(57)【要約】【課題】  本発明の目的は、分子の相互作用を精密に測定することが可能な1分子蛍光分析の方法を提供することである。【解決手段】  上記課題を解決するために、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いた一分子蛍光解析する技術を考案した。すなわち、本発明は、試料Aと試料Bの会合または相互作用を検出するための蛍光分光分析の方法であって、蛍光標識された試料Aと、該試料Aに標識した蛍光物質の蛍光エネルギーを励起エネルギーとするような蛍光物質で蛍光標識された試料Bとを接触させる工程と、前記試料Aに標識した蛍光物質を励起する波長の光を照射する工程と、前記試料Aと前記試料Bに標識した蛍光物質から発生する蛍光を検出する工程と、前記検出した蛍光に基づいて蛍光相関分光法または蛍光強度分布解析を行い、前記試料Aと前記試料Bとの反応変化の過程を検出する工程とを含むことを特徴とする方法を提供する。【選択図】      図１
2005207823.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料Aと試料Bの会合または相互作用を検出するための蛍光分光分析の方法であって、
蛍光標識された試料Aと、該試料Aに標識した蛍光物質の蛍光エネルギーを励起エネルギーとするような蛍光物質で蛍光標識された試料Bとを接触させる工程と、
前記試料Aに標識した蛍光物質を励起する波長の光を照射する工程と、
前記試料Aと前記試料Bに標識した蛍光物質から発生する蛍光を検出する工程と、
前記検出した蛍光に基づいて蛍光相関分光法または蛍光強度分布解析を行い、前記試料Aと前記試料Bとの反応変化の過程を検出する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
試料Aと試料Bと試料Cの会合または相互作用を検出するための蛍光分光分析の方法であって、請求項1に記載の方法において、
前記蛍光標識された試料A、該試料Aに標識した蛍光物質の蛍光エネルギーを励起エネルギーとするような蛍光物質で蛍光標識された試料Bと、試料Cとを接触させる工程と、
前記試料Aに標識した蛍光物質を励起する波長の光を照射する工程と、
前記試料Aと前記試料Bに標識した蛍光物質から発生する蛍光を検出する工程と、
前記検出した蛍光に基づいて蛍光相関分光法または蛍光強度分布解析を行い、前記試料A、前記試料B、および前記試料Cの反応変化の過程を検出する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項2に記載の方法であって、
前記蛍光標識された試料Aと、該試料Aに標識した蛍光物質の蛍光エネルギーを励起エネルギーとするような蛍光物質で蛍光標識された試料Bと、さらに前記試料Bに標識した蛍光物質の蛍光エネルギーを励起エネルギーとするような蛍光物質で蛍光標識された試料Cとを接触させる工程と、
前記試料Aに標識した蛍光物質を励起する波長の光を照射する工程と、
前記試料A、前記試料B、および試料Cに標識した蛍光物質から発生する蛍光を検出する工程と、
前記検出した蛍光に基づいて蛍光相関分光法または蛍光強度分布解析を行い、前記試料A、前記試料B、および前記試料Cの反応変化の過程を検出する工程と、
を含むこと特徴とする方法。
【請求項４】
試料における構造変化または分子内ドメインの会合状態を検出するための蛍光分光分析の方法であって、
第1の蛍光物質と、該第1の蛍光物質の蛍光エネルギーを励起エネルギーとするような第2の蛍光物質の両方で蛍光標識しされた試料に対し、前記第1の蛍光物質を励起する波長の光を照射する工程と、
前記第1の蛍光物質と、前記第2の蛍光物質から発生する蛍光を検出する工程と、
前記検出した蛍光に基づいて蛍光相関分光法または蛍光強度分布解析を行い、前記試料の構造変化もしくは分子内ドメインの会合状態を検出する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
前記試料Aまたは前記試料Bまたは前記試料が、細胞膜に固定されていることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光相関分光法や蛍光強度分布解析などの蛍光のゆらぎ解析を使用して、分子間相互作用を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質機能解析の研究は、主にタンパク質をコードする遺伝子配列の解析が対象であった。しかし、近年のヒトゲノム解析の急速な進展により、タンパク質機能解析の研究は、細胞内に存在する遺伝子から合成されるタンパク質がどのように動き、機能しているかを解析する点に重点が移行しつつある。
【０００３】
例えば、生体内ではさまざまな遺伝子の発現やシグナル伝達作用により、特異的な機能を有する様々な分子（酵素、受容体をはじめとする機能タンパク質；細胞構造を保持するタンパク質、脂質、糖鎖タンパク質、イオン等；の生物学的活性分子など）が常に変化し、その生命機構を維持している。このような生体機能を観測・解析するためには、立体的に機能を保持したタンパク質の動態を分子レベルで観測する必要がある。
【０００４】
ホルモンや神経伝達物質など生理活性物質の多くは、細胞表面に存在する受容体分子に結合することによって作用を発揮し、様々な生命現象の調節を行なっている。これら生理活性物質の作用を補填、増強、または阻害する物質を探索することは、新規医薬の研究・開発のための主要な手段の一つとなっており、その過程において、特に、作用点となる受容体分子の性状を理解することが極めて重要である。
【０００５】
