(57)【要約】【課題】新たな手法により活性酸素ストレス耐性、低温ストレス耐性、塩ストレス耐性などのストレス耐性が向上した植物及びかかる植物の製造方法を提供する。【解決手段】真核藻類由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子が導入され、かつ前記遺伝子が発現していることを特徴とするストレス耐性が向上した植物。真核藻類由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列で植物を形質転換する工程を含むことを特徴とするストレス耐性が向上した植物の製造方法。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核藻類由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子が導入され、かつ前記遺伝子が発現していることを特徴とするストレス耐性が向上した植物。
【請求項２】
真核藻類が緑藻であることを特徴とする請求項１記載の植物。
【請求項３】
緑藻がクラミドモナスであることを特徴とする請求項２記載の植物。
【請求項４】
クラミドモナスがクラミドモナスＷ８０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４７４）であることを特徴とする請求項３記載の植物。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子が導入され、かつ前記遺伝子が発現していることを特徴とするストレス耐性が向上した植物：
（ａ）配列番号２のアミノ酸からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンペルオシキダーゼ様タンパク質活性を有するタンパク質。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子が導入され、かつ前記遺伝子が発現していることを特徴とするストレス耐性が向上した植物：
（ａ）配列番号１の塩基配列のうち第１９０番目のヌクレオチドから第６７８番目のヌクレオチドの領域の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１の塩基配列のうち第１９０番目のヌクレオチドから第６７８番目のヌクレオチドの領域の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルタチオンペルオシキダーゼ様タンパク質活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
ストレス耐性が活性酸素ストレス耐性、低温ストレス耐性及び／又は塩ストレス耐性であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項記載の植物。
【請求項８】
遺伝子が植物の葉緑体及び／又は細胞質で発現していることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項記載の植物。
【請求項９】
真核藻類由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列で植物を形質転換する工程を含むことを特徴とするストレス耐性が向上した植物の製造方法。
【請求項１０】
真核藻類が緑藻であることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
緑藻がクラミドモナスであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
クラミドモナスがクラミドモナスＷ８０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４７４）であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列で植物を形質転換する工程を含むことを特徴とするストレス耐性が向上した植物の製造方法：
（ａ）配列番号２のアミノ酸からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンペルオシキダーゼ様タンパク質活性を有するタンパク質。
【請求項１４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列で植物を形質転換する工程を含むことを特徴とするストレス耐性が向上した植物の製造方法：
（ａ）配列番号１の塩基配列のうち第１９０番目のヌクレオチドから第６７８番目のヌクレオチドの領域の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１の塩基配列のうち第１９０番目のヌクレオチドから第６７８番目のヌクレオチドの領域の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルタチオンペルオシキダーゼ様タンパク質活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１５】
ストレス耐性が活性酸素ストレス耐性、低温ストレス耐性及び／又は塩ストレス耐性であることを特徴とする請求項９〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
制御配列がｒｂｃＳトランジットペプチドを含み、これにより遺伝子が植物の葉緑体で発現されることを特徴とする請求項９〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
制御配列がｒｂｃＳトランジットペプチドを含まず、これにより遺伝子が植物の細胞質で発現されることを特徴とする請求項９〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
