(57)【要約】      （修正有）【課題】ＨＣＶ感染の治療と診断に有用な方法を提供する。特にその治療薬の標的となり得る宿主細胞由来の因子を特定し、感染予後の予測マーカー、前記標的の活性または発現を調節する化合物のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】宿主細胞由来のＨＣＶレプリコン調節ポリペプチドから選択される、特定のアミノ酸配列からなる少なくとも一つのポリペプチドが、抗ＨＣＶ薬の標的および予後の予測マーカーとして有用であることを見出した。また、その活性または発現を調節する化合物をin vitroで評価する方法を示すと共に、医薬品、診断キットとして提示した。【効果】ＨＣＶ感染の治療薬、診断薬を提供しうる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１および２に列挙されているポリペプチドの群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む抗ウイルス化合物の標的ポリペプチド。
【請求項２】
表３に列挙されているポリペプチドの群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む抗ウイルス化合物の標的ポリペプチド。
【請求項３】
表４に列挙されているポリペプチドの群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む抗ウイルス化合物の標的ポリペプチド。
【請求項４】
表５に列挙されているポリペプチドの群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む抗ウイルス化合物の標的ポリペプチド。
【請求項５】
表６に列挙されているポリペプチドの群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む抗ウイルス化合物の標的ポリペプチド。
【請求項６】
抗ウイルス化合物が、抗ＨＣＶ化合物である、請求項１〜５のいずれか一項記載の標的ポリペプチド。
【請求項７】
表１および２に列挙されているポリペプチドの群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含むウイルス感染の結果を予測するためのマーカーポリペプチド。
【請求項８】
表３〜６に列挙されているポリペプチドの群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含むウイルス感染の結果を予測するためのマーカーポリペプチド。
【請求項９】
ウイルス感染が、ＨＣＶ感染である、請求項７および８のいずれか一項記載のマーカーポリペプチド。
【請求項１０】
ＨＣＶ感染対象から生物学的サンプルを入手すること、ならびに表１および２に列挙されているポリペプチドの群に由来する少なくとも１つのポリペプチドの発現レベルを決定することを含む、対象におけるＨＣＶ感染の結果を予測するためのインビトロ方法。
【請求項１１】
表３〜６に列挙されているポリペプチドの群に由来する少なくとも１つのポリペプチドの発現レベルを決定することを含む対象におけるＨＣＶ感染の結果を予測するためのインビトロ方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのポリペプチドの発現レベルをＨＣＶ感染の経過の別の時点で決定されたその発現レベルと、または健常対象におけるその発現レベルと比較することを更に含む、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
その発現が、ＨＣＶ感染組織において上方調節もしくは下方調節されている表１〜６に列挙されているポリペプチドから選択されるポリペプチドと相互作用する化合物を同定および／または入手するためのスクリーニング方法であって、
ａ）該ポリペプチドを化合物または複数の化合物と、該化合物と該ポリペプチドとの相互作用を可能にする条件下で接触させる工程と、および
ｂ）該化合物または複数の化合物と該ポリペプチドの相互作用を決定する工程と、を含むスクリーニング方法。
【請求項１４】
その発現が、ＨＣＶ感染組織において上方調節されている、表２〜６に列挙されているポリペプチドのインヒビターもしくはアンタゴニストである化合物を同定および／または入手するためのスクリーニング方法であって、
ａ）該ポリペプチドを化合物または複数の化合物と、該化合物と該ポリペプチドとの相互作用を可能にする条件下で接触させる工程と、
ｂ）該ポリペプチドの活性を決定する工程と、
ｃ）化合物または複数の化合物の存在下の該ポリペプチドの活性を、化合物または複数の化合物の不在下で決定された活性と比較する工程、ならびに
ｄ）インヒビターまたはアンタゴニストを同定および／または入手する工程と、
を含み、ここで（ｃ）で決定された活性の低下が、インヒビターまたはアンタゴニストを示す、スクリーニング方法。
【請求項１５】
その発現が、ＨＣＶ感染組織において下方調節されている表１、３〜６に列挙されているポリペプチドのアクチベーターまたはアゴニストである化合物を同定および／または入手するためのスクリーニング方法であって、
ａ）該ポリペプチドを化合物または複数の化合物と、該化合物と該ポリペプチドとの相互作用を可能にする条件下で接触させる工程と、
ｂ）該ポリペプチドの活性を決定する工程と、
ｃ）化合物または複数の化合物の存在下の該ポリペプチドの活性を、化合物または複数の化合物の不在下で決定された活性と比較する工程と、ならびに
ｄ）アクチベーターまたはアゴニストを同定および／または入手する工程と、
