(57)【要約】【課題】  生体試料中に含まれる内因性または外因性アンモニアによる測定誤差を少なくする生体成分測定法を提供する。【解決手段】  試料にアンモニアに対するＫｍ値が少なくとも５ｍＭであるアミノ酸脱水素酵素、好ましくは好熱性菌由来のアミノ酸脱水素酵素、該脱水素酵素の基質およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含む第１試薬を作用させ、得られる吸光度の減少速度を測定し、次いで試料中の生体成分に作用し、アンモニアを生成する酵素を含む第２試薬を作用させて吸光度の減少速度を測定し、後者から前者を差し引くことにより、試料中の生体成分を測定することを特徴とする生体成分測定方法およびそのための試薬組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の生体成分または該生体成分に由来する物質に、生体成分またはそれに由来する物質に作用し、アンモニアを生成する酵素を作用させ、生成したアンモニアを測定することにより生体成分を測定する方法において、好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素、該脱水素酵素の基質およびＮＡＤＨを使用し、ダブルカイネテイック法により、内因性または外因性アンモニアの干渉を回避することを特徴とする生体成分測定方法。
【請求項２】
試料に好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素、該脱水素酵素の基質およびＮＡＤＨを含む第１試薬を作用させ、得られる吸光度の減少速度を測定し、次いで試料中の生体成分に作用し、アンモニアを生成する酵素を含む第２試薬を作用させて吸光度の減少速度を測定し、後者から前者を差し引くことにより、試料中の生体成分を測定することを特徴とする生体成分測定方法。
【請求項３】
生体成分がクレアチニンであり、該生体成分に作用し、アンモニアを生成する酵素がクレアチニンデイミナーゼである請求項１または２記載の生体成分測定方法。
【請求項４】
生体成分が尿素であり、該生体成分に作用し、アンモニアを生成する酵素がウレアーゼである請求項１または２記載の生体成分測定方法。
【請求項５】
試料に好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素、該脱水素酵素の基質、ＮＡＤＨおよび試料中の生体成分に由来する物質に作用し、アンモニアを生成する酵素を含む第１試薬を作用させ、得られる吸光度の減少速度を測定し、次いで試料中の生体成分に作用して、該成分に由来する前記物質を生成する酵素を含む第２試薬を作用させて吸光度の減少速度を測定し、後者から前者を差し引くことにより、試料中の生体成分または該生体成分に由来する物質を測定することを特徴とする生体成分測定方法。
【請求項６】
生体成分がクレアチンであり、該生体成分に作用して、該成分に由来する物質を生成する酵素がクレアチンアミジノヒドロラーゼであり、該成分に由来する物質が尿素であり、該成分に作用し、アンモニアを生成する酵素がウレアーゼである請求項１または５記載の生体成分測定方法。
【請求項７】
好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素が、好熱菌由来のアラニン脱水素酵素またはロイシン脱水素酵素である請求項１、２または５記載の生体成分測定方法。
【請求項８】
好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素が、バチルス・ステアロサーモフィルス由来のアラニン脱水素酵素またはロイシン脱水素酵素である請求項１、２または５記載の生体成分測定方法。
【請求項９】
好熱菌由来アラニン脱水素酵素の基質が、ピルビン酸である請求項７または８記載の生体成分測定方法。
【請求項１０】
好熱菌由来ロイシン脱水素酵素の基質が、２−オキソイソ吉草酸（α−ケトイソペンタン酸）、２−オキソイソカプロン酸（α−ケトイソヘキサン酸）、２−オキソ吉草酸（α−ケトペンタン酸）、２−オキソ酪酸（α−ケトブタン酸）、２−オキソカプロン酸（α−ケトヘキサン酸）ある請求項７または８記載の生体成分測定方法。
【請求項１１】
生体成分または生体成分に由来する物質に作用し、アンモニアを生成する酵素、好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素、該脱水素酵素の基質およびＮＡＤＨを含むことを特徴とする生体成分測定用試薬組成物。
【請求項１２】
好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素がアンモニアに対するＫｍ値が少なくとも５ｍＭである請求項１１記載の生体成分測定用試薬組成物。
【請求項１３】
