(57)【要約】  【課題】遺伝的に肺腺癌、肺扁平上皮癌および頭頸部癌の発症危険率の高い人を早期に発見すること。  【解決手段】  被験者の染色体上の、hRAD17遺伝子、POLD1遺伝子、RASSF1遺伝子、ETL1遺伝子、DUSP6遺伝子、hEXOI遺伝子およびWRN遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子におけるミスセンス１塩基多型を調べ、その遺伝子型を解析することにより、被験者が肺腺癌、肺扁平上皮癌および頭頸部癌をそれぞれ発症する危険率を予測することができる。その結果、遺伝的にこれらの癌の発症危険率の高い人を発見することができる。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の染色体上の遺伝子の、以下の（ａ）〜（ｇ）から選ばれる少なくとも１つのミスセンス１塩基多型を調べることを特徴とする、ヒトにおける肺癌または頭頸部癌の発症危険率を予測する方法。
（ａ）hRAD17遺伝子における、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCTCまたはCGCであるミスセンス１塩基多型
（ｂ）POLD1遺伝子における、該遺伝子がコードする119番目のアミノ酸のコドンがCGCまたはCACであるミスセンス１塩基多型
（ｃ）RASSF1遺伝子における、該遺伝子がコードする133番目のアミノ酸のコドンがGCTまたはTCTであるミスセンス１塩基多型
（ｄ）ETL1遺伝子における、該遺伝子がコードする301番目のアミノ酸のコドンがGCAまたはGTAであるミスセンス１塩基多型
（ｅ）DUSP6遺伝子における、該遺伝子がコードする114番目のアミノ酸のコドンがGTGまたはTTGであるミスセンス１塩基多型
（ｆ）hEXOI遺伝子における、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTまたはCTTであるミスセンス１塩基多型
（ｇ）WRN遺伝子における、該遺伝子がコードする1074番目のアミノ酸のコドンがTTTまたはTTGであるミスセンス１塩基多型
【請求項２】
hEXOI遺伝子において、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCTTであるアリルのホモ型である遺伝子型を有するかどうかを調べることを特徴とする、ヒトにおける肺腺癌または肺扁平上皮癌の発症危険率を予測する方法。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｅ）から選ばれる少なくとも１つの遺伝子型について、被験者が該遺伝子型を有するかどうかを調べることを特徴とする、ヒトにおける肺腺癌の発症危険率を予測する方法。
（ａ）hRAD17遺伝子において、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCGCであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｂ）POLD1遺伝子において、該遺伝子がコードする119番目のアミノ酸のコドンがCACであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｃ）RASSF1遺伝子において、該遺伝子がコードする133番目のアミノ酸のコドンがGCTであるアリルとTCTであるアリルとのヘテロ型である遺伝子型
（ｄ）hEXOI遺伝子において、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCTTであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｅ）WRN遺伝子において、該遺伝子がコードする1074番目のアミノ酸のコドンがTTTであるアリルのホモ型である遺伝子型
【請求項４】
（ａ）〜（ｅ）から選ばれる２つ以上の遺伝子型について同時に、被験者が該遺伝子型を有するかどうかを調べることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｉ）から選ばれる２つ以上の遺伝子型について同時に、被験者が該遺伝子型を有するかどうかを調べることを特徴とする、ヒトにおける肺腺癌の発症危険率を予測する方法。
（ａ）hRAD17遺伝子において、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCGCであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｂ）POLD1遺伝子において、該遺伝子がコードする119番目のアミノ酸のコドンがCACであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｃ）RASSF1遺伝子において、該遺伝子がコードする133番目のアミノ酸のコドンがGCTであるアリルとTCTであるアリルのヘテロ型である遺伝子型
（ｄ）DUSP6遺伝子において、該遺伝子がコードする114番目のアミノ酸のコドンがGTGであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｅ）ATR遺伝子において、該遺伝子がコードする211番目のアミノ酸のコドンがATGであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｆ）TP53遺伝子において、該遺伝子がコードする72番目のアミノ酸のコドンがCGCであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｇ）POLI遺伝子において、該遺伝子がコードする706番目のアミノ酸のコドンがGCAであるアリルを有する遺伝子型
（ｈ）WRN遺伝子において、該遺伝子がコードする1074番目のアミノ酸のコドンがTTTであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｉ）hEXOI遺伝子において、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCTTであるアリルのホモ型である遺伝子型
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれる少なくとも１つの遺伝子型について、被験者が該遺伝子型を有するかどうかを調べることを特徴とする、ヒトにおける肺扁平上皮癌の発症危険率を予測する方法。
（ａ）ETL1遺伝子において、該遺伝子がコードする301番目のアミノ酸のコドンがGTAであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｂ）DUSP6遺伝子において、該遺伝子がコードする114番目のアミノ酸のコドンがTTGであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｃ）hEXOI遺伝子において、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCTTであるアリルのホモ型である遺伝子型
【請求項７】
（ａ）〜（ｃ）から選ばれる２つ以上の遺伝子型について同時に、被験者が該遺伝子型を有するかどうかを調べることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
以下の（ａ）および（ｂ）から選ばれる少なくとも１つの遺伝子型について、被験者が該遺伝子型を有するかどうかを調べることを特徴とする、ヒトにおける頭頸部癌の発症危険率を予測する方法。
（ａ）hRAD17遺伝子において、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCTCであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｂ）hEXOI遺伝子において、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTであるアリルとCTTであるアリルとのヘテロ型である遺伝子型
【請求項９】
（ａ）および（ｂ）の２つの遺伝子型について同時に、被験者が該遺伝子型を有するかどうかを調べることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれる２つ以上の遺伝子型について同時に、被験者が該遺伝子型を有するかどうかを調べることを特徴とする、ヒトにおける頭頸部癌の発症危険率を予測する方法。
（ａ）hRAD17遺伝子において、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCTCであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｂ）hEXOI遺伝子において、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTであるアリルとCTTであるアリルとのヘテロ型である遺伝子型
（ｃ）ATR遺伝子において、該遺伝子がコードする211番目のアミノ酸のコドンがACGであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｄ）DUSP6遺伝子において、該遺伝子がコードする114番目のアミノ酸のコドンがGTGであるアリルのホモ型である遺伝子型
【請求項１１】
被験者の染色体上の遺伝子の、hEXOI遺伝子における、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTまたはCTTであるミスセンス１塩基多型を調べることを特徴とする、ヒトにおける肺腺癌または肺扁平上皮癌の発症危険率を予測するための試薬または該試薬を含むキット。
【請求項１２】
被験者の染色体上の遺伝子の、以下の（ａ）〜（ｅ）から選ばれる少なくとも１つのミスセンス１塩基多型を調べることを特徴とする、ヒトにおける肺腺癌の発症危険率を予測するための試薬または該試薬を含むキット。
（ａ）hRAD17遺伝子における、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCTCまたはCGCであるミスセンス１塩基多型
（ｂ）POLD1遺伝子における、該遺伝子がコードする119番目のアミノ酸のコドンがCGCまたはCACであるミスセンス１塩基多型
（ｃ）RASSF1遺伝子における、該遺伝子がコードする133番目のアミノ酸のコドンがGCTまたはTCTであるミスセンス１塩基多型
（ｄ）hEXOI遺伝子における、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTまたはCTTであるミスセンス１塩基多型
（ｅ）WRN遺伝子における、該遺伝子がコードする1074番目のアミノ酸のコドンがTTTまたはTTGであるミスセンス１塩基多型
【請求項１３】
（ａ）〜（ｅ）から選ばれる２つ以上のミスセンス１塩基多型を同時に調べることを特徴とする、請求項１２に記載の試薬または該試薬を含むキット。
【請求項１４】
被験者の染色体上の遺伝子の、以下の（ａ）〜（ｉ）から選ばれる２つ以上のミスセンス１塩基多型を同時に調べることを特徴とする、ヒトにおける肺腺癌の発症危険率を予測するための試薬または該試薬を含むキット。
（ａ）hRAD17遺伝子における、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCTCまたはCGCであるミスセンス１塩基多型
（ｂ）POLD1遺伝子における、該遺伝子がコードする119番目のアミノ酸のコドンがCGCまたはCACであるミスセンス１塩基多型
（ｃ）RASSF1遺伝子における、該遺伝子がコードする133番目のアミノ酸のコドンがGCTまたはTCTであるミスセンス１塩基多型
（ｄ）DUSP6遺伝子において、該遺伝子がコードする114番目のアミノ酸のコドンがGTGまたはTTGであるミスセンス１塩基多型
（ｅ）ATR遺伝子において、該遺伝子がコードする211番目のアミノ酸のコドンがATGまたはACGであるミスセンス１塩基多型
（ｆ）TP53遺伝子において、該遺伝子がコードする72番目のアミノ酸のコドンがCGCまたはCCCであるミスセンス１塩基多型
（ｇ）POLI遺伝子において、該遺伝子がコードする706番目のアミノ酸のコドンがACAまたはGCAであるミスセンス１塩基多型
（ｈ）WRN遺伝子において、該遺伝子がコードする1074番目のアミノ酸のコドンがTTTまたはTTGであるミスセンス１塩基多型
（ｉ）hEXOI遺伝子において、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTまたはCTTであるミスセンス１塩基多型
【請求項１５】
被験者の染色体上の遺伝子の、以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれる少なくとも１つ以上のミスセンス１塩基多型を調べることを特徴とする、ヒトにおける肺扁平上皮癌の発症危険率を予測するための試薬または該試薬を含むキット。
（ａ）ETL1遺伝子における、該遺伝子がコードする301番目のアミノ酸のコドンがGCAまたはGTAであるミスセンス１塩基多型
（ｂ）DUSP6遺伝子における、該遺伝子がコードする114番目のアミノ酸のコドンがGTGまたはTTGであるミスセンス１塩基多型
（ｃ）hEXOI遺伝子における、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTまたはCTTであるミスセンス１塩基多型
【請求項１６】
（ａ）〜（ｃ）から選ばれる２つ以上のミスセンス１塩基多型を同時に調べることを特徴とする、請求項１５に記載の試薬または該試薬を含むキット。
【請求項１７】
被験者の染色体上の遺伝子の、以下の（ａ）および（ｂ）から選ばれる少なくとも１つ以上のミスセンス１塩基多型を調べることを特徴とする、ヒトにおける頭頸部癌の発症危険率を予測するための試薬または該試薬を含むキット。
（ａ）hRAD17遺伝子における、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCTCまたはCGCであるミスセンス１塩基多型
（ｂ）hEXOI遺伝子における、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTまたはCTTであるミスセンス１塩基多型
【請求項１８】
（ａ）および（ｂ）の２つのミスセンス１塩基多型を同時に調べることを特徴とする、請求項１７に記載の試薬または該試薬を含むキット。
【請求項１９】
被験者の染色体上の遺伝子の、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれる２つ以上のミスセンス１塩基多型を同時に調べることを特徴とする、ヒトにおける肺腺癌の発症危険率を予測するための試薬または該試薬を含むキット。
（ａ）hRAD17遺伝子における、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCTCまたはCGCであるミスセンス１塩基多型
（ｂ）hEXOI遺伝子における、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTまたはCTTであるミスセンス１塩基多型
（ｃ）ATR遺伝子において、該遺伝子がコードする211番目のアミノ酸のコドンがATGまたはACGであるミスセンス１塩基多型
（ｄ）DUSP6遺伝子において、該遺伝子がコードする114番目のアミノ酸のコドンがGTGまたはTTGであるミスセンス１塩基多型
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染色体上の遺伝子のミスセンス１塩基多型を調べることにより肺癌および頭頸部癌の発症危険率を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国の肺癌死亡率は1960年以降男女とも一貫して増加しており、日本人人口10万人当たりの男女別肺癌死亡者数は2000年には1960年のそれぞれ8.0倍、7.2倍となっている（非特許文献１参照）。
肺癌検診は、胸部間接撮影や直接撮影により行われてきたが、その技術的進歩はほぼ限界に達し、早期の病巣の発見は極めて困難と考えられている。肺癌の中でも肺癌全体の８から９割を占める肺腺癌、肺扁平上皮癌は化学療法や放射線療法に感受性が低く外科手術の対象となっており、早期発見が特に重要であるが、Ｘ線撮影像で明らかに陽性となるのはステージIII期以降のものであり、この末期の肺癌患者の５年生存率は10％未満と言われている。近年、低線量高速らせんCT（コンピューター断層装置）による肺癌検診が検討されているが、コストが高く、一般市民に対する検診として普及するにはまだ時間がかかると考えられる。
【０００３】
我が国における肺癌死亡率を低下させるための方策として、肺癌患者の早期発見とともに、肺癌の発症危険率の高い人に対して喫煙などの環境要因の暴露を極力取り除くことによって、肺癌患者そのものの発生を抑止しようという考え方がある。しかし、肺癌の発症危険率の高くなる遺伝的背景については、いまだ系統的研究はない。
頭頸部癌は鎖骨から上の頭部、頸部のうち、脳や脊髄などを除く部位に発生する癌と定義されている。頭頸部癌の診断においては、視診・触診が主体となるが、喉頭癌や口腔癌は早期発見の比率が高いが、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌、上顎洞癌は観察しにくいため発見が遅れ、ステージＩで発見されるケースはわずか数％と言われている。
【０００４】
１塩基多型（single nucleotide polymorphism、以下、SNPと呼ぶ）は疾患の発症や増悪に関連する遺伝子を見つけるために有用であるが、特に、翻訳領域にあってなおかつアミノ酸変化を伴うミスセンスSNP（以下、ms-SNPと表記する）は、その遺伝子から翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列を変化させるので、該タンパク質の機能を変化させたり、遺伝子の発現量の調節異常に繋がる場合がある。したがって、ms-SNPを疾患の発症危険率の予測や薬剤の種類や量の使い分けに利用することができる可能性がある。
【０００５】
ある遺伝子の変異や多型が、癌の発症にどの程度関与するかを検定し、個人の遺伝的要因による発癌の危険率を予測する試みがなされている。
例えば、BRCA1遺伝子の生殖細胞系列突然変異はヒト乳癌および卵巣癌の発症危険度の診断に利用できることが報告されている（特許文献１参照）。
また、DNA修復に関与するX-ray cross-complementing group 1 protein（XRCC1）遺伝子のms-SNPの１つとして、コードするXRCC1タンパクの399番目のアミノ酸がアルギニンまたはグルタミンとなるms-SNPが発見されているが、年齢を合わせた200例の非ヒスパニック系白人の患者−対照研究（非特許文献２参照）によると、該タンパクの399番目のアミノ酸がグルタミンとなる対立遺伝子（以下、アリルと呼ぶ）を２つ持っている、すなわち該アリルをホモで持つ人は肺腺癌の発症危険率が高くなることが推定されうる。
【０００６】
また、癌抑制遺伝子p53（以下、TP53と呼ぶ）の遺伝子産物の72番目のアミノ酸のコドンがプロリンとなるアリルをホモで持つ人は、アルギニンとなるアリルをホモで持つ人と比較して肺腺癌となる危険率が高いと報告されている（非特許文献３参照）。
