(57)【要約】【課題】ライムギなどのムギ類のゲノムに特異的に存在する新規なトランスポゾン様因子を得ることが本発明の課題である。【解決手段】本発明により、3041塩基対からなるトランスポゾン様因子RevolverのDNA配列、およびその構造変異体のDNA配列が提供された。本発明のトランスポゾン様因子RevolverのDNA配列、Revolverがコードする転写活性がある遺伝子のDNA配列、およびその構造変異体のDNA配列は、イネ科の有用資源植物のゲノムの検出、DNAマーカー開発、染色体の同定、進化の検討のためのプローブ、PCRのエントリーポイントなどに利用することが可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示す塩基番号３８２−３４２２で示される塩基配列、あるいは当該塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、トランスポゾン様因子。
【請求項２】
配列表の配列番号１に示す塩基番号１−４０００で示される塩基配列、あるいは当該塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、制御因子領域含有トランスポゾン様因子。
【請求項３】
配列表の配列番号２に示す塩基番号３７７−３３０５で示される塩基配列、あるいは当該塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、トランスポゾン様因子。
【請求項４】
配列表の配列番号２に示す塩基番号１−３５２８で示される塩基配列、あるいは当該塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、制御因子領域含有トランスポゾン様因子。
【請求項５】
配列表の配列番号３に示す塩基番号４３−４３１１で示される塩基配列、あるいは当該塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、トランスポゾン非自律性因子。
【請求項６】
配列表の配列番号３に示す塩基番号１−４４７９で示される塩基配列、あるいは当該塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、制御因子領域含有トランスポゾン非自律性因子。
【請求項７】
配列表の配列番号４に示す塩基番号２４−３２４２で示される塩基配列、あるいは当該塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、トランスポゾン非自律性因子。
【請求項８】
配列表の配列番号４に示す塩基番号１−３４１３で示される塩基配列、あるいは当該塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、制御因子領域含有トランスポゾン非自律性因子。
【請求項９】
配列表の配列番号５に示す塩基番号２４−２６８８で示される塩基配列、あるいは当該塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、トランスポゾン非自律性因子。
【請求項１０】
配列表の配列番号５に示す塩基番号１−２８５８で示される塩基配列、あるいは当該塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、制御因子領域含有トランスポゾンの非自律性因子。
【請求項１１】
配列表の配列番号６に示す塩基番号２４−３５２６で示される塩基配列、あるいは当該塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、トランスポゾン非自律性因子。
【請求項１２】
配列表の配列番号６に示す塩基番号１−３６９７で示される塩基配列、あるいは当該塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、制御因子領域含有トランスポゾンの非自律性因子。
【請求項１３】
配列表の配列番号７に示す塩基番号１−６９４で示される塩基配列、あるいは当該塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、トランスポゾンcDNA。
【請求項１４】
配列表の配列番号８に示す塩基番号１−７２６で示される塩基配列、あるいは当該塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、トランスポゾンcDNA。
【請求項１５】
配列表の配列番号９に示す塩基番号１−７２８で示される塩基配列、あるいは当該塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、トランスポゾンcDNA。
【請求項１６】
配列表の配列番号１０に示す塩基番号１−６６５で示される塩基配列、あるいは当該塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、トランスポゾンcDNA。
【請求項１７】
配列表の配列番号１１に示す塩基番号１−３９５で示される塩基配列、あるいは当該塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、トランスポゾンcDNA。
【請求項１８】
配列表の配列番号１２に示す塩基番号１−１５９７で示される塩基配列、あるいは当該塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、トランスポゾンcDNA。
【請求項１９】
配列表の配列番号１３に示すアミノ酸番号１−１１７で示されるアミノ酸配列、あるいは当該アミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなることを特徴とする、トランスポゼース。
【請求項２０】
請求項１記載のトランスポゾン様因子又はその一部分からなるDNAフラグメントであることを特徴とする、プローブ又はプライマー。
【請求項２１】
請求項２記載の制御因子領域含有トランスポゾン様因子又はその一部分からなるDNAフラグメントであることを特徴とする、プローブ又はプライマー。
【請求項２２】
請求項３記載のトランスポゾン様因子又はその一部分からなるDNAフラグメントであることを特徴とする、プローブ又はプライマー。
【請求項２３】
請求項４記載の制御因子領域含有トランスポゾン様因子又はその一部分からなるDNAフラグメントであることを特徴とする、プローブ又はプライマー。
【請求項２４】
請求項５記載のトランスポゾン非自律性因子又はその一部分からなるDNAフラグメントであることを特徴とする、プローブ又はプライマー。
【請求項２５】
請求項６記載の制御因子領域含有トランスポゾンの非自律性因子又はその一部分からなるDNAフラグメントであることを特徴とする、プローブ又はプライマー。
【請求項２６】
請求項７記載のトランスポゾン非自律性因子又はその一部分からなるDNAフラグメントであることを特徴とする、プローブ又はプライマー。
【請求項２７】
請求項８記載の制御因子領域含有トランスポゾンの非自律性因子又はその一部分からなるDNAフラグメントであることを特徴とする、プローブ又はプライマー。
【請求項２８】
請求項９記載のトランスポゾン非自律性因子又はその一部分からなるDNAフラグメントであることを特徴とする、プローブ又はプライマー。
【請求項２９】
請求項１０記載の制御因子領域含有トランスポゾンの非自律性因子又はその一部分からなるDNAフラグメントであることを特徴とする、プローブ又はプライマー。
【請求項３０】
請求項１１記載のトランスポゾン非自律性因子又はその一部分からなるDNAフラグメントであることを特徴とする、プローブ又はプライマー。
【請求項３１】
請求項１２記載の制御因子領域含有トランスポゾンの非自律性因子又はその一部分からなるDNAフラグメントであることを特徴とする、プローブ又はプライマー。
【請求項３２】
請求項１３から請求項１８のいずれか一つの請求項記載のトランスポゾンcDNA又はその一部分からなるDNAフラグメントであることを特徴とする、プローブ又はプライマー。
【請求項３３】
請求項１９記載のトランスポゼースをコードする遺伝子又はその一部分からなるDNAフラグメントであることを特徴とする、プローブ又はプライマー。
【請求項３４】
請求項２０ないし請求項３３のいずれか一つの請求項記載のプローブ又はプライマーを、有用資源植物の遺伝子マーカーを開発するためにツールとして使用する方法。
【請求項３５】
請求項２０ないし請求項３３のいずれか一つの請求項記載のプローブ又はプライマーを、有用資源植物のゲノムを検出するために使用する方法。
【請求項３６】
請求項２０ないし請求項３３のいずれか一つの請求項記載のプローブ又はプライマーを、有用資源植物の染色体を同定するために使用する方法。
【請求項３７】
請求項２０ないし請求項３３のいずれか一つの請求項記載のプローブ又はプライマーを、植物におけるRevolverのホモログを得るために使用する方法。
【請求項３８】
請求項１３から請求項１８のいずれかひとつの請求項記載のトランスポゾンcDNAを用いて、植物の形質転換を行う方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なトランスポゾン様因子であるRevolver及びその構造変異体、更にはそれらの利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ライムギSecale cereale(2n=2x=14)をはじめとする近縁種は、病害抵抗性や環境ストレスに対する耐性遺伝子を持ち、コムギやライコムギの有意義な育種のための重要な遺伝資源である。例えばライムギのゲノムは7.8 Gbに及び、染色体短腕だけでショウジョウバエゲノムの２倍に匹敵する。しかも、ゲノム中でタンパク質の合成を指示する遺伝子は数％に過ぎず、90%以上を同じ塩基配列を繰り返す反復配列が占めている。
