(57)【要約】【課題】本発明の目的は、フィルタホイールを用いることなく複数の干渉フィルタを装備して干渉フィルタの選択切換えが可能であり、しかも干渉フィルタを交換することなしに追加のフィルタを加えることができ、装置の小型化と操作上の容易さを実現した蛍光測定装置を提供することである。【解決手段】本発明の蛍光測定装置は測定条件に従って投光用干渉フィルタ４５と受光用干渉フィルタ４２とが対で配されたプローブ１６を選択して、選択したプローブ１６をファイバ保持部材１５に嵌合させてマイクロプレート１８のウエル１９上に移動する。そしてウエル１９内の試料２０に励起光を照射して励起発光する蛍光を測定する。【選択図】      図２
2005207740.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料容器内の測定対象物に励起光を照射し前記測定対象物からの蛍光を検出する蛍光測定装置において、
前記励起光を発生する励起光発生手段と、前記励起光発生手段からの励起光を入射端面で導入し出射端面で照射する投光用ファイバと、前記試料容器内の前記測定対象物からの蛍光を入射端面で導入し出射端面で照射する受光用ファイバと、前記受光用ファイバの出射端面から照射される蛍光を検出するための蛍光検出手段と、前記投光用ファイバの出射端面側と前記受光用ファイバの入射端面側を保持するファイバ保持手段と、前記ファイバ保持手段に嵌合し前記投光用ファイバの出射端面に対峙する励起光選択フィルタと前記受光用ファイバの入射端面に対峙する蛍光選択フィルタとを有する光選択手段とを備えたことを特徴とする蛍光測定装置。
【請求項２】
前記試料容器内の前記測定対象物に対して投光の光軸と受光の光軸が一致する同軸落射光学系を前記光選択手段の内部に備えたことを特徴とする請求項１記載の蛍光測定装置。
【請求項３】
前記投光用ファイバの出射端面に対峙して置かれた投光用レンズと、前記受光用ファイバの入射端面に対峙して置かれた受光用レンズとを前記ファイバ保持手段の内部に備えたことを特徴とする請求項１記載の蛍光測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料容器（例えば、マイクロプレート）内に収容された測定対象物からの光ルミネセンス（蛍光、燐光）を測定する蛍光測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光測定装置には、複数のウェルが設けられたマイクロプレートが用いられ、そのマイクロプレートの各ウェル内の測定対象物に励起光が照射され、その測定対象物からの蛍光が測定されるものがある。この種の蛍光測定装置は、光源部が出力する光を投光用ファイバに導光して、マイクロプレートにマトリックス（行列）状に形成された複数のウエル（試料を入れるくぼみ）に光を導いて照射する。そのウエル部分を通過した光を受光用ファイバに導入して、受光部に光を導いて検出器（例えば、光電子増倍管）で検出する。
【０００３】
また、照射する励起光の波長を選択するために光源部と投光用ファイバの間に位置するように干渉フィルタが挿入される。この干渉フィルタはターレット状に励起フィルタホイールに複数配置されており、このホイールを回転させることにより干渉フィルタを切換えて照射する励起光の波長を選択する。
【０００４】
さらに、受光する蛍光の波長を選択するために受光部と受光用ファイバの間に位置するように干渉フィルタが挿入される。この干渉フィルタはターレット状に放射フィルタホイールに複数配置されており、このホイールを回転させることにより干渉フィルタを切換えて受光する蛍光の波長を選択する（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特表２００３−５２１６７０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、多数の干渉フィルタを配置したフィルタホイールを内臓すると装置が大きくなることと、追加の干渉フィルタを入れられないので、追加のためには干渉フィルタを交換しなければならず操作上煩雑であるという問題点があった。
