(57)【要約】【課題】  検体試料からターゲットの微生物を正確に検出し、計測できる微生物の計測装置及び計測方法を提供する。【解決手段】  微生物の測定装置が、微生物を含むサンプル液がマイクロフローとして流されるノズル流路を備えたマイクロフローサイトメータと、ノズル流路中の微生物を検出する蛍光顕微鏡と、蛍光顕微鏡を介して微生物を撮影する撮影手段とを含む。また、微生物の計測方法が、微生物を蛍光標識する工程と、微生物を含むサンプル液をマイクロフローとして流す工程と、マイクロフロー中の微生物を蛍光顕微鏡を介してカラー撮影する工程と、撮影された画像から微生物の数を計測する工程とを含む。【選択図】図４
2005245317.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を含むサンプル液がマイクロフローとして流されるノズル流路を備えたマイクロフローサイトメータと、
該ノズル流路中の該微生物を検出する蛍光顕微鏡と、
該蛍光顕微鏡を介して該微生物を撮影する撮影手段とを含むことを特徴とする微生物の測定装置。
【請求項２】
上記マイクロフローサイトメータが、
２つのシース流路と、該シース流路に挟まれたサンプル流路と、該シース流路と該サンプ流路とに接続されたノズル流路とを含み、該シース流路を流れるシース流が該サンプル流を挟むように該サンプル流と合流し、該ノズル流路中でマイクロシースフローを形成することを特徴とする請求項１に記載の測定装置。
【請求項３】
上記ノイズ流路の幅が、約１０〜約１５０μｍの範囲内にあることを特徴とする請求項１に記載の測定装置。
【請求項４】
上記撮影手段が、カラーＣＣＤであることを特徴とする請求項１に記載の測定装置。
【請求項５】
上記微生物が、該微生物に結合する蛍光物質で処理された微生物であることを特徴とする請求項１に記載の測定装置。
【請求項６】
２つのシース流路と、該シース流路に挟まれたサンプル流路と、該シース流路と該サンプ流路とに接続されたノズル流路とが基体に設けられ、
該シース流路を流れるシース流がサンプル流を挟むように該サンプル流と合流し、該ノズル流路中でマイクロシースフローを形成し、
該基体が、エラストマー及びプラスチックからなる群から選択される一の材料からなることを特徴とするマイクロフローサイトメータ。
【請求項７】
上記基体が、ポリジメチルシロキサンからなることを特徴とする請求項６に記載のマイクロフローサイトメータ。
【請求項８】
上記ノイズ流路の幅が、約１０〜約１５０μｍの範囲内にあることを特徴とする請求項６に記載のマイクロフローサイトメータ。
【請求項９】
微生物を蛍光標識する標識工程と、
該微生物を含むサンプル液をマイクロフローとして流すフロー工程と、
該マイクロフロー中の該微生物を蛍光顕微鏡を介してカラー撮影する工程と、
撮影された画像から該微生物の数を計測する計測工程とを含むことを特徴とする微生物の計測方法。
【請求項１０】
上記標識工程が、上記微生物を含むサンプルを該微生物に結合する蛍光物質で処理する
工程であることを特徴とする請求項９に記載の計測方法。
【請求項１１】
上記フロー工程が、２つのシース流で上記微生物を含むサンプル流を挟み、ハイドロダイナミックフォーカシングにより、該サンプル流を所定の幅のマイクロシースフローとする工程であることを特徴とする請求項９に記載の計測方法。
【請求項１２】
上記サンプル液の流速が、約１０ｎｌ／分〜約２００ｎｌ／分の範囲内にあることを特徴とする請求項９に記載の計測方法。
【請求項１３】
上記計測工程が、上記画像に撮影された上記微生物の蛍光強度から、該微生物の数を計測する工程であることを特徴とする請求項９に記載の計測方法。
【請求項１４】
上記計測工程が、上記画像に撮影された上記微生物を蛍光波長により分類する工程と、分類されたそれぞれの微生物の数を計測する多重計測工程とを含むことを特徴とする請求項９に記載の計測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の計測装置及び計測方法に関し、特に、微生物の多重計測を可能とした計測装置及び計測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、短時間で微粒子を正確に検出する方法として、半導体微細加工技術やマイクロマシン技術（ＭＥＭＳ：Micro Electro Mechanical System）を用いてノズル部分を形成するマイクロフローサイトメトリー法が提案されていた。