【０００３】
トランスポゾン又はレトロトランスポゾンとは、原核生物や真核生物の染色体やプラスミド上に存在する可動性遺伝因子の一種であり、両端に数百から千数百の塩基が逆向きに繰り返された塩基配列があり、逆向き反復配列およびそれに挟まれた領域が一つの単位を構成しており、そのようなトランスポゾンは、生物種を越えてゲノムの構築や進化の駆動力となっている。
【０００４】
イネやトウモロコシにおいては、可動性遺伝因子であるトランスポゾン様因子が遺伝子解析やDNAマーカー開発のツールとして利用されている。コムギやライコムギの育種においても、種属を越えてゲノムや遺伝情報を移入しようとする場合、有用な資源植物のゲノムに特異的に存在するトランスポゾンがあればDNAマーカー開発のツールとして有効である。しかしながら、これまでに見い出されていたトランスポゾンは生物界を敷衍して共通する構造を持ち、また、ムギ類ではトランスポゾンは発見されておらず、これまでムギ類においてはDNAマーカー開発のためのツールはなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明者らは、病害抵抗性や環境ストレスに対する耐性を示すコムギを育種することを目的として、コムギゲノムには存在せず、ライムギゲノムに特異的に存在するトランスポゾン様因子のクローニングを試みた。コムギとライムギが分化した後にライムギゲノムで増幅・分散したトランスポゾンがあれば、コムギゲノムに導入されたライムギゲノムの検出・同定、DNAライブラリーの作製、遺伝子増幅、DNA多型検出のためのプローブやPCRのエントリーポイント、染色体in situ ハイブリダイゼーションによる外来遺伝子同定などに利用できる。よって、ライムギなどのムギ類のゲノムに特異的に存在する新規なトランスポゾン様因子を得ることが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明により、配列表の配列番号１に示す塩基番号３８１−３４２２からなることを特徴とする、トランスポゾン様因子RevolverのDNA配列、cDNAおよびその構造変異体のDNA配列が提供された。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のトランスポゾン様因子Revolverの塩基配列はライムギ属とその近縁種において保存されているが、普通コムギには存在していない。Revolverはコムギの祖先種からの進化の過程でいくつかの近縁種で増幅し、普通コムギでは消失しているので、コムギゲノムにおける近縁種の遺伝標識として有用である。より具体的には、本発明のトランスポゾン様因子は、有用資源植物の分子育種に資するプローブ又はプライマー、更には染色体マーカーを開発するためのツールとして有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
下記の実施例で示すように本発明者らは、相同配列のサブトラクション法を用いてゲノム特異的なDNAを単離することにより、ライムギゲノム特異的な反復配列のクローニングを行い、新規なトランスポゾン様因子を得た。よって本発明は、３０４１塩基対からなるトランスポゾン様因子Revolverである。なお本発明のRevolverは新規な塩基配列を有する因子であるが、トランスポゾンと似た塩基配列部分が見出されているために、本願明細書においてRevolverをトランスポゾン様因子と呼ぶこととする。本発明のトランスポゾン様因子Revolverは、配列表の配列番号１に示す、塩基番号３８２−３４２２で示される塩基配列からなることを特徴とする。
【０００９】
なお、配列表の配列番号１に示す塩基番号１−４０００で示される塩基配列は、上記のトランスポゾン様因子Revolverに、5’側隣接領域及び3’隣接領域が付加されたものである。配列表の配列番号１において、塩基番号１−３８１の領域は5’側隣接領域であり、塩基番号３４２３−４０００の領域は3’側隣接領域である。
【００１０】
またトランスポゾン様因子Revolverは、３つのエキソン領域と２つのイントロン領域を含む。配列表の配列番号１において、塩基番号３８２−５３９はトランスポゾンの末端に特徴的な逆位反復配列（TGTGACGCCCGAGACCGAC：配列番号１４）と繰返し配列(TCCAGAAGAT：配列番号１５)を含む５’側共通領域であり、塩基番号６２１−９６２は第１エキソン領域であり、塩基番号９６３−１７１２は第１イントロン領域であり、塩基番号１７１３−１８００は第２エキソン領域であり、塩基番号１８０１−３０３７は第２イントロン領域であり、塩基番号３０３８−３３２８は第３エキソン領域であり、塩基配列３３２９−３４２２はトランスポゾンの末端に特徴的な逆位反復配列（GTCCCATCCTGGGCATTACA：配列番号１６）と繰返し配列(ATCATTCTAGGA：配列番号１７)を含む３’側共通領域である。
【００１１】
このRevolverの塩基配列又はその隣接領域をプローブ又はプライマーとしてサザンハイブリダイゼーションを行うことにより、ゲノム進化を検討することが可能である。なお本願明細書において「制御因子含有トランスポゾン因子」とは、トランスポゾン様因子の塩基配列に、5’側隣接領域及び3’ 隣接領域の塩基配列が付加されたものを意味するものである。
【００１２】
本発明のRevolverのトランスポゾン様因子から得られた塩基配列をプローブ又はプライマーとして用いて、あらゆる種類の生物から本発明のRevolverに相当するホモログを採取することが可能である。また下記に詳しく述べるように染色体マッピングなどの目的に応用することも可能である。そのようなプローブ又はプライマーは、トランスポゾン様因子のみならず、上記の5’側隣接領域及び3’ 隣接領域の塩基配列から得ることが可能である。よって本発明の制御因子含有トランスポゾン因子の塩基配列は、有用なプローブ又はプライマーを与えることができる隣接領域を含むトランスポゾン因子の塩基配列を与えるものである。トランスポゾン因子の塩基配列のみならず、有用なプローブ又はプライマーを与えることができる隣接領域の塩基配列も、本発明の範囲内である。
【００１３】
また、このプローブを用いて蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を行うことにより、ライムギ染色体の検出を行うこともまた可能である。下記の実施例において、Revolverプローブを用いたFISH解析を行ったところ、ドット状のシグナルが検出された。
【００１４】
また、Revolverの内部配列をプライマ−として用いてPCRを行うと、ゲノム中から種々の大きさのDNA断片が増幅されてくる。これらの断片は染色体に位置付けられ、DNA多型によりマッピングが可能であるために、染色体や遺伝子のマーカーを与えるものと考えられる。ゲノムに散在する因子をプライマーにして遺伝子マーカーを開発することは、レトロトランスポゾンの配列を使って実施されているが、本発明のRevolverの内部配列から得たプライマ−は、その様な染色体マーカー、遺伝子マーカーの開発のためのツールを新たに与えるものであると考えられる。
【００１５】
遺伝子組み換え技術によれば、基本となるDNAの特定の部位に、当該DNAの基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、人為的に変異を起こすことができる。本発明のトランスポゾン様因子の特性を変えることなく、本発明により提供される天然の塩基配列を有するDNAの人為的な改変を行う事が可能であり、本発明はそのような変異DNAを含むものである。
【００１６】
本発明において、そのような変異DNAの塩基配列と配列表の配列番号１に示す塩基配列とは６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、なお更に好ましくは９５％以上の相同性を有する。その様な変異DNAも、本発明のトランスポゾン様因子としての特性を有する限り、本発明の範囲内である。なお、配列表の配列番号２から１２に示すDNAにおいても同様に、それらの変異DNAも本発明の範囲内である。
【００１７】
更に本発明者らは上記のRevolverとは異なるクローンから、２９２９塩基対からなるトランスポゾン様因子Revolver-2を得た。本発明のトランスポゾン様因子Revolver-2は、配列表の配列番号２に示す、塩基番号３７７−３３０５で示される塩基配列からなることを特徴とする。
【００１８】
なお、配列表の配列番号２に示す塩基番号１−３５２８で示される塩基配列は、上記のトランスポゾン様因子Revolver-2に、5’側隣接領域及び3’ 隣接領域が付加されたものである。配列表の配列番号２において、塩基番号１−３７６の領域は5’側隣接領域であり、塩基番号３３０６−３５２８の領域は3’側隣接領域である。
【００１９】
またトランスポゾン様因子Revolver-2は、３つのエキソンと２つのイントロンを含む。配列表の配列番号２において、塩基番号３７７ー５０４は、トランスポゾンの末端に特徴的な逆位反復配列(TGTTCTACTACCGTCGCCCGGAAAAGAC：配列番号１８)と繰返し配列(TACCGTCGCC：配列番号１９)を含む５’側共通領域であり、塩基番号５０５−８４６は第１エキソン領域であり、塩基番号８４７−１５８６は第１イントロン領域であり、塩基番号１５８７−１６７５は第２エキソン領域であり、塩基番号１６７６−２８９７は第２イントロン領域であり、塩基番号２８９８−３２０８は第３エキソン領域であり、塩基番号３２０９ー３３０５はトランスポゾンの末端に特徴的な逆位反復配列（GTCCCATCCTGGGCATTACA：配列番号２０）と繰返し配列(ATCATTCTGGGA：配列番号２１)を含む３’側共通領域である。
