(57)【要約】【課題】  ＲＮＡの精製方法を提供すること。【解決手段】  １またはそれ以上の化学的修飾を有する化学的に合成されたＲＮＡを精製する方法であって，（ａ）  前記ＲＮＡを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムに負荷し，ここで，前記ＲＮＡは５’−保護基を含み；（ｂ）  適当な緩衝液を前記逆相カラムに通すことにより前記ＲＮＡを溶出させ；（ｃ）  前記ＲＮＡから前記５’−保護基を除去し；（ｄ）  前記脱保護されたＲＮＡを陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムに負荷し；（ｅ）  適当な緩衝液を前記陰イオン交換カラムに通すことにより前記ＲＮＡを溶出させ；そして（ｆ）  前記陰イオン交換カラムから溶出物を集め，前記ＲＮＡを精製することができる条件下で前記溶出物から前記ＲＮＡを回収する，ことを含む方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１またはそれ以上の化学的修飾を有する化学的に合成されたＲＮＡを精製する方法であって，
（ａ）  前記ＲＮＡを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムに負荷し，ここで，前記ＲＮＡは５’−保護基を含み；
（ｂ）  適当な緩衝液を前記逆相カラムに通すことにより前記ＲＮＡを溶出させ；
（ｃ）  前記ＲＮＡから前記５’−保護基を除去し；
（ｄ）  前記脱保護されたＲＮＡを陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムに負荷し；
（ｅ）  適当な緩衝液を前記陰イオン交換カラムに通すことにより前記ＲＮＡを溶出させ；そして
（ｆ）  前記陰イオン交換カラムから溶出物を集め，前記ＲＮＡを精製することができる条件下で前記溶出物から前記ＲＮＡを回収する，
ことを含む方法。
【請求項２】
１またはそれ以上の化学的修飾を有する化学的に合成されたＲＮＡを精製する方法であって，
（ａ）  前記ＲＮＡを陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムに負荷し；
（ｂ）  適当な緩衝液を前記カラムに通すことにより前記ＲＮＡを溶出させ；そして
（ｃ）  前記陰イオン交換カラムから溶出物を集め，前記ＲＮＡを精製することができる条件下で前記溶出物から前記ＲＮＡを回収する，
ことを含む方法。
【請求項３】
１またはそれ以上の化学的修飾を有する化学的に合成されたＲＮＡを精製する方法であって，
（ａ）  前記ＲＮＡを陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムに負荷し；
（ｂ）  適当な緩衝液を前記カラムに通すことにより前記ＲＮＡを溶出させ；
（ｃ）  前記カラムから溶出物を集め，前記溶出物を脱塩し；そして
（ｄ）  前記ＲＮＡを精製することができる条件下で前記脱塩した溶出物から前記ＲＮＡを回収する，
ことを含む方法。
【請求項４】
１またはそれ以上の化学的修飾を有する化学的に合成されたＲＮＡを脱保護し精製する方法であって，
（ａ）  前記ＲＮＡを，環外アミン保護基またはリン酸エステル保護基を除去するのに適した条件下でアルキルアミンと接触させ；
（ｂ）  前記ＲＮＡを，前記ＲＮＡからアルキルシリル保護基を除去するのに適した条件下でトリエチルアミン−フッ化水素と接触させ；
（ｃ）  前記ＲＮＡを陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムに負荷し；
（ｄ）  適当な緩衝液を前記カラムに通すことにより前記ＲＮＡを溶出させ；そして
（ｅ）  前記カラムから溶出物を集め，前記ＲＮＡを精製することができる条件下で前記溶出物から前記ＲＮＡを回収する，
ことを含む方法。
【請求項５】
１またはそれ以上の化学的修飾を有する化学的に合成されたＲＮＡを脱保護し精製する方法であって，
（ａ）  前記ＲＮＡを，環外アミン保護基またはリン酸エステル保護基を除去するのに適した条件下でアルキルアミンと接触させ；
（ｂ）  前記ＲＮＡを，前記ＲＮＡからアルキルシリル保護基を除去するのに適した条件下でトリエチルアミン−フッ化水素と接触させ；
（ｃ）  前記ＲＮＡを陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムに負荷し；
（ｄ）  適当な緩衝液を前記カラムに通すことにより前記ＲＮＡを溶出させ；
（ｅ）  前記カラムから溶出物を集め，前記溶出物を脱塩し；そして
（ｆ）  前記ＲＮＡを精製することができる条件下で前記脱塩した溶出物から前記ＲＮＡを回収する，
ことを含む方法。
【請求項６】
前記陰イオン交換カラムが，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＭｏｎｏＱ（登録商標）カラムおよびＤｉｏｎｅｘ  ＮｕｃｌｅｏＰａｃ（登録商標）カラムからなる群より選択される，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記陰イオン交換カラムが，４級または３級アミノ誘導化固定相の樹脂を含む，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記樹脂がシリカ系またはポリスチレン系である，請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡが酵素的ＲＮＡである，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素的ＲＮＡがハンマーヘッドモチーフのものである，請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ＲＮＡが複数の化学的修飾を含む，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記化学修飾が糖修飾である，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記化学修飾が塩基修飾である，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記化学修飾がリン酸骨格修飾である，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記糖修飾が２’−Ｏ−メチル修飾である，請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記糖修飾が２’−デオキシ−２’−アミノ修飾である，請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
前記糖修飾が２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾である，請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
前記リン酸骨格修飾がホスホロチオエート修飾である，請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
前記ＲＮＡがアンチセンスＲＮＡである，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記ＲＮＡが２８−７０ヌクレオチドの長さである，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記ＲＮＡが３０−４０ヌクレオチドの長さである，請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記ＲＮＡが固相合成を用いて化学的に合成されたものである，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記固相合成が５’−保護基および３’−カップリング基を有するヌクレオシドモノマーを用いて行われる，請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記５’−保護基がジメトキシトリチル基である，請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記３’−カップリング基がホスホルアミダイト基である，請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
ＲＮＡの前記固相合成が制御孔ガラス（ＣＰＧ）固体支持体上で行われる，請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
ＲＮＡの前記固相合成がポリスチレン固体支持体上で行われる，請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
前記ホスホロチオエート修飾が硫化試薬を用いて導入される，請求項１８記載の方法。
【請求項２９】
前記硫化試薬がボーケージ試薬である，請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記アルキルアミンがメチルアミンである，請求項４または５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，炎症または自己免疫疾患，慢性骨髄性白血病，または気道疾患等の疾患に関連する遺伝子の発現の阻害剤として有用な試薬に関する。
【０００２】
本発明は，新規な酵素的ＲＮＡ分子，すなわちリボザイム，およびそれらを疾病関連遺伝子（例えば，ＩＣＡＭ−１，ＩＬ−５，ｒｅｌＡ，ＴＮＦ−α，ｐ２ｌ０bcr-abl，および呼吸器多核性ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）遺伝子）の発現の阻害に用いる方法を特徴とする。このようなリボザイムは，ヒトおよび他の動物（他の霊長類を含む）においてこれらの遺伝子の発現により引き起こされる疾病の治療法に用いることができる。
【背景技術】
【０００３】
リボザイムは，他の別個のＲＮＡ分子をヌクレオチド塩基配列特異的な様式で反復切断しうる，酵素的活性を有するＲＮＡ分子である。これらの酵素的ＲＮＡ分子は実質的にいかなるＲＮＡ転写産物をも標的とすることができ，インビトロで効果的な切断が達成されている。  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，８４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７８８，１９８７；Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ，３３４  Ｎａｔｕｒｅ  ５８５，１９８８；Ｃｅｃｈ，２６０  ＪＡＭＡ  ３０３０，１９８８；ならびにＪｅｆｆｅｒｉｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，１７  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３７１，１９８９。
【０００４】
これまでに，天然に生ずる酵素的ＲＮＡの６個の基本的変種が知られている。それぞれのリボザイムは，生理学的条件下で，トランスでＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒することができる（したがって，他のＲＮＡ分子も切断しうる）。表１はこれらのリボザイムの性質のいくつかをまとめたものである。
【０００５】
リボザイムは，まず標的ＲＮＡに結合することにより作用する。この結合は，標的ＲＮＡを切断させる作用をするＲＮＡの酵素的部分に近接して保持された，リボザイムの標的ＲＮＡ結合部分により行われる。従ってリボザイムは，まず標的ＲＮＡを認識し，次いで相補的塩基対形成により標的ＲＮＡに結合し，適正な部位にいったん結合すると，酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。そのような標的ＲＮＡの戦略的切断は，それがコードする蛋白質の合成を指令する能力を破壊するであろう。リボザイムはそのＲＮＡ標的に結合して切断させたのち，そのＲＮＡから離脱して他の標的を探し，新たな標的に反復的に結合して切断させることができる。
【０００６】
リボザイムの酵素的性質は他の手法，例えばアンチセンス法（この場合は核酸分子が単に核酸標的に結合して，その翻訳を阻止するだけである）より有利である。療法処置を行うのに必要なリボザイムの有効濃度はアンチセンスオリゴヌクレオチドのものより低いからである。この利点は，リボザイムが酵素的に作用しうることを反映している。すなわち１個のリボザイム分子が多数の標的ＲＮＡ分子を切断しうる。さらにリボザイムは特異性の高い阻害剤であり，その阻害の特異性は結合の塩基対形成のメカニズムのみでなく，その分子がそれの結合するＲＮＡの発現を阻害するメカニズムにも依存する。すなわち阻害はＲＮＡ標的の切断により引き起こされ，従って特異性は非標的ＲＮＡの切断速度に対する標的ＲＮＡの切断速度の比率として定義される。この切断メカニズムは，塩基対形成に関与するもの以外の因子に依存する。従って，リボザイムの作用の特異性は，同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドのものより大きいと考えられる。これらの触媒活性および増加した部位特異性により，リボザイムはアンチセンスオリゴヌクレオチドより強力かつ安全な治療用分子である。
【０００７】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【特許文献１】WO94/02595
【特許文献２】WO92/07065
【非特許文献１】Nature, 331, 624-627, 1988
【非特許文献２】Nucleic Aci Research, 17(14), 5853, 1989
【非特許文献３】Biochem. Biophys. Acta, 1131, 108-110, 1992
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１つの観点においては，本発明は，１またはそれ以上の化学的修飾を有する化学的に合成されたＲＮＡを精製する方法であって，
（ａ）  前記ＲＮＡを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムに負荷し，ここで，前記ＲＮＡは５’−保護基を含み；
（ｂ）  適当な緩衝液を前記逆相カラムに通すことにより前記ＲＮＡを溶出させ；
（ｃ）  前記ＲＮＡから前記５’−保護基を除去し；
（ｄ）  前記脱保護されたＲＮＡを陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムに負荷し；
（ｅ）  適当な緩衝液を前記陰イオン交換カラムに通すことにより前記ＲＮＡを溶出させ；そして
（ｆ）  前記陰イオン交換カラムから溶出物を集め，前記ＲＮＡを精製することができる条件下で前記溶出物から前記ＲＮＡを回収する，
ことを含む方法を提供する。
【０００９】
別の観点においては，本発明は，１またはそれ以上の化学的修飾を有する化学的に合成されたＲＮＡを精製する方法であって，
（ａ）  前記ＲＮＡを陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムに負荷し；
（ｂ）  適当な緩衝液を前記カラムに通すことにより前記ＲＮＡを溶出させ；そして
（ｃ）  前記陰イオン交換カラムから溶出物を集め，前記ＲＮＡを精製することができる条件下で前記溶出物から前記ＲＮＡを回収する，
ことを含む方法を提供する。
【００１０】
別の観点においては，本発明は，１またはそれ以上の化学的修飾を有する化学的に合成されたＲＮＡを精製する方法であって，
（ａ）  前記ＲＮＡを陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムに負荷し；
（ｂ）  適当な緩衝液を前記カラムに通すことにより前記ＲＮＡを溶出させ；
（ｃ）  前記カラムから溶出物を集め，前記溶出物を脱塩し；そして
（ｄ）  前記ＲＮＡを精製することができる条件下で前記脱塩した溶出物から前記ＲＮＡを回収する，
ことを含む方法を提供する。
【００１１】
別の観点においては，本発明は，１またはそれ以上の化学的修飾を有する化学的に合成されたＲＮＡを脱保護し精製する方法であって，
（ａ）  前記ＲＮＡを，環外アミン保護基またはリン酸エステル保護基を除去するのに適した条件下でアルキルアミンと接触させ；
（ｂ）  前記ＲＮＡを，前記ＲＮＡからアルキルシリル保護基を除去するのに適した条件下でトリエチルアミン−フッ化水素と接触させ；
（ｃ）  前記ＲＮＡを陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムに負荷し；
（ｄ）  適当な緩衝液を前記カラムに通すことにより前記ＲＮＡを溶出させ；そして
（ｅ）  前記カラムから溶出物を集め，前記ＲＮＡを精製することができる条件下で前記溶出物から前記ＲＮＡを回収する，
ことを含む方法を提供する。
【００１２】
別の観点においては，本発明は，１またはそれ以上の化学的修飾を有する化学的に合成されたＲＮＡを脱保護し精製する方法であって，
（ａ）  前記ＲＮＡを，環外アミン保護基またはリン酸エステル保護基を除去するのに適した条件下でアルキルアミンと接触させ；
（ｂ）  前記ＲＮＡを，前記ＲＮＡからアルキルシリル保護基を除去するのに適した条件下でトリエチルアミン−フッ化水素と接触させ；
（ｃ）  前記ＲＮＡを陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムに負荷し；
（ｄ）  適当な緩衝液を前記カラムに通すことにより前記ＲＮＡを溶出させ；
（ｅ）  前記カラムから溶出物を集め，前記溶出物を脱塩し；そして
（ｆ）  前記ＲＮＡを精製することができる条件下で前記脱塩した溶出物から前記ＲＮＡを回収する，
ことを含む方法を提供する。
【００１３】
好ましくは，前記陰イオン交換カラムは，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＭｏｎｏＱ（登録商標）カラムおよびＤｉｏｎｅｘ  ＮｕｃｌｅｏＰａｃ（登録商標）カラムからなる群より選択される。また好ましくは，前記陰イオン交換カラムは，４級または３級アミノ誘導化固定相の樹脂を含む。好ましくは，前記樹脂はシリカ系またはポリスチレン系である。
【００１４】
好ましくは，前記ＲＮＡは酵素的ＲＮＡである。好ましくは，前記酵素的ＲＮＡはハンマーヘッドモチーフのものである。好ましくは，前記ＲＮＡは複数の化学的修飾を含む。
【００１５】
好ましくは，前記化学修飾は糖修飾である。また好ましくは，前記化学修飾は塩基修飾である。また好ましくは，前記化学修飾はリン酸骨格修飾である。好ましくは，前記糖修飾は２’−Ｏ−メチル修飾である。また好ましくは，前記糖修飾は２’−デオキシ−２’−アミノ修飾である。また好ましくは，前記糖修飾は２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾である。好ましくは，前記リン酸骨格修飾はホスホロチオエート修飾である。
【００１６】
好ましくは，前記ＲＮＡはアンチセンスＲＮＡである。また好ましくは，前記ＲＮＡは２８−７０ヌクレオチドの長さである。好ましくは，前記ＲＮＡは３０−４０ヌクレオチドの長さである。
【００１７】
好ましくは，前記ＲＮＡは固相合成を用いて化学的に合成されたものである。好ましくは，前記固相合成は５’−保護基および３’−カップリング基を有するヌクレオシドモノマーを用いて行われる。好ましくは，前記５’−保護基はジメトキシトリチル基である。また好ましくは，前記３’−カップリング基はホスホルアミダイト基である。
【００１８】
好ましくは，ＲＮＡの前記固相合成は制御孔ガラス（ＣＰＧ）固体支持体上で行われる。また好ましくは，ＲＮＡの前記固相合成はポリスチレン固体支持体上で行われる。また好ましくは，前記ホスホロチオエート修飾は硫化試薬を用いて導入される。好ましくは，前記硫化試薬はボーケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬である。好ましくは，前記アルキルアミンはメチルアミンである。
【００１９】
別の観点においては，本発明は，ＩＣＡＭ−１，ＩＬ−５，ｒｅｌＡ，ＴＮＦ−α，ｐ２ｌ０bcr-ablまたはＲＳＶ蛋白質をコードするＲＮＡ分子種の切断を指令するリボザイムもしくは酵素的ＲＮＡ分子に関する。より詳細には，本発明は，これらのＲＮＡを切断しうるリボザイムの選択および機能，ならびに種々の組織においてＩＣＡＭ−１，ＩＬ−５，ｒｅｌＡ，ＴＮＦ−α，ｐ２ｌ０bcr-ablまたはＲＳＶ蛋白質のレベルを減少させて，本願明細書で議論される疾患を治療するためのこれらの使用を記載する。このようなリボザイムはまた，診断における使用にも有用である。
【００２０】
本発明においては，これらのリボザイムがＩＣＡＭ−１，ＩＬ−５，ｒｅｌＡ，ＴＮＦ−α，ｐ２ｌ０bcr-abl，またはＲＳＶ遺伝子の発現を阻害しうること，およびリボザイムの触媒活性がこれらの阻害効果に必要であることが示されている。当業者には，本願明細書に記載される例から，標的ＩＣＡＭ−１，ＩＬ−５，ｒｅｌＡ，ＴＮＦ−α，ｐ２ｌ０bcr-abl，またはＲＳＶをコードするｍＲＮＡを切断する他のリボザイムを容易に設計しうることおよびそれらも本発明の範囲内であることが明らかであることがわかるであろう。
【００２１】
これらの化学的または酵素的に合成したＲＮＡ分子は，その標的ｍＲＮＡのアクセス可能な領域に結合する基質結合ドメインを含む。ＲＮＡ分子はまた，ＲＮＡの切断を触媒するドメインをも含む。結合した際，リボザイムは標的をコードするｍＲＮＡを切断し，翻訳および蛋白質の蓄積を妨害する。標的遺伝子が発現されなければ，治療的効果が認められるであろう。
【００２２】
“遺伝子”は，同族（ｃｏｇｎａｔｅ）ｍＲＮＡの蛋白質コード領域，または蛋白質合成もしくはそのｍＲＮＡの安定性を制御する，ＲＮＡ中のいずれかの制御領域を表すものとする。この用語はまた，同族ポリペプチド生成物のＯＲＦをコードするｍＲＮＡのこれらの領域，ならびにプロウイルスゲノムも表す。
【００２３】
“酵素的ＲＮＡ分子”とは，基質結合領域において特定の遺伝子標的に対する相補性を有し，かつその標的内のＲＮＡを特異的に切断する作用をする酵素的活性をも有するＲＮＡ分子を意味する。すなわち，酵素的ＲＮＡ分子はＲＮＡを分子間切断し，このことにより標的ＲＮＡ分子を不活性化することができる。この相補性は，切断を起こさせるのに十分なほど，標的ＲＮＡに酵素的ＲＮＡ分子をハイブリダイズさせる機能を有する。１００％の相補性が好ましいが，５０−７５％程度の低い相補性も本発明に有用である。ウイルスに“均等な”ＲＮＡとは，ヒト，猫，猿および他の霊長類を含む種々の動物においてウイルスにより引き起こされる疾患に関連する，天然に生ずるウイルスによりコードされるＲＮＡ分子を包含するものとする。これらのウイルスＲＮＡまたはウイルスによりコードされるＲＮＡは互いに類似の構造および均等な遺伝子を有する。
【００２４】
”相補性”とは，他のＲＮＡ配列と，伝統的なワトソン−クリックまたは他の非伝統的なタイプの塩基対相互作用（例えば，ホーグステン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）タイプ）のいずれかにより水素結合を形成しうる核酸を意味する。
【００２５】
本発明の好ましい態様においては，酵素的核酸分子はハンマーヘッドまたはヘアピンのモチーフで形成されるが，デルタ肝炎ウイルス，グループイントロンＩ，またはＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列に関連する）またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡのモチーフで形成されてもよい。このようなハンマーヘッドモチーフの例は，Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９２，Ａｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，８，１８３に記載され；ヘアピンモチーフの例はＨａｍｐｅｌ  ａｎｄ  Ｔｒｉｔｚ，１９８９  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８，４９２９，ＥＰ  ０３６０２５７およびＨａｍｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８，２９９に記載され；デルタ肝炎ウイルスモチーフの例は，Ｐｅｒｏｔｔａ  ａｎｄ  Ｂｅｅｎ，１９９２  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１  １６に記載され；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は，Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３  Ｃｅｌｌ，３５  ８４９に記載され；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡリボザイムモチーフは，Ｃｏｌｌｉｎｓ（Ｓｅｖｉｌｌｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９０  Ｃｅｌｌ  ６１，６８５−６９６；Ｓａｖｉｌｌｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９１  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８８，８８２６−８８３０；Ｃｏｌｌｉｎｓ  ａｎｄ  Ｏｌｉｖｅ，１９９３  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２，２７９５−２７９９，Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９５  ＥＭＢＯ．Ｊ．，１４，３６８）により記載され；グループＩイントロンは，Ｃｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，９８７，０７１号により記載されている。これらの具体的なモチーフは本発明を限定するものではなく，本発明の酵素的核酸分子において重要なすべては，それが１または２以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に対して相補的な特異的基質結合部位を有し，かつその基質結合部位内またはその周囲にその分子にＲＮＡ切断活性を付与するヌクレオチド配列を有することであることは，当業者には認識されるであろう。
【００２６】
本発明は，所望の標的のＲＮＡに対して高い特異性を示す一群の酵素的切断剤を製造する方法を提供する。酵素的核酸分子は，好ましくは，１つまたはいくつかの酵素的核酸により疾患または病状の特異的治療が与えられるように，標的（すなわちＩＣＡＭ−１，ＩＬ−５，ｒｅｌＡ，ＴＮＦ−α，ｐ２ｌ０bcr-ablまたはＲＳＶ蛋白質）をコードするｍＲＮＡの高度に保存された配列領域を標的とする。このような酵素的核酸分子は，必要に応じて特定の細胞に外的送達することができる。あるいは，リボザイムは，特定の細胞に送達されるベクターから発現させることができる。”ベクター”とは，所望の核酸を送達するために用いられる任意の核酸および／またはウイルスに基づく技術を意味する。
【００２７】
１００ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は自動化された方法によっては困難であり，そのような分子の療法経費は著しい。本発明においては，小型の酵素的核酸モチーフ（例えばハンマーヘッドまたはヘアピン構造のもの）を外的送達に用いる。これらの分子の構造が簡単であることは，酵素的核酸がｍＲＮＡ構造の標的領域内へ侵入する能力を高める。しかし，これらの触媒的ＲＮＡ分子は，細胞内で真核生物プロモーターから発現させることもできる（例えば，Ｓｃａｎｉｏｎ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｄｒｏｐｏｕｌｉｃ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６５，５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇ，Ｊ．Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９  １０８０２−６；Ｃｈｅｎ  Ｃ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１２２２−１２２５）。当業者は，適当なＤＮＡまたはＲＮＡベクターから，任意のリボザイムを真核生物細胞において発現させうることを理解するであろう。そのようなリボザイムの活性は，第２のリボザイムにより一次転写産物からそれらを放出させることにより増加させることができる（Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ  ＷＯ９３／２３５６９，およびＳｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ  ＷＯ９４／０２５９５（これらの内容のすべてを本願明細書の一部としてここに引用する）；Ｏｈｋａｗａ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２７，１５−６；Ｔａｉｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９，５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５５，Ｃｈｏｗｒｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５８５６）。
【００２８】
”阻害”とは，ＩＣＡＭ−１，ｒｅｌＡ，ＩＬ−５，ＴＮＦ−α，ｐ２ｌ０bcr-ablまたはＲＳＶをコードするｍＲＮＡの活性もしくはレベルが，リボザイムの不在下で観察されるものよりも減少すること，好ましくはｍＲＮＡの同一の部位に結合しうるがそのＲＮＡを切断できない不活性ＲＮＡ分子の存在下で観察されるレベルより低いことを意味する。
【００２９】
このようなリボザイムは，上述の疾患および病状，ならびにＩＣＡＭ−１，ＩＬ−５，ｒｅｌＡ，ＴＮＦ−α，ｐ２ｌ０bcr-ablまたはＲＳＶ蛋白質のレベルまたは細胞もしくは組織における活性に関連する他のいずれの疾患または病状の予防に有用である。”関連する”とは，ＩＣＡＭ−１，ＩＬ−５，ｒｅｌＡ，ＴＮＦ−α，Ｐ２１０bcr-ablまたはＲＳＶのｍＲＮＡの翻訳の阻害，したがって，ＩＣＡＭ−１，ＩＬ−５，ｒｅｌＡ，ＴＮＦ−α，ｐ２ｌ０bcr-ablまたはＲＳＶの蛋白質のレベルの減少が，疾患の症状または病状をある程度軽減させるであろうことを意味する。
【００３０】
リボザイムは直接加えることもできるが，カチオン性脂質とともに複合させるか，リポソーム中に封入するか，または他の方法により標的細胞に送達することができる。ＲＮＡまたはＲＮＡ複合体は，バイオポリマーに取り込ませてまたは取り込ませずに，カテーテル，注入ポンプまたはステントを用いて関連する組織に局所的に投与することができる。好ましい態様においては，リボザイムは，表２，３，６−９，１１，１３，１５−２３，２７，２８，３１，３３，３４，３６および３７の配列に相補的な結合アームを有する。
【００３１】
このようなリボザイムの例は，表４−８，１０，１２，１４−１６，１９−２２，２４，２６−２８，３０，３２，３４および３６−３８に示される。このようなリボザイムの例は，本質的にこれらの表において定義される配列からなる。”本質的に・・からなる”とは，活性なリボザイムが，標的部位において切断が生ずるように，例に示されるリボザイムと均等な酵素的中心およびｍＲＮＡに結合しうる結合アームを含むことを意味する。そのような切断を妨害しない他の配列が存在していてもよい。
【００３２】
当業者は，これらの配列が，活性に影響を及ぼすためにリボザイムの酵素的部分（結合アームを除くすべて）が変更されているはるかに多くのそのような配列の代表例にすぎないことを理解するであろう。例えば，上述した表に挙げられるハンマーヘッドリボザイムのステム−ループII配列は，最小で２つの塩基対形成したステム構造を形成しうる限り，任意の配列を含むように変更（置換，欠失，および／または挿入）することができる。同様に，上述した表に挙げられるヘアピンリボザイムのステム−ループIV配列は，最小で２つの塩基対形成したステム構造を形成しうる限り，任意の配列を含むように変更（置換，欠失，および／または挿入）することができる。上述した表に挙げられる配列は，リボヌクレオチドまたは他のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドで形成することができる。そのようなリボザイムは，表に具体的に記載されるリボザイムと均等である。
【００３３】
本発明の別の観点においては，標的分子を決断し，ＩＣＡＭ−１，ＩＬ−５，ｒｅｌＡ，ＴＮＦ−α，ｐ２ｌ０bcr-ablまたはＲＳＶの遺伝子発現を阻害するリボザイムは，ＤＮＡ，ＲＮＡ，またはウイルス性ベクター中に挿入された転写ユニットから発現される。細胞中でリボザイムを高濃度に蓄積させるための他の方法は，リボザイムをコードする配列をＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター中に取り込ませることである。リボザイム配列の転写は，真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ），ＲＮＡポリメラーゼII（ｐｏｌII），またはＲＮＡポリメラーゼIII（ｐｏｌIII）のプロモーターから推進される。ｐｏｌIIまたはｐｏｌIIIプロモーターからの転写産物は，すべての細胞において高レベルで発現されるであろう。あるタイプの細胞におけるあるｐｏｌIIプロモーターのレベルは，近くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサー，サイレンサー等）の性質に依存する。原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた用いられるが，ただし，原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素は適切な細胞で発現される（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，１９９０  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６７４３−７；Ｇａｏ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ  １９９３  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１  ２８６７−７２；Ｌｉｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。何人かの研究者が，そのようなプロモーターから発現されたリボザイムが哺乳動物細胞で機能しうることを示した（例えば，Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６３４０−４；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２  ＥＭＢＯ  Ｊ．１１，４４１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９０，８０００−４）。上述のリボザイム転写ユニットは，哺乳動物細胞に導入するための種々のベクター内に取り込ませることができる。このようなベクターとしては，プラスミドＤＮＡベクター，ウイルスＤＮＡベクター（例えばアデノウイルスまたはアデノ関連ウイルスベクター），またはウイルスＲＮＡベクター（例えばレトロウイルスまたはアルファウイルスベクター）が挙げられるが，これらに限定されるものではない。
【００３４】
本発明の他の特徴および利点は，以下の本発明の好ましい態様の記載および特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
好ましい態様の説明
最初に図面を簡単に説明する。
【００３６】
図面：
図１は当業界において公知のハンマーヘッドリボザイムドメインの図解的描写である。ステム２は２塩基対以上の長さでありうる。
【００３７】
図２（ａ）は当業界において公知のハンマーヘッドリボザイムドメインの図解的描写であり；図２（ｂ）はウーレンベック（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ）（１９８７，Ｎａｔｕｒｅ，３２７，５９６−６００）により基質および酵素部分に分割されたハンマーヘッドリボザイムの図解的描写であり，図２（ｃ）はハゼロフとゲルラッチ（Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ）（１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３４，５８５−５９１）により２つの部分に分割されたハンマーヘッドを示し；そして図２（ｄ）はジェフリーとシモンズ（Ｊｅｆｆｒｉｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｍｏｎｓ）（１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７，１３７１−１３７１）により２つの部分に分割されたハンマーヘッドを示す同様な図面である。
【００３８】
図３はヘアピンリボザイムの一般的な構造の図解的描写である。ヘリックス２（Ｈ２）は少なくとも４塩基対（即ち，ｎは１，２，３または４）にて提供され，ヘリックス５は任意に２以上の長さの塩基（好ましくは３−２０塩基，即ち，ｍは１−２０またはそれ以上）にて提供されうる。ヘリックス２およびヘリックス５は１以上の塩基により共有結合してよい（即ち，ｒは１塩基以上）。ヘリックス１，４または５も２以上の塩基対により伸長することにより（例えば，４−２０塩基対）リボザイム構造を安定化してよく，好ましくは蛋白質結合部位である。各々の例においては，各ＮおよびＮ’は独立にいずれかの通常の塩基または修飾塩基であり，そして各ダッシュは潜在的塩基対相互作用を表す。これらヌクレオチドは，糖，塩基またはリン酸部分で修飾されてよい。完全な塩基対形成はヘリックス内において必要ないが好ましい。ヘリックス１および４は，幾つかの塩基対が維持される限り任意の大きさであってよい（即ち，ｏおよびｐは各々独立に０から任意の数値，例えば２０である）。必須塩基は構造中において特定の塩基として示されるが，当業者はひとつまたはそれ以上が顕著な影響なしに化学的に修飾（脱塩基（ａｂａｓｉｃ），塩基，糖および／またはリン酸修飾）または他の塩基により置換されてよいことを認識するであろう。ヘリックス４は２つの別々の分子から，即ち接続ループを用いずに形成できる。接続ループが存在する場合には，これは，塩基，糖またはリン酸を修飾してもしなくてもよいリボヌクレオチドでありうる。「ｑ」は２塩基以上である。接続ループをは非ヌクレオチドリンカー分子で置換されうる。Ｈは塩基Ａ，Ｕ，またはＣを意味する。Ｙはピリミジン塩基を意味する。” ”は共有結合を意味する。
【００３９】
図４は当業界において公知のデルタ肝炎ウイルスリボザイムドメインの一般的構造の描写である。
【００４０】
図５は自己切断ＶＳＲＮＡリボザイムドメインの一般的構造の描写である。
【００４１】
図６はＲＳＶ株Ａ２の遺伝地図の図解的描写である。
【００４２】
図７はＲＮＡの固相合成の図解的描写である。
【００４３】
図８は核酸合成のための環外アミノ保護基の図解的描写である。
【００４４】
図９はＲＮＡの脱保護の図解的描写である。
【００４５】
図１０は本明細書に記載された改良法を用いて合成，脱保護そして精製されたリボザイムによるＲＮＡ基質の切断の図解的描写である。
【００４６】
図１１は２ポット脱保護のプロトコルの図解的描写である。塩基の脱保護は水性メチルアミンを用いて６５℃１０分間実施する。サンプルは，ＲＮＡ合成のスケールにより，スピードバックで２−２４時間乾燥する。２’−ヒドロキシル位におけるシリル保護基は，サンプルを１．４Ｍ無水ＨＦで６５℃において１．５時間処理することにより除去する。
【００４７】
図１２はＲＮＡホスホルアミダイト化学を用いて合成されたＲＮＡの１ポット脱保護の図解的描写である。無水メチルアミンを用いて６５℃１５分で塩基を脱保護する。サンプルを１０分間冷却して，同じポットにＴＥＡ・３ＨＦ試薬を加えて２’−ヒドロキシル位の保護基を除去する。脱保護は１．５時間行う。
【００４８】
図１３ａ−ｂは部位Ｂを標的とする３６ｎｔの長さのリボザイムのＨＰＬＣのプロフィールである。ＲＮＡは２ポットまたは１ポット脱保護プロトコルの何れかを用いて脱保護する。完全長ＲＮＡに対応するピークを示す。部位Ｂの配列はＣＣＵＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＵＵＡＡＵＧＧＡＧＡＵＧＣＣＣＡＣＵである。
【００４９】
図１４は２ポット対１ポット脱保護プロトコルによる脱保護されたリボザイムのＲＮＡ切断活性を比較するグラフである。
【００５０】
図１５はホスホロチオエート結合を含むＲＮＡを合成する改良法の図解的描写である。
【００５１】
図１６はホスホロチオエート結合を含むリボザイムにより触媒されたＲＮＡ切断反応を示す。部位Ｃを標的とするハンマーヘッドリボザイムは，５’末端の４塩基がホスホロチオエート結合を含むように合成される。Ｐ＝Ｏはホスホロチオエート結合を有さないリボザイムを意味する。Ｐ＝Ｓはホスホロチオエート結合を有すリボザイムを意味する。部位Ｃの配列は，ＵＣＡＵＵＵＵＧＧＣＣＡＵＣＵＣ  ＵＵＣＣＵＵＣＡＧＧＣＧＵＧＧである。
【００５２】
図１７は２’−Ｎ−フタルイミド−ヌクレオシド  ホスホルアミダイトの合成の図解的描写である。
【００５３】
図１８はシリルエーテルを用いたＲＮＡの固相合成のための従来法，およびＳＥＭを２’保護基として用いる本発明の方法の図解的描写である。
【００５４】
図１９はＲＮＡ合成に有用な２’ＳＥＭ−保護ヌクレオシドおよびホスホアミダイトの合成の図解的描写である。Ｂは図面に例示された任意のヌクレオチド塩基であり，Ｐはプリンであり，そしてＩはイノシンである。当業界において知られている標準的な略記は本明細書中を通して用いられる。
【００５５】
図２０は２’ヒドロキシル基のＴＢＤＭＳ保護を用いたＲＮＡの保護法の図解的描写である。
【００５６】
図２１は２’ヒドロキシル基のＳＥＭ保護を有するＲＮＡの脱保護の図解的描写である。
【００５７】
図２２はウリジン酸の完全に脱保護された１０ｍｅｒのＨＰＬＣクロマトグラムの描写である。
【００５８】
図２３−２５は自己プロセシングＲＮＡ転写物を含む，ハンマーヘッド，ヘアピンまたは肝炎デルタウイルスリボザイムの図解的描写である。実線の矢印は自己プロセシング部位を示す。ボックスはヌクレオチド置換部位を示す。実線はプライマー伸長アッセイにおいて用いるプライマーの結合部位を示すために引いてある。小文字の記号は，ＨｉｎｄＩＩＩ直鎖状化プラスミドから転写される場合のＲＮＡ中に存在するベクター配列を示す。（２３）ＨＨカセットは３’シス作用ハンマーヘッドリボザイムに結合したハンマーヘッド型トランス作用リボザイムを含む転写物である。ハンマーヘッドリボザイムの構造は系統発生的分析および変異分析に基づく（前記シモンズによる）。トランスリボザイムドメインはヌクレオチド１から４９までに及ぶ。３’末端のプロセシング後，トランスリボザイムは２つの非リボザイムヌクレオチドを３’末端に含む（５０および５１番目のＵＣ）。３’プロセシングリボザイムは４４から９６のヌクレオチドからなる。ローマ数字Ｉ，ＩＩおよびＩＩＩは３’シス作用ハンマーヘッドリボザイムの構造に寄与する３つのヘリックスを示す（ハーテル（Ｈｅｒｔｅｌ）ら，１９９２  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０，３２５２）。Ｇ70およびＡ71から各々ＵおよびＧへの置換はハンマーヘッドリボザイムを不活性化して（ルフナー（Ｒｕｆｆｎｅｒ）ら，１９９０  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｒｙ  ２９，１０６９５），ＨＨ（変異株）構築物を生じる。（２４）ＨＰカセットは３’シス作用ヘアピンリボザイムに結合したハンマーヘッド型トランス作用リボザイムを含む転写物である。該ヘアピンリボザイムの構造は系統発生的分析および変異分析に基づく（ベルツアル−ヘランツ（Ｂｅｒｚａｌ−Ｈｅｒｒａｎｚ）ら，１９９３  ＥＭＢＯ．Ｊ．１２，２５６７）。トランスリボザイムドメインは１から４９ヌクレオチドに及ぶ。３’末端のプロセシング後，トランスリボザイムは５つの非リボザイムヌクレオチドを３’末端に含む（５０から５４番目のＵＧＧＣＡ）。３’シス作用リボザイムは５０から１１５のヌクレオチドからなる。ＨＰ（ＧＵ）と命名された転写物はＧ52からＵ77の間の潜在的に不安定な塩基対により構築され，ＨＰ（ＧＣ）はＧ52からＣ77の間にワトソン−クリック塩基対を有する。短縮されたヘリックス１（５塩基対）およびヘリックス１の末端の安定なテトラループ（ＧＡＡＡ）を用いて基質とヘアピンリボザイムの触媒ドメインを結合した（フェルドシュタインとブルエニング（Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎ  ＆  Ｂｒｕｅｎｉｎｇ），１９９３  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１，１９９１；アルトシュラー（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｒ）ら，１９９２，前記）。（２５）ＨＤＶカセットは３’シス作用デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムに結合したトランス作用ハンマーヘッドリボザイムを含む転写物である。ＨＤＶリボザイムの二次構造はビーンと共同研究者ら（Ｂｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１，１１８４３）により提案されたとおりである。トランスリボザイムドメインはヌクレオチド１から４８までに及ぶ。３’末端のプロセシング後，トランスリボザイムは２つの非リボザイムヌクレオチドを３’末端に含む（４９および５０番目のＡＡ）。３’シス作用ＨＤＶリボザイムは５０から１１４のヌクレオチドからなる。ローマ数字Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩおよびＩＶは３’シス作用ＨＤＶリボザイム内の４つのヘリックスの位置を示す（ペロータ（Ｐｅｒｒｏｔａ  ＆  Ｂｅｅｎ），１９９１  Ｎａｔｕｒｅ  ３５０，４３４）。ΔＨＤＶ転写物は転写物のＨＤＶ部分において３１ヌクレオチドの欠失を含む（ヌクレオチド８４から１１５までを欠失）。
【００５９】
図２６は自己プロセシングカセットをコードする挿入物を含むプラスミドの図解的描写である。図は，同一スケールで描かれていない。
【００６０】
図２７はインビトロにおけるＲＮＡ自己プロセシングに及ぼす３’配列の影響を示す。Ｈは制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩにより直鎖状化したプラスミドの鋳型である。Ｈ鋳型からの転写物は３’末端に４つの非リボザイムヌクレオチドを含む。Ｎは制限酵素ＮｄｅＩにより直鎖状化したプラスミドの鋳型である。Ｎ鋳型からの転写物は３’末端に２２０の非リボザイムヌクレオチドを含む。Ｒは制限酵素ＲｃａＩにより直鎖状化したプラスミドの鋳型である。Ｒ鋳型からの転写物は３’末端に４５０の非リボザイムヌクレオチドを含む。
【００６１】
図２８はハンマーヘッドリボザイムにより触媒されたトランス切断反応に及ぼす３’フランキング配列の影響を示す。６２２ヌクレオチドの内部標識ＲＮＡ（＜１０ｎＭ）を一回の代謝回転条件にてリボザイムとインキュベートした（ヘルシュラグとケック（Ｈｅｒｓｃｈｌａｇ  ａｎｄ  Ｃｅｃｈ），１９９０  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９，１０１５９）。ＨＨ＋２，ＨＨ＋３およびＨＨ＋５２はそれぞれＨＨ，ΔＨＤＶおよびＨＨ（変異株）構築物からの転写により生成されたトランス作用リボザイムであり，そして３’末端において２，３７および５２の余分なヌクレオチドを含む。時間に対する非切断基質フラクションのプロットはカレイダ（Ｋａｌｅｉｄａ）グラフの作図プログラムを用いた２段指数曲線（ｄｏｕｂｌｅ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｃｕｒｖｅ）に適合させた（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＰＡ）。２段指数曲線の適合を用いた理由は，データ点がおそらくリボザイムおよび／または基質ＲＮＡの型の変化のために一次指数曲線に適合しなかったためであった。
【００６２】
図２９はＯＳＴ７−１細胞中のＲＮＡ自己プロセシングを示す。インビトロのレーンは，ＲＮＡ抽出前に細胞溶解物に加えられた完全長の非プロセシング転写物を含む。これらのＲＮＡは，５’末端標識プライマーとハイブリダイズさせる前に，ＭｇＣｌ2（＋）またはＤＥＰＣ処理水（−）の何れかで予めインキュベートされた。細胞レーンは４つの自己プロセシング構築物の一つでトランスフェクトした細胞からの全細胞ＲＮＡを含む。細胞ＲＮＡは配列特異的プライマー伸長アッセイを用いてリボザイム発現について探索される。実線矢印は完全長ＲＮＡおよび３’切断生成物に対応するプライマー伸長バンドの位置を示す。
【００６３】
図３０および３１は自己プロセシングに続いて５’末端および３’末端において規定された安定なステムループ構造を有するトランス作用リボザイムを放出する自己プロセシングカセットを図解的に描写する。図３０はハンマーヘッド自己プロセシングカセットのさまざまな順列（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を示す。図３１はヘアピン自己プロセシングカセットのさまざまな順列を示す。
【００６４】
図３２ａ−ｂはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーター構造の図解的描写である。矢印は転写開始部位およびコード領域の方向を示す。Ａ，ＢおよびＣはコンセンサスなＡ，ＢおよびＣボックスプロモーター配列を意味する。Ｉは中間のシス作用プロモーター配列を意味する。ＰＳＥは近位の配列要素を意味する。ＤＳＥは遠位の配列要素を意味する。ＡＴＦは転写因子結合要素の活性化を意味する。？は完全に特徴付けられていないシス作用配列要素を意味する。ＥＢＥＲはエプスタインバールウイルスによりコードされるＲＮＡである。ＴＡＴＡは当業界においてよく知られたボックスである。
【００６５】
図３３ａ−ｅは初期ｔＲＮＡimetおよびΔ３−５転写物の配列である。ボックスＡおよびＢはｐｏｌＩＩＩの転写に必要な内部プロモーター領域である。矢印は内因性ｔＲＮＡプロセシング部位を示す。Δ３−５転写物はｔＲＮＡの欠損バージョンであり，ボックスＢの３’配列が欠失している（アデニー−ゾーンズ（Ａｄｅｎｉｙｉ−Ｊｏｎｅｓ），１９８４，前記）。この修飾によりΔ３−５ＲＮＡは内因性ｔＲＮＡのプロセシングに耐性となる。
【００６６】
図３４はΔ３−５ＲＮＡに挿入されたＲＮＡ構造モチーフの図解的描写である。Δ３−５／ＨＨＩ：ハンマーヘッド（ＨＨＩ）リボザイムをΔ３−５ＲＮＡの３’領域にクローン化した。Ｓ３：安定なステムループ構造をΔ３−５／ＨＨＩキメラの３’末端に挿入した。Ｓ５：安定なステムループ構造をΔ３−５／ＨＨＩリボザイムキメラの５’および３’末端に挿入した。Ｓ３５：Δ３−５／ＨＨＩリボザイムキメラの３’末端の配列を変更して，５’末端と，同じＲＮＡの相補的な３’領域との間で二重鎖を形成させた。Ｓ３５プラス：Ｓ３５の構造的変更に加えて，配列を変更してΔ３−５／ＨＨＩリボザイムキメラの非リボザイム配列中に付加的な二重鎖を形成させた。
【００６７】
図３５および３６はΔ３−５ベクターで形質導入されたＴ細胞株のリボザイムを定量するノーザン分析に関する。（３５）Δ３−５／ＨＨＩおよびその変異株をＤＣレトロウイルスベクター中に個々にクローン化した（スレンゲル（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ）ら，１９９０，前記）。ＭＴ−２細胞内で発現されたリボザイムキメラのノーザン分析を実施した。全ＲＮＡを細胞から単離し（コモチンスキーとザッチ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ＆  Ｓａｃｃｈｉ），１９８７  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６２，１５６−１５９），図３４に記載されるとおりにさまざまな構築物を形質導入した。ノーザン分析は標準的プロトコルを用いて実施した（Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９２，アウスベル（Ａｕｓｂｅｌ）ら著，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ）。命名は図３４と同じである。このアッセイはタイプ２のｐｏｌＩＩＩプロモーターからの発現レベルを測定する。（３６）ＭＴ２細胞内のＳ３５構築物の発現。Ｓ３５（＋リボザイム）はＨＨＩリボザイムを含むＳ３５構築物である。Ｓ３５（−リボザイム）はリボザイムを含まないＳ３５構築物である。
【００６８】
図３７は形質導入されたＭＴ２細胞から抽出された全ＲＮＡ中のリボザイム活性を示す。全ＲＮＡは図３５および３６に記載されるΔ３−５構築物を形質導入された細胞から単離した。標準的リボザイム切断反応において，５μｇの全ＲＮＡおよび痕跡量の５’末端標識リボザイム標的ＲＮＡを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2存在下において９０℃にて２分間個別に変性した。ＲＮＡは反応混合物を１０−１５分間３７℃に冷却することにより再生した。切断反応は標識基質ＲＮＡと全細胞ＲＮＡを３７℃にて混合することにより開始した。反応を約１８時間行わせたのち，サンプルを２０％尿素−アクリルアミドゲルにて分析した。バンドはオートダジオグラフィーにより可視化した。
【００６９】
図３８および３９はＳ３５で形質導入されたクローンＣＥＭ細胞株のリボザイム発現および活性レベルに関する。３８）Ｓ３５で形質導入されたクローンＣＥＭ細胞株のノーザン分析。標準曲線は，既知量のインビトロ転写されたＳ５のＲＮＡを，非形質導入ＣＥＭ細胞から単離された全細胞ＲＮＡにスパイク（ｓｐｉｋｅ）することにより作成した。プールは，Ｓ３５構築物形質導入された保存細胞からのＲＮＡを含む。プール（−Ｇ４１８，３Ｍｏ）は，最初にＧ４１８耐性に関して選択されて次にＧ４１８不在下にて３カ月間成長させた保存細胞からのＲＮＡを含む。レーンＡからＮは，Ｓ３５構築物で形質導入された保存細胞から生じた個々のクローンからのＲＮＡを含む。ｔＲＮＡimetは内因性ＲＮＡを意味する。Ｓ３５はリボザイムのバンドの位置を示す。Ｍはマーカーレーンを示す。３９）Ｓ３５で形質導入されたクローン化ＣＥＭ細胞株の活性レベル。ＲＮＡ単離および切断反応は図３７に記載のとおりであった。命名法は図３５および３６におけるものと同様であるが，ただし，Ｓは５’末端標識基質ＲＮＡであり，Ｐは８ｎｔの５’末端標識リボザイム介在ＲＮＡ切断反応物である。
【００７０】
図４０および４１は，それぞれＳ３５および所望のＲＮＡ（ＨＨＩ）を含むＳ３５の提案された二次構造である。ＨＨＩリボザイムの位置は図４１に示されている。分子内ステムとは，３’配列と相補的な５’末端との間の分子内塩基対相互作用により形成されたステム構造を意味する。ステムの長さは１５−１６塩基対の範囲である。ＡおよびＢボックスの位置を示す。
【００７１】
図４２および４３はＳ３５プラスおよびＨＨＩリボザイムを含むＳ３５プラスの提案された二次構造である。
【００７２】
図４４，４５，４６および４７は，それぞれＳ３５，ＨＨＩＳ３５，Ｓ３５プラスおよびＨＨＩＳ３５プラスのヌクレオチド塩基配列である。
【００７３】
図４８ａ−ｂは本発明のｐｏｌＩＩＩ  ＲＮＡの一般式である。
【００７４】
図４９は５Ｔ構築物の図解的描写である。この構築物において，所望のＲＮＡは分子内ステムの３’に位置する。
【００７５】
図５０および５１は，それぞれ５Ｔ構築物のみおよび所望のＲＮＡ（ＨＨＩリボザイム）含む５Ｔの提案された二次構造を含む。
【００７６】
図５２はＴＲＺ−ｔＲＮＡキメラの図解的描写である。所望のＲＮＡ挿入物の位置を示す。
【００７７】
図５３は，ＨＨＩＴＲＺ−Ａリボザイムのキメラの一般的な構造を示す。部位Ｉを標的とするハンマーヘッドリボザイムは，ＴＲＺ−ｔＲＮＡキメラのステムＩＩ領域に挿入される。
【００７８】
図５４はＨＲＩＴＲＺ−Ａリボザイムのキメラの一般的な構造を示す。部位Ｉを標的とするヘアピンリボザイムは，ＴＲＺ−ｔＲＮＡキメラの指示された領域にクローン化される。
【００７９】
図５５は，ＨＨＩＴＲＺ−Ａ，ＨＨＩＴＲＺ−Ｂおよび化学的に合成されたＨＨＩハンマーヘッドリボザイムのＲＮＡ切断活性の比較を示す。
【００８０】
図５６は，ウイルスベクターを安定に形質導入されたＴ細胞株中のリボザイムの発現を示す。Ｍはマーカーであり，レーン１は非形質導入ＣＥＭ細胞であり，レーン２および３はレトロウイルスベクターを形質導入したＭＴ２およびＣＥＭ細胞株であり，レーン４および５はＡＡＶベクターを形質導入したＭＴ２およびＣＥＭ細胞株である。
【００８１】
図５７ａ−ｂは，リボザイムを送達するためのアデノ関連ウイルスおよびアデノウイルスベクターの模式図である。両ベクターは，ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに基づくひとつまたはそれ以上のリボザイムをコードする転写ユニット（ＲＺ）を利用する。Ａは，ベクターゲノムの各末端の反転ターミナルリピート（ＩＴＲ），外因性プロモーター（Ｐｒｏ）により推進される任意の選択マーカー（Ｎｅｏ），リボザイム転写ユニット，および有効なパッケージングに適切な長さのベクターを維持するための十分な付加的配列（スタッファー）からなる，最小ＡＡＶ配列を含むＡＡＶ系ベクターの図解である。Ｂは，ひとつまたはそれ以上の野生型アデノウイルスコード領域の欠失を含み（Ｅ１，ｐＩＸ，Ｅ３およびＥ４と付された斜線のボックス），そしてこれら欠失領域の任意の１つまたは幾つかにリボザイム転写ユニットの挿入を含む，リボザイム発現アデノウイルスベクターの図解である。
【００８２】
図５８は，ライゲーションされたハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムの活性に及ぼすアームの長さの変化の影響を示すグラフである。５／５，６／６，７／７，８／８等の命名は，リボザイムと標的の間に形成された塩基対の数を意味する。例えば，５／８は，ＨＨリボザイムが全１３ｂｐの場合に，切断部位の５’側に５ｂｐおよび３’側に８ｂｐを形成することを意味する。−ΔＧは，リボザイムと基質ＲＮＡの間の塩基対相互作用に関して計算された，結合の自由エネルギーを意味する（ターナーとスギモト（Ｔｕｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｓｕｇｉｍｏｔｏ），１９８８  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１７，１６７）。ＲＰＩ  Ａは，６／６結合アームを有するＨＨリボザイムである。
【００８３】
図５９および６０および６１は，ライゲーションされたＨＨリボザイムによる長い基質（６２２ｎｔ）の切断を示す。
【００８４】
図６２は，Ｈと名付けられた部位を標的とするハンマーヘッドリボザイム（ＨＨ−Ｈ）の図解的描写である。２塩基対のステムＩＩ（ＨＨ−Ｈ１およびＨＨ−Ｈ２）または３塩基対のステムＩＩ（ＨＨ−Ｈ３およびＨＨ−Ｈ４）の何れかを含むＨＨ−Ｈの可変物も示す。
【００８５】
図６３および６４は，ＨＨ−Ｉおよびその可変物のＲＮＡ切断活性を示す（図６２を参照）。６３）マッチした基質ＲＮＡ（１５ｎｔ）の切断。６４）長い基質ＲＮＡ（６１３ｎｔ）の切断。
【００８６】
図６５ａ−ｂは，完全長のヘアピンリボザイムを合成するための本発明の方法の図解的描写である。ライゲーションには副木鎖は必要ないが，そのかわり２つの断片はヘリックス４においてライゲーション前にハイブリダイズする。唯一前もって必要なものは，３’断片がその５’末端においてリン酸化されていること，並びに５’断片の３’末端がヒドロキシル基を有することである。ヘアピンリボザイムは部位Ｊを標的とする。Ｈ１およびＨ２は，リボザイムと基質の間に形成された分子内ヘリックスである。Ｈ３およびＨ４は，ヘアピンリボザイムのモチーフ内に形成された分子内ヘリックスである。矢印は切断部位を示す。
【００８７】
図６６は，部位Ｊを標的とするライゲーションされたヘアピンリボザイムのＲＮＡ切断活性を示す。
【００８８】
図６７ａ−ｂは，当業界において記載されたとおり，ヘアピンリボザイム／基質複合体の提案された二次構造を示す部位Ｋヘアピンリボザイム（ＨＰ−Ｋ）の図解的描写である（ベルツアル−ヘランツ（Ｂｅｒｚａｌ−Ｈｅｒｒａｎｚ）ら，１９９３  ＥＭＢＯ．Ｊ．１２，２５６７）。該リボザイムは２つの断片から組み立てられており（２分子リボザイム；チョウリアとブルケ（Ｃｈｏｗｒｉａ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｅ），１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｓ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０，２８３５），＃Ｈ１およびＨ２はリボザイムと基質の間の分子間ヘリックス形成を表す。Ｈ３およびＨ４は，リボザイム内部の分子内ヘリックス形成を表す（２分子リボザイムの場合は分子間ヘリックス）。左のパネル（ＨＰ−Ｋ１）は４塩基対のヘリックス２を示し，そして右のパネル（ＨＰ−Ｋ２）は６塩基対のヘリックス２を示す。矢印はＲＮＡ切断部位を示す。本明細書において議論されるすべてのリボザイムは，他に示されない限り，ＲＮＡホスホルアミダイト化学を用いて固相合成により化学合成された。当業者であれば，これらリボザイムをインビトロおよびインビボで転写により作成しうることは認識するであろう。
【００８９】
図６８は，部位Ｋを標的とするヘアピンリボザイムによるＲＮＡ切断を示すグラフである。切断されなかった標的ＲＮＡのフラクション（非切断フラクション）のプロットを時間の函数として示す。ＨＰ−Ｋ２（６ｂｐのヘリックス２）は，ＨＰ−Ｋ１（４ｂｐのヘリックス２）より高い程度で４２２の標的ＲＮＡを切断する。
【００９０】
トランスリボザイム切断反応のための内部標識基質ＲＮＡを作成するために，増幅された配列の上流にＴ７ＲＮＡプロモーターを配置するプライマーを用いるＰＣＲにより，４２２ｎｔ領域（ヘアピン部位Ａを含む）を合成した。標的ＲＮＡは，［α−32Ｐ］ＣＴＰの存在下において標準転写バッファー中で転写された（チョウリアとブルケ（Ｃｈｏｗｒｉａ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｅ），１９９１，前記）。反応混合物は１５ユニットのリボヌクレアーゼ不含ＤＮａｓｅＩで処理し，フェノール抽出してからクロロホルム：イソアミルアルコール（２５：１）抽出したのち，イソプロパノールで沈殿し，７０％エタノールで洗浄した。乾燥ペレットは２０μｌのＤＥＰＣ処理水に懸濁して−２０℃に保存した。
【００９１】
