(57)【要約】      （修正有）【課題】化学物質のメダカアンドロジェンレセプターに対する活性化能を評価する方法を提供する。【解決手段】アンドロジェン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子と、特定の塩基配列からなる遺伝子とを、アンドロジェンレセプター非内在性宿主細胞に導入して取得した形質転換体に試験化学物質を作用させ、宿主細胞が産生したレポータータンパク質量を測定することによる化学物質のアンドロジェンレセプターに対する活性化能の評価方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示される塩基配列を有する遺伝子。
【請求項２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の遺伝子を含有するベクター。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の遺伝子の上流に前記遺伝子発現のためのプロモーターを接続したベクター。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の遺伝子が宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
【請求項６】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項７】
アンドロジェン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子と、配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子とを、アンドロジェンレセプター非内在性宿主細胞に導入して取得した形質転換体に試験化学物質を作用させ、宿主細胞が産生したレポータータンパク質量を測定することによる化学物質のアンドロジェンレセプターに対する活性化能の評価方法。
【請求項８】
アンドロジェン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子と、配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子とを、アンドロジェンレセプター非内在性宿主細胞に導入して取得した形質転換体に試験化学物質とアンドロジェンとを作用させ、宿主細胞が産生したレポータータンパク質量を測定することによるアンドロジェンのホルモン作用に対する化学物質の阻害能の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メダカアンドロジェンレセプター遺伝子、前記遺伝子を組み込んだベクター、前記遺伝子を導入した形質転換体、及び前記遺伝子が発現したタンパク質に関する。また、本発明は、前記形質転換体を用いた化学物質のメダカアンドロジェンレセプターに対する活性化能及びアンドロジェンのホルモン作用に対する化学物質の阻害能を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中に存在する化学物質あるいは化学製品から漏出する化学物質で、生体内においてホルモンに類似した作用あるいはホルモン作用に対する阻害性を示すものは、内分泌攪乱化学物質（いわゆる「環境ホルモン」）と呼ばれる。内分泌攪乱化学物質はヒトや生物の内分泌系に影響を及ぼし、生殖障害等を引き起こすことが明らかになっている。
【０００３】
内分泌攪乱化学物質がヒトや環境生物の内分泌系に及ぼす主な作用として、以下の２つの作用が知られている。即ち、内分泌攪乱化学物質がホルモンレセプター（エストロジェンレセプター、アンドロジェンレセプター、甲状腺ホルモンレセプター等）に結合してそれらのホルモンの支配下に置かれている遺伝子を転写活性化するホルモン様作用と、内分泌攪乱化学物質がホルモンレセプターに結合することにより内因性ホルモン（エストロジェン、アンドロジェン等）がホルモンレセプターに結合するのを阻害して内因性ホルモンによる遺伝子の転写活性化を阻害する抗ホルモン作用である。このホルモン様作用及び抗ホルモン作用は、内分泌攪乱化学物質が環境生物の内分泌攪乱を引き起こす主要な作用メカニズムであると考えられている。
【０００４】
内分泌攪乱化学物質が引き起こす内分泌攪乱作用には、女性ホルモン系、男性ホルモン系等への作用がある。内分泌攪乱化学物質の多くは女性ホルモン様化学物質であることから、従来は女性ホルモン系を中心とした研究が進められている。しかしながら、実際にある種の農薬は生体内の男性ホルモンの作用を阻害することが明らかとなっており、女性ホルモン系のみならず男性ホルモン系への影響を評価する方法の開発は重要な課題となっている。男性ホルモン系への影響を評価する手法としては、化学物質のヒトアンドロジェンレセプターに対する結合性を測定する方法、ヒトアンドロジェンレセプターを介した遺伝子転写活性化能を測定する方法等のヒト内分泌系への影響を評価する方法が構築されている（例えば、非特許文献１、２）。
【非特許文献１】マツイ, ケイ. エト アル. (2002)  ダブル  エバリュエーションズ  オブ  ケミカルズ  ユージング  ア  カクテイル  オブ  フューズド  リコンビナント  レセプターズ，アナリティカル  バイオケミストリー, 307, 147-152. （Matsui, K. et al. (2002) Double evaluations of chemicals using a cocktail of fused recombinant receptors, Anal. Biochem., 307, 147-152.)
