(57)【要約】【課題】  本発明は、葉緑素を持たない腐生ラン、特にシナノショウキランの無菌人工培養に最適な培地を提供し、また、これを用いた無菌発芽及び無菌増殖によりシナノショウキランの保護に必要な培養苗を育成することを目的とする。さらに本発明によって増殖した苗を無菌で肥大させることにより、無菌培養下での充実した培養苗の育成方法を提供するものである。【解決手段】  シナノショウキランの種子を無菌発芽培地上で無菌的に発芽させる工程と、発芽し分化したものを無菌増殖培地で増殖させる工程とを備えた無菌人工培養方法で、さらに無菌肥大培地で肥大させ充実した培養苗を育てる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シナノショウキランの無菌人工培養において、種子を無菌発芽培地上で無菌的に発芽させる工程と、発芽し分化したものを無菌増殖培地で増殖させる工程とを備えることを特徴とするシナノショウキランの無菌人工培養方法。
【請求項２】
前記無菌増殖培地で増殖させる工程の後、さらに無菌肥大培地で肥大させることを特徴とする請求項１記載のシナノショウキランの無菌人工培養方法。
【請求項３】
前記無菌発芽培地の成分組成が、無機質の窒素・リン・カリウムを約１：１：３の割合で含有する複合肥料０．５〜８．０ｋｇｍ-3、窒素源０．５〜５．０ｋｇｍ-3、炭素源２．０〜６０．０ｋｇｍ-3、凝固剤０〜２０．０ｋｇｍ-3、の組成要件を満たすことを特徴とする請求項１又は２記載のシナノショウキランの無菌人工培養方法。
【請求項４】
前記無菌発芽培地の成分組成のうち、複合肥料が微粉ハイポネックス（ハイポネックスジャパン（株）登録商標）であることを特徴とする請求項３記載のシナノショウキランの無菌人工培養方法。
【請求項５】
前記無菌発芽培地の成分組成のうち、窒素源がタンパク質の加水分解物であることを特徴とする請求項３又は４記載のシナノショウキランの無菌人工培養方法。
【請求項６】
前記タンパク質の加水分解物が、カザミノ酸であることを特徴とする請求項５記載のシナノショウキランの無菌人工培養方法。
【請求項７】
前記無菌発芽培地の成分組成のうち、炭素源が単糖類、二糖類又はオリゴ糖の群から選ばれる一種又は二種以上であることを特徴とする請求項３〜６いずれか一記載のシナノショウキランの無菌人工培養方法。
【請求項８】
前記無菌発芽培地の成分組成のうち、凝固剤がゲルライト（ジェランガム）であることを特徴とする請求項２〜７いずれか一記載のシナノショウキランの無菌人工培養方法。
【請求項９】
前記無菌発芽培地が、ｐＨ約５．３〜６．０であることを特徴とする請求項３〜８いずれか一記載のシナノショウキランの無菌人工培養方法。
【請求項１０】
前記無菌増殖培地の成分組成が、無機質の窒素・リン・カリウムを約１：１：３の割合で含有する複合肥料０．５〜８．０ｋｇｍ-3、窒素源０．５〜５．０ｋｇｍ-3、炭素源２．０〜６０．０ｋｇｍ-3、凝固剤０〜２０．０ｋｇｍ-3、の組成要件を満たすことを特徴とする請求項１又は２記載のシナノショウキランの無菌人工培養方法。
【請求項１１】
前記無菌増殖培地の成分組成のうち複合肥料が、微粉ハイポネックスであることを特徴とする請求項１０記載のシナノショウキランの無菌人工培養方法。
【請求項１２】
前記無菌増殖培地の成分組成のうち窒素源が、タンパク質の加水分解物であることを特徴とする請求項１０記載のシナノショウキランの無菌人工培養方法。
【請求項１３】
前記タンパク質の加水分解物が、カザミノ酸であることを特徴とする請求項１２記載のシナノショウキランの無菌人工培養方法。
【請求項１４】
前記無菌増殖培地の成分組成のうち炭素源が、単糖類、二糖類又はオリゴ糖の群から選ばれる一種又は二種以上であることを特徴とする請求項１０〜１３いずれか一記載のシナノショウキランの無菌人工培養方法。
【請求項１５】
前記無菌増殖培地がｐＨ約５．３〜６．０であることを特徴とする請求項１０〜１４いずれか一記載のシナノショウキランの無菌人工培養方法。
【請求項１６】