未標識リボザイム（１μＭ）および内部標識された４２２ｎｔ基質ＲＮＡ（＜１０ｎＭ）を別々に標準切断バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む）中で，９０℃で２分間加熱して１０分間３７℃にゆっくり冷却することにより変性および再生した。反応はリボザイムと基質混合物を最初に混合することにより開始して３７℃にてインキュベートした。５μｌのアリコートを一定時間の間隔で取り出して，等量の２×ホルムアミドゲルローディングバッファーを加えることにより急冷し，そしてドライアイス上で凍らせた。サンプルを５％ポリアクリルアミド配列決定ゲルで分離し，その結果をホスホルイメージャー（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いた放射分析イメージにより定量分析した。
【００９２】
図６９ａ−ｂは，部位Ｌヘアピンリボザイム（ＨＰ−Ｌ）であり，ヘアピンリボザイム／基質複合体の提案された二次構造を示す。該リボザイムは上記のとおり２つの断片から組み立てられた。命名は上記のとおりである。
【００９３】
図７０は，部位Ｌを標的とするヘアピンリボザイムによるＲＮＡ切断を示す。Ａは切断されなかった標的ＲＮＡのフラクション（非切断フラクション）のプロットを時間の函数として示す。ＨＰ−Ｌ２（６ｂｐのヘリックス２）は，ＨＰ−Ｌ１（４ｂｐのヘリックス２）より高い程度で２ｋＢの標的ＲＮＡを切断する。トランスリボザイム切断反応のための内部標識基質ＲＮＡを作成するために，増幅された配列の上流にＴ７ＲＮＡプロモーターを配置するプライマーを用いるＰＣＲにより，２ｋＢ領域（ヘアピン部位Ｌを含む）を合成した。切断反応は上記のとおりに実施した。
【００９４】
図７１ａ−ｂは，部位Ｍヘアピンリボザイム（ＨＰ−Ｍ）であり，ヘアピンリボザイム／基質複合体の提案された二次構造を示す。該リボザイムは上記のとおり２つの断片から組み立てられた。
【００９５】
図７２は，部位Ｍを標的とするヘアピンリボザイムによるＲＮＡ切断を示すグラフである。リボザイムは２０℃と２６℃の両方で試験された。トランスリボザイム切断反応のための内部標識基質ＲＮＡを作成するために，増幅された配列の上流にＴ７ＲＮＡプロモーターを配置するプライマーを用いるＰＣＲにより，１．９ｋＢ領域（ヘアピン部位Ｍを含む）を合成した。切断反応は上記のとおりに実施したが，但し２０℃および２６℃の温度を用いた。
【００９６】
図７３ａ−ｄは，本発明のさまざまな構造修飾を示す。ａ）ヘリックス５を欠くヘアピンリボザイム。命名は図３の記載のとおりである。ｂ）ヘリックス４およびヘリックス５を欠くヘアピンリボザイム。ヘリックス４はヌクレオチドループに置き換えられており，ｑは２塩基以上である。命名は図３の記載のとおりである。ｃ）ヘリックス５を欠くヘアピンリボザイムに関する。ヘリックス４ループはリンカー１０３”Ｌ”に置き換えられており，Ｌは非ヌクレオチドリンカー分子である（ベンセラー（Ｂｅｎｓｅｌｅｒ）ら，１９９３  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５，８４８３；ジェニングス（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）ら，ＷＯ９４／１３６８８）。命名は図３の記載のとおりである。ｄ）ヘリックス４およびヘリックス５を欠くヘアピンリボザイム。ヘリックス４は非ヌクレオチドリンカー分子”Ｌ”に置き換えられている（ベンセラーら，１９９３前記；ジェニングスら，前記）。命名は図３の記載のとおりである。
【００９７】
図７４ａ−ｂは，示された位置にヌクレオチドスペーサー領域”ｓ”を含むヘアピンリボザイムを示し，ここでｓは１以上である。スペーサー領域を含むヘアピンリボザイムは一つの断片として合成することができるかまたは複数の断片から組み立てることができる。命名は図３のとおりである。
【００９８】
図７５ａ−ｅは，５’−Ｃ−アルキル修飾ヌクレオチドの構造を示す。Ｒ1は上記の定義のとおりである。ＲはＯＨ，Ｈ，Ｏ−保護基，ＮＨ，または上記または下記文献により記載された何れかの基である。Ｂは図にて定義されたとおりであるかまたは他の均等なヌクレオチド塩基である。ＣＥはシアノエチルであり，ＤＭＴは標準的ブロッキング基である。他の略記は当業界において標準的なものである。
【００９９】
図７６は，５’−Ｃ−アルキル−Ｄ−アロース（ａｌｌｏｓｅ）ヌクレオチドおよびそのホスホルアミダイトの図解的描写である。
【０１００】
図７７は，５’−Ｃ−アルキル−Ｄ−タロース（ｔａｌｏｓｅ）ヌクレオチドおよびそのホスホルアミダイトの図解的描写である。
【０１０１】
図７８は，部位Ｏを標的とする，さまざまな位置において５’−Ｃ−メチル−Ｌ−タロ修飾を含むハンマーヘッドリボザイムの図解的描写である。
【０１０２】
図７９は，ＨＨ−ＯリボザイムのＲＮＡ切断活性を示す。切断されなかった標的ＲＮＡのフラクションを時間の函数として示す。
【０１０３】
図８０は，特定の置換を示すハンマーヘッドリボザイムの位置に番号を付したものの図解的描写である（ハーテル（Ｈｅｒｔｅｌ）ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２，２０，３２５２に基づく）。
【０１０４】
図８１ａ−ｊは，さまざまな２’−アルキル修飾ヌクレオチドの構造を示すものであり，それらは本発明を例示する。Ｒ基はアルキル基であり，Ｚは保護基である。
【０１０５】
図８２は，２’−Ｃ−アリルウリジンおよびシチジンの合成の図解的描写である。
【０１０６】
図８３は，２’−Ｃ−メチレンおよび２’−Ｃ−ジフルオロメチレンウリジンの合成の図解的描写である。
【０１０７】
図８４は，２’−Ｃ−メチレンおよび２’−Ｃ−ジフルオロメチレンシチジンの合成の図解的描写である。
【０１０８】
図８５は，２’−Ｃ−メチレンおよび２’−Ｃ−ジフルオロメチレンアデノシンの合成の図解的描写である。
【０１０９】
図８６は，２’−Ｃ−カルボキシメチリジンウリジン，２’−Ｃ−メトキシカルボキシメチリジンウリジンおよびその誘導されたアミダイトの合成の図解的描写である。Ｘは，上記のとおりＣＨ3またはアルキルであるか，または他の置換基である。
【０１１０】
図８７は，ヌクレオシド５’−デオキシ−５’−ジフルオロメチルホスホネートの合成の図解的描写である。
【０１１１】
図８８は，ヌクレオシド５’−デオキシ−５’−ジフルオロメチルホスホネート  ３’−ホスホルアミダイトの，ダイマーおよび固体に支持されたダイマーの合成の図解的描写である。
【０１１２】
図８９は，ヌクレオシド５’−デオキシ−５’−フルオロメチレン三リン酸の合成の図解的描写である。
【０１１３】
図９０および９１は，３’−デオキシ−３’−ジフルオロメチルホスホネートおよびダイマーの合成の図解的描写である。
【０１１４】
図９２は，本発明の２’−ヒドロキシル基修飾を含むヌクレオチドのＲＮＡホスホルアミダイトの合成の図解的描写である。
【０１１５】
図９３ａ−ｂは，本発明の２’−ヒドロキシル基修飾を含むオリゴヌクレオチドの脱保護法を記載する。
【０１１６】
図９４は，部位Ｎを標的とするハンマーヘッドリボザイムの図解的描写である。２’−ヒドロキシル基の置換の位置を示す。
【０１１７】
図９５は，本発明の２’−ヒドロキシル基修飾を含むリボザイムのＲＮＡ切断活性を示す。全ＲＮＡは，２’−ヒドロキシル基修飾を含まないハンマーヘッドリボザイム（ＨＨＮ）を表す。Ｕ７−ａｒａは，Ｕ７位に２’−ＮＨ−アラニン修飾を含むＨＨＮリボザイムを表す。Ｕ４／Ｕ７−ａｌａは，Ｕ４およびＵ７位に２’−ＮＨ−アラニン修飾を含むＨＨＡを表す。Ｕ４  ｌｙｓは，Ｕ４位に２’−ＮＨ−リジン修飾を含むＨＨＡを表す。Ｕ７  ｌｙｓは，Ｕ７位に２’−ＮＨ−リジン修飾を含むＨＨＡを表す。Ｕ４／Ｕ７−ｌｙｓは，Ｕ４位およびＵ７位に２’−ＮＨ−リジン修飾を含むＨＨＮを表す。
【０１１８】
図９６および９７は，本発明の修飾を有するＲＮＡの３’末端の合成（固相合成）の図解的描写である。Ｂは塩基，修飾塩基，またはＨである。
【０１１９】
図９８および９９は，本発明の修飾を有するＲＮＡの５’末端の合成（固相合成）の図解的描写である。Ｂは塩基，修飾塩基，またはＨである。
【０１２０】
図１００および１０１は，本発明の一般的な図解的描写である。
【０１２１】
図１０２ａ−ｄは，本発明の方法の図式的描写である。
【０１２２】
図１０３は，図１０４に図解された実験の結果のグラフである。
【０１２３】
図１０４は，図１０２に図解された実験に用いられた融合ｍＲＮＡの図解的描写である。
【０１２４】
図１０５は，本発明の有用なリボザイムの選択法の図解的描写である。
【０１２５】
図１０６は，Ｒループ形成，およびＲループ複合体を一般的に示す。さらに，少なくとも３つの異なる方法，例えばリガンドリセプター相互作用，脂質またはリン酸カルシウム介在送達またはエレクトロポレーションを用いて，Ｒループ複合体を細胞に標的化するためにリガンドを提供しうる位置を示す。
【０１２６】
図１０７は，ユニット長の治療用リボザイムを生成するために自己プロセシングリボザイムを使用する方法を示す。この方法は本質的にドラッパー（Ｄｒａｐｅｒ）ら（ＰＣＴ  ＷＯ９３／２３５０９）に記載されている。
【０１２７】
図１０８は，葉酸塩（ｆｏｌａｔｅ），炭水化物またはペプチドのようなリガンドをＲＮＡループ形成ＲＮＡに結合させる方法を示す。
【０１２８】
本発明のリボザイムは，ＩＣＡＭ−１，ＩＬ−５，ｒｅｌＡ，ＴＮＦ−α，ｐ２１０bcr-ablまたはＲＳＶ遺伝子の発現をある程度ブロックし，そしてそのような疾患の治療または診断に用いることができる。リボザイムは培養中の細胞および動物モデル中の組織に送達されるであろう。これらの系におけるＩＣＡＭ−１，ＩＬ−５，ｒｅｌＡ，ＴＮＦ−α，ｐ２１０bcr-ablまたはＲＳＶｍＲＮＡのリボザイムによる切断は，疾患の症状または状態を予防または緩和しうる。
【０１２９】
Ｉ．標的部位
有用なリボザイムの標的はドレイパー（Draper）等のＰＣＴ ＷＯ93／23509，サリバン（Sullivan）等のＰＣＴ ＷＯ94／02595並びにドレイパー等のＰＣＴ／ＵＳ94／13129（これらは全体を参照として本願明細書に組み入れる）に開示されているようにして決定することができる。本願明細書ではこれらの文書で提供されている手本を繰り返さないで，以下でこれら方法の特定の例を提供するが，これらは当該技術分野の方法に限定されない。このような標的に対するリボザイムはこれらの適用で記載されているようにして設計しそして記載されているようにして合成し，インビトロ及びインビボで試験する。このようなリボザイムは本願明細書に記載したようにして最適化しそして送達することもできる。動物及びヒトＲＮＡに対する特定の例を提供するが，当業者は記載された等価のヒトＲＮＡ標的を以下で記載するようにして使用できることを認めるであろう。かくして，同一の標的を使用することができるが，ヒトＲＮＡ配列を標的とするのに適する結合アームはリボザイムに存在する。このような標的は以下に記載するようにして選択することもできる。
【０１３０】
コンピューターに基づくＲＮＡ折りたたみアルゴリズムによって予測される部位が潜在的な開列部位に相当することを確立しなければならない。ハンマーヘッド又はヘアピンリボザイムが結合し得るように設計し，そしてコンピューター折りたたみ（Jaeger等，1989年 Proc. Natl. Acad. Sci., USA，86 7706〜7710）で個々に分析してリボザイム配列が適当な二次構造に折りたたまれているかどうかを評価する。結合アームと触媒コア間に好ましくない分子内相互作用を有するリボザイムは考慮から除外する。種々の結合アームの長さを選択して活性を最適にすることができる。一般に，各アームの少なくとも５塩基が標的ＲＮＡと結合できるか又はそうでない場合には標的ＲＮＡと相互作用することができる。
【０１３１】
ｍＲＮＡは利用可能な開裂部位について，ドレイパー等のＰＣＴ ＷＯ93／23569（これは参照として本願明細書に組み入れる）に一般的に記載されている方法によってスクリーニングする。簡単に言えば，潜在的ハンマーヘッド又はヘアピンリボザイム開裂部位を表すＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成する。ポリメラーゼ連鎖反応を使用して，ｃＤＮＡクローンからＴ7 ＲＮＡポリメラーゼ転写用基質を生じさせる。標識ＲＮＡ転写物はＤＮＡ鋳型からインビトロで合成する。オリゴヌクレオチドと標識転写物をアニーリングする。リボヌクレアーゼＨを加え，そしてこの混合物を37℃で指定された時間インキュベートする。反応を停止させそしてＲＮＡを配列決定ポリアクリルアミドゲルで分離する。開裂された基質のパーセントは，リン画像化システムを使用してオートラジオグラフィー定量で測定する。これらのデータから，ハンマーヘッド又はヘアピンリボザイム部位を最も利用可能なものとして選択する。
【０１３２】
ハンマーヘッド又はヘアピンモチーフのリボザイムを設計してｍＲＮＡメッセージ中の種々の部位にアニーリングする。結合アームは上記した標的部位配列と相補的である。リボザイムは化学的に合成する。使用する合成方法は，ウスマン（Usman）等，1987年 J. Am. Chem. Soc.，109，7485及びスカリンジ（Scaringe）等，1990年 Nucleic Acids Res.，18，5433に記載されそして５'末端のジメトキシトリチル，３'末端のホスホラミダイトのような通常の核酸保護基及びカップリング基を使用する通常のＲＮＡ合成方法に従う。平均的な段階的カップリング収率は＞98％である。不活性リボザイムはＧ5の代わりにＵをそしてＡ14の代わりにＵを使用して合成する（Hertel等，1992年 Nucleic Acids Res.，20，3252による番号)。ヘアピンリボザイムを２つの部分で合成しそしてアニーリングして活性リボザイムを再構築する（Chowrira及びBurke，1992年 Nucleic Acids Res.，20，2835〜2840)。リボザイムはバクテリオファージＴ7 ＲＮＡポリメラーゼを使用してＤＮＡ鋳型からも合成される（Milligan及びUhlenbach，1989年，Mehtods Enzymol，180，51)。リボザイムは全て，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２'−アミノ，２'−Ｃ−アリル，２'−フルオロ，２'−Ｏ−メチル，２'Ｈで修飾して安定性を高めるように広範囲に修飾される（総説については，Usman及びCedergren，1992年 TIBS 17，34参照)。リボザイムは一般的な方法を使用してゲル電気泳動で精製するか又は高圧液体クロマトグラフィーで精製しそして水に再懸濁する。
【０１３３】
実施例１：  ＩＣＡＭ−１
ＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡを開裂するリボザイムは炎症性又は自己免疫疾患に対する新規治療方法を示している。モノクローナル抗体を使用してＩＣＡＭ−１の機能を治療的にブロックすることができる。リボザイムは一般的に免疫学的に不活性であるという利点を有しており，一方幾つかのモノクローナル抗体治療により抗ＩgＧ応答の顕著な中和を観察することができる。
【０１３４】
以下でＩＣＡＭ−１の生理学的役割を簡単に説明する。考察は完全であるように意図したものではなくて後に続く本発明を理解するためにだけ提供する。この要約は以下に記載した研究のいずれかがクレームした発明の先行技術であることを認めるものではない。
【０１３５】
細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）は，炎症性メディエーターによって発現が誘発される細胞表面タンパク質である。ＩＣＡＭ−１は白血球が内皮細胞に接着するために必要でありそして抗原の提示，免疫グロブリンの産生及び細胞毒細胞活性を含む幾つかの免疫学的機能に必要である。ＩＣＡＭ−１機能をブロックすると，移植拒絶反応中並びにリウマトイド関節炎，喘息及び再潅流損傷の動物モデルで免疫細胞認識や活性を妨げる。
【０１３６】
細胞−細胞接着は炎症性及び免疫応答で極めて重要な役割を果たす（Springer等，1987年 Ann. Rev. Immunol. 5，223〜252)。細胞接着は白血球が血管内皮細胞に結合しそしてそこを通して移動するために必要である。加えて，細胞−細胞接着はＴ細胞に対する抗原提示，Ｔ細胞によるＢ細胞誘発，並びにＴ細胞，ＮＫ細胞，単球又は顆粒球の細胞毒性活性に必要である。細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）はこれらの細胞−細胞相互作用の全てに関与している免疫グロブリンスーパーファミリーの110キロダルトンのメンバーである（Simmons等，1988年 Nature（ロンドン）331，624〜627)。
【０１３７】
ＩＣＡＭ−１は刺激の不存在下ではある限られた数の細胞でしかそして低い値でしか発現しない（Dustin等，1986年 J. Immunol. 137，245〜254)。多数の炎症性メディエーター（リポ多糖，γ−インターフェロン，腫瘍壊死因子−α又はインターロイキン−１）で治療すると，多様な組織中の多様な細胞タイプ（内皮，上皮，線維芽及び造血細胞）はそれらの表面に高いＩＣＡＭ−１値を発現する（Sringer等，上述; Dustin等，上述; 及びRothlein等，1988年 J. Immunol. 141，1665〜1669)。誘発はＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡの転写増加によって生起する（Simmons等，上述)。発現増加は誘発４時間後に検出可能でありそして16〜24時間後に最大に達する。
【０１３８】
ＩＣＡＭ−１誘発は多数の炎症及び免疫応答に重要である。インビトロで，ＩＣＡＭ−１の抗体は白血球とサイトカイン活性化内皮細胞の接着をブロックする（Boyd，1988年 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85，3095〜3099; Dustin及びSpringer，1988年 J. Cell Biol. 107，321〜331)。かくして，免疫細胞が炎症部位に溢出するためにはＩＣＡＭ−１の発現が必要であると思われる。ＩＣＡＭ−１の抗体はＴ細胞殺傷，混合リンパ球反応及びＴ細胞媒介Ｂ細胞分化もブロックし，これらの同系細胞の相互作用にＩＣＡＭ−１が必要であることを示唆している（Boyd等，上述)。抗原提示におけるＩＣＡＭ−１の重要性は，ＩＣＡＭ−１欠失ネズミＢ細胞突然変異体が抗原依存性Ｔ細胞増殖を刺激できないことで強調される（Dang等，1990年 J. Immunol. 144，4082〜4091)。逆に言えば，ネズミＬ細胞はヒトＴ細胞に抗原を提供するためにＨＬＡ−ＤＲに加えてヒトＩＣＡＭ−１によるトランスフェクションを必要とする（Altmann等，1989年 Nature（ロンドン）338，512〜514)。要するに，インビトロの証拠は，炎症応答，細胞免疫応答及び体液抗体応答に決定的な細胞−細胞相互作用にはＩＣＡＭ−１が必要であることを示している。
【０１３９】
リボザイムモチーフを巧みに操作することによって，本発明者はＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ配列に向けた幾つかのリボザイムを設計した。これらはヌクレアーゼ耐性を改善するように修飾して合成した。これらのリボザイムはインビトロでＩＣＡＭ−１標的配列を開裂する。
【０１４０】
ヒト，ラット及びマウスＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡの配列はコンピューター折りたたみアルゴリズムを使用して利用可能な部位についてスクリーニングすることができる。二次折りたたみ構造を形成しておらずそして潜在的ハンマーヘッド又はヘアピンリボザイム開裂部位を含有するｍＲＮＡの領域を同定することができる。これらの部位は表２，３及び６〜９に示す。（これらの表で，配列は全て5'から3'である)。ラット，マウス及びヒト配列をスクリーニングしそしてその後リボザイムを設計することができるが，ヒト標的化配列が最も有益である。
【０１４１】
この研究で有用な化学合成リボザイムの配列は表４〜８及び10に示す。当業者はこれらの配列が，リボザイムの酵素部分（結合アーム以外の全て）が活性に影響を与えるように変更されておりそしてリボヌクレオチド若しくは他のヌクレオチド又は非ヌクレオチドから作り得るような多数の配列の代表例にすぎないことを認めるであろう。このようなリボザイムは表に明示的に記載したリボザイムと等価である。
【０１４２】
リボザイムはヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に外来的に送達することによってインビボ機能について試験する。リボザイムは，リポソーム中への取り込みによって，陽イオン脂質とのコンプレックス形成によって，微量注入によって，又は上記したＤＮＡ若しくはＲＮＡベクターからの発現によって送達される。サイトカイン誘発ＩＣＡＭ−１発現はエリザ法によって，間接免疫蛍光法によって，及び／又はＦＡＣＳ分析によってモニターする。ＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ値はノーザン法によって，リボヌクレアーゼ保護によって，プライマー延長によって，又は定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によって評価する。ＩＣＡＭ−１タンパク質及びｍＲＮＡの誘発を90％以上ブロックするリボザイムを同定する。
【０１４３】
本願明細書に参照として組み入れたサリバン等のＰＣＴ ＷＯ94／02595で開示されているように，リボザイム及び／又はリボザイムをコードする遺伝子は動物モデルのエクスビボ移植組織に局所的に送達される。リボザイムの発現はＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ及びタンパク質のエクスビボ誘発をブロックする能力によってモニターする。次に，移植片拒絶反応に与える抗ＩＣＡＭ−１リボザイムの効果を評価する。同様に，リボザイムはコラーゲン誘発性関節炎を有するマウス又はストレプトコッカス細胞壁誘発性関節炎を有するウサギの関節中に導入される。リポソーム送達，陽イオン脂質送達又はアデノ関連ウイルスベクター送達を使用することができる。安定な抗ＩＣＡＭ−１リボザイム又は本質的にリボザイムを発現する遺伝子構築物の単回投与（又は２，３回の不定期投与）によってこれらの疾病の炎症及び免疫応答を終了させることができる。
【０１４４】
使用
ＩＣＡＭ−１は免疫細胞認識及び機能で中心的な役割を果たしている。リボザイムによるＩＣＡＭ−１発現の阻止によって移植片拒絶反応を軽減しそしてリウマトイド関節炎，喘息又は他の急性及び慢性炎症性疾患患者の症状を緩解することができる。本発明者はＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡを開裂する幾つかのリボザイムを設計した。細胞内でのＩＣＡＭ−１発現を効果的に阻止するリボザイムは容易に見つけることができそしてそれらの活性は動物モデルでの移植片拒絶反応及び関節炎症状をブロックする能力に関して測定することができる。これらの抗ＩＣＡＭ−１リボザイムは免疫学的又は炎症性疾患を治療する新規治療法を示している。
【０１４５】
ＩＣＡＭ−１機能の活性を低下させることによる治療的有用性は以下の疾病標的で明白である。記載した参照文献はＩＣＡＭ−１の役割及び本明細書に記載したリボザイムの治療的能力を示している。かくして，これらの標的はＩＣＡＭ−１発現又は機能を低下させる物質で治療することができる。これらの疾病及びそれらの病理学におけるＩＣＡＭ−１の決定的な役割を支持する試験は以下のリストで示す。このリストは完全であるように意図するものではなくそして当業者は本発明のリボザイムを使用して効果的に治療できる更なる状態や疾病を認めるであろう。
【０１４６】
・  移植片拒絶反応
ＩＣＡＭ−１は移植片拒絶反応の組織学的徴候を有するヒト心臓生検体の細静脈及び毛細血管で発現する（Briscoe等，1991年 Transplantation 51，537〜539)。
ＩＣＡＭ−１の抗体は霊長類の腎臓（Cosimi等，1990年 J. Immunol. 144，4604〜4612）及び心臓（Flavin等，1991年 Transplant. Proc. 23，533〜534）移植片拒絶反応をブロックする。
モノクローナル抗ＩＣＡＭ−１抗体のフェーズＩ臨床試験はヒト腎臓移植片患者における拒絶反応の顕著な軽減及び移植片機能の顕著な上昇を示した（Haug等，1993年 Transplantation 55，766〜772)。
【０１４７】
・  リウマトイド関節炎
ＩＣＡＭ−１過剰発現が滑液線維芽細胞，内皮細胞，マクロファージ及び或るリンパ球で見られる（Chin等，1990年 Arthritis Rheum 33，1776〜1786; Koch等，1991年 Lab Invest 64，313〜320)。
可溶性ＩＣＡＭ−１値は疾病の重篤度と関係がある（Mason等，1993年 Arthritis Rheum 36，519〜527)。
抗ＩＣＡＭ抗体はマウスのコラーゲン誘発性関節炎を阻止する（Kakimoto等，1992年 Cell Immunol 142，326〜337)。
抗ＩＣＡＭ抗体はラットのアジュバント誘発性関節炎を阻止する（Iigo等，1991年 J Immunol 147，4167〜4171)。
【０１４８】
・  心筋虚血，発作及び再潅流損傷
抗ＩＣＡＭ−１抗体は無酸素内皮細胞に対する好中球の接着をブロックする（Yoshida等，1992年 Am J Physiol 262，Ｈ1891〜1898)。
抗ＩＣＡＭ−１抗体はウサギ脳卒中モデルの神経病学的損傷を軽減する（Bowes等，1993年 Exp Neurol 119，215〜219)。
抗ＩＣＡＭ−１抗体はネコ心筋虚血モデルの再潅流損傷を保護する（Ma等，1992年 Circulation 86，937〜946)。
【０１４９】
・  喘息
ＩＣＡＭ−１の抗体は内皮細胞に対する好酸球接着を部分的にブロックしそしてインビボで炎症気道内皮及び上皮で過剰発現する（Wegner等，1990年 Science 247，456〜459)。
喘息の霊長類モデルで，抗ＩＣＡＭ−１抗体は気道好酸球増加をブロックし（Wegner等，上述）そしてデキサメサゾン治療後の気道炎症及び過剰応答の復活を防止する（Gundel等，1992年 Clin Exp Allergy 22，569〜575)。
【０１５０】
・  乾癬
表面ＩＣＡＭ−１及びＩＣＡＭ−１の切断可溶性体は乾癬病変で発現し，そして発現は炎症と関係がある（Kellner等，1991年 Br J Dermatol 125，211〜216; Griffiths 1989年 J Am Acad Dermatol 20，617〜629; Schopf等，1993年 Br J Dermatol 128，34〜37)。
抗ＩＣＡＭ−１抗体はＴ細胞へのケラチノサイト抗原提示をブロックする（Nickoloff等，1993年 J Immunol 150，2148〜2159)。
【０１５１】
・  川崎病
表面ＩＣＡＭ−１発現は川崎病と関係がありそして有効な免疫グロブリン治療によって減少する（Leung等，1989年 Lancet 2，1298〜1302)。
可溶性ＩＣＡＭ値は川崎病患者で上昇する; 特に高い値は冠動脈病変患者で見られる（Furukawa等，1992年 Arthritis Rheum 35，672〜677; Tsuji，1992年 Arerugi 41，1507〜1514)。
循環ＬＦＡ−1+ Ｔ細胞が川崎病患者では欠失している（多分ＩＣＡＭ−１媒介溢出によって）（Furukawa等，1993年 Scand J Immunol 37，377〜380)。
【０１５２】
実施例２：  ＩＬ−5
ＩＬ−5 ｍＲＮＡを開裂するリボザイムは喘息のような炎症性疾患に対する新規治療方法を示している。本発明はリボザイムを使用して，例えばリンパ球でのＩＬ−5の合成を阻止しそして好酸球の補充及び活性化を防止することによって，慢性喘息を治療することを特徴とする。
【０１５３】
ＩＬ−5の他に血小板活性化因子，ＩＬ−1，ＩＬ−3，ＩＬ−4，ＧＭ−ＣＳＦ，ＴＮＦ−α，ガンマインターフェロン，ＶＣＡＭ，ＩＬＡＭ−1，ＥＬＡＭ−1及びＮＦ−κＢを含む多数のサイトカインも喘息患者の炎症活性化に関与している可能性がある。これらの分子に加えて，サイトカインの活性を媒介する任意の細胞レセプターも炎症性疾患で介在するための良好な標的であると考えられる。これらの標的には気道のケラチノサイト，上皮及び内皮細胞のＩＬ−1Ｒ及びＴＮＦ−αＲが含まれるがこれらに限定されない。最近のデータは，或る種の神経ペプチドが喘息症状で役割を果たしていることを示唆している。これらのペプチドには物質Ｐ，ニューロキニンＡ及びカルシトニン−遺伝子−関連ペプチドが含まれる。これらの標的遺伝子は炎症性疾患で一層一般的な役割を有する可能性があるが現時点では喘息にだけ役割を有すると考えられている。
【０１５４】
本発明のリボザイムはＩＬ−５発現を或る程度ブロックしそして疾病の治療又はこのような疾病の診断に使用することができる。リボザイムは培養中の細胞及び喘息の動物モデルの細胞又は組織に送達される（Clutterbuck等，1989年 上述; Garssen等，1991年 Am. Rev. Respir. Dis. 144，931〜938; Larsen等，1992年 J. Clin. Invest. 89，747〜752; Mauser等，1993年 上述)。これらの系におけるＩＬ−5 ｍＲＮＡのリボザイム開裂によって炎症性細胞機能を防止しそして疾病の症状を緩解することができる。
【０１５５】
ヒト及びマウスＩＬ−5 ｍＲＮＡの配列はコンピューター折りたたみアルゴリズムを使用して利用可能な部位についてスクリーニングした。潜在的ハンマーヘッド又はヘアピンリボザイム開裂部位を同定した。これらの部位は表11，13及び14，15に示す。（表の配列は全て5'から3'である)。マウス及びヒト配列をスクリーニングしそしてその後リボザイムを設計することができるが，ヒト標的化配列が最も有益である。しかし乍ら，ヒトで試験する前にリボザイムの作用の有効性を試験するにはマウス標的化リボザイムが有用である。ヌクレオチド塩基位置は指定したリボザイムタイプで開裂される部位として表中に記載する（表12で，下のケースの文字はヒト及びマウスＩＬ−5配列間で保持されていない位置を示す。）。
【０１５６】
この研究で有用な化学合成リボザイムの配列は表12，14〜16に示す。当業者はこれらの配列が，リボザイムの酵素部分（結合アーム以外の全て）が活性に影響を与えるように変更されているような多数の配列の代表例にすぎないことを認めるであろう。例えば，表12及び14に示したハンマーヘッドリボザイムのステムループII配列（5'−ＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣ−3'）は，最低限２個の塩基対のステム構造を形成できる限り，任意の配列を含むように変更する（置換，欠失及び／又は挿入）ことができる。同様に，表15及び16に示したヘアピンリボザイムのステムループIＶ配列（5'−ＣＡＣＧＵＵＧＵＧ−3'）は，最低限２個の塩基対のステム構造を形成できる限り，任意の配列を含むように変更する（置換，欠失及び／又は挿入）ことができる。表12，14〜16に示した配列はリボヌクレオチド若しくは他のヌクレオチド又は非ヌクレオチドから作ることができる。このようなリボザイムは表に明示的に記載したリボザイムと等価である。
【０１５７】
リボザイムモチーフを巧みに操作することによって，本発明者はＩＬ−5 ｍＲＮＡ配列に向けた幾つかのリボザイムを設計した。これらのリボザイムはヌクレアーゼ耐性を改善するように修飾して合成する。ＩＬ−5標的配列をインビトロで開裂するリボザイムの能力を評価する。
【０１５８】
リボザイムはＩＬ−5発現値を分析することによってインビボ機能について試験する。リボザイムはリポソームへの取り込みによって，陽イオン脂質とのコンプレックス形成によって，微量注入によって，又はＤＮＡ若しくはＲＮＡベクターからの発現によって細胞に送達される。ＩＬ−5発現は生物学的アッセイ，エリザ法によって，間接免疫蛍光法によって，及び／又はＦＡＣＳ分析によってモニターする。ＩＬ−5 ｍＲＮＡ値はノーザン分析，リボヌクレアーゼ保護若しくはプライマー延長分析又は定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価する。ＩＬ−5活性及び／又はＩＬ−5 ｍＲＮＡの誘発を90％以上ブロックするリボザイムを同定する。
【０１５９】
使用
ＣＤ4+ Ｔヘルパー細胞及び肥満細胞によって産生されるサイトカイン，インターロイキン５（ＩＬ−5）は最初Ｂ細胞増殖因子IIと称された（Takatsu等，1988年 Immunol. Rev. 102，107で総説されている)。これは活性化Ｂ細胞の増殖を刺激しそしてＩgＭ及びＩgＡの産生を誘発する。ＩＬ−5は分化（Clutterbuck等，1989年 Blood 73，1504〜1512)，血管接着（Walsh等，1990年 Immunology 71，258〜265）及び好酸球のインビトロ生存（Lopez等，1988年 J. Exp. Med. 167，219〜224）を促進することによって好酸球機能で主要な役割を果たしている。このサイトカインも好塩基球からのヒスタミン放出を高める（Hirai等，1990年 J. Exp. Med. 172，1525〜1528)。以下の臨床結果の要約は喘息を治療するための一次標的としてＩＬ−5の選択を支持している。
【０１６０】
幾つかの研究によって，喘息患者対通常患者から得られる活性化Ｔ細胞数と好酸球数間の直接的関係が示されている（Oehling等，1992年 J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 2，295〜299)。アレルギー性喘息か又は内因性喘息のどちらかの患者をコルチコステロイドで治療した。28〜30日間に亘って好酸球，活性化Ｔヘルパー細胞及び肺機能回復について気管支肺胞洗浄をモニターした。好酸球及び活性化Ｔヘルパー細胞の数は，コルチコステロイドで治療していない内因性喘息患者と比較して，肺機能のその後の改善につれて徐々に減少した。
【０１６１】
気管支肺胞洗浄細胞は，ｍＲＮＡのインシトゥハイブリッド形成を使用してサイトカインの産生についてスクリーニングした。インシトゥハイブリッド形成シグナルはＩＬ−2，ＩＬ−3，ＩＬ−4，ＩＬ−5及びＧＭ−ＣＳＦで検出された。ｍＲＮＡの上方調節がＩＬ−4，ＩＬ−5及びＧＭ−ＣＳＦで観察された（Robinson等，1993年 J. Allergy Clin. Immunol. 92，313〜324)。別の研究はアレルゲン投与対生理食塩液投与喘息患者から得られるＩＬ−5転写物の上方調節を示した（Krishnaswamy等，1993年 Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 9，279〜286)。
【０１６２】
喘息症状のコルチコステロイド改善の作用メカニズムを決定するために18人の患者の試験を実施した。改善はメタコリン応答性によってモニターした。メタコリン応答性，好酸球数の減少，ＩＬ−4及びＩＬ−5 ｍＲＮＡ発現細胞数の減少並びにインターフェロン−ガンマ発現細胞数の増加の間の関係が観察された。
【０１６３】
アレルゲン投与24時間後に15人の患者の気管支生検体が分析された（Bentley等，1993年 Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8，35〜42)。好酸球とＩＬ−2レセプター陽性細胞数の増加がこれらの生検体中で見られた。総白血球数，Ｔリンパ球数，エラスターゼ陽性好中球数，マクロファージ数又はマスト細胞サブタイプ数に差異は観察されなかった。ＩＬ−5及びＧＭ−ＣＳＦ ｍＲＮＡを発現する細胞数は顕著に増加した。
【０１６４】
別の患者の試験で，好酸球表現型は喘息患者と健常人で同一であった。しかし乍ら，喘息患者の好酸球はより大きいロイコトリエンＣ4産生能力及び移動能力を有していた。喘息患者の循環中でＩＬ−3，ＩＬ−5及びＧＭ−ＣＳＦ値が上昇したが，健常人では上昇しなかった（Bruijnzeel等，1992年 Schweiz. Med. Wochenschr. 122，298〜301)。
【０１６５】
ＩＬ−5の抗体の有効性をモルモット喘息モデルで評価した。動物にオバルミンを投与しそして好酸球及び気管支収縮物質Ｐに対する応答性についてアッセイした。30mg／kgの抗体投与量を腹腔内投与すると物質Ｐに対するオバルミン誘発性感受性増強をブロックしそして好酸球の気管支肺胞及び肺組織蓄積の増加をブロックした（Mauser等，1993年 Am. Rev. Respir. Dis. 148，1623〜1627)。別個の試験で，オバルミンを８日間投与したモルモットをＩＬ−5のモノクローナル抗体で治療した。治療によって気管支洗浄物中の好酸球数が減少した。オバルミンを投与しなかったモルモット及び対照抗体で治療したモルモットでは減少は観察されなかった。抗体治療は，オバルミン投与後のヒスタミン及びアレコリンに対する過剰反応性の発生を完全に阻止した（van Oosterhout等，1993年 Am. Rev. Respir. Dis. 147，548〜552)。
【０１６６】
ヒト臨床分析及び動物試験から得られた結果は喘息における活性化Ｔヘルパー細胞，サイトカイン及び好酸球の役割を示している。好酸球発生及び機能におけるＩＬ−5の役割はＩＬ−5を標的選択の良好な候補にするものである。抗体試験は循環中のＩＬ−5を中和し，その結果好酸球増加を妨げた。ＩＬ−5の産生を阻止すると同じ目的が達成されるであろう。
【０１６７】
喘息 − 喘息の主要な特徴は肺における好酸球の浸潤及び毒性好酸球タンパク質の沈着（例えば，主要な塩基性タンパク質，好酸球由来の神経毒）である。ＩＬ−5のような多数のＴ細胞由来因子が好酸球の活性化及び維持の原因である（Kay，1991年 J. Allergy Clin. Immun. 87，893)。肺におけるＩＬ−5発現の阻止は好酸球の活性化を低下させることができるので喘息の症状の緩解に役立つであろう。
【０１６８】
アトピー − は或る種の環境抗原への暴露に関係したタイプＩの過敏反応の発生を特徴とする。アトピーの通常の臨床的悪化の１つは好酸球増加（血液中での異常に高い好酸球値の蓄積）である。ＩＬ−5に対する抗体はマウスの好酸球値を低下させることが示されている（Cook等，1993年 Immunopharmacol. Eosinophils，Smith及びCook編集，193〜216頁，Academic，英国ロンドン)。
【０１６９】
寄生虫感染関連好酸球増加症 − 蠕虫のような寄生虫の感染で重篤な好酸球増加症になる可能性がある（Cook等，1993年 上述)。好酸球増加症の動物モデルは，例えば，マウスが感染して血液，腹膜及び／又は組織好酸球増加症になる可能性があることを示唆しており，そしてこれら増加症は全てＩＬ−5に向けた抗体によって種々の程度に低下させられるように思われる。
【０１７０】
肺浸潤好酸球増加症 − は肺実質での高好酸球値蓄積を特徴とする（Gleich，1990年 J. Allergy Clin. Immunol. 85，422)。
【０１７１】
Ｌ−トリプトファン関連好酸球増加症−筋肉痛症候群（ＥＭＳ)− ＥＭＳ疾患は不眠症のような状態を治療するために使用される必須アミノ酸，Ｌ−トリプトファンの消費と密接に関連がある（総説については，Varga等，1993年 J Invest. Dermatol. 100，97以下参照)。病理学的及び組織学的研究によってＥＭＳ患者の高い好酸球値及び単核炎症細胞値が証明された。ＩＬ−5及び形質転換増殖因子は好酸球及び他の炎症細胞を活性化することによってＥＭＳの発生で重要な役割を果たしているように思われる（Varga等，1993年 上述)。
【０１７２】
かくして，ＩＬ−5 ｍＲＮＡを開裂しそしてそれによってＩＬ−5活性を消失させる本発明のリボザイムは多くの潜在的治療用途を有しており，そして多数の考えられる適応症でリボザイムを送達する合理的な態様が存在している。ＩＬ−5機能を阻止する有効なリボザイムの開発が上記で説明される; 利用可能な細胞及び活性アッセイは非常に多く，再現性がありそして正確である。ＩＬ−5機能及び示唆された各疾病標的の動物モデルが存在し（Cook等，1993年 上述）そして活性を最適にするために使用することができる。
【０１７３】
実施例３：  ＮＦ−κＢ
relＡ ｍＲＮＡを開裂するリボザイムは炎症性又は自己免疫疾患の新規治療方法を示している。リポ多糖（ＬＰＳ)，インターロイキン−1（ＩＬ−1）又は腫瘍壊死因子−ａ（ＴＮＦ−α）のような炎症メディエーターは，他のサイトカイン及び接着分子を含む多数の二次メディエーターの転写を誘発することによって細胞に対して作用する。多くの場合，この遺伝子活性化は転写レギュレーター，ＮＦ−κＢで媒介されることが知られている。ＮＦ−κＢの１つのサブユニット，relＡ遺伝子産生物（ＲelＡ又はｐ65と称される）は炎症応答の誘発に特異的に関係している。リボザイム治療は，非常に特異性であるために，疾病の病理学に寄与する細胞内因子を標的とするのに特に良く適合する。かくして，relＡ又はＴＮＦ−αでコードされるｍＲＮＡを開裂するリボザイムは炎症性及び自己免疫疾患を治療するための新規治療法を示している。
【０１７４】
核ＤＮＡ結合活性，ＮＦ−κＢは最初，Ｂ細胞で免疫グロブリンκＬ鎖エンハンサーと結合してこれを活性化する因子として同定された。ＮＦ−κＢは現在，多様な刺激（例えば，ホルボールエステル，マイトジェン，サイトカイン及び酸化的ストレス）に対する応答で他の多様な細胞遺伝子（例えば，サイトカイン，接着タンパク質，腫瘍遺伝子及びウイルスタンパク質）の転写を活性化することが知られている。加えて，ＮＦ−κＢの分子及び生化学的特徴は，この活性がＤＮＡ結合サブユニットのファミリーのホモ二量体又はヘテロ二量体によるものであることを示している。各サブユニットは腫瘍遺伝子，v−relと相同性の300アミノ酸の長さを有している。最初ＮＦ−κＢとして記載された活性はｐ49又はｐ50とｐ65のヘテロ二量体である。ＮＦ−κＢのｐ49とｐ50サブユニット（それぞれ，nf-κＢ2又はnf-κＢ1遺伝子によってコードされる）はプリカーサー，ＮＦ−κＢ1（ｐ105）又はＮＦ−κＢ2（ｐ100）から生成される。ＮＦ−κＢのｐ65サブユニット（現在，ＲelＡと称される）はrel Ａ座位でコードされる。
【０１７５】
各特異的転写活性化コンプレックスの役割は現在では細胞内で解明されようとしている（N.D. Perkins等，1992年 Proc. Natl Acad. Sci USA 89，1529〜1533)。例えば，ＮＦ−κＢ1とＲel Ａのヘテロ二量体（ｐ50／ｐ65）は接着分子，ＶＣＡＭ−1のプロモーターの転写を活性化し，一方ＮＦ−κＢ2／ＲelＡヘテロ二量体（ｐ49／ｐ65）は転写を実際に阻止する（H.B. Shu等，Mol. Cell. Biol. 13，6283〜6289（1993年）)。逆に言えば，ＮＦ−κＢ2／ＲelＡのヘテロ二量体（ｐ49／ｐ65）はＴat−Iと作用してＨＩＶゲノムの転写を活性化し，一方ＮＦ−κＢ1／ＲelＡ（ｐ50／ｐ65）ヘテロ二量体は殆ど効果を有していない（J. Liu，N.D. Perkins，R.M. Schmid，G.J. Nabel，J. Virol. 1992年 66，3883〜3887)。同様にアンチセンスオリゴヌクレオチドでrelＡ遺伝子の発現をブロックすると胚幹細胞の接着を特異的にブロックする; アンチセンスオリゴヌクレオチドでＮＦ−κＢ1遺伝子の発現をブロックしても細胞接着には何の効果も有していなかった（Narayanan等，1993年 Mol. Cell. Biol. 13，3802〜3810)。かくして，転写活性化で初期にＮＦ−κＢに割り当てられた無差別的役割（M.J. Lenardo，D. Baltimore，1989年 Cell 58，227〜229）はＤＮＡ結合タンパク質のrelファミリーの活性の総計を表している。この結論はrelファミリーの個々のメンバーの最近のトランスジェニック「ノックアウト」マウスによって支持されている。このような「ノックアウト」は発生上の欠損が殆どないことを示しており，本質的な転写活性化機能がrelファミリーの１つより多いメンバーによって行われ得ることを示唆している。
【０１７６】
細胞内のＮＦ−κＢ機能の特異的インヒビターが多数存在し，それらにはホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理，二本鎖ＮＦ−κＢ結合部位での処理及び天然インヒビターＭＡＤ−3（IκＢファミリーのメンバー）の過剰発現が含まれる。これらは，以下に記載するように，炎症に関与する多数の分子を誘発するためにＮＦ−κＢが必要であることを示すために使用されてきた。
【０１７７】
・ＮＦ−κＢはＩＬ−6（I. Kitajima等，Science 258，1792〜1795（1992年））及びＩＬ−8（Kunsch及びRosen，1993年 Mol. Cell. Biol. 13，6137〜6146）のホルボールエステル媒介誘発のために必要である。
【０１７８】
・ＮＦ−κＢは内皮細胞での接着分子ＩＣＡＭ−1（Eck等，1993年 Mol. Cell. Biol. 13，6530〜6536)，ＶＣＡＭ−1（Shu等，上述）及びＥ−選択（Read等，1994年 J. Exp. Med. 179，503〜512）誘発に必要である。
【０１７９】
・ＮＦ−κＢはインテグリンサブユニット，ＣＤ18及び白血球の他の接着特性の誘発に関与している（Eck等，1993年 上述)。
【０１８０】
上記研究は，ＮＦ−κＢが炎症メディエーターによるサイトカイン及び接着分子の誘発に不可欠的に関与していることを示唆している。最近の２つの論文はＮＦ−κＢと炎症の間のもう１つの関係を指摘している: グルココルチコイドはＮＦ−κＢを阻止することによって抗炎症効果を発揮することができる。グルココルチコイドレセプターとｐ65は共にＩＣＡＭ−1プロモーターのＮＦ−κＢ結合部位で作用する（van de Stolpe等，1994年 J. Biol. Chem. 269，6185〜6192)。グルココルチコイドレセプターはＩＬ−6のＮＦ−κＢ媒介誘発を阻止する（Ray及びPrefontaine，1994年 Proc. Natl Acad. Sci USA 91，752〜756)。逆に，ｐ65の過剰発現はマウス哺乳類腫瘍ウイルスプロモーターのグルココルチコイド誘発を阻止する。最後に，タンパク質架橋及び共免疫沈降実験によってｐ65とグルココルチコイドレセプター間の直接的物理的相互作用が証明された（同上)。
【０１８１】
本発明のリボザイムはＮＦ−κＢ発現を或る程度ブロックし，そして疾病を治療するか又はこのような疾病を診断するために使用することができる。リボザイムは培養中の細胞並びに再発狭窄症，移植片拒絶反応及びリウマトイド関節炎の動物モデルの細胞又は組織に送達される。これらの系におけるrelＡ ｍＲＮＡのリボザイム開裂は炎症細胞機能を防止しそして疾病の症状を緩解することができる。
【０１８２】
ヒト及びマウスrelＡ ｍＲＮＡの配列はコンピューター折りたたみアルゴリズムを使用して利用可能な部位についてスクリーニングすることができる。潜在的なハンマーヘッド又はヘアピンリボザイム開裂部位を同定した。これらの部位は表17，18及び21〜22で示す。（これらの表で，配列は全て5'から3'である)。マウス及びヒト配列をスクリーニングしそしてその後リボザイムを設計することができるが，ヒト標的化配列が最も有益である。
【０１８３】
この研究で有用な化学合成リボザイムの配列は表19〜22に示す。当業者はこれらの配列が，リボザイムの酵素部分（結合アーム以外の全て）が活性に影響を与えるように変更されておりそしてリボヌクレオチド若しくは他のヌクレオチド又は非ヌクレオチドから作り得るような多数の配列の代表例にすぎないことを認めるであろう。このようなリボザイムは表に明示的に記載したリボザイムと等価である。
【０１８４】
リボザイムモチーフを巧みに操作することによって，本発明者はrelＡ ｍＲＮＡ配列に向けた幾つかのリボザイムを設計した。これらのリボザイムはヌクレアーゼ耐性を改善するように修飾して合成する。relＡ標的配列をインビトロで開裂するリボザイムの能力を評価する。
【０１８５】
リボザイムはサイトカイン誘発ＶＣＡＭ−1，ＩＣＡＭ−1，ＩＬ−6及びＩＬ−8発現値を分析することによってインビボ機能について試験する。リボザイムはリポソーム中への取り込みによって，陽イオン脂質とのコンプレックス形成によって，微量注入によって，又はＤＮＡ及びＲＮＡベクターからの発現によって細胞に送達される。サイトカイン誘発ＶＣＡＭ−1，ＩＣＡＭ−1，ＩＬ−6及びＩＬ−8発現はエリザ法によって，間接免疫蛍光法によって，及び／又はＦＡＣＳ分析によってモニターする。relＡ ｍＲＮＡ値はノーザン分析，リボヌクレアーゼ保護若しくはプライマー延長分析又は定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価する。ＮＦ−κＢの活性はゲル遅延アッセイでモニターする。ＮＦ−κＢ活性及び／又はrelＡ ｍＲＮＡの誘発を50％以上ブロックするリボザイムを同定する。
【０１８６】
ＲＮＡリボザイム及び／又はこれらをコードする遺伝子は動物モデルの移植組織にエクスビボで局所的に送達される。リボザイムの発現はＶＣＡＭ−1，ＩＣＡＭ−1，ＩＬ−6及びＩＬ−8 ｍＲＮＡ及びタンパク質のエクスビボ誘発をブロックする能力によってモニターする。次に，移植片拒絶反応に与える抗relＡリボザイムの効果を評価する。同様に，リボザイムはコラーゲン誘発性関節炎を有するマウス又はストレプトコッカス細胞壁誘発性関節炎を有するウサギの関節中に導入される。リポソーム送達，陽イオン脂質送達又はアデノ関連ウイルスベクター送達を使用することができる。安定な抗relＡリボザイム又は本質的にリボザイムを発現する遺伝子構築物の単回投与（又は２，３回の不定期投与）によってこれらの疾病の炎症及び免疫応答を終了させることができる。
【０１８７】
使用
サイトカイン遺伝子発現を阻止し，接着分子発現を阻止しそしてグルココルチコイドの抗炎症効果を模擬する（ステロイド応答遺伝子を誘発しないで）治療剤は炎症及び自己免疫疾患の治療に理想的である。このような医薬品の疾病標的は数が多い。標的適応症及びそれぞれが必要とする送達オプションを以下に要約する。全ての場合に，relＡ ｍＲＮＡを開裂するリボザイムの潜在的免疫抑制特性のため，使用は局所送達，急性適応症又はエクスビボ治療に限定される。
【０１８８】
・リウマトイド関節炎（ＲＡ）
ＲＡの慢性特性のため，遺伝子治療法は論理的なものである。炎症関節へのリボザイムの送達はアデノウイルス，レトロウイルス又はアデノ関連ウイルスベクターによって媒介される。例えば，適当なアデノウイルスベクターは直接注入によって滑液中に投与することができる: 数ヶ月間の遺伝子伝達及び発現という高い有効性が期待されよう（B.J. Roessler，E.D. Allen，J.M. Wilson，J.W. Hartman，B.L. Davidson，J. Clin. Invest. 92，1085〜1092（1993年))。疾病の経過が抗炎症剤の一時的な局所投与で逆転するとは思われない。多数回投与が必要であると思われる。レトロウイルス及びアデノ関連ウイルスベクターによって関節での永久的遺伝子伝達及び発現が導かれるであろう。しかし乍ら，強力な抗炎症剤の永久発現によって局所的免疫欠損になる可能性がある。
【０１８９】
・再発狭窄症
ブタの血管壁でのＮＦ−κＢの発現は細胞外マトリックス成分の過剰沈着のため内腔間隙を狭小化させる。この表現型は冠血管形成後に生じるマトリックス沈着に類似している。加えて，腫瘍遺伝子c-mybの発現にはＮＦ−κＢが必要である（F.A. La Rosa，J.W. Pierce，G.E. Soneneshein，Mol. Cell. Biol. 14，1039〜1044（1994年）)。かくして，ＮＦ−κＢは平滑筋の増殖及び過剰マトリックス成分の発現を誘発する: これら過程は共に冠血管形成後の血管の再閉塞に寄与すると考えられている。
【０１９０】
・移植
ＮＦ−κＢは，免疫認識及び炎症応答で機能する接着分子の誘発に必要である（Eck等，上述，K. O'Brien等，J. Clin. Invest. 92，945〜951（1993年))。少なくとも２つの潜在的治療態様が考えられる。第１に，移植器官をリボザイム又はリボザイム発現ベクターでエクスビボ処置する。移植片関連脈管炎を阻止するには移植内皮におけるＮＦ−κＢの一次的阻止で十分でありそして移植片拒絶反応を顕著に調節すると思われる。第２に，ドナーＢ細胞をリボザイム又はリボザイム発現ベクターでエクスビボ処置する。被移植者は移植前に処置されるであろう。Ｔ細胞の共刺激分子（例えば，ＩＣＡＭ−1，ＶＣＡＭ−1，及び／又はＢ7及びＢ7-2）を発現しないＢ細胞による被移植者の処置は抗原特異的アネルギーを誘発することができる。ドナーの組織適合性抗原に対する耐性が生じるであろう; 潜在的に，移植法に任意のドナーを使用することができよう。
【０１９１】
・喘息
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は喘息性外傷に対する後期相反応中に好酸球及び他の炎症細胞の補充で主要な役割を果たすと考えられている。また，ＧＭ−ＣＳＦ及び他の炎症メディエーターの局所的誘発をブロックしても慢性喘息で観察される持続性炎症を減少させると思われる。リボザイム又はアデノウイルスリボザイム発現ベクターのエアゾール送達は実現可能な治療法である。
【０１９２】
・遺伝子治療法
免疫応答は多数の遺伝子伝達技術の有効性を制限する。レトロウイルスベクターでトランスフェクションした細胞は免疫コンピテント個体での寿命が短い。最終的に分化した細胞におけるアデノウイルスベクターの発現期間は新生児又は免疫損傷動物ではより長い。炎症及び免疫応答を調節する小リボザイム発現カセットを存在するアデノウイルス又はレトロウイルス構築物中に挿入するとそれらの能力を大いに高める。
【０１９３】
かくして，relＡ ｍＲＮＡを開裂しそしてそれによってＮＦ−κＢ活性を消失させる本発明のリボザイムには多数の潜在的治療用途があり，そして多数の考えられる適応症でリボザイムを送達する合理的な態様が存在している。ＮＦ−κＢ機能を阻止する有効なリボザイムの開発が上記で説明される; 利用可能な細胞及び活性アッセイは多く，再現性がありそして正確である。ＮＦ−αＢ機能（Kitajima等，上述）及び示唆された各疾病標的の動物モデルが存在しそして活性を最適にするために使用することができる。
【０１９４】
実施例４：  ＴＮＦ−α
ＴＮＦ−α ｍＲＮＡの特定の部位を開裂するリボザイムは炎症又は自己免疫疾患に対する新規治療方法を示している。
【０１９５】
腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）は活性化白血球によって分泌されるタンパク質，即ち炎症反応の強力なメディエーターである。実験動物にＴＮＦ−αを注射すると，敗血症性ショック又はリウマトイド関節炎のような全身及び局所炎症疾病の症状を刺激することができる。
【０１９６】
ＴＮＦ−αは最初は，マウスの固形腫瘍の破壊を媒介する活性化マクロファージによって分泌される因子として記載された（Old，1985年 Science 230，4225〜4231)。ＴＮＦ−αはその後，腫瘍や慢性感染に関連した体重損失及び消耗性症候群の原因物質であるカケクチンと同一であることが見い出された（Beutler等，1985年 Nature 316，552〜554)。ＴＮＦ−αのｃＤＮＡ及びゲノム座位をクローン化しそしてＴＮＦ−βと関係があることが見い出された（Shakhov等，1990年 J. Exp. Med. 171，35〜47)。ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βは共に同じレセプターに結合しそしてほぼ同一の生物学的活性を有している。試験した大部分の細胞タイプで２つのＴＮＦレセプターが見い出されている（Smith等，1990年 Science 248，1019〜1023)。ＴＮＦ−α分泌は単球／マクロファージ，ＣＤ4+及びＣＤ8+ Ｔ細胞，Ｂ細胞，リンホカイン活性化キラー細胞，好中球，星状細胞，内皮細胞，平滑筋細胞，並びに種々の非造血腫瘍細胞系から検出されている（総説については，Turestskaya等，1991年 Tumor Necrosis Factor: Structure Function and Mechanism of Action B.B. Aggarwal，J. Vilcek編集，Marcel Dekker, Inc.，35〜60頁参照)。ＴＮＦ−αは転写及び翻訳で調節され，そして分泌されるためには血漿膜でタンパク質分解処理が必要である（Kriegler等，1988年 Cell 53，45〜53)。分泌されると，ＴＮＦ−αの血清半減期は約30分である。ＴＮＦ−αの厳格な調節はこのサイトカインが非常に毒性であるために重要である。指標の増加は感染中のＴＮＦ−αの過剰産生によって重篤な全身毒性及び死亡に至る可能性があることを示す（Tracey & Cerami，1992年 Am. J. Trop. Med. Hyg. 47，2〜7)。
【０１９７】
アンチセンスＲＮＡ及びハンマーヘッドリボザイムは，特定の開裂部位を標的とすることによってＴＮＦ−αの発現値を低下させる試みで使用されており［Sioud等，1992年 J. Mol. Biol. 223; 831; Sioud WO94/10301; Kisich及び共同研究者，1990年 抄録（FASEB J. 4，A1860; 1991年 スライド発表（J. Leukocyte Biol. 上述 2，70); 1992年12月 カリフォルニア州サンジエゴでの抗ＨＩＶ治療学会でのポスター発表; 及び「ＴＮＦ−α遺伝子発現を制御するための抗ＴＮＦ−αリボザイムの開発」−Kisich，博士論文，1993年 カリフォルニア大学，Davis]，種々のＴＮＦ−α標的化リボザイムが示されている。
【０１９８】
本発明のリボザイムはＴＮＦ−α発現を或る程度ブロックし，そして疾病を治療するか又はこのような疾病を診断するために使用することができる。リボザイムは培養中の細胞並びに敗血症性ショック及びリウマトイド関節炎の動物モデルの細胞又は組織に送達される。これらの系におけるＴＮＦ−α ｍＲＮＡのリボザイム開裂は炎症細胞機能を防止しそして疾病の症状を緩解することができる。
【０１９９】
ヒト及びマウスＴＮＦ−α ｍＲＮＡの配列はコンピューター折りたたみアルゴリズムを使用して利用可能な部位についてスクリーニングすることができる。ハンマーヘッド又はヘアピンリボザイム開裂部位を同定した。これらの部位は表23，25及び27〜28に示す（これらの表で，配列は全て5'から3'である)。マウス及びヒト配列をスクリーニングしそしてその後リボザイムを設計することができるが，ヒト標的化配列が最も有益である。しかし乍ら，ヒトで試験する前にリボザイムの作用の有効性を試験するにはマウス標的化リボザイムが有用である。ヌクレオチド塩基の位置は，指定したタイプのリボザイムで開裂される部位として表中に記載する（表24で，下のケースの文字はヒト及びマウスＴＮＦ−α配列間で保持されていない位置を示す。）。
【０２００】
この研究で有用な化学合成リボザイムの配列は表24，26〜28に示す。当業者はこれらの配列が，リボザイムの酵素部分（結合アーム以外の全て）が活性に影響を与えるように変更されているような多数の配列の代表例にすぎないことを認めるであろう。例えば，表24及び26に示したハンマーヘッドリボザイムのステムループII配列（5'−ＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣ−3'）は，最低限２個の塩基対のステム構造を形成できる限り，任意の配列を含むように変更する（置換，欠失及び／又は挿入）ことができる。同様に，表27及び28に示したヘアピンリボザイムのステムループIＶ配列（5'−ＣＡＣＧＵＵＧＵＧ−3'）は，最低限２個の塩基対のステム構造を形成できる限り，任意の配列を含むように変更する（置換，欠失及び／又は挿入）ことができる。表24，26〜28に示した配列はリボヌクレオチド若しくは他のヌクレオチド又は非ヌクレオチドから作ることができる。このようなリボザイムは表に明示的に記載したリボザイム又はＡＡＶと等価である。
【０２０１】
本発明の好ましい実施態様では，ＴＮＦ−α ＲＮＡを開裂するリボザイムを発現する転写ユニットをプラスミドＤＮＡベクター若しくはアデノウイルスＤＮＡウイルスベクター又はＡＡＶ若しくはアルファウイルス又はレトロウイルスベクター中に挿入する。ウイルスベクターは無傷の脈管構造又は生存動物の関節に遺伝子を伝達するために使用されており（Willard等，1992年 Circulation，86，1〜473; Nabel等，1990年 Science，249，1285〜1288)，そしてこれらの両ベクターによって一次的遺伝子発現に導かれる。アデノウイルスベクターは組換えアデノウイルス粒子として送達される。ＤＮＡは単独で送達されるか又は媒体とコンプレックスを形成することができる（上記のＲＮＡで記載したようにして)。ＤＮＡ，ＤＮＡ／媒体コンプレックス又は組換えアデノウイルス粒子は治療部位に，例えば注入カテーテル，ステント若しくは注入ポンプを使用して局所的に投与するか又は細胞若しくは組織にエクスビボで直接加える。
【０２０２】
本発明のもう１つの好ましい実施態様では，リボザイムの持続的発現のために，ＴＮＦ−α ＲＮＡを開裂するリボザイムの発現転写ユニットをレトロウイルスベクター中に挿入する。
【０２０３】
リボザイムモチーフを巧みに操作することによって，本発明者はＴＮＦ−α ｍＲＮＡ配列に向けた幾つかのリボザイムを設計した。これらのリボザイムはヌクレアーゼ耐性を改善するように修飾して合成する。ＴＮＦ−α標的配列をインビトロで開裂するリボザイムの能力を評価する。
【０２０４】
リボザイムは細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）誘発ＴＮＦ−α発現値を分析することによって細胞内の機能について試験する。リボザイムはリポソーム中への取り込みによって，陽イオン脂質とのコンプレックス形成によって，微量注入によって，又はＤＮＡベクターからの発現によって細胞に送達される。ＴＮＦ−α発現はエリザ法によって，間接免疫蛍光法によって，及び／又はＦＡＣＳ分析によってモニターする。ＴＮＦ−α ｍＲＮＡ値はノーザン分析，リボヌクレアーゼ保護，プライマー延長分析又は定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価する。ＴＮＦ−α活性及び／又はＴＮＦ−α ｍＲＮＡの誘発を90％以上ブロックするリボザイムを同定する。
【０２０５】
ＲＮＡリボザイム及び／又はこれらをコードする遺伝子は腹腔内注射によってマクロファージに局所的に送達される。リボザイム取込み期間後，腹膜マクロファージを採集しそしてＬＰＳを用いてエクスビボで誘発させる。ＴＮＦ−α分泌を顕著に減少させるリボザイムを選択する。ＴＮＦ−αは，エクスビボの代わりに腹膜腔内に固定したストレプトコッカスを用いてリボザイム処理後に誘発させることもできる。このようにして，局所的炎症応答でのＴＮＦ−α分泌をブロックするＴＮＦ−αリボザイムの能力を評価する。加えて，本発明者は，固定ストレプトコッカスを注射して誘発させた後ＴＮＦ−αリボザイムを送達することによってリボザイムが進行中の炎症応答をブロックできるかどうかを測定する。
【０２０６】
全身性炎症に与える抗ＴＮＦ−αリボザイムの効果を試験するために，リボザイムを静注して送達する。全身ＬＰＳ投与によって生じるＴＮＦ−α分泌及び致死的ショックを阻止するリボザイムの能力を評価する。同様に，コラーゲン誘発関節炎を有するマウスの関節中にＴＮＦ−αリボザイムを導入することができる。これらの動物モデル実験ではリボザイムを供給するために遊離送達，リポソーム送達，陽イオン脂質送達，アデノ関連ウイルスベクター送達，アデノウイルスベクター送達，レトロウイルスベクター送達又はプラスミドベクター送達のいずれかを使用することができる。安定な抗ＴＮＦ−αリボザイム又は本質的にリボザイムを発現する遺伝子構築物の単回投与（又は２，３回の不定期投与）によってこれらの炎症性疾病の組織損傷を終了させることができる。
