(57)【要約】【課題】  効率的な弱毒ウイルス候補株の選抜を可能にする植物弱毒ウイルスの分離方法を提供する。【解決手段】  植物ウイルスに低温処理や高温処理などの変異化処理を施し、変異化処理した植物ウイルスを植物に接種して黄色部と緑色部からなるモザイク葉を発生させ、その緑色部から植物ウイルスを得ることにより弱毒ウイルスを分離する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある植物に対する弱毒ウイルスを含む植物ウイルスを、その植物に接種して黄色部と緑色部からなるモザイク葉を発生させ、その緑色部から植物ウイルスを得ることにより前記弱毒ウイルスを分離することを特徴とする弱毒植物ウイルスの分離方法。
【請求項２】
植物ウイルスに変異化処理を施し、変異化処理した植物ウイルスを植物に接種して黄色部と緑色部からなるモザイク葉を発生させ、その緑色部から植物ウイルスを得ることにより弱毒ウイルスを分離することを特徴とする弱毒植物ウイルスの分離方法。
【請求項３】
ある植物に対する強毒ウイルスに前記変異化処理を施すことを特徴とする請求項２記載の弱毒植物ウイルスの分離方法。
【請求項４】
強毒ウイルスに感染した植物を低温処理又は高温処理することによって前記変異化処理を施すことを特徴とする請求項３記載の弱毒植物ウイルスの分離方法。
【請求項５】
前記モザイク葉が奇形のないモザイク葉であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の弱毒植物ウイルスの分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ある植物に対して病原性の弱い植物ウイルス（以下、弱毒ウイルスまたは弱毒株という。）を分離する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物ウイルスが感染した植物体に、その近縁のウイルスが感染できない現象を干渉効果という。多くの農作物で被害を与えているウイルス病に対する最も有効な防除法は、弱毒ウイルスをあらかじめ感染させることによる干渉効果の利用である。
【０００３】
従来、弱毒ウイルスを分離ないし選抜する方法として、病原性の強いウイルス（以下、強毒ウイルスまたは強毒株という。）に変異化処理を行って、病徴の軽減されたウイルスを分離する方法がある。しかし、この方法では、変異化処理後の弱毒ウイルスの分離にあたって、局部病斑を形成する植物を用い、接種後に現れるそれぞれの病斑を１つずつ切り取って接種する単病斑分離法と、その後の病徴観察による選抜のために、大量の植物個体への接種を数回繰り返さなければならない（下記非特許文献１参照）。よって、従来の弱毒ウイルスの分離方法は、偶然性によるところが非常に大きく、多くの労力と長時間を要しているのが実情であり、研究者がそれぞれに試行錯誤を繰り返して弱毒ウイルスの候補株を選抜している状況にある。このように弱毒ウイルスの作製においては、世界的に見ても、決め手になる手法はいまだ確立されていない。
【０００４】
ところで、植物ウイルスは、植物体に感染すると、葉の奇形、壊死、黄化、葉脈の透過、植物体のわい化等さまざまな病徴を現すが、植物ウイルスの多くは、モザイク症状と呼ばれる感染葉に黄色部と緑色部が寄木細工のような斑紋を現す。モザイク症状を現す葉（以下、モザイク葉という。）の黄色部では、葉の厚みが薄く、柵状細胞が健全葉のものに比べ小さく、葉緑体、ミトコンドリア等の細胞内小器官の形態異常も見られる。一方、緑色部は、形態的には健全葉とほとんど違いはない（Y. Hondaら、”Electron Microscopy of Cucumber Mosaic Virus-Infected Tobacco Leaves Showing Mosaic Symptoms”、1974年、Phytopathology Vol. 64、p534-539）。
【０００５】
ここで、黄色部とは、通常黄色ないし黄緑色を呈し、健全な葉よりも緑色が薄い部分をいい、また、緑色部とは、一般にモザイク葉において濃緑色部とも言われている部分のことであり、上記黄色部よりも緑色が濃い部分をいう（本発明において用いる「黄色部」及び「緑色部」についても同様）。
【０００６】