塩基配列が２種類あり、一方の塩基配列においては制御配列がｒｂｃＳトランジットペプチドを含み、他方の塩基配列においては制御配列がｒｂｃＳトランジットペプチドを含まず、これにより遺伝子が植物の葉緑体及び細胞質の両方で発現されることを特徴とする請求項９〜１５のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は外来遺伝子の導入によりストレス耐性が向上した植物及びかかる植物の製造方法に関する。具体的には本発明は真核藻類由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子の導入により活性酸素ストレス耐性、低温ストレス耐性及び／又は塩ストレス耐性などのストレス耐性が向上した植物及びかかる植物の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物細胞内では正常条件下においても余剰光エネルギーにより葉緑体中の光化学系Ｉ及びＩＩ近傍で活性酸素種（ＡＯＳ）の一種であるＯ２ラジカルが生成する。Ｏ２ラジカルはそれ自身非常に毒性が高く、続く不均化反応により更に毒性が高いＨ２Ｏ２へと変換される。このようなＡＯＳによる傷害を防御する機構は植物の細胞内に存在しており、この機構の主要な機能としては、Ｃｕ／Ｚｎ−スーパーオキシドジスムーターゼ（ＳＯＤ）及びアスコルビン酸ペルオキシターゼ（ＡＰＸ）によるＡＯＳの消去が挙げられる。前者はチラコイド膜近傍で発生したＯ２ラジカルを不均化しＨ２Ｏ２にする反応を触媒し、後者はそのＨ２Ｏ２をＨ２Ｏに分解する反応を触媒する。しかし、強光や低温、乾燥などのストレスによりもたらされる還元力過剰の状態においては、これらのＡＯＳ消去系酵素による消去能力を超過するほど多量の活性酸素が発生するため、植物細胞内で生体膜及びタンパク質分子の過酸化が進行し、膜機能が低下する。これがいわゆる酸化的傷害である。
【０００３】
これまでに、植物の酸化的傷害に対する耐性を向上させることに成功した例がいくつか報告されているが、これらの例はいずれも植物中に元来存在するＳＯＤやＡＰＸ、カタラーゼを葉緑体で過剰発現させるものである。一方、動物細胞ではチオレドキシンペルオキシダーゼやグルタチオンペルオキシダーゼなどの酵素による生体膜の酸化的傷害の修復機構の存在がよく知られているが、かかる修復機構の存在は植物細胞ではほとんど明らかになっていない。即ち、植物ではチオレドキシンペルオキシダーゼやグルタチオンペルオキシダーゼなどの酵素が過酸化脂質の還元に関与していることが明らかになっているものの、いずれの酵素も非常に活性が弱い。更に、これらの酵素はリン脂質ヒドロペルオキシドなどを基質とするが、生体膜の主要構成成分である不飽和脂肪酸ヒドロペルオキシドは基質としないため、植物細胞内で実際にどれだけ機能しているかについては疑問が多い。従って、植物細胞においてかかる修復機構を形質転換により強化した例は全く報告されていない。
【０００４】
一方、真核藻類に属する緑藻クラミドモナスＷ８０株が発現するグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質（ＣＷ．ＧＰＸ）は植物のグルタチオンペルオキシダーゼとは異なり生体膜の主要構成成分である不飽和脂肪酸ヒドロペルオキシドを基質とし、緑藻クラミドモナスＷ８０株において脂質過酸化物の消去に積極的に機能していることが明らかになっている（非特許文献１）（図１参照）。しかしながら、かかるグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質を植物細胞中で発現させた例はなく、植物細胞中で発現させた場合にどのような効果を奏するのかについても今だ確認されていない。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｔａｋｅｄａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｔ  Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｗ８０１．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ  １１７：１−９，２００３
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はかかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は新たな手法により活性酸素ストレス耐性、低温ストレス耐性、塩ストレス耐性などのストレス耐性が向上した植物及びかかる植物の製造方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者はかかる課題を解決するために緑藻クラミドモナスＷ８０株由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子を用いて植物を形質転換させ、形質転換植物のストレス耐性について鋭意研究した結果、遂に本発明の完成に至った。
【０００８】
本発明によれば、真核藻類由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子が導入され、かつ前記遺伝子が発現していることを特徴とするストレス耐性が向上した植物が提供される。
【０００９】
本発明のストレス耐性が向上した植物の好ましい実施態様においては、植物は緑藻由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子を導入され、更に好ましい実施態様においては、植物はクラミドモナス由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子を導入されている。本発明のストレス耐性が向上した植物の特に好ましい実施態様においては、植物はクラミドモナスＷ８０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４７４）由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子を導入されている。
