(57)【要約】  【課題】  本発明の課題は医学、薬学、臨床化学の分野およびその他の分野で要求されているアミン類の光学異性体の分離において、温和な条件でジアステレオマーを生成し、ジアステレオマー間の優れた分離能と高い検出感度を有する蛍光標識試薬を提供することにある。  【解決手段】  蛍光団として2,1,3-ベンゾオキサジアゾール骨格を選択し、アミン類と反応させるためにカルボキシル基、あるいはクロロカルボニル基を有する光学活性プロリン類を選択した。また、ジアステレオマー間の良好な分離を達成するためにプロリン骨格にヒドロキシル基を導入することにより上記課題を解決した。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式
【化１】
2005047863.tif 000007
（ただし、＊は不斉炭素原子を示し、R1はヒドロキシル基、塩素原子から選択される。）で示される新規光学活性2,1,3-ベンゾオキサジアゾール誘導体。
【請求項２】
下記構造式
【化２】
2005047863.tif 000008
（ただし、＊は不斉炭素原子を示し、R2はヒドロキシル基、塩素原子から選択される。）で示される新規光学活性2,1,3-ベンゾオキサジアゾール誘導体。
【請求項３】
下記構造式
【化３】
2005047863.tif 000009
（ただし、＊は不斉炭素原子を示し、R3はヒドロキシル基、塩素原子から選択される。）で示される新規光学活性2,1,3-ベンゾオキサジアゾール誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、薬学、臨床化学の分野およびその他の分野で要求されている光学活性アミン類の光学異性体の分離、定量を行うことができる2,1,3-ベンゾオキサジアゾール誘導体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
医薬品などの生理活性物質は不斉中心を有する化合物が多く、これら不斉中心を有する化合物には光学異性体が存在する。特に光学活性アミン類は生理活性物質の主要な構成要素となっている。この光学異性体の間では、生理活性が大きく異なったり、生体内での挙動が異なる場合がある。従って、これらの光学異性体を分離し、高感度で再現性良く定量することは、重要な分析課題となっている。
【０００３】
従来、知られている光学活性アミン類の光学異性体を分離、定量する方法は、シフト試薬を用いるNMR法、旋光分散法、光学活性固定相を用いるクロマトグラフィー、光学活性移動相を用いるクロマトグラフィー、ジアステレオマー法によるクロマトグラフィーなどがある。
【０００４】
これらの方法の中で、ジアステレオマー法によるクロマトグラフィーが光学異性体を分離する能力と検知する能力において優れており、種々の光学活性誘導体化試薬が開発され、報告されている。例えば、(+)-あるいは(-)-α-トリフルオロメチル-α-メトキシフェニルアセチルクロリドを用いてガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による分離、定量を行う方法、蛍光標識試薬(-)-1-(1-ナフチル)エチルイソシアナートを用いて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分離、定量を行う方法（例えば非特許文献１）、蛍光標識試薬(+)-あるいは(-)-2-メチル-1,1'-ビナフタレン-2'-カルボニルシアニドを用いてＨＰＬＣによる分離、定量を行う方法（例えば非特許文献２）、蛍光標識試薬1-[7-(ジメチルアミノスルホニル)-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル]-D-プロリン（DBD-D-pro）あるいは1-[7-(ジメチルアミノスルホニル)-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル]-L-プロリン（DBD-L-pro）を用いてＨＰＬＣによる分離、定量を行う方法（例えば非特許文献３）などである。
【０００５】
