(57)【要約】【目的】  優れたテロメレース抑制能を有する新規微生物と、この微生物を利用したテロメレース抑制剤を提供する。【構成】  Shewanella属微生物（例えばShewanella NB6603：FERM P-19702）であって、テロメレース抑制能を有することを特徴とする微生物と、この微生物菌体またはその菌体抽出物を有効成分とするテロメレース抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Shewanella属またはその近縁微生物であって、テロメレース抑制能を有することを特徴とする微生物。
【請求項２】
配列番号１の塩基配列と90％以上相同の16S rDNA配列を有する請求項１の微生物。
【請求項３】
Shewanella NB6603(FERM P-19702)である請求項1の微生物。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１以上の微生物菌体、または１以上の菌体抽出物を有効成分とするテロメレース抑制剤。
【請求項５】
請求項４のテロメレース抑制剤を含有する薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、テロメレース（telomerase）活性に対する抑制能を有する新規微生物と、この微生物菌体またはその菌体抽出物を有効成分とするテロメレース抑制剤、および薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子を担う染色体の末端部分はテロメア（telomere）と呼ばれ、(TTAGGG)の６塩基の繰り返し配列と蛋白質からなる特殊な高次構造をしており、染色体同士の融合を防いで、染色体構造を安定に保つ役割を果たしている。テロメアは、細胞分裂毎に約100塩基ずつ短縮し、限界の長さに達すると細胞は分裂能を喪失する。テロメレース（またはテロメラーゼ）は、テロメア配列を伸長する活性を有する酵素であり、その活性によってテロメア短縮を防ぐ働きがある。生体を構成する体細胞は、テロメレース活性が無いか、極端に低いために分裂能は有限であるのに対し、癌細胞の90%はテロメレース活性を有するために分裂能が無限である。
【０００３】
現在使用されている抗癌剤の最大の弱点は、癌細胞に対する特異性が低いことであり、正常な細胞にまで傷害を及ぼすために重とくな副作用が生じる。ゆえに、癌細胞に特異性の高い抗癌剤の開発が望まれている。テロメレースは、癌細胞に特異的に発現する酵素であり、正常体細胞では発現していないか、その活性が極端に低い。そのため、テロメレース抑制により、癌細胞の増殖を特異性高く阻害することが可能となる。
【０００４】
従って、これまでにも抗癌剤成分として有望なテロメレース活性の抑制機能を有する化合物が幾つか提案されている（例えば、特許文献１−３）。また、自然界から単離された物質を有効成分とするテロメレース抑制剤（阻害剤）としては、カテキンを有効成分とするテロメレース阻害剤（特許文献４）、子嚢菌亜門不整子嚢菌綱ユーロチウム目微生物の産生するフラボマンニンを有効成分とするもの（特許文献５）、子嚢菌亜門核菌網ソルダリア目微生物の産生する物質を有効成分とするもの（特許文献６）、子嚢菌門核菌網タマカビ目部生物の産生する物質を有効成分とするもの（特許文献７）、不完全菌亜門糸状不完全菌綱モニリア目微生物の産生する物質を有効成分とするもの（特許文献８）等が知られている。
【特許文献１】特開平11-130676号公報
【特許文献２】特開2001-81029号公報
【特許文献３】特開2002-104995号公報
【特許文献４】特開平11-246402号公報
【特許文献５】特開2001-31564号公報
【特許文献６】特開2002-47179号公報
【特許文献７】特開2002-47187号公報
【特許文献８】特開2002-47281号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この出願の発明は、テロメレース抑制物質を産生する新規な海洋微生物を提供することを課題としている。
【０００６】
またこの出願の発明は、前記微生物菌体またはその菌体抽出物を利用したテロメレース抑制剤と、薬剤を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この出願は、前記の課題を解決するための第１の発明として、Shewanella属またはその近縁微生物であって、テロメレース抑制能を有することを特徴とする微生物を提供する。
【０００８】
第1発明の微生物は、配列番号１の塩基配列と90％以上相同の16S rDNA配列を有する微生物である。
【０００９】
また第1発明の具体例として、この出願は、Shewanella NB6603(FERM P-19702)を提供する。
【００１０】
この出願は、第２の発明として、前記第１発明の微生物菌体、または１以上の菌体抽出物を有効成分とするテロメレース抑制剤を提供する。
【００１１】
さらにこの出願は、第３の発明として、前記第２発明のテロメレース抑制剤を含有する薬剤を提供する。
【００１２】
すなわち、この発明の微生物Shewanella属細菌は、冷温菌細菌であり、主に海底や海洋生物体内から単離されたものが知られている。また市販品も存在する（Shewanella putrefaciensa ATCC 8071、ATCC49138等）。これらのShewanella属細菌は、例えばアルカリフォスファターゼの製造や、プロテアーゼの製造のための微生物材料として利用されているが、このShewanella属細菌がテロメレース抑制能を有する物質を産生することは知られていない。
【００１３】
この出願の発明者らは、長崎県南松浦郡上五島町相河川河口の河口砂石で採取したShewanella属細菌が、優れたテロメレース抑制能を有することを見出してこの発明を完成させた。
【００１４】
なお、この発明における用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、この発明の薬剤の調製はRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
