラント培地で維持している菌体（リゾビウム・ラジオバクター（Rhizobium radiobacter）ＷＵ−０１０８株）を１白金耳接種した。３０℃の恒温室にて１２０ｒｐｍで２日間振とう培養を行い、菌体を増殖させた。十分に増殖した培養液４ｍｌを、表１に示した組成に２．０ｇ／ｌになるようにγ−レゾルシン酸を加えた合成培地２００ｍｌに接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで２日間振とう培養した。培養終了後、培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって菌体を回収した。
【００４８】
【表１】
2005118002.tif 000002
【００４９】
２．酵素精製
タンパク質の精製を行うために、菌体を緩衝液Ａ（５０ｍＭ  リン酸塩、ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波破砕機（ＴＯＭＹ社  Ultrasonic disruptor UD-200）を用いて４℃で２５分間破砕を行った。１６０００ｒｐｍで３０分間遠心を行い、得られた上清をフィルター濾過（０．２２μｍ孔径）し、緩衝液Ａで平衡化した陰イオン交換カラム（東ソー社  TOYOPEARL DEAE ６５０Ｍ）にアプライした。緩衝液Ａで洗浄後、１．０Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａまでの塩化ナトリウムによる直線濃度勾配により溶出を行った。活性画分（０．１０−０．１７Ｍ塩化ナトリウム溶出画分）を集めて１．０Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  リン酸塩、ｐＨ７．０）で１８時間透析を行った。この溶液を１．０Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ｂで平衡化した疎水クロマトカラム（ファルマシア社、Hiprep 16/10 Butyl FF）に供した。活性画分（０．８４−０．７１Ｍ硫酸アンモニウム溶出画分）を集めた後、０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ｂで平衡化した疎水クロマトカラム（ファルマシア社、HiLoad 16/10 Phenyl Sepharose ＨＰ）に供して、溶出された活性画分（０．４６−０．４０Ｍ硫酸アンモニウム溶出画分）を集めた。この結果、活性画分は電気泳動的に均一であることが確認された。
【００５０】
３．酵素活性の測定
３０ｍＭレゾルシノール、１Ｍ炭酸緩衝液５００μｌに酵素溶液５００μｌを加え、４０℃恒温槽にて（全溶液量１ｍｌ）１８時間反応させた。反応終了後、６規定塩酸１０μｌを用いて反応を停止させ、下記の条件で各画分領域を薄層クロマトグラフィーによりγ−レゾルシン酸の生成について定性分析を行った。
展開液；メタノール：クロロホルム：アンモニア（５：１３：０．８）
呈色液；メタノール：アンモニア：０．１ｇ／ｌCuCl２・２H2O水（８：２：１０）
【００５１】
４．比活性の測定
３０ｍＭレゾルシノール、１Ｍ炭酸緩衝液５００μｌに酵素溶液５００μｌを加え、４０℃恒温槽にて（全溶液量１ｍｌ）３０分間反応させた。反応終了後、６規定塩酸１０μｌを用いて反応を停止させ、反応溶液をフィルター濾過（０．２２μｍ孔径）し、高速液体クロマトグラフィーによりγ−レゾルシン酸の生成量について定量分析を行った。各精製段階における酵素活性を表２に示す。なお、高速液体クロマトグラフィーの条件は、カラム：Puresil C18（MILLIPORE社製）、移動相：メタノール：リン酸カリウムバッファー（４０：６０）、送液：０．５ｍｌ／min、カラム温度：４０℃、検出方法：UV吸収波長２５４ｎｍである。また、炭酸固定によるレゾルシノールからレゾルシン酸の合成を下記の反応式に示す。
【００５２】
【化１】
2005118002.tif 000003
【００５３】
【表２】
2005118002.tif 000004
【００５４】
５．分子量の測定
得られた精製酵素タンパクをMicrocon ＹＭ−３０（Amicon社）を用いて濃縮し、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  リン酸塩、ｐＨ７．２）で平衡化したゲル濾過クロマトカラム（ファルマシア社、Superdex２００）にアプライした。標準タンパク質として、チログロブリン（６６７，０００）、フェリチン（３９５，０００）、カタラーゼ（２１５，０００）アドラーゼ（１９１，０００）、アルブミン（６９，８００）、オブアルブミン（４９，４００）、キモトリプシノゲン（２１，２００）、リボヌクレアーゼ（１５，８００）を緩衝液Ａ（２０ｍＭ  リン酸塩、ｐＨ７．２）で平衡化したゲル濾過クロマトカラム（ファルマシア社、Superdex２００）に供し、その溶出時間との比較により本酵素の分子量を約１３０ｋDaと決定した。
