(57)【要約】【課題】骨内微小循環障害に起因する疾患に有効な予防及び／又は治療剤を提供する。【解決手段】非ステロイド性抗炎症薬を有効成分として含有する骨内微小循環障害に起因する疾患の予防及び／又は治療剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ステロイド性抗炎症薬を有効成分として含有する骨内微小循環障害に起因する疾患の予防及び／又は治療剤。
【請求項２】
上記骨微小循環障害に起因する疾患が骨壊死である請求項１記載の予防及び／又は治療剤。
【請求項３】
上記骨壊死が、骨頭壊死、多発性骨壊死、大腿骨頭壊死、特発性大腿骨頭壊死及び特発性膝骨壊死からなる群から選択される少なくとも１種である請求項２記載の予防及び／又は治療剤。
【請求項４】
上記骨壊死がステロイド剤誘発性骨壊死である請求項２又は３記載の予防及び／又は治療剤。
【請求項５】
上記非ステロイド性抗炎症薬がＣＯＸ阻害薬である請求項１〜４のいずれか一項記載の予防及び／又は治療剤。
【請求項６】
上記ＣＯＸ阻害薬がＣＯＸ−２阻害薬である請求項５記載の予防及び／又は治療剤。
【請求項７】
骨髄内細動脈及び／又は抵抗血管の拡張を抑制する請求項１〜７いずれか一項記載の予防及び／又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨内微小循環障害に起因する疾患の予防及び／又は治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
特発性大腿骨頭壊死は、その罹患により股関節が破壊され、起立性歩行障害等、ＱＯＬが著しく低下する疾患であり、壮年期成人に好発することで知られている。本疾患の病因に関しては、明らかではないが、副腎皮質ホルモン剤（ステロイド剤）投与歴やアルコール愛飲歴が危険因子として注目されている。しかしながら、特に、本疾患の発症に至る病態の詳細は未だ明らかでなく、治療方法及び予防方法のいずれも確立されていない。
【０００３】
ところで、ステロイド剤は、抗炎症薬として、膠原病、慢性関節リウマチ、アレルギー疾患の治療に広く用いられている。ステロイド剤の使用により誘発される特発性大腿骨頭壊死症（ステロイド性特発性大腿骨頭壊死症）は、骨粗鬆症と同様に、ステロイド剤の副作用のひとつとみなされている。ステロイド剤の使用により誘発される特発性大腿骨頭壊死の発症機序には、いくつかの仮説がある。例えば、ステロイド剤投与による血液凝固能亢進や高脂血症が病因であるとの説、あるいは、骨内微小循環障害が病因であるとの説もあるが、いずれも未だ確立されていない。
【０００４】
ステロイド剤が骨内微小循環に与える影響は明らかにされておらず、障害発生のメカニズムは不明のままである。生体各組織の局所血流量は、各組織に分布する抵抗血管である細動脈の収縮や拡張によって直接的に調節されていることが知られているが、骨内微小循環、すなわち骨髄内を走行する細動脈ならびに抵抗血管の機能的相互作用は明らかにされていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、どのような薬物が骨内微小循環障害を抑制し、その結果、特発性大腿骨頭壊死等に代表される骨内微小循環障害に起因する疾患を予防または治療薬となるのかは全く不明であった。
そこで、本発明は、骨内微小循環障害に起因する疾患の発症メカニズムを解明し、骨内微小循環障害に起因する疾患に有効な予防及び／又は治療剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成するため、本発明者らは、骨内微小循環に対するステロイド剤の障害作用を明らかにすることが必須であると考え、骨内微小血管の運動機能（収縮、弛緩）に対するステロイド剤の影響を鋭意検討した。その結果、本発明者らは、ステロイド高負荷の状態によりＣＯＸ−２が誘導され、抵抗血管の拡張が生じること、抵抗血管の拡張は骨髄内に炎症性充血、水分透過性亢進、浮腫、骨髄内静水圧上昇、骨髄内細静脈圧平現象をもたらし、結果として骨内微小循環が障害されていることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）非ステロイド性抗炎症薬を有効成分として含有する骨内微小循環障害に起因する疾患の予防及び／又は治療剤。
