(57)【要約】      （修正有）【課題】（Ｓ）−２−ペンタノール、又は、（Ｓ）−２−ヘキサノールを製造方法を提供する。【解決手段】２−ペンタノン又は２−ヘキサノンに、ブレッタノマイセス属、キャンディダ属、ホルテア属、ロッデロマイセス属、ピキア属、ロドトルラ属、アルスロバクター属、ブレビバクテリウム属、クルトバクテリウム属、ゲオバチルス属、ミクロバクテリウム属、オクロバクトラム属、パラコッカス属、リゾビウム属、ロドコッカス属の微生物、該処理物、該培養液、及び／又は、該微生物から得られるカルボニル還元酵素の粗精製物若しくは精製物を作用させ、（Ｓ）−２−ペンタノール又は（Ｓ）−２−ヘキサノールを生成させる。２−ペンタノン又は２−ヘキサノンに、上記微生物由来のカルボニル還元酵素をコードするＤＮＡを発現させた形質転換体、該処理物及び／又は該培養物を作用させ、（Ｓ）−２−ペンタノール又は（Ｓ）−２−ヘキサノールを生成させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−ペンタノン又は２−ヘキサノンに、下記（Ａ）〜（Ｆ）の何れかのＤＮＡを発現さ
せた形質転換体細胞、該細胞処理物及び／又は該細胞培養液を作用させ、（Ｓ）−２−ペンタノール又は（Ｓ）−２−ヘキサノールを生成させることを特徴とする高光学純度（Ｓ）−２−ペンタノール又は（Ｓ）−２−ヘキサノールの製造方法。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有し、カルボニル基を還元し光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号２に記載の塩基配列において、１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列を有し、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ｆ）配列番号２に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項２】
２−ペンタノン又は２−ヘキサノンに、ブレッタノマイセス（Brettanomyces）属、キ
ャンディダ（Candida）属、ホルテア（Hortaea）属、イサチェンキア（Issatchenkia）属、ロッデロマイセス（Lodderomyces）属、ピキア（Pichia）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、アルスロバクター(Arthrobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、クルトバクテリウム(Crutobacterium)属、ゲオバチルス(Geobacillus)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属、パラコッカス(Paracoccus)属、リゾビウム(Rhizobium)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属からなる群より選ばれる微生物、該微生物処理物、該微生物培養液、及び／又は、該微生物から得られるカルボニル還元酵素画分の粗精製物若しくは精製物を作用させ、（Ｓ）−２−ペンタノール又は（Ｓ）−２−ヘキサノールを生成させることを特徴とする高光学純度（Ｓ）−２−ペンタノール又は（Ｓ）−２−ヘキサノールの製造方法。
【請求項３】
２−ペンタノン又は２−ヘキサノンに、ブレッタノマイセス（Brettanomyces）属、キ
ャンディダ（Candida）属、ホルテア（Hortaea）属、イサチェンキア（Issatchenkia）属、ロッデロマイセス（Lodderomyces）属、ピキア（Pichia）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、アルスロバクター(Arthrobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、クルトバクテリウム(Crutobacterium)属、ゲオバチルス(Geobacillus)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属、パラコッカス(Paracoccus)属、リゾビウム(Rhizobium)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属からなる群より選ばれる微生物から得られるカルボニル還元酵素をコードするＤＮＡを発現させた形質転換体細胞、該細胞処理物、該細胞培養液、及び／又は、該細胞から得られるカルボニル還元酵素画分の粗精製物若しくは精製物を作用させ、（Ｓ）−２−ペンタノール又は（Ｓ）−２−ヘキサノールを生成させることを特徴とする高光学純度（Ｓ）−２−ペンタノール又は（Ｓ）−２−ヘキサノールの製造方法。
【請求項４】
微生物が、ブレッタノマイセス・ブルクセレンシス（Brettanomyces bruxellensis）、ブレッタノマイセス・アノマラス(Brettanomyces anomalus)、キャンディダ・ファマータ（Candida famata）、キャンディダ・クルセイ（Candida krusei）、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ゼイラノイデス（Candida zeylanoides）、ホルテア・ウェ ルネッキ（Hortaea werneckii）、イサチェンキア・スクチュラータ（Issatchenkia scutulata）、ロッデロマイセス・エロンジスポラス（Lodderomyceselongisporus）、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)、ピキア・ベッセイ（Pichia besseyi）、ピキア・カクトフィラ（Pichia cactophila）、ピキア・セゴビエンシス（Pichia segobiensis）、ピキア・スパルティナエ（Pichia spartinae）、ピキア・トレハロフィラ（Pichia trehalophila）、ロドトルラ・ミヌータ（Rhodotorula minuta）、アルスロバクター・オキシダンス(Arthrobacter oxydans)、アルスロバクター・ポリクロモゲネス(Arthrobacter polychromogenes)、アルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)、アルスロバクター・スルフロウス(Arthrobacter sulfurous)、ブレビバクテリウム・ブタニカム(Brevibacterium butanicum)、クロトバクテリウム・フラキュムファシエンス(Curtobacterium flaccumfaciens)、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus)、ミクロバクテリウム・ケラタノリチカム(Microbacterium keratanolyticum)、ミクロバクテリウム・サペルダエ(Microbacterium saperdae)、ミクロバクテリウム・エスピー(Microbacterium sp.)、ミクロバクテリウム・テスタセウム(Microbacterium testaceum)、オクロバトラム・アントロピー(Ochrobactrum anthropi)、オクロバクトラム・エスピー(Ochrobactrum sp.)(シュードモナス・オバリス(Pseudomonas ovalis))、パラコッカス・デニトリフィカンス(Pracoccus denitrificans)、リゾビウム・ラジオバクター(Rhizobium radiobacter)及び、ロドコッカス・エスピー(Rhodococcus sp.)(コリネバクテリウム・ハイドロカルボクラスタム(Corynebacterium hydrocarboclastum))からなる群より選ばれる微生物であることを特徴とする請求項２又は３に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−ペンタノン又は２−ヘキサノンにイサチェンキア属等に属する微生物、該微生物処理物及び／又は該微生物培養物を作用させて、医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である（Ｓ）−２−ペンタノール又は（Ｓ）−２−ヘキサノールを製造する方法に関し、また、２−ペンタノン又は２−ヘキサノンに、上記微生物から得られるカルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質（カルボニル還元酵素）をコードするＤＮＡを発現させた形質転換体細胞、該細胞処理物および／または該細胞培養液を作用させて、（Ｓ）−２−ペンタノール又は（Ｓ）−２−ヘキサノールを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（Ｓ）−２−ペンタノールあるいは（Ｓ）−２−ヘキサノールを化学的に製造する方法としては、例えば、２−ペンタノンに対しポリアミドアミンとグルコノラクトンから成るデンドリマー存在下で還元を行う方法（非特許文献１）又は、２−ヘキサノンに対し光学活性ボロンを用いて還元する方法（特許文献１）などが知られている。しかしながらこれらは生成物の光学純度が満足のいくものではない。
【０００３】
一方、微生物の菌体及び／又は該菌体処理物を用いて光学活性なアルコール体を生成する方法としては、ラセミ体のエステル化合物に微生物を作用させることにより光学選択的にエステルを加水分解することにより、光学活性なアルコール体を生成する方法が知られているが（特許文献２）、収率が低いという問題、また望みの立体化学ではないアルコールもしくはそのエステルを捨てなければならない等の問題があった。また、ケト基を有する化合物を立体選択的に還元し、光学活性なアルコール体を生成する方法としては、２−ペンタノン又は２−ヘキサノンに微生物を作用させることより製造する方法（非特許文献２）が知られているが生成物の光学純度又は生産濃度が満足のいくものではない、菌体の固定化又はアセトン処理等の反応に用いる菌体の前処理が煩雑である、基質の仕込み濃度が低い等の問題があり実用的ではなかった。
【特許文献１】特開平１１−２４０８９４号公報
【特許文献２】特開平１０−４９９８号公報
【非特許文献１】J. Am. Chem. Soc.、Vol.123、p.5956-5961、2001
