(57)【要約】【課題】  標識されたR-メバロン酸を提供すること。【解決手段】  メバロン酸生産菌に標識化合物を取り込ませ、培養物中に標識されたR-メバロン酸を蓄積させることを特徴とする標識R-メバロン酸の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メバロン酸生産菌に標識化合物を取り込ませ、培養物中に標識されたR-メバロン酸を蓄積させることを特徴とする標識R-メバロン酸の製造方法。
【請求項２】
メバロン酸生産菌に標識化合物を取り込ませるに際し、メバロン酸生産菌を、菌体増殖用の培地成分を用いて１次培養した後、この１次培養物から、標識されていないR-メバロン酸を含む培養液画分を除去して菌体画分を調製し、次いで、該菌体画分を、標識化合物を含む培地成分を用いて２次培養することにより、２次培養物中に標識R-メバロン酸を蓄積させることを特徴とする請求項１記載の標識R-メバロン酸の製造方法。
【請求項３】
上記メバロン酸生産菌が、サッカロマイコプシス・フィブリゲラ（Saccharomycopsis fibuligera）に属する菌株又はこれらの変異株である請求項１又は２記載の標識R-メバロン酸の製造方法。
【請求項４】
上記メバロン酸生産菌が、サッカロマイコプシス・フィブリゲラ（Saccharomycopsis fibuligera）ADK 8107株 (FERM BP-2320) 又はサッカロマイコプシス・フィブリゲラ（Saccharomycopsis fibuligera）ADK 8108株 (FERM BP-2321) 又はこれらの変異株である請求項１〜３のいずれか１項記載の標識R-メバロン酸の製造方法。
【請求項５】
上記メバロン酸生産菌が、メバロン酸経路を有しない放線菌に対して、3-ハイドロキシ-3-メチルグルタリルコエンザイムA合成酵素遺伝子及び3-ハイドロキシ-3-メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素遺伝子をコードするＤＮＡを形質転換した菌株又はこれらの変異株である請求項１又は２記載の標識R-メバロン酸の製造方法。
【請求項６】
上記標識化合物が、2Ｈ（Ｄ）、3Ｈ（Ｔ）、13Ｃ、14Ｃ、17Ｏ及び18Ｏからなる群から選ばれた1種又は2種以上の同位体を含む化合物であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載の標識R-メバロン酸の製造方法。
【請求項７】
上記標識化合物が、酢酸、グリセロール、グルコース、グルコース６-リン酸、フルクトース６-リン酸、フルクトース１，６-ビスリン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセルアルデヒド３-リン酸、１，３-ビスホスホグリセリン酸、３-ホスホグリセリン酸、２-ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、フルクトース、フルクトース1-リン酸、ピルビン酸、炭素数４〜２２の脂肪酸、該脂肪酸の誘導体であるモノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリド、並びにリン脂質からなる群から選ばれた１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする請求項１〜６いずれか１項記載の標識R-メバロン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識されたＲ−メバロン酸（以下、標識R-メバロン酸とも言う）の製造方法に関する。本発明の製造方法で得られる標識されたR-メバロン酸は、主に医薬・化粧品・食品分野等で有用なテルペノイドが、どのような生合成経路により合成及び代謝されるかを解明するための研究用試薬として有用であり、さらに、標識された各種化合物の合成原料としても有用である。
【背景技術】
【０００２】
メバロン酸は、重要な生理活性物質群であり多くの生命維持に必須のテルペノイドと呼ばれる物質群の生合成中間体であり、例えば、哺乳類などの動物やカビ・酵母等の真菌類ではステロイドなどのテルペノイドの生合成中間体である。メバロン酸は、天然型のR-メバロン酸及び非天然型であるS-メバロン酸が知られている。メバロン酸の製造においては、多くの場合、発酵法では天然型が得られ、化学合成方法では天然型と非天然型との等量混合物であるラセミ体が得られる。また、メバロン酸は、無水状態では容易に脱水して分子内エステル化（ラクトン化)しメバロノラクトンとなるが、メバロノラクトンは、水溶液ないしアルカリ水溶液中で容易に水と反応してメバロン酸ないしメバロン酸塩となる。
【０００３】
メバロン酸の発酵生産方法に関しては、サッカロマイコプシス・フィブリゲラ（Saccharomycopsis fibuligera）を用いる方法（特許文献１参照）、培地成分としてカゼイン由来のペプトン及びコーン スティープ リカーを用いる方法（特許文献２参照）、ML-236Bに耐性を有するサッカロマイコプシス・フィブリゲラ（Saccharomycopsis fibuligera）を用いる方法（特許文献３参照）等が知られている。
【０００４】
テルペノイドは、炭素数５のイソプレン単位を基本骨格に持つ一群の有機化合物の総称であり、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の重合によって生合成される。（C5H8）nの不飽和炭化水素以外に、それらの酸化還元生成物(アルコール、ケトン、酸等）、炭素の脱離した化合物等が、多くの植物及び動物体内に見出されている。テルペノイドは、炭素数により、ヘミテルペン（C5）、モノテルペン（C10）、セスキテルペン（C15）、ジテルペン（C20）、セスタテルペン（C25）、トリテルペン（C30）、テトラテルペン（C40、カロチノイド）及びその他のポリテルペンに分類することができる。テルペノイドには、アブシジン酸、幼若ホルモン、ジベレリン、フォルスコリン、ホルボール等、生理活性を示す化合物も多い。また、構造の一部にイソプレン構造を有する複合テルペンとして、クロロフィル、ビタミンK、ユビキノン、tRNA等があり、これらも有用な生理活性を示す。
【０００５】
例えば、テルペノイド化合物の一種であるユビキノンは、電子伝達系の必須成分として、生体内で重要な機能を果たしており、心疾患に効果のある医薬品として使用されているほか、健康食品としての需要が増大している。また、ビタミンＫは、血液凝固系に関与する重要なビタミンであり、止血剤として利用されているほか、最近では骨代謝への関与が示唆され、骨粗鬆症治療への応用が期待されており、フィロキノンとメナキノンは医薬品として許可されている。また、ユビキノンやビタミンＫ類には、船体や橋脚等の建造物への貝類の付着阻害作用があり、貝類付着防止塗料への応用が期待される。さらに、カロチノイドには抗酸化作用があり、β−カロチン、アスタキサンチン、クリプトキサンチン等、がん予防や免疫賦活活性を有するものとして期待されているものもある。
【０００６】
このように、テルペノイドには生体にとって有用な物質が含まれているが、これらの化合物は全て、基本骨格単位であるイソペンテニルピロリン酸(IPP)を経由して生合成されることが知られている。
【０００７】
そして、テルペノイド化合物の基本骨格であるIPPは、動物や酵母等の真核生物では、アセチルCoAからメバロン酸を経由して生合成されることが証明されている。
【０００８】
最近の研究から、生物には、全く異なる２種類のテルペノイド生合成経路が存在することが明らかとなった。すなわち、メバロン酸経路および非メバロン酸経路である。
【０００９】
メバロン酸経路は、既に説明したように動物や酵母などの真核生物に存在し、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルCoA (以下HMG CoAと略記する)還元酵素が律速酵素であると考えられている（非特許文献１参照）。この観点から、酵母において、HMG CoA還元酵素を高発現させて細胞内のメバロン酸レベルを上げることにより、カロチノイドの生産性を向上させる試みがなされている（非特許文献２参照）。
【００１０】
放線菌Streptomyces sp. CL190株（非特許文献７参照）は、メバロン酸経由でIPPを合成していることが分っており（非特許文献８及び９参照）、放線菌Streptomyces sp. CL190株から、メバロン酸経路上の一つの反応を触媒する酵素であるHMG CoA還元酵素をコードする遺伝子(hmgr)（非特許文献１０参照）、およびメバロン酸経路に関与する全ての酵素、すなわちホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、メバロン酸キナーゼ、イソペンテニル 2-リン酸イソメラーゼ、HMG CoA還元酵素、HMG CoA合成酵素、全てを含む遺伝子クラスターがクローニングされている（特許文献４、非特許文献１１及び非特許文献１２参照）。
【００１１】
一方、大腸菌などの多くの原核生物では、非メバロン酸経路、すなわちピルビン酸及びグリセルアルデヒド-3-リン酸が縮合して生じる1-デオキシ-D-キシルロース 5-リン酸(ＤＸＰ)が還元及び異性化を受けて生成する2-C-メチル-D-エリスロース  ４-リン酸（ＭＥＰ）を経由してIPPが生合成されるＭＥＰ経路が発見されており（非特許文献３参照）、13Cラベル化基質を使った実験から、1-デオキシ-D-エリスリトール ４-リン酸を経由してIPPへと転換されることが証明されている（非特許文献４及び５参照）。特に、大腸菌では、IPPは非メバロン酸経路でのみ合成されることが実証されている（非特許文献６、１１及び非特許文献１２参照）。
【００１２】
さらに、植物では、細胞質ではメバロン酸経路が、葉緑体等の色素体ではMEP経路が、テルペノイドの生合成に作用していることが知られている（非特許文献１６参照）。また、放線菌は、一般には、MEP経路により必要なテルペノイドを生産するが、特殊な放線菌は、２次代謝産物生産のために、さらに別途メバロン酸経路を持っていることが報告されている（非特許文献１７参照）。これらの両方の経路を持つ生物においてテルペノイドがどのように生合成されるかは、量的及び質的に不明な点が多い。この点を解明することは、生理活性物質の利用の可能性を広げるということから、非常に重要な研究対象の一つとなっている。かかる研究においては、研究用試薬として、標識されたメバロン酸を使用することが有用である。
【００１３】
また、R-メバロン酸を利用する生物が、メバロン酸を取り込み、メバロン酸キナーゼ及びホスホメバロン酸キナーゼ両酵素の作用により５-ピロリン酸化し、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにより脱炭酸し、テルペノイドの基本骨格であるイソペンテニルピロリン酸 (IPP) を生成することを利用して、R-メバロン酸を利用する生物に、標識されたメバロン酸を取り込ませ、メバロン酸経路から標識されたテルペノイドを生産させることも可能である。標識されたテルペノイドは、テルペノイドがどのような経路により代謝されるかを解明するために有用である。
【００１４】
標識したメバロン酸については合成品が入手可能である。標識したメバロン酸の合成品は、標識されていないメバロン酸の合成品と同様に、ほとんどの場合、天然型であるR-メバロン酸と非天然型であるS-メバロン酸との等量混合物（ラセミ体）である。一般に、S-メバロン酸は、生物に利用されず、微生物やカルス、培養細胞の系では培養液中に残存するとされている。また、S-メバロン酸は、ヒトを含む哺乳類等に経口投与した場合は、そのまま排泄されると考えられる。しかし、S-メバロン酸の生理作用についてはほとんど情報が得られておらず、何等かの有害な生理作用が存在する可能性もある。
【００１５】
標識されたメバロン酸又はメバロノラクトンの化学合成法に関しては、メバロン酸又はメバロノラクトンの化学合成に使用する原料として、標識された原料（以下、標識化合物とも言う）を使用する方法が報告されている。
【００１６】
メバロン酸又はメバロノラクトンの化学合成に使用する原料として、標識された原料を使用する方法としては、ジメトキシフェニルラクトンおよびトリメチルフォスフォアセテートを出発物質とする合成法（非特許文献１３参照）等が知られているが、その他の一般的なメバロン酸／メバロノラクトンの化学合成法により、標識されたメバロン酸を合成することも容易に類推できる。但し、これらの化学合成法で得られるメバロン酸は、ラセミ体である。
