(57)【要約】【課題】  筋損傷や筋力低下に関与する新規遺伝子の提供、該遺伝子を利用した筋ジストロフィーの診断方法、治療薬および診断薬の提供を課題とする。【解決手段】    骨格筋由来の細胞株の作成およびマイクロアレイ解析により、筋再生における調節因子として重要な役割を果たすRAMP遺伝子を単離することに成功した。また、ヒト正常骨格筋由来の細胞株に比べDMD患者およびBMD患者の骨格筋由来の細胞株ではRAMP mRNAの発現が低下していることを確認し、本遺伝子が筋ジストロフィーの診断や治療に有用であることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ） 配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１または３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA
（ｃ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるDNA
（ｄ）配列番号：１または３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
【請求項２】
請求項１に記載のDNAを含むベクター。
【請求項３】
請求項１に記載のDNAまたは請求項２に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
【請求項４】
請求項１に記載のDNAによりコードされるタンパク質。
【請求項５】
請求項３に記載の形質転換細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から組換えタンパク質を回収する工程を含む、請求項４に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項６】
請求項４に記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項７】
配列番号：１または３に記載の塩基配列またはその相補配列に相補的な少なくとも15の連続する塩基を含むポリヌクレオチド。
【請求項８】
被験試料が、請求項４に記載のタンパク質に結合するか否かを評価する方法であって、
（ａ）請求項４に記載のタンパク質に被験試料を接触させる工程、
（ｂ）被験試料と該タンパク質との結合活性を測定する工程、
を含み、結合活性の有無により被験試料が請求項４に記載のタンパク質に結合するか否かを判定する方法。
【請求項９】
被験試料が、請求項１に記載のDNAの発現を高めるか否かを評価する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のDNAを発現する細胞に被験試料を接触させる工程、
（ｂ）該細胞における請求項１に記載のDNAの発現レベルを測定する工程、
を含み、上記DNAの発現レベルが、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が請求項１に記載のDNAの発現を高めると判定する方法。
【請求項１０】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、請求項４に記載のタンパク質に結合する被験試料のスクリーニング方法。
（ａ）請求項８に記載の評価方法により、複数の被験試料が、請求項４に記載のタンパク質に結合するか否かを評価する工程。
（ｂ）複数の被験試料から、請求項４に記載のタンパク質に結合すると評価された試料を選択する工程。
【請求項１１】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、請求項４に記載のタンパク質の発現を高める被験試料のスクリーニング方法。
（ａ）請求項９に記載の評価方法により、複数の被験試料が、請求項４に記載のタンパク質の発現を高めるか否かを評価する工程。
（ｂ）複数の被験試料から、請求項４に記載のタンパク質の発現を高めると評価された試料を選択する工程。
【請求項１２】
筋ジストロフィーを診断する方法であって、
（ａ）被験者から筋組織を抽出する工程。
（ｂ）抽出した筋組織において、請求項１に記載のDNAの発現を検出する工程。
を含み、被験者における請求項１に記載のDNAの発現量が、健常者における請求項１に記載のDNAの発現量より少ない場合に、筋ジストロフィーの危険があると診断する方法。
【請求項１３】
請求項１に記載のDNA、請求項４に記載のタンパク質、または請求項１０もしくは１１の方法により同定された化合物を含む、筋ジストロフィーの治療薬。
【請求項１４】
請求項６の抗体、請求項７のポリヌクレオチド、または請求項１０に記載の方法により同定された化合物を含む、筋ジストロフィーの診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋損傷や筋力低下からの筋再生過程において、重要な調節因子としての機能を示す新規遺伝子および該遺伝子を利用した筋ジストロフィーの診断方法、治療薬および診断薬に関する。
【０００２】
筋損傷や筋力低下に関与する遺伝子を特定し該遺伝子を利用することは、筋損傷や筋力低下が関わる疾患の診断や治療の分野において非常に有用である。
【背景技術】
【０００３】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)は筋線維の筋形質膜下に発現するジストロフィンの発現が欠損することにより起こる遺伝性の難治性筋疾である。X染色体上のジストロフィン遺伝子のナンセンス変異や欠損がデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)の発症原因である（非特許文献１）。DMD患者は新生男児の3,500人に１人の割合で生まれ、病気は常に進行性で、最終的には呼吸あるいは心不全で死亡する。ジストロフィンは非常に大きな膜裏打ちタンパク質で、細胞内骨格のアクチンフィラメントと細胞外基底膜をつなぐ役割を果たしている（非特許文献２）。さらに、ジストログリカン、サルコグリカンやシントロフィンと共にジストロフィン結合性複合体を形成している（非特許文献３、４）。ジストロフィンは筋収縮で生じる張力からの筋形質膜の機械的支持と（非特許文献５）、細胞内シグナル伝達系、特にCa2+依存性カスケードに影響を与えていると考えられている（非特許文献６）。
【０００４】
DMD患者と正常なヒトの骨格筋に発現している遺伝子の広範囲な比較解析は、DMD患者の筋肉における二次的な変化をつかむ手がかりになると考えられるが（非特許文献７、８）、DMD患者骨格筋の壊死部位は沢山のマクロファージや免疫細胞で埋め尽くされているのでこれらの細胞の影響は免れない。また、若い患者由来の筋生検中にも沢山の血液細胞が含まれる。したがって、骨格筋中のジストロフィン変異による遺伝子発現の変化を正確に検討することは非常に困難であった。
【０００５】
ジストロフィン遺伝子の3185番目に点突然変異を持っているmdx変異マウスは、これまでDMDのモデルマウスとして利用されてきた（非特許文献９、１０）。だが、このmdxマウスではDMD患者同様に筋形質膜におけるジストロフィンタンパク質の局在がみられないのにもかかわらず、生後3-4週後の広範囲な筋変性の後、殆どの筋が再生によって修復され、その後中心核は見られるものの、大きな筋変性、壊死部位は観察されなくなる（非特許文献１１）。その結果、マウスではヒトDMD患者と比較して、筋力低下が殆どみられない。一方、DMD患者では筋変性、壊死の進行が筋再生を上回るために筋線維が減少し、繊維化が進行していくことがわかっている（非特許文献１２）。
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Hoffman, E. P., Brown, R. H., Jr., and Kunkel, L. M. (1987) Cell 51, 919-928
【非特許文献２】Ervasti, J. M., and Campbell, K. P. (1993) Curr. Opin. Cell Biol. 5, 82-87
【非特許文献３】Ervasti, J. M., and Campbell, K. P. (1991) Cell 66, 1121-1131
【非特許文献４】Brenman, J. E., Chao, D. S., Xia, H., Aldape, K., and Bredt, D. S. (1995) Cell 82, 743-752
【非特許文献５】Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., and Sweeney, H. L. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3710-3714
【非特許文献６】Fong, P. Y., Turner, P. R., Denetclaw, W. F., and Steinhardt, R. A. (1990) Science 250, 673-676
【非特許文献７】Chen, Y. W., Zhao, P., Borup, R., and Hoffman, E. P. (2000) J. Cell Biol. 151, 1321-1336
【非特許文献８】Haslett, J. N., Sanoudou, D., Kho, A. T., Bennett, R. R., Greenberg, S. A., Kohane, I. S., Beggs, A. H., and Kunkel, L. M. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 15000-15005
【非特許文献９】Bulfield, G., Siller, W. G., Wight, P. A., and Moore, K. J. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81, 1189-1192
【非特許文献１０】Sicinski, P., Geng, Y., Ryder-Cook, A. S., Barnard, E. A., Darlison, M. G., and Barnard, P. J. (1989) Science 244, 1578-1580
【非特許文献１１】Dangain, J., and Vrbova, G. (1984) Muscle Nerve 7, 700-704
【非特許文献１２】Roberts, R. G. (1995) Adv. Genet. 33, 177-231
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、筋損傷や筋力低下からの筋再生過程において、重要な調節因子としての機能を示す新規遺伝子を提供することにある。また、本発明は、該遺伝子を利用して筋損傷や筋力低下が関わる疾患の診断方法や、治療薬および検査薬を提供することをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、共にジストロフィンが欠損しているのにも関わらず、DMD患者とmdxマウスの症状に違いがみられるのは、DMD患者には筋損傷や筋力低下をもたらす因子が存在しているためであると考えた。筋損傷や筋力低下からの筋再生過程において、重要な調節因子としての機能を示す新規遺伝子が単離されれば、それらを用いて筋損傷や筋力低下が関わる疾患の診断や治療を行うことが出来ると考えられる。筋損傷や筋力低下が関わる疾患は難病とされ、これまでに適切な治療方法が確立されていなかったが、該新規遺伝子の診断や医療への利用はこれらの分野に極めて有用なものであるものと考えられる。そこで、本発明者は、筋損傷や筋力低下が関わる疾患としてデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)に着目して、その筋損傷や筋力低下に関与する遺伝子の単離を試みた。