【非特許文献１】K. Sasaki, H. Hirata, J. Chromatogr., 585, 117 (1991)
【非特許文献２】J. Goto., Anal. Sci., 6, 261 (1990)
【非特許文献３】S. Al-Kindy, T. Santa, T. Fukushima, H. Homma, K. Imai, Biomedical Chromatography, 12, 276 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、(+)-あるいは(-)-α-トリフルオロメチル-α-メトキシフェニルアセチルクロリドを用いてＧＣで分離、定量を行う方法は、熱に不安定な化合物には適用できない。また、蛍光標識試薬(-)-1-(1-ナフチル)エチルイソシアナート、(+)-あるいは(-)-2-メチル-1,1'-ビナフタレン-2'-カルボニルシアニドを用いてＨＰＬＣによる分離、定量を行う方法は、ジアステレオマー生成のために９０℃に加熱する必要があり、熱に不安定な化合物の誘導体化に用いることができない。そして、蛍光標識試薬DBD-D-proあるいはDBD-L-proを用いてＨＰＬＣによる分離、定量を行う方法は、化合物によっては分離効果が低いという問題点を有している。それゆえに、熱に不安定な化合物にも適用できる温和な条件でジアステレオマーを生成することができ、ジアステレオマー間の分離の高い蛍光標識試薬が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は下記構造式１
【０００８】
【化１】
2005047863.tif 000002
【０００９】
（ただし、＊は不斉炭素原子を示し、R1はヒドロキシル基、塩素原子から選択される）で示される新規光学活性2,1,3-ベンゾオキサジアゾール誘導体および下記構造式２
【００１０】
【化２】
2005047863.tif 000003
【００１１】
（ただし、＊は不斉炭素原子を示し、R2はヒドロキシル基、塩素原子から選択される）で示される新規光学活性2,1,3-ベンゾオキサジアゾール誘導体および下記構造式３
【００１２】
【化３】
2005047863.tif 000004
【００１３】
（ただし、＊は不斉炭素原子を示し、R2はヒドロキシル基、塩素原子から選択される）で示される新規光学活性2,1,3-ベンゾオキサジアゾール誘導体に関するものである。上記構造式１、２、３で示された新規光学活性2,1,3-ベンゾオキサジアゾール誘導体は文献未載の新規化合物である。本発明の代表的な例として下記構造式４
【００１４】
【化４】
2005047863.tif 000005
【００１５】
で示される1-[7-(ジメチルアミノスルホニル)-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル]- trans-4-ヒドロキシ-L-プロリン（DBD-trans-4-OH-L-pro）を取り上げ、その製造法を例示する。
【００１６】
上記DBD-trans-4-OH-L-proは下記反応式５
【００１７】
【化５】
2005047863.tif 000006
【００１８】
に従って合成することができる。上記反応式５において、使用する溶媒としては、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル（CH3CN）、ジオキサン、ジメチルホルムアミド等の有機溶媒から適宜選択される。反応温度は通常-50から100℃の範囲内で行われるが、好ましくは0から50℃である。反応時間は通常10分から12時間、好ましくは10分から2時間である。反応混合物からの目的物の単離、精製は常法に従って容易に行うことができる。例えば、ろ過、エーテル、ベンゼン、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル等の有機溶媒による抽出、再結晶、あるいはシリカゲル、活性炭素、イオン交換樹脂、デキストラン架橋重合体、スチレンもしくはアクリル酸エステルの多孔質重合体等を用いた各種のクロマトグラフィーを行うことにより、単離、精製することができる。
