(57)【要約】【課題】  現状では有効な治療法が確立されていないプリオン病の予防および治療に応用可能な異常型プリオンタンパク質の抑制方法およびその利用法を提供する。【解決手段】  プリオン感染細胞において、ｓｉＲＮＡを用いて正常型プリオンタンパク質の発現を抑制することにより、その結果として異常型プリオンタンパク質の蓄積を抑制することが可能となる。異常型プリオンタンパク質の抑制は、プリオン病の予防および治療に応用することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プリオン感染細胞において、正常型プリオンタンパク質の発現を抑制することを特徴とする、異常型プリオンタンパク質抑制方法。
【請求項２】
正常型プリオンタンパク質の発現を抑制するために、プリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡを用いることを特徴とする、請求項１に記載の異常型プリオンタンパク質抑制方法。
【請求項３】
正常型プリオンタンパク質の発現を抑制するために、プリオンタンパク質特異的配列を有するｓｉＲＮＡ発現ベクターをプリオン感染細胞に導入することを特徴とする、請求項２に記載の異常型プリオンタンパク質抑制方法。
【請求項４】
上記プリオンタンパク質特異的配列を有するｓｉＲＮＡ発現ベクターは、ウイルスベクターであることを特徴とする、請求項３に記載の異常型プリオンタンパク質抑制方法。
【請求項５】
上記プリオンタンパク質特異的配列を有するｓｉＲＮＡ発現ベクターは、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターであることを特徴とする、請求項３に記載の異常型プリオンタンパク質抑制方法。
【請求項６】
上記プリオンタンパク質は、ヒト、家畜動物または実験動物のプリオンタンパク質であることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の異常型プリオンタンパク質抑制方法。
【請求項７】
請求項１ないし６に記載の異常型プリオンタンパク質抑制方法を利用することを特徴とする、プリオン病の予防および治療方法。
【請求項８】
プリオンタンパク質特異的配列を有することを特徴とする、ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【請求項９】
上記ベクターは、ウイルスベクターであることを特徴とする、請求項８に記載のｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【請求項１０】
上記ベクターは、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターであることを特徴とする、請求項８に記載のｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【請求項１１】
プリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする、プリオン病の予防および治療薬剤。
【請求項１２】
請求項８ないし１０のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ発現ベクターを含むことを特徴とする、プリオン病の予防および治療薬剤。
【請求項１３】
請求項８ないし１０のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ発現ベクターを含むことを特徴とする、プリオン研究用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プリオンタンパク質の抑制方法およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プリオン病とは、海綿状空胞変性を伴う神経細胞死、アストロサイトやミクログリアの増生、アミロイド斑などの病理学的変化を特徴とする、致死性および伝播性海綿状脳症の総称である。動物のプリオン病の代表として、ヒツジやヤギに発病するスクレイピーがある。ヒトプリオン病としては、クロイツフェルト・ヤコブ病、Gerstmann-Straussler-Scheinker症候群、クルー病、致死性家族性不眠症が知られている。これらの疾患は、どれも罹患した個体の脳抽出物を健康個体へ移入することで病気を伝染できることが特徴である。
【０００３】
プリオン病の病原因子は、核酸を含有せず、タンパク質のみから構成されている「プリオン」であると考えられている。すべての哺乳動物は、唯一のプリオンタンパク質遺伝子を持っており、発現されるプリオンタンパク質は脳神経系で重要な働きをしていると考えられる。プリオンタンパク質は、アミノ酸配列は同一であるが立体構造の異なる正常型プリオンタンパク質（PrPc：cellular prion protein）と、異常型プリオンタンパク質（PrPSc：scrapie prion protein）の２つの形態をとる。正常型プリオンタンパク質は正常組織に発現し、病原体としての活性はないが、異常型プリオンタンパク質には病原活性がある。また、正常型プリオンタンパク質はタンパク質分解酵素感受性で界面活性剤に可溶性であるが、異常型プリオンタンパク質はタンパク質分解酵素抵抗性で界面活性剤に不溶性である。