【００５５】
６．ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動
Laemmliの方法に従い、１２．５％アクリルアミドゲルを用いて行った。標準タンパク質として、ミオシン（２００，０００）、β−ガラクトシダーゼ（１１６，２５０）、ホスホリラーゼ Ｂ（９７，４００）、血清アルブミン（６６，２００）、オボアルブミン（４５，０００）、脱炭酸酵素（３１，０００）、トリプシン阻害剤（２１，５００）、リゾチーム（１４，４００）およびアプロニチン（６，５００）を電気泳動し、その泳動位置との比較により本酵素の分子量を約３４ｋDaと決定した。各精製過程における芳香族カルボン酸合成酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１に示す。
【００５６】
７．アミノ酸配列の決定
最終クロマトグラフィー分画の酵素を、タカラバイオ株式会社に依頼分析を行い、アミノ末端２２個のアミノ酸配列を決定した。タンパク質のＮ末端アミノ酸配列決定の結果は下記のとおりである。
アミノ末端  NＨ２−MQGKVALEEHFAIPETLQDSAG……−ＣＯＯＨ
（アミノ酸は一文字記号により示してある。）
【実施例２】
【００５７】
組換え大腸菌での芳香族カルボン酸合成活性の確認
芳香族カルボン酸合成酵素をコードする遺伝子の供与体にはリゾビウム・ラジオバクター（Rhizobium radiobacter）ＷＵ−０１０８株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９６１）を、当該酵素発現のための宿主には大腸菌ＢＬ２１株を使用した。リゾビウム・ラジオバクターＷＵ−０１０８株から、以下のようにして当該遺伝子をＰＣＲにより増幅し、組換え大腸菌による芳香族カルボン酸合成活性を確認した。以下にその詳細を説明する。
【００５８】
１．組換え大腸菌の作製
リゾビウム・ラジオバクター（Rhizobium radiobacter）ＷＵ−０１０８株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９６１）から精製された炭酸固定反応によりレゾルシノールからγ−レゾルシン酸を選択的に合成する機能を有する酵素すなわち芳香族カルボン酸合成酵素のＮ末端アミノ酸配列を上記実施例１で決定した。このアミノ酸配列について、FASTA及びBLASTプログラムによりデータベース検索を行った結果、ゲノムプロジェクトで決定されたアグロバクテリウム・ツメフェイシェンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｃ５８株由来のAtu２５２９（Science vol.294（5550），2323-2328（2001））がコードする機能未知のタンパク質のＮ末端アミノ酸配列と一致した。そこで、リゾビウム・ラジオバクター−ＷＵ−０１０８株のAtu２５２９類似タンパク質を大腸菌内で発現させて、当該類似タンパク質の芳香族カルボン酸合成活性を確認した。まず、アグロバクテリウム・ツメフェイシェンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｃ５８株由来のAtu２５２９の塩基配列情報をもとに、以下に示すような開始コドン及び終止コドン付近でのＰＣＲ用プライマーを作製した。
センスプライマー        ５’−AAC TCC ATG GAA GGC AAG GTC−３’
アンチセンスプライマー  ５’−CAT GTC GAC CGA AAG GCT GCA Ｔ−３’
【００５９】
これらのセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いて、リゾビウム・ラジオバクターＷＵ−０１０８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。リゾビウム・ラジオバクターＷＵ−０１０８株からのゲノムＤＮＡの調製を以下のように行った。ＬＢ培地を用いて３０℃で２４時間培養したリゾビウム・ラジオバクターＷＵ−０１０８株の培養液０．１ｍｌを、新鮮な１０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３０℃で２４時間培養した。培養後、菌体を遠心分離により回収し、得られた菌体を１ｍｌのＢ１緩衝液（５０ｍＭ EDTA、５０ｍＭ Tris-HCl、０．