(57)【要約】      （修正有）【課題】  アイメリア属のグリセロアルデヒド３燐酸脱水素酵素をコードするＤＮＡを提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するアイメリアのグリセロアルデヒド３燐酸脱水素酵素をコードするＤＮＡ分子が提供され、当該ＤＮＡ分子を用いて発現させたグリセロアルデヒド３燐酸脱水素酵素が提供される。また当該ＤＮＡ分子を含有する組み換えベクターが提供され、当該ＤＮＡ分子を含有する組み換えウイルスが提供される。更に、当該組み換えウイルスを有効成分として含有してなるコクシジウムのためのワクチンが提供され、前記グリセロアルデヒド３燐酸脱水素酵素を有効成分として含有してなるコクシジウムのためのワクチン。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２記載のアミノ酸配列からなるアイメリアのグリセロアルデヒド３燐酸脱水素酵素をコードするＤＮＡ分子。
【請求項２】
塩基配列が、配列番号１記載の塩基配列のオープン・リーディング・フレーム部分である請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】
請求項１記載のＤＮＡ分子を用いて発現させた組み換えグリセロアルデヒド３燐酸脱水素酵素。
【請求項４】
配列番号２の第８番目から３３９番目のアミノ酸配列を含有する組み換えグリセロアルデヒド３燐酸脱水素酵素融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１記載のＤＮＡ分子を含有する組み換えベクター。
【請求項６】
請求項１記載のＤＮＡ分子を含有する組み換えウイルス。
【請求項７】
ウイルスがアビポックスウイルス又はヘルペスウイルスである請求項６記載の組み換えウイルス。
【請求項８】
請求項６記載の組み換えウイルスを有効成分として含有してなるコクシジウムのためのワクチン。
【請求項９】
更に生理的燐酸塩バッファー及び／又は保存料を含有する請求項８のワクチン。
【請求項１０】
請求項３記載のグリセロアルデヒド３燐酸脱水素酵素を有効成分として含有してなるコクシジウムのためのワクチン。
【請求項１１】
更に生理的燐酸塩バッファー及び／又はアジュバント、保存料を含有する請求項１０記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鳥類寄生性のアイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）原虫由来のグリセロアルデヒド３燐酸脱水素酵素（ｇｌｙｃｅｒｏａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、以下「ＧＡＰＤＨ」と略す）をコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを発現させて得られるＧＡＰＨＤ、当該ＤＮＡを含有する組み換えベクター又は組み換えウイルス、及び当該組み換えウイルス又はＧＡＰＤＨを有効成分とする組み換えコクシジウムワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
コクシジウム症は腸に異常が起きる家禽疾病であり、軽症では下痢や飼料の肉転換率低下、重症では急性死亡など多様な問題を引き起こす。
この病気はアイメリア属の寄生虫によって引起される。この属には、アッセルブリナ、テネラ、マキシマ、ネカトリクス、ブルネッチ、ミチス、パラエコックスがある。この他ミバチやハガニという種をメンバーに加える研究者もいる。これらは全て類似の生活環を有するが、組織特異性や病原性は異なる。アッセルブリナ又はマキシマによる感染は、飼料の消化に大きな役割を果たす小腸部分に感染するので、特にブロイラーに大きな損害をもたらす。
コクシジウム症は抗コクシジウム剤の投与で対処されうるが、薬剤耐性株が頻繁に出現し、新しい薬剤の開発には多くのコストが必要である。更に、これら薬剤の多くは肉に残留し、それが消費者に問題を起こす可能性もある。
アイメリアの弱毒株或いは不活化した虫体を鶏に免疫して病気を予防する試みがなされてきた。早熟株のような弱毒生ワクチン株は野生型のアイメリア属各種のオーシストを鶏に感染させ、糞便に再びオーシストが排出されるまでの時間が短くなった虫を集めることによって得られる（Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１９７５、６１：１０８３−１０９０）。しかしながら、このような弱毒ワクチンでも免疫した鶏において少ないながらも虫は増殖し、病変が検出されるのである。一方、不活化ワクチンの防御レベルは充分には程遠い。更に、これらワクチンを大量生産するにはたくさんの鶏が必要であり、生産コストが高くなるという欠点がある。
【０００３】
上記以外には遺伝子組み換え技術を用いてアイメリア原虫の防御抗原を生産する方法がある。一度、見出された抗原は原核細胞や真核細胞の培養システムで無制限に安く製造でき、コクシジウムワクチンとして使用できる。
今までに多数の防御抗原候補の遺伝子が報告されてきた。例えば、Ｊｅｎｋｉｎｓらはアッセルブリナの膜画分抽出物で免疫した兎血清を用いてスクリーニングした２５０，０００ダルトンのメロゾイト表面タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡについて記載している（Ｅｘｐ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１９８８；６６：９６−１０７、米国特許５１２２４７１号）。或いは、抗血清でなくアイメリア原虫に対するモノクローナル抗体を使っても、アイメリア原虫の抗原遺伝子がスクリーニングされた（米国特許５０２８６９４号、米国特許５２７９９６０号、米国特許５８１４３２０号、米国特許５４４９７６８号）。しかしながら、これら抗原遺伝子がコードするタンパク質、又はこの抗原遺伝子を発現する組み換えウイルスを鶏に接種した場合、いずれも不十分な防御効果を示すにとどまっていた（米国特許５３８７４１４号、５４０３５８１号、５６０２０３３号、６００１３６３号）。
【０００４】
一般に、獲得免疫には細胞性免疫と液性免疫がある。上記の抗原遺伝子はいずれも抗体スクリーニングで得られたものなので、液性免疫を誘導する抗原であった。しかしながら、原虫や細菌に対する生体防御機能としては、液性免疫よりも細胞性免疫が重要と考えられている。
