(57)【要約】【課題】エンドトキシンを含む多糖類からのエンドトキシン除去方法を提供する。【解決手段】エンドトキシンを含む多糖類を、酸のアルカリ金属塩の存在下、界面活性剤で処理することを特徴とするエンドトキシン除去方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドトキシンを含む多糖類を、酸のアルカリ金属塩の存在下、界面活性剤で処理することを特徴とするエンドトキシン除去方法。
【請求項２】
塩基性条件下で実施することを特徴とする請求項１記載のエンドトキシン除去方法。
【請求項３】
酸のアルカリ金属塩の酸の種類が１種類である請求項１又は２記載のエンドトキシン除去方法。
【請求項４】
多糖類それ自身が酸のアルカリ金属塩である請求項３記載のエンドトキシン除去方法。
【請求項５】
界面活性剤が非イオン界面活性剤である請求項４記載のエンドトキシン除去方法。
【請求項６】
一般式［ＩＩ］
2005036036.tif 000019
〔式中、Ｒ１及びＲ２は低級アルキル基、Ｅはエステル残基、Ｘはハロゲン原子を表す。〕
で示される化合物と一般式［ＩＩＩ］
2005036036.tif 000020
［式中、Ｂｏｃはベンジルオキシカルボニル基を表す。］
で示される化合物とを反応させて一般式［ＩＶ］
2005036036.tif 000021
［式中、記号は前記と同一意味を有する。］
で示される化合物とした後保護基を除去して一般式［Ｖ］
2005036036.tif 000022
［式中、記号は前記と同一意味を有する。］
で示される化合物又はその塩を得、次いで一般式［ＶＩ］
2005036036.tif 000023
［式中、Ｘ１はハロゲン原子を表す。］
で示される化合物と反応させて一般式［ＶＩＩ］
2005036036.tif 000024
［式中、記号は前記と同一意味を有する。］
で示される化合物を得、さらに一般式［ＶＩＩＩ］
Ｘ２−ＣＨ２ＣＨ３
［式中、Ｘ２はハロゲン原子を表す。］
で示される化合物と反応させ、得られる一般式［ＩＸ］
2005036036.tif 000025
［式中、記号は前記と同一意味を有する。］
で示されるＳ型２−置換ヒドロキシ−２−インドリジニル酪酸エステル誘導体のシアノ基を還元後アルカノイル化して、一般式〔Ｘ〕
2005036036.tif 000026
〔式中、Ｒ３は低級アルカノイル基を表し、他の記号は前記と同一意味を有する。〕
で示されるＳ型２−置換ヒドロキシ−２−（６−置換アミノメチルインドリジニル）酪酸エステル誘導体とした後、これをニトロソ化反応及び転移反応に付して、一般式〔ＸＩ〕
2005036036.tif 000027
〔式中、記号は前記と同一意味を有する。〕
で示されるＳ型２−置換ヒドロキシ−２−（６−置換ヒドロキシメチルインドリジニル）酪酸エステル誘導体とし、該化合物を分子内閉環後または分子内閉環と同時に、アセタールをケトンに変換して一般式〔ＸＩＩ〕
2005036036.tif 000028
〔式中、記号は前記と同一意味を有する。〕
で示されるＳ型４−置換ヒドロキシピラノインドリジン誘導体とし、さらに、一般式〔ＸＩＩＩ〕
2005036036.tif 000029
〔式中、Ｒ５〜Ｒ９は水素原子又は保護基を有していてもよい置換基を表す。〕
で示されるｏ−アシルアニリン化合物とを反応させて、一般式〔ＸＩＶ〕
2005036036.tif 000030
〔式中、記号は前記と同一意味を有する。〕
で示される２０位水酸基が置換されたカンプトテシン化合物を得、この化合物を、２０位水酸基の置換基除去反応に付して一般式〔Ｉ〕
2005036036.tif 000031
〔式中、記号は前記と同一意味を有する。〕
で示されるカンプトテシン誘導体とし、さらに、アミノ酸またはペプチドと反応させ、得られた化合物のアミノ酸が保護されている場合はその保護基を除去したのち、カルボキシル基を有する多糖類と反応させ、所望により、酸のアルカリ金属塩の存在下、界面活性剤で処理してエンドトキシン除去することを特徴とする化合物［Ｉ］とカルボキシル基を有する多糖類とがアミノ酸またはペプチドを介して結合してなるカンプトテシン誘導体またはその薬理的に許容しうる塩の製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エンドトキシンを含む多糖類からのエンドトキシン除去方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エンドトキシンは、発熱、ショックの原因物質であり、注射薬、輸液など非経口医薬品の製造過程でエンドトキシンの混入が判明した場合は、安全性確保のため、除去が必須である。
蛋白質からエンドトキシンを除去する方法は種々報告されており、界面活性剤でエンドトキシンを抽出し、界面活性剤相を分液後、水相から蛋白質を回収する二相抽出法も有力な方法の一つとなっている（非特許文献１）。一方、多糖類からエンドトキシンを除去する方法としては、二相抽出法が一例報告されているのみである（非特許文献２）。この方法は、エンドトキシンを含む多糖類の水溶液を界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４）で抽出を２回繰返し、エンドトキシン含量を３０００  ＥＵ／ｍｇから３０  ＥＵ／ｍｇまで減少させるものである。しかし、除去効果は十分でなく、抽出操作を２回以上繰返しても３０  ＥＵ／ｍｇ以下に減少させ得ない。
上述の如く、既存の二相抽出法を用いて多糖類からエンドトキシンを除く場合、除去効果が十分でなく、従って、より実用性の高い二相抽出法の開発が望まれていた。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｆ．  Ｂ．  Ａｎｓｐａｃｈら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７６巻  ９７頁  ２０００年
【非特許文献２】
Ｏ．  Ａｄａｍら，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２５巻  ３２１頁  １９９５年
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、非経口医薬品の原薬等に用いられる多糖類からエンドトキシンを効率的に除去する方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の通りである。
１．  エンドトキシンを含む多糖類を、酸のアルカリ金属塩の存在下、界面活性剤で処理することを特徴とするエンドトキシン除去方法。
２．  塩基性条件下で実施することを特徴とする１．記載のエンドトキシン除去方法。
３．  酸のアルカリ金属塩の酸の種類が１種類である１．又は２．記載のエンドトキシン除去方法。
４．  多糖類それ自身が酸のアルカリ金属塩である３．記載のエンドトキシン除去方法。
５．界面活性剤が非イオン界面活性剤である４．記載のエンドトキシン除去方法。
６．一般式［ＩＩ］
2005036036.tif 000002
【０００６】
〔式中、Ｒ１及びＲ２は低級アルキル基、Ｅはエステル残基、Ｘはハロゲン原子を表す。〕
で示される化合物と一般式［ＩＩＩ］
2005036036.tif 000003
【０００７】
