(57)【要約】【課題】  組換えアポイクオリンから再生された、高純度なイクオリンを精製し用いることによりカルシウムイオンの濃度測定において、検出精度を高める。【解決手段】  組換えアポイクオリン、イクオリンの再生溶液において、濃度勾配溶出クロマトグラフィー法を用い、アポイクオリンのアイソフォーム、イクオリン再生溶液中に含まれる非発光性アイソフォームを除去することにより解決される。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
粗製アポイクオリンをクロマトグラフィーにかけ、還元型および酸化型アポイクオリンを分離し精製することを特徴とするアポイクオリンの精製分離方法。
【請求項２】
請求項１のアポイクオリンの精製分離方法で得られた酸化型アポイクオリンを用いて、セレンテラジン、酸素および還元剤存在下においてイクオリンを再生し、クロマトグラフィーにかけ、蛍光を発する一つのアイソフォームおよび蛍光を発しない三つのアイソフォームに分離し精製することを特徴とするイクオリンの精製分離方法。
【請求項３】
請求項２記載のイクオリンの精製分離方法を用いて分離されたことを特徴とするイクオリン。
【請求項４】
セレンテラジン、酸素および還元剤存在下においてアポイクオリンから再生されたイクオリンをクロマトグラフィーにかけ、蛍光を発する一つのアイソフォームおよび蛍光を発しない三つのアイソフォームに分離し精製するイクオリンの精製分離方法。
【請求項５】
請求項４記載のイクオリンの精製分離方法によって得られたことを特徴とするイクオリン。
【請求項６】
請求項３又は５記載のイクオリンを用いたことを特徴とするカルシウムイオン検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えＤＮＡの手法を用いるカルシウム受容発光タンパク質イクオリンのタンパク部分（アポイクオリン）の菌体外での培養に関する製造法から得られた該培養の濾液からイクオリンを再生し精製、分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）はオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）から単離された発光物質であり、アポイクオリン（ａｐｏａｅｑｕｏｒｉｎ）、セレンテラジン（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）と酸素分子からなる複合体である。発光生物であるオワンクラゲは、傘の周辺にある発光器（ｐｈｏｔｏｃｙｔｅｓ）から緑色の光を出す。２つのタンパク質；イクオリンと呼ばれるＣａ２＋イオン結合性の発光タンパク質と緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）の存在により発光する。
【０００３】
アポイクオリンは、１８９アミノ酸残基のタンパク質であり、３個のカルシウムイオンと結合できる４つのＥＦハンドドメイン（ＥＦ−ｈａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）および三つのシステイン残基をもち、分子量は２１．４ｋＤａである。
【０００４】
イクオリンはカルシウムイオンが結合すると、急速な分子内反応が起こり、それによりアポイクオリンの構造がオキシゲナーゼに変化し、セレンテラジンの酸化を触媒し、これにより発光が起こり（極大波長＝４７０ｎｍ，量子収量＝０．１４）、反応生成物である青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）および二酸化炭素が生じる。その発光には励起光照射の必要は無い。
【０００５】
ＢＦＰはセレンテラミド（セレンテラジンの酸化産物）がアポイクオリンに結合しており、励起状態のＢＦＰは発光因子である（非特許文献１及び非特許文献２、参照）。
【０００６】
しかし、ＧＦＰ存在下で、励起状態のＢＦＰからＧＦＰ中の蛍光発色団へ共鳴エネルギー移動が生じると、ＢＦＰが励起し、その状態から基底状態へ戻る時、緑色の発光（極大波長＝５１０ｎｍ）を出し、これがオワンクラゲの出す発光と同一である（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５及び非特許文献６参照）。
【０００７】
イクオリンの結晶構造は２．３Ａの解像度で報告されている（非特許文献７、参照）。
【０００８】
また、図３に示すように、アポイクオリンは、カルシウムイオン非存在下においてセレンテラジン、酸素および還元剤と反応させることにより活性イクオリンが再生する。
【０００９】
イクオリンはカルシウムイオンに対する感受性が高く、極めて低濃度のカルシウムイオンの存在により起こるので、生理的条件下の細胞内カルシウムイオンの濃度測定にも使用することができる。高感度かつ特異的なイクオリンの発光を利用したカルシウムイオン解析を行うためには高純度なイクオリンの精製方法が必要であり、多くの研究が行われてきた。
【００１０】