上記緑色部の性質についてはこれまで様々な報告がなされており、例えば、タバコモザイクウイルスに感染したタバコのモザイク葉において、その緑色部は黄色部に比べてウイルス濃度が極端に低いことが報告されている（下記非特許文献２参照）。また、緑色部は、すでに感染しているウイルスと同種のウイルスの感染に対して抑制効果を示し、干渉効果と類似の現象を現すことが明らかとなっている（下記非特許文献２，３参照）。そして、この現象は、先に感染したウイルスと相同塩基配列を持つウイルスの遺伝子を分解するジーンサイレンシング現象によるものと考えられている（下記非特許文献４，５参照）。その一方で、モザイク葉からは、様々な病徴を示す分離株が得られているものの、緑色部から特定の特徴を示す分離株が得られることはないとされており（下記非特許文献６参照）、ましてや、緑色部に弱毒ウイルスが存在することの証拠は全くないとされている（下記非特許文献７参照）。
【非特許文献１】後藤忠則、「弱毒ウイルスの作出法と選抜法」、バイオ農薬・生育調節剤  開発利用マニュアル、1987年、株式会社エル・アイ・シー、p.339-347
【非特許文献２】Robert W. Fulton、”Superinfection by Strains of Tobacco Mosaic Virus”、1951年、Phytopathology, Vol.41, p579-592
【非特許文献３】P. H. Atkinsonら、”On the Origin of Dark Green Tissue in Tobacco Leaves Infected with Tobacco Mosaic Virus”、1970年、Virology, 40, p.344-356
【非特許文献４】Carolyn J. Mooreら、”Dark Green Islands in Plant Virus Infection are the Result of Posttranscriptional Gene Silencing”、2001年、MPMI, Vol.14, No.8, p.939-946
【非特許文献５】Frank G. Raticliffら、”Gene Silencing without DNA: RNA-Mediated Cross-Protection between Viruses”、1999年、Plant Cell, Vol.11, p.1207-1215
【非特許文献６】J. P. Chalcroftら、”Role of Virus Strains and Leaf Ontogeny in the Production of Mosaic Patterns by Turnip Yellow Mosaic Virus”、1967年、Virology, 33, p.659-673
【非特許文献７】Roger Hull、Matthews’ Plant Virology 4th、2002年、p.432-461
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のジーンサイレンシングは、ウイルス感染が一因となって起こる一般的な現象であるが、その一方で、植物ウイルスの多くは、ジーンサイレンシングを抑制するタンパク質を持っている。しかし、病原力が低下した弱毒ウイルスには、その機能が減少したものが多い（飯  哲夫、「ジーンサイレンシングとサプレッサー」、2003年、化学と生物、Vol.41, No.6, p.390-397）。従って、弱毒ウイルスの多くは、ジーンサイレンシングを抑制する能力が低いといえる。
【０００８】
そこで、弱毒ウイルスの分離方法に用いる材料として、今まで全く注目されていなかったモザイク葉の緑色部に注目した。上記のように、モザイク葉からは、さまざまな病徴を示す分離株が得られるが、特定の特徴を示す分離株が得られることはないとされている。一方で、モザイク葉は、葉が形成される初期段階の葉原基と呼ばれる時期において、すでに黄色部と緑色部の分布が決定されていると考えられている。また、緑色部では、ウイルスは低濃度ながら存在しているにもかかわらず、ジーンサイレンシング現象は抑制されておらず、しかも時間が経過してもウイルスは増殖してこないことから、植物ウイルス感染モザイク葉の緑色部においては、ジーンサイレンシングを抑制できる強毒ウイルスよりも、その抑制能が減少した弱毒ウイルスの方が高い比率で存在すると考えられる。
【０００９】
