(57)【要約】      （修正有）【課題】脳腫瘍のより正確な診断に有効な新規タンパク質マーカーを提供する。【解決手段】脳腫瘍組織で発現し、それぞれ１６種類の特定アミノ酸配列を有するタンパク質群から選択される１以上のタンパク質であって、各タンパク質は高悪性度脳腫瘍、低悪性度脳腫瘍、薬剤感受性脳腫瘍、または薬剤抵抗性脳腫瘍のいずれか１以上の組織で発現することを特徴とする脳腫瘍マーカー、この脳腫瘍マーカーをコードするポリヌクレオチド、およびこれらを指標とする脳腫瘍の診断方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳腫瘍組織で発現し、それぞれ配列番号1-16のアミノ酸配列を有するタンパク質群から選択される１以上のタンパク質であって、各タンパク質は高悪性度脳腫瘍、低悪性度脳腫瘍、薬剤感受性脳腫瘍、または薬剤抵抗性脳腫瘍のいずれか１以上の組織で発現することを特徴とする脳腫瘍マーカー。
【請求項２】
高悪性度の脳腫瘍組織で発現するタンパク質群から選択される１以上のタンパク質であって、各タンパク質は配列番号1、4、5、6または7のアミノ酸配列を有する高悪性脳腫瘍マーカー。
【請求項３】
低悪性度の脳腫瘍組織で発現するタンパク質群から選択される１以上のタンパク質であって、各タンパク質は配列番号2または3のアミノ酸配列を有する低悪性脳腫瘍マーカー。
【請求項４】
薬剤感受性の脳腫瘍組織で発現するタンパク質群から選択される１以上のタンパク質であって、各タンパク質は配列番号5、8、11、13、14、15または16のアミノ酸配列を有する薬剤感受性脳腫瘍マーカー。
【請求項５】
薬剤抵抗性の脳腫瘍組織で発現するタンパク質群から選択される1以上のタンパク質であって、各タンパク質は配列番号1、2、9、10、12または16のアミノ酸配列を有する薬剤抵抗性脳腫瘍マーカー。
【請求項６】
配列番号1-16のそれぞれのアミノ酸配列を有するタンパク質と結合する抗体。
【請求項７】
少なくとも、請求項６の抗体および／またはその標識化抗体の1種類以上を含むことを特徴とする診断キット。
【請求項８】
請求項２の高悪性度脳腫瘍マーカーをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項３の低悪性度脳腫瘍マーカーをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項４の薬剤感受性脳腫瘍マーカーをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項５の薬剤抵抗性脳腫瘍マーカーをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号17から32のそれぞれの一部連続配列からなるDNA断片。
【請求項１３】
請求項８から１１のポリヌクレオチドおよび／または請求項１４のDNA断片を備えたDNAマイクロアレイ。
【請求項１４】
配列番号17から32のヌクレオチド配列をPCR増幅するためのプライマーセット。
【請求項１５】
被験者の生体試料における請求項８のポリヌクレオチドの発現量を試験し、1以上のポリヌクレオチドの発現量が健常者のそれらと比較して多い被験者を高悪性度脳腫瘍患者と判定することを特徴とする高悪性度脳腫瘍の診断方法。
【請求項１６】
被験者の生体試料における請求項９のポリヌクレオチドの発現量を試験し、1以上のポリヌクレオチドの発現量が健常者のそれらと比較して多い被験者を低悪性度脳腫瘍患者と判定することを特徴とする低悪性度脳腫瘍の診断方法。
【請求項１７】
被験者の生体試料における請求項１０のポリヌクレオチドの発現量を試験し、1以上のポリヌクレオチドの発現量が健常者のそれらと比較して多い被験者を薬剤感受性脳腫瘍患者と判定することを特徴とする薬剤感受性脳腫瘍の診断方法。
【請求項１８】
被験者の生体試料における請求項１１のポリヌクレオチドの発現量を試験し、1以上のポリヌクレオチドの存在量が健常者のそれらと比較して多い被験者を薬剤抵抗性脳腫瘍患者と判定することを特徴とする薬剤抵抗性脳腫瘍の診断方法。
【請求項１９】
請求項１５から１８の診断方法を組み合わせることによって、被験者の脳腫瘍が：
(a)高悪性度の薬剤感受性；
(b)高悪性度の薬剤抵抗性；
(c)低悪性度の薬剤感受性；または
(d)低悪性度の薬剤抵抗性
のいずれであるかを判定することを特徴とする脳腫瘍の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、ヒト脳腫瘍の悪性度および薬剤感受性／抵抗性を診断するのに有用なマーカータンパク質と、これをコードするポリヌクレオチド、並びにこれらを用いた脳腫瘍の癌診断方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
星状細胞腫瘍はその広範な多様性ゆえに、病理学的分類を行うことが非常に困難である。同じ低グレードの星状細胞腫であっても、脳腫瘍（神経膠芽腫）に進行するものと、数年にわたって休止状態であり続けるものとがある。いくつかの遺伝学的異常および遺伝子発現の変化が、星状細胞腫瘍の腫瘍形成と悪性度の進行に関連することが確認されているが（非特許文献1）、それらを用いた神経膠腫の分子生物学的診断には限界があった。患者の予後および治療反応予測のための分子生物学的診断法を確立するためには、神経膠腫の臨床的挙動と相関するであろう遺伝子発現をより包括的に特徴化する必要がある。上記のようなヒト神経膠腫の分子生物学的診断は、最終的には、個々の患者に対する治療戦略および患者全体に対する臨床的治療効果を高めるための目標を絞った治療手法に繋がると考えられる。
【０００３】
これまで、いくつかの型のヒト癌において、治療の選択を行うのに有用な分子マーカーを得るために、オリゴヌクレオチドまたはcDNAに基づくマイクロアレイを用いた分子発現プロファイルが用いられてきた（非特許文献2、3）。マイクロアレイ技術を用いて遺伝子発現プロファイルを調べることにより、多くの遺伝子が脳内神経膠腫の種々の組織学的な型およびグレードにおいて、異なって発現されていることが確認されている（非特許文献4〜6）。しかしながら、生物系には、転写および転写後制御、翻訳後修飾および異なる細胞区画間でのタンパク質の移動が含まれ、これらの特性はRNAレベルでのマイクロアレイシステムによっては分析することができない。このため、脳腫瘍を含む腫瘍組織で特異的に発現するタンパク質を対象とする分子生物学的な診断もいくつか提案されている（特許文献1−４）。