【００１９】
本発明化合物はアミン類のラセミ体と速やかに反応してジアステレオマーを生成し、同時に蛍光標識する。このジアステレオマーはＨＰＬＣで良好な分離能を有する。検体中のアミン類と本発明に係る化合物とを反応させた後、生成する蛍光性化合物をＨＰＬＣで分離し、その蛍光強度を測定することにより検体中の光学活性アミン類を検出でき、また標準物質により作成した検量線を用いてその定量を行うことができる。
【００２０】
本発明の代表的な例として1-[7-(ジメチルアミノスルホニル)-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル]-trans-4-ヒドロキシ-L-プロリン（DBD-trans-4-OH-L-pro）、1-[7-(ジメチルアミノスルホニル)-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル]-cis-4-ヒドロキシ-L-プロリン（DBD-cis-4-OH-L-pro）、1-[7-(ジメチルアミノスルホニル)-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル]-cis-4-ヒドロキシ-D-プロリン（DBD-cis-4-OH-D-pro）、1-[7-(ジメチルアミノスルホニル)-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル]-trans-3-ヒドロキシ-L-プロリン（DBD-trans-3-OH-L-pro）、(S)-1-[7-(ジメチルアミノスルホニル)-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル]-β-プロリン（(S)-DBD-β-pro）、(R)-1-[7-(ジメチルアミノスルホニル)-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル]-β-プロリン（(R)-DBD-β-pro）を取り上げ、D-およびL-フェニルアラニンメチルエステル、(R)-(+)-および(S)-(-)-1-フェニルエチルアミン、(R)-(+)-および(S)-(-)-1-(1-ナフチル)エチルアミンを蛍光標識し、その蛍光標識体のＨＰＬＣの分離度（Rs）について行った実験例を以下に示す。
【００２１】
参考例１  DBD-trans-4-OH-L-proによるD-およびL-フェニルアラニンメチルエステルの分離
D-およびL-フェニルアラニンメチルエステルのアセトニトリル溶液にDBD-trans-4-OH-L-proのアセトニトリル溶液を加え、この混合溶液に1-エチル-3-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）、ピリジンのアセトニトリル溶液を加え、室温で3時間攪拌する。反応液にアセトニトリルを加え1mlとし、下記条件下、ＨＰＬＣによる測定を行った。
カラム：ULTRON  VX-ODS 150×4.6mmID, 5μm
カラム温度：40℃
溶出液：水／メタノール（45／55）
流速：1.0ml/min
検出波長：励起波長450nm；蛍光波長560nm
本測定におけるRsは2.993であり、第一溶出成分はD-フェニルアラニンメチルエステル誘導体であった。
【００２２】
参考例２  DBD-trans-3-OH-L-proによるD-およびL-フェニルアラニンメチルエステルの分離
DBD-trans-3-OH-L-proを蛍光標識試薬とし、D-およびL-フェニルアラニンメチルエステルの分離を同様の方法で行った。
カラム：ULTRON  VX-ODS 150×4.6mmID, 5μm
カラム温度：40℃
溶出液：水／メタノール（45／55）
流速：1.0ml/min
検出波長：励起波長450nm；蛍光波長560nm
本測定におけるRsは3.149であり、第一溶出成分はD-フェニルアラニンメチルエステル誘導体であった。
【００２３】
参考例３  (S)-DBD-β-proによるD-およびL-フェニルアラニンメチルエステルの分離
