(57)【要約】【課題】生分解性を有して生体や環境に無害で、機能発現物質を安定して含ませることのできるヒアルロン酸ハイドロゲル等の多糖ハイドロゲルの製造方法を提供する。【解決手段】ヒアルロン酸などの酸性多糖に１，１−カルボニルジイミダゾール等の縮合剤を用いてチラミン等のフェノール性水酸基を有する重合性化合物を結合させた後、酵素にて処理することで重合硬化させることを特徴とする多糖ハイドロゲルの製造方法。【選択図】図１
2005200494.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖と重合性化合物との縮合体の重合体であることを特徴とする多糖ハイドロゲル。
【請求項２】
前記多糖が酸性多糖であり、前記重合性化合物が下記一般式（１）で示される構造であるところの請求項１に記載の多糖ハイドロゲル。
【化１】
2005200494.tif 000004
（式中、Ｒは、アルコール性水酸基、１級アミノ基、２級アミノ基またはカルボキシル基；ａは、１〜１０の整数；Ａ1〜Ａ5のうち１つまたは２つはフェノール性水酸基で、残りは水素原子または炭素数１〜６のアルコキシ基である。Ａ1〜Ａ5のうち２つがフェノール性水酸基である場合、２つのフェノール性水酸基はオルトまたはパラ位の位置関係にあるものとする。）
【請求項３】
前記Ｒがアルコール性水酸基、１級アミノ基または２級アミノ基である請求項２に記載の多糖ハイドロゲル。
【請求項４】
前記多糖がヒアルロン酸である請求項１〜３のいずれかに記載の多糖ハイドロゲル。
【請求項５】
多糖に縮合剤を用いて重合性化合物を結合させた後、酵素にて処理することで重合硬化させることを特徴とする多糖ハイドロゲルの製造方法。
【請求項６】
前記多糖が酸性多糖であり、前記重合性化合物が下記一般式（１）で示される構造である請求項５に記載の製造方法。
【化２】
2005200494.tif 000005
（式中、Ｒは、アルコール性水酸基、１級アミノ基、２級アミノ基またはカルボキシル基；ａは、１〜１０の整数；Ａ1〜Ａ5のうち１つまたは２つはフェノール性水酸基で、残りは水素原子または炭素数１〜６のアルコキシ基である。Ａ1〜Ａ5のうち２つがフェノール性水酸基である場合、２つのフェノール性水酸基はオルトまたはパラ位の位置関係にあるものとする。）
【請求項７】
前記Ｒがアルコール性水酸基、１級アミノ基または２級アミノ基である請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記多糖がヒアルロン酸である請求項５〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
前記縮合剤が１，１−カルボニルジイミダゾール、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび３−（３−ジメチルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミド・塩酸塩のうちから選ばれる１種以上である請求項５〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
前記酵素がラッカーゼ、チロシナーゼ、カタラーゼ及びペルキシダーゼのうちから選ばれる１種以上である請求項５〜９に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖ハイドロゲル及びその製造方法に属し、特に細胞足場、薬剤キャリヤー等の生医学材料や化粧品もしくは食品用マトリックス素材に利用できるヒアルロン酸ハイドロゲル及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は代表的なムコ多糖の一つであり、眼の硝子体、臍帯、結合組織、血液、関節液、動静脈壁などに広く存在する。合成法としてはこれまでに発酵合成法が工業的に確立され、化粧品原料、医薬品原料として供給されている。ヒアルロン酸の主たる用途として、高級化粧品の保湿成分、眼外科薬、関節症治療薬、術後癒着防止剤が挙げられる。また、ヒアルロン酸をはじめとする生体高分子の各種ゲルが、これに薬剤、細胞等の機能発現物質を含ませることにより、所望の時期に機能を発現させることを可能にするマトリックス材料として生医学、化粧品、食品等の幅広い分野で用いられている。