【非特許文献２】タムラ, エイチ., エト  アル. (2001)  アンドロジェン  レセプター  アンタゴニズム  バイ  ザ  オルガノホスフェイト  インセクティサイド  フェニトロチオン, トキシコロジカル  サイエンシィズ, 60, 56-62. （Tamura, H., et al. (2001) Androgen Receptor Antagonism by the Organophosphate Insecticide Fenitrothion, Toxicol. Sci., 60, 56-62.）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、化学物質が生態系へ与える影響を評価するためには、ヒトのみならず環境生物由来のアンドロジェンレセプターに対する作用を解明する必要があり、上記文献の方法のみでは未だ不十分である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、環境生物の中でも国際的に生態毒性試験法の検証作業が進んでおり試験魚として特に有用なメダカに着目し、化学物質がメダカの内分泌系へ与える影響を評価する方法について鋭意検討した。その結果、アンドロジェンレセプター遺伝子を取得し、更にこの遺伝子とレポーター遺伝子とを導入した形質転換体を用いてレポーターアッセイを行うことにより化学物質のメダカアンドロジェンレセプターに対する活性化能とアンドロジェンのホルモン作用に対する阻害能が評価できることを見出し本発明を完成するに到った。
【０００７】
即ち、上記課題を解決する本発明は以下に記載するものである。
【０００８】
〔１〕  配列番号１で示される塩基配列を有する遺伝子。
【０００９】
〔２〕  配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００１０】
〔３〕  〔１〕又は〔２〕に記載の遺伝子を含有するベクター。
【００１１】
〔４〕  〔１〕又は〔２〕に記載の遺伝子の上流に前記遺伝子発現のためのプロモーターを接続したベクター。
【００１２】
〔５〕  〔１〕又は〔２〕に記載の遺伝子が宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
【００１３】
〔６〕  配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
【００１４】
〔７〕  アンドロジェン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子と、配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子とを、アンドロジェンレセプター非内在性宿主細胞に導入して取得した形質転換体に試験化学物質を作用させ、宿主細胞が産生したレポータータンパク質量を測定することによる化学物質のアンドロジェンレセプターに対する活性化能の評価方法。
【００１５】
〔８〕  アンドロジェン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子と、配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子とを、アンドロジェンレセプター非内在性宿主細胞に導入して取得した形質転換体に試験化学物質とアンドロジェンとを作用させ、宿主細胞が産生したレポータータンパク質量を測定することによるアンドロジェンのホルモン作用に対する化学物質の阻害能の評価方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、化学物質のメダカアンドロジェンレセプターに対する活性化能及びアンドロジェンのホルモン作用に対する阻害能を簡便に測定することができる。従って、本発明は、男性ホルモン系に影響を及ぼす内分泌攪乱化学物質のプレスクリーニング法として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
後述する実施例において取得した配列番号１で表される塩基配列はメダカアンドロジェンレセプター遺伝子の全長を表す。配列番号１の塩基配列に対応するアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００１８】