本発明は、以上に鑑みてなされたものであり、植物ウイルスが感染したモザイク葉の緑色部から弱毒ウイルスを分離することで、効率的な弱毒ウイルス候補株の選抜を可能にする植物弱毒ウイルスの分離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、弱毒ウイルスの迅速な作製、分離を図るべく鋭意研究を重ねた結果、対象とするウイルスが感染した植物体を低温や高温で一定期間処理した後、これらを直接に又は単一病斑分離法によって植物体に接種すると、奇形がほとんどなく明瞭な緑色部が残るモザイク葉が現れ、そして、この緑色部からウイルスを分離すると、病原性の弱い弱毒ウイルスが高い頻度で現れることを見出した。
【００１１】
本発明は、この知見に基づきなされたものであり、第１に、ある植物に対する弱毒ウイルスを含む植物ウイルスを、その植物に接種して黄色部と緑色部からなるモザイク葉を発生させ、その緑色部から植物ウイルスを得ることより前記弱毒ウイルスを分離することを特徴とする弱毒植物ウイルスの分離方法に係るものである。
【００１２】
また、本発明は、第２に、植物ウイルスに変異化処理を施し、変異化処理した植物ウイルスを植物に接種して黄色部と緑色部からなるモザイク葉を発生させ、その緑色部から植物ウイルスを得ることにより弱毒ウイルスを分離することを特徴とする弱毒植物ウイルスの分離方法に係るものである。
【００１３】
上記第２の発明においては、ある植物に対する強毒ウイルスに前記変異化処理を施してもよい。また、その場合、強毒ウイルスに感染した植物を低温処理又は高温処理することによって前記変異化処理を施してもよい。
【００１４】
また、本発明においては、前記モザイク葉が奇形のないモザイク葉であってもよい。
【発明の効果】
【００１５】
上記のように従来の方法で弱毒ウイルスを分離するためには、変異化処理後、単一病斑分離法と大量の植物体への接種、その病徴観察を数回繰り返す必要があり、弱毒ウイルスの作製に長い期間と労力が必要であり、このことが弱毒ウイルスの開発と実用化を妨げている一因でもあった。これに対して、本発明の分離方法によれば、単一病斑分離と大量接種の回数を大幅に減らすことが可能になり、また特別な装置を使用することなく実施できるので、誰にでも簡便に、かつ迅速に弱毒ウイルスを分離することができる。
【００１６】
また、モザイク症状を現す植物ウイルスと植物の組み合わせであれば本発明の方法を適応できるため、多くのウイルス病防除に利用可能な弱毒ウイルスの作製に対応できる。
【００１７】
よって、本発明は弱毒ウイルスの普及を広め、ウイルス病の被害軽減による収量の増加、品質の向上、および農薬使用の軽減による環境保全型農業への貢献が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の実施形態に係る弱毒植物ウイルスの分離方法は、ある植物に対する弱毒ウイルスを含む植物ウイルスを、その植物に接種して黄色部と緑色部からなるモザイク葉を発生させ、その緑色部から植物ウイルスを抽出、即ち分離することによるものである。後述する実施例に示されるように、弱毒株を含む植物ウイルスを植物体に接種してモザイク葉を発生させると、弱毒株はその緑色部に高い確率で存在している。そのため、この緑色部から植物ウイルスを分離することにより、効率的に弱毒ウイルス候補株を得ることができ、大量の植物個体を扱う病徴選抜の回数が極端に少なくなり、従来要していた労力と時間を大幅に削減することができる。この場合、植物ウイルスの接種源に弱毒ウイルスが含まれていることが重要であり、強毒ウイルスのみからなる場合には、後記実施例に示されるように、緑色部から弱毒ウイルスは得られない。従来緑色部に弱毒ウイルスが存在しないと結論づけられていた理由は、そもそも弱毒ウイルスを含まないものを植物体に接種していたためではないかと推察される。
【００１９】
接種源とする上記植物ウイルスとしては、通常は対象となる植物に対する弱毒株と強毒株が混在する植物ウイルスの混合物が用いられるが、これに限られず、例えば、強毒株には至らない中間的な病徴を示す株と、弱毒株との混合物であってもよい。
【００２０】
弱毒株と強毒株が混在する植物ウイルスの混合物としては、自然界に存在していたものをそのまま使用することもできるが、より好ましくは、植物ウイルス（特に強毒ウイルス）に変異化処理を施したものを使用することである。変異化処理を施すことにより弱毒ウイルスを発生させることができるため、自然界のものをそのまま使用する場合よりも、弱毒ウイルスを含むウイルス混合物を効率的に得られる場合が多い。
【００２１】