【特許文献１】特開2002−223765号公報
【特許文献２】特表2003−506100号公報
【特許文献３】特表2002−519702号公報
【特許文献４】特表2002−509734号公報
【非特許文献１】Cavenee, W.K. et al. , Diffuse infiltrating astrocytomas. In: W.K. Cavenee and P. Kleihues (eds.), pp. 9-15, Lyon: IARC Press, 2000
【非特許文献２】Alizadeh, A.A., et al., Nature 403: 503-l1, 2000
【非特許文献３】Bittner, M., et al., Nature 406: 536-540, 2000
【非特許文献４】Pomeroy, S.L., et al., Nature 415: 436-42, 2002
【非特許文献５】Rickman, D.S., et al., Cancer Res. 61: 6885-6891, 2001
【非特許文献６】Sallinen, S.L., et al., Cancer Res. 60: 6617-22. 20O0
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
前記のとおり、脳腫瘍の早期診断のための方法として、脳腫瘍組織に特異的に発現するタンパク質マーカーを用いた分子生物学的診断方法の有効性が指摘されており、そのための新しいタンパク質マーカーも幾つか提案されている。しかしながら、その診断精度をさらに向上させるためには、脳腫瘍の生物学的特性等に対応するタンパク質マーカーをより多く準備し、それらを組合せて使用することが不可欠である。
【０００５】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、脳腫瘍のより正確な診断に有効な新規タンパク質マーカーを提供することを課題としている。
【０００６】
またこの出願の発明は、前記のタンパク質マーカーをコードする遺伝子材料と、タンパク質マーカーに対する抗体、およびこれらを用いた脳腫瘍の診断方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の(1)〜(19)の発明を提供する。
(1)脳腫瘍組織で発現し、それぞれ配列番号1-16のアミノ酸配列を有するタンパク質群から選択される１以上のタンパク質であって、各タンパク質は高悪性度脳腫瘍、低悪性度脳腫瘍、薬剤感受性脳腫瘍、または薬剤抵抗性脳腫瘍のいずれか１以上の組織で発現することを特徴とする脳腫瘍マーカー。
(2)高悪性度の脳腫瘍組織で発現するタンパク質群から選択される１以上のタンパク質であって、各タンパク質は配列番号1、4、5、6または7のアミノ酸配列を有する高悪性脳腫瘍マーカー。
(3)低悪性度の脳腫瘍組織で発現するタンパク質群から選択される１以上のタンパク質であって、各タンパク質は配列番号2または3のアミノ酸配列を有する低悪性度脳腫瘍マーカー。
(4)薬剤感受性の脳腫瘍組織で発現するタンパク質群から選択される１以上のタンパク質であって、各タンパク質は配列番号5、8、11、13、14、15または16のアミノ酸配列を有する薬剤感受性脳腫瘍マーカー。
(5)薬剤抵抗性の脳腫瘍組織で発現するタンパク質群から選択される1以上のタンパク質であって、各タンパク質は配列番号1、2、9、10、12または16のアミノ酸配列を有する薬剤抵抗性脳腫瘍マーカー。
(6)配列番号1-16のそれぞれのアミノ酸配列を有するタンパク質と結合する抗体。
(7)少なくとも、請求項６の抗体および／またはその標識化抗体の1種類以上を含むことを特徴とする診断キット。
(8)前記発明(2)の高悪性度脳腫瘍マーカーをコードするポリヌクレオチド。
(9)前記発明(3)の低悪性度脳腫瘍マーカーをコードするポリヌクレオチド。
(10)前記発明(4)の薬剤感受性脳腫瘍マーカーをコードするポリヌクレオチド。
(11)前記発明(5)の薬剤抵抗性脳腫瘍マーカーをコードするポリヌクレオチド。
(12)配列番号17から32のそれぞれの一部連続配列からなるDNA断片。
(13)前記発明(8)から(11)のポリヌクレオチドおよび／または前記発明(14)のDNA断片を備えたDNAマイクロアレイ。
(14)配列番号17から32のヌクレオチド配列をPCR増幅するためのプライマーセット。
(15)被験者の生体試料における前記発明(8)のポリヌクレオチドの発現量を試験し、1以上のポリヌクレオチドの発現量が健常者のそれらと比較して多い被験者を高悪性度脳腫瘍患者と判定することを特徴とする高悪性度脳腫瘍の診断方法。
(16)被験者の生体試料における前記発明(9)のポリヌクレオチドの発現量を試験し、1以上のポリヌクレオチドの発現量が健常者のそれらと比較して多い被験者を低悪性度脳腫瘍患者と判定することを特徴とする低悪性度脳腫瘍の診断方法。
(17)被験者の生体試料における前記発明(10)のポリヌクレオチドの発現量を試験し、1以上のポリヌクレオチドの発現量が健常者のそれらと比較して多い被験者を薬剤感受性脳腫瘍患者と判定することを特徴とする薬剤感受性脳腫瘍の診断方法。
(18)被験者の生体試料における前記発明(11)のポリヌクレオチドの発現量を試験し、1以上のポリヌクレオチドの存在量が健常者のそれらと比較して多い被験者を薬剤抵抗性脳腫瘍患者と判定することを特徴とする薬剤抵抗性脳腫瘍の診断方法。
(19)前記発明(15)から(18)の診断方法を組み合わせることによって、被験者の脳腫瘍が：
(a)高悪性度の薬剤感受性；
(b)高悪性度の薬剤抵抗性；
(c)低悪性度の薬剤感受性；または
(d)低悪性度の薬剤抵抗性
のいずれであるかを判定することを特徴とする脳腫瘍の診断方法。
【０００８】
すなわち、この出願の発明者らは、2次元電気泳動およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（MAlDI-TOF）質量分析を用いて、ヒト脳腫瘍の複数の標本の間でのプロテオームプロファイリングパターンを調べ、以下の表1に示す16種のタンパク質（配列番号1-16）を同定した。
【０００９】
【表１】
2005073621.tif 000002
