(57)【要約】【課題】１核酸分子あたり２つのタグ（ジタグ）を得ることにより、核酸分子（例えば、遺伝子）を表示するためのタグの特異性を増大させること。【解決手段】少なくとも１つのジタグを含む単離オリゴヌクレオチドにおいて、前記ジタグが２つの連結した第１および第２の配列タグを含み、前記第１のタグが核酸分子またはそのフラグメントの５’末端配列を含み、前記第２のタグが核酸分子またはそのフラグメントの３’末端配列を含む、単離オリゴヌクレオチド。ジタグ分析は、遺伝子の発見およびゲノムマッピングに有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのジタグを含む単離オリゴヌクレオチドであって、前記ジタグが２つの連結された第１および第２の配列タグを含み、前記第１のタグが核酸分子またはそのフラグメントの５’末端配列を含み、前記第２のタグが核酸分子またはそのフラグメントの３’末端配列を含む、単離オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
ジタグに隣接した２つのアダプターをさらに含み、各アダプターが少なくとも１つの制限部位を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記各アダプターが、非対称制限部位である少なくとも１つの第１の制限部位と、少なくとも１つの第２の制限部位とを含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記非対称制限部位が、II型制限部位である、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記核酸分子が、遺伝子の全長配列またはそのフラグメントである、請求項１〜４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記核酸が、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、全長ｃＤＮＡ、またはｃＤＮＡである、請求項１〜５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記ジタグが、少なくとも１つの制限酵素の存在下で５’末端および３’末端をスプライシングすることによって得られ、前記配列タグのサイズが、使用した制限酵素によって決定される、請求項１〜６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記制限酵素が、II型制限酵素である、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記II型制限酵素が、ＡａｒＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｅＩ、Ｂｂｒ７Ｉ、ＢｂｖＩ、ＢｂｖＩＩ、ＢｃｃＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｅｆＩ、ＢｃｇＩ、Ｂ  ｃｉＶＩ、ＢｆｉＩ、ＢｉｎＩ、ＢｐＩＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｃＡＩ、ＢｓｅＭＩＩ，ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、Ｂｓｐ２４Ｉ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｔＦ５Ｉ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＣｊｅＩ、ＣｊｅＰＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａＩＩ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＧｓｕＩ、ＨａｅＩＶ、ＨｇａＩ、Ｈｉｎ４Ｉ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎＩＩ、ＰｌｅＩ、ＰｐｉＩ、ＰｓｒＩ、ＲｌｅＡＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｓｐＤ５Ｉ、Ｓｔｈ１３２Ｉ、ＳｔｓＩ、ＴａｑＩＩ、ＴｓｐＤＴＩ、ＴｓｐＧＷＩ、ＴｓｐＲＩ、Ｔｔｈ１１１ＩＩからなる群から選択される、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記制限酵素が、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、およびＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択される、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ジタグのサイズが１２〜６０ｂｐである、請求項１〜１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記ジタグが３４〜３８個のヌクレオチドを含み、前記各ジタグのサイズが制限酵素ＭｍｅＩを使用して決定される、請求項１〜１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記第１および第２のタグが、同数または異なる数のヌクレオチドを有する、請求項１〜１２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが、１〜１０００個のジタグからなる、請求項１〜１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１〜１４に記載のオリゴヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１６】
前記ベクターの骨格が、前記非対称制限部位および前記第２の制限部位を含まない、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
前記非対称制限部位が、II型制限部位またはホーミングエンドヌクレアーゼ非対称制限部位である、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
少なくとも１つの核酸分子および前記核酸分子に隣接する２つのアダプターを含むベクターであって、前記各アダプターが、非対称制限部位である少なくとも１つの第１の制限部位と、少なくとも１つの第２の制限部位とを含み、前記ベクターの骨格が前記非対称制限部位および前記第２の制限部位を含まない、ベクター。
【請求項１９】
前記非対称制限部位が、II型制限部位またはホーミングエンドヌクレアーゼ非対称制限部位である、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
前記II型制限部位がＭｍｅＩである、請求項１８〜１９に記載のベクター。
【請求項２１】
配列番号１８に記載の配列を有するベクター。
【請求項２２】
請求項１〜１４に記載のオリゴヌクレオチドを含む、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
ｃＤＮＡライブラリーであって、前記ライブラリーの各ｃＤＮＡクローンが請求項１〜１４に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、ｃＤＮＡライブラリー。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、１〜１０００個のジタグを含む、請求項２３に記載のｃＤＮＡライブラリー。
【請求項２５】
少なくとも１つのジタグを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを調製する方法であって、
少なくとも１つの核酸分子を産生するステップと、
前記核酸分子またはそのフラグメントの５’末端および３’末端を単離するステップと、
前記５’末端と前記３’末端とを連結し、前記少なくとも１つのジタグを作製するステップと
を含む方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの核酸分子が２つのアダプターに隣接する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ジタグの鎖状体を作製するステップをさらに含む、請求項２５〜２６に記載の方法。
【請求項２８】
１〜１０００個のジタグが存在する、請求項２５〜２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記アダプターに隣接した前記少なくとも１つのジタグを含む前記オリゴヌクレオチドがベクターに挿入されている、請求項２６〜２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸分子が、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、全長ｃＤＮＡ、またはｃＤＮＡである、請求項２５〜２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのジタグのヌクレオチド配列を決定し、遺伝子発現を検出するステップをさらに含む、請求項２５〜３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つのジタグ配列を決定するステップと、
前記ジタグのヌクレオチド配列とゲノム配列を含むデータベースと比較し、それにより５’末端および３’末端配列の適合を同定するステップと
をさらに含む請求項２５〜３１に記載の方法。
【請求項３３】
２つのアダプターに隣接した少なくとも１つの核酸分子を産生するステップであって、前記各アダプターが少なくとも１つの制限部位を含むステップと、
前記分子の前記前記５’末端および３’末端をスプライシングし、少なくとも１つのジタグを産生するステップであって、前記制限部位を認識する少なくとも１つの制限酵素を添加するステップを含むステップと
を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記制限部位が非対称制限部位である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記非対称制限部位が、II型制限酵素によって認識可能な制限エンドヌクレアーゼ非対称切断部位配列であり、前記II型制限酵素が、ＡａｒＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｅＩ、Ｂｂｒ７Ｉ、ＢｂｖＩ、ＢｂｖＩＩ、ＢｃｃＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｅｆＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｉＩ、ＢｉｎＩ、ＢｐＩＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｃＡＩ、ＢｓｅＭＩＩ，ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、Ｂｓｐ２４Ｉ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｔＦ５Ｉ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＣｊｅＩ、ＣｊｅＰＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａＩＩ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＧｓｕＩ、ＨａｅＩＶ、ＨｇａＩ、Ｈｉｎ４Ｉ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎＩＩ、ＰｌｅＩ、ＰｐｉＩ、ＰｓｒＩ、ＲｌｅＡＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｓｐＤ５Ｉ、Ｓｔｈ１３２Ｉ、ＳｔｓＩ、ＴａｑＩＩ、ＴｓｐＤＴＩ、ＴｓｐＧＷＩ、ＴｓｐＲＩ、およびＴｔｈ１１１ＩＩからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記非対称制限部位が、ホーミングエンドヌクレアーゼ非対称制限部位配列であり、前記ホーミングエンドヌクレアーゼ非対称制限部位を認識する酵素が、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、およびＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
全長ｃＤＮＡの５’末端および３’末端に隣接する２つのアダプターを含む少なくとも１つの全長ｃＤＮＡ分子を産生するステップであって、前記各アダプターがＭｍｅＩ制限部位である少なくとも１つの制限部位を含むステップと、
前記全長ｃＤＮＡの前記５’末端および前記３’末端をスプライシングして、少なくとも１つのジタグを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを産生するステップであって、３’突出タグ末端を形成するＭｍｅＩで前記全長ｃＤＮＡを切断するステップと、前記２つの５’末端および３’末端タグをライゲーションして、ジタグを産生するステップとを含むステップと
を含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１つのジタグが、３５〜３９個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項２５〜３７に記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも１つのジタグを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを調製するステップであって、前記ジタグが２つの連結された第１および第２の配列タグを含み、前記第１のタグが核酸分子の５’末端配列を含み、前記第２のタグが核酸分子の３’末端配列を含み、前記核酸分子が遺伝子の全長またはそのフラグメントに対応するステップと、
ゲノム上に少なくとも１つのジタグの各２つのタグをマッピングするステップと、