【０００８】
本発明者はまず正常マウスとmdxマウスの骨格筋由来の細胞株を作製した。SV40ts Tをもつレトロウイルスベクターを感染させることで初代培養細胞を条件的に形質転換させることにより不死化を行った。レトロウイルスを感染させない場合、初代培養筋細胞は3-4回の継代後に増殖停止するのであるが、mdx-smとB10-sm細胞株は32.5 ℃ で１年以上維持された。これらの細胞株の倍化時間はほぼ一致していた。これらの細胞株を39.5 ℃で培養すると、全て増殖を停止し、筋管への分化が進行した。このことは温度依存的な細胞の不死化に成功したことを示している。
【０００９】
続いて培養された筋細胞の形態的な観察を行ったところ、mdxマウスから作製した筋細胞株(mdx-sm)はB10マウス由来の細胞株(B10-sm)より高い頻度で筋管様の構造を作ってin vitro分化することが判明した(図1A)。mdxマウスでは、ジストロフィンの欠損により筋線維の崩壊とそれを補う筋再生が連続的に起きていると考えられており、mdxマウスの大部分の筋芽細胞においては、損傷に応答するシグナル伝達系が活性化されていると推察される。
【００１０】
次に、マイクロアレイ解析によりmdx変異により影響を受ける遺伝子の検索をおこなった。本発明者はマウス胎仔と成体脳より由来する約4000種類のマウスcDNA断片（&gt;0.5 kb）を持つマウスcDNAマイクロアレイを用いた。蛍光ラベルしたmdx-sm とB10-sm細胞株由来のcDNAをハイブリダイズした後、mdx-smとB10-sm の蛍光強度の割合が1.5倍以上あるいは0.62倍以下の遺伝子を選んだ。また、疑似陽性を避けるために、蛍光標識を入れ替えたプローブでも同じ実験を行った。
【００１１】
cDNAマイクロアレイはPoly(A)+RNAはFastTrack 2.0 (Invitrogen)を用いて行った。マウス胎生17.5日胚と成体マウス脳由来の約4000種類のcDNAを持つマイクロアレイにB10あるいはmdxマウス骨格筋細胞株由来のmRNAより調製したCy3あるいはCy5でラベルしたcDNAをハイブリダイズさせた。蛍光シグナルはScanArray 4000 (GSI Lumonics) を用いて定量化され、そのデータはQuantArray softwareにより解析された。これらの結果より、mdxマウス細胞株で発現が昂進しているL-arginine:glycine aminodinotransferase、thymosin (4を含む12遺伝子、およびmdxマウス細胞株発現が低下しているselenoprotein P 、  新規の regeneration-associated muscle protease (RAMP)を含む7遺伝子を得ることが出来た(図1B)。
【００１２】
次に、mdxとB10マウスの骨格筋自体におけるthymosin (4 と Arg/Gly aminodinotransferase を含む5つのmRNAの発現をRT-PCRで調べた。その結果、骨格筋自体における5つのmRNAの発現は、細胞株と同様の発現パターンを示した(図1C, 表1)。一方、GARG16, selenoprotein P 、RAMP mRNAの発現を調べたところ、imdx骨格筋では発現が昂進していた(図1C, 表1)。
【００１３】
ジストロフィンは筋管や成熟した筋線維に発現し、増殖中の筋細胞には発現しないことが知られている。mdx-sm細胞では、ジストロフィン遺伝子の変異により遺伝子の発現変動が起こった、あるいはジストロフィンmRNAあるいはタンパク質の欠失により遺伝子の発現変動が起こった可能性を排除するために、本発明者はdoxycyclin (Dox) 誘導性プロモーター下でマイクロジストロフィンを持続的に発現するmdx-sm細胞を作製した(図2A)。図2Bに示されるように、Doxを培地に添加して48時間後、マイクロジストロフィンmRNAとタンパク質の発現がmdx-sm細胞に誘導された。しかしながら、thymosin (4,、selenoprotein P 、 RAMPを含むmdxマウスで発現パターンが異なっていた遺伝子の発現レベルはDoxを添加しても変化しなかった(図2C)。これらの結果よりmdx-smとB10-sm細胞間での異なる遺伝子発現はジストロフィンの発現とは無関係であることが判明した。
【００１４】
次に、再生筋においてRAMP mRNAの発現が昂進していることに注目し、RAMPタンパク質の一次構造の予測、およびノーザンブロット解析およびin situ hybiridizationによる、RAMP mRNAの発現確認を行った。マウスRAMP cDNA (accession no. XM149185)はデータベース中では3085 bpの長さで、予想されるアミノ酸配列は720 残基である(図3A)。データベースのBLAST searchによりマウスRAMPタンパク質は機能が未知であるヒトタンパク質DKFZP586H2131 (accession no. MN015430)と88%の相同性があることが明らかになり、DKFZP586H213をヒトRAMPと呼ぶことにした。図3Bの模式図に示されるようにマウスRAMPタンパク質はN末領域に分泌シグナル配列 (1-22)、CUB ドメイン (122-236)、2つのcomplement control protein (CCP) modules (Sushi ドメインとしても知られている) (280-342 と 389-442)、1つのトリプシン様セリンプロテアーゼ ドメインn (444-715)を持っている。CUB とCCP/Sushi ドメインは、発生期に発現制御されているタンパク質と細胞接着性分子にそれぞれ頻繁に存在している。これらのサブドメイン構造はヒトRAMPタンパク質にも同様に保存されている。マウスRAMPの予想される分子量は82.1 kDa、等電点は7.3である。ノーザンブロット解析およびin situ hybiridizationの結果、正常な成体獣マウスではRAMP mRNAは脳と骨格筋に約4.5 kbのシングルバンドとして検出されることが判明した(図3C)。従って、RAMPは骨格筋で機能する新規の分泌型プロテアーゼである可能性が示された。
【００１５】
次にRAMP mRNAの発現が再生中の骨格筋線維で変化していないか調べた。まず緋腹筋に筋損傷を与え、RAMP mRNAの発現をRT-PCR解析および、in situハイブリダイゼーション解析により確認を行った。これらの結果より、RAMP mRNAの発現は筋損傷後徐々に増加し、筋損傷後4日目にピークに達した後、1-2週間内に元の発現レベルまで低下する事が明らかになった(図4A)。マウス筋損傷モデルで見られた一過的なRAMP mRNAの発現と一致して、in situハイブリダイゼーション解析ではRAMP mRNAは特に中心核を持つ再生筋線維に強く発現し(矢印で示されている)、損傷を受けていない筋線維 (矢頭で示されている) には殆ど発現しないことが明らかになった(図4B)。従って、RAMP 遺伝子は骨格筋損傷により誘導されることが判明した。
【００１６】
さらに、ヒト正常骨格筋由来の細胞株と比べ、６人のDMD患者骨格筋由来の細胞株ではRAMP mRNAの発現が低下していることが判明した（表1）。これらの結果はRAMPが骨格筋の再生に非常に重要な働きをし、その発現低下はヒトDMDの病態進行に関与している可能性を示唆している。
【００１７】
即ち、本発明者は、筋損傷や筋力低下からの筋再生過程において、重要な調節因子としての機能を示す新たな遺伝子を単離することに成功した。また、本発明者は該遺伝子を利用することにより、筋損傷や筋力低下を引き起こしている患者の筋再生能力を回復させる、または増強することの出来る被験化合物のスクリーニングや、被験者が筋損傷や筋力低下を引き起こしているか否かの診断を行うことが可能であることを見出し、これにより本発明を完成するに至った。
【００１８】
本発明は、より具体的には、
〔１〕（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ） 配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１または３のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるDNA
（ｄ）配列番号：１または３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
〔２〕〔１〕に記載のDNAを含むベクター。
〔３〕〔１〕に記載のDNAまたは〔２〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
〔４〕〔１〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質。
〔５〕〔３〕に記載の形質転換細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から組換えタンパク質を回収する工程を含む、〔４〕に記載のタンパク質の製造方法。
〔６〕〔４〕に記載のタンパク質に結合する抗体。
〔７〕配列番号：１または３に記載の塩基配列またはその相補配列に相補的な少なくとも15の連続する塩基を含むポリヌクレオチド。
〔８〕被験試料が、〔４〕に記載のタンパク質に結合するか否かを評価する方法であって、
（ａ）〔４〕に記載のタンパク質に被験試料を接触させる工程、
（ｂ）被験試料と該タンパク質との結合活性を測定する工程、
を含み、結合活性の有無により被験試料が〔４〕に記載のタンパク質に結合するか否かを判定する方法。
〔９〕被験試料が、〔１〕に記載のDNAの発現を高めるか否かを評価する方法であって、
（ａ）〔１〕に記載のDNAを発現する細胞に被験試料を接触させる工程、
（ｂ）該細胞における〔１〕に記載のDNAの発現レベルを測定する工程、
を含み、上記DNAの発現レベルが、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が〔１〕に記載のDNAの発現を高めると判定する方法。
〔１０〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、〔４〕に記載のタンパク質に結合する被験試料のスクリーニング方法。
（ａ）〔８〕に記載の評価方法により、複数の被験試料が、〔４〕に記載のタンパク質に結合するか否かを評価する工程。
（ｂ）複数の被験試料から、〔４〕に記載のタンパク質に結合すると評価された試料を選択する工程。
〔１１〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、〔４〕に記載のタンパク質の発現を高める被験試料のスクリーニング方法。
