(57)【要約】 【課題】  観賞魚において、従来になく多種類の選択肢を提供し、しかも、遺伝子組換え技術を逐次実行するよりもはるかに迅速かつ安価な手法で、これら観賞魚を作製する。【解決手段】  本発明は、新規遺伝子断片、前記遺伝子断片に由来したトランスジェニックフィッシュの作製方法、該方法により作製された新規トランスジェニックフィッシュに関する。本発明はさらに、トランスジェニックフィッシュを、該トランスジェニックフィッシュと異なる表現型または行動パターンを有する魚と交配することによる、新規観賞魚を作製する新規方法に関する。その結果得られるトランスジェニックフィッシュは、両親のそれぞれと異なる表現型や行動パターンを呈する。本発明はまた、前記方法により作製された新規観賞魚を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）メダカのβ‐アクチン遺伝子プロモーター；（２）赤色蛍光遺伝子；および（３）アデノ随伴ウィルスの末端反復配列（ＩＴＲ）を含み、前記蛍光遺伝子が、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子に由来しないことを特徴とする遺伝子断片。
【請求項２】
下記構造：
【化１】
2005245435.tif 000006
を有する請求項１に記載の遺伝子断片。
【請求項３】
請求項１に記載の遺伝子断片を含むプラスミド。
【請求項４】
全身性の蛍光を有するメダカを生産する方法であって、
（ａ）請求項３に記載のプラスミドの適量をメダカの受精卵にマイクロインジェクションする工程；
（ｂ）蛍光を有する卵を選択する工程；
（ｃ）選択された卵を孵化させて成熟させる工程；
（ｄ）得られた成魚と野生型の魚とを交雑する工程；および
（ｅ）全身性の蛍光を有する子孫を選択する工程
を含むことを特徴とする生産方法。
【請求項５】
前記受精卵に注入されたプラスミドの前記適量が、組換え遺伝子をメダカの胚性細胞に導入するのに十分量である請求項４に記載の生産方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法で生産された、全身性の蛍光を有するメダカ。
【請求項７】
Oryzias javanicus, Oryzias latipes, Oryzias nigrimas, Oryzias luzonensis, Oryzias profundicola, Oryzias matanensis, Oryzias mekongensis, Oryzias minutillus, Oryzias melastigma, O. curvinotus, O. celebensis, Xenopecillus oophorus またはXenopecillus saracinorumである請求項６に記載のメダカ。
【請求項８】
Oryzias latipesである請求項７に記載のメダカ。
【請求項９】
（１）ゴールデン・ゼブラフィッシュのα‐アクチン遺伝子プロモーター；（２）蛍光遺伝子；および（３）アデノ随伴ウィルスの末端反復配列（ＩＴＲ）を含むことを特徴とする遺伝子断片。
【請求項１０】
下記構造：
【化２】
2005245435.tif 000007
または
【化３】
2005245435.tif 000008
を有する請求項９に記載の遺伝子断片。
【請求項１１】
請求項１０に記載の遺伝子断片を含むプラスミド。
【請求項１２】
全身性の蛍光を有するゼブラフィッシュを生産する方法であって、
（ａ）請求項１１に記載のプラスミドの適量をゼブラフィッシュの受精卵にマイクロインジェクションする工程；
（ｂ）蛍光を有する卵を選択する工程；
（ｃ）選択された卵を孵化させて成熟させる工程；
（ｄ）得られた成魚と野生型の魚とを交雑する工程；および
（ｅ）全身性の蛍光を有する子孫を選択する工程
を含むことを特徴とする生産方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法で生産された、全身性の蛍光を有するゼブラフィッシュ。
【請求項１４】
ゴールデン・ゼブラフィッシュである請求項１３に記載のゼブラフィッシュ。
【請求項１５】
全身性の赤色蛍光を有する請求項１４に記載のゼブラフィッシュ。
【請求項１６】
全身性の緑色蛍光を有する請求項１４に記載のゼブラフィッシュ。
【請求項１７】
観賞魚を作製する方法であって、
（ａ）１種類以上の融合型蛍光遺伝子を有するトランスジェニックフィッシュを作製する工程；
（ｂ）前記トランスジェニックフィッシュを、該トランスジェニックフィッシュと異なる表現型またはパターンを有する魚と交配する工程；および
（ｃ）両親と異なる表現型またはパターンを示すような、新規トランスジェニック子孫をスクリーニングする工程
を含む作製方法。
【請求項１８】
前記トランスジェニックフィッシュと、該トランスジェニックフィッシュと異なる表現型またはパターンを有する前記魚とが、科、属、もしくは種について同一である、または互いに異なる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記トランスジェニックフィッシュと、該トランスジェニックフィッシュと異なる表現型またはパターンを有する前記魚とが、属または種について互いに異なる請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記蛍光遺伝子が、緑色蛍光タンパク質 (GFP)、 変性緑色蛍光タンパク質、 増幅緑色蛍光タンパク質(EGFP)、 赤色蛍光タンパク質(RFP)、 増幅赤色蛍光タンパク質(ERFP)、 青色蛍光タンパク質(BFP)、 増幅青色蛍光タンパク質(EBFP)、 黄色蛍光タンパク質(YFP)、 増幅黄色蛍光タンパク質(EYFP)、 シアン蛍光タンパク質 (CFP)、および増幅シアン蛍光タンパク質(ECFP)からなる群より選ばれる請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記蛍光遺伝子が、緑色蛍光タンパク質(GFP)、 変性緑色蛍光タンパク質、 増幅緑色蛍光タンパク質(EGFP)、 赤色蛍光タンパク質(RFP)および増幅赤色蛍光タンパク質(ERFP)からなる群より選ばれる請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
魚の前記表現型が、色、蛍光色、体形、体の大きさ、体の透明度、点の色、縞の色、ひれの形、ひれの大きさ、尾部の形、尾部の大きさ、眼の色、眼の形；および、他の蛍光魚と異なる表現型であって観察可能ないずれかの差異、からなる群より選ばれる請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
魚の前記表現型が、色、体形、体の透明度、点の色、および縞の色からなる群より選ばれる請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
魚の前記パターンが、点のパターン、縞のパターン、および泳ぎ方のパターンからなる群より選ばれる請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記魚が、シクリダエ、ファイティング・フィッシュ、 キャットフィッシュ、 カラシダエ、キュプリニダエおよびキリフィッシュからなる群より選ばれる請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