変異化処理としては、弱毒ウイルスを発生させることができる方法であれば、特に限定されず、既存あるいは今後開発されるすべての方法が利用できる。例えば、植物ウイルスを接種した植物体を一定期間低温下あるいは高温下で生育させる低温処理や高温処理、植物ウイルス自体に対する紫外線処理や、亜硝酸処理などの薬品処理などが挙げられる。
【００２２】
変異化処理した後、その植物ウイルスはそのまま直接、対象とする植物体に接種してもよいが、好ましくは、ケノポディウム・キノア（Chenopodium quinoa）などを用いた単一病斑分離法によって分離した後、対象とする植物体に接種することである。単一病斑分離により、接種する植物ウイルス中に存在する弱毒株の比率を高めることができ、後述する奇形のない緑色斑点を伴うモザイク葉を持つ個体が得やすくなる。また緑色部における弱毒株の存在比率を高めて、緑色部からの一層効率的な弱毒ウイルスの分離が可能となる。
【００２３】
上記植物ウイルスの植物体への接種方法としては、特に限定されず、植物体の磨砕汁液などの植物ウイルスを含むウイルス液を、対象とする植物体に接触させることによる方法や、植物ウイルス伝搬昆虫に吸汁させてその昆虫によって接種する方法など、公知の種々の接種法を採用することができる。
【００２４】
上記植物ウイルスを接種することにより発生させるモザイク葉は、黄色部と緑色部とからなるものであればその模様の形態は特に限定されないが、緑色部が斑点状になっているものが好ましい。また、このモザイク葉は、奇形を伴うものであってもよいが、好ましくは奇形のない（但し、わずかに奇形しているものも含む。）モザイク葉を形成したものを用いることであり、より好ましくは、奇形のない緑色斑点を伴うモザイク葉を形成するものを用いることである。このように奇形のないモザイク葉を発生させることにより、緑色部における弱毒ウイルスの存在比率を高めて、緑色部からの一層効率的な弱毒ウイルスの分離が可能となる。
【００２５】
上記緑色部から植物ウイルスを分離するには、例えば、モザイク葉から緑色部を切り取り、これを接種源としてその磨砕汁液を植物体に接種する方法が挙げられる。また、例えば、緑色部を植物ウイルス伝搬昆虫に吸汁させた後、その昆虫によって接種することも可能であり、これにより、汁液接種で感染しない植物ウイルスに対しても適応できる。このようにすることで、植物ウイルスを低温や高温による処理、あるいはその他の変異化処理を施した後に現れるモザイク葉の緑色部から、弱毒ウイルスを効率的に分離することができる。
【００２６】
本発明の分離方法において対象とする植物ウイルスは、感染植物に黄色部と緑色部からなるモザイク症状を示す植物ウイルスであれば、特に限定なく適用可能である。また、対象となる得る植物は、上記したモザイク症状を示す植物ウイルスが感染するすべての作物であり、特に限定されない。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）
キュウリモザイクウイルスの強毒株（Pepo）と弱毒株（R46C）を混合してタバコに接種した後、３週間目の上位葉に現れるモザイク葉の黄色部と緑色部を切り分け、それぞれの磨砕汁液をタバコに接種した。強毒株（Pepo）単独のものについても同様にしてモザイク葉を得て、黄色部と緑色部の各磨砕汁液をタバコに接種した。各磨砕汁液のタバコへの供試個体数は、強毒株（Pepo）単独の緑色部について５０個体としたほかは、全て２０個体とした。
【００２９】
接種後１４日目の病徴を観察したところ、下記表１に示すように、強毒株（Pepo）のみを接種したタバコのモザイク葉の緑色部からは、弱毒株はまったく得られなかった。これに対し、強毒株（Pepo）と弱毒株（R46C）を混合して接種したモザイク葉の緑色部からは、弱毒株が高率で得られ、強毒株は得られなかった。なお、強毒株（Pepo）と弱毒株（R46C）を識別できる遺伝子診断手法（RT-PCR-RFLP）によって、病徴のタイプと弱毒株あるいは強毒株の存在が一致していることを確認した。
【表１】
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【００３０】
この結果から、強毒株のみを接種した場合、緑色部には植物ウイルスが存在するものの、それらはいずれも強毒株であり、弱毒株は得られないこと、及び、弱毒株と強毒株が混在したものを接種することにより初めて、その緑色部から高い確率で弱毒株が得られることが確認された。
【００３１】