５％ Triton X-100、０．２ｍｇ／ｍｌ RNaseA、ｐＨ８．０）に懸濁させた。この懸濁液に、１００ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を２０μｌと２０ｍｇ／ｍｌのProteinase Ｋ溶液を４５μｌ添加して、３７℃で１０分間反応させた。反応液に０．３５ｍｌのＢ２緩衝液（８００ｍＭ GuHCl、２０％ Tween-20、ｐＨ５．５）を添加し、攪拌混合して、５０℃で３０分間反応させ、５秒間ミキサーで攪拌して、菌体反応液を調製した。陰イオン交換樹脂が充填されたQIAGEN GENOMIC-TIP20/G（QIAGEN社製）カラムを２ｍｌのＱＢＴ緩衝液（７５０ｍＭ NaCl、 ５０mM MOPS、 １５％ ethanol、０．１５% Triton X-100、ｐＨ７．０）で平衡化して、菌体反応液をカラムに注入した。カラムを３ｍｌのＱＣ緩衝液（１．０M NaCl、５０mM MOPS、１５％ ethanol、ｐＨ７．０）で洗浄したのち、２ｍｌのＱＦ緩衝液（１．２５M NaCl、５０mM Tris-HCl、１５％ ethanol,ｐＨ８．５）でゲノムＤＮＡ溶液を溶出した。ゲノムＤＮＡ溶液に１．４ｍｌのイソプロパノールを添加してＤＮＡを沈殿させたのち、ガラス棒で巻きとり回収した。回収したＤＮＡを５０μl のＴＥ緩衝液（１０mM Tris-HCl、１mM EDTA、ｐＨ８．０）に溶解してゲノムＤＮＡ溶液を調製した。
【００６０】
調製したリゾビウム・ラジオバクター（Rhizobium radiobacter）ＷＵ−０１０８株のゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件を表３に示す。なお、ＤＮＡ増幅機は、ＰＣ−７００（アステック社製）を用いた。
【００６１】
【表３】
2005118002.tif 000005
【００６２】
上記表３の条件でＰＣＲを行った結果、約１kbpの増幅断片を得た。この約１kbpのＰＣＲ増幅断片をNcoIとSalIで消化した後、pET-21d（＋）ベクターのNcoIとSalI部位に連結し、大腸菌ＢＬ２１株の形質転換に利用した。
【００６３】
２．芳香族カルボン酸合成活性の確認
得られた形質転換体（組換え大腸菌）の芳香族カルボン酸合成活性を確認した。組換え大腸菌のコロニーを白金耳にて２ｍｌのＬＢ培地に植菌し３０℃で２４時間培養し、得られた組換え大腸菌の培養液０．１ｍｌを１ｍＭ ITPGを含む新鮮な１０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３０℃で２４時間培養した。培養後、菌体を遠心分離により回収し、得られた菌体を緩衝液Ａ（５０ｍＭ  リン酸塩、ｐＨ８．０）に懸濁し、活性測定に使用した。なお、酵素活性の測定は上記実施例１に記載の方法により行った。また、対照として、ベクターpET-21d（＋）のみを保持する組換え大腸菌を用いた。
【００６４】
酵素活性測定結果（薄層クロマトグラフィー）を図２に示す。ベクターのみを保持した組換え大腸菌ではγ−レゾルシン酸の生成が確認されなかったが、ＰＣＲ増幅断片を含む組換えプラスミドを保持する大腸菌ではγ−レゾルシン酸の生成が確認された。なお、反応時間１時間でも、同様の結果が得られた。以上から本酵素は芳香族カルボン酸合成活性を示すことが確認された。
【実施例３】
【００６５】
芳香族カルボン酸合成酵素をコードする遺伝子断片のクローニング
芳香族カルボン酸合成酵素をコードする遺伝子のクローニングには、リゾビウム・ラジオバクター（Rhizobium radiobacter）ＷＵ−０１０８株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９６１）を用いた。本株から、以下のようにしてプローブおよび部分ＤＮＡライブラリーを作製し、コロニーハイブリダイゼーションにより当該遺伝子をクローニングした。当該遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。
【００６６】
１．プローブ作製
リゾビウム・ラジオバクターＷＵ-０１０８株のAtu２５２９類似タンパク質が、芳香族カルボン酸合成活性を示すことを実施例２で明らかにした。そこで、リゾビウム・ラジオバクターＷＵ-０１０８株から当該酵素をコードする遺伝子のクローニングを行った。まず、アグロバクテリウム・ツメフェイシェンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｃ５８株由来のＡｔｕ２５２９の塩基配列情報をもとに、プローブ作製のために以下に示すような当該酵素の中央部分約５００bpを増幅するためのPCR用プライマーを作製した。