前記シクリダエが、シュードトロフェウス、シクラソマ、アピストグラマ、プテロフィルムまたはシモヒソドンである請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ファイティング・フィッシュが、べタまたはマクロポドゥスである請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記キャットフィッシュが、コリドラス、 アンシストルスまたはプテリゴプリクチスである請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記カラシダエが、テトラスまたはカルネギエラである請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記キュプリニダエが、キュプリヌス、ブラキダニオ （ゼブラフィッシュ）、 ダニオまたはカラシウスである請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記キリフィッシュが、メダカ、リブリネスまたはライブベアリング・トゥースカープスである請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記ゼブラフィッシュが、D. acrostomus, D. aequipinnatus, D. malabaricus, D. albolineatus, D. annandalei, D. apogon, D. apopyris, D. assamensis, D. choprae, D. chrysotaeniatus, D. dangila, D. devario, D. fangfangae, D. frankei, D. fraseri, D. gibber, D. interruptus, D. kakhienensis, D. kyathit, D. laoensis, D. leptos, D. maetaengensis, D. malabaricus, D. naganensis, D. neilgherriensis, D. nigrofasciatus, D. pathirana, D. regina, D. rerio, D. roseus, D. salmonata, D. shanensis, D. spinosus, Brachydanio frankeiおよびBrachydanio sp.からなる群より選ばれる請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記メダカが、Oryzias javanicus, Oryzias latipes, Oryzias nigrimas, Oryzias luzonensis, Oryzias profundicola, Oryzias matanensis, Oryzias mekongensis, Oryzias minutillus, Oryzias melastigma, O. curvinotus, O. celebensis, Xenopecillus oophorus,およびXenopecillus saracinorumからなる群より選ばれる請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
新規トランスジェニック子孫が、TK1 red × O. curvinotus, TK1 green × O. curvinotus, TK2 red × Brachydanio frankei, TK2 red × Brachydanio sp, TK2 green × Brachydanio frankei, TK2 green × Brachydanio spまたはパープル・ゼブラ・フィッシュである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１７にしたがって作製された観賞魚。
【請求項３６】
TK1 red × O. curvinotus, TK1 green ×  O. curvinotus, TK2 red × Brachydanio frankei, TK2 red ×  Brachydanio sp, TK2 green × Brachydanio frankei, TK2 green × Brachydanio sp,またはパープル・ゼブラ・フィッシュである請求項３５に記載の魚。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規核酸断片、新規トランスジェニックメダカ、および新規トランスジェニックゼブラフィッシュに関する。本発明はまた、トランスジェニック蛍光魚から新規観賞魚を作製する方法、および、該方法によって作製された新規観賞魚に関する。 
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術は、遺伝子の機能を研究するための重要な手段となっている。外来遺伝子を魚に導入する手法としては多くのものがある。例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔法、精細胞を媒介とした遺伝子移入、ジーン・ボンバードメント(gene bombardment)すなわち遺伝子銃、リポソームを媒介とした遺伝子移入、ＤＮＡの筋組織への直接注入が挙げられる（非特許文献１）。
【０００３】
トランスジェニックフィッシュはまた、娯楽用としても作製されてきている。例えば、魚に特異的な遺伝子プロモーターと融合したGFP遺伝子を受精卵に導入することによって緑色蛍光の発現したトランスジェニックフィッシュが、メダカを用いて既に作製されている（非特許文献２）。Tanakaらは、ヒメダカの胚性細胞のみにおいて緑色蛍光を示すトランスジェニックメダカを作製した （非特許文献３）。
【０００４】
トランスジェニックフィッシュの研究では、異種由来および同種由来のいずれでもよい制御エレメントによって駆動され、構成遺伝子群あるいは組織特異的に発現している遺伝子群に由来する遺伝子が利用されている。制御エレメントとしては、不凍化タンパク質、マウス  メタロチオネイン、ニワトリ  δ‐クリスタリン、コイ  β‐アクチン、サケ  ヒストン Ｈ３、コイ  α‐グロビン等に由来する遺伝子などが挙げられる。
しかしながら、これらのＤＮＡエレメントをトランスジェニックフィッシュに利用しようとすると、重大な欠点が存在し、欠点として、たとえば発現効率の低さや、組換え遺伝子パターンのモザイク発現現象などが挙げられる。
【０００５】
メダカ  β‐アクチン プロモーター によって駆動されたlacZ レポーター遺伝子をメダカの卵に注入するマイクロインジェクションを行うと、lacZ 遺伝子が一過性に発現する結果が得られる。この結果は、Ｆ１世代においても同様である。ところが、ここでの発現は低頻度であり、かつ高度のモザイク型である。Hamadaらは、メダカβ‐アクチンプロモーターと融合された緑色蛍光タンパク質をマイクロインジェクトされた卵に由来するメダカ胚について、同様の結果を報告している(Hamadaらによる上記文献)。
【０００６】
残念ながら、従来の遺伝子組換え技術では、モザイク型を呈するあるいは蛍光の弱いトランスジェニックフィッシュしか生産することができず、このようなトランスジェニックフィッシュの蛍光は、特定波長の光源を備えた蛍光顕微鏡下でしか観察できなかった。これら実用性の乏しさおよび種々の欠点のため、このような種類の蛍光魚は、消費者にあまり受け入れられず、商業的には成功していなかった。
【０００７】
Chi-Yuan Chouらは、メダカにおける導入遺伝子の発現効率を向上させるために、両端に末端反復配列（inverted terminal repeats ：ITRs）を隣接させたＤＮＡコンストラクトを開示しており、組換え遺伝子の均一の発現を、Ｆ０世代、およびＦ０世代に続く２世代において達成している（非特許文献４）。また、緑色蛍光のトランスジェニックメダカについて記述がなされている。しかし、その他の蛍光タンパク質遺伝子(例えば赤色蛍光タンパク質の)を有する他種類のトランスジェニックフィッシュを作製しようとすると、その作成方法や条件は、先行技術とは異なり、しかも先行技術から容易には推定できない。遺伝子構築、遺伝子発現、遺伝方式についての戦略の立て方や、遺伝子組換え技術の不確定性が、遺伝子によってそれぞれ異なるからである。
【０００８】
魚を交配することには、遺伝的変異を利用して魚の改良品種を作り出すという目的がある。遺伝子組換え技術を、所望の色や型に応じて一種類ごとに利用すれば、種々の蛍光色や表現型パターンを呈する新規観賞魚を作製することはできる。しかし、このように逐一技術を適用することは、明らかに費用がかかり、多大な労力を要求し、また長い時間を要する。
【非特許文献１】Xu et al., DNA Cell Biol. 1999. 18,85-95
