(57)【要約】      （修正有）【課題】  本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）遺伝子型の新規配列、ならびにそれらの予防薬、治療薬および診断薬としての使用に関する。【解決手段】  ＮＳ５遺伝子ヌクレオチド配列の一部の比較によって分類されるＨＣＶサブタイプ１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、５ａまたは６ａとは異なるこれまでに未確認のＨＣＶタイプまたはサブタイプに固有であるヌクレオチド配列を有すること、および該既知のＨＣＶヌクレオチド配列と異なる少なくとも１つのヌクレオチドを含有することを特徴とするＨＣＶポリ核酸、またはその相補体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
位置７９３２〜８２７１（アミノ酸ナンバリングは、第１表に示されている）にわたるＮＳ５遺伝子ヌクレオチド配列の一部の比較によって第３表に示すとおり分類されるＨＣＶサブタイプ１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、５ａまたは６ａとは異なるこれまでに未確認のＨＣＶタイプまたはサブタイプに固有であるヌクレオチド配列を有すること、および該既知のＨＣＶヌクレオチド配列と異なる少なくとも１つのヌクレオチドを含有することを特徴とするＨＣＶポリ核酸、またはその相補体。
【請求項２】
請求項１において定義されたと同様に分類されるＨＣＶタイプ９に固有であるヌクレオチド配列を有する請求項１記載のポリ核酸。
【請求項３】
アミノ酸配列において以下のアミノ酸残基のうち少なくとも１つを含むＨＣＶポリタンパクをコードする請求項１または２記載のポリ核酸、または請求項２において定義したＨＣＶタイプに固有であり、かつ、既知のＨＣＶヌクレオチド配列と異なる少なくとも１つのヌクレオチドを含有する該ポリ核酸の一部、またはその相補体：Ａ５８、Ｎ７１、Ｄ１０６、Ｅ１５０、Ｎ２１７、Ｌ２３５、Ｅ２６０、Ｉ３００、Ｇ２６４９、Ｆ２７２７、Ｔ２７２８、またはＩ２７５２（ここで、表記法は、アミノ酸残基をその一文字表記によって表す文字、および第１表に示すアミノ酸ナンバリングを表す番号からなる）。
【請求項４】
アミノ酸配列において以下のリストから選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むＨＣＶポリタンパクをコードする請求項１〜３のいずれか１項記載のポリ核酸、または請求項２において定義したＨＣＶタイプに固有であり、かつ、既知のＨＣＶヌクレオチド配列と異なる少なくとも１つのヌクレオチドを含有する該ポリ核酸の一部、またはその相補体：
ＶＲＱＰＴＧＲＳＷＧＱ（配列番号１１４）
ＩＱＶＫＮＡＳＧＩＹＨＬ（配列番号１３５）
ＶＦＥＡＥＴＭＩＬＨＬ（配列番号１５２）
ＩＫＡＧＮＥＳＲＣＷＬＰＶ（配列番号１７１）
ＶＰＮＳＳＶＰＩＨＧ（配列番号１８７）
ＲＰＫＹＨＱＶＴＱＤ（配列番号２０４）。
【請求項５】
配列番号４１または９５のいずれかから選択される配列を有する請求項１〜４のいずれか１項記載のポリ核酸、または請求項２において定義したＨＣＶタイプに固有であり、かつ、既知のＨＣＶヌクレオチド配列と異なる少なくとも１つのヌクレオチドを含有する該ポリ核酸の一部、またはその相補体。
【請求項６】
５'ＵＲ、コア／Ｅ１領域、ＮＳ４領域もしくはＮＳ５Ｂ領域またはその一部をコードする請求項１〜５のいずれか１項記載のポリ核酸。
【請求項７】
ｃＤＮＡ配列である請求項１〜６のいずれか１項記載のポリ核酸。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載のポリ核酸の一部を含むオリゴヌクレオチドプライマーであって、該プライマーが誘導される遺伝子型に属するある単離体の核酸を特異的に増幅させるためのプライマーとして作用することができるオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項記載のポリ核酸の一部を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、該ヌクレオチド配列を含有するＨＣＶ核酸のタイプおよび／またはサブタイプの特異的検出および／または分類のためのハイブリダイゼーションプローブとして作用することができ、所望により、標識化されているかまたは固体基質に結合されていてもよい、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１０】
請求項８記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよび／または請求項９記載のオリゴヌクレオチドプローブを含む、ＨＣＶの遺伝子型の決定に用いるための診断用キット。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドプローブが固体基質に結合されている請求項１０記載の診断用キット。
【請求項１２】
一群のオリゴヌクレオチドプローブが固体基質上の特異的な位置に結合されている請求項１１記載の診断用キット。
【請求項１３】
固体基質が膜ストリップであり、オリゴヌクレオチドプローブが平行線の形で膜に結合されている請求項１２記載の診断用キット。
【請求項１４】
（ｉ）所望により、試料核酸を抽出すること、
（ii）請求項８記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該核酸を増幅させること、
（iii）増幅した核酸を検出すること
を含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶ核酸の検出方法。
【請求項１５】
（ｉ）所望により、試料核酸を抽出すること、
（ii）所望により、請求項８記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーまたはユニバーサルＨＣＶプライマーを用いて該核酸を増幅させること、
（iii）適当な条件下にて生物学的試料の核酸を、所望により変性条件下で、請求項９記載の１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせること（ここで、該プローブは固体基質に結合されている）、
（iv）所望により、適当な条件下で洗浄すること、
（ｖ）形成されたハイブリッドを検出すること
を含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶ核酸の検出方法。
【請求項１６】
（ｉ）所望により、試料核酸を抽出すること、
（ii）請求項８記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該核酸を特異的に増幅させること、
（iii）増幅した核酸を検出すること、
（iv）増幅したフラグメントの観察されたパターンから存在するＨＣＶの１種類またはそれ以上の遺伝子型の存在を推断すること
を含む、生物学的試料中に存在する１種類またはそれ以上のＨＣＶ遺伝子型の存在の検出方法。
【請求項１７】
（ｉ）所望により、試料核酸を抽出すること、
（ii）所望により、請求項８記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーまたはユニバーサルＨＣＶプライマーを用いて該核酸を増幅させること、
（iii）適当な条件下にて生物学的試料の核酸を、所望により、変性条件下で、請求項９記載の１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせること（ここで、該プローブは固体基質に結合されている）、
（iv）所望により、適当な条件下で洗浄すること、
（ｖ）形成されたハイブリッドを検出すること、
（vi）観察されたハイブリダイゼーションパターンから存在する１種類またはそれ以上のＨＣＶ遺伝子型の存在を推断すること
からなることを特徴とする、生物学的試料中に存在する１種類またはそれ以上のＨＣＶ遺伝子型の存在の検出方法。
【請求項１８】
オリゴヌクレオチドプローブがさらに請求項１１〜１３のいずれか１項における定義により特徴付けられる、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
核酸が増幅の間または後に標識される請求項１４〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜７のいずれか１項記載のポリ核酸によってコードされたアミノ酸配列を有するポリペプチド、または、請求項２において定義したＨＣＶタイプに固有であり、かつ、既知のＨＣＶタイプまたはサブタイプアミノ酸配列と異なる少なくとも１つのアミノ酸を含有する該ポリペプチドの一部、または、実質的に相同であり生物学的に等価であるそのアナログ。
【請求項２１】
アミノ酸配列において以下のアミノ酸残基のうち少なくとも１つを含む請求項２０記載のポリペプチド、または請求項２において定義したＨＣＶタイプに固有であり、かつ、既知のＨＣＶタイプまたはサブタイプアミノ酸配列と異なる少なくとも１つのアミノ酸を含有する該ポリペプチドの一部、または該ポリペプチドと実質的に相同であり生物学的に等価であるそのアナログ：Ａ５８、Ｎ７１、Ｄ１０６、Ｅ１５０、Ｎ２１７、Ｌ２３５、Ｅ２６０、Ｉ３００、Ｇ２６４９、Ｆ２７２７、Ｔ２７２８、またはＩ２７５２（ここで、表記は、アミノ酸残基を一文字表記によって表す文字および第１表に示すアミノ酸ナンバリングを表す数字からなる)。
【請求項２２】
アミノ酸配列において請求項４に挙げられた配列番号１１４、１３５、１５２、１７１、１８７または２０４によって表される配列のうち少なくとも１つを含む請求項２０記載のポリペプチド、または、請求項２において定義したＨＣＶタイプに固有であり、かつ、既知のＨＣＶタイプまたはサブタイプアミノ酸配列と異なる少なくとも１つのアミノ酸を含有する該ポリペプチドの一部、または、該ポリペプチドと実質的に相同であり生物学的に等価であるそのアナログ。
【請求項２３】
配列番号４２または９６のいずれかにおいて表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または、請求項２におけるＨＣＶタイプに固有であり、かつ、既知のＨＣＶタイプまたはサブタイプアミノ酸配列と異なる少なくとも１つのアミノ酸を含有するその一部、または該ポリペプチドと実質的に相同であり生物学的に等価であるそのアナログ。
【請求項２４】
請求項１〜７のいずれか１項記載のポリ核酸によってコードされる組換えポリペプチド、または、請求項２において定義したＨＣＶタイプに固有であり、かつ、既知のＨＣＶタイプまたはサブタイプアミノ酸配列と異なる少なくとも１つのアミノ酸を含有する該組換えポリペプチドの一部、または、該ポリペプチドと実質的に相同であり生物学的に等価であるそのアナログ。
【請求項２５】
適当な細胞宿主を、適当な調節要素の制御下にて請求項１〜７のいずれか１項記載のポリ核酸またはその一部を挿入した組換えベクターで形質転換させること、
該挿入体の発現を可能にする条件下にて、該形質転換細胞宿主を培養すること、および
該ポリペプチドを収集すること
を含む、請求項２４記載の組換えポリペプチドの生産方法。
【請求項２６】
原核生物性、真核生物性またはウイルス性転写および翻訳制御要素に操作可能に結合された請求項１〜７のいずれか１項記載のポリ核酸またはその一部を含む組換え発現ベクター。
【請求項２７】
請求項２６記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２８】
（ｉ）ＨＣＶの存在について分析しようとする生物学的試料を請求項２０〜２４のいずれか１項記載のポリペプチドと接触させること、
（ii）抗体と該ポリペプチドとの間で形成された免疫複合体を検出すること
を含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶに対する抗体の検出方法。
【請求項２９】
（ｉ）ＨＣＶの存在について分析しようとする生物学的試料を請求項２０〜２４のいずれか１項記載のポリペプチドと接触させ、
（ii）抗体と該ポリペプチドとの間で形成された免疫複合体を検出すること
からなることを特徴とするＨＣＶ分類方法。
【請求項３０】
所望により固体支持体に結合されていてもよい請求項２０〜２４のいずれか１項記載の少なくとも１つのポリペプチドを含む、ＨＣＶの存在の検出に用いるための診断用キット。
【請求項３１】
所望により固体支持体に結合されていてもよい請求項２０〜２４のいずれか１項記載の少なくとも１つのポリペプチドを含む、ＨＣＶ分類のための診断用キット。
【請求項３２】
固体基質上の特異的な位置に結合される一群のポリペプチドを含む、請求項３０または３１記載の診断用キット。
【請求項３３】
固体支持体が膜ストリップであり、ポリペプチドが平行線の形で膜に結合されている、請求項３０〜３２のいずれか１項記載の診断用キット。
【請求項３４】
請求項２０〜２４のいずれか１項記載の少なくとも１つのポリペプチドまたは請求項１〜７のいずれか１項記載の少なくとも１つのポリ核酸および適当な賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項３５】
防御抗体または防御Ｔ−細胞応答の生産を刺激するのに有効な量の請求項３４記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、ＨＣＶ感染の予防方法。
【請求項３６】
請求項３５において定義したＨＣＶ感染の予防方法における請求項３４記載の医薬組成物の使用。
【請求項３７】
医薬的に許容される担体中、請求項２０〜２４のいずれか１項記載の少なくとも１つのポリペプチドを含む、ＨＣＶ感染に対して哺乳動物を免疫化するためのワクチン。
【請求項３８】
請求項２において定義したＨＣＶタイプに固有である請求項２０〜２４のいずれか１項記載の少なくとも１つのポリペプチドを含む、請求項３７記載のワクチン。
【請求項３９】
請求項２０〜２４のいずれか１項記載の少なくとも１つのポリペプチドによる免疫化により生じる抗体（ここで、該抗体は、該ポリペプチドと特異的に反応し、該抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である）。
【請求項４０】
（ｉ）生物学的試料を請求項３９記載の抗体と接触させること、
（ii）ＨＣＶ抗原と該抗体との間で形成された免疫複合体を検出すること
を含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗原の検出方法。
【請求項４１】
（ｉ）生物学的試料を請求項３９記載の抗体と接触させること、
（ii）ＨＣＶ抗原と該抗体との間で形成された免疫複合体を検出すること
を含む、ＨＣＶ分類方法。
【請求項４２】
所望により固体支持体に結合されていてもよい請求項３９記載の少なくとも１つの抗体を含む、ＨＣＶの存在の検出に用いるための診断用キット。
【請求項４３】
所望により固体支持体に結合されていてもよい請求項３９記載の少なくとも１つの抗体を含む、ＨＣＶ分類のための診断用キット。
【請求項４４】
固体基質上の特異的な位置に結合される一群の抗体を含む、請求項４２または４３記載の診断用キット。
【請求項４５】
請求項３９記載の少なくとも１つの抗体および適当な賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項４６】
哺乳動物に有効量の請求項４５記載の医薬組成物を投与することを含む、ＨＣＶ感染の予防または治療方法。
【請求項４７】
請求項４６において定義したＨＣＶ感染の予防または治療方法における請求項４５記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）遺伝子型の新規配列、ならびにそれらの予防薬、治療薬および診断薬としての使用に関する。
本発明は、新規ゲノムヌクレオチド配列およびこれらのゲノムのコード領域に対応するアミノ酸配列に関する。本発明は、既知のＨＣＶタイプおよびサブタイプ配列と異なる新規ＨＣＶタイプおよびサブタイプ配列に関する。さらに詳しくは、本発明は、新規ＨＣＶタイプ７配列、新規ＨＣＶタイプ９配列、新規ＨＣＶタイプ１０および新規ＨＣＶタイプ１１配列に関する。さらに、本発明は、サブタイプ１ｄ、１ｅ、１ｆおよび１ｇの新規ＨＣＶタイプ１配列；サブタイプ２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉ、２ｋおよび２ｌの新規ＨＣＶタイプ２配列；サブタイプ３ｇの新規ＨＣＶタイプ３配列；サブタイプ４ｋ、４ｌおよび４ｍの新規ＨＣＶタイプ４配列；それらの調製方法、ならびに診断、予防および治療のためのそれらの使用に関する。
本発明の根本的な技術的課題は、現在知られていないＨＣＶタイプおよび／またはサブタイプからの新規ＨＣＶ配列を提供することである。さらに詳しくは、本発明は、新規ＨＣＶタイプ７、９、１０および１１の、ならびにＨＣＶタイプ１、２、３および４の新規変異株（サブタイプ）の、コア領域、Ｅ１領域およびＮＳ５領域の新規タイプ特異的配列を提供するものである。これらの新規ＨＣＶ配列は、生物学的試料中のＨＣＶタイプ１、および／またはタイプ２、および／またはタイプ３、および／またはタイプ４、および／またはタイプ７、および／またはタイプ９、および／またはタイプ１０、および／またはタイプ１１遺伝子型または血清型の存在を診断するのに有用である。さらにまた、これらの新規タイプ特異的配列の利用能は、ＨＣＶ検出の全体的な感度を高めることができ、予防目的および治療目的のために有用であることも証明する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、非Ａ・非Ｂ型肝炎の主な原因であることが判明した。いくつかのプロトタイプ単離体の完全なゲノムを包含するｃＤＮＡクローンの配列が決定された（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。これらの単離体の比較により、ヌクレオチド配列における変異性を用いて、約６８％の平均ホモロジーを有する少なくとも２種類の遺伝子型、タイプ１（ＨＣＶ−１およびＨＣＶ−Ｊ）およびタイプ２（ＨＣ−Ｊ６およびＨＣ−Ｊ８）を識別できることが判明する。各タイプ内には、約７９％の平均ホモロジーを有する少なくとも２つのサブタイプ（例えば、ＨＣＶ−１およびＨＣＶ−Ｊによって表される）が存在する。同一サブタイプに属するＨＣＶゲノムは、９０％を超える平均ホモロジーを示す（非特許文献４）。しかしながら、ＨＣＶ−Ｔ単離体のＮＳ５領域の部分ヌクレオチド配列は、従前に公表されている配列と多くても６７％のホモロジーを示し、なおも別のＨＣＶタイプの存在を示した（非特許文献５）。このタイプ３の５'非翻訳領域（ＵＲ)、コア領域、ＮＳ３領域およびＮＳ５領域の一部は、公表されており、さらに、３つの主な遺伝子型とそれらのサブタイプとの間の類似した進化の距離を確立した（非特許文献６）。続いて、タイプ４が発見された（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。同様にタイプ５（非特許文献７、非特許文献１１、非特許文献９、非特許文献１２）およびタイプ６（非特許文献９、非特許文献１１）ＨＣＶグループも発見された。ＨＣＶ遺伝子型に関する当該技術の現状の概観を第３表に示す。本発明者らによって提案された命名システムは、現在、世界中の科学者によって受け入れられている（非特許文献１３）。
【非特許文献１】Kato N, Hijikata M, Ootsuyama Y, Nakagawa M, Ohkoshi S, Sugimura T, Shimotohno K (1990) Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanese patients with non-A, non-B hepatitis. Proc Natl Acad Sci USA 87:9524-9528
【非特許文献２】Choo Q, Richamn K, Han J, Berger K, Lee C, Dong C, Gallegos C, Coit D, Medina-Selby A, Barr P, Weiner A, Bradley D, Kuo G, Houghton M (1991) Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci USA 88:2451-2455