興味深いことに、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍやＳ．ｍａｎｓｏｎｉではＧＡＰＤＨがワクチン候補であることが知られ（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９３；６１：４７１６−４７２３、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９９；１７：１３−１８）、Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉのＧＡＰＤＨ上のＴ細胞、Ｂ細胞エピトープ領域も既に同定されている（Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０００；１８：２０３９−２０４８）。その他、トリパノゾーマやキャンディダ症でもＧＡＰＤＨが免疫に関与していることが示されている（Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．１９９５；１７２：８４５−８５０、Ｅｌｅｃｔｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９９９；２０：１００１−１０１０）。更にＴ細胞免疫応答に関与する抗原を同定するため、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓのゲノムライブラリーをスクリーニングしたところ、ＧＡＰＤＨがＴ細胞、Ｂ細胞応答抗原として選択された（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２；５１：６６１−６７１）。
アイメリアでは、このような細胞性免疫抗原はあまり知られておらず、虫に対する抗体を使ったスクリーニングでは得ることが困難であった。
【０００５】
更に、従来はインビトロでオーシストからスポロシストやスポロゾイトなどを調製し、そこから調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング材料にしてきた。これはアイメリアが感染した鶏腸管内で転写している多くのｃＤＮＡから抗原候補のｃＤＮＡを選別することが大変困難であった為である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、アイメリアの感染を防御することができるアイメリア由来の細胞性免疫抗原遺伝子を得るべく鋭意検討した結果、アイメリア感染鶏の腸からｃＤＮＡライブラリーを調製し、このライブラリー中に存在する多数のクローンのエクスプレスシークエンスタグ（ＥＳＴ）を解読することで、ＧＡＰＤＨをコードするＤＮＡを見出し、本発明を完成するに到った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
かくして本発明によれば、配列番号２記載のアミノ酸配列を有するアイメリアのグリセロアルデヒド３燐酸脱水素酵素をコードするＤＮＡ分子が提供され、当該ＤＮＡ分子を用いて発現させたグリセロアルデヒド３燐酸脱水素酵素が提供される。また当該ＤＮＡ分子を含有する組み換えベクターが提供され、当該ＤＮＡ分子を含有する組み換えウイルスが提供される。更に、当該組み換えウイルスを有効成分として含有してなるコクシジウムのためのワクチンが提供され、前記グリセロアルデヒド３燐酸脱水素酵素を有効成分として含有してなるコクシジウムのためのワクチンが提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のアイメリアＧＡＰＤＨ遺伝子を含有する、組み換えウイルスや、本発明のＧＡＰＤＨ遺伝子を用いた組み換えＧＡＰＤＨは、コクシジウムに対するワクチンとして利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（ＤＮＡ分子）
本発明のＤＮＡは、上記のアイメリアＧＡＰＤＨをコードするＤＮＡである。このようなＤＮＡは、例えば、アイメリア・マキシマ及びアッセルブリナを感染させた鶏の腸管細胞から、ｃＤＮＡとして調製される。
具体例としては配列番号１記載のものが挙げられる。配列番号１記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号２に記載されたアミノ酸配列である。もちろん、遺伝子の翻訳コードには１つのアミノ酸を決定するトリヌクレオチド配列が複数存在する場合があるので、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号１記載のものに限らない。
【００１０】
ＤＮＡは、ヌクレオチドの置換、欠失、又は付加により簡単にその分子構造を変えることができ、その結果、本発明のＤＮＡやそれから派生する新たなＤＮＡ配列が得られる。このように配列を変更したＤＮＡは、直接発現やミュータントのタンパク質の製造等に用いられる。ＤＮＡ分子にランダムに変異を入れる方法や部位特異的に変異を入れる方法はすでに確立された技術である（参考例として“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｓａｍｂｒｏｏｋら１３章があげられる）。
【００１１】
本発明のＤＮＡは、配列番号１の一部からなるものでもよいし、配列番号１の塩基配列に対し、９０％以上、好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなるものであってもよい。この場合の相同性は、ＢＬＡＳＴ検索ツールを用いて計算される。
【００１２】
本発明のＤＮＡは、後述するように、必要に応じて適当なリンカーを付加させて組み換えベクターや形質転換体や組み換えウイルスを構築するために変更することが可能である。
【００１３】
これらの組み換えＤＮＡ分子に、別のＤＮＡ配列を結合させ天然には存在しないヌクレオチド配列からなる融合ＤＮＡ分子を得ることもできる。具体的には、分泌のシグナル配列をあるタンパク質をコードするＤＮＡとインフレームで結合させれば、その結合遺伝子は分泌タンパク質として発現される。また、タンパク質をコードする配列にプロモーターを遺伝子操作によって結合させれば、その配列の転写を制御することが可能になる。一般に遺伝子操作による結合が意味するところは、隣接（或いはきわめて近接）に結合させることである。
【００１４】
本発明のＤＮＡ分子は、通常の遺伝子操作において適当なリンカーを付加することがある。リンカーは、天然には本発明のＤＮＡ分子と連結していない少なくとも１塩基、又は２以上のヌクレオチドをいい、ベクターやウイルスなどの組み込み部位に応じて設計されればよい。リンカーの付加は、各遺伝子発現が阻害されなければどのような方法でもよく、本発明のＤＮＡを適当な制限酵素で切断して直接或いはリンカーを介してベクターやウイルスＤＮＡと連結すればよい。
【００１５】
（組み換えＧＡＰＤＨ）
組み換えＧＡＰＤＨは、少なくとも本発明のＤＮＡ分子、又は少なくとも該ＤＮＡ分子を含有する組み換えベクターによって形質転換された宿主細胞、又は本発明のＤＮＡ分子、又は少なくとも該ＤＮＡ分子を含有する組み換えウイルスが導入された細胞で発現したタンパク質である。
【００１６】
本発明の組み換えＧＡＰＤＨは、鳥類寄生性のアイメリア由来であり、具体的には配列番号２記載のアミノ酸配列からなる。また、配列番号２記載のアミノ酸配列のマイナー変異体も本発明のＧＡＰＤＨである。ここでマイナー変異体は、アイメリア由来であって、天然に又は人工的に配列番号２記載のアミノ酸配列中の１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたものである。また、マイナー変異体の、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴｐホモロジーサーチのアルゴリズムにより算出される、配列番号２記載のアミノ酸配列に対する相同性は、９０％以上である。但し、マイナー変異体は、アイメリアのＧＡＰＤＨの少なくとも１つのエピトープ領域を保持している必要がある。得られたタンパク質を鶏に接種してＧＡＰＤＨに対する液性又は細胞性免疫を誘導することができれば、エピトープ領域は保持されたと判断される。