DNAの複製・修復に関連する遺伝子、癌抑制遺伝子、染色体の再構築に関与する遺伝子など、癌の発症に関与する可能性がある遺伝子である、RAD17ヒトホモログ（以下、hRAD17とよぶ）遺伝子、DNAポリメラーゼδ（以下、POLD1とよぶ）遺伝子、Ras結合ドメインファミリー蛋白質１（Ras association domain family protein 1、以下RASSF1とよぶ）遺伝子、二重特異性ホスファターゼ６（Dual-specificity phosphatase 6、以下DUSP6とよぶ）遺伝子、エキソヌクレアーゼ１ヒトホモログ（以下、hEXO1と略す）遺伝子、ウェルナー症候群遺伝子（以下、WRN遺伝子とよぶ）、ATR（ataxia-telangiectasia and rad3-related）遺伝子、DNAポリメラーゼι（以下POLIとよぶ）遺伝子のms-SNPがSNPデータベース上に報告されているが、これらの遺伝子のms-SNPで肺癌や頭頸部癌の発症危険率との関係が報告されたものはない。
【非特許文献１】「日本医師会雑誌」，２００２年，第１２８巻，第３号，ｐ．３７９−３８１
【非特許文献２】「ミューテーション・リサーチ（Mutation Research）」，（オランダ），２００１年、第４６１巻、第４号，ｐ．２７３−２７８
【非特許文献３】「キャンサー・リサーチ（Cancer Research）」，（米国），２００１年、第６１巻、第２４号，ｐ．８７１８−８７２２
【特許文献１】特表２００２−５０２２２７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
遺伝的に肺癌および頭頸部癌の発症危険率の高い人を早期に発見し、発癌の予防措置や定期的な検査を行わせることにより、早期発見が困難なこれらの癌の死亡率を低下させることができる。そのためには、これらの癌の発症危険率と関係するms-SNPを有する遺伝子とその遺伝子型を同定する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発癌に関係する候補遺伝子のms-SNPを広汎に検索し、選ばれたms-SNPについて、肺腺癌、肺扁平上皮癌および頭頸部癌それぞれの患者群と健常人群とで相関解析を行った結果、hRAD17、POLD1、RASSF1、ETL1、DUSP6、hEXO1、WRN、TP53、ATR、POLIの10種の遺伝子のms-SNPが発症危険率の予測に使用できることを明らかにした。本発明は、以下の（１）〜（１９）に関する。
（１）被験者の染色体上の遺伝子の、以下の（ａ）〜（ｇ）から選ばれる少なくとも１つのミスセンス１塩基多型を調べることを特徴とする、ヒトにおける肺癌または頭頸部癌の発症危険率を予測する方法。
（ａ）hRAD17遺伝子における、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCTCまたはCGCであるミスセンス１塩基多型
（ｂ）POLD1遺伝子における、該遺伝子がコードする119番目のアミノ酸のコドンがCGCまたはCACであるミスセンス１塩基多型
（ｃ）RASSF1遺伝子における、該遺伝子がコードする133番目のアミノ酸のコドンがGCTまたはTCTであるミスセンス１塩基多型
（ｄ）ETL1遺伝子における、該遺伝子がコードする301番目のアミノ酸のコドンがGCAまたはGTAであるミスセンス１塩基多型
（ｅ）DUSP6遺伝子における、該遺伝子がコードする114番目のアミノ酸のコドンがGTGまたはTTGであるミスセンス１塩基多型
（ｆ）hEXOI遺伝子における、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTまたはCTTであるミスセンス１塩基多型
（ｇ）WRN遺伝子における、該遺伝子がコードする1074番目のアミノ酸のコドンがTTTまたはTTGであるミスセンス１塩基多型
（２）hEXOI遺伝子において、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCTTであるアリルのホモ型である遺伝子型を有するかどうかを調べることを特徴とする、ヒトにおける肺腺癌または肺扁平上皮癌の発症危険率を予測する方法。
【０００９】
（３）以下の（ａ）〜（ｅ）から選ばれる少なくとも１つの遺伝子型について、被験者が該遺伝子型を有するかどうかを調べることを特徴とする、ヒトにおける肺腺癌の発症危険率を予測する方法。
（ａ）hRAD17遺伝子において、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCGCであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｂ）POLD1遺伝子において、該遺伝子がコードする119番目のアミノ酸のコドンがCACであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｃ）RASSF1遺伝子において、該遺伝子がコードする133番目のアミノ酸のコドンがGCTであるアリルとTCTであるアリルとのヘテロ型である遺伝子型
（ｄ）hEXOI遺伝子において、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCTTであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｅ）WRN遺伝子において、該遺伝子がコードする1074番目のアミノ酸のコドンがTTTであるアリルのホモ型である遺伝子型
（４）（ａ）〜（ｅ）から選ばれる２つ以上の遺伝子型について同時に、被験者が該遺伝子型を有するかどうかを調べることを特徴とする、（３）に記載の方法。
【００１０】
（５）以下の（ａ）〜（ｉ）から選ばれる２つ以上の遺伝子型について同時に、被験者が該遺伝子型を有するかどうかを調べることを特徴とする、ヒトにおける肺腺癌の発症危険率を予測する方法。
（ａ）hRAD17遺伝子において、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCGCであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｂ）POLD1遺伝子において、該遺伝子がコードする119番目のアミノ酸のコドンがCACであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｃ）RASSF1遺伝子において、該遺伝子がコードする133番目のアミノ酸のコドンがGCTであるアリルとTCTであるアリルのヘテロ型である遺伝子型
（ｄ）DUSP6遺伝子において、該遺伝子がコードする114番目のアミノ酸のコドンがGTGであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｅ）ATR遺伝子において、該遺伝子がコードする211番目のアミノ酸のコドンがATGであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｆ）TP53遺伝子において、該遺伝子がコードする72番目のアミノ酸のコドンがCGCであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｇ）POLI遺伝子において、該遺伝子がコードする706番目のアミノ酸のコドンがGCAであるアリルを有する遺伝子型
（ｈ）WRN遺伝子において、該遺伝子がコードする1074番目のアミノ酸のコドンがTTTであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｉ）hEXOI遺伝子において、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCTTであるアリルのホモ型である遺伝子型
【００１１】
（６）以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれる少なくとも１つの遺伝子型について、被験者が該遺伝子型を有するかどうかを調べることを特徴とする、ヒトにおける肺扁平上皮癌の発症危険率を予測する方法。
（ａ）ETL1遺伝子において、該遺伝子がコードする301番目のアミノ酸のコドンがGTAであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｂ）DUSP6遺伝子において、該遺伝子がコードする114番目のアミノ酸のコドンがTTGであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｃ）hEXOI遺伝子において、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCTTであるアリルのホモ型である遺伝子型
（７）（ａ）〜（ｃ）から選ばれる２つ以上の遺伝子型について同時に、被験者が該遺伝子型を有するかどうかを調べることを特徴とする、（６）に記載の方法。
【００１２】
（８）以下の（ａ）および（ｂ）から選ばれる少なくとも１つの遺伝子型について、被験者が該遺伝子型を有するかどうかを調べることを特徴とする、ヒトにおける頭頸部癌の発症危険率を予測する方法。
（ａ）hRAD17遺伝子において、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCTCであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｂ）hEXOI遺伝子において、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTであるアリルとCTTであるアリルとのヘテロ型である遺伝子型
（９）（ａ）および（ｂ）の２つの遺伝子型について同時に、被験者が該遺伝子型を有するかどうかを調べることを特徴とする、（８）に記載の方法。
（１０）以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれる２つ以上の遺伝子型について同時に、被験者が該遺伝子型を有するかどうかを調べることを特徴とする、ヒトにおける頭頸部癌の発症危険率を予測する方法。
（ａ）hRAD17遺伝子において、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCTCであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｂ）hEXOI遺伝子において、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTであるアリルとCTTであるアリルとのヘテロ型である遺伝子型
（ｃ）ATR遺伝子において、該遺伝子がコードする211番目のアミノ酸のコドンがACGであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｄ）DUSP6遺伝子において、該遺伝子がコードする114番目のアミノ酸のコドンがGTGであるアリルのホモ型である遺伝子型
【００１３】
（１１）被験者の染色体上の遺伝子の、hEXOI遺伝子における、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTまたはCTTであるミスセンス１塩基多型を調べることを特徴とする、ヒトにおける肺腺癌または肺扁平上皮癌の発症危険率を予測するための試薬または該試薬を含むキット。
（１２）被験者の染色体上の遺伝子の、以下の（ａ）〜（ｅ）から選ばれる少なくとも１つのミスセンス１塩基多型を調べることを特徴とする、ヒトにおける肺腺癌の発症危険率を予測するための試薬または該試薬を含むキット。
（ａ）hRAD17遺伝子における、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCTCまたはCGCであるミスセンス１塩基多型
（ｂ）POLD1遺伝子における、該遺伝子がコードする119番目のアミノ酸のコドンがCGCまたはCACであるミスセンス１塩基多型
（ｃ）RASSF1遺伝子における、該遺伝子がコードする133番目のアミノ酸のコドンがGCTまたはTCTであるミスセンス１塩基多型
（ｄ）hEXOI遺伝子における、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTまたはCTTであるミスセンス１塩基多型
（ｅ）WRN遺伝子における、該遺伝子がコードする1074番目のアミノ酸のコドンがTTTまたはTTGであるミスセンス１塩基多型
（１３）（ａ）〜（ｅ）から選ばれる２つ以上のミスセンス１塩基多型を同時に調べることを特徴とする、（１２）に記載の試薬または該試薬を含むキット。
【００１４】
（１４）被験者の染色体上の遺伝子の、以下の（ａ）〜（ｉ）から選ばれる２つ以上のミスセンス１塩基多型を同時に調べることを特徴とする、ヒトにおける肺腺癌の発症危険率を予測するための試薬または該試薬を含むキット。
（ａ）hRAD17遺伝子における、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCTCまたはCGCであるミスセンス１塩基多型
（ｂ）POLD1遺伝子における、該遺伝子がコードする119番目のアミノ酸のコドンがCGCまたはCACであるミスセンス１塩基多型
（ｃ）RASSF1遺伝子における、該遺伝子がコードする133番目のアミノ酸のコドンがGCTまたはTCTであるミスセンス１塩基多型
（ｄ）DUSP6遺伝子において、該遺伝子がコードする114番目のアミノ酸のコドンがGTGまたはTTGであるミスセンス１塩基多型
（ｅ）ATR遺伝子において、該遺伝子がコードする211番目のアミノ酸のコドンがATGまたはACGであるミスセンス１塩基多型
（ｆ）TP53遺伝子において、該遺伝子がコードする72番目のアミノ酸のコドンがCGCまたはCCCであるミスセンス１塩基多型
（ｇ）POLI遺伝子において、該遺伝子がコードする706番目のアミノ酸のコドンがACAまたはGCAであるミスセンス１塩基多型
（ｈ）WRN遺伝子において、該遺伝子がコードする1074番目のアミノ酸のコドンがTTTまたはTTGであるミスセンス１塩基多型
（ｉ）hEXOI遺伝子において、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTまたはCTTであるミスセンス１塩基多型
【００１５】
（１５）被験者の染色体上の遺伝子の、以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれる少なくとも１つ以上のミスセンス１塩基多型を調べることを特徴とする、ヒトにおける肺扁平上皮癌の発症危険率を予測するための試薬または該試薬を含むキット。
（ａ）ETL1遺伝子における、該遺伝子がコードする301番目のアミノ酸のコドンがGCAまたはGTAであるミスセンス１塩基多型
（ｂ）DUSP6遺伝子における、該遺伝子がコードする114番目のアミノ酸のコドンがGTGまたはTTGであるミスセンス１塩基多型
（ｃ）hEXOI遺伝子における、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTまたはCTTであるミスセンス１塩基多型
（１６）（ａ）〜（ｃ）から選ばれる２つ以上のミスセンス１塩基多型を同時に調べることを特徴とする、（１５）に記載の試薬または該試薬を含むキット。
【００１６】
（１７）被験者の染色体上の遺伝子の、以下の（ａ）および（ｂ）から選ばれる少なくとも１つ以上のミスセンス１塩基多型を調べることを特徴とする、ヒトにおける頭頸部癌の発症危険率を予測するための試薬または該試薬を含むキット。
（ａ）hRAD17遺伝子における、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCTCまたはCGCであるミスセンス１塩基多型
（ｂ）hEXOI遺伝子における、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTまたはCTTであるミスセンス１塩基多型
（１８）（ａ）および（ｂ）の２つのミスセンス１塩基多型を同時に調べることを特徴とする、（１７）に記載の試薬または該試薬を含むキット。
（１９）被験者の染色体上の遺伝子の、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれる２つ以上のミスセンス１塩基多型を同時に調べることを特徴とする、ヒトにおける肺腺癌の発症危険率を予測するための試薬または該試薬を含むキット。
（ａ）hRAD17遺伝子における、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCTCまたはCGCであるミスセンス１塩基多型
（ｂ）hEXOI遺伝子における、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTまたはCTTであるミスセンス１塩基多型
（ｃ）ATR遺伝子において、該遺伝子がコードする211番目のアミノ酸のコドンがATGまたはACGであるミスセンス１塩基多型
（ｄ）DUSP6遺伝子において、該遺伝子がコードする114番目のアミノ酸のコドンがGTGまたはTTGであるミスセンス１塩基多型
【発明の効果】
【００１７】
hRAD17、POLD1、RASSF1、ETL1、DUSP6、hEXO1、WRN、ATR、POLIから選ばれる少なくとも１つの遺伝子のms-SNPに関する遺伝子型を調べることにより、肺腺癌、肺扁平上皮癌または頭頸部癌の発症危険率の予測をすることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（１）解析するms-SNPの候補の選択
遺伝子のSNPの情報を集めたデータベースから、DNA修復や発癌と関係する機能を有する遺伝子のSNPを、肺癌または頭部頸部癌の発症危険率と関係するSNPの候補として選択する。SNPとしてはms-SNPが好ましい。一般に利用可能なSNPのデータベースとして、例えば、National Center for Biotechnology Information（NCBI）のSNPデータベースなどがあげられる。
【００１９】
また、SNPの出現頻度、すなわちSNPとして登録されている２つの配列のうちの出現頻度の低い方の配列を有するアリル（マイナーアリル）の出現頻度は、１％以上であることが好ましく、５％以上であることがより好ましい。候補として選択したSNPが、解析サンプル数や出現頻度が明確にされていないSNPの場合は、100以上の検体のDNAについて、下記（２）に記載の方法に基づいて、SNPタイピングを行い、該SNPの出現頻度を確認しておくことが好ましい。
【００２０】
以上のようにして選択される、肺癌または頭頸部癌の発症危険率に関与するms-SNPの候補としては、例えば以下の（i）〜（x）に示すms-SNPをあげることができる。各コドンの配列の直後の括弧内にそのコドンがコードするアミノ酸を示す。
（ａ）DNA修復に関与する遺伝子のms-SNP
（i）hRAD17遺伝子における、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCTC（ロイシン）またはCGC（アルギニン）であるms-SNP（NCBI SNPデータベース番号：rs1045051、マイナーアリルCGCの頻度33％）
（ii）POLD1遺伝子における、該遺伝子がコードする119番目のアミノ酸のコドンがCGC（アルギニン）またはCAC（ヒスチジン）であるms-SNP（NCBI SNPデータベース番号：rs1726801、マイナーアリルCACの頻度21％）
（iii）hEXOI遺伝子における、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCT（プロリン）またはCTT（ロイシン）であるms-SNP（NCBI SNPデータベース番号：rs9350、マイナーアリルCTTの頻度46％）
（iv）WRN遺伝子における、該遺伝子がコードする1074番目のアミノ酸のコドンがTTT（フェニルアラニン）またはTTG（ロイシン）であるms-SNP（NCBI SNPデータベース番号：rs2725362、マイナーアリルTTGの頻度39％）