第１試薬に好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素、該脱水素酵素の基質およびＮＡＤＨを含み、第２試薬に生体成分または生体成分に由来する物質に作用し、アンモニアを生成する酵素および好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素および必要により該脱水素酵素の基質またはＮＡＤＨを含むことを特徴とする生体成分測定用試薬組成物。
【請求項１４】
第１試薬に生体成分に由来する物質に作用し、アンモニアを生成する酵素および好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素、該脱水素酵素の基質およびＮＡＤＨを含み、第２試薬に直接、生体成分に作用して、該成分に由来する前記物質を生成する酵素および好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素および必要により該脱水素酵素の基質またはＮＡＤＨを含むことを特徴とする生体成分測定用試薬組成物。
【請求項１５】
生体成分または該成分に由来する物質に作用し、アンモニアを生成する酵素が、ウレアーゼまたはクレアチニンデイミナーゼである請求項１１〜１４項記載の生体成分測定用試薬組成物。
【請求項１６】
好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素が好熱菌由来のアラニン脱水素酵素またはロイシン脱水素酵素である請求項１１〜１４記載の生体成分測定用試薬組成物。
【請求項１７】
第１試薬が好熱菌由来アラニン脱水素酵素またはロイシン脱水素酵素、該脱水素酵素の基質、ＮＡＤＨおよび緩衝液を含み、第２試薬がクレアチニンデイミナーゼ、好熱性菌由来アラニン脱水素酵素またはロイシン脱水素酵素および必要により該脱水素酵素の基質またはＮＡＤＨおよび緩衝液を含むクレアチニン測定用試薬組成物。
【請求項１８】
第１試薬が好熱菌由来アラニン脱水素酵素またはロイシン脱水素酵素、該脱水素酵素の基質、ＮＡＤＨおよび緩衝液を含み、第２試薬がウレアーゼ、好熱菌由来アラニン脱水素酵素またはロイシン脱水素酵素および必要により該脱水素酵素の基質またはＮＡＤＨおよび緩衝液を含む尿素測定用試薬組成物。
【請求項１９】
第１試薬が好熱菌由来アラニン脱水素酵素またはロイシン脱水素酵素、該脱水素酵素の基質、ウレアーゼ、ＮＡＤＨおよび緩衝液を含み、第２試薬がクレアチンアミジノヒドロラーゼ、好熱菌由来アラニン脱水素酵素またはロイシン脱水素酵素および必要により該脱水素酵素の基質またはＮＡＤＨおよび緩衝液を含むクレアチン測定用試薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体成分測定方法及びそのための試薬組成物に関し、さらに詳細にはクレアチン、クレアチニン、尿素などの生体成分に酵素を作用させ、生成するアンモニアを測定することによって、これらの生体成分を測定する方法において、生体試料中の内因性または外因性アンモニアによる誤差の少ない正確な測定を可能とする方法及びそのための試薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清、尿などの生体試料中のクレアチン、クレアチニン、尿素などの成分の存在およびその量の測定は、臨床検査の分野において、有益な情報をもたらす。これらの測定方法としては、それぞれの成分に対して、高い基質特異性を有する酵素を使用した測定方法が急速に普及している。その中でも生体成分に酵素を作用させ、生成するアンモニアを測定することによって、これらの生体成分を定量する方法が用いられている。測定しようとする生体成分と使用酵素の組み合わせとしては、例えばクレアチニンとクレアチニンデイミナーゼ、尿素とウレアーゼなどが挙げられる。
【０００３】
また測定対象である生体成分から直接、アンモニアを生成することのできない場合は、予め生体成分にある酵素を作用させて、アンモニアを生成する酵素の基質となる物質を生成させた後、該物質にアンモニアを生成する酵素を作用させ、生成するアンモニアを測定する方法が用いられる。このような代表例としては、クレアチンにクレアチンアミジノヒドロラーゼを作用させて、尿素を生成させ、次いでウレアーゼを作用させて、生成するアンモニアを測定する方法などが挙げられる。
【０００４】
