(57)【要約】【課題】  複数種類の細胞を共培養する培養系において、目的とする細胞の遺伝子発現量等といった、遺伝子発現の変化を選択的に定量することのできる細胞の遺伝子発現量の定量方法を提供する。【解決手段】  細胞の遺伝子発現量の定量方法であって、複数種類の細胞種を培養する共培養系において、それぞれの細胞の全RNAを抽出し、この全RNAを鋳型としてcDNAを合成し、このcDNAをコードするポリヌクレオチド鎖のうち、目的とする細胞の遺伝子のポリヌクレオチド鎖に対して特異的に結合する、複数種類の細胞種間での遺伝子相同性の低い領域のポリヌクレオチド鎖と同一配列のポリヌクレオチド鎖を有するプライマー（センスプライマー）と相補的なポリヌクレオチド鎖を有するプライマー（アンチセンスプライマー）とからなる2種類1組のプライマーを調整し、そしてこの2種類1組のプライマーを用いてリアルタイムPCRを行い、目的とする細胞の遺伝子発現量を選択的に定量測定することを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の遺伝子発現量の定量方法であって、複数種類の細胞種を培養する共培養系において、それぞれの細胞の全RNAを抽出し、この全RNAを鋳型としてcDNAを合成し、このcDNAをコードするポリヌクレオチド鎖のうち、目的とする細胞の遺伝子のポリヌクレオチド鎖に対して特異的に結合する、複数種類の細胞種間での遺伝子相同性の低い領域のポリヌクレオチド鎖と同一配列のポリヌクレオチド鎖を有するプライマー（センスプライマー）と相補的なポリヌクレオチド鎖を有するプライマー（アンチセンスプライマー）とからなる2
種類1組のプライマーを調整し、そしてこの2種類1組のプライマーを用いてリアルタイムPCRを行い、目的とする細胞の遺伝子発現量を選択的に定量測定することを特徴とする遺伝子発現量の定量方法。
【請求項２】
複数種類の細胞種間での遺伝子相同性の低い領域は、前記2種類1組のプライマーにおいて、このプライマーの中心15塩基以下の内、少なくとも1塩基以上がそれぞれの細胞種の
遺伝子間で相違する請求項１記載の遺伝子発現量の定量方法。
【請求項３】
遺伝子相同性の低い領域が、非翻訳領域に含有されている請求項１または２記載の遺伝子発現量の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、目的とする細胞の遺伝子発現量の定量方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、複数種類の細胞種が混在する培養系においても、目的とする細胞の遺伝子発現量を選択的に定量することのできる遺伝子発現量の定量方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内の器官は、複数種類の細胞が相互作用できるように三次元的に構成されている。この細胞間の相互作用は、発生段階の器官形成、組織の再生や修復、あるいは維持においても増殖、分化、老化等の細胞特性を相互に制御し合うという重要な役割を果たしている。このようなの観点から、近年、再生医学の分野において、複数種類の細胞の三次元培養に関する技術や研究が盛んに行われている。この三次元培養は、上記のとおり必然的に複数種類の細胞を共培養することが重要であるため、共培養に関する研究が盛んに行われている（たとえば、非特許文献１等）。そして、上記のように発生段階の器官形成、組織の再生や修復等を分子レベルから解析するため、個々の細胞の検出や遺伝子発現の測定、定量等が行われている
このような背景から、細胞の検出方法として、多くの報告や提案がなされている。たとえば、サンプルの競合因子として、サンプルに一定量のコンペティターDNAあるいはRNAを混合してRT-PCRを行い、目的とする遺伝子の発現量を定量するコンペティティブRT-PCR法（非特許文献２）や別の遺伝子発現量の定量方法として、サンプル中に含まれる目的遺伝子と異なる内部標準遺伝子とを用いて、遺伝子定量する方法（非特許文献３）等が報告されている。
【０００３】
しかしながら、上記非特許文献２の検出方法の場合は、測定のたびにコンペティターDNAあるいはRNAが必要であり、その調製等に多くの手間が必要であった。一方、非特許文献３の検出方法の場合は、目的の遺伝子および内部標準遺伝子それぞれにプライマーを用意し、さらに両者を同程度に増幅させるための反応条件の検討も必要があるという問題があった。
【０００４】