ゲノムマップ上において対応する遺伝子の構造領域を決定するステップと
を含むゲノムマッピング方法。
【請求項４０】
遺伝子を発見する方法であって、
少なくとも１つのジタグを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを調製するステップであって、前記ジタグが２つの連結された第１および第２の配列タグを含み、前記第１のタグが核酸分子の５’末端配列を含み、前記第２のタグが核酸分子の３’末端配列を含み、前記核酸分子が遺伝子の全長またはそのフラグメントに対応するステップと、
得られた少なくとも１つのジタグをゲノムマップおよび／または遺伝子データベースと比較するステップと、
前記ゲノムマップ上における前記５’末端および前記３’末端タグの適合を検出するが、１つまたは複数の遺伝子データベースで適合が検出されないステップと
を含む方法。
【請求項４１】
新規に発見された遺伝子に対応する全長核酸分子を回収するステップをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
全長ｃＤＮＡを回収する方法であって、
全長ｃＤＮＡライブラリーから、少なくとも１つのジタグを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを調製するステップであって、前記ジタグが２つの連結された第１および第２の配列タグを含み、前記第１のタグが全長ｃＤＮＡの５’末端配列を含み、前記第２のタグが全長ｃＤＮＡの３’末端配列を含むステップと、
得られたオリゴヌクレオチドジタグを配列決定するステップと、
目的のジタグを決定するステップと、
全長ｃＤＮＡライブラリーから目的のジタグに対応する全長ｃＤＮＡを回収するステップと
を含む方法。
【請求項４３】
遺伝子の転写活性を定量する方法であって、
全長ｃＤＮＡライブラリーから、少なくとも１つのジタグを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを調製するステップであって、前記ジタグが２つの連結した第１および第２の配列タグを含み、前記第１のタグが全長ｃＤＮＡの５’末端配列を含み、前記第２のタグが全長ｃＤＮＡの３’末端配列を含むステップと、
得られたオリゴヌクレオチドジタグを配列決定するステップと、
前記遺伝子の転写活性に対応する配列決定ジタグの頻度を決定するステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、遺伝子および転写発現分野に関し、詳細には、転写物内の定義された領域に対応する遺伝子特性の同定（ＧＩＳ）による非常に多数の転写物の一連の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム計画の最も重要な目的の１つは、ヒトおよびモデル生物のゲノムの完全な遺伝子リストを得ることである。遺伝子の完全なゲノムアノテーションは、実験およびコンピュータアプローチによる包括的転写分析による。最初から、実験データによって遺伝子の予想が立証されなければならない。理想的な解決は、全ての全長転写物のクローン化およびこれらの完全な配列決定である。最近、このアプローチは認識されており(Strausberg,R.L.,et al.,1999,Science,286:455-457)、進歩している(Jongeneel C.V.,et al.,2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100,4702-4705)。しかし、生物の生活環の種々の発生段階において発現された転写物が複雑且つ膨大であるので、全ての異なるトランスクリプトームの完全な配列決定分析は依然として非現実的である。
【０００３】
このようなジレンマを回避するために、全転写物を示す部分的配列が得られるｃＤＮＡタグ化ストラテジーが開発されており、過去１０年間で遺伝子の決定およびトランスクリプトームの特徴づけに広く適用されている。
【０００４】
発現配列タグ（ＥＳＴ）アプローチでは、５’および／または３’末端からｃＤＮＡクローンが配列決定されている(Adams,M.,et al.,1991,Science,252,1651-1656)。
【０００５】
各ＥＳＴ配列の読み込み(read)により、１転写物あたり平均５００ｂｐのタグが作製される。同一または重複ＥＳＴ数により、遺伝子発現活性の相対レベルが明らかとなる。ＥＳＴは遺伝子の同定に有効であるにもかかわらず、トランスクリプトーム中の各転写物をタグ化するには非常に高価である。実際、配列決定は、通常、何百万もの転写物がクローン化された場合、１０，０００以下のＥＳＴがｃＤＮＡライブラリーから得られた後に中止される。
【０００６】
非常に多数の転写物の配列決定および計数の効率を増大させるために、転写物の短鎖特性配列（１４〜２０ｂｐ）がその遺伝子を示すのに十分に特異的であり得るという事実に基づいて連続遺伝子発現分析(Serial Analysis of Gene Expression)(SAGE)(Velculescu,V.E.,et al.,1995,Science,270,484-487;Saha S,et al.,2002,Nature Biotechnology,20,508-12;米国特許第6,498,013号、同第6,383,743号)および最近の大量並行特性配列決定(Massively Parallel Signature Sequencing)(MPSS)技術(Mao C.,et al.,2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,1665-1670;Brenner S,et al.,2000,Nature Biotechnology,18,630-634)を開発した。
【０００７】
実験的に、１転写物あたり１タグで短鎖タグをｃＤＮＡから抽出することができる。このような短鎖タグを、鎖状体形成法（ＳＡＧＥに関して）またはＭＰＳＳについてはハイブリッド形成ベースの方法のいずれかによって有効に配列決定することができる。例えば、ＳＡＧＥでは、複数のタグを長鎖ＤＮＡフラグメントに鎖状体形成させ、配列決定のためにクローン化する。各ＳＡＧＥ配列の読出しによって、通常、２０〜３０個のＳＡＧＥタグを明らかにすることができる。１０，０００個未満を読み込む適度なＳＡＧＥ配列決定により、有意な範囲のトランスクリプトームが得られる。ＳＡＧＥタグの頻度の簡単な計数によって転写の存在量を測定する。
【０００８】
公的なデータベース中の多数の構築されたゲノム配列を利用して、トランスクリプトームの特徴づけのための短鎖タグストラテジーの使用が信頼されつつある(Jongeneel et al.,2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:4702-4705)。理論的には、約２０ｂｐの短鎖ＤＮＡタグは、全トランスクリプトームに関して複雑な哺乳動物ゲノム内の１つの位置に特異的にマッピングされ、固有に転写物を示す。しかし、実際には、ゲノム中で複数の位置に存在する非常に多数の「あいまいな」ＳＡＧＥタグ（１４〜２１ｂｐ）およびＭＰＳＳタグ（１７ｂｐ）が依然として存在する。２１ｂｐ超を切断することができるII型制限酵素の利用は制限されており、ＳＡＧＥ法は、現在、特異性を改良するためのいかなる長鎖タグを作製することもできない。
【０００９】
さらに、ＳＡＧＥ法およびＭＰＳＳ法は、遺伝子中央の転写物あたり１つの特性のみを産生する。転写物中のタグの「内部」特性に照らして、これらの方法では、制限されたタグ情報しか得られない。
【００１０】
したがって、配列決定効率におけるその有用性にもかかわらず、その特異性の欠如およびそれによって決定的でないことにより、ＳＡＧＥまたはＭＰＳＳなどの方法の有用性が非常に損なわれる。
【発明の開示】
【００１１】
配列決定効率が保持されると同時にトランスクリプトームの特徴づけのためのタグ化ストラテジーの使用が改良され、ゲノムアノテーションが容易になるより有効な方法が当分野で必要である。
【００１２】
本発明は、１核酸分子あたり２つのタグ（ジタグ）を得ることにより、核酸分子（例えば、遺伝子）を表示するためのタグの特異性を増大させることによって上記の問題を解決する。２つのタグを同一の核酸分子の５’末端よび３’末端から抽出するので、ジタグは核酸分子構造の反映により有益である。特に、本発明は、同一の核酸分子の５’タグと３’タグとを１つのジタグ単位に連結する方法を提供する。したがって、核酸分子を表示する５’タグと３’タグとの対を、簡単な配列決定分析によって容易に認識することができる。本発明を、新規の遺伝子の同定、トランスクリプトーム中の転写物量の測定、ゲノム配列のアノテーションと同時に配列決定効率を増大させることに使用することができる。
【００１３】
特に、本発明は、少なくとも１つのジタグを含む単離オリゴヌクレオチドであって、前記ジタグが２つの連結された第１および第２の配列タグを含み、前記第１のタグが核酸分子の５’末端配列を含み、前記第２のタグが核酸分子の３’末端配列を含む単離オリゴヌクレオチドを提供する。
【００１４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ジタグに隣接した(flanking)少なくとも２つのアダプターをさらに含み、各アダプターが少なくとも１つの制限部位を含む。特に、各アダプターは、タグの近位に非対称制限部位である少なくとも１つの第１の制限部位（例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ制限部位またはII型制限部位）と、少なくとも１つの第２の制限部位とを含む。第２またはさらなる制限部位として、当分野で公知の任意の制限部位を使用することができる。例えば、ＢａｍＨＩ。また、第１の制限部位と異なる任意の非対称制限部位を使用することができる。しかし、この酵素の認識部位は、ジタグの挿入後にベクター骨格に存在してはならない。
【００１５】
核酸分子は、遺伝子の全長配列またはそのフラグメントであり得る。例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、全長ｃＤＮＡ、またはｃＤＮＡ。
【００１６】
ジタグは、ヌクレオチド数が異なっていてもよい。１つの実施形態によれば、ジタグを、少なくとも１つの制限酵素の存在下での核酸分子の５’末端および３’末端のスプライシングによって獲得し、前記配列タグのサイズを使用した制限酵素によって決定する。したがって、タグのヌクレオチド数は、使用した制限酵素によって変化し得る。
【００１７】
ＭｍｅＩを使用する場合、この酵素は、縮小を意図する核酸分子に隣接する２つの各アダプター内の配列を認識するが、核酸分子内で切断して１９〜２１個のヌクレオチドを含むタグを形成する。２つのこのようなタグを、平滑末端化およびライゲーションによってさらに処理して３４〜３８個のヌクレオチドを含むジタグを形成することができる。したがって、同一の核酸分子の５’末端および３’末端のスプライシングによってジタグが得られる。
【００１８】
本発明のジタグは、任意のサイズであり得る（好ましくは、１２〜６０ｂｐ）。
【００１９】
オリゴヌクレオチドは、ジタグの鎖状体(concatemer)（例えば、１〜１０００個のジタグ）を含み得る。
【００２０】
本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチドを含むベクターを提供する。特に、ベクターは、少なくとも１つの核酸分子および前記核酸分子に隣接する少なくとも２つのアダプターを含むベクターであって、前記各アダプターが非対称制限部位（例えば、非対称認識部位はホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位またはII型制限部位である）である少なくとも１つの第１の制限部位と、少なくとも１つの第２の制限部位（例えば、ＢａｍＨＩ）とを含み、前記ベクターの骨格が前記非対称制限部位および前記第２のまたはさらなる制限部位を含まないベクターを提供する。好ましい非対称認識部位は、II型制限部位ＭｍｅＩである。
【００２１】
本発明はまた、配列番号１８に記載の配列を有するベクターを提供する。
【００２２】
本発明は、さらに、各ｃＤＮＡクローンが本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むｃＤＮＡライブラリーを提供する。
【００２３】
別の態様によれば、本発明はまた、少なくとも１つのジタグを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを調製する方法であって、
少なくとも１つの核酸分子を産生するステップと、
前記核酸分子またはそのフラグメントの５’末端および３’末端を単離するステップと、
前記５’末端と前記３’末端とを連結し、前記少なくとも１つのジタグを作製するステップと
を含む方法を提供する。
【００２４】
特に、少なくとも１つのジタグを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを調製する方法であって、
２つのアダプターに隣接する少なくとも１つの核酸分子を産生するステップと、
前記核酸分子の５’末端および３’末端を単離するステップと、
前記５’末端と前記３’末端とを連結し、前記２つのアダプターに隣接する少なくとも１つのジタグを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを作製するステップと
を含む方法を提供する。
【００２５】
ジタグ形態に縮小すべき所望の核酸分子は、全核酸分子または核酸分子内の一部であり得る。
【００２６】
核酸分子は、遺伝子の全長またはそのフラグメントに対応し得る。
【００２７】
方法は、少なくとも１つのジタグのヌクレオチド配列を決定し、遺伝子発現を検出するステップをさらに含み得る。
【００２８】
さらなる態様によれば、本発明の方法は、
少なくとも１つのジタグ配列を決定するステップと、
前記ジタグのヌクレオチド配列とゲノム配列を含むデータベースと比較し、それにより５’末端および３’末端配列の適合を同定するステップと
をさらに含み得る。
【００２９】
特定の実施形態によれば、本発明は、２つのアダプターに隣接した少なくとも１つの核酸分子（好ましくは、全長ｃＤＮＡ）を産生するステップであって、前記各アダプターが少なくとも１つの制限部位を含むステップと、前記制限部位を認識する少なくとも１つの制限酵素を添加することによって、前記核酸分子の５’末端および３’末端をスプライシングし、少なくとも１つのジタグを産生するステップとを含む方法を提供する。