かかる測定方法では、半導体加工技術によりガラス基板上にフローサイトメトリーのノズル（流路は〜４００ｎｍ）を作製し、これに５０〜１５０ｎｌ／分の流速で送液しながらサンプルを注入し、レーザー光（波長６３２．８ｎｍ）を照射し、その透過光をフォトダイオードで計測している。即ち、サンプル中の微粒子がレーザー光を散乱すれば、シグナルが発生する仕組みである（例えば、非特許文献１）。
【非特許文献１】Che-Hsin Lin、Gwo-Bin Lee、“Micromachined flow cytometers with embedded etched optic fibers for optical detection、”Journal of Micromechanics and Microengineering、Vol. 13、No 3、pp. 447-453、May 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来のマイクロフローサイトメトリー法では、例えば、直径２０μｍのポリスチレンビーズを用いた場合には、シグナルの検出に成功しているが、実際の血液サンプルではシグナルのピークが重なり、粒子数の正確な計測が困難であった。また、散乱光を用いて計測するため、血球（赤血球、白血球、血小板等）の区別のような、粒子の種類の選別も困難であった。
【０００４】
そこで、本発明は、検体試料からターゲットの微生物を正確に検出し、計測できる微生物の計測装置及び計測方法の提供を目的とする。特に、大きさが１μｍ以下の微生物の多重計測が可能な計測装置及び計測方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、微生物を含むサンプル液がマイクロフローとして流されるノズル流路を備えたマイクロフローサイトメータと、ノズル流路中の微生物を検出する蛍光顕微鏡と、蛍光顕微鏡を介して微生物を撮影する撮影手段とを含む微生物の測定装置である。
【０００６】
更に、本発明は、微生物を蛍光標識する標識工程と、微生物を含むサンプル液をマイクロフローとして流すフロー工程と、マイクロフロー中の微生物を蛍光顕微鏡を介してカラー撮影する工程と、撮影された画像から微生物の数を計測する計測工程とを含む微生物の計測方法でもある。
【発明の効果】
【０００７】
本発明にかかる計測装置では、極微量のサンプルを用いて、目的とする生物の計測が可能となる。また、多種類の微生物をそれぞれ計測する多重計測や、形状の分類も可能となる。
【０００８】
また、マイクロフローサイトメータの低コスト化、コンパクト化が図れるとともに、使い捨てにより微生物検査の安全性を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
図１は、本実施の形態にかかる微生物の計測方法の原理を示す概略図である。図１に示すように、微生物サンプルに含まれる微生物の数を正確に計測するには、微粒子を、その微生物の容積に近い大きさの経路中に流動させ、例えば蛍光顕微鏡を用いてその数を計測すればよい。即ち、経路中では、微粒子が１個ずつ並んで流動するため、経路中に設けた蛍光顕微鏡で、通過する微生物の数を計測する。
【００１０】
微生物の検出（計測）が必要な場合としては、食品工場、病院や保険所での細菌検査、上下水や河川での微生物検査などが想定される。本発明で検出すべき微生物の種類は特に限定されず、大腸菌、サルモネラ菌、枯草菌、黄色ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎菌、シュードモナス属、クロストリジウム属などの細菌や、酵母、カビ、放線菌など、微生物一般を含む。
【００１１】
マイクロフローサイトメトリ法では、フローサイトメトリーと同じくシース流を用いて微生物を流動させる。図２は、マイクロフローサイトメトリ法に用いるマイクロフローサイトメータの一部分の上面図である。マイクロフローサイトメータは、例えばＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）のような透明の高分子材料からなり、図２に示すように、基板に３つの流路が合わさって１つの流路となる構造となっている。かかる構造において、中央から微生物を含むサンプル流を流し、その両側からキャリアであるシース流（シースフロー）を流すことにより、サンプル流の幅を絞ってマイクロフローとすることができる（ハイドロダイナミックフォーカシング）。
