(57)【要約】【課題】  本発明においては、雌性花から両性花への性変化率を増大させることにより性変化した植物を産生すること、そして植物を性変化させるための方法を提供することを課題とする。【解決手段】  本発明の発明者らは、イオン粒子-照射によりその安定な性発現が変化しうるかどうかを調べることにより、上記課題を解決できることを示し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は、種子に対して放射線を照射することにより、植物を性変化させる方法を提供することにより、上記課題を解決した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
種子に対して放射線を照射し、植物を性変化させる方法。
【請求項２】
植物が雌雄異株植物である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
雌雄異株植物がホウレンソウである、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
放射線がイオンビームである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
イオンビームがHeイオンまたはCイオンにより生じるものである、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
5〜50 GyのHeイオン粒子照射または5〜15 GyのCイオン粒子照射を行う、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
植物の性変化が、雌植物体から偏雌間性株（gynomonoecy）または偏雄間性株（andromonoecy）への変化である、請求項1〜6いずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射線を用いて、植物を性変化させることに関する。より具体的には、イオンビームを使用して、雌雄異株植物の雌植物体または雄植物体を偏雌間性株（gynomonoecy）または雄雌間性株へ性変化させることに関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどの顕花植物種において、他家受粉は一般的な交配メカニズムである。植物は、他家受粉を促進するために様々なメカニズムを進化させてきており、このようなメカニズムには、同一植物または別個の植物上に単性の雄花あるいは雌花を形成すること（それぞれ雌雄同株植物あるいは雌雄異株植物と呼ばれる）が含まれる。いくつかの雌雄異株種、例えば、ギシギシ属（Rumex）、メランドリウム属（Melandrium）およびアサ属（Cannabis）、は、2つの異形の性染色体を有することが報告されており、そして雄性の性関連DNAマーカーを同定するために分子的解析が行われ、そして雄性-特異的遺伝子が単離された。特徴的なMADSボックス遺伝子の発現もまた、雌花と雄花の間で観察された。これらの結果から、転写因子が特定の遺伝子セットを誘導して、特定の性を発現する可能性があることが示された。
【０００３】
ホウレンソウ（Spinacia oleracea L.）は、20世紀初頭以来、雌雄異株種として分類されている。ホウレンソウのF1品種の種子は、雌植物体と雄植物体との間の他家受粉に基づいて産生されるものであり、そしてしたがって雌花親株に出現する雄植物体を取り除くことが必要である。そのため、非常に多くの面倒な作業を行わなければならない。
【０００４】
これに対して以前の研究では、ホウレンソウのF1交配に関する一連の交配実験を行い、そして75％雌植物体（すなわち、75％の雌性花と25％両性花を有する植物）を、完全な雌植物体と交配させることにより、雌性種子を産生できることが報告された。このことから、植物の不均一性が低いこと、すなわち均一性が高いことは、雌花親株に出現する雄植物体を取り除くという非常に多くの面倒な作業を行わなくてよいという点で経済的には利点となる。そしてしたがって、ホウレンソウを均質な雌植物体を介して育種することができるのであれば、そのような均質な特性は有用である。しかしながら、均質な雌植物体を介して育種することを行うためには、均質な雌植物体を見いだすことだけでなく、雌性から両性へ、花の性別を転換するための効率的な方法を開発することもまた、必要である。
【０００５】