［式中、Ｂｏｃはベンジルオキシカルボニル基を表す。］
で示される化合物とを反応させて一般式［ＩＶ］
2005036036.tif 000004
【０００８】
［式中、記号は前記と同一意味を有する。］
で示される化合物とした後保護基を除去して一般式［Ｖ］
2005036036.tif 000005
【０００９】
［式中、記号は前記と同一意味を有する。］
で示される化合物又はその塩を得、次いで一般式［ＶＩ］
2005036036.tif 000006
【００１０】
［式中、Ｘ１はハロゲン原子を表す。］
で示される化合物と反応させて一般式［ＶＩＩ］
2005036036.tif 000007
【００１１】
［式中、記号は前記と同一意味を有する。］
で示される化合物を得、さらに一般式［ＶＩＩＩ］
Ｘ２−ＣＨ２ＣＨ３
［式中、Ｘ２はハロゲン原子を表す。］
で示される化合物と反応させ、得られる一般式［ＩＸ］
2005036036.tif 000008
【００１２】
［式中、記号は前記と同一意味を有する。］
で示されるＳ型２−置換ヒドロキシ−２−インドリジニル酪酸エステル誘導体のシアノ基を還元後アルカノイル化して、一般式〔Ｘ〕
2005036036.tif 000009
【００１３】
〔式中、Ｒ３は低級アルカノイル基を表し、他の記号は前記と同一意味を有する。〕
で示されるＳ型２−置換ヒドロキシ−２−（６−置換アミノメチルインドリジニル）酪酸エステル誘導体とした後、これをニトロソ化反応及び転移反応に付して、一般式〔ＸＩ〕
2005036036.tif 000010
【００１４】
〔式中、記号は前記と同一意味を有する。〕
で示されるＳ型２−置換ヒドロキシ−２−（６−置換ヒドロキシメチルインドリジニル）酪酸エステル誘導体とし、該化合物を分子内閉環後または分子内閉環と同時に、アセタールをケトンに変換して一般式〔ＸＩＩ〕
2005036036.tif 000011
【００１５】
〔式中、記号は前記と同一意味を有する。〕
で示されるＳ型４−置換ヒドロキシピラノインドリジン誘導体とし、さらに、一般式〔ＸＩＩＩ〕
2005036036.tif 000012
【００１６】
〔式中、Ｒ５〜Ｒ９は水素原子又は保護基を有していてもよい置換基を表す。〕
で示されるｏ−アシルアニリン化合物とを反応させて、一般式〔ＸＩＶ〕
2005036036.tif 000013
【００１７】
〔式中、記号は前記と同一意味を有する。〕
で示される２０位水酸基が置換されたカンプトテシン化合物を得、この化合物を、２０位水酸基の置換基除去反応に付して一般式〔Ｉ〕
2005036036.tif 000014
【００１８】
〔式中、記号は前記と同一意味を有する。〕
で示されるカンプトテシン誘導体とし、さらに、アミノ酸またはペプチドと反応させ、得られた化合物のアミノ酸が保護されている場合はその保護基を除去したのち、カルボキシル基を有する多糖類と反応させ、所望により、酸のアルカリ金属塩の存在下、界面活性剤で処理してエンドトキシン除去することを特徴とする化合物［Ｉ］とカルボキシル基を有する多糖類とがアミノ酸またはペプチドを介して結合してなるカンプトテシン誘導体またはその薬理的に許容しうる塩の製法。
７．界面活性剤添加時には冷却し、その後加温することを特徴とする１．〜５．記載のエンドトキシン除去方法。
８．水の存在下で行うことを特徴とする１．〜５．及び７．記載のエンドトキシン除去方法。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【００２０】
エンドトキシンを含む多糖類水溶液を、酸のアルカリ金属塩の存在下、必要に応じｐＨ調整した後、界面活性剤で処理し、エンドトキシンを含む界面活性剤相と多糖類を含む水相の二相に分液させ、さらに所望により、多糖類を含む水相から残存する界面活性剤を限外ろ過（ＵＦ）膜で除去し、多糖類を含む水相を濃縮、凍結乾燥等で水分を除くことにより、エンドトキシンが除去された多糖類が効率よく得られる。
エンドトキシンを含む多糖類における多糖類の具体例としては、デキストラン、プルラン、マンノグルカン、キチン、キトサン、マンナン等の中性多糖類、ヒアルロン酸、ペクチン酸、アルギン酸、コンドロイチン、ヘパリン等の酸性多糖類、上記中性多糖類にカルボキシメチル基を導入した化合物（即ち多糖類置換酢酸）、上記中性多糖類をポリアルコール化したのちにカルボキシルメチル基を導入した化合物（即ち、カルボキシメチル基を有する多糖ポリアルコール）等があげられる。
中性多糖類にカルボキシメチル基を導入した化合物（即ち多糖類置換酢酸）の例としては、ＷＯ９４／１９３７６に開示されている物質を、中性多糖類をポリアルコール化したのちにカルボキシルメチル基を導入した化合物（即ち、カルボキシメチル基を有する多糖ポリアルコール）の例としては、ＷＯ９７／４６２６０に開示されている物質を、それぞれあげることができる。
また、中性多糖類にカルボキシメチル基を導入した化合物（即ち多糖類置換酢酸）に、さらに薬物等が結合した化合物の例としては、式：
2005036036.tif 000015
【００２１】
（式中、ＣＭ・Ｄｅｘｔｒａｎ・Ｎａは、カルボキシメチルデキストラン・ナトリウム塩を表す。以下、同様。）
で示される化合物など特開平１０−７２４６７号及び特開平１０−９５８０２号に開示されている物質や、中性多糖類をポリアルコール化したのちにカルボキシルメチル基を導入した化合物（即ち、カルボキシメチル基を有する多糖ポリアルコール）に、さらに薬物等が結合した化合物、即ち、式：
2005036036.tif 000016
【００２２】
で示される化合物等があげられる。
酸のアルカリ金属塩の具体例としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム等の炭酸アルカリ金属塩、四ほう酸ナトリウム（Ｎａ２Ｂ４Ｏ７）等のほう酸アルカリ金属塩、りん酸三ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）、トリポリりん酸ナトリウム（Ｎａ５Ｐ３Ｏ１０）、二りん酸ナトリウム（Ｎａ４Ｐ２Ｏ７）、ヘキサメタりん酸ナトリウム（Ｎａ６Ｐ６Ｏ１８）、りん酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、りん酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）等のりん酸アルカリ金属塩、けい酸ナトリウム（Ｎａ２ＳｉＯ３、Ｎａ６Ｓｉ２Ｏ７、Ｎａ２Ｓｉ３Ｏ７）等のけい酸アルカリ金属塩、硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム等の硫酸アルカリ金属塩、塩化ナトリウム等の塩酸アルカリ金属塩酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等の有機酸アルカリ金属塩などがあげられる。
界面活性剤としては、水相と界面活性剤相との二相に分離し得る界面活性剤であればよいが、好ましくは、非イオン界面活性剤を好適に用いることができ、具体例としては、例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００などがあげられる。
ｐＨ調整に用いる塩基としては、水酸化ナトリウム等の水酸化アルカリ金属を好適に用いることができる。
【００２３】