【０００３】
ヒアルロン酸のゲルは、例えば酸性水溶液を冷却することにより物理ゲルとして得られることが知られているが、可逆的に水溶液になる性質から、安定性や持続性に欠けるといった問題点を有している（特許文献１、２＆５）。
ヒアルロン酸のこのような性質を改善する目的で、ヒアルロン酸の化学修飾による架橋ハイドロゲルが知られている。代表的な架橋剤として、ビスエポキシド類、ジビニルスルホン、ジヒドラジン、ジヒドラジド、ポリイソシアネートが挙げられる（特許文献３＆６）。また、ヒアルロン酸にメタクリルエステル等のビニル基を導入し、その後のビニル基のラジカル重合により架橋ハイドロゲルの合成が報告されている（特許文献４）。
【０００４】
【特許文献１】特開平０５−  ５８８８１号公報
【特許文献２】特開平０５−１４０２０１号公報
【特許文献３】特開平０９−５９３０３号公報
【特許文献４】特開平１０−６７６８７号公報
【特許文献５】特開２０００−２３０００３号公報
【特許文献６】特開２００１−３４８４０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、架橋剤を介する従来の架橋方法は、酸、アルカリの使用を必要とするため、生成ハイドロゲルのマトリックス材料としての用途に関して、ゲルに含ませるべき機能発現物質（薬剤、細胞等）をゲルの製造過程で変性させたり、失活させたりするといった問題点があった。また、架橋剤の多くは二官能性であることから、ゲル化に際して架橋剤と機能発現物質が反応することにより、機能発現物質が変性したり、失活したりする可能性があり、更に機能発現物質の徐放目的には適さない。ビニル重合によるゲル化の場合も開始剤により機能発現物質の変性や失活の可能性がある。更に、特許文献３及び６で得られたヒアルロン酸ゲルは、生分解性を有しないし、ジラウリン酸ジブチルスズのように毒性の高い金属触媒の添加を必要とする架橋方法（特許文献６）の場合、得られるハイドロゲルに金属触媒が残存する可能性があり、生医学材料として適さない。
【０００６】
そのため、この発明の第一の課題は、生分解性を有して生体や環境に無害なヒアルロン酸ハイドロゲル等の多糖ハイドロゲルを提供することにある。第二の課題は、機能発現物質を安定して含ませることのできるヒアルロン酸ハイドロゲル等の多糖ハイドロゲルの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
その課題を解決するために、この発明の多糖ハイドロゲルの製造方法は、多糖に縮合剤を用いて重合性化合物を結合させた後、酵素にて処理することで重合硬化させることを特徴とする。
この発明の方法によれば、多糖に重合性化合物を結合させて得られる多糖誘導体を酵素で処理することで重合しているので、多糖とともに調合された機能発現物質がゲルの製造過程で変性したり失活したりすることはなく、その機能を維持した状態でゲル中に残る。また、この方法によれば、多糖誘導体と酵素を準備しておき、必要なときのみゲル化させることもできる。
【０００８】
この発明の方法では酵素が触媒として機能しているだけで生成物に結合していないから、製造された多糖ハイドロゲルは、多糖と重合性化合物との縮合体の重合体であることを特徴とする。
前記多糖が酸性多糖であり、前記重合性化合物が下記一般式（１）で示される構造であると好ましい。
【０００９】
【化３】
2005200494.tif 000003
（式中、Ｒは、アルコール性水酸基、１級アミノ基、２級アミノ基またはカルボキシル基；ａは、１〜１０の整数；Ａ1〜Ａ5のうち１つまたは２つはフェノール性水酸基で、残りは水素原子または炭素数１〜６のアルコキシ基である。Ａ1〜Ａ5のうち２つがフェノール性水酸基である場合、２つのフェノール性水酸基はオルトまたはパラ位の位置関係にあるものとする。）
【００１０】
前記多糖をカルボン酸などの酸基を含む多糖とすることで、その酸基に重合性化合物のＲが結合し、多糖がフェノール性水酸基を有する多糖誘導体となる。そして、多糖誘導体がフェノール性水酸基を有することで、酵素によって容易に重合しうるからである。
前記Ｒがアルコール性水酸基、１級アミノ基または２級アミノ基であると特に好ましい。これらの官能基は、酸性多糖の酸基と特異的に縮合するので、反応を制御しやすいからである。
【００１１】