を含み、ここで（ｃ）で決定された活性の上昇が、アクチベーターまたはアゴニストを示す、スクリーニング方法。
【請求項１６】
その発現が、ＨＣＶ感染組織において上方調節されている、表２〜６に列挙されているポリペプチドから選択されるポリペプチドの発現のインヒビターである化合物を同定および／または入手するためのスクリーニング方法であって、
ａ）該ポリペプチドを発現する宿主を化合物または複数の化合物と接触させる工程と、
ｂ）該ポリペプチドの発現レベルを決定する工程と、
ｃ）化合物または複数の化合物の存在下で決定された発現レベルを、化合物または複数の化合物の不在下で決定された発現レベルと比較する工程と、ならびに
ｄ）ポリペプチドの発現のインヒビターを同定および／または入手する工程と、
を含み、ここで（ｃ）で決定された発現レベルの低下が、インヒビターを示す、スクリーニング方法。
【請求項１７】
その発現が、ＨＣＶ感染組織で下方調節されている、表１、３〜６に列挙されているポリペプチドから選択されるポリペプチドの発現のアクチベーターである化合物を同定および／または入手するためのスクリーニング方法であって、
ａ）該ポリペプチドを発現する宿主を化合物または複数の化合物と接触させる工程と、
ｂ）該ポリペプチドの発現レベルを決定する工程と、
ｃ）化合物または複数の化合物の存在下で決定された発現レベルを、化合物または複数の化合物の不在下で決定された発現レベルと比較する工程と、ならびに
ｄ）ポリペプチドの発現のアクチベーターを同定および／または入手する工程と、を含み、ここで（ｃ）で決定された発現レベルの上昇が、アクチベーターを示すスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のいずれか一項記載のスクリーニング方法により同定および／または入手された化合物。
【請求項１９】
請求項１８記載の化合物および薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項２０】
薬学的に許容される担体または希釈剤中で請求項１８記載の化合物を処方することを含む、請求項１９記載の医薬組成物の調製のための方法。
【請求項２１】
ＨＣＶ感染の処置または防御のための医薬品の調製のための請求項１８記載の化合物の使用。
【請求項２２】
該化合物が、抗体、抗体誘導体、抗体フラグメント、ペプチド、またはアンチセンス構築物を含む群から選択される、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
対象におけるＨＣＶ感染の結果を予測するためのインビトロ方法において使用するための表１および２に列挙されるようなポリペプチドに対する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２４】
請求項２３記載の１つもしくはそれ以上の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、対象におけるＨＣＶ感染の結果を予測するためのキット。
【請求項２５】
表１および２に列挙されるようなポリペプチドのいずれか１つの活性を活性化もしくは阻害するか、またはその発現を活性化もしくは阻害する化合物のスクリーニングのためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）レプリコン調節ポリペプチド発現の分析により同定された抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）薬に関する新規宿主細胞標的、ウイルス感染の結果を予測するための予後マーカー、対象におけるＨＣＶ感染の結果を予測するためのインビトロ方法、新規宿主細胞標的と相互作用する、および／もしくはその活性を調節するか、または該新規宿主細胞標的の発現を調節する化合物を同定するためのスクリーニング方法に関する。
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、急速に増加しつつある公衆衛生の問題であり、全世界で２万人の慢性感染患者がいると推定されている。現在、ＨＣＶに利用できるワクチンはなく（Hagedom, C.H.およびRice, C.M.編、Current Topics in Microbiology and Immunology (Springer、Berlin)(1999)）、そして一部の患者のみが現行の処置に応答する。適切な動物モデルおよび細胞培養系の欠如のために、ウイルス感染のメカニズム、持続、およびクリアランスは、よく理解されていない。
【０００３】
細胞培養におけるウイルスの増殖は、成功していないので（Tan, S.-L.ら、Hepatitis C Therapeutics: Current Status and Emerging Strategies, Nature Reviews 1巻:867-881(2002)）、ＨＣＶ非構造タンパク質の発現がサブゲノムＨＣＶ  ＲＮＡの複製を促すＨＣＶレプリコン系（Bartenschlaeger, R., Hepatitis C virus replicons: potential role for drug development, Nature Reviews 1巻:911-916(2002)）が作製されている。進行中のこの系を用いて、ＨＣＶ複製および宿主のすべての応答を更により詳細に研究することができる。大抵の現行のウイルスに抗する努力は、ＨＣＶ複製に必須である重要なウイルスの酵素に向けられているが、ＨＣＶ複製に必要とされる細胞由来遺伝子は、例えば、小型分子を用いてウイルス複製を制御するために標的化するための魅力的な遺伝子クラスに相当する。