【００１７】
テルペノイドの生合成及び代謝についての検討に際し、標識されたメバロン酸のラセミ体を用いた場合、ラセミ体中の天然型のR-メバロン酸の含量が最大５０％と考えられるばかりでなく、生理作用の明らかでない非天然型の異性体(S-メバロン酸)による予想不能な生理作用が影響している可能性もあることから、誤った結果が得られるおそれがある。そのため、ラセミ体を用いるのは好ましくないのは当然である。また、医薬品分野で光学活性物質を使用する場合には、安全性と生理作用の両面から、光学異性体を含まない状態で利用することが求められ、産業上どうしてもラセミ体で利用したい場合には、光学異性体である天然型及び非天然型の両方について安全性及び生理作用を明確にすることが求められる。これらのことから明らかなように、テルペノイドの生合成及び代謝を検討するために標識されたメバロン酸を使用する場合は、可能な限り天然型の光学異性体含量が高い標識されたメバロン酸を用いることが好ましい。
【００１８】
以上の理由により、標識されたR-メバロン酸が求められていたが、これまで標識されたR-メバロン酸はほとんど提供されていなかった。R-［2-14C］メバロノラクトンがアマシャムバイオサイエンス（株）から提供されているが、非常に高価であり、しかも、放射性同位体であることから、使用するためには封じ込めのための設備及び技術が必要であった。
【００１９】
また、光学活性な天然型のR-メバロノラクトンやR-メバロン酸を化学合成する方法として、ジアセトン-Ｄ-グルコース-3-ウロースをテンプレートとして使用する方法（非特許文献１４参照）、シャープレス不斉エポキシ化を利用する方法が報告（非特許文献１５参照）されているが、これらの方法においては、高度な技術を必要とし、しかも高価であるため、安価で且つ比較的容易に大量生産可能な方法が望まれていた。このことから、これらの方法を、標識されたR-メバロン酸の製造に応用することは現実的ではない。
【００２０】
【特許文献１】特開昭６３−２１６４８７号公報
【特許文献２】特開平２−２１５３８９号公報
【特許文献３】特開平３−２１０１７４号公報
【特許文献４】特開２００１−１６１３７０号公報
【非特許文献１】Mol. Biol. Cell, 5, 655 (1994)
【非特許文献２】三沢ら、カロチノイド研究談話会講演要旨集 (1997)
【非特許文献３】Biochem. J, 295, 517 (1993)
【非特許文献４】Tetrahedron Lett. 38, 4769 (1997)
【非特許文献５】Tetrahedron Lett. 39, 4509 (1998)
【非特許文献６】Rohmer, M. In Comprehensive Natural Products Chemistry, Vol. 2: Isoprenoids Including Carotenoids and Steroids; Barton, D. Nakanishi, K. Eds. Elsevier: Amsterdam, 1999; pp. 45-67
【非特許文献７】J. Antibiot. 43: 444 (1990)
【非特許文献８】Tetrahedron Lett. 31: 6025 (1990)
【非特許文献９】Tetrahedron Lett. 37:  7979 (1996)
【非特許文献１０】J. Bacteriol. 181: 1256 (1999)
【非特許文献１１】J. Bacteriol. 182: 4153 (2000)
【非特許文献１２】Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 98: 932(2001)
【非特許文献１３】Journal of the American Chemical Society (1998), 120 (22), 5427-5433
【非特許文献１４】Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1: Organic and  Bio-Organic Chemistry (1997), (6), 891-895
【非特許文献１５】Tetrahedron (2003), 59(32), 6035-6038
【非特許文献１６】J. Biol. Chem., 277, 45188 - 45194, 2002
【非特許文献１７】Biosci. Biotechnol. Biochem., 65(7), 1627-1635, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
従って、本発明の目的は、安価で且つ比較的容易に、標識されたR-メバロン酸を大量に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
尚、本出願人は、メバロン酸を利用しない原核生物を用いてメバロン酸の生合成に必要な遺伝子を組み込むことにより、効率的にR-メバロン酸を発酵生産する方法を開発し、特許出願している（特願２００２−３５７２１４号、特願２００３−３１１３８号）。
【００２３】
本発明者等は、鋭意検討を重ねた結果、メバロン酸生産菌に標識された化合物を取り込ませながら、R-メバロン酸を生産させることにより、上記目的を達成し得ることを見出し、本発明に至った。
【００２４】
即ち、本発明（請求項１記載の発明）は、メバロン酸生産菌に標識化合物を取り込ませ、培養物中に標識されたR-メバロン酸を蓄積させることを特徴とする標識R-メバロン酸の製造方法を提供するものである。
【００２５】
また、本発明（請求項２記載の発明）は、メバロン酸生産菌に標識化合物を取り込ませるに際し、メバロン酸生産菌を、菌体増殖用の培地成分を用いて１次培養した後、この１次培養物から、標識されていないR-メバロン酸を含む培養液画分を除去して菌体画分を調製し、次いで、該菌体画分を、標識化合物を含む培地成分を用いて２次培養することにより、２次培養物中に標識R-メバロン酸を蓄積させることを特徴とする請求項１記載の標識R-メバロン酸の製造方法を提供するものである。
【００２６】
また、本発明（請求項３記載の発明）は、上記メバロン酸生産菌が、サッカロマイコプシス・フィブリゲラ（Saccharomycopsis fibuligera）に属する菌株又はこれらの変異株である、請求項１又は２記載の標識R-メバロン酸の製造方法を提供するものである。
【００２７】
また、本発明（請求項４記載の発明）は、上記メバロン酸生産菌が、サッカロマイコプシス・フィブリゲラ（Saccharomycopsis fibuligera）ADK 810７株 (FERM BP-2320) 又はサッカロマイコプシス・フィブリゲラ（Saccharomycopsis fibuligera）ADK 8108株 (FERM BP-2321) 又はこれらの変異株である、請求項１〜３のいずれか１項記載の標識R-メバロン酸の製造方法を提供するものである。
【００２８】
また、本発明（請求項５記載の発明）は、上記メバロン酸生産菌が、メバロン酸経路を有しない放線菌に対して、3-ハイドロキシ-3-メチルグルタリルコエンザイムA合成酵素遺伝子及び3-ハイドロキシ-3-メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素遺伝子、をコードするＤＮＡを形質転換した菌株又はこれらの変異株である、請求項１又は２記載の標識R-メバロン酸の製造方法を提供するものである。
【００２９】
また、本発明（請求項６記載の発明）は、上記標識化合物が、2Ｈ（Ｄ）、3Ｈ（Ｔ）、13Ｃ、14Ｃ、17Ｏ及び18Ｏからなる群から選ばれた1種又は2種以上の同位体を含む化合物であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の標識R-メバロン酸の製造方法を提供するものである。
【００３０】
また、本発明（請求項７記載の発明）は、上記標識化合物が、酢酸、グリセロール、グルコース、グルコース６-リン酸、フルクトース６-リン酸、フルクトース１，６-ビスリン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセルアルデヒド３-リン酸、１，３-ビスホスホグリセリン酸、３-ホスホグリセリン酸、２-ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、フルクトース、フルクトース1-リン酸、ピルビン酸、炭素数４〜２２の脂肪酸、該脂肪酸の誘導体であるモノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリド、並びにリン脂質からなる群から選ばれた１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする、請求項1〜６いずれか１項記載の標識R-メバロン酸の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、安価で且つ比較的容易に、標識されたR-メバロン酸を大量に製造する方法を提供することができる。この方法で得られた標識されたR-メバロン酸は、医薬・化粧品・食品分野等に有用なテルペノイドが、どのような生合成経路により合成及び代謝されるかを解明するための研究用試薬として有用であり、標識された各種化合物の合成原料としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３３】
本発明の標識されたR-メバロン酸の製造方法においては、メバロン酸生産菌及び標識化合物を使用することが必須要件である。なお、R-メバロン酸は酸型とラクトン型の二通りの構造を示すが、両型は相互に変換することが公知であり、本明細書では特に断らない限り、両型をR-メバロン酸と言う。
【００３４】
上記メバロン酸生産菌としては、R-メバロン酸の生産菌であれば、どのような菌株でも使用可能であり、例えば、特開昭６３−２１６４８７号公報や特開平３−２１０１７４号公報に記載の生産菌が使用可能である。上記メバロン酸生産菌としてR-メバロン酸の生産性が高い菌株を用いることが、生産効率がよいため安価に製造可能であり、標識原料である標識化合物のR-メバロン酸への取込みが高くなるため好ましい。このため、好ましくは真核生物である酵母に属するサッカロマイコプシス・フィブリゲラ（Saccharomycopsis fibuligera）、さらに好ましくはサッカロマイコプシス・フィブリゲラ（Saccharomycopsis fibuligera） ADK 8107株 (FERM BP-2320) 又はサッカロマイコプシス・フィブリゲラ（Saccharomycopsis fibuligera）ADK 8108株 (FERM BP-2321)を用いる。また、これらのR-メバロン酸生産菌の生産性を向上させた変異株を用いることも好ましい。
【００３５】
また、上記メバロン酸生産菌として、菌体の取り扱いが容易で培養日数が短いという特徴がある原核生物である放線菌等を用いた下記の形質転換体１及び形質転換体２を用いることも好ましい。下記段落〔００３６〕〜〔００５２〕において、形質転換体１について説明し、下記段落〔００５３〕〜〔００７６〕において、形質転換体２について説明する。尚、形質転換体１は、特願２００２−３５７２１４号明細書に記載されているものであり、形質転換体２は特願２００３−３１１３８号明細書に記載されているものである。
【００３６】
先ず、形質転換体１について説明する。
形質転換体１は、メバロン酸経路を有しない放線菌等の宿主に対して、3-ハイドロキシ-3-メチルグルタリルコエンザイムA合成酵素遺伝子及び3-ハイドロキシ-3-メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素遺伝子の2種類を形質転換したものである。
【００３７】
形質転換に使用するHMG CoA合成酵素遺伝子は、実質的にHMG CoA合成酵素蛋白質、即ちアセトアセチルCoAとアセチルCoAとからHMG CoAを生成する反応を触媒する活性を持つ酵素蛋白質をコードするDNA配列であればよい。また、酵素反応にNADPH等の補助因子を必要としてもしなくても構わない。
【００３８】
