(57)【要約】  【課題】  スーパーオキサイドやメルカプト化合物に高選択的に応答する蛍光プローブ等に使用可能な新規有機化合物を提供する。  【解決手段】  本発明では、例えば下記式(i)〜(iv)等のようなスルホン酸エステル化合物を用いてスーパーオキサイドやメルカプト化合物（チオール等の −ＳＨ基を有する化合物）を高選択的に検出することができる。下記式(i)〜(iv)においてＲ1およびＲ2のうち少なくとも一方はニトロ基等の強力な電子吸引基であり、ニトロ基が特に好ましい。スーパーオキサイド検出用には例えば(i)が好ましく、メルカプト化合物検出用には例えば(ii)〜(iv)が好ましい。ただし本発明の化合物はこれらに限定されない。本発明の化合物は、各種臨床分析用試薬の製造や医薬のスクリーニング等、様々な用途に用いることができる。【化２】2005047891.tif 000029【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表される構造を含むスルホン酸エステル化合物。
【化１】
2005047891.tif 000022
式（Ｉ）中、原子団Ａ−Ｏは、スルホニル基との共有結合を切断することにより蛍光性化合物を形成する原子団であり、原子団Ａに結合する原子団 Ｂ−ＳＯ3− は１つでも複数でも良く、Ｂは、１個または複数の電子吸引基で置換された環であり、前記電子吸引基は、ハロゲン化アルキル基、ニトロ基、およびシアノ基からなる群から選択される少なくとも一つを含み、Ｂは、複数存在する場合は同一でも異なっていても良い。
【請求項２】
前記式（Ｉ）中の原子団Ｂが、１個または複数の電子吸引基で置換された芳香環または複素芳香環である請求項１に記載のスルホン酸エステル化合物。
【請求項３】
前記式（Ｉ）中の原子団Ａ−Ｏにおいて、Ｏ原子が芳香環または複素芳香環に直接結合している請求項２に記載のスルホン酸エステル化合物。
【請求項４】
前記式（Ｉ）中の原子団Ａに結合する原子団 Ｂ−ＳＯ3− が複数である請求項１〜３のいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物。
【請求項５】
前記式（Ｉ）中の原子団Ａに結合する原子団 Ｂ−ＳＯ3− が１つである請求項１〜３のいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物。
【請求項６】
前記ハロゲン化アルキル基が炭素数１〜６の直鎖または分枝ハロゲン化アルキル基である請求項１〜５のいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物。
【請求項７】
前記式（Ｉ）中の原子団Ｂにおいて、前記電子吸引基がニトロ基およびトリフルオロメチル基の少なくとも一方を含む請求項１〜６のいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物。
【請求項８】
前記式（Ｉ）中の原子団Ｂにおいて、前記電子吸引基がニトロ基を含む請求項１〜６のいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物。
【請求項９】
前記式（Ｉ）中の原子団Ｂにおいて、前記電子吸引基が複数のニトロ基を含む請求項５に記載のスルホン酸エステル化合物。
【請求項１０】
前記式（Ｉ）中の原子団Ｂにおいて、前記電子吸引基がニトロ基を１個のみ含む請求項５に記載のスルホン酸エステル化合物。
【請求項１１】
前記式（Ｉ）中の原子団Ｂにおいて、前記環が、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ピレン環、ピリジン環、ピロール環、チオフェン環、フラン環、ベンゾピリジン環、ベンゾピロール環、ベンゾチオフェン環、およびベンゾフラン環からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１〜１０のいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物。
【請求項１２】
前記式（Ｉ）において、原子団Ｂが、2,4−ジニトロフェニル基、4−ニトロフェニル基、2−ニトロフェニル基、2−ニトロ−（4−トリフルオロメチル）フェニル基、2−ニトロ−4−メトキシフェニル基、4−ニトロ−2−メトキシフェニル基、2−ニトロ−4−メチルフェニル基、4−ニトロ−2−メチルフェニル基、2−ニトロ−4,6−ジメチルフェニル基、4−ニトロ−2,6−ジメチルフェニル基、2−ニトロ−4−クロロフェニル基、4−ニトロ−2−クロロフェニル基、および2−ニトロ−4−イソプロピルフェニル基からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１〜６のいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物。
【請求項１３】
前記式（Ｉ）において、原子団Ｂが、2,4−ジニトロフェニル基、2−ニトロ−（4−トリフルオロメチル）フェニル基、2−ニトロ−4−メトキシフェニル基、4−ニトロ−2−メトキシフェニル基、2−ニトロ−4−メチルフェニル基、4−ニトロ−2−メチルフェニル基、2−ニトロ−4,6−ジメチルフェニル基、4−ニトロ−2,6−ジメチルフェニル基、2−ニトロ−4−クロロフェニル基、4−ニトロ−2−クロロフェニル基、および2−ニトロ−4−イソプロピルフェニル基からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１〜６のいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物。
【請求項１４】
前記原子団Ａ−Ｏとスルホニル基との共有結合を切断することにより形成される蛍光性化合物が、フルオレセイン、レゾルフィン、７−ヒドロキシクマリン、１−ナフトール、２−ナフトール、１−ヒドロキシアントラセン、２−ヒドロキシアントラセン、９−ヒドロキシアントラセン、１−ヒドロキシピレン、１−ヒドロキシアクリジン、２−ヒドロキシアクリジン、９−ヒドロキシアクリジン、２−ヒドロキシキノロン、４−ヒドロキシキノロン、５−ヒドロキシキノロン、６−ヒドロキシキノロン、８−ヒドロキシキノロン、４−ヒドロキシ−７−ニトロ−２−オキサ−１，３−ジアゾールまたはそれらの誘導体である請求項１〜１３のいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物。
【請求項１５】
前記原子団Ａ−Ｏとスルホニル基との共有結合を切断することにより形成される蛍光性化合物が、７−ヒドロキシクマリンであるか、または７−ヒドロキシ−４−（トリフルオロメチル）クマリン以外の７−ヒドロキシクマリン誘導体であり、前記原子団Ｂが、2,4−ジニトロフェニル基、2−ニトロ−（4−トリフルオロメチル）フェニル基、2−ニトロ−4−メトキシフェニル基、4−ニトロ−2−メトキシフェニル基、2−ニトロ−4−メチルフェニル基、4−ニトロ−2−メチルフェニル基、2−ニトロ−4,6−ジメチルフェニル基、4−ニトロ−2,6−ジメチルフェニル基、2−ニトロ−4−クロロフェニル基、4−ニトロ−2−クロロフェニル基、または2−ニトロ−4−イソプロピルフェニル基である請求項１〜１３のいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物。
【請求項１６】
前記フルオレセイン誘導体は、フルオレセインの２位、４位、５位および７位のうち少なくとも一つが炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝アルキル基、またはハロゲンで置換された誘導体であり、前記７−ヒドロキシクマリン誘導体は、７−ヒドロキシクマリンの４位が炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝アルキル基、またはトリフルオロメチル基で置換された誘導体である、請求項１４に記載のスルホン酸エステル化合物。
【請求項１７】
前記原子団Ａ−Ｏとスルホニル基との共有結合を切断することにより形成される蛍光性化合物が、フルオレセイン、２，７−ジクロロフルオレセイン、２，７−ジフルオロフルオレセイン、４，５−ジフルオロフルオレセイン、２，４，５，７−テトラフルオロフルオレセイン、２，７−ジメチルフルオレセイン、４，５−ジメチルフルオレセイン、２，４，５，７−テトラメチルフルオレセイン、２，７−ジイソプロピルフルオレセイン、２，７−ジ−ｔ−ブチルフルオレセイン、２，７−ジメトキシフルオレセイン、２，４−ジフルオロ−５，７−ジメチルフルオレセイン、レゾルフィン、２，８−ジクロロレゾルフィン、７−ヒドロキシ−４−（トリフルオロメチル）クマリン、または７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンである請求項１４に記載のスルホン酸エステル化合物。
【請求項１８】
下記式(i)〜(iv)のいずれかで表される請求項１に記載のスルホン酸エステル化合物。
【化２】
2005047891.tif 000023
式(i)〜(iv)中、
Ｘ1、Ｘ2、Ｙ1およびＹ2は、それぞれ水素原子、炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝アルキル基、またはハロゲンであり、同一でも異なっていても良く、
Ｘ3は炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝アルキル基、またはトリフルオロメチル基であり、
Ｒ1およびＲ3は、それぞれ水素原子、ニトロ基、メチル基、クロロ基またはメトキシ基であり、同一でも異なっていても良く、
Ｒ2およびＲ4は、それぞれ水素原子、ニトロ基、トリフルオロメチル基、メチル基、イソプロピル基、クロロ基またはメトキシ基であり、同一でも異なっていても良く、
かつ、Ｒ1およびＲ2のうち少なくとも一方はニトロ基であり、Ｒ3およびＲ4のうち少なくとも一方はニトロ基であり、式(iv)中、Ｘ3が炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝アルキル基である場合は、Ｒ1およびＲ2はいずれも水素原子以外の基である。
【請求項１９】
前記式(ii)〜(iv)のいずれかで表され、Ｒ1およびＲ2のうちいずれもがニトロ基である請求項１８に記載のスルホン酸エステル化合物。
【請求項２０】
下記式１および３〜８のいずれかで表される請求項１に記載のスルホン酸エステル化合物。
【化３】
2005047891.tif 000024
【化４】
2005047891.tif 000025
式１および８中、Ｘ1、Ｘ2、Ｙ1およびＹ2は、それぞれ水素原子、メチル基またはハロゲンであり、同一でも異なっていても良く、式４、５および６中、Ｒ1は水素原子、ニトロ基、メチル基、クロロ基またはメトキシ基であり、Ｒ2は水素原子、ニトロ基、トリフルオロメチル基、メチル基、イソプロピル基、クロロ基またはメトキシ基であり、かつ、Ｒ1およびＲ2のうち少なくとも一方はニトロ基である。
【請求項２１】
下記式１ａ〜１ｄ、３、４ａ〜４ｅ、５ａ、５ｂ、６ａおよび６ｂのうちいずれかで表される請求項１に記載のスルホン酸エステル化合物。
【化５】
2005047891.tif 000026
【請求項２２】
下記式５ａ、６ａ、７、８ａ、８ｂおよび８ｃのうちいずれかで表される請求項１に記載のスルホン酸エステル化合物。
【化６】
2005047891.tif 000027
【請求項２３】
下記式（II）の化合物と下記式（III）の化合物とを化合させる工程を含む、請求項１〜２２のいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物の製造方法。
【化７】
2005047891.tif 000028
式（III）中、Ｘ5はハロゲンであり、ＡおよびＢは前記式（Ｉ）と同じである。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物を含む蛍光プローブ。
【請求項２５】
スーパーオキサイド検出に用いる、請求項２４に記載の蛍光プローブ。
【請求項２６】
メルカプト化合物検出に用いる、請求項２４に記載の蛍光プローブ。
【請求項２７】
請求項１〜１８、２０および２１のうちいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物を含む、請求項２５に記載の蛍光プローブ。
【請求項２８】
請求項５、９、１９および２２のうちいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物を含む、請求項２６に記載の蛍光プローブ。
【請求項２９】
バイオイメージングに用いる請求項２４〜２６のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項３０】
請求項２４〜２６のいずれかに記載の蛍光プローブを含むバイオイメージング用キット。
【請求項３１】
ブロッティング（転写）を用いたアッセイ方法、スーパーオキサイドジスムターゼ定量方法、機能性食品または医薬のスーパーオキサイド消去能測定方法、臨床分析方法および医薬のスクリーニング方法からなる群から選択される少なくとも一つの方法に使用する、請求項２５に記載の蛍光プローブ。
【請求項３２】
キナーゼアッセイ方法、アセチルコリンエステラーゼアッセイ方法、ブロッティング（転写）を用いたアッセイ方法、臨床分析方法および医薬のスクリーニング方法からなる群から選択される少なくとも一つの方法に使用する、請求項２６に記載の蛍光プローブ。
【請求項３３】
請求項２６に記載の蛍光プローブ、γ-S-ATPおよび基質を含むキナーゼアッセイ用キット。
【請求項３４】
キナーゼの抗体をさらに含む請求項３３に記載のキナーゼアッセイ用キット。
【請求項３５】
請求項２６に記載の蛍光プローブおよびアセチルチオコリンを含むアセチルコリンエステラーゼアッセイ用キット。
【請求項３６】
支持体上にブロッティング（転写）した物質を請求項２４〜２６のいずれかに記載の蛍光プローブを用いて検出する工程を含むアッセイ方法に用いるためのキットであり、請求項２４〜２６のいずれかに記載の蛍光プローブおよび前記支持体を含むキット。
【請求項３７】
請求項２５に記載の蛍光プローブを含む、ヒトまたは動物の体液中のスーパーオキサイドジスムターゼ濃度を測定するためのキットであり、前記スーパーオキサイドジスムターゼ濃度測定においては、請求項２５に記載の蛍光プローブをスーパーオキサイドと反応させた後の蛍光応答を、前記反応をヒトもしくは動物の体液またはその体液から抽出した試料の存在下で行なった場合と非存在下で行なった場合とで比較することにより、スーパーオキサイドジスムターゼを定量するキット。
【請求項３８】
請求項１〜２２のいずれかに記載のスルホン酸エステル化合物を含む臨床分析用試薬。
【請求項３９】
請求項３８に記載の臨床分析用試薬を含む臨床分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スルホン酸エステル化合物およびそれを用いた蛍光プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内で活性酸素種の発生が亢進されることにより、様々な疾病が惹起されることが明らかになってきている。したがって、活性酸素種の生体内ダイナミック解析は、病因や病態等の解明に不可欠である。活性酸素種の解析においては、蛍光プローブによるバイオイメージング法が中心的役割を担っている。スーパーオキサイドの発生が全ての活性酸素種生成の源流にあるため、その解析は非常に重要である。しかし、スーパーオキサイドに対する蛍光プローブとしては、ヒドロエチジン (HE)（下記スキーム１）しか存在しない。（HEについては、例えば、非特許文献１〜１０等を参照のこと。）