【０００４】
ｍＲＮＡウイルスは、全体的にはタンパク質合成に関して宿主細胞に依存する。これらのウイルスは、そのウイルスタンパク質を発現するために宿主細胞タンパク質合成機構を大幅に妨害しなければならない。驚くことではないが、この過程の一部は、既にこの技術分野で報告されている。したがって、Kruegerら(Krueger, M.ら、「機能的ゲノム研究法を用いるＨＣＶ  ＩＲＥＳ媒介翻訳のコファクターとしてのｅＩＦ２ＢγおよびｅＩＦ２γの同定」PNAS 97: 8566-8571(2000)）機能的ゲノム研究法を用いてＨＣＶ  ＩＲＥＳ機能に関与するｅＩＦ２ＢγおよびｅＩＦ２γ細胞性コファクターを同定した。
【０００５】
ウイルスアセンブリの間、哺乳動物ウイルスは、形態形成および分泌に関して宿主細胞のグリコシル化メカニズムに依存している。Ｎ結合グリコシル化経路の最初の工程は、ＥＲ局在グルコシダーゼにより達成され、これは宿主を危うくすることなくウイルス感染を処置するために低レベルで標的化され得る。Su, A.J.(Su,A.I.、Pezacki, J.P.ら、PNAS 99(24): 15669-15674(2002)）は、ＨＣＶ感染で誘導される宿主遺伝子の中で免疫応答に関与するものがいくつかあり、そしてＣＤ８のごときＩＦＮ−γ、ＭＨＣ  クラスＩＩ成分、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＧのごときケモカインにより誘導されることを示した。ＨＣＶの感染初期の間に別々に誘導または抑制された、同定されたその他の遺伝子は、脂質代謝と関連していた（結果の予測マーカー）。
【０００６】
しかしながら、転写レベルにおける調節は、翻訳レベルで各々の遺伝子の発現の類似の調節を示すのに必ずしも必要ではないことは周知である。いくつかの研究により、ｍＲＮＡレベルおよび実際のタンパク質発現は、ほんのわずかしか相関しないことが示されている（Gygi, S.P.、Rochon, Y.、Franza,B.R.、Aebersold, R.、Mol Cell Biol 19(3):1720-1730(1999)）。したがって、表１および２に列挙されているポリペプチドが、ＨＣＶレプリコン由来のＲＮＡの存在により下方または上方調節されることを実証することによってのみ、それをウイルス薬の新規標的として、および疾患の結果を予測するための予後マーカーとして使用することができる。
【０００７】
したがって、この技術分野には、ＨＣＶ感染の処置における新規宿主細胞標的、およびＨＣＶ感染の結果を研究し、そして予測するためのマーカーに関する要求がある。
【０００８】
本発明は、ＨＣＶレプリコン調節ポリペプチド発現の分析により同定された、抗ウイルス化合物、好ましくは抗ＨＣＶ化合物に関する新規宿主細胞標的ウイルス感染の結果を予測するための予後マーカー、対象におけるＨＣＶ感染の結果を予測するためのインビボ方法、新規宿主細胞標的と相互作用する、および／もしくはその活性を変調するか、または該新規宿主細胞標的の発現を変調する化合物を同定するためのスクリーニング方法に関する。
【０００９】
本発明は、表１および２に列挙されているポリペプチドの群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む抗ウイルス化合物の標的を提供する。好ましくは、表３に列挙されているポリペプチドの群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む抗ウイルス化合物の標的を提供する。表３に列挙されているポリペプチドは、上方または下方調節ｍＲＮＡシャペロン、ｍＲＮＡ結合タンパク質、例えば、ＰＴＢを含む。また好ましくは、表４に列挙されているポリペプチドの群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む抗ウイルス化合物の標的をも提供する。表４に列挙されているポリペプチドは、上方または下方調節翻訳開始タンパク質、例えば、ｅＩＦ２γおよびｅＩＦ２Ｂγを含む。更に好ましい態様では、表５に列挙されているポリペプチドの群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む抗ウイルス化合物の標的を提供する。表５に列挙されているポリペプチドは、脂質代謝に関与する上方または下方調節ポリペプチド、例えば、コレステロール合成およびβ酸化に関与するポリペプチドを含む。別の好ましい態様では、表６に列挙されているポリペプチドの群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む抗ウイルス化合物の標的を提供する。表６に列挙されているポリペプチドは、シグナル・トランスダクション経路に関与する上方または下方調節ポリペプチド、例えば、ＭＫ０１のごときＭＡＰキナーゼまたはＳＲＣ８のごときオンコジーンを含む。好ましくは、抗ＨＣＶ標的のごとき先に記載した標的である。抗ウイルス化合物、好ましくは抗ＨＣＶ化合物の標的は表１、表２、好ましくは表３、表４、表５、および表６に列挙されている、２、３、４、５、６、７またはそれ以上のポリペプチドを含むことができる。特に抗ＨＣＶ化合物の標的として好ましいものは、配列番号：７０（ＰＴＢ＿ＨＵＭＡＮ）、１０１（ＮＲ５４＿ＨＵＭＡＮ）、７２（ＡＣＤＢ＿ＨＵＭＡＮ）、１９３（ＣＨＲ１−Ｏ１４８０５）、または１６６（ＳＣＲ８＿ＨＵＭＡＮ）のポリペプチドである。本明細書で用いる抗ウイルス化合物は、いずれかのウイルス、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスに対する化合物を含むことができ、好ましくは、これらはＲＮＡウイルス、例えば、ＨＩＶ、ポリオウイルスに対する化合物を含む。最も好ましくは、抗ウイルス化合物はＨＣＶに対する化合物である。