そこで、上記の問題を改善した細胞の検出方法が提案されている（特許文献１）。この特許文献１に例示した細胞の検出方法は、極微量の細胞も検出することのできる細胞の検出方法としている。具体的には、細胞マーカー遺伝子とこの細胞マーカー遺伝子とスプライシングフォームの関係にある内部標準遺伝子を一組のプライマーにより、同時にポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法にて増幅し、その発現量を比較検討することによって、細胞（
特にガン細胞）を検出している。
【特許文献１】特開平10-248600号公報
【非特許文献１】Harimoto, M. et al., Inc. J. Biomed. Mater. Res., 62, p464-470, 2002
【非特許文献２】Gilliland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, p2725-2729, 1990
【非特許文献３】Noonan, KE. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, p7160-7164, 1990
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記特許文献１に示した細胞の検出方法は、複数種類の細胞を共培養する場合においては、目的の細胞の遺伝子発現量等といった遺伝子発現の変化を個別に定量
することは極めて困難であるという問題があった。このことは、すなわち、複数種類の細胞を三次元的に共培養する研究には、活用することが難しいこと意味する。
【０００６】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、複数種類の細胞を共培養する培養系においても、目的とする細胞の遺伝子発現量等といった、遺伝子発現の変化を選択的に定量することのできる細胞の遺伝子発現量の定量方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この出願の発明は、前記の課題を解決するための第１の発明として、細胞の遺伝子発現量の定量方法であって、複数種類の細胞種を培養する共培養系において、それぞれの細胞の全RNAを抽出し、この全RNAを鋳型としてcDNAを合成し、このcDNAをコードするポリヌクレオチド鎖のうち、目的とする細胞の遺伝子のポリヌクレオチド鎖に対して特異的に結合する、複数種類の細胞種間での遺伝子相同性の低い領域のポリヌクレオチド鎖と同一配列のポリヌクレオチド鎖を有するプライマー（センスプライマー）と相補的なポリヌクレオチド鎖を有するプライマー（アンチセンスプライマー）とからなる2種類1組のプライマーを調整し、そしてこの2種類1組のプライマーを用いてリアルタイムPCRを行い、目的とす
る細胞の遺伝子発現量を選択的に定量測定することを特徴とする遺伝子発現量の定量方法を提供する。
【０００８】
またこの出願の発明は、第２には、複数種類の細胞種間での遺伝子相同性の低い領域は、それぞれの細胞種における相同性の低い領域のポリヌクレオチド鎖を基にして作製される、前記2種類1組のプライマーにおいて、このプライマーの中心15塩基以下の内、少なくとも1塩基以上がそれぞれの細胞種の遺伝子間で相違する遺伝子発現量の定量方法を、そ
して第３には、遺伝子相同性の低い領域は、非翻訳領域に含有されている遺伝子発現量の定量方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
上記第１の細胞の遺伝子発現量の定量方法によれば、複数種類の細胞種を共培養する培養系においても、目的とする細胞の遺伝子発現の変化を選択的に定量することを実現することができる。
【００１０】
上記第２の細胞の遺伝子発現量の定量方法によれば、上記第１の定量方法と同様な効果が得られ、それぞれの細胞種の遺伝子間における相同性を明確にすることにより、目的とする細胞の遺伝子に対する選択性を向上することができる。
【００１１】
上記第３の細胞の遺伝子発現量の定量方法によれば、上記第１および第２の定量方法と同様な効果が得られ、それぞれの細胞種の遺伝子間での相同性の低い領域は、翻訳領域内よりも非翻訳領域内の方が多く存在することから、標的とする相同性の低い領域を非翻訳領域内のものとすることで目的細胞の遺伝子に対する選択性、特異性をさらに向上することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【００１３】