そしてさらに、これら16種のタンパク質が、高悪性度脳腫瘍、低悪性度脳腫瘍、薬剤感受性脳腫瘍、または薬剤抵抗性脳腫瘍のいずれか１以上の組織で発現することを確認した。すなわち、表1におけるNo.1、4、5、6および7のタンパク質は、悪性度の高い脳腫瘍組織で発現することから、高悪性度脳腫瘍マーカーとなること；No.2および3のタンパク質は、悪性度の低い脳腫瘍組織で発現することから、低悪性度脳腫瘍マーカーとなること；No. 5、8、11、13、14、15および16のタンパク質は薬剤感受性の脳腫瘍で発現することから、薬剤感受性脳腫瘍マーカーとなること；および、No. 1、2、9、10、12および16のタンパク質は薬剤抵抗性の脳腫瘍で発現することから、薬剤抵抗性脳腫瘍マーカーとなること、を見出した。
【００１０】
なお、表1のNo.1-16のタンパク質については、以下の機能が知られている。
No.1:核小体に存在し、他のGタンパク質群と相同のアミノ酸配列を有しており、細胞膜に存在するGタンパク質共役型受容体を介した細胞内信号伝達に関与する。
No.2:いくつかの癌細胞において、一般的に種々の代謝酵素活性が高まっていることが知られている。
No.3:神経細胞に特異的に存在するアイソザイム(NSE)が知られており、正常神経細胞の減少と共に低下すると考えられている。
No.4:転写因子であり、炎症反応や神経再生などの場で重要な働きが知られており、種々の細胞における癌化に重要な働きをするチロシンキナーゼ型受容体からのシグナル伝達系の最終ステップで、標的遺伝子の転写にも関与している。
No.5:解糖系で生じるホスホグリセリン酸の代謝に関与する酵素であり、脳卒中や心筋梗塞における重症度マーカーとしての有用性や、いくつかの癌においてその活性の上昇が報告されている。
No.6:Gタンパク質のうち、Rab familyに属し、脳と内分泌系組織で発現が認められる。シナプスなどにおける分泌顆粒の形成に重要と考えられている。腫瘍形成との関連を指摘した報告は少ない。
No.7:Gタンパク質のうち、Ras familyに属し癌を含む種々の疾患に関与していると考えられる。
No.8:細胞接着に関与すると共に、細胞表面の受容体や細胞骨格に作用してシグナル伝達にも関与している。
No.9:アクチン、チュブリンなどの細胞質タンパク質の構造形成に重要な分子シャペロンであり、大腸癌や肝細胞癌との関連は指摘されている。
No.10:小胞体に局在し、そこで合成されるタンパク質の分子シャペロンとして機能する。
No.11:RNAと結合し、翻訳開始に関する制御を行なうタンパク質である。
No.12:Protein kinase Cと相互作用し、インテグリンを介した細胞接着・運動に関与する。ある種の癌細胞において細胞増殖誘導作用を有する。
No.13:小胞体に存在するタンパク質であり、RNAと相互作用しシャペロン機能を有する。
No.14:細胞からの脂質の排出に関与し、HDLとともにその低下は虚血性心疾患のリスクファクターとなる。一方、細胞膜合成に脂質成分は必須であり、増殖の速い細胞ではそのレベルが低下することが知られている。
No.15:ミトコンドリアの膜に局在する分子シャペロンである。細胞の増殖抑制効果も知られており、癌抑制効果を有するタンパク質である。
No.16:Gタンパク質のうち、Rho familyに属し、細胞骨格の調節を行なう他、細胞の悪性転化に関与することも知られている。近年、脳腫瘍の悪性度が高まるにつれて、その発現が減少することが報告されている。
【００１１】
しかしながら、これら16種のタンパク質にていては、脳腫瘍の高／低悪性度および／または薬剤感受性／抵抗性との関係は全く知られていない。
【００１２】
この出願の発明は、以上のとおりの新規マーカータンパク質と、それらをコードするポリヌクレオチドを基礎とするものである。
【００１３】
なお、この発明において、「タンパク質」および「ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ-N-グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ATP、GTP、CTP、UTP；またはdATP、dGTP、dCTP、dTTP）が100個以上結合した分子を言い、「オリゴヌクレオチド」とは2-99個連結した分子を言う。
【００１４】
また、表1にそれぞれ示した塩基配列およびアミノ酸配列については、１以上の塩基の付加、欠失、他の塩基への置換、あるいはこれらの塩基変異に基づく１以上のアミノ酸残基の付加、欠失および他のアミノ酸への置換をも包含するものである。
【００１５】
さらに、「高悪性度腫瘍」とは高い増殖能と浸潤能を有し、早期に致命的となる腫瘍を意味する。従って、この発明における「高悪性度腫瘍」と「低悪性度腫瘍」は、具体的には、高い増殖能・浸潤能により生存期間が1年半以内の場合を「高悪性度」、生存期間が２〜３年以上の場合を「低悪性度」とする基準によって区別される。
【００１６】
また「薬剤感受性」とは臨床常用量で得られる血中濃度において細胞死を誘導しうる抗癌剤が存在することを意味し、「薬剤抵抗性」とはそのような抗癌剤が、この発明の完成時点では存在していないことを意味する。なお、薬剤感受性の脳腫瘍とは、例えば、アルキル化剤（4−ヒドロペルオキシ−シクロホスファミド(CPM)(1(g/ml)、4−ヒドロペルオキシ−イホスファミド(IFOS)(1(g/ml)、メルファラン(MPL)(0.5(g/ml)、カルボコン(CQ)(0.1(g/ml)、ニムスチン(ACNU)(2(g/ml)、ラニムスチン(MCNU)(2(g/ml)、シスプラチン(CDDP)(0.5(g/ml)、およびカルボプラチン(JM-8)(4(g/ml)；代謝拮抗剤（メトトレキサート(MTX)(3(g/ml)、5−フルオロウラシル(5-FU)(10(g/ml)、チオイノシン(6-MRP)(3(g/ml)、およびシトシンアラビノシド(CA)(4(g/ml)；抗生物質（マイトマイシンC(MMC)(0.2(g/ml)、ブレオマイシン(BLM)(1(g/ml)、ペプロマイシン(PEP)(0.5(g/ml)、クロモマイシンA3(TM)(0.01(g/ml)、およびネオカルジノスタチン(NCS)(0.15(g/ml)；トポイソメラーゼインヒビター（アクチノマイシンD(ACD)(0.01(g/ml)、アクラルビシン(ACR)(0.6(g/ml)、アドリアマイシン(ADM)(0.3(g/ml)、ダウノマイシン(DM)(0.6(g/ml)、ピラルビシン(THP)(0.3(g/ml)、エピルビシン(4'-EPI)(0.4(g/ml)、ミトキサントロン(MIT)(0.06(g/ml)、エトポシド(VP-16)(3(g/ml)、およびカンプトセシン(CPT-11)(3(g/ml)；微小管阻害剤（ビンクリスチン(VCR)(0.1(g/ml)、ビンブラスチン(VLB)(0.1(g/ml)、ビンデシン(VDS)(0.1(g/ml)、およびパクリタキセル(TAX)(0.6(g/ml)等の抗癌剤によって死滅するか、増殖能を消失または低減するか、あるいは浸潤能を消失または低減する脳腫瘍細胞を意味する。