（v）ATR遺伝子における、該遺伝子がコードする211番目のアミノ酸のコドンがATG（メチオニン）またはACG（スレオニン）であるms-SNP（NCBI SNPデータベース番号：rs2227928、マイナーアリルACGの頻度43％）
（vi）POLI遺伝子における、該遺伝子がコードする706番目のアミノ酸のコドンがACA（スレオニン）またはGCA（アラニン）であるms-SNP（NCBI SNPデータベース番号：rs8305、マイナーアリルGCAの頻度27％）
（ｂ）癌抑制遺伝子のms-SNP
（vii）RASSF1遺伝子における、該遺伝子がコードする133番目のアミノ酸のコドンがGCT（アラニン）またはTCT（セリン）であるms-SNP（NCBI SNPデータベース番号：rs2073498、マイナーアリルTCTの頻度5％）
（viii）DUSP6遺伝子における、該遺伝子がコードする114番目のアミノ酸のコドンがGTG（バリン）またはTTG（ロイシン）であるms-SNP（NCBI SNPデータベース番号：rs2279574、マイナーアリルTTGの頻度47％）
（ix）TP53遺伝子における、該遺伝子がコードする72番目のアミノ酸のコドンがCGC（アルギニン）またはCCC（プロリン）であるms-SNP（NCBI SNPデータベース番号：rs1042522、マイナーアリルCCCの頻度36％）
（ｃ）染色体再構築に関係する遺伝子のms-SNP
（x）ETL1遺伝子における、該遺伝子がコードする301番目のアミノ酸のコドンがGCA（アラニン）またはGTA（バリン）であるms-SNP（NCBI SNPデータベース登録なし、マイナーアリルGTAの頻度22％）
【００２１】
（２）遺伝子型の決定方法
（１）で選択したms-SNPについて、健常人と癌患者それぞれの遺伝子型、すなわち染色体上の２つのアリルがms-SNPのどちらの配列を有しているかを決定する。SNPに関する遺伝子型の決定は、SNPタイピングとも呼ばれる。SNPタイピングに用いる試料はゲノムDNAが好適であるが、ms-SNPの場合にはcDNAであってもよい。ゲノムDNAは癌患者または健常人から採取した血液等の検体から、例えば公知の方法〔Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕によって抽出できる。ゲノムDNA抽出にはDNeasy Tissue Kit〔キアゲン（QIAGEN）社製〕やWizard SV Genomic〔プロメガ（Promega）社製〕のような市販キットを使用することも可能である。cDNAは検体からRNAを抽出し、RNAに含まれるmRNAを逆転写酵素を用いてcDNAに変換することによって得られる。RNAの抽出には例えば公知の方法〔Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕に加え、RNeasy（キアゲン社製）やSV total RNA（プロメガ社製）のような市販キットを使用することも可能である。
【００２２】
本発明において用いることのできるSNPタイピングの方法としては例えば、以下の（ａ）から（ｍ）の方法があげられる。
（ａ）塩基配列決定による方法
試料のDNAの、SNPが存在する領域の塩基配列決定を行うことにより、直接遺伝子型を決定する方法である。塩基配列決定は、例えば、蛍光シーケンサーなどを用いて行うことができる。ゲノムDNAを試料とする場合は、SNPが存在するゲノム領域をPCR法によって増幅し、増幅された断片に対して配列決定を行う。
【００２３】
（ｂ）プライマー伸長反応を用いる方法
試料のDNAを鋳型とし、SNPが存在する位置の直前にアニーリングするように設計したプライマーおよび塩基ごとに異なる標識をしたダイデオキシヌクレオチドを用いた伸長反応を行うことで標識ダイデオキシヌクレオチドを取り込ませて、取り込む標識の違い、またあるいは、標識を取り込むか否かを検出する方法である。例えばSNaPshot法（遺伝子医学, 5, 398-403, 2001）は、プライマー伸長反応によって取り込んだ蛍光標識を蛍光シーケンサーなどを使って検出する方法である。また、プライマー伸長反応によって生成した標識プライマーをMALDI TOF-MS（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrum）で検出する方法もある（遺伝子ビジネスの世紀, 日経BP社, 200-202, 2000）。
【００２４】
（ｃ）DNAチップを利用する方法
各アリルの配列特異的にハイブリダイズできる15〜25塩基のオリゴDNAプローブを、ガラスやシリコンなどの基盤上に格子状に固定化したDNAチップと、蛍光標識した試料のDNAとをハイブリダイズさせ、各プローブ上の蛍光量を測定する方法である。SNPを大量、高速に解析する目的に適している。ゲノムDNAの場合は、ms-SNPの部位を含む適当な長さの領域をPCRにより増幅したDNAを用いる。
【００２５】
（ｄ）プローブを結合したビーズを用いる方法
ビーズ様の粒子に、各アリルの配列特異的にハイブリダイズできるオリゴDNAプローブを結合させ、これに試料のDNAおよびオリゴDNAプローブと相補的な配列を有する標識したオリゴDNAをハイブリダイズさせ、標識したオリゴDNAが結合するか否かをもって所望のSNPを検査する方法も利用可能である（Mutat. Res., 461, 273-278, 2001）。ゲノムDNAの場合は、ms-SNPの部位を含む適当な長さの領域をPCRにより増幅したDNAを用いる。この方法に好適に用いられるビーズとしては、例えばルミネックス・ビーズ〔ルミネックス（Luminex）社製〕があげられる。ルミネックス・ビーズは、ビーズ番号により濃度の異なる２種類の蛍光色素によって標識されており、該ビーズに励起ビームを照射することによって発する該２種類の蛍光強度を、区別して精密に測定することによって、ビーズの種類を容易に区別することができる。したがって、プローブごとに違う番号のビーズを用い、１つのチューブ内でビーズを混合して反応させることにより、各プローブについて同時に測定を行うことができる利点を有する。現在まで最大100種類のビーズを識別しうる。また、該ビーズは表面にはカルボキシル基が表出しており、アミノ標識末端をアミノ化したオリゴDNAプローブを公知の方法でビーズ表面上に固相化できる。
【００２６】
（ｅ）TaqMan PCR法
TaqMan PCR法（遺伝子医学, 5, 398-403, 2001）は、試料のDNAを鋳型としてSNPを含む位置で増幅されたPCR産物に対して各アリルの配列特異的にハイブリダイズできるオリゴDNAプローブをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブが耐熱性ポリメラーゼの有するエキソヌクレアーゼ活性によって破壊される度合いを検出する方法である。該方法の場合、プローブの5'と3'の両方に異なる蛍光標識を付加し、その間で起きるエネルギー転移反応を利用することで検出を容易にしている。
【００２７】
（ｆ）ARMS法
ARMS（amplification refractory mutation system）法は、MASA（mutant allel-specific amplification）法とも呼ばれ、PCRプライマーの3'端または3'近傍がSNPによってミスマッチとなるよう設計されたプライマーを使ってPCRを行った場合に、PCRが起きにくくなることを利用したものである。これをTaqMan法へ応用した方法、すなわちPCR産物の形成の有無をPCRプライマーによる増幅領域に設計され、かつ5'と3'の両方に異なる蛍光標識を付加されたプローブの分解で検出する方法も考案されている（遺伝子医学, 5, 398-403, 2001）。また、該方法においてサイバーグリーンのように２本鎖DNAにインターカレートして蛍光を発する性質の蛍光物質がPCR産物が取り込まれ蛍光を発することを利用して検出を容易にする方法もある。
【００２８】
（ｇ）コンフロントPCR法
コンフロントPCR法はARMS法の変法であり、SNPの一方のアリルによって３´端がミスマッチとなるセンス鎖のプライマーと、もう一方のアリルによって３´端がミスマッチとなるアンチセンス鎖のプライマー、さらにそれぞれの該プライマーに対となって適切な長さのPCR産物を生じるためのプライマーの計４種類を混ぜて、試料のDNAを鋳型として一度にPCRを行い、生じるPCR産物の長さによってどちらのアリルであったかを判定する方法である。
【００２９】
（ｈ）一本鎖DNA高次構造多型法
一本鎖DNA高次構造多型（SSCP;single-strand conformation polymorphism）法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2766-2770 1989）は塩基配列による一本鎖DNAの立体構造の差を利用してSNPタイピングを行う方法である。まず試料のDNAを鋳型とし、放射性物質または蛍光物質で標識されたDNAプライマーによってPCRを行うことでPCR産物を標識しておく。その後、PCR産物を１本鎖化した後にウレアなどの変性剤を含まないゲルで電気泳動を行う。もし、SNPが存在すれば立体構造が異なり違いを検出することが可能である。
【００３０】
（ｉ）ヘテロデュープレックス法
ヘテロデュープレックス法（Genomics, 12, 301-306, 1992）は、正常と変異（多型）のある遺伝子のPCR産物を混合して再アニールさせ、生じたホモとヘテロ２本鎖DNAが示す挙動の変化を変性剤を含まないゲルの電気泳動で解析する手法である。該方法の変法として、ゲル電気泳動の代わりにHPLCを使い、ホモとヘテロ２本鎖DNAのカラムへの保持力の差を用いて検出する方法（DHPLC法：denaturing high performance liquid chromatography法）がある（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 196-200 1996）。
【００３１】
（ｊ）RFLP法
RFLP（restriction fragment length polymorphism）法では、試料のDNAのSNPを含む領域をPCRにより増幅した後、SNPのある部位を制限酵素で切断する方法であり、SNPがあるために切断断片の大きさに違いが生じることを利用した方法である。RFLP法の変法としては、SNPのある部位で目的とするアリルがあった場合に所望の制限酵素が切断できるように設計されたプライマーを用いてPCRを行うことによって増幅断片を得て、その後に該制限酵素によって切断し、切断断片の大きさに違いが生じることを利用する方法も可能である。
【００３２】
（ｋ）ミスマッチ特異的切断を利用する方法
標識した特定のアリルの配列をもつPCR産物またはcRNAプローブに試料DNAのSNPを含む領域のPCR産物をハイブリダイズさせ、その後にミスマッチ特異的に切断する操作を行って、SNPの部位でミスマッチがあった場合に生ずる正常より短くなったプローブを検出する方法である。ミスマッチ特異的切断方法としては、プローブにcRNAを用いてミスマッチ部位をRNaseAで切断する方法（Cell, 53, 549-554, 1988）、化学修飾によってミスマッチ塩基を取り除き鎖切断を行う方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 4397-4401 1988）、大腸菌のミスマッチ修復酵素系を用いて特異的に切断する方法などがある。
【００３３】
同様にミスマッチ特異的切断を使用する方法にインベーダー法があげられる（Clin. Chem., 47, 164-172, 2001）。この方法は、DNAの特異的配列に対し、あらかじめ設計されたプローブが結合し形成される３重鎖構造を認識した場合のみ特異的に切断する酵素であるクリーバーゼによって切断された断片を検出する技術である。
また、宝酒造が開発したICAN（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids）法の変法であるUCAN法（http://www.takara.co.jp/news/2001/10-12/01-i-033.htm）もミスマッチ特異的に切断する操作によって検出する方法である。該方法はDNAの特異的配列に対し、あらかじめ設計されたDNA-RNA-DNAプライマーが結合し形成される２本鎖にRNaseHを作用させることでミスマッチがない場合にはプライマーが切断され3'末端が露出し、DNAポリメラーゼ反応が進行する。これ以降の反応においてはICAN法と同様の原理（http://www.takara.co.jp/news/2000/07-09/00-i-019.htm）により、RNaseHによって5'末端近傍が切り取られそこに新たに結合したプローブが結合することによって鎖置換反応が進行しDNA増幅が起きる。この増幅断片の有無を検出することによってSNPを検出する技術である。
【００３４】
（ｌ）DGGE法およびTGGE法
DGGE（denaturing gradient gel electrophoresis）法では、尿素とホルムアミドなどの変性剤の濃度勾配中を泳動させることによって、変異のために起こる半変性状態での挙動の変化を検出する（Nature, 313, 495-498, 1985）。TGGE（temperature gradient gel electrophoresis）法は温度勾配中を泳動させる方法である。
【００３５】
（ｍ）リガーゼを利用する方法
耐熱性DNAリガーゼを用いて、SNP部位を境界とする２本のオリゴヌクレチドプローブの連結産物が生成するか否かで検出する方法（ligase chain reaction法）もSNPタイピングに好適に用いられる。リガーゼを利用する方法としては、RCA（rolling circle amplification）法もあげられる。SNPの部位で切れ目をもつよう設計された１本鎖のDNAが試料DNAと反応した時に該DNAと完全にマッチした場合にはDNAリガーゼによって環状の１本鎖DNAとなる。この環状１本鎖DNAを鋳型にしてPCRを行い、増幅断片を検出する方法である（Nucleic Acids Res., 26, 5073-5078, 1998）。
【００３６】
（３）発症危険率の予測に使用できるms-SNPの選択
（１）で選択したms-SNPについて、（２）に記載した方法で、数十人以上の健常人およびある特定の癌の患者それぞれの遺伝子型を決定する。本発明においては、患者として肺腺癌、肺扁平上皮癌または頭頸部癌の患者を用いる。癌の発症率は、年齢、性、喫煙歴により影響を受けるので、対照となる健常人群は、患者群と年齢、性比、および喫煙歴の割合がほぼ一致するように標準化した健常人群を用いるのが好ましい。該ms-SNPが、遺伝子Xにおいて配列aまたはbで表される場合、遺伝子型としては（i）aのアリルのホモ型（a/a）、（ii）aのアリルとbのアリルのヘテロ型（a/b）および（iii）bのアリルのホモ型（b/b）があげられる。また、１つのアリルの有無に着目した、（iv）aのアリルを有する遺伝子型（a/aまたはa/b）および（v）bのアリルを有する遺伝子型（b/bまたはa/b）という遺伝子型もあげられる。各遺伝子型の出現頻度が、患者群と対照とする健常人群で差があるかどうかを検定する。差があると検定された遺伝子型がある場合、該遺伝子型は該癌の発症危険率に関与する遺伝子型であり、対応するms-SNPを該癌の発症危険率の予測のために使用できるms-SNPとして選択する。
【００３７】
患者群と対照とする健常人群の各遺伝子型の出現頻度に差があるかどうかを検定するためには、分割表を作成するのが好ましい。ある遺伝子型について検定する場合、まず患者群および健常人群で遺伝子型を調べた結果を（ａ）健常人であるか患者であるか、（２）該遺伝子型であるかそうでないかの２つの要因で分類した２×２の分割表を作成する。ます目には、それぞれの要因の組み合わせに該当する人数が入る。
【００３８】
この分割表をもとに、患者群および健常人群それぞれにおける、該遺伝子型の出現率（該遺伝子型である人数／群の全人数）または出現オッズ（該遺伝子型である人数／該遺伝子型ではない人数）を求める。さらに、該遺伝子型の、健常人群における出現率に対する患者群における出現率の比である尤度比、あるいは健常人群における出現オッズに対する患者群における出現オッズの比であるの比であるオッズ比を求め、検定に用いることができる。
【００３９】
尤度比またはオッズ比が１でない場合は、該遺伝子型の出現頻度に患者群と健常人群で差があることを表しており、尤度比またはオッズ比が１より大きい場合は、該遺伝子型の出現頻度が健常人群と比べて患者群で高く、１より小さい場合は、該遺伝子型の出現頻度が健常人群と比べて患者群で低いことを表す。例えば、尤度比またはオッズ比が1.5以上または0.5以下の遺伝子型をその癌の発症危険率に関与する遺伝子として選択することができ、該遺伝子型に対応するms-SNPをその癌の発症危険率の予測に用いることができる。
【００４０】
遺伝子型の出現頻度の尤度比またはオッズ比は、該遺伝子型を有していない人の発症率（該遺伝子型を有していない人の中で患者である割合）に対する該遺伝子型を有している人の発症率（該遺伝子型を有している人の中で患者である割合）の比、または該遺伝子型を有していない人の発症オッズ（該遺伝子型を有している人の中で健常者に対する患者の比）に対する該遺伝子型を有している人の発症オッズ（該遺伝子型を有している人の中で健常者に対する患者の比）の比と等しくなるので、該遺伝子型を有する人の発症危険率の指標となる。
【００４１】
ただし、尤度比またはオッズ比から選択された遺伝子型の母集団における出現頻度を、（１）で求めたマイナーアリルの頻度から計算したとき、その出現頻度が50％をこえる場合は、該遺伝子型自体は、発症危険率の予測に用いないことが好ましい。例えば、遺伝子Ｘ（マイナーアリルbの頻度30％）において、メジャーアリルaを有する遺伝子型のオッズ比が10という結果がでた場合、aを有する遺伝子型の出現頻度は、(1-0.3)2＋2×(1-0.3)×0.3すなわち91％となる。この場合、アリルaを有する遺伝子型のヒトの発症率または発症オッズが10倍高くなったと考えるより、アリルaを有しない遺伝子型のヒト、すなわちマイナーアリルbのホモ型（b/b）の遺伝子型のヒトの発症率または発症オッズが1/10に抑制されていると考える方が合理的である。したがって、このような場合は、該遺伝子型ではない遺伝子型を発症危険率に関与している遺伝子型として選択する方が好ましい。上記の例でいえば、発症危険率の予測にはアリルaを有する遺伝子型ではなく、アリルbのホモ型の遺伝子型を用いるのが好ましい。
【００４２】
該尤度比またはオッズ比が統計学上有意であるかどうかは、95％信頼区間を求めることにより検定でき、95％信頼区間が１をまたがない場合は有意であるといえる。95％信頼区間は「探索的データ解析ツール／ビュジュアル統計ソフト  StatFlex Ver.5.0  活用マニュアル」（株式会社アーテック）に記載の式に基づいて求めることができる。また、表計算ソフトウェア・エクセル（マイクロソフト社製）等を利用して計算することもできる。尤度比またはオッズ比から発症危険率に関与する遺伝子型を選択する場合、その尤度比またはオッズ比が有意である遺伝子型を選択するのが、より好ましい。
【００４３】
