(57)【要約】【課題】  ヒトグリオーマ細胞を特異的にインビボで殺傷する能力を有し、ヒトグリオーマの治療に有用でかつ安全な変異ＨＳＶベクター（ウイルスストック）や、その作製に用いられるMusashi1プロモータを利用したアンプリコンベクターや、前記ウイルスストックを有効成分とするヒトグリオーマ治療薬等を提供すること。【解決手段】  宿主細胞に、（１）Musashi1プロモータとその下流に連結されたＨＳＶのγ３４．５遺伝子とポリＡ配列とＨＳＶoriと、ＨＳＶのａ倒置反復配列とを備えたアンプリコンベクターと、（２）前記γ３４．５遺伝子が不活性化されてγ３４．５を発現する機能を失ったヘルパーウイルスとを、ともに感染させることにより、感染細胞内でγ３４．５を発現することができるアンプリコンベクター由来のウイルス粒子と、ヘルパーウイルス由来のウイルス粒子とを含むウイルスストックを得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Musashi1プロモータと、その下流に連結されたＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子と、Musashi1プロモータによる前記遺伝子の転写を終結させるポリＡ配列と、ＨＳＶoriと、ＨＳＶのａ倒置反復配列とを備えたことを特徴とするアンプリコンベクター。
【請求項２】
ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子が、ＨＳＶのγ３４．５遺伝子であることを特徴とする請求項１記載のアンプリコンベクター。
【請求項３】
宿主細胞に、（１）Musashi1プロモータと、その下流に連結されたＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子と、Musashi1プロモータによる前記遺伝子の転写を終結させるポリＡ配列と、ＨＳＶoriと、ＨＳＶのａ倒置反復配列とを備えたアンプリコンベクターと、（２）前記ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子が破壊・欠損・置換等により不活性化されてＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったヘルパーウイルスとを、ともに感染させることにより得ることができる、感染細胞内でＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現することができる前記アンプリコンベクター由来のウイルス粒子と、前記ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったヘルパーウイルス由来のウイルス粒子とを含むことを特徴とするウイルスストック。
【請求項４】
感染細胞が、ヒトグリオーマ細胞、又はニューロブラストーマ等の未分化神経上皮腫瘍細胞であることを特徴とする請求項３記載のウイルスストック。
【請求項５】
ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子が、ＨＳＶのγ３４．５遺伝子であることを特徴とする請求項３又は４記載のウイルスストック。
【請求項６】
ヘルパーウイルスが、ＨＳＶのγ３４．５及びリボヌクレオチドリダクターゼを発現する機能を失ったヘルパーウイルスであることを特徴とする請求項３〜５のいずれか記載のウイルスストック。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか記載のウイルスストックを有効成分とすることを特徴とするヒトグリオーマ治療薬。
【請求項８】
請求項７記載のヒトグリオーマ治療薬を、ヒトグリオーマに直接投与することを特徴とするヒトグリオーマの治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Musashi1プロモーターを利用したヒトグリオーマ治療に有用な変異ＨＳＶベクター、より詳しくはニューロビルレンスファクターと呼ばれるγ３４．５などのヒトグリオーマ細胞内でＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現することができる前記アンプリコンベクター由来のウイルス粒子と、前記ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったヘルパーウイルス由来のウイルス粒子とを含むヒトグリオーマ（グリオーマ）治療に有用な複製欠陥ＨＳＶベクター（ウイルスストック）等に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性グリオーマ、特に、多型性神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、成人の主要な脳腫瘍の最も一般的で絶望的な形態である（例えば、非特許文献１参照。）。ＧＢＭは、周囲の正常な脳組織を広範囲に浸潤する傾向があるため、最近の神経画像処理技術や外科的技術の改善による助けを用いても、それを完全に除去することは実質的に不可能であり、その他の治療の形態を必要とした。しかしながら、診断上の手順、放射線治療、化学療法及び支持療法の大きな進展にも関わらず、これらの新生物（neoplasm）は、従来の治療に対して強い耐性を示す（例えば、非特許文献２，３，４，５参照。）。患者の予後は、過去２０年間において低いままであり、患者のほとんどが診断から１年以内に病気に屈する（例えば、非特許文献６，７参照。）。したがって、有効な治療がなく、この病気の予後が著しく低いことから、遺伝子治療等の新たな治療の選択肢が必要となる。
【０００３】
現在まで、非複製ベクター（replication-defective vector）による腫瘍への遺伝子導入（tumor transduction）の高効率性が達成していないため、複製型ウイルスベクター（replication-competent virus vector）は癌治療剤として期待されている（例えば、非特許文献８，９，１０参照。）。癌の遺伝子治療における近年の発達は、細胞毒性遺伝子を腫瘍細胞に送達（deliver）するばかりでなく融解性感染を介してそれらを直接破壊する、遺伝子改変して分裂細胞において選択的に複製するように設計された殺腫瘍性ウイルスの使用を中心に展開し（例えば、非特許文献１１，１２参照。）、少なくとも１０種のウイルス種について臨床試験が始まっている（非特許文献１３参照。）。分裂細胞において選択的に複製するように設計された殺腫瘍性ウイルスの使用は、新生物内複製（intraneoplastic replication）が、接種した腫瘍塊に抗癌効果の解剖学的広がりの増大や、抗癌遺伝子の送達（delivery）による腫瘍性効果の増強を可能にすることから（例えば、非特許文献１４，１５参照。）、殺腫瘍活性と安全性の両面で有望視されている。
【０００４】
ＨＳＶは２本鎖ＤＮＡウイルスで、核内で増殖するＤＮＡウイルスの中で最大長のゲノム（１５３ｋｂ）を有し、８４種のオープンリーディングフレームをコードする。ゲノムはＬ（long）領域とＳ（short）領域から構成され、各ユニーク配列をその両側に倒置反復配列が挟む形で存在する。ウイルスゲノムの全塩基配列が決定され、ほとんどのウイルス遺伝子の機能は解明されている。そして、このＨＳＶの、分裂細胞において選択的に複製するように設計された殺腫瘍性変異体として、２つのタイプの単一遺伝子が変異したＨＳＶ変異体が研究されてきた。１つは、チミジンキナーゼ、リボヌクレオチドリダクターゼ（ＲＲ）、ウラシルＮ−グリコシレート（uracyl N-glycosylate）等の核酸代謝に必要とされるウイルス遺伝子の機能に欠陥を持つウイルス変異体であり、もう１つは、宿主タンパク質合成の遮断の抑制を通して感染細胞のウイルス放出数を著しく増強することによりビルレンスファクターとして機能するγ３４．５遺伝子（ＩＣＰ３４．５）の機能に欠陥を持つウイルス変異体である（例えば、非特許文献１６，１７参照。）。
【０００５】