【００１７】
またこの発明における「診断」とは、被験者が脳腫瘍に羅患しているか否かの判定、将来的に脳腫瘍に羅患する危険性が存在するか否かの判定、治療の効果の判定および治療後に脳腫瘍を再発する危険性が存在するか否かの判定を意味する。また、診断には、脳腫瘍の羅患やその危険性がどの程度であるか測定することも含まれる。
【００１８】
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はJ. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA技術）」、東京化学同人(1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987); J. H. Miller ed., "Methods in Enzymology", Vol. 204, Academic Press, New York (1991); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 218, Academic Press, New York (1993); S. Weissman (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 303, Academic Press, New York (1999); J. C. Glorioso et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 306, Academic Press, New York (1999)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。
【発明の効果】
【００１９】
この出願の発明によれば、脳腫瘍の悪性度の高低および／または薬剤感受性の有無を簡便かつ正確に判定するための腫瘍マーカータンパク質が提供される。また、このマーカータンパク質に関わる各種の分子生物学的材料が提供され、これらを使用することによって、脳腫瘍の悪性度および／または薬剤感受性を正確に診断することが可能となり、より有効な治療法の選択が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
発明(1)に係わる脳腫瘍マーカーは、表1に示したNo.1-16のそれぞれのタンパク質である。これらのタンパク質はそれぞれ配列番号1-16のアミノ酸配列を有し、各タンパク質は高悪性度脳腫瘍、低悪性度脳腫瘍、薬剤感受性脳腫瘍、または薬剤抵抗性脳腫瘍のいずれか１以上の組織で発現することを特徴とする。
【００２１】
これらの脳腫瘍マーカーはさらに、以下の発明(2)〜(5)にグループ化される。
【００２２】
発明(2)に係わる脳腫瘍マーカーは、表1に示したNo.1、4、5、6および7のタンパク質（それぞれ配列番号1、4、5、6または7）であって、これらは高悪性度の脳腫瘍で発現する高悪性度腫瘍マーカータンパク質である。
【００２３】
発明(3)に係わる脳腫瘍マーカーは、表1に示したNo.2および3のタンパク質（それぞれ配列番号2および3）であって、これらは低悪性度の脳腫瘍組織で発現している低悪性度脳腫瘍マーカーである。
【００２４】
さらに発明(4)に係わる脳腫瘍マーカーは、表1に示したNo.5、8、11、13、14、15および16のタンパク質（それぞれ配列番号5、8、11、13、14、15または16）であって、これらは薬剤感受性の脳腫瘍組織では発現する薬剤感受性脳腫瘍マーカーである。
【００２５】
さらにまた、発明(5)に係わる脳腫瘍マーカーは、表1に示したNo.1、2、9、10、12および16のタンパク質（それぞれ配列番号1、2、9、10、12または16）であって、これらは薬剤抵抗性の脳腫瘍組織で発現する薬剤抵抗性脳腫瘍マーカーである。
【００２６】
これら発明(1)−(5)のマーカータンパク質はそれぞれ、その精製品を使用して、例えば発明(6)の抗体作成のための抗原として使用することができる。
【００２７】
各マーカータンパクの精製品は、ヒトの細胞（例えば脳腫瘍組織の細胞）から単離して精製する方法によって得ることもでき、あるいは、それぞれ配列番号17-32に示した塩基配列からなるポリヌクレオチド（cDNA）を利用した遺伝子工学的方法によっても得ることができる。例えば、それぞれのcDNAを保有する組換え発現ベクターからインビトロ転写によってRNAを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行うことによりインビトロで発現できる。また組換え発現ベクターを大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞に導入して形質転換細胞を作製すれば、この形質転換細胞から発現させることができる。
【００２８】
マーカータンパク質をインビトロ翻訳で発現させる場合には、ポリヌクレオチドを、RNAポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して組換え発現ベクターを作製し、このベクターを、プロモーターに対応するRNAポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、目的のタンパク質をインビトロで生産することができる。RNAポリメラーゼプロモーターとしては、T7、T3、SP6などが例示できる。これらのRNAポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、pKA1、pCDM8、pT3/T7 18、pT7/3 19、pBluescript IIなどが例示できる。
【００２９】