【００１０】
本明細書で用いる「ポリペプチド」なる用語は、アミノ酸の重合体を意味し、そして特定の長さを意味することはない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質はポリペプチドの定義内に含まれる。
【００１１】
本発明は、また表１および２に列挙されているポリペプチドの群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含むウイルス感染の結果を予測するための予後マーカーをも提供する。好ましくは、表３〜６に列挙されているポリペプチドの群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含むウイルス感染の結果を予測するための予後マーカーを提供する。マーカーは、表１および表２に列挙されている、または表３〜６に列挙されている、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれ以上のポリペプチドを含むことができる。好ましくは、本発明は、ＨＣＶ感染の結果を予測するための予後マーカーを提供する。ＨＣＶ感染の結果は、肝不全、肝細胞癌腫、および肝硬変を含むことができる（Hofnagle, J.H.、「Ｃ型肝炎−疾患の臨床スペクトル"Hepatitis C - the clinical spectrum of desease"」、Hepatology 26: 15-20(1997)）。
【００１２】
本発明は、また、ＨＣＶ感染対象から生物学的サンプルを入手する工程と、および表１〜６に列挙するポリペプチドの群に由来する少なくとも１つのポリペプチドの発現レベルを決定する工程とを含む、対象におけるＨＣＶ感染の結果を予測するためのインビトロ方法をも提供する。本明細書で用いる「発現レベルを決定すること」なる用語は、ＨＣＶ感染対象に由来する生物学的サンプルにおけるポリペプチドの発現の定量的決定を意味する。更に、インビトロ方法は、表１〜６に列挙されているポリペプチドの群に由来する少なくとも１つのポリペプチドの発現レベルを、ＨＣＶ感染のコースの異なる時点からのその発現レベル、および／または感染していない対象に由来する生物学的サンプルに対する発現における差異と比較することに関する。生物学的サンプルにおけるポリペプチドの発現レベルを決定するための方法は、この技術分野で公知であり、これらに限定されないが、ウェスタン・ブロッティング、ＥＬＩＳＡ、またはＲＩＡなどを含む。例えば、精製されたタンパク質でウサギを免疫することにより、表１〜６に列挙するポリペプチドを認識する抗体を、該ポリペプチドを検出する目的のために作製することができるか、または該ポリペプチドを認識する公知の抗体を用いることができる。例えば、変性タンパク質に結合できる抗体、例えば、ポリクローナル抗体を用いて本発明のポリペプチドをウェスタンブロットで検出することができる。予後マーカーの発現レベルを決定するためのかかる方法に関する実例は、ＥＬＩＳＡである。この型のタンパク質定量は、特異的抗原を捕捉することができる抗体、および捕捉された抗原を検出することができる２次抗体に基づく。ＨＣＶ感染の結果を予測するためのマーカーの発現を決定するための別の方法は、本発明のマーカーの存在または不在に関して生検標本を分析することを含む。これらのマーカーを検出するための方法は、この技術分野で公知であり、これらに限定されないが、本発明のポリクローナル抗体の存在もしくは不在の免疫組織化学または免疫蛍光検出などを含む。抗体の調製方法および使用、ならびに先に記載したアッセイは、Harlow, E.およびLane, D.、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)に記載されている。
【００１３】
本発明のＨＩＶ感染の結果を予測するための方法のために、適当な生物学的サンプルをマーカーの発現に関して分析する必要がある。該生物学的サンプルは、血清、血漿、または肝臓組織でよい。肝臓組織に由来する細胞を例えば、大口径針生検により入手することができる。
【００１４】
本発明では、対象なる用語は、ＨＣＶで感染していてもよい、いかなる哺乳動物を含む。好ましくは、対象はヒトである。
【００１５】
本発明は、また、その発現が、ＨＣＶ感染組織で上方調節または下方調節されている、表１〜６に列挙されているポリペプチドから選択されるポリペプチドと相互作用する化合物を同定および／または入手するためのスクリーニング方法であって、該ポリペプチドと１つの化合物または複数の化合物を、該ポリペプチドと該化合物との相互作用を可能にする条件下で接触させる工程を含み、ならびに該化合物または複数の化合物と該ポリペプチドとの間の相互作用を検出することによる方法をも提供する。
【００１６】
本明細書に開示するスクリーニング方法における「相互作用」を従来の方法により測定することができる。膜結合性とは対照的に、可溶性であるポリペプチドと化合物との相互作用を試験するための従来の型の方法は、精製された組換えポリペプチドかまたはポリペプチドを内因的に発現する細胞から精製された元来のポリペプチドのいずれかを用いるインビトロ法でよい。非限定例としては、本発明のポリペプチドをビーズに結合するか、またはプラスチックもしくはその他の表面に固定することができ、そして標識化合物を使用し、そしてポリペプチドに結合した標識を測定することか、または該ポリペプチドから標識された公知のリガンドを置換することのいずれかにより化合物とポリペプチドの相互作用を測定することができる。