配列番号１で表される塩基配列を有する遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法を用いてプラスミド、ウイルス、ファージベクター等のベクターに挿入することができる。ベクターには必要により導入される宿主細胞において上記遺伝子が発現するためのプロモーターやプロモーターの制御因子を遺伝子の上流に接続する。ベクターは１以上の選択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子等を含んでいてもよい。
【００１９】
構築したベクターは常法により宿主細胞に導入して形質転換体を取得することができる。取得した形質転換体の培養を行うことにより、導入した遺伝子が発現したタンパク質（アンドロジェンレセプター）が産生する。
【００２０】
例えば、宿主細胞として、ほ乳動物培養細胞を用いる場合には、遺伝子を適当なエンハンサー/プロモーターの下流に接続し、細胞内で機能するベクターに挿入して発現ベクターを作成する。代表的なエンハンサー/プロモーターの由来としては、ヒトサイトメガロウイルス（インビトロゲン社製、プロメガ社製）、SV40（インビトロゲン社製、プロメガ社製）、ラウス肉腫（インビトロゲン社製）及びポリペプチド伸長因子EF-1α（インビトロゲン社製）が挙げられる。宿主細胞としてはヒト子宮頸がん由来HeLa（ATCC、大日本製薬社製）などが適用できる。
【００２１】
以下、形質転換体を用いたレポーターアッセイにより化学物質のアンドロジェンレセプターに対する活性化能を評価する方法につき説明する。
【００２２】
まず、配列番号１で示される塩基配列を組み込んだアンドロジェンレセプター発現プラスミドと、前記プラスミドから発現したアンドロジェンレセプターが結合するアンドロジェン応答配列を含む転写制御領域の下流にレポーター遺伝子を組み込んだレポータープラスミドの２種のベクターを調製する。
【００２３】
次いで、上記２種のベクターを常法により非内在性アンドロジェンレセプター宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。この形質転換体においては、細胞内に導入した受容体発現プラスミドからアンドロジェンレセプターが発現する。この形質転換体に試験化学物質を作用させると、化学物質がアンドロジェン様ホルモン作用を有するものであれば、アンドロジェンレセプターのリガンド結合ドメインに特異的に結合し、アンドロジェンレセプターの構造変化を惹起する。化学物質が結合して構造変化したアンドロジェンレセプターは、レポータープラスミドのアンドロジェン応答配列に結合し、アンドロジェン応答配列の下流にある遺伝子の転写を促進する。アンドロジェン応答配列の下流にはレポーター遺伝子が導入されているので、構造変化したアンドロジェンレセプターが結合したレポータープラスミドからはレポーター遺伝子に基づいたレポータータンパク質が発現する。従って、発現したレポータータンパク質の生成量の測定を行えば試験化学物質のアンドロジェンレセプターに対する活性化能を評価することができる。
【００２４】
レポーター遺伝子としては、高感度で検出することができるタンパク質を発現するものであれば制限されないが、例えばルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子等を例示できる。
【００２５】
レポーター遺伝子を組み込んだレポータープラスミドとしては、例えば特開２００３−７９３６８号公報記載のプラスミドを挙げることができる。
【００２６】
上述した化学物質のアンドロジェンレセプターに対する活性化能の評価方法においては２種のベクターを導入した形質転換体に試験化学物質のみを作用させるが、同様にして調製した形質転換体に試験化学物質とともにアンドロジェンを作用させることによりアンドロジェンのホルモン作用に対する化学物質の阻害能を評価することができる。
【００２７】
形質転換体に作用させた化学物質が細胞中で発現しているアンドロジェンレセプターのリガンド結合ドメインに結合し、且つアンドロジェンレセプターの構造変化を起こさない場合には、レポータータンパク質は発現しない。従って、形質転換体にアンドロジェンのみを作用させた場合とアンドロジェンと化学物質とを作用させた場合のレポータータンパク質の生成量を比較することにより、化学物質のホルモン作用に対する阻害能が評価できる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００２９】
実施例１（アンドロジェンレセプター遺伝子の取得）