【０００３】
【化８】
2005047891.tif 000002
【０００４】
さらに、HEの発蛍光機構はスーパーオキサイドによる酸化反応に基づくため、特異性（選択性）に問題がある。すなわち、活性酸素種の多くが酸化剤として働く結果、HE の酸化は他の活性酸素種によっても起こり、その程度は、ペルオキシナイトライト＞ヒドロキシルラジカル＞スーパーオキサイド＞過酸化水素の順である。また、HEは、チトクローム c によっても酸化を受けることが知られている。したがって、HE を用いて得た蛍光応答は、スーパーオキサイド発生量ではなく、“活性酸素種を含む生体内酸化剤のトータル発生量”の指標として活用すべきであると考えられている。一方、スーパーオキサイドの還元力に基づくプローブとしては、ニトロブルーテトラゾリウム (NBT) がある。NBT は、スーパーオキサイドにより還元を受け、青色色素ジフォルマザンに変換される。しかし、吸光プローブ NBT には、NOS 等の様々な還元酵素により還元を受ける、生成するジフォルマザンが不均化や酸化により NBT に変換される等の問題があるだけでなく、フローサイトメトリー、共焦点レーザー顕微鏡等の先端蛍光解析法には利用できない。このような背景の下、高選択的にスーパーオキサイドに応答する蛍光プローブの開発が細胞生理学的観点等から待ち望まれている。
【０００５】
一方、アセチルコリンエステラーゼ(AChE)アッセイ等のアッセイ方法は、生化学や医療の技術分野において重要である。そのようなアッセイ方法には、メルカプト基（チオール基）を有する化合物を検出できる化合物（メルカプト基検出用化合物）が有用であると考えられる。これまでにメルカプト基検出能を有する化合物が実際にいくつか開発されており、それらはおおむね次のtype1〜3の３種類に分類できる。すなわち、[type 1]は蛍光性化合物の導入試薬、[type 2]はメルカプト基のラベル化剤であり、[type 3]はメルカプト基との反応に基づく発色試薬である。これらtype1〜3に属する化合物の例示およびそのメルカプト基検出機構の概要を、下記スキーム２に示す。
【０００６】
【化９】
2005047891.tif 000003
【０００７】
化合物9等の type 1 に属する試薬は、専ら蛍光標識したタンパク質や核酸の合成目的に用いられているが、AChEアッセイ等に用いるには次のような難点がある。すなわち、まず、化合物9は、その生成物10と同様に蛍光性化合物である。従って、AChE アッセイや AChE 阻害活性の測定を 9 を用いて行なった場合、酵素反応後において 9 と 10 の分離操作が必ず必要となるため煩雑である。また、9 におけるメルカプト基との反応部位であるマレイミド(maleimide)はアミン類やアルコール類などの他の求核試薬とも反応するため、特異性（選択性）の点で難点がある。
【０００８】
次に、化合物11 等の type 2 に属する試薬は、専ら分離分析用のラベル化剤として利用されている。type 2 の試薬 11 は非蛍光性であり、メルカプト基と反応することにより蛍光性色素である 12 を与える。従って、9 とは異なり反応後における試薬の分離操作は必要としない。しかし、11 も様々な求核剤と反応し、12 と類似の蛍光性化合物を与えるため、AChE アッセイ等に用いるにはやはり特異性の点で難点がある。ただし、様々な求核剤と反応することはそれら求核剤のラベル化剤として有利であるため、11 は、アミン類やチオール類の HPLC 分析におけるラベル化剤として重宝されている。
【０００９】
type 3 の試薬 13 (Ellman's reagent) は、AChE アッセイに実際使用されている試薬である。しかし、13 自身の水溶液中での安定性が悪いこと、つまり、ブランク応答が大きいことに起因する低感度という問題点がある。
【００１０】
なお、チオールに対し選択的に反応する化合物の例としては、これらtype 1〜3以外に、スルホンアミド化合物 15 のチオールによる脱保護反応も報告されている (非特許文献１１)。化合物15 における芳香族求核置換反応は、アミノ化合物に比べてチオール化合物により、より円滑に進行すること、すなわち、アミノ化合物の場合、15 に対して大過剰を用いて長い反応時間が必要であることが報告されている。しかし、化合物15およびその生成物はともに蛍光を示さないため、チオール検出用化合物としての利用は全く望めない。
【００１１】
【化１０】
2005047891.tif 000004
【００１２】
以上の通り、アセチルチオコリン(acetyl thiocholine)を基質として用いる AChE アッセイ法をより一般的な手法として活用する等の観点から、化合物13 等にとって代わる新しいメルカプト基検出用化合物の開発が待ち望まれている。
【非特許文献１】M. Nakano, Cell. Mol. Neurobiol. 1998, 18, 565-579
【非特許文献２】C. L. Murrant, M. B. Reid, Microsc. Res. Tech. 2001, 55, 236-248
【非特許文献３】M. M. Tarpey, I. Fridovich, Circ. Res. 2001, 89, 224-236
【非特許文献４】T. Munzel, I. B. Afanas'ev, A. L. Klescchyov, D. G. Harrison, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2002, 22, 1761-1768
【非特許文献５】M. D. Esposti, Methods, 2002, 26, 335-340
【非特許文献６】G. Rothe, G. Valet, J. Leukoc. Biol. 1990, 47, 440-448
【非特許文献７】W. O. Carter, P. K. Narayanan, J. P. Robinson, J. Leukoc. Biol. 1994, 55, 253-258
【非特許文献８】V. P. Bindokas, J. Jordan, C. C. Lee, R. J. Miller, J. Neurosci. 1996, 16, 1324-1336
【非特許文献９】A. B. Al-Mehdi, H. Shuman, A. B. Fisher, Am. J. Pysiol. 1997, 272, L294-L300
【非特許文献１０】L. Benov, L. Sztejnberg, I. Fridovich, Free Radic. Biol. Med. 1998, 25, 826-831
【非特許文献１１】Fukuyama, T., et al., Tetrahedron Lett., 1997, 38, 5831-5834
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明は、スーパーオキサイドやメルカプト化合物に高選択的に応答する蛍光プローブ等に使用可能な新規有機化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記課題を解決するために、本発明は、下記一般式（Ｉ）で表される構造を含むスルホン酸エステル化合物を提供する。
【００１５】
【化１１】
2005047891.tif 000005
【００１６】
式（Ｉ）中、原子団Ａ−Ｏは、スルホニル基との共有結合を切断することにより蛍光性化合物を形成する原子団であり、原子団Ａに結合する原子団 Ｂ−ＳＯ3− は１つでも複数でも良く、Ｂは、１個または複数の電子吸引基で置換された環であり、前記電子吸引基は、ハロゲン化アルキル基、ニトロ基、およびシアノ基からなる群から選択される少なくとも一つを含み、Ｂは、複数存在する場合は同一でも異なっていても良い。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のスルホン酸エステル化合物は、前記一般式（Ｉ）で表される構造を有することにより、例えば、ヒドロキシルラジカルおよび過酸化水素に応答せず、スーパーオキサイドだけに対して応答する高選択的な蛍光プローブ、またはメルカプト化合物に対し高選択的に応答する蛍光プローブ等の用途に使用することができる。さらに、本発明のスルホン酸エステル化合物を用いた蛍光プローブは、スーパーオキサイド以外の細胞内活性酸素種例えばヒドロキシルラジカルおよび過酸化水素のみならず、他の生理学的活性物質に対する応答が極めて低く、スーパーオキサイドまたはメルカプト化合物に対して高選択的に応答する蛍光プローブとして使用することも可能である。前記他の生理学的活性物質は、例えば、アスコルビン酸、１，４−ヒドロキノン等の還元性化合物、グルコース、プロピルアミン、ジエチルアミン等の求核性化合物、ならびにチトクロームP450リダクターゼ+ NADPH系およびジアフォラーゼ + NADH系等の還元酵素系が挙げられる。なお、本発明で「メルカプト化合物」とは、メルカプト基（−ＳＨ基）を有する化合物全般を指し、メルカプト基が結合している原子は炭素原子でも良いしそれ以外の任意の原子、例えば窒素、リン等であっても良いものとする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
まず、スーパーオキサイド検出における本発明の化合物の特徴を説明する。
【００１９】
従来の蛍光プローブ HE は酸化反応により蛍光化合物に変換される。したがって、上述したように特異性に関して問題がある。一方、還元反応に基づく発蛍光機構を利用する蛍光プローブは存在しないが、吸光プローブとしては NBT がある。NBT の場合、単純な還元反応を発蛍光機構とするため、逆反応つまり生成する色素の NBT への変換反応が存在する。それに対して、前記一般式（Ｉ）の化合物における発蛍光機構は、単純な酸化還元反応ではなく、例えば芳香族求核置換反応により誘起される脱スルホニル化反応に基いている。すなわち、例えば下記スキーム４のようにである。ただしスキーム４は例示に過ぎず、本発明を限定するものではない。
【００２０】
【化１２】
2005047891.tif 000006
【００２１】
従って、前記一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物によれば、HE における問題点を回避できるだけでなく、NBT における逆反応も起こらないと考えられる。このような発蛍光反応に基づき蛍光プローブを設計開発したのは本発明者らが初めてである。
【００２２】
なお、スキーム４の反応のより具体的なメカニズムは、例えば下記スキーム５のように推定される。ただし、スキーム５は推定可能なメカニズムの一例を示すに過ぎず、本発明を何ら限定しない。
【００２３】
【化１３】
2005047891.tif 000007
【００２４】
次に、メルカプト化合物検出における本発明のスルホン酸エステル化合物の特徴を説明する。
【００２５】
本発明のスルホン酸エステル化合物は、メルカプト基検出用化合物としては、前記 type 3 に属するが、既存のtype 1~3 の試薬に比べて以下のような特徴を有する。
【００２６】
本発明のメルカプト化合物応答型蛍光プローブの発蛍光機構は、例えば、下記スキーム６による芳香族求核置換反応に基づくものと推定される。ただし、スキーム６は推定可能なメカニズムの一例を示すに過ぎず、本発明を限定するものではない。
【００２７】
【化１４】
2005047891.tif 000008
【００２８】
このような反応による発蛍光は、本発明の化合物のようなスルホン酸エステル化合物については報告例がない。そして、本発明の化合物は、前記一般式（Ｉ）で表されることにより、アミノ化合物等と比較してメルカプト化合物に対し高特異的かつ高感度に応答する。さらに、前記原子団Ａ−Ｏとスルホニル基との共有結合を切断することにより蛍光性化合物を形成するため、反応後における化合物の分離等を行なわず簡易な操作でメルカプト化合物の検出を行なうことも可能である。したがって、従来のメルカプト化合物検出用試薬では達成できなかったアッセイ系の構築が、本発明の化合物を用いて行えると期待できる。
【００２９】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００３０】
前記式（Ｉ）中の原子団Ｂは、前記の通り１個または複数の電子吸引基で置換された環であるが、１個または複数の電子吸引基で置換された芳香環または複素芳香環が好ましい。すなわち、原子団Ｂを形成する環が芳香環または複素芳香環であれば、スーパーオキサイド検出用プローブやメルカプト化合物検出用プローブに用いる場合の検出能がより高くなることが期待される。すなわち、例えば反応が前記スキーム５や６のように単なる求核置換反応ではなく芳香族求核置換反応になると考えられるため、より検出能に優れることが期待できる。
【００３１】
前記式（Ｉ）中の原子団Ｂにおいて、前記電子吸引基は、炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝ハロゲン化アルキル基、ニトロ基、およびシアノ基からなる群から選択される少なくとも一つが好ましく、スーパーオキサイドやメルカプト化合物に対する検出能等の観点からは、ニトロ基およびトリフルオロメチル基の少なくとも一方を含むことがより好ましく、ニトロ基を含むことがさらに好ましい。なお、前記原子団Ｂは、必要に応じ、ハロゲン化アルキル基、ニトロ基、およびシアノ基以外の電子吸引基、例えばハロゲン原子等でさらに置換されていても良いし、電子吸引基以外の任意の基、例えばメチル基、イソプロピル基、メトキシ基等でさらに置換されていても良い。また、前記原子団Ｂにおいて、前記環が、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ピレン環、ピリジン環、ピロール環、チオフェン環、フラン環、ベンゾピリジン環、ベンゾピロール環、ベンゾチオフェン環、およびベンゾフラン環からなる群から選択される少なくとも一つであることがより好ましい。
【００３２】
前記原子団Ｂは、2,4−ジニトロフェニル基、4−ニトロフェニル基、2−ニトロフェニル基、2−ニトロ−（4−トリフルオロメチル）フェニル基、2−ニトロ−4−メトキシフェニル基、4−ニトロ−2−メトキシフェニル基、2−ニトロ−4−メチルフェニル基、4−ニトロ−2−メチルフェニル基、2−ニトロ−4,6−ジメチルフェニル基、4−ニトロ−2,6−ジメチルフェニル基、2−ニトロ−4−クロロフェニル基、4−ニトロ−2−クロロフェニル基、および2−ニトロ−4−イソプロピルフェニル基からなる群から選択される少なくとも一つであることが蛍光プローブの感度およびスーパーオキサイドやメルカプト化合物に対する特異性（選択性）の観点からさらに好ましく、2,4−ジニトロフェニル基、2−ニトロ−（4−トリフルオロメチル）フェニル基、2−ニトロ−4−メトキシフェニル基、4−ニトロ−2−メトキシフェニル基、2−ニトロ−4−メチルフェニル基、4−ニトロ−2−メチルフェニル基、2−ニトロ−4,6−ジメチルフェニル基、4−ニトロ−2,6−ジメチルフェニル基、2−ニトロ−4−クロロフェニル基、4−ニトロ−2−クロロフェニル基、および2−ニトロ−4−イソプロピルフェニル基からなる群から選択される少なくとも一つであることが一層好ましく、2,4−ジニトロフェニル基であることが特に好ましいが、これ以外にも種々の基が可能である。
【００３３】