【００１０】
本発明のストレス耐性が向上した植物の一つの具体的実施態様においては、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子が導入され、かつ前記遺伝子が発現していることを特徴とするストレス耐性が向上した植物が提供される：
（ａ）配列番号２のアミノ酸からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンペルオシキダーゼ様タンパク質活性を有するタンパク質。
【００１１】
本発明のストレス耐性が向上した植物の他の具体的実施態様においては、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子が導入され、かつ前記遺伝子が発現していることを特徴とするストレス耐性が向上した植物が提供される：
（ａ）配列番号１の塩基配列のうち第１９０番目のヌクレオチドから第６７８番目のヌクレオチドの領域の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１の塩基配列のうち第１９０番目のヌクレオチドから第６７８番目のヌクレオチドの領域の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルタチオンペルオシキダーゼ様タンパク質活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１２】
本発明のストレス耐性が向上した植物の好ましい実施態様においては、ストレス耐性は活性酸素ストレス耐性、低温ストレス耐性及び／又は塩ストレス耐性である。
【００１３】
本発明のストレス耐性が向上した植物の好ましい実施態様においては、植物に導入された遺伝子は植物の葉緑体及び／又は細胞質で発現している。
【００１４】
また、本発明によれば、真核藻類由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列で植物を形質転換する工程を含む、ストレス耐性が向上した植物の製造方法が提供される。
【００１５】
本発明のストレス耐性が向上した植物の製造方法の好ましい実施態様においては、植物は緑藻由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列で形質転換され、更に好ましい実施態様においては、植物はクラミドモナス由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列で形質転換される。本発明のストレス耐性が向上した植物の製造方法の特に好ましい実施態様においては、植物はクラミドモナスＷ８０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４７４）由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列で形質転換される。
【００１６】
本発明のストレス耐性が向上した植物の製造方法の一つの具体的実施態様においては、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列で植物を形質転換する工程を含む、ストレス耐性が向上した植物の製造方法が提供される：
（ａ）配列番号２のアミノ酸からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンペルオシキダーゼ様タンパク質活性を有するタンパク質。
【００１７】
本発明のストレス耐性が向上した植物の他の具体的実施態様においては、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列で植物を形質転換する工程を含む、ストレス耐性が向上した植物の製造方法が提供される：
（ａ）配列番号１の塩基配列のうち第１９０番目のヌクレオチドから第６７８番目のヌクレオチドの領域の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１の塩基配列のうち第１９０番目のヌクレオチドから第６７８番目のヌクレオチドの領域の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルタチオンペルオシキダーゼ様タンパク質活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１８】
本発明のストレス耐性が向上した植物の製造方法の好ましい実施態様においては、ストレス耐性は活性酸素ストレス耐性、低温ストレス耐性及び／又は塩ストレス耐性である。
【００１９】
本発明のストレス耐性が向上した植物の製造方法の一つの好ましい実施態様においては、制御配列はｒｂｃＳトランジットペプチドを含み、これにより遺伝子は植物の葉緑体で発現される。
【００２０】
本発明のストレス耐性が向上した植物の製造方法の他の好ましい実施態様においては、制御配列はｒｂｃＳトランジットペプチドを含まず、これにより遺伝子は植物の細胞質で発現される。
【００２１】
本発明のストレス耐性が向上した植物の製造方法の更に他の好ましい実施態様においては、塩基配列は２種類あり、一方の塩基配列においては制御配列がｒｂｃＳトランジットペプチドを含み、他方の塩基配列においては制御配列がｒｂｃＳトランジットペプチドを含まず、これにより遺伝子が植物の葉緑体及び細胞質の両方で発現される。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明のストレス耐性が向上した植物及びその植物の製造方法を具体的に説明するが、特許請求の範囲の記載から逸脱しない限りこれらに限定されるものではない。本発明のストレス耐性が向上した植物は真核藻類由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子が導入され、かつ前記遺伝子が発現している植物である。かかる植物は本発明によれば真核藻類由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列で植物を形質転換することによって製造される。