（２）上記骨微小循環障害に起因する疾患が骨壊死である（１）記載の予防及び／又は治療剤。
（３）上記骨壊死が、骨頭壊死、多発性骨壊死、大腿骨頭壊死、特発性大腿骨頭壊死及び特発性膝骨壊死からなる群から選択される少なくとも１種である（２）記載の予防及び／又は治療剤。
【０００８】
（４）上記骨壊死がステロイド剤誘発性骨壊死である（２）又は（３）記載の予防及び／又は治療剤。
（５）上記非ステロイド性抗炎症薬がＣＯＸ阻害薬である（１）〜（４）のいずれか一記載の予防及び／又は治療剤。
（６）上記ＣＯＸ阻害薬がＣＯＸ−２阻害薬である（５）記載の予防及び／又は治療剤。
（７）骨髄内細動脈及び／又は抵抗血管の拡張を抑制する（１）〜（７）いずれか一項記載の予防及び／又は治療剤。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＣＯＸ−２阻害薬等の非ステロイド性抗炎症薬が抵抗血管の拡張を阻害することで、ステロイド剤によって誘導された骨内微小循環障害を改善するといった知見に基づき、骨内微小循環障害に起因する疾患の予防及び／又は治療剤を提供する。すなわち、本予防及び／又は治療剤は、非ステロイド性抗炎症薬を有効成分として含有している。
【００１０】
ここで、骨内微小循環とは、骨内、特に骨髄内に発達した動脈および静脈から構築される血管網を意味し、特に、毛細血管によって構築された血管網を意味する。毛細血管は、多くの場合３次元的な網を形成しているが、毛細血管領域が１本の動脈、すなわち、側副枝（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）を持たない動脈によって支配されている場合、終動脈（ｅｎｄ−ａｒｔｅｒｙ）と呼ばれ、当該終動脈の閉塞は、当該毛細血管領域の壊死を招くことになる。肝臓、骨髄、脾臓では特徴的な毛細血管が形成されており、洞様毛細血管（ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ  ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ）といわれる。
【００１１】
例えば、抵抗血管の拡張が発生すると骨髄内に炎症性充血、水分透過性亢進、浮腫、骨髄内静水圧上昇、骨髄内細静脈圧平現象をもたらし、その結果、骨内微小循環障害に至る。骨内微小循環障害に至ると、骨組織や骨髄に充分な栄養や酸素を供給することができず、骨壊死が生じることになる。すなわち、骨内微小循環障害に起因する疾患とは、骨壊死を含む意味である。
【００１２】
骨壊死とは、骨組織の無菌性壊死を意味しており、壊死の発生部位、あるいは発生の仕方により、骨頭壊死、多発性骨壊死、大腿骨頭壊死、特発性大腿骨頭壊死、特発性膝骨壊死等が含まれる。特に、特発性大腿骨頭壊死は、非外傷性に大腿骨頭の無菌性、阻血性の壊死をきたした疾患であり、大腿骨頭の圧潰変形が生じると二次性の股関節症にいたる。なお、特発性大腿骨頭壊死には、ステロイド剤およびアルコール愛飲に関連した症例も含まれている。
また、骨壊死が骨端部や骨頭部に生じると関節障害につながり、著しいＱＯＬ（ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ）の低下を招く。特に、体重のかかる大腿骨の骨頭部に壊死（大腿骨頭壊死）が生じると歩行障害に至る。
【００１３】
また、骨壊死は、ステロイド剤の長期投与や大量短期間投与に合併する疾患であると知られている。ステロイド剤の長期投与や大量短期間投与によって、大腿骨頭が最も頻繁に侵されるが、他の大きな関節も影響を受ける。関節痛と関節の硬直が初期症状として認められる。特に、ステロイド剤によって惹起された骨壊死をステロイド性骨壊死とよぶ。すなわち、骨壊死は、ステロイド性骨壊死も含む意味である。
【００１４】
