(57)【要約】【課題】テストステロンに以外のメカニズムの薄毛、脱毛を対象にした薄毛、脱毛の鑑別であって、該当するメカニズムを的確に鑑別し、その対応策を講じる手段を提供する。【解決手段】被験物の存在下及び非存在下に於ける、毛髪関連細胞のサイクリンＴ１の発現状況を指標とし、被験物の毛髪への影響を鑑別する。具体的には、毛乳頭細胞及び／又は結合織鞘細胞を、被験物のプレートには被験物を共存させて、コントロールのプレートにはベヒクルを共存させて、同調培養し、サイクリンＴ１の発現状況の比較結果を指標として鑑別する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物の存在下及び非存在下に於ける、毛髪関連細胞のサイクリンＴ１の発現状況を指標とすることを特徴とする、被験物の毛髪への影響の鑑別法。
【請求項２】
毛関連細胞が、毛乳頭細胞及び／又は結合織鞘細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法。
【請求項３】
毛乳頭細胞及び／又は結合織鞘細胞を、被験物のプレートには被験物を共存させて、コントロールのプレートにはベヒクルを共存させて、同調培養し、サイクリンＴ１の発現状況の比較結果を指標として鑑別することを特徴とする、請求項１又は２に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法。
【請求項４】
毛乳頭細胞及び／又は結合織鞘細胞を、被験物のプレートには被験物を共存させて、コントロールのプレートにはベヒクルを共存させて、同調培養し、サイクリンＴ１の発現の変化から細胞周期を測定し、被験物の共存下における細胞周期の方が、ベヒクル共存下における細胞周期よりも短い場合に於いて、前記被験物を育毛物質と鑑別することを特徴とする、請求項３に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法。
【請求項５】
毛乳頭細胞及び／又は結合織鞘細胞を、被験物のプレートには被験物を共存させて、コントロールのプレートにはベヒクルを共存させて、同調培養し、サイクリンＴ１の発現状況を測定し、該サイクリンＴ１の発現量を指標とすることを特徴とする、請求項３に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法。
【請求項６】
請求項１〜５何れか１項に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法にて、毛髪への影響を鑑別することを特徴とする、育毛剤の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被験物の毛髪への影響の鑑別法に関し、更に詳細には、サイクリンＴ１の発現状況を指標とする、被験物の毛髪への影響の鑑別法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
毛髪に関するアイデンティティーは非常に高く、毛髪が薄いことに、大きな負い目を感じる人は少なくない。この様な状況を背景に、種々の育毛剤、養毛剤が世に出されている。かかる育毛剤、養毛剤のメカニズムとしては、テストステロン−α−リダクターゼ阻害などが知られている（例えば、特許文献１参照）が、薄毛、脱毛のメカニズムがテストステロンの異常発現に尽くされているわけではなく、かかるテストステロン５αリダクターゼ阻害剤によって効を奏さない薄毛、脱毛も少なくない。同様の状況が発毛促進、或いは育毛作用のメカニズムについても存する。言い換えれば、テストステロンに起因しない薄毛、脱毛を的確に鑑別し、その対応策を講じることが望まれていた。一方、サイクリン類は細胞周期に関与した蛋白質であり、核酸合成に関与したり、細胞分裂を成業したりしていることが知られており（例えば、特許文献２、３参照）、そのファミリーとしてはＡ〜Ｉ及びＴが存することが知られている。サイクリン類と毛関連細胞との関連については、キューティクルの形成にはサイクリン依存性キナーゼが関与していること（例えば、非特許文献１参照）、或いは、サイクリン依存性キナーゼが、毛関連細胞をアポトーシスから保護していること（例えば、非特許文献２参照）が知られている。しかしながら、毛周期とサイクリン類の発現の間の関係については全く知られていない。又、前記サイクリン類の内、サイクリンＴ１の発現状況の変化を追うことにより、毛乳頭細胞や結合織鞘細胞などの毛関連細胞の細胞周期が判別出来ることも全く知られていなかった。
【０００３】
シクロスポリンＡについて、発毛促進作用が存することが知られている（特許文献４）が、本発明者らの検討によれば、該シクロスポリンＡは外毛根鞘のイン・ビトロの培養では、細胞増殖を抑制することを見出しており、いかなるメカニズムによって発毛促進を奏するのかは、今まで全く不明であった。
【０００４】
毛関連細胞の細胞周期を揃えて、同調培養する技術については既に知られており（山本卓也、宍戸まゆみ、荒瀬誠治（徳島大）、第５２回日本皮膚科学会西部支部総会（２０００年、徳島）、「同調化ラット髭外毛根鞘細胞の細胞周期移行に対するシクロスポリンＡの影響」参照）、汎用技術となっている。