また、この分割表をもとに、χ2検定により、あるいはFisherの直接確率、φ係数やユールの連関係数を求めることにより、この２つの要因に関連があるかないか、すなわち患者群と健常人群における該遺伝子型の出現頻度に差があるかどうかを検定することもできる。χ2検定では、分割表の値から検定統計量χ2値を文献〔「探索的データ解析ツール／ビュジュアル統計ソフト  StatFlex Ver.5.0活用マニュアル」（株式会社アーテック）〕に記載の式から求める。自由度１のχ2分布における求めたχ2値の確率Pを求め、Pが有意水準、例えば0.05よりも小さければ、患者群と健常人群における該遺伝子型の出現頻度に差があるといえる。Fisherの直接確率は、分割表の値から検定のための有意確率を直接求めるもので、得られた確率が、有意水準（例えば0.05）よりも小さければ、患者群と健常人群における該遺伝子型の出現頻度に差があるといえる。また、φ係数やユールの連関係数は、２つの要因の関連の強さを表す統計量で、その絶対値が１に近いほど関連が強い、すなわち患者群と健常人群における該遺伝子型の出現頻度に差があることを表す。
【００４４】
以上のようにして見出される、肺腺癌において、健常人群に対し患者群における出現頻度が有意に高い遺伝子型としては、以下の（ａ）〜（ｄ）の遺伝子型をあげることができる。
（ａ）hRAD17遺伝子において、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCGCであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｂ）POLD1遺伝子において、該遺伝子がコードする119番目のアミノ酸のコドンがCACであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｃ）RASSF1遺伝子において、該遺伝子がコードする133番目のアミノ酸のコドンがGCTであるアリルとTCTであるアリルのヘテロ型である遺伝子型
（ｄ）TP53遺伝子における、該遺伝子がコードする72番目のアミノ酸のコドンがCGCであるアリルのホモ型である遺伝子型
【００４５】
有意とはいえないが、肺腺癌において、健常人群に対し患者群における出現頻度が高く、95％信頼区間が0.87以上であった遺伝子型として、以下の（ｅ）〜（ｇ）の遺伝子型をあげることができる。
（ｅ）DUSP6遺伝子において、該遺伝子がコードする114番目のアミノ酸のコドンがGTGであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｆ）ATR遺伝子において、該遺伝子がコードする211番目のアミノ酸のコドンがATGであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｇ）POLI遺伝子において、該遺伝子がコードする706番目のアミノ酸のコドンがGCAを有する遺伝子型
【００４６】
肺腺癌において、健常人群に対し患者群における出現頻度が有意に低い遺伝子型としては、以下の（ｈ）〜（ｉ）の遺伝子型をあげることができる。
（ｈ）hEXOI遺伝子において、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCTTであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｉ）WRN遺伝子において、該遺伝子がコードする1074番目のアミノ酸のコドンがTTTであるアリルのホモ型である遺伝子型
【００４７】
また、肺扁平上皮癌において、健常人群に対し患者群における出現頻度が有意に高い遺伝子型としては以下の（ａ）および（ｂ）の遺伝子型をあげることができ、
（ａ）ETL1遺伝子において、該遺伝子がコードする301番目のアミノ酸のコドンがGTAであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｂ）DUSP6遺伝子において、該遺伝子がコードする114番目のアミノ酸のコドンがTTGであるアリルのホモ型である遺伝子型
【００４８】
肺扁平上皮癌において、健常人群に対し患者群における出現頻度が有意に低い遺伝子型としては、以下の（ｃ）の遺伝子型をあげることができる。
（ｃ）hEXOI遺伝子において、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCTTであるアリルのホモ型である遺伝子型
【００４９】
さらに頭頸部癌において、健常人群に対し患者群における出現頻度が有意に高い遺伝子型としては以下の（ａ）および（ｂ）の遺伝子型をあげることができる。
（ａ）hRAD17遺伝子において、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCTCであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｂ）hEXOI遺伝子において、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTであるアリルとCTTであるアリルとのヘテロ型である遺伝子型
【００５０】
頭頸部癌において、健常人群に対し患者群における出現頻度が低い遺伝子型であって、有意とはいえないが、95％信頼区間が1.40以下であった遺伝子型として、以下の（ｃ）および（ｄ）の遺伝子型をあげることができる。
（ｃ）ATR遺伝子において、該遺伝子がコードする211番目のアミノ酸のコドンがACGであるアリルのホモ型である遺伝子型
（ｄ）DUSP6遺伝子において、該遺伝子がコードする114番目のアミノ酸のコドンがGTGであるアリルのホモ型である遺伝子型
【００５１】
また、肺腺癌または肺扁平上皮癌のいずれかの肺癌において健常人群に対し患者群における出現頻度が有意に低い遺伝子型としては、hEXOI遺伝子において、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCTTであるアリルのホモ型である遺伝子型をあげることができる。
【００５２】
これらの遺伝子型は、TP53遺伝子の遺伝子型以外は、本発明ではじめて、健常人群に対し患者群における出現頻度に差があることが見出された遺伝子型である。
また、以上から、肺腺癌、肺扁平上皮癌または頭頸部癌の発症危険率の予測に用いられるms-SNPとしては以下の（ａ）〜（ｉ）のms-SNPをあげることができる。肺腺癌の発症危険率の予測には以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）または（ｊ）のms-SNPを、肺扁平上皮癌の発症危険率の予測には以下の（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｈ）のms-SNPを、頭頸部癌の発症危険率の予測には以下の（ａ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｉ）のms-SNPを、それぞれ用いることができる。
（ａ）hRAD17遺伝子における、該遺伝子がコードする546番目のアミノ酸のコドンがCTCまたはCGCであるms-SNP
（ｂ）POLD1遺伝子における、該遺伝子がコードする119番目のアミノ酸のコドンがCGCまたはCACであるms-SNP
（ｃ）RASSF1遺伝子における、該遺伝子がコードする133番目のアミノ酸のコドンがGCTまたはTCTであるms-SNP
（ｄ）ETL1遺伝子における、該遺伝子がコードする301番目のアミノ酸のコドンがGCAまたはGTAであるms-SNP
（ｅ）DUSP6遺伝子における、該遺伝子がコードする114番目のアミノ酸のコドンがGTGまたはTTGであるms-SNP
（ｆ）hEXOI遺伝子における、該遺伝子がコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTまたはCTTであるms-SNP
（ｇ）WRN遺伝子における、該遺伝子がコードする1074番目のアミノ酸のコドンがTTTまたはTTGであるms-SNP
（ｈ）TP53遺伝子における、該遺伝子がコードする72番目のアミノ酸のコドンがCGCまたはCCCであるms-SNP
（ｉ）ATR遺伝子において、該遺伝子がコードする211番目のアミノ酸のコドンがATGまたはACGであるms-SNP
（ｊ）POLI遺伝子において、該遺伝子がコードする706番目のアミノ酸のコドンがACAまたはGCAであるms-SNP
【００５３】
（４）発症危険率の予測方法
発症危険率を予測したい癌を肺腺癌、肺扁平上皮癌および頭頸部癌の中から選ぶ。（３）であげられたms-SNPの中から、選択した癌の発症危険率に関与するms-SNPを１つ以上選ぶ。選んだms-SNPについて、被験者の遺伝子型を（２）に記載した方法で調べる。発症危険率の指標となる数値としては、（３）で求められる選択した癌における該遺伝子型の出現頻度の尤度比またはオッズ比を用いることができる。ただし、母集団における出現頻度が50％をこえる遺伝子型については１とする。また、オッズ比が有意でない遺伝子型についても１としてもよい。複数のms-SNPについて遺伝子型を調べた場合は、それぞれの遺伝子型の数値を掛け合わせる。得られた数値が１より大きいほど、発症危険率が高く、１より小さいほど発症危険率が低いことが予測できる。
【００５４】
（５）肺腺癌、肺扁平上皮癌または頭頸部癌の発症危険率を測定するための試薬
肺腺癌、肺扁平上皮癌または頭頸部癌の発症危険率を測定するための試薬には、上記（２）に記載した遺伝子型の決定方法に使用する各ms-SNPに対応したプライマーやプローブが含まれる。さらに、ms-SNPを含む領域のDNAを検体のゲノムDNAから増幅するためのプライマーセット、およびそれぞれの遺伝子型の決定に用いる反応に必要な酵素や緩衝液等の試薬類を含んでもよい。２種類以上の遺伝子のms-SNPを調べる場合は、１つの操作で、複数のms-SNPを同時にかつ容易に調べられるSNaPshot法、DNAチップを用いる法、ルミネックス・ビーズを用いる方法、TaqMan PCR法などが適している。
【００５５】
例えば、SNaPshot法を用いる試薬には、ms-SNPが存在する位置の5'側の直前にアニーリングするように設計した15〜30塩基のオリゴDNAプライマーを含まれる。さらに、伸長反応に必要な、塩基ごとに異なる標識をしたダイデオキシヌクレオチド、DNAポリメラーゼ、ポリメラーゼ反応用緩衝液を含むのが好ましい。２種類以上の遺伝子のms-SNPを同時に調べる場合には、プライマーの長さをそれぞれのms-SNPで変え、区別できるようにする。
【００５６】
DNAチップを利用する試薬では、ms-SNPの２種類のアリルの配列それぞれに特異的にハイブリダイズするように設計した15〜25塩基のオリゴDNAプローブをシリコンやガラス等の基盤に固定化したDNAチップ、検体DNA増幅のためのプライマーセットが含まれる。オリゴDNAプローブは、２種類のアリルの配列を区別してハイブリダイズできるように、ms-SNPの部位をほぼ中央に有し、15〜25塩基の長さのものが好ましい。
【００５７】
ルミネックス・ビーズを利用する試薬には、DNAチップのプローブと同様に設計したオリゴDNAプローブをそれぞれ固相化した異なる番号のビーズ、プローブと相補的な配列からなるビオチン化オリゴDNA、および検体DNA増幅のためのプライマーセットが含まれる。２種類以上の遺伝子のms-SNPを同時に調べる場合には、全て異なる番号のビーズを用いるようにする。
【００５８】
TaqMan PCR法を用いる試薬には、DNAチップのプローブと同様に設計し、5'と3'のの両方に異なる蛍光標識を付加したオリゴDNAプローブ、および検体DNA増幅のためのプライマーセットが含まれる。
【実施例１】
【００５９】
肺腺癌、肺扁平上皮癌または頭頸部癌の発症危険率に関与するms-SNPの候補の選択
SNPデータベース、ヒトESTデータベースから、DNA修復及び癌化に関する遺伝子のms-SNPを検索した。結果として45遺伝子、82ヵ所のms-SNPを見出した。
これらのうち、18種の遺伝子を選択し、その中からマイナーなアリルの頻度が５％以上で存在することが確定できたms-SNPとして、第１表に示す11遺伝子のms-SNPを選択した。
【００６０】
【表１】
2005245362.tif 000002
【００６１】
ms-SNPのアリル頻度を調べるための検体としては、健常人匿名化検体、インフォームドコンセントを得た癌患者の検体および癌細胞株を用いた。健常人匿名化検体としては、匿名化した健常人から採取した血液から分離した末梢血単核球を用いた。癌患者の検体は、肺癌患者および頭頸部癌患者から岡山大学附属病院において手術により摘出した癌部を含む組織の癌部、非癌部それぞれを用いた。同病院病理部の複数の病理医により、肺癌は肺腺癌、肺扁平上皮癌のどちらかに診断された。頭頸部癌は全て扁平上皮癌であった。
【００６２】
これらの検体から、以下のようにしてゲノムDNAを調製した。まず、検体を10 mM Tris-10 mM EDTA (pH7.5)に懸濁し、SDSを0.1%、プロテイナーゼKを100μg/mlの濃度になるようにそれぞれ添加し、37℃で12時間消化した。反応後の溶液をTrisバッファーで飽和したフェノールで抽出し、水層をクロロフォルム抽出した後、エタノール沈殿を行った。遠心分離により得られたゲノムDNAを、70%エタノールで洗浄後、10 mM Tris-1 mM EDTA (pH 7.5) に溶解した。ゲノムDNAの量は紫外線吸収法で定量した。このゲノムDNAを用いて以下の実施例２〜１２に記載した方法により遺伝子型の解析を行い、アリル頻度を求めた。
【実施例２】
【００６３】
hRAD17遺伝子のms-NSPを利用した癌の発症危険率に関与する遺伝子型の解析
hRAD17遺伝子については、RFLP法を用いて、コードする546番目のアミノ酸のコドンがCTCとCGCのどちらであるかを調べた。すなわち、CGCの場合は、AciIの認識配列（CCGC）となり、AciIで切断されるが、CTCの場合にはAciIの認識配列にはならないことを利用し、この領域を含むDNA断片をゲノムDNAを鋳型として増幅し、AciIでこの箇所が切断されるかどうかを調べた。具体的には以下のように行った。
【００６４】
実施例１と同様にして、肺腺癌患者72例、肺扁平上皮癌患者30例、頭頸部癌患者66例および年齢、性比、並びに喫煙歴を患者集団とマッチさせた健常人（以下、標準化した健常人という）110例の各検体からゲノムDNAを調製し、まず配列番号12と13それぞれの配列からなるプライマー〔インビトロジェン（Invitrogen）社の受託合成品〕を用いてこのゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRは、変性を94℃で30秒間、アニーリングを60℃で60秒間、伸長を72℃で60秒間のサイクルを30回行う条件によって行った。
【００６５】
263bpのPCR増幅産物を制限酵素AciI〔ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）社製〕で37℃、一晩インキュベーションすることによって切断反応を行った。反応後のPCR増幅産物を３％アガロースゲルの電気泳動にかけることによって分離した。AciIによる切断を受けない263bpのバンドが現れた場合には、hRAD17遺伝子がコードする546番目のアミノ酸がロイシン（コドンCTC）であるアリル（以下、ロイシン型アリルとする）と判定し、AciIによって切断された66bpと197bpのバンドが現れた場合には、同アミノ酸がアルギニン（コドンCGC）であるアリル（以下、アルギニン型アリルとする）と判定した。
【００６６】
それぞれの検体の判定に基づいて、肺腺癌、頭頸部癌それぞれの癌患者群と健常人群の２群間において、アルギニン型アリルのホモ型（Arg/Arg）およびロイシン型アリルのホモ型（Leu/Leu）の各遺伝子型のオッズ比および95％信頼区間を表計算ソフトウェア・エクセル（マイクロソフト社製）を用いて計算し、統計学的有意差があるかどうかを検定した。有意差のあった場合は、Fisherの直接確率（P値、両側検定）を求めた。
【００６７】
その結果、第２表に示すように、健常人群に対する肺腺癌患者群におけるアルギニン型アリルのホモ型の遺伝子型のオッズ比は2.47、95％信頼区間は1.00から6.13となり、健常人群と肺腺癌患者群の２群間において統計学的有意差が認められた。よって、hRAD17遺伝子の遺伝子型が、アルギニン型アリルのホモ型であることは、肺腺癌の発症危険率を高める遺伝的要因となることが明らかとなった。
【００６８】
また、健常人群に対する頭頸部癌患者群におけるロイシン型アリルのホモ型の遺伝子型のオッズ比は1.91、95％信頼区間は1.02から3.57となり、健常人群と頭頸部癌患者群の２群間において統計学的有意差が認められた。よって、hRAD17遺伝子の遺伝子型が、ロイシン型アリルのホモ型であることは、頭頸部癌の発症危険率を高める遺伝的要因となることが明らかとなった。
【００６９】
【表２】
2005245362.tif 000003
【実施例３】
【００７０】
POLD1遺伝子のms-SNPを利用した癌の発症危険率に関与する遺伝子型の解析
POLD1については、RFLP法を用いてコードする119番目のアミノ酸のコドンがCGCとCACのどちらであるかを調べた。すなわち、CGCの場合は、SacIIの認識配列（CCGCGG）となり、SacIIで切断されるが、Aの場合にはSacIIの認識配列にはならないことを利用し、この領域を含むDNA断片をゲノムDNAを鋳型として増幅し、SacIIでこの箇所が切断されるかどうかを調べた。具体的には以下のように行った。
【００７１】
実施例１と同様にして、肺腺癌患者72例、肺扁平上皮癌患者72例、頭頸部癌患者66例、標準化した健常人110例の各検体からゲノムDNAを調製し、まず配列番号14と15それぞれの配列からなるプライマー（インビトロジェン社の受託合成品）を用いてこのゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRは、変性を94℃で30秒間、アニーリングを62℃で60秒間、伸長を72℃で60秒間のサイクルを30回行う条件によって行った。
【００７２】
251 bpのPCR増幅産物を制限酵素SacII（ニューイングランド・バイオラブズ社製）で37℃、３時間インキュベーションすることによって切断反応を行った。反応後のPCR増幅産物を３％アガロースゲルの電気泳動にかけることによって分離した。SacIIによって切断された157bpと94bpのバンドが現れた場合には、POLD1遺伝子がコードする119番目のアミノ酸がアルギニン（コドンCGC）であるアリル（以下、アルギニン型アリルとする）と判定し、SacIIによる切断を受けない251bpのバンドが現れた場合には、同アミノ酸がヒスチジン（コドンCAC）であるアリル（以下、ヒスチジン型アリルとする）と判定した。
【００７３】
それぞれの検体の判定に基づいて、肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部癌それぞれの癌患者群と健常人群の２群間において、ヒスチジン型アリルのホモ型（His/His）の遺伝子型のオッズ比および95％信頼区間を表計算ソフトウェア・エクセル（マイクロソフト社製）を用いて計算し、統計学的有意差があるかどうかを検定した。有意差のあった場合は、Fisherの直接確率（P値、両側検定）を求めた。
【００７４】
その結果、第３表に示すように、健常人群に対する肺腺癌患者群におけるヒスチジン型アリルのホモ型の遺伝子型のオッズ比は4.46、95％信頼区間は1.14から17.4となり、健常人群と肺腺癌患者群の２群間において統計学的有意差が認められた。よって、POLD1遺伝子の遺伝子型がヒスチジン型アリルのホモ型であることは、肺腺癌の発症危険率を高める遺伝的要因となることが明らかとなった。
【００７５】
【表３】
2005245362.tif 000004
【実施例４】
【００７６】
RASSF1遺伝子のms- SNPを利用した癌の発症危険率に関与する遺伝子型の解析
RASSF1遺伝子については、RFLP法を用いてコードする133番目のアミノ酸のコドンがGCTとTCTのどちらであるかを調べた。すなわち、GCTの場合は、AluIの認識配列（AGCT）となり、AluIで切断されるが、TCTの場合にはAluIの認識配列にはならないことを利用し、この領域を含むDNA断片をゲノムDNAを鋳型として増幅し、AluIでこの箇所が切断されるかどうかを調べた。具体的には以下のように行った。