ここで、ステロイド剤とは、糖質コルチコイド（グルココルチコイド）を意味し、構造上ステロイド骨格を有し、かつ抗炎症作用を有する化合物、あるいは当該化合物を有効成分として含有する医薬品を意味する。ステロイド剤としては、例えば、コルチゾール（ｃｏｒｔｉｓｏｌ）、テトラヒドロコルチゾール（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｌ）、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｏｎｉｓｏｌｏｎｅ）、メチルプレドニゾロン（６−ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、フルドロコルチゾン（ｆｌｕｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、デスオキシコルチゾール（１１−ｄｅｓｏｘｙｃｏｒｉｔｓｏｌ）、コルチゾン（ｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、コルチコステロン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ）、トリアムシノロン（ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ）、パラメタゾン（ｐａｒａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、ベタメタゾン（ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）等が挙げられる。
【００１５】
１．非ステロイド性抗炎症薬
本発明に係る予防及び／又は治療剤に含まれる非ステロイド性抗炎症薬（「ＮＳＡＩＤ」と称する。）は、構造上ステロイド骨格を有さず、かつ抗炎症作用、例えば、解熱、鎮痛作用を有する化合物又は当該化合物を有効成分として含有する医薬品を含む意味である。非ステロイド性抗炎症薬は、古くから知られている医薬品であり、限定されないが、例えば、アスピリン（ａｓｐｉｒｉｎ）、フェニルブタゾン（ｐｈｅｎｙｌｂｕｔａｚｏｎｅ）、アンチピリン（ａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ）、アセトアミノフェン（ａｃｅｔｏａｍｉｎｏｐｈｅｎ）、フェナセチン（ｐｈｅｎａｃｅｔｉｎ）、インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）、スリンダック（ｓｕｌｉｎｄａｃ）、メフェナム酸（ｍｅｆｅｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、トルメチン（ｔｏｌｍｅｔｉｎ）、イブプロフェン（ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ）、ナプロキセン（ｎａｐｒｏｘｅｎ）、ケトプロフェン（ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ）、ピロキシカム（ｐｉｒｏｘｉｃａｍ）、ジクロフェナック（ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ）等を例示することができる。
【００１６】
これら列挙したＮＳＡＩＤを含め、非ステロイド性抗炎症薬として広く用いられている薬剤の多くは、その作用機序として、シクロオキゲナーゼ（「ＣＯＸ」と称する。）阻害作用を有している。ＣＯＸは、アラキドン酸に２分子の酸素を付加してプロスタグランジンＧ２を生成する反応とプロスタグランジンＧ２からプロスタグランジンＨ２を生成するヒドロペルオキシダーゼ反応の二つの反応を触媒する酵素であり、プロスタグランジン・エンドペルオキシド・シンターゼとも呼ばれる。
【００１７】
プロスタグランジンＧ２から作られるプロスタグランジンＨ２から、炎症反応に重要な役割を果たしているプロスタグランジンＥ２やプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）が産生される。また血小板おいてはＣＯＸの作用によりトロンボキサンＡ２が産生され、これが変化してできるトロンボキサンＢ２も炎症に一定の役割を果たすと考えられている。したがって、本予防及び／又は治療剤において、非ステロイド性抗炎症薬は、ＣＯＸ阻害作用を有するＣＯＸ阻害薬であることが好ましい。
【００１８】
最近、ＣＯＸ阻害薬としては、炎症性サイトカインなどによる刺激で短時間で誘導される新しいアイソザイムが見つかっている。従来見つかっていた酵素は１型（ＣＯＸ−１）、新しく見つかったアイソザイムは２型（ＣＯＸ−２）と呼ばれている。ＣＯＸ−２は、炎症時に誘導され、通常ではほとんど発現しいない。本予防及び／又は治療剤において、非ステロイド性抗炎症薬は、ＣＯＸ−２に対してのみ特異的に阻害するＣＯＸ−２阻害薬であることがより好ましい。