また、形質転換に使用するHMG CoA還元酵素遺伝子は、実質的にHMG CoA還元酵素蛋白質、即ちHMG CoAからメバロン酸を生成する反応を触媒する活性を持つ酵素蛋白質をコードするDNA配列であればよい。また、酵素反応にNADPH等の補助因子を必要としてもしなくても構わない。
【００３９】
上記HMG CoA合成酵素遺伝子及び上記HMG CoA還元酵素遺伝子は、いずれも、メバロン酸経路を持つ生物に由来するものであればよく、放線菌等の微生物由来のもの、動物細胞由来のもの、植物細胞由来のもの等が挙げられるが、放線菌由来のものが好ましく、放線菌Streptomyces sp. CL190株由来のものが特に好ましい。
【００４０】
また、上記HMG CoA合成酵素遺伝子及び上記HMG CoA還元酵素遺伝子は、宿主である放線菌等の細胞中で酵素遺伝子から産生される酵素蛋白質の発現効率が高いものが好ましい。また、発現した酵素蛋白質が、高い触媒機能を発現できるように、上記HMG CoA合成酵素遺伝子及び上記HMG CoA還元酵素遺伝子と、宿主との組合せを選択するのが好ましい。これらの点から、宿主としてメバロン酸経路を持たない微生物を用いる場合は、微生物由来、特に放線菌由来のHMG CoA合成酵素遺伝子及びHMG CoA還元酵素遺伝子が好ましい。宿主としてメバロン酸経路を持たない放線菌を用いる場合は、放線菌由来のHMG CoA合成酵素遺伝子及びHMG CoA還元酵素遺伝子が好ましい。
【００４１】
これらの2種類の酵素遺伝子を含むDNA断片を宿主細胞中で発現させるためには、まず目的とする該DNA断片を制限酵素あるいはDNA分解酵素で該酵素遺伝子を含む適当な長さのDNA断片とした後、発現ベクター中においてプロモーターの下流に挿入し、次いで上記DNAを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主細胞中に導入する。
【００４２】
使用する宿主は、非メバロン酸経路を利用している（メバロン酸経路を有しない）生物であればよく、メバロン酸経路を有しない生物としては、グラム陽性菌である、Alicyclobacillus属、Corynebacterium属、Brevibacterium属、Mycobacterium属、Bacillus属、Clostridium属、Deinococcus属、多くのStreptomyces属、グラム陰性菌である、Escherichia属、Salmonella属、Agrobacterium属、Azotobacter属、Methylobacterium属、Pseudomonas属、Rhodopseudomonas属、Zymomonas属、光合成グラム陰性細菌である、Chromatium属、Rhodospirillum属、藍藻である、Anabaena属、Anacystis属、Phormidium属、Synnecoccus属、緑藻である、Chlorella属、Scenedesmun属等に属する生物が挙げられる。
【００４３】
ちなみに、メバロン酸経路を利用している（メバロン酸経路を有している）生物としては、動物、真菌、酵母、グラム陽性菌である、Actinoplanes属、 Lactobacillus属、Mycoplasma属、Staphylococcu属、Enterococcus属、Streptococcus属、一部のStreptomyces属、グラム陰性菌である、Chloropseudomonas属、Flavobacterium属、Myxococcus属、Nannocystis属、Borrelia属、古細菌である、Archaeoglobus属、Methanobacterium属、Methanococcus属、Pyrococcus属、Cardarella属、Halobacterium属、 Sulfolobus属等が知られている。
【００４４】
また、一部のStreptomyces属は、メバロン酸経路及び非メバロン酸の両方を利用していることが知られている。
【００４５】
使用する宿主としては、上述したメバロン酸経路を有しない生物の中でも、微生物、特に放線菌が好ましく、該放線菌としては、Streptomyces lividans、Streptomyces chromofuscus、Streptomyces exfoliatus、Streptomyces argenteorus等が挙げられるが、Streptomyces lividansが特に好ましい。
【００４６】
また、上記発現ベクターとしては、上記宿主の細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、目的とするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。細菌等の微生物の細胞を宿主細胞として用いる場合は、上記ＤＮＡを発現させるための発現ベクターは、該微生物の細胞中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、上記ＤＮＡ及び転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４７】
上記発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、pKK233-2（Pharmacia社製）、pSE280（Invitrogen社製）、pGEMEX-1（Promega社製）、pQE-8（QIAGEN社製）、pQE-30（QIAGEN社製）、pKYP10（特開昭58-110600号公報）、pKYP200〔Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescriptII SK+、pBluescriptII SK(-)（Stratagene社製）、pTrS30(FERM BP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX（Pharmacia社製）、pET-3（Novagen社製）、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18〔gene, 33, 103 (1985)〕、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pSTV29（宝酒造社製）、pUC118（宝酒造社製）、pPA1（特開昭63-233798号公報）、pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392(1990)〕、pQE-30（QIAGEN社製）等が挙げられる。
【００４８】
上記プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等が挙げられる。また、Ｐtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrpｘ２）、tacプロモーター、letIプロモーター、lacT7プロモーターのように、人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００４９】
上記リボソーム結合配列としては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
【００５０】
形質転換においてプラスミドベクターを用いるのが好ましく、該プラスミドベクターとしては、大腸菌とのシャトルベクターが特に好ましい。
【００５１】
上記組換えベクター等の発現ベクターの導入方法としては、上記宿主の細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-2483942号公報）、又はGene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等が挙げられる。
【００５２】
形質転換体１は、以上のように詳述したようにして得ることができるが、形質転換体１としては、放線菌ストレプトマイセス リビダンス 34-1株、34-7株又は35-6株を用いることもできる。これらの菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、微生物の表示が、寄託者が付した識別のための表示「Streptomyces lividans 34-1」、受託番号「FERM P-19120」；寄託者が付した識別のための表示「Streptomyces lividans 34-7」、受託番号「FERM P-19121」；寄託者が付した識別のための表示「Streptomyces lividans 35-6」、受託番号「FERM P-19122」としてそれぞれ寄託されている。
【００５３】
次に、形質転換体２について説明する。
形質転換体２は、メバロン酸経路を有しない放線菌に対して、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子、3-ハイドロキシ-3-メチルグルタリルコエンザイムA合成酵素遺伝子及び3-ハイドロキシ-3-メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素遺伝子の3種類をコードするＤＮＡを形質転換したものである。
【００５４】
以下に、アセトアセチルCoA合成酵素蛋白質をコードするＤＮＡの取得について詳述する。
取得されるアセトアセチルCoA合成酵素蛋白質をコードするＤＮＡはアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を含むものであればよく、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、実質的にアセトアセチルCoA合成酵素、即ち2分子のアセチルCoAからアセトアセチル CoAを生成する反応を触媒する活性をもつ酵素蛋白質をコードするDNA配列であればよい。また、酵素反応にNADPH等の補助因子を必要としてもしなくても構わない。
【００５５】
アセトアセチルCoA合成酵素蛋白質をコードするＤＮＡの取得方法としては、具体的には以下の方法等をあげることができる。
アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は既にいくつか報告されているため、本発明では、これらの遺伝子を使用しても構わないが、放線菌、特に放線菌ストレプトマイセス  sp. CL190株からアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を取得するのが好ましい。例えば、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子のクローニングを行い、放線菌ストレプトマイセス  sp. CL190株から、新規なアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を取得し、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡを得ることができる。以下に、放線菌ストレプトマイセス  sp. CL190株を例示しながら、アセトアセチルCoA合成酵素蛋白質をコードするＤＮＡの取得方法を具体的に説明する。
【００５６】
放線菌ストレプトマイセス  sp. CL190株を、適当な培地、例えば、グルコース２％、可溶性でんぷん２．５％、大豆粉１．５％、ドライイースト０．２％、及び炭酸カルシウム０．４％を含有するKG培地（pH 6.2）で、適当な温度(例えば３０℃)で数日間培養する。培養後、得られた培養液より遠心分離により菌体を取得し、菌体より常法(モレキュラークローニング 第二版)に従い染色体ＤＮＡを単離精製する。
【００５７】
PCR法により配列番号1の塩基配列を有するＤＮＡを取得するためには、放線菌ストレプトマイセス  sp. CL190株の染色体ＤＮＡを鋳型として使用し、既知のアセトアセチルCoA合成酵素の遺伝情報から設計した１対のプライマーＤＮＡを使用して、TaKaRa LA-PCR(登録商標) Kit Ver.2(宝酒造社製)又はExpand(登録商標) High-Fidelity PCR System(ベーリンガー・マンハイム社製)等を用い、ＤＮＡThermal Cycler(パーキンエルマージャパン社製)等でＰＣＲを行う。なお、後のクローニング操作を容易にするために、プライマーには適当な制限酵素部位を付加させておくことが好ましい。
【００５８】
