(57)【要約】【課題】  封入体を形成することなく宿主細胞によってポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を大量に発現させ、活性のあるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を効率良く取得する方法を提供すること。【解決手段】  ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素と分子シャペロンを共発現し得る細胞を培養し、該細胞においてポリヒドロキシアルカノエート合成酵素と分子シャペロンを共発現させることにより、宿主細胞中で封入体の形成割合を低減させて、発現した酵素分子量に対する酵素として機能する酵素分子の割合を増加させる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素と分子シャペロンを共発現し得る細胞を培養し、該細胞においてポリヒドロキシアルカノエート合成酵素と分子シャペロンを共発現させることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の取得方法。
【請求項２】
該細胞におけるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素と分子シャペロンの共発現において、分子シャペロンの発現開始時期が、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の発現開始時期と同時、もしくは先行してなる請求項１記載の方法。
【請求項３】
該細胞がポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子を発現し得るベクターと、分子シャペロンをコードする遺伝子を発現し得るベクターの両者によって形質転換された細胞である請求項１〜２記載の方法。
【請求項４】
該分子シャペロンがDnaK-DnaJ-GrpEの分子シャペロンチームからなる分子シャペロン群である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該分子シャペロンがDnaK-DnaJ-GrpE及びGroES-GroELの２つの分子シャペロンチームからなる分子シャペロン群である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
該分子シャペロンがGroES-GroEL及びトリガーファクターの２つの分子シャペロンチームからなる分子シャペロン群である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該細胞が大腸菌である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子を発現し得るベクターと、分子シャペロンをコードする遺伝子を発現し得るベクターの両者によって共形質転換されたものであることを特徴とする細胞。
【請求項９】
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素と分子シャペロンを共発現し得る細胞を培養し、該細胞においてポリヒドロキシアルカノエート合成酵素と分子シャペロンを共発現させることにより得られたポリヒドロキシアルカノエート合成酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素と分子シャペロンを同時に発現し得る細胞、及びそれを用いたポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の取得方法、及びその方法により得られたポリヒドロキシアルカノエート合成酵素に関する。さらに詳しくは、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子を発現し得るベクターと、分子シャペロンをコードする遺伝子を発現し得るベクターの両者によって形質転換された細胞、それを用いたポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の取得方法、及びその方法により得られたポリヒドロキシアルカノエート合成酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、３−ヒドロキシブチレート以外の様々な３−ヒドロキシアルカノエートをモノマーユニットとするポリヒドロキシアルカノエート（以下、PHAと略す場合がある）が微生物によって生産されることがわかってきており、PHBの脆性を克服した、機能性を付与しうるポリマーとして注目されはじめている。
【０００３】
このPHAの生合成は、原料となる各種アルカン酸から、生体内の様々な代謝経路（例えば、β酸化系や脂肪酸合成経路）を経て生成された（R）-3-ヒドロキシアシルCoAを基質とした、酵素による重合反応によって行われる。この重合反応を触媒する酵素はPHA合成酵素（PHAポリメラーゼ、PHAシンターゼともいう）と呼ばれている。
【０００４】
さらに最近では、上記PHA合成酵素を菌体外に取り出して、無細胞系（in  vitro）でPHAを合成しようとする試みが始まっている。このPHA合成酵素を用いた無細胞系（in  vitro）でのPHA合成は、微生物によって生産したPHAを抽出し、それを成型して構造体を作る場合と異なり、in Situにおいて微細な構造体を構築することに応用でき、従来にはない画期的なミクロ成型技術として大きく期待されている。この無細胞系（in  vitro）でのPHA合成を実用化していくためには、PHA合成酵素を大量に取得する方法が不可欠であり、その一つとして、PHA合成酵素をコードする遺伝子を大腸菌等の宿主細胞に形質転換し、その遺伝子を宿主細胞内で高発現させることによって、目的とするPHA合成酵素を大量に生産することが検討されている。
【０００５】
しかしながらPHA合成酵素を宿主細胞内で大量に発現させると、PHA合成酵素が宿主細胞内で封入体（inclusion body）と呼ばれる凝集物を形成し、結果として活性のある酵素が得られないという問題が生じている。このような封入体の形成はPHA合成酵素に限ったものではなく、各種外来タンパク質を宿主細胞によって高発現させた場合にしばしば見られる現象である。これは、細胞内で外来タンパク質が大量に生産されることによって、宿主細胞が本来持っている、タンパク質を正常な構造に調整する（フォールディング）作用がすべての外来タンパク質に対して施されなくなり、変性したタンパク質が細胞内に蓄積するためだと考えられている。以上のことから、封入体の形成は、組み換え体による有用タンパク質の大量生産にとって大きな課題となっている。
【０００６】
従来、この封入体の形成を回避する方法として、外来タンパク質発現のための誘導物質の濃度を低減する、発現のための誘導時間を短縮する、培養温度を低下させる、などの方法が採られているが、いずれも目的とするタンパク質の生産効率を低下させることにつながり、また確実に効果を期待できるものではなかった。
【０００７】
また、封入体を形成し、不活性となった変性タンパク質を再び活性のある正常な構造のタンパク質に再生させるために、変性タンパク質の異常な構造を正しい構造に巻き戻し（リフォールディング）を行うことが検討されている。例えば変性タンパク質を塩酸グアニジンなどの強力な変性剤によっていったん変性させた後、希釈や透析などの方法によって変性剤の濃度を薄め、それによってタンパク質の巻き戻しを行なわせる方法がある。しかし、こうした方法では必ずしも全てのタンパク質を本来の正しい構造に巻き戻すことはできず、また巻き戻し効率も通常低いため、活性のあるタンパク質を効率よく取得することが困難であった。
【０００８】
近年、分子シャペロンによってタンパク質のフォールディングもしくはリフォールディングを行うことに関心が高まっている。分子シャペロンは主にヒートショックタンパク質の一群であり、細胞が高温などの環境ストレスにさらされた際に発現が誘導され、他のタンパク質の変性を防止する作用があることから見出された。これらは原核生物、真核生物を問わず広く存在しており、特に大腸菌から生産される分子シャペロンとしてGroEやDnaK，DnaJ，GrpEと呼ばれる一群やトリガーファクターと呼ばれるタンパク質などが知られている。
【０００９】
こうした分子シャペロンのフォールディングもしくはリフォールディング機能を利用して、通常は宿主細胞内で封入体タンパク質として発現されていた外来タンパク質を、同一細胞内で外来タンパク質と分子シャペロンを共発現させることにより、外来タンパク質を不溶化させることなく発現させる方法が報告されている。ＤｎａＪの共発現でトランスグルタミナーゼが可溶化した例（特開平８−３０８６５４号公報：特許文献１）や、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥの共発現によりインターフェロンやなどの種々の外来タンパク質を可溶化して発現させる方法が提案されている（特開平１１−９２７４号公報：特許文献２）。
【００１０】
ところで、上記のようなシャペロンによるフォールディングもしくはリフォールディング作用の効果はタンパク質の種類によって異なるという研究が報告されている（Hockney, R. C. (1994) Trends Biotechnol. 12, 456-463：非特許文献１）。これはタンパク質の種類によってその構造は千差万別であり、それに応じてフォールディングの仕方も異なるためであり、したがって、シャペロンによって外来タンパク質を正確にフォールディングするためには、各外来タンパク質に応じてシャペロンの種類及びその共発現条件を個別に検討することが不可欠である。