【００３０】
好ましくは、各アダプターは、非対称制限部位である少なくとも１つの第１の認識部位および第２の認識部位を含む。第２の認識部位はまた、第１の非対称認識部位と同一であっても異なっていてもよい非対称認識部位であり得る。
【００３１】
制限酵素として、任意の有用な酵素を使用することができる。例えば、２つの非対称認識部位を認識する制限酵素。
【００３２】
非対称制限部位は、以下であり得る。ｉ）制限ホーミングエンドヌクレアーゼによって認識可能なホーミングエンドヌクレアーゼ非対称制限部位配列、またはii）II型制限酵素によって認識可能な制限エンドヌクレアーゼ非対称切断部位配列。
【００３３】
II型制限酵素は非対称ＤＮＡ配列を認識し、固定された位置（切断部位）で両ＤＮＡ鎖（典型的には、認識部位から離れたいくつかの塩基対）を切断する。これらの酵素は、認識配列の外側を切断する。
【００３４】
特定の実施形態によれば、（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼと共に）ＭｍｅＩを使用することによって、スプライシングステップを行い、２つのアダプターに隣接した３４〜３８個のヌクレオチドのジタグを産生する。
【００３５】
さらなる態様によれば、本発明の任意の実施形態のジタグを他のジタグと連結してジタグの鎖状体を産生することができる。例えば、１〜１０００個のジタグ。
【００３６】
さらに別の態様によれば、ゲノムマッピング方法であって、
少なくとも１つのジタグを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを調製するステップであって、前記ジタグが２つの連結された第１および第２の配列タグを含み、前記第１のタグが核酸分子の５’末端配列を含み、前記第２のタグが核酸分子の３’末端配列を含み、前記核酸分子が遺伝子の全長またはそのフラグメントに対応するステップと、
ゲノム上に少なくとも１つのジタグの各２つのタグをマッピングするステップと、
ゲノムマップ上において対応する遺伝子の構造領域を決定するステップと
を含む方法を提供する。
【００３７】
さらに別の態様によれば、本発明は、遺伝子の発見方法であって、
少なくとも１つのジタグを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを調製するステップであって、前記ジタグが２つの連結された第１および第２の配列タグを含み、前記第１のタグが核酸分子の５’末端配列を含み、前記第２のタグが核酸分子の３’末端配列を含み、前記核酸分子が遺伝子の全長またはそのフラグメントに対応するステップと、
得られた少なくとも１つのジタグをゲノムマップおよび／または遺伝子データベースと比較するステップと、
前記ジタグの５’末端および３’末端タグがゲノム配列と適合するが、公知の遺伝子データベースに存在ない場合、検出されたジタグは所与のゲノム中の新規の遺伝子を示し得るステップと
を含む方法を提供する。
【００３８】
このようなジタグは、新規に同定された遺伝子に対応する全長核酸分子を回収するプロセスを直接誘導し得る。
【００３９】
新規および／または他の興味深い遺伝子の全長ｃＤＮＡを回収する方法であって、
全長ｃＤＮＡライブラリーから、少なくとも１つのジタグを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを調製するステップであって、前記ジタグが２つの連結した第１および第２の配列タグを含み、前記第１のタグが全長ｃＤＮＡライブラリーの５’末端配列を含み、前記第２のタグが全長ｃＤＮＡライブラリーの３’末端配列を含むステップと、
得られたオリゴヌクレオチドジタグ、好ましくは非常に多数の得られたジタグを配列決定するステップと、
（例えば、生物学的態様に基づいて）目的のジタグを決定するステップと、
全長親ｃＤＮＡライブラリーから目的のジタグに対応する全長ｃＤＮＡを回収するステップと
を含む方法もまた本発明の態様である。
【００４０】
さらに、本発明はまた、
遺伝子の転写活性を定量する方法であって、
全長ｃＤＮＡライブラリーから、少なくとも１つのジタグを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを調製するステップであって、前記ジタグが２つの連結した第１および第２の配列タグを含み、前記第１のタグが全長ｃＤＮＡの５’末端配列を含み、前記第２のタグが全長ｃＤＮＡの３’末端配列を含むステップと、
得られたオリゴヌクレオチドジタグ、好ましくは非常に多数の得られたジタグを配列決定するステップと、
前記遺伝子の転写活性に対応する配列決定ジタグの頻度を決定するステップと
を含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明は、例えば、転写発現の全パターン（トランスクリプトーム）を同定するための多数の転写物の迅速な分析、ｃＤＮＡおよび全長ｃＤＮＡの選択および／または構築、タグの配列決定、遺伝子発見、ゲノムマッピング、ならびにアノテーションに有用な遺伝子識別特性（ＧＩＳ）およびＧＩＳ分析同定を提供する。一般に、本発明のＧＩＳおよびＧＩＳ分析方法は、実験アプローチによる遺伝情報の回収を非常に容易にする。
【００４２】
本発明を適用するために、ＧＩＳは、ジタグ（ＧＩＳジタグとも示す）または少なくとも１つのジタグを含むオリゴヌクレオチドであって、縮小する（「縮まる」）または表示(represent)することが望まれる核酸分子の５’末端（または５’末端領域）および核酸分子の３’末端（３’末端領域）を含むものを意図する。
【００４３】
ジタグは、起源となるか表示する元の核酸分子よりも短い。好ましくは、ジタグは、元の核酸分子よりも非常に短くなければならない。「縮小」の結果として、ジタグは、本質的に、元の核酸分子の５’末端領域（５’タグとも示す）および３’末端領域（３’タグとも示す）を含む。したがって、５’タグと３’タグとの間またはこれらの内部に存在する元の核酸分子の一部は、ジタグに含まれない。本発明のジタグは、元の核酸分子のほとんどの情報の特徴（すなわち、核酸の開始および終結特性）を保持する。したがって、これは、ゲノム配列に対するＧＩＳタグのマッピングによってトランスクリプトームの特徴づけおよび遺伝子構造の定義においてＳＡＧＥ法またはＭＰＳＳ法よりも特異的且つ正確である。
【００４４】
したがって、本発明は、少なくとも１つのジタグを含む単離オリゴヌクレオチドにおいて、前記ジタグが２つの連結された第１および第２の配列タグを含み、前記第１のタグが核酸分子またはそのフラグメントの５’末端配列を含み、前記第２のタグが核酸分子またはそのフラグメントの３’末端配列を含む、単離オリゴヌクレオチドを提供する。
【００４５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、さらに、各アダプターが少なくとも１つの制限部位を含む、ジタグに隣接する２つのアダプターを含み得る（図１および図２を参照のこと）。特に、各アダプターは、非対称制限部位である少なくとも１つの第１の制限部位と、少なくとも１つの第２の隣接制限部位とを含む。したがって、各アダプター中に存在する制限部位数は、２つまたはそれ以上であり得る。非対称制限部位は、切断部位がしばしば認識部位から分離したヌクレオチド配列である。非対称制限部位の例は、ホーミングエンドヌクレアーゼ非対称制限部位およびII型（またはクラスII）制限部位である。可能な非対称制限部位およびこのような非対称部位を認識する対応制限酵素のリストを以下に示す。例えば、II型制限酵素は、非対称ＤＮＡ配列（認識部位）を認識し、固定された位置での両ＤＮＡ（切断部位）（典型的には、認識部位から離れたいくつかの塩基対）を切断する。したがって、これらの酵素は認識配列の外側を切断する。第２およびさらなる認識部位の例はＢａｍＨＩである。この第２の認識部位は、その後に共にライゲーションして鎖状体を形成することができ、ジタグプールのその後の単離を目的とする。
【００４６】
縮小（縮める）ことを意図する元の核酸分子は、任意の天然の、任意の修飾、または任意の合成核酸分子であり得る。これは任意のサイズであり得る。核酸分子は、遺伝子（遺伝子の全長）またはそのフラグメントであり得る。核酸は、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、全長ｃＤＮＡ、もしくはｃＤＮＡまたはそのフラグメントであり得る。
【００４７】
ジタグが表示することを意図する核酸分子の５’末端および３’末端を含めることによりジタグを完全に化学合成することもできる。
【００４８】
縮小することを意図する分子はまた、核酸分子内の一部またはフラグメントであり得る。したがって、縮小することを意図する領域に隣接した制限部位を認識する制限酵素を使用することが可能である。核酸分子（例えば、ｃＤＮＡまたは全長ｃＤＮＡ）の調製時に、所望の制限部位を適切な位置に位置付けることができる。
【００４９】
特定の態様によれば、縮小することが望ましい核酸は、全長ｃＤＮＡである。全長ｃＤＮＡを、当分野で公知の任意の方法にしたがって調製することができる。例えば、キャップトラッパーアプローチ(例えば、Carninci et al.,1996,Genomics,Vol.37,327-336;米国特許第6,143,528号;Edery et al.,1995,Mol.Cell.Biol.Vol.15,No.6,3363-3371)を参照のこと。
【００５０】
当業者は、他の捕捉系を理解しており、例えば、全長ｃＤＮＡを単離するためのビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニンに基づいた系を使用することができる。
【００５１】
当分野で公知の任意の技術にしたがってジタグを調製することができる。例えば、任意の化学反応によって元の核酸分子を切断し、ジタグを得るためにライゲーションした５’末端および３’末端を得ることができる。
【００５２】
核酸分子に隣接する２つのアダプターを含むように調製することが好ましい縮小することを意図する核酸分子を、ベクターに挿入することができる。特定の実施形態では、各アダプターは、少なくとも１つの制限部位を含み、好ましくは、非対称制限部位を含む少なくとも１つの第１の制限部位と、第２の制限部位とを含む。したがって、使用したベクターでは、ベクター骨格はアダプター中に存在する制限部位を含まないことが重要である。
【００５３】
したがって、核酸分子のライブラリー（例えば、全長ｃＤＮＡのライブラリー）を調製する。
【００５４】
好ましくは、縮小すべき核酸分子に隣接する制限部位を認識する制限酵素の使用によって、核酸分子をジタグまたはジタグを含むオリゴヌクレオチドにスプライシングする。したがって、制限部位を、縮小することが望ましい核酸分子またはそのフラグメントの５’末端の上流および３’末端の下流に（好ましくはアダプター内に）設ける。したがって、スプライシングによって得られたオリゴヌクレオチドは、ジタグに隣接した２つのアダプターを含む。各アダプターは、少なくとも１つの制限部位を含む。好ましくは、非対称部位（例えば、ＭｍｅＩのようなII型制限部位）である少なくとも１つの第１の制限部位と、少なくとも１つの第２の制限部位（任意の公知の制限部位（例えば、ＢａｍＨＩ）を使用することができる）とを含む。
【００５５】
ジタグを形成する５’タグおよび３’タグは、同一または異なるサイズであり得る。好ましくは、これらは、同数のヌクレオチドを有する。
【００５６】
ジタグは、任意のサイズであり得るが、由来する親配列のサイズよりも有意義且つ有益である必要がある。タグまたはジタグの好ましいサイズを、ゲノムの複雑性によって決定する。細菌ゲノムについて、約８ｂｐ〜約１６ｂｐのタグが十分であり得るが、ヒトゲノムなどの複雑なゲノムについては、１６〜２０ｂｐのタグ（言い換えれば、３２〜４０ｂｐのジタグ）を考慮することができる。一般に、ジタグのサイズは、約１２〜６０ｂｐである。
【００５７】
本発明を適用する目的のために、用語５’末端(5'-terminus)、５’末端(5'-end)、および５’タグは、互いに等価であり、交換可能に使用することができる。同一の方法では、用語３’末端(3'-terminus)、３’末端(3'-end)、および３’タグは互いに等価であり、交換可能に使用することができる。縮小するか表示することを目的とする元の核酸分子または核酸分子内の一部では、５’末端および３’末端はそれぞれ末端に最も近く、且つ分子の中央の領域から最も離れた領域または部分を示す。
【００５８】
１つの態様によれば、ジタグ中に含まれる５’タグおよび３’タグは、縮小または表示することを意図する核酸分子またはその一部の５’末端および３’末端にそれぞれ最も近い制限酵素によって切断された分子の領域である。したがって、ジタグのサイズを、使用した制限酵素によって決定することができる。したがって、本発明は、核酸分子に隣接する認識部位を認識する少なくとも１つの認識酵素の存在下で核酸分子の５’末端および３’末端のスプライシングによってジタグを得る、少なくとも１つのジタグを含むオリゴヌクレオチドに関する。したがって、配列タグのサイズを、使用した制限酵素によって決定する。
【００５９】
核酸分子（例えば、全長ｃＤＮＡ）を調製する場合、縮小または表示することを意図する領域の５’末端および３’末端に隣接する所望の制限部位を挿入する。５’末端および３’末端に隣接する所望の制限部位の挿入による全長ｃＤＮＡの構築の例を、図１および図２に示す。次いで、全長ｃＤＮＡライブラリーを調製し、その後にＧＩＳジタグライブラリーを調製する。
【００６０】
例として、非対称制限部位を認識する制限酵素を、本発明のジタグの調製のために使用することができる。特に、II型酵素（例えば、ＭｍｅＩ）。
【００６１】
例として、非対称部位を移入することができる。本発明の目的に有用な非対称部位配列は、ｉ）制限ホーミングエンドヌクレアーゼによって認識可能な２つのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称制限（認識）部位配列、またはii）II型制限酵素によって認識可能な制限エンドヌクレアーゼ非対称切断部位配列である。
【００６２】