メダカ（オス）の肝臓を摘出し、QuickPrep Micro mRNA Purification Kit（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて、mRNAを抽出・精製した。得られたmRNAを鋳型として、オリゴdTプライマーを用いたSuperScript II RNase H- Reverse Transcriptase（登録商標、インビトロゲン社製）による逆転写反応を行い、一本鎖cDNAを合成し、さらに、二本鎖cDNAを合成した。合成した二本鎖cDNAを鋳型として、以下のプライマー対（kAR-S1とkAR-AS1）を用いたPCR（30サイクル、96℃-30秒、58℃-30秒、75℃-2分）によりDNAフラグメントの増幅を行った。プライマーの塩基配列は、kAR-S1：5'-atgagccaaaccagccgcca-3'（配列番号３）、kAR-AS1：5'-ctacttgtgaaacaaaattggc-3'（配列番号４）である。
【００３０】
増幅されたDNAフラグメントをpCR-Blunt II-TOPO（登録商標、インビトロゲン社製）を用いてサブクローニングし、プラスミドを調製した。pCR-Blunt II（登録商標、インビトロゲン社製）に基づいたプライマーを用い、ダイターミネーター法により塩基配列を決定した。さらに、本遺伝子の内部配列に基づいたプライマーにより塩基配列を決定した。DNAシーケンサーはABI PRISM 377（登録商標、パーキンエルマー社製）を用いた。
【００３１】
実施例２（遺伝子発現タンパク質を用いたレポーター遺伝子アッセイ）
（1）受容体発現プラスミドの構築
実施例１で取得した遺伝子を鋳型として、以下のプライマー（kAR-S1/E-IとkAR-AS1/N）を用いて、配列番号５で示されるメダカアンドロジェンレセプター全長cDNAを単離した後、BamH I及びNot Iで消化し、同制限酵素で消化した培養細胞用発現プラスミドpSI（プロメガ社製）に導入し、発現プラスミドを構築した。
kAR-S1/E-I：5'-acaggatccatgagccaaaccagccgcca-3'（配列番号５）、kAR-AS1/N：5'-ttagcggccgcctacttgtgaaacaaaattggc-3'（配列番号６）
（2）レポータープラスミドの構築
まず、アンドロジェン応答配列（ARE、配列番号７）を合成した。市販レポータープラスミド（商品名 pGL3-ベーシックベクター、プロメガ社）1μgを制限酵素Kpn IとSac Iとを用いて切断した後、上記のAREを組込みARE/pGL3-ベーシックベクターを作製した。
【００３２】
さらに、プラスミド（ARE/pGL3-ベーシックベクター）を制限酵素Nco Iと Xho Iで切断し、AREとルシフェラーゼの開始コドンの間にプロモーター（ラットα2u-グロブリンプロモーター領域）AUG150（配列番号８）を組み込んだ。
【００３３】
上記AUG150を組み込んだARE/pGL3-ベーシックベクター用いて大腸菌を形質転換した後、コロニーを培地で培養した。プラスミドの精製（GFXTM Micro Plasmid Prep Kit、アマシャムバイオサイエンス社製又はプラスミド精製キット、キアゲン社製）を行って、ARE-AUG150-Luc+レポータープラスミドを得た。
【００３４】
(3)プラスミドのホルモン活性
得られたARE-AUG150-Luc+レポータープラスミドの男性ホルモン活性を確認するため以下の操作を行った。
【００３５】
（男性ホルモン受容体発現遺伝子及びレポータープラスミドを含む培養細胞の調製）
６０％-８０％ コンフルエントの培養細胞HeLa（ヒト子宮頸ガン由来）を準備した[遺伝子導入直前に5mL イーグル基礎培地(EMEM)で２回洗浄後、培地を除去しておく]。
【００３６】
男性ホルモン受容体発現プラスミド（hAR/pCI）2 μgとARE-AUG150-Luc+レポータープラスミド  4μgをEMEM 300 μLに加えた後、LipofectAMINE PLUS 試薬(GibcoBRL社)、60 μLを添加し混和後、15分間放置（Ａ液）した。同時に別の容器にてLipofectAMINE (GibcoBRL社) 12 μLとEMEM 300 μLを混和後15分間放置（Ｂ液）した。
【００３７】
（Ａ液）及び（Ｂ液）を混合後、EMEM 2.4 mLを加え、約3 mLのDNA調製液を調製した後、前述の細胞培養シャーレに加え30分間放置した。次いで２０％牛胎児血清を含むEMEM 3 mLを添加後、一晩培養した。
【００３８】
（男性ホルモン活性の検出方法）
上記のようにして調製した細胞を1 ｘ 105 個／mL  になるように調製し、マイクロプレートに100 μLずつ添加した（1 ｘ 104 個／ウエル）。
