(57)【要約】      （修正有）【課題】  本発明の目的は、上記のような課題を解決して、アルコール脱水素酵素の遺伝子多型を明確にかつ再現性よく検出することができる方法及びそのための試薬を提供することである。【解決手段】  アルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列を検出する方法においてアルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な特定の配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも一つを用いて増幅を行うことを特徴とするアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列を検出する方法においてアルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも一つを用いて増幅を行うことを特徴とするアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。
【請求項２】
アルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−３に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも一つを、野生型および変異型の共通プライマーとして用いることを特徴とする請求項１に記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。
【請求項３】
アルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列を検出する方法においてアルコール脱水素酵素遺伝子にハイブリダイズすることが可能な配列番号４−７に示されるオリゴヌクレオチドの３‘末端が標的遺伝子と相補的であり、３‘末端から２番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応するように設計されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１または２に記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。
【請求項４】
請求項１に記載のアルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列を検出する方法において、用いられるプライマーがアルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも２つの組み合わせであることを特徴とするアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。
【請求項５】
増幅反応がＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドが予め標識されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。
【請求項７】
核酸特異標識により検出することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。
【請求項８】
アルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列を検出する方法においてアルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも１つを用いて増幅を行うことを特徴とするアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。
【請求項９】
アルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−３に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも一つを、野生型および変異型の共通プライマーとして用いて増幅を行うことを特徴とする請求項８記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。
【請求項１０】
アルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列を検出する方法においてアルコール脱水素酵素遺伝子にハイブリダイズすることが可能な配列番号４−７に示されるオリゴヌクレオチドの３‘末端が標的遺伝子と相補的であり、３‘末端から２番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応するように設計されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項８または９に記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。
【請求項１１】
請求項８に記載のアルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列の検出キットにおいて、用いられるプライマーがアルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも２つの組み合わせであることを特徴とするアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。
【請求項１２】
増幅反応がＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする請求項８〜１１のいずれかに記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドが予め標識されていることを特徴とする請求項８〜１２のいずれかに記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。
【請求項１４】
核酸特異標識により検出することを特徴とする請求項８〜１３のいずれかに記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在する薬物代謝酵素遺伝子多型の中で特にアルコール脱水素酵素の遺伝子多型を検出する方法および試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明において、遺伝子多型とは野生型とは異なる塩基配列を有することをいう。遺伝子の塩基多型は薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において個体間変動の原因として重要な役割を果たし、体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知られている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マーカーとしての働きもする。それゆえ、これら突然変異の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとって特に推奨される（GramおよびBrsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg, 1990, 第８７〜９６頁; Balantら、 Eur. J. Clin. Pharmacol. 第３６巻、第５５１〜５５４頁、(1989)）。また、原因となる変異型遺伝子の同定に続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所望される。