【００７７】
実施例１と同様にして、肺腺癌患者71例、肺扁平上皮癌患者30例、頭頸部癌患者66例、標準化した健常人110例の各検体からゲノムDNAを調製し、まず配列番号16と17それぞれの配列からなるプライマー（インビトロジェン社の受託合成品）を用いてこのゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRは、変性を94℃で30秒間、アニーリングを62℃で60秒間、伸長を72℃で60秒間のサイクルを30回行う条件によって行った。
【００７８】
217 bpのPCR増幅産物を制限酵素AluI（ニューイングランド・バイオラブズ社製）で37℃、一晩インキュベーションすることによって切断反応を行った。反応後のPCR増幅産物を３％アガロースゲルの電気泳動にかけることによって分離した。AluIにより切断された、158 bpと59 bpのバンドが現れた場合には、RASSF1遺伝子がコードする133番目のアミノ酸がアラニン（コドンGCT）であるアリル（以下、アラニン型アリルとする）と判定し、AluIによって切断を受けない217 bpのバンドが現れた場合には、同アミノ酸がセリン（コドンTCT）であるアリル（以下、セリン型アリルとする）と判定した。
【００７９】
それぞれの検体の判定に基づいて、肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部癌それぞれの癌患者群と健常人群の２群間において、アラニン型アリルとセリン型アリルのヘテロ型（Ala/Ser）およびアラニン型アリルのホモ型（Ala/Ala）の各遺伝子型のオッズ比および95％信頼区間を表計算ソフトウェア・エクセル（マイクロソフト社製）を用いて計算し、統計学的有意差があるかどうかを検定した。有意差のあった場合は、Fisherの直接確率（P値、両側検定）を求めた。
【００８０】
その結果、第４表に示すように、健常人群に対する肺腺癌群におけるアラニン型アリルとセリン型アリルのヘテロ型の遺伝子型のオッズ比は2.68、95％信頼区間は1.13から6.36となり、健常人群と肺腺癌患者群の２群間において統計学的有意差が認められた。よって、RASSF1遺伝子の遺伝子型がアラニン型アリルとセリン型アリルのヘテロ型であることは、肺腺癌の発症危険率を高める遺伝的要因となることが明らかとなった。
【００８１】
また、健常人群に対する肺腺癌群におけるアラニン型アリルのホモ型の遺伝子型のオッズ比は、0.38、95％信頼区間は0.17-0.88となり、健常人群と肺腺癌患者群の２群間において統計学的有意差が認められたが、該遺伝子型の頻度が90％であるため、該遺伝子型は肺腺癌の発症危険率の予測には用いないことにした。
【００８２】
【表４】
2005245362.tif 000005
【実施例５】
【００８３】
ETL1遺伝子のms-SNPを利用した癌の発症危険率に関与する遺伝子型の解析
ETL1遺伝子については、RFLP法を用いてコードする301番目のアミノ酸のコドンがGCAとGTAのどちらであるかを調べた。すなわち、GCAの場合は、EcoT22Iの認識配列（ATGCAT）となり、EcoT22Iで切断されるが、GTAの場合にはEcoT22Iの認識配列にはならないことを利用し、この領域を含むDNA断片をゲノムDNAを鋳型として増幅し、EcoT22Iでこの箇所が切断されるかどうかを調べた。具体的には以下のように行った。
【００８４】
実施例１と同様にして、肺腺癌患者71例、肺扁平上皮癌患者29例、頭頸部癌患者66例、標準化した健常人110例の各検体からゲノムDNAを調製し、まず配列番号18と19それぞれの配列からなるプライマー（インビトロジェン社の受託合成品）を用いてこのゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRは、変性を94℃で30秒間、アニーリングを56℃で60秒間、伸長を72℃で60秒間のサイクルを30回行う条件によって行った。
【００８５】
324 bpのPCR増幅産物を制限酵素EcoT22I（宝酒造社製）で37℃、一晩インキュベーションすることによって切断反応を行った。反応後のPCR増幅産物を２％アガロースゲルの電気泳動にかけることによって分離した。EcoT22Iにより切断された、120 bpと204 bpのバンドが現れた場合には、ETL1遺伝子がコードする301番目のアミノ酸がアラニン（コドンGCA）であるアリル（以下、アラニン型アリルとする）と判定し、EcoT22Iによって切断を受けない324 bpのバンドが現れた場合には、同アミノ酸がバリン（コドンGTA）であるアリル（以下、バリン型アリルとする）と判定した。
【００８６】
それぞれの検体の判定に基づいて、肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部癌それぞれの癌患者群と健常人群の２群間において、バリン型アリルのホモ型（Val/Val）の遺伝子型のオッズ比および95％信頼区間を表計算ソフトウェア・エクセル（マイクロソフト社製）を用いて計算し、統計学的有意差があるかどうかを検定した。有意差のあった場合は、Fisherの直接確率（P値、両側検定）を求めた。
【００８７】
その結果、第５表に示すように、健常人群に対する肺扁平上皮癌患者群におけるバリン型アリルのホモ型の遺伝子型のオッズ比は3.61、95％信頼区間は1.02から12.8となり、健常人群と肺扁平上皮癌患者群の２群間において統計学的有意差が認められた。よって、ETL1遺伝子の遺伝子型がバリン型アリルのホモ型であることは、肺扁平上皮癌の発症危険率を高める遺伝的要因となることが明らかとなった。
【００８８】
【表５】
2005245362.tif 000006
【実施例６】
【００８９】
DUSP6遺伝子のms-SNPを利用した癌の発症危険率に関与する遺伝子型の解析
DUSP6遺伝子については、RFLP法を用いてコードする114番目のアミノ酸のコドンがGTGとTTGのどちらであるかを調べた。すなわち、GTGの場合は、Bsp1286Iの認識配列（GTGCTC）となり、Bsp1286Iで切断されるが、TTGの場合にはBsp1286Iの認識配列にはならないことを利用し、この領域を含むDNA断片をゲノムDNAを鋳型として増幅し、Bsp1286Iでこの箇所が切断されるかどうかを調べた。具体的には以下のように行った。
【００９０】
実施例１と同様にして、腺癌患者70例、肺扁平上皮癌患者29例、頭頸部癌患者66例、標準化した健常人109例の各検体からゲノムDNAを調製し、このゲノムDNAを鋳型として、まず配列番号20と21それぞれの配列からなるプライマー（インビトロジェン社の受託合成品）を用いてPCRを行った。PCRは、変性を94℃で30秒間、アニーリングを66℃で60秒間、伸長を72℃で60秒間のサイクルを32回行う条件によって行った。
【００９１】
185 bpのPCR増幅産物を制限酵素Bsp1286I（ニュー・イングランド・バイオラブズ社製）で37℃、３時間インキュベーションすることによって切断反応を行った。反応後のPCR増幅産物を３％アガロースゲルの電気泳動にかけることによって分離した。Bsp1286Iにより切断された、51 bpと134 bpのバンドが現れた場合には、DUSP6遺伝子がコードする114番目のアミノ酸がバリン（コドンGTG）であるアリル（以下、バリン型アリルとする）と判定し、Bsp1286Iにより切断を受けない185 bpのバンドが現れた場合には、同アミノ酸がロイシン（コドンTTG）であるアリル（以下、ロイシン型アリルとする）と判定した。
【００９２】
それぞれの検体の判定に基づいて、肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部癌それぞれの癌患者群と健常人群の２群間において、バリン型アリルとロイシン型アリルのヘテロ型（Val/Leu）、バリン型アリルのホモ型（Val/Val）、ロイシン型アリルのホモ型（Leu/Leu）の各遺伝子型のオッズ比および95％信頼区間を表計算ソフトウェア・エクセル（マイクロソフト社製）を用いて計算し、統計学的有意差があるかどうかを検定した。有意差のあった場合は、Fisherの直接確率（P値、両側検定）を求めた。
【００９３】
その結果、第６表に示すように、健常人群に対する肺扁平上皮癌患者群におけるロイシン型アリルのホモ型の遺伝子型のオッズ比は2.47、95％信頼区間は1.05から5.78となり、健常人群と肺扁平上皮癌患者群の２群間において統計学的有意差が認められた。よって、DUSP6遺伝子の遺伝子型がロイシン型アリルのホモ型であることは、肺扁平上皮癌の発症危険率を高める遺伝的要因となることが明らかとなった。また、健常人群に対する肺腺癌患者群におけるバリン型アリルのホモ型の遺伝子型のオッズ比は1.91であり、健常人群と肺腺癌患者群の２群間において差が見られたが、95％信頼区間は0.94から3.86となり１をはさんでいるため、その差は統計学上有意とはいえなかった。
【００９４】
さらに、健常人群に対する頭頸部癌患者群におけるバリン型アリルのホモ型の遺伝子型のオッズ比は0.56であり、健常人群と頭頸部癌患者群の２群間において差が見られ、該遺伝子型を有するヒトは、頭頸部癌を発症する危険率が低いと考えられるが、95％信頼区間は0.22から1.40となり１をはさんでいるため、その差は統計学上有意とはいえなかった。
【００９５】
【表６】
2005245362.tif 000007
【実施例７】
【００９６】
hEXO1遺伝子のms-SNPを利用した癌の発症危険率に関与する遺伝子型の解析
hEXO1遺伝子については、RFLP法を用いてコードする757番目のアミノ酸のコドンがCCTとCTTのどちらであるかを調べた。すなわち、CCTの場合は、MnlIの認識配列（CCTC）となり、MnlIで切断されるが、CTTの場合にはMnlIの認識配列にはならないことを利用し、この領域を含むDNA断片をゲノムDNAを鋳型として増幅し、MnlIでこの箇所が切断されるかどうかを調べた。具体的には以下のように行った。
【００９７】
実施例１と同様にして、肺腺癌患者70例、肺扁平上皮癌患者29例、頭頸部癌患者66例、標準化した健常人110例の各検体からゲノムDNAを調製し、このゲノムDNAを鋳型として、まず配列番号22と23それぞれの配列からなるプライマー（インビトロジェン社の受託合成品）を用いてPCRを行った。PCRは、変性を94℃で30秒間、アニーリングを56℃で30秒間、伸長を72℃で30秒間のサイクルを30回行う条件によって行った。
【００９８】
255 bpのPCR増幅産物を制限酵素MnlI（ニュー・イングランド・バイオラブズ社製）で37℃、一晩インキュベーションすることによって切断反応を行った。反応後のPCR増幅産物を３％アガロースゲルの電気泳動にかけることによって分離した。MnlIにより切断された、153 bpと102 bpのバンドが現れた場合には、hEXO1遺伝子がコードする757番目のアミノ酸がプロリン（コドンCCT）であるアリル（以下、プロリン型アリルとする）と判定し、MnlIによる切断を受けない255 bpのバンドが現れた場合には、同アミノ酸がロイシン（コドンCTT）であるアリル（以下、ロイシン型アリルとする）と判定した。
【００９９】
それぞれの検体の判定に基づいて、肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部癌それぞれの癌患者群と健常人群の２群間において、ロイシン型アリルのホモ型（Leu/Leu）、プロリン型アリルとロイシン型アリルのヘテロ型（Pro/Leu）、プロリン型アリルを有する（＋Pro、ホモ型でもロイシン型アリルとのヘテロ型でもよい）遺伝子型の各遺伝子型のオッズ比および95％信頼区間を表計算ソフトウェア・エクセル（マイクロソフト社製）を用いて計算し、統計学的有意差があるかどうかを検定した。有意差のあった場合は、Fisherの直接確率（P値、両側検定）を求めた。
【０１００】
その結果、第７表に示すように、健常人群に対する頭頸部癌患者群におけるプロリン型アリルとロイシン型アリルのヘテロ型の遺伝子型のオッズ比は2.04、95％信頼区間は1.08から3.83となり、健常人群と頭頸部癌患者群の２群間において統計学的有意差が認められた。よって、hEXO1遺伝子の遺伝子型がプロリン型アリルとロイシン型アリルのヘテロ型であることは、頭頸部癌の発症危険率を高める遺伝的要因となることが明らかとなった。
【０１０１】
また、健常人群に対する肺腺癌患者群におけるロイシン型アリルのホモ型の遺伝子型のオッズ比および肺扁平上皮癌患者群におけるロイシン型アリルのホモ型の遺伝子型のオッズ比は95％信頼区間が１をまたいでおり有意でなかったが、健常人群に対し、肺腺癌患者群と肺肺腺癌患者群を加えた群（以下、肺癌患者群という）におけるロイシン型アリルのホモ型の遺伝子型のオッズ比を計算したところ、オッズ比は0.42、95％信頼区間は0.20から0.89となり、健常人群と肺癌患者群の２群間において統計学的有意差が認められた。一方、健常人に対する肺癌患者群において、ロイシン型アリルのホモ型の遺伝子型でない遺伝子型、すなわちプロリン型アリルを有する遺伝子型のオッズ比は2.36、95％信頼区間は1.12から4.96となり、健常人群と肺癌患者群の２群間において統計学的有意差が認められた。なお、該遺伝子型の健常人群に対する肺腺癌患者におけるオッズ比および健常人群に対する肺扁平上皮癌患者群におけるオッズ比は、それぞれ有意にはならなかった。これらの結果は、ロイシン型アリルのホモ型の遺伝子型を有するヒトは、他の遺伝子型を有するヒトに比べて肺腺癌または肺扁平上皮癌を発症する危険率が低く、また、プロリン型アリルを有する遺伝子型を有するヒトは、他の遺伝子型を有するヒトに比べて肺腺癌または肺扁平上皮癌を発症する危険率が高いことを示している。プロリン型アリルを有する遺伝子型の頻度が79％であることから、プロリン型アリルを有する遺伝子型を有するヒトの肺腺癌または肺扁平上皮癌の発症危険率が上昇すると考えるよりも、ロイシン型アリルのホモ型の遺伝子型を有するヒトの肺腺癌または肺扁平上皮癌の発症危険率が有意に抑制されると考えた方が妥当であると結論した。
【０１０２】
【表７】
2005245362.tif 000008
【実施例８】
【０１０３】
WRN遺伝子のms-SNPを利用した癌の発症危険率に関与する遺伝子型の解析
WRN遺伝子については、コンフロントPCR法を用いてコードする1074番目のアミノ酸のコドンがTTTとTTGのどちらあるかを調べた。具体的には以下のように行った。
実施例１と同様にして、肺腺癌患者71例、肺扁平上皮癌患者28例、頭頸部癌患者64例、標準化した健常人110例の各検体からゲノムDNAを調製し、このゲノムDNAを鋳型として、まず配列番号24、25、26および27それぞれの配列からなるプライマー（インビトロジェン社の受託合成品、以下、それぞれプライマー24、25、26および27とする）を用いてPCRを行った。上記のコドンがTTTの場合は、この配列に対応するプライマー26（フォワード）とプライマー25（リバース）により135bpのDNA断片が増幅され、上記のコドンがTTGの場合は、この配列に対応するプライマー27（リバース）とプライマー24（フォワード）により184bpのDNA断片が増幅される。PCRは、変性を94℃で30秒間、アニーリングを62℃で60秒間、伸長を72℃で60秒間のサイクルを32回行う条件によって行った。
【０１０４】
PCR増幅産物を２％アガロースゲルの電気泳動にかけることによって分離し、135 bpのバンドが現れた場合には、WRN遺伝子がコードする1074番目のアミノ酸がフェニルアラニン（コドンTTT）であるアリル（以下、フェニルアラニン型アリルとする）と判定し、184 bpのバンドが現れた場合には、同アミノ酸がロイシン（コドンTTG）であるアリル（以下、ロイシン型アリルとする）と判定した。
【０１０５】
それぞれの検体の判定に基づいて、肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部癌それぞれの癌患者群と健常人群の２群間において、フェニルアラニン型アリルとロイシン型アリルのヘテロ型（Phe/Leu）、フェニルアラニン型アリルのホモ型（Phe/Phe）、ロイシン型アリルを有する（＋Leu、ホモ型でもフェニルアラニン型アリルとのヘテロ型でもよい）遺伝子型の各遺伝子型のオッズ比および95％信頼区間を表計算ソフトウェア・エクセル（マイクロソフト社製）を用いて計算し、統計学的有意差があるかどうかを検定した。有意差のあった場合は、Fisherの直接確率（P値、両側検定）を求めた。
【０１０６】
その結果、第８表に示すように、健常人群に対する肺腺癌患者群におけるフェニルアラニン型アリルのホモ型の遺伝子型のオッズ比0.40、95％信頼区間は0.20-0.80となり、健常人群と肺腺癌患者群の２群間において統計学的有意差が認められた。一方、健常人群に対する肺腺癌患者群において、フェニルアラニン型アリルのホモ型の遺伝子型でない遺伝子型、すなわちロイシン型アリルを有する遺伝子型のオッズ比は2.51、95％信頼区間は1.25から5.06となり、健常人群と肺腺癌患者群の２群間において統計学的有意差が認められた。これらの結果は、フェニルアラニン型アリルのホモ型の遺伝子型を有するヒトは、他の遺伝子型に比べて肺腺癌を発症する危険率が低く、また、ロイシン型アリルを有する遺伝子型は、他の遺伝子型を有するヒトに比べて肺腺癌を発症する危険率が高いことを示している。ロイシン型アリルを有する遺伝子型の頻度が79％であることから、ロイシン型アリルを有する遺伝子型を有するヒトの肺腺癌の発症危険率が上昇すると考えるよりも、フェニルアラニン型アリルのホモ型の遺伝子型を有するヒトの肺腺癌の発症危険率が有意に抑制されると考えた方が妥当であると結論した。
【０１０７】
【表８】
2005245362.tif 000009
【実施例９】
【０１０８】
ATR遺伝子のms-SNPを利用した癌の発症危険率に関与する遺伝子型の解析
ATR遺伝子については、RFLP法を用いてコードする211番目のアミノ酸のコドンがATGとACGのどちらであるかを調べた。すなわち、ATGの場合は、AseIの認識配列（ATTAAT）となり、AseIで切断されるが、ACGの場合にはAseIの認識配列にはならないことを利用し、この領域を含むDNA断片をゲノムDNAを鋳型として増幅し、AseIでこの箇所が切断されるかどうかを調べた。具体的には以下のように行った。
【０１０９】
実施例１と同様にして、肺腺癌患者70例、肺扁平上皮癌27例、頭頸部癌患者66例、標準化した健常人109例の各検体からゲノムDNAを調製し、このゲノムDNAを鋳型として、まず配列番号28と29それぞれの配列からなるプライマー（インビトロジェン社の受託合成品）を用いてPCRを行った。PCRは、変性を94℃で30秒間、アニーリングを62℃で60秒間、伸長を72℃で60秒間のサイクルを30回行う条件によって行った。
【０１１０】
218 bpのPCR増幅産物を制限酵素Ase I（ニューイングランド・バイオラブズ社製）で37℃、３時間インキュベーションすることによって切断反応を行った。反応後のPCR増幅産物を３％アガロースゲルの電気泳動にかけることによって分離した。AseIによって切断された159 bpと59 bpのバンドが現れた場合には、ATR遺伝子がコードする211番目のアミノ酸がメチオニン（コドンATG）であるアリル（以下、メチオニン型アリルとする）と判定し、AseIによる切断を受けない218 bpのバンドが現れた場合には、同アミノ酸がスレオニン（コドンACG）であるアリル（以下、スレオニン型アリルとする）と判定した。
【０１１１】