（ａ）〔９〕に記載の評価方法により、複数の被験試料が、〔４〕に記載のタンパク質の発現を高めるか否かを評価する工程。
（ｂ）複数の被験試料から、〔４〕に記載のタンパク質の発現を高めると評価された試料を選択する工程。
〔１２〕筋ジストロフィーを診断する方法であって、
（ａ）被験者から筋組織を抽出する工程。
（ｂ）抽出した筋組織において、〔１〕に記載のDNAの発現を検出する工程。
を含み、被験者における〔１〕に記載のDNAの発現量が、健常者における〔１〕に記載のDNAの発現量より少ない場合に、筋ジストロフィーの危険があると診断する方法。
〔１３〕〔１〕に記載のDNA、〔４〕に記載のタンパク質、または〔１０〕もしくは〔１１〕の方法により同定された化合物を含む、筋ジストロフィーの治療薬。
〔１４〕〔６〕の抗体、〔７〕のポリヌクレオチド、または〔１０〕に記載の方法により同定された化合物を含む、筋ジストロフィーの診断薬。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、筋損傷や筋力低下からの筋再生過程において、重要な調節因子としての機能を示す新たな遺伝子が提供された。これまで、筋損傷や筋力低下が起こる疾患は難病とされており、明確な治療方法が存在していなかった。本発明において見出された新規遺伝子は筋再生過程において重要な調節因子として働くことが考えられるため、該遺伝子を利用することにより、筋損傷や筋力低下を引き起こしている患者の筋再生能力を回復させる、もしくは増強することの出来る化合物のスクリーニングを行うことができる。また、該遺伝子の発現や機能を指標として被験者が筋損傷や筋力低下を引き起こす可能性があるか否かの診断を行うことも可能である。また、本発明において見出されたDNAおよびタンパク質、該タンパク質の発現量を増加させる化合物は、筋損傷や筋力低下を引き起こしている患者における筋再生において有効な治療薬として働くことが考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、ヒト由来のRAMPタンパク質およびマウス由来のRAMPタンパク質をコードするDNAを提供する。ヒト由来RAMPのcDNAの塩基配列を配列番号：１に、該DNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。また、マウス由来RAMPのcDNAの塩基配列を配列番号：３に、該DNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。
【００２１】
RAMP遺伝子は、mdx細胞株で発現低下する７遺伝子の中で、唯一６例のDMD患者と２例のBMD患者由来の細胞株で正常ヒト細胞株と比較して発現が減少していた。マウスRAMP cDNAは3085bpの長さで、予想されるアミノ酸配列は720残基である。また、マウスRAMPタンパク質とヒトタンパク質は88%の相同性があることも判明した。RAMPタンパク質はアミノ末端領域に分泌シグナル配列（1-22）、CUBドメイン（122-236）、２つのcomplement control protein (CCP) modules (Sushiドメインとしても知られている)（280-342と389-442）、一つのトリプシン様セリンプロテアーゼドメインn(444-715)を持っており、CUBおよびCCP/Sushiドメインは、発生期に発現制御されているタンパク質として細胞接着性分子にそれぞれ頻繁に存在している。マウスRAMPの分子量は82.1 kDa、等電点は7.3と予想され、正常な成体獣マウスではRAMP mRNAは脳と骨格筋に約4.5kbのシングルバンドとして検出される。また、正常なマウスでは、RAMP mRNAは骨格筋と脳に発現が検出され、心臓では見られなかった。これらの分子構造から、RAMPは骨格筋で機能する新規の分泌型プロテアーゼであることが示唆される。
【００２２】
以前の研究でカテプシンSとカテプシンH遺伝子はmdx骨格筋で発現上昇していることが報告されているが、RAMP様のプロテアーゼは報告がない。Mdxマウスを用いたこれまでのマイクロアレイ解析でRAMP遺伝子が同定されなかった理由は、その発現量が非常に低いのに加えmdxマウスと正常マウスの骨格筋内でのmRNA発現にはほとんど違いが見られなかった為と考えられる。本発明により、RAMP mRNAは骨格筋損傷後、再生筋に特に発現が誘導されることわかり、このことよりRAMPは筋再生過程において、調節因子としての機能を示していることが明らかになった。筋再生中に、筋芽細胞は筋管に分化し、隣接する筋線維に融合するが、最近の報告よると、再生筋でのカルシウム濃度の増加はnuclear factors of activated T cells (NF-ATs)を脱リン酸化するカルシュニューリンを活性化し、骨格筋におけるNF-ATの特別なisoformが筋分化と筋芽細胞の融合に重要な働きをしていることがわかっている（Abbott, K. L., Friday, B. B., Thaloor, D., Murphy, T. J., and Pavlath, G. K. (1998) Mol. Biol. Cell. 9, 2905-2916、Delling, U., Tureckova, J., Lim, H. W., De Windt, L. J., Rotwein, P., and Molkentin, J. D. (2000) Mol. Cell. Biol. 20, 6600-6611）。筋管の融合を引き起こすIL-4が筋再生部位で発現誘導される（Horsley, V., Jansen, K. M., Mills, S. T., and Pavlath, G. K. (2003) Cell 113, 483-494）のと同様に、RAMP mRNAは中心核を持つ小さな再生筋で発現が誘導されることから、RAMPは筋再生過程の重要な調節因子であると考えられる。
【００２３】
このように、RAMPタンパク質は筋再生における重要な調節因子として機能していることから、該タンパク質をコードする遺伝子や該タンパク質は、筋損傷や筋低下が原因である疾患の治療に非常に有益なものであると考えられる。
【００２４】
本発明のRAMPタンパク質をコードするDNAには、ゲノムDNA、cDNA、および化学合成DNAが含まれる。ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、筋損傷や筋力低下からの回復力を持つ健常者や健常なマウスの組織からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できる）を作成し、これを展開して、本発明タンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号：１，３）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、本発明タンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号：１，３）に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRをおこなうことによって調製することも可能である。また、cDNAは、例えば、筋損傷や筋力低下からの回復力を持つ健常者や健常なマウスの組織から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。
【００２５】
本発明は、配列番号：２または４に記載のRAMPタンパク質（ヒト由来またはマウス由来）と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを包含する。ここで「RAMPタンパク質と同等の機能を有する」とは、筋損傷や筋力低下からの筋再生過程において、対象となるタンパク質が調節因子としての機能を有することを指す。対象となるタンパク質が筋再生の調節機構としてセリンプロテアーゼーの活性を有しうる。また、対象となるタンパク質は、CUBドメイン（発生中に発現制御されているタンパク質の細胞外領域に存在するドメイン）、CCP/Sushiドメイン（補体や接着タンパク質に存在するドメイン）、セリンプロテアーゼドメインという三つのドメインを持ち、筋再生の調節機構として各ドメインが独自の調節機能を有することが好ましい。
【００２６】
このようなDNAには、例えば、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アレル、バリアントおよびホモログが含まれる。
【００２７】
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするDNAを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、site-directed mutagenesis法（Kramer, W.&amp; Fritz,H.-J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA.Methods in Enzymology, 154: 350-367）が挙げられる。また、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても生じ得る。このように天然型のRAMPタンパク質をコードするアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAであっても、天然型のRAMPタンパク質（配列番号：２または４）と同等の機能を有するタンパク質をコードする限り、本発明のDNAに含まれる。また、たとえ、塩基配列が変異した場合でも、それがタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）もあり、このような縮重変異体も本発明のDNAに含まれる。
【００２８】
また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、RAMPタンパク質のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、該タンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明に含まれる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
【００２９】
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666、Zoller, M. J. &amp; Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433 、Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413）。
【００３０】