本発明における温度は、界面活性剤添加時には、冷却下、例えば０〜１０℃が好ましい。また、エンドトキシンを含む界面活性剤相と多糖類を含む水相の二相に分液させる際には、加温下、とりわけ４０〜５０℃が好ましい。
【００２４】
なお、多糖類の製造方法としては、上記ＷＯ９４／１９３７６、ＷＯ９７／４６２６０、特開平１０−７２４６７号及び特開平１０−９５８０２号記載の方法に加え、さらに特開平１０−１８２６４６号記載の方法があげられるが、その他に、化合物［ＩＩ］と化合物［ＩＩＩ］を反応させて化合物［ＩＶ］とした後、保護基を除去して化合物［Ｖ］を得、次いで化合物［ＶＩ］と反応させて化合物［ＶＩＩ］を得、さらに化合物［ＶＩＩＩ］と反応させ、得られる化合物［ＩＸ］を以下、特開平１０−１８２６４６号及び特開平１０−７２４６７号記載の方法に従って製造することもできる。
化合物［ＩＩ］と化合物［ＩＩＩ］との反応は、炭酸カリウム等の塩基の存在下、ジメチルホルムアミド等の適当な溶媒中で実施することができる。
化合物［ＩＶ］の保護基の除去は、テトラヒドロフランやエタノール等の適当な溶媒中、塩化水素等の酸で処理することにより実施することができる。
化合物［Ｖ］又はその塩と化合物［ＶＩ］との反応は、炭酸水素ナトリウム等の塩基の存在下、酢酸エチルや水等の適当な溶媒中で実施することができる。化合物［Ｖ］の塩としては、例えば、塩酸塩などの酸付加塩を好適に用いることができる。
化合物［ＶＩＩ］と化合物［ＶＩＩＩ］との反応は、ｔ−ブトキシカリウム等の塩基の存在下、ジメチルアセトアミド、トルエン、水等の適当な溶媒中で実施することができる。
化合物［ＩＸ］から化合物［Ｉ］への工程は、特開平１０−１８２６４６号記載の方法に従って実施することができ、化合物［Ｉ］とアミノ酸又はペプチドとの反応及び引き続くカルボキシル基を有する多糖類との反応は、特開平１０−７２４６７号記載の方法に従って実施することができる。
Ｒ１及びＲ２としてはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基等の低級アルキル基をあげることができ、Ｘ、Ｘ１及びＸ２のハロゲン原子としては塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等をあげることができる。Ｅとしては慣用のエステル残基をいずれも使用することができ、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基等の低級アルキル基があげられる。Ｒ３の低級アルカノイルとしては、アセチル、プロピオニル等、炭素数２〜７の直鎖または分岐鎖のアルカノイルをあげることができる。
Ｒ５〜Ｒ９としては、従来既知のカンプトテシン誘導体（例えば、特開平５−２２２０４８号、同１−２７９８９１号、同６−２２８１４１号、同６−８７７４６号、特表平４−５０３５０５号、同５−５０２０１７号記載の化合物）、欧州公開特許Ｎｏ．７５７０４９及び欧州公開特許Ｎｏ．７８１７８１に含まれるカンプトテシン誘導体における置換基の組み合わせがあげられ、例えば、（ａ）Ｒ５〜Ｒ９のうち、隣接する２つが互いに結合して炭素数２〜６個の直鎖又は分岐鎖アルキレン基を形成しているか、又は、２つとも水素原子であり、Ｒ５〜Ｒ９のうち残りの１つが−Ｑｑ−Ａｌｋｐ−Ｒ１０であり、他の２つが水素原子、置換もしくは非置換低級アルキル基又はハロゲン原子であるか、あるいは、（ｂ）Ｒ５〜Ｒ９のうち、隣接する２つが互いに結合して炭素数２〜６個の直鎖又は分岐鎖アルキレン基を形成し、そのアルキレン基のいずれかの炭素原子に−Ｑｑ−Ａｌｋｐ−Ｒ１０が置換しており、Ｒ５〜Ｒ９の残りの３つが水素原子、置換もしくは非置換低級アルキル基又はハロゲン原子であり、（ａ）及び（ｂ）におけるアルキレン基中の１つ又は２つのメチレン基は−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＨ−で置き換えられていてもよく、Ｑは−Ｏ−又は−ＮＨ−、Ａｌｋは酸素原子が介在していることもある炭素数１〜６個の直鎖又は分岐鎖アルキレン基、Ｒ１０は保護されたアミノ基、保護された低級アルキルアミノ基、保護されたピペラジノ基、保護された水酸基、ｐ及びｑは共に０又は１であるか、ｐが１、ｑが０であるものがあげられる。化合物［Ｉ］とカルボキシル基を有する多糖類との結合に際して介在させるべきアミノ酸としては、天然アミノ酸および合成アミノ酸（Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸、これらの混合物を含む）のいずれも含み、また中性アミノ酸、塩基性アミノ酸および酸性アミノ酸のいずれであってもよい。さらにα−アミノ酸に限らず、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、ε−アミノ酸等も含まれる。具体例としては、グリシン、α−アラニン、β−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジン、トリプトファン、プロリン、オキシプロリン、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸等が挙げられる。
【００２５】
またペプチドとしては、上記アミノ酸から導かれるペプチドのほか、鎖中の一部にアミノ酸以外の化合物を含む場合も包含する。例えば、コハク酸のようなジカルボン酸、エチレンジアミンの様なジアミンあるいはエチレングリコールの様なジオールがペプチド鎖の中にまたは末端に存在していてもよい。また、ペプチド鎖の結合方向は、多糖類のカルボキシル基にＮ末端から酸アミド結合によって結合しているのが通常であるが、ペプチド鎖中に塩基性アミノ酸（例えば、リジン）が存在する場合にはそのε−アミノ基を多糖類のカルボキシル基と結合させ、α−アミノ基をペプチド鎖のＣ末端と結合させることによってペプチド鎖の結合方向を逆転させてもよい。このようなペプチドは２以上のアミノ酸がペプチド結合したもの、すなわちペプチド鎖２以上のものであって、好ましくは、ペプチド鎖２〜５のものである。その具体的なペプチド鎖の例としては、例えば、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＬまたはＤ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−、−ＬまたはＤ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−、−ＬまたはＤ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−、−ＬまたはＤ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−または−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−および鎖中にこの配列を含むペプチド鎖が挙げられる（ここで、これらペプチドおよびこれら配列を含むペプチド鎖のＮ末端側が多糖類のカルボキシル基に導入される）。これらペプチドのうち、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＬまたはＤ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−ＬまたはＤ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−および−ＬまたはＤ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−であるものがより好ましい。また、これらのうち、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−ＬまたはＤ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−がとりわけ好ましい。