【０００３】
アルコール脱水素酵素 (ADH)は体内に取りこまれたアルコールの分解に関与する酵素である。ADH2の47番目のアミノ酸を決定している塩基がCGCの配列をとるものはADH2*1、CACとなるとADH2*2と区別される。またコドン369がCGTとなるとADH2*1、TGTとなるとADH2*3遺伝子となる。日本人を含む東アジアにはADH2*2が多いとの報告があるが、逆にADH2*3は頻度が低いと報告されている。ADH2*2はアルデヒド産生能と関連が深く、47G/AのSNPを検出することは臨床上有用であると考えられている。
【０００４】
従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定することができるが、鋳型核酸の調製、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等、核酸配列の解析等を行うため多大な労力と時間を必要でする。また近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うことができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。
一方、遺伝子の点突然変異により引き起こされる遺伝病が種々知られており、それらの中には、遺伝子のどの部位がどのように点突然変異することにより遺伝病が引き起こされるかわかっているものも少なくない。
【０００５】
このような予想される点突然変異を検出する方法として、従来より、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（例えば、特許文献１、特許文献２参照）などの遺伝子増幅法を利用した遺伝子の点突然変異の検出方法が知られている。この方法では、遺伝子増幅法に用いる一対のオリゴヌクレオチドのうち、一方のオリゴヌクレオチドとして、野生型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な野生型用オリゴヌクレオチドと、変異型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な変異型用オリゴヌクレオチドとを用いる。変異型のオリゴヌクレオチドは、その３’末端が予想される点突然変異を起こしたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドになっている。このような野生型及び変異型用オリゴヌクレオチドをそれぞれ別個に用いて試料遺伝子を遺伝子増幅法に供する。
【０００６】
試料遺伝子が野生型であれば、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には核酸の増幅が起きるが、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には、オリゴヌクレオチドの３’末端が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミスマッチ）ので伸長反応が起きず、核酸の増幅は起きない。一方、試料遺伝子が変異型であれば、逆に、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には増幅が起きず、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きる。従って、各オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きるか否かを調べることにより、試料遺伝子が野生型か変異型かを判別することができ、それによって試料遺伝子中の点突然変異を同定することができる。この時増幅がおきたか否かを調べる方法として、増幅産物をアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイド等の核酸特異的結合蛍光試薬を用いて染色の後、ＵＶ照射して増幅核酸の有無を検出できる。またほかの様式として、ナイロン膜上に増幅核酸を固定し、標識プローブを用いて検出するサザンブロット法、個体担体上に固定した補足プローブで捕捉した後検出プローブを作用させて検出するサンドイッチハイブリダイゼーション法などが開発されてきた。
【０００７】
上記のような方法により増幅核酸を検出し、容易に多型を同定が行えるように思われるが、実際には、操作は煩雑であり、検出値を数値化することが困難である為に野生型シグナルと多型シグナルの比をとると言った解析が困難となり、正確な多型を同定するには多大な作業が必要であった。
【０００８】
たとえば電気泳動法によれば野生型及び変異型を別々に検出する必要がありまた泳動像から核酸量を正確に数値化することは困難である。またサザンブロット法やサンドイッチハイブリダイゼーション法ではプローブとのハイブリダイゼーション反応が必要であり、その条件を厳密に整える必要がある。更には過剰なプローブを除去する工程が必要であり、操作は非常に煩雑であることから、アルコール脱水素酵素の遺伝子多型を検出する場合、特殊な専用装置を使用することなく簡便、短時間に検出する方法は提案されていなかった。特に、プライマーを用いて増幅反応を行い、その増幅反応の有無を調べることで多型の同定を行う方法では、どの位置にハイブリダイズするプライマーを用いれはさせれば非特異的な反応を抑え、効果的に増幅反応させることができるかは解明されていなかった。
【０００９】
【特許文献１】特公平４−６７９６０号公報
【特許文献２】特公平４−６７９５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、上記のような課題を解決して、アルコール脱水素酵素の遺伝子多型を明確にかつ再現性よく検出することができる方法及びそのための試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、上記の従来法に対して、特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、野生型検出用オリゴヌクレオチド及びまたは１種又は２種の変異型検出用オリゴヌクレオチドを同時に又は別々に反応させた後、増幅された該オリゴヌクレオチドの量を測定することで、煩雑な検出操作を必要とせずまた容易に数値化したデータが得られ、したがって明確な多型同定が可能となる方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）  アルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列を検出する方法においてアルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも一つを用いて増幅を行うことを特徴とするアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。
