(57)【要約】【課題】イムノアッセイやバイオアッセイと言った生体反応を利用した測定法という簡易且つ迅速な測定法で得られた値から、世界保健機構の毒性当量に近似する補正毒性当量を算出できる近似補正方法の提供。【解決手段】上記測定法による測定値は、ダイオキシン類等の毒性を有する化学物質に含まれる各化合物がそれぞれ特定の反応係数に基づいてリガンドに結合した量の総量が定量されること、および、化学物質の発生源が共通する区域内においては各化合物の濃度組成比が略同一であることを前提として、予め取得しておいた各化合物の濃度組成比を用いて、各化合物の推定濃度を算出し、該推定濃度に世界保健機関の毒性等価係数（ＴＥＦ）を乗じたものの積算値を算出し、この算出値を補正毒性当量（Ｃ−ＴＥＱ）とする。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
毒性を有する化学物質の生体反応を利用した測定値の毒性当量への近似補正方法であって、
（１）生体反応を利用した測定法では、前記化学物質に含まれる各化合物がそれぞれ特定の反応係数に基づいてリガンドに結合した量の総量が定量されること、および、
（２）化学物質の発生源が共通する区域内においては、どの地点において試料を採取しても各化合物の濃度組成比が略同一であることがガスクロマトグラフ／質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）測定法による測定や歴史調査、シミュレーション解析等により明らかになっていること、
を前提として、予め取得しておいた各化合物の濃度組成比を用いて、
【表１】
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式（１）に従って、前記各化合物（１，２，３，４……）の推定濃度（ａＸ，ｂＸ，ｃＸ，ｄＸ……）を算出し、
【数１】
2005188992.tif 000011
次に、式（２）に従って、前記各化合物（１，２，３，４……）の推定濃度（ａＸ，ｂＸ，ｃＸ，ｄＸ……）に毒性等価係数を乗じた値の積算値を、補正毒性当量（Ｃ−ＴＥＱ）として算出することを特徴とする補正方法。
【数２】
2005188992.tif 000012
【請求項２】
請求項１に記載した毒性を有する化学物質の生体反応を利用した測定値の毒性当量への近似補正方法において、測定値は、２，３，７，８−位塩素置換異性体の各化合物の推定濃度に前記各化合物に対する反応係数を乗じた値の積算値に等しいと推定することを特徴とする補正方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載した毒性を有する化学物質の生体反応を利用した測定値の毒性当量への近似補正方法において、濃度組成比はガスクロマトグラフ／質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）測定法により測定された化学物質の各化合物の個別の実測濃度に基づいて算出されたものであることを特徴とする補正方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載した毒性を有する化学物質の生体反応を利用した測定値の毒性当量への近似補正方法において、濃度組成比は生体反応を利用した測定法により測定される試料が採取される地点と化学物質の発生源が共通する区域内の地点において採取され、測定された化学物質の各化合物の個別の実測濃度に基づいて算出されたものであることを特徴とする補正方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体反応を利用した測定法により得られた化学物質の測定値（定量値）を毒性当量（ＴＥＱ）に近似補正する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
毒性を有する化学物質として代表的なものはダイオキシン類（本明細書中では、塩化ビフェニル（ＣＢ）も含む）であるが、これらの測定方法としては、高い分解能を有するガスクロマトグラフ／質量分析計（以下、「ＧＣ／ＭＳ」と記載。）測定法が代表的なものである。
ダイオキシン類化合物には、塩素原子の置換位置と数により７５化合物のポリクロロジベンゾ−パラ−ジオキシン（ＰＣＤＤｓ）と１３５化合物のポリクロロジベンゾ−パラ−フラン（ＰＣＤＦｓ）があるが、機械的、装置的な検出測定法の代表的な例であるＧＣ／ＭＳを用いれば、試料中に超微量しか含まれないダイオキシン類の濃度を個別に高感度且つ高精度で測定することができる。ＧＣ／ＭＳは、例えばＪＩＳ  Ｋ  ０３１１“工業用水・工業排水中のダイオキシン類及びコプラナーＰＣＢの測定方法”やＪＩＳ  Ｋ  ０３１２“排水中のダイオキシン類及びコプラナーＰＣＢの測定方法”のような種々のマニュアルの測定法の欄に記載されており、所謂公定法として取り扱われている。
しかしながらこの測定法に用いる機器は非常に高価であり、しかも多種類の化合物に応じて煩雑な抽出や精製等の繰り返し処理が必要なため、測定結果が得られるまでに数十日もかかる場合が珍しくない。
【０００３】