ホウレンソウにおいて、（1または複数の）性決定遺伝子が、最長の染色体（染色体1）上に位置することが、トリゾミック解析により予想された。しかし、それらの性決定遺伝子は未だ単離されていない。また、植物ホルモンが、開花誘導に関与すると考えられているが、特定のホルモンが特定の性を誘導したりあるいは抑制したりすることができるかどうかは、明らかになっていない。その一方で、以前に行われたin vitro実験において、雄性外植片から再生させた植物の10〜20％が、偏雄間性株（andromonoecy）を示し、一方雌性外植片から再生させた植物は、それらの性発現を変化しなかったように、組織培養をすることにより、性変化に対して何らかの影響があるようである（Al-Khayri et al. 1992；Komai et al. 1999）。しかしながら、雌性花から両性花への性変化に関する研究は、未だ報告されたことはない。
【０００６】
イオン粒子は、X-線、ガンマ線、および電子などの低線エネルギー付与（LET）放射線と比べると、高線エネルギー付与（LET）放射線の形態を取る。イオン粒子は、致死性、腫瘍形成、および花粉生存率に関してかなりの相対的生物学的効果比（RBE）を示す。植物に対するイオン粒子の作用を扱ったいくつかの文献が存在する（Mei et al. 1994；Nishimura et al. 1997；Tanaka et al. 1997b；Shikazono et al. 1998）。
【０００７】
【非特許文献１】Al-Khayri et al. (1992) Sci. Hort., 52:277-282
【非特許文献２】Komai et al. (1999)  Plant Sci. 146:35-40
【非特許文献３】Mei et al. (1994) Adv. Space Res. 14:363-372
【非特許文献５】Nishimura et al. (1997) Can. J. Bot., 75:1261-1266
【非特許文献６】Tanaka et al. (1997) Genes Genet. Syst., 72:141-148
【非特許文献８】Shikazono et al. (1998) Genes Genet. Syst., 73:173-179
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明においては、雌性花から両性花への性変化率を増大させることにより性変化した植物を産生すること、そして植物を性変化させるための方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者らは、放射線により植物の安定な性発現が変化しうるかどうかを明らかにすることにより、上記課題を解決できることを示し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は、種子に対して放射線を照射することにより、植物を性変化させることができることを示すことにより、上記課題を解決した。
【００１０】
本発明において、性変化を生じさせる対象となる植物は、雌雄異株植物、すなわち雌植物体および雄植物体が存在する植物であることが必要である。このような雌雄異株植物の例としては、ホウレンソウ、キウイ、アスパラガス、イチョウ、ヤナギ、などが存在する。本発明の好ましい態様において、雌雄異株植物としてホウレンソウを使用する。
【００１１】
本発明における植物の性変化は、雌植物体に生じる性変化であっても雄植物体に生じる性変化であってもかまわない。本発明においては、植物の性別を、以下の4つのカテゴリー：雌植物体；雌花および両性花を共に有する偏雌間性株（gynomonoecy）；雄花および両性花の両方を産生する偏雄間性株（andromonoecy）；または雄植物体；に分類した。雌植物体に生じる性変化としては、雌植物体から偏雌間性株、偏雄間性株への性変化が含まれ、雄植物体に生じる性変化としては、雄植物体から偏雌間性株、偏雄間性株への性変化が含まれる。より好ましくは、本発明においては、雌植物体の性変化を行わせ、偏雌間性株、偏雄間性株への性変化を行わせる。
【００１２】
本発明においては、雌雄異株植物に対してこのような性変化を行わせる場合に、本発明において「放射線」という場合、イオンビーム、α線、β線、中性子線、陽子、重陽子、負π中間子、X線、γ線、電子線、などを含むことができるが、これらに限定されない。本発明においては、「放射線」として、イオンビームを使用することが好ましい。
【００１３】
「イオンビーム」は、大型加速器（サイクロトロン）を用いて、原子核（イオン）を光に近い高速度で加速し、正に荷電したビームを取り出すことにより得られる。イオンビームを発生する大型加速器としては、日本原子力研究所がもつイオン照射研究施設（TIARA）の大型加速器（AVFサイクロトロン）、タンデム加速器などを使用することができる。
【００１４】