マーカータンパク質を、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、DNAクローニング部位、ターミネーター等を有するベクターにポリヌクレオチドを組換えた発現ベクターを作製し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、そのポリヌクレオチドがコードしているタンパク質を微生物から発現させることができる。この際、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、pUC系、pBluescript II、pET発現システム、pGEX発現システムなどが例示できる。
【００３０】
マーカータンパク質を、真核細胞で発現させる場合には、ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ(A)付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製し、真核細胞内に導入すれば、目的のタンパク質を形質転換真核細胞で発現させることができる。発現ベクターとしては、pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBVベクター、pRS、pcDNA3、pMSG、pYES2などが例示できる。また、pIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-N1、pEGFP-C1などを発現ベクターとして用いれば、Hisタグ、FLAGタグ、mycタグ、HAタグ、GFPなど各種タグを付加した融合タンパク質としてタンパク質を発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞COS7、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHOなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、この発明のマーカータンパク質を発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００３１】
マーカータンパク質を原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的ペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００３２】
なお、以上の方法によって得られる組換えタンパク質は、他の任意のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。例えば、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラ-ゼ（GST）や緑色蛍光蛋白質（GFP）との融合蛋白質などである。さらに、形質転換細胞で発現されたタンパク質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたタンパク質もこの発明のタンパク質の範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテア-ゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
【００３３】
発明(6)の抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、それぞれ配列番号1-16のアミノ酸配列を有するタンパク質のエピトープに結合することができる全体分子、およびFab、F(ab')2、Fv断片等が全て含まれる。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、タンパク質やその一部断片を免疫原として動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。
【００３４】
また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996）に従い作製することができる。
【００３５】
またこの発明(6)の抗体には、標識物質によって標識化された抗体も含まれる。標識物質は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、turnover numberが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のEIAに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3',5,5'−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、125Ｉや3Ｈ等の通常のRIAで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。
【００３６】
発明(7)は、前記の抗体および／またはその標識化抗体の1種以上を含む脳腫瘍診断キットである。これらの診断キットは、抗体や標識化抗体を液相中に含むものであってもよく、あるいは抗体や標識化抗体を固相担体に結合したものであってもよい。さらにこの診断キットは、例えば標識化抗体の標識が酵素の場合にはその基質を含むもであってもよく、固相担体を含むものの場合には、固相への非結合分子を洗浄除去するための溶液を含むものであってもよい。このようなキットは、被検成分の種類に応じて各種のものが市販されており、この発明の診断キットも、この発明によって提供される抗体および／または標識化抗体を用いることを除き、公知公用のキットに用いられている各要素によって構成することができる。
【００３７】
発明(8)-(11)は、それぞれ発明(2)-(5)のマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチド（DNA断片、RNA断片）である。具体的には、各タンパク質をコードするゲノムDNA、ゲノムDNAから転写されるmRNA、mRNAから合成されるcDNAである。cDNAは、それぞれ配列番号17-32の塩基配列を有している。また、2本鎖であっても1本鎖であってもよい。さらに、これらのゲノムDNAやmRNA、cDNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖も含まれる。またさらに、ゲノムDNAの場合には、その発現制御領域（プロモーター、エンハンサー、サプレッサー領域）をも含む。