【００２３】
本発明のストレス耐性が向上した植物に導入されるグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子としては、緑藻、車軸藻、プラシノ藻、ミドリムシ、褐藻、黄金藻、黄緑藻、珪藻、ラフィド藻、ハプト藻、クリプト藻、又は紅藻の如き真核藻類由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定されないが、例えば緑藻の一種であるクラミドモナスＷ８０株由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子を使用することができる。クラミドモナスＷ８０株は日本国近畿地方の沿岸で採集されたものであり、特許生物寄託センター〔日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）〕にＦＥＲＭ  Ｐ−１８４７４として寄託されている。
【００２４】
上記クラミドモナスＷ８０株由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子は既に単離されており、ＤＤＢＪ，ＥＭＢＬ及びＧｅｎＢａｎｋ塩基配列データベースに受託番号ＡＢ００９０８３として受託されている。その塩基配列は配列表の配列番号１に示す通りであり（ＯＲＦは第１９０番目のヌクレオチドから第６７８番目のヌクレオチドまで）、アミノ酸配列は配列表の配列番号２に示す通りである。
【００２５】
他の真核藻類由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子は例えばクラミドモナスＷ８０株由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子、その一部又はそれらのｃＤＮＡをプローブとして他の真核藻類から作成したｃＤＮＡライブラリー又は染色体ライブラリーに対してスクリーニングを行うことにより得ることができる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８９：渡辺  格ら、植物バイオテクノロジー実験マニュアル  クローニングとシークエンス、１９８９など）。またクラミドモナスＷ８０株由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子の一部又はそのｃＤＮＡをプライマーとし、ＰＣＲ法により他の真核藻類由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子を得ることもできる（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８９：Ｃ．Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３０，１９８７）。
【００２６】
本発明のストレス耐性が向上した植物において植物に導入される遺伝子は具体的には以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子であることができる：
（ａ）配列番号２のアミノ酸からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンペルオシキダーゼ様タンパク質活性を有するタンパク質。
かかる遺伝子は例えば以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子であることができる：
（ａ）配列番号１の塩基配列のうち第１９０番目のヌクレオチドから第６７８番目のヌクレオチドの領域の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１の塩基配列のうち第１９０番目のヌクレオチドから第６７８番目のヌクレオチドの領域の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルタチオンペルオシキダーゼ様タンパク質活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２７】
配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、例えばサイトダイレクテドミュータジェネシスキット（宝酒造）や、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）等の市販キットを用いてＤＮＡ塩基配列を置換することにより得ることができる。得られた遺伝子がグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、例えば得られた遺伝子を大腸菌に導入し、形質転換体中のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質の酵素活性を測定することにより確認することができる。
【００２８】
配列番号１の塩基配列のうち第１９０番目のヌクレオチドから第６７８番目のヌクレオチドの領域の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子は、配列番号１の塩基配列のうち第１９０番目のヌクレオチドから第６７８番目のヌクレオチドの領域の塩基配列又はその一部をプローブとしてコロニー又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより得ることができる。なお、本明細書において用いる用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えばある塩基配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡのみが特異的にハイブリダイズする条件であることができる。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより作り出すことができる。