【非特許文献２】Tetrahedron:  Asymmetry、vol.14、p.2659-2681、2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、より光学純度の高い（Ｓ）−２−ペンタノールあるいは（Ｓ）−２−ヘキサノール、好ましくは光学純度９９．０％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−２−ペンタノールあるいは（Ｓ）−２−ヘキサノールを工業的に簡便で、安価に製造できる新規な製造方法を提供することを本発明の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために、（Ｓ）−２−ペンタノールあるいは（Ｓ）−２−ヘキサノールの製造方法について鋭意検討した結果、ブレッタノマイセス（Brettanomyces）属、キャンディダ（Candida）属、ホルテア（Hortaea）属、イサチェンキア（Issatchenkia）属、ロッデロマイセス（Lodderomyces）属、ピキア（Pichia）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、アルスロバクター(Arthrobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、クルトバクテリウム(Crutobacterium)属、ゲオバチルス(Geobacillus)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属、パラコッカス(Paracoccus)属、リゾビウム(Rhizobium)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属からなる群より選ばれる微生物を用いることにより、２−ペンタノンあるいは２−ヘキサノンを基質として（Ｓ）−２−ペンタノールあるいは（Ｓ）−２−ヘキサノールを簡便に、効率よく生成することができることを見出した。さらに、上記微生物の一つとしてイサチェンキア（Issatchenkia）属微生物より２−ペンタノン又は２−ヘキサノンを還元して（Ｓ）−２−ペンタノール又は（Ｓ）−２−ヘキサノールを生成するカルボニル還元酵素、及び該酵素をコードするＤＮＡを単離してその塩基配列を解析した。さらに、該ＤＮＡを発現させた形質転換体を作製し、該形質転換体細胞、該細胞処理物および／または該細胞培養液を、原料となる２−ペンタノンあるいは２−ヘキサノンに作用させることにより、高い光学純度かつ高濃度で目的物（Ｓ）−２−ペンタノールあるいは（Ｓ）−２−ヘキサノールを得ることができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【０００６】
すなわち、本発明の要旨は、以下のとおりである。
（１）  ２−ペンタノン又は２−ヘキサノンに、下記（Ａ）〜（Ｆ）の何れかのＤＮＡを発現させた形質転換体細胞、該細胞処理物及び／又は該細胞培養液を作用させ、（Ｓ）−２−ペンタノール又は（Ｓ）−２−ヘキサノールを生成させることを特徴とする高光学純度（Ｓ）−２−ペンタノール又は（Ｓ）−２−ヘキサノールの製造方法。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有し、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号２に記載の塩基配列において、１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列を有し、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ｆ）配列番号２に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
（２）  ２−ペンタノン又は２−ヘキサノンに、ブレッタノマイセス（Brettanomyces）
属、キャンディダ（Candida）属、ホルテア（Hortaea）属、イサチェンキア（Issatchenkia）属、ロッデロマイセス（Lodderomyces）属、ピキア（Pichia）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、アルスロバクター(Arthrobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、クルトバクテリウム(Crutobacterium)属、ゲオバチルス(Geobacillus)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属、パラコッカス(Paracoccus)属、リゾビウム(Rhizobium)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属からなる群より選ばれる微生物、該微生物処理物及び／又は該微生物培養液、及び／又は該微生物から得られるカルボニル還元酵素画分の粗精製物若しくは精製物を作用させ、（Ｓ）−２−ペンタノール又は（Ｓ）−２−ヘキサノールを生成させることを特徴とする高光学純度（Ｓ）−２−ペンタノール又は（Ｓ）−２−ヘキサノールの製造方法。
（３）  ２−ペンタノン又は２−ヘキサノンに、ブレッタノマイセス（Brettanomyces）
属、キャンディダ（Candida）属、ホルテア（Hortaea）属、イサチェンキア（Issatchenkia）属、ロッデロマイセス（Lodderomyces）属、ピキア（Pichia）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、アルスロバクター(Arthrobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、クルトバクテリウム(Crutobacterium)属、ゲオバチルス(Geobacillus)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属、パラコッカス(Paracoccus)属、リゾビウム(Rhizobium)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属からなる群より選ばれる微生物から得られるカルボニル還元酵素をコードするＤＮＡを発現させた形質転換体細胞、該細胞処理物、該細胞培養液、及び／又は、該細胞から得られるカルボニル還元酵素画分の粗精製物若しくは精製物を作用させ、（Ｓ）−２−ペンタノール又は（Ｓ）−２−ヘキサノールを生成させることを特徴とする高光学純度（Ｓ）−２−ペンタノール又は（Ｓ）−２−ヘキサノールの製造方法。
（４）  微生物が、ブレッタノマイセス・ブルクセレンシス（Brettanomyces bruxellensis）、ブレッタノマイセス・アノマラス(Brettanomyces anomalus)、キャンディダ・ファマータ（Candida famata）、キャンディダ・クルセイ（Candida krusei）、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ゼイラノイデス（Candida zeylanoides）、ホルテア・ウェ ルネッキ（Hortaea werneckii）、イサチェンキア・スクチュラータ（Issatchenkia scutulata）、ロッデロマイセス・エロンジスポラス（Lodderomyceselongisporus）、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)、ピキア・ベッセイ（Pichia besseyi）、ピキア・カクトフィラ（Pichia cactophila）、ピキア・セゴビエンシス（Pichia segobiensis）、ピキア・スパルティナエ（Pichia spartinae）、ピキア・トレハロフィラ（Pichia trehalophila）、ロドトルラ・ミヌータ（Rhodotorula minuta）、アルスロバクター・オキシダンス(Arthrobacter oxydans)、アルスロバクター・ポリクロモゲネス(Arthrobacter polychromogenes)、アルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)、アルスロバクター・スルフロウス(Arthrobacter sulfurous)、ブレビバクテリウム・ブタニカム(Brevibacterium butanicum)、クロトバクテリウム・フラキュムファシエンス(Curtobacterium flaccumfaciens)、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus)、ミクロバクテリウム・ケラタノリチカム(Microbacterium keratanolyticum)、ミクロバクテリウム・サペルダエ(Microbacterium saperdae)、ミクロバクテリウム・エスピー(Microbacterium sp.)、ミクロバクテリウム・テスタセウム(Microbacterium testaceum)、オクロバトラム・アントロピー(Ochrobactrum anthropi)、オクロバクトラム・エスピー(Ochrobactrum sp.)(シュードモナス・オバリス(Pseudomonas ovalis))、パラコッカス・デニトリフィカンス(Pracoccus denitrificans)、リゾビウム・ラジオバクター(Rhizobium radiobacter)、ロドコッカス・エスピー(Rhodococcus sp.)(コリネバクテリウム・ハイドロカルボクラスタム(Corynebacterium hydrocarboclastum))からなる群より選ばれる微生物であることを特徴とする（２）又は（３）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の方法により、医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である（Ｓ）−２−ペンタノールあるいは（Ｓ）−２−ヘキサノールを高光学純度かつ高濃度で得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の一例であり、これらの内容に特定はされない。
本発明の（Ｓ）−２−ペンタノール又は（Ｓ）−２−ヘキサノールの製造方法は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は該アミノ酸配列のホモログであってカルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質（以下これを単に「カルボニル還元酵素」と称することがある）をコードするＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて実施することができる。
【０００９】
本明細書において、カルボニル還元酵素活性とは、カルボニル基含有化合物中のカルボニル基を不斉還元して光学活性なアルコール類とする活性をいう。このような活性は、カルボニル基含有化合物を基質として含有し、さらにＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨを補酵素として含有する反応液において、酵素として、目的のタンパク質、該タンパク質を発現する能力を有する形質転換体、形質転換体処理物、または培養液を作用させ、反応液中のＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨの減少初速度を反応液の吸光度の変化を測定することにより算出することができる。
本発明に用いるカルボニル還元酵素は２−ペンタノン又は２−ヘキサノンから（Ｓ）−２−ペンタノール又は（Ｓ）−２−ヘキサノールを生成することができる酵素であればよい。本発明に用いるカルボニル還元酵素のカルボニル還元酵素活性を測定するに当たっては、カルボニル基含有化合物を基質として用いるが、カルボニル基含有化合物としては、２−ペンタノン又は２−ヘキサノンに限らず、その置換体・誘導体等の構造類似化合物も好適に使用することができる。そのような例としては、１−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノン等を挙げることができる。
【００１０】
カルボニル還元酵素は、本明細書の記載によってそのアミノ酸配列および該アミノ酸配列をコードする塩基配列が明らかになったので、後述するようにカルボニル還元酵素のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列を元にして作製したプローブを用いて、カルボニル還元酵素活性を有する任意の微生物からカルボニル還元酵素をコードするＤＮＡを単離した後、それを元に通常の遺伝子工学的手法を用いて得ることができる。