それぞれの検体の判定に基づいて、肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部癌それぞれの癌患者群と健常人群の２群間において、メチオニン型アリルのホモ型（Met/Met）の遺伝子型、およびスレオニン型アリルのホモ型（Thr/Thr）の遺伝子型のオッズ比および95％信頼区間を表計算ソフトウェア・エクセル（マイクロソフト社製）を用いて計算し、統計学的有意差があるかどうかを検定した。
【０１１２】
その結果、第９表に示すように、健常人群に対する肺腺癌患者群におけるメチオニン型アリルのホモ型（Met/Met）の遺伝子型のオッズ比は1.67であり、健常人群と肺腺癌患者群の２群間において差がみられたが、95％信頼区間は、0.90から3.08となり、１をはさんでいるため、その差は統計学上有意とはいえなかった。
また、健常人群に対する頭頸部癌患者群におけるスレオニン型アリルのホモ型の遺伝子型のオッズ比は0.49であり、健常人群と頭頸部癌患者群の２群間において差が見られ、該遺伝子型を有するヒトは、頭頸部癌を発症する危険率が低いと考えられるが、95％信頼区間は0.20から1.23となり１をはさんでいるため、その差は統計学上有意とはいえなかった。
【０１１３】
【表９】
2005245362.tif 000010
【実施例１０】
【０１１４】
TP53遺伝子のms-SNPを利用した癌の発症危険率に関与する遺伝子型の解析
TP53遺伝子については、塩基配列決定により、コードする72番目のアミノ酸のコドンがCGCとCCCのどちらであるかを調べた。具体的には以下のように行った。
実施例１と同様にして、肺腺癌患者83例、肺扁平上皮癌患者35例、頭頸部癌患者66例、標準化した健常人108例の各検体からゲノムDNAを調製し、このゲノムDNAを鋳型として、まず配列番号30と31それぞれの配列からなるプライマー（インビトロジェン社の受託合成品）を用いてPCRを行った。PCRは、変性を94℃で30秒間、アニーリングを62℃で60秒間、伸長を72℃で60秒間のサイクルを30回行う条件によって行った。この結果得られた、365 bpのPCR産物（ゲノムDNAの配列から予想される塩基配列を配列番号32に示した）の塩基配列を蛍光シークエンサーを用いて決定した。配列番号32の第144番目の塩基がGであった場合には、TP53遺伝子がコードする72番目のアミノ酸がアルギニン（コドンCGC）であるアリル（以下、アルギニン型アリルとする）と判定し、該塩基がCであった場合には、該アミノ酸がプロリン（コドンCCC）であるアリル（以下、プロリン型アリルとする）と判定した。
【０１１５】
それぞれの検体の判定に基づいて、肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部癌それぞれの癌患者群と健常人群の２群間において、肺腺癌の発症危険率との関係が報告されているアルギニン型アリルのホモ型（Arg/Arg）の遺伝子型のオッズ比および95％信頼区間を表計算ソフトウェア・エクセル（マイクロソフト社製）を用いて計算し、統計学的有意差があるかどうかを検定した。有意差のあった場合は、Fisherの直接確率（P値、両側検定）を求めた。
【０１１６】
その結果、第１０表に示すように、健常人群に対する肺腺癌患者群におけるアルギニン型アリルのホモ型の遺伝子型のオッズ比1.94、95％信頼区間は1.08から3.46となり、健常人群と肺腺癌患者群の２群間において統計学的有意差が認められた。よって、TP53遺伝子の遺伝子型がアルギニン型アリルのホモ型であることは、肺腺癌の発症危険率を高める遺伝的要因となることが明らかとなった。
【０１１７】
【表１０】
2005245362.tif 000011
【実施例１１】
【０１１８】
POLI遺伝子のms-SNPを利用した癌の発症危険率に関与する遺伝子型の解析
POLI遺伝子については、塩基配列決定により、コードする706番目のアミノ酸のコドンがACAとGCAのどちらであるかを調べた。具体的には以下のように行った。
実施例１と同様にして、肺腺癌患者77例、肺扁平上皮癌患者30例、頭頸部癌患者66例、標準化した健常人110例の各検体からゲノムDNAを調製し、このゲノムDNAを鋳型として、まず配列番号33と34それぞれの配列からなるプライマー（インビトロジェン社の受託合成品）を用いてPCRを行った。PCRは、変性を94℃で30秒間、アニーリングを60℃で60秒間、伸長を72℃で60秒間のサイクルを30回行う条件によって行った。この結果得られた、194 bpのPCR産物（ゲノムDNAの配列から予想される塩基配列を配列番号35に示した）の塩基配列を蛍光シークエンサーを用いて決定した。配列番号35の第125番目の塩基がAであった場合には、POLI遺伝子がコードする706番目のアミノ酸がスレオニン（コドンACA）であるアリル（以下、スレオニン型アリルとする）と判定し、該塩基がGであった場合には、該アミノ酸がアラニン（コドンGCA）であるアリル（以下、アラニン型アリルとする）と判定した。
【０１１９】
それぞれの検体の判定に基づいて、肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部癌それぞれの癌患者群と健常人群の２群間において、アラニン型アリルを有する（＋Ala、ホモ型でもスレオニン型アリルとのヘテロ型でもよい）遺伝子型のオッズ比および95％信頼区間を表計算ソフトウェア・エクセル（マイクロソフト社製）を用いて計算し、統計学的有意差があるかどうかを検定した。
【０１２０】
その結果、第１１表に示すように、健常人群に対する肺腺癌患者群におけるアラニン型アリルを有する（+Ala）の遺伝子型のオッズ比は1.57であり、健常人群と肺腺癌患者群の２群間において差がみられたが、その差は95％信頼区間は、0.87から2.82となり、１をはさんでいるため統計学上有意とはいえなかった。
【０１２１】
【表１１】
2005245362.tif 000012
【実施例１２】
【０１２２】
XRCC1遺伝子のms-SNPを利用した癌の発症危険率に関与する遺伝子型の解析
XRCC1遺伝子については、RFLP法を用いてコードする399番目のアミノ酸のコドンがCGGとCAGのどちらであるかを調べた。すなわち、CGGの場合は、MspIの認識配列（CCGG）となり、MspIで切断されるが、CAGの場合にはMspIの認識配列にはならないことを利用し、この領域を含むDNA断片をゲノムDNAを鋳型として増幅し、MspIでこの箇所が切断されるかどうかを調べた。具体的には以下のように行った。
【０１２３】
実施例１と同様にして、肺腺癌患者68例、肺扁平上皮癌25例、頭頸部癌患者61例、標準化した健常人110例の各検体からゲノムDNAを調製し、このゲノムDNAを鋳型として、まず配列番号36と37それぞれの配列からなるプライマー（インビトロジェン社の受託合成品）を用いてPCRを行った。PCRは、変性を94℃で30秒間、アニーリングを64℃で60秒間、伸長を72℃で60秒間のサイクルを30回行う条件によって行った。
【０１２４】
263 bpのPCR増幅産物を制限酵素MspI（ニューイングランド・バイオラブズ社製）で37℃、３時間インキュベーションすることによって切断反応を行った。反応後のPCR増幅産物を２％アガロースゲルの電気泳動にかけることによって分離した。MspIによって切断された157 bpと106 bpのバンドが現れた場合には、XRCC1遺伝子がコードする399番目のアミノ酸がアルギニン（コドンCGG）であるアリル（以下、アルギニン型アリルとする）と判定し、MspIによる切断を受けない263 bpのバンドが現れた場合には、同アミノ酸がグルタミン（コドンCAG）であるアリル（以下、グルタミン型アリルとする）と判定した。
【０１２５】
それぞれの検体の判定に基づいて、肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部癌それぞれの癌患者群と健常人群の２群間において、グルタミン型アリルを有する（＋Gln、ホモ型でもアルギニン型アリルとのヘテロ型でもよい）遺伝子型およびアルギニン型アリルのホモ型（Arg/Arg）の遺伝子型のオッズ比および95％信頼区間を表計算ソフトウェア・エクセル（マイクロソフト社製）を用いて計算し、統計学的有意差があるかどうかを検定した。
【０１２６】
その結果、第１２表に示すように、健常人群に対する頭頸部癌患者群におけるアルギニン型アリルのホモ型（Arg/Arg）の遺伝子型のオッズ比は1.59であり、健常人群と頭頸部癌患者群の２群間において差がみられたが、その差は95％信頼区間は、0.83から3.03となり、１をはさんでいるため統計学上有意とはいえなかった。また、健常人群に対する頭頸部癌患者群におけるグルタミン型アリルを有する（＋Gln）遺伝子型のオッズ比は0.63であり、健常人群と頭頸部癌患者群の２群間において差がみられたが、その差は95％信頼区間は、0.33から1.20となり、１をはさんでいるため統計学上有意とはいえなかった。
【０１２７】
【表１２】
2005245362.tif 000013
【実施例１３】
【０１２８】
複数の遺伝子のms-SNPを利用した肺腺癌の発症危険率の解析
実施例２〜１２の結果に基づき、肺腺癌の発症危険率を高める要因となる遺伝子型として、第１３表に示した９種類の遺伝子の遺伝子型を選んだ。これらの遺伝子型のうち７種類の遺伝子型は、健常人群に対し肺腺癌患者群において1.5以上のオッズ比を示した遺伝子型のうち、オッズ比が統計学上有意であったhRAD17、POLD1、RASSF1およびTP53の各遺伝子の遺伝子型、ならびに統計学上は有意とはいえないが、95％信頼区間が0.87以上であったDUSP6、ATRおよびPOLIの各遺伝子型である。他の２種類の遺伝子型は、発症危険率が有意に抑制されると考えられたhEXO1およびWRN遺伝子型である。これらの遺伝子型９種全てについて、実施例２、３、４、６、７，８，９、１０および１１を通じて遺伝子型解析を行った肺腺癌患者群71例、肺扁平上皮癌患者群30例、頭頸部癌患者群66例および健常人群110例の個々の累積オッズ比を求めた。累積オッズ比は、hRAD17、POLD1、RASSF1、TP53、DUSP6、ATR、POLI、WRNおよびhEXO1の各遺伝子の遺伝子型のオッズ比を掛け合わせた数値であるが、第１３表に示した遺伝子型以外の遺伝子型のオッズ比は１として計算した。
【０１２９】
【表１３】
2005245362.tif 000014
【０１３０】
求めた累積オッズ比を１.3以下、1.3より多く5.8未満、5.8以上の３群に分け、それぞれの群に当てはまる各患者群および健常人群の度数分布を求めた。結果を第１４表に示した。累積オッズ比5.8以上であるのは、肺腺癌患者群では29.6％にのぼるのに対し、肺扁平上皮癌患者群、頭頸部癌患者群および健常人群では、それぞれ6.9％、6.3％および5.5％であり、累積オッズ比が1.3より多く5.8未満であるのは、肺腺癌患者群では60.6％に対し、肺扁平上皮癌患者群、頭頸部癌患者群および健常人群では、それぞれ62.1％、49.2％および50％であった。一方、累積オッズ比１.3以下であるのは、肺腺癌患者群では9.9％に対し、肺扁平上皮癌患者群、頭頸部癌患者群および健常人群では、それぞれ31％、44.4％および44.5％であった。この９種類の遺伝子の遺伝子型については、肺腺癌患者群では、他の患者群および健常人群に比較して累積オッズ比の高い遺伝子型の組み合わせを持つ患者数が多く、逆に累積オッズ比の低い遺伝子型の組み合わせを持つ患者は少ないこと、この傾向は肺腺癌患者に特異的であり、肺扁平上皮癌患者群および頭頸部癌の患者群では、このような傾向はみられないことが分かった。したがって、肺腺癌の発症危険率に関与する複数の遺伝子のms-SNPについて、遺伝子型を解析し、その累積オッズ比を求めることにより、肺腺癌の発症危険率を予測することが可能であった。
【０１３１】
【表１４】
2005245362.tif 000015
【実施例１４】
【０１３２】
複数の遺伝子のms-SNPを利用した肺扁平上皮癌の発症危険率の解析
実施例２〜１２の結果に基づき、肺扁平上皮癌の発症危険率を高める要因となる遺伝子型として、第１５表に示した３種類の遺伝子の遺伝子型を選んだ。これらの遺伝子型は、健常人群に対し肺扁平上皮癌患者群において1.5以上のオッズ比を示した遺伝子型のうち、オッズ比が統計学上有意であったETL1およびDUSP6の各遺伝子の遺伝子型である。他の１種類の遺伝子型は、発症危険率が有意に抑制されると考えられたhEXO1遺伝子の遺伝子型である。これらの遺伝子型３種全てについて、実施例５，６および７を通じて遺伝子型解析を行った肺腺癌患者群71例、肺扁平上皮癌患者群29例、頭頸部癌患者群66例および健常人群110例の個々の累積オッズ比を求めた。累積オッズ比は、ETL1、DUSP6およびhEXO1の各遺伝子の遺伝子型のオッズ比を掛け合わせた数値であるが、第１４表に示した遺伝子型以外の遺伝子型のオッズ比は１として計算した。
【０１３３】
【表１５】
2005245362.tif 000016
【０１３４】
求めた累積オッズ比を0.42以上1.52以下および2.47以上の２群に分け、それぞれの群に当てはまる各患者群および健常人群の度数分布を求めた。結果を第１６表に示した。累積オッズ比2.47以上であるのは、肺扁平上皮癌患者群では51.7％にのぼるのに対し、肺腺癌患者群、頭頸部癌患者群および健常人群では、それぞれ25.4％、30.3％および23.6％であった。一方、累積オッズ比が0.42以上1.52以下であるのは、肺扁平上皮癌患者群では48.3％に対し、肺腺癌患者群、頭頸部癌患者群および健常人群では、それぞれの74.6％、69.7％および76.4％であった。この３種類の遺伝子の遺伝子型については、肺扁平上皮癌患者群では、他の患者群および健常人群に比較して累積オッズ比の高い遺伝子型の組み合わせを持つ患者数が多く、逆に累積オッズ比の低い遺伝子型の組み合わせを持つ患者は少ないこと、この傾向は肺扁平上皮癌患者に特異的であり、肺腺癌患者群および頭頸部癌の患者群では、このような傾向はみられないことが分かった。したがって、肺扁平上皮癌の発症危険率に関与する複数の遺伝子のms-SNPについて、遺伝子型を解析し、その累積オッズ比を求めることにより、肺扁平上皮癌の発症危険率を予測することが可能であった。
【０１３５】
【表１６】
2005245362.tif 000017
【実施例１５】
【０１３６】
複数の遺伝子のms-SNPを利用した頭頸部癌の発症危険率の解析
実施例２〜１２の結果に基づき、頭頸部癌の発症危険率を高める要因となる遺伝子型として、第１７表に示した４種類の遺伝子の遺伝子型を選んだ。これらの遺伝子型は、健常人群に対し頭頸部癌患者群において1.5以上のオッズ比を示した遺伝子型のうち、オッズ比が統計学上有意であったhRAD17およびhEXO1の各遺伝子の遺伝子型である。他の２種類の遺伝子型は、健常人群に対し頭頸部癌患者群における出現頻度が低い遺伝子型であって、有意とはいえないが、頭頸部癌において、95％信頼区間が1.40以下の遺伝子型であったATR遺伝子およびDUSP6遺伝子の遺伝子型であるこれらの遺伝子型４種全てについて、実施例２、６、７および９を通じて遺伝子型解析を行った肺腺癌患者群71例、肺扁平上皮癌患者群30例、頭頸部癌患者群66例および健常人群110例の個々の累積オッズ比を求めた。累積オッズ比は、hRAD17、hEXO1、ATRおよびDUSP6の各遺伝子の遺伝子型のオッズ比を掛け合わせた数値であるが、第１５表に示した遺伝子型以外の遺伝子型のオッズ比は１として計算した。
【０１３７】
【表１７】
2005245362.tif 000018
【０１３８】
求めた累積オッズ比を1.0以下、1.0より多く1.92未満、2.0以上の３群に分け、それぞれの群に当てはまる各患者群および健常人群の度数分布を求めた。結果を第１８表に示した。累積オッズ比2.0以上であるのは、頭頸部癌患者群では53.0％にのぼるのに対し、肺腺癌患者群、肺扁平上皮癌患者群および健常人群では、それぞれ35.2％、48.3％および26.4％であり、累積オッズ比1.0より多く1.92未満であるのは、頭頸部癌患者群では27.3％に対し、肺腺癌患者群、肺扁平上皮癌患者群および健常人群では、それぞれ23.9％、17.2％および28.2％であった。一方、累積オッズ比1.0以下であるのは、頭頸部癌患者群では19.7％に対し、肺腺癌患者群、肺扁平上皮癌患者群および健常人群では、それぞれの40.8％、34.5％および45.5％であった。この４種類の遺伝子の遺伝子型については、頭頸部癌患者群では、肺腺癌患者群、肺扁平上皮癌患者群および健常人群に比較して累積オッズ比の高い遺伝子型の組み合わせを持つ患者数が多く、逆に、累積オッズ比の低い遺伝子型の組み合わせを持つ患者数が少なく、この傾向は頭頸部癌患者に特異的であり、肺扁平上皮癌患者および肺腺癌患者の患者群では、このような傾向はみられないことが分かった。したがって、頭頸部癌の発症危険率に関与する第１７表に示す複数の遺伝子のms-SNPについて、遺伝子型を解析し、その累積オッズ比を求めることにより、頭頸部癌の発症危険率を予測することが可能であった。
【０１３９】
【表１８】
2005245362.tif 000019
【実施例１６】
【０１４０】
ルミネックス・ビーズを用いたhRAD17遺伝子の遺伝子型解析
ルミネックス・ビーズ（ルミネックス社製）を用いて、以下のようにしてhRAD17遺伝子の遺伝子型を調べた。ルミネックス・ビーズは、その表面にはカルボキシル基が表出しており、末端にアミノ基を有するオリゴDNAを共有結合により固相化することができる。また、ビーズ番号によって濃度の異なる２種類の蛍光色素によって標識されているので、該2種類の蛍光の強度を区別して精密に測定することによって、１つの反応チューブ内に混在する異なるビーズ番号のビーズを区別することができる。
【０１４１】
（１）ルミネックス・ビーズへのオリゴDNAの固相化
ビーズ番号111および112のルミネックス・ビーズを10000×ｇで遠心分離し、上澄みを取り除いてペレット状にした。それぞれのビーズに50μLの0.1mol/Lの2[N-モルフォリノ]エタンスルホン酸（以下、MESと略する）バッファー（pH 4.5）を加え、ボルテックスミキサー処理と超音波処理を行いビーズ懸濁液を調製した。配列番号40、配列番号41それぞれの配列からなる5'末端がアミノ化されたオリゴDNA（プロリゴ社の受託合成品、以下、それぞれオリゴDNA40およびオリゴDNA41とよぶ）をそれぞれ、濃度が1 mmol/Lとなるように0.1 mol/LのMESバッファー（pH 4.5）に溶解した溶液を調製した。オリゴDNA40は、hRAD17遺伝子のアルギニン型アリルの配列と相補的な配列を有し、オリゴDNA41は、hRAD17遺伝子のロイシン型アリルの配列と相補的な配列を有する。ビーズ番号111のビーズ懸濁液にはオリゴDNA40の溶液を、ビーズ番号112のビーズ懸濁液にはオリゴDNA41の溶液をそれぞれ1 μLずつを添加した。
【０１４２】
次いで、10 mg/mlの1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（以下、EDCと略す）水溶液を調製し、2.5μLを添加した。暗室で30分間インキュベーションし、オリゴDNAのアミノ基とビーズ表面上のカルボキシ基を共有結合させ、オリゴDNAの固相化を行った。再び10 mg/ml EDC水溶液を調製し、2.5μLを該懸濁液にさらに添加した。1 mLの0.02％ツイーン（Tween）20溶液を該懸濁液に添加した。該懸濁液を10000×ｇで遠心分離し、上澄みを取り除いてビーズをペレット状にした。1mLの0.1％ツイーン20溶液を該ペレットに添加しボルテックスミキサーで懸濁した。再び、該懸濁液を10000×ｇで遠心分離し、上澄みを取り除いてビーズをペレット状にした。100μLの0.1mol/L MESバッファー（pH4.5）を該ペレットに添加し再懸濁した。該懸濁液に含まれるビーズ数を血球計算盤で計算した。使用まで４℃遮光下で保存した。