配列番号：２または４に記載のRAMPタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E.M. (1975) Journal of Molecular Biology, 98, 503）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, R. K. et al. (1985) Science, 230, 1350-1354、Saiki, R. K. et al. (1988) Science, 239, 487-491）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、RAMP遺伝子の塩基配列（配列番号：１または３）もしくはその一部をプローブとして、またRAMP遺伝子（配列番号：１または３）に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをプライマーとして、ヒトやマウスおよび他の動物からRAMP遺伝子と高い相同性を有するDNAを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やPCR技術により単離しうるRAMPタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAもまた本発明のDNAに含まれる。
【００３１】
このようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、6M尿素、 0.4%SDS、0.5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件を用いることにより、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。これにより単離されたDNAは、アミノ酸レベルにおいて、RAMPタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２または４）と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%,96%,97%,98%,99%以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【００３２】
本発明によるRAMP（あるいはそのホモログ）をコードするDNAは、適当なベクターに組み込むことによってRAMP（あるいはそのホモログ）発現用ベクターとすることができる。更にこのベクターを発現可能な宿主に形質転換することによって、本発明による形質転換体を得ることができる。
【００３３】
DNA断片を挿入するためのベクターDNAは、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。プラスミドDNAとしては、例えばプラスミドpUCl18（宝酒造社製）、pBluescript SK＋（Stratagene 社製）、pGEM-T（Promega 社製）等が挙げられ、ファージDNAとしては、例えばM13mp18、 M13mp19等が挙げられる。ベクターDNAとしてプラスミドDNAを用いる場合は、例えばEcoRI DNA断片を挿入する際に、プラスミドDNAを制限酵素 EcoRI（NEB社製）を用いて消化しておく。次いで、DNA断片と切断されたベクターDNAとを混合し、これに、例えばT4DNAリガーゼ（宝酒造社製）を作用させて組換えベクターを得る。
【００３４】
宿主としては、目的とする遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、真核細胞および原核細胞のいずれをも用いることができる。真核細胞としては、酵母、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、あるいは昆虫細胞等が挙げられる。一方原核細胞では、大腸菌（Escherichia coli）やバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等の細菌が挙げられる。
【００３５】
大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、本発明の組換えベクターが該宿主中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、本発明の遺伝子、転写終結配列を含む構成であることが好ましい。大腸菌としては例えばXLl-Blue（Stratagene 社製）、JM109（宝酒造社製）等が挙げられ、発現ベクターとしては、例えばpBTrp2等が挙げられる。また、プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。
【００３６】
本発明では、形質転換は、例えばHanahanの方法［Techniques for Transformation of E． coli In DNA Cloning, Vol.1, Glover, D.M．(ed.)，pp109-136, IRL Press(1985)］により行うことができる。酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えばYep13、 Ycp50等が挙げられる。プロモーターとしては、例えばgal 1プロモーター、gal 10プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポーレーション法[Methods.Enzymol.,194,pp182-187(1990)]、スフェロプラスト法 [Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84, pp1929-1933(1978)]、酢酸リチウム法[J.Bacteriol.,153,163-168(1983)］等が挙げられる。動物細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばpcDNAI、pcDNAI／Amp（インビトロジェン社）等が用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポーレーション法、リポフェクション法、あるいはリン酸カルシウム沈殿法等が挙げられる。昆虫細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばpVL1392、pVL1393（いずれもInvitrogen社）、 pMBac（Stratagene社）、pBacPAK8／9（Clontech社）等が用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、あるいはエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３７】
上記形質転換株のスクリーニングは、目的遺伝子の一部を含むDNA断片をプローブとしたコロニーハイブリダイゼーション、あるいは、目的の遺伝子の塩基配列に基づいた5'プライマー（FP：forward primer）を合成し、次いで、相補鎖DNAの塩基配列に基づいた3'プライマー（RP；reverse primer）を合成し、これらのプライマーを用いたPCR法により、目的とする遺伝子を含むコロニー（形質転換体）を選択し、採取することができる。
【００３８】
更に、本発明による形質転換体を培養することにより、本発明のRAMP（あるいはそのホモログ）を生産することができる。培養方法は特に限定されないが、液体培養法を採用することによって、発現の誘導や菌体の分離、あるいは発現生成物の単離等の操作を容易に行うことができる。本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００３９】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主とする形質転換体を培養する培地としては、天然培地、合成培地のいずれを用いることもできる。具体的には、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば特に限定されない。培養は、通常、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下、35〜40℃、好ましくは３７℃前後で14〜20時間行う。培養期間中、pHは7．2〜7．4に調整する。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質、ビタミン等を培地に添加することもできる。プロモーターとして誘導性のものを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（IAA）等を培地に添加してもよい。動物細胞を宿主とする形質転換体を培養する場合には、一般に使用されているRPMI-1640培地、DMEM培地またはこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、5%CO2存在下、３７℃で行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する特地としては、Grace's Insect Medium［Grace，T．C．C．Nature，195：788，(1962)］に10%ウシ胎児血清などの添加物を適宜加えたものなどが挙げられる。培地のpHは6．6〜7．0に調製し、通常25℃で1〜7日培養を行い、必要に応じて通気や攪拌を加える。
【００４０】
培養終了後、培養物（細胞破砕液、培養液またはそれらの上清中）より本発明のタンパク質を採取するには、通常のタンパク質精製手段を用いることができる。培養後、本発明のタンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合には、リゾチーム等の酵素を用いた溶菌処理、超音波破砕処理、磨砕処理等により菌体を破壊し、本発明のタンパク質を菌体外に排出させる。次いで、濾過または遠心分離を用いて不溶物を除去し、粗タンパク質溶液を得る。
【００４１】
一方、本発明のタンパク質が菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体または細胞を除去し、上清を得る。そして、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動法等を、単独または適宜組み合わせることにより、上記
培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。
【００４２】
あるいは本発明のRAMPタンパク質を、結合性リガンドとの融合タンパク質として発現させれば、この結合性リガンドの受容体と組み合わせることによってアフィニティクロマトグラフィーによる精製が可能となる。たとえば、ヒスチジン残基の連続からなるヒスチジンタグとの融合タンパク質を、ニッケルカラムで精製する方法が公知である。また、そのためのヒスチジンタグ含有ベクターも市販されている。結合性リガンドとRAMPをプロテアーゼなどで切断可能なリンカーを介して融合させておけば、アフィニティクロマトグラフィーに吸着した発現生成物を容易に回収することができるので便利である。
【００４３】