【００２９】
ハイブリダイゼーションの手順としては、先ず目的の遺伝子源から得たＤＮＡ（染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ）のライブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー等をニトロセルロース等の膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡを膜に固定する。この膜を３２Ｐ等で標識したプローブ（配列番号１の塩基配列のうち第１９０番目のヌクレオチドから第６７８番目のヌクレオチドの領域の塩基配列又はその一部）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下、例えば６×ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中で６５℃で２０時間行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的に吸着したプローブを洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成したクローンが単一になるまで繰り返す。こうして得られたクローンの中には目的の遺伝子が挿入されている。得られた遺伝子がグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、例えば得られた遺伝子を大腸菌に導入し、形質転換体中のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質の酵素活性を測定することにより確認することができる。
【００３０】
真核藻類に属する緑藻クラミドモナスＷ８０株が発現するグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質は緑藻クラミドモナスＷ８０株において脂質過酸化物の消去に積極的に機能している。グルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質に対応するグルタチオンペルオキシダーゼは植物中にも元来存在する。しかし、植物由来のグルタチオンペルオキシダーゼは生体膜の主要構成成分である不飽和脂肪酸ヒドロペルオキシドを基質としないため、生体膜の酸化的障害の修復にはほとんど寄与しないと考えられる。一方、動物由来のグルタチオンペルオキシダーゼはセレン含有型であり、植物に導入して用いるには好適でない。これに対し、真核藻類由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質は生体膜の主要構成成分である不飽和脂肪酸ペルオキシドを基質としかつセレン非含有型であるため、植物に導入して用いるのに極めて好適である。
【００３１】
本発明のストレス耐性が向上した植物の製造方法においては植物の形質転換に用いる塩基配列は上述の真核藻類由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子に加えて前記遺伝子の発現を制御する制御配列も含む。かかる制御配列は前記遺伝子を植物細胞内で効果的に発現させる役割を有する。かかる制御配列は例えば前記遺伝子の５′末端側に連結されるプロモーターであることができる。プロモーターとしてはカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーター、ＯＣＳプロモーターなどの構成的に発現するプロモーターを用いることができる。制御配列は前記遺伝子の３´末端側に連結されるターミネーターも含むことが効果的な発現のため好ましい。ターミネーターとしてはＮＯＳターミネーター、３５Ｓターミネーターなどを用いることができる。
【００３２】
また、前記遺伝子の植物細胞中での発現場所を制御する制御配列を用いることもできる。例えばｒｂｃＳトランジットペプチドを前記遺伝子の５′末端側に連結すれば遺伝子を植物の葉緑体で発現させることができる。逆に、ｒｂｃＳトランジットペプチドが前記遺伝子の５′末端側に連結されていなければ遺伝子は植物の細胞質で発現する。従って、植物細胞の形質転換に用いる塩基配列を２種類準備し、一方の塩基配列においては制御配列がｒｂｃＳトランジットぺプチドを含み、他方の塩基配列においては制御配列がｒｂｃＳトランジットペプチドを含まないようにすれば、真核藻類由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子を植物の葉緑体及び細胞質の両方で発現させることができる。
【００３３】
本発明のストレス耐性が向上した植物の製造方法においては、上述の真核藻類由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列を用いた植物の形質転換は従来公知の外来遺伝子導入方法により行うことができる。これらの方法にはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌を用いる方法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法などがあるが、双子葉植物細胞を対象とする場合はアグロバクテリウム属細菌を用いる方法が確実さの点で好ましい。アグロバクテリウム属細菌を用いた形質転換法としては、リーフディスク法及びプロトプラスト法（大野哮司（１９８６）ベクターの開発−Ｔｉプラスミド、現代化学増刊５「植物バイオテクノロジー」、山田泰之、岡田吉美編、ｐ．１９７−２１３の第２０７〜２１２頁：内宮博文（１９８９）トランスジェニック植物、「植物遺伝情報の交換」、秀潤社、岡田吉美ら編ｐ２６１−２７６）が周知である。このようにして得られた形質転換植物が真核藻類由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子を発現しているかどうかは例えば形質転換植物中のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質の酵素活性を測定することにより確認することができる。