【００２０】
また、上記のトランスポゾン様因子Revolver又はRevolver-2のDNA配列又はその一部分からなるDNAフラグメントは、有用な資源植物のゲノムを検出するためのプローブまたはプライマーとして有用である。ここで、RevolverのDNA配列又はその一部分からなるDNAフラグメントとは、配列表の配列番号１記載の塩基配列の一部分を構成しているDNAフラグメントを意味する。また、Revolver-2のDNA配列又はその一部分からなるDNAフラグメントとは、配列表の配列番号２記載の塩基配列の一部分を構成しているDNAフラグメントを意味する。
【００２１】
なお本願明細書において「有用資源植物」とは、類縁性があり遺伝資源が利用可能な植物を意味するものである。そして、その範疇に含まれる植物は、主としてイネ科植物であって、より具体的にはコムギ、オオムギ、ライムギ、ライコムギなどのムギ類の植物である。これらのイネ科植物にはRevolverのホモログが存在する可能性があるために、遺伝子マーカー開発に応用できると考えられる。
【００２２】
また本願明細書において「一部分からなるDNAフラグメント」とは、特に限定されるものではないが、配列表に記載されている塩基配列の少なくとも１０塩基以上からなる一部分に相当するDNAフラグメント、より好ましくは２０塩基以上からなる一部分に相当するDNAフラグメント、更に好ましくは５０塩基以上からなる一部分に相当するDNAフラグメントを意味するものである。
【００２３】
またこのトランスポゾン様因子又は制御因子領域含有トランスポゾン様因子から得たプローブ又はプライマーを用いて、他のRevolverの構造変異体を得ることができる。下記の実施例において本発明者は、配列表の配列番号２の3’側隣接領域である塩基番号３４５６−３４７８の領域をプライマーとして用いてPCRを行うことにより、Revolver非自律性因子であるRevolver-3 (pSc626)、Revolver-4 (pSc627)、Revolver-5 (pSc628)、Revolver-6 (pSc5R1)を得ており、Revolver-2の3’側隣接領域（配列表の配列番号２の塩基番号３３０６−３５２８）は上記の非自律性因子と共通している。これらの非自律性因子の構造の概略を図1に示す。
【００２４】
なおこれらの非自律性因子は、Revolver又はRevolver-2の構造の第２エキソン側5’上流が破壊されている塩基配列を有しており、そのためにエキソン１部分を欠いている。よって、Revolver又はRevolver-2とは異なり、Revolver-3、Revolver-4、Revolver-5、Revolver-6はトランスポゼースのmRNAを発現せず、自らは転移することができない非自律性因子である。
【００２５】
本発明のRevolver-3(pSc626)は、配列表の配列番号３に示す、塩基番号４３−４３１１で示される塩基配列からなることを特徴とする、４２６９塩基対からなる非自律性因子であり、6R染色体にマッピングされた。配列表の配列番号３において、塩基番号１−４２の領域は5’側隣接領域であり、塩基番号４３−１９１はトランスポゾンの末端に特徴的な逆位反復配列と繰返し配列を含む５’側共通領域であり、塩基番号２５９８−２６８７は第２エキソン領域であり、塩基番号２５８８−３９２３は第２イントロン領域であり、塩基番号３９２４−４２１８は第３エキソン領域であり、塩基配列４２１９−４３１１はトランスポゾンの末端に特徴的な逆位反復配列と繰返し配列を含む３’側共通領域であり、塩基番号４３１２−４４７９の領域は3’側隣接領域である。
【００２６】
また本発明のRevolver-4(pSc627)は、配列表の配列番号４に示す、塩基番号２４−３２４２で示される塩基配列からなることを特徴とする、３２１９塩基対からなる非自律性因子である。配列表の配列番号４において、塩基番号１−２３の領域は5’側隣接領域であり、塩基番号１５６７−１６５７は第２エキソン領域であり、塩基番号１６５８−２８５８は第２イントロン領域であり、塩基番号２８５９−３１４３は第３エキソン領域であり、塩基配列３１４４−３２４２はトランスポゾンの末端に特徴的な逆位反復配列と繰返し配列を含む３’側共通領域であり、塩基番号３２４３−３４１３の領域は3’側隣接領域である。
【００２７】
また本発明のRevolver-5(pSc628)は、配列表の配列番号５に示す、塩基番号２４−２６８８で示される塩基配列からなることを特徴とする、２６６５塩基対からなる非自律性因子であり、1R染色体にマッピングされた。配列表の配列番号５において、塩基番号１−２３の領域は5’側隣接領域であり、塩基番号１０１０−１０９５は第２エキソン領域であり、塩基番号１０９６−２２８８は第２イントロン領域であり、塩基番号２２８９−２５８９は第３エキソン領域であり、塩基配列２５９０−２６８８はトランスポゾンの末端に特徴的な逆位反復配列を含む３’側共通領域であり、塩基番号２５９０−２６８８の領域は3’側隣接領域である。
【００２８】
また本発明のRevolver-6 (pSc5R1)は、配列表の配列番号６に示す、塩基番号２４−３５２６で示される塩基配列からなることを特徴とする、３５０３塩基対からなる非自律性因子であり、5R染色体にマッピングされた。配列表の配列番号６において、塩基番号１−２３の領域は5’側隣接領域であり、塩基番号２２３２−３１４６は第２イントロン領域であり、塩基番号３１４７−３４２６は第３エキソン領域であり、塩基配列３４２７−３５２６はトランスポゾンの末端に特徴的な逆位反復配列を含む３’側共通領域であり、塩基番号３５２７−３６９７の領域は3’側隣接領域である。
【００２９】
本発明のトランスポゾン様因子Revolver、 Revolver-2、又はそれらをプローブにして得られたものをSTS化することにより、染色体やゲノム位置のマーカーを作製することができる。また上記の非自律性因子は既にSTS化されているので、やはり同様のマーカーを与えることが可能であると考えられる。RFLPプローブやRAPD法により増幅断片の両末端の塩基配列を決定し、その配列をもとにPCRプライマーを設計してPCR法でその領域を特異的に増幅したものがSequence Tagged Site（配列タグ部位：STS）マーカーである。このSTS化されたRevolverの染色体マーカーは、染色体やゲノム位置のマーカーとして特に有用であると考えられる。
【００３０】
また本発明者は、Revolverの第１エキソン、第２エキソン、第３エキソンからなるcDNAのクローンを４種類採取した。配列表の配列番号８に示す、塩基番号１−７２６で示される塩基配列からなることを特徴とするpSc1はそのようなRevolverのcDNAである。なお配列表の配列番号８において、塩基番号１−３４２の領域は第１エキソン領域であり、塩基番号３４３−４３３の領域は第２エキソン領域であり、塩基番号４３４−７２６の領域は第３エキソン領域である。そしてpSc1の両末端部分をプライマーとしてRT-PCRを行うことにより、他のcDNA としてpSc5、pSc12、pSc4を得た。Revolverと各cDNAの構造の関係を図２に示す。
【００３１】
これらのcDNAの構造をpSc1と比較すると、第１エキソンの相同性は低いが、第２エキソンと第３エキソンにおいては高い相同性を示した。そのようなRevolverのcDNAが、配列表の配列番号７に示す、塩基番号１−６９４で示される塩基配列からなることを特徴とするpSc5である。なお配列表の配列番号７において、塩基番号１−３１０の領域は第１エキソン領域であり、塩基番号３１１−４０２の領域は第２エキソン領域であり、塩基番号４０３−６９４の領域は第３エキソン領域である。また、塩基番号１１０−４６３の領域はトランシポゼースのコーディング領域である。
【００３２】
またそのようなcDNAは、配列表の配列番号９に示す塩基番号１−７２８で示される塩基配列からなることを特徴とするpSc12である。なお配列表の配列番号９において、塩基番号１−３４４の領域は第１エキソン領域であり、塩基番号３４５−４３５の領域は第２エキソン領域であり、塩基番号４３６−７２８の領域は第３エキソン領域である。
【００３３】
またそのようなcDNAは、配列表の配列番号１０に示す塩基番号１−６６５で示される塩基配列からなることを特徴とするpSc4である。なお配列表の配列番号１０において、塩基番号１−２８２の領域は第１エキソン領域であり、塩基番号２８３−３７２の領域は第２エキソン領域であり、塩基番号３７３−６６５の領域は第３エキソン領域である。
【００３４】
これらのcDNAはRevolverのトランスポゼースをコードしていると考えられる。よってこれらのcDNAを用いることにより、生物種を超えてRevolverを形質転換し、Revolverを可動・転移されることが可能となる。Revolverを形質転換と稼働は、種々の生物における遺伝子破壊によるクローニングに、あるいは遺伝子マーカー開発に応用することが可能である。このような形質転換を行う方法は、本技術分野において広く知られている。
【００３５】
更に、Revolverの第２イントロンと第３エキソンを有するが、第１エキソンの構造が異なっている他の種類のcDNAクローンもまた得られた。そのようなRevolverのcDNAが、配列表の配列番号１２に示す、塩基番号１−１５９７で示される塩基配列からなることを特徴とするpSc23である。なお配列表の配列番号１２において、塩基番号１−８６の領域は第１エキソン領域であり、塩基番号８７−１３９３の領域は第２エキソン領域であり、塩基番号１３９４−１５９７の領域は第３エキソン領域である。