ホーミングエンドヌクレアーゼは、New England Biolabs,Inc.から販売および説明されており、非対称部位配列の説明もまたNew England Biolabsのカタログで利用可能である。これらのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称制限（認識）部位配列は、１８〜３９ｂｐである。しかし、本発明では、制限部位配列は、これらの配列やこれらのサイズに制限されない。好ましくは、非対称部位配列を切断することができる制限ホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、およびＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択される。しかし、上記のリストは網羅的ではない。当分野で公知の他のホーミングエンドヌクレアーゼおよびその後に発見することができるものは、本発明の範囲内に含まれる。
【００６３】
II型制限酵素の例には、ＡａｒＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｅＩ、Ｂｂｒ７Ｉ、ＢｂｖＩ、ＢｂｖＩＩ、ＢｃｃＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｅｆＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｉＩ、ＢｉｎＩ、ＢｐＩＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｃＡＩ、ＢｓｅＭＩＩ，ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、Ｂｓｐ２４Ｉ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｔＦ５Ｉ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＣｊｅＩ、ＣｊｅＰＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａＩＩ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＧｓｕＩ、ＨａｅＩＶ、ＨｇａＩ、Ｈｉｎ４Ｉ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎＩＩ、ＰｌｅＩ、ＰｐｉＩ、ＰｓｒＩ、ＲｌｅＡＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｓｐＤ５Ｉ、Ｓｔｈ１３２Ｉ、ＳｔｓＩ、ＴａｑＩＩ、ＴｓｐＤＴＩ、ＴｓｐＧＷＩ、ＴｓｐＲＩ、およびＴｔｈ１１１ＩＩが含まれる（Rebase Enzymes(登録商標)のウェブサイト中のリスト： HYPERLINK "http://rebase.neb.com/cgi-bin/outsidelist" http://rebase.neb.com/cgi-bin/outsidelist;さらに、Szybalski,W.,1985,Gene,40:169も参照のこと）。しかし、上記のリストは網羅的ではない。当分野で公知の他のII型酵素およびその後に発見することができるものは、本発明の範囲内に含まれる。
【００６４】
いくつかのクラスII制限酵素の認識部位および切断部位の例は、（括弧内は認識部位および切断部位である）ＢｂｖＩ（ＧＣＡＧＣ  ８／１２）、ＨｇａＩ（ＧＡＣＧＣ  ５／１０）、ＢｓｍＦＩ（ＧＧＧＡＣ  １０／１４）、ＳｆａＮＩ（ＧＣＡＴＣ  ５／９）、およびＢｓｐＩ（ＡＣＣＴＧＣ  ４／８）。
【００６５】
本発明のジタグをライゲーションまたは連結して都合よくジタグの鎖状体を形成することができる。したがって、本発明は、１〜１０００個のジタグ、詳細には１〜２００個、さらに詳細には８〜２０個のジタグを含むオリゴヌクレオチドに関する。ジタグを鎖状体化する場合、オリゴヌクレオチド、ベクター、またはクローンがより多いジタグを含むので、より大量の情報が得られる。したがって、ジタグの鎖状体化により、１つのベクターまたはクローン内の複数のジタグの配列決定による一連の様式で、全長ｃＤＮＡのような核酸分子を効率よく分析可能である。
【００６６】
オリゴヌクレオチド、ジタグ、またはジタグの鎖状体を、鎖状体化の前後のいずれかでベクターに挿入することができる。
【００６７】
１つの態様によれば、ジタグを含むオリゴヌクレオチドを増幅する。例えば、ＰＣＲまたは任意の他の公知の増幅方法の使用による。したがって、ベクター内の特定の領域に対応する適切なＰＣＲプライマーを使用する。このような領域は、ジタグおよびアダプターを含むオリゴヌクレオチドに隣接する。ライゲーション（自己環状化）反応物に対してＰＣＲを直接行って、短い（例えば、２００ｂｐ）ＰＣＲ産物を得ることができる（図２のＰＣＲアプローチを参照のこと）。必要なＧＩＳタグを含むこれらのＰＣＲ産物を、少なくとも第２の制限部位（アダプター内）を認識する酵素を使用して切断して、必要な短鎖付着ジタグを作製することができる。第２またはさらなる認識部位を認識する制限酵素として、例えば、ＢａｍＨＩを使用することができ、５０ｂｐの付着ジタグが作製される。この増幅ステップの利点は、自己環状化タグ化プラスミドを形質転換しないことによって回避することができる、ＧＩＳジタグライブラリーを増幅させる必要を避けて、ＧＩＳジタグを産生できることである。次いで、増幅したオリゴヌクレオチドを、ベクターから切り出し（この例では、ＢａｍＨＩでの消化による）、その後のクローニングおよび配列決定分析のための長鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを鎖状体化することができる（図１および図２を参照のこと）。
【００６８】
特定の態様として、本発明は、ｃＤＮＡライブラリーであって、オリゴヌクレオチドが少なくとも１つのジタグを含み、ジタグが３４〜３８個のヌクレオチドを含み、全長ｃＤＮＡまたはそのフラグメントの５’末端由来のヌクレオチドおよび３’末端由来のヌクレオチドのスプライシングによって得られるｃＤＮＡライブラリーを開示する。
【００６９】
本発明のジタグライブラリーは、元の核酸分子を含むライブラリーを代表する。例えば、核酸分子を含むライブラリーが全長ｃＤＮＡライブラリーである場合、ジタグライブラリーは全長ジタグライブラリーを代表する。各ジタグクローンは、特異的全長クローンを特徴付ける十分な情報を含む。より重要には、本発明のジタグは、元の全長ｃＤＮＡの５’末端および３’末端を含む。したがって、ジタグは、全長ｃＤＮＡ構造の代表である。
【００７０】
したがって、ジタグライブラリーのジタグクローンの配列決定および分析に十分である。目的のジタグが見出された場合、対応する全長ｃＤＮＡを選択し、例えばＰＣＲによって全長ｃＤＮＡライブラリーから調製するか、ＲＴ−ＰＣＲによって標的ＲＮＡサンプルから直接調製することができる。
【００７１】
本発明は、少なくとも１つのジタグを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを調製する方法であって、
少なくとも１つの核酸分子を産生するステップと、
前記核酸分子またはそのフラグメントの５’末端および３’末端を単離するステップと、
前記５’末端と前記３’末端とを連結し、前記少なくとも１つのジタグを作製するステップと
を含む方法を提供する。
【００７２】
特に、本発明は、少なくとも１つのジタグを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを調製する方法であって、
２つのアダプターに隣接する少なくとも１つの核酸分子を産生するステップと、
前記核酸分子の５’末端および３’末端を単離するステップと、
前記５’末端と前記３’末端とを連結し、前記２つのアダプターに隣接する少なくとも１つのジタグを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを作製するステップと
を含む方法を提供する。
【００７３】
本方法は、アダプターに隣接した少なくとも１つのジタグを含むオリゴヌクレオチドをベクターに挿入するステップをさらに含む。
【００７４】
縮小または表示することを意図する核酸分子は、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、全長ｃＤＮＡ、またはｃＤＮＡであり得る。
【００７５】
核酸分子は、遺伝子の全長配列またはそのフラグメントであり得る。
【００７６】
本発明の方法は、少なくとも１つのジタグのヌクレオチド配列を決定し、遺伝子発現を検出するステップをさらに含み得る。
【００７７】
本方法は、
少なくとも１つのジタグ配列を決定するステップと、
前記ジタグのヌクレオチド配列とゲノム配列を含むデータベースと比較し、それにより５’末端および３’末端配列の適合を同定するステップと
をさらに含み得る。
【００７８】
より詳細には、本発明は、
２つのアダプターに隣接した少なくとも１つの核酸分子（例えば、全長ｃＤＮＡ）を産生するステップであって、前記各アダプターが少なくとも１つの制限部位を含むステップと、
前記制限（認識）部位を認識する少なくとも１つの制限酵素を添加することによって、前記核酸分子またはそのフラグメントの５’末端および３’末端をスプライシングし、少なくとも１つのジタグを産生するステップと
を含む方法に関する。
【００７９】
当分野で公知の任意の制限（認識）部位を使用することができる。核酸分子内の少なくとも１つの制限部位を認識し、且つ使用することができる制限酵素は当業者に自明である(例えば、Current Protocols in Molecular Biology,Vol.2,1995,Ed.Ausubel,et al.,Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience,Unit 3.1.15;New England Biolabs Catalog,1995を参照のこと)。
【００８０】
例えば、制限部位は、非対称制限（認識）部位であり得る。
【００８１】
非対称制限酵素は、以下であり得る。ｉ）制限ホーミングエンドヌクレアーゼによって認識可能なホーミングエンドヌクレアーゼ非対称制限部位配列、またはii）II型制限酵素によって認識可能な制限エンドヌクレアーゼ非対称切断部位配列。
【００８２】
II型制限酵素は、ＡａｒＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｅＩ、Ｂｂｒ７Ｉ、ＢｂｖＩ、ＢｂｖＩＩ、ＢｃｃＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｅｆＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｉＩ、ＢｉｎＩ、ＢｐＩＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｃＡＩ、ＢｓｅＭＩＩ，ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、Ｂｓｐ２４Ｉ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｔＦ５Ｉ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＣｊｅＩ、ＣｊｅＰＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａＩＩ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＧｓｕＩ、ＨａｅＩＶ、ＨｇａＩ、Ｈｉｎ４Ｉ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎＩＩ、ＰｌｅＩ、ＰｐｉＩ、ＰｓｒＩ、ＲｌｅＡＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｓｐＤ５Ｉ、Ｓｔｈ１３２Ｉ、ＳｔｓＩ、ＴａｑＩＩ、ＴｓｐＤＴＩ、ＴｓｐＧＷＩ、ＴｓｐＲＩ、およびＴｔｈ１１１ＩＩからなる群から選択される（Rebase Enzymes(登録商標)のウェブサイト中のリスト：http://rebase.neb.com/cgi-bin/outsidelist;さらに、Szybalski,W.,1985,Gene,40:169も参照のこと）。しかし、上記のリストは網羅的ではない。当分野で公知の他のＩＩ型酵素およびその後に発見することができるものは、本発明の範囲内に含まれる。
【００８３】
ホーミングエンドヌクレアーゼ非対称制限部位を認識する酵素は、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、およびＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択される。しかし、上記のリストは網羅的ではない。当分野で公知の他のホーミングエンドヌクレアーゼおよびその後に発見することができるものは、本発明の範囲内に含まれる。
【００８４】
本発明によれば、特に好ましいタグ化酵素は、その制限部位の２０／１８ヌクレオチド３’を切断して３’突出末端を形成する酵素（ＭｍｅＩなど）である。
【００８５】
人為的制限エンドヌクレアーゼも使用することができる。これらのエンドヌクレアーゼを、タンパク質工学によって調製することができる。例えば、ＤＮＡ基質の両鎖上の認識部位からさらに離れた１つのヌクレオチドを切断するような挿入によってエンドヌクレアーゼＦｏｋＩを操作した。Li and Chandrasegaran,Proc.Nat.Acad.Science USA 90:2764-8,1993を参照のこと。このような技術を、所望の制限配列を有し、且つ制限部位から切断部位までの望ましい距離を有する制限エンドヌクレアーゼの調製に適用することができる。
【００８６】
本方法は、ジタグの鎖状体を産生するステップをさらに含む。鎖状体は、一般に、約１〜１０００個のジタグ、詳細には１〜２００個のジタグ、さらに詳細には８〜２０個のジタグであり得る。これらは好ましい鎖状体であるが、鎖状体化することができるジタグ数は各タグの長さに依存し、当業者は過度に実験することなく容易に決定することができることが明らかである。鎖状体の形成後、配列分析のために複数のタグをベクターにクローン化するか、当業者に公知の方法により、クローニングを使用せずにジタグまたは鎖状体を直接配列決定することができる。