【００１３】
（２）アルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−３に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも一つを、野生型および変異型の共通プライマーとして用いることを特徴とする上記（１）に記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。
【００１４】
（３）アルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列を検出する方法においてアルコール脱水素酵素遺伝子にハイブリダイズすることが可能な配列番号４−７に示されるオリゴヌクレオチドの３‘末端が標的遺伝子と相補的であり、３‘末端から２番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応するように設計されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）または（２）記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。
【００１５】
（４）上記（１）に記載のアルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列を検出する方法において、用いられるプライマーがアルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも２つの組み合わせであることを特徴とするアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。
【００１６】
（５）  増幅反応がＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。
【００１７】
（６）  オリゴヌクレオチドが予め標識されていることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。
【００１８】
（７）  核酸特異標識により検出することを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。
【００１９】
（８）  アルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列を検出する方法においてアルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも１つを用いて増幅を行うことを特徴とするアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。
【００２０】
（９）アルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−３に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも一つを、野生型および変異型の共通プライマーとして用いて増幅を行うことを特徴とする上記（８）記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。
【００２１】
（１０）アルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列を検出する方法においてアルコール脱水素酵素遺伝子にハイブリダイズすることが可能な配列番号４−７に示されるオリゴヌクレオチドの３‘末端が標的遺伝子と相補的であり、３‘末端から２番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応するように設計されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（８）または（９）記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。
【００２２】
（１１）上記（８）に記載のアルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列の検出キットにおいて、用いられるプライマーがアルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも２つの組み合わせであることを特徴とするアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。
【００２３】
（１２）増幅反応がＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする上記（８）〜（１１）のいずれかに記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。
【００２４】
（１３）  オリゴヌクレオチドが予め標識されていることを特徴とする上記（８）〜（１２）のいずれかに記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。
【００２５】
（１４）  核酸特異標識により検出することを特徴とする上記（８）〜（１３）のいずれかに記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、試料核酸中の遺伝子多型を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、これまでの方法のように煩雑な操作を必要とせ  ず、遺伝子多型を迅速かつ容易に判定することができる。また、本発明の方法は非特異的な反応を抑え、効果的に増幅反応させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明する。試料中に含まれる遺伝子多型部位を含む染色体又はその断片は、目的の遺伝子の情報を担う遺伝子多型部位を含む標的核酸であれば、特に制限されない。該標的核酸の例としては、Ａｌｕ配列、蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。
【００２８】
本発明において、核酸配列を単に核酸ということがある。変異箇所とは、野生型核酸のうち少なくとも１つ、好ましくは１つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレオチドに置換されているものや、野生型核酸の一部に挿入、欠失配列等を含む核酸のことであり、どの部位のヌクレオチドが変異しているかが解明されているものである。例えば、このような遺伝子多型が生じることにより薬物代謝酵素の代謝活性が異なっていることが解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸がこのような予想される変異を有しているか否かを検査し、被験者の有する遺伝子のタイプを検出する方法である。
