(57)【要約】【課題】  選択マーカーとして、高度好熱菌、特にThermus菌において使いやすい耐熱性薬剤耐性遺伝子であって、特にカナマイシン以外の薬剤に対し耐性を付与する遺伝子を提供する。【課題解決手段】  大腸菌のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を変異させ、ハイグロマイシンＢに対し高い耐熱性を発揮する、耐熱性変異型ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列中、少なくとも３０２番目までのアミノ酸配列を有するタンパク質において、Ala8Val、Asp20Gly、Asp24His、Arg44Cys、Asn51Ser、Cys53Arg 、Arg65Gln、Ser86Gly、Ala118Val、Thr145Ala、His161Asp、Gln176Arg、Ala197Gly、Ser225Pro、Gln226Leu、Thr246Ala、Gly258Arg、Asp280Asn、Asp284Glu、及びGly291Serからなる群から選択される１以上の点突然変異を有し、かつ耐熱性の向上した変異型ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、熱安定性の向上した変異型ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ。
【請求項３】
請求項１あるいは２に記載のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子。
【請求項４】
請求項３の遺伝子を含有する選択マーカー
【請求項５】
請求項３に記載の遺伝子を含有するベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを含有する形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性を向上させた新規なハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ及びこれをコードする遺伝子、該遺伝子を利用した選択マーカー、並びに該遺伝子を選択マーカーとして含有するベクター、該ベクターを含有する形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
好熱性細菌は、耐熱性、耐溶媒性等の性質に優れた酵素の供給源として、また高温発酵による発酵工業における冷却コスト、蒸留コスト等の節減などの工業的な応用面で注目されている。とくにDNAを短時間に増幅する技術として開発され、病気診断などで広く利用されているPCR法は好熱菌由来の耐熱性DNA合成酵素があって初めて実用化された技術である。
【０００３】
好熱菌の中でも高度好熱菌のThermus属細菌はもっとも研究されており、とくにThermus thermophilus HB8株については理化学研究所により全ゲノムの配列が決定された。機能未知の遺伝子から有用遺伝子を探索するために、遺伝子破壊などに応用できる使い易い選択マーカー遺伝子が望まれている。とくにThermus菌において７０℃以上の高温でも用いることが出来る抗生物質耐性マーカー遺伝子はカナマイシン耐性遺伝子しかなく、大腸菌等とくらべ遺伝子破壊実験やその後の遺伝子導入等において不便であった。
【０００４】
すなわち、大腸菌などの常温菌においては、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン等の多くの抗生物質耐性遺伝子を選択マーカー遺伝子として利用できるが、Thermus属細菌が生育する高い温度ではこれらの耐性遺伝子がコードする抗生物質不活化酵素等の蛋白質が失活してしまい、そのままでは選択マーカー遺伝子として利用できない。
【０００５】
一方、T. thermophilus において、その生育上限温度近くまで使える唯一の抗生物質耐性マーカーとしては黄色ブドウ球菌由来の変異型カナマイシン耐性遺伝子がある。これは1999年にHosekiらが報告した（非特許文献１参照）もので、もともとは常温菌であるStaphilococcus aureus由来のpUB110プラスミド上にあるカナマイシン耐性遺伝子（カナマイシンにヌクレオチドを付加することにより失活させるカナマイシンヌクレオチド転移酵素をコードしている）をＤＮＡシャフリングとThermus菌遺伝子操作系による選択を組み合わせ、１５箇所以上の耐熱性上昇変異を導入し、Thermus菌において８１℃まで使用できるカナマイシン耐性遺伝子を分離した。
【０００６】