単一遺伝子が変異したＨＳＶ変異体は、相同組み換え等のバックミューテーションによる野生型への復帰変異の危険の他、例えば、チミジンキナーゼの機能欠損変異体におけるガンシクロビルに対する抵抗力の増強、γ３４．５の機能欠損変異体における殺腫瘍活性の減少等の問題を有する。そこで、野生型への復帰変異の危険性を減少させるため、多重変異が導入されたＨＳＶが開発された。これらには、γ３４．５の欠失変異及びリボヌクレオチドリダクターゼの挿入変異（insertional mutation）の両方の機能が欠損した変異体であるＧ２０７及びＭＧＨ１を挙げることができる。これら二重変異体は、頭蓋内に直接注入することによりニューロビルレンスの著しい減少を示し、ガンシクロビルに対し感受性を維持し、正常な組織と比較して腫瘍細胞において相対的に選択的な複製を示す。このような二重変異ＨＳＶ系統は、欠陥γ３４．５遺伝子を維持し、それによって正常な組織に対して弱いビルレンスを示す。しかしながら、それらは腫瘍細胞に対して明らかな殺腫瘍効果を示すが、かかる効果は正常なγ３４．５遺伝子を有する変異体において観察されるものより少ない。
【０００６】
上記Ｇ２０７は、Martuzaらにより、γ３４．５遺伝子における欠失及びＩＣＰ６遺伝子へのｌａｃＺ遺伝子挿入により、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）の二重変異体として開発された（例えば、非特許文献１８，特許文献１参照。）。Ｇ２０７は他のウイルスベクター類よりも治療上の観点において優れている。Ｇ２０７は分裂細胞において複製され、その結果感染細胞は融解して死に至るが、非分裂細胞ではその増殖は顕著に弱まっている。無胸腺症マウスに樹立された腫瘍内にＧ２０７を接種すると腫瘍選択的複製によって腫瘍増殖が抑制され、マウスが延命された（例えば、非特許文献１９参照。）。また、免疫応答性マウスにおいてはＧ２０７を腫瘍内接種することにより腫瘍特異的免疫応答が誘導され、Ｇ２０７を接種しなかった腫瘍の増殖をも抑制する（例えば、非特許文献２０参照。）。この場合、Ｇ２０７がインサイチュー癌ワクチンとして機能している。現在まで、脳腫瘍を中心に変異ヘルペスウイルスＧ２０７を用いた遺伝子治療が行われ、米国で臨床応用も開始された（例えば、非特許文献９参照。）。この臨床応用において、Ｇ２０７の安全性は証明されているが、これまでに報告された臨床結果は、あまり効果的でないことが報告されている（例えば、非特許文献９，１０参照。）。
【０００７】
臨床的に関連するウイルスベクターを構築する際は、安全性及び殺腫瘍の有効性（oncolytic efficacy）の両方が必須である（例えば、非特許文献２１，２２参照。）。安全性は、変異ウイルスの複製の選択性に直接依存する。有効性は、ウイルスの効率的に腫瘍細胞を感染させ、感染した新生物塊の中で増殖する能力に依存する。Ｇ２０７等の多重変異ＨＳＶベクターは、安全性を高め、野生型復帰変異のリスクを減らそうと努力して構築されたが、それらの殺腫瘍の有効性は同時に減少したようである。Ｇ２０７における欠失遺伝子のひとつであるγ３４．５遺伝子は、ニューロビルレンスファクター（neurovirulence factor）とも呼ばれており、宿主タンパク質合成の遮断の抑制を通して感染細胞のウイルス放出数を著しく増強する機能を有する（例えば、非特許文献１６，２３参照。）。γ３４．５遺伝子を欠失させることにより、Ｇ２０７は非常に安全性が高くなったが、その治療効果は少々低下したと考えられる。
【０００８】
腫瘍細胞に選択的なＨＳＶ複製を与えるいくつかの戦略が知られている。例えば、分裂終了細胞における複製に必要とされるウイルス遺伝子の欠失又は変異（例えば、非特許文献１２，１４，２４参照。）、ウイルスの子孫産生調節の責任を有するウイルス遺伝子の欠失（例えば、非特許文献２５，２６，２７参照。）。必須のウイルス遺伝子の発現を調節するための腫瘍特異的プロモーターの使用（例えば、非特許文献２８参照。）、正常な組織よりむしろ腫瘍に対するＨＳＶ糖タンパク質の受容体特異性の変化（例えば、非特許文献２９参照。）等が知られている。
【０００９】
Musashi1は、本発明者らにより見い出された神経のＲＮＡ結合タンパク質であり、神経幹細胞／前駆細胞の進化的によく保存されたマーカーである（例えば、非特許文献３０，３１，３２，３３参照。）。それは、固有の（proper）神経細胞及び膠細胞の発達に必須である転写後の遺伝子調節において重要な役割を果たす可能性が高い（例えば、非特許文献３０，３１，３２，３３，３４参照。）。近年、Musashi1は、複数の腫瘍、特に中枢神経系では悪性グリオーマに発現し（例えば、非特許文献３５，３６，３７参照。）、悪性グリオーマのマーカーとして使用できることが解明された（例えば、非特許文献３６，３７参照。）。
【００１０】
さらに、マウスのMusashi1プロモーター（Ｐ／Musashi1）がヒト胎児脳においても機能することや、Ｐ／Musashi1の作動によるＧＦＰ発現に基づいて、蛍光標識細胞分取器（ＦＡＣＳ）を用いて神経幹細胞の選別ができることが報告されている（例えば、非特許文献３８参照。）。
【特許文献１】米国特許第５５８５０９６号明細書
【非特許文献１】Benign Cerebral Gliomas, Vol. 1. pp. 181-189, 1995
【非特許文献２】Hum. Gene Ther. 8, 965-977, 1997
【非特許文献３】Pathol. Res. Pract. 194, 149-155, 1998
【非特許文献４】Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 14453-14458, 1998
【非特許文献５】J. Neurooncol. 42, 95-102, 1999
【非特許文献６】J. Neurosurg. 88, 1-10, 1998
【非特許文献７】Cancer Res. 62, 756-763, 2002
【非特許文献８】Nat. Med. 6, 879-885, 2000
【非特許文献９】Gene Ther. 7, 867-874, 2000
【非特許文献１０】Gene Ther. 7, 859-866, 2000
【非特許文献１１】Surg. Oncol. Clin. N. Am. 7, 589-602, 1998
【非特許文献１２】Science 252, 854-856, 1991
【非特許文献１３】Nat. Med. 7, 781-787, 2001
【非特許文献１４】Hum. Gene. Ther. 5, 183-191, 1994
【非特許文献１５】Cancer Res. 58, 5731-5737, 1998
【非特許文献１６】Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3266-3270, 1992
【非特許文献１７】Nat Cell Biol 3, 745-750, 2001
【非特許文献１８】Nat. Med. 1, 938-943, 1995
【非特許文献１９】Cancer. Res. 55, 4752, 1995
【非特許文献２０】Hum. Gene Ther. 9, 2177-2185, 1998
【非特許文献２１】J. Virol. 73, 3843-3853, 1999
【非特許文献２２】J. Virol. 74, 4765-4775, 2000
【非特許文献２３】Science 250, 1262-1266, 1990
【非特許文献２４】Hum. Gene Ther. 8, 533-544, 1997
【非特許文献２５】Neurosurgery 32, 597-603, 1993
【非特許文献２６】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1411-1415, 1995
【非特許文献２７】Lab. Investig. 73, 636-648, 1995
【非特許文献２８】J. Virol. 73, 7556-7564, 1999
【非特許文献２９】J. Virol. 72, 9683-9697, 1998
【非特許文献３０】Neuron 13, 67-81, 1994
【非特許文献３１】Dev. Biol. 176, 230-242, 1996
【非特許文献３２】Genomics 52, 382-384, 1998
【非特許文献３３】Dev. Neurosci. 22, 139-153, 2000
【非特許文献３４】J. Neurosci. 17, 8300-8312, 1997
【非特許文献３５】Differentiation. 68, 141-152, 2001