【００２９】
本発明は、アルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列を検出する方法においてアルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−１０に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーを用いて増幅を行うことを特徴とする。
【００３０】
本発明が適応できる遺伝子の変異箇所の配列を検出する方法としては、配列番号１−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーを用いて増幅反応を行う方法であれば特に制限なく用いることができるが、例としては、アレル特異的オリゴマーを用いる方法、Ｔａｑ  Ｍａｎ  ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法等があげられるが、これらの代表として説明する以下の方法が好ましい。
【００３１】
なお、本発明において、「ハイブリダイズ可能なプライマー」の「ハイブリダイズ可能な」の意味は、各検出方法で用いるプライマーがその検出方法に適正な条件下で、増幅反応が進行する程度にハイブリダイズしていること、もしくはＴａｑ  Ｍａｎ  ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法等で停止側のプライマーとして用いる場合には実用上停止できる程度にハイブリダイズしていることである。
【００３２】
また、当該プライマーは配列番号１−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能であればよく、実際の検出において、配列番号１−７に示される配列を越えた部分までハイブリダイズしていてもよく、また、プライマー末端等がハイブリダイズせずに浮き上がっていてもよい。
【００３３】
アルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号4−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーは、野生型配列および変異型配列を区別するために用いられることが好ましい。
【００３４】
配列番号４−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーは、アルコール脱水素酵素遺伝子の塩基多型（４７  G→A）配列を区別するために好ましく用いられる。
【００３５】
なお、これらの野生型配列および変異型配列を区別するために用いられるプライマーは、塩基多型部分を含むことが好ましい。
【００３６】
本発明を達成するには、検出のための重要な要素であるオリゴヌクレオチドの遺伝子多型部位近辺が、野生型検出用オリゴヌクレオチドの場合は変異型配列と、変異型検出用オリゴヌクレオチドの場合は野生型配列と２本鎖を形成することなく明確に解離しするような、野生型検出用および変異型検出用オリゴヌクレオチドを選択することが好ましい。このように明確に解離させることにより、伸長反応やハイブリダイズの有無などといった相補的なオリゴヌクレオチドと相補的でないオリゴヌクレオチドとの差異が生じる条件の範囲が広くなり、本発明を達成するのに好適である。
【００３７】
本発明で用いられるこのようなプライマーは、配列番号４〜７に挙げたプライマーの例のように、対象となる配列に完全に相補的であることも好ましいが、変異箇所以外に少なくとも１箇所の人為的ミスマッチを有する野生型検出用及び変異型検出用オリゴヌクレオチドであることが好ましい。変異箇所以外の人為的ミスマッチ部位としては、変異箇所から５塩基以内が好ましく、さらに好ましくは４塩基以内、特に好ましくは３塩基以内である。最も好ましくは２塩基以内である。
【００３８】
また、PCRを実施するために必要なプライマーの組み合わせは配列番号1-7で示されるプライマー中から選択することができる。PCRが効果的に実施可能となるように選択されたプライマーペアのオリゴヌクレオチドの融解温度Tm(melting temperature)は５０℃から８０℃の範囲が好ましく、更に好ましくは５５℃から７５℃、より好ましくは６０℃から６８℃である。更に選択したプライマー間のTｍ差が少なくなるよう考慮されたプライマーペアであることが好ましい。Tm差としては１０℃以内が好ましく、更に好ましくは５℃以内、特に好ましくは３℃以内である。
【００３９】
また、人為的ミスマッチの数としては５個以下が好ましく、より好ましくは３個以下、さらに好ましくは２個以下、特に好ましくは１個以下である。具体的な例としては、実施例で用いたオリゴ4-7に記載したプライマーが挙げられる。
【００４０】
なお、プライマーはこれら人為的ミスマッチが存在したりする場合であっても、対象となる配列番号４−７に示される配列またはこれに相補的な塩基配列部分に特異的にハイブリダイズする必要があることは言うまでもない
【００４１】
従来では変異箇所のみで差を出していたために２本鎖の形成の有無が明確でない場合があったが、オリゴヌクレオチドとしてこのような構成を採ることで変異箇所と他のミスマッチ部の２箇所で２本鎖形成を妨げることになり、複数箇所の変異部位を同一の条件で検出することが容易に出来るようになる。
【００４２】
このようなオリゴヌクレオチドの例としては、野生型検出用及び変異型検出用オリゴヌクレオチドを増幅のフォワード側プライマーとして用いる場合、好ましくは、野生型検出用及び変異型検出用オリゴヌクレオチドの３‘末端から２番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応するように設計されたオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、野生型検出用及び変異型検出用オリゴヌクレオチドの３‘末端から２番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応し、かつ野生型及び変異型両方に相補的でない塩基を３’末端から３〜７番目の少なくとも１箇所、（特に好ましくは３番目）に有するよう設計されたオリゴヌクレオチドである。
【００４３】
このように設計した場合野生型用オリゴヌクレオチド／野生型核酸及び変異型用オリゴヌクレオチド／変異型核酸の組合せにおいて、各オリゴヌクレオチドは少なくとも３’  末端から２番目の配列までは一致する為伸長反応は起こる。一方、野生型用オリゴヌクレオチド／変異型核酸及び変異型用オリゴヌクレオチド／野生型核酸の組合せにおいてはオリゴヌクレオチドの３’末端もしくは３‘末端より２番目の塩基、さらにもう１塩基の人為的ミスマッチがあるため伸長反応が起こらない。
【００４４】
また、アルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−３に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーは野生型および変異型の共通プライマーとして用いることが好ましい。このようなプライマーを用いることによって、野生型と変異型を検出する際に野生型および変異型に特異的なプライマー以外を共通化できるため、配合間違い等がなく、また、容易に測定を行うことができる。なお、このプライマーはハイブリダイズする範囲であればミスマッチがあってもよいが、ミスマッチがないことが最も好ましい。