得られた組換えタンパク質を用いれば、これに結合する抗体を調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、精製した本発明のタンパク質若しくはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取し、血ぺいを除去することにより調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記タンパク質若しくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明には、本発明のタンパク質に結合する抗体が含まれる。これら抗体は、本発明のタンパク質をアフィニティー精製する際に利用することができる他、本発明のタンパク質の発現量検出等を通じて、被験者における本発明のタンパク質の発現異常や構造異常に起因する疾患の検査や診断に用いることができる。または、遺伝子治療などにより本発明のDNAが導入された患者において、導入されたDNAより本発明のタンパク質が発現していることを確認する目的でも用いることができる。さらには、本発明のタンパク質と相互作用する因子を本抗体で免疫沈降させることにより、該相互作用する因子を得る道具としても利用することができる。これらの抗体を用いることにより、生物の体内におけるRAMPタンパク質の発現位置および量の確認、被験者が筋損傷や筋力低下により引き起こる疾患（例えば筋ジストロフィー）を発症するか否かの診断を行うことが出来る。例えば、DMD患者とBMD患者由来の細胞株においては、RAMP遺伝子の発現量が低下していることがわかっているため、該抗体によりRAMP遺伝子の発現量の確認を行うことで、被験者が筋ジストロフィーを発症しているか否かを診断することが可能である。
【００４４】
本発明はまた、本発明のRAMPタンパク質をコードするDNAのセンス鎖またはその相補鎖に相補的な少なくとも15の連続する塩基を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のRAMPタンパク質をコードするDNAの検出や増幅に用いるプローブやプライマー、該DNAの発現を検出するためのプローブやプライマー、本発明のタンパク質の発現を制御するためのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えば、アンチセンスポリヌクレオチドやリボザイム、またはこれらをコードするDNA等）として使用することができる。また、本発明のポリヌクレオチドは、DNAアレイの基板の形態で使用することができる。該ポリヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、本発明のDNAまたはその相補鎖の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。また、プライマーとして用いる場合、3'側の領域は相補的とし、5'側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。また、上記ポリヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、本発明のDNAまたはその相補鎖の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成ポリヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも15bp以上の鎖長を有する。本発明のポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、ポリヌクレオチドの5'端を32Pでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーポリヌクレオチド等をプライマーとして32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。本発明のポリヌクレオチドは、例えば市販のポリヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得されるの二本鎖DNA断片として作製することもできる。
【００４５】
本発明はまた、被験試料が、RAMPタンパク質に結合するか否かを評価する方法を提供する。
【００４６】
本評価方法の態様としては、まず、RAMPタンパク質に被験試料を接触させる。第一の態様に用いられるRAMPタンパク質の状態としては、特に制限はなく、例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。また、RAMPタンパク質が発現している細胞としては、内在性のRAMPタンパク質を発現している細胞、または外来性のRAMPタンパク質を発現している細胞が挙げられる。上記内在性のRAMPタンパク質を発現している細胞としては、培養細胞などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。上記培養細胞としては、特に制限はなく、例えば、市販のものを用いることが可能である。内在性のRAMPタンパク質を発現している細胞が由来する生物種としては、特に制限はなく、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、酵母、昆虫などが挙げられる。また、上記外来性のRAMPタンパク質を発現している細胞は、例えば、RAMPタンパク質をコードするDNAを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。また、上記外来性のRAMPタンパク質を有する細胞は、例えば、RAMPタンパク質をコードするDNAを、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により、染色体へ挿入することで作製することができる。このような外来性のRAMPタンパク質が導入される細胞が由来する生物種としては、哺乳類に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。
【００４７】
本発明の方法における「被検試料」としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験試料は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、「複数の被験試料」としては、特に制限はなく、例えば、上記被験試料に加えて、これらの被験試料を複数種混合した混合物も含まれる。
【００４８】
また、RAMPタンパク質が発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、RAMPタンパク質をコードするDNAを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。
【００４９】
また、本発明において「接触」は、RAMPタンパク質の状態に応じて行う。例えば、RAMPタンパク質が精製された状態であれば、精製標品に被験試料を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被験試料を添加することにより行うことができる。被験試料がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするDNAを含むベクターを、RAMPタンパク質が発現している細胞へ導入する、または該ベクターをRAMPタンパク質が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた2ハイブリッド法を利用することも可能である。
【００５０】
次いで、上記RAMPタンパク質の結合活性を測定する。本発明の結合活性の検出方法は、好ましくは、RAMPタンパク質と結合した被験試料の量を測定する工程を含む。RAMPタンパク質への、被験試料の結合量は、これらの物質を標識しておくことにより測定することができる。被験試料は、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、酵素活性物質、あるいはタグによって標識することができる。RAMPタンパク質に結合した被験試料を測定するには、RAMPタンパク質を反応液から分離し、分離された画分に含まれる標識を測定すれば良い。RAMPタンパク質を予め固相に結合させておくと、RAMPタンパク質を容易に反応液から分離することができる。固相には、磁性粒子や反応容器の内壁などが一般に用いられる。
【００５１】
本発明の結合活性の検出方法に基づいて、前記RAMPタンパク質に対する結合活性を有する化合物の評価方法が提供される。すなわち前記検出方法の結果、RAMPタンパク質への結合活性を測定し、被験試料群の中から結合活性が大きい物質を選択することにより、RAMPタンパク質に対する結合活性を有する物質をスクリーニングすることができる。本発明の評価方法によって得られる物質は、前記RAMPタンパク質に対する結合作用を有することから、前記RAMPタンパク質のアゴニスト、あるいはアンタゴニストとして作用する可能性が大きい。このような物質は、本発明のRAMPタンパク質の活性調節剤として有用である。また、被験者が体内においてRAMPタンパク質を正常に発現しているかの診断において、診断薬として有用である。
【００５２】
上記評価方法を使用して、複数の被験試料から本発明のRAMPタンパク質に結合する試料を選択することで、効率的に、本発明のRAMPタンパク質に結合する化合物をスクリーニングすることが可能となる。本発明は、このようなスクリーニング方法もまた提供する。
【００５３】
本発明はまた、被験試料が、RAMPタンパク質をコードするDNAの発現を高めるか否かを評価する方法を提供する。
【００５４】
本評価方法としては、まず、本発明のRAMPタンパク質をコードするDNAを発現する細胞に被験試料を接触させる。ここで「DNAの発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。本方法における「被検試料」と「接触」については、上記記載の内容と同等のものである。次いで、上記細胞における本発明のRAMPタンパク質をコードするDNAの発現レベルを測定する。本発明のRAMPタンパク質をコードするDNAの発現レベルは、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、該DNAのmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはRT-PCR法を実施することによって該DNAの転写レベルの測定を行うことができる。さらに、DNAアレイ技術を用いて、該DNAの発現レベルを測定することも可能である。また、該遺伝子からコードされるRAMPタンパク質を含む画分を定法に従って回収し、該RAMPタンパク質発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、該DNAの翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、RAMPタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施し、該RAMPタンパク質の発現を検出することにより、該DNAの翻訳レベルの測定を行うことも可能である。本評価方法においては、本発明のRAMPタンパク質をコードするDNAの発現レベルが、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、該DNAの発現を上昇させると判定される。
【００５５】