【００１７】
本発明の組み換えＧＡＰＤＨを得る具体的な方法を、形質転換された宿主細胞を用いた場合を例にとり、以下に説明する。
宿主細胞とは、発現ベクターに対する適性、生成物の安定性などを加味して選択することができ、原核細胞でも真核細胞でもよい。具体的には、エシェリヒア属（例えば、エシェリヒア・コリなど）、サルモネラ属（例えば、サルモネラ・チフィムリウムなど）、酵母、昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＣＥＦ細胞などが例示される。
【００１８】
形質転換された宿主細胞を、当該細胞が生存し、増殖することができる培養条件下で培養、増殖させる。例えば、大腸菌を用いた場合、好気的条件下、３７℃でＬＢ培地を用いて培養する。また、プロモーターを含有する組み換えベクターを用いた場合、プロモーター機能を誘発させる成分（例えば、ｌａｃプロモーター・オペレーターを用いた場合はイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ））を培養液に配合すると、組み換えＧＡＰＤＨ生産性が向上するので好ましい。
【００１９】
アフィニティ精製可能なタグ部分との融合タンパク質として発現させた場合には、そのアフィニティを利用した精製が便利である。例えば、ｐＧＥＸベクターを使ってグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させた組み換えＧＡＰＤＨは、グルタチオンセファロース４Ｂカラム（アマシャムバイオサイエンス社）で簡便に精製することができる。
このような融合タンパク質として、実施例６で示した配列番号２の第８番目から３３９番目のアミノ酸配列を含んでなる組み換えＧＡＰＤＨが例示される。
【００２０】
（組み換えベクター）
本発明の組み換えベクターは、少なくとも本発明のＤＮＡ分子を含有する組み換えベクターであり、後述するプロモーターやｌａｃＺ遺伝子などのマーカーとして用いられるマーカー遺伝子などが共に挿入されたものであってもよい。
ＤＮＡ分子やマーカー遺伝子などを組み込むベクターは、一般にベクターとして用いられているプラスミド、コスミド、ファージなどの中から任意に選択され、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＭなどのプラスミド、λファージ、Ｍ１３ファージなどのファージ、ｐＨＣ７９などのコスミドなどが挙げられる。ベクターは適当な制限酵素で切断し、常法に従って本発明のＤＮＡ分子やその他の必要なＤＮＡを挿入することにより、本発明の組み換えベクターを得ることができる。
【００２１】
また、本発明の組み換えＧＡＰＤＨを得るのに好適な組み換えベクターとしては、組み換えＧＡＰＤＨを容易に精製できるようにアフィニティ精製可能なタグ部分との融合タンパク質として発現させることができるような組み換えベクターが挙げられる。そのような組み換えベクターを与えるベクターの具体例としては、市販のｐＧＥＸベクター（アマシャムバイオサイエンス社）やｐＱＥベクター（キアゲン社）などが挙げられる。
【００２２】
（組み換えウイルス）
本発明の組み換えウイルスは、本発明のＤＮＡ分子を有するものであり、親ウイルスの増殖に非必須な領域（以下、単に非必須領域という）に当該遺伝子を常法に従って挿入することにより構築される。また、必要に応じて当該遺伝子の他に、組み換えベクターと同様のプロモーターやマーカー遺伝子を組み込むこともできる。
【００２３】
（１）親ウイルス
組み換えウイルスを得るために用いる親ウイルスは、本発明のＤＮＡ分子を挿入するためのウイルスであり、その種類は組み換えウイルス用ウイルスとして用いられるものであれば特に限定されない。このようなウイルスとして、具体的には、七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）、マレック氏病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルスなどのヘルペスウイルス；ファウルポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルス等が例示される。鶏ワクチンとしての利用を考慮すれば、ＨＶＴ  ＦＣ１２６（血清型３），ＳＢ１（血清型２）、リスペン（血清型１）のようなマレック病ワクチンが本発明の目的として特に好ましい。これらは、市販されているなど容易に入手することができる。
【００２４】
（２）非必須領域
組み換えウイルスを得るために用いる非必須領域は、前記親ウイルスの増殖に非必須なＤＮＡ領域である。ヘルペスウイルスの非必須領域に関してはいくつかの報告があり、例えば、ＷＯ８９／０１０４０号公報記載のＵＬ４３遺伝子、ＷＯ９３／２５６６５号公報記載のＵＳ２遺伝子、ＷＯ９９／１８２１５号公報記載のＵＬ４４からＵＬ４６のＯＲＦ間領域は、挿入した外来遺伝子を安定して保持できるため好適である。これらの中では、ＵＬ４４からＵＬ４６のＯＲＦ間領域がウイルス安定性の点で最も好適である。ポックスウイルスの非必須領域としては米国特許５，３８７，５１９号公報記載の７．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片、５．０ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、４．０ｋｂのＢａｍＨＩ断片、５．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片などが例示される。
【００２５】
（３）親ウイルスの非必須領域を含有するベクター
組み換えウイルス構築のために、上述したような非必須領域を有するベクターを用意する。ウイルスの非必須領域を含有するベクターは、前記組み換えベクターと同様のものを用いれば良く、これらのベクターを適当な制限酵素で処理して、常法に従って非必須領域を挿入することにより得られる。
【００２６】
（４）外来遺伝子
本発明でウイルスに組み込む外来遺伝子のうち少なくとも一つは、本発明のＧＡＰＤＨ遺伝子である。その他、アイメリアのほかの抗原遺伝子やその断片、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）のＨＮ、Ｆなどをコードする遺伝子やその断片、ＩＬＴＶのｇＢ、ｇＣ、ＵＬ３２などをコードする遺伝子やその断片、ＭＤＶのｇＢ、ｇＣ、ｇＤなどをコードする遺伝子やその断片も一緒に組み込むことができる。
外来遺伝子は、ウイルスゲノムの一つの領域に組み込んでも、別の領域に複数個組み込んでもよい。
【００２７】
（５）相同組み換えベクター（組み換えウイルス構築用ベクター）