【非特許文献３６】BBRC 293, 150-154, 2002
【非特許文献３７】GLIA 34, 1-7, 2001
【非特許文献３８】Nat. Biotechnol. 19, 843-850, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、ヒトグリオーマ細胞を特異的にインビボで殺傷する能力を有し、ヒトグリオーマの治療に有用でかつ安全な変異ＨＳＶベクター（ウイルスストック）や、かかるウイルスストックを作製するのに用いられるMusashi1プロモータを利用したアンプリコンベクターや、前記ウイルスストックを有効成分とするヒトグリオーマ治療薬等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、臨床的に適用可能なＨＳＶベクターを構築することを考慮して、安全性を可能な限り低下させずに、従来の変異体の殺腫瘍の有効性を増強することが必要であると考えた。そこで、腫瘍細胞に選択的なＨＳＶ複製を与えるためのいくつかの戦略のうち、必須のウイルス遺伝子の発現を調節するために腫瘍特異的プロモーターを使用することが有望であると考えた。
【００１３】
他方、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）の変異体Ｇ２０７は、前記のように、γ３４．５遺伝子の一部欠失及びＵL３９遺伝子へのｌａｃＺ挿入により、これら遺伝子が不活性化されてγ３４．５やリボヌクレオチドリダクターゼを発現する機能が欠失するように設計されている。Ｇ２０７は、インビトロ及びインビボでの研究で効率的な殺腫瘍活性（oncolytic activity）を示すが、正常な組織においては最小の毒性を示し、現在、悪性グリオーマの臨床試験が行なわれている。しかしながら、フェイズＩ試験の結果によると、Ｇ２０７の安全性については証明されているが、その殺腫瘍活性については有効であるとの結果が得られなかった。ニューロビルレンスファクターをコードするγ３４．５遺伝子を欠失させることにより、Ｇ２０７の安全性は非常に高くなったが、ＨＳＶ１による殺腫瘍活性は著しく減少した。かかるＧ２０７の殺腫瘍活性の低下を考慮すると、γ３４．５遺伝子が腫瘍細胞にのみ特異的に発現した場合、γ３４．５が発現しない場合と比較して、治療効果はより強く増強すると考えた。
【００１４】
本発明者らは、Ｇ２０７の安全性を低下させることなくその治療効果を増強するため、本発明者らにより見い出された神経のＲＮＡ結合タンパク質であり、最近ヒト悪性グリオーマに発現し、それらのマーカーとして使用されることが明らかになったMusashi1のプロモーター（Ｐ／Musashi1）が神経前駆細胞以外の悪性グリオーマにおいても機能し、特に悪性グリオーマにおけるＨＳＶの複製増殖能に関与するＨＳＶ１遺伝子の発現を調節するための腫瘍特異的プロモーターとして使用できるのではないかと考えた。そこで、まず最初に、ヒトグリオーマ細胞株（Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１、Ｔ９８Ｇ）及びその他のいくつかの癌細胞株（肺癌細胞株Ａ５４９、胃癌細胞株ＴＭＫ−１、大腸癌細胞株ＨＴ２９、膀胱癌細胞株ＫＵ１９−９及びＴ２４、前立腺癌細胞株ＤＵ１４５）におけるMusashi1のｍＲＮＡ発現についてＲＴ−ＰＣＲ分析により調べた。その結果、腫瘍細胞株の中では、Musashi1のｍＲＮＡがグリオーマ細胞株及びニューロブラスト細胞株に特異的に発現することを確認した。この結果は、これまでに報告された事例と完全に一致した（Differentiation 68, 141-152, 2001、GLIA 34, 1-7, 2001）。次に、ヒト胎児脳の神経幹細胞において機能することが知られているＰ／Musashi1の転写活性について調べた（Nat. Biotechnol. 19, 843-850, 2001）。ＧＦＰレポーターアッセイにより、ヒトグリオーマ細胞株及びその他のいくつかの腫瘍細胞株におけるＰ／Musashi1の転写活性について調べた結果、ヒトグリオーマ細胞株の方がその他の癌細胞株と比較して、Ｐ／Musashi1の転写活性が著しく高いデータが得られた。この結果から、本発明者らは、Ｐ／Musashi1がヒトグリオーマ細胞株で選択的に機能することを確認した。
【００１５】
次に、本発明者らは、ＨＳＶの複製増殖能に関与するＨＳＶ１遺伝子であるγ３４．５遺伝子をＰ／Musashi1で転写する再ターゲティングが、正常な組織においては減衰したビルレンスを維持しながら、グリオーマにおいては選択的ビルレンスを達成する手段を提供する可能性があると考えた。そこで、γ３４．５遺伝子をＰ／Musashi1で転写制御した複製欠損ウイルスを作製し、この複製欠損ウイルスとヘルパーウイルスとしてのＧ２０７とをグリオーマ細胞にコ・トランスフェクションすることによりｄｖＭ３４５をウイルスストックとして得た。そして、このｄｖＭ３４５（ウイルスストック）が、培養において、Ｇ２０７単独の場合と比較して、ヒトグリオーマ細胞株においてより高い細胞変性の有効性を顕著に示すことがわかった。これに対して、その他の癌細胞株においては、ｄｖＭ３４５とＧ２０７単独との場合の差異は明白ではなかった。また、一段階ウイルス成長解析の結果によると、Ｐ／Musashi1が効率的に働くヒトグリオーマ細胞株におけるＵ８７ＭＧにおいては、ｄｖＭ３４５のより高い子孫ウイルス（Ｇ２０７）産生能力から、ｄｖＭ３４５のより高い殺腫瘍活性が得られるが、Ｐ／Musashi1が効率的に作動しない肺癌細胞株Ａ５４９においては、かかる効果は観察されず、ｄｖＭ３４５の高い殺腫瘍活性は腫瘍タイプ特異的であることを確認した。
【００１６】
次いで、ヌードマウスにおける皮下Ｕ８７ＭＧ腫瘍モデル及び脳内Ｕ８７ＭＧ腫瘍モデルの両モデルを用いて、ｄｖＭ３４５のインビボでの治療効果について調べた。皮下腫瘍モデルにおいては、ｄｖＭ３４５はＧ２０７単独の場合と比較して、Ｕ８７ＭＧ腫瘍の成長をより劇的に阻害した。脳内Ｕ８７ＭＧ腫瘍モデルにおいては、５．０×１０5ＰＦＵのウイルスの低投与量で、Ｇ２０７で処理したグループと比較して、ｄｖＭ３４５で処理した動物では統計的に有意な生存の増加を確認した。両モデルにおいて、ｄｖＭ３４５（ウイルスストック）の腫瘍内直接投与での治療効果が増大することがわかった。最後に、本発明者らは、３匹のマウスを使用して、ｄｖＭ３４５の安全性について調べたところ、投与量５．０×１０6ＰＦＵでは副作用を観察することができなかった。
【００１７】
さらに、変異ウイルスの安全性について考慮すると、前記のように、ウイルスの複製の選択性に直接依存する。本発明におけるように、腫瘍特異的プロモータＰ／Musashi1を使用した場合、主要な問題はプロモータの特異性に直接依存する。原始的な未分化ＣＮＳ細胞において優先的に発現する神経のＲＮＡ結合タンパク質であるMusashi1の性質（Dev. Biol. 176, 230-242, 1996、J. Neurosci. 17, 8300-8312, 1997、Genomics 52, 382-384, 1998、Dev. Neurosci. 22, 139-153, 2000）を考慮すると、そのプロモーターは末端の分化した正常な組織においては機能しないと考えられたが、本発明者らの得た結果から、Ｐ／Musashi1は、本発明者らによる文献（Nat. Biotechnol. 19, 843-850, 2001）に最初にその活性を報告した神経前駆細胞以外に、グリオーマ特異的プロモーターと呼ぶことができる。このように、Ｐ／Musashi1をｄｖＭ３４５作製に利用し、グリオーマ特異的にγ３４．５を発現させた結果、Ｇ２０７の治療効果を、その安全性に障害を与えることなく増強しうることを見い出した。
【００１８】
以上のとおり、ｄｖＭ３４５（ウイルスストック）を用いると、Ｇ２０７単独の場合と比較して、インビトロ及びインビボでのより高い殺腫瘍活性を示しながら、安全性上好ましい毒性プロファイルを維持しうることを確認した。本発明は以上の知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１９】