上記の変異カナマイシン耐性遺伝子マーカーによりThermus菌においても使いやすい薬剤耐性遺伝子がはじめて生育温度のほぼ全域において用いることができるようになったが、現在まで、Thermus菌において使用できるものとしては、この１種類の抗生物質耐性マーカーのみが提供されているにすぎない。したがって、染色体上の遺伝子破壊にその一種類の抗性物質耐性遺伝子を用いてしまうと、その遺伝子破壊株は当然その抗生物質に耐性であるので、この遺伝子破壊株にある遺伝子を導入する場合、遺伝子破壊株のうち該遺伝子が導入された株を識別するための選択マーカーが存在しないことになり、薬剤耐性マーカーを持つプラスミドによる遺伝子導入ができないという不都合があったほか、染色体上の２種以上の遺伝子を破壊することもできなかった。また、２種以上のプラスミドを菌に導入するためには２種以上の抗生物質耐性マーカー遺伝子が必須となるが、現状では、これも可能ではなかった。
【０００７】
Thermus属細菌以外においては、イタリアのCannioらが大腸菌由来の野生型のハイグロマイシンＢ耐性遺伝子に２箇所の変異を導入し、好気性古細菌のSulfolobus属細菌において８２℃まで使うことができる変異ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を報告（非特許文献２参照）しているが、同等の変異型遺伝子を発明者が作成してThermus菌に導入したところ、５２℃までしかハイグロマイシンＢ耐性の表現形を示さず、野生型と同等の低い耐熱性しか示さなかった。このことからこの変異遺伝子がSulfolobus属細菌において高い温度でも発現するのは、蛋白質の翻訳後修飾や安定化蛋白質（シャペロニン）などのSulfolobus属細菌特有の因子によるものであると考えられ、上記変異ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子は、Thermus菌には適用できない。
【０００８】
【非特許文献１】Hosekiら、J. Baiochem. 126, 951-956 (1999)
【非特許文献２】Cannioら、Extremophiles, 5,153-159 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで本発明の課題は、選択マーカーとして、高度好熱菌特にThermus菌において使いやすい耐熱性薬剤耐性遺伝子であって、特にカナマイシン以外の薬剤に対し耐性を付与する遺伝子を提供することにある。  
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者はこれまでにThermus属細菌にＤＮＡを導入する方法である形質転換法、T. thermophilus HB27株のトリプトファン要求性変異を相補するトリプトファン合成酵素遺伝子マーカー、同遺伝子をマーカーとするプラスミドベクターなどのThermus属細菌の遺伝子操作に必要な基礎技術の開発を行ってきた。
【００１１】
そこで、発明者は上記黄色ブドウ球菌由来のカナマイシン耐性遺伝子以外にもThermus菌で用いることができる薬剤耐性遺伝子を開発すべく、これまでにThermus菌における発現の報告がない大腸菌由来のハイグロマイシンＢ耐性遺伝子がコードするハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼの耐熱化を試みた。その結果、該ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子にランダムな突然変異（ＤＮＡシャフリング）を行うとともに、Thermus属細菌を使用する遺伝子操作系スクリーニングを反復することによって、初めてThermus属細菌における選択マーカーとして有用な、耐熱性変異型ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼの遺伝子を取得するとともに、併せて該変異型ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼを得ることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）に示されるとおりものである。
（１）   配列番号１で表されるアミノ酸配列中、少なくとも３０２番目までのアミノ酸配列を有するタンパク質において、Ala8Val、Asp20Gly、Asp24His、Arg44Cys、Asn51Ser、Cys53Arg 、Arg65Gln、Ser86Gly、Ala118Val、Thr145Ala、His161Asp、Gln176Arg、Ala197Gly、Ser225Pro、Gln226Leu、Thr246Ala、Gly258Arg、Asp280Asn、Asp284Glu、及びGly291Serからなる群から選択される１以上の点突然変異を有し、かつ耐熱性の向上した変異型ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ。
（２）   配列番号２で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、熱安定性の向上した変異型ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ。