また、本発明を完成するにあたってなされたように、カルボニル還元酵素活性を有する微生物、すなわち、カルボニル還元酵素をコードするＤＮＡを有する微生物、例えば、ブレッタノマイセス（Brettanomyces）属、キャンディダ（Candida）属、ホルテア（Hortaea）属、ロッデロマイセス（Lodderomyces）属、ピキア（Pichia）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、アルスロバクター(Arthrobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、クルトバクテリウム(Crutobacterium)属、ゲオバチルス(Geobacillus)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属、パラコッカス(Paracoccus)属、リゾビウム(Rhizobium)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属からなる群より選ばれる微生物、好ましくはイサチェンキア（Issatchenkia）属酵母の培養物より精製することも出来る。
【００１１】
イサチェンキア（Issatchenkia）属酵母としては、イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Issatchankia  scutulata  var.  scutulata）が好ましく用いることができ、例えば、イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Issatchankia  scutulata  var.  scutulata）ＪＣＭ１８２８株由来のカルボニル還元酵素が特に本発明のカルボニル還元酵素として用いることに光学活性アルコールの製造の点において優れている。本菌株は、理化学研究所微生物系統保存施設（Japan Collection of Microorganism（ＪＣＭ））より入手可能である。
【００１２】
２−ペンタノンに作用させることにより、（Ｓ）−２−ペンタノールを製造する場合のカルボニル還元酵素あるいは該酵素をコードするＤＮＡとしては、ブレッタノマイセス（Brettanomyces）属、キャンディダ（Candida）属、ホルテア（Hortaea）属、ロッデロマイセス（Lodderomyces）属、又は、ピキア（Pichia）属に属する微生物由来のものが好ましく用いられる。
【００１３】
さらに好ましくは、ブレッタノマイセス・ブルクセレンシス（Brettanomyces bruxellensis）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ゼイラノイデス（Candida zeylanoides）、ホルテア・ウェルネッキ（Hortaea werneckii）、ロッデロマイセス・エロンジスポラス（Lodderomyces elongisporus）、ピキア・セゴビエンシス（Pichia segobiensis）、ピキア・スパルティナエ（Pichia spartinae）、アルスロバクター・グロビホルミス(Arthrobacter globiformis)、アルスロバクター・オキシダンス(Arthrobacter oxydans)、アルスロバクター・ポリクロモゲナーゼ(Arthrobacter polychromogenes)、クルトバクテリウム・フラキュファシエンス(Curtobacterium flaccumfaciens)、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus)、ミクロバクテリウム・テスタセウム(Microbacterium testaceum)、オクロバクトラム・アントロピー(Ochrobactrum anthropi)、オクロバクトラム・エスピー(Ochrobactrum sp.)(シュードモナス・オバリス(Pseudomonas ovalis))、リゾビウム・ラジオバクター(Rhizobium radiobacter)由来のものが用いられる。
【００１４】
具体的には、ブレッタノマイセス・ブルクセレンシス（Brettanomyces bruxellensis）NBRC 0629、ブレッタノマイセス・ブルクセレンシス（Brettanomyces bruxellensis）NBRC 0797、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）NBRC 0006、キャンディダ・ゼイラノイデス（Candida zeylanoides）CBS 6408、キャンディダ・ゼイラノイデス（Candida zeylanoides）JCM 1627、ホルテア・ウェルネッキ（Hortaea werneckii）NBRC 4875、ロッデロマイセス・エロンジスポラス（Lodderomyces elongisporus）NBRC 1676、ピキア・セゴビエンシス（Pichia segobiensis）JCM 10740、ピキア・スパルティナエ（Pichia spartinae）JCM 10741、アルスロバクター・グロビホルミス(Arthrobacter globiformis)NBRC 12137、アルスロバクター・オキシダンス(Arthrobacter oxydans)DSM 20120、アルスロバクター・ポリクロモゲナーゼ(Arthrobacter polychromogenes)DSM 342、クルトバクテリウム・フラキュファシエンス(Curtobacterium flaccumfaciens)ATCC 12813、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus)NBRC 12550、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus)IAM 11002、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus)IAM 11004、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus )IAM 12043、ミクロバクテリウム・テスタセウム(Microbacterium testaceum)JCM 1353、オクロバクトラム・アントロピー(Ochrobactrum anthropi)ATCC 49237、オクロバクトラム・エスピー(Ochrobactrum sp.)(シュードモナス・オバリス(Pseudomonas ovalis))NBRC 12950、オクロバクトラム・エスピー(Ochrobactrum sp.)(シュードモナス・オバリス(Pseudomonas ovalis)) NBRC 12952、オクロバクトラム・エスピー(Ochrobactrum sp.)(シュードモナス・オバリス(Pseudomonas ovalis))NBRC 12953、リゾビウム・ラジオバクター(Rhizobium radiobacter)IAM 12048由来のものが特に好ましく用いられる
【００１５】
また、２−ヘキサノンに作用させることにより、（Ｓ）−２−ヘキサノールを製造する場合カルボニル還元酵素あるいは該酵素をコードするＤＮＡとしては、ブレッタノマイセス(Brettanomyces)属、キャンディダ（Candida）属、イサチェンキア（Issatchenkia）属、ロッデロマイセス（Lodderomyces）属、ピキア（Pichia）属、又は、ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する微生物由来のものが好ましく用いられる。
それらの中で、ブレッタノマイセス・アノマーラ(Brettanomyces anomala)、キャンデ
ィダ・ファマータ（Candida famata）、キャンディダ・クルセイ（Candida krusei）、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）、キャンディダ・ゼイラノイデス（Candida zeylanoides）、イサチェンキア・スクチュラータ（Issatchenkia scutulata）、ロッデロマイセス・エロンジスポラス（Lodderomyces elongisporus）、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)、ピキア・カクトフィラ（Pichia cactophila）、ピキア・セゴビエンシス（Pichia segobiensis）、ピキア・トレハロフィラ（Pichia trehalophila）及び、ロドトルラ・ミヌータ（Rhodotorula minuta）由来のものが特に好ましく用いられる。
【００１６】
具体的には、ブレッタノマイセス・アノマーラ(Brettanomyces anomala)NBRC 0627、キャンディダ・ファマータ（Candida famata）ATCC 10539、キャンディダ・クルセイ（Candida krusei）NBRC 1664、キャンディダ・クルセイ（Candida krusei）JCM 2284、キャンディダ・クルセイ（Candida krusei）JCM 2341、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）NBRC 1977、キャンディダ・ゼイラノイデス（Candida zeylanoides）CBS 6408、イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Issatchenkia scutulata var. scutulata）JCM 1828、 ロッデロマイセス・エロンジスポラス（Lodderomyces elongisporus）NBRC 1676、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)NBRC 1024、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)NBRC 1071ピキア・カクトフィラ（Pichia cactophila） JCM 1830、ピキア・セゴビエンシス（Pichia segobiensis） JCM 10740、ピキア・トレハロフィラ（Pichiatrehalophila）JCM 3651及び、ロドトルラ・ミヌータ（Rhodotorula minuta）NBRC 0879、アルスロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）DSM 20407、アルスロバクター・サルフレウス（Arthrobacter sulfureus）（ブレビバクテリウム・サルフレウム（Brevibacterium sulfureum））JCM 1338、ブレビバクテリウム・ブタニカム（Brevibacterium butanicum）ATCC 21196、ブレビバクテリウム・サルフレウム（Brevibacterium sulfureum）JCM 1485、クロトバクテリウム・フラキュファシエンス（Curtobacterium flaccumfaciens）ATCC 12813、ミクロバクテリウム・ケラタノリティカム（Microbacterium keratanolyticum）NBRC 13309、ミクロバクテリウム・サペルダエ（Microbacterium saperdae）JCM 1352、ミクロバクテリウム・エスピー（Microbacterium sp.）NBRC 15615、オクロバクトラム・アンスロピー（Ochrobactrum anthropi）ATCC 49237、オクロバクトラム・エスピー（Ochrobactrum sp .）(シュードモナス・オバリス（Pseudomonas ovalis）)NBRC 12952、オクロバクトラム・エスピー（Ochrobactrum sp.）（シュードモナス・オバリス(Pseudomonas ovalis)）NBRC 12953、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）NBRC 12442、リゾビウム・ラジオバクター（Rhizobium radiobacter）IAM 12048、リゾビウム・ラジオバクター（Rhizobium radiobacter）IAM 13129、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）ATCC 15960由来のものが好ましく用いられる。