(S)-DBD-β-proを蛍光標識試薬とし、D-およびL-フェニルアラニンメチルエステルの分離を参考例１と同様の方法で行った。
カラム：ULTRON  VX-ODS 150×4.6mmID, 5μm
カラム温度：40℃
溶出液：水／メタノール（47／53）
流速：1.0ml/min
検出波長：励起波長450nm；蛍光波長560nm
本測定におけるRsは2.231であり、第一溶出成分はL-フェニルアラニンメチルエステル誘導体であった。
【００２４】
参考例４  (R)-DBD-β-proによるD-およびL-フェニルアラニンメチルエステルの分離
(R)-DBD-β-proを蛍光標識試薬とし、D-およびL-フェニルアラニンメチルエステルの分離を参考例１と同様の方法で行った。
カラム：ULTRON  VX-ODS 150×4.6mmID, 5μm
カラム温度：40℃
溶出液：水／メタノール（47／53）
流速：1.0ml/min
検出波長：励起波長450nm；蛍光波長560nm
本測定におけるRsは2.219であり、第一溶出成分はD-フェニルアラニンメチルエステル誘導体であった。
【００２５】
参考例５  DBD-trans-4-OH-L-proによる(R)-(+)-および(S)-(-)-1-フェニルエチルアミンの分離
DBD-trans-4-OH-L-proを蛍光標識試薬とし、(R)-(+)-および(S)-(-)-1-フェニルエチルアミンの分離を同様の方法で行った。
カラム：ULTRONVX-ODS 150×4.6mmID, 5μm
カラム温度：40℃
溶出液：水／メタノール（45／55）
流速：1.0ml/min
検出波長：励起波長450nm；蛍光波長560nm
本測定におけるRsは1.306であり、第一溶出成分は(R)-(+)-1-フェニルエチルアミン誘導体であった。
【００２６】
参考例６  DBD-cis-4-OH-L-proによる(R)-(+)-および(S)-(-)-1-フェニルエチルアミンの分離
DBD-cis-4-OH-L-proを蛍光標識試薬とし、(R)-(+)-および(S)-(-)-1-フェニルエチルアミンの分離を同様の方法で行った。
カラム：ULTRON  VX-ODS 150×4.6mmID, 5μm
カラム温度：40℃
溶出液：水／メタノール（46／54）
流速：1.0ml/min
検出波長：励起波長450nm；蛍光波長560nm
本測定におけるRsは1.327であり、第一溶出成分は(S)-(-)-1-フェニルエチルアミン誘導体であった。
【００２７】
参考例７  DBD-cis-4-OH-D-proによる(R)-(+)-および(S)-(-)-1-フェニルエチルアミンの分離
DBD-cis-4-OH-D-proを蛍光標識試薬とし、(R)-(+)-および(S)-(-)-1-フェニルエチルアミンの分離を同様の方法で行った。
カラム：ULTRON  VX-ODS 150×4.6mmID, 5μm
カラム温度：40℃
溶出液：水／メタノール（45／55）
流速：1.0ml/min
検出波長：励起波長450nm；蛍光波長560nm
本測定におけるRsは1.383であり、第一溶出成分は(R)-(+)-1-フェニルエチルアミン誘導体であった。
【００２８】
参考例８  (S)-DBD-β-proによる(R)-(+)-および(S)-(-)-1-フェニルエチルアミンの分離
(S)-DBD-β-proを蛍光標識試薬とし、(R)-(+)-および(S)-(-)-1-フェニルエチルアミンの分離を同様の方法で行った。
カラム：ULTRON  VX-ODS 150×4.6mmID, 5μm
カラム温度：40℃
溶出液：水／メタノール（47／53）
流速：1.0ml/min
検出波長：励起波長450nm；蛍光波長560nm
本測定におけるRsは2.091であり、第一溶出成分は(R)-(+)-1-フェニルエチルアミン誘導体であった。
【００２９】
参考例９  (R)-DBD-β-proによる(R)-(+)-および(S)-(-)-1-フェニルエチルアミンの分離
(R)-DBD-β-proを蛍光標識試薬とし、(R)-(+)-および(S)-(-)-1-フェニルエチルアミンの分離を同様の方法で行った。