【００１２】
本実施の形態にかかるマイクロフローサイトメータでは、例えば大きさが１０μｍ以下、特に１μｍ程度の微生物の計測を行なうため、サンプル流の幅を、シース流により１０μｍ以下に絞る必要がある。ノズルや各流路の断面形状は、このようにサンプル流を絞ってマイクロシースフローを形成できる構造であれば、矩形、円形、半円形、多角形等でもよい。ここで、マイクロシースフローは、シース流と、マイクロフローとなるように絞られたサンプル流からなる。
【００１３】
サンプル流の絞り込みに重要なノズルの幅は、約１０μｍ〜約１５０μｍであるあることが適当である。１０μｍより小さければ、圧力損失が大きく所定の流速が得られず、ノズルに微生物が詰まる可能性があり、また、１５０μｍよりも大きければ、微生物濃度が１０，０００個以上のような場合、絞込みによって微生物が重なる（一直線に流動しない）ことが多くなり、計測精度が低下するためである。一方、ノズルの深さは、１０μｍ程度が好ましい。
また、サンプル流路やシース流路も、ノズルと同様の断面形状、寸法であることが好ましい。
【００１４】
マイクロフローサイトメータの基体の材料にはＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン：ダウコーニング社製）を用いたが、安価で量産し易い高分子材料であれば他の材料を用いても良いが、特に、光学的な検出が容易な透明材料が望ましい。
具体的には、やわらかい材料ではエラストマー、硬い材料ではプラスチックが適している。エラストマーでは、シリコンゴム（上述のＰＤＭＳ）、ブタジエンゴム、イソプレンゴム、フッ素系ゴム、スチレン系透明ゴムなどの透明合成ゴム及びそれらのブレンドゴムが好ましい。
性質としては、密度が約１ｇ／ｍｌ、給水率が０．１％以下、全光線透過率が８５％以上、成形収縮率が１％以下、曲げ弾性率が３００Ｍｐａ以上を満たすことが好ましい。
【００１５】
また、硬化型としては、化学開始剤や架橋剤による硬化型、熱硬化型、光などのエネルギー線硬化型が好ましい。
【００１６】
プラスチック材料であれば、励起光や蛍光を透過する材料であることが好ましい。例えば、ポリスチレン系、ポリスルホン系、アクリル系、ポリカーボネート系、ポリオレフィン系、塩素含有ポリマー、ポリエーテル系、ポリエステル系などである。これらは単独、共重合、ブレンド、プレポリマーのいずれの形態でもよい。成形の点では熱可塑性が好ましいが、熱硬化性、エネルギー線硬化性の架橋重合体でもよい。
【００１７】
次に、マイクロフローサイトメータの製造方法について簡単に説明する。マイクロフローサイトメータの作製方法では、まず、例えば３インチのシリコン基板上に、厚さ１０μｍのＵＶ硬化性レジストを塗布する。ＵＶ硬化性レジストとしては、例えばＳＵ−１０が用いられる。
【００１８】
基板には、シリコン等の半導体材料の他、セラミックス、ガラス、ポリマーアロイ等を使用しても良い。
【００１９】
次に、マスクパターンを設計し、かかるマスクパターンを用いてＵＶ硬化性レジストのパターニングを行なう。これにより、凸型の鋳型を形成する。
【００２０】
次に、この鋳型に、透明なＰＤＭＳのプレポリマー約３０ｍｌを充填して、３７℃の温度で４０時間保持し、プレポリマーを重合させる。
【００２１】
次に、鋳型からＰＤＭＳを取り出し、マイクロフローサイトメータのレプリカを作製する。かかるレプリカには、シース流路等のマイクロ流路に相当する溝部が形成されている。
【００２２】
最後に、ガラスカバーで表面を覆い、所定のマイクロ流路を有するマイクロフローサイトメータが完成する。
【００２３】
なお、マイクロフローサイトメータの作製には、レプリカ法に限らず、直接成型法などの他の方法を用いてもよい。また、ここでは平面状に作製したが、フローサイトメーターで一般的に使用される円筒状としてもよい。
【００２４】
図３は、本実施の形態にかかるマイクロフローサイトメータの概略図であり、図３（ａ）は、マイクロフローサイトメータのマイクロ流路の概略図、図３（ｂ）は検出部位の断面図、図３（ｃ）はサンプル液注入部位の断面図である。
【００２５】
図３（ａ）に示すように、マイクロフローサイトメータは、５．６ｍｍの長さの、２本のシース流路と、それらに挟まれた５ｍｍ長さのサンプル流路を有する。２本のシース流路と、サンプル流路とが合流してノズルとなる。ノズルの長さは１．０ｃｍである。
【００２６】
