(57)【要約】【課題】複数のハイブリダイゼーション用の試料を自動的に処理する自動化装置を提供する。【解決手段】複数の試料を同時に保持することができるボトルと、該ボトルが配置されるチャンバーの温度を調節するチャンバー温度調節部と、該ボトルに試薬を分注する吸引ノズルと、該試薬の温度を調節する試薬温度調節部とを備える。この自動化装置により、実質的に同時に複数の試料をハイブリダイゼーション法により処理し、検出することが可能となる。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリダイゼーション法に用いる多数の試料を実質的に同時に同法により検出する自動化装置であって、
前記多数の試料を保持して処理するボトルと、
該ボトルが配置されるチャンバー内の温度を調節するチャンバー温度調節部と、
該ボトルに試薬を分注する吸引ノズルと、
該試薬の温度を調節する試薬温度調節部と、を備える自動化装置。
【請求項２】
前記試薬温度調節部により前記試薬に含まれるプローブを予め加熱・急冷することにより１本鎖ＤＮＡとして当該ハイブリダイゼーション法に用いる請求項１記載の自動化装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コロニーハイブリダイゼーション法を自動化する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食品や飲料等の製品、あるいは生活空間等の環境中における有害菌の存在が注目されている。有害菌の発生源を同定する方法としては、発生源と思われる場所から得られたサンプルをＰＣＲ法やコロニーハイブリダイゼーション法で処理し、その場所における有害菌の存在の有無を調べて行なうものが一般的である。
【０００３】
ＰＣＲ法は、ＤＮＡの目的とする一部分のみを大幅に増幅させる方法である。一方、コロニーハイブリダイゼーション法は、プラスミドベクターによって作製したｃＤＮＡライブラリーなどから目的とするクローンを選び出す方法である。このハイブリダイゼーション法では、プレート上に生育させた菌体をフィルター上に移し、溶菌させることによって抽出したＤＮＡをそのままフィルター上に固定化したものに対して行なう。例えば、寒天培地上のコロニー（１個の細菌に由来する均一な集団）に、アイソトープなどでラベルしたプローブ（検出子）をハイブリダイズさせることによって、目的遺伝子コロニーを検出する。
【０００４】
具体的には、コロニーを形成したプレートに、ナイロン膜を接着させてコロニーをフィルターに移行させる。フィルターを平板培地に裏返しに置いて、数時間以上培養することにより、コロニーをナイロン膜に確実に増殖させることもできる。あるいは、既にコロニーを形成させたプレートに、ナイロン膜を接着させることにより、コロニーをナイロン膜に付着させることができる。コロニーを付着させたナイロン膜は、菌の残渣を除去し、ＤＮＡをナイロン膜に固定する必要がある。例えば、ナイロン膜を用いた場合は、アルカリ溶液を作用させて、ＤＮＡを一本鎖に変性し、中和した後、標識したＤＮＡもしくはＲＮＡプローブとハイブリッド形成させる。このフィルターをオートラジオグラフィー蛍光色素法あるいは酵素発色法などにかけ、目的のＤＮＡ断片を取り込んだコロニーを検出する。多くのコロニーの中からプローブと結合しうるクローンを素早く選び出すことができる方法である。菌種によっては、アルカリ処理の前にリゾチームやプロテアーゼ処理等をする溶菌工程を加える必要がある場合もある。
【０００５】
対象となるサンプル中の目的菌の数が極めて少なかった場合や、毒素により菌が死滅している場合では、ＰＣＲ法によって目的菌の存在を検出できたとしても、その菌の単離は困難であるところ、コロニーハイブリダイゼーション法によれば、このような場合でも目的菌を単離することが可能である。また、サンプル中の数千に及ぶ数の菌を一度に検定して、目的菌の存否を推定できるというより有利な特徴を有している。
【０００６】
ハイブリダイゼーションは、様々な方法があるが、以下に典型的な方法を記載する。核酸を固定化した膜（ナイロン膜が多い）を、プレハイブリダイゼーション溶液に入れる。プレハイブリダイゼーション用の溶液は方法によって様々であるが、一例としては、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．０９Ｍ  クエン酸ナトリウム）、５×デンハルト溶液（０．１％  牛血清アルブミン、０．１％  フィコール、０．１％  ポリビニルピロリドン）、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液からなるものがある。プレハイブリダイゼーションは、一例として、６５℃で1時間程度行なうことができる。