(57)【要約】【課題】  核酸を含む試料溶液中の核酸を核酸吸着性の多孔膜に吸着させた後、洗浄等を経て脱着させて核酸を分離精製する方法において、効率よく、簡便で、迅速で、自動化適性に優れ、再現性のある核酸を含む試料溶液を得る方法を提供すること。【解決手段】  細胞又はウイルスを含む検体に界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液を添加して検体と核酸可溶化試薬溶液を混合する工程、及び混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程を含む、核酸を含む試料溶液の調製方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞又はウイルスを含む検体に界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液を添加して検体と核酸可溶化試薬溶液を混合する工程、及び混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程を含む、核酸を含む試料溶液の調製方法。
【請求項２】
（ａ）細胞又はウイルスを含む検体を容器に注入する工程、（ｂ）上記容器に、カオトロピック塩、界面活性剤およびタンパク質分解酵素を含む核酸可溶化試薬溶液を添加し、検体と核酸可溶化試薬溶液を混合する工程、（ｃ）工程（ｂ）で得られた混合液をインキュベートする工程、（ｄ）インキュベートした混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
界面活性剤がノニオン界面活性剤の１種類である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
界面活性剤がカチオン界面活性剤の１種類である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
界面活性剤がアニオン界面活性剤の１種類である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
界面活性剤が両性界面活性剤の１種類である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
界面活性剤がノニオン界面活性剤とアニオン界面活性剤の２種類からなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
界面活性剤がノニオン界面活性剤とカチオン界面活性剤の２種類からなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
界面活性剤がノニオン界面活性剤と両性界面活性剤の２種類からなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
ノニオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤以外の界面活性剤である、請求項１〜３又は７〜９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
ノニオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である、請求項１〜３又は７〜９の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
ノニオン系界面活性剤が脂肪酸アルカノールアミドである、請求項請求項１〜３又は７〜９の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
カチオン系界面活性剤がセチルトリメチルアンモニウムブロミドである、請求項１、２、４又は８の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
カチオン系界面活性剤がドデシルトリメチルアンモニウムクロリドである、請求項１、２、４又は８の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
カチオン系界面活性剤がテトラデシルトリメチルアンモニウムクロリドである、請求項１、２、４又は８の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
カチオン系界面活性剤がセチルピリジニウムクロリドである、請求項１、２、４又は８の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
カオトロピック塩がグアニジウム塩である、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノールまたはそれらの混合物から選択される、請求項１から１７の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
水溶性有機溶媒により、試料溶液中の核酸が沈殿を形成しない、請求項１から１８の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも２個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔膜を収容した核酸分離精製ユニットを用いて、請求項１から１９の何れかに記載の方法で調製した核酸を含む試料溶液中の核酸の吸着及び脱着を行う、核酸の分離精製方法。
【請求項２１】
(ａ)核酸吸着性多孔膜、(ｂ)前記核酸吸着性多孔膜を収容する少なくとも２個の開口を有する容器、及び(ｃ)前記容器の一の開口に結合された圧力差発生装置を含む核酸分離精製ユニットを用いて、請求項１から１９の何れかに記載の方法で調製した核酸を含む試料溶液中の核酸の吸着及び脱着を行う、核酸の分離精製方法。