アンモニアを生成する酵素の作用により、生成したアンモニアは、一般的に、牛肝由来あるいは微生物由来のグルタミン酸脱水素酵素とその基質であるα−ケトグルタル酸およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いて測定するか、あるいはインドフェノールなどを作用させ、比色定量する。しかしながら、グルタミン酸脱水素酵素とその基質であるα−ケトグルタル酸を用いる方法では、生体試料中の内因性または外因性アンモニアまたはアンモニウムイオン濃度が高い場合、試薬中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを消費してしまい、目的成分を測定することが不能となる。またインドフェノールを用いる測定方法では、アンモニア以外の成分に反応する等の特異性に問題がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような生体成分の測定方法において、生体試料中に含まれる内因性または外因性アンモニアによって測定に誤差を生じ、正しい測定結果が得られないことがしばしば経験されている。このような問題を解決する手段として、グルタミン酸脱水素酵素とイソクエン酸脱水素酵素を試薬中に共存させることにより、効率的にアンモニアを消去し、生体成分の測定への干渉を回避する方法が用いられている。しかしながら、この方法では反応に直接、関与しないイソクエン酸脱水素酵素および該脱水素酵素の基質であるイソクエン酸を試薬中に添加しなければならない。また、主反応進行中にはイソクエン酸脱水素酵素の反応をきわめて速やかに停止しなければならなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記問題点を解消するために、内因性または外因性アンモニアの測定値への干渉を回避する方法を鋭意検討した結果、アンモニアに対するＫｍ値が少なくとも５ｍＭである好熱菌由来のアミノ酸脱水素酵素と該脱水素酵素の基質を含有させ、かつダブルカイネテイック法を用いることによって、上記問題を解決するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は試料中の生体成分または該生体成分に由来する物質に、生体成分またはそれに由来する物質に作用し、アンモニアを生成する酵素を作用させ、生成したアンモニアを測定することにより生体成分を測定する方法において、アンモニアに対するＫｍ値が少なくとも５ｍＭであるアミノ酸脱水素酵素、該脱水素酵素の基質およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを使用し、ダブルカイネテイック法により、内因性または外因性アンモニアの干渉を回避することを特徴とする生体成分測定方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、アンモニアに対するＫｍ値が少なくとも５ｍＭであるアミノ酸脱水素酵素、好ましくは好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素、該脱水素酵素の基質およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを使用し、ダブルカイネテイック法により、内因性または外因性アンモニアの干渉を回避することが可能となる。したがって、生体試料中に含まれる内因性または外因性アンモニアが及ぼす生体成分の測定への干渉を、反応に直接、関与しない成分、例えばイソクエン酸脱水素酵素および該酵素の基質であるイソクエン酸を試薬中に添加する必要がない。また、アンモニアに対するＫｍ値が５ｍＭ未満であるアミノ酸脱水素酵素、例えばグルタミン酸脱水素酵素では、アンモニアに対する親和性が高いために反応が速やかに進行し、カイネティックアッセイが難しくなる。
【０００９】
本発明によれば、反応に直接、関与しない成分、例えばイソクエン酸脱水素酵素およびイソクエン酸を試薬中に添加する必要がない。また、Ｋｍ値が５ｍＭ未満であるグルタミン酸脱水素酵素では不可能であったカイネテイックアッセイ法を実施できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
ダブルカイネティック法とは、試料と第１試薬混合時に生じる吸光度変化量とさらに第２試薬を添加した後に生じた吸光度変化量とから、目的とする成分の量と比例関係を有する吸光度変化量を求め、予め標準液を用いた検量線から、目的とする成分の量を測定する方法である。
【００１１】
本発明の一実施態様は、試料にアンモニアに対するＫｍ値が少なくとも５ｍＭであるアミノ酸脱水素酵素、好ましくは好熱性菌由来のアミノ酸脱水素酵素、該脱水素酵素の基質およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含む第１試薬を作用させ、得られる吸光度の減少速度を測定し、次いで試料中の生体成分に作用し、アンモニアを生成する酵素を含む第２試薬を作用させて吸光度の減少速度を測定し、後者から前者を差し引くことにより、試料中の生体成分を測定することを特徴とする生体成分測定方法である。
【００１２】
また別の実施態様は、試料にアンモニアに対するＫｍ値が少なくとも５ｍＭであるアミノ酸脱水素酵素、好ましくは好熱性菌由来のアミノ酸脱水素酵素、該脱水素酵素の基質、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび試料中の生体成分に由来する物質に作用し、アンモニアを生成する酵素を含む第１試薬を作用させ、得られる吸光度の減少速度を測定し、次いで試料中の生体成分に作用して、該成分に由来する前記物質を生成する酵素をを含む第２試薬を作用させて吸光度の減少速度を測定し、後者から前者を差し引くことにより、試料中の生体成分または該生体成分に由来する物質を測定することを特徴とする生体成分測定方法である。