ＰＣＲの条件としては、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件をあげることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。クローニングは、常法、例えば、モレキュラークローニング 第二版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)(以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばSuperScript Plasmid System for cDNASynthesis and Plasmid Cloning（ライフ・テクノロジーズ社製）やZAP-cDNA Synthesis Kit〔ストラタジーン（Staratagene)社製〕を用いて行うことが出来る。
【００５９】
クローニングベクターとしては、大腸菌K12株中で自律複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる、大腸菌の発現用ベクターをクローニングベクターとして用いてもよい。具体的には、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescript II SK(+)〔Nucleic Acids Research,17, 9494 (1989)〕、Lambda ZAP II（ストラタジーン社製）、λgt10、λgt11〔DNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)〕、λTriplEx（クローンテック社製）、λExCell（ファルマシア社製）、pT7T318U（ファルマシア社製）、pcD2〔H.Okayama and P.Berg；Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)〕、pMW218（和光純薬社製）、pUC118（宝酒造社製）、pEG400〔J. Bac.,172, 2392 (1990)〕、pQE-30（QIAGEN社製）等をあげることができる。
【００６０】
得られた形質転換株より、目的とするＤＮＡを含有したプラスミドを、常法、例えば、モレキュラークローニング 第二版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記載された方法により取得することができる。上記方法により、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡを取得することができる。
【００６１】
また、配列番号1の塩基配列において1〜数個の塩基配列が欠失、置換、付加及び／又は挿入されている塩基配列であって、アセトアセチルCoA合成酵素を機能させるために必要な配列をすべてコードする塩基配列、又は配列番号1の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、アセトアセチルCoA合成酵素を機能させるのに必要な配列をすべてコードする塩基配列を有するDNAであれば、形質転換体の作製に用いることができる。
【００６２】
次に、アセトアセチルCoA合成酵素蛋白質をコードする上記ＤＮＡ、並びに天然型のR-メバロン酸の生合成に関与するHMG CoA合成酵素蛋白質及びHMG CoA還元酵素蛋白質それぞれをコードするDNAの計3種のＤＮＡを有する形質転換体の作製について詳述する。
【００６３】
形質転換体２では、天然型のR-メバロン酸の生合成に関与する酵素蛋白質をコードするＤＮＡとして、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子、HMG CoA合成酵素遺伝子及びHMG CoA還元酵素遺伝子の3種類の遺伝子を形質転換することが必須である。
【００６４】
アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、実質的にアセトアセチルCoA合成酵素、即ち2分子のアセチルCoAからアセトアセチル CoAを生成する反応を触媒する活性をもつ酵素蛋白質をコードするDNA配列であればよい。また、酵素反応にNADPH等の補助因子を必要としてもしなくても構わない。
【００６５】
HMG CoA合成酵素遺伝子は、実質的にHMG CoA合成酵素、即ちアセトアセチルCoAとアセチルCoAからHMG CoAを生成する反応を触媒する活性をもつ酵素蛋白質をコードするDNA配列であればよい。また、酵素反応にNADPH等の補助因子を必要としてもしなくても構わない。
【００６６】
また、HMG CoA還元酵素遺伝子は、実質的にHMG CoA還元酵素、即ちHMG CoAからメバロン酸を生成する反応を触媒する活性をもつ酵素蛋白質をコードするDNA配列であればよい。また、酵素反応にNADPH等の補助因子を必要としてもしなくても構わない。
【００６７】
上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子、上記HMG CoA合成酵素遺伝子及び上記HMG CoA還元酵素遺伝子は、いずれも、メバロン酸経路を持つ生物に由来するものであればよく、放線菌等の微生物由来のもの、動物細胞由来のもの、植物細胞由来のもの等が挙げられるが、これらの中でも放線菌由来のものが好ましく、放線菌ストレプトマイセス sp. CL190株由来のものが特に好ましい。
【００６８】
上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子、上記HMG CoA合成酵素遺伝子及び上記HMG CoA還元酵素遺伝子は、いかなる生物由来であっても構わないが、宿主である放線菌の細胞中で酵素遺伝子から産生される酵素蛋白質の発現効率が高いことが好ましい。また、発現した酵素蛋白質が高い触媒機能を発現できる細胞との組合せが好ましい。これらの点から、宿主としてメバロン酸経路を持たない放線菌を用いる本発明のメバロン酸の製造方法においては、放線菌由来の酵素遺伝子を用いるのが好ましく、放線菌ストレプトマイセス sp. CL190由来の酵素遺伝子がさらに好ましい。とりわけ、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子、HMG CoA合成酵素遺伝子及びHMG CoA還元酵素遺伝子の３種類すべてが、放線菌由来、特に放線菌ストレプトマイセス sp. CL190由来であることが好ましい。また、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子の形質転換に用いるＤＮＡの好ましい一例としては、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。
【００６９】
得られた3種類の酵素遺伝子を含むDNA断片を放線菌細胞中で発現させるために、まず、目的とする該DNA断片を制限酵素あるいはDNA分解酵素で該遺伝子を含む適当な長さのDNA断片とした後、発現ベクター中においてプロモーターの下流に挿入する。次いで、上記DNAを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した放線菌細胞中に導入することにより、上記の3種類のＤＮＡを有する形質転換体が得られる。
【００７０】
本発明のメバロン酸の製造方法においては、宿主としてメバロン酸経路を有しない放線菌を使用する。該放線菌としては、Streptomyces lividans、Streptomyces chromofuscus、Streptomyces exfoliatus、Streptomyces argenteorusが好ましく、これらの中でもStreptomyces lividansが特に好ましい。
【００７１】
上記発現ベクターとしては、宿主である放線菌の細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、上記目的とするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。上記ＤＮＡを発現させるための発現ベクターは、該放線菌中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、上記ＤＮＡ及び転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００７２】
上記発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、pKK233-2（Pharmacia社製）、pSE280（Invitrogen社製）、pGEMEX-1（Promega社製）、pQE-8（QIAGEN社製）、pQE-30（QIAGEN社製）、pKYP10（特開昭58-110600号公報）、pKYP200〔Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescriptII SK+、pBluescriptII SK(-)（Stratagene社製）、pTrS30(FERMBP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX（Pharmacia社製）、pET-3（Novagen社製）、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18〔gene, 33, 103 (1985)〕、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pSTV29（宝酒造社製）、pUC118（宝酒造社製）、pPA1（特開昭63-233798号公報）、pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392(1990)〕、pQE-30（QIAGEN社製）等を例示することができる。
【００７３】
上記プロモーターとしては、宿主である放線菌の細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等をあげることができる。また、Ｐtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrpｘ２）、tacプロモーター、letIプロモーター、lacT7プロモーターのように、人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００７４】
上記リボソーム結合配列としては、宿主である放線菌の細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
【００７５】
形質転換においては、プラスミドベクターを用いるのが好ましく、該プラスミドベクターとしては、大腸菌とのシャトルベクターが特に好ましい。
【００７６】
上記組換えベクター等の発現ベクターの導入方法としては、宿主である放線菌の細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-2483942号公報）、又はGene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。
【００７７】
本発明の標識R-メバロン酸の製造方法においては、R-メバロン酸生産菌を、標識原料である標識された化合物（標識化合物）を取り込ませながら培養すればよい。該標識化合物は、R-メバロン酸の生産菌が利用可能な標識原料であれば、いかなる化合物でもよい。培養開始時の培養液に含まれる炭素、水素及び酸素のうちの１〜３種を含む化合物が、実質的に全て標識化合物であれば、培養後の全ての菌体成分及び代謝成分を標識することが可能である。培養後の培養液中におけるR-メバロン酸の標識率（標識されたR-メバロン酸の全メバロン酸に対する比率）は、原料に用いた標識化合物の標識率（標識された化合物の全化合物に対する割合）に限りなく等しくなるため、標識化合物の標識率を実質的に１００％とすれば、R-メバロン酸の標識率を実質的に１００％とすることが可能である。しかし、この方法は、高価であるばかりでなく、菌体やR-メバロン酸以外の不要な化合物まで標識されることから、放射性の標識化合物を取り込ませた場合、放射性同位体で標識された菌体等の廃棄物が大量に生成し、環境負荷や処理費が高価になる等のデメリットがある。そのため、標識化合物の標識率は、経済性と高ラベル化率の必要性等から、目的に応じて選択すればよい。
