(57)【要約】【課題】  安全性に優れ、新しい作用機作を持つ抗癌剤の提供。【解決手段】  本発明者等は、シュードアレッシェリア属に属する微生物より得られた発酵生産物が、IGF-1依存性の癌細胞の増殖を良好に抑制することを見出した。更に該化合物はその感受性パターンより新規作用機序をもつことが示唆されることから、新しいタイプの抗癌剤、殊に乳癌、大腸癌並びに脳腫瘍等のIGF-1依存性癌の治療剤として有用な化合物である。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式（Ｉ）で示される化合物またはその製薬学的に許容される塩。
【化１】
2005272357.tif 000007
【請求項２】
請求項１に記載される化合物またはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項３】
抗癌剤である請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
IGF-1依存性癌の治療剤である請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
シュードアレッシェリア属に属し、請求項１記載の化合物の産生能を有する微生物を培養し、得られた培養物から請求項１記載の化合物を採取することを特徴とする、請求項１記載の化合物の製造方法。
【請求項６】
シュードアレッシェリア属に属する微生物がシュードアレッシェリア エスピー (Pseudallescheria sp.) QN23319株（FERM P-19742号）及びその変異体である請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
シュードアレッシェリア エスピー (Pseudallescheria sp.) QN23319株（FERM FERM P-19742号号）及び請求項１記載の化合物の産生能を有するその変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は乳癌等のヒト癌細胞の増殖抑制作用を有する新規化合物、及びこれを有効成分とする医薬組成物、殊に抗癌剤に関する。また、該化合物産生能を有する新規菌株、並びに該菌株を用いた該化合物の製造方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の治療は、大きく分けて、外科的手術、抗癌剤による化学療法、放射線療法の３つがある。このうち、外科的手術は初期の癌には有効であるが、転移を伴う場合は効力が限られたものとなってしまうことが多い。また放射線は正常な組織への障害があり、放射線療法をすべての癌に適用することはできない。また多くの抗癌剤は、未だに副作用の問題があり、また初期治療で有効性を示した抗癌剤でも、耐性細胞の出現や再発によって治療に用いることができなくなる場合がある。よって、副作用の少ない、癌細胞選択的な細胞増殖抑制作用を有する新しい抗癌剤が切望されている。
増殖因子の１つであるIGF-1は、プロインスリンと相同性の高いポリペプチドであり、インスリンレセプターと構造的に極めて類似したレセプター型チロシンキナーゼである。その生理作用としては主に細胞増殖の促進とアポトーシスの抑制が報告されている。乳癌や肺癌をはじめとした多くのヒト癌細胞において、IGF-1の分泌促進やIGF-1レセプターの過剰発現が観察されている(Biochem Biophys Res Commun, 274, 845-851, 2000)。また、IGF-1レセプターの中和抗体やアンチセンスオリゴヌクレオチドはin vivoにおいて高い抗腫瘍活性を示すことが報告されている(Nature, 363, 45-45, 1993)。一方、大腸癌ではIGF-1依存的に転移能が亢進することが知られている(Cancer Res, 46, 4613-4619, 1986)。また、癌細胞に特徴的な足場非依存的な増殖もIGF-1によって顕著に増強される(Nature, 363, 45-45, 1993)。このように、IGF-1が発癌に深く関与することを示唆する報告は数多くあり、IGF-1レセプターを介するシグナル伝達を阻害する物質は有用な抗癌剤となりうることが期待されている。
【０００３】
一方、レプトグラフィウム  レンドベルギ（Leptographium lundbergii）株（NRRL12527)の培養物から得られた、下式で示される抗真菌活性を有する抗生物質（JM971-A、B及びC）が報告されている（特許文献１参照）。このうち、JM971-BはR1、R2がそれぞれH,メチルの化合物である。しかし、その立体構造については記載が無い。
【化２】
2005272357.tif 000002
（式中、R1及びR2は同一又は異なって、H又はメチル。）
【０００４】
【特許文献１】ドイツ公開特許第3333553号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