【００１７】
微生物の培養物からのカルボニル還元酵素の取得方法としては、通常の酵素の精製方法を用いることができ、例えば、以下の方法で行うことができる。上記微生物をＹＭ培地等の酵母の培養に用いられる一般的な培地で培養することで十分に増殖させた後に回収し、ＤＴＴ（dithiothreitol）等の還元剤や、フェニルメタンスルホニルフルオリド（phenylmethansulfonyl fluoride；ＰＭＳＦ）の様なプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液から、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、疎水、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、キレート、色素、抗体等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することが出来る。
【００１８】
例えば、本明細書の実施例に示すように、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Amersham  Biosciences社製）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｂ
ｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ   ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Amersham  Biosciences社製）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＭｏｎｏＱ（Amersham  Biosciences社製）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（Amersham  Biosciences社製）を用いたゲル ろ過クロマトグラフィー等を経ることにより電気泳動的にほぼ単一バンドまで精製することが出来る。
【００１９】
このように精製されたイサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Issatchankia scutulata var. scutulata）ＪＣＭ１８２８株に由来するカルボニル還元酵素（以下、本酵素を「ＩｓＡＤＨ１」と称することがある。）は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと省略）によると分子量約４０，０００Ｄａのサブユニット１種からなり、また、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＨＲ１０／３０（Amersham Biosciences社製）を用いたゲル濾過に決定された分子量は、約４０，０００Ｄａであった。以上のことから、ＩｓＡＤＨ１は、約４０，０００Ｄａのサブユニット１種からなる単量体であると推察される。
【００２０】
カルボニル還元酵素をコードするＤＮＡは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。
まず、カルボニル還元酵素を上記の方法等にて精製後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析し、さらに、リジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの酵素により切断し、逆相液体クロマトグラフィーなどによりペプチド断片を精製後、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列を解析することにより複数のアミノ酸配列を決めることができる。
【００２１】
決定したアミノ酸配列を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、カルボニル還元酵素生産微生物株の染色体ＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、アミノ酸配列から設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより本発明のＤＮＡの一部を得ることができる。さらに、得られたＤＮＡ断片をプローブとして、カルボニル還元酵素生産微生物株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、カルボニル還元酵素をコードするＤＮＡを得ることができる。
【００２２】
また、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のＤＮＡの外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、カルボニル還元酵素生産微生物株のｃＤＮＡを用いてＲＡＣＥ（Rapid amplification of cDNA ends）法（Molecular Cloning ３rd Ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、以下、Molecular Cloning）により本発明のＤＮＡを得ることも可能である。
【００２３】
このようにしてイサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Issatchankia scutulata var. scutulata）ＪＣＭ１８２８株の染色体ＤＮＡから単離されたカルボニル還元酵素ＩｓＡＤＨ１をコードするＤＮＡの塩基配列は、配列番号２に示すとおりである。
なおカルボニル還元酵素ＩｓＡＤＨ１をコードするＤＮＡは、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡ、あるいはｃＤＮＡの他、本明細書に記載の通りその塩基配列が明らかになったため、配列番号２に基づく化学合成等によって得ることもできる。
【００２４】
ＩｓＡＤＨ１をコードするＤＮＡのホモログとは、カルボニル基還元酵素活性を害さない範囲内において配列番号１に記載のアミノ酸配列に一個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものである。ここで複数個とは、具体的には２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。
【００２５】
また、ＩｓＡＤＨ１のホモログとは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上のホモロジーを有するタンパク質をいう。
ちなみに上記タンパク質のホモロジー検索は、例えば、日本ＤＮＡデータバンク（DNA Databank of JAPAN（ＤＤＢＪ））等を対象に、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴなどのプログラ ムを用いて行うことができる。配列番号１に記載のアミノ酸配列を用いてＤＤＢＪを対象にＢＬＡＳＴ  ｐｒｏｇｒａｍを用いてホモロジー検索を行った結果、既知のタンパク質の中でもっとも高いホモロジーを示したのは、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces  cerevisiae）由来の機能未知のタンパク質Ｙｄｒ５４１ｃｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ（配列番号３：Accession No. AAB64983）であり、４２％の相同性を示した。
【００２６】
また、ＩｓＡＤＨ１をコードするＤＮＡは、上記ＩｓＡＤＨ１をコードするＤＮＡまたはそのホモログであって、カルボニル還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
上記タンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２で表される塩基配列を含むものが挙げられる。
ＩｓＡＤＨ１をコードするＤＮＡのホモログとは、カルボニル基還元酵素活性を害さない範囲内において配列番号１に記載のアミノ酸配列に１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡを含む。ここで複数個とは、具体的には６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１０個以下である。
【００２７】
当業者であれば、配列番号２に記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Nucleic Acids Res.、vol.10、pp.6487（1982）、Methods in Enzymol.、vol.100、pp.448（1983）、Molecular Cloning、PCR - A Practical Approach、IRL Press、pp.200（1991））等を用 いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付加変異を導入することによりＩｓＡＤＨ１をコードするＤＮＡのホモログを得ることが可能である。
【００２８】
また、ＩｓＡＤＨ１のアミノ酸配列またはその一部や、ＩｓＡＤＨ１をコードするＤＮＡまたはその一部を元に、例えばDNA Databank of JAPAN（ＤＤＢＪ）等のデータベース に対してホモロジー検索を行って、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡホモログの塩基配列情報を手に入れることも可能である。当業者であれば、この塩基配列情報を元に寄託菌株からのＰＣＲ等により該ＤＮＡ断片を手に入れることが可能である。
【００２９】
さらに、ＩｓＡＤＨ１をコードするＤＮＡのホモログは、ＩｓＡＤＨ１をコードするＤＮＡまたはその一部をプローブとして用いて、カルボニル還元酵素活性を有する任意の微生物から調製したＤＮＡに対し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等によりストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズするＤＮＡを得ることによっても取得できる。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの「一部」とは、プローブとして用いるのに十分な長さのＤＮＡのことであり、具体的には１５ｂｐ以上、好ましくは５０ｂｐ以上、より好ましくは１００ｂｐ以上のものである。
各ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ等に記載されてい
る方法に準じて行うことができる。
【００３０】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、ストリンジェントな条件下、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、ストリンジェントな条件としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法およびプラークハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
【００３１】