【００１３】
また、本発明は生体成分または生体成分に由来する物質に作用し、アンモニアを生成する酵素、アンモニアに対するＫｍ値が少なくとも５ｍＭであるアミノ酸脱水素酵素、該脱水素酵素の基質およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含むことを特徴とする生体成分測定用試薬組成物である。
【００１４】
本発明において測定する生体成分としては、クレアチン、クレアチニンまたは尿素などが挙げられる。本発明において測定しようとする成分はこれらの成分に限らず、アンモニアを生成する酵素を用いて生成するアンモニアを測定することにより、測定可能な成分を包含する。このような成分としては、例えばＬ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、シトシン、アデニン、アデノシン、シチジン、ＡＭＰ、グアノシンなどが挙げられる。
【００１５】
本発明において測定しようとする生体成分に由来する物質としては、クレアチンに由来する尿素などが挙げられる。本発明において、測定しようとする成分は、これらの成分に限らず、アンモニアを生成する酵素の基質となる物質を生成するものであって、該物質にアンモニアを生成する酵素を作用させてアンモニアを生成させ、その量を測定することにより測定可能な成分を包含する。
【００１６】
生体成分に直接、作用してアンモニアを生成する酵素としては、クレアチニンデイミナーゼ、ウレアーゼ、Ｌ−アスパラギンアミドヒドロラーゼ、Ｌ−グルタミンアミドヒドロラーゼ、シトシンアミノヒドロラーゼ、アデニンアミノヒドロラーゼ、アデニシンアミノヒドロラーゼ、シチジンアミノヒドロラーゼ、ＡＭＰアミノヒドロラーゼ、グアニンアミノヒドロラーゼなどが挙げられる。
【００１７】
上記アンモニアを生成する酵素の基質となる物質としては、クレアチニン、尿素、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、シトシン、アデニン、アデノシン、シチジン、ＡＭＰ、グアノシンなどが挙げられ、これらの物質を生成する酵素としては、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、アシルＣｏＡシンセターゼなどが挙げられる。
【００１８】
本発明に使用されるアミノ酸脱水素酵素としては、アンモニアに対するＫｍ値が少なくとも５ｍＭであれば、その由来について特に限定されるものではなく、通常、天然の起源から採取されるもの、または遺伝子組換えあるいは変異処理によって取得されるものであってもよい。特に好適には好熱菌由来のアミノ酸脱水素酵素が用いられる。
好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素としては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）  由来のアラニン脱水素酵素、およびバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）  、バチルス・スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）  、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）  由来のロイシン脱水素酵素などが挙げられる。
【００１９】
本発明における好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素の基質とは、アンモニアを除く物質であって、アラニン脱水素酵素を使用する場合は、ピルビン酸であり、ロイシン脱水素酵素を使用する場合は、２−オキソイソ吉草酸（α−ケトイソペンタン酸）、２−オキソイソカプロン酸（α−ケトイソヘキサン酸）、２−オキソ吉草酸（α−ケトペンタン酸）、２−オキソ酪酸（α−ケトブタン酸）、２−オキソカプロン酸（α−ケトヘキサン酸）などである。
【００２０】
本発明における内因性アンモニアとは、生体成分中に存在するアンモニアおよび生体試料の保存中に発生するアンモニアを意味する。本発明における外因性アンモニアとは、生体試料測定中に混入するアンモニアを意味する。
【００２１】
