(57)【要約】【課題】本発明は、迅速かつ簡便に核酸結合タンパク質を検出する方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明に係る核酸結合タンパク質の検出方法は、以下の工程を含むことを特徴としている。（１） 核酸結合タンパク質が特異的に結合可能な認識配列を含む二本鎖核酸プローブと標的試料とを接触させる工程、（２） 工程１の後、前記二本鎖核酸プローブを、核酸を３'末端から分解するエキソヌクレアーゼ、または核酸を伸長できない塩基数まで消化しうるエンドヌクレアーゼで消化する工程、（３） 工程２の後、消化された二本鎖核酸プローブの３'末端から、相補鎖合成用基質により、相補的な塩基配列を含む核酸を合成する工程、（４） 工程３において、相補的な塩基配列を含む核酸が合成されたときに、核酸結合タンパク質の存在を検出する工程。【選択図】  図１2005269957.tif 000006
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、核酸結合タンパク質の検出方法；
（１） 核酸結合タンパク質が特異的に結合可能な認識配列を含む二本鎖核酸プローブと標的試料とを接触させる工程、
（２） 工程１の後、前記二本鎖核酸プローブを、核酸を３'末端から分解するエキソヌクレアーゼ、または核酸を伸長できない塩基数まで消化しうるエンドヌクレアーゼで消化する工程、
（３） 工程２の後、消化された二本鎖核酸プローブの３'末端から、相補鎖合成用基質により、相補的な塩基配列を含む核酸を合成する工程、
（４） 工程３において、相補的な塩基配列を含む核酸が合成されたときに、核酸結合タンパク質の存在を検出する工程。
【請求項２】
前記工程２において、前記二本鎖核酸プローブを、エキソヌクレアーゼで消化することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記相補鎖合成用基質が、検出用に標識された基質を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
二本鎖核酸プローブを、予測される核酸結合タンパク質に対して過剰量用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
二本鎖核酸プローブの一方の３'末端が、ヌクレアーゼ耐性を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記二本鎖核酸プローブが、ヘアピン−ループ構造であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記核酸結合タンパク質が特異的に結合可能な認識配列が、１〜３０塩基からなることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記二本鎖核酸プローブが、二本鎖ＤＮＡプローブであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記二本鎖核酸プローブが、二本鎖ＲＮＡプローブであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
以下の工程を含む、核酸結合タンパク質の二本鎖核酸プローブへの結合を阻害または促進する化合物のスクリーニング方法；
（１） 標的化合物と、核酸結合タンパク質または核酸結合タンパク質が特異的に結合可能な認識配列を含む二本鎖核酸プローブとを接触させる工程、
（２） 工程１の後、工程１で用いなかった前記二本鎖核酸プローブまたは前記核酸結合タンパク質を混合する工程、
（３） 工程２の後、核酸を３'末端から分解するエキソヌクレアーゼ、または核酸を伸長できない塩基数まで消化しうるエンドヌクレアーゼで消化する工程、
（４） 工程３の後、消化された二本鎖核酸プローブの３'末端から、相補鎖合成用基質により、相補的な塩基配列を含む核酸を合成する工程、
（５） 工程４の後、相補的な塩基配列を含む核酸が合成されたか否かを確認する工程、
（６） 工程５において、
（ａ） 相補的な塩基配列を含む核酸が合成されなかったとき、または予測される相補的な塩基配列を含む核酸の合成量が低下したときに、前記標的化合物が、核酸結合タンパク質結合阻害化合物である、
（ｂ） 相補的な塩基配列を含む核酸が予測される相補的な塩基配列を含む核酸の合成量より増加したときに、前記標的化合物が、核酸結合タンパク質結合促進化合物である、
と判定する工程。
【請求項１１】
前記工程２において、前記二本鎖核酸プローブを、エキソヌクレアーゼで消化することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記相補鎖合成用基質が、検出用に標識された基質を含むことを特徴とする請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
標的化合物を、二本鎖核酸プローブに対して過剰量用いることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記二本鎖核酸プローブが、二本鎖ＤＮＡプローブであることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記二本鎖核酸プローブが、二本鎖ＲＮＡプローブであることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
核酸結合タンパク質が特異的に結合可能な認識配列を含む二本鎖核酸プローブ、二本鎖の核酸を認識して３'末端から分解するエキソヌクレアーゼまたは核酸を伸長できない塩基数まで消化しうるエンドヌクレアーゼ、および相補鎖合成用基質で構成されることを特徴とする核酸結合タンパク質検出キット。
【請求項１７】
核酸結合タンパク質、核酸結合タンパク質が特異的に結合可能な認識配列を含む二本鎖核酸プローブ、二本鎖の核酸を認識して３'末端から分解するエキソヌクレアーゼまたは核酸を伸長できない塩基数まで消化しうるエンドヌクレアーゼ、および相補鎖合成用基質で構成されることを特徴とする二本鎖核酸結合阻害または促進化合物のスクリーニングキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸結合タンパク質の検出方法に関する。また、核酸結合タンパク質の核酸結合阻害または促進化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
転写因子をはじめとするＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡに結合することにより遺伝子の発現などの調節を行うタンパク質であり、ＤＮＡ−タンパク質相互作用の解析は遺伝子機能を理解する上で非常に重要である。近年、ＤＮＡ結合タンパク質の研究は、分子機構の解明、癌その他の重要疾患の病態のプロテオーム解析のみならず、これらの成果を基にした新しい分子診断・分子治療、創薬などの分野での応用が期待されている。
【０００３】
ＤＮＡ結合タンパク質の検出のため、これまで、各種の方法が試みられている。
【０００４】
たとえば、従来、ゲルシフトアッセイ法と呼ばれるＤＮＡ結合タンパク質の検出方法が知られている。この検出方法は、ＤＮＡ−タンパク質複合体をアクリルアミドゲル、またはアガロースゲル中で電気泳動した場合、ＤＮＡのみの場合と比べて移動度が遅れることを利用した検出法である。検出はDNAを[32P]等で標識することで行う（非特許文献１）。
しかし、ＤＮＡ−タンパク質複合体は、複合体を形成したまま泳動すると、ＤＮＡのみの場合に比べ泳動速度が遅くなり、たとえば、検出に数時間程度の時間がかかる。
【０００５】
また、フットプリンティング法と呼ばれる方法も知られている。この方法は、特定の遺伝子配列を認識し、結合するタンパク質因子の存在を同定し、その結合する遺伝子部位を決定する方法である。片末端を[32P]などで標識したＤＮＡ断片を細胞抽出液ないしその精製分画とインキュベートした後、ヌクレアーゼや化学処理によって塩基配列非特異的に切断する。反応精製物を電気泳動すると一塩基ずつ長さの違うバンドが現れるが、タンパク質が結合した部位は切断から保護されるためその位置のバンドが消失し、結合部位の同定を行うことができる。（非特許文献２）しかし、この方法は、結果の定量が困難であること、ランダムにＤＮＡを分解するためＤＮＡ結合タンパク質が結合していた位置を特定することが困難で、また特異的な吸着であるかどうかの判断ができない。
【０００６】
また、マイクロプレートでの検出法と呼ばれる方法も知られている。これは、ＤＮＡ結合タンパク質検出用キットとして市販もされている（たとえば、クロンテック社、Active motif社（フナコシが販売））もので、９６穴マイクロプレートにＤＮＡが固定化されており、これに測定サンプルを反応させ、抗体で検出を行う方法である。しかしながら、抗体は高価であり、既知のタンパク質しか検出できない。
【０００７】
また、二本鎖ＤＮＡアレイを用いる方法も知られている（非特許文献３、４、５）。この方法は、二本鎖ＤＮＡをガラス基板などにアレイ化し、基板上で測定サンプルを反応させた後、ＤＮＡに結合したタンパク質を抗体などを用いて検出する方法である。しかし、抗体は高価であり、また、一般に検出は二次抗体を必要とする。
【０００８】
さらに、表面プラズモン共鳴(SPR)法を用いる方法も知られている。この方法は、ＳＰＲの原理を利用した検出法でセンサーとなる金薄膜にDNAまたは、タンパク質を固定化し、測定サンプルと反応させ、結合したタンパク質あるいは、ＤＮＡを検出する（非特許文献６）。しかし、この方法では、固相で反応が行われるため、反応が制限され、また装置が高価である。
【０００９】
またさらに、サウスウェスタン法という方法も知られている。この方法は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法にてタンパク質を分離した後、ニトロセルロースフィルターなどへ転写する。これに、[32P]などで標識したDNAをプローブとして用い、ＤＮＡプローブと標的物質との結合を測定の指標とする方法である（非特許文献７）。しかし、この方法では操作が煩雑であり、また、タンパク質をニトロセルロースフィルターに転写することにより、ＤＮＡとの結合能が低下または失活するという問題があった。
【非特許文献１】Fried, R. W., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res 23, 6505-6525 (1981)
【非特許文献２】Galas, D., Schmitz, A. DNase footprinting: A simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Rel 5, 3157-3170 (1978)
【非特許文献３】Carlson, R., Brent, R. Double-stranded DNA arrays:next steps in the surface campaign. Nat Biotechnol 17, 536-537 (1999).