プレハイブリダイゼーションの終了後、ハイブリダイゼーションを行なってよい。ハイブリダイゼーション溶液は、プレハイブリダイゼーション溶液と同じであることが通常である。条件は、一例として、６５℃、一昼夜で行なう。ハイブリダイゼーション溶液には、標識したＤＮＡ等のプローブを加える。プローブの標識の方法は、様々であるが、標識の際、あるいは、ハイブリダイゼーション溶液に加える際に１００℃、５分間程度加熱した後に、４℃に５分間急冷することで、単鎖ＤＮＡ（又は一本鎖ＤＮＡ）とすることが必要である。ハイブリダイゼーションが終了した後には、洗浄工程を加える。洗浄工程も方法によって様々であるが、一例としては、２×ＳＳＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３Ｍ  クエン酸ナトリウム）で６５℃、１５分、２回、２×ＳＳＣ−０．１％  ＳＤＳで６５℃、３０分、０．１×ＳＳＣ（０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム）で６５℃、１０分行なってよい。
【０００７】
しかし、ハイブリダイゼーションは、プレハイブリダイゼーション工程、ハイブリダイゼーション工程、プローブの変性、洗浄工程と各工程があり、手作業で行なうと作業者は作業場から離れることができず、また、コンタミネーションを生じさせる恐れがあった。
【特許文献１】特開２００３−９３０３９号公報
【特許文献２】特開２００３−１６９６６２号公報
【特許文献３】特開２００３−１７７１２８号公報
【特許文献４】特開２００３−１８０３２９号公報
【特許文献５】特開２００３−１９４８２２号公報
【特許文献６】特開２００３−１２１４４１号公報
【特許文献７】特開２００３−１２５７５１号公報
【特許文献８】特開２００３−１０２４６０号公報
【特許文献９】特開２００３−８８３９９号公報
【特許文献１０】特開２００３−９３０３８号公報
【特許文献１１】特開２００３−７９３９８号公報
【特許文献１２】特開２００３−８３９６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のようにハイブリダイゼーション法では手作業で種々の工程が行なわれているため、同時に多量の処理を行なうことが難しく、多量処理において効率が低い。また、菌を取り扱うので、作業者の接触の機会を減少させコンタミネーションを生じさせ難くすることがより好ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明においては、サンプルである膜を多量に実質的に同時に膜処理装置により準備された多数の処理膜を用いて、ハイブリダイゼーション法を自動化して行なう装置を提供する。即ち、複数の種類の異なるサンプルを実質的に同時に、ほぼ自動的にハイブリダイゼーション法で検出する装置を提供することができる。
【００１０】
上記装置は、試料に対して施される種々の処理を行なう手段のうち少なくとも１つを試料間で共有することができるため、装置の小型化を図ることができる。
【００１１】
より具体的には、以下のようなものを提供する。
【００１２】
（１）ハイブリダイゼーション法に用いる多数の試料を実質的に同時に同法により検出する自動化装置であって、前記多数の試料を保持して処理するボトルと、該ボトルが配置されるチャンバー内の温度を調節するチャンバー温度調節部と、該ボトルに試薬を分注する吸引ノズルと、該試薬の温度を調節する試薬温度調節部と、を備える自動化装置。
【００１３】
（２）前記試薬温度調節部により前記試薬に含まれるプローブを予め加熱・急冷することにより１本鎖ＤＮＡとして当該ハイブリダイゼーション法に用いる上記（１）記載の自動化装置。
【００１４】
ここで、試料とは、ハイブリダイゼーション法に直接用いられるものを意味することができる。例えば、ナイロン膜やニトロセルロース膜等の膜を含んでよく、試料の原料が、ナイロン膜やニトロセルロース膜等の膜を含んでもよい。更に、試料の原料は、かかる膜について対象となる菌を含んでよい。また、試料は、その膜について当該菌に由来する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）の少なくとも一部を含んでいてよい。
【００１５】
また、本発明の装置により検出される試料は、例えば、核酸が固定された膜であってよい。当該試料は、コロニーハイブリダイゼーション法のみならず、プラークハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法等において、試料として用いることを排除するものではない。
【００１６】
