(57)【要約】【課題】  ヒトアンチトロンビンを細胞培養法にて高濃度で取得する。【解決手段】  ヒトアンチトロンビンをコードする遺伝子およびジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドをＣＨＯ細胞に形質転換して得られた細胞を、浮遊化して培養可能な無血清培地を入れたホローファーバー型細胞培養器で培養して、ヒトアンチトロンビンを製造する。このとき、ヒトアンチトロンビンの濃度が細胞培養液中、少なくとも１ＩＵ／ｍＬ以上となるように、細胞培養液の一部を新鮮培養液と交換しながら連続培養する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養によりヒトアンチトロンビンを高濃度に生産する方法であって、
ヒトアンチトロンビンをコードする遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドを付着性細胞に形質転換して得られた細胞を、ホローファーバー型細胞培養器にて浮遊化培養することを特徴とするヒトアンチトロンビンの生産方法。
【請求項２】
前記細胞が浮遊する細胞培養液中のヒトアンチトロンビン濃度が、少なくとも１ＩＵ／ｍＬ以上であることを特徴とする請求項１に記載のヒトアンチトロンビンの生産方法。
【請求項３】
前記細胞に、さらにジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドが形質転換されたことを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載のヒトアンチトロンビンの生産方法。
【請求項４】
浮遊化して培養可能な無血清培地を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のヒトアンチトロンビンの生産方法。
【請求項５】
前記付着性細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞のいずれかであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のヒトアンチトロンビンの生産方法。
【請求項６】
前記付着性細胞が浮遊する細胞培養液の一部を回収補充しながら連続培養することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のヒトアンチトロンビンの生産方法。
【請求項７】
前記細胞が浮遊する細胞培養液中のアンチトロンビン濃度が、１０ＩＵ／ｍＬ以上となるように、細胞培養液の回収速度を調整することを特徴とする請求項６に記載のヒトアンチトロンビンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトアンチトロンビンの生産方法に関する。具体的には、ホローファイバー型細胞培養器を用いたヒトアンチトロンビンの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトアンチトロンビンはヒト血漿中に１５０ｍｇ／Ｌ程度（この濃度は、約１ＩＵ／ｍＬに相当する。）含まれている分子量約５８,０００の生体内タンパク質である。ヒトアンチトロンビンは、セリンプロテアーゼ阻害剤の一種であり、ヘパリンの存在下において強いトロンビンの阻害活性を有する。したがって、その生理学的な重要性は高く、その製剤は臨床上、先天性アンチトロンビン欠損症および汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の治療に使用されている。
アンチトロンビン製剤は、他の生体内活性物質、例えばサイトカイン製剤等と比較すれば、多量のヒトアンチトロンビンが必要となる。したがって、効率よく大量のアンチトロンビンを生産する方法が求められる。
【０００３】
ところが、ヒトタンパク質は、通常翻訳後に高度な修飾が施されている例が多く、そのため、組換え遺伝子を導入する宿主細胞として、産生量の低い哺乳類系の細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞やベイビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞、ヒト肝癌（ＨｅｐＧ２）細胞、ヒト子宮頸部癌（ＨｅＬａ）細胞などを選択しているのが現状である。
【０００４】