【０００６】
そこで本発明は、フィルタホイールを用いることなく複数の干渉フィルタを装備して干渉フィルタの選択切換えが可能であり、しかも干渉フィルタを交換することなしに追加のフィルタを加えることができ、装置の小型化と操作上の容易さを実現した蛍光測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１記載の発明では、試料容器内の測定対象物に励起光を照射し前記測定対象物からの蛍光を検出する蛍光測定装置において、
前記励起光を発生する励起光発生手段と、前記励起光発生手段からの励起光を入射端面で導入し出射端面で照射する投光用ファイバと、前記試料容器内の前記測定対象物からの蛍光を入射端面で導入し出射端面で照射する受光用ファイバと、前記受光用ファイバの出射端面から照射される蛍光を検出するための蛍光検出手段と、前記投光用ファイバの出射端面側と前記受光用ファイバの入射端面側を保持するファイバ保持手段と、前記ファイバ保持手段に嵌合し前記投光用ファイバの出射端面に対峙する励起光選択フィルタと前記受光用ファイバの入射端面に対峙する蛍光選択フィルタとを有する光選択手段とから構成して、前記課題を解決している。
【０００８】
そして請求項２に記載の発明では、請求項１記載の蛍光測定装置において、前記試料容器内の前記測定対象物にて投光の光軸と受光の光軸が一致する同軸落射光学系を前記光選択手段の内部に備えたことを特徴としている。
【０００９】
更に、請求項３記載の発明では、請求項１記載の蛍光測定装置において、前記投光用ファイバの出射端面に対峙して置かれた投光用レンズと、前記受光用ファイバの入射端面に対峙して置かれた受光用レンズとを前記ファイバ保持手段の内部に備えたことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の蛍光測定装置によれば、蛍光測定において励起光選択フィルタと蛍光選択フィルタは対で使用されるので、励起光選択フィルタと蛍光選択フィルタを光選択手段に配した。そして投光用ファイバの出射端面側と受光用ファイバの入射端面側を保持するファイバ保持手段に光選択手段が嵌合し、励起光選択フィルタは投光用ファイバに対峙し蛍光選択フィルタは受光用ファイバに対峙するように構成したので、光選択手段を交換することにより励起光選択フィルタと蛍光選択フィルタを同時に切換えることができる。必要に応じて光選択手段を複数用意すれば各種励起波長・蛍光波長に対応することができる。
【００１１】
そして、光選択手段の内部に同軸落射光学系を備えたので測定対象物に対して投光の光軸と受光の光軸が一致するので、マイクロプレートの１つのウエルに対して投光受光が同一の光軸でなされるから周囲のウエルに励起光を照射して周囲のウエルからの蛍光を受光するようなことがないことから正確な測定を行うことができる。
【００１２】
更に、ファイバ保持手段の内部に投光用レンズと受光用レンズを配して、投光用ファイバの射出端面から照射される励起光を測定対象物に集光し測定対象物からの蛍光を受光用ファイバの入射端面に集光するようにしたので、感度良く高精度に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の一実施の形態を図面を参照して説明する。図１は本発明の一実施の形態である蛍光測定装置の斜視図及びブロック図である。図２は蛍光測定装置のファイバ保持手段と光選択手段を示す図、図３はファイバ保持手段と光選択手段が嵌合した状態図である。
【００１４】
まず、図１を参照して蛍光測定装置１０の全体構造を説明する。図１に示すように、蛍光測定装置１０には、試料容器としてのマイクロプレート１８が置かれる。マイクロプレート１８には、その上面に測定対象となる試料２０を収容する複数（９６個）のウェル１９が形成され、ウェル１９は例えばマイクロプレート１８の上面に８列１２行に配列されている。また、各ウェル１９内に収容される試料２０は、例えば測定対象としての蛍光標識した細胞、及びその細胞を含有するためのバッファー溶液が用いられる。