【００１７】
細胞表面の細胞膜に随伴されるか、または膜貫通性もしくは膜内在性ポリペプチドに関して、化合物と該ポリペプチドとの相互作用を、非限定例としてはポリペプチドを正常に発現するか、またはポリペプチドが過剰発現される細胞を用いる、例えば、スクリーニングされる化合物により標識されている公知のリガンドの置換を検出することによる方法を含む異なる方法で検出することができる。あるいは、膜調製物を用いて化合物のかかるポリペプチドとの相互作用を試験することができる。
【００１８】
本明細書に開示される方法で用いられる相互作用アッセイは、ＥＲＥＴアッセイ（蛍光共鳴エネルギー転移：とりわけNg、Science 283: 2085-2089(1999)またはUbarretxena-Belandia、Biochem.38: 7398-7405(1999)）、ＴＲ−ＦＲＥＴおよび本明細書に開示する生化学的アッセイを含むことができる。更に、「Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay（商標）」（BioSignal Packard）のような市販のアッセイを用いることができる。別の方法が、技術分野で公知であり、そしてとりわけ、Fernandez、Curr. Opin. Chem.Biol.2: 597-603(1998)に記載されている。
【００１９】
相互作用化合物を同定および／または入手するための方法を、技術分野で公知であり、そして例えば、本明細書に後記するような同種および異種アッセイを含む特異的免疫学的および／または生化学的アッセイにより実施することもできる。読み出しシステムを用いる該相互作用アッセイは、技術分野で公知であり、そしてとりわけTwo-Hybridスクリーニング（とりわけ欧州特許第０９６３３７６号、国際公開公報第９８／２５９４７号、国際公開公報第００／０２９１１号に記載されるもののごとき）、ＧＳＴ−プル・ダウン・カラム、とりわけKasus-Jacobi、Oncogene 19: 2052-2059(2000)に記載されるような細胞抽出物からの同時沈殿アッセイ、「相互作用トラップ」系（とりわけ米国特許第６００４７４６号に記載されるもののごとき）発現クローニング（例えば、λｇｔ１１）、ファージ・ディスプレイ（とりわけ米国特許第５５４１１０９号に記載されるもののごとき）、インビトロ結合アッセイ等を含む。別の相互作用アッセイ方法および対応する読み出しシステムは、とりわけ、米国特許第５５２５４９０号、国際公開公報第９９／５１７４１号、国際公開公報第００／１７２２１号、国際公開公報第００／１４２７１号または国際公開公報第００／０５４１０に記載されている。VidalおよびLegrain(Nucleic Acids Research 27: 919-929(1999)）は、本発明にしたがって用いることができる技術分野で公知の別の相互作用アッセイについて記載、概説、および要約する。
【００２０】
同種（相互作用）アッセイは、結合パートナーが溶液中に残留するアッセイを含み、そして例えば、アッセイ、例えば、凝集アッセイを含む。異種アッセイはとりわけイムノアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射活性イムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射線アッセイ（ＩＲＭＡ）、フローインジェクション分析（ＦＩＡ）、フロー・アクチベーティッド・セル・ソーティング（Flow Activated Cell Sorting: FACS）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、または電気発生化学発光（Electrogenerated Chemiluminescent: ECL）レポーティングのごときアッセイを含む。
【００２１】
本発明は、更に、その発現が、ＨＣＶ感染組織で上方調節されている、表２〜６に列挙されているポリペプチドのインヒビターまたはアンタゴニストである化合物を同定および／または入手するためのスクリーニング方法であって、ａ）該ポリペプチドを化合物または複数の化合物と、該化合物と該ポリペプチドとの相互作用を可能にする条件下で接触させる工程と、ｂ）該ポリペプチドの活性を決定する工程と、ｃ）化合物または複数の化合物の存在下の該ポリペプチドの活性を、化合物または複数の化合物の不在下で決定された活性と比較する工程と、ならびにインヒビターまたはアンタゴニストを同定および／または入手する工程とを含む方法を提供し、ここで（ｃ）で決定された活性の低下が、インヒビターまたはアンタゴニストを示す。本明細書で用いるインヒビターおよびアンタゴニストなる用語は、互換的に用いられる。スクリーニング方法をインビトロアッセイまたは宿主ベースアッセイのいずれかとして実施することができる。本発明のスクリーニング方法で用い、そして表２〜６に列挙するポリペプチドを含む、および／または発現する宿主は、真核および原核細胞を含むことができる。該細胞は細菌細胞、酵母細胞および、とりわけ哺乳動物から誘導された培養（組織）細胞株を含むことができる。更に動物、例えば、ヒト以外のトランスジェニック動物を宿主として用いることができる。したがって、本明細書で開示するようなＩＣＶ感染組織で差別的に発現されるポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターで該宿主（細胞）をトランスフェクトまたは形質転換することができる。したがって該宿主細胞または宿主はかかるポリペプチドをコードする核酸分子で、またはかかる核酸分子を含むベクターで遺伝的に修飾することができる。