（３）   上記（１）あるいは（２）に記載のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子。
（４）   上記（３）の遺伝子を含有する選択マーカー
（５）   上記（３）に記載の遺伝子を含有するベクター。
（６）   上記（５）に記載のベクターを含有する形質転換体。
なお、上記（１）におけるAla8Val等の表記は、野生型の８位のAlaがValに置換していることを意味する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明において得られた最も高い耐熱性をもつ変異型ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼは８１℃においても活性を示す。したがって、本発明の変異型ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子）は、Thermus属細菌における遺伝子破壊株あるいは遺伝子導入株のスクリーニングを行うための選択マーカーとして極めて有用な手段であり、この耐熱性変異型ハイグロマイシン耐性マーカー遺伝子はThermus属細菌の遺伝子解析研究において極めて有効なツールである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の耐熱性変異型ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼは、 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる大腸菌由来の野生型のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼにアミノ酸置換による変異を導入したものであり、具体的には、配列番号１のアミノ酸配列中、少なくとも３０２番目までのアミノ酸配列を有するタンパク質において、Ala8Val、Asp20Gly、Asp24His、Arg44Cys、Asn51Ser、Cys53Arg、Arg65Gln、Ser86Gly、Ala118Val、Thr145Ala、His161Asp、Gln176Arg、Ala197Gly、Ser225Pro、Gln226Leu、Thr246Ala、Gly258Arg、Asp280Asn、Asp284Glu、及びGly291Serからなる群から選択される１以上の点突然変異を導入したアミノ酸配列を有する。
【００１５】
なお、本明細書において、アミノ酸置換に対する記載、例えば「Ala8Val」は、野生型の８位のAlaがValに置換していることを意味する。更に、本明細書において「耐熱性の向上した」とは、野生型の遺伝子がコードするタンパク質が変性し、ハイグロマイシン耐性の表現型が消失する高温条件下において、ハイグロマイシン耐性の表現型を示しているものをいう。
【００１６】
本発明の耐熱性変異型ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼは、ハイグロマイシンＢをリン酸化することにより抗菌活性を失わせる機能を有し、上記耐熱性変異型ハイグロマイシントランスフェラーゼの遺伝子は、該遺伝子により形質転換された菌株をハイグロマイシンＢ耐性にする。したがって、ハイグロマイシンＢ添加培地で培養することにより、上記耐熱性変異型ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼの遺伝子を有する菌株のみが生育し、これにより、目的とする遺伝子を有するあるいは破壊された菌株のスクリーニングを行うことが可能となる。例えば、染色体中の目的遺伝子と置換するか、その一部に挿入して遺伝子破壊する場合、あるいは遺伝子を担持したベクターに挿入して形質転換を行う場合において、遺伝子破壊株あるいは所望の遺伝子を有する形質転換体をスクリーニングする際の選択マーカーとなる。
【００１７】
本発明の耐熱性変異型ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼの遺伝子は、極めて高い温度条件下でも発現し、該酵素遺伝子を含有する菌株は、最大８１℃においてもハイグロマイシンＢに対し耐性を示し、好熱細菌であるThermus属細菌を使用する遺伝子操作の際の選択マーカーとして極めて好適である。しかしこれに限らず、他の細菌特に好熱細菌の遺伝子操作においても有用である。  
【００１８】
これまで研究されてきた蛋白質の耐熱性を上昇させる多くの方法は、蛋白質の正確な立体構造のデータから、合理的デザインをおこない、ジスルフィド結合の導入や疎水性中心の充填度向上、ターン構造へのプロリンの導入などアミノ酸の置換を設計する方法であった。しかしこの方法は立体構造の分かっていない蛋白質には適用できない。それに対して、蛋白質の遺伝子にランダムな突然変異を導入後、耐熱性の上昇した蛋白質をスクリーニングする方法は蛋白質の正確な立体構造のデータなしで行える。とくにスクリーニングに好熱菌の遺伝子操作系を利用すると、好熱菌の培養温度を細かく制御することにより、望んだ耐熱性上昇度を持つ変異体のみを選択的にスクリーニングできるメリットがある。