また、図３（ｂ）に示すように、検出部位には、厚さ６ｍｍのＰＤＭＳに、幅１００μｍ、深さ１０μｍの矩形断面の溝からなるノズルが設けられている、ＰＤＭＳの表面上には厚さ約０．５ｍｍのガラスカバーが設けられている。
ノズル中を流動する微生物は、ガラスカバーを介して蛍光顕微鏡で観察され、計測される。
【００２７】
更に、図３（ｃ）に示すように、サンプル液注入部位には、厚さ６ｍｍのＰＤＭＳに、幅１００μｍ、深さ１０μｍの矩形断面の溝からなるサンプル流路が設けられている、ＰＤＭＳの表面上には厚さ約０．５ｍｍのガラスカバーが設けられている。
サンプル流路の端部では、ガラスカバーに直径１ｍｍの穴が開口され、キャピラリーチューブがエポキシ樹脂で接続されている。サンプル流は、キャピラリーチューブからサンプル流路に供給される。
【００２８】
図４は、本実施の形態にかかる微生物の計測装置の概略図である。計測装置は、上述のマイクロフローサイトメータを含む。マイクロフローサイトメータのサンプル流路には、キャピラリチューブを介して微生物サンプルが供給される。同様に、シース流路には、キャピラリチューブを介してキャリア緩衝液が供給される。微生物サンプル、キャリア緩衝液は、それぞれシリンジポンプで制御されるマイクロシリンジから供給される。
【００２９】
サンプル流路、シース流路に供給された微生物サンプル、キャリア緩衝液は、一緒になってノズルに流れ込む。
サンプル流路の両側にシース流路が設けられているため、微生物を含むサンプル流を挟むようにシース流が供給される。この結果、ノズル中でサンプル流は細く絞られ、微生物が一直線に並んで流動する。ここでは、サンプル流の幅を、１０μｍ以下の大きさの微生物の大きさに近付けている。
【００３０】
ノズルの上には、蛍光顕微鏡（Ｈｇランプ）が設けられている。微生物の光学計測は、蛍光顕微鏡と高感度カラーＣＣＤと画像解析（主に輝度分布）を用いて行なう。微生物は、例えばＳＹＢＲグリーンのような微生物蛍光標識物質で染められている。
【００３１】
本実施の形態にかかる計測装置では、上述のように、サンプル流やキャリア流を送液するために、マイクロシリンジとシリンジポンプが用いられるが、流路の大きさに合わせて、例えば１ｎｌ〜１００μｌ／ｍｌの流量が制御できる装置であれば、他の装置を用いても良い。例えば、マイクロ超音波ポンプやマイクロせんどうポンプでもよい。
【００３２】
シース流及びサンプル流の流量については、上述のような、流路幅１００μｍ、深さ１０μｍの流路では、約１０〜約２００ｎｌ／分の流量が適当である。この場合、サンプル流およびシース流の流速は、約１〜約５００μｍ／秒の間になる。なお、流量が１０ｎｌ／分以下では、拡散の影響で絞込みが困難となり、一方、流量が２００ｎｌ／分以上では微生物の動きが速く、ＣＣＤでは計測しにくい場合が多くなる。
【００３３】
微生物の光学計測には、蛍光顕微鏡と高感度カラーＣＣＤと画像解析を用いたが、これらの組み合わせに限定されるわけではなく、２次元画像と同様なレベルの情報が得られれば１次元計測やスポット計測でもよい。
【００３４】
励起光としてレーザー、レーザーダイオード、又はＬＥＤ光源、受光側として光電子増倍管又はフォトダイオードを組み合わせ、更に任意波長のフィルターを用いても２次元画像のライン計測と同じ計測が可能である。
【００３５】
また、光学計測以外に、例えば熱レンズ顕微鏡や、電極を利用した電気的あるいは電気化学的検出なども利用できる。基本的に、空間分解能がサブミクロンオーダーの検出器であれば使用可能である。しかしながら、ＣＣＤ（ＮＴＳＣフォーマット）を使用した場合、１コマあたり最大３３ミリ秒の露出時間があるため、ミリ秒以下で検出するサイトメーターに比べて感度は高くなる。
【００３６】
また、サイトメーターを用いた場合は、高速化のため、血球の種類や不純物（ゴミ）等は、１次元的な情報（前方、後方散乱光、蛍光など）からのみ分析しているので、形状認識能力が殆ど無いが、本実施の形態のようにＣＣＤを用いた場合は、２次元画像が得られるためサンプルの形状を特定できる。このため、例えば食材や環境サンプルのように成分が一定しないサンプルの分析にＣＣＤ検出は有効である。
【００３７】