【非特許文献２】Hamada, K. et al., Mol. Marine Biol. Biotech., 1998. 7, 173-180
【非特許文献３】Tanaka, et al, The 22nd Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, Program, Abstract, 1999. pp. 458
【非特許文献４】Chi-Yuan Chou et al., Transgenic Research 2001. 10: 303-315
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
子孫魚の遺伝子型は、雄性配偶子の遺伝子型と雌性配偶子の遺伝子型との組み合わせ結果であって、融合によって接合体に受け継がれ、最終的に、この接合体から子孫の魚体が発生する。本発明者は、遺伝的交配を、トランスジェニックフィッシュと、該トランスジェニックフィッシュと表現型もしくは行動パターンが異なる、例えばスポットのパターン、縞の色、さらには環境の変化に対する感受性が異なる、同種または異種の魚との間で行うことによって、観賞魚において、トランスジェニックフィッシュの登場より前には提供され得なかったような、従来になく多種類の選択肢を提供し得ること、しかも、遺伝子組換え技術を逐次実行するよりもはるかに迅速かつ安価な手法で、これら観賞魚を作製できることを見出した。 
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の主題の一つは、組換えＤＮＡ技術を、所望の組換え遺伝子を有した蛍光魚の安定供給を確立するために利用することである。
【００１１】
本発明の別の主題は、（１）メダカのβ‐アクチン遺伝子プロモーター；（２）蛍光遺伝子；および（３）アデノ随伴ウィルスの末端反復配列（ＩＴＲ）を含み、前記蛍光遺伝子が、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子に由来しない核酸断片に関する。
【００１２】
本発明の別の主題は、（１）ゼブラフィッシュのα‐アクチン遺伝子プロモーター；（２）緑色蛍光遺伝子；および（３）アデノ随伴ウィルスの末端反復配列（ＩＴＲ）を含む核酸断片に関する。
【００１３】
本発明の別の主題は、（１）ゴールデン・ゼブラフィッシュのα‐アクチン遺伝子プロモーター；（２）赤色蛍光遺伝子；および（３）アデノ随伴ウィルスの末端反復配列（ＩＴＲ）を含む核酸断片に関する。
【００１４】
本発明の別の主題は、蛍光組換え遺伝子を保持し蛍光タンパク質を発現するような新規メダカを作製する方法に関する。
【００１５】
本発明の別の主題は、蛍光組換え遺伝子を保持し蛍光タンパク質を発現するような新規ゼブラフィッシュを作製する方法に関する。
【００１６】
本発明のさらに別の主題は、新規観賞魚を作製する方法であって、
（ａ）１種類以上の融合型蛍光遺伝子を有するトランスジェニックフィッシュを作製する工程；（ｂ）前記トランスジェニックフィッシュを、該トランスジェニックフィッシュと異なる表現型またはパターンを有する魚と交配する工程；および（ｃ）両親と異なる表現型またはパターンを示すような、新規トランスジェニック子孫をスクリーニングする工程
を含む作製方法に関する。
【００１７】
本発明のさらに別の主題は、本発明の方法により作製された新規トランスジェニックフィッシュに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
・遺伝子断片pβ-DsRed2-1-ITR
従来技術の蛍光トランスジェニックフィッシュにおける不都合を克服するために、本発明は概念上の飛躍的進歩をともなって、綿密かつ慎重に設計されている。本発明は、メダカのβ‐アクチン遺伝子プロモーターを、発現ベクターpDsRed2-1-ITRに導入することによって作製されるプラスミド構築物（プラスミドコンストラクト）である、pβ-DsRed2-1-ITRを提供する。
【００１９】
本発明は、（１）メダカのβ‐アクチン遺伝子プロモーター；（２）蛍光遺伝子；および（３）アデノ随伴ウィルスの末端反復配列（ＩＴＲ）を含み、前記蛍光遺伝子が、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子に由来しないことを特徴とする遺伝子断片を提供する。
【００２０】
上記本発明における好ましい遺伝子断片は、下記構造：
【００２１】
【化１】
2005245435.tif 000002
を有するものである。
【００２２】
本願発明はまた、本発明の遺伝子断片を含むプラスミドを提供する。
【００２３】
・新規トランスジェニックメダカの作製方法
本発明はまた、新規トランスジェニックメダカの作製方法を提供する。
適量の前記プラスミドpβ-DsRed2-1-ITRを、メダカ受精卵の細胞質に、第一卵割よりも前にマイクロインジェクションする。マイクロインジェクションの施された受精卵をスクリーニングして、全身の骨格筋にくまなく蛍光を呈している子孫を見いだす。その後、蛍光組換え遺伝子を有する子孫を、以降の交配に用いる。
本発明の方法は、現在一般に利用可能な他の方法に比して、５種類の改善をもたらす。すなわち、
１．本発明の核酸断片、例えばpβDsRed2-1-ITRは、市販のベクターから製造することができる。
２．本発明の核酸断片は、メダカにおいて、全身の骨格筋にくまなく蛍光を呈させることを可能とする。
３．組換え遺伝子コンストラクトを受精卵にマイクロインジェクションする工程を含む本発明の方法によれば、作製されたトランスジェニックメダカにおいて、確実に、蛍光を全身の骨格筋に、従来より高い比率で、かつ、より高品質に発させることができる。
４．作製された異種性のトランスジェニックフィッシュから次世代に、組換え遺伝子が安定して伝達される。したがって、トランスジェニック群を維持するために自然繁殖を利用することも可能であり、繁殖コストを削減することができる。
５．作製されたトランスジェニックメダカの蛍光は、全身の骨格筋に発せられ、肉眼で容易に見ることができる。この蛍光はさらに、比較的短波長の光源下で増強されるので、観賞魚に、より高度の娯楽性を付与することもできる。
【００２４】
上述したように、本発明は、
（ａ）上記本発明のプラスミドの適量をメダカの受精卵にマイクロインジェクションする工程；
（ｂ）蛍光を有する卵を選択する工程；
（ｃ）選択された卵を孵化させて成熟させる工程；
（ｄ）得られた成魚と野生型の魚とを交雑する工程；および
（ｅ）全身性の蛍光を有する子孫を選択する工程
を含む、トランスジェニックメダカの生産方法を提供する。
【００２５】
本発明の方法において好ましい蛍光遺伝子は、pDsRed2-1 (Clontech, USA)由来の赤色蛍光遺伝子である。
【００２６】
本発明のトランスジェニックメダカの生産方法において、受精卵に注入されるNotI処理-線状化プラスミドコンストラクトの適量とは、組換え遺伝子をメダカの胚性細胞に導入するために十分な分量である。上記受精卵に注入される線状プラスミドコンストラクトの好ましい分量は、1-10nlである。受精卵に注入される線状プラスミドコンストラクトの最も好ましい分量は、2-3nlである。
【００２７】
・赤色蛍光トランスジェニックフィッシュ
本発明によれば、また、発現ベクター pβ-DsRed2-1-ITR由来に作製されたトランスジェニックフィッシュが提供される。さらに具体的には、赤色蛍光を示すメダカである “red TK-1”が提供される。
【００２８】
EGFPを発現した蛍光メダカを作製する方法は、Chi-Yuan Chouらによる上記引用文献において開示されているが、この引用文献から推定して、他の種類の蛍光遺伝子を発現するようなその他トランスジェニックメダカを作製することは、下記で論述する理由により、容易には行えない。
【００２９】