【００１９】
非ステロイド性抗炎症薬としてＣＯＸ−２阻害薬を用いた場合には、ＣＯＸ−１に対する阻害作用を低減することができ、非ステロイド性抗炎症剤の副作用を軽減することができる。ＣＯＸ−２阻害薬としては、ＮＳ−３９８、メロキシカム（Ｍｅｌｏｘｉｃａｍ）及びセレコシキブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）等を例示することができる（炎症と免疫、３（１），  ２９−３６  （１９９５）；  ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  ５（８），  ８６７−８７２  （１９９５）；  日本薬理学雑誌、１０９（６），  ２４７−２５８  （１９９７）；  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４７，  Ｓ１０７−１１１（１９９８）；  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １０７（６Ａ），  １１Ｓ−１６Ｓ  （１９９９））。
【００２０】
ＣＯＸ阻害薬の活性を測定する方法及びスクリーニング方法は、当業者によく知られているが、具体的には、トロンボキサンＢ２が安定な化合物であり、ＣＯＸ活性を反映することから、トロンボキサンＢ２を指標とする方法を挙げることができる。
【００２１】
例えば、ＣＯＸ−２阻害薬の活性を測定する方法及びスクリーニング方法は、当業者によく知られているが、例えば、ヒト抹消血を用いてＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２に対する阻害活性をそれぞれ測定し、ＣＯＸ−２への選択性を測定する方法を例示することができる。すなわち、ＣＯＸ−１阻害活性を測定するためには、健常人より採取した抹消血５００μｌに被験物質を添加し、３７℃で４時間インキュベートする。ついでカルシウムイオノフォアＡ２３１８７を最終濃度が５００μＭとなるように加え、３７℃で３０分間インキュベートし、氷上に移して反応を停止させる。
【００２２】
ＣＯＸ−２の阻害活性を測定する場合には、同様に被験物質を添加したヒト抹消血にＬＰＳ（Ｅ．Ｃｏｌｉ０２６：Ｂ６）を最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるように加え、３７℃で５時間インキュベートし、氷上に移して反応を停止させる。反応を停止させたサンプルを遠心分離（１５０Ｇ、１０分間）した後、上清に含まれるトロンボキサンＢ２量を測定すればよい。トロンボキサンＢ２量の測定はトロンボキサンＢ２  ＥＩＡキット（Ｃａｙｍａｎ社製）を用いればよい。
【００２３】
被験物質の活性を比較するにはＩＣ５０値を算出すればよい。ＩＣ５０値を算出するには、溶媒コントロール（上記と同様の操作にて、被験物質を加えずに調製したもの）の値を１００％として、５０％阻害活性を示す濃度を求めればよい。
【００２４】
本予防及び／又は治療薬において、非ステロイド性抗炎症薬として使用するＣＯＸ−２阻害薬は、好ましくはＩＣ５０値が１０ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下、さらに好ましくは１００ｎＭ以下、最も好ましくは１０ｎＭ以下である。また、ＣＯＸ−２阻害薬は、ＣＯＸ−１阻害活性と比較してＣＯＸ−２の阻害活性の方が１０倍以上強いことが好ましく、より好ましくは１００倍以上、最も好もしくは１０００倍以上活性が強いことである。
【００２５】
２．本予防及び／又は治療薬の用途
本予防及び／又は治療薬は、骨微小循環障害に起因する疾患として例えば、骨壊死の予防及び／又は治療を目的として使用することができる。骨壊死としては、例えば、骨頭壊死、多発性骨壊死、大腿骨頭壊死、特発性大腿骨頭壊死及び特発性膝骨壊死等が挙げられ、これらの疾患を単独で又は複数発症したもの、あるいは他の疾患と合併したものも含まれる。
【００２６】