【００３８】
これらのポリヌクレオチドは、それぞれ公知の方法によって容易に取得することができる。例えば、cDNAの場合には、公知の方法（Mol. Cell Biol. 2, 161-170, 1982； J. Gene 25, 263-269, 1983； Gene, 150, 243-250, 1994）を用いてcDNAを合成し、配列番号1-16のそれれの塩基配列に基づいて作製したプローブDNAを用いて、それぞれのcDNAを単離する方法によって取得することができる。得られたcDNAは、例えば、PCR（Polymerase Chain Reaction）法、NASBN（Nucleic acid sequence based amplification）法、TMA（Transcription-mediated amplification）法およびSDA（Strand Displacement Amplification）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。また、この発明によって提供されるプライマーセットを用い、ヒト細胞から単離したmRNAを鋳型とするRT-PCR法によっても必要量の各cDNAを得ることができる。
【００３９】
発明(12)は、配列番号17-32のそれぞれの一部連続配列からなるDNA断片である。なお、このDNA断片には配列番号17-32の相補配列の一部連続配列からなるDNA断片も含まれる。好ましくは6〜75ヌクレオチド、さらに好ましくは10〜40、またさらに好ましくは15〜30ヌクレオチドからなるDNA断片である。
【００４０】
このDNA断片は、例えば前記のポリヌクレオチド(cDNA)を適当な制限酵素で切断することによっても得ることができる。あるいは、Carruthers（1982）Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams（1983）J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov（1997）Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel（1995）Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers（1994）Biochemistry 33:7886-7896; Narang（1979）Meth. Enzymol. 68:90; Brown（1979）Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage（1981）Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することができる。このDNA断片は、前記のポリヌクレオチドと同様に、標識物質により標識化することによって、プローブとして使用することができる。標識は、ラジオアイソトープ（RI）法または非RI法によって行うことができるが、非RI法を用いることが好ましい。非RI法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シアニン色素（例えば、Cy DyeTMシリーズのCy3、Cy5等）、ローダミン6G試薬、N-アセトキシ-N2-アセチルアミノフルオレン（AAF）、AAIF（AAFのヨウ素誘導体）などを使用することができる。
【００４１】
さらに発明(12)のDNA断片は、前記発明(8)〜(11)のポリヌクレオチドとストリンジェント（stringent）な条件下でハイブリダイゼーションすることを特徴とする。ここで、ストリンジェントな条件とは、前記のポリヌクレオチドとDNA断片プローブとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、およびその他公知の条件によって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、NaCl約750 mM以下およびクエン酸三ナトリウム約75 mM以下、より好ましくはNaCl約500 mM以下およびクエン酸三ナトリウム約50 mM以下、最も好ましくはNaCl約250 mM以下およびクエン酸三ナトリウム約25 mM以下である。ストリンジェントな有機溶媒濃度は、ホルムアミド約35%以上、最も好ましくは約50%以上である。ストリンジェントな温度条件は、約30℃以上、より好ましくは約37℃以上、最も好ましくは約42℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、SDS）の濃度、およびキャリアーDNAの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。
【００４２】
１つの好まし態様としては、750 mM NaCl、75 mM クエン酸三ナトリウムおよび1% SDSの条件で、30℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。より好ましい態様としては、500 mM NaCl、50 mM クエン酸三ナトリウム、1% SDS、35%ホルムアミド、100 μg/mlの変性サケ精子DNAの条件で、37℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。最も好ましい態様としては、250 mM NaCl、25 mM クエン酸三ナトリウム、1% SDS、50%ホルムアミド、200 μg/mlの変性サケ精子DNAの条件で、42℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。例えば、洗浄のためのストリンジェントな塩条件は、好ましくはNaCl約30 mM以下およびクエン酸三ナトリウム約3 mM以下、最も好ましくはNaCl約15 mM以下およびクエン酸三ナトリウム約1.5 mM以下である。洗浄のためのストリンジェントな温度条件は、約25℃以上、より好ましくは約42℃以上、最も好ましくは約68℃以上である。１つの好ましい態様としては、30 mM NaCl、3 mM クエン酸三ナトリウムおよび0.1% SDSの条件で、25℃の温度により洗浄を行う。より好ましい態様としては、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1% SDSの条件で、42℃の温度により洗浄を行う。最も好ましい態様としては、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1% SDSの条件で、68℃の温度により洗浄を行うことである。