近年の分子生物学的手法の発達により、多くの生理活性物質の受容体を分子レベルで解析することが可能になった。ターゲットとなる受容体が決定されると、これに対するリガンド、およびこれらの相互作用を阻害する分子についての研究へと発展することになる。リガンドおよび阻害剤などのリガンド様物質として、さまざなな候補物質を選択し、これらの候補物質と受容体との相互作用を調べれることにより、これらの受容体およびリガンドが調節している新たな生理機能または病態が明らかになることが期待される。
【０００６】
分子の相互作用を観測するための手法の1つとして、FCS(Fluorescence Correlation Spectroscopy)を解析手法とする1分子蛍光分光分析法が挙げられる（非特許文献1）。これは、蛍光標識した標的分子の媒質中におけるゆらぎ運動を測定し、自己相関関数（Auto-correlation function）を用いることによって個々の標的分子の微小運動を正確に測定する技術である。この方法により、分子の数、大きさ等の物理量を算出することができる。
【０００７】
しかし、FCSによる解析手法では、正確に解析することができる分子の大きさが限られており、たとえば膜分画などの大きな分子や大きさの均一ではない分子の反応については限界がある。
【０００８】
特許文献1では、この限界を補完する解析手法として、計測した蛍光揺らぎの信号について蛍光強度分布を解析する方法が開示されている。蛍光強度分布解析（FIDA）は、蛍光のゆらぎを検出するという点では、FCSと同様であるが、得られた蛍光シグナルを統計分布解析することにより、蛍光の1分子あたりの強度および計測している系に存在する分子数を算出することができる解析手法である。このFIDAを用いて、蛍光標識リガンドの1分子あたりの蛍光強度および共焦点領域に存在する蛍光分子の数を計測すると、受容体と結合した蛍光標識リガンドの数を予測することも可能である。たとえば、膜分画に複数の受容体が存在し、リガンドが受容体と結合するのに十分な濃度で存在する場合には、膜分画に複数の標識リガンドが結合する。このとき、膜分画は1つの分子として計測される。したがって、計測される分子数は、受容体と結合する前の蛍光標識リガンドの分子数より減少する。また、複数の蛍光標識リガンドが膜分画に結合している場合は、1分子あたりの検出される蛍光強度は高くなる。さらに蛍光標識リガンドの濃度を一定とし、蛍光標識リガンドと受容体の反応を阻害する物質の濃度を変えて反応させ、それぞれの濃度における受容体と反応している蛍光標識リガンドと、モノマー状態で存在する蛍光標識リガンドの分子の割合を算出することにいより、受容体／リガンド反応の結合定数を算出することも可能である。以上のように、FCSやFIDA解析を行うことにより受容体とリガンドの反応を知ることが可能である。
【０００９】
一方、細胞膜上のタンパク質が外部からの刺激を伝達する場合、そのタンパク質が構造変化を起こしたり、またはタンパク質が会合して細胞内へ刺激を伝達することが多い。たとえば、同じタンパク質が2つ会合し2量体を形成したり、または4量体として機能するタンパク質によるものなど、さまざまなものがある。
【００１０】
先述の膜分画とリガンドの反応のFIDAを利用した解析では、蛍光標識されたリガンドの明るさの変化を観測することにより、膜分画とリガンドの反応を知ることができた。しかし、膜分画に結合したリガンドが膜分画内に点在しているのか、相互作用して多量体を形成しているかを検出することは困難であった。たとえば、上皮細胞増殖因子受容体（Epidermal Growth Factor Receptor：EGFR）は、そのリガンドである上皮細胞成長因子（Epidermal Growth Factor：EGF）と結合すると2量体を形成することが明らかとなっている。このEGFRが多く発現している細胞の膜分画を調整し、蛍光標識EGFを反応させて1分子蛍光分析装置によりFIDA解析を行なうと、1分子あたりの蛍光強度が大きくなり、蛍光標識EGFと膜分画が相互作用していることがわかる。しかし2量体を形成していることのを確認することはできなかった。
【００１１】
たとえば、細胞内のオルガネラの膜上で受容体とリガンドが反応するときに、受容体の種類によっては、上述のEGFRのようにリガンドが受容体と結合すると多量体を形成する場合がある。また、膜上に存在するタンパク質が遊離したり会合したりする場合がある。つまり、蛍光強度からでは、受容体とリガンドが1対1で反応しているのか、受容体とリガンドの反応後に、受容体の構造変化が起こったり、または受容体同士の会合が起こっているのか、といった判断は困難であった。
【００１２】
したがって、細胞機能の解析においては、膜分画上の膜タンパク質とリガンドの相互作用を検出した後、膜タンパク質同士の相互作用や構造変化を高精度で検出する方法が求められていた。
【００１３】
また、分子同士の会合や相互作用の検出方法として、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が挙げられる（非特許文献2）。これは、分子をそれぞれ分光特性の異なる複数の蛍光物質で標識し、蛍光分子同士の距離が非常に近づいたとき生じる蛍光分子間の蛍光エネルギーの移動を観測する手法である。FRETでは、2種類の分光特性の異なる蛍光物質を使用する。蛍光エネルギーを与える蛍光物質（ドナー）とそのエネルギーを励起エネルギーとして受け取る蛍光物質（アクセプター）を用いる。蛍光共鳴エネルギー遷移は、２つの蛍光分子がお互いに混合して相互作用し、１つの吸収波長が他方の放射波長と重複する場合に観測される。エネルギー遷移の効率は、ｒ-6に比例する。ここでｒは、２つの蛍光分子間の平均間隔である。それ故、２つの分子間の相互作用や相互の親和性が増大すると、エネルギー遷移現象が増強され、その結果アクセプターからの蛍光発光が増大することとなる。従来のFRETの検出は、相互作用する分子をそれぞれの蛍光物質にて標識し、ｍMオーダーの濃度で使用して蛍光分光光度計や蛍光顕微鏡によって観測されていた。しかし、これらの手法では、検出される分子数が多いので、検出される信号は平均的なものとなり、たとえば多くの分子の中でごくわずかな分子の反応が起こった場合は、エネルギー遷移にいよる蛍光シグナルが、反応の起こっていない多数の分子の蛍光シグナルに埋もれてしまうため、わずかな反応を検出することは困難であった。そのため個々の分子がどのような動きをしているか、または観測している領域において相互作用している分子がどれくらいの割合で存在しているかなどの定量的な評価を行うことはできなかった。