センスプライマー        ５’−ATT GCT GGA CGG AAC TG−３’
アンチセンスプライマー  ５’−AGC TTC ACC CAG GCA TT−３’
【００６７】
これらのセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いて、実施例２で得た約１kbpの増幅断片を鋳型としてPCRを行った。得られた約５００bpの増幅断片を鋳型として用いてランダムプライム法（マルチプライム法）によりＤＩＧ標識プローブを作製した。ランダムプライム法によるＤＩＧ標識プローブの調製法は、ロッシュ・ダイアグノスティックス社のプロトコールに従った。ＤＩＧ標識プローブの調製法を以下に示す。
【００６８】
得られたＰＣＲ産物１５μlに相当する１μgを沸騰した熱湯中で１０分間熱変性させ、塩を含んだ氷上で冷却した。得られた変性ＤＮＡ溶液に、２μlのヘキサヌクレオチド混合液（０．５Ｍ Tris-HCl、０．１Ｍ MgCl2、１ｍＭ Dithioerythritol、２mg/ml BSA、３．１４３mg/ml Random Primer、ｐＨ７．２）、２μlのｄＮＴＰ標識混合液（１ｍＭ dATP、１ｍＭdCTP、１ｍＭdGTP、０．６５ｍＭdTTP、０．３５ｍＭDIG-dUTP、ｐＨ７．５）及び１μlのKlenow酵素を添加して、３７℃で１８時間反応させた。反応液に、２μlの０．２Ｍ ＥＤＴＡ溶液を添加し、６５℃で１０分間処理して反応を停止させた。次に２０μlのＴＥ緩衝液を添加して、ＤＩＧ標識プローブを調製した。ＤＩＧ標識プローブは、使用前に９９℃で５分間熱変性処理を行なった後に使用した。
【００６９】
２．サザンハイブリダイゼーション
リゾビウム・ラジオバクターＷＵ-０１０８株のゲノムＤＮＡをBamHI、EcoRI、Hind III、PstI、SalI、XbaIで消化した断片に対して、サザンハイブリダイゼーションを行った。ゲノムＤＮＡ約１μgを上述の各制限酵素を用いて３７℃で１時間消化した後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、Hybond N+メンブレンに転写した。上述の方法で調製したＤＩＧ標識プローブを使用して、ゲノムＤＮＡ制限酵素消化物を転写したメンブランに対してハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイズする断片の検出にはDIG-ELISA検出キット（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）を用いた。この結果、PstIおよびSalI消化物ではそれぞれ約８kbpおよび約３．５kbpの長さで、BamHI、EcoRI、Hind III、XbaI消化物では２０kbp以上の長さでハイブリダイズした。このため、SalI消化断片での部分ＤＮＡライブラリーから目的の遺伝子を取得することとした。
【００７０】
３．SalI部分ＤＮＡライブラリーの作製
リゾビウム・ラジオバクターＷＵ-０１０８株のSalI部分ＤＮＡライブラリーは以下のようにして作製した。リゾビウム・ラジオバクターＷＵ-０１０８株のゲノムＤＮＡ標品約１０μgを調製した。ＤＮＡの調製方法は、実施例２に記載のゲノムＤＮＡの調製方法により行った。このゲノムＤＮＡを１０ユニットのSalIを用いて３７℃で２時間消化した後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、約３〜４kbpの断片に相当する電気泳動位置のゲル約３００mgを切り出し、QIAEX IIキット（キアゲン社）を用いて目的断片の精製を行い、滅菌水２０μlに溶解した。得られたＤＮＡ溶液１μlをSalI消化した後BAP処理したpUC１８ベクター１μgと３weissUのT４ＤＮＡリガーゼ存在下に４℃１８時間反応させた。反応混合物を用いて大腸菌JM１０９株を形質転換し、SalI部分ＤＮＡライブラリーを作製した。
【００７１】
４．コロニーハイブリダイゼーション
芳香族カルボン酸合成酵素をコードする遺伝子断片のスクリーニングは、上述の方法で調製したＤＩＧ標識プローブを使用して、上述のSalI部分ライブラリーのコロニーを転写したHybond N+メンブレンに対してコロニーハイブリダイゼーションにより行った。ハイブリダイズする断片の検出にはDIG-ELISA検出キット（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）を用いた。SalI部分ライブラリーにより約２００個にコロニーについてスクリーニングを行った結果、１コロニーの陽性プラ−クが得られた。この陽性コロニーを単離し、プラスミド抽出を行い、SalI消化による解析を行った結果、約３．４kbpのSalI断片が挿入されていた。この結果は、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーションの結果と一致した。