【００７８】
標識に使用する核種はメバロン酸を構成する炭素、水素及び酸素のいずれか１種でも、２種あるいは３種でも良い。使用目的に応じてダブル標識体やトリプル標識体を調製してもよい。また、放射性同位体で標識された化合物を使用しても、安定同位体で標識された化合物を使用してもよく、また、放射性同位体と安定同位体の両方で標識された化合物を調製してもよい。標識に使用する核種は、安定性が良いことから、2Ｈ（Ｄ、デューテリウム）、3Ｈ（Ｔ、トリチウム）、13Ｃ、14Ｃ、17Ｏ及び18Ｏからなる群から選択される一種以上が好ましいが、その他の同位体でもよい。但し、安定同位体の場合は、使用制限がほとんどなく産業上の利用が容易であるのに対し、放射性同位体の場合は、厳密に管理することが必要であるためコスト高になる傾向にある。従来、検出感度は、放射活性を測定する放射性同位体の方が、安定同位体に比べてはるかに高いとされてきたが、最近の質量分析装置や核磁気共鳴装置等の発達により、安定同位体の検出感度及び分解能が共に改良され、安全性を含めて安定同位体の産業価値が高まっている。
【００７９】
本発明の製造方法においては、上記の標識化合物をメバロン酸生産菌に取り込ませ、培養物中に標識されたR-メバロン酸を蓄積させる。メバロン酸の生合成は、アセチルCoAの供給段階及びアセチルCoAからのメバロン酸の生成段階の２段階に分けて考えることができる。
【００８０】
メバロン酸の生合成の前半であるアセチルCoAの供給段階において、アセチルCoAの供給は、主に解糖系と脂肪酸のβ酸化の２経路である。解糖系においては、グルコース、澱粉、果糖、ショ糖等からピルビン酸に至った後、ピルビン酸が脱炭酸することによりアセチルCoAが生成する。脂肪酸のβ酸化においては、脂肪酸の酸化末端から酢酸単位で炭素骨格が切断されアセチルCoAが生成する。
【００８１】
メバロン酸の生合成の後半では、アセチルCoA 2分子からアセトアセチルCoA合成酵素の作用でアセトアセチルCoAが生成した後、アセトアセチルCoA及びアセチルCoAからHMG CoA合成酵素の作用でHMG CoAが生成し、続いてHMG CoA からHMG CoA還元酵素の作用でメバロン酸が生成する。
【００８２】
本発明で使用するメバロン酸生産菌に取り込ませる標識化合物としては、メバロン酸の生合成に関係する物質であればいかなるものでもよいが、上記で説明した解糖系又はβ酸化系に直接導入可能な物質が、メバロン酸への取込みがよいため好ましく、これらの化合物の中でも、標識体が安価で入手容易な化合物がさらに好ましい。
【００８３】
解糖系に直接導入可能な物質の好ましい例としては、酢酸、グリセロール、グルコース、グルコース６-リン酸、フルクトース６-リン酸、フルクトース１，６-ビスリン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセルアルデヒド３-リン酸、１，３-ビスホスホグリセリン酸、３-ホスホグリセリン酸、２-ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、フルクトース、フルクトース1-リン酸、ピルビン酸が挙げられ、これらの中でも、グリセロール、酢酸、グルコース、フルクトースが特に好ましい。
【００８４】
β酸化に直接導入可能な物質の好ましい例としては、炭素数4〜22の各種脂肪酸、これらの脂肪酸の誘導体であるモノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリド、各種リン脂質等が挙げられる。
【００８５】
尚、酢酸等の有機酸及びグルコース6-リン酸等のリン酸エステルは、酸性物質であるため、そのまま添加すると培養液が酸性となる一方で、ナトリウム塩等の塩として添加すると、菌体によるこれらの化合物の吸収により、ナトリウム等のアルカリが培養液に残存し、培養液が塩基性となる傾向にある。このため、これらの酸性物質を使用する場合は、培養中の培養液のｐＨを厳密にコントロールする必要が発生し、管理要因が増えて手間とコストが増大する場合がある。また、原料として使用する標識化合物は、安価で安定な化合物が好ましい。
【００８６】
本発明の製造方法においては、これらの標識された化合物を１種又は２種以上含有する培養液を用いてメバロン酸生産菌を培養し、公知の方法によりメバロン酸発酵を行うことにより、メバロン酸生産菌に標識化合物を取り込ませ、培養物中に標識されたR-メバロン酸を蓄積させる。培養液中の標識化合物の濃度は、好ましくは０．１〜１０重量％である。
【００８７】
培養液へ標識された化合物を添加する時期は、R-メバロン酸生産菌を使用してメバロン酸発酵を行った際に、培養液中のR-メバロン酸生産菌に標識された化合物を取り込ませることが可能であれば、培養前の培養液に添加しても良いし、培養の途中で培養液に添加してもよい。培養の途中で添加する場合は、R-メバロン酸生産菌によるメバロン酸の生合成速度が高いときに、メバロン酸の生合成中間体の標識体を添加することが、得られるR-メバロン酸の標識率を高めることができるため好ましい。しかし、培養の途中で標識化合物を添加する方法は、標識化合物を添加する前にメバロン酸生産菌により生合成されたR-メバロン酸と、標識化合物を添加した後に生合成された標識されたR-メバロン酸とが混合してしまうため、得られる標識されたR-メバロン酸の標識率は低下する。
【００８８】
本発明で使用する培地は、R-メバロン酸生産菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、メバロン酸生産菌の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００８９】
炭素源としては、R-メバロン酸生産菌が資化し得るものであればよく、グルコース、フルクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。
【００９０】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等を用いることができる。
【００９１】
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【００９２】
培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うのが好ましい。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜１４日間である。培養中、ｐＨは、３．０〜９．０に保持するのが好ましい。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。
【００９３】
また、培養中、必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン、チオストレプトン等の抗生物質を、培地に添加してもよい。
【００９４】
一般に標識化合物は高価なことが多いことから、得られる標識R-メバロン酸への取込み効率が高い方法が、経済的に有利である。また、標識されたR-メバロン酸の全メバロン酸に対する比率（標識率）が高いほど、検出感度が高いことから利用価値が高く好ましい。また、メバロン酸生産能の高い菌体を使用することが、生産効率の観点から好ましい。本発明者等はこれらの点について検討した結果、メバロン酸生産菌に標識化合物を取り込ませるに際し、メバロン酸生産菌を、菌体増殖用の培地成分を用いて１次培養した後、この１次培養物から、標識されていないR-メバロン酸を含む培養液画分を除去して菌体画分を調製し、次いで、該菌体画分を、標識化合物を含む培地成分を用いて２次培養することにより、２次培養物中に標識R-メバロン酸を蓄積させることにより、経済性も高く、高い標識率のR-メバロン酸を調製できることを見いだした。
【００９５】
１次培養で使用する培地成分は、メバロン酸生産菌が高いメバロン酸発酵能を示す培地であれば、前述した培地等いかなるものでも良く、例えば、窒素源や無機塩類を含有する培地を用いることができる。該窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、コーン・スティープ・リカー等及びこれらの組合せが挙げられ、該無機塩類としては、リン酸1カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム等及びこれらの組合せが挙げられる。１次培養において、培養温度、培養時間、ｐH等の条件は、前述と同様の条件を採用することができる。また、メバロン酸生産菌が真核生物であるサッカロマイコプシス・フィブリゲラ（Saccharomycopsis fibuligera）の場合、特開平２−２１５３８９号公報に記載の方法等で培養することができる。１次培養において充分に菌体濃度が上がりメバロン酸発酵能が高まった時点で、遠心分離ないしろ過により、１次培養物から培養液及び培養液中の標識されていないR-メバロン酸を除いた後、菌体を集めてリン酸緩衝液等で菌体を充分に洗浄し、２次培養に供する。１次培養で調製した菌体を、標識化合物を含む２次培養用の培地成分に混合し、好気的に培養を継続して、標識された化合物から標識されたR-メバロン酸を生成させる。２次培養における培養温度等の条件も、前述と同様の条件を採用することができる。また、１次培養の具体的な培養時間を決定する方法としては、あらかじめメバロン酸生産菌にメバロン酸発酵を行なわせ、生成するメバロン酸濃度をモニターした経時データを参考にする方法が好ましい。それにより、メバロン酸生産速度が最大となる直前の菌体を得ることで、メバロン酸生産能の高い菌体が得られる。
【００９６】
２次培養に使用する培地成分は、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩等の無機塩類、標識R-メバロン酸の原料となる標識化合物、メバロン酸発酵において菌体が必要とする最低限のアミノ酸等を含有する窒素源、及び、必要に応じて、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NADH)、コエンザイムＡ(CoA)、アデノシン３-リン酸(ATP)、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、フラビンモノヌクレオチド（FADH2）及びリポ酸からなる群から選択される０〜７種の補助成分を必要量（0〜100ｍＭ）添加した成分で構成することができる。
【００９７】
また、あらかじめメバロン酸生産能の高い菌体を保存しておいて、それを使用することも可能であるが、菌体は保存により活性が低下するため、前記したように１次培養した直後に、２次培養する方法が好ましい。もちろん、活性が落ちない条件で保存した菌体であれば、１次培養を行なわなくてもかまわない。
【００９８】
また、培養後の培養物から標識R-メバロン酸を単離精製するには、通常のメバロン酸ないしメバロン酸の分子内エステルであるメバロノラクトンの単離精製方法、すなわち、菌体分離、抽出、蒸留、クロマトグラフィ、再結晶等を適宜組み合わせることにより得ることが出来る。
【００９９】
標識R-メバロン酸は、分子量が小さい（例えば13C6H12O4の質量数は１５４）ことから、多くの場合メバロン酸生産菌の細胞膜を透過できるため培養ろ液中に蓄積し、菌体中で検出されるメバロン酸は比較的僅かである。このため、培養ろ液を得るために菌体を遠心分離やろ過を用いて除去することが好ましい。ただし、形質転換体の細胞内にR-メバロン酸が蓄積する場合は菌体もしくは菌体を含めた培養ろ液から抽出してもよい。
【０１００】
標識されたR-メバロン酸の抽出は、通常の酸性有機物の抽出方法に従って行うことが出来る。すなわち、培養物を有機酸ないし無機酸を用いてｐＨ１．０〜４．０とした後、酢酸エチル、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、酢酸ブチル、アセトン等の有機溶媒を用いて抽出できる。また、必要に応じて、培養物に塩化ナトリウム等の電解質を溶解させてもよい。さらに、抽出液（有機溶媒相）中に含有する水分を減らす必要があれば、無水硫酸ナトリウム等で脱水してもよい。得られた抽出液から蒸留や減圧下で抽出溶媒を留去することにより、標識されたメバロノラクトンを含有する抽出物を得ることが出来る。ただし、メバロン酸は有機溶媒で抽出すると容易に分子内エステル化（ラクトン化、メバロノラクトン）する。メバロノラクトンをメバロン酸として使用したい場合は、メバロノラクトンと等モル量の水酸化ナトリウム等のアルカリを用いて中和することが出来る。