なお、特定の物質を検出するためのプローブに用いる場合、特異性（選択性）の観点から、他の物質に対する応答をなるべく低く抑えることが好ましい。ただし、特定の物質以外に対して応答することが、前記特定の物質を検出するためのプローブに用いられる可能性を排除するものではなく、測定条件を適宜設定すること等により、前記特定の物質の検出用に用いることが充分可能である。本発明のスルホン酸エステル化合物は、前記式（Ｉ）に示す範囲内で適宜分子設計することにより、スーパーオキサイドおよびメルカプト化合物のいずれかに高い特異性を示すスルホン酸エステル化合物を得ることができる。なお、本発明のスルホン酸エステル化合物を用いた蛍光プローブの特異性（選択性）は特に限定されないが、好ましくは、例えば以下の通りである。すなわち、スーパーオキサイドまたはメルカプト化合物に対する蛍光応答が、過酸化水素に対する蛍光応答の１０倍以上であることが好ましく、２０倍以上であることがより好ましく、１００倍以上であることが特に好ましい。前記スーパーオキサイドまたはメルカプト化合物に対する蛍光応答の上限値は特に限定されないが、例えば過酸化水素に対する蛍光応答の１０００倍以下である。また、前記スーパーオキサイドまたはメルカプト化合物に対する蛍光応答は、ヒドロキシルラジカル、グルコース、アスコルビン酸、１，４−ヒドロキノン、プロピルアミン、またはジエチルアミンに対する蛍光応答の１０倍以上であることが好ましく、２０倍以上であることがより好ましく、１００倍以上であることが特に好ましく、上限値は特に限定されないが、例えばこれらいずれかの物質に対する蛍光応答の１０００倍以下である。前記スーパーオキサイドまたはメルカプト化合物に対する蛍光応答は、チトクロームP450リダクターゼ+ NADPH系またはジアフォラーゼ + NADH系に対する蛍光応答と比較した場合は、４倍以上が好ましく、５倍以上がより好ましく、１０倍以上がさらに好ましく、２０倍以上が特に好ましく、上限値は特に限定されないが、例えばこれらいずれかの系に対する蛍光応答の１００倍以下である。なお、これらは、スーパーオキサイドまたはメルカプト化合物と前記各物質とを等モル量で比較した値であるものとし、測定温度は３７℃であり、励起波長は485±20 nmであり、放射波長は530±20 nmであるものとする。ただし、本発明の蛍光プローブを用いた測定条件がこれに限定されるものではなく、あらゆる測定条件が可能である。
【００３４】
本発明のスルホン酸エステル化合物をスーパーオキサイド検出用プローブに用いる場合は、特異性（選択性）の観点から、前記式（Ｉ）中の原子団Ａに結合する原子団 Ｂ−ＳＯ3− が複数であるスルホン酸エステル化合物が好ましく、この場合において、前記式（Ｉ）中の原子団Ｂにおける前記電子吸引基がニトロ基およびトリフルオロメチル基の少なくとも一方を含むことがより好ましく、前記電子吸引基はニトロ基を含むことがさらに好ましい。原子団Ｂは、2,4−ジニトロフェニル基、4−ニトロフェニル基、2−ニトロフェニル基、2−ニトロ−（4−トリフルオロメチル）フェニル基、2−ニトロ−4−メトキシフェニル基、4−ニトロ−2−メトキシフェニル基、2−ニトロ−4−メチルフェニル基、4−ニトロ−2−メチルフェニル基、2−ニトロ−4,6−ジメチルフェニル基、4−ニトロ−2,6−ジメチルフェニル基、2−ニトロ−4−クロロフェニル基、4−ニトロ−2−クロロフェニル基、および2−ニトロ−4−イソプロピルフェニル基からなる群から選択される少なくとも一つであることが一層好ましく、2,4−ジニトロフェニル基、2−ニトロ−（4−トリフルオロメチル）フェニル基、2−ニトロ−4−メトキシフェニル基、4−ニトロ−2−メトキシフェニル基、2−ニトロ−4−メチルフェニル基、4−ニトロ−2−メチルフェニル基、2−ニトロ−4,6−ジメチルフェニル基、4−ニトロ−2,6−ジメチルフェニル基、2−ニトロ−4−クロロフェニル基、4−ニトロ−2−クロロフェニル基、および2−ニトロ−4−イソプロピルフェニル基からなる群から選択される少なくとも一つであることがより一層好ましく、2,4−ジニトロフェニル基であることが特に好ましい。また、前記式（Ｉ）中の原子団Ａに結合する原子団 Ｂ−ＳＯ3− が１つであるスルホン酸エステル化合物をスーパーオキサイド検出用プローブに用いる場合は、スーパーオキサイド選択性の観点から、前記式（Ｉ）中の原子団Ｂにおいて、前記電子吸引基がニトロ基を１個のみ含むことが好ましい。このような原子団Ｂとしては、例えば上記のような、2−ニトロフェニル基、4−ニトロフェニル基またはこれらから誘導される基等がある。ただし、本発明におけるこれら以外のスルホン酸エステル化合物もスーパーオキサイド検出用蛍光プローブに当然使用可能である。
【００３５】
また、本発明のスルホン酸エステル化合物は、メルカプト化合物検出用プローブに用いる場合は、特異性（選択性）の観点からは、前記式（Ｉ）中の原子団Ａに結合する原子団 Ｂ−ＳＯ3− が１つであることが好ましい。この場合において、より高い特異性およびメルカプト化合物検出能等の観点から、前記式（Ｉ）中の原子団Ｂにおいて、前記電子吸引基がニトロ基を含むことがより好ましく、複数のニトロ基を含むことが特に好ましい。例えば、前記式（Ｉ）において、原子団Ｂが、2,4−ジニトロフェニル基、4−ニトロフェニル基、2−ニトロフェニル基、2−ニトロ−（4−トリフルオロメチル）フェニル基、2−ニトロ−4−メトキシフェニル基、4−ニトロ−2−メトキシフェニル基、2−ニトロ−4−メチルフェニル基、4−ニトロ−2−メチルフェニル基、2−ニトロ−4,6−ジメチルフェニル基、4−ニトロ−2,6−ジメチルフェニル基、2−ニトロ−4−クロロフェニル基、4−ニトロ−2−クロロフェニル基、および2−ニトロ−4−イソプロピルフェニル基からなる群から選択される少なくとも一つであることがさらに好ましく、2,4−ジニトロフェニル基、2−ニトロ−（4−トリフルオロメチル）フェニル基、2−ニトロ−4−メトキシフェニル基、4−ニトロ−2−メトキシフェニル基、2−ニトロ−4−メチルフェニル基、4−ニトロ−2−メチルフェニル基、2−ニトロ−4,6−ジメチルフェニル基、4−ニトロ−2,6−ジメチルフェニル基、2−ニトロ−4−クロロフェニル基、4−ニトロ−2−クロロフェニル基、および2−ニトロ−4−イソプロピルフェニル基からなる群から選択される少なくとも一つであることが一層好ましく、2,4−ジニトロフェニル基であることが特に好ましい。しかしながら、これら以外のスルホン酸エステル化合物も、当然メルカプト化合物検出用プローブに使用可能である。
【００３６】
本発明のスルホン酸エステル化合物における前記式（Ｉ）中の原子団Ａ−Ｏにおいては、例えば、Ｏ原子が芳香環または複素芳香環に直接結合していることが、蛍光プローブに使用する場合のより高い検出能等の観点からさらに好ましい。本発明のスルホン酸エステル化合物において、前記原子団Ａ−Ｏとスルホニル基との共有結合を切断することにより形成される蛍光性化合物は、フルオレセイン、レゾルフィン、７−ヒドロキシクマリン、１−ナフトール、２−ナフトール、１−ヒドロキシアントラセン、２−ヒドロキシアントラセン、９−ヒドロキシアントラセン、１−ヒドロキシピレン、１−ヒドロキシアクリジン、２−ヒドロキシアクリジン、９−ヒドロキシアクリジン、２−ヒドロキシキノロン、４−ヒドロキシキノロン、５−ヒドロキシキノロン、６−ヒドロキシキノロン、８−ヒドロキシキノロン、４−ヒドロキシ−７−ニトロ−２−オキサ−１，３−ジアゾールまたはそれらの誘導体であることが好ましいが、これらには限定されず、あらゆる蛍光性化合物が可能である。なお、前記蛍光性化合物が７−ヒドロキシクマリンであるか、または７−ヒドロキシ−４−（トリフルオロメチル）クマリン以外の７−ヒドロキシクマリン誘導体である場合は、前記原子団Ｂは、2,4−ジニトロフェニル基、2−ニトロ−（4−トリフルオロメチル）フェニル基、2−ニトロ−4−メトキシフェニル基、4−ニトロ−2−メトキシフェニル基、2−ニトロ−4−メチルフェニル基、4−ニトロ−2−メチルフェニル基、2−ニトロ−4,6−ジメチルフェニル基、4−ニトロ−2,6−ジメチルフェニル基、2−ニトロ−4−クロロフェニル基、4−ニトロ−2−クロロフェニル基、または2−ニトロ−4−イソプロピルフェニル基であることがより好ましい。前記フルオレセイン誘導体は、フルオレセインの２位、４位、５位および７位のうち少なくとも一つが炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝アルキル基、またはハロゲンで置換された誘導体であり、前記７−ヒドロキシクマリン誘導体は、７−ヒドロキシクマリンの４位が炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝アルキル基、またはトリフルオロメチル基で置換された誘導体であることがより好ましい。前記原子団Ａ−Ｏとスルホニル基との共有結合を切断することにより形成される蛍光性化合物として特に好ましい化合物の具体例は、例えば、フルオレセイン、２，７−ジクロロフルオレセイン、２，７−ジフルオロフルオレセイン、４，５−ジフルオロフルオレセイン、２，４，５，７−テトラフルオロフルオレセイン、２，７−ジメチルフルオレセイン、４，５−ジメチルフルオレセイン、２，４，５，７−テトラメチルフルオレセイン、２，７−ジイソプロピルフルオレセイン、２，７−ジ−ｔ−ブチルフルオレセイン、２，７−ジメトキシフルオレセイン、２，４−ジフルオロ−５，７−ジメチルフルオレセイン、レゾルフィン、２，８−ジクロロレゾルフィン、７−ヒドロキシ−４−（トリフルオロメチル）クマリン、および７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンである。
【００３７】
次に、本発明のスルホン酸エステル化合物は、例えば下記式(i)〜(iv)のいずれかで表されることがより好ましい。
【００３８】
【化１５】
2005047891.tif 000009
【００３９】
式(i)〜(iv)中、
Ｘ1、Ｘ2、Ｙ1およびＹ2は、それぞれ水素原子、炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝アルキル基、またはハロゲンであり、同一でも異なっていても良く、
Ｘ3は炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝アルキル基、またはトリフルオロメチル基であり、
Ｒ1およびＲ3は、それぞれ水素原子、ニトロ基、メチル基、クロロ基またはメトキシ基であり、同一でも異なっていても良く、
Ｒ2およびＲ4は、それぞれ水素原子、ニトロ基、トリフルオロメチル基、メチル基、イソプロピル基、クロロ基またはメトキシ基であり、同一でも異なっていても良く、
かつ、Ｒ1およびＲ2のうち少なくとも一方はニトロ基であり、Ｒ3およびＲ4のうち少なくとも一方はニトロ基であり、式(iv)中、Ｘ3が炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝アルキル基である場合は、Ｒ1およびＲ2はいずれも水素原子以外の基である。
【００４０】
メルカプト化合物検出用プローブに用いる場合は、前記式(ii)〜(iv)のいずれかで表され、Ｒ1およびＲ2のうちいずれもがニトロ基であることがさらに好ましい。
【００４１】
本発明のスルホン酸エステル化合物の特に好ましい例としては、例えば、下記式１および３〜８のいずれかで表される化合物がある。
【００４２】
【化１６】
2005047891.tif 000010
【００４３】
【化１７】
2005047891.tif 000011
【００４４】
式１および８中、Ｘ1、Ｘ2、Ｙ1およびＹ2は、それぞれ水素原子、メチル基またはハロゲンであり、同一でも異なっていても良く、式４、５および６中、Ｒ1は水素原子、ニトロ基、メチル基、クロロ基またはメトキシ基であり、Ｒ2は水素原子、ニトロ基、トリフルオロメチル基、メチル基、イソプロピル基、クロロ基またはメトキシ基であり、かつ、Ｒ1およびＲ2のうち少なくとも一方はニトロ基である。
【００４５】
これらのうち、スーパーオキサイド検出用プローブに用いる場合は、下記式１ａ〜１ｄ、３、４ａ〜４ｅ、５ａ、５ｂ、６ａおよび６ｂのうちいずれかで表されるスルホン酸エステル化合物が特に好ましく、メルカプト化合物検出用プローブに用いる場合は、下記式５ａ、６ａ、７、８ａ、８ｂおよび８ｃのうちいずれかで表されるスルホン酸エステル化合物が特に好ましい。
【００４６】
【化１８】
2005047891.tif 000012
【００４７】
【化１９】
2005047891.tif 000013
【００４８】
前記一般式（Ｉ）で表される本発明のスルホン酸エステル化合物の製造方法は特に限定されず、公知のスルホン酸エステル化合物の製造方法等を適宜用いることができるが、例えば、下記式（II）の化合物と下記式（III）の化合物とを化合させる工程を含む製造方法により製造することができる。
【００４９】
【化２０】
2005047891.tif 000014
【００５０】
式（III）中、Ｘ5はハロゲンであり、ＡおよびＢは前記式（Ｉ）と同じである。また、前記式（II）の化合物としては、例えば前記蛍光性化合物等が使用でき、好ましい蛍光性化合物は例えば前述の通りである。すなわち、式（II）の化合物としては、例えば、下記式で表されるフルオレセインおよびその誘導体、レゾルフィン、７−ヒドロキシ−４−（トリフルオロメチル）クマリン、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン等の蛍光色素があるが、これらに限定されず、種々の化合物を使用できる。
【００５１】
【化２１】
2005047891.tif 000015
【００５２】
なお、本発明で「ハロゲン」とは、任意のハロゲン元素を指すが、例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素があげられる。ハロゲン化アルキル基としては、特に限定されないが、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基およびtert-ブチル基等をそれぞれハロゲン化した基があげられ、トリフルオロメチル基が特に好ましい。
【００５３】
前記式（Ｉ）で表される化合物に互変異性体、立体異性体、光学異性体等の異性体が存在する場合は、それら異性体も本発明の化合物に含まれる。さらに、前記式（Ｉ）の化合物およびその他本発明に係る化合物が塩を形成し得る場合は、その塩も本発明の化合物に含まれる。前記塩は特に限定されず、例えば酸付加塩でも塩基付加塩でも良く、さらに、前記酸付加塩を形成する酸は無機酸でも有機酸でも良く、前記塩基付加塩を形成する塩基は無機塩基でも有機塩基でも良い。前記無機酸としては、特に限定されないが、例えば、硫酸、リン酸、塩酸、臭化水素酸および、ヨウ化水素酸等があげられる。前記有機酸も特に限定されないが、例えば、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモベンゼンスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸および酢酸等があげられる。前記無機塩基としては、特に限定されないが、例えば、水酸化アンモニウム、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩および炭酸水素塩等があげられ、より具体的には、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、水酸化カルシウムおよび炭酸カルシウム等があげられる。前記有機塩基も特に限定されないが、例えば、エタノールアミン、トリエチルアミンおよびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等があげられる。