【０２０７】
マクロファージ単離：
応答性マクロファージを産生させるために，無菌の液体チオグリコレートブイヨン（Difco，ミシガン州デトロイト）１mlを６週齢の雌Ｃ57bl／6ＮＣＲマウスに腹膜洗浄３日前に腹腔内注射した。マウスは層状流フード内のオートクレーブケージで特別の病原体不含として維持しそしてマクロファージの「自然」活性化を最少にするために無菌水を与えた。生じた腹膜滲出細胞（ＰＥＣ）はハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を使用する洗浄によって得られ，そして10％の熱不活性化ウシ胎児血清を含有するイーグル最少必須培地（ＥＭＥＭ）を用いて96ウェルプレート（Costar，マサチューセッツ州ケンブリッジ）に2.5×105個／ウェルでまいた。２時間接着させた後，ウェルを洗浄して非接着細胞を除去した。得られた培養物は，形態学及び非特異的エステラーゼの染色で測定するとき97％マクロファージであった。
【０２０８】
リボザイムのマクロファージ中へのトランスフェクション：
リボザイムは最終濃度を２倍希釈し，等量の11nＭのリポフェクタミン（Life Technologies，メリーランド州ガイザーバーグ）と混合し，そして撹拌した。次に，脂質：リボザイムコンプレックス100mlを細胞に直接加え，続いてすぐにウシ胎児血清10mlを加えた。リボザイム添加３時間後に，１mg／mlの細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）100mlを各ウェルに加えてＴＮＦ産生を刺激した。
【０２０９】
マウスマクロファージ中のＴＮＦ−αの定量：
ＬＰＳ刺激後０，２，４，８及び24時間目に上清液を試料採取しそして−70℃で貯蔵した。ＴＮＦ−αは特異的エリザ法で定量した。エリザプレートは１：1000希釈のウサギ抗マウスＴＮＦ−α血清（Genzyme）で被覆し，続いて乳タンパク質でブロックし，そして上清液を含有するＴＮＦ−αと共にインキュベートした。次に，ネズミＴＮＦ−α特異的ハムスターモノクローナル抗体（Genzyme）を使用してＴＮＦ−αを検出した。エリザ法はアルカリホスファターゼにカップリングさせたヤギ抗ハムスターＩgＧで発色させた。
【０２１０】
試薬毒性の評価：
マクロファージをリボザイム／脂質処理しそして上清液を採集した後，細胞を 3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）5mg／mlと共にインキュベーションして細胞の生存性を評価した。この化合物はミトコンドリアジヒドロゲナーゼで減少するので，その活性は細胞の生存性と良好な相関関係を有する。12時間後，減少したＭＴＴの吸光度を585nmで測定する。
【０２１１】
使用
ＴＮＦ−αと細菌性敗血症，リウマトイド関節炎及び自己免疫疾患との間の関係がＴＮＦ−αを治療的介在の魅力的な標的としている（Tracy & Cerami 1992年 上述; Williams等，1992年 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89，9784〜9788; Jacob，1992年 J. Autoimmun. 5（補遺Ａ)，133〜143)。
【０２１２】
敗血症性ショック
敗血症ショックは高熱，心拍出量の増加，血圧低下並びに肺及び他の主要器官への好中球浸潤を特徴とする大手術，細菌感染及び多外傷の合併症である。現在の治療オプションは細菌負荷を減少させる抗生物質及び熱を下げる非ステロイド抗炎症剤に限定されている。最良の集中治療場所でのこれらの治療にも拘わらず，敗血症性ショックによる死亡率は，主として多臓器損傷及び散在性脈管凝固により，平均50％である。米国で１年当たり200,000症例の発生率を有する敗血症ショックは集中治療病棟の主要な死亡原因である。敗血症ショック症候群では，組織損傷又は細菌産生物は強力な免疫活性化を開始させ，その結果ＴＮＦ−α，インターロイキン−1β（ＩＬ−1β)，γ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ)，インターロイキン−6（ＩＬ−6）及びインターロイキン−8（ＩＬ−8）のような血清中では通常検出されない親炎症性サイトカインが分泌される。インターロイキンｂ4，プロスタグランジンＥ2，Ｃ3a及びＣ3dのような他の非サイトカインメディエーターも高レベルに達する（de Boer等，1992年 Immunopharmacology 24，135〜148)。
【０２１３】
ＴＮＦ−αは大部分の患者で敗血症ショックの過程の初期に検出される（de Boer等，1992年 上述)。動物モデルでは，ＴＮＦ−αを注射するとＬＰＳ注射で誘発されるのと同様なショック様症候群を誘発することが示された（Beutler等，1985年 Science 229，869〜871); 対照的に，ＩＬ−1β，ＩＬ−6又はＩＬ−8の注射はショックを誘発しない。ＴＮＦ−αの注射はまた，実験動物の血清中のＩＬ−1β，ＩＬ−6，ＩＬ−8，ＰgＥ2，急性相タンパク質及びＴxＡ2も上昇させる（de Boer等，1992年 上述)。動物モデルでは，ＬＰＳの致死的影響は抗ＴＮＦ−α抗体の前投与によってブロックすることができる。累積証拠は，ＴＮＦ−αが敗血症ショックの病因論で重要な役割を果たすので，治療介在用の良好な候補であることを示している。
【０２１４】
リウマトイド関節炎
リウマトイド関節炎（ＲＡ）は，骨の破壊や関節機能の損失につながる関節の慢性炎症を特徴とする自己免疫疾患である。細胞レベルでは，自己反応性Ｔリンパ球及び単球が典型的に存在し，そして滑膜細胞はしばしば形態学及び免疫染色パターンを変えている。ＲＡ関節は高いＴＮＦ−α，ＩＬ−1α及びＩＬ−1β，ＩＬ−6，ＧＭ−ＣＳＦ並びにＴＧＦ−β値を含有し（Abney等，1991年 Imm. Rev. 119，105〜123)，そしてそれらの幾つか又は全部が該疾患の病理学的経過に寄与する可能性があることが示されている。
【０２１５】
ＲＡ関節から培養した細胞はインビボで検出される全ての親炎症性サイトカインを自然に分泌する。ＴＮＦ−αに対する抗血清をこれらの培養物に加えるとこれらの細胞によるＩＬ−1α／β産生が検出不能な値にまで減少することが示されている（Abney等，1991年 上述)。かくして，ＴＮＦ−αはＲＡ関節の他のサイトカインの産生を直接誘発することができる。抗炎症性サイトカイン，ＴＧＦ−βを添加してもＲＡ培養物によるサイトカイン分泌に全く影響がない。ヒトＲＡ外科標本の免疫細胞化学研究によって，パンヌスが軟骨に侵入しそして繁茂するとき，軟骨／パンヌス関節近くのマクロファージからＴＮＦ−α，ＩＬ−1α／β及びＩＬ−6が産生することが明白に証明されている（Chu等，1992年 Br. J. Rheumatology 31，653〜661)。ＧＭ−ＣＳＦはこれらの試料中では主として脈管内皮によって産生されることが示された。ＴＮＦ−αとＴＧＦ−βは共に線維芽細胞増殖因子であることが示されており，そしてＲＡ関節の瘢痕組織の堆積の一因である可能性がある。ＴＮＦ−αはまた，破骨細胞活性及び骨再吸収を高めることも示されており，そしてＲＡ関節で通常見られる骨侵食で役割を有していると思われる（Cooper等，1992年 Clin. Exp. Immunol. 89，244〜250)。
【０２１６】
リウマチ性関節からＴＮＦ−αを消失させると，ＭＨＣクラスII，ＩＬ−1α／β，ＩＬ−6及びＧＭ−ＣＳＦの産生を減少させそしてＴ細胞活性化を低下させることによって炎症全体を減少させると予測されよう。破骨細胞活性も低下し，関節での骨侵食速度を低下させるであろう。最後に，ＴＮＦ−αを消失させると，線維芽増殖因子の除去によって関節内の瘢痕組織の蓄積を減少させることが期待されよう。
【０２１７】
抗ＴＮＦ−α抗体で処置すると，マウスの関節膨潤及びコラーゲン誘発関節炎の組織学的重篤度が減少する（Williams等，1992年 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89，9784〜9788)。加えて，抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の静脈内注入を受けているＲＡ患者の研究で，処置後の炎症関節の数及び重篤度の減少が報告されている。長期間のモノクローナル抗体治療の利益は抗体の費用と免疫原性によって制限されることがある。
【０２１８】
乾癬
乾癬は，ケラチノサイト過剰増殖及び免疫細胞浸潤を特徴とする皮膚の炎症性疾患である（Kupper，1990年 J. Clin. Invest. 86，1783〜1789)。これは人口の1.5から2.0％に影響を与えているかなり普通の状態である。この疾患の重篤度の範囲は易剥離皮膚小片の穏和なものから表皮全体の炎症に係わる重篤なものまでである。乾癬の細胞浸潤物はＴリンパ球，好中球，マクロファージ及び真皮デンドロサイトを含有している。Ｔリンパ球の大部分はＴH−1表現型の活性化ＣＤ4+ であるが，ＣＤ8+ やＣＤ4-／ＣＤ8- も幾らか存在している。Ｂリンパ球は典型的には乾癬プラークに豊富には見られない。
【０２１９】
乾癬の基本原因に関しては自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞，増殖因子の過剰産生並びに遺伝的素質を含む多くの仮説が提供されている。乾癬におけるこれらの各因子の関与を支持する証拠はあるが，それらは相互に排他的でもなければまたそれらのいずれも乾癬の病因論に必要且つ十分ではない（Reeves，1991年 Semin. Dermatol. 10，217)。
【０２２０】
乾癬の病因論におけるサイトカインの役割を調査した。異常に発現されることが見い出されているこれらのサイトカインのなかにはＴＧＦ−α，ＩＬ−1α，ＩＬ−1β，ＩＬ−1ra，ＩＬ−6，ＩＬ−8，ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αがあった。異常なサイトカイン産生に加えて，ＩＣＡＭ−1，ＥＬＡＭ−1及びＶＣＡＭの発現増加が観察されている（Reeves，1991年 上述)。このサイトカインプロフィールは通常の外傷治癒プロフィールと類似しているが，注目に値する例外は治癒するとサイトカイン値が下がることである。ケラチノサイト自体は最近，ＥＧＦ，ＴＧＦ−α，ＩＬ−6及びＴＮＦ−αを分泌し得ることが示されており，そしてこれらは自己分泌態様で増殖を高めることができよう（Oxholm等，1991年 AMPIS 99，58〜64)。
【０２２１】
ニッコロフ（Nickoloff）等，1993年（J Dermatol Sci 6，127〜133）は乾癬プラークの開始及び維持に関して以下のモデルを提案している：
組織損傷は皮膚の外傷治癒応答を誘発する。ケラチノサイトはＩＬ−1α，ＩＬ−1β，ＩＬ−6，ＩＬ−8，ＴＮＦ−αを分泌する。これらの因子は真皮毛細血管の内皮を活性化し，ＰＭＮ，マクロファージ及びＴ細胞を外傷部位に補充する。
【０２２２】
真皮／表皮接合部近くの真皮デンドロサイトは，それらが静止状態に戻ったとき活性化されたままであり，そしてその後ＴＮＦ−α，ＩＬ−6及びＩＬ−8を含むサイトカインを分泌する。サイトカイン発現は，順次，内皮の活性化状態を維持し，追加的な免疫細胞の溢出並びにＴＧＦ−α及びＩＬ−8を分泌するケラチノサイトの活性化状態を可能にする。ケラチノサイトＩＬ−8は真皮から表皮に免疫細胞を補充する。真皮通過中に，Ｔ細胞はＴH−1表現型を効果的に活性化する活性化真皮デンドロサイトに遭遇する。活性化Ｔ細胞は表皮に移動し続け，表皮でＴ細胞はケラチノサイト発現ＩＣＡＭ−1及びＭＨＣクラスIIで刺激される。Ｔ細胞によって分泌されるＩＦＮ−γは真皮デンドロサイトからのＴＮＦ−αと相乗作用してケラチノサイト増殖並びにＴＧＦ−α，ＩＬ−8及びＩＬ−6産生値を高める。ＩＦＮ−γも真皮デンドロサイトにフィードバックされ，活性化表現型及び炎症サイクルを維持する。
【０２２３】
ＩＬ−6の血清力価の上昇は，肝臓による補体因子を含む急性相タンパク質の合成及び血漿細胞による抗体産生を高める。補体及び抗体値の上昇は自己免疫反応の可能性を高める。
【０２２４】
乾癬プラークの維持にはこれらの全過程の継続的発現が必要であるが，治療介在の魅力的な点は，真皮デンドロサイトによるＴＮＦ−α発現で活性化内皮及びケラチノサイトを維持しそしてＴ細胞によるＩＦＮ−γ発現で活性化真皮デンドロサイトを維持することである。
【０２２５】
米国には乾癬で悩む300万人の患者がいる。乾癬に利用できる治療はコルチコステロイドである。最も広範に処方されるのは，局所適用用に処方されるテモベート（TEMOVATE）（クロベタゾールプロピオネート)，リデックス（LIDEX）（フルオシノニド)，ジプロレン（DIPROLENE）（ベタメサゾンプロピオネート)，プソルコン（PSORCON）（ジフロラゾンジアセテート）及びトリアムシノロン（TRIAMCINOLONE）である。コルチコステロイドの作用メカニズムは多因子性である。これは，この疾病の基になる原因が残っておりそして疾病の治療を中止すると元に戻るので一時しのぎの治療法である。治療の中止はしばしば，萎縮，毛細血管拡張及び紫斑のような副作用の出現によって促進される。コルチコステロイドは長期治療又は広く及び／又は炎症領域の治療が必要なときには推奨されない。代替的治療には，重篤な難治性乾癬の治療に承認されているエトレチネート（etretinate）のようなレチノイドが含まれる。代替的なレチノイドに基づく治療は臨床試験が進行した段階にある。レチノイドはケラチノサイトを分化状態に変えそして正常皮膚発生を回復させることによって作用する。シクロスポリンのような免疫抑制医薬品も臨床試験が進行した段階にある。コルチコステロイド，レチノイド及び免疫抑制薬の作用の非特異的メカニズムにより，これらの治療は重篤な副作用を示すので，状態が生命を脅かすか又は無能力にしていない限り，長期間使用すべきでない。乾癬患者においてはより毒性が少なく有効な治療剤に対する需要がある。
【０２２６】
ＨＩＶ及びエイズ
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は感染時から完全な後天性免疫不全症候群（エイズ）の発生までにヒト免疫系で幾つかの基本的な変化を生じさせる。これらの変化にはＣＤ4+ 対ＣＤ8+ Ｔ細胞の比率の移動，ＩＬ−4値の持続的上昇，ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−β値の一時的上昇，ガンマグロブリン過剰血症並びにリンパ腫／白血病が含まれる（Rosenberg & Fauci，1990年 Immun. Today 11，176; Weiss 1993年 Science 260，1273)。多くの患者は特有の腫瘍，カポジ肉腫及び／又は珍しい日和見感染（例えば，カリニ・ニューモシスティ，サイトメガロウイルス，ヘルペスウイルス，肝炎ウイルス，パピローマウイルス及び結核）を経験する。エイズによる個体の免疫学的機能不全はこの病理学のなかにはサイトカインの調節不全によるものがあることを示唆している。
【０２２７】
血清ＴＮＦ−α及びＩＬ−6の値がエイズ患者で上昇していることがしばしば見られる（Weiss，1933年 上述)。組織培養では，健常人から単離した単球のＨＩＶ感染はＴＮＦ−αとＩＬ−6の両方の分泌を刺激する。この応答は，ＣＤ−4との結合に寄与するウイルスコートタンパク質である精製gp120を使用して再現された（Buonaguro等，1992年 J. Virol. 66，7159)。ウイルス遺伝子レギュレーター，ＴatがＴＮＦ転写を直接誘発することも証明されている。ＴＮＦ−α及びＩＬ−6の分泌を直接刺激するＨＩＶの能力はウイルスの適応メカニズムであると思われる。ＴＮＦ−αはＨＩＶのＬＴＲの転写を上方調節し，感染細胞中のＨＩＶ特異的転写物数を増加させることが示されている。ＩＬ−6はＨＩＶ産生を高めるが，転写後の値ではＨＩＶ転写物がタンパク質に翻訳される効率を明らかに高める。かくして，ＨＩＶウイルスによるＴＮＦ−α分泌の刺激は潜在的感染細胞からのウイルス産生を高めこと及び新たに感染した細胞でウイルスを複製させることの両方によって近くのＣＤ4+細胞の感染を促進する可能性がある。
【０２２８】
ＨＩＶ複製におけるＴＮＦ−αの役割は感染の組織培養モデルで良好に確立されており（Sher等，1992年 Immun. Rev. 127，183)，ＨＩＶ複製とＴＮＦ−α複製の相互誘導がインビボで積極的なフィードバックをもたらす可能性があることを示唆している。しかし乍ら，感染患者におけるこのような積極的なフィードバックの存在の証拠は豊富でない。ＴＮＦ−α値は試験した患者の全てではないが何人かでは上昇することが見い出されている。ジドブジンを投与されたエイズの子供はジドブジンを投与されなかった子供と比較してＴＮＦ−α値が減少していた（Cremoni等，1993年 AIDS 7，128)。この相関関係は，ウイルス複製の減少がＴＮＦ−α値と生理学的に関係があるという仮説に対する支持を与えている。更に，ＨＩＶ感染に関連したポリクローナルＢ細胞活性化は膜結合ＴＮＦ−αによるものであることが最近示された。かくして，分泌されるＴＮＦ−α値はエイズ病因論に対するこのサイトカインの寄与を正確に反映していない可能性がある。
【０２２９】
ＴＮＦ−αの慢性的な上昇は悪液質（Tracey等，1992年 Am. J. Trop. Med. Hyg. 47，2〜7)，自己免疫疾患の増加（Jacob，1992年 上述)，嗜眠，及び動物モデルでの免疫抑制（Aderka等，1992年 Isr. J. Med. Sci. 28，126〜130）を生じさせることが示されている。エイズに関連した悪液質はエイズ患者で頻繁に観察されるＴＮＦ−αの慢性的な上昇と関係があると思われる。同様に，ＴＮＦ−αはエイズ患者のカポジ肉腫病変から単離される紡錘細胞の増殖を刺激することができる（Barillari等，1992年 J Immunol 149，3727)。
【０２３０】
サイトカイン遺伝子発現を阻止し，接着分子発現を阻止し，そしてグルココルチコイドの抗炎症効果を（ステロイド反応性遺伝子を誘発しないで）模擬する治療剤は炎症性及び自己免疫疾患の治療用に理想的である。このような医薬品の疾病標的は多数ある。標的適応症と各々に必要な送達オプションは以下に要約する。全ての場合に，ＴＮＦ−α ｍＲＮＡの特定の部位を開裂するリボザイムの潜在的免疫抑制特性のために，使用は局所送達，急性適応症又はエクスビボ治療に限定される。
【０２３１】
・敗血症ショック
マクロファージへのリボザイムの外来送達は腹腔内又は静脈注射によって達成することができる。リボザイムはリポソーム中への取り込みによって又は陽イオン脂質とコンプレックスを形成して送達される。
【０２３２】
・リウマトイド関節炎（ＲＡ）
ＲＡの慢性特性のため，遺伝子治療法は論理的なものである。炎症関節へのリボザイムの送達はアデノウイルス，レトロウイルス又はアデノ関連ウイルスベクターによって媒介される。例えば，適当なアデノウイルスベクターは直接注入によって滑液中に投与することができる: 数ヶ月間の遺伝子伝達及び発現という高い有効性が期待されよう（B.J. Roessler，E.D. Allen，J.M. Wilson，J.W. Hartman，B.L. Davidson，J. Clin. Invest. 92，1085〜1092（1993年))。疾病の経過を抗炎症剤の一時的な局所投与で逆転させ得るとは思われない。多数回投与が必要であると思われる。レトロウイルス及びアデノ関連ウイルスベクターによって関節での永久的遺伝子伝達及び発現が導かれるであろう。しかし乍ら，強力な抗炎症剤の永久発現によって局所的免疫欠損になる可能性がある。
【０２３３】
・乾癬
乾癬プラークはリボザイム又はベクター送達の特に良好な候補である。プラークの角質層は薄くなっており，増殖ケラチノサイトへの接近を提供する。Ｔ細胞及び真皮デンドロサイトは，経表皮拡散によって効果的に標的とすることができる。
【０２３４】
乾癬皮膚及び正常皮膚の生検標本用の器官培養系は現在の文献中に記載されている（Nickoloff等，1993年 上述)。一次ヒトケラチノサイトは容易に取得されそして組織培養物中で表皮シートに増殖させられる。これらの組織培養モデルに加えて，易剥離皮膚マウスはＵＶ光に応答して乾癬皮膚を発生する。このモデルは乾癬のリボザイム治療に対する動物有効性の証明を可能にするであろう。
【０２３５】
・遺伝子治療法
免疫応答は多数の遺伝子伝達技術の有効性を制限する。レトロウイルスベクターでトランスフェクションした細胞は免疫コンピテント個体での寿命が短い。最終的に分化した細胞におけるアデノウイルスベクターの発現期間は新生児又は免疫損傷動物ではより長い。炎症及び免疫応答を調節する小リボザイム発現カセットを存在するアデノウイルス又はレトロウイルス構築物中に挿入するとそれらの能力が大いに高められる。
【０２３６】
かくして，ＴＮＦ−α ｍＲＮＡを開裂しそしてそれによってＴＮＦ−α活性を消失させる本発明のリボザイムには多数の潜在的治療用途があり，そして多数の考えられる適応症でリボザイムを送達する合理的な態様が存在している。ＴＮＦ−α機能を阻止する有効なリボザイムの開発が上記で説明される; 利用可能な細胞及び活性アッセイは多く，再現性がありそして正確である。ＴＮＦ−α機能及び示唆された各疾病標的には動物モデルが存在しそして活性を最適にするために使用することができる。
【０２３７】
実施例５：  ｐ210bcr-abl
慢性骨髄性白血病は特徴的な疾病経過を示し，最初は慢性顆粒球過形成症として現れ，そして不変的に，余り分化していない表現型を有する細胞のクローナル拡大によって生じる急性白血病（即ち，疾病の突然発症段階）に進展する。ＣＭＬは，究極的に急性白血病に類似する最終段階に進行する不安定な疾病である。この致死的疾病は１年に約16,000人の患者に影響を与える。ヒドロキシウレア又はブスルファン（busulfan）のような化学療法剤は白血病の重荷を軽減できるが患者の平均余命（例えば，約４年）には影響を与えない。従って，ＣＭＬ患者は骨髄移植（ＢＭＴ）治療法の候補である。しかし乍ら，ＢＭＴを乗り切った患者には，疾病の再発が主要な障害のまま残っている（Apperley等，1988年 Br. J. Haematol. 69，239)。
【０２３８】
染色体９から染色体22のbcr遺伝子までのabl腫瘍遺伝子の転位に由来するフィラデルフィア（Ｐh）染色体はＣＭＬ患者の95％以上で見られそして急性リンパ芽球白血病の全症例の10〜25％で見られる［（ＡＬＬ); 白血病の染色体に関する第４回国際ワークショップ 1982年，Cancer Genet. Cytogenet. 11，316]。実際上全てのＰh陽性ＣＭＬそして約50％のＰh陽性ＡＬＬにおいて，白血病細胞はbcr-abl融合ｍＲＮＡを発現し，そこではbcr遺伝子の主要なブレークポイントクラスター領域のエキソン２（ｂ2-ａ2接合）又はエキソン３（ｂ3-ａ2接合）がabl遺伝子のエキソン２にスプライシングされている（Heisterkamp等，1985年 Nature 315，758; Shtivelman等，1987年，Blood 69，971)。Ｐh陽性ＡＬＬの残りの症例では，bcr遺伝子の最初のエキソンがabl遺伝子のエキソン２にスプライシングされている（Hooberman等，1989年 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86，4259; Heisterkamp等，1988年 Nucleic Acids Res. 16，10069)。
【０２３９】
ｂ3-ａ2とｂ2-ａ2の融合ｍＲＮＡは腫瘍原活性を示す210kdのbcr-abl融合タンパク質をコードする（Daley等，1990年 Science 247，824; Heisterkamp等，1990年 Nature 344，251)。ヒト疾病の白血病表現型の進化及び維持におけるbcr-abl融合タンパク質（ｐ210bcr-abl）の重要性はｐ210bcr-abl発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻止を使用して証明されている。これらの阻止分子はＣＭＬ患者骨髄中の白血病細胞のインビトロ増殖を阻止することが示されている（Szczylik等，1991年 Science 253，562)。
【０２４０】
レディ（Reddy）の米国特許5,246,921（参照として本願明細書に組み入れる）は，bcr-abl融合転写物の特異的接合領域を標的とすることによって慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）のような白血病の治療剤としてのリボザイムの使用を記載している。この特許は上記のようなハイブリッド染色体のブレークポイント又はその近くでリボザイムによる開裂が生じることを示しており，そして特に配列ＧＵＸ（式中，ＸはＡ，Ｕ又はＧである）での開裂を含んでいる。示されている１つの例は配列 5'−ＡＧＣ ＡＧＡＧＵＵ（開裂部位）ＣＡＡ ＡＡＧＣＣＣＵ−3'を開裂することである。
【０２４１】
スカンロン（Scanlon）のＷＯ 91/18625，ＷＯ 91/18624及びＷＯ 91/18913並びにスナイダー（Snyder）等のＷＯ93/03141及びＷＯ94/13793はＨ−ras ＲＮＡの腫瘍原性変異体の開裂に有効なリボザイムを記載している。このリボザイムは外部刺激に応答してＨ−ras発現を阻止すると言われている。
【０２４２】
本発明は，リボザイムを使用してＣＭＬの発現の一因である遺伝子の発現を調節することによってヒト及び他の動物における形質転換表現型の発生又は発現を阻止することを特徴とする。腫瘍発現前及び形質転換細胞で発現した標的化ｍＲＮＡの開裂は形質転換状態の阻止を誘発する。
【０２４３】
本発明は癌又は腫瘍発現前状態を治療するために使用できる。２つの好ましい投与プロトコールは，腫瘍の重荷を軽減するためのインビボ投与か又は再移植前の骨髄のような組織から形質転換細胞を一掃するためのエクスビボ処置のどちらかで使用することができる。
【０２４４】
本発明はＣＭＬの発生又は維持と関係があるｍＲＮＡを開裂する酵素ＲＮＡ分子（又はリボザイム）を特徴とする。ｍＲＮＡ標的はｂ2-ａ2及びｂ3-ａ2組換えｍＲＮＡのbcr及びabl配列の融合部位の周囲の425ヌクレオチド中に存在する。bcr ｍＲＮＡの５'位又はabl ｍＲＮＡの３'位の他の配列もリボザイム開裂の標的とすることができる。融合ｍＲＮＡ分子のこれらの部位のいずれかでの開裂によって処理細胞中の融合タンパク質の翻訳が阻止される。
【０２４５】
本発明はＣＭＬの原因となるｍＲＮＡに対して高度の特異性を示す１つのクラスの化学的開裂物質を提供する。このような酵素ＲＮＡ分子は苦痛のある細胞に対して外来的にか又は内在的に送達することができる。好ましいハンマーヘッドモチーフでは，分子の大きさが小さい（長さが40未満のヌクレオチド，好ましくは32から36の間のヌクレオチド）ため，治療費用を軽減することができる。
【０２４６】
今日までに報告されている任意のタイプの治療用に送達された最小のリボザイム（Rossi等，1992年 上述による）は142ヌクレオチドの長さを有するインビトロ転写物である。100ヌクレオチドの長さより長いリボザイムを自動化方法を使用して合成するのは非常に困難であり，そしてこのような分子の治療費用は法外なものである。発現ベクターによるリボザイムの送達はエクスビボ処置を使用して初めて実行できるにすぎない。これがこの方法の有用性を制限する。本発明では，より小さいリボザイムモチーフ及び外来的送達を別の方法で使用する。これらの分子の単純な構造もｍＲＮＡ構造の標的化領域に侵入するリボザイムの能力を高める。かくして，ハンマーヘッド構造がより長い転写物内に含まれている状況とは異なって，リボザイム構造の正しい折りたたみ並びにリボザイムとｍＲＮＡ標的の相補的結合に干渉する非リボザイムフランキング配列は存在していない。
【０２４７】
本発明の酵素ＲＮＡ分子を使用してヒトＣＭＬ又は前癌状態を治療することができる。疾患のある動物は癌検出時にか又は予防的方法で治療することができる。この治療タイミングは疾患細胞数を減少させそして細胞複製を不能にする。これは，リボザイムが上首尾な細胞増殖に必要な構造を不能にするように設計されているので可能である。
【０２４８】
本発明のリボザイムはｐ210bcr-abl発現を或る程度ブロックし，そして疾病を治療するか又はこのような疾病を診断するために使用することができる。リボザイムは培養中の細胞及びＣＭＬの動物モデルの組織に送達される。これらの系におけるbcr/abl ｍＲＮＡのリボザイム開裂は疾病の症状又は状態を予防しそして緩解することができる。
【０２４９】
ヒトbcr/abl ｍＲＮＡの配列はコンピューター折りたたみアルゴリズムを使用して利用可能な部位についてスクリーニングすることができる。二次折りたたみ構造を形成せずそして潜在的ハンマーヘッド又はヘアピンリボザイム開裂部位を含有するｍＲＮＡの領域を同定することができる。これらの部位は表29に示す（表で，配列は全て5'から3'である)。ヌクレオチド塩基の位置は，指定されたタイプのリボザイムによって開裂される部位として表中に記載する。
【０２５０】
この研究で最も有用な化学合成リボザイムの配列は表30に示す。当業者はこれらの配列が，リボザイムの酵素部分（結合アーム以外の全て）が活性に影響を与えるように変更されているような多数の配列の代表例にすぎないことを認めるであろう。例えば，表30に示したハンマーヘッドリボザイムのステムループII配列（5'−ＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣ−3'）は，最低限２個の塩基対のステム構造を形成できる限り，任意の配列を含むように変更する（置換，欠失及び／又は挿入）ことができる。表30に示した配列はリボヌクレオチド若しくは他のヌクレオチド又は非ヌクレオチドから作ることができる。このようなリボザイムは表に明示的に記載したリボザイムと等価である。
【０２５１】
リボザイムモチーフを巧みに操作することによって，本発明者はbcr-abl ｍＲＮＡ配列に向けた幾つかのリボザイムを設計した。これらは，上記したようにヌクレアーゼ耐性を改善するように修飾して合成した。これらのリボザイムはインビトロでbcr-abl標的配列を開裂する。
【０２５２】
リボザイムはbcr-ablを発現する細胞に外来的に送達することによってインビボ機能について試験する。リボザイムはリポソーム中への取り込みによって，陽イオン脂質とのコンプレックス形成によって，微量注入によって，又はＤＮＡベクターからの発現によって送達される。bcr-ablの発現はエリザ法によって，間接免疫蛍光法によって，及び／又はＦＡＣＳ分析によってモニターする。bcr-abl ｍＲＮＡ値はノーザン分析，リボヌクレアーゼ保護，プライマー延長分析又は定量的ＲＴ−ＰＣＲ技術によって評価する。ｐ210bcr-ablタンパク質及びｍＲＮＡの誘発を20％以上ブロックするリボザイムを同定する。
【０２５３】
実施例６：  ＲＳＶ
本発明は呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）産生のインヒビターとしてのリボザイムの使用，そして特にＲＳＶ複製の阻止に関するものである。
【０２５４】
ＲＳＶはウイルスのパラミクソウイルス科のメンバーでありそしてニューモウイルス属に分類される（総説については，Mclntosh及びChanock，1990年 Virology，B.N. Fields編集，1045頁以下，Raven Press Ltd. ニューヨーク参照)。感染性ウイルス粒子はエンベロープに内包されたヌクレオキャプシドでできている。ヌクレオキャプシドは，コンパクトな構造を形成しそしてそれによってＲＮＡをヌクレアーゼ分解から保護するようにキャプシドタンパク質の繰返しサブユニットと結合した負の線状１本鎖非切断ＲＮＡでできている。ヌクレオキャプシド全体はエンベロープによって内包されている。ウイルス粒子の大きさは直径150〜300nmの範囲である。ＲＳＶの完全な生活環は感染細胞の細胞質で生起しそしてヌクレオキャプシドは決して核小室には到達しない（Hall，1990年 感染性疾病の原理と実際，Mandell等編集，ニューヨーク州チャーチヒルリビングストン)。
【０２５５】
ＲＳＶゲノムはウイルス産生に必須の10種のウイルスタンパク質をコードする。ＲＳＶタンパク質産生物はエンベロープスパイク中に見られる２種の構造糖タンパク質（Ｇ及びＦ)，内膜に見られる２種のマトリックスタンパク質［Ｍ及びＭ2（22Ｋ）]，ヌクレオキャプシドに所在する３種のタンパク質（Ｎ，Ｐ及びＬ)，感染細胞の表面に存在する１種のタンパク質（ＳＨ）及び感染細胞にしか見られない２種の非構造タンパク質［ＮＳ1（1Ｃ）及びＮＳ2（1Ｂ)］を含有している。10種のＲＳＶタンパク質のｍＲＮＡは同様な5'及び3'末端を有している。ＵＶ不活性化試験は多数の転写開始部位で１個のプロモーターが使用されることを示唆している（Barik等，1992年 J. Virol. 66，6813)。ゲノムＲＮＡへのタンパク質割当てに一致する転写順序は1Ｃ，1Ｂ，Ｎ，Ｐ，Ｍ，ＳＨ，Ｇ，Ｆ，22Ｋ及びＬ遺伝子であり（Huang等，1985年 Virus Res. 2，157)，そして転写の豊富さは遺伝子割当ての順序に一致する（例えば，1Ｃ及び1Ｂ ｍＲＮＡはＬ ｍＲＮＡよりはるかに豊富である)。ウイルスメッセージの合成は細胞のＲＳＶ感染直後に始まり，そして感染後14時間目に最大に達する（Mclntosh及びChanock，上述）。
【０２５６】
ＲＳＶには２つの抗原性サブグループ，Ａ及びＢが存在し，そしてこれらは異なる年に種々の割合で共同して同時に循環することができる（Mclntosh及びChanock，上述)。サブグループＡが通常優勢である。２つのサブグループ内には多数の株がある。サブグループ内でも同様に配列の多様性が認められるが，利用できる配列分析が限られているためヌクレオチドレベルでの相同性はサブグループ間よりサブグループ内で完全であるように思われる。抗原決定基は主として両表面糖タンパク質，Ｆ及びＧから生じる。Ｆでは，中和エピトープの少なくとも半分は30年間安定的に維持されている。しかし乍らＧでは，Ａ及びＢサブグループは２，３パーセントほどの少ない割合で抗原的に関係しないと思われる。しかし乍ら，ヌクレオチドレベルではＧのコード化領域の多様性の大部分は細胞外ドメインの配列に見られる（Johnson等，1987年，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84，5625)。
【０２５７】
呼吸器同胞体ウイルス（ＲＳＶ）は乳児期及び小児期の下部気道疾患の主要な原因であり（Hall，上述）そしてこのような原因として米国だけで推定90,000人の入院及び4500人の死亡に関係している（最新版: 呼吸器同胞体ウイルス活性 − 米国，1993年，Mmwr Morb Mortal Wkly Rep，42，971)。ＲＳＶ感染は一般に，肺炎や気管支炎の両方につながる他の全ての微生物物質より上位に位置する。主として免疫が完全でない２歳未満の子供に影響を与えるが，年長児及び成人，特に入院看護者（Mclntosh及びChanock，上述）の再感染は珍しくない。免疫損傷患者は酷く影響を受けそしてＲＳＶ感染は骨髄移植を受けている患者の主要な合併症である。
【０２５８】
平穏なＲＳＶ呼吸器疾患は通常の風邪に類似しておりそして７から12日で回復する。初期症状（鼻漏，鼻充血，微熱等）の後１〜３日で咳や喘鳴を含む下部気道の感染徴候が続く。幾つかの症例では，これらの穏和な症状は急速に頻呼吸，チアノーゼ及び大儀さに進行しそして入院しなければならない。心臓又は呼吸器疾患のある乳児では，症状の進行は特に急速でありそして病気になって２又は３日で呼吸不全になる可能性がある。しかし乍ら，近代的な集中治療により，全体的な死亡率は通常入院患者の５％未満である（Mclntosh及びChanock，上述）。
【０２５９】
現在，効果的なワクチンもまた特別の抗ウイルス剤も利用できない。ウイルス表面糖タンパク質に対する免疫応答は多数の実験動物でＲＳＶに対する耐性を提供することができ，そしてサブユニットワクチンは，ＲＳＶ感染で以前に入院した子供で６ヶ月までの間有効であることが示されている（Tristam等，1993年，J. Infect. Dis. 167，191)。弱毒ウシＲＳＶワクチンも仔ウシで同様な期間有効であることが示されている（Kubota等，1992年 J. Vet. Med. Sci. 54，957)。しかし乍ら以前には，ホルマリン不活性化ＲＳＶワクチンはその後ＲＳＶの自然感染で非常に頻度の高い重篤な疾病に関係があった（Connors等，1992年 J. Viol. 66，7444）。
【０２６０】
入院を必要とするＲＳＶ感染の現在の治療法ではエアゾール投与リバビリン（ribavirin)，グアノシン類似体が使用される［抗ウイルス剤とヒトのウイルス疾患，第３版，1990年（G.J.Galasso，R.J.Whitley及びT.C.Merigan編集）Raven Press Ltd. ニューヨーク]。リバビリン治療法は症状の重篤度の低下，動脈酸素の改善及び治療期間終了時のウイルス脱離量の減少と関係がある。しかし乍ら，リバビリン治療法が実際に患者の入院期間を短縮するのかそれとも支持治療法の必要性がなくなるのかどうかは明らかでない（Mclntosh及びChanock，上述)。リバビリン治療法の利益は，最も重篤な症状を有する危険性の高い乳児又は気管支肺又は心臓疾患のある患者で特に明白である。ウイルスポリメラーゼコンプレックスの阻止は，ＲＳＶ感染細胞でウイルスのポリペプチド合成がリバビリンによって阻止されるが細胞ポリペプチド合成は阻止されないので，リバビリンによるＲＳＶの主要な阻止メカニズムとして支持されている［抗ウイルス剤とヒトのウイルス疾患，第３版，1990年（G.J.Galasso，R.J.Whitley及びT.C.Merigan編集）Raven Press Ltd. ニューヨーク]。リバビリンはエアゾール適用によって送達したときＲＳＶに対して少なくとも部分的に有効であるので，標的細胞は上皮の表面又はその近くにあると推定することができる。この点に関して，致命的肺炎の生検試験でＲＳＶ抗原は呼吸器上皮の表在層より深くには広がっていなかった（Mclntosh及びChanock，上述)。
【０２６１】
ジェニングス（Jennings）等のＷＯ 94/13688は，特定のタイプのリボザイムの標的に呼吸器同胞体ウイルスが含まれていることを示している。
【０２６２】
本発明は新規酵素ＲＮＡ分子又はリボザイム及びこれらを呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の産生を阻止するために使用する方法を特徴とする。このようなリボザイムはヒト及び他の動物でこれらの関連ウイルスで引き起こされた疾病の治療方法で使用することができる。本発明はまた，リボザイムを使用するこれらウイルスのゲノムＲＮＡ及びｍＲＮＡの開裂も特徴とする。特に，記載したリボザイム分子はＮＳ1（1Ｃ)，ＮＳ2（1Ｂ）及びＮウイルス遺伝子に向けられる。これらの遺伝子は当該技術分野で既知である（総説については，Mclntosh及びChanock，1990年 上述 参照)。
【０２６３】
ＲＳＶ ｍＲＮＡの特定の部位を開裂するリボザイムは呼吸器疾患に対する新規治療方法を示している。出願人はリボザイムがＲＳＶの活性を阻止できそしてリボザイムの阻止効果にはこれらの触媒活性が必要であることを示している。当該技術分野の通常の技倆を有する者は，1Ｃ，1Ｂ及びＮタンパク質をコードするＲＳＶ ｍＲＮＡのこれらの部位を開裂する他のリボザイムを容易に設計することができそしてこれらが本発明の範囲内であることは記載した実施例から明白であることが分かるであろう。更に，当該技倆分野の通常の技倆を有する者は，ＲＳＶ及びゲノムＲＮＡによってコードされる他のｍＲＮＡ（Ｐ，Ｍ，ＳＨ，Ｇ，Ｆ，22Ｋ及びＬ）を開裂するリボザイムを容易に設計することができそしてこれらが本発明の範囲内であることも記載した実施例から明白であることが分かるであろう。
【０２６４】
好ましい実施態様では，リボザイムは表31，33，35，37及び38の配列と相補的な結合アームを有している。このようなリボザイムの例は表32，34，36〜38に示す。このようなリボザイムの例は本質的にこれらの表で特定された配列からなる。「本質的に〜からなる」によって，活性リボザイムが実施例中の酵素中心と等価のもの及び標的部位で開裂が生起するようにｍＲＮＡと結合できる結合アームを含有していることを意味する。このような開裂に干渉しない他の配列が存在することができる。
【０２６５】
本発明のリボザイムはＲＳＶ産生を或る程度ブロックし，そして疾病を治療するか又はこのような疾病を診断するために使用することができる。リボザイムは培養中の細胞及び呼吸障害の動物モデルの細胞又は組織に送達される。これらの系でのＲＳＶコード化ｍＲＮＡ又はゲノムＲＮＡのリボザイム開裂は疾病の症状を緩解することができる。
【０２６６】
全10種のＲＳＶコード化タンパク質（1Ｃ，1Ｂ，Ｎ，Ｐ，Ｍ，ＳＨ，22Ｋ，Ｆ，Ｇ及びＬ）はウイルスの生活環に必須でありそして全てリボザイム開裂の潜在的標的であるが，或るタンパク質（ｍＲＮＡs）は他のものよりリボザイムの標的として一層好ましい。例えば，ＲＳＶコード化タンパク質 1Ｃ，1Ｂ，ＳＨ及び22Ｋはパラミクソウイルス科の他のメンバー中には見られないのでＲＳＶに独特であると思われる。対照的に，Ｇタンパク質のエクトドメインとＦタンパク質のシグナル配列はヌクレオチドレベルで，種々のＲＳＶサブグループ間でかなりの配列多様性を示している（Johnson等，1987年 上述)。ＲＳＶタンパク質 1Ｃ，1Ｂ及びＮは，ヌクレオチド及びアミノ酸の両レベルで，種々のサブタイプ間で高度に保持されている。更に，1Ｃ，1Ｂ及びＮは全てのＲＳＶタンパク質のうちで最も豊富である。
【０２６７】
1Ｃ，1Ｂ及びＮタンパク質をコードするヒトＲＳＶ ｍＲＮＡの配列はコンピューター折りたたみアルゴリズムを使用して利用可能な部位についてスクリーニングする。ハンマーヘッド又はヘアピンリボザイム開裂部位を同定した。これらの部位は表31，33，34，37及び38に示す（これらの表で，配列は全て5'から3'である)。ヌクレオチド塩基の位置は，指定されたタイプのリボザイムによって開裂される部位として表中に記載する。
【０２６８】
ハンマーヘッド又はヘアピンモチーフのリボザイムを設計してｍＲＮＡメッセージ中の種々の部位にアニーリングする。結合アームは上記した標的部位配列と相補的である。リボザイムは化学的に合成する。使用する合成方法は，ウスマン等，1987年 J. Am. Chem. Soc.，109，7845〜7854及びスカリンジ等，1990年 Nucleic Acids Res.，18，5433〜5441に記載されている通常のＲＮＡ合成方法に従いそして５'−末端のジメトキシトリチル及び３'−末端のホスホラミダイトのような通常の核酸保護基及びカップリング基を使用する。平均的な段階的カップリング収率は＞98％であった。不活性リボザイムはＧ5の代わりにＵをそしてＡ14の代わりにＵを使用して合成した（Hertel等，1992年 Nucleic Acids Res.，20，3252による番号)。ヘアピンリボザイムは２つの部分で合成しそしてアニーリングして活性リボザイムを再構築する（Chowrira及びBurke，1992年 Nucleic Acids Res.，20，2835〜2840)。ヘアピンリボザイムはバクテリオファージＴ7 ＲＮＡポリメラーゼを使用してＤＮＡ鋳型からも合成される（Milligan及びUhlenbeck，1989年，Methods Enzymol. 180，51)。リボザイムは全て，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２'−アミノ，２'−Ｃ−アリル，２'−フルオロ，２'−Ｏ−メチル，２'−Ｈで修飾して安定性を高めるように広範囲に修飾される（総説については，Usman及びCedergren，1992年 TIBS 17，34参照)。リボザイムは一般的な方法を使用してゲル電気泳動で精製するか又は高圧液体クロマトグラフィーで精製し，そして水に再懸濁する。
【０２６９】
この研究で有用な化学合成リボザイムの配列は表32，34，36，37及び38に示す。当業者はこれらの配列が，リボザイムの酵素部分（結合アーム以外の全て）が活性に影響を与えるように変更されているような多数の配列の代表例にすぎないことを認めるであろう。例えば，表32及び34に示したハンマーヘッドリボザイムのステムループII配列（5'−ＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣ−3'）は，最低限２個の塩基対のステム構造を形成できる限り，任意の配列を含むように変更する（置換，欠失及び／又は挿入）ことができる。同様に，表37及び38に示したヘアピンリボザイムのステムループIＶ配列（5'−ＣＡＣＧＵＵＧＵＧ−3'）は，最低限２個の塩基対のステム構造を形成できる限り，任意の配列を含むように変更する（置換，欠失及び／又は挿入）ことができる。表32，34，36，37及び38に示した配列はリボヌクレオチド若しくは他のヌクレオチド又は非ヌクレオチドから作ることができる。このようなリボザイムは表に明示的に記載したリボザイムと等価である。
【０２７０】
リボザイムモチーフを巧みに操作することによって，本発明者はＲＳＶコード化ｍＲＮＡ配列に向けた幾つかのリボザイムを設計した。これらのリボザイムはヌクレアーゼ耐性を改善するように修飾して合成される。標的配列をインビトロで開裂するリボザイムの能力を評価する。
【０２７１】
多数の通常の細胞系を実験目的でＲＳＶで感染させることができる。これらにはＨeＬa，Ｖero及び幾つかの初期上皮細胞系が含まれる。実験的ヒトＲＳＶ感染のコットンラット動物モデルも利用可能であり，そしてウシＲＳＶはヒトウイルスと全く相同性である。迅速な臨床診断はＲＳＶ感染細胞の免疫蛍光染色又はエリザアッセイ用に設計したキットを使用してなされ，そしてこれら方法は共に実験的研究に適合する。ＲＳＶコード化ｍＲＮＡ値はノーザン分析，リボヌクレアーゼ保護，プライマー延長分析又は定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価する。ＲＳＶ活性及び／又は 1Ｃ，1Ｂ及びＮタンパク質をコードするｍＲＮＡの誘発を90％以上ブロックするリボザイムを同定する。
【０２７２】
リボザイム活性の最適化
リボザイム活性はドレイパー等のＰＣＴ ＷＯ93/23569によって記載されているようにして最適化することができる。それらの詳細はここでは繰り返さないが，血清リボヌクレアーゼによる分解を防止するように修飾し（例えば，Eckstein等，国際公開番号ＷＯ 92/07065; Perrault等，1990年 Nature 344，565; Pieken等，1991年 Science 253，314; Usman及びCedergren，1992年 Trends in Biochem. Sci. 17，334; Usman等，国際公開番号ＷＯ 93/15187; 及びRossi等，国際公開番号ＷＯ 91/03162，並びにJennings等のＷＯ 94/13688参照，これらは酵素ＲＮＡ分子の糖部分に行うことができる種々の化学修飾を記載している。これら刊行物は全て参照として本願明細書に組み入れる。)，細胞内での有効性を高めるように修飾し，そしてＲＮＡ合成時間を短縮しそして化学的要件を減少させるためにステムII塩基を除去して，リボザイム結合アーム又は化学合成リボザイムの長さを変えることが含まれる。
【０２７３】
本明細書に参照として組み入れたサリバン等のＰＣＴ ＷＯ94/02595は酵素ＲＮＡ分子の一般的な送達方法を記載している。リボザイムは，リポソーム内でのカプセル化を含むがこれに限定されない当業者に知られている多様な方法によって，イオン導入法によって，又はヒドロゲル，シクロデキストリン，生物分解性ナノカプセル及び生物接着性微小球のような他の媒体中への導入によって細胞に投与することができる。ＲＮＡ／媒体組合せ物は直接注射するか又はカテーテル，注入ポンプ若しくはステントを使用して局所的に送達される。別の送達経路には静脈注射，筋肉注射，皮下注射，エアゾール吸入，経口（錠剤又は丸剤形態)，局所，全身，眼，腹腔内及び／又は鞘内送達が含まれるがこれらに限定されない。リボザイム送達及び投与の更に詳細な説明は本明細書に参照として組み入れたサリバン等，上述及びドレイパー等，上述に提供されている。
【０２７４】
細胞内に高濃度のリボザイムを蓄積させるもう１つの手段はリボザイムコード化配列をＤＮＡ発現ベクター中に導入することである。リボザイム配列の転写は真核細胞ＲＮＡポリメラーゼＩ（pol I)，ＲＮＡポリメラーゼII（pol II）又はＲＮＡポリメラーゼIII（pol III）のプロモーターから行われる。pol II又はpol IIIプロモーターからの転写は全ての細胞で高レベルで発現される; 一定の細胞タイプ中の一定のpol IIプロモーターの値は近くに存在する遺伝子調節配列（エンハンサー，サイレンサー等）の性質に依存する。原核細胞ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適当な細胞内で発現する限り，原核細胞ＲＮＡポリメラーゼプロモーターも使用される（Elroy−Stein及びMoss，1990年 Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87，6743〜6747; Gao及びHuang 1993年 Nucleic Acids Res.，21，2867〜2872; Lieber等，1993年 Methods Enzymol.，217，47〜66; Zhou等，1990年 Mol. Cell. Biol.，10，4529〜4537)。数人の研究者によって，このようなプロモーターから発現されたリボザイムは哺乳類細胞で機能できることが証明されている（例えば，Kashani−Sabet等，1992年 Antisense Res. Dev.，2，3〜15; Ojwang等，1992年 Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89，10802〜10806; Chen等，1992年 Nucleic. Acids Res.，20，4581〜4589; Yu等，1993年 Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90，6340〜6344; L'Huillier等，1992年 EMBO J. 11，4411〜4418; Lisziewicz等，1993年 Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90，8000〜8004)。上記のリボザイム転写単位は，哺乳類細胞中に導入するために，プラスミドＤＮＡベクター，ウイルスＤＮＡベクター（例えば，アデノウイルス又はアデノ関連ウイルスベクター）又はウイルスＲＮＡベクター（例えば，レトロウイルス又はアルファウイルスベクター）を含むがこれらに限定されない多様なベクター中に組み入れることができる。
【０２７５】
本発明の好ましい実施態様では，標的ＲＮＡを開裂するリボザイムを発現する転写単位はプラスミドＤＮＡベクター，レトロウイルスＤＮＡウイルスベクター，アデノウイルスＤＮＡウイルスベクター若しくはアデノ関連ウイルスベクター又はアルファウイルスベクター中に挿入される。これらのベクターや他のベクターは遺伝子を生存動物に伝達し（総説については，Friedman，1989年 Science 244，1275〜1281; Roemer及びFriedman，1992年 Eur. J. Biochem. 208，211〜225参照）そして一時的又は安定な遺伝子発現に導くために使用されている。ベクターは組換えウイルス粒子として送達される。ＤＮＡは単独で送達するか又は媒体とコンプレックスを形成させることができる（ＲＮＡについて上記で説明したように)。ＤＮＡ，ＤＮＡ／媒体コンプレックス又は組換えウイルス粒子は，例えば，カテーテル，ステント又は注入ポンプを使用して治療部位に局所的に投与される。
【０２７６】
診断使用
本発明のリボザイムは疾患細胞内の遺伝子浮動及び突然変異を試験する診断手段として使用することができる。リボザイム活性と標的ＲＮＡの構造間の密接な関係によって，標的ＲＮＡの塩基対合及び三次元構造が変化している分子領域での突然変異の検出が可能になる。本発明に記載した多数のリボザイムを使用することによって，インビトロでの並びに細胞及び組織中でのＲＮＡ構造や機能に重要なヌクレオチド変化をマップにすることができる。リボザイムによる標的ＲＮＡの開裂を使用して遺伝子発現を阻止しそして疾病進行中の特定の遺伝子産生物の（本質的な）役割を特定することができる。このようにして，他の遺伝子標的を疾病の重要なメディエーターと特定することができる。これらの実験は組合せ治療法を可能にする（例えば，種々の遺伝子を標的とする多数のリボザイム，既知の小分子インヒビターと結合させたリボザイム，或いはリボザイム及び／又は他の化学的若しくは生物学的分子の組合せ物による断続的治療）ことによって疾病進行のより良好な治療に導かれるであろう。本発明のリボザイムの他のインビトロ使用は当該技術分野で周知であり，そしてそれらにはＩＣＡＭ−1，relＡ，ＴＮＦ−α，ｐ210bcr-abl又はＲＳＶ関連状態と関係のあるｍＲＮＡの存在の検出が含まれる。このようなＲＮＡは，標準的な方法論を使用してリボザイムで処置した後の開裂生成物の存在を測定して検出される。
【０２７７】
特定の実施例では，野生型又は突然変異型の標的ＲＮＡだけを開裂できるリボザイムをアッセイに使用する。最初のリボザイムは試料中に存在する野生型ＲＮＡを同定するために使用し，そして２番目のリボザイムは試料中の突然変異ＲＮＡを同定するために使用する。反応対照として，野生型と突然変異ＲＮＡの両方の合成基質を両リボザイムで開裂して，反応における相対的なリボザイム効率及び「非標的」ＲＮＡ種の開裂の不存在を証明する。合成基質から得られる開裂生成物は，試料集団中の野生型及び突然変異ＲＮＡの分析用のサイズマーカーを生成するためにも役立つであろう。かくして，各分析には２つのリボザイム，２つの基質及び６つの反応に組み合わせる１つの未知試料が必要である。開裂生成物の存在は，各ＲＮＡの全長及び開裂フラグメントをポリアクリルアミドゲルの１つのレーンで分析できるようにリボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して測定する。標的細胞における突然変異ＲＮＡの発現及び所望の表現型の変化の推定上の危険性を見抜くためには結果を定量することが絶対的に必要というわけではない。ｍＲＮＡのタンパク質産生物が表現型（即ち，ＩＣＡＭ−1，relＡ，ＴＮＦα，ｐ210bcr-abl又はＲＳＶ）の発生に関係しているようなｍＲＮＡの発現は危険性の確立に適切である。類似した比活性のプローブを両転写物用に使用する場合には，ＲＮＡ値の質的比較が適切でありそして初期診断費用を軽減するであろう。ＲＮＡ値を質的に比較しようと量的に比較しようと，突然変異型対野生型の比が高ければ高いほどより高い危険性と相関関係があろう。
【０２７８】
II.  リボザイムの化学的合成
ミリグラムを超える量のRNA，酵素RNA又は修飾RNAについての高い生物活性をもたせた化学的合成，脱保護，及び精製が続行される。出願人は，酵素的に活性なRNAの高収率・高収量な合成は，その作成中に用いられるいくつかの重要な施策に依存することを確認した。特に，重要なことは，RNAホスホルアミダイトは，収量及び時間の両方の見地から効率的に結合されるということ，正しい環外アミノ保護基が用いられるべきであるということ，環外アミノ保護基と2'-ヒドロキシル上のアルキルシリル保護基の除去に適切な条件が用いられるべきであるということ，及び得られるリボザイムの正しい後処理と精製の処置が講じられなければならないということである。
【０２７９】
大型RNA分子（即ち，約30乃至40のヌクレオチド塩基）の収量と生物活性から見て正しい合成を達成するためには，塩基のアミノ機能の保護は，アミド又は置換アミド保護基の何れかを必要とし，これは，一方で，合成条件を維持できるほど十分安定でなければ成らず，他方，合成終了時に除去できなければならない。これらの要件は，図8に示すアミド保護基，特に，アデノシンに対してベンゾイル，シチジンに対してイソブチルイル又はベンゾイル，及びグアノシンに対してイソブチルイルで満足され，これらは，合成終了時，RNAをNH3/EtOH中で65℃ー20時間温置することにより除去することができる。グアノシンとアデノシンに関して図8に示すフェノキシアセチル型保護基及びシチジンに関してアセチル保護基の場合，これらの保護基の完全な除去を達成するのに，エタノールアンモニア中の65℃ー4時間の温置が使われる。アルキルシリル2'-ヒドロキシル保護基の除去は，室温にて8〜24時間，TBAFのテトラヒドロフラン溶液を用いて達成することができる。
【０２８０】
十分脱保護されたRNA分子を取り出す最も定量的手法は，Scaringe等，NucleicAcids Res.1990, 18, 5433-5341に記述されているような，エタノール沈降，又は陰イオン交換カートリッジ脱塩の何れかによる。長いRNA配列の精製は，2段のクロマトグラフ的手法で達成してよく，この場合，その分子は，先ず，5'位置にトリチル基を付けるか又は付けない逆相カラムで精製される。この精製は，水性相としてトリエチルアンモニウム又は重炭酸塩に関するアセトニトリル勾配を使って達成される。トリチルを使う精製の場合，そのトリチル基は，酸の添加と部分的に精製されたRNA分子の乾燥とによって除去してよい。最終的精製は，十分精製されたRNA分子を適当な金属塩，例えば，Na+，Li+等として溶出させるためにアルカリ金属の過塩素酸塩の勾配を用いる，陰イオン交換カラムで実施する。小さい逆相カートリッジでの最終脱塩処理を行えば精製処置が完了する。そのような処置は，リボザイムの活性に逆作用を及ぼさないばかりか，標的RNA分子を切断するその活性を改善できることを，出願人は見出した。
【０２８１】
出願人は，また，所要の全長生成物(FLP)の収量の顕著な改善は，次の諸操作で達成できることを確認した：
1.  結合処理中のRNA（又は類似物）のアミダイトの活性化に0.25-0.5Mもしくは0.15-0.35Mという出用(delivered)又は有効濃度の5-S-アルキルテトラゾールを用いること。（出用とは，反応混合物中の実際の薬品量が既知であることを意味する。このことは，反応容器がそのような操作ができるほどの十分なサイズであるという理由から，大規模合成については可能である。用語有効とは，混合物中の他の試薬と反応し得る使用可能量の薬品が実際に反応混合物に与えられることを意味する。熟練した当業者は，ここに挙げた諸例からそれらの用語の意味を認知するであろう。）この処理に要する時間は，10-15 m，上を見よ，から5-10 mに短縮される。ここで用いられるような，アルキルは，直鎖，分枝鎖，及び環状アルキル基を含む，飽和脂肪族炭化水素を指す。好ましくは，アルキル基は，1乃至12個の炭素をもつ。より好ましくは，それは1〜7個の炭素，より好ましくは1〜4個の炭素をもつ低級アルキルである。アルキル基は，置換されても置換されなくてもよい。置換される時，置換基（群）は，好ましくは，ヒロロキシル，シアノ，アルコキシ，=O，=S，NO2又はN(CH3)2，アミノ，又はSHである。その項はまたアルケニル基を含み，これは，直鎖，分枝鎖，及び環状基を含む少なくとも1つの炭素ー炭素二重結合を包含する不飽和炭化水素である。好ましくは，アルケニル基は，1乃至12個の炭素をもつ。より好ましくは，それは1〜7個の炭素，より好ましくは1〜4個の炭素をもつ低級アルキルである。アルケニル基は，置換されても置換されなくてもよい。置換される時，置換基（群）は，好ましくは，ヒロロキシル，シアノ，アルコキシ，=O，=S，ハロゲン，NO2，ハロゲン，N(CH3)2，アミノ，又はSHである。その項"アルキル"はまたアルキニル基を含み，これは，直鎖，分枝鎖，及び環状基を含む少なくとも1つの炭素ー炭素三重結合を包含する不飽和炭化水素である。好ましくは，アルキニル基は，1乃至12個の炭素をもつ。より好ましくは，それは1〜7個の炭素，より好ましくは1〜4個の炭素をもつ低級アルキルである。アルキル基は，置換されても置換されなくてもよい。置換される時，置換基（群）は，好ましくは，ヒロロキシル，シアノ，アルコキシ，=O，=S，NO2又はN(CH3)2，アミノ，又はSHである。
【０２８２】
前述のアルキル基は，また，アリール，アルキルアリール，炭素環式アリール，ヘテロ環式アリール，アミド及びエステル基を含んでいてもよい。"アリール"基は，共役π電子系を有する少なくとも1つのリングをもち且つそれらの全てが適宜置換されてよい炭素環式アリール，ヘテロ環式アリール及びバイアリールを包含する芳香族を指す。アリール基の好ましい置換基（群）は，ハロゲン，トリハロメチル，ヒドロキシル，SH，OH，シアノ，アルコキシ，アルキル，アルケニル，アルキニル，及びアミノ基である。"アルキルアリール"基は，（上述のような）アリール基に共有連結した（上述のような）アルキル基を指す。炭素環式アリールは，芳香環のリング原子が全て炭素原子である基である。炭素原子は随意に置換される。ヘテロ環式アリール基は，芳香環のリング原子として1乃至3個のヘテロ原子を有し且つリング原子の残りが炭素原子である基である。適当なヘテロ原子には，酸素，硫黄，及び窒素があり，且つその全てが随意に置換される，フラニル，チエニル，ピリジル，ピロリル，N-低級アルキルピロロ，ピリミジル，ピラジニル，イミダゾリルOYOBIその類が含まれる。"アミド"は，-C(O)-NH-Rを指し，ここで，Rは，アルキル，アリール，アルキルアリール又は水素の何れかである。"エステル"は，-C(O)-OR'を指し，ここで，Rは，アルキル，アリール，アルキルアリール又は水素の何れかである。
【０２８３】
2.  結合処理中のRNA（又は類似物）のアミダイトの活性化に0.1-0.35Mという有効，又は最終的，濃度の5-S-アルキルテトラゾールを用いること。この処理に要する時間は，10-15 m，上を見よ，から5-10 mに短縮される。
【０２８４】
3.  環外アミノ保護基を除去するために（NH4OH/EtOH又はNH3OH/EtOH，上を見よ，を使って，55-65℃-4〜20時間に対して），65℃-10〜15分間，アルキルアミン（MA，ここでアルキルは，好ましくは，メチル，エチル，プロピル又はブチル）又はNH4OH/アルキルアミン（MAで指摘したものと同じアルキル基を有する，AMA）を用いること。他のアルキルアミン，例えば，エチルアミン，プロピルアミン，ブチルアミン等を用いてもよい。
【０２８５】
4.  2'-ヒドロキシルアルキルシリル保護基を除去するのに（TBAF，上を見よ，を使って8-24時間又はTEA・3HFで24時間(Gasparutto et al.Nucleic Acids res.1992, 20, 5159-5166に対して），65℃-0.5〜1.5時間，無水トリチルアミン・フッ化水素を用いること。他のアルキルアミン・HF複合体，例えば，トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミンを用いてもよい。
【０２８６】
5.  完全脱保護RNAを精製及び／又は分析するのに陰イオン交換樹脂の使用。これらの樹脂は，限定されるものではないが，シリカ又はポリスチレンのような第四級又は第三級アミノ誘導化固定相を含む。特定実施例では，Dionex-NA100(R)，Mono-Q(R)，Poros-Q(R)が含まれる。
【０２８７】
従って，発明は，RNAホスホルアミダイトの結合のための；アミド又は置換アミド保護基の除去のための；及び2'-ヒドロキシルアルキルシリル保護基の除去のための改良法を特徴とする。該方法で上述の種類の（例えば，置換2'-基を有する）RNA又は類似物の製造が改善され，且つ該RNAの大量の効果的合成ができる。該RNAはまた，酵素活性を持っていいてもよく且つその活性を損失することなく精製できるものである。ここに特定の実施例が与えられているとはいえ，等価の化学反応は，日常の実験で最適化され且つ選択できる上述の代替薬品で実行してよい，ということは当業者には分かるであろう。