イオンビームを作成するためのイオンとしては、Heイオン、Cイオン、アルゴンイオン、ネオンイオン、Nイオン、Oイオン、などを使用することができる。本発明においては、Heイオン、Cイオンを使用することが好ましい。
【００１５】
イオンビームは、透過性は浅いが、局所的に大きなエネルギーを与え、また透過深度も調整ができるという特徴があるため、植物の種子や培養体に照射することにより、突然変異を起こすことができる。このイオンビームを用いた変異誘発の方法は、イオンビームが有する上述した特徴のため、特定の遺伝子のみに突然変異を起こすことができると考えられている。
【００１６】
したがって、イオンビームのイオンの種類、強度、速度などの特徴は、変異を誘発する対象、目的、選抜方法にしたがって、当業者が容易に選択することができる。本願発明において例えば、雌雄異株植物における性変化を起こさせることを目的としてホウレンソウの種子を選択した場合、例えばHeイオン粒子を照射する際には5〜50 Gy、またはCイオン粒子を照射する際には5〜15 Gyの強度のイオンビームを使用する。最も好ましくは、50 Gyの強度を有するHeイオン粒子を照射するイオンビームを使用する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、雌雄異株植物、例えばホウレンソウ、において、性変化した雌植物体または雄植物体を産生するという効果を有する。本発明はまた、苗条形成、苗条原基培養、不定胚形成、およびプロトプラスト培養などの、ホウレンソウ植物の植物再生システムと、イオン-粒子照射とを組み合わせることにより、植物の性発現を変化させるための有望なアプローチを提供するとという効果もまた有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明を実施するための最良の形態を以下に記載するが、これらの記載は、本発明の範囲を限定することを目的としたものではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ規定されるものである。
【００１９】
本発明の好ましい態様において、植物として雌雄異株植物であるホウレンソウを使用し、この雌植物体種子に対してHeイオン粒子またはCイオン粒子から作られるイオンビームを照射することにより、雌植物体を偏雌間性株または偏雄間性株に性変化させる。
【００２０】
ホウレンソウの品種としては、品種：禹城、品種：次郎丸などのいずれの品種を用いてもかまわないが、雌性種子の個体群を作製するために使用された手順の簡便性、そして雌雄同株種子の混入が存在しないなどの点を考慮し、品種：次郎丸を使用することが好ましい。
【００２１】
性変化を調べるためには完全な雌植物体を得ると都合がよいため、まず、品種：次郎丸の完全な雌植物体ホウレンソウを選抜する。具体的には、品種：次郎丸の雌植物体ホウレンソウにおいて、その雌植物体上に生じる雌花と葯とを用いて自家受粉させ、この結果生じる完全な雌植物体を生じる種子、すなわち雌性種子を得る。
【００２２】
この雌性種子に対してイオンビームの照射を均一に行うために、果皮を除いた雌性種子を単層に並べ、これに対して5〜50 GyのHeイオン粒子または5〜25 GyのCイオン粒子から作られるイオンビームを大気圧下で20秒〜3分間照射する。イオンビーム照射処理した雌性種子を植木鉢に播種し、そしてこれを生育させ、開花させることにより、雌植物体から偏雌間性株または偏雄間性株が得られたかどうかを視覚的に確認する。
【実施例】
【００２３】
実施例1：ホウレンソウにおける雌性発現
ホウレンソウ（Spinacia oleracea L.）植物の性発現は、4つのカテゴリーに分類した：雌植物体、偏雌間性株（gynomonoecy）、偏雄間性株（andromonoecy）、または雄植物体。ここで、雌花および両性花を共に有する植物は、偏雌間性株植物として、そして雄花および両性花の両方を産生する植物は、偏雄間性株の植物として分類した。
【００２４】
次郎丸植物の性別は、播種後9週に全ての植物が開花したとき、同定した。雌性と同定された植物は、さらに1週間後にチェックして、葯を生じるかどうかを確認した。葯を有する雌性ホウレンソウ植物の自家受粉により生じた後代の性発現は、播種後12週で分類した。
【００２５】
Spinacia oleracea L.の品種：次郎丸の種子を一晩水中に浸漬し、そして60個の種子を、圃場の3箇所に、3回繰り返して播種した（実験番号1、2および3）。雄植物体、偏雄間性株植物そして偏雌間性株植物を、それらの葯が裂開する前に、完全に取り除いたことにより、播種後9週には、雌植物体のみが圃場に存在した。
【００２６】