【００５４】
前記本発明の化合物の塩の製造方法も特に限定されず、例えば、本発明の化合物に、前記のような酸や塩基を公知の方法により適宜付加させる等の方法で製造することができる。
【００５５】
本発明の蛍光プローブは、前記本発明のスルホン酸エステル化合物を含むことにより、スーパーオキサイドやメルカプト化合物に対し高い選択性を示す。したがって、本発明の蛍光プローブは感度および精度に優れ、本発明の蛍光プローブ、またはそれを用いたスーパーオキサイド検出方法もしくはメルカプト化合物検出方法は、例えばバイオイメージング方法等への応用に適している。したがって、本発明のスルホン酸エステル化合物は臨床分析用試薬等の用途にも適する。
【００５６】
なお、本発明のスルホン酸エステル化合物の構造はその用途により限定されないが、用途に応じて構造を適宜選択して使用することが好ましい。スーパーオキサイド検出用蛍光プローブまたはメルカプト化合物検出用プローブに本発明の化合物を用いる場合、それぞれの用途に好ましい化合物は、特異性（選択性）の観点から前述の通りである。本発明の蛍光プローブは、これら本発明の化合物を含むことにより、スーパーオキサイドまたはメルカプト化合物に対し高い特異性（選択性）と検出能を有することが可能である。
【００５７】
本発明の蛍光プローブは、前記の通りバイオイメージング等の用途に適しているが、これ以外にも種々の用途に使用可能である。本発明のスーパーオキサイド検出用蛍光プローブの用途は特に限定されないが、例えば、ブロッティング（転写）を用いたアッセイ方法、スーパーオキサイドジスムターゼ定量方法、機能性食品または医薬のスーパーオキサイド消去能測定方法、臨床分析方法、および医薬のスクリーニング方法等に適している。また、本発明のメルカプト化合物検出用蛍光プローブの用途は特に限定されないが、例えば、キナーゼアッセイ方法、アセチルコリンエステラーゼアッセイ方法、ブロッティング（転写）を用いたアッセイ方法、臨床分析方法、および医薬のスクリーニング方法に適している。以下、これらの方法についてより具体的に説明する。
【００５８】
ブロッティング（転写）を用いたアッセイ方法とは、支持体上にブロッティング（転写）した物質を本発明の蛍光プローブを用いて検出する工程を含むアッセイ方法である。その操作等は特に限定されず、前記物質を前記支持体上で本発明の蛍光プローブと反応させる以外は公知の手法を適宜用いることができる。前記支持体も特に限定されず、例えばアガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等の公知の物が使用可能である。例えば本発明の蛍光プローブおよび前記支持体を含むキットを適宜設計することにより、前記ブロッティングを用いたアッセイ方法に使用することができる。
【００５９】
次に、本発明のスーパーオキサイド検出用蛍光プローブを用いたスーパーオキサイド定量方法は、本発明のスーパーオキサイド検出用蛍光プローブをスーパーオキサイドと反応させた後の蛍光応答を、前記反応をスーパーオキサイドジスムターゼ含有試料の存在下で行なった場合と非存在下で行なった場合とで比較することにより行なう。例えば、前記スーパーオキサイドジスムターゼ含有試料として、ヒトもしくは動物の体液またはその体液から抽出した試料を用いて前記スーパーオキサイドジスムターゼ定量方法を行なうことにより、前記ヒトまたは動物の体液中のスーパーオキサイドジスムターゼ濃度を測定することができる。さらに、前記スーパーオキサイドジスムターゼ定量方法は、例えば、機能性食品または医薬のスーパーオキサイド消去能測定にも応用することができる。すなわち、前記スーパーオキサイドジスムターゼ定量方法を用いてヒトまたは動物の体液中におけるスーパーオキサイドジスムターゼ濃度を測定する工程と、その後前記ヒトまたは動物に機能性食品または医薬を投与する工程と、投与後に再び前記スーパーオキサイドジスムターゼ定量方法を用いて前記ヒトまたは動物の体液中におけるスーパーオキサイドジスムターゼ濃度を測定する工程とを含む方法により、前記機能性食品または医薬のスーパーオキサイド消去能を測定することができる。例えばこれらの測定方法を用いてヒトまたは動物に対するアッセイを行なうことにより、スーパーオキサイドに関連する疾患の治療、予防または症状の軽減のための医薬のスクリーニングを行なうことも可能である。そして、これら測定方法に適したキットは、本発明のスーパーオキサイド検出用プローブを含むキットを適宜設計することにより得られる。
【００６０】
次に、本発明のメルカプト化合物検出用プローブを用いたキナーゼアッセイ方法は、例えば、キナーゼおよびγ-S-ATPを用いて基質をチオリン酸化する工程と、前記チオリン酸化された基質を本発明のメルカプト化合物検出用プローブを用いて検出する工程とを含む。前記基質としては、例えばタンパク質が使用できる。すなわち、キナーゼおよびATPによりタンパク質をリン酸化するところ、ATPに代えてγ-S-ATPを用いれば、タンパク質をチオリン酸化することができる。そのチオリン酸化タンパク質を本発明のメルカプト化合物検出用プローブにより検出することでキナーゼアッセイ方法を行なうことができるのである。前記キナーゼアッセイ方法は、抗体を用いて前記キナーゼを試料から分離する工程をさらに含むことが好ましい。このキナーゼアッセイ方法に適したキットは、例えば、本発明のメルカプト化合物検出用プローブ、γ-S-ATPおよび基質を含むキットを適宜設計することで得られ、キナーゼの抗体をさらに含むことが好ましい。
【００６１】
次に、本発明のメルカプト化合物検出用蛍光プローブを用いたアセチルコリンエステラーゼアッセイ方法は、例えば、アセチルチオコリンとアセチルコリンエステラーゼとの反応によりチオコリンを生じさせる工程と、前記チオコリンを本発明のメルカプト化合物検出用蛍光プローブを用いて検出する工程とを含む。このアセチルコリンエステラーゼアッセイ用キットは、本発明のメルカプト化合物検出用蛍光プローブおよびアセチルチオコリンを含むキットを適宜設計することで得られる。
【００６２】
以下、一般的なキナーゼアッセイおよびアセチルコリンエステラーゼ(AChE)アッセイについて説明するとともに、前記本発明のキナーゼアッセイおよびアセチルコリンエステラーゼ(AChE)アッセイの利点について述べる。
【００６３】
AChE やキナーゼ等の酵素の場合、その発現量よりむしろ活性量が生命現象と深く関与する。それらの簡便な酵素活性アッセイ法の開発は、臨床的観点から非常に重要であるとともに、新薬開発という視点からも非常に意義深い。すなわち、酵素活性の測定法は、ある疾病に対する病態の診断法として利用できるだけでなく、新薬シーズとなる酵素阻害剤のスクリーニング法としても活用できる。診断法およびスクリーニング法のどちらの目的に利用する場合においても、アッセイ法は、操作的に簡便で、短時間で測定できる、環境に優しい手法であることが好ましい。
【００６４】
従来用いられてきたAChE またはキナーゼのアッセイ法の一つに、RI で標識した基質 acetyl choline（3H 標識）または ATP（32P 標識）を用いるラジオアッセイがある。この手法には高感度という利点があるが、RI を使用するため、環境に対する影響という観点から問題がある。AChE アッセイについては別法として Ellman's reagent を使う方法があるが、前述の通り感度に関する問題点がある。
【００６５】
さらに、キナーゼアッセイ法について非放射性手法として、エンザイムイムノアッセイが従来から用いられている。これらの操作手順は以下の２種類がある。すなわち、（１）固定化基質のリン酸化→酵素修飾抗体によるリン酸化基質との抗原抗体反応→洗浄→酵素反応による発色または化学発光→検出、および（２）固定化基質のリン酸化→ビオチン修飾抗体によるリン酸化基質との抗原抗体反応→洗浄→アビジン修飾酵素との複合体形成→洗浄→酵素反応による発色または化学発光→検出、という手順である。これらの手法には、リン酸化された基質に対して特異的な修飾抗体が必ず必要である、という問題点がある。
【００６６】
前記本発明のキナーゼアッセイおよびアセチルコリンエステラーゼ(AChE)アッセイの利点について述べれば、以下の通りである。すなわち、まず、操作が簡便である。具体的には、AChE アッセイでは、酵素反応と発蛍光反応を同時に行なうこともでき、キナーゼアッセイでは、酵素反応の後発蛍光反応を行なうという簡単な操作で測定することも可能であり、試薬として酵素基質とプローブのみを用いて測定することもできる。さらに、本発明のメルカプト化合物検出用蛍光プローブを用いる測定方法の検出感度は、化学発光のそれに匹敵し得ることも期待できる。
【００６７】
前記本発明のアセチルコリンエステラーゼアッセイ方法またはキナーゼアッセイ方法を用いてヒトまたは動物に対するアッセイを行なうことにより、例えば、アセチルコリンまたはキナーゼに関連する疾患の治療、予防または症状の軽減のための医薬のスクリーニングを行なうこともできる。前記アセチルコリンまたはキナーゼに関連する疾患は、特に限定されないが、例えば、癌、アルツハイマー病、高血圧症、狭心症、心筋梗塞等の動脈硬化性疾患、関節炎等の炎症性疾患、および種々の代謝性疾患等が挙げられる。
【００６８】
以上説明したような本発明のスーパーオキサイド検出用プローブおよびメルカプト化合物検出用プローブを用いてヒトまたは動物に対するアッセイを行なうことにより、様々な臨床分析方法を実施することができる。このため、本発明のスルホン酸エステル化合物は、前記の通り臨床分析用試薬の用途に適し、また、この臨床分析用試薬を含むキットを適宜設定することで、様々な用途に適した臨床分析用キットが得られる。
【００６９】
（実施例）
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。しかし、この実施例は本発明の例示に過ぎず、本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００７０】
本実施例では、前記化合物1a~1d、3、4a、4b、5a、5b、6aおよび6bを合成し、さらに、これら化合物のスーパーオキサイド検出用蛍光プローブとしての機能を評価した。また、細胞系への応用試験も行なった。
【００７１】
（測定条件等）
核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、測定機器として、JEOL社製EX-270（商品名）（1Ｈ測定時２７０ＭＨｚ）を用いて測定した。ケミカルシフトは百万分率（ｐｐｍ）で表している。内部標準０ｐｐｍには、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を用いた。結合定数（Ｊ）は、ヘルツで示しており、略号ｓ、ｄ、ｔ、ｑ、ｍおよびｂｒは、それぞれ、一重線(singlet)、二重線(doublet)、三重線(triplet)、四重線(quartet)、多重線(multiplet)および広幅線(broad)を表す。質量分析（MS）は、JEOL社製JMS-700（商品名）を用い、高分解能（HRMS）／高速原子衝撃法（FAB）により行った。赤外吸収（ＩＲ）スペクトルは、日本分光株式会社製VALOR-III（商品名）を用い、ＫＢｒ法により行った。元素分析は、ヤナコ株式会社製CHN CORDER MT-5（商品名）を用いて行った。融点は、ヤナコ株式会社製MP-S3（商品名）を用いて測定した。蛍光強度測定は、特に示さない限り、米国PerSeptive Biosystems社製の機器CytoFluor II multiwell fluorescence plate reader（商品名）を用い、励起（excitation）および放射（emission）フィルターをそれぞれ485±20 および 530±25 nmにセットして行なった。カラムクロマトグラフィー分離には、シリカゲル（メルク社製、シリカゲル６０（商品名））を用いた。全ての化学物質は、試薬級であり、特に示さない限り、アルドリッチ社、ランカスター社、東京化成株式会社、ナカライテスク株式会社、および和光純薬株式会社のいずれかから購入した。
【００７２】
（合成）
［1a~1d の合成］
化合物1a~1dは全て同様の方法により合成した。すなわち、まず、それぞれに対応するフルオレセイン2a~2d を準備した。具体的には、2aおよび2bは市販品を使用し、2cおよび2dはW.-C. Sun, K. R. Gee, D. H. Klaubert, R. P. Haungland, J. Org. Chem. 1997, 62, 6469-6475.に記載の方法で合成した。次に、このフルオレセイン (1.0 g) と２，４−ジニトロベンゼンスルホニルクロリド (2.2 eq) のジクロロメタン (20 mL) 懸濁液に０℃で２，６−ルチジン (5.0 mL) を加えた。得られた混合液を室温で４〜６時間撹拌した。反応液をジクロロメタン (200 mL) で希釈し、1M 塩酸 (200 mL×2) および飽和食塩水 (200 mL) で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。減圧下溶媒を留去し得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン）により精製して目的物を得た。以下に、化合物1a~1dの収量および機器分析値を示す。
【００７３】
1a: 1.4 g (59%) 淡黄色粉末.   融点. 131-135°C.   1H-NMR (270 MHz, d6-DMSO, TMS): δ = 9.11 (d, 4JH,H = 2.3 Hz, 2H; 芳香環), 8.62 (dd, 3JH,H = 8.6 Hz, 4JH,H = 2.3 Hz, 2H; 芳香環), 8.36 (d, 3JH,H = 8.6 Hz, 2H; 芳香環), 8.05 (d, 3JH,H = 7.3 Hz, 1H; 芳香環), 7.85-7.73 (m, 2H, 芳香環), 7.39-7.36 (m, 3H; 芳香環), 7.00-6.98 (m, 4H; 芳香環).   FTIR (KBr): ν = 1770 (CO, s), 1557 (NO2, s), 1541 (NO2, s) cm-1.   FAB HRMS 計算値 C32H17N4O17S2 (MH+): 793.0030; 実測値: 793.0017. 
1b: 1.0 g (47%) 淡黄色粉末.   融点. 199-202°C.   1H-NMR (270 MHz, d6-DMSO, TMS): δ = 9.12 (d, 4JH,H = 2.1 Hz, 2H; 芳香環), 8.66 (dd, 3JH,H = 8.7 Hz,4JH,H = 2.1 Hz, 2H; 芳香環), 8.43 (d, 3JH,H = 8.7 Hz, 2H; 芳香環), 8.05 (d, 3JH,H = 7.4 Hz, 1H; 芳香環), 7.86-7.74 (m, 2H, 芳香環), 7.59 (s, 2H; 芳香環), 7.43 (d, 3JH,H = 7.4 Hz, 1H; 芳香環), 7.23 (s, 2H; 芳香環).   FTIR (KBr): ν = 1773 (CO, s), 1558 (NO2, s), 1541 (NO2, s) cm-1.   元素分析値 (%) 計算値 C32H14Cl2N4O17S2: C 44.61, H 1.64, N 6.50; 実測値: C 44.54, H 1.82, N 6.27.   FAB HRMS 計算値 C32H15Cl2N4O17S2 (MH+): 860.9251; 実測値: 860.9221. 