上記評価方法を使用して、複数の被験試料から本発明のRAMPタンパク質をコードするDNAの発現を上昇させる試料を選択することで、効率的に、本発明のRAMPタンパク質をコードするDNAの発現を上昇させる化合物をスクリーニングすることが可能となる。本発明は、このようなスクリーニング方法もまた提供する。
【００５６】
本発明は、また、本発明のRAMP蛋白質をコードするDNAの発現を検出することを特徴とする、筋ジストロフィーの診断方法を提供する。
【００５７】
本実施例において、本発明のRAMP蛋白質をコードするDNAが、筋ジストロフィー患者から抽出した組織において、健常人と比較して有意に発現レベルが低下することが見出された。従って、被検患者から抽出した組織における、本発明のRAMP蛋白質をコードするDNAの発現を検出することにより、これら疾患の診断を行うことが可能である。ここで「DNAの発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。
【００５８】
本発明の診断方法は、例えば、以下の如く実施することができる。
【００５９】
被検患者より採取した組織から、常法によりRNAを抽出し、定量的PCR、ノーザンハイブリダイゼイション、あるいはドットブロットハイブリダイゼイションなどによりRAMP mRNAの定量を行い、診断することが可能である。また、上記組識から蛋白質を抽出し、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、ELISA等の方法を用いたRAMP蛋白質の定量、あるいは、非侵襲な方法として、RAMP蛋白質に結合する化合物や抗体を標識したものを被検患者に投与し、PET（ポジトロンエミッショントモグラフィー）などでの検出により診断することも可能である。
【００６０】
この診断の結果、被検者由来の組織における遺伝子の発現が、上記疾患に罹患した患者由来の組織における遺伝子の発現と、同一の傾向（例えば、正常組織と比較した遺伝子の発現レベルの低下）を示せば、該被検者は、疾患に罹患している、または罹患のおそれがあると判定される。
【００６１】
本発明は、また、本発明のRAMPタンパク質をコードするDNA、本発明のRAMPタンパク質、または本発明のスクリーニング方法により同定された化合物を含む、筋ジストロフィーの治療薬および、本発明の抗体、本発明のポリヌクレオチドを含む、筋ジストロフィーの診断薬を提供する。
【００６２】
本発明におけるDNA、タンパク質、および各化合物を医薬品として用いる場合には、単離されたDNA、タンパク質、および各化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物として投与を行うことも可能である。例えば、薬理学上許容しうる担体（賦形剤、結合剤、崩壊剤、矯味剤、矯臭剤、乳化剤、希釈剤、溶解補助剤等）と混合して得られる医薬組成物または錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、眼軟膏等の製剤として経口または非経口に適した形態で処方される。患者への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がDNAによりコードされうるものであれば、該DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。
【実施例１】
【００６３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００６４】
mdxとB10マウス由来細胞株の作製
mdx変異を持つ骨格筋中の筋細胞における遺伝子発現プログラムが変化するかどうかを検討するために、mdxとB10マウス骨格筋由来の筋細胞株の作製をおこなった。SV40ts Tをもつレトロウイルスベクターを感染させることで初代培養細胞を条件的に形質転換させることにより不死化を行った。新規に本発明者らが作製したマウス由来の筋細胞株はmdxマウス由来をmdx-sm、B10マウス由来をB10-smと名付けた。
【００６５】
骨格筋細胞の初代培養と不死化は以下の方法（Pinset, C., and Montarras, D. (1994) Cell systems for ex vivo studies of myogenesis: A protocol for the isolation of stable muscle cell populations from newborn to adult mice. Cell biology: A laboratory handbook (Celis, J. E., Ed.), Academic Press, Inc., San Diego）で行った。2ヶ月齢のB10と mdxマウスより後肢の筋肉を取り出し、はさみでミンチ状にした後、5% トリプシン (Difco) /PBS中で37 ℃、30分間処理して解離させた。解離した筋組織を20% ウシ胎児血清 (FCS)と0.5% ペニシリン・ストレプトマイシン(PS) (Sigma)を含む高グルコース型 のダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に懸濁し、10 mlピペットでよく懸濁した後、100 μm ナイロンメッシュに通した。細胞はゼラチンコートした培養フラスコ内で、20% FCS, 4% Ultroser G (Biosepra, France) と0.5% PS を含むDMEM 中で24時間培養した。その後、初代筋芽様細胞を含む、非接着性の細胞を新しいフラスコに移した。２日間培養後、温度感受性SV40 large T抗原をコードするレトロウイルス（Lee, G. H., Ogawa, K., and Drinkwater, N. R. (1995) Am. J. Pathol. 147, 1811-1822）に半分の細胞を1日間感染させ、増殖している細胞が現れるまで32.5 ℃ の許容温度にて培養した。レトロウイルスの産生は以前報告されたパッケージング細胞株PLAT-E（Morita, S., Kojima, T., and Kitamura, T. (2000) Gene Ther. 7, 1063-1066）と pMESVts レトロウイルスベクター（Dr. Drinkwaterより分与）を用いて行った。約１ヶ月培養後Ultroser Gを増殖培地から除いた。  筋管への分化には、5% ウマ血清 (HS)を含むDMEM中で39.5 ℃ 、7 日間培養した。
【００６６】
レトロウイルスを感染させない場合、初代培養筋細胞は3-4回の継代後に増殖停止した。一方、mdx-smとB10-sm細胞株は32.5 ℃ で１年以上維持された。これらの細胞株の倍化時間はほぼ一致していた。これらの細胞株を39.5 ℃で培養すると、全て増殖を停止し、筋管への分化が進行した。このことは温度依存的な細胞の不死化に成功したことを示している。SV40 ラージT抗原を用いて骨格筋細胞株を作製しても、それらはin vitro分化能を保っている事はすでに報告されていた（Mouly, V., Edom, F., Decary, S., Vicart, P., Barbert, J. P., and Butler-Browne, G. S. (1996) Exp. Cell Res. 225, 268-276、Berghella, L., De Angelis, L., Coletta, M., Berarducci, B., Sonnino, C., Salvatori, G., Anthonissen, C., Cooper, R., Butler-Browne, G. S., Mouly, V., Ferrari, G., Mavilio, F., and Cossu, G. (1999) Hum. Gene Ther. 10, 1607-1617）。これを支持するように本発明で作製した骨格筋細胞株も筋管への分化能を持っていた。齧歯類の細胞はSV40 T抗原により完全に不死化されることが知られている（Manfredi, J. J., and Prives, C. (1994) Biochim. Biophys. Acta. 1198, 65-83）。しかしながら、ヒト初代培養細胞の分裂回数は in vitroではテロメラーゼ活性に依存しているので、SV40  T 抗原を持つヒト細胞でもテロメアの短縮により最終的には増殖停止と崩壊に向かうだろう。しかしながら、本発明のアプローチによりDMDやBMD患者の筋生検由来の筋細胞数をin vitroで十分に増やすことが出来た。
【００６７】
次に培養された筋細胞の形態的な観察を行うために、免疫染色を行った。4ウェルの培養皿（Nunc）で培養した細胞は0.1% Triton-X100を含む PBS で1 分間処理し、冷却メタノールで2分間固定した。PBSでリンスした後、2% BSA ( bovine serum albumin) (Sigma) を含むPBSで１時間処理、さらにウサギ抗デスミン抗体 (Progen, Germany)  (100倍希釈)を含むPBSで１時間インキュベートした。サンプルをPBSで洗浄した後、西洋ワサビベルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG  (Jackson Immunoresearch Laboratories)（250倍希釈）を含むPBSで1時間インキュベートした。3回洗浄した後。0.25% diaminobenzidine、0.075% H</SUB>2</SUB>O</SUB>2</SUB> 、 3.36 mM NiCl</SUB>2</SUB>を含むPBS中で発色させた。
【００６８】
その結果、mdxマウスから作製した筋細胞株(mdx-sm)はB10マウス由来の細胞株(B10-sm)より高い頻度で筋管様の構造を作ってin vitro分化することが判明した(図1A)。mdx-sm細胞におけるMEF2Cの発現の昂進はこの細胞株内で筋分化のプログラムが方向付けられていることを支持する。この特性はウイルス感染時のmdxマウス骨格筋の前駆細胞の状態を反映していると考えられる。成体マウスでは、筋線維上に位置する骨格筋幹細胞（サテライト細胞）は増殖停止状態にあり、運動や損傷などの機械的な刺激にのみ応答して活性化する。筋再生の過程では、サテライト細胞が筋芽細胞へと分化し、それらが増殖した後に、残存する筋線維に融合すると考えられている（Seale, P., Asakura, A., and Rudnicki, M. A. (2001) Dev. Cell 1, 333-342）。mdxマウスでは、ジストロフィンの欠損により筋線維の崩壊とそれを補う筋再生が連続的に起きていると考えられている。以前の報告（Kolodziejczyk, S. M., Walsh, G. S., Balazsi, K., Seale, P., Sandoz, J., Hierlihy, A. M., Rudnicki, M. A., Chamberlain, J. S., Miller, F. D., and Megeney, L. A. (2001) Curr. Biol. 11, 1278-1282）と一致して、mdxマウスの大部分の筋芽細胞においては、JNK/p38 MAP kinases含めて損傷に応答するシグナル伝達系が活性化されているものと推察される。mdx-sm細胞株のサブクローンはどれもがより高頻度でデスミン陽性の筋管様構造を作った。レトロウイルスの感染は分裂中の細胞にのみ起こるので、mdx-sm細胞株はmdx骨格筋内で増殖している筋芽細胞を不死化したものといえよう。このことはヒト患者由来の筋細胞株にも当てはまると考えられる。従って、これらの細胞株での遺伝子発現プログラムの大部分（全部ではないが）は、in vivoの骨格筋にある筋芽細胞の遺伝子プログラムを示していると考えられる。