【００１５】
蛍光測定装置１０は、励起光発生手段としての光源部１２が設けられ、光源としてのキセノンフラッシュランプ１２ｂと、このキセノンフラッシュランプ１２ｂで発生した光を投光用ファイバ１４の入射端面に集光するコンデンサレンズ１２ａを備えており、投光用ファイバ１４の出射端面側はファイバ保持手段としてのファイバ保持部材１５の上部に開けられた孔に挿入して保持されている。投光用ファイバ１４は複数本の石英ガラス光ファイバ（例えば外径２００μｍ程で中心部のコアとその外周部のクラッドからなる）が束ねて保護チューブで覆われ、さらに両端部はステンレス製の口金で補強された構造となっている。
【００１６】
また、蛍光測定装置１０には、蛍光検出手段としての受光部１１が設けられ、光検出器としての光電子増倍管１１ｂと、この光電子増倍管１１ｂの受光面に受光用ファイバ１３の出射端面１３ｂからの光を集光するフォーカスレンズ１１ａを備えており、受光用ファイバ１３の入射端面１３ａ側はファイバ保持手段としてのファイバ保持部材１５の上部に開けられた孔に挿入して保持されている。前記投光用ファイバ１４と同様に受光用ファイバ１３は複数本の石英ガラス光ファイバ（例えば外径２００μｍ程で中心部のコアとその外周部のクラッドからなる）が束ねて保護チューブで覆われ、さらに両端部はステンレス製の口金で補強された構造となっている。
【００１７】
蛍光測定装置１０には、Ｙ軸ガントリー３１とＸ軸ガントリー３２とＺ軸ガントリー３３を備えており、Ｙ軸ガントリー３１にはＸ軸ガントリー３２が搭載されてＸ軸ガントリー３２を水平なＹ軸方向に移動させる。Ｘ軸ガントリー３２にはＺ軸ガントリー３３が搭載されてＺ軸ガントリー３３を水平なＸ軸方向に移動させる。Ｚ軸ガントリー３３にはファイバ保持部材１５が搭載されてファイバ保持部材１５を鉛直なＺ軸方向（上下方向）に移動させる。従って、ファイバ保持部材１５は水平面方向と上下方向に移動可能である。
【００１８】
次に、図２において投光用ファイバ１４の出射端面１４ｂ側はファイバ保持手段としてのファイバ保持部材１５の上部に開けられた孔に挿入して保持されている。投光用ファイバ１４の出射端面１４ｂの下部には前記出射端面１４ｂに対峙して投光用レンズ４４が配置され、投光用ファイバ１４から出射される光をマイクロプレート１８のウエル１９に入れられた測定対象物である試料２０に励起光として集光照射する。
【００１９】
同様に、受光用ファイバ１３の入射端面１３ａ側はファイバ保持手段としてのファイバ保持部材１５の上部に開けられた孔に挿入して保持されている。受光用ファイバ１３の入射端面１３ａの下部には前記入射端面１３ａに対峙して受光用レンズ４１が配置され、マイクロプレート１８のウエル１９に入れられた測定対象物である試料２０から発せられる蛍光を受光用ファイバ１３の入射端面１３ａに集光する。
【００２０】
光選択手段としてのプローブ１６がファイバ保持部材１５と嵌合した際に、投光用ファイバの出射端面に対峙するように励起光選択フィルタとしての投光用干渉フィルタ４５と受光用ファイバ１３の入射端面１３ａに対峙するように蛍光選択手段としての受光用干渉フィルタ４２をプローブ１６の上部に設けたボアホールに配している。投光用干渉フィルタ４５により特定の波長範囲の光を透過させて励起光として作用させる。受光用干渉フィルタ４２は特定の波長範囲の光を透過させて励起光によって励起した蛍光を受光する。受光用干渉フィルタ４２により試料２０やウエル１９の底面側面から反射した励起光などの迷光を遮断して精度の良い測定を行うことができる。
【００２１】
投光用干渉フィルタ４５の下部には直角プリズム４６を、その一方の直角面を上向きに、他方の直角面を左向きに、プリズム斜面が右側（右斜め下向き）となるように配し、受光用干渉フィルタ４２の下部にはキューブ型ビームスプリッタ４３をその薄膜蒸着面が直角プリズム４６のプリズム斜面と平行となるように配している。なお、直角プリズム４６のプリズム斜面は直角プリズム４６の入射面に対して４５°の角度をなしている。同様に、キューブ型ビームスプリッタ４３の薄膜蒸着面はキューブ型ビームスプリッタ４３の入射面に対して４５°の角度をなしている。