【００４５】
なお、アルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーは少なくとも１つを用いればよいが、さらに好ましくは、２つ以上の組み合わせで用いられる。
【００４６】
組み合わせとしては、配列番号１−３に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも１つと、配列番号４−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも１つの組み合わせであることが好ましい。
【００４７】
本発明におけるオリゴヌクレオチドの長さとしては、下限は好ましくは１５塩基，より好ましくは１６塩基、さらに好ましくは１７塩基、特に好ましくは１８塩基であり、上限は好ましくは５０、より好ましくは３５塩基、さらに好ましくは３０塩基である。また、本発明におけるオリゴヌクレオチドは人為的ミスマッチが存在してもよく、その場合は該オリゴヌクレオチド中に少なくとも１つ存在することが好ましい。また、その位置は、３’末端の３番目から５’末端までのいずれかであれば、特に限定されないが、好ましくは、３’末端の３番目に近い位置、より好ましくは、３’末端から３番目が好ましい。
３番目に人為的ミスマッチを用いた場合、伸長反応を期待しない核酸配列を鋳型とした時には、塩基多型部位と併せて２塩基のミスマッチとなり、伸長反応が強く阻害される。
【００４８】
なお、上記にはフォワード側プライマーに用い、伸長反応開始点の３’末端部を明確に解離させる例を示したが、リバース側プライマーとして用いる場合も同様に明確に解離させたりすることもできる。さらには、前述の思想を基に、相補的でないプライマー自身をハイブリダイズさせにくくしたりすることも可能である。
【００４９】
本発明においては、上記野生型用オリゴヌクレオチドと変異型検出用オリゴヌクレオチドを、試料に別々、又は同時に作用させる。
本発明において、オリゴヌクレオチドの伸長方法は、基本的には、従来の方法を用いて行うことができる。通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼと共に、野生型検出用オリゴヌクレオチドと、１種又は２種の変異型検出用オリゴヌクレオチドを同時又はそれぞれ別個に用いて作用させることで、標的核酸を鋳型としてオリゴヌクレオチドが伸長する。
【００５０】
該伸長反応は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrookら、1989)に記載の方法に従って行うことができる。本発明において、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片の増幅方法も、基本的には、従来の方法を用いて行うことができ、例えば、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼ及びリバースプライマーと共に、野生型検出用オリゴヌクレオチドと、１種又は２種の変異型検出用オリゴヌクレオチド（フォーワードプライマーに相当）を同時又はそれぞれ別個に用いて作用させることで、標的核酸を鋳型としてファワードオリゴヌクレオチドとリバースオリゴヌクレオチドの間で増幅される。
【００５１】
核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based amplification method；Ｎａｔｕｒｅ  第３５０巻、第９１頁(1991)）、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：Nucleic acid research  第２０巻、第１６９１頁(1992)）、ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification method；J.Clin.Microbiol.  第３１巻、第３２７０頁(1993)）などが挙げられる。
【００５２】
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各オリゴヌクレオチドを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２ｎ倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。
【００５３】
上記のような核酸増幅法を利用した方法では、野生型核酸を増幅できる野生型検出用オリゴヌクレオチドと、変異型核酸を増幅できる変異型検出用オリゴヌクレオチドをそれぞれ別個又は同時に用いて遺伝子増幅法を行う。
【００５４】
野生型検出用オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が野生型であれば反応が起きるが、変異型では反応が起きない。逆に、変異型検出用オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が変異型であれば反応が起きるが、野生型であれば反応は起こらない。従って、一つの試料を二つに分け、一方は野生型検出用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、他方は変異型検出用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、反応が起ったか否かを調べることにより、試料核酸が野生型であるか変異型であるかを明確に知ることができる。
【００５５】
また、一つの試料に野生型検出用オリゴヌクレオチド及び変異型検出用オリゴヌクレオチドの両方を用いて反応を行い、どちらのオリゴヌクレオチドで反応が起こったかを調べることにより、試料核酸が野生型であるか変異型であるかを明確に知ることもできる。
【００５６】
特に、ヒトを始め、高等生物は、１種類の遺伝子について、父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子をそれぞれ１つずつ有しているが、この方法によれば、試料遺伝子が野生型のホモか、変異型のホモか、あるいは、両方のヘテロかを区別することもできる。すなわち、ヘテロの場合には、野生型遺伝子と変異型遺伝子が共に存在するから野生型検出用オリゴヌクレオチドを用いた場合も変異型検出用オリゴヌクレオチドを用いた場合も反応が起きる。
【００５７】
また、オリゴヌクレオチドが反応したか否かを検出する方法とは、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片を含む核酸試料に、一定量の野生型検出用オリゴヌクレオチドと及び１種又は２種の変異型検出用オリゴヌクレオチド（フォーワードプライマーに相当）を同時にまたはそれぞれ別々に用いて反応を行った後、核酸特異標識、特に２本鎖核酸特異的結合物質と反応させることによって前記増幅反応により生じたオリゴヌクレオチド量を検出できる。
【００５８】
