(57)【要約】  【課題】  転写因子タンパク質の添加や除去をすることなしに、転写反応溶液組成を調節することによって、人工的に転写反応を開始／停止し、並びに転写活性を増大させる。  【解決手段】  転写反応液に特定濃度範囲の多価イオン／親水性高分子及び陰イオンなどを加えると、鋳型ＤＮＡの大規模な高次構造変化が引き起こされ、転写活性が増大又は減少する。更にこの高次構造の不連続転移（折り畳み転移）によって、転写性をＯＮ／ＯＦＦ制御することができる。本発明は、長鎖ＤＮＡを含む転写反応液に該ＤＮＡの折り畳み転移を誘起する物質を特定範囲濃度となるように添加し、該物質の濃度を変化させることから成る、該ＤＮＡの転写反応を開始又は停止させる方法であって、該転写反応液中の該折り畳み転移を誘起する物質の濃度を該長鎖ＤＮＡが解きほぐれたコイル構造及び凝縮構造をとるような範囲に選択することを特徴とするＤＮＡ転写反応の制御方法である。  【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
長鎖ＤＮＡを含む転写反応液に該ＤＮＡの折り畳み転移を誘起する物質を特定範囲濃度となるように添加し、該物質の濃度を変化させることから成る、該ＤＮＡの転写反応を開始又は停止させる方法であって、該転写反応液中の該折り畳み転移を誘起する物質の濃度を該長鎖ＤＮＡが解きほぐれたコイル構造及び凝縮構造をとるような範囲に選択することを特徴とするＤＮＡ転写反応の制御方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡが約10,000塩基対以上の２本鎖ＤＮＡである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡの折り畳み転移を誘起する物質が多価陽イオン、中性親水性高分子又はアルコールである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡの折り畳み転移を誘起する物質がポリアミン、ヘキサミンコバルト、ポリアミノ酸、ポリエチレングリコール又はアルコールである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
更に、前記転写反応液に多価陰イオン又は塩類を加えた請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記多価陰イオンがヌクレオチド又はＲＮＡである請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ＤＮＡの転写反応をON/OFFする方法に関し、より詳細には、長鎖ＤＮＡを含む転写反応液に特定濃度の多価陽イオン、中性親水性高分子又はアルコールを加えて、その濃度を変化させることにより、ＤＮＡの転写反応をON/OFFする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品原料及び食品原料として重要なタンパクの工業生産においては、固定化酵素又は固定化微生物を利用したバイオリアクターなどによる生化学合成がほぼ唯一の方法であり、反応制御の視点からは転写・翻訳反応過程をどのように制御するかが、生産効率の増大にとって極めて重要である。
一方、多くの転写反応では、鋳型ＤＮＡに結合して転写反応を開始するタンパクである転写因子が存在することから、従来転写反応の開始及び停止には、転写因子又は転写酵素の反応系への添加及び除去が唯一の方法と考えられていたが、転写因子や転写酵素の分離・生成が技術的に困難で高コストであることから、従来転写反応を工業的に制御する方法は存在しなかった。
また研究用試薬においても、転写活性の増大・最適化に関する系統的な方法論は存在しなかった。また１分子中の鋳型ＤＮＡにおける転写反応を制御する方法は基礎並びに応用の両分野においても従来存在しなかった。
また近年、遺伝子発現が細胞内のエネルギー状態に依存して顕著に変化することに近年注目が集まっているが、発明者らの研究グループは、長鎖DNAの高次構造がエネルギー状態に依存して折り畳み転移することを明らかにしてきている(非特許文献１、２)。
【０００３】
【非特許文献１】Makita N. et al. FEBS Lett. 460, 333-337, 1999