本発明の一実施態様は、第１試薬にアンモニアに対するＫｍ値が少なくとも５ｍＭであるアミノ酸脱水素酵素、好ましくは好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素、該脱水素酵素の基質およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含み、第２試薬に生体成分または生体成分に由来する物質に作用し、アンモニアを生成する酵素、アンモニアに対するＫｍ値が少なくとも５ｍＭであるアミノ酸脱水素酵素、好ましくは好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素および必要により該脱水素酵素の基質またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含む生体成分測定用試薬組成物である。
【００２２】
さらに本発明の別な実施態様は、第１試薬に生体成分に由来する物質に作用し、アンモニアを生成する酵素およびアンモニアに対するＫｍ値が少なくとも５ｍＭであるアミノ酸脱水素酵素、好ましくは好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素、該脱水素酵素の基質およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含み、第２試薬に直接、生体成分に作用する酵素、好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素および必要により該脱水素酵素の基質およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含む生体成分測定用試薬組成物である。
【００２３】
具体的な実施態様は、第１試薬が好熱性菌由来アラニン脱水素酵素またはロイシン脱水素酵素、該脱水素酵素の基質、ＮＡＤＨおよび緩衝液を含み、第２試薬がクレアチニンデイミナーゼ、好熱性菌由来アラニン脱水素酵素またはロイシン脱水素酵素および必要により該脱水素酵素の基質またはＮＡＤＨおよび緩衝液を含むクレアチニン測定用試薬組成物である。
【００２４】
別な実施態様は、第１試薬が好熱性菌由来アラニン脱水素酵素またはロイシン脱水素酵素、該脱水素酵素の基質、ＮＡＤＨおよび緩衝液を含み、第２試薬がウレアーゼ、好熱性菌由来アラニン脱水素酵素またはロイシン脱水素酵素および必要により該脱水素酵素の基質またはＮＡＤＨおよび緩衝液を含む尿素測定用試薬組成物である。
【００２５】
さらに別な実施態様としては、第１試薬が好熱性菌由来アラニン脱水素酵素またはロイシン脱水素酵素、該脱水素酵素の基質、ウレアーゼ、ＮＡＤＨおよび緩衝液を含み、第２試薬がクレアチンアミジノヒドロラーゼ、好熱性菌由来アラニン脱水素酵素またはロイシン脱水素酵素および必要により該脱水素酵素の基質またはＮＡＤＨおよび緩衝液を含むクレアチン測定用試薬組成物である。
【００２６】
本発明の生体成分測定用試薬組成物は、第１試薬に、少なくとも、アンモニアに対するＫｍ値が５ｍＭ以上であるアミノ酸脱水素酵素、好ましくは好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素、該脱水素酵素の基質およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含み、第２試薬にアンモニアを生成する酵素、アンモニアに対するＫｍ値が５ｍＭ以上であるアミノ酸脱水素酵素、好ましくは好熱菌由来アミノ酸脱水素酵素および必要により該脱水素酵素の基質およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含むものである。
該組成物の形状としては、液状試薬であっても、凍結乾燥製剤であってもよく、溶解液を組み合わせてもよい。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グット緩衝液等、酵素反応を阻害しないものであれば、その種類に限定されない。ｐＨは、５〜１０で用いられる。安定剤としては、糖類、アミノ酸類、金属塩類、キレート剤等が用いられる。他の添加剤としては、界面活性剤、防腐剤など、反応を阻害しないものであれば、その使用は限定されない。
【００２７】
第１試薬組成物中のアミノ酸脱水素酵素の添加量は、特に限定されるものではないが、好適には０．１〜５０Ｕ／ｍｌで用いられる。該脱水素酵素の基質の濃度は測定に支障をきたさない限り、限定されるものではない。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの添加量は０．１〜０．４ｍＭで好適に用いられる。第２試薬組成物中のアミノ酸脱水素酵素の添加量は、第１試薬および第１試薬と第２試薬の量の比に依存し、反応液の最終酵素添加量が、第１試薬の添加量に（第１試薬＋第２試薬）量／第１試薬量の係数を乗じた量が好適に用いられる。
第２試薬組成物中のアンモニアを生成する酵素の添加量は、特に限定されるものではないが、好適には２〜３００Ｕ／ｍｌである。
【００２８】