【特許文献１】特表2002-5434142号公報
【非特許文献１】Oliver Meissner and Hanns Haberlein、“Biochemistry”、2003年、42巻、p.1667-1672
【非特許文献２】Theodorus W. J. Gadella, Jr. and Thomas M. Jovin、“The Journal of Cell Biology”、1995年、129巻、p.1543-1558
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記事情に鑑み、本発明の目的は、分子の相互作用を精密に測定することが可能な1分子蛍光分析の方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するために、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いた一分子蛍光解析する技術を考案した。
【００１６】
すなわち、本発明は、試料Aと試料Bの会合または相互作用を検出するための蛍光分光分析の方法であって、蛍光標識された試料Aと、該試料Aに標識した蛍光物質の蛍光エネルギーを励起エネルギーとするような蛍光物質で蛍光標識された試料Bとを接触させる工程と、前記試料Aに標識した蛍光物質を励起する波長の光を照射する工程と、前記試料Aと前記試料Bに標識した蛍光物質から発生する蛍光を検出する工程と、前記検出した蛍光に基づいて蛍光相関分光法または蛍光強度分布解析を行い、前記試料Aと前記試料Bとの反応変化の過程を検出する工程とを含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は、試料Aと試料Bと試料Cの会合または相互作用を検出するための蛍光分光分析の方法であって、上記方法において、前記蛍光標識された試料Aと、該試料Aに標識した蛍光物質の蛍光エネルギーを励起エネルギーとするような蛍光物質で蛍光標識された試料Bと、試料Cを接触させる工程と、前記試料Aに標識した蛍光物質を励起する波長の光を照射する工程と、前記試料Aと前記試料Bに標識した蛍光物質から発生する蛍光を検出する工程と、前記検出した蛍光に基づいて蛍光相関分光法または蛍光強度分布解析を行い、前記試料A、前記試料B、および前記試料Cの反応変化の過程を検出する工程とを含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、上記方法であって、前記蛍光標識された試料Aと、該試料Aに標識した蛍光物質の蛍光エネルギーを励起エネルギーとするような蛍光物質で蛍光標識された試料Bと、さらに前記試料Bに標識した蛍光物質の蛍光エネルギーを励起エネルギーとするような蛍光物質で蛍光標識された試料Cとを接触させる工程と、前記試料Aに標識した蛍光物質を励起する波長の光を照射する工程と、前記試料A、前記試料B、および試料Cに標識した蛍光物質から発生する蛍光を検出する工程と、前記検出した蛍光に基づいて蛍光相関分光法または蛍光強度分布解析を行い、前記試料A、前記試料B、および前記試料Cの反応変化の過程を検出する工程とを含むこと特徴とする方法を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は、試料における構造変化または分子内ドメインの会合状態を検出するための蛍光分光分析の方法であって、第1の蛍光物質と、該第1の蛍光物質の蛍光エネルギーを励起エネルギーとするような第2の蛍光物質の両方で蛍光標識しされた試料に対し、前記第1の蛍光物質を励起する波長の光を照射する工程と、前記第1の蛍光物質と、前記第2の蛍光物質から発生する蛍光を検出する工程と、前記検出した蛍光に基づいて蛍光相関分光法または蛍光強度分布解析を行い、前記試料の構造変化もしくは分子内ドメインの会合状態を検出する工程とを含むことを特徴とする方法を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、多量体形成の有無、分子の結合や解離、分子の構造変化、および分子内ドメインの会合状態を容易に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
ここでは、複数種類の異なった分光特性を有する蛍光物質に蛍光色素を使用し、それぞれの蛍光色素で標識された異なる分子間の相互作用を検出するために、FCSやFIDA等の1分子蛍光分析を利用する。
【００２２】
分子の相互作用の解析について問題となるのは、複数の分子が相互作用する順番や、相互作用する際に関与する分子の構造の場所、あるいは分子構造がどのように変化するのかということである。本発明は、このような分子間の微細な相互作用を計測するために、1分子蛍光分光計測を行う装置を使用して、蛍光色素のFRETを利用した計測を行う。FCSやFIDA等の1分子蛍光分析では、蛍光標識された分子からの蛍光情報を1分子レベルで解析することができるので、微小領域の反応を検出でき、反応していない多数の分子の蛍光シグナルを検出してしまうことがない。
【００２３】
以下、本発明の1つの態様を例に具体的に説明する。
【００２４】