これらの雌植物体をさらに一週間生育すると、5.6％〜14.3％の雌植物体が、性発現後1週間後に雌性花由来の葯を生じた（表1）。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
これらの性変化した雌植物体は、自家受粉すること、すなわち単系交雑することができ、そしてそれらの植物は結果として種子を生じた。植物あたり採取した20個の種子を、25±3℃、16時間明期（光強度：150μmol m-2 s-1）の温室内の植木鉢に播種したところ、これらの種子は、正常に発芽することができ、そして全てが雌植物体に発生した（表2）。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
実施例2：雌性種子の発芽および開花に対する、イオン粒子の作用
本実施例においては、雌性種子の発芽および開花に対するイオン粒子の作用を調べた。この実験を行うため、まず、実施例1に記載した方法にしたがって雌性種子を採取し、個の雌性種子に対してイオン粒子を照射した。
【００３１】
雌性のホウレンソウ種子から果皮をピンセットで取り除いたのち、種子をKaptonTMフィルム（7.5μm厚；大きさ45 mm角；Toray-Dupont, Japan）の間にはさみ、均質なイオン粒子照射を行うために、種子を単層にした。AVFサイクロトロン（JAERI, Takasaki, Japan）を使用して、12.5 MeV/nのHeイオン線および18.3 MeV/nのCイオン線を作製した。ここで使用したイオンの物理的特性は、表3中にまとめた。
【００３２】
【表３】
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【００３３】
HeイオンおよびCイオンに対する線エネルギー付与（LET）は、それぞれ23.7 keV/μmおよび189.3 keV/μmであり、そして到達深度はそれぞれ1.67 mmおよび1.10 mmであった。種子の厚みが、照射方向に1.55±0.02 mm（平均±標準誤差（SE）、n＝50）であるため、He粒子は、種子を貫通することができた。胚は種子の中心部に位置しているため、それぞれの胚は、C粒子に対して曝露されたと考えられる。これらの物理的特性は、OSCARプログラム（Tanaka et al. (1997) JAERI-Data/Code 97-019:1-77）の改変版であるELOSSプログラムを用いて計算した。種子は、それぞれの線量に対して最大で3分間、大気圧下で曝露した。
【００３４】
雌性種子を5〜50 GyのHeイオンに曝露することによっても、発芽率または開花率に対しては顕著な作用は生じなかった（図1）。この図に示した実験においては、種子を、Heイオン（A）およびCイオン（B）に対して曝露した。種子を植木鉢に播種し、そして開花するまで育成した。データは、50個の種子に基づいて、2種類の独立した実験から得られた。鉛直のバーは、±SD（標準偏差）を示す。
【００３５】
5〜50 GyのHeイオンを照射した場合には、いくつかの植物が、複数の苗条を有し、そして縮葉を示したが、これらの植物は全て、発芽し、そして開花段階まで発生した。対照的に、Cイオンに対して曝露した種子の発芽率は、種子を15 Gyよりも高い線量に曝露したときに、減少した。15 Gyよりも高い線量のCイオンを曝露した場合には、植物のわずか11.3〜25.7％しか開花せず、そして多くの植物は極端に短い花柄やひょろ長い花柄などの形態学的な異常を有した。形態学的に異常な植物のほとんどは開花前に枯死した。結果として、雌性種子における発芽および開花を抑制する際には、Cイオンの方がHeイオンよりもずっと効率的である。
【００３６】
実施例3：イオン粒子を照射した雌性種子の性発現
本実施例においては、雌性種子の性発現に対するイオン粒子の照射の作用について調べた。
イオン粒子の照射の雌性種子の性発現に対する作用を、表4にまとめた。雌性種子に対するイオン粒子の照射は、実施例2において示した通り行った。また、種子の性判別は、実施例1に記載した通り行った。データは、2回の独立した実験に由来する、50個の種子に基づく。
【００３７】
【表４】
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【００３８】
Heイオン粒子照射においては、使用したそれぞれの線量（5〜50 Gy）で偏雌間性株の植物が誘導され、そして開花した後代における偏雌間性株の割合は、線量が増大しても、大きくは変化しなかった。葯の出現前に、全ての偏雌間性株植物は雌性花を生じた。50 Gyの線量のHeイオンを照射することにより、偏雄間性株の植物もまた誘導された。これらから、イオン粒子照射により、雌植物体から高い頻度で偏雌間性株植物または偏雄間性株植物への性変化が行われたことが示された。