【非特許文献３】Okamoto H, Okada S, Sugiyama Y, Kurai K, Iizuka H, Machida A, Miyakawa Y, Mayumi M (1991) Nucleotide sequence of the genomic RNA of hepatitis C virus isolated from a human carrier: comparison with reported isolates for conserved and divergent regions. J Gen Virol 72:2697-2704
【非特許文献４】Okamoto H, Kurai K, Okada S, Yamamoto K, Lizuka H, Tanaka T, Fukuda S, Tsuda F, Mishiro S (1992) Full-length sequences of a hepatitis C virus genome having poor homology to reported isolates: comparative study of four distinct genotypes. Virology 188:331-341
【非特許文献５】Mori S, Kato N, Yagyu A, Tanaka T, Ikeda Y, Petchclai B, Chiewsilp P, Kurimura T, Shimotohno K (1992) A new type of hepatitis C virus in patients in Thailand. Biochem Biophys Res Comm 183:334-342
【非特許文献６】Chan S-W, McOmish F, Holmes E, Dow B, Peuthere J, Follett E, Yap P, Simmonds P (1992) Analysis of a new hepatitis C virus type and its phylogenetics relationship to exsisting variant. J Gen Virol 73:1131-1141
【非特許文献７】Stuyver L, Rossau R, Wyseur A, Duhamel M, Vanderborght B, Van Heuverswyn H, Maertens G (1993b) Typing of hepatitis C virus (HCV) isolates and characterization of new (sub)types using a Line Probe Assay. J Gen Virology, 74: 1093-1102
【非特許文献８】Simmonds P, McOmsh F, Yap P, Chan S, Lin C, Dusheiko G, Saeed A, Holmes E (1993a), Sequence variability in the 5' non-coding region of hepatitis C virus: identification of a new virus type and restrictions on sequence diversity. J Gen Virology, 74:661-668
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【非特許文献１０】Stuyver, L., Wyseur, A., Van Arnhem, W., Rossau, R., Delaporte, E., Dazza, M.-C., Van Doorn, L.-J., Kleter, B. & Maertens, G. (1994a) The use of a line probe assay as a tool to detect new types or subtypes of hepatitis C virus. In: Viral Hepatitis and Liver Disease, Proceedings of the International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease (Eds. Nishioka, K., Suzuki, H., Mishiro, S., and Oda, T.), pp 317-319
【非特許文献１１】Simmonds, P., Holmes, E.C., Cha, T.-A., Chan, S.-W., McOmish, F., Irvine, B., Beall, E., Yap, P.L., Kolberg, J., & Urdea, M.S. (1993c) J. Gen. Virol. 74, 2391-2399
【非特許文献１２】Stuyver, L., Van Arnhem, W., Wyseur, A. & Maertens, G. (1994b) Cloning and Phylogenetic analysis of the Core, E2, and NS3/4 regions of the hepatitis C virus type 5a. Biochem. Biophys. Res. Comm. 202, 1308-1314
【非特許文献１３】Simmonds, P., Alberti, A., Alter, H., Bonino, F., Bradley, D.W., Brechot, C., Brouwer, J., Chan, S.-W., Chayama K., Chen, D.-S., Choo, Q.-L., Colombo, M., Cuypers, T., Date, T., Dusheiko, G., Esteban, J.I., Fay, O., Hadziyannis, S., Han, J., Hatzakis, A., Holmes, E.C., Hotta, H., Houghton, M., Irvine, B., Kohara, M., Kolberg, J.A., Kuo, G., Lau, J.Y.N., Lelie, P.N., Maertens, G., McOmish, F., Miyamua, T., Mizokami, M., Nomoto, A., Prince A.M., Reesink, H.W., Rice, C., Roggendorf, M., Schalm, S., Shikata, T., Shimotohno, K., Stuyver, L., Trepo, C., Weiner, A., Yap, P.L. & Urdea, M.S. (1994) A proposed system for the nomenclature of hepatitis C virus genotypes. Hepatology 19, 1321-1324
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、ＨＣＶ感染の検出を可能にする新規ＨＣＶヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供することである。
本発明の別の目的は、感染した生物学的液体の種々の血清学上のグループへの分類を可能にする新規ヌクレオチドおよびアミノ酸ＨＣＶ配列を提供することである。
本発明の別の目的は、全ＨＣＶ検出速度を改良する新規ヌクレオチドおよびアミノ酸ＨＣＶ配列を提供することである。
本発明の別の目的は、ＨＣＶ予防用または治療用ワクチン組成物の設計に有用な新規ＨＣＶ配列を提供することである。
本発明の別の目的は、これらの新規ＨＣＶ配列によってコードされるポリペプチドに対して生じる抗体からなる治療用または診断用医薬組成物を提供することである。
本発明の全ての目的は、本発明の以下の具体例により達成される。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、さらに詳しくは、位置７９３２〜８２７１（アミノ酸のナンバリングは、第１表に示されている）にわたるＮＳ５遺伝子ヌクレオチド配列の一部の比較によって第３表に示すとおり分類されるＨＣＶサブタイプ１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、５ａまたは６ａとは異なるこれまでに未確認のＨＣＶタイプまたはサブタイプに固有であるヌクレオチド配列を有すること、および該既知のＨＣＶヌクレオチド配列と異なる少なくとも１つのヌクレオチドを含有することを特徴とするＨＣＶポリ核酸、またはその相補体（complement）に関する。公知のＨＣＶ単離体の配列は、当該技術分野で知られているヌクレオチド配列データベース（例えば、ＥＭＢＬデータベースなど）において見いだすことができる。
【０００５】
したがって、本発明は、前記において定義されたと同様に分類されるＨＣＶサブタイプ１ｄ、１ｅ、１ｆ、１ｇ、２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉ、２ｋ、２ｌ、３ｇ、４ｋ、４ｌ、４ｍ、７ａ、７ｃまたは７ｄのうち少なくとも１つに固有であるヌクレオチド配列を有するポリ核酸に関する。
【０００６】
したがって、本発明は、前記において定義されたと同様に分類されるＨＣＶタイプ９、１０または１１のうち少なくとも１つに固有であるヌクレオチド配列を有するポリ核酸にも関する。
【０００７】
本発明のポリ核酸におけるヌクレオチド差異は、該ポリ核酸によってコードされる対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸差異を含むことに注意すべきである。本発明の組成物は、ポリ核酸配列のみ、または診断、予防もしくは治療の分野において知られている賦形剤と混合したポリ核酸配列を含有する。
【０００８】
好ましい具体例によると、本発明は、アミノ酸配列において以下のアミノ酸残基のうち少なくとも１つを含有してなるＨＣＶポリタンパクをコードするポリ核酸、または第５表に示されているＨＣＶサブタイプまたはタイプのうち少なくとも１つに固有であり、かつ、既知のＨＣＶヌクレオチド配列と異なる少なくとも１つのヌクレオチドを含有する該ポリ核酸の一部、またはその相補体に関する：Ｉ１５、Ｃ３８、Ｖ４４、Ａ４９、Ｑ４３、Ｐ４９、Ｑ５５、Ａ５８、Ｓ６０またはＤ６０、Ｅ６８またはＶ６８、Ｈ７０、Ａ７１またはＱ７１またはＮ７１、Ｄ７２、Ｈ８１、Ｈ１０１、Ｄ１０６、Ｓ１１０、Ｌ１３０、Ｉ１３４、Ｅ１３５、Ｌ１４０、Ｓ１４８、Ｔ１５０またはＥ１５０、Ｑ１５３、Ｆ１５５、Ｄ１５７、Ｇ１６０、Ｅ１６５、Ｉ１６９、Ｆ１８１、Ｌ１８６、Ｔ１９０、Ｔ１９２またはＩ１９２またはＨ１９２、Ｉ１９３、Ａ１９５、Ｓ１９６、Ｒ１９７またはＮ１９７またはＫ１９７、Ｑ１９９またはＤ１９９またはＨ１９９またはＮ１９９、Ｆ２００またはＴ２００、Ａ２０８、Ｉ２１３、Ｍ２１６またはＳ２１６、Ｎ２１７またはＳ２１７またはＧ２１７またはＫ２１７、Ｔ２１８、Ｉ２１９、Ａ２２２、Ｙ２２３、Ｉ２３０、Ｗ２３１またはＬ２３１、Ｓ２３２またはＨ２３２またはＡ２３２、Ｑ２３３、Ｅ２３５またはＬ２３５、Ｆ２３６またはＴ２３６、Ｆ２３７、Ｌ２４０またはＭ２４０、Ａ２４２、Ｎ２４４、Ｎ２４９、Ｉ２５０またはＫ２５０またはＲ２５０、Ａ２５２またはＣ２５２、Ａ２５４、Ｉ２５５またはＶ２５５、Ｄ２５６またはＭ２５６、Ｅ２５７、Ｅ２６０またはＫ２６０、Ｒ２６１、Ｖ２６８、Ｓ２７２またはＲ２７２、Ｉ２８５、Ｇ２９０またはＦ２９０、Ａ２９１、Ａ２９３またはＬ２９３またはＷ２９３、Ｔ２９４またはＡ２９４、Ｓ２９５またはＨ２９５、Ｋ２９６またはＥ２９６、Ｙ２９７またはＭ２９７、Ｉ２９９またはＹ２９９、Ｉ３００、Ｓ３０１、Ｐ３１６、Ｓ２６４６、Ａ２６４８、Ｇ２６４９、Ａ２６５０、Ｖ２６５２、Ｑ２６５３、Ｈ２６５６またはＬ２６５６、Ｄ２６５７、Ｆ２６５９、Ｋ２６６３またはＱ２６６３、Ａ２６６７またはＶ２６６７、Ｄ２６７７、Ｌ２６８１、Ｍ２６８６またはＱ２６８６またはＥ２６８６、Ａ２６９２またはＫ２６９２、Ｈ２６９７、Ｉ２７０７、Ｌ２７０８またはＹ２７０８、Ａ２７０９、Ａ２７１９またはＭ２７１９、Ｆ２７２７、Ｔ２７２８またはＤ２７２８、Ｅ２７２９、Ｆ２７３０またはＹ２７３０、Ｉ２７４１、Ｉ２７４５、Ｖ２７４６またはＥ２７４６またはＬ２７４６またはＫ２７４６、Ａ２７４８、Ｓ２７４９またはＰ２７４９、Ｒ２７５０、Ｅ２７５１、Ｄ２７５２またはＮ２７５２またはＳ２７５２またはＴ２７５２またはＶ２７５２またはＩ２７５２またはＱ２７５２、Ｓ２７５３またはＤ２７５３またはＧ２７５３、Ｄ２７５４、Ａ２７５５、Ｌ２７５６またはＱ２７５６、Ｒ２７５７（ここで、表記法は、アミノ酸残基をその一文字表記によって表す文字、および第１表に示すKato et al., (1980)によるアミノ酸ナンバリングを表す番号からなる）。
【０００９】
前記残基の各々は、コア／Ｅ１領域について、ＨＣＶの別のタイプまたはサブタイプの既知の配列と並べた本発明の新規アミノ酸配列を示す第２図、第４図または第６図において見ることができる。
【００１０】
もう１つの好ましい具体例によると、本発明は、アミノ酸配列において以下のリストから選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含有してなるＨＣＶポリタンパクをコードするポリ核酸、または第５表に示されているＨＣＶサブタイプまたはタイプのうち少なくとも１つに固有であり、かつ、既知のＨＣＶヌクレオチド配列と異なる少なくとも１つのヌクレオチドを含有する該ポリ核酸の一部、またはその相補体に関する：
【００１１】
サブタイプ１ｄに関してはＡＲＱＳＤＧＲＳＷＡＱまたはＡＲＲＳＥＧＲＳＷＡＱ（配列番号１０７および１０８）
サブタイプ１ｅに関してはＥＲＲＰＥＧＲＳＷＡＱ（配列番号１０９）
サブタイプ１ｆに関してはＡＲＲＰＥＧＲＳＷＡＱ（配列番号１１０）
サブタイプ２ｋに関してはＤＲＲＴＴＧＫＳＷＧＲ（配列番号１１１）
サブタイプ２ｅに関してはＤＲＲＡＴＧＲＳＷＧＲ（配列番号１１２）
サブタイプ２ｆに関してはＤＲＲＡＴＧＫＳＷＧＲ（配列番号１１３）
タイプ９に関してはＶＲＱＰＴＧＲＳＷＧＱ（配列番号１１４）
サブタイプ７ａおよび７ｃに関してはＶＲＨＱＴＧＲＴＷＡＱ（配列番号１１５）
サブタイプ７ｄに関してはＶＲＱＮＱＧＲＴＷＡＱ（配列番号１１６）
タイプ１０に関してはＡＲＲＴＥＧＲＳＷＡＱ（配列番号１１７）
タイプ１１に関してはＶＲＲＴＴＧＲＸＸＸＸまたはＶＲＲＴＴＧＲＴＷＡＱ（配列番号１１８および１１９）
【００１２】
サブタイプ１ｄに関してはＨＥＶＲＮＡＳＧＶＹＨＶまたはＨＥＶＲＮＡＳＧＶＹＨＬ（配列番号１２０および１２１）
サブタイプ１ｆに関してはＹＥＶＨＳＴＴＤＧＹＨＶ（配列番号１２２）
サブタイプ２ｅに関してはＶＥＶＫＮＴＳＱＡＹＭＡ（配列番号１２３）
サブタイプ２ｆに関してはＩＱＶＫＮＮＳＨＦＹＭＡ（配列番号１２４）
サブタイプ２ｇに関してはＶＱＶＫＮＴＳＴＭＹＭＡ（配列番号１２５）
サブタイプ２ｈに関してはＶＱＶＫＮＴＳＨＳＹＭＶ（配列番号１２６）
サブタイプ２ｉに関してはＶＱＶＡＮＲＳＧＳＹＭＶ（配列番号１２７）
サブタイプ２ｋに関してはＶＥＩＫＮＴＸＮＴＹＶＬまたはＶＥＩＫＮＴＳＮＴＹＶＬ（配列番号１２８および１２９）
サブタイプ４ｋに関してはＩＮＹＲＮＶＳＧＩＹＹＶまたはＩＮＹＲＮＴＳＧＩＹＨＶまたはＩＮＹＨＮＴＳＧＩＹＨＩまたはＴＮＹＲＮＶＳＧＩＹＨＶ（配列番号１３０、１３１、１３２または１３３）
サブタイプ４ｌに関してはＱＨＹＲＮＶＳＧＩＹＨＶ（配列番号１３４）
タイプ９に関してはＩＱＶＫＮＡＳＧＩＹＨＬ（配列番号１３５）
サブタイプ７ｃに関してはＡＨＹＴＮＫＳＧＬＹＨＬ（配列番号１３６）
サブタイプ７ｄに関してはＬＮＹＡＮＫＳＧＬＹＨＬ（配列番号１３７）
タイプ１０に関してはＬＥＹＲＮＡＳＧＬＹＭＶ（配列番号１３８）
サブタイプ１ｄに関してはＩＹＥＭＤＧＭＩＭＨＹまたはＩＹＥＭＳＧＭＩＬＨＡ（配列番号１３９および１４０）
サブタイプ１ｆに関してはＶＹＥＡＫＤＩＩＬＨＴ（配列番号１４１）
サブタイプ２ｅに関してはＶＷＱＬＸＤＡＶＬＨＶ（配列番号１４２）
サブタイプ２ｆに関してはＶＷＱＬＲＤＡＶＬＨＶ（配列番号１４３）
サブタイプ２ｇに関してはＩＷＱＭＱＧＡＶＬＨＶ（配列番号１４４）
サブタイプ２ｈに関してはＶＷＱＬＫＤＡＶＬＨＶ（配列番号１４５）
サブタイプ２ｉに関してはＶＷＱＬＥＥＡＶＬＨＶ（配列番号１４６）
サブタイプ２ｋに関してはＴＷＱＬＸＸＡＶＬＨＶ（配列番号１４７）
サブタイプ４ｋに関してはＶＹＥＡＤＨＨＩＬＨＬまたはＶＹＥＡＤＨＨＩＬＡＬまたはＶＦＥＡＤＨＨＩＬＨＬ（配列番号１４８、１４９および１５０）
サブタイプ４ｌに関してはＶＹＥＳＤＨＨＩＬＨＬ（配列番号１５１）
タイプ９に関してはＶＦＥＡＥＴＭＩＬＨＬ（配列番号１５２）
サブタイプ７ｃに関してはＶＹＥＡＥＴＬＩＬＨＬ（配列番号１５３）
【００１３】
サブタイプ７ｄに関してはＶＹＥＡＮＧＭＩＬＨＬ（配列番号１５４）
タイプ１０に関してはＶＹＥＡＧＤＩＩＬＨＬ（配列番号１５５）
サブタイプ１ｄに関してはＶＲＥＤＮＨＬＲＣＷＭＡＬまたはＶＲＥＮＮＳＳＲＣＷＭＡＬ（配列番号１５６および１５７）
サブタイプ１ｆに関してはＩＲＥＧＮＩＳＲＣＷＶＰＬ（配列番号１５８）
サブタイプ２ｅに関してはＥＮＳＳＧＲＦＨＣＷＩＰＩ（配列番号１５９）
サブタイプ２ｆに関してはＥＲＳＧＮＲＴＦＣＷＴＡＶ（配列番号１６０）
サブタイプ２ｇに関してはＥＬＱＧＮＫＳＲＣＷＩＰＶ（配列番号１６２）
サブタイプ２ｈに関してはＥＲＨＱＮＱＳＲＣＷＩＰＶ（配列番号１６３）
サブタイプ２ｉに関してはＥＷＫＤＮＴＳＲＣＷＩＰＶ（配列番号１６４）
サブタイプ２ｋに関してはＥＲＥＧＮＳＳＲＣＷＩＰＶ（配列番号１６５）
サブタイプ４ｋに関してはＶＲＥＧＮＱＳＲＣＷＶＡＬまたはＶＲＴＧＮＱＳＲＣＷＶＡＬまたはＶＲＶＧＮＱＳＳＣＷＶＡＬまたはＶＲＶＧＮＱＳＲＣＷＶＡＬまたはＶＫＥＧＮＨＳＲＣＷＶＡＬ（配列番号１６６、１６７、１６８または１６９）
サブタイプ４ｌに関してはＶＫＴＧＮＴＳＲＣＷＶＡＬ（配列番号１７０）
タイプ９に関してはＩＫＡＧＮＥＳＲＣＷＬＰＶ（配列番号１７１）
サブタイプ７ｃに関してはＶＫＥＧＮＱＳＲＣＷＶＱＡ（配列番号１７２）
サブタイプ７ｄに関してはＶＫＸＸＮＬＴＫＣＷＬＳＡ（配列番号１７３）
タイプ１０に関してはＶＲＳＧＮＴＳＲＣＷＩＰＶ（配列番号１７４）
サブタイプ１ｄに関してはＶＫＮＡＳＶＰＴＡＡまたはＶＫＤＡＮＶＰＴＡＡ（配列番号１７５および１７６）
サブタイプ１ｆに関してはＡＲＩＡＮＡＰＩＤＥ（配列番号１７７）
サブタイプ２ｅに関してはＶＳＫＰＧＡＬＴＫＧ（配列番号１７８）
サブタイプ２ｆに関してはＶＳＲＰＧＡＬＴＲＧ（配列番号１７９）
サブタイプ２ｇに関してはＶＮＱＰＧＡＬＴＲＧ（配列番号１８０）
サブタイプ２ｈに関してはＶＳＱＰＧＡＬＴＲＧ（配列番号１８１）
サブタイプ２ｉに関してはＶＳＱＰＧＡＬＴＫＧ（配列番号１８２）
サブタイプ２ｋに関してはＶＳＲＰＧＡＬＴＥＧ（配列番号１８３）
サブタイプ４ｋに関してはＡＰＹＩＧＡＰＬＥＳまたはＡＰＹＴＡＡＰＬＥＳ（配列番号１８４および１８５）
サブタイプ４ｌに関してはＡＰＩＬＳＡＰＬＭＳ（配列番号１８６）
タイプ９に関してはＶＰＮＳＳＶＰＩＨＧ（配列番号１８７）
サブタイプ７ｃに関してはＶＰＮＡＳＴＰＶＴＧ（配列番号１８８）
【００１４】
サブタイプ７ｄに関してはＶＱＮＡＳＶＳＩＲＧ（配列番号１８９）
タイプ１０に関してはＶＫＳＰＣＡＡＴＡＳ（配列番号１９０）
サブタイプ１ｄに関してはＳＰＲＭＨＨＴＴＱＥまたはＳＰＲＬＹＨＴＴＱＥ（配列番号１９１および１９２）
サブタイプ１ｆに関してはＴＳＲＲＨＷＴＶＱＤ（配列番号１９３）
サブタイプ２ｅに関してはＡＰＫＲＨＹＦＶＱＥ（配列番号１９４）
サブタイプ２ｆに関してはＳＰＱＹＨＴＦＶＱＥ（配列番号１９５）
サブタイプ２ｇに関してはＳＰＱＨＨＮＦＳＱＤ（配列番号１９６）
サブタイプ２ｈに関してはＳＰＱＨＨＩＦＶＱＤ（配列番号１９７）
サブタイプ２ｋに関してはＳＰＥＨＨＨＦＶＱＤ（配列番号１９８）
サブタイプ４ｋに関してはＲＰＲＲＨＷＴＴＱＤまたはＲＰＲＲＨＷＴＡＱＤまたはＱＰＲＲＨＷＴＴＱＤまたはＲＰＲＲＨＷＴＴＱＥ（配列番号１９９、２００、２０１または２０２）
サブタイプ４ｌに関してはＱＰＲＲＨＷＴＶＱＤ（配列番号２０３）
タイプ９に関してはＲＰＫＹＨＱＶＴＱＤ（配列番号２０４）
サブタイプ７ｃに関してはＲＰＲＭＨＱＶＶＱＥ（配列番号２０５）
サブタイプ７ｄに関してはＲＰＲＭＹＥＩＡＱＤ（配列番号２０６）
タイプ１０に関してはＲＨＲＱＨＷＴＶＱＤ（配列番号２０７）。
【００１５】
