(57)【要約】【課題】  ジペプチジルペプチダーゼIVを阻害することで改善しうる疾患又は状態を予防または治療するための、優れたDPPIV阻害活性を示す新規フルオロシアノピロリジン誘導体を有する医薬を提供する。【解決手段】  優れたジペプチジルペプチダーゼIV阻害活性を示す（２Ｓ，４Ｓ）−２−シアノ−４−フルオロ−１−[（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチル）エチルアミノ]アセチルピロリジン・ベンゼンスルホン酸塩を有効成分として含有する医薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（２Ｓ，４Ｓ）−２−シアノ−４−フルオロ−１−[（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチル）エチルアミノ]アセチルピロリジン・ベンゼンスルホン酸塩またはその水和物を有効成分として含有するDPPIV阻害剤。
【請求項２】
（２Ｓ，４Ｓ）−２−シアノ−４−フルオロ−１−[（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチル）エチルアミノ]アセチルピロリジン・ベンゼンスルホン酸塩またはその水和物を有効成分として含有する、ジペプチジルペプチダーゼIVを阻害することで改善しうる疾患又は状態の予防又は治療剤。
【請求項３】
（２Ｓ，４Ｓ）−２−シアノ−４−フルオロ−１−[（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチル）エチルアミノ]アセチルピロリジン・ベンゼンスルホン酸塩またはその水和物を有効成分として含有する糖尿病治療剤。
【請求項４】
（２Ｓ，４Ｓ）−２−シアノ−４−フルオロ−１−[（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチル）エチルアミノ]アセチルピロリジン・ベンゼンスルホン酸塩またはその水和物を有効成分として含有する免疫疾患治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４−フルオロ−２−シアノピロリジン誘導体ベンゼンスルホン酸塩を有効成分として含有する医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジペプチジルペプチダーゼIV（DPPIV）はセリンプロテアーゼの一種であり、腎臓、肝臓など広く組織、血漿中に分布しており、さまざまな生理活性ペプチドの代謝に関与している。
DPPIV阻害化合物としては、（２Ｓ，４Ｓ）−２−シアノ−４−フルオロ−１−[（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチル）エチルアミノ]アセチルピロリジン（特許文献１）が知られている。しかし遊離体は固体安定性が悪く、該出願で示されている鉱酸との塩及び有機酸との塩化合物は、固体安定性、加湿下での安定性が悪く、また合成上の困難性を有する等の欠点があった。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０２／３８５４１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、ジペプチジルペプチダーゼIVを阻害することで改善しうる疾患又は状態を予防または治療するための優れたDPPIV阻害活性を示し、且つ安定性等の医薬品として必要な物性を兼ね備えた医薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記目的を達成するべく４−フルオロ−２−シアノピロリジン誘導体に関して種々検討した結果、ベンゼンスルホン酸の塩にすることで好ましい安定な化合物が得られることを見いだし、本発明を完成した。
すなわち本発明の１態様によると、本発明は、
【０００６】
【化１】
2005272457.tif 000002
【０００７】
で表される（２Ｓ，４Ｓ）−２−シアノ−４−フルオロ−１−[（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチル）エチルアミノ]アセチルピロリジン・ベンゼンスルホン酸塩またはその水和物を有効成分として含有するDPPIV阻害剤である。
本発明の他の態様は、（２Ｓ，４Ｓ）−２−シアノ−４−フルオロ−１−[（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチル）エチルアミノ]アセチルピロリジン・ベンゼンスルホン酸またはその水和物を有効成分として含有する、ジペプチジルペプチダーゼIVを阻害することで改善しうる疾患又は状態の予防又は治療剤である。