【００３９】
Cイオン粒子照射においては、使用したそれぞれの線量（5〜25 Gy）で偏雌間性株の植物が誘導されたが、雌植物体から偏雄間性株植物への性変化は行われなかった。
高頻度の性変化に照らして考えると、これらの変化がイオンビームによる変異生成の結果として引き起こされるという可能性は、可能性が低いと考えられる。一方で、照射により高い頻度で変化を生じさせることができるという本発明における知見と、光周期条件、温度条件、および水条件が性発現に対して影響を与えうるという以前の知見とをあわせると、本発明においては、イオン粒子-照射により、何らかのストレスが誘導され、その結果として雌植物体に対して性変化が生じたことが示唆される。
【００４０】
次に、イオン粒子を照射した雌性種子から得られた植物体の形態学的特徴を観察した。結果を図2に示す。図2Aは、羽状に裂開した柱頭を有する雌性花のみを形成する雌植物体（品種：次郎丸）を示す（バーは、1 cmを示す）。雄性ホウレンソウ植物と比較して、雌植物体は、顕著な生長パターンを有し、それは開花遅延、大型で深緑色の葉、花柄の頂での葉の増殖、そして雌性花のみの産生により特徴づけられた（図2A）。
【００４１】
図2Bは、50 Gyの線量のHeイオンに曝露した雌性種子に由来する、雄性花（矢頭）が形成された偏雄間性株植物を示す（バーは、5 mmを示す）。偏雄間性株は、雌性種子に由来する植物中でしばしば生じた（図2B）。
【００４２】
一方、偏雌間性株もまた、使用した全ての線量のCイオンに曝露することにより誘導された。図2Cは、HeイオンまたはCイオンに曝露した雌性種子に由来する、偏雌間性株植物を示す（バーは、5 mmを示す）。Heの場合と同様に、偏雌間性株の全ての場合で、雌性花が生じ、葯（矢頭）は、雌性花から出現した。そしてその後に雄性花を生じた（図2C）。雌植物体から雄植物体への完全な性転換は、HeイオンまたはCイオンによる照射の結果としては観察されなかった。
【００４３】
雄性ホウレンソウ外植片からカルス培養を介して再生された植物（R1）が、自家受粉の結果として正常に種子を形成し、そしてホウレンソウ植物での雌雄同株が、自然発生的に発現されうること、また個々の再生体（R1）から切り出した雌性ホウレンソウ外植片および雄性ホウレンソウ外植片に由来する再生体（R2）は、偏雌間性株および偏雄間性株をそれぞれ発現した、という以前に報告された結果からは、反対の性表現型を抑制することにより、ホウレンソウ植物が誘導されて、雌雄異株となる、と推測されていた。
【００４４】
しかしながら、意外なことに、本発明においては、植物の雌性個体群を50 Gyの線量のHeイオンに曝露した場合、偏雌間性株がしばしば生じ、そして偏雄間性株が出現した。偏雌間性株においては、イオン粒子に対する曝露により、雄花が、雌植物体上でシステマチックに抑制されていた状態から解放され、そして偏雄間性株においては、イオン粒子に対する曝露により、雌花が抑制され、それに加えて雄花が、雌植物体上でシステマチックに抑制されていた状態から解放される可能性があることが、これらの結果から、示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本研究において、本発明の発明者らは、雌花から両性花への性変化率を増大させることに成功した。このことは交配について有用である。本発明において示したシステムにより、雌雄異株植物、例えばホウレンソウ、において、性変化した雌植物体または雄植物体を産生するための有用なツールとして産業上の利用可能性を有する。
【００４６】
より稔性が高い種子を産生する可能性を増大させるためには、育種プログラムにおいて、多様な性変化が得られることが望ましい。本発明においては、苗条形成、苗条原基培養、不定胚形成、およびプロトプラスト培養などの、ホウレンソウ植物の植物再生システムと、イオン-粒子照射とを組み合わせることにより、植物の性発現を変化させるための有望なアプローチが提供される点でも、産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図1は、イオン粒子の雌性ホウレンソウ種子の発芽（●）および開花（○）に対する作用を示す。
【図２】図2は、ホウレンソウにおける花の形態を示す。
【図１】
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【図２】
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