【００１９】
本発明の耐熱性変異型ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ及びその遺伝子は、後者の手法により得られたものである。
以下に、本発明の耐熱性変異型ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ及びその遺伝子の製法を具体的に説明する。
【００２０】
大腸菌由来の野生型ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼの遺伝子の塩基配列及びこれにコードされるハイグロマイシンホストトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、すでに知られており(Gritzら、Gene,
25:179-188(1983))、これらの塩基配列及びアミノ酸配列はそれぞれ配列表の配列番号3，同１として示される。また、上記大腸菌由来の野生型ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼの遺伝子を有するプラスミドも知られている（pJR225）。
【００２１】
本発明においては、このようなハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼの遺伝子を有するプラスミドあるいはこれをさらに改良したプラスミド等から、該遺伝子部分を切り出し、高度好熱菌に対する発現プラスミドに導入し、この遺伝子組み換え導入プラスミドによりThermus属細菌を形質転換する。
該形質転換体をハイグロマイシンＢ含有培地で各温度条件下形質転換体を培養し、その生育の有無により、Thermus属細菌において発現した野生型ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼの上限温度を確認する。
【００２２】
次いで、プラスミド上のハイグロマイシンＢ耐性遺伝子に対し、変異ＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡを適当なプラスミドに連結し、該組み換えベクターによりThermus属細菌を形質転換し、得られた形質転換体を、ハイグロマイシンＢ含有培地において上記確認された上限温度よりも若干高い温度条件下で培養する。例えば、上限温度が５３℃の場合、５４℃で培養する。この培養条件下生育した形質転換体から、プラスミドを採取し、これを耐熱性が向上した変異型ハイグロマイシン耐性マーカー遺伝子のプールとする。
【００２３】
この後、該遺伝子プールのハイグロマイシンＢ耐性遺伝子に対してＤＮＡシャフリングを行い、得られたＤＮＡを高度好熱菌用プラスミドベクターに連結し、これを用いてThermus属細菌を形質転換する。次いで、該形質転換体をハイグロマイシンＢ含有培地で、上記遺伝子プール作製時に使用した温度条件よりも若干高い温度、例えば５９℃で培養することによりスクリーニングし、生育した形質転換体からプラスミドを採取し、遺伝子プールとする。以後、得られた遺伝子プールに対して、上記ＤＮＡ シャフリング、得られたＤＮＡのプラスミドベクターへの連結、形質転換体の作製、ハイグロマイシンＢ含有培地でのスクリーニング等からなる操作を繰り返すが、上記ハイグロマイシンＢ培地におけるクリーニングにおいてはその温度条件を、該操作を繰り返す毎に、例えば６４℃、６８℃、７２℃、７７℃というように順次引き上げる。
【００２４】
本発明においては、上記操作により、最終的には、８１℃でハイグロマイシンＢ耐性を発揮する、変異型ハイグロマイシントランスフェラーゼ遺伝子を得ることに成功している。この遺伝子は、配列表の配列番号14に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしており、そのＣＤＳ領域の塩基配列は配列番号13に示される。この遺伝子は、配列番号１に示される野生型ハイグロマイシントランスフェラーゼのアミノ酸配列に対して、Ala8Val、Asp20Gly、Asp24His、Arg44Cys、Asn51Ser、Cys53Arg、Arg65Gln、Ser86Gly、Ala118Val、Thr145Ala、His161Asp、Gln176Arg、Ala197Gly、Ser225Pro、Gln226Leu、Thr246Ala、Gly258Arg、Asp280Asn、Asp284Glu、及びGly291Serの点突然変異を有し、かつ野生型より２３短い３１８個のアミノ酸よりなる蛋白質をコードするものである。
【００２５】