今なお新規の抗癌剤の創製が期待されており、本発明が解決しようとする課題は、安全性に優れ、新しい作用機作を持つ抗癌剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる実情において、本発明者らは、癌細胞に対して選択的に作用する新しい抗癌剤の発見をめざし、IGF-1感受性のヒト乳癌細胞を用いて、IGF-1による細胞の増殖または生存を選択的に抑制する物質を鋭意探索した。その結果、シュードアレッシェリア属に属する微生物より得られた化合物が、IGF-1感受性の乳癌、大腸癌並びに脳腫瘍等の癌細胞の増殖を良好に抑制することを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、下式（Ｉ）で示される化合物（以下、化合物Ｉと略記する）またはその製薬学的に許容される塩、並びに該化合物を有効成分とする医薬組成物、並びに抗癌剤、殊にIGF-1依存性癌の治療剤に関する。
【化３】
2005272357.tif 000003
【０００７】
また、本発明は化合物Iを産生する新規微生物並びに該微生物を用いた化合物Ｉの製造方法にも関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明化合物は、ヒト癌細胞のIGF-1依存的な増殖に対して、良好な抑制活性を有するので、各種の腫瘍、特にIGF-1依存性を有する乳癌、肺癌、大腸癌及び脳腫瘍等の癌の治療剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明につき詳述する。
本発明の化合物Iは、シュードアレッシェリア属に属する当該物質生産菌を栄養培地にて培養し、当該物質を蓄積させた培養物から常法により分離することによって容易に入手することができる。当該物質の製造方法において使用する微生物は、シュードアレッシェリア属に属し当該物質の生産能を有する微生物であればいずれも用いることができる。このような微生物としては、例えば、沖縄県石垣市で採集された土壌より分離されたシュードアレッシェリア属に属する糸状菌シュードアレッシェリア エスピー (Pseudallescheria sp.) QN23319株を挙げることができる。
【００１０】
本菌株の菌学的性状は次の通りである。
１．各種培地における性状
ポテトデキストロース寒天培地、麦芽エキス寒天培地、ツァペック寒天培地で、24℃、2週間培養した場合、発育は速やかでコロニーの大きさは50 mm以上に達する。どの培地においても、コロニー表面は綿毛状で、初め白色、次第に灰褐色となる。裏面は淡黄色からやがて灰褐色となる。気生菌糸中または寒天中に淡褐色〜黒色の子のう殻と分生子を多数形成する。可溶性色素は生成しない。ポテトデキストロース寒天培地で培養した場合、生育温度範囲は15〜40℃であり、最適生育温度は、24〜32℃である。
２．顕微鏡下における特徴
ポテトデキストロース寒天培地に生育した菌株を顕微鏡下で観察した。菌糸は無色で隔壁を有し、表面は平滑で、培地上に有性世代と無性世代を形成する。有性世代では、子のう殻は、球形、直径 120〜200μmで、孔口はなく閉子のう殻となる。子のうは、球形から亜球形で、8個の子のう胞子を生じ、成熟時に消失する。子のう胞子は１細胞性、卵円形、褐色、平滑で、大きさは 7〜8×4〜5μmである。無性世代では、スケドスポリウム (Scedosporium) 様の分生子が認められ、単純な長短の分生子柄に１個または複数個のアネロ型分生子が形成される。分生子は１細胞性、卵円形または楕円形、褐色、平滑、大きさは5〜8×4〜6μmで、基部が裁断状である。
【００１１】
以上の菌学的性状より、本菌株は子のう菌類に属し、子のう胞子などの形態的特徴から不整子のう菌綱のミクロアスカス (Microascus) 科に属すると考えられる。そこで、各種文献 (von Arx, J. A. 1973. The Genera Petriellidium and Pithoascus (Microascaceae). Persoonia 7: 365-375など) より検索したところ、本菌株は子のうや無性世代などの特徴からシュードアレッシェリア属 (Pseudallescheria) の一菌種と判断された。したがって、本菌株をシュードアレッシェリア エスピー (Pseudallescheria) QN23319と呼称することにした。なお、本菌株は産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P-19742号として寄託されている。
【００１２】
培養は一般微生物の培養方法に準じて行われる。