1c: 1.5 g (67%) 白色結晶.   融点. 140-146°C (酢酸エチルから再結晶).   1H-NMR (270 MHz, d6-DMSO, TMS): δ = 9.13 (d, 4JH,H = 2.0 Hz, 2H; 芳香環), 8.66 (dd, 3JH,H = 8.7 Hz,4JH,H = 2.0 Hz, 2H; 芳香環), 8.43 (d, 3JH,H = 8.7 Hz, 2H; 芳香環), 8.04 (d, 3JH,H = 7.3 Hz, 1H; 芳香環), 7.85-7.32 (m, 2H, 芳香環), 7.58 (d, 4JH,F = 6.3 Hz, 2H; 芳香環), 7.43 (d, 3JH,H = 7.4 Hz, 1H; 芳香環), 7.13 (d, 3JH,F = 10.2 Hz, 2H; 芳香環).   FTIR (KBr): ν = 1774 (CO, s), 1557 (NO2, s), 1542 (NO2, s) cm-1.   元素分析値 (%) 計算値 C32H14F2N4O17S2・C4H8O2: C 47.17, H 2.42, N 6.11; 実測値: C 47.20, H 2.47, N 6.03.   FAB HRMS 計算値 C32H15F2N4O17S2 (MH+): 828.9842; 実測値: 828.9847. 
1d: 1.1 g (51%) 白色結晶.   融点. 155-160°C (酢酸エチル−ヘキサンから再結晶).   1H-NMR (270 MHz, CDCl3, TMS): δ = 8.74 (d, 4JH,H = 2.1 Hz, 2H; 芳香環), 8.63 (dd, 3JH,H = 8.7 Hz , 4JH,H = 2.1 Hz, 2H; 芳香環), 8.40 (d, 3JH,H = 8.7 Hz, 2H; 芳香環), 8.09 (d, 3JH,H = 6.9 Hz, 1H; 芳香環), 7.83-7.72 (m, 2H, 芳香環), 7.21 (d, 3JH,H =7.4 Hz, 1H; 芳香環), 6.52 (dd, 3JH,F = 9.3 Hz, 4JH,F = 2.1 Hz, 2H; 芳香環).   FTIR (KBr): ν = 1775 (CO, s), 1558 (NO2, s), 1542 (NO2, s) cm-1.   元素分析値 (%) 計算値 C32H12F4N4O17S2: C 44.45, H 1.64, N 6.48; 実測値: C 44.35, H 1.64, N 6.24.   FAB HRMS 計算値 C32H13F4N4O17S2 (MH+): 864.9653; 実測値: 864.9625. 
【００７４】
［3 の合成］
テトラフルオロフルオレセイン2d (1.0 g) と２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンゼンスルホニルクロリド (2.2 eq) のジクロロメタン (20 mL) 懸濁液に０℃で２，６−ルチジン (5.0 mL) を加えた。得られた混合液を室温で４時間撹拌した。反応液をジクロロメタン (200 mL) で希釈し、1M 塩酸 (200 mL x 2) および飽和食塩水 (200 mL) で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。減圧下溶媒を留去し得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン）により精製して目的物を得た。以下にこの化合物の収量および機器分析値を示す。
【００７５】
3: 2.1 g (92%) 白色結晶.   融点. 138-142°C (酢酸エチルから再結晶).   1H-NMR (270 MHz, d6-DMSO, TMS): δ = 8.84 (s, 2H; 芳香環), 8.47 (d, 3JH,H = 8.4 Hz, 2H; 芳香環), 8.40 (d, 3JH,H = 8.4 Hz, 2H; 芳香環), 8.05 (d, 3JH,H = 6.9 Hz, 1H; 芳香環), 7.86-7.74 (m, 2H, 芳香環), 7.46 (d, 3JH,H = 7.4 Hz, 1H; 芳香環), 7.15 (dd, 3JH,F = 10.2 Hz, 4JH,F = 2.1 Hz, 2H; 芳香環).   FTIR (KBr): ν = 1776 (CO, s), 1557 (NO2, s) cm-1.   元素分析値 (%) 計算値 C34H12F10N2O13S2・C4H8O2: C 45.70, H 2.02, N 2.81; 実測値: C 45.56, H 1.82, N 2.73.   FAB HRMS 計算値 C34H13F10N2O13S2 (MH+): 910.9699; 実測値: 910.9674. 
【００７６】
［4a および 4b の合成］
4aおよび4bはいずれも同様の方法により合成した。すなわち、まず、テトラフルオロフルオレセイン2d (2.0 g) と２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンゼンスルホニルクロリドまたは４−ニトロベンゼンスルホニルクロリド(1.1 eq) とのジクロロメタン (20 mL) 懸濁液に０℃で２，６−ルチジン (1.1 eq) を加えた。次に、得られた混合液を室温で４時間撹拌した。反応液をジクロロメタン (200 mL) で希釈し、1M 塩酸 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。減圧下溶媒を留去し得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−アセトン＝２０：１）により精製して目的物を得た。以下に化合物4aおよび4bの収量および機器分析値を示す。
【００７７】
4a: 0.72 g (22%) 黄色粉末.   融点. 118-135°C (酢酸エチル−ヘキサンから再結晶).   1H-NMR (270 MHz, CD3CN, TMS): δ = 8.36 (d, 4JH,H = 1.2 Hz, 1H; 芳香環), 8.32 (d, 3JH,H = 8.2 Hz, 1H; 芳香環), 8.19-7.99 (m, 1H; 芳香環), 7.82-7.70 (m, 2H; 芳香環), 7.27-7.24 (m, 1H, 芳香環), 6.68 (dd, 3JH,F = 10.1, 3JH,H = 2.4 Hz, 1H; 芳香環), 6.49 (dd, 3JH,F = 10.1 Hz, 4JH,F = 2.4 Hz, 2H; 芳香環).   FTIR (KBr): ν = 3208 (OH, br), 1766 (CO, s), 1557 (NO2, s) cm-1.   FAB HRMS 計算値 C27H11F7NO9S (MH+): 658.0043; 実測値: 658.0040. 
4b: 0.6 g (21%) 黄色粉末.   融点. 245-250°C (酢酸エチル−ヘキサンから再結晶).   1H-NMR (270 MHz, CD3CN, TMS): δ = 8.45-8.40 (m, 2H; 芳香環), 8.24-8.20 (m, 2H; 芳香環), 8.02-7.99 (m, 1H; 芳香環), 7.82-7.70 (m, 2H; 芳香環), 7.27-7.23 (m, 1H, 芳香環), 6.64 (dd, 3JH,F = 10.1, 3JH,H = 2.3 Hz, 1H; 芳香環), 6.47 (dd, 3JH,F = 10.9 Hz, 4JH,F = 2.3 Hz, 2H; 芳香環)).   FTIR (KBr): ν = = 3183 (OH, br), 1747 (CO, s), 1538 (NO2, s) cm-1.   元素分析値 (%) 計算値 C26H11F4NO9S: C 52.98, H 1.88, N 2.38; 実測値: C 53.01, H 2.15, N 2.23.   FAB HRMS 計算値 C26H12F4NO9S (MH+): 590.0169; 実測値: 590.0161.
【００７８】
［5a および 5b の合成］
5aおよび5bはいずれも同様の方法により合成した。すなわち、まず、5aまたは5bに対応するレゾルフィン・ナトリウム塩 (2.0 g) のピリジン (20 mL) 懸濁液に−４０℃で２，４−ジニトロベンゼンスルホニルクロリドまたは２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンゼンスルホニルクロリド (1.1 eq) を加えた。次に、得られた混合液を−４０〜−２０℃で４時間撹拌した。反応液をジクロロメタン (200 mL) で希釈し、1M 塩酸 (200 mL x 2) および飽和食塩水 (200 mL) で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。減圧下溶媒を留去し得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−アセトン＝２０：１）により精製して目的物を得た。以下に収量および機器分析値を示す。
【００７９】
5a: 0.9 g (24%) 橙色結晶.   融点. 213-215°C (ベンゼンから再結晶).   1H-NMR (270 MHz, [D]6DMSO, TMS): δ = 9.13(s, 1H; 芳香環), 8.62 (d, 3JH,H = 8.7 Hz, 1H; 芳香環), 8.34 (d, 3JH,H = 8.7 Hz, 1H; 芳香環), 7.90 (d, 3JH,H = 8.7 Hz, 1H; 芳香環), 7.55 (d, 3JH,H = 9.8 Hz, 1H; 芳香環), 7.47 (s, 1H, 芳香環), 7.25 (d, 3JH,H = 8.7 Hz, 1H; 芳香環), 6.85 (d, 3JH,H = 9.8 Hz, 1H; 芳香環), 6.29 (s, 1H; 芳香環).   FTIR (KBr): ν = 1622 (CO, s), 1558 (NO2, s), 1517 (NO2, s) cm-1.   元素分析値 (%) 計算値 C18H9N3O9S: C 48.76, H 2.05, N 9.48, S 7.23; 実測値: C 48.88, H 2.27, N 9.26, S 7.17.
5b: 1.2 g (30%) 橙色結晶.   融点. 204-207°C (酢酸エチルから再結晶).   1H-NMR (270 MHz, CDCl3, TMS): δ = 8.35 (d, 3JH,H = 8.1 Hz, 1H; 芳香環), 8.15 (s, 1H; 芳香環), 8.01 (d, 3JH,H = 8.1 Hz, 1H; 芳香環), 7.81 (d, 3JH,H = 8.4 Hz, 1H; 芳香環), 7.42 (d, 3JH,H = 9.7 Hz, 1H; 芳香環), 7.27-7.23 (m, 2H, 芳香環), 6.87 (dd, 3JH,F = 9.7, 3JH,H = 2.0 Hz, 1H; 芳香環), 6.33 (d, 4JH,H = 2.0 Hz, 1H; 芳香環).   FTIR (KBr): ν = 1647 (CO, s), 1561 (NO2, s) cm-1.   元素分析値 (%) 計算値 C19H9F3N2O7S: C 48.93, H 1.95, N 6.01; 実測値: C 48.75, H 2.05, N 5.76.   FAB HRMS 計算値 C19H10F3N2O7S (MH+): 467.0161; 実測値: 467.0149. 
【００８０】
［6a および 6b の合成］
6a および 6bはいずれも同様の方法で合成した。すなわち、まず、７−ヒドロキシ−４−（トリフルオロメチル）クマリン(1.0 g) と２，４−ジニトロベンゼンスルホニルクロリドまたは２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンゼンスルホニルクロリド (1.1 eq) とのジクロロメタン (20 mL) 懸濁液に０℃でトリエチルアミン (1.1 eq) を加えた。次に、得られた混合液を室温で１時間撹拌した。反応液をジクロロメタン (200 mL) で希釈し、1M 塩酸 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。減圧下溶媒を留去し得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン）により精製して目的物を得た。以下に収量および機器分析値を示す。
【００８１】
6a: 1.9 g (95%) 白色結晶.   融点. 123-124.5°C (ベンゼンから再結晶).   1H-NMR (270 MHz, [D]6-DMSO, TMS): δ = 9.13 (d, 4JH,H = 2.3 Hz, 1H; 芳香環), 8.64 (dd, 3JH,H = 8.7 Hz, 4JH,H = 2.3 Hz, 1H; 芳香環), 8.35 (d, 3JH,H = 8.7 Hz, 1H; 芳香環), 7.79 (dd, 3JH,H = 8.9 Hz, 3JH,H = 1.5 Hz, 1H; 芳香環), 7.54 (d, 4JH,H = 2.5 Hz, 1H, 芳香環), 7.32 (dd, 3JH,H = 8.9, 4JH,H = 2.5 Hz, 1H; 芳香環), 7.15 (s, 1H; 芳香環).   FTIR (KBr): ν = 1751 (CO, s), 1558 (NO2, s), 1542 (NO2, s) cm-1.   元素分析値 (%) 計算値 C16H7 F3N2O9S: C 41.75, H 1.53, N6.09; 実測値: C 41.74, H 1.63, N 5.92.   FAB HRMS 計算値 C16H8F3N2O9S (MH+): 460.9903; 実測値: 460.9888. 
6b: 2.0 g (95%) 白色結晶.   融点. 134.5-136°C (酢酸エチル−ヘキサンから再結晶).   1H-NMR (270 MHz, [D]6-DMSO, TMS): δ = 8.82 (s, 1H; 芳香環), 8.33 (d, 4JH,H = 1.5 Hz, 2H; 芳香環), 7.83 (dd, 3JH,H = 8.9 Hz, 4JH,H = 1.8 Hz, 1H; 芳香環), 7.57 (t, 4JH,H = 2.2 Hz, 1H; 芳香環), 7.34 (dt, 3JH,H = 8.9 Hz, 4JH,H = 2.2 Hz, 1H, 芳香環), 7.15 (s, 1H; 芳香環).   FTIR (KBr): ν = 1752 (CO, s), 1557 (NO2, s) cm-1.   元素分析値 (%) 計算値 C17H7F6NO7S: C 42.25, H 1.46, N 2.90; 実測値: C 42.24, H 1.55, N 2.72.   FAB HRMS 計算値 C17H8F6NO7S (MH+): 483.9926; 実測値: 483.9925. 