【実施例２】
【００６９】
cDNAマイクロアレイ解析によるmdx-smで発現変動する遺伝子の同定
DNAチップ解析はテストしたい細胞と正常な細胞とで全ての遺伝子発現のプロファイルを比較するのに強力な方法である。本発明者らはマウス胎仔と成体脳より由来する約4000種類のマウスcDNA断片（&gt;0.5 kb）を持つマウスcDNAマイクロアレイを用いた。蛍光ラベルしたmdx-sm とB10-sm細胞株由来のcDNAをハイブリダイズした後、mdx-smとB10-sm の蛍光強度の割合が1.5倍以上あるいは0.62倍以下の遺伝子を選んだ(データは示していない)。また、疑似陽性を避けるために、蛍光標識を入れ替えたプローブでも同じ実験を行った。
【００７０】
cDNAマイクロアレイはPoly(A)+RNAはFastTrack 2.0 (Invitrogen)を用いて行った。以前に報告された方法（Yoshikawa, T., Nagasugi, Y., Azuma, T., Kato, M., Sugano, S., Hashimoto, K., Masuho, Y., Muramatsu, M., and Seki, N. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 275, 532-537、Maeda, S., Otsuka, M., Hirata, Y., Mitsuno, Y., Yoshida, H., Shiratori, Y., Masuho, Y., Muramatsu, M., Seki, N., and Omata, M. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 284, 443-449）に従って、マウス胎生17.5日胚と成体マウス脳由来の約4000種類のcDNAを持つマイクロアレイにB10あるいはmdxマウス骨格筋細胞株由来のmRNAより調製したCy3あるいはCy5でラベルしたcDNAをハイブリダイズさせた。蛍光シグナルはScanArray 4000 (GSI Lumonics) を用いて定量化され、そのデータはQuantArray softwareにより解析された。この方法で、本発明者らはmdx-smで発現が昂進する20遺伝子と発現低下する21遺伝子を同定した。
【００７１】
これらの候補遺伝子の発現変動を確認するために、本発明者らはmdx-sm B10-sm細胞由来のmRNAを用いてノーザンブロット解析を行った。成体C57BL/6マウスの様々な組織由来のPoly(A)+RNAs (2 μg) を1% ホルムアルデヒド-アガロースゲルにより電気泳動し、Hybond-N+nylon membrane (Amersham Pharmacia Biotech)にブロット後、[α-32P] dCTPでラベルされたcDNAプローブと42 ℃で一晩ハイブリダイズした。 それぞれのレーンに流したRNA量を検証するためにβ-チューブリンのプローブでリハイブリダイゼーションを行った。最も厳しい条件にてメンブレンを洗浄後、オートラジオグラフィーによりシグナルを検出した。図1Bに示されるようにschwannomin-interacting protein 1 (SCHIP-1)（Goutebroze, L., Brault, E., Muchardt, C., Camonis, J., and Thomas, G. (2000) Mol. Cell. Biol. 20, 1699-1712）, mc7 (dystrophin結合タンパク質)（Boutou, E., Matsas, R., and Mamalaki, A. (2001) Brain Res. Mol. Brain Res. 86, 153-167）, thymosin (4 (G-actin 重合阻害タンパク質)（Huff, T., Muller, C. S., Otto, A. M., Netzker, R., and Hannappel, E. (2001) Int. J. Biochem. Cell Biol. 33, 205-220）, and L-arginine:glycine (Arg/Gly) aminodinotransferase（Guthmiller, P., Van Pilsum, J. F., Boen, J. R., and McGuire, D. M. (1994) J. Biol. Chem. 269, 17556-17560）はB10-smよりmdx-smにおいて発現昂進しており、GARG16 (グルココルチコイド制御タンパク質)（Smith, J. B., and Herschman, H. R. (1996) Arch. Biochem. Biophys. 330, 290-300）, selenoprotein P (抗酸化タンパク質)（Mostert, V. (2000) Arch. Biochem. Biophys. 376, 433-438）, and EST-MNCb1423 (本発明でRAMPと名付けられた)がmdx-smで発現低下していることが明らかになった。加えて筋分化促進活性を持つMEF2C（Lin, Q., Schwarz, J., Bucana, C., and Olson, E. N. (1997) Science 276, 1404-1407）を含む8つの遺伝子がmdx-sm細胞で発現昂進し、 4つの遺伝子が発現低下していることが明らかになった(表1)。この遺伝子発現パターンは全てのmdx-smサブクローンで一致していた。16個の発現変動が見られた遺伝子のうち、13は機能が既知のタンパク質をコードし、残り3つはexpressed sequenced tags (EST)としてdatabaseに登録されていた。
【００７２】
次に、mdxとB10マウスの骨格筋自体におけるthymosin (4 と Arg/Gly amidinotransferase を含む5つのmRNAの発現をRT-PCRで調べた。RT-PCR解析にはTRIzol (Gibco)を用いて骨格筋や様々な細胞株より調製した全RNAを鋳型にした。5 (gのtotal RNAはオリゴ(dT)プライマーを用いてthe superscript preamplification system for first strand cDNA synthesis (Invtrogen) により 逆転写された。cDNA混合液の一部を鋳型とし、ExTaq DNA polymerase (Takara)とTable1に記した特異的なプライマーセットを用いてPCR反応を行った。その結果骨格筋自体における5つのmRNAの発現は、細胞株と同様の発現パターンを示した(図1C, 表1)。一方、GARG16, selenoprotein P 、RAMP mRNAの発現を調べたところ、imdx骨格筋では発現が昂進していた(図1C, 表1)。  これによりmdxマウスの増殖中の筋細胞と成獣内の筋線維とでは遺伝子発現プログラムは必ずしも一致していないことが明らかになった。
【００７３】
【表１】
2005073574.tif 000002
N.D.は検知できなかったもの、N.T.はテストを行っていないものを示す。
【実施例３】
【００７４】
mdx細胞株でのジストロフィン導入による遺伝子発現の効果の確認
ジストロフィンは筋管や成熟した筋線維に発現し、増殖中の筋細胞には発現しないことが知られている。mdx-sm細胞では、ジストロフィン遺伝子の変異により遺伝子の発現変動が起こった、あるいはジストロフィンmRNAあるいはタンパク質の欠失により遺伝子の発現変動が起こった可能性を排除するために、本発明者らはdoxycyclin (Dox) 誘導性プロモーター下でマイクロジストロフィンを持続的に発現するmdx-sm細胞を作製した(図2A)。
これらの細胞の作成は、ヒトマイクロジストロフィンcDNAの構築とトランスフェクションにより行った。４つのロッド配列と３つのヒンジ領域を持つヒトマイクロジストロフィンcDNAの構築は報告された論文を元に行った(Sakamoto, M., Yuasa, K., Yoshimura, M., Yokota, T., Ikemoto, T., Suzuki, M., Dickson, G., Miyagoe-Suzuki, Y., and Takeda, S. (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun. 293, 1265-1272) 。ヒト骨格筋細胞より調製したcDNAを鋳型として、2つのプライマーセットHD1 (5'-CTCGAGATGCTTTGGTGGGAAGAAGT-3'／配列番号：５) and HD2 (5'-TCTTTCAAGGGTATCCACAGTAATCTGCCTCTTC-3' ／配列番号：６) or HD3 (5'-ATTACTGTGGATACCCTTGAAAGACTCCAGGAAC-3' ／配列番号：７) and HD4 (5'-GCGGCCGCCTACATTGTGTCCTCTCTCAT-3' ／配列番号：８)を用いて2つのPCR反応を別々に行った。2つのPCR産物を混合し、さらにHD1とHD4で再増幅し、約4.6 kbpのcDNAが得られた。これをpPCR-Script Amp SK(+) vector (Stratagene)にクローニング後、XhoI/ NotI 処理し、得られた  cDNA断片をreverse tet-regulated retrovirus vector pLRT-X (Dr. Hagiwaraより分与) (Watsuji, T., Okamoto, Y., Emi, N., Katsuoka, Y., and Hagiwara, M. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 234, 769-773)に挿入した。クローン化したmdxマウス由来細胞株にpLRT-microdystrophin vector を FuGENE 6 (Roche)を用いて導入し、5 (g/ml blasticidin Sを含む増殖培地で3週間培養し、ヒトマイクロジストロフィンを恒常的に発現する細胞株を作製した。
【００７５】
図2Bに示されるように、Doxを培地に添加して48時間後、マイクロジストロフィンmRNAとタンパク質の発現がmdx-sm細胞に誘導された。しかしながら、thymosin (4,、selenoprotein P 、 RAMPを含むmdxマウスで発現パターンが異なっていた遺伝子の発現レベルはDoxを添加しても変化しなかった(図2C)。これらの結果よりmdx-smとB10-sm細胞間での異なる遺伝子発現はジストロフィンの発現とは無関係であることが判明した。
【実施例４】
【００７６】
RAMPの一次構造の確認