【０１０１】
標識されたメバロノラクトンを含有する抽出物は、シリカゲルクロマト等のカラムクロマトグラフィーに吸着させ、ヘキサン/酢酸エチル等の溶媒を用いて溶出することで精製することが可能である。また、蒸留により直接メバロノラクトンを精製することも可能である。また、適当な溶媒を用いることにより結晶化することも可能である。
【実施例】
【０１０２】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、以下の実施例及び比較例において、「％」は、特に断らない限り「重量％」である。
【０１０３】
〔実施例１−１〕メバロン酸生産菌サッカロマイコプシス・フィブリゲラ（S. fibuligera ）ADK8107株 (FERM BP-2320)の培養及び菌体の調製 (１次培養)
YM寒天培地に保管しているS. fibuligera ADK8107株 (FERM BP-2320)を、以下の組成の滅菌済み培養液50 mlに１白金耳接種し、回転式培養機を用いて26℃、200rpmで4日間前培養した。前培養後の培養液から2mlをとり、前培養と同じ組成の培養液50 mlに接種し、前培養と同じ条件で4日間培養を行った。得られた培養液を20℃、3500  rpmで15分間遠心分離し、デカンテーションで上清を除いた後、リン酸カリウム緩衝液（pH  6.5）20mlを加えて、菌体を良く懸濁し、再び同様の条件で遠心分離を行い、上清を除いた(菌体洗浄工程)。菌体の洗浄は２回繰り返した。
＜培養液組成＞
ポリペプトン：          0.5％
イーストエキス：        0.25％
MgSO4・７H2O：        0.05％
KH2PO4：               0.10％
アデカノールLG−294：  0.05％
D-グルコース：          10.0％
水（pH無調整）：        残部
【０１０４】
〔実施例１−２〕メバロン酸生産菌サッカロマイコプシス・フィブリゲラ（S. fibuligera）ADK8107株 (FERM BP-2320)の菌体による標識されたR-メバロン酸の生成 (2次培養)
実施例１−１で使用した培養液組成からグルコースを除き、各成分の濃度を2倍にした培養液（グルコースなし）を10ml用意した。次に、Ｄ-グルコース-U-13C6 (クロレラ工業株式会社，Lot No.3052，[13C]: 98.2 atom%)  1gを水10mlに溶解し、０．45μｍのフィルターでろ過した後、上記培養液に混合して標識化合物含有培養液を得た。得られた標識化合物含有培養液20mlと実施例１−１で調製した菌体とを混合し、14日間培養を行った。培養後の培養液を遠心分離（3500rpm、10分）し、上清(培養ろ液)18mlを得た。この培養ろ液について、以下の方法により分析を行ったところ、メバロン酸濃度は0.91mg/mlであった。
【０１０５】
＜分析方法＞
培養ろ液1 mlにリン酸2滴、無水硫酸ナトリウム1 g、酢酸エチル2mlを添加し30秒間撹拌した後、3500 rpmで10分間遠心分離し、分離した酢酸エチル層を別の試験管にとる。残った水層に再び酢酸エチル2mlを添加し30秒間撹拌した後、3500 rpmで10分間遠心分離する。さらにこの操作を再度行い、計約6ｍｌの抽出液を得る。この抽出液を遠心エバポレーターで乾固させて抽出物を得た後、抽出物をイソプロパノール0.1 mlに溶解し、以下に示す分析条件でHPLCを用いて分析を行う。
（分析条件）
カラム：ヌクレオジル5N(CH3)2 (ドイツ、M. ナーゲル社製)、サイズ直径4.6 mm×長さ250 mm、40℃
移動層：N-ヘキサン/イソプロパノール=9/1、流速2.0 ml/分
検出：示差屈折計 （昭和電工（株）製、SE-61型）、注入量 0.005 ml
【０１０６】
〔実施例１−３〕標識されたR-メバロノラクトンの精製
実施例１−２で得られた培養ろ液を10 %リン酸を用いてpH 2.0とした後、メチルエチルケトンを36 ml添加し、交流分配により抽出を行った。水層に再度メチルエチルケトンを36 ml添加し再度交流分配を行い、計3回水層の抽出を行った。その後、水層に食塩4gを添加し撹拌した。そこに酢酸エチルを36ml添加して交流抽出を行い、計３回水層の抽出を行った。得られた3回分のメチルエチルケトン層（108ml）と酢酸エチル層（108ml）を合わせ、ロータリーエバポレーターで乾固し標識された油状の粗メバロノラクトン96mgを得た。
得られた粗メバロノラクトンを蛍光剤を含有しない分析用シリカゲルプレートで展開(展開溶媒：ヘキサン/酢酸エチル=1/9)した後、メバロノラクトン画分を掻き取り、掻き取ったシリカゲルからメバロノラクトンをアセトンで抽出した。この抽出液からアセトンを除き乾固し、標識された精製メバロノラクトン11.9 mgを得た。
得られた精製メバロノラクトンをGC-MSで質量分析したところ、分子イオン(M+)である136を検出した。また、プロトンをデカップリングした13C-NMR(JEOL JMN-AL400 FT-NRM System)を測定したところ、以下の表１に示す炭素間のカップリングを示すスペクトルを得た。
【０１０７】
【表１】
2005269982.tif 000002
【０１０８】
また、本品は旋光度測定により左旋性を示したことから、天然型であるR-メバロノラクトンであることを確認した。
以上より、本品は全ての炭素原子が13Cで標識率されたR-メバロノラクトンであることが明らかである。
【０１０９】
〔実施例２〕メバロン酸生産菌サッカロマイコプシス・フィブリゲラ（S. fibuligera）ADK8108株 (FERM BP-2321)による標識されたR-メバロン酸発酵
実施例１−１、１−２で使用したメバロン酸生産菌S. fibuligera ADK8107株 (FERM BP-2320)をメバロン酸生産菌S. fibuligera ADK8108株 (FERM BP-2321)に変更する以外は、実施例１−１〜１−３と同様に実施し、標識された精製メバロノラクトン 11.2 mgを得た。得られたR-メバロノラクトンをGC-MSで質量分析したところ、分子イオン(M+)である136を検出し、全ての炭素原子が13Cで標識されたR-メバロノラクトンであることを確認した。
【０１１０】
〔比較例１〕
実施例１−２で用いたＤ-グルコース-U-13C6の代わりに、D-グルコースを使用する以外は実施例１−１〜１−３と同様に行い、精製メバロノラクトンを得た。このメバロノラクトンをGC-MSにより質量分析したところ、分子イオン(M+)である130を検出した。また、プロトンをデカップリングした13C-NMRを測定したところ、全くカップリングを示さないスペクトルを得た（表２）。また、旋光度は左旋性を示した。以上より、本品は標識されていない天然型であるR-メバロノラクトンであることが明らかである。
【０１１１】
【表２】
2005269982.tif 000003
【０１１２】
〔実施例３〕メバロン酸生産菌ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）35AS-3株による標識されたR-メバロン酸発酵
下記段落〔０１１３〕〜〔０１５８〕に従って得た形質転換株Streptomyces lividans 35AS-3株（尚、該菌株は特願２００３−３１１３８号明細書に記載されているものである）を、チオストレプトン5μｇ／ｍｌを含むSK-II液体培地 （可溶性でんぷん２％、グルコース０．５％、酵母エキス０．５％、BactoTM  Peptone ０．３％、肉エキス０．３％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．０２％、ＭｇＳＯ4 ０．００６％） 10 mlに１白金耳植菌し、振とう培養器で30℃、120 rpmで2日間培養を行った。得られた培養液を各1 mlずつ、チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含むKG液体培地 (グルコース２％、可溶性でんぷん２．５％、大豆粉１．５％、ドライイースト０．２％、炭酸カルシウム０．４％、pH 6.2) 50 mlを入れたバッフル付き三角フラスコに分注し、さらに2日間培養を継続した。得られた培養液を3500 rpmで10分遠心分離を行い、菌体約2.5 ｍｌを得た。得られた菌体を、リン酸カリウム緩衝液（pH  6.5）20mlを加えて菌体を良く懸濁し、再び同様の条件で遠心分離を行い、上清を除いた(菌体洗浄工程)。菌体の洗浄は2回繰り返した。
得られた菌体を、チオストレプトン５μｇ／ｍｌ、イーストエキス0.1%、ＫＨ2ＰＯ4 ０．０２％、ＭｇＳＯ4 ０．００６％及びＤ-グルコース-U-13C6 5%を含有する培地20ｍｌを用いて、振とう培養器で30℃、120 rpmで7日間培養した。
培養終了後、この培養液から、実施例１−３と同様の方法でメバロノラクトンを精製し、全ての炭素原子が13Cで標識されたR-メバロノラクトンであることを確認した。
【０１１３】
以下に説明する形質転換株Streptomyces lividans 35AS-3株の作成における遺伝子組換え実験は、特に言及しない限り、モレキュラークローニング 第二版に記載の方法（以下、常法と呼ぶ）を用いて行った。
（１）放線菌ストレプトマイセス  sp. CL190株からのアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子のクローニング
Streptomyces sp. CL190株を1白金耳、１００ｍｌのKG液体培地（グルコース２％、可溶性でんぷん２．５％、大豆粉１．５％、ドライイースト０．２％、炭酸カルシウム０．４％、pH 6.2）に植菌し、３０℃で３日間培養した。
該菌体より、常法に従い染色体ＤＮＡを単離・精製した。
【０１１４】
配列番号2の塩基配列と配列番号3の塩基配列との組合せを有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを、ＤＮＡ合成機を用いて合成した。尚、配列番号2の塩基配列において、４番目の塩基から９番目の塩基までの部位「gaattcc」はEcoRI切断部位を示し、sはg又はcを、hはa、c又はtを、rはa又はgを示す。配列番号3の塩基配列において、４番目の塩基から９番目の塩基までの部位「aagctt」はHindIII切断部位を示し、sはg又はcを、vはa、c又はgを示す。
染色体ＤＮＡを鋳型として、これらプライマーと、TaKaRa LA-PCR(登録商標) Kit Ver.2(宝酒造社製)、Expand(登録商標) High-Fidelity PCR System(ロシュ社製)又はTaq DNA polymerase（Promega社製）を用い、ＤＮＡ増幅装置 (MJ Research社製)でＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。
ＰＣＲ終了後、該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約８００ｂpのDＮＡ断片を取得した。
【０１１５】
上記で取得したＤＮＡ断片をpGEM-T Easyベクター（Promega社製）と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli（東洋紡より購入）DH5α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃にて１６時間振盪培養した。
【０１１６】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドの塩基配列を決定することにより、目的のアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子の一部分を含むＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認し、本プラスミドをpAAS-PCR1と命名した。
【０１１７】
pAAS-PCR1をEcoRIとHindIII消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約0.8kbのＤＮＡ断片を取得した。本断片をプローブに用い、常法により、Streptomyces sp. CL190株染色体ＤＮＡとのサザンハイブリダイゼーションを行った結果、約3.0 kbのBamHI断片とハイブリダイズした。