【００１１】
ここで先のPHA合成酵素に関して、従来このようなシャペロンによるフォールディングもしくはリフォールディングの検討はなされてきておらず、シャペロンとの共発現がPHA合成酵素の封入体形成の防止に効果があるか、また、どのようなシャペロンとの共発現が封入体形成の防止に効果があるかはこれまでわかっていなかった。
【特許文献１】特開平８−３０８６５４号公報
【特許文献２】特開平１１−９２７４号公報
【非特許文献１】Hockney, R. C. (1994) Trends Biotechnol. 12, 456-463
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、封入体を形成することなく宿主細胞によってポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を大量に発現させ、活性のあるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を効率良く取得する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素と分子シャペロンを共発現し得る細胞を培養し、該細胞においてポリヒドロキシアルカノエート合成酵素と分子シャペロンを共発現させることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の取得方法を提供するものである。
【００１４】
また、本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子を発現し得るベクターと、分子シャペロンをコードする遺伝子を発現し得るベクターの両者によって共形質転換されたものであることを特徴とする細胞を提供するものである。
【００１５】
また、本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素と分子シャペロンを共発現し得る細胞を培養し、該細胞においてポリヒドロキシアルカノエート合成酵素と分子シャペロンを共発現させることにより得られたポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を提供するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、微生物によるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産において、凝集体の形成を抑制しながらポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を高発現することが可能となり、活性のあるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を効率的に取得することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に、本発明をより詳細に説明する。
＜PHA合成酵素遺伝子発現ベクターの作製＞
PHA合成酵素遺伝子の発現ベクターは、適当な発現用ベクターにPHA合成酵素をコードするDNAを挿入することによって構築できる。PHA合成酵素遺伝子は、mcl−PHAやunusual−PHAなどのPHAを生産する微生物からクローニングすることによって得ることができる。このPHA合成酵素遺伝子のクローニング方法は、定法に従って行うことができる。
【００１８】
また、PHAを生産する微生物としては、前述のシュードモナス・アエルギノーサなどのほかに、本発明者らにより分離された、特開2002−080571号公報に記載のシュードモナス・チコリアイ・YN2株（Pseudoｍonas  cichorii  YN2），特開2002−080571号公報に記載のシュードモナス・プチダ・P91株（Pseudomonas  putida P91），特開2002−080571号公報に記載のシュードモナス・チコリアイ・H45株（Pseudoｍonas  cichorii  H45），特開2002−080571号公報に記載のシュードモナス・ジェッセニイ・P161株（Pseudoｍonas  jessenii P161）等のシュードモナス属微生物や、特開2001−78753号公報に記載のバークホルデリア属・OK3株（Burkholderia  sp．OK3），特開2001−69968号公報に記載のバークホルデリア属・OK4株（Burkholderia sp．OK4）などのバークホルデリア属微生物を用いることができる。また、これら微生物に加えて、アエロモナス属（Aeromonas  sp．），コマモナス属（Comamonas  sp．）などに属し、mcl−PHAやunusual−PHAを生産する微生物を用いることも可能である。
【００１９】
なお、YN2株は寄託番号FERM  BP−7375として、P91株は寄託番号FERM  BP−7373として、H45株は寄託番号FERM  BP−7374として、P161株は寄託番号FERM  BP−7376として、OK3株はFERM  P−17370として、OK4株はFERM  P−17371として、特許手続上の微生物の寄託（BP番号については国際的承認に関するブタペスト条約に基づいた寄託）として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（経済産業省産業技術総合研究所（旧通商産業省工業技術院）生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター）に寄託されている。
【００２０】
PHA合成酵素遺伝子発現ベクターを構築するための発現用ベクターとしては、プラスミドやファージなど、宿主細胞に応じて宿主−ベクター系が確立されたものの中から適宜選択すればよく、プラスミドであればシャペロンベクターとプラスミド不和合性を示さないもの、ファージであればシャペロンベクターと排他性を示さないものが使用可能であり、特に限定されるものではない。さらにベクターを含む宿主細胞の選択を可能とする、抗生物質耐性などの遺伝形質（マーカー）や適当な制限酵素切断点を有するものであればより好ましい。
【００２１】
また、PHA合成酵素を発現するためのプロモーターとしては、PHA合成酵素とシャペロンの発現量比を考慮して適当なものを選択すればよいが、PHA合成酵素の生産量を多くするために高発現が可能なプロモーターであることが好ましい。また、PHA合成酵素の発現を適当な化学物質によって誘導できるプロモーターを用いることもできる。これによってPHA合成酵素の発現時期をシャペロンの発現時期に応じて制御することが可能となり、PHA合成酵素のフォールディングないしはリフォールディングの効率を上げることが可能となる。このようなプロモーターとしては、例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導が可能なｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ等のプロモーター等が使用できる。
【００２２】
また、後述するようにPHA合成酵素をアフィニティを用いて簡便に精製するために、PHA合成酵素のN末端やC末端にヒスチジン残基やグルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）等のアフィニティ吸着機能を有する「タグ」を結合させ、PHA合成酵素をタグとの融合タンパク質の形で発現させ、このタグに対してアフィニティを有する不溶性材料に融合タンパク質を結合させる方法が好適に用いられるが、このタグをPHA合成酵素に融合させるために、ベクターに挿入するPHA合成酵素の上流もしくは下流にこのようなタグをコードする塩基配列を配置しておくこともできる。
【００２３】
上記の発現用ベクターにPHA合成酵素をコードするDNAを挿入する方法としては、定法によって行えばよく、例えばPHA合成酵素遺伝子のPCR産物と発現用ベクターを制限酵素処理した後、両者をライゲーション反応によって結合することによって構築できる。
【００２４】
＜分子シャペロン発現ベクターの作製＞
分子シャペロン発現ベクターは、適当な発現用ベクターに分子シャペロンをコードするDNAを挿入することによって構築できる。このときの分子シャペロンとしては、発現するPHA合成酵素の封入体形成を防止できるものであればいかなるものでも良いが、例えばDnaK-DnaJ-GrpEの分子シャペロンチーム、DnaK-DnaJ-GrpE及びGroES-GroELの２つの分子シャペロンチーム、GroES-GroEL及びトリガーファクターの２つの分子シャペロンチームのうち、いずれかのセットの分子シャペロン群を用いることが好ましい。
【００２５】
用いる分子シャペロン遺伝子は、従来クローニングされた中から適当なものを選択して用いることができる。また、適当な生物種から自らクローニングしてきたものを用いることもできる。例えば分子シャペロンの中には、GroELなどのように、微生物間で非常にホモロジーの高いコンセンサス配列を有するものもあり、これらコンセンサス配列をコードするDNAをプライマーとしてPCRにより目的の分子シャペロンDNAをクローニングすることができる。