【００４３】
発明(13)は、前記発明(8)から(11)のポリヌクレオチドおよび／または前記発明(14)のDNA断片を備えたDNAマイクロアレイである。
【００４４】
マイクロアレイの作製方法としては、固相担体表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法（オン・チップ法）と、予め調製したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを固相担体表面に固定する方法とが知られている。この発明で使用するマイクロアレイは、このいずれの方法でも作製することができる。オン・チップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術とを組み合わせて、微少なマトリックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（マスキング技術：例えば、Fodor, S.P.A. Science 251:767, 1991）等によって行うことができる。一方、予め調製したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを固相担体表面に固定する場合には、官能基を導入したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面にオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、Lamture, J.B. et al. Nucl. Acids Res. 22:2121-2125, 1994; Guo, Z. et al. Nucl. Acids Res. 22:5456-5465, 1994）。
【００４５】
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成オリゴヌクレオチドを共有結合させる方法も知られている（Yershov, G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4913, 1996）。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでビオチン化オリゴヌクレオチドを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法も知られている（Sosnowski, R.G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1119-1123, 1997）。
【００４６】
発明(14)は、配列番号17から32のヌクレオチド配列をPCR増幅するためのプライマーセットである。
【００４７】
これらのプライマーセットは、配列番号17-32の各塩基配列に基づき設計し、合成・精製の各工程を経て調製することができる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、鋳型DNAとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、15-40塩基、望ましくは15-30塩基である。ただし、LA（long accurate）PCRを行う場合には、少なくとも30塩基が効果的である。センス鎖（5'末端側）とアンチセンス鎖（3'末端側）からなる１組あるいは１対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、鋳型DNAとの安定な結合を確保するためGC含量を約50％にし、プライマー内においてGC-richあるいはAT-richが偏在しないようにする。アニーリング温度はTm（melting temperature）に依存するので、特異性の高いPCR産物を得るため、Tm値が55-65℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、PCRにおけるプライマー使用の最終濃度が約0.1〜約１μMになるよう調整する等を留意すうことも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばOligoTM［National Bioscience Inc.（米国）製］、GENETYX［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。
【００４８】
以上の各発明によって提供される材料を用いて、脳腫瘍の診断、特に脳腫瘍の特性（悪性度の高低、薬剤感受性の有無）の判定診断が可能となる。
【００４９】
発明(15)〜(18)の方法は、それぞれ前記発明(8)〜(11)のポリヌクレオチドの発現量を指標として脳腫瘍を診断する方法である。具体的には、発明(15)は、発明(8)のポリヌクレオチド発現量を指標として高悪性度脳腫瘍を診断する方法、発明(16)は、発明(9)のポリヌクレオチド発現量を指標として低悪性度脳腫瘍を診断する方法、発明(17)は、発明(10)のポリヌクレオチド発現量を指標として薬剤感受性脳腫瘍を診断する方法、発明(18)は、発明(11)のポリヌクレオチド発現量を指標として薬剤抵抗性脳腫瘍を診断する方法である。この方法において「ポリヌクレオチド」とは、前記の各腫瘍マーカーをコードするゲノム遺伝子DNAであり、被験者から単離した組織細胞中に存在するものを意味する。「被験者」は、例えばMRI検査等によって脳腫瘍の疑いがあると診察されて患者であり、その「生体試料」とは患者脳からの切除組織あるいは血液等である。また具体的な判定基準としては、被験者のポリヌクレオチド発現量が健常者のそれと比較して、10％以上、好ましくは30%以上、さらに好ましくは70%以上、最も好ましくは100％以上である場合である。
【００５０】