【００２６】
本明細書において、低級アルキルとは、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル等、炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖のアルキルを意味し、好ましくは炭素数１〜４のものを意味する。低級アルカノイルとは、例えば、アセチル、プロピオニル等、炭素数２〜７の直鎖または分岐鎖のアルカノイルを意味し、好ましくは炭素数２〜５のものを意味する。低級アルコキシカルボニルとは、例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル等、炭素数２〜７の直鎖または分岐鎖のアルコキシカルボニルを意味し、好ましくは炭素数２〜５のものを意味する。低級アルケニルとは、例えば、ビニル、アリル、イソプロペニル等、炭素数２〜７の直鎖または分岐鎖のアルケニルを意味し、好ましくは炭素数２〜４のものを意味する。低級アルケニルオキシカルボニルとは、例えば、ビニルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、イソプロペニルオキシカルボニル等、炭素数２〜７の直鎖または分岐鎖のアルケニルオキシカルボニルを意味し、好ましくは炭素数２〜４のものを意味する。低級アルキニルとは、エチニル、２−プロピニル等、炭素数２〜７の直鎖または分岐鎖のアルキニルを意味し、好ましくは炭素数２〜４のものを意味する。低級アルキニルオキシカルボニルとは、エチニルオキシカルボニル、２−プロピニルオキシカルボニル等、炭素数２〜７の直鎖または分岐鎖のアルキニルオキシカルボニルを意味し、好ましくは炭素数２〜４のものを意味する。また、ｔ−ブトキシは１，１−ジメチルエトキシを意味する。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により説明する。
実施例１
デキストラン  ３．２ｇ、蒸留水１５２  ｍＬ、２０００  ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン水溶液８  ｍＬ、ＫＨ２ＰＯ４  ３５４  ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４  ５５４  ｍｇを混合溶解させる。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、１．６  ｍＬを加え、５℃  以下で５  ｍｉｎ  攪拌後、４０〜４５℃で５  ｍｉｎ  攪拌する。同温度を維持しながら遠心機で二相に分離し、上相の水相のみを抜き出す（エンドトキシン含量  ＜０．００１５  ＥＵ／ｍｇ）。この水相に蒸留水１５０  ｍＬを加え、ＵＦ膜ろ過装置  （分画分子量５ｋＤａ）で処理してＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を除去後、凍結乾燥してエンドトキシンが除去されたデキストラン２．２７ｇ（エンドトキシン含量  ０．０１５  ＥＵ／ｍｇ、水分２．１％、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４含量  ＜  ０．０５％）を得る。なお、二相抽出前のエンドトキシン含量は  ６．０  ＥＵ／ｍｇであった。
実施例２
実施例１の酸のアルカリ金属塩であるＫＨ２ＰＯ４  及びＮａ２ＨＰＯ４に代えて、下記表１記載の酸のアルカリ金属塩を用いて適宜ｐＨ調整して同様に処理して、下記表１記載の結果を得た。
〔表１：エンドトキシン除去効果まとめ〕１）
2005036036.tif 000017
【００２８】
１）二相抽出１回実施後の水相のエンドトキシン含量；単位：ＥＵ／ｍｇ
２）ＮａＯＨでｐＨ９に調整
３）比濁法により測定。その他はゲル化法により測定
実施例３
後記製造例１で得られた化合物（Ｎａ含量３  ％）１００．０  ｇを蒸留水２  Ｌに溶解させ、溶液の一部をサンプリングしてエンドトキシン含量  を測定する（６．９５ＥＵ／ｍｇ）。  １Ｎ    ＮａＯＨ  水溶液でｐＨを９．５に調整する。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４  ２０  ｍＬを加え、５℃以下で５  分攪拌後、４０〜４５℃で５分攪拌する。同温度を維持しながら遠心機で二相に分離し、上相の水相のみを抜き出す（水相のエンドトキシン含量  ＜０．０４２  ＥＵ／ｍｇ）。この水相に蒸留水８  Ｌを加え、ＵＦ膜ろ過装置（分画分子量  ５０  ＫＤａ）で処理してＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を除去後、エバポレータで約１Ｌまで濃縮する。濃縮液をエタノールに加え、この混液に食塩水を滴下して結晶を析出させ、攪拌、静置後、上澄みを除く。含水エタノ−ル、エタノ−ル、アセトンで順次、攪拌、静置、上澄みの除去操作を繰返す。最終の沈殿物をろ取し、アセトンで洗浄する。３０  ℃で減圧乾燥後、凍結乾燥してエンドトキシンが除去された化合物  ８４ｇ（エンドトキシン含量  ＜０．０３１  ＥＵ／ｍｇ、  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４含量  ＜０．０１  ％）を得る。
３８０  ｎｍのＵＶ吸収により、薬物活性残基、１０−（３’−アミノプロピルオキシ）−７−エチル−（２０Ｓ）−カンプトテシンの含量は４．８１  ％であり、二相抽出操作前の含量は５．０３  ％であった。ゲル透過カラムクロマトグラフィ−（ＧＰＣ）による分析の結果、平均分子量は、１３６，０００、多分散度Ｍｗ／Ｍｎは１．３０であり、二相抽出操作前の平均分子量は１３３，０００、多分散度Ｍｗ／Ｍｎは、１．２８であった。
実施例４
後記製造例２で得られた化合物  ５１  ｍｇ、蒸留水４．８７  ｍＬ、２０００  ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン水溶液０．１３  ｍＬを混合溶解させ、０．０５Ｎ    ＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨを９．５に調整する。実験例３と同様の処理後、凍結乾燥して３２  ｍｇのエンドトキシンが除去された化合物を得る（エンドトキシン含量  ＜０．０１５  ＥＵ／ｍｇ）。二相抽出前のエンドトキシン含量は、３．６    ＥＵ／ｍｇであった。
製造例１
【００２９】
ＣＭ−Ｄｅｘｔｒａｎ−Ｎａ−７−エチル−１０−［３’−（グリシル−グリシル−グリシルアミノ）プロピルオキシ］−（２０Ｓ）−カンプトテシンの製造：