また、ハイブリダイゼーション反応は、コロニーハイブリダイゼーション法における膜とプローブとのハイブリダイゼーションだけでなく、プラークハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法等におけるものも含むことができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明による装置では、多サンプルについて実質的に自動的かつ同時に処理することができる。そのため、効率の向上だけでなく、安全性に優れることが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の好適な実施形態を、図面を参照しつつ以下に説明する。
【００１９】
図１及び２は、本発明の好適な実施形態の１つであるコロニーハイブリダイゼーション法を用いる自動化装置１００の正面図及び側面図である。この装置のフレーム内には、試薬室温部（例えば、２５℃）２１と、吸引ノズル２２と、試薬温度調節部（例えば、６５℃）２３と、チャンバー温度調節部（例えば、６５℃）２４と、があり所定の温度に試薬やチャンバーが設定されている。このチャンバー内には、専用ボトル２５が配置され、ハイブリダイゼーション法が適用されている。フレームの上部右側にはチューブ搬送機２６が配置され、その奥には、試薬温度調節部（４℃）２７及び試薬温度調節部（１００℃）２８が配置されている。自動化装置１００の正面図において、右側に表示パネル２９があり、その下に電源スイッチ及び非常停止スイッチ３０が配置されている。その下には、各温度調節部の温度を調節する温度調節器３１が配置されている。その下には、左から順に、廃液タンク３２、真空タンク３３、真空ポンプ３４が備えられ、それぞれハイブリダイゼーション法を行なうにあたり適宜活用される。
【００２０】
試薬温度調節部２３は、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄工程で用いる溶液を、ハイブリダイゼーションを行なう所定の温度（例えば、６５℃）に維持するために用いることができる。チャンバー温度調節部２４は、専用ボトル２５があるチャンバーを、ハイブリダイゼーションを行なう所定の温度（例えば、６５℃）に保つために用いることができる。専用ボトル２５は、ＤＮＡが固定されている膜を置くことでハイブリダイゼーションを行なうことができる。試薬温度調節部２７は、ハイブリダイゼーションに用いるプローブを低温（例えば、４℃）に保管することに用いることができる。ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、ハイブリダイゼーション溶液が試薬温度調節部２３から、専用ボトル２５へ導入された後、チューブ搬送機２６によって、４℃になっている試薬温度調節部２７から試薬温度調節部２８に、２本鎖ＤＮＡが１本鎖となる高温（例えば、１００℃に５分間）置かれた後に、低温（例えば、４℃）になっている試薬温度調節部２７で急冷することで、１本鎖ＤＮＡとすることができる。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄工程に使用する溶液、及びプローブは、吸引ノズル２２で、真空ポンプ３４によって、専用ボトル２５に導入される。専用ボトル２５に導入されている溶液は、廃液タンク３２に移送されるが、真空ポンプ３４の容量が十分ではないので、真空タンク３３を用いて容量を拡大させることで移送することができる。試薬室温部２１は、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄工程に用いる溶液の温度と異なる場合、例えば、洗浄工程の後に、抗体反応等によって、ハイブリダイゼーションしたプローブを検出する方法を用いる時等に用いることができる。洗浄工程の後に、抗体反応を行なう場合とは、例えば、アマシャムバイオサイエンス株式会社製のＥＣＬランダムプライムラベリングシステム等が挙げられる。表示パネル２９は、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄工程等の温度、時間等の条件を設定することに用いることができる。電源スイッチ及び非常停止スイッチ３０は、本装置の始動、停止のために用いられる。
【００２１】
ＤＮＡが固定されている膜は、専用ボトル２５に入れられる。適切な温度、例えば６５℃に加温されたプレハイブリダイゼーション用の溶液が２３の試薬温度調節部で温度調節されている。プレハイブリダイゼーション用の溶液は方法によって様々であるが、一例としては、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．０９Ｍ  クエン酸ナトリウム）、５×デンハルト溶液（０．１％  牛血清アルブミン、０．１％  フィコール、０．１％  ポリビニルピロリドン）、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液からなるものがある。プレハイブリダイゼーション溶液は、試薬温度調節部２３から、吸引ノズル２２で吸引され、ＤＮＡが固定されている膜がおかれている専用ボトル２５に導入される。専用ボトル２５があるチャンバー温度調節部２４は、温度調節され、適切な温度、例えば６５℃にて加温され、ハイブリダイゼーションが行なわれる。