ベクターの構築について言えば、EGFPをコードする配列を含むベクターは、β‐アクチン プロモーターを、pOBA-109から、制限酵素であるSalIおよびNcoIを用いて切り出すことによって構築された。回収された4 kbのＤＮＡ断片は、同様の酵素で消化されたpEGFPITRベクターの4.7 kb断片に連結された。本発明のベクターは、RFPをコードする配列を含み、ごく少数の制限酵素認識部位しか有さず、構築することがより困難である。まず、β‐アクチン  プロモーターを、プラスミドpOBA-109から、EcoRI およびNcoIを用いて切り出した。制限酵素消化断片の突出した５´末端を充填し、4 kbの断片を採取した。プラスミドpDsRedITRを、制限酵素SalIおよびBamHIによって消化し、消化断片の５´末端を脱リン酸化した。4.7 kbの消化断片を採取した。おわりに、β‐アクチン プロモーター断片を、上記4.7 kbの断片に連結した。
【００３０】
受精卵におけるマイクロインジェクションについて言えば、緑色蛍光の魚を作製するために用いられたキャピラリー針の直径は4-5μmであり、シリンジの内壁はシリコン処理されていた。20-30 plのＤＮＡ(10 ng/ml)を拡大率100 倍の条件下で注入した。注入後の、卵の生存率は85%-90%であった。本発明で用いられるキャピラリー針の直径は、1.6-2.5 μmであり、これはＤＮＡ溶液が針に残留しない最小直径である。そして、シリンジの内壁はシリコン処理されていなかった。20-30 plのＤＮＡ溶液を注入した。注入後の卵の生存率は90-95%すなわち、上記緑色蛍光の魚での生存率よりも5%高い割合であった。
【００３１】
RFPがGFPよりも安定に発現するので、トランスジェニックメダカにおけるGFPの発現はイエローグリーン(yellow-green)やオレンジグリーン(orange-green)に見える。トランスジェニックメダカに発現したRFPは、色の偏向を示さない。このことは、RFPが胚に対する毒性をあるいは有するからかもしれない。というのも、生存する胚はすべてヘテロ接合体であったからである。
【００３２】
緑色蛍光メダカと比較した、赤色蛍光メダカの繁殖育種の困難さについて、下記の表１に示す。
【００３３】
【表１】
2005245435.tif 000003
【００３４】
表１では、繁殖条件を、green TK-1 (Chi-Yuan Chouらの上記引用文献にて開示されている)と、本発明におけるred TK-1とで比較している。表１に示されているとおり、red TK-1の卵の総数、卵数の魚あたり平均値、損失された卵の割合、孵化した子孫魚の割合、子孫の生存率、30 mmまで成長した魚体数、魚あたり卵の数、卵重量の平均値、成魚の体長、および成魚の体重の平均値は、green TK-1のそれら指標よりも明らかに低水準である。これらデータは、red TK-1の繁殖がgreen TK-1の繁殖よりも顕著に困難であり、したがって、red TK-1を繁殖させる方法は、Chi-Yuan Chouらの上記引用文献にて開示されている方法とは異なってくるということを示唆している。
【００３５】
・遺伝子断片p-αDsRedITR
本発明は、ゴールデン・ゼブラフィッシュのα‐アクチン遺伝子プロモーターを、発現ベクターpDsRed2-1-ITRに導入することによって作製されるプラスミドコンストラクトである、p-αDsRedITRを提供する。
【００３６】
本発明は、（１）ゼブラフィッシュのα‐アクチン遺伝子プロモーター；（２）蛍光遺伝子；および（３）アデノ随伴ウィルスの末端反復配列（ＩＴＲ）を含む遺伝子断片を提供する。
【００３７】
本発明はまた、ゴールデン・ゼブラフィッシュのα‐アクチン遺伝子プロモーターを、発現ベクターであるpDsRed2-1-ITRに導入し、ベクターpDsRed2-1-ITR のDsRed遺伝子と、EGFP 遺伝子とを交換することによって作製されるプラスミドコンストラクトである、p-αEGFPITRを提供する。
【００３８】
したがって、本発明における好ましい遺伝子断片は、下記構造： 
【００３９】
【化２】
2005245435.tif 000004
または
【００４０】
【化３】
2005245435.tif 000005
を有するものである。
【００４１】
本発明はまた、この発明の遺伝子断片を含むプラスミドを提供する。
【００４２】
本発明における赤色蛍光遺伝子を、BD Bioscience Clontechから購入することが可能である。本発明の実施態様において、pDsRed2-1が赤色蛍光遺伝子の原料として用いられる。pDsRed2-1は、DsRed2をコードする。このDsRed2は、DsRedの変異型であって、より速く成熟し、また非特異的な凝集がより低頻度となるように設計されている。DsRed2が恒常的に発現している哺乳類の細胞培養物においては、トランスフェクションから２４時間以内に、赤色に発光している細胞を蛍光顕微鏡法にて検出することができる。
【００４３】
・新規トランスジェニックゼブラフィッシュの作製方法
本発明はまた、
（ａ）上記本発明のプラスミドの適量をゼブラフィッシュの受精卵にマイクロインジェクションする工程；
（ｂ）蛍光を有する卵を選択する工程；
（ｃ）選択された卵を孵化させて成熟させる工程；
（ｄ）得られた成魚と野生型の魚とを交雑する工程；および
（ｅ）全身性の蛍光を有する子孫を選択する工程
を含む、トランスジェニックゼブラフィッシュの生産方法を提供する。
【００４４】
本発明の方法に用いられる蛍光遺伝子として好ましいものは、pDsRed2-1由来の赤色蛍光遺伝子である。
【００４５】
好ましいゼブラフィッシュは、ゴールデン・ゼブラ・ダニオ（Golden Zebra Danio） (以下、「ゴールデン・ゼブラフィッシュ」と称する)である。
【００４６】
本発明のトランスジェニックゼブラフィッシュの生産方法において、上記受精卵に注入されるNotI-線状化プラスミドコンストラクトの適量とは、組換え遺伝子をゴールデン・ゼブラフィッシュの胚性細胞に導入するために十分な分量である。受精卵に注入される線状プラスミドコンストラクトの好ましい分量は、1-10 nlである。受精卵に注入される線状プラスミドコンストラクトの最も好ましい分量は、2-3 nlである。
【００４７】
・赤色蛍光トランスジェニックフィッシュ
また本発明によれば、発現ベクターp-αDsRedITR由来に作製されたトランスジェニックフィッシュが提供される。さらに具体的には、赤色蛍光を示すゴールデン・ゼブラフィッシュである “red TK-2”が提供される。
【００４８】
・緑色蛍光トランスジェニックフィッシュ
また本発明によれば、発現ベクターp-αEGFPITR由来に作製されたトランスジェニックフィッシュが提供される。さらに具体的には、緑色蛍光を示すゴールデン・ゼブラフィッシュである “green TK-2”が提供される。
【００４９】
・新規観賞魚の作製方法
本発明では、（ａ）１種類以上の融合型蛍光遺伝子を有するトランスジェニックフィッシュを作製する工程；（ｂ）前記トランスジェニックフィッシュを、該トランスジェニックフィッシュと異なる表現型またはパターンを有する魚と交配する工程；および（ｃ）両親と異なる表現型またはパターンを示すような新規トランスジェニック子孫をスクリーニングする工程、を含む、観賞魚の作製方法が規定される。
【００５０】
ここで使用される用語「観賞魚」とは、トランスジェニックフィッシュ、または外来性コンストラクトが導入された魚の子孫を示す。「コンストラクトが導入された魚」には、当該コンストラクトの導入された胚性細胞から発生した魚が包含される。ここでいう「外来性コンストラクト」とは、魚に対し、人工的に導入する、またはもともと人工的に導入されている核酸のことである。「人工的な導入」という語は、通常の生殖すなわち遺伝的交雑によるコンストラクト導入を除外する意図で用いている。すなわち、交雑育種法による、動物の系あるいは系統への、遺伝子または形質の最初の導入を除外する意図で用いる。しかしながら、外来性コンストラクトを有している魚の、この外来性コンストラクト (つまり、元来は人工的に導入されたコンストラクト)を、通常の交配を介して移入することで作り出された魚は、外来性コンストラクトを有しているとみなす。このような魚は、外来性コンストラクトが既に導入された魚の子孫に相当する。ここで、ある魚の「子孫」とは、有性生殖またはクローニングによってこの魚から由来し、この魚から遺伝物質を受け継いでいる、いかなる魚であってもよい。この文脈において、「クローニング」とは、祖先に相当する魚のＤＮＡ、一個の細胞または細胞群から、この魚と遺伝的に同一の魚を作製することを意味する。他の魚の由来に相当する魚を、祖先魚と称する。本明細書等において、一個の細胞または細胞群(例えば胚性細胞)からの魚の発生、つまり一個の細胞または細胞群から魚体への成育とは、受精卵細胞あるいは胚性細胞 (およびこれらの子孫)が成長、分裂、および分化して、成魚を形づくるような発生過程を意味する。
