(57)【要約】      （修正有）【課題】完全長ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡクローンの塩基配列を解析し、このうちプロテインキナーゼをコードすると推定される完全長ｃＤＮＡについては、これがコードするタンパク質の生理活性を特定し、該生理活性に基づくタンパク質およびそれをコードするＤＮＡの利用方法を提案する。【解決手段】以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質を含有する細胞増殖促進剤；（ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）特定のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性および／または細胞増殖活性を有するタンパク質、（ｃ）特定のアミノ酸配列における部分アミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性および／または細胞増殖活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質を含有する細胞増殖促進剤；
（ａ）配列番号７〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号７〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性および／または細胞増殖活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号７〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列における部分アミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性および／または細胞増殖活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質が有する活性を阻害する物質を含有する細胞増殖阻害剤。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質の遺伝子の発現を調節する物質を含有する細胞増殖促進剤または細胞増殖阻害剤。
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、当該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体、当該センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる２本鎖オリゴヌクレオチド、および当該２本鎖オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチドを含有する細胞増殖阻害剤；
（ａ）配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列、
（ｂ）配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列を有し、かつキナーゼ活性および／または細胞増殖活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列、
（ｃ）配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列あるいはその相補配列を有するＤＮＡをストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列を有し、かつキナーゼ活性および／または細胞増殖活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列。
【請求項５】
２本鎖オリゴヌクレオチドが以下の（ａ）〜（ｃ）から成る群から選ばれる、請求項４に記載の細胞増殖阻害剤；
（ａ）配列番号２５および２６に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる２本鎖オリゴヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２７および２８に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる２本鎖オリゴヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２９および３０に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる２本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体あるいはその部分フラグメントを含有する細胞増殖阻害剤。
【請求項７】
請求項１に記載のタンパク質と被検物質を接触させ、該被検物質による該タンパク質が有するキナーゼ活性および／または細胞増殖活性の変化を測定することを特徴とする、該タンパク質の細胞増殖活性調節物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１に記載のタンパク質を含有することを特徴とする、該タンパク質の細胞増殖活性調節物質のスクリーニング用キット。
【請求項９】
請求項１に記載のタンパク質を発現する細胞または該タンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを導入した遺伝子導入細胞と被検物質を接触させ、該細胞における該ＤＮＡの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、該ＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、該タンパク質を発現する細胞、該ＤＮＡを含む組換えベクターまたは該組換えベクターを導入した遺伝子導入細胞から成る群から選ばれる少なくとも１を含有することを特徴とする、該ＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング用キット。
【請求項１１】
請求項１に記載のタンパク質を用いて細胞の増殖を促進する方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを用いて細胞の増殖を促進する方法。
【請求項１３】
請求項４または５に記載のオリゴヌクレオチドを用いて細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項１４】
請求項６に記載の抗体またはその部分フラグメントを用いて細胞の増殖を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キナーゼ活性および／または細胞増殖活性を有するタンパク質を含有する細胞増殖促進剤、該タンパク質が有する活性を阻害する物質を含有する細胞増殖阻害剤、該タンパク質の遺伝子の発現を調節する物質を含有する細胞増殖促進剤または細胞増殖阻害剤、該タンパク質の遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドを含有する細胞増殖阻害剤、該タンパク質に特異的に結合する抗体を含有する細胞増殖阻害剤等に関する。さらに本発明は、該タンパク質の細胞増殖活性を調節する物質をスクリーニングする方法、該タンパク質をコードするＤＮＡの発現を調節する物質をスクリーニングする方法、および細胞の増殖を促進または阻害する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼは、基質であるタンパク質のセリン、スレオニンあるいはチロシン残基をリン酸化する酵素であり、極めて多くのファミリーが知られている。また、一般にプロテインキナーゼはタンパク質リン酸化を介する細胞内シグナル伝達系を調節することにより、アポトーシスや細胞増殖・分化のみならず種々の生命現象の制御に関わっていることが知られており、疾患との関係の解明が進められている（例えば、非特許文献１を参照）。
【０００３】
細胞は、増殖因子やサイトカイン、あるいは物理化学的なストレスなど外部からの種々の刺激に応答して、増殖、分化、アポトーシスなどの適応反応を示す。細胞外からの刺激を細胞核へ的確に伝える主要なシステムの１つがマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（mitogen-activated protein kinase; ＭＡＰＫ）経路であり、この経路は、遺伝子発現を制御することで、酵母から哺乳類までの範囲の生物における細胞増殖および分化ならびにストレス誘導性応答を調節する種々のシグナルを媒介する（例えば、非特許文献２を参照）。
【０００４】
ＭＡＰＫは、上皮成長因子や血小板由来成長因子等の種々の増殖因子およびインスリンなどの増殖刺激で共通に活性化されるセリン／スレオニンキナーゼとして哺乳類培養細胞より見出された。ＭＡＰＫは、その活性化ループ内のスレオニン／チロシン残基が、セリン／スレオニン／チロシンキナーゼであるＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）によるリン酸化を受けて活性化される。ＭＡＰＫＫも、その活性化ループ内のセリン／スレオニン残基が、ＭＡＰＫＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）によるリン酸化を受けて活性化される。このように、ＭＡＰＫ経路はＭＡＰＫＫＫ−ＭＡＰＫＫ−ＭＡＰＫの３種類のキナーゼのカスケードにより構成され、活性化されたＭＡＰＫは数ある基質の中でもとりわけ転写因子をリン酸化し活性化する。細胞外からのシグナルは、チロシンキナーゼ型受容体→アダプター分子→ＧＴＰ／ＧＤＰ交換因子→低分子量Ｇ蛋白質（Ｒａｓ）→ＭＡＰＫＫＫ（Ｒａｆ１）→ＭＡＰＫＫ→ＭＡＰＫ→転写因子という一連のリン酸化反応のカスケードを通じて、増幅されつつ細胞膜から核へ伝えられる。
【０００５】
ＭＡＰＫカスケードには、古典的ＭＡＰＫカスケードとストレス応答ＭＡＰＫ（stress-activated protein kinase; ＳＡＰＫ）カスケードがある。古典的ＭＡＰＫである哺乳類のＥＲＫ（extracellular signal-regulated kinase）１やＥＲＫ２のカスケードは、増殖因子の刺激を受けたＲａｓにより開始され、Ｒａｆ、ＭＥＫおよびＥＲＫが関与する（例えば、非特許文献２を参照）。古典的ＭＡＰＫカスケードによるシグナル伝達の結果、細胞の増殖や分化が制御される。一方、ＳＡＰＫカスケードは種を超えて保存されており、出芽酵母、分裂酵母、ショウジョウバエや線虫からヒトに至るすべての真核細胞に共通の機構である。ＳＡＰＫとして、哺乳類ではＪＮＫ（c-Jun N-terminal kinase）やｐ３８、出芽酵母では高浸透圧に応答するカスケードにおけるＨｏｇ１、分裂酵母では接合フェロモンに応答するカスケードにおけるＦｕｓ３やＫｓｓ１が知られている。ＥＲＫが増殖刺激によって活性化されるのに対し、ＪＮＫおよびｐ３８はともに放射線、紫外線、抗癌剤、高浸透圧、熱ショック、過酸化物、エンドトキシン、血清除去などの種々の物理化学的ストレスによって活性化され、またＴＮＦ（tumor necrosis factor）−１やＩＬ（interleukin）−１などの炎症性サイトカインによっても活性化される。ＳＡＰＫカスケードによるシグナル伝達の結果は多様で、ストレス適応、アポトーシス、細胞の癌化、細胞増殖、細胞分化、細胞周期、免疫応答などの生理的、細胞化学的反応が制御される。そのため、キナーゼが関与するこれらの反応の異常は多くの生体機能障害の原因になっていることが判明している。特に、細胞増殖、細胞分化または細胞周期の異常は癌の発生の直接的な原因であり、また癌以外にも細胞増殖、細胞分化または細胞周期の異常に起因する疾患として、動脈硬化、糖尿病性網膜症、子宮内膜増殖症、糸球体腎炎、心肥大等を挙げることができる（ここで、細胞増殖、細胞分化および細胞周期の３つの反応の制御は密接な関係があるので、本発明においては、細胞増殖促進、細胞分化阻害および細胞周期開始／亢進を「細胞増殖促進」と、また細胞増殖阻害、細胞分化促進および細胞周期停止／遅延を「細胞増殖阻害」と称する。また、「細胞増殖促進」と「細胞増殖阻害」をあわせて、「細胞増殖調節」と称する）。従って、細胞増殖、細胞分化または細胞周期を調節することができる本発明の細胞増殖促進剤または細胞増殖阻害剤は、これらの細胞増殖、細胞分化または細胞周期の異常に起因する疾患の治療および／または予防剤として使用することができる。
【０００６】
３０億塩基対といわれるヒトのゲノムについては２００１年２月にその塩基配列のドラフトが発表されていたが、２００３年４月に完全配列が解読され公表された。ゲノム配列を明らかにする目的は、全ての遺伝子の機能や制御、あるいは遺伝子間、タンパク質間、細胞間さらには個体間における相互作用のネットワークとして複雑な生命現象を理解するところにある。種々の生物種のゲノム情報から生命現象を解明していくことは、単に学術分野における研究課題として重要であるのみならず、そこで得られる研究成果をいかに産業上の応用へと発展させていくかという点で、その社会的な意義も大きい。
【０００７】
真核生物のゲノム配列では、多くの場合、一つの遺伝子がイントロンによって複数のエクソンに分断されている。そのため、ゲノム配列情報だけからそこにコードされるタンパク質の構造を正確に予測するには、多くの問題がある。一方、イントロンが除かれたmRNAから作製されるcDNAでは、タンパク質のアミノ酸配列の情報が一つの連続した配列情報として得られるため、容易にその一次構造を明らかにすることが可能である。ヒトのcDNAの研究では、これまでに５００万以上のEST（Expressed Sequence Tags）データが公共データベースに公開されている。
【０００８】
これらの情報は、ヒト遺伝子構造の解明やゲノム配列におけるエクソン領域の予測、あるいはその発現プロファイルの推定など、様々な角度から利用されている。ところが、これらのヒトEST情報の多くはcDNAの3' 末端側近傍に集中しているため、特にmRNAの5' 末端近傍の情報が極端に不足している状況にある。一方、同一のゲノムにコードされたタンパク質であっても、それをコードするｍＲＮＡが転写される際、ゲノム中一部のエクソンが挿入・欠失して結合する異性体（以下、これを「スプライシングバリアントmRNA」と称することがある）がある。実際、これらのmRNAが翻訳されて生成される、複数種の類似のタンパク質（以下、これらを「スプライシングバリアント」と称することがある）が生体内において確認されている。スプライシングバリアントは、組織特異的、発生段階特異的、あるいは疾患特異的に発現し、それぞれ異なる機能を有していると考えられている。
【０００９】
また、世界の研究機関 (ヘリックス研究所、かずさＤＮＡ研究所、東大医科学研究所、ドイツ癌研究センター、ＭＧＣプロジェクトなど) で行われている解析の結果明らかにされているｃＤＮＡは４万数千に上り、数的には３万数千と言われる遺伝子座の大半をカバーしていると思われるが、全長クローンとして取得されているｃＤＮＡの割合は８０％程度であることや、重複やスプライスバリアントが含まれていることを考慮すると、まだ取得されていないｃＤＮＡは多数存在していると考えられる。
【００１０】
前述のように、プロテインキナーゼは、基質であるタンパク質のセリン、スレオニンあるいはチロシン残基をリン酸化する酵素であり、極めて多くのファミリーが存在する。また、一般にプロテインキナーゼはタンパク質リン酸化を介する細胞内シグナル伝達系を調節することにより、細胞増殖、細胞分化または細胞周期のみならず種々の生命現象の制御に関連しており、疾患との関係の解明が進められていることも先に述べた。ヒトの遺伝子の約３〜４％はプロテインキナーゼの遺伝子であると言われ、ヒトの体内には数百種もの異なるプロテインキナーゼが存在すると推定されているが、まだ多くのプロテインキナーゼ遺伝子がクローニングされないまま、またはクローニングされていてもその機能（キナーゼ活性およびキナーゼ活性以外の機能）はin silicoで推定されるのみで、その遺伝子がコードするタンパク質を実際に取得してその活性を測定したり細胞や動物を用いてその遺伝子の機能を確認するといった実験的手法では確認あるいは明確にされないままに残されている。例えば、アポトーシスを誘導することを示唆する結果が蓄積されているＪＮＫおよびｐ３８が関与するカスケードにおいては、ＪＮＫ遺伝子を欠損したマウスでは前脳の神経細胞のアポトーシスが亢進し胎生致死となることや、ＪＮＫを活性化するプロテインキナーゼであるＭＫＫ４を欠損するＴ細胞ではＦａｓやＣＤ３刺激に対するアポトーシス感受性が亢進するといった、ＪＮＫおよびｐ３８が関与するカスケードはある状況下ではむしろ生存シグナルとして機能することを示唆する逆の結果が報告されている（例えば、非特許文献３を参照）。したがって、バリアントを含むプロテインキナーゼの機能、およびキナーゼ活性とキナーゼ以外の機能との関連、特に細胞増殖、細胞分化または細胞周期との関連を、実験的手法で解析して明確にする意義は大きい。また、細胞増殖、細胞分化または細胞周期との関連が明確となったプロテインキナーゼは、細胞増殖、細胞分化または細胞周期の異常が起因する疾患の治療のための標的分子として、またタンパク質自身に医薬品としての有用性を期待できる。したがって、全長ｃＤＮＡにコードされるプロテインキナーゼの、細胞増殖、細胞分化または細胞周期に関連する機能を解析し、これらのタンパク質を用いて新たな細胞増殖促進剤または阻害剤を開発することには大きな意義がある。
【非特許文献１】Hunter, T., Cell, 50: 823-829 (1987)
【非特許文献２】Lewis, T.S. et al., Adv. Cancer Res., 74: 49-139 (1998)