本予防及び／又は治療剤は、通常の製剤化技術を用いて製剤化することができ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，米国）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。剤型としては錠剤、カプセル剤、顆粒剤、座剤、クリーム剤、軟膏、乳剤、水溶液、貼付剤等を使用することができる。さらに、製剤化において通常使用される添加成分である賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、安定化剤、保存剤、浸透圧調節剤、基剤等、薬学的に許容できる添加剤を使用することができる。このような担体および医薬添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
【００２７】
実際の添加物は、本発明の抑制剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、これらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ  ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
【００２８】
本予防及び／又は治療薬において、投与経路としては経口であっても非経口であってもよく、非経口投与としては、静脈内投与、経粘膜投与、経皮投与、経肺投与等が挙げられる。経口投与量としては、例えば、ＣＯＸ−２阻害活性等に応じて適宜選択することができるが、１日あたり１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは１０ｍｇ〜５００ｍｇ、さらに好ましくは３０ｍｇ〜３００ｍｇ、最も好ましくは５０ｍｇ〜１００ｍｇである。但し、上記治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
【００２９】
３．骨髄内細動脈及び／又は抵抗血管の摘出及び灌流標本の作製
本予防及び／又は治療薬は、骨髄内細動脈及び／又は抵抗血管の拡張を抑制することができる。以下、本予防及び／又は治療薬において使用する非ステロイド性抗炎症薬について、骨髄内細動脈及び／又は抵抗血管の拡張を抑制する作用を確認する方法を説明する。
【００３０】
（１）  骨の採取
骨の採取源としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、サル、ブタ（ミニブタを含む）等の実験動物が挙げられ、ヒトから摘出した手術材料を用いることもできる。骨の種類は特に限定されるものではなく、任意の箇所から採取することができるが、大腿骨、上腕骨、脛骨等が好ましい。以下、大腿骨を例に説明する。
まず、動物をペントバルピタール等の麻酔薬で処理して麻酔・屠殺し、大腿に付着する皮膚・筋・靭帯をすべて取り除いて大腿骨を露出・摘出する。摘出した大腿骨は、使用するまで冷却したクレブス液（約４℃）中に保管しておく。
【００３１】
次に、モスキート紺子を用いて大腿骨長軸方向に力をかけ、大腿骨長軸に沿って亀裂を入れる。そして、亀裂を入れた大腿骨をペトリ皿（約４℃のクレブス液を含む）に入れる。なお、骨の把持固定を容易にさせるため、ペトリ皿をシリガード（商品名、シリコンをラバー状にしたもの）等でコートしておくことが好ましい。
【００３２】
（２）  骨髄内細動脈、抵抗血管の摘出
（１）により調製した大腿骨について、実体顕微鏡下、マイクロサージカル用の攝子（市販の攝子をさらにグラインダーで磨いだもの）を用いて大腿骨を剥がし骨髄を露出させる。シリンジ（２７Ｇの針を付けたもの）にクレブス液（約４℃）を吸引し、そのクレブス液で骨髄内を洗浄し、血管に付着する骨髄細胞成分を取り除く。以上の操作により血管網が現われるため、そのうち細動脈及び／又は抵抗血管を、実体顕微鏡下で、マイクロ尖頭及びマイクロサージカル用攝子を用いて摘出する。
【００３３】
（３）  細動脈へのカニューレ装着及び内圧負荷
骨髄内細動脈及び抵抗血管灌流標本を調製するための操作の概略を図１に示す。以下の操作は、図１に示すように顕微鏡１の下で行うことが好ましい。なお、以下では骨髄内細動脈（以下、細動脈と称する。）を例示する。
【００３４】
図１において、標本を調製するための操作は、まず、前記の通り摘出した細動脈１０を臓器槽（ｖｅｓｓｅｌ  ｃｈａｍｂｅｒ）９に入れてカニュレーションを施すことから開始する。
細動脈流入路側の微小ガラスピペット１１（外径５０μｍ程度のもの）に細動脈１０を装着し、ナイロン糸（１０μｍ程度のもの）を用いて結紮・固定する。続いて細動脈流入路に連結するタイゴンチューブ（Ｔｙｇｏｎ  ｔｕｂｅ）１３を通じて、シリンジ１５により静水圧を負荷し、細動脈内腔に含まれる血液を洗浄・除去する。洗浄液はクレブス液、生理食塩水等が使用される。