【００２２】
本発明は、更に、その発現が、ＨＣＶ感染組織において下方調節されている表１、３〜６に列挙されているポリペプチドのアクチベーターまたはアゴニストである化合物を同定および／または入手するためのスクリーニング方法であって、ａ）該ポリペプチドを化合物または複数の化合物と、該化合物と該ポリペプチドとの相互作用を可能にする条件下で接触させる工程と、ｂ）該ポリペプチドの活性を決定する工程と、ｃ）化合物または複数の化合物の存在下の該ポリペプチドの活性を、化合物または複数の化合物の不在下で決定された活性と比較する工程と、ならびにアクチベーターまたはアゴニストを同定および／または入手する工程とを含む方法を提供し、ここで（ｃ）で決定された活性の上昇が、アクチベーターまたはアゴニストを示す。本明細書で用いるアクチベーターおよびアゴニストなる用語は、互換的に用いられる。スクリーニング方法をインビトロアッセイまたは宿主基盤アッセイのいずれかとして実施することができる。本発明のスクリーニング方法で用い、そして表１、３〜６に列挙するポリペプチドを含む、および／または発現する宿主は真核および原核細胞を含むことができる。該細胞は、細菌細胞、酵母細胞および、とりわけ哺乳動物から誘導された培養（組織）細胞系を含むことができる。更に動物を宿主、例えば、ヒト以外のトランスジェニック動物として用いることができる。したがって、本明細書で開示するようなＩＣＶ感染組織で差別的に発現されるポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターで該宿主（細胞）をトランスフェクトまたは形質転換することができる。したがって該宿主細胞または宿主はかかるポリペプチドをコードする核酸分子で、またはかかる核酸分子を含むベクターで遺伝的に修飾することができる。
【００２３】
「遺伝的に修飾された」なる用語は、宿主細胞または宿主がその天然のゲノムに加えて、表２〜６に列挙されているポリペプチドまたは少なくともそのフラグメントをコードする核酸分子またはベクターを含むことを意味する。更なる該遺伝物質を宿主（細胞）またはその祖先／親の１つに導入することができる。核酸分子もしくはベクターは、ゲノムの外側で独立した分子として、好ましくは複製可能な分子として遺伝的に修飾された宿主細胞もしくは宿主に存在し得るか、または宿主細胞もしくは宿主のゲノムに安定して組み込まれ得る。
【００２４】
本明細書に記載するように、本発明の宿主細胞は、いかなる原核または真核細胞でよい。適当な原核細胞は、大腸菌（E.coli）またはBacillus subtilisのように一般にクローニングに用いられるものである。更に、これらの原核宿主細胞は、本明細書に開示するスクリーニング方法においても想定される。更に、真核細胞は、例えば、菌類または動物細胞を含む。適当な菌類細胞の実例は、酵母細胞、好ましくはSaccharomyces属のもの、そして最も好ましくはSaccharomyces cerevisiae種のものである。適当な動物細胞は、例えば、昆虫細胞、脊椎動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３またはＭＯＬＴ−４である。技術分野で公知の更に適当な細胞系は、American Type Culture Collection(ATCC)のごとき細胞系寄託から入手可能である。
【００２５】
宿主をヒト以外の哺乳動物、最も好ましくはマウス、ラット、ヒツジ、仔ウシ、イヌ、サル、またはサルから選択することもできる。本明細書で先に記載したように、該動物／哺乳動物は、好ましくは本明細書に開示したようにＨＣＶ感染細胞または組織において差別的に発現された少なくとも１つのポリペプチドを発現する、ヒト以外のトランスジェニック動物を含むこともできる。好ましくは、該ポリペプチドは、ＨＣＶ感染対象に由来する組織で上方調節されているポリペプチドである。更に、本明細書に開示するようなポリペプチドを発現しないか、または該ポリペプチドを限定量しか発現しないヒト以外のトランスジェニック動物が作製されることもまた想定される。該動物は、ＨＣＶ感染組織で下方調節されているポリペプチドに関連するのが好ましい。本発明の上方調節されたポリペプチドを含む、および／もしくは発現するか、あるいは、サイレンシングされているかもしくは効率の悪い、下方調節されたポリペプチドを含むヒト以外のトランスジェニック動物はＨＣＶ感染の経過および／もしくは結果を研究するための有用なモデルであり、そしてＨＣＶ感染の処置のための薬物および治療方法を試験するための有用なモデルを提供する。
【００２６】
表１〜６に列挙されているポリペプチドを阻害もしくは拮抗するか、または活性化もしくは作動させる化合物を、該化合物の存在下で該ポリペプチドの活性を決定することにより同定する。
【００２７】
本明細書で用いる「活性」なる用語は、特定のポリペプチドの機能的特性または複数の特性に関する。酵素として公知の表１〜６に列挙されているポリペプチドに関しては、「活性」なる用語は、特定のポリペプチドの酵素活性に関する。表１〜６に列挙されている酵素に関する活性アッセイは、技術分野で公知である。
【００２８】
付着分子として公知の表１〜６に列挙されているポリペプチドに関しては、「活性」なる用語は、ポリペプチドの付着特性に関し、そしてアッセイ、例えば、非限定例としては、付着アッセイ、細胞拡散アッセイ、または付着分子の公知リガンドとのインビトロ相互作用アッセイを用いることにより決定することができる。かかるアッセイは技術分野で公知である。
【００２９】