【００２２】
図３はファイバ保持部材１５にプローブ１６が嵌合した状態図である。ファイバ保持部材１５の底部の凸部１５ｂにプローブ１６の上部の凹部１６ｂが嵌合し、ファイバ保持部材１５の底面に設けられた溝に配置した永久磁石４７の磁力によりプローブ１６はファイバ保持部材１５に吸引保持される。永久磁石４７の下面はファイバ保持部材１５の底面より僅かに低くなっおり、プローブ１６の上面と永久磁石４７の吸引面（図にて下側）との間にエアギャップの形成がなされている。
【００２３】
図３において、投光の光軸Ｚ１は直角プリズム４６のプリズム斜面にて水平方向左向きの光軸Ｚ２に曲げられる（反射される）。さらに、左向きの光軸Ｚ２はキューブ型ビームスプリッタ４３によって下向きの光軸Ｚ３に曲げられる（反射される）。そして試薬２０に励起光として照射される。キューブ型ビームスプリッタ４３は照射した光の約１／２を反射するが約１／２の光を透過する。試料２０の蛍光標識した細胞に励起光が照射されると蛍光を発するが、蛍光はキューブ型ビームスプリッタ４３を透過して受光用ファイバ１３の入射端面１３ａに入射して受光される。この受光の光軸Z０は前記投光の光軸Ｚ３と一致している。このように測定対象物に対する投光の光軸と受光の光軸が一致する光学系を同軸落射光学系と称されている。
【００２４】
蛍光測定装置１０の構成は上記のように成り、以下その動作について説明する。図１において外部入出力回路２７をかいしてＰＣ（図示せず）から測定条件やスタート信号がＣＰＵ２３に入力される。ＣＰＵ２３はコントローラ２２に作動信号を送出する。コントローラ２２はまずＹ軸ガントリとＸ軸ガントリ３２を作動させてファイバ保持部材１５をプローブホルダ１７に保持された所定のプローブ１６の真上に位置させる。次にＺ軸ガントリ３３を作動させてファイバ保持部材１５にプローブ１６が嵌合する高さまでファイバ保持部材１５を下降させる。プローブホルダ１７のコの字部にプローブ１６の溝１６ａがはまる状態でプローブ１６はプローブホルダ１７に保持されているから、コの字部からプローブ１６が外れる方向にＹ軸ガントリを作動させる。そして所定の測定高さとなるようにＺ軸ガントリ３３を作動させると共にＹ軸ガントリ３１とＸ軸ガントリ３２を作動させて、マイクロプレート１８の所定のウエル１９の中心に受光の光軸Ｚ０（図３参照）が位置するようにする。
【００２５】
次にＣＰＵ２３はコントローラ２２に対しては投光信号を、Ａ／Ｄ変換器２５には受光信号（ＡＤＣＮＶ信号）を送出する。コントローラ２２はトリガ回路２１に作動信号を送出する。トリガ回路２１はキセノンフラッシュランプ１２ｂのトリガ端子に短時間の高電圧を出力する。そこでキセノンフラッシュランプ１２ｂ内部に小電流の放電が発生する。この放電をトリガとしてキセノンフラッシュランプ１２ｂ内部には低電圧で大電流の放電が発生して強い光が発せられる。そして発せられた光はコンデンサレンズ１２ａによって投光用ファイバ１４の入射端面１４ａに集光される。
【００２６】
投光用ファイバ１４の入射端面１４ａより導入された光は投光用ファイバ１４の出射端面１４ｂより照射される。図３において出射端面１４ｂより照射された光はマイクロプレート１８のウエル１９に入れられた試料２０に集光するための投光用レンズ４４を透過し、所定の波長範囲の光が励起光として投光用干渉フィルタ４５を透過する。そして直角プリズム４６により左側に光は曲げられてキューブ型ビームスプリッタ４３に達する。ここでキューブ型ビームスプリッタ４３に照射された光の約１／２の光量の光が下方に曲げられて試料２０に照射される。
【００２７】