【００３５】
この静水圧を負荷した状態で、細動脈流出路側の微小ガラスピペット１２（外径５０μｍ程度のもの）に細動脈１０を装着し、ナイロン糸（１０μｍ程度のもの）を用いて結紮・固定する。
【００３６】
細動脈流出路に連結するタイゴンチューブ１４に三方活栓１７を装着し、流出路を閉鎖する。また、マニュピレーター１８によって、標本を生体長方向に伸長し、固定する。一方、細動脈流入路に連結するタイゴンチューブ１３はシリンジ１５に連結され、シリンジの高さを上下することによって、標本作製操作中、標本の内圧を維持する。標本の内圧は、２０〜６０ｍｍＨｇ、好ましくは４０ｍｍＨｇである。
【００３７】
ＰＳＳ液２２は、ポンプ２１により輸送管１９を介して灌流液として臓器槽９に供給される。従って、前記の通り調製された骨髄内細動脈灌流標本の外腔側をクレブス液により持続的に灌流し（１２ｍｌ／分）、灌流液は水流式の吸引機にて回収・廃棄する。クレブス液２２には、混合ガスボンベ２３により９５％酸素と５％二酸化炭素との混合ガスが供給されている。
【００３８】
なお、ポンプ２１から供給されたクレブス液２２は、熱交換器２０により所定温度に調節される。クレブス液２２は、ｐＨ７．３５〜７．４５、好ましくは７．４に、温度は３６．５〜３７．５℃、好ましくは３７℃に維持しておく。薬物は、灌流方法と同様の操作により、所定の濃度の薬物を外腔投与する。
【００３９】
灌流標本は、顕微鏡１のステージ２に静置されており、顕微鏡観察が可能である。また、ビデオカメラにより標本を撮影することができる（ビデオ顕微鏡システムともいう）。図１において、ＣＣＤカメラ３は、顕微鏡１により拡大された標本像を撮影するためのカメラである。骨髄内細動脈灌流標本は、顕微鏡１のレンズ１６を通してＣＣＤカメラ３により撮影される。ＣＣＤカメラ３からの信号は、ＶＣＲ（カメラ画像の録画・記録装置）４に入力され、ＶＣＲ４からの信号は、内径測定装置であるビデオカリパ（Ｖｉｄｅｏ  ｃａｌｉｐｅｒ）５に入力される。ビデオカリパ５は、エッジ検出システム（ｅｄｇｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（画像辺縁部を輝度変化と閾値レベルから設定し、口径を測定するシステム）を応用したものであり、内径変化を時系列的に自動測定することができる。また、その分解能は０．４μｍである。ビデオカリパ５からの情報は、チャートレコーダー７及びパーソナルコンピューター８に同時出力され、標本の像変化及び内径変化の実測値を記録するとともに、モニター６から写し出された映像を観察することができる。
これにより、本予防及び／又は治療剤について、骨髄内細動脈及び抵抗血管の拡張を抑制する作用を確認することができる。
【００４０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が制限されるものではない。
〔実施例１〕  抵抗血管の拡張に対する抑制試験
（１）方法
骨内微小循環障害モデル動物として、グルココルチコイド（メチルプレドニゾロン：ＭＰＳＬ）を投与した家兎を作出した。グルココルチコイド（メチルプレドニゾロン：ＭＰＳＬ）投与家兎は、雄の日本白色家兎にＭＰＳＬを２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで三日間連続投与することにより作出した。これらの家兎をＭＰＳＬ群とした。コントロール群には無処置の家兎を用いた。各々の家兎から大腿骨内の抵抗血管（内径約２００μｍ）を摘出し、標本を作製した。
【００４１】
抵抗血管灌流標本の作製は、既報告の方法に準じた（水野雄介ほか：厚生省特定疾患対策研究事業  骨・関節系調査研究班  特発性大腿骨頭壊死調査研究分科会  平成１１年度研究報告書、１１−１５  （１９９９））。すなわち、家兎をペントバルビタールの腹腔内投与にて麻酔、屠殺後、大腿骨を露出、摘出し、クレブス液（４℃）に浸した。大腿骨長軸方向に沿って亀裂を入れ、骨髄を露出し、クレブス液で骨髄内を洗浄することで、血管に付着する骨髄細胞成分を除去した。得られた血管網から、抵抗血管を実体顕微鏡下に摘出した。摘出した標本を灌流標本装置の臓器槽に固定し、静水圧を負荷して血管内腔に含まれる血液を洗浄、除去した。尚、標本の内圧は、４０ｍｍＨｇに維持し、外腔側は、９５％酸素５％二酸化炭素で飽和したクレブス液（ｐＨ７．４、３７℃）を１２ｍｌ／分の速度で持続的に灌流した。後述する薬物は外腔側の灌流液に添加した。標本の径は、対物レンズ、撮影レンズ、ＣＣＤカメラを通して画像として取り込んだ。