【００８７】
特定のクローン中に存在するジタグを、手動または自動化方法のいずれかの標準的な方法（例えば、Current Protocols in Molecular Biology,supra,Unit7を参照のこと）によって配列決定することができる。
【００８８】
上記のように、本方法は、ベクター中に少なくとも１つのジタグを含むオリゴヌクレオチドを移入するステップを含む。
【００８９】
用語「ベクター」または「組換えベクター」は、ジタグの遺伝子配列の挿入または組み込みによって操作された当分野で公知のプラスミド、ウイルス、または他の送達体を意図する。このようなベクターは、有効な転写を促進するプロモーター配列を含む。ベクターは、典型的には、複製起点、プロモーター、および形質転換細胞の表現型選択が可能な特異的遺伝子を含む。本発明での使用に適切なベクターには、例えば、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ(Stratagene,La Jolla,CA);ｐＢＣ、ｐＺＥｒＯ-1(Invitrogen,Carlsbad,CA)（図８を参照のこと）およびｐＧＥＭ３ｚ(Promega,Madison,WI)またはその修飾ベクターならびに当業者に公知の他の類似のベクターが含まれる。特定の実施形態として、ｐＧＥＭ３ｚベクターを修飾し、ｐＧＩＳ１と呼ばれる（図７および１０も参照のこと）。ｐＧＥＭベクターは、米国特許第4,766,072号（本明細書中で参考として援用される）にも開示されている。
【００９０】
親核酸分子（例えば、全長ライブラリーおよびＧＩＳジタグライブラリー）の産生のために、適切なベクターを使用する。したがって、本発明の範囲内の適切なベクターは、ベクターの骨格が親核酸分子の挿入後に親核酸分子またはジタグに隣接するアダプター中に含まれる同一の制限部位を含まないベクターである。好ましくは、本発明は、ベクター骨格（親核酸分子の挿入時に除去されるスタッファー領域内以外）がアダプター内に含まれる非対称制限部位ならびに第２またはさらなる制限部位を含まないベクターを提供する。特に、ベクターは、アダプター中に含まれる少なくとも非対称II制限部位（例えば、II型制限部位）および少なくとも第２またはさらなる制限部位を含まない。より好ましくは、ベクター骨格（親核酸分子の挿入時に除去されるスタッファー領域内以外）は、ＭｍｅＩおよびＢａｍＨＩを含まない。
【００９１】
スタッファーの外側のいかなる領域にもＭｍｅＩを含まないこのようなベクターの例は、図７および図１０に示すベクターｐＧＩＳ１である。ｐＧＩＳ１では、ＭｍｅＩ認識部位を変異誘発によって欠失させた。配列を図１０および配列番号１８に示す。図１０では、ＮｏｔＩ部位とＳａｌＩ部位との間のスタッファー領域を強調した。本発明はまた、本発明の任意の実施形態のオリゴヌクレオチドを含むｐＧＩＳベクターに関していた。
【００９２】
本発明のオリゴヌクレオチド、ジタグ、または鎖状体を、配列決定のためにベクターにライゲーションすることもできる。
【００９３】
ジタグがクローン化されたベクターを、適切な宿主細胞に導入することができる。宿主細胞は、ベクターが増殖してそのＤＮＡを発現することができる細胞である。この用語には、目的の宿主細胞の任意の子孫も含まれる。複製中に変異し得るので、全ての子孫が親細胞と同一ではないことがあると理解される。しかし、用語「宿主細胞」を使用する場合、このような子孫が含まれる。宿主中で外来ＤＮＡが連続的に維持されることを意味する安定な導入方法は、当分野で公知である。
【００９４】
ジタグを含むベクターでの宿主細胞の形質転換を、当業者に周知の従来の技術によって行うことができる。宿主が大腸菌などの原核生物である場合、ＤＮＡを取り込むことができるコンピテント細胞を、指数増殖期後に採取された細胞から調製し、その後当分野で周知の手順を使用したＣａＣｌ2法によって処理することができる。あるいは、ＭｇＣｌ2またはＲｂＣｌを使用することができる。エレクトロポレーションまたは当分野で一般的に使用されている他の方法によって形質転換を行うこともできる。
【００９５】
この実施形態を、図１および図２に示す。この実施形態によれば、本発明の方法は、
２つのアダプターに隣接した全長ｃＤＮＡ分子を含む少なくとも１つの核酸分子を産生するステップであって、前記各アダプターが全長ｃＤＮＡの５’末端および３’末端に隣接したＭｍｅＩ制限（認識）部位およびＢａｍＨＩであり得る別の制限部位を含むステップと、
全長ｃＤＮＡの５’末端および３’末端をスプライシングして少なくとも１つのジタグを産生するステップであって、ＭｍｅＩで全長ｃＤＮＡを切断して３’突出タグ末端を形成するステップと、２つの５’および３’末端タグをライゲーションしてジタグを産生するステップとを含むステップと
を含む。
【００９６】
図１および図２に示すように、制限酵素の使用により、少数のヌクレオチドからなる短鎖突出末端（粘着末端または付着末端ともいう）を含む５’および３’二本鎖末端を遊離させることができる。特に、ＭｍｅＩの使用により、産生された５’および３’末端は、それぞれ２０ｂｐの二本鎖および３’突出末端として２つのヌクレオチドからなる。２つのタグの後に平滑末端化および分子内自己ライゲーションを行って、親転写物の５’末端として１８ｂｐの特性配列および３’末端として別の１８ｂｐの特性配列を含むタグ化プラスミドが産生される。しかし、ＭｍｅＩで切断されるヌクレオチド数は多様である。したがって、ＭｍｅＩの使用によって得られたジタグは、３４〜３８ｂｐであり得る。
【００９７】
全長ｃＤＮＡライブラリーの調製で使用されたベクターは、ｐＧＩＳ１である。上記のように、ｐＧＩＳ１は、ＮｏｔＩとＳａｌＩとの間のスタッファー領域内以外のその骨格中にＭｍｅＩ制限部位を含まず、このスタッファー領域はその後ライブラリーの産生時に除去される。
【００９８】
アダプターに隣接したジタグを含むオリゴヌクレオチドを切り出してＧＩＳジタグライブラリーを形成し、ジタグおよびアダプターを含む他のオリゴヌクレオチドと連結してジタグの鎖状体を形成する。次いで、配列決定分析のためにジタグの鎖状体をベクターにクローン化する。
【００９９】
ＧＩＳジタグライブラリーからのオリゴヌクレオチドの切り出しの前に、例えば、オリゴヌクレオチドを、適切なプライマーを使用したＰＣＲによってライゲーション（自己環状化）反応混合物から直接増幅することができる。ジタグおよびアダプターを含む回収した増幅オリゴヌクレオチドを、ジタグおよびアダプターを含む他のオリゴヌクレオチドと連結して、ジタグの鎖状体を形成する。配列決定分析のために、次いで、ジタグの鎖状体をベクターにクローン化する。
【０１００】
本方法は、
ジタグのヌクレオチド配列を決定するステップと、
遺伝子発現を検出するステップと、
および／または、決定されたヌクレオチド配列をゲノム配列を含むデータベースと比較し、それにより５’および３’末端配列の適合を同定するステップと
をさらに含み得る。
【０１０１】
特に、少なくとも１つのジタグは３６個のヌクレオチドを含み、第１および第２の配列タグはそれぞれ１８個のヌクレオチドを含む。
【０１０２】
上記のように、本発明のジタグには、縮小するか表示することを意図する核酸分子の「特性」（５’および３’末端からなる）が含まれる。ライブラリーのこのようなジタグ、好ましくはｃＤＮＡを、鎖状体化および配列決定することができる。ジタグ中の転写物の対合した５’および３’特性配列（タグ）は、転写物の開始点および終結点を示す。データ分析時にジタグを２つのタグに分割し、構築されたゲノム配列の染色体上の妥当な距離内の特異的領域に接近させてマッピングすることができる。これら２つのタグ間のゲノムＤＮＡ配列は、エクソンおよびイントロンを含む各遺伝子の全構造内容物である。
【０１０３】
本発明のジタグを使用してマッピングしたゲノムの一般的な説明を、図３に示す。
【０１０４】
適度な配列決定により、転写量レベルの決定だけでなく、明らかとなった５’および３’領域を使用した転写物の構造の定義づけによってもトランスクリプトームの特徴付けに十分なデータを得ることができる。これにより、ＥＳＴ配列決定より約２０倍有効である。
【０１０５】
ジタグのタグを任意のゲノム（例えば、ヒトゲノム配列）と適合させることができるので、ゲノム配列の適合に基づいてＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲプライマーをデザインすることができる。
【０１０６】
したがって、本発明のさらなる態様は、ゲノムマッピング方法であって、
少なくとも１つのジタグを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを調製するステップであって、前記ジタグが２つの連結した第１および第２の配列タグを含み、前記第１のタグが核酸分子の５’末端配列を含み、前記第２のタグが核酸分子の３’末端配列を含み、前記核酸分子が遺伝子の全長またはそのフラグメントに対応するステップと、
ゲノム上で少なくとも１つのジタグの各２つのタグをマッピングするステップと、
ゲノムマップ上において対応する遺伝子の構造領域を決定するステップと
を含む方法に関する。
【０１０７】
さらに、遺伝子の発見方法であって、
少なくとも１つのジタグを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを調製するステップであって、前記ジタグが２つの連結した第１および第２の配列タグを含み、前記第１のタグが核酸分子の５’末端配列を含み、前記第２のタグが核酸分子の３’末端配列を含み、前記核酸分子が遺伝子の全長またはそのフラグメントに対応するステップと、
得られた少なくとも１つのジタグをゲノムマップおよび／または遺伝子データベースと比較するステップと、
前記ゲノムマップ上の５’末端および３’末端タグの適合を検出するが、１つまたは複数の既知の遺伝子データベースで適合が検出されないステップと
を含む方法を提供することも本発明の態様である。
【０１０８】
本方法は、新規に発見された遺伝子に対応する全長核酸分子を回収するステップをさらに含む。
【０１０９】
本発明はまた、全長ｃＤＮＡを回収する方法であって、
全長ｃＤＮＡライブラリーから、少なくとも１つのジタグを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを調製するステップであって、前記ジタグが２つの連結した第１および第２の配列タグを含み、前記第１のタグが全長ｃＤＮＡの５’末端配列を含み、前記第２のタグが全長ｃＤＮＡの３’末端配列を含むステップと、
得られたオリゴヌクレオチドジタグを配列決定するステップと、
目的のジタグを決定するステップと、
全長ｃＤＮＡライブラリーから目的のジタグに対応する全長ｃＤＮＡを回収するステップと
を含む方法を提供する。
【０１１０】
本発明はまた、遺伝子の転写活性を定量する方法であって、
全長ｃＤＮＡライブラリーから、少なくとも１つのジタグを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを調製するステップであって、前記ジタグが２つの連結した第１および第２の配列タグを含み、前記第１のタグが全長ｃＤＮＡの５’末端配列を含み、前記第２のタグが全長ｃＤＮＡの３’末端配列を含むステップと、
得られたオリゴヌクレオチドジタグを配列決定するステップと、
前記遺伝子の転写活性に対応する配列決定ジタグの頻度を決定するステップと
を含む方法を提供する。
【０１１１】
本明細書中に本発明を一般的に記載したが、以下の実施例を参照して本発明はより容易に理解され、実施例は例示を目的とし、本発明を制限することを意図しない。
【実施例】
【０１１２】
ｃＤＮＡ合成のためのＧＩＳオリゴヌクレオチド、５０ｂｐの付着ジタグのゲノム配列、ベクターｐＧＩＳ１の構築に使用するプライマー、および実施例で使用するｄｓ−ＤＮＡアダプターを以下に列挙する。
【０１１３】
〔ｃＤＮＡ合成用のＧＩＳ分析オリゴ〕
−ＧｓｕＩ−オリゴｄＴプライマー：
【化１】
2005118036.tif 000003
−ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ／ＭｍｅＩ（Ｎ）６プライマーリンカー（上流）：
【化２】
2005118036.tif 000004
−ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ／ＭｍｅＩ（Ｎ）プライマーリンカー（下流）：
【化３】
2005118036.tif 000005
−ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ／ＭｍｅＩ（Ｎ）５プライマーリンカー（上流）：
【化４】
2005118036.tif 000006
−ＭｍｅＩ／ＢａｍＨＩ／ＳａＩＩアダプター（上流）：
【化５】
2005118036.tif 000007
−ＭｍｅＩ／ＢａｍＨＩ／ＳａＩＩアダプター（下流）：
【化６】
2005118036.tif 000008
【０１１４】
〔５０ｂｐの一般的な付着ジタグの構造〕
【化７】
2005118036.tif 000009
（配列中、ＸおよびＮは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれでもよい）
【０１１５】
〔ベクターｐＧＩＳ１の構築に使用するプライマー〕
【化８】
2005118036.tif 000010
【０１１６】
〔ｄｓ−ＤＮＡアダプター〕
【化９】
2005118036.tif 000011
【０１１７】
〔ｐＧＩＳ１配列〕
ｐＧＩＳ１配列（配列番号１８）を、図１０に示す。
【０１１８】
［実施例１］
〔方法〕
以下のｃＤＮＡライブラリーの構築および分析のモジュールにしたがって、ＧＩＳジタグ分析の実験手順を行った。
（１）各ｃＤＮＡインサートの両末端に隣接するＭｍｅＩ部位を導入した全長ｃＤＮＡライブラリー；
（２）各クローンが転写単位の５’の１８ｂｐ特性および３’の１８ｂｐ特性を含むＧＩＳジタグライブラリー；
（３）鎖状体化ＧＩＳジタグのクローンのためのＧＩＳライブラリー；
（４）ＧＩＳ配列決定分析。
【０１１９】
〔１．各ｃＤＮＡインサートとしてＭｍｅＩ部位を添加したＧＩＳ全長ｃＤＮＡライブラリー〕
本節の手順の概要は以下であった。高品質のｍＲＮＡから出発して、ＧｓｕＩ−オリゴｄＴプライマー（配列番号１）を使用して第１のｃＤＮＡを合成した。
【０１２０】