培養に用いられる培地としては、シュードアレッシェリア エスピー (Pseudallescheria) QN23319株等の、本発明化合物生産能を有するシュードアレッシェリア属の微生物が利用する栄養源を含有する培地であればよく、合成培地、半合成培地または天然培地が用いられる。培地に添加する栄養物として公知のものを使用できる。培地の組成は、例えば炭素源としては、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、イノシトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−マンノース、マルトース、トレハロース、デンプン、ブドウ糖、デキストリン、グリセリン、植物油等が挙げられる。窒素源としては肉エキス、ペプトン、グルテンミール、綿実粕、大豆粉、落花生粉、魚粉、コーンスチーブリカー、乾燥酵母、酵母エキス、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿酸その他の有機、無機の窒素源が用いられる。また、金属塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄、コバルトなどの硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、リン酸塩などが必要に応じて添加される。さらに、必要に応じてメチオニン、システイン、シスチン、チオ硫酸塩、オレイン酸メチル、ラード油、シリコン油、界面活性剤などの生成促進物質または消泡剤を添加することもできる。
【００１３】
培養条件としては好気的条件下で培養するのが一般的に有利で、培養温度は１５〜４０℃の範囲、好ましくは２４〜３２℃付近で行われる。培地のｐＨは約５〜９、好ましくは約６〜８の範囲に調整すると好結果が得られる。培養期間は培地の組成、温度条件に応じて適宜設定されるが、通常１〜１０日程度、好ましくは４〜８日程度である。
【００１４】
培養物より目的とする本発明物質を単離するには、微生物が産生する代謝産物に用いる通常の抽出、精製の手段が適宣利用できる。例えば培養物質中の該物質は培養液をそのままか、又は遠心分離あるいは培養物に濾過助剤を加えて濾過して得られた培養液に酢酸エチル等の水と混和しない有機溶剤を加えて抽出する。また、培養液を適宜の坦体に接触させ、濾液中の生産物質を吸着させ、次いで適当な溶媒で溶出することにより該物質を抽出することができる。例えば、アンバーライトＸＡＤ−２、ダイヤイオンＨＰ−２０、ダイヤイオンＣＨＰ−２０、又はダイヤイオンＳＰ−９００のような多孔性吸着樹脂に接触させて該物質を吸着させる。次いでメタノール、エタノール、アセトン、ブタノール、アセトニトリル等の有機溶媒と水の混合液を用いて該物質を溶出させる。このときの有機溶媒の混合比率を段階的に又は連続的に変化させることが有利である。酢酸エチル、クロロホルム等の有機溶媒で抽出する場合には、培養濾液にこれらの溶媒を加え、良く振とうし、該物質を抽出する。次に、上記の各操作法を用いて得た該物質含有画分は、シリカゲル、ＯＤＳ等を用いたカラムクロマトグラフィー、遠心液々分配クロマトグラフィー、ＯＤＳを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の定法により、さらに純粋に分離精製することができる。すなわち、活性を指標として、適当な溶剤に対する溶解性及び溶解度の差等を利用する一般の生理活性物質の製造に用いられる手段によって、分離、精製される。これらの方法は必要に応じて単独に用いられ、又は任意の順序に組合せ、反復して適用できる。
【００１５】
本発明化合物Ｉの製薬学的に許容される塩としては、酸若しくは塩基との製薬学的に許容される塩である。塩基との塩としては、好ましくは、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウムなど無機塩基、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミンなどの有機塩基、又は、リジン、オルニチンなどの塩基性アミノ酸との塩を挙げることができる。酸との塩としては、好ましくは、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸もしくはリン酸等との無機酸、又はギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸若しくはエタンスルホン酸等との酸付加塩が挙げられる。これらの塩は常法の造塩反応を用いて化合物Ｉから入手できる。更に本発明は、化合物Ｉ又はその塩の各種の水和物や溶媒和物及び結晶多形の物質をも包含する。
【００１６】
化合物Ｉを有効成分として含有する医薬組成物は，当分野において通常用いられている薬剤用担体，賦形剤等を用いて通常使用されている方法によって調製することができる。投与は錠剤，丸剤，カプセル剤，顆粒剤，散剤，液剤，吸入剤等による経口投与，又は，静注，筋注等の注射剤，坐剤，点眼剤，眼軟膏，経皮用液剤，軟膏剤，経皮用貼付剤，経粘膜液剤，経粘膜貼付剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。
【００１７】
本発明による経口投与のための固体組成物としては，錠剤，散剤，顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては，一つ又はそれ以上の活性物質が，少なくとも一つの不活性な賦形剤，例えば乳糖，マンニトール，ブドウ糖，ヒドロキシプロピルセルロース，微結晶セルロース，デンプン，ポリビニルピロリドン，メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等と混合される。組成物は，常法に従って，不活性な添加剤，例えば滑沢剤や崩壊剤，溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性コーティング剤で被膜してもよい。