本発明で用いる相同組み換えベクターは、本発明の組み換えベクターである。これは、少なくとも本発明のＧＡＰＤＨ遺伝子を後述するプロモーターとともに常法によって前述の親ウイルスの非必須領域を含有するベクターの非必須領域に挿入ることにより得られる。ＧＡＰＤＨ遺伝子に加えて、前述の外来遺伝子、或いはｌａｃＺ遺伝子などのマーカー遺伝子が本ベクターに挿入されていてもよい。
【００２８】
（６）プロモーター
ここで用いるプロモーターは、組み換えウイルス感染宿主中でプロモーターとして機能するものであれば、特に限定されない。例えば、組み換えヘルペスウイルスには、鶏のβ−アクチンプロモーター、サイトメガロウイルスのＩＥプロモーターなどを用いることができ、組み換えポックスウイルスには、ワクシニアウイルスの７．５ｋＤａや１１ｋＤａポリペプチドプロモーターなどを用いることができる。また、プロモーターとして機能する限りにおいては、プロモーターの塩基の一部を削除するなど改変されたものであってもよく、また、Ｍｏｓｓらの文献（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１０、第７４９〜６９頁、第７７１〜７８４頁、１９８９年）を参考にして合成プロモーターを用いることもできる。
【００２９】
（７）組み換えウイルスの作製方法
組み換えウイルスの作製方法は特に限定されず、常法に従えばよい。つまり、あらかじめウイルスを感染させた細胞に、例えば相同組み換えベクターが予め親ウイルスが感染した細胞に、或いは感染性ウイルスゲノムとともに細胞に導入される。導入方法は、エレクトロポレーションなど良く知られた方法で実施される。導入された細胞は、培養プレートに移され、相同組み換えベクターとウイルスゲノムとの間で相同組み換えを引起すようにウイルスプラークが出現するまで培養される。確認されたプラークには、親ウイルスと同様、組み換えウイルスも含まれる。組み換えウイルスはこれらプラークの中から公知の方法で純化される。
【００３０】
例えば、プラークを形成した細胞を適当な濃度で希釈し、９６−ウェルプレートに移し、アイメリアのＧＡＰＤＨに対する抗体を使った抗原抗体反応で、或いは、ＧＡＰＤＨ遺伝子をプローブとしたプラークハイブリダイゼーションによって選択できる。ｌａｃＺのようなマーカー遺伝子を有する組み換えウイルスの場合には、β−ガラクトシダーゼの基質の一つであるＢｌｕｏ−Ｇａｌ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）存在下で青いプラークを形成するのでより容易に選択できる。
【００３１】
宿主細胞としては、用いるウイルスが感染し増殖することが可能なものであればよく、例えば七面鳥ヘルペスウイルスを用いた場合は、ＣＥＦやアヒル胚線維芽細胞など、ＦＰＶを用いた場合は鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）や発育鶏卵漿尿膜細胞などが挙げられる。
【００３２】
（ワクチン）
本発明のワクチンは、本発明の組み換えウイルス又は組み換えＧＡＰＤＨの一用途であり、本発明の組み換えウイルス又は組み換えＧＡＰＤＨを有効成分として含有する。本発明のワクチンは、鶏に安全に投与できる限り、生理食塩水、或いはアジュバントや保存剤などのいかなる成分を含んでいても良い。
【００３３】
本発明のワクチンの鶏への投与方法は接種した鶏に免疫を誘導させることができる限りにおいて特に限定されない。例えば、組み換えウイルスを１０〜１０５ｐｆｕ／ドーズ、好ましくは１０２〜１０４ｐｆｕ／ドーズになるようにＰＢＳで懸濁し、初生齢鶏の背部皮下に、或いは、発育鶏卵の卵に注射針で、或いは、なんらかの器具を使って注射する方法などが例示される。
【００３４】
組み換えＧＡＰＤＨの場合には、強い免疫応答を誘導する為に免疫賦活剤とともに接種することが望ましい。免疫賦活剤も公知の多くの免疫賦活剤から選択することができる。例えば、油性アジュバント、水酸化アルミニウム、或いは細胞表層にあるトール様レセプター９に認識されて細胞性免疫を活性化するＣｐＧオリゴヌクレオチドなども使用できる。
組み換えＧＡＰＤＨの接種量も特に限定されないが、生理的食塩水で０．１ｍｇ／ｍｌ以上になるようにし、等量のフロインド不完全アジュバントとよく混合して、その混合液０．２ｍｌを４週齢の鶏の皮下に免疫すればよい。この場合は、追加免疫することが好ましく、更に好ましくは１週間隔で２回追加免疫する。
【実施例】
【００３５】
以下に、本発明を実施例にて説明する。
（実施例１）  アイメリアを感染させた鶏の腸管からのｃＤＮＡライブラリーの作製
鶏はハイライン・インターナショナル・プロダクションセンター（アイオア州ダラス）から卵で購入し、疫学系統分類学研究所寄生虫生物学室（メリーランド州ベルツビル）の施設で孵化し、一定の光、食餌、給水の元で飼育された。
エイメリア・マキシマ及びアッセルブリナは動物自然資源研究所で維持されていた野生株を５．２５％次亜塩素酸ナトリウム液で浮揚させることできれいにし、蒸留水で３回洗浄して鶏に感染させるのに用いた。
３週齢の鶏５羽に１×１０４個の胞子化オーシストを経口から感染させた。そして９週齢時に２×１０４個の同じ株の胞子化オーシストを経口から二次感染させた。
【００３６】
ｍＲＮＡを調製するため以前報告（Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＩＬ−１β，ＩＬ−２，ＩＬ−８，ＩＬ−１５，ＩＦＮ−α，ＩＦＮ−γ，ＴＧＦ−β４  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ  ｏｎ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ．、Ｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００１；２０：２６７−７４）したようにして、初回或いは二次感染後４日目の鶏の十二指腸（アッセルブリナ感染鶏）又はメッケル憩室から回腸の領域（マキシマ感染鶏）から腸管上皮細胞間リンパ球を集めた。即ち、鶏から摘出した腸部分は縦に切断して、氷冷の１０ｍＭヂチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加したカルシウム・マグネシウム不含ハンクス平衡塩液（ＣＭＦ−ＨＢＳＳ）で数回洗浄した。その後、腸は３センチ角断片に切断し、２５０ｍｌのＣＭＦ−ＨＢＳＳ液に入れて攪拌しながら３７℃１０分間置き、その上清は捨てた。腸の断片は２００ｍｌの０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ＣＭＦ−ＨＢＳＳ液で２回懸濁して、攪拌しながら３７℃１０分間置いた。死んだ細胞や細胞の凝塊を除く為、上清中の細胞をナイロンウール（ロビンズ・サイエンティフィック社）に通し、その細胞をパーコールの不連続密度勾配で６００ｇ、２４℃、２５分間遠心分離した。４０と５０％の中間層に集まった細胞を集め、ＣＭＦ−ＨＢＳＳで３回洗浄して−８０℃で保存した（これが腸管上皮細胞間リンパ球で次のｍＲＮＡ調製に使用した）。
【００３７】