【００２６】
分子シャペロン発現ベクターを構築するための発現用ベクターとしては、プラスミドやファージなど、宿主細胞に応じて宿主−ベクター系が確立されたものの中から適宜選択すればよく、プラスミドであればPHA合成酵素ベクターとプラスミド不和合性を示さないもの、ファージであればPHA合成酵素ベクターと排他性を示さないものが使用可能であり、特に限定されるものではない。さらにベクターを含む宿主細胞の選択を可能とする、抗生物質耐性などの遺伝形質（マーカー）や適当な制限酵素切断点を有するものであればより好ましい。
【００２７】
また、分子シャペロンを発現するためのプロモーターとしては、PHA合成酵素とシャペロンの発現量比を考慮して適当なものを選択すればよいが、大量に発現させるPHA合成酵素をフォールディングないしはリフォールディングするために高発現が可能なプロモーターであることが好ましい。また、分子シャペロンの発現を適当な化学物質によって誘導できるプロモーターを用いることもできる。これによって分子シャペロンの発現時期をPHA合成酵素の発現時期に応じて制御することが可能となり、PHA合成酵素のフォールディングないしはリフォールディングの効率を上げることが可能となる。例えば、L-Arabinoseを誘導化学物質とするaraBやTetracyclinを誘導化学物質とするPzt1等を用いることが好ましい。
【００２８】
上記の発現用ベクターに分子シャペロンをコードするDNAを挿入する方法としては、定法によって行えばよく、例えば分子シャペロン遺伝子のPCR産物と発現用ベクターを制限酵素処理した後、両者をライゲーション反応によって結合することによって構築できる。
【００２９】
＜宿主細胞＞
PHA合成酵素の生産を行わせる宿主細胞としては、PHA合成酵素発現ベクターと分子シャペロン発現ベクターの両者で形質転換され、PHA合成酵素と分子シャペロンを共発現できるものであればよい。特に大腸菌は容易に高密度培養が可能であること、宿主−ベクター系の研究が最も進んでおり、多くの高発現ベクターが開発されるなど、宿主細胞として好適に用いることができる。
【００３０】
＜形質転換＞
PHA合成酵素発現ベクターと分子シャペロン発現ベクターの両者で宿主細胞を形質転換し、共形質転換細胞を得る方法としては、当業者に良く知られた技術を用いることができる。例えばエレクトロポレーション法や塩化カルシウム法などを用いることができる。
【００３１】
PHA合成酵素発現ベクターと分子シャペロン発現ベクターを宿主細胞に導入する順番としては、使用する宿主細胞及びベクターの種類によって形質転換効率が変動することを考慮しておけば、どのような順番を用いることも可能であり、例えばPHA合成酵素発現ベクターを先に導入する、または分子シャペロン発現ベクターを先に導入する、あるいは両者を同時に導入するなど、いずれの場合も可能である。PHA合成酵素発現ベクターにより形質転換した後、分子シャペロン発現ベクターで形質転換する場合には形質転換効率が低下するが、そのような場合、分子シャペロン発現ベクターに耐性マーカーとして導入した抗生物質を付与した液体培地で培養した後、同じく抗生物質を付与した固体培地で形成したコロニーを選択する方法をとることが好ましい。
【００３２】
＜PHA合成酵素と分子シャペロンの共発現＞
PHA合成酵素と分子シャペロンを共発現させる方法としては、PHA合成酵素発現ベクターと分子シャペロン発現ベクターの両者で共形質転換された宿主細胞を培養することによって行えばよい。
宿主細胞の培養方法としては、宿主細胞の増殖に好適な条件の範囲内で、PHA合成酵素と分子シャペロンの発現量及び発現割合を満たすものであれば良い。例えば大腸菌を宿主細胞とした場合は、LB培地などを用い、培養温度25から37℃の範囲で好気的に培養することによって行うことができる。
【００３３】
また、発現ベクターに抗生物質耐性遺伝子を付与している場合には、その発現ベクターを保有する宿主細胞のみを選択的に培養するために、対応する抗生物質を培地に添加しても良い。このような抗生物質として、例えば、カナマイシン，アンピシリン，テトラサイクリン，クロラムフェニコール，ストレプトマイシン等が挙げられる。ただし、PHA合成酵素または分子シャペロンの発現ベクターにおいて誘導性のプロモーターを用いている場合は、これらの誘導物質となり得る抗生物質を避けることが望ましい。
【００３４】
また、PHA合成酵素及び分子シャペロンの少なくともいずれかの発現に誘導が必要なベクターを用いている場合は、それらに応じた誘導物質を目的とする発現時期に添加することによって、それぞれの発現時期を制御することができる。ここで、分子シャペロンの発現時期はPHA合成酵素の発現時期と同時もしくは先行することが好ましい。分子シャペロンがPHA合成酵素より少なくとも早く発現していることにより、発現したPHA合成酵素が封入体を形成する前にシャペロンによって正しい構造にフォールディングさせることが可能となる。
【００３５】
また、分子シャペロンの発現量は、PHA合成酵素の封入体の形成を抑制できる量であればよく、可能であれば分子シャペロンの機能単位が発現したPHA合成酵素の分子数よりも多いことが好ましい。
【００３６】
＜PHA合成酵素の抽出＞
上記の培養により所望する量のPHA合成酵素を発現した後は、通常用いられる方法により宿主細胞からPHA合成酵素を抽出すればよい。例えば培養した宿主細胞を遠心分離により集菌し、緩衝液等で洗浄後、再び緩衝液等に懸濁したのち、通常用いられる方法、例えばフレンチプレス、凍結融解、超音波破砕、リゾチームや各種界面活性剤などによって細胞を破砕したのち、遠心分離した上清を回収することによってPHA合成酵素を含有する粗酵素を得ることができる。
【００３７】
さらに各種方法でこの粗酵素中から目的とするPHA合成酵素を精製しても良い。例えばアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等の手段を単独または複数組み合わせることによって精製酵素を得ることができる。特に、PHA合成酵素のN末端やC末端にヒスチジン残基やグルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）等のアフィニティ吸着機能を有する「タグ」を結合させ、PHA合成酵素をタグとの融合タンパク質の形で発現させ、このタグに対してアフィニティを有する不溶性材料に融合タンパク質を結合させることによって、より簡便に精製することができる。この融合タンパク質からPHA合成酵素のみを分離するには、トロンビン、血液凝固因子Xa等のプロテアーゼで切断する、pHを低下せしめる、結合競合剤として高濃度のイミダゾールを添加する等の方法を用いることができる。あるいは、発現ベクターとしてpTYB1（New Enｇlan Biolab社製）を用いた場合のようにタグがインテインを含む場合はdithiothreitolなどで還元条件として切断することができる。このようなアフィニティクロマトグラフィーによる精製を可能とする融合タンパク質の形成には、前述の他にキチン結合ドメイン（CBD）、マルトース結合タンパク（MBP）、チオレドキシン（TRX）等を用いることもできる。
【００３８】
なお、精製した酵素には必要に応じて、金属塩，グリセリン，ジチオスレイトール，EDTA，ウシ血清アルブミン（BSA）などの安定化剤、賦活剤を適宜添加して用いることができる。
【００３９】
＜PHA合成酵素発現量の評価＞
PHA合成酵素及び分子シャペロンの発現量は、当業者に公知のタンパク質測定法を用いて評価することができる。例えば、宿主細胞を破砕して得られた粗酵素液中のPHA合成酵素及び分子シャペロンは、SDS-PAGE等のゲル電気泳動を用いて分離し、Coomassie blue染色や銀染色によって検出することができる。さらに、ゲル上で分離された各タンパク質バンドの染色量から、発現量の比較をすることが可能である。この方法を用いて、共発現した分子シャペロンによるPHA合成酵素のフォールディング効果を評価することができる。例えば、遠心分離等によって宿主細胞の破砕液を可溶成分と不溶成分に分離し、それぞれに関してSDS-PAGEを行い、PHA合成酵素のバンド染色量から、可溶成分中と不溶成分中のPHA合成酵素量の比較、すなわちPHA合成酵素の可溶化程度を評価できる。また、特に精製を行ったPHA合成酵素であれば、従来用いられているタンパク質定量方法を用いてPHA合成酵素の発現量を定量することができる。例えば、BCA法、Bradford法、Lowry法、biuret法、比濁法、紫外部吸収スペクトル法などを用いることができる。
【００４０】
＜PHA合成酵素の活性測定方法＞