本発明の測定方法は、試料と第１試薬混合時に生じるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの吸光度変化量とさらに第２試薬を添加した後に生じたＮＡＤ（Ｐ）Ｈの吸光度変化量とから、目的とする成分の量と比例関係を有するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの吸光度変化量を求め、予め標準液を用いた検量線から、目的とする成分の量を測定する方法である。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例をもって詳細に説明するが、これらによって本発明は限定されるものではない。なお、実施例中の略号は以下のものを示す。
ＴＥＳ：Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸
ＴＡＰＳ：Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸
【００３０】
実施例１  血清中のクレアチニンの測定
下記試薬Ａまたは試薬Ｂを調製した。
試薬Ａ（比較例）：
（第１試薬）
グルタミン酸脱水素酵素            ６．０Ｕ／ｍｌ
α−ケトグルタル酸                ３．０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ                        ０．３ｍＭ
リン酸緩衝液                      ０．１Ｍ
（第２試薬）
クレアチニンデイミナーゼ          １０  Ｕ／ｍｌ
グルタミン酸脱水素酵素            １４  Ｕ／ｍｌ
リン酸緩衝液                      ０．１Ｍ
試薬Ｂ（本発明）：
（第１試薬）
ロイシン脱水素酵素                ６．０Ｕ／ｍｌ
α−ケトイソヘキサン酸            ３．０ｍＭ
ＮＡＤＨ                          ０．３ｍＭ
リン酸緩衝液                      ０．１Ｍ
（第２試薬）
クレアチニンデイミナーゼ          １０  Ｕ／ｍｌ
ロイシン脱水素酵素                １４  Ｕ／ｍｌ
リン酸緩衝液                      ０．１Ｍ
【００３１】
サンプルとしては、下記サンプル１〜６を使用した。
サンプル１  人プール血清：蒸留水＝９：１
サンプル２  人プール血清：  ３６０ｍｇ／ｄｌ  塩化アンモニウム水溶液＝９：１
サンプル３  人プール血清：  ７２０ｍｇ／ｄｌ  塩化アンモニウム水溶液＝９：１
サンプル４  人プール血清：１０８０ｍｇ／ｄｌ  塩化アンモニウム水溶液＝９：１
サンプル５  人プール血清：１４４０ｍｇ／ｄｌ  塩化アンモニウム水溶液＝９：１
サンプル６  人プール血清：１８００ｍｇ／ｄｌ  塩化アンモニウム水溶液＝９：１
【００３２】
各サンプル３μｌに試薬Ａまたは試薬Ｂの第１試薬を３００μｌ添加し、３７℃で加温し、第１試薬添加２分後と４分後に精製水を対照に、３４０ｎｍの吸光度を測定した。さらに試薬Ａまたは試薬Ｂの第２試薬を１００μｌ添加し、３７℃で加温し、第２試薬添加２分後と５分後に精製水を対照に、３４０ｎｍの吸光度を測定した。
得られた吸光度をもとに、あらかじめ標準液を用いて作成した検量線からクレアチニン濃度を求めた。吸光度よりクレアチニン濃度を求める計算式は、以下の通りである。
【００３３】
△ＡＢＳ＝（Ｂ２−Ｂ５）／３−（Ａ２−Ａ４）／２
Ｂ２：第２試薬添加２分後の吸光度    Ａ２：第一試薬添加２分後の吸光度
Ｂ５：第二試薬添加５分後の吸光度    Ａ４：第一試薬添加５分後の吸光度
クレアチニン濃度＝（Ｓ−ＢＬ）／（ＳＴＤ−ＢＬ）×５．０
ＢＬ：精製水の△ＡＢＳ      ５．０：標準液のクレアチニン濃度
ＳＴＤ：標準液の△ＡＢＳ
Ｓ：試料の△ＡＢＳ
その結果を表１に示す。表中の数字の単位はｍｇ／ｄｌである。
【００３４】
【表１】
2005245466.tif 000002
【００３５】
表１から明らかなように、アンモニア濃度が高いサンプルにおいても、試薬Ｂ
はその影響を回避することができる。
【００３６】
実施例２  血清中の尿素窒素の測定
下記試薬Ｃおよび試薬Ｄを調製した。
試薬Ｃ（比較例）：
（第１試薬）
グルタミン酸脱水素酵素            ６．０Ｕ／ｍｌ
α−ケトグルタル酸                ３．０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ                        ０．３ｍＭ
リン酸緩衝液                      ０．１Ｍ
（第２試薬）
ウレアーゼ                        ３０  Ｕ／ｍｌ
グルタミン酸脱水素酵素            １４  Ｕ／ｍｌ
リン酸緩衝液                      ０．１Ｍ
試薬Ｄ（本発明）：
（第１試薬）