【０００４】
プリオン病発症メカニズムの仮説の１つとして、以下のモデルが提唱されている。すなわち、正常個体に取り込まれた異常型プリオンタンパク質が脳内に侵入後、既存の正常型プリオンタンパク質に接触し、何らかの翻訳後修飾を施すことによって異常型プリオンタンパク質に変換する。変換によって生じた異常型プリオンタンパク質は、近くの正常型プリオンタンパク質を次々と異常型プリオンタンパク質に変換する。その結果、脳内に異常型プリオンタンパク質が蓄積し、発症に至るというモデルである。現在は、本仮説が主流となっている。
【０００５】
プリオン病に有効な治療法を開発するために、多くの研究が精力的に行われている。例えば、正常型プリオンタンパク質から異常型プリオンタンパク質への変換を阻害する方法、逆に異常型プリオンタンパク質を正常型プリオンタンパク質に戻す方法、抗プリオンタンパク質抗体や弱毒プリオン株によるワクチン開発の研究等が試みられている。
【０００６】
一方、ＲＮＡ干渉（RNA interference、RNAi）は、２本鎖のＲＮＡを細胞の中に入れると、その配列に相同なｍＲＮＡが分解され、遺伝子発現を抑制する現象である。短い２本鎖ＲＮＡであるｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）が、遺伝子特異的にその発現を抑制することは、既に多くの研究で確立されている。
【０００７】
発明者らは、ＲＮＡポリメラーゼIII系のプロモーターであるＵ６プロモーターを利用し、哺乳動物細胞内でｓｉＲＮＡを産生させるベクターを既に開発している（非特許文献１）。
【０００８】
最近、Tillyらは、Ｕ６プロモーターを有するｓｉＲＮＡ発現ベクターを用いて、プリオン非感染細胞における正常型プリオンタンパク質の発現が抑制されることを報告した（非特許文献２）。
【非特許文献１】Miyagishi M, Taira K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat Biotechnol. 2002 May;20(5):497-500.
【非特許文献２】Tilly G, Chapuis J, Vilette D, Laude H, Vilotte JL. Efficient and specific down-regulation of prion protein expression by RNAi. Biochem Biophys Res Commun. 2003 Jun 6;305(3):548-51.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のように、プリオン病に有効な治療法の開発研究が精力的に行われているが、未だ有効な治療法は開発されていない。近年、ウシプリオン病である狂牛病（牛海綿状脳症）からの感染による新型クロイツフェルト・ヤコブ病や、感染脳硬膜移植による医原性のプリオン病が多数報告されており、プリオン病の有効な治療法が切に望まれている。したがって、プリオン病の予防および治療に応用できる新たな知見が必要である。
【００１０】
上記、プリオン病発症メカニズムの仮説に従うと、異常型プリオンタンパク質は正常型プリオンタンパク質が構造変換することにより生じるものと考えられる。したがって、正常型プリオンタンパク質の発現を抑制することにより、異常型プリオンタンパク質の蓄積が抑制されることが期待される。
【００１１】
非特許文献２においては、Ｕ６プロモーターを有するｓｉＲＮＡ発現ベクターを用いて、プリオン非感染細胞における正常型プリオンタンパク質の発現が抑制されることが報告されている。しかしながら、プリオン感染細胞において、正常型プリオンタンパク質の発現を抑制すれば、異常型プリオンタンパク質が抑制されるか否かについては、未だ報告されていない。
【００１２】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、プリオン病の予防および治療に応用可能な異常型プリオンタンパク質の抑制方法およびその利用法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、プリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡが、プリオン感染細胞において、正常型プリオンタンパク質の発現を抑制するとともに、異常型プリオンタンパク質の蓄積をも抑制することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明に係る異常型プリオンタンパク質抑制方法は、プリオン感染細胞において、正常型プリオンタンパク質の発現を抑制することを特徴とする。正常型プリオンタンパク質の発現を抑制する方法としては、プリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡを用いる発現抑制方法が好適である。特に、プリオンタンパク質特異的配列を有するｓｉＲＮＡ発現ベクターをプリオン感染細胞に導入することが好ましい。
【００１５】