細胞骨格タンパク質として公知の表１〜６に列挙されているポリペプチドに関しては、「活性」なる用語は、かかるポリペプチドによる細胞骨格の調節か、または細胞骨格へのその組み込みに関する。非限定例としては、ゲルソリンのアクチン重合化を調節する能力か、またはフィラミンＡのアクチンフィラメントの直交分岐を促進する能力を、インビトロアクチン重合化アッセイを用いて決定することができる。更に細胞骨格構造の調節に関する活性を、非限定例としては細胞拡散アッセイ、細胞遊走アッセイ、細胞増殖アッセイ、もしくは免疫蛍光アッセイによるか、またはアクチンフィラメントを蛍光標識ファロイジンで染色することにより決定することができる。これらのアッセイは、すべて当業者に周知である。
【００３０】
イオンチャネルとして公知の表１〜６に列挙されているポリペプチドに関しては、「活性」なる用語は、膜を通過するイオンフラックスに関する。膜を通過するイオンフラックスを決定する方法は、当業者に周知である。
【００３１】
転写因子として公知の表１〜６に列挙されているポリペプチドに関しては、「活性」なる用語は、遺伝子転写を調節するその能力に関する。ポリペプチドの転写活性は、技術分野で公知アッセイ、例えば、レポーター遺伝子アッセイを用いて決定することができる。
【００３２】
成長因子およびホルモンまたはそのレセプターとして公知の表１〜６に列挙されているポリペプチドに関しては、「活性」なる用語は、そのレセプターもしくはリガンドの各々と結合し、そしてレセプター活性化および続くシグナリングカスケードを誘導するその能力に関し、ならびに／またはそれは因子もしくはレセプターが、レセプター活性化に媒介される成長因子もしくはホルモンにより実際に引き起こされる１つもしくは複数の細胞機能を媒介する能力に関する。レセプターに結合する成長因子またはホルモンを一般に公知のリガンド結合アッセイにより決定することができる。自己リン酸化に関して試験することにより、または下流のレセプターに対するシグナリングメディエーターの修飾もしくは補充を検定することにより（シグナリング複合体免疫沈澱およびウェスタン・ブロッティングによる）レセプター活性化を決定することができる。成長因子またはホルモンおよびそのレセプターにより調節される細胞機能は細胞増殖（例えば、チミジン組み込みまたは細胞数を用いることにより決定される）、細胞遊走アッセイ（例えば、修飾Boydenチャンバーを用いることにより決定される）、細胞生存、またはアポトーシスアッセイ（例えば、ＤＡＰＩ染色を用いることにより決定される）、血管形成アッセイ（例えば、市販により入手可能な内皮チューブ形成を測定するインビトロアッセイ）でよい。これらのアッセイに加えて、その他のアッセイを同様に用いてこれらのおよびその他の細胞機能を決定することができる。
【００３３】
先に記載したスクリーニング方法において化合物の不在下での活性に比較して化合物の存在下で決定された活性の低下がある場合、表２〜６に列挙されているポリペプチドのインヒビターまたはアンタゴニストが、そのスクリーニング方法により同定される。
【００３４】
先に記載したスクリーニング方法において化合物の不在下での活性に比較して化合物の存在下で決定された活性の上昇がある場合、表１、３〜６に列挙されているポリペプチドのアクチベーターまたはアゴニストが、そのスクリーニング方法により同定される。
【００３５】
先に記載した開示したスクリーニング方法に加えて、本発明は、更に、その発現が、ＨＣＶ感染組織で上方調節されている、表２〜６に列挙されているポリペプチドから選択されるポリペプチドの発現のインヒビターである化合物を同定および／または入手するためのスクリーニング方法であって、ａ）該ポリペプチドを発現する宿主を化合物または複数の化合物と接触させる工程と、ｂ）該ポリペプチドの発現レベルを決定する工程と、ｃ）化合物または複数の化合物の存在下で決定された該ポリペプチドの発現レベルを、化合物または複数の化合物の不在下で決定された該ポリペプチドの発現レベルと比較することならびに、ｄ）ポリペプチドの発現のインヒビターを同定および／または入手する工程とを含む方法を提供し、ここで（ｃ）で決定される発現レベルの低下はインヒビターを示す。
【００３６】
先に記載したように開示したスクリーニング方法に加えて、本発明は、更に、その発現が、ＨＣＶ感染組織で下方調節されている、表１、３〜６に列挙されているポリペプチドから選択されるポリペプチドの発現のアクチベーターである化合物を同定および／または入手するためのスクリーニング方法であって、ａ）該ポリペプチドを発現する宿主を化合物または複数の化合物と接触させる工程と、ｂ）該ポリペプチドの発現レベルを決定する工程と、ｃ）化合物または複数の化合物の存在下で決定された該ポリペプチドの発現レベルを、化合物または複数の化合物の不在下で決定された該ポリペプチドの発現レベルと比較する工程とならびに、ｄ）ポリペプチドの発現のアクチベーターを同定および／または入手する工程とを含む方法を提供し、ここで（ｃ）で決定される発現レベルの上昇はアクチベーターを示す。
【００３７】
本明細書に先に記載したスクリーニング方法において、化合物の不在下に比較して、化合物の存在下でタンパク質の発現の低下が決定される場合、表２〜６に列挙されているポリペプチドの発現のインヒビターは、そのスクリーニング方法により同定され、そのスクリーニング方法は、ポリペプチドの発現のインヒビターを示す。
【００３８】
本明細書で用いる「発現」なる用語は、ＨＣＶ感染組織、ＨＣＶ感染細胞で上方調節および下方調節されている、表２〜６に列挙されているポリペプチドの決定された量に関し、これは非感染組織または非感染細胞における同一のポリペプチドの量に比較して増加または減少している。好ましくは、発現レベルは、非感染組織または細胞よりも少なくとも２倍、更に好ましくは少なくとも３倍、更に好ましくは少なくとも４倍、最も好ましくは少なくとも５倍高いかまたは低い。