本発明の1つの態様は、試料Aと試料Bの会合または相互作用を検出するための蛍光分光分析の方法であって、第1の工程は、蛍光標識された試料Aと、該試料Aに標識した蛍光物質の蛍光エネルギーを励起エネルギーとするような蛍光物質で蛍光標識された試料Bとを接触させる工程である。
【００２５】
試料Aと試料Bは、相互作用を検出したい試料対である。本明細書においての「試料」の語は、生物個体から採取した細胞、組織、臓器、血液、血清、リンパ液、組織、毛髪および耳垢などの生物試料を所望に応じて調製した試料や、人工的に合成または製造した物質を含む試験に供したい試料、特に単離された分子および遺伝子組換えタンパク質を含む。また、「試料」は必要に応じて、生物試料をホモジネートおよび抽出などの必要な任意の前処理を行って得た試料であってもよく、単離されていない膜分画に組み込まれた状態の分子、たとえば、細胞膜に固定されたタンパク質などの試料であってもよい。このような試料は、当業者であれば、対象となる試料に応じてによって容易に取得することができるであろう。本明細書において使用される「個体」の語は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、及びサルを含む任意の哺乳動物、並びに植物および昆虫など哺乳動物以外の生物を含む。
【００２６】
上記試料においてFRETの検出を行うために、試料AおよびBを、第1の蛍光物質の発光波長の光により第2の蛍光物質ロが励起されて、該第1の蛍光物質の発光波長とは別の波長の光が発光する蛍光共鳴エネルギー移動が起こる蛍光物質対で標識しておく。
【００２７】
本発明において標識として使用できる蛍光物質は、当業者に既知のいずれの蛍光物質であってもよいが、種々の蛍光色素や希土類元素等を含有した蛍光ガラス粒子、蛍光タンパク質を用いることができる。また、検出対象の試料に蛍光標識をするための方法は、当業者に既知のいずれの手段を使用して行うこともでき、GFP、CFP、YFP等の蛍光タンパク質が、検出対象の試料に融合タンパク質として発現するように遺伝子導入等を行うことも、本発明における標識に含まれる。たとえば試料AとBの間の反応を検出する場合には、試料AをFITC、試料Bをテトラメチルローダミンで、または試料AをCFP、試料BをGFPで標識しておけばよい。
【００２８】
次いで、試料Aおよび試料Bを接触させる。たとえば、両試料を含む溶液を混合し、適切な条件下において反応させることにより接触させればよい。このような条件は、以下の実施例に示したとおり、当業者であれば容易に選択できるであろう。
【００２９】
次いで、試料Aに標識した蛍光物質を励起する波長の光を照射する。たとえば、試料AをFITCで標識している場合は、試料に488nmの波長の光を照射することによってFITCを励起する。また、蛍光物質対としてCFPとGFPを使用した場合は、450nmの波長の光を照射してCFPを励起させる。
【００３０】
次いで、試料Aと試料Bに標識した蛍光物質から発生する蛍光を検出する（図1の右を参照されたい）。励起された標識蛍光物質からの蛍光シグナルは、ダイクロイックミラーを用いて量標識の蛍光を分離して検出することが好ましい。たとえば、FITCの蛍光とテトラメチルローダミンの蛍光に分離して検出される。ここで、試料Aと試料Bが相互作用せずに独立して試料中に存在するならFITCの蛍光のみが検出される。また、試料AとBが反応して分子間の距離が近接しているならば、FITCの蛍光エネルギーがテトラメチルローダミンに移動するFRETにより、テトラメチルローダミンの蛍光シグナルが検出される。
【００３１】
検出に用いることができる光学系は、たとえば、蛍光検出のための検出器、検出器に蛍光シグナルを分けて入力するためのダイクロイックミラーもしくは特定の分光特性をもちある波長幅ごとに光を透過することのできる分光素子を追加した光学系である。蛍光物質を励起する光源は、レーザなどであってもよく、波長は紫外から可視、赤外までのどの波長であってもよい。励起光は、対物レンズを介して絞り込まれ試料に照射される。蛍光物質からの蛍光は、集光レンズによって集められ、ピンホールによってノイズを除去する。蛍光は、ダイクロイックミラーによってまず２つの波長領域に分けられる。分けられた蛍光は光学フィルターを透過することによって特定の波長の蛍光のみを取り出す。この蛍光は検出器によって検出し、信号解析を行う。もう1つの光は次におかれたダイクロイックミラーによってさらに2つの波長域に分けられる。2つに分けられた蛍光はそれぞれの波長を取り出すフィルターを通過し検出器によって検出される。
【００３２】
次いで、検出した蛍光に基づいて蛍光相関分光法または蛍光強度分布解析を行い、試料Aと試料Bとの反応変化の過程を検出する。
【００３３】
検出された蛍光信号は、蛍光の明るさについて分布解析を行うことにより、1分子あたりの蛍光の明るさを情報として得ることができる。また蛍光信号について自己相関関数解析を行い共焦点領域に蛍光分子が滞在する時間（並進拡散時間）を算出する。さらに、波長の異なるレーザを用い複数の蛍光物質をそれぞれの波長で同時に励起し同時に各蛍光物質の蛍光シグナルを分離して得ることにより蛍光の相互相関解析を行ない異なる試料の相互作用の有無そして存在する蛍光分子のうち相互作用している分子割合を知ることができる。たとえば、上記解析の結果、試料Aと試料Bが会合している場合は、試料Aまたは試料Bが単独で存在している場合よりも、蛍光相関分光法による並進拡散時間が長くなる。
【００３４】
このように、拡散定数や蛍光相互相関分析とFRETを同時に測定することにより、反応の状態をより高精度に検出することが可能となる。
【００３５】
試料の反応の時間変化について、時間的空間的に制御することで、相互作用する試料の結合の強さだけでなく、さらに結合の早さや解離の早さなどの情報も得ることが可能となる。また、細胞計測において、目的の場所のみを蛍光標識し、目的の試料の拡散や移動の状態を調べることも可能となる。