５'非コード化ＬiＰＡ系（Stuyver et al., 1993）およびコア領域から誘導されたサブタイプ１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂまたは２ｃに対する複数のプローブを含む新規コアＬiＰＡ系（Stuyver et al., 1995）を用いて、ベネルクス、カメルーン、フランスおよびベトナムからの試料を、それらの異常な反応性のために選択した（単離体ＣＡＭ１０７８、ＦＲ２、ＦＲ１、ＶＮ４、ＶＮ１２、ＶＮ１３、ＮＥ９８）。いくつかの試料を、多くの他の試料と一緒に、分類するための対照体として配列決定した。しかしながら、配列決定の結果は、新規サブタイプ（単離体ＢＮＬ１、ＢＮＬ２、ＢＮＬ３、ＦＲ４、ＢＮＬ４、ＢＮＬ５、ＢＮＬ６、ＢＮＬ７、ＢＮＬ８、ＢＮＬ９、ＢＮＬ１０、ＢＮＬ１１およびＢＮＬ１２）の発見を示した。本発明のフレームにおいて、以前に報告されたことがないコアおよびＥ１領域におけるヌクレオチド配列を分析した。サブタイプ１ｄ、１ｅ、１ｆ、１ｇ、２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉ、２ｋ、２ｌ、３ｇ、４ｋ、４ｌ、４ｍ、７ａ、７ｃ、７ｄならびにタイプ９、１０および１１単離体のゲノム配列は、本発明において初めて報告される。ＮＳ５Ｂ領域も分析した。
【００１６】
「ポリ核酸」なる用語は、完全ヌクレオチド配列と共通の少なくとも５つの隣接するヌクレオチドを含有する一本鎖または二本鎖核酸配列を意味する（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７５またはそれ以上の隣接するヌクレオチド）。約１００ヌクレオチドまでの長さのポリ核酸は、しばしば、オリゴヌクレオチドとも称される。ポリ核酸は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたは修飾ヌクレオチドからなるか、あるいは、治療目的に適応させられる。ポリ核酸は、また、クローニングのために、またはin vivo治療もしくは予防のために用いることができる二本鎖ｃＤＮＡクローンからなってもよい。
【００１７】
プライマーまたはプローブとして用いられる本発明のオリゴヌクレオチドは、チオリン酸化物（Matsukura et al., 1987）、アルキルリン酸化物（Miller et al., 1979）またはペプチド核酸（Nielsen et al., 1991; Nielsen et al., 1993）などのヌクレオチドアナログを含有するかまたは該ヌクレオチドアナログからなるか、あるいは、挿入剤（Asseline et al., 1984）を含有してもよい。
【００１８】
本発明の最初のＤＮＡ配列中に導入されたほとんどの他の変異または修飾の場合、これらの変異は、所望の特異性および感受性を得るために該オリゴヌクレオチドを用いる条件に関する適応を必要とするであろう。しかしながら、実際の結果は、実質的には、非修飾オリゴヌクレオチドを用いて得られたものと同一であろう。
【００１９】
これらの修飾の導入は、ハイブリダイゼーション速度、ハイブリッド−形成の可逆性、オリゴヌクレオチド分子の生物学的安定性などの特徴に明確に影響を及ぼすために好都合である。
【００２０】
本発明のポリ核酸は、ある種の組成物に含まれる。該組成物は、診断用、治療用または予防用であってよい。
【００２１】
「ＨＣＶタイプまたはサブタイプに固有である配列」なる表現は、ＨＣＶの他のタイプまたはサブタイプによって共有されていない配列を意味し、したがって、これを用いて、ＨＣＶタイプまたはサブタイプを固有に検出することができる。本発明では、新しく見いだされたＨＣＶタイプおよびサブタイプ（第５表を参照）と既知のＨＣＶタイプおよびサブタイプ（第３表を参照）との間で配列変異性が示され、したがって、特に、配列変異性を有するこれらの領域から、タイプ特異的またはサブタイプ特異的ポリ核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドおよびペプチドが得られる。「タイプ特異的またはサブタイプ特異的」なる用語は、配列が、含まれるＨＣＶタイプまたはサブタイプに固有であるということを意味する。
【００２２】
「〜に対応するヌクレオチド」なる表現は、特異的ＨＣＶ配列内の所定のヌクレオチド配列または領域と相同または相補的であるヌクレオチドを意味する。
【００２３】
「コード領域」なる用語は、ＨＣＶポリタンパクをコードするＨＣＶゲノムの領域に相当する。実際、５'非翻訳領域および３'非翻訳領域を除いては完全ゲノムからなる。
【００２４】
「ＨＣＶポリタンパク」なる用語は、ＨＣＶ−Ｊ単離体（Kato et al., 1990）のＨＣＶポリタンパクを意味する。３３０位のアデニン残基（Kato et al., 1990）は、ＨＣＶ−Ｊおよび他のタイプ１ｂ単離体における３０１０個のアミノ酸、およびＨＣＶ−１および他のタイプ１ａ単離体における３０１１個のアミノ酸、およびタイプ２単離体ＨＣ−Ｊ６およびＨＣ−Ｊ８（Okamoto et al., 1992）における３０３３個のアミノ酸からなる長いＨＣＶポリタンパクを開始するＡＴＧコドンの第１残基である。
【００２５】
本発明では、このアデニンは、核酸レベルで１位と記され、このメチオニンは、アミノ酸レベルで１位と記される。タイプ１ａ単離体は、ＮＳ５Ａ領域において１個の余分なアミノ酸を含有するので、タイプ１ａおよび１ｂのコード配列は、コア領域、Ｅ１領域、ＮＳ３領域およびＮＳ４領域において同一のナンバリングを有するが、第１表に示すようにＮＳ５Ｂにおいては異なるであろう。タイプ２単離体は、タイプ１単離体と比較してＥ２領域において４個の余分なアミノ酸を有し、ＮＳ５領域において１７個または１８個の余分なアミノ酸を有し、第１表に示すようにＮＳ３／４領域およびＮＳ５ｂ領域においてタイプ１単離体とはナンバリングが異なるであろう。タイプ１と比較して同様の挿入がタイプ３ａ配列において観察されることができ、したがって、該挿入は、タイプ３ａアミノ酸のナンバリングに影響を及ぼす。既知のＨＣＶ配列と並べると、タイプ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１配列において、他の挿入または欠失を容易に観察することができる。
【００２６】
【表１】
2005118044.tif 000002
【００２７】
「遺伝子型」なる用語は、本発明で用いる場合、タイプおよび／またはサブタイプの両方を示す。
【００２８】
「ＨＣＶタイプ」なる用語は、グループの他の単離体のポリタンパクに対して、完全ゲノムが核酸レベルで７３％を超える、好ましくは７４％を超えるホモロジーを示すか、または、ヌクレオチド位置７９３２〜８２７１間のＮＳ５領域が核酸レベルで７５.４％を超えるホモロジーを示すか、または、完全ＨＣＶポリタンパクがアミノ酸レベルで７８％を超えるホモロジーを示すか、または、アミノ酸位置２６４５〜２７５７間のＮＳ５領域がアミノ酸レベルで８０％を超えるホモロジーを示すＨＣＶ単離体のグループに対応する（ここで、該ナンバリングは、ＨＣＶ−Ｊ単離体（Kato et al., 1990）の長いＨＣＶポリタンパクの最初のＡＴＧコドンまたは最初のメチオニンで始まる）。ＨＣＶの異なるタイプに属する単離体は、完全ゲノムに関して、核酸レベルで７４％未満、好ましくは７３％未満、アミノ酸レベルで７８％未満のホモロジーを示す。同一タイプに属する単離体は、通常、同一サブタイプに属する場合、核酸レベルで約９０〜９９％、アミノ酸レベルで９５〜９６％のホモロジーを示し、同一タイプに属するが異なるサブタイプに属する単離体は、好ましくは、核酸レベルで約７６％〜８２％（さらに詳しくは、約７７％〜８０％）、アミノ酸レベルで８５〜８６％のホモロジーを示す。
【００２９】
さらに好ましくは、ＨＣＶタイプの定義は、以下に詳述するように、算出されたヌクレオチド距離に従ってＨＣＶ単離体の分類により推断される：
【００３０】
（１）ヌクレオチド７９３５〜８２７４間（Choo et al., 1991）または８２６１〜８６００間（Kato et al., 1990）または８３４２〜８６８１間（Okamoto et al., 1991）のＮＳ５Ｂ領域における核酸配列の系統発生的分析に基づいて、同一ＨＣＶタイプに属する単離体は、０.３４未満、一般的には０.３３未満、さらに一般的には０.３２未満のヌクレオチド距離を示し、同一サブタイプに属する単離体は、０.１３５未満、一般的には０.１３未満、さらに一般的には０.１２５未満、一般的には０.０００３〜０.１１５１の範囲のヌクレオチド距離を示し、その結果、同一タイプに属するが異なるサブタイプに属する単離体は、０.１３５〜０.３４の範囲、一般的には０.１３８４〜０.２９７７の範囲、さらに一般的には０.１５〜０.３２の範囲のヌクレオチド距離を示し、異なるＨＣＶタイプに属する単離体は、０.３４より大きい、一般的には０.３５より大きい、さらに一般的には０.３５８より大きい、さらに一般的には０.３５８１〜０.６６７０の範囲のヌクレオチド距離を示す。
【００３１】
（２）ヌクレオチド３７８〜９５７間のコア／Ｅ１領域における核酸配列の系統発生的分析に基づいて、同一ＨＣＶタイプに属する単離体は、０.３８未満、一般的には０.３７未満、さらに一般的には０.３６４未満のヌクレオチド距離を示し、同一サブタイプに属する単離体は、０.１７未満、一般的には０.１６未満、さらに一般的には０.１５未満、さらに一般的には０.１３５未満、さらに一般的には０.１３４未満のヌクレオチド距離を示し、その結果、同一タイプに属するが異なるサブタイプに属する単離体は、０.１５〜０.３８の範囲、一般的には０.１６〜０.３７の範囲、さらに０.１７〜０.３６の範囲、さらに一般的には０.１３３〜０.３７９の範囲のヌクレオチド距離を示し、異なるＨＣＶタイプに属する単離体は、０.３４、０.３５、０.３６より大きい、一般的には０.３６５より大きい、さらに一般的には０.３７より大きいヌクレオチド距離を示す。
【００３２】
【表２】
2005118044.tif 000003
【００３３】
入手可能な配列の比較系統発生的分析において、ゲノムの種々の領域についての分子進化距離の範囲を、系統発生推論パッケージＰＨＹＬＩＰバージョン３.５ｃのＤＮＡＤＩＳＴプログラム（Felsenstein, 1993）による１９,７８１ペアワイズ比較に基づいて算出した。結果は、第２表に示されており、各領域において得られた距離の大部分がある種の単離体の分類に適合しているが、３４０ｂｐ ＮＳ５Ｂ領域において得られた範囲のみが重複せず、したがって決定的であることを示す。しかしながら、本発明で行われたように、所定の単離体の最終分類前に少なくとも２つの領域から配列情報を得るのが好ましい。
【００３４】
ＨＣＶの種々のタイプへの番号の付与およびＨＣＶ命名は、種々のタイプの発見年代順に基づいている。本発明において用いられるナンバリングシステムは、国際的な協定またはガイドラインによって変動するかもしれない。例えば、「タイプ４」が「タイプ５」または「タイプ６」に変わるかもしれない。タイプおよびサブタイプおよび単離体の間の任意に選択された境界距離もまた、国際的なガイドラインまたは協定によって変わる対象である。したがって、タイプ７ａ、８ａ、８ｂ、９ａは、例えば、将来、６ｂ、６ｃ、６ｄおよび６ｄと称されるかもしれない；遺伝子型３との関係を示すタイプ１０ａは、１０ａの代わりに３ｇと記されるかもしれない。
【００３５】
「サブタイプ」なる用語は、同一グループの他の単離体のゲノムの対応する部分に対して、完全ポリタンパクが核酸およびアミノ酸レベルで共に９０％より大きなホモロジーを示すか、またはヌクレオチド位置７９３２〜８２７１間のＮＳ５領域が核酸レベルで９０％より大きなホモロジーを示すＨＣＶ単離体のグループに対応する（ここで、ナンバリングは、ＨＣＶポリタンパクの開始コドンのアデニン残基で始まる）。ＨＣＶの同一タイプに属するが異なるサブタイプに属する単離体は、核酸レベルで７４％より大きく、アミノ酸レベルで７８％より大きなホモロジーを示す。
【００３６】
Ｅ１領域、Ｅ２領域およびＮＳ４領域などの非常に変化し得る領域がポリタンパクの完全ゲノムの平均ホモロジーよりも低いホモロジーを示すことが分かる。
これらの基準を用いて、ＨＣＶ単離体を少なくとも１１種類のタイプに分類することができる。タイプ１、２、３、４および７において、いくつかのサブタイプを明確に識別できる；５'ＵＲおよびコード領域のホモロジーに基づいて１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、１ｇ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉ、２ｋ、２ｌ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｆ、３ｇ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、４ｋ、４ｌ、４ｍ、７ａ、７ｃおよび７ｄ。報告された単離体および本発明の分類システムによるそれらの提案された分類ならびに他の提案された分類のほとんどの概観を第３表に示す。
【００３７】
【表３】
2005118044.tif 000004
【００３８】
「相補体（complement）」なる用語は、所定の配列と相補的であり、かつ、所定の配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を表す。
【００３９】
本発明の組成物は、多くの組合せからなり得る。例えば、本発明の組成物は、
同一領域からの２つ（またはそれ以上）の核酸または、
同一単離体についてまたは異なる単離体について、各々異なる領域からの２つ（またはそれ以上）の核酸、
または同一領域および少なくとも２つの異なる領域からの核酸（同一単離体についてまたは異なる単離体について）
からなり得る。
【００４０】
本発明は、特に、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３〜１０５から選択された配列を有する前記定義のポリ核酸、または、第５表に示しているＨＣＶサブタイプまたはタイプに固有であり、かつ、既知のＨＣＶポリ核酸と異なる少なくとも１つのヌクレオチドを含有する該ポリ核酸の一部、またはその相補体に関する。
【００４１】
さらに詳しくは、本発明は、５'ＵＲ、コア／Ｅ１領域、ＮＳ４領域またはＮＳ５Ｂ領域をコードする前記定義のポリ核酸またはその一部に関する。
【００４２】
さらに詳しくは、本発明は、ｃＤＮＡ配列である前記定義のポリ核酸に関する。
【００４３】
主にオリゴヌクレオチドの末端（３'または５'のいずれか）での１以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入、特に、１以上のコドンの挿入または欠失、またはいくつかの可欠ヌクレオチド（すなわち、ＨＣＶの異なる遺伝子型間で識別するのに不可欠ではないヌクレオチド）の他のヌクレオチド（修飾ヌクレオチドおよび／またはイノシンを含む）による置換（例えば、タイプ１または２配列は、例えば図１および２に示されるようにタイプ１または２配列のいくつかのヌクレオチドをタイプ７のタイプ特異的ヌクレオチドと置換することによってタイプ７配列に修飾される）を含有する、前記配列番号で与えられるヌクレオチド配列から選択されるポリ核酸の配列変異体も本発明の範囲内に含まれる。
【００４４】
本発明の特に好ましい変異体ポリ核酸としては、ストリンジェントな条件下、本発明のポリ核酸配列とハイブリダイズする配列が挙げられる。特に、前記のような本発明のポリ核酸と高いホモロジー（類似性）を示す配列、特に、本発明のポリ核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上相同である配列が挙げられる。好ましくは、該配列は、ポリ核酸配列の初期ヌクレオチドの２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満の変異を有するであろう。
【００４５】
配列番号によって示される配列と相同である本発明のポリ核酸配列は、配列特異的プライマーによる増幅、多少ストリンジェントな条件下での配列特異的プローブとのハイブリダイゼーション、血清スクリーニング方法またはＬiＰＡ分類システムを介してなどの当該技術分野で知られている技術に従って特徴付けられ、単離することができる。
【００４６】
本発明の他の好ましい変異体ポリ核酸としては、本発明の前記ポリ核酸と比較して遺伝暗号の縮重の結果として余分である配列が挙げられる。したがって、これらの変異体ポリ核酸配列は、それらが誘導されるポリ核酸と同一のアミノ酸配列をコードするであろう。
【００４７】
本明細書に記載のタイプ１サブタイプ１ｄ、１ｅ、１ｆまたは１ｇ単離体；タイプ２サブタイプ２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉ、２ｋまたは２ｌ単離体；タイプ３サブタイプ３ｇ単離体；タイプ４サブタイプ４ｋ、４ｌまたは４ｍ単離体；タイプ７サブタイプ７ａ、７ｃまたは７ｄ単離体；タイプ９、タイプ１０またはタイプ１１単離体から容易に得ることができる５'非コード領域配列も本発明の範 囲内に含まれる。かかる配列は、Stuyver et al. (1993)によって開示されているようなタイプ特異的および／またはサブタイプ特異的ハイブリダイゼーションアッセイのために用いることができるタイプ特異的またはサブタイプ特異的モチーフを含有してよい。
【００４８】
本実施例、図面および配列リストに記載されていない領域からの前記ゲノムのポリ核酸配列は、本発明の図１に示されるこれらの新規ゲノムの配列から適切なプライマーを用いる増幅技術などの当該技術分野で知られている技術のいずれによっても得ることができる。
【００４９】
本発明は、前記定義のポリ核酸の一部からなるオリゴヌクレオチドプライマーであって、該プライマーが誘導される遺伝子型に属するあるＨＣＶ単離体の核酸を特異的に増幅させるためのプライマーとして機能することができるオリゴヌクレオチドプライマーにも関する。
【００５０】
「プライマー」なる用語は、コピーしようとする核酸鎖と相補的であるプライマー伸長産生物の合成のための開始点として作用する能力を有する一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を意味する。該プライマーの長さおよび配列は、該伸長産生物の合成をプライムさせるようなものでなければならない。好ましくは、該プライマーは、約５〜５０ヌクレオチドである。特異的な長さおよび配列は、必要とされるＤＮＡまたはＲＮＡ標的の複雑さならびに温度およびイオン強度などのプライマーの使用条件に依存するであろう。
【００５１】
増幅プライマーが適正な増幅を保証するために対応する鋳型配列と正確に適合しなくてよいということは、文献（Kwok et al., 1990）に詳細に開示されている。
【００５２】
用いられる増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ; Saiki et al., 1988）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ; Landgren et al., 1988; Wu & Wallace, 1989; Barany, 1991）、核酸配列をベースとする増幅（ＮＡＳＢＡ; Guatelli et al., 1990; Compton, 1991）、転写をベースとする増幅システム（ＴＡＳ; Kwoh et al., 1989）、鎖置換増幅（ＳＤＡ; Duck, 1990; Walker et al., 1992）またはＱβレプリカーゼによる増幅（Lizardi et al., 1988; Lomeli et al., 1989）またはプライマー伸長を用いて核酸分子を増幅させるための他の適切な方法であってもよい。増幅の間、増幅産生物は、好都合には、標識プライマーを用いるかまたは標識ヌクレオチドを取り込むことによって標識することができる。標識は、同位体（３２Ｐ、３５Ｓなど）であってもまたは非同位体（ビオチン、ジゴキシゲニンなど）であってもよい。増幅反応は、２０〜７０回、好都合には、２５〜４５回繰り返す。
【００５３】
本発明は、前記ポリ核酸の一部からなるオリゴヌクレオチドプローブであって、該ヌクレオチド配列を含有するＨＣＶ核酸の特異的検出および／またはそのタイプおよび／またはサブタイプへの分類のためのハイブリダイゼーションプローブとして機能することができ、出来る限り標識化されているかまたは固体基質に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブにも関する。
【００５４】
「プローブ」なる用語は、検出しようとするＨＣＶ遺伝子型の標的配列と相補的である配列を有する一本鎖配列特異的オリゴヌクレオチドを意味する。
【００５５】
好ましくは、これらのプローブは、約５〜５０ヌクレオチド長、より好ましくは約１０〜２５ヌクレオチドである。
【００５６】