【００３６】
更にpSc23のイントロンを欠いているcDNAクローンもまた得られた。そのようなRevolverのcDNAが、配列表の配列番号１１に示す、塩基番号１−３９５で示される塩基配列からなることを特徴とするpSc14である。なお配列表の配列番号１１において、塩基番号１−９８の領域は第１エキソン領域であり、塩基番号９９−３９５の領域は第２エキソン領域である。
【００３７】
またpSc1のcDNAによりコードされるトランスポゼースは、配列表の配列番号１３に示す、アミノ酸番号１−１１７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。配列表の配列番号１３に示すアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、なお更に好ましくは９５％以上の相同性を有する変異タンパク質も、本発明のトランスポゼースとしての特性を有する限り、本発明の範囲内である。
【実施例】
【００３８】
（実施例１：トランスポゾン様因子Revolverの構造）
（サブトラクション法によるゲノム特異的反復配列のクローニング）
コムギゲノムにはなく、ライムギゲノムに特異的に豊富に存在する遺伝因子のクローニングを試みた。ライムギの染色体DNAを４塩基認識の制限酵素MboIで短く消化し、これに超音波でランダムに切断したコムギゲノムDNAを過剰に混合した。塩基間の相補的な水素結合で結ばれる２本鎖ヌクレオチドを高温で１本鎖DNAに変性し、さらに、室温で２本鎖DNAに再生させた。２本鎖形成の過程では、ライムギMboI断片のうちコムギDNAと共通する配列は長さや末端の形が異なる過剰のコムギ断片と会合するのに対して、ライムギ特異的反復配列を持つMboI断片同士は再会合して、付着末端を持つ２本鎖DNAに復元する。これらの再生DNAに対して相補的な付着末端を持つプラスミドをベクターとして用意すれば、付着末端を持つライムギ特異的２本鎖DNAだけが連結される。このベクターを大腸菌JM109株に導入し、ライムギからコムギと共通する配列をサブトラクション（削除）したDNAライブラリーを作製した。
【００３９】
富田(1995)の方法に従ってゲノムDNAを抽出した。出穂前の植物体の上位2成葉を採取し、-80℃で凍結保存した。これを液体窒素で凍結し、粉砕した。これに葉の粉末の重量と等量のDNA抽出液(2%CTAB、100 mM Tris-HCl、 20 mM EDTA・2Na、 1.4 M NaCl、pH8.0)を加えて55℃で振盪しながら１時間30分以上インキュベートした。この溶液をクロロホルム・イソアミルアルコール(24:1)で2回抽出した。上清に1/10量の3 M sodium acetate pH5.2を加えた後、2倍量の-20℃の99.5%イソプロパノールを加えて重合沈殿した高分子DNAをスプールアウトした。スプールアウトしたDNAを5 mlのHigh-Salt TE(1 M NaCl、 10 mM Tris・HCl、 1 mM EDTA・2Na、pH8.0)に溶解し、エタノール沈殿後、5 mlのTE（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA・2Na、pH8.0）に溶解した。 これに1/100量のRNase溶液(1mg/ml)を加えて37℃で一晩インキュベートした。 RNAの分解とDNAの物理的切断の有無を1%アガロースゲル電気泳動によって確認した。このDNA溶液にフェノール−クロロホルム抽出およびクロロホルム抽出を1回ずつ行った後、エタノール沈殿して5mlのTE （10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA・2Na、pH8.0）に溶解した。 
【００４０】
普通コムギ(Triticum aestivum L.)の品種 Chinese spring (CS,2n=42)およびライムギ(Secale cereale L.)の自殖系統 IR130 の 5R, 6Rそれぞれの染色体添加型コムギ Chinese  Spring 系統(5R add CS, 6R add CS, 2n=44)からCTAB法(Murray  & Thompson  1980)でゲノムDNAを抽出した。コムギ連植物の反復配列は異なる反復配列のユニットが組合わさって複雑に分化してきた証拠が示されている。(Flavell & Smith  1976,  Smith & Flavrll  1977,   Bedbrook et al. 1980,  Flavell  et  al .  1981,  McIntyre  et  al .  1988)。そこで反復配列中の最小ユニットをアニーリングさせることを考えて, 4塩基認識の制限酵素Mboを用いてゲノムDNAを2 kb 以下に消化した。
【００４１】
6R add CS のDNAは制限酵素Mbo消化後 0.8 %から1.0 %のアガロースゲルで分離し, 液体窒素凍結法 (Koenen  1989)で 0.5から2.0 kb の断片を回収した。回収DNA 6.6μgを超音波で 1 kb 以下に切断した CS のDNAと混合し, これを 10 分間沸騰水中に置いて1 本鎖に変性した。DNAのアニーリングを促進するため、1 本鎖に変性した混合DNAをフェノールエマルジョンバッファー (0.8% phenol, 1.25 M sodium perchlorate, 0.12 M sodium phosphate, pH6.8) 4 ml 中で 72 時間アニーリングさせた。
【００４２】
フェノールエマルジョンはロータリーエバポレーターで回転させることによって誘起した。このとき制限酵素断片がアニーリングしてできる2 本鎖DNAの種類は同じ制限酵素断片と再会合して復元するもの、異なる制限酵素断片と会合するもの、および過剰量の超音波断片と会合するものとなる。このうち制限酵素断片が復元した2 本鎖DNA断片だけが付着末端を持つため, ベクターにライゲーション可能となる。このようにアニーリングによって再編成されたDNA溶液を Sephadex G-25 に通してリン酸塩を除去した後、DNA 3.2μgを用いて pUC19 の BamHIサイトとライゲーションし、0.1M CaCl2 , 8%  PEG600 によってコンピテント化した E. coli JM109 株を形質転換させた。
【００４３】
組換えプラスミドをアルカリSDS 法( Brinboin  &  Doly   1979)  またはシングルステップ法(He et al . 1989) で単離して 1μgずつ 2 枚のナイロンメンブレンにスポットし, 80℃で 3 時間ベーキングした。このナイロンメンブレン 1 枚に対してライムギ IR130 の全DNA 5 ng およびコムギ Chinese Spring の全DNA 10 ng をそれぞれプローブに用いて14 時間ドットブロットハイブリタイゼーションし, ライムギ全DNAにのみ強くハイブリッドシグナルを示す反復配列クローンを選抜した。プローブはランダムプライマー法で Digoxigenin-11-dUTP ( Boehringer  mannheim  社)を用いてラベリングし, プローブの検出はBoehringer  mannheim 社のアルカリフォスファターゼで標識された Digoxigenin 抗体を結合させてNBTを発色させる方法または AMPPD を発光させる方法を用いた。
【００４４】
ライムギ自殖系統 IR130 の 5 R 染色体添加コムギ系統( 2n=44 ) のMbo消化DNA断片 13.4 μgを CS ( 2n=42 ) のDNA 67.0 μg と混合して1 本鎖に変性した後, フェノールエマルジョン中でアニーリングさせ, Sephadex  G-25 で脱塩し, クローニングに用いた。その他の方法は上記方法に準じて行った。
【００４５】
上記の サブトラクション法の対照とするため, ライムギ自殖系統 IR130 の MboI断片を pUC19 の BumHIサイトにショットガンクローニングした。
【００４６】
その結果、6R  add  CS  に由来するアニーリング後のDNA  0.8μgを用いて組換えクローン 77 個を得た。MboI断片と超音波切断片を1: 3  に混合したので, アニーリング後のDNA溶液中にも 6R  add  CS  の Mbo断片が 0.2μg 含まれていると考えると,  MboI断片 1μg 当たり組換えクローン 385 個を得たことになる。同じ MboI断片 1μg を上記の調整を経ずにショットガン法で pUC19の BumHIサイトにライゲーションした場合には3.28×104個の組換えクローンが得られた。アニーリング後のクローン数はショットガン法で得られるクローン数と比較すると 1.2 % だった。
【００４７】
このことは MboI断片の 98.8 % が超音波切断片とのランダムにアニーリングし,  MboI断片の 1.2 % が復元してベクターにライゲーションしたものと考えられる。以後, ショットガン法によって得られたクローン数に対する比率をアニーリング後の Mbo断片の復元率とする。組換えクローン 77 個をライムギおよびコムギの全DNAとドットハイブダイゼーションさせたところ, 6個がライムギゲノムに強いハイブリッドシグナルを示した。
【００４８】