試料２０中に蛍光識別された細胞が存在すれば照射された光に励起されて蛍光が発せられる。次にキューブ型ビームスプリッタ４３照射された蛍光の約１／２の光量の蛍光がキューブ型ビームスプリッタ４３を透過する。そしてこの蛍光は所定範囲の波長を透過させる受光用干渉フィルタ４２（通常は蛍光の中心波長に対して半値幅が１０ｎｍから２０ｎｍ）を透過する。さらに蛍光は受光用レンズ４１によって受光用ファイバ１３の入射端面１３ａに集光され、受光用ファイバ１３の入射端面１３ａより導入された蛍光は受光用ファイバ１３の出射端面１３ｂ（図１参照）より照射される。
【００２８】
図１にもどり、受光用ファイバ１３の出射端面１３ｂより照射された蛍光はフォーカスレンズ１１ａにより光電子増倍管１１ｂの受光部に集光される。そして蛍光の受光によって光電子増倍管１１ｂは信号を発し、さらに電圧変換回路２４によって増幅される。増幅された信号はＡ／Ｄ変換器２５に送られ、Ａ／Ｄ変換器２５はアナログ信号をデジタル信号に変換して記憶装置２６に送り、前記デジタル信号は測定値として記憶装置２６に記憶される。外部入出力回路２７を通じてＰＣから測定値の出力要求があればＣＰＵ２３は記憶装置２６から測定値を読み込んで外部入出力回路２７を通じてＰＣに測定値を出力する。
【００２９】
なおプローブ１６のファイバ保持部材１５への嵌合を外すには、プローブホルダ１７のコの字部１７ａにプローブ１６の溝１６ａが一致するようにY軸ガントリ３１とX軸ガントリ３２及びZ軸ガントリ３３を作動させる。そしてY軸ガントリ３１を作動させてプローブ１６の溝１６ａをプローブホルダ１７のコの字部１７ａにはめ込む。次にＺ軸ガントリ３３を作動させてファイバ保持部材１５を上昇させてプローブ１６のファイバ保持部材１５への嵌合を外す。
【００３０】
以上のように測定条件に合わせてプローブ１６を選択して測定することができるので、各種蛍光標識に対応できる。新規に蛍光標識が導入されても新たなプローブをプローブホルダ１７にセットすればよいので、フィルタホイールからフィルタを取り外して新たなフィルタを組み込むというような煩雑さがなく、取り扱いに柔軟性がある。
【００３１】
測定はマイクロプレート１８の上側から行うように実施例で説明したが、マイクロプレート１８のウエル１９の底面が透明であればマイクロプレート１８の下側から行っても良い。すなわち、ファイバ保持部材１５の取付け方向を図１の例とは上下逆向きとなるようにＺ軸ガントリ３３に取付けて、ファイバ保持部材１５の上にプローブ１６が嵌合するようにする。この場合、プローブホルダ１７へのプローブ１６のセットは図１の例とは上下逆向きとなるようにする必要がある。実施例では光源としてキセノンフラッシュランプ１２ｂを取り上げたがメタルハライドランプやハロゲンランプに置き換えることができる。また光電子増倍管１１ｂは高感度のフォトダイオードに置き換えることができる。さらに直角プリズム４６はミラーに、キューブ型ビームスプリッタ４３はハーフミラーに置き換えが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】蛍光測定装置の斜視図及びブロック図である。
【図２】ファイバ保持手段と光選択手段を示す図である。
【図３】ファイバ保持手段と光選択手段が嵌合した状態図である。
【符号の説明】
【００３３】
１０  蛍光測定装置
１１  受光部（蛍光検出手段）
１２  光源部（励起光発生手段）
１３  受光用ファイバ
１３ａ  入射端面
１３ｂ  出射端面
１４  投光用ファイバ
１４ａ  入射端面
１４ｂ  出射端面
１５  ファイバ保持部材（ファイバ保持手段）
１５ｂ  凸部
１６  プローブ（光選択手段）
１６ｂ  凹部
１７  プローブホルダ
１８  マイクロプレート（試料容器）
１９  ウエル
２０  試料
４１  受光用レンズ
４２  受光用干渉フィルタ（蛍光選択フィルタ）
４３  キューブ型ビームスプリッタ
４４  投光用レンズ
４５  投光用干渉フィルタ（励起光選択フィルタ）
４６  直角プリズム
【図１】
2005207740.tif 000003
【図２】
2005207740.tif 000004
【図３】
2005207740.tif 000005