【００８２】
（スーパーオキサイド選択性蛍光プローブとしての評価）
化合物1a〜1dについてスーパーオキサイドとの反応性を調べたところ、いずれもスーパーオキサイドと反応して蛍光応答を示すが、1dが感度等の点で特に優れていることが分かった。そこで次に、主として前記化合物1dを試験用化合物として用いてスーパーオキサイド選択性蛍光プローブとしての性能を評価し、さらに細胞系での試験も行なった。以下、これらの試験について説明する。
【００８３】
［１−１．スーパーオキサイドに対する反応性］
以下のようにして、化合物1dとスーパーオキサイドとの反応性を試験した。すなわち、化合物1d (0.25 mmol)を、KO2 (5 eq)とともに、DMSOとpH 7.4の10 mM HEPES緩衝液との混合液(1:1) 中、室温で10分間反応させたところ、フルオレセイン誘導体2dに由来する蛍光が確認された。生成物を調べたところ、1dは完全に消費されていることが分かり、さらに0.24 mmolの2,4−ジニトロフェノールが単離された。生成物の同定は、1H-NMR、IRおよびマススペクトルを市販の化合物と比較することにより行なった。この反応機構は明らかではないが、例えば下記スキーム７のように推定される。KO2が大過剰存在したにも関わらず2,4−ジニトロフェノールの発生量は1dに対しほぼ１等量であったことから、二度目の脱離反応（17dから2dへの変換反応）はスーパーオキサイドとの反応ではなくむしろ別の機構により起こっているとも思われる。ただし、スキーム７は、あくまでも化合物1dに対し上記の条件で推定されるメカニズムの一例に過ぎず、本発明を限定するものではない。
【００８４】
【化２２】
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【００８５】
［１−２．スーパーオキサイド選択性（１）］
まず、化合物1dのスーパーオキサイド選択性蛍光プローブとしての性能を試験したところ、1d はスーパーオキサイドに対して優れた特異性を有することが分かった。図１にその試験結果を示す。同図は、化合物1dをH2O2または酵素的に生成させたスーパーオキサイドと反応させて蛍光発光を追跡した結果を示すグラフであり、横軸は反応時間（秒）、縦軸は蛍光強度（au）を表す。図中、(a)はHPXおよびXO存在下、(b)はHPX、XOおよびSOD存在下、(c)はHPX、XOおよびSODの存在する嫌気性条件下、そして(d)はH2O2のみと反応させたときの結果をそれぞれ示す。以下、図１の試験結果についてさらに詳細に説明する。
【００８６】
まず、図１(a)に示す通り、1dは、ヒポキサンチン (HPX)／キサンチンオキシダーゼ (XO) 系から発生したスーパーオキサイドに反応して蛍光応答が短時間に顕著に増加したことから、スーパーオキサイドに対し高い感度を有していることが分かった。より具体的には、HEPES緩衝液(pH 7.4, 10 mM, 2.5 mL)中、37℃における化合物1d(16 μM)、キサンチンオキシダーゼ(XO, 0.01 U/mL)、およびヒポキサンチン(HPX, 40 μM)の酵素反応を、励起（excitation）波長511 nmおよび放射（emission）波長531 nmで追跡したところ、化合物2dの形成（前記スキーム４）に由来する蛍光応答が観測され、図１(a)に示す右上がりの（progressive）曲線が得られた。なお、スーパーオキサイドジスムターゼ(SOD)(40 U/mL)をさらに添加する以外は同様にして試験したところ、図１(b)に示す通り蛍光応答が顕著に阻害されたことから、図１(a)の蛍光応答はスーパーオキサイドに起因することが確認された。
【００８７】
そして、図１(d)に示す通り、化合物1dとH2O2(40 μM)との反応は、無視できるほど小さな蛍光強度増加を引き起こしたのみであった。すなわち、1d は、過酸化水素に対しほとんど応答せず、スーパーオキサイドに対して優れた特異性を有することが示された。
【００８８】
さらに、図１(c)に示す結果から、化合物1dは、従来のスーパーオキサイド検出剤であるニトロブルーテトラゾリウム(NBT)と比較して利点を有していることが分かる。具体的には以下の通りである。NBTは、スーパーオキサイドO2-・により還元される性質を有していることから分光光度測定等のプローブ等に利用されている。しかし、NBTには、スーパーオキサイドのみならず生体系に存在するリダクターゼによっても還元されてしまうという大きな問題がある。そこで、化合物1dによるO2-・の検出が同様の問題を有するか否か、嫌気性条件下で化合物1d, XO, HPX および SODを用いた酵素反応により試験したところ、図１(c)に示す通り、XO還元体に起因する1dから2dの生成は非常に低速度であった。この結果は、キサンチン-XO系によるNBTからホルマザンへの還元では好気性条件下よりも嫌気性条件下の方がより高速度で還元されたという観測結果とはっきり対照的である。このように、化合物1dを用いた蛍光に基づくO2-・の検出では、細胞内リダクターゼによる複雑化は排除されるかまたは顕著に低減されることが示された。
【００８９】
［１−３．スーパーオキサイド選択性（２）］
さらに、上記と異なる条件で、化合物1a〜1dの全てについて、H2O2およびそれ以外の各種求核剤、還元剤等との反応性も試験した。より具体的には、XO-HPX系、XO-HPX-SOD系、H2O2、アスコルビン酸、１，４−ヒドロキノン、プロピルアミン、ジエチルアミン、グルコース、エステラーゼ、チトクロームP450リダクターゼ+ NADPH系およびジアフォラーゼ + NADH系のそれぞれについて蛍光応答を測定した。操作は以下の通りである。すなわち、まず、1a〜1dおよび上記各試薬を、それぞれpH 7.4の10 mM HEPESに溶かし、溶液を調製した。次に、96ウェルミクロプレートを準備し、各ウェルに、前記1a〜1dのうちいずれかの溶液(25 μM, 170 μL)を入れ、さらに、ブランク溶液30 μL、または反応させようとする試薬の溶液30 μLを加えた。ウェル中における最終的な濃度は、1a〜dについては21.3 μM、XOについては13.1 mU/mL、HPX、H2O2、アスコルビン酸、１，４−ヒドロキノン、プロピルアミン、ジエチルアミン、グルコース、NADPHおよびNADHについてはそれぞれ50 μM each、チトクロームP450リダクターゼは 68 mU/mL、ジアフォラーゼは65 mU/mL、エステラーゼは0.5 U/mLとなるように調製した。そして、そのままウェル中で37℃で10分間反応させた後に蛍光応答を測定した。蛍光強度測定は、JASCO社製 FP-750 spectrofluorometer（商品名）に、JASCO社製 ETC-272 Peltier thermostatted single cell holder（商品名）またはMolecular Devices社製 SpectraMax GeminiEM fluorescence plate reader（商品名）を装備して用い、励起波長および放射波長は、1a, 1bおよび1cについてはそれぞれ485および515 nmに、1dについては511および540 nmに設定して測定した。その結果、下記表１に示す通り、1a〜1dのいずれも、XO-HPX系およびXO-HPX-SOD系に対する結果から、スーパーオキサイドに対しては優れた感度で応答を示すことが確認されたが、H2O2、アスコルビン酸、１，４−ヒドロキノン、プロピルアミン、ジエチルアミン、およびグルコースに対してはまったく応答せず、エステラーゼに対しても無視できるほど小さな応答を示したのみであった。なお、チトクロームP450リダクターゼ+ NADPH系およびジアフォラーゼ + NADH系においても、スーパーオキサイド検出に影響するほどの応答はないことが分かった。1a、1b、1cおよび1dは、0.1 M Et4NClO4を含むCH3CN-H2O (3:1)でのボルタンメトリー測定において-0.5 V vs. SCE付近で陰極応答を示すことから、スーパーオキサイド以外の細胞内リダクターゼによる還元でスーパーオキサイド検出が阻害されることも予想されたが、その予想に反して上記の通りスーパーオキサイドに対し高い選択性を示した。
【００９０】
（表１）1a、1b、1cまたは1dの、各種生物学的反応剤または酵素系に対する蛍光応答比較
反応剤または酵素系                蛍光応答                        
1a      1b      1c      1d
ブランク                          10      10      10      10
XO-HPX                            70      288     797     554 
XO-HPX-SOD                        12      22      48      60
H2O2                              10      11      11      11 
アスコルビン酸                    10      11      11      11
1,4−ヒドロキノン                 10      11      10      11 
プロピルアミン                    10      10      10      10
ジエチルアミン                    11      10      10      11
グルコース                        10      10      10      10
エステラーゼ                      17      20      23      15
（※上記表１の数値は、ブランク時の蛍光応答強度を10として算出した相対的な蛍光強度値である。）
【００９１】
［２．定量性］
96ウェルミクロプレートアッセイにより、HPX / XO系における前記プローブ（化合物1d）の蛍光応答における感度および定量性を試験した。具体的には、1dのDMSO溶液 (10 mM) をHEPES(pH 7.4, 10 mM)で400倍に希釈してプローブ溶液を調製し、このプローブ溶液(150 μL)をHPXのHEPES溶液 (10 μL) および XOのHEPES溶液 (0.26 U/mL, 10 μL) と混合し、37℃で10分間静置した後に蛍光強度を測定した。HPX濃度を様々に変化させて測定を行なったところ、HPX濃度の検出限界値は5.0 pmol (RSD, n=8; 2.7%) であり、細胞レベルの解析に対応可能な値であることが分かった。さらに、HPXが前記検出限界値から10.0 nmolまでの間で良好な直線較正曲線が得られたことから、1dの蛍光応答はHPXとXOとの酵素反応により生成したO2-・の量に対し良好な依存性を示すことが確認された。この直線較正曲線の相関係数は1.000、傾きは0.58 au/pmolであった。
【００９２】
また、蛍光強度の測定機器およびアッセイ条件を変える以外は上記と同様にして定量性を試験したところ、やはり優れた定量性を示すことが確認された。すなわち、アッセイ条件については、1dのDMSO溶液濃度を5 mMとし、これをHEPES(pH 7.4, 10 mM)で400倍に希釈してプローブ溶液を調製することと、プローブ溶液使用量を180 μLとすること以外は上記と同様に行なった。蛍光強度測定は、JASCO社製 FP-750 spectrofluorometer（商品名）に、JASCO社製 ETC-272 Peltier thermostatted single cell holder（商品名）またはMolecular Devices社製 SpectraMax GeminiEM fluorescence plate reader（商品名）を装備して行なった。その結果、HPX濃度の検出限界値は1.0 pmol (RSD, n=8; 2.9%) であり、HPXが前記検出限界値から2.0 nmolまでの間で相関係数0.9993および傾き0.80 au/pmolの良好な直線較正曲線が得られた。直線較正曲線の傾きが上記と異なるのは、蛍光強度の単位が任意単位であり、測定機器が異なることに由来する。
【００９３】
［３．細胞系への応用］
好中球（neutrophils）をフォルボールエステルで刺激するとスーパーオキサイドを産生することが知られている。この現象を測定する蛍光プローブとしての1dの可能性を、フォルボール ミリステート アセテート(PMA)で刺激した好中球を用いて試験したところ、1dは細胞系においてもスーパーオキサイドを感度よく検出できることが明らかになった。具体的な試験方法は以下の通りである。
【００９４】
まず、健康なボランティアの提供による全血をヘパリン化し、大日本製薬株式会社製モノポリ分離溶液（Mono-Poly resolving medium）を加えて遠心分離した。分離後、細胞をPBS (−) で二回洗浄し、PBS (+)を用いて1×106個または1×105個 細胞/mL濃度で再懸濁させ、これを使用時まで氷冷条件下で保存した。なお、PBSとはphosphate buffered salineすなわちリン酸緩衝生理食塩水であり、PBS (+)とは0.54 mMのCaCl2 および 1.22 mMのMgSO4を含むPBSを指し、PBS(−)とはそれらを含まないPBSを指す。このようにして得た細胞懸濁液(100 μL)と、プローブ溶液(25 μM in PMS (+), 50 μL)と、PMA溶液(0.64 μM in PBS (+), 50 μL)またはブランク溶液(PBS (+), 50 μL)とを、96ウェル平底ミクロタイタプレート（旭テクノグラス株式会社製）中に添加した。直ちに蛍光強度測定（タイム0時点での測定）を行ない、その後37℃で120分間インキュベートした。インキュベーションの間、前記細胞の蛍光強度の変化を30分ごとに測定した。全ての測定は、米国PerSeptive Biosystems社製の機器CytoFluor II multiwell fluorescence plate reader（商品名）を用い、励起（excitation）および放射（emission）フィルターをそれぞれ485±20 および 530±25 nmにセットして行なった。
【００９５】
図２のグラフに、上記試験の結果を示す。同図は、各ウェル中の細胞数が1.0×104個または1.0×105個である場合について、それぞれPMAの存在下または非存在下での結果を示す。横軸はインキュベーション時間（分）、縦軸は蛍光強度（au）である。同図から分かる通り、化合物1dによるアッセイは、PMA刺激好中球がO2-・を放出することをはっきりと示した。蛍光強度増加は無刺激細胞においても観測されたが、これは、従来の研究によれば、使用した組織培養プレート表面と細胞との相互作用により好中球の活性化が起こるためであるとされている。
【００９６】
なお、蛍光強度測定機器を変えて、すなわち、JASCO社製 FP-750 spectrofluorometer（商品名）に、JASCO社製 ETC-272 Peltier thermostatted single cell holder（商品名）またはMolecular Devices社製 SpectraMax GeminiEM fluorescence plate reader（商品名）を装備して用いることと、蛍光強度の変化を15分ごとに測定すること以外は上記と同様に試験を行なったところ、やはり同様の結果が確認された。図３のグラフに、その結果を示す。各ウェル中の細胞数は1.0×105個であり、横軸はインキュベーション時間（分）である。縦軸は蛍光強度（au）であり、８ウェルについて得た実測値の平均値±標準偏差で表している。蛍光強度の数値が図２と図３とで異なるのは、単位が任意単位であり、測定機器が異なることに由来する。
【００９７】
さらに、化合物1dの好中球に対する毒性を、トリパンブルー染色法で細胞生存率（cell viability）を見積もることにより評価した。すなわち、好中球（1.0×105個細胞）を、ヒト血清アルブミンによりコートされたガラス製試験管中、化合物1d (6.25 μM) および PMA (0.16 μM)の両方が存在する条件下、どちらか一方のみの存在下、ならびにどちらも存在しない条件下において、37℃で120分間インキュベートし、インキュベート前に対するインキュベート後の細胞生存率を測定した。その結果、1dおよびPMAのどちらも存在しない存在下では、インキュベート後の細胞生存率はインキュベート前に対して98％であった。これに対し、1のみの存在下ではインキュベート後の細胞生存率は95％、PMAのみの存在下では93％、1およびPMAがともに存在する条件下では97％であった。すなわちいずれの条件下でも好中球の死滅はほとんど起こっていないことが分かる。このように、PMAのみならず化合物1dも、120分間のインキュベーションにおいて好中球に対し毒性を示さないことが確認された。
【００９８】
上述の結果は、化合物1dから2dへの還元的脱保護がO2-・により効果的に誘起されることをも示し、したがって、化合物1dが、PMA刺激好中球から放出されるO2-・検出用新規蛍光プローブとして機能する上にインキュベーション中細胞に損傷を与えないことをも示した。このプローブおよびその同族体は、細胞由来O2-・の測定を容易にし、ミトコンドリアのみならず、食細胞（phagocytes）や脈管細胞（vascular cells）により発現される酸化的ストレスの動的機能（dynamic functions）の解明にも役立つことが期待できる。
【００９９】
［４．その他の化合物についての試験］
化合物1dと同様に2, 4−ジニトロベンゼンスルホニル基を含む1a~1c、5aおよび6aについてスーパーオキサイド検出用蛍光プローブとしての性能を試験したところ、いずれもスーパーオキサイドにより脱保護され、各々対応する蛍光色素へ変換されることが明らかになった。さらに、2, 4−ジニトロベンゼンスルホニル基に代えて4−トリフルオロメチル−2−ニトロベンゼンスルホニル基を導入した3、4a、5bおよび6b、ならびに4−ニトロベンゼンスルホニル基を導入した4bも同様にスーパーオキサイドにより脱保護され、蛍光色素に変換されることも分かった。したがって、フェノール性色素と 2, 4−ジニトロベンゼンスルホニル基、4−トリフルオロメチル−2−ニトロベンゼンスルホニル基または4−ニトロベンゼンスルホニル基の組み合わせからなる化合物は、いずれも同様にスーパーオキサイド検出用蛍光プローブとして利用できると考えられる。例えば下記スキーム８のようにである。さらに、これらの組み合わせに限定されず、前記一般式（Ｉ）の範囲内で本発明の化合物を自由に設計して本発明者らの開発した発蛍光機構を活用することにより、使用目的に適う特性を有する蛍光プローブ用化合物を自在に設計開発できると期待できる。本発明の化合物の用途としては、例えば、スーパーオキサイドを用いた微少着色技術への応用等、多種多様な用途が考えられる。
【０１００】
【化２３】
2005047891.tif 000017
【実施例２】
【０１０１】
本実施例では、実施例１で合成した化合物に加え、前記式4c〜4e、7および8a〜cで表されるスルホン酸エステル化合物を合成した。そして、これら化合物について、メルカプト化合物検出用蛍光プローブとしての機能性を試験した。蛍光強度測定は、特に示さない限り、JASCO社製 FP-750 spectrofluorometer（商品名）に、JASCO社製 ETC-272 Peltier thermostatted single cell holder（商品名）またはMolecular Devices社製 SpectraMax GeminiEM fluorescence plate reader（商品名）を装備して用い、測定した。それ以外の測定条件等は実施例１と同様である。
【０１０２】
［4cの合成］
まず、テトラフルオロフルオレセイン (2.0 g) と２−ニトロベンゼンスルホニルクロリド (1.1 eq) のジクロロメタン (20 mL) 懸濁液を調製した。次に、この懸濁液を０℃に冷却し、その温度で２，６−ルチジン (1.1 eq) を加えた。得られた混合液を室温で４時間撹拌した。その反応液をジクロロメタン (200 mL) で希釈し、1M 塩酸 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。さらに、減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−アセトン＝２０：１）により精製して、目的の化合物4cを得た。以下にこの化合物の収量および機器分析値を示す。
【０１０３】
4c: 0.66 g (22%) 暗黄色結晶.   融点. 234-246°C (酢酸エチル−ヘキサンから再結晶).   1H-NMR (270 MHz, [D]6DMSO, TMS): δ =11.33 (s, 1H, COOH), 8.27 (t, 3JH,H = 8.9 Hz, 2H; 芳香環), 8.17 (t, 3JH,H = 7.7 Hz, 1H; 芳香環), 8.05-7.97 (m, 2H; 芳香環), 7.85-7.73 (m, 2H; 芳香環), 7.43 (d, 3JH,H = 7.4 Hz, 1H, 芳香環), 7.02 (d, 3JH,F = 10.1 Hz, 1H; 芳香環), 6.59 (d, 3JH,F = 10.9 Hz, 2H; 芳香環).   FTIR (KBr): ν = 3254 (OH, br), 1752 (CO, s), 1553 (NO2, s) cm-1.   FAB HRMS 計算値 C26H12F4NO9S (MH+): 590.0169; 実測値: 590.0167. 