【００３９】
男性ホルモンの一種であるDHT（ジヒドロテストステロン、和光純薬）を、前記プレートに濃度を変えて添加し、CO2インキュベータ内で24時間培養した。
【００４０】
インキュベータからプレートを取りだし、培地を捨てた後、リン酸緩衝液(10 mM、pH 7.2)でプレートを２回洗浄した。その後、細胞溶解剤（Cell Culture Lysis Reagent 5X、プロメガ社）を15 μL添加し、10分間静置した後、発光基質[ルシフェラーゼ測定用キット、プロメガ（株）製]を加え、化学発光測定装置（LUMI star、BMG LabTecnologies社製）を用いて化学発光量を測定した。その結果を図１に示す。
【００４１】
（4）プラスミドの大量精製
（1）、（2）で得られたプラスミドでそれぞれ形質転換した大腸菌を大量培養し、EndoFree Plasmid Maxi Kit（キアゲン社製）を用いて、精製した。精製後、分光光度計を用いて、純度及び濃度を測定した。
【００４２】
（5）培養細胞の形質転換
LipofectAMINE PLUS Reagent（登録商標、インビトロゲン社製）を用いて培養細胞HeLa（ヒト子宮頸ガン由来）の形質転換を行った。本操作はメーカーのプロトコールに従って行った。無血清培地で希釈したそれぞれ3 μgのレポーター及びレセプター発現プラスミド溶液にPLUS試薬10 μLを混合し、室温で15分間放置した。さらに、LipofectAMINE（登録商標、インビトロゲン社製）15 μLを添加し15分放置した。5 ｘ 105 個/ディッシュとなるように播種し、一晩培養した細胞に、上述のプラスミド溶液を添加し、CO2インキュベータで培養した。3〜4.5時間後に血清培地に交換し、一晩培養した。
【００４３】
（6）試験化学物質の曝露
受容体発現プラスミド及びレポータープラスミドを導入した培養細胞HeLa（ヒト子宮頸ガン由来）を、96穴マイクロプレートに入れて1 x 10-5〜1 x 10-11 M（公比10、7濃度区）の下記の試験化学物質を曝露した。
【００４４】
試験化学物質
ジヒドロテストステロン(DHT)、エストラジオール(E2:以上、和光純薬社製)、ノルエチノドレル(Norethynodrel)、アンドロステンジオン(Androstenedione)、スピロノラクトン(Spironolactone:以上、シグマ社製)
【００４５】
（7）ルシフェラーゼアッセイ
（6）で化学物質を曝露した培養細胞をCO2インキュベータで培養後、Steady-Glo Luciferase Assay System（登録商標、プロメガ社製）を用いて、細胞内に発現しているルシフェラーゼの酵素活性を測定した。本操作はメーカーのプロトコールに従って行った。同時測定した溶媒対照区のルシフェラーゼの酵素活性を１としたときの各化学物質の転写活性化倍率を化学物質濃度に対してプロットしたグラフを図２に示す。
【００４６】
図２より、解析プログラムGraphPad Prism Ver. 3（登録商標、GraphPad Software社製）を用いてEC50を算出した。EC50は、化学物質の転写活性化倍率が一定に達した値の５０％値を得るために必要な化学物質濃度を表し、化学物質のアンドロジェンレセプターに対する活性化能を表すパラメータとなる。各化学物質のEC50値を表１に示す。
【００４７】
表  １
──────────────────────
試験化学物質               log(EC50) 
──────────────────────
ジヒドロテストステロン        -10.3
エストラジオール              -7.61
ノルエチノドレル              -9.93
アンドロステンジオン          -8.01
スピロノラクトン              -9.01
──────────────────────
【００４８】
実施例３（ホルモン作用に対する化学物質の阻害能の評価方法）
（1）培養細胞の形質転換
実施例2（5）と同様にLipofectAMINE PLUS Reagent（登録商標、インビトロゲン社製）を用いて培養細胞の形質転換を行った。本操作はメーカーのプロトコールに従って行った。このとき、レポーター及びレセプター発現プラスミド溶液のほかに細胞内で構成的に発現するコントロールレポータープラスミドとして、2μｇのウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミドpRL-TK（東洋インキ社製）も同時に細胞内に導入した。
