(57)【要約】【課題】細胞培養に適した綿状繊維構造体を提供すること。【解決手段】有機高分子を溶媒に溶解させて溶液を製造する段階と、前記溶液に高電圧を印加させる段階と、前記溶液を噴出させる段階と、前記噴出された溶液から溶媒を蒸発させ繊維構造体を形成させる段階と、前記形成された繊維構造体の電荷を消失させる段階と、前記電荷消失によって繊維構造体を累積させる段階を含むことにより、平均繊維径が０．１〜２０μｍであり、平均見掛け密度が１０〜９５ｋｇ／ｍ３である綿状体を得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機高分子からなり平均繊維径が０．１〜２０μｍであり、平均見掛け密度が１０〜９５ｋｇ／ｍ３である綿状体の製造法であって、前記有機高分子を溶媒に溶解させて溶液を製造する段階と、前記溶液に高電圧を印加させる段階と、前記溶液を噴出させる段階と、前記噴出された溶液から溶媒を蒸発させ繊維構造体を形成させる段階と、前記形成された繊維構造体の電荷を消失させる段階と、前記電荷消失によって繊維構造体を累積させる段階を含む、綿状体の製造方法。
【請求項２】
前記噴出された溶液の電荷を消失させる段階が帯電風による電荷の消失である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記溶解に用いる溶媒が揮発性有機溶媒である、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
前記揮発性有機溶媒がハロゲン化炭化水素を含む有機溶媒である、請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
前記ハロゲン化炭化水素がジクロロメタンである、請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
前記有機高分子が脂肪族ポリエステルである、請求項１記載の製造方法。
【請求項７】
前記脂肪族ポリエステルがポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体である、請求項６記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は綿状体の製造方法に関する。更に詳しくは、本発明は細胞を培養する基材として有用な繊維構造体としての綿状体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療分野においては、細胞を培養する際に基材として繊維構造体が用いられることがある。繊維構造体としては、例えば手術用縫合糸などに用いられるポリグリコール酸を用いることが検討されている（例えば、非特許文献１参照。）。しかしながら、これら通常の方法で得られる繊維構造体は繊維径が大きすぎるため、細胞が接着できる面積は不十分であり、表面積を大きくするためにより繊維径の小さい繊維構造体が望まれていた。
【０００３】
一方繊維径の小さい繊維構造体を製造する方法として、静電紡糸法は公知である（例えば、特許文献１および２参照。）。静電紡糸法は、液体、例えば繊維形成物質を含有する溶液等を電場内に導入し、これにより液体を電極に向かって曳かせ、繊維状物質を形成させる工程を包含する。普通、繊維形成物質は溶液から曳き出される間に硬化させる。硬化は、例えば冷却（例えば、紡糸液体が室温で固体である場合）、化学的硬化（例えば、硬化用蒸気による処理）、または溶媒の蒸発などにより行われる。また、得られる繊維状物質は、適宜に配置した受容体上に捕集され、必要ならばそこから剥離することも出来る。また、静電紡糸法は綿状体状の繊維状物質を直接得ることが出来るため、一旦繊維を製糸した後、さらに繊維構造体を形成する必要がなく、操作が簡便である。
【０００４】
静電紡糸法によって得られる繊維構造体を、細胞を培養する基材に用いることは公知である。例えばポリ乳酸よりなる繊維構造体を静電紡糸法により形成し、この上で平滑筋細胞を培養することにより血管の再生が検討されている（例えば、非特許文献２参照。）。しかしながら、これら静電紡糸法を用いて得られた繊維構造体は、繊維間の距離が短い緻密な構造、すなわち見掛け密度の大きい構造をとりやすい。これを細胞培養する基材（足場）として用いると、培養が進むにつれて繊維構造体を形成している一本一本の繊維表面に、培養された細胞が堆積され繊維の表面が厚く覆われてしまう。その結果、繊維構造体内部にまで栄養分などを含む溶液が十分に移動することが困難であり、繊維上に培養・堆積された細胞の表面近傍でしか細胞培養が出来ないことがあった。
【０００５】
【特許文献１】特開昭６３−１４５４６５号公報
【特許文献２】特開２００２−２４９９６６号公報
【非特許文献１】大野典也、相澤益男監訳代表「再生医学」株式会社エヌ・ティー・エス、２００２年１月３１日、２５８頁