核酸特異標識を用いる場合は、電気泳動等の後処理を行うこともなくフォワードプライマーのタイプにより伸長反応が起こったか否かによってのみ判断するため、標識したオリゴヌクレオチドを用いる必要がなく、コスト面で有利であるにもかかわらず、未だ同一条件で伸長反応を行うことは困難であると考えられていたが、例えば上述のプライマーを用いることで同一条件で伸長反応を行うことが可能となった。
【００５９】
上記検出方法としては、標識したオリゴヌクレオチドを用いることも可能である。
例えば、該検出は、該各オリゴヌクレオチドを、予め酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識しておき、伸長又は増幅反応後に、反応したオリゴヌクレオチドの標識を検出することによって、遺伝子多型の検出を行うことができる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが挙げられる。２本鎖核酸特異的結合物質としては、エチレンブロマイド、SYBR Green Iなどが挙げられる。ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。放射性物質としては、３２Ｐ、３５Ｓなどが挙げられる。
発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。該標識は、オリゴヌクレオチドの伸長反応に影響を与えることがなければオリゴヌクレオチドのどの位置に結合させてもよい。フォワード側プライマーとして用いる場合は、好ましくは、５’ 部位である。
本鎖核酸特異的結合物質として、SYBR Green Iを使用する場合、増幅産物の長さによりシグナル強度を増大させることが可能である。SYBR Green Iを使用した場合の増幅産物長は100bp以上が好ましく、更に好ましくは200bp以上である。但しシグナルとノイズとの比（S/N）が十分得られるプライマーの組み合わせであればその限りではない。
【００６０】
野生型検出用オリゴヌクレオチドと変異型検出用オリゴヌクレオチドに異なる標識を用いた場合には、一つの試料に野生型検出用オリゴヌクレオチドと変異型検出用オリゴヌクレオチドの両方を添加して、１つの反応槽で検出ができる。
【００６１】
本発明で増幅を行う際には、溶液としては、その増幅方法に合った反応液を用いる。この反応液は、公知のものを用いることができる。
【００６２】
例えば、ＰＣＲ法であれば、オリゴヌクレオチド及び試料以外では、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、緩衝液、MgCl2、MgSO4等の各種塩類等が添加された溶液である。本発明の操作の簡便性、人為的ミスを少なくするためには、オリゴヌクレオチド以外の反応液は予め所定の濃度に調製されたものを用いることが好ましく、さらに、試料の濃度も同じにすることが好ましいが、本発明の、同一の増幅条件で少なくとも２箇所の異なった変異箇所の配列を検出するためには、塩類等の濃度を適宜変えることもできる。
【００６３】
反応液の調整の方法としては、具体的には、試料に対して、野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび変異型検出用オリゴヌクレオチドの両方ともが増幅してしまう場合には、オリゴヌクレオチド、塩類、ＤＮＡポリメラーゼ、等の濃度を下げることが好ましい。また、増幅すべきでない方の濃度のみ下げることも好ましい。
逆に、野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび変異型検出用オリゴヌクレオチドの両方とも増幅が認められない場合には、オリゴヌクレオチド、塩類、ＤＮＡポリメラーゼ、等の濃度を上げることが好ましい。また、増幅すべき方の濃度のみ上げることも好ましい。
なお、緩衝液、ｄＮＴＰの濃度は、野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび変異型検出用オリゴヌクレオチドや対象の変異箇所にかかわらず、同一であることが好ましい。
【００６４】
これらの反応液としては、反応液２５μｌあたり、オリゴヌクレオチドが0.5〜50pmol、×１０の緩衝液が0.5〜50μｌ、２ｍＭのｄＮＴＰで0.5〜50μｌ、塩類が25mM濃度液で0.1〜30μｌ、ＤＮＡポリメラーゼが0.1〜30ｎｇ程度であることが好ましい。
【００６５】
本発明では、少なくとも２箇所以上の異なった変異箇所を対象とした増幅反応を、温度および時間サイクルが同一の条件下で行う。
これまで知られているオリゴヌクレオチドを用いて変異箇所を検出する方法では、各変異箇所の周辺の塩基配列は全く同じではないため、異なった条件で増幅反応を行うことが必要である他、標的核酸部位を特異的に増幅させるために、増幅産物の塩基数は各変異箇所に応じて異なっていたため、複数の変異箇所を同じ温度及び時間サイクル条件では増幅が行えないと考えられていた。本発明では、各変異箇所に特異的なオリゴヌクレオチドを用いること、および反応液を適宜調整することによって従来の課題を克服し、本発明を完成するに至った。
【００６６】
増幅反応としては、最初の熱変形工程が80〜100℃で1〜15分、繰り返しの熱変形工程が80〜100℃で2〜300秒、アニーリンクが40〜80℃で2〜300秒、伸長反応工程が60〜85℃で2〜300秒程度行い、この繰り返しを20〜50回繰り返しすことが好ましい。
【００６７】
本発明の方法により、従来は変異箇所個々に変異型を調べ、そのデータを総合して遺伝子多型を判断・検出していたが、複数箇所の変異型を同時に調べることができるため、遺伝子多型の検出が短時間で済む上、条件設定の複雑さが解消されたため、単純な設定ミスなどの人的ミスを減らすことができる。
【００６８】
キット
本発明において、キットとしては、野生型検出用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型検出用オリゴヌクレオチド、リバースオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む遺伝子多型検出用試薬キットを含むものである。
また、該各オリゴヌクレオチドは、予め上述したような酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識されていてもよい。
【００６９】
また、キットとしては、複数の変異箇所に対応するそれぞれの野生型検出用オリゴヌクレオチド及び／又は変異型検出用オリゴヌクレオチド、リバースプライマーを一つのセットとしてパッケージされていることが好ましい。
キットとしては、反応容器内にそれぞれの野生型検出用オリゴヌクレオチド及び／又は変異型検出用オリゴヌクレオチド、リバースプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、塩類など、試料以外の増幅に必要なものがすべて溶解された状態か、もしくは一定量の水を加えるのみで後は試料を加えるだけの反応液となる状態であることが好ましい。
また、キットのオリゴヌクレオチドの種類以外は同じ組成、含有量であることが好ましいが、本発明の、同一の増幅条件で少なくとも２箇所の異なった変異箇所の配列を検出するためには、塩類等の濃度を前述のように適宜変えることもできる。