前記無菌肥大培地が、Ｎｏｒｓｔｏｇ培地であることを特徴とする請求項２〜１５のいずれか一記載のシナノショウキランの無菌人工培養方法。
【請求項１７】
ショウキラン属の無菌人工培養において、種子を無菌発芽培地上で無菌的に発芽させる工程と、発芽し分化したものを無菌増殖培地で増殖させる工程とを備えることを特徴とするショウキラン属の無菌人工培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生ランの人工培養、特にシナノショウキラン（腐生ラン）の無菌人工培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シナノショウキランとは、長野県南部に生息する葉緑素を持たない腐生ランで、２００２年５月に新種として記載されたものである。日本にはこれまで、ショウキラン（Ｙｏａｎｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）とキバナノショウキラン（Ｙｏａｎｉａ ａｍａｇｉｅｎｓｉｓ）の２種のショウキラン属が確認されていたが、人工増殖は成功していない。シナノショウキランについても早急な保護が必要であるが、その生態の詳細すら不明であった。
【０００３】
ラン科植物の生活史においては、一般にラン菌と呼ばれる糸状菌との共生関係を持つことがよく知られている。これら糸状菌（共生菌）は、ランの発芽・成長に重要な役割を持つことが解明されているが、特にシナノショウキランのような腐生ランは葉緑素を持たないため、共生菌への依存が大きく、発芽に際しても共生菌の存在下でないと難しいと考えられている。
【０００４】
これに対し、野生ランを無菌的に栽培する「野生ランの大量生産方法」が紹介されている（特許文献１）。この方法は、絶滅危惧種に指定されているエビネやシュンラン、ヘッカランなどの野生ランを、共生菌を利用することなく大量生産する方法で、具体的には、
人工受粉させた種子に発芽阻害物質の除去処理及び殺菌処理を施す前処理工程と、
種子を発芽促進剤が入った培地に播種し培養する第一の培養工程と、発根促進剤を入れた培地で培養する第二の培養工程とを設けて苗を生長させる培養工程と、
培養した苗を培地から培養土に移し替えて順化、育苗させる工程
からなる、野生ランの大量生産方法である。
【０００５】
非特許文献１によれば、無菌でのランの発芽は多くの種で可能となり、園芸植物としての発展を遂げてきた。
【０００６】
一方、腐生ランを含む地生ランについても同様の試みは行われており、その詳細は非特許文献２にまとめられている。
【０００７】
しかしながら、腐生ランのなかでもショウキラン属、特にシナノショウキランについては、人工発芽や人工培養の成功例はいまだ報告されていない。
【特許文献１】特開２００３−１８９７５０公報
【非特許文献１】ジョゼフ  アーディティ編著「ランの生物学Ｉ」（市橋  正一  日本語版編集  誠文堂新光社  １９９１年  １３頁）
【非特許文献２】「Ｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌ  Ｏｒｃｈｉｄ」（Ｈａｎｎｅ  Ｎ．Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ  １９９５年  １７頁、７７頁、１４２頁、２２７頁）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明は、葉緑素を持たない腐生ラン、特にシナノショウキランの無菌人工培養に最適な培地を提供し、また、これを用いた無菌発芽及び無菌増殖によりシナノショウキランの保護に必要な培養苗を育成することを目的とする。さらに本発明によって増殖した苗を無菌で肥大させることにより、無菌培養下での充実した培養苗の育成方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明者は鋭意研究を重ねた結果、以下のような無菌人工培養方法を開発した。
【００１０】
本発明の無菌人工培養方法は、腐生ランの種子を無菌発芽培地上で無菌的に発芽させる工程と、発芽し分化したものを無菌増殖培地で増殖させる工程とを備えている。