【非特許文献４】Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nat Biotechnol 17, 573-577 (1999).
【非特許文献５】Bulyk, M. L., Huang, X. H., Choo, Y., Church, G. M. Exploring the DNA-binding specificities of zinc fingers with DNA microarrays. Proc Natl Acad Sci USA 98, 7158-7163 (2001).
【非特許文献６】Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. Study of Protein-DNA Interactions by Surface-Plasmon Resonance (Real-Time Kinetics). Nucleic Acids Res 19, 2788-2788. (1991)
【非特許文献７】Singh, H., Lebowitz, J. H., Baldwin, A. S., Sharp, P.  .Molecular-Cloning of an Enhancer Binding-Protein - Isolation by Screening of an Expression Library with a Recognition Site DNA. Cell 52, 415-423 (1988).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記のような従来技術に基づく課題を解決しようとするものであって、迅速かつ簡便に、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸に結合するタンパク質（核酸結合タンパク質）を検出する方法を提供することを課題とする。また、本発明は、迅速かつ簡便に核酸結合タンパク質の核酸への結合阻害／促進化合物のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
〔１〕以下の工程を含む、核酸結合タンパク質の検出方法；
（１） 核酸結合タンパク質が特異的に結合可能な認識配列を含む二本鎖核酸プローブと標的試料とを接触させる工程、
（２） 工程１の後、前記二本鎖核酸プローブを、核酸を３'末端から分解するエキソヌクレアーゼ、または核酸を伸長できない塩基数まで消化しうるエンドヌクレアーゼで消化する工程、
（３） 工程２の後、消化された二本鎖核酸プローブの３'末端から、相補鎖合成用基質により、相補的な塩基配列を含む核酸を合成する工程、
（４） 工程３において、相補的な塩基配列を含む核酸が合成されたときに、核酸結合タンパク質の存在を検出する工程。
〔２〕前記工程２において、前記二本鎖核酸プローブを、エキソヌクレアーゼで消化することを特徴とする〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記相補鎖合成用基質が、検出用に標識された基質を含むことを特徴とする〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕二本鎖核酸プローブを、予測される核酸結合タンパク質に対して過剰量用いることを特徴とする〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕二本鎖核酸プローブの一方の３'末端が、ヌクレアーゼ耐性を有することを特徴とする〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕前記二本鎖核酸プローブが、ヘアピン−ループ構造であることを特徴とする〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕前記核酸結合タンパク質が特異的に結合可能な認識配列が、１〜３０塩基からなることを特徴とする〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕前記二本鎖核酸プローブが二本鎖ＤＮＡプローブであることを特徴とする〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕前記二本鎖核酸プローブが二本鎖ＲＮＡプローブであることを特徴とする〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕以下の工程を含む、核酸結合タンパク質の二本鎖核酸プローブへの結合を阻害または促進する化合物のスクリーニング方法；
（１） 標的化合物と、核酸結合タンパク質または核酸結合タンパク質が特異的に結合可能な認識配列を含む二本鎖核酸プローブとを接触させる工程、
（２） 工程１の後、工程１で用いなかった前記二本鎖核酸プローブまたは前記核酸結合タンパク質を混合する工程、
（３） 工程２の後、核酸を３'末端から分解するエキソヌクレアーゼ、または核酸を伸長できない塩基数まで消化しうるエンドヌクレアーゼで消化する工程、
（４） 工程３の後、消化された二本鎖核酸プローブの３'末端から、相補鎖合成用基質により、相補的な塩基配列を含む核酸を合成する工程、
（５） 工程４の後、相補的な塩基配列を含む核酸が合成されたか否かを確認する工程、
（６） 工程５において、
(a)相補的な塩基配列を含む核酸が合成されなかったとき、または予測される相補的な塩基配列を含む核酸の合成量が低下したときに、前記標的化合物が、核酸結合タンパク質結合阻害化合物である、
(b)相補的な塩基配列を含む核酸が予測される相補的な塩基配列を含む核酸の合成量より増加したときに、前記標的化合物が、核酸結合タンパク質結合促進化合物である、
と判定する工程。
〔１１〕前記工程２において、前記二本鎖核酸プローブを、エキソヌクレアーゼで消化することを特徴とする〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕前記相補鎖合成用基質が、検出用に標識された基質を含むことを特徴とする〔１０〕または〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕標的化合物を、二本鎖核酸プローブに対して過剰量用いることを特徴とする〔１０〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕前記二本鎖核酸プローブが二本鎖ＤＮＡプローブであることを特徴とする〔１０〕〜〔１３〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕前記二本鎖核酸プローブが二本鎖ＲＮＡプローブであることを特徴とする〔９〕〜〔１３〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕核酸結合タンパク質が特異的に結合可能な認識配列を含む二本鎖核酸プローブ、二本鎖の核酸を認識して３'末端から分解するエキソヌクレアーゼまたは核酸を伸長できない塩基数まで消化しうるエンドヌクレアーゼ、および相補鎖合成用基質で構成されることを特徴とする核酸結合タンパク質検出キット。