【非特許文献３】Nishida, H. et al., Nature, 385: 350-353 (1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、完全長ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡクローンの塩基配列を解析し、このうちｃＤＮＡのコードするタンパク質がキナーゼ活性および／または細胞増殖活性を有するものを実験的手法により新規に特定し、該活性に基づくタンパク質およびそれをコードするＤＮＡの利用方法を提案することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、オリゴキャップ法 （Maruyama, K., et al.,  Gene, 138: 171-174 (1994); Suzuki , Y.  et al., Gene,  200: 149-156 (1997)）を用いて取得された完全長ｃＤＮＡについて、該cDNAクローンの塩基配列の相同性に基づきデータベースを検索し、プロテインキナーゼをコードすると推定される完全長ｃＤＮＡを選択した。そしてこれらのプロテインキナーゼをコードすると推定される該ｃＤＮＡのうち、ＦＣＢＢＦ２００３１０２（配列番号１、７；ＧｅｎＢａｎｋ登録記号  ＡＫ１２２９８８）を発現させて取得したタンパク質がキナーゼ活性を有することを明らかにし、さらにＦＣＢＢＦ２００３１０２の発現を阻害した細胞の表現型の変化を解析し、ＦＣＢＢＦ２００３１０２がコードするタンパク質が細胞増殖活活性を有することを初めて明らかにした。あわせて、ＦＣＢＢＦ２００３１０２のスプライシングバリアントを含むバリアントであり、プロテインキナーゼであるＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＸ４５２８６５（配列番号２および８；ｎａｇｅｎｅｓｅｑ登録記号ＡＡＬ４４０１７、ａａｇｅｎｅｓｅｑ登録記号ＡＡＯ１５４１９、ＷＯ０２／４２４３８号公報のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３およびＮＯ．５）、ＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＸ５０４２３７（配列番号３および９；ｎａｇｅｎｅｓｅｑ登録記号ＡＡＤ３８８４７、ａａｇｅｎｅｓｅｑ登録記号ＡＡＥ２４１３３、ＷＯ０２／３３０９９号公報のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４およびＮＯ．２６）、ＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＸ５３４７３６（配列番号４および１０；ｎａｇｅｎｅｓｅｑ登録記号ＡＢＶ７３２８７、ａａｇｅｎｅｓｅｑ登録記号ＡＢＢ８２４７１、ＷＯ０２／７０６７８号公報のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１およびＮＯ．２、ＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＸ０５６３８２（配列番号５および１１；ｎａｇｅｎｅｓｅｑ登録記号ＡＡＦ４４６４７、ａａｇｅｎｅｓｅｑ登録記号ＡＡＢ６５６２１、ＷＯ００／７３４６９号公報のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２６およびＮＯ．１４７）およびＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＢ０５１５５２（配列番号６および１２）が、細胞増殖活性を有することも、初めて明らかにした。本発明は、これらの知見に基づいて成し遂げられたものである。なお表１は、本発明で用いられるＤＮＡについて、各種データベースにおける登録記号、記載されている文献、文献等で付与された名前等の関係をまとめたものである。
【００１３】
【表１】
2005245274.tif 000002
【００１４】
すなわち本発明によれば、以下の１〜１４に記載の発明が提供される。
１．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質を含有する細胞増殖促進剤；
（ａ）配列番号７〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号７〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性および／または細胞増殖活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号７〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列における部分アミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性および／または細胞増殖活性を有するタンパク質。
２．前項１に記載のタンパク質が有する活性を阻害する物質を含有する細胞増殖阻害剤。
３．前項１に記載のタンパク質の遺伝子の発現を調節する物質を含有する細胞増殖促進剤または細胞増殖阻害剤。
４．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、当該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体、当該センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる２本鎖オリゴヌクレオチド、および当該２本鎖オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチドを含有する細胞増殖阻害剤；
（ａ）配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列、
（ｂ）配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列を有し、かつキナーゼ活性および／または細胞増殖活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列、
（ｃ）配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列あるいはその相補配列を有するＤＮＡをストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列を有し、かつキナーゼ活性および／または細胞増殖活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列。
５．２本鎖オリゴヌクレオチドが以下の（ａ）〜（ｃ）から成る群から選ばれる、前項４に記載の細胞増殖阻害剤；
（ａ）配列番号２５および２６に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる２本鎖オリゴヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２７および２８に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる２本鎖オリゴヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２９および３０に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる２本鎖オリゴヌクレオチド。
６．前項１に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体あるいはその部分フラグメントを含有する細胞増殖阻害剤。
７．前項１に記載のタンパク質と被検物質を接触させ、該被検物質による該タンパク質が有するキナーゼ活性および／または細胞増殖活性の変化を測定することを特徴とする、該タンパク質の細胞増殖活性調節物質のスクリーニング方法。
８．前項１に記載のタンパク質を含有することを特徴とする、該タンパク質の細胞増殖活性調節物質のスクリーニング用キット。
９．前項１に記載のタンパク質を発現する細胞または該タンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを導入した遺伝子導入細胞と被検物質を接触させ、該細胞における該ＤＮＡの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、該ＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング方法。
１０．前項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、該タンパク質を発現する細胞、該ＤＮＡを含む組換えベクターまたは該組換えベクターを導入した遺伝子導入細胞から成る群から選ばれる少なくとも１を含有することを特徴とする、該ＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング用キット。
１１．前項１に記載のタンパク質を用いて細胞の増殖を促進する方法。
１２．前項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを用いて細胞の増殖を促進する方法。
１３．前項４または５に記載のオリゴヌクレオチドを用いて細胞の増殖を阻害する方法。
１４．前項６に記載の抗体またはその部分フラグメントを用いて細胞の増殖を阻害する方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明で用いられるタンパク質はキナーゼ活性に加えて細胞増殖活性を有することから、該タンパク質を利用した細胞増殖促進剤を提供することができる。また、該タンパク質あるいはそれをコードするＤＮＡを用いて細胞増殖活性を調節する物質をスクリーニングすることができ、該タンパク質が関連する疾患等に作用し得る医薬の開発、例えば細胞増殖促進剤または細胞増殖阻害剤等の開発に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、配列番号７〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を含有する細胞増殖促進剤等を提供する。以下、本発明をさらに詳細に説明するが、これらの記載は本発明の実施態様の一例（代表例）であり、本発明の範囲を限定するものではない。
（１）完全長ｃＤＮＡの取得及び塩基配列の解析
本発明で用いられるＤＮＡは、配列番号７〜１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号７〜１２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個（ここで、数個とは、例えば５個以下、好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下を意味する）のアミノ酸残基の置換、欠失及び／または付加を含むアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性および／または細胞増殖活性を有するタンパク質をコードし得るものであれば如何なるものであってもよい。具体的には、該アミノ酸配列をコードする翻訳領域（以下、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」と称することがある）のみでも、あるいはそのｃＤＮＡの全長を含むものでもよい。
【００１７】
具体的には、ｃＤＮＡの全長を含むＤＮＡとしては、例えば配列番号１〜６に記載の塩基配列からなるＤＮＡ等が挙げられる。また、その翻訳領域としては、配列番号１の塩基番号２７〜１７５７（終止コドンを含む）、配列番号２の塩基番号１１３〜２５６６（終止コドンを含む）、配列番号３の塩基番号１〜２５０８（終止コドンを含む）、配列番号４の塩基番号１〜２５０５（終止コドンを含まない）、配列番号５の塩基番号１〜２０６１（終止コドンを含む）、配列番号６の塩基番号２〜１８２８（終止コドンを含む）に示される配列を有するものが挙げられる。さらに上記のｃＤＮＡの全長でなくても、上記翻訳領域とその３'及び／または５'端に隣接する、翻訳領域の発現に最低限必要な部分を含むもの等も本発明で用いられるＤＮＡに含まれる。
【００１８】
本発明で用いられるＤＮＡは、これを取得できる方法であれば如何なる方法により取得したものでもよいが、具体的には例えば下述の方法により取得することができる。まず、ヒトの組織あるいは培養細胞等からそれ自体既知の通常用いられる方法によりｍＲＮＡを調製する。次に、このｍＲＮＡを鋳型としてオリゴキャップ法（Maruyama, K. et al., Gene, 138, 171-174 (1994)）によりｃＤＮＡを取得する。具体的には、取得したｍＲＮＡについて酸性ピロフォスファターゼにより５'キャップをはずし、その後露出した５'末端のリン酸基を標的に、オリゴキャップリンカーをＲＮＡライゲースを用いて連結する。ここで、キャップ構造を５'末端に有していないＲＮＡ分子について、上記オリゴキャップリンカーが結合しないように、予め５'末端に存在するリン酸基を、５'キャップは外さないが５'端のリン酸基のみ外す活性を有するフォスファターゼ等を用いて外しておくことは有効である。このＲＮＡ分子を鋳型として、３'側のプライマーとしてオリゴ ｄＴプライマーを用いて逆転写酵素により逆転写を行った後、ＲＮＡ鎖を分解除去する。
【００１９】
さらに取得された１本鎖ＤＮＡを鋳型として、上記オリゴキャップリンカーの部分配列を有するオリゴヌクレオチドを５'プライマーとし、３'末端に特異的なプライマー（オリゴｄＴプライマー等）を用いてポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）を行うことにより完全長ｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。プライマーの鎖長としては、通常15〜100塩基、好ましくは15〜30塩基が挙げられるが、増幅するｃＤＮＡの鎖長が長い場合には25〜35塩基の長さとすることが好ましく、また、Long and Accurate PCR（LA PCR：林健志、実験医学別冊・PCRの最新技術、羊土社；Cheng, S. et al., Nature 369: 684-685 (1994)）を用いることが好ましい。
【００２０】
このようにして取得されたｃＤＮＡは、これを適当なクローニングベクターに挿入してクローニングを行う。ここで用いられるベクターとしては、取得されたｃＤＮＡクローンを細胞に導入して該ｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現できるようなタンパク質発現用ベクターが好ましく用いられる。具体的には例えば、宿主が哺乳動物細胞等の場合にはｐＭＥ１８ＳＦＬ３（Genbank AB009864）等が好ましく、また大腸菌の場合では、ｐＥＴ３、ｐＥＴ１１（ストラタジーン社製）、ｐＧＥＸ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等が挙げられ、酵母の場合ではｐＥＳＰ−Ｉエクスプレッションベクター（ストラタジーン社製）等が挙げられ、さらに昆虫細胞の場合ではＢａｃＰＡＫ６（クロンテック社製）等が用いられる。また宿主が動物細胞の場合では、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等が挙げられる。
【００２１】
かくして取得されるｃＤＮＡライブラリーは、それ自体既知の通常用いられる方法により塩基配列の解析を行う。本発明で用いられるＤＮＡは、取得されたｃＤＮＡの５'末端あるいは３'末端の塩基配列を解析し、これをＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のＧｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＰＤＢ、ＥＳＴ等のデータベースについてＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５，  ４０３−４１０（１９９０））を用いて検索し、その全長について完全に一致する配列が見出されない場合は新規として以下の解析に供することとした。
【００２２】
このような完全長ｃＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、配列番号１〜６に記載の塩基配列を有するものが挙げられる。また、その翻訳領域としては、配列番号１の塩基番号２７〜１７５７（終止コドンを含む）、配列番号２の塩基番号１１３〜２５６６（終止コドンを含む）、配列番号３の塩基番号１〜２５０８（終止コドンを含む）、配列番号４の塩基番号１〜２５０５（終止コドンを含まない）、配列番号５の塩基番号１〜２０６１（終止コドンを含む）、配列番号６の塩基番号１２〜１８２８（終止コドンを含む）に示される配列を有するものが挙げられる。
【００２３】
かくして取得されたｃＤＮＡの全長として新規な塩基配列を、ＢＬＡＳＴによる相同性検索（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈ）や、ＨＭＭＥＲ（隠れＭａｒｋｏｖモデルによる配列解析手法；Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｒ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４，７５５−７６３（１９９８））の機能群のひとつであるＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索（ｐｒｏｆｉｌｅ  ｓｅａｒｃｈ：ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）等を行うことにより、該塩基配列がコードするタンパク質の機能を推定することができる。
【００２４】
ＢＬＡＳＴによる相同性検索においては、検索の結果得られた相同性が十分有意なヒット配列に付随する種々のアノテーション情報から、解析対象としているクローンの機能を推定することができる。ここで、十分有意なヒット配列とは、登録されている配列の触媒ドメイン部分と本発明で用いられるＤＮＡのこれに対応する部分とのｉｄｅｎｔｉｔｙが３０％以上のものか、ｅ−ｖａｌｕｅとして１０-4以下のものを示す。
【００２５】
例えば、上位にヒットした触媒ドメイン配列の多くがキナーゼとしての機能を確認されたものであるならば、それと配列上類似である解析対象クローンもまた同じ機能、即ち、キナーゼ活性を持つであろうという予測が成り立つ。
ＨＭＭＰＦＡＭは、Ｐｆａｍというタンパク質プロファイルを集積したデータベース中にあるエントリーが有するアミノ酸配列の特徴を、解析対象である塩基配列のコードするアミノ酸配列が有するかどうかを洗い出す方法による解析である。プロファイルは一連の同一特徴を持つタンパク質群から抽出されており、一配列対一配列の全長に亘る比較では明確化できない機能でも、配列中にその特徴領域があればこれを見出し機能予測ができる。このように、それがコードするタンパク質がキナーゼ活性を有すると予測されるcDNAは、後述する生化学的実験によりそのキナーゼ活性を確認することができる。
