(57)【要約】【課題】    nt1838を含むMseI部位を用いる公知のPCR-RFLP（特許文献１、非特許文献１８）よりも正確に、かつ、上記領域の全塩基配列決定よりも簡便にHBV/BjとHBV/Baの判別を行うことができる、Ｂ型肝炎ウイルスのジェノタイプＢのサブタイプがBaとBjのいずれであるかを判別する方法を提供すること。【解決手段】  Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子のnt2020がgであるか否か、及び／又はnt2167がtであるか否かを調べることにより、Ｂ型肝炎ウイルスのジェノタイプＢのサブタイプがBaとBjのいずれであるかを判別する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子のnt2020がgであるか否か、及び／又はnt2167がtであるか否かを調べることを含む、Ｂ型肝炎ウイルスのジェノタイプＢのサブタイプがBaとBjのいずれであるかを判別する方法。
【請求項２】
Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子のnt2020がgであるか否か、及びnt2167がtであるか否かを調べることを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子のnt2020がgであるか否かは、制限酵素StuIを用いるPCR-RFLPにより調べられる請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子のnt2167がtであるか否かは、制限酵素HpaIを用いるPCR-RFLPにより調べられる請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子のnt2020がgであるか否かを制限酵素StuIを用いるPCR-RFLPにより調べ、かつ、nt2167がtであるか否かは、制限酵素HpaIを用いるPCR-RFLPにより調べる請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスのジェノタイプＢのサブタイプがBaとBjのいずれであるかを判別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（以下、「HBV」ということがある）は、全ゲノム配列の乖離が８％を超えることを基準として、AないしGの７種類のジェノタイプに分類されており、これらは特徴的な地理的分布を有している（非特許文献１〜３）。最近、第８番目のジェノタイプが、仮称「H」として提案されている（非特許文献４）が、新規なジェノタイプに分類するかジェノタイプＦのサブタイプとして分類するかはまだ決まっていない。宿主における肝疾患の臨床的徴候が、HBVのジェノタイプにより影響を受けることを示す証拠が蓄積されつつある（非特許文献５〜１１）。HBVジェノタイプＢは、ジェノタイプＣに比べ、Ｂ型肝炎e抗原(HBeAg)から、対応する抗体(抗HBe)へのセロコンバージョンが早く、組織学的活性スコアが低く、肝硬変患者の間で感染率がより低いことが報告されている。これらのデータは、HBVジェノタイプＢが、ジェノタイプＣより活性が低く、肝疾患の進行度がより遅いことを示している。もっとも、最近、長期間の転帰では、ジェノタイプＢとＣ感染の間に差異は見出されないことが報告されている（非特許文献１２、１３）。しかしながら、台湾では、HBVジェノタイプＢは、５０歳未満の患者において、肝細胞癌(HCC)の発達を促進することが報告されており（非特許文献７）、日本の同年代の患者ではこのようなことはない（非特許文献８）。HBVジェノタイプＢキャリア間でのこのような顕著な臨床的相違は、同一のジェノタイプであっても、宿主に感染しているHBV株のウイルス学的相違に起因するものであろう。
【０００３】
異なるジェノタイプのHBVゲノム間の組換えが報告されている（非特許文献１４〜１６）。しかしながら、宿主のHBV感染の病理学的転帰にそれらがどのように影響するかは知られていない。最近、本願発明者らは、プレコア領域及びコア領域にジェノタイプＣとの組換えを有するサブタイプ(Ba)と、このような組換えを有さないサブタイプ(Bj)とを報告した（非特許文献１７）。これらの判別のために新たに開発したポリメラーゼチェインリアクション(PCR)-制限断片長多型(RFLP)でプレコア領域を調べたところ、HBVのサブタイプBj(HBV/Bj)は日本に固有のものであり、一方、HBVのサブタイプBa(HBV/Ba)は、アジアの他の国々において広く見られるものであることがわかった（非特許文献１８）。さらに、ケースコントロール研究において、HBeAg及びコアプロモーター変異(T1762/A1764)が、HBV/BjキャリアよりもHBV/Baキャリアにおいてより頻度が高いことがわかった（非特許文献１８）。
【０００４】
最近、プレコア領域に対する、先に報告したPCR-RFLPの結果と一致しない結果を与える２つの完全なHBV/Bjゲノムが日本人キャリアから回収され、その塩基配列が決定された(GenBank Accession No. AB106884及びAB106885)。それらにおいては、PCR-RFLP（非特許文献１８、特許文献１）において用いられるMseI制限部位内の、第1838番目の塩基（以下、「nt1838」のように記載）がアデニンであるか、又はnt1837と1838の間にアデニンが挿入されており、このため、HBV/Bjの少数のサンプルでは、誤ってサブタイプBaと判別され得る。