〔１７〕核酸結合タンパク質、核酸結合タンパク質が特異的に結合可能な認識配列を含む二本鎖核酸プローブ、二本鎖の核酸を認識して３'末端から分解するエキソヌクレアーゼまたは核酸を伸長できない塩基数まで消化しうるエンドヌクレアーゼ、および相補鎖合成用基質で構成されることを特徴とする二本鎖核酸結合阻害または促進化合物のスクリーニングキット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の核酸結合タンパク質の検出方法によれば、迅速かつ簡便に核酸結合タンパク質を検出することができる。また、本発明の核酸結合タンパク質の二本鎖核酸プローブへの結合を阻害または促進する化合物のスクリーニング方法によれば、迅速かつ簡便に核酸結合タンパク質結合促進／阻害化合物をスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
＜核酸結合タンパク質の検出方法＞
本発明に係る核酸結合タンパク質の検出方法は、以下の工程（１）〜（４）を含むことを特徴としている。
（１） 核酸結合タンパク質が特異的に結合可能な認識配列を含む二本鎖核酸プローブと標的試料とを接触させる工程、
（２） 工程１の後、前記二本鎖核酸プローブを、核酸を３'末端から分解するエキソヌクレアーゼ、または核酸を伸長できない塩基数まで消化しうるエンドヌクレアーゼで消化する工程、
（３） 工程２の後、消化された二本鎖核酸プローブの３'末端から、相補鎖合成用基質により、相補的な塩基配列を含む核酸を合成する工程、
（４） 工程３において、相補的な塩基配列を含む核酸が合成されたときに、核酸結合タンパク質の存在を検出する工程。
【００１４】
工程１
前記工程（１）においては、核酸結合タンパク質が特異的に結合可能な結合部位を含む二本鎖核酸プローブ（以下、二本鎖核酸プローブ中の二本鎖核酸の部分を「ステム」ということがある。）と標的試料とを接触させる。
【００１５】
工程１においては、標的試料中に核酸結合タンパク質が含有されている場合には、該核酸結合タンパク質は、核酸中の特異的に結合可能な認識配列に結合する。このような核酸としては、たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。また、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドであってもよい。
【００１６】
したがって、核酸がＤＮＡの場合、前記二本鎖核酸プローブは二本鎖ＤＮＡプローブであり、前記核酸がＲＮＡの場合、前記二本鎖核酸プローブは二本鎖ＲＮＡプローブである。さらにこれらの二本鎖核酸プローブは、二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡの類縁体であってもよい。
【００１７】
このような、二本鎖核酸プローブと結合する核酸結合タンパク質は、公知のものであっても未知のものであってもよい。なお、核酸結合タンパク質は、一本鎖または二本鎖のいずれの鎖を認識するタンパク質でもよい。
【００１８】
例えば、タンパク質と認識配列が公知の場合、該公知のタンパク質の有無を検出できる。
【００１９】
たとえば、公知のＤＮＡ結合タンパク質としては、λファージ転写因子croタンパク質、ATF2、c-Fos、DP-1、c-Myb、c/EBP、CREB、FosB、E2F-1、c-Myc 、Egr-1、c-Fos、c-Jun、E2F-2、Infl 1、Infl 2、Onc 1、Onc 2、Onc 3、Max、HIF-1α、c-Rel、JunD、Rb、USF1、HIF-1β、NFκB p50、Sp-1、p107、USF2、Oct I、NFκB p65、 STAT1、Sp-1、p53、Oct IIなどが挙げられる。
【００２０】
またＲＮＡ結合タンパク質としては、DRBP (dsRNA binding proteins)などがあり、たとえば、DRBP76、PACT、RAXなどが挙げられる。
【００２１】
未知のタンパク質を用いる場合、たとえば、該未知のタンパク質を含む標的試料と、二本鎖核酸プローブとを接触させ、結合した部位に対応する認識配列を決定することができる。また、結合タンパク質の結合力の強弱測定や定量測定にも利用することができる。
【００２２】
本発明で用いる核酸結合タンパク質が特異的に結合可能な認識配列を含む二本鎖核酸プローブは、核酸合成機を用いて化学的に合成することができる。また、微生物やＰＣＲ法を利用して生物学的に増幅した核酸を二本鎖核酸プローブとすることもできる。
【００２３】
本発明で用いる二本鎖核酸プローブ中に含まれる特異的に結合可能な認識配列は公知の配列を含み、通常、該認識配列の核酸の鎖長は、好ましくは１〜３０塩基、さらに好ましくは８〜３０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基である。
【００２４】
このような認識配列は３'末端から、好ましくは１０〜３０塩基、さらに好ましくは１５〜２５塩基下流に配置している。このような３'末端から始まる塩基配列（以下「３'末端配列」ということがある。）の配列は特に限定されない。認識配列の上流に存在する該３'末端配列が上記の長さの鎖長であると、工程４において合成された相補鎖により核酸結合タンパク質を検出するのに好適である。また、工程２における消化酵素による分解を適度な時間で完了することができる。
【００２５】
また、ステム部分の長さは、好ましくは１１〜６０塩基、さらに好ましくは１６〜５５塩基、より好ましくは３０〜５０塩基である。ステムがこの範囲の長さであると、操作の利便性が向上する、消化時間および標識時間が短縮される、擬陽性の出現を低下させるといった利点がある。
【００２６】
本発明では、二本鎖核酸プローブは、全体として１本鎖であっても、２本鎖であってもよい。
【００２７】
全体として二本鎖の場合に、工程２においてエキソヌクレアーゼを用いるときは、二本鎖核酸プローブの３'末端の一方は、エキソヌクレアーゼに対して耐性を有することが好ましい。３'末端の一方がこのようなヌクレアーゼ耐性を有することにより、検出感度の向上および検出の安定性の向上を図ることができる。
【００２８】
二本鎖核酸プローブにヌクレアーゼ耐性を与える方法は、片側が突出した末端をもつ構造であってもよく特に限定されるものではない。このため、この分野において通常用いられる方法をいずれも利用することができる。また、片側の鎖が固定化担体に固定化されている構造をもつものであってもかまわない。
【００２９】
たとえば、ＤＮＡ合成装置などの核酸合成装置で二本鎖核酸プローブを合成するときに、公知の方法によって必要な部位にホスホロチオエート(Phosphorothioate)結合を導入すれば、該二本鎖核酸プローブにヌクレアーゼ耐性を与えることができる。
【００３０】
このような方法としては、たとえば、固相ホスホルアミダイト（Phosphoramidite）法で核酸を合成する場合であれば、ヨウ素水等による酸化工程に代えて適当なＳ化試薬（ホスホロチオエート化試薬）によって酸化処理を行うことで通常のリン酸ジエステル結合ではなくホスホロチオエート結合を二本鎖核酸プローブに導入することができる。Ｓ化試薬としては、３Ｈ−１，２−benzodithiole-3-one1,1-dioxide(Beaucage's Reagent)、TETD/Acetonitrile(TETD:tetraethylthiuram disulfide)等が知られている。この方法によれば、ホスホロチオエート結合を二本鎖核酸プローブの任意の部位に導入することができる。
【００３１】