【００３４】
本発明のストレス耐性が向上した植物においては、ストレス耐性は乾燥ストレス、強光ストレス耐性、高温ストレス耐性、低温ストレス耐性、塩ストレス耐性、病害ストレス耐性、農薬ストレス耐性、大気汚染ストレス耐性、紫外線ストレス耐性などの任意のストレス耐性を含むことができるが、活性酸素ストレス耐性、低温ストレス耐性及び／又は塩ストレス耐性であることが好ましい。特に、低温ストレス及び塩ストレスについてはこれらのストレスと生体膜の酸化的障害との関連は今まで推察の段階に留まっていた。これに対し、本発明はこれらのストレスは植物細胞内での活性酸素の発生をもたらし、最終的に生体膜の酸化的障害を引き起こすこと、従って生体膜の酸化的障害を真核藻類由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質により修復することによりこれらのストレス耐性を著しく向上させることができることをはじめて実際に確認したものである。
【００３５】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、実施例の記載は純粋に発明の理解のためのみに挙げるものであり、本発明はこれによって何ら限定されるものではない。
【００３６】
（１）クラミドモナスＷ８０株由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質（Ｃ．Ｗ８０ｇｐｘ）をコードする遺伝子を用いた形質転換タバコ植物の作成１）植物材料の調製
日本タバコ産業株式会社より分譲されたタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ  Ｘａｎｔｈｉ）の種子をＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地に播種し、種子発芽から約１ｃｍに生長するまで培養した。培養条件は光照度：１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、明期１２時間、暗期１２時間、２５℃であった。その後、ＭＳ培地より根を切らないように注意しながら植物体を取り、土壌栽培に移行した。土壌に移した後は、グロスチャンバー内で、光強度３００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、相対湿度６０％、明期１２時間、暗期１２時間、２５℃の条件下で培養した。
【００３７】
２）導入プラスミドの構築
配列番号１により規定されるクラミドモナスＷ８０株由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質のｃＤＮＡ（Ｃ．Ｗ８０ｇｐｘ  ｃＤＮＡ；全長９８２ｂｐ）からＯＲＦを含む５６６ｂｐ（配列番号１の塩基配列のうち第１８４番目から第７４９番目までのヌクレオチド）の断片をＰＣＲにより増幅した。
【００３８】
ＰＣＲに用いたプライマー（ＧＰＸ−ｆ及びＧＰＸ−ｒ）の配列は以下の通りであった：
ＧＰＸ−ｆ
５′−ＡＡＣＡＧＣＡＴＧＣＣＧＴＣＧＣＣＡＴＴ−３′（配列番号３）
ＧＰＸ−ｒ
５′−ＴＴＣＴＡＴＧＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＡＧＣ−３′（配列番号４）
【００３９】
増幅した断片を植物細胞導入用ベクターｐＢＩ１２１．ＫＴ（ＣＬＯＮＴＥＣ製）に導入し、細胞質で恒常的に発現させるための導入プラスミドを構築した（図２上側）。導入断片の５′末端側にはカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターを連結し、３′末端側にはＮＯＳターミネーターを連結した。また、葉緑体で恒常的に発現させるための導入プラスミドとして、トマトｒｂｃＳのトランジットペプチドコード領域を増幅断片の５′末端側に連結し、同様に植物細胞導入用ベクターｐＢＩ１２１．ＫＴに導入したものを構築した（図２下側）。
【００４０】
３）タバコへのＣ．Ｗ８０ｇｐｘをコードする遺伝子の導入
タバコへのＣ．Ｗ８０ｇｐｘをコードする遺伝子の導入は、目的の導入プラスミドを形質転換したアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４株を１）で培養したタバコから調製したリーフディスクに感染させることにより行った。即ち、無菌的に生育したタバコの葉より作成した５ｍｍ角のリーフディスクを目的の導入プラスミドを形質転換したアグロバクテリウム懸濁液中で震盪することにより傷口から感染させた。
【００４１】
４）形質転換株の選抜
アグロバクテリウムによる形質転換を行った後のリーフディスクはカルス誘導用ＭＳ選抜培地で培養することにより、１次選抜を行った。シュートの形成が認められたカルスはＭＳ選抜培地に植え替えた。その後、発根が認められたシュートは土壌へ移し、グロスチャンバー内（光強度３００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、相対湿度６０％、明期１２時間、暗期１２時間、２５℃）で植物体の再生を行った。
【００４２】
再生した植物体を繁殖させることにより、ＴｃＧＰＸ（クラミドモナスＷ８０株由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子が細胞質で発現される形質転換株）及びＴｐＧＰＸ（クラミドモナスＷ８０株由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子が葉緑体で発現される形質転換株）においてそれぞれ４系統及び３系統のＴ２世代が種子として得られた。
【００４３】
（２）形質転換タバコ植物の酵素活性及びストレス耐性の評価
方法
（１）で得られた種子を（１）の１）に記載した手順で播種し、１２週間培養して以下の実験に供した。また、比較のため、野生株の種子を同様に播種し、１２週間培養して以下の実験に供した。