第１のｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖を、ビオチン化ベースのキャップ−トラッパーアプローチによる全長濃縮手順に供した。当分野で公知の任意のキャップ−トラッパーアプローチを使用することができる(例えば、Carninci et al.,1996,Genomics,Vol.37,327-336;米国特許第6,143,528号;Edery et al.,1995,Mol.Cell.Biol.Vol.15,No6,3363-3371)。
【０１２１】
濃縮された全長の第１のｃＤＮＡ鎖を、ＭｍｅＩ部位、ＢａｍＨＩ部位、およびＮｏｔＩ部位を含むアダプター−プライマー（ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ／ＭｍｅＩ−（Ｎ）５および−（Ｎ）６（配列番号２〜４））を使用してプライミングした第２のｃＤＮＡ合成用のテンプレートとした。
【０１２２】
二本鎖ｃＤＮＡを作製後、ＧｓｕＩ制限酵素によってｃＤＮＡポリ−Ａ／Ｔテールを切断した。ＧｓｕＩは、その認識部位から１６ｂｐのＤＮＡを切断する別のII型エンドヌクレアーゼである。ＧｓｕＩ切断末端で、ＭｍｅＩ、ＢａｍＨＩ部位、およびＳａＩＩ付着末端を含むアダプターを、ｃＤＮＡにライゲーションした（配列番号５〜７）。
【０１２３】
ＮｏｔＩ消化後、全長ｃＤＮＡを、ベクターｐＧＩＳ１のポリリンカー中のＮｏｔＩとＳａＩＩ部位との間に挿入した。ベクターｐＧＩＳ１（図７および１０を参照のこと）を、ｐＧＥＭ３ｚ(Promega)から改変する。
【０１２４】
〔１−１．ｍＲＮＡの調製〕
Trizol試薬(Invitrogen)を使用して、マウス胚幹細胞Ｅ１４株から全ｍＲＮＡを調製した。しかし、任意の標準的な方法（Sambrook J.and Russell D.W.,2001,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法）も使用することができる。標準的な方法（例えば、Sambrook and Russell,2001、上記）に従って、オリゴｄＴ磁性ビーズによってｍＲＮＡ（ポリＡ  ＲＮＡ）を精製した。あるいは、標準的な方法（例えば、Sambrook and Russell,2001、上記）にしたがって、アフィニティカラムによって、精製を行うことができる。
【０１２５】
〔１−２．第１のｃＤＮＡ鎖合成および全長選択〕
このステップでは、第１のｃＤＮＡを、ＧｓｕＩ−オリゴｄＴプライマーを使用して合成する。次いで、第１のｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖を、ビオチン化ベースのキャップ−トラッパーアプローチによって全長濃縮手順に供する。
【０１２６】
ＧｓｕＩ−オリゴｄＴプライマー：
【化１０】
2005118036.tif 000012
【０１２７】
以下を混合した。
GsuI−オリゴdTプライマー（7μg/μl）     2μl
ポリA RNA（20μg）                      18μl
【０１２８】
得られた溶液を、６５℃で１０分間および３７℃で１分間加熱した。
【０１２９】
次いで、チューブを遠心分離機でスピンし、以下の物質を添加した。
2×GC-I緩衝液（Takara）                 75μl
RNアーゼインヒビター（Promega）          1μl
10mM dNTP（メチル−dCTPを含む）          4μl
飽和トレハロース                        10μl
4.9Mソルビトール                        26μl
SuperscriptII逆転写酵素（Invitrogen）   15ul
【０１３０】
得られた溶液を、３７℃で１０分間、４２℃で３０分間、５０℃で２０分間、および５５℃で２０分間インキュベートした。２μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。得られた溶液を、４５℃で１５分間インキュベートし、その後フェノール／クロロホルム抽出およびイソプロパノール沈殿を行った（標準的な技術（例えば、Sambrook and Russel,2001、上記）による）。
【０１３１】
ＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロ二本鎖を、４４．５μｌのｄｄＨ2Ｏに再懸濁した。３μｌの１．１Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）および２．５μｌの１００ｍＭ  ＮａＩＯ4を添加して、ｍＲＮＡのジオール構造を酸化した。５０μｌの反応溶液を、暗所の氷上で４５分間インキュベートし、その後０．５μｌの１０％ＳＤＳ、１１μｌｌの５Ｍ  ＮａＣｌ、および６１μｌのイソプロパノールを添加して、ＲＮＡ／ＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＲＮＡ／ＤＮＡを、５０μｌのｄｄＨ2Ｏに再懸濁した。５μＬの１Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ６．１）、５μＬの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、および１５０μＬの１０ｍＭ  長腕ビオチンヒドラジドを添加して、ＲＮＡをビオチン化した。反応物を、室温の暗所で一晩インキュベートした。５μＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、７５μＬの１Ｍ  無ＲＮアーゼＮａＯＡｃ（ｐＨ６．１）、および７５０μＬの１００％ＥｔＯＨ、または２００μＬの１００％イソプロパノールの添加によって、ビオチン化ＲＮＡ／ＤＮＡを沈殿させた。−８０℃で３０分間インキュベートし、１４ｋｒｐｍ、４℃で３０分間スピンした。
【０１３２】
ペレットを、ｗ／７０％（ｖ／ｖ）のＥｔｄＯＨ／３０％、ＤＥＰＣ処理ｄｄＨ2Ｏ（ＤＥＰＣは、ＲＮアーゼインヒビターであるジエチルピロカーボネートである）で洗浄し、１４ｋｒｐｍスピンを、４℃で１０分間行った。過剰な液体を、慎重に除去した。次いで、ペレットを風乾し、４００μＬのＤＥＰＣ−ｄｄＨ2Ｏに再懸濁した。次いで、５０μＬの１０×ＲＮアーゼ緩衝液および２５単位のＲＮアーゼＩ／μｇの出発ｍＲＮＡを添加した。得られた溶液を、３７℃で３０分間インキュベートした。１０μＬの１０ｍｇ／ｍＬの酵母ｔＲＮＡ(Ambion)および１５０μＬの５Ｍ  ＮａＣｌを添加して、反応を停止させた。
【０１３３】
ＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖をビオチン化する一方で、ストレプトアビジンダイナビーズを、以下のように調製した。４００μＬのＭ−２８０ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｌ）を、無ＲＮアーゼエッペンドルフチューブにピペッティングし、ビーズを磁石上におき、少なくとも３０分間静置し、上清を除去した。ビーズを、４００μｌの１×結合緩衝液（２Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））中に再懸濁した。チューブを磁石上に置き、少なくとも３０分間待ち、上清を除去した。１×結合緩衝液での洗浄を２回以上繰り返した。ビーズを、１００μｇの酵母ｔＲＮＡを含む４００μｌの１×結合緩衝液中に再懸濁し、時々撹拌しながら４℃で３０分間インキュベートした。チューブをマグネットスタンド上に置き、少なくとも３０秒間待ち、上清を除去した。ビーズを、１×結合緩衝液で３回洗浄した。ビーズおよびＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖を混合した（この時点での全体積は６６０μＬであり、結合条件は１Ｍ  ＮａＣｌであった）。混合物を、室温で３０分間回転した。
【０１３４】
チューブを、マグネットスタンド上に置き、少なくとも３０秒間待ち、上清を除去した（上清を、「非結合物」として確保した）。
【０１３５】
ビーズを、４００μＬの１×結合緩衝液で２回洗浄した。４００μＬの０．４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ＋５０μｇ／ｍＬの酵母ｔＲＮＡで洗浄した。４００μＬの１×洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、および２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、４０μｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡ）で洗浄した。ｗ／４００μＬの５０μｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡで洗浄した。全ての洗浄について、チューブをマグネットスタンドに置き、少なくとも３０秒間待ち、上清を除去した。
【０１３６】
ＲＮＡのアルカリ加水分解によって第１のｃＤＮＡ鎖を遊離させた。以下を添加した。５０μＬｌの５０ｍＭ  ＮａＯＨおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）。チューブを、６５℃で１０分間回転させた。チューブをマグネットスタンドに置き、上清を５０μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）を含む別のチューブに移した。溶解手順を２回以上繰り返した。上清の最終体積は、３００μＬであった（第１のｃＤＮＡ鎖を含む）。
【０１３７】
フェノール／クロロホルム抽出によってｃＤＮＡを抽出し、グリコーゲンを含む１ｍＬｌエタノールによって沈殿させた。ｃＤＮＡを、５μＬのＬｏＴＥ（０．１×）に再懸濁した。ＬｏＴＥは、低塩Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５））である。
【０１３８】
〔１−３．第２のｃＤＮＡ鎖の合成〕
以下の試薬を、氷上の対応する各チューブに添加した。
cDNAを含むLoTE                          5μL
リンカー（N5)                           1.6μg
リンカー（N6）                          0.4μg
Soln II（Takaraライゲーションキット）   10μL
Soln I（Takaraライゲーションキット）    20μL
【０１３９】
リンカー（Ｎ６）は以下である。
ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ／ＭｍｅＩ（Ｎ）６プライマーリンカー（上流）：
【化１１】
2005118036.tif 000013
ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ／ＭｍｅＩ（Ｎ）プライマーリンカー（下流）：
【化１２】
2005118036.tif 000014
【０１４０】
リンカー（Ｎ５）は以下である。
ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ／ＭｍｅＩ（Ｎ）５プライマーリンカー（上流）：
【化１３】
2005118036.tif 000015
【０１４１】
ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ／ＭｍｅＩ（Ｎ）プライマーリンカー（下流）は、上記の配列（配列番号３）である。
【０１４２】
ｃＤＮＡおよびリンカー混合物を、１６℃で一晩インキュベーションした。以下を添加した。
ddH2O                         20μL
10×ExTaq緩衝液（Takara）      8μL
2.5mM dNTP                     8μL
ExTaqポリメラーゼ（Takara）    4μL
【０１４３】
混合物を、サーモサイクラー中で６５℃で５分間、６８℃で３０分間、７２℃で１０分間予備加熱し、その後フェノール／クロロホルム抽出を行い、グリコーゲンを含むエタノールで沈殿させ、８５μｌのｄｄＨ2Ｏに再懸濁した。
【０１４４】
〔１−４．ＧｓｕＩ消化によるポリＡテールの除去〕
以下の試薬をチューブに添加した。
cDNA                        85μL
GsuI（Fermentas）            5μL
10×緩衝液B（Fermentas）    10μL
【０１４５】
混合物を３０℃で２時間インキュベートし、その後フェノール／クロロホルム抽出およびエタノールで沈殿させた。ペレットを、１０μｌのｄｄＨ2Ｏに再懸濁し、以下の３’アダプターライゲーション反応を行った。
【０１４６】
〔１−５．ＭｍｅＩおよびＢａｍＨＩおよびＳａＩＩ部位を含む３’アダプターの添加〕
１０μｌのサンプルを含むチューブに、以下の成分を添加した。１０μｌのサンプルは、ＧｓｕＩ消化によって除去されるポリ（Ａ）テールを有する二本鎖全長ｃＤＮＡであった。
5×ライゲーション緩衝液                    10μL
GsuI SaIIアダプター（0.4μg/μL）          25μL
（GsuI SaIIアダプターは、MmeI/BamHI/SaIIアダプターである）
T4 DNAリガーゼ（5単位/μl）（Invitrogen）    5μL
【０１４７】
−ＭｍｅＩ／ＢａｍＨＩ／ＳａＩＩアダプター（上流）：
【化１４】
2005118036.tif 000016
−ＭｍｅＩ／ＢａｍＨＩ／ＳａＩＩアダプター（下流）：
【化１５】
2005118036.tif 000017
【０１４８】
反応物を、１６℃で一晩インキュベートし、その後フェノール／クロロホルムで抽出およびエタノール沈殿を行い、ペレットを、４１μｌのｄＨ2Ｏに再懸濁した。
【０１４９】
〔１−６．ＮｏｔＩ消化およびｃＤＮＡサイズ分画〕
以下を氷上で以下の順番で添加した。
NEB緩衝液3                5μL
NotI（10単位/μl）（NEB）  4μL
【０１５０】
得られた溶液を、３７℃で１〜２時間インキュベーションした。
【０１５１】