しかし、これらの細胞は付着性細胞であって、組織培養フラスコを使用した培養では、浮遊性細胞と比較して同一のスペースで培養できる細胞数は少なく、維持管理する手間も多い。そこで、これらの付着性細胞を無血清培地にて培養することにより浮遊化して、培養フラスコと同様な条件下で培養する方法が、例えば特公平８−４４９５号公報や特許第２９９０８０５号公報に開示されている。これらの方法によれば、付着性細胞を浮遊性細胞と同様な培養条件下で培養することが可能となり、生産効率の向上を図ることができる。
【０００５】
そして、さらにその生産性を高めるべく、特許第２７９８６５９号公報には、ｐＢＲ３２２配列およびアンチトロンビンｃＤＮＡを発現可能に含むベクターおよびジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（dhfr）を発現可能に含むベクターを共形質転換した哺乳動物細胞を用いる方法、さらに特許第２５７６２００号公報には、生理活性タンパク質をコードする遺伝子およびジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（dhfr）を発現可能な状態で有するプラスミドをチャイニーズ・ハムスターオバリージヒドロ葉酸還元酵素欠損株（ＣＨＯ  dhfr-）に形質転換して得られた浮遊攪拌培養に適した細胞を用いる方法が開示されている。
【０００６】
一方、浮遊性細胞や付着性細胞を、中空糸膜をハウジングに納めたいわゆるホローファイバー型細胞培養器（あるいは中空糸膜型バイオリアクターと称される）で大量培養する方法が、例えば、特開平３-１０３１７０号公報に開示されている。このようなホローファイバー型細胞培養器によると、培養フラスコを用いた従来の浮遊化培養方法に比べると高密度（約１０倍程度）に培養し、かつ中空糸膜を通じて栄養、ガス、老廃物の交換を行いえるので長期間の生育が可能になる一方、細胞によって生産されるタンパク質は高分子であるため中空糸膜を通過できず、チャンバー中に蓄積される。
【０００７】
そして、産生された生産物質を回収するために、培養器（ハウジングと中空糸膜との間の空間）中の細胞培養液を連続的もしくは間歇的に取り出し、取り出した液量とほぼ等しい液量の新鮮培養液を追加供給して、さらに高濃度にしかも長期間に培養するシステムも提供されている（例えば、株式会社京都第一科学製  「高密度細胞培養装置」）。
【特許文献１】特公平８−４４９５号公報
【特許文献２】特許第２９９０８０５号公報
【特許文献３】特許第２７９８６５９号公報
【特許文献４】特許第２５７６２００号公報
【特許文献５】特開平３-１０３１７０号公報
【非特許文献１】株式会社  京都第一科学  「高密度細胞培養装置」販売カタログ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところが、単に細胞を浮遊培養させた場合で、多くても細胞培養液中のアンチトロンビン濃度は１μｇ／ｍＬ（０.００７ＩＵ／ｍＬ）程度にしかすぎない。また、特許文献２や特許文献３に記載された細胞を用いた場合でも、細胞培養液中のアンチトロンビン濃度は５μｇ／ｍＬ（０.０３ＩＵ／ｍＬ）程度にしかすぎない。
【０００９】
一方、ホローファイバー型細胞培養器を用いたとしても、中空糸膜への細胞付着や生産物質による細胞毒性により、期待する細胞密度で連続培養を確保できるとは限らない。そして、細胞培養器中の培養液を連続的もしくは間歇的に取り出して培地交換を行えば、一度の細胞接種におけるタンパク質の総生産量は増加するが、培地交換により取り出した細胞培養液中のタンパク質濃度が低下すればタンパク質の回収作業が面倒なものになる。
【００１０】
そこで、本願発明者らは、ヒトアンチトロンビンを高濃度で回収するとともにタンパク質の総生産量を向上すべく鋭意検討したところ、ヒトアンチトロンビンをコードする遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドを付着性細胞に形質転換して得られた細胞を、浮遊化、例えば培養可能な無血清培地を用いて浮遊化し、ホローファーバー型細胞培養器にて培養することによって、上記目的が達成できることを見出し、本願発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の生産方法は、細胞培養によりヒトアンチトロンビンを高濃度、具体的には少なくとも１ＩＵ／ｍＬ以上に生産させる方法であって、ヒトアンチトロンビンをコードする遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドを付着性細胞に形質転換して得られた細胞を、ホローファーバー型細胞培養器にて浮遊化培養することを特徴としている。