また、核酸のうち、ＤＮＡへのヌクレアーゼ耐性を付与する方法として、たとえばＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡを合成する際に、デオキシリボヌクレオシドトリリン酸のα位のリン原子に結合した酸素を硫黄に置換したものを基質として用いることによって、二本鎖ＤＮＡプローブにホスホロチオエート結合を導入することができる。このような置換化合物としては、α−Ｓ−デオキシチミジントリリン酸、α−Ｓ−デオキシシトシントリリン酸、α−Ｓ−デオキシアデニントリリン酸、およびα−Ｓ−デオキシグアニントリリン酸等（これらの置換化合物を総称してＳｄＸＴＰという。）が挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼによる合成反応を行うときに、デオキシヌクレオシドトリリン酸（ｄＸＴＰ）に代えて、ＳｄＸＴＰを基質とすることにより、合成された二本鎖ＤＮＡプローブは、ホスホロチオエート化され、ヌクレアーゼ耐性を得ることができる。
【００３２】
なお、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡへの取り込みの効率はＳｄＸＴＰがｄＸＴＰよりかなり低いので、始めにＳｄＸＴＰを取り込ませた後に、分解用のｄＸＴＰを加えるか、あるいはＳｄＸＴＰ濃度を高めに設定しておくことが必要である。
【００３３】
他のヌクレアーゼ耐性の付与手段としては、前記ホスホロチオエート化の他に、メチルホスホネート（Methylphosphonate）結合、ホスホロアミデート（Phosphoroamidate）結合、ポリアミド核酸（Polyamide nucleic acid(PNA)）結合等の導入方法が挙げられる。これらの結合によって二本鎖核酸プローブのリン酸結合部位、リボース部位、核酸の塩基部位が修飾、あるいは構造をモディファイされてヌクレアーゼ耐性を得ることができる。
【００３４】
また、ＤＮＡアレイのように多数のプローブを基板等に固定して配置したものでもよい。このとき、片鎖が固定化されているため、ヌクレアーゼ耐性とすることができる。
【００３５】
核酸が全体として一本鎖の場合、２本鎖核酸プローブは、ヘアピン−ループ構造（ステム−ループ構造）であることが好ましい。ヘアピン−ループ構造の核酸は、核酸合成機を用いて化学的に合成することができる。また、微生物やＰＣＲ法を利用して生物学的に増幅して合成することもできる。
このような通常の方法により、両末端からの一定の塩基が互いに相補的で、その中に特異的に結合可能な認識配列を含み、中心にループ部分を有する核酸を合成する。中心のループ部分の塩基数は、好ましくは３〜１０塩基、さらに好ましくは４〜８塩基である。
【００３６】
たとえば、核酸を、緩衝液等の溶液中、８０〜１００℃の範囲で５〜６０分程度インキュベートし、その後徐々に０〜１０℃に冷却することにより、ヘアピン−ループ構造を有する二本鎖ＤＮＡプローブを得ることができる。
【００３７】
本発明で用いる二本鎖核酸プローブは、５'末端は特に修飾する必要はなく、たとえば、リン酸化というような処理は不要である。
【００３８】
核酸結合タンパク質と前記二本鎖核酸プローブとの接触は、通常、溶媒中、好ましくは２０〜４５℃、さらに好ましくは３０〜４０℃程度で、５分〜３０分程度の時間インキュベートして行う。溶媒として緩衝液を用いる場合、緩衝液としてはたとえばトリス−塩酸緩衝液等を好ましく用いることができ、この場合、ｐＨは好ましくは７〜９、さらに好ましくは７．５〜８．５である。
【００３９】
標的となる核酸結合タンパク質の量を正確に予め予測することは困難な場合があるが、二本鎖核酸プローブの使用量は、予想される核酸結合タンパク質１モルに対して、好ましくは０．５〜１００モル、さらに好ましくは１〜１０モルであり、過剰量用いることが望ましい。過剰量の二本鎖核酸プローブを用いることにより、高い検出感度を確保することができる。
【００４０】
工程１〜工程４は連続して行うことが可能であり、工程３において行う相補鎖合成のため、工程１の段階から予めデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）や、検出用の核酸を混合しておいてもよい。
【００４１】
工程２
前記工程２は、工程１の後、前記二本鎖核酸プローブを消化酵素で消化する工程である。消化酵素としては、核酸を３'末端から分解するエキソヌクレアーゼ、または核酸を伸長できない塩基数まで消化しうるエンドヌクレアーゼが挙げられる。
【００４２】
二本鎖の核酸を認識して３'末端から分解するエキソヌクレアーゼとしては、エキソヌクレアーゼIII(ExonucleaseIII（ExoIII)）などが挙げられる。
エキソヌクレアーゼIIIは、二本鎖の核酸を認識して３'末端から分解する活性を有するものであればその由来は限定されない。たとえば、大腸菌由来のものが挙げられ、他の微生物、あるいは遺伝子組換えにより得られたものを利用することもできる。
【００４３】
本発明で用いることのできるエンドヌクレアーゼは、核酸結合タンパク質非存在下で、核酸を伸長できない塩基数まで消化できるエンドヌクレアーゼである。再伸長反応は通常、公知のポリメラーゼを用いて行うことができる。
このような、通常、ポリメラーゼにより再伸長できない塩基数（残存する塩基数）は、好ましくは４塩基以下、さらに好ましくは０〜３塩基である。
【００４４】
このような、核酸を再伸長できない塩基数まで消化できるエンドヌクレアーゼとしては、たとえば、核酸中の一方の鎖にニックを導入するエンドヌクレアーゼが挙げられ、たとえば、DNaseI （Deoxyribonuclease I）、S1 Nuclease、Mung Bean Nuclease、Micrococcal Nuclease、RNase、RNase A、RNaseT1などが挙げられる。
また、RNA-DNAハイブリッドを特異的に認識するRNaseH（Ribonuclease H）やDNA Topoisomeraseなどの修飾酵素を用いて核酸にニックを導入してもよい。
【００４５】
これらのうちでは、エキソヌクレアーゼを用いることが、反応の安定性、反応モデル構築の簡便性などの点から好ましい。
【００４６】
前記二本鎖核酸プローブの消化は、たとえばエキソヌクレアーゼIIIを用いる場合、工程１の後、エキソヌクレアーゼIIIの存在下に行う。反応は、好ましくは２０〜４５℃、さらに好ましくは３０〜４０℃の温度で、２分〜２０分程度行う。反応は、工程１から連続して行っても、いったん工程１における反応生成物を分離してから工程２を実施してもよい。
工程１と分離して行う場合、溶媒としては、工程１と同様の溶媒を用いることができる。
【００４７】
消化酵素の使用量は、二本鎖核酸プローブ１モルに対して、好ましくは１〜１００モルである。
【００４８】
エキソヌクレアーゼによる消化は、ステムの３'末端から進むが、前記工程１において、核酸結合タンパク質が結合している二本鎖の核酸では、該核酸結合タンパク質の存在により、消化が途中で停止する。すなわち、核酸結合タンパク質が結合した二本鎖核酸プローブは、３'末端を有する二本鎖が残存する。一方、工程１において、核酸結合タンパク質が結合していない二本鎖核酸プローブでは、ステム部分は全て消化され、３'末端を有する二本鎖部分が存在しない。
この結果、前記工程３において、核酸結合タンパク質が結合した二本鎖核酸プローブのみを残存する３'末端から伸長させることができる。
【００４９】
一方、本発明で用いるエンドヌクレアーゼによる消化も、エキソヌクレアーゼと同様の原理により、鎖を消化するが、核酸結合タンパク質が結合している二本鎖の核酸では、該核酸結合タンパク質の存在により、消化が途中で停止する。核酸結合タンパク質が結合していない二本鎖核酸プローブでは、ステム部分は、ポリメラーゼなどによって再伸長できない塩基数にまで消化される。
【００５０】
工程３