最初に、エイメリア・マキシマ及びアッセルブリナ感染鶏の腸から回収した腸管上皮細胞間リンパ球から全ＲＮＡをトリゾル試薬（インビトロゲン社製、製品番号１５５９６−０２６）を用いて抽出し、ＤＮＡを除去するためＤＮａｓｅ処理をした。全ＲＮＡからのｍＲＮＡの分離はポリＡトラクトｍＲＮＡ分離システムＩＶ（プロメガ社製）を用いて行い、溶出させたｍＲＮＡの濃度と純度は、分光光度計（ベックマン社製）或いはノーザンマックス−グリ・キット（アムビオン社製）を用いて作製した１％変性アガロースゲルで決定した。
【００３８】
感染後の日数が異なる感染鶏の腸管上皮細胞間リンパ球から調製したｍＲＮＡをプールしてｃＤＮＡライブラリーの構築に用いた。ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡ合成とプラスミドへのクローニングの為のスーパースクリプトプラスミドシステム（インビトロジェン社製、製品番号１８２４８−０１３）を用いて調製し、製造元推奨に従ってキットに入っているｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６のＮｏｔＩ−ＳａｌＩ制限酵素サイトにクローニングされた。ｃＤＮＡライブラリーはエレクトロマックスＤＨ１０Ｂコンピテントセル（インビトロジェン）に導入してアンピシリン含有ＬＢプレートで増殖させ、オリジナルライブラリーとして−８０℃で保存した。
【００３９】
（実施例２）  アイメリアＧＡＰＤＨタンパク質をコードするｃＤＮＡのスクリーニング
２．１  ｃＤＮＡライブラリーの均質化
新規な遺伝子配列の発見はｃＤＮＡライブラリーの均質化をすることによって大いに進展した。体細胞ｍＲＮＡは優勢、稀、そしてその中間クラスの３つに分けられる。
平均的な細胞では、優勢クラスは１０種類のｍＲＮＡで、各々細胞当たり約５，０００コピー存在する。反対に、稀なクラスは約１５，０００種類の異なるｍＲＮＡがあり、各々は細胞当たり１〜１５コピーである。
優勢クラスのＲＮＡを除去する方法は、コロニーハイブリダイゼーションに基づいている。ｃＤＮＡライブラリーを固定培地に蒔いて出現コロニーをナイロンメンブレンに移した。メンブレンを［３２Ｐ］で標識した優勢ＲＮＡでハイブリダイズさせた。反応しなかったコロニーを塩基配列解読する為に選択した。
【００４０】
ｃＤＮＡライブラリーを均質化する方法は、再結合の動力学に基づいている。全ＤＮＡ分子が変性した時、再結合する速度は一本鎖ＤＮＡの濃度の２次数である。従って、稀なクラスはゆっくりとアニールが起こり、再結合反応が進行する時、１本鎖として残ったＤＮＡはだんだんと均質化していく。
【００４１】
２．２  ライブラリーの特性調査
挿入ｃＤＮＡクローンは分離されたプラスミドを鋳型として、Ｔ７とＳＰ６プライマーでＰＣＲ反応によって増幅した。増幅された挿入ＤＮＡは、タンパク質やプライマーを除去するため、イソプロパノールで沈殿させ、ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）で再懸濁した。挿入ＤＮＡの長さはアガロースゲル電気泳動で決定した。ＰＣＲで増幅させた挿入ＤＮＡはＢｉｏＭｅｋ２０００ロボット（ベックマン・コールター社製）を使ってナイロンフィルターにスポットし、鶏由来なのか、それともアイメリア由来なのかを調べる為、［３２Ｐ］で標識した鶏、アイメリア・マキシマ又はアッセルブリナ由来のゲノムＤＮＡとそれぞれハイブリザイズさせた。
【００４２】
２．３  塩基配列解読
約５，０００個のコロニーを寒天培地に出現させ、拾った。各コロニーをマイクロタイタープレートの各ウェルで３０℃、１６時間培養した。ｃＤＮＡライブラリーのプラスミドＤＮＡはキアゲン社のミニプレップキットを使用して調製した。ＤＮＡ濃度は２６０ｎｍでの分光光度計（ベックマン）で決定し、約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように調整した。ＤＮＡは小分けして塩基配列解析する為−８０℃で保存した。
【００４３】
自動シーケンサーの場合、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、バッファー、ヌクレオチド、蛍光標識色素ターミネーターを含むＰＣＲ反応液に鋳型ＤＮＡとＴ７プライマーを加えた。ＰＣＲ反応は最初に９４℃で５分間変性させ、９４℃１分の変性、５５℃１分のアニーリーング、６０℃１分の伸長反応の循環を２５回続けて行った。反応液に７０％イソプロパノールを加えて攪拌し、３２００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより反応物を沈殿させた。９６−ウェルプレートをひっくり返し、再度６００ｒｐｍで２分間遠心分離して残存するイソプロパノールを除いた。沈殿物は７０％エタノールで洗浄し、先ほどと同じ操作でエタノールを除去した。プレートを１０分間乾燥させ−２０℃のデシケーター内に保存した。シーケンサーのサンプルをセットする直前にホルムアミドを加えて２０００ｒｐｍで３分間、室温で遠心分離した。そのサンプルはＡＢＩ３７００（アプライドバイオシステム社製）自動シーケンサーに供した。
【００４４】
２．４  シーケンス解析
シーケンスデータは国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の塩基及びタンパク質データベースをそれぞれＢＬＡＳＴｎ、ＢＬＡＳＴｘプログラムで検索した。
【００４５】
（実施例３）  アイメリアＧＡＰＤＨをコードするｃＤＮＡの同定
このようにして約５，０００コロニーを調べた中で、クローン１ＧＡＬ６２Ｉ＿２１のＥＳＴ配列は、上記ＢＬＡＳＴｎ解析によって最も相同性の高い配列としてアイメリア・テネラのＥＳＴ配列  ＥｔＥＳＴｅｅ３３ｅ０９．ｙ１（ＧｅｎｅＢａｎｋにＢＭ３０６６１６のアクセッション番号で登録）が検索され、ＢＬＡＳＴｘ解析によってトキソプラズマ・ゴンジのＧＡＰＤＨタンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋにＡＡＫ２０４２０のアクセッション番号で登録）が検索された。
【００４６】
クローン１ＧＡＬ６２Ｉ＿２１の全塩基配列解読の結果、このクローンの塩基配列の全貌が明らかになった。このクローンは３’末端にポリＡ配列を含む１，２８０塩基からなり、これを配列番号１で示す。このｃＤＮＡ配列中には３３９アミノ酸からなる一つのオープン・リーディング・フレーム（以下、ＯＲＦと略す）が存在しており、この見出されたＯＲＦのアミノ酸配列を配列番号２に記載する。
ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴｐホモロジーサーチでこの配列番号２のアミノ酸配列は、トキソプラズマ・ゴンジのＧＡＰＤＨタンパク質のアミノ酸配列に対し、７６％（２５９／３３９アミノ酸）同一であり、類似性アミノ酸も含めると８８％（２９８／３３９アミノ酸）相同であった。
【００４７】
また、二番目に相同性が高い既知タンパク質はマラリア原虫（Ｐ．  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のＧＡＰＤＨ（アクセッション番号はＮＰ＿７０２４８７）であり、２３９アミノ酸（７１％）が同一配列であった。以下、配列番号２の類似性タンパク質としてその他の生物のＧＡＰＤＨが検索されたので、配列番号２のタンパク質はアイメリアのＧＡＰＤＨであることが強く示唆された。