【請求項２２】
（ａ）請求項１から１９の何れかに記載の方法で調製した核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、圧力差により溶液が通過可能な、核酸吸着性多孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、  （ｂ）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カ−トリッジト内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜内に核酸を吸着させる工程、（ｃ）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、（ｄ）核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、（ｅ）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、及び（ｆ）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程、を含む、核酸の分離精製方法。
【請求項２３】
核酸吸着性多孔膜が、イオン結合が関与しない弱い相互作用で核酸が吸着する、有機高分子からなる多孔膜である、請求項２０から２２の何れかに記載の方法。
【請求項２４】
有機高分子からなる多孔膜が、水酸基を有する有機高分子からなる多孔膜である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
水酸基を有する有機高分子からなる多孔膜が、アセチルセルロースの多孔膜を鹸化処理した多孔膜である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
洗浄液が、メタノール、エタノール、イソプロパノール又はｎ−プロパノールを２０から１００重量％含む溶液である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
回収液が、塩濃度が０．５Ｍ以下の溶液である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
圧力差発生装置が、核酸分離精製カートリッジの一の開口に着脱可能に結合されたポンプである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２０から２８に何れかに記載の核酸分離精製方法を行うための装置。
【請求項３０】
請求項２０から２８に何れかに記載の核酸分離精製方法を行うための試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を含む試料溶液の調製方法、並びにそれを用いて核酸を分離精製する方法に関する。より詳細には、本発明は、界面活性剤を用いて核酸を含む試料溶液を調製し、次いで、少なくとも２個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力差発生装置を用いて、調製した核酸を含む試料溶液から核酸を分離精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸は、様々な分野で種々の形態で使用されている。例えば、組換え核酸技術の領域においては、核酸をプローブ、ゲノム核酸、およびプラスミド核酸の形状で用いることを要求する。
【０００３】
診断分野においても、核酸は種々の方法で用いられている。例えば、核酸プローブは、ヒトの病原体の検出および診断に日常的に用いられている。同様に核酸は遺伝障害の検出に用いられている。核酸はまた食品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は遺伝地図の作製からクローニングおよび組換え発現におよぶ種々の理由により、興味ある核酸の位置確認、同定および単離において日常的に用いられている。
【０００４】
多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手できず、そして単離および精製操作が煩雑で時間を要する。このしばしば時間を消費する煩雑な操作は核酸の損失に結びつきやすい。血清、尿およびバクテリアのカルチャーから得られた試料の核酸の精製においては、コンタミネーションおよび疑陽性の結果が生じるという危険性も加わる。
【０００５】
広く知られた精製方法の一つに、核酸を二酸化珪素、シリカポリマー、珪酸マグネシウム等の表面に吸着させ、引き続く洗浄、脱着等の操作によって精製する方法がある（例えば、特公平７−５１０６５号公報）。この方法は、分離性能としては優れているが、同一性能の吸着媒体の工業的大量生産が困難であり、かつ取扱いが不便で、種々の形状に加工しがたい等の問題点がある。
【０００６】