上記プリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、ウイルスベクターであることが好ましく、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターであることが特に好ましい。
【００１６】
発現を抑制する対象とするプリオンタンパク質としては、ヒト、家畜動物または実験動物のプリオンタンパク質であることが好ましい。
【００１７】
また、本発明は上記異常型プリオンタンパク質抑制方法を利用する、プリオン病の予防および治療方法である。
【００１８】
また、本発明にはプリオンタンパク質特異的配列を有するｓｉＲＮＡ発現ベクターも含まれる。当該ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、ウイルスベクターであることが好ましく、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターであることが特に好ましい。
【００１９】
さらに、本発明には上記プリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ、または上記プリオンタンパク質特異的配列を有するｓｉＲＮＡ発現ベクターを含むプリオン病の予防および治療薬剤が含まれる。また、当該ｓｉＲＮＡ発現ベクターを含むプリオン研究用キットも含まれる。
【発明の効果】
【００２０】
プリオン病は、異常型プリオンタンパク質が脳内に蓄積することにより発症し、異常型プリオンタンパク質は正常型プリオンタンパク質が構造変換することにより生じると考えられている。したがって、本発明に係る異常型プリオンタンパク質抑制方法、当該方法を利用するプリオン病の予防および治療方法、およびプリオン病の予防および治療薬剤は、現状では有効な治療方法が確立されていないプリオン病の予防および治療に応用することができるという効果を奏する。
【００２１】
本発明において、正常型プリオンタンパク質の発現抑制にはプリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡを用いることができるが、プリオンタンパク質特異的配列を有するｓｉＲＮＡ発現ベクターをプリオン感染細胞に導入する方法を用いれば、ｓｉＲＮＡを直接細胞内に導入するより長期間にわたり正常型プリオンタンパク質の発現を抑制できるという効果を奏する。また、上記ｓｉＲＮＡ発現ベクターをウイルスベクター、中でもアデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターとすることにより、哺乳動物の神経細胞に効率よく遺伝子を導入できるという効果を奏する。
【００２２】
また、プリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡおよびプリオンタンパク質特異的配列を有するｓｉＲＮＡ発現ベクターはプリオン病の予防および治療薬剤の主成分として、有効に利用することができるという効果を奏する。
【００２３】
さらに、プリオンタンパク質特異的配列を有するｓｉＲＮＡ発現ベクターを含むプリオン研究用キットは、プリオン病の基礎研究の進展に貢献できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００２５】
（１）異常型プリオンタンパク質抑制方法
本発明に係る異常型プリオンタンパク質抑制方法（以下「本抑制方法」と略記する場合がある）は、プリオン感染細胞において、正常型プリオンタンパク質の発現を抑制することにより異常型プリオンタンパク質を抑制する方法である。すなわち、プリオン感染細胞において、正常型プリオンタンパク質の発現を抑制すれば、それに伴い異常型プリオンタンパク質の蓄積が抑制される。したがって、正常型プリオンタンパク質の発現を抑制する方法としては、プリオン感染細胞において正常型プリオンタンパク質の発現が抑制できる方法であればよく、特に限定されるものではない。ここで、「プリオン」とは、ヒトのクロイツフェルト・ヤコブ病などの病因と考えられている感染性のタンパク質、すなわち異常型プリオンタンパク質を意味し、「プリオン感染細胞」とは、異常型プリオンタンパク質に感染している細胞を意味する。また、「正常型プリオンタンパク質」とは、正常組織に発現している病原活性のないプリオンタンパク質を意味する。「異常型プリオンタンパク質」とは、アミノ酸配列は正常型プリオンタンパク質と同一であるが立体構造が異なり、病原活性を有するプリオンタンパク質を意味する。
【００２６】
〔ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）〕
上記正常型プリオンタンパク質の発現を抑制する方法としては、プリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡを用いる方法、すなわち、ＲＮＡ干渉法を挙げることができる。「ＲＮＡ干渉」とは、２本鎖のＲＮＡを細胞の中に入れると、その配列に相同なｍＲＮＡが分解され、遺伝子発現を抑制する現象である。「ｓｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉を起こすことができる短い２本鎖ＲＮＡを意味する。ｓｉＲＮＡが、遺伝子特異的にその発現を抑制することは、既に多くの研究で確立されている。