【００１１】
また、必要に応じて、無菌増殖培地で増殖させた後、さらに無菌肥大培地で肥大させることも可能である。
【００１２】
まず、無菌人工培養をするシナノショウキランの種子を採取する。ラン科植物の種子は、さく果（朔果）と呼ばれる果実の中に入っているが、野生株では結実率が不安定であることから人工受粉によって結実させることが望ましい。人工受粉は自家受粉、他家受粉のいずれの方法も用いることができる。結実したさく果は採取後滅菌処理を行う必要がある。滅菌処理方法としては、例えば、さく果を流水下で、脱脂綿等でこすりながら表面を洗浄し、７０％エタノールに３０秒間浸漬・攪拌する。続いて１％次亜鉛素酸ナトリウム水溶液に１０分浸漬・攪拌後滅菌水で５分×３回すすぎを行う。その後さらに７０％エタノールに１分間浸漬し、ガスバーナーで表面を焼いて完全に滅菌を行うことができる。
【００１３】
続いてさく果の先端を切り落として縦半分に割り、中の種子を掻きだして無菌発芽培地に置床する。無菌発芽培地の成分組成は、通常、無機質の窒素・リン・カリウムを約１：１：３の割合で含有する複合肥料０．５〜８．０ｋｇｍ-3、窒素源０．５〜５．０ｋｇｍ-3、炭素源２．０〜６０．０ｋｇｍ-3、凝固剤０〜２０．０ｋｇｍ-3とする。望ましくは、無機質の窒素・リン・カリウムを約１：１：３の割合で含有する複合肥料１．０〜５．０ｋｇｍ-3、窒素源１．０〜３．０ｋｇｍ-3、炭素源５．０〜４０．０ｋｇｍ-3、凝固剤０〜１５．０ｋｇｍ-3とする。
【００１４】
前記複合肥料として例えば微粉ハイポネックス（ハイポネックスジャパン（株）登録商標）を好適に使用することができる。
【００１５】
また、前記窒素源としては、例えばペプトン、プロテアーゼペプトン、プロテアーゼペプトンＮｏ．３、トリプトン、トリプテーゼ、ネオペプトン、プロトン、カシトン、カザミノ酸又はイースト抽出物等タンパク質の加水分解物を使用することができる（非特許文献１  ９５頁）。特にカザミノ酸は好適に使用可能である。
【００１６】
さらに前記炭素源としては、グルコース（ブドウ糖）、フルクトース（果糖）、マン二トール等の単糖類、スクロース（蔗糖）、マルトース（麦芽糖）等の二糖類、またはオリゴ糖の群から一種または二種以上を使用可能であるが、特にグルコース（単糖）、スクロース（非還元性二糖類）を使用することが望ましい。さらには、スクロースを使用することが望ましい。本発明者らは、スクロースを使用した方がグルコースに比して発芽率が良好であることを確認している。
【００１７】
種子を採取後無菌発芽培地に播種するが、培地としては液体培地よりも固体培地のほうが望ましい。種子が空気雰囲気下に置かれたほうが発芽率は良好だからである。そのため、凝固剤を添加し固体培地とすることが望ましい。前記凝固剤としては、寒天、ゲルライト（ジェランガム）、増粘性多糖類等凝固剤を使用することができるが、特に寒天、ゲルライトを好適に使用することができる。さらに、無菌発芽培地は通常、ｐＨ約５．３〜６．０であるが、望ましくはｐＨ約５．５〜５．８とする。
【００１８】
また、種子を播種する無菌発芽培地の形態としては、必ずしも固体培地である必要は無い。前記凝固剤を添加しない液体の無菌発芽培地を、例えばスポンジ、不織布、紙等の吸水性支持体に浸透させ、その表面に播種して無菌発芽培地とすることも可能である。ただしこの場合使用する吸水性支持体の滅菌を行う必要がある。
【００１９】
種子を前記無菌発芽培地上に播種すると、２〜３ヶ月で発芽しプロトコーム（原塊体）が形成される。プロトコームを形成した種子は、さらにリゾーム（根茎）へと成長する。種子がプロトコーム又はリゾームへと成長した段階で次の工程である無菌増殖培地に移し代える。
【００２０】
無菌増殖培地の成分組成は、通常、無機質の窒素・リン・カリウムを約１：１：３の割合で含有する複合肥料０．５〜８．０ｋｇｍ-3、窒素源０．５〜５．０ｋｇｍ-3、炭素源２．０〜６０．０ｋｇｍ-3、凝固剤０〜２０．０ｋｇｍ-3とする。望ましくは、無機質の窒素・リン・カリウムを約１：１：３の割合で含有する複合肥料１．０〜５．０ｋｇｍ-3、窒素源１．０〜３．０ｋｇｍ-3、炭素源５．０〜４０．０ｋｇｍ-3、凝固剤０〜１５．０ｋｇｍ-3とする。