【００１８】
経口投与のための液体組成物は，薬剤的に許容される乳剤，液剤，懸濁剤，シロップ剤，エリキシル剤等を含み，一般的に用いられる不活性な溶剤，例えば精製水，エタノールを含む。この組成物は不活性な溶剤以外に可溶化剤、湿潤剤，懸濁化剤のような補助剤，甘味剤，矯味剤，芳香剤，防腐剤を含有していてもよい。
非経口投与のための注射剤としては，無菌の水性又は非水性の液剤，懸濁剤，乳剤を含有する。水性の溶剤としては，例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水性の溶剤としては，例えばプロピレングリコール，ポリエチレングリコール，オリーブ油のような植物油，エタノールのようなアルコール類，ポリソルベート８０（商品名）等がある。このような組成物は，さらに等張化剤、防腐剤，湿潤剤，乳化剤，分散剤，安定化剤，溶解補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過，殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成物を製造し，使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解、懸濁して使用することもできる。
【００１９】
通常、経口投与の場合、化合物Ｉの１日の投与量は約0.001から100mg/kg、好ましくは0.01〜50mg/kgが適当である。静脈内注射の場合、1日の投与量は約0.0001から50mg/kg、好ましくは、約0.001から20mg/kgが、それぞれ適当であり、これを1日1回乃至複数回に分けて投与することが好ましい。投与頻度、投与量は症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
本発明の医薬組成物は、通常癌治療に用いられる医薬品類と併用することもできる。このような医薬品としては、アドリアマイシン、マイトマイシン、５−フルオロウラシル、イリノテカン、タキソール等の抗癌剤、モルヒネ等の痛み止め成分、ステロイド剤等が挙げられる。またこれらの医薬品類との併用にあたっては、合剤として同一製剤として投与してもよく、あるいは、同一若しくは異なる投与経路で投与される別の製剤として、同時に若しくは別々に投与されてもよい。投与量、投与方法は、個々の医薬品類に応じて適宜選択される。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例にて具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
グルコース3%、コーンスティープリカー1%、乾燥酵母0.5%、ファーマメディア0.5%、大豆粉0.5%、炭酸カルシウム0.2%よりなる培地（滅菌前pH6.5）を100mlずつ500ml容の三角フラスコに分注し、121℃で20分間滅菌した。この培地にポテトデキストロース寒天培地に良く生育させたシュードアレッシェリア エスピー QN23319株をかき取って接種し、24℃、200回転／分の条件で6日間振とう培養し、種培養液とした。次にデキストリン4%、グルコース1%、麦芽エキス0.5%、ポリペプトン0.5%、大豆粉0.5%、酵母エキス0.2%、リン酸水素ニカリウム1%よりなる培地（滅菌前pH6.5）を20本の500ml容の三角フラスコに100mlずつ分注し、121℃で20分間滅菌した。この培地に前記種培養液を2mlずつ接種し、24℃、200回転／分の条件で6日間、振盪培養した。
培養液(2L)を遠心分離して得た菌体にアセトン1Lを加えて活性物質を抽出した。アセトンを濃縮除去し、等量の酢酸エチルを加えて2回抽出した。有機溶媒層を濃縮した後、クロロホルム?メタノール（5 : 1）にてシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、粗精製物を得た。さらに、センシュー科学製PEGASIL-ODSカラム（粒径7μ、内径2 cmラ25 cm）を用いて、0.1% トリフルオロ酢酸を含む65%メタノールにて高速液体クロマトグラフィーを行い、無色粉末の化合物Ｉ（13.5 mg）を得た。
【００２１】
化合物Ｉは下記の物理化学的性状を示した。
色及び形状  ：  無色粉末
融点 ： 123〜127℃
旋光度  [α]D24  ：  -21° (c 0.35, メタノール)
分子式  ：  C21H35NO2
高分解能FABマススペクトル：
Found： 334.2740 (M+H) +
Calcd： 334.2746
紫外吸収スペクトル  ・max nm(・) ： 
MeOH      225 (5,500), 278 (1,100)
0.01 M HCl-MeOH    225 (5,500), 278 (1,100)
0.01 M NaOH-MeOH    227 (4,300), 240 (3,600), 286 (1,100)