すなわち本発明は、Musashi1プロモータと、その下流に連結されたＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子と、Musashi1プロモータによる前記遺伝子の転写を終結させるポリＡ配列と、ＨＳＶoriと、ＨＳＶのａ倒置反復配列とを備えたことを特徴とするアンプリコンベクター（請求項１）や、ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子が、ＨＳＶのγ３４．５遺伝子であることを特徴とする請求項１記載のアンプリコンベクター（請求項２）に関する。
【００２０】
また本発明は、宿主細胞に、（１）Musashi1プロモータと、その下流に連結されたＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子と、Musashi1プロモータによる前記遺伝子の転写を終結させるポリＡ配列と、ＨＳＶoriと、ＨＳＶのａ倒置反復配列とを備えたアンプリコンベクターと、（２）前記ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子が破壊・欠損・置換等により不活性化されてＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったヘルパーウイルスとを、ともに感染させることにより得ることができる、感染細胞内でＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現することができる前記アンプリコンベクター由来のウイルス粒子と、前記ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったヘルパーウイルス由来のウイルス粒子とを含むことを特徴とするウイルスストック（請求項３）や、感染細胞が、ヒトグリオーマ細胞、又はニューロブラストーマ等の未分化神経上皮腫瘍細胞であることを特徴とする請求項３記載のウイルスストック（請求項４）や、ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子が、ＨＳＶのγ３４．５遺伝子であることを特徴とする請求項３又は４記載のウイルスストック（請求項５）や、ヘルパーウイルスが、ＨＳＶのγ３４．５及びリボヌクレオチドリダクターゼを発現する機能を失ったヘルパーウイルスであることを特徴とする請求項３〜５のいずれか記載のウイルスストック（請求項６）に関する。
【００２１】
さらに本発明は、請求項３〜６のいずれか記載のウイルスストックを有効成分とすることを特徴とするヒトグリオーマ治療薬（請求項７）や、請求項７記載のヒトグリオーマ治療薬を、ヒトグリオーマに直接投与することを特徴とするヒトグリオーマの治療方法（請求項８）に関する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によると、ヒトグリオーマ細胞を特異的にインビボで殺傷する能力を有し、ヒトグリオーマの治療に有用でかつ安全な変異ＨＳＶベクター（ウイルスストック）や、かかるウイルスストックを作製するのに用いられるMusashi1プロモータを利用したアンプリコンベクターや、前記ウイルスストックを有効成分とするヒトグリオーマ治療薬等を提供することができる。本発明のウイルスストックがヒトグリオーマ組織に直接投与された場合、Musashi1プロモータがヒトグリオーマ細胞内でのみ特異的に作動することから、選択的にヒトグリオーマ細胞内で変異ＨＳＶが増殖し、グリオーマ細胞が融解して、腫瘍組織の増殖抑制や消滅を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明のアンプリコンベクターとしては、Musashi1プロモータ（Ｐ／Musashi1）と、その下流に連結されたＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子と、Ｐ／Musashi1による前記遺伝子の転写を終結させるポリＡ配列と、ＨＳＶoriと、ＨＳＶのａ倒置反復配列とを備えたものであればどのようなものでもよく、また、本発明のウイルスストックとしては、宿主細胞に、（１）Ｐ／Musashi1と、その下流に連結されたＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子と、Ｐ／Musashi1による前記遺伝子の転写を終結させるポリＡ配列と、ＨＳＶoriと、ＨＳＶのａ倒置反復配列とを備えたアンプリコンベクターと、（２）前記ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子が破壊・欠損・置換等により不活性化されてＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったヘルパーウイルスとを、ともに感染させることにより得ることができる、感染細胞内でＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現することができる前記アンプリコンベクター由来のウイルス粒子と、前記ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったヘルパーウイルス由来のウイルス粒子とを含むものであればどのようなものでもよく、上記ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子としては、ＨＳＶのγ３４．５遺伝子、リボヌクレオチドリダクターゼ（ＩＣＰ６）遺伝子、ＩＣＰ０遺伝子、ＩＣＰ４遺伝子、ＩＣＰ２７遺伝子等を挙げることができるが、殺腫瘍活性と安全性の両立の点で、ＨＳＶのγ３４．５遺伝子が好ましく、また、ＨＳＶのタイプとしては、ＨＳＶ１及びＨＳＶ２を挙げることができる。
【００２４】
本発明のアンプリコンベクター作製に用いられるＰ／Musashi1は、文献（Nat. Biotechnol. 19, 843-850, 2001）記載の方法により調製することができる。また、転写を終結させるポリＡ配列としては、哺乳動物に由来するポリＡ配列であれば特に制限されるものではなく、例えばラビットβ−グロビン、ＳＶ４０、ＢＧＨ等のポリＡ配列を例示することができる。これらは常法により調製することができる。また、ＨＳＶoriとＨＳＶのａ倒置反復配列は、文献（Mol Cell Neurosci 2, 320-330, 1991）記載のプラスミドpHCLより調製することができる。本発明のアンプリコンベクターは、Ｐ／Musashi1とその下流に連結されるγ３４．５遺伝子等のＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子と、Ｐ／Musashi1による前記遺伝子の転写を終結させるポリＡ配列と、ＨＳＶoriと、ＨＳＶのａ倒置反復配列とから、常法により作製することができる。
【００２５】
本発明のウイルスストックの作製に用いられる上記宿主細胞としては、アンプリコンベクターとヘルパーウイルスとをともに感染させた場合、アンプリコンベクター由来のウイルス粒子と、ヘルパーウイルス由来のウイルス粒子とが混在しているウイルス液を得ることができる細胞であれば制限されず、ＨＳＶの宿主となりうる哺乳動物細胞を挙げることができる。また、本発明のウイルスストックにおける感染細胞としては、Ｐ／Musashi1が特異的に作動する腫瘍細胞を好適に例示することができ、具体的には、ヒトグリオーマ細胞や、ニューロブラストーマ等の未分化神経上皮腫瘍細胞を挙げることができ、ヒトグリオーマ細胞としては、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１、Ｔ９８Ｇ等のヒトグリオーマ細胞株やヒトグリオーマ組織から単離された腫瘍細胞を例示することができる。
【００２６】