【０００５】
HBV/Baは、非特許文献１７に記載されているように、ＨＢＶの遺伝子型Ｂと遺伝子型ＣのＰｒｅＣ−ＣＯＲＥが組み換えを起こしていることにより定義されるサブタイプであり、HBV/Bjは、組換えがないことにより定義されるサブタイプである。従って、HBVのジェノタイプＢのサブタイプがBaかBjかの判別は、少なくともＰｒｅＣ−ＣＯＲＥの領域の全塩基配列を決定することにより確実に行うことができる。しかしながら、この領域の全塩基配列を決定することは手間もコストもかかり、多数の検体について所定の時間内にサブタイプを決定する臨床検査においては、より簡便にサブタイプを決定できる方法が望まれる。
【０００６】
【特許文献１】特開2003-180357号公報
【非特許文献１】Okamoto H, Tsuda F, Sakugawa H, Sastrosoewignjo RI, Imai M, Miyakawa Y, Mayumi M. Typing hepatitis  B virus by homology in nucleotide sequence: comparison of surface antigen subtypes. J Gen Virol 1988;69:2575-2583.
【非特許文献２】Norder H, Courouce AM, Magnius LO. Complete genomes, phylogenetic relatedness, and structural proteins of six strains of the hepatitis B virus, four of which represent two new genotypes. Virology 1994;198:489-503.
【非特許文献３】Stuyver L, De Gendt S, Van Geyt C, Zoulim F, Fried M, Schinazi RF, Rossau R. A new genotype of hepatitis B virus: complete genome and phylogenetic relatedness. J Gen Virol 2000;81 Pt 1:67-74.
【非特許文献４】Arauz-Ruiz P, Norder H, Robertson BH, Magnius LO. Genotype H: a new Amerindian genotype of hepatitis B virus revealed in Central America. J Gen Virol 2002;83:2059-2073.
【非特許文献５】Lindh M, Hannoun C, Dhillon AP, Norkrans G, Horal P. Core promoter mutations and genotypes in relation to viral replication and liver damage in East Asian hepatitis B virus carriers. J Infect Dis 1999;179:775-782.
【非特許文献６】Mayerat C, Mantegani A, Frei C. Does hepatitis B virus (HBV) genotype influence the clinical outcome of HBV infection? J Viral Hepatitis 1999;6:299-304.
【非特許文献７】Kao JH, Chen PJ, Lai MY, Chen DS. Hepatitis B genotypes correlate with clinical outcomes in patients with chronic hepatitis B. Gastroenterology 2000;118:554-559.
【非特許文献８】Orito E, Ichida T, Sakugawa H, Sata M, Horiike N, Hino K, Okita K, et al. Geographic distribution of hepatitis B virus (HBV) genotype in patients with chronic HBV infection in Japan. Hepatology 2001;34:590-594.
【非特許文献９】Orito E, Mizokami M, Sakugawa H, Michitaka K, Ishikawa K, Ichida T, Okanoue T, et al. A case-control study for clinical and molecular biological differences between hepatitis B viruses of genotypes B and C. Japan HBV Genotype Research Group. Hepatology 2001;33:218-223.