【００５１】
祖先魚と異なる表現型またはパターンを呈する新規トランスジェニックフィッシュが作製および利用され得る方式を、具体例によって説明する。これら具体例で記述するトランスジェニックフィッシュは、観賞魚の商業的価値を向上させるために特に有用である。
【００５２】
・組換え遺伝子コンストラクト
組換え遺伝子コンストラクトは、トランスジェニックフィッシュを生産するために魚に導入される遺伝物質である。このようなコンストラクトは、人工的に魚に導入される。導入する方式、および往々にして組換え遺伝子コンストラクトの構造は、組換え遺伝子コンストラクトが外来性コンストラクトとなるようにする。組換え遺伝子コンストラクトは、いかなる核酸配列からも構築されうるが、本明細書等で開示したトランスジェニックフィッシュに用いるためには、組換え遺伝子コンストラクトが、発現配列を、発現産物タンパク質をコードする配列に対し操作可能に連結された状態で結合していることが好ましい。組換え遺伝子コンストラクトはまた、発現、安定性や、当該コンストラクトの魚ゲノムへの組込みを助けるようなその他構成要素を含んでいることが好ましい。本明細書等で用いる際、組換え遺伝子コンストラクトについて、「操作可能に」または「有効に」連結された構成要素とは、意図する目的に関して、協同して機能するように連結されている構成要素を意味している。
【００５３】
・魚
本明細書等で開示されているコンストラクトおよび方法は、いかなるタイプの魚にも適用することができる。ここで、「魚」とは、集合的に１種として呼称される種類であれば、いかなるものであってもよい。魚のうち、商業的または学問的に興味深い種や変種に属する魚を用いることが好ましい。このような魚として、シクリダエ（Cichlidae）［例えばシュードトロフェウス（Pseudotropheus）, シクラソマ（Cichlasoma）, アピストグラマ（Apistogramma）, プテロフィルム（Pterophyllum）, シモヒソドン（Symohysodon）など］, ファイティング・フィッシュ（Fighting fish）［例えばべタ（Betta） , マクロポドゥス（Macropodus）など］, キャットフィッシュ（Catfish）［例えば コリドラス（Corydoras）, アンシストルス（Ancistrus）, プテリゴプリクチス（Pterygoplichthys）など］, カラシダエ（Characidae）［例えばテトラス（Tetras） , カルネギエラ（Carnegiella） Carnegiellaなど］, キュプリニダエ（Cyprinidae）［例えば キュプリヌス（Cyprinus）, ブラキダニオ（Brachydanio）(ゼブラフィッシュ), ダニオ（Danio）, カラシウス（Carassius）など］，キリフィッシュ（Killifish）［例えば メダカ（Ｍedaka）, リブリネス（Rivulines）, ライブベアリング・トゥースカープス（Livebearing Toothcarps）など］、等が挙げられる。
【００５４】
本願で開示されたコンストラクトおよび方法に用いるために好適な魚は、メダカおよびゼブラフィッシュ (ブラキダニオまたはダニオ)である。メダカおよびゼブラフィッシュは、大部分が透明である (Kimmel, Trends Genet 5:283-8 (1989))という、観賞魚への利用に関して顕著に有利な点を有する。ゼブラフィッシュの一般的な飼育法および維持法は、StreisingerによってNatl. Cancer Inst. Monogr. 65:53-58 (1984)に記述されている。本発明における「メダカ」の用語は、特に制限されず、例えばOryzias javanicus, Oryzias latipes, Oryzias nigrimas, Oryzias luzonensis, Oryzias profundicola, Oryzias matanensis, Oryzias mekongensis, Oryzias minutillus, Oryzias melastigma, O. curvinotus, O. celebensis, Xenopecillus oophorus, Xenopecillus saracinorumなどの、Adrianichthyidae (ライスフィッシュ：Ricefishes)などの魚も含まれる。好ましいメダカは、特に制限されず、例えばOryzias javanicus, Oryzias latipes, Oryzias nigrimas, Oryzias luzonensis, Oryzias profundicola, Oryzias matanensis, Oryzias mekongensis, Oryzias minutillus, Oryzias melastigma, O. curvinotus, O. celebensisなどのOryziinaeが挙げられる。最も好ましいメダカは、Oryzias latipesである。
【００５５】
ブラキダニオとして好ましいものは、D. acrostomus, D. aequipinnatus, D. malabaricus, D. albolineatus, D. annandalei, D. apogon, D. apopyris, D. assamensis, D. choprae, D. chrysotaeniatus, D. dangila, D. devario, D. fangfangae, D. frankei, D. fraseri, D. gibber, D. interruptus, D. kakhienensis, D. kyathit, D. laoensis, D. leptos, D. maetaengensis, D. malabaricus, D. naganensis, D. neilgherriensis, D. nigrofasciatus, D. pathirana, D. regina, D. rerio, D. roseus, D. salmonata, D. shanensis および D. spinosusからなる群より選択される。最も好ましいものは、ゴールデン・ゼブラフィッシュである。
【００５６】
メダカおよびゼブラフィッシュの胚は、容易に入手することができ、ほぼ透明である。これらの特徴を有するので、レポータータンパク質、および、全身性に発現させようとする遺伝子配列をコードするコンストラクトを保持しているトランスジェニックメダカまたはトランスジェニックゼブラフィッシュの、卵もしくは胚によって、成功したトランスジェニック体を、in vivoで、迅速に、リアルタイムに同定することが可能となる。上記と同様の望ましい特徴のうち一部またはすべてを備えた他の魚も、同様に好適に利用できる。
【００５７】
・蛍光遺伝子
本発明の方法において、蛍光遺伝子は、緑色蛍光タンパク質 (GFP)、変性緑色蛍光タンパク質、増幅緑色蛍光タンパク質(EGFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、増幅赤色蛍光タンパク質(ERFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、増幅青色蛍光タンパク質(EBFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、増幅黄色蛍光タンパク質(EYFP)、シアン蛍光タンパク質 (CFP)、および増幅シアン蛍光タンパク質(ECFP)からなる群より選択される。好ましい蛍光遺伝子は、緑色蛍光タンパク質(GFP)、変性緑色蛍光タンパク質、増幅緑色蛍光タンパク質(EGFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)および増幅赤色蛍光タンパク質(ERFP)からなる群より選択される。
【００５８】
・祖先となるトランスジェニックフィッシュの作製