【００３９】
更に、本発明は、本明細書で先に記載したスクリーニング方法のいずれかにより同定および／または入手される化合物を提供する。本発明のスクリーニング方法のいずれかにより同定および／または入手された化合物は、小型分子、ポリペプチド、ホルモン、アンチセンスヌクレオチドを含むポリヌクレオチドおよび抗体を含む。該化合物および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物も更に提供される。薬学的に許容される担体または希釈剤中で該化合物を処方することを含む該薬学的組成物の調製方法もまた特許請求する。いずれかの従来の担体材料を利用することができる。担体材料は、経腸、経皮、もしくは非経口投与に適した有機または無機物でよい。適当な担体には、水、ゼラチン、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレングリコール、ワセリン等がある。更に薬学的調製物は、その他の薬学的活性物質を含有することができる。更なる添加剤、例えば、着香剤、安定剤、乳化剤、バッファー等を医薬品調合の許容される手法にしたがって添加することができる。
【００４０】
該化合物をＨＣＶ感染の処置または予防のための医薬品の調製のために用いることができる。好ましくは、該化合物を、抗体、抗体誘導体、抗体フラグメント、ペプチドまたはアンチセンス構築物を含む群から選択する。
【００４１】
本発明の範囲内で、対象におけるＨＣＶ感染の結果を予測するためのインビトロ方法で使用するための、表１〜６に列挙されているポリペプチドに対する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００４２】
予後方法を効率よく実施するために、本発明は、先に記載したような１つもしくはそれ以上の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む対象におけるＨＣＶ感染の結果を予測するためのキットを提供する。本発明により提供されるもう１つのキットは、表１および２に列挙されているポリペプチドのいずれか１つの活性を活性化もしくは阻害するか、またはその発現を活性化もしくは阻害する化合物をスクリーニングするためのキットである。
【００４３】
ここで本発明を一般的に記載してきたが、説明のみの目的のために本明細書に含まれ、そして特記しない場合、限定されることを意図しない特定の実施例を参照することにより、同一物が更によく理解されるようになるであろう。
【００４４】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【００４５】
【表２】
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【００４６】
【表３】
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【００４７】
【表４】
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【００４８】
【表５】
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【実施例】
【００４９】
実施例において言及する市販により入手可能な試薬を、特記しない場合、製造者の指示書にしたがって使用した。
【００５０】
〔実施例１〕
Ｈｕｈ８．１細胞株を標準的な条件（対照）下で成長させ、そしてＨｕｈ９．１３（レプリコン）と比較した。Lohmann, V.ら、Science 285: 110-113(1999)にしたがってＨｕｈ９．１３細胞株を調製した。成長実験を３回繰り返し、各回で異なる細胞溶解条件を用いた（Lohmann, V.ら、Science 285: 110-113(1999)、Bartenschlaeger, R.、Nature Reviews、「Ｃ型肝炎ウイルスレプリコン：薬物開発のための潜在的役割」１巻：911-916(2002)）。
【００５１】
異なる遠心分離（８００ｇ、１２０００ｇ、６００００ｇ）を用いるいくつかの標準的な細胞分画を作製した。加えて、レプリコンタンパク質（レプリコン粒子）富化粒子分画を異なる遠心／密度勾配遠心分離により単離した。全分画に関して、３−１０および４−７／６−１０にわたるＩＰＧを用いて同一条件下で２Ｄ  ＰＡＧＥのサンプル／対照対を同一条件下で走らせ、そしてＭＡＬＩＤＩ  ＭＳペプチド・フィンガープリンティングを用いてすべての利用可能なタンパク質スポットを同定した。
【００５２】
【表６】
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【００５３】
比較のために、全実験の結果をまとめ、そしてタンパク質同定の計数を作成した。少なくとも２つのサンプルを見出すことができ、そしてそれが対照（各々のレプリコンサンプル）では全体で不在であるか、またはサンプルおよび対照においてタンパク質として同定されたマススペクトルの計数間で商が２よりも大きい（０．５よりも小さい）場合、タンパク質を「上方調節された」（「下方調節された」）とした。
【００５４】
ＨＣＶレプリコン由来のＲＮＡの存在により下方調節されたポリペプチドを表１に表し、そしてＨＣＶレプリコン由来のＲＮＡの存在により上方調節されたポリペプチドを表２に表し、これはタンパク質合成機構の多くの興味深いｍＲＮＡ結合タンパク質および無調節成分を含む。
【配列表】
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