【０２８８】
他の様相では，発明は，RNA又は酵素RNA分子をHPLC，例えば，逆相及び／又は陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにわたって通過させて，前記RNA又は酵素RNA分子（例えば，長さが28-70個のヌクレオチド）の精製又は分析のための改良法を特徴とする。その精製法で，ゲル精製法に関する酵素RNA（群）の触媒活性が改善される（図10参照）。
【０２８９】
ここに参考として引用した，Draper et al.,PCT WO93/23569では，逆相HPLC精製が開示されている。長いRNA分子の精製は，陰イオン交換クロマトグラフィーを，特にアルカリ過塩素酸塩と共に用いて達成してよい。このシステムは，極めて長いRNA分子を精製するのに用いてよい。特に，陰イオン交換法によるRNAの精製には，Dionex NucleoPak 100(C)又はPharmacia Mono Q(R)の使用は有利である。この陰イオン交換精製法は，逆相精製に続いて又は逆相精製の前に用いてよい。この方法で，クロマトグラフィー中にリボザイムのナトリウム塩が生成されることになる。ナトリウムアルカリ土類塩を他の金属塩，例えば，リチウム，マグネシウム又はカルシウム過塩素酸塩で置換すれば，精製中にRNA分子の対応塩が生ずる。
【０２９０】
2-段精製処理の場合，この場合は第一段が逆相精製でその後陰イオン交換処理が行われるが，逆相精製は，5'-トリチル-オン又は5'-トリチル-オフの何れかの方法を使う，高分子の，例えば，ポリスチレン素地の，逆相媒質を使って最良に達成される。どちらの分子でも，この逆相法を使って回収でき，そして従って，いったんトリチル化されると，2つの留分をプールでき，次いで，上述のように陰イオン交換精製のために供給してよい。
【０２９１】
同方法は，酵素的に活性なRNA分子を逆相HPLCカラムにわたって通過させることが包含され；酵素的に活性なRNA分子は合成化学法で且つ酵素処理によらずに形成され；そして酵素活性RNA分子は部分的にブロックされ，その部分的にブロックされた酵素的に活性なRNA分子は，それを他のRNA分子から分離するために逆相HPLCカラム上を通過させる。
【０２９２】
より好ましい具体例では，酵素的に活性なRNA分子は，逆相HPLCカラム上を通過後，脱保護され，次いで第二の逆相HPLCカラム（これは逆相HPLCカラムと同じものであってよい）の上を通過させて，他の成分から酵素RNA分子を取り除く。加えて，カラムは，シリカ又は有機高分子素地のC4，C8又はC18カラムであって，少なくとも125Å，好ましくは300Åの多孔度と，少なくとも2μm，好ましくは5μmの粒子サイズを有するものである。
【０２９３】
活性化
RNA分子の合成は，化学的にもしくは酵素的に実行してよい。化学的合成の場合，RNAホスホルアミダイトの活性化因子としてテトラゾールを用いることが知られている（Usman et al. J.Am.Chem.Soc.1987,109,7845-7854）。ここで，及び後続の報告で，テトラゾールの0.5M溶液をRNAホスホルアミダイトと反応させ且つ高分子結合5'-ヒドロキシル基と10分間結合させる。5-S-アルキルテトラゾールの0.25-0.5M溶液を僅かに5分間用いれば，同等又はそれ以上の結果を得る，ということを出願人は確認している。下記は，その手順を例示するものである。
【０２９４】
実施例7：活性化因子として5-S-アルキルテトラゾールを使うRNAとリボザイムの合成
用いられた合成法は，Usman et al.,1987（上記）及びScaringe et al., Nucleic Acids Res.1990, 18, 5433-5441に記述されたようなRNA合成の一般的手順に従い，且つ5'-末端のジメトキシトリチル，及び3'-末端のホスホルアミダイトのような通常の核酸保護・結合基を利用するものである。用いられた主なる相違は，5分間ー0.25 M濃度での活性化剤，5-S-エチル又は-メチルテトラゾールであった。
【０２９５】
全ての小規模合成は，修飾した2.5μmol規模のプロトコルを用いてアルキルシリル保護RNAに関しては結合処理を5分間短縮し且つ2'-O-メチル化RNAに関しては2.5分の結合処理で394(ABI)シンセサイザで実施した。高分子結合5'-ヒドロキシルに関してホスホルアミダイトの6.5-fold excess(162.5 μL of 0.1 M = 32.5μmol)とS-エチルテトラゾールの40-fold excess(400 μL of 0.25 M = 100μmol)が各結合サイクルに用いられた。トリチルフラクションの比色定量法で測定された，394での平均結合収率は，97.5-99%であった。394用の他のオリゴヌクレオチド合成試薬：脱トリメチル化溶液は塩化メチレン中の2% TCAであった；キャップ形成は，THF中の16% N-メチルイミダゾールとTHF中の10%無水酢酸/10% 2,6-ルチジンで実行された；酸化溶液は，THF中の16.9 mM I2，49 mMピリジン，9%水であった。Fisher Synthesis Gradeアセトニトリルは，試薬ビンから直接用いた。S-エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中0.25 M）は，Applied Biosystemsから入手した固体から作った。
【０２９６】
全ての大規模合成は，修飾した25μmol規模のプロトコルを用いてアルキルシリル保護RNAに関しては結合処理を5-15分間短縮し且つ2'-O-メチル化RNAに関しては7.5分の結合処理で改良（8アミダイトポート容量）390Z(ABI)シンセサイザで実施した。高分子結合5'-ヒドロキシルに関してホスホルアミダイトの6-fold excess(1.5 mL of 0.1 M = 150μmol)とS-エチルテトラゾールの45-fold excess(4.5 mL of 0.25 M = 1125μmol)が各結合サイクルに用いられた。トリチルフラクションの比色定量法で測定された，390Zでの平均結合収率は，95.0-96.7%であった。390Z用のオリゴヌクレオチド合成試薬：脱トリメチル化溶液は塩化メチレン中の2% DCAであった；キャップ形成は，THF中の16% N-メチルイミダゾールとTHF中の10%無水酢酸/10% 2,6-ルチジンで実行された；酸化溶液は，THF中の16.9 mM I2，49 mMピリジン，9%水であった。Fisher Synthesis Gradeアセトニトリルは，試薬ビンから直接用いた。S-エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中0.25-0.5 M）は，Applied Biosystemsから入手した固体から作った。
【０２９７】
脱保護
RNA分子の脱保護の第一段階は，NH4OH/EtOH:3/1 (Usman et al. J.Am.Chem.Soc. 1987, 109, 7845-7854)又はNH3OH/EtOH (Scaringe et al. Nucleic Acids Res. 1990, 18, 5433-5341)を用いて55-65℃で〜20時間，環外アミノ保護基を除去することにより実行してよい。55-65℃-10〜15分間，メチルアミン又はNH4OH/メチルアミンを用いれば，同等又はそれ以上の結果が得られることを出願人は確認している。下記は，その手順を例示するものである。
【０２９８】
実施例8：メチルアミン(MA)又はNH4OH/メチルアミン(AMA)を用いて環外アミノ保護基についてのRNA及びリボザイムの脱保護
トリチルーオン又はオフ何れかの，高分子結合オリゴヌクレオチドを，メチルアミン(MA)又はNH4OH/メチルアミン(AMA)の溶液中で，55-65℃-5〜15分間，懸濁して環外アミノ保護基を除去する。高分子結合オリゴヌクレオチドを合成カラムから4 mLのガラスねじ口びんへ移した。NH4OHと水性メチルアミンを同容積予め混合した。得られる試薬の4 mLを室温で5分間びんに加え，次いで，55もしくは65℃で5〜15分間加熱した。-20℃まで冷却後，上澄みを高分子支持体から取り除いた。その支持体を1.0 mLのEtOH:MeCN:H2O/3:1:1で洗浄し，渦をたて，次いで，その上澄みを最初の上澄みに加えた。オリゴヌクレオチドを含有しているその結合上澄みを白色粉体になるまで乾燥した。同様の手順を水性メチルアミン試薬に関しても実施した。
【０２９９】
表40は，塩基の脱保護に関する本明細書で概説した諸改良法を用いて得られた結果の要約である。
【０３００】
RNA分子の脱保護の第二段階は，8-24時間，TBAFを用いて2'-ヒドロキシルアルキルシリル保護基を除去することで達成してよい(Usman et al. J.Am.Chem.Soc.1987, 109, 7845-7854)。N-メチルピロリジン(NMP)中の無水TEA・HFを55-65℃で0.5〜1.5時間用いれば，同等もしくはそれ以上の結果が得られることを出願人は確認している。下記は，この手順を例示するものである。
【０３０１】
実施例9：無水TEA・HFを用いる2'-ヒドロキシルアルキルシリル保護基についてのRNA及びリボザイムの脱保護
アルキルシリル保護基を除去するために，アンモニアで脱保護されたオリゴヌクレオチドを250μLの1.4 M無水HF溶液（1.5 mL N-メチルピロリジン，750μLのTEA及び1.0 mL TEA・3HF）に懸濁し，1.5時間，65℃に加熱した。  9 mLの50 mMTEABを加えて反応物を急冷した。得られる溶液は，10 mLの50 mM TEABで予洗したQiagen 500(R)陰イオン交換カートリッジ（Qiagen社）上に充填した。そのカートリッジを10 mLの50 mM TEABで洗浄後，10 mLの2 M TEABでRNAを溶出させて，白色粉体まで乾燥した。
【０３０２】
表41は，アルキルシリルの脱保護に関する本明細書で概説した諸改良法を用いて得られた結果の要約である。
【０３０３】
実施例10：HPLC精製，陰イオン交換カラム
小規模合成に関しては，粗材料は，ジエチルピロカーボネイトで処理した水で5 mLに希釈した。その試料を100%緩衝液A (10 mM NaClO4)でPharmacia Mono Q(R)16/10もしくはDionex NucleoPac(R)カラムの何れかの上に注入した。Pharmacia Mono Q(R)陰イオン交換カラムに関して0.85 mM/void volumeの率での180-210 mMNaClO4又はDionex NucleoPac(R)陰イオン交換カラムに関して1.7mM/void volumeの率での100-150 mM NaClO4からの勾配をRNA溶出に用いた。フラクションをDionex NucleoPac(R)カラム付きHP-1090 HPLCで分析した。ピークエリアで≧80%の全長生成物を含有するフラクションをプールした。
【０３０４】
トリチルーオフの大規模合成に関しては，粗材料は，脱シリル化反応のクエンチから生じた溶液を53 mL Pharmacia HiLoad 26/10 Q-Sepharose(R) Fast Flowカラムに加えて脱塩した。カラムを10 mMの過塩素酸ナトリウム緩衝液で完全に洗浄した。オリオヌクレオチドは，300 mMの過塩素酸ナトリウムでカラムから溶出した。溶離液を定量し，分析用HPLCを稼動して合成物中の全長材料の百分率を測定した。溶離液を無菌H2O中で4倍に希釈して塩濃度を下げ，そしてPharmacia MonoQ(R)16/10に添加した。10-185 mMの過塩素酸ナトリウムの勾配を4カラム容積にわたって通して比較的短い配列を溶出させ，次いで，全長生成物を30カラム容積中の185-214 mMの過塩素酸ナトリウムからの勾配で溶出した。対象とするフラクションは，Dionex NucleoPac(R)カラム付きHP-1090 HPLCで分析した。85%を越える全長材料を含有しているフラクションをプールした。そのプール物を脱塩のためPharmacia RPC(R)カラムに添加した。
【０３０５】
トリチルーオンの大規模合成に関しては，粗材料は，脱シリル化反応のクエンチから生じた溶液を53 mL Pharmacia HiLoad 26/10 Q-Sepharose(R) Fast Flowカラムに加えて脱塩した。カラムを20 mMのNH4CO3H/10% CH3CN緩衝液で完全に洗浄した。オリオヌクレオチドは，1.5 MのNH4CO3H/10%アセトニトリルでカラムから溶出した。溶離液を定量し，分析用HPLCを稼動して合成物中の全長材料の百分率を測定した。次いで，オリゴヌクレオチドをPharmacia Resource RPCカラムへ加えた。20-55% B (20 mMのNH4CO3H/25% CH3CN，緩衝液 A = 20 mMのNH4CO3H/10% CH3CN)からの勾配を35カラム容積にわたって稼動させた。対象とするフラクションは，Dionex NucleoPac(R)カラム付きHP-1090 HPLCで分析した。60%を越える全長材料を含有しているフラクションをプールした。次いで，そのプールしたフラクションを80%酢酸による手動脱トリチル化させ，直ちに乾燥して，無菌H2O中で懸濁させ，乾燥して，H2O中で再度懸濁させた。この材料をDionex NucleoPac(R)カラム付きHP-1090 HPLCで分析した。その材料を（上記の）トリチルーオフの様式におけるように陰イオン交換クロマトグラフィーで精製した。
【０３０６】
実施例11：リボザイム活性化検定
精製した5'-末端標識RNA基質(15-25-mers)と精製した5'-末端標識リボザイム(〜36-mers)とを共に95℃に加熱し，氷上でクエンチしそして37℃で別々に平衡化した。リボザイム保存溶液は，1μM，200nM，40 nM又は8 nMであり，最終的基質RNAの濃度は，〜1 nMであった。全反応容積は，50μLであった。検定用緩衝液は，50 mM Tris-Cl, pH 7.5及び10 mMのMgCl2であった。 反応は，t = 0で基質とリボザイム溶液とを混合することにより開始した。各5 μLのアリコートを時間点 1,5, 15, 30, 60及び120 mで取り出した。各アリコートをホルムアミド充填緩衝液中でクエンチし，分析のため15% 変性ポリアクリルアミド上に充填した。リン光イメージャ（Molecular Dynamics）を使って定量分析を実施した。
【０３０７】
実施例12：RNAのワンポット脱保護
水性メチルアミンは，RNA分子の塩基を脱保護するのに効率的な試薬であることが出願人によって示された。しかし，多くの時間（2〜24時間）を要する処理では，RNA試料は，糖質の2'-ヒドロキシル基の脱保護に先立って完全に乾燥する必要がある。さらに，大規模（例えば，100 μmol）で合成したRNAの脱保護は，用いられる固体支持体の容積が相当大きいという理由から，興味をそそるものとなっている。大規模で合成されるRNAの脱保護に要する時間を最小にし且つ脱保護のプロセスを簡略化する試みにおいて，出願人は，ワンポット脱保護プロトコル（図12）を説明するものである。このプロトコルに従い，水性メチルアミンの代わりに無水メチルアミンを用いる。塩基の脱保護は，65℃で15分間実施し，その反応物を10分間冷却させる。次いで，2'-ヒドロキシル基の脱保護をTEA・3HF試薬で同一容器において90分間実施する。反応物を16 mM TEAB溶液でクエンチする。
【０３０８】
図13を参照して，部位Bへ向けたハンマーヘッドリボザイムは，RNAホスホルアマダイト化学を使って合成され且つツーポット又はワンポットプロトコルの何れかを使って脱保護される。HPLCカラム上のこれらのリボザイムのプロフィルを比較する。図は，ワンポット又はツーポットプロトコルの何れかによって脱保護されたRNAは，類似した全長生成物のプロフィルを生ずることを示す。ワンポットプロトコルを使って，RNA脱保護に要する時間は，全長RNAの品質又は収量を落とすことなくかなり低減し得ることが出願人によって示されている。
【０３０９】
図14を参照して，（図13から）RNA部位Bへ向けたハンマーヘッドリボザイムは，RNAを切断するそれらの能力に関して試験する。図14に示すように，ワンポットプロトコルを使って，脱保護されるリボザイムは，ツーポットプロトコルを使って，脱保護されるリボザイムに匹敵し得る触媒活性を持っている。
【０３１０】
実施例12a：活性化因子として5-S-アルキルテトラゾールを使ってRNAとリボザイムを含有するホスホロチオエイトを合成するための改良プロトゴル
リボホスホロチオエイトを合成するのに用いられてきた2つの硫化試薬は，テトラエチルチウラム・ジスルフィド(TETD; VuとHirschbein, 1991, Tetrahedron Letter 31, 3005)，及び3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン 1,1-ジオキサイド(Beaucage reagent; VuとHirschbein, 1991 上記)。TETDは，長い硫化時間を要する（DNAに関して600秒及びRNAに関して3600秒）。DNAの硫化に関しては，Beaucage試薬はTETDよりさらに有効であることが最近示された(WyrzkiewiczとRavikumar,1994 bioorganic Med.Chem. 4, 1519)。Beaucage試薬はまた，2'-ジオキシ-2'-フロロ変態を含有するホスホロチオエイトオリゴヌクレオチドを合成するのに用いられており，この場合，待ち時間は10分である(Kawasaki et al.,1992 J.Med.Chem)。
【０３１１】
用いられた合成法は，ここに記述したようなRNA合成の手順に従い且つ通常の核酸保護・結合基，例えば，5'-末端のジメトキシトリチル，及び3'-末端のホスホルアミダイトを使用する。文献に記述されているRNAの硫化処理は，8秒の出用と10分の待ち段階である(Beaucage and Iyer, 1991 Tetrahedron 49, 6123)。これらの条件で，HPLC分析で測定時，約95%の硫化がもたらされた(Morvan et al,.1990 Tetrahedron Letter 31, 7149) 。この5%の汚染酸化は，溶媒に溶解された酸素の存在及び／又は先の合成中に出用ラインの内表面に吸着された微量ヨウ素の緩慢放出によって上昇し得る。
【０３１２】
主要な改良点は，活性化因子，即ち0.25 Mの濃度の5-S-エチルテトラゾール又は5-S-メチルテトラゾールを5分間使うことである。加えて，ホスホロチオエイトであるそれらの連結には，ヨウ素溶液は，アセトニトリル中の3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン 1,1-ジオキサイド(Beaucage試薬)の0.05 Mと置き換えられる。硫化処理のための出用時間は5秒に短縮され且つ待ち時間は300秒に短縮される。
【０３１３】
RNA合成は，修飾した2.5μmol規模のプロトコルを用いてアルキルシリル保護RNAに関しては結合処理を5分間短縮し且つ2'-O-メチル化RNAに関しては2.5分の結合処理で394(ABI)シンセサイザで実施した。高分子結合5'-ヒドロキシルに関してホスホルアミダイトの6.5-fold excess(162.5 μL of 0.1 M = 32.5μmol)とS-エチルテトラゾールの40-fold excess(400 μL of 0.25 M = 100μmol)が各結合サイクルに用いられた。トリチルフラクションの比色定量法で測定された，394での平均結合収率は，97.5-99%であった。394用の他のオリゴヌクレオチド合成試薬：脱トリメチル化溶液は塩化メチレン中の2% TCAであった；キャップ形成は，THF中の16% N-メチルイミダゾールとTHF中の10%無水酢酸/10% 2,6-ルチジンで実行された；酸化溶液は，THF中の16.9 mM I2，49 mMピリジン，9%水であった。Fisher Synthesis Gradeアセトニトリルは，試薬ビンから直接用いた。S-エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中0.25 M）は，Applied Biosystemsから入手した固体から作った。硫化試薬は，Glen Researchから入手した。
【０３１４】
平均硫化効率(ASE)は，下式を使って定められる：
ASE = (PS/Total)1/n-1
ここで，PS  =  P=Sジエステルの31P NMR積分値
Total =  全ピークの積分値
n =  オリゴの長さ
【０３１５】
表42と43を参照して，Beaucage試薬での硫化に関する出用と待ち時間を可変する効果が説明されている。これらのデータが示唆することは，5秒の待ち時間と300秒の出用時間はその下でASEが最大となる条件である，ということである。
【０３１６】
上記条件を使って，36 merハンマーヘッドリボザイムを合成し，それを部位Cへ向ける。リボザイムは，5'-末端方向の4位置にホスホロチオエイト結合を含むよう合成される。このリボザイムのRNA切断活性を図16に示す。ホスホロチオエイトリボザイムの活性は，リボザイムを欠いているどのホスホロチオエイト結合の活性にも匹敵し得るものである。
【０３１７】
実施例13：2'-N-フタルイミド-ヌクレオシドホスホルアミダイトの合成のためのプロトコル
2'-デオキシ-2'-アミノヌクレオシドの2'-アミノ基は，N-(9-フロレニルメトキシカルボニル)で正常に保護される(Fmoc; Imazawa and Eckstein, 1979 supra; Pieken et al., 1991 Science 253, 314)。この保護基は，CH3CN溶液中で又は-20℃で延長保管中の乾燥形態においてさえ，安定ではない。これらの問題は，RNAの大規模合成を達成するためには克服する必要がある。
【０３１８】
出願人は，2'-デオキシ-2'-アミノヌクレオシドの2'-アミノ基に代わる代替保護基の使用法を記述するものである。図17を参照して，ホスホルアミダイト17は，Markevich試薬による一時的保護を使って2'-デオキシ-2'-アミノヌクレオシドから開始して合成した(Markiewicz J.Chem.Res. 1979, S, 24)。中間体13を50%収率で得，但しそれに続くNefken法(Nefkens, 1960 Nature 185, 306)によるN-フタロイル(Pht)の導入，脱シリル化(15)，ジメトキシトリチル化(16)及びホスファイト化によってホスホルアミダイト17に達した。この多段処理の全収量は低い(20%)ので，出願人は，5'と3'ヒドロキシルのアクリル化をせずにN-フタロイル基を選択導入することに集中して，いくつかの代替アプローチ法を検討した。
【０３１９】
2'-デオキシ-2'-アミノヌクレオシドをDMF中の1.05当量のNefkens試薬と一晩反応させ，その後Et3Nで処理(1時間)した時，僅かに10-15%のNと5'(3')-ビス-フタロイル誘導体とが形成され，主要成分はN-Pht-誘導体15であった。N,O-ビス副産物は，cat.KCN/MeOHでの粗反応混合物の処理によって選択的に且つ定量的にN-Pht-誘導体15に変換される。
【０３２０】
重要な中間体16の合成に便利な"ワンポット"処置には，選択的N-フタロイル化それに続くDMTC/Et3Nによるジメトキシトリチル化が包含され，次のように85%の総合収量でDMT誘導体16の標品を生ずる。16の標準フォスファイ化で87%収量のホスホルアミダイト17を産した。1グラムの2'-アミノ，例えば，2'-アミノウリジン(US Biochemicals(R)part # 77140)を乾燥ジメチルホルムアミド(Dmf)から二回共蒸発させ，真空中で一晩乾燥した。注射器を介して50 mlsのAldrich sure-seal Dmfを乾燥2'-アミノウリジンに添加し，その混合物を10分間攪拌して透明生成物を産した。1.0グラム(1.05 eq.)のN-carbethoxyphthalimide (Nefken's reagent,98% Jannsen Chimica)を添加しその溶液を一晩攪拌した。薄相クロマトグラフィー(TLC)では，より速く移動する生成物(CHCl3中の10% ETOH)への90%変換が示され，57μlのTEA (0.1 eq.)を添加してフタルイミド環の閉鎖を実行した。1時間後，追加の855μl(1.5 eq.)のTEAを添加し，続いて1.53グラム(1.1 eq.)のDMT-Cl(Lancaster Synthesis(R), 98%)を加えた。反応混合物をそのまま一晩攪拌させETOHでクエンチし，その後TLCは90%を越える所望の生成を示した。真空中でDmfを取り除き，その混合物を二炭酸ナトリウム溶液(5% aq.,500 mls)で洗浄し，酢酸エチル(2x 200 mls)で抽出した。精製には，25mm x 300mmのフラッシュカラム(75グラムMerckフラッシュシリカ)を用いた。化合物は，ヘキサン中に80〜85%で酢酸エチルを溶出した（収量： 80%純度：＞95% by 1HNMR）。次いで，上述の標準プロトコルを使ってホスホルアミダイトを作製した。
【０３２１】
手元のホスホルアミダイト17で，出願人は，2'-デオキシ-2'-アミノ変態をもついくつかのリボザイムを合成した。合成分析では，97-98%の範囲の結合効率が立証された。2'-アミノ位置がFmoc又はPhtでどちらも保護されている場合，U4及び／又はU7位置に2'-デオキシ-2'-アミノ-U変態を含んでいるリボザイムのRNA切断活性は同一であった。加えて，2'-デオキシ-2'-アミノウリジンの完全な脱保護は，塩基ー組成分析で確認した。ホスホルアミダイト17の結合効率は，低温での長期保管(1-2ヶ月)にわたって発効されなかった。
【０３２２】
SEM基での2'位置の保護
オリゴヌクレオチド，及び特に上述のような酵素分子の合成において，2'-(トリメチルシリル)エトキシメチル保護基(SEM)を用いる方法が続行される。RNAの合成に関して，重要なことは，2'-ヒドロキシル保護基は，種々の合成並びに塩基脱保護の諸処置を通して安定でなければならない，ということである。同時に，この基はまた，必要な時容易に除去できなければならない。これに関しては，t-ブチルジメチルシリル基は効果があった(Usman,N.;Ogilvie,K.K.;Jiang,M.-Y.;Cedergren,R.J. J.Am.Chem.Soc. 1987, 109, 7845-7854及びScaringe,S.A.;Franklyn,C.;Usman,N. Nucl.Acids Res. 1990, 18, 5433-5441)。しかし，この保護基を2'-ヒドロキシルから除去するには，一般に，テトラ-n-ブチルアンモニウムフロリド(TBAF)に長時間晒す必要がある。加えて，バルク状のアルキル置換基は結合にとって障害物であり従ってより長い結合時間を必要とすることが判明している。最終的に，TBDMSは反応活性な塩基であり且つエタンアンモニアでの処理中に部分的に脱保護されることが示された(Scaringe,S.A.;Franklyn,C.;Usman,N. Nucl.Acids Res. 1990,18, 5433-5441及びStawinski,J.;Stromberg,R.;Thelin,M.;Westman,E. Nucleic Acids Res. 1988, 16,9285-9298)。
【０３２３】
（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテル(SEM)は，適当な置換基と思われる。この保護基は，塩基及び最も厳しい酸条件を除く全てに対して安定である。それ故，それはオリゴヌクレオチドの合成に要する条件下では安定である。それは容易に導入でき且つ酸素炭素結合で移動が不可能となる。最終的に，SEM基は，BE3OEt2で極めて迅速に除去できる。
【０３２４】
RNA合成中，ヌクレオチドの2'-位置を（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテル(SEM)で保護することによりRNAの合成法が続行する。同方法には，後述のような標準RNA合成条件の使用，もしくは他の任意の等価処理が含まれる。当業者は，前述の諸処理に精通している。用いられるヌクレオチドは，通常の任意のヌクレオチドであってよく又は従来よりよく知られている方法，例えば，Ecksteinet al., International Publication No. WO 92/07065, Perrault et al., Nature 1990, 344, 565-568, Pieken et al., Science 1991, 253, 314-317, Usman,N.;Cedergren,R.J. Trends in Biochem.Sci,1992, 17, 334-339, Usman et al.,PCT WO93/15187, 及びSproat,B. European Patent Application 92110298.4に記載されているような方法により，種々の位置で置換されてよい。
【０３２５】
本発明はまた，SEM基をヌクレオチドの2'-位置へ共有結合する方法を特徴とする。同方法には，ヌクレオチドをSEM結合条件下でSEM含有分子と接触させることが含まれる。好ましい具体例では，該条件は，酸化ジブチルスズ，フッ化テトラブチルアンモニウム及びSEM-CIである。しかし，当業者は，他の等価条件も使用してよいことが分かるであろう。
【０３２６】
別の様相では，発明は，ヌクレオシド分子又はオリゴヌクレオチドからのSEM基の除去法を特徴とする。同方法は，SEM除去条件下で，例えば，アセトニトリル中で，その分子又はオリゴヌクレオチドをボロントリフルオリドエタレート（BE3OEt2）と接触させることを包含する。
【０３２７】
図18を参照して，RNAの固体相合成の方法が示されている。2',5'-保護ヌクレオチドは，RNA合成条件下で固体相結合ヌクレオチドと接触させてジヌクレオチドを形成する。従来技術の方法での2'-位置の保護基は，図に示すように，シリルエーテルであってよい。本発明の方法では，SEM基は，シリルエーテルの代わりに用いられる。そうでなく，RNA合成を標準の方法で実行してもよい。
【０３２８】
図19を参照して，2'-O-SEMで保護したヌクレオシドとホスホルアミダイトの合成を示す。簡単に云えば，5'-保護ヌクレオシド(1)は，適当な条件下でSEMの誘導体と接触させることによって2'-又は3'-位置で保護される。特に，これらの条件には，ヌクレオシドを酸化ジブチルスズ及びSEMクロリドと接触させることが含まれる。2つの位置異性体は，クロマトグラフィーで分離され且つ2'-保護半分は，標準の手順でホスホルアミダイトに変換される。3'-保護ヌクレオシドは，固体支持体の誘導化に適するコハク酸塩の誘導体に変換される。
【０３２９】
図20を参照して，シリルエーテルを用いるRNA脱保護の従来法が示されている。これは，SEM基を含んでいるRNAの脱保護が実行される図21に示す方法と対照をなすものである。ステップ1で，塩基保護基とシアノエチル基とが標準手順で除去される。次いで，SEM基が図に示すように除去される。ホスホルアミダイトとSEM保護ヌクレオシドの合成の詳細及びオリゴヌクレオチドの合成の際のそれらの用法及び後続の・・・・の脱保護。
【０３３０】
実施例14：2'-O-((トリメチルシリル)エトキシメチル)-5'-O-ジメトキシトリチルウリジンの合成(2)
図19を参照して，CH3CN (18 mL)に溶かした5'-O-ジメトキシトリチルウリジン1 (1.0 G, 1.83 mmol)を酸化ジブチルスズ(1.0 g, 4.03 mmol)とTBAF(1M, 2.38 mL, 2.38 mmol)とに添加した。その混合物を室温（約20-25℃）で2時間攪拌し，その時に(トリメチルシリル)エトキシメチルクロリド(SEM-CI)(487 μL, 2.75 mmol)を添加した。反応混合物を一晩攪拌し，その後濾過・蒸発した。フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル中の30%ヘキサン）で347 mg (28.0%)の2'-ヒドロキシル保護ヌクレオシド2と314 mg (25.3%)の3'-ヒドロキシル保護ヌクレオシド3とを産した。
【０３３１】
実施例15：2'-O-((トリメチルシリル)エトキシメチル)ウリジンの合成(4)
図19に示すように，標準の方法に従ってヌクレオシド2を脱トリチル化した。
【０３３２】
実施例16：2'-O-((トリメチルシリル)エトキシメチル)-5',3'-O-アセチルウリジンの合成(5)
図19に示すように，標準の方法に従ってヌクレオシド4をアセチル化した。
【０３３３】
実施例17：5',3'-O-アセチルウリジンの合成(5)
図19を参照して，十分保護されたウリジン5 (32 mg, 0.07 mmol)をCH3CN (700μL)に溶解しそしてBE3・OEt2(17.5 μL0.14 mmol)を添加した。反応物を15 m攪拌しそしてMeOHを添加して反応物をクエンチした。フラッシュクロマトグラフィー
(CH2Cl2中の5% MeOH)で20 mg (88%)のSEM脱保護ヌクレオシド6を得た。
【０３３４】
実施例18：2'-O-((トリメチルシリル)エトキシメチル)-3'-O-スクシニル-5'-O-ジメトキシトリチルウリジンの合成(2)
図19に示すように，標準の方法に従ってヌクレオシド3をスクシニル化して支持体に結合した。
【０３３５】
実施例19：2'-O-((トリメチルシリル)エトキシメチル)-5'-O-ジメトキシトリチルウリジン 3'-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト)の合成(8)
図19に示すように，標準の方法に従ってヌクレオシド3をホスファイト化した。
【０３３６】
実施例20：2'-O-SEM保護を用いるRNAの合成
図18を参照して，用いられた合成法は，Usman,N.;Ogilvie,K.K.;Jiang,M.-Y.;Cedergren,R.J. J.Am.Chem.Soc.1987, 109,7845-7854及びScaringe,S.A.;Franklyn,C.;Usman,N. Nucl.Acids Res.1990, 18, 5433-5441に記載されたようなRNA合成の一般手順に従う。ホスホルアミダイト8を標準のRNAの方法に従って結合して10-merのウリジル酸を生成した。合成は，修飾した2.5μmol規模のプロトコルを用いて10 m結合処理で394(ABI)シンセサイザで実施した。高分子結合5'-ヒドロキシルに関して13-fold excess (325 μL of 0.1 M = 32.5μmol)とテトラゾールの80-fold excess(400 μL of 0.5 M = 200μmol)が各結合サイクルに用いられた。トリチルフラクションの比色定量法で測定された，394での平均結合収率は，98-99%であった。394用の他のオリゴヌクレオチド合成試薬：脱トリメチル化溶液は塩化メチレン中の2% TCAであった；キャップ形成は，THF中の16% N-メチルイミダゾールとTHF中の10%無水酢酸/10% 2,6-ルチジンで実行された；酸化溶液は，THF中の16.9 mM I2，49 mMピリジン，9%水であった。Fisher Synthesis Gradeアセトニトリルは，試薬ビンから直接用いた。
【０３３７】
図21を参照して，ホモポリマーは，65℃のNH3/EtOHで塩基脱保護した。その溶液をデカントしそして支持体を1:1:1 H2O:CH3CN:NeOHの溶液で二回洗浄した。混合溶液を乾燥し，次いで，CH3CN (1 mL)で希釈した。BE3・OEt2(2.5 μL, 30 μmol)をその溶液に添加し，アリコートを10の時間点で取り出した。その結果から，図22に示すように，30分後に脱保護が完了していることが分かる。
【０３３８】
III. ベクター発現リボザイム
ここでは，バクテリア又は真核生物におけるリボジアイムの発現法，並びにそのようなリボザイムの大規模製造法に従う。一般に，本発明は，低減したコストでリボザイムを製造するための，定義されたリボザイムをエンコードする多重複写カセットを作成する方法を特徴としている。ベクターが作られ，これは，他の1つのリボザイムだけでベクターから作られたRNA転写物からの3'及び5'末端で切断される複数のリボザイムをエンコードする。その系は，リボザイムの製造規模を拡大するのに有用であり，それは，原位置で又は生体外で修飾されてもされなくてもよい。該ベクター系は特定のセル中で所望のリボザイムを発現させるのに用いることができ，又は生体外の系で用いて大量の所望riboqyneの製造を可能にすることもできる。この発明のベクターによって，転写前後に原位置又は生体外で切断されるRNA転写物の形でより収率の高いリボザイムの合成ができる。
【０３３９】
従って，本発明は，1つの末端だけ，又は1つのリボザイムだけを処理する代わりに各治療，トランス作用又は所望のリボザイムの3'及び5'末端を処理するのにシングルのリボザイムを用いる従来技術とは区別されるものである。これによって，mRNA転写物から他の1つのリボザイムだけで放出される多重トランス作用リボザイムでより小さいベクターを誘導することができる。出願人はまた，リボザイムをエンコードするベクターとそれに対応する転写物とをmRNAの折りたたみが放出リボザイムによる処理でじゃまされないように設計することによって，該リボザイムの活性が従来のそれらに比べそれで増大される方法も提供した。
【０３４０】
この方法で作られるリボザイムの安定性は，Draper et al., PCT WO93/23509に記載され，参考としてここに引用されているような，リボザイムの末端に配列を設けることにより向上することができる。
【０３４１】
本発明の方法は，現行の化学的リボザイム合成に比べ，低コストの複写をベースとしたプロトコルを用いて高収率のリボザイム合成を実現し，且つ化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを生成するのに現に使われている分離技法を用いることができるという理由から，有益である。従って，同方法により，分析，診断，又は治療用途用として低コスト高収率でリボザイムの合成が可能となる。
【０３４２】
その方法はまた，リボザイム構造研究，酵素的研究，標的RNAの接近性の研究，転写阻害研究及びヌクレアーゼ保護の研究のための生体外リボザイムの合成にも有用であり，その多くは，ここに参考として引用したDraper et al., PCT WO93/23509に記載されている。
【０３４３】
その方法はまた，所望の治療用リボザイムの細胞内濃度を高めるために，もしくはその後の単位長さのリボザイムの生体外分離用の鎖状体の転写を生成するために原位置でのリボザイムを作るのに用いることもできる。所望のリボザイムは，分子遺伝の分析又は感染性細胞系における遺伝子発現を阻害するのに，及び治療用分子又は処理しずらい細胞の効率をテストするのに用いることができる。
【０３４４】
従って，一般に，本発明は，プラスミド，コスミド，ファグミド，ウイルス，ウイロイド，ウイルソイド又はファージベクター内部にバクテリア，ウイルス又は真核生物のプロモーターを含むベクターを特徴とする。他のベクターも，同じように適しており，ポリメラーゼの連鎖反応のような増幅法で形成された，二本鎖，又は部分的に二本鎖のDNA，又はウイルスもしくはウイロイドのRNAゲノム中への部位指向相同的組換えによって形成された，二本鎖，部分的に二本鎖又は一本鎖のRNAを含む。それらのベクターは環状でなくてよい。最初のリボザイムエンコード領域が転写的にプロモーター領域に結合され，そして治療用又は所望の第二のリボザイムをエンコードする領域の両側に配置されるリボザイム開裂配列をエンコードしてヌクレオチドが配列決定する。DNAベクターにおける又はRNA発現系の必要なDNAにおけるこのベクターの構成を容易にするため，適当な制限エンドヌクレアーゼ部位を与えることができる。所望の第二のリボザイムは，ハンマーヘッド，ヘアピン，肝炎デルタウイルス(HVD)又は他の触媒中心のような，任意の望ましいタイプのリボザイムであってよく，また，上述のように，グループI及びグループIIのイントロンを包含してよい。第一のリボザイムは，エンコードされた開裂配列を切断できるよう選択され，且つまた任意の所望のリボザイム，例えば，Tetrahymena誘導リボザイムであってもよく，これは，例えば，ベクター構成に助けとなるよう自己認識配列の中心にはめ込まれた制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでもよい。このエンドヌクレアーゼ部位は，ベクターの構成，及びその後のベクターの分析に有用である。
【０３４５】
前述のベクターのプロモーターが活性化されると，RNAの転写体が作られ，これは第一及び第二のリボザイム配列を含む。第一リボザイムの配列は，適当な条件下で，開裂部位で開裂を起こして第二リボザイムの配列を放出するよう作用することができる。これらの第二リボザイム配列は，その時，それらの標的RNA部位で作用でき，又は後の使用又は分析用として分離してよい。
【０３４６】
従って，1つの様相において，発明は，（分子内切断活性を有する第一リボザイムをエンコードする）第一核酸配列，及びベクターでエンコードされたRNA転写体から第二リボザイムを放出するために第一リボザイムで切断されるRNAをエンコードする核酸配列によって隣接された，（分子内切断酵素活性を有する第二リボザイムをエンコードする）第二核酸配列を含むベクターを特徴とする。第二のリボザイムは，5'サイド又は3'サイドの何れかで第一リボザイムによって隣接されてよい。必要なら，第一リボザイムは，別々のベクターでエンコードされてよく且つ分子内切断活性を有してよい。
【０３４７】
上で議論したように，第一リボザイムは，任意の自己切断リボザイムになるよう選択でき，また，第二リボザイムは，任意の所望リボザイムになるよう選択してよい。フランキング配列は，第一リボザイムで認識される配列群を含むよう選択される。ベクターがこれらの核酸配列からRNAを発現させられると，そのRNAは，適当な条件下で，フランキング領域の各々を切断する能力を持ち，よって，1つ以上の第二リボザイムのコピーを放出する。必要なら，同一のベクターでいくつかの異なった第二リボザイムを作ることができ，又は，いくつかの異なったベクターを同一の容器又はセルに配置して異なったリボザイムを作ることもできる。
【０３４８】
好ましい具体例では，ベクターは，各々が第一リボザイムで認識された核酸配列によって隣接された，第二リボザイムをエンコードする複数の核酸配列を包含する。より好ましくは，該複数は，少なくとも6乃至9個の又は60〜100間の個数までもの核酸配列を含む。他の好ましい具体例では，ベクターは，ベクターからのリボザイムをエンコードする核酸の発現を調節するプロモーターを含み；また，ベクターは，プラスミド，コスミド，ファグミド，ウイルス，ウイロイド又はファージから選択される。最も好ましい具体例では，複数の核酸配列は，同一であり且つプロモーターに最近接の同一末端を有するよう続き順に配列される。必要なら，第一及び第二のリボザイムをエンコードする配列に隣り合うポリ(A)配列は，ベクターによって作られるRNAの安定性を高めるよう設けてよく；また，第一リンボザイムをエンコードする核酸に隣り合う制限エンドヌクレアーゼは，ベクターの構成中，第二リボザイムをエンコードする核酸の挿入を可能にするよう与えられる。
【０３４９】
第二の様相では，本発明は，上述のように，第一リボザイムをエンコードする核酸を含んでいるベクターを生成することにより，及び上述のように，第二リボザイムをエンコードする一本鎖DNAを生成することにより，リボザイム発現ベクターを形成する方法を特徴とする。次いで，その一本鎖DNAをアニールさせて部分二重らせんDNAを形成し，これはdNTPsの存在におけるDNAポリメラーゼのような，適当な酵素での処理で充填して，その後でベクターに結合できる二重らせんDNAを形成できる。この方法で生ずる大型のベクターは，従って，第二リボザイムをエンコードする高複写数の一本鎖DNAがそのベクターに組み込まれることを保証するよう選択できる。
【０３５０】
さらに別の様相では，本発明は，上述のようなベクターを生成し，そのベクターからRNAを発現させ，そして第一リボザイムで切断して第二リボザイムを放出させることによるリボザイムの生成法を特徴とする。
【０３５１】
好ましい具体例では，シス-切断リボザイムとして3つの異なったリボザイムモチーフが用いられる。ハンマーヘッド，ヘアピン，及び肝炎デルタウイルス(HDV)のリボザイムモチーフは，生体外で素早く自己切断する小さい，よく定義された配列から成る(Symons, 1992 Annu.Rev.Biochem. 61, 641)。3つのリボザイムモチーフの間には構造的機能的相違は存在するが，それらは生体内で効率よく自己作用する。3つの全てのリボザイムモチーフは，3'フランキング配列の欠失で87-95%完結まで自己作用する。生体外で，この発明に記載された自己作用構造は，Taira et al.,1990 上記；及びAltschuler et al.,1992 Gene 122, 85によって報告されたそれらより明らかにより活性である。本発明は，シス-切断リボザイムを使って，作用を防御する二次的構造の欠失を確保することにより生体内の特定部位でRNA分子を効率よく切ることを可能にするものである。
【０３５２】
治療用リボザイムの分離
望ましい治療用リボザイムの分離法は，クロマトグラフィーの技法による。ここに参考までに引用した，Draper et al.,PCT WO 93/23509によるHPLC精製法及び逆HPLC精製法を用いることができる。あるいは，相補的オリゴヌクレオチドをセルロース又は他のクロマトグラフィー用カラムに付着させれば，例えば，フランキングアームと酵素RNAの間の領域へのハイブリッド形成によって，治療用第二リボザイムを分離することができる。このハイブリッド形成は，所望の酵素RNA無しで短いフランキング配列に対して，及び放出第一リボザイムに対して選択される。ハイブリッド形成は，ヌクレアーゼの分解を防ぐべくカオトロピック剤の存在で達成することができる。マトリックス上のオリゴヌクレオチドは，ヌクレアーゼ活性を最小にするため，例えば，2'-O-メチルRNAを設けて修飾してよい。カラムマトリックスに付着されたオリゴヌクレオチドのそのような修飾によって，オリゴの分解を最小にしてカラムの多重使用が可能となる。そのような多くの修飾法が当分野で知られているが，望ましいのは化学的に安定な非還元性修飾である。例えば，ホスホロチオエイト修飾を用いてもよい。
【０３５３】
発現リボザイムRNAは，溶解とそれに続くイソチオシアン酸グアニジンの分離のような通常の手続きでバクテリア又は真核生物から分離できる。
【０３５４】
現在知られているTetrahymenaの自己切断部位は，本発明の代替ベクターに用いることができる。必要なら，全長Tetrahymena配列を用いてよく，又はより短い配列を用いてよい。5'切断末端の自己切断部位における余分な配列を減らすために，Tetrahymenaリボザイムに通常存在するヘアピンは，治療用第二リボザイムの3'配列とその補体を含んでいることが望まれる。即ち，第一放出リボザイムエンコーディングDNAは，2つの部分に与えられ，所望の第二リボザイムをエンコードするDNAで分離される。例えば，治療用第二リボザイム認識配列が，CGGACGA/CGAGGAであるなら，CGAGGAは，それがTetrahymenaリボザイムで認識されるステム構造になるよう自己切断部位のループに与えられる。そのステムループは，所望の第二リボザイムエンコーディングDNAがそこに配置される制限エンドヌクレアーゼ部位を包含してよい。
【０３５５】
望まれるなら，ベクターは，ここに参考までに引用された，Lechner,PCT WO92/13070で記述された系を用いて治療プロトコルに使って，治療用第二リボザイムの時限発現，並びに細胞又は遺伝子機能の適切な遮断を可能にしてよい。従って，ベクターは，RNAの存在においてのみ酵素的に活性なRNAを適宜発現するプロモーター又は望ましくない生物又は状態の存在を表す別の分子を包含する。その時，前述の酵素的に活性なRNAは，Lechner（同上）によって説明されたように，それがそこに存在している細胞を殺すか傷つけるか，もしくは所望のタンパク質生成物の発現を減ずるよう作用する。
【０３５６】
多くの適当なRNAベクターも本発明に用いてよい。そのベクターには，植物ウイロイド，一本鎖又は二本鎖RNAゲノムを包含する植物ウイルス及びRNAゲノムを包含する動物ウイルス，例えば，ピコルナウイルス，ミクソウイルス，パラミクソウイルス，A型肝炎ウイルス，レオウイルス及びレトロウイルスがある。引用された多くの場合，これらのウイルスベクターの使用はまた，リボザイムの組織特定送達となる。
【０３５７】
実施例21：自己作用カセットの設計
好ましい具体例において，出願人は，3つの異なったリボザイムモチーフーーハンマーヘッド，ヘアピン及び肝炎デルタウイルスリボザイムーーの生体外及び生体内シス-切断活性を比較して，生体内転写物の末端を処理するそれらの能力を検定した。しかし，3つの間で直接比較するため，リボザイム含有転写物はできるだけ類似するよう設計することが重要である。このために，リボザイムカセットは全て，3つのシス-作用リボザイムの1つがその後直ぐ続く同一のトランス作用ハンマーヘッドリボザイムを含んだ（図23-25）。簡単のため，出願人は，下流側のシス-切断リボザイムだけを表す省略形で各カセットを呼ぶことにする。従って，HHは，ハンマーヘッドリボザイムを含んでいるシス-切断リボザイムを指し，一方，HP及びHDVは，それぞれ，ヘアピン及び肝炎デルタウイルスシス-切断リボザイムを含んでいるカセットを指す。リボザイムの一般的設計，並びにカセット間の特異的差異を以下に概説する。
【０３５８】
安定なステムループ構造を形成すると予測される配列は，転写物全ての5'末端に含まれる。ヘアピンステムは，安定なテトラループ(Antao et al.,1991 Nucleic Acids Res. 19, 5901) で分離された，T7 RNAポリメラーゼ開始配列(Milligan & Uhlenbeck, 1989 Methods Enzymol. 180, 51)とその補体を包含する。T7開始配列をステムループ構造の中へ組み込むことにより，出願人は，トランス-作用リボザイムとのもしくはシス-作用リボザイムとの非生産的塩基対合相互作用を避けようと期待した。転写物の末端におけるヘアピンの存在もまた，生体内転写物の安定性に寄与してよい。これらは非限定の諸例である。当業者は，当分野で周知の各種のプロモーター，イニシエーター配列及びステムループ構造の組合せを使って他の態様を容易に案出し得ることが分かるであろう。
【０３５９】
本研究に用いられるトランス-作用リボザイムは，部位B (5'...CUGGACUC↓GACCUUC...3')を目標とする。リボザイムの5'結合アーム，5'-GAAGGUC-3'，及びリボザイムの核，5'-CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA-3'，は全ての場合において不変である。加えて，全ての転写物も5'ステムループとリボザイムの第一ヌクレオチド間で単一のヌクレオチドを含む。リンカーヌクレオチドは，5'ヘアピンを欠く同一のリボザイムで測定されたものと同じ生体外活性を得るために必要とした。3つのシス-切断リボザイムは切断部位で異なった要件をもつ故，処理された転写物の3'末端での多少の差異は避け得なかった。しかし，トランス-及びシス-作用リボザイム間の連結は，いったんシス-切断が起こると，トランス-切断リボザイムの3'末端に最小の異質配列が残るよう設計される。構造間の差異だけがリボザイムの3'結合アームに存在し，ここでは，標的配列に相補的な，6もしくは7個のヌクレオチド，5'-ACUCCA(＋/−G)-3'が存在し，また，処理後は，2乃至5個のエキストラヌクレオチドが残る。
【０３６０】
HHカセットに使われるシス-切断ハンマーヘッドリボザイムは，Grosshans及びCech, 1991（上記）の設計に基づいている。図23に示すように，トランス-作用リボザイムの3'結合アームは，ステムIを形成するのに要するシス-切断リボザイムの塩基対合相互作用に含まれる。2つのエキストラヌクレオチド，UC，は，3'結合アームの末端に含まれ，自己作用に続いてトランス-作用リボザイムの3'末端に残る自己作用ハンマーヘッドリボザイム部位(Ruffner et al.,1990（上記）を形成した。
【０３６１】
HP自己作用構造のヘアピンリボザイム部分は，最小の野生型配列に基づく(Hampel & Tritz, 1989（上記）)。ヘリックス1末端のテトラループ（切断部位の3'サイド）は，2つの部分を結合するよう働き且つ従って自己作用に続き放出トランス-作用リボザイムの末端に5個の最小ヌクレオチドを残す。HPの2つの変異体，HP(GU)とHP(GC)を設計した。HP(GU)は，ヘリックス2におけるG・Uゆらぎ塩基対で構成した(A52G置換；図24)。このヘリックス2の多少の不安定性は，生成物放出を促進し且つ逆反応を防ぐことによって自己作用活性を改善しようとしたものである(Berzal-Herranz et al.,1992  Genes & Dev. 6, 129;  Chowrira et al., 1993 Biochemistry 32, 1088)。HP(GC)カセットは，ヘリックス2における強力な塩基対合相互作用に対するコントロールとして構成した(U77C及びA52G置換；図24)。ヘアピンリボザイムの逆連結反応を妨害する別の修飾は，野生型配列に関連した1つの塩基対によってヘリックス1(図24)を短くすることであった(Chowrira & Burke,1991 Biochemistry 30, 8518)。
【０３６２】
HDVリボザイムは，切断部位に関するヌクレオチド5'がピリミジンである時に効率よく自己作用し，その位置にアデノシンがある時は幾分その効力が落ちる。他の配列要件のどれも切断部位の上流を同定しなかったが，ステムループ構造が切断部位の2 nt内に存在する時はいくらかの活性の低下を我々は観察した。HDV自己作用構造（図25）は，自己作用の後，その3'末端にわずか2個のヌクレオチドを付加してトランス-作用ハンマーヘッドリボザイムを生ずるよう設計した。ここに用いられるHDV配列は，抗ゲノム配列(Perrota & Been, 1992（上記）)に基づいているが，Been et al.,1992 (Biochemistry 31, 11843)の修飾を含み，この場合，リボザイムのシス-切断活性は，野生型ステムループに対する短縮ヘリックス4の置換で改善される（図25）。
【０３６３】
自己作用リボザイムカセットをエンコードするDNA挿入を作成するため，部分的に重複する頂部-及び底部-鎖のオリゴヌクレオチド(60-90ヌクレオチド)が，T7プロモーター，トランス-作用リボザイム，シス-切断リボザイム及びクローン化に使える適当な制限部位の配列を含むよう設計された（図26）。アニールされたオリゴヌクレオチドの一本鎖部分は，Sequenase(R)(U.S.Biochemicals)を使って二本鎖に変換した。挿入DNAは，標準プロトコルを使ってEcoR1/Hindlll-digested puc 18に連結しそしてE.coli strain DH5αに形質転換した(Maniatis et al., 1982 in Molecular Cloning Cold Spring Harbor Press)。正のクローンの同一性は，小規模プラスミド配合物を配列決定して確認した。
【０３６４】
生体外転写鋳型として及び処理に使える比較的大規模のプラスミドDNAの配合物は，付帯的エタノール沈降が最終段処理として含められたことを除けば，QIAGENInc.(Studio City, CA)からのプロトコルとカラムを用いて作成した。
【０３６５】
実施例22：生体外RNA処理
線状プラスミド鋳型を含んでいる転写反応は，実質的に，記述されたように実施した(Milligan & Uhlenbeck,1989（上記）； Chowrira & Burke,1991（上記）)。5'末端で標識された転写物を作成するため，10-20 μCi[γ-32P]GTP,200μM 各 NTP及び0.5乃至1μgの線形化プラスミド鋳型の存在において標準転写反応が実施された。MgCl2の濃度は，全ヌクレオチドの濃度を超える10 mMに維持した。
【０３６６】
生体外自己作用に適する個々のリボザイムカセットの能力を比較するため，各構造を転写しそして37℃の同一条件下で自己作用させた。これらの比較のために，種々のリボザイムカセットをもっている同量の線形化DNA鋳型を[γ-32P]GTPの存在で転写して5'末端で標識された転写物を作った。この方法では，全長の，未処理の転写物と放出トランス-リボザイムだけがオートラジオグラフィーで可視化された。全ての反応では，Mg2+は，全てのリボザイムカセットで切断が支持されるようヌクレオチドの濃度を超える10 mMを含有させた。転写鋳型は，下流側の配列の長さを増やした状態での自己作用が比較し得るよう異なった制限酵素による消化によって数位置で線形化した（図26）。得られる転写物は，3'末端での4-5非リボザイムヌクレオチド(HindIIIで消化した鋳型)，下流側配列の220ヌクレオチド(Ndel消化鋳型)又は454ヌクレオチド(Rcal消化鋳型)の何れかをもつ。
【０３６７】
図27に示すように，4つの全てのリボザイムカセットは，自己作用でき且つ期待サイズをもつRNA生成物を生ずる。ハンマーヘッドリボザイム活性に不可欠な2つのヌクレオチド(Ruffner et al.,1990（上記）)をHH（突然変異体）核配列において変化させられ（図23参照），そのためこの転写物は自己作用できない（図27）。このことは，全長RNAが存在するが，HH（突然変異体）における放出5'RNAの欠失で証明される。放出されるトランスリボザイム（図27）の量を比較することにより，特に下流側配列の存在に関連して，生体外自己作用に対するこれらのリボザイムの能力差が存在することが示される。2つのHP構造に関して，HP(GC)は，エキストラ下流配列が存在する場合も無い場合も，HP(GU)リボザイムより有効であることは明らかである。加えて，HP(GU)の活性は，下流配列が存在する時は劇的にますます衰える。比較的強いG:C塩基対は，多分，HP(GC)構造の能力に寄与して，216個程のエキストラヌクレオチドが下流側に存在するときでさえ，生産の構造に正しく（及び／又はより迅速に）折り込まれる。HHリボザイム構造はまた，自己作用時に極めて有効であり，下流側配列が存在する時でもHP(GU)構造より多少優れている。
【０３６８】
3つのリボザイムモチーフについて，エキストラ下流配列の存在は，HDVの効率に最も影響を及ぼすと思われる。エキストラ配列が下流側に何ら存在しない時，HDVは極めて有効であり且つHH及びHP(GC)カセットとほぼ同レベルまで自己作用する。しかし，エキストラ下流配列が存在すると，自己作用活性は，（準最適な）HP(GU)カセットで見られる位ほとんど劇的に減少すると思われる。
【０３６９】
実施例23：自己作用反応の力学
Hindlllで消化された鋳型(250 ng)を標準転写に用いた。反応混合物：50 mM Tris.HCl pH 8.3; 1 mM ATP, GTP及びUTP; 50 μM CTP; 40 μCi[α-32P]CTP; 12mM MgCl2; 10 mM DTT.  転写／自己作用反応は，T7 RNAポリメラーゼ(15 U/μl)の付加で開始した。5 μlのアリコートは，規則的時間間隔で採取し，反応は，同量の2xホルムアミド充填緩衝液(95%ホルムアミド，15 mM EDTA，＆染料)を加えて停止させ，そしてドライアイスで凍結した。試料を10%ポリアクリルアミド・シーケンスゲルで溶解し，得られたものをPhosphorImager(Molecular Dynamics, Sunnyvale,CA)で定量した。リボザイムの自己切断速度は，下式へのデータの非線形最小二乗適用(KaleidaGraph, Synergy Software, Reeding, PA)により定めた：
（フラクション非切断転写）＝ 1/kt (1-e-kt)
ここで，tは時間を表し，kは切断に関する単分子率定数を表す(Long & Uhlenbeck, 1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,6977)。
【０３７０】
線形鋳型は，転写物が3'末端に4乃至5個のベクター誘導ヌクレオチドだけを含むようプラスミドをHindlllで消化して作成した（図23-25参照）。各構造について定められた単分子率定数(k)の比較により，HHは自己作用時に最も効率がよいことは明らかである（表44）。HH転写物は，HDVより2倍速く，且つHP(GC)転写物より3倍速く自己作用する。HP(GU)RNAは自己作用するが，HP(GC)構造より少なくとも6倍遅い。このことは，ヘリックス2の安定性は，ヘアピンリボザイムの自己作用及びトランス切断活性にとって本質的であるという先の観察と一致するものである(Hampel et al., 1990 （上記）；Chowrira & Burke, 1991（上記）)。ここで測定された転写中のHH自己切断率(1.2 min-1)は，異なったステムIとステムIIIを有するHHを使ってLongとUhlenbeck 1994（上記）によって測定された率と類似している。HPとHDVについての転写中の自己作用率は，以前には報告されていない。しかし，転写中にここで測定されるようなーーHDVリボザイムの自己作用は，変性ゲルから分離後に試験された時より明らかに遅い(Been et al.,1992（上記）)。この減少は，多分，プロトコルの差異並びにここで用いたHDV構造における5'フランキング配列の存在を反映している。
【０３７１】
実施例24：生体外トランス-切断に及ぼす下流側配列の影響
3'フランキング配列を有しているか有していないトランスリボザイムを含んでいる転写物は，トランスにおけるそれらの標的を切断するそれらの能力に関して検定された。このために，3つの鋳型からの転写物を予備のゲルで溶解し，HH転写反応からの処理済みトランス-作用リボザイムと全長HH（突然変異体）の両方に対応するバンドと△HDV転写物を分離した。3つの転写物全てにおいて，トランス-作用リボザイム部分は，それらの3'末端の配列を除いて同一である。HHトランス-作用リボザイムは，その3'末端に追加UCだけを含み，一方，HH（突然変異体）と△HDVは，それらの3'末端に，それぞれ，52と37個のヌクレオチドをもつ。622ヌクレオチド，内部標識された標的RNAは，リボザイム超過条件下で，標準の反応緩衝液に溶かした3つのリボザイム転写物と共に温置した。
【０３７２】
トランス-リボザイム切断反応用の内部標識された基質RNAを作るために，622 nt領域（ハンマーヘッド部位P含有）を，T7 RNAプロモーターを増幅配列の上流側に配しているプライマーを使って合成した。標的RNAは，[α-32P]CTP (Chowrira& Burke, 1991（上記）)の存在で標準転写緩衝液において転写した。その反応混合物を15単位のリボヌクレアーゼの無いDNaselで処理し，フェノール続いてクロロホルム：アソアミルアルコール(25:1)で抽出し，イソプロパノールで沈殿させそして70%エタノールで洗浄した。乾燥させたペレットを20 μlの DEPC処理水に再懸濁しそして-20℃で保管した。
【０３７３】
非標識リボザイム(1μM)と内部標識した622 nt 基質RNA (＜10 nM)とを90℃-2分間加熱しそして10分間で37℃まで徐冷することにより標準切断緩衝液(50 mM Tris.HCL pH 7.5と10 mM MgCl2含有)中で別々に変性復元した。反応は，リボザイムと基質混合物とを混合することにより開始し，37℃で温置した。5 μlのアリコートは，規則的時間間隔で採取し，同量の2xホルムアミドゲル充填緩衝液を加えてクエンチし，そしてドライアイスで凍結した。試料を5%ポリアクリルアミド・シーケンスゲルで溶解し，得られたものをPhosphorImager(R)(Molecular Dynamics, Sunnyvale,CA)を用いてゲルの放射性分析画像により定量的に分析した。