本願で開示されるトランスジェニックフィッシュは、ある組換え遺伝子コンストラクトを、魚の細胞に、好ましくは胚性細胞に、最も好ましくは単細胞胚に導入することによって生産される。組換え遺伝子コンストラクトを胚性細胞に導入すると、胚性細胞または細胞群を魚体にまで成育させることによって、トランスジェニックフィッシュを得ることができる。魚類のうちほとんどの種において胚が親の体外で成育するという事実により、魚の胚性細胞に対するコンストラクトの導入、およびそれに続く魚の成育を簡便化できる。
【００５９】
本願で開示されている組換え遺伝子コンストラクトは、適当ないかなる技術を用いても、魚の胚性細胞に導入され得る。外来性遺伝物質のこのような導入については、多種類の技術が、魚および他の動物において既に実施されている。これら技術には、マイクロインジェクション、電気穿孔法、パーティクル・ガン・ボンバードメント、および、リポソームを利用する手法が包含される。組換え遺伝子コンストラクトを魚の胚性細胞に導入するために好ましい手法は、マイクロインジェクションである。
【００６０】
胚あるいは胚性細胞は、一般に、産みつけられた直後に卵を採集することによって入手できる。魚のタイプにもよるが、採集よりも前または採集と同時に、卵を受精させることが一般的に好ましい。受精は、魚のオス１匹およびメス１匹を、交尾行動を刺激する条件下で卵を回収できるような水槽内に一緒に入れることによって好適に達成される。卵を採集した後には、卵膜を除去することによって、胚を、遺伝物質の導入にさらされる状態とすることが好ましい。この卵膜除去は用手法で行うこともできるし、好ましくはタンパク質分解酵素、例えばプロナーゼなど、を用いて行うこともできる。第一卵割より前の受精卵細胞は、単細胞胚であると考えられ, よって受精卵の細胞は一個の胚性細胞であるとみなせる。
【００６１】
組換え遺伝子コンストラクトを導入した後、胚を魚体にまで成育させる。このためには、一般に、卵のインキュベーションに用いられる条件と同様の条件下で胚をインキュベートする工程さえ含まれていればよい。しかし、胚性細胞を短時間、等張緩衝液中で培養することもまた可能である。導入が適切であれば、導入された組換え遺伝子コンストラクトの発現を、胚の発生過程中に観察することができる。
【００６２】
組換え遺伝子を擁した魚は、適当ないかなる手段によっても同定することができる。例えば、トランスジェニック体と思われる魚のゲノムに対し、コンストラクト配列の存在の探索を行うことができる。当該組換え遺伝子を実際に発現しているトランスジェニックフィッシュを同定するために、遺伝子発現産物の存在について分析することができる。このような同定のための技術として、いくつものものが知られており、またトランスジェニック動物に利用されていて、これら技術のほとんどが、トランスジェニックフィッシュに対して適用可能である。トランスジェニック体と思われる、または実際にトランスジェニック体となっている魚に対する、組換え遺伝子コンストラクトに存在するあるいは組換え遺伝子コンストラクトに特異的な核酸配列の探索を、サザンまたはノーザンブロッティング法によって好適に行うことができる。また、ポリメレース・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法あるいは、配列特異的な他の核酸増幅法を利用して検出を行うことも好ましい。自らが保持した組換え遺伝子によって蛍光を呈しているトランスジェニックメダカおよびトランスジェニックゼブラフィッシュは、目視にて直接確認できる。詳しくは例において記述する。
【００６３】
・新規トランスジェニックフィッシュの作製
本発明は、一倍体細胞を作製する方法に関する。また、該一倍体細胞から新規トランスジェニックフィッシュを作製する方法に関する。
【００６４】
本発明において、一倍体細胞は減数分裂過程によってできたものであることが好ましい。減数分裂過程は、遺伝的多様性を作り出す過程であり、生体のライフサイクルにおいて中心的な事象である。さらに、減数分裂という過程は、二倍体と一倍体の間の移行を表す。メスの生殖器官内の、減数分裂過程に入る分化細胞は、卵母細胞と呼ばれ、この細胞は、卵巣内部の分化した胚珠の中に包埋される。この卵母細胞から、減数分裂を経て一倍体の卵が形成される。
【００６５】
オスの生殖器官内では、同様の過程により、一倍体の精子が形成される。
【００６６】
雌性配偶子と雄性配偶子とでは、配偶子の形成に至る細胞性の過程には顕著な違いがあるが、雌性あるいは雄性の減数分裂の間に起こる細胞学的な事象は、互いに非常に似通っている。このことは、共通の遺伝子産物の関与を示唆している。
【００６７】
減数分裂の最終産物は、互いに遺伝的に異なる４個の一倍体細胞からなる組であり、この一倍体細胞が、有糸分裂を経て配偶体にまで発達しうる。配偶体は、融合の結果、接合体を形成し、次世代を産生可能な胚にまで発達する。
【００６８】
新規トランスジェニックフィッシュを作製するために、組換え遺伝子を有する祖先魚を、これと異なる表現型またはパターンを有する祖先魚と交配する。魚の表現型は、色、蛍光色、体形、体の大きさ、体の透明度、点の色、縞の色、ひれの形、ひれの大きさ、尾部の形、尾部の大きさ、眼の色、眼の形；および、他の蛍光魚と異なる表現型であって観察可能ないずれかの差異、からなる群より選択される。好ましい実施態様としては、前記魚の表現型を、色、体形、体の透明度、点の色および縞の色からなる群より選択する。
【００６９】
魚の前記パターンは、点のパターン、縞のパターン、泳ぎ方のパターンからなる群より選ばれる。
【００７０】
祖先魚由来の組換え遺伝子を保持した一倍体配偶子を、その祖先魚と表現型またはパターンの異なる祖先魚に由来する一倍体配偶子と、受精させる。この受精は、適切で実施可能ないかなる交配手法を用いて行ってもよい。なお、種に特異的な交配条件が必要となる場合がありえる。新規トランスジェニックメダカおよびトランスジェニックゼブラフィッシュの作製例を図に示した。例えば、トランスジェニックフィッシュの好ましい態様として、TK1 red × O. curvinotus, TK1 green × O. curvinotus, TK2 red × Brachydanio frankei, TK2 red × Brachydanio sp, TK2 green × Brachydanio frankei, TK2 green × Brachydanio spや、 パープル・ゼブラ・フィッシュ（Purple Zebra Fish）が例示される。 
【００７１】
トランスジェニックフィッシュと、該トランスジェニックフィッシュと異なる表現型またはパターンを有する魚とは、科、属、もしくは種について同一であってもよいし、互いに異なっていてもよい。好ましい態様において、トランスジェニックフィッシュと、該トランスジェニックフィッシュと異なる表現型またはパターンを有する魚とは、互いに異なる属または種である。
【００７２】
本分野における当業者は、記述されている本発明の具体的な実施態様に対応する、多数の同等例を、認識すること、あるいはごく通常の実験法を用いるのみで見出すことができよう。そのような同等例は、本願特許請求の範囲に包含されるものとみなす。
【実施例】
【００７３】
以下の実施例は限定的なものではなく、あくまで、本発明の種々の態様および特徴の代表例である。
【００７４】
・実施例１  プラスミドpβ-EGFPITRの作製
緑色蛍光のメダカである “green TK-1”を作製するために、プラスミドpβ-EGFPITRを、Chou CY et al, Transgenic Res. 2001 10(4): 303-15、にしたがって構築した。その構成について図１に示す。pβ-EGFPは、hGFP1 cDNAと融合したメダカ  β‐アクチン プロモーター、スモールＴ抗原のイントロン配列、SV40 ポリA、および、メダカβ‐アクチン遺伝子由来のポリAを含んでいた。メダカβ‐アクチン プロモーターを、pOBA-hGFP1から採取し、SalIおよびNcoIによって消化した。3.8 kbフラグメント長の最終消化産物を、pCMV-EGFPITR由来の、4.2 kbの SalI-NcoI消化断片に連結した。最終的な産物は、EGFP cDNAがβ‐アクチン プロモーターによって駆動されており、かつ、両端にAAV-ITRの隣接した、8 kbの pβ-EGFPITRプラスミドであった。