【００４２】
ＭＰＳＬ群から作製した抵抗血管灌流標本に供給される灌流液に、脈管に対する収縮作用を有するノルエピネフリン（ＮＥ）を１０−５Ｍとなるように添加して、抵抗血管灌流標本を前収縮させた。次に、脈管に対する拡張（弛緩）作用を有するアラキドン酸（ＡＡ）又はイソカルバルサイクリン（ＩＣＣ、プロスタサイクリンのアナログ）を、ＣＯＸ−２阻害薬であるＮＳ−３９８又はインドメタシンの存在下若しくは非存在下で灌流液に添加した。
【００４３】
（２）結果
ＭＰＳＬ群から摘出した抵抗血管について、ＡＡの拡張作用に対するＮＳ−３９８（３×１０−６Ｍ）の影響を検討した結果を図２に示す。図２において、Ａ、ＤはＮＥ添加前の抵抗血管灌流標本の顕微鏡写真であり、Ｂ、ＥはＮＥ添加して前収縮させた抵抗血管灌流標本の顕微鏡写真であり、Ｃ、ＦはＡＡを添加した後の抵抗血管灌流標本の顕微鏡写真である。また、Ａ、Ｂ及びＣにおいてはＮＳ−３９８（３×１０−６Ｍ）を存在させず、Ｄ、Ｅ及びＦにおいてはＮＳ−３９８（３×１０−６Ｍ）を存在させた。
【００４４】
図２から判るように、ＮＳ−３９８（３×１０−６Ｍ）を存在させずにＡＡを添加した場合（図２Ｃ）、ＡＡによる拡張作用が認められる。また、ＮＳ−３９８（３×１０−６Ｍ）を存在させてＡＡを添加した場合（図２Ｆ）、ＡＡによる拡張作用を抑制していることが判る。
【００４５】
また、ＭＰＳＬ群から摘出した抵抗血管について、ＡＡ及びＩＣＣの拡張作用に対するＮＳ−３９８（３×１０−６Ｍ）又はインドメタシン（１０−５Ｍ）の影響を検討した結果を図３に示す。なお、図３ＡはＡＡ濃度と拡張割合との関係を、インドメタシンの存在下（白丸）及び非存在下（黒丸）それぞれで検討した結果を示し、図３ＢはＡＡ濃度と拡張割合との関係を、ＮＳ−３９８の存在下（白丸）及び非存在下（黒丸）それぞれで検討した結果を示し、図３ＣはＩＣＣ濃度と拡張割合との関係を、ＭＰＳＬ群（黒丸）及びコントロール群（白丸）それぞれで検討した結果を示している。
【００４６】
図３Ａ及びＢから判るように、インドメタシン或いはＮＳ−３９８の存在下においては、ＡＡによる抵抗血管の拡張作用が抑制されている。言い換えると、ＡＡ（１０−８〜１０−５Ｍ）は、抵抗血管に対して用量依存的な拡張反応（１０−５Ｍで８０％）を誘起したが、インドメタシン或いはＮＳ−３９８の存在下においては当該拡張反応は完全に抑制された。また、ＡＡはコントロール群に対しては、収縮ならびに拡張反応を誘起しなかった。
さらに、ＩＣＣについては、ＭＰＳＬ群及びコントロール群の標本に対してともに用量依存的に拡張反応を誘起し、その反応量には両群間に有意な差はなかった（図３Ｃ）。
【００４７】
〔比較例１〕大腿動脈の拡張に対する抑制試験
比較例１では、実施例１で作出したＭＰＳＬ群及びコントロール群の家兎から摘出した大腿動脈（外径約１ｍｍ）を用いた。摘出した大腿動脈は、８−０の絹糸を用いて長さ５ｍｍのリング状標本とした。作製したリング状標本は、１０ｍｌの灌流型臓器槽内に懸垂し、クレブス液（３７℃、ｐＨ７．４、ＰＯ２１５０ｍｍＨｇ）を４ｍｌ／ｍｉｎの速度で持続的に灌流した。リング状標本の発生張力は、トランスデューサーを用いて連続的に測定し、ペンレコーダーに記録した。リング状標本に、至的基本張力５００ｍｇを負荷し、１時間の安定時間を経過した後、実施例１と同様にして、実験を開始した。
【００４８】
結果を図４に示す。なお、図４Ａはコントロール群に対してＡＡを所望の濃度で作用させたときの大腿動脈の反応例を示し、図４Ｂはコントロール群に対してＩＣＣを所望の濃度で作用させたときの大腿動脈の反応例を示し、図４ＣはＭＰＳＬ群に対してＡＡを所望の濃度で作用させたときの大腿動脈の反応例を示し、図４ＤはＭＰＳＬ群に対してＩＣＣを所望の濃度で作用させたときの大腿動脈の反応例を示している。
【００４９】
これら図４Ａ〜Ｄに示すように、ＡＡ（１０−５Ｍ）はコントロール群の大腿動脈標本に対して収縮ならびに弛緩反応を誘起しなかったが、ＭＰＳＬ群の大腿動脈標本に対してわずかな収縮反応を誘起した。一方、高濃度（１０−６Ｍ以上）のＩＣＣは、用量依存的にコントロール群ならびにＭＰＳＬ群の大腿動脈に弛緩反応を誘起したが、その反応量は両群間に有意な差はなかった。