【非特許文献１０】Chu CJ, Hussain M, Lok AS. Hepatitis B virus genotype B is associated with earlier HBeAg seroconversion compared with hepatitis B virus genotype C. Gastroenterology 2002;122:1756-1762.
【非特許文献１１】Chu CJ, Lok AS. Clinical significance of hepatitis B virus genotypes. Hepatology 2002;35:1274-1276.
【非特許文献１２】Sumi H, Yokosuka 0, Seki N, Arai M, Imazeki F, Kurihara T, Kanda T, et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the progression of chronic type B liver disease. Hepatology 2003;37:19-26.
【非特許文献１３】Yuen MF, Sablon E, Yuan HJ, Wong DK, Hui CK, Wong BC, Chan AO, et al. Significance of hepatitis B genotype in acute exacerbation, HBeAg seroconversion, cirrhosis-related complications, and hepatocellular carcinoma. Hepatology 2003;37:562-567.
【非特許文献１４】Bollyky PL, Rambaut A, Harvey PH, Holmes EC. Recombination between sequences of hepatitis B virus from different genotypes. J Mol Evol 1996;42:97-102.
【非特許文献１５】Bowyer SM, Sim JG. Relationships within and between genotypes of hepatitis B virus at points across the genome: footprints of recombination in certain isolates. J Gen Virol 2000;81 Pt 2:379-392.
【非特許文献１６】Morozov V, Pisareva M, Groudinin M. Homologous recombination between different genotypes of hepatitis B virus. Gene 2000;260:55-65.
【非特許文献１７】Sugauchi F, Orito E, Ichida T, Kato H, Sakugawa H, Kakumu S, Ishida T, et al. Hepatitis B virus of genotype B with or without recombination with genotype C over the precore region plus the core gene. J Virol 2002;76:59855992.
【非特許文献１８】Sugauchi F, Orito E, Ichida T, Kato H, Sakugawa H, Kakumu S, Ishida T, et al. Epidemiologic and virologic characteristics of hepatitis B virus genotype B having the recombination with genotype C. Gastroenterology 2003;124:925932.
【非特許文献１９】Usuda S, Okamoto H, Iwanari H, Baba K, Tsuda F, Miyakawa Y, Mayumi M. Serological detection of hepatitis B virus genotypes by ELISA with monoclonal antibodies to type-specific epitopes in the preS2-region product. J Virol Methods 1999;80:97-112.
【非特許文献２０】Usuda S, Okamoto H, Tanaka T, Kidd-Ljunggren K, Holland PV, Miyakawa Y, Mayumi M. Differentiation of hepatitis B virus genotypes D and E by ELISA using monoclonal antibodies to epitopes on the preS2-region product. J Virol Methods 2000;87:81-89.
【非特許文献２１】Mizokami M, Nakano T, Orito E, Tanaka Y, Sakugawa H, Mukaide M, Robertson BH. Hepatitis B virus genotype assignment using restriction fragment length polymorphism patterns. FEBS Lett 1999;450:66-71.
【非特許文献２２】Sugauchi F, Mizokami M, Orito E, Ohno T, Kato H, Suzuki S, Kimura Y, et al. A novel variant genotype C of hepatitis B virus identified in isolates from Australian Aborigines: complete genome sequence and phylogenetic relatedness. J Gen Virol 2001;82:883-892.
【非特許文献２３】Sugauchi F, Chutaputti A, Orito E, Kato H, Suzuki S, Ueda R, Mizokami M. Hepatitis B virus genotypes and clinical manifestation among hepatitis B carriers in Thailand. J Gastroenterol Hepatol 2002;17:671-676.
【非特許文献２４】Kobayashi M, Arase Y, Ikeda K, Tsubota A, Suzuki Y, Saitoh S, Suzuki F, et al. Viral genotypes and response to interferon in patients with acute prolonged hepatitis B virus infection of adulthood in Japan. J Med Virol 2002;68:522528.