【００７５】
適量のpβ-EGFPITRをNotIで制限酵素処理した。pβ-EGFPITR DNA断片の大きさは、予測どおり7.6 kbであった。
【００７６】
・実施例２  プラスミドpβ-DsRed2-1-ITRの作製
赤色蛍光のメダカである“red TK-1”を作製するために、プラスミドpβ-DsRed2-1-ITRを構築した。図２に示すとおり、メダカβ‐アクチン遺伝子プロモーターを、制限酵素NcoIおよびEcoRIでプラスミドコンストラクト pOBA-109を消化することで採取した。このとき、まずNcoIを使用してから、制限酵素断片の両端を充填し、引き続いて、EcoRIによる消化を行った。その結果、4 kbの断片が得られた。
【００７７】
図２に示したように、コンストラクトpDsRed2-1-ITRを、制限酵素BamHIおよびSalIで消化することにより、CMVプロモーターを切り出した。BamHIおよびSalIを用いた消化によって、4.7kbの断片が得られた。次いで、メダカ  β‐アクチン遺伝子プロモーターを、上記プラスミドコンストラクトpDsRed2-1-ITRの、CMV プロモーターが切り出された位置に挿入した。得られたプラスミドコンストラクトは、145bpのアデノ随伴ウィルス末端反復配列（ＩＴＲ）を２箇所有するものであった。一方のＩＴＲはSV40 ポリAの３´末端側に位置し、他方のＩＴＲはβ‐アクチン遺伝子プロモーターの５´末端側に位置していた。
【００７８】
図２において示されているように、得られたプラスミドコンストラクトであるpβ-DsRed2-1-ITRの全長は8.7 kbであった。pβ-DsRed2-1-ITRは、（１）メダカ  β‐アクチン 遺伝子プロモーター (全身における広範な発現のため);（２）サンゴの赤色蛍光タンパク質;（３）アデノ随伴ウィルスの末端反復配列;および（４）pUCプラスミド構築物ベースを含んでいた。
【００７９】
適量のpβ-DsRed2-1-ITRを、該適量に釣り合った分量のNot I制限酵素で消化した。消化産物のうち少量を、アガロースゲル電気泳動によって分析し、断片の直線性を確認した。消化断片の長さは、予測どおり8.7 kbであった。
【００８０】
・実施例３  プラスミドp-αEGFPITRの作製
緑色蛍光のゴールデン・ゼブラフィッシュである“green TK-2”を作製するために、プラスミドp-αEGFPITRを構築した。
【００８１】
pβ-EGFPITRのメダカ  β‐アクチン プロモーターを、制限酵素SalIおよびNcoIによる消化によって切り出した。次いで、ゴールデン・ゼブラフィッシュのα‐アクチン 遺伝子プロモーターを、上記プラスミドコンストラクトの、上記メダカβ‐アクチン プロモーターが切り出された位置に挿入した。得られたプラスミドコンストラクトは、145bpのアデノ随伴ウィルス末端反復配列（ＩＴＲ）を２箇所有するものであった。一方のＩＴＲはSV40 ポリAの３´末端側に位置し、他方のＩＴＲはα‐アクチン 遺伝子プロモーターの５´末端側に位置していた。
【００８２】
図３（ａ）において示したように、得られたプラスミドコンストラクトであるp-αEGFPITRの全長は8.1 kbであった。p-αEGFPITRは、（１）ゴールデン・ゼブラフィッシュ  α‐アクチン 遺伝子プロモーター (全身における広範な発現のため);（２）緑色蛍光タンパク質;（３）アデノ随伴ウィルスの末端反復配列;および（４）pUCプラスミド構築物ベースを含んでいた。
【００８３】
適量のp-αEGFPITRを、該適量に釣り合った分量のNot I制限酵素で消化した。消化産物のうち少量を、アガロースゲル電気泳動によって分析し、断片の直線性を確認した。消化断片の長さは、予測どおり8.1 kbであった。
【００８４】
・実施例４  プラスミドp-αDsRedITRの作製
赤色蛍光のゼブラフィッシュである“red TK-2”を作製するために、プラスミドp-αDsRedITRを構築した。図３（ｂ）に示すとおり、ゴールデン・ゼブラフィッシュのα‐アクチン 遺伝子プロモーターは、プラスミドコンストラクトp-αEGFPITRを、制限酵素NcoIおよびSalIで消化することで採取された。このとき、まずNcoIを使用してから、制限酵素断片の両端を充填し、引き続いて、SalIによる消化を行った。その結果、3.8 kbの断片が得られた。
【００８５】
図３（ｂ）において示したように、コンストラクトpDsRedITRを制限酵素BamHIおよびSalIで消化することによって、CMVプロモーターを切り出した。このとき、まずBamHIを使用してから、制限酵素断片の両端を充填し、引き続いて、SalIによる消化を行った。その結果4.2 kbの断片が得られた。次いで、ゴールデン・ゼブラフィッシュのα-アクチン 遺伝子プロモーターを、上記プラスミドコンストラクトpDsRedITRの、CMV プロモーターが切り出された位置に挿入した。得られたプラスミドコンストラクトは、145bpのアデノ随伴ウィルス末端反復配列（ＩＴＲ）を２箇所有するものであった。一方のＩＴＲはSV40 ポリAの３´末端側に位置し、他方のＩＴＲはα‐アクチン 遺伝子プロモーターの５´末端側に位置していた。
【００８６】
図３（ｂ）に示したように、得られたプラスミドコンストラクトであるp-αDsRedITRの全長は8.0 kbであった。得られたコンストラクトp-αDsRedITRは、（１）ゴールデン・ゼブラフィッシュ  α‐アクチン  遺伝子プロモーター（全身における広範な発現のため）；（２）サンゴの赤色蛍光タンパク質；（３）アデノ随伴ウィルスの末端反復配列；および（４）pUCプラスミド構築物ベースを含んでいた。
【００８７】
適量のp-αDsRedITRを、該適量に釣り合った分量のNot I制限酵素で消化した。消化産物のうち少量を、アガロースゲル電気泳動によって分析し、断片の直線性を確認した。消化断片の長さは、予測どおり8 kbであった。
【００８８】
・実施例５  マイクロインジェクションに供されるＤＮＡの調製
全てのＤＮＡプラスミドを、セシウムクロライドおよびエチジウムブロマイドのグラディエントを用いた超遠心法によって調製した(Radloff et al., 1967 Proc Natl Acad Sci USA 57:1514-1521)。マイクロインジェクションに供される全種類のＤＮＡは、電気泳動の後に、アガロースゲルから溶出された。
【００８９】
・実施例６  細胞質へのマイクロインジェクション
細胞質へのマイクロインジェクションに関して従った手順については、KinoshitaおよびOzato, 1995 Fish Biol J MEDAKA 7:59-64、ならびに、Kinoshita et al. 1996 Aquaculture 143:267-276、において詳細に記載されている。
【００９０】
魚の維持は、明期14h、暗期10h、26℃という人工条件下で行い、飼料Tetramin (Tetra, Germany)で飼育した。飼育器が暗期に入る前に、魚体を回収し、隔離用ネットで互いに隔離した。明期が始まった後の、翌朝に、魚の卵を15-20 分ごとに採集した。
【００９１】
受精から30分以内に卵を採集し、付着しているフィラメントを除去した。上述の各線状コンストラクトを計量し、所望の濃度となるように、フェノールレッド入り5× PBSに溶解した。ＤＮＡを、注入針の幅が約10μmであるマイクロキャピラリーを備えたゼブラフィッシュ・マイクロインジェクター(Drummond製)の、マイクロキャピラリーを用いて採取した。マイクロ針が標的細胞の細胞質に入ると、注入されたＤＮＡは約2-3 nlであった。マイクロインジェクションの操作１回あたり、30-40個の卵に対してインジェクションを行った。そして、一試験あたり250-300個の卵にインジェクションを行った。インジェクションを施した卵を、26℃の条件で、蒸留水中でインキュベートした。
【００９２】
・実施例７  トランスジェニック胚の孵化およびスクリーニング
インジェクションの施された卵を滅菌済み溶液ですすぎ、内部温度28.5℃のインキュベーター内で培養した。培養24時間後の、発生中の胚において、蛍光を観察確認できた。