【実施例】
【００７０】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００７１】
実施例１  アルコール脱水素酵素(ADH2  47)遺伝子多型の検出
（１）アルコール脱水素酵素遺伝子の多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号1〜７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ1〜７）と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、（株）サワディー、ＧＥＮＳＥＴ KK、アマシャムファルマシア  バイオテク（株）等）に依頼した。
（  ）内はTm値を示す。なお、TmはFreier S. M .et al., PNAS 83巻 (1986年)  9373-9377頁及びRychlick W., et al, NAR 18巻, (1990年) No. 21, 6409-6412頁の文献を参考にし、オリゴマーの長さを考慮した若干の改良を加えて算出した。なお、隣接エンタルピーの変化量および隣接エントロピーの変化量に関する値は、PNAS  83巻  (1986年)  3746-3750頁及び各社より公開されている値に従った。
【００７２】
オリゴ１  5’-GGT AGA GAA GGG CTT TAG ACT GA-3’  （63.58）
オリゴ２  5’-GTT TAT TCA TCC GTA GCC ATG T -3’    （63.15）
オリゴ３  5’-GGG AAA TCC TGG ATG GTG AAC -3’      （67.12）
オリゴ４  5’-AAC CAC GTG GTC ATC TGT ACG -3’      （64.43）
オリゴ５  5’-AAC CAC GTG GTC ATC TGT TTG -3’      （64.36）
オリゴ６  5’-TGG CTG TAG GAA TCT GTT GC -3’        （62.59）
オリゴ７  5’-GGT GGC TGT AGG AAT CTG TAA C -3’      （62.40）
【００７３】
オリゴ１から３はADH2遺伝子の47番目の多型を検出するためのものである。これらのオリゴは野生型、変異型何れも増幅することが可能なオリゴである。なお、すべてのオリゴは必要により標識して使用される。
【００７４】
オリゴ４から７はADH2遺伝子の47番目の多型を検出するためのものである。
オリゴ4および６は野生型(G)を検出するためのオリゴヌクレオチドで3’末端から2番目に野生型(G)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチを有し、オリゴ５と７は変異型(A)を検出するためのオリゴヌクレオチドで3’末端から2番目に変異型(A)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチを有し、オリゴ４，５がアンチセンス鎖であり、オリゴ１と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。また,オリゴ６，７がセンス鎖でありオリゴ２，３と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、すべてのオリゴは必要により標識して使用される。
【００７５】
また、本実施例での、オリゴ４から７の各オリゴヌクレオチドは３’末端から３番目に人為的ミスマッチを導入したが、前述のように、３〜７番目の範囲であっても良いし、さらにはこれ以外に数カ所（１〜５箇所程度でプライマーの全体長による（特に５’末端））のミスマッチが導入されていても良い。
さらに、オリゴ1-３の各オリゴヌクレオチドは伸長反応の有無を検出するのに適当な長さ等を基準に決めたものであって、対象となる遺伝子の適当な部分に対応するものであれば、本実施例の配列に限定されるものではない。
【００７６】
（２）ＰＣＲ法によるアルコール脱水素酵素の47遺伝子多型の解析
＜１＞ＰＣＲ法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりADH2遺伝子多型を解析した。
【００７７】
試薬
以下の試薬を含む25μｌ溶液を6種類調製した。
Taq DNAポリメラーゼ反応液ａ
オリゴ１                              5 pmol
オリゴ４                              5 pmol
×10緩衝液                           2.5 μl
2mM dNTP                              2.5 μl
25 mM  MgCl２                          2.5 μl
Taq DNAポリメラーゼ                   1.3 Ｕ
抽出DNA溶液                           20 ng
【００７８】
Taq DNAポリメラーゼ反応液ｂ
オリゴ１                              5 pmol
オリゴ５                              5 pmol
×10緩衝液                           2.5 μl
2mM dNTP                              2.5 μl
25 mM  MgCl２                          3.5μl
Taq DNAポリメラーゼ                   1.3 Ｕ
抽出DNA溶液                           20 ng
【００７９】
Taq DNAポリメラーゼ反応液ｃ
オリゴ２                              5 pmol
オリゴ6                              5 pmol
×10緩衝液                           2.5 μl
2mM dNTP                              2.5 μl
25 mM  MgCl２                          4.5 μl
Taq DNAポリメラーゼ                   1.3 Ｕ
抽出DNA溶液                           20 ng
【００８０】
Taq DNAポリメラーゼ反応液ｄ
オリゴ２                              5 pmol
オリゴ7                              5 pmol
×10緩衝液                           2.5 μl
2mM dNTP                              2.5 μl
25 mM  MgCl２                          4.5μl
Taq DNAポリメラーゼ                   1.3 Ｕ
抽出DNA溶液                           20 ng