前記多糖としてはヒアルロン酸が好ましく挙げられるが、アルギン酸などの他の多糖でもよい。アルギン酸もカルボン酸基を介して上記重合性化合物と容易に縮合し、酵素の作用で重合するし、その他の多糖も同様だからである。
前記縮合剤としては１，１−カルボニルジイミダゾール、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび３−（３−ジメチルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミド・塩酸塩のうちから選ばれる１種以上が挙げられる。
前記酵素としてはラッカーゼ、チロシナーゼ、カタラーゼ及びペルキシダーゼのうちから選ばれる１種以上が挙げられる。ラッカーゼ及びチロシナーゼは、ゲルの構成要素とならない他の薬品を一切加える必要がないので、ゲル化の際に機能発現物質が変性するおそれが全くない点で優れる。ペルオキシダーゼは、過酸化水素等の酸化剤と併用することで瞬時にゲル化させることができ、医療現場などで瞬間接着剤や止血剤などに適している。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、酵素触媒を用いているので、常温、中性付近で架橋ヒアルロン酸ハイドロゲル等の多糖ハイドロゲルを容易に得ることができる。従って、出発物質の多糖とともに機能発現物質を調合しておけば、得られるゲル中に機能発現物質を含ませることができる。このヒアルロン酸ハイドロゲル等の多糖ハイドロゲルは透明性と生分解性を有するため、医薬、化粧品、食品等の広範な分野において利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
多糖誘導体製造に用いられる重合性化合物は、重合性官能基としてフェノール性水酸基、多糖と結合させるための官能基としてアルコール性水酸基、１，２級アミノ基あるいはカルボキシル基を有する化合物である。フェノール性水酸基を１つ有する化合物の例としてはチラミンおよびホモバニリン酸誘導体類、またフェノール性水酸基を２つ有する化合物の例としてはドーパミン、ノルアドレナリンあるいはアドレナリンなどのカテコールアミン誘導体類があげられるが、特にチラミン誘導体類が好ましい。
【００１４】
多糖誘導体製造に用いられる溶媒としては、例えばジメチルホルムアミドおよびジメチルスルホキシドが挙げられるが、特にジメチルホルムアミドが好ましい。ヒアルロン酸が良く分散するからである。
重合硬化過程に用いられる酵素の起源については特に限定されるわけではないが次のものが挙げられる。まずラッカーゼ、チロシナーゼ（フェノールオキシダーゼ）等の銅酵素類の起源は、例えばウルシ、キノコ(ツチカブリ、マッシュルーム)、カビ(Polyporus vericolor)が挙げられる。またカタラーゼ、ペルキシダーゼ等のヒドロペルオキシダーゼ類の起源は、例えばウシ肝臓、ウマ血球、ヒト血球、M. lysodeikticus、西洋ワサビ、大豆、ダイコン、カブ、甲状腺、牛乳、腸、白血球、赤血球、酵母、Caldariomyces fumago、Steptococcus faecalisが挙げられる。この中で特にチロシナーゼとしてはマッシュルーム由来、ペルオキシダーゼとしては西洋ワサビ由来のものが好ましい。
【実施例】
【００１５】
本発明を実施例を用いて詳細に説明する。なお、本発明は実施例に限定されるものではない。
［ヒアルロン酸誘導体の製造］
【００１６】
製造例１
アルゴン雰囲気下、ヒアルロン酸（チッソ社製、塩酸で中和したもの）２．３０ｇを乾燥ジメチルホルムアミド（溶媒）２３０ｍｌに加え、撹拌により分散させた。１，１−カルボニルジイミダゾール（縮合剤）１．１５ｇを加え、更に６時間撹拌した。次にチラミン（重合性化合物）０．１８ｇを加え、４８時間撹拌した。その後、減圧下で溶媒を留去し、残渣をアセトンで洗浄し、続いてメタノールで洗浄した。残渣を水５０ｍｌに分散させ、水酸化ナトリウムを加えて溶解させた。得られた溶液を排除分子量２千の透析チューブに入れ、透析により溶液中のポリマーを精製した。透析後、チューブ内の水溶液を凍結乾燥することにより、ヒアルロン酸誘導体を単離した。
【００１７】
収量１．４０ｇ、数平均分子量４，５００、分子量分布１．８、1Ｈ−ＮＭＲより求めたフェノール性水酸基導入率１７％。