【０１４３】
（２）遺伝子型の解析
実施例１において調製したゲノムDNAを鋳型として、実施例２と同様の条件によって、配列番号12および13それぞれの配列からなるプライマーによってPCRを行い、PCR産物を得た。コントロールのPCR産物としてゲノムDNAを添加しないで反応を行ったものも調製した。
【０１４４】
1.5×TMAC溶液として、5 mol/Lの塩化テトラメチルアンモニウム（シグマ−アルドリッチ社製）溶液450 mL、20％ラウロイルサルコシンナトリウム（シグマ−アルドリッチ社製）溶液3.75 mL、１mol/Lトリス−塩酸バッファー（pH8.0）37.5 mL、0.5 mol/Lエチレンジアミン４酢酸（以下、EDTAと略す）溶液6.0 mLを混合し、滅菌蒸留水を加えて500mLにしたものを調製した。また、1×TMAC溶液として、5 mol/Lの塩化テトラメチルアンモニウム溶液300 mL、20％ラウロイルサルコシンナトリウム溶液を2.5 mL、１mol/Lトリス−塩酸バッファー（pH8.0）25 mL、0.5 mol/L EDTA溶液4.0 mLを混合し、滅菌蒸留水を加えて500 mLにしたものを調製した。
【０１４５】
（１）で調製したビーズ番号111と112のそれぞれのオリゴDNA固相化ビーズをおよそ50000個ずつを、333 μLの1.5×TMAC溶液に一緒に懸濁した。得られたビーズの懸濁液33μLに、配列番号38と39それぞれの配列からなる5'末端ビオチン化オリゴDNA（プロリゴ社受託合成品、以下、それぞれビオチン化オリゴDNA38および39とよぶ）の10 nmol/L溶液をそれぞれ10μLずつとコントロールまたはゲノムDNAのPCR産物10μLを添加し、ヒートブロック上で96℃、3分間加熱変性処理を行った後、55℃で20分間インキュベーションし、ビーズ上に固相化したオリゴDNAとビオチン化オリゴDNAとをハイブリダイズさせた。ビオチン化オリゴDNA38はオリゴDNA40と、ビオチン化オリゴDNA39はオリゴDNA41とそれぞれ相補的な配列からなりハイブリダイズする。該懸濁液に、R-フィコエリスリン結合ストレプトアビジン（1 mg/mL、モレキュラープローブ社製）1.5μLを滅菌蒸留水150μLに溶解したものを12μL添加し、55℃で５分間インキュベーションし、ビオチン化オリゴDNAと結合させた。R-フィコエリスリンは、ルミネックス・ビーズ自体の標識に利用している２種類の蛍光色素とは励起波長および蛍光波長の異なる蛍光色素である。ルミネックス100システム（ルミネックス社製）を用いて、２種類のビーズを区別して、R-フィコエリスリン由来の蛍光量を測定することにより、それぞれの固相化したオリゴDNAにハイブリダイズしたビオチン化オリゴDNAの量を測定した。２種類のビーズに対するビオチン化オリゴDNAのハイブリダイズのパターンが異なる３種類のゲノムDNA（それぞれゲノムDNA1、2および3とよぶ）についての結果を第１３表に示した。
結果を第１９表に示した。
【０１４６】
【表１９】
2005245362.tif 000020
【０１４７】
測定の結果、コントロール（ゲノムDNAなし）と比較して、ゲノムDNA1由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA38がビーズ番号111のビーズ上のオリゴDNA40（アルギニン型アリルに対応）にハイブリダイズするのを妨げた。このことは、ゲノムDNA１由来のPCR産物はオリゴDNA40とハイブリダイズすることを示し、ゲノムDNA1のhRAD17遺伝子は、アルギニン型アリルを有すると考えられた。一方、ビオチン化オリゴDNA39がビーズ番号112のビーズ上のオリゴDNA41（ロイシン型アリルに対応）にハイブリダイズするのはほとんど妨げなかったことから、ゲノムDNA1のhRAD17遺伝子は、ロイシン型アリルは有しないと考えられた。したがって、ゲノムDNA1のhRAD17遺伝子の遺伝子型は、アルギニン型アリルのホモ型と考えられた。
【０１４８】
逆にゲノムDNA2由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA39がビーズ番号112のビーズ上のオリゴDNA41にハイブリダイズするのを妨げたのに対し、ビオチン化オリゴDNA38がビーズ番号111のビーズ上のオリゴDNA40にハイブリダイズするのは妨げなかったことから、ゲノムDNA2のhRAD17遺伝子は、ロイシン型アリルは有するが、アルギニン型アリルは有さないと考えられた。したがってゲノムDNA2のhRAD17遺伝子の遺伝子型は、ロイシン型アリルのホモ型と考えられた。
【０１４９】
ゲノムDNA3由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA38がビーズ番号111のビーズ上のオリゴDNA40にハイブリダイズすることと、ビオチン化オリゴDNA39がビーズ番号112のビーズ上のオリゴDNA41にハイブリダイズすることの両方を妨げたことから、ゲノムDNA3のhRAD17遺伝子は、アルギニン型アリルとロイシン型アリルの両方を有すると考えられた。したがってゲノムDNA3のhRAD17遺伝子の遺伝子型は、ロイシン型アリルとアルギニン型アリルとのヘテロ型と考えられた。
以上の結果から、ルミネックス・ビーズを用いることによりhRAD17遺伝子の遺伝子型を解析できることがわかった。
【実施例１７】
【０１５０】
ルミネックス・ビーズを用いたPOLD1遺伝子の遺伝子型解析
POLD1遺伝子の遺伝子型を、ルミネックス・ビーズを用いて以下のようにして調べた。
実施例１６（１）と同様の方法によって、ビーズ番号113および114のルミネックス・ビーズに、それぞれ配列番号44および配列番号45それぞれの配列からなる5'末端がアミノ化されたオリゴDNA（プロリゴ社の受託合成品、以下、それぞれオリゴDNA44および45とよぶ）を固相化した。オリゴDNA44はPOLD1遺伝子のアルギニン型アリルと、オリゴDNA45はPOLD1遺伝子のヒスチジン型アリルと、それぞれ相補的な配列を有する。
【０１５１】
実施例１において調製したゲノムDNAを鋳型として、実施例３と同様の条件によって、配列番号14および15それぞれの配列からなるプライマーによってPCRを行い、PCR産物を得た。コントロールのPCR産物としてゲノムDNAを添加しないで反応を行ったものも調製した。
実施例１６（２）に記載した方法に準じて、オリゴDNA固相化ビーズ、配列番号42および43それぞれの配列からなるビオチン化オリゴDNA（プロリゴ社委託合成品、以下、それぞれビオチン化オリゴDNA42および43とよぶ）、コントロールまたはゲノムDNAのPCR産物を混合し、ハイブリダイゼーションを行った後、R-フィコエリスリン結合ストレプトアビジンを反応させた。ビオチン化オリゴDNA42および43はそれぞれ、オリゴDNA44および45と相補的な配列からなりハイブリダイズする。反応後のビーズのR-フィコエリスリンの蛍光量を、ルミネックス100システムを用いて測定することにより、それぞれの固相化したオリゴDNAにハイブリダイズしたビオチン化オリゴDNAの量を測定した。２種類のビーズに対するビオチン化オリゴDNAのハイブリダイズのパターンが異なる３種類のゲノムDNA（それぞれゲノムDNA4、5および6とよぶ）についての結果を第２０表に示した。
【０１５２】
【表２０】
2005245362.tif 000021
【０１５３】
測定の結果、コントロールと比較して、ゲノムDNA4由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA42がビーズ番号113のビーズ上のオリゴDNA44（アルギニン型アリルの配列に対応）にハイブリダイズするのを妨げたのに対し、ビオチン化オリゴDNA43がビーズ番号114のビーズ上のオリゴDNA45（ヒスチジン型アリルの配列に対応）にハイブリダイズするのは妨げなかった。したがってゲノムDNA4のPOLD1遺伝子の遺伝子型は、アルギニン型アリルのホモ型と考えられた。
【０１５４】
逆にゲノムDNA5由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA43がビーズ番号114のビーズ上のオリゴDNA45にハイブリダイズするのを妨げたのに対し、ビオチン化オリゴDNA42がビーズ番号113のビーズ上のオリゴDNA44にハイブリダイズするのは妨げなかった。したがってゲノムDNA5のPOLD1遺伝子の遺伝子型は、ヒスチジン型アリルのホモ型と考えられた。
また、ゲノムDNA6由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA42がビーズ番号113のビーズ上のオリゴDNA44にハイブリダイズすることと、ビオチン化オリゴDNA43がビーズ番号114のビーズ上のオリゴDNA45にハイブリダイズすることの両方を妨げた。したがってゲノムDNA6のPOLD1遺伝子の遺伝子型は、アルギニン型アリルとヒスチジン型アリルとのヘテロ型と考えられた。
以上の結果から、ルミネックス・ビーズを用いることによりPOLD1遺伝子の遺伝子型を解析できることがわかった。
【実施例１８】
【０１５５】
ルミネックス・ビーズを用いたRASSF1遺伝子の遺伝子型解析
RASSF1遺伝子の遺伝子型を、ルミネックス・ビーズを用いて以下のようにして調べた。
実施例１６（１）と同様の方法によって、ビーズ番号115および101のルミネックス・ビーズに、それぞれ配列番号48および配列番号49それぞれの配列からなる5'末端がアミノ化されたオリゴDNA（プロリゴ社の受託合成品、以下、それぞれオリゴDNA48および49とよぶ）を固相化した。オリゴDNA48はRASSF1遺伝子のアラニン型アリルと、オリゴDNA49はRASSF1遺伝子のセリン型アリルと、それぞれ相補的な配列を有する。
【０１５６】
実施例１において調製したゲノムDNAを鋳型として、実施例４と同様の条件によって、配列番号16および17それぞれの配列からなるプライマーによってPCRを行い、PCR産物を得た。コントロールのPCR産物としてゲノムDNAを添加しないで反応を行ったものも調製した。
実施例１６（２）に記載した方法に準じて、オリゴDNA固相化ビーズ、配列番号46および47それぞれの配列からなるビオチン化オリゴDNA（プロリゴ社委託合成品、以下、それぞれビオチン化オリゴDNA46および47とよぶ）、コントロールまたはゲノムDNAのPCR産物を混合し、ハイブリダイゼーションを行った後、R-フィコエリスリン結合ストレプトアビジンを反応させた。ビオチン化オリゴDNA46および47はそれぞれ、オリゴDNA48および49と相補的な配列からなりハイブリダイズする。反応後のビーズのR-フィコエリスリンの蛍光量を、ルミネックス100システムを用いて測定することにより、それぞれの固相化したオリゴDNAにハイブリダイズしたビオチン化オリゴDNAの量を測定した。２種類のビーズに対するビオチン化オリゴDNAのハイブリダイズのパターンが異なる３種類のゲノムDNA（それぞれゲノムDNA7、8および9とよぶ）についての結果を第２１表に示した。
【０１５７】
【表２１】
2005245362.tif 000022
【０１５８】
測定の結果、コントロールと比較して、ゲノムDNA7由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA46がビーズ番号115のビーズ上のオリゴDNA48（アラニン型アリルの配列に対応）にハイブリダイズするのを妨げたのに対し、ビオチン化オリゴDNA47がビーズ番号101のビーズ上のオリゴDNA49（セリン型アリルの配列に対応）にハイブリダイズするのは妨げなかった。したがってゲノムDNA7のRASSF1遺伝子の遺伝子型は、アラニン型アリルのホモ型と考えられた。
【０１５９】
逆にゲノムDNA8由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA47がビーズ番号101のビーズ上のオリゴDNA49にハイブリダイズするのを妨げたのに対し、ビオチン化オリゴDNA46がビーズ番号115のビーズ上のオリゴDNA48にハイブリダイズするのは妨げなかった。したがってゲノムDNA8のRASSF1遺伝子の遺伝子型は、セリン型アリルのホモ型と考えられた。
また、ゲノムDNA9由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA46がビーズ番号115のビーズ上のオリゴDNA48にハイブリダイズすることと、ビオチン化オリゴDNA47がビーズ番号101のビーズ上のオリゴDNA49にハイブリダイズすることの両方を妨げた。したがってゲノムDNA9のRASSF1遺伝子の遺伝子型は、アラニン型アリルとセリン型アリルとのヘテロ型と考えられた。
以上の結果から、ルミネックス・ビーズを用いることによりRASSF1遺伝子の遺伝子型を解析できることがわかった。
【実施例１９】
【０１６０】
ルミネックス・ビーズを用いたETL1遺伝子の遺伝子型解析
ETL1遺伝子の遺伝子型を、ルミネックス・ビーズを用いて以下のようにして調べた。
実施例１６（１）と同様の方法によって、ビーズ番号111および112のルミネックス・ビーズに、それぞれ配列番号52および配列番号53それぞれの配列からなる5'末端がアミノ化されたオリゴDNA（プロリゴ社の受託合成品、以下、それぞれオリゴDNA52および53とよぶ）を固相化した。オリゴDNA52はETL1遺伝子のアラニン型アリルと、オリゴDNA53はETL1遺伝子のバリン型アリルと、それぞれ相補的な配列を有する。
【０１６１】
実施例１において調製したゲノムDNAを鋳型として、実施例５と同様の条件によって、配列番号18および19それぞれの配列からなるプライマーによってPCRを行い、PCR産物を得た。コントロールのPCR産物としてゲノムDNAを添加しないで反応を行ったものも調製した。
実施例１６（２）に記載した方法に準じて、オリゴDNA固相化ビーズ、配列番号50および51それぞれの配列からなるビオチン化オリゴDNA（プロリゴ社委託合成品、以下、それぞれビオチン化オリゴDNA50および51とよぶ）、コントロールまたはゲノムDNAのPCR産物を混合し、ハイブリダイゼーションを行った後、R-フィコエリスリン結合ストレプトアビジンを反応させた。ビオチン化オリゴDNA50はオリゴDNA52と、ビオチン化オリゴDNA51はオリゴDNA53とそれぞれ相補的な配列からなりハイブリダイズする。反応後のビーズのR-フィコエリスリンの蛍光量を、ルミネックス100システムを用いて測定することにより、それぞれの固相化したオリゴDNAにハイブリダイズしたビオチン化オリゴDNAの量を測定した。２種類のビーズに対するビオチン化オリゴDNAのハイブリダイズのパターンが異なる３種類のゲノムDNA（それぞれゲノムDNA10、11および12とよぶ）についての結果を第２２表に示した。
【０１６２】
【表２２】
2005245362.tif 000023
【０１６３】
測定の結果、コントロールと比較して、ゲノムDNA10由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA50がビーズ番号111のビーズ上のオリゴDNA52（アラニン型アリルの配列に対応）にハイブリダイズするのを妨げたのに対し、ビオチン化オリゴDNA51がビーズ番号112のビーズ上のオリゴDNA53（バリン型アリルの配列に対応）にハイブリダイズするのは妨げなかった。したがってゲノムDNA10のETL1遺伝子の遺伝子型は、アラニン型アリルのホモ型と考えられた。
【０１６４】
逆にゲノムDNA11由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA51がビーズ番号112のビーズ上のオリゴDNA53にハイブリダイズするのを妨げたのに対し、ビオチン化オリゴDNA50がビーズ番号111のビーズ上のオリゴDNA52にハイブリダイズするのは妨げなかった。したがってゲノムDNA11のETL1遺伝子の遺伝子型は、バリン型アリルのホモ型と考えられた。
また、ゲノムDNA12由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA50がビーズ番号111のビーズ上のオリゴDNA52にハイブリダイズすることと、ビオチン化オリゴDNA51がビーズ番号112のビーズ上のオリゴDNA53にハイブリダイズすることの両方を妨げた。したがってゲノムDNA12のETL1遺伝子の遺伝子型は、アラニン型アリルとバリン型アリルとのヘテロ型と考えられた。
以上の結果から、ルミネックス・ビーズを用いることによりETL1遺伝子の遺伝子型を解析できることがわかった。
【実施例２０】
【０１６５】
ルミネックス・ビーズを用いたDUSP6遺伝子の遺伝子型解析
DUSP6遺伝子の遺伝子型を、ルミネックス・ビーズを用いて以下のようにして調べた。
実施例１６（１）と同様の方法によって、ビーズ番号113および114のルミネックス・ビーズに、それぞれ配列番号56および配列番号57それぞれの配列からなる5'末端がアミノ化されたオリゴDNA（プロリゴ社の受託合成品、以下、それぞれオリゴDNA56および57とよぶ）を固相化した。オリゴDNA56はDUSP6遺伝子のバリン型アリルと、オリゴDNA57はDUSP6遺伝子のロイシン型アリルと、それぞれ相補的な配列を有する。
【０１６６】
実施例１において調製したゲノムDNAを鋳型として、実施例６と同様の条件によって、配列番号20および21それぞれの配列からなるプライマーによってPCRを行い、PCR産物を得た。コントロールのPCR産物としてゲノムDNAを添加しないで反応を行ったものも調製した。
実施例１６（２）に記載した方法に準じて、オリゴDNA固相化ビーズ、配列番号54および55それぞれの配列からなるビオチン化オリゴDNA（プロリゴ社委託合成品、以下、それぞれビオチン化オリゴDNA54および55とよぶ）、コントロールまたはゲノムDNAのPCR産物を混合し、ハイブリダイゼーションを行った後、R-フィコエリスリン結合ストレプトアビジンを反応させた。ビオチン化オリゴDNA54はオリゴDNA56と、ビオチン化オリゴDNA55はオリゴDNA57とそれぞれ相補的な配列からなりハイブリダイズする。反応後のビーズのR-フィコエリスリンの蛍光量を、ルミネックス100システムを用いて測定することにより、それぞれの固相化したオリゴDNAにハイブリダイズしたビオチン化オリゴDNAの量を測定した。２種類のビーズに対するビオチン化オリゴDNAのハイブリダイズのパターンが異なる３種類のゲノムDNA（それぞれゲノムDNA10、11および12とよぶ）についての結果を第２３表に示した。
【０１６７】
【表２３】
2005245362.tif 000024
【０１６８】
測定の結果、コントロールと比較して、ゲノムDNA13由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA54がビーズ番号113のビーズ上のオリゴDNA56（バリン型アリルの配列に対応）にハイブリダイズするのを妨げたのに対し、ビオチン化オリゴDNA55がビーズ番号114のビーズ上のオリゴDNA57（ロイシン型アリルの配列に対応）にハイブリダイズするのは妨げなかった。したがってゲノムDNA13のDUSP6遺伝子の遺伝子型は、バリン型アリルのホモ型と考えられた。
【０１６９】
逆にゲノムDNA14由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA55がビーズ番号114のビーズ上のオリゴDNA57にハイブリダイズするのを妨げたのに対し、ビオチン化オリゴDNA54がビーズ番号113のビーズ上のオリゴDNA56にハイブリダイズするのは妨げなかった。したがってゲノムDNA14のDUSP6遺伝子の遺伝子型は、ロイシン型アリルのホモ型と考えられた。