従来方法においては、アポイクオリンは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）で発現し、イクオリンは培養液中に含まれているアポイクオリンにセレンテラジンを加えることで再生され、クロマトグラフィーにて精製されている。これによりイクオリンを比較的高い純度で入手することができるようになった。
【００１１】
しかしながらこの方法では蛍光を発しないイクオリンのアイソフォームが含まれている可能性があり、カルシウムイオンの濃度測定の検出精度が不安定になるという問題点がある。
【００１２】
第１の問題点は、菌体から精製したアポイクオリンは、従来の方法（特許文献１、参照）においては二種類のアイソフォームが含まれている可能性があることである。その理由は、菌体から精製したアポイクオリンに対して濃度勾配溶出クロマトグラフィーを行っていないためである。図２Ａ及びＢに示すように、濃度勾配溶出クロマトグラフィーによって分離された二種類のアイソフォームは還元型のアイソフォームおよび酸化型のアイソフォームである。還元型のアイソフォームは以前の研究により自己消化によりＮ末端側が欠けている可能性があるため、定量的な実験操作には不適当である。
【００１３】
第２の問題点は、アポイクオリンから再生されたイクオリンには四種類のアイソフォームが含まれている可能性があることである。その理由は、再生されたアポイクオリンの精製に際して濃度勾配溶出クロマトグラフィーを行っていないためである。図４Ａ及び図４Ｂに示すように、濃度勾配溶出クロマトグラフィーによって分離された四種類のアイソフォームのうち、カルシウムイオンに対して蛍光を発するのは、ピーク（ｐｅａｋ）ｂのみである。このため四種類のアイソフォームを分離しないカルシウムイオンの濃度測定においては検出精度が不安定になる。
【特許文献１】特開平１−１３２３９７号公報
【非特許文献１】Ｏ．Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１４（１９７３）２９６３−２９６６．
【非特許文献２】Ｔ．Ｈｉｒａｎｏ等、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２（１９９４）１６５−１６８．
【非特許文献３】Ｆ．Ｈ．Ｊｏｈｎｓｏｎ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６０（１９６２）８５−１０３．
【非特許文献４】Ｊ．Ｇ．Ｍｏｒｉｎ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７７（１９７１）３１３−３１８．
【非特許文献５】Ｈ．Ｍｏｒｉｓｅ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３（１９７４）２６５６−２６６２．
【非特許文献６】Ｈ．Ｎｉｗａ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３（１９９６）１３６１７−１３６２２．
【非特許文献７】Ｊ．Ｆ．Ｈｅａｄ等、Ｎａｔｕｒｅ、４０５（２０００）３７２−３７６．
【非特許文献８】Ｊ．Ｒ．Ｂｌｉｎｋｓ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．５７（１９７８）２９２−３２８．
【非特許文献９】Ｓ．Ｉｎｏｕｙｅ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ．  Ｐｕｒｉｆ．２（１９９１）１２２−１２６．
【非特許文献１０】Ｓ．Ｉｎｏｕｙｅ等、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（１９７５）１４１−１４４．
【非特許文献１１】Ｊ．Ｒ．Ｂｌｉｎｋｓ等、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０（１９８２）１−１１４．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の一般的な技術的課題は、以上の問題点を解決するために、高純度のイクオリンの精製方法と、それを用いたカルシウムイオンの濃度測定方法を提供する。
【００１５】
より詳細には、本発明の特別な技術的課題は、組換えＤＮＡ法により、大腸菌において発現されたアポイクオリンから、高純度なイクオリンを再生、精製することにより、精度の高い定量的なカルシウムイオン濃度の測定を可能とすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明によれば、粗製アポイクオリンをクロマトグラフィーにかけ、還元型および酸化型アポイクオリンを分離し精製することを特徴とするアポイクオリンの精製分離方法が得られる。
【００１７】
また、本発明によれば、前記アポイクオリンの精製分離方法で得られた酸化型アポイクオリンを用いて、セレンテラジン、酸素および還元剤存在下においてイクオリンを再生し、クロマトグラフィーにかけ、蛍光を発する一つのアイソフォームおよび蛍光を発しない三つのアイソフォームに分離し精製することを特徴とするイクオリンの精製分離方法が得られる。