【非特許文献２】吉川裕子ら、生物物理 42, 179-184 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、転写因子タンパク質の添加や除去をすることなしに、転写反応溶液組成を調節することによって、人工的に転写反応を開始／停止し、並びに転写活性を増大させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、転写反応液に特定濃度範囲の多価イオン／親水性高分子及び陰イオンなどを加えると、鋳型ＤＮＡの大規模な高次構造変化が引き起こされ、転写活性が増大又は減少することを見出し、更にこの高次構造の不連続転移（即ち、折り畳み転移）によって、転写性をＯＮ／ＯＦＦ制御、即ち開始／停止することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、長鎖ＤＮＡを含む転写反応液に該ＤＮＡの折り畳み転移を誘起する物質を特定範囲濃度となるように添加し、該物質の濃度を変化させることから成る、該ＤＮＡの転写反応を開始又は停止させる方法であって、該転写反応液中の該折り畳み転移を誘起する物質の濃度を該長鎖ＤＮＡが解きほぐれたコイル構造及び凝縮構造をとるような範囲に選択することを特徴とするＤＮＡ転写反応の制御方法である。また、この方法において、転写を開始状態又は停止状態にいずれかに保ちたい場合には、ＤＮＡの折り畳み転移を誘起する物質の濃度を変化させずに、その濃度を転写反応のON又はOFFのいずれか一方の状態を与える濃度に固定してもよい。このＤＮＡの折り畳み転移を誘起する物質を含有する転写反応液に更に多価陰イオンや塩類を加えることにより転写の開始又は停止し、あるいは転写活性を増大させることができる。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の方法によれば、１分子のＤＮＡ及び多分子のＤＮＡのどちらを鋳型にしても、転写因子の存在なしに転写反応を開始／停止し、転写活性を調節できる。従って、工業的大量合成反応系や、今後発展が期待されるマイクロスケールやナノスケールの微小反応系においても、細胞の種類によらず、細胞抽出液などの生体由来物質を必要とせずに、人工的に転写反応を実施し、制御することが可能となる。
本発明により、酵素反応や微生物を利用した工業生産において、転写反応制御が可能となり、生産効率の増大とコスト低減が期待される。これによってさらに従来困難であった有用タンパクの生産が可能となり、医薬品原料生産、食品原料生産の分野に与える影響は大きい。また本発明は、人工細胞、マイクロスケール反応槽、ナノスケール反応槽などの、次世代の医療・工業生産の中核となる技術において、従来不可能であった、微小空間での転写反応及び１分子の鋳型DNAでの転写反応とその制御を可能にする。さらに本技術は脂質膜小胞のような、人口細胞や遺伝子導入担体において、従来困難であった小胞内での発現したタンパク分子の膜移行、即ち膜タンパクの発現をも可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の方法は本発明者らが見出した２本鎖ＤＮＡの折り畳み転移という自然現象に基づいており、これを利用して、転写活性をＯＮ／ＯＦＦスイッチを行うことである。これはＯＮ／ＯＦＦスイッチは通常の凝縮剤添加によるＤＮＡ凝縮では不可能であって、折り畳み転移でのみ可能である。折り畳み転移は、添加化合物の官能基と塩基の局所的な結合で起きるのではく、化合物がＤＮＡと周囲の対イオンの静電気的状態および溶液系全体のエントロピー収支に影響を与えることによって生じる。
本発明の方法によれば、鋳型ＤＮＡの折り畳み転移を誘起することにより、転写反応の開始・停止並びに転写活性の増大を行わせることができる。
本方法の実施に好ましい長鎖ＤＮＡは数万塩基対以上、例えば約10,000塩基対以上の２本鎖ＤＮＡである。
ＤＮＡの折り畳み転移を誘起する物質として、多価陽イオン、中性親水性高分子、アルコール等が挙げられる。これらはＤＮＡの分子内凝縮及び分子間凝集を誘起する物質であり、具体的には、ポリアミン、ヘキサミンコバルト、ポリアミノ酸、ポリエチレングリコール、アルコールなどが挙げられる。
【０００９】
ＤＮＡの折り畳み転移を誘起する物質の作用を変化させる物質としては、多価陰イオン等が挙げられ、例えば、ＡＴＰ、ＡＤＰなどのヌクレオチド又はＲＮＡなどがある。
転写反応液中のＤＮＡの折り畳み転移を誘起する物質（試薬）の至適濃度は、各試薬に固有であり、いかなる試薬にも汎用的に適用できる数値を挙げるわけにはいかない。この濃度は用いる試薬により個別に設定する必要があり、その方法としては、下記に示すようにDNAの高次構造の変化を観察するか、又は実際に転写反応のON/OFFを直接観察することにより定めることができる。
転写反応液は、DNAの転写が起こるような水溶液であれば特に制限は無く、実施の細胞質又はこれと同等の組成を有する反応液を用いてもよいし、適宜転写に必要な薬剤を混合して転写反応液を構成してもよい。このような転写反応液として、例えば、水、ｐＨ緩衝剤、リボヌクレオチド三リン酸、金属塩類、還元剤、鋳型ＤＮＡ、転写酵素からなる転写反応液が挙げられる。この転写反応液は、リボヌクレアーゼを含まないものである。
【００１０】
本発明の方法は、鋳型ＤＮＡの折り畳み転移を誘起する物質あるいはその作用を変化させる物質を転写反応液に添加するか、又は予め共存させたこれら物質の濃度を変化させることにより行う。
