(57)【要約】    【課題】  核酸の塩基配列やタンパク質のアミノ酸配列を容易に決定できるようにする。    【解決手段】  溶液中で基板１にＲＮＡポリメラーゼ２を固定化すると、ＲＮＡポリメラーゼ２はＤＮＡ３をその内部に取り込み、ＤＮＡ３の塩基配列を鋳型にして、ｍＲＮＡ前駆体４を合成する。走査型トンネル顕微鏡の探針５をピエゾスキャナ６とピエゾスキャナ駆動回路７を用いてＤＮＡ３がＲＮＡポリメラーゼ２の内部に取り込まれる個所の近傍に設置し、ＤＮＡ３との距離をトンネル電流が計測できる一定の距離に保つ。トンネル電流計測回路８によりＤＮＡ３とＳＴＭ探針５の間に流れるトンネル電流を測定し、そのトンネルスペクトルの形状からＤＮＡ３を構成する各塩基の別を識別する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップをその順に備えて生体物質の構造を決定する方法。
（Ａ）生体物質に作用して生体物質を取り込み又は生体物質を送り出す酵素を基板に固定して試料溶液に作用させるステップ、
（Ｂ）前記酵素に取り込まれ又は前記酵素から送り出される生体物質の近傍に走査型トンネル顕微鏡の探針を固定してその探針と生体物質との間に流れるトンネル電流を測定するステップ、及び
（Ｃ）前記トンネル電流の特性によって生体物質を構成する塩基又はアミノ酸の種類を識別するステップ。
【請求項２】
前記トンネル電流の特性は前記探針に印加するバイアス電圧を変化させて得られるトンネルスペクトルの形状である請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記生体物質は核酸であり、前記酵素は核酸の転写、複製、修復、伸長、切断、再結合又は一本鎖への解離を行なうものであり、決定する構造は核酸の塩基配列である請求項1又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記生体物質はタンパク質であり、前記酵素はタンパク質の合成を行なうものであり、決定する構造はタンパク質のアミノ酸配列である請求項1又は２に記載の方法。
【請求項５】
走査型トンネル顕微鏡と、
基板に固定された酵素に取り込まれ又は前記酵素から送り出される生体物質の近傍に前記走査型トンネル顕微鏡の探針を固定する機構と、
前記探針と前記生体物質との間に流れるトンネル電流の特性によって生体物質を構成する塩基又はアミノ酸の種類を識別する演算部と、
を備えた生体物質構造決定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の塩基配列、及びタンパク質のアミノ酸配列を決定する方法と装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
核酸の塩基配列を決定する方法として、電気泳動法に替わるものとして走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）又は原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて構成塩基の種類を直接検知する方法が試みられている。
その1つは、ＤＮＡやＲＮＡを構成する塩基をその形状から識別しようとする方法である（特許文献１参照。）。そこでは、各塩基を水素結合により塩基ごとに形の異なる標識分子で修飾して基板に固定し、それらの標識分子の外形を走査型電子顕微鏡、走査型トンネル顕微鏡又は原子間力顕微鏡を用いて直接観察することにより塩基の種別を識別する。
【０００３】
他の方法として塩基毎の電子状態の違いに注目し、走査型トンネル顕微鏡を用いて塩基の種別を識別することが考えられる。その場合、基板上に固定したＤＮＡやＲＮＡを走査型トンネル顕微鏡の探針で走査し、探針とＤＮＡやＲＮＡの間に流れるトンネル電流からその電子状態を測定することによって塩基の種別を識別することが考えられる。
【特許文献１】特開平５−２４４９９７号公報
【非特許文献１】Yoshie Harada, et. al, Nature, 409, 113-115 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
走査型トンネル顕微鏡などで核酸の塩基種別を直接識別しようとすれば、測定対象となる核酸を基板に固定しなければならない。通常、核酸が基板上に固定される位置は定まっていないため、走査型トンネル顕微鏡などで測定を行なう際には基板の２次元表面内を走査し、測定しようとするＤＮＡなどの位置を確かめた上で改めてＤＮＡなどの塩基の形状や電子状態を測定する必要がある。そのため試料の作成から測定終了までの時間が長くなる問題がある。
【０００５】
また、核酸の塩基種別を外形形状から識別しようとすると、塩基自体の外形上の違いはそれほど顕著には識別できないために、上に紹介したように標識分子で修飾しなければならないという操作上の煩わしさを伴う。