アイメリア属のＧＡＰＤＨの塩基配列及びアミノ酸配列はこの時点では報告されておらず、本発明のアイメリアのＧＡＰＤＨはその最初の報告である。
【００４８】
（実施例４）  アイメリアＧＡＰＤＨ遺伝子を含む組み換えベクターの鶏への免疫効果
受精ＳＰＦ卵をＳＰＡＦＡＳ社製から購入し、孵化させた。孵化した雛を９羽ずつ３群に分けた。プラスミド１ＧＡＬ６２Ｉ＿２１をハンクス平衡塩（ＨＢＳＳ）培地で０．１ｍｌ当り２５ないし５０μｇにして、１週齢と２週齢の２回、鶏脚皮下に遺伝子銃を使ってそれぞれ接種した。対照群鶏はＨＢＳＳ培地のみを接種した。３週後、鶏はアイメリア・アッセルブリナ  ベルツビル株の１０，０００胞子化オーシストで経口から攻撃した。その攻撃後６日から９日までの糞を集め、糞中の排出オーシストを集めてＭｃＭａｓｔｅｒ計数器と顕微鏡で計数した。総オーシスト量は以下の式で算出した。
総オーシスト量＝カウント数×希釈率×糞サンプル量／計数器の容量
コントロール群、２５μｇ、５０μｇ接種群の平均排出オーシスト量は各々３８６、２６０、２６７×１０Ｅ６個であった（図１）。この結果は、ＧＡＰＤＨ遺伝子がワクチンとして有望抗原であることを示唆している。
【００４９】
（実施例５）  アイメリアＧＡＰＤＨを含有する組み換えウイルス作製用ベクターの構築
５．１  鶏β−アクチンプロモータ遺伝子の単離
鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＰｒＢａｃ１（配列番号４）とプライマーＰｒＢａｃ２（配列番号５）を用いてポリメラーゼ・チェイン反応（ＰＣＲ）により鶏β−アクチンプロモーターを含むＤＮＡ断片（約１．５Ｋｂｐ）を得た。このＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩで二重切断して切り出さしたＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１８にクローニングして、前述のＤＮＡシークエンサーを用いて、このＤＮＡ断片の塩基配列分析をした。その結果、配列番号３で示される１，５２５ｂｐの鶏β−アクチンプロモーターであることを確認した。
【００５０】
５．２  プラスミドｐＧＩＢａｃｐＡの構築（図２）
ＷＯ９９／１８２１５号公報に記載されたプラスミドｐＧＩＭＣＳｐｏｌｙＡＳｆｉ（２，７７３ｂｐ）を制限酵素ＢａｍＨＩ／ＡｐａＩで切断し、合成オリゴヌクレオチドＡｄ−Ｂ−Ａ−Ｕ（配列番号６）と合成オリゴヌクレオチドＡｄ−Ｂ−Ａ−Ｌ（配列番号７）をアニールさせて調製した合成二本鎖ＤＮＡアダプターを挿入してプラスミドｐＧＩＭＣＳ２（２，７６５ｂｐ）を作製した。
次に、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩで二重切断して切り出した前述の鶏β−アクチンプロモーター（１，５２３ｂｐ）とｐＧＩＭＣＳ２を同じく制限酵素ＰｓｔＩ／ＸｂａＩで切断したプラスミド断片とを連結させ、ｐＧＩＢａｃ（４，２７２ｂｐ）を作製した。
更にプラスミドｐＢＫ−ＣＭＶ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、カタログ番号＃２１２２０９）をテンプレートにして、プライマーＰｏｌｙＡ−Ｆ（配列番号８）とプライマーＰｏｌｙＡ−Ｒ（配列番号９）でＰＣＲを行い、ＳＶ４０のｐｏｌｙＡシグナルのＤＮＡ断片（３３４ｂｐ）を増幅し、これを制限酵素ＡｐａＩ／ＫｐｎＩで切断して切り出したＤＮＡ断片（３２４ｂｐ）を、同じく制限酵素ＡｐａＩ／ＫｐｎＩで二重切断したｐＧＩＢａｃに挿入し、ｐＧＩＢａｃｐＡ（４，５８４ｂｐ）を作製した。ｐＧＩＢａｃｐＡまでの構築過程を図２に示す。
【００５１】
５．３  プラスミドｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐＡの構築（図３）
上記のようにして作製したｐＧＩＢａｃｐＡを制限酵素ＢｇｌＩで切断して、アガロースゲル電気泳動でＤＮＡ断片を分離し、１，９３１ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した。この回収ＤＮＡ断片を制限酵素ＳｆｉＩで切断したＷＯ９９／１８２１５号公報記載のプラスミドｐＮＺ４５／４６Ｓｆｉ（全長５，４９３ｂｐ）に挿入して、ｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐＡ（７，４２４ｂｐ）を構築した。この構築過程を図３に示す。
【００５２】
５．４  プラスミドｐ４５ＢａｃＧＡＰＤＨの構築（図４）
実施例３で得られたアイメリアＧＡＰＤＨ遺伝子のＯＲＦの前後にそれぞれＸｂａＩサイトとＸｈｏＩサイトを導入する為、クローン１ＧＡＬ６２Ｉ＿２１をテンプレートにし、プライマーＸｂａＧＡＰＤＨ（配列番号１０：５’−ＣＣＴＴＡＣＴＣＡＧＴＣＴＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＴＧＣＣＧ−３’）とプライマーＧＡＰＤＨＸｈｏ（配列番号１１：５’−ＣＴＡＡＡＧＴＧＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＡＧＧＣＧＡＣＡＧ−３’）を用いてＰＣＲを行った。そして増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩとＸｈｏＩで処理したＤＮＡ断片（１，０６６ｂｐ）と、制限酵素ＸｂａＩ／ＳａｌＩで二重切断したｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐＡ（７．４ｋｂ）に連結した。構築されたプラスミドｐ４５ＢａｃＧＡＰＤＨ（８，３７８ｂｐ）は組み換えＨＶＴを作出するためのホモロジーベクターとして用いられる。
【００５３】
（実施例６）  組み換えＧＡＰＤＨの生産
６．１  アイメリアＧＡＰＤＨのＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターの構築
組み換えアイメリアＧＡＰＤＨタンパク質をＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、精製するために、大腸菌発現ベクターｐＧＥＸ−ＧＡＰＤＨを以下のようにして構築した（図５）。
ＧＳＴ遺伝子を有するプラスミドベクターｐＧＥＸ−６ｐ−３（アマシャムファルマシア社コード番号２７−４５９９−０１）に挿入するためにアイメリアＧＡＰＤＨ遺伝子のＯＲＦ内にＢａｍＨＩサイトを、ＯＲＦの下流にＸｈｏＩサイトをＰＣＲで導入した。具体的には、クローン１ＧＡＬ６２Ｉ＿２１をテンプレートにして、ＧＡＰＤＨＢａｍ１プライマー（５’−ＧＴＧＣＣＧＴＡＴＧＧＧＡＴＣＣＡＡＣＧＧＣＴＴＣＧＧ−３’）とＧＡＰＤＨＸｈｏｅｎｄプライマー（５’−ＣＴＡＡＡＧＴＧＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＡＧＧＣＧＡＣＡＧ−３’）とでＰＣＲ反応を行い、約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。こうして得られたＤＮＡ断片は、配列番号２の８〜３３９番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片である。