ｃＤＮＡサイズ分画カラムを調製した（Invitrogenの説明書は、以下であった。カラムのキャップを取り（底を最初に取る）、完全に排水し、８００μＬのＴ10Ｅ0.1Ｎ25緩衝液で５回洗浄し、各回にカラムを完全に排水する。）。ＤＮＡサンプルを、カラムにロードした。通過物をエッペンドルフチューブに回収した（画分１）。１００μＬのＴ10Ｅ0.1Ｎ25緩衝液を添加した。通過物をエッペンドルフチューブに回収した（画分２）。別の１００μＬのＴ10Ｅ0.1Ｎ25緩衝液を添加した。予め番号を付けたエッペンドルフチューブあたり１滴の通過物を回収した（画分３から開始し、各液滴は３０〜４０μＬであった）。
【０１５２】
カラムが乾燥したときはいつでも、別の１００μＬのＴ10Ｅ0.1Ｎ25緩衝液を添加することができる。
【０１５３】
２０滴までを回収すべきである（Invitrogenプロトコールによる）。３μＬの各画分をアガロースゲルで泳動し、各画分中のｃＤＮＡのサイズを視覚化した。プールした画分は、ｃＤＮＡ≧１．０ｋｂｐを示した（通常、２〜３ｋｂｐまで）。プールしたサンプルを原液のままで保持した（使用したキュベットを少なくとも３０秒間酸性化１００％ＥｔＯＨ中に浸漬し、ｄｄＨ2Ｏで５回リンスし、サンプルを保存した。これは、ライゲーションすべき物質である）。
【０１５４】
１つの画分での使用であれば、これを沈殿させ、ゲルの状態によってこれの半分から全部を使用する。
【０１５５】
この時点で、ｃＤＮＡフラグメントは５’側にＮｏｔＩ付着末端を有し、３’側のＳａＩＩ付着末端は、ベクター中でクローン化される状態にある。
【０１５６】
〔１−７．線状化プラスミドｐＧＩＳ１でのｃＤＮＡのライゲーション〕
１−７−１．クローニングベクターｐＧＩＳ１をＮｏｔＩおよびＳａＩＩ消化によって調製した。ｐＧＩＳ１のベクター配列を、図７および９に示す。
【０１５７】
＜ｐＧＩＳ１クローニングベクターの構築＞
（Ｉ）ＭｍｅＩマイナスベクターを作製するためのｐＧＥＭ３ｚの部位特異的変異誘発
ベクターｐＧＩＳ−１は、ｐＧＥＭ３ｚ(Promega)に由来していた。ｐＧＥＭ３ｚは、本来部位特異的変異誘発によってノックアウトされた２つのＭｍｅＩ認識部位を含んでいた。以下の変異誘発プライマーと共にQuikChange Multiキット(Stratagene)を使用した。
【化１６】
2005118036.tif 000018
【０１５８】
（ＩＩ）ポリリンカー領域の修飾
既存のＥｃｏＲＩ部位でのｄｓ−ＤＮＡアダプターの簡単な挿入によって、ポリリンカー領域を修飾した。したがって、以下のさらなる認識部位が導入される。ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、およびＥｃｏＲＶ（スタッファーフラグメントの挿入時にＥｃｏＲＶは欠失する（以下を参照のこと））。
ｄｓ−ＤＮＡアダプター：
【化１７】
2005118036.tif 000019
【０１５９】
（ＩＩＩ）スタッファーフラグメント挿入
修飾ベクターのＮｏｔＩ部位とＳａＩＩ部位との間に約６９０ｂｐのフラグメントを挿入した（図１０中のベクター配列を参照のこと）。スタッファーを明確に視覚化し、ゲル精製中に切り出すことができるので、これにより、ＮｏｔＩ／ＳａＩＩ二重消化ベクターの産生が促進される。
【０１６０】
線状化プラスミドをゲル精製した。
【０１６１】
１−７−２．ｃＤＮＡをｐＧＩＳ１ベクターに一晩ライゲーションし、構築物を、標準的な技術に従ったエレクトロポレーションによってエレクトロコンピテント大腸菌ＴＯＰ１０細胞に導入した（Sambrook and Russel,2001，上記を参照のこと）。
【０１６２】
〔１−８．ライブラリーのＱＣ（ＱＣ＝品質検査）〕
１〜１００μＬの形質転換体の連続希釈物を、抗生物質選択を使用したＬＢ寒天プレートにプレートした。コロニーを一晩インキュベートし、計数してライブラリーの力価を決定した。
【０１６３】
２４〜９６個のコロニー（不定数）を選択し、直接コロニーＰＣＲによってインサートのサイズを決定し、アガロースゲル電気泳動を行った（標準的な技術（例えば、Sambrook and Russel,2001、上記を参照のこと）に従う）。ｃＤＮＡインサートの比率および平均インサートサイズを評価した。
【０１６４】
この段階で、標準的な方法（Sambrook and Russel,2001、上記を参照のこと）にしたがって、ＧＩＳ全長ｃＤＮＡライブラリーを、ライゲーション反応物または大腸菌細胞での形質転換体として保存することができる。
【０１６５】
［実施例２］
〔２．ＧＩＳジタグライブラリー〕
ステップ１−１〜１−８から作製されたｃＤＮＡクローンは、５’部位にＭｍｅＩ部位（ＴＣＣＧＡＣ）および３’末端に逆向きに別のＭｍｅＩ部位（ＴＣＣＡＡＣ）を含んでいた。これら２つのＭｍｅＩ制限部位はＭｍｅＩによって認識することができる２つのイソ型（ＴＣＣＲＡＣ  ２０／１８（Ｒ＝（Ａ／Ｇ）））であることに留意のこと。この配列の相違は、その後の方向性の表示に有用である。ＭｍｅＩ制限酵素は、これらの２０ｂｐのクローンを５’末端および３’末端由来のｃＤＮＡフラグメントに切断する。したがって、消化されたｃＤＮＡは種々のサイズであるにもかかわらず、ベクター＋全クローンの各末端上の２０ｂｐのｃＤＮＡ特性タグは、アガロースゲル電気泳動で容易に認識することができる均一のサイズであり、望ましくないｃＤＮＡフラグメントから容易に精製することができる。
【０１６６】
次いで、ゲル精製ベクター＋タグを自己ライゲーションして、５’および３’ＧＩＳ特性タグを含む「タグ化プラスミド」を得ることができる。
【０１６７】
〔２−１．プラスミド調製〕
ＧＩＳ全長ｃＤＮＡライブラリーを、適切な数のクローンの巨大な（２２×２２ｃｍ）寒天プレート(Genetix)上へのプレーティングによって１回増殖させた。必要なコロニー数を、トランスクリプトームサイズの評価によって決定した。３７℃で一晩のインキュベーション後、得られた細菌クローンを回収し、３０００ｇで３０分間の遠心分離によってペレット化した。Qiagen HiSpeed Plasmid Maxiキットを使用してプラスミドＤＮＡを調製した。得られたＤＮＡの質を、アガロースゲル電気泳動および制限消化によって試験した。約３００，０００個のコロニーを処理して少なくとも１ｍｇのプラスミドＤＮＡを得ることができる。
【０１６８】
〔２−２．ＭｍｅＩ消化〕
製造者の条件（ＮＥＢ）（メチル化による阻害を回避するために使用した酵素の単位数は常に４倍過剰未満であることを確保する）にしたがってＭｍｅＩを使用して約１０μｇのプラスミドＤＮＡを消化した。３７℃で２〜６時間消化を進行させた。
【０１６９】
消化反応物のアリコートを、アガロースゲルで試験した。元のプラスミド由来のｃＤＮＡの切り出しに由来する多数のフラグメントと共に、ＧＩＳ特性タグを含む線状化ベクターに対応する約２８００ｂｐのサイズの強いバンドが容易に認められた（図４を参照のこと）。
【０１７０】
〔２−３．線状ベクター−ＧＩＳジタグ精製〕
消化反応物を、０．７％アガロースで電気泳動し、２８００ｂｐのベクター−ＧＩＳタグバンドを切り出し、Qiagenアガロースゲル抽出キットを使用して精製した。
【０１７１】
〔２−４．「タグ化プラスミド」を作製するためのベクター−ＧＩＳジタグ自己ライゲーション〕
ＭｍｅＩ消化によって５’および３’特性タグの両方に２ｂｐの突出末端が得られた。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ(Promega)を使用してこれらを除去し（一掃する）、１８ｂｐのタグが遊離した。
（0.5〜2.0μg）DNA                50μL
10×Y+/TANGO緩衝液（Fermentas）  6.0μL
0.1M DTT                         0.3μL
T4 DNAポリメラーゼ               ５単位／μg
10mM dNTP                        0.6μL
ddH2O                            60.0μLにする
【０１７２】
３７℃で５分間インキュベートし、７５℃で１０分間不活化した。
【０１７３】
精製された平滑末端化ＤＮＡを、エタノール沈殿し、約２０ｎｇ／μｌの濃度で再懸濁した。以下のように自己ライゲーション（分子内環状化）を行った。
約350ng DNA                                         15.0μL
ライゲーション溶液I（Takaraライゲーションキット2）  15.0μL
【０１７４】
１６℃で２時間から一晩インキュベートした。
【０１７５】
〔２−５．ジ特性タグ（ジタグ）の作製〕
このステップの目的は、タグ化プラスミドが由来する元のｃＤＮＡライブラリーを定量的に示す形態でＧＩＳジ特性タグを得ることである。
【０１７６】
＜一般的な５０ｂｐの付着ジタグの構造＞
【化１８】
2005118036.tif 000020
（配列中、ＸおよびＮは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれでもよい）
【０１７７】
本発明者らは、これに対して以下の２つのアプローチを使用した。
（ｉ）細菌形質転換、タグ化プラスミド精製、および５０ｂｐの付着ジタグを遊離するための制限消化。
（iｉ）ライゲーション反応による直接ＰＣＲおよびその後の５０ｂｐの付着ジタグを遊離するためのＰＣＲ産物の制限消化。
【０１７８】
〔２−５−１  形質転換および増殖；タグ化プラスミドの調製（図１を参照のこと）〕
エレクトロポレーションによって５０μｌのエレクトロコンピテントＴＯＰ１０細胞(Invitrogen)あたり１μｌのライゲーション反応物（２〜４節）を形質転換した。１ｍｌのＳＯＣ培地に３７℃で１時間回収し、ＱＣおよび滴定のためにＬＢ寒天＋アンピシリンでのいくつかの希釈物にプレートした。
【０１７９】
ＱＣ（品質検査）：いくつかのコロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、ＢａｍＨＩでの消化によって試験した。タグ化プラスミドは５０ｂｐの付着ジタグを遊離する。次いで、巨大な寒天プレートへの残りの培養物のプレーティングおよびQiagen HiSpeed Plasmid Maxiキットを使用した拡大(maxiprep)によってこのプロセスをスケールアップした。
【０１８０】
例として、約５，０００個のコロニーを処理して少なくとも４０μｇのタグ化プラスミドＤＮＡを得た。次いで、このプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ消化して５０ｂｐの付着ジタグを作製した（結果の例として図５を参照のこと）。
【０１８１】
〔２−５−２  付着ジタグのＰＣＲベースの回収（図２を参照のこと）〕
ジタグに隣接したベクター配列に結合するプライマーＰＭＲ００３およびＰＭＲ００４を使用してライゲーション反応物に対してＰＣＲを行った。
【化１９】
2005118036.tif 000021
【０１８２】
出発材料の量を、連続希釈および条件の選択によって実験的に決定し、約２００ｂｐの夾雑物のない特異的ＰＣＲ産物が得られた。
（例えば、200倍）希釈のライゲーション反応物    5.0μL
10×HiFi緩衝液                                 2.0μL
10mM dNTP                                      0.4μL
PMR003 (100ng/μL)                             1.0μL
PMR994 '100ng/μL)                              1.0μL
エッペンドルフTripleMasterポリメラーゼ         0.2μL
dH2O                                          10.4μL
（ＨｉＦｉ緩衝液は、エッペンドルフＴｒｉｐｌｅＭａｓｔｅｒ酵素を使用して得た反応緩衝液であった）
サーモサイクリング条件：
ステップ１：９５℃で２分間
ステップ２：９５℃で３０秒間
ステップ３：５５℃で１分間
ステップ４：７２℃で３０秒間
ステップ２に戻り、ステップ（２〜４）を２４サイクル繰り返す
ステップ５：７２℃で４分間
１６℃で継続
【０１８３】
ＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲルで分析した。負のコントロールとして、（ｉ）テンプレートなし、および（ｉｉ）リガーゼなしでＰＣＲ反応を行った。その後の５０ｂｐ付着ジタグ産生のために十分な２００ｂｐのＰＣＲ産物を得るために、反応を以下のようにスケールアップした。９６ウェルＰＣＲプレートを使用して９６のＰＣＲ反応を行った；これにより、約５０μｇの２００ｂｐジタグが得られる。各ＰＣＲ反応物を合わせ、エタノール沈殿を行い、ＢａｍＨＩで消化して５０ｂｐの付着ジタグを作製した（結果の例として図６を参照のこと）。
【０１８４】
〔３．ＧＩＳライブラリー〕
〔３−１．タグ化プラスミドの調製〕
これを、細菌形質転換ベースのアプローチのみに適用する（２−５−１節を参照のこと）。
【０１８５】
〔３−２．ＢａｍＨＩ消化およびＧＩＳタグの精製〕
３−２−１  タグ化プラスミドのＢａｍＨＩ（２−５−１節）により５０ｂｐの付着ジタグが遊離した。
DNA（タグ化プラスミド）          40μg
10×固有のBamHI緩衝液（NEB）    100μL
100×BSA                         10μL
BamHI（20U/μL、NEB）             10μL
dH2O                             1mLにする
【０１８６】
４０μｇのＤＮＡ（タグ化プラスミド）の値の選択は、任意であった。
【０１８７】
より有効な消化のためにアリコートを１０×１００μｌに分割し、３７℃で４時間インキュベートした。消化後、これを６５℃で１５分間不活化し、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行った。その後、ＢａｍＨＩ消化後の５０ｂｐの付着ジタグおよび残りの切断産物を含むペレットを、ゲル精製のためにＬｏＴＥ緩衝液に再懸濁した。
【０１８８】
３−２−２  ＰＣＲ（２−５−２節）によって回収した２００ｂｐジタグのＢａｍＨＩ消化によって５０ｂｐの付着ジタグが放出された。
DNA（PCR産物）                   40μg