近年のダイオキシン類の規制強化及び測定の義務化に伴い、使用機器の費用が安く、しかも迅速・簡便に測定できる簡易測定法の導入が強く求められている。それに応じて、抗体への結合を介してダイオキシン類を検出するイムノアッセイ測定法（酵素標識免疫測定法）や、動物細胞のＡｈレセプターへの結合を介してダイオキシン類を検出するバイオアッセイ測定法等の生体反応を利用した測定法が提案されている。
【０００４】
普及している、代表的なイムノアッセイ法の測定原理を簡単に記載すると以下の通りである。
（１）マイクロプレートのウェルやチューブなどの壁面に検出対象物質、即ちダイオキシン類に結合する抗体をコーティングしておき、ここへ検出対象物質を含む試料液と酵素標識抗原液を加える。検出対象物質と酵素標識抗原は競合的に該抗体と結合し、共雑物質は結合しない。
（２）洗浄して、抗体と結合しなかった共雑物質と酵素標識抗原を除去する。
（３）酵素の基質となる発色試薬を添加して、抗体に結合している酵素標識抗原を検出する。検出対象物質が高濃度で存在するほど、抗体に結合する酵素標識抗原の量は少なくなるため、発色は薄くなる。
（４）既知濃度の標準液から作成した標準曲線を利用して、濃度を求める。
【０００５】
イムノアッセイ法によるダイオキシン類の測定キットとしては、既に種々のものが市販されており、その一例としては、「Ahイムノアッセイ（登録商標）」(PARACELSIAN,Inc.製造、株式会社クボタ  販売)、「ダイオキシン類ELISAキットワコー」（和光純薬工業株式会社  製造・販売）、「イムノエコDXN」（コスモ石油株式会社製造、コスモ・バイオ株式会社）、「エコ・アッセイ（登録商標）  ダイオキシンＥＬＩＳＡキット」（大塚製薬株式会社  大塚ライフサイエンス事業部  販売・製造）等がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したようにダイオキシン類には多くの化合物が含まれており、各化合物間で毒性が著しく異なっている。従って、ＪＩＳ  Ｋ  ０３１１“工業用水・工業排水中のダイオキシン類及びコプラナーＰＣＢの測定方法”やＪＩＳ  Ｋ  ０３１２“排水中のダイオキシン類及びコプラナーＰＣＢの測定方法”をはじめとする公定法によれば、ダイオキシン類の毒性評価に際しては、指標として毒性当量（ＴＥＱ）が採用されている。
毒性当量の導き方は以下の通りである。即ち、先ず、最も毒性の強い２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−パラ−ジオキシン（２，３，７，８−ＴｅＣＤＤ）に対する毒性を１とし、他の化合物の毒性を相対的に係数化する。このように係数化したもの、即ち、毒性等価係数（ＴＥＦ）は、世界保健機関から公表されている。次に、各化合物の個別の濃度に世界保健機関から公表されている毒性等価係数を乗じた値の積算値を算出する。この積算値が毒性当量である。
【０００７】
従って、代替の測定法を利用した場合にも、毒性を簡単且つ適正に評価するためには、上記毒性当量（ＴＥＱ）として取り扱える値が得られることが前提となる。
しかしながら、同一の地点から採取された試料についての測定値と、ＧＣ／ＭＳを利用して公定法により算出された毒性当量とを比較すると、必ずしも一致しているわけではなく、生体反応を利用した測定値が毒性当量よりも数倍〜数十倍もの値を示すことが多い。また、試料によって、測定値と毒性当量との相関関係には差が見られる。
それ故、生体反応を利用した測定値に対する信頼性は高くなく、簡易・迅速に測定できるにもかかわらず、生体反応を利用した測定法の普及を阻害する大きな要因となっている。
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明は生体反応を利用した測定法という簡易且つ迅速な測定法で得られた測定値を、ＧＣ／ＭＳを利用して公定法により算出された毒性当量に近似する値に補正できる、測定値の近似補正方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、
（１）ダイオキシン類等の目的とする化学物質以外の化合物への生体反応による過剰評価を除けば、理論的には、生体反応を利用した測定法では、前記化学物質に含まれる各化合物がそれぞれ特定の反応係数に基づいてリガンドに結合した量の総量が定量されること、および、
（２）化学物質の発生源が共通する区域内においては、どの地点において試料を採取しても各化合物の濃度組成比が略同一であることがＧＣ／ＭＳによる測定や歴史調査、シミュレーション解析等により明らかになっていること、を前提とする、本発明の毒性を有する化学物質の生体反応を利用した測定法による測定値（定量値）の毒性当量（ＴＥＱ）への近似補正方法を提案するに至った。
【００１０】
請求項１の発明は、毒性を有する化学物質の生体反応を利用した測定値の毒性当量への近似補正方法であって、
（１）生体反応を利用した測定法では、前記化学物質に含まれる各化合物がそれぞれ特定の反応係数に基づいてリガンドに結合した量の総量が定量されること、および、
（２）化学物質の発生源が共通する区域内においては、どの地点において試料を採取しても各化合物の濃度組成比が略同一であることがＧＣ／ＭＳによる測定や歴史調査、シミュレーション解析等により明らかになっていること、