この発明のShewanella属に属する微生物は、具体的には、Shewanella alga、Shewanella violancea、Shewanella benthica、Shewanella colwelliana、Shewanella frigidimarina、Shewanella gelidmarina、Shewanella hanedai、Shewanella putrefaciensa、Shewanella sp等である。
【００１６】
この発明の微生物は、これらの微生物から、例えば後記実施例に示した方法によってテロメレース抑制能を検定し、強いテロメレース抑制を示す菌株を選択することによって得ることができる。すなわち、TRAP (Telomerase Reaction Amplification Protocol)アッセイによって、コントロール値に対する相対的抑制値が３０％以下、好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下の微生物を選択する。
【００１７】
この出願の発明は、微生物の具体例として、Shewanella NB6603株を提供する。
【００１８】
Shewanella NB6603株は、この出願の発明者らが長崎県南松浦郡上五島町相河川河口で採取した河口砂石から分離したShewanella属微生物であり、2004年2月26日付で独立行政法人産業技術研究所特許微生物寄託センターに受託番号FERM P-19702として特許寄託されている。
【００１９】
このShewanella NB6603株は、好気性のグラム陰性桿菌であり、dextrin、N-acetyl-glucosamine、L-arabinose、D-fructose、L-fructose、D-galactose、α-D-glucose、α-L-lactose、maltose、mannitol、mannose、D-melibiose、L-rhamnose、D-sorbitol、sucrose、xylitol、formic acid, D-galacturonic acid, γ-hydroxybutyric acid, α-keto butyric acid, α-keto glutaric acid, α-keto valeric acid, D, L-lactic acid, malonic acid, propionic acid, quinic acid, L-asparagine, D-serine, inosine, uridine, thymidineおよびglycerolの資化性を有している。
【００２０】
この微生物Shewanella NB6603株は塩類要求性を有し、海水培地で生育する。例えば、煮沸殺菌した人口海水Marine Agar 2216培地（pH7.6; Difco社）等で良好に生育させることができる。また、-80℃程度の温度で凍結保存することもできる。
【００２１】
さらに、Shewanella NB6603株はその16s rDNAが配列番号１の塩基配列を有することによって特徴付けることもできる。そして、この発明におけるShewanella属微生物とこの近縁微生物は、配列番号１の塩基配列と90%以上、好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上相同の16s rDNAを有する微生物と定義することもできる。
【００２２】
この発明のテロメレース抑制剤は、前記のとおりのテロメレース抑制能を有する１以上の微生物の菌体、または１以上の菌体抽出物を有効成分とする。
【００２３】
菌体としては、菌体破壊物や乾燥菌体を含む。また菌体抽出物としては、微生物の培養上清、その濃縮液、あるいは水またはアルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等）による公知の抽出法によって抽出された菌体成分等である。
【００２４】
この発明のテロメレース抑制剤は、前記のとおりの微生物菌体または菌体抽出物を実質的に単独で含むものであってもよく、あるいは培地や蒸留水等に懸濁したものであってもよい。
【００２５】
さらにこの発明の薬剤は、前記のテロメレース抑制剤を単独で、または２種以上を組み合わせて配合することができ、その配合量は、薬剤中のテロメレース抑制剤を0.001〜10重量%、好ましくは0.1〜5重量%程度とする。
【００２６】
この薬剤が対象とする疾患は癌疾患、すなわち、造血系癌（白血病、リンパ腫等）、浮遊癌（腹水癌、胸水癌等）および固形癌（食道癌、胃癌、肺癌、腎癌、甲状腺癌、耳下腺癌、頭頚部癌、骨・軟部肉腫、尿管癌、膀胱癌、子宮癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、卵管癌等）である。
【００２７】
この発明の薬剤には、前記の対象疾患の種類や薬剤の投与形態に応じて、通常の薬剤製造に用いられる各種の担体と混合して製剤化することもできる。担体は、広い範囲から適宜に選択することができるが、この発明の薬剤は、一つの形態として、経口的にまたは注射により投与しうる単位服用形態にあることが望ましい。特に、注射による投与の場合には、局所注入、腹腔内投与、選択的静脈内注入、静脈注射、皮下注射、臓器灌流液注入等を採用することができる。
【００２８】
懸濁剤およびシロップ剤のような経口液体調製物は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトース等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、ゴマ油、大豆油等の油類、アルキルパラヒドロキシベンゾエート等の防腐剤、ストロベリー・フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造することができる。
【００２９】