取得されたPHA合成酵素の活性を測定することによって、さらに発現したPHA合成酵素のフォールディング程度を評価することができる。PHA合成酵素の活性測定は、従来報告されている方法を用いることができるが、例えば、3−ヒドロキシアシルCoAがPHA合成酵素の触媒作用により重合してPHAになる過程で放出されるCoAを、5，5’−ジチオビス−（2−ニトロ安息香酸）で発色させて測定することを測定原理とする、以下に示す方法によって測定することができる。試薬1：ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）を0．1 M トリス塩酸バッファー（pH8．0） に3．0 mｇ／ml溶解、試薬2：3−ヒドロキシアシルCoAを0．1 M トリス塩酸バッファー（pH8．0） に3．0 mM溶解、試薬3：トリクロロ酢酸を0．1 M トリス塩酸バッファー（pH8．0） に10 mｇ／ml溶解、試薬4：5，5’−ジチオビス−（2−ニトロ安息香酸）を0．1 M トリス塩酸バッファー（pH8．0） に2．0 mM溶解。第1反応（PHA合成反応）：試料（酵素）溶液100μlに試薬1を100μl添加して混合し、30℃で1分間プレインキュベートする。ここに、試薬2を100μl添加して混合し、30℃で1〜30分間インキュベートしたのち、試薬3を添加して反応を停止させる。第2反応（遊離CoAの発色反応）：反応停止した第1反応液を遠心分離（15，000×ｇ、10分間）し、この上清500μlに試薬4を500μl添加し、30℃で10分間インキュベートしたのち、412 nmの吸光度を測定する。酵素活性の算出：1分間に1μmolのCoAを放出させる酵素量を1単位（U）とする。なお、この活性測定に使用する3−ヒドロキシアシルCoAは、酵素によって合成を期待するＰＨＡのモノマーを適宜選択すればよく、後述する方法により調製することができる。
【００４１】
＜PHA合成酵素によるPHA合成＞
本発明によって得られたPHA合成酵素によって合成可能なPHAとしては、PHA合成酵素の取得源である微生物によって合成可能なPHAのいずれもが可能である。前述の通り、PHA合成酵素は、生物体内でのPHA合成反応系における最終段階を触媒する酵素であり、従って、生物体内において合成され得ることが知られているPHAであれば、いずれも該酵素による触媒作用を受けて合成されていることになる。よって、所望のPHAに対応する3−ヒドロキシアシルCoAを、本発明において取得されたPHA合成酵素に作用させることによって、in vitroでPHAを合成することができる。
【００４２】
このようなPHAとして、具体的には、下記化学式［１］から［１０］で表されるモノマーユニットを少なくとも含むPHAを例示することができる。
【００４３】
【化１】
2005073563.tif 000002
【００４４】
（ただし、該モノマーユニットは、式中R1およびaの組合せが下記のいずれかであるモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。
【００４５】
R1が水素原子（H）でありaが3から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1がハロゲン原子でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が発色団でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が カルボキシル基でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が、
【００４６】
【化２】
2005073563.tif 000003
【００４７】
でありaが1から7の整数のいずれかであるモノマーユニット。）
【００４８】
【化３】
2005073563.tif 000004
【００４９】
（ただし、式中bは0から7の整数のいずれかを表し、R2は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5及び−C3F7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００５０】
【化４】
2005073563.tif 000005
【００５１】
（ただし、式中cは1から8の整数のいずれかを表し、R3は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5及び−C3F7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００５２】
【化５】
2005073563.tif 000006
【００５３】
（ただし、式中dは0から7の整数のいずれかを表し、R4は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5及び−C3F7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００５４】
【化６】
2005073563.tif 000007
【００５５】
（ただし、式中eは１から８の整数のいずれかを表し、R5は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7，−CH3，−C2H5及び−C3H7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００５６】
【化７】
2005073563.tif 000008
【００５７】
（ただし、式中fは0から7の整数のいずれかを表す。）
【００５８】
【化８】
2005073563.tif 000009
【００５９】
（ただし、式中ｇは1から8の整数のいずれかを表す。）
【００６０】
【化９】
2005073563.tif 000010
【００６１】
（ただし、式中hは１から７の整数のいずれかを表し、R6は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−COOR'，−SO2R"，−CH3，−C2H5，−C3H7，−CH(CH3)2及び−C(CH3)3からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、
ここでR'は水素原子（H），Na，K，−CH3，−C2H5のいずれかであり、R"は−OH，−ONa，−OK，ハロゲン原子，−OCH3及び−OC2H5のいずれかである。）
【００６２】
【化１０】
2005073563.tif 000011
【００６３】
（ただし、式中iは１から７の整数のいずれかを表し、R７は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−COOR'及び−SO2R"からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、
ここでR'は水素原子(H)，Na，K，−CH3，−C2H5のいずれかであり、R"は−OH，−ONa，−OK，ハロゲン原子，−OCH3及び−OC2H5のいずれかである。）
【００６４】
【化１１】
2005073563.tif 000012
【００６５】
（ただし、式中jは1から9の整数のいずれかを表す。）
なお、前記のハロゲン原子の具体例としては、フッ素，塩素，臭素などを挙げることができる。また、前記の発色団としては、その3−ヒドロキシアシルCoA 体がPHA合成酵素の触媒作用を受け得るものである限り特に限定はされないが、高分子合成時の立体障害などを考慮すると、3−ヒドロキシアシルCoA 分子内において、CoAの結合したカルボキシル基と発色団との間に炭素数1から5のメチレン鎖があるほうが望ましい。また、発色団の光吸収波長が可視域にあれば着色した構造体が得られ、可視域以外に光吸収波長があっても種々の電子材料として利用することができる。このような発色団の例として、ニトロソ、ニトロ、アゾ、ジアリールメタン、トリアリールメタン、キサンテン、アクリジン、キノリン、メチン、チアゾール、インダミン、インドフェノール、ラクトン、アミノケトン、ヒドロキシケトン、スチルベン、アジン、オカサジン、チアジン、アントラキノン、フタロシアニン、インジゴイドなどを挙げることができる。
【００６６】
また、上記モノマーユニットを複数含むランダム共重合体やブロック共重合体からなるＰＨＡも合成可能であり、各モノマーユニットや含まれる官能基の特性を利用したPHAの物性制御や複数の機能の付与、官能基間の相互作用を利用した新たな機能の発現等が可能となる。また必要に応じて、PHAを合成したのち、あるいは合成中にさらに化学修飾等を施すこともできる。
【００６７】
上記のようなPHAの基質として用いる3−ヒドロキシアシルCoAとして、具体的には、下記化学式［１１］から［２０］で表される3−ヒドロキシアシルCoAを例示することができる。
【００６８】
【化１２】
2005073563.tif 000013
【００６９】
（ただし、前記化学式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、式中R1およびaの組合せが下記のいずれかである群より選択される少なくとも一つであり、かつ、前記化学式［１］で表されるモノマーユニットにおけるR1およびａと対応する。
R1が 水素原子（H）でありaが3から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が ハロゲン原子でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が 発色団でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が カルボキシル基でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が、
【００７０】
【化１３】
2005073563.tif 000014
【００７１】
でありaが1から7の整数のいずれかであるモノマーユニット。）
【００７２】
【化１４】
2005073563.tif 000015
【００７３】