【００２２】
適切な時間、例えば２時間のプレハイブリダイゼーションが終了すると、専用ボトル２５にあるプレハイブリダイゼーション溶液は、真空ホンプ３４によって吸引され、廃液タンク３２に吸引・排出される。プレハイブリダイゼーション液の吸引が終了すると、適切な温度、例えば６５℃に加温されたハイブリダイゼーション用の溶液が２３の試薬温度調節部で温度調節されている。ハイブリダイゼーション用の溶液は方法によって様々であるが、プレハイブリダイゼーションの溶液と同じであることが多く好ましい。温度調節部２３から、ＤＮＡが固定されている膜がある専用ボトル２５への溶液の吸引方法は、プレハイブリダイゼーションの場合と同じである。ハイブリダイゼーションをおこなっている専用ボトル２５は、チャンバー温度調節部２４によって一定の温度、例えば６５℃に保たれている。
【００２３】
ハイブリダイゼーションの溶液が専用ボトル２５に吸引された後に、放射線アイソトープあるいは酵素で標識したプローブが専用ボトル２５に吸引され、ハイブリダイゼーションが開始する。プローブは、反応を開始する前は、４℃になっている試薬温度調節部２７で保管されているが、ハイブリダイゼーションの溶液が専用ボトル２５に吸引された後、チューブ搬送機２６によって、１００℃になっている試薬温度調節部２８に移動され、５分間維持された後、再び、４℃になっている試薬温度調節部２７に移される。その結果、使用するプローブは１本鎖となって、ハイブリダイゼーションに用いることが可能となる。１本鎖となったプローブは、吸引ノズル２２によって、ＤＮＡが固定されている膜がある専用ボトル２５に吸引される。
【００２４】
ハイブリダイゼーションが終了した後、ＤＮＡが固定されている膜を洗浄する。洗浄溶液は、方法によって様々であるが、一例としては、２×ＳＳＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３Ｍ  クエン酸ナトリウム）で６５℃、１５分、２回、２×ＳＳＣ−０．１％  ＳＤＳで６５℃、３０分、０．１×ＳＳＣ（０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム）で６５℃、１０分間行なう。それぞれの洗浄溶液は、試薬温度調節部２３によって、一定の温度に保たれており、吸引ノズル２２によって専用ボトル２５に吸引される。一定時間の洗浄が終了すると、真空ポンプ３４によって、専用ボトルから排出され、廃液タンク３２に吸引される。
【００２５】
図３は、本ハイブリダイゼーション法をフローチャートに示したものである。まず、上述のように、対象となる膜を複数準備する（Ｓ６０）。酵素標識等により、ラベリングされたプローブを作成する（Ｓ１００）。上述の膜作成（Ｓ６０）により準備した試料に対して、プレハイブリダイゼーション（Ｓ１１０）、ハイブリダイゼーションを行なう（Ｓ１２０）。これにより、プローブを試料の該当部位に固定することができる。次にこれらを洗浄し（Ｓ１３０）、乾燥する（Ｓ１４０）。得られた膜をＸ線写真フィルムにあてがい、プローブによる感光を調べて、目的物の検出を行なう（Ｓ１５０）。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】コロニーハイブリダイゼーション法の自動化装置の正面図である。
【図２】コロニーハイブリダイゼーション法の自動化装置の側面図である。
【図３】コロニーハイブリダイゼーション法のフローチャートである。
【符号の説明】
【００２７】
２１    試薬室温部
２２    吸引ノズル
２３    試薬温度調節部
２４    チャンバー温度調節部
２５    専用ボトル
２６    チューブ搬送機
２７    試薬温度調節部（４℃）
２８    試薬温度調節部（１００℃）
２９    表示パネル
３０    電源スイッチ、非常停止スイッチ
３１    温度調節器
３２    廃液タンク
３３    真空タンク
３４    真空ポンプ
１００    自動化装置
【図１】
2005245405.tif 000003
【図２】
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【図３】
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