【００２６】
上記でcDNAの全長として新規であるとされたクローンとして具体的には、配列番号１〜６に示す塩基配列を有するものが挙げられる。また、これらの塩基配列がコードするアミノ酸配列は配列番号７〜１２に示すものが挙げられる。
かくして取得され、塩基配列が決定され、機能が推定され、また後述するように機能が確認される本発明で用いられるＤＮＡは上記の配列番号１〜６に記載の塩基配列、あるいはその翻訳領域として上記に示した塩基配列を有するものだけでなく、これらの塩基配列において、１若しくは数個（ここで言う数個とは、例えば１５個以下、好ましく９個以下、より好ましくは６個以下を意味する）の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列を有し、かつキナーゼ活性および／または細胞増殖活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ等も含まれる。これらＤＮＡには前記したとおり、配列番号７〜１２に記載のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性および／または細胞増殖活性を有するタンパク質をコードするものが含まれる。
【００２７】
さらに、本発明で用いられるＤＮＡは、上述の方法により取得されたものでも、また合成されたものでもよい。ＤＮＡの塩基配列の置換は、例えばサイトダイレクテッドミュータジェネシスキット（タカラバイオ社製）や、クイックチェンジサイトダイレクテッドミュータジェネシスキット（ストラタジーン社製）等の市販キットで容易に行うことができる。
【００２８】
（２）本発明で用いられるｃＤＮＡがコードするタンパク質
本発明で用いられるＤＮＡがコードするタンパク質の翻訳領域は、例えば、該ＤＮＡが有する塩基配列について３種類の読み枠によりアミノ酸に変換していき、最も長いポリペプチドをコードする範囲を本発明で用いられるＤＮＡの翻訳領域としてそのアミノ酸配列を推定することができる。このようなアミノ酸配列として例えば、配列番号７〜１２に記載のもの等が挙げられる。また、本発明で用いられるタンパク質は、上記のアミノ酸配列に限られるものではなく、該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性および／または細胞増殖活性を有するものも含まれる。
【００２９】
本発明で用いられるタンパク質の取得方法としては、（１）に記載の本発明で用いられるＤＮＡを適当な方法により転写／翻訳する方法が好ましく用いられる。具体的には、適当な発現用ベクター若しくは適当なベクターに適当なプロモーターとともに挿入した組換えベクターを作製し、この組換えベクターで適当な宿主微生物を形質転換したり、適当な培養細胞に導入することにより発現させ、これを精製することにより取得することができる。
【００３０】
また、そのＮ末端またはＣ末端に適当なタグが融合するように設計されたベクターなどに挿入してタグを付加したタンパク質も本発明で用いられるタンパク質に含まれる。タグとして具体的には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン、Ｆｌａｇなどが挙げられる。
上記形質転換体が産生するタンパク質には、タンパク質合成時に重原子などで置換・修飾したアミノ酸を取り込ませることにより修飾することができる。また、タンパク質を、精製の前又は後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することにより修飾タンパク質とすることができる。例えば、Ｎ末端アセチル化、Ｃ末端アミド化などの末端修飾、糖鎖付加、脂質付加、アシル化、メチル化、スルホン化、カルボキシル化、水酸化、リン酸化、ＡＤＰ−リボシル化などであるが、必ずしもこれらに限定されない。これらの修飾タンパク質も上記したキナーゼ活性および／または細胞増殖活性を有するものであれば本発明で用いられるタンパク質の範囲に含まれる。
【００３１】
また、上記形質転換体が産生するタンパク質を、精製の前又は後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することにより修飾タンパク質とすることができる。これらの修飾タンパク質も上記したキナーゼ活性および／または細胞増殖活性を有するものであれば本発明で用いられるタンパク質の範囲に含まれる。
【００３２】
本発明で用いられるタンパク質の産生を行う際、本発明で用いられるＤＮＡを含む組換えベクターの作製に用いるベクターとしては、形質転換体内で該ＤＮＡが発現されるものであれば特に制限はなく、プラスミドベクター、ファージベクターのいずれでもよい。これらのうち通常は、該ＤＮＡが導入される宿主に適したプロモーター等の発現制御領域ＤＮＡが既に挿入されている市販のタンパク質発現用ベクターを用いる。このようなタンパク質発現用ベクターとして、具体的には例えば、宿主が大腸菌の場合では、ｐＥＴ３、ｐＥＴ１１（ストラタジーン社製）、ｐＧＥＸ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等が挙げられ、酵母の場合ではｐＥＳＰ−Ｉエクスプレッションベクター（ストラタジーン社製）等が挙げられ、さらに昆虫細胞の場合ではＢａｃＰＡＫ６（クロンテック社製）等が用いられる。また宿主が動物細胞の場合では、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャムファルマシアバイオテク社製）が挙げられ、宿主が哺乳動物細胞等の場合にはｐＭＥ１８ＳＦＬ３（Genbank AB009864）等が好ましい。
【００３３】
発現制御領域が挿入されていないベクターを用いる場合には、発現制御領域として少なくともプロモーターを挿入する必要がある。ここでプロモーターとしては、宿主微生物または培養細胞が保有するプロモーターを用いることができるが、これに限られるものではなく、具体的には例えば、宿主が大腸菌の場合にはＴ３、Ｔ７、ｔａｃ、ｌａｃプロモーター等を用いることができ、酵母の場合にはｎｍｔ１プロモーター、Ｇａｌ１プロモーター等を用いることができる。昆虫細胞の場合には、ポリヘドリンプロモーター等を用いることができる。また宿主が動物細胞の場合にはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等が好ましく用いられる。
【００３４】
また哺乳動物由来のプロモーターが機能可能な宿主を用いる場合には、本発明で用いられる遺伝子に固有のプロモーターを用いることもできる。これらのベクターへの本発明で用いられるＤＮＡの挿入は、該ＤＮＡまたはこれを含むＤＮＡ断片をベクター中のプロモーターの下流に該遺伝子ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を連結して行えばよい。
【００３５】
このようにして作製した組換えベクターは、それ自体既知の方法により後述する宿主を形質転換して、ＤＮＡ導入体を作製することができる。宿主への該ベクターの導入方法として、具体的には、ヒートショック法（Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５４，（１９７０））、リン酸カルシウム法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２１，５５１，（１９８３））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１５，１６６，（１９８２））、インビトロパッケージング法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２，５８１，（１９７５））、ウィルスベクター法（Ｃｅｌｌ，３７，１０５３，（１９８４））、および電気パルス法（Ｃｈｕ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５，１３３１（１９８７））等が挙げられる。
【００３６】
ＤＮＡ導入体を作製するための宿主としては、本発明で用いられるＤＮＡが体内で発現するものであれば特に限定されないが、例えば大腸菌、酵母、バキュロウィルス（節足動物多角体ウイルス）−昆虫細胞、あるいは動物細胞等が挙げられる。具体的には、大腸菌ではＢＬ２１、ＸＬ−２Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社製）等、酵母ではＳＰ−Ｑ０１（ストラタジーン社製）等、バキュロウィルスではＡｃＮＰＶ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，７４０６，（１９８８））とその宿主であるＳｆ９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７１１；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，  ７４０６，（１９８８））等が挙げられる。また動物細胞としてはマウス繊維芽細胞株Ｃ１２７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１８０４；Ｊ．Ｖｉｏｌ．，２６，２９１，（１９７８））やチャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６，（１９８０））等が挙げられるが、発現量やスクリーニングの簡便さから好ましくはアフリカミドリザル腎臓由来細胞株ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１：アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション保存細胞）、ヒトアデノウイルス５型でトランスフォームしたヒト胎児腎臓由来細胞株ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３；以下、「ＨＥＫ２９３細胞」と称することがある。）またはヒト子宮頸部癌由来細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２；以下、「ＨｅＬａ細胞」と称することがある。）が用いられる。
【００３７】
上記したようなタンパク質発現用ベクターを用いる発現方法の他に、プロモーターを連結した本発明で用いられるＤＮＡ断片を宿主微生物の染色体中に直接挿入する相同組換え技術（Ａ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７，２０３６，（１９９３））、あるいはトランスポゾンや挿入配列（Ａ．Ａ．  Ｖｅｒｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１１，７３９，（１９９４））等を用いてＤＮＡ導入体を作製することもできる。
【００３８】
上記で得られた培養物は細胞または菌体を遠心分離等の方法により収集し、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム、および／または凍結融解等のそれ自体既知の適当な方法により破壊した後、遠心分離や濾過等によりタンパク質粗精製液を得、さらに適当な精製方法を組み合わせることにより精製することができる。
かくして、本発明で用いられるタンパク質が取得される。上記したタンパク質発現組換えベクターを用いる発現方法の他に、上記（１）で取得された本発明で用いられるＤＮＡを無細胞転写翻訳系に供することによりタンパク質発現を誘導し、本発明で用いられるタンパク質を取得することができる。本発明で用いられる無細胞転写翻訳系とは、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写、およびｍＲＮＡからタンパク質への翻訳に必要な全ての要素を含む系であり、そこにＤＮＡを加えることによってそのＤＮＡがコードしているタンパク質が合成されるようなあらゆる系を指す。無細胞転写翻訳系の具体例としては、真核細胞、およびバクテリア細胞、又はそれらの一部からの抽出液に基づいて調製された転写翻訳系が挙げられる。無細胞タンパク質合成系として具体的には、大腸菌、植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球等の細胞抽出液等の既知のものが用いられる。これらは市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液は、Pratt, J. M.et al., Transcription and Tranlation, Hames, 179-209, B. D. & Higgins, S. J., eds), IRL Press, Oxford(1984)に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の無細胞タンパク質合成系、または細胞抽出液としては、大腸菌由来のものは、E.coli S30 extract system（Promega社製）とRTS 500 Rapid Tranlation System（Roche社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはRabbit Reticulocyte Lysate Sytem（Promega社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものはPROTEIOSTM（TOYOBO社製）等が挙げられる。
【００３９】
得られた無細胞転写翻訳系の転写翻訳産物からの、本発明で用いられるタンパク質の分離、および精製は、それ自体既知の通常用いられる方法で行うことができる。具体的には、エピトープペプチド（例えば、ポリヒスチジンペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質等）をコードするＤＮＡ領域を、前記した転写翻訳されるべきＤＮＡに導入し、前記の通り発現させ、該タンパク質と親和性を有する物質とのアフィニティーを利用して精製することができる。
【００４０】
目的とするタンパク質の発現は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等で分離し、クマシーブリリアントブルー（シグマ社製）等で染色するか、または後述する本発明で用いられるタンパク質に特異的に結合する抗体により検出する方法等によって確認できる。また一般的に、発現されたタンパク質は生体内に存在するタンパク質分解酵素により切断されること（プロセッシング）が知られている。本発明で用いられるタンパク質も当然のことながら切断されたアミノ酸配列の部分断片であっても、キナーゼ活性および／または細胞増殖活性を有するものであれば、本発明で用いられるタンパク質に含まれる。
【００４１】
（３）本発明で用いられるタンパク質が有する活性の確認
本発明で用いられるタンパク質は、これを上記（２）に記載のとおり組み換えタンパク質として作製し、これを解析することにより（１）で推測した活性を有していることを確認することができる。さらに下記（４）に記載の抗体等との組み合わせにより解析することもできる。
【００４２】
本発明で用いられるタンパク質が、キナーゼ活性を有することは、それ自体既知の常法を用いることができる。具体的な方法の例として、基質を該組み換えタンパク質に接触させ、該組み換えタンパク質のキナーゼ活性により基質がリン酸化される際に消費されるＡＴＰ量、生成物の量を測定する方法等を以下に説明する。
反応液としては、基質のリン酸化部位がセリン／スレオニンである、Ｓｅｒ／Ｔｈｒプロテインキナーゼの活性を測定する場合は、マグネシウムイオン、例えば５〜１００ｍＭの塩化マグネシウムあるいは酢酸マグネシウム、および還元剤として１〜１００ｍＭの２−メルカプトエタノール或いは１〜１０ｍＭのジチオスレイトールを含む、リン酸イオンの存在しない、中性から弱塩基性緩衝液、例えば５０ｍＭのトリス−塩酸あるいはＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）を用い、また、基質のリン酸化部位がチロシンであるＴｙｒプロテインキナーゼの活性を測定する場合は、塩化マンガン、塩化亜鉛、ＮａＶＯ3、ジチオスレイトールを含むトリス−塩酸あるいはＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）を用いることができる。
【００４３】
この反応液に、ＡＴＰおよびそれぞれに適した基質を加えた後、精製した本発明で用いられるタンパク質を添加し、室温〜３７℃で２４時間程度反応後、該タンパク質が有するキナーゼ反応により消費したＡＴＰ量、或いは該タンパク質により行われるキナーゼ反応による生成物を測定する。
ここで、受容体型キナーゼと予想されるタンパク質のキナーゼ活性を測定する場合には、該タンパク質の細胞内部分、あるいはキナーゼ活性中心部分のみを組み換えタンパク質として発現させて上記の反応に用いることが好ましい。
【００４４】
キナーゼ反応に関して、Ｓｅｒ／Ｔｈｒプロテインキナーゼである環状ヌクレオチド依存性プロテインキナーゼの場合、各キナーゼに対応する環状ヌクレオチドを反応液中に添加することが必要である。例えば、Ａ−キナーゼの場合は環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）を、Ｇ−キナーゼの場合は環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）を添加し、基質としてヒストンを用いる。
リン脂質依存性プロテインキナーゼの場合は、リン脂質を反応液中に添加する。例えば、Ｃ−キナーゼの場合、ホスファチジルセリンを添加し、基質としてヒストンを用いる。カルシウム依存性プロテインキナーゼの場合には、カルモジュリンを反応液に添加し、基質としてミオシンＬ鎖を用いる。ここには、ミオシンＬ鎖キナーゼ、カルモジュリンキナーゼが含まれる。チロシン特異的プロテインキナーゼの場合は、基質としてチューブリン、ヒストン、カゼイン、ミオシンＬ鎖、ガストリン、アンギオテンシン、チロシン−グルタミン酸（１：４）重合物等を用いる。
【００４５】
キナーゼ活性測定において、基質へのリン酸基の転移に先立ち、キナーゼによるＡＴＰのＡＤＰへの加水分解反応が起こる。ここで加水分解されたＡＴＰ量を測定することで、キナーゼ活性を定義づけることも可能である。この場合、基質非存在下で行った反応液中のＡＴＰ量を測定し、消費ＡＴＰ量をキナーゼ活性とする。