【００１８】
また、本発明によれば、前記イクオリンの精製分離方法を用いて分離されたことを特徴とするイクオリンが得られる。
【００１９】
また、本発明によれば、セレンテラジン、酸素および還元剤存在下においてアポイクオリンから再生されたイクオリンをクロマトグラフィーにかけ、蛍光を発する一つのアイソフォームおよび蛍光を発しない三つのアイソフォームに分離し精製するイクオリンの精製分離方法が得られる。
【００２０】
また、本発明によれば、前記イクオリンの精製分離方法によって得られたことを特徴とするイクオリンが得られる。
【００２１】
また、本発明によれば、前記いずれかのイクオリンを用いたことを特徴とするカルシウムイオン検出方法が得られる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、組換えＤＮＡ法により、大腸菌において発現されたアポイクオリンから、高純度なイクオリンを再生、精製することにより、精度の高い定量的なカルシウムイオン濃度の測定を可能とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明についてさらに詳細に説明する。
【００２４】
大腸菌から精製されたアポイクオリン、アポイクオリンから再生されたイクオリンには複数のアイソフォームが含まれており、本発明者はそれらのアイソフォームを分離する方法を検討した結果、濃度勾配溶出クロマトグラフィー法を用いて精製することによりそれらのアイソフォームが分離可能であることを明らかにした。
【００２５】
すなわち、本発明者らは、大腸菌において発現されたアポイクオリンから、高純度なイクオリンを再生、精製することにより、精度の高い定量的なカルシウムイオン濃度の測定を可能とした。
【００２６】
すなわち、前記特許文献１に記載の従来の方法によって、大腸菌から得られたアポイクオリンを濃度勾配溶出クロマトグラフィー法を用いて精製することにより還元型アポイクオリン、酸化型アポイクオリンの二つのアイソフォームを得る方法である。
【００２７】
図２はアポイクオリンのＭｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  １０／１０による濃度勾配溶出クロマトグラフィーとｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥを示し、Ａでは、Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  １０／１０によるクロマトグラフィーを示している。サンプル：ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．のピークフラクション部分、平衡バッファー：３０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、溶出バッファー：１Ｍ  ＮａＣｌを含む平衡バッファーである。また、Ｂでは、ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥを示している。レーンＭ：分子量マーカー、レーン１：ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのピークフラクション、レーン２〜４：Ａのピーク−１，１および２のピークフラクションである。
【００２８】
組換えアポイクオリンの古い精製物では、還元型アポイクオリンの図２Ａに示すサンプルで５０％までＮ末端の配列Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−が欠けており、おそらくペプチダーゼの消化によるものと思われる（データ未提示）。従って、組換えアポイクオリン溶液は精製や保存方法によってはアポイクオリンのアイソフォームを含んでいると思われる。よって還元型アポイクオリンは均一でないことが考えられる。
【００２９】
従って、上記の方法で得られた生成物の一つである酸化型アポイクオリンを用いて、イクオリンの再生を行い、濃度勾配溶出クロマトグラフィーを用いて精製することにより高純度なイクオリンを得る方法。
【００３０】
図３はイクオリンの発光及び再生反応を示す図である。イクオリンは蛋白質部分であるアポイクオリン（アポ蛋白ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、基質であるセレンテラジン（４２３Ｄａ）および分子状酸素Ｏ２の複合体で構成される。イクオリンにカルシウムイオンが結合すると、急速な分子内反応が起こり、それによりアポイクオリンの構造がオキシゲナーゼに変化し、セレンテラジンの酸化を触媒し、これにより発光が起こり（極大波長＝４７０ｎｍ，量子収量＝０．１４）、反応生成物である青色蛍光蛋白質（ＢＦＰ）および二酸化炭素が生じる。ＢＦＰはセレンテラミド（セレンテラジンの酸化産物）がアポイクオリンに結合しており、励起状態のＢＦＰは発光物質である。発光後、イクオリンは、新しいセレンテラジン、ＥＤＴＡ、２−メルカプトエタノールおよび分子状酸素とインキュベートすることによってアポイクオリンに再生可能である。