【００３６】
上記方法において使用する蛍光物質の励起、蛍光の検出、およびFCS／FIDAによる解析等は、市販の1分子蛍光分析システム、たとえばMS20/10S装置（オリンパス株式会社）を使用して行うことができる。
【００３７】
本発明のもう1つの態様において、試料Aと試料Bと試料Cの会合または相互作用を検出するための蛍光分光分析の方法であって、上記方法において、蛍光標識された試料Aと、該試料Aに標識した蛍光物質の蛍光エネルギーを励起エネルギーとするような蛍光物質で蛍光標識された試料Bと、試料Cを接触させる工程と、試料Aに標識した蛍光物質を励起する波長の光を照射する工程と、試料Aと試料Bに標識した蛍光物質から発生する蛍光を検出する工程と、検出した蛍光に基づいて蛍光相関分光法または蛍光強度分布解析を行い、試料A、試料B、および試料Cの反応変化の過程を検出する方法を提供する。本方法により、試料A、試料B、および試料Cの会合または相互作用を検出してもよいが、試料Aと試料Bの会合または相互作用に対する試料Cの影響を検出してもよく、たとえば両試料の阻害および増強などが含まれる。
【００３８】
たとえば、試料Cが試料Aと試料Bの相互作用を阻害する物質の場合、試料Cが存在することにより、試料Aと試料Bの相互作用が阻害される。試料Cが存在しないときは、試料Aと試料Bが相互作用すると考えられる。従って、試料Aの蛍光物質を励起すると、試料Aの蛍光物質から試料Bの蛍光物質へのFRETが観察され、その結果、試料Aからの蛍光はほとんど観測されないが、試料Bからの蛍光が観察されると考えられる。一方、試料Cが存在するときは、試料Cの濃度に依存して試料Aと試料Bの相互作用が阻害されると考えられる。その結果、試料Aの蛍光物質を励起してもFRETは観察されず、試料Aのみの蛍光が観察されると考えられる。
【００３９】
このように、試料Aと試料Bの会合または相互作用に対する試料Cの影響を検出することができる。
【００４０】
本発明のもう1つの態様において、蛍光標識された試料Aと、該試料Aに標識した蛍光物質の蛍光エネルギーを励起エネルギーとするような蛍光物質で蛍光標識された試料Bと、さらに試料Bに標識した蛍光物質の蛍光エネルギーを励起エネルギーとするような蛍光物質で蛍光標識された試料Cとを接触させる工程と、試料Aに標識した蛍光物質を励起する波長の光を照射する工程と、試料A、試料B、および試料Cに標識した蛍光物質から発生する蛍光を検出する工程と、検出した蛍光に基づいて蛍光相関分光法または蛍光強度分布解析を行い、試料A、試料B、および試料Cの反応変化の過程を検出する工程とを含むこと特徴とする方法を提供する。
【００４１】
たとえば、試料AをCFPで、試料BをGFPで、試料CをYFPで蛍光標識をしておく。ここで、YFPおよびGFPは、CFPの蛍光エネルギーを励起エネルギーとするような蛍光物質であり、各試料がCFPとYFPまたはGFPとの間でFRETが生じるような距離に存在する場合は、CFPを励起するとYFPまたはGFPが発光することとなる。
【００４２】
次いで、CFPを450nmの波長の光で励起し、上記と同様に各蛍光物質から発生する蛍光を検出し、蛍光相関分光法または蛍光強度分布解析を行い、各試料間の反応変化の過程を検出する。その結果、CFPとYFPおよび／またはGFPとが相互作用している場合は、CFPの蛍光がほとんど観測されずにYFPおよび／またはGFPの蛍光のみが観察され、相互作用してない場合は、CFPのみの蛍光が観察されると考えられる。
【００４３】
このように種々の蛍光物質を組み合わせて、複数の試料を種々の蛍光物質で標識することにより、複数の試料についての会合または相互作用を検出することができる。また、たとえば、試料Aと、試料Aに標識した蛍光物質の蛍光エネルギーを励起エネルギーとするような蛍光物質で蛍光標識された試料Bと、試料Bに標識した蛍光物質の蛍光エネルギーを励起エネルギーとするような蛍光物質で蛍光標識された試料Cとを使用して同様の方法を行えば、試料A、B、およびCの全てが近接して存在する場合のみ、試料Cからの蛍光を検出することができる。
【００４４】
また、上記方法によれば、上記試料A、試料B、および試料Cが同時に会合する場合だけでなく、それぞれをの会合状態を経時的に検出することもできる。たとえば、試料A、試料B、および試料Cにおいて、試料Aおよび試料Bがカルシウムの存在下でのみ会合し、かつ両分子が会合した場合にのみさらに試料Cが会合する場合を想定する。まず、反応系において試料Aおよび試料Bおよび試料Cを混合する。これらの分子は、カルシウムの不存在下では会合しないため、このとき試料Aに標識した蛍光物質を励起すると該蛍光物質のみに由来する蛍光が検出される。次いで、反応系にカルシウムを添加すると試料Aおよび試料Bが会合することとなる。ここで試料Aに標識した蛍光物質を励起すると、試料Aの蛍光物質から試料Bの蛍光物質へのFRETが観察され、その結果、試料Aからの蛍光はほとんど観測されないが、試料Bからの蛍光が観察される。また、FCS解析により試料Aの蛍光から算出した並進拡散時間よりも試料Bの蛍光から算出した並進拡散時間は長くなることが観察される。試料Cは、試料Aおよび試料Bが会合して初めて反応が起こり、次第に試料Bの蛍光物質から試料Cの蛍光物質へのFRETが観察され、その結果、試料Bからの蛍光が減少し、試料Cからの蛍光が観察される。また、FCS解析により試料Bの蛍光から算出した並進拡散時間よりも試料Cの蛍光から算出した並進拡散時間は長くなることが観察される。一方、試料中に試料Bが存在しない場合は、いずれの試料同士も会合しないため、試料Aに標識した蛍光物質を励起しても試料Aの蛍光物質に由来する蛍光のみしか検出されない。
【００４５】
さらに、標識された試料の数は、上記のものに限定されず、必要であれば、試料の種類に対応してさらに増加させることもできる。