【特許文献１】特公平７−５１０６５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、核酸を含む試料溶液中の核酸を核酸吸着性の多孔膜に吸着させた後、洗浄等を経て脱着させて核酸を分離精製する方法において、効率よく、簡便で、迅速で、自動化適性に優れ、再現性のある核酸を含む試料溶液を得る方法を提供することである。本発明の別の目的は、分離性能に優れ、洗浄効率が良く、簡便で、迅速で、自動化適性に優れ、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産可能である多孔膜を使用した核酸の分離精製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、核酸を多孔膜に吸着及び脱着させる工程を含む核酸の分離精製に先立って行う検体から核酸を含む試料溶液の調製の際に、界面活性剤を用いることによって、検体から効率よく核酸を含む試料溶液を得ることができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明によれば、細胞又はウイルスを含む検体に界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液を添加して検体と核酸可溶化試薬溶液を混合する工程、及び混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程を含む、核酸を含む試料溶液の調製方法が提供される。本発明の具体例としては、（ａ）細胞又はウイルスを含む検体を容器に注入する工程、（ｂ）上記容器に、カオトロピック塩、界面活性剤およびタンパク質分解酵素を含む核酸可溶化試薬溶液を添加し、検体と核酸可溶化試薬溶液を混合する工程、（ｃ）工程（ｂ）で得られた混合液をインキュベートする工程、（ｄ）インキュベートした混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程を含む、核酸を含む試料溶液の調製方法が提供される。
【００１０】
界面活性剤がノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤又は両性界面活性剤の何れでもよく、１種類又は２種類以上の界面活性剤を使用することができる。例えば、界面活性剤は、ノニオン界面活性剤とアニオン界面活性剤の２種類からなるか、ノニオン界面活性剤とカチオン界面活性剤の２種類からなるか、又はノニオン界面活性剤と両性界面活性剤の２種類からなる。好ましくは、ノニオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤以外の界面活性剤である。好ましくは、ノニオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。好ましくは、ノニオン系界面活性剤は、脂肪酸アルカノールアミドである。好ましくは、カチオン系界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、又はセチルピリジニウムクロリドである。好ましくは、カオトロピック塩はがグアニジウム塩である。好ましくは、水溶性有機溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノールまたはそれらの混合物から選択される。好ましくは、水溶性有機溶媒により、試料溶液中の核酸は沈殿を形成しない。
【００１１】
本発明の別の側面によれば、少なくとも２個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔膜を収容した核酸分離精製ユニットを用いて、上記の方法で調製した核酸を含む試料溶液中の核酸の吸着及び脱着を行う、核酸の分離精製方法が提供される。
【００１２】
好ましくは、(ａ)核酸吸着性多孔膜、(ｂ)前記核酸吸着性多孔膜を収容する少なくとも２個の開口を有する容器、及び(ｃ)前記容器の一の開口に結合された圧力差発生装置を含む核酸分離精製ユニットを用いて、上記の方法で調製した核酸を含む試料溶液中の核酸の吸着及び脱着を行う、核酸の分離精製方法が提供される。
【００１３】
さらに好ましくは、（ａ）上記の方法で調製した核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、圧力差により溶液が通過可能な、核酸吸着性多孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、  （ｂ）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カ−トリッジト内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜内に核酸を吸着させる工程、（ｃ）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、（ｄ）核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、（ｅ）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、及び（ｆ）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程、を含む、核酸の分離精製方法が提供される。
【００１４】
好ましくは、核酸吸着性多孔膜は、イオン結合が関与しない弱い相互作用で核酸が吸着する、有機高分子からなる多孔膜である。好ましくは、有機高分子からなる多孔膜は、水酸基を有する有機高分子からなる多孔膜である。好ましくは、水酸基を有する有機高分子からなる多孔膜は、アセチルセルロースの多孔膜を鹸化処理した多孔膜である。
【００１５】
好ましくは、洗浄液は、メタノール、エタノール、イソプロパノール又はｎ−プロパノールを２０から１００重量％含む溶液である。好ましくは、回収液は、塩濃度が０．５Ｍ以下の溶液である。好ましくは、圧力差発生装置が、核酸分離精製カートリッジの一の開口に着脱可能に結合されたポンプである。
【００１６】