カラム：ULTRON  VX-ODS 150×4.6mmID, 5μm
カラム温度：40℃
溶出液：水／メタノール（47／53）
流速：1.0ml/min
検出波長：励起波長450nm；蛍光波長560nm
本測定におけるRsは2.058であり、第一溶出成分は(S)-(-)-1-フェニルエチルアミン誘導体であった。
【００３０】
参考例１０  DBD-trans-4-OH-L-proによる(R)-(+)-および(S)-(-)-1-(1-ナフチル)エチルアミンの分離
DBD-trans-4-OH-L-proを蛍光標識試薬とし、(R)-(+)-および(S)-(-)-1-(1-ナフチル)エチルアミンの分離を同様の方法で行った。
カラム：ULTRON  VX-ODS 150×4.6mmID, 5μm
カラム温度：40℃
溶出液：水／メタノール（45／55）
流速：1.0ml/min
検出波長：励起波長450nm；蛍光波長560nm
本測定におけるRsは1.746であり、第一溶出成分は(R)-(+)-1-(1-ナフチル)エチルアミン誘導体であった。
【００３１】
参考例１１  DBD-cis-4-OH-L-proによる(R)-(+)-および(S)-(-)-1-(1-ナフチル)エチルアミンの分離
DBD-cis-4-OH-L-proを蛍光標識試薬とし、(R)-(+)-および(S)-(-)-1-(1-ナフチル)エチルアミンの分離を同様の方法で行った。
カラム：ULTRON  VX-ODS 150×4.6mmID, 5μm
カラム温度：40℃
溶出液：水／メタノール（46／54）
流速：1.0ml/min
検出波長：励起波長450nm；蛍光波長560nm
本測定におけるRsは4.706であり、第一溶出成分は(S)-(-)-1-(1-ナフチル)エチルアミン誘導体であった。
【００３２】
参考例１２  DBD-cis-4-OH-D-proによる(R)-(+)-および(S)-(-)-1-(1-ナフチル)エチルアミンの分離
DBD-cis-4-OH-D-proを蛍光標識試薬とし、(R)-(+)-および(S)-(-)-1-(1-ナフチル)エチルアミンの分離を同様の方法で行った。
カラム：ULTRON  VX-ODS 150×4.6mmID, 5μm
カラム温度：40℃
溶出液：水／メタノール（45／55）
流速：1.0ml/min
検出波長：励起波長450nm；蛍光波長560nm
本測定におけるRsは4.339であり、第一溶出成分は(R)-(+)-1-(1-ナフチル)エチルアミン誘導体であった。
【００３３】
参考例１３  (S)-DBD-β-proによる(R)-(+)-および(S)-(-)-1-(1-ナフチル)エチルアミンの分離
(S)-DBD-β-proを蛍光標識試薬とし、(R)-(+)-および(S)-(-)-1-(1-ナフチル)エチルアミンの分離を同様の方法で行った。
カラム：ULTRON  VX-ODS 150×4.6mmID, 5μm
カラム温度：40℃
溶出液：水／メタノール（47／53）
流速：1.0ml/min
検出波長：励起波長450nm；蛍光波長560nm
本測定におけるRsは5.192であり、第一溶出成分は(R)-(+)-1-(1-ナフチル)エチルアミン誘導体であった。
【００３４】
参考例１４  (R)-DBD-β-proによる(R)-(+)-および(S)-(-)-1-(1-ナフチル)エチルアミンの分離
(R)-DBD-β-proを蛍光標識試薬とし、(R)-(+)-および(S)-(-)-1-(1-ナフチル)エチルアミンの分離を同様の方法で行った。
カラム：ULTRON  VX-ODS 150×4.6mmID, 5μm
カラム温度：40℃
溶出液：水／メタノール（47／53）
流速：1.0ml/min
検出波長：励起波長450nm；蛍光波長560nm
本測定におけるRsは5.220であり、第一溶出成分は(S)-(-)-1-(1-ナフチル)エチルアミン誘導体であった。
【００３５】