【非特許文献２】ジョエル  ディー  スティッチェルら（Ｊｏｅｌ  Ｄ．Ｓｔｉｔｚｅｌ，  Ｋｒｉｓｔｉｎ  Ｊ．Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ，  Ｇａｒｙ  Ｅ．Ｗｎｅｋ，  Ｄａｖｉｄ  Ｇ．Ｓｉｍｐｓｏｎ，  Ｇａｒｙ  Ｌ．Ｂｏｗｌｉｎ）著、「ジャーナル  オブ  バイオマテリアルズ  アプリケーションズ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」，（米国），セージ  パブリケーションズ（ＳＡＧＥ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ），２００１年，１６，ｐ．２２−３３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、長時間の細胞培養に適するように、繊維間の空隙も大きく、細胞培養に充分な厚みのある綿状体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記従来技術に鑑み鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明の目的は、
有機高分子からなり平均繊維径が０．１〜２０μｍであり、平均見掛け密度が１０〜９５ｋｇ／ｍ３である綿状体の製造法であって、前記有機高分子を溶媒に溶解させて溶液を製造する段階と、前記溶液に高電圧を印加させる段階と、前記溶液を噴出させる段階と、前記噴出された溶液から溶媒を蒸発させ繊維構造体を形成させる段階と、前記形成された繊維構造体の電荷を消失させる段階と、前記電荷消失によって繊維構造体を累積させる段階を含む、綿状体の製造方法によって達成される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の製造方法によって得られる綿状体は、構成する繊維の繊維径が小さく、細胞培養に適することから、細胞培養用の基材として有効である。また、得られる綿状体はそのまま使用することも出来るし、また取扱い性やその他の要求事項に合わせて他の部材と組み合わせて用いることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について詳述する。本発明により得られる綿状体とは、得られた単数または複数の繊維が積層され、必要に応じて繊維間が固定されて、形成された３次元の構造体である。綿状体の形態は、平均見掛け密度が１０〜９５ｋｇ／ｍ３であり、平均繊維径が０．１〜２０μｍである。得られた綿状体をその後例えば他のシート状の材料と積層する、またはチューブ状若しくはメッシュ状に形状加工する等の２次加工しやすいように、綿状体の形状は正方形であっても、円形であってもその形状は問わない。綿状体の厚みに関しては、取扱いの観点から１００μｍ以上であることが好ましく、さらに綿状体同士を重ねることで、厚みのある構造体を成形することも可能である。
【００１０】
本発明により得られる綿状体は、揮発性溶媒に溶解可能な有機高分子からなる。揮発性溶媒に溶解可能な有機高分子としては、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリアクリロニトリル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリヘキサメチレンカーボネート、ポリアリレート、ポリビニルイソシアネート、ポリブチルイソシアネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチルメタクリレート、ポリノルマルプロピルメタクリレート、ポリノルマルブチルメタクリレート、ポリメチルアクリレート、ポリエチルアクリレート、ポリブチルアクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリトリメチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリパラフェニレンテレフタラミド、ポリパラフェニレンテレフタラミド−３，４′―オキシジフェニレンテレフタラミド共重合体、ポリメタフェニレンイソフタラミド、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、メチルセルロース、プロピルセルロース、ベンジルセルロース、フィブロイン、天然ゴム、ポリビニルアセテート、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルエチルエーテル、ポリビニルノルマルプロピルエーテル、ポリビニルイソプロピルエーテル、ポリビニルノルマルブチルエーテル、ポリビニルイソブチルエーテル、ポリビニルターシャリーブチルエーテル、ポリビニリデンクロリド、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−ビニルカルバゾル）、ポリ（４−ビニルピリジン）、ポリビニルメチルケトン、ポリメチルイソプロペニルケトン、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリシクロペンテンオキシド、ポリスチレンサルホン、ナイロン６、ナイロン６６、ナイロン１１、ナイロン１２、ナイロン６１０、ナイロン６１２、並びにこれらの共重合体などが挙げられる。
【００１１】