「固体支持体」なる用語は、オリゴヌクレオチドプローブを結合することができる基質を意味することができる。ただし、そのハイブリダイゼーション特徴を保持し、ハイブリダイゼーションのバックグラウンドレベルは低いままである。通常、固体基質は、マイクロタイタープレート、膜（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース）またはマイクロスフェア（ビーズ）であろう。該膜への適用または固定前に、固定を容易にするかまたはハイブリダイゼーション効率を改良するために核酸プローブを修飾するのが好都合である。かかる修飾は、ホモポリマーテーリング、脂肪族基、ＮＨ２基、ＳＨ基、カルボン酸基のような種々の反応性基とのカップリング、またはビオチンもしくはハプテンとのカップリングを包含する。
【００５７】
本発明は、前記定義のプライマーを含有してなることを特徴とするＨＣＶの遺伝子型の決定に用いるための診断用キットに関する。
【００５８】
本発明は、前記定義のプローブを含有してなることを特徴とするＨＣＶの遺伝子型の決定に用いるための診断用キットに関する。
【００５９】
本発明は、プローブが固体基質に結合されている、前記定義の診断用キットにも関する。
【００６０】
本発明は、一群のプローブが固体基質上で特異的な位置に結合される、前記定義の診断用キットにも関する。
【００６１】
本発明は、固体支持体が膜ストリップであり、プローブが平行線の形で膜に結合されている前記定義の診断用キットにも関する。
【００６２】
本発明は、また、
（ｉ）試料核酸を出来る限り抽出し、
（ii）該核酸を、前記定義の少なくとも１つのプライマーを用いて増幅させ、
（iii）増幅した核酸を検出すること
からなることを特徴とする、生物学的試料中に存在するＨＣＶ核酸の検出方法にも関する。
【００６３】
本発明は、また、
（ｉ）試料核酸を出来る限り抽出し、
（ii）該核酸を、前記定義の少なくとも１つのプライマーまたはユニバーサルＨＣＶプライマーを用いて出来る限り増幅させ、
（iii）該生物学的試料の核酸を、出来る限り変性条件下、前記定義の１つ以上のプローブを用いて適切な条件下でハイブリダイズさせ（ここで、該プローブは、好ましくは、固体基質に結合されている）、
（iv）適切な条件下で出来る限り洗浄し、
（ｖ）形成されたハイブリッドを検出すること
からなることを特徴とする、生物学的試料中に存在するＨＣＶ核酸の検出方法にも関する。
【００６４】
本発明は、また、
（ｉ）試料核酸を出来る限り抽出し、
（ii）該核酸を、前記定義の少なくとも１つのプライマーを用いて特異的に増幅させ、
（iii）増幅した核酸を検出すること
からなる、生物学的試料中に存在する１以上のＨＣＶ遺伝子型の存在の検出方法にも関する。
【００６５】
本発明は、また、
（ｉ）試料核酸を出来る限り抽出し、
（ii）該核酸を、前記定義の少なくとも１つのプライマーまたはユニバーサルＨＣＶプライマーを用いて出来る限り増幅させ、
（iii）該生物学的試料の核酸を、出来る限り変性条件下で、前記定義の１以上のプローブを用いて適切な条件下でハイブリダイズさせ（ここで、該プローブは、好ましくは、固体基質に結合されている）、
（iv）適切な条件下で出来る限り洗浄し、
（ｖ）形成されたハイブリッドを検出し、
（vi）観察されたハイフリダイゼーションパターンから存在する１以上のＨＣＶ遺伝子型の存在を推断すること
からなることを特徴とする、生物学的試料中に存在する１以上のＨＣＶ遺伝子型の存在の検出方法にも関する。
【００６６】
本発明は、プローブが前記定義のようにさらに特徴付けられる、前記定義の方法にも関する。
【００６７】
本発明は、核酸が増幅の間または後に標識される、前記定義の方法にも関する。
【００６８】
好ましくは、この技術は、５'非コード領域、コア領域またはＮＳ５Ｂ領域において行われる。
【００６９】
「核酸」なる用語は、分析鎖と記されることもあり、一本鎖または二本鎖核酸分子に相当する。この分析鎖は、好ましくは、正または負のストランドＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは増幅ｃＤＮＡである。
【００７０】
「生物学的試料」なる用語は、ＨＣＶ核酸配列を含有する生物学的試料（組織または液体）を意味し、特に、血清試料または血漿試料を意味する。
【００７１】
「ユニバーサルＨＣＶプライマー」なる用語は、ＨＣＶゲノムの保存される領域に相補的なオリゴヌクレオチド配列を意味する。
【００７２】
「適切な」ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、ストリンジェントであると解され、当該技術分野で一般に知られている（例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982）。
【００７３】
しかしながら、これらのプローブは、充分な特異性を得るために、ハイブリダイゼーション溶液（ＳＳＣ、ＳＳＰＥなど）に従って、それらの適切な温度でハイブリダイズされるべきである。
【００７４】
「標識された」なる用語は、標識核酸の使用を意味する。これは、Saiki et al.（1988）またはBej et al.（1990）によって開示されているような増幅のポリメラーゼ工程の間に取り込まれる標識ヌクレオチドの使用、標識プライマーの使用または当業者に知られている他の方法による使用を含む。
【００７５】
本発明の方法は、前記定義のプローブを以下の要素：
核酸がハイブリダイゼーションのために利用され得る生物学的試料、
または生物学的試料に含有される精製した核酸、
または精製した核酸から誘導された単一コピー、
または精製した核酸から誘導された増幅コピー
のうちの１つと接触させる工程からなる（ここで、該要素または該プローブは、固体基質に結合されている）。
【００７６】
「観察されたハイブリダイゼーションパターンから存在する１以上のＨＣＶ遺伝子型の存在を推断すること」なる表現は、オリゴヌクレオチドプローブの一団の結合パターンを分析することによる試料中のＨＣＶゲノムの存在の同定を意味する。単一プローブは、試料中のＨＣＶゲノムの存在または不在に関する有用な情報を提供する。他方、ＨＣＶゲノムの変異は、実際に分散されており、特異的ＨＣＶゲノムを固有に同定できるいずれか１つのプローブであるのは非常に稀である。むしろ、ＨＣＶ遺伝子型の同一性は、異なるＨＣＶゲノムの（異なる）セグメントに対して特異的であるオリゴヌクレオチドプローブの一団の結合パターンから推断される。これらのオリゴヌクレオチドプローブの選択に依存して、各既知のＨＣＶ遺伝子型は、プローブの特異的組合せの使用による特異的なハイブリダイゼーションパターンに対応するであろう。各ＨＣＶ遺伝子型は、オリゴヌクレオチドプローブの選択に依存して、同一プライマーを用いて増幅された他のＨＣＶ遺伝子型と区別され得るであろう。１以上の未知のＨＣＶ配列を含有する試料についての有効にハイブリダイズするプローブの発生パターンの、予想されるハイブリダイゼーションパターンのスキームとの比較により、該試料中に存在するＨＣＶ遺伝子型が明らかに推断される。
【００７７】
したがって、本発明は、１以上のハイブリダイゼーションプローブが配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３もしくは１０５または前記定義のその配列変異体から選択される前記定義の方法に関する。
【００７８】
増幅ＨＣＶゲノムをお互いに区別するために、標的ポリ核酸を、ＨＣＶポリ核酸中に位置するＨＣＶ遺伝子型領域（固有の領域）を標的とする１組の配列特異的ＤＮＡプローブにハイブリダイズさせる。
【００７９】
これらのプローブのほとんどは、ＨＣＶ遺伝子型の最もタイプまたはサブタイプ特異的な領域を標的とするが、いくつかは、２以上のＨＣＶ遺伝子型とのハイブリダイゼーションを生じることができる。
【００８０】
これらのプローブは、充分な特異性を得るためには、ハイブリダイゼーション溶液（ＳＳＣ、ＳＳＰＥなど）に従って、それらの適切な温度でストリンジェントにハイブリタイズされるべきである。しかしながら、ＤＮＡプローブをわずかに修飾することによって、それらの末端（３'または５'のいずれか）で１個または数個のヌクレオチドを付加または欠失するかまたはいくつかの可欠ヌクレオチド（すなわち、タイプ間で識別するのに不可欠ではないヌクレオチド）を他のヌクレオチド（すなわち、修飾ヌクレオチドまたはイノシンを含む）によって置換することによって、これらのプローブまたはその変異体は、同一ハイブリダイゼーション条件（すなわち、同一温度および同一ハイブリダイゼーション溶液）下で特異的なハイブリダイゼーションを生じることができる。プローブの使用量
（濃度）を変化させることもまた、より特異的なハイブリダイゼーション結果を得るのに有益である。これに関連して、同一の長さのプローブは、それらのＧＣ含量に関係なく、ＴＭＡＣＩ溶液（Jacobs et al., 1988）中でほぼ同一温度で特異的にハイブリダイズするであろう。
【００８１】
試料中、オリゴヌクレオチドプローブと核酸配列との間で形成されたハイブリッドを検出するという本発明の目的のための好適なアッセイ方法は、例えば、慣用のドット−ブロット・フォーマット、サンドイッチハイブリダイゼーションまたはリバースハイブリダイゼーションなどの当該技術分野で知られているアッセイフォーマットからなる。例えば、該検出は、ドット・ブロット・フォーマットを用い、非標識増幅試料を膜に結合させ、該膜を好適なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で少なくとも１つの標識プローブと一体化させ、結合したプローブの存在をモニターすることによって行うことができる。
【００８２】
別の好ましい方法は、増幅配列が標識を含有する「リバース」ドット−ブロット・フォーマットである。このフォーマットでは、非標識オリゴヌクレオチドプローブは、固体支持体に結合され、適当なストリンジェントハイブリダイゼーション条件および次なる洗浄条件下で標識試料に暴露される。試料の核酸と本発明のオリゴヌクレオチドプローブとの間のハイブリッドの形成を頼みにする他のアッセイも用いることができると解されるべきである。
【００８３】
好都合な具体例によると、生物学的試料中に含有される１以上のＨＣＶ遺伝子型を検出するプロセスは、生物学的試料から誘導された増幅ＨＣＶ核酸コピーを、固体支持体上に平行線の状態に固定したオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程からなる。
【００８４】
この好都合な方法によると、該プローブは、ライン・プローブ・アッセイ（ＬiＰＡ）フォーマットにおいて固定される。これは、好都合にはいくつかのオリゴヌクレオチドプローブ（負または正の対照オリゴヌクレオチドを含む）を平行線状に適用することができる膜ストリップを用いるリバースハイブリダイゼーションフォーマット（Saiki et al., 1989）である。
【００８５】
したがって、本発明は、平行線の形に支持体上に結合した１以上の前記プローブを表面上に担持する固体支持体、好ましくは膜ストリップに関する。
【００８６】
ＬiＰＡは、非常に迅速かつ使用者にやさしいハイブリダイゼーション試験である。結果は、増幅開始から４時間後に測定することができる。通常非同位体標識を増幅産生物中に取り込む増幅、およびアルカリ変性の後、増幅産生物を膜上でプローブと接触させ、約１〜１.５時間、ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズしたポリ核酸を検出する。生じたハイブリダイゼーションパターンから、視覚的に、しかし好ましくは専用のソフトウエアを用いて、ＨＣＶタイプを導き出すことができる。ＬiＰＡフォーマットは、市販のスキャニング装置と完全に適合しており、したがって、結果の自動解釈を非常に信頼できるものにする。これらの利点全ては、ルーチン設定においてＬiＰＡフォーマットをＨＣＶ検出に使用し易いものにしている。該ＬiＰＡフォーマットは、異なるＨＣＶ遺伝子型の存在を検出するのに特に優れている。
【００８７】
本発明は、また、以下の工程：
前記定義のプロセスにより生物学的試料中に存在するヌクレオチドがいずれのＨＣＶ遺伝子型に属するかを決定し、
第３表において定義されるものに適合したハイブリダイゼーションパターンを生じない試料が見られる場合、決定しようとする新規ＨＣＶ遺伝子型の異常にハイブリダイズするプローブに対応するＨＣＶゲノム配列の部分を配列決定すること
からなる、既知のＨＣＶゲノムとは異なる新規ＨＣＶ遺伝子型の検出および同定方法にも関する。
【００８８】
本発明は、本発明のポリ核酸の製造方法にも関する。これらの方法としては、ポリ核酸を製造するための当該技術分野で知られている方法が挙げられる（例えば、Agarwal et al. 1972, Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. 11:451によって開示されているオリゴヌクレオチド合成のためのホスホジエステル法、Hsiung et al. 1979, Nucleic Acid Res. 6:1371のホスホトリエステル法、またはBaeucage et al. 1981, Tetrahedron Letters 22:1859-1862の自動ジエチルホスホロアミダイト法）。別法としては、本発明のポリ核酸は、天然またはクローン化ＤＮＡまたはＲＮＡの単離フラグメントである。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、種々の製造会社によって販売されている市販の装置で自動的に合成してもよい。
【００８９】
本発明は、特に、前記ポリ核酸によってコードされたアミノ酸配列を有するポリペプチド、または、第５表において定義されたＨＣＶサブタイプもしくはタイプのうちの少なくとも１つに固有であり、かつ、既知のＨＣＶタイプまたはサブタイプと異なる少なくとも１つのアミノ酸を含有するその一部、または、実質的に相同であり生物学的に等価であるそのアナログにも関する。
【００９０】
「ポリペプチド」なる用語は、アミノ酸のポリマーを意味し、産生物の特定の長さを意味しない；したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパクは、該ポリペプチドの定義の範囲内に含まれる。この用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを意味しないかまたは除外する。例えば、アミノ酸の１以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸、ＰＮＡなどを含む）を含有するポリペプチド、天然および非天然の置換された結合および当該技術分野で知られている他の修飾を有するポリペプチドは、この定義の範囲内に含まれる。
【００９１】
「固有」なる用語は、前記されている。
【００９２】
本明細書および請求の範囲の全体にわたって用いる場合、「生物学的に等価」とは、組成物が前記および以下に定義する本発明のタンパク（ポリペプチド）またはペプチドと免疫学的に等価であることを意味する。
【００９３】
タンパクおよびペプチドの記載を確実にするために本明細書および請求の範囲の全体にわたって用いる場合、「実質的に相同」とは、アミノ酸配列における本発明のタンパクまたはペプチドに対するホモロジーの程度を意味する。好ましくは、ホモロジーの程度は、９０を超え、好ましくは９５を超え、タンパクの特に好ましいグループは、本発明のタンパクまたはペプチドと９９を超えて相同である。
【００９４】
本発明のタンパクまたはペプチドを記載するために本明細書または請求の範囲の全体にわたって用いる場合、「アナログ」としては、１以上の残基が生物学的に等価な残基で保存的に置換された本明細書に詳細に示される配列と実質的に同一のアミノ酸残基配列を有するタンパクまたはペプチドが挙げられる。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの１つの極性（疎水性）残基の他の残基との置換、アルギニンとリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間のような１つの極性（親水性）残基の他の残基との置換、リシン、アルギニンまたはヒスチジンなどの１つの塩基性残基の他の残基との置換、またはアスパラギン酸またはグルタミン酸などの１つの酸性残基の他の残基との置換が挙げられる。本発明の突然変異の例は、第４表に見ることができる。
【００９５】
「保存的置換」なるフレーズは、得られたタンパクまたはペプチドが本発明のタンパクまたはペプチドと生物学的に等価であることを条件に、非誘導残基の代わりに化学的に誘導された残基の使用を含む。
【００９６】
「化学的誘導体」とは、官能性側鎖基の反応によって化学的に誘導された１以上の残基を有するタンパクまたはペプチドを意味する。このように誘導された分子の例としては、限定されないが、遊離アミノ基が誘導されてアミン塩酸塩を形成する分子、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾオキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロルアセチル基またはホルミル基が挙げられる。遊離カルボキシル基は、誘導されて、塩、メチルおよびエチルエステルもしくは他のタイプのエステルまたはヒドラジドを形成する。遊離ヒドロキシル基は、誘導されて、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成する。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、誘導されて、Ｎ−イムベンジルヒスチジンを形成する。２０の標準的なアミノ酸の１以上の天然アミノ酸誘導体を含有するタンパクまたはペプチドも化学的誘導体として挙げられる。例えば：４−ヒドロキシプロリンは、プロリンの代わりに用いられる；５−ヒドロキシリシンは、リシンの代わりに用いられる；３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンの代わりに用いられる；ホモセリンは、セリンの代わりに用いられる；オルニチンは、リシンの代わりに用いられる。本発明のタンパクまたはペプチドとしては、配列が本明細書に示されているペプチドの配列と比較して残基の１以上の付加および／または欠失または残基を有するタンパクまたはペプチドも、該ペプチドが本発明のタンパクまたはペプチドと生物学的に等価である限り含まれる。
【００９７】
アミノ酸配列のレベルで、少なくとも１つのアミノ酸差異（既知のＨＣＶアミノ酸配列に関する）は、充分に本発明の一部であり、これが、本発明のポリペプチドが、コードされたポリタンパクにおけるアミノ酸差異を含む少なくとも１つのヌクレオチド差異（既知のＨＣＶポリ核酸配列に関する）を有するポリ核酸に対応することを意味する。
【００９８】
ＮＳ４領域およびコア領域は、例えば特許出願EP-A-0 489 968において特徴付けられているいくつかのエピトープを含有することが知られており、Ｅ１タンパクは、ウイルスエンベロープの一部として免疫攻撃されると予想され、かつ、エピトープを含有すると予想され、本明細書に記載している新しいタイプおよびサブタイプのＮＳ４エピトープ、コアエピトープおよびＥ１エピトープは、従前に知られている遺伝子型に存在するエピトープとは一貫して異なるであろう。これは、Simmonds et al. (1993c）およびStuyver et al. (1993b）およびPCT/EP94/01323に開示されているＮＳ４合成ペプチドのタイプ特異性およびMaertens et al. (1994）に開示されている組換えＥ１タンパクのタイプ特異性によって例示される。
【００９９】
本発明のペプチドは、好ましくは、少なくとも３個、好ましくは、４個、５個の隣接するＨＣＶアミノ酸、６個、７個、好ましくは少なくとも８個の隣接するＨＣＶアミノ酸、少なくとも１０個または少なくとも１５個（例えば、少なくとも９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個またはそれ以上）のアミノ酸を含有する。
【０１００】
【表４】
2005118044.tif 000005
【０１０１】
本発明のポリペプチド、特に該フラグメントは、古典的な化学合成によって製造することができる。
【０１０２】
該合成は、均質溶液または固相において行うことができる。
【０１０３】
例えば、用いることができる均質溶液における合成技術は、E.Wunshによって編集された「Methode der organischen chemie」なる題名の本（vol.15-1 et ll. THIEME, Stuttgart 1974）においてHoubenweylによって開示されているものである。
【０１０４】
本発明のポリペプチドは、「Solid phase peptide synthesis」なる題名の本（IRL Press, Oxford, 1989）においてAthertonおよびShepardによって開示されている方法に従って固相において製造することもできる。