工程３は、工程２の後、消化された二本鎖核酸プローブの３'末端から、相補鎖合成用基質により、相補的な塩基配列を含む核酸を合成する工程である。
【００５１】
本明細書において「相補鎖」とは、塩基配列が塩基対のワトソン・クリック則に従って、もう一方の核酸と水素結合による２重鎖を形成し得る鎖であり、「相補的」とは、そのような２重鎖を形成し得る状態をいう。具体的には、アデニン（Ａ）に対してはチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）に対してはシトシン（Ｃ）が対応する相補鎖である。
【００５２】
なお、本発明では、相補鎖の合成によって得られる二本鎖核酸は、当初の二本鎖核酸プローブの塩基配列と完全に相補的である必要はなく、少なくとも得られる二本鎖核酸の塩基全体の少なくとも７０％が前記の相補性を当初の二本鎖核酸プローブとの関係において有することが好ましい。相補性が７０％未満となると、ハイブリダイズ自体が困難となり、相補鎖を合成することが困難になる。
【００５３】
相補鎖合成用基質としては、通常、４種類のデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、およびリボヌクレオチド（ｄＵＴＰ）を用いることができる。また、相補鎖合成用基質として、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの誘導体を利用し、核酸誘導体を合成することができる。
この種の誘導体として、蛍光色素や結合性リガンドで修飾したデオキシヌクレオチド誘導体を用いることができる。したがって、本明細書において核酸は、該核酸の誘導体を含む。
【００５４】
本発明では、検出工程で、合成された相補鎖を検出することができればよく、相補鎖合成用基質は、検出用の標識された基質を含む場合も、検出用の標識された基質を含まない場合のいずれも包含する。
【００５５】
このうち、相補鎖合成用基質は、検出用の標識された基質を含むことが好ましい。このような検出用の標識された基質として、たとえば、標識を含む前記デオキシリボヌクレオチドの誘導体、リボヌクレオチドの誘導体を用いることができる。
【００５６】
標識は、一般に核酸の標識技術として知られている方法を利用できる。たとえば、具体的には、蛍光成分、発光成分、ラジオアイソトープ、ビオチン、ハプテン等が挙げられる。
【００５７】
たとえば、前記検出用の塩基として、蛍光標識されたｄＮＴＰ、ｄＵＴＰを好ましく用いることができる。蛍光標識されたｄＮＴＰ、ｄＵＴＰとしては、たとえば、Alexafluor488-dUTP、Alexa Fluor 488-5-dUTP、Cascade Blue-7-dUTP、Alexa Fluor 488-5-dUTP、Alexa Fluor 488-7-OBEA-dCTP、Fluorescein-12-dUTP、Oregon Green 488-5-dUTP、BODIPY FL-14-dUTP、Rhodamine Green-5-dUTP、Alexa Fluor 532-5-dUTP、BODIPY TMR-14-dUTP、Teramethylrhodamine-6-dUTP、Alexa Fluor 546-14-dUTP、Alexa Fluor 546-16-OBEA-dCTP、Alexa Fluor 568-5-dUTP、Texas Red-12-dUTP、Texas Red-5-dUTP、BODIPY TR-14-dUTP、Alaxa Fluor 594-5-dUTP、Alaxa Fluor 594-7-OBEA-dCTP、BODIPY 630/650-14-dUTP、BODIPY 650/665-14-dUTP、Alexa Fluor 647-12-OBEA-dCTPなどが挙げられる。
【００５８】
また、発光標識の場合、DIG（ジゴキシゲン）を結合したｄＵＴＰ（デオキシウリジン５´−三リン酸）などを用い、CSPD、CDP-Star、Lumi-Phos 530、Lumigen PPDなどを発光試薬として用い、検出する方法が挙げられる。
【００５９】
さらに、ラジオアイソトープによる場合、32Pを用い、検出する方法が挙げられる。
【００６０】
ビオチンによる場合、ビオチン化ヌクレオチド（ビオチン−16−ｄＵＴＰ、ビオチン−11−ｄＵＴＰなど）を用いる方法が挙げられる。
【００６１】
ハプテンによる場合、スルホン化DNA等の修飾塩基などを使用する方法が挙げられる。
【００６２】
核酸結合タンパク質の検出の場合、これらのうち、蛍光、ラジオアイソトープによる標識を用いることが、バックグラウンドの観点から好ましい（S/N比が高い）。
【００６３】
前述の通り、これらの相補鎖合成用基質は、工程１で予め存在させておいてもよいし、工程３で添加してもよい。
【００６４】
相補的な塩基配列を含む核酸の合成反応は、ポリメラーゼの存在下に行う。工程３は、工程２から連続して行っても、いったん工程２における反応生成物を分離してから工程３を実施してもよい。工程２と分離して行う場合、溶媒としては、工程２と同様の溶媒を用いることができる。
【００６５】
消化酵素として、エキソヌクレアーゼを用いる場合、ポリメラーゼは３'末端がＯＨ基で好ましくは３塩基以上、さらに好ましくは４塩基以上の核酸分子（プライマー）により合成を開始する活性を有するものであればその由来は限定されない。たとえば、核酸がＤＮＡの場合、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼが挙げられ、他の微生物あるいは遺伝子組換えによりえら得たものを利用することもできる。
【００６６】
消化酵素としてエンドヌクレアーゼを用いる場合、ポリメラーゼは、エンドヌクレアーゼにより消化されて残存する塩基数を超える塩基数で合成を開始する活性を有するものが好ましい。通常、残存する塩基数は、好ましくは４塩基以下、さらに好ましくは０〜３塩基であり、このような塩基数では伸長反応を起こさないポリメラーゼを用いる。
【００６７】
ＤＮＡポリメラーゼとしては、前記消化されたＤＮＡプローブの３'末端から、検出用の基質を含む相補鎖合成用基質により、相補的な塩基配列を含む核酸を合成する機能を有する任意のＤＮＡポリメラーゼを利用することができる。
【００６８】
たとえば、利用可能なＤＮＡポリメラーゼとして下記のものが挙げられる。
タカラ社製 ExTaq 、Taq 、Z Taq、Pyrobest DNA polymerase、
ファルマシア社製 Taq DNA Polymease,Cloned for PCR、
QIAGEN社製 Hot Star Taq、
TOYOBO社製 KOD DNA Polymerase
【００６９】
これらのＤＮＡポリメラーゼの中でも、Taq DNA polymerase (TaKaRa Ex Taq TM R-PCR Version)などの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、温度の昇降を利用したＤＮＡ合成制御を行う反応系を使用する場合に、熱負荷に対する安定性が高いため好ましい。
【００７０】
また、ＲＮＡを鋳型として伸長反応を行う場合、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼが必要である。たとえば、Thermus thermophilus（高熱菌）由来、Tth DNA polymeraseなどが挙げられる。
【００７１】
これらの酵素は、その触媒作用が維持される条件の下で利用される。各酵素の至適条件は公知である。酵素活性に影響を与える要因として、温度、塩濃度、ｐＨ、変性剤や保護剤の存在、あるいはその他に各酵素が要求する各種の補因子などを示すことができる。これらの諸条件は、当業者が適宜設定することができる。
