(57)【要約】【課題】  液体回路内に気体が混入しても、核酸合成効率が低下しない核酸合成装置を提供する。【解決手段】  核酸合成装置１の反応カラム２の排出路２４に、排液路３０と排気路３１とに分かれる分岐部２８を設け、前記排気路３１にエアフィルタ１３を設ける。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応カラムの排出路に、排液路と排気路とに分かれる分岐部を設け、
前記排気路にエアフィルタを設けたことを特徴とする核酸合成装置。
【請求項２】
前記排気路は、前記分岐部から上方に延伸することを特徴とする請求項１に記載の核酸合成装置。
【請求項３】
前記排液路は、前記分岐路から水平方向よりも下向きに延伸することを特徴とする請求項１または２に記載の核酸合成装置。
【請求項４】
前記反応カラムを、複数有することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の核酸合成装置。
【請求項５】
試薬をガスで加圧して前記反応カラムに供給することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の核酸合成装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸合成装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１および２に記載されているようにＤＮＡやＲＮＡなどの核酸（ポリヌクレオチド）を合成する装置が公知であり、現在、特許文献３に記載されているような固相ホスホルアミダイト法による自動合成装置が汎用されている。さらに、特許文献４に記載されているように複数の反応カラムを並列に接続し、核酸の合成効率を高めたものも多く使用されている。固相ホスホアミダイト法は、ヌクレオチドを固定した支持体を包含する反応カラムに、所定の試薬を所定の順番に供給することで、前記ヌクレオチドに所定の塩基を有するヌクレオチドを１つずつ付加していくものである。このヌクレオチドの付加工程は、５’末端の脱保護と、所定の塩基を持つヌクレオチドのカップリングとを目的の核酸の塩基配列に従って繰り返す。こうして合成された核酸から、クロマトグラフィー分離などで所定の鎖長を有する核酸、つまり、反応カラムに供給したすべてのヌクレオチドが欠損なく結合した核酸だけを抽出する。
【特許文献１】特開昭６０−２３７０９７号公報
【特許文献２】特開平６０−５４３９８号公報
【特許文献３】特開平３−６８５９３号公報
【特許文献４】特公平８−２６０６１号公報
【０００３】
図４に、従来の核酸合成装置３１の流れ図を示す。核酸合成装置３１は、４つの反応カラム３２と、それぞれＡ，Ｇ，Ｃ，Ｔいずれかの塩基を有するヌクレオチドを含んだヌクレオチド試薬を供給する４つの試薬瓶３３と、溶媒を供給する試薬瓶３４と、５’脱保護のためのデブロック剤を供給する試薬瓶３５と、５’保護のためのキャッピング剤を供給する試薬瓶３６と、リン酸基の酸化するための酸化剤を供給する試薬瓶３７と、ヌクレオチドの結合反応を促進するための活性化剤を供給する試薬瓶３８とを装着可能である。核酸合成装置３１は、外部から供給されるガスをレギュレータ３９で圧力調整してガス供給電磁弁４０で分配し、切換弁を介して試薬瓶３３および試薬瓶３４〜３８に供給して試薬瓶３３〜３８内の試薬（及び溶剤等）を加圧するようになっており。さらに、圧力開放弁４１で試薬瓶３３内のガスを切換弁を介して外部に放出し、圧力を除去することもできる。前記ガスの圧力によって押し出される試薬は、試薬選択電磁弁４２に導入され、試薬選択電磁弁４２によっていずれか１つの試薬がカラム選択電磁弁４３に供給されるようになっている。カラム選択電磁弁４３は、各反応カラム３２の供給側の流路を任意に開閉して、反応を行う反応カラム３２を選択して前記試薬を供給できる。各反応カラム３２に供給された試薬は、反応に使用された後、廃液として排出路４４を通して核酸合成装置３１の外部に設置した廃液瓶４５に排出されるようになっている。