を前提として、予め取得しておいた各化合物の濃度組成比を用いて、
【表１】
2005188992.tif 000003
式（１）に従って、前記各化合物（１，２，３，４……）の推定濃度（ａＸ，ｂＸ，ｃＸ，ｄＸ……）を算出し、
【数１】
2005188992.tif 000004
次に、式（２）に従って、前記各化合物（１，２，３，４……）の推定濃度（ａＸ，ｂＸ，ｃＸ，ｄＸ……）に毒性等価係数を乗じた値の積算値を、補正毒性当量（Ｃ−ＴＥＱ）として算出することを特徴とする補正方法。
【数２】
2005188992.tif 000005
【００１１】
請求項２の発明は、請求項１に記載した毒性を有する化学物質の生体反応を利用した測定値の毒性当量への近似補正方法において、測定値は、２，３，７，８−位塩素置換異性体の各化合物の推定濃度に前記各化合物に対する反応係数を乗じた値の積算値に等しいと推定することを特徴とする補正方法である。
【００１２】
請求項３の発明は、請求項１または２に記載した毒性を有する化学物質の生体反応を利用した測定値の毒性当量への近似補正方法において、濃度組成比はガスクロマトグラフ／質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）測定法により測定された化学物質の各化合物の個別の実測濃度に基づいて算出されたものであることを特徴とする補正方法である。
【００１３】
請求項４の発明は、請求項１から３のいずれかに記載した毒性を有する化学物質の生体反応を利用した測定値の毒性当量への近似補正方法において、濃度組成比は生体反応を利用した測定法により測定される試料が採取される地点と化学物質の発生源が共通する区域内の地点において採取され、測定された化学物質の各化合物の個別の実測濃度に基づいて算出されたものであることを特徴とする補正方法である。
【発明の効果】
【００１４】
生体反応を利用した測定値に、本発明の測定値の毒性当量への近似補正方法を適用すれば、信頼性の高い補正値が得られる。生体反応を利用した測定法は、ガスクロマトグラフ／質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）測定法より、簡易且つ迅速に測定できることから、毒性評価の簡易測定法として有用性が高まるものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、ダイオキシン類を例にとって、図１に従って説明する。
先ず、ダイオキシン類の発生源が共通する調査区域、例えば区域内には一つの化学工場のみがありダイオキシン類の発生源としてはその化学工場のみと推定できるような調査区域を設定し、該区域内の任意の代表地点で上記マニュアルに記載されている手順に従ってダイオキシン類の底質試料を採取し、トルエン・ソックスレー抽出、硫酸処理、多層シリカゲルによるクロマトグラフィーに供して、試料溶液を調製する。
次に、上記マニュアルに記載されている手順に従って、試料溶液を高い分解能を有したガスクロマトグラフ／質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）測定法に供して、ダイオキシン類の各化合物の個別濃度を測定する。
【００１６】
上記の測定法では、当然ながら、２，３，７，８−位塩素置換異性体以外のダイオキシン類化合物（世界保健機関の毒性等価係数（ＴＥＦ）のない化合物）も定量する。
しかしながら、この実施の形態では、２，３，７，８−位塩素置換異性体のみを考慮する。補正の精度を高めるためには、定量したダイオキシン類化合物全てを対象として考慮すべきであろうが、そこまでの精度を必要としない場合には、世界保健機関の毒性等価係数（ＴＥＦ）の有るもののみ、即ち表２に示すように、２，３，７，８−位塩素置換異性体のような重要な化合物のみを限定的に選択し定量する。市販の測定キットの取扱説明書には、２，３，７，８−位塩素置換異性体の交差反応係数は通常記載されていることから、上記のように化合物を限定することで、簡単・迅速にある程度の精度の補正毒性当量を得ることができる。
【００１７】
【表２】
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【００１８】
次に、２，３，７，８−位塩素置換異性体（化合物１，２，３，４，……）の各実測濃度（ｐｇ／ｇ−ｄｒｙ）のデータに基づいて、化合物毎に濃度組成比（ａ，ｂ，ｃ，ｄ，……）を算出する。式（３）は、２，３，７，８−ＴｅＣＤＤについて表現したものであり、他の異性体についても同様の式を立てて計算する。
【００１９】
【数３】
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【００２０】
次に、該区域内の代表地点とは別の調査対象地点において、ダイオキシン類の試料を採取して、同様に上記マニュアルに記載されている手順に従ってダイオキシン類の底質試料を採取し、且つ測定するイムノアッセイに必要な前処理（例えば、高速溶媒抽出、トルエン・ソックスレー抽出、硫酸処理、多層シリカゲルクロマトグラフィー等）に供して、試料溶液を調製する。
【００２１】