2005036036.tif 000018
（１）エチル  ２−クロロ−２−［６−シアノー１，１−（２，２−ジメチルトリメチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロー７−インドリジニル］アセテート  （２３０ｇ，０．６０    ｍｏｌ）と（３Ｒ）−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−イソキノリンカルボン酸  （１８４．１ｇ，０．６５  ｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（１．１５  Ｌ）溶液に、炭酸カリウム（５８．５ｇ，  ０．４２  ｍｏｌ）を加え、４０〜５０℃で約２時間撹拌した。反応終了後、接種し、水（３４５    ｍｌ）を４５〜５０℃、１０分で滴下し晶析させた。水（２  Ｌ）を同温で加えて１時間撹拌後、室温まで冷却し、さらに１時間撹拌した。析出晶をろ取し、水  （１．２    Ｌ）で洗浄した。得られた結晶を５０℃で１６時間送風乾燥し、エチル  ２−［（３Ｒ）−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−イソキノリンカルボニルオキシ］−２−［６−シアノー１，１−（２，２−ジメチルトリメチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロー７−インドリジニル］アセテート（３６１ｇ，  Ｙ＝９６  ％  ）を得た。
融点：１６５−１６８℃
（２）エチル  ２−［［（３Ｒ）−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−イソキノリル］カルボニルオキシ］−２−［６−シアノー１，１−（２，２−ジメチルトリメチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロー７−インドリジニル］アセテート（３５０．０ｇ，  ０．５６  ｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（０．８８  Ｌ）、エタノール（０．５９  Ｌ）の混合物に、塩化水素（４５．２ｇ，１．２４  ｍｏｌ）のエタノール（０．２８  Ｌ）溶液を３８〜４０℃で加えた。同温で２時間攪拌後、接種し、同温で２２時間撹拌した。５〜１５℃まで冷却し、さらに１時間、同温で攪拌した。析出晶をろ取し、エタノール（〜０．７  Ｌ）でｐＨ４以上になるまで洗浄した。得られた結晶を５０℃で１６時間送風乾燥し、粗体、２５５ｇを得た。この粗体２５０ｇを、炭酸水素ナトリウム（４１．４ｇ，  ０．４９  ｍｏｌ）、水（１  Ｌ）、酢酸エチル（１  Ｌ）の混合物に加えて溶解させた。分液後、有機層を１０％  食塩水（０．５  Ｌ）、２０％  食塩水（０．５  Ｌ）で順次洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過後、酢酸エチル（２５０  ｍｌ）で洗浄した。ろ液に接種後、塩化水素（１６．４ｇ，  ０．４５  ｍｏｌ）のエタノール（０．５  Ｌ）溶液を３０分かけて２０〜３０℃で滴下した。同温で３０分撹拌後、５〜１５℃に冷却し、１時間撹拌した。析出晶をろ取し、エタノール（〜０．５  Ｌ）でｐＨ４以上になるまで洗浄した。得られた結晶を５０℃で１６時間送風乾燥し、エチル  ２−［［（３Ｒ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−イソキノリル］カルボニルオキシ］−２−［６−シアノー１，１−（２，２−ジメチルトリメチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロー７−インドリジニル］アセテート塩酸塩（１８８ｇ，  Ｙ＝５９  ％，  水２．４％含有）を得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：５２２（Ｍ＋１）＋
（３）４−ビフェニリルスルホニルクロリド（７５．３ｇ，  ０．３０  ｍｏｌ）、酢酸エチル（０．７  Ｌ）、水（１．０５  Ｌ）、炭酸水素ナトリウム（５８．０ｇ，  ０．６９  ｍｏｌ）の順に仕込み、溶解後、エチル  ２−［［（３Ｒ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−イソキノリル］カルボニルオキシ］−２−［６−シアノー１，１−（２，２−ジメチルトリメチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロー７−インドリジニル］アセテート塩酸塩（１７５．０ｇ，  ０．３１  ｍｏｌ）を加えた。２８〜３０℃で６時間攪拌後、５〜１５℃に冷却し、さらに１時間撹拌した。析出晶をろ取し、冷却した酢酸エチル（３５０  ｍｌ）で洗浄した。得られた結晶を５０℃で１６時間送風乾燥しエチル  ２−［［（３Ｒ）−Ｎ−（４−ビフェニリルスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−イソキノリル］カルボニルオキシ］−２−［６−シアノー１，１−（２，２−ジメチルトリメチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロー７−インドリジニル］アセテート（１７９ｇ、Ｙ＝７８  ％、酢酸エチル１．８  ％含有）を得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：７３８（Ｍ＋１）＋
（４）ジメチルアセトアミド（２７５  ｍｌ）、トルエン（２７５  ｍｌ）、エチル  ２−［［（３Ｒ）−Ｎ−（４−ビフェニリルスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−イソキノリル］カルボニルオキシ］−２−［６−シアノー１，１−（２，２−ジメチルトリメチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロー７−インドリジニル］アセテート（５５．０ｇ，  ０．０７５    ｍｏｌ））及び水（２７．５  ｍｌ）の混合物に、ｔ−ブトキシカリウム（１０．０  ｇ，  ０．０８９  ｍｏｌ）を１５℃以下で加えた。２５〜３０℃で１時間撹拌後、ヨウ化エチル（１１６．５  ｇ，  ０．７５  ｍｏｌ）を滴下し、２５℃で一夜撹拌した。２０℃以下に冷却し、酢酸エチル（２２０  ｍｌ）を加えた後、濃塩酸（２．０  ｇ）と水（２２０  ｍｌ）の混液を滴下した。塩化ナトリウム（５．５  ｇ）を加え、撹拌後、分液した。水層を酢酸エチルで（２２０  ｍｌ１回及び１１０  ｍｌ１回）逆抽出した。有機層を合せてチオ硫酸ナトリウム・５水和物（１６．５  ｇ）の水（２２０  ｍｌ）溶液、水（２２０  ｍｌ）、食塩（５５．０  ｇ）の水（２２０  ｍｌ）溶液で順次洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過後、酢酸エチル（５５  ｍｌ）で洗浄し、ろ液を減圧濃縮した。濃縮残渣にクロロホルム（１６５  ｍｌ）に溶かし、シリカゲル及び活性炭を加え撹拌、ろ過、クロロホルム（１６５  ｍｌ）で洗浄した。ろ液を減圧濃縮し、クロロホルム（５５０  ｍｌ３回）、アセトン（５５０  ｍｌ３回）で順次置換濃縮した。最終残渣の半量を採り、アセトン（１０３  ｍｌ）と水（３４ｍｌ）を加え、加温、溶解した。接種し、２５℃で２０時間、次いで１０℃で５時間、撹拌した。析出晶をろ取し、アセトン（３９  ｍｌ）と水（１９  ｍｌ）の混液で洗浄した。得られた結晶を５０℃で送風乾燥し、（２Ｓ）−２−［［（３Ｒ）−Ｎ−（４−ビフェニリルスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−イソキノリル］カルボニルオキシ］−２−［６−シアノー１，１−（２，２−ジメチルトリメチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロー７−インドリジニル］酪酸エチルエステル（２１．２ｇ、Ｙ＝６９  ％，アセトン７．１％  含有）を得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：７６６（Ｍ＋１）＋