【００２７】
ｓｉＲＮＡの塩基配列は、本発明に係る異常型プリオンタンパク質抑制方法を適用しようとする生物種のプリオンタンパク質遺伝子の配列に基づいて設計すればよい。ｓｉＲＮＡの設計の指針については既に多数の文献や成書において公表されており、これらの指針にしたがってプリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡを設計することができる。下記実施例においては、マウス神経芽細胞株の正常型プリオンタンパク質発現を抑制するために、マウスプリオンタンパク質遺伝子の塩基配列（GenBank accession No. M13685）に基づいて５種類のｓｉＲＮＡを設計した。No.1は83〜103番目、No.2は180〜200番目、No.3は370〜390番目、No.4は651〜671番目、No.5は785〜805番目の塩基配列を標的としている。
【００２８】
ｓｉＲＮＡはリポフェクション法等により直接細胞内に導入することができる。また、細胞内でｓｉＲＮＡが発現するように構築したベクター（ｓｉＲＮＡ発現ベクター）を細胞内に導入し、細胞内でｓｉＲＮＡを発現させることも可能である。ｓｉＲＮＡ発現ベクターを用いた場合には、ｓｉＲＮＡを直接細胞内に導入した場合より、ｓｉＲＮＡが細胞内に存在できる期間が長くなり、遺伝子発現抑制の効率が高くなるという利点を有する。したがって、ｓｉＲＮＡ発現ベクターを細胞内に導入して正常型プリオンタンパク質の発現を抑制することが好ましい。
【００２９】
〔ｓｉＲＮＡ発現ベクター〕
ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、細胞内に導入したときに細胞内でｓｉＲＮＡを発現できるものであればよく、特に限定されるものではない。例えば、図２に示すように、ＲＮＡポリメラーゼが結合するＵ６プロモーターの下流にセンス配列、ループ配列、アンチセンス配列＋ｔｔｔｔｔの順に繋がる構造を有するベクターを挙げることができる。また、センス配列およびアンチセンス配列のそれぞれの上流に別々にＵ６プロモーターを有する構造であってもよい。ただし、これら例示した構造を有するベクターに限定されるものではない。さらに、プロモーターはＵ６プロモーターに限定されるものではなく、ＲＮＡポリメラーゼが結合するプロモーターであればよい。ｓｉＲＮＡ発現用のプラスミドベクターは、既に公表されているものや販売されているものがあり、これらのベクターを好適に使用することができる。例えば、発明者らは、ＲＮＡポリメラーゼIII系のプロモーターであるＵ６プロモーターを利用し、哺乳動物細胞内でｓｉＲＮＡを産生させるベクターを既に開発している（非特許文献１参照）。また、市販品としては、フナコシから販売されている、pSilencerTM1.0-U6 siRNA Expression Vector等が知られている。
【００３０】
ｓｉＲＮＡ発現ベクターはプラスミドベクターでもよいが、哺乳動物に導入する場合にはウイルスベクターであることが好ましい。ウイルスベクターを用いることにより、効率よく細胞内でｓｉＲＮＡを発現させることができる。ウイルスベクターの場合にはウイルス遺伝子の一部に、ｓｉＲＮＡ発現用プロモーターおよびｓｉＲＮＡ配列を挿入すればよい。例えば、図２に示す構造のうち、Ｕ６プロモーター、センス配列、ループ配列およびアンチセンス配列＋ｔｔｔｔｔをウイルス遺伝子の一部に挿入することにより、ｓｉＲＮＡ発現ウイルスベクターを構築することができる。
【００３１】
ウイルスベクターとしては、特に限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを用いることが好ましい。アデノウイルスベクターは、遺伝子治療用ベクターとして利用されているベクターであり、既にヒトでの使用実績もある。ヘルペスウイルスベクターは、プリオンの標的細胞である神経細胞に選択性が高いことが知られている。レトロウイルスベクターは、宿主細胞の染色体に遺伝子が組み込まれ、永久にｓｉＲＮＡを発現できるという利点がある。このため、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターは、ヒトを含む哺乳動物に適用するためのプリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ発現ベクターとして好適である。
【００３２】
なお、本発明には上記ｓｉＲＮＡ発現ベクターにプリオンタンパク質特異的配列を挿入した、プリオンタンパク質特異的配列を有するｓｉＲＮＡ発現ベクターが含まれる。
【００３３】
〔対象生物〕
本発明に係る異常型プリオンタンパク質抑制方法の対象となる生物は、プリオンタンパク質遺伝子を有する生物であれば特に限定されるものではない。中でも、本抑制方法を適用することが好ましい生物としては、ヒト、家畜動物および実験動物を挙げることができる。ヒトについては、クロイツフェルト・ヤコブ病をはじめとするプリオン病の予防および治療に応用できる可能性がある。家畜動物としては、ウシ、ヒツジ、ヤギ等を挙げることができる。家畜動物が感染するプリオン病として、ウシの狂牛病、ヒツジやヤギのスクレイピーが知られており、本抑制方法は家畜動物のプリオン病の予防および治療に応用できる可能性がある。また、本抑制方法を実験動物に適用すると、プリオン病の基礎研究の進展に貢献することが可能となる。実験動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル、チンパンジー等を挙げることができる。