以上実施例１及び比較例１から、以下の（１）〜（３）が明らかになった。
【００５０】
（１）ステロイド剤投与された家兎（ＭＰＳＬ群）の骨髄内から摘出された抵抗血管は、ＡＡに対して用量依存的に拡張反応を誘起したが、コントロール群では、拡張反応も弛緩反応も示さなかった。このＭＰＳＬ群におけるＡＡの拡張反応は、ＣＯＸ阻害薬であるインドメタシン及びＣＯＸ−２阻害薬であるＮＳ−３９８によって完全に抑制された。
（２）ＩＣＣは、コントロール群ならびにＭＰＳＬ群の摘出骨髄内抵抗血管に対して、同程度の拡張反応を誘起した。
（３）大腿骨の主幹栄養血管である大動脈標本に対して、高濃度のＩＣＣは、両群ともに同程度の弛緩反応を誘起したが、ＡＡは有意な弛緩反応を誘起しなかった。
【００５１】
これらの結果は、ステロイド剤投与によって、骨髄内から摘出した抵抗血管では、特異的にＣＯＸを誘導し、誘導されたＣＯＸ活性を介して内因性の血管拡張性プロスタグランジンを産生することを示している。したがって、ステロイド剤の投与によって誘導されたＣＯＸ活性を阻害すれば、当該抵抗血管の拡張を抑制することが可能となる。
【００５２】
すなわち、例えば、ステロイド剤投与によって骨内微小循環系、特に骨髄内抵抗血管においてＣＯＸが誘導され、誘導されたＣＯＸは、アラキドン酸から血管拡張作用を有するＰＧＧ２等のプロスタグランジンを産生し、骨髄内抵抗血管を拡張し、骨髄内に充血性の血流増加を誘起する。骨髄内の毛細血管床は肝臓や脾臓と同様に類洞構造であるため、毛細血管床の入り口である抵抗血管の拡張することによって、直接的に顕著な血管透過性を亢進し、骨髄内の組織間隙に浮腫が形成される。骨髄は、頭蓋同様に骨組織によって保定されている臓器であるため、組織間隙の圧上昇は、経壁圧の影響を直接受ける骨髄内に分布する細動脈やリンパ管の狭窄、圧平を引き起こし、二次的に浮腫を憎悪させる。骨髄内の浮腫は、組織間隙における物質交換の拡散距離を延長し、骨細胞への栄養や酸素供給障害、老廃物除去障害を引き起こし、骨髄内の微小循環環境の恒常性維持の破綻を起こす。ステロイド剤の投与によって誘起されるこれらの骨内微小循環障害は、骨壊死、特に特発性大腿骨頭壊死を引き起こす。
したがって、実施例１のように、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、ＣＯＸ阻害剤）の投与によって、骨壊死、特に特発性大腿骨頭壊死を予防及び／又は治療できることが明らかとなった。
【００５３】
【発明の効果】
本発明により骨内微小循環障害に起因する疾患に有効な予防及び／又は治療剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】抵抗血管灌流標本を調製するための装置の概略図である。
【図２】ＭＰＳＬ群から摘出した抵抗血管について、ＡＡの拡張作用に対するＮＳ−３９８（３×１０−６Ｍ）の影響を検討した結果を示す顕微鏡写真である。
【図３】ＭＰＳＬ群から摘出した抵抗血管についてＡＡの拡張作用に対するＮＳ−３９８（３×１０−６Ｍ）又はインドメタシン（１０−５Ｍ）の影響、コントロール群及びＭＰＳＬ群から摘出した抵抗血管についてＩＣＣの拡張作用を検討した結果を示す特性図である。
【図４】コントロール群及びＭＰＳＬ群から摘出した大腿動脈について、ＡＡ及びＩＣＣの拡張作用を検討した結果を示す特性図である。
【符号の説明】
１．顕微鏡、  ２．ステージ、  ３．ＣＣＤカメラ、  ４．ビデオ録画・記録装置、  ５．ビデオカリパ、  ６．モニター、  ７．チャートレコーダー、  ８．パーソナルコンピューター、  ９．臓器槽、  １０．細動脈、  １１．ガラスピペット、  １２．ガラスピペット、  １３．タイゴンチューブ、  １４．タイゴンチューブ、  １５．シリンジ、  １６．レンズ、  １７．三方活栓、  １８．マニュピレーター、  １９．輸送管、  ２０．熱交換器、  ２１．ポンプ、  ２２．クレブス液、  ２３．混合ガスボンベ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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