そして、本発明の新規光学活性2,1,3-ベンゾオキサジアゾール誘導体の有用性を示すために、従来から用いられているDBD-D-proおよびDBD-L-proでD-およびL-フェニルアラニンメチルエステル、(R)-(+)-および(S)-(-)-1-フェニルエチルアミン、(R)-(+)-および(S)-(-)-1-(1-ナフチル)エチルアミンを蛍光標識し、その蛍光標識体のＨＰＬＣのRsについて行った実験を比較例として以下に示す。
【００３６】
比較例１  DBD-L-proによるD-およびL-フェニルアラニンメチルエステルの分離
DBD-L-proを蛍光標識試薬とし、D-およびL-フェニルアラニンメチルエステルの分離を同様の方法で行った。
カラム：ULTRON  VX-ODS 150×4.6mmID, 5μm
カラム温度：40℃
溶出液：水／メタノール（48／52）
流速：1.0ml/min
検出波長：励起波長450nm；蛍光波長560nm
本測定におけるRsは1.372であり、第一溶出成分はL-フェニルアラニンメチルエステル誘導体であった。
【００３７】
比較例２  DBD-D-proによるD-およびL-フェニルアラニンメチルエステルの分離
DBD-D-proを蛍光標識試薬とし、D-およびL-フェニルアラニンメチルエステルの分離を同様の方法で行った。
カラム：ULTRON  VX-ODS 150×4.6mmID, 5μm
カラム温度：40℃
溶出液：水／メタノール（48／52）
流速：1.0ml/min
検出波長：励起波長450nm；蛍光波長560nm
本測定におけるRsは1.333であり、第一溶出成分はD-フェニルアラニンメチルエステル誘導体であった。
【００３８】
比較例３  DBD-L-proによる(R)-(+)-および(S)-(-)-1-フェニルエチルアミンの分離
DBD-L-proを蛍光標識試薬とし、(R)-(+)-および(S)-(-)-1-フェニルエチルアミンの分離を同様の方法で行った。
カラム：ULTRON  VX-ODS 150×4.6mmID, 5μm
カラム温度：40℃
溶出液：水／メタノール（48／52）
流速：1.0ml/min
検出波長：励起波長450nm；蛍光波長560nm
本測定におけるRsは1.132であり、第一溶出成分は(R)-(+)-1-フェニルエチルアミン誘導体であった。
【００３９】
比較例４  DBD-D-proによる(R)-(+)-および(S)-(-)-1-フェニルエチルアミンの分離
DBD-D-proを蛍光標識試薬とし、(R)-(+)-および(S)-(-)-1-フェニルエチルアミンの分離を同様の方法で行った。
カラム：ULTRON  VX-ODS 150×4.6mmID, 5μm
カラム温度：40℃
溶出液：水／メタノール（48／52）
流速：1.0ml/min
検出波長：励起波長450nm；蛍光波長560nm
本測定におけるRsは1.025であり、第一溶出成分は(S)-(-)-1-フェニルエチルアミン誘導体であった。
【００４０】
比較例５  DBD-L-proによる(R)-(+)-および(S)-(-)-1-(1-ナフチル)エチルアミンの分離
DBD-L-proを蛍光標識試薬とし、(R)-(+)-および(S)-(-)-1-(1-ナフチル)エチルアミンの分離を同様の方法で行った。
カラム：ULTRON  VX-ODS 150×4.6mmID, 5μm
カラム温度：40℃
溶出液：水／メタノール（48／52）
流速：1.0ml/min
検出波長：励起波長450nm；蛍光波長560nm
本測定におけるRsは1.231であり、第一溶出成分は(R)-(+)-1-(1-ナフチル)エチルアミン誘導体であった。
【００４１】
比較例６  DBD-D-proによる(R)-(+)-および(S)-(-)-1-(1-ナフチル)エチルアミンの分離
DBD-D-proを蛍光標識試薬とし、(R)-(+)-および(S)-(-)-1-(1-ナフチル)エチルアミンの分離を同様の方法で行った。
カラム：ULTRON  VX-ODS 150×4.6mmID, 5μm
カラム温度：40℃
溶出液：水／メタノール（48／52）
流速：1.0ml/min
検出波長：励起波長450nm；蛍光波長560nm
本測定におけるRsは1.236であり、第一溶出成分は(S)-(-)-1-(1-ナフチル)エチルアミン誘導体であった。