【０１０５】
本発明のポリペプチドは、Maniatis et al.（ Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982）によって開示されている組換えＤＮＡ技術によって製造することができる。
【０１０６】
本発明は、特に、アミノ酸配列において以下のアミノ酸残基のうち少なくとも１つを含有してなる前記定義のポリペプチド、または第５表において定義されるＨＣＶサブタイプまたはタイプのうち少なくとも１つに固有であり、かつ、既知のＨＣＶタイプまたはサブタイプと異なる少なくとも１つのアミノ酸を含有するその一部、または、該ポリペプチドもしくはその一部と実質的に相同であり生物学的に等価であるそのアナログに関する：Ｉ１５、Ｃ３８、Ｖ４４、Ａ４９、Ｑ４３、Ｐ４９、Ｑ５５、Ａ５８、Ｓ６０またはＤ６０、Ｅ６８またはＶ６８、Ｈ７０、Ａ７１またはＱ７１またはＮ７１、Ｄ７２、Ｈ８１、Ｈ１０１、Ｄ１０６、Ｓ１１０、Ｌ１３０、Ｉ１３４、Ｅ１３５、Ｌ１４０、Ｓ１４８、Ｔ１５０またはＥ１５０、Ｑ１５３、Ｆ１５５、Ｄ１５７、Ｇ１６０、Ｅ１６５、Ｉ１６９、Ｆ１８１、Ｌ１８６、Ｔ１９０、Ｔ１９２またはＩ１９２またはＨ１９２、Ｉ１９３、Ａ１９５、Ｓ１９６、Ｒ１９７またはＮ１９７またはＫ１９７、Ｑ１９９またはＤ１９９またはＨ１９９、Ｎ１９９、Ｆ２００またはＴ２００、Ａ２０８、Ｉ２１３、Ｍ２１６またはＳ２１６、Ｎ２１７またはＳ２１７またはＧ２１７またはＫ２１７、Ｔ２１８、Ｉ２１９、Ａ２２２、Ｙ２２３、Ｉ２３０、Ｗ２３１またはＬ２３１、Ｓ２３２またはＨ２３２またはＡ２３２、Ｑ２３３、Ｅ２３５またはＬ２３５、Ｆ２３６またはＴ２３６、Ｆ２３７、Ｌ２４０またはＭ２４０、Ａ２４２、Ｎ２４４、Ｎ２４９、Ｉ２５０またはＫ２５０またはＲ２５０、Ａ２５２またはＣ２５２、Ａ２５４、Ｉ２５５またはＶ２５５、Ｄ２５６またはＭ２５６、Ｅ２５７、Ｅ２６０またはＫ２６０、Ｒ２６１、Ｖ２６８、Ｓ２７２またはＲ２７２、Ｉ２８５、Ｇ２９０またはＦ２９０、Ａ２９１、Ａ２９３またはＬ２９３またはＷ２９３、Ｔ２９４またはＡ２９４、Ｓ２９５、Ｈ２９５、Ｋ２９６またはＥ２９６、Ｙ２９７またはＭ２９７、Ｉ２９９またはＹ２９９、Ｉ３００、Ｓ３０１、Ｐ３１６、Ｓ２６４６、Ａ２６４８、Ｇ２６４９、Ａ２６５０、Ｖ２６５２、Ｑ２６５３、Ｈ２６５６またはＬ２６５６、Ｄ２６５７、Ｆ２６５９、Ｋ２６６３またはＱ２６６３、Ａ２６６７またはＶ２６６７、Ｄ２６７７、Ｌ２６８１、Ｍ２６８６またはＱ２６８６またはＥ２６８６、Ａ２６９２またはＫ２６９２、Ｈ２６９７、Ｉ２７０７、Ｌ２７０８またはＹ２７０８、Ａ２７０９、Ａ２７１９またはＭ２７１９、Ｆ２７２７、Ｔ２７２８またはＤ２７２８、Ｅ２７２９、Ｆ２７３０またはＹ２７３０、Ｉ２７４１、Ｉ２７４５、Ｖ２７４６またはＥ２７４６またはＬ２７４６またはＫ２７４６、Ａ２７４８、Ｓ２７４９またはＰ２７４９、Ｒ２７５０、Ｅ２７５１、Ｄ２７５２またはＮ２７５２またはＳ２７５２またはＴ２７５２またはＶ２７５２またはＩ２７５２またはＱ２７５２、Ｓ２７５３またはＤ２７５３またはＧ２７５３、Ｄ２７５４、Ａ２７５５、Ｌ２７５６またはＱ２７５６、またはＲ２７５７（ここで、表記は、アミノ酸残基を一文字表記によって表す文字および第１表に示すKato et al., 1990によるアミノ酸ナンバリングを表す数字からなる（図２、図４および図６におけるナンバリングも参照））。
【０１０７】
これらの固有のアミノ酸残基は、図３に示されているように新規ＨＣＶアミノ酸配列を全ての既知のＨＣＶ配列と整列させることにより推断することができる。配列番号１〜１０６で示される新規配列との整列は、例えば、図２、図４および図６において示される。これらの図面に示された整列が全ての既知のＨＣＶ配列と共に完成されて、前記固有の残基は、本発明の新規ＨＣＶ配列のうち少なくとも１つについて実際に固有であるということを説明することは明らかである。
【０１０８】
本発明の固有の新規アミノ酸残基のグループの範囲内で、本発明において用いられるＨＣＶ分類システムによりＨＣＶの以下の新規タイプ（サブタイプ）に対して特異的である固有の残基が見いだされる：タイプ１サブタイプ１ｄ、１ｅ、１ｆまたは１ｇ単離体；タイプ２サブタイプ２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉ、２ｋまたは２ｌ単離体；タイプ３サブタイプ３ｇ単離体；タイプ４サブタイプ４ｋ、４ｌまたは４ｍ単離体；タイプ７サブタイプ７ａ、７ｃまたは７ｄ単離体、タイプ９、タイプ１０またはタイプ１１単離体。これらの残基を得るために、図２、図４および図６に示される整列を用いて、前記の固有の残基のタイプ特異性および／またはサブタイプ特異性を推断することができる。
【０１０９】
例えば、Ｔ１９０（サブタイプ１ｄにおいて検出された）は、１９０位のトレオニンを表す（図２を参照）。別の配列においては、唯一セリン（Ｓ１９０）または例外的にアラニン（タイプ１０ａにおけるＡ１９０）を検出することができる。
【０１１０】
本発明のこの具体例によるポリペプチドは、出来る限り標識されているか、または固体基質に結合されているか、またはビオチンなどの担体分子に結合されているか、または当該技術分野において知られており所定の用途（診断、治療または予防）による全ての適正なアジュバントと混合される。
【０１１１】
本発明は、アミノ酸配列において、前記で挙げた配列番号１０７〜２０７によって表される配列のうち少なくとも１つを含有してなる前記ポリペプチド、または第５表において定義されるＨＣＶサブタイプもしくはタイプのうち少なくとも１つに固有であるその一部、または該ポリペプチドもしくはその一部に実質的に相同であり生物学的に等価であるそのアナログにも関する。
【０１１２】
本発明は、配列番号１〜１０６によって表されるアミノ配列を有するポリペプチド、または第５表において定義されるＨＣＶサブタイプもしくはタイプのうち少なくとも１つに固有であるその一部、または該ポリペプチドもしくはその一部に実質的に相同であり生物学的に等価であるそのアナログにも関する。
【０１１３】
コアタンパクにおける可変領域（図２におけるＶ−コア）は、血清型を分類するのに有用であることが示された（Machida et al., 1992）。本発明のタイプ１サブタイプ１ｄ、１ｅ、１ｆまたは１ｇ配列；タイプ２サブタイプ２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉ、２ｋおよび２ｌ配列；タイプ３サブタイプ３ｇ；タイプ４サブタイプ４ｋ、４ｌまたは４ｍ配列；タイプ７（サブタイプ７ａ、７ｃおよび７ｄ配列）、９、１０または１１配列は、この領域においてタイプ特異的な特徴を示す。アミノ酸６８から７８までのペプチド（Ｖ−コア領域）は、本発明の配列について以下の固有の配列を示す（図２を参照）：
サブタイプ１ｄに関してはＡＲＱＳＤＧＲＳＷＡＱまたはＡＲＲＳＥＧＲＳＷＡＱ（配列番号１０７および１０８）
サブタイプ１ｅに関してはＥＲＲＰＥＧＲＳＷＡＱ（配列番号１０９）
サブタイプ１ｆに関してはＡＲＲＰＥＧＲＳＷＡＱ（配列番号１１０）
サブタイプ２ｋに関してはＤＲＲＴＴＧＫＳＷＧＲ（配列番号１１１）
サブタイプ２ｅに関してはＤＲＲＡＴＧＲＳＷＧＲ（配列番号１１２）
サブタイプ２ｆに関してはＤＲＲＡＴＧＫＳＷＧＲ（配列番号１１３）
タイプ９に関してはＶＲＱＰＴＧＲＳＷＧＱ（配列番号１１４）
サブタイプ７ａおよび７ｃに関してはＶＲＨＱＴＧＲＴＷＡＱ（配列番号１１５）
サブタイプ７ｄに関してはＶＲＱＮＱＧＲＴＷＡＱ（配列番号１１６）
タイプ１０に関してはＡＲＲＴＥＧＲＳＷＡＱ（配列番号１１７）
タイプ１１に関してはＶＲＲＴＴＧＲＸＸＸＸまたはＶＲＲＴＴＧＲＴＷＡＱ（配列番号１１８および１１９）。
【０１１４】
５つのタイプ特異的可変領域（Ｖ１〜Ｖ５）は、図２に示すように本発明の遺伝子型のＥ１アミノ酸配列を既に知られている遺伝子型と整列させた後に同定することができる。
【０１１５】
領域Ｖ１は、アミノ酸１９２〜２０３を包含し、これは、Ｅ１タンパクのアミノ末端の１０アミノ酸である。図２に示す以下の固有の配列を推断することができる：
サブタイプ１ｄに関してはＨＥＶＲＮＡＳＧＶＹＨＶまたはＨＥＶＲＮＡＳＧＶＹＨＬ（配列番号１２０および１２１）
サブタイプ１ｆに関してはＹＥＶＨＳＴＴＤＧＹＨＶ（配列番号１２２）
サブタイプ２ｅに関してはＶＥＶＫＮＴＳＱＡＹＭＡ（配列番号１２３）
サブタイプ２ｆに関してはＩＱＶＫＮＮＳＨＦＹＭＡ（配列番号１２４）
サブタイプ２ｇに関してはＶＱＶＫＮＴＳＴＭＹＭＡ（配列番号１２５）
サブタイプ２ｈに関してはＶＱＶＫＮＴＳＨＳＹＭＶ（配列番号１２６）
サブタイプ２ｉに関してはＶＱＶＡＮＲＳＧＳＹＭＶ（配列番号１２７）
サブタイプ２ｋに関してはＶＥＩＫＮＴＸＮＴＹＶＬまたはＶＥＩＫＮＴＳＮＴＹＶＬ（配列番号１２８および１２９）
サブタイプ４ｋに関してはＩＮＹＲＮＶＳＧＩＹＹＶまたはＩＮＹＲＮＴＳＧＩＹＨＶまたはＩＮＹＨＮＴＳＧＩＹＨＩまたはＴＮＹＲＮＶＳＧＩＹＨＶ（配列番号１３０、１３１、１３２または１３３）
サブタイプ４ｌに関してはＱＨＹＲＮＶＳＧＩＹＨＶ（配列番号１３４）
タイプ９に関してはＩＱＶＫＮＡＳＧＩＹＨＬ（配列番号１３５）
サブタイプ７ｃに関してはＡＨＹＴＮＫＳＧＬＹＨＬ（配列番号１３６）
サブタイプ７ｄに関してはＬＮＹＡＮＫＳＧＬＹＨＬ（配列番号１３７）
タイプ１０に関してはＬＥＹＲＮＡＳＧＬＹＭＶ（配列番号１３８）。
【０１１６】
領域Ｖ２は、アミノ酸２１３〜２２３を包含する。図２に示すＶ２領域において、以下の固有の配列を見いだすことができる：
サブタイプ１ｄに関してはＩＹＥＭＤＧＭＩＭＨＹまたはＩＹＥＭＳＧＭＩＬＨＡ（配列番号１３９および１４０）
サブタイプ１ｆに関してはＶＹＥＡＫＤＩＩＬＨＴ（配列番号１４１）
サブタイプ２ｅに関してはＶＷＱＬＸＤＡＶＬＨＶ（配列番号１４２）
サブタイプ２ｆに関してはＶＷＱＬＲＤＡＶＬＨＶ（配列番号１４３）
サブタイプ２ｇに関してはＩＷＱＭＱＧＡＶＬＨＶ（配列番号１４４）
サブタイプ２ｈに関してはＶＷＱＬＫＤＡＶＬＨＶ（配列番号１４５）
サブタイプ２ｉに関してはＶＷＱＬＥＥＡＶＬＨＶ（配列番号１４６）
サブタイプ２ｋに関してはＴＷＱＬＸＸＡＶＬＨＶ（配列番号１４７）
サブタイプ４ｋに関してはＶＹＥＡＤＨＨＩＬＨＬまたはＶＹＥＡＤＨＨＩＬＡＬまたはＶＦＥＡＤＨＨＩＬＨＬ（配列番号１４８、１４９および１５０）
サブタイプ４ｌに関してはＶＹＥＳＤＨＨＩＬＨＬ（配列番号１５１）
タイプ９に関してはＶＦＥＡＥＴＭＩＬＨＬ（配列番号１５２）
サブタイプ７ｃに関してはＶＹＥＡＥＴＬＩＬＨＬ（配列番号１５３）
サブタイプ７ｄに関してはＶＹＥＡＮＧＭＩＬＨＬ（配列番号１５４）
タイプ１０に関してはＶＹＥＡＧＤＩＩＬＨＬ（配列番号１５５）。
【０１１７】
領域Ｖ３は、アミノ酸２３０〜２４２を包含する。図２から以下の固有のＶ３領域配列を推断することができる：
サブタイプ１ｄに関してはＶＲＥＤＮＨＬＲＣＷＭＡＬまたはＶＲＥＮＮＳＳＲＣＷＭＡＬ（配列番号１５６および１５７）
サブタイプ１ｆに関してはＩＲＥＧＮＩＳＲＣＷＶＬＰ（配列番号１５８）
サブタイプ２ｅに関してはＥＮＳＳＧＲＦＨＣＷＩＰＩ（配列番号１５９）
サブタイプ２ｆに関してはＥＲＳＧＮＲＴＦＣＷＴＡＶ（配列番号１６０）
サブタイプ２ｇに関してはＥＬＱＧＮＫＳＲＣＷＩＰＶ（配列番号１６２）
サブタイプ２ｈに関してはＥＲＨＱＮＱＳＲＣＷＩＰＶ（配列番号１６３）
サブタイプ２ｉに関してはＥＷＫＤＮＴＳＲＣＷＩＰＶ（配列番号１６４）
サブタイプ２ｋに関してはＥＲＥＧＮＳＳＲＣＷＩＰＶ（配列番号１６５）
サブタイプ４ｋに関してはＶＲＥＧＮＱＳＲＣＷＶＡＬまたはＶＲＴＧＮＱＳＲＣＷＶＡＬまたはＶＲＶＧＮＱＳＳＣＷＶＡＬまたはＶＲＶＧＮＱＳＲＣＷＶＡＬまたはＶＫＥＧＮＨＳＲＣＷＶＡＬ（配列番号１６６、１６７、１６８または１６９）
サブタイプ４ｌに関してはＶＫＴＧＮＴＳＲＣＷＶＡＬ（配列番号１７０）
タイプ９に関してはＩＫＡＧＮＥＳＲＣＷＬＰＶ（配列番号１７１）
サブタイプ７ｃに関してはＶＫＸＸＮＱＳＲＣＷＶＱＡ（配列番号１７２）
サブタイプ７ｄに関してはＶＫＴＧＮＬＴＫＣＷＬＳＡ（配列番号１７３）
タイプ１０に関してはＶＲＳＧＮＴＳＲＣＷＩＰＶ（配列番号１７４）。
【０１１８】
領域Ｖ４は、アミノ酸２４８〜２５７を包含する。図２から以下の固有のＶ４領域配列を推断することができる：
サブタイプ１ｄに関してはＶＫＮＡＳＶＰＴＡＡまたはＶＫＤＡＮＶＰＴＡＡ（配列番号１７５および１７６）
サブタイプ１ｆに関してはＡＲＩＡＮＡＰＩＤＥ（配列番号１７７）
サブタイプ２ｅに関してはＶＳＫＰＧＡＬＴＫＧ（配列番号１７８）
サブタイプ２ｆに関してはＶＳＲＰＧＡＬＴＲＧ（配列番号１７９）
サブタイプ２ｇに関してはＶＮＱＰＧＡＬＴＲＧ（配列番号１８０）
サブタイプ２ｈに関してはＶＳＱＰＧＡＬＴＲＧ（配列番号１８１）
サブタイプ２ｉに関してはＶＳＱＰＧＡＬＴＫＧ（配列番号１８２）
サブタイプ２ｋに関してはＶＳＲＰＧＡＬＴＥＧ（配列番号１８３）
サブタイプ４ｋに関してはＡＰＹＩＧＡＰＬＥＳまたはＡＰＹＴＡＡＰＬＥＳ（配列番号１８４および１８５）
サブタイプ４ｌに関してはＡＰＩＬＳＡＰＬＭＳ（配列番号１８６）
タイプ９に関してはＶＰＮＳＳＶＰＩＨＧ（配列番号１８７）
サブタイプ７ｃに関してはＶＰＮＡＳＴＰＶＴＧ（配列番号１８８）
サブタイプ７ｄに関してはＶＱＮＡＳＶＳＩＲＧ（配列番号１８９）
タイプ１０に関してはＶＫＳＰＣＡＡＴＡＳ（配列番号１９０）。
【０１１９】
領域Ｖ５は、アミノ酸２９４〜３０３を包含する。図２から以下の固有のＶ５領域配列を推断することができる：
サブタイプ１ｄに関してはＳＰＲＭＨＨＴＴＱＥまたはＳＰＲＬＹＨＴＴＱＥ（配列番号１９１および１９２）
サブタイプ１ｆに関してはＴＳＲＲＨＷＴＶＱＤ（配列番号１９３）
サブタイプ２ｅに関してはＡＰＫＲＨＹＦＶＱＥ（配列番号１９４）
サブタイプ２ｆに関してはＳＰＱＹＨＴＦＶＱＥ（配列番号１９５）
サブタイプ２ｇに関してはＳＰＱＨＨＮＦＳＱＤ（配列番号１９６）
サブタイプ２ｈに関してはＳＰＱＨＨＩＦＶＱＤ（配列番号１９７）
サブタイプ２ｋに関してはＳＰＥＨＨＨＦＶＱＤ（配列番号１９８）
サブタイプ４ｋに関してはＲＰＲＲＨＷＴＴＱＤまたはＲＰＲＲＨＷＴＡＱＤまたはＱＰＲＲＨＷＴＴＱＤまたはＲＰＲＲＨＷＴＴＱＥ（配列番号１９９、２００、２０１または２０２）
サブタイプ４ｌに関してはＱＰＲＲＨＷＴＶＱＤ（配列番号２０３）
タイプ９に関してはＲＰＫＹＨＱＶＴＱＤ（配列番号２０４）
サブタイプ７ｃに関してはＲＰＲＭＨＱＶＶＱＥ（配列番号２０５）
サブタイプ７ｄに関してはＲＰＲＭＹＥＩＡＱＤ（配列番号２０６）
タイプ１０に関してはＲＨＲＱＨＷＴＶＱＤ（配列番号２０７）。
【０１２０】
ペプチドの前記リストは、治療およびワクチンおよび診断開発に特に有用である。
【０１２１】
ペプチド鎖において少なくとも前記ペプチドから誘導されたエピトープを含有する合成ペプチド（以下を参照）またはポリペプチドも本発明を構成する。それらのペプチド鎖において前記ペプチドから誘導される少なくとも６個、７個、８個または９個の隣接するアミノ酸からなる合成ペプチドまたはポリペプチドも本発明を構成する。
【０１２２】
本明細書で用いる場合、「エピトープ」または「抗原決定因子」とは、免疫反応性であるアミノ酸配列を意味する。一般的に、エピトープは、少なくとも３個〜４個のアミノ酸からなり、より一般的には、少なくとも５個または６個のアミノ酸からなり、しばしば、該エピトープは、約７個〜８個のアミノ酸からなり、または約１０個のアミノ酸からもなる。
【０１２３】
本発明は、特に、配列番号２、４、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４または１０６で表されるアミノ酸配列に含有されるペプチド（以下を参照）またはポリペプチドに関する（第５表および図３、実施例を参照）。
【０１２４】
本発明は、前記ポリ核酸によってコードされた組換えポリペプチド、第５表において定義されるＨＣＶサブタイプまたはタイプに固有であるその一部、または該ポリペプチドと実質的に相同であり生物学的に等価であるそのアナログにも関する。
【０１２５】
本発明は、原核生物性、真核生物性またはウイルス性転写および翻訳制御要素に操作可能に結合した前記定義のポリ核酸またはその一部を含有することを特徴とする組換え発現ベクターにも関する。
【０１２６】
一般に、組換えベクターは、ベクター配列、適切な原核生物性、真核生物性またはウイルス性プロモーター配列、次いで前記ヌクレオチド配列からなるであろう。ここで、該組換えベクターは、原核宿主もしくは真核宿主において、または裸のＤＮＡとして注入される場合は生きている哺乳動物において、前記ポリペプチドのうちいずれか１つを発現させ、さらに詳しくは、組換えベクターは、特に以下のアミノ酸位置にわたる本発明の新規ＨＣＶ配列を発現させる：
【０１２７】
１〜１０位の間の領域で開始し、７０〜４２０位の間の領域のいずれかの位置で終わるポリペプチド、さらに詳しくは、コアタンパクの発現については、１〜７０位、１〜８５位、１〜１２０位、１〜１５０位、１〜１９１位または１〜２００位にわたるポリペプチド、およびコアタンパクおよびＥ１タンパクの発現については、１〜２６３位、１〜３２６位、１〜３８３位、または１〜４２０位にわたるポリペプチド；
【０１２８】
Ｅ１の発現については、１１７〜１９２位の間の領域のいずれかの位置で開始し、２６３〜４２０位の間の領域のいずれかの位置で終わるポリペプチドまたは疎水性領域（２６４〜２９３位置プラスまたはマイナス８アミノ酸）を欠失した形態；
【０１２９】
ＮＳ４の発現については、１５５６〜１６８８位の間の領域のいずれかの位置で開始し、１７３９〜１７６４位の間の領域のいずれかの位置で終わるポリペプチド；さらに詳しくは、ＮＳ４ａ抗原の発現については、１６５８位で開始し、１７１１位で終わるポリペプチド、さらに詳しくは、ＮＳ４ｂ抗原の発現については、１７１２位で開始し、１７４３〜１９７２位の間の領域で終わるポリペプチド（例えば、１７１２〜１７４３、１７１２〜１７６４、１７１２〜１７８２、１７１２〜１９７２、１７１２〜１７８２、１７１２〜１９０２）またはその一部。   本発明の組換えポリペプチドのために、当該技術分野で知られている他のＨＣＶベクター構築を用いてもよい。
【０１３０】
本発明の組換えポリペプチドの産生のために、組換えタンパクのための公知の精製方法、特に、Innogenetics N.V.の名義のPCT/EP95/03031に開示されているＨＣＶ組換えポリペプチド精製方法を用いてもよい。
【０１３１】
「ベクター」なる用語は、プラスミド、コスミド、ファージまたはウイルスまたはトランスジェニック動物からなる。ＢＣＧまたはアデノウイルスベクターならびにアビポックス組換えウイルスは、ワクチン開発に特に有用である。
【０１３２】
本発明は、
適切な細胞宿主を、前記定義のポリ核酸またはその一部が適切な調節要素の制御下で挿入された組換えベクターと形質転換させ、
挿入体の発現を可能にする条件下、該形質転換した細胞宿主を培養し、
該ポリペプチドを収穫すること
からなることを特徴とする、前記組換えポリペプチドの製造方法にも関する。
【０１３３】
本発明の範囲内で用いられる「組換え的に発現される」なる用語は、本発明のタンパクが、以下に詳述する原核生物または下等もしくは高等真核生物における組換え発現方法によって産生されるということを意味する。
【０１３４】
「下等真核生物」なる用語は、酵母、真菌類などの宿主細胞を意味する。下等真核生物は、一般に（必ずではないが）、単細胞である。好ましい下等真核生物は、酵母、特に、サッカロミセス（Ｓaccharomyces）、シゾサッカロミセス（Ｓchizosaccharomyces）、クルベロミセス（Ｋluveromyces）、ピチア（Ｐichia）（例えば、ピチア・パストリス（Ｐichia pastoris)）、ハンゼヌラ（Ｈansenula）(例えば、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈansenula polymorpha))、ヤロウィア（Ｙarowia）、シュワニオミセス（Ｓchwaniomyces）、シゾサッカロミセス（Ｓchizosaccharomyces）、ザイゴサッカロミセス(Ｚygosaccharomyces)などの範囲内の種である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓaccharomyces cerevisiae）、エス・カールスベルゲンシス（Ｓ. carlsbergensis）およびケイ・ラクティス（Ｋ. lactis）は、もっとも一般的に用いられる酵母宿主であり、好都合な真菌類宿主である。
【０１３５】