【００５４】
このＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで二重切断し、アガロースゲル電気泳動後ゲルからＤＮＡ断片を切り出し、ＱＩＡクイックエキストラクションキット（キアゲン社製）でＤＮＡを抽出した。同様に制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで二重切断したプラスミドベクターｐＧＥＸ−６ｐ−３もゲルから回収した。ｐＧＥＸ−ＧＡＰＤＨを作製する為、回収した二つのＤＮＡをライゲーションし、コンピテントセルＪＭ１０９（タカラバイオ社製）に導入した。得られたアンピシリン耐性の形質転換体をランダムに拾い、２ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地で培養後、プラスミドを常法に従って回収し、制限酵素切断で目的とするプラスミドを選択した。
塩基配列プライマー（アマシャムファルマシア社製、コード番号２７−１４１０−０１と同２７−１４１１−０１）を使って、制限酵素切断で選択したこのプラスミドの塩基配列を解読し、目的としたＧＡＰＤＨ遺伝子がインフレームで接続されていることを確認した。
【００５５】
６．２  組み換えＧＡＰＤＨの発現
大腸菌ＢＬ２１株（アマシャムファルマシア社製）を目的とする組み換えプラスミドで形質転換し、得られた形質転換体をアンピシリン含有ＬＢ培地で１６時間培養後、新鮮な１００倍量の同培地に接種して２時間培養後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように添加して更に３時間培養し、この大腸菌細胞を集菌し、レムリバッファー（６０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８）、２５％グリセロール、２％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）に懸濁後、１００℃で煮沸した。ライセートを１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）し、クマジーブリリアントブルー（ＣＢＢ）でゲルを染色して調べたところ、ＧＳＴとの融合タンパク質として期待された約６２−ｋＤａのタンパク質が大量に発現していた。
【００５６】
６．３  組み換えＧＡＰＤＨの精製
組み換えプラスミドを有する大腸菌形質転換体を２ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地で１６時間培養後、新鮮な１００ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地に１／１００量を接種して２時間培養後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように添加して更に３時間培養した。その後、大腸菌細胞を遠心分離で集め、燐酸バッファー塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。その細胞をリシスバッファー（５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ  ４−（２−アミノエチル）−ベンゾルサルフォニル  フルオリド  ハイドロクロリド（ＭＥＲＣＫ社製、商品名Ｐｅｆａｂｌｏｃ  ＳＣ）、１．５ｍｇ／ｍｌリゾチーム）に懸濁し、４℃で１時間ゆっくりと攪拌した。その後Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を終濃度０．３％になるように添加し、更に２０分ゆっくりと攪拌した。その後、その懸濁液を遠心チューブに移し、１２，０００×ｇで３０分遠心分離し、ペレットと上清に分けた。
【００５７】
このペレットと上清画分を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べたところ、目的とするタンパク質は殆どが不溶性のペレット画分に存在した。
そこで、このペレット画分をレムリバッファーに懸濁して煮沸した後、８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、６２ｋＤａ付近のタンパク質が存在するゲル部分を切り取り、ミニ・ホール・ゲル・エリューター（バイオラッド社製）にてｐＨ８．７の溶出バッファー（６０ｍＭトリス塩酸、２５ｍＭホウ酸）を使ってゲルからタンパク質を抽出した。画分に回収されたタンパク質を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＣＢＢ染色で確かめた。この方法で、１００ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地での培養から、約１ｍｇの組み換えタンパク質が精製された。
【００５８】
（実施例７）  組み換えＧＡＰＤＨを接種した鶏に誘導された免疫
精製した組み換えＧＡＰＤＨ（０．２ｍｇ／ｍｌ）に１５μｇ／ｍｌになるように化学合成したオリゴヌクレオチドＣｐＧ（配列番号１４：５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’）を加え、更に等容量のフロインド完全アジュバンド（ＦＣＡ）と混合しミセルを形成させた。１０羽の４週齢の鶏に、その０．２ｍｌずつを皮下に免疫し、更に等量の組み換えタンパク質とＣｐＧ、フロインド不完全アジュバンド（ＩＦＡ）を用いた抗原で１週間隔２回追加免疫した。最後の免疫から１０日後に免疫鶏から約２ｍｌずつ部分採血した。それらから常法に従って、抹消血リンパ球と血清を調製した。また、５羽の非免疫鶏からも採血して対照サンプルとして調製した。
【００５９】
血清については、アッセルブリナのスポロゾイトに対する反応性をウエスタンブロット法で調べた。１×１０７個のアッセルブリナのスポロゾイトを、レムリバッファーに懸濁して５分間煮沸後、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。電気泳動終了後、スポロゾイトタンパク質をイモビロンＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）にブロットした。ブロット後、メンブレンを乾燥させ、全部で１２本の短冊に切断した。５００倍に希釈した鶏血清と室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳでニ回洗浄し、次に、アルカリホスファターゼ標識羊抗−鶏ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＢＥＴＨＹＬ社製、＃Ａ３０−１０６ＡＰ）と、室温で、１時間インキュベートした。ＰＢＳで数回洗浄した後、発色基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェイト／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を用いて、反応するタンパク質を検出した。その結果、免疫した１０羽の鶏血清は全て３６−ｋＤａのタンパク質が特異的に反応した。一方、陰性コントロール血清では、非特異的に染まるタンパク質は有るものの特異的に染まるタンパク質は無かった。このことは、組み換えＧＡＰＤＨは接種した鶏に、液性免疫を誘導できたことを示している。