キナーゼ反応により消費したＡＴＰ量を測定する場合、上記キナーゼ反応液にルシフェリン、ルシフェラーゼを加え、一定時間反応後、添加したルシフェリン特有の蛍光波長で蛍光強度を測定し、残存ＡＴＰによる蛍光量とする。プロテインキナーゼおよび基質非存在下で測定した、反応液中に存在する全ＡＴＰ蛍光強度から上記蛍光強度を差し引いた値を、キナーゼ活性により消費したＡＴＰ量とし、酵素のキナーゼ活性とする。
【００４６】
キナーゼ反応による生成物を測定する場合は、反応液に添加するＡＴＰとして放射性同位元素である32ＰをＡＴＰのγ位に含んだ［γ−32Ｐ］ＡＴＰを用いる。キナーゼ反応終了後、反応液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、泳動後のゲルをＸ線フィルムによりオートラジオグラフィーを行い32Ｐの取り込まれたタンパク質バンドを検出する。また、反応液に１０％トリクロロ酢酸、或いは終濃度９０％となるようにエタノールまたはアセトンを加え、タンパク質を沈殿させる。その後遠心或いはフィルター濾過により上清を除き、さらに同溶液で数回洗浄した後乾燥し、基質タンパク質がリン酸化されたために不溶化画分に移行した32Ｐを液体シンチレーションカウンターで測定する。放射性同位元素を用いない方法としては、キナーゼ反応終了後の反応液を、クロマトグラフィーにより分離し、リン酸化された基質の溶出位置の変化および変化量で活性を測定することも可能である。この場合、クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーを用いることができる。また、基質のリン酸化による質量変化を質量分析装置で測定することにより、活性測定することも可能である。この場合、前述のクロマトグラフィー分離と併用することで、測定精度がさらに上昇する。
【００４７】
このようなキナーゼ活性の解析系は、本発明で用いられるキナーゼ活性を有するタンパク質のアゴニストやアンタゴニストの評価にも用いることができる。なお、本発明で用いられるタンパク質が有する活性の確認は、上記した方法に限定されるものではない。
【００４８】
（４）本発明で用いられるタンパク質の機能解析
かくして得られた完全長ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質であって、かつキナーゼ活性を有する本発明で用いられるタンパク質は、上記（３）で確認されたキナーゼ活性以外の機能、すなわち細胞増殖活性を解析することによりその新規の利用法が提供される（このキナーゼ活性以外の機能をさらに解析する対象となるタンパク質を、以下「解析対象タンパク質」と称することがある）。特に、本発明で用いられるタンパク質には、公知のタンパク質のバリアントが含まれるため、このバリアントが公知のバリアントとどのような異なる機能があるかを同定することは重要である。
【００４９】
具体的な機能の解析方法としては、例えば、（i）各組織、疾患、あるいは発生段階における発現状態を比較解析する方法、（ii）他のタンパク質、ＤＮＡとの相互作用を解析する方法、（iii）適当な細胞あるいは個体へ導入し、表現型の変化を解析する方法、（iv）適当な細胞あるいは個体において該タンパク質の発現を阻害して表現型の変化を解析する方法などが挙げられる。
【００５０】
（i）の方法においては、本発明で用いられるタンパク質の発現を、mRNAレベルあるいはタンパク質レベルで解析することができる。mRNAレベルで発現量を解析する場合は、例えば、in situハイブリダイゼーション法（In situ hybridization: Application to Developmental Biology & Medicine. ,Ed. by Harris, N. and Wilkinson, D. G.）,Cambridge University Press（1990））、DNAチップを利用したハイブリダイゼーション法、定量ＰＣＲ法等が用いられる。ここで、解析の対象タンパク質に公知のバリアントが存在する場合には、解析対象タンパク質をコードするcDNAにのみ存在し、公知のバリアントをコードするcDNAとはハイブリダイズしないプローブを用いることが好ましい。定量ＰＣＲ法の場合には、対象バリアントと公知バリアント間で異なる長さの増幅断片ができるプライマーを選択して行う方法（Wong, Y. W., Neuroscience Lett., 320, 141-145(2002)）等が挙げられる。また、タンパク質レベルで解析する場合には、後述する本発明で用いられるタンパク質に特異的に結合する抗体を用いた組織染色法などが挙げられる。この場合、対象タンパク質にのみ反応し、公知のバリアントには反応しない抗体を用いることが好ましい。
【００５１】
（ii）の相互作用の解析法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法等が挙げられる。該方法においても、解析対象タンパク質に公知のバリアントが存在する場合には、公知のバリアントも同様にして相互作用する物質を解析し、対象タンパク質特異的に相互作用する物質を同定することが好ましい。
【００５２】
（iii）の方法では、本発明で用いられるcDNAを導入する細胞は特に制限はないが、ヒト培養細胞等が特に好ましく用いられる。DNAの細胞への導入法としては、上記（２）に記載のものが挙げられる。さらに導入細胞の表現型としては、細胞の生死、細胞の増殖速度、細胞の分化、細胞が神経細胞の場合には神経突起の伸長度、細胞内タンパク質の局在や移行など顕微鏡等で観察可能なものや、細胞内の特定タンパク質の発現変化など生化学的実験により解析可能なものも含む。これらの表現型は、公知のバリアントが存在する場合には、公知のものも同様に細胞へ導入し、比較解析することにより解析対象バリアントに関連する表現型を同定することができる。また、本発明で用いられるタンパク質はキナーゼ活性を有するものであることがわかっているので、キナーゼが関連する疾患に見られる表現型等に注目して解析することも好ましい。
【００５３】
（iv）の方法では、後述するオリゴヌクレオチドを用いた方法や、RNAインターフェアレンス法により効率的に行うことができる。この方法においても、解析する対象タンパク質に、公知のバリアントが存在する場合には、公知のバリアントやその他のバリアントについても同様の解析を行い、比較解析することにより対象タンパク質特異的な機能を同定することができる。
【００５４】
かくして機能を解析された本発明で用いられるタンパク質は、キナーゼ活性に加えて細胞増殖活性を有することから、細胞増殖促進剤として用いられ得る。また、本発明で用いられるタンパク質は、脳組織(例えば胎児脳、正常脳など)等から構築されたcDNAライブラリーからクローニングされており、取得された本発明で用いられるタンパク質は、上記組織および器官等において特有の機能を有している可能性があるので、該組織および器官に特有の疾患の治療剤として用いられ得る。かかるタンパク質は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
【００５５】
（５）オリゴヌクレオチドの調製
上記（１）に記載の方法で取得した本発明で用いられるＤＮＡまたはその断片を用いて、ＤＮＡ合成機などを用いる常法により、本発明で用いられるＤＮＡの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。
【００５６】
該オリゴヌクレオチドとしては、上記ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを挙げることができる。具体例としては、配列番号１〜６で表される塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを挙げることができる。ここで、対象タンパク質に、公知のバリアントＤＮＡが存在する場合には、公知のバリアントと異なる部分の塩基配列を選択することが好ましい。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記のオリゴヌクレオチドが好ましい。また、配列の長さは、一般的には５〜１００塩基であり、好ましくは１０〜６０塩基であり、より好ましくは１５〜５０塩基である。
【００５７】
また、これらオリゴヌクレオチドの誘導体も本発明で用いられるオリゴヌクレオチドとして利用することができる。該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３'−Ｐ５'ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２'−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２'−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる。
【００５８】
また、本発明で用いられるオリゴヌクレオチドは、これを２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）として調製することにより、ＲＮＡインターフェアレンス法（ＲＮＡi法）に適用することができる。このうち、鎖長が短いもの特に２１塩基程度のものを「ｓｉＲＮＡ」(small interfering RNAs )と称することがある。２本鎖ＲＮＡの作製方法、及びＲＮＡインターフェアレンス法については、例えば、Elbashir, S., et al., Nature, 411, 494-498(2001)に記載の方法等を用いることができる。上記２本鎖ＲＮＡは、そのすべてがＲＮＡである必要はない。具体的には、その一部がＤＮＡであるものとして、ＷＯ０２／１０３７４号公報に記載のものを用いることができる。
【００５９】
このＲＮＡインターフェアレンス法において標的となる遺伝子（以下これを「標的遺伝子」と称することがある）は、本発明で用いられるＤＮＡであれば、如何なるものであってもよい。また、該遺伝子ＤＮＡのオルソログと予想される遺伝子も標的遺伝子とすることができる。これらのＤＮＡの少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一な配列を有するＲＮＡからなる２本鎖オリゴヌクレオチド（以下、これを「２本鎖オリゴヌクレオチド」と称することがある）とは、標的遺伝子の塩基配列のうち、いずれの部分でもよい１５ｂｐ以上の配列と実質的に同一な配列からなるものである。ここで、実質的に同一とは、標的遺伝子の配列と８０％以上の相同性を有することを意味する。
【００６０】
また、解析対象タンパク質が公知タンパク質と比較して、挿入型あるいは置換型バリアントである場合は、２本鎖オリゴヌクレオチド配列は挿入あるいは置換部位に設定することができる。また、解析対象タンパク質が公知タンパク質の欠失型バリアントである場合は、欠失部を跨ぐ配列を２本鎖オリゴヌクレオチド配列とすることにより、該タンパク質特異的に効果のある配列を選定することができる。さらに、解析対象タンパク質と公知タンパク質のそれぞれをコードするＤＮＡの塩基配列と比較して、解析対象タンパク質をコードするＤＮＡに特異的な塩基配列を選定することによれば、解析対象タンパク質特異的にその発現を阻害することができる。
【００６１】
ヌクレオチドの鎖長は１５ｂｐから標的遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長までの如何なる長さでもよいが、１５〜５００ｂｐ程度のものが好ましく用いられる。ただし、哺乳類動物由来の細胞においては、３０ｂｐ以上の長い２本鎖ＲＮＡに反応して活性化するシグナル伝達系の存在が知られている。これはインターフェロン反応と呼ばれており（Ｍａｒｅｕｓ，Ｐ．Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，５，１１５−１８０（１９８３））、該２本鎖ＲＮＡが細胞内に侵入すると、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ：Ｂａｓｓ，Ｂ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９（２００１））を介して多くの遺伝子の翻訳開始が非特異的に阻害され、それと同時に２'−５'−ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（Ｂａｓｓ，Ｂ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９（２００１））を介してＲＮａｓｅＬの活性化が起こり、細胞内のＲＮＡの非特異的な分解が惹起される。これらの非特異的な反応のために、標的遺伝子の特異的反応が隠蔽されてしまう。従って哺乳類動物または該動物由来の細胞あるいは組織を被導入体として用いる場合には１５〜３０ｂｐ、好ましくは１９〜２４ｂｐ、さらに好ましくは２１ｂｐの２本鎖オリゴヌクレオチドを用いることが好ましい。２本鎖オリゴヌクレオチドはその全体が２本鎖である必要はなく、５'または３'末端が一部突出したものも含むが、３'末端が２塩基突出したものを用いることが好ましい。２本鎖オリゴヌクレオチドは相補性を有する２本鎖のオリゴヌクレオチドを意味するが、自己相補性を有する１本鎖オリゴヌクレオチドが自己アニーリングしたものでもよい。自己相補性を有する１本鎖オリゴヌクレオチドとしては、例えば、逆方向反復配列を有するもの等が挙げられる。
【００６２】
２本鎖オリゴヌクレオチドの調製方法としては特に制限はないが、それ自体既知の化学合成方法を用いることが好ましい。化学合成は相補性を有する１本鎖オリゴヌクレオチドを別個に合成し、これを適当な方法で会合させることにより２本鎖とすることができる。会合の方法としては上記オリゴヌクレオチドを混合し、２本鎖が解離する温度にまで加熱し、その後徐々に冷却する方法等が挙げられる。会合した２本鎖オリゴヌクレオチドは、アガロースゲル等を用いて確認し、残存する１本鎖オリゴヌクレオチドを適当な酵素により分解する等して除去する。
【００６３】
このようにして調製した２本鎖オリゴヌクレオチドを導入する被導入体としては、標的遺伝子がその細胞内でＲＮＡに転写、またはタンパク質に翻訳を受け得るものであれば如何なるものであってもよいが、具体的には、植物、動物に属するものが挙げられる。植物は単子葉植物、双子葉植物または裸子植物であってよく、動物は、脊椎動物または無脊椎動物であってよい。脊椎動物の例には、魚類、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、マウス、ラット、及びヒトを含む哺乳動物が含まれ、無脊椎動物には、線虫、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、及び他の昆虫が含まれる。好ましくは、細胞は脊椎動物細胞である。
【００６４】
被導入体は、細胞、組織あるいは個体を意味する。ここで細胞とは、生殖系列または体性、分化全能、または多分化能、分割または非分割、実質組織または上皮、不滅化したものまたは形質転換したもの等からであってよい。細胞は、配偶子または胚であってよく、胚の場合、単一細胞胚または構成性細胞、または多重細胞胚からの細胞であり、胎児組織を含む。さらには、幹細胞のような未分化細胞、または胎児組織を含む器官または組織の細胞からのような分化細胞、または生物内に存在する任意の他の細胞であってよい。分化している細胞型には、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア細胞、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞及び内分泌腺または外分泌腺の細胞が含まれる。細胞増殖に関連する機能の解析においては、用いる細胞は培地にて増殖できる細胞であればいかなるものであってもよいが、ヒト由来の細胞が好ましく、具体的にはＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、神経芽腫由来細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、前骨髄性白血病由来細胞株ＨＬ６０等が挙げられる。
【００６５】
被導入体への２本鎖オリゴヌクレオチドの導入法としては、被導入体が細胞、あるいは組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウィルス感染、２本鎖オリゴヌクレオチド溶液への浸漬、あるいは形質転換法等が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウィスル感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には、植物体の体腔または間質細胞等への注入または灌流、あるいは噴霧による方法が用いられる。また、動物個体の場合には、経口、局所、非経口（皮下、筋肉内及び静脈内投与を含む）、経膣、経直腸、経鼻、経眼、腹膜内投与等によって全身的に導入する方法、あるいはエレクトロポレーション法やウイルス感染等が用いられる。経口導入のための方法には、２本鎖オリゴヌクレオチドを生物の食物と直接混合することができる。さらに、個体に導入する場合には、例えば埋め込み長期放出製剤等として投与することや、２本鎖オリゴヌクレオチドを導入した導入体を摂取させることにより行うこともできる。
【００６６】
導入する２本鎖オリゴヌクレオチドの量は、導入体や、標的遺伝子によって適宜選択することができるが、細胞あたり少なくとも１コピー導入されるに充分量を導入することが好ましい。具体的には、例えば、被導入体がヒト培養細胞で、カルシウムフォスフェート法により２本鎖オリゴヌクレオチドを導入する場合、０．１〜１０００ｎＭが好ましい。
ＲＮＡインターフェアレンスによる本発明で用いられる遺伝子の導入体内での発現抑制により、本発明で用いられる遺伝子がコードするタンパク質の機能の確認、あるいは新たな機能の解析等を行うことができる。
【００６７】
本発明で用いられるオリゴヌクレオチドは、臨床へ応用するに際し、例えば、遺伝子治療への応用が考えられる。本発明で用いられるタンパク質がキナーゼ活性および／または細胞増殖活性を有するので、遺伝子治療の標的となる疾患としては、例えば癌が好適であると考えられる。該オリゴヌクレオチドを遺伝子治療に用いる場合には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターなどを利用して、ex vivo法やin vivo法などにより患者へ投与すればよく、細胞増殖阻害剤として用いられ得る。
【００６８】
（６）本発明で用いられるタンパク質に特異的に結合する抗体