本実施の形態で用いる微生物蛍光標識物質の種類は、検出できるものであれば特に限定されない。例えば、ＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲゴールド、ＤＡＰＩなどのＤＮＡ染色剤をはじめとして、フィコエリスリン（ＰＥ）、ＦＩＴＣが挙げられるが、この他にも、エチジウムブロマイド（Ethidium bromide）、プロピジウムアイオダイド（Propidium iodide）、ヘキスト（Hoechst）３３２５８／３３３４２、アクリジンオレンジ（Acridine orange)、クロモマイシン（Chromomycin）、ミトラマイシン（Mithramycin）、オリボマイシン（Olivomycin）、パイロニン（Pyronin）Ｙ、チアゾールオレンジ（Thiazole orange）、ローダミン（Rhodamine）１０１、イソチオシアネート（isothiocyanate）、ＢＣＥＣＦ、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ、Ｃ．ＳＮＡＲＦ−１、Ｃ．ＳＮＡＲＦ−１−ＡＭＡ、エクオリン（Aequorin）、Ｉｎｄｏ−１、Ｉｎｄｏ−１−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ、Ｆｕｒａ−２、Ｆｕｒａ−２−ＡＭ、オキソノール（Oxonol）、ローダミン（Rhodamine）１２３、１０−Ｎ−ノニ−アクリジンオレンジ（nony-acridine orange）、フルオレセイン（Fluorescein）、フルオレセインジアセテート（Fluorescein diacetate）、カルボキシフルオレセイン（Carboxyfluorescein：ＣＦ）、カルボキシフルオレセインジアセテート（Carboxyfluorescein diacetate：ＣＦＤＡ）、カルボキシジクロロフルオレセイン（Carboxydichlorofluorescein：ＣＤＣＦ）、カルボキシジクロロフルオレセインジアセテート（Carboxydichlorofluorescein diacetate：ＣＤＣＦＤＡ）などが挙げられる。
【００３８】
また、例えば、ＣｄＳ、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＳ粒子などの、半導体ナノ粒子などの半導体蛍光物質（ナノクリスタル）でもよい。
【００３９】
更に、微生物を蛍光標識した抗体で特異的に標識できれば、それぞれ特異的な微生物を蛍光標識することが可能である。例えば、抗体にはビオチンを標識しておき、蛍光物質にはアビジンを結合させてもよい。
【００４０】
微生物濃度が低い場合は、０．４５μｍのメンブランフィルターで、サンプル液をろ過濃縮して検出する。例えば１００個／ｍｌ程度の微生物濃度であれば、約１／１００に濃縮して１００個／１０μｌ程度にすれば短時間で検出可能である。
また、特定の微生物と結合できる抗体を蛍光標識して、ターゲット微生物のみ蛍光標識したり、抗体を磁気ビーズに結合させて微生物を集め、その後にシースフローデバイスで検出することも可能である。磁気ビーズは、検出すべき微生物を特異的に結合できるものであればその種類は特に限定されない。ビーズのサイズは１μｍから１０μｍである。
更に、これらの磁気ビーズを蛍光波長の異なる蛍光物質で標識することにより、種々の微生物を同時にカラーで検出することが可能となる。また、用いる抗体は、微生物吸着過程ではポリクローナル抗体でやや広く微生物を吸着し、蛍光標識抗体として特異性が厳しいモノクローナル抗体を使用すれば、選択性が高まる。蛍光磁気ビーズで検出した場合、蛍光検出されるのはビーズの数であるので、微生物数との相関係数を事前に求める必要がある。
【００４１】
次に、本発明の検出微生物が大腸菌である場合を例に、本実施の形態にかかる計測方法について説明する。
【００４２】
まず、マイクロ流路（シース流路及びサンプル流路）への送液は、２５μｌまたは５０μｌ容量のマイクロシリンジを用いて行った。送液スピードは、マイクロシースフローの形成に大変重要な役割を果たすため、正確な送液が確保されるシリンジポンプを用いて制御した。送液スピードは、約１０ｎｌ／分〜約１μｌ／分である。
【００４３】
シースフローは、ほぼ全域の送液スピード及び溶液組成で観察された。サンプル流を細く絞るためにはシース流をサンプル流より速く流せばよい。今回のパターンでは、キャリア流は左右から同じスピードで流れるため、ノズル領域において、サンプル流はシース流に挟まれて流路の真中を通る。
【００４４】
流路の深さは１０μｍに設計した。１０μｍより浅くすれば、蛍光顕微鏡レンズの焦点が合い易くなるが、一方で流速が早くなり、単位時間あたりに解析可能な微生物数が限られてくる。
【００４５】