「原核生物」なる用語は、エシェリキア・コリ（Ｅ. coli）、ラクトバシラス（Ｌactobacillus）、ラクトコッカス（Ｌactococcus）、サルモネラ（Ｓalmonella）、ストレプトコッカス（Ｓtreptococcus）、バシラス・サチリス（Ｂacillus subtilis）またはストレプトマイセス（Ｓtreptomyces）などの宿主を表す。また、これらの宿主は、本発明の範囲内である。
【０１３６】
「高等真核生物」なる用語は、哺乳動物、爬虫類、昆虫などの高等動物由来の宿主細胞を表す。現在、好ましい高等真核生物宿主細胞は、チャイニーズハムスター（例えば、ＣＨＯ）、サル（例えば、ＣＯＳおよびベロ細胞）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ブタ腎臓（ＰＫ１５)、ウサギ腎臓１３細胞（ＲＫ１３)、ヒト骨肉腫細胞系１４３Ｂ、ヒト細胞系ＨeＬaおよびヒトヘパトーム細胞系Ｈep Ｇ２、および昆虫細胞系（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓpodoptera frugiperda)）から誘導される。宿主細胞は、懸濁またはフラスコ培養、組織培養、臓器培養などにおいて提供される。別法としては、宿主細胞は、トランスジェニック動物であってもよい。
【０１３７】
「組換えポリヌクレオチドまたは核酸」なる用語は、起源または操作によっては（１）自然に会合されるポリヌクレオチドの全部または一部と会合されないか、または（２）自然に結合されるもの以外のポリヌクレオチドに結合されるか、または（３）自然には生じない、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成または合成起源のポリヌクレオチドまたは核酸を意味する。
【０１３８】
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養」なる用語、および単細胞体として培養される微生物または高等真核細胞系を示す他のかかる用語は、組換えベクターまたは他のトランスファーポリヌクレオチドについての受容体として用いることができるかまたは用いられた細胞を表し、トランスフェクトされた初期細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、自然の突然変異、偶発的な突然変異または故意の突然変異のために、形態において、またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補体において初期親と完全に同一である必要はない。
【０１３９】
「レプリコン」なる用語は、細胞内で自律的ポリヌクレオチド複製の単位として機能する、すなわち、自体制御下で複製可能な、遺伝的要素、例えば、プラスミド、染色体、ウイルス、コスミドなどである。
【０１４０】
「ベクター」なる用語は、さらに、所望のオープンリーディングフレームの複製および／または発現を提供する配列からなるレプリコンである。
【０１４１】
「制御配列」なる用語は、それらがライゲートされるコード配列の発現に影響を及ぼすのに必要とされるポリヌクレオチド配列を表す。かかる制御配列の性質は、宿主微生物に依存して異なる；原核生物においては、かかる制御配列としては、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、スプライシング部位およびターミネーターが挙げられ；真核生物においては、一般的に、かかる制御配列としては、プロモーター、スプライシング部位、ターミネーター、および場合によってはエンハンサーが挙げられる。「制御配列」なる用語は、最小でも、発現のために存在が必要である全ての成分を含み、存在が好都合であるさらなる成分、例えば、分泌を制御するリーダー配列を含むことを意図する。
【０１４２】
「プロモーター」なる用語は、隣接する構造遺伝子に対して正常な転写開始部位でｍＲＮＡ産生が始まるような方法で、ＤＮＡ鋳型にＲＮＡポリメラーゼを結合させるコンセンサス配列からなるヌクレオチド配列である。
【０１４３】
「操作可能に結合される」なる表現は、このように記載された成分が所定の方法でそれらを機能させる関係にある並列を表す。コード配列に「操作可能に結合される」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合可能な条件下で行われるような方法でライゲートされる。
【０１４４】
ベクター配列中に挿入される所望の配列をコードするＨＣＶｃＤＮＡのセグメントは、シグナル配列に結合される。該シグナル配列は、非ＨＣＶ供給源由来のものであり、例えば、哺乳動物細胞における発現のためのＩgＧまたは組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔｐａ）リーダー配列、または酵母細胞中への発現のためのα−接合因子配列であるが、本発明の特に好ましい構築物は、タンパクの個々の開始点の前のＨＣＶゲノムにおいて出現するシグナル配列を含有する。
【０１４５】
種々のベクターを用いて、本発明のＨＣＶ単一または特異的オリゴマーエンベロープタンパクの組換え発現を得ることができる。酵母およびグリコシル化突然変異株などの下等真核生物は、典型的には、プラスミドで形質転換されるか、または、組換えウイスルで形質転換される。該ベクターは、独立して、宿主内で複製されるか、または宿主細胞ゲノム中に取り込まれる。
【０１４６】
高等真核生物は、ベクターで形質転換されるか、または、組換えウイルス、例えば組換えワクシニアウイルスに感染する。外来ＤＮＡのワクシニアウイルス中への挿入のための技術およびベクターは、当該技術分野においてよく知られており、例えば、相同的組換えを利用する。種々のウイルスプロモーター配列、できる限りターミネーター配列およびポリ(Ａ)−付加配列、エンハンサー配列ならびに増幅配列（全て、哺乳動物発現のために必要とされる）は、当該技術分野で入手可能である。ワクシニアは、宿主細胞タンパクの発現を停止させるので、特に好ましい。ワクシニアは、例えば生きている組換えワクシニアウイルスで免疫される細胞または個体においてＨＣＶのＥ１およびＥ２タンパクを発現させるので非常に好ましい。ヒトの予防接種については、アビポックスおよびアンカラ修飾ウイルス（Ａnkara Ｍodified Ｖirus）（ＡＭＶ）は、特に有用なベクターである。
【０１４７】
ヘルパー独立ウイルス発現ベクターであるバキュロウイルス、オートグラファ・カリフォルニカ・ニュークレア（Ａutographa californica nuclear）ポリヘドロシスウイルス（ＡcＮＰＶ）由来の昆虫発現伝達ベクターも知られている。この系由来の発現ベクターは、通常、強いウイルスポリヘドリン遺伝子プロモーターを用いて、異種遺伝子の発現を駆動する。バキュロウイルスの所望の部位中に異種ＤＮＡを導入するための異なるベクターおよび方法は、バキュロウイルス発現についての当該技術分野における当業者に利用可能である。昆虫細胞によって認識される翻訳後修飾のための異なるシグナルも知られている。
【０１４８】
本発明は、前記定義の組換えベクターで形質転換した宿主細胞にも関する。
【０１４９】
本発明は、
（ｉ）ＨＣＶの存在について分析しようとする生物学的試料を前記定義のポリペプチドと接触させ、
（ii）抗体と該ポリペプチドとの間で形成された免疫複合体を検出すること
からなることを特徴とする、生物学的試料中に存在するＨＣＶに対する抗体の検出方法にも関する。
【０１５０】
本発明は、
（ｉ）ＨＣＶの存在について分析しようとする生物学的試料を前記定義のポリペプチドと接触させ、
（ii）抗体と該ポリペプチドとの間で形成された免疫複合体を検出すること
からなることを特徴とするＨＣＶ分類方法にも関する。
【０１５１】
本発明は、好ましくは固体支持体に結合されている前記定義の少なくとも１つのポリペプチドを含有してなることを特徴とする、ＨＣＶの存在の検出に用いるための診断用キットにも関する。
【０１５２】
本発明は、好ましくは固体支持体に結合されている前記定義の少なくとも１つのポリペプチドを含有してなることを特徴とする、ＨＣＶ分類のための診断用キットにも関する。
【０１５３】
本発明は、固体基質上の特異的な位置に結合される一群のポリペプチドを含有してなる、前記定義の診断用キットにも関する。
【０１５４】
本発明は、固体支持体が膜ストリップであり、ポリペプチドが平行線の形で膜に結合されている、前記定義の診断用キットにも関する。
【０１５５】
本発明のイムノアッセイ方法は、ＨＣＶに感染した個体由来の血清中で抗体によって認識される直線状エピトープ（ペプチドの場合）および高次構造エピトープ（ポリペプチドの場合）を維持する本発明の新規および固有のポリペプチド配列の種々のドメインからの抗原を利用する。例えば、単一または特異的オリゴマー抗原、二量体抗原、ならびに単一または特異的オリゴマー抗原の組換え体を使用することは、本発明の範囲内である。本発明のＨＣＶ抗原は、実質的には、抗体を検出するために既知の抗原を用いるアッセイフォーマットにおいて用いられる。もちろん、ＨＣＶ高次構造エピトープを変性させるフォーマットは、回避されるかまたは適合させるべきである。これらのアッセイの全ての一般的な特徴は、抗原を、体成分中に存在する抗体に抗原を結合させる条件下でＨＣＶ抗体を含有すると推測される体成分と接触させることである。かかる条件は、典型的には、過剰の抗原を用いる生理学的温度、pＨおよびイオン強度である。抗原の検体とのインキュベーションの後、抗原からなる免疫複合体を検出する。
【０１５６】
イムノアッセイの設計は、かなり変形され、多くのフォーマットが当該技術分野において知られている。プロトコールは、例えば、固体支持体またはイムノプレシピテーションを用いてもよい。ほとんどのアッセイは、標識抗体またはポリペプチドの使用を含む；該標識は、例えば、酵素分子、蛍光分子、化学発光分子、放射性分子または色素分子であってよい。免疫複合体からのシグナルを増幅するアッセイもまた知られている；例えば、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビシンを用いるアッセイ、ならびにＥＬＩＳＡアッセイのような酵素標識および媒介イムノアッセイである。
【０１５７】
イムノアッセイは、限定されないが、異種フォーマットまたは同種フォーマットであってもよく、標準的タイプまたは競合的タイプのものであってもよい。異種フォーマットでは、ポリペプチドは、典型的には、固体マトリックスまた支持体に結合されて、インキュベーション後、試料をポリペプチドから分離し易くする。用いることができる固体支持体の例としては、ニトロセルロース（例えば、膜またはマイクロタイターウエル形態で）、ポリビニルクロリド（例えば、シートまたはマイクロタイターウエルで）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレートで）、ポリビニリジンフルオリド（イムノロン（ＩmmunolonＴＭ)として知られている）、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性化ビーズおよびタンパクＡビーズが挙げられる。例えば、ダイナテック(Ｄynatech)・イムノロン（ＩmmunolonＴＭ）１またはイムノロン（ＩmmunolonＴＭ)２マイクロタイタープレートまたは０.２５インチのポリスチレンビーズ（プリシジョン・プラスチック・ボール（Ｐrecision Ｐlastic Ｂall））は、異種フォーマットで用いることができる。抗原ポリペプチドを含有する固体支持体は、典型的には、試験試料から分離した後、結合した抗体を検出する前に洗浄される。標準的なフォーマットおよび競合的フォーマットは、共に、当該技術分野で知られている。
【０１５８】
同種フォーマットでは、溶液中、試験試料を抗原混合物と一緒にインキュベートする。例えば、これは、形成される抗原−抗体複合体を沈殿する条件下であってよい。これらのアッセイのための標準的なフォーマットおよび競合的なフォーマットは、共に、当該技術分野で知られている。
【０１５９】
標準的なフォーマットでは、抗体−抗原複合体におけるＨＣＶ抗体の量は、直接的にモニターされる。これは、抗ＨＣＶ抗体上でエピトープを認識する標識抗異種（例えば、抗ヒト）抗体が複合体形成により結合するかを決定することによって行われる。競合的フォーマットでは、試料中のＨＣＶ抗体の量は、複合体における既知の量の標識抗体（または他の競合するリガンド）の結合に対する競合的効果をモニターすることによって導き出される。
【０１６０】
抗ＨＣＶ抗体からなる形成された複合体（競合アッセイの場合、競合する抗体の量）は、フォーマットに依存して、多くの公知技術によって検出される。例えば、複合体における非標識ＨＣＶ抗体は、複合化された抗異種Ｉgの標識とのコンジュゲートを用いて検出される。
【０１６１】
イムノプレシピテーションまたは凝集アッセイフォーマットでは、ＨＣＶ抗原と抗体との間の反応は、溶液または懸濁液から沈降するネットワークを形成し、目視できる沈殿物の層またはフィルムを形成する。抗ＨＣＶ抗体が試験検体中に存在しない場合、目視できる沈殿物は、形成されない。
【０１６２】
現在、粒子凝集（ＰＡ）アッセイの３つの特異的なタイプが存在する。これらのアッセイは、支持体に被覆する場合、種々の抗原に対する抗体の検出のために用いられる。このアッセイの１つのタイプは、赤血球（ＲＢＣ）に抗原（または抗体）を受身的に吸着させることによって感作されるＲＢＣを用いる血球凝集アッセイである。体成分中に存在する特異的な抗原抗体の付加は、たとえあるとしても、精製した抗原で被覆したＲＢＣを凝集させる。
【０１６３】
血球凝集アッセイにおいて起こり得る非特異的反応を排除するために、ＰＡにおけるＲＢＣの代わりに２つの人工担体を用いてもよい。これらのうち最も一般的なものは、ラテックス粒子である。しかしながら、ゼラチン粒子を用いてもよい。これらの担体のいずれかを用いるアッセイは、精製した抗原で被覆した粒子の受身凝集に基づいている。
【０１６４】
高次構造エピトープからなる本発明のＨＣＶ抗原は、これらのイムノアッセイにおいて用いるキットの形態で包装されるであろう。該キットは、通常、別々の容器中に、天然ＨＣＶ抗原、対照抗体製剤（正および／または負）、アッセイフォーマットが必要とする場合には標識抗体、および、標識が直接シグナルを発生しない場合にはシグナル発生剤（例えば、酵素基質）を収容するであろう。天然ＨＣＶ抗原は、既に固体マトリックスに結合されているか、または、該抗原を該マトリックスに結合させるための試薬と別々にする。該アッセイを行うための指示（例えば、書面、テープ、ＣＤ−ＲＯＭなど）がキットに含まれるであろう。
【０１６５】
天然ＨＣＶ抗原を用いるイムノアッセイは、潜在的感染性ＨＣＶを含まない供給物の調製のための血液スクリーニングに有用である。血液供給物の調製方法は、以下の工程からなる。個体供血由来の体成分、好ましくは、血液または血液成分を本発明のＨＣＶポリペプチドと反応させて、ＨＣＶ抗体と存在する場合のＨＣＶ抗原との間で免疫学的反応させる。該反応の結果として抗ＨＣＶ抗体−ＨＣＶ抗原複合体が形成されるかを検出する。供血に寄与する血液は、天然ＨＣＶ抗原に対する抗体を示さないドナーからである。
【０１６６】
ＨＣＶ抗原に対して陽性反応性の場合、イムノアッセイを繰り返して、擬陽性の可能性を減少させるのが好ましい。例えば、血液製剤（例えば、輸血、血漿、第VIII因子、イムノグロブリンなど）の製造のための大規模な血液スクリーニングにおいて、「スクリーニング」試験は、典型的には、特異性を犠牲にして感度を高めるように（汚染血液が全く通過しないことを保証にするように）フォーマット化される；すなわち、擬陽性率が増大する。したがって、単に反復反応性の；すなわち、供血試料についてイムノアッセイの２回以上のランにおいて陽性のドナーをさらに試験するために譲歩することが典型的である。しかしながら、ＨＣＶ陽性の確認のために、「確認」試験は、典型的には、感度を犠牲にして特異性を高めるように（擬陽性試料が全く確認されないのを保証にするように）フォーマット化される。
【０１６７】
選択された固相としては、重合体ビーズまたはガラスビーズ、ニトロセルロース、微粒子、反応トレーのマイクロウエル、試験管および磁気ビーズを挙げることができる。シグナル発生化合物としては、酵素、発光性化合物、色素原、放射性要素および化学発光性化合物を挙げることができる。酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびベータ−ガラクトシダーゼが挙げられる。エンハンサー化合物の例としては、ビオチン、抗−ビオチンおよびアビジンが挙げられる。エンハンサー化合物結合メンバーの例としては、ビオチン、抗−ビオチンおよびアビジンが挙げられる。リウマチ因子様物質の影響を遮断するために、試験試料は、リウマチ因子様物質の影響を遮断するのに充分な条件に付される。これらの条件は、該試料を、多量の抗ヒトＩgＧと接触させて、混合物を形成し、リウマチ因子様物質を実質的に含まない反応混合生成物を形成するのに充分な条件下でしばらくの間、混合物をインキュベートすることからなる。
【０１６８】
本発明は、特に、本発明のポリペプチド（またはペプチド）が平行線の形で膜に結合されるイムノアッセイフォーマットに関する。このアッセイフォーマットは、特に、ＨＣＶ分類のために好都合である。
【０１６９】
本発明は、前記の少なくとも１つの（組換え）ポリペプチドおよび好適な賦形剤、希釈剤または担体からなる医薬組成物にも関する。
【０１７０】
本発明は、前記医薬組成物を、防御抗体の産生または防御Ｔ−細胞応答を刺激するのに有効な量で哺乳動物に投与することからなる、ＨＣＶ感染の予防方法にも関する。
【０１７１】
本発明は、ＨＣＶ感染の予防方法における前記組成物の使用に関する。
【０１７２】
本発明は、さらに、医薬的に許容される担体における前記の少なくとも１つの（組換え）ポリペプチドからなるＨＣＶ感染に対して哺乳動物を免疫するためのワクチンに関する。
【０１７３】
「免疫原性」なる用語は、アジュバントの存在下または不在下で、単独の場合または担体に結合した場合のいずれであっても、物質の体液性および／または細胞性応答を生じる能力を意味する。「中和」とは、病原菌の感染性を一部または完全に遮断する免疫応答を表す。「ワクチン」とは、ＨＣＶに対する保護を一部または完全に引き出す能力を有する免疫原性組成物である。ワクチンは、個体の治療にも有用であり、この場合、治療用ワクチンと称される。
【０１７４】
「治療用」なる用語は、ＨＣＶ感染を治療する能力を有する組成物を意味する。「有効量」なる用語は、投与される個体において免疫原性反応を誘発するのに充分であるか、または、所定の系（例えば、イムノアッセイ）において検出可能に免疫反応させるのに充分なエピトープ担持ポリペプチドの量を意味する。好ましくは、有効量は、前記治療に効果を与えるのに充分である。正確な必要量は、用途によって変化するであろう。ワクチン用またはポリクローナル抗血清／抗体の発生のためには、例えば、有効量は、個体の種、年齢および一般的な健康状態、治療される症状の重篤度、選択された特定のポリペプチド、ならびに投与形態などに依存して変化する。有効量は、比較的大きな非限界的な範囲内にあると思われる。適切な有効量は、慣用的な実験のみを用いて容易に決定することができる。ＨＣＶ疾患の予防のためのタンパクの好ましい範囲は、０.０１〜１００μg／用量、好ましくは０.１〜５０μg／用量である。充分な免疫応答およびＨＣＶ疾患に対する次なる保護を達成するために、個体当たり数回の投与を必要とする。
【０１７５】
本発明は、前記定義の少なくとも１つの（組換え）ポリペプチドからなり、該ポリペプチドが前記定義のサブタイプまたはタイプのうち少なくとも１つについて固有であるワクチンにも関する。
【０１７６】
該ワクチン組成物は、予防用および治療用ワクチン組成物を含む。
【０１７７】
医薬的に許容される担体としては、該組成物を投与される個体に対して有害な抗体の産生を自体誘発しない担体が挙げられる。好適な担体は、典型的には、タンパク、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマーなどのゆっくりと代謝される巨大分子；および不活性ウイルス粒子である。かかる担体は、当業者によく知られている。
【０１７８】