本発明で用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体の調製方法としては、通常用いられる公知の方法を用いることができ、抗原として用いられるポリペプチドについても、公知の方法に従って抗原性が高くエピトープ（抗原決定基）として適した配列を選択して用いることができる。エピトープの選択方法としては、例えばＥｐｉｔｏｐｅ  Ａｄｖｉｓｅｒ（富士通九州システムエンジニアリング社製）等の市販のソフトウェアを用いることができる。また、対象タンパク質に、公知のバリアントが存在する場合には、対象タンパク質にのみ反応し、公知の、またはそれ以外のバリアントには反応しない抗体を用いることにより、対象タンパク質に特異的な機能を同定することができる。このような抗体のエピトープとしては、例えば、対象タンパク質が公知のバリアントと比較して欠失しているアミノ酸配列がある場合、欠失部分の前後のアミノ酸配列（ジャンクション部分）等が好ましい。また、対象タンパク質が公知のバリアントのＮ末またはＣ末が添加されているアミノ酸配列を有する場合、添加されているアミノ酸配列をエピトープとすることも好ましい。上記以外の方法として、対象タンパク質に対して取得したポリクローナル抗体から、公知の、またはそれ以外のバリアントに反応する抗体を除去することにより、対象タンパク質にのみ反応する抗体を取得することができる。除去する方法としては、公知の、またはそれ以外のバリアントをリガンドとして固定したアフィニティークロマトグラフィー、或いは、公知の、またはそれ以外のバリアントによる免疫沈降法等が用いられる。
【００６９】
上記の抗原として用いるポリペプチドは、公知の方法に従って合成した合成ペプチドでも、また本発明で用いられるタンパク質そのものを用いることもできる。抗原となるポリペプチドは、公知の方法に従って適当な溶液等に調製して、哺乳動物、例えばウサギ、マウス、ラット等に免疫を行えばよいが、安定的な免疫を行ったり抗体価を高めるために抗原ペプチドを適当なキャリアタンパク質とのコンジュゲートにして用いたり、アジュバント等を加えて免疫を行うのが好ましい。
【００７０】
免疫に際しての抗原の投与経路は特に限定されず、例えば皮下、腹腔内、静脈内、あるいは筋肉内等のいずれの経路を用いてもよい。具体的には、例えばＢＡＬＢ／ｃマウスに抗原ポリペプチドを数日〜数週間おきに数回接種する方法等が用いられる。また、抗原の摂取量としては、抗原がポリペプチドの場合０．３〜０．５ｍｇ／１回程度が好ましいが、ポリペプチドの種類、また免疫する動物種によっては適宜調節される。
【００７１】
免疫後、適宜試験的に採血を行ってオクタローニー法、固相酵素免疫検定法（以下、これを「ＥＬＩＳＡ法」と称することがある）やウエスタンブロッティング等の方法で抗体価の上昇を確認し、十分に抗体価の上昇した動物から採血を行う。これに抗体の調製に用いられる適当な処理を行えばポリクローナル抗体を得ることができる。具体的には、例えば、公知の方法に従い血清から抗体成分を精製した精製抗体を取得する方法等が挙げられる。抗体成分の精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を用いることができる。
【００７２】
また、該動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを用いて公知の方法に従って融合させたハイブリドーマを用いる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５））ことによりモノクローナル抗体を作製することもできる。モノクローナル抗体は、例えば以下の方法により取得することができる。
まず、上記した抗原の免疫により抗体価の高まった動物から抗体産生細胞を取得する。抗体産生細胞は、形質細胞、及びその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体の何れから取得してもよいが、好ましくは脾臓、リンパ節、末梢血等から取得する。これらの細胞と融合させるミエローマとしては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来等）ミエローマ細胞株であるＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８０）、Ｐ３−ＮＳ１／１Ａｇ４．１（理研セルバンク：ＲＣＢ００９５）等が好ましく用いられる。細胞の融合は、抗体産生細胞とミエローマ細胞を適当な割合で混合し、適当な細胞融合培地、例えばＲＰＭＩ１６４０やイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、あるいはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等に、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を溶解したもの等を用いることにより行うことができる。また電気融合法（Ｕ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ，６８，５７７（１９８１））によっても行うことができる。
【００７３】
ハイブリドーマは、用いたミエローマ細胞株が８−アザグアニン耐性株であることを利用して適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）液を含む正常培地（ＨＡＴ培地）中で５％ＣＯ2、３７℃で適当時間培養することにより選択することができる。この選択方法は用いるミエローマ細胞株によって適宜選択して用いることができる。選択されたハイブリドーマが産生する抗体の抗体価を上記した方法により解析し、抗体価の高い抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等により分離し、分離した融合細胞を適当な培地で培養して得られる培養上清から硫安分画、アフィニティクロマトググラフィー等の適当な方法により精製してモノクローナル抗体を得ることができる。また精製には市販のモノクローナル抗体精製キットを用いることもできる。さらには、免疫した動物と同系統の動物、またはヌードマウス等の腹腔内で上記で得られた抗体産生ハイブリドーマを増殖させることにより、本発明で用いられるモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることもできる。
【００７４】
また、本発明で用いられるタンパク質としてヒト由来のものを取得した場合には、かかるポリペプチド、あるいはその部分ペプチドを抗原として、ヒト末梢血リンパ球を移植したＳｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）マウスに上記した方法と同様にして免疫し、該免疫動物の抗体産生細胞とヒトのミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製することによってもヒト型抗体を作製することができる（Ｍｏｓｉｅｒ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３３５，２５６−２５９（１９８８）；Ｄｕｃｈｏｓａｌ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５５，２５８−２６２（１９９２））。
【００７５】
また、取得したヒト型抗体を産生するハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、目的のヒト型抗体をコードする遺伝子をクローニングして、この遺伝子を適当なベクターに挿入し、これを適当な宿主に導入して発現させることにより、さらに大量にヒト型抗体を作製することができる。ここで、抗原との結合性の低い抗体は、それ自体既知の進化工学的手法を用いることによりさらに結合性の高い抗体として取得することもできる。一過性抗体等の部分フラグメントは、例えばパパイン等を用いてＦａｂ部分とＦｃ部分を切断し、アフィニティカラム等を用いてＦａｂ部分を回収することによって作製することができる。
【００７６】
かくして得られる本発明で用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体は、本発明で用いられるタンパク質に特異的に結合することによって該タンパク質が有するキナーゼ活性および／または細胞増殖活性等を阻害する中和抗体として用いることもできる。タンパク質が有する活性を阻害するものの選択方法としては特に制限はないが、例えば、上記（２）で作製したＤＮＡ導入体に抗体を接触または導入し、導入体中の目的タンパク質の機能が阻害されるか否かを解析する方法等が挙げられる。
【００７７】
かかる中和抗体は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
【００７８】
（７）本発明で用いられるタンパク質が有する活性を調節する分子のスクリーニングおよびスクリーニング用キット
本発明で用いられるタンパク質に特異的に結合し、かつ本発明で用いられるタンパク質の機能（活性）を阻害、拮抗または増強する作用を有する物質をスクリーニングすることにより本発明で用いられるタンパク質の機能調節物質（以下、これを「調節物質」と称することがある）を得ることができる。
【００７９】
この調節物質のスクリーニング方法は、本発明で用いられるタンパク質に特異的に結合し、且つ該タンパク質の活性を阻害、拮抗または増強する作用を有する物質が得られる方法であれば如何なるものであってもよい。例えば、先ずはじめに本発明で用いられるタンパク質とスクリーニングに供する物質（以下、これを「被検物質」と称することがある）とを接触させ、該タンパク質との結合性を指標として選抜した後に、本発明で用いられるタンパク質が有する活性の変化を指標として被検物質を選抜する方法を用いることができる。
【００８０】
被検物質としては、本発明で用いられるタンパク質と相互作用して、該タンパク質が有する活性に影響を及ぼす可能性のある物質であれば如何なるものであってもよいが、具体的には、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、低分子化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。これらの物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。被検物質と本発明で用いられるタンパク質の相互作用の解析法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法、あるいは上記（６）に記載した抗体との競合解析法等が挙げられる。このような方法により、本発明で用いられるタンパク質に結合する活性を見いだされた物質は、次に該物質の存在下で本発明で用いられるタンパク質が有する活性がどのような影響を受けるかを解析することによって、調節物質として用いられるか否かが同定される。ここで、対象タンパク質に、公知のバリアントが存在する場合には、対象タンパク質にのみ結合し、公知のまたは他のバリアントには結合しない物質についてその影響を解析するか、または公知のあるいは他のバリアントにおいても同様に結合するか否かを同定し、結合した場合にはその影響の相違を解析することによって、対象タンパク質に対する該物質の影響を解析することができる。また、該物質の個体内での分布を検討することにより、対象タンパク質や公知のまたは他のバリアントに対する影響を解析することができる。
【００８１】
具体的な解析方法としては、例えば、キナーゼ活性を調節する物質を解析する場合には、（２）に記載したＤＮＡ導入体に基質となるタンパク質も同様の方法で導入する。この導入体について選択された物質の存在下／または非存在下で基質となるタンパク質のリン酸化をそれ自体既知の通常用いられる方法により解析する。具体的には、上記（３）に記載の方法等を用いて行うことができる。基質となるタンパク質のリン酸化が、物質の非存在下の場合と比べて増加した場合には、該物質はキナーゼ活性物質として機能する可能性があり、また低下、または阻害された場合には物質はキナーゼ阻害物質として機能する可能性があると同定できる。また、細胞増殖活性を調節する物質を解析する場合には、（２）に記載したＤＮＡを導入した細胞、具体的にはＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞、ＨＬ６０細胞、各種正常細胞など、を選択された物質の存在／または非存在下で培養し、生存細胞数の計測あるいは生存細胞数に相関する細胞内ＡＴＰ含量の定量などそれ自体既知の通常用いられる方法により解析する。細胞増殖が、物質の非存在下の場合と比較して促進した場合は、該物質は細胞増殖促進剤として機能する可能性があり、また抑制、あるいは阻害された場合には該物質は細胞増殖阻害物質として機能する可能性があると同定できる。なお、本発明で用いられるタンパク質が有する活性を調節する物質のスクリーニングは、例えば、キナーゼ活性または細胞増殖活性のいずれかを指標にしてもよいし、これらの二つの指標を組合わせてもよい。
【００８２】
ここで、医薬活性成分の取得を目的として調節物質をスクリーニングするために用いる本発明で用いられるＤＮＡ、あるいは組み換えタンパク質を用いる場合は、ヒトのＤＮＡあるいはタンパク質を用いることが好ましい。さらに上記方法によってスクリーニングされた物質は、さらに生体内でのスクリーニングによって医薬候補としての選択を行ってもよい。なお、本発明で用いられるタンパク質の機能調節物質の評価は、上記した方法に限定されるものではない。
【００８３】
本発明で用いられるタンパク質が有するキナーゼ活性としては、例えば、癌に関連するパスウェイ上のシグナル伝達機能、心筋発達に関連するパスウェイ上のシグナル伝達機能、精子の運動性を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、生殖細胞分化を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、細胞分化を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、精子の分化を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、アルツハイマー病発症を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、グリセロール３燐酸を生成する機能、脳皮質発達、神経細胞等の遊走を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、脂肪酸やステロールの合成に関連する機能、細胞死に関連するパスウェイ上のシグナル伝達機能、インシュリンシグナル伝達等である。そこで、本スクリーニング方法により同定できる調節物質は、制癌剤、心疾患治療剤、不妊治療剤、再生組織誘導剤、アルツハイマー病治療剤、神経変性疾患治療剤、糖尿病治療剤、免疫・炎症性疾患治療剤として用いられ得るものである。また、本発明で用いられるタンパク質は、キナーゼ活性に加えて細胞増殖活性を有することから、該タンパク質または該タンパク質をコードする遺伝子を用いたスクリーニング法により同定できる調節物質は、細胞増殖促進剤または細胞増殖阻害剤として用いられ得る。
【００８４】
さらに、本発明で用いられるタンパク質は、脳組織(例えば胎児脳、正常脳など)等から構築されたcDNAライブラリーよりクローニングされており、上記組織および器官等において特有の機能を有している可能性があるので、該タンパク質または該タンパク質をコードする遺伝子を用いたスクリーニング法により同定できる調節物質は、該組織および器官に特有の疾患の治療剤として用いられ得る。
【００８５】
かかる調節物質は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
また、かかる調節物質のスクリーニング用キットは、本発明で用いられるタンパク質等を含有するものであればよい。
【００８６】
（８）本発明で用いられるＤＮＡの発現調節物質のスクリーニングおよびスクリーニング用キット
スクリーニングの方法としては、被検物質の存在下で本発明で用いられるタンパク質、あるいはそれをコードするｍＲＮＡの発現量を解析する方法等が挙げられる。具体的には、例えば、（２）に記載した本発明で用いられるタンパク質を発現する細胞を被検物質を含む適当な培地で培養し、該細胞内に発現している本発明で用いられるタンパク質量をＥＬＩＳＡ等の常法を用いて解析するか、あるいは該細胞内の本発明で用いられるタンパク質をコードするｍＲＮＡ量を、定量的逆転写ＰＣＲ法や、ノーザンブロット法等により解析することにより行うことができる。
【００８７】
被検物質としては、（７）に記載のものを用いることができる。この解析により、被検物質の非存在下で培養された当該細胞内で発現されたタンパク質、あるいはｍＲＮＡ量と比べてその量が増加すれば、この被検物質は本発明で用いられるＤＮＡの発現促進物質として機能する可能性があり、逆に減少した場合には、この被検物質は本発明で用いられるＤＮＡの発現阻害物質として用いられ得ると判断することができる。
【００８８】
かかる発現調節物質は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
また、かかる発現調節物質のスクリーニング用キットは、本発明で用いられるＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクターまたは該組換えベクターを導入した遺伝子導入細胞等を含有するものであればよい。
【００８９】
（９）本発明で用いられるＤＮＡの導入動物
上記（１）に記載の、本発明で用いられるＤＮＡを含む導入ＤＮＡを構築し、ヒト以外の哺乳動物の受精卵に導入して、これを雌個体卵管に移植して発生させることにより、本発明で用いられるＤＮＡが導入された非ヒト哺乳動物を作製することができる。より具体的には、例えば、雌個体をホルモン投与により過剰排卵させた後、雄と交配し、交配後１日目の卵管から受精卵を摘出し、該受精卵に導入ＤＮＡをマイクロインジェクション等の方法により導入する。この後、適当な方法で培養した後、生存している受精卵を、偽妊娠させた雌個体（仮親）の卵管に移植して出産させる。新生仔に目的のＤＮＡが導入されているか否かは、該個体の細胞から抽出したＤＮＡのサザンブロット解析を行うことにより同定することができる。ヒト以外の哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等が挙げられる。
【００９０】
かくして得られた本発明で用いられるＤＮＡの導入動物は、この個体を交配し、導入されたＤＮＡが安定的に保持されていることを確認しながら通常の飼育環境で継代飼育することによりその子孫を得ることができる。また、体外受精を繰り返すことによりその子孫を得て、系統を維持することもできる。