これらのうち好ましくはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、およびポリエチレンサクシネート並びにこれらの共重合体などの脂肪族ポリエステルが挙げられ、さらに好ましくはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトンが挙げられる。なかでもポリ乳酸が特に好ましい。
【００１２】
本発明においては、その目的を損なわない範囲で、他のポリマーや他の化合物を併用（例えば、ポリマー共重合、ポリマーブレンド、化合物混合）しても良い。
【００１３】
本発明により得られる綿状体は平均繊維径が０．１〜２０μｍである繊維より形成される。平均繊維径が０．１μｍより小さいと、再生医療用細胞培養基材として用いるには、生体内分解性が早すぎるため好ましくない。また平均繊維径が２０μｍより大きいと細胞が接着できる面積が小さくなり好ましくない。より好ましい平均繊維径は０．１〜１０μｍである。なお繊維径とは繊維断面の直径を表す。しかし時には繊維断面の形状が楕円形になることもありうる。この場合の繊維径とは、該楕円形の長軸方向の長さと短軸方向の長さの平均をその繊維径として算出する。また繊維断面が円形でも楕円形でもない時には円、または楕円に近似して繊維径を算出する。
【００１４】
本発明により得られる綿状体は、平均見掛け密度が１０〜９５ｋｇ／ｍ３である綿状体である。ここで平均見掛け密度とは、作製した綿状体の面積、平均厚、質量から割り出した密度を意味する。好ましい平均見掛け密度は５０〜９０ｋｇ／ｍ３である。平均見掛け密度が９５ｋｇ／ｍ３より大きいと、細胞培養時に栄養分などを含む溶液が基材内部まで十分に浸透しないため好ましくない。平均見掛け密度が１０ｋｇ／ｍ３より小さいと、細胞培養時に必要な力学強度を保つことが出来ないため好ましくない。
【００１５】
次に有機高分子を溶媒に溶解させて溶液を製造する段階について説明する。本発明の製造方法における溶液中の溶媒に対する有機ポリマーの濃度は１〜３０重量％であることが好ましい。有機ポリマーの濃度が１重量％より小さいと、濃度が低すぎるため繊維構造体を形成することが困難となり好ましくない。また、３０重量％より大きいと得られる繊維構造体の繊維径が大きくなり好ましくない。より好ましい溶液中の溶媒に対する有機ポリマーの濃度は２〜２０重量％である。
【００１６】
また、溶媒は一種を単独で用いても良く、複数の溶媒を組み合わせても良い。前記溶媒としては、有機ポリマーを溶解可能で、かつ紡糸する段階で蒸発し、繊維を形成可能なものであれば特に限定されず、例えば、アセトン、クロロホルム、エタノール、イソプロパノール、メタノール、トルエン、テトラヒドロフラン、水、ベンゼン、ベンジルアルコール、１，４−ジオキサン、プロパノール、ジクロロメタン、四塩化炭素、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、フェノール、ピリジン、トリクロロエタン、酢酸、蟻酸、ヘキサフルオロイソプロパノール、ヘキサフルオロアセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド、１，３−ジオキソラン、メチルエチルケトン、上記溶媒の混合溶媒等が挙げられる。これらのうち、取扱い性や物性などから、ジクロロメタンを用いることが好ましい。
【００１７】
次に、溶液に高電圧を印加させる段階と、溶液を噴出させる段階と、噴出された溶液から溶媒を蒸発させ繊維構造体を形成させる段階について説明する。
【００１８】
本発明においては、有機高分子を溶解した溶液を噴出させ、繊維構造体を形成させるために、溶液に高電圧を印加させる必要がある。電圧を印加させる方法については、有機高分子を溶解した溶液を噴出させ、繊維構造体が形成されれば特に限定されないが、溶液に電極を挿入させ電圧を印加させる方法や、溶液噴出ノズルに対して電圧を印加させる方法などがある。
【００１９】
また、溶液に印加させる電極とは別に補助電極を設ける事も可能である。また、印加電圧の値については、前記繊維構造体が形成されれば特に限定されないが、通常は５〜５０ｋＶの範囲であり、印加電圧が５ｋＶより小さい場合は、溶液が噴出されずに繊維構造体が形成されないため好ましくなく、印加電圧が５０ｋＶより大きい場合は、電極からアース電極に向かって放電が起きるために好ましくない。より好ましくは１０〜３０ｋＶの範囲である。所望の電位は従来公知の任意の適切な方法で作れば良い。
【００２０】
また、有機高分子を溶解した溶液を噴出させた直後に有機高分子を溶解させた溶媒が揮発し繊維構造体が形成される。通常の紡糸は大気下、室温で行われるが、揮発が不十分である場合には陰圧下で行うことや、高温の雰囲気下で行うことも可能である。また、紡糸する温度は溶媒の蒸発挙動や紡糸液の粘度に依存するが、通常は０〜５０℃の範囲である。
【００２１】
次に、形成された繊維構造体の電荷を消失させる段階について説明する。前記繊維構造体の電荷を消失させる方法は、前記繊維構造体の電荷を消失させる方法であれば特に限定を受けないが、好ましい方法として、イオナイザーにより電荷を消失させる方法が挙げられる。イオナイザーとは内蔵のイオン発生装置によりイオンを発生させ、前記イオンを帯電物に放出させることにより前記帯電物の電荷を消失させうる装置である。本発明で用いられるイオナイザーを構成する好ましいイオン発生装置として、内蔵の放電針に高電圧を印加させることによりイオンを発生する装置が挙げられる。