【００４２】
以上のように本発明化合物は容易に合成することができ、これを蛍光標識試薬として用いて光学活性アミン類をＨＰＬＣで分離、定量することができる。従来法と比較して、温和な条件下でジアステレオマーを生成することができる。また、DBD-L-proおよびDBD-D-proよりもRsの値が大きいことから、本発明の新規光学活性2,1,3-ベンゾオキサジアゾール誘導体は極めて有用な蛍光標識試薬であるといえる。本発明化合物は極微量の光学活性アミン類の定性、定量分析に応用できるだけでなく、広くアミン類を含有するタンパク質、ペプチドの定量、酵素中のアミン類の機能の研究、細胞、膜、組織等の生体中の光学活性アミン類の分離、検出、あるいは生体構成部分の構造と機能の関係についての検討等、医学、薬学、臨床化学等の分野で広く利用することができる。
【実施例】
【００４３】
以下に本発明の好ましい実験例を記載するが、これは例示の目的であり、本発明を制限するものではない。本発明の範囲内では変形が可能なことは当業者には明らかであろう。
【００４４】
実施例１  DBD-trans-4-OH-L-proの合成
4-N,N-ジメチルアミノスルホニル-7-フルオロ-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール（DBD-F）100mg（0.41mmol）をCH3CN溶液10mlに溶解した。trans-4-ヒドロキシ-L-プロリン 54mg（0.41mmol）を0.25mol/l 炭酸ナトリウム溶液（pH=11.5）20mlに溶解し、室温（15〜25℃）で30分混合し、酢酸エチル10mlを加え、未反応のDBD-Fを除去した。水溶性相を2mol/l塩酸でpH＝1〜2まで調整し、酢酸エチル10mlずつで3回抽出を行った。合わせた酢酸エチル溶液を減圧蒸留し、残渣をベンゼン／酢酸エチルで再結晶することによって黄色針状結晶DBD-trans-4-OH-L-pro（収率56%）を得た。
【００４５】
得られたDBD-trans-4-OH-L-proの物性値を以下に示す。
融点：218-220℃
1H-NMR (CD3OD)：δ7.89 (1H, d), 6.22 (1H, d), 5.1-5.4 (1H, m), 4.56-4.66 (1H, m), 3.6-4.1 (2H, m), 2.78 (6H, s), 2.3-2.6 (2H, m)
UV (CH3CN)：λmax 436 nm (ε=10030), λmax 262 nm (ε=13050), λmax 232 nm (ε=14540)
【００４６】
実施例２  DBD-cis-4-OH-L-proの合成
DBD-F 100mg（0.41mmol）をCH3CN溶液10mlに溶解した。cis-4-ヒドロキシ-L-プロリン54mg（0.41mmol）を0.25mol/l炭酸ナトリウム溶液（pH=11.5）20mlに溶解し、室温（15〜25℃）で30分混合し、酢酸エチル10mlを加え、未反応のDBD-Fを除去した。水溶性相を2mol/l塩酸でpH＝1〜2まで調整し、酢酸エチル10mlずつで3回抽出を行った。合わせた酢酸エチル溶液を減圧蒸留し、残渣をベンゼン／酢酸エチルで再結晶することによって黄色針状結晶DBD-cis-4-OH-L-pro（収率55%）を得た。
【００４７】
得られたDBD-cis-4-OH-L-proの物性値を以下に示す。
融点：200-203℃
1H-NMR (CD3OD)：δ7.88 (1H, d), 6.22 (1H, d), 5.2-5.5 (1H, m), 4.56-4.66 (1H, m), 3.7-4.0 (2H, m), 2.78 (6H, s), 2.4-2.6 (2H, m)
UV (CH3CN)：λmax 438 nm (ε=9420), λmax 266 nm (ε=12080), λmax 232 nm (ε=14350)
【００４８】
実施例３  DBD-cis-4-OH-D-proの合成