1H-NMR(D2O, ppm) 1.9(s, CH3C=O), 2.7 (br, CH2Ar), 3.1-3.9 (m, CH2N, CHN, CHO, CH2OH), 4.5 (br, CHO at 1 and 1` positions of hyaluronic acid), 6.7, 7.0 (br, Ar)
【００１８】
製造例２
チラミン量を０．４４ｇに変える以外は製造例１と同じ手法で反応を行ったところ、２．３０ｇのヒアルロン酸誘導体が得られた。数平均分子量１６，０００、分子量分布３．５、1Ｈ−ＮＭＲより求めたフェノール性水酸基導入率３６％。
【００１９】
製造例３
チラミン量を０．０８７ｇに変える以外は製造例１と同じ手法で反応を行ったところ、２．２０ｇのヒアルロン酸誘導体が得られた。数平均分子量２２０，０００、分子量分布２．５、1Ｈ−ＮＭＲより求めたフェノール性水酸基導入率１３％。
【００２０】
［ヒアルロン酸誘導体の硬化］
硬化例１
製造例１のヒアルロン酸誘導体５０ｍｇを水１ｍｌに溶解させ、Ｍｙｃｅｌｏｐｔｈｏｒａ属由来のラッカーゼを５０ユニット加えたところ、２時間で透明なハイドロゲルが生成した。
【００２１】
硬化例２
製造例１のヒアルロン酸誘導体５０ｍｇを水１ｍｌに溶解させ、マッシュルーム由来のチロシナーゼ５００ユニットを加えたところ、４時間で透明なハイドロゲルが生成した。
【００２２】
硬化例３
製造例１のヒアルロン酸誘導体５０ｍｇと西洋ワサビペルオキシダーゼ１ｍｇを水１ｍｌに溶解させ、３０％過酸化水素液を５０μｌ加えたところ、瞬時に透明なハイドロゲルが生成した。
【００２３】
硬化例４
製造例２のヒアルロン酸誘導体５０ｍｇを水１ｍｌに溶解させ、Ｍｙｃｅｌｏｐｔｈｏｒａ属由来のラッカーゼを５０ユニット加えたところ、１時間で透明なハイドロゲルが生成した。
【００２４】
硬化例５
製造例２のヒアルロン酸誘導体５０ｍｇと西洋ワサビペルオキシダーゼ１ｍｇを水１ｍｌに溶解させ、３０％過酸化水素液を５０μｌ加えたところ、瞬時に透明なハイドロゲルが生成した。
【００２５】
硬化例６
製造例３のヒアルロン酸誘導体１００ｍｇと西洋ワサビペルオキシダーゼ２ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７）２ｍｌに溶解させ、３０％過酸化水素液を５０μｌ加えたところ、瞬時に透明なハイドロゲルが生成した。
【００２６】
硬化例７
製造例３のヒアルロン酸誘導体１００ｍｇを硬化例６で用いたものと同じＰＢＳ１．９ｍｌに溶解させ、マッシュルーム由来のチロシナーゼ６００ユニットのＰＢＳ溶液０．１ｍｌを加えたところ、６時間で透明なハイドロゲルが生成した。このゲルの膨潤度を重量法により求めたところ、ＰＢＳ中、２日間後に５０倍であった。
【００２７】
比較例１
未修飾のヒアルロン酸５０ｍｇを水５ｍｌに溶解させ、ラッカーゼ水溶液を５０μｌ加えて３日間放置したが、ゲルは得られなかった。
比較例２
未修飾のヒアルロン酸５０ｍｇと西洋ワサビペルオキシダーゼ１ｍｇを水５ｍｌに溶解させ、３０％過酸化水素液を５０μｌ加えて３日間放置したが、ゲルは得られなかった。
【００２８】
［ヒアルロン酸ハイドロゲルの酵素分解］
硬化例７で調製したゲルを平板状に裁断し、５０ユニット／ｍｌのヒアルロニダーゼＰＢＳ溶液中に３７℃にて浸漬し、ゲルの重量減少を経時的に測定した。比較のためにヒアルロニダーゼを含まないＰＢＳ溶液にも裁断したゲルを同様に浸漬し、重量減少を測定した。測定結果を図１に示す。図中、白丸はヒアルロニダーゼを含む溶液中での測定結果、白四角は含まない溶液中での測定結果である。
【００２９】
図１にみられるように、ヒアルロニダーゼを含まないＰＢＳ中では、ゲルの重量変化は全く観察されなかったのに対し、ヒアルロニダーゼを含むＰＢＳ溶液中では時間の経過とともにゲルの重量が直線的に減少した。この結果より、ヒアルロン酸ハイドロゲルが良好な生分解性を有し、また、ゲルは酵素によって表面より分解することがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】硬化例７で合成したヒアルロン酸ハイドロゲルのヒアルロニダーゼ酵素の有無による分解率を示したグラフである。
【図１】
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