この出願の発明は、異なる動物種の細胞間で保存されているそれぞれの遺伝子において、相同性の低い領域を標的とすることに基づいている。すなわち、複数種類の動物種の細胞を培養する共培養系において、複数種類の細胞間での遺伝子相同性の低い領域のポリヌクレオチド鎖を対象にしたプライマーを当業者において、周知である方法で合成・調整す
る。このプライマーは、遺伝子相同性の低い領域のポリヌクレオチド鎖と同一配列のポリヌクレオチド鎖を有するプライマー（センスプライマー）および相補的なポリヌクレオチド鎖を有するプライマー（アンチセンスプライマー）の2種類である。
【００１４】
また、この2種類のプライマーは、上記の共培養系における、それぞれの細胞の全RNAを抽出し、この全RNAを鋳型としてcDNAを合成し、このcDNAをコードするポリヌクレオチド
鎖のうち、目的とする細胞の遺伝子のポリヌクレオチド鎖に対して特異的に結合するプライマーである。
【００１５】
そして、上記のとおりの2種類1組のプライマーを用いて、リアルタイムPCRを行い、目
的とする細胞の遺伝子発現量を選択的に定量測定することができることを特徴としている。
【００１６】
図１に、ヒト由来の培養細胞とラット由来の培養細胞との共培養系における、それぞれの細胞で発現している遺伝子を解析する様子を模式図にて例示した。
【００１７】
リアルタイムPCRとは、解析ソフトが搭載されたコンピュータと接続された特殊なPCR反応装置等から構成されており、サンプルのPCR反応を蛍光物質とともに反応させ、この反
応をオンラインでモニターする間、PCRの各サイクル後の増幅結果をリアルタイムで表示
することを特徴としているPCR法の一種である（たとえば、Applied Biosystems社製;ABI PISM（登録商標） 7000 Sequence Detection System等）。
【００１８】
目的対象となる細胞の遺伝子は、特に限定されるものではない。たとえば、アルブミン遺伝子、グリセルアルデヒドリン酸脱水酵素（GAPDH）遺伝子、グルココルチコイド受容
体遺伝子、ビタミンD受容体遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子、アンドロゲン受容体遺
伝子、レチノイン酸受容体遺伝子、9-cisレチノイン酸受容体遺伝子、甲状腺ホルモン受
容体遺伝子、電解質コルチコイド受容体遺伝子、トランスフォーミングβ増殖因子受容体遺伝子、上皮増殖因子受容体遺伝子、トランスフォーミングβ増殖因子遺伝子、上皮増殖因子遺伝子、肝細胞増殖因子遺伝子、繊維芽増殖因子遺伝子、神経成長因子遺伝子、ヒスチジン脱炭素酵素遺伝子やクラムフェニコールアセチル転移酵素遺伝子、チロシンキナーゼ遺伝子等、その他にもp53遺伝子、Fas遺伝子、bcl-2遺伝子、bax遺伝子、ras遺伝子、myc遺伝子、fos遺伝子、jun遺伝子、myb遺伝子、mas遺伝子等、非常に多岐にわたる遺伝子を対象にすることができる。
【００１９】
上記の細胞の由来は、共培養系を構築することができものであり、その際細胞の互いの由来が異なるものであれば、特に限定されるものではない。たとえば、サル、ヒツジ、ラット、マウス、ウサギ等の動物種由来の各種の細胞が挙げられる。特に、一方の細胞はヒト由来であることが好ましい。すなわち、ヒト-ラット共培養系、ヒト-マウス共培養系等を構築することができる。
【００２０】
また、これら細胞は、各種の臓器組織から採取することもできる。たとえば、肝臓、心臓、腎臓、皮膚、骨、軟骨、骨髄等や、これら例示した組織から派生して形成された組織等が挙げることができる。
【００２１】
もちろん、この出願の発明の定量方法は、複数種類の細胞種が混在培養される共培養系だけでなく、単一種類の細胞培養系においても活用することができる。
【００２２】
この出願の発明における、複数種類の細胞間での遺伝子相同性の低い領域とは、それぞれの細胞における遺伝子相同性の低い領域のポリヌクレオチド鎖を基にして作製される、前記2種類1組のプライマーにおいて、このプライマーの中心15塩基以下の内、少なくとも
1塩基以上（相互の遺伝子の相同性において約6.6%以上が相違していること）が、それぞ
れの細胞の遺伝子間で相違していることを特徴としている領域を意味する。特に、プライマーの中心塩基が10塩基以下の範囲で、少なくとも3塩基以上（相互の遺伝子の相同性に