そして、この場合に、さらにジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドを用いることを特徴としている。
また、前記付着性細胞を浮遊化させるには、浮遊化して培養可能な無血清培地を用い、さらに、培養細胞が浮遊する細胞培養液の一部を回収補充しながら連続培養するのがよい。そして、細胞培養液中のヒトアンチトロンビン濃度をより高濃度に維持するべく、細胞培養液の回収（交換）スピードを調整するのが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ヒトアンチトロンビンが細胞培養液中に従来の方法では想像さえつかない程度の高濃度で生産され、高濃度にヒトアンチトロンビンを含有する培養液を連続的に回収できる。この結果、ヒトアンチトロンビンの精製工程等の後処理を効率よく行うことができる。また、ヒトアンチトロンビンの抗アポトーシス作用によって細胞の寿命が延び、フラスコ培養に比べて非常に長期にわたって連続的にヒトアンチトロンビンを生産、回収できる。こうして、一度の培養、一度の細胞接種によるヒトアンチトロンビンの総生産量が飛躍的に増大する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の生理活性タンパク質の生産方法は、いわゆるホローファイバー型の細胞培養器を用いて行う方法であって、付着性細胞を細胞培養器内において浮遊培養して、ヒトアンチトロンビンを生産させる方法である。この方法を採用することによって、従来のフラスコ法（浮遊培養法）に比べて格段に高い濃度、少なくとも１ＩＵ／ｍＬ以上にヒトアンチトロンビンを含有する細胞培養液を回収することができる。
【００１４】
本発明において使用されるホローファイバー型の細胞培養器は、細胞が浮遊する培養液の一部を交換できるシステムであれば特に制約されるものではないが、当該培養液の交換速度を可変できるシステムを用いるのが望ましい。このシステムとしては、例えば、上記非特許文献１に示されたシステムが示され、Ｂｉｏ  Ｂｅｓｔ社から上市されている販売名「AcuSyst-Maximizer-1000」が具体的に例示される。また、新鮮な培養液を供給できる限りにおいていかなる細胞培養器でも実施可能で、培養された細胞が浮遊する培養液を交換できない細胞培養器でもアンチトロンビンを高濃度に産生させることは可能であるが、培養できる期間が短くなり一度の培養で多量のヒトアンチトロンビンを得ることが困難になる。
【００１５】
本発明においては、細胞培養器中において付着性細胞を浮遊培養させる必要がある。浮遊培養の方法として、例えば、浮遊化に馴化させた後に浮遊化に適した細胞を選択して培養する方法や付着性細胞を浮遊化できる無血清培地、例えば上記特許文献２，３に記載された無血清培地を用いて培養する方法があるが、本発明においては後者の方法が好ましく採用される。前者では、浮遊培養に馴化させる期間や浮遊化した細胞の選択を行わなければならないが、後者の方法では浮遊化させる手順を省けるとともに無血清培地を用いることによって培地血清由来によるアンチトロンビンの汚染を防げるからである。このような無血清培地として、ＡＳＦ１０４Ｎ（味の素タカラコーポレーション社製）、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（Invitrogen社製）が具体的に例示される。
【００１６】
次に、タンパク質の産生に用いる細胞は、上記理由から、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞やベイビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞、ヒト肝癌（ＨｅｐＧ２）細胞、ヒト子宮頸部癌（ＨｅＬａ）細胞などの哺乳類系の付着性細胞が好適であり、その中でも特に、ＣＨＯ細胞やＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞が望ましい。
これらの細胞には、目的とするタンパク質をコードする遺伝子が予め導入される。遺伝子の導入には、タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターを形質転換して導入する方法、あるいは遺伝子組換えプラスミドを形質導入する方法、直接遺伝子を導入する方法などがあるが、公知のいずれの方法でもよく、具体的には特許文献２に記載開示された方法が参照される。また、形質転換する方法としても、リポフェクション法やリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等の公知の方法が例示される。