本発明の耐熱性変異型ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子は、例えば選択マーカーとして、該遺伝子が発現できるように、Thermus属細菌の染色体中の機能解析を行いたい遺伝子と置換するかあるいはその一部に挿入する。このような遺伝子破壊がなされたThermus属細菌は、ハイグロマイシンＢ耐性であり、ハイグロマイシンＢ含有培地を使用することにより、遺伝子破壊株のみをスクリーニングできる。このスクリーニングされた株と遺伝子破壊されていない株との表現型を比較すれば、破壊された遺伝子の機能を推定することができる。また、この遺伝子破壊において、カナマイシン耐性遺伝子と、本発明のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の２種の薬剤耐性遺伝子を用いて染色体上の２種の遺伝子を破壊した株の取得も可能となり、より精密な遺伝子解析も可能となる。さらに、本発明においては、上記のようにハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子により遺伝子破壊された株を、有用遺伝子を有するベクタ−を用いて形質転換する際、該ベクターにカナマイシン耐性遺伝子を連結することにより、遺伝子破壊された株であって、かつ有用遺伝子を有する形質転換体のみをスクリーニングすることができる。このことにより、例えば、有用遺伝子に基づくタンパク質を発現に対して悪影響を与える染色体上の遺伝子を破壊して、より生産性の高い株を取得可能となり、また、破壊された遺伝子と同じ遺伝子をベクターに連結して、形質転換を行い、得られた形質転換株の表現型を調べれば、上記の推定された遺伝子の機能を確認することも可能となる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
以下の実施例の工程に示される、T.thermophilusの培養は、以下のとおり行ったものである。
〔T.thermophilusの培養〕
T.thermophilus HB27野生株（ATCC  BAA-163）は、好ましくは0.4%トリプトン、0.2%酵母抽出物、0.1%NaCl(pH7.5)を含有する液体培地中で培養した。T.thermophilusの形質転換株の選択には、50μg/mlハイグロマイシンBを含む  1.5％寒天培地（70℃以下の場合）、100μg/mlハイグロマイシンBを含む1.2%ゲランガム培地(70℃以上の場合)を使用する。ゲランガムを固化させるために、２価の陽イオンである1.5mMのCaCl2と1.5mMのMgCl2を加えた。
【００２７】
（１）ハイグロマイシン耐性遺伝子カートリッジの準備
大腸菌由来の野生型ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子は原子力研究所の鳴海一成博士より分与されたハイグロマイシンＢ耐性プラスミドpKatHPH3よりハイグロマイシン耐性遺伝子部分をＰＣＲ増幅することにより取得した。上記DNA断片を大腸菌プラスミドpUC8（アマシャムバイオサイエンス株式会社より購入）のマルチクローニングサイト中のＳｍａＩサイトにクローニングし、プラスミドpHG108を得た。該プラスミドの構造を図１（a）に示す。
得られたプラスミドpHG108のハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を含む挿入ＤＮＡ断片の塩基配列は配列番号5によって示される。コードされるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号６）はpJR225の野生型ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子とまったく同一である。また、pHG108中のハイグロマイシンＢ耐性遺伝子は、カートリッジとして、EcoRIとHindIIIの２種の制限酵素を用いることにより切り出すことが出来る。
【００２８】
（２）ハイグロマイシン耐性遺伝子のT.thermophilusのへの導入
ハイグロマイシン耐性遺伝子のT.thermophilus HB27株のへの導入には好熱菌由来のアデニレートキナーゼ遺伝子のプロモーター断片を持つThermus菌発現ベクターpYK141（図１（b））を用いた。なお、pYK141は発明者がT.thermophilus HB8由来のクリプティックプラスミドpTT8をもとにThermus
T2株由来のトリプトファン合成酵素遺伝子（trpB）およびアデニレートキナーゼ遺伝子のプロモーター断片を組み合わせて独自に開発したものであり、そのプラスミドを保持する株Thermus thermophilus HB27 trpB5 (pYK141)は特許生物寄託センターに寄託している（寄託番号FERM  P-19699）。
【００２９】
このpYK141と（１）の工程で作成されたpHG108のDNAを 制限酵素EcoRI及びHindIIIで切断後、T4 DNA リガーゼで連結後、T.thermophilus HB27野生株を形質転換した。
形質転換は、以下のようにして行った。T.thermophilus HB27野生株を一夜培養したものを新しい培地で100分の１に希釈し、70℃で２時間振騰培養した。培養物（108cells/ml）を連結したDNAと混合し、５５℃で2時間、振騰しながらインキュベートした後、ハイグロマイシンＢを含む平板培地上に撒いた。