【００４６】
このように、本発明によって、複数の分子について拡散定数や蛍光相互相関分析とFRETを同時に測定することにより、複数の分子の反応の状態をより高精度に検出することが可能となる。
【００４７】
上記方法では試料Aと試料Bとの会合、および結合や解離などの2分子以上の会合または相互作用を検出したが、本発明のもう1つの態様において、分子内の構造変化または分子内ドメインの会合状態を検出するための蛍光分光分析の方法であって、第1の蛍光物質と、該第1の蛍光物質の蛍光エネルギーを励起エネルギーとするような第2の蛍光物質の両方で蛍光標識された試料に対し、前記第1の蛍光物質を励起する波長の光を照射する工程と、前記第1の蛍光物質と、前記第2の蛍光物質から発生する蛍光を検出する工程と、前記検出した蛍光に基づいて蛍光相関分光法または蛍光強度分布解析を行い、前記試料の構造変化もしくは分子内ドメインの会合状態を検出する工程とを含むことを特徴とする方法を提供する。
【００４８】
たとえば、単一の分子において、ある条件下では近接して存在するが、別の条件下では立体構造が変化して離れた位置に存在するような、第1の領域および第2の領域に、それぞれ第1の蛍光物質および第2の蛍光物質で標識しておく。このような分子の第1の領域と第2の領域が近接するような条件下では、これらの領域の蛍光物質が近接すると考えられる。従って、このような条件下において第1の蛍光物質を励起する波長の光を試料に照射すると、第1の蛍光物質から第2の蛍光物質へのFRETが観察され、その結果、第1の蛍光物質からの蛍光はほとんど観測されないが、第2の蛍光物質からの蛍光が観察されると考えられる。
【００４９】
このように、単一分子の構造変化または分子内ドメインの会合状態を、蛍光分光分析によって検出することができる。
【実施例１】
【００５０】
膜分画とリガンドの反応の検出について、具体例として上皮細胞増殖因子受容体（EGFR）を考える。EGFRは、リガンドであるEGFと結合すると2量体を形成する。EGFRが2量体となることで細胞内に刺激が伝わり反応が起こる。たとえば、実験において、EGFRが多く発現しているヒト培養細胞A431を用い、この細胞を低張液処理の後、ホモジナイザーでEGFRを発現している膜分画を調整する。次いで、FITCで蛍光標識したEGF（epidermal growth factor, fluorescein conjugate , Molecular Probes社E-3481)、およびテトラメチルローダミン標識したEGF （epidermal growth factor, tetramethylrhodamine conjugate ,Molecular Probes社 E-3478)を同時に添加して、EGFRとの反応をFIDA−FRET解析を用いて観測する。この場合、試料の励起は、FITCを励起する488nmの波長の光で行なう。次いで、蛍光の検出は、上述したとおりに、FITCとテトラメチルローダミンのそれぞれの蛍光を分離して検出する。検出されるFITCの蛍光とテトラメチルローダミンの蛍光強度の比は、膜分画の存在によって小さくなり、FRETが観測されると考えられる。このとき、図１に示す反応が起こっていると考えられる。すなわち、上記FITCで蛍光標識したEGFおよびテトラメチルローダミン標識したEGFは、蛍光標識のみが異なるのでEGFRに対して競合反応を生じる。従って、多量体を形成してもFITC標識されたEGFのみの2量体、テトラメチルローダミン標識されたEGFのみの2量体も生成するが、一定の確率（おそらく50％程度）でFITC標識されたEGFとテトラメチルローダミン標識されたEGFの2量体が生成すると考えられる。この場合は、励起されたFITCによってテトラメチルローダミンからの蛍光発光が増大されるため、この蛍光を検出することにより多量体形成を検出することができる。1分子あたりの蛍光強度を測定できるFIDA−FRETにより、多量体生成の有無を正確に観察することは可能である。
【００５１】
次に、またEGFRと蛍光標識EGFとの反応の阻害状態を確認するために、上記実験においてさらにEGFRに対する抗体（Santa Cruz社）添加した実験を行い、この濃度を変化させてたときに得られるであろう結果を示す(図２)。図2に示したように、反応系における阻害剤の濃度が低いときには、テトラメチルローダミン（四角）の蛍光強度が高く、阻害剤の濃度が高いときには、低くなった（菱形）。このように、蛍光相関分光法または蛍光強度分布解析などの蛍光のゆらぎ解析を使用してFRETを観測することにより、分子の会合が起こっているかどうかの検出が可能であると考えられる。
【実施例２】
【００５２】
分子間相互作用の検出
実験例として、トロポニン、トロポミオシン、アクチンの相互作用を解析を行う場合について述べる。トロポニンをローダミングリーンで、トロポミオシンをテトラメチルローダミンで、およびアクチンをCy5で蛍光標識した。トロポニン、トロポミオシン、およびアクチンは、ウサギ骨格筋から抽出、精製し、蛍光標識を行う。
【００５３】