【００３４】
〔プリオン病の予防および治療方法〕
本発明には、上記異常型プリオンタンパク質抑制方法を利用するプリオン病の予防および治療方法も含まれる。本抑制方法により異常型プリオンタンパク質の蓄積を抑えることができれば、プリオン病を予防し、また治療することが可能となる。
【００３５】
（２）プリオン病の予防および治療薬剤
プリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡまたはプリオンタンパク質特異的配列を有するｓｉＲＮＡ発現ベクターをプリオン感染細胞に導入すると、当該細胞の正常型プリオンタンパク質の発現を抑制し、その結果異常型プリオンタンパク質の蓄積を抑制することができる。したがって、プリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡまたはプリオンタンパク質特異的配列を有するｓｉＲＮＡ発現ベクターはプリオン病の予防および治療薬剤として利用することができる。すなわち、本発明には、プリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡを含むプリオン病の予防および治療薬剤、および本発明に係るプリオンタンパク質特異的配列を有するｓｉＲＮＡ発現ベクターを含むプリオン病の予防および治療薬剤が含まれる。
【００３６】
本薬剤には、少なくともプリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ、またはプリオンタンパク質特異的配列を有するｓｉＲＮＡ発現ベクターのいずれかが含まれていればよく、これら以外のものが含まれていてもよいことはいうまでもない。具体的には、例えば、ｓｉＲＮＡやベクターを溶解または懸濁するための緩衝液を挙げることができる。
【００３７】
（３）プリオン研究用キット
本発明に係るプリオンタンパク質特異的配列を有するｓｉＲＮＡ発現ベクターは、正常型プリオンタンパク質の発現を抑制することができるため、正常型プリオンタンパク質の機能解析や異常型プリオンタンパク質の複製機構解析のためのツールとして非常に有用である。したがって、プリオンタンパク質特異的配列を有するｓｉＲＮＡ発現ベクターを含むプリオン研究用キットは、プリオン研究を促進するために利用することができる。すなわち、本発明には、プリオンタンパク質特異的配列を有するｓｉＲＮＡ発現ベクターを含むプリオン研究用キットが含まれる。
【００３８】
本キットには、少なくともプリオンタンパク質特異的配列を有するｓｉＲＮＡ発現ベクターが含まれていればよく、他にどのような構成を有していてもよい。具体的には、例えば、コントロールベクター、プロテイナーゼＫ、電気泳動用ゲル、電気泳動用試薬、ウエスタンブロッティング用試薬、プリオン検出用抗体等を挙げることができる。
【００３９】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、各実施例において用いたｓｉＲＮＡ、細胞、プリオン株、実験方法等について先に説明する。
【００４１】
〔ｓｉＲＮＡのターゲット領域〕
マウスプリオンタンパク質遺伝子の塩基配列（GenBank accession No. M13685）に基づいて５種類のｓｉＲＮＡを設計した。図１に５種類のプリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡのターゲット領域を示した。図中の１〜５はｓｉＲＮＡの番号を表す。PrPはプリオンタンパク質を示す。ATGは開始コドンを示し、TGAは終止コドンを示す。No.1は83〜103番目、No.2は180〜200番目、No.3は370〜390番目、No.4は651〜671番目、No.5は785〜805番目の塩基配列を標的としている。
【００４２】
〔プリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ発現ベクター〕
図２に、本実施例で使用したプリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ発現ベクターの構造を示した。図２から明らかなように、本ベクターはプラスミドベクターであり、Ｕ６プロモーターの下流にセンス配列とアンチセンス配列とがループ配列を介して繋がっている。アンチセンス配列の下流には、ＲＮＡポリメラーゼIIIによる転写を終了させるために（TTTTT）配列が付加されている。
【００４３】