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、bは前記化学式［２］で表されるモノマーユニットにおけるbと対応する0から7の整数のいずれかを表し、R2は前記化学式［２］で表されるモノマーユニットにおけるR2と対応する、水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5及び−C3F7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００７４】
【化１５】
2005073563.tif 000016
【００７５】
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、cは前記化学式［３］で表されるモノマーユニットにおけるcと対応する1から8の整数のいずれかを表し、R3は前記化学式［３］で表されるモノマーユニットにおけるR3と対応する、水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5及び−C3F7からなる群から選ばれたいずれか1つを表す。）
【００７６】
【化１６】
2005073563.tif 000017
【００７７】
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、dは前記化学式［４］で表されるモノマーユニットにおけるdと対応する0から7の整数のいずれかを表し、R4は前記化学式［４］で表されるモノマーユニットにおけるR4と対応する、水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5及び−C3F7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００７８】
【化１７】
2005073563.tif 000018
【００７９】
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、eは前記化学式［５］で表されるモノマーユニットにおけるeと対応する1から8の整数のいずれかを表し、R5は前記化学式［５］で表されるモノマーユニットにおけるR5と対応する、水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7，−CH3，−C2H5及び−C3H7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００８０】
【化１８】
2005073563.tif 000019
【００８１】
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、fは前記化学式［６］で表されるモノマーユニットにおけるfと対応する0から7の整数のいずれかを表す。）
【００８２】
【化１９】
2005073563.tif 000020
【００８３】
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、ｇは前記化学式［７］で表されるモノマーユニットにおけるｇと対応する1から8の整数のいずれかを表す。）
【００８４】
【化２０】
2005073563.tif 000021
【００８５】
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、hは前記化学式［８］で表されるモノマーユニットにおけるhと対応する1から7の整数のいずれかを表し、R6は前記化学式［８］で表されるモノマーユニットにおけるR6と対応する、水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−COOR'，−SO2R"，−CH3，−C2H5，−C3H7，−CH(CH3)2及び−C(CH3)3からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、
ここでR'は水素原子（H），Na，K，−CH3，−C2H5のいずれかであり、R"は−OH，−ONa，−OK，ハロゲン原子，−OCH3及び−OC2H5のいずれかである。）
【００８６】
【化２１】
2005073563.tif 000022
【００８７】
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、iは前記化学式［９］で表されるモノマーユニットにおけるiと対応する1から7の整数のいずれかを表し、R7は前記化学式［９］で表されるモノマーユニットにおけるR７と対応する、水素原子（H），ハロゲン原子, −CN，−NO2，−COOR'及び−SO2R"からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、
ここでR'は水素原子（H），Na，K，−CH3，−C2H5のいずれかであり、R"は−OH，−ONa，−OK，ハロゲン原子，−OCH3及び−OC2H5のいずれかである。）
【００８８】
【化２２】
2005073563.tif 000023
【００８９】
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、jは前記化学式［１０］で表されるモノマーユニットにおけるjと対応する1から9の整数のいずれかを表す。）
なお、上記式[１１]〜[１５]及び［１８］〜［１９］における発色団及びハロゲン原子の具体例としても先に挙げたものを同様に挙げることができる。
【００９０】
これらの3−ヒドロキシアシルCoAは、例えば、酵素を用いたin  vitro合成法、微生物や植物などの生物体を用いたin vivo合成法、化学合成法等の中から適宜選択した方法で合成して用いることができる。特に酵素合成法は該基質の合成に一般に用いられている方法であり、市販のアシルCoAシンセターゼ（アシルCoAリガーゼ、E．C．6．2．1．3）を用いた下記反応、
3−ヒドロキシアルカン酸  ＋  CoA  →（アシルＣｏＡシンセターゼ）→3−ヒドロキシアシルCoA
を用いた方法などが知られている（Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997）、Appl．Microbiol．Biotechnol．，54，37−43（2000）など）。酵素や生物体を用いた合成工程には、バッチ式の合成方法を用いても良く、また、固定化酵素や固定化細胞を用いて連続生産してもよい。
【００９１】
PHA合成酵素によって合成されたPHAは、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（GC/MS）や、核磁気共鳴分光器（NMR）によってモノマーユニットの組成分析を行うことができる。
【００９２】
また、PHA合成酵素によるPHAの合成を簡便に確認する方法として、本発明者らによって新たに開発された、ナイルブルーA染色と蛍光顕微鏡観察とを組み合わせた方法を用いることができる。本発明者らは、PHA合成酵素によるPHA合成を簡便に判定できる方法について鋭意検討を続けてきた結果、PHAに特異的に結合して蛍光を発する性質を有する薬剤であり、Appl．Environ．Microbiol．，44，238−241（1982） において微生物細胞（in vivo）でのPHA生産の簡易的判別に用いることができると報告されているナイルブルーAが、適切な使用方法および使用条件の設定によって、無細胞系でのPHA合成の判定にも用いることができることを見出し、上記の方法を完成させた。即ち、本方法では、所定濃度のナイルブルーA溶液を濾過したのち、PHAを含む反応液に混合し、蛍光顕微鏡で一定の波長の励起光を照射しながら観察することにより、合成されたPHAのみから蛍光を発せしめ、これを観察することによって、PHA合成酵素によるPHA合成を簡易に判定することができる。
【００９３】
また、ＰＨＡ合成酵素によって合成されるPHAの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（GPC）等によって測定することができ、数平均分子量で1，000から1，000万程度の値となる。
【００９４】
なお、本発明によって取得されたPHA合成酵素により合成されるPHAは、一般にＲ体のみから構成されるアイソタクチックなポリマーである。
【実施例】
【００９５】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下に述べる実施例は本発明の最良の実施形態の一例ではあるが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。なお、以下における「％」は特に標記した以外は質量基準である。
＜実施例１＞