【００４４】
１）酵素活性の測定
ＧＰＸ活性
ＧＰＸ活性は１ｍＭ還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、１ｕｎｉｔ  グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）、０．２ｍＭ  リノレン酸ヒドロペルオキシド、リン脂質ヒドロペルオキシドあるいは０．１ｍＭ  クメンヒドロペルオキシド、粗酵素液および０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）１ｍｌの反応系で３７℃下で測定を行った。なお、反応は酵素液添加で開始し、ＮＡＤＰＨ（３４０ｎｍ，６．２２ｍＭ／ｃｍ）の吸光度変化により酵素活性を測定した。
【００４５】
グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性（コントロールとして測定）
ＧＳＴ活性は１ｍＭ  ＧＳＨ、１ｍＭ  １−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ｃＤＮＢ）、および粗酵素液を含む１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌの反応系で２５℃で測定を行った。なお、反応は酵素液添加で開始し、ＧＳＨとｃＤＮＢにより生成するＧＳＨ抱合体の３４０ｎｍにおける吸光度変化により酵素活性を測定した。
【００４６】
２）ストレス耐性の評価
活性酸素ストレス
活性酸素ストレスを与えるため、植物体内でフリーラジカルとなることにより殺草作用を示す除草剤であるパラコートを以下の手順で付与した。形質転換株および野生株の４葉よりリーフディスク（１１．３ｍｍ２）を回収した。回収したリーフディスクを１０μＭパラコート溶液にそれぞれ浮かべ、１２時間の暗処理を行った。その後、光強度２００μｍｏｌ／ｍ２／ｓの条件下で静置し、経時的にサンプルを回収し、電気伝導度、クロロフィル量および過酸化脂質量を測定した。
【００４７】
低温ストレス
播種後１２週目の野生株と形質転換株を低温（４℃、光強度３００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）で６時間静置し、その後栽培条件下で３時間回復させた。低温ストレスに対する耐性は、光合成活性、クロロフィル蛍光および過酸化脂質量で評価した。
【００４８】
塩ストレス
播種後１２週目の野生株と形質転換株に２５０ｍＭ  ＮａＣｌを１５ｍｌずつ１２時間置きに与えた。塩ストレス処理中、植物体は光照射下（光強度３００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）で栽培した。塩ストレスに対する耐性は、光合成活性、クロロフィル蛍光および過酸化脂質量で評価した。
【００４９】
３）電気伝導度の測定
ＣＯＮＤＵＣＴＩＶＩＴＹ  ＭＥＴＥＲ  ＥＳ−１２（ＨＯＲＩＢＡ）を用い、経時的にリーフディスクを浮かべているパラコート溶液中の電気伝導度を測定した。なお、リーフディスク、パラコート溶液ともにオートクレーブ（１２１℃、３分間）にかけた後のパラコート溶液中の電気伝導度の数値を１００％とし、それぞれの測定値から膜障害率を算出した。
【００５０】
４）クロロフィル量の測定
クロロフィル量の測定はＡｒｎｏｎらの方法に従った。パラコート処理したリーフディスクを経時的に回収し、乳鉢中で８０％アセトン存在下で破砕し、クロロフィルをアセトン中に抽出した。得られた抽出液の波長７３０ｎｍ、６６３ｎｍ、６４５ｎｍにおける吸光度を求め、それぞれの吸光係数からクロロフィル量を算出した。
【００５１】
５）過酸化脂質量の測定
パラコート処理を行ったリーフディスクを液体窒素により凍結、破砕し、１％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）溶液１ｍｌで懸濁した。このうち５００μｌを分取し、チオバルビツール酸（ＴＢＡ）試薬（８．８Ｍ酢酸、０．３３５％（ｗ／ｖ）２−チオバルビツール酸）５００μｌを加えた。よく混合した後、９５℃で６０分間加温を行い、流水により急冷して反応を停止させた。反応より形成されたマロンジアルデヒド−ＴＢＡ複合体をｎ−ブタノール２ｍｌを用いて抽出した。抽出した複合体は分光蛍光光度計により波長５１５ｎｍで励起し、波長５５３ｎｍで発せられる蛍光強度を測定した。なお、蛍光強度の標準には５ｐＭ  １，１，３，３−テトラエトキシプロパンを用い、ＴＣＡ溶液、ＴＢＡ試薬のみで実験操作を行い測定したものを盲検とした。
【００５２】
６）光合成活性の測定
光合成活性は、携帯用光合成蒸散測定システム（Ｌｉ−６４００，ＬＩ−ＣＯＲ社，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて行った。測定条件は、ＣＯ２濃度３６０ｐｐｍ、流速５００μｍｏｌ／ｓ、光強度４００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、相対湿度６０％、２５℃で行った。
【００５３】
７）クロロフィル蛍光の測定
クロロフィル蛍光はＭＩＮＩ−ＰＡＭクロロフィル蛍光測定機（Ｗａｌｔｚ  Ｅｆｆｅｌｔｒｉｃｈ  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、２５℃で行った。暗適応（暗処理３０分間）させた葉に測定光（０．１５μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）を照射し、Ｆｏ（最小蛍光）を求めた。次に、葉にλ＜７１０ｎｍの飽和パルス（１００００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）を０．８秒間照射し、Ｆｍ（最大蛍光）を求めた。（Ｆｍ−Ｆｏ）／Ｆｍ＝Ｆｖ／Ｆｍとした。
【００５４】
結果
結果を以下の図３〜図１２に示す。
酵素活性の測定