本発明のウイルスストックの作製に用いられるＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子が破壊・欠損・置換等により不活性化されてＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったヘルパーウイルスとしては、前記アンプリコンベクター作製に用いられたＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子と同じ遺伝子が不活性化されているＨＳＶ変異体であれば特に制限されず、γ３４．５遺伝子が不活性化されてＨＳＶの複製増殖能に関与するγ３４．５を発現する機能を失ったＲ３６１６や１７１６や、リボヌクレオチドリダクターゼ（ICP6）遺伝子が不活性化されてＨＳＶの複製増殖能に関与するリボヌクレオチドリダクターゼを発現する機能を失ったｈｒＲ３や、これらγ３４．５及びリボヌクレオチドリダクターゼを発現する機能を失ったＧ２０７や、ICP4遺伝子が不活性化されてＨＳＶの複製増殖能を失ったd120等を具体的に例示することができる。これらヘルパーウイルスは、Ｒ３６１６については文献（Science 250, 1262-1266, 1990）、１７１６については文献（Gene Ther 7, 859-866, 2000）、ｈｒＲ３については文献（J Virol 62, 196-205, 1988）、Ｇ２０７については文献（Nat. Med. 1, 938-943, 1995、米国特許第５５８５０９６号明細書）にそれぞれ記載の方法で調製することができる。
【００２７】
本発明のウイルスストックは、前記アンプリコンベクターと上記ヘルパーウイルスとを前記宿主細胞に感染させることにより、感染細胞内でＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現することができるアンプリコンベクター由来のウイルス粒子と、ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったヘルパーウイルス由来のウイルス粒子の混在物として得ることができるが、上記ヘルパーウイルス由来のウイルス粒子は、感染させたヘルパーウイルスの子孫ウイルスであり、ヘルパーウイルスと同等物である。また、本発明のウイルスストックの形態としては、液状、その凍結物、その凍結乾燥による粉体、プロファージ状態の宿主細胞の凍結物等を挙げることができる。さらに、本発明のウイルスストックにおけるアンプリコンベクター由来のウイルス粒子とヘルパーウイルス由来のウイルス粒子の混在割合は、ヘルパーウイルスの添加等により適宜変更しうる。
【００２８】
本発明のヒトグリオーマ治療薬は、上記本発明のウイルスストックを有効成分として含有するものであれば特に制限されるものではなく、上記ヒトグリオーマ治療薬には、ヒトグリオーマの他、便宜上ニューロブラストーマ等の未分化神経上皮腫瘍に対する治療薬も含まれる。また、本発明のヒトグリオーマの治療方法としては、上記ヒトグリオーマ治療薬をヒトグリオーマ（便宜上ニューロブラストーマ等の未分化神経上皮腫瘍も含む）に直接投与する方法であれば特に制限されるものではない。本発明のヒトグリオーマ治療薬を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。また、これら予防若しくは治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできるが、ヒトグリオーマ組織に直接接種することが、即答的な腫瘍融解を誘導しうる点で好ましい。
【００２９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［材料と方法］
【実施例１】
【００３０】
（細胞株）
ヒトグリオーマ細胞株（Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１及びＴ９８Ｇ）、ヒトニューロブラストーマ細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、６種のヒト由来癌細胞株（肺癌（Ａ５４９）、胃癌（ＴＭＫ−１）、大腸癌（ＨＴ２９）、膀胱癌（ＫＵ１９−９、Ｔ２４）、前立腺癌（ＤＵ１４５））、ラットニューロブラストーマ細胞株Ｂ１０４及びアフリカミドリザル腎細胞（Ｖｅｒｏ細胞）を、American Type Culture Collectionより入手した。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、Ａ５４９、Ｂ１０４及びＶｅｒｏ細胞を、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＩＦＢＳ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＴＭＫ−１及びＨＴ２９を、１０％のＩＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。全ての細胞株は、抗生物質（Sigma社製）を添加した培地で、加湿下５％のＣＯ2、３７℃で維持した。０．２５％のトリプシン−エチレンジアミン四酢酸溶液（Sigma社製）を用いて、通常は２週間に１度の継代を行なった。
【実施例２】
【００３１】
（Musashi1のＲＴ−ＰＣＲ分析）
１０種のヒト由来腫瘍細胞株（Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１、Ｔ９８Ｇ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、Ａ５４９、ＴＭＫ−１、ＨＴ２９、ＫＵ１９−９、Ｔ２４及びＤＵ１４５）のＲＮＡパネルを用いて、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅を行なうことにより、Musashi1のｍＲＮＡの発現を分析した。
【００３２】
ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲは、Toda et al.（GLIA 34, 1-7, 2001）に記載の方法に変更を加えて行なった。つまり、トリゾル（Trizol）試薬（Sigma社製）を用いてグアニジニウムチオシアネート法（guanidinium thiocyanate method）を行なうことにより、全ＲＮＡを調製した。全ＲＮＡテンプレート（１μｇ）、オリゴ（ｄＴ）アダプタープライマー及びトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（Takara社製）を４０℃でインキュベーションし、ＲＴ−ＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用されるｃＤＮＡ調製物を合成した。その後、９４℃の変性温度（１分／サイクル）、６０℃のアニーリング温度（１分／サイクル）及び７２℃の伸展温度（１分／サイクル）で、３５サイクル（Musashi1）又は３０サイクル（βアクチン）からなるＰＣＲ反応において、イントロンにまたがる（intron-spanning）Musashi1プライマー対（ＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＣＣＡＣＡＧＴＣＴＴＧＧＧ（フォワード；配列番号１）、ＧＣＡＧＧＣＡＧＴＡＧＣＧＧＧＴＣＣＧＡＧＴＣＧ（リバース；配列番号２））又はβアクチンプライマー対（ＧＴＣＧＡＣＡＡＣＧＣＴＣＣＧＧＣＡＴＧＴＧＣＡ（フォワード；配列番号３）、ＧＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧ（リバース；配列番号４））のいずれかを用いて、合成したｃＤＮＡを増幅した。得られた増幅産物を２％のアガロースゲル上で分画し、次に臭化エチジウム染色により視覚化した。βアクチン特異的プライマーを用いたＰＣＲにより、各サンプルのｃＤＮＡ合成の効率性を測定した。
【実施例３】
【００３３】
（Musashi1プロモーターの転写活性）
ＧＦＰレポータープラスミドを用いて、ヒトグリオーマ細胞株（Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１及びＴ９８Ｇ）又はその他の腫瘍細胞（Ａ５４９、ＨＴ２９、Ｂ１０４及びＶｅｒｏ細胞）におけるマウスのMusashi1プロモーター（Ｐ／Musashi1）の転写活性を測定した。
【００３４】
本実施例において、プラスミドpm-msi：ＧＦＰ（切断（truncated））、pHCMV：ＧＦＰ、pHmsi：ＧＦＰ及びpHCMV.SLアンプリコンベクターをＧＦＰレポータープラスミドとして用いた。
【００３５】