YN2株を100 mlのLB培地（1％ポリペプトン（日本製薬（株）製）、0．5％酵母エキス（Difco社製）、0．5％塩化ナトリウム、pH7．4）で30℃、一晩培養後、マーマーらの方法により染色体DNAを分離回収した。得られた染色体DNAを制限酵素HindIIIで完全分解した。ベクターにはpUC18を使用し、制限酵素HindIIIで切断した。末端の脱リン酸処理（Molecular Cloninｇ，1，572，（1989）; Cold Sprinｇ Harbor Laboratory出版）ののち、DNAライゲーションキットVer．II（宝酒造（株）製）を用いて、ベクターの切断部位（クローニングサイト）と染色体DNAのHindIII完全分解断片とを連結した。この染色体DNA断片を組み込んだプラスミドベクターを用いて、大腸菌（Escherichia coli）HB101株を形質転換し、YN2株のDNAライブラリーを作製した。次に、YN2株のPHA合成酵素遺伝子を含むDNA断片を選択するため、コロニー・ハイブリダイズ用のプローブ調製を行った。配列番号：１および配列番号：２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し（アマシャムファルマシア・バイオテク（株））、このオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、染色体DNAをテンプレートとしてPCRを行った。PCR増幅されてきたDNA断片をプローブとして用いた。プローブの標識化は、市販の標識酵素系AlkPhosDirect（アマシャムファルマシア・バイオテク（株）製）を利用して行った。得られた標識化プローブを用いて、YN2株の染色体DNAライブラリーからコロニーハイブリダイゼーション法によってPHA合成酵素遺伝子を含む組換えプラスミドを有する大腸菌菌株を選抜した。選抜した菌株から、アルカリ法によってプラスミドを回収することで、PHA合成酵素遺伝子を含むDNA断片を得ることができた。ここで取得した遺伝子DNA断片を、不和合性グループであるIncP、IncQ、あるいはIncWの何れにも属さない広宿主域複製領域を含むベクターpBBR122（Mo Bi Tec）に組み換えた。この組み換えプラスミドをシュードモナス・チコリアイYN2ml株（PHA合成能欠損株）にエレクトロポレーション法により形質転換したところ、YN2ml株のPHA合成能が復帰し、相補性を示した。従って、選抜された遺伝子DNA断片は、シュードモナス・チコリアイYN2ml株内において、PHA合成酵素に翻訳可能な、PHA合成酵素遺伝子領域を含むことが確認された。
【００９６】
このDNA断片について、サンガー法により塩基配列を決定した。その結果、決定された塩基配列中には、それぞれペプチド鎖をコードする、配列番号：３および配列番号：４で示される塩基配列が存在することが確認された。これらのうち、配列番号：３のPHA合成酵素遺伝子について、染色体DNAをテンプレートとしてPCRを行い、PHA合成酵素遺伝子の完全長を再調製した。即ち、配列番号：３で示される塩基配列のPHA合成酵素遺伝子に対する、上流側プライマー（配列番号：５）および下流側プライマー（配列番号：６）を合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク（株））。
【００９７】
これらのプライマーを用いて、先に調製したPHA合成酵素遺伝子をテンプレートとしてPCRを行い、PHA合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（LA−PCRキット；宝酒造（株）製）。次に、得られたPCR増幅断片および発現ベクターpTrc99Aを制限酵素HindIIIで切断し、脱リン酸化処理（Molecular Cloninｇ，1巻，572頁，1989年；Cold Sprinｇ Harbor Laboratory出版）したのち、この発現ベクターpTrc99Aの切断部位に、両末端の不用な塩基配列を除いたPHA合成酵素遺伝子の完全長を含むDNA断片を、DNAライゲーションキットVer．II（宝酒造（株）製）を用いて連結した。
【００９８】
得られた組換えプラスミドで大腸菌（Escherichia coli HB101：宝酒造）を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた組換え体を培養し、組換えプラスミドの増幅を行い、組換えプラスミドを回収した。配列番号：３の遺伝子DNAを保持する組換えプラスミドをpYN2−C1とした。pYN2−C1で大腸菌（Escherichia coli HB101fB fadB欠損株）を塩化カルシウム法により形質転換し、この組換えプラスミドを保持する組換え大腸菌株、pYN2−C1組換え株を得た。
【００９９】
次にpYN2−C1に対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：７）および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：８）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク（株））。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pYN2−C1をテンプレートとしてPCRを行い、上流にBamHI制限部位、下流にXhoI制限部位を有するPhaC1遺伝子の完全長を増幅した（LA−PCRキット；宝酒造（株）製）。
【０１００】
精製したPhaC1遺伝子のPCR増幅産物をBamHIおよびXhoIにより消化し、グルタチオン−S−トランスフェラーゼをコードする塩基配列を制限酵素サイトの上流に配したプラスミドpＧEX−6P−1（アマシャムファルマシア・バイオテク（株）製）の対応する部位に挿入し、GSTタグを融合したPhaC1発現ベクターを構築した。このベクターを用いて大腸菌（JM109）を形質転換した。GST融合PhaC1発現ベクターで形質転換された菌株の確認は、Miniprep（Wizard Minipreps DNA Purification Systems、PROMEＧA社製）を用いて大量に調製したプラスミドDNAをBamHI、XhoIで処理して得られるDNA断片により行った。
【０１０１】
GST融合PhaC1発現ベクターで形質転換された菌株をアンピシリン100μg/mlを含有するLB培地5mlで一晩プレ・カルチャーした後、その2 mlを、アンピシリン100μg/mlを含有するLB培地200mlに添加し、37℃、170 rpmでOD600=0.5〜0.6となるまで振とう培養した。培養液をすみやかに4℃に冷却した後、遠心 （8，000×ｇ， 10分、4℃）して上清を除去した。4℃に冷却した滅菌水で2回洗浄・遠心を繰り返した後、遠心 （8，000×ｇ， 10分、4℃）して上清を除去したペレットに、ペレットと同重量の滅菌水を添加して再懸濁した。
【０１０２】
この菌懸濁液100μlにDnaK-DnaJ-GrpE及びGroES-GroELの２つの分子シャペロンチームからなる分子シャペロン群を発現するように構成されたプラスミドベクターであるpG-KJE8（タカラバイオ(株)製）10ng量を添加・混合し、冷却したエレクトロポレーション用キュベット（Gene Pulser Cuvette;BIO RAD社製）に注入し、このキュベットをエレクトロポレーション装置（Gene Pulser II;BIO RAD社製）に装着して2.5kv、25μF、200Ωの条件で電圧を印加した。この処理菌液をSOC培地1mlに添加し、37℃で1時間振とう培養した。この培養液100μlをアンピシリン100μg/ml、クロラムフェニコール20μg/mlを含有するLB寒天培地にまき、37℃で一晩培養し、コロニーの出現を確認した。以上により、GST融合PhaC1発現用プラスミドと、DnaK-DnaJ-GrpE及びgroES-groELの発現用プラスミドが共形質転換された菌株を得た。
【０１０３】
得られた菌株をアンピシリン100μg/ml、クロラムフェニコール20μg/mlを含有するLB培地20mlで一晩プレ・カルチャーした後、その10mlを、アンピシリン100μg/ml、クロラムフェニコール20μg/ml、アラビノース4mg/ml、テトラサイクリン10ng/mlを含有するLB培地1Lに添加し、30℃、120 rpmで振とう培養し、OD600=0.5になった時点でIPTGを添加 （終濃度20μg/ml） し、さらに3時間培養を続けた。
【０１０４】
培養した菌液を集菌（8，000×ｇ、10分、4℃）し、40mlの 4℃ PBS緩衝液（8 ｇ NaCl，1．44 ｇ Na2HPO4，0．24 ｇ KH2PO4，0．2 ｇ KCl，1L精製水）に再懸濁した。フレンチプレスにより菌体を破砕し、それを遠心 （15,000×ｇ， 10分、4℃）し、可溶成分と不溶成分を分離した。可溶成分と不溶成分それぞれについてSDS−PAＧE後にクマジー染色を行ったところ、GSTの融合したPhaC1に相当する分子量87kDのバンドが可溶成分と不溶成分ともに確認された。この可溶成分と不溶成分におけるGST融合PhaC1のバンドの量比は、おおよそ5:2であり、後述する比較例１と比べると分子シャペロンとの共発現により、GST融合PhaC1の溶解性が向上したことがわかった。また主に可溶成分において、DnaK、DnaJ、GrpE及びgroES、groELに相当する分子量のバンドが確認された。
【０１０５】
次に、この菌体破砕液の可溶成分、すなわち粗酵素中に存在するＧST融合PhaC1をグルタチオン・セファロース４B（アマシャムファルマシア・バイオテク（株）製）で精製した。75％グルタチオンセファロースのスラリー500μlを1mlのPBSで3回洗浄（8，000×ｇ、１分、４℃）した後、粗酵素溶液に添加し、室温で静かに振とうした。これにより、GST融合PhaC1をグルタチオンセファロースに吸着させた。吸着後、遠心（500×ｇ、1分、4℃）してグルタチオンセファロースを回収し、4℃のPBS1mlで3回洗浄した。さらに5℃のCleavage 緩衝液（6.1gTris-HCl、8.7gNaCl、0.37gEDTA、0.15gDithiothreitol、0.1gNonidet、1L精製水、PH7）で洗浄し、5℃のCleavage 緩衝液200μlに再懸濁した。これにPreScissionプロテアーゼ（アマシャムファルマシア・バイオテク（株）製、5U）20μlを添加し、5℃で15時間処理してグルタチオンセファロースからPhaC1のみを切り出した。さらに処理液をPBSで洗浄したグルタチオン・セファロースに通してPreScissionプロテアーゼを除去した。フロースルー分画をさらに透析にかけ、PhaC1のTris-HCl溶液（Tris-HCl;6.05g Tris 、1L精製水、pH8.0、）約300μlを得た。この精製酵素溶液についてSDS−PAＧEを行ったところ、PhaC1の分子量に相当する61kDaのシングルバンドを確認した。