（５）（２Ｓ）−２−〔〔（３Ｒ）−Ｎ−（４−ビフェニリルスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−２−〔６−シアノ−１，１−（２，２−ジメチルトリメチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−７−インドリジニル〕酪酸エチルエステル２３．７１ｇ及びラネーニッケル（Ｗ−４）４９ｇを無水酢酸−酢酸混液（４６０ｍｌ−１９０ｍｌ）に溶解し、水素雰囲気下５０〜６０℃にて撹拌した。反応終了後触媒をろ去し、ろ液を減圧濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；クロロホルム：メタノール＝１００：１〜７０：１〜６０：１）にて精製することにより、（２Ｓ）−２−〔〔（３Ｒ）−Ｎ−（４−ビフェニリルスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−２−〔６−〔（アセチルアミノ）メチル〕−１，１−（２，２−ジメチルトリメチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−７−インドリジニル〕酪酸エチルエステル２２．１０ｇを淡黄色粉末として得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：８１２（ＭＨ＋）
（６）（２Ｓ）−２−〔〔（３Ｒ）−Ｎ−（４−ビフェニリルスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−２−〔６−〔（アセチルアミノ）メチル〕−１，１−（２，２−ジメチルトリメチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−７−インドリジニル〕酪酸エチルエステル３０．１６ｇを無水酢酸−酢酸混液（４５０ｍｌ−１５０ｍｌ）に溶解し、氷冷下亜硝酸ナトリウム１３．１８ｇを加え、氷浴上にて４時間撹拌した。反応混合物をクロロホルム１．５ｌに注ぎ、不溶物をろ過した。ろ液を減圧乾固し、残渣を酢酸エチル９００ｍｌと混合し、６０℃にて１３時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル７００ｍｌにて希釈し、水及び食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムにて乾燥後、炭末処理した。溶媒を減圧留去後、酢酸エチル−ヘキサンより結晶化することにより、（２Ｓ）−２−〔〔（３Ｒ）−Ｎ−（４−ビフェニリルスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−２−〔６−アセトキシメチル−１，１−（２，２−ジメチルトリメチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−７−インドリジニル〕酪酸エチルエステル１６．７７ｇを無色プリズム晶として得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：８１３（ＭＨ＋）
（７）（２Ｓ）−２−〔〔（３Ｒ）−Ｎ−（４−ビフェニリルスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−２−〔６−アセトキシメチル−１，１−（２，２−ジメチルトリメチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−７−インドリジニル〕酪酸エチルエステル１．４５７ｇを８０％トリフルオロ酢酸水溶液１５ｍｌに氷冷下溶解し、反応混合物を室温２日撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、残渣をクロロホルムで抽出後、抽出液を水洗し、硫酸マグネシウムにて乾燥した。抽出液から溶媒を減圧留去することにより、（４Ｓ）−７，８−ジヒドロ−４−エチル−４−〔〔（３Ｒ）−Ｎ−（４−ビフェニリルスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−１Ｈ−ピラノ〔３，４−ｆ〕インドリジン−３，６，１０（４Ｈ）−トリオン１．１４５ｇを無色の泡状物として得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：６３９（ＭＨ＋）
（８）（４Ｓ）−７，８−ジヒドロ−４−エチル−４−〔〔（３Ｒ）−Ｎ−（４−ビフェニリルスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−１Ｈ−ピラノ〔３，４−ｆ〕インドリジン−３，６，１０（４Ｈ）−トリオン１．１４５ｇ及び１−［５’−（３’’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノプロピルオキシ）−２’−アミノフェニル）−プロパン−１−オン８６７ｍｇを酢酸１５ｍｌに溶解し、６０℃で４７時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；クロロホルム：酢酸エチル＝２：１〜１：１）で精製後、酢酸エチル−ヘキサンにて再結晶することにより、（２０Ｓ）−７−エチル−１０−〔３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロピルオキシ〕−２０−Ｏ−〔〔（３Ｒ）−Ｎ−（４−ビフェニリルスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−イソキノリル〕カルボニル〕カンプトテシン１．１１ｇを無色結晶として得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：９２５（ＭＨ＋）