これらの条件が酵素活性の維持に必要な範囲に設定されれば、前記相補鎖合成基質を利用して、相補鎖を合成できる。
【００７２】
工程２により、前記核酸結合タンパク質が結合していた二本鎖核酸プローブは、該核酸結合タンパク質の存在により、消化が途中で停止し、３'末端を有する二本鎖が存在している。このため、工程３においては、該消化した二本鎖核酸プローブはポリメラーゼを認識して、相補鎖の合成が進行する。
【００７３】
一方、核酸結合タンパク質が結合していなかった二本鎖核酸プローブは、工程２においてステム部分が全て消化され、３'末端を有する二本鎖部分が存在しないので、ポリメラーゼを認識できず、相補鎖の合成が行われない。
【００７４】
工程４
工程４は、工程３において、相補的な塩基配列を含む核酸が合成されたときに、核酸結合タンパク質の存在を検出する工程である。
工程３において、相補鎖の合成が行われた場合、相補鎖の検出は、検出用の基質の種類に応じて対応する検出方法を採用する。
【００７５】
たとえば検出用の標識を有する相補鎖合成用基質を用いる場合には、相補鎖中の標識を検出することにより、相補鎖が合成された二本鎖の核酸を検出することができる。この結果、核酸結合タンパク質の存在を確認することができる。
【００７６】
たとえば、検出用の相補鎖合成用基質として、蛍光されたｄＮＴＰあるいはｄＵＴＰを用いる場合、ゲルなどを用いて電気泳動を行った後、蛍光スキャニングを実施するか、蛍光偏光法、FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）法により検出することができる。
【００７７】
また、発光による検出の場合、CCDカメラ、光電子増倍管、イメージングプレートを用いて検出することができる。
【００７８】
さらに、ラジオアイソトープによる検出の場合、１）試料中の放射性物質の分布を写真乳剤膜に直接記録する技術（オートラジオグラフィー）による検出を行い、放射性核種をトレーサーとして含む試料を写真乾板や感光乳剤と接触させて感光させ、感光剤の黒化度によって試料の特定の場所に存在する放射性核種の分布を調べる方法を用いるか、２）輝尽性蛍光体に中性子コンバーターを均一に混入させた積分型エリア熱中性子検出器であるイメージングプレートを用いて検出できる。また、３）合成反応により取り込まれなかった遊離放射性物質をゲルろ過カラムにより回収した後、液体シンチレーションカウンターなどで測定することができる。
【００７９】
また、単に、SybrGreenなどインターカレーターを用いて検出することもできる。このような方法によれば、検出用の標識を含まない相補鎖合成用基質を用いる場合の伸長反応により合成された相補鎖の検出も可能である。
【００８０】
以下本発明の核酸結合タンパク質の検出原理を、例示した図１（核酸がＤＮＡ、消化酵素がエキソヌクレアーゼ、標識（蛍光）を用いる場合の例）を用いてより具体的に説明するが、本発明は、図１の例示に限定されるものではない。
【００８１】
適当な長さ（図１では69 mer）の１本鎖ＤＮＡを熱変性後徐冷し、片方の鎖にループ構造を保有する二本鎖ＤＮＡプローブに再変性させる。二本鎖ＤＮＡプローブのステム部分には、ＤＮＡ結合タンパク質（図１（１）の左カラム：λファージ転写因子croタンパク質）の結合配列が存在している。
【００８２】
このようにして作製したループとステム構造を保有する２本鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡ結合タンパク質の結合反応を行った後、消化酵素（図１（２）：３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を持つExonucleaseIII）を加えＤＮＡの消化を行う。
【００８３】
このとき、ＤＮＡ結合タンパク質が結合した二本鎖ＤＮＡプローブではステムの３'末端から進むＤＮＡの消化が、ＤＮＡ結合タンパク質の存在により途中で停止する（図１（３）左カラム）。
【００８４】
一方、ＤＮＡ結合タンパク質が結合していないＤＮＡではステム部分はすべて消化され、直鎖状の一本鎖ＤＮＡが残る（図１（３）右カラム）。
【００８５】
次に、検出用の基質（図１ではdUTPに蛍光色素が修飾されたAlexafluor488-dUTP）を含む相補鎖合成用の基質の存在下に、ＤＮＡポリメラーゼ（図１（３）では、高熱菌由来taq DNAポリメラーゼ）を加えて伸長反応を行う。
【００８６】
消化酵素による消化がＤＮＡ結合タンパク質の結合部位で停止した二本鎖ＤＮＡプローブでは３'末端は二本鎖を組むため、ＤＮＡポリメラーゼが伸長反応を行う際のプライマーとして作用し、プローブＤＮＡの３'側が再合成される（図１（４）左カラム）。
【００８７】
しかし、ステムの３'側から２本鎖部分がすべて消化された二本鎖ＤＮＡプローブは伸長反応が起こらない（図１（４）右カラム）。
【００８８】
このとき、伸長反応において検出用の基質（図１（３）、（４）では、dUTPに蛍光色素が修飾されたAlexafluor488-dUTP）も再合成されたステムに含有されることとなる。
【００８９】
伸長反応後の二本鎖ＤＮＡプローブを電気泳動法等を用いて解析することにより、ＤＮＡ結合タンパク質が結合した場合のみ、検出用の基質が取り込まれた二本鎖ＤＮＡプローブを確認することができる。
【００９０】
＜核酸結合阻害／促進化合物のスクリーニング方法＞
本発明に係る核酸結合タンパク質の二本鎖核酸プローブへの結合を阻害または促進する化合物のスクリーニング方法は、以下の工程を含むことを特徴としている。
（１） 標的化合物と、核酸結合タンパク質または核酸結合タンパク質が特異的に結合可能な認識配列を含む二本鎖核酸プローブとを接触させる工程、
（２） 工程１の後、工程１で用いなかった前記二本鎖核酸プローブまたは前記核酸結合タンパク質を混合する工程、
（３） 工程２の後、核酸を３'末端から分解するエキソヌクレアーゼ、または核酸を伸長できない塩基数まで消化しうるエンドヌクレアーゼで消化する工程、
（４） 工程３の後、消化された二本鎖核酸プローブの３'末端から、相補鎖合成用基質により、相補的な塩基配列を含む核酸を合成する工程、
（５） 工程４の後、相補的な塩基配列を含む核酸が合成されたか否かを確認する工程、
（６） 工程５において、
（ａ）相補的な塩基配列を含む核酸が合成されなかったとき、または予測される相補的な塩基配列を含む核酸の合成量が低下したときに、前記標的化合物が、核酸結合タンパク質結合阻害化合物である、
（ｂ）相補的な塩基配列を含む核酸が予測される相補的な塩基配列を含む核酸の合成量より増加したときに、前記標的化合物が、核酸結合タンパク質結合促進化合物である、
と判定する工程。
【００９１】
工程１、２は、標的化合物を、核酸結合タンパク質および／または二本鎖核酸プローブと共存させる工程である。
【００９２】
標的化合物は、前記核酸結合タンパク質および／または二本鎖核酸プローブに作用して、前記核酸結合タンパク質が二本鎖核酸プローブに結合するのを促進または阻害しうる化合物である。
標的化合物の種類に限定はなく、有機化合物、高分子化合物など全てが対象となる。
【００９３】
工程１における接触反応は特に限定されないが、通常、溶媒中、好ましくは２０〜４５℃、さらに好ましくは３０〜４０℃程度で、５分〜３０分程度の時間インキュベートして行う。溶媒として緩衝液を用いる場合、緩衝液としてはたとえばトリス−塩酸緩衝液等を好ましく用いることができ、この場合、ｐＨは好ましくは７〜９、さらに好ましくは７．５〜８．５である。