また、ゲノムDNA15由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA54がビーズ番号113のビーズ上のオリゴDNA56にハイブリダイズすることと、ビオチン化オリゴDNA55がビーズ番号114のビーズ上のオリゴDNA57にハイブリダイズすることの両方を妨げた。したがってゲノムDNA15のDUSP6遺伝子の遺伝子型は、バリン型アリルとロイシン型アリルとのヘテロ型と考えられた。
以上の結果から、ルミネックス・ビーズを用いることによりDUSP6遺伝子の遺伝子型を解析できることがわかった。
【実施例２１】
【０１７０】
ルミネックス・ビーズを用いたWRN遺伝子の遺伝子型解析
WRN遺伝子の遺伝子型を、ルミネックス・ビーズを用いて以下のようにして調べた。
実施例１６（１）と同様の方法によって、ビーズ番号125および101のルミネックス・ビーズに、それぞれ配列番号60および配列番号61それぞれの配列からなる5'末端がアミノ化されたオリゴDNA（プロリゴ社の受託合成品、以下、それぞれオリゴDNA60および61とよぶ）を固相化した。オリゴDNA60はWRN遺伝子のフェニルアラニン型アリルと、オリゴDNA61はWRN遺伝子のロイシン型アリルと、それぞれ相補的な配列を有する。
【０１７１】
実施例１において調製したゲノムDNAを鋳型として、実施例８と同様の条件によって、配列番号24および25それぞれの配列からなるプライマーによってPCRを行い、PCR産物を得た。コントロールのPCR産物としてゲノムDNAを添加しないで反応を行ったものも調製した。
実施例１６（２）に記載した方法に準じて、オリゴDNA固相化ビーズ、配列番号58および59それぞれの配列からなるビオチン化オリゴDNA（プロリゴ社委託合成品、以下、それぞれビオチン化オリゴDNA58および59とよぶ）、コントロールまたはゲノムDNAのPCR産物を混合し、ハイブリダイゼーションを行った後、R-フィコエリスリン結合ストレプトアビジンを反応させた。ビオチン化オリゴDNA58はオリゴDNA60と、ビオチン化オリゴDNA59はオリゴDNA61とそれぞれ相補的な配列からなりハイブリダイズする。反応後のビーズのR-フィコエリスリンの蛍光量を、ルミネックス100システムを用いて測定することにより、それぞれの固相化したオリゴDNAにハイブリダイズしたビオチン化オリゴDNAの量を測定した。２種類のビーズに対するビオチン化オリゴDNAのハイブリダイズのパターンが異なる３種類のゲノムDNA（それぞれゲノムDNA16、17および18とよぶ）についての結果を第２４表に示した。
【０１７２】
【表２４】
2005245362.tif 000025
【０１７３】
測定の結果、コントロールと比較して、ゲノムDNA16由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA58がビーズ番号125のビーズ上のオリゴDNA60（フェニルアラニン型アリルの配列に対応）にハイブリダイズするのを妨げたのに対し、ビオチン化オリゴDNA59がビーズ番号101のビーズ上のオリゴDNA61（ロイシン型アリルの配列に対応）にハイブリダイズするのは妨げなかった。したがってゲノムDNA16のWRN遺伝子の遺伝子型は、フェニルアラニン型アリルのホモ型と考えられた。
【０１７４】
逆にゲノムDNA17由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA59がビーズ番号101のビーズ上のオリゴDNA61にハイブリダイズするのを妨げたのに対し、ビオチン化オリゴDNA58がビーズ番号125のビーズ上のオリゴDNA60にハイブリダイズするのは妨げなかった。したがってゲノムDNA17のWRN遺伝子の遺伝子型は、ロイシン型アリルのホモ型と考えられた。
また、ゲノムDNA18由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA58がビーズ番号125のビーズ上のオリゴDNA60にハイブリダイズすることと、ビオチン化オリゴDNA59がビーズ番号101のビーズ上のオリゴDNA61にハイブリダイズすることの両方を妨げた。したがってゲノムDNA18のWRN遺伝子の遺伝子型は、フェニルアラニン型アリルとロイシン型アリルとのヘテロ型と考えられた。
以上の結果から、ルミネックス・ビーズを用いることによりWRN遺伝子の遺伝子型を解析できることがわかった。
【実施例２２】
【０１７５】
ルミネックス・ビーズを用いたhEXO1遺伝子の遺伝子型解析
hEXO1遺伝子の遺伝子型を、ルミネックス・ビーズを用いて以下のようにして調べた。
実施例１６（１）と同様の方法によって、ビーズ番号111および112のルミネックス・ビーズに、それぞれ配列番号64および配列番号65それぞれの配列からなる5'末端がアミノ化されたオリゴDNA（プロリゴ社の受託合成品、以下、それぞれオリゴDNA64および65とよぶ）を固相化した。オリゴDNA64はhEXO1遺伝子のプロリン型アリルと、オリゴDNA65はhEXO1遺伝子のロイシン型アリルと、それぞれ相補的な配列を有する。
【０１７６】
実施例１において調製したゲノムDNAを鋳型として、実施例７と同様の条件によって、配列番号22および23それぞれの配列からなるプライマーによってPCRを行い、PCR産物を得た。コントロールのPCR産物としてゲノムDNAを添加しないで反応を行ったものも調製した。
実施例１６（２）に記載した方法に準じて、オリゴDNA固相化ビーズ、配列番号62および63それぞれの配列からなるビオチン化オリゴDNA（プロリゴ社委託合成品、以下、それぞれビオチン化オリゴDNA62および63とよぶ）、コントロールまたはゲノムDNAのPCR産物を混合し、ハイブリダイゼーションを行った後、R-フィコエリスリン結合ストレプトアビジンを反応させた。ビオチン化オリゴDNA62はオリゴDNA64と、ビオチン化オリゴDNA63はオリゴDNA65とそれぞれ相補的な配列からなりハイブリダイズする。反応後のビーズのR-フィコエリスリンの蛍光量を、ルミネックス100システムを用いて測定することにより、それぞれの固相化したオリゴDNAにハイブリダイズしたビオチン化オリゴDNAの量を測定した。２種類のビーズに対するビオチン化オリゴDNAのハイブリダイズのパターンが異なる３種類のゲノムDNA（それぞれゲノムDNA19、20および21とよぶ）についての結果を第２５表に示した。
【０１７７】
【表２５】
2005245362.tif 000026
【０１７８】
測定の結果、コントロールと比較して、ゲノムDNA19由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA62がビーズ番号111のビーズ上のオリゴDNA64（プロリン型アリルの配列に対応）にハイブリダイズするのを妨げたのに対し、ビオチン化オリゴDNA63がビーズ番号112のビーズ上のオリゴDNA65（ロイシン型アリルの配列に対応）にハイブリダイズするのは妨げなかった。したがってゲノムDNA19のhEXO1遺伝子の遺伝子型は、プロリン型アリルのホモ型と考えられた。
【０１７９】
逆にゲノムDNA20由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA63がビーズ番号112のビーズ上のオリゴDNA65にハイブリダイズするのを妨げたのに対し、ビオチン化オリゴDNA62がビーズ番号111のビーズ上のオリゴDNA64にハイブリダイズするのは妨げなかった。したがってゲノムDNA20のhEXO1遺伝子の遺伝子型は、ロイシン型アリルのホモ型と考えられた。
また、ゲノムDNA21由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA62がビーズ番号111のビーズ上のオリゴDNA64にハイブリダイズすることと、ビオチン化オリゴDNA63がビーズ番号112のビーズ上のオリゴDNA65にハイブリダイズすることの両方を妨げた。したがってゲノムDNA21のhEXO1遺伝子の遺伝子型は、プロリン型アリルとロイシン型アリルとのヘテロ型と考えられた。
以上の結果から、ルミネックス・ビーズを用いることによりhEXO1遺伝子の遺伝子型を解析できることがわかった。
【実施例２３】
【０１８０】
ルミネックス・ビーズを用いたATR遺伝子の遺伝子型解析
ATR遺伝子の遺伝子型を、ルミネックス・ビーズを用いて以下のようにして調べた。
実施例１６（１）と同様の方法によって、ビーズ番号113および114のルミネックス・ビーズに、それぞれ配列番号68および配列番号69それぞれの配列からなる5'末端がアミノ化されたオリゴDNA（プロリゴ社の受託合成品、以下、それぞれオリゴDNA68および69とよぶ）を固相化した。オリゴDNA68はATR遺伝子のメチオニン型アリルと、オリゴDNA69はATR遺伝子のスレオニン型アリルと、それぞれ相補的な配列を有する。
【０１８１】
実施例１において調製したゲノムDNAを鋳型として、実施例９と同様の条件によって、配列番号28および29それぞれの配列からなるプライマーによってPCRを行い、PCR産物を得た。コントロールのPCR産物としてゲノムDNAを添加しないで反応を行ったものも調製した。
実施例１６（２）に記載した方法に準じて、オリゴDNA固相化ビーズ、配列番号66および67それぞれの配列からなるビオチン化オリゴDNA（プロリゴ社委託合成品、以下、それぞれビオチン化オリゴDNA66および67とよぶ）、コントロールまたはゲノムDNAのPCR産物を混合し、ハイブリダイゼーションを行った後、R-フィコエリスリン結合ストレプトアビジンを反応させた。ビオチン化オリゴDNA66はオリゴDNA68と、ビオチン化オリゴDNA67はオリゴDNA69とそれぞれ相補的な配列からなりハイブリダイズする。反応後のビーズのR-フィコエリスリンの蛍光量を、ルミネックス100システムを用いて測定することにより、それぞれの固相化したオリゴDNAにハイブリダイズしたビオチン化オリゴDNAの量を測定した。２種類のビーズに対するビオチン化オリゴDNAのハイブリダイズのパターンが異なる３種類のゲノムDNA（それぞれゲノムDNA22、23および24とよぶ）についての結果を第２６表に示した。
【０１８２】
【表２６】
2005245362.tif 000027
【０１８３】
測定の結果、コントロールと比較して、ゲノムDNA22由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA66がビーズ番号113のビーズ上のオリゴDNA68（メチオニン型アリルの配列に対応）にハイブリダイズするのを妨げたのに対し、ビオチン化オリゴDNA67がビーズ番号114のビーズ上のオリゴDNA69（スレオニン型アリルの配列に対応）にハイブリダイズするのは妨げなかった。したがってゲノムDNA22のATR遺伝子の遺伝子型は、メチオニン型アリルのホモ型と考えられた。
【０１８４】
逆にゲノムDNA23由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA67がビーズ番号114のビーズ上のオリゴDNA69にハイブリダイズするのを妨げたのに対し、ビオチン化オリゴDNA66がビーズ番号113のビーズ上のオリゴDNA68にハイブリダイズするのは妨げなかった。したがってゲノムDNA23のATR遺伝子の遺伝子型は、スレオニン型アリルのホモ型と考えられた。
また、ゲノムDNA24由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA66がビーズ番号113のビーズ上のオリゴDNA68にハイブリダイズすることと、ビオチン化オリゴDNA67がビーズ番号112のビーズ上のオリゴDNA69にハイブリダイズすることの両方を妨げた。したがってゲノムDNA24のATR遺伝子の遺伝子型は、メチオニン型アリルとスレオニン型アリルとのヘテロ型と考えられた。
以上の結果から、ルミネックス・ビーズを用いることによりATR遺伝子の遺伝子型を解析できることがわかった。
【実施例２４】
【０１８５】
ルミネックス・ビーズを用いたTP53遺伝子の遺伝子型解析
TP53遺伝子の遺伝子型を、ルミネックス・ビーズを用いて以下のようにして調べた。
実施例１６（１）と同様の方法によって、ビーズ番号115および125のルミネックス・ビーズに、それぞれ配列番号72および配列番号73それぞれの配列からなる5'末端がアミノ化されたオリゴDNA（プロリゴ社の受託合成品、以下、それぞれオリゴDNA72および71とよぶ）を固相化した。オリゴDNA70はTP53遺伝子のアルギニン型アリルと、オリゴDNA71はTP53遺伝子のプロリン型アリルと、それぞれ相補的な配列を有する。
【０１８６】
実施例１において調製したゲノムDNAを鋳型として、実施例９と同様の条件によって、配列番号30および31それぞれの配列からなるプライマーによってPCRを行い、PCR産物を得た。コントロールのPCR産物としてゲノムDNAを添加しないで反応を行ったものも調製した。
実施例１６（２）に記載した方法に準じて、オリゴDNA固相化ビーズ、配列番号70および71それぞれの配列からなるビオチン化オリゴDNA（プロリゴ社委託合成品、以下、それぞれビオチン化オリゴDNA70および71とよぶ）、コントロールまたはゲノムDNAのPCR産物を混合し、ハイブリダイゼーションを行った後、R-フィコエリスリン結合ストレプトアビジンを反応させた。ビオチン化オリゴDNA70はオリゴDNA72と、ビオチン化オリゴDNA71はオリゴDNA73とそれぞれ相補的な配列からなりハイブリダイズする。反応後のビーズのR-フィコエリスリンの蛍光量を、ルミネックス100システムを用いて測定することにより、それぞれの固相化したオリゴDNAにハイブリダイズしたビオチン化オリゴDNAの量を測定した。２種類のビーズに対するビオチン化オリゴDNAのハイブリダイズのパターンが異なる３種類のゲノムDNA（それぞれゲノムDNA25、26および27とよぶ）についての結果を第２７表に示した。
【０１８７】
【表２７】
2005245362.tif 000028
【０１８８】
測定の結果、コントロールと比較して、ゲノムDNA25由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA70がビーズ番号115のビーズ上のオリゴDNA72（アルギニン型アリルの配列に対応）にハイブリダイズするのを妨げたのに対し、ビオチン化オリゴDNA71がビーズ番号125のビーズ上のオリゴDNA73（プロリン型アリルの配列に対応）にハイブリダイズするのは妨げなかった。したがってゲノムDNA25のTP53遺伝子の遺伝子型は、アルギニン型アリルのホモ型と考えられた。
【０１８９】
逆にゲノムDNA26由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA71がビーズ番号125のビーズ上のオリゴDNA73にハイブリダイズするのを妨げたのに対し、ビオチン化オリゴDNA70がビーズ番号115のビーズ上のオリゴDNA72にハイブリダイズするのはほとんど妨げなかった。したがってゲノムDNA26のTP53遺伝子の遺伝子型は、プロリン型アリルのホモ型と考えられた。
【０１９０】
また、ゲノムDNA27由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA70がビーズ番号115のビーズ上のオリゴDNA72にハイブリダイズすることと、ビオチン化オリゴDNA71がビーズ番号125のビーズ上のオリゴDNA73にハイブリダイズすることの両方を妨げた。したがってゲノムDNA27のTP53遺伝子の遺伝子型は、アルギニン型アリルとプロリン型アリルとのヘテロ型と考えられた。
以上の結果はから、ルミネックス・ビーズを用いることによりTP53遺伝子の遺伝子型を解析できることがわかった。
【実施例２５】
【０１９１】
ルミネックス・ビーズを用いたPOLI遺伝子の遺伝子型解析
POLI遺伝子の遺伝子型を、ルミネックス・ビーズを用いて以下のようにして調べた。
実施例１６（１）と同様の方法によって、ビーズ番号111および112のルミネックス・ビーズに、それぞれ配列番号76および配列番号77それぞれの配列からなる5'末端がアミノ化されたオリゴDNA（プロリゴ社の受託合成品、以下、それぞれオリゴDNA76および77とよぶ）を固相化した。オリゴDNA76はPOLI遺伝子のスレオニン型アリルと、オリゴDNA77はPOLI遺伝子のアラニン型アリルと、それぞれ相補的な配列を有する。
【０１９２】
実施例１において調製したゲノムDNAを鋳型として、実施例１１と同様の条件によって、配列番号33および34それぞれの配列からなるプライマーによってPCRを行い、PCR産物を得た。コントロールのPCR産物としてゲノムDNAを添加しないで反応を行ったものも調製した。
実施例１６（２）に記載した方法に準じて、オリゴDNA固相化ビーズ、配列番号74および75それぞれの配列からなるビオチン化オリゴDNA（プロリゴ社委託合成品、以下、それぞれビオチン化オリゴDNA74および75とよぶ）と、コントロールまたはゲノムDNAのPCR産物を混合し、ハイブリダイゼーションを行った後、R-フィコエリスリン結合ストレプトアビジンを反応させた。ビオチン化オリゴDNA74はオリゴDNA76と、ビオチン化オリゴDNA75はオリゴDNA77とそれぞれ相補的な配列からなりハイブリダイズする。反応後のビーズのR-フィコエリスリンの蛍光量を、ルミネックス100システムを用いて測定することにより、それぞれの固相化したオリゴDNAにハイブリダイズしたビオチン化オリゴDNAの量を測定した。２種類のビーズに対するビオチン化オリゴDNAのハイブリダイズのパターンが異なる３種類のゲノムDNA（それぞれゲノムDNA28、29および30とよぶ）についての結果を第２８表に示した。
【０１９３】
【表２８】
2005245362.tif 000029
【０１９４】
測定の結果、コントロールと比較して、ゲノムDNA28由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA74がビーズ番号111のビーズ上のオリゴDNA76（スレオニン型アリルの配列に対応）にハイブリダイズするのを妨げたのに対し、ビオチン化オリゴDNA75がビーズ番号112のビーズ上のオリゴDNA77（アラニン型アリルの配列に対応）にハイブリダイズするのは妨げなかった。したがってゲノムDNA28のPOLI遺伝子の遺伝子型は、スレオニン型アリルのホモ型と考えられた。
【０１９５】
逆にゲノムDNA29由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA75がビーズ番号112のビーズ上のオリゴDNA77にハイブリダイズするのを妨げたのに対し、ビオチン化オリゴDNA74がビーズ番号111のビーズ上のオリゴDNA76にハイブリダイズするのはほとんど妨げなかった。したがってゲノムDNA29のPOLI遺伝子の遺伝子型は、アラニン型アリルのホモ型と考えられた。
【０１９６】
また、ゲノムDNA30由来のPCR産物は、ビオチン化オリゴDNA74がビーズ番号111のビーズ上のオリゴDNA76にハイブリダイズすることと、ビオチン化オリゴDNA75がビーズ番号112のビーズ上のオリゴDNA77にハイブリダイズすることの両方を妨げた。したがってゲノムDNA30のPOLI遺伝子の遺伝子型は、スレオニン型アリルとアラニン型アリルとのヘテロ型と考えられた。
以上の結果から、ルミネックス・ビーズを用いることによりPOLI遺伝子の遺伝子型を解析できることがわかった。
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配列番号１−発明者：清水憲二
【配列表】
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