そして、ダイオキシン類のイムノアッセイ測定キットを用いて、試料溶液のイムノアッセイ測定値を測定する。ここで得られるイムノアッセイ測定値は、厳密に言えば、抗体に実際に結合した物質の総濃度である。
しかしながら、この実施の形態では、簡易算出のために、化合物の種類としては、２，３，７，８−位塩素置換異性体のみが含まれていると仮定している。また、各異性体については、試料中に実際に存在していた総量が全てイムノアッセイに用いた抗体に結合しているわけではなく、該抗体に対する反応係数を乗じた量だけ結合しているが、反応係数は用いた測定キットの取扱説明書に記載された数値をそのまま利用する。
【００２２】
従って、２，３，７，８−ＴｅＣＤＤの試料中の推定濃度がａＸであり、イムノアッセイに用いた抗体の２，３，７，８−ＴｅＣＤＤに対する反応係数がαだとすると、２，３，７，８−ＴｅＣＤＤに関しては、該抗体にａＸに反応係数を乗じた値の濃度分（ａＸα）だけ結合したと推定する。これは他の異性体についても適用される。
なお、各異性体の推定濃度の積算値（ａＸ＋ｂＸ＋ｃＸ＋ｄＸ＋……＝Ｘ）は、試料溶液をＧＣ／ＭＳ測定法に供して、高精度に実測したダイオキシン類化合物の中から選択抽出した２，３，７，８−位塩素置換異性体の個別濃度の総量に等しいはずである。
【００２３】
従って、上記の推定の成立条件を示す式（１）に具体的な数値を代入する。
【数４】
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【００２４】
式（１）中、測定値、２，３，７，８−位塩素置換異性体の濃度組成比（ａ，ｂ，ｃ，ｄ，……）、２，３，７，８−位塩素置換異性体の使用した抗体についての（ａＸα）（α、β、γ、δ，……）の数値を代入すると、変数Ｘの一次式となり、Ｘを算出できる。
そして、算出されたＸ値から、各異性体の推定濃度（ａＸ，ｂＸ，ｃＸ，ｄＸ，……）を個々に算出する。
【００２５】
各異性体の個別の推定濃度（ａＸ，ｂＸ，ｃＸ，ｄＸ，……）を算出した後は、公定法に従って、各異性体の個別濃度に世界保健機関の毒性等価係数を乗じたものの積算値を算出する。
【００２６】
【数５】
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【００２７】
算出した補正毒性当量（C−ＴＥＱ）の数値は、ＧＣ／ＭＳ測定法を利用して公定法により算出された毒性当量（ＴＥＱ）と同等に、毒性評価用にそのまま利用できる。
【実施例１】
【００２８】
一例として、同一地点において採取した試料を、ＧＣ／ＭＳを利用した公定法により算出された毒性当量（ＴＥＱ）（ＧＣ／ＭＳ（ｐｇ−ＴＥＱ／ｇ−ｄｒｙ））と、イムノアッセイ測定値（ＥＩＡ（ｐｇ／ｇ−ｄｒｙ））と、該イムノアッセイ測定値から上記の方法で算出された補正毒性当量（Ｃ−ＴＥＱ（ＥＩＡ  ｐｇ−ＴＥＱ／ｇ−ｄｒｙ））とを比較したところ、図２に示す結果が得られた。
図２より、イムノアッセイ測定値を本発明の方法により近似補正することで、公定法により得られる毒性当量に近づき且つ相関関係も改善されていることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
生体反応を利用した測定値に、本発明の測定値の毒性当量への近似補正方法を適用すれば、信頼性の高い補正値が得られる。生体反応を利用した測定法は、ガスクロマトグラフ／質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）測定法より、簡易且つ迅速に測定できることから、毒性評価の簡易測定法として有用性が高まるものと期待される。
【００３０】
底質に特徴的に見られるダイオキシン類化合物には世界保健機関の毒性等価係数（ＴＥＦ）の無い化合物もある。従って、補正精度を上げるためには、毒性等価係数（ＴＥＦ）の無い化合物を含めて、濃度組成比を算出すると共に、該化合物に対する交差反応係数も考慮する必要があると思われる。
また、ダイオキシン類においては、その中に含まれる化合物の交差反応に悪影響を及ぼす要因として、前処理工程における共雑物質や有機溶媒の残存による交差反応の妨害も考えられるので、前処理の精度を高めることで、上記要因を極力排除する必要もあると思われる。
【００３１】
なお、濃度組成比の算出に利用する測定法は、ガスクロマトグラフ／質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）測定法に限定されない。
また、試料も土壌や底質に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明のイムノアッセイ測定法とガスクロマトグラフ／質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）測定法を用いた場合の補正毒性当量の算出方法を説明するフローチャートである。
【図２】実施例１の比較データを示す図である。
【図１】
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【図２】
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