【００３１】
図４はイクオリン再生溶液の濃度勾配溶出クロマトグラフィーを示す図である。再生溶液の組成：０．８５ｍｇのアポイクオリンを含む溶液３．４ｍｌ（ピーク２、３０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ／１０ｍＭ２−メルカプトエタノールで透析）＋合成セレンテラジン（１０μｇ）、インキュベーション：冷却槽。Ａでは、混合して３時間後に、再生溶液の２分の１をカラムにアプライし、濃度勾配溶出クロマトグラフィーを行った。また、Ｂでは、混合して１２時間後に、残り半分の再生溶液をカラムにアプライし、濃度勾配溶出クロマトグラフィーを行った。カラム：Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ５／５；平衡化バッファー：３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ／１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール；  溶出バッファー：１ＭＮａＣｌを含む平衡化バッファー；流速：１ｍｌ／ｍｉｎ；フラクション量：２ｍｌ／ｔｕｂｅ；Ａ、Ｂ共にＮａＣｌ濃度０．１６Ｍでイクオリンが溶出された。アッセイ：測光器のサンプル室に１００μｌのサンプルが入ったバイアルをおき、１．０ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６／３０ｍＭ  ＣａＣｌ２を注入した。最大輝度をｒｌｕで示した。
【００３２】
すなわち、図４は、酸化型アポイクオリン、セレンテラジン（１０μｇ）、ＥＤＴＡ、２−ＭＥおよび分子状酸素から成る再生溶液を濃度勾配溶出クロマトグラフィーにかけた結果、混合して３時間後の溶液を濃度勾配溶出クロマトグラフィーでは溶出曲線は４つのピーク（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）を示した（図４Ａ）。混合後１２時間でも４つのピーク（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）が観察された（図４Ｂ）。
【００３３】
２組の溶出カーブは同様に重ね合わせられた。溶出フラクションにそれぞれ過剰の塩化カルシウム溶液を注入し、最初の極大輝度を記録することによって活性を測定した。ピークｂでのみ活性が見られ、３時間と１２時間ではイクオリン活性は１．４倍に増加していた。従ってピークｂは非常に純粋なイクオリンとして存在していると思われる。ピークａは再生溶液中に残存するアポイクオリンの量を示している。ピークｃ及びｄはアポイクオリンかイクオリンの未知のオリゴマーである。従って、２つの他の産物はイクオリンが再生される間に再生溶液中で形成される。もし同じ再生溶液がカルシウムイオン測定のアッセイに使用されたら、イクオリンと非発光性アイソフォーム（ａ、ｃおよびｄ）間でカルシウムイオン分割があるので、発光量が正確なカルシウムイオンの量を反映しないであろう。イクオリンの実際の応用法は非特許文献８に記述されている。
【００３４】
それでは、本発明の実施の形態について説明する。
【００３５】
（１）まず、組換えアポイクオリンの発現と粗精製について説明する。
【００３６】
本発明に用いるアポイクオリンは発光生物であるオワンクラゲ由来の発光タンパク質である。組換えアポイクオリンの発現と粗精製は従来の方法（特許文献１、参照）と同じものを用いた。
【００３７】
（２）アポイクオリンの精製について説明する。
【００３８】
以前の報告により、粗精製された組換えアポイクオリンからＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラムを使用して単一の鋭いピークフラクションを得られていた。また、凍結乾燥したアポイクオリンを２０％アセトニトリルで溶解し、逆相ＨＰＬＣをかけると（非特許文献９＝Ｓ．Ｉｎｏｕｙｅ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ．  Ｐｕｒｉｆ．２（１９９１）１２２−１２６．）単一、鋭いピークが得られていた。本発明においては、図２に示すように、粗精製された組換えアポイクオリンの精製に濃度勾配溶出クロマトグラフィーを用いた。その結果、ＮａＣｌ濃度が０．０８〜０．１Ｍのときに二つのピーク（ピーク１およびピーク２）が検出され、時には第三の小さいピーク（ピーク−１）が検出された。
【００３９】
組換えアポイクオリンの古い精製物では、図２Ａに示すように、アポイクオリンのピーク１のサンプルでおそらくペプチターゼの自己消化の結果５０％までＮ末端の配列が欠けており、従って、組換えアポイクオリンの溶液は精製や保存方法によってはアポイクオリンのアイソフォームを含んでいると思われる。ピーク１のアポイクオリンは均一でないことが考えられるので、以降のイクオリンの精製においてはピーク２を用いた。