【００２２】
次に前記電荷消失によって繊維構造体を累積させる段階について説明する。前記電荷消失によって繊維構造体を累積させる方法は、前記繊維構造体が累積される方法であれば特に限定を受けないが、通常の方法として、電荷消失により繊維構造体の静電力を失わせ、自重により落下、累積させる方法が挙げられる。また必要に応じて、静電力を消失させた繊維構造体を吸引しメッシュ上に累積させる方法、装置内の空気を対流させメッシュ上に累積させる方法などを行ってもよい。
【００２３】
また、本発明により得られる綿状体は、単独で用いても良いが、取扱い性やその他の要求事項に合わせて、他の部材と組み合わせて使用しても良い。
【００２４】
また、本発明により得られる綿状体の用途は、再生医療用の細胞培養基材に限定されるものではなく、各種フィルターや触媒担持基材など各種用途に用いることが出来る。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例により何等限定を受けるものではない。また以下の各実施例、比較例における評価項目は以下のとおりの手法にて実施した。
また実施例中における各値は下記の方法で求めた。
１．平均繊維径：
得られた繊維構造体の表面を走査型電子顕微鏡（株式会社日立製作所製Ｓ−２４００）により撮影（倍率２０００倍）して得た写真から無作為に２０箇所を選んで繊維の径を測定し、すべての繊維径（ｎ＝２０）の平均値を求めて、平均繊維径とした。
２．面積の測定：
０．１ｍｍ角の方眼紙上に綿状体を置き、綿状体の輪郭を写し取り、輪郭線内の升数を数える事により算出した。
３．平均厚：
高精度デジタル測長機（株式会社ミツトヨ：商品名「ライトマチックＶＬ−５０」）を用いて測長力０．０１Ｎによりｎ＝１０にて綿状体の膜厚を測定した平均値を算出した。なお本測定においては測定機器が使用可能な最小の測定力で測定を行った。
４．平均見掛け密度：
綿状体の質量を測定し、上記方法により求めた面積、平均厚をもとに平均見掛け密度を算出した。
【００２６】
［実施例１］
ポリ乳酸（株式会社島津製作所製：商品名「Ｌａｃｔｙ９０３１」）１重量部、ジクロロメタン（和光純薬工業株式会社、特級）９重量部を室温（２５℃）で混合し溶液を作製した。図１に示す装置を用いて紡糸を行い綿状体を得た。噴出ノズル１の内径は０．８ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、噴出ノズル１からイオナイザー７までの距離は１５ｃｍ、噴出ノズル１から電極４までの距離は２５ｃｍであった。得られた綿状体を構成する繊維構造体の平均径は３．４μｍであり、平均見掛け密度は７０ｋｇ／ｍ３であった。綿状体表面の電子顕微鏡写真を図２、３に示す。
【００２７】
［参考例］
ポリ乳酸（株式会社島津製作所：商品名「Ｌａｃｔｙ９０３１」）１重量部、ジクロロメタン（和光純薬工業株式会社製、特級）９重量部を室温（２５℃）で混合し溶液を作製した。図１に示す装置のイオナイザー７の電源を切った状態で紡糸を行い、電極４上に繊維構造体を得た。噴出ノズル１の内径は０．８ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、噴出ノズル１から電極４までの距離は２５ｃｍであった。得られた繊維集合体を構成する繊維構造体の平均径は３．５μｍであり、平均見掛け密度は１８０ｋｇ／ｍ３であった。繊維集合体の電子顕微鏡写真を図４、５に示す。
【００２８】
電子顕微鏡観察の結果、実施例１によって得られた見掛け密度の低い綿状体の表面構造と、参考例で得られた繊維構造体の表面構造とでは表面構造に大きな差は観られず、実施例１で得られたものものは、細胞を培養する基材として好適に用いることができることを確認した。
【００２９】
なお、本実施例で得られた繊維構造体は、見掛け密度がより低く、より細胞培養に適しているものである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の製造方法を行うための製造装置を模式的に示した図である。
【図２】実施例１の操作で得られた綿状体の表面を走査型電子顕微鏡で撮影（２０００倍）して得られた写真図である。
【図３】実施例１の操作で得られた綿状体の表面を走査型電子顕微鏡で撮影（２００００倍）して得られた写真図である。
【図４】比較例１の操作で得られた繊維集合体の表面を走査型電子顕微鏡で撮影（２０００倍）して得られた写真図である。
【図５】比較例１の操作で得られた繊維集合体の表面を走査型電子顕微鏡で撮影（２００００倍）して得られた写真図である。
【符号の説明】
【００３１】
１  溶液噴出ノズル
２  溶液
３  溶液保持槽
４  電極
５  高電圧発生器
６  綿状体堆積台
７  イオナイザー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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