【非特許文献２５】Sakai T, Shiraki K, Sugimoto K, Ohmori S, Murata K, Takase K, Nakano T, et al. Hepatitis B genotypes in patients with acute hepatitis B virus infection. J Hepatol 2001;35:829-830.
【非特許文献２６】Chen HS, Kew MC, Hornbuckle WE, Tennant BC, Cote PJ, Gerin JL, Purcell RH, et al. The precore gene of the woodchuck hepatitis virus genome is not essential for viral replication in the natural host. J Virol 1992;66:5682-5684.
【非特許文献２７】Li JS, Tong SP, Wen YM, Vitvitski L, Zhang Q, Trepo C. Hepatitis B virus genotype A rarely circulates as an HBe-minus mutant: possible contribution of a single nucleotide in the precore region. J Virol 1993;67:5402-5410.
【非特許文献２８】Lok AS, Akarca U, Greene S. Mutations in the pre-core region of hepatitis B virus serve to enhance the stability of the secondary structure of the pregenome encapsidation signal. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:4077-4081.
【非特許文献２９】Kao JH, Liu CJ, Chen DS. Hepatitis B viral genotypes and lamivudine resistance. J Hepatol 2002;36:303-304.
【非特許文献３０】Ben-Ari Z, Daudi N, Klein A, Sulkes J, Papo 0, Mor E, Samra Z, et al. Genotypic and phenotypic resistance: longitudinal and sequential analysis of hepatitis B virus polymerase mutations in patients with lamivudine resistance after liver transplantation. Am J Gastroenterol 2003;98:151-159.
【非特許文献３１】Akuta N, Suzuki F, Kobayashi M, Tsubota A, Suzuki Y, Hosaka T, Someya T, et al. The influence of hepatitis B virus genotype on the development of lamivudine resistance during long-term treatment. J Hepatol 2003;38:315-321.
【非特許文献３２】Dienes HP, Gerken G, Goergen B, Heermann K, Gerlich W, Meyer zum Buschenfelde KH. Analysis of the precore DNA sequence and detection of precore antigen in liver specimens from patients with anti-hepatitis B epositive chronic hepatitis. Hepatology 1995;21:1-7.
【非特許文献３３】Kramvis A, Kew MC, Bukofzer S. Hepatitis B virus precore mutants in serum and liver of Southern African Blacks with hepatocellular carcinoma. J Hepatol 1998;28:132-141.