本発明のさらに別の側面によれば、上記の核酸分離精製方法を行うための装置が提供される。本発明のさらに別の側面によれば、上記の核酸分離精製方法を行うための試薬キットが提供される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明による核酸を含む試料溶液の調製方法、並びにそれを用いた核酸の分離精製方法により、分離性能良く、簡便で、迅速に、核酸を含む検体から核酸を分離精製することができ、当該方法は自動化も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明は、核酸を含む試料溶液の調製方法に関するものであり、具体的には、細胞又はウイルスを含む検体に界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液を添加して検体と核酸可溶化試薬溶液を混合する工程、及び混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程を含むことを特徴とする。
【００１９】
本発明で用いる界面活性は、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、又は両性界面活性剤の何れでもよい。ノニオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤（例えば、Triton-X100など）以外の界面活性剤であることが好ましく、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤または脂肪酸アルカノールアミドが好ましい。ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤の具体例としては、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリドまたはセチルピリジニウムクロリドなどが挙げられる。アニオン界面活性剤の具体例としては、ＰＯＥジエチルエーテル、ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥデシルエーテル、ＰＯＥトリデシルエーテル、ＰＯＥアルキレンデシルエーテル、ＰＯＥソルビタンモノラウレート、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンモノステアレート、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングルコールなどが挙げられる。
【００２０】
また、カチオン系界面活性剤の具体例としては、モノアルキルアンモニウムクロライド、ジアルキルアンモニウムクロライドなどが挙げられる。
【００２１】
両性界面活性剤の具体例としては、パルミトイルリゾレシチン、Ｎ−ドデシル−ベタイン、ステアリル−Ｎ−ベタイン、ドデシル−β−アラニン、３−（ドデシルジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホン酸、３−（テトラデシルメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホン酸などが挙げられる。
【００２２】
本発明において「核酸」は一本鎖、二本鎖のいずれでもよく、また、分子量の制限も無い。
【００２３】
試料とは、核酸を含む任意の試料を意味する。試料中の核酸の種類は１種類でも２種類以上の複数でもよい。個々の核酸の長さも特に限定されず、例えば、数ｂｐ〜数Ｍｂｐの任意の長さの核酸を使用することができる。取り扱い上の観点からは、核酸の長さは一般的には、数ｂｐ〜数百ｋｂｐ程度である。
【００２４】
核酸吸着性多孔膜の種類は特に限定されず、例えば、表面に水酸基を有する有機高分子から成る核酸吸着性多孔膜や、あるいは二酸化珪素、シリカポリマー又は珪酸マグネシウムから成る核酸吸着性多孔膜、あるいはシリカ又はその誘導体、珪藻土、又はアルミナから成る核酸吸着性多孔膜などを使用することができる。好ましくは、表面に水酸基を有する有機高分子から成る核酸吸着性多孔膜を使用することができる。
【００２５】
表面に水酸基を有する有機高分子としては、アセチルセルロースの鹸化物が好ましい。アセチルセルロースしては、モノアセチルセルロース、ジアセチルセルロース、トリアセチルセルロースの何れでもよいが、特にはトリアセチルセルロースが好ましい。本発明では、表面鹸化したアセチルセルロースを核酸吸着性多孔膜として使用することが好ましい。ここで表面鹸化とは、鹸化処理液（例えば、ＮａＯＨ）が接触する表面だけが鹸化されることを言う。本発明では、核酸吸着性多孔膜の構造体はアセチルセルロースのままで、核酸吸着性多孔膜の表面だけが鹸化されていることが好ましい。これにより、鹸化処理の程度（鹸化度）で核酸吸着性多孔膜の表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。
【００２６】
表面に水酸基を有する有機高分子の表面積を大きくするためには、表面に水酸基を有する有機高分子を膜化することが好ましい。また、アセチルセルロースは多孔膜でも非孔性膜でもよいが、膜を多孔性とすることが更に好ましい。核酸吸着性多孔膜において、構造体はアセチルセルロースのままで、構造体の表面だけを鹸化することが好ましい。これにより、鹸化処理の程度（鹸化度）×孔径により空間的な水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。また、膜の構造体はアセチルセルロースから構成されているため、堅固な核酸吸着性多孔膜を得ることができる。
【００２７】
例えば、トリアセチルセルロースの膜は、商品名ＴＡＣベースとして富士写真フイルムから市販されており、トリアセチルセルロースの多孔膜としては、ミクロフィルターＦＭ５００（富士写真フイルム（株）製）がある。
【００２８】
核酸の分離効率を挙げるためには、水酸基の数が多い方が好ましい。例えば、トリアセチルセルロースなどのアセチルセルロースの場合には、鹸化率が約５％以上であることが好ましく、１０％以上であることが更に好ましい。
