(57)【要約】【課題】新規な有用物質である特定のトリペプチドおよびその製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】下記式で表されるＮ末端からβ−アラニン、オルニチン、オルニチンの順でペプチド結合したトリペプチド。このトリペプチドは、以下のようにして製造できる。（１）シジミエキスを水で希釈し、分画する、あるいは（２）α−アミノ基とδ−アミノ基を保護したオルニチン及びβ−アミノ基を保護したβ−アラニンを用いて化学的に合成する。    【化１】2005200377.tif 000006【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端からβ−アラニン、オルニチン、オルニチンの順でペプチド結合したトリペプチド。
【請求項２】
シジミエキスを水で希釈し、分画することを特徴とするＮ末端からβ−アラニン、オルニチン、オルニチンの順でペプチド結合したトリペプチドを製造する方法。
【請求項３】
α−アミノ基とδ−アミノ基を保護したオルニチン及びβ−アミノ基を保護したβ−アラニンを用いて化学的に合成することを特徴とするＮ−末端からβ−アラニン、オルニチン、オルニチンの順でペプチド結合したトリペプチドを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なトリペプチドおよびその製造方法に関する。より具体的にいえば、本発明は一分子のβ−アラニンと、二分子のオルニチンからなるトリペプチドに関し、またそのトリペプチドをシジミエキスより製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者等は、従来より、シジミの有効成分に関する研究を続けてきている。
シジミは、古来より滋養強壮食品等として国民に利用されてきた。近年その有効成分についての研究が進展して、その成分の解明も進んでいる。シジミには特にビタミンＢ１２等の各種ビタミン類をはじめ、重要な生理活性を示す有用成分、例えば、脂質代謝改善作用をもつα、β−不飽和脂肪酸、尿素サイクルを活性化させ、肝機能を改善する作用や成長ホルモン分泌促進作用によるダイエット作用を有するオルニチン等のアミノ酸が含まれている。その他、シジミに含まれるメチオニン、シスチン等のアミノ酸も肝機能亢進作用を示すとする報告もある。
これら等シジミエキス中の有用成分の中でも特に注目されているのが、オルニチンである。シジミは古くからいわゆる二日酔いに効く、あるいはその症状を軽減するものとして知られているが、その作用には、オルニチンの前記生理活性作用が関与していると考えられる。本発明者も、この有用なオルニチンのシジミ生体内での合成作用を助長、促進させてその生体内含有量を増大化させる方法についてすでに提案している（特許文献１、２）。
【特許文献１】特開２００１−２０４４３２
【特許文献２】特開２００３−２７４９０７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、シジミ中には未だ未知の有用な物質が存在していると思われ、その物質の解明が待たれている。
本発明は、こうした状況の下で、新規な有用物質である特定のトリペプチドおよびその製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者等は、シジミエキス中の有用成分の研究を進めた結果、β−アラニンとオルニチンが前述のとおりシジミエキス中に含まれていることはよく知られているが、これらのアミノ酸が遊離のアミノ酸形態とは別に、ペプチドの形態でも存在していることを究明した。そして、さらに研究を進めた結果、このペプチドが前記二つのアミノ酸が特定の結合構造にてペプチドを形成する新規なトリペプチドであることを見出し、本発明に至った。
すなわち、本発明は、
（１）  Ｎ末端からβ−アラニン、オルニチン、オルニチンの順でペプチド結合したトリペプチド、
（２）  シジミエキスを水で希釈し、分画することを特徴とするＮ末端からβ−アラニン、オルニチン、オルニチンの順でペプチド結合したトリペプチドを製造する方法、
（３）  α−アミノ基とδ−アミノ基を保護したオルニチン及びβ−アミノ基を保護したβ−アラニンを用いて化学的に合成することを特徴とするＮ−末端からβ−アラニン、オルニチン、オルニチンの順でペプチド結合したトリペプチドを製造する方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明に係る一分子のβ−アラニンと二分子のオルニチンから構成されるトリペプチドは新規なペプチドである。そして、このペプチドは、食品であるシジミエキスから容易に製造することができ、安全性が高く、またその構成アミノ酸から少なくともオルニチンが示す生理活性作用類似の作用を期待することができる。さらに少なくともその構成アミノ酸の製造原料として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の新規トリペプチドは、一分子のβ−アラニンと二分子のオルニチンとから構成され、その構造は、Ｎ末端からβ−アラニン、オルニチン、オルニチンの順でペプチド結合した下記式で表されるトリペプチドである。