【０００５】
他方、被験物の存在下及び非存在下に於ける、毛髪関連細胞のサイクリンＴ１の発現状況を指標とし、被験物の毛髪への影響を鑑別する方法は全く知られていない。
【０００６】
【特許文献１】
特開平８−１５０２２１号公報
【特許文献２】
特開平１１−号３０８９９７公報
【特許文献３】
特開平７−３１６１９６号公報
【特許文献４】
特開平１１−１７４０４１号公報
【非特許文献１】
Ｍｉｔｓｕｉ  Ｓ．  ｅｔ．  ａｌ．  ，  Ｊ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  Ｓｃｉ．  ，  （２００１），  ２５（２），  １６４−９
【非特許文献２】
Ｔｕｒｃｈｉｎｓｋｙ  Ｃ．  ｅｔ．  ａｌ．  ，  Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．  ，  （１９９９），  ２８（１０−１１），  ９１３−２４
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、この様な状況下為されたものであり、テストステロンに以外のメカニズムの薄毛、脱毛を対象にした薄毛、脱毛の鑑別であって、該当するメカニズムを的確に鑑別し、その対応策を講じる手段を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題の解決手段】
この様な状況に鑑みて、本発明者ら、テストステロンに以外のメカニズムの薄毛、脱毛を対象にした薄毛、脱毛の鑑別であって、該当するメカニズムを的確に鑑別し、その対応策を講じる手段を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、被験物の存在下及び非存在下に於ける、毛髪関連細胞のサイクリンＴ１の発現状況を指標とすることにより、メカニズムの鑑別が行え、且つ、この原理を利用して有効成分のスクリーニングが可能であることを見出し、発明を完成させるに至った。
（１）被験物の存在下及び非存在下に於ける、毛髪関連細胞のサイクリンＴ１の発現状況を指標とすることを特徴とする、被験物の毛髪への影響の鑑別法。
（２）毛関連細胞が、毛乳頭細胞及び／又は結合織鞘細胞であることを特徴とする、（１）に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法。
（３）毛乳頭細胞及び／又は結合織鞘細胞を、被験物のプレートには被験物を共存させて、コントロールのプレートにはベヒクルを共存させて、同調培養し、サイクリンＴ１の発現状況の比較結果を指標として鑑別することを特徴とする、（１）又は（２）に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法。
（４）毛乳頭細胞及び／又は結合織鞘細胞を、被験物のプレートには被験物を共存させて、コントロールのプレートにはベヒクルを共存させて、同調培養し、サイクリンＴ１の発現の変化から細胞周期を測定し、被験物の共存下における細胞周期の方が、ベヒクル共存下における細胞周期よりも短い場合に於いて、前記被験物を育毛物質と鑑別することを特徴とする、（３）に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法。
（５）毛乳頭細胞及び／又は結合織鞘細胞を、被験物のプレートには被験物を共存させて、コントロールのプレートにはベヒクルを共存させて、同調培養し、サイクリンＴ１の発現状況を測定し、該サイクリンＴ１の発現量を指標とすることを特徴とする、（３）に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法。
（６）（１）〜（５）何れか１項に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法にて、毛髪への影響を鑑別することを特徴とする、育毛剤の評価方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の被験物の毛髪への影響の鑑別法は、被験物の存在下及び非存在下に於ける、毛髪関連細胞のサイクリンＴ１の発現を指標とすることを特徴とする。サイクリン類はサイクリンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇが細胞周期を回すエンジンにあたるタンパク質として正確づけられており、サイクリンＴ１については、分化促進因子或いは増殖促進因子のスイッチのＯＮ／ＯＦＦに関与することが、本発明者らの検討では見出されている。本発明の鑑別法は、このサイクリンＴ１の発現状況を指標とするものであるが、その発現状況は、ウエスタンブロット、ノーザンブロットなどのブロットによって知ることが出来るし、或いは標識抗体などを用いた組織染色により知ることが出来る。抗サイクリンＴ１標識抗体は既に市販されているものが存するのでそれを購入して使用することが出来る。本発明者の検討によれば、後記実施例に示す如く、サイクリンＴ１は成長期中期後期に毛乳頭細胞結合織鞘細胞に於いて特異的に発現することが見出されている。この発現の推移を追うことにより、毛周期を判別することが出来る。