【００２９】
アセチルセルロースを鹸化するには、水酸化ナトリウム水溶液中に、鹸化したい対象を浸漬する。鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度を変えればよい。鹸化率は、ＮＭＲにより、残存アセチル基を定量して定められる。
【００３０】
本発明の核酸の分離精製方法では、好ましくは、少なくとも２個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔膜（例えば、表面に水酸基を有する有機高分子から成る核酸吸着性多孔膜）を収容した核酸分離精製ユニットを用いて核酸の吸着及び脱着を行うことができる。
【００３１】
さらに好ましくは、(ａ) 核酸吸着性多孔膜（例えば、表面に水酸基を有する有機高分子から成る核酸吸着性多孔膜）、(ｂ)  前記核酸吸着性多孔膜を収容する、少なくとも２個の開口を有する容器、及び(ｃ)  前記容器の一の開口に結合された圧力差発生装置を含む核酸分離精製ユニットを用いて核酸の吸着及び脱着を行うことができる。
【００３２】
この場合の本発明の核酸の分離精製方法の第一の実施態様は、以下の工程を含むことができる。
(ａ)  核酸分離精製ユニットの一の開口を核酸を含む試料溶液中に挿入する工程、
(ｂ)  核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を減圧状態にして核酸を含む試料溶液を吸引し、核酸吸着性多孔膜に接触させる工程、
(ｃ)  核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、吸引された核酸を含む試料溶液を容器外に排出する工程、
(ｄ)  核酸分離精製ユニットの一の開口を核酸洗浄バッファ溶液中に挿入する工程、
(ｅ)  核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を減圧状態にして核酸洗浄バッファ溶液を吸引し、核酸吸着性多孔膜に接触させる工程、
(ｆ)  核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、吸引された核酸洗浄バッファ溶液を容器外に排出する工程、
(ｇ)  核酸分離精製ユニットの一の開口を、核酸吸着性多孔膜に吸着された核酸を脱着せしめうる液中に挿入する工程、
(ｈ)  核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を減圧状態にして、核酸吸着性多孔膜に吸着された核酸を脱着せしめうる液を吸引し、核酸吸着性多孔膜に接触させる工程、及び
(ｉ)  核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、核酸吸着性多孔膜に吸着された核酸を脱着せしめうる液を容器外に排出する工程。
【００３３】
本発明の核酸の分離精製方法の第二の実施態様は、以下の工程を含むことができる。
(ａ)  検体を用いて核酸を含む試料溶液を調製し、核酸分離精製ユニットの一の開口に上記の核酸を含む試料溶液を注入する工程、
(ｂ)  核酸分離精製ユニットの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜に接触させる工程、
(ｃ)  核酸分離精製ユニットの上記一の開口に核酸洗浄バッファを注入する工程、
(ｄ)  核酸分離精製ユニットの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した核酸洗浄バッファを上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜に接触させる工程、
(ｅ)  核酸分離精製ユニットの上記一の開口に核酸吸着性多孔膜に吸着された核酸を脱着せしめうる液を注入する工程、
(ｆ)  核酸分離精製ユニットの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した核酸を脱着せしめうる液を上記他の開口より排出させることによって、核酸吸着性多孔膜に吸着された核酸を脱着させ、容器外に排出する工程。
【００３４】
本発明による核酸の分離精製方法についてさらに具体的に説明する。本発明では、好ましくは、核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔膜（例えば、表面に水酸基を有する有機高分子から成る核酸吸着性多孔膜）に接触させることにより試料溶液中の核酸を核酸吸着性多孔膜に吸着させ、次いで、核酸吸着性多孔膜に吸着させた核酸を、以下に説明する好適な溶液を用いて核酸吸着性多孔膜から脱着させる。さらに好ましくは、核酸を含む試料溶液は、細胞又はウイルスを含む検体を細胞膜及び核膜を溶解する溶液で処理することにより核酸を液中に分散させた溶液に水溶性有機溶媒を添加し、さらに界面活性剤を添加した溶液である。
【００３５】
本発明において使用できる核酸を含む試料溶液に制限はないが、例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、精液、唾液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）など、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生物材料から調製された溶液が対象となる。
【００３６】
最初にこれらの検体を、細胞膜を溶解して核酸を可溶化する試薬を含む水溶液で処理する。これにより細胞膜および核膜が溶解されて、核酸が水溶液内に分散する。
【００３７】