【０１１８】
Streptomyces sp. CL190株染色体ＤＮＡをBamHI消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約3.0kbのＤＮＡ断片を取得した。
上記で取得された約3.0kbのBamHI処理ＤＮＡ断片を、BamHI処理pUC118（寶酒造より購入）断片と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
【０１１９】
該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli（東洋紡より購入）DH5α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニーを、常法によりナイロンメンブレンフィルターに移植し、上記pAAS-PCR1をEcoRIとHindIII消化後、アガロースゲル電気泳動により精製した約0.8kbのアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子の一部分を含むＤＮＡ断片をプローブに用いて、常法によりコロニー・ハイブリダイゼーションを行った。
該方法により同定した、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入されたpUC118を保持する形質転換体のコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃にて１６時間振盪培養した。
【０１２０】
培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
配列番号1記載の塩基配列2949 bpを有するＤＮＡをpAAS2と命名した。
【０１２１】
（２）Streptomyces sp. CL190株由来のHMG CoA 合成酵素遺伝子及びHMG CoA還元酵素遺伝子、並びにこれらの遺伝子の上流域の塩基配列を含むStreptomyces属の形質転換用プラスミドpSEMV34の構築
1-1) 大腸菌と放線菌で複製可能なシャトルベクターpSE101の構築：
pUC19（宝酒造）を制限酵素AatIIで消化後、BglIIリンカー（宝酒造）をライゲーションし、AatIIサイトをBglIIサイトに変えたプラスミドベクターpUC19Bを作成した。
pUC19Bを、制限酵素BglII及びKpnIで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、BglII-KpnI処理pUC19B断片を取得した。
放線菌用ベクターpIJ702 （John Innes Institute）を、制限酵素BglII及びKpnIで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、BglII-KpnI処理pIJ702断片を取得した。
【０１２２】
上記で取得されたBglII-KpnI処理pUC19B断片とBglII-KpnI処理pIJ702断片とを混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli（東洋紡より購入）DH5α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃にて１６時間振盪培養した。
【０１２３】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
得られたプラスミドは、大腸菌と放線菌の両方で複製可能なシャトルベクターであり、pSE101と命名した。
【０１２４】
1-2) Streptomyces sp. CL190株由来のメバロン酸経路遺伝子クラスター及び該クラスターの上流のプロモーター領域を含むpUMV33の構築：
特開2001-161370号公報記載のpUMV19は、Streptomyces sp. CL190株由来のメバロン酸経路遺伝子クラスターを含むプラスミドであり、HMG CoA 合成酵素遺伝子及びHMG CoA還元酵素遺伝子を含む（PCT/JP00/08620、放線菌由来のメバロン酸経路に関与する酵素の遺伝子）。pUMV19にクローニングされている6798 bpからなるDNA断片の塩基配列を配列番号4に記す。
【０１２５】
Streptomyces sp. CL190株を1白金耳、１００ｍｌのKG液体培地（グルコース２％、可溶性でんぷん２．５％、大豆粉１．５％、ドライイースト０．２％、炭酸カルシウム０．４％、pH 6.2）に植菌し、３０℃で３日間培養した。
該菌体より、常法に従い染色体ＤＮＡを単離・精製した。
【０１２６】
配列番号5の塩基配列と配列番号6の塩基配列との組合せを有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを、ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
染色体ＤＮＡを鋳型として、これらプライマーと、TaKaRa LA-PC R (登録商標) Kit Ver.2(宝酒造社製)、Expand(登録商標) High-Fidelity PCR System(ロシュ社製)又はTaq DNA polymerase（Promega社製）を用い、ＤＮＡ増幅装置 (MJ Research社製)でＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、６０℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。
【０１２７】
ＰＣＲ終了後、該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約２．３ｋｂのEcoRIサイトを両端に持つＤＮＡ断片を取得した。
上記で取得したＤＮＡ断片をpGEM-T Easyベクター（Promega社製）と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli（東洋紡より購入）DH5α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃１６時間振盪培養した。
【０１２８】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
配列番号7記載の塩基配列2370 bpを有するＤＮＡをｐＣＬ３３０１６と命名した。
【０１２９】
ｐＣＬ３３０１６をEcoRI消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約2.3 kbのEcoRI処理ＤＮＡ断片を取得した。
pUMV19を、制限酵素EcoRIで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、EcoRI処理pUMV19断片を取得した。
【０１３０】
上記で取得された約2.3 kbのEcoRI処理ＤＮＡ断片をEcoRI処理pUMV19断片と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli（東洋紡より購入）DH5α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃１６時間振盪培養した。
【０１３１】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
配列番号8記載の塩基配列8719 bpを有するＤＮＡをｐＵＭＶ３３と命名した。
【０１３２】
1-3) Streptomyces sp. CL190株由来のHMG CoA還元酵素遺伝子、HMG CoA合成酵素遺伝子及び異なる塩基長のプロモーター領域を含むpUMV34とpUMV35の構築：
pUMV33を制限酵素Aor51HIで完全消化後、引き続き、制限酵素SnaBIで部分消化し、約7.5 ｋｂと約6.4 ｋbのDNAを回収した。得られたＤＮＡ断片それぞれを５μｌの蒸留水に溶解し、それぞれセルフライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
【０１３３】
それぞれの該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli（東洋紡より購入）DH5α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたそれぞれのアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個ずつについて、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃にて１６時間振盪培養した。
【０１３４】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
配列番号9記載の塩基配列を有するＤＮＡをｐＵＭＶ３４と命名した。
配列番号10記載の塩基配列を有するＤＮＡをｐＵＭＶ３５と命名した。
【０１３５】
1-4) pBMV34の構築(両端に制限酵素サイトを付与するためブルースクリプトへのベクター交換)：
ｐＵＭＶ３４を制限酵素EcoRIとHindIIIで消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約3.2 kbのEcoRI-HindIII処理ｐＵＭＶ３４を取得した。
pBluescript II SK(+)（Stratagene社製）を、制限酵素EcoRIとHindIIIで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、EcoRI-HindIII処理pBluescript II SK(+)断片を取得した。
【０１３６】
上記で取得された約3.2 kbのEcoRI-HindIII処理ｐＵＭＶ３４をEcoRI-HindIII処理pBluescript II SK(+)と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli（東洋紡より購入）DH5α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃にて１６時間振盪培養した。
【０１３７】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
得られたプラスミドをｐＢＭＶ３４と命名した。
【０１３８】
1-5) 放線菌発現プラスミドpSEMV34 (プロモーター領域0.8 kbを含む)の構築：
ｐＢＭＶ３４を制限酵素XbaIとHindIIIで消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約3.2 kbのXbaI-HindIII処理ｐＢＭＶ３４を取得した。
ｐSE101を、制限酵素XbaIとHindIIIで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、XbaI-HindIII処理ｐSE101断片を取得した。
【０１３９】
上記で取得された約3.2 kbのXbaI-HindIII処理ｐＢＭＶ３４をXbaI-HindIII処理ｐSE101と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli（東洋紡より購入）DH5α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃にて１６時間振盪培養した。
【０１４０】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
得られたプラスミドをｐＳＥＭＶ３４と命名した。
【０１４１】
（３）プラスミドpSEMV34 による放線菌Streptomyces lividans TK23株の形質転換
プラスミドpSEMV34 による、放線菌S. lividans TK23株の形質転換は、Practical  Streptomyces  Genetics (ISBN 0-7084-0623-8、Tobias Kieser他、the John Innes Foundation社)に記載の方法を用いて行った。
【０１４２】