【０００６】
測定対象の生体物質としては核酸に留まらず、タンパク質についてもそのアミノ酸配列を決定することが望まれている。そのため、本発明は核酸及びタンパク質の構造決定を対象とする。
本発明は核酸の塩基配列やタンパク質のアミノ酸配列を容易に決定できる方法と装置を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の生体物質構造決定方法は、以下のステップをその順に備えて生体物質の構造を決定する。
（Ａ）生体物質に作用して生体物質を取り込み又は生体物質を送り出す酵素を基板に固定して試料溶液に作用させるステップ、
（Ｂ）前記酵素に取り込まれ又は前記酵素から送り出される生体物質の近傍に走査型トンネル顕微鏡の探針を固定してその探針と生体物質との間に流れるトンネル電流を測定するステップ、及び
（Ｃ）前記トンネル電流の特性によって生体物質を構成する塩基又はアミノ酸の種類を識別するステップ。
【０００８】
塩基又はアミノ酸の種類を識別するためのトンネル電流の特性の一例は、走査型トンネル顕微鏡の探針に印加するバイアス電圧を変化させて得られるトンネルスペクトルの形状である。
【０００９】
測定する生体物質の第１の例は、ＤＮＡ又はＲＮＡからなる核酸であり、決定する構造は核酸の塩基配列である。その場合、核酸に作用する酵素は、核酸の転写、複製、修復、伸長、切断、再結合又は一本鎖への解離を行なうものである。具体的には、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡプライマーゼ、ヌクレアーゼ、ＲＮＡレプリカーゼ、リボソームなどを挙げることができる。
【００１０】
ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡを鋳型としてｍＲＮＡを合成する酵素で、正確には「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」と呼ばれる。ＲＮＡポリメラーゼの働きによりＤＮＡの情報はＲＮＡに転写されるので、「転写酵素」とも呼ばれる。
ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡの鎖を合成する酵素であり、複製や修復などを行なう。
ＲＮＡプライマーゼはＤＮＡの複写の際に必要なＲＮＡプライマーを合成する酵素である。
【００１１】
ヌクレアーゼは核酸を分解する酵素であり、ＲＮＡを分解するＲＮａｓｅとＤＮＡを分解するＤＮａｓｅに分類できる他、分解の仕方によりエンドヌクレアーゼとエキソフクレアーゼに分類できる。
ＲＮＡレプリカーゼはウイルスの仲間のように一本鎖のＲＮＡを遺伝子として用いる生命体において、ＲＮＡの複製を司る酵素である。
【００１２】
測定する生体物質の第２の例はタンパク質であり、決定する構造はタンパク質のアミノ酸配列である。その場合、タンパク質に作用する酵素は、タンパク質の合成を行なうものである。具体的には、リボソームなどを挙げることができる。
リボソームはｍＲＮＡから各種タンパク質を合成（翻訳）する働きをもつ酵素である。
【００１３】
本発明では、基板に固定されたＤＮＡポリメラーゼやＲＮＡポリメラーゼなどの酵素の中をＤＮＡやタンパク質の複製や転写の作用の過程で一定の方向に進行する核酸やタンパク質をその酵素に取り込まれる位置で又は酵素から送り出される位置で核酸を構成する塩基又はタンパク質を構成するアミノ酸の電子状態を測定するものであるが、そのために酵素を基板に固定する。酵素の固定には種々の方法があってすでに実用化されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【００１４】
本発明の方法を実現する装置は、走査型トンネル顕微鏡と、基板に固定された酵素に取り込まれ又は前記酵素から送り出される生体物質の近傍に前記走査型トンネル顕微鏡の探針を固定する機構と、前記探針と前記生体物質との間に流れるトンネル電流の特性によって生体物質を構成する塩基又はアミノ酸の種類を識別する演算部とを備えている。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法によれば、探針を一度その酵素の入口又は出口近傍に設置しておけば、酵素の働きにより、試料であるＤＮＡやＲＮＡ又はタンパク質が一定の速度で順次探針の直下へ移動してくるため、その後は大きく２次元的走査をすることなく、各塩基やアミノ酸の電子状態を測定することが可能となり、短時間に塩基配列やアミノ酸配列を計測することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、図に示す実施形態により本発明を詳細に説明する。
図１は、本発明の実施形態にかかるＤＮＡの塩基配列決定方法の構成図である。