（実施例２）
本実施例での分離方法の概要は図１に示すとおりであり、即ち、まず、キュウリモザイクウイルスの強毒株（Pepo）をトマトおよびタバコに接種して感染させ、感染により奇形と激しいモザイクを伴うトマトおよびタバコを、それぞれ低温（１５℃）あるいは高温（３６℃）で３０日間処理（生育）した。処理後の各植物体から単一病斑分離法により分離した植物ウイルスをタバコに接種し、接種後１２日目のタバコの病徴を観察した。すると、下記表２に示すように、奇形のほとんどない明瞭な緑色部（濃緑色斑点）が残るモザイク症状を呈する個体が高温処理及び低温処理のそれぞれについて現れた。このようにして得られた奇形のないモザイク葉の緑色部（濃緑色斑点）を切り取ってタバコに接種し、接種後１２日目の病徴を観察したところ、下記表３に示すように、軽微な病徴のみを現す弱毒ウイルスを分離できた。すなわち、緑色部を接種することにより、効率よく弱毒株を得ることができた。なお、比較のため、上記強毒株を接種したタバコについて、高温又は低温処理せずに２５℃のままで生育させたものから、同様に単一病斑分離してタバコに接種したが、奇形のないモザイク葉は得られなかった。
【表２】
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【００３２】
【表３】
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【００３３】
（実施例３）
ズッキーニ黄斑モザイクウイルスの弱毒株（2002）と強毒株（Z5-1）の各感染葉を用いて、１０倍量の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）でそれぞれの感染葉を磨砕し、得られた汁液を、下記表４の比率で混合した。混合した汁液をキュウリに感染させ、重複感染したキュウリのモザイク葉から、分離株を表４に示す部位別に採取した。採取した分離株をそれぞれキュウリに接種し、接種後２０日目の病徴を観察した。その結果、表４に示すように、黄色部（黄〜黄緑部）から得られたすべての分離株がZ5-1株の特徴的な激しいモザイク症状と奇形葉を示したのに対し、緑色部（濃緑色部）からは、奇形葉を伴わないモザイク症状を示す中間的な分離株と2002株と同程度の軽微なモザイク症状を示す弱毒株が得られた。この場合、弱毒株（2002）の混合接種比率が低かったことが影響したためか、緑色部から得られた弱毒株の比率は高いものとは言えなかったが、黄色部では弱毒株が全く得られなかったのに対して、緑色部では弱毒株が得られており、そのため、無作為に抽出する従来の手法に比べれば、なお、効率的な弱毒株の分離が可能であることが分かる。
【００３４】
なお、比較のため、弱毒株（2002）のみ又は強毒株（Z5-1）のみをそれぞれキュウリに感染させたモザイク葉についても、同様に部位別に分離株を採取してキュウリに接種した。なお、表４中の感染株数について、感染の有無はＥＬＩＳＡ法で検定した。
【表４】
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【００３５】
表４に示すように、ズッキーニ黄斑モザイクウイルスについても、上記したキュウリモザイクウイルスと同様、強毒株のみを接種した場合、緑色部には植物ウイルスが存在するものの、それらはいずれも強毒株であり、弱毒株は得られないこと、及び、弱毒株と強毒株が混在したものを接種することにより初めて、その緑色部から弱毒株が得られることが確認された。
【００３６】
（特記事項）
本発明は、文部科学省科学技術振興調整費・先導的研究等の推進「植物ワクチン開発とその利用システムの確立」における研究成果によるものである。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明に係る弱毒植物ウイルスの分離方法は、弱毒植物ウイルスを簡便かつ迅速に分離することを可能にするため、ウイルス病防除に利用可能な弱毒ウイルスの普及を広め、ウイルス病の被害軽減による収量の増加、品質の向上、および農薬使用の軽減による環境保全型農業への貢献に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】実施例２の弱毒植物ウイルスの分離方法の流れを示す図である。
【図１】
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