【化１】
2005200377.tif 000002
この新規トリペプチドは、シジミエキスから製造することができる。シジミエキスの製造法は、一般的には生シジミ、あるいは冷凍シジミに水を加えて沸騰させ、エキス分を抽出し、濾過し、必要により濃縮し、あるいは凍結乾燥などの手段で粉末化するというものである。その他、すでに種々の方法が開発されているが、本発明に使用するシジミエキスは何れの方法によって得られた物でも構わない。しかし、その取扱の易さなどから粉末化したエキスを使用することが好ましい。
【０００７】
本発明のトリペプチドは、シジミエキスの濃縮物あるいはその乾燥粉末を水に希釈してゲルろ過法あるいはイオン交換法などのクロマトグラフィーにより分画（精製）して製造することができる。
すなわち、シジミエキスを水で固形分に対して２０〜５０倍程度に希釈してゲルろ過法、イオン交換法を用いて分画することができる。しかし、シジミエキスは、シジミの種類や季節によりその成分組成は変動するが、概ね約５０％のグリコーゲンを主成分とする糖質、約３５％のタンパク質、約１０％の灰分、及び約５％の水からなり、その中で本発明のトリペプチドは分子量が３１７と低分子で、かつそのシジミエキス固形分中の含有量は少量であるから、まず、前処理として、分画分子量１，０００から１０，０００程度の膜を用いて限外ろ過や透析を行うことにより、高分子量の糖質やタンパク質を除去し、次いで得られた低分子画分をゲルろ過法あるいはイオン交換法などによりさらに分画することにより目的のトリペプチドを得ることが好ましい。
【０００８】
本発明のトリペプチドは、上述のように、シジミエキスから分画することによって製造することができるが、他のペプチドと同様に化学的に合成することもできる。
操作のし易さから、各社から市販されているペプチドシンセサイザーを用いて固相法により合成することが好ましい。すなわち、使用する装置のプログラムに従ってＣ末端より逐次Ｆｍｏｃ法によりペプチド鎖を延長する。固相法ペプチド合成用支持体である担体を使用し、副反応を防止するために、あらかじめＦｍｏｃおよびＢｏｃによりα−アミノ基とδ−アミノ基を保護したオルニチン［Ｆｍｏｃ−０ｒｎ（Ｂｏｃ）］とＦｍｏｃによりβ−アミノ基を保護したβ−アラニン［Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ］のＦｍｏｃアミノ誘導体を用いる。Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）を担体に結合させ、ピペリジンなどを用いてα−アミノ基を脱保護後、Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）のＣ末端をカップリング剤を用いてカップリングさせ、再びピペリジンなどで二つ目のオルニチンのα−アミノ基を脱保護し、Ｆｍｏｃ−β−ＡｌａのＣ末端を同様にカップリングさせる。最後にトリフルオロ酢酸などの酸を用いて全ての脱保護と担体除去を行い、０．１％トリフルオロ酢酸水を用いて抽出したものを凍結乾燥することで本発明のトリペプチドを製造することができ、必要に応じて逆相高速液体クロマトグラフィーなどで精製する。
【０００９】
本発明の前記トリペプチドは、β−アラニンとオルニチンとから構成されるものである。したがって、本発明のトリペプチドには、これらのアミノ酸を含むペプチドと類似の生理機能を期待することができる。
例えば、β−アラニンを含有するペプチドとして、カルノシン（β−アラニン−ヒスチジン）およびアンセリン（β−アラニン−メチルヒスチジン）が知られている。これらは多くの脊椎動物の骨格筋組織に含まれる主要なペプチドであり、強力な細胞内ｐＨ緩衝、抗酸化作用、酵素の活性化、および神経伝達物質としての生理機能が知られている。本発明のトリペプチドは、分子中にアミノ基が３つあり、極めて特徴的であることから、カルノシンやアンセリン同様、生理機能を発現するに十分な構造を有していると考えられる。
また、オルニチンは前述のとおりの生理機能を有するものであり、本発明のトリペプチドも同様な肝機能亢進作用を期待することができる。
【００１０】
実施例
以下に本発明を実施例により、具体的に説明する。
（１）シジミエキスの遊離アミノ酸組成および加水分解物のアミノ酸組成の解明