【００４０】
図２Ｂに示すように、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅおよびピーク−１、１、２のアポイクオリンをｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥした結果、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで分離したアポイクオリンでは二つの顕著なバンド（レーン１）が見られ、ピーク−１（レーン２）とピーク１（レーン３）ではレーン１の上部バンドに相当する単一バンドが、一方ピーク２（レーン４）はレーン１の下のバンドに相当する単一バンドが得られた。それぞれのピークフラクションに２−メルカプトエタノールを加えて再度ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥで泳動したところ、それぞれのピークはすべてレーン１の上のバンドに対応する単一バンドになった。これらの結果から上部バンド、またはピーク−１とピーク１は還元型アポイクオリンであり、下部バンドまたはピーク２は酸化型アポイクオリンであることがわかった。
【００４１】
（３）イクオリンの再生について説明する。
【００４２】
図１は組換えアポイクオリン再生の経時変化プロットを示す図である。再生溶液の組成：アポイクオリン７５μｌ＋３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  １５．０ｍｌ＋２−メルカプトエタノール６０μｌ＋ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  セレンテラジン  １．５μｇ。インキュベーション：冷却槽、アッセイに使用したサンプル量：１００μｌ。アッセイ：１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６  ｍＭ  ＣａＣｌ２１．０ｍｌを測光器に設置したサンプル入りバイアルに注入した。アッセイ時間：１，２，４，５，６，６，５及び７分に一回測定、１０分に二回測定、１５，３０，６０，９０，１２０，１８０，３００，４２０，６００及び７８０分に三回測定、最大輝度をｒｌｕで示した。
【００４３】
図１に示す通りにイクオリンの再生は１２時間で平衡に達した。再生溶液は酸化型アポイクオリン、セレンテラジン、ＥＤＴＡ、２−メルカプトエタノールおよび分子状酸素からなる。
【００４４】
（４）イクオリンの精製について説明する。
【００４５】
イクオリンの精製は、前記（３）項で再生されたイクオリン再生溶液を濃度勾配溶出クロマトグラフィーを用いて精製した。その結果、図４Ａで示すようにピークａ，ｂ，ｃ，ｄの４種類のピークを得た。溶出フラクションをカルシウムイオン存在下で最初の極大輝度を記録し活性を測定すると、ピークｂのみ活性が得られた。従ってこのピークｂが非常に純粋なイクオリンである。ピークｃおよびｄはアポイクオリンかイクオリンの未知のオリゴマーであり。従って二つの他の産物はイクオリンが再生される間に再生溶液中で形成される。もし、濃度勾配溶出クロマトグラフィーを用いないで精製を行ったイクオリンの再生溶液をカルシウムイオン測定のアッセイに使用したら、イクオリンと非発光性アイソフォーム（ａ，ｃおよびｄ）間でカルシウムイオン分割があるので、発光量が正確なカルシウムイオンの量を反映しない。
【００４６】
以下、本発明を具体例を挙げて詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。本発明の範囲は、具体例に示す特定の実施形態よりも、発明の詳細な説明で示された内容により、請求の範囲が定義される。
【００４７】
（イ）化学薬品：２−メルカプトエタノール（２．０ｍｌのアンプル）、ＣＢＢおよびＥＤＴＡは和光純薬から購入した。消泡剤ＣＥ４５７は日本油脂から提供頂いた。他の化学薬品はすべて特級を使用した。セレンテラジンは化学合成し、精製度９５％以上のものを使用した（非特許文献１０、参照）。
【００４８】
（ロ）組換えアポイクオリンの発現と粗精製：