【０００８】
本発明の他の態様は、（２Ｓ，４Ｓ）−２−シアノ−４−フルオロ−１−[（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチル）エチルアミノ]アセチルピロリジン・ベンゼンスルホン酸またはその水和物を有効成分として含有する糖尿病治療剤である。
本発明の他の態様は、（２Ｓ，４Ｓ）−２−シアノ−４−フルオロ−１−[（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチル）エチルアミノ]アセチルピロリジン・ベンゼンスルホン酸またはその水和物を有効成分として含有する免疫疾患治療剤である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る化合物は、高純度で均一な結晶形として取得が容易であり、高湿度条件下において優れた安定性を備えている。したがって、製造時における機械への粉体の付着、流動性の低下等が解消され、本化合物を含む医薬品の安定的供給を可能とする。また本発明に係る化合物は、固体安定性にも優れていることから、外観の変化、結晶形の転移等についての問題はなく、医薬品としての製造時における過酷な条件下にも耐え、配合剤添加時の長期品質保持をも可能とする。本化合物により安定で優れたジペプチジルペプチダーゼIV阻害活性を有する、糖尿病、免疫疾患等の予防又は治療剤の提供が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明に係るベンゼンスルホン酸塩は、WO02/38541記載の方法により得られる（２Ｓ，４Ｓ）−２−シアノ−４−フルオロ−１−[（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチル）エチルアミノ]アセチルピロリジンを適当な溶媒に溶解し、ベンゼンスルホン酸またはその水和物を直接または溶解した状態で混合し、その後の析出物または貧溶媒を添加した際の析出物を目的物として濾取することにより得られる。本化合物は上記方法により、結晶性も優れ、他の塩化合物（例えばトシル酸塩）に比べ、均一な結晶形としての取得が容易である。また、通常医薬品製造時に用いる配合剤と混合した際の安定性についても、より安定した組成物が製造できた。
【００１１】
本化合物は、生体内でジペプチジルペプチダーゼIVを抑制することができ、よって、インスリン作用を亢進し糖代謝を改善することができ、また、ニューロペプチドYの代謝抑制、T細胞の活性化抑制、癌細胞の内皮への接着抑制、HIVウィルスのリンパ球への進入防止に寄与することができる。
したがって、本発明は、ジペプチジルペプチダーゼIVを阻害することで改善しうる疾患又は状態、例えば、糖尿病（特にII型）、免疫疾患、関節炎、肥満、骨粗しょう症、耐糖性損傷の状態、良性の前立腺肥大、皮膚病などを予防または治療するための上記医薬を提供する。
【００１２】
免疫疾患のための医薬としては、組織移植における免疫抑制剤；例えば、炎症腸病、多発硬化症、慢性関節リウマチ（RA）の様な様々な自己免疫症でのサイトカイン放出抑制剤、T−細胞へのHIVの侵入防止による、AIDSの予防及び治療に有用な薬剤、転移防止、特に乳及び前立腺腫瘍の肺への転移を防止する薬剤などがあげられる。
本発明の医薬は、全身的又は局所的に経口又は直腸内、皮下、筋肉内、静脈内、経皮等の非経口投与することができる。
【００１３】
本発明の医薬は、固体組成物、液体組成物、及びその他の組成物のいずれの形態でもよく、必要に応じて最適のものが選択でき、本化合物に薬学的に許容されるキャリヤーを配合して製造することができる。具体的には、常用の賦形剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、被覆剤、糖衣剤、pH調整剤、溶解剤、又は水性若しくは非水性溶媒などを添加し、常用の製剤技術によって、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤、乳剤、懸濁剤、注射剤、などに調製する事ができる。
また、本化合物は、α、β若しくはγ−シクロデキストリン又はメチル化シクロデキストリン等と包接化合物を形成させて製剤化することができる。
【００１４】
本化合物の投与量は、疾患、症状、体重、年齢、性別、投与経路等により異なるが、成人に対し、経口投与の場合、好ましくは約１〜約１０００ mg / 人／日であり、より好ましくは約１０〜約２００ mg / 人／日であり、これを１日１回又は数回に分けて投与することができる。 
【実施例】
【００１５】
以下実施例、参考例及び試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。