【００２１】
複合肥料、窒素源、炭素源についても前記無菌発芽培地と同様の成分を使用することが可能である。さらに、無菌増殖培地は通常、ｐＨ約５．３〜６．０であるが、望ましくは、ｐＨ約５．５〜５．８とする。
【００２２】
上記無菌増殖培地に移し代えたプロトコーム又はリゾームは、成長と肥大を続ける。例えば約２ヶ月後、前記プロトコーム又はリゾームを充実した培養苗にしたい場合には、無菌肥大培地に移し替える。
【００２３】
無菌肥大培地としては、Ｎｏｒｓｔｏｇ培地を使用することが望ましい。Ｎｏｒｓｔｏｇ培地の主要な成分は表４に示す。
【実施例】
【００２４】
＜試料採取＞
人工増殖のための試料として、シナノショウキランの花茎、さく果、及び地下茎を採取した。シナノショウキランの生息地では、開花・結実期の気温１２〜２６℃、１０ｃｍ深さの地温１７〜１８℃、４０ｃｍ深さの地温１５〜１７℃、湿度６６〜９９％、照度６１０〜４３７００ｌｘ、光子量１１〜６５８μｍｏｌｍ-2ｓ-1との測定結果を得た。シナノショウキランの好む環境は、高温になることはないが、湿度が高く直射の届きにくい環境であることが予想できる。
【００２５】
また、生息土壌の表層部は腐植が堆積している。その下部には大量の礫が存在し粘土質の土壌がその間隙を充填している。
【００２６】
受精した場合には、直後から花弁の褐変化が始まり、やがて花の基部が膨らみ始める。開花３週間後には、大きなさく果（朔果）となり、その後約１ヶ月で熟す。多くはこの過程で昆虫による食害を受けるため、自然状態での結実数は大変低いものである。
【００２７】
試料採取にあたり、結実率を向上させるため人工受粉も実施した。
＜無菌発芽と無菌増殖＞
１）無菌発芽
採取したさく果は、流水下で脱脂綿でこすりながら表面を洗浄し、７０％エタノールに３０秒間浸漬して攪拌した。つぎに１％次亜鉛素酸ナトリウム水溶液に１０分浸漬・攪拌し、滅菌水で５分×３回すすいだ。さらに、７０％エタノールに１分浸漬・攪拌した後、ガスバーナーで表面を焼いて完全に滅菌した。
【００２８】
さく果の先端を切り落として縦半分に割り、中の種子を掻きだして無菌発芽培地に置床した。無菌発芽培地には、複合肥料としてハイポネックスを含むものと希釈したＭＳ培地成分を含むものを用意し、それぞれ液体及び固体の培地を使用した。無菌発芽培地の成分組成の例を表１に示す。
【００２９】
【表１】
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シナノショウキランの種子は、熟度が進むと種子表面の筋模様が濃くはっきりしてくる。さく果には虫喰いなどの痛みが多く、さく果を表面殺菌しても培養中にコンタミネーション（雑菌混入）が多く発生した。しかし、コンタミネ―ションを起こした種子は、一旦培地から取り出して再度滅菌すれば、再び発芽試験に用いることが可能である。
【００３０】
無菌発芽培地の種類を代え、発芽状況を観察した。また、各培地で種子の熟度によって発芽数にどのような差が見られるのかについても観察した。観察結果を以下に示す。
【００３１】
【表２】
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置床後２〜３ヶ月を経ると、一部の種子からプロトコーム状に白く膨らんだ組織ができる。この実験では、前記状態に成長した種子を発芽種子とした。種子は、未熟なもののほうが発芽率が高く、培地は、液体よりも固体のほうが発芽率は高い。
【００３２】
２）無菌増殖
無菌発芽培地で発芽後、プロトコーム状あるいはリゾームへと生長した段階で数種の無菌増殖培地へと移植し、定期的な重量測定、写真撮影など行い経過を観察した。
【００３３】
無菌増殖培地の成分組成の例を表３に示す。
【００３４】
【表３】