【００１７】
さらに、本発明においては、導入された遺伝子の発現量を高めるべく、ｄｈｆｒ遺伝子を挿入されたベクターを、ｄｈｆｒを欠損した細胞に導入するのが好ましい。このｄｈｆｒ遺伝子は、特許文献３に記載されたようにヒトアンチトロンビンをコードする遺伝子を発現可能な状態で含むベクターに含ませても、また特許文献２に記載されたようにヒトアンチトロンビンをコードする遺伝子を含むベクターとは異なるベクターに導入して細胞内に共存させても差し支えない。そして、ｄｈｆｒ遺伝子の導入についてもこれらの特許文献２や特許文献３に開示された方法が参照される。そして、メトトレキセートに耐性を示した細胞を選択する。この方法によれば、タンパク質をコードするベクターが高度に複製しており、タンパク質の産生能力が向上する。
【００１８】
このような培養方法の採用によって、細胞培養液中のアンチトロンビンは比較的高濃度で産生されるが、このままでは連続培養可能な期間が短くなり、一度の接種、培養で得られるタンパク質総量を増やすことができない恐れがある。そこで、本発明においては、細胞培養液の一部を新鮮な培養液と交換しながら連続培養をするのが好ましい。すなわち、細胞が浮遊している培養液を少量ずつ細胞培養器から抜き取るとともに新鮮な培養液を供給する。この場合においても、ホローファイバー内部には新鮮な培養液が供給され、細胞培養液中の老廃物はホローファイバーを通じて培養器外部に排出される。
【００１９】
この交換速度は、細胞培養液中のアンチトロンビン濃度が少なくとも１ＩＵ／ｍＬ、好ましくは５ＩＵ／ｍＬ、望ましくは１０ＩＵ／ｍＬ以上となるように調整される。この濃度は、特許文献２の実施例４に記載されている浮遊培養による際の濃度（５〜６μｇ／ｍＬ＝０.０３〜０.０４ＩＵ／ｍＬ）に比べて、約２５〜３０倍以上、１０ＩＵ／ｍＬとした場合にはその約２５０倍以上の高濃度であって、処理すべき培養液量を従来の方法の約１／２５〜１／３０以下とすることができる。
【００２０】
より具体的に言えば、この交換速度は、細胞培養器（ホローファイバーの外部）を流れる全流路（新鮮培地タンク→ハウジング→回収タンク）の総容量に応じて異なるが、概ね毎分総容量の１０％以下、好ましくは２〜５％程度である。さらに、具体的に言うと上記「AcuSyst-Maximizer-1000」では、２０ｍｌ／ｍｉｎ以下、好ましくは２〜５ｍｌ／ｍｉｎの流量で交換するのがよい。なお、培養液の交換は培養開始直後から始めても差し支えないが、培養初期ではヒトアンチトロンビン濃度が低いので、培養開始数日経過後、アンチトロンビン濃度が１ＩＵ／ｍＬを超えたところから培地交換を始めるのがよい。また、交換速度は、細胞培養液中のアンチトロンビン濃度により適宜調整され、より高濃度、例えば５ＩＵ／ｍＬ、望ましくは１０ＩＵ／ｍＬとなるように交換速度を絞り込んでも差し支えない。
【実施例１】
【００２１】
〔遺伝子組換えヒトアンチトロンビン発現ベクターの構築〕
まず、発現ベクターとして、pcＤＮＡ3.1-(+)ベクター（invitrogen社製）にマウスdhfr発現カセットを挿入した遺伝子増幅用発現ベクターpcＤＮＡ3.1-(+)-dhfrを作製した。マウスdhfr遺伝子発現カセットは、pSV2-dhfr（ATCC  37146）を鋳型とし、ＰＣＲ法にてクローニングした。このとき、フォワードプライマーは、CCCACGTGTCGCGACAATTAGTCAGCAACCATAGTCCとし、リバースプライマーは、CCCACGTGTCGCGAGGACAAACCACAACTAGAATGCとした。得られたＰＣＲ断片は、ＴＡクローニング法によりpCR-2.1ベクター（invitrogen社製）にクローニングし、Nru Iを付加したdhfr遺伝子をクローニングしたベクターpCR-2.1-dhfrを作製した。そして、得られたベクターpcDNA3.1-(+)およびベクターpCR-2.1-dhfrを制限酵素Nru Iで消化し、それぞれの断片をライゲーションして、pcDNA3.1-dhfrを作製した。その経過、結果を図１に示す。
【００２２】