アポイクオリンの過剰発現方法は既に報告されている方法を用いた（非特許文献１０、参照）。発現用プラスミドはｐｉＰ−ＨＥ、ホストの大腸菌はＷＡ８０２を使用した。アポイクオリンのＮ−末端と大腸菌のｏｍｐＡ（ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）シグナルペプチドを融合させてあるので、タンパク質はペリプラズムに蓄積し、培養液中に産生される。大腸菌は３．０ＬのＬＢ培地中で３７℃、３．０Ｌ／ｍｉｎのエアレーションと穏やかな震盪下で培養した。２０時間培養後に、培養液を４℃、５，０００ｘｇで５分間遠心した。上清は１Ｍ酢酸でｐＨ４．２（アポイクオリンのｐＩは４．７）まで下げることによりタンパク質を析出させ、４℃で１−２時間撹拌した。その後４℃、９，０００ｘｇで１０分間遠心し、上澄みをデカントして、粗精製アポイクオリンの沈殿物を３０ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ  ｐＨ１０で溶解した。クルードなアポイクオリン溶液は３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ  ｐＨ７．６／５ｍＭ  ＣａＣｌ２で３回（１回に付５時間撹拌）、４℃で透析し、透析液は４℃、１０，０００ｘｇで５分間遠心した。上清は０．２２μｍのフィルターに通し、次の精製ステップまでは４℃で保存した。活性測定用に分注したアポイクオリン溶液は測定まで−２０℃で冷凍保存した。
【００４９】
（ハ）アポイクオリン及びイクオリンの精製：
４℃のクロマトチャンバー内にＬＣＣ−５０１コントローラ、二波長紫外線モニターおよびフラクションコレクターＦｒａｃ−２００が装備されたＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製のＦＰＬＣシステムを設置、濃度勾配溶出クロマトグラフィーに用いた。
【００５０】
１００ｍｇのクルードアポイクオリンを含むフィルターをかけた上清２５ｍｌをＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を詰め、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ  ｐＨ７．６／５ｍＭ  ＣａＣｌ２で平衡化した２．６ｘ３０ｃｍのカラムにアプライした。アポイクオリンは１ＭＮａＣｌを含む３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ  ｐＨ７．６／５ｍＭ  ＣａＣｌ２の濃度勾配で溶出した。流速は４ｍｌ／ｍｉｎであり、１フラクション当たり１２ｍｌを集めた。アポイクオリンはＮａＣｌ濃度が０．１５−０．３０Ｍの時、単一で鋭いピークとして分離された。
【００５１】
他の精製には、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入したプレパックのＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２６／６０  ７５ｐｇ（２．６ｘ６０ｃｍ）、ＭｏｎｏＱ  １０／１０（１．０ｘ１０ｃｍ、強陰イオン交換体）及びｍｏｎｏＱ  ５／５（０．５ｘ５．０ｃｍ）を使用した。各サンプルは精製前に４°Ｃ下で使用するカラムの平衡化バッファーで完全に透析し、フィルターに掛けた。ＭｏｎｏＱ  １０／１０には、約２０ｍｇのアポイクオリンを含む３０−４０ｍｌのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅピークフラクションをかけた。ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５には、ＭｏｎｏＱ  １０／１０をかけて得られた還元型アポイクオリンと酸化型アポイクオリンからそれぞれ６．０ｍｌ取りアプライし、それぞれ単一なピークが得られた。
【００５２】
図４Ａ及び図４Ｂに示したＭｏｎｏＱ  ５／５を使用して再生したイクオリンの精製条件は次の通りである。再生溶液の組成：０．８５ｍｇの酸化型アポイクオリンを含む溶液３．４ｍｌ（ピーク２、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ７．６／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ／１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールで透析）＋合成セレンテラジン（１０μｇ）、インキュベーション：冷却槽。
【００５３】
Ａでは、混合して３時間後に、再生溶液の２分の１をカラムにアプライし、濃度勾配溶出クロマトグラフィーを行った。
【００５４】
Ｂでは、混合して１２時間後に、残り半分の再生溶液をカラムにアプライし、濃度勾配溶出クロマトグラフィーを行った。
【００５５】
カラム：Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  ５／５；平衡化バッファー：３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ／１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール；溶出バッファー：１Ｍ  ＮａＣｌを含む平衡化バッファー；流速：１ｍｌ／ｍｉｎ；フラクション量：２ｍｌ／ｔｕｂｅ；Ａ、Ｂ共にＮａＣｌ濃度０．１６Ｍでイクオリンが溶出された。アッセイ：測光器のサンプル室に１００μｌのサンプルが入ったバイオアルをおき、１．０ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６／３０ｍＭ  ＣａＣｌ２を注入した。