【０３７４】
HHトランス-作用リボザイムは，標的RNAを△HDV転写物よりほぼ10倍速くそしてHH（突然変異体）転写物より20倍以上速く切断する（図28）。HH（突然変異体）の末端の追加ヌクレオチドは，トランス-作用リボザイムの3'標的結合アームとの7塩基対を形成する（図23）。この相互作用は，トランス-作用リボザイムを標的配列の結合に使えるよう(6 kcal/moleの消費で)崩壊させなければならない。対照的に，△HDV末端の追加ヌクレオチドは，トランス-リボザイムとの任意の強い代替塩基対合を形成するよう設計されなかった。それにもかかわらず，△HDV配列は，1-2 kcal/moleの範囲の安定性をもつトランス-リボザイムの3'標的結合アームを包含してする多重構造を形成すると予測される。従って，△HDVとHH（突然変異体）の構造について観察された活性化の減少は，予め折り込まれた構造と矛盾するものではなく，且つそれは，リボザイムか基質の何れか又はその両方との非生産的相互作用を通してフランキング配列がリボザイムの触媒効率を低減し得る，という見方を強調する。
【０３７５】
実施例25：生体内RNA自己作用
3つの構造(HH, HDV及びHP(GC))は溶液で効率よく自己作用する故，出願人は，リボザイムの自己作用に及ぼす哺乳動物の細胞環境の影響を次に検討した。一時的発現系を用いて生体内リボザイム活性を調べた。この研究には，細胞質で構成的にT7 RNAポリメラーゼを発現するマウスの細胞系(OST7-1)を選んだ(Elroy-Stein and Moss, 1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,6743)。これらの細胞では，T7プロモーターの下流側にリボザイムカセットを含有しているプラスミドは，細胞質において効率的に転写されるであろう(Elroy-Stein & Moss, 1990（上記）)。
【０３７６】
マウスのL9繊維芽細胞系(PST7-1;Elroy-Stein and Moss, 1990（上記）)の単層を〜5 x 105 cells/wellの率で6-ウエル板で成長させた。細胞に，リン酸カルシウム-DNA沈殿法を使って環状プラスミド(5 μg/well)を移入した(Maniatis et al., 1982（上記）)。細胞は，4Mイソチオシアン酸グアナジニウム，25 mMクエン酸ナトリウム(pH 7.0)，0.5%サルコシル(Chomczynski and  Sacchi, 1987 Anal.Biochem. 162, 156)，及び50 mM EDTA pH 8.0を含有している標準の溶解緩衝液(200 μl/well)を付加して溶解させた(4時間ポストトランスフェクション)。ライゼートを水飽和フェノールで一回，続いてクロロホルム：イソアミルアルコール(25:1)で一回抽出した。細胞のRNA全部を同量のイソプロパノールで沈殿させた。RNAペレットを0.2Mの酢酸アンモニウムに再懸濁しそしてエタノールで再沈殿させた。次いで，そのペレットを70%エタノールで洗浄し，DEPC処理水に再懸濁した。  精製した細胞RNA(3 μg/反応)は，Mg2+の欠失で，90℃で2分間加熱し，次いで氷上で少なくとも15分間スナップ冷却することにより，5'末端標識DNAプライマー(100 pmol)の存在で，先ず変性した。このプロトコルは，その相補的RNA配列に適するプライマーの効率的アニーリングを見越している。そのプライマーは，50 mM Tris.HCl pH 8.3; 10 mM DTT; 75 mM KCl; 1mM MgCl2; 1 mM 各dNTPを含有する緩衝液中のSuperscript II 逆転写酵素(8 U/μl; BRL)を使って拡張した。拡張反応は，42℃で10分間実施した。反応は，同量の2xホルムアミドゲル充填緩衝液を加えて終了させ，砕いたドライアイス上で凍結した。試料を10%ポリアクリルアミド・シーケンスゲルで溶解した。プライマーの配列は次の通り：HH プライマー，5'-CTCCAGTTTCGAGCTTT-3'; HDV プライマー，5'-AAGTAGCCGAGGTCGGACC-3'; HP プライマー，5'-ACCAGGTAATATACCACAAC-3'。
【０３７７】
図29に示すように，全長RNA前駆体と3'切断生成物に対応する特定のバンドは，自己作用カセットを移入した細胞から検出した。3つの構造全ては，転写的に活性であることに加えて，OST7-1細胞の細胞質で効率的に自己作用すると思われる。特に，HHとHP(GC)構造は，95%を上回るところまで自己作用する。OST7-1細胞において自己作用する全範囲は，生体外で自己作用する範囲に厳密に類似していると思われる(図29"In Vitro ＋ MgCl2" vs."Cellular")。
【０３７８】
生体外自己作用の結果と一致して，HP(GU)カセットは，OST7-1細胞においてほぼ50%まで自己作用した。予想されるように，HH（突然変異体）カセットを含有しているプラスミドの移入によって，検出可能な切断生成物を何らもたない全長RNAに対応するプライマー拡張生成物が生じた(図29)。後者の結果によって強力に示唆されることは，3'切断生成物に対応するプライマー拡張バンドは逆転写の人工物ではないということである。
【０３７９】
出願人は，RNAの自己作用は，細胞溶解中，RNA分離ちゅう及び／又はプライマー拡張検定中に生ずるかも知れないと云う可能性に関与した。この可能性を排除するために2つの予防策が講じられた。先ず，溶解緩衝液に50 mM EDTAを含めた。EDTAは，リボザイム活性に必要とされるMg2+及びCa2+のような二価金属イオンの強力なキレート剤である。それ故，二価金属イオンは，細胞溶解に続く自己作用RNAには利用できない。第二の予防策には，プライマー拡張検定に，作用リボザイムの本質的領域にハイブリッド形成するよう設計されたプライマーを使うことが含まれる。これらのプライマーの結合で，触媒活性に本質的な立体配座への3'シス-作用リボザイムの折り込みが防止されることになろう。
【０３８０】
RNA作成中もしくはプライマー拡張分析中の何れかに自己作用が生じている可能性をさらに排除するため，2つの実験を実施した。最初の実験には，細胞溶解後，非移入OST-7ライゼートに加えられたRNA前駆体に関するプライマー拡張分析が含まれる。従って，溶解後ある点で自己作用が生じている時だけ切断生成物が検出される。全長RNA前駆体は，自己作用反応に要求される遊離Mg2+を排除する試みで低濃度のMg2+(5 mM)と高濃度のNTP(全体で12 mM)の条件下で転写することにより作成した(Michel et al. 1992 Genes & Dev. 6, 1373)。全長RNA前駆体はゲルー精製し，既知量を非移入OST-7ライゼートに付加した。RNAをこれらのライゼートから精製し，標準のプライマー拡張分析に先立ちDEPC処理水中で37℃-1時間温置した（図29, in vitro "MgCl2" control)。全ての場合において検出された主要なRNAは，全長RNA前駆体のプライマー拡張生成物に対応するものである。その代わりに，もし，全長前駆体を含有している精製RNAがプライマー拡張分析に先立ち10 mM MgCl2 中に温置されるなら，プライマー拡張分析で検出されるRNAのほとんど又は全ては切断される（図29, in vitro "MgCl2" control)。これらの結果によれば，ここに用いられる標準RNA分離とプライマー拡張プロトコルは，問題のRNAが本質的に自己作用できるとしても，RNAの自己作用にとって有利な環境をもたらさない，ということが示される。
【０３８１】
後処理中の自己作用の欠如を立証する第二の実験では，内部標識RNA前駆体を作成して，先の制御におけるように非移入OST-7ライゼートに付加した。内部標識したRNA前駆体は，RNA精製及び（非標識プライマーの存在で）プライマー拡張反応にかけ，分析して自己作用の範囲を測定した。この分析で，付加された大多数の全長RNAは，RNA分離及びプライマー拡張の全工程中そのまま残った。
【０３８２】
これらの2つの制御実験は，用いられたプロトコルを評価し，且つ，HH，HDV及びHP(GC)のカセットによって触媒される自己作用反応はOST-7細胞の細胞質に生じているという出願人の結論を支持するものである。
【０３８３】
図23〜25における配列は，非限定例のつもりである。当業者は，公知の技術を使えば他の態様も容易に招来できることが分かるであろう。
【０３８４】
加えて，当業者は，上記の諸例を通して，mRNAの二次的構造によって放出リボザイムによる効果的切断ができるようこの発明のベクターを最良に設計する方法についてのガイダンスを出願人が提供していることが分かるであろう。従って，特定の構造が本発明に限定されるものではない。該構造は，上述のように，コンピュータの折りたたみアルゴリズムによるか又は経験によって，前述の二次的構造に関して容易にテストできるものである。その上，該構造によって，少なくとも80%のリボザイム放出が完了でき，このことは，上述のように又は周知の方法で容易に測定できる。即ち，RNAの該二次的構造はどれもリボザイムの放出を20%を越える程まで減らさないということである。
【０３８５】
ＩＶ．ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより発現されたリボザイム
出願人は，ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）に基づくシステムを使用した外来ＲＮＡの産生レベルは，ＲＮＡが確実に，塩基が対になって安定な分子内ステム構造を形成したＲＮＡ分子における５’末端と３’領域を伴って産生されるようにすることによって，顕著に増強できることを確認した。このステム構造は，同じＲＮＡ分子における３’領域のヌクレオチド（少なくとも８塩基）と５’末端の相補的なヌクレオチドの間の水素結合による相互作用（ワトソン・クリック型または非ワトソン・クリック型）によって形成される。
【０３８６】
下に示す実施例は２型ｐｏｌＩＩＩ遺伝子単位に関するものであるが，数々の他のｐｏｌＩＩＩプロモーターシステム，例えばｔＲＮＡ（ホールら，１９８２年，セル２９巻３−５頁），５ＳＲＮＡ（ニールセンら，１９９３年，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ２１巻３６３１−３６３６頁），アデノウイルスＶＡＲＮＡ（フォウクスおよびシェンク，１９８０年，セル２２巻４０５−４１３頁），Ｕ６ｓｎＲＮＡ（グプタおよびレディー，１９９０年，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ１９巻２０７３−２０７５頁），円蓋ＲＮＡ（キッケファーら，１９９３年，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２６８巻７８６３−７８７３頁），テロメラーゼＲＮＡ（ロメロおよびブラックバーン，１９９１年，セル６７巻３４３−３５３頁）なども使用することができる。
【０３８７】
この発明で記載する構築物は，５’および３’終末がヘアピンループに関与するものでさえも，他の構築物より顕著に高いレベルまでＲＮＡを蓄積することが可能である。このような構築物を使用すると，外来ＲＮＡの発現レベルを細胞当たり２０，０００ないし５０，０００コピーに増加することができる。このことは，このような構築物およびこの構築物を暗号化するベクターを，デコイ，治療用編集およびアンチセンスプロトコルにおける使用，ならびにリボザイム生成において，優れたものにする。さらに，この分子は，作用剤または拮抗剤ＲＮＡ類（親和性ＲＮＡ類）として使用することができる。出願人は，一般に，ＲＮＡの５’末端と３’領域の塩基対による分子内相互作用は，高いＲＮＡ蓄積を達成するために２本鎖構造であるべきだと考える。
【０３８８】
すなわち，一つの好ましい実施態様において，この発明はｔＲＮＡ配列および目的とするＲＮＡを含むキメラＲＮＡ分子（例えばｔＲＮＡに基づく分子）の合成に使用するｐｏｌＩＩＩプロモーターシステム（例えば２型システム）を特徴とする。
【０３８９】
下記は，この発明を２型ｐｏｌＩＩＩプロモーターおよびｔＲＮＡ遺伝子を用いて例示している。具体的には，広義の発明を説明するために，下記実施例中のＲＮＡ分子は，２型ｐｏｌＩＩＩプロモーターシステムのＡボックスおよびＢボックスをもち，同じＲＮＡ分子の相補的３’終末または領域の少なくとも８塩基と塩基対を形成し得る５’末端または領域をもつ。これは，具体例として示すものである。当業者は，これが一例にすぎず，他のｐｏｌＩＩＩプロモーターシステムおよび当業界で一般に知られる技術を使用して容易に他の態様を作成しうることが理解できる。
【０３９０】
「末端」は，３’ヒドロキシルまたは５’燐酸または５’キャップ部分で終わるＲＮＡ分子の末端塩基を意味する。「領域」は，塩基対を作る相互作用に関与する末端から延びる３’または５’塩基伸長部を意味する。これは，必ずしもＲＮＡの終末に隣接するものでなくてよい。出願人は，分子の他の終末から多くても約５０塩基，好ましくは僅か２０塩基の領域をもつＲＮＡ分子の少なくとも一端の塩基対形成が，高いレベルで発現され得る有用な分子を提供することを確認した。
【０３９１】
「３’領域」は，同じ分子における５’末端の相補的ヌクレオチドとの間で分子内塩基対を作る相互作用に関与する末端から延びる３’塩基伸長部を意味する。３’領域は，３’末端を含むように設計することができる。それ故，３’領域は，３’末端から延びる≧０個のヌクレオチドである。例えば，この発明で記載する（図４０）Ｓ３５構築物において，３’領域は３’末端から〜４３ｎｔである。これらの例は，限定を意味するものではない。当業者は，当業界で一般に知られる技術を使用して容易に他の態様を作成できることが理解できる。一般に，３’末端の１００塩基以内に３’領域をもつのが好ましい。
【０３９２】
「ｔＲＮＡ分子」は，一般に任意の承認されたｔＲＮＡ遺伝子から由来する２型ｐｏｌＩＩＩ由来ＲＮＡ分子を意味する。当業者は，このような分子を暗号化するＤＮＡは容易に入手できること，およびこのＲＮＡ分子および／またはプロモーターシステムを暗号化するＤＮＡ内の１個以上の塩基を所望に応じて修飾することにより改変し得ることを，容易に理解することができる。常にではないが，一般に，このような分子は当業界で周知の（そしてその例が文献中にみられる）配列からなるＡボックスおよびＢボックスを含む。このようなＡおよびＢボックスは，ｐｏｌＩＩＩの最適な転写に必要なある種の共通配列をもつ。
【０３９３】
「キメラｔＲＮＡ分子」は，ｐｏｌＩＩＩプロモーター（２型）領域を含むＲＮＡ分子を意味する。例えば，キメラｔＲＮＡ分子は，その分子の３’領域と相補的５’末端の間できた分子内塩基対構造を含み，２型ｐｏｌＩＩＩプロモーターボックスの活性に影響しない任意の分子内位置に外来ＲＮＡ配列を含むものであり得る。すなわち，このような外来ＲＮＡは，Ｂボックスの３’終末に，またはＡおよびＢボックス間に，外来ＲＮＡ内または他の位置の適当な位置に移動したＢボックスを備え，ｐｏｌＩＩＩの転写に効果的なようにしたものであり得る。一つの例として，ＲＮＡ分子はリボザイムのステムＩＩ内にある２型ｐｏｌＩＩＩプロモーターのＢボックスをもったハンマーヘッドリボザイムであり得る。２番目の例として，ＢボックスはヘアピンリボザイムのステムＩＶ領域内に存在し得る。このようなＲＮＡ分子の具体例は下に示す。当業者は，これが一例にすぎず，当業界で一般に知られる技術を使用して容易に他の態様を作成しうることが理解できる。
【０３９４】
「目的とするＲＮＡ」分子は，治療，診断または他の始点から有用な任意の外来ＲＮＡ分子を意味する。このような分子は，アンチセンスＲＮＡ，デコイＲＮＡ，酵素ＲＮＡ，治療用編集ＲＮＡならびに作用剤および拮抗剤ＲＮＡを含む。
【０３９５】
「アンチセンスＲＮＡ」は，ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用により他のＲＮＡ（標的ＲＮＡ）に結合し，標的ＲＮＡの活性を改変する，非酵素ＲＮＡ分子を意味する（エグチら，１９９１年，アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー６０巻６３１−６５２頁）。「酵素ＲＮＡ」は，酵素活性をもつＲＮＡ分子を意味する（チェッヘ，１９８８年，ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエーション２６０巻３０３０−３０３５頁）。酵素核酸は（リボザイム）は，まず標的ＲＮＡに結合することにより作用する。このような結合は，標的ＲＮＡを切り離すように働く分子の酵素部位に極めて近接して保持された酵素核酸の標的結合部によって起こる。すなわち，酵素核酸は，まず標的核酸を認識しついで塩基対形成により結合し，正しい部位に結合すると，酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。
【０３９６】
「デコイＲＮＡ」は，リガンドに対する天然結合ドメインを模倣するＲＮＡ分子を意味する。それ故，デコイＲＮＡは，特定リガンド結合の天然結合標的と競合する。例えば，ＨＩＶのトランス活性化応答（ＴＡＲ）ＲＮＡの過剰発現が，デコイとして作用し，ＨＩＶのｔａｔ蛋白と効果的に結合でき，それがＨＩＶのＲＮＡ中に暗号化されたＴＡＲ配列に結合するのを妨げることが示されている（サレンジャー，１９９０年，セル６３巻６０１−６０８頁）。これは具体例として示したものである。当業者は，これが一例にすぎず，当業界で一般に知られる技術を使用して容易に他の態様を作成しうることが理解できる。
【０３９７】
「治療的編集ＲＮＡ」は，細胞標的に結合し，特定塩基の修飾を仲介しうるアンチセンスＲＮＡを意味する。
【０３９８】
「作用剤ＲＮＡ」は，高い親和性で蛋白レセプターに結合し，特定の細胞経路の刺激を起こし得るＲＮＡ分子を意味する。
【０３９９】
「拮抗剤ＲＮＡ」は，細胞蛋白に結合し，その正常な生物学的機能が果たされるのを妨げ得るＲＮＡ分子を意味する（例えば，ツァイら，１９９２年，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ８９巻８８６４−８８６８頁参照）。
【０４００】
別の特徴として，この発明は，上記のＲＮＡ分子を暗号化するベクター，このようなベクターを含む細胞，目的とするＲＮＡの製造法およびこのＲＮＡの製造におけるベクターの使用を含む。
【０４０１】
すなわち，この発明は，目的とする治療用ＲＮＡ部分およびＲＮＡの３’領域と５’末端の相補的ヌクレオチド間で塩基対を形成する相互作用によって生じた分子内ステムを含む，転写した非天然産ＲＮＡを特徴とする。ステムは，好ましくは少なくとも８個の塩基対を含み，さらにそれ以上，例えば１５または１６塩基対を含むことができる。
【０４０２】
好ましい態様において，キメラｔＲＮＡの５’末端は，その≧８ヌクレオチドが３’領域と塩基を形成する相互作用に関与する一次ｔＲＮＡ分子の前駆体分子の一部分を含み；キメラｔＲＮＡはＡおよびＢボックスを含み；Ｂボックスの天然配列３’は除去され，それにより内因性ＲＮＡプロセッシングが妨げられ；目的とするＲＮＡ分子はＢボックスの３’終末にあり；目的とするＲＮＡ分子はＡおよびＢボックスの間にあり；目的とするＲＮＡ分子はＢボックスを含み；目的とするＲＮＡ分子はアンチセンスＲＮＡ，デコイＲＮＡ，治療用編集ＲＮＡ，酵素ＲＮＡならびに作用剤および拮抗剤ＲＮＡの群から選ばれ；分子はＲＮＡの５’末端と同じＲＮＡ内の相補的３’領域間で塩基対を作る相互作用によりもたらされる分子内ステムをもち，また少なくとも８個の塩基対を含み；５’末端は３’領域の少なくとも１５個の塩基と塩基対を作り得る。
【０４０３】
最も好ましい態様において，分子は，ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩに基づくプロモーターシステム，例えば２型ｐｏｌＩＩＩプロモーターシステムにより転写され，０ないし３００個の塩基により隔てられた２型ｐｏｌＩＩＩプロモーターのＡおよびＢボックスをもつ。
【０４０４】
そのほか，関係する特徴として，この発明は，ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターとして機能するＲＮＡを暗号化するベクターの部分をもつ，上記ＲＮＡ分子を暗号化するＲＮＡまたはＤＮＡベクター；またはそのベクターを含む細胞；または上記のようにしてＲＮＡ分子をもつ細胞中にその分子を導入することによる，細胞中に目的とするＲＮＡ分子を供給する方法を，特徴とする。
【０４０５】
ＲＮＡに基づく遺伝子療法手段を有効にするためには，充分な量の治療用ＲＮＡが，処理した細胞の適当な細胞内コンパートメント中に集積しなければならない。集積は，抗ウイルス遺伝子のプロモーターの強さと抗ウイルスＲＮＡの細胞内安定性の両者の関数である。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）に基づく発現システムの両者が，細胞中で治療用ＲＮＡ類を発現させるために使用されてきた（サーバーおよびロッシ，１９９３年，エイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン・レトロウイルシズ９巻４８３−４８７頁；ユーら，１９９３年，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ９０巻６３４０−６３４４頁）。しかし，ｐｏｌＩＩＩに基づく発現カセットは，次の理由から，抗ウイルスＲＮＡ類の発現用として，理論的に魅力が大きかった。ｐｏｌＩＩは，細胞質中に限定して存在するメッセンジャーＲＮＡ類を産生し，他方ｐｏｌＩＩＩは，核と細胞質の両者に存在する機能的ＲＮＡ類を産生する。ｐｏｌＩＩプロモーターは，組織に限定される傾向があるが，他方ｐｏｌＩＩＩ遺伝子は，ｔＲＮＡおよび全ての細胞型における基本的「家政」機能に必要な他の機能的ＲＮＡ類を暗号化する。それ故，ｐｏｌＩＩＩプロモーターは全ての組織型で発現されるように見える。最後に，ｐｏｌＩＩＩは，ｐｏｌＩＩ遺伝子に比較して，所定の遺伝子集積からより大きなレベルにまで転写する。
【０４０６】
治療用ＲＮＡ類の細胞内集積は，使用する遺伝子移入法によっても変わる。例えば，安定な遺伝子移入を得るために現在使用されているレトロウイルスベクターは，標的細胞のゲノムにランダムに組み込む。このランダム組み込みは，個々の細胞を含む大処理細胞集団において種々の移入遺伝子発現をもたらす。それ故，効果を最大にするには，移入遺伝子は，組み込み部位に関係なく，全ての処理細胞集団において治療に使える量の抗ウイルスＲＮＡを発現する能力をもたなければならない。
【０４０７】
ｐｏｌＩＩＩシステム
下記は，限定を意図しないこの発明の一実施例である。ひとｔＲＮＡimet遺伝子から由来しΔ３−５と称されるｐｏｌＩＩＩに基づく遺伝子要素（図３３；アデニイ−ジョーンズら，１９８４年，前掲）は，抗ウイルスＲＮＡ類の発現に適応化されている（サレンジャーら，１９９０年，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー１０巻６５１２−６５２３頁）。この要素を，安定な遺伝子移入のためにＤＣレトロウイルスベクター（サレンジャーら，１９９０年，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー１０巻６５１２−６５２３頁）に挿入し，モロニーマウス白血病ウイルスに対するアンチセンスＲＮＡ類および抗ＨＩＶデコイＲＮＡ類の発現に使用した（サレンジャーら，１９９０年，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー１０巻６５１２−６５２３頁；サレンジャーら，１９９０年，セル６３巻６０１−６０８頁；サレンジャーら，１９９１年，ジャーナル・オブ・ビロロジー６５巻６８１１−１８１６頁；リーら，１９９２年，ザ・ニュー・バイロジスト４巻６６−７４頁）。大集団中に存在する個々の細胞からクローン系を増大させ，細胞中に同様な量の治療用ＲＮＡを発現させた。全ての処理細胞中に治療レベルの治療用ＲＮＡを生ずるベクターシステムの開発は，ＲＮＡに基づく遺伝子療法様式において顕著な進歩を表す。
【０４０８】
出願人は，Δ３−５ベクターシステムを使用してひとＴ細胞系におけるハンマーヘッド（ＨＨＩ）リボザイム（酵素活性をもつＲＮＡ）の発現を試験した（これらの構築物は，「Δ３−５／ＨＨＩ」と称される；図３４）。平均して，リボザイムは，大Ｔ細胞集団中の細胞当たり１００コピー未満を集積したことがわかった。Δ３−５キメラの発現レベルを改良する試みとして，出願人は，転写率を増すために増強したプロモーター要素を含んだ一連の修飾Δ３−５遺伝子単位を作り，構造遺伝子中に挿入してリボザイム転写物の細胞内安定性を改良した（図３４）。Ｓ３５と称されるこのような修飾遺伝子単位の一つは，元のΔ３−５／ＨＨＩベクターシステムに較べて，１００倍以上のリボザイム集積を大Ｔ細胞集団中にもたらした。プールしたＴ細胞集団から得た個々のクローン系中のリボザイム集積は，このベクターの元のΔ３−５／ＨＨＩ型が達成したものの１０ないし１００倍以上にわたっていた。
【０４０９】
Ｓ３５遺伝子単位は，限定されるものではないが，リボザイム，アンチセンス，デコイ，治療用編集物，作用剤および拮抗剤を含む他の治療用ＲＮＡ類の発現に使用することができる。Ｓ３５遺伝子の適用は抗ウイルス療法に限られるものではなく，がんのような治療用ＲＮＡ類が有効であり得る他の疾病にも可能である。Ｓ３５遺伝子単位は，限定するものではないが，アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ；カーター，１９９２年，カレント・オピニオン・イン・ジェネティック・デベロプメント３巻７４頁）のような他の安定な遺伝子移入システムを含む，レトロウイルス以外のベクターシステム，ならびにプラスミド送達およびアデノウイルスベクター（バークナー，１９８８年，バイオ・テクニックス６巻６１８−１２９頁）のような遷移ベクターシステムの関係でも使用し得る。
【０４１０】
上述のように，Ｓ３５ベクターは，ＲＮＡの３’領域が，普通ｔＲＮＡの成熟の際に切り離される５’前駆体部分をもつ５’末端の相補的ヌクレオチドと，塩基対を形成する，ｔＲＮＡの切断型を暗号化している。学説に結びつくものではないが，出願人は，この特徴は観察された発現レベルにとって重要だと考える。すなわち，当業者は今やこのような高い発現レベルをもつ同様なＲＮＡ分子を設計できるのである。下記は，このようなベクターおよびｔＲＮＡ分子を作成できる方法の例を示すものである。
【０４１１】
Δ３−５ベクター
Δ３−５と称される切断型のひとｔＲＮＡimet遺伝子（図３３；アデニイ−ジョーンズら，１９８４年，前掲）を使用するアンチセンスＲＮＡ類およびその後デコイＲＮＡ類の発現推進（サレンジャーら，１９９０年，前掲）は，最近になって報告された。ｔＲＮＡ遺伝子は内部ｐｏｌＩＩＩプロモーターを利用するから，アンチセンスおよびデコイＲＮＡ配列はｔＲＮＡimet配列を含むキメラとして発現される。切断型ｔＲＮＡ遺伝子は，モロニーマウス白血病ウイルスベクターＬＴＲのＵ３領域に入れられた（サレンジャー，１９９０年，前掲）。
【０４１２】
塩基対構造
Δ３−５ベクターの組み合わせがアンチセンスおよびデコイＲＮＡの両者の阻害レベルでの発現に使用できたので，出願人は，治療用リボザイムの発現に対する利用性を探るために，リボザイム暗号化配列（「Δ３−５／ＨＨＩ」と称される）このベクターにクローンした。しかし，このベクターで安定に形質導入されたひとＴ細胞系中では低いリボザイム集積が観察された（図３５）。リボザイムの集積改良を試みるために，出願人は，種々のＲＮＡ構造要素（図３４）をリボザイムキメラの一つ（Δ３−５／ＨＨＩ）に組み込んだ。
【０４１３】
キメラ転写物の末端をエキソヌクレアーゼ分解から保護する試みのために，２種の方策を使用した。一つの方策は，転写物の末端へのステム・ループ構造組み込みを含むものであった。このような構築物２個，すなわち３’終末にステム・ループ構造を含むＳ３，および転写物の両終末にステム・ループ構造を含むＳ５をクローン化した（図３４）。第二の方策は，５’末端と３’終末の配列が安定な塩基対ステムを形成できるように３’末端配列を修飾することを含むものであった。このような構築物２個，すなわち３’終末を５’リーダーおよびｔＲＮＡimetドメインのアクセプターステムとハイブリダイズするように改変したＳ３５，およびＳ３５と同様であるがΔ３−５キメラのひリボザイム部分にさらに大幅の構造を入れたＳ３５プラスを作成した（図３４）。これらのステム・ループ構造は，リボザイムの触媒活性による干渉から保護する構造中で非リボザイム配列を隔離することをも目的とする。このような構築物をクローン化し，産生細胞系を作り，安定に形質導入したひとＭＴ２（ハラダら，１９８５年，前掲）およびＣＥＭ（ナラおよびフィッシンジャー，１９８８年，前掲）細胞系を樹立した（カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，１９９２年，アウスベルら編，ニューヨーク，ワイリー・アンド・ソンズ）。ＲＮＡ配列ならびにＳ３５およびＳ３５プラスの構造を図４０−４７に示す。
【０４１４】
図４８に，この発明のキメラＲＮＡ分子の一般構造を示す。Ｎはそれぞれ独立に塩基対を形成するかしない塩基の有無または数を示す。ＡおよびＢボックスは，所望によるものであり，任意の既知ＡおよびＢボックス，または図に例示する共通配列であることができる。発現すべき目的核酸は分子の任意の位置にあることができるが，ＡおよびＢボックスに隣接するかまたは間に示す位置にあるのが好ましい（矢で示す）。図４９は，目的とするＲＮＡが分子内３’を提供するこのような構造の一例を示す。このような構築物の具体例は，図５０および５１に示す。
【０４１５】
実施例２６：Δ３−５リボザイムキメラのクローン化
少なくとも１５個のヌクレオチドで重なるＳ３５挿入物を暗号化するオリゴヌクレオチドを設計した（５’ＧＡＴＣＣＡＣＴＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＴＴＴＴＴＧＡ３’および５’ＣＧＣＧＴＣＡＡＡＡＡＣＡＧＡＡＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧ３’）。オリゴヌクレオチドを，４０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ８を含有する緩衝液中で５分間煮沸して変性した。オリゴヌクレオチドを氷で１０−１５分間急冷してアニールさせた。
【０４１６】
アニールしたオリゴヌクレオチド混合物を，４０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．５，２０ｍＭＭｇＣｌ2，５０ｍＭＮａＣｌ，４種のデオキシリボヌクレオチド３燐酸各０．５ｍＭ，１０ｍＭＤＴＴを含む緩衝液中で酵素シクエネース（商標）（ユー・エス・バイオケミカルス）を用いて２本鎖分子に変換した。反応は，３７℃で３０分間進行させた。７０℃で１５分間加熱して反応を停止させた。
【０４１７】
２本鎖ＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ（ＢａｍＨＩおよびＭｌｕＩ）で消化して，Δ３−５のクローン化に適する終末を作成した。
【０４１８】
２本鎖挿入ＤＮＡを，６６ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．６，６．６ｍＭＭｇＣｌ2，１０ｍＭＤＴＴ，０．０６６μＭＡＴＰおよび０．１Ｕ／μｌＴ４ＤＮＡリガーゼ（ユー・エス・バイオケミカルス）を含む緩衝液中，室温（約２０℃）で６０分間インキュベートすることにより，Δ３−５ベクターＤＮＡに連結した。
【０４１９】
形質転換能をもつエシエリキア・コリ細菌株を，氷上で６０分間細胞とＤＮＡを混合することにより，組換えベクターＤＮＡで形質転換した。混合物を３７℃で１分間熱ショック処理した。反応混合物をＬＢ培地で希釈し，細胞を３７℃で６０分間回収した。細胞をＬＢ寒天板上におき，３７℃で〜１８時間インキュベートした。
【０４２０】
プラスミドＤＮＡを，標準手法により組換えクローンの一夜培養から分離した（アウスベルら，カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，１９９０年，ニューヨーク，ワイリー・アンド・ソンズ）。
【０４２１】
クローンの同一性は，シクエネース（商標）ＤＮＡ配列決定キット（ユー・エス・バイオケミカルス）を用いてプラスミドＤＮＡを配列決定することにより確認した。
【０４２２】
得られた組換えΔ３−５ベクターは，Ｓ３５配列を含んでいる。ＨＨＩを暗号化するＤＮＡを，ＳａｃＩＩおよびＢａｍＨＩを用いてこのΔ３−５・Ｓ３５含有ベクターにクローン化した。
【０４２３】
実施例２７：ノザーン分析
形質導入したＭＴ２細胞からＲＮＡを抽出し，Δ３−５キメラ転写物の存在をノザーン分析（カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，１９９２年，アウスベルら編，ニューヨーク，ワイリー・アンド・ソンズ）で検索した。ＭＴ２形質導入体から抽出したＲＮＡのノザーン分析は，適当な大きさのΔ３−５／リボザイムキメラが発現されたことを示した（図３５，３６）。さらに，これらの結果は，種々の構築物間の集積の違いを明らかにした（図３５，３６）。Δ３−５／ＨＨＩリボザイムキメラからみられる発現パターンは，Δ３−５ベクターにクローン化した他の１２個のリボザイムと同様であった（図示せず）。ＭＴ２細胞系では，Δ３−５／ＨＨＩリボザイムキメラが，平均して，細胞当たり１００コピー未満集積した。
【０４２４】
Δ３−５／ＨＨＩの３’終末へのステム・ループの付加は，Δ３−５レベルの増加を導かなかった（図３５，３６のＳ３）。５’および３’ステム・ループの両者を含むＳ５構築物も，リボザイムレベルの増加を導かなかった（図３５，３６）。
【０４２５】
興味深いことに，ＭＴ２細胞中におけるＳ３５構築物の発現は元のΔ３−５／ＨＨＩベクター転写物に比べて約１００倍大きかった（図３５，３６）。これは，Ｓ３５転写物の安定性が増加したためかも知れない。
【０４２６】
実施例２８：切断活性
形質導入細胞中で転写されたリボザイムが切断活性を含むか否かを試験するために，形質導入したＭＴ２Ｔ細胞から得た総ＲＮＡ抽出物を，ＨＨＩ切断部位を含む標識した基質とともにインキュベートした（図３７）。Ｓ３５構築物以外の全部のリボザイム活性は，低すぎて検出できなかった。しかし，リボザイム活性はＳ３５形質導入Ｔ細胞ＲＮＡで検出できた。Ｓ３５形質導入ＭＴ２ＲＮＡに見られた活性と，種々の量のインビトロ転写Ｓ５リボザイムキメラが存在するＭＴ２ＲＮＡで見られる活性との比較は，１−３ｎＭのＳ３５リボザイムがＳ３５形質導入ＭＴ２ＲＮＡ中に存在することを示した。この活性レベルは，細胞当たり５，０００−１５，０００リボザイム分子の細胞内濃度に相当する。
【０４２７】
実施例２９：クローンによる変動
大母集団を作る細胞間のリボザイム発現レベルの変動は，バルクのＳ３５形質導入ＣＥＭ細胞株から数種のクローン細胞系を作ることにより測定し（カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，１９９２年，アウスベルら編，ニューヨーク，ワイリー・アンド・ソンズ），個々のクローンにおけるリボザイムの発現および活性レベルを測定した（図３８および３９）。個々のクローンはすべて活性リボザイムを発現することが判った。各クローンで検出されたリボザイム活性は，ノザーン分析で観察された相対的リボザイム量とよく相関した。クローン間の定常リボザイムレベルは，クローンＧの細胞当たり約１，０００分子からクローンＨの細胞当たり１１，０００分子の範囲にわたっていた（図３８）。クローンのリボザイムレベルを平均することにより計算したクローン平均集積は，元の大集団で測定したレベルと正確に等しかった。このことは，個々のクローンが大集団中に存在した変動の代表であることを示唆する。
【０４２８】
１４個のクローン全部がリボザイムを発現したという事実は，大集団中のリボザイムを発現する細胞のパーセントが極めて高いことを示す。さらに，クローン中の最低発現レベルは元のΔ３−５ベクターで形質導入した大細胞集団で見られるものの１０倍以上あった。それ故，Ｓ３５遺伝子単位は，大量の細胞を取り出し，形質導入しついで患者に再導入する遺伝子治療セッティングにおいてより有効である。
【０４２９】
実施例３０：安定性
最後に，Ｇ４１８に抵抗性の多量のＳ３５形質導入系を，リボザイム発現が長期間にわたり安定化否かを調べるために３か月間（Ｇ４１８なしで）増殖させた。この状況は，多量の細胞を形質導入した後患者に再導入し増殖させる診療所の状況をまねたものである。３か月後リボザイム発現の程々の３０％減少が見られた。この違いは，おそらく種々の量でリボザイムを発現し培養中種々の成長速度を示し培養物中で僅かに優勢になる細胞により起こったのであろう。しかし，リボザイム発現は少なくなくともこの期間中明らかに安定であった。
【０４３０】
実施例３１：ＴＲＺ・ｔＲＮＡキメラの設計と構築
Ｓ３５因子を含みＴＲＺと称される転写単位を設計する（図５２）。目的とするＲＮＡ（例えばリボザイム）は，ＴＲＺｔＲＮＡキメラの指示領域に挿入することが出来る。この構築物は，目的とするＲＮＡの安定性を高める可能性がある。限定するもではないが，ＴＲＺ−ＡおよびＴＲＺ−ＢはＴＲＺ・ｔＲＮＡの例である。
【０４３１】
図５３−５４において，部位Ｉを標的とするハンマーヘッドリボザイム（ＨＨＩＴＲＺ−Ａ；図５３）および同じく部位Ｉを標的とするヘアピンリボザイム（ＨＰＩＴＲＺ−Ａ；図５４）を，ＴＲＺｔＲＮＡキメラの指示領域に独立にクローン化した。精製したリボザイム転写物は，全ＲＮＡリボザイム以外に，アンチセンス，治療用編集ＲＮＡ，デコイのような目的とするＲＮＡ類をＴＲＺｔＲＮＡキメラの切断活性を保持していた（例えば図５５）。出願人は，これらＴＲＺｔＲＮＡキメラの効果的な発現が哺乳類細胞中で達成しうることを示した。
【０４３２】
リボザイム以外に，アンチセンス，治療用編集ＲＮＡ，デコイのような目的とするＲＮＡ類をＴＲＺｔＲＮＡキメラの指示領域に挿入して，哺乳類細胞中で治療レベルのＲＮＡ発現を達成することが出来る。
【０４３３】
図４０−４７および５０−５４に挙げた配列は，限定を意図しない例を示すものである。当業者は，当業界で一般に知られる技術を使用して上記例の変形（変異，挿入および欠失）を容易に作成でき，それらがこの発明の範囲内にあることを理解できる。
【０４３４】
実施例３２：Ｔ細胞系中でのリボザイム発現
レトロウイルスまたはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）に基づくリボザイム発現ベクターで安定に形質導入されたＴ細胞系におけるリボザイムの発現（図５６）。ひとＴ細胞系ＭＴ２およびＣＥＭを，ネオマイシン選択マーカーおよびｐｏｌＩＩＩｍｅｔiｔＲＮＡ誘導プロモーターから発現されるリボザイム（Ｓ３５／ＨＨＩ）を暗号化しているレトロウイルスまたはＡＡＶベクターで形質導入した。ベクターで安定に形質導入された細胞を，ネオマイシン系抗生物質誘導体Ｇ４１８（０．７ｍｇ／ｍｌ）を含む培地で選択的に増殖させた。安定な細胞系中のリボザイム発現をノザーン分析で分析した。リボザイム転写物の検出に用いたプローブはひとｍｅｔiｔＲＮＡ配列とも交差ハイブリダイズした。図５６において，Ｓ３５／ＨＨＩＲＮＡは，レトロウイルスまたはＡＡＶベクターで形質導入したＭＴ２およびＣＥＭ中に顕著なレベルで集積した。
【０４３５】
これらは限定を意図しない例を示すものでり，。当業者は，当業界で一般に知られる技術を使用して，アデノウイルスベクター（図５７），プラスミドＤＮＡベクター，アルファウイルスベクターおよびそれらの他の誘導体のような他のベクターを容易に作成でき，それらがこの発明の範囲内にあることを理解できる。さらに，転写単位はｐｏｌＩＩおよび／またはｐｏｌＩＩＩプロモーターを使用して個別にまたは多重に発現させることが出来る。
【０４３６】
ここに引用した参照資料，並びにドレイパーのＷＯ９３／２３５６９，９４／０２４９５，９４／０６３３１，サレンジャーのＷＯ９３／１２６５７，トムスンのＷＯ９３／０４５７３およびサリバンのＷＯ９４／０４６０９，９３／１１２５３は，ここに記載したベクターの使用法を記載し，引用することによってここに包含させる。特に，これらのベクターはアンチセンスおよびデコイＲＮＡ分子の投与に有用である。
【０４３７】
実施例３３：連結したリボザイムは触媒活性をもつ
ドレイパーのＷＯ９３／２３５６９に記載された連結法で作ったリボザイムの標的ＲＮＡを切断する能力は，対応基質ＲＮＡ（図５８）または長い（６２２ｎｔ）ＲＮＡ（図５９，６０および６１）で試験した。
【０４３８】
対応基質ＲＮＡは，こ相ＲＮＡ合成技術を用いて化学的に合成した（スカリンジャら，１９９０年，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ１８巻５４３３−５４４１頁）。基質ＲＮＡを，［γ−32Ｐ］ＡＴＰとポリヌクレオチドキナーゼ（カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，１９９２年，アウスベルら編，ニューヨーク，ワイリー・アンド・ソンズ）を用いて５’末端を標識した。リボザイム反応を，リボザイム過剰条件下に行った（ｋcat／ＫM；ヘルシュラクおよびツェッヘ，１９９０年，バイオケミストリー２９巻１０１５９−１０１７１頁）。略述すると，リボザイムと基質ＲＮＡを，５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．５，および１０ｍＭＭｇＣｌ2を含む緩衝液中で，９０℃に加熱し氷上で１０分間急冷することにより，別々に変性し復元した。切断反応は，リボザイムを基質と３７℃で混合することにより開始した。規則的時間間隔で５μｌの試料を取り出し，等容量のホルムアミドゲルロード緩衝液（カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，１９９２年，アウスベルら編，ニューヨーク，ワイリー・アンド・ソンズ）と混合して反応を停止させた。試料を２０％ポリアクリルアミド尿素ゲル上で分割した。図５８において，−ΔＧはリボザイムと基質ＲＮＡ間の塩基対形成相互作用について計算した結合の自由エネルギーである（ターナーおよびスギモト，１９８８年，前掲）。ＲＰＩＡは，６／６結合手をもつＨＨリボザイムである。このリボザイムは，１本のリボザイムとして化学的に合成するか，または２個の断片として合成しついで連結して１本のリボザイムとした。２種のリボザイムに対するｋcat／ＫM値は同等であった。
【０４３９】
６２２ｎｔの長い標的配列のＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター上流を含む鋳型を，ＤＮＡクローンからＰＣＲ増幅した。標的ＲＮＡ（ＨＨリボザイム切断部位Ｂ，ＣおよびＤを含む）を，このＰＣＲ増幅鋳型からＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して転写した。転写物を転写中に４種のリボヌクレオチド３燐酸の１種として［α−32Ｐ］ＣＴＰを含めることにより標識した。３７℃で２時間転写後，転写混合物を，ＤＮアーゼ１で処理して転写に使用したＤＮＡ鋳型を消化除去した。ＲＮＡをイソプロパノールで沈殿させ，ペレットを７０％エタノールで２回洗浄し塩と転写反応に使用したヌクレオチドを除去した。ＲＮＡをＤＥＰＣ処理水に再懸濁し，４℃で保存した。リボザイム切断反応は，リボザイム過剰条件下に行った［ｋcat／ＫM；ヘルシュラクおよびセッヘ，１９９０年，前掲］。略述すると，１０００ｎＭリボザイムと１０ｎＭ内部標識標的ＲＮＡを，５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．５，および１０ｍＭＭｇＣｌ2の存在下に，９０℃に２分間加熱することにより，別々に変性した。ＲＮＡを３７℃に１０−２０分間冷却して復元した。切断反応は，リボザイムを標的ＲＮＡと３７℃で混合することにより開始した。規則的時間間隔で５μｌの試料を取り出し，等容量の停止緩衝液を加えて反応を停止させた。試料を，配列決定ゲル上で分割した。
【０４４０】
実施例３４：≧２塩基対ステムＩＩをもつハンマーヘッドリボザイムは触媒活性をもつ
ＲＮＡ化学合成のコストを減少するために，出願人は，代表的ハンマーヘッドリボザイム（≧４ｂｐステムＩＩ）のステムＩＩ領域の長さを，ＨＨリボザイムの触媒効果を減らさずに短縮できるかどうかに興味をもった。ステムＩＩの長さを，１回１塩基対づつ系統的に短縮した。３および２個の塩基対ステムＩＩをもつＨＨリボザイムを，固相ＲＮＡホスホルアミダイト技術を用いて化学的に合成した（スカリンジェら，１９９０年，前掲）。
【０４４１】
対応および長い基質ＲＮＡを合成し，リボザイムアッセイを実施例３３記載のように行った。図６２，６３および６４において，データは，ハンマーヘッドリボザイムのステムＩＩの短縮は触媒効果を大きく変えないことを示す。出願人の意見では，≧２塩基対ステムＩＩ領域をもつはんまーヘッドリボザイムは触媒活性をもつ。
【０４４２】
実施例３５：触媒活性をもつヘアピンリボザイムの合成
５’および３’断片の両者につき図６５に示すヌクレオチド塩基配列をもつＲＮＡ分子を化学的に合成した。３’断片は，燐酸化し，基本的に実施例３７に記載するように５’断片に連結した。図６５から明らかなように，３’および５’断片はヘリックス４でハイブリダイズすることができ，ＧＡＡＡ配列を介して共有結合で連結した。この構造が基質にハイブリダイズすると，リボザイム・基質複合体構造ができる。ヘリックス４は３塩基対で示したが，１または２塩基対のみで作ってもよい。
【０４４３】
連結したリボザイムの４０ｎＭ混合物を，１−５ｎＭ５’終末標識対応基質（ＲＮＡホスホルアミダイト技術を用いて固相合成法で化学合成）と５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭＭｇＣｌ2中で種々の時間インキュベートすると，効率的に基質を切断することを示した（図６６）。
【０４４４】
図６２および６５に示す標的およびリボザイム配列は，限定を意図しない例を示すものである。当業者は，当業界で一般に知られる他の配列および技術を使用して別の態様を容易に作成しうることを理解できる。
【０４４５】
Ｖ．ヘアピンリボザイムの構築
以下に，別の基質核酸の５’領域と塩基対を形成するためにリボザイム中に新しいヘリックス（すなわち，別の一本鎖核酸と２本鎖領域を作りうる配列）を備えた改良トランス切断ヘアピンリボザイムを示す。このヘリックスは，図３に示すヘリックス３の後ろのリボザイム３’終末に備えられる。さらに，少なくとも２個の余分な塩基をヘリックス２に備えることができ，ヘリックス２に対応する基質部分は，ヘアピンの３’終末に水素結合できる５’部分に直接連結されるか，または少なくとも１塩基のリンカーを有しうる。トランス切断は，リボザイムが，リボザイム自身に共有結合されていない別のＲＮＡ分子をトランスに切断することを意味する。すなわち，リボザイムは分子内切断反応で自身に作用することはできない。
【０４４６】
「塩基対」は，従来のワトソン・クリックまたは他の非従来型（例えばフーグスティーン型）相互作用により，他のＲＮＡ配列と水素結合を形成しうる核酸を意味する。
【０４４７】
ヘアピンリボザイム（ヘリックス５をもつかもたない）のヘリックス２の長さの増加はいくつかの利点をもたらす。これには，インビボにおけるリボザイム・標的複合体の安定性が含まれる。さらに，ヘアピンリボザイムの認識配列の増加は，リボザイムの特異性を改良する。これはまた，隣接する２次構造のため接近できない筈の潜在的ヘアピンリボザイム部位の標的化を可能にする。
【０４４８】
ヘアピンリボザイム（ヘリックス５をもつかもたない）のヘリックス２の長さの増加はリボザイム触媒トランス連結反応を増強する。普通のヘパリンリボザイム（４ｂｐのヘリックス２をもつ）に触媒されるトランス連結反応は極めて効果的である（コマツら，１９９３年，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ２１巻１８５頁）。これは，基質ＲＮＡとリボザイム間の弱い塩基対形成相互作用に帰せられる。ヘリックス２（ヘリックス５をもつかもたない）の長さを増加することにより，（インビトロおよびインビボ）連結速度が数倍増加する。
【０４４９】
実験結果は，ヘパリンリボザイムの活性を顕著に減少することなく，Ｈ２の長さを６ｂｐになし得ることを示唆する。Ｈ２の腕の長さの変化は，配列依存性でないようである。６ｂｐのＨ２をもつＨＰリボザイムを，５種の異なる標的ＲＮＡに対して設計したところ，５種のリボザイム全部が，その同型標的ＲＮＡを効果的に切断した。さらに，これらリボザイムの２種は，哺乳類細胞で遺伝子発現（例えばＴＮＦ−α）を阻害することができた。この実験の結果を下に示す。
【０４５０】
７および８ｂｐのＨ２をもつＨＰリボザイムは，標的ＲＮＡを配列特異的に切断することができるが，切断反応の速度は６ｂｐのＨ２をもつＨＰリボザイム触媒の場合より遅い。
【０４５１】
実施例３６：４および６塩基対のＨ２
図６７ー７２において，ＨＰリボザイムは上記のように合成し，活性を試験した。驚いたことに，Ｈ２に６塩基対をもつものは４塩基対のものと同様な活性であった。
【０４５２】
ＶＩ．化学的修飾
５’−Ｃ−アルキル基をもつオリゴヌクレオチド
ヌクレオシドまたはヌクレオチドの等の５’位へのアルキル基の導入は，糖部分への新たなキラル中心導入を招く。図７５に，Ｄ−アロース２およびＬ−タロース３糖族に属する５’−Ｃ−アルキルヌクレオチドの一般構造を示す。族名は，既知の糖であるＤ−アロースおよびＬ−タロース（図７５において，２および３のＲ1＝ＣＨ3）に由来する。有用な具体的Ｄ−アロースおよびＬ−タロースヌクレオチド誘導体は，図７６の２９−３２および図７７の５８−６１にそれぞれ示す。
【０４５３】
この発明は，ＲＮＡまたは１本鎖ＤＮＡの酵素的切断に特に有用なオリゴヌクレオチドにおける，およびアンチセンスオリゴヌクレオチドとしての，５’−Ｃアルキルヌクレオチドの使用に関するものである。本願で使用する用語として，５’−Ｃ−アルキルヌクレオチド含有酵素核酸は，限定されるものではないが，２本鎖ステム，１本鎖「触媒コア」配列，１本鎖ループまたは１本鎖認識配列を置換する５’−Ｃ−アルキルヌクレオチドを含む触媒的核酸性分子である。この分子は，ヌクレオチド塩基配列特異的に，別のＲＮＡまたはＤＮＡ分子を切断（好ましくは反復切断）することができる。このような触媒的核酸は，目的とするならば分子内切断の作用もある。このような酵素分子は，殆どすべてのＲＮＡ転写物を標的化することができる。
【０４５４】
またこの発明には，酵素核酸またはさらにアンチセンスヌクレオチド中に存在しうる５’−Ｃ−アルキルヌクレオチドが含まれる。このような核酸は，アンチセンスまたは酵素分子の安定性を増し，目的とする分子の活性に影響しない位置で使用しうるので，有用である。すなわち，５’−アルキル基の存在はこの修飾を含むオリゴヌクレオチドの結合親和性を減少するかも知れないが，その部分が必須の塩基対形成領域でないならば，分子に供給する強い安定性は有利である。さらに，結合性の減少は酵素活性を減少させるが，安定性の増加は活性低下の重要性を減らす。例えば，５’−Ｃ−アルキル含有分子が被修飾分子の１０％の活性をもち，インビボで１０倍安定性が高ければ，この発明で有用性をもつ。同様の分析は，この修飾をもつアンチセンスオリゴヌクレオチドについてもいえる。この発明はまた，このようなヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド（その例は図に示す）の合成に有用な新規中間体およびその合成法にも関するものである。
【０４５５】
すなわち，一つの特徴において，この発明は，糖分子の５’位にアルキル部分を有するヌクレオチド塩基である５’−Ｃ−アルキルヌクレオシドを特徴とする。関連する特徴として，この発明はまた，５’−Ｃ−アルキルヌクレオチドを特徴とし，好ましい態様としてヌクレオチドがウリジンまたはチミジンでないものを特徴とする。すなわち，この発明は，好ましくは，上で検討した文献に記載されていない酵素核酸またはアンチセンス分子の製造に有用なヌクレオチドを含む。好ましい態様において，ヌクレオシドまたはヌクレオチドの糖は，タロースまたはアロースの糖として光学的純粋である。
【０４５６】
この発明に有用な種々のアルキル基の例は，図７５中Ｒ１が任意のアルキルのものとして示す。これらの例は，この発明を限定するものではない。具体的には，「アルキル」基は，飽和脂肪族炭化水素であり，直鎖，分枝鎖および環状鎖アルキル基を含む。好ましくは，アルキル基は１−１２個の炭素原子を有する。さらに好ましくは，炭素数１−７，さらには１−４の低級アルキル基である。アルキル基は，置換されてもされなくてもよい。置換された場合，置換基（群）は好ましくはヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ2またはＮ（ＣＨ3）2，アミノまたはＳＨである。この語はまた，少なくとも１個の炭素・炭素２重結合を含む不飽和炭化水素であるアルケニル基を含み，直鎖，分枝鎖および環状の基を含む。好ましくは，アルケニル基は１−１２個の炭素原子を有する。さらに好ましくは，炭素数１−７，さらには１−４の低級アルケニル基である。アルケニル基は，置換されてもされなくてもよい。置換された場合，置換基（群）は好ましくはヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ2，ハロゲン，Ｎ（ＣＨ3）2，アミノまたはＳＨである。「アルキル」の語はまた，少なくとも１個の炭素・炭素３重結合を含む不飽和炭化水素を有するアルキニル基を含み，直鎖，分枝鎖および環状の基を含む。好ましくは，アルキニル基は１−１２個の炭素原子を有する。さらに好ましくは，炭素数１−７，さらには１−４の低級アルキニル基である。アルキニル基は，置換されてもされなくてもよい。置換された場合，置換基（群）は好ましくはヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ2またはＮ（ＣＨ3）2，アミノまたはＳＨである。
【０４５７】
このようなアルキル基はまた，アリール，アルキルアリール，炭素環アリール，複素環アリール，アミドおよびエステル基を含むことができる。「アリール」基は，共役π電子系を有する少なくとも一つの環をもち，炭素環アリール，複素環アリールおよびビアリール基を含む芳香族基であり，これらはすべて所望により置換されていてもよい。アリル基の好ましい置換基は，ハロゲン，トリハロメチル，ヒドロキシル，ＳＨ，ＯＨ，シアノ，アルコキシ，アルキル，アルケニル，アルキニルおよびアミノ基である。「アルキルアリール」基は，（上記の）アリール基に共役結合した（上記の）アルキル基である。炭素環アリール基は，芳香環の環原子がすべて炭素原子の基である。炭素原子は所望により置換されていてもよい。複素環アリール基は，芳香環の環原子として１−３個のヘテロ原子を有し，環原子の残りが炭素原子である基である。適当なヘテロ原子としては，酸素，硫黄および窒素が含まれ，これはフラニル，チエニル，ピリジル，ピロリル，Ｎ−低級アルキルピロロ，ピリミジル，ピラジニル，イミダゾリル等を含み，これらはすべて所望により置換されていてもよい。「アミド」は，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒであり，ここでＲはアルキル，アリール，アルキルアリールまたは水素である。「エステル」は，−Ｃ（Ｏ）−ＯＲであり，ここでＲはアルキル，アリール，アルキルアリールまたは水素である。
【０４５８】
別の態様として，上記の検討に関連するが，この発明は，１個以上の５’−Ｃアルキルヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド，例えば５’−Ｃ−アルキルヌクレオチドを有する酵素核酸，および５’位にアルキル基を有するヌクレオチドを少なくとも１個有する酵素分子を形成することによるＲＮＡまたは１本鎖ＤＮＡ分子切断の高い活性をもつ酵素核酸分子の製造法を特徴とする。別の関連した態様として，この発明は，５’−Ｃ−アルキルヌクレオチドトリ燐酸を特徴とする。これらのトリ燐酸は，標準的手法によりこの発明の有用なオリゴヌクレオチドを形成するために使用される。
【０４５９】
この発明の５’−Ｃ−アルキル誘導体は，それを含むオリゴヌクレオチドに高い安定性を与える。これらはインビトロアッセイで絶対還元活性が減少するが，インビボで高い総活性を与える。下に，このような分子が有用であることを明らかにするアッセイ法を示す。当業者には，均等なアッセイが容易に考案できることがわかる。
【０４６０】
別の特徴として，この発明は，保護されたアロ糖を保護されたタロ糖に変換する方法を特徴とする。この方法では，保護されたアロ糖をトリフェニルホスフィン，ジエチルアゾジカルボキシレートおよびｐ−ニトロ安息香酸と反転生起条件下に接触させ，保護されたタロ糖を得る。このような条件の一例を下に示すが，当業者は他の同様な条件を認識できる。出願人は，このような変換が，図に例示するようにすべての型のヌクレオチド塩基の容易な合成を可能にすることを発見した。
【０４６１】
この発明はすべてのオリゴヌクレオチドに適用できるが，出願人は，この発明の修飾分子が特に酵素ＲＮＡ分子に有用であることを発見した。すなわち，下に示すのはこのような分子の例である。当業者は，他のこのような酵素活性のない分子の製造に均等な方法を用いうることがわかる。具体的に述べると，図１はハンマーヘッドリボザイムの種々のヌクレオチドの番号付けを示す，ハンマーヘッド型に対する塩基の番号付けである。これは，図が請求の範囲に対する先行技術であること，または検討した技術が請求の範囲に対する先行技術であることの指標とされるべきでない。図１において，触媒コアの５’から３’方向のハンマーヘッドリボザイムの好ましい配列は，ＣＧＡＡＡ［と塩基対を作る］ＣＵＧＡＮＧＡＧである。この発明では，触媒活性を維持しまたは高める５’−Ｃ−アルキル置換ヌクレオチドおよびまたはハンマーヘッドリボザイムのヌクレアーゼ抵抗性を記載する。図７５に示す任意の修飾ヌクレオチドによる任意のヌクレオチドの置換が可能である。
【０４６２】
以下に示すのは，５’−Ｃ−アルキル置換ホスホルアミダイトを用いた核酸の合成法およびアミダイトの合成法の，限定を意図しない例である。
【０４６３】
実施例３７：５’−Ｃ−アルキルヌクレオチドおよび他の修飾ヌクレオチドを含むハンマーヘッドリボザイムの合成
この合成法は，エヌ・ウスマン，ケイ・ケイ・オギルビー，エム・ワイ・ジアング，アール・ジェイ・セダーグレン，ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ，１９８７年，１０９巻７８４５−７８５４頁およびエス・エイ・スカリンジ，シー・フランクリン，エヌ・ウスマン，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，１９９０年，１８巻５４３３−５４４１頁に記載された普通のＲＮＡの合成法にしたがうもので，５’終末のジメトキシトリチル，３’終末のホスホルアミダイトのような一般的核酸保護および縮合基を利用するものである（化合物２６−２９および５６−５９）。これらの５’ーＣーアルキル置換ホスホルアミダイトは，ハンマーヘッドリボザイムだけでなく，ヘアピン，ヘパチチス・デルタウイルス，１群または２群イントロン触媒核酸またはアンチセンスオリゴヌクレオチドにも組み込むことができる。それ故これらは，任意の核酸構造に一般的に使用される。
【０４６４】
実施例３８：メチル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−６−デオキシ−β−Ｄ−アロフラノシド（４）
Ｌ−ラムノース（１００ｇ，０．５５ｍｏｌ），ＣｕＳＯ4（１２０ｇ）および濃Ｈ2ＳＯ4（４．０ｍｌ）の乾燥アセトン１．０Ｌ中懸濁液を，室温で２４時間攪拌し，濾過した。濃ＮＨ4ＯＨ（５ｍｌ）を濾液に加え，新たに生じた沈殿を濾過した。残留物を真空濃縮し，ピリジン（２×３００ｍｌ）と同時蒸発させ，ピリジン（５００ｍｌ）にとかし，０℃に冷却した。ｐ−トルエンスルホニルクロリド（１０７ｇ，０．５６ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＣＥ（５００ｍｌ）溶液を，０．５時間を要して滴下した。反応混合物を，室温で１６時間放置した。氷水（０．５Ｌ）を加えて反応を停止させ，０．５時間攪拌後，クロロホルム（０．７５ｍｌ）で抽出した。有機層をＨ2Ｏ（２×５００ｍｌ），１０％Ｈ2ＳＯ4（２×３００ｍｌ），水（２×３００ｍｌ），飽和ＮａＨＣＯ3（２×３００ｍｌ），食塩水（２×３００ｍｌ）で洗浄し，ＭｇＳＯ4で乾燥し，蒸発乾固した。残留物（１１５ｇ）を乾燥ＭｅＯＨ（１Ｌ）にとかし，ＮａＯＭｅ（２３．２ｇ，０．４２ｍｍｏｌ）とＭｅＯＨ中で処理した。反応混合物を２０℃で１６時間放置し，乾燥ＣＯ2で中和し，蒸発乾固した。残留物をクロロホルム（７５０ｍｌ）に懸濁し，濾過し，１００ｍｌまで濃縮し，クロロホルム中でフラッシュクロマトグラフィーにより精製して，４５ｇ（３７％）の化合物４を得た。
【０４６５】
実施例３９：メチル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５−０−ｔ−ブチルジフェニルシリル−６−デオキシ−β−Ｄ−アロフラノシド（５）
メチルフラノシド４（１２．５ｇ，６２．２ｍｍｏｌ）およびＡｇＮＯ3（２１．２５ｇ，１２５．０ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（３００ｍｌ）溶液に，ｔ−ブチルジフェニルシリルクロリド（２２．２ｇ，８１ｍｍｏｌ）を，Ａｒ中０．５時間を要して滴下した。反応混合物を室温で４時間攪拌し，ＣＨＣｌ3（２００ｍｌ）で希釈し，濾過し，蒸発乾固した（４０℃以下，高度真空油ポンプ使用）。残留物をＣＨ2Ｃｌ2（３００ｍｌ）にとかし，ＭｇＳＯ4で乾燥し，蒸発乾固した。残留物をＣＨ2Ｃｌ2中でフラッシュクロマトグラフィーにより精製して，２０．０ｇ（７５％）の化合物５を得た。
【０４６６】
実施例４０：メチル−５−０−ｔ−ブチルジフェニルシリル−６−デオキシ−β−Ｄ−アロフラノシド（６）
メチルフラノシド５（１３．５ｇ，３０．６ｍｍｏｌ）をＣＦ3ＣＯＯＨ：ジオキサン：Ｈ2Ｏ／２：１：１（ｖ／ｖ／ｖ，２００ｍｌ）にとかし，２４℃で４５分間攪拌した。反応混合物を−１０℃に冷却し，濃ＮＨ4ＯＨ（１４０ｍｌ）で中和し，ＣＨ2Ｃｌ2（５００ｍｌ）で抽出した。有機層を分離し，飽和ＮａＨＣＯ3（２×７５ｍｌ），食塩水（２×７５ｍｌ）で洗浄し，ＭｇＳＯ4で乾燥し，蒸発乾固した。生成物６をＣＨ2Ｃｌ2中０−１０％ＭｅＯＨの勾配を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量９．０ｇ（７６％）。
【０４６７】
実施例４１：メチル−２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−５−０−ｔ−ブチルジフェニルシリル−６−デオキシ−β−Ｄ−アロフラノシド（７）
メチルフラノシド６（７．０ｇ，１７．５ｍｍｏｌ）をピリジン（２×１００ｍｌ）と同時蒸発させ，ピリジン（１００ｍｌ）にとかした。塩化ベンゾイル（５．４ｇ，３８．５ｍｍｏｌ）を加え，反応混合物を室温で１６時間放置した。乾燥ＥｔＯＨ（５０ｍｌ）を加え，０．５時間後反応混合物を蒸発乾固した。残留物をＣＨ2Ｃｌ2（３００ｍｌ）にとかし，飽和ＮａＨＣＯ3（２×７５ｍｌ），食塩水（２×７５ｍｌ）で洗浄し，ＭｇＳＯ4で乾燥し，蒸発乾固した。生成物をＣＨ2Ｃｌ2中でフラッシュクロマトグラフィーにより精製して，９．５ｇ（８９％）の化合物７を得た。
【０４６８】
実施例４２：１−Ｏ−アセチル−２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−５−０−ｔ−ブチルジフェニルシリル−６−デオキシ−β−Ｄ−アロフラノース（８）