【００７２】
５．塩基配列の決定
得られた約３．４kbpのSalI断片について、DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit（アマシャムバイオサイエンス）を用いて行い、ABI Prism３１０（アプライドバイオシステムズ）により塩基配列を決定した。得られた塩基配列データは、GENETYX-MAC/ATSQ v ３．０およびGENETYX-Win v ６．０を用いて解析した。
【００７３】
決定された配列中のＯＲＦを検索した結果、９８４bpのＯＲＦ（終止コドンを含む）が見つかった。このＯＲＦは３２７個のアミノ酸をコードし推定分子量は約３７ｋＤａであった。このＯＲＦを含む塩基配列を配列番号１に、その塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、このＯＲＦは実施例２で得た約１kbpの増幅断片の塩基配列と同一であった。さらに、相同性検索の結果、このＯＲＦの塩基配列は、ゲノムプロジェクトで決定されたアグロバクテリウム・ツメフェイシェンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｃ５８株由来の機能未知のタンパク質をコードするＡｔｕ2529と塩基配列で９２％、アミノ酸配列で９６％の相同性を示した。さらに、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来の２，３−ジヒドロキシ安息香酸脱炭酸酵素と塩基配列で５４％、アミノ酸配列で４５％の相同性を示したが、他に４０％以上の相同性を示すタンパク質は検出されなかった。
【実施例４】
【００７４】
γ−レゾルシン酸からレゾルシノールの選択的合成
２０ｍＭγ-レゾルシン酸、５０ｍＭリン酸緩衝液９００μｌに実施例１の方法に従い精製した酵素溶液１００μｌを加え、５０℃恒温槽にて（全溶液量１ｍｌ）３０分間反応させた。反応終了後、６規定塩酸１０μｌを用いて反応を停止させ、下記の条件で薄層クロマトグラフィーによりレゾルシノールの生成について定性分析を行った。
展開液；メタノール：クロロホルム：アンモニア（５：１３：０．８）
呈色液；メタノール：アンモニア：０．１ｇ／ｌCuCl２・２H2O水（８：２：１０）
また、反応溶液をフィルター濾過（０．２２μｍ孔径）し、高速液体クロマトグラフィーによりレゾルシノールの生成量について定量分析を行った。なお、高速液体クロマトグラフィーの条件は、カラム：Puresil C18（MILLIPORE社製）、移動相：メタノール：リン酸カリウムバッファー（４０：６０）、送液：０．５ｍｌ／min、カラム温度：４０℃、検出方法：UV吸収波長２５４ｎｍである。
【００７５】
最終的に０．８９ｍＭのレゾルシノールが生成された。 
【実施例５】
【００７６】
カテコールから２，３−ジヒドロキシ安息香酸の選択的合成
基質に３０ｍＭカテコール、１Ｍ炭酸緩衝液５００μｌに実施例１の方法に従い精製した酵素溶液５００μｌを用いて実施例１と同様の操作によって合成反応を行い、薄層クロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーにより分析を行った。本酵素によって、最終的に１ｍＭの２，３−ジヒドロキシ安息香酸を生成した。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
芳香族化合物のベンゼン環への炭酸固定反応を触媒する酵素を分離し、この酵素をコードする遺伝子を単離して、これを利用した常温、常圧の環境調和型プロセス及び酸素存在下で芳香族カルボン酸を製造することができ、且つ、酵素反応の特徴である基質特異性及び反応特異性により位置選択的なカルボキシル基導入反応が可能となり、高選択的かつ高収率で特定の基質から目的とする芳香族カルボン酸を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明の実施例１におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示すチャートである。
【図２】本発明の実施例２における組換え大腸菌の活性測定結果を示すチャートである。
【図１】
2005118002.tif 000006
【図２】
2005118002.tif 000007
【配列表】
2005118002000001.app