上記のようにして単離された、カルボニル還元酵素をコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、カルボニル還元酵素発現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、カルボニル還元酵素を該形質転換体から得ることができる。あるいは、形質転換体は、公知の宿主の染色体ＤＮＡにカルボニル還元酵素をコードするＤＮＡを発現可能に組み込むことによっても得ることができる。
【００３２】
形質転換体の作製方法としては、具体的には、微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中に、本発明のＤＮＡを導入し、構築された発現ベクターを該微生物中に導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中にカルボニル還元酵素をコードするＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
このとき、カルボニル還元酵素をコードするＤＮＡが宿主微生物中で発現可能なプロモーターを含んでいない場合には、適当なプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５'−側上流に、より好ましくはターミネーターを３'−側下流にそれぞれ組み込む必要がある。この プロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．  ４３，７５−１０２（１９９０）、Ｙｅａｓｔ  ８，４２３−４８８（１９９２）などに詳細に記述されている。
【００３３】
本発明のカルボニル還元酵素を発現させるための形質転換の対象となる宿主微生物としては、宿主自体が本反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、具体的には以下に示すような微生物を挙げることができる。
【００３４】
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている細菌。
【００３５】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている放線菌。
【００３６】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている酵母。
【００３７】
ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などに属する宿主ベクター系の確立されているカビ。
【００３８】
上記微生物の中で宿主として好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属であり、特に好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属である。
【００３９】
形質転換体作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築および宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇに記載の方法）。
【００４０】
以下、具体的に、好ましい宿主微生物、各微生物における好ましい形質転換の手法、ベクター、プロモーター、ターミネーターなどの例を挙げるが、本発明はこれらの例に限定されない。
【００４１】
エシェリヒア属、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）においては、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドが挙げられ、ｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃ、ｔｒｐの融合）、λファージＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが挙げられる。また、ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどが挙げられる。
【００４２】
バチルス属においては、ベクターとしては、ｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどを挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーターなどが利用できる。
【００４３】
シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｃｅｐａｃｉａ）などで確立されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の
分解に関与するプラスミド、ＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０（Ｇｅｎｅ，２６，２７３−８２（１９８３））を挙げることができる。
【００４４】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＡＪ４３（Ｇｅｎｅ  ３９，２８１（１９８５））などのプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
【００４５】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＣＢ１０１（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９６，１７５（１９８４））などのプラスミドベクターが挙げられる。
【００４６】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、特にサッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ベクターとしては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミドが挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００４７】
シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属においては、ベクターとしては、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６，８０（１９８６）に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクターを挙げることができる。特に、ｐＡＵＲ２２４は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００４８】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリジー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７，２８３−２８７（１９８９））。
【００４９】
また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が確立されており、それらを適宜使用することができる。
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に蚕を用いた昆虫などの動物中（Ｎａｔｕｒｅ  ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系、及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽などの無細胞タンパク質合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。
【００５０】
本発明は、上記の方法などで得られる配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、又は、該ＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込んで得られる形質転換体細胞、該形質転換体細胞処理物および／または培養液を、反応基質である２−ペンタノンあるいは２−ヘキサノンに作用させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元させ、（Ｓ）−２−ペンタノールあるいは（Ｓ）−２−ヘキサノールを製造することができる。
【００５１】
また本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体細胞又は、該ＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込んで得られる形質転換体細胞、該形質転換体細胞処理物および／または培養液を、反応基質である２−ペンタノンあるいは２−ヘキサノンに作用させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元させ、（Ｓ）−２−ペンタノールあるいは（Ｓ）−２−ヘキサノールを製造することができる。
【００５２】
また本発明は、ブレッタノマイセス（Brettanomyces）属、キャンディダ（Candida）属、ホルテア（Hortaea）属、イサチェンキア（Issatchenkia）属、ロッデロマイセス（Lodderomyces）属、ピキア（Pichia）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、アルスロバクター(Arthrobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、クルトバクテリウム(Crutobacterium)属、ゲオバチルス(Geobacillus)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属、パラコッカス(Paracoccus)属、リゾビウム(Rhizobium)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属からなる群より選ばれる微生物、該微生物処理物、該微生物培養液、及び／又は、該微生物から得られるカルボニル還元酵素画分の粗精製物若しくは精製物を、反応基質である２−ペンタノンあるいは２−ヘキサノンに作用させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元させ、（Ｓ）−２−ペンタノールあるいは（Ｓ）−２−ヘキサノールを製造することができる。