図３に上記５種類のｓｉＲＮＡを発現するプリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ発現ベクター構築に使用したオリゴＤＮＡの塩基配列（配列番号１〜５）を示した。図中の１〜５は発現するｓｉＲＮＡの番号を表す。BspMIは制限酵素名である。図３に示したオリゴＤＮＡ配列を有するプリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ発現ベクター（図２）を標的の細胞内に導入すると、Ｕ６プロモーター領域にＲＮＡポリメラーゼIIIが結合し、挿入されたオリゴＤＮＡ配列に基づいてセンス、ループ、アンチセンスの順にＲＮＡが合成される。合成されたＲＮＡは、センス配列とアンチセンス配列が２本鎖となり、ループ配列を介したヘアピン構造のｓｉＲＮＡが生じる。
【００４４】
〔使用細胞株〕
本実施例で使用した細胞株は、マウス正常型プリオンタンパク質を過剰発現する、マウス神経芽細胞腫細胞株（Ｎ２ａ）である。Ｎ２ａ細胞（ATCC CCL131）に野生型マウスプリオンタンパク質のｃＤＮＡを有するプラスミドをトランスフェクションし、マウス正常型プリオンタンパク質を過剰発現するＮ２ａ細胞を得た。
【００４５】
〔使用プリオン株〕
本実施例で使用したプリオン株は、Chandlerプリオン株、福岡−１プリオン株および22Ｌプリオン株の３種類である。
【００４６】
〔プリオン感染細胞の作製方法〕
プリオン感染細胞は、プリオン感染マウス脳の１％乳剤を培地に添加することにより作製した。
【００４７】
〔実験方法〕
上記プリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ発現ベクターまたはコントロールベクターをプリオン感染細胞にリポフェクション法により導入した。コントロールベクターとしては、プリオンタンパク質とは無関係のルシフェラーゼタンパク質配列を有するｓｉＲＮＡ発現ベクターを用いた。４８時間または９６時間培養後それぞれの細胞抽出液を回収した。全プリオンタンパク質（正常型プリオンタンパク質および異常型プリオンタンパク質）を検出する場合は、プロテイナーゼＫ処理を行わずにポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。異常型プリオンタンパク質のみを検出する場合は、細胞抽出液をプロテイナーゼＫで３７℃、３０分間処理した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。その後ウエスタンブロッティング法にてプリオンタンパク質を検出した。検出には抗プリオンタンパク質抗体を用いた。
【００４８】
〔実施例１：Chandlerプリオン株感染細胞におけるプリオンタンパク質抑制効果〕
Chandlerプリオン株感染細胞に５種類のプリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ発現ベクターをトランスフェクションし、９６時間培養後、ウエスタンブロッティング法にてプリオンタンパク質を検出した。結果を図４に示した。図中のstemはコントロールベクターを表し、PK(-)およびPK(+)はプロテイナーゼＫ処理の有無を表す。図４から明らかなように、５種類すべてのｓｉＲＮＡは、PK(-)およびPK(+)のいずれにおいてもコントロールと比較してプリオンタンパク質の産生を抑制した。特にNo.1は最も強い抑制効果を示し、異常型プリオンタンパク質（PK(+)）の検出量は、コントロールの２０〜３０％であった。この結果を踏まえて、以下の実施例においてはｓｉＲＮＡとしてNo.1のみを使用することとした。
【００４９】
〔実施例２：プリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ発現ベクター量依存性プリオンタンパク質抑制効果〕
Chandlerプリオン株感染細胞にプリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ（No.1）発現ベクター１、２、４および８μｇをトランスフェクションした。コントロールベクターの量は４μｇとした。９６時間培養後、ウエスタンブロッティング法にてプリオンタンパク質を検出した。結果を図５に示した。図中のstemはコントロールベクターを表し、PK(-)およびPK(+)はプロテイナーゼＫ処理の有無を表す。左端の数値（15、20、25、37）はタンパク質の分子量を示す。β−アクチンは内部コントロールとして使用した。図５から明らかなように、PK(-)では、ｓｉＲＮＡ発現ベクターのＤＮＡ量に依存してプリオンタンパク質が抑制された。一方、PK(+)では、４μｇまではｓｉＲＮＡ発現ベクターのＤＮＡ量に依存してプリオンタンパク質が抑制されたが、４μｇと８μｇではほとんど差が認められなかった。したがって、本実験系において異常型プリオンタンパク質を抑制するためには、ｓｉＲＮＡ発現ベクターのＤＮＡ量は４μｇで十分効果があることが明らかとなった。
【００５０】
〔実施例３：プリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ発現ベクター導入後の時間依存性プリオンタンパク質抑制効果〕