微生物の検出には、落射型蛍光顕微鏡を用いた。光源はＨｇランプであり、蛍光色素にＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用いる、励起波長は４９０ｎｍ、蛍光波長は５２０ｎｍのフィルターを用いて測定する。
【００４６】
対物レンズは、蛍光専用のタイプを装着し、倍率は１０〜４０倍を用いる。写真撮影装置の部分に高感度カラーＣＣＤ（３０万画素）を装着して、微生物を計測する。観察画像（ＮＴＳＣフォーマット）はＶＴＲに記録するか、もしくは直接、アナログ−デジタルインターフェースを介してパーソナルコンピュータ（ＰＣ）にＡＶＩフォーマットで入力する。光学計測にフォトダイオードや光電子増倍管で行った場合は、それぞれＡＤコンバーターを介してデジタル信号としてＰＣに入力する。
【００４７】
記録したＡＶＩフォーマットの画像は、動画解析ソフトに取り込み、任意ＸＹ座標もしくはＹ軸に平行な２点間の輝度変化を、各ビデオフレームに計測する。計測結果は、各フレームをエクセルのファイルに出力し、このデータに基づいて、微生物の蛍光強度をグラフ化する。
グラフ化した結果は、例えば図５のようになる。図５において、横軸はビデオフレーム数（コマ数）、縦軸は蛍光強度を示す。かかるグラフに示すように、蛍光強度はパルス状のシグナルになる。画像中の輝度変化を解析するには、汎用の解析プログラムを用いる。
【００４８】
以上で説明したように、本実施の形態にかかる計測方法を用いることにより、下水中の大腸菌をリアルタイムで検出できるため、オゾンなどの消毒剤の最適制御が可能になり省エネルギーに役立つと共に、河川でのリアルタイム微生物監視が実現できる。
【００４９】
また、ターゲットの細菌を特異的に標識することにより、食品中のサルモネラ菌や大腸菌などの汚染菌の状況を短時間に把握でき、食品流通における検査待ち時間が短縮され流通効率が高まる。
【００５０】
また、病院での感染症検査での時間が短縮され、早期診断が実現されると共に、診察や手術等のオンサイトでの迅速な細菌検査が可能になる。
【実施例１】
【００５１】
本実施の形態にかかる計測装置を用いて大腸菌の計測を行なう。
大腸菌の計測では、まず、寒天プレートに生育している大腸菌（ＪＭ−１０９）のコロニーを、栄養培地（ＬＢ培地）に植菌して６時間培養し、ＯＤ（optical density）約０．６前後で集菌する。続いて、トリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）で洗浄し、約１,０００,０００個／ｍｌになるように微生物濃度を調整する。
【００５２】
次に、蛍光試薬であるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（１ｍＭ）を大腸菌溶液に、１／２００〜１／１０００の容量比で加え、室温で５分間、静置する。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎは大腸菌細胞内の２本鎖ＤＮＡと結合して蛍光を発するため、大腸菌全体が５２０ｎｍの蛍光を発する。この溶液を５０μｌのマイクロシリンジに充填してシリンジポンプに装着する。かかる溶液がサンプル液となる。
【００５３】
キャリア液は、同じくトリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）を用い、５０μｌのマイクロシリンジに充填してシリンジポンプに装着する。
【００５４】
それぞれのマイクロシリンジは、キャピラリーチューブを介してマイクロフローサイトメータ（マイクロフローセル）に接続され、流速５０ｎｌ／ｍｉｎ（サンプル液）及び１５０ｎｌ／ｍｉｎ（キャリア液）で、各流路に送液する。この結果、シースフローによりキャリア液に挟まれ、微生物サンプル流の幅が数ミクロンまで絞られ、一直線に並んで流動する微生物の蛍光が観察される。
【００５５】
微生物は、蛍光顕微鏡を介してＣＣＤカメラで撮影される。ＣＣＤカメラでの撮影フォーマットがＮＴＳＣフォーマット（３３コマ／秒で取り込み）の場合、観察可能な微生物の最大線速度は、レンズの倍率やＰＣへの取り込み速度などに大きく影響されるが、約５００μｍ／秒、流速に換算すると約１０μｌ／分である。
【００５６】