ジベンゾエート７（４．７ｇ，７．７ｍｍｏｌ）をＡｃＯＨ（１０．０ｍｌ），Ａｃ2Ｏ（２０．０ｍｌ）およびＥｔＯＡｃ（３０ｍｌ）の混合物にとかし，反応混合物を０℃に冷却した。９８％Ｈ2ＳＯ4（０．１５ｍｌ）を加えた。反応混合物を０℃に１６時間保ち，飽和ＮａＨＣＯ3とＥｔＯＡｃの１：１冷混合物（１５０ｍｌ）中に注いだ。０．５時間激しく攪拌したのち，有機層を分離し，飽和ＮａＨＣＯ3（２×７５ｍｌ），食塩水（２×７５ｍｌ）で洗浄し，ＭｇＳＯ4で乾燥し，蒸発乾固し，トルエン（２×５０ｍｌ）と同時蒸発させた。生成物をＣＨ2Ｃｌ2中０−５％ＭｅＯＨの勾配を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量４．０ｇ（αおよびβ異性体混合物として８２％）。
【０４６９】
実施例４３：１−（２’，３’−ジ−Ｏ−ベンゾイル−５’−０−ｔ−ブチルジフェニルシリル−６’−デオキシ−β−Ｄ−アロフラノシル）ウラシル（９）
ウラシル（１．４４ｇ，１１．５ｍｍｏｌ）を，ヘキサメチルジシラザン（１００ｍｌ）およびピリジン（５０ｍｌ）の混合物に懸濁し，完全に溶けるまで（３時間）およびさらに１時間加熱還流した。反応混合物を室温に冷却し，蒸発乾固し，トルエン（２×５０ｍｌ）と同時蒸発させた。残留物にアセテート８（６．３６ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ3ＣＮ（１００ｍｌ）溶液，ついでＣＦ3ＳＯ3ＳｉＭｅ3（２．８ｇ，１２．６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２４℃で１６時間保ち，３／１容まで濃縮し，１００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2で希釈し，飽和ＮａＨＣＯ3（２×５０ｍｌ），食塩水（２×５０ｍｌ）で抽出し，ＭｇＳＯ4で乾燥し，蒸発乾固した。生成物９をＣＨ2Ｃｌ2中０−５％ＭｅＯＨの勾配を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量５．７ｇ（８０％）。
【０４７０】
実施例４４：Ｎ4−ベンゾイル−１−（２’，３’−ジ−Ｏ−ベンゾイル−５’−０−ｔ−ブチルジフェニルシリル−６’−デオキシ−β−Ｄ−アロフラノシル）シトシン（１０）
Ｎ4−ベンゾイルシトシン（１．８４ｇ，８．５６ｍｍｏｌ）を，ヘキサメチルジシラザン（１００ｍｌ）およびピリジン（５０ｍｌ）の混合物に懸濁し，完全に溶けるまで（３時間）およびさらに１時間加熱還流した。反応混合物を室温に冷却し，蒸発乾固し，トルエン（２×５０ｍｌ）と同時蒸発させた。残留物にアセテート８（３．６ｇ，５．６ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ3ＣＮ（１００ｍｌ）溶液，ついでＣＦ3ＳＯ3ＳｉＭｅ3（４．７６ｇ，２１．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を５時間加熱還流し，室温に冷却し，３／１容まで濃縮し，ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）で希釈し，飽和ＮａＨＣＯ3（２×５０ｍｌ），食塩水（２×５０ｍｌ）で抽出し，ＭｇＳＯ4で乾燥し，蒸発乾固した。ＣＨ2Ｃｌ2中０−５％ＭｅＯＨの勾配を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製し，１．８ｇ（５５％）の化合物１０を得た。
【０４７１】
実施例４５：Ｎ6−ベンゾイル−９−（２’，３’−ジ−Ｏ−ベンゾイル−５’−０−ｔ−ブチルジフェニルシリル−６’−デオキシ−β−Ｄ−アロフラノシル）アデニン（１１）
Ｎ6−ベンゾイルアデニン（２．８６ｇ，１１．８６ｍｍｏｌ）を，ヘキサメチルジシラザン（１００ｍｌ）およびピリジン（５０ｍｌ）の混合物に懸濁し，完全に溶けるまで（７時間）およびさらに１時間加熱還流した。反応混合物を室温に冷却し，蒸発乾固し，トルエン（２×５０ｍｌ）と同時蒸発させた。残留物にアセテート８（３．６ｇ，５．６ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ3ＣＮ（１００ｍｌ）溶液，ついでＣＦ3ＳＯ3ＳｉＭｅ3（６．５９ｇ，２９．７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を８時間加熱還流し，室温に冷却し，３／１容まで濃縮し，ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）で希釈し，飽和ＮａＨＣＯ3（２×５０ｍｌ），食塩水（２×５０ｍｌ）で抽出し，ＭｇＳＯ4で乾燥し，蒸発乾固した。生成物１１をＣＨ2Ｃｌ2中０−５％ＭｅＯＨの勾配を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量２．７ｇ（６０％）。
【０４７２】
実施例４６：Ｎ2−イソブチリル−９−（２’，３’−ジ−Ｏ−ベンゾイル−５’−０−ｔ−ブチルジフェニルシリル−６’−デオキシ−β−Ｄ−アロフラノシル）グアニン（１２）
Ｎ2−イソブチリルグアニン（１．４７ｇ，１１．２ｍｍｏｌ）を，ヘキサメチルジシラザン（１００ｍｌ）およびピリジン（５０ｍｌ）の混合物に懸濁し，完全に溶けるまで（６時間）およびさらに１時間加熱還流した。反応混合物を室温に冷却し，蒸発乾固し，トルエン（２×５０ｍｌ）と同時蒸発させた。残留物にアセテート８（３．４ｇ，５．３ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ3ＣＮ（１００ｍｌ）溶液，ついでＣＦ3ＳＯ3ＳｉＭｅ3（６．２２ｇ，２８．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を８時間加熱還流し，室温に冷却し，３／１容まで濃縮し，ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）で希釈し，飽和ＮａＨＣＯ3（２×５０ｍｌ），食塩水（２×５０ｍｌ）で抽出し，ＭｇＳＯ4で乾燥し，蒸発乾固した。生成物１２をＣＨ2Ｃｌ2中０−２％ＭｅＯＨの勾配を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量２．１ｇ（５４％）。
【０４７３】
実施例４７：Ｎ6−ベンゾイル−９−（２’，３’−ジ−Ｏ−ベンゾイル−６’−デオキシ−β−Ｄ−アロフラノシル）アデニン（１５）
ヌクレオシド１１（１．６５ｇ，２．０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５０ｍｌ）にとかし，ＴＨＦ（４ｍｌ）中ＴＢＡＦの１Ｍ溶液を加えた。反応混合物を室温に４時間保ち，蒸発乾固し，生成物をＣＨ2Ｃｌ2中０−５％ＭｅＯＨの勾配を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製し，１．０ｇ（８５％）の化合物１５を得た。
【０４７４】
実施例４８：Ｎ6−ベンゾイル−９−（２’，３’−ジ−Ｏ−ベンゾイル−５’−０−ジメトキシトリチル−６’−デオキシ−β−Ｄ−アロフラノシル）アデニン（１９）
ヌクレオシド１５（０．５５ｇ，０．９２ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍｌ）に溶解した。ＡｇＮＯ3（０．３４ｇ，２．０ｍｍｏｌ），ジメトキシトリチルクロリド（０．６８ｇ，２．０ｍｍｏｌ）およびシンコリジン（０．４８ｇ）を，Ａｒ中で加えた。反応混合物を２時間攪拌し，ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）で希釈し，濾過し，蒸発乾固し，トルエン（２×５０ｍｌ）と同時蒸発させた。残留物をＣＨ2Ｃｌ2（３００ｍｌ）にとかし，ＭｇＳＯ4で乾燥し，蒸発乾固した。残留物をＣＨ2Ｃｌ2中０−５％ＭｅＯＨの勾配を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製し，０．８ｇ（９７％）の化合物１９を得た。
【０４７５】
実施例４９：Ｎ6−ベンゾイル−９−（５’−０−ジメトキシトリチル−６’−デオキシ−β−Ｄ−アロフラノシル）アデニン（２３）
ヌクレオシド１９（１．８ｇ，２ｍｍｏｌ）をジオキサン（５０ｍｌ）にとかし，０℃に冷却し，２ＭＮａＯＨ（５０ｍｌ）を加えた。反応混合物を０℃に４５分間保ち，ダウエックス５０（Ｐｙｒ＋形）で中和し，濾過し，樹脂をＭｅＯＨ（２×５０ｍｌ）で洗浄した。ついで，濾液を蒸発乾固した。ＣＨ2Ｃｌ2中０−１０％ＭｅＯＨの勾配を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製し，１．１ｇ（８０％）の２３を得た。
【０４７６】
実施例５０：Ｎ6−ベンゾイル−９−（５’−０−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−６’−デオキシ−β−Ｄ−アロフラノシル）アデニン（２７）
ヌクレオシド２３（１．２ｇ，１．８ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（５０ｍｌ）に溶解し，ピリジン（０．５０ｇ，８ｍｍｏｌ）およびＡｇＮＯ3（０．４ｇ，２．３ｍｍｏｌ）を加えた。ＡｇＮＯ3が溶解した後（１．５時間），ｔ−ブチルジメチルシチルクロリド（０．３５ｇ，２．３ｍｍｏｌ）を加え，反応混合物を室温で１６時間攪拌した。反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）で希釈し，飽和ＮａＨＣＯ3（５０ｍｌ）中へ濾過し，有機層を食塩水（２×５０ｍｌ）で洗浄し，ＭｇＳＯ4で乾燥し，蒸発乾固した。生成物２７をヘキサン：ＥｔＯＡｃ／７：３勾配を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量：０．７ｇ（５０％）。
【０４７７】
実施例５１：Ｎ6−ベンゾイル−９−（５’−０−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−６’−デオキシ−β−Ｄ−アロフラノシル）アデニン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（３１）
エス・エイ・スカリンジ，シー・フランクリン，エヌ・ウスマン，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，１９９０年，１８巻５４３３−５４４１頁にしたがって２７を標準的方法でホスフィチル化子，ホスホルアミダイト３１を７３％の収率で得た。
【０４７８】
実施例５２：メチル−５−Ｏ−ｐ−ニトロベンゾイル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−６−デオキシ−β−Ｌ−タロフラノシド（５）
メチルフラノシド４（３．１ｇ，１４．２ｍｍｏｌ）を，乾燥ジオキサン（２００ｍｌ）にとかし，ｐ−ニトロ安息香酸（１０．０ｇ，６０ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（１５．７４ｇ，６０．０ｍｍｏｌ），ついでＤＥＡＤ（１０．４５ｇ，６０．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１６時間放置し，ＥｔＯＨ（５ｍｌ）を加え，０．５時間後反応混合物を蒸発乾固した。残留物をＣＨ2Ｃｌ2（３００ｍｌ）にとかし，飽和ＮａＨＣＯ3（２×７５ｍｌ），食塩水（２×７５ｍｌ）で洗浄し，ＭｇＳＯ4で乾燥し，蒸発乾固した。ヘキサン：ＥｔＯＡｃ／９：１勾配を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製し４．１ｇ（７８％）の化合物３３を得た。続いて脱ベンゾイル（ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ）およびシリル化（製造例５参照）を行うと，Ｌ−タロフラノシド３４を得，これを，Ｄ−アロ異性体２９−３２について上に記載したのと同じ方法でホスホロアミダイト５８−６１に変換した。
【０４７９】
この発明のアルキル置換ヌクレオチドは，上記のようにしてアンチセンス位置の酵素的切断用の安定なオリゴヌクレオチドの形成に使用することができる。このようなオリゴヌクレオチドは，標準的方法によりトリホスフェート形を用いて酵素的に形成することができる。このようなオリゴヌクレオチドの投与は，標準的方法により行う。サリバンら，ＰＣＴＷＯ９４／０２５９５参照。
【０４８０】
部位Ｏを含むリボザイムおよび標的ＲＮＡを上記のように合成し，脱保護し，精製した。ＲＮＡ切断アッセイを，上記のように１０ｍＭＭｇＣｌ2の存在下に３７℃で行った。
【０４８１】
出願人は，図７８（ＨＨ−０１ないしＨＨ−０５）に示すように，Ａ６，Ａ９，Ａ９＋Ｇ１０，Ｃ１１．１およびＣ１１．１＋Ｇ１０の位置で５’−Ｍｅ−Ｌ−タロヌクレオチドを置換した。ＨＨ−Ｏ１，２，４および５は野生型に近い活性を示した（図７９）。しかし，ＨＨ−０３は低い触媒活性を示した。リボザイムＨＨ−０１，２，３，４および５はまた，ひと血清ヌクレアーゼによる分解に対して極めて抵抗が強かった。
【０４８２】
２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド
本発明は，オリゴヌクレオチド内に２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチドを用いるが，このオリゴヌクレオチドはＲＮＡもしくは一本鎖ＤＮＡ，および更にはアンチセンスオリゴヌクレオチドの酵素開裂に特に有用である。本出願において用いられる際には，用語「２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチド含有性酵素的核酸」は，二本鎖ステム，一本鎖「触媒性コア」配列，一本鎖ループ，もしくは一本鎖認識配列（しかし，これらに限定はされない）を置換する２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチド構成成分を含む触媒性核酸分子である。これらの分子は個別のＲＮＡもしくはＤＮＡ分子をヌクレオチド塩基配列特異的様式で開裂（好ましくは，反復的に開裂）することが可能である。このような触媒性核酸は，所望される場合には分子内開裂を行うように作用することも可能である。このような酵素的分子は実際にはいずれかのＲＮＡ転写物を標的とすることが可能である。
【０４８３】
酵素的核酸中，もしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド中にさえも存在することができる２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒらの所見とは対称的に，本出願者は，このようなヌクレオチドが有用であることを見いだしているが，それはそれらのヌクレオチドがアンチセンスもしくは酵素的分子の安定性を亢進させ，かつそれらをその分子の所望される活性に影響を及ぼすことのない位置に用いることが可能であるためである。これはすなわち，２’−アルキル基の存在がこの修飾を含むオリゴヌクレオチドの結合親和性を減少させることがある一方で，その部分が主要塩基対形成性領域内に存在しない場合には，その分子に提供される安定性の亢進は有利なものとなるということである。それに加え，結合性の減少が酵素活性を減少させることがある一方で，安定性の増加により活性の損失がより少なく抑えられるという結果を生じることがある。従って，例えば，２’−デオキシ−２’−アルキル含有性分子が非修飾化分子の１０％の活性を有する場合には，その修飾化分子はインビボでは１０倍高い安定性を有しており，そのためその分子は本発明内においては利用性を有するのである。同様の分析結果がそのような修飾物を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに関しても取得されている。本発明は更に，そのようなヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド（これらの例は図に示されている）の合成に有用な新規の中間体，ならびにそれらの合成のための方法にも関する。
【０４８４】
従ってある態様では本発明は，２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチドを特徴とし（このアルキルヌクレオチドはその糖分子の２’の位置に一つのアルキル部分を有する），そして好ましい態様ではそのヌクレオチドがウリジンもしくはチミジンではないものを特徴とする。これはすなわち，本発明が先に論議される技術によっては記載されていない酵素的核酸もしくはアンチセンス分子を作製するのに有用な全ヌクレオチドを含むことが好ましいということである。
【０４８５】
本発明において有用な様々なアルキル基の例が図８１に示されており，この図中，Ｒ基はアルキルである。用語「アルキル」は「−Ｏ−アルキル」基を有するアルコキシ基は含まず，この場合「アルキル」は既述の要領で特定され，Ｏはその糖分子の２’の位置に近接している。
【０４８６】
先に論議されたものにも関連する他の態様では，本発明は一つもしくは複数の２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチド（２’−アルキル−ウリジンもしくはチミジンではないことが好ましい）を有するオリゴヌクレオチド；例えば，２’−デオキシ−２’アルキルヌクレオチドを有する酵素的核酸；およびその２’位置にアルキル基を有する少なくとも一つのヌクレオチドを含む酵素的分子を形成することにより，ＲＮＡもしくは一本鎖ＤＮＡ分子を開裂する活性が亢進されている酵素的核酸分子を作製するための方法を特徴とする。他の関連態様では，本発明は２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチドの三リン酸エステルを特徴とする。これらの三リン酸エステルを本発明の有用なオリゴヌクレオチドを形成するために標準的プロトコールにおいて用いることが可能である。
【０４８７】
本発明の２’−アルキル誘導体は，それらを含むオリゴヌクレオチドに対する安定性を亢進させる。それらはインビトロアッセイにおける絶対活性を減少させることもあるが，それらはインビトロでの総活性を増加させるであろう。これ以降にはそのような分子が有用であることを決定するためのアッセイが提供される。当業者は，等価アッセイを容易に考案することが可能であることを認識するであろう。
【０４８８】
他の態様では，本発明は，酵素活性を有し，図８０に示される位置５，６，８，１２，および１５．１にリボヌクレオチドを有し，かつ所望される場合にはコアおよび置換結合性アーム内の他の位置に置換されたリボヌクレオチドを有するシュモクザメ（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）モチーフを特徴とする。（用語「コア」は，図８０の塩基３と１４との間の位置を意味し，そして「結合性アーム」は，３’−末端〜塩基１５．１および５’−末端〜塩基２の塩基に相当する）。本出願人は，コアにおけるこれら５つの位置でのリボヌクレオチドの使用により，たとえモチーフ化されたヌクレオチドがそのモチーフの他の部位に存在するとしても十分な酵素活性を有する分子が提供されることを見いだした。有用なリボヌクレオチドの他のこのような組み合わせ物はＵｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（上述）により記載される要領で決定することが可能である。
【０４８９】
図８０はシュモクザメ（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）モチーフの塩基番号を示し，この図ではシュモクザメ（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）リボザイム内の様々なヌクレオチドの番号付けがなされている。この図は同時係属中の請求の範囲に対する従来の技術であるとか，あるいは論議される技術は請求の範囲に記載されるものに対する従来の技術であるという意味に解釈されるべきではない。図８０を参照すると，触媒性コアの５’−〜３’−方向でのシュモクザメ（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）リボザイムの好ましい配列はＣＵＧＡＮＧＡＧ［塩基対を形成する塩基］ＣＧＡＡＡである。本発明では２’−Ｃ−アルキル置換化ヌクレオチドの使用が所望され，このヌクレオチドはシュモクザメ（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）リボザイムの触媒活性および／またはヌクレアーゼ耐性を維持もしくは亢進させる。図８１に示されるいずれかのモチーフ化ヌクレオチドを有するいずれかのヌクレオチドの置換が可能であり，かつそれらが実際に合成されているものの，主に選択された置換基を有する２’−Ｏ−Ｍｅヌクレオチドからなる塩基構造が，最高の酵素活性を維持させ（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９２，３１，５００５−５００９，およびＰａｏｌｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９９２，１１，１９１３−１９１９）かつ合成を容易にさせる目的で選択されている（しかし，これは本発明を制限するものではない）。
【０４９０】
図８０および表４５からのリボザイムを合成し，そして触媒活性およびヌクレアーゼ耐性についてアッセイした。エントリー  ８および１７を例外として全ての修飾化リボザイムは野生型触媒活性の少なくとも１／１０を保持していた。表４５から，全ての２’−修飾化リボザイムはヒト血清中での安定性（データ公開）およびこれ以降に記載される他の液体中での安定性（実施例５５，データ非公開）において非常に大きくかつ有意な増加を示した。ヌクレアーゼ活性の高い順から示すと，ウシ胎仔血清＞ヒト血清＞ヒト血漿＞ヒト関節液となった。安定性および活性についてのこれら２’−置換物の効果の総括的測定として比率βを算出した（表４５）。このβ値は，検査した全修飾化リボザイムが総括的安定性および活性において有意な増加（＞１００〜＞１７００倍）を有することを示した。βのこれらの増加は，インビボにおけるこれら修飾化リボザイムの寿命が有意に増加することを示しており，このことにより一層明白な生物学的効果がもたらされるはずである。
【０４９１】
図８１からの２’−修飾化ヌクレオチドの一層一般的な置換によっても，得られる修飾化リボザイムのｔ1/2の増加が生じた。しかしながらこれらのリボザイムの触媒活性は＞１０倍の減少を示した。
【０４９２】
図８６では化合物３７を，誘導化２’−Ｃ−アルキルホスホルアミダイト［この場合，ＸはＣＨ3，もしくはアルキル，もしくは既述の他の基である］を製造するための一般的中間体として用いることができる。
【０４９３】
以下のものは２’−Ｃ−アルキル置換化ホスホルアミダイトを有する核酸の合成法，そのアミダイトの合成法，酵素活性およびヌクレアーゼ耐性についてのそれらの検査法を示す非制限的実施例である。
【０４９４】
実施例５３：２’−デオキシ−２’−アルキルヌクレオチド  ＆  他の２’−修飾化ヌクレオチドを含むシュモクザメ（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）リボザイムの合成
一般的に用いられる合成方法は，Ｕｓｍａｎ，Ｎ．；Ｏｇｉｌｖｉｅ，Ｋ．Ｋ．；Ｊｉａｎｇ，Ｍ．−Ｙ．；Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｒ．Ｊ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １９８７，１０９，７８４５−７８５４，およびＳｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．：Ｆｒａｎｋｌｙｎ，Ｃ．；Ｕｓｍａｎ，Ｎ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９０，１８，５４３３−５４４１，において記載される通常のＲＮＡ合成用の方法に従い，かつ例えば５’−末端のジメトキシトリチル，および３’−末端のホスホルアミダイトのような一般的な核酸保護用およびカップリング用の基を利用する（化合物１０，１２，１７，２２，３１，１８，２６，３２，３６，および３８）。他の２’−修飾化ホスホルアミダイトは：３  ＆  ４，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９２／０７０６５号；および５，Ｋｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９９３，１２，１０９３−１１０９，に従って製造した。平均段階的カップリング収率は約９８％であった。２’−置換化ホスホルアミダイトを図８０に示されるようにシュモクザメ（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）リボザイム中に取り込ませた。しかしながらこれらの２’−アルキル置換化ホスホルアミダイトはシュモクザメ（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）リボザイム中に取り込まれるばかりでなく，ヘアピン構造をなす肝炎デルタウイルスのグループＩもしくはグループＩＩイントロンの触媒性核酸中，もしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド中にも取り込まれることがある。従ってこれらはいずれかの核酸構造において一般的に使用されるものである。
【０４９５】
実施例５４：リボザイム活性アッセイ
精製された５’−末端ラベル化ＲＮＡ基質（１５〜２５量体）および精製された５’−末端ラベル化リボザイム（おおよそ３６量体）の両方を個別に９５℃に加熱し，氷内でのクエンチングを行い，そして３７℃で平衡化させた。リボザイムの保存溶液は，１ｍＭ，２００ｎＭ，４０ｎＭ，もしくは８０ｎＭであり，そして最終基質ＲＮＡ濃度は約１ｎＭであった。総反応容積は５０ｍＬであった。アッセイ緩衝液は，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．５および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2であった。反応は基質とリボザイム溶液をｔ＝０の時点で混合することにより開始させた。５ｍＬのアリコートを，１，５，１５，３０，６０，および１２０分の時点で取り分けた。各時点でホルムアミド重層用緩衝液中でのクエチングを行い，そして分析のために１５％の変性用ポリアクリルアミドゲルにかけた。定量分析はホスホルイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎｓｍｉｃｓ社）を用いて実施した。
【０４９６】
実施例５５：安定性アッセイ
５００ｐモルのゲル精製化５’−末端ラベル化リボザイムをエタノール中で沈殿させ，そして遠心分離によりペレット化させた。各ペレットを，室温で２０秒間のボルテックス震盪により２０ｍＬの適切な溶液（ヒト血清，ヒト血漿，ヒト関節液，もしくはウシ胎仔血清）中に再懸濁させた。これらの試料を３７℃のインキュベーター内に入れ，そして２ｍＬのアリコートを，０，１５，３０，４５，６０，１２０，２４０，および４８０分間のインキュベーションの後に採取した。各アリコートに，９５％のホルムアミドおよび０．５×  ＴＢＥ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，５０ｍＭ  ホウ酸塩，１ｍＭのＥＤＴＡ）を添加して更に進行するヌクレアーゼ活性のクエンチングを行い，そして各試料をゲルにかけるまで凍結した。リボザイムは，２０％アクリルアミド／８Ｍ  尿素ゲル内での電気泳動によりサイズ分画化した。各時点での未変性リボザイムの量をホスホルイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社）を用いるバンドのスキャンにより定量化し，そして各液体中の各リボザイムの半減期は，インキュベーション時間に対して未変性リボザイムのパーセンテージをプロットし，そしてグラフからの外挿を行うことにより決定した。
【０４９７】
実施例５６：３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピル−ジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−フェノキシチオカルボニル−ウリジン（７）
３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピル−ジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン，６，（１５．１ｇ，３１ｍモル，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｅｄ．  Ｌｅｒｏｙ  Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，１９８６，ｐｐ．２２９−２３１，に従って合成された）およびジメチルアミノピリジン（７．５７ｇ，６２ｍモル）の撹拌溶液に，５０ｍＬのアセトニトリル中のフェニルクロロチオギ酸エステル（５．１５ｍＬ，３７．２ｍモル）の溶液を滴下により添加し，そしてこの反応物を８時間撹拌した。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン／１：１）により出発物質の消失が示された。この反応混合物を蒸発させ，残渣をクロロホルム中に溶解し，水，次いで食塩水で洗浄し，有機層を硫酸ナトリウムに通して脱水し，濾過し，そして蒸発乾固させた。この残渣を，溶出液としてＥｔＯＡｃ：ヘキサン／２：１を用いるシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して１６．４４ｇ（８５％）の７を取得した。
【０４９８】
実施例５７：３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピル−ジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｃ−アリル−ウリジン（８）
アルゴン下での無水トルエン中の３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピル−ジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−フェノキシチオカルボニル−ウリジン  ７（５ｇ，８．０３ｍモル）およびアリルトリブチルチン（１２．３ｍＬ，４０．１５ｍモル）の還流溶液に過酸化ベンゾイル（０．５ｇ）を１時間にわたり数回に分けて加える手法により添加した。得られる混合物をアルゴン下で追加的に７〜８時間還流させた。この反応物をその後に蒸発させ，そして生成物  ８を溶出液としてＥｔＯＡｃ：ヘキサン／１：３を用いるシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収率は２．８２ｇ（６８．７％）であった。
【０４９９】
実施例５８：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｃ−アリル−ウリジン（９）
１０ｍＬの無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の８（１．２５ｇ，２．４５ｍモル）の溶液をＴＨＦ（３．７ｍＬ）中のフッ化テトラブチルアンモニウムの１Ｍ溶液で，室温下で処理した。得られる混合物を蒸発し，残渣をシリカゲルカラムにかけ，１Ｌのクロロホルムでの洗浄を行い，そして所望の脱保護化化合物をクロロホルム：メタノール／９：１で溶出した。適切な分画を合わせ，溶媒を留去させ，そして残渣を無水ピリジンとの共蒸発により脱水した。油状残渣を無水ピリジン中に再溶解し，塩化ジメトキシトリチル（１．２等量）を添加し，そしてこの反応混合物を無水条件下に一晩放置した。反応のクエンチングをメタノール（２０ｍＬ）で実施し，蒸発させ，クロロホルム中に溶解し，５％の重炭酸ナトリウム水溶液，次いで食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムを通して脱水し，そして蒸発させた。残渣を溶出液としてＥｔＯＡｃ：ヘキサン／１：１を用いるシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し，０．８５ｇ（５７％）の９を白色泡状物として取得した。
【０５００】
実施例５９：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｃ−アリル−ウリジン  ３’−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（１０）
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｃ−アリル−ウリジン（０．６４ｇ，１．１２ｍモル）を無水アルゴン下で無水ジクロロメタン中に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３９ｍＬ，２．２４ｍモル）を添加し，そしてこの溶液を氷冷した。２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．３５ｍＬ，１．５７ｍモル）をその撹拌反応溶液に滴下により添加し，そして撹拌を２時間室温で継続した。その後にこの反応混合物を氷冷し，そして１２ｍＬの無水メタノールでのクエンチングを行った。５分間の撹拌後，この混合物を減圧濃縮し（４０℃），そして溶出液として１％のトリエチルアミンを含むヘキサン混合物中の１０〜６０％ＥｔＯＡｃの濃度勾配液を用いるシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収率：０．７８ｇ（９０％），白色泡状物。
【０５０１】
実施例６０：３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピル−ジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｃ−アリル−Ｎ4−アセチル−シチジン（１１）
トリエチルアミン（６．３５ｍＬ，４５．５５ｍモル）を，５０ｍＬの無水アセトニトリル中の１，２，４−トリアゾール（５．６６ｇ，８１．９９ｍモル）およびオキシ塩化リン（０．８６ｍＬ，９．１１ｍモル）の撹拌氷冷混合物に滴下により添加した。得られる懸濁液に，３０ｍＬのアセトニトリル中の３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピル−ジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｃ−アリルウリジン（２．３２ｇ，４．５５ｍモル）の溶液を滴下により添加し，そしてこの反応混合物を４時間室温で撹拌した。この反応混合物を減圧濃縮して最少容積にさせた（減圧乾固にまでは至らない状態）。この残渣をクロロホルム中に溶解し，そして水，飽和重炭酸ナトリウム水溶液，次いで食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムに通して脱水し，そして溶媒を減圧除去した。得られる泡状物を５０ｍＬの１，４−ジオキサン中に溶解し，そして２９％のＮＨ4ＯＨ水溶液で一晩，室温で処理した。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール／９：１）により出発物質の完全な転移が観察された。この溶液を蒸発させ，無水ピリジンとの共蒸発により脱水し，そしてピリジン中の無水酢酸（０．５２ｍＬ，５．４６ｍモル）で一晩のアセチル化を施した。この反応混合物のクエンチングをメタノールで行い，蒸発させ，その残渣をクロロホルムに溶解し，重炭酸ナトリウム，次いで食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムに通して脱水し，蒸発乾固させ，そしてシリカゲル（クロロホルム中の３％ＭｅＯＨ）上でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収率：２．３ｇ（９０％），白色泡状物。
【０５０２】
実施例６１：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−アリル−Ｎ4−アセチル−シチジン
この化合物は，ウリジン誘導体９に類似の方法で５５％の収率で取得された。
【０５０３】
実施例６２：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−アリル−Ｎ4−アセチル−シチジン  ３’−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（１２）
２’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｃ−アリル−Ｎ4−アセチルシチジン（０．８ｇ，１．３１ｍモル）をアルゴン下で無水ジクロロメタン中に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．４６ｍＬ，２．６２ｍモル）を添加し，そしてその溶液を氷冷した。２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．３８ｍＬ，１．７ｍモル）を撹拌反応溶液に滴下により添加し，そして撹拌を室温で２時間継続させた。その後にこの反応混合物を氷冷し，そして１２ｍＬの無水メタノールでのクエンチングを行った。５分間の撹拌後，この混合物を減圧濃縮し（４０℃），そして溶出液として２％のトリエチルアミンを含むクロロホルム：エタノール／９８：２混合液を用いるシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収率：０．９１ｇ（８５％），白色泡状物。
【０５０４】
実施例６３：２’−デオキシ−２’−メチレン−ウリジン
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解される２’−デオキシ−２’−メチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン  １４（Ｈａｎｓｓｋｅ，Ｆ．；Ｍａｄｅｊ，Ｄ．；Ｒｏｂｉｎｓ，Ｍ．Ｊ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９８４，４０，１２５，およびＭａｔｓｕｄａ，Ａ．；Ｔａｋｅｎｕｋｉ，Ｋ．；Ｔａｎａｋａ，Ｓ．；Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．；Ｕｅｄａ，Ｔ．  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  １９９１，３４，８１２）（２．２ｇ，４．５５ｍモル）を，ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の１Ｍ  ＴＢＡＦで２０分間処理し，そして減圧濃縮した。この残渣を石油エーテルで粉砕し，そしてシリカゲルカラム上でのクロマトグラフィーにかけた。２’−デオキシ−２’−メチレン−ウリジン（１．０ｇ，３．３ｍモル，７２．５％）をＣＨ2Ｃｌ2中の２０％  ＭｅＯＨで溶出した。
【０５０５】
実施例６４：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−メチレン−ウリジン（１５）
２’−デオキシ−２’−メチレン−ウリジン（０．９１ｇ，３．７９ｍモル）をピリジン（１０ｍＬ）中に溶解し，そしてピリジン（１０ｍＬ）中のＤＭＴ−Ｃｌの溶液を１５分間にわたって滴下により添加した。得られる混合物を室温で１２時間撹拌し，そしてＭｅＯＨ（２ｍＬ）を添加してその反応のクエンチングを行った。この混合物を減圧濃縮し，そして残渣をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）中に溶解し，そして飽和ＮａＨＣＯ3，水，次いで食塩水で洗浄した。有機抽出物をＭｇＳＯ4に通して脱水し，減圧濃縮し，そして溶出液としてＥｔＯＨ：ヘキサンを用いてシリカゲルカラムに通して精製して１５（０．４３ｇ，０．７９ｍモル，２２％）を取得した。
【０５０６】
実施例６５：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−メチレン−ウリジン  ３’−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（１７）
無水ＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍＬ）中に溶解される１−（２’−デオキシ−２’−メチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−ウラシル（０．４３ｇ，０．８ｍモル）をＡｒ下で丸底フラスコ中に入れた。ジイソプロピルエチルアミン（０．２８ｍＬ，１．６ｍモル）を添加し，その後に２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．２５ｍＬ，１．１２ｍモル）を滴下により添加した。この反応混合物を２時間室温で撹拌し，そしてエタノール（１ｍＬ）でのクエンチングを行った。１０分後にその混合物をシロップ状物になるまで減圧蒸発させた（４０℃）。この生成物（０．３ｇ，０．４ｍモル，５０％）を，溶出液として１％のトリエチルアミンを含むヘキサン中の２５〜７０％のＥｔＯＡｃ濃度勾配液を用いるシリカゲルを通すフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。Ｒf  ０．４２（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／１５：１）。
【０５０７】
実施例６６：２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン
２’−ケト−３’，５’−Ｏ−（テトライプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ウリジン  １４（１．９２ｇ，１２．６ｍモル）およびトリフェニルホスフィン（２．５ｇ，９．２５ｍモル）をジグリム（２０ｍＬ）中に溶解し，そして１６０℃の浴槽温度にまで加熱した。ジグリム（５０ｍＬ）中のクロロジフルオロ酢酸ナトリウムの温溶液（６０℃）を，約１時間の期間にわたって添加した（均衡性滴下漏斗からの滴下による）。得られる混合物を更に２時間撹拌し，そして減圧濃縮した。残渣をＣＨ2Ｃｌ2中に溶解し，そしてシリカゲル上でのクロマトグラフィーにかけた。２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン（３．１ｇ，５．９ｍモル，７０％）を，ＥｔＯＡｃ中の２５％ヘキサンで溶出させた。
【０５０８】
実施例６７：２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−ウリジン
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解される２’−デオキシ−２’−メチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン（３．１ｇ，５．９ｍモル）を，ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の１Ｍ  ＴＢＡＦで２０分間処理し，そして減圧濃縮した。この残渣を石油エーテルで粉砕し，そしてシリカゲル上でのクロマトグラフィーにかけた。２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−ウリジン（１．１ｇ，４．０ｍモル，６８％）をＣＨ2Ｃｌ2中の２０％  ＭｅＯＨで溶出させた。
【０５０９】
実施例６８：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−ウリジン（１６）
２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−ウリジン（１．１ｇ，４．０ｍモル）をピリジン（１０ｍＬ）中に溶解し，そしてピリジン（１０ｍＬ）中のＤＭＴ−Ｃｌ（１．４２ｇ，４．１８ｍモル）の溶液を１５分間にわたり滴下により添加した。得られる混合物を室温で１２時間撹拌し，そしてＭｅＯＨ（２ｍＬ）を添加して反応のクエンチングを行った。この混合物を減圧濃縮し，そして残渣をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）中に溶解し，そして飽和ＮａＨＣＯ3，水，次いで食塩水で洗浄した。有機抽出物をＭｇＳＯ4に通して脱水し，減圧濃縮し，そして溶出液として４０％  ＥｔＯＡｃ：ヘキサンを用いてシリカゲルカラムに通して精製して５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−ウリジン  １６（１．０５ｇ，１．８ｍモル，４５％）を取得した。
【０５１０】
実施例６９：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−ウリジン  ３’−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（１８）
無水ＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍＬ）中に溶解される１−（２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−ウラシル（０．５７７ｇ，１ｍモル）をＡｒ下で丸底フラスコに入れた。ジイソプロピルエチルアミン（０．３６ｍＬ，２ｍモル）を添加し，その後に２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．４４ｍＬ，１．４ｍモル）を滴下により添加した。この反応混合物を室温で２時間撹拌し，そしてエタノール（１ｍＬ）でのクエンチングを行った。１０分後に，この混合物をシロップ状物になるまで減圧蒸発させた（４０℃）。この生成物（０．４０４ｇ，０．５２ｍモル，５２％）を，溶出液として１％のトリエチルアミンを含むヘキサン中の２０〜５０％  ＥｔＯＨ濃度勾配液を用いるシリカゲルを通すフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。Ｒf  ０．４８（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／１５：１）。
【０５１１】
実施例７０：２’−デオキシ−２’−メチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−Ｎ−アセチル−シチジン  ２０
トリエチルアミン（４．８ｍＬ，３４ｍモル）を，アセトニトリル（２０ｍＬ）中のＰＯＣｌ3（０．６５ｍＬ，６．８ｍモル）および１，２，４−トリアゾール（２．１ｇ，３０．６ｍモル）の溶液に０℃下で添加した。アセトニトリル（２０ｍＬ）中の２’−デオキシ−２’−メチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ウリジン  １９（１．６５ｇ，３．４ｍモル）の溶液を先の反応混合物に滴下により添加し，そして室温で４時間撹拌させたままにした。この混合物を減圧濃縮し，ＣＨ2Ｃｌ2（２×１００ｍＬ）中に溶解し，そして５％のＮａＨＣＯ3（１×１００ｍＬ）で洗浄した。この有機抽出物をＮａ2ＳＯ4に通して脱水し，減圧濃縮し，ジオキサン（１０ｍＬ）およびアンモニア水溶液（２０ｍＬ）中に溶解した。この混合物を１２時間撹拌し，そして減圧濃縮した。残渣を無水ピリジン（２×２０ｍＬ）と共沸させた。無水酢酸（３ｍＬ）を，ピリジン中に溶解させた残渣に添加し，４時間室温で撹拌し，飽和ＮａＨＣＯ3（５ｍＬ）でのクエンチングを行った。この混合物を減圧濃縮し，ＣＨ2Ｃｌ2（２×１００ｍＬ）中に溶解し，そして５％  ＮａＨＣＯ3（１×１００ｍＬ）で洗浄した。有機抽出物をＮａ2ＳＯ4に通して脱水し，減圧濃縮し，そして残渣をシリカゲルに通すクロマトグラフィーにかけた。２’−デオキシ−２’−メチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−Ｎ−アセチル−シチジン  ２０（１．３ｇ，２．５ｍモル，７３％）をヘキサン中の２０％ＥｔＯＡｃで溶出した。
【０５１２】
実施例７１：１−（２’−デオキシ−２’−メチレン５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−Ｎ−アセチル−シトシン  ２１
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解される２’−デオキシ−２’−メチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−Ｎ−アセチル−シチジン  ２０（１．３ｇ，２．５ｍモル）を，ＴＨＦ（３ｍＬ）中の１Ｍ  ＴＢＡＦで２０分間処理し，そして減圧濃縮した。この残渣を石油エーテルで粉砕し，そしてシリカゲルカラム上でのクロマトグラフィーにかけた。２’−デオキシ−２’−メチレン−４−Ｎ−アセチル−シチジン（０．５６ｇ，１．９９ｍモル，８０％）を，ＣＨ2Ｃｌ2中の１０％  ＭｅＯＨで溶出した。２’−デオキシ−２’−メチレン−４−Ｎ−アセチル−シチジン（０．５６ｇ，１．９９ｍモル）をピリジン（１０ｍＬ）中に溶解し，そしてピリジン（１０ｍＬ）中のＤＭＴ−Ｃｌ（０．８１ｇ，２．４ｍモル）の溶液を１５分間にわたる滴下により添加した。得られる混合物を室温で１２時間撹拌し，そしてＭｅＯＨ（２ｍＬ）を添加してこの反応のクエンチングを行った。この混合物を減圧濃縮し，そして残渣をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）中に溶解し，そして飽和ＮａＨＣＯ3（５０ｍＬ），水（５０ｍＬ），次いで食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機抽出物をＭｇＳＯ4に通して脱水し，減圧濃縮し，そして溶出液としてＥｔＯＡｃ：ヘキサン／６０：４０を用いるシリカゲルカラムに通して精製して２１を取得した（０．８８ｇ，１．５ｍモル，７５％）。
【０５１３】
実施例７２：１−（２’−デオキシ−２’−メチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−Ｎ−アセチル−シトシン  ３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（２２）
無水ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）中に溶解される１−（２’−デオキシ−２’−メチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−Ｎ−アセチル−シトシン  ２１（０．８８ｇ，１．５ｍモル）をＡｒ下で丸底フラスコ内に入れた。ジイソプロピルエチルアミン（０．８ｍＬ，４．５ｍモル）を添加し，その後に２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．４ｍＬ，１．８ｍモル）を滴下により添加した。この反応混合物を２時間室温で撹拌し，そしてエタノール（１ｍＬ）でのクエンチングを行った。１０分後に，この混合液をシロップ状物になるまで減圧濃縮した（４０℃）。生成物  ２２（０．８２ｇ，１．０４ｍモル，６９％）を，溶出液として１％のトリチルアミンを含むヘキサン中の５０〜７０％  ＥｔＯＡｃ濃度勾配液を用いるシリカゲルに通すフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。Ｒf  ０．３６（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／２０：１）。
【０５１４】
実施例７３：２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−Ｎ−アセチル−シチジン（２４）
Ｅｔ3Ｎ（６．９ｍＬ，５０ｍモル）を，アセトニトリル（２０ｍＬ）中のＰＯＣｌ3（０．９４ｍＬ，１０ｍモル）および１，２，４−トリアゾール（３．１ｇ，４５ｍモル）の溶液に０℃で添加した。アセトニトリル（２０ｍＬ）中の２’−デオキシ−２’−フルオロメチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ウリジン  ２３（［実施例１４に記載される］２．６ｇ，５ｍモル）の溶液を先の反応混合物に滴下により添加し，そして室温で４時間撹拌させたままにした。この混合物を減圧濃縮し，ＣＨ2Ｃｌ2（２×１００ｍＬ）中に溶解し，そして５％  ＮａＨＣＯ3（１×１００ｍＬ）で洗浄した。有機抽出物をＮａ2ＳＯ4に通して脱水し，減圧濃縮し，ジオキサン（２０ｍＬ）およびアンモニウム水溶液（３０ｍＬ）中に溶解した。この混合物を１２時間撹拌し，そして減圧濃縮した。残渣を無水ピリミジン（２×２０ｍＬ）と共に共沸させた。無水酢酸（５ｍＬ）を，ピリジン中に溶解させたその残渣に添加し，室温で４時間撹拌し，そして飽和ＮａＨＣＯ3（５ｍＬ）でのクエンチングを行った。この混合物を減圧濃縮し，ＣＨ2Ｃｌ2（２×１００ｍＬ）中に溶解し，そして５％  ＮａＨＣＯ3（１×１００ｍＬ）で洗浄した。有機抽出物をＮａ2ＳＯ4に通して脱水し，減圧濃縮し，そしてその残渣をシリカゲルに通すクロマトグラフィーにかけた。２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−Ｎ−アセチル−シチジン  ２４（２．２ｇ，３．９ｍモル，７８％）を，ヘキサン中の２０％  ＥｔＯＡｃで溶出させた。
【０５１５】
実施例７４：１−（２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−Ｎ−アセチル−シトシン（２５）
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解される２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−Ｎ−アセチル−シチジン  ２４（２．２ｇ，３．９ｍモル）を，ＴＨＦ（３ｍＬ）中の１Ｍ  ＴＢＡＦで２０分間処理し，そして減圧濃縮した。その残渣を石油エーテルで粉砕し，そしてシリカゲルカラム上でのクロマトグラフィーにかけた。２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−４−Ｎ−アセチル−シチジン（０．８９ｇ，２．８ｍモル，７２％）を，ＣＨ2Ｃｌ2中の１０％  ＭｅＯＨで溶出した。２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−４−Ｎ−アセチル−シチジン（０．８９ｇ，２．８ｍモル）をピリジン（１０ｍＬ）中に溶解し，そしてピリジン（１０ｍＬ）中のＤＭＴ−Ｃｌ（１．０３ｇ，３．１ｍモル）の溶液を１５分間にわたり滴下により添加した。得られる混合物を室温で１２時間撹拌し，そしてＭｅＯＨ（２ｍＬ）を添加して反応のクエンチングを行った。この混合物を減圧濃縮し，そして残渣をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）中に溶解し，そして飽和ＮａＨＣＯ3（５０ｍＬ），水（５０ｍＬ），次いで食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機抽出物をＭｇＳＯ4に通して脱水し，減圧濃縮し，そして溶出液としてＥｔＯＡｃ：ヘキサン／６０：４０を用いるシリカゲルカラムに通して精製して２５を取得した（１．２ｇ，１．９ｍモル，６８％）。
【０５１６】
実施例７５：１−（２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−Ｎ−アセチルシトシン  ３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（２６）
無水ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）中に溶解させた１−（２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−Ｎ−アセチルシトシン  ２５（０．６ｇ，０．９７ｍモル）をＡｒ下で丸底フラスコ内に入れた。ジイソプロピルエチルアミン（０．５ｍＬ，２．９ｍモル）を添加し，その後に２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．４ｍＬ，１．８ｍモル）を滴下により添加した。この反応混合物を２時間室温で撹拌し，そしてエタノール（１ｍＬ）でのクエンチングを行った。１０分後に，この混合液をシロップ状物になるまで減圧濃縮した（４０℃）。白色泡状物である生成物  ２６（０．５２ｇ，０．６３ｍモル，６５％）を，溶出液として１％のトリチルアミンを含むヘキサン中の３０〜７０％  ＥｔＯＡｃ濃度勾配液を用いるシリカゲルに通すフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。Ｒf  ０．４８（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／２０：１）。
【０５１７】
実施例７６：２’−ケト−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（２８）
無水酢酸（４．６ｍＬ）を，ＤＭＳＯ（３７ｍＬ）中の３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．；Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｌｏｕ，Ｃ．；Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．；Ｍｏｄａｋ，Ａ．；Ｒｅｅｓｅ，Ｃ．；Ｓｉｂａｎｄａ，Ｓ．；Ｕｂａｓａｎａ，Ａ．  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１  １９８９，１７３５）（６．２ｇ，９．２ｍモル）の溶液に添加し，そして得られる混合物を室温で２４時間撹拌した。この混合物を減圧濃縮した。その残渣をＥｔＯＡｃに溶解し，そして水で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ4に通して脱水し，減圧濃縮した。この残渣をシリカゲルカラム上で精製して２’−ケト−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン  ２８（４．８ｇ，７．２ｍモル，７８％）を取得した。
【０５１８】
実施例７７：２’−デオキシ−２’−メチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（２９）
アルゴン圧力下でヘキサン中の第二級−ブチルリチウム（１１．２ｍＬ，１４．６ｍモル）を，−７８℃に冷却したＴＨＦ（２５ｍＬ）中のヨウ化トリフェニルメチルホスホニウム（７．０７ｇ，１７．５ｍモル）の懸濁液に添加した。この均一有機溶液を−３０℃にまで暖め，そしてＴＨＦ（２５ｍＬ）中の２’−ケト−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン  ２８（４．８７ｇ，７．３ｍモル）の溶液をアルゴン圧力下でこの混合物に移した。室温にまで暖めた後，撹拌を２４時間継続した。ＴＨＦを蒸発させ，そしてＣＨ2Ｃｌ2（２５０ｍＬ）に置換し，水を添加し（２０ｍＬ），そしてその溶液を２％  ＨＣｌの冷却溶液で中和した。有機層をＨ2Ｏ（２０ｍＬ），５％のＮａＨＣＯ3水溶液（２０ｍＬ），Ｈ2Ｏで中性になるまで洗浄し，次いで食塩水（１０ｍＬ）で洗浄した。脱水後（Ｎａ2ＳＯ4）に溶媒を減圧蒸発させて粗生成化合物を取得し，これをシリカゲルカラム上でのクロマトグラフィーにかけた。軽油エーテル：ＥｔＯＡｃ／７：３での溶出により純粋な２’−デオキシ−２’−メチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン  ２９（３．８６ｇ，５．８ｍモル，７９％）が取得された。
【０５１９】
実施例７８：２’−デオキシ−２’−メチレン−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン
ＴＨＦ（３０ｍＬ）中に溶解される２’−デオキシ２’−メチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（３．８６ｇ，５．８ｍモル）を，ＴＨＦ（１５ｍＬ）中の１Ｍ  ＴＢＡＦで２０分間処理し，そして減圧濃縮した。この残渣を石油エーテルで粉砕し，そしてシリカゲル上でのクロマトグラフィーにかけた。２’−デオキシ２’−メチレン−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（１．８ｇ，４．３ｍモル，７４％）をＣＨ2Ｃｌ2中の１０％  ＥｔＯＨで溶出した。
【０５２０】
実施例７９：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−メチレン−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（２９）
２’−デオキシ２’−メチレン−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（０．７５ｇ，１．７７ｍモル）をピリジン（１０ｍＬ）中に溶解し，そしてピリジン（１０ｍＬ）中のＤＭＴ−Ｃｌ（０．６６ｇ，１．９８ｍモル）の溶液を１５分間にわたり滴下により添加した。得られる混合物を室温で１２時間撹拌し，そしてＭｅＯＨ（２ｍＬ）を添加して反応のクエンチングを行った。この混合物を減圧濃縮し，そしてその残渣をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）中に溶解し，そして飽和ＮａＨＣＯ3，水，次いで食塩水で洗浄した。有機抽出物をＭｇＳＯ4に通して脱水し，減圧濃縮し，そして溶出液として５０％のＥｔＯＡｃ：ヘキサンを用いてシリカゲルカラムに通して精製して２９（０．８１ｇ，１．１ｍモル，６２％）を取得した。
【０５２１】
実施例８０：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−メチレン−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン  ３’−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（３１）
無水ＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍＬ）中に溶解される１−（２’−デオキシ−２’−メチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデニン  ２９をＡｒ下で丸底フラスコに入れた。ジイソプロピルエチルアミンを添加し，その後に２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトを滴下により添加した。この反応混合物を室温で２時間撹拌し，そしてエタノール（１ｍＬ）でクエンチングを行った。１０分後に，この混合物をシロップ状物になるまで減圧蒸発させた（４０℃）。この生成物を，溶出液として１％のトリエチルアミンを含むヘキサン中の３０〜５０％  ＥｔＯＡｃの濃度勾配液を用いるシリカゲルを通すフラッシュクロマトグラフィーにより精製した（０．７ｇ，０．７６ｍモル，６８％）。Ｒf  ０．４５（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／２０：１）。
【０５２２】
実施例８１：２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン
２’−ケト−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン  ２８（６．７ｇ，１０ｍモル）およびトリフェニルホスフィン（２．９ｇ，１１ｍモル）をジグリム（２０ｍＬ）中に溶解し，そして１６０℃の浴槽温度にまで加熱した。ジグリム（５０ｍＬ）中のクロロジフルオロ酢酸ナトリウム（２．３ｇ，１５ｍモル）の温溶液（６０℃）を約１時間の期間にわたって添加した（均衡性滴下漏斗からの滴下による）。得られる混合物を更に２時間撹拌し，そして減圧濃縮した。この残渣をＣＨ2Ｃｌ2中に溶解し，そしてシリカゲルに通すクロマトグラフィーにかけた。２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（４．１ｇ，６．４ｍモル，６４％）を，ＥｔＯＡｃ中の１５％  ヘキサンで溶出させた。
【０５２３】
実施例８２：２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解される２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（４．１ｇ，６．４ｍモル）を，ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の１Ｍ  ＴＢＡＦで２０分間処理し，そして減圧濃縮した。この残渣を石油エーテルで粉砕し，そしてシリカゲルカラム上でのクロマトグラフィーにかけた。２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（２．３ｇ，４．９ｍモル，７７％）を，ＣＨ2Ｃｌ2中の２０％  ＭｅＯＨで溶出させた。
【０５２４】
実施例８３：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（３０）
２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン（２．３ｇ，４．９ｍモル）をピリジン（１０ｍＬ）中に溶解し，そしてピリジン（１０ｍＬ）中のＤＭＴ−Ｃｌの溶液を１５分間にわたり滴下により添加した。得られる混合物を室温で１２時間撹拌し，そしてＭｅＯＨ（２ｍＬ）を添加して反応のクエンチングを行った。この混合物を減圧濃縮し，そして残渣をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）中に溶解し，そして飽和ＮａＨＣＯ3，水，次いで食塩水で洗浄した。有機溶出物をＭｇＳＯ4に通して脱水し，減圧濃縮し，そして溶出液として５０％  ＥｔＯＡｃ：ヘキサンを用いてシリカゲルカラムに通して精製して  ３０（２．６ｇ，３．４１ｍモル，６９％）を取得した。
【０５２５】
実施例８４：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデノシン  ３’−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（３２）
無水ＣＨ2Ｃｌ2（２５ｍＬ）中に溶解される１−（２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−アデニン  ３０（２．６ｇ，３．４ｍモル）をＡｒ下で丸底フラスコに入れた。ジイソプロピルエチルアミン（１．２ｍＬ，６．８ｍモル）を添加し，その後に２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（１．０６ｍＬ，４．７６ｍモル）を滴下により添加した。この反応混合物を室温で２時間撹拌し，そしてエタノール（１ｍＬ）でのクエンチングを行った。１０分後に，この混合物をシロップ状物になるまで減圧蒸発させた（４０℃）。３２（２．３ｇ，２．４ｍモル，７０％）を，溶出液として１％のトリエチルアミンを含むヘキサン中の２０〜５０％  ＥｔＯＡｃ濃度勾配液を用いるシリカゲルを通すフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。Ｒf  ０．５２（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／１５：１）。
【０５２６】
実施例８５：２’−デオキシ−２’−メトキシカルボニルメチリジン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン（３３）
酢酸メチル（トリフェニルホスホルアニリジン）（５．４ｇ，１６ｍモル）を，アルゴン下でＣＨ2Ｃｌ2中の２’−ケト−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン  １４の溶液に添加した。この混合物を室温で３０時間撹拌させたままにした。ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）および水（２０ｍＬ）を添加し，そしてこの溶液を２％  ＨＣｌの冷却溶液で中和させた。有機層をＨ2Ｏ（２０ｍＬ），５％のＮａＨＣＯ3水溶液（２０ｍＬ），Ｈ2Ｏで洗浄して中和させ，次いで食塩水（１０ｍＬ）で洗浄した。脱水後（Ｎａ2ＳＯ4），溶媒を減圧留去させ，そして粗生成物を取得し，これをシリカゲルカラム上でのクロマトグラフィーにかけた。軽油エーテル：ＥｔＯＡｃ／７：３での溶出により，純粋な２’−デオキシ−２’−メトキシカルボニルメチリジン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン  ３３（５．８ｇ，１０．８ｍモル，６７．５％）を取得した。
【０５２７】
実施例８６：２’−デオキシ−２’−メトキシカルボニルメチリジン−ウリジン（３４）
Ｅｔ3Ｎ・３ＨＦ（３ｍＬ）を，ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）およびＥｔ3Ｎ（１５ｍＬ）中に溶解される２’−デオキシ−２’−メトキシカルボニルメチリジン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン  ３３（５ｇ，９．３ｍモル）の溶液に添加した。得られる混合物を１時間後に減圧蒸発させ，そしてシリカゲルカラム上でのクロマトグラフィーにかけ，ＴＨＦ：ＣＨ2Ｃｌ2／４：１を用いて２’−デオキシ−２’−メトキシカルボニルメチリジン−ウリジン  ３４（２．４ｇ，８ｍモル，８６％）を溶出させた。
【０５２８】
実施例８７：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−メトキシカルボニルメチリジン−ウリジン（３５）
２’−デオキシ−２’−メトキシカルボニルメチリジン−ウリジン  ３４（１．２ｇ，４．０２ｍモル）をピリジン（２０ｍＬ）中に溶解した。ピリジン（１０ｍＬ）中のＤＭＴ−Ｃｌ（１．５ｇ，４．４２ｍモル）の溶液を１５分間にわたり滴下により添加した。得られる混合物を室温で１２時間撹拌し，そしてＭｅＯＨ（２ｍＬ）を添加して反応のクエンチングを行った。この混合物を減圧濃縮し，そしてその残渣をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）中に溶解し，そして飽和ＮａＨＣＯ3，水，次いで食塩水で洗浄した。有機抽出物をＭｇＳＯ4に通して脱水し，減圧濃縮し，そして溶出液としてＣＨ2Ｃｌ2中の２〜５％  ＭｅＯＨを用いるシリカゲルカラムに通して精製して５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−メトキシカルボニルミチリジン−ウリジン  ３５（２．０３ｇ，３．４６ｍモル，８６％）を取得した。
【０５２９】
実施例８８：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−メトキシカルボニルメチリジン−ウリジン  ３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（３６）
無水ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）中に溶解される１−（２’−デオキシ−２’，２’−メトキシカルボニルメチリジン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−ウリジン  ３５（２．０ｇ，３．４ｍモル）をＡｒ下で丸底フラスコに入れた。ジイソプロピルエチルアミン（１．２ｍＬ，６．８ｍモル）を添加し，その後に２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．９１ｍＬ，４．０８ｍモル）を滴下により添加した。この反応混合物を室温で２時間撹拌し，そしてエタノール（１ｍＬ）でのクエンチングを行った。１０分後に，この混合物をシロップ状物にまるまで減圧蒸発させた（４０℃）。５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−メトキシカルボニルメチリジン−ウリジン  ３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）  ３６（１．８ｇ，２．３ｍモル，６７％）を，溶出液として１％のトリエチルアミンを含むヘキサン中の３０〜６０％  ＥｔＯＡｃ濃度勾配液を用いるシリカゲルを通すフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。Ｒf  ０．４４（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９．５：０．５）。
【０５３０】
実施例８９：２’−デオキシ−２’−カルボキシメチリジン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン  ３７
２’−デオキシ−２’−メトキシカルボニルメチリジン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン  ３３（５．０ｇ，１０．８ｍＬ）をＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中に溶解し，そして１Ｎ  ＮａＯＨ溶液（５０ｍＬ）を室温でその撹拌溶液に添加した。この混合物を２時間撹拌し，そしてＭｅＯＨを減圧除去した。水層のｐＨを１Ｎ  ＨＣｌ溶液で４．５に調節し，ＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）での抽出を行い，食塩水で洗浄し，ＭｇＳＯ4に通して脱水し，そして減圧濃縮して粗生成の酸を取得した。２’−デオキシ−２’−カルボキシメチリジン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−ウリジン  ３７（４．２ｇ，７．８ｍモル，７３％）を，ＣＨ2Ｃｌ2中の１０〜１５％のＭｅＯＨの濃度勾配液を用いてシリカゲルカラム上で精製した。
【０５３１】
本発明のアルキル置換化ヌクレオチドは，酵素開裂もしくはアンチセンスという状況における使用について先に論議された安定なオリゴヌクレオチドを形成するのに用いることが可能である。そのようなオリゴヌクレオチドは標準的方法により三リン酸形態を用いて酵素的に形成することが可能である。そのようなオリゴヌクレオチドの投与は標準的方法による。Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９４／０２５９５号を参照されたい。
【０５３２】
３’および／または５’ジハロホスホネートを含むオリゴヌクレオチド
本発明は，３’および／または５’ジハロホスホネート−（例えば，３’−もしくは５’−ＣＦ2−ホスホネート−）置換化ヌクレオチド（これは，酵素的分子もしくはアンチセンス分子の酵素活性および／またはヌクレアーゼ耐性を維持もしくは亢進させる）を合成および使用する。
【０５３３】
本出願において用いられる際には，用語「５’−および／または３’−ジハロホスホネートヌクレオチド含有性リボザイム，デオキシリボザイム（Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第９４／１１６４９号（これは引用により本明細書に取り込まれる）を参照されたい），およびヌクレオチドのキメラ」は，二本鎖ステム，一本鎖「触媒性コア」配列，一本鎖ループ，もしくは一本鎖認識配列（しかし，これらには限定されない）を置換する５’−および／または３’−ジハロホスホネートヌクレオチド構成成分を含む触媒性核酸分子である。これらの分子は個別のＲＮＡもしくはＤＮＡ分子をヌクレオチド塩基配列特異的様式で開裂（好ましくは，反復的に開裂）することが可能である。このような触媒性核酸は更に，所望される場合には分子内開裂を行うように作用することも可能である。このような酵素性分子は，実際にいずれかのＲＮＡもしくはＤＮＡ転写物を標的とすることが可能である。本発明は，標準的ヌクレオチドもしくは修飾化ヌクレオチドを構成する核酸に関し，これらのヌクレオチドは更に少なくとも一つの５’−ジハロホスホネートおよび／または一つの３’−ジハロホスホネート基を含む。
【０５３４】
１−Ｏ−メチル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノース  ５−デオキシ−５−ジハロメチルホスホネートからの３段階での１−Ｏ−Ａｃ−２，３−ジ−Ｏ−Ｂｚ−Ｄ−リボフラノース  ５−ｄ−５＋ジハロメチルホスホネートの合成が記載される（例えば，図８７中のジフルオロについて）。適切な誘導化を施してあるこの糖とシリル化ピリミジンおよびプリンとの縮合により新規のヌクレオシド  ５’−デオキシ−５’−ジハロメチルホスホネートが取得される。これらの中間体を，化学的手法（ヌクレオシド  ５’−デオキシ−５’−ジハロメチルホスホネートの，適切な保護化を施してあるホスホルアミダイト  １２ａもしくは固体支持体  １２ｂ（例えば，図８８）への転化），あるいは酵素的手法（Ｔ７  転写のためのヌクレオシド  ５’−デオキシ−５’−ジハロメチルホスホネートのそれらのトリホスホネートへの転化（例えば，図８８の１４））のいずれかにより触媒性核酸もしくはアンチセンス核酸内に取り込ませることができる。
【０５３５】
従って一つの態様では，本発明は，５’および／または３’−ジハロヌクレオチド，ならびに５’−および／または３’−ジハロヌクレオチドを含む核酸を特徴とする。このような分子の一般構造が以下に示される。
【化１】
2005118056.tif 000002
［式中，Ｒ1はＨ，ＯＨ，もしくはＲであり，Ｒはヒドロキシル保護基（例えば，アシル，アルキシリル，もしくはカルボネートであり；各Ｒ2は個別にＨ，ＯＨ，もしくはＲであり；各Ｒ3は個別にホスホネート保護基（例えば，メチル，エチル，シアノエチル，ｐ−ニトロフェニル，もしくはクロロフェニル）であり；各Ｘは個別にいずれかのハロゲンであり；そして各Ｂはいずれかのヌクレオチド塩基である］。
【０５３６】
本発明は特に，そのような修飾化ヌクレオチドおよび酵素活性を有する核酸分子を特徴とする。関連態様では，本発明はジハロホスホネート−含有性糖のピリミジンもしくはプリンとの，ヌクレオシド  ５’−デオキシ−５’−ジハロホスホネートおよび／または３’−デオキシ−３’−ジハロホスホネートを形成するのに適する条件下での縮合によるそのようなヌクレオシド  ５’−デオキシ−５’−ジハロおよび／または３’−デオキシ−３’−ジハロホスホネートの合成のための方法を特徴とする。
【０５３７】
ホスホン酸は，それらがリン酸エステルに類似しているため重要な生物学的特性を呈することがある（Ｅｎｇｅｌ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．  １９７７，７７，３４６−３６７）。ＢｌａｃｋｂｕｒｎおよびＫｅｎｔ（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  １９８６，９１３−９１７）により，電子的および立体化学的考察に基づくと，＿−フルオロおよび＿，＿−ジフルオロメチルホスホネートは対応するホスホネートよりもホスホネートエステルに一層類似していることが示される。ピロ−および三リン酸  １のアナログ［この場合，結合性酸素原子がジフルオロメチレン基により置換される］が酵素過程における基質として利用されている（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９８５，４，１６５−１６７；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｒ．  １９８６，２６，２１−２４）。９−（５，５−ジフルオロ−５−ホスホノペンチル）グアニン（２）が，プリンヌクレオシドホスホリラーゼの多重基質アナログインヒビターとして利用されている（Ｈａｌａｚｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １９９１，１１３，３１５−３１７）。ホスホルジエステル  ５’−酸素の代わりにメチレン基を含むオリゴヌクレオチドは，リンと５’−酸素との間のホスホジエステル結合を開裂するヌクレアーゼに対する耐性を示すが（Ｂｒｅａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９３，３２，９１２５−９１２８），依然として相補的配列と安定な複合体を形成することが可能である。Ｈｅｉｎｅｍａｎｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９１，１９，４２７−４３３）は，単一の３’−メチレンホスホネート結合がＤＮＡ１０量体二重らせんの立体配座に微妙な影響を与えることを見いだした。
【０５３８】
【化２】
2005118056.tif 000003
【０５３９】
α，α−ジフルオロ−アルキルホスホネートに至るための一つの一般的合成アプローチは，ジエチル（リチオジフルオロメチル）ホスホネート（３）による適切な反応性基質からの遊離基の置換を特徴とする（Ｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  １９８２，２３，２３２３−２３２６）。しかしながら，３を用いて５’−デオキシ−５’−ヨードヌクレオシドからヌクレオシド  ５’−デオキシ−５’−ジフルオロ−メチルホスホネートを合成するという我々の試みは不成功に終わり，すなわち，出発化合物が定量的に回収されてしまったのである。ヌクレオシド  ５’−アルデヒドの３との反応は，Ｍａｒｔｉｎら（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  １９９２，３３，１８３９−１８４２）によると，生成物の複合体混合物をもたらしてしまうとのことである。最近では，３を用いる第一級糖酸トリフラートからの糖α，α−ジフルオロアルキルホスホネートの合成が記載された（Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．  １９９３，５８，６１７４−６１７６）。不運なことに我々の経験では，ヌクレオシド  ５’−トリフラートは不安定すぎてこれらの合成に用いることができない。
【０５４０】
以下のものは，ヌクレオシド  ５’−デオキシ−５’−ジフルオロメチル−ホスホネートの合成法を示す非制限的実施例である。当業者は，等価方法をこれらの実施例に基づいて容易に考案することが可能であることを認識するであろう。これらの実施例は，良好な収率での５’−デオキシ−５’−ジフルオロ誘導体の合成を達成し，そしてそのため当業者をそのような等価方法に導くことが可能であることを示す。これらの実施例は更に，既述の有用なオリゴヌクレオチドを提供するための合成法の利用性も示す。
【０５４１】
当業者は，有用な修飾化酵素的核酸（そのような多くのものがＤｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第９４／１３１２９号により記載されており，この特許は引用により図面を含み本明細書に取り込まれる）を今度は設計することか可能であることを認識するであろう。
【０５４２】
実施例９０：ヌクレオシド  ５’−デオキシ−５’−ジフルオロメチルホスホネートの合成
図８７を参考に，我々は，ヌクレオシド  ５’−ジフルオロメチレンホスホネートの合成のための主要中間体として作用する既知のＤ−リボース  α，α−ジフルオロ−メチルホスホネート（４）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  １９９２，３３，１８３９−１８４２）から適切なグリコシル化試薬を合成した。
【０５４３】
メチル  ２，３−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノース  α，α−ジフルオロ−メチルホスホネート（４）を，Ｍａｒｔｉｎら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  １９９２，３３，１８３９−１８４２）の方法に従って５−アルデヒドから合成した（図８７）。イソプロピリデン基の除去は緩和な条件下（Ｉ2−ＭｅＯＨ，還流１８時間（Ｓｚａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  １９８６，２７，３８２７）もしくはＤｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ８（Ｈ＋），ＭｅＯＨ，室温（約２０〜２５℃），３日間）の条件下で達成し，７２％の収率を得た。このようにして取得されたアノマー混合物を塩化ベンゾイル／ピリジンでベンゾイル化させて２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル誘導体を取得し，これを緩和なアセトリシス条件（Ｗａｌｃｚａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９３，７９０−７９２）（Ａｃ2Ｏ，ＡｃＯＨ，Ｈ2ＳＯ4，ＥｔＯＡｃ，０℃）に供した。所望される１−Ｏ−アセチル−２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−Ｄ−リボフラノース  ジフルオロメチルホスホネート（５）は，アノメリック混合物として定量的収率で取得された。これらの誘導体を，Ｖｏｒｂｒｕｇｇｅｎ条件（Ｖｏｒｂｒｕｇｇｅｎ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＮＡＴＯ  ＡＳＩ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ａ，２６，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８０；ｐｐ．３５−６９）下でのシリル化ウラシルおよびＮ4−アセチルシトシンの選択的グルコシル化に用いた。β−ヌクレオシドを取得する目的では（６２％  ６ａ，７５％  ６ｂ）グリコシル化触媒としてのＦ3ＣＳＯ2Ｓｉ（ＣＨ3）3の使用は除外されており，それはその使用により所望されない１−エチルウラシルもしくは９−エチルアデニン副産物がもたらされることが予想されるためである：Ｐｏｄｙｕｋｏｖａ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９８７，２８，３６２３−３６２６，および本明細書に引用される引用文献）（触媒としてのＳｎＣｌ4，沸騰アセトニトリル）。同一条件下でのシリル化  Ｎ6−ベンゾイルアデニンのグリコシル化により，Ｎ−９異性体  ６ｃとＮ−７異性体  ７との混合物が，それぞれ３４％と１５％との収率で取得された。先のヌクレオチドはエチル基の開裂用の臭化トリメチルシリルを用い，その後にアシル保護基を除去する目的でのアンモニア−メタノールでの処理を行うことにより首尾よく脱保護化された。ヌクレオシド  ５’−デオキシ−５’−ジフルオロメチルホスホネート  ８は最終的には，溶出用に０．０１〜０．２５Ｍ  ＴＥＡＢ濃度勾配液を用いるＤＥＡＥセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）  Ａ−２５（ＨＣＯ3-）カラム上で精製し，そしてそれらのナトリウム塩として取得された（８２％  ８ａ；８７％  ８ｂ；８２％  ８ｃ）。
【０５４４】
選択された分析データ：31Ｐ−ＮＭＲ（31Ｐ）および1Ｈ−ＮＭＲ（1Ｈ）をＶａｒｉａｎ  Ｇｅｍｉｎｉ  ４００上で記録した。ｐｐｍでの化学シフトは各々Ｈ3ＰＯ4およびＴＭＳを参照としている。溶媒は特別な記載が他になされていない限りＣＤＣｌ3であった。
【０５４５】
【化３】
2005118056.tif 000004
【０５４６】
化合物  ７をアンモニアのメタノール溶液で脱アシル化させて，λmax（Ｈ2Ｏ）２７１ｎｍおよびλmin２３３ｎｍを示す生成物を取得し，このことによりグリコシル化部位がＮ−７であることが立証された。
【０５４７】
実施例９１：コアを含む改変化ヌクレオチドを含む核酸の合成
用いられた合成方法は，Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １９８７，１０９，７８４５−７８５４中およびＳｃａｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９０，１８，５４３３−５４４１において記載される通常のＲＮＡ合成用の方法に従い，かつ通常の核酸保護用およびカップリング用の基（例えば，５’−末端のジメトキシトリチル，および３’−末端のホスホロアミダイト）を利用する（図８８，およびＪａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９，２４４：４３７−４４０）。これらのヌクレオシド  ５’−デオキシ−５’−ジフルオロメチルホスホネートはシュモクザメ（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）のリボザイム中にばかりでなく，ヘアピン構造をとる肝炎デルタウイルス，グループ１もしくはグループ２のイントロン中，あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチド中にも取り込まれることがある。従ってこれらはいずれかの核酸構造において一般的に用いられるものである。
【０５４８】
実施例９２：修飾化三リン酸の合成
先のヌクレオチドのトリホスフェート誘導体は，図８９に示される要領で，既知の方法に従って形成することが可能である。Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍ．，Ｌｅｒｏｙ  Ｂ．Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９１，ｐｐ３３７−３４０；Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｋａｒｌ  Ｈｅｉｎｚ  Ｓｃｈｅｉｔ；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８０，ｐｐ．２２１−２１８。
【０５４９】
３’ジハロホスホネートについての等価合成スキームが図９０および９１に示され，これには当業者に認識される命名法が用いられている。これらの条件は標準的方法により至適化することが可能である。
【０５５０】
本明細書に記載されるヌクレオシド  ジハロホスホネートはいずれかの核酸構造（例えば，触媒的もしくはアンチセンス）中の修飾化ヌクレオチドとして有利であり，それはそれらがインビボにおいては通常非修飾化核酸を分解するエキソ−およびエンドヌクレアーゼに対する耐性を示すためである。それらは更にそれらが取り込まれる核酸の通常の構造を不安定にさせることがなく，そのためその構造に関連するいずれかの活性が維持される。これらの化合物は更に，抗ウイルス剤および／または抗腫瘍剤としてモノマーで用いられることもある。
【０５５１】
アミドもしくはペプチド修飾を有するオリゴヌクレオチド
本発明は，リボヌクレオチド部分の２’−ヒドロキシル基を２’−アミドもしくは２’−ペプチド部分で置換する。他の態様では，ヌクレオチドの糖の３’および５’部分が置換されることがあるか，あるいはホスフェート基がアミドもしくはペプチド部分で置換されることがある。一般的にはこのようなヌクレオチドは以下の式Ｉに示される一般構造を有する：
【化４】
2005118056.tif 000005
【０５５２】
塩基（Ｂ）は標準的塩基の内のいずれか一つであるか，あるいは当業者に知られる修飾化ヌクレオチド塩基であるか，あるいは水素基であることが可能である。追加的に，Ｒ1もしくはＲ2のいずれかはＨ，あるいは２と１０の間の炭素原子もしくは水素を含むアルキル，アルケン，もしくはアルキン基，アミン（第一級，第二級，もしくは第三級アミン（例えば，Ｒ3ＮＲ4［式中，各Ｒ3およびＲ4は独立に水素，または２と１０との間の炭素原子を有するアルキル，アルケン，もしくはアルキンであるか，またはアミノ酸の残基（すなわち，アミド）である］，アルキル基，あるいはアミノ酸（ＤもしくはＬ形態）もしくは２と５との間のアミノ酸を含むペプチドである。ジグザグの線は水素，あるいは当業者に知られる他の塩基もしくは他の化学部分に対する結合を表す。Ｒ1，Ｒ2，およびＲ3の内の一つがＨであり，そして他のものがアミノ酸もしくはペプチドであることが好ましい。
【０５５３】
本出願人は，ＲＮＡはＤＮＡと比較するとより一層複雑な構造形態を採ることが可能であると認識しており，それはＲＮＡ中の２’−ヒドロキシル基の存在のためである。この基は，そのＲＮＡ分子内に含まれる他の水素ドナー，アクセプター，および金属イオンに追加的水素結合を提供することが可能である。本出願人は今回は，２’の位置に修飾化アミン基を有する分子を提供するが，そのアミン基の存在の結果，有意に一層複雑な構造がその修飾化オリゴヌクレオチドにより形成されることが可能となる。２’−アミドもしくはペプチド基でのこのような修飾により，側鎖水素結合ネットワークの拡充および濃縮がもたらされる。これらのアミドおよびペプチド部分はオリゴヌクレオチドの複雑な構造形成の原因であり，そして他の塩基との強力な複合体を形成し，かつ標準的な塩基対形成相互作用を妨害することが可能である。このような妨害により複雑な核酸および蛋白質複合体の形成が可能となるであろう。
【０５５４】
本発明のオリゴヌクレオチドは現存のオリゴヌクレオチドと比較すると有意に一層安定であり，かつそのオリゴヌクレオチドによりこれまではオリゴヌクレオチドにとって可能ではなかった生物学的に活性な生物複合体を形成することが可能になる公算が強い。これらを更に，独特なアプタマー（ａｐｔｅｒｍｅｒ），すなわち標的蛋白質，核酸，もしくは多糖にとっての有効なリガンド内に組み込まれることが可能なランダムに作製されたオリゴヌクレオチドのインビトロでの選択に用いることもできる。
【０５５５】
従って，ある態様では本発明は，先の式Ｉに示される修飾化塩基を含むオリゴヌクレオチドを特徴とする。
【０５５６】
他の態様では，オリゴヌクレオチドは３’もしくは５’に位置するアミノ酸もしくはアミノアシル基を有する３’もしくは５’ヌクレオチドを含むことがある。これら全ての態様，ならびに２’−修飾化ヌクレオチドでは，様々な標準的修飾物を作製することが可能であることが理解されるであろう。例としては，「Ｏ」を「Ｓ」で置換することができ，糖が塩基を有さないことがあり（無塩基性（ａｂａｓｉｃ）），そしてホスホネート部分が修飾されて他の置換基を含むことがある（Ｓｐｒｏａｔ，上述，を参照されたい）。
【０５５７】
実施例９３：２’−アミノアシル−２’−デオキシ−２’−アミノヌクレオシド複合体の製造のための一般方法
図９２を参照にして，メタノール［ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）も用いることが可能である］中の２’−デオキシ−２’−アミノ  ヌクレオシド（１ｍモル），ならびにＮ−Ｆｍｏｃ  Ｌ−（もしくはＤ−）アミノ酸（１ｍモル）の溶液に，１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）［もしくは，１−イソブチルオキシカルボニル−２−イソブチルオキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＩＩＤＱ）］（２ｍモル）を添加し，そしてこの反応混合物を室温でかもしくは最高５０℃までで３〜４８時間撹拌する。溶媒を減圧除去し，そして残渣であるシロップ状物を，ジクロロメタン中の１〜１０％のメタノールを用いるシリカゲルのカラム上でのクロマトグラフィーにかけた。生成物を含む分画を濃縮して，８５〜９５％にわたる範囲の収率で白色泡状物を取得した。構造を複合体の1Ｈ  ＮＭＲスペクトルにより確認するが，そのスペクトルにより，その分子のヌクレオシドおよびアミノアシル部分についての正しい化学シフトが示される。構造の更に進んだ確認はアミノアシル保護基を適切な条件下で開裂し，そして完全に脱保護化が行われた複合体用の1Ｈ  ＮＭＲ共鳴値を割り当てることにより取得される。
【０５５８】
既述の部分的に保護された複合体は，標準的方法を用いてそれらの５’−Ｏ−ジメトキシトリチル誘導体および３’−ホスホルアミダイトに転化される（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４）。ＲＮＡ内へのこれらのホスホルアミダイトの取り込みは標準的な方法を用いて実施された（Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，上述）。
【０５５９】
本発明のオリゴヌクレオチドについての一般的脱保護化プロトコールが図９３に示されている。
【０５６０】
そのスキームは２’−ｄ−２’−アミノウリジンの複合体の合成を示している。これは非制限的実施例であることが意味され，かつ当業者はこの合成プロトコールに対する変法を容易に作製して他のヌクレオチド（例えば，アデノシン，シチジン，グアノシン）および／または無塩基部分を合成することが可能であることを認識するであろう。
【０５６１】
実施例９４：２’−アミノアシル修飾基を含むシュモクザメ（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）のリボザイムによるＲＮＡ開裂
部位Ｎ（図９４を参照されたい）を標的とするシュモクザメ（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）リボザイムは既述の要領で固相合成を用いて合成される。Ｕ４およびＵ７の位置が個別にか，もしくは併せて，２’−ＮＨ−アラニンもしくは２’−ＮＨ−リシンで修飾される。
【０５６２】
インビトロでのＲＮＡ開裂アッセイ：基質ＲＮＡを［γ−32Ｐ］−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を用いて５’−ラベル化する。開裂反応はリボザイム「過剰」条件下で実施した。微量の（≦１ｎＭ）の５’−末端ラベル化基質および４０ｎＭの非ラベル化リボザイムに個別に，９０℃への２分間の加熱および１０〜１５分間の氷上での急冷による変性および再生を施す。このリボザイムおよび基質を個別に，５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ2を含む緩衝液中，３７℃で１０分間インキュベートする。反応は，リボザイム溶液と基質溶液との混合および３７℃でのインキュベーションにより開始させる。５μｌのアリコートを一定の時間間隔を空けて採取し，そしてこの反応を同一容量の２×  ホルムアミドストップミックスとの混合によりクエンチングさせた。試料を２０％変性用ポリアクリルアミドゲル上で分離させる。結果の定量を行い，そして開裂を受けた標的ＲＮＡのパーセンテージを時間の関数としてプロットする。
【０５６３】
図９５を参照にすると，Ｕ４およびＵ７の位置に２’−ＮＨ−アラニンもしくは２’−ＮＨ−リシン修飾を含むシュモクザメ（ｈａｍｍｅｒｄｅａｄ）リボザイムは標的ＲＮＡを効率よく開裂する。
【０５６４】
図９４に列挙される配列ならびに図９５に記載される修飾物は，非制限的実施例であることを意味する。当業者は，他の２’−ヒドロキシ基修飾基（これにはアミノ酸，ペプチド，およびコレステロールが含まれるが，これらには限定されない）を含むリボザイムおよびＲＮＡの変異体（塩基置換体，欠失体，挿入体，突然変異体，化学修飾体）を当該技術分野において知られる技術を用いて容易に作製することが可能であることを認識するであろうし，かつそれらは本発明の範囲内に含まれる。
【０５６５】
実施例９５：ＲＮＡの３’−末端のアミノアシル化
Ｉ．  図９６を参照して，ヌクレオチドの３’−ＯＨ基をＧａｉｔ（上述）により記載されるコハク酸エステルに転化させる。これをアミノ−アルキル固体支持体（例えば：ＣｐＧ）に結合させることが可能である。ジグザグの線は３’−ＯＨ基とその固体支持体との結合を示す。
【０５６６】
ＩＩ．  アミノアシル−誘導化固体支持体の製造
Ａ）Ｏ−ジメトキシトリチル（Ｏ−ＤＭＴ）アミノ酸の合成
図９７を参照して，無水ピリジン（１５ｍｌ）中のＬ−（もしくはＤ−）セリン，チロシン，またはスレオニン（２ｍモル）の溶液に塩化４，４’−ジメトキシトリチル（３ｍモル）を添加し，そしてその反応混合物を室温（２０〜２５℃）で１６時間撹拌した。その後にメタノール（１０ｍＬ）を添加し，そしてその溶液を減圧蒸留した。この残渣であるシロップ状物を５％のＮａＨＣＯ3水溶液とジクロロメタンとの間で分配し，有機層を食塩水で洗浄し，脱水し（Ｎａ2ＳＯ4），そして減圧濃縮した。この残渣を，ジクロロメタン（０．５％のピリジンを含む）中の２〜１０％メタノールを用いるフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製する。生成物を含む分画を合わせ，そして減圧濃縮して白色泡状物を取得する（収率７５〜８５％）。
【０５６７】
Ｂ）固体支持体の製造およびアミノ酸でのその誘導化
図９７を参照して，修飾化固体支持体（標準的ＮＨ2末端基の代わりにＯＨ基を有する）を，Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  １９８７，２８，５１９９に従って製造した（ＰはアミノプロピルＣＰＧもしくはポリスチレンタイプの支持体を表す）。Ｏ−ＤＭＴもしくはＮＨ−モノメトキシトリチル（ＮＨ−ＭＭＴ）アミノ酸を先の固体支持体に，この固体支持体の誘導化用の標準方法（Ｇａｉｔ，１９８４，上述）を用いて連結させて，アミノ酸とその支持体との間に塩基−不安定性エステルの結合を作製した。この支持体は，適切な方法で保護されたヌクレオシド  ホスホルアミダイトを用いるＲＮＡ／ＤＮＡ鎖の構築に適する。
【０５６８】
実施例９６：ＲＮＡの５’−末端のアミノアシル化
Ｉ．  図９８を参照して，５’−アミノ−含有性糖部分を既述の要領で合成した（Ｍａｇ  ａｎｄ  Ｅｎｇｅｌｓ，１９８９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７，５９７３）。モノマーの５’−末端のアミノアシル化は既述の要領で達成し，そして５’−アミノアシル化モノマーのＲＮＡホスホルアミダイトをＵｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７（上述）により記載される要領で製造した。その後にこのホスホルアミダイトを，既述の標準的固相合成プロトコールを用いてオリゴヌクレオチドの５’−末端に取り込ませた。
【０５６９】
ＩＩ．  図９９を参照して，アミノアシル基（一つもしくは複数）を，既述の標準方法を用いてＲＮＡの５’−末端のリン酸エステル基に連結させる。
【０５７０】
ＶＩＩ．  復帰遺伝子突然変異
既存の核酸配列の修飾は，相同的組換えによって達成されうる。この過程において，トランスフェクションされた配列は相同染色体配列と再結合し，そして内因性細胞配列に代わりうる。ボッグス（Ｂｏｇｇｓ），８  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ８０，１９９０年は，標的遺伝子修飾を記載している。それは，遺伝子欠損を訂正するための相同ＤＮＡ組換えの使用を論評している。バンガ（Ｂａｎｇａ）およびボイド（Ｂｏｙｄ），８９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１７３５年は，５０塩基オリゴヌクレオチドを用いるインビボでの特定部位の突然変異誘発の具体的な例を記載している。この方法論において，遺伝子または遺伝子セグメントは，用いられたオリゴヌクレオチドによって本質的に置換えられる。
【０５７１】
本発明は相補的オリゴヌクレオチドを用いて，ヌクレオチド修飾活性が野生型への突然変異またはその同等のことを変更する（または復帰する）ように，遺伝子（ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）上の特定の部位にヌクレオチド塩基変更活性を配置する。突然変異の復帰または変更により，本発明者は，野生型表現型への機能的復帰をもたらす第二部位での突然変異の場合のように，広義の意味での復帰を意味する。更に，遺伝コードの縮重のために，復帰突然変異体は，三つのコドン位置のいずれか一つを変更することによって達成されうる。更に，有害な遺伝子（または転写物）中の停止コドンの生成を，ここで，突然変異表現型の野生型への復帰として定義する。この種類の復帰の例は，ヒトの臨界的ＨＩＶプロウイルス遺伝子中の停止コドンの生成である。
【０５７２】
図１００および図１０１を論及すると，大まかに，突然変異を野生型へ復帰させるためには特定部位の変更を引き起こす二つの方法がある。一つにおいて（図１００），オリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡを特異的に標的にする。ＲＮＡは，標的分子中のそれと相補的な（ワトソン・クリック）オリゴヌクレオチド配列を伴って与えられる。この場合，配列修飾オリゴヌクレオチドは，（アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムと同様に）それが細胞によって作られる時にＲＮＡを復帰させるように継続して存在しているべきであろう。このような復帰は一時的であると考えられ，しかも更に多くの配列修飾オリゴヌクレオチドを連続的に加える必要があるかもしれないと考えられる。この方法の一時的性質は，（伝統的薬物によるのと同様に）配列修飾オリゴヌクレオチドを単純に除去することによって処置を停止させうるという利点である。
【０５７３】
第二の方法はＤＮＡを標的とし（図１０１），標的細胞の遺伝コード中に変更が永久にコードされうるという利点を有する。したがって，処置の一つの過程（またはいくつかの過程）が遺伝病の永久的復帰をもたらすことがある。誤った染色体突然変異が導入された場合，これが癌を引き起こすことがあるし，他の遺伝子を突然変異させることがあるし，または（出産年齢の患者において）生殖系列の遺伝的変化を引き起こすことがある。しかしながら，塩基変更活性が，遺伝子発現を調節しうる特定のメチル化である場合，それは必ずしも生殖系列伝達をもたらさないでろう。レヴィン（Ｌｅｗｉｎ），Ｇｅｎｅｓ，１９８３年  ジョン・ウィルリー・アンド・サンズ・インコーポレーテッド（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｉｎｃ．）ＮＹ  ４９３〜４９６頁を参照されたい。
【０５７４】
一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに対する相補的塩基対合は，オリゴヌクレオチドをＤＮＡの特定部位に対して向ける一つの方法である。これは，ＤＮＡが一本鎖である場合，鎖置換機序によってまたはＤＮＡを標的にすることによって起こりうる（例えば，複製または転写の際に）。もう一つの方法は，二本鎖ＤＮＡに対しする三本鎖結合（三重ラセン形成）の使用であり，それは，ポリピリミジン部分を結合するために確立された技法であり，４ヌクレオチド全部を認識するように拡大しうる。ポヴシク（Ｐｏｖｓｉｃ），Ｔ．，ストローベル（Ｓｔｒｏｂｅｌ），Ｓ．およびダーバン（Ｄｅｒｖａｎ），Ｐ．（１９９２），三重らせん形成によって媒介されたＤＮＡの配列特異的二本鎖アルキル化および開裂，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，５９３４〜５９４４（１９９２）を参照されたい。ノーレ（Ｋｎｏｒｒｅ），Ｄ．Ｇ．，バレンチン（Ｖａｌｅｎｔｉｎ），Ｖ．Ｖ．，バレンチナ（Ｖａｌｅｎｔｉｎａ），Ｆ．Ｚ．，レベデヴ（Ｌｅｂｅｄｅｖ），Ａ．Ｖ．およびフェデロバ（Ｆｅｄｅｒｏｖａ），Ｏ．Ｓ．，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  １〜３６６（ＣＲＣプレス，ノボシビルスク，１９９３年）は，オリゴヌクレオチドに対する反応性基または酵素の結合を記載しており，本明細書中に記載の方法で用いることができる。
【０５７５】
最近，アンチセンスオリゴヌクレオチドは，インビトロにおいてスプライス突然変異グロビン遺伝子の正しいスプライシングを得るために，誤ったスプライスを支配するのに用いられている。ドミンスキ（Ｄｏｍｉｎｓｋｉ）Ｚ；コール（Ｋｏｌｅ）Ｒ（１９９３），アンチセンスオリゴヌクレオチドによるサラセミアプレｍＲＮＡ中の正しいスプライシングの回復，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：８６７〜７。同様に，本発明の一つの好ましい実施態様においては，既存の突然変異ＲＮＡを訂正するのに，アンチセンスによってそのＲＮＡを阻害する伝統的方法の代わりに相補的オリゴマーを用いる。
【０５７６】
ＲＮＡかまたはＤＮＡ様式において，ＲＮＡまたはＤＮＡ上の特定部位に対する結合後，オリゴヌクレオチドは核酸配列を修飾する。これは，内因性酵素を活性化することによって（図１０２を参照されたい），オリゴヌクレオチドに対して結合した（または二重らせんによって活性化した）酵素（またはリボザイム）の適当な配置によって，または化学的突然変異原の適当な配置によって達成されうる。特定の突然変異原，例えば，Ｃを脱アミノしてＵにする亜硝酸が最も有用であるが，有害なＲＮＡの失活が望まれる場合，他のものも用いることができる。
【０５７７】
ＲＮＡ修正は，哺乳動物細胞中において天然に存在することであり，そこにおいて配列修飾活性は，転写後にＲＮＡをその適切な配列に修正する。ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ），Ｍ，シングル（Ｓｉｎｇｌｅ），Ｆ，コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ），Ｍ，ソマー（Ｓｏｍｍｅｒ），Ｂ．およびシーバーグ（Ｓｅｅｂｕｒｇ），Ｐ．（１９９３），ＡＭＰＡ受容体サブユニットＧｌｕＲ−ＢのＲＮＡ修正：塩基対合イントロン−エキソン構造は位置および効率を決定する，Ｃｅｌｌ  ７５：１３６１〜１３７０。ＲＮＡ修正に関与する機構は，化学的修飾を促進するのに適当なオリゴヌクレオチドによって選択されうる。
【０５７８】
本発明の方法によって生成された塩基の変化は，直接的にかまたは正常細胞機序によるＤＮＡ修復後にヌクレオチド配列の変化を引き起こす。これらの変化は，遺伝子欠損を機能的に訂正するかまたは停止コドンを導入する。したがって，本発明は，活性化学基（例えば，アルキル化剤）をアンチセンスまたは三本鎖オリゴヌクレオチドに対して結合して標的ＲＮＡまたはＤＮＡを化学的に失活させる技法とは異なる。
【０５７９】
したがって，本発明は，核酸分子中の既存の塩基を変化させるので，その塩基はインビボにおいて別の塩基として読み取られる。これは，遺伝子を失活させる代わりに配列を訂正することを包含するが，有害な遺伝子を失活させることも包含しうる。
【０５８０】
したがって，一つの態様において，本発明は，天然に存在する突然変異核酸分子のヌクレオチド塩基配列をインビボで変更する方法を特徴とする。該方法は，インビボにおいて核酸分子を，該核酸分子と一緒に二重らせんまたは三重らせん分子を生成することができるオリゴヌクレオチド若しくはペプチド核酸または他の配列特異的結合分子と接触させることを含む。二重らせんまたは三重らせん分子の生成後，塩基修飾活性は，化学的にまたは酵素的に，標的塩基を直接的にまたはインビボでの核酸修復後に変更する。これは，核酸配列の機能的変更を引き起こす。
【０５８１】
本文脈において用いられる「変更する」とは，１個または複数の標的塩基中の１個またはそれ以上の化学的部分を，突然変異核酸が機能的に異なるように変更することを意味する。したがって，これは，ＤＮＡの欠損を訂正する従来の方法，例えば，標的配列の完全なセグメントが，トランンスフェクションされた核酸からのＤＮＡのセグメントによって置換えられる相同的組換えとは異なる。これはまた，この方法が，標的の配列を単に損傷させる代わりに，それをポリメラーゼによって元の塩基とは別の塩基として読み取らせることによってそれを機能的に訂正するという点において，反応性基を用いてＲＮＡまたはＤＮＡ標的を失活させる他の方法とも異なる。上記のように，細胞中の天然に存在する酵素は，化学的変更を引き起こすのに用いることができ，その例を以下に与える。
【０５８２】
「機能的に変更する」とは，標的核酸の正常な機能を果たすその能力（すなわち，転写または翻訳制御）を変化させることを意味する。例えば，ＲＮＡ分子は，それが望ましいタンパク質の生産を引き起こしうるように変更されうるし，またはＤＮＡ分子は，ＤＮＡ修復の際にＤＮＡ配列が変化するように変更されうる。
【０５８３】
「突然変異体」とは，正常個体に存在する同等の分子と比較して同様に変更される核酸分子を意味する。このような突然変異体は当該技術分野において周知であり，既知の遺伝子欠損症，例えば，筋ジストロフィーまたは糖尿病等の個体に存在する分子がある。それは，更に，遺伝子の異常な発現を特徴とする疾患または症状，例えば，癌，サラセミアおよび鎌状赤血球貧血並びに嚢胞性線維症の個体を包含する。それは，動脈疾患を減少させる脂質代謝，組込まれたＡＩＤＳゲノムおよびＡＩＤ  ＲＮＡの処置並びにアルツハイマー病の調節を可能にする。したがって，本発明は，「野生型」表現型および／または遺伝子型を提供する突然変異体中の塩基の変更に関する。有害な症状に対して，これは，必要に応じて発現を可能にするまたは発現を妨げるように塩基を変更することを包含する。ＨＩＶなどの感染を処置する場合，それは，突然変異体（すなわち，非ヒト遺伝子）の野生型への突然変異（すなわち，非ヒトタンパク質の非生産）によるＨＩＶ  ＲＮＡ中の遺伝子の失活に関する。このような調節は，従来の方法でのようなシスでよりもむしろトランスで達成される。
【０５８４】
好ましい実施態様において，オリゴヌクレオチドは，アデニン塩基をイノシンに変換させるようにインビボでｄｓＲＮＡデアミナーゼを活性化するのに十分な長さであり（少なくとも１２塩基，好ましくは１７〜２２塩基）；該オリゴヌクレオチドは，塩基を化学的に修飾するように活性な酵素核酸分子であり（以下を参照されたい）；該核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡであり；該オリゴヌクレオチドは化学的突然変異原を包含し，例えば，該突然変異原は亜硝酸であり；そして該オリゴヌクレオチドは５−メチルシトシンを脱アミノ化してチミジンに，シトシンをウラシルに，若しくはアデニンをイノシンにさせるし，またはシトシンをメチル化して５−メチルシトシンにさせる。
【０５８５】
最も好ましい実施態様において，本発明は，突然変異を引き起こすことによる標的の失活よりもむしろ，突然変異の訂正を特徴とする。
【０５８６】
インビトロで支配された展開を用いると，ＲＮＡ開裂とは異なる触媒活性を有するリボザイムのスクリーニングが可能である。バーテル（Ｂａｒｔｅｌ），Ｄ．およびゾスタク（Ｓｚｏｓｔａｋ），Ｊ．（１９９３），ランダム配列の大プールからの新規リボザイムの単離，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１〜１４１８。インビトロで支配されて展開するこれらの方法を用いると，ホスホジエステル主鎖を切断する代わりに，酵素核酸分子，または塩基を突然変異させるリボザイムを選択することができる。これは，本発明において用いるための適当な塩基配列修飾活性を有する酵素を得る好都合な方法である。
【０５８７】
配列修飾活性は，一つのヌクレオチドを別のものに変化させることができる（またはヌクレオチドが細胞機序によって修復されるようにヌクレオチドを別のヌクレオチドに修飾する）。配列修飾活性はまた，１個またはそれ以上のヌクレオチドを欠失させるかまたは配列に加えうる。付加配列の具体的な実施態様は，サレンジャー（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ）およびセフ（Ｃｅｃｈ），ＰＣＴ／ＵＳ９４／１２９７６号明細書（本明細書中に援用された）によって記載されており，ここにおいて，野生型配列を有する完全なエクソンはスプライシングされて突然変異体転写物になる。本発明は，数個の塩基（１〜３個）の付加のみを特徴とする。
【０５８８】
したがって，もう一つの態様において，本発明は，別個の核酸分子中の既存の塩基の化学的構造を変化させる活性なリボザイムまたは酵素核酸分子を特徴とする。出願人は，このような分子が有用でありうることを初めて決定し且つこのような分子がどのように単離されうるかを説明している。
【０５８９】
現場復帰を達成するのに用いられる分子は，リポソームおよび陽イオン脂質複合体を含めた，アンチセンス分子およびリボザイムを誘導するのに用いられた既存手段を用いて誘導することができる。現場復帰分子がＲＮＡだけから成る場合，発現ベクターは，アンチセンスまたはリボザイム発現ベクターと同様に，復帰分子を内因的に生産する遺伝子療法プロトコルで用いることができる。このような発現ベクターの使用には，標準的な遺伝子療法によって遺伝子を単純に置換えるよりもむしろ，いくつかの利点がある。第一に，このアプローチは，訂正された遺伝子の生産を，その遺伝子を既に発現している細胞に限定するであろう。更に，訂正された遺伝子は，その天然の転写プロモーターによって適切に調節されるであろう。最後に，復帰は，突然変異ＲＮＡが機能タンパク質を優先的に獲得させる場合（例えば，鎌状赤血球貧血の場合）に用いることができ，その場合，突然変異ＲＮＡの訂正は，有害な突然変異タンパク質の生産を停止させ且つ訂正されたタンパク質を生産させるのに必要である。
【０５９０】
内因性哺乳動物ＲＮＡ修正系
１９８０年代中頃に，ある種の細胞性ＲＮＡの配列は，それらをコードしているＤＮＡ配列とは異なることが観察された。ＲＮＡ修正と称する過程により，細胞性ＲＮＡは翻訳後修飾されて，（ａ）翻訳開始および終結コドンを生成し，（ｂ）ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡが機能的コンホメーションに折りたたまれることを可能にする（論評については，バス（Ｂａｓｓ）Ｂ．Ｌ．（１９９３），Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ，Ｒ．ゲステランド（Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ），Ｒ．およびアトキンス（Ａｔｋｉｎｓ），Ｊ．監修（コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク；ＣＳＨラブ・プレス（Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ））の３８３〜４１８頁を参照されたい）。ＲＮＡ修正過程は，ヌクレオチドの修飾，欠失および挿入を包含する。
【０５９１】
ＲＮＡ修正過程は下等真核生物の間では広範囲にわたっているが，極めて少数（４種類）のＲＮＡだけが哺乳動物において修正が行われると報告されている（バス，上記）。哺乳動物系において優先的に存在するＲＮＡ修正様式は塩基修飾である（Ｃ→ＵおよびＡ→Ｇ）。哺乳動物系におけるＲＮＡ修正機序は，Ｃ→Ｕ変換がシチジンデアミナーゼによって触媒されると仮定される。Ａ→Ｇ変換の機序は，ラットＰＣ１２細胞中のグルタミン酸受容体Ｂサブユニット（ｇｌｕＲ−Ｂ）に対して最近報告された（ヒグチ，Ｍら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５，１３６１〜１３７０）。ヒグチによれば，ｇｌｕＲ−Ｂ  ｍＲＮＡ前駆体は，イントロン１１およびエクソン１１が安定なステム・ループ構造を形成しうるような構造になっている。このステム・ループ構造は，核内二本鎖特異的アデノシンデアミナーゼ酵素の基質である。脱アミノ化は，Ａ→Ｉの変換を引き起こす。逆転写に続く二本鎖合成は，Ａの代わりにＧの組込みをひきおこす。
【０５９２】
本発明においては，内因性デアミナーゼ活性または他のこのような活性を用いて，標的塩基修飾を達成することができる。
【０５９３】
以下は，塩基のインビボ変換を達成することができる異なる方法を例証する本発明の実施例である。これらは，本発明の具体的な実施態様を明確にするためにのみ与えられており，本発明を制限するものではない。当業者は，同等の方法を請求の範囲の範囲内で容易に考案しうることを理解するであろう。
【０５９４】
実施例９７：イノシン変換物質に対する細胞性ｄｓＲＮＡ依存性アデニンの利用
大部分の哺乳動物細胞およびアフリカツメガエル卵母細胞における内因性活性は，二本鎖ＲＮＡ中においてアデノシンの約５０％をイノシンに変換する（バス，Ｂ．Ｌ．およびワイントラウブ（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ），Ｈ．（１９８８），二本鎖ＲＮＡ基質を共有結合によって修飾する巻き戻し活性，Ｃｅｌｌ，５５，１０８９〜１０９８）。この活性は，突然変異の現場復帰をＲＮＡレベルで引き起こすのに用いることができる。実証のために図１０２および図１０４を論及すると，停止コドンはジストロフィンのコーディング部分に組込まれ，それが受容体遺伝子ルシフェラーゼに融合される。この停止コドンは，アデニンをイノシンに変換するｄｓＲＮＡデアミナーゼを活性化するのに十分な長さのアンチセンスＲＮＡを標的にすることによって復帰することができる。Ａ−Ｉトランジションは，若干の場合Ａ−Ｇトランジションと同様にリボソームによって読み取られ，それによって停止コドンを機能的に復帰させる。この部分の他のＡはＩに変換されうるし且つＧとして読み取られうるが，Ａ−Ｉ（Ｇ）の変換は停止コドンを生じることができない。標的突然変異の周囲部分のＡ−Ｉトランジションは若干の点突然変異を生じるが，しかしながら，ジストロフィンタンパク質の機能は，点突然変異では希にしか失活しない。
【０５９５】
次に，復帰したｍＲＮＡを細胞溶解産物中に翻訳し且つルシフェラーゼ活性について検定した。図１０３のグラフのルシフェラーゼ計数の劇的増加によって明らかであるように，Ａ−ＩトランジションはＡ−Ｇトランジションと同様にリボソームによって読み取られ，そして停止コドンは，該溶解産物で処理された複合体によって首尾よく復帰した。対照として，無関係の非相補的ＲＮＡオリゴヌクレオチドをジストロフィン／ルシフェラーゼｍＲＮＡに加えた。予想通り，この場合，停止コドンのために翻訳（ルシフェラーゼ活性）は見られない。更に別の対照として，ハイブリッドを抽出物によって処理しなかったが，再度翻訳（ルシフェラーゼ活性）は見られない（図１０３）。
【０５９６】
標的部分の他のＡはＩに変換されうるし且つＧとして読み取られうるが，Ａ−Ｉ（Ｇ）の変換は停止コドンを生じることができないので，リボソームはなおその部分によって読み取る。読み取り枠が維持されている場合，概して，ジストロフィンは点突然変異に対して感受性ではないので，この方法によって復帰したｍＲＮＡから製造されたジストロフィンタンパク質は十分な活性を維持しているはずである。
【０５９７】
方法論についての以下の詳論：ＲＮＡオリゴヌクレオチドを，３９４（ＡＢＩ）合成機においてホスホルアミダイト化学を用いて合成した。突然変異ジストロフィン配列に対して結合する合成相補的ＲＮＡの配列は下記の通りである（５′〜３′）。
ＣＣＣＧＣＧＧＴＡＧＡＴＣＴＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＴＴＡＣＡＧＴＴＴＴＣＴＡＣＡＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＡＡ（配列番号１）
【０５９８】
図１０４を論及すると，停止コドンを含むヒトジストロフィン突然変異体配列の５４塩基対を，枠内においてルシフェラーゼコーディング領域に対して標準的なクローニング技術を用いて融合して，ｐＲＣ−ＣＭＶ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），サン・ディエゴ，ＣＡ）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ部位にした。ルシフェラーゼのＡＵＧを削除した。ＨｉｎｄＩＩＩ部位からルシフェラーゼコーディング領域の開始までのインサートの配列（５′〜３′）は，  ＧＣＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＴＧＧＡＧＧＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＧＧＴＴＴＧＴＧＧＡＡＡＡＣＴＧＴＡＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＡＴＣＴＡＣＣＧＣＧＧ（配列番号２）
である。
【０５９９】
これは，３′末端にＳａｃＩＩ部位を有する正常ジストロフィン（エントレツ（Ｅｎｔｒｅｚ）ＩＤ＃３１１６２７）の塩基対３６４９〜３７０８に対応する。このプラスミドを，製造者プロトコル（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ），マディソン，ＷＩ）によってＴ７ポリメラーゼを用いるｍＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型として用いた。
【０６００】
アフリカツメガエル核抽出物を，０．５Ｘ  ＴＧＫＥＤ緩衝液（０．５Ｘ＝２５ｍＭトリス（ｐＨ７．９），１２．５％グリセロール，２５ｍＭ  ＫＣｌ，０．２５ｍＭ  ＤＴＴおよび０．０５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中において核をかきまぜることによって調製し且つ卵母細胞の全細胞質容量に等しい量の０．５Ｘ  ＴＧＫＥＤ中に再懸濁させた。バス，Ｂ．Ｌ．およびラワイントラウブ，Ｈ．，Ｃｅｌｌ  ５５，１０８９〜１０９８（１９８８）。
【０６０１】
５００ｎｇ／μｌの標的ｍＲＮＡを，７０℃まで加熱し且つそれを徐々に３７℃まで３０分間にわたって冷却することによって１マイクロモルの相補的または無関係のＲＮＡオリゴヌクレオチドに対してプレアニーリングした。ＲＮＡオリゴヌクレオチドに対してプレアニーリングされたｍＲＮＡ  ５０ナノグラムを，１ｍＭ  ＡＴＰ，１５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１６００ｕｎ／ｍｌのＲＮアシンおよび１２．５ｍＭトリス，ｐＨ８を含む核抽出物７μｌに対して加え，全容量を１２μｌにした。バス，Ｂ．Ｌ．およびラワイントラウブ，Ｈ．，上記。ｄｓＲＮＡデアミナーゼ活性を有するこの混合物を，２５℃で３０分間インキュベートした。次に，この混合物１．５μｌを，ウサギ網状赤血球溶解産物インビトロ翻訳混合物に対して加え，そして１．３ｍＭ酢酸マグネシウムを更に加えて，核抽出物から一貫しているＥＤＴＡを補ったこと以外は製造者プロトコル（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ゲイサーズバーグ，ＭＤ）にしたがって２時間翻訳した。ルシフェラーゼ検定は，プロメガルシフェラーゼ検定システム（プロメガ，マディソン，ＷＩ）を用いて抽出物１５μｌについて行い，そして９６ウェルルミノメーターを用いてルミネセンスを検出したが，その結果は図１０２のグラフで示す。
【０６０２】
実施例９８：塩基変更活性