5R add CSの MboI断片を CS の超音波切断片と 67.0 μg 混合後、アニーリングさせて, 脱塩したところ,  20.0 μg が回収された。このうち 500 ng を pUC19  20 ng  とライゲーションし, 組換えクローン 145 個を得た。これは, 5R add CSのMbo断片 83.3 ng から組換えクローン145 個を得たことになり, 1μg 当たりにすると 1740 個である。ショットガン法に対する比率, すなわちアニーリングによる MboI断片の復元率は 0.13 % であった。ライムギおよびコムギ全DNAとのドットブロットハイブリダイゼーションを行ったところ、145 個中 8 個がライムギにのみハイブリッドシグナルを示し, ライムギゲノムに特異的反復配列であると考えられた。その他, ライムギ, コムギ双方にハイブリッドするものが 5 個, コムギにのみハイブリッドするものが 12 個存在した。
【００４９】
以上のように, ライムギ染色体添加型コムギ系統のゲノムDNAからコムギゲノムDNAをサブトラクションすることにより, ライムギゲノムに特異的なDNA断片を含むライブラリーを作製することができた。制限酵素断片の復元率から 1 制限酵素断片:5 超音波切断片の比で混合してアニーリングさせたことが成功したものと考えられる。反復クローンのインサーションの大きさは 6R  add  CS  のライブラリーで 500bp前後,  5R  add  CS  のライブラリーで 100から200bp であった。
【００５０】
以上のサブトラクション法から得たDNAライブラリーから、ライムギの全 ゲノムDNAに特異的に強くハイブリダイゼーションする14 個のクローンの塩基配列を解読した。その結果、12クローンはライムギの既知の３種類の反復配列のうち２種類(350 bpファミリー Bedbrook et al. 1980，R173ファミリー Rogowsky et al.1992)と相同であったが、２クローンはDNA塩基配列データベースに無い未知の配列であった。以後、このうちの一つ89 bp断片を出発材料として、配列の全体構造を解析した。
【００５１】
（ゲノムに散在するトランスポゾン様因子の共通配列）
89 bp断片の全体構造を明らかにするため、ライムギのゲノムDNAの大きい断片のライブラリーを作製し、その中から89 bp断片を含む複数のDNA断片を選抜して塩基配列を解読し、ゲノム中に繰り返す反復配列の共通配列を求めた。
【００５２】
ライムギ自殖系統IR27のゲノムDNAを制限酵素Mbo Iで9から20 kbの大きさに部分分解し、EMBL系ファージλFixIIDNAのXhoI部位に連結した。これらのファージDNAをファージ粒子に組み込み、宿主大腸菌XL1-Blue MRA(P2)株に感染させて、ライムギゲノムDNA断片をライブラリー化した。このゲノムDNAライブラリーから、89 bp断片を含むファージを選抜するため、ファージの感染によるプラーク（溶菌斑）を、φ14 cmのプレート当たり50,000 個形成するように感染させた。このプレート上のプラークをナイロンメンブレンに転写して、89 bp断片をプローブとするプラークハイブリダイゼーションを行った。
【００５３】
その結果、89 bp断片は約50,000個のファージプラークに対して約800個にハイブリダイゼーションした。したがって、ライムギゲノム中の89 bp断片のコピー数は、１bp当たりに89 bp断片が存在する個数［ポジティブプラーク数（800 個）／ライムギゲノムDNAライブラリーの平均挿入長（13 kb）×スクリーニングしたプラーク数（約50,000 ）］×［ライムギ１細胞当たりの染色体DNA量（7.8Gb）］＝10000 コピーと推定される。
【００５４】
89 bp断片とハイブリダイゼーションしたファージを任意に６個選び、89 bp断片が含まれる領域と塩基配列を解読すべき領域を決定するため、ファージに挿入されたライムギDNA断片の制限酵素地図を作製した。まず、ファージに連結されたライムギDNA断片を制限酵素NotIで両サイドのT3及びT7領域ごと切り出し、これをDNA１μｇ当たり2 unitの制限酵素BamHIまたはSacIを用いて、反応時間を２分から３時間まで変動させて部分消化した。これを電気泳動後、ナイロンメンブレンにトランスファーし、両サイドを標識するT3またはT7プローブとのハイブリダイゼーションを行い、各制限断片の位置関係を決定した。さらに、ファージの挿入DNA断片をBamHIまたはSacIで完全消化し、89 bp断片をプローブとするハイブリダイゼーションを行い、89 bp断片を含む制限断片を特定した。
【００５５】
89 bp断片が制限酵素地図上の中央よりに位置するλ２、λ６、λ８の塩基配列を解読するため、サブクローニングを行った。89 bp断片とハイブリダイゼーションしたDNA断片およびそれらに隣接するDNA断片をアガロースゲルから回収して、プラスミドpUC119またはpBlue ScriptIIにサブクローニングした。１回のシークエンシングで解読できるのは700 bpあまりなので、長いサブクローンについては、Exonuclease IIIまたはAluI、HaeI、AfaIによって様々な長さに削ったディレーションクローンを作製して、ジデオキシチェインターミネーター反応に供した。
【００５６】
λ２の挿入断片は、Bam HIで８個のDNA断片に切断し、そのうち７個12.7 kbをサブクローニングした。４個のサブクローンについては両方向から約300 bpずつ削ったディレーションクローンを合計58個作製した。λ６の挿入断片は、Sac Iで７個のDNA断片に切断し、そのうち３個7.6 kbをサブクローニングした。さらに、この３クローンから45個のディレーションクローンを作製した。λ８の挿入断片は、Sac Iで９個のDNA断片に切断し、そのうち１個1.3 kbをサブクローニングして、11個のディレーションクローンを作製した。
【００５７】
以上21.6 kbの領域について、プラスミドクローン合計117個をテンプレートにしてサイクル法でジデオキシチェインターミネーター反応を行った。DNA自動シーケンサーで終結因子となった塩基を次々に解読した。その結果、λ２とλ６は91.5%相同の共通配列3041bpを含み、末端に20 bpの逆位反復配列(TIR)を持つトランスポゾン様の因子であった。これをRevolverと命名した。Revolverの塩基配列を配列表の配列番号１に示す。また、BERE-100との比較におけるRevolverの構造を図３に示す。
【００５８】
Revolver(3,041 bp) は，両端部分がオオムギのcopia 型レトロトランスポゾンBARE-1の中に挿入配列として見いだされ(Manninen & Schulman 1993)，gypsy 型レトロトランスポゾンのsolo-LTRとみなされているBARE-100 (3,130 bp)の両端部分と相同性を示す以外に、類似の配列はない。Revolverの5'側で転写開始点の上流には，BARE-100 の5'末端との149 bpの相同領域 (相同性62%) が存在する。また，Revolverの3'側では，第２イントロンの途中から第３エキソン下流の非翻訳領域3'末端にわたる768 bpの領域が，BARE-100 の3'側777 bpと62%の相同性を示す。
【００５９】
Revolverは，両末端が逆位反復配列に挟まれてゲノムに散在するトランスポゾン様の挿入因子で、ライムギゲノムに約１万コピー散在している。
【００６０】
（トランスポゾン様因子の転写産物）
ライムギSecale cereale他殖系統Petkus、Triticum aestivum品種Chiese Spring、品種Gabo、ライムギ1R染色体転座型コムギGabo系統、ライコムギから抽出した全RNAおいた植物材料の成葉−80℃に保存して1.0 gを、液体窒素で凍結し、ホモジナイザーで粉砕した。この凍結粉末を、Denaturing Solution (4.2 M グアニジンチオシアネート，25 mMクエン酸ナトリウム・2水和物，0.5％ Sodium N-lauroyl Sarcosine)を加えて、ボルテックスで混和しタンパク質を変性させた。
【００６１】
1/10量(1 ml)の2 M Sodium acetate(pH 4.0)を加えて転倒混和した後、1:1量(10 ml)の酸性フェノールを加えて混和し、さらに、1/5量(2 ml)のクロロホルム/イソアミルアルコール(49:1)を加えてよく転倒混和して除タンパク質した遠心後上層を分取して、イソプロパノール沈殿させたRNAペレットに0.5 mlの Denaturing Solution を加え45℃の恒温水槽につけながら完全に溶解させた。0.6 mlのイソプロパノ−ルを加えて遠心してRNA をペレットにした。上澄みを取り除いてRNAペレットに300 μlの DEPC 処理水を加え、45℃の恒温水槽につけながら溶解させ、−80℃に保存した。
【００６２】
ライムギSecale cereale品種Petkus、Triticum aestivum品種Chiese Spring、品種Gabo、ライムギ1R染色体転座型コムギGabo系統、ライコムギから抽出した全RNA 5 μgを1% アガロースゲルで20 Vで20時間電気泳動した後、バキュームブロッティング装置を用いてナイロンメンブレンにトランスファーした。ブロッティング装置にゲルを乗せてバキュームポンプで20×SSCを2時間吸引した。トランスファー後、ナイロンメンブレンを10×SSCで洗浄し、UV(125 mJoule)でDNAをクロスリンクした。
【００６３】