まず、標識したトロポニン、トロポミオシン、およびアクチンを混合する。次いで、ローダミングリーンが励起される488nmのレーザ光を照射し、ローダミングリーン、テトラメチルローダミン、およびCY5の蛍光のゆらぎを検出してFCS解析を行なう。たとえば、図3上段(a)に示したように、ローダミングリーンからの蛍光が観察されると考えられる。次に、これらの分子間の反応開始剤となる塩化カルシウム水溶液を添加して混合後に、488nmのレーザ光を照射し、FCS解析を行なう。たとえば、図3上段(b)に示したように、ローダミングリーンからの蛍光が減少し、テトラメチルローダミンからの蛍光が新たに観察されると考えられる。ローダミングリーンからの蛍光より算出した並進拡散時間よりも、テトラメチルローダミンからの蛍光より算出した並進拡散時間は長くなる。この現象は、トロポニンとトロポミオシンの相互作用により、それぞれの分子に標識している蛍光色素の距離が近くなり、蛍光色素間でFRETが起こることによってテトラメチルローダミンの信号が検出され、さらに分子が結合して並進拡散時間が長くなると考えられる。さらに、一定時間経過後は、図3上段(c)に示されたようにローダミングリーンからの蛍光が更に減少し、テトラメチルローダミンからの蛍光が減少し、新たにCy5からの蛍光が観察されると考えられる。また、ローダミングリーンからの蛍光より算出した並進拡散時間よりも、テトラメチルローダミンからの蛍光より算出した並進拡散時間は長く、Cy5からの蛍光より算出した並進拡散時間はさらに長くなると考えられる。この現象は、3つの分子の相互作用が生じた結合、それぞれの標識された分子の蛍光色素の距離が近くなり、3つの蛍光色素間でFRETが生じるためであると考えられる。したがって、反応が生じるためには、カルシウムイオンの存在が必要であること、反応が生じる順番は、トロポニン、トロポミオシン、アクチンの順番であることが明らかとなるであろう。さらに、FRETが生じることを検出できれば、標識されたローダミングリーンとテトラメチルローダミンの距離、テトラメチルローダミンとCy5の距離は、FRETが生じる距離（約10nm）の範囲内であることが明らかとなる。
【００５４】
例えば、トロポニン−アクチン−トロポミオシンの順番で相互作用するならば、FRETは起こらず、ローダミングリーンの信号しか得られない。また、並進拡散時間からもこれらが反応していないことがわかる。
【００５５】
分子の相互作用は起こっていても、分子を標識している蛍光色素間の距離についてFRETが起こるような距離（約10nm）に達しない場合でも、FCS解析による拡散速度より反応したか否かを評価することが可能である。また、それぞれの蛍光色素を励起する2種類のレーザを用いて同時に励起し得られる蛍光シグナルについて相互相関解析を行ない相互作用している分子とそうでない分子の割合を算出することも可能である。これらの計測から分子の相互作用に関する種々の知見を得ることが可能である。
【００５６】
このように、複数の分子相互作用の反応の順番や分子への標識する場所を工夫することによって生成した分子の構造や分子間の相互作用する場所についての知見を得ることができる。
【実施例３】
【００５７】
分子の解離を検出する例を挙げる。
【００５８】
例として、膜上に存在するGタンパク質の解離の検出がある。Gタンパク質は、同じ膜に存在する膜タンパク質のGタンパク質結合受容体（GPCR：G  Protein Coupled Receptor）がリガンドと結合すると、それをトリガーとして3つのサブユニットからなる3量体のうち1つのサブユニット（αサブユニット）が遊離し、細胞内に刺激を伝達する。たとえば、分子生物学的にこのGタンパク質の各サブユニットをFRETが生じるような異なる蛍光タンパク質にて標識する。GPCRとして、たとえばアンジオテンシン受容体（angiotensin Receptor）を使用する。具体的には、アンジオテンシン受容体が発現している培養細胞（たとえば、CHO-K1細胞）を使用する。次いで、この細胞に対して遺伝子導入を行いGタンパク質結合受容体が発現する際に各サブユニット（α、β、γ）のそれぞれに分光特性の異なる蛍光タンパク質が発現するように遺伝子を導入する。たとえば、αサブユニットにはCFP、βサブユニットにはGFP、γサブユニットにはYFPが発現するようにする。実験で使用するGPCRおよびGタンパク質は、細胞を低張液処理およびホモジナイザーにより破砕して膜分画として使用する。
【００５９】
膜分画中のGPCRが活性化されないときは、Gタンパク質は、α、β、およびγサブユニットが3量体を形成していると考えられる。次いで、αサブユニットを標識しているCFPを450nmの波長で励起する（GFPは、この波長によって励起される）。次いで、CFPの蛍光、GFPの蛍光、およびYFPの蛍光を観測すると３つの蛍光タンパク質から蛍光のが観測される。CFPとGFPまたはYFPとの間でFRETが生じると考えられる。膜分画溶液に、リガンドであるアンジオテンシンを添加し、GPCRを活性化させるとGタンパク質のαサブユニットが遊離する。450nmの波長でCFPを励起し（CFPは、この波長によって励起される）、各蛍光タンパク質の蛍光を観測すると、CFPの蛍光強度が高く、その他の蛍光タンパク質からの蛍光は、ほとんど観測されないと考えられる。この現象は、FRETが起こらずにαサブユニットの蛍光のみが観測されるめに生じる。図4に、解離反応のモデルを示した。たとえば、図4上段のようにGPCRがリガンドと結合していない状態では、GPCRは活性化されていないため、Gタンパク質のサブユニットの全てが会合していると考えられる。ここでCFPに450nmの波長の励起光を照射すると、CFPから蛍光エネルギー移動が生じ、結果としてYFPの蛍光が観測されると考えられる。次に、リガンドであるアンジオテンシンを添加すると、GPCRがリガンドと結合して活性化され、Gタンパク質のαサブユニットが解離する。ここでCFPに450nmの波長の励起光を照射しても蛍光エネルギー移動は起こらないため、CFPの蛍光が観測され、蛍光相関分光法によると並進拡散時間も短くなり、αサブユニットが解離したことが明確に観測されると考えられる。さらにGFPを励起する波長の光を照射して測定を行うと、YFPの蛍光が観測され、蛍光相関分光法による並進拡散時間は、α、β、γサブユニットが結合していたときよりも短くなり、γサブユニット単体での並進拡散時間よりも長い。従って、αサブユニットは解離し、βとγサブユニットは結合している状態であることが明確に分かる（図4下段）。このようにして、FRETを用いて分子の解離を検出することも可能である。