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前記無菌発芽と同様、当初はハイポネックス培地（液体）でリゾームの生育が早く、２ヶ月後に６００％の成長率を示した。ここで成長率とは、試験開始時のリゾーム又はプロトコームの質量に対して増加した質量（累積した各月の増加質量）の割合をいう。その後、Ｎｏｒｓｔｏｇ培地でのリゾームの増加量（月次の増加質量）が大きくなり、４ヶ月後にはハイポネックス培地（液体）でのリゾームの増加量を上回り旺盛な生育を続けた。ＭＳ培地を基本とした培地は、他のラン科植物で発明者等がもっとも良い結果を得た１／２０ＭＳ改変培地と、ＥＣ（電気伝導度）をハイポネックス培地（液体）と同等にした１／２ＭＳ改変培地を用いたが、どちらも生長が遅く差もなかった。またＴ処方培地は炭素源としてスクロースを用いたが、全くと言えるほどリゾームは生長しなかった。
【００３５】
前記無菌増殖培地のうち、ハイポネックス培地（液体）、１／２０ＭＳ改変培地、Ｎｏｒｓｔｏｇ培地での結果を図１に示す。
【００３６】
培地の違いによる最も大きな差は形態である。生育の良かったハイポネックス培地（液体）では、細いリゾームが何本もでき、ごくまれに１〜２本のリゾームがより太く生長した。一方同程度の成長量を示したＮｏｒｓｔｏｇ培地では、最初から１〜２本のリゾームが太く成長し、６ヶ月後には節間が詰まっていたものの現地で採取したほどの太さに成長した。
＜考察＞
ショウキラン属は、これまで殆ど研究例がなく、ショウキランの保護対策を確立するために、人工受粉、無菌培養に取り組んできた。
【００３７】
生態調査では、毎年同じ場所にシナノショウキランが見られることはまれで、特に大きな群落が見られた場所では、翌年シナノショウキランを見ることはできなかった。このため、土壌から現れるタイミングを観察したり、開花初期から虫害防除を施したりすることが殆どできなかった。自然状態で種子はつきにくく、またついても成熟まで達するものが非常に少なく、保護増殖が難しい植物である。
【００３８】
人工授粉については、自家受粉と他家受粉のどちらが適当であるかは明言できないが、人工受粉の有効性は示されたと考えられる。
【００３９】
無菌発芽培地を用いれば、共生菌が無くとも発芽させることができる。無菌発芽に用いる種子は比較的未熟であることが望ましく、本実施例では、受粉後１ヶ月程度のもので良い結果を得た。基本培地による差は殆ど無いが、ペプトンやカザミノ酸が添加されていることが望ましく、これらを添加していない培地では、発芽は無いか発芽しても成長はみられなかった。
【００４０】
また、固体培地の方が発芽数は多い。液体培地では種子が沈んでしまうことから、酸素供給量が影響しているものと考えられる。
【００４１】
発芽後は、プロトコームからリゾームへと成長し、ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ（試験管内）での植物体保持は問題なく行えるようになった。細く枝分かれしたリゾームは、細かく折って増殖させることができ、実施例で用いたリゾームも同様にして増やした個体である。枝分かれしてボリュームのでたリゾームからは、ごくまれに１〜２本の太いリゾームが成長したが、Ｎｏｒｓｔｏｇ培地では枝分かれすること無く、太くがっちりとしたリゾームが成長した。
【００４２】
無菌培地の組成をさらに細かく検討し、細かく枝分かれする条件、太いリゾームを伸ばす条件を明らかにできれば、個体の保護増殖だけでなく、生態解明のうえでも新たな知見を得られる可能性がある。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明に係る無菌人工培養方法により、シナノショウキランの保護が可能となるだけでなく、ショウキラン属、さらには腐生ランに属する多くのランの野生株を保護にも適用可能であることが期待される。
【００４４】
前述のＮｏｒｓｔｏｇ培地の組成を以下に示す。
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】培地の種類と無菌リゾームの成長を示すヒストグラムである。
【図１】
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