細胞膜の溶解および核酸の可溶化のためには、例えば、対象となる試料が全血の場合、1)赤血球の除去、2)各種タンパク質の除去、及び3)白血球の溶解及び核膜の溶解が必要となる。1)赤血球の除去および2)各種タンパク質の除去は、核酸吸着性多孔膜への非特異吸着および多孔膜の目詰まりを防ぐために、3)白血球の溶解及び核膜の溶解は、抽出の対象である核酸を可溶化させるためにそれぞれ必要となる。特に、3)白血球の溶解及び核膜の溶解は重要な工程であり、本発明の方法では、この工程で核酸を可溶化することが必要である。例えば、塩酸グアニジン、界面活性剤、プロテアーゼＫ（ＳＩＧＭＡ製）を添加した状態で６０℃で１０分インキュベートすることによって上記の1)、2)及び3)を同時に達成することができる。
【００３８】
本発明で用いる核酸可溶化試薬としては、グアニジン塩、界面活性剤、及びタンパク質分解酵素を含む溶液が挙げられる。
【００３９】
グアニジン塩としては、塩酸グアニジンが好ましいが、他のグアニジン塩（イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン）を使用することもできる。グアニジン塩の溶液中の濃度は、０.５Ｍ以上６Ｍ以下  好ましくは  １Ｍ以上５Ｍ以下である。
【００４０】
界面活性剤としては本明細書中上記したものを用いることができる。界面活性剤の溶液中の濃度は、通常０．０５重量％〜１０重量％  特に好ましくは０．１重量％〜５重量％である。
【００４１】
タンパク質分解酵素としては、プロテアーゼＫを使用することはできるが、他のプロテアーゼでも同様の効果を得ることができる。プロテアーゼは酵素であるため加温するのが好ましく、３７℃〜７０℃で使用することが好ましく、特に５０℃〜６５℃で使用することが好ましい。
【００４２】
このように核酸が分散した水溶液中に、水溶性有機溶媒を添加して、核酸吸着性多孔膜と接触させる。この操作により、試料溶液中の核酸が核酸吸着性多孔膜（例えば、表面に水酸基を有する有機高分子）に吸着される。本明細書中上記した操作で可溶化された核酸を、核酸吸着性多孔膜に吸着させるためには、可溶化した核酸混合液に水溶性有機溶媒を混合することと、得られた核酸混合液中に塩が存在することが必要である。
【００４３】
即ち、核酸の周りに存在する水分子の水和構造を破壊することにより、核酸は不安定な状態で可溶化することになる。この状態の核酸を、核酸吸着性多孔膜と接触させると、核酸表面上の極性基と核酸吸着性多孔膜表面の極性基間で相互作用し、核酸は核酸吸着性多孔膜の表面上に吸着するものと考えられる。本発明の方法では、可溶化した核酸混合液に水溶性有機溶媒を混合することと、得られた核酸混合液中に塩が存在することによって、核酸を不安定な状態にさせることができる。
【００４４】
ここで用いる水溶性有機溶媒としては、エタノール、イソプロパノール又はプロパノールなどが挙げられ、中でもエタノールが好ましい。水溶性有機溶媒の濃度は、好ましくは５重量％〜９０重量％であり、さらに好ましくは２０重量％〜６０重量％である。エタノールの添加濃度は、擬集物を生じない程度でできるだけ高くすることが特に好ましい。
【００４５】
得られた核酸混合液中に存在する塩としては、各種カオトロピック物質（グアニジウム塩、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム）や塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化アンモニウム等が好ましい。特にグアニジウム塩は、細胞膜の溶解および核酸の可溶化の効果を併有するので特に好ましい。
【００４６】
次いで、この核酸が吸着した核酸吸着性多孔膜を核酸洗浄バッファ溶液に接触させる。この溶液は核酸と一緒に核酸吸着性多孔膜に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する。従って、核酸吸着性多孔膜から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成を有する必要がある。核酸洗浄バッファ溶液は主剤と緩衝剤、及び必要に応じて界面活性剤を含む水溶液からなる。主剤としてはメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノール、アセトン等の約１０〜１００重量％（好ましくは約２０〜１００重量％、さらに好ましくは約４０〜８０重量％）の水溶液が、緩衝剤及び界面活性剤としては、既述の緩衝剤及び界面活性剤が挙げられる。これらの内では、エタノール、Ｔｒｉｓ及び界面活性剤を含む溶液が好ましい。Ｔｒｉｓ及び界面活性剤の好ましい濃度は、それぞれ１０〜１００ｍＭ、及び０．１〜１０重量％である。
【００４７】
次に、核酸吸着性多孔膜に吸着した核酸を脱着せしめうる溶液に、上記洗浄後の核酸吸着性多孔膜を接触させる。この溶液には目的とする核酸が含まれているので、これを回収し、後に続く操作、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による核酸の増幅に提供する。核酸を脱着せしめうる溶液としては、塩濃度が低いことが好ましく、特に好ましくは０．５Ｍ以下の塩濃度の溶液を使用する。この溶液としては、精製蒸留水、ＴＥバッファ等が使用できる。
【００４８】
本発明で使用する核酸分離精製ユニットは、少なくとも２個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔膜（例えば、表面に水酸基を有する有機高分子から成る核酸吸着性多孔膜など）を収容した核酸分離精製ユニットである。
容器の材料に特別な限定はなく、核酸吸着性多孔膜を収容でき、かつ少なくとも２個の開口を設けることができればよいが、製造の容易性からプラスチックが好ましい。例えば、ポリスチレン、ポリメタアクリル酸エステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ナイロン、ポリカーボネート等の透明あるいは不透明の樹脂を用いるのが好ましい。