【非特許文献３４】Koseki,T., Hongo,S., Muraki,Y., Sugawara,K., Matsuzaki,Y. and Nakamura,K.  Sequence analysis of the entire genome of hepatitis B virus from a patient with fulminant hepatitis.  Yamagata Med. J. 17, 27-40 (1999)
【非特許文献３５】Sastrosoewignjo,R.I., Okamoto,H., Mayumi,M., Warsa,U.C. and             Sujudi,X. The complete nucleotide sequence of an HBV DNA clone of subtype adw            (pRTB299) from Indonesia.  ICMR annals 5, 39-50 (1985)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、nt1838を含むMseI部位を用いる公知のPCR-RFLP（特許文献１、非特許文献１８）よりも正確に、かつ、上記領域の全塩基配列決定よりも簡便にHBV/BjとHBV/Baの判別を行うことができる、Ｂ型肝炎ウイルスのジェノタイプＢのサブタイプがBaとBjのいずれであるかを判別する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ほとんどのHBVにおいて、サブタイプBjではnt2020がaであり、かつ、nt2167がtであり、一方、サブタイプBaではnt2020がgであり、かつ、nt2167がcであることを見出し、これらの知見を利用してサブタイプBaとBjの判別を行なうことに想到し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子のnt2020がgであるか否か、及び／又はnt2167がtであるか否かを調べることを含む、Ｂ型肝炎ウイルスのジェノタイプＢのサブタイプがBaとBjのいずれであるかを判別する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、nt1838に上記のような変異が生じているHBVであっても、正確に、簡便にHBVのサブタイプを判別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
下記実施例において具体的に記載されている通り、ほとんどのHBVのジェノタイプＢにおいて、サブタイプBjではnt2020がaであり、かつ、nt2167がtであり、一方、サブタイプBaではnt2020がgであり、かつ、nt2167がcである。本発明は、この新知見に基づく。なお、HBV遺伝子中の塩基の位置の特定は、既に確立されている。位置特定のための基本となる塩基配列は、例えば非特許文献３４(GenBank Accession No.AB010290) （配列表の配列番号１）に記載されている。本発明における、nt2020及びnt2167の位置も、この配列の第１番目の塩基をnt1とする、この分野において確立されている基準に従うものである。
【００１２】
nt2020がg否かは、nt2020を含む領域の塩基配列を決定することによって行うことができる。あるいは、nt2020がgの場合（HBV/Baの場合)には、nt2019〜nt2024がaggcctとなって制限酵素StuIの切断部位を与え、一方、nt2020がaの場合（HBV/Bjの場合)にはStuI部位が生じないので、StuIを用いたPCR-RFLPによりnt2020がgか否かを判別することができ、こちらの方が簡便であるので好ましい。同様に、nt2167がtか否かは、nt2167を含む領域の塩基配列を決定することによって行うことができる。あるいは、nt2167がtの場合（HBV/Bjの場合)には、nt2165〜nt2170がgttaacとなって制限酵素HpaIの切断部位を与え、一方、nt2167がcの場合（HBV/Baの場合)にはHpaI部位が生じないので、HpaIを用いたPCR-RFLPによりnt2167がtか否かを判別することができ、こちらの方が簡便であるので好ましい。
【００１３】