【００１０】
本発明の鑑別法では、サイクリンＴ１の発現状況を判定するのに、ｉｎ  ｖｉｖｏで被験物を動物（人を除く）に処置し、しかる後に処置部位をバイオプシなど行い、組織標本に加工し、これを前記抗サイクリンＴ１標識抗体で免疫染色して、細胞周期の状況を判定することも出来るし、動物より採取した、ひげ乃至は体毛の毛乳頭細胞や結合織鞘細胞を同調培養し、これに被験物を作用させ、しかる後に、免疫染色したり、フローサイトメトリにより、細胞分布像を作成し、これより判定することも出来る。勿論、ＰＣＲ反応により増幅した後、ウエスタンブロットやノーザンブロットによって、発現量を判別することも出来る。
【００１１】
後記実施例に示すように、サイクリンＴ１は成長期中期後期に毛乳頭細胞結合織鞘細胞に於いて特異的に発現することが認められる。これらより毛の成長サイクルが判別出来、サイクリンＴ１は成長期中期後期に毛乳頭細胞結合織鞘細胞に於いて特異的に発現する毛成長のサイクルの長短やサイクリンＴ１そのものの発現多少（程度）を指標に、被験物の存在下の状況と非存在下の状況を比較することにより、毛髪への作用を鑑別出来ることが判る。
【００１２】
かかるサイクリンＴ１の発現状況からの被験物の影響の鑑別としては、次のような判断が例示出来る。
１）サイクリンＴ１の発現が全般にわたって少ない場合には、被験物質は発毛抑制作用を有すると鑑別される。
２）サイクリンＴ１の発現が全般にわたって多い場合には、被験物は発毛促進作用を有すると鑑別される。
３）毛周期が早まっている場合には、被験物は発毛促進作用を有すると鑑別される。
４）毛周期が遅くなっている場合は、被験物は発毛抑制作用を有すると鑑別される。
斯くのごとく、サイクリン類の発現状況自体或いは発現状況の変化の仕方を指標に、被験物の毛成長への影響を鑑別することが出来る。
【００１３】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ限定されないことは言うまでもない。
【００１４】
＜実施例１＞
成長期初期、成長期中期、退行期〜休止期のマウスの体毛を含む毛周辺組織を採取し、ホルマリン固定、パラフィン包埋後切片を作成し、脱パラフィンした後、ウサギ抗サイクリンＴ１免疫グロブリンＧ（何れも一次抗体）で免疫染色し、これを標識抗ウサギ免疫グロブリンＧ（二次抗体）でサンドイッチし、ＤＢＡで発色させた。この詳細な手技は下記に示す。切片の顕微鏡写真を図１に示す。これより、サイクリンＴ１は成長期中期後期に毛乳頭細胞結合織鞘細胞に於いて特異的に発現することことが明らかになった。従って、経時的にサイクリンＴ１の発現状況を追うことにより、毛周期の全容が判別出来る。
（切片の処理の手技）
１．脱パラフィン
キシレン  １０分ｘ３回、１００％ＥｔＯＨ  ３分ｘ２回、９５％ＥｔＯＨ  ３分、７０％ＥｔＯＨ  ３分
２．抗原賦活
Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ダコ社製）中で１２１℃、２０分間オートクレーブ、冷却後、ＰＢＳ（−）で３回洗浄
３．３７℃で乾燥
４．内因性ペルオキシダーゼのブロック
５．ブロッキング
６．一次抗体（ウサギ抗サイクリンＩｇＧ）で４℃、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ
７．  ＰＢＳ（−）で１０分、３回洗浄
８．二次抗体（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗ウサギＩｇＧ）で３７℃、１．５時間
９．  ＰＢＳ（−）で１５分、３回洗浄
１０．ＤＡＢ発色
１１．蒸留水で洗浄
１２．カウンターステイン（マイヤーのヘマトキシリン５分、流水３０分）
１３．脱水、封入
蒸留水洗浄、９５％ＥｔＯＨ  ２分、１００％ＥｔＯＨ  ２分ｘ２回、キシレン５分ｘ２回、封入
【００１５】
＜実施例２＞
実施例１の組織をラットの髭周囲の組織に変えて、同様の検討を行った。但し、抗原賦活は行わなかった。抗サイクリン免疫グロブリンＧとしては、ウサギ抗サイクリンＡ免疫グロブリンＧ、ウサギ抗サイクリンＤ１免疫グロブリンＧ及びウサギ抗サイクリンＴ１免疫グロブリンＧを用いた。結果を図２に示す。これより、ラットの髭周囲の組織に於いてもサイクリンＴ１は成長期中期後期に毛乳頭細胞結合織鞘細胞に於いて特異的に発現することことが確認された。
【００１６】
【発明の効果】
本発明によれば、テストステロンに以外のメカニズムの薄毛、脱毛を対象にした薄毛、脱毛の鑑別であって、該当するメカニズムを的確に鑑別し、その対応策を講じる手段を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の結果を示す図である。（図面代用写真）
【図２】実施例２の結果を示す図である。（図面代用写真）
【図１】
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【図２】
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