【０００４】
核酸合成装置３１による核酸の合成は、目的とする塩基配列の第１番目の塩基を有するヌクレオチドを固定したガラスビーズなどの支持体を封入した反応カラム３２を装着してから開始する。この反応カラム３２に、試薬瓶３５からデブロック剤を供給して５’末端を脱保護し、試薬瓶３４から溶媒を供給して洗浄し、試薬瓶３３からＡ，Ｇ，Ｃ，Ｔのいずれか、目的の塩基配列の２番目の塩基を有するヌクレオチドを含むヌクレオチド試薬と、試薬瓶３８から活性化剤とを供給して、第１番目のヌクレオチドに第２番目のヌクレオチドを結合させる。続いて、反応カラム３２に溶剤を供給して洗浄し、試薬瓶３６からキャッピング剤を供給して未反応の５’末端を保護して封鎖する。さらに、溶剤で洗浄し、試薬瓶３７から酸化剤を供給してリン酸基を安定化した後、再び溶剤で洗浄して、第２番目のヌクレオチドの結合安定化が終了する。同様の工程を繰り返すことにより、第３番目以降のヌクレオチドを順番に結合させて核酸を合成し、クロマトグラフィー分離などによって所定の鎖長を有する核酸のみを分離することで目的の塩基配列を有する核酸を得る。
【０００５】
このような核酸合成装置において、反応カラムに供給する試薬（溶剤を含む）の量は、できるだけ少ない方が経済的である。しかし、試薬の量を少なくしすぎると、所定のヌクレオチドが結合していない欠損状態が発生し易くなり、最終的な収率が悪くなるので結局は非効率となる。このため、核酸合成装置は、このようなヌクレオチドの欠損が発生しない最小限度の試薬で核酸を合成するように設計されており、試薬の供給量は、１００μｌ以下の極微量である場合も少なくない。特許文献１，２および４においても、微量の試薬を反応カラムへ安定して供給するため、機械的なポンプではなく、図４に示すように、ガスで試薬瓶を加圧して供給圧を得ている。微量の試薬を安定して供給量するために、ガスの供給圧力はさほど高くできず、０．１ＭＰａ程度である。
【０００６】
一般に、核酸合成装置では複雑な流路を構成するために装置内の液体回路および反応カラムから試薬を排出する排出路は、細い金属管や樹脂製のチューブでできている。前述のようなガス圧によって液体回路に供給される試薬は、反応カラムを通過した時には、流路抵抗によりほぼ圧力が失われている。反応カラムから排出された試薬（廃液）は、通常、装置本体よりも下に設置される廃液瓶に自重によって樹脂チューブを通して排出されるのが一般的である。
【０００７】
図５に、樹脂製のチューブからなる排出路４４を接続した反応カラム３２の形態を示す。反応カラム３２は、筒体４６の両端にフィルタ４７を配置して蓋体４８で挟み込み、ナット４９で締め付けて固定している。この筒体４６の内部が、ヌクレオチドを固定した支持体を封入して核酸を合成する反応室３２ａである。蓋体４８はフィルタ４７を介して反応室３２ａと連通する筒状のノズル部４８ａを有している。下側のノズル部４８ａには、ねじ継手５０が嵌合されており、上側のノズル部４８ａには、排出路４４が接続されたチューブ継手５１が嵌合されている。
【０００８】
このような反応カラム３２を有する核酸合成装置３１において、加圧のためのガスや外部の空気などが液体回路に混入し、反応カラム３２を通過して排出路４４に排出されることがある。すると、細い排出路４４の中に気泡が入り込むことになるが、廃液瓶４５に到る下向きの流路において、気泡は、液の中を流れに逆らって上昇しようとする。廃液を廃液瓶４５に排出するには、流路内の気泡を、試薬の液圧によって下向きに押し流さなければならず、このような気泡の存在は、核酸合成装置３１の液体回路に対する不規則な背圧となる。時として、排出路４４の長さは１ｍ以上になり、こうして流体回路に背圧が加えられることによって、反応カラム３２内での試薬の流れが乱れるため、予定された反応が十分に行われずに最終的に核酸の収率が悪くなるという問題があった。