PCR-RFLP自体は周知の手法である。すなわち、調べようとする部位（すなわち、nt2020又はnt2167）を先ずPCRにより増幅し、増幅産物を所定の制限酵素（すなわち、nt2020を調べるためにはStuI、nt2167を調べるためにはHpaI)で消化し、消化後のＤＮＡ断片のサイズを電気泳動等により調べる。制限酵素による切断が起きた場合と起きなかった場合では、生じる断片の数もサイズも異なるので、それに基づいて切断が起きたか否か、ひいては目的の位置の塩基がいずれであったかを知ることができる。すなわち、nt2020がgか否かを調べるためには、nt2020を含む領域をPCRにより増幅し、増幅産物をStuIで消化し、消化物を電気泳動にかける。StuIによる切断が起きなかった場合、すなわち、サブタイプBjの場合には、増幅断片は切断されないので、増幅断片のサイズを有する１個の断片が検出される。一方、StuIによる切断が起きた場合、すなわち、サブタイプBaの場合には、増幅断片が切断されるので、切断されたサイズの２個の断片が検出される。同様に、nt2167がtか否かを調べるためには、nt2167を含む領域をPCRにより増幅し、増幅産物をHpaIで消化し、消化物を電気泳動にかける。HpaIによる切断が起きなかった場合、すなわち、サブタイプBaの場合には、増幅断片は切断されないので、増幅断片のサイズを有する１個の断片が検出される。一方、HpaIによる切断が起きた場合、すなわち、サブタイプBjの場合には、増幅断片が切断されるので、切断されたサイズの２個の断片が検出される。
【００１４】
増幅領域は、切断が起きた場合に生じる２個の断片が、それぞれ電気泳動で明瞭に検出できるサイズ、好ましくは、小さい方の断片が１bp以上、さらに好ましくは20bp以上となるように設定する。また、生じる２個の断片のサイズの差が、電気泳動で明瞭に検出できるように、好ましくは、１bp以上、さらに好ましくは20bp以上になるように設定する。増幅領域のサイズの上限は特にないが、あまりに大きいとPCRの時間もコストもかかり、また、それによる利点もないので、好ましくは、1000bp以下である。
【００１５】
PCRによる増幅は、１段階で行なってもよいが、感度をより高めるために、下記実施例に具体的に記載するように、第１段階のPCRでより広い範囲の領域を増幅し、得られた増幅産物を鋳型として、その中に含まれる領域を第２段階のPCRで増幅してもよい(nested PCR)。この場合、第２段階のPCRに用いるプライマーは両方とも、第１段階のPCRに用いるプライマーと異なるものであってもよいし、一方のみ異なるプライマーを用い、他方は第１段階のPCRで用いたプライマーと同じものを用いてもよい(hemi-nested PCR,下記実施例参照）。
【００１６】
nt2020とnt2167は、いずれか一方を調べればよいが、正確を期すためには、両者を調べ、それぞれにより判別される型が不一致となった場合には、上記領域の全塩基配列決定により型判別を行なうことにより、正確に型判別を行うことができ好ましい。nt2020とnt2167の両者を調べる場合、PCRによる増幅は、それぞれの部位を含む領域を別個に増幅することもできるが、両方の部位を含む領域を増幅し、増幅断片についてStuI又はHpaIを用いるRFLPを行なうと、PCRによる増幅が１回で済むのでより簡便であり好ましい。この場合の増幅領域は、StuI及びHpaIのいずれで増幅産物を消化した場合でも、上記した小さい方の断片の最低サイズ、及び大小の断片のサイズの差が満足されるように設定することが好ましい。
【００１７】
なお、PCR自体は、周知であり、そのためのキットも市販されているので、容易に実施することができる。また、RFLPも周知であり、市販の制限酵素を用いて容易に実施することができる。
【００１８】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
１．  患者及び方法
(1)  患者
HBVジェノタイプＢが主たる型であることが報告されている（非特許文献８）、本州北部及び沖縄の７つの病院に訪れたHBVの慢性キャリアから合計３１３例の血清を得た。これらの血清は、preS2領域産物についてのELISA（非特許文献１９、２０）によりHBVジェノタイプＢであることが判定され、かつ、S遺伝子のPCR-RFLP（非特許文献２１）によりそれが確認されたものである。各血清のアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)活性及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST) 活性を測定し、さらに、市販のキット(EIA, ダイナボット社製）を用いてHBe抗原(HBeAg)及び抗HBe抗体を測定した。少なくとも１２ヶ月の追跡後、慢性キャリアを３群に分けた。すなわち、無症状で追跡期間中自覚症状がなく、血清ALTが正常レベルに維持された非肝硬変キャリア及びALTレベルが正常値の上限(35 U/L)を超えた非肝硬変キャリア、並びに超音波診断により肝硬変の徴候（粗い肝構造、結節性表面及び肝臓の角が丸い）が観察され、かつ、脾機能亢進（超音波診断で脾腫大が観察され、血小板数が100,000/mm3未満）の証拠が認められた肝硬変キャリアの３群に分けた。急性肝炎は、追跡期間中の６ヶ月以内に血清からHBsAgが失われることにより確認した。Ｃ型肝炎ウイルスに共感染している患者は除外した。いずれの患者も、追跡期間中に抗ウイルス治療は受けなかった。