トランスファーしたナイロンメンブレンをハイブリダイゼーション溶液(2% blocking reagent (Boehringer Mannheim Biochemica)、5×SSC、 0.1% N-lauroyl Sarcosine、0.02% SDS)に浸し、4時間のプリハイブリダイゼーションを行った。次に、ラベリングしたRevolver cDNA pSc1 (726 bp) DNA断片200 ngを含む10 mlのハイブリダイゼーション溶液中で65℃で20時間ハイブリダイゼーションを行った。洗浄は2×SSC、0.1%SDSで室温5分間を2回、0.1×SSC、0.1%SDSで65℃15分間を2回行った。
【００６４】
さらに、Washing buffer(0.3%(W/V)Tween20/buffer 1、buffer 1:0.1 M Maleic acid、0.15 M NaCl、pH7.5)で3分間洗浄後、buffer 2(1%(w/v)blocking reagent(Boehringer Mannheim Biochemica)/buffer1)で30分間ブロッキングし、0.01%のAnti-digoxigenin-AP,Fab fragments(750 units/ml)を含むbuffer 2で30分間の抗原抗体反応を行った。これをWashing bufferで30分間2回洗浄し、buffer 3(0.1 M Tris-HCl pH9.5、0.1 M NaCl、0.05 M MgCl2)に5分間インキュベートした後、CDP Star溶液(0.1%CDP Star/Buffer 3)を2ml滴下してナイロンメンブレンをハイブリバッグに封入し、37℃で10分間インキュベートした。さらに、ナイロンメンブレンをX線フィルムにコンタクトして3時間感光させ、ハイブリダイゼーションのシグナルを検出した。ノーザン解析により、トランスポゾン様因子Revolverは0.4 kb、0.7 kb、3 kb、5 kbのRNAに転写されていることが分かった。
【００６５】
ライムギのS.cereale自殖系統IR10の全RNAからPoly A Tract mRNA Isolation System(Promega) でmRNAを分離し, XhoIリンカー付オリゴd(T)をプライマーにしてMMLV逆転写酵素で１本鎖cDNAを合成し、それにEcoRIアダプターを付加した。 これらcDNAをλZAPII DNAに連結し, in vitroパッケージングでファージ粒子を形成させ, これらを宿主菌XL1-Blue MRF′に感染させて1.4×106 pfuのcDNAライブラリーを作製した。
【００６６】
Revolver（クローンλ2）プローブにして, cDNAライブラリー25万プラークとのハイブリダイゼーションを行って9個の陽性ファージを選び、さらに, 二次スクリーニングで3個にしぼった。 これら3個の陽性ファージとヘルパーファージを共感染させてファージミドDNAを合成し,サイクルシーケンス法でDNA塩基配列を決定した。そのようにして得られたのがcDNAクローンであるpSc1でありその塩基配列を配列表の配列番号８に示す。なお、トランスポゾン様因子RevolverのゲノムDNAクローンとpSc1の構造比較から，Revolverは３個のエキソン（342 bp, 88 bp, 291 bp）と２個のイントロン（750 bp, 1237 bp）で構成されていることが分かった。
【００６７】
そしてプロセシングを受けたRevolverのmRNAは、117アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードする一つのオープンリーディングフレームを有していた。なお、RevolverのcDNAがコードするトランスポゼースのポリペプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号１３に示す。
【００６８】
（実施例２：トランスポゾン様因子Revolverがコードする遺伝子）
（ライムギにおけるRevolver mRNAの分類）
ライムギSecale cerealeの品種・自殖系統，野生種S.fragile， S.silvestre，ライムギ染色体転座型コムギ系統，ライムギ染色体添加型コムギ系統、普通コムギの葉から全RNAを抽出し、RevolverのcDNA pSc1(726 bp) の両末端から設計したプライマーでRT-PCRを行った。Revolver cDNAの3’末端の23塩基を含む38 merのoligo dT プライマー[726RT38（5’-TTTTTTTTTTTTTTTGGCACAACTCATGTAAAAGAGGG-3’：配列番号２２(Tm値74.6)）]を用いてAMV逆転写酵素で反応を行った。RNA PCR Kit (AMV) Ver.1.1 (TaKaRa)を用いた。逆転写反応で一本鎖cDNAを合成した。さらに、逆転写産物を鋳型にして、38 merの726RT38プライマーと22 merの726-5Fプライマー（5’-GGCACGAGGGTACGAGTCCGAG-3’：配列番号２３(Tm値 73.0)）にはさまれた二本鎖cDNAを増幅した。DNA20 ngを鋳型にして、200 nM プライマー(33 ng)、100μM dNTPs、50 mM KCl、10 mM Tris-HCl(pH8.8)、1.5 mM MgCl2で1 U TaqDNAポリメラーゼを含む全量50 μｌの反応液を作製した。 
【００６９】
サーマルサイクラーPC-700(ASTEC)を用いて、変性95℃  30秒、アニーリング63℃ 30秒、伸長72℃ 1分の一連のPCR反応を30回行った。また、最初の変性94℃と最後の合成72℃は5分間ずつ行った。ライムギ、 コムギCS及びライムギ染色体添加コムギCS系統シリーズのPCR産物を1.5%アガロースゲルで100 Vで１時間30分間電気泳動した。その結果，約0.7 kb と1.5  kbのcDNAが強く増幅された。
【００７０】
PCR産物をバキュームブロッティング装置を用いてナイロンメンブレン(バイオダインプラス)にトランスファーした。ブロッティング装置にゲルを乗せてバキュームポンプで3分間吸引しながら0.25 N HClをゲル上に注いで脱プリンした。同様に0.4 N NaOHでゲルを覆って1時間吸引した。トランスファー終了後、ナイロンメンブレンを2xSSCで洗浄後UV(125 mJoule)でDNAをクロスリンクした。RT-PCR産物のゲルブロットでも，RevolverのpSc1由来の cDNAプローブが0.7 kb と1.5 kbのDNAにハイブリダイゼーションした。
【００７１】
RT-PCR産物とのゲルブロットハイブリダイゼーションで相同性を示したcDNAをpGEM-T ベクターでクローニングし，サイクルシーケンス法でそれらの塩基配列を決定した。
【００７２】
RT-PCR産物のTAクローニングで得られたRevolverのcDNA 30クローンを解析した結果，全長665から723 bpで第１エキソンの構造が異なる３つのクラス (IからIII)に分類された（クラス内の相同性I:89%，II:97%，III:93%）。このようにして得られたcDNAクローンが、配列表の配列番号７に示すpSc5（クラスI）, 配列表の配列番号９に示すpSc12（クラスII）, 配列表の配列番号１０に示すpSc4（クラスIII）であり、pSc1はクラスIIに分類される。
【００７３】
クラス間の相同性は，クラスIとクラスIIIで75％，クラスIとクラスIIIで80％，クラスIとクラスIIIで76％である。エキソンごとに対比すると，第２エキソン (89から92 bp) と第３エキソン(293 bp) はクラス間でも91から95%の高い相同性を示した。これに対して，第１エキソン (282から341 bp) は，各クラス内では相同性が高いが (I:98%，II:99%，III:99%)，クラス間の相同性が60%台と低かった (IとII:63%，IとIII:64%，IIとIII:67%)。第１エキソンには，3つのクラス間で互いに部分的な塩基配列の欠失と変異が見いだされ，長さも異なっている。つまり，cDNAの分類は第１エキソンの構造変異に対応している。また，第１エキソンには，8から14 bpを単位とする同方向反復配列がいくつも存在していて、対立遺伝子間で非相同組み換えを起こして、多様な構造変異をもたらしたと考えられる。トランスポゾン様因子RevolverのcDNA解析によって，第２，第３エキソン部分はほぼ一致するが，第１エキソン部分が部分的な重複，欠失などで異なっている３つのサブファミリーが存在することが分かった。
【００７４】
以上のように，自殖性の純系ライムギから得た転写活性を持つRevolverの遺伝子には第１エキソンに多様な構造が存在することが分かり、ゲノムのランドマークとして着目される。
【００７５】
（コムギ連植物におけるRevolver mRNAの分類）
Revolver mRNAのコムギ連植物Triticeaeにおける変異を解析した。S. fragile，S. silvestre，T. monococcum，Ae. squarrosa，D. villosumの成葉からRT-PCR法で得たRevolverのcDNA構造を決定した。全RNAを抽出し、RevolverのcDNA pSc1(726bp)の両末端から設計したプライマーでRT-PCRを行った。Revolver cDNAの3’末端の23塩基を含む38 merのoligo dT プライマー[726RT38（5’-TTTTTTTTTTT-TTTTGGCACAACTCATGTAAAAGAGGG-3’：配列番号２２(Tm値74.6)）]を用いてAMV逆転写酵素で一本鎖cDNAを合成した。RNA PCR Kit (AMV) Ver.1.1 (TaKaRa)を用いた。
【００７６】