DBD-F 100mg（0.41mmol）をCH3CN溶液10mlに溶解した。cis-4-ヒドロキシ-D-プロリン54mg（0.41mmol）を0.25mol/l炭酸ナトリウム溶液（pH =11.5）20mlに溶解し、室温（15〜25℃)で30分混合し、酢酸エチル10mlを加え、未反応のDBD-Fを除去した。水溶性相を2mol/l塩酸でpH＝1〜2まで調整し、酢酸エチル10mlずつで3回抽出を行った。合わせた酢酸エチル溶液を減圧蒸留し、残渣をベンゼン／酢酸エチルで再結晶することによって黄色針状結晶DBD-cis-4-OH-D-pro（収率53%）を得た。
【００４９】
融点：210-212℃
1H-NMR (CD3OD)：δ7.89 (1H, d), 6.22 (1H, d), 5.36 (1H, m), 4.39 (1H, m), 3.7-3.9 (2H, m), 2.78 (6H, s), 2.4-2.6 (2H, m)
UV (CH3CN)：λmax 438 nm (ε=8870), λmax 266 nm (ε=11420), λmax 231 nm (ε=13540)
【００５０】
実施例４  DBD-trans-3-OH-L-proの合成
DBD-F 100mg（0.41mmol）をCH3CN溶液10mlに溶解した。trans-3-ヒドロキシ-L-プロリン54mg（0.41mmol）を0.25mol/l炭酸ナトリウム溶液（pH=11.5）20mlに溶かし、室温（15〜25℃）で30分混合し、酢酸エチル10mlを加え未反応のDBD-Fを除去した。水溶性相を2mol/l塩酸でpH＝1〜2まで調整し、酢酸エチル10mlずつで3回抽出を行った。合わせた酢酸エチル溶液を減圧蒸留し、残渣をベンゼン／酢酸エチルで再結晶することによって黄色針状結晶DBD-trans-3-OH-L-pro（収率45%）を得た。
【００５１】
得られたDBD-trans-3-OH-L-proの物性値を以下に示す。
融点：170-173℃
1H-NMR (CD3OD)：δ7.90 (1H, d), 6.27 (1H, d), 5.0-5.4 (1H, m), 4.6-4.8 (1H, m), 3.6-4.0 (2H, m), 2.79 (6H, s), 2.1-2.3 (2H, m)
UV (CH3CN)：λmax 438 nm (ε=7300), λmax 265 nm (ε=9370), λmax 232 nm (ε=10920)
【００５２】
実施例５  1-[7-(ジメチルアミノスルホニル)-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル]-β-プロリン（DBD-β-pro）の合成
DBD-F 100mg（0.41mmol）をCH3CN溶液10mlに溶解した。β-プロリン 47mg（0.41mmol）を0.25mol/l炭酸ナトリウム溶液（pH =11.5）20mlに溶解し、室温（15〜25℃）で30分混合し、酢酸エチル10mlを加え、未反応のDBD-Fを除去した。水溶性相を2mol/l塩酸でpH＝1〜2まで調整し、酢酸エチル10mlずつで3回抽出を行った。合わせた酢酸エチル溶液を減圧蒸留し、残渣をベンゼン／酢酸エチルで再結晶することによって黄色針状結晶DBD-β-pro（収率50%）を得た。
【００５３】
得られたDBD-β-proの物性値を以下に示す。
融点：219-221℃
1H-NMR (CD3OD)：δ7.85 (1H, d), 6.14 (1H, d), 3.8-4.3 (3H, m), 3.3-3.4 (2H, m), 2.77 (6H, s), 2.40 (1H, m)
UV (CH3CN)：λmax 443 nm (ε=4790), λmax 270 nm (ε=5760), λmax 233 nm (ε=6740)
【００５４】
実施例６  DBD-β-proの光学分割
実施例５で得られたDBD-β-pro 1mgを水10mlに溶解し、CHIRALPAK  AD-Hカラムを用いて光学分割し、２つの化合物をそれぞれ分取した。得られた２つの化合物のCDスペクトルを計測し、DBD-L-proおよびDBD-D-proのCDスペクトルと比較することにより(S)-DBD-β-proおよび(R)-DBD-β-proとした。