最大輝度をｒｌｕで示した。混合して３時間後の溶液を濃度勾配溶出クロマトグラフィーにかけると溶出曲線は４つのピーク（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）を示した（図４Ａ）。混合後１２時間でも４つのピーク（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）が観察された（図４Ｂ）。２組の溶出カーブは同様に重ね合わせられた。溶出フラクションはそれぞれ１００μｌを測定器のバイアルに取り、過剰のＣａＣｌ２を注入し、最初の極大輝度を記録することによって活性を測定した。ピークｂでのみ活性が見られ、３時間と１２時間ではイクオリン活性は１．４倍に増加していた。従ってピークｂは非常に純粋なイクオリンとして存在していると思われる。ピークａは再生溶液中に残存するアポイクオリンの量を示している。ピークｃ及びｄはアポイクオリンかイクオリンの未知のオリゴマーである。従って、２つの他の産物はイクオリンが再生される間に再生溶液中で形成される。もし同じ再生溶液がＣａ２＋イオン測定のアッセイに使用されたら、イクオリンと非発光性アイソフォーム（ａ、ｃおよびｄ）間でＣａ２＋イオン分割があるので、発光量が正確なＣａ２＋イオンの量を反映しないであろう。イクオリンの実際の応用法は、非特許文献８及び非特許文献１１）に記述されている。
【００５６】
（ニ）タンパク質の分析：
集めたフラクションはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）及び非還元条件下のｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ（５−２０％勾配のゲル及びＴｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ泳動バッファーを使用）により解析し、ゲルはＣＢＢで染色した。タンパク質濃度はウシ血清アルブミンをスタンダードとしブラッドフォード法により測定した。Ｎ−末端アミノ酸シーケンス決定のために、タンパク質のバンドはＰＶＤＦ膜にｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇによって転写し、その配列はＭｏｄｅｌ  ４９４  Ｐｒｏｃｉｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用してＵＣＳＤ大学にて決定された。
【００５７】
（ホ）イクオリン活性測定と光強度の測定：
イクオリン活性はアポイクオリンをセレンテラジン、ＥＤＴＡ、２−メルカプトエタノールおよび分子状酸素と２時間インキュベートし、イクオリンに再生した後測定した。再生溶液は少量、反応バイアルに移し、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ−Ｈａｓｔｉｎｇｓの光電子増倍管測光器のサンプル室に置いて、１．５ｍｌの３０ｍＭ  ＣａＣｌ２／１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌ  ｐＨ７．６を注入した。初期の極大光度はＰａｎａｓｏｎｉｃ  ＶＰ−６７１２Ａチャート式記録計にｒｌｕとして記録された。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明に係るアポイクオリンの精製分離方法は、Ｃａイオン等の分析に用いられるイクオリンの精製に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】組換えアポイクオリン再生の経時変化プロットを示す図である。
【図２】アポイクオリンのＭｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  １０／１０による濃度勾配溶出クロマトグラフィーとｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥを示す図で、図２ＡはＭｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  １０／１０によるクロマトグラフィー、図２Ｂはｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥを示す図である。
【図３】イクオリンの発光及び再生反応を示す図である。
【図４】イクオリン再生溶液の濃度勾配溶出クロマトグラフィーを示す図で、図４Ａは混合して３時間後に、再生溶液の２分の１をカラムにアプライし、濃度勾配溶出クロマトグラフィーを行った結果を示している。図４Ｂは混合して１２時間後に、残り半分の再生溶液をカラムにアプライし、濃度勾配溶出クロマトグラフィーを行った結果を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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