pm-msi：ＧＦＰ（切断）は発明者らが構築し（Nat. Biotechnol. 19, 843-850, 2001）、pHCMV.SLアンプリコンベクターは、Dr. Samuel D. Rabkin（Department of Neurosurgery, Georgetown University Medical Center）より入手し、ネガティブコントロールとして使用した。
【００３６】
pHCMV：ＧＦＰ（図１）は、以下の通りに構築した。pm-msi：ＧＦＰ（切断）からSac II（平滑末端化した）／Sal IによりｈＧＦＰ−ＳＶ４０ポリ（Ａ）断片を切除し、ｈＧＦＰがＣＭＶプロモーター下で作動するように、pHCMV.SLのpHIND III（平滑末端化した）／Salの制限部位に挿入した。
【００３７】
pHmsi：ＧＦＰ（図２）は、以下の通りに構築した。pHCMV.SLをSpe Iで消化し、自己結合（self-ligated）させ、pHCMV.SLのＣＭＶプロモーター配列が欠如するpHSLを生成した。その後、pm-msi：ＧＦＰ（切断）からSal IによりＰ／Musashi1−ｈＧＦＰ−ＳＶ４０ポリ（Ａ）発現カセットを切除し、ｈＧＦＰがＰ／Musashi1下で作動するように、pHSLの制限部位のSal Iに挿入した。したがって、pHCMV：ＧＦＰ及びpHmsi：ＧＦＰはともに、ｈＧＦＰのプロモーター配列以外にも同じ配列を有する（両者は共通して、pHCMV.SLのＨＳＶａ及びＨＳＶｏｒｉ配列を有する）。
【００３８】
ＧＦＰレポータープラスミドをトランスフェクションする１日前に、１．０×１０5細胞／ｍｌの密度で、細胞をガラス皿に蒔いた。細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、培地をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）に置き換え、Lipofectamine Plus試薬（Life Technologies社製）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後、細胞をＰＢＳで２度洗浄し、４％のパラホルムアルデヒド（Nacalai Tesque社製）で固定した。
【００３９】
Ｐ／Musashi1の転写活性は、各ウエルの（ｈＧＦＰ）蛍光の強度により測定した。蛍光強度は、FluorImager 595（Molecular Dynamics Japan 社製）を用いて測定し、ImageQuaNT analysis software（Molecular Dynamics Japan）を用いて定量化した。
【実施例４】
【００４０】
（pSRA Ｐ／Musashi1：ＩＣＰ３４．５アンプリコンプラスミドの構築）
pm-msi：ＧＦＰ（切断）からHind III／Sac II（平滑末端化した）を用いてＰ／Musashi1を切除して、Dr. Samuel C. Rabkinより入手したpSRaori４アンプリコンプラスミドの制限部位Hind III／Bgl IIに導入し、pSRaori４：Ｐ／Musashi1を生成した。
【００４１】
全ＩＣＰ３４．５コード配列を含むプラスミドpBGL３４．５は、Peter Pechan（Massachusetts General Hospital）より提供された。完全長ＩＣＰ３４．５ｃＤＮＡをpBGL３４．５からNco I（平滑末端化した）−Sac I断片として切除し、Sac I／Pvu IIの制限部位で、事前にＢＧＨポリ（Ａ）配列が取り込まれた、BamH I（平滑末端化した）／Sac Iの制限部位でpKF３（Takara社製）に結合した。得られたγ３４．５−ＢＧＨポリ（Ａ）配列をSal I／Pvu IIで切除し、pSRaori４：Ｐ／Musashi1に取り込み、ＩＣＰ３４．５ｃＤＮＡのＰ／Musashi1上流及びＢＧＨポリ（Ａ）配列下流を有するアンプリコンプラスミドpSRaP／Musashi1：ＩＣＰ３４．５（図３）を構築した。
【００４２】
さらに、pSRaP／Musashi1：ＩＣＰ３４．５によるＩＣＰ３４．５の発現の効果を確認するため、Lipofectamine Plus試薬を用いて、pSRaP／Musashi1：ＩＣＰ３４．５をＵ８７ＭＧ、Ａ５４９又はＢ１０４にトランスフェクションした。モック（ＰＢＳ）及びpHmsi：ＧＦＰをネガティブコントロールとして使用し、pSRap／Musashi1：ＩＣＰ３４．５の場合と全く同じ方法でトランスフェクションした。トランスフェクションから２日後、Ｇ２０７を低い感染効率で重感染させた。重感染から４８時間後、細胞を収集し、得られたウイルスの収率を、他で記載の通り（Science 252, 854-856, 1991）Ｖｅｒｏ細胞に滴定した。
【実施例５】
【００４３】
（Ｐ／Musashi1で作動するγ３４．５発現ＨＳＶ−１ヘルパー／欠陥ウイルスベクター、ｄｖＭ３４５の生成）
pSRa Ｐ／Musashi1：ＩＣＰ３４．５アンプリコンプラスミドを、Lipofectamine Plus試薬を用いてＶｅｒｏ細胞にトランスフェクションした。約４８時間のインキュベーションの後、培地を除去した。細胞を０．０１の感染効率（ＭＯＩ）でＧ２０７により重感染させ、１％のＩＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養した。Kaplitt et al.（Molecular and Cellular Neurosciences 2, 320-330, 1991）に記載の方法に従い、ウイルスストックを作製した。Ｇ２０７ヘルパーウイルスの滴定は、文献（Science 252, 854-856, 1991）記載の通りに、Ｖｅｒｏ細胞のプラーク形成アッセイを行なうことにより決定した。以下に説明するように、Ｕ８７ＭＧの細胞培養細胞毒性（cell culture cytotoxicity）及び一段階ウイルス成長（single-step viral growth）に基づき、各ストック中の欠陥ウイルスベクターの割合を推測した。Ｕ８７ＭＧにおいて最も高い細胞変性の有効性及びウイルス成長を示した最良のストックは、継代４で出現した。このストックを、その後のインビトロ及びインビボ実験に使用した。
【実施例６】
【００４４】
（細胞培養細胞毒性）
本発明者らは、コントロールとなるウイルスベクターとして、２種のヘルパー／欠陥ウイルスベクターを作製した。すなわち、ｄｖＨｍｓｉ：ＧＦＰ及びｄｖＨＣＲＬ１である。これらは、ｄｖＭ３４５の作製方法と全く同じ方法に従い、ヘルパーウイルスとしてＧ２０７の重感染とともに、pHmsi：ＧＦＰ又はpHCRL１をＶｅｒｏ細胞にトランスフェクションすることにより得られた。また、本研究において、本発明者らは、継代４から得られた系統を使用した。
【００４５】
ウイルス感染の２４時間前に、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１、Ａ５４９、ＨＴ２９及びＢ１０４細胞（１．０×１０6）を６ウエル皿に蒔いた。ウイルス感染は、１％のＩＦＢＳを補充した０．５ｍｌのＰＢＳ中で３０分間行なった。
【００４６】
ヘルパーウイルス（Ｇ２０７）力価に基づいた０．０２のプラーク形成単位（ＰＦＵ）／細胞のＭＯＩで、Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１細胞にｄｖＭ３４５を感染させ、また、ウイルス接種に用いたときと同じ手順によりモック感染細胞（mock-infected cells）から調製した抽出物を用いて、コントロールをモック感染させた。同様に、Ｇ２０７力価に基づき、０．０２ＭＯＩで細胞にｄｖＨｍｓｉ：ＧＦＰ又はｄｖＨＣＲＬ１を感染させた。グリオーマ細胞株（Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１）に関しては、ｄｖＨＣＲＬ１はコントロールウイルスとしても使用した。生存細胞数は、感染後６時間毎に行なったトリパンブルー排除法により決定した。アッセイは、全て３回ずつ行なった。
【００４７】
Ａ５４９、ＨＴ２９及びＢ１０４細胞に関しては、０．１のＭＯＩでウイルス感染を行なった。その他の点においては、実験は上記と同様の方法で行なった。
【実施例７】
【００４８】
（一段階ウイルス成長）