溶液中で基板１にＲＮＡポリメラーゼ２を、その転写活性を保ったまま固定化する。基板１としては酵素を固定することができればよく、ガラス基板、プラスチック基板など種々のものを使用することができる。ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡを鋳型としてｍＲＮＡを合成する。
【００１７】
転写因子などの条件が整えば、ＲＮＡポリメラーゼ２はＤＮＡ３をその内部に取り込み、ＤＮＡ３の塩基配列を鋳型にして、ＲＮＡの素となる４つのヌクレオシドＡ，Ｕ，Ｇ，Ｃ（Ａ：アデノシン、Ｕ：ウリジン、Ｇ：グアノシン、Ｃ：シチジン）を重合し、ｍＲＮＡ前駆体４を合成する。この過程を転写と呼ぶ。ＲＮＡポリメラーゼ２を基板１に固定化した場合、ＤＮＡ３はＲＮＡポリメラーゼ２に一方方向（図の場合、左）から取り込まれ、他方（図の場合、右）から押し出される。詳しくは、ＤＮＡ３がＲＮＡポリメラーゼ２の内部をスライドして、プロモーターと呼ばれる開始部分を探す。そしてプロモーターが認識されると、ＤＮＡ３の二重鎖がほどけ、一本鎖になったＤＮＡ３を鋳型にして情報をＲＮＡに転写し、ｍＲＮＡ前駆体４を合成する。このとき、転写されたｍＲＮＡ前駆体４は、ＲＮＡポリメラーゼ２の別の個所より押し出されることになる。
【００１８】
ここでは、ＲＮＡポリメラーゼ２に取り込まれるＤＮＡ３の塩基配列を決定するために、走査型トンネル顕微鏡の探針（ＳＴＭ探針という）５をピエゾスキャナ６とピエゾスキャナ駆動回路７を用いることにより、ＤＮＡ３がＲＮＡポリメラーゼ２の内部に取り込まれる個所の近傍に設置し、さらにＤＮＡ３との距離をトンネル電流が計測できる一定に保つ。これにより、ＳＴＭ探針５の直下をＤＮＡ３がベルトコンベアの上に乗ったがごとく次々と一定方向に進んでいくことになる。
【００１９】
その状態を保ったまま、トンネル電流計測回路８を用いて、ＤＮＡ３とＳＴＭ探針５の間に流れるトンネル電流を測定することにより、ＤＮＡ３を構成する各塩基の電子状態を測定することが可能となる。ＤＮＡ３を構成する各塩基は、その種類ごとに電子状態が異なるため、これによりＤＮＡ３を構成する塩基を端から順に読み取ることが可能となる。
【００２０】
ＤＮＡを構成する塩基を識別するために、ここではトンネルスペクトルを測定する。ＳＴＭ探針５とＤＮＡ３との距離をトンネル電流が流れる大きさで固定し、探針に印加するバイアス電圧を走査するとともに、そのときのトンネル電流を測定する。バイアス電圧の変化に対し、得られるトンネル電流の波形はトンネルスペクトルと呼ばれるものであり、トンネルスペクトルはその探針の下を移動するＤＮＡの塩基の電子状態により各塩基に応じた特有の形状をもつ。各塩基について予めトンネルスペクトルを測定しておき、試料の測定で得られたトンネルスペクトルの形状を予め求めた形状と比較することによって塩基の種別を識別することができる。
【００２１】
本発明の生体物質構造決定装置では、トンネル電流計測回路８により計測されたトンネル電流の特性によって生体物質を構成する塩基又はアミノ酸の種類を識別する演算部１０を備えている。
トンネル電流計測回路８は探針５に印加するバイアス電圧を走査してトンネルスペクトルを測定するものとすることができる。その場合、演算部１０は核酸を構成する各塩基について又はタンパク質を構成する各アミノ酸について、予め測定されたトンネルスペクトルの形状をデータとして保持しており、試料の測定で得られたトンネルスペクトルの形状を予め求めた形状と比較することによって塩基の種別又はアミノ酸の種別を識別するように構成されている。
【００２２】
上記の説明では、酵素としてＲＮＡポリメラーゼを例にあげて説明したが、他の酵素として例えばＤＮＡの複製を司るＤＮＡポリメラーゼを用いても同様の効果が期待できる。
また、ＳＴＭ探針５は酵素５から出てくるＤＮＡを測定する位置に配置してもよい。
また、酵素としてｍＲＮＡから各種タンパク質を合成する働きをもつリボソームを基板に固定して同様に測定を行なうと、リボソームに取り込まれるｍＲＮＡの塩基配列又はリボソームで生成されて出てくるタンパク質のアミノ酸配列を読み込むことが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明の方法は、遺伝子工学の分野における核酸の塩基配列やタンパク質のアミノ酸配列を決定するのに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の実施形態にかかる塩基配列又はアミノ酸配列の決定装置を概略的に示すブロック図である。
【符号の説明】
【００２５】
１      基板
２      ＲＮＡポリメラーゼ
３      ＤＮＡ
４      ｍＲＮＡ前駆体
５      ＳＴＭ探針
６      ピエゾスキャナ
７      ピエゾスキャナ駆動回路
８      トンネル電流計測回路
１０      演算部
【図１】
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