【０１０４】
［4dおよび4e の合成］
２−ニトロベンゼンスルホニルクロリドに代えて２−ニトロ−４−メトキシベンゼンスルホニルクロリドを用いる以外は4cの合成と同様にして4dを得た。さらに、２−ニトロベンゼンスルホニルクロリドに代えて４−ニトロ−２−メトキシベンゼンスルホニルクロリドを用いる以外は4cの合成と同様にして4eを得た。以下に、これらの収量および機器分析値を示す。
【０１０５】
4d: 0.46 g (15%) 暗橙色粉末.   融点. 111-125°C.   1H-NMR (270 MHz, CD3CN, TMS): δ = 8.07-8.01 (m, 2H; 芳香環), 7.79-7.68 (m, 2H; 芳香環), 7.36 (s, 2H; OH and 芳香環), 7.20-7.16 (m, 2H; 芳香環), 6.41 (dd, 3JH,F = 9.5, 3JH,H = 2.2 Hz, 1H; 芳香環), 6.34 (dd, 3JH,F = 10.2 Hz, 4JH,F = 2.0 Hz, 1H; 芳香環), 3.99 (s, 3H; OCH3).   FTIR (KBr): ν = = 3227 (OH, br), 1755 (CO, s), 1552 (NO2, s) cm-1.   元素分析値 (%) 計算値 C26H11F4NO9S: C 52.98, H 1.88, N 2.38; 実測値: C 53.01, H 2.15, N 2.23.   FAB HRMS 計算値 C27H14F4NO10S (MH+): 620.0275; 実測値: 620.0280. 
4e: 0.52 g (17%) 暗橙色粉末.   融点. 127-144°C.   1H-NMR (270 MHz, CD3CN, TMS): δ = 8.10-8.05 (m, 2H; 芳香環), 7.95-7.90 (m, 2H; 芳香環), 7.79-7.68 (m, 2H; 芳香環), 7.18 (d, 3JH,H = 6.9 Hz,, 1H; 芳香環), 6.39 (dd, 3JH,F = 9.6, 3JH,H = 2.0 Hz, 1H; 芳香環), 6.33 (dd, 3JH,F = 10.3 Hz, 4JH,F = 1.9 Hz, 1H; 芳香環), 4.12 (s, 3H; OCH3).   FTIR (KBr): ν = 3222 (OH, br), 1763 (CO, s), 1538 (NO2, s) cm-1.   FAB HRMS 計算値 C27H14F4NO10S (MH+): 620.0275; 実測値: 620.0280. 
【０１０６】
[7の合成]
まず、4-メチル−7-ヒドロキシクマリン(4-methyl-7-hydroxycoumarin) (1.0 g) の 2ジクロロメタン (20 mL) 懸濁液を調製し、０℃に冷却し、その温度でトリエチルアミン (1.2 eq) を加えた。これを5 分間撹拌した後、2,4-ジニトロベンゼンスルホニルクロリド (1.2 eq) を更に加えた。得られた混合液を室温で 4~6 時間撹拌した。その反応液をジクロロメタン (200 mL) で希釈し、1M 塩酸 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。減圧下溶媒を留去し得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−アセトン＝２０：１）により精製して目的の化合物7を得た。以下にこの化合物の収量および機器分析値を示す。
【０１０７】
7: 2.2 g (95%) 白色針状晶.  融点.188-190°C (ベンゼンから再結晶).  1H-NMR (270 MHz, CDCl3, TMS): δ = 8.75 (d, 4JH,H = 2.0 Hz, 1H; 芳香環), 8.45 (dd, 3JH,H = 8.6 Hz, 4JH,H = 2.0 Hz, 1H; 芳香環), 8.16 (d, 3JH,H = 8.6 Hz, 1H; 芳香環), 7.75 (d, 3JH,H = 8.6 Hz, 1H; 芳香環), 7.21-7.16 (m, 2H; 芳香環), 6.31 (s, 1H; 芳香環), 2.41 (S, 3H; CH3).  FTIR (KBr): ν = 1732 (CO, s), 1560 (NO2, s), 1537 (NO2, s) cm-1.  FAB HRMS 計算値 C16H11N2O9S (MH+): 407.0185; 実測値: 407.0184.
【０１０８】
[8a〜c の合成]
4-メチル−7-ヒドロキシクマリンに代えて8a〜cの構造にそれぞれ対応するフルオレセイン(fluorescein)誘導体(1.0 g)を用いる以外は化合物7の合成と同様にして、化合物8a〜cをそれぞれ合成した。以下にこれらの化合物の収量および機器分析値を示す。
【０１０９】
8a: 0.63 g (37%) 黄色固体.  融点. 125-147°C.  1H-NMR (270 MHz, CD3OD, TMS): δ 8.87 (d, 4JH,H = 2.8 Hz, 1H; 芳香環), 8.44 (dd, 3JH,H = 9.2 Hz, 4JH,H = 2.8 Hz, 1H; 芳香環), 8.03-7.98 (m, 1H; 芳香環), 7.81-7.69 (m, 2H; 芳香環), 7.33-7.16 (m, 3H; 芳香環), 6.90-6.81 (m, 2H; 芳香環), 6.69-6.55 (m, 3H; 芳香環).  FTIR (KBr): ν = 3438 (OH, br) 1736 (CO, s), 1539 (NO2, s) cm-1.  FAB HRMS 計算値 C26H15N2O11S (MH+): 563.0397; 実測値: 563.0396.
8b: 0.75 g (46%) 黄色固体.  融点. 131-156°C.  1H-NMR (270 MHz, CDCl3, TMS): δ 8.70 (s, 1H; 芳香環), 8.58 (d, 3JH,H = 8.4 Hz, 1H; 芳香環), 8.32 (d, 3JH,H = 8.4 Hz, 1H, 芳香環), 8.06 (d, 3JH,H = 6.8 Hz, 1H; 芳香環), 7.71-7.66 (m, 2H; 芳香環), 7.15 (d, 3JH,H = 6.8 Hz, 1H; 芳香環), 7.05 (s, 1H; 芳香環), 6.66 (s, 1H; 芳香環), 6.63 (s, 1H; 芳香環), 6.47 (s, 1H; 芳香環), 5.67 (s, 1H; OH), 2.06 (S, 6H; CH3 x 2).  FTIR (KBr): ν = 3318 (OH, br), 1735 (CO, s), 1557 (NO2, s), 1542 (NO2, s) cm-1.  FAB HRMS 計算値 C28H19N2O11S (MH+): 590.0710; 実測値: 599.0698.
8c: 0.62 g (38%) 黄色固体.  融点. 143-158°C (CHCl3から再結晶).  1H-NMR (270 MHz, CDCl3, TMS): δ 8.67 (d, 4JH,H = 2.1 Hz, 1H; 芳香環), 8.55 (dd, 3JH,H = 8.6 Hz, 4JH,H = 2.1 Hz, 1H; 芳香環), 8.25 (d, 3JH,H = 8.6 Hz, 1H, 芳香環), 8.01 (d, 3JH,H = 7.1 Hz, 1H; 芳香環), 7.72-7.60 (m, 2H; 芳香環), 7.16 (d, 3JH,H = 7.4 Hz, 1H; 芳香環), 6.73 (d, 3JH,H = 7.4 Hz, 1H; 芳香環), 6.60 (d, 3JH,H = 8.7 Hz, 1H; 芳香環), 6.55 (d, 3JH,H = 8.7 Hz, 1H; 芳香環), 6.48 (d, 3JH,H = 8.7 Hz, 1H; 芳香環), 5.50 (s, 1H; OH), 2.44 (S, 3H; CH3), 2.38 (S, 3H; CH3).  FTIR (KBr): ν = 3266 (OH, br), 1735 (CO, s), 1558 (NO2, s), 1541 (NO2, s) cm-1.  FAB HRMS 計算値 C28H19N2O11S (MH+): 590.0710; 実測値: 599.0705.