【０１０６】
得られた精製酵素の濃度を、マイクロBCAタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって定量し、さらに培養液あたりの収率に換算した。また、精製酵素の活性を、モノマーとして（R）−3−ヒドロキシオクタノイルCoA（Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997） に記載の方法で調製）を用いて前述の方法で測定し、酵素量(mg)あたりの酵素活性に換算した。その結果を表１に示す。結果から、本発明の方法により、活性を保持したPHA合成酵素が収率良く得られることがわかった。
【０１０７】
次に、この精製酵素を用いてPHAの合成を検討した。先の精製酵素溶液10μlを27.3mg/mlの（R）−3−ヒドロキシオクタノイルCoA  Tris-HCl溶液10μl、3mg/mlのウシ血清アルブミン（Siｇma社製）Tris-HCl溶液10μlと混合し、30℃で24時間緩やかに振盪した。
【０１０８】
上記反応液10μlをスライドグラス上に採取し、1％ナイルブルーA水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡（330〜380 nm励起フィルタ、420 nmロングパス吸収フィルタ、（株）ニコン製）観察を行った。その結果、蛍光を発している粒子が確認され、本実施例によるPhaC1によってPHAが合成されることがわかった。
【０１０９】
対照として、Tris-HCl溶液10μlを27mg/mlの（R）−3−ヒドロキシオクタノイルCoA  Tris-HCl溶液10μl、3mg/mlのウシ血清アルブミン（Siｇma社製）Tris-HCl溶液10μlと混合し、30℃で24時間緩やかに振盪した後、同様にナイルブルーAで染色して蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、蛍光を発する粒子は確認されなかった。
【０１１０】
さらに、このPHA粒子の一部を遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブレンフィルターでろ過し、分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧPC；東ソーHLC−8020、カラム；ポリマーラボラトリーPLｇel MIXED−C（5μm）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；40℃、ポリスチレン換算）により測定した結果を図１に示す。その結果、Ｍn＝36,000、Ｍｗ＝70,000であった。
【０１１１】
＜実施例２＞
実施例１で得られたGST融合PhaC1発現ベクターで形質転換されたJM109株に、DnaK-DnaJ-GrpEの分子シャペロンチームからなる分子シャペロン群を発現するように構成されたプラスミドベクターであるpKJE7（タカラバイオ(株)製）を実施例１と同様にエレクトロポレーションによって形質転換した。
【０１１２】
得られた菌株をアンピシリン100μg/ml、クロラムフェニコール20μg/mlを含有するLB培地5mlで一晩プレ・カルチャーした後、その2 mlを、アンピシリン100μg/ml、クロラムフェニコール20μg/ml、アラビノース4mg/mlを含有するLB培地1Lに添加し、30℃、120 rpmで振とう培養し、OD600=0.5になった時点でIPTGを添加 （終濃度20μg/ml） し、さらに3時間培養を続けた。
【０１１３】
次に実施例1と同様に、培養した菌体を破砕し、それを遠心し、可溶成分と不溶成分を分離した。可溶成分と不溶成分それぞれについてSDS−PAGE後にクマジー染色を行ったところ、GST融合PhaC1に相当する分子量87ｋDのバンドが可溶成分と不溶成分ともに確認された。この可溶成分と不溶成分におけるGST融合PhaC1のバンドの量比は、おおよそ3:1であり、後述する比較例１と比べると、分子シャペロンとの共発現により、GST融合PhaC1の溶解性が向上したことがわかった。また、主に可溶成分にDnaK、DnaJ、GrpEに相当する分子量のバンドが確認された。
【０１１４】
次に、この菌体破砕液の可溶成分、すなわち粗酵素中に存在するＧST融合PhaC1を実施例１と同様にして精製した。この精製酵素についてSDS−PAＧEを行ったところ、PhaC1の分子量に相当する61kDaのシングルバンドを確認した。
【０１１５】
得られた精製酵素の濃度を、実施例１と同様に定量し、さらに培養液あたりの収率に換算した。また、精製酵素の活性を、実施例１と同様に測定し、酵素量(mg)あたりの酵素活性に換算した。それらの結果を表１に示す。結果から、本発明の方法により、活性を保持したPHA合成酵素が収率良く得られることがわかった。
【０１１６】
次に、この精製酵素を用いて、実施例１と同様にPHAの合成を検討した。その結果、蛍光を発している粒子が確認され、本実施例のPhaC1によってPHAが合成されることがわかった。
【０１１７】
さらに、PHA粒子の一部を用いて、実施例１と同様にゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより分子量を測定した結果、Ｍn＝38,000、Ｍｗ＝75,000であった。
【０１１８】
＜実施例３＞
実施例１で得られたGST融合PhaC1発現ベクターで形質転換されたJM109株に、GroES-GroEL及びトリガーファクターの２つの分子シャペロンチームからなる分子シャペロン群を発現するように構成されたプラスミドベクターであるpG-Tf2（タカラバイオ(株)製）を実施例１と同様にエレクトロポレーションによって形質転換した。
【０１１９】
得られた菌株をアンピシリン100μg/ml、クロラムフェニコール20μg/mlを含有するLB培地5mlで一晩プレ・カルチャーした後、その2 mlを、アンピシリン100μg/ml、クロラムフェニコール20μg/ml、テトラサイクリン10ng/mlを含有するLB培地1Lに添加し、30℃、120 rpmで振とう培養し、OD600=0.5になった時点でIPTGを添加 （終濃度20μg/ml）し、さらに3時間培養を続けた。
【０１２０】
次に、実施例1と同様に、培養した菌体を破砕し、それを遠心し、可溶成分と不溶成分を分離した。可溶成分と不溶成分それぞれについてSDS−PAGE後にクマジー染色を行ったところ、GST融合PhaC1に相当する分子量87kDのバンドが可溶成分と不溶成分ともに確認された。この可溶成分と不溶成分におけるGST融合PhaC1のバンドの量比は、おおよそ4:1であり、後述する比較例１と比べると、分子シャペロンとの共発現により、GST融合PhaC1の溶解性が向上したことがわかった。また、主に可溶成分にgroES、groEL、tigに相当する分子量のバンドが確認された。
【０１２１】
次に、この菌体破砕液の可溶成分、すなわち粗酵素中に存在するＧST融合PhaC1を実施例１と同様にして精製した。この精製酵素についてSDS−PAＧEを行ったところ、PhaC1の分子量に相当する61kDaのシングルバンドを確認した。
【０１２２】
得られた精製酵素の濃度を、実施例１と同様に定量し、さらに培養液あたりの収率に換算した。また、精製酵素の活性を、実施例１と同様に測定し、酵素量(mg)あたりの酵素活性に換算した。それらの結果を表１に示す。結果から、本発明の方法により、活性を保持したPHA合成酵素が収率良く得られることがわかった。
【０１２３】
次に、この精製酵素を用いて、実施例１と同様にPHAの合成を検討した。その結果、蛍光を発している粒子が確認され、本実施例のPhaC1によってPHAが合成されることがわかった。
【０１２４】
さらに、PHA粒子の一部を用いて、実施例１と同様にゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより分子量を測定した結果、Ｍn＝32,000、Ｍｗ＝69,000であった。
【０１２５】
＜比較例１＞
実施例１で得られたGST融合PhaC1発現ベクターで形質転換されたJM109株を用いて、アンピシリン100μg/mlを含有するLB培地5mlで一晩プレ・カルチャーした後、その2 mlを、アンピシリン100μg/mlを含有するLB培地200 mlに添加し、30℃、120 rpmで振とう培養し、OD600=0.5になった時点でIPTGを添加 （終濃度20μg/ml） し、さらに3時間培養を続けた。
【０１２６】