これによるコイル構造と凝縮構造の間のＤＮＡの高次構造の変化は、数万塩基対以上のＤＮＡが関与する大規模な構造変化であり、蛍光顕微鏡、原子間力顕微鏡、電子顕微鏡など適当な手段により観察することができる。これらの手段の中で、溶液中に存在するＤＮＡを直接観察できるため、蛍光顕微鏡が好ましい。コイル構造とは、ＤＮＡがほぐれてコイル状になった状態であり、この状態になると転写が開始する。一方、凝縮構造とはＤＮＡが塊となって観察される状態をいい、この状態では転写は停止する。
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００１１】
この実施例では、スペルミン及びポリエチレングリコールによる転写反応の制御及び転写活性への影響を調べた。
転写反応溶液の組成は、10mMトリス−塩酸(pH7.6)、100mM塩化ナトリウム、5mM塩化マグネシウム、0.5mMアデノシン三リン酸、0.5mMグアノシン三リン酸、0.5mMシトシン三リン酸、0.5mMウリジン三リン酸、5mMジチオスレイトール、2μg/ml(塩基対濃度 約3μM)T7プロモーター配列含有鋳型DNA、50ＵバクテリオファージT7RNAポリメラーゼに、0〜800μMスペルミン四塩酸塩又は0〜160mg/mlポリエチレングリコールを含有する水溶液で、1反応あたり50μｌとした。
鋳型DNAとして、λZAPIIDNA(Stratagene社 Bacteriophage λ、41,000塩基対)を用いた(図１)。
反応液を37℃で１〜1.5時間静置した。反応液にTE飽和フェノール100μlを添加して反応を停止し、攪拌後遠心分離した。水相を別の容器に分取した後、冷エタノールを添加してDNAとRNAをエタノール沈殿させ、乾燥した。さらに1Ｕデオキシリボヌクレアーゼ水溶液を添加し、37℃で1.5時間静置して、DNAを消化した。反応液に蛍光色素(200倍希釈Bibo Green(Molecular Probes社))及び1mMエチレンジアミン四酢酸含有トリス−塩酸緩衝液を等量添加して１５分以上室温で静置して、RNAを蛍光色素標識した。反応液の525nmにおける相対蛍光強度を蛍光分光器によって測定した。
【００１２】
比較例１
鋳型DNAとして、λZAPIIDNAの代わりにこのDNAのT7プロモーター配列(配列番号１)の上流側と下流側に各々結合するオリゴDNAプライマー(配列番号２(FP)、配列番号３(RP))を用いてPCR増幅した、140塩基対のDNA断片(図１)を用いて、実施例１と同様の実験を行った。
【００１３】
実施例１と比較例１の結果を図２に示す。
図２（A）と（C）に示すように、スペルミン四塩酸塩共存下では、λZAPIIDNAを鋳型とした場合（図２（A）、実施例１）、スペルミン四塩酸塩濃度400μM近傍で転写活性が急峻に変化し、400μM以上で転写活性は完全に抑制された。
またλZAPIIDNAを鋳型とした場合、スペルミン四塩酸塩濃度200μM近傍での転写活性が、スペルミン濃度が0μMの場合よりも増大した。
一方、図２（B）と（D）に示すように、ポリエチレングリコール共存下では、λZAPIIDNAを鋳型とした場合（図２（B）、実施例１）、ポリエチレングリコール濃度50〜90mg/mlで転写活性が急峻に変化し、90mg/ml以上で転写活性は完全に抑制された。またλZAPIIDNAではポリエチレングリコール濃度50mg/ml近傍、140塩基対DNA断片ではポリエチレングリコール濃度70mg/ml近傍での転写活性が、ポリエチレングリコール濃度が0μＭの場合よりも増大した。
【００１４】
また、実施例１においてλZAPIIDNAを鋳型とし、スペルミンを添加した場合の転写活性が変化した濃度におけるDNA分子の蛍光顕微鏡像を図３(A)〜(B)に示す。このDNA分子は0.3μM DAPI で染色し、スライドガラス表面に吸着させた。
このDNAは転写活性がONの状態（スペルミン400μM、図２(A)）では、広がったコイル構造(図３(A))をとり、OFFの状態（スペルミン450μM、図２(A)）では、分子内凝縮あるいは分子間凝集した構造(図３(B))が観察された。
一方、比較例１において140塩基対のDNA断片を鋳型とし、ポリエチレングリコール(PEG)を添加した場合の転写活性が変化した濃度におけるDNA分子の蛍光顕微鏡像を図３(C)〜(D)に示す。このDNA分子は0.33μM YOYO-1で染色し、溶液中には100mM NaClを共存させた。転写活性が高いポリエチレングリコール50mg/ml共存下（図２(B)）では広がったコイル構造(図３(C))が観察され、転写活性が抑制された200mg/ml共存下（図２(B)）では分子内凝縮構造(図３(D))が観察された。