また、複数の反応カラムを並列に接続している場合には、一部の反応カラム３２の排出路４４に気泡が混入すると、反応カラム３２の間に流路抵抗のばらつきが生じ、試薬の流量に偏りが発生するので、核酸合成の効率がさらに低くなる問題があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、液体回路内に気体が混入しても、核酸合成効率が低下しない核酸合成装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明による核酸合成装置は、反応カラムの排出路に、排液路と排気路とに分かれる分岐部を設け、前記排気路にエアフィルタを設けたものとする。
【００１１】
また、本発明の核酸合成装置において、前記排気路は、前記分岐部から上方に延伸してもよく、前記排液路は、前記分岐路から水平方向よりも下向きに延伸してもよい。
【００１２】
また、本発明の核酸合成装置は、前記反応カラムを複数有してもよい。
【００１３】
また、本発明の核酸合成装置において、試薬をガスで加圧して前記反応カラムに供給してもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、核酸合成装置の液体回路内に混入した気泡は、反応カラムの排気路からエアフィルタを通して核酸合成装置の外部に排出されるので、廃液のみが排液路を流れる。このため、排液路には、気泡による流路抵抗がないので、反応カラムに背圧が加わらず、試薬の流れに乱れが生じない。このため、液体回路に気泡が混入しても、核酸の合成効率が低下しない。また、排気路にエアフィルタを設けているので、外部の塵埃や微生物が、核酸合成装置の液体回路内に侵入して汚染することがない。
【００１５】
また、気泡は、廃液中を上向きに上昇しようとするので、分岐部から上方に延伸する排気路に進入し易く、分岐部から水平方向よりも下向きに延伸する排液路には進入し難い。このため、排液路に気泡が混入せず、異常な背圧が発生しないので核酸の合成効率が低下しない。
【００１６】
また、反応カラムによって圧力が異なることがないので、複数の反応カラム間で試薬の流れが偏ることがない。このため、複数の反応カラムを有していても、混入した気泡による核酸合成効率が低下しない。
【００１７】
また、機械的なポンプに比べて、圧力変動によって流量が変化し易いガス圧により試薬を供給しても、液体回路内に混入した気泡によって核酸合成効率が低下しない。
【００１８】
以上のように、本発明による核酸合成装置は、液体回路内に気体が混入しても排液路に気泡が流入せず、液体回路内に異常な背圧が発生しないので核酸合成効率が低下しない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
図１に、本発明の実施形態である核酸合成装置１の正面を示すとともに、図２に、カバーを取り外した核酸合成装置１の側面を示す。核酸合成装置１は、前後２列、各８本、合計１６本の反応カラム２と、９本のヌクレオチド試薬瓶３と、活性化剤試薬瓶４と、２本のキャッピング剤試薬瓶５と、１本の酸化剤試薬瓶６と、１本のデブロック剤試薬瓶７と、２本の溶剤試薬瓶８とが装着可能である。反応カラム２の供給側端部は、装置内に固定したねじ継手９に装着され、反応カラム２の排出側端部には、分岐継手１０を介して廃液チューブ１１が取り付けられている。分岐継手１０には、接続ホース１２によってエアフィルタ１３が取り付けられており、分岐継手１０は、上下方向に移動可能であり、反応カラム２の着脱交換が可能である。１６本の反応カラム２にそれぞれ装着した分岐継手１０に一端を接続した１６本の廃液チューブ１１は、１本に束ねられて、他端が核酸合成装置１の外部に設置した廃液瓶（不図示）に挿入される。また、核酸合成装置１は、作動圧力源となるガスを供給するためのガス接続口１４と、ガス圧力を調節するレギュレータ１５と、ガス圧力を確認するための圧力計１６とを有し、ガス供給電磁弁１７によって分配、接続して試薬瓶２〜８を加圧している。さらに、各試薬瓶２〜８からの流路のいずれかを選択して反応カラム２に接続する試薬選択電磁弁１８と、反応カラム２の供給側の流路を開閉して、核酸合成を行う反応カラムを選択するカラム選択電磁弁１９とを有している。