２−ペンタノンに作用させることにより、（Ｓ）−２−ペンタノールを製造する場合は、ブレッタノマイセス（Brettanomyces）属、キャンディダ（Candida）属、ホルテア（Hortaea）属、ロッデロマイセス（Lodderomyces）属、又は、ピキア（Pichia）属に属する微生物が好ましく用いられ、ブレッタノマイセス・ブルクセレンシス（Brettanomyces bruxellensis）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ゼイラノイデス（Candida zeylanoides）、ホルテア・ウェルネッキ（Hortaea werneckii）、ロッデロマイセス・エロンジスポラス（Lodderomyces elongisporus）、ピキア・セゴビエンシス（Pichia segobiensis）、ピキア・スパルティナエ（Pichia spartinae）、アルスロバクター・グロビホルミス(Arthrobacter globiformis)、アルスロバクター・オキシダンス(Arthrobacter oxydans)、アルスロバクター・ポリクロモゲナーゼ(Arthrobacter polychromogenes)、クルトバクテリウム・フラキュファシエンス(Curtobacterium flaccumfaciens)、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus)、ミクロバクテリウム・テスタセウム(Microbacterium testaceum)、オクロバクトラム・アントロピー(Ochrobactrum anthropi)、オクロバクトラム・エスピー(Ochrobactrum sp.)(シュードモナス・オバリス(Pseudomonas ovalis))、リゾビウム・ラジオバクター(Rhizobium radiobacter)が特に好ましく用いられ、具体的には、ブレッタノマイセス・ブルクセレンシス（Brettanomyces bruxellensis）NBRC 0629、ブレッタノマイセス・ブルクセレンシス（Brettanomyces bruxellensis）NBRC 0797、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）NBRC 0006、キャンディダ・ゼイラノイデス（Candida zeylanoides）CBS 6408、キャンディダ・ゼイラノイデス（Candida zeylanoides）JCM 1627、ホルテア・ウェルネッキ（Hortaea werneckii）NBRC 4875、ロッデロマイセス・エロンジスポラス（Lodderomyces elongisporus）NBRC 1676、ピキア・セゴビエンシス（Pichia segobiensis）JCM 10740、ピキア・スパルティナエ（Pichia spartinae）JCM 10741、アルスロバクター・グロビホルミス(Arthrobacter globiformis)NBRC 12137、アルスロバクター・オキシダンス(Arthrobacter oxydans)DSM 20120、アルスロバクター・ポリクロモゲナーゼ(Arthrobacter polychromogenes)DSM 342、クルトバクテリウム・フラキュファシエンス(Curtobacterium flaccumfaciens)ATCC 12813、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus)NBRC 12550、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus)IAM 11002、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus)IAM 11004、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus )IAM 12043、ミクロバクテリウム・テスタセウム(Microbacterium testaceum)JCM 1353、オクロバクトラム・アントロピー(Ochrobactrum anthropi)ATCC 49237、オクロバクトラム・エスピー(Ochrobactrum sp.)(シュードモナス・オバリス(Pseudomonas ovalis))NBRC 12950、オクロバクトラム・エスピー(Ochrobactrum sp.)(シュードモナス・オバリス(Pseudomonas ovalis)) NBRC 12952、オクロバクトラム・エスピー(Ochrobactrum sp.)(シュードモナス・オバリス(Pseudomonas ovalis))NBRC 12953、リゾビウム・ラジオバクター(Rhizobium radiobacter)IAM 12048が好ましく用いられる
【００５３】
２−ヘキサノンに作用させることにより、（Ｓ）−２−ヘキサノールを製造する場合は、ブレッタノマイセス(Brettanomyces)属、キャンディダ（Candida）属、イサチェンキア（Issatchenkia）属、ロッデロマイセス（Lodderomyces）属、ピキア（Pichia）属、又は、ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する微生物が好ましく用いられる。
それらの中で、ブレッタノマイセス・アノマーラ(Brettanomyces anomala)、キャンデ
ィダ・ファマータ（Candida famata）、キャンディダ・クルセイ（Candida krusei）、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）、キャンディダ・ゼイラノイデス（Candida zeylanoides）、イサチェンキア・スクチュラータ（Issatchenkia scutulata）、ロッデロマイセス・エロンジスポラス（Lodderomyces elongisporus）、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)、ピキア・カクトフィラ（Pichia cactophila）、ピキア・セゴビエンシス（Pichia segobiensis）、ピキア・トレハロフィラ（Pichia trehalophila）及び、ロドトルラ・ミヌータ（Rhodotorula minuta）が特に好ましく用いられる。
具体的には、ブレッタノマイセス・アノマーラ(Brettanomyces anomala)NBRC 0627、キャンディダ・ファマータ（Candida famata）ATCC 10539、キャンディダ・クルセイ（Candida krusei）NBRC 1664、キャンディダ・クルセイ（Candida krusei）JCM 2284、キャンディダ・クルセイ（Candida krusei）JCM 2341、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）NBRC 1977、キャンディダ・ゼイラノイデス（Candida zeylanoides）CBS 6408、イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Issatchenkia scutulata var. scutulata）JCM 1828、 ロッデロマイセス・エロンジスポラス（Lodderomyces elongisporus）NBRC 1676、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)NBRC 1024、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)NBRC 1071ピキア・カクトフィラ（Pichia cactophila） JCM 1830、ピキア・セゴビエンシス（Pichia segobiensis） JCM 10740、ピキア・トレハロフィラ（Pichiatrehalophila）JCM 3651及び、ロドトルラ・ミヌータ（Rhodotorula minuta）NBRC 0879、アルスロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）DSM 20407、アルスロバクター・サルフレウス（Arthrobacter sulfureus）（ブレビバクテリウム・サルフレウム（Brevibacterium sulfureum））JCM 1338、ブレビバクテリウム・ブタニカム（Brevibacterium butanicum）ATCC 21196、ブレビバクテリウム・サルフレウム（Brevibacterium sulfureum）JCM 1485、クロトバクテリウム・フラキュファシエンス（Curtobacterium flaccumfaciens）ATCC 12813、ミクロバクテリウム・ケラタノリティカム（Microbacterium keratanolyticum）NBRC 13309、ミクロバクテリウム・サペルダエ（Microbacterium saperdae）JCM 1352、ミクロバクテリウム・エスピー（Microbacterium sp.）NBRC 15615、オクロバクトラム・アンスロピー（Ochrobactrum anthropi）ATCC 49237、オクロバクトラム・エスピー（Ochrobactrum sp .）(シュードモナス・オバリス（Pseudomonas ovalis）)NBRC 12952、オクロバクトラム・エスピー（Ochrobactrum sp.）（シュードモナス・オバリス(Pseudomonas ovalis)）NBRC 12953、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）NBRC 12442、リゾビウム・ラジオバクター（Rhizobium radiobacter）IAM 12048、リゾビウム・ラジオバクター（Rhizobium radiobacter）IAM 13129、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）ATCC 15960が好ましく用いられる。
【００５４】
また、反応基質となる２−ペンタノンあるいは２−ヘキサノンは、通常、基質濃度が０．０１〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜３０％ｗ／ｖの範囲で用いられる。反応基質は、反応開始時に一括して添加しても良いが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
【００５５】
本発明の製造方法において、２−ペンタノンあるいは２−ヘキサノンのカルボニル基含有化合物（反応基質）に上記形質転換体細胞又はカルボニル還元活性を有する微生物を作用させるにあたっては、該形質転換体細胞又は微生物細胞をそのまま用いることもできるが、該細胞処理物、例えば、該細胞をアセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の細胞処理物、該細胞中のカルボニル還元酵素画分を粗精製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いることができる。反応液に添加する形質転換体細胞若しくは微生物細胞及び／又は該細胞処理物の量は、反応液にその細胞の濃度が通常、湿菌体重で０．１〜５０％ｗ／ｖ程度、好ましくは１〜２０％ｗ／ｖとなるように添加し、酵素のような調製物を用いる場合には、酵素の比活性を求め、添加したときに上記細胞濃度になるような量を添加する。
【００５６】
また、本発明の製造方法においては、補酵素ＮＡＤＰ+もしくはＮＡＤＰＨ、又はＮＡ
Ｄ+もしくはＮＡＤＨを添加するのが好ましく、補酵素の濃度としては、通常０．００１
ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭ添加する。
上記補酵素を添加する場合には、ＮＡＤＰＨ（ＮＤＡＨ）から生成するＮＡＤＰ+（Ｎ
ＡＤ+）をＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＨ）へ再生させることが生産効率向上のため好ましく、再
生方法としては、１）宿主微生物自体のＮＡＤＰ+（ＮＡＤ+）還元能を利用する方法、２）ＮＡＤＰ+（ＮＡＤ+）からＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＨ）を生成する能力を有する微生物やその処理物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などのＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＨ）の再生に利用可能な酵素（再生酵素）を反応系内に添加する方法、３）形質転換体を製造するに当たり、ＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＨ）の再生に利用可能な酵素である上記再生酵素類の遺伝子を本発明のＤＮＡと同時に宿主に導入し発現させる方法、等が挙げられる。