該組成物の有効性を増強するために好ましいアジュバントとしては、限定されないが、水酸化アルミニウム（alum）、U.S.特許第4,606,918号に開示されているＮ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（thr−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（nor−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−(１'−２'−ジパルミトイル−sn−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、および、２％スクアレン／トゥイーン（Ｔween）８０エマルジョン中の細菌から抽出された３つの成分、すなわち、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロース・ジミコール酸および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含有するＲＩＢＩが挙げられる。３つの成分ＭＰＬ、ＴＤＭまたはＣＷＳのいずれも、単独で、または、２つずつ組み合わせて用いてもよい。さらに、スティムロン（Ｓtimulon)（マサチューセッツ州ウスターのケンブリッジ・バイオサイエンス（Ｃambridge Ｂioscience））などのアジュバントが挙げられる。
【０１７９】
ワクチンとして用いられる免疫原性組成物は、本発明のタンパクの「充分な量」または「免疫学的に有効な量」および所望により前記成分からなっている。「免疫学的に有効な量」とは、その量を、単投与において、または、シリーズの一部として、個体に投与することが前記治療に有効であることを意味する。この量は、治療しようとする個体の健康および身体的状態、治療しようとする個体の分類学的グループ（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系の抗体合成能、所望の保護の程度、ワクチンの製剤、治療する医者の医学的状況の評価、感染するＨＣＶの菌株、および他の関連する因子に依存して変化する。この量は、慣用的な試験を介して決定することができる比較的広い範囲内にあると予想される。通常、この量は、０.０１から１０００μg／用量まで、特に、０.１から１００μg／用量まで変化するであろう。
【０１８０】
本発明のタンパクは、Ｂ型肝炎表面抗原（欧州特許出願174,444を参照）と同一の方法で、存在する同種（例えば、コア領域、Ｅ１領域、Ｅ２領域、ＮＳ２領域、ＮＳ３領域、ＮＳ４領域またはＮＳ５領域など由来のＴ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープ）または異種（非ＨＣＶ）ハプテンに対するワクチン担体としても供される。この用途では、エンベロープタンパクは、凝集体にコンジュゲートされるハプテンまたは抗原に対する免疫応答を刺激する能力を有する免疫原性担体を提供する。該抗原は、慣用の化学的方法によってコンジュゲートされるか、または、タンパクの親水性領域に対応する位置でＥ１および／またはＥ２をコードする遺伝子中にクローン化されてもよい。かかる親水性領域としては、Ｖ１領域（アミノ酸位置１９１〜２０２を包含する）、Ｖ２領域（アミノ酸位置２１３〜２２３を包含する）、Ｖ３領域（アミノ酸位置２３０〜２４２を包含する）Ｖ４領域（アミノ酸位置２３０〜２４２を包含する）、Ｖ５領域（アミノ酸位置２９４〜３０３を包含する）およびＶ６領域（アミノ酸位置３２９〜３３６を包含する）が挙げられる。ハプテンの挿入に有用なもう１つの位置は、疎水性領域（おおよそのアミノ酸位置２６４〜２９３を包含する）である。本発明において、この領域は、欠失したＥ１タンパクの抗血清との反応性に影響を及ぼさずに欠失させることができることを示している。したがって、ハプテンは、欠失の部位で挿入される。
【０１８１】
免疫原性組成物は、好都合には非経口投与され、典型的には、例えば皮下または筋肉内などの注射によって投与される。他の投与方法に適しているさらなる製剤としては、経口製剤および坐剤が挙げられる。投与治療法は、単投与スケジュールであってもまたは多投与スケジュールであつてもよい。該ワクチンは、他の免疫調整剤と共に投与されてもよい。
【０１８２】
本発明の免疫原の投与は、予防目的であってもまたは治療目的であってもよい。予防的に投与される場合、免疫原は、ＨＣＶへの暴露に先立って、またはＨＣＶ感染により症状に先立って投与される。免疫原の予防的投与は、哺乳動物におけるＨＣＶの次なる感染を予防または弱毒化するのに役立つ。治療的に投与する場合、該免疫原は、感染の発症時（または直後）またはＨＣＶを原因とする感染もしくは疾患の症状の発症時に投与される。免疫原の治療的投与は、感染または疾患を弱毒化するのに役立つ。
【０１８３】
ワクチンとしての使用に加えて、該組成物は、ＨＣＶ（Ｅ１）タンパクに対する抗体を調製するために用いることができる。該抗体は、抗ウイルス剤として直接用いることができる。抗体を調製するために、宿主動物は、ワクチンについて前記した担体に結合したウイルス粒子に対する天然Ｅ１タンパクを用いて免疫化される。宿主血清または血漿は、適当な時間の後に回収されて、ウイルス粒子の該（Ｅ１）タンパクとの反応性を有する抗体からなる組成物を提供する。ガンマグロブリンフラクションまたはＩgＧ抗体は、飽和硫酸アンモニウムまたはＤＥＡＥセファデックス（Ｓephadex）の使用によって、または当業者に知られている他の技術によって得ることができる。該抗体は、実質的には、薬物のような他の抗ウイルス剤に関連する副作用の多くを含まない。
【０１８４】
本発明は、特に、第５表において定義されるＨＣＶサブタイプまたはタイプに対して固有であり、かつ、既知のＨＣＶタイプまたはサブタイプとは異なる少なくとも１つのアミノ酸を含有する、前記ＨＣＶゲノム配列のうち少なくとも１つによってコードされるアミノ酸配列に対応するペプチド、または実質的に同種であり生物学的に等価であるそのアナログにも関する。
【０１８５】
本発明は、配列番号１〜１０６で示される本発明の新規配列の少なくとも１つの固有のエピトープからなるペプチドに関する。
【０１８６】
本発明は、配列において前記本発明の固有のアミノ酸残基からなるペプチドにも関する。
【０１８７】
本発明は、特に、WO 93/18054に開示されているようなビオチニル化されるペプチドに関する。
【０１８８】
前記本発明のポリペプチドについて説明された具体例（イムノアッセイフォーマット、組成物、用途など）の全てもまた、本発明のペプチドに関係する。
【０１８９】
本発明は、また、
（ｉ）ＨＣＶの存在について分析しようとする生物学的試料を前記ペプチドと接触させ、
（ii）抗体と該ペプチドとの間で形成された免疫複合体を検出すること
からなることを特徴とする、生物学的試料中に存在するＨＣＶに対する抗体の検出方法にも関する。
【０１９０】
本発明は、また、
（ｉ）ＨＣＶの存在について分析しようとする生物学的試料を前記定義のペプチドと接触させ、
（ii）抗体と該ペプチドとの間で形成された免疫複合体を検出すること
からなることを特徴とする、ＨＣＶ分類方法にも関する。
【０１９１】
本発明は、好ましくは固体支持体に結合した前記の少なくとも１つのペプチドを含有してなることを特徴とする、ＨＣＶの存在の検出に用いるための診断用キットにも関する。
【０１９２】
本発明は、好ましくは固体支持体に結合した前記の少なくとも１つのペプチドを含有してなることを特徴とする、ＨＣＶ分類のための診断用キットにも関する。  本発明は、ペプチドが
少なくとも１つのＮＳ４ペプチド、
少なくとも１つのＮＳ４ペプチドおよび少なくとも１つのコアペプチド、
少なくとも１つのＮＳ４ペプチドおよび少なくとも１つのコアペプチドおよび少なくとも１つのＥ１ペプチド、
少なくとも１つのＮＳ４ペプチドおよび少なくとも１つのＥ１ペプチド
から選択される前記定義の診断用キットにも関する。
【０１９３】
本発明は、固体基質上の特異的な位置に結合される一群のペプチドを含有してなる前記診断用キットにも関する。
【０１９４】
本発明は、また、固体支持体が膜ストリップであり、ペプチドが平行線の形で膜に結合されている前記診断用キットにも関する。
【０１９５】
本発明は、また、前記の少なくとも１つペプチドおよび好適な賦形剤、希釈剤または担体からなる医薬組成物にも関する。
【０１９６】
本発明は、また、前記医薬組成物を、防御抗体の産生または防御Ｔ細胞応答を刺激するのに有効な量で哺乳動物に投与することからなる、ＨＣＶ感染の予防方法にも関する。
本発明は、また、ＨＣＶ感染の予防方法における前記組成物の使用にも関する。  本発明は、また、医薬的に許容される担体において前記の少なくとも１つのペプチドを含有してなることを特徴とする、ＨＣＶ感染に対して哺乳動物を免疫化するためのワクチンにも関する。
【０１９７】
本発明は、第５表において定義されるサブタイプまたはタイプのうち少なくとも１つについて固有である前記定義の少なくとも１つのペプチドを含有してなることを特徴とする、前記ワクチンにも関する。
【０１９８】
本発明は、前記定義の少なくとも１つのポリペプチドまたはペプチドによる免疫化後に生じる抗体に関する。ここで、該抗体は、該ポリペプチドまたはペプチドと特異的に反応し、該抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。
【０１９９】
本発明のモノクローナル抗体は、古典的な方法に従って一方では前記定義の本発明ＨＣＶポリペプチドに対して免疫化された動物（特にマウスまたはラット）の脾臓から、他方では骨髄腫細胞系の細胞から形成されやすく、ハイブリドーマの、動物の免疫化のために最初に用いられたポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を産生する能力によって選択されやすいハイブリドーマによって産生され得る。
【０２００】
本発明に関係する抗体は、酵素タイプ、蛍光タイプまたは放射性タイプの適当な標識によって標識することができる。
【０２０１】
本発明の好ましい具体例によるモノクローナル抗体は、Ｈ鎖およびＬ鎖をコードするマウスおよび／またはヒトゲノムＤＮＡ配列の一部からまたはＨ鎖およびＬ鎖をコードするｃＤＮＡクローンから出発して、組換えＤＮＡ技術によって調製されたマウスモノクローナル抗体のヒト化バージョンである。
【０２０２】
別法としては、本発明の好ましい具体例によるモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。本発明の具体例によるこれらの抗体は、ＨＣＶタイプ１サブタイプ１ｄ、１ｅ、１ｆまたは１ｇ；ＨＣＶタイプ２サブタイプ２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉ、２ｋまたは２ｌ；ＨＣＶタイプ３サブタイプ３ｇ；ＨＣＶタイプ４サブタイプ４ｋ、４ｌまたは４ｍ；および／またはＨＣＶタイプ７（サブタイプ７ａ、７ｃまたは７ｄ）、９、１０または１１に感染したかまたはＨＣＶに対してワクチン接種された患者のヒト末梢血液リンパ球から誘導することもできる。かかるヒトモノクローナル抗体は、例えば、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスのヒト末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）再増殖によって（最近のリビューについて、Duchosal et al. 1992を参照）、または本発明の抗原によって反応性Ｂ細胞の存在について、感染したかまたはワクチン接種された個体のエプスタイン・バー−ウイルス−形質転換リンパ球をスクリーニングすることによって調製される。
【０２０３】
本発明は、また、レパートリークローニングのプロセスによる組換え抗体の選択のための、本発明のタンパク、そのムテイン（mutein）、またはそれから誘導されたペプチドの使用にも関する（Persson et al., 1991）。
【０２０４】
ある種の遺伝子型から誘導されたペプチドに指向される抗体は、かかるＨＣＶ遺伝子型の検出のための、または治療薬として用いられる。
【０２０５】
本発明は、
（ｉ）生物学的試料を前記抗体と接触させ、
（ii）ＨＣＶ抗原と該抗体との間で形成された免疫複合体を検出すること
からなることを特徴とする、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗原の検出方法にも関する。
【０２０６】
本発明は、
（ｉ）生物学的試料を前記抗体と接触させ、
（ii）ＨＣＶ抗原と該抗体との間で形成された免疫複合体を検出すること
からなることを特徴とするＨＣＶ分類方法にも関する。
【０２０７】
本発明は、好ましくは固体支持体に結合される前記定義の少なくとも１つの抗体を含有してなることを特徴とする、ＨＣＶの存在の検出に用いるための診断用キットにも関する。
【０２０８】
本発明は、好ましくは固体支持体に結合される前記定義の少なくとも１つの抗体を含有してなることを特徴とする、ＨＣＶ分類のための診断用キットにも関する。
【０２０９】
本発明は、固体支持体上の特異的な位置に結合される一群の抗体を含有してなる前記定義の診断用キットにも関する。
【０２１０】
本発明は、また、前記定義の少なくとも１つの抗体および好適な賦形剤、希釈剤または担体からなることを特徴とする医薬組成物に関する。
【０２１１】
本発明は、哺乳動物に前記医薬組成物を有効量で投与することからなる、ＨＣＶ感染の予防または治療方法にも関する。
【０２１２】
本発明は、ＨＣＶ感染の予防または治療方法における前記組成物の使用に関する。
【０２１３】
遺伝子型は、形成された免疫複合体を検出するために後にＰＣＲによって増幅することができるポリヌクレオチド配列に結合されてもよい前記タイプ特異的抗体によっても検出される（Immuno-PCR、Sano et al., 1992）。
【０２１４】
本明細書に引用している文献または特許出願は、出典明示により本明細書の一部とする。以下の実施例は、本発明の態様を説明するが、如何なる場合も本発明の範囲を限定するものではない。
【０２１５】
（図面の説明）
図１
本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列。
図２
本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のアミノ酸配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列。
図３
本発明の新規ＨＣＶ単離体から得られたヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１〜１０６）。
図４
本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のアミノ酸配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列。
図５
本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列。
図６
本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のアミノ酸配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列。
第５表
本発明の新規サブタイプおよびタイプならびに配列決定された領域の概観。括弧の間のサブタイプは、Tokita et al.（1994）の分類に従って括弧を付していないサブタイプと置き換えられた。
【実施例】
【０２１６】
血清試料
カメルーン人供血者（ＣＡＭ）からの血清試料をイノテスト（Ｉnnotest）ＨＣＶ Ａb ＩＩＩを用いてＨＣＶ抗体についてスクリーニングし、ＩＮＮＯ−ＬＩＡ ＨＣＶ ＩＩＩ（イノジェネティクス（Ｉnnogenetics）、ベルギー国アントワープ）によって確認した。慢性Ｃ型肝炎の患者からの血清試料をベネルクス３国（ＢＮＬ）の種々のセンターから、フランス（ＦＲ）から、パキスタン（ＰＡＫ）から、エジプト（ＥＧ）から、およびベトナム（ＶＮ）から得た。
【０２１７】
ベネルクス、カメルーン、フランスおよびベトナムからの試料をその異常型反応性のために選択した（単離体ＣＡＭ１０７８、ＦＲ２、ＦＲ１、ＶＮ４、ＶＮ１２、ＶＮ１３、ＮＥ９８など（第５表を参照））。
【０２１８】
ｃＰＣＲ、ＬiＰＡ、クローニングおよび配列決定
ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、ＰＣＲ、クローニング、およびビオチニル化した５'ＵＲ増幅産生物を用いるＬiＰＡ遺伝子型分類（genotyping）は、開示に従って行った（Stuyver et al., 1994c）。直接配列決定のために５'ＵＲ、コア／Ｅ１、およびＮＳ５Ｂ ＰＣＲ産生物を用いた。ユニバーサル５'ＵＲプライマーＨＣＰr９５、ＨＣＰr９６、ＨＣＰr９８、およびＨＣＰr２９の配列は、従前に開示されていた（Stuyver et al., 1993b）。以下のプライマーも開示されていた（Stuyver et al., 1994c）：ＨＣＰr４１、コア領域の増幅のためのセンスプライマー；コア／Ｅ１領域の増幅のためのＨＣＰr５２およびＨＣＰr５４；ならびに３４０−ｂｐ ＮＳ５Ｂ領域の増幅のためのＨＣＰr２０６およびＨＣＰr２０７。
【０２１９】
直接配列決定によって、コア／Ｅ１領域において、血清試料ＢＮＬ１、ＢＮＬ２、ＢＮＬ３、ＢＮＬ４、ＢＮＬ５、ＢＮＬ６、ＢＮＬ７、ＢＮＬ８、ＢＮＬ９、ＢＮＬ１０、ＢＮＬ１１、ＢＮＬ１２、ＣＡＭ１０７８、ＦＲ２、ＦＲ１６、ＦＲ４、ＦＲ１３、ＶＮ１３、ＶＮ４、ＶＮ１２、ＦＲ１、ＮＥ９８、およびＦＲ１９を分析した。直接配列決定によって、ＮＳ５Ｂ領域において、血清試料ＢＮＬ１、ＢＮＬ２、ＦＲ１７、ＣＡＭ１０７８、ＦＲ２、ＦＲ１６、ＢＮＬ３、ＦＲ４、ＢＮＬ５、ＦＲ１３、ＦＲ１８、ＰＡＫ６４、ＢＮＬ８、ＢＮＬ１２、ＥＧ８１、ＶＮ１３、ＶＮ４、ＶＮ１２、ＦＲ１、ＮＥ９８、ＦＲ１４、ＦＲ１５およびＦＲ１９もまた分析した。部分的な５'ＵＲ、コア、Ｅ１およびＮＳ５Ｂ配列を得た。得られた配列の長さは、得られた配列を、既知の配列に対する系統発生的距離に基づいて、新規タイプまたはサブタイプに分類するのに充分である。以下の配列を得ることができた（ヌクレオチド配列は、奇数番号の配列番号を有しており、アミノ酸配列は、偶数番号の配列番号を有している）：配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３および１０５。それらから推断されるアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４および１０６で示される。第５表は、これらの配列の概観を示す。
【０２２０】
【表５−１】
2005118044.tif 000006
【表５−２】
2005118044.tif 000007
【０２２１】
系統発生的分析
ＥＭＢＬ／Ｇenbankデータベースから従前に公表された配列を得た。プログラムＨＣＶＡＬＩＧＮ（Stuyer et al. 1994c）を用いて整列させた。連続フォーマットにおいて、ファイロジェニー・インフェレンス・パッケージ（Ｐhylogeny Ｉnference Ｐackage）（ＰＨＹＬＩＰ）バージョン３.５ｃ（アメリカ合衆国シアトルのユニバーシティ・オブ・ワシントン（Ｕniversity of Ｗashington）から自由に入手できる公共のドメインプログラム）に配列を与えた。距離マトリックスを、Ｋimura ２−パラメーター設定を用いてＤＮＡＤＩＳＴによって得、さらに隣接設定（neighbor-joining setting）を用いてＮＥＩＧＨＢＯＲにおいて分析した。プログラムＤＲＡＷＴＲＥＥを用いて、図表的アウトプットを得た。
【０２２２】
新規サブタイプの同定
これらの分析により、ＢＮＬ１、ＢＮＬ２、ＣＡＭ１０７８、ＦＲ２、ＦＲ１６およびＦＲ１７のタイプ１単離体とのクラスター形成が判明したが、これらの配列のいずれも既知のタイプ１サブタイプ１ａ、１ｂまたは１ｃとはクラスター形成しなかった。ＢＮＬ１、ＢＮＬ２およびＦＲ１７は、明らかに一緒にクラスター形成し、新しいタイプ１サブタイプ１ｄと称され、ＣＡＭ１０７８は、別の新しいサブタイプ１ｅに分類され、ＦＲ２は、別のタイプ１サブタイプ１ｆに分類され、ＦＲ１６は、別のタイプ１サブタイプ１ｇに分類される。興味深いことに、３つのタイプ１ｄ単離体（ＢＮＬ１、ＢＮＬ２およびＦＲ１７）および１ｇ単離体ＦＲ１６の全ては、ヨーロッパに住むモロッコ人種血統の患者から得た。
【０２２３】
単離体の別のグループは、他のタイプ２配列とホモロジーを示すが、単離体ＢＮＬ３、ＦＲ４、ＢＮＬ４、ＢＮＬ５、ＢＮＬ６、ＦＲ１３またはＦＲ１８は、既知のタイプ２サブタイプ２ａ、２ｂ、２ｃ（Bukh et al., 1993）または２ｄ
（Stuyver et al., 1994c）のうちの１つには全く分類されない。タイプ２単離体および該グループの他の単離体に対する系統発生的距離に基づいて、これらの単離体の各々は、新しいタイプ２サブタイプに分類される。ＢＮＬ３は、サブタイプ２ｅと称され、ＦＲ４は、サブタイプ２ｆと称され、ＢＮＬ４は、サブタイプ２ｇと称され、ＢＮＬ５は、サブタイプ２ｈと称され、ＢＮＬ６は、別のタイプ２サブタイプ２ｉに分類される。従前に公表された単離体ＨＮ４を２ｊと分類すれば、ＦＲ１３およびＦＲ１８は、新しいタイプ２サブタイプ２ｋおよび２ｌに分類される。しかしながら、ＦＲ１３およびＦＲ１８がサブタイプ２ｇまたは２ｉに属する可能性は、除外されていなかった。明確な分類は、各々サブタイプ２ｇおよび２ｉに属する単離体ＢＮＬ４およびＢＮＬ６のＮＳ５Ｂ配列を決定することによって得ることができる。