【００２０】
図３に、本発明の実施形態の核酸合成装置１の反応カラム２、分岐継手１０およびエアフィルタ１３の詳細を示す。カラム２は、下端にねじ継手９が嵌入され、上端で分岐継手１０に嵌入しており、分岐継手１０は、側部に横方向やや下側から廃液チューブ１１が挿入され、上端に接続ホース１２によってエアフィルタ１３が取り付けられている。
【００２１】
カラム２は、筒体２０の両端にフィルタ２１を配置して蓋体２２で挟み込みナット２３で締め付けて固定している。この筒体２０の内部が、末端のヌクレオチドを固定した支持体を封入して、核酸を合成する反応室２ａである。蓋体２２はフィルタ２１を介して反応室２ａと連通する筒状のノズル部２２ａを有している。下側の蓋体２２のノズル部２２ａにはねじ継手９が嵌入されており、上側の蓋体２２のノズル部２２ａは分岐継手１０に嵌入している。
【００２２】
分岐継手１０は、内部に垂直な排出路２４を有する本体２５を有し、本体２５の下端は、反応カラム２のノズル部２２ａと嵌合する嵌合部２６になっており、上端は、接続ホース１２に挿入するホースニップル部２７になっている。また、本体２５の分岐部２８に、廃液チューブ１１が挿入され、チューブコネクタ２９によって固定されている。分岐部２８には、排出路２４から水平方向よりも下向きに傾斜して延伸するにように接続した排出路３０が設けられ、排出路２４と廃液チューブ１１の内部流路とを連通させている。また、ホースニップル部２７の内部は、分岐部２８から上方に延伸する排気路３１になっており、エアフィルタ１３に連通している。
【００２３】
エアフィルタ１３は、内部に空間を構成する上下２分割のハウジング１３ａ，１３ｂとからなり、ハウジング１３ａ，１３ｂの間には、内部の空間を２分割するように目開き０．２２μｍのメンブレンフィルタ１３ｃが挟みこまれている。上側のハウジング１３ａは、上部に開口する開口部１３ｄを有し、下側のハウジング１３ｂは、下向きに延伸するホースニップル部１３ｅを有し、一端に分岐継手１０のホースニップル部２７を嵌入したホースの他端に嵌入して、排気路３１をエアフィルタ１３のメンブレンフィルタ１３ｃを介して外部に連通させている。
【００２４】
本実施形態の核酸合成装置１において、デブロック剤はトリクロロ酢酸３％溶液、活性化剤はテトラゾール、キャッピング剤は無水酢酸とイミダゾール、酸化剤はヨウ素水、溶剤はアセトニトリルを使用する。また、作動源のガスとしてアルゴンガスを供給し、レギュレータ１５によって圧力が０．１ＭＰａになるよう設定してある。
【００２５】
核酸合成装置１による核酸の合成は、目的とする塩基配列の一端の塩基を有するヌクレオチドを固定した直径およそ１００μｍの多孔質ガラスビーズ支持体を封入した反応カラム２の一端をねじ継手９に嵌入し、目的とする塩基配列に対応する（通常は、Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔの４本で一組）保護基で保護されたヌクレオチド（アミダイト）を含むヌクレオチド試薬の試薬瓶３と、活性化剤、キャッピング剤、酸化剤、デブロック剤および溶剤の試薬瓶４〜８とを装着することで可能になる。先ず、反応カラム２に、試薬瓶７からデブロック剤を供給して第１番目のヌクレオチドの５’末端を脱保護し、試薬瓶８から溶媒を供給して洗浄し、ヌクレオチド試薬瓶３からＡ，Ｇ，Ｃ，Ｔのいずれか、第２番目の塩基を有するヌクレオチド試薬と、試薬瓶４から活性化剤とを供給して、第１番目のヌクレオチドに第２番目のヌクレオチドを結合させる。