【００５７】
このうち、上記１）の方法においては、反応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加する方が好ましい。
また、上記２）の方法においては、上記再生酵素類を含む微生物、該微生物菌体をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の酵素を用いても良い。
この場合、上記再生酵素の使用量としては、具体的には、本発明のカルボニル還元酵素に比較して、酵素活性で通常０．０１〜１００倍、好ましくは０．５〜２０倍程度となるよう添加する。
また、上記再生酵素の基質となる化合物、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなどの添加も必要となるが、その添加量としては、反応原料である２−ペンタノン、又は、２−ヘキサノンに対して、通常０．１〜２０倍モル当量、好ましくは１〜５倍モル当量添加する。
【００５８】
また、上記３）の方法においては、カルボニル還元酵素をコードするＤＮＡと上記再生酵素類のＤＮＡを染色体に組み込む方法、単一のベクター中に両ＤＮＡを導入し、宿主を形質転換する方法及び両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法を用いることができるが、両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法の場合、両ベクター同士の不和合性を考慮してベクターを選択する必要がある。
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００５９】
本発明の製造方法は、反応基質及びカルボニル還元酵素をコードするＤＮＡを発現させた形質転換体細胞、該細胞処理物、該細胞培養液、及び／又は、該細胞から得られるカルボニル還元酵素画分の粗精製物若しくは精製物、並びに、必要に応じて添加された各種補酵素及びその再生システムを含有する水性媒体中もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。
また、本発明の製造方法は、反応基質及びブレッタノマイセス（Brettanomyces）属、
キャンディダ（Candida）属、ホルテア（Hortaea）属、イサチェンキア（Issatchenkia）属、ロッデロマイセス（Lodderomyces）属、ピキア（Pichia）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、アルスロバクター(Arthrobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、クルトバクテリウム(Crutobacterium)属、ゲオバチルス(Geobacillus)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属、パラコッカス(Paracoccus)属、リゾビウム(Rhizobium)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属のカルボニル還元酵素活性を有する微生物、該微生物処理物、該微生物培養液、及び／又は、該微生物から得られるカルボニル還元酵素画分の粗精製物若しくは精製物、並びに、必要に応じて添加された各種補酵素及びその再生システムを含有する水性媒体中もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。
上記、水性媒体としては、水又は緩衝液が挙げられる。緩衝液としては、リン酸ナトリウムやリン酸カリウム、トリス、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられ、また、有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、ジメチルスルホキシド等、反応基質の溶解度が高い物を使用することができる。
本発明の方法は、通常４〜６０℃、好ましくは１０〜４５℃の反応温度で、通常ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜８で行われる。反応時間は通常、１〜７２時間程度である。また、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
【００６０】
本発明の方法により生成する光学活性アルコールは、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質を遠心分離、膜処理などにより分離した後に、酢酸エチル、トルエンなどの有機溶媒による抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、晶析等を適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
【実施例】
【００６１】
次に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限
り、以下の実施例の記載に限定されるものではない。
【００６２】
（１）２−ペンタノンから（Ｓ）−２−ペンタノールを生成する微生物、及び、２−へキサノンから（Ｓ）−２−ヘキサノールを生成する微生物の単離
イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ社製）  ５ｇ／Ｌ、ポリペプトン（日本製薬社製）  ５ｇ／Ｌ，麦芽エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）  ３ｇ／Ｌ、グルコース（日本食品加工社製）  ２０ｇ／Ｌの組成からなる液体培地２．５ｍＬに、表１に示した各種の菌株を接種し、３０℃で２４から７２時間好気的に培養した。得られた各培養液から１ｍＬづつ培養液を採取し遠心分離により菌体を集めた。この菌体にトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を０．０４ｍＬ、脱塩水を０．０２８ｍＬ加え、菌体を十分に懸濁させたのちに、グルコース１００ｇ／Ｌを０．０５ｍＬ、ＮＡＤＰ+（オリエンタル酵母社製）１２ｇ／Ｌを０．０２ｍＬ添加し、さらに反応基質として２−ペンタノン又は２−ヘキサノンをイソプロパノールに１００ｇ／Ｌとなるように溶かした溶液を０．０１ｍＬ加え、３０℃で２０時間反応させた。
【００６３】
反応終了後の反応液を酢酸エチルで抽出し、生成した（Ｓ）−２−ペンタノール又は（Ｓ）−２−ヘキサノールの定量を行った。生成物の定量は、酢酸エチル抽出溶液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて測定した。ＧＣの条件は以下の通りである。
【００６４】
カラム：β−ＤＥＸ１２０  （ＳＵＰＥＬＣＯ社製、３０ｍ×０．２５ｍｍＩＤ、０．２５μｍ  ｆｉｌｍ）
キャリア：Ｈｅ  １．５ｍｌ／ｍｉｎ、  ｓｐｌｉｔ  １／５０
カラム温度：（Ｓ）−２−ペンタノールの定量時は５０℃、（Ｓ）−２−ヘキサノールの定量時は６５℃
注入温度：２５０℃
検出：ＦＩＤ  ２５０℃
ＧＣ：島津ＧＣ−１４Ａ
【００６５】
（Ｓ）−２−ペンタノールの定量結果を表１に、（Ｓ）−２−ヘキサノールの定量結果を表２に示す。
【００６６】
【表１】
2005245439.tif 000002
【００６７】
【表２】
2005245439.tif 000003
【００６８】
（２）イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ  ＪＣＭ１８２８株由来カルボニル還元酵素の単離
イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Issatchankia  scutulata  var.  scutulata）  ＪＣＭ１８２８株を２Ｌの培地（グルコース８０ｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）２０ｇ、ペプトン（極東製薬製）４０ｇ／Ｌ）で培養し、遠心分離により菌体を調製した。得られた湿菌体１５０ｇを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）、０．１ｍＭ  ＤＴＴ（以下これを単に「バッファー」と称する）で懸濁し、ダイノーミルＫＤＬ（シンマルエンタープライゼス製）により破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液に９０ｇ／Ｌの濃度になるようＰＥＧ６０００を添加し４℃で１時間静置後、遠心分離により沈殿を除去した。この上清より、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Amersham  Biosciences社製）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Amersham  Biosciences社製）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー、Ｍｏ ｎｏＱ（Amersham  Biosciences社製）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、及び Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（Amersham  Biosciences社製）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーを経ることにより、目的のカルボニル還元酵素を電気泳動的に単一バンドまで精製した。
【００６９】
精製の際、カルボニル還元酵素の活性は、酵素液を含む反応液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．３２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、２ｍＭ  １−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノン）を３７℃で反応させ、ＮＡＤＰＨの消費量を３４０ｎｍの吸光度の減少から算出することにより測定した。吸光度の測定にはＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  １９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を使用した。尚、上記反応において１分間に１ｎｍｏｌのＮＡＤＰＨを消費する活性を１Ｕとした。
イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ  ＪＣＭ１８２８株由来カルボニ
ル還元酵素の精製の結果を表３に示す。
【００７０】
【表３】
2005245439.tif 000004
【００７１】
上記表３の精製段階のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００活性画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により解析した結果、精製されたタンパク質はほぼ単一バンドであり、その分子量は約４０，０００Ｄａであった。
【００７２】
（３）ＩｓＡＤＨ１の基質特異性
様々なカルボニル化合物について上記（２）で精製したカルボニル還元酵素液を含む反応液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．３２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、２ｍＭ