さらに、逆転写産物を鋳型にして、38 merの726RT38プライマーと22 merの726-5Fプライマー（5’-GGCACGAGGGTACGAGTCCGAG-3’ ：配列番号２３ (Tm値 73.0)）にはさまれた二本鎖cDNAを増幅した。DNA 20 ngを鋳型にして、200 nM プライマー(33 ng)、100 μM dNTPs、50 mM KCl、10 mM Tris-HCl(pH8.8)、1.5 mM MgCl2  で1 U TaqDNAポリメラーゼを含む全量50μｌの反応液を作製した。 サーマルサイクラーPC-700(ASTEC)を用いて、変性95℃  30秒、アニーリング63℃ 30秒、伸長72℃ 1分の一連のPCR反応を30回行った。その結果，大多数が S. cereale のクラスI(47%) またはクラスII(27%) に属し，主要な２つのクラスが種属を越えて保存されている。従って3つのクラスは偶然の産物ではないと考えられる。
【００７７】
（種属を越えたRevolverコーディング領域の保存性）
Revolverは0.7 kbのmRNAを活発に産生しており、そのうちクラスIのmRNAはコムギ連植物に種属を越えて保存されている118アミノ酸残基（配列表の配列番号１３）のORFをコードしている。
【００７８】
（実施例３：トランスポゾン様因子Revolverの消長と構造変異）
（イネ科植物におけるRevolverの消長）
イネ科植物におけるRevolverの分布を調べるため，ライムギSecale cereale (RR) 品種Petkus，自殖系統（IR-10，IR48-1），ライムギ属野生種 (S. montanum，S. fragile，S. silvestre)，コムギ Triticum aestivum (AABBDD), T. monococcum (AA), T. durum (AABB),  T. polonicum (AABB), T. timopheevi (AAGG),T. tauschii (DD), ライムギ染色体転座型コムギ系統 (DRA-I), ライムギ染色体1Rから7R添加型コムギ系統, Dasypyrum villosum (VV), オオムギHordeum bulbosum (HH), イネOryza  sativa からゲノムDNAを抽出し, 制限酵素Sac IとDra Iで完全に消化した。
【００７９】
これらの植物のゲノムDNA を20 μgずつ1%アガロースゲルで20 Vで20時間電気泳動した後、バキュームブロッティング装置を用いてナイロンメンブレン(バイオダインプラス)にトランスファーした。ブロッティング装置にゲルを乗せてバキュームポンプで3分間吸引しながら0.25 N HClをゲル上に注いで脱プリンした。次に0.4 N NaOHで2時間吸引した。トランスファー後、ナイロンメンブレンを5×SSCで洗浄し、UV(125 mJoule)でDNAをクロスリンクした。
【００８０】
トランスファーしたナイロンメンブレンをハイブリダイゼーション溶液(2% blocking reagent (Boehringer Mannheim Biochemica)、5×SSC、 0.1%N-lauroylsarcosine、0.02%SDS)に浸し、4時間のプリハイブリダイゼーションを行った。次に、ラベリングしたRevolver cDNA pSc1 (726 bp) DNA断片200 ngを含む10mlのハイブリダイゼーション溶液中で65℃で20時間ハイブリダイゼーションを行った。洗浄は2×SSC、0.1%SDSで室温5分間を2回、0.1×SSC、0.1%SDSで65℃15分間を2回行った。
【００８１】
さらに、Washing buffer(0.3%(W/V)Tween20/buffer 1、buffer 1:0.1 M Maleic acid、0.15 M NaCl、pH7.5)で3分間洗浄後、buffer 2(1%(w/v)blocking reagent(Boehringer Mannheim Biochemica)/buffer1)で30分間ブロッキングし、1/1000 Anti-digoxigenin-AP,Fab fragments(750 units/ml)を含むbuffer 2で30分間の抗原抗体反応を行った。
【００８２】
これをWashing bufferで30分間2回洗浄し、buffer 3(0.1 M Tris-HCl pH9.5、0.1 M NaCl、0.05 M MgCl2)に5分間インキュベートした後、CDP Star溶液(CSPD(10 mg/ml):Buffer 3=1:100)を2ml滴下してナイロンメンブレンをハイブリバッグに封入し、37℃で10分間インキュベートした。さらに、ナイロンメンブレンをX線フィルムにコンタクトして1から3時間感光させ、ハイブリダイゼーションのシグナルを検出した。
【００８３】
cDNA (726 bp) プローブは, Rゲノム種であるSecale cereale, S. montanum, S. fragile, S. silvestre),  Dasypyrum villosum (VV) に強くハイブリダイゼーションし, Triticum monococcum (AA), T. durum (AABB), T. polonicum (AABB), T. timopheevi (AAGG), T. tauschii  (DD)に中度にハイブリダイゼーションした。また, Hordeum bulbosum (HH), Oryza sativaにもハイブリダイゼーションした。T. aestivum (AABBDD)にはハイブリダイゼーションしなかった。
【００８４】
このことから, RevolverはRRゲノム, AAゲノム, AABBゲノム, DDゲノムには存在するが, 普通コムギのAABBDDゲノムには存在しないことがわかった。興味深いことに, Revolverは 普通コムギには存在しないが, より祖先種に近いAゲノムやDゲノムには存在している。
【００８５】
コムギ族植物におけるサザンブロット解析（図４）では，RevolverのcDNAプローブはライムギ属の３種 S. cereale，S. fragile，S. silvestreとDasypyrum villosum に強くハイブリダイゼーションし，Triticum monococcum，Aegilops squarrosa，にも中程度にハイブリダイゼーションした。したがって，Revolverは，ライムギ属とDasypyrum属に多数のコピーが存在する他，一粒系コムギ，タルホコムギなど二倍体種やデュラムコムギ等の四倍体種には中度に反復して存在しているが，普通コムギには存在していない。Revolverはコムギの祖先種からの進化の過程で、いくつかの近縁種で増幅し、普通コムギでは消失しているので、コムギゲノムにおける近縁種の遺伝標識として有用である。コムギ連植物の種属間でコピー数が異なるので，ゲノム進化の指標、染色体のランドマークとして着目される。
【００８６】
（ゲノムにおけるRevolverの多様な構造変異）
Revolverの一つのクローン（Revolve-2：配列表の配列番号２）の3'側隣接領域GTAGTCGTCAGGAGTCCTCACCA(配列番号２４)をシングルプライマーとするPCRを行うとライムギゲノムから2.3 kb、2.8 kb、3.3kb、4.3 kbの４種類のDNAが増幅されるが、コムギゲノムからは何も増幅されない。このプライマーによって、コムギとライムギの遺伝質を簡便に区別することができる。さらに、同じプライマーでライムギ染色体添加コムギ系統のゲノムDNAをテンプレートとするPCRを行うと、1R染色体添加系統からは2.8 kbのDNA、5R染色体添加系統からは3.6 kbのDNA、6R染色体添加系統からは4.3 kbのDNAが増幅される。このプライマーによるPCRにより、ライムギの染色体1R、5R、6R、7Rを識別、同定することができる。ライムギゲノムから増幅された４種類のDNA、1R、5R、6R、7Rの染色体添加系統から増幅されるそれぞれ１個のDNAをpGEM-Tvectorを用いてTAクローニングし、塩基配列を決定した。その結果、いずれもRevolverの第２イントロン以降を持つが，５’側に構造変異が生じていているものであり、Revolverの非自律性因子であった。
【００８７】
まず、６R染色体に存在するRevolve-3（配列表の配列番号３） は、全長が4269 bpで，３'側にRevolverの第１イントロンの途中から第３エキソンを経て３'末端にわたる2112 bpの領域を持ち，５'末端には逆位反復配列を含む150 bpの相同領域を持つが、その間約2 kbは、第１エキソンから第１イントロン途中までを欠くかわりに，Revolverにないオオムギの挿入配列BARE-100 (3130 bp) と相同性が高い370 bpの領域を含むなど，Revolverとは全く異なっている。
【００８８】
Revolve-3 (pSc626)（4,269 bp）およびBARE-100（3,130 bp）はいずれも両端にRevolverとの相同領域を含む。5'末端にはいずれもgypsy 型レトロトランスポゾンLTRの5'末端共通配列14 bpを含み、Revolverの転写開始点の上流との123から149 bpの相同領域を持ち，さらにRevolve-3 (pSc626)とBARE-100に特異的な相同領域が600 bp前後まで続いている。
【００８９】
一方，3'側にはRevolverの転写される領域との相同配列を含み，Revolve-3 (pSc626)は第１イントロンの途中から第３エキソンの下流までの2,112 bpを持ち，BARE-100は第２イントロンの途中から第３エキソンの下流までの777 bpを持っている。３'末端はいずれもRevolverの第３エキソン下流非翻訳領域の３'末端と一致し，かつgypsy 型レトロトランスポゾンLTRの3'末端共通配列14 bp を含んでいる。以上の領域ごとの相同性は，Revolverとの相同部分ではRevolverに対してRevolve-3 (pSc626)が77から93%，BARE-100が58から65%を示し，5'側のRevolve-3 (pSc626)とBARE-100のみの相同部分では65%であった。