【００９４】
標的化合物は、二本鎖核酸プローブ、または核酸結合タンパク質１モルに対して、好ましくは１．５〜１００モル、さらに好ましくは１〜１０モルであり、過剰量用いることが望ましい。過剰量の標的化合物を用いることにより、高い検出感度を確保することができる。
工程２において、工程１で用いなかった前記二本鎖核酸プローブまたは前記核酸結合タンパク質を混合し、標的化合物を、核酸結合タンパク質および／または二本鎖核酸プローブと共存させる。
【００９５】
工程２における反応は特に限定されないが、通常、溶媒中、好ましくは２０〜４５℃、さらに好ましくは３０〜４０℃程度で、５分〜３０分程度の時間インキュベートして行う。溶媒として緩衝液を用いる場合、緩衝液としてはたとえばトリス−塩酸緩衝液等を好ましく用いることができ、この場合、ｐＨは好ましくは７〜９、さらに好ましくは７．５〜８．５である。
【００９６】
工程３〜５は、前記核酸結合タンパク質の工程２〜４と同様にして行うことができる。
工程５において相補鎖が合成されたか否かを確認し、工程６において、
（ａ）相補的な塩基配列を含む核酸が合成されなかったとき、または予測される相補的な塩基配列を含む核酸の合成量より低下したときに、前記標的化合物が、核酸結合タンパク質結合阻害化合物である、
（ｂ）相補的な塩基配列を含む核酸が予測される相補的な塩基配列を含む核酸の合成量より増加したときに、前記標的化合物が、核酸結合タンパク質結合促進化合物である、
と判定する。
【００９７】
予測される合成量として、標的化合物の非存在下で検出した場合（対照）を用い、この場合と比較して、相補的な塩基配列を含む核酸が合成されないまたは低下したときに、前記標的化合物が、核酸結合タンパク質結合阻害化合物である、あるいは、標的化合物の非存在下で検出した場合（対照）と比較して、相補的な塩基配列を含む核酸が増加したときに、前記標的化合物が、核酸結合タンパク質結合促進化合物である、と判定することもできる。
【００９８】
合成量の測定には、工程４における検出用の基質として発光、ラジオアイソトープを用いることが好ましい。これらを用いると、工程５を経て得られる相補的な塩基配列を含む核酸を定量的に測定することができる。
予測される相補的な塩基配列を含む核酸量は、コントロールとして、標的化合物を用いない系を対照させることにより設定することが可能である。この系との検出指標の相対的な定量比較により、標的化合物が核酸結合タンパク質結合阻害化合物であるか、促進化合物であるのかの判定を行うことができる。
【００９９】
生命現象は、遺伝子発現により合成されるタンパク質が正常に発現・機能することにより営まれるが、異常な遺伝子発現は発がんやアポトーシスの原因となる。遺伝子発現の大部分は、転写因子と呼ばれるＤＮＡ結合タンパク質により制御されている。このため、たとえば、正常な遺伝子発現の原因となるＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡへの結合を促進する化合物は、該正常遺伝子の働きが低下している場合の疾患の予防あるいは治療剤となりうる。また、たとえば、異常な遺伝子発現の原因となるＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡへの結合を阻害する化合物は、該異常遺伝子により誘発される疾患の予防あるいは治療剤となりうる。
【０１００】
＜核酸結合タンパク質検出キット、二本鎖核酸結合阻害／促進化合物のスクリーニングキット＞
本発明に係る核酸結合タンパク質検出キットは、核酸結合タンパク質が特異的に結合可能な認識配列を含む二本鎖核酸プローブ、二本鎖の核酸を認識して３'末端から分解するエキソヌクレアーゼ、または核酸を伸長できない塩基数まで消化しうるエンドヌクレアーゼ、および相補鎖合成用基質で構成されることを特徴とする。
また、本発明に係る二本鎖核酸結合阻害または促進化合物のスクリーニングキットは、核酸結合タンパク質、核酸結合タンパク質が特異的に結合可能な認識配列を含む二本鎖核酸プローブ、二本鎖の核酸を認識して３'末端から分解するエキソヌクレアーゼ、または核酸を伸長できない塩基数まで消化しうるエンドヌクレアーゼ、および相補鎖合成用基質で構成されることを特徴とする。
【実施例】
【０１０１】
以下実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。たとえば、使用する酵素、目的とする核酸結合タンパク質によって反応条件が変化することはいうまでもない。たとえば超低温菌や高温菌など特殊環境微生物の核酸結合タンパク質の場合は反応温度（接触条件）を目的とする生物種に合わせて変更する必要がある。
【０１０２】
使用した試薬及び装置
Thermus aquaticus 由来の組換えDNAポリメラーゼ（Taq DNAポリメラーゼ）はBOEHRINGER MANNHEIM社から購入した。
【０１０３】
デオキシリボヌクレオシド三リン酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、エキソヌクレアーゼIII、短鎖DNAの電気泳動用アガロースゲルであるMetaPhor Agarose、電気泳動後のDNAの染色剤SYBR Green Iはタカラバイオ社から購入した。
【０１０４】
デオキシウリジン三リン酸（dUTP）に蛍光物質が修飾されたAlexa Fluor 488-5-dUTPはモレキュラープローブ社から購入した。
【０１０５】
λファージ由来のDNA結合タンパク質（以下「Cro」または「Croタンパク質」という。）は、遺伝子をクローニングしてタンパク質発現用ベクターpGEX-6P-2に改変したものを大腸菌[BL21(DE3)pLysS]にトランスフォームし、培養した菌体より分離、精製した。
【０１０６】
反応用緩衝液に使用した2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール（Tris）、塩化マグネシウム、塩化カリウムは和光純薬から購入した。
【０１０７】
ゲル濾過スピンカラムはアマシャムバイオサイエンス社製AutoSeq G-50を使用した。
【０１０８】
電気泳動にはコスモバイオ社製のミューピッドαを使用した。
【０１０９】
電気泳動後のゲルの解析に用いた蛍光イメージスキャナーはアマシャムバイオサイエンス社製のフルオロイメージャー595を使用し、解析後の画像処理はImage Quant（version 4.2 a）で行った。
【０１１０】
サーマルサイクラーはアプライドバイオシステムズ社製のGene Amp PCR System 9600を使用した。
【０１１１】
〔調製例１〕
二本鎖ＤＮＡプローブの調製
本研究で使用した合成DNAの配列を以下（表1）に示した。各DNAは69merで中心の5 merがループを形成し、両端の32 merずつが互いに相補的でステムを形成する。下記のように、ステムの部分にCroタンパク質の結合サイトを含むもの（L-Cro）と含まないコントロール（L-control）をそれぞれ設計した。
【０１１２】
各10 μMのDNA溶液（20 mM Tris-HCl (pH 7.6)、100 mM NaCl）を、95℃で10分間インキュベートした後、３０分間かけて4℃に徐冷して二本鎖ＤＮＡプローブを作製した。
【０１１３】
[L-Cro]配列番号１
CACAGACACATATCACCGCAAGGGATAGACCGTTTTTCGGTCTATCCCTTGCGGTGATATGTGTCTGTG
[L-Control]配列番号２