（９）（２０Ｓ）−７−エチル−１０−〔３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロピルオキシ〕−２０−Ｏ−〔〔（３Ｒ）−Ｎ−（４−ビフェニリルスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−イソキノリル〕カルボニル〕カンプトテシン９９１ｍｇを水−メタノール（６−３０ｍｌ）混液に溶解し、氷冷下、水酸化リチウム・一水和物１８０ｍｇを加え、室温で２２時間撹拌後、５０℃にて４時間加熱撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、クロロホルム２０ｍｌ及び酢酸４ｍｌを加え、室温にて１９時間撹拌する。反応混合物をクロロホルム、水で希釈し、クロロホルム層を、水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧濃縮することにより、（２０Ｓ）−７−エチル−１０−〔３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロピルオキシ〕カンプトテシンを得た。
（１０）得られた（２０Ｓ）−７−エチル−１０−〔３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロピルオキシ〕カンプトテシンを水−エタノール（５ｍｌ＋１５ｍｌ）混液に溶解し、６．６Ｎ塩酸−エタノール５ｍｌを加え、室温で２３時間撹拌した。反応混合物を減圧乾固し、酢酸エチル及び水に溶かした。酢酸エチル層から更に水で抽出し、全水層を減圧乾固して得られた残渣をイソプロパノール−水から結晶化することにより、（２０Ｓ）−７−エチル−１０−（３−アミノプロピルオキシ）カンプトテシン塩酸塩２４０ｍｇを淡黄色針状晶として得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：４５０（〔Ｍ−Ｃｌ〕＋）
（１１）（２０Ｓ）−７−エチル−１０−（３−アミノプロピルオキシ）カンプトテシン塩酸塩５００ｍｇをアセトニトリル２５ｍｌに溶解し、ｔ−ブトキシカルボニル−グリシル−グリシル−グリシン３４５ｍｇ、Ｎ−メチルモルホリン１２１ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール１６１ｍｇおよび１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩２２８ｍｇを順次加え、一夜攪拌した。析出した生成物を濾取した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製して、淡黄色泡状粉末を得た。ノルマルプロパノールから再結晶し、無色結晶の７−エチル−１０−［３’−（ｔ−ブトキシカルボニル−グリシル−グリシル−グリシルアミノ）プロピルオキシ］−（２０Ｓ）−カンプトテシンを６６３ｍｇ得た。融点：１５７−１５９℃
（１２）７−エチル−１０−［３’−（ｔ−ブトキシカルボニル−グリシル−グリシル−グリシルアミノ）プロピルオキシ］−（２０Ｓ）−カンプトテシン３．８６ｇを精製水６４ｍｌに乳濁させ、６Ｎ塩酸水溶液３２ｍｌを加え、室温にて攪拌しながら２時間反応後、溶媒を濃縮し、ノルマルプロパノールを加え、粉末を析出させる。粉末を濾取したのち、ノルマルプロパノール水より再結晶すると、黄色結晶の７−エチル−１０−［３’−（グリシル−グリシル−グリシルアミノ）プロピルオキシ］−（２０Ｓ）−カンプトテシン塩酸塩を２．５６ｇ得た。
（１３）ＣＭ−デキストラン・ナトリウム塩（ＣＭ化度＝０．４４、エンドトキシン値＝５．９３ＥＵ／ｍｇ）（６００  ｇ）を精製水（２４  Ｌ）に溶かし、０．２Ｎ  塩酸でｐＨ  ６とした後、７−エチル−１０−［３’−（グリシル−グリシル−グリシルアミノ）プロピルオキシ］−（２０Ｓ）−カンプトテシン塩酸塩（５０．４ｇ、０．０７６７  ｍｏｌ）の精製水（０．６  Ｌ）溶液を加えた。この液に１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（６００ｇ，  ２．０７  ｍｏｌ）の精製水（４．８  Ｌ）溶液を、０．２Ｎ  塩酸でｐＨ  ５．０〜６．５に調整しながら１４〜１５℃で、約１時間で滴下した。同温で一夜攪拌した後、精製水（６０  Ｌ）で希釈し、ＵＦ膜を用いてｐＨ４．５以下で脱塩する。脱塩液を１０％  水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ  ８に調整し、陽イオン交換樹脂（ＭＳＣ−１  Ｎａ型）に通した後、溶出液を再度、ＵＦ膜で脱塩処理を行った。脱塩処理液をＵＦ膜、ＲＯ膜、減圧留去（ロ−タリ−エバポレ−タ−）で順次濃縮（７  Ｌ）し、ろ過後、１０％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ  ４とした。この液をエタノ−ル（３６Ｌ）に加え、攪拌下、３Ｍ  食塩水（２４０  ｍｌ）を滴下し、一夜、室温で攪拌した。攪拌を停止し、デカンテ−ションにより上澄み液を除き、９０％含水エタノ−ル（３０  Ｌ）を加えて１０分間攪拌、デカンテ−ションにより上澄み液を除いた。この操作をエタノ−ル（６０  Ｌ）、アセトン（３０Ｌ、２回）を用いて繰り返した後、最終の沈殿をアセトン（６  Ｌ）を用いて、ろ取した。得られた結晶をロ−タリ−エバポレ−タ−で減圧乾燥後、精製水に溶かし、凍結乾燥することにより、５９７ｇのＣＭ−Ｄｅｘｔｒａｎ−Ｎａ−７−エチル−１０−［３’−（グリシル−グリシル−グリシルアミノ）プロピルオキシ］−（２０Ｓ）−カンプトテシンを得た。本品のエンドトキシン値は、６．９５ＥＵ／ｍｇであった。
製造例２
カルボキシメチルデキストランポリアルコール−（１Ｓ，９Ｓ）−１−（グリシルグリシルーＬ−フェニルアラニルグリシルアミノ）−９−エチル−５−フルオロ−２，３−ジヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３‘，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）−ジオンの製造：
（１）（１Ｓ，９Ｓ）−１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−２，３−ジヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３‘，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）−ジオン塩酸塩  （１６７ｍｇ；  ０．３５４ｍｍｏｌ），  ｔ−ブトキシカルボニル−グリシル−グリシル−Ｌ−フェニルアラニル−グリシン  （４６３ｍｇ；  １．０６ｍｍｏｌ）  及び  １−ヒドロキシベンゾトリアゾール・一水和物（ＨＯＢＴ）  （１４３ｍｇ；  １．０６ｍｍｏｌ）  のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液  （１０ｍｌ）  に１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）塩酸塩  （２７０ｍｇ；  １．４２ｍｍｏｌ），  トリエチルアミン  （１４８μｌ；  １．０６ｍｍｏｌ）  及び  ４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）  （５ｍｇ；  ０．０４ｍｍｏｌ）を加える。    反応混合物を室温で１５時間かくはんし、溶媒を減圧留去する。    残査をクロロホルムに溶解し、該溶液を洗浄、乾燥後、溶媒を減圧留去する。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒；クロロホルム：メタノール＝５０：１〜１０：１）で精製して、（１Ｓ，９Ｓ）−１−（ｔ−ブトキシカルボニルグリシルグリシルーＬ−フェニルアラニルグリシルアミノ）−９−エチル−５−フルオロ−２，３−ジヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３‘，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）−ジオン（２２８ｍｇ，  Ｙ＝７５％）  を淡黄色固体として得る    ＩＲ（Ｎｕｊｏｌ）  ；  ３２９０，  １７１０，  １６５５  ｃｍ−１．  ＥＳＩ−ＭＳ  ；  ８５４  （Ｍ＋Ｈ）．