【００２０】
(2)  HBVジェノタイプＢのサブタイプBa及びBjを判別するためのPCR-RFLP
ＤＮＡ抽出キット（福島県のゲノム  サイエンス  ラボラトリー社製）を用いて各血清100μLから核酸を抽出し、-40℃で保存した。HBV/Ba及びHBV/Bjは、２種類のPCR-RFLP法を用いて決定した。１つは公知の方法であり、プレコア領域を標的とするものである（非特許文献１８）。もう一方は、コア領域を標識にする、新たに開発された方法である。新しい方法では、１回目のPCRは、センスプライマーとしてPC1-HBV: 5'-cat gca act ttt tca cct ctg cct-3'(nt1813-1836)、アンチセンスプライマーとしてCOR-HBV: 5'-gag tgc gaa tcc aca ctc ca-3' (nt2285-2266)を用いて行なった。２回目のPCRは、別のセンスプライマーPC2-HBV: 5'-tgt tca agc ctc caa gct gtg-3' (nt1861-1881)と上記アンチセンスプライマーCOR-HBVを用いて行なった。425塩基対(bp)の増幅産物の一部(5μg)を５単位のHpaI又はStuIで３７℃で３時間消化した。HpaI又はStuIによる消化物を、3.0%(w/v)アガロースゲル上で電気泳動にかけ、臭化エチジウムで染色し、紫外光の下でサイズを調べた。
【００２１】
２つの制限酵素で矛盾する結果が出た血清については、HBV/BaかHBV/Bjかを確認するために、公知のプライマー（非特許文献２２）を用いてプレコア領域及びコア領域の塩基配列を決定した。PCR中のコンタミネーションを避ける一般的な注意事項は注意深く遵守し、それぞれの実験には陰性対照血清を含めて増幅の特異性を確認した。
【００２２】
(3)  統計学的解析
統計学的差異は、Mann-Whitneyのノンパラメトリック検定、Fisherの直接確率検定(exact probability test)及びStudentのt検定を適宜用いて評価した。P値が0.05未満の場合に統計学的有意差有りと判定した。
【００２３】
２．  結果
(1)  HBVジェノタイプＢのサブタイプBa及びBjを判別するためのPCR-RFLP
DDBJ/EMBL/GenBankデータベースから検索した７０例のHBV/B単離物を全ゲノムについて比較した。２９例の全てのHBV/Bj単離物では、nt2020がAであり(A2020)、nt2167がT(T2167)でHpaI部位(gttaac[nt2165-2170])の一部を形成していた。対照的に、残りの４１例であるHBV/Ba単離物では、例外なく、G2020であってStuI部位(aggcct[nt2019-2024])の一部を形成しており、また、C2167であった。HBV/Bj及びHBV/Ba単離物の代表的な各２０例の塩基配列を図１に示す。nt2020におけるa又はgのSNP、及びnt2167におけるt又はcのSNPを利用して、２つの制限酵素を用いる、サブタイプBjとBaを判別するためのRFLPを開発した。HBV/Bj単離物について増幅された425bp(nt1861-2285)のPCR産物は、HpaI消化により、それぞれ306bpと119bpの２つの断片に分離され、一方、HBV/Ba単離物についてはこのような分離は生じなかった。対照的に、HBV/Ba単離物について増幅された425bpのPCR産物は、StuI消化により、それぞれ265bpと160bpの２つの断片に分離され、一方、HBV/Bj単離物についてはこのような分離は生じなかった。
【００２４】
このPCR-RFLP法を、３１３例の日本人のジェノタイプＢのHBV検体について適用したところ、３５例(11%)がHBV/Baで、２５３例(81%)がHBV/Bjであり、残りの２５例(8%)はサブタイプの判別ができなかった。このPCR-RFLP法の信頼性を確認するために、３５例のHBV/Ba検体のうちの３５例、２５３例のHBV/Bj検体のうちの４４例、及び２５例のサブタイプ判別不能検体について、プレコア領域及びコア領域の塩基配列を決定した。PCR-RFLPによりHBV/Bjであると決定された４４例のHBV/Bjの全例が、塩基配列決定によりサブタイプBjであることが確認された。しかしながら、PCR-RFLPによりHBV/Baであると決定された３５例のうちの１例(3%)が、塩基配列決定によりサブタイプBjであることがわかった。
【００２５】
PCR-RFLPによってサブタイプの判別ができなかった２５例のうち、４例(16%)がHBV/Baであり、２１例(84%)がHBV/Bjであることが塩基配列決定により確認された。
【００２６】