これらの結果は、DNAの高次構造が折り畳み転移する長鎖DNA（λZAPIIDNA、実施例１）の場合には、高次構造転移しない短鎖DNA（140塩基対のDNA断片、比較例１）を用いた場合とは異なって、転写活性がだらだらと変化するのではなく、ON/OFFとはっきりと変化することを示している。
【実施例２】
【００１５】
この実施例では、ヌクレオチド三リン酸濃度による転写反応の制御を調べた。
転写反応溶液の組成は、40mMトリス−塩酸(pH8.0)、25mM塩化ナトリウム、8mM塩化マグネシウム、5mMスペルミジン三塩酸塩、5mMジチオスレイトール、2μg/ml(塩基対濃度約3μM)T7プロモーター配列含有鋳型DNA、50ＵバクテリオファージT7RNAポリメラーゼに加え、核ヌクレオチド濃度50〜60μM(総ヌクレオチド濃度0.2〜2.4mM)のヌクレオチド三リン酸（アデノシン酸、グアノシン三リン酸、シトシン三リン酸、ウリジン三リン酸の等量混合物）を含有する水溶液で、１反応当たり50μlとした。
鋳型DNAとして、λZAPIIDNAを用いた。
反応液を37℃で1〜1.5時間静置した。反応液にTE飽和フェノール100μlを添加して反応を停止し、攪拌後遠心分離した。
水相を別の容器に分取した後、冷エタノールを添加してDNAとRNAをエタノール沈殿させ、乾燥した。さらに１Uデオキシリボヌクレアーゼ水溶液を添加し、37℃で1.5時間静置して、DNAを消化した。反応液に蛍光色素(200倍希釈Bibo Green(Molecular Probes社))及び1mMエチレンジアミン四酢酸含有トリス−塩酸緩衝液を等量添加して１５分以上室温で静置して、RNAを蛍光色素標識した。反応液の525nmにおける相対蛍光強度を蛍光分光器によって測定した。
【００１６】
比較例２
鋳型DNAとして、λZAPIIDNAの代わりに比較例２で用いた140塩基対のDNA断片を用いて、実施例２と同様の実験を行った。
【００１７】
実施例２と比較例２の結果を図４に示す。
図４（ａ）に示すように、λZAPIIDNAを鋳型とした場合（実施例２）、総ヌクレオチド三リン酸濃度1.0〜1.6mMの範囲で転写活性が急峻に変化し、1.0mM以下では転写活性は完全に抑制された。即ち総NTP濃度を変化させることによって、転写活性がON/OFF制御された。
一方、図４（ｂ）に示すように、140塩基対のDNA断片を鋳型とした場合（比較例２）には、このようなはっきりとON/OFF制御される様子は見られなかった。
【００１８】
また、転写活性が変化した濃度におけるDNA分子の蛍光顕微鏡像を図５に示す。ＤＮＡは0.1μM DAPIで染色し、スライドガラス表面に吸着させ、100倍対物レンズで観察した。図５上段左に示すように、転写活性が完全に抑制された0.2mM NTP 条件下では（図４(A)）、分子内凝縮または分子間凝集した構造が観察された（転写活性OFF状態）。一方、図５上段右に示すように、高い転写活性を示す2.4mM NTP条件下では（図４(A））、ときほぐれて広がったコイル構造が観察された（転写活性ON状態）。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
本発明の方法は、医薬品原料・食品原料・工業材料の生物化学的合成システム（バイオリアクター）の最適制御や分子生物学研究用転写関連試薬の最適化に利用することができる。更に、本発明の方法を用いることにより、医薬品スクリーニングシステムへの転写反応系の導入したり、人口細胞、医療用マイクロチップ、マイクロスケール反応槽、ナノスケール反応槽、ナノスケール反応槽へ転写反応系を付与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】転写反応の鋳型となるλZAPIIDNAと140塩基対のDNA断片との塩基配列上の位置関係を示す図である。
【図２】相対転写活性のスペルミン四塩酸塩濃度依存性及びポリエチレングリコール濃度依存性を示す図である。(A)と(B)はλZAPIIDNAを鋳型とし、(C)と(D)は140塩基対のDNA断片を鋳型として転写反応を行った場合を示す。
【図３】転写活性が変化した濃度におけるDNA分子の蛍光顕微鏡像を示す図である（実施例１）。
【図４】スペルミジン三塩酸塩共存下で転写反応を実施したときの、相対転写活性のヌクレオチド三リン酸（NTP）濃度依存性を示す図である。(a)はλZAPIIDNAを鋳型とし、(b)は140塩基対のDNA断片を鋳型として転写反応を行った場合を示す。
【図５】転写活性が変化した濃度におけるDNA分子の蛍光顕微鏡像を示す図である（実施例２）。下段は上段の写真をトレースした図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【図５】
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【配列表】
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