５２℃で３日培養後生育してきたハイグロマイシン耐性の形質転換体のコロニーをハイグロマイシンＢ（３０μｇ/ml）を含む液体培地に植えつぎ５２℃で１日培養後、形質転換体からアマーシャムファルマシア製GFX Micro Plasmid Prep Kitにてプラスミドを調製した。該プラスミドpYK500の構造を図１（c）に示す。
【００３０】
（３）pYK500上の野生型ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子の耐熱性の評価
pYK500（1μｇ）を用いてT.thermophilus
HB27野生株を形質転換し、ハイグロマイシンＢを含む平板培地上に撒き、各種温度で３日培養後にコロニー形成の有無を調べた。形質転換体がコロニーを形成する上限温度を該遺伝子の耐熱性とした。pYK500を含有するT.thermophilus
HB27のハイグロマイシンＢに対する耐性発現は５３℃が上限であり、５４℃では耐性を発現しなかった。
【００３１】
（４）耐熱性上昇変異型ハイグロマイシンＢ耐性マーカー遺伝子の分離
まずpHG108上のハイグロマイシン耐性遺伝子をmutagenic PCRにより以下のように変異を導入した。50μl反応液（ 0.2mM MnCl2, 7mM MgCl2, 50mM KCl, 10mM Tris-HCl, pH8.3,0.01% gelatin, 0.2mM dGTP, 0.2mM dATP, 1mM dCTP , 1mM dTTP 、5'-プライマー（5'-GATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3', 配列番号7）0.6μM、3'-プライマー（5'-CAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3',
配列番号8）0.6μM）にpHG108 DNA 50ngとTaq DNA polymerase 5 unitを加え94℃ 1分, 62℃ 30秒、72℃ 1分のサイクルを３０サイクル行い、ＤＮＡを増幅した。この増幅したDNA １μｇと高度好熱菌プラスミドベクターpYK141
DNA  1μｇとを制限酵素EcoRI およびHindIIIで切断後、T4 DNAリガーゼで連結した。
連結したＤＮＡを用いてT.thermophilus HB27野生株を形質転換し、ハイグロマイシンＢを含む平板培地上に撒き、３日間培養した。この培養温度は、上記pYK500の耐熱性評価に基づき、野生型のハイグロマイシン耐性遺伝子ではコロニーを形成できない温度である５４℃に設定した。この培養条件で生育してきたハイグロマイシン耐性コロニー２５個をようじでハイグロマイシンＢを含む平板培地にレプリカし、54℃で１日間培養後、生育してきたコロニーをかき集め混合した後、40mlの液体栄養培地（ハイグロマイシンを１ｍｇ含む）に植え、54℃で１日間培養後集菌し、アルカリ溶菌法によりプラスミドDNAを調製し、これを変異型耐熱性上昇ハイグロマイシン耐性マーカー遺伝子の54℃耐性プールDNAとした。
【００３２】
（５）DNA シャフリングによる変異の導入と選択
上記の54℃耐性プールDNAのハイグロマイシン耐性遺伝子に対してStemmerらの論文（Stemmer, W.P.C.ら,Nature, 370, 389-391 (1994)）に記載されている方法によりＤＮＡシャフリングを実施した。
すなわち、まず上記のプールDNAより5'-プライマー
(5'- GACGTACCGGGCGCTTGCAT -3', （配列番号9）)および3'-プライマー
(5'- GACCTCGGCCCCTAAAAGC -3', （配列番号10）)を用いてTaq DNA ポリメラーゼによりハイグロマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片を増幅した。このＰＣＲ産物をMarigen
Bioscience 製のRapid PCR Purification Systemを用いて精製した。これをDNaseIにより不完全消化後、アガロースゲル電気泳動し、タカラバイオ製のRECOCHIPを用いて100-300bpのＤＮＡ断片を回収した。このDNA断片をプライマーなしでＰＣＲ増幅した。このとき、各断片間にオーバーラップする配列が存在するため、DNaseI処理前の全長ＤＮＡが再構成される。さらに再び 5'-プライマー  (5'- GACGTACCGGGCGCTTGCAT -3', （配列番号9）)および 3'-プライマー  (5'- GACCTCGGCCCCTAAAAGC -3', （配列番号10）)を用いてＰＣＲ増幅した。この増幅したDNA １μｇと高度好熱菌プラスミドベクターpYK141