反応性基に対して結合したアンチセンスおよび三本鎖形成オリゴマーの化学合成は十分に研究され且つ特性決定された（ノーレ，Ｄ．Ｇ．，バレンチン，Ｖ．Ｖ．，バレンチナ，Ｆ．Ｚ．，レベデヴ，Ａ．Ｖ．およびフェデロバ，Ｏ．Ｓ．，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  １〜３６６（ＣＲＣプレス，ノボシビルスク，１９９３年）並びにポヴシク，Ｔ．，ストローベル，Ｓ．およびダーバン，Ｐ．，三重らせん形成によって媒介されたＤＮＡの配列特異的二本鎖アルキル化および開裂，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，５９３４〜５９４４（１９９２））。標的ＲＮＡまたはＤＮＡ中のヌクレオチド塩基を修飾しうるアルキル化剤などの反応性基は，オリゴヌクレオチドに対して結合された。更に，核酸を修飾する酵素はオリゴヌクレオチドに対して結合された（ノーレ，Ｄ．Ｇ．，バレンチン，Ｖ．Ｖ．，バレンチナ，Ｆ．Ｚ．，レベデヴ，Ａ．Ｖ．およびフェデロバ，Ｏ．Ｓ．，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  １〜３６６（ＣＲＣプレス，ノボシビルスク，１９９３年））。従来，これらの結合した化学基または酵素は，アンチセンスまたは三本鎖相互作用によって特異的に標的にされるＤＮＡまたはＲＮＡを失活させるのに用いられてきた。以下は，本明細書中に記載のように（図１００〜１０４を参照されたい）突然変異の現場復帰を達成するために，アンチセンスまたは三本鎖相互作用によって標的にされたＤＮＡまたはＲＮＡの配列を変更するのに用いうる有用な塩基変更活性のリストである。
【０６０３】
１．  チミジンを生成する５−メチルシトシンの脱アミノ化（酵素シチジンデアミナーゼによって行われた（バス，Ｂ．Ｌ．，Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），コールド・スプリング・ハーバー，１９９３年）中）。更に，亜硝酸または関連化合物は，Ｔで読み取られるＣの酸化的脱アミノ化を促進する（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，デービッド・フライフェルダー（Ｄａｖｉｄ  Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ），ジョーンズ・アンド・バートレット・パブリッシャーズ・インコーポレーテッド（Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．），ボストン，１９８７年，２２６〜２３０頁）。更に，ヒドロキシルアミンまたは関連化合物は，Ｔで読み取られるＣを変換しうる（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，デービッド・フライフェルダー，ジョーンズ・アンド・バートレット・パブリッシャーズ・インコーポレーテッド，ボストン，１９８７年，２２６〜２３０頁）。
【０６０４】
２．  ウラシルを生成するシトシンの脱アミノ化（酵素シチジンデアミナーゼによって（バス，Ｂ．Ｌ．，Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，コールド・スプリング・ハーバー，１９９３年）中）または酸化的脱アミノ化を促進する亜硝酸と同様の化学基によって（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，デービッド・フライフェルダー，ジョーンズ・アンド・バートレット・パブリッシャーズ・インコーポレーテッド，ボストン，１９８７年，２２６〜２３０頁）行われた）。
【０６０５】
３．  Ｇ（イノシン）のように読み取られるアデニンの脱アミノ化（アデノシンデアミナーゼ，ＡＭＰデアミナーゼまたはｄｓＲＮＡ脱アミノ化活性によって行われる（バス，Ｂ．Ｌ．，Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，コールド・スプリング・ハーバー，１９９３年）中））。
【０６０６】
４．  ５−メチルシトシンへのシトシンのメチル化
【０６０７】
５．  アルキニトロソ尿素によってシトシンとして読み取られるＯ2−メチルチミジン（またはＯ2−メチルウラシル）へのチミジン（またはウラシル）の変換（スー（Ｘｕ）およびスワン（Ｓｗａｎｎ），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５：３０３〜３０６（１９９４））。
【０６０８】
６．  突然変異原メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）を用いて行うことができる（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，デービッド・フライフェルダー，ジョーンズ・アンド・バートレット・パブリッシャーズ・インコーポレーテッド，ボストン，１９８７年，２２６〜２３０頁），アデニンとして読み取られる６−Ｏ−メチル（または他のアルキル）へのグアニンの変換（メータ（Ｍｅｈｔａ）およびルドルム（Ｌｕｄｌｕｍ），Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，５２１：７７０〜７７８（１９７８））。
【０６０９】
７．  シトシンへのウラシルのアミノ化（細胞酵素ＣＴＰシンテターゼによって行われる（バス，Ｂ．Ｌ．，Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，コールド・スプリング・ハーバー，１９９３年）中））。
【０６１０】
以下は，本発明において用いることができる有用な化学的修飾の例である。一つの塩基を別の塩基に変更しうる好ましい簡単な化学的修飾が僅かにある。適当な突然変異原性化学物質，例えば，亜硝酸またはこのような活性を有する適当なタンパク質は標的オリゴヌクレオチド上におかれる。このような化学物質およびタンパク質は，標準法によって結合することができる。これらは，特定の技術的アプローチとは無関係に有用であると考えられる基本的化学変化を導入する分子を含む。レヴィン，Ｇｅｎｅｓ，１９８３年，ジョン・ウィルリー・アンド・サンズ・インコーポレーテッド，ＮＹ，４２〜４８頁を参照されたい。
【０６１１】
以下のマトリックスは，記述された化学的修飾がＲＮＡまたはＤＮＡにおいてトランスバージョン復帰（ピリミジン対ピリミジンまたはプリン対プリン）を引き起こしうるということを示す。トランスバージョン（ピリミジン対プリンまたはプリン対ピリミジン）は，これらがより難しい化学的変換であるの好ましくない。脚注は，特定の望ましい化学的変換を示す。肉太活字脚注は，対向するＤＮＡ鎖に対する反応を示す。例えば，ＡをＧに変更することが望まれる場合，これは，ＤＮＡレベルにおいて対向鎖のＴをＣに変更する反応＃５を用いることによって達成されうる。この実施例において，Ａ／Ｔ塩基対はＡ／Ｃになり，ＤＮＡが複製されるかまたはミスマッチ修復が起こる場合，これはＧ／Ｃになりうるし，したがって元のＡはＧに変換された。
【０６１２】
【化５】
2005118056.tif 000006
【０６１３】
１  チミジンを生成する５−メチルシトシンの脱アミノ化。
２  ウラシルを生成するシトシンの脱アミノ化。
３  Ｇ（イノシン）のように読み取られるアデニンの脱アミノ化。
４  ５−メチルシトシンへのシトシンのメチル化。
５  シトシンとして読み取られるＯ2−メチルチミジン（またはＯ2−メチルウラシル）へのチミジン（またはウラシル）の変換（スーおよびスワン，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５：３０３〜３０６（１９９４））。
６  アデニンとして読み取られる６−Ｏ−メチル（または他のアルキル）へのグアニンの変換（メータおよびルドルム，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，５２１：７７０〜７７８（１９７８））。
７  シトシンへのウラシルのアミノ化。バス，上記，図６ｃ。
【０６１４】
インビトロ選択計画
図１０５を論及すると，このような塩基変更活性を有するリボザイムについて選択する方法を記載した図を提供する。ひとりでに折り返されるＲＮＡを設計する（これは，ＲＮＡリガーゼについて選択するのに既に用いられた方法と同様である，バーテル，Ｄ．およびゾスタク，Ｊ．（１９９３），ランダム配列の大プールからの新規リボザイムの単離，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１〜１４１８）。修飾される塩基の反対側の縮重ループは多様性を与える。緩衝液中において分子のこのライブラリーをインキュベートした後，ＲＮＡをＤＮＡに逆転写し（すなわち，インビトロ展開プロトコルにおいて標準を用いて），そして次に，塩基変化があるＤＮＡを選択する。制限酵素切断およびサイズ選択またはその同等のことを用いて，適当な塩基変化のあるＤＮＡの部分を単離する。続いて，サイクルは何度も繰り返されうる。
【０６１５】
インビトロ選択（展開）計画は，ジョイス（Ｊｏｙｃｅ）（ボードリ（Ｂｅａｕｄｒｙ），Ａ．Ａ．およびジョイス，Ｇ．Ｆ．（１９９２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７，６３５〜６４１；ジョイス，Ｇ．Ｆ．（１９９２），Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２６７，９０〜９７）およびゾスタク（バーテル，Ｄ．およびゾスタク，Ｊ．（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１〜１４１８；ゾスタク，Ｊ．Ｗ．（１９９３），ＴＩＢＳ  １７，８９〜９３）によって開発された方法と同様である。簡単にいうと，核酸のランダムプールを合成し，ここにおいてそれぞれのメンバーは二つのドメインを含み，（ａ）一つのドメインは，規定された（既知の）ヌクレオチド配列を有する部分から成り；（ｂ）第二ドメインは，縮重（ランダム）配列を有する部分から成る。既知のヌクレオチド配列ドメインは，（１）標的に対して結合する核酸（突然変異ヌクレオチドに隣接した部分），（２）相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成およびそれらの塩基修飾活性について選択された分子のＰＣＲ増幅，（３）クローニングの目的のための制限エンドヌクレアーゼ部位の導入を可能にする。縮重ドメインは，完全にランダム（ランダム部分中のあらゆる位置に示された４ヌクレオチドのそれぞれ）であるように生成されうるしまたは縮重は部分的でありうる（ボードリ，Ａ．Ａ．およびジョイス，Ｇ．Ｆ．（１９９２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７，６３５〜６４１）。本発明において，縮重ドメインは，縮重ドメインが突然変異塩基（修飾のために標的にされる塩基）から反対側に置かれるように，既知の配列を含む部分に隣接している（図１０５を参照されたい）。核酸のこのランダムライブラリーを，核酸が塩基修飾の触媒作用を促進するコンホメーションに折りたたまれることを確実にする条件下でインキュベートする（反応プロトコルは，更に，選択が一層緊縮になるように，ＡＴＰ若しくはＧＴＰまたはＳ−アデニルメチオニン（メチル化が望まれる場合）のようなある種の補助因子を含んでいてよい）。インキュベーション後，核酸は相補的ＤＮＡに変換される（核酸の出発プールがＲＮＡである場合）。塩基修飾を有する（突然変異塩基位置に）核酸は，残りの核酸集団から種々の方法によって分離することができる。例えば，制限エンドヌクレアーゼ切断部位は，塩基修飾の結果として生成されうるかまたは廃止されうる。制限エンドヌクレアーゼ部位が塩基修飾の結果として生成される場合，ライブラリーは制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）によって消化されうる。ＲＥによって切断される集団部分は，塩基修飾反応を触媒することができた集団である（活性プール）。ＤＮＡの新規部分（ＰＣＲのためのオリゴヌクレオチドプライマー結合部位およびクローニングのためのＲＥ部位を含む）を活性プールの末端に連結して，ＰＣＲ増幅および引続きの選択サイクル（必要ならば）を容易にする。最もよい塩基修飾活性を有する核酸の最終プールをプラスミドベクター中にクローン化し且つ細菌宿主中に形質転換する。次に，組換え体プラスミドを形質転換細菌から単離することができ，そしてクローンの同定はＤＮＡ配列決定技術を用いて決定することができる。
【０６１６】
塩基修飾酵素核酸（インビトロ選択によって識別される）は，インビボでの化学的修飾を引き起こすのに用いることができる。
【０６１７】
更に，リボザイムは，酵素的塩基変更活性を有するタンパク質を特異的に結合するように展開されうる。
【０６１８】
このようなリボザイムを用いて，上記化学的修飾をインビボで引き起こすことができる。リボザイムまたは上記アンチセンス型分子は，上記に言及された技術において論及された方法によって投与することができる。
【０６１９】
ＶＩＩＩ．  核酸の投与
出願人は，転写終結シグナルを欠いている二本鎖核酸を，エンコードされたＲＮＡの連続的発現に用いることができることを確認した。これは，Ｒループ，すなわち，二本鎖核酸と非共有結合したＲＮＡ分子で，二本鎖核酸中に局在化変性（「バブル」形成）を引き起こすものの使用によって達成される（トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）ら，１９７６年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６，２２９４）。更に，出願人は，ＲループのＲＮＡ部分を用いてＲループ複合体全体を望ましい細胞内または細胞部位に集中させ，そして該複合体の細胞内取込みを助けることができることを確認した。更に，出願人は，酵素的に活性なＲＮＡまたはリボザイムの発現が，このようなＲループ複合体の使用によって有意に促進されうることを示している。
【０６２０】
したがって，一つの態様において，本発明は，細胞または組織中への酵素核酸の導入のための方法を特徴とする。酵素核酸をコードしている第一核酸と第二核酸分子との複合体を提供する。第二核酸分子は，生理学的条件下でＲループ塩基対構造を形成することができるように十分な第一核酸との相補性を有する。Ｒループは，生理学的条件下で第一核酸からのＲＮＡの発現を促進する第一核酸分子の部分に形成される。該方法は，更に，複合体と細胞または組織とを，酵素核酸が該細胞または組織中で生産される条件下で接触させることを包含する。
【０６２１】
「複合体」とは，簡単に，二つの核酸分子が二つの相補的塩基対合配列間の分子間結合形成によって（例えば，水素結合によって）相互作用することを意味する。概して，複合体は，それが第一核酸分子から転写を開始させることができるような生理学的条件下で安定である。
【０６２２】
第一および第二核酸分子は，任意の望ましいヌクレオチド塩基，天然に存在するもの（例えば，アデニン，グアニン，チミンおよびシトシン）かまたは当該技術分野において周知の他の塩基から生成されてよいし，或いは，より大きい安定性またはより大きい複合体形成を達成させるように糖またはリン酸残基に修飾を有していてよい。更に，このような分子は，ヌクレオチドの代わりに非ヌクレオチドを有していてよい。このような修飾は当該技術分野において周知であり，例えば，酵素的ＲＮＡ分子の糖残基に対して行うことができる種々の化学的修飾を記載しているエクスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）ら，国際公開第ＷＯ９２／０７０６５号明細書；ペロー（Ｐｅｒｒａｕｌｔ）ら，１９９０年，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４，５６５；ピーケン（Ｐｉｅｋｅｎ）ら，１９９１年，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，３１４；アスマン（Ｕｓｍａｎ）およびセダグレン（Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ），１９９２年，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；アスマンら，国際公開第ＷＯ９３／１５１８７号明細書；およびロッシ（Ｒｏｓｓｉ）ら，国際公開第ＷＯ９１／０３１６２号明細書，並びにスプロート（Ｓｐｒｏａｔ），Ｂ．，欧州特許出願第９２１１０２９８．４号明細書を参照されたい。これらの刊行物はいずれも本明細書中に援用される。
【０６２３】
「十分な相補性」とは，Ｒループ塩基対構造が，酵素核酸の転写を引き起こす適当な条件下で形成されうるように十分な塩基対合が起こることを意味する。当業者は，このように十分な塩基対を決定することができる日常試験を認識するであろう。概して，約１５〜８０塩基が本発明において十分である。
【０６２４】
「生理学的条件」とは，第一核酸分子によって標的にされる細胞または組織中の条件を意味するが，Ｒループ複合体は多数の他の条件下で生成されうる。一つの例は，３７℃の標準的な生理食塩水の使用であるが，本発明においては，所望の核酸の発現が作用部位で達成されるように，その作用部位にＲループ構造がある程度まで存在することが単に望ましい。Ｒループ構造はそれらの条件下で安定であるのが好ましいが，発現を引き起こす最少量のＲループ構造形成でも十分である。当業者は，特に，第一核酸分子上のプロモーターまたはリーダー配列のいずれかの不存在において，このような発現の測定が容易に達成されることを認識するであろう（ドーブ（Ｄａｕｂｅ）およびヒッペル（ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ），１９９２年，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８，１３２０）。したがって，このような発現は，Ｒループ構造が第二核酸によって正しく形成される場合に達成されうるにすぎない。プロモーターまたはリーダー配列が与えられる場合，Ｒループ構造は，転写が促進されるようにそれらの部分から離れた部位に形成されることが好ましい。
【０６２５】
関連した態様において，本発明は，いったん発現が開始したら，第一核酸が分解するまでそれが続くように，プロモーター部分または転写終結シグナルのいずれかを欠いた第一核酸分子と一緒にＲループ塩基対合構造（上記の）を形成することによる細胞または組織中のリボ核酸の導入のための方法を特徴とする。
【０６２６】
もう一つの関連した態様において，本発明は，望ましい細胞または組織に対してＲループ複合体を集中させるのを助けるであろうタンパク質などの局在化因子，例えば，抗体，トランスフェリン，核局在化ペプチド若しくは葉酸塩または当該技術分野において周知の他のこのような化合物を伴って第二核酸を提供する方法を特徴とする。
【０６２７】
好ましい実施態様において，第一核酸はプラスミド，例えば，プロモーターまたは転写終結シグナルを含まないものであり；第二核酸は，長さが約４０〜２００塩基であり且つ大部分の位置でリボヌクレオチドから生成されていて；そして第二核酸は，リガンド，例えば，核酸，タンパク質，ペプチド，脂質，炭水化物，細胞性受容体，核局在化因子と共有結合しているかまたはマレイミド若しくはチオール基に対して結合していて；第一核酸は，望ましい遺伝子を発現することができるプロモーターを欠いた発現プラスミドであり，例えば，それは，大部分のデオキシリボ核酸によって生成された二本鎖分子であり；Ｒループ複合体は，ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖であり；第一核酸中にはプロモーター部分もリーダー部分も与えられていないし；そしてＲループは，ヌクレオソーム集合を妨げるように修正されていて且つ細胞内転写機序の補充を助けるように設計されている。
【０６２８】
他の好ましい実施態様において，第一核酸は１種類またはそれ以上の酵素核酸をコードし，例えば，それは，インビボでの治療的酵素核酸の放出を可能にする複数の分子内および分子間切断酵素核酸によって生成される。
【０６２９】
更にもう一つの関連した態様において，本発明は，上記第一核酸分子および第二核酸分子の複合体を特徴とする。
【０６３０】
Ｒ−ループ複合体
ＲＮＡポリメラーゼがプラスミドに結合したとき，プラスミドが分解されるまで転写が連続的に起こるような，非インテグレートプラスミドを提供するために，Ｒ−ループ複合体を設計する。これは，４０から２００ヌクレオチドの長さのＲＮＡ分子をＤＮＡ発現プラスミドにハイブリダイズさせ，Ｒ−ループ構造を形成することにより行う（図１０６を参照されたい）。このＲＮＡは，細胞表面レセプターに結合するリガンドとコンジュゲートしたとき，プラスミド／ＲＮＡ−リガンド複合体の内在化の引き金となる。Ｒ−ループの形成は，一般にＤｅＷｅｔ，１９８７  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４５，２３５；Ｎｅｕｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２１，１０１９；およびＭｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６  Ｊ．Ｕｌｔ．Ｍｏｌ．Ｓｔｒ．Ｒｅｓ．９６，１８７に記載されている。したがって，当業者は，当該技術分野の教示にしたがって，本発明の複合体を容易に設計することができる。
【０６３１】
レトロウイルスゲノム中に配置されたプロモーターは，別のプロモーターが終止シグナルとして作用するかまたはポリメラーゼの方向を逆転させるため，常に計画されたようには振る舞わない。プロモーターとレポーター遺伝子との間にＲ−ループを形成させると，トランスフェクション効率が増加するといわれている。ＲＮＡ分子をＲＮＡと相補的な領域を含む二本鎖ＤＮＡ分子とインキュベートすると，安定なＲＮＡ−ＤＮＡヘテロデュープレックスが形成され，ＲＮＡと同一の配列を有するＤＮＡ鎖は，Ｒ−ループと称されるループ−様構造中に置き換えられる。このＤＮＡ鎖の置き換えはＲＮＡ−ＤＮＡデュープレックスがＤＮＡ−ＤＮＡデュープレックスより安定であるために生ずる。また，８０ヌクレオチド長さのＲＮＡを用いてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードするプラスミド中にＲ−ループ構造を生成させたといわれている。Ｒ−ループは，プロモーター領域またはリーダー配列のいずれかにおいて開始された。Ｒ−ループ構造を含むプラスミドをＣＯＳ細胞の細胞質にマイクロインジェクションして，遺伝子発現をアッセイした。プラスミドのプロモーター領域におけるＲ−ループの形成は遺伝子の発現を阻害した。プロモーターと遺伝子の間のリーダー配列に，またはｍＲＮＡの最初の８０ヌクレオチドに直接ハイブリダイズするＲＮＡは，発現レベルを８−１０倍増加させた。提唱されているメカニズムは，Ｒ−ループ形成がヌクレオソームの組立を妨害し，このことによりＤＮＡを転写に対してよりアクセス可能とするというものである。あるいは，Ｒ−ループはＤＮＡ複製または転写のいずれかを促進するＲＮＡプライマーと似ているかもしれない（Ｄａｕｂｅ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ，１９９２，上掲）。
【０６３２】
本発明の顕著な特徴の１つは，選択された発現ベクター中にＲ−ループを生成させ，これらを細胞中に導入して発現ベクターからの増強された発現を達成することである。Ｒ−ループの存在は，細胞の転写機構の動員を助けるであろう。ＲＮＡポリメラーゼがいったんプラスミドに結合して転写を開始すると，このプロセスは終止シグナルに達するまで，またはプラスミドが分解されるまで継続する。
【０６３３】
本発明は細胞中のリボザイムの発現を増加させるであろう。この意図は，転写産物を含有する多数のリボザイムユニットを生成しうるように，転写終止シグナルを有しないプラスミドを構築することである。Ｄｒａｐｅｒ（上掲）に記載されるように，単位長さのリボザイムを遊離させるために，自己プロセシングリボザイムをそれぞれの治療的リボザイムの下流にクローニングすることができる（図１０７を参照されたい）。
【０６３４】
リガンド標的化
本発明の別の顕著な特徴は，Ｒ−ループ構造を発生させるために用いられるＲＮＡをリガンド（核酸，蛋白質，ペプチド，脂質，炭水化物等）に共有結合させうることである。特異的リガンドは，リガンドが所望の細胞表面レセプターに選択的に結合しうるように選択することができる。このリガンド−レセプター相互作用は，Ｒ−ループを含有するプラスミドの内在化を助けるであろう。すなわち，ＲＮＡを用いて，遺伝子が細胞のある特定の領域に局在化するように，リガンドをＤＮＡに結合させる。いくつかの方法の１つを用いて，リガンドをＲＮＡに結合させることができる。これは，末端第１アミンを有する６炭素のスペーサーを含むデオキシチミジンをＲＮＡに取り込ませることを含む（図１０８を参照されたい）。このアミノ基は，葉酸塩等のリガンドで直接誘導化することができる（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｌｏｗ，１９９４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３１９８−３２０４）。末端第１アミン基を有する６炭素のスペーサーを含むＲＮＡを葉酸塩と混合し，混合物を１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等の活性化剤と反応させる。この反応は，望まない副反応を回避するため，１−ヒドロキシベンゾトリアゾールヒドレート（ＨＯＢＴ）の存在下で実施すべきである。
【０６３５】
ＲＮＡはまた，スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）等のヘテロ二官能性架橋剤（またはリンカー）で誘導化することもできる。ＳＭＰＢはマレイミドをＲＮＡ中に導入する。次に，このマレイミドをペプチドまたは蛋白質中のチオール部分と反応させる。また，スクシニルアセチルチオアセテートを用いて，天然に生ずるチオールを欠失した蛋白質またはペプチド中にチオールを導入することもできる。アミノリンカーをＲＮＡの５’末端または３’末端に結合させることができる。ＲＮＡはまた，ＤＮＡとハイブリダイズせず，リンカーをＲＮＡ／ＤＮＡ複合体から離して延長させる一連のヌクレオチドを含んでいてもよく，このことにより，ハイブリダイゼーションを妨害せずにリガンドのそのレセプターへのアクセス可能性を増大させることができる。Ｒ−ループ−ＤＮＡ複合体の取り込みおよび局在化を容易にするために，これらの技術を用いて，核局在化シグナルペプチド（ＮＬＳ）（Ｌａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４  Ｃｅｌｌ  ３７，８０１−８１３；Ｋａｌｄｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４  Ｃｅｌｌ  ３９，４９９−５０９；Ｇｏｌｄｆａｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２，６４１−６４４）等のペプチド，および／またはトランスフェリン（Ｃｕｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，８８５０−８８５４；Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，６０９９−６１０３；Ｇｉｕｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｃｅｌｌ．Ｓｉｇｎａｌ．６，８３−９０）等の蛋白質をＲ−ループ形成ＲＮＡに結合させることができる。Ｒループ形成ＲＮＡの末端に蛋白質を結合させるために，固有のチオールを用いてマレイミドと反応させるか，またはイミノチオレートまたはスクシンイミジルアセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ；Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２，６８）を用いてチオールを蛋白質それ自身に導入することができる。ＳＡＴＡは，０．５Ｍヒドロキシルアミンを用いる追加の脱保護工程を必要とする。
【０６３６】
さらに，リポソームを用いて，当該技術分野でよく知られた技術により，Ｒ−ループ複合体を適当な細胞内部位に送達することができる。例えば，ｐＨ−感受性リポソーム（Ｃｏｎｎｏｒ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，１９８６  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６，３４３１−３４３５）を用いてＤＮＡトランスフェクションを行うことができる。
【０６３７】
Ｒ−ループ複合体の所望の細胞へのリン酸カルシウム介在性またはエレクトロポレーション介在性送達も容易に行うことができる。
【０６３８】
インビトロ選択
インビトロ選択戦略を用いて，ａ）安定なＲ−ループを形成することができる核酸，ｂ）特定の細胞表面レセプターに選択的に結合することができる核酸を選択することができる。次に，これらの核酸を互いに共有結合させる。このことは，レセプター−介在性エンドサイトーシスを用いてＲ−ループ含有プラスミドを効率的に内在化させることを助ける。インビトロ選択（進化（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ））戦略は，Ｊｏｙｃｅ（Ｂｅａｕｄｒｙ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，１９９２  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７，６３５−６４１；Ｊｏｙｃｅ，１９９２  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２６７，９０−９７）およびＳｚｏｓｔａｋ（Ｂａｒｔｅｌ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８；Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９３  ＴＩＢＳ  １７，８９−９３）により開発された方法に類似するものである。簡単には，それぞれのメンバーが２つのドメイン，すなわち，ａ）１つのドメインは，規定された（既知の）ヌクレオチド配列の領域からなり，ｂ）第２のドメインは，縮重（ランダム）配列の領域からなる，を含む核酸のランダムプールを合成する。既知のヌクレオチド配列ドメインは，１）核酸をその標的（二本鎖ＤＮＡの特定の領域）に結合させること，２）Ｒ−ループを形成するその親和性および／または特定のレセプターに結合するその能力について選択された分子の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成およびＰＣＲ増幅，３）クローニングのための制限エンドヌクレアーゼ部位の導入，を可能とする。縮重ドメインは，完全にランダムに（ランダム領域中のすべての位置に４つのヌクレオチドのそれぞれが存在する）作成するか，または縮重は部分的でもよい（Ｂｅａｕｄｒｙ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，１９９２  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７，６３５−６４１）。本発明においては，縮重ドメインは，既知の配列を含む領域にフランキングされている。この核酸のランダムライブラリを，二本鎖ＤＮＡまたは細胞表面レセプターのいずれかに等しく結合することを確実にするような条件下でインキュベートする。インキュベート後，核酸を相補的ＤＮＡに変換する（核酸の出発のプールがＲＮＡの場合）。種々の方法を用いて，所望の性質を有する核酸を残りの核酸の集団から分離することができる（Ｊｏｙｃｅ，１９９２（上掲））。次に，所望の核酸のプールについて，次の選択のラウンドを実施して，最も望ましい特徴を有する集団を濃縮する。次にこれらの分子を適当なベクター中にクローニングする。次に，トランスフォームした細菌から組換えプラスミドを単離し，ＤＮＡ配列決定技術を用いてクローンの同一性を決定することができる。
【０６３９】
他の態様も特許請求の範囲に含まれる。
【０６４０】
表１
リボザイムの特徴
グループＩイントロン
サイズ：約２００から＞１０００ヌクレオチド
標的配列中，切断部位のすぐ５’側にＵを必要とする。
切断部位の５’側で４−６ヌクレオチドに結合する。
このクラスには７５個を越えるメンバーが知られている。Ｔｅｔｏｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  ｒＲＮＡ，真菌ミトコンドリア，クロロプラスト，Ｔ４ファージ，らん藻類，および他のものに見いだされている。
ＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡ  （Ｍ１  ＲＮＡ）
サイズ：約２９０から４００ヌクレオチド
リボヌクレオ蛋白質酵素のＲＮＡ部分。ｔＲＮＡ前駆体を切断して，成熟ｔＲＮＡを形成する。
このグループには約１０個のメンバーが知られており，すべて細菌由来のものである。
ハンマーヘッドリボザイム
サイズ：約１３から４０ヌクレオチド
切断部位のすぐ５’側に標的配列ＵＨを必要とする。
切断部位の両側で種々の数のヌクレオチドに結合する。
このクラスには１４個のメンバーが知られている。感染剤としてＲＮＡを用いる多くの植物病原体（ウイルソイド）において見いだされている（図１および図２）。
ヘアピンリボザイム
サイズ：約５０ヌクレオチド
切断部位のすぐ３’側に標的配列ＧＵＣを必要とする。
開列部位の５’側の４−６ヌクレオチドおよび３’側の種々の数のヌクレオチドに結合する。
このクラスには３個のメンバーのみが知られている。感染剤としてＲＮＡを用いる３つの植物病原体（タバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡ，アラビスモザイクウイルスおよびチコリイエローモットルウイルス）において見いだされている（図３）。
デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイム
サイズ：５０−６０ヌクレオチド（現在のところ）
最近，標的ＲＮＡの切断が示された。
配列要件は完全には決定されていない。
結合部位および構造的要件は完全には決定されていないが，切断部位の５’側の配列は必要ではない。
このクラスには１個のメンバーのみが知られている。ヒトＨＤＶにおいて見いだされている（図４）。
Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ   ＶＳ  ＲＮＡリボザイム
サイズ：約１４４ヌクレオチド（現在のところ）
最近，標的ＲＮＡの切断が示された。
配列要件は完全には決定されていない。
結合部位および構造的要件は完全には決定されていない。
このクラスには１個のメンバーのみが知られている。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ   ＶＳ  ＲＮＡにおいて見いだされている（図５）。
【０６４１】
【表１】
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【０６４２】
【表２】
2005118056.tif 000008
【０６４３】
【表３】
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【０６４４】
【表４】
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【０６４５】
【表５】
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【０６４６】
【表６】
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【０６４７】
【表７】
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【０６４８】
【表８】
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【０６４９】
【表９】
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【０６５０】
【表１０】
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【０６５１】
【表１１】
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【０６５２】
【表１２】
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【０６５３】
【表１３】
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【０６５４】
【表１４】
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【０６５５】
【表１５】
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【０６５６】
【表１６】
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【０６５７】
【表１７】
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【０６５８】
【表１８】
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【０６５９】
【表１９】
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【０６６０】
【表２０】
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【０６６１】
【表２１】
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【０６６２】
【表２２】
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【０６６３】
【表２３】
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【０６６４】
【表２４】
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【０６６５】
【表２５】
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【０６６６】
【表２６】
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【０６６７】
【表２７】
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【０６６８】
【表２８】
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【０６６９】
【表２９】
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【０６７０】
【表３０】
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【０６７１】
【表３１】
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【０６７２】
【表３２】
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【０６７３】
【表３３】
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【０６７４】
【表３４】
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【０６７５】
【表３５】
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【０６７６】
【表３６】
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【０６７７】
【表３７】
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【０６７８】
【表３８】
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【０６７９】
【表３９】
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【０６８０】
【表４０】
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【０６８１】
【表４１】
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【０６８２】
【表４２】
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【０６８３】
【表４３】
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【０６８４】
【表４４】
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【０６８５】
【表４５】
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【０６８６】
【表４６】
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【０６８７】
【表４７】
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【０６８８】
【表４８】
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【０６８９】
【表４９】
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【０６９０】
【表５０】
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【０６９１】
【表５１】
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【０６９２】
【表５２】
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【０６９３】
【表５３】
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【０６９４】
【表５４】
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【０６９５】
【表５５】
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【０６９６】
【表５６】
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【０６９７】
【表５７】
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【０６９８】
【表５８】
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【０６９９】
【表５９】
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【０７００】
【表６０】
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【０７０１】
【表６１】
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【０７０２】
【表６２】
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【０７０３】
【表６３】
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【０７０４】
【表６４】
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【０７０５】
【表６５】
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【０７０６】
【表６６】
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【０７０７】
【表６７】
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【０７０８】
【表６８】
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【０７０９】
【表６９】
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【０７１０】
【表７０】
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【０７１１】
【表７１】
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【０７１２】
【表７２】
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【０７１３】
【表７３】
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【０７１４】
【表７４】
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【０７１５】
【表７５】
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【０７１６】
【表７６】
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【０７１７】
【表７７】
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【０７１８】
【表７８】
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【０７１９】
【表７９】
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【０７２０】
【表８０】
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【０７２１】
【表８１】
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【０７２２】
【表８２】
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【０７２３】
【表８３】
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【０７２４】
【表８４】
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【０７２５】
【表８５】
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【０７２６】
【表８６】
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【０７２７】
【表８７】
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【０７２８】
【表８８】
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【０７２９】
【表８９】
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【０７３０】
【表９０】
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【０７３１】
【表９１】
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【０７３２】
【表９２】
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【０７３３】
【表９３】
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【０７３４】
【表９４】
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【０７３５】
【表９５】
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【０７３６】
【表９６】
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【０７３７】
【表９７】
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【０７３８】
【表９８】
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【０７３９】
【表９９】
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【０７４０】
【表１００】
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【０７４１】
【表１０１】
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【０７４２】
【表１０２】
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【０７４３】
【表１０３】
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【０７４４】
【表１０４】
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【０７４５】
【表１０５】
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【０７４６】
【表１０６】
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【０７４７】
【表１０７】
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【０７４８】
【表１０８】
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【０７４９】
【表１０９】
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【０７５０】
【表１１０】
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【０７５１】
【表１１１】
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【０７５２】
【表１１２】
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【０７５３】
【表１１３】
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【０７５４】
【表１１４】
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【表１１５】
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【０７５６】
【表１１６】
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【０７５７】
【表１１７】
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【０７５８】
【表１１８】
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【０７５９】
【表１１９】
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【図面の簡単な説明】
【０７６０】
【図１】図１はハンマーヘッドリボザイムドメインの図解的描写である。
【図２】図２はハンマーヘッドリボザイムドメインの図解的描写である。
【図３】図３はヘアピンリボザイムの一般的な構造の図解的描写である。
【図４】図４はデルタ肝炎ウイルスリボザイムドメインの一般的構造の描写である。
【図５】図５は自己切断ＶＳＲＮＡリボザイムドメインの一般的構造の描写である。
【図６】図６はＲＳＶ株Ａ２の遺伝地図の図解的描写である。
【図７】図７はＲＮＡの固相合成の図解的描写である。
【図８】図８は核酸合成のための環外アミノ保護基の図解的描写である。
【図９】図９はＲＮＡの脱保護の図解的描写である。
【図１０】図１０はリボザイムによるＲＮＡ基質の切断の図解的描写である。
【図１１】図１１は２ポット脱保護のプロトコルの図解的描写である。
【図１２】図１２はＲＮＡホスホルアミダイト化学を用いて合成されたＲＮＡの１ポット脱保護の図解的描写である。
【図１３】図１３は部位Ｂを標的とする３６ｎｔの長さのリボザイムのＨＰＬＣのプロフィールである。
【図１４】図１４は２ポット対１ポット脱保護プロトコルによる脱保護されたリボザイムのＲＮＡ切断活性を比較するグラフである。
【図１５】図１５はホスホロチオエート結合を含むＲＮＡを合成する改良法の図解的描写である。
【図１６】図１６はホスホロチオエート結合を含むリボザイムにより触媒されたＲＮＡ切断反応を示す。
【図１７】図１７は２’−Ｎ−フタルイミド−ヌクレオシド  ホスホルアミダイトの合成の図解的描写である。
【図１８】図１８はシリルエーテルを用いたＲＮＡの固相合成のための従来法，およびＳＥＭを２’保護基として用いる本発明の方法の図解的描写である。
【図１９】図１９はＲＮＡ合成に有用な２’ＳＥＭ−保護ヌクレオシドおよびホスホアミダイトの合成の図解的描写である。
【図２０】図２０は２’ヒドロキシル基のＴＢＤＭＳ保護を用いたＲＮＡの保護法の図解的描写である。
【図２１】図２１は２’ヒドロキシル基のＳＥＭ保護を有するＲＮＡの脱保護の図解的描写である。
【図２２】図２２はウリジン酸の完全に脱保護された１０ｍｅｒのＨＰＬＣクロマトグラムの描写である。
【図２３】図２３は自己プロセシングＲＮＡ転写物を含む，ハンマーヘッドリボザイムの図解的描写である。
【図２４】図２４は自己プロセシングＲＮＡ転写物を含むヘアピンリボザイムの図解的描写である。
【図２５】図２５は自己プロセシングＲＮＡ転写物を含む肝炎デルタウイルスリボザイムの図解的描写である。
【図２６】図２６は自己プロセシングカセットをコードする挿入物を含むプラスミドの図解的描写である。
【図２７】図２７はインビトロにおけるＲＮＡ自己プロセシングに及ぼす３’配列の影響を示す。
【図２８】図２８はハンマーヘッドリボザイムにより触媒されたトランス切断反応に及ぼす３’フランキング配列の影響を示す。
【図２９】図２９はＯＳＴ７−１細胞中のＲＮＡ自己プロセシングを示す。
【図３０】図３０はハンマーヘッド自己プロセシングカセットを図解的に描写する。
【図３１】図３１はヘアピン自己プロセシングカセットを図解的に描写する。
【図３２】図３２はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーター構造の図解的描写である。
【図３３】図３３は初期ｔＲＮＡimetおよびΔ３−５転写物の配列である。
【図３４】図３４はΔ３−５ＲＮＡに挿入されたＲＮＡ構造モチーフの図解的描写である。
【図３５】図３５はΔ３−５ベクターで形質導入されたＴ細胞株のリボザイムを定量するノーザン分析の結果を示す。
【図３６】図３６はΔ３−５ベクターで形質導入されたＴ細胞株のリボザイムを定量するノーザン分析の結果を示す。
【図３７】図３７は形質導入されたＭＴ２細胞から抽出された全ＲＮＡ中のリボザイム活性を示す。
【図３８】図３８Ｓ３５で形質導入されたクローンＣＥＭ細胞株のリボザイム発現を示す。
【図３９】図３９はＳ３５で形質導入されたクローンＣＥＭ細胞株の活性レベルを示す。
【図４０】図４０は，Ｓ３５を含むＳ３５の提案された二次構造である。
【図４１】図４１は，所望のＲＮＡ（ＨＨＩ）を含むＳ３５の提案された二次構造である。
【図４２】図４２はＳ３５プラスの提案された二次構造である。
【図４３】図４３はＨＨＩリボザイムを含むＳ３５プラスの提案された二次構造である。
【図４４】図４４は，Ｓ３５のヌクレオチド塩基配列である。
【図４５】図４５は，ＨＨＩＳ３５のヌクレオチド塩基配列である。
【図４６】図４６は，Ｓ３５プラスのヌクレオチド塩基配列である。
【図４７】図４７は，ＨＨＩＳ３５プラスのヌクレオチド塩基配列である。
【図４８】図４８は本発明のｐｏｌＩＩＩ  ＲＮＡの一般式である。
【図４９】図４９は５Ｔ構築物の図解的描写である。
【図５０】図５０は，５Ｔ構築物のみの提案された二次構造を含む。
【図５１】図５１は，所望のＲＮＡ（ＨＨＩリボザイム）含む５Ｔの提案された二次構造を含む。
【図５２】図５２はＴＲＺ−ｔＲＮＡキメラの図解的描写である。所望のＲＮＡ挿入物の位置を示す。
【図５３】図５３は，ＨＨＩＴＲＺ−Ａリボザイムのキメラの一般的な構造を示す。
【図５４】図５４はＨＲＩＴＲＺ−Ａリボザイムのキメラの一般的な構造を示す。
【図５５】図５５は，ＨＨＩＴＲＺ−Ａ，ＨＨＩＴＲＺ−Ｂおよび化学的に合成されたＨＨＩハンマーヘッドリボザイムのＲＮＡ切断活性の比較を示す。
【図５６】図５６は，ウイルスベクターを安定に形質導入されたＴ細胞株中のリボザイムの発現を示す。
【図５７】図５７は，リボザイムを送達するためのアデノ関連ウイルスおよびアデノウイルスベクターの模式図である。
【図５８】図５８は，ライゲーションされたハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムの活性に及ぼすアームの長さの変化の影響を示すグラフである。
【図５９】図５９は，ライゲーションされたＨＨリボザイムによる長い基質（６２２ｎｔ）の切断を示す。
【図６０】図６０は，ライゲーションされたＨＨリボザイムによる長い基質（６２２ｎｔ）の切断を示す。
【図６１】図６１は，ライゲーションされたＨＨリボザイムによる長い基質（６２２ｎｔ）の切断を示す。
【図６２】図６２は，Ｈと名付けられた部位を標的とするハンマーヘッドリボザイム（ＨＨ−Ｈ）の図解的描写である。
【図６３】図６３は，ＨＨ−Ｉおよびその可変物のＲＮＡ切断活性を示す。
【図６４】図６４は，ＨＨ−Ｉおよびその可変物のＲＮＡ切断活性を示す。
【図６５】図６５は，完全長のヘアピンリボザイムを合成するための本発明の方法の図解的描写である。
【図６６】図６６は，部位Ｊを標的とするライゲーションされたヘアピンリボザイムのＲＮＡ切断活性を示す。
【図６７】図６７は，ヘアピンリボザイム／基質複合体の提案された二次構造を示す部位Ｋヘアピンリボザイム（ＨＰ−Ｋ）の図解的描写である。
【図６８】図６８は，部位Ｋを標的とするヘアピンリボザイムによるＲＮＡ切断を示すグラフである。
【図６９】図６９は，部位Ｌヘアピンリボザイム（ＨＰ−Ｌ）であり，ヘアピンリボザイム／基質複合体の提案された二次構造を示す。
【図７０】図７０は，部位Ｌを標的とするヘアピンリボザイムによるＲＮＡ切断を示す。
【図７１】図７１は，部位Ｍヘアピンリボザイム（ＨＰ−Ｍ）であり，ヘアピンリボザイム／基質複合体の提案された二次構造を示す。
【図７２】図７２は，部位Ｍを標的とするヘアピンリボザイムによるＲＮＡ切断を示すグラフである。
【図７３】図７３は，本発明のリボザイムのさまざまな構造修飾を示す。
【図７４】図７４は，示された位置にヌクレオチドスペーサー領域”ｓ”を含むヘアピンリボザイムを示す。
【図７５】図７５は，５’−Ｃ−アルキル修飾ヌクレオチドの構造を示す。
【図７６】図７６は，５’−Ｃ−アルキル−Ｄ−アロースヌクレオチドおよびそのホスホルアミダイトの図解的描写である。
【図７７】図７７は，５’−Ｃ−アルキル−Ｄ−タロースヌクレオチドおよびそのホスホルアミダイトの図解的描写である。
【図７８】図７８は，部位Ｏを標的とする，さまざまな位置において５’−Ｃ−メチル−Ｌ−タロ修飾を含むハンマーヘッドリボザイムの図解的描写である。
【図７９】図７９は，ＨＨ−ＯリボザイムのＲＮＡ切断活性を示す。
【図８０】図８０は，特定の置換を示すハンマーヘッドリボザイムの位置に番号を付したものの図解的描写である。
【図８１】図８１は，さまざまな２’−アルキル修飾ヌクレオチドの構造を示すものである。
【図８２】図８２は，２’−Ｃ−アリルウリジンおよびシチジンの合成の図解的描写である。
【図８３】図８３は，２’−Ｃ−メチレンおよび２’−Ｃ−ジフルオロメチレンウリジンの合成の図解的描写である。
【図８４】図８４は，２’−Ｃ−メチレンおよび２’−Ｃ−ジフルオロメチレンシチジンの合成の図解的描写である。
【図８５】図８５は，２’−Ｃ−メチレンおよび２’−Ｃ−ジフルオロメチレンアデノシンの合成の図解的描写である。
【図８６】図８６は，２’−Ｃ−カルボキシメチリジンウリジン，２’−Ｃ−メトキシカルボキシメチリジンウリジンおよびその誘導されたアミダイトの合成の図解的描写である。
【図８７】図８７は，ヌクレオシド５’−デオキシ−５’−ジフルオロメチルホスホネートの合成の図解的描写である。
【図８８】図８８は，ヌクレオシド５’−デオキシ−５’−ジフルオロメチルホスホネート  ３’−ホスホルアミダイトの，ダイマーおよび固体に支持されたダイマーの合成の図解的描写である。
【図８９】図８９は，ヌクレオシド５’−デオキシ−５’−フルオロメチレン三リン酸の合成の図解的描写である。
【図９０】図９０は，３’−デオキシ−３’−ジフルオロメチルホスホネートおよびダイマーの合成の図解的描写である。
【図９１】図９１は，３’−デオキシ−３’−ジフルオロメチルホスホネートおよびダイマーの合成の図解的描写である。
【図９２】図９２は，本発明の２’−ヒドロキシル基修飾を含むヌクレオチドのＲＮＡホスホルアミダイトの合成の図解的描写である。
【図９３】図９３は，本発明の２’−ヒドロキシル基修飾を含むオリゴヌクレオチドの脱保護法を記載する。
【図９４】図９４は，部位Ｎを標的とするハンマーヘッドリボザイムの図解的描写である。
【図９５】図９５は，本発明の２’−ヒドロキシル基修飾を含むリボザイムのＲＮＡ切断活性を示す。
【図９６】図９６は，本発明の修飾を有するＲＮＡの３’末端の合成（固相合成）の図解的描写である。
【図９７】図９７は，本発明の修飾を有するＲＮＡの３’末端の合成（固相合成）の図解的描写である。
【図９８】図９８は，本発明の修飾を有するＲＮＡの５’末端の合成（固相合成）の図解的描写である。
【図９９】図９９は，本発明の修飾を有するＲＮＡの５’末端の合成（固相合成）の図解的描写である。
【図１００】図１００は，本発明の一般的な図解的描写である。
【図１０１】図１０１は，本発明の一般的な図解的描写である。
【図１０２】図１０２は，本発明の方法の図式的描写である。
【図１０３】図１０３は，図１０４に図解された実験の結果のグラフである。
【図１０４】図１０４は，図１０２に図解された実験に用いられた融合ｍＲＮＡの図解的描写である。
【図１０５】図１０５は，本発明の有用なリボザイムの選択法の図解的描写である。
【図１０６】図１０６は，Ｒループ形成，およびＲループ複合体を一般的に示す。
【図１０７】図１０７は，ユニット長の治療用リボザイムを生成するために自己プロセシングリボザイムを使用する方法を示す。
【図１０８】図１０８は，葉酸塩，炭水化物またはペプチドのようなリガンドをＲＮＡループ形成ＲＮＡに結合させる方法を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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