散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、シュークロース、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の表面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製剤化することができる。錠剤およびカプセル剤は、投与が容易であるという点において、この発明の薬剤における好ましい単位投与形態である。錠剤やカプセルを製造する際には、固体の製薬担体が用いられる。
【００３０】
また、注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物、各種の緩衝液等からなる担体を用いて製剤化することができる。また粉末状態で製剤化し、使用時に前記液体担体と混合して注射液を調製するようにしてもよい。
【００３１】
さらにこの発明の薬剤は、例えば皮膚癌等の表皮癌に対しては、外用剤の形態として製剤化することもできる。その場合の剤形は、坐薬、乳液、クリーム、分散液、軟膏、液剤、エアゾール等とすることができる。またこのような剤形とした場合、一般的な外用医薬品等に通常使用される各種の成分を、この発明の効果を損なわない範囲で適宜加えることができる。このような成分としては、例えば水、アルコール、油剤、界面活性剤、増粘剤、粉体、キレート剤、pH調整剤、各種薬効剤、動植物・微生物由来の抽出物、香料等である。
【００３２】
この発明の薬剤の投与量は、患者の年齢や体重、症状、投与経路等によって異なるが、前記のテロメレース抑制剤の血中濃度が10nmol〜0.1mmol、好ましくは5nmol〜0.5mmol程度となる量を投与すればよい。
【００３３】
以下、実施例として、この発明の微生物について行った試験結果を示す。
(1)  16s rDNA塩基配列の決定
長崎県南松浦郡上五島町相河川河口で採取した河口砂石から分離した微生物NB6603株から公知の方法（例えば、前記Sambrook and Maniatis、Ausubel, F. M. et al等）に基づいてDNAを抽出し、PCR法によって16s rDNAを増幅した。PCRプライマーとしては、27f（5'-agagtttgatcctggctcag-3'：配列番号２）およびr1L(5'-gtattaccgcggctgctgg-3'：配列番号３）を用いた。またPCR条件は表１のとおりとした。
【００３４】
【表１】
2005245314.tif 000002
【００３５】
増幅したDNAについてABI PRISMTM3100-Avant Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて塩基配列を解析後、得られた塩基配列をBLASTにより検索することにより種を確認した。その結果、この微生物NB6603株はShewanella属に属する微生物であり、その16s rDNAは配列番号１の塩基配列を有することが確認された。さらに、このShewanella属細菌と近縁種の系統樹をLasergene（DNASTAR, Inc.）ソフトウエアを用いてCLUSTAL Wにより作成した。
（2）テロメレース活性抑制能の確認
Shewanella NB6603株をマリンブロス5mlに白金耳で植え付け、20℃で4日間静置培養後、培養液を3600rpm 5分間遠心し、上清を分離した。スクリーニングはTelo TAGGG Telomerase PCR ELISA(Roche, USA)を用いて以下のように行った。細胞はヒト肺がん由来細胞（H1299）を用い、細胞2000個に相当する細胞抽出液を作製し、Shewanella NB6603株の培養上清を25倍希釈になるように加えて、96穴マイクロタイタープレートを利用したTRAP (Telomerase Reaction Amplification Protocol)アッセイを行った。テロメレース活性陽性の黄色の呈色を450nmの吸光度により定量し、テロメレース活性抑制能を検討した。
【００３６】
結果は、図1に示したとおりであり、Shewanella NB6603株培養上清に強いテロメレース活性抑制能が見られた。
（3）テロメレース活性抑制成分の温度安定性試験
Shewanella NB6603株の上清を100℃で3分間の加熱処理をし、前記（2）と同様の方法でテロメレース抑制能を試験した。結果は図2に示したとおりであり、加熱処理した細菌上清はテロメレース抑制能を喪失した。この結果から、この発明のShewanella属細菌が産生するテロメレース抑制物質は耐熱性ではないことが確認された。
（4）テロメレース活性抑制成分の分子量の推定
テロメレース活性抑制成分の分子量の推定を限外ろ過膜法を用いて行ったところ、分子量1万以上の分画においてテロメレース活性抑制能が見られた。
（5）がん細胞における細胞増殖抑制効果
正常細胞、がん細胞ともに一定の個数を培養し、翌日に細胞培養液中にShewanella NB6603株の培養上清を添加し、2週間培養した。その後、PBS(-)で洗浄後、99%メタノールで細胞を固定し、5%ギムザ液で染色し、形成された細胞のコロニー数を測定した。
【００３７】
その結果、Shewanella NB6603株培養上清は、ヒト正常細胞の細胞増殖に対しては影響を及ぼさなかった。これに対し、Shewanella NB6603株培養上清を添加したがん細胞ではコロニー数が減少したことから、Shewanella NB6603株培養上清はがん細胞増殖抑制効果を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
以上詳しく説明したとおり、この出願によって、優れたテロメレース抑制能を有する新規微生物が提供される。さらにこの出願によって、がん細胞の増殖抑制を作用機序とする薬剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】Shewanella NB6603株培養上清のテロメレース活性抑制効果を調べた結果である。
【図２】Shewanella NB6603株培養上清の耐熱性を調べた結果である。
【図１】
2005245314.tif 000003
【図２】
2005245314.tif 000004
【配列表】
2005245314000001.app