【００６０】
また、この組み換えタンパク質による細胞性免疫の誘導については、Ｔ細胞増殖活性で測定した。具体的には以下の手順であった。末梢血リンパ球を、血球算定器でカウントし、１ｍｌ当り１×１０６個の細胞となるようにＲＰＭＩ１６４０培地で調整した。９６ウェル平底組織培養用プレートに、０．１ｍｌ細胞懸濁液を加え、５％ＣＯ２雰囲気下において、４１℃で１６時間培養した。更に１０ｍｌ抗原懸濁液を加え（非刺激ウェルには添加しない）６４時間培養した。抗原懸濁液は、３つの異なる数のアイメリア・アッセルブリナ  スポロゾイト（５×１０５個、１×１０６個、３×１０６個）を超音波処理して調製した。その後、１ウェルに付き、０．５マイクロキューリーの３Ｈ−サイミジンを加え、１８時間後、細胞をグラスファイバー・フィルター（ミリポア社製、ＡＰＦＣ０２５００）に回収した。ＰＢＳで洗浄したそのフィルターを乾燥後、液体シンチレーションカウンター（ベックマン・コールター社製；ＬＳ３８０１）で、細胞に取込まれた３Ｈ量を測定した。各抗原濃度で２ウェルずつ測定した。
【００６１】
（実施例８）  組み換えＨＶＴの単離精製
Ｍｏｒｇａｎらの方法（Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １９９０；３４；３４５−３５１）によって、親株ＨＶＴのＤＮＡを調製し、実施例４に記述したプラスミドｐ４５ＢａｃＧＡＰＤＨとともに電気穿孔法を用いてＣＥＦ細胞に導入し、実施例６に記述したＧＡＰＤＨに対する鶏抗血清を用いて組み換えＨＶＴの純化を行った。その具体的方法は以下の通りである。
ｐ４５ＢａｃＥ．ＧＡＰＤＨのＤＮＡ５μｇと２５μｇのＨＶＴゲノムＤＮＡを１００μｌのＳａｌｉｎｅＧ（０．１４Ｍ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ塩化カリウム、１．１ｍＭリン酸一水素二ナトリウム、１．５ｍＭリン酸二水素一ナトリウム０．５ｍＭ塩化マグネシウム・６水和物、０．０１１％グルコース）に懸濁した。２×１０６個の鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を０．７ｍｌのＳａｌｉｎｅＧに懸濁し、上記ＤＮＡ液を加え、室温でジーンパルサー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて２５μＦ、１．２ｋＶ、０．４ミリ秒の条件にて遺伝子導入した。細胞を室温で１０分間静置した後、４％牛血清を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５とＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ  Ｍｅｄｉｕｍと（ともにＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製、カタログ番号＃４１３００−０３９、＃２１５００−０６１）を同容量比で混合した培地（以下、ＬＭ（＋）培地と略す）を加え、直径６０ｍｍの細胞培養皿で、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で６日間、培養する。この細胞を適当に希釈し、ＬＭ（＋）培地に懸濁したＣＥＦと混ぜ、９６−ウェルプレートに分注し、プラークがでるまで培養した。プレートの各ウェルの細胞をトリプシン処理して、新鮮なＣＥＦ細胞を追加して９６−ウェルプレート２枚の各ウェルに移した。こうして作製したレプリカプレートをプラークが出現するまで培養した。その後、その１枚のプレートの細胞をメタノールで固定し、ＧＡＰＤＨに対する鶏抗血清を１次抗体とした抗原抗体反応により、ＧＡＰＤＨを発現する組み換えＨＶＴが存在しているかどうかの確認を行った。組み換えＨＶＴの確認されたウェルに相当するレプリカより細胞を回収、希釈し、ＬＭ（＋）培地に懸濁した新鮮なＣＥＦ細胞とまぜて９６−ウェルプレートに分注し、培養した。この、希釈・レプリカの作製・組み換えＨＶＴの確認の繰り返しを、１ウェルから由来する全てのプラークがほぼ１００％組み換えＨＶＴであることを確認できるまで行った。この組み換えＨＶＴを１０５ｐｆｕ程度までＣＥＦで増殖後、超音波破砕処理を行い、遠心上清を、９６−ウェルプレートのＣＥＦ細胞に感染させた。１週間培養後、再び、この操作を繰り返して組み換えＨＶＴが１００％になるまで繰り返した。こうして純化した組み換えＨＶＴウイルスをｒＨＶＴ／ＧＡＰＤＨと命名した。
【００６２】
（実施例９）  組み換えウイルスでのＧＡＰＤＨタンパク質の発現
７５ｃｍ２フラスコに新鮮な１×１０７ｐｆｕのＣＥＦと１×１０５ｐｆｕのｒＨＶＴ／ＧＡＰＤＧＨをまき、約７２時間後に、感染細胞をスクレーパーにて回収した。遠心分離（２，０００ｒｐｍで５分）で感染細胞を回収し、１０ｍｌのＰＢＳで細胞を洗浄し、再び遠心分離で細胞を集めた。その細胞ペレットに０．１ｍｌのタンパク質電気泳動用バッファーを加えて煮沸した。そのライセートを１２．５％ＳＤＳ−電気泳動にかけた後、ゲル上のタンパク質をイモビロンＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）に転写し、乾燥させた後、実施例７で採取した鶏抗ＧＡＰＤＨ血清（１：２００倍希釈）と３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで２回洗浄した後、メンブレンはアルカリホスファターゼ標識羊抗鶏ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｂｅｔｈｙｌ社製、カタログ番号Ａ３０−１０６ＡＰ、１０００倍希釈）と室温で１時間反応させ、ＰＢＳで数回洗浄して、ＢＣＩＰ／ＮＢＴで発色させた。期待された３６−ｋＤａのタンパク質が、野生型ＨＶＴのレーンと比較して、ｒＨＶＴ／ＧＡＰＤＧＨのレーンに特異的に検出された。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ＧＡＰＤＨ遺伝子を有する組み換えベクターを鶏に接種した効果を表した図である。
【図２】プラスミドｐＧＩＢａｃｐＡの構築過程を説明した図である。
【図３】プラスミドｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐＡの構築過程を説明した図である。
【図４】プラスミドｐ４５ＢａｃＥ．ＧＡＰＤＨの構築過程を説明した図である。
【図５】プラスミドｐＧＥＸ−ＧＡＰＤＨの構築過程を説明した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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