また、ヒトアンチトロンビン遺伝子はヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（TAKARA社製）を鋳型とし、ＰＣＲ法にてクローニングした。このとき、フォワードプライマーは、AGCCCTGTGGAAGATTAGCGとし、リバースプライマーはCCAAAAATAGGAAGAGGTGCとした。得られたＰＣＲ断片はＴＡクローニング法によりpCR-2.1ベクター（invitrogen社製）にクローニングし、pCR2.1-rhATIIIを作製した。
【００２３】
そして、pcDNA3.1-dhfrとpCR2.1-rhATIIIをそれぞれ制限酵素EcoR Iで消化した。次いで、各断片をライゲーションし、pcDNA3.1-rhATIII／dhfrを構築した。その過程、結果を図２に示す。
【実施例２】
【００２４】
〔遺伝子組換えヒトアンチトロンビン発現細胞の作製〕
pcDNA3.1-rhATIII／dhfrをリポインフェクション法によりＣＨＯ／dhfr-株（ATCC  CRL−9096）に導入し、rhATIII安定産生株を作製した。次に細胞のクローニングを行い、培養液上清中のアンチトロンビン活性を測定した（テストチームATIII・２キット〔第一化学薬品社製〕を使用した）。細胞培養には、７５cm2フラスコ（Iwaki社製）を使用し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養を行った。その結果は、１×１０5cells/mL/5days（以下、同条件）で、０.０３６ＩＵ/ｍＬの遺伝子組換えヒトアンチトロンビン産生量であった。なお、培養は、浮遊化が可能な無血清培地ＡＳＦ１０４Ｎ（味の素タカラコーポレーション社製）を使用して浮遊化状態で行った。
【００２５】
次に、上記の遺伝子組換えヒトアンチトロンビン発現細胞に対してメトトレキセートセレクションを行うことにより、遺伝子増幅を行った。その結果を表１に示す。メトトレキセート濃度を上げるにつれて遺伝子組換えアンチトロンビン産生量は増加し、１０００ｎＭメトトレキセートセレクション時では、０.１４２ＩＵ／ｍＬの遺伝子組換えヒトアンチトロンビンを産生する株が得られた。
【００２６】
【表１】
2005073509.tif 000002
【実施例３】
【００２７】
〔ホローファイバー型細胞培養器を用いた遺伝子組換えヒトアンチトロンビン産生細胞の培養〕
実施例２で得られた１０００ｎＭメトトレキセートセレクション後の細胞株を用いて、ＡＳＭ−１０００（AcuSyst Maxmizer-1000;BioBest社製）による培養を行った。培養は、無血清培地ＡＳＦ１０４Ｎ培地を用いて浮遊化状態で行った。
細胞は初期密度１.２×１０9cells/100mLで培養器にアプライし、４０日間連続培養を行った。ホローファイバー中への培養液速度は２５０〜７５０ｍＬ/minとして、図３に示すような交換速度となるように細胞培養液の交換を行った。図３に交換により回収された細胞培養液中のアンチトロンビン濃度を示す。この方法によると、培養開始４日目で３ＩＵ／ｍＬ以上の高濃度のアンチトロンビンを生産することができ、４０日間もの長期間に渡って高濃度でアンチトロンビンを含む培養液を回収することができた。さらに、優れたことに、細胞培養液の交換速度を低下させることによって、１０ＩＵ／ｍＬ以上の高濃度でアンチトロンビンを産生させることが可能となった。これは、本発明実施例２で得られたメトトレキセートセレクション後の細胞を浮遊培養した場合の６０倍以上もの高濃度であった。しかも、培養開始後３６〜４０日目の５日間における総ヒトアンチトロンビンの生産量は約１０００ｍｇ（全回収培養液量約４２０ｍＬ）となり、この５日間だけで、実に約５０Ｌの培養液で浮遊培養したのと同様な生産量を得ることができた。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】遺伝子増幅用発現ベクターpcDNA3.1-(+)-dhfrの作製を示す説明図である。
【図２】遺伝子増幅用発現ベクターpcDNA3.1-rhATIII／dhfrの作製を示す説明図である。
【図３】ホローファイバー型細胞培養器を用いた培養における培養液の交換速度とアンチトロンビン濃度の推移を示す図である。
【図１】
2005073509.tif 000003
【図２】
2005073509.tif 000004
【図３】
2005073509.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月31日(2004.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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