【００８１】
Taq DNAポリメラーゼ反応液e
オリゴ3                              5 pmol
オリゴ6                              5 pmol
×10緩衝液                           2.5 μl
2mM dNTP                              2.5 μl
25 mM  MgCl２                          3.5 μl
Taq DNAポリメラーゼ                   1.3 Ｕ
抽出DNA溶液                           20 ng
【００８２】
Taq DNAポリメラーゼ反応液f
オリゴ3                              5 pmol
オリゴ7                              5 pmol
×10緩衝液                           2.5 μl
2mM dNTP                              2.5 μl
25 mM  MgCl２                          3.5μl
Taq DNAポリメラーゼ                   1.3 Ｕ
抽出DNA溶液                           20 ng
【００８３】
増幅条件（ａおよびｂ）
95℃・5分
95℃・30秒、67.5℃・30秒、72℃、30秒（35サイクル）
72℃・2分。
【００８４】
増幅条件（ｃおよびｄ）
95℃・5分
95℃・30秒、67.5℃・30秒、72℃、30秒（35サイクル）
72℃・2分。
【００８５】
増幅条件（eおよびf）
95℃・5分
95℃・30秒、67.5℃・30秒、72℃、30秒（35サイクル）
72℃・2分。
【００８６】
＜２＞ポリアクリルアミドゲル電気泳動による検出
＜１＞のａ，ｂそれぞれの増幅反応液５μｌを5％ポリアクリルアミドゲルにアプライしＡＴＴＯ社電気泳動装置で１５０Ｖ-３０分間電気泳動を行った。結果は図１に示す。
【００８７】
＜３＞核酸特異的結合物質による検出
＜１＞のａ，ｂそれぞれの増幅反応液3μｌを30000倍に希釈されたSyberGreenI（Molecular Probe製）の溶液100μlに加えて、室温にて攪拌後に暗室中で蛍光プレートリーダー（大日本製薬社）で蛍光強度量を測定した。所要時間は約10分であった。
得られた蛍光強度から、以下の計算式を用いて試料の蛍光強度量を算出した。
FL（試料の蛍光強度）＝FLs-FLb      （式１）
FLｂ：Negative Control （試料が未添加）の蛍光強度
FLｓ：各試料の蛍光強度
【００８８】
【表１】
2005245272.tif 000002
【００８９】
＜１＞のｃ，ｄそれぞれの増幅反応液3μｌを上記ａ，ｂと同様の条件で蛍光プレートリーダー（大日本製薬社）で蛍光強度量を測定した。
【００９０】
【表２】
2005245272.tif 000003
【００９１】
＜１＞のｅ，ｆそれぞれの増幅反応液3μｌを上記ａ，ｂと同様の条件で蛍光プレートリーダー（大日本製薬社）で蛍光強度量を測定した。
【００９２】
【表３】
2005245272.tif 000004
【００９３】
実施例２  アルコール脱水素酵素(ADH2  47)遺伝子多型の多検体測定
（１）ＰＣＲ法によるアルコール脱水素酵素の47遺伝子多型の解析
＜１＞ＰＣＲ法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりADH2遺伝子多型を解析した。なお、オリゴ1,3,4は実施例１と同様のオリゴを使用した。
【００９４】
試薬
以下の試薬を含む25μｌ溶液を2種類調製した。
Taq DNAポリメラーゼ反応液ａ
オリゴ１                              5 pmol
オリゴ4                              5 pmol
×10緩衝液                           2.5 μl
2mM dNTP                              2.5 μl
25 mM  MgCl２                          2.5 μl
Taq DNAポリメラーゼ                   1.3 Ｕ
抽出DNA溶液                           20 ng
【００９５】
Taq DNAポリメラーゼ反応液ｂ
オリゴ１                              5 pmol
オリゴ5                              5 pmol
×10緩衝液                           2.5 μl
2mM dNTP                              2.5 μl
25 mM  MgCl２                          3.5μl
Taq DNAポリメラーゼ                   1.3 Ｕ
抽出DNA溶液                           20 ng
【００９６】
増幅条件
95℃・5分
95℃・30秒、67.5℃・30秒、72℃、30秒（35サイクル）
72℃・2分。
【００９７】
＜２＞ 核酸特異的結合物質による検出
＜１＞のそれぞれの増幅反応液3μｌを30000倍に希釈されたSyberGreenI（Molecular Probe製）の溶液100μlに加えて、室温にて攪拌後に暗室中で蛍光プレートリーダー（大日本製薬社）で蛍光強度量を測定した。所要時間は約10分であった。
得られた蛍光強度から、以下の計算式を用いて試料の蛍光強度量を算出した。
FL（試料の蛍光強度）＝FLs-FLb      （式１）
FLｂ：Negative Control （試料が未添加）の蛍光強度
FLｓ：各試料の蛍光強度
【００９８】
【表４】
2005245272.tif 000005
【００９９】
上記のように、オリゴヌクレオチドを用いて、塩基多型特異的増幅反応を行い、増幅反応物質を核酸特異的結合物質を用いて測定することで、容易にかつ迅速に遺伝子型を明確に判定することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
上述したように、本発明により、試料核酸中の遺伝子多型を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、これまでの方法のように煩雑な操作を必要とせ  ず、遺伝子多型を迅速かつ容易に判定することができる。また、本発明の方法は非特異的な反応を抑え、効果的に増幅反応させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】実施例１の増幅反応液のポリアクリルアミドゲル電気泳動結果。
【図１】
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【配列表】
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