シジミエキスの加水分解は、タンパク質の構成アミノ酸の測定に一般的に用いられている方法に従い、シジミエキス粉末１ｍｇを試験管にとり、２０％塩酸を１ｍｌ加え、減圧封管後１１０℃で２０時間加水分解した。その後減圧乾固し、全自動アミノ酸分析装置（日本電子、ＪＬＣ−５００／Ｖ）を用いて、遊離アミノ酸の分析条件でオルニチンを含む各種アミノ酸含量を測定した。シジミエキスの遊離アミノ酸組成及び加水分解物のアミノ酸組成の結果を表１に示した。
【００１１】
【表１】
2005200377.tif 000003
【００１２】
オルニチン含量は、加水分解前、すなわち、遊離の状態では５．９（ｎｍｏｌ／ｍｇ）、加水分解物では６６．４（ｎｍｏｌ／ｍｇ）であった。加水分解物（Ｂ）の値から遊離アミノ酸（Ａ）の値を減じた（Ｂ）−（Ａ）値はタンパク質あるいはペプチドを構成するアミノ酸量と考えられる。したがって、遊離ではなくタンパク質あるいはペプチドを構成するオルニチンがエキス中に６０．５（ｎｍｏｌ／ｍｇ）存在することが明らかになった。
表１に示したオルニチンとβ−アラニンを除くアミノ酸は、タンパク質を構成するアミノ酸であることから、加水分解によりエキスに含まれるタンパク質が分解されてアミノ酸となり、加水分解物のアミノ酸含量が増えるのは当然のことである。
しかしながら、一般にオルニチンとβ−アラニンはタンパク質を構成するアミノ酸ではないことから、これらがどのような構造の化合物か大変興味が持たれた。
【００１３】
（２）シジミエキス中に含まれるオルニチン含有物質の構造解明
そこで、本発明者らは、シジミエキスに含まれるオルニチン含有物質の分子量に関する知見を得るために、シジミエキスの限外ろ過膜を用いた分画を試みた。シジミエキス溶液を分画分子量１０，０００の透析膜（ＰＩＥＲＣＥ社製、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ）を用いて水に対して十分透析し、透析内液は分子量１０，０００以上の高分子画分、透析外液は分子量１０，０００以下の低分子画分として回収し、それぞれ減圧濃縮後、凍結乾燥により粉末化した。
【００１４】
これらの画分について、前述と同様に加水分解前後におけるアミノ酸組成を比較し、オルニチン含有物質がどちらの画分に分画されているかを検討した。その結果、オルニチン含有物質は、分子量１０，０００以下の低分子画分に分画されていることが分かった。さらに、分画分子量３，５００の透析膜（ＰＩＥＲＣＥ社製、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ）を用いて同様に調べた結果、オルニチン含有物質は透析外液画分、すなわち分子量３，５００以下の低分子画分に分画されることが分かった。このことから、オルニチン含有物質は分子量３，５００以下のペプチドと考えられた。
【００１５】
次に、ペプチドの研究によく用いられているＳｅｐ−Ｐａｃ  ｔＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製）及び「Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ（野村化学社製）などの逆相カラムを用いて、移動相を０．１％トリフルオロ酢酸とアセトニトリルによる濃度勾配により、オルニチン含有物質の精製を試みたが、オルニチン含有物質は非吸着画分に溶出され、精製できなかった。そこで、上記により調製した分子量３，５００以下の低分子画分を試料として塩及び遊離アミノ酸を除去後、ＨＰＬＣを用いたゲルろ過による精製を試みた。
【００１６】
ＨＰＬＣの条件は、カラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＨＲ  １０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、移動相は２５０ｍＭ  Ｎａｃｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、流速は０．２５ｍｌ／ｍｉｎとし、検出は２０５ｎｍでの吸光度を測定した。
そして、フラクションコレクタを用いて５００μｌずつ分取した。
各フラクションから２０μｌを試験管に取り凍結乾燥後、２０％塩酸を１ｍｌ加え、減圧封管後１１０℃で２０時間加水分解した。その後減圧乾固し、全自動アミノ酸分析装置（日本電子、ＪＬＣ−５００／Ｖ）を用いて、遊離アミノ酸の分析条件でオルニチンを含む各種アミノ酸含量を測定した。
【００１７】
図１には、ＨＰＬＣにより得られた２０５ｎｍの吸光度と分取した各フラクションの加水分解後のオルニチン含量を示した。その結果、フラクションナンバー３０から３６にオルニチンが対称なピークとして検出され、単一化合物であると考えられた。