10×固有のBamHI緩衝液（NEB）    100μL
100×BSA                         10μL
BamHI（20U/μL、NEB）             10μL
dH2O                             1mLにする
【０１８９】
４０μｇのＤＮＡ（タグ化プラスミド）の値の選択は任意である。
【０１９０】
より有効な消化のためにアリコートを１０×１００μｌに分割し、３７で４時間インキュベートした。
【０１９１】
消化後、これらを６５℃で１５分間不活化し、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行った。その後、ＢａｍＨＩ消化後の５０ｂｐの付着ジタグおよび残りの切断産物を含むペレットを、ゲル精製のためにＬｏＴＥ緩衝液に再懸濁した。
【０１９２】
〔３−３  ５０ｂｐ付着ジタグのゲル精製〕
３−２−１または３−２−２の両節のＢａｍＨＩ消化ＤＮＡを、巨大な（Hoefer Ruby 600、１５×１５ｃｍ、厚さ１．５ｍｍ）１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ブロモフェノールブルー（標準追跡色素）バンドのほとんどがゲルの下に達するまで、２００Ｖで約２時間電気泳動を行った。ゲルを、SYBR Green I(Molecular Probes,Inc.)で３０分間染色し、その後５０ｂｐの付着ジタグを視覚化および切り出した。この段階で、レーンあたり５μｇを超えてロードしない方が都合がよい（蛍光が消光される）。
【０１９３】
５０ｂｐの付着ジタグを切り出し、２１Ｇニードルで底に穴をあけた０．６ｍｌの微量遠心管（遠心管あたり２ゲル片）に回収した。この穴をあけたチューブを、１．７ｍｌの微量遠心管内に入れ、４℃、１２Ｋｇで２〜５分間遠心分離した。これによりゲル片が刻まれ、１．７ｍｌのチューブ中に回収される。
【０１９４】
１５０μｌのＬｏＴＥ：ＮＨ4ＯＡｃ（１２５：２５）を、各チューブに添加し、４℃で一晩溶出させた。翌日、溶出物を、マイクロスピンフィルターユニット(SpinX、Costar)を使用して回収し、エタノール沈殿を行って５０ｂｐの精製ジタグを回収し、ＬｏＴＥに再懸濁した。７０μｇの２００ｂｐジタグから出発して、数百ｎｇの５０ｂｐジタグが回収されることが予想された。
【０１９５】
〔３−４  ジタグ濃縮およびゲル精製〕
５０ｂｐのジタグ濃度により約３００ｂｐから１０００ｂｐ超までの範囲の産物の標本が確実に得られるようにいくつかの至適化（ライゲーション時間、出発材料の量）が必要であり得る。以下の条件を起始点として示唆する。
50bpの付着ジタグ              150〜500ng
5×緩衝液（PEG:BRLを含む）    2.0μL
T4 DNAリガーゼ（5U/μL）      1.0μL
dH2O                          10μLにする
【０１９６】
１６℃で１時間インキュベートした。
【０１９７】
ローディング緩衝液を添加し、全サンプルを６５℃で１５分間加熱した。８％ポリアクリルアミドミニゲルを含む１つのウェルにサンプルをロードし、２００Ｖで約１時間泳動するか、ブロモフェノールブルーが下から約２ｃｍに移動するまで泳動した。
【０１９８】
ライゲーション産物の標本を、２つまたはそれ以上の画分に切り出すことができる（例えば、２００〜５００ｂｐ；５００〜１０００ｂｐ；１０００ｂｐ超）。
【０１９９】
３−３節に詳述するように、ゲル片からのＤＮＡの溶出を行った。溶出物を、フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿した。ＤＮＡペレットを６μｌのＬｏＴＥに再懸濁した。
【０２００】
〔３−５  鎖状体のクローニング〕
１０単位のＢａｍＨＩによる３７℃で３時間の２μｇのｐＺＥｒＯ−１プラスミドＤＮＡ（Invitrogen）（図８）（図８は配列決定／ＰＣＲプライマー結合部位を示す）の消化によってクローニングベクターを調製した。消化したＤＮＡをフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿し、３３ｎｇ／μｌの濃度でＬｏＴＥに再懸濁した。以下のようにライゲーション反応を行った。
鎖状体DNA                  6.0μL
BamHI/pZErO-1              1.0μL
5×リガーゼ緩衝液          2.0μL
T4 DNAリガーゼ（5U/μL）   1.0μL
【０２０１】
１６℃で一晩インキュベートした。並行してコントロールとしてベクターの自己ライゲーションも行った。
【０２０２】
エレクトロポレーション前にライゲーション産物を精製した。フェノール−クロロホルムで抽出し、その後エタノール沈殿を行った；ペレットを７５％エタノールで３回洗浄し、１２μｌＴＥ（０．１×）に再懸濁した。１μｌのこのＤＮＡを使用して、５０μｌのエレクトロコンピテントＴＯＰ１０細菌細胞を形質転換した。回収後（２−５−１節も参照のこと）、５０μｌを小寒天プレート（低塩ＬＢ寒天(Lennox L)＋ゼオシン（５０μｇ／ｍｌ）およびＩＰＴＨ（５０μｇ／ｍｌ）を含む）にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。バックグラウンドコントロールとして、細菌をプレートし、同時に上記のベクター自己ライゲーション反応を使用して形質転換した。（ＩＰＴＧは、ＴＯＰ１０細胞を使用した場合に最適となるが、バックグラウンドが減少し得る）。
【０２０３】
〔３−６  ＧＩＳライブラリーのＱＣ（品質検査）〕
翌日、ＰＣＲによるインサートサイズのチェックのために１０〜３０個のコロニーを選択した。各反応のために、１つのコロニーを以下を含むＰＣＲチューブに入れた。
10×HiFi緩衝液                          2.0μL
10mM dNTP                               0.4μL
PMR003(100ng/ul)                        1.0μL
PMR004(100ng/ul)                        1.0μL
エッペンドルフTripleMasterポリメラーゼ  0.2μL
dH2O                                   11.4μL
【０２０４】
サーモサイクリング条件：
ステップ１：９５℃で２分間
ステップ２：９５℃で３０秒間
ステップ３：５５℃で１分間
ステップ４：７２℃で３分間
ステップ２に戻り、ステップ（２〜４）を２４サイクル繰り返す
ステップ５：７２℃で４分間
１６℃で継続
【０２０５】
１％アガロースゲル上のＰＣＲ産物を視覚化した。典型的な結果を図９に示す。任意のクローン化インサートの非存在下で、プライマー対ＰＭＲ００３／ＰＭＲ００４（配列番号７／配列番号８）から約２２０ｂｐのバンドが得られる。このようにして産生された一定量のライブラリーが良好な場合、ＤＮＡ配列決定分析のために残りの形質転換混合物を巨大な寒天プレート上にプレートすることができる（３−５節）。
【０２０６】
プライマー対ＰＭＲ００３／ＰＭＲ００４はまた、ライブラリーの質のチェックに都合がよいが、配列決定のためのＰＣＲテンプレートの実際の調製にはプライマー対ＰＭＲ０１２／ＰＭＲ００３（配列番号１１／配列番号７）が好ましかった（４−２節を参照のこと）。
【化２０】
2005118036.tif 000022
【０２０７】
〔４  ＧＩＳタグの配列決定分析〕
〔４−１  ライブラリーのプレーティングおよびコロニー選択〕
形質転換ＴＯＰ１０(Invitrogen)細菌細胞を、２２×２２ｃｍ寒天プレートに３，０００／プレート未満のコロニー密度でプレートした。各コロニーを選択し、ＬＢ＋ゼオシンを含む３８４ウェルプレートに３７℃で一晩培養した（上記の３．５節を参照のこと）。３８４ウェルプレートの複数のコピーを複製し、−８０℃で保存する。
【０２０８】
〔４−２  テンプレートの調製〕
３８４ウェルプレート中の細菌培養物を、プレミックスＰＣＲカクテルに接種した。プライマー対ＰＭＲ０１２／ＰＭＲ００３を使用してＰＣＲを行った。
【０２０９】
このプライマー対により、任意の鎖状体インサートの非存在下で２４５ｂｐのバンドが得られる。それにもかかわらず、配列決定プライマーＰＭＲ００４（Ｍ１３逆方向；ＢａｍＨＩ部位由来の６８ｂｐ）およびＰＭＲ００６（配列番号９）（Ｍ１３正方向；ＢａｍＨＩ部位由来の８７ｂｐ）を使用することができるので、このプライマー組が好ましい。
【化２１】
2005118036.tif 000023
【０２１０】
〔４−３  配列決定〕
両方向で配列決定するために配列決定プライマーＰＭＲ００４およびＰＭＲ００６を使用してＰＣＲテンプレートを配列決定した。
【０２１１】
〔適用〕
本発明の任意の実施形態によるＧＩＳ分析方法は、完全な遺伝子発見プラットフォームである。これは、全長ｃＤＮＡライブラリー構築物、ｃＤＮＡタグ配列決定、ゲノムマッピング、およびアノテーションを同一の出発物質からの１つの操作に組み合わせている。例えば、ヒト幹細胞中で発現する遺伝子を研究するために、幹細胞ｍＲＮＡから開始し、幹細胞ＧＩＳ全長ｃＤＮＡライブラリーを構築し、その後ＧＩＳライブラリーを構築する。１００万個を超える転写物を明らかにするために、５０，０００クローンのＧＩＳライブラリーのみを配列決定する必要がある。このような大規模な(deep)サンプリングにより、ヒト幹細胞トランスクリプトーム中で発現するほぼ全ての固有の転写物を捕捉することが可能である。各ＧＩＳジタグをゲノムに特異的にマッピングし、それにより染色体上の対応する遺伝子の構造領域を定義することができる。染色体上の公知の遺伝子に対するほとんどのＧＩＳジタグマップおよびＧＩＳジタグ数により、発現活性を測定する。いくつかのＧＩＳジタグは、ゲノムの砂漠（「遺伝子なし」）領域にマッピングすることができ、これにより、幹細胞トランスクリプトーム中に発現される新規の遺伝子の同定が示唆され得る。このような方法では、この全トランスクリプトーム−全ゲノムアプローチによって遺伝子のゲノムアノテーションをさらに緻密にする。ＧＩＳジタグ配列に基づいて、これらの新規の推定遺伝子を、元のＧＩＳ全長ｃＤＮＡライブラリーから容易にクローン化することができる。
【０２１２】
このＧＩＳ遺伝子発見系をヒト幹細胞だけでなく全ての他の生体系（ヒトおよびモデル生物の細胞、組織、および器官の発生など）にも適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１】ＧＩＳ分析の実験の流れ（細菌形質転換アプローチ）を示す図である。図では、大文字または小文字のいずれかの文字Ｎ、Ｂ、Ｍ、Ｓは、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＭｍｅＩ、およびＳａｌＩの制限（認識）部位を示す。テキスト「Ｍｅ」は、新規に合成された第１のｃＤＮＡ鎖のメチル化を示す。
【図２】ＧＩＳ分析の実験の流れ（ＰＣＲベースのアプローチ）を示す図である。図では、大文字または小文字のいずれかの文字Ｎ、Ｂ、Ｍ、Ｓは、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＭｍｅＩ、およびＳａｌＩの制限（認識）部位を示す。テキスト「Ｍｅ」は、新規に合成された第１のｃＤＮＡ鎖のメチル化を示す。
【図３】ゲノムへのトランスクリプトームのマッピングであるＧＩＳの適用を示す図である。
【図４】元の全長ｃＤＮＡクローンの混合物のＭｍｅＩ消化を示す電気泳動ゲルを示す図である。レーン１：元の超らせん形成プラスミド調製物。レーン２：１ｋｂ  ＤＮＡラダー。レーン３：ＭｍｅＩ消化産物。矢印の先は全ての線状化タグ化プラスミドの位置を示す。
【図５】ＧＩＳジタグの調製に関する電気泳動ゲルを示す図である。ＧＩＳジタグライブラリーのプラスミドＤＮＡを、ＢａｍＨＩで消化する。５０ｂｐのジタグフラグメントを分離し、１０％ポリアクリルアミドゲルを使用してベクターから精製する。レーン１：ＤＮＡサイズマーカー。レーン２〜８：５０ｂｐＧＩＳジタグの形成。
【図６】ＰＣＲによるＧＩＳジタグの調製に関する電気泳動ゲルを示す図である。ＧＩＳ全長ｃＤＮＡライブラリーから作製したジタグ含有ＰＣＲフラグメントを、ＢａｍＨＩで消化する。５０ｂｐのジタグフラグメントを分離し、１０％ポリアクリルアミドゲルでアダプターアームから精製する。レーン１：ＤＮＡサイズマーカー。レーン２〜１５：５０ｂｐＧＩＳジタグの大量調製物。
【図７】ｐＧＩＳ１ベクター構築物を示す図である。
【図８】市販のｐＺＥｒＯ−１ベクター構築物(Invitrogen)を示す図である。種々の配列決定／ＰＣＲプライマー結合部位（ＰＭＲ００３、ＰＭＲ００４、ＰＭＲ０１１、およびＰＭＲ０１２）の位置を示す。
【図９】ＰＣＲを使用したＧＩＳライブラリー由来の複数のクローンに対して行ったＱＣ（品質検査）の典型的な例を示す図である。レーン１：負のコントロールとしてのｐＺＥｒＯ−１ベクター。Ｍ：１ｋｂ＋ＤＮＡラダー。レーン２〜２５：無作為に選択したクローン。
【図１０】ｐＧＩＳ１の二本鎖ヌクレオチド配列を示す図である。ＮｏｔＩとＳａｌＩとの制限部位の間の領域は、クローニング時に除去されたスタッファーフラグメント(stuffer fragment)である。これを太字と斜字体で強調する。一本鎖ヌクレオチド配列を、配列番号１８としても報告する。スタッファーフラグメントを示す領域は、ヌクレオチド１５と７０４との間である（両ヌクレオチドを含む）。
【図１】
2005118036.tif 000024
【図２】
2005118036.tif 000025
【図３】
2005118036.tif 000026
【図４】
2005118036.tif 000027
【図５】
2005118036.tif 000028
【図６】
2005118036.tif 000029
【図７】
2005118036.tif 000030
【図８】
2005118036.tif 000031
【図９】
2005118036.tif 000032
【図１０】
2005118036.tif 000033
【配列表】
2005118036000001.app
【外国語明細書】
2005118036.tif 000034
2005118036.tif 000035
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