本発明で用いられるＤＮＡが導入された非ヒト哺乳動物は、本発明で用いられるＤＮＡの生体内における機能の解析や、またこれを調節する物質のスクリーニング系等として用いることができる。
【００９１】
（１０）本発明で用いられるタンパク質及びそれをコードする塩基配列を含むＤＮＡの他の利用
本発明で用いられるタンパク質は、それを基盤上に結合させた担体として利用することができる。また、本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列、例えば、配列番号１〜６に記載の塩基配列を有するＤＮＡ及びその部分断片は、それらを基板上に結合させた担体として用いられ得る。これらを、以下、「プロテインチップ」、「ＤＮＡチップ」または「ＤＮＡアレイ」（ＤＮＡマイクロアレイ及びＤＮＡマクロアレイ）と称することがある。これらのプロテインチップ、又はＤＮＡチップもしくはアレイには、本発明で用いられるタンパク質やＤＮＡ以外に、他のタンパク質やＤＮＡが含まれていてもよい。ここで、対象タンパク質に公知のバリアントが存在する場合、上記プロテインチップには対象タンパク質特異的なアミノ酸配列部分断片を用いることもできるが、他バリアントと異なる立体構造を有している可能性もあるためその全長を用いることもできる。また、ＤＮＡアレイには、対象タンパク質をコードするＤＮＡ配列のうち、他のバリアントＤＮＡと異なる配列を選択することが好ましい。
【００９２】
また、タンパク質やＤＮＡを結合させる基盤としては、ナイロン膜、ポリプロピレン膜等の樹脂基板、ニトロセルロース膜、ガラスプレート、シリコンプレート等が用いられるが、ハイブリダイゼーションの検出を非ＲＩ的に、例えば、蛍光物質等を用いて行う場合には、蛍光物質を含まないガラスプレート、シリコンプレート等が好適に用いられる。また該基盤へのタンパク質、あるいはＤＮＡの結合は、それ自体公知の通常用いられる方法により容易に行うことができる。これらのプロテインチップ、ＤＮＡチップ、あるいはＤＮＡアレイも、本発明で用いられる基盤の範囲に含まれる。
【００９３】
また、本発明で用いられるタンパク質のアミノ酸配列及びＤＮＡの塩基配列は、配列情報としても用いることができる。このＤＮＡの塩基配列には、対応するＲＮＡの塩基配列も含まれる。すなわち、得られたアミノ酸配列や塩基配列をコンピューターが読みとり可能な所定の形式で適当な記録媒体に格納することにより、アミノ酸配列や塩基配列のデータベースが構築できる。このデータベースには、他の種類のタンパク質やそれをコードするＤＮＡの塩基配列が含まれていてもよい。また、本発明においてデータベースとは、上記配列を適当な記録媒体に書き込み、所定のプログラムに従って検索を行うコンピューターシステムをも意味する。ここで適当な記録媒体としては、例えば、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＡＭ等の光ディスク、半導体メモリ等を挙げることができる。
【００９４】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００９５】
オリゴキャップ法によるｃＤＮＡライブラリーの作製
ヒト胎児脳(Brain, Fetal)組織より、文献（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））記載の方法によりｍＲＮＡを抽出した。さらに、オリゴｄＴセルロースを用いてポリ（Ａ）+ＲＮＡを精製した。
【００９６】
上記で取得したポリ（Ａ）+ＲＮＡよりオリゴキャップ法（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１３８，１７１−１７４（１９９４））によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。
まず、上記ＲＮＡをＢＡＰ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）およびＴＡＰ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ａｃｉｄ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で処理した後に、オリゴキャップリンカー（配列番号１３）をＲＮＡライゲースを用いて連結した。このＲＮＡ鎖を鋳型としてオリゴｄＴプライマー（配列番号１４）用いた逆転写反応により第１鎖ｃＤＮＡを合成し、続いてＲＮＡ鎖を分解除去した（鈴木ら、タンパク質  核酸  酵素、４１、６０３−６０７（１９９６）；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２００，１４９−１５６（１９９７））。次いで、５'のＰＣＲプライマー（配列番号１５）と３'のＰＣＲプライマー（配列番号１６）を用いＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により２本鎖ｃＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡ鎖をＳｆｉＩにより切断した。
【００９７】
次いで、発現用ベクターであるｐＭＥ１８ＳＦＬ３（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ００９８６４）のＤｒａＩＩＩサイトに上記で取得したＳｆｉＩ切断断片をクローニングし、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。上記で用いたｐＭＥ１８ＳＦＬ３ベクターは、クローニング部位の上流にＳＲαプロモーターとＳＶ４０  ｓｍａｌｌ  ｔイントロンが組み込まれており、またその下流にはＳＶ４０ポリＡ付加シグナル配列が挿入されている。ｐＭＥ１８ＳＦＬ３のクローン化部位は非対称性のＤｒａＩＩＩサイトとなっており、ｃＤＮＡ断片の末端にはこれと相補的なＳｆｉＩ部位を付加しているので、クローン化したｃＤＮＡ断片はＳＲαプロモーターの下流に一方向性に挿入される。したがって、全長ｃＤＮＡを含むクローンでは、得られたプラスミドをそのままＣＯＳ細胞に導入することにより、一過的に遺伝子を発現させることが可能である。すなわち、非常に容易に、遺伝子産物であるタンパク質として、あるいはそれらの生物学的活性として実験的に解析することが可能となっている。
【００９８】
これらより得たクローンのプラスミドＤＮＡについて、ｃＤＮＡの５'端または３'端の塩基配列をＤＮＡシーケンシング試薬（Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＫｉｔまたはＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、マニュアルに従ってシーケンシング反応後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００：ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）でＤＮＡ塩基配列を解析した。
【実施例２】
【００９９】
オリゴキャップ法で作製したｃＤＮＡライブラリーからのクローンの５'末端の全長性の評価
実施例１で作製したヒトｃＤＮＡライブラリーの５'末端の塩基配列は、これを公共データベース中のヒト既知ｍＲＮＡの配列と比較し、５'末端配列が一致する全クローンについて、公共データベース中の既知ｍＲＮＡ配列より長く５'末端が伸びている場合、または５'末端は短いが翻訳開始コドンは有している場合を「全長」と判断し、翻訳開始コドンを含んでいない場合を「非全長」と判断した。
【０１００】
次に、ＥＳＴｉＭａｔｅＦＬによるクローンの評価を行った。ＥＳＴｉＭａｔｅＦＬは、公共データベース中のＥＳＴの５'末端配列や３'末端配列との比較によって全長ｃＤＮＡの可能性の高いクローンを選択するために、ヘリックス研究所の西川・太田らにより開発された方法である。実施例１で解析したｃＤＮＡクローンの５'末端や３'末端配列をＥＳＴデータベースに登録されている塩基配列と比較し、取得されたｃＤＮＡクローンの配列よりも、５'側または３'側へ伸長しているＥＳＴが存在する場合には、そのクローンは「全長ではない可能性が高い」と判断した。公共データベース中のＥＳＴ配列より５'末端が伸長している場合、あるいは５'末端が短いクローンでも、その差が５０塩基以内の場合を便宜的に全長とし、それ以上短い場合を非全長とした。
【実施例３】
【０１０１】
ｃＤＮＡクローンの塩基配列、アミノ酸配列の解析
実施例２で解析したｃＤＮＡクローンの全塩基配列について、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５，  ４０３−４１０（１９９０））による相同性検索（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈ）や、ＨＭＭＥＲ（隠れＭａｒｋｏｖモデルによる配列解析手法；Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｒ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４，７５５−７６３（１９９８））の機能群のひとつであるＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索（ｐｒｏｆｉｌｅ  ｓｅａｒｃｈ：ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）を行い、各ｃＤＮＡクローンがコードするタンパク質の機能を推定した。また、その塩基配列の一部が完全に一致する公知のクローンが存在するスプライシングバリアントと推定されるクローンについては、そのゲノム配列が解析可能であればどのエクソンが欠失してスプライシングしたものであるかを解析した。
【実施例４】
【０１０２】
ｃＤＮＡクローンＦＣＢＢＦ２００３１０２（配列番号１、７）の配列解析
実施例３でキナーゼ活性を有すると推定されたｃＤＮＡクローンであるＦＣＢＢＦ２００３１０２（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号１に示すように２１５７塩基から成り、そのうち塩基番号２７から１７５７までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、５７６アミノ酸残基から成る（配列番号７）。
【０１０３】
配列番号７に示すアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool; Altschul, S.F., et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410(1990)）を用いて相同性検索を行ったところ、(1)特許配列データベース（ＧｅｎｅＳｅｑ）のアミノ酸配列データベース（ａａｇｅｎｅｓｅｑ）中の登録記号ＡＡＯ１５４１９(配列番号８；Novel human kinase protein 2、ＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＸ４５２８６５)がヒットした。その内容として、ＡＡＯ１５４１９は８１７アミノ酸からなり、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号２４２〜８１７が、配列番号７に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５７６と、ｅ−ｖａｌｕｅ：０．０、かつ５７６アミノ酸に亘り９９％の一致度であった。(2)特許配列データベース（ＧｅｎｅＳｅｑ）のアミノ酸配列データベース（ａａｇｅｎｅｓｅｑ）中の登録記号ＡＡＥ２４１３３（配列番号９；Human kinase (PKIN)-4 protein、ＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＸ５０４２３７）がヒットした。その内容として、ＡＡＥ２４１３３は８３５アミノ酸からなり、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号２６０〜８３５が、配列番号７に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５７６と、ｅ−ｖａｌｕｅ：０．０、かつ５７６アミノ酸に亘り１００％の一致度であった。(3) 特許配列データベース（ＧｅｎｅＳｅｑ）のアミノ酸配列データベース（ａａｇｅｎｅｓｅｑ）中の登録記号ＡＢＢ８２４７１(配列番号１０；Human serine/threonine protein kinase、ＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＸ５３４７３６) がヒットした。その内容として、ＡＢＢ８２４７１は８３５アミノ酸からなり、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号２６０〜８３５が、配列番号７に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５７６と、ｅ−ｖａｌｕｅ：０．０、かつ５７６アミノ酸に亘り１００％の一致度であった。(4)特許配列データベース（ＧｅｎｅＳｅｑ）のアミノ酸配列データベース（ａａｇｅｎｅｓｅｑ）中の登録記号ＡＡＢ６５６２１（配列番号１１；Novel protein kinase protein、ＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＸ０５６３８２）がヒットした。その内容として、ＡＡＢ６５６２１は６８６アミノ酸からなり、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号３１３から６８６が、配列番号７に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２０４から５７６と、ｅ−ｖａｌｕｅ：０．０、かつ３７４アミノ酸に亘り９８％の一致度であった。(5)ＴＲＥＭＢＬデータベース中の登録記号ＡＢ０５１５５２（配列番号１２;ＫＩＡＡ１７６５、ＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＢ０５１５５２）がヒットした。その内容として、ＡＢ０５１５５２は、６０８アミノ酸からなり、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号３３〜６０８が、配列番号７に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５７６と、ｅ−ｖａｌｕｅ：０．０、かつ５７６アミノ酸に亘り１００％の一致度であった。(6)特許配列データベース（ＧｅｎｅＳｅｑ）のアミノ酸配列データベース（ａａｇｅｎｅｓｅｑ）中の登録記号ＡＢＢ８２４７２(Human doublecortin-like and cam kinase-like 1)がヒットした。その内容として、ＡＢＢ８２４７２は７４０アミノ酸からなり、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号３８２〜６７４が、配列番号７に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２７６〜５６９と、ｅ−ｖａｌｕｅ：１×１０-87、かつ２９４アミノ酸に亘り５２％の一致度であった。
【０１０４】
次に、配列番号７に示すアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭ(profile search:http://pfam.wustl.edu)によるタンパク質特徴検索を行ったところ、アミノ酸番号２８４〜５４１にプロテインキナーゼの触媒ドメインの特徴をしめす配列（Ｐｆａｍにｐｋｉｎａｓｅとしてエントリーされるアミノ酸配列）がヒットした。ＢＬＡＳＴの相同性検索でヒットしたＡＡＯ１５４１９（配列番号８；ＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＸ４５２８６５）、ＡＡＥ２４１３３（配列番号９；ＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＸ５０４２３７）、ＡＢＢ８２４７１（配列番号１０；ＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＸ５３４７３６）、ＡＡＢ６５６２１（配列番号１１；ＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＸ０５６３８２）およびＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＢ０５１５５２（配列番号１２）の示すアミノ酸配列に関してもＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索を行ったところ、同様のプロテインキナーゼの触媒ドメインの特徴をしめす配列（Ｐｆａｍにｐｋｉｎａｓｅとしてエントリーされるアミノ酸配列）がヒットした。更に、ＡＡＯ１５４１９、ＡＡＥ２４１３３、ＡＢＢ８２４７１およびＡＡＢ６５６２１に関しては、Doublecortinコンセンサスドメインを示す配列（ＰｆａｍにＤＣＸとしてエントリーされるアミノ酸配列）がヒットしたが、配列番号７に示すアミノ酸配列とＡＢ０５１５５２のアミノ酸配列についてはヒットしなかった。
【０１０５】
上記ＡＡＯ１５４１９、ＡＡＥ２４１３３、ＡＢＢ８２４７１およびＡＡＢ６５６２１に対応する塩基配列は、特許配列データベース（ＧｅｎｅＳｅｑ）の塩基配列データベース（ｎａｇｅｎｅｓｅｑ）中の登録記号ＡＡＬ４４０１７(配列番号２；Novel human kinase protein coding sequence 2)、ＡＡＤ３８８４７(配列番号３；Human kinase (PKIN)-4)、ＡＢＶ７３２８７(配列番号４；Human serine/threonine protein kinase coding sequence)およびＡＡＦ４４６４７（配列番号５；Novel protein kinase cDNA）であることを、ＡＡＬ４４０１７、ＡＡＤ３８８４７、ＡＢＶ７３２８７およびＡＡＦ４４６４７の示す塩基配列からオープンリーディングフレームを調査し、そのアミノ酸配列がそれぞれＡＡＯ１５４１９、ＡＡＥ２４１３３、ＡＢＢ８２４７１およびＡＡＢ６５６２１と一致することで確認した（表１）。なお、ＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＢ０５１５５２については、アミノ酸配列データベースＴＲＥＭＢＬデータベースでも塩基配列データベースＥＭＢＬでも同じ登録記号ＡＢ０５１５５２付与されていた。