筋芽細胞は筋再生に重要な働きをするため、mdx-sm細胞株で発現変動する19遺伝子はDMD患者に見られる筋萎縮やmdxマウスのマイルドな筋疾患の進行どちらか、あるいは両方に重要な働きをしていることが考えられる。RAMP mRNAの発現が再生筋において昂進しているのが確認されたので (図4)、RAMP遺伝子に特に注目した。マウスRAMP cDNA (accession no. XM149185)はデータベース中では3085 bpの長さで、予想されるアミノ酸配列は720 残基である(図3A)。データベースのBLAST検索によりマウスRAMPタンパク質は機能が未知であるヒトタンパク質DKFZP586H2131 (accession no. MN015430)と88%の相同性があることが明らかになり、DKFZP586H213をヒトRAMPと呼ぶことにした。図3Bの模式図に示されるようにマウスRAMPタンパク質はN末領域に分泌シグナル配列 (1-22)（von Heijne, G. (1985) J. Mol. Biol. 184, 99-105）、CUB ドメイン (122-236)（Bork, P., and Beckmann, G. (1993) J. Mol. Biol. 231, 539-545）、2つのcomplement control protein (CCP) modules (Sushi ドメインとしても知られている) (280-342 と 389-442)（Norman, D. G., Barlow, P. N., Baron, M., Day, A. J., Sim, R. B., and Campbell, I. D. (1991) J. Mol. Biol. 219, 717-725）、1つのトリプシン様セリンプロテアーゼ ドメインn (444-715)（Rawlings, N. D., and Barrett, A. J. (1993) Biochem. J. 290, 205-218）を持っている。CUB とCCP/Sushi ドメインは、発生期に発現制御されているタンパク質と細胞接着性分子にそれぞれ頻繁に存在している。これらのサブドメイン構造はヒトRAMPタンパク質にも同様に保存されている。マウスRAMPの予想される分子量は82.1 kDa、等電点は7.3である。正常な成体獣マウスではRAMP mRNAは脳と骨格筋に約4.5 kbのシングルバンドとして検出される(図3C)。従って、RAMPは骨格筋で機能する新規の分泌型プロテアーゼである可能性が示された。
【実施例５】
【００７７】
再生中の骨格筋線維におけるRAMP mRNAの発現誘導
次にRAMP mRNAの発現が再生中の骨格筋線維で変化していないか調べた。まず緋腹筋に筋損傷を与え、RAMP mRNAの発現をRT-PCR解析および、in situハイブリダイゼーション解析により確認を行った。
【００７８】
まず、8週齢C57BL/10 マウス雄の緋腹筋に23G針を突き刺すことにより筋損傷を与えた。筋損傷を与えた後、継時的に緋腹筋を回収し、液体窒素で凍らせ、RNAを調整した。in situ ハイブリダイゼーション解析は、前脛骨筋に筋損傷を与えて6日後に筋肉を回収し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で冷凍した。厚さ10 (mの凍結切片を作製し、4% パラホルムアルデヒドを含む PBSで固定し、1 (g/ml proteinase K (Wako)を含むPBS中に室温で7分間処理した。  トリエタノールアミンに氷酢酸を加えてアセチレーション後、切片をジゴキシゲニンラベルしたセンス鎖あるいはアンチセンス鎖RNAプローブと65 ℃ 、18時間ハイブリダイゼーションした。洗浄と発色は以前報告した方法（Hara, T., Tamura, K., de Miguel, M. P., Mukouyama, Y., Kim, H., Kogo, H., Donovan, P. J., and Miyajima, A. (1998) Dev. Biol. 201, 144-153）で行った。
【００７９】
これらの結果より、RAMP mRNAの発現は筋損傷後徐々に増加し、筋損傷後4日目にピークに達した後、1-2  週間内に元の発現レベルまで低下する事が明らかになった(図4A)。マウス筋損傷モデルで見られた一過的なRAMP mRNAの発現と一致して、in situハイブリダイゼーション解析ではRAMP mRNAは特に中心核を持つ再生筋線維に強く発現し(矢印で示されている)、損傷を受けていない筋線維 (矢頭で示されている) には殆ど発現しないことが明らかになった(図4B)。従って、RAMP 遺伝子は骨格筋損傷により誘導されることが判明した。
【実施例６】
【００８０】
BMD/DMD患者由来骨格筋細胞株におけるRAMP mRNAの発現の確認
DMDの病態におけるRAMPの重要性を評価するために、本発明者らは健常人とBMD/DMD患者の筋生検由来の骨格筋細胞株を作製した。細胞株の作製はアンフォトロピックなレトロウイルスを用いたこと、ウイルスの感染時間をより長くしたことを除くと、マウス骨格筋細胞株の作製と同じ方法で行った。正常ヒト（52歳）、２人のBMD患者（1-6歳）、6人のDMD患者（1-6歳）の筋生検は病院医師と患者あるいはその両親との間のインフォームドコンセントに基づいて得た。ヒト筋細胞は酵素処理により解離させ、20% FCS と 5% ニワトリ胚抽出物（chicken embryo extract）を含むDMEM中で培養した。１週間の培養後、骨格筋細胞は温度感受性SV40 large T抗原をコードするレトロウイルスに２日間感染させ、 その後32.5 ℃で培養した。両種性（アンフォトロピック）レトロウイルスはPLAT-A パッケージング細胞を用いて産生した(S. M., T. K, 未出版)。本ヒト実験は、東京都臨床医学総合研究所および各大学病院のヒト実験倫理委員会の承認を得た上で実施した。
【００８１】
正常1、BMD由来2、DMD由来6例の筋生検よりSV40 tsT導入後、32.5 ℃で持続的に増殖する細胞株が1-2ヶ月以内に得られた。反対に非感染のコントロールは細胞増殖を停止した。mdx-sm細胞株と同様に、ヒトBMD/DMD由来の筋細胞株は39.5 ℃で培養すると筋管に分化した。Figure 5は代表的なBMD細胞株、BMD-sm1で、増殖培地における未分化状態(a)、分化培地に交換後(b)を示している。免疫化学染色により分化したBMD-sm1細胞株はデスミン陽性の筋管が高頻度で見られることが明らかになった(図5A-c/d)。他の8例のヒト筋由来細胞株も同様に増殖し、筋細胞の特徴を持っていたが、増殖速度はマウス細胞株と比較すると非常に低かった。mdx細胞株で発現昂進、発現低下した遺伝子のヒトの相同分子種に対する特異的なプライマーセットを作製し、9種類のヒト筋芽細胞株におけるこれらの遺伝子のmRNAの発現をRT-PCR解析により調べた。その結果、健常人由来の筋細胞株と比較して、Arg/Gly aminodinotransferase と EST-MNCb4008 mRNAは殆どのBMD/DMD患者由来の細胞株で発現が上昇していた(表1)。一方、全てのBMD/DMD患者由来の細胞株でRAMP mRNAの発現レベルは健常人由来の細胞株と比較して減少していた(図5B)。mdx-smとBMD/DMD患者由来の筋芽細胞株はともに共通してRAMPの発現減少を示すことから、RAMPはDMDの病態進行に関与している可能性が示唆される。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】mdxマウス由来骨格筋細胞株で発現変動する遺伝子群の同定を示す写真である。A.  B10-sm, mdx-sm細胞株における筋管分化。分化培養条件で培養したそれぞれの細胞を抗デスミン抗体で染色した。B.  mdxマウス由来骨格筋細胞株で発現変動する遺伝子群のノザンブロット解析。B10-sm, mdx-sm細胞株より抽出したmRNAを用いた。RNAの質・量を示すコントロールとしてβ-tubulin cDNAをプローブに使用した。C.  mdxマウス由来骨格筋細胞株で発現変動する遺伝子群のRT-PCR解析。B10およびmdxマウスの骨格筋そのものよりcDNAを調製して各遺伝子特異的なプライマーを用いて20サイクルのPCRをおこなった。等量のcDNA基質を示すコントロールとしてGAPDHを増幅した。
【図２】mdx-sm筋細胞株におけるマイクロジストロフィンの強制発現による影響を示す図および写真である。A. マイクロジストロフィン遺伝子をDox誘導性に発現させるpLRTベクターの構造図。B. pLRTベクターをトランスフェクトしたmdx-sm細胞株におけるDox誘導的なマイクロジストロフィンmRNAとタンパク質の発現を示す写真。C. mdx-sm細胞株で発現変動する遺伝子群に対するマイクロジストロフィンの影響を示す写真。Dox処理前後でのthymosinβ4, selenoprotein P, RAMPの発現を それぞれRT-PCRにて解析した。
【図３】RAMPの配列の図と組織分布を示す写真である。A.マウスおよびヒトRAMPタンパク質のアミノ酸配列の図。予測されるシグナル配列をボックスで囲い、CUBとCCp/Sushiドメインを二重線、太線でそれぞれ示した。また、トリプシン様のセリンプロテアーゼドメインを灰色ボックスで囲んだ。B.  RAMPタンパク質にみつかるそれぞれの構造モチーフの位置を模式的に示す図。C. RAMP mRNAの骨格筋・脳における特異的発現を示す写真。成獣マウスの各臓器のmRNAをそれぞれ2マイクログラムずつ電気泳動した後、ノザンブロット解析した。
【図４】筋損傷後のRAMP mRNAの発現上昇を示す写真である。A. 針でマウス緋腹筋に損傷を与えてから、5時間 (1レーン)、1日(2レーン)、2日(3レーン)、3日(4レーン)、4日(5レーン)、7日(6レーン)10日(7レーン)、14日(8レーン)後にそれぞれRNAを抽出し、30サイクルのRT-PCRにて解析した。等量のcDNA基質を示すコントロールとしてGAPDHを増幅した。B.  in situ hybridizationによる再生筋でのRAMP mRNAの検出。筋損傷を与えて6日後の前脛骨筋の凍結切片をDIG標識されたアンチセンス（a, c）、センス（b, d）cRNAプローブとそれぞれハイブリダイズした。特異的なシグナルは青色にて検出される。中心核を持つ再生筋（矢印）にRAMP mRNAは発現し、成熟筋線維（矢頭）では発現していない。図内の横棒は500 μm (a, b), あるいは200 μm (c, d)を表す。
【図５】ヒトBMD, DMD患者由来筋細胞株におけるRAMPの発現を示す写真である。A. BMD患者骨格筋由来細胞株BMD-sm1の筋管分化活性。39.5 ℃（a）、あるいは32.5 ℃ (b)で培養したときの細胞形態をそれぞれ示す。また、39.5 ℃ で培養したBMD-sm1細胞を抗デスミン抗体(d)、あるいは陰性コントロール抗体(c)にて免疫染色した。図内の横棒は150 μmを表す。B. 9種類のヒト骨格筋由来細胞株におけるRAMP mRNAのRT-PCR解析。健常人由来細胞株（1レーン）、BMD患者由来細胞株（２，３レーン）、DMD患者由来細胞株（４-９レーン）よりそれぞれcDNAを調製し、RAMP特異的なプライマーを用いて30サイクルのPCRをおこなった。等量のcDNA基質を示すコントロールとしてβ-tubulinを増幅した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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