ロイシン脱水素酵素                ６．０Ｕ／ｍｌ
α−ケトイソヘキサン酸            ３．０ｍＭ
ＮＡＤＨ                          ０．３ｍＭ
リン酸緩衝液                      ０．１Ｍ
（第２試薬）
ウレアーゼ                        ３０  Ｕ／ｍｌ
ロイシン脱水素酵素                １４  Ｕ／ｍｌ
リン酸緩衝液                      ０．１Ｍ
サンプルとしては実施例１と同じサンプルを使用した。
【００３７】
各サンプル３μｌに試薬Ｃまたは試薬Ｄの第１試薬を３００μｌ添加し、３７℃で加温し、第１試薬添加２分後と４分後に精製水を対照に、３４０ｎｍの吸光度を測定した。さらに試薬Ｃまたは試薬Ｄの第２試薬を１００μｌ添加し、３７℃で加温し、第２試薬添加２分後と５分後に精製水を対照に３４０ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとに、あらかじめ標準液を用いて作成した検量線から尿素窒素濃度を求めた。
吸光度より尿素窒素濃度を求める計算式は以下の通りである。
△ＡＢＳ＝（Ｂ２−Ｂ５）／３−（Ａ２−Ａ４）／２
Ｂ２：第二試薬添加２分後の吸光度      Ａ２：第一試薬添加２分後の吸光度
Ｂ５：第二試薬添加５分後の吸光度      Ａ４：第一試薬添加５分後の吸光度
尿素窒素濃度＝（Ｓ−ＢＬ）／（ＳＴＤ−ＢＬ）×５０
ＢＬ：精製水の△ＡＢＳ    ５０：標準液の尿素窒素濃度
ＳＴＤ：標準液の△ＡＢＳ
Ｓ：試料の△ＡＢＳ
その結果を表２に示す。表中の数字の単位はｍｇ／ｄｌである。
【００３８】
【表２】
2005245466.tif 000003
【００３９】
表２から明らかなように、アンモニア濃度が高いサンプルにおいても、試薬Ｄはその影響を回避することができる。
【００４０】
実施例３  血清中のクレアチンの測定
下記試薬Ｅおよび試薬Ｆを調製した。
試薬Ｅ（比較例）：
（第１試薬）
グルタミン酸脱水素酵素                ６Ｕ／ｍｌ
α−ケトグルタル酸                    ３ｍＭ
ウレアーゼ                          ２０Ｕ／ｍｌ
ＮＡＤＰＨ                        ０．３ｍＭ
ＴＥＳ緩衝液                        ５０ｍＭ
（第２試薬）
クレアチンアミジノヒドロラーゼ    ３００Ｕ／ｍｌ
グルタミン酸脱水素酵素              １４Ｕ／ｍｌ
ＴＥＳ緩衝液                        ５０ｍＭ
試薬Ｆ（本発明）：
（第１試薬）
ロイシン脱水素酵素                    ６Ｕ／ｍｌ
α−ケトイソヘキサン酸                ３ｍＭ
ウレアーゼ                          ２０Ｕ／ｍｌ
ＮＡＤＨ                            ０．３ｍＭ
ＴＥＳ緩衝液                        ５０ｍＭ
（第２試薬）
クレアチンアミジノヒドロラーゼ    ３００Ｕ／ｍｌ
ロイシン脱水素酵素                  １４Ｕ／ｍｌ
ＴＥＳ緩衝液                        ５０ｍＭ
サンプルとしては実施例１と同じサンプルを使用した。
【００４１】
サンプル５μｌに試薬Ｅまたは試薬Ｆの第１試薬を３００μｌ添加し、３７℃で加温し、第１試薬添加２分後と４分後に精製水を対照に、３４０ｎｍの吸光度を測定した。さらに試薬ＥまたはＦの第２試薬を１００μｌ添加し、３７℃で加温し、第２試薬添加２分後と５分後に精製水を対照に３４０ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとに、あらかじめ標準液を用いて作成した検量線からクレアチン濃度を求めた。
吸光度よりクレアチン濃度を求める計算式は以下の通りである。
△ＡＢＳ＝（Ｂ２−Ｂ５）／３−（Ａ２−Ａ４）／２
Ｂ２：第二試薬添加２分後の吸光度    Ａ２：第一試薬添加２分後の吸光度
Ｂ５：第二試薬添加５分後の吸光度    Ａ４：第一試薬添加５分後の吸光度
尿素窒素濃度＝（Ｓ−ＢＬ）／（ＳＴＤ−ＢＬ）×５．０
ＢＬ：精製水の△ＡＢＳ        ５．０：標準液のクレアチン濃度
ＳＴＤ：標準液の△ＡＢＳ
Ｓ：試料の△ＡＢＳ
その結果を表３に示す。表中の数値の単位はｍｇ／ｄｌである。
【００４２】
【表３】
2005245466.tif 000004
【００４３】
表３から明らかなように、アンモニア濃度が高いサンプルにおいても、試薬Ｆはその影響を回避することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は、血清、尿などの生体試料中のクレアチン、クレアチニン、尿素などの成分の存在およびその量の測定など、臨床検査の分野において、有用である。