【実施例４】
【００６０】
分子内の構造変化の検出（請求項４に対応）
カルシウムイオンの濃度変化によってトロポニンが筋タンパク質と相互作用したときの、構造変化についての知見を得ることも可能である。
【００６１】
たとえば、分子生物学的な手法を用い、トロポニンの発現に際して構造変化すると考えられる部位に蛍光タンパク質を発現させる。トロポニンの立体構造におけるTnT1部位にGFPを、またC-TnT部位にRFPをそれぞれ発現させる。まず、GFPを励起する波長の光を照射すると、図5の左のようにGFPからの蛍光が多く観測されると考えられる。次に、カルシウムイオンを添加した後にFIDA解析を行なってFRETを観測するすると、トロポニン分子の立体構造が変化し、TnT1部位とC-TnT部位の 2つの部位が非常に近接した状態となることが知られている。したがって、図5の左のように、RFPの蛍光強度が増加し、GFPの蛍光強度が低くなると考えられる。このようにして、立体構造変化が起こっているか否かを知ることができる。
【００６２】
さらに、トロポニンと反応するトロポミオシンを添加してFCS解析を行なって、添加前と添加後において算出した並進拡散時間を比較することにより、両分子の相互作用の有無を確認することができる。図6上段は、カルシウム添加前、図6下段は、カルシウム添加後のFCSの計測結果である。このように、カルシウムを添加するとRFPの蛍光強度の上昇が観察され、またトロポミオシンを添加したときのRFPの蛍光シグナルをFCS解析することによって算出される並進拡散時間が、上昇することを観察することができる。
【００６３】
コントロールとして、カルシウムを添加しないトロポニンにトロポミオシンを添加すると、GFPの蛍光が観測され、またFCS解析を行なうことによって算出される並進拡散時間もトロポニンそのものの拡散時間を示すと考えられる。
【００６４】
このような手法を用いて、分子内構造変化による他分子との相互作用を検出することも可能である。たとえば、カルモジュリンとカルモジュリン結合タンパク質の反応を例に挙げる。カルモジュリンは、カルシウムイオンと結合するを活性化され構造を大きく変える特性をもつ。これをトリガーとしてカルモジュリン結合タンパク質がカルモジュリンと結合し刺激が伝わる。この際に、カルモジュリンに異なる蛍光色素を用いて標識し、さらにカルモジュリン結合タンパク質にFRETが生じるような蛍光色素で標識すればFRETをもちいて分子の相互作用の検出が可能となる。
【実施例５】
【００６５】
分子間相互作用の際に関与する分子構造（分子間の距離）に関する解析
分子間相互作用は、分子のある特異的な部位が近接して相互作用することによって起こる。したがって、これらの分子の相互作用をFRETによって検出するためには、所与の分子において結合部位の解析を行なう際に、相互作用するそれぞれの分子の結合部位の近傍に蛍光標識を行なえばよい。
【００６６】
両分子の結合部位同士が相互作用し、両者が非常に近接した場合にはFRETが起こると考えられ、この蛍光発光を測定することによって分子の相互作用を検出することができる。
【００６７】
。このFRETの効率は、ドナーとアクセプターの距離ｒの６乗に反比例することが明らかとなっている。FIDA解析では、1分子あたりの蛍光強度についての情報を得ることができるため、両分子に由来するそれぞれの波長の蛍光色素の強度比からFRET効率を算出し、両分子間の距離に換算することが可能である。このとき、並進核酸時間を算出すると分子の解離によりFRETが起こらなくなったのか、構造変化により起こらなくなったのかを明確に区別することが可能となる。
【００６８】
たとえば、分子間相互作用の解析のために、分子毎にその結合部位をいくつか予測して行なう場合を想定すると、それぞれの結合部位に対して蛍光標識を行い、FIDA解析によってFRETの有無を確認する。また、蛍光強度の比を算出し、さらにFCS解析において共焦点領域に滞在する時間を解析することにより、解離や結合が起こったかどうか等の分子の相互作用を確認することができる。また、上記の通り、蛍光強度の比から分子同士の近接度合いを知ることも可能である。すなわちFRETが起こっているが、以上2つのデータから、相互作用が起こっているかの確認および、目的の結合部位との相互作用の有無さらには相互作用している分子間の距離を知ることができる。図8には、ドナー−アクセプター間の距離とFRET効率について、得られると想定される結果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明の方法による上皮細胞増殖因子受容体とそのリガンドとの相互作用の検出を示す模式図。
【図２】EGF阻害剤濃度による蛍光強度変化（Ｑ＝任意単位）を示す模式図。
【図３】本発明の方法によって検出される分子間相互作用の一例（Ｑ＝任意単位）を示す図。
【図４】本発明の方法によって検出される分子間相互作用の一例を示す図。
【図５】本発明の方法によるGタンパク質受容体群の相互作用の検出（Ｑ＝任意単位）を示す模式図。
【図６】本発明の方法による分子内構造変化の検出を示す模式図。
【図７】本発明の方法によって検出される分子間相互作用の一例を示す図。
【符号の説明】
【００７０】
1、8・・・膜分画
2、9・・・EGFR
3・・・FITC標識EGF
4・・・TRITC標識EGF
5・・・Ch1（ローダミングリーン−トロポニン）
6・・・Ch2（TAMRA−トロポミオシン）
7・・・Ch3（Cy5−アクチン）
10・・・Gタンパク質DNAプローブ
11・・・CFP
12・・・GFP
13・・・YFP
14・・・リガンド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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