基質）を調製し、３７℃で反応させた。反応液中のＮＡＤＰＨの消費量を３４０ｎｍの吸光度によりモニターすることによりそれぞれの化合物に対するカルボニル還元酵素活性を測定した。吸光度の測定にはＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  １９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を使用した。１−アセトキシ−３−クロロ−２−プロパノンに対するカルボニル還元酵素活性を１００とした時の、各基質化合物に対するカルボニル還元酵素の相対活性を表４に示す。
【００７３】
【表４】
2005245439.tif 000005
【００７４】
（４）ＩｓＡＤＨ１のアミノ酸配列の解析
前記（２）で得られた上記表３の精製段階のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００のカルボニル還元酵素を含む画分を脱塩、濃縮後、エドマン法によりＮ末端アミノ酸の解析を行い１８残基のＮ末端アミノ酸配列を決定した。結果を配列番号４に示す。
また、精製したカルボニル還元酵素を、リジルエンドペプチダーゼを用いた消化法（タンパク質実験ノート・下、羊土社）により消化して得たペプチドを逆相ＨＰＬＣ（アマシャム  バイオサイエンス社製  μＲＰＣ  Ｃ２／Ｃ１８  ＰＣ３．２／３）を用い、ペプチドを分離し、分取した。分取したペプチドピーク１種をエドマン法によりアミノ酸配列の解析を行い、アミノ酸配列を配列番号５に示した。
【００７５】
（５）ＩｓＡＤＨ１をコードするＤＮＡの配列解析及び形質転換体の作製
イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Issatchankia scutulata var. scutulata）ＪＣＭ１８２８株を前記（２）に示した培地で培養し、菌体を調製した。
菌体からのゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ  ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて抽出、精製した。得られたゲノムＤＮＡを元に、逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（インビトロジェン社製）を用いて、酵素添付のプロトコルによりｃＤＮＡを合成した。
【００７６】
前記（４）で得られた配列番号４のＮ末端アミノ酸配列を元にセンスデジェネレイト（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマー及び配列番号５の内部アミノ酸配列を元にアンチセンスのデジェネレイト（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマーを計２種類合成した。それぞれの塩基配列を配列番号６，７に示した。この２種のプライマーを用いて、イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Issatchankia scutulata var. scutulata）ＪＣＭ１８２８株のｃＤＮＡに対してデジェネレイト（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ＰＣＲを行ったところ、約３５０ｂｐの増幅断片が認められた。
【００７７】
このＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動を行い、約３５０ｂｐの断片のバンドを切り出しＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製して回収した。得られたＤＮＡ断片を、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地で生育させ、いくつかのコロニーを用いて、Ｔ７プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とＳＰ６プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられるコロニーを、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＰｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）によりプラスミドを精製した。
精製したプラスミドを用いて、挿入ＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析した。決された塩基配列を配列番号８として示した。
【００７８】
次に、イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Issatchankia scutulata
var. scutulata）ＪＣＭ１８２８株のゲノムＤＮＡを元に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌ
ｏｎｉｎｇ記載の方法に従ってＲＡＣＥ反応用のｃＤＮＡを合成し、同文献記載の方法で５'−及び３'−ＲＡＣＥ反応を行った。反応には上記塩基配列を元に設計した配列番号９および１０に示す２種の遺伝子特異的プライマーを用いた。
【００７９】
ＲＡＣＥ反応による増幅遺伝子断片の配列解析の結果、本カルボニル還元酵素の推定ｃＤＮＡ配列を配列番号１１に、該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列を配列番号１に示した。配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号２に示した。
【００８０】
引き続き、上記配列番号１１に記載の配列を元に、クローニング用のプライマーとして配列番号１２に記載の塩基配列及び配列番号１３に記載の塩基配列を合成し、上記プライマーを各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０００ｎｍｏｌ、イサチェンキア・スクチュラータ変種スクチュラータ（Issatchankia scutulata var. scutulata）ＪＣＭ１８２８株のｃ ＤＮＡ  ２５０ｎｇ、ＥｘＴａｑ  ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ用１０×緩衝液（タカラバイオ社製）１０μＬ、ＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ５ユニット（タカラバイオ社製）を含む１００μＬの反応液を用い、変性（９５℃、１分）、アニール（５８℃、１分）、伸長（７２℃、１分）を３０サイクル、ＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。
【００８１】
上記反応液をＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製した。精製したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Ｑｉａｇｅｎ
Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製後回収した。
得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ、及びＸｂａＩで消化したｐＵＣ１１８とＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上で生育させ、コロ
ニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。
目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられる形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＰｒｅｐＳｐｉｎ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを精製し、ｐＵＣＩｓＡＤＨ１とした。
プラスミドに挿入したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析したところ、挿入されたＤＮＡ断片は、配列番号２の塩基配列と一致した。
【００８２】
（６）ＩｓＡＤＨ１をコードするＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いた（Ｓ）−２−ペンタノールの合成
前記（５）で得られた形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＣｉｒｃｌｅ  Ｇｒｏｗ培地１００ｍＬ（ＢＩＯ  １０１社製）を１０連で３０℃で３０時間培養した。得られた菌体を遠心分離により集菌後、下記に示す方法により、２−ペンタノンを基質として（Ｓ）−２−ペンタノールの合成を行った。
【００８３】
上記菌体１０ｇに０．６ｇ／Ｌ  ＮＡＤＰ+（オリエンタル酵母社製）２０ｍｇ、１Ｍ トリス塩酸バッファー（ｐＨ７．０）１０ｍＬ、１００ｇ／Ｌ  グルコース  ４０ｍＬ、グルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、７６ｕｎｉｔ／ｍｇ）  ２０ｍｇ、２−ペンタノン（東京化成社製、ニート）１ｇを添加後３０℃で８時間反応させた。反応時のｐＨを２Ｍ  炭酸ナトリウムで７．０に保った。反応終了後の反応液を酢酸エチル抽出し、生成した（Ｓ）−２−ペンタノールの定量を行った。
【００８４】
定量は酢酸エチル溶液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて測定した。ＧＣの条件は以下の通りである。
カラム：β−ＤＥＸ１２０  （ＳＵＰＥＬＣＯ社製、３０ｍ×０．２５ｍｍＩＤ、０．２５μｍ  ｆｉｌｍ）
キャリア：Ｈｅ  １．５ｍｌ／ｍｉｎ、  ｓｐｌｉｔ  １／５０
カラム温度：５０℃
注入温度：２５０℃
検出：ＦＩＤ  ２５０℃
ＧＣ：島津ＧＣ−１４Ａ
【００８５】
この結果、（Ｓ）−２−ペンタノールの収量は０．９９ｇであり、光学純度は＞９９．０％ｅ．ｅ．であった。
【００８６】
（７）ＩｓＡＤＨ１をコードするＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いた（Ｓ）−２−ヘキサノールの合成。
前記（６）で得られた形質転換体を用い下記に示す方法により、２−ヘキサノンを基質として（Ｓ）−２−ヘキサノールの合成を行った。
【００８７】
上記菌体１０ｇに０．６ｇ／Ｌ  ＮＡＤＰ+（オリエンタル酵母社製）２０ｍｇ、１Ｍ トリス塩酸バッファー（ｐＨ７．０）１０ｍＬ、１００ｇ／Ｌ  グルコース  ４０ｍＬ、グルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、７６ｕｎｉｔ／ｍｇ）  ２０ｍｇ、２−ヘキサノン（東京化成社製、ニート）１ｇを添加後３０℃で６時間反応させた。反応時のｐＨを２Ｍ  炭酸ナトリウムで７．０に保った。反応終了後の反応液を酢酸エチル抽出し、生成した（Ｓ）−２−ヘキサノールの定量を行った。
【００８８】
定量は酢酸エチル溶液をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて測定した。ＧＣの条件は以下の通りである。
カラム：β−ＤＥＸ１２０  （ＳＵＰＥＬＣＯ社製、３０ｍ×０．２５ｍｍＩＤ、０．２５μｍ  ｆｉｌｍ）
キャリア：Ｈｅ  １．５ｍｌ／ｍｉｎ、  ｓｐｌｉｔ  １／５０
カラム温度：６５℃
注入温度：２５０℃
検出：ＦＩＤ  ２５０℃
ＧＣ：島津ＧＣ−１４Ａ
【００８９】
この結果、（Ｓ）−２−ヘキサノールの収量は０．９９ｇであり、光学純度は＞９９．０％ｅ．ｅ．であった。
【配列表】
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