（２）（１Ｓ，９Ｓ）−１−（ｔ−ブトキシカルボニルグリシルグリシルーＬ−フェニルアラニルグリシルアミノ）−９−エチル−５−フルオロ−２，３−ジヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３‘，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）−ジオン（２２０ｍｇ；  ０．２５８ｍｍｏｌ）のジオキサン溶液  （４ｍｌ）に氷浴中かくはん下に４Ｎ塩化水素―ジオキサン溶液  （６ｍｌ）  を加える。    混合物を室温で１６時間かくはんする。反応混合物にジエチルエーテル  （３０ｍｌ）を加え、室温で１時間かくはんする。析出物をろ取し、乾燥して、（１Ｓ，９Ｓ）−１−（グリシルグリシルーＬ−フェニルアラニルグリシルアミノ）−９−エチル−５−フルオロ−２，３−ジヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３‘，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）−ジオン  （１７６ｍｇ，  Ｙ＝８６％）を黄色粉末として得る。    ＩＲ  （Ｎｕｊｏｌ）；  ３２５０，  １７４５，  １６６０，  １６０５，  １５３５  ｃｍ−１．  ＥＳＩ−ＭＳ；  ７５４  （Ｍ＋Ｈ）．
（３）３リットル３つ首丸底フラスコに酢酸緩衝液（０．１Ｍ，  ｐＨ５．５）（１０００  ｍｌ）を加える。  デキストラン  Ｔ−５００ＴＭ  （１０．０  ｇ，  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）を室温で少量づつ３０分間かけて緩衝液に加える。かくはんを、透明な液が得られるまで（約３０分）行い、その後水浴中で５℃（内温）まで冷却する。
１リットルフラスコに、過ヨウ素酸ナトリウム（３３．０ｇ）及び水（１０００ｍｌ）を加え、室温でかくはんし、その後５℃に冷却する。
上記デキストラン溶液に５℃にて上記過ヨウ素酸ナトリウム溶液をかくはんしながら加え、反応温度を５日間５℃に保つとともに暗所に保存する。過剰の過ヨウ素酸ナトリウムを除去するため、エチレングリコール（１０ｍｌ）加え、さらに５℃で２時間かくはんする。反応混合物を３℃に冷却し、８Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を６℃以下となるように調節しながら滴下する（反応混合物のｐＨが９以上となる）。反応混合物に水素化ホウ素ナトリウム（１４ｇ）をかくはんしながら少量づつ加え、５℃で終夜かくはんする。過剰の水素化ホウ素ナトリウムを除去するために、かくはん下、３〜６℃で、酢酸を加えて反応混合物のｐＨを５．５以下に調節し、さらに２時間かくはんする。反応混合物を８Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．８前後に調節する。反応混合物を水に対して透析（ＳｐｅｃｔｏｒａＴＭ／  Ｐｏｒ  ３  ｍｅｍｂｒａｎｅ，  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔｏｆｆ  ＜３５００）  した後、凍結乾燥して、デキストランポリアルコール（８．３４ｇ）を無定形粉末として得る。
（４）５００ｍｌ３つ首丸底フラスコに水（１５５ｍｌ）を加え、さらにデキストランポリアルコール（５．１８ｇ）を室温でかくはんしながら１０分間かけて加える。かくはんは、透明溶液が得られるまで（１０〜３０分間）行う。水酸化ナトリウム  （ｐｅｌｌｅｔ，  ９７．０％，  ２１．８ｇ）を少量づつデキストランポリアルコール溶液にかくはんしながら加える。その際、内温は、氷浴を用いて３０〜４０℃に保つ。    反応フラスコを水浴に浸して３０℃でかくはんする。クロロ酢酸（３１．１  ｇ）を少量づつ反応混合物にかくはんしながら３０〜４０℃で加える。添加完了後、水浴中で３０℃でかくはんを２０時間続ける。反応混合物を氷浴中に冷却し、かくはんしながら酢酸を加えて中性とする（ｐＨを９以下とする）。水（１６０ｍｌ）を加え、溶液を水に対して透析  （ＳｐｅｃｔｏｒａＴＭ／  Ｐｏｒ３  ｍｅｍｂｒａｎｅ，  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔｏｆｆ  ＜３５００）し、凍結乾燥してカルボキシメチルデキストランポリアルコール（６．５３ｇ）を無定形粉末として得る。
（５）１００ｍｌ１つ首丸底フラスコに水（４０ｍｌ）を加え、さらにカルボキシメチルデキストランポリアルコール（１．０ｇ）を室温でかくはんしながら５分間かけて加える。かくはんを透明な溶液が得られるまで（３０分間）続ける。さらに、（１Ｓ，９Ｓ）−１−（グリシルグリシルーＬ−フェニルアラニルグリシルアミノ）−９−エチル−５−フルオロ−２，３−ジヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３‘，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）−ジオンのジメチルホルムアミド溶液（１００  ｍｇ  ｉｎ  １０  ｍｌ）をかくはんしながら加え、ついでジメチルホルムアミド１５ｍｌを加え、さらに１０分間かくはんする。２−エトキシー１−エトキシカルボニルー１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）のジメチルホルムアミド溶液（１．０  ｇ  ｉｎ  １０  ｍｌ）  を室温でかくはんしながら滴下しさらに１８時間かくはんする。反応混合物を３度水ろ過  （ＳｐｅｃｔｏｒａＴＭ／  Ｐｏｒ  ３  ｍｅｍｂｒａｎｅ，  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔｏｆｆ  ＜３５００）    し、さらに陽イオン交換カラム（ＢｉｏＲａｄ  ＡＧＴＭ  ＭＰ−５０  カラム、  Ｎａ  ｔｙｐｅ，  ３０  ｍｌ）を通してで精製する。主要な画分を水に対して透析  （ＳｐｅｃｔｏｒａＴＭ／  Ｐｏｒ  ３  ｍｅｍｂｒａｎｅ，  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔｏｆｆ  ＜３５００）し、凍結乾燥して粗生成物を得る。粗生成物をアセトンで粉末化後、ろ取、乾燥して目的物（９０４ｍｇ）を淡黄色粉末として得る。
【００３０】
【発明の効果】
本発明によれば、エンドトキシンを含む多糖類からエンドトキシンを効率的に除去することができる。