【００４９】
容器は、核酸吸着性多孔膜の収容部を持ち、収容部に核酸吸着性多孔膜を収容でき、核酸吸着性多孔膜が試料液等の吸引及び排出時に収容部の外へは出ることがなく、開口に圧力差発生装置、例えば注射器を接合できればよい。このためには、容器が当初は二つの部分に分かれており、核酸吸着性多孔膜を収容した後で一体化できることが好ましい。また、核酸吸着性多孔膜が収容部から外へでることをさける為には、核酸吸着性多孔膜の上下にＤＮＡを汚染しない材料で作成されたメッシュを置くことができる。
【００５０】
上記容器に収容される核酸吸着性多孔膜の形状にも特別な限定は無く、円形、正方形、長方形、楕円、膜の場合には筒状、巻物状、あるいは表面に水酸基を有する有機高分子をコーティングしたビーズ等、任意の形状で良いが、製造適性の点からは、円、正方形、円筒状、巻物状等の対称性の高い形状及びビーズが好ましい。
【００５１】
上記容器の一の開口を核酸を含む試料溶液中に挿入し、他の一の開口から吸引して核酸吸着性多孔膜に試料溶液を接触させ、これを排出し、次いで核酸洗浄バッファ溶液を吸引・排出し、次いで、核酸吸着性多孔膜に吸着した核酸を脱着せしめうる溶液を吸引・排出して、この排出液を回収することにより、目的とする核酸を得ることができる。
【００５２】
本発明で使用する核酸分離精製ユニットは、(ａ) 核酸吸着性多孔膜（例えば、表面に水酸基を有する有機高分子から成る核酸吸着性多孔膜）、(ｂ)  前記核酸吸着性多孔膜を収容する、少なくとも２個の開口を有する容器、及び(ｃ)  前記容器の一の開口に結合された圧力差発生装置、を含むものであることが好ましい。以下、この核酸分離精製ユニットについて説明する。
【００５３】
容器は、通常、核酸吸着性多孔膜を収容する本体と、蓋体に分けた態様で作製され、いずれにも少なくとも１個の開口が設けられている。一方は核酸を含有する試料溶液、核酸洗浄バッファ溶液及び核酸吸着性多孔膜に吸着された核酸を脱着せしめうる液（以下、「試料溶液等」と記す。）の入口及び出口として使用され、他方は容器内を減圧又は加圧状態にせしめうる圧力差発生装置に接続される。本体の形状に特に限定はないが、製造が容易で、試料溶液等が核酸吸着性多孔膜の全面に拡散し易くするには、断面を円形にすることが好ましい。断面を四角形にすることも、核酸吸着性多孔膜の裁断屑を発生させないために好ましい。
【００５４】
上記蓋は、圧力差発生装置によって容器内部を減圧及び加圧状態にできるように本体に接合されている必要があるが、この状態が達成できれば、接合方法は任意に選択できる。例えば、接着剤の使用、ねじ込み、はめ込み、ネジ止め、超音波加熱による融着等が挙げられる。
【００５５】
容器の内容積は処理すべき試料溶液の量のみによって決められるが、通常、収容される核酸吸着性多孔膜の体積で表す。即ち、厚さが約１ｍｍ以下（例えば、５０〜５００μｍ程度）で、直径が約２ｍｍ〜２０ｍｍの核酸吸着性多孔膜を１枚〜６枚程度収容する大きさとすることが好ましい。
【００５６】
核酸吸着性多孔膜の端面は、試料溶液等が通過しない程度に、容器の内壁面に密着させることが好ましい。
【００５７】
試料溶液等の入り口に使用される開口に対向する核酸吸着性多孔膜の下は、容器の内壁に密着させずに空間を設け、試料溶液等が核酸吸着性多孔膜の全面にできるだけ均等に拡散する構造にする。
【００５８】
他の一の開口、即ち圧力差発生装置に結合される開口に対向する核酸吸着性多孔膜の上には、ほぼ中央に穴を穿った部材を設けることが好ましい。この部材は、核酸吸着性多孔膜を押さえると共に、試料溶液等を効率よく排出する効果を有するものであり、液が中央の穴に集まる様に、漏斗状あるいはお椀状等の斜面を有する形状にすることが好ましい。この穴の大きさ、斜面の角度、部材の厚さは、処理する試料溶液等の量や核酸吸着性多孔膜を収容する容器の大きさ等を考慮して、当業者が適宜定めることができる。この部材と当該開口の間には、オーバーフローした試料溶液等を溜めて、圧力差発生装置内に吸引されることを防ぐための空間を設けることが好ましい。この空間の大きさも当業者が適宜選択することができる。なお、核酸を効率良く集めるためには、核酸吸着性多孔膜の全体が浸る以上の量の核酸を含む試料溶液を吸引することが好ましい。
【００５９】
また、吸引している開口の真下の部分にのみ試料溶液等が集中することを防いで、試料溶液等が核酸吸着性多孔膜内を比較的均一に通過できるようにするため、核酸吸着性多孔膜とこの部材の間にも空間を設けることが好ましい。このためには、当該部材から核酸吸着性多孔膜に向けて複数の突起物を設けることが好ましい。突起物の大きさや数は当業者が適宜選択することができるが、空間を保持しながら核酸吸着性多孔膜の開口面積をできる限り大きく保つことが好ましい。
【００６０】
なお、容器に３以上の開口を設けた場合には、減圧及び加圧操作に伴う液の吸引及び排出を可能にすべく、余分の開口を一時的に封鎖する必要があることはいうまでもない。
【００６１】
圧力差発生装置は、まず核酸吸着性多孔膜を収容した容器内を減圧にして核酸を含む試料溶液を吸引する。圧力差発生装置としては、注射器、ピペッタ、あるいはペリスタポンプのような吸引及び加圧が可能なポンプ等が挙げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操作にはポンプが適している。また、ピペッタは片手操作が容易にできるという利点を有する。好ましくは、圧力差発生装置は、前記容器の一の開口に着脱可能に結合されている。
【００６２】