DNA  1μｇとを制限酵素EcoRI およびHindIIIで切断後、T4 DNAリガーゼで連結した。連結したＤＮＡを用いてT.thermophilus HB27野生株を形質転換し、ハイグロマイシンＢを含む平板培地上に撒き、59℃で３日間培養した。生育してきたハイグロマイシン耐性コロニー50個をようじでハイグロマイシンＢを含む平板培地にレプリカし、59℃で１日間培養後、生育してきたコロニーをかき集め混合した後、40mlの液体栄養培地（ハイグロマイシンを１ｍｇ含む）に植え、59℃で１日間培養後集菌し、アルカリ溶菌法によりプラスミドDNAを調製し、これを変異型耐熱性上昇ハイグロマイシン耐性マーカー遺伝子の59℃耐性プールDNAとした。
このプールDNAに対してＤＮＡシャフリングとさらに高い温度での選択というサイクルをさらに６回（選択温度64℃、68℃、72℃、77℃、79℃、81℃）行い、最終的に81℃でハイグロマイシン耐性を発現するThermus菌プラスミドpYK505を分離した。得られたpYK505は図１（c）に示されるpYK500と同様の構造をしていた。
【００３３】
pYK505のハイグロマイシン耐性遺伝子の塩基配列（配列番号13）を決定したところ、配列番号14に示されるアミノ酸配列をコードしていた。その配列は野生型のアミノ酸配列に対してAla8Val、Asp20Gly、Asp24His、Arg44Cys、Asn51Ser、Cys53Arg 、Arg65Gln、Ser86Gly、Ala118Val、Thr145Ala、His161Asp、Gln176Arg、Ala197Gly、Ser225Pro、Gln226Leu、Thr246Ala、Gly258Arg、Asp280Asn、Asp284Glu、及びGly291Serの点突然変異を有していたほか、野生型では３０３番目のスレオニンのコドンであるACTの前にAの挿入されておりフレームシフトが起きたため３０３番目以降のアミノ酸配列がすべて変化していた。さらにフレームシフトによりできた配列内でナンセンス変異が重ねて起きており野生型より２３短い３１８個のアミノ酸よりなる蛋白質をコードしていた（配列番号14）。
【００３４】
上記のことより３０３番目から３１８番目のアミノ酸はハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼの酵素活性には必要ないことが示唆された。そこでpYK505 DNAを5'-プライマー (5'- AGGAGGTACCTATGAAAAAGCCTGAACTCA -3', （配列番号11）)および 3'-プライマー  (5'-  TTATCACCCGGCTCCGGATCGGACGATTGC -3', （配列番号12）)を用いてＰＣＲ増幅し大腸菌プラスミドのpUC8のSmaIサイトに連結してpHG177プラスミドを作成した。pHG177は配列番号15により示される塩基配列をもつ挿入DNAをもち、配列番号2に示されるアミノ酸配列をもつハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードしている。
pHG177は野生型のハイグロマイシンＢ耐性遺伝子の303番目以降をコードするDNAをまったく含まず、かわりに終始コドンが２個連続して存在する。pHG177とpYK141のDNAを 制限酵素EcoRI及びHindIIIで切断後、T4 DNA リガーゼで連結後、T.thermophilus
HB27野生株を形質転換したところ摂氏８１度においてハイグロマイシン耐性を発現した。よってpHG177にコードされる野生型より３９個短い３０２個のアミノ酸よりなるハイグロマイシンＢ耐性遺伝子は８１℃においても発現することが明らかとなった。つまり、本発明により、野生型ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子の耐熱性は、２８℃向上したことになる。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
高度好熱菌、特にThermus細菌は、各種耐熱性酵素等の産業上有用なタンパク質を産生する遺伝子が多く含まれている可能性があり、その遺伝子の機能解析あるいは該遺伝子操作による有用タンパク質の生産は、産業上極めて重要な意義を有する。しかし、従来、Thermus細菌の遺伝子の機能解析に必要な選択マーカーはカナマイシン耐性遺伝子のみしかなく、上記遺伝子の機能解析あるいは遺伝子操作において、大きな障害となっていた。本発明は、高度好熱菌、特にThermus細菌の遺伝子解析あるいは遺伝子操作による有用タンパク質の生産に必要な選択マーカーとして、新たにハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を提供するものであり、産業発展に大いに貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】プラスミドpHG108（a）、pYK141（b）、及びpYK500（c）の各制限酵素地図を示す図である。
【図１】
2005245261.tif 000002
【配列表】
2005245261000001.app