おいて約30%以上が相違していること）が相違していることが好ましい。目的対象とする
遺伝子に対するプライマーに、このような特徴を持たせることにより、複数種類の細胞が混在培養されている共培養系においても、目的とする細胞の遺伝子発現量をより選択的、特異的に定量することができる。
【００２３】
さらに、一般に翻訳領域よりも非翻訳領域の方が、遺伝子相同性の低い領域が多く存在することから、上記の遺伝子相同性の低い領域は、非翻訳領域に含有されていることがさらに好ましい。これにより、さらに、効率よく目的とする細胞の遺伝子発現量を選択的、かつ、特異的に定量することができる
以下に、アルブミン遺伝子とGAPDH遺伝子を用いて、ヒト-ラット共培養系におけるこの出願の発明の実施例を示し、さらに詳しくこの出願の発明について説明する。もちろん、以下の例によってこの出願の発明が限定されることはない。
【実施例】
【００２４】
（実施例１）異種細胞の共培養
本実施例で利用した細胞は、ヒト由来のヒト臍帯静脈内皮細胞（Human umbilical vein
endothelial cell; HUVEC）とラット肝細胞由来のFao細胞であり、この2種類の細胞を共培養した。
（１）HUVEC培養方法：
HUVEC（旭テクノグラス株式会社）は、HUVEC専用培地であるEGM-2 BulletKit（Cambrex
Bio Science Walkersville, Inc製）を使用し、温度感受性のポリマーであるポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）をコートした培養シャーレに播種し、37℃、5% CO2の条件の下で培養した。
【００２５】
HUVECをコンフルエントまで培養した後、EGM-2 BulletKitに終濃度20%のウシ胎児血清
（Fetal Bovine Serum; FBS）を添加し、さらに終濃度0.05mg/mlのアスコルビン酸および終濃度3 ng/mlの硫酸銅をそれぞれ添加した。以降、この培地を使用して2-4週間の継続培養をする。
（２）Fao細胞の培養方法：
Fao細胞の培養には、培地F-12 COON'S MODIFICATION（SIGMA社）に終濃度10%のFBSを加え、さらにペニシリン／ストレプトマイシンを添加した培地を用いた。Fao細胞は、37℃
、5% CO2の培養条件でコンフルエントになるまで培養した。
（３）HUVECとFao細胞との共培養系の培養方法：
ナイロンメッシュを利用した三次元的な培養システム（Cell Tissue Res., 273(3), p571-575, 1993）、多孔質膜や羊膜を利用した細胞培養方法（Biochem. Biophys. Res. Commun., 210(2), p302-309, 1995）等の各種の方法が利用できる。本実施例における共培養系では、Harimoto, M. et al., Inc. J. Biomed. Mater. Res., 62, p464-470, 2002の方法に準じて培養を行った。
【００２６】
具体的には、培地を除去したHUVEC上にPVDF膜を重層し、20℃、30分間放置し、HUVECを付着させた。HUVECが付着したPVDF膜を回収し、このPVDF膜を培地を除去したFao細胞に重層し、37℃、1時間放置して、Fao細胞を付着させた。そして、PVDF膜を取り除くことで、HUVEC-Fao細胞（すなわち、ヒト-ラット）の共培養系を構築した。
【００２７】
構築したこの共培養系は、EGM-2 BulletKit：F-12 COON'S MODIFICATIONを1：1の割合
で混合した混合培地を用いて、37℃、5% CO2の条件の下で培養した。
（実施例２）プライマーの作製
ラットGAPDH遺伝子、ヒトGAPDH遺伝子およびラットアルブミン遺伝子、それぞれのポリヌクレオチド鎖の塩基配列に基づいて、同一配列のポリヌクレオチド鎖を有するプライマー、および相補的なポリヌクレオチド鎖を有するプライマーを合成・作製した。
【００２８】
プライマー合成の際には、このプライマーの中心部分10塩基の内、少なくとも3塩基以
上異なるように変異を加えて合成した。すなわち、（１）ラットGAPDH遺伝子に対しての
プライマーは、配列番号１および配列番号２として、（２）ヒトGAPDH遺伝子に対しての
プライマーは、配列番号３および配列番号４として、（３）ラットアルブミン遺伝子に対してのプライマーは、配列番号５および配列番号６として、それぞれ合成した。
【００２９】