次に、実施例1と同様に、培養した菌体を破砕し、それを遠心し、可溶成分と不溶成分を分離した。可溶成分と不溶成分それぞれについてSDS−PAＧE後にクマジー染色を行ったところ、GSTの融合したPhaC1に相当する分子量87kDのバンドが可溶成分と不溶成分ともに確認された。この可溶成分と不溶成分におけるGST融合PhaCのバンドの量比は、おおよそ1:8であり、発現したGST融合PhaC1はほとんどが不溶性の封入体を形成していることがわかった。
【０１２７】
次に、この菌体破砕液の可溶成分、すなわち粗酵素中に存在するＧST融合PhaCを、実施例１と同様にして精製した。この精製酵素についてSDS−PAＧEを行ったところ、わずかではあるが、PhaC1の分子量に相当する61kDaのシングルバンドを確認した。
【０１２８】
得られた精製酵素の濃度を、実施例１と同様に定量し、さらに培養液あたりの収率に換算した。また、精製酵素の活性を、実施例１と同様に測定し、酵素量(mg)あたりの酵素活性に換算した。それらの結果を表１に示す。結果から、分子シャペロンをPHA合成酵素と共発現させない場合には、得られたPhaC1の収率は低く、また酵素量あたりの酵素活性も低くなることがわかった。
【０１２９】
次にこの精製酵素を用いて、実施例１と同様にPHAの合成を検討した。その結果、実施例１と比較して1割以下の数の弱い蛍光を発する粒子が確認されたのにとどまり、PHAの合成量も少なくなることがわかった。
【０１３０】
＜比較例２＞
実施例１で得られたGST融合PhaC1発現ベクターで形質転換されたJM109株に、GroES-GroELの分子シャペロンチームからなる分子シャペロン群を発現するように構成されたプラスミドベクターであるpGro7（タカラバイオ(株)製）を実施例１と同様にエレクトロポレーションによって形質転換した。
【０１３１】
得られた菌株をアンピシリン100μg/ml、クロラムフェニコール20μg/mlを含有するLB培地5mlで一晩プレ・カルチャーした後、その2 mlを、アンピシリン100μg/ml、クロラムフェニコール20μg/ml、アラビノース4mg/mlを含有するLB培地1Lに添加し、30℃、120 rpmで振とう培養し、OD600=0.5になった時点でIPTGを添加 （終濃度20μg/ml）し、さらに3時間培養を続けた。
【０１３２】
次に実施例1と同様に、培養した菌体を破砕し、それを遠心し、可溶成分と不溶成分を分離した。可溶成分と不溶成分それぞれについてSDS−PAGE後にクマジー染色を行ったところ、GST融合PhaC1に相当する分子量87kDのバンドが可溶成分と不溶成分ともに確認された。この可溶成分と不溶成分におけるGST融合PhaC1のバンドの量比は、おおよそ2:3であり、発現したGST融合PhaC1の半数以上が不溶性の封入体を形成していることがわかった。また、主に可溶成分にgroES、groELに相当する分子量のバンドが確認された。
【０１３３】
次に、この菌体破砕液の可溶成分、すなわち粗酵素中に存在するＧST融合PhaC1を実施例１と同様にして精製した。この精製酵素についてSDS−PAＧEを行ったところ、PhaC1の分子量に相当する61kDaのシングルバンドを確認した。
【０１３４】
得られた精製酵素の濃度を、実施例１と同様に定量し、さらに培養液あたりの収率に換算した。また、精製酵素の活性を、実施例１と同様に測定し、酵素量(mg)あたりの酵素活性に換算した。その結果を表１に示す。結果から、PHA合成酵素と共発現させる分子シャペロンの種類によっては、得られたPhaC1の収率は低く、また酵素量あたりの酵素活性も低くなることがわかった。
【０１３５】
次にこの精製酵素を用いて、実施例１と同様にPHAの合成を検討した。その結果、実施例１と比較して1割以下の数の弱い蛍光を発する粒子が確認されたのにとどまり、PHAの合成量も少なくなることがわかった。
【０１３６】
＜比較例３＞
実施例１で得られたGST融合PhaC1発現ベクターで形質転換されたJM109株に、トリガーファクター単独の分子シャペロンを発現するように構成されたプラスミドベクターであるpTf16（タカラバイオ(株)製）を実施例１と同様にエレクトロポレーションによって形質転換した。
得られた菌株をアンピシリン100μg/ml、クロラムフェニコール20μg/mlを含有するLB培地5mlで一晩プレ・カルチャーした後、その2 mlを、アンピシリン100μg/ml、クロラムフェニコール20μg/ml、アラビノース4mg/mlを含有するLB培地1Lに添加し、30℃、120 rpmで振とう培養し、OD600=0.5になった時点でIPTGを添加 （終濃度20μg/ml）し、さらに3時間培養を続けた。
【０１３７】
次に、実施例1と同様に、培養した菌体を破砕し、それを遠心し、可溶成分と不溶成分を分離した。可溶成分と不溶成分それぞれについてSDS−PAGE後にクマジー染色を行ったところ、GST融合PhaC1に相当する分子量87kDのバンドが可溶成分と不溶成分ともに確認された。この可溶成分と不溶成分におけるGST融合PhaC1のバンドの量比は、おおよそ1:3であり、発現したGST融合PhaC1の多くが不溶性の封入体を形成していることがわかった。また、主に可溶成分にtigに相当する分子量のバンドが確認された。
【０１３８】
次に、この菌体破砕液の可溶成分、すなわち粗酵素中に存在するＧST融合PhaC1を実施例１と同様にして精製した。この精製酵素についてSDS−PAＧEを行ったところ、PhaC1の分子量に相当する61kDaのシングルバンドを確認した。
【０１３９】
得られた精製酵素の濃度を、実施例１と同様に定量し、さらに培養液あたりの収率に換算した。また、精製酵素の活性を、実施例１と同様に測定し、酵素量(mg)あたりの酵素活性に換算した。その結果を表１に示す。結果から、PHA合成酵素と共発現させる分子シャペロンの種類によっては、得られたPhaC1の収率は低く、また酵素量あたりの酵素活性も低くなることがわかった。
【０１４０】
次にこの精製酵素を用いて、実施例１と同様にPHAの合成を検討した。その結果、実施例１と比較して1割以下の数の弱い蛍光を発する粒子が確認されたのにとどまり、PHAの合成量も少なくなることがわかった。
【０１４１】
【表１】
2005073563.tif 000024
【０１４２】
＜実施例４＞
実施例１で得られたPhaC1精製酵素を用いて、（R）−3−ヒドロキシ−5−フェニルバレリルCoAをモノマーとして、PHAの合成を検討した。モノマーとして、28.3mg/mlの（R）−3−ヒドロキシ−5−フェニルバレリルCoA（Reformatsky反応により得られた3−ヒドロキシフェニル吉草酸エステルを加水分解して3−ヒドロキシ−5−フェニル吉草酸を得たのち、Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997） に記載の方法で調製）Tris-HCl溶液10μlを用いた他は、実施例１と同様の方法でPHAの合成を検討した。その結果、蛍光を発している粒子が確認され、モノマーとして（R）−3−ヒドロキシ−5−フェニルバレリルCoAを用いた場合も本実施例のPhaC1によってPHAが合成されることがわかった。
【０１４３】
さらに、PHA粒子の一部を用いて、実施例１と同様にゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより分子量を測定した結果を図２に示す。その結果、Ｍn＝37,000、Ｍｗ＝69,000であった。また、このポリマーにおいてUV吸収が確認され（RI及びUV検出器間の流路長により、展開時間に若干のずれがある）、フェニル基を有するモノマーがPHAに導入されていることが推測された。
【０１４４】
＜実施例５＞
実施例１で得られたPhaC1精製酵素を用いて、（R，S）−3−ヒドロキシ−5−フェノキシバレリルCoAをモノマーとして、PHAの合成を検討した。モノマーとして、28.8mg/mlの（R，S）−3−ヒドロキシ−5−フェノキシバレリルCoA（3−フェノキシプロパナールとブロモ酢酸エチルとのReformatsky反応で得られた3−ヒドロキシ−5−フェノキシ吉草酸エステルを加水分解して3−ヒドロキシ−5−フェノキシ吉草酸を得たのち、Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997）に記載の方法で調製）Tris-HCl溶液10μlを用いた他は、実施例１と同様の方法でPHAの合成を検討した。その結果、蛍光を発している粒子が確認され、モノマーとして（R，S）−3−ヒドロキシ−5−フェノキシバレリルCoAを用いた場合も本実施例のPhaC1によってPHAが合成されることがわかった。
【０１４５】
さらに、PHA粒子の一部を用いて、実施例１と同様にゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより分子量を測定した結果を図３に示す。その結果、Ｍn＝65,000、Ｍｗ＝172,000であった。また、このポリマーにおいてUV吸収が確認され（RI及びUV検出器間の流路長により、展開時間に若干のずれがある）、フェニル基を有するモノマーがPHAに導入されていることが推測された。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】実施例１におけるPHAのGPC分析結果を示す図である。
【図２】実施例４におけるPHAのGPC分析結果を示す図である。
【図３】実施例５におけるPHAのGPC分析結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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