赤外吸収スペクトル  νmax(KBr) cm-1：  3200, 1680, 1210, 1140
1H-NMRスペクトル（500Hz、重アセトン中）： 図1の通り
13C-NMRスペクトル（125Hz、重アセトン中）： 図2の通り
以上の結果より、化合物Iは以下の構造を有する化合物であると決定した。
【化４】
2005272357.tif 000004
【００２２】
実施例２
化合物Ｉのヒト乳癌細胞（MCF-7、T47D、MDA-MB-231、HBC-4）、ヒト子宮頸癌細胞（HeLa）、ヒト骨肉腫細胞（Saos-2）、ヒト結腸癌細胞（Colo320DM）に対する増殖抑制効果を以下の方法にて測定した。
なお、MCF-7細胞、HBC-4細胞、HeLa細胞及びSaos-2細胞は10％牛胎児血清(FBS)を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中、37℃、5%CO2存在下で、又、MDA-MB-231細胞及びColo320DM細胞は10％FBSを含むRPMI1640培地中、37℃、5%CO2存在下で培養した。
(1) 5×104cells/mlの細胞を100μlずつ96穴マイクロプレートに播種した。MCF-7細胞には30 ng/mlのIGF-1含有無血清培地を、他の細胞には50 ng/mlのIGF-1含有無血清培地を用い、コントロールとして0.5% FBS含有培地を用いた。
(2) 細胞接着後、希釈試料を添加し、72時間培養した。
(3) 10μlの3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム ブロマイド(MTT, 5 mg/ml)を各ウェルに添加し、さらに2時間培養した。培地を除去し、生成したホルマザンを溶解するためジメチルスルホキシド(DMSO)を100μl加えた。
(4) ORGANON TEKUNIKA製96穴マイクロプレートリーダー（OTリーダー510）にて、検査波長450 nm、対数波長630 nmで比色定量し、吸光度を求めた。相対細胞数は、試料無添加の吸光度を100%として計算した。
(5) それぞれの細胞に対するIC50値は、相対細胞数を片対数グラフ上にプロットし、近似曲線を作成することにより算出した。
【００２３】
結果：  化合物Ｉの各細胞に対するIC50値(ng/ml)を表１に示す。化合物IはMCF-7細胞およびT47D細胞に対して低濃度でIGF-1依存的な増殖を抑制した。これに対して0.5%FBS存在下では全ての細胞において増殖抑制効果は認められず、高濃度で非特異的な細胞毒性が観察された。
【表１】
2005272357.tif 000005
実施例３
実施例２で用いたMCF-7細胞に対する化合物Iの増殖抑制作用を実施例２と同様にMTT法によって調べた。その結果を図３に示す。化合物Iは30 ng/mlのIGF-1存在下で濃度依存的にMCF-7細胞の増殖を抑制し、そのIC50値は9.7 ng/mlであった。一方、化合物Iは無血清培地中でも増殖抑制活性を示したが、0.5%のFBSを含む培地中では増殖阻害はほとんど認められなかった（図３参照）。
以上の結果より、本発明化合物はIGF-1依存性の細胞の増殖または生存を選択的に抑制することが確認され、癌細胞に対して選択的に作用する新しいタイプの抗癌剤になり得ることが示唆された。
実施例４
財団法人癌研究会癌化学療法センターに依頼し、ヒト培養癌細胞パネル（ＨＣＣパネル）によるスクリーニングを実施した。ＨＣＣパネルは、肺癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、脳腫瘍、乳癌、腎癌、前立腺癌、及びメラノーマの系からなる。これらを一つのパネルとして扱い、in vitro薬剤感受性試験を行い、その薬剤に対する感受性パターン(Finger Print)を得、既存の抗癌剤との作用様式を比較できる。
スクリーニングは、癌細胞を９６ウェルプレートにまき込み、翌日検体溶液を添加、２日間培養後、細胞増殖をスルホローダミンＢによる比色定量で測定した。測定結果はコンピューターに入力し、GI50（コントロールに比べ増殖を50％に抑制する濃度(M)）を求めた
結果：下表に記載の癌種において増殖阻害活性が認められた。また、そのFinger Printから、新規作用機作をもつことが示唆された。
【表２】
2005272357.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】化合物Ｉの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図２】化合物Ｉの13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図３】IGF-1含有培地、無血清培地、若しくはFBS含有培地中でのMCF-7細胞に対する化合物Iの増殖抑制作用を示す図である
【図１】
2005272357.tif 000008
【図２】
2005272357.tif 000009
【図３】
2005272357.tif 000010