【０１１０】
（メルカプト化合物応答型蛍光プローブとしての評価）
［１．メルカプト化合物に対する特異性］
化合物1d、5a、6a、7および8aについて、実施例１の［１−３．スーパーオキサイド選択性（２）］と同じ条件で、スーパーオキサイドおよびチオールの一種であるグルタチオン (glutathione, GSH)に対する反応性をそれぞれ試験した。図４に、その結果を示す。縦軸は蛍光強度であり、対照に対する％(% of control)で表している。図示の通り、1dはスーパーオキサイド選択性（特異性）に優れ、5a、6a、7および8aは、スーパーオキサイドに対する応答も示すもののメルカプト化合物選択性に優れていることが分かった。また、化合物8bおよび8cも、グルタチオンに対し高感度に応答することを確認した。これらのことから、フェノール性水酸基を有する蛍光性化合物である７−ヒドロキシクマリン、レゾルフィンおよびフルオレセインならびにそれらの誘導体のＯ−２，４−ジニトロベンゼンスルホニル化体は、グルタチオンやシステインなどのメルカプト化合物に対して短時間にかつ高感度に応答するプローブとして特に好ましいと思われる。さらに、5a、6a、7、8a、8bおよび8cについて、前記表１（実施例１の［１−３．スーパーオキサイド選択性（２）］）に示した各化合物に対する応答を実施例１と同条件で試験した結果、全くと言って良いほど応答を示さなかった。すなわち、化合物5a、6a、7、8a、8bおよび8cは、H2O2やアミン等、メルカプト化合物以外の反応剤にほとんど応答しないことから、メルカプト化合物に対する選択性がきわめて高いことが分かった。
【０１１１】
[２. メルカプト化合物応答型蛍光プローブとしての評価]
次に、化合物6aおよび化合物8aについて、メルカプト化合物応答型蛍光プローブとしての性能を評価した。
【０１１２】
チオールの一種であるグルタチオン (glutathione, GSH) および システイン(cysteine) を用い、化合物6aおよび8aの、メルカプト化合物に対する定量性等を評価した。すなわち、まず、化合物6aのEtOH 溶液 (10 mM) を調製し、それをさらに pH 7.4の HEPES緩衝液で 500 倍希釈し、化合物6aを含むプローブ溶液を調製した。次に、このプローブ溶液 200 μL および様々な濃度のグルタチオンまたはシステイン溶液(pH 7.4の HEPES緩衝液に溶かしたもの) 10 μL を96 穴マイクロプレートの各ウェルに加え、37°C で 10 分間放置して反応させた。さらに、化合物6aに代えて8aを用いる以外は同様にして8aを含むプローブ溶液を調製し、このプローブ溶液についても6aを含むプローブ溶液と同様にしてチオール溶液と反応させた。そして、反応後それぞれのウェルについて蛍光応答を測定した。測定は、6a の場合 λex = 383 nmおよび λem = 500 nm、8a の場合 λex = 483 nmおよび λem = 515 nmで行なった。なお、λex は励起波長を、λem は放射波長をそれぞれ示す。
【０１１３】
図５に、上記蛍光応答の測定結果を示す。図５（ａ）は6aについての、図５（ｂ）は8aについての測定結果を示すグラフである。同図に示す通り、6a を用いた場合、GSH および cysteine の検出限界はどちらも 7 pmol であり、7 pmol ~ 1000 pmol の濃度範囲で良好な検量線が得られた。なお、GSHについては、傾き = 0.37 au / pmol、相関係数 (r) = 0.9998であり、cysteineについては、傾き = 0.66 au / pmol、r = 0.9995であった。一方、8a を用いた場合、GSH および cysteine の検出限界は各々 2 および 1 pmol であり、その検出限界から 1000 pmol の濃度範囲で良好な検量線が得られた。GSHについては傾き = 4.25 au / pmol、相関係数 (r) = 1.0000であり、cysteineについては傾き = 4.82 au / pmol、r = 0.9999であった。
【０１１４】
これらの結果から、6a および 8a が、メルカプト化合物応答型蛍光プローブとして利用できることが示された。具体的には、前記相関係数 (r)の値から非常に優れた定量性を持つことが分かり、傾きの大きさから高い感度を有することが分かる。特に8aは感度が高かった。
【０１１５】
さらに、6a または 8aを含む蛍光プローブは、反応時間が非常に短くて済むことと、6a および 8a自体は蛍光性を持たず、反応で生成する色素のみが蛍光性を有するため反応の前後で試薬の分離操作が不必要であることが特徴的であった。
【０１１６】
さらに、上記の6a または 8aを含む蛍光プローブを、チオールに代えて水酸基やアミノ基などを含む他の求核剤を用いる以外は同様の条件で反応させたところ、まったく蛍光を示さないことが確認された。すなわち、これらの蛍光プローブは、水酸基やアミノ基等に応答せず、メルカプト化合物に対し高い特異性（選択性）を有することが分かった。
【０１１７】
なお、化合物5a、7、8bおよび8cについても同様に試験を行ない、同様の結果を確認した。
【０１１８】
[３．アセチルコリンエステラーゼアッセイ]
下記スキーム９に示す通り、アセチルチオコリンを基質、アセチルコリンエステラーゼを酵素として酵素反応させるとメルカプト化合物（チオール）の一種であるチオコリンが生じる。このチオコリンを、例えば下記スキーム１０のように本発明のスルホン酸エステル化合物により検出すれば、アセチルコリンエステラーゼ(acetyl cholinesterase, AChE)の活性が短時間で測定できると期待できる。なお、スキーム１０は可能なメカニズムの一例を示すに過ぎず、本発明を限定するものではない。
【０１１９】
【化２４】
2005047891.tif 000018
【０１２０】
本発明者らは、実際に上記各化合物がアセチルコリンエステラーゼの活性測定に使用できることを確認した。化合物8aについて具体的な操作を以下に示す。すなわち、まず、化合物8aのEtOH 溶液 (10 mM) を調製し、それをさらに pH 7.4の HEPES緩衝液で 500 倍希釈し、化合物8aを含むプローブ溶液(20 μM)を調製した。一方、市販のアセチルチオコリンをpH 7.4のHEPES緩衝液に溶かした溶液(1 mM)を調製した。さらに、様々な濃度（活性量）のアセチルコリンエステラーゼ(AChE) 溶液(pH 7.4のHEPES緩衝液に溶かした溶液）を調製した。
【０１２１】
次に、前記プローブ溶液200 μL、アセチルチオコリン溶液10 μL、および様々な濃度（活性量）のアセチルコリンエステラーゼ(AChE) 溶液10 μLを 96ウェルミクロプレートの各ウェルに加え、37°C で１０分間酵素反応を行なった。その直後に、λex（励起波長）= 483 nmおよび λem（放射波長）= 515 nmで蛍光応答を測定した。図６に蛍光応答の測定結果を示す。同図において、横軸はAChE活性量(μU)であり、縦軸は蛍光強度（au）である。図示の通り、各ウェルについて得られた蛍光応答は AChE の活性量に対して良好な依存性を示した。さらに、0.1 μU ~ 0.5 μU の範囲では、AChE 活性と蛍光応答の間に良好な直線関係が観察された（傾き = 28.8 au / μU、r = 0.9998）。本 AChE アッセイは、バックグランド応答が小さいことに起因する感度の良さだけでなく、反応時間が 10 分と非常に短いことが特徴であった。
【０１２２】
さらに、上記アッセイ法がAChE 阻害薬の活性測定にも活用できることを、良く知られている抗コリン薬であるネオスチグミン（neostigmine）およびピリドスチグミン（pyridostigmine）を用いて確認した。具体的な操作は以下の通りである。すなわち、まず、8aを含むプローブ溶液、アセチルチオコリン溶液、およびアセチルコリンエステラーゼ(AChE)溶液を上記と同様にして調製した。ただし、AChE溶液の濃度（活性量）は5 U/mLに固定した。一方、様々な濃度の ネオスチグミン溶液およびピリドスチグミン溶液 (いずれもpH 7.4 HEPES緩衝液に溶かしたもの)を調製した。そして、このプローブ溶液 (25 μM, 150 μL)、アセチルチオコリン溶液 (1 mM, 10 μL)、AChE溶液 (5 U/mL, 10 μL) および様々な濃度のネオスチグミン溶液またはピリドスチグミン溶液を、96ウェルミクロプレートの各ウェルに加え、37°C で 10 分間酵素反応を行なった後、各ウェルについて蛍光応答を測定した。測定は、λex（励起波長）= 483 nmおよび λem（放射波長）= 515 nmで行なった。そして、蛍光強度から阻害％値を算出し、阻害活性曲線を作成した。図７に、その阻害活性曲線を示す。横軸はネオスチグミンまたはピリドスチグミンの濃度（μmol）であり、縦軸は蛍光強度から算出した阻害％値である。
【０１２３】
図７の阻害曲線からネオスチグミンおよびピリドスチグミンの IC50 値を見積もったところ、0.18 μM および 0.29 μM となった。これらの値は、ネオスチグミンおよびピリドスチグミンの IC50 値として周知の文献値と一致していないが、それは測定条件等が異なるためである。しかしながら、これら両抗コリン薬の IC50 値間の相対的な程度差は文献値と良い相関を示した。すなわち、化合物8aが、AChE阻害薬に対し精度の良い活性測定剤として使用可能であることが分かった。
【０１２４】
AChEアッセイやAChE阻害活性の測定は、AChEが関与する疾患、例えばアルツハイマー病等の診断や新薬候補化合物のスクリーニングに非常に重要である。特に、AChE阻害薬は、近年アルツハイマー病治療薬として注目を集めており、本発明のスルホン酸エステル化合物は、上記の試験結果によればAChE阻害薬のスクリーニングに大いに役立つことが期待できる。
【０１２５】
［４．チオリン酸基応答型プローブとしての活用］
さらに、チオール（−ＳＨ基が炭素原子に結合した化合物）以外のメルカプト化合物に対する蛍光プローブとしての、本発明のスルホン酸エステル化合物の可能性を検討した。より具体的には、化合物5a、6a、7および8a〜8cが、アデノシン5'-[γ-チオ]三リン酸(adenosine 5'-[γ-thio]triphosphate, γ-S-ATP) やアデノシン一チオリン酸(adenosine monothiophosphate, S-AMP) が有するいわゆるチオリン酸基中のチオール基に対しても応答することを明らかにした。化合物8a〜8cおよびγ-S-ATP を用いた試験結果について以下に述べる。
【０１２６】
【化２５】
2005047891.tif 000019
【０１２７】
8aの溶液(20 μM, 200 μL) および様々な濃度の γ-S-ATP の溶液 (いずれもpH 7.4のイミダゾール緩衝液に溶かした溶液) を 96-穴マイクロプレートの各ウェルに加え、37°C で 180 分間反応を行なった後、各ウェルについて蛍光応答を測定した。測定は、λex（励起波長）= 483 nmおよび λem（放射波長）= 515 nmで行なった。図８にその結果を示す。図示の通り、反応後に観察された応答は、γ-S-ATP 濃度に対して良好な依存性を示した。また、検出限界は 5 pmolと、8aがγ-S-ATPに対して高感度であることを示した。また、8b および 8c において同様に試験を行なったところ、8aよりもさらに高感度にγ-S-ATP を検出できることも明らかになった。
【０１２８】
このように、チオリン酸基に対し8a〜8c が応答を示したことから、これらの化合物をメルカプト化合物応答型蛍光プローブを用いることにより、下記スキーム１１および１２に示す概念に基づいてキナーゼアッセイが構築できると期待される。実際に8aを用い、チオリン酸基の導入程度が異なるチオリン酸化タンパク質（シスメックス株式会社から提供）に対する蛍光応答を測定したところ、導入程度に応じた蛍光応答が得られた。
【０１２９】
【化２６】
2005047891.tif 000020
【０１３０】
上記スキーム１１および１２についてより具体的に説明すると以下の通りである。キナーゼは ATP 存在下タンパク質のチロシン残基等の水酸基をリン酸化する酵素であるが、ATP の代わりに γ-S-ATP を用いて本酵素反応を行なうとチオリン酸化されたタンパク質が生成する。このチオリン酸化タンパク質をチオール応答型蛍光プローブで検出すればキナーゼアッセイがおこなえる。このキナーゼアッセイを臨床診断に使用する時の実際の方法としては、例えば下記（１）および（２）の二通りが考えられる。
【０１３１】
（１）キナーゼの特異的基質を固定化したマイクロプレートを用いる方法は、例えば下記(i)〜(v)の操作を順番に行なうことで実施できる。
(i)試料（血液または組織）からの分析対象キナーゼの抗体を用いた分離、すなわち免疫沈降(immunoprecipitation)
(ii)分離したキナーゼおよびγ-S-ATP による固定化基質のチオリン酸化、すなわちキナーゼによる酵素反応(enzyme reaction with kinase)
(iii)添加物の洗浄除去(wash-out)
(iv)チオリン酸基応答型プローブとの反応による発蛍光(fluorescing process)
(v)蛍光プレートリーダーによる検出(detection) 
（２）キナーゼの特異的基質をブロッティングする方法は、例えば下記(i)〜(v)の操作を順番に行なうことで実施できる。
(i)試料（血液または組織）からの分析対象キナーゼの抗体を用いた分離、すなわち免疫沈降(immunoprecipitation)
(ii)分離したキナーゼおよびγ-S-ATP による基質のチオリン酸化、すなわちキナーゼによる酵素反応(enzyme reaction with kinase)
(iii)チオリン酸化された基質の分離とそのメンブレン(膜)上へのブロッティング(separation and blotting on a membrane)
(iv)チオリン酸基応答型プローブとの反応による発蛍光(fluorescing process)
(v)蛍光イメージアナライザーによる検出(detection) 
上記（１）または（２）の方法によれば、特異的な抗体ならびに基質を用いることにより、様々な生命現象（細胞の分化、分裂および増殖、ならびに周期）に関する数多くのキナーゼの中から、ある特定のキナーゼを特異的に検出できると考えられる。従って、チオリン酸基応答型プローブは、キナーゼ活性量を測定するための研究用試薬としてだけでなく、癌診断等の臨床への応用も期待される。
【０１３２】
以上説明した通り、本実施例の結果から、本発明のアセチルAChE アッセイおよびキナーゼアッセイでは、環境に影響を及ぼす放射性同位体ラベルを用いることなく、簡便な測定が行なえることが分かった。具体的には、AChE アッセイでは、酵素反応と発蛍光反応を同時に行なうこともでき、キナーゼアッセイでは、酵素反応の後発蛍光反応を行なうという簡単な操作で測定することも可能であり、試薬として酵素基質とプローブのみを用いて測定することもできた。さらに、本発明のメルカプト化合物検出用蛍光プローブを用いる測定方法の検出感度は、前述の実施例の結果から、化学発光のそれに匹敵し得ると考えられる。
【０１３３】
さらに、本発明のメルカプト化合物検出用プローブを用いたその他の酵素活性測定法も、酵素反応によりそれらの酵素基質からチオールが生成するように分子設計することで、簡単に構築できる。例えば下記スキーム１３のようにである。このような利点を考慮すると、メルカプト化合物応答型蛍光プローブは、様々な酵素アッセイキットの構築に適した多様な機能を持つ試薬として期待できる。
【０１３４】
【化２７】
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【産業上の利用可能性】
【０１３５】
以上説明した通り、本発明のスルホン酸エステル化合物は、スーパーオキサイドに対して高選択的に応答する蛍光プローブの用途に適する。蛍光プローブは、現在の細胞生理学研究において重要な試薬であり、さらに、蛍光顕微鏡を用いる画像解析システムやフローサイトメトリー（セルソーター）における最近のハードおよびソフト面の著しい発展を考慮すると、今後益々蛍光プローブの市場は広がると考えられる。本発明は、例えばバイオイメージングや臨床分析等に適し、活性酸素種やアセチルコリンエステラーゼと関連のある疾患に対する新しい治療法や創薬シーズを開発するために良好に用いることができる。特に、メルカプト化合物検出用プローブは、アセチルコリンエステラーゼ活性の検出やカイネースアッセイへの利用を通じて、アルツハイマー病や癌等の治療薬のスクリーニング等に役立つことが期待できる。さらに、本発明のスルホン酸エステル化合物の用途は蛍光プローブに限定されず、あらゆる用途に使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】化合物1dのスーパーオキサイド検出性能を示すグラフである。
【図２】化合物1dを細胞系に応用した試験結果を示すグラフである。
【図３】化合物1dを細胞系に応用した試験結果を示すその他のグラフである。
【図４】化合物5a、7、6a、8aおよび1dのそれぞれについて、スーパーオキサイドまたはグルタチオンに対する特異性を示すグラフである。
【図５】グルタチオンおよびシステインに対する蛍光応答を示すグラフであり、図５（ａ）は化合物6aについての、図５（ｂ）は化合物8aについての測定結果を示す。
【図６】アセチルコリンエステラーゼ活性と化合物8aの蛍光応答との関係を示すグラフである。
【図７】化合物8aによるネオスチグミンおよびピリドスチグミンのアセチルコリンエステラーゼ阻害活性測定結果を示すグラフである。
【図８】化合物8aのγ-S-ATPに対する蛍光応答を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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