参考例１
（２Ｓ，４Ｓ）−２−シアノ−４−フルオロ−１−[（２−ヒドロキシ−１，１ −ジメチル）エチルアミノ]アセチルピロリジン・塩酸塩の合成
（２Ｓ，４Ｓ）−２−シアノ−４−フルオロ−１−[（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチル）エチルアミノ]アセチルピロリジン(5.00g)のメタノール(75mL)懸濁液に、４Ｍ塩酸（酢酸エチル溶液、6.17mL）を加えると透明な溶液になった。この溶液にジイソプロピルエーテル(300mL)を加えて攪拌し、析出した粉末を濾取して、無色粉末の表題化合物（5.47g）を得た。
融点：197-198℃
【００１６】
参考例２
（２Ｓ，４Ｓ）−２−シアノ−４−フルオロ−１−[（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチル）エチルアミノ]アセチルピロリジン・メタンスルホン酸塩の合成
（２Ｓ，４Ｓ）−２−シアノ−４−フルオロ−１−[（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチル）エチルアミノ]アセチルピロリジン(0.15g)のメタノール(0.92mL)懸濁液に、メタンスルホン酸(0.042mL)のメタノール(0.08mL)溶液を加えると透明な溶液になった。この溶液を、ジイソプロピルエーテル(5mL)に攪拌しながら滴下した。析出した粉末を濾取して、無色粉末の表題化合物（0.20g）を得た。
融点：179-180℃
【００１７】
実施例１
（２Ｓ，４Ｓ）−２−シアノ−４−フルオロ−１−[（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチル）エチルアミノ]アセチルピロリジン・ベンゼンスルホン酸塩の合成
（１）（２Ｓ，４Ｓ）−２−シアノ−４−フルオロ−１−[（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチル）エチルアミノ]アセチルピロリジン
２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（0.54g）をテトラヒドロフラン（7.5mL）とエタノール(2.5ml)の混合溶媒に溶解し、氷冷下（２Ｓ，４Ｓ）−１−ブロモアセチル−２−シアノ−４−フルオロピロリジン（0.71g）を加え、室温で１時間攪拌した。析出した結晶を濾取し、無色固体として表題化合物(0.36g)を得た。更に濾液をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒；クロロホルム：メタノール：２５％アンモニア水＝３００：１０：１）で精製し、表題化合物(0.22g)を得た。
【００１８】
（２）（２Ｓ，４Ｓ）−２−シアノ−４−フルオロ−１−[（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチル）エチルアミノ]アセチルピロリジン・ベンゼンスルホン酸塩  （２Ｓ，４Ｓ）−２−シアノ−４−フルオロ−１−[（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチル）エチルアミノ]アセチルピロリジン(20g)をメタノール(300mL)に加温溶解し、ベンゼンスルホン酸１水和物(15.2g)のメタノール(30mL)溶液を加えたところ粉末が析出した。この懸濁液にジイソプロピルエーテル(330mL)を加えた後、粉末を濾取して無色粉末の表題化合物（31.5g）を得た。
融点：220-221℃
【００１９】
試験例 １[加湿下での重量変化試験]
各検体10.0mgをミクロチューブ（直径8mm、長さ50mm）にはかりとり、水をはったデシケータの中に水に接しないように放置した。デシケータは、室温に放置した。経時的に状態観察と重量測定を行い、重量変化を百分率表示した。
＜重量変化と状態変化＞
【００２０】
【表１】
2005272457.tif 000003
【００２１】
参考例１の塩酸塩と参考例２のメタンスルホン酸塩は吸湿して潮解したが、実施例１のベンゼンスルホン酸塩は重量変化せず潮解しなかった。
【００２２】
試験例 ２[固体安定性試験]
各検体約1mgを精密に量り取り、加温条件（70℃）では遮光（アルミ箔）密栓、加温・加湿条件（40℃・75%RH）では遮光（アルミ箔）開栓のネジ口試験管に入れ保存した。薬物の残存率測定は以下の手順で行った。所定の保存期間が終了した試験管にHPLC移動相10mlを加えて溶解後HPLCで定量し、これを加温又は加温・加湿前の初期値と面積比較して薬物の残存率を算出した。
【００２３】
HPLC条件
カラム：CAPCELL PAK UG120，5μm，φ4.6×150mm（SHISEIDO）