【０１０６】
本ＤＮＡのエクソン構造を明らかにするために、ｃＤＮＡ塩基配列をゲノム塩基配列へ写像するソフトウェアｓｉｍ４(Genome Res. 8, 967-974 (1998)) を用いて、配列番号１に示すｃＤＮＡ、ＡＡＬ４４０１７（配列番号２；ＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＸ４５２８６５）、ＡＡＤ３８８４７（配列番号３；ＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＸ５０４２３７）、ＡＢＶ７３２８７（配列番号４；ＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＸ５３４７３６）、ＡＡＦ４４６４７（配列番号５；ＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＸ０５６３８２）およびＡＢ０５１５５２（配列番号６）の６つの塩基配列をゲノム塩基配列上にそれぞれマッピングした結果、３番染色体３ｐ２２．３の領域のゲノム塩基配列にそれぞれ、４個、５個、５個、５個、４個、４個のエクソンとしてマッピングされた。配列番号１に示すｃＤＮＡの４つのエクソンは、ＡＡＬ４４０１７、ＡＡＤ３８８４７およびＡＢＶ７３２８７の各々２から５番目のエクソンに対応しており、配列番号１に示すｃＤＮＡは、ＡＡＬ４４０１７、ＡＡＤ３８８４７およびＡＢＶ７３２８７のｃＤＮＡの１番目のエクソンに対応するエクソンを持っていないことが解った。配列番号１に示すｃＤＮＡの４つのエクソンは、ＡＢ０５１５５２の４つのエクソンと対応し、その塩基配列の違いはＡＢ０５１５５２の方が、第１エクソンの５'末端側が７１塩基長く、第４エクソンの３'末端側が２５０６塩基長いことであった。ＡＡＦ４４６４７は、5末端'側のエクソンがゲノム上にマッピングできなかったが、マッピングできた４つのエクソンは配列番号１に示すｃＤＮＡの４つのエクソンに対応したが、配列番号１に示すｃＤＮＡの1つ目のエクソンに比べて、ＡＡＦ４４６４７のエクソンは5'末端側が短かった。また、ＡＡＬ４４０１７の第１エクソンと比較して、ＡＡＤ３８８４７およびＡＢＶ７３２８７の第１エクソンは、ゲノム上の異なった部位にマッピングされた。このことからＡＡＬ４４０１７とＡＡＤ３８８４７およびＡＢＶ７３２８７はお互いにスプライスバリアントの関係にあることが解った。
【０１０７】
以上のことから、本ＤＮＡは、Doublecortin 様のプロテインキナーゼ遺伝子のｃＤＮＡであるＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＸ４５２８６５（配列番号２）、ＡＸ５０４２３７（配列番号３）、ＡＸ５３４７３６（配列番号４）およびＡＸ０５６３８２（配列番号５）のバリアントであることが解った。本ＤＮＡの発現量とＡＸ４５２８６５、ＡＸ５０４２３７、ＡＸ５３４７３６およびＡＸ０５６３８２の発現量は、組織、発生・分化の時期、および疾患などにおいて異なる可能性もある。
【０１０８】
本タンパク質は、プロテインキナーゼドメインは持つが、Doublecortin  ドメインを持たないことによって、ＡＸ４５２８６５、ＡＸ５０４２３７、ＡＸ５３４７３６およびＡＸ０５６３８２がコードするタンパク質とは機能が異なることが推測された。Doublecortinドメインは微小管との会合に関与することが知られている(Hum Mol Genet. Sep;8(9):1599-610.(1999))。このことから、本タンパク質は、たとえば、微小管との会合等においてＡＸ４５２８６５、ＡＸ５０４２３７、ＡＸ５３４７３６およびＡＸ０５６３８２がコードするタンパク質とは機能が異なる可能性もある。
【０１０９】
プロテインキナーゼは、細胞増殖や癌に関連するパスウェイ上のシグナル伝達機能、心筋発達に関連するパスウェイ上のシグナル伝達機能、精子の運動性を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、生殖細胞分化を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、細胞分化を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、グリセロール３燐酸を生成する機能、脳皮質発達、神経細胞等の遊走を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、脂肪酸やステロールの合成に関連する機能等に関与することが知られており、プロテインキナーゼである本タンパク質は、癌、免疫・炎症性疾患、心疾患、不妊、形態形成異常、神経疾患、循環器疾患、骨系統疾患、内分泌疾患、ストレス性疾患、ウイルス性疾患などのさまざまな疾患に関与することが示唆された。
【０１１０】
本ＤＮＡは、胎児の脳由来のｃＤＮＡライブラリーからクローニングされたものである。また、上記に述べたように本ＤＮＡと相同性のあることが解ったヒト doublecortin-like and cam kinase-like 1は脳特異的な発現を示すことが知られている（Genomics. Feb 15;56(1):121-6 (1999)）。以上のことから、本ＤＮＡも脳で発現する可能性がある。また、ヒト doublecortin-like and cam kinase-like 1は、中枢神経系の発生・分化に関与し、X染色体に連鎖した滑脳症や、皮質下帯状異所性灰白質の関連遺伝子であることが知られており（Genomics. Feb 15;56(1):121-6 (1999)）、本タンパク質も、神経系細胞の増殖や遊走、中枢神経系の発生・分化に関連し、脳形成異常、パーキンソン病・アルツハイマー病、うつ病、統合失調症等の神経疾患に関与する可能性がある。
【実施例５】
【０１１１】
キナーゼ活性の測定
（１）タンパク質の調製
実施例３および実施例４でキナーゼ活性を有すると推定されたｃＤＮＡクローンであるＦＣＢＢＦ２００３１０２について、これがコードするタンパク質を無細胞タンパク質合成系を用いて合成し、該タンパク質がキナーゼ活性を有するか否かを以下の生化学的実験により解析した。
【０１１２】
ＦＣＢＢＦ２００３１０２のオープンリーディングフレーム（ORF）断片を、５'側のプライマーとして各クローンに特異的な下記プライマー、３'側のプライマーとして下記の共通プライマーを使用したPCR法によって取得した。
５'側のプライマー
TGAGGCACCAGGGGAA（配列番号１７）
３'側のプライマー
GGCCCTTATGGCCGGAGAAAGGCGGACAGGTAT（配列番号１８）
これを、SP6プロモーターを含む翻訳制御領域−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子−PreScission Protease（アマシャムファルマシアバイオテク社製）切断サイト−DNAクローニングサイト（SmaI,SfiI）−ポリＡシグナル配列を有するベクター（ｐＥＵ−ＳＳ４）のクローニングサイトに挿入した。
【０１１３】
上記で調製されたプラスミドＤＮＡを鋳型として、SP6 RNA Polymerase（Promega社製）を用いて転写を行い、得られたRNAをフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿の後、Nick Column（Amersham Pharmacia Biotech社製）によって精製した。
透析法によるコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成の方法は既報（Endo, Y. et al., (1992) J. Biotech., 25, 221-230）の方法に従った。反応溶液は、容量の２４％のコムギ胚芽抽出液を含み、上記Ericksonらの方法に準じた以下の成分組成である。20 mM HEPES-KOH、pH 7.6、80 mM酢酸カリウム、1.6 mM酢酸マグネシウム、0.4 mMスペルミジン、2 mMジチオスレイトール、20種類のL-アミノ酸(各 0.24 mM)、1.2 mM ATP、0.26 mM GTP、16 mMクレアチンリン酸、0.4 mg/mlクレアチンキナーゼ、1000 units/ml ribonuclease inhibitor (RNasinTM)に、上述したmRNA (1 mg/ml反応容量) を添加して用いた。
【０１１４】
上記反応溶液をフロータ・ライザー（Spectra / Float-A-Lyzer (Biotech RC)、分画分子量: 10 kDa, 容量: 1 ml）に入れ、反応液の40倍容量の透析外液（30 mM HEPES-KOH、pH 7.6、100 mM酢酸カリウム、2.7 mM酢酸マグネシウム、0.4 mMスペルミジン、2.5 mMジチオスレイトール、20 種類のL-アミノ酸(各 0.3 mM)、1.2 mM ATP、0.25 mM GTP、16 mMクレアチンリン酸）に対しての透析系で、反応は26℃で、48時間行った。
【０１１５】
反応終了後、透析内液を１６，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を分離した。この上清を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で５倍希釈し、同緩衝液で平衡化したアフィニティ樹脂であるグルタチオンセファロース・４Ｂ（アマシャムバイオサイエンス社製）を充填したアフィニティカラムに室温で添加し、目的タンパク質を吸着した。ここで、上記カラムには、取得した遠心上清の１／２量のアフィニティ樹脂を用いた。
【０１１６】
さらに、上記で用いたアフィニティ樹脂の１０倍容量の同緩衝液にてカラムを洗浄した後、２ｕｎｉｔｓ／μｌ濃度のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）の同緩衝液による２５倍希釈液を、アフィニティ樹脂と等容量添加し、４℃で４０時間切断反応を行った後、上記緩衝液にて目的タンパク質を溶出した。
【０１１７】
（２）目的タンパク質のＡＴＰ消費量を指標とするキナーゼ活性の測定
上記（１）で単離した目的タンパク質は、ウシ血清アルブミンを標準として定量した。０．１μｇの目的タンパク質を、０．２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、８ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で、終濃度１〜１０ｍＭとなるようにジチオスレイトールを添加後、１μＭのＡＴＰと室温で２４時間インキュベートした後、ルシフェラーゼ・ルシフェリンキット（和光純薬工業社製）１００μｌを加え、室温で２４時間反応した後、５６０ｎｍの蛍光強度を測定した。目的タンパク質を添加していない反応系をコントロールとして、同様に５６０ｎｍの蛍光強度を測定した。このコントロールの値と目的タンパク質を添加した系の値の差を目的タンパク質が消費したＡＴＰ量として、目的タンパク質１ｍｏｌあたりが２４時間に消費するＡＴＰ量（ｍｏｌ）を目的タンパク質のキナーゼ活性として同定した。
【０１１８】
（３）目的タンパク質によるポリペプチドのリン酸化を指標としたキナーゼ活性の測定
上記（１）で単離した目的タンパク質は、ウシ血清アルブミンを標準として定量した。０．１μｇの目的タンパク質を、基質としての標準ポリペプチド（Ｃｄｃ２、Ａｒｇ２−ＯＨ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＰＴＫ１、ＰＴＫ２：Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＭＬＣＫＳ、ＣａＭＫＩＩ：Ｓｉｇｍａ社、Ｓｙｎｔｉｄｅ２：ＢＡＣＨＥＭ  ＦＥＩＮＣＨＥＭＩＫＡＬＩＥＮ  ＡＧ）０．２μｇとともに、０．２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１〜１０ｍＭジチオスレイトール、８ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１μＭ  ＡＴＰと室温で２時間インキュベートした。反応終了後、反応液を、２０％アセトニトリルを含む０．１％トリフルオロ酢酸で平衡化したＢａｋｅｒｂｏｎｄ  Ｃ１８（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社製：０．４６×２５ｃｍ）カラムに添加し、０．１％トリフルオロ酢酸の存在下で、２０〜８０％のアセトニトリルの６０分間の直線濃度勾配により流速１ｍｌ／分でペプチドを分離した。ペプチドの溶出は、２１５ｎｍの吸光度により測定した。コントロールとして目的タンパク質を添加しない反応液についても同様に分離し２１５ｎｍの吸光度を測定した（図１）。ここで、目的タンパク質を添加することによってピークの減少および溶出位置の変動が検出されるポリペプチドについては、目的タンパク質の有するキナーゼ活性の基質となると判断することができる。
【０１１９】
（４）測定結果
本タンパク質のＡＴＰ消費活性を指標としたキナーゼ活性を、上記（２）の系で測定したところ、98.9であり、また、ペプチド基質に対する反応性を検討したところ（上記（３））、カルモジュリンキナーゼII基質ペプチド（ＣａＭＫＩＩ）とSyntide2の２種類に反応し（Syntide2に対する反応がやや強かった）これらを基質としてリン酸基の転移によるピークシフトが認められた（図２）ことから、キナーゼ活性を有することが確認された。なお、ネガティブコントロールとして、上記（１）の系でセリンプロテアーゼをコードするマウス全長ｃＤＮＡであるＢ４３０２０６Ｅ１８（配列番号３６、Nature，420: 563‐573(2002)）から合成・単離したタンパク質０．１μｇを用いたが、上記（２）の系の測定でＡＴＰ消費活性は認められず、また上記（３）の測定でもリン酸基の転移による基質のピークシフトは認められなかった。
【実施例６】
【０１２０】
定量ＰＣＲ法を用いたヒト細胞株および組織での発現解析
本発明で用いられるヒトタンパク質をコードするｍＲＮＡ（ＦＣＢＢＦ２００３１０２）のヒト細胞株、並びに正常ヒトおよび疾患患者での組織発現変動を検討するために、常法（Higuchi R, et al., Biotechnology, 11: 1026-30 (1993)）に従い、定量ＰＣＲ法を用いた発現解析を行った。
（１）ｃＤＮＡ合成および入手
ヒト由来細胞株である、ヒト子宮頸部癌由来細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）、ヒト胎児腎臓由来細胞株ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）、神経芽腫由来細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２６６）、前骨髄性白血病由来細胞株ＨＬ６０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）、肝臓癌由来細胞株ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６５）、星状細胞腫由来細胞株ＫＩＮＧＳ−１（ＪＣＲＢ  ＩＦＯ５０４３５）、神経芽腫由来細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１１）、膵臓癌由来細胞株ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４６９）、結腸直腸腺癌由来細胞株ＳＷ６２０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２７）、乳癌由来細胞株ＢＴ−４７４（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２０）および転移性膵臓腺癌由来細胞株ＡｓＰＣ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６８２）から全ＲＮＡを抽出し、ランダムプライマーを用いて鋳型ｃＤＮＡを合成した。
【０１２１】
以下のヒト組織由来ｃＤＮＡはクロンテック社から購入した（正常乳房、乳癌、正常結腸、結腸癌、正常腎臓、腎臓癌、正常肝臓、肺癌、正常直腸、直腸癌、正常小腸、小腸癌、正常胃、胃癌、および胎盤）。以下のヒト組織由来ｃＤＮＡはバイオチェイン社から購入した（胎児脳、正常脳、正常前頭葉、アルツハイマー病前頭葉、正常海馬、アルツハイマー病海馬、正常視床、正常腎臓、ループス病腎臓、正常肝臓、肝硬変肝臓、正常膵臓、正常骨格筋、正常脂肪、正常脾臓、心臓、および白血球）。
【０１２２】
（２）ＰＣＲ法による定量
本発明で用いられるヒトタンパク質をコードしているｍＲＮＡ（ＦＣＢＢＦ２００３１０２）の定量は、ABI PRISM7000 Sequence Detection System（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、反応溶液には上記ｃＤＮＡを鋳型とし、qPCR Mastermix Plus（EUROGENTEC社 RT-QP2X-03-075+）、３００ｎＭ  ５'側プライマー，３００ｎＭ  ３'側プライマー，および１００ｎＭ  ２重標識プローブを使用し、機器のマニュアルに従い実施した。
定量ＰＣＲに用いたプライマーおよびプローブの合成ＤＮＡ配列を以下に示す。
（ａ）ＦＣＢＢＦ２００３１０２の定量用
５'側プライマー；CTATGCGATGAAGATCATTGACAAG（配列番号１９）
３'側プライマー；CGTACTCCAGGATCAGGTAGATTTC（配列番号２０）
２重標識プローブ；TCACCCCAACATCGTGAAATTGCATG（配列番号２１）
（ｂ）ヒトＧＡＰＤＨの定量用
５'側（フォワード）プライマー；ACACCCACTCCTCCACCTTTGA（配列番号２２）
３'側（リバース）プライマー；CCTGTTGCTGTAGCCAAATTCG（配列番号２３）
２重標識（TaqMan）プローブ；TTGCCCTCAACGACCACTTTGTCAAGC（配列番号２４）
定量結果は、Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（ＧＡＰＤＨ）を内部標準として、補正した。即ち、各組織での対象遺伝子の発現量をＧＡＰＤＨの発現量で除し、常数（１×１０5）を乗して表示した。ＦＣＢＢＦ２００３１０２のヒト細胞株での発現解析結果を表２に、ＦＣＢＢＦ２００３１０２の正常ヒトおよび疾患患者での組織発現解析結果を表３にそれぞれ示す。