野生株ではリノレン酸ヒドロペルオキシド（ＬｉｎＯＯＨ）を基質としたＧＰＸ活性は検出されなかったが、形質転換株であるＴｐＧＰＸ及びＴｃＧＰＸではＬｉｎＯＯＨに対する活性（４７．５±５．１〜７５．３±７．９および３２．７±４．０〜４２．１±４．３ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が認められた（図３）。クメンヒドロペルオキシドを基質としたＧＰＸ活性は野生株よりも形質転換株の方が高かった。リン脂質ヒドロペルオキシドを基質としたＧＰＸ活性は野生株と形質転換株の間で有意差はなかった。また、コントロールとして測定したＧＳＴ活性は野生株と形質転換株の間で有意差はなかった。
【００５５】
なお、通常栽培条件下での播種後８週目までの植物体の生育は、野生株と形質転換株との間で有意な差は認められなかった。播種後８週目の形質転換株の光合成活性およびクロロフィル蛍光も野生株と有意差はなかった。形質転換株における他の抗酸化酵素の活性抗酸化剤の含量は野生株のものと有意差はなかった（以上、データは示さず）。
【００５６】
活性酸素のストレス耐性の評価
形質転換株のリーフディスクを１０μＭパラコートで９時間処理したところ、ＴｐＧＰＸおよびＴｃＧＰＸでは膜障害の指標である電気伝導度の上昇が野生株に比べそれぞれ４６〜６５％および３２〜４５％抑制された（図４）。また、ＴｐＧＰＸおよびＴｃＧＰＸのクロロフィル量の減少は野生株に比べてそれぞれ９０〜９１％および９１〜９２％抑制された（図５）。この時、ＴｐＧＰＸとＴｃＧＰＸの過酸化脂質生成量は野生株に比べてそれぞれ５３〜６５％および５２〜６５％抑制された（図６）。これらの結果は、クラミドモナスＷ８０株由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子の導入により活性酸素ストレス（光・酸素毒）による膜脂質の酸化的障害に対する耐性が著しく向上していることを示す。
【００５７】
低温ストレス耐性の評価
播種後１２週目の野生株、ＴｐＧＰＸおよびＴｃＧＰＸを低温（４℃）で６時間処理すると、野生株の光合成活性は完全に失活したが、ＴｐＧＰＸおよびＴｃＧＰＸの光合成活性は４２．４±５．９％および１１．２±１．９％維持された（図７）。低温ストレス付与６時間後のクロロフィル蛍光は、野生株ではかなり減少したのに対し、ＴｐＧＰＸおよびＴｃＧＰＸではほとんど減少しなかった（図８）。低温ストレス付与６時間後の過酸化脂質量は、野生株では１．４３±０．０８倍上昇したのに対し、ＴｐＧＰＸでは１．１４±０．０６倍、ＴｃＧＰＸでは１．３２±０．０７倍と有意に抑制された（図９）。これらの結果は、クラミドモナスＷ８０株由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子の導入により低温ストレスによる膜脂質の酸化的障害に対する耐性が著しく向上していることを示す。
【００５８】
なお、野生株と形質転換株の低温ストレスに対する耐性の相違は、抗酸化酵素活性およびアスコルビン酸、グルタチオンなどの抗酸化剤量の変動にも反映していた（データは示さず）。
【００５９】
塩ストレス耐性の評価
播種後１２週目の野生株、ＴｐＧＰＸおよびＴｃＧＰＸを塩ストレス（２５０ｍＭ  ＮａＣｌ潅水）処理すると、野生株の光合成活性は２４時間後に完全に失活したが、ＴｐＧＰＸおよびＴｃＧＰＸの光合成活性は４４．９±１．３％および３５．２±０．７％維持された（図１０）。塩ストレス付与２４時間後のクロロフィル蛍光は、野生株ではかなり減少したのに対し、ＴｐＧＰＸおよびＴｃＧＰＸではほとんど減少しなかった（図１１）。この際の野生株の過酸化脂質量は１．７０±０．２倍上昇したのに対し、ＴｐＧＰＸでは１．０５±０．０７倍、ＴｃＧＰＸでは１．１２±０．０６倍と有意に抑制された（図１２）。これらの結果は、クラミドモナスＷ８０株由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子の導入により塩ストレスによる膜脂質の酸化的障害に対する耐性が著しく向上していることを示す。
【００６０】
以上の結果から、クラミドモナスＷ８０株由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換植物において、種々の環境ストレスによる膜脂質の酸化的傷害に対する耐性が野生株に比べて著しく向上していることが明らかである。
【００６１】
【発明の効果】
本発明によれば、活性酸素ストレス、低温ストレス、塩ストレスなどの種々のストレスに対する耐性が向上した植物及びかかる植物の製造方法を提供することができる。本発明の植物は種々のストレスに対して強い耐性を有するので、熱帯、寒帯、乾燥地帯、又は海岸地帯のような過酷な環境下でも良好に育成することができる植物等として極めて有用である。
【００６２】
【配列表】
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配列表フリーテキスト
配列番号３はプライマーの配列である。
配列番号４はプライマーの配列である。
【図面の簡単な説明】
【図１】クラミドモナスにおける活性酸素代謝機構を示す。
【図２】実施例１で構築した２種類の導入プラスミドを示す。
【図３】野生株および形質転換体におけるＧＰＸ活性の比較を示す。
【図４】パラコート付与の電気伝導度に及ぼす影響を示す。
【図５】パラコート付与のクロロフィル量に及ぼす影響を示す。
【図６】パラコート付与の過酸化脂質量に及ぼす影響を示す。
【図７】低温ストレスの光合成活性に及ぼす影響を示す。
【図８】低温ストレスのクロロフィル蛍光（ＰＳＩＩ活性）に及ぼす影響を示す。
【図９】低温ストレスの過酸化脂質量に及ぼす影響を示す。
【図１０】塩ストレスの光合成活性に及ぼす影響を示す。
【図１１】塩ストレスのクロロフィル蛍光（ＰＳＩＩ活性）に及ぼす影響を示す。
【図１２】塩ストレスの過酸化脂質量に及ぼす影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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