(2)  日本の種々の地方における急性及び慢性肝炎患者中のHBVジェノタイプＢのBa及びBjサブタイプの分布
HBVジェノタイプＢに感染し、PCR-RFLPによりサブタイプがBaかBjかを決定した３１３例のうち、１５例が急性Ｂ型肝炎であり、２９８例が慢性Ｂ型肝炎であった。急性肝炎１５例のうち、サブタイプBaが１３例(87%)であり、この頻度は、慢性肝炎患者における、２９８例中２５例(8%)に対して有意に(P<0.01)高かった。
【００２７】
図２は、日本の７箇所の病院を訪れた２９８名の慢性肝炎患者のサブタイプBa及びBjの地理的分布を示すものである。Ba及びBjサブタイプの分布には地域的な差が見られた。サブタイプBaは、東京（２つの病院の合計）での５８例中１２例(21%)で検出され、他の地域では、２４０例中１３例(5%)(0〜9%の範囲）であり、これより少なかった。
【００２８】
(3)  HBVジェノタイプＢのサブタイプBaとBjのキャリアの比較
２５例のHBV/Baキャリアと２７３例のHBV/Bjキャリアとの、人口学的、ウイルス学的及び臨床特徴的な比較を表１に示す。HBV/Bjキャリアの平均年齢は、HBV/Baキャリアの平均年齢よりも有意に高かった(48.7±14.4対42.0±15.0歳、P<0.01)。トランスアミナーゼレベル及び慢性肝疾患の分布による臨床症状には差異は見られなかった。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
Baサブタイプに感染した患者とBjサブタイプに感染した患者の間には、HBeAg/抗HBe抗体について顕著な差異が見られた。HBV/Baに感染した患者におけるHBeAgの検出率は、HBV/Bjに感染した患者よりも有意に高く (32%対9%、P<0.01)、この差異は、３０歳を超える患者に限定するとより顕著であった(32%対4%、P<0.01)。対照的に、HBV/Ba感染患者における抗HBe抗体の検出率は、HBV/Bj感染患者における検出率よりも有意に低く(68%対88%、P<0.01)、これは３０歳を超える患者に限定しても同様であった(74%対94%、P<0.01)。
【００３１】
(4)  HBV/BaとHBV/Bjの判別についての２つのPCR-RFLP法の比較
nt1838におけるg又はaのSNPを利用する、制限酵素SpeIとMseIを用いる公知のPCR-RFLP（非特許文献１８）を、本実施例でサブタイプが決定された３１３例のHBVジェノタイプＢ検体（表２）に適用した。公知のPCR-RFLP法では、３８例のHBV/Ba検体のうち３４例(89%)がHBV/Baに分類されたが、４例(11%)は判別不能であった。また、公知のPCR-RFLP法では、２７５例のHBV/Bj検体のうち、２３８例(86%)がHBV/Bjに分類されたが２７例(10%)が判別不能であった。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
公知のPCR-RFLPでHBV/Baに分類されたHBV/Bj検体が１０例あった。公知のPCR-RFLPによりHBV/Baに分類された１０例のHBV/Bjのプレコア領域の部分配列を図３に示す。それらのうちの３例では、nt1838においてgからaへの変異が起き、残りの７例ではnt1837と1838の間にaが挿入され、これはHBeAg陰性の表現型であった。これらの変異によりMseIの制限部位(ttaa)が生じ、公知のPCR-RFLPでは偽陽性が生じた。aが挿入された、７名のHBV/Baのキャリアは、いずれも血清中にHBeAgを有していなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の方法は、HBVジェノタイプＢのサブタイプがBaかBjかを簡便かつ正確に判別できる方法であり、該判別に有用である。サブタイプBaとBjでは、上記の通り臨床症状が異なるので、サブタイプがBaかBjかを判別することは、肝疾患の治療や進行の予防に有用である。また、サブタイプBaとBjでは、地域的な分布が異なるので、サブタイプがBaかBjかを判別することは、感染経路の特定にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】HBV/Bj及びHBV/Baの典型的なnt2020及びnt2167近傍の塩基配列を、各２０症例ずつ示す図である。
【図２】日本の種々の地域における、HBV/Bj及びHBV/Baの分布を示す図である。
【図３】公知のPCR-RFLPによる判別で誤りが生じた症例の、nt1838近傍の塩基配列を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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