微生物の最大計測数は、ＣＣＤの毎秒あたりのコマ数を上げたり、ＰＣへの取り込みを早くすれば原理的には制限はない。また、受光器に、ＣＣＤに変えてフォトダイオードを用いれば、ミリ秒以下での計測も可能となり、この場合は１分間に１００００〜１０００００個以上の微生物の計測が可能となる。ただし、フォトダイオードを用いる場合は、受光素子部のスリットをサブミクロン〜ミクロンオーダーで作製するか、もしくはレンズ系を用いて空間分解能をあげる必要がある。
【００５７】
図５は、５秒間で約３０個の微生物を計測した場合の出力結果である。横軸はビデオフレーム数（コマ数）、縦軸は蛍光強度である。図５に示すように、微生物の数は鋭いパルス状のシグナルになる。蛍光強度がばらついているが、これは以下の理由による。
即ち、図５で検出されたピークをビデオ画面で確認すると、まず、蛍光強度が３０以上の場合は大腸菌が２個以上固まって流動した場合である。蛍光強度が１５〜３０の場合は１個で流動、蛍光強度が１５以下は蛍光染色が薄い場合もしくは、焦点がうまく合っていない場合であることが分かった。
【００５８】
従って、全てのピークをカウントし、さらに、２個以上の場合のピークを補正すれば、単位時間もしくは単位容量あたりの菌数を正確に計測できる。この方法で微生物を計測した場合と従来の平板法（寒天プレート法）で計測した場合の検量線を図６に示す。図６は、同じ微生物サンプルを、従来の寒天プレート法と、本実施例の微生物計測方法でそれぞれ計測した結果を示し、横軸は寒天プレート法、縦軸は微生物計測方法の計測結果である。図６からわかるように、両者の計測結果は非常に近似し、本実施例にかかる微生物計測方法において、微生物の正確な計測が可能なことがわかる。
【００５９】
一方、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎの代わりに、プロピジウムアイオダイド（Propidium iodide）で微生物を染色した場合は、細胞は波長６００ｎｍ付近の赤い蛍光を発する。プロピジウムアイオダイドは細菌の細胞膜が損傷している場合に、特に細胞内に侵入しやすくなり、ＤＮＡに結合して蛍光を発する。このため、この試薬は、サンプル内の微生物の生死判定によく用いられる。
即ち、プロピジウムアイオダイドで微生物を染色した際に赤い蛍光が観察されれば、その細胞は損傷している死菌の可能性が高い。本実施例では、蛍光の検出にカラーＣＣＤを用いているため、全菌数をグリーンで、また死んだ菌をレッドで多重計測することができ、リアルタイムで微生物や細菌の生死判定を行うことが可能となる。
【００６０】
このように、本実施例にかかる計測方法では、検体試料中の微生物を短時間でかつ精度よく検出できるとともに、更に以下のような長所を有する。
【００６１】
第１に、前培養を行うことなく、適当な微生物濃度に濃縮または希釈するのみで検体試料から微生物を検出し計測することができる。即ち、環境サンプルや食品サンプルを試料としてそのまま使用でき、試料を予め前培養、選択培養に付して検出すべき目的微生物を増殖させることは不要である。
【００６２】
第２に、サンプルは、極微量(例えば数μｌ）あればよく、その中の微生物数が５０〜１００個以下でも正確に計測できる。
【００６３】
第３に、試料の前処理から微生物の検出までを数分以内で終了することができる。
【００６４】
第４に、カラー検出器を用いることにより、多重計測が可能であり、例えばサンプル中の死菌の割合などを短時間で表示することができる。
【００６５】
第５に、画像により微生物を計測するため、ゴミなどとの区別だけではなく、形状（球菌、かん菌、糸状菌）の分類も可能となる。
【００６６】
第６に、マイクロフローサイトメータの材料に、高分子（例えばＰＤＭＳ）を用いるため、低コスト化、機器のコンパクト化、使い捨てによる微生物検査の安全性が向上する
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本実施の形態にかかる微生物の計測方法の原理を示す概略図である。
【図２】本実施の形態にかかるマイクロフローサイトメータの一部分の上面図である。
【図３】本実施の形態にかかるマイクロフローサイトメータの概略図である。
【図４】本実施の形態にかかる微生物の計測装置の概略図である。
【図５】本実施の形態にかかる計測方法で微生物を計測した結果である。
【図６】本実施の形態にかかる計測方法と、従来の寒天プレート法との比較である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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