次に、上記した核酸分離精製ユニットを使用した、核酸の精製方法について説明する。先ず、核酸を含む試料溶液中に、上記の核酸分離精製ユニットの一の開口を挿入する。次いで他の一の開口に接続された圧力差発生装置を用いて精製ユニットの内部を減圧にして試料溶液を容器内に吸入する。この操作により、試料溶液が核酸吸着性多孔膜と接触して試料溶液中にある核酸が核酸吸着性多孔膜に吸着する。この際に、核酸吸着性多孔膜のほぼ全体と接触する量の試料溶液を吸引することが好ましいが、圧力差発生装置内に吸引すると装置を汚染するので、適量に調整する。
【００６３】
適量の試料溶液を吸引後、圧力差発生装置を用いてユニットの容器内を加圧して、吸引した液を排出する。この操作までに間隔を開ける必要はなく、吸引後直ちに排出してもよい。
【００６４】
次に、上記と同様の減圧−加圧操作で核酸洗浄バッファ溶液を容器内に吸引し、これから排出して容器内部を洗浄する。この溶液は容器内に残留する試料溶液を洗い流すと共に、核酸と一緒に核酸吸着性多孔膜に吸着した試料溶液中の不純物も洗い流す機能を有する。従って、核酸吸着性多孔膜から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成を有する必要がある。核酸洗浄バッファ溶液は主剤と緩衝剤、及び必要に応じて界面活性剤を含む水溶液からなり、主剤としてはメチルアルコール、エチルアルコール、ブチルアルコール、アセトン等の約１０〜９０％（好ましくは約５０〜９０％）の水溶液が、緩衝剤及び界面活性剤としては、既述の緩衝剤及び界面活性剤が挙げられる。
【００６５】
次に、核酸吸着性多孔膜に吸着した核酸を脱着せしめうる溶液を、上記と同様の減圧−加圧操作によって容器内部に導入し、容器から排出する。この排出液には目的とする核酸が含まれているので、これを回収し、後に続く操作、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による核酸の増幅に提供することができる。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００６６】
実施例１
（１）核酸分離精製容器の作成
内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔膜を収容する部分を持つ核酸分離精製容器を、ハイインパクトポリスチレンで作成した。
【００６７】
（２）核酸分離精製カートリッジの作成
核酸吸着性多孔膜として、トリアセチルセルロースの多孔膜を鹸化処理した多孔膜を使用し、上記で作成した核酸分離精製容器の核酸吸着性多孔膜収納部に収容した。
【００６８】
（３）核酸可溶化試薬溶液及び洗浄液の調製
表１に示す処方の核酸可溶化試薬溶液及び洗浄液を調製した。
【００６９】
（表１）
核酸可溶化試薬溶液（本発明の実施例）            
塩酸グアニジン（ライフテクノロジー製）３８２ｇ
Ｔｒｉｓ（ライフテクノロジー製）    １２．１ｇ
ＰＯＥラウリルエーテル（花王製）    １０ｇ
蒸留水                            １０００ｍｌ  
洗浄液                                          
１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ    ６５％エタノール    
【００７０】
（４）核酸精製操作
ガン化人骨髄細胞（ＨＬ６０）培養液を用意した。この培養液２００μｌに表１に記載の核酸可溶化試薬溶液２００μlとプロテアーゼＫ（ＳＩＧＭＡ製）溶液２０μｌを添加して６０℃で１０分間インキュベートする。インキュベート後、エタノール２００μｌを加え、攪拌する。攪拌後、上記（１）及び（２）で作成した核酸吸着性多孔膜を有する核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔膜に通過させることで、核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出する。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出する。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。
【００７１】
また、比較例として、表１に記載の核酸可溶化試薬溶液の代わりに表２に記載の核酸可溶化試薬溶液を用いる以外は、上記と同様の条件下で操作を行い、核酸を含有する液を回収した。
【００７２】
（表２）
核酸可溶化試薬溶液（比較例）                    
塩酸グアニジン（ライフテクノロジー製）３８２ｇ
Ｔｒｉｓ（ライフテクノロジー製）    １２．１ｇ
蒸留水                            １０００ｍｌ  
【００７３】
（５）核酸の回収量の定量
上記した実施例と比較例の実験をそれぞれ２回繰り返した。回収した液の２６０ｎｍの光吸収測定により、ＤＮＡの回収量を定量した。測定結果を表３に示す。
【００７４】
（表３）
229.8    259.6    280.3    320    399.8   260/280  
比較例（１回目） 0.260    0.140    0.110   0.01   0.00      1.857
（２回目） 0.330    0.183    0.131   0.01   0.04      1.803
実施例（１回目） 0.460    0.390    0.230   0.010   0.020    1.727
（２回目） 0.320    0.390    0.220   0.010   0.010    1.810   
【００７５】
表３の結果から明らかなように、本発明の方法を用いることにより、核酸を効率よく、優れた再現性により回収および精製できることが分かる。