６ウエル皿のＵ８７ＭＧ又はＡ５４９のサブコンフルエントな単層を、０．０２（Ｕ８７ＭＧ）又は０．１（Ａ５４９）のＭＯＩで、１％のＩＦＢＳを補充した０．５ｍｌのＰＢＳ中のｄｖＭ３４５、ｄｖＨｍｓｉ：ＧＦＰ又はヘルパーウイルス（Ｇ２０７）単独で感染させた。数値（count）は、ヘルパーウイルス（Ｇ２０７）力価に基づいた。感染後４時間毎にウイルスをウエルから収集し、ヘルパーウイルス（Ｇ２０７）の滴定を行なった。プラーク数をカウントし、プラーク形成単位毎ミリリットル（plaque-forming units per mililiter）（ＰＦＵ／ｍｌ）と表した。実験は、また３回ずつ行なった。
【実施例８】
【００４９】
（動物実験）
Japan SLC社より購入した、生後６週間の胸腺欠損のＢＡＬＢ／ｃ雌ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）を、５匹又は５匹以下のグループにして無菌ケージで飼育し、オートクレーブした（autoclaved）食物及び水を自由に利用できるようにした。全ての動物手順（animal procedure）はLaboratory Animal Center（慶應義塾大学医学部）により承認された。外科的手順に関しては、８４％の静菌性生理的食塩水（bacteriostatic saline）、１０％のペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｍｌ；Abbott Laboratories社製）及び６％のエチルアルコールからなる溶液を、各マウスの腹腔内に０．２５ｍｌ投与して麻酔をかけた。マウスの生存状態を確認するために毎日巡回した。
【実施例９】
【００５０】
（モデル１：皮下腫瘍モデル及び皮下腫瘍への新生物内接種）
５０μｌ中の５．０×１０6のＵ８７ＭＧ細胞を右脇腹に注入し、皮下腫瘍を誘発した。移植から約１０日後、皮下腫瘍の直径が６ｍｍに到達した頃、マウスをランダムに３つのグループに分けた（各グループにおいて、ｎ＝６）。
【００５１】
マウスは、２０μｌのウイルス緩衝液に懸濁した、１．０×１０6ＰＦＵのＧ２０７（グループＩ）又はｄｖＭ３４５（グループII）を用いて、新生物内（intraneoplastically）で処理した。グループIIIのマウスを、２０μｌのモック感染抽出物で処理した。腫瘍は、０．１ｍｍ以内の外側ノギス測定（external caliper measurements）で測定した。二次元直径測定（bidimensional diameter measurements）により段階的な腫瘍量を得て、腫瘍の成長速度は、ａが長軸、ｂが短軸である、０．５（ａ×ｂ）日ｎ／０．５（ａ×ｂ）日０により決定した。腫瘍の直径が２４ｍｍを越えた場合、その動物を屠殺した。成長速度の統計学的差異については、不対ｔ検定を用いることにより評価した。
【実施例１０】
【００５２】
（モデル２：脳内腫瘍モデル及びウイルスの接種）
マウスに麻酔をかけて定位的装置（D. Kopf Instruments社製）で不動化した後、ブレグマ上に直線的な皮膚切開を行ない、頭蓋骨に１ｍｍの穴を開けた。３μｌの無血清培地中の２．５×１０5のＵ８７ＭＧ細胞を、５μｌのハミルトンシリンジ（Hamilton Company社製）を用いて、ヌードマウスの右前頭葉に定位的に注入した。１０日後、マウスをランダムに３つのグループに分けた（各グループにおいて、ｎ＝６）。５．０×１０5のＧ２０７（グループII）、ｄｖＭ３４５（グループIII）又は３μｌのモック感染抽出物（グループＩ）を同じ配位で定位的に接種し、生存を継続した（and survival was followed）。生存率の統計学的差異については、Wilcoxon signed-ranks testを用いることにより評価した。
【００５３】
病理学的研究のため、移植から１７日後にマウスを５．０×１０5ＰＦＵのＧ２０７又はｄｖＭ３４５で処理し、かかる処理の５日後に屠殺した。ＰＢＳ中の１％のＰＦＡ及び０．５％グルタルアルデヒド（Nacalai Tesque社製）で灌流を行なった後、脳を取り除いた。試料をＰＢＳ中の１％のＰＦＡ及び０．５％のグルタルアルデヒドに４℃で２４時間固定した。その後、ＰＢＳ中の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ、１ｍｇ／ｍｌ；Takara社製）、５ｍＭのフェリシアン化カリウム、５ｍＭのフェロシアン化カリウム及び２ｍＭの塩化マグネシウムを含む基質溶液に腫瘍を３７℃で６時間入れ、ＰＢＳで洗浄し、３０％のショ糖を含む冷えたＰＢＳで１晩インキュベーションした。液体窒素中のＯＣＴ化合物（Miles社製）の中で凍結させた後、針路（needle tract）の周辺の脳をクリオスタットで薄く切断した。切片をゼラチンでコートしたガラスのスライドに置いた。スライドをＰＢＳで洗浄し、再びＸ−ｇａｌで１晩染色し、その後ヘマトキシリン及びエオシン溶液で対比染色を行なった。
【００５４】
ｄｖＭ３４５の安全性を確認するため、ｄｖＭ３４５の５．０×１０6ＰＦＵを３匹のヌードマウスの右大脳半球に注入し、接種から９０日後に屠殺した。脳、肺、肝臓及び腎臓を取り除き、上記の方法と同様に固定及び染色を行なった。
［結果］
【実施例１１】
【００５５】
（悪性グリオーマ細胞におけるMusashi1のｍＲＮＡ発現）
まず、本発明者らは、１０種のヒト由来腫瘍細胞株、すなわち、３種の悪性グリオーマ（Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１、Ｔ９８）、１種のニューロブラストーマ（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）、肺癌（Ａ５４９）、胃癌（ＴＭＫ−１、ＭＫＮ７４）、大腸癌（ＨＴ２９、ＨＣＴ１５／Ｗ）、膀胱癌（ＫＵ１９−９、Ｔ２４）及び前立腺癌（ＤＵ１４５）におけるMusashi1のｍＲＮＡ発現について、ＲＴ−ＰＣＲ分析により調べた。
【００５６】
図４に示すように、調べた全ての悪性グリオーマ細胞がMusashi1のｍＲＮＡに対し陽性を示した。ＳＫ−Ｎ−ＳＨも陽性であった。これに対して、今回調べたその他の癌細胞株においては、Musashi1のｍＲＮＡは検出されなかった。
【実施例１２】
【００５７】
（悪性グリオーマ細胞におけるＰ／Musashi1の転写活性）
腫瘍タイプに特異的な様式（tumor-type specific fashion）においてMusashi1プロモーターが機能するかどうかを調べて確認するため、ＲＴ−ＰＣＲ分析により、Musashi1 ｍＲＮＡが発現したグリオーマ又はMusashi1 ｍＲＮＡの発現が検出されなかったＡ５４９及びＨＴ２９を含むいくつかの腫瘍細胞株におけるＧＦＰレポータープラスミドを用いて、Ｐ／Musashi1の転写活性を評価した。Ｐ／Musashi1が機能しないＢ１０４（データは図示せず）をネガティブコントロールとして使用した。各細胞株において、ＣＭＶプロモーターによる蛍光レベル（Ａ）はＰ／Musashi1によるレベルよりも高かった（Ｂ）。しかしながら、細胞株の間の（Ａ）と（Ｂ）の割合は、グリオーマ細胞株の方が調べたその他の細胞株と比較して著しく高かった（図５）。
【実施例１３】
【００５８】
（培養におけるＵ８７ＭＧのpSRa Ｐ／Musashi1：ＩＣＰ３４．５の開存性）
pSRa Ｐ／Musashi1：ＩＣＰ３４．５によるＩＣＰ３４．５の発現の効果を調べて確認するため、pSRa Ｐ／Musashi1：ＩＣＰ３４．５をＵ８７ＭＧ、Ａ５４９又はＢ１０４にトランスフェクションした。モック（ＰＢＳ）及びpHmsi：ＧＦＰをネガティブコントロールとして使用した。トランスフェクションの後、Ｇ２０７を低ＭＯＩで重感染させた。２日後、得られたウイルスの収率（Ｇ２０７）をカウントした。pSRa Ｐ／Musashi1：ＩＣＰ３４．５をトランスフェクションした細胞と、ＰＢＳ（モック）をトランスフェクションした細胞とのウイルスの収率の割合を計算した。予想した通り、Ｕ８７ＭＧ（８１±３．６１）における割合は著しく高く、これに対し、Ｐ／Musashi1が効率的に働かないＡ５４９（１．１３±０．１５）及びＢ１０４（１．０３±０．１５）では、ほとんど１．０であった。このことから、Ｕ８７グリオーマ細胞株において、Ｐ／Musashi1がＩＣＰ３４．５を効率的に発現することを確認した。（コントロールプラスミドとしてpHmsi：ＧＦＰも使用したところ、その結果はモック（ＰＢＳ）とほとんど同じであった）。データは、３回の試行の平均及びＳＤを表す。
【００５９】