得られた形質転換体のコロニー数個について、チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌのSK-II液体培地（可溶性でんぷん２％、グルコース０．５％、酵母エキス０．５％、BactoTM  Peptone ０．３％、肉エキス０．３％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．０２％、ＭｇＳＯ4 ０．００６％）で３０℃、３日間振盪培養した。
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
上記で得られたS. lividans TK23株の形質転換体の一株をS. lividans 34-1株と命名した。この菌株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号「FERM  Ｐ−１９１２０」として寄託されている。
【０１４３】
（４）Streptomyces sp. CL190株由来のHMG CoA 合成酵素遺伝子及びHMG CoA還元酵素遺伝子、及び、これらの遺伝子の上流域の塩基配列を含むStreptomyces属の形質転換用プラスミドベクター(pSEMV35)の構築
3-1) pBMV35の構築(両端に制限酵素サイトを付与するためブルースクリプトへのベクター交換)：
ｐＵＭＶ３５を制限酵素EcoRIとHindIIIで消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約4.3 kbのEcoRI-HindIII処理ｐＵＭＶ３５を取得した。
pBluescript II SK(+)（Stratagene社製）を、制限酵素EcoRIとHindIIIで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、EcoRI-HindIII処理pBluescript II SK(+)断片を取得した。
【０１４４】
上記で取得された約4.3 kbのEcoRI-HindIII処理ｐＵＭＶ３５をEcoRI-HindIII処理pBluescript II SK(+)と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli（東洋紡より購入）DH5α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃にて１６時間振盪培養した。
【０１４５】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
得られたプラスミドをｐＢＭＶ３５と命名した。
【０１４６】
3-2) 放線菌発現プラスミドpSEMV35の構築 (プロモーター領域1.9 kbを含む)：
ｐＢＭＶ３５をE制限酵素XbaIとHindIIIで消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約4.3 kbのXbaI-HindIII処理ｐＢＭＶ３５を取得した。
ｐSE101を、制限酵素XbaIとHindIIIで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、XbaI-HindIII処理ｐSE101断片を取得した。
【０１４７】
上記で取得された約4.3 kbのXbaI-HindIII処理ｐＢＭＶ３５をXbaI-HindIII処理ｐSE101と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli（東洋紡より購入）DH5α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃にて１６時間振盪培養した。
【０１４８】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
得られたプラスミドをｐＳＥＭＶ３５と命名した。
【０１４９】
（５）プラスミドベクター pSEMV35 による放線菌S. lividans TK23株の形質転換
プラスミドpSEMV35 による、放線菌S. lividans TK23株の形質転換は、Practical Streptomyces Genetics (ISBN 0-7084-0623-8、Tobias Kieser他、the John Innes Foundation社) に記載の方法を用いて行った。
【０１５０】
得られた形質転換体のコロニー数個について、チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌのSK-II液体培地で３０℃、３日間振盪培養した。
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
上記で得られたS. lividans TK23株の形質転換体の一株をS. lividans 35-6株と命名した。この菌株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号「FERM  Ｐ−１９１２２」として寄託されている。
【０１５１】
（６）Streptomyces   sp. CL190株由来のアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子、HMG CoA 合成酵素遺伝子及びHMG CoA還元酵素遺伝子、及び、これらの遺伝子の上流域の塩基配列を含むStreptomyces属の形質転換用プラスミドpSEMV34ASの構築と、pSEMV34ASによる放線菌S. lividans TK23株の形質転換
配列番号11の塩基配列と配列番号12の塩基配列との組合せを有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを、ＤＮＡ合成機を用いて合成した。尚、配列番号11の塩基配列において、5番目の塩基から10番目の塩基までの部位「tctaga」は、Xba I切断部位を示し、配列番号12の塩基配列において、4番目の塩基から9番目の塩基までの部位「gaattc」は、EcoRI切断部位を示す。
前記（１）で取得したpAAS2を鋳型として、これらプライマーと、TaKaRa LA-PCR(登録商標) Kit Ver.2(宝酒造社製)、Expand(登録商標) High-Fidelity PCR System(ロシュ社製)又はTaq DNA polymerase（Promega社製）を用い、ＤＮＡ増幅装置 (MJ Research社製)でＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、 ６０℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。
ＰＣＲ終了後、該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約１．３ｂpのXbaIサイトとEcoRIサイトを両端に持つＤＮＡ断片を取得した。
【０１５２】
上記で取得したＤＮＡ断片を、XbaIとEcoRIで切断した pUC118ベクター（寶酒造社製）と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli（東洋紡より購入）DH5α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃にて１６時間振盪培養した。
【０１５３】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドの塩基配列を決定することにより、目的のアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
配列番号13の塩基配列1308 bpを有するＤＮＡをpAAS3と命名した。
【０１５４】
（７）Streptomyces   sp. CL190株由来のアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子、HMG CoA 合成酵素遺伝子及びHMG CoA還元酵素遺伝子、並びにこれらの遺伝子の上流域の塩基配列を含むStreptomyces属の形質転換用プラスミドpSEMV35ASの構築と、pSEMV35ASによる放線菌S. lividans TK23株の形質転換
前記（５）で取得したpAAS3をXbaIとEcoRI消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約1.3kbのＤＮＡ断片を取得した。
前記（４）で構築したpSEMV35を、制限酵素XbaIとEcoRIで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、XbaIとEcoRI処理しＤＮＡ断片を取得した。
上記で取得した1.3kb及びpSEMV35由来の２つのＤＮＡ断片を混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
【０１５５】
該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli（東洋紡より購入）DH5α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃１６時間振盪培養した。
【０１５６】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
得られたプラスミドをpSEMV35ASと命名した。
【０１５７】
プラスミドpSEMV35ASによる、放線菌S. lividans TK23株の形質転換は、Practical Streptomyces Genetics (ISBN 0-7084-0623-8、Tobias Kieser他、the John Innes Foundation社) に記載の方法を用いて行った。
得られた形質転換体のコロニー数個について、チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌのSK-II液体培地で３０℃、３日間振盪培養した。
【０１５８】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
上記で得られたS. lividans TK23株の形質転換体のうちの１株をS. lividans 35AS-3株と命名した。
【０１５９】
〔実施例４、５〕13Cで標識された酢酸及びグリセロールからメバロン酸への取込み
実施例１−２で使用した、Ｄ-グルコース-U-13C6の代わりに、酢酸-U-13C2(実施例４)又はグリセロール-U-13C3(実施例５)を使用する以外は、実施例１−１〜１−３と同様にして、精製メバロノラクトンを得た。これらのメバロノラクトンをGC-MSにより質量分析したところ、分子イオン(M+)である136を検出し、実施例４及び実施例５で得られたメバロノラクトンはいずれも、全ての炭素原子が13Cで標識されたR-メバロノラクトンであることを確認した。
【０１６０】
〔実施例６〕Dで標識された酢酸からメバロン酸への取込み
実施例４で使用した、酢酸-U-13C2の代わりに、CD3COOHを使用する以外は、実施例４と同様に行い、精製メバロノラクトンを得た。このメバロノラクトンをGC-MSにより質量分析したところ、分子イオン(M+)は137を検出した。得られたメバロノラクトンは2位のメチレン水素、3-メチル基の水素、及び4位のメチレン水素の７か所がDで標識されたR-メバロノラクトンであることを確認した。
【０１６１】
〔実施例７〕13Cで標識されたD-グルコースからメバロン酸への取込み
ポテト・シュークロース寒天培地に保管しているS. fibuligera ADK8107株 (FERM BP-2320)を、Ｄ-グルコースをＤ-グルコース-U-13C6に変更する以外は実施例１−１で用いた培養液と同様の組成の滅菌済み培養液20 mlに１白金耳接種し、回転式培養機を用いて26℃、200rpmで7日間培養を行った。得られた培養液から、実施例１−３と同様にしてR-メバロノラクトンを精製した。得られたR-メバロノラクトンをGC-MSで質量分析したところ、分子イオン(M+)である136を検出し、全ての炭素原子が13Cで標識されたR-メバロノラクトンであることを確認した。
【配列表】
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