【００４９】
ホルモン作用の阻害能を検出する際には、ホルモンによって発現誘導されたレポータータンパク質であるホタルルシフェラーゼの発現量の化学物質による減少を観察した。ここで、試験物質が細胞毒性を持つ場合、細胞数が減少することによって、見かけ上ホタルルシフェラーゼの発現量が減少し、ホルモン作用を阻害したかのように検出される場合がある。そこで、試験物質のアンドロジェン様作用に依存せず、細胞内で構成的に発現するウミシイタケルシフェラーゼの発現量を測定し、細胞毒性によるアッセイへの影響を調べた。
【００５０】
（2）化学物質の曝露
受容体発現プラスミド及び2種類のレポータープラスミドを導入した培養細胞HeLa（ヒト子宮頸ガン由来）を96穴μプレートに入れ、1 x 10-5〜1 x 10-10 M（公比10、6濃度区）の下記の試験化学物質と1 x 10-10 Mのジヒドロテストステロンを同時に曝露した。
【００５１】
試験化学物質
フルタミド（FTM:シグマ社製）、p,p'-ジクロロジフェニルジクロロエチレン（p,p'-DDE）、ビンクロゾリン（VIN:以上、和光純薬社製）
【００５２】
（3）ルシフェラーゼアッセイ
（2）で化学物質を曝露した培養細胞を終夜CO2インキュベータで培養後、Dual-Glo Luciferase Assay System（登録商標、プロメガ社製）を用いて、細胞内に発現しているホタルルシフェラーゼ及びウミシイタケルシフェラーゼの酵素活性を測定した。本操作はメーカーのプロトコールに従って行った。同時測定した溶媒対照区のホタルルシフェラーゼの酵素活性を1としたとき、ジヒドロテストステロンによって誘導されたルシフェラーゼ発現量を各化学物質濃度に対してプロットしたグラフを図3に示す。
【００５３】
図３より、解析プログラムGraphPad Prism Ver.3 (登録商標、Graph Software社製)を用いてIC50値を算出した。算出したIC50値を表２に示す。IC50は、ジヒドロテストステロンによって誘導されるルシフェラーゼ発現を50%阻害するために必要な化学物質濃度を表し、化学物質のアンドロジェンレセプターに対する阻害的な作用を表すパラメータとなる。
【００５４】
図４に、溶媒対照区（std）の発光強度を100％とした場合の各化学物質濃度におけるウミシイタケルシフェラーゼの発光強度を示す。図４中、「DHT+10nM」はジヒドロテストステロンと10nＭの濃度の試験化学物質を同時に曝露したことを示す。最大の化学物質濃度（10-5M）においても細胞毒性によると考えられる発光強度の低下はわずかで、IC50値への影響はほとんど生じなかった。
【００５５】
表  ２
──────────────────────
試験化学物質               log(IC50) 
──────────────────────
フルタミド                   -5.76
p,p'-DDE                     -5.15
ビンクロゾリン               -6.86
──────────────────────
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】実施例２で調製したレポータープラスミドのDHT濃度に対する転写活性化倍率を示すグラフである。
【図２】実施例２における試験化学物質の濃度とルシフェラーゼ遺伝子の転写活性化倍率の関係を示すグラフである。
【図３】実施例３における試験化学物質の濃度とホタルルシフェラーゼ遺伝子の転写活性化倍率の関係を示すグラフである。
【図４】実施例３において測定したウミシイタケルシフェラーゼの発光強度を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【００５７】
〔配列番号５について〕
5’端にEcoR I認識配列を付加したメダカアンドロジェンレセプターcDNA増幅用センスプライマー
〔配列番号６について〕
5’端にNot I認識配列を付加したメダカアンドロジェンレセプターcDNA増幅用アンチセンスプライマー
〔配列番号７について〕
マウス乳がんウイルス由来アンドロジェン応答配列の3回繰り返し配列
【図１】
2005073517.tif 000002
【図２】
2005073517.tif 000003
【図３】
2005073517.tif 000004
【図４】
2005073517.tif 000005
【配列表】
2005073517000001.app