カラム温度：40℃
検出：紫外吸光光度計（検出波長：210nm）
流速：1.0ml/min
注入量：10μl
移動相：水/アセトニトリル/リン酸/SDS（700:300:1:2）
＜薬物の残存率＞
【００２４】
【表２】
2005272457.tif 000004
【００２５】
参考例１の塩酸塩と参考例２のメタンスルホン酸塩は、何れの条件でも薬物の残存率が９７％以下であったが、実施例１のベンゼンスルホン酸塩は何れの条件でも９９％以上であった。
【００２６】
試験例  ３［添加剤との配合変化試験］
Serajuddin A.T.M.らの報告（J.Pharm.Sci.,88,696-704,1999）に準じて行った。配合Ａ（原薬10mg、結晶セルロース68mg、ステアリン酸マグネシウム2mg）又は配合Ｂ（原薬10mg、乳糖68mg、硬化油2mg）の分量で、原薬と添加剤をねじ口試験管中に秤量後、ミックスローター（MIX-ROTAR VMR-5、井内盛栄堂）で1時間混合した。配合Ａには何も添加せず、配合Ｂには精製水16μlを添加し、ボルテックスミキサー（TOUCH MIXER MT-31、ヤマト科学）で攪拌した。これを密栓・完全遮光状態で65℃・1週間保存して、保存後の含量を測定し、残存率を算出した。
【００２７】
含量は次に記す手順により求めた。保存後の試料に50%メタノール10mlを加え、分散および抽出のために超音波（BRANSON 社のBRANSONIC 5200を使用）を30分間照射した後、振とう機で1時間振とうし、この液を50mlメスフラスコに移した。50%メタノールで洗い込みメスアップを行なった。ここに更に超音波を30分間照射した。本液を0.45μmメンブランフィルターでろ過後5ml分取し、10mlのメスフラスコに50%メタノールでメスアップしたものを試料溶液とし、HPLCで定量した。HPLC条件は試験例２と同様である。
【００２８】
＜薬物の残存率＞
2005272457.tif 000005
【００２９】
配合Aの場合、参考例２のメタンスルホン酸塩では、薬物の残存率は91.6%になってしまうが、実施例１のベンゼンスルホン酸塩ではほとんどその低下はみられなかった。また、メタンスルホン酸塩の残存率が74.5%に低下してしまう配合Bの場合でも、ベンゼンスルホン酸塩は90%以上の残存率を示した。
実施例１の化合物は、医薬品製造時に用いる配合剤を加えても劣化が少なく、医薬品として安定した配合組成物を提供できることが確認された。
【００３０】
試験例 ４[ジペプチジルペプチダーゼIV活性阻害実験]
ジペプチジルペプチダーゼIV（DPPIV）活性阻害実験はＤｉａｂｅｔｅｓ、４７、７６４−７６９、１９９８に掲載された方法に従って行った。ジペプチジルペプチダーゼIVを含む血漿は、健常人ボランティアから血液を採取し、遠心分離により調製した。酵素反応は９６穴平底プレートを用い、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、ｐＨ７．８から成る緩衝液中で行った。 １００μM   Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−４−メチルクマリル−７−アミド（ペプチド研究所製）溶液  ２５μｌ、１３３ｍＭ 塩化マグネシウム溶液７．５μｌ、検体化合物５μｌを混合し、次いで上記緩衝液で１／１００倍に希釈した血漿１２．５μｌを加えた。室温で２時間反応させた後、２５％酢酸水溶液５０μｌを添加し反応を止めた。遊離した７−アミノ−４−メチルクマリン量を蛍光プレートリーダー（１４２０ ＡＲＶＯＴＭ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ；Ｗａｌｌａｃ社製）を用いて３９０ｎｍで励起させたときの４６０ｎｍの蛍光強度を測定した。溶媒添加して反応時間を０分としたときの蛍光強度をブランク値とし、各測定値からブランク値を差し引いたものを特異的蛍光強度とした。得られた特異的蛍光強度から、下式によりジペプチジルペプチダーゼIV活性阻害率（％）を求めた。被検化合物は１０００倍高濃度のジメチルスルフォキシド溶液を調製し、上記緩衝液で希釈して使用した。各濃度の阻害率から５０％阻害を示す化合物濃度（ＩＣ５０値）を算出した。
【００３１】
阻害率（％）＝Ａ÷Ｂ×１００
（Ａ＝溶媒添加における蛍光強度−検体化合物添加における蛍光強度）
（Ｂ＝溶媒添加における蛍光強度）
試験の結果、実施例１の化合物はＩＣ５０値  ５ｎＭ  を示した。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明により、安定で優れたジペプチジルペプチダーゼIV阻害活性を有する、現代の疾患として代表的な糖尿病、免疫疾患等の予防又は治療剤の提供が可能となる。