Chandlerプリオン株感染細胞にプリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ（No.1）発現ベクターをトランスフェクションし、４８時間培養後および９６時間培養後にウエスタンブロッティング法にてプリオンタンパク質を検出した。結果を図６に示した。図中のstemはコントロールベクターを表し、PK(-)およびPK(+)はプロテイナーゼＫ処理の有無を表す。左端の数値（15、20、25、37）はタンパク質の分子量を示す。図６から明らかなように、PK(-)およびPK(+)とも時間に依存してプリオンタンパク質を抑制した。ただし、４８時間後においては、PK(-)ではプリオンタンパク質の抑制が認められたが、PK(+)ではほとんど抑制効果が認められなかった。以上の結果から、本実験系において異常型プリオンタンパク質が抑制されるためには、プリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ発現ベクター導入後、少なくとも４８時間以上経過することが必要であり、好ましくは９６時間以上経過させることが必要である。
【００５１】
〔実施例４：福岡−１プリオン株感染細胞におけるプリオンタンパク質抑制効果〕
福岡−１プリオン株感染細胞にプリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ（No.1）発現ベクターをトランスフェクションし、９６時間培養後、ウエスタンブロッティング法にてプリオンタンパク質を検出した。結果を図７に示した。図中のstemはコントロールベクターを表し、PK(-)およびPK(+)はプロテイナーゼＫ処理の有無を表す。左端の数値（15、20、25、37）はタンパク質の分子量を示す。β−アクチンは内部コントロールとして使用した。図７から明らかなように、PK(-)およびPK(+)のいずれにおいてもコントロールと比較してプリオンタンパク質の産生を抑制した。したがって、Chandlerプリオン株と異なる性質を有する福岡−１プリオン株に感染した細胞においても、異常型プリオンタンパク質を抑制できることが明らかとなった。
【００５２】
〔実施例５：22Ｌプリオン株感染細胞におけるプリオンタンパク質抑制効果〕
22Ｌプリオン株感染細胞にプリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ（No.1）発現ベクターをトランスフェクションし、９６時間培養後、ウエスタンブロッティング法にてプリオンタンパク質を検出した。結果を図８に示した。図中のstemはコントロールベクターを表し、PK(-)およびPK(+)はプロテイナーゼＫ処理の有無を表す。左端の数値（15、20、25、37）はタンパク質の分子量を示す。図８から明らかなように、PK(-)およびPK(+)のいずれにおいてもコントロールと比較してプリオンタンパク質の産生を抑制したが、上記Chandlerプリオン株感染細胞および福岡−１プリオン株感染細胞における抑制効果より抑制の程度が低かった。
【００５３】
以上の結果より、本発明に係る異常型プリオンタンパク質抑制方法は、感染しているプリオン株により感受性に差があるものの、複数のプリオン株に対して抑制効果が認められ、臨床応用への有用性の高さが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、現状では有効な治療方法が確立されていないプリオン病の予防および治療に応用できるものである。したがって、主として医薬品産業に利用可能であり、広く医療や畜産の分野に大いに貢献できるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】５種類のプリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡのターゲット領域を示す模式図である。
【図２】プリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ発現ベクターの構造を示した模式図である。
【図３】５種類のプリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ発現ベクターの構築に使用したオリゴＤＮＡの塩基配列を示す図である。
【図４】Chandlerプリオン株感染細胞における異常型プリオンタンパク質の抑制効果を検討した結果を示すウエスタンブロッティング像である。
【図５】Chandlerプリオン株感染細胞において、プリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ（No.1）発現ベクターのＤＮＡ量を変化させて異常型プリオンタンパク質の抑制効果を検討した結果を示すウエスタンブロッティング像である。
【図６】Chandlerプリオン株感染細胞において、プリオンタンパク質特異的ｓｉＲＮＡ（No.1）発現ベクター導入後の時間を変えて異常型プリオンタンパク質の抑制効果を検討した結果を示すウエスタンブロッティング像である。
【図７】福岡−１プリオン株感染細胞における異常型プリオンタンパク質の抑制効果を検討した結果を示すウエスタンブロッティング像である。
【図８】２２Ｌ−１プリオン株感染細胞における異常型プリオンタンパク質の抑制効果を検討した結果を示すウエスタンブロッティング像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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