図２には、GAPDH遺伝子の構造を概略的に模式図とした例示した。また、図３は、ラッ
トおよびヒト由来のGAPDH遺伝子の定量に用いたプライマーの塩基配列を示している。図
３中の「Human 1081」は、ヒトGAPDH遺伝子における1081番目の塩基からを示しており、
「Rat 1084」は、ラットGAPDH遺伝子における1084番目の塩基からを示している。また、
下線部は、プライマー作製の際に基にした塩基配列を示している。
（実施例３）目的とする細胞の遺伝子の発現量の定量
目的とする細胞の遺伝子発現量を定量するため、SYBER Green master mix：10μl、セ
ンスプライマー（10 pmol/μL）：10μl、アンチセンスプライマー（10 pmol/μL）：10
μl、蒸留水：7μl、0.4μgのRNAから合成したcDNA：1μlを混合し、合計20μlの反応系
を調製した。
【００３０】
なお、この反応系におけるRNAとは、細胞が発現している全RNAを指し、公知の方法（たとえば、バイオ実験イラストレイテッド、第２巻遺伝子解析の基礎、秀潤社；Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press等）に従い抽出したものである。
【００３１】
そして、目的とする測定したい遺伝子に特異的なプライマーを用いて、増幅・定量をした。
【００３２】
本実施例においての目的とする測定したい遺伝子は、ラットGAPDH遺伝子、ラットアル
ブミン遺伝子およびヒトGAPDH遺伝子である。
【００３３】
上記GAPDH遺伝子については、ヒト由来のものとラット由来のものとを、以下の割合で
混合した。
（１）ヒトRNAを4μg：ラットRNAを0μg （0%）；
（２）ヒトRNAを3μg：ラットRNAを1μg （25%）；
（３）ヒトRNAを2μg：ラットRNAを2μg （50%）；
（４）ヒトRNAを1μg：ラットRNAを3μg （75%）；および
（５）ヒトRNAを0μg：ラットRNAを4μg （100%）；
なお、括弧内の%は、次式より算出した。
【数１】
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【００３４】
この反応系を以下の反応条件にて、リアルタイムPCR（Applied Biosystems社製;ABI PISM（登録商標）7000 Sequence Detection Systemを使用）を行った。
（i）95℃、10分
（ii）95℃、15秒→60℃、1分を40サイクル
結果は、図４に示したとおりであった。ラットGAPDH遺伝子の発現は、ヒトのRNAが混在していてもラットのRNA量の増加にともなって上昇することが確認された。また、ヒトGAPDH遺伝子の発現の場合は、ラットのRNAが混在していてもヒトのRNA量が増加することによって、ヒトGAPDH遺伝子の発現が上昇することを確認した。ラットアルブミン遺伝子にお
いても、ラットGAPDH遺伝子と同様の結果を得た。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、複数種類の細胞を共培養する培養系において、目的とする細胞の遺伝子発現量等といった、遺伝子発現の変化を選択的に定量することのできる細胞の遺伝子発現量の定量方法が提供される。
【００３６】
この出願の発明の定量方法により、細胞間相互作用を解明するため、複数種類の細胞を三次元的に共培養している培養系においても活用することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ヒト由来の培養細胞とラット由来の培養細胞との共培養系においてのそれぞれの細胞で発現している遺伝子を解析する様子を模式的に例示した図である。
【図２】GAPDH遺伝子の構造を概略的に例示した模式図である。
【図３】ラットおよびヒト由来のGAPDH遺伝子の定量に用いたプライマーの塩基配列を示した図である。「Human 1081」は、ヒトGAPDH遺伝子における1081番目の塩基からを示しており、「Rat 1084」は、ラットGAPDH遺伝子における1084番目の塩基からを示している。
【図４】2種類の細胞からそれぞれ細胞で発現している遺伝子を解析した結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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