オルニチン含有物質のリテンションボリウムは１７ｍｌで あったが、ゲルろ過においては、分子量の分かっている標品のリテンションボリウムとの比較から、目的物質の分子量を推定することが可能である。そこで、今回使用したゲルろ過カラムにおける標品の溶出位置（表２）からオルニチン含有物質の分子量を推定したところ、約３００であることが分かった（図２）。
【００１８】
【表２】
2005200377.tif 000004
【００１９】
また、フラクションナンバー３０から３６の加水分解物のアミノ酸分析からはβ−アラニンとオルニチンのみが検出され、その比は１対２であった。β−アラニンの分子量は８９、オルニチンの分子量は１３２であることから、β−アラニン１分子とオルニチン２分子がペプチド結合した化合物の分子量は３１７となり、ゲルろ過から推定された分子量とほぼ一致した。すなわち、シジミエキスに含まれるオルニチン含有物質は、β−アラニン１分子とオルニチン２分子がペプチド結合した化合物と考えられた。以下、シジミエキスに含まれるオルニチン含有物質をオルニチン含有化合物という。
【００２０】
（３）シジミエキス中に含まれるオルニチン含有化合物の構造解明
次に、ＨＰＬＣにより得られたフラクションナンバー３０〜３６を回収し、脱塩後、重水置換し１Ｈ−ＮＭＲを測定した。その結果、炭素に結合した全てのプロトンが帰属された。４．１５ｐｐｍ及び４．００ｐｐｍ付近のシグナルはオルニチン２分子のアルファ炭素に結合したプロトン１個分ずつの２個分、２．５６及び３．０７ｐｐｍ付近のシグナルはβ−アラニンのアルファ及びベータ炭素に結合したプロトン２個分ずつの４個分、２．８３ｐｐｍ付近のシグナルはオルニチン２分子のデルタ炭素に結合したプロトン２個分ずつの４個分、１．５ｐｐｍから１，７ｐｐｍ付近のシグナルは、オルニチン２分子のベータ及びガンマ炭素に結合したプロトン４個分ずつの８個分に由来し、炭素に結合した１８個全てのプロトンが帰属され、β−アラニン１分子とオルニチン２分子がペプチド結合していることが確認された（図３）。
【００２１】
以上の結果から、オルニチン含有化合物の構造は、Ｎ−末端からβ−アラニン−オルニチン−オルニチン、オルニチン−β−アラニン−オルニチン、オルニチン−オルニチン−β−アラニンの３通りが考えれる。そこで、Ｃ−末端を決定するために、ヒドラジン分解を試みた。ペプチドを無水ヒドラジンと反応させるとペプチド結合が切断されて、Ｃ−末端アミン酸を除く全てのアミノ酸はアミノ酸ヒドラジドになる。そこで、オルニチン含有化合物を無水ヒドラジンと１００℃で２時間反応させた後、アミノ酸分析装置に供した。その結果、オルニチンが検出され、β−アラニンは検出されなかった。このことから、Ｃ−末端アミノ酸はオルニチンであり、オルニチン含有化合物の構造は、Ｎ−末端からβ−アラニン−オルニチン−オルニチンか、オルニチン−β−アラニン−オルニチンのどちらかである。
【００２２】
次に本発明者らは、加水分解により遊離されてくるβ−アラニン及びオルニチンの経時変化を測定した。すなわち、凍結乾燥したオルニチン含有化合物約５０μｇに２０％塩酸５００μｌ加え、減圧封管後、１１０℃で０，１，２，４，８，２０時間加水分解し、アミノ酸分析装置を用いて遊離されてくるβ−アラニン及びオルニチンを測定した。その結果、β−アラニンは加水分解処理１時間後にはほとんど全てが遊離されており、一方オルニチンは２０時間後まで徐々に加水分解が進んでいくことが分かった（図４）。このことは、オルニチン−β−アラニン−オルニチンの構造では起こり得ず、β−アラニンが末端にあることが必須である。すなわち、Ｎ−末端は、β−アラニンであり、オルニチン含有化合物の構造は、下記に示す構造を有するβ−アラニン−オルニチン−オルニチンであると決定した。
【００２３】
【化２】
2005200377.tif 000005
なお、上記式で表される化合物を別途化学的に合成し、１Ｈ−ＮＭＲを測定して前述の各シグナルを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】シジミエキス低分子画分のゲルろ過クロマトグラフィーを示すグラフ。
【図２】ゲルろ過クロマトグラフィーにおけるオルニチン含有物質の分子量の推定に使用した標品のリテンションボリウムと分子量との関係を示すグラフ。
【図３】本発明のオルニチン含有化合物の１Ｈ−ＮＭＲを示すグラフ。
【図４】本発明のオルニチン含有化合物の加水分解により遊離されるオルニチン及びβ−アラニンの経時変化を示すグラフ。
【図１】
2005200377.tif 000007
【図２】
2005200377.tif 000008
【図３】
2005200377.tif 000009
【図４】
2005200377.tif 000010