続いて、反応カラム２に溶剤を供給して洗浄し、試薬瓶５からキャッピング剤を供給して未反応の５’水酸基をアセチル化して除去する。さらに、溶剤で洗浄し、試薬瓶６から酸化剤を供給してリン酸基を安定化した後、再び溶剤で洗浄して、第２番目のヌクレオチドの結合安定化が終了する。同様の工程を繰り返すことにより、第３番目以降のヌクレオチドを順番に結合させて核酸を合成し、クロマトグラフィー分離などによって所定の鎖長を有する核酸のみを分離することで目的の塩基配列を有する核酸が得られる。
【００２６】
次に、分岐継手１０およびエアフィルタ１３を取り付けた反応カラム２の作用について説明する。核酸合成の際、反応カラム２および排出路２４の分岐部２８までは、廃液（反応カラム２から排出された使用済みの試薬及び溶剤）によって満たされており、分岐部２８から自重によって、排出路３０から廃液チューブ１１を通して流れ落ちる。試薬は、アルゴンガスによって加圧されて供給されるが、排出路２４に到ったときには、流路抵抗のためにほぼ圧力を喪失しており、排気路３１を通って上部に流れ出ることはできない。ここで、液体回路内にアルゴンガスや空気などの気体が混入し、反応カラム２に流入した場合、反応カラム２から排出された気体は、排出路２４を気泡となって上昇し、分岐部２８に到る。前述のように、分岐部２８において、廃液を積極的に排液路３０に押し込む圧力は存在せず、廃液が、前記気泡を抱き込んだまま排液路３０に流れ込むことはない。このため、廃液に含まれる気体は、分岐部２８において、廃液から分離され、排気路３１を上昇してエアフィルタ１３に到る。そして、エアフィルタ１３に到達した気体は、メンブレンフィルタ１３ｃを通過して開口部１３ｄから外部に放出される。このように、排出路３０には、気泡が流入しないので、廃液チューブ１１内で気泡が流路抵抗となることがない。これにより、反応カラム２および核酸合成装置１の液体回路全体に異常な背圧が加わることがないので、反応カラム２の内部を試薬が設計どおりに流れ、核酸合成の効率が高く保たれる。
【００２７】
本実施形態のように、核酸合成装置１が複数の反応カラム２を有しており、複数の反応カラムを同時に使用して一度に多くの核酸を合成する場合には、一部の反応カラム２だけに排出路に気泡による背圧が発生し、反応カラム２の圧力がばらついて一部の反応カラム２に試薬の流れが偏るために、試薬が十分に供給されない反応カラム２において核酸合成効率が低下するという問題が発生しないので、本発明は特に好ましい。
【００２８】
核酸合成装置１において、万一、レギュレータ１５の故障などのトラブルによって反応カラム２および排出路２４での試薬の圧力が異常に上昇した場合、試薬は、排気路３１を通ってエアフィルタ１３の内部に流入するが、メンブレンフィルタ１３ｃは、気体を通過させるが、液体を通過させないので、廃液チューブ１１を通して廃液ビンに排出され、試薬が核酸合成装置１の内部にあふれ出すことがない。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の実施形態である核酸合成装置の正面図。
【図２】カバーを外した図１の核酸合成装置の側面図。
【図３】図１の核酸合成装置の部分断面図。
【図４】従来の核酸合成装置の流れ図。
【図５】図４の核酸合成装置の部分断面図。
【符号の説明】
【００３０】
１  核酸合成装置
２  反応カラム
１３  エアフィルタ
２４  排出路
２８  分岐部
３０  排液路
３１  排気路
【図１】
2005272371.tif 000003
【図２】
2005272371.tif 000004
【図３】
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【図４】
2005272371.tif 000006
【図５】
2005272371.tif 000007