【０２２４】
単離体ＰＡＫ６４は、タイプ３配列とホモロジーを示すが、既知のタイプ３サブタイプ３ａ〜ｆのうちの１つに分類することができなかった。他のタイプ３単離体に対する系統発生的距離に基づいて、ＰＡＫ６４は、新しいタイプ３サブタイプに分類することができた。ＰＡＫ６４は、タイプ３ｇと称された。しかしながら、ＰＡＫ６４が既知のタイプ３サブタイプに属する可能性は、ゲノムの１つの領域が配列決定されただけなので、厳密に言えば除外することができない。明確な分類は、プライマーＨcＰr５２およびＨcＰr５４による増幅の後、単離体ＰＡＫ６４のコア／Ｅ１配列を決定することによって得ることができる。
【０２２５】
分析されたベネルクス人およびエジプト人の試料のうち、いくつかの配列は、従前に定義されたタイプ４サブタイプ４ｃおよび４ｄとクラスター形成した。しかしながら、ＢＮＬ７、ＢＮＬ８、ＢＮＬ９、ＢＮＬ１０、ＢＮＬ１１、ＢＮＬ１２およびＥＧ８１は、タイプ４の新しいサブタイプにクラスター形成した。単離体ＢＮＬ７、ＢＮＬ８、ＢＮＬ９、ＢＮＬ１０およびＢＮＬ１１は、ＢＮＬ１２およびＥＧ８１と別に、新しいサブタイプ４ｋに再度クラスター形成した。このサブタイプは、ベネルクス３国において優勢なサブタイプであった。ＢＮＬ１２およびＥＧ８１は、別々のサブタイプに分離した。ＢＮＬ１２は、別の新しいサブタイプ４ｌと称され、ＥＧ８１は、別の新しいサブタイプ４ｍと称された。
【０２２６】
新しいＨＣＶメジャータイプの同定
単離体ＦＲ１、ＶＮ４、ＶＮ１２、ＶＮ１３、ＮＥ９８、ＦＲ１４、ＦＲ１５およびＦＲ１９は、ＨＣＶの既知の６つのメジャータイプのいずれともクラスター形成しなかった。ＶＮ４、ＶＮ１２およびＶＮ１３は、遺伝子型６と非常に離れた関係にあったが、系統発生的分析により、これらの単離体が新しいメジャータイプを示すことが判明した。ＶＮ１３、ＶＮ４およびＶＮ１２は、サブタイプレベルで関係しており、各々、７ａ、７ｃおよび７ｄと称された。ＦＲ１は、既知の単離体と関係しておらず、遺伝子型９ａと称された。ＮＥ９８は、タイプ３配列と遠い関係を示し、系統発生的分析は、新しいメジャータイプ１０ａへの分類を示した。タイプおよびサブタイプレベルを割り当てるための国際ガイドラインに依存して、ＮＥ９８は、別のタイプ３サブタイプに分類される。ＦＲ１４、ＦＲ１５およびＦＲ１９は、タイプ２配列と非常に遠い関係にあることを示し、系統発生的分析は、これらの単離体が新しいメジャータイプ１１に分類されるべきであることを示した（全て、１１ａと称される同一サブタイプに属する）。タイプおよびサブタイプレベルを割り当てるための国際ガイドラインに依存して、ＦＲ１４、ＦＲ１５およびＦＲ１９は、別のタイプ２サブタイプに分類される。
【０２２７】
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【図面の簡単な説明】
【０２３４】
【図１−１】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図１の一部。
【図１−２】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図１の一部。
【図１−３】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図１の一部。
【図１−４】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図１の一部。
【図１−５】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図１の一部。
【図１−６】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図１の一部。
【図１−７】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図１の一部。
【図１−８】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図１の一部。
【図１−９】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図１の一部。
【図１−１０】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図１の一部。
【図１−１１】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図１の一部。
【図１−１２】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図１の一部。
【図１−１３】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図１の一部。
【図１−１４】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図１の一部。
【図１−１５】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図１の一部。
【図１−１６】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図１の一部。
【図１−１７】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図１の一部。
【図１−１８】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図１の一部。
【図１−１９】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図１の一部。
【図１−２０】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のヌクレオチド配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図１の一部。
【図２−１】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のアミノ酸配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図２の一部。
【図２−２】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のアミノ酸配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図２の一部。
【図２−３】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のアミノ酸配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図２の一部。
【図２−４】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のアミノ酸配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図２の一部。
【図２−５】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のアミノ酸配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図２の一部。
【図２−６】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のアミノ酸配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図２の一部。
【図２−７】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のアミノ酸配列と、サブタイプの他の既知のプロトタイプ単離体との整列を示す図２の一部。
【図３−１】本発明の新規ＨＣＶ単離体から得られたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図３の一部。
【図３−２】本発明の新規ＨＣＶ単離体から得られたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図３の一部。
【図３−３】本発明の新規ＨＣＶ単離体から得られたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図３の一部。
【図３−４】本発明の新規ＨＣＶ単離体から得られたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図３の一部。
【図３−５】本発明の新規ＨＣＶ単離体から得られたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図３の一部。
【図３−６】本発明の新規ＨＣＶ単離体から得られたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図３の一部。
【図３−７】本発明の新規ＨＣＶ単離体から得られたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図３の一部。
【図３−８】本発明の新規ＨＣＶ単離体から得られたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図３の一部。
【図３−９】本発明の新規ＨＣＶ単離体から得られたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図３の一部。
【図３−１０】本発明の新規ＨＣＶ単離体から得られたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図３の一部。
【図３−１１】本発明の新規ＨＣＶ単離体から得られたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図３の一部。
【図３−１２】本発明の新規ＨＣＶ単離体から得られたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図３の一部。
【図３−１３】本発明の新規ＨＣＶ単離体から得られたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図３の一部。
【図３−１４】本発明の新規ＨＣＶ単離体から得られたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図３の一部。
【図３−１５】本発明の新規ＨＣＶ単離体から得られたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図３の一部。
【図３−１６】本発明の新規ＨＣＶ単離体から得られたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図３の一部。
【図４−１】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のアミノ酸配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図４の一部。
【図４−２】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のアミノ酸配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図４の一部。
【図４−３】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のアミノ酸配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図４の一部。
【図４−４】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のアミノ酸配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図４の一部。
【図４−５】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のアミノ酸配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図４の一部。
【図４−６】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のアミノ酸配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図４の一部。
【図４−７】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のアミノ酸配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図４の一部。
【図４−８】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のアミノ酸配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図４の一部。
【図４−９】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のアミノ酸配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図４の一部。
【図４−１０】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のアミノ酸配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図４の一部。
【図４−１１】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのコア／Ｅ１領域のアミノ酸配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図４の一部。
【図５−１】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図５の一部。
【図５−２】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図５の一部。
【図５−３】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図５の一部。
【図５−４】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図５の一部。
【図５−５】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図５の一部。
【図５−６】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図５の一部。
【図５−７】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図５の一部。
【図５−８】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図５の一部。
【図５−９】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図５の一部。
【図５−１０】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図５の一部。
【図５−１１】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図５の一部。
【図５−１２】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図５の一部。
【図５−１３】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図５の一部。
【図５−１４】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のヌクレオチド配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図５の一部。
【図６−１】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のアミノ酸配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図６の一部。
【図６−２】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のアミノ酸配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図６の一部。
【図６−３】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のアミノ酸配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図６の一部。
【図６−４】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のアミノ酸配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図６の一部。
【図６−５】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のアミノ酸配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図６の一部。
【図６−６】本発明の新しく同定されたタイプおよびサブタイプの単離体のいくつかのＮＳ５ｂ領域のアミノ酸配列と、他の既知のサブタイプのプロトタイプ単離体との整列を示す図６の一部。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
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【図３−１０】
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【図３−１１】
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【図３−１２】
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【図３−１３】
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【図３−１４】
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【図３−１５】
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【図３−１６】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図４−９】
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【図４−１０】
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【図４−１１】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図５−１０】
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【図５−１１】
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【図５−１２】
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【図５−１３】
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【図５−１４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【配列表】
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