【００９０】
Revolve-3 (pSc626)の5'側から631から2,176 bpの領域とBARE-100の598から2,353 bpの領域には短い配列が繰り返して存在し，両クローン間では53%の相同性を示すが，Revolverとの相同性は全くない。Revolve-3 (pSc626)とBARE-100は5'側に独自の共通領域を持つなど全体として相同性が高く，BARE-100はRevolve-3 (pSc626)からの第１イントロンから第２イントロンに相当する領域が欠失したタイプである。
【００９１】
次に、Revolver-4 (pSc627)は全長が3219 bpで（配列表の配列番号４）、３'側にRevolverの第２エキソンの直前から３'末端にわたる1806 bpの領域を持つが，その５’側1413 bpでRevolverとの相同領域は末端101 bpにすぎない。
【００９２】
さらに、1R染色体に存在するRevolver-5 (pSc628)は全長が2665 bpで（配列表の配列番号５）、３'側にRevolverの第２エキソンの直前から３'末端にわたる1826 bpの領域を持っている。その５’側でRevolverとの相同領域は末端部分37 bpにすぎないが、Revolver-4 (pSc627)とは約670 bpが相同である。
【００９３】
最後に、5R染色体から増幅されたRevolver-6 (pSc5R1)は全長が3503 bpで（配列表の配列番号６）、３'側にRevolverの第２イントロンの途中から３'末端にわたる1294 bpの領域を持つが，その５’側にはRevolverとの相同領域はなく、５’末端121 bpがRevolver-4 (pSc627)、Revolver-5 (pSc628)と相同である。
【００９４】
（Revolver mRNAの多様な構造変異）
Revolverの種属ごとの特性や変異を見いだすため，cDNAクローンの構造解析を進めた。その結果，第１エキソンの構造が全く異なるcDNAが見いだされた。ライムギの野生種Secale silvestreからクローン化した５個のcDNAは，全長が1597 bpで，Revolverの第２イントロン（1210 bp），第３エキソン(301 bp)を持つが，その５’側にRevolverに見られない86 bpの配列を持っている。５クローン間の相同性は96%を示す。他方，ライムギ栽培種S. cerealeからクローン化した４個のcDNAは，全長が395 bpで，上記の1597 bpのcDNAクローンに対して第２イントロンを欠いている。以上のことから，全長が1597 bpで２つのエキソンと１個のイントロンで構成され，86 bpの特異的な第１エキソンを持ち，イントロン以降の構造はRevolverと共通する因子の存在が明らかになった。このRevolverファミリーの第３のタイプを，Revolver-7 (pSc23)とする（配列表の配列番号１２）。
【００９５】
一方，葉のcDNAライブラリーからスクリーニングされた別のcDNAクローン（pSc14:全長2,182 bp）は，Revolverの第２エキソン（90 bp, 相同性97％）と第３エキソン（260 bp, 92%）を持つが，第１エキソンに相当する領域が極めて長く，他のcDNAとの相同性もなかった（配列表の配列番号１１）。第２イントロン以降の構造が共通しているRevolverファミリーは，活発に転写されていて，５’側に多様な構造変異が生じている。
【００９６】
（実施例４：トランスポゾン様因子Revolverによる染色体マーカー開発）
（Revolverのin situ ハイブリダイゼーションによる染色体同定）
ライムギ品種Petkusの体細胞分裂中期の染色体標本を作製し，RevolverとL6のBARE-100 の5'側に特異的な370 bp領域の染色体位置をFISH法によって分析した。Revolverのプローブは，クローンRevolver-1 が含む共通配列3,041 bp の全長をbiotin-16-dUTPで標識して作製し，Revolver-3 (pSc626)特異的領域のプローブはBARE-100との相同部分370 bpを使用した。ハイブリダイゼーション後，avidin-FITCを介して間接蛍光法で染色体上のプローブを検出した。ライムギ染色体の同定は，末端領域の縦列型反復配列350 bpファミリーとの同時FISH法(dig標識，ローダミン抗dig抗体で検出)とFISH後のＣ-バンド法により行った。
【００９７】
Revolverプローブはライムギ染色体全域に弱くハイブリダイゼーションし，ドット状で点在する比較的大きいシグナルが検出された。1R染色体では短腕中央の介在部１箇所，2R染色体では短腕の末端近傍と動原体付近の介在部２箇所，5R染色体では短腕中央の介在部１箇所，長腕の動原体付近と中央の介在部２箇所において，ドット状のシグナルが安定して検出された。Revolverプローブによって1R，2R，5R染色体を明確に識別できる。 一方、Revolver-3 (pSc626)でBARE-100と共通する370 bpの領域は，ライムギ染色体全域に比較的強くハイブリダイゼーションし，Revolverより高いコピー数で散在している。
【００９８】
（Revolverの多様な構造変異体のSTS化による染色体マーカー）
Revolverのゲノムクローンのうち、Revolverの第２イントロン以降を持つが，５’側に構造変異が生じていて、非自律性因子と考えられるクローンを、ライムギ染色体コムギ系統を用いてライムギ染色体上にSTS化した。Revolver-3はRevolver-2の3’側隣接領域のプライマーGTAGTCGTCAGGAGTCCTCACCA（配列番号２４）によってライムギ6R染色体添加系統のみから増幅されるので、6R染色体にSTS化された。
【００９９】
また、Revolver-5 (pSc628)はRevolver-2の3’側隣接領域のプライマーGTAGTCGTCAGGAGTCCTCACCA（配列番号２４）によってライムギ1R染色体添加系統のみから増幅されるので、ライムギ1R染色体に位置づけられた。さらに、Revolver-6 (pSc5R1)はRevolver-2の3’側隣接領域のプライマーGTAGTCGTCAGGAGTCCTCACCA（配列番号２４）によってライムギ5R染色体添加系統のみから増幅されるので、ライムギ5R染色体に座乗している。
【０１００】
さらに、Revolver-６(pSc5R1)の内部配列をプライマー(ATAGCTCCACTGTTGGCTCCTCTTGC（配列番号２５）、CATTCATCCAAAGAACACAGAGTCCG（配列番号２６）にして５R染色体に特異的な2973 bpのDNAが確かに増幅される。また、Revolver-２は5’側の隣接領域GCCTTTCGGCCTTCCTCTCAGGCGG（配列番号２７）とGTACTTGGCATCGGTAGATGTTCGG（配列番号２８）によるPCRでライムギ7R染色体添加系統のみから492 bpのDNAが増幅されるので、ライムギ７R染色体に位置づけられた。以上のように、ゲノムに散在するRevolverの各因子に隣接する配列、内部配列およびそれらの組み合わせたPCRプライマーによって、Revolverの各因子が座乗する染色体を決定し、染色体を検出・同定するためのPCRマーカーに利用することができる。
【０１０１】
Revolver-７の第１エキソン部分は，S. cerealeでは98 bp （Revolver-７、pSc23）で、S. silvestreでは86 bp（Revolver-７、pSc14）である。そこで，（Revolver-７、pSc23）の第１エキソン部分を増幅するように配列を設計し，挿入因子ファミリーを多数持つS. cereale，S. silvestreおよびDasypyrum villosumについてPCRを行った。その結果，第１エキソンに相当するDNAが増幅され，S. silvestreとD. villosumでは約90 bp，S. cerealeでは約100 bpであった。挿入因子はゲノム全域に存在するので，Revolver-７の第１エキソン部分のプライマーセットは，コムギの遺伝的背景でS. cerealeとD. villosumのDNAを識別・同定するのに有効である。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明のトランスポゾン様因子RevolverのDNA配列、Revolverがコードする転写活性がある遺伝子のDNA配列、およびその構造変異体のDNA配列は、有用資源植物のゲノムの検出、同定、DNAマーカーの開発、染色体同定、進化の検討のためのプローブ、PCRのエントリーポイントなどに利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、Revolverとその非自律性因子の構造を示す模式図である。
【図２】図２は、RevolverとそのcDNAの構造を示す模式図である。
【図３】図３は、Revolverの構造をBARE-100との比較において示す模式図である。
【図４】図４は、種々のコムギ族植物においてRevolverのサザンブロット解析を行った写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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