ｄｖＭ３４５の細胞毒性の特徴を調べるため、Ｐ／Musashi1が効率的に働くヒト由来グリオーマ細胞株（Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１）及び、Ｐ／Musashi1が効率的に働かないその他の腫瘍細胞株（Ａ５４９、ＨＴ２９及びＢ１０４）について検査を行なった。グリオーマ細胞株に関しては、細胞を０．０２のＭＯＩで感染させ、ｄｖＨｍｓｉ：ＧＦＰ、ｄｖＨＣＲＬ１又はＧ２０７単独をコントロールとして使用した。また、Ａ５４９、ＨＴ２９及びＢ１０４に関しては、細胞を０．１のＭＯＩで感染させ、ｄｖＨｍｓｉ：ＧＦＰ又はＧ２０７単独をコントロールとして使用した。感染から１８時間後、グリオーマ細胞株においてのみ、ｄｖＭ３４５の細胞変性効果とコントロールウイルスの細胞変性効果との間に統計学的な有意差が認められた（ｐ＞０．０５、不対ｔ検定）（図６Ａ、Ｂ）。一方、その他の腫瘍細胞株においては、本研究で使用したウイルスの間で細胞変性効果の差異は認められなかった（図６Ｃ、Ｄ、Ｅ）。
【実施例１４】
【００６０】
（培養におけるｄｖＭ３４５の成長の特徴）
欠陥ウイルス（ｄｖＭ３４５）の存在がヘルパーウイルス（Ｇ２０７）のウイルス収率に影響を与えるかどうかを調べるため、一段階成長分析を行なった。ｄｖＨｍｓｉＧＦＰ及びヘルパーウイルス（Ｇ２０７）単独をネガティブコントロールとして使用した。その結果、Ｐ／Musashi1が効率的に働くＵ８７ＭＧにおいては、早ければ感染から１２時間後には、ｄｖＭ３４５とコントロールとのウイルス収率（Ｇ２０７）の差が、統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５；不対ｔ検定）（図７Ａ）。また、Ｐ／Musashi1が働かないＡ５４９においては、差異は認められなかった（図７Ｂ）。
【実施例１５】
【００６１】
（皮下Ｕ８７ＭＧ腫瘍における新生物内接種）
Ｕ８７ＭＧ細胞株を用いて、ＢＡＬＢ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）マウスの脇腹の皮下組織に異種移植腫瘍を作製した。腫瘍が直径で約６ｍｍに到達したとき、１．０×１０6ＰＦＵのＧ２０７（グループII）、ｄｖＭ３４５（グループIII）又はモック抽出物（グループＩ）を脇腹の腫瘍の新生物内に注入した。接種より６日目以降、３つのグループの腫瘍の大きさが分かれた（図８）。コントロール動物（グループＩ）の腫瘍による負担が大きくなったため（直径で＞２４ｍｍ）、実験を１６日目に終了したが、グループＩとグループIIとの平均腫瘍成長割合の差は統計学的に有意であった（ｐ＜０．０００５、不対ｔ検定）。さらに重要なことには、グループIIとグループIIIとの差は、統計学的に有意であった（ｐ＜０．０００５）。１６日目におけるグループIIの腫瘍の成長率は、９．９４±１．１３（ＳＥＭ）、グループIIIの成長率は１．４２±０．７１であり、グループIIIの成長率は２１．９±１．３７であった。
【実施例１６】
【００６２】
（ｄｖＭ３４５処理後の、Ｕ８７脳内グリオーマを移植した胸腺欠損マウスの生存）
脳内Ｕ８７腫瘍モデルを有するヌードマウスを用いた生存研究において、Ｇ２０７（グループII）又はモック抽出物（グループＩ）で処理したマウスの生存と比較して、ｄｖＭ３４５（グループIII）で処理したマウスの生存では統計学的に有意な生存の延長を確認した（図９）。また、ｄｖＭ３４５の安全性について調べるため、３匹のマウスで実験を行なった。今回、技術的に得られた最も高い用量（highest dose technically obtained）は、５．０×１０6ＰＦＵであった。全てのマウスが、ウイルスの接種より３ヶ月後まで、顕著な副作用を示さずに生存した。かかるマウスの脳、肺、肝臓及び腎臓の切片は、針路の周辺の瘢痕を除いては、異常を見せなかった。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明において用いられるＧＦＰ発現ベクターpHCMV：ＧＦＰの概要を示す図である。
【図２】本発明において用いられるＧＦＰ発現ベクターpHmsi：ＧＦＰの概要を示す図である。
【図３】本発明のアンプリコンプラスミドpSRaP／Musashi1：ＩＣＰ３４．５の概要を示す図である。
【図４】１０種のヒト由来腫瘍細胞株におけるMusashi1遺伝子ｍＲＮＡの発現の結果を示す図である。各細胞株からＲＮＡを単離した後、プライマーセットを用いて逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）を行ない、Musashi1のｍＲＮＡを検出した。ＰＣＲ産物を２％のアガロースゲルで分析し（run on）、臭化エチジウム染色により視覚化した。調べた全ての悪性グリオーマ細胞株及びＳＫ−Ｎ−ＳＨにおいて、予想したサイズ（１９９ｂｐ）の明白なバンドが現れた。一方、本実験で使用した癌細胞株においては、そのようなバンドは認められなかった。βアクチンのプラーマ−セットを正のコントロールとして使用した。
【図５】いくつかの腫瘍細胞株におけるＰ／Musashi1の転写活性の結果を示す図である。Ｐ／Musashi1によるｈＧＦＰシグナル強度とＣＭＶプロモーターによるｈＧＦＰのシグナル強度との割合を図示した。グリオーマ細胞株の方が本研究において調べたその他の細胞株と比較して著しく高かった。データは、３回の平均±ＳＤを表す。
【図６】様々な腫瘍細胞株におけるｄｖＭ３４５のインビトロの細胞変性効果の結果を示す図である。（Ａ）Ｕ８７ＭＧ、（Ｂ）Ｕ２５１、（Ｃ）Ａ５４９、（Ｄ）ＨＴ２９、（Ｅ）Ｂ１０４。（Ａ）及び（Ｂ）においては、ｄｖＨｍｓｉ：ＧＦＰ、ｄｖＨＣＲＬ１及びＧ２０７単独を、コントロールウイルスとして使用した。（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）においては、ｄｖＨｍｓｉ：ＧＦＰ及びＧ２０７単独をコントロールとして使用した。ｄｖＭ３４５とコントロールウイルスとの間では、（Ａ）と（Ｂ）の両方において（ｐ＜０．０５；不対ｔ検定）、感染から１８時間後に細胞毒性効果の統計学的な有意差が認められた。また、（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）においては、ｄｖＭ３４５とコントロールウイルスとの間に有意差は認められなかった。図示したデータは、３回の試行の平均±ＳＤである。
【図７】ｄｖＭ３４５の一段階ウイルス成長の結果を示す図である。ヘルパーウイルス（Ｇ２０７）の力価を、感染後４時間毎にカウントした。ｄｖＨｍｓｉＧＦＰ及びヘルパーウイルス（Ｇ２０７）単独をコントロールとして使用した。Ｐ／Musashi1が効率的に機能するＵ８７ＭＧにおいては、ｄｖＭ３４５は子孫ウイルスの産生を増加させた。これに対し、Ｐ／Musashi1が効率的に機能しないＡ５４９においては、そのような効果は認められなかった。
【図８】皮下腫瘍（Ｕ８７ＭＧ）を有するＢＡＬＢ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）マウスにおける、Ｇ２０７（グループII）及びｄｖＭ３４５（グループIII）の新生物内接種の結果を示す図である。皮下Ｕ８７ＭＧ腫瘍を有するマウスを、０日目に、ヘルパーウイルス（Ｇ２０７）の力価に基づき、モック溶液（グループＩ）、１．０×１０6ＰＦＵのＧ２０７（グループII）又は１．０×１０6ＰＦＵのｄｖＭ３４５（グループIII）のいずれかで処理した。データは、平均腫瘍成長率±標準偏差を表す。
【図９】ｄｖＭ３４５で処理した脳内Ｕ８７ＭＧ腫瘍を有するマウスの生存延長の結果を示す図である。脳内Ｕ８７ＭＧ腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）（移植から１０日後）に、５×１０5ＰＦＵのＧ２０７（グループII）、５×１０5ＰＦＵのｄｖＭ３４５（グループIII）又はモック抽出物（グループＩ）を与えた。グループIIIとその他の２つのグループとの生存の差は、統計学的に有意であった（ｐ＜０．０１、Wilcoxon signed ranks test）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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