【００９３】
解剖立体顕微鏡 (MZAPO, Leica, Germany)を用い、明視野で胚を観察した。また、GFP Plusフィルター(480 nm)を装備した立体顕微鏡を用いて、暗視野照明による緑色蛍光の検出を行った。赤色蛍光の分布および輝度を、蛍光顕微鏡 (Leica MZ-12; 蛍光システム: 光源Hg 100 W; 主要発光波長558 nm, および主要吸収波長583 nm, フィルター・セット RFP-Plus; 写真撮影システムMPS60)下で観察した。ISO 400のフィルムを搭載し、フィルム露光時間の制御装置を装備したMPS60カメラ(Leica, Germany)を用いて、写真を撮影した。トランスジェニックフィッシュの体組織におけるGFPあるいはRFP発現の分布を調べるために、GFP またはRFPの発現が認められた受精後11日の幼生を薄切し、蛍光顕微鏡鏡検で観察した。このとき、幼生を4℃、4%パラホルムアルデヒド、30分間の処理で固定し、クリオマトリックス(Shandon, USA)中に包埋し、−20℃で凍結した。厚み15μmの凍結切片（Cryostat Microtome, HM500 OM, Microm, Germany、を用いて作製したもの）をスライドに載せ、ただちにGFPまたはRFPの蛍光を観察した。
【００９４】
発現ベクター pβ-DsRed2-1-ITR由来に作製された赤色蛍光の魚がred TK-1である（図５（ａ））。発現ベクターpβ-EGFPITR由来に作製された緑色蛍光の魚がgreen TK-1である（図６（ａ））。発現ベクターp-αEGFPITR由来に作製された緑色蛍光の魚がgreen TK-2である。発現ベクターp-αDsRedITR由来に作製された赤色蛍光の魚がred TK-2である（図７（ａ））。
【００９５】
・実施例８  新規トランスジェニック種の作製
図４に示すように、red TK-1（図５（ａ））とOryzias curvinotus（図５（ｂ））との、green TK-1（図６（ａ））とOryzias curvinotus（図６（ｂ））との、red TK-2（図７（ａ））とBrachydanio sp（図７（ｂ））との、red TK-2（図８（ａ））とBrachydanio frankei（図８（ｂ））との、red TK-2（図９（ａ））とBrachydanio rerio（図９（ｂ））との、遺伝的交配をそれぞれ行った。
【００９６】
得られたＦ１世代の各種子孫トランスジェニック体、すなわちred TK-1 × Oryzias curvinotus（図５（ｃ））、green TK-1 × Oryzias curvinotus（図６（ｃ））、red TK-2 ×Brachydanio sp（図７（ｃ））、red TK-2 × Brachydanio frankei（図８（ｃ））、パープル・ゼブラ・フィッシュ（図９（ｃ））は、これらの各々の両親の遺伝的多様性の産物である。これらの実施例においては、祖先魚の一方が緑色または赤色の蛍光を呈するものであり、他方が特徴的な縞または点のパターンを示すものであった。このことから、上記交配により作製された各種新規トランスジェニック体は、両親双方の特徴を受け継いでいるとともに、両親のそれぞれと異なる表現型を示したといえる。
【００９７】
上述の各種新規トランスジェニック体を自己交雑してＦ２ホモ接合体を作製し、実施例７の記述と同様に孵化させた。このＦ２ホモ接合体の子孫はすべて、上述の組換え遺伝子を受け継ぎ、そして、上述のような新規な表現型を呈する。
【００９８】
ここまで、本発明を、当業者が本発明を製造および使用できる程度に十分に詳細に、記述および例示して説明してきたが、様々な同等例、変形例、および改良例が、本発明の思想および範囲から逸脱することなく導き出されるであろう。
【００９９】
当業者にとって、本発明に包含される態様はもちろんのこと、本発明が、上記目的を実現し、上述の結果および利点を得るために好適であることは、容易に認容できることである。上述した細胞系統、胚、動物、およびこれらを生産するための手順および方法は、好ましい実施態様の代表例であり、典型例であって、本発明の範囲に対する制限を意味するものではない。当業者は、本発明の範囲内の変形例や他の用途を想起できるであろう。このような改変は、本発明の思想の範囲内に包含され、そして、当該範囲は本願特許請求の範囲によって規定される。
【０１００】
本発明の範囲および思想から逸脱することなく、本明細書等で開示されている発明について、様々な代替例や変形例を作成可能であるということは、当業者において容易に認容されるであろう。
【０１０１】
本明細書において言及されている特許および文献はすべて、本発明が属する技術分野における通常の技術的手段を有する者の水準を示している。本明細書においては、すべての特許および文献は、参照のために示されており、参照のために、各文献を具体的かつ個別に示すのに十分な程度に記載されている。
【０１０２】
本明細書等において例示を用いて説明されている発明は、ここで特に開示されていない要素あるいは要素の集合を必要とせず、また、限定あるいは複数の限定要因を課せられることなく、適切に実施することができる。ここまで文中で採用してきている用語および表現は、定義通りの語として用いられており、制限を伴うものではない。また、これら用語や表現を使用することには、明細書中で提示されたり詳述されたりしている態様あるいはそれらの一部、と等価ないかなる態様についても、除外する意図がなく、特許請求の範囲に記載された発明の範囲内で様々な変形例が存在し得ることが容認される。したがって、本発明は好ましい態様および随意の特徴を用いて具体的に開示されているものの、ここで開示されている概念の変形や展開を、当業者が想起し得ると理解することができる。そして、このような改良や変形や展開は、本願に添付した特許請求の範囲によって規定されている本発明の範囲に、包含されると解される。
【０１０３】
他の各種態様は、本願特許請求の範囲内で表される。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１（ａ）はプラスミドコンストラクトpβ-EGFPを、図１（ｂ）はpβ-EGFP-ITRを示す。
【図２】図２は、pOBA-109およびpDsRed2-1-ITRからのプラスミドpβ-DsRed2-1-ITRの構築を図解したものである。
【図３】図３は、挿入された遺伝子断片および制限酵素認識部位を含むプラスミドコンストラクトであるp-αDsRedITRを示す。
【図４】図４は、red TK-1とOryzias curvinotusとの、green TK-1とOryzias curvinotusとの、red TK-2とBrachydanio spとの、red TK-2とBrachydanio frankeiとの、red TK-2とBrachydanio rerioとの交配を、それぞれ示す。
【図５】図５（ａ）は、red TK-1を、図５（ｂ）は、Oryzias curvinotusを、図５（ｃ）は、red TK-1×Oryzias curvinotusを、それぞれ示す写真である。
【図６】図６（ａ）は、green TK-1を、図６（ｂ）は、Oryzias curvinotusを、図６（ｃ）は、green TK-1 × Oryzias curvinotusを、それぞれ示す写真である。
【図７】図７（ａ）は、red TK-2を、図７（ｂ）は、Brachydanio spを、図７（ｃ）は、red TK-2 ×Brachydanio sp.を、それぞれ示す写真である。
【図８】図８（ａ）は、red TK-2を、図８（ｂ）は、Brachydanio frankeiを、図８（ｃ）は、red TK-2 × Brachydanio frankeiを、それぞれ示す写真である。
【図９】図９（ａ）は、red TK-2を、図９（ｂ）は、Brachydanio rerioを、図９（ｃ）は、パープル・ゼブラ・フィッシュを、それぞれ示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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