【０１２３】
【表２】
2005245274.tif 000003
【０１２４】
【表３】
2005245274.tif 000004
【０１２５】
表２から明らかな通り、ＦＣＢＢＦ２００３１０２のｍＲＮＡは、前骨髄性白血病由来細胞株ＨＬ６０、結腸直腸腺癌由来細胞株ＳＷ６２０、神経芽腫由来細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙなどで発現が高かった。表３から明らかな通り、ＦＣＢＢＦ２００３１０２のｍＲＮＡは、全体的に発現量が低いが、胎盤の他、正常および癌の胃・小腸・直腸など消化器系組織、脳・胎児脳など神経系組織、脾臓・白血球など免疫・炎症に関連する組織に発現が認められた。
【０１２６】
以上の結果から、上記ｃＤＮＡおよび該ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質は、
脳、消化管、免疫関連組織に発現しており、脳腫瘍・神経芽腫・胃癌・小腸癌・大腸癌・白血病などの各種癌や、免疫・炎症性疾患、統合失調症・うつ病などの中枢性疾患、アルツハイマー病・パーキンソン病などの神経変性疾患、消化器系疾患、クローン病などの治療や診断に応用できる。また該ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質は、上記のようなｍＲＮＡ発現量の多い組織に関わる疾患に関与している可能性がある。
【実施例７】
【０１２７】
ＦＣＢＢＦ２００３１０２を標的遺伝子として設計したsiRNAを用いたＲＮＡインターフェアレンス法による機能解析
（１）siRNAの作製
ＦＣＢＢＦ２００３１０２を標的遺伝子として設計したsiRNAをHEK293細胞内に導入し、このｓｉＲＮＡの導入がＦＣＢＢＦ２００３１０２の発現およびHEK293細胞の増殖に及ぼす効果を調べた。なお、ネガティブコントロールsiRNAはホタル（Photinus pyralis）のluciferase遺伝子（P. pyralis luc遺伝子：配列番号３４）の配列に対応して設計したものを用いた。
【０１２８】
本実施例に用いたsiRNAの作製に使われた２１塩基RNAは、配列番号２５〜３０で示すものである。配列番号２５、２７、２９で示す配列はsiRNAのセンス鎖に、また配列番号２６、２８、３０で示す配列は各々のアンチセンス鎖に対応する。これらのRNAは日立計測器サービス株式会社を通じてプロリゴ社（旧名ジェンセット社）に合成を委託した。配列番号２５および配列番号２７に示す配列は、標的遺伝子であるＦＣＢＢＦ２００３１０２の翻訳開始部位（配列番号１の塩基番号２７）から数えてセンス鎖の１２９６〜１３１６および１３３７〜１３５７番目の塩基に示される配列（すなわち配列番号１の塩基番号１３２２〜１３４２および塩基番号１３６３〜１３８３に示される配列）にそれぞれ相当する。また配列番号２６および配列番号２８に示す配列は、ＦＣＢＢＦ２００３１０２の翻訳開始部位から数えてアンチセンス鎖の１３１４〜１２９４および１３５５〜１３３５番目の塩基に示される配列（すなわち配列番号１の塩基番号１３２０〜１３４０および塩基番号１３６１〜１３８１に示される配列の相補配列）にそれぞれ相当する。また配列番号２９および配列番号３０に示す配列は、P. pyralis luc遺伝子の翻訳開始部位（配列番号３４の塩基番号１）から数えてセンス鎖の２０〜４０番目の塩基およびアンチセンス鎖の３８〜１８番目の塩基に示される配列（すなわち配列番号３４の塩基番号２０〜４０に示される配列および塩基番号１８〜３８に示される配列の相補配列）にそれぞれ相当する（図５）。
【０１２９】
ＦＣＢＢＦ２００３１０２遺伝子の発現を阻害するために用いた２本鎖siRNAの作製法を以下に示す。配列番号２５のセンス鎖と配列番号２６のアンチセンス鎖とを会合させることでＦＣＢＢＦ２００３１０２−１２９４のsiRNAを作製した。同様に、配列番号２７のセンス鎖と配列番号２８のアンチセンス鎖とを会合させることでＦＣＢＢＦ２００３１０２−１３３５のsiRNAを、配列番号２９のセンス鎖と配列番号３０のアンチセンス鎖とを会合させることでネガティブコントロールsiRNAを作製した。会合は、上記の合成委託先会社に依頼するか、または、センス１本鎖RNAおよびアンチセンス１本鎖RNAそれぞれを単品で受領し、自ら会合した。後者の場合は、センス鎖RNAおよびアンチセンス鎖RNAの混合物を10μM Tris-HCl（pH7.5）、 20μM NaCl反応液中で９０℃にて２分間加熱し、更に漸次３７℃まで降温した後に、３７℃にて１時間インキュベートし、その後、室温になるまで放置することで行った。これによりセンス鎖とアンチセンス鎖は会合し２本鎖RNAが形成される。２本鎖RNAの形成は、TBE緩衝液中での２％アガロースゲル電気泳動で検定するが、上記条件で殆どすべての１本鎖RNAが２本鎖RNAに会合していた。
以下に用いた２本鎖ｓｉＲＮＡの配列を記載する。
（ａ）ＦＣＢＢＦ２００３１０２−１２９４のｓｉＲＮＡ
センス鎖；GCAUGUGGUGAGACCUAUAUU（配列番号２５）
アンチセンス鎖；UAUAGGUCUCACCACAUGCUU（配列番号２６）
（ｂ）ＦＣＢＢＦ２００３１０２−１３３５のｓｉＲＮＡ
センス鎖；CUUACGUAGCUCCCGAAAUUC（配列番号２７）
アンチセンス鎖；AUUUCGGGAGCUACGUAAGUU（配列番号２８）
（ｃ）ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡ
センス鎖；UAAAGAAAGGCCCGGCGCCAU（配列番号２９）
アンチセンス鎖；GGCGCCGGGCCUUUCUUUAUG（配列番号３０）
【０１３０】
（２）siRNAの培養細胞への導入
培養細胞としてはHEK293細胞(ヒトアデノウイルス５型でトランスフォームしたヒト胎児腎細胞、大日本製薬)を用い、培地はDulbecco's modified Eagle's medium（シグマ社製）に非慟化１０％牛胎児血清（ＪＲＨ社製）及び抗生物質としてpenicillin１００units／ml、streptomycin１００μg／ml（インビトロジェン社製）を添加したものを用い、３７℃、５％CO2存在下で培養した。
【０１３１】
このHEK293細胞は０．９×１０5cells／mlの密度で２４穴プレート（コラーゲンタイプ１コート済、岩城硝子社製）に１ウェル当たり１ｍｌの量で播種し、１日後にGeneSilencer siRNA Transfection Reagent（Gene Therapy Systems社製）を用いて、合計５０nMの各siRNAを導入した。siRNA の濃度は、２本鎖RNAの状態を１分子と見なし、最終的に１ウェル当たり１ｍｌの培地が存在している状態でのモル濃度で表示した。
【０１３２】
（３）培養細胞内の遺伝子発現量の測定
上記実施例７（２）で調製した細胞は、siRNA導入４８時間後にLysis Solution（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて可溶化することにより回収し、核酸抽出装置ABI PRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてトータルRNAを抽出精製した。更にReverseTranscriptaseXL(AMV) for RT-PCR、Ribonuclease inhibitor、Random Primer、25mM MgCl2溶液、10xPCR Buffer（以上TaKaRa社製）、dNTP Mixture(10mM)（TOYOBO社製）を用いて逆転写反応を行い、cDNA標品を得た。このようにして得られたcDNA標品を鋳型として、定量PCR装置ABI PRISM 7000（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて目的遺伝子mRNAの定量を行った。定量手法はアプライドバイオシステムズ社のTaqManケミストリーを利用した。当該手法に用いたフォワードプライマー、リバースプライマー、TaqMan プローブ（ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ２重標識）の配列を配列番号２２〜２４、３１〜３３に示す。配列番号３１、３２、３３に示す配列は、それぞれＦＣＢＢＦ２００３１０２の定量のためのフォワードプライマー、リバースプライマー、TaqMan プローブを示す。また、配列番号２２、２３、２４に示す配列は、それぞれヒトGAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、配列番号３５）の定量のためのフォワードプライマー、リバースプライマー、TaqMan プローブを示す。これらのフォワードプライマー、リバースプライマー、TaqMan プローブの合成はアプライドバイオシステムズジャパン社に委託した。定量用の試薬としてｑＰＣＲマスターミックスプラス（二ッポンジーン社製）を用いた。ＦＣＢＢＦ２００３１０２のmRNAの発現量は、ＦＣＢＢＦ２００３１０２の定量値をGAPDHの定量値で標準化することによって求めた。
【０１３３】
HEK293細胞におけるＦＣＢＢＦ２００３１０２遺伝子の発現は、２種類のsiRNAのいずれによっても阻害された（図３）。値はいずれも、ＦＣＢＢＦ２００３１０２遺伝子の発現量（GAPDH量にて標準化）をsiRNAのトランスフェクション操作を行っていない細胞群（非導入群）の数値を１００％として相対的に表したものである。またこれらは６ウェルの実験の平均値を示しており、図中の縦線は標準偏差を示す。siRNAを導入していない非導入群に比べ、ＦＣＢＢＦ２００３１０２に対するsiRNAを５０nM添加した群においては、ＦＣＢＢＦ２００３１０２−１２９４、ＦＣＢＢＦ２００３１０２−１３３５についてそれぞれ９４％、８４％のＦＣＢＢＦ２００３１０２遺伝子発現の阻害が観察された。ネガティブコントロールsiRNAを導入した群ではＦＣＢＢＦ２００３１０２遺伝子の発現阻害は認められなかった。
【０１３４】
以下にＦＣＢＢＦ２００３１０２の定量に用いたプライマーおよびプローブの配列を記載する。
フォワードプライマー；ACGTAGCTCCCGAAATTCTTTCT（配列番号３１）
リバースプライマー；CTGATGAGCTGTGTAGCGCTTT（配列番号３２）
TaqMan プローブ；TCCTCTATATCCTGCTGTGTGGCTTTCCC（配列番号３３）
【０１３５】
（４）HEK293細胞の増殖に及ぼす効果
培地はDulbecco's modified Eagle's medium（シグマ社製）に非慟化１０％牛胎児血清（ＪＲＨ社製）及び抗生物質としてpenicillin１００units／ml、streptomycin１００μg／ml（インビトロジェン社製）を添加したものを用い、３７℃、５％CO2存在下で培養した。
HEK293細胞は０．１または０．１５×１０5cells／mlの密度で９６穴プレート（コラーゲンタイプ１コート済、岩城硝子社製）に１ウェル当たり０．２５ｍｌで播種し、１日後にGeneSilencer siRNA Transfection Reagent（Gene Therapy Systems社製）を用いて、合計５０ｎＭのsiRNAを導入した。siRNAとしてはネガティブコントロールsiRNAならびにＦＣＢＢＦ２００３１０２-1294を使用し、ＦＣＢＢＦ２００３１０２-1294の用量は０，５、１２．５、２５、５０nMである。
【０１３６】
細胞増殖の定量化は、siRNA導入から３日後または４日後にCellTiter-Glo Luminescent Cell Vialbility Assay（プロメガ社製）を用いて生存細胞由来のＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を測定することにより行った。細胞内ＡＴＰ含量が生細胞数に比例することは知られている。
HEK293細胞の増殖は、ＦＣＢＢＦ２００３１０２-1294によって阻害された（図４）。値は各ウェル中の生細胞に由来するＡＴＰが１００μlの液体培地に溶出した場合のＡＴＰ濃度で示されている。またこれらは８ウェルの実験の平均値を示しており、図中の縦線は標準偏差を示す。ネガティブコントロールsiRNA ５０ｎＭを導入した群では、トランスフェクション処置をしていない非導入群に比べて２７％のＡＴＰ含量低下が見られるが、これはトランスフェクション処置に由来する細胞増殖への影響と推測される。ＦＣＢＢＦ２００３１０２-1294  ５０ｎＭを導入した細胞群では、ネガティブコントロールsiRNA ５０ｎＭを導入した群と比較して、ＡＴＰ含量が６０％低下した。ＦＣＢＢＦ２００３１０２に対するsiRNAをHEK293細胞に導入することによってＦＣＢＢＦ２００３１０２遺伝子の発現が低下し、細胞の増殖抑制が起こったことから、ＦＣＢＢＦ２００３１０２は細胞増殖活性を有し、HEK293細胞の増殖において重要な役割を担っていることが示唆された。
【０１３７】
また、配列番号２５および配列番号２７に示す配列は、ＦＣＢＢＦ２００３１０２のスプライシングバリアントを含むバリアントでありプロテインキナーゼと推定される、ＡＸ４５２８６５の翻訳開始部位（配列番号２の塩基番号１１３）から数えてセンス鎖の２０１９〜２０３９および２０６０〜２０８０番目の塩基に示される配列（すなわち配列番号２の塩基番号２１３１〜２１５１および塩基番号２１７２〜２１９２に示される配列）に、またＡＸ５０４２３７の翻訳開始部位（配列番号３の塩基番号１）から数えてセンス鎖の２０７６〜２０９６および２１１７〜２１３７番目の塩基に示される配列（すなわち配列番号３の塩基番号２０７６〜２０９６および塩基番号２１１７〜２１３７に示される配列）、ならびにＡＸ５３４７３６の翻訳開始部位（配列番号４の塩基番号１）から数えてセンス鎖の２０７６〜２０９６および２１１７〜２１３７番目の塩基に示される配列（すなわち配列番号４の塩基番号２０７６〜２０９６および塩基番号２１１７〜２１３７に示される配列）にそれぞれ相当する。さらに、ＡＸ０５６３８２の全長配列の最初の塩基（配列番号５の塩基番号１）から数えてセンス鎖の１１０７〜１１２７および１１４８〜１１６８番目の塩基に示される配列（すなわち配列番号５の塩基番号１１０７〜１１２７および塩基番号１１４８〜１１６８に示される配列）に、またＡＢ０５１５５２の全長配列の最初の塩基（配列番号６の塩基番号１）から数えてセンス鎖の１３９３〜１４１３および１４３４〜１４５４番目の塩基に示される配列（すなわち配列番号６の塩基番号１３９３〜１４１３および塩基番号１４３４〜１４５４に示される配列）にそれぞれ相当する。
【０１３８】
さらに、配列番号２６および配列番号２８に示す配列は、ＡＸ４５２８６５の翻訳開始部位から数えてアンチセンス鎖の２０３７〜２０１７および２０７８〜２０５８番目の塩基に示される配列（すなわち配列番号２の塩基番号２１２９〜２１４９および塩基番号２１７０〜２１９０に示される配列の相補配列）に、またＡＸ５０４２３７の翻訳開始部位から数えてアンチセンス鎖の２０９４〜２０７４および２１３５〜２１１５番目の塩基に示される配列（すなわち配列番号３の塩基番号２０７４〜２０９４および塩基番号２１１５〜２１３５に示される配列の相補配列）、ならびにＡＸ５３４７３６の翻訳開始部位から数えてアンチセンス鎖の２０９４〜２０７４および２１３５〜２１１５番目の塩基に示される配列（すなわち配列番号４の塩基番号２０７４〜２０９４および塩基番号２１１５〜２１３５に示される配列の相補配列）にそれぞれ相当する。さらに、ＡＸ０５６３８２の全長配列の最初の塩基から数えてアンチセンス鎖の１１２５〜１１０５および１１６６〜１１４６番目の塩基に示される配列（すなわち配列番号５の塩基番号１１０５〜１１２５および塩基番号１１４６〜１１６６に示される配列の相補配列）、およびＡＢ０５１５５２の全長配列の最初の塩基から数えてアンチセンス鎖の１４１１〜１３９１および１４５２〜１４３２番目の塩基に示される配列（すなわち配列番号６の塩基番号１３９１〜１４１１および塩基番号１４３２〜１４５２に示される配列の相補配列）に、それぞれ相当する（図５）。
【０１３９】
よって、ＦＣＢＢＦ２００３１０２のスプライシングバリアントを含むバリアントであり、プロテインキナーゼと推定される、ＡＸ４５２８６５、ＡＸ５０４２３７、ＡＸ５３４７３６、ＡＸ０５６３８２およびＡＢ０５１５５２もＦＣＢＢＦ２００３１０２と同様に細胞増殖活性を有し、HEK293細胞の増殖において重要な役割を担っていることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】図１は、逆相ＨＰＬＣ上で測定した、基質としての標準ポリペプチド（Ｃｄｃ２、Ａｒｇ２−ＯＨ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＰＴＫ１、ＰＴＫ２、ＭＬＣＫＳ、ＣａＭＫＩＩ、Ｓｙｎｔｉｄｅ２）およびＢＳＡのピークを示す。
【図２】図２は、基質としての標準ポリペプチド（Ｃｄｃ２、Ａｒｇ２−ＯＨ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＰＴＫ１、ＰＴＫ２、ＭＬＣＫＳ、ＣａＭＫＩＩ、Ｓｙｎｔｉｄｅ２）に配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質を添加して反応させた後、逆相ＨＰＬＣ上でピークを測定した結果を示す。
【図３】図３は、ＦＣＢＢＦ２００３１０２を標的遺伝子としたｓｉＲＮＡ（ＦＣＢＢＦ２００３１０２−１２９４、ＦＣＢＢＦ２００３１０２−１３３５）をＨＥＫ２９３細胞に導入し、ｓｉＲＮＡが導入されたＨＥＫ細胞内のＦＣＢＢＦ２００３１０２遺伝子発現量を測定した結果を示す。
【図４】図４は、ＦＣＢＢＦ２００３１０２を標的遺伝子としたｓｉＲＮＡ（ＦＣＢＢＦ２００３１０２−１２９４）をＨＥＫ２９３細胞に導入し、導入４日後にｓｉＲＮＡが導入されたＨＥＫ細胞の増殖を細胞内ＡＴＰ含量を指標として測定した結果を示す。
【図５】図５は、ＦＣＢＢＦ２００３１０２およびそのスプライシングバリアントを含むバリアント（ＡＸ４５２８６５、ＡＸ５０４２３７、ＡＸ５３４７３６、ＡＸ０５６３８２およびＡＢ０５１５５２）と、ＦＣＢＢＦ２００３１０２を標的遺伝子としたｓｉＲＮＡ（ＦＣＢＢＦ２００３１０２−１２９４）の位置関係を示す図である。＊は終止コドンの位置を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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