CACAGACACACACACGGGACTTTCCCAGACCGTTTTTCGGTCTGGGAAAGTCCCGTGTGTGTGTCTGTG
【０１１４】
〔実施例１〕
ＤＮＡ結合タンパク質の結合、ＤＮＡの消化、および伸長反応
調製例１で調製したＬ−Croの二本鎖ＤＮＡプローブ（20 pmol）を反応溶液中[10 mM Tris-HCl （pH8.3）, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 40μM dATP, 40μM dGTP, 40μM dCTP, 40μM Alexa Fluor 488-5-dUTP]で、Croタンパク質（40 pmol）と室温で１５分間インキュベートし、ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成させた。
【０１１５】
づづけてExonucleaseIII (12U) を加え、３７℃で１０分間ＤＮＡの消化を行った。９５℃にて15分間加熱しExonuclease IIIを失活処理した。
【０１１６】
さらに、Taq DNAポリメラーゼ(1U)を加え、72℃で６０分間伸長反応を行った。反応は200μlのPCRチューブで行い、温度制御はサーマルサイクラーを用いた。反応条件を表１に示す。
【０１１７】
〔実施例２〕
実施例１において、溶液にＢＳＡ（Bovine Serum Albumin、ウシ血清アルブミン）１．６μｇ（終濃度３．４μＭ）を含有させた反応溶液を用いた以外は、実施例１と同様にして反応を行った。反応条件を表１に示す。
【０１１８】
〔比較例１〕
実施例１において、Croタンパク質を添加しなかった以外は、実施例１と同様の条件下に、反応を行った。反応条件を表１に示す。
【０１１９】
〔比較例２〕
実施例１において、Ｌ−Cro（20 pmol）を用いる代わりに、調製例１で調製したＬ−Controlの二本鎖ＤＮＡプローブ（20 pmol）を用いた以外は、実施例１と同様の条件下に、ＤＮＡ結合タンパク質の結合、ＤＮＡの消化、および伸長反応を行った。反応条件を表１に示す。
【０１２０】
〔比較例３〕
実施例１において、Croタンパク質を添加せず、消化反応を行わなかった以外は、実施例１と同様の条件下に、反応を行った。反応条件を表１に示す。
【０１２１】
【表１】
2005269957.tif 000003
【０１２２】
電気泳動および蛍光検出
実施例１、２および比較例１〜３で得られた反応後のＤＮＡをゲル電気泳動で解析した。ゲルは３％アガロースゲル、泳動用緩衝液に1×TAE（40 mM Tris-Acetate、1 mM EDTA）を用い、室温で100V、30分間泳動を行った。
泳動したゲルはフルオロイメジャーで488nmのレーザーと530 nmのバンドパスフィルターを用いて蛍光解析した（図２の左半分の写真）。
さらに、その後ゲルをSYBR Green IIで３０分間染色し、フルオロイメージャーで解析した（図２の右半分の写真）。
【０１２３】
反応の特異性の確認
反応後のサンプルを電気泳動で解析した結果を図２に示す。またその泳動（図 ２）、Croタンパク質とL-Croの混合サンプルでのみ蛍光標識されたＤＮＡが観察された。これは、伸長反応でＤＮＡ鎖内にAlexa Fluor 488-5-dUTPが取り込まれたことを示している。
また、実施例１、２について、SYBR Green IIによる染色したものは、蛍光標識されたＤＮＡが検出された位置に対応する位置にのみ観測された。
この結果から、本実験系を用いてＤＮＡ結合タンパク質であるCroタンパク質を特異的に検出できることが確認された。（図２中の矢印のバンド）
図２中、「Ｅ」は実施例を示し、「ＣＥ」は比較例を示す。図３、４において以下同じ。
【０１２４】
〔実施例３〜７〕
実施例１と同様にして、ＤＮＡ結合タンパク質の結合、ＤＮＡの消化、伸長反応を行った。L-Cro20 pmolに対しCroタンパク質の量を2.5〜40 pmolに変化させ、ＤＮＡ結合タンパク質の検出限界の検討を行った。実験条件を表２に示す。
【０１２５】
〔比較例４〕
実施例１において、Croタンパク質を添加しなかった以外は、実施例１と同様の条件下に、反応を行った。反応条件を表２に示す。
【０１２６】
〔比較例５〕
実施例１において、Ｌ−Cro（20 pmol）を用いる代わりに、調製例１で調製したＬ−Control（20 pmol）を用いた以外は、実施例１と同様の条件下に、ＤＮＡ結合タンパク質の結合、ＤＮＡの消化、および伸長反応を行った。反応条件を表２に示す。
【０１２７】
【表２】
2005269957.tif 000004
【０１２８】
以上の結果を図３に示す。図３の左半分の写真は蛍光解析の結果であり、図３の右半分の写真はSYBR Green IIにより染色し、フルオロイメージャーで解析した結果である。
その結果、２．５〜４０ pmolの範囲にわたって、ＤＮＡ結合タンパク質を検出することができた（図３中の矢印のバンド）。また、実施例３、４、５について、SYBR Green IIによる染色したものは、蛍光標識されたＤＮＡが検出された位置に対応する位置にのみ観測された。
【０１２９】
〔実施例８〜１０〕
ＤＮＡの消化、伸長時間を変え、反応時間の検討を行った。Croタンパク質と各L-Croの複合体を室温で１５分間それぞれ形成させた後、Exonuclease III (12U) で37℃、１０分、３分、５分間ＤＮＡの消化を行った後、Taq DNAポリメラーゼ (1U) による伸長反応を72℃で、それぞれ６０分、３分、３分間行った。反応条件を表３に示す。他の反応条件は実施例１と同様である。
【０１３０】
【表３】
2005269957.tif 000005
【０１３１】
この結果、最速で消化３分間、伸長３分間でDNA結合タンパク質を検出することができた（図４上の矢印のバンド）。なお、図４の上半分の写真は蛍光解析の結果であり、図４の下半分の写真はSYBR Green IIにより染色し、フルオロイメージャーで解析した結果である。実施例８、９、１０について、SYBR Green IIによる染色したものは、蛍光標識されたＤＮＡが検出された位置に対応する位置にのみ観測された。
図４中、ａ〜ｃは下記の通りである。ｂ、ｃは、ａの比較対象として示した。
ａ：L-cro＋Croタンパク質
ｂ：L-croのみ（Croタンパク質を含まない）
ｃ：L-control＋Croタンパク質
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明の核酸結合タンパク質の検出方法によれば、迅速かつ簡便に核酸結合タンパク質を検出することができる。また、本発明の核酸結合タンパク質の二本鎖核酸プローブへの結合を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法によれば、迅速かつ簡便に核酸結合タンパク質結合促進／阻害化合物をスクリーニングすることができる
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】図１は、ＤＮＡ結合タンパク質の検出方法の原理を模式的に示した図である。
【図２】図２は、反応後のＤＮＡをゲル電気泳動で解析した写真である。
【図３】図３は、反応後のＤＮＡをゲル電気泳動で解析した写真である。
【図４】図４は、反応後のＤＮＡをゲル電気泳動で解析した写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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