ポリヌクレオチドの発現量は、ポリヌクレオチドの転写産物（mRNA、タンパク質）を測定することによって知ることができる。例えばin situ ハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、ドットブロット、RNase プロテクションアッセイ、RT-PCR、Real-Time PCR（例えばJournal of Molecular Endocrinology, 25, 169-193, 2000およびそこで引用されている文献）、DNAマイクロアレイ解析法（例えばMark Shena編、"Microarray Biochip Technology", Eaton Publishing, 2000年）等によって転写産物の測定が可能である。
【００５１】
例えば、前記発明(12)のDNA断片を標識化したプローブを用いるノーザンブロット分析によってポリヌクレオチドから転写されるmRNA量を標識シグナルの強度として測定することができる。
【００５２】
また前記発明(13)のDNAマイクロアレイを使用することによってポリヌクレオチド発現量を広範かつ簡便に測定することもできる。具体的には、例えば被験者の細胞から単離したmRNAを鋳型として、cDNAを合成し、PCR増幅する。その際に、標識dNTPを取り込ませて標識cDNAとする。この標識cDNAをマクロアレイに接触させ、マイクロアレイのキャプチャープローブ（オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）にハイブリダイズしたcDNAを標識シグナルを指標として検出する。ハイブリダイゼーションは、96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注して標識cDNA水性液を、マイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、1〜100nl程度とすることができる。ハイブリダイゼーションは、室温〜70℃の温度範囲で、6〜20時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識cDNAを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
【００５３】
あるいはまた、発明(15)のプライマーセットを用いたRT-PCR法によってもポリヌクレオチドの転写産物mRNAを測定することもできる。さらに定量的RT-PCR法を用いれば、ポリヌクレオチドmRNA量を定量化することもできる。
【００５４】
またポリヌクレオチドの転写産物としてタンパク質（腫瘍マーカー）を測定する場合には、前記発明(6)の抗体、または前記発明(7)の診断キットを用いて行うことができる。このような抗体を使用する方法は、例えば免疫染色、例えば組織あるいは細胞染色、免疫電子顕微鏡、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで行うことができ、放射免疫測定法（RIA）、蛍光免疫測定法（FIA）、ルミネッセント免疫測定法（LIA）、酵素免疫測定法（EIA）、ELISAなどを用いることができ、B-F分離を行ってもよいし、あるいは行わないでその測定を行うことができる。好ましくはRIA、EIA、FIA、LIAであり、さらにサンドイッチ型アッセイが挙げられる。サンドイッチ型アッセイには、同時サンドイッチ型アッセイ、フォワード（forward）サンドイッチ型アッセイあるいは逆サンドイッチ型アッセイなどであってもよい。
【００５５】
このような抗体を用いた診断方法における一つの態様は、抗体と脳腫瘍マーカータンパク質との結合を液相系において検出する方法である。例えば、発明(6)の標識化抗体と生体試料とを接触させて標識化抗体とマーカータンパク質を結合させ、この結合体を分離する。分離は、マーカータンパク質＋標識化抗体の結合体を公知の分離手段（クロマト法、固相法等）によって分離する方法等によって行うことができる。また公知のウエスタンブロット法に準じた方法を採用することもできる。標識シグナルの測定は、標識として酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。
【００５６】
液相系での診断の別の方法は、発明(6)の抗体（一次抗体）と生体試料とを接触させて一次抗体とHRFタンパク質を結合させ、この結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず抗体＋抗原ペプチド結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をビオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域（例えば、Fc領域）を認識する抗体（三次抗体）を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。液相からの結合体の分離やシグナルの検出は前記と同様とすることができる。
【００５７】
抗体を用いる場合のさらに別の態様は、抗体とマーカータンパク質との結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量のマーカータンパク質の検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、発明(6)の抗体を樹脂プレートまたはメンブレン等に固定化し、この固定化抗体にマーカータンパク質を結合させ、非結合タンパク質を洗浄除去した後、プレート上に残った抗体＋マーカータンパク質結合体に標識化抗体を結合させて、この標識化抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカーとして酵素を用いる場合には、「ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）」として広く用いられている方法である。2種類の抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、いずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。
【００５８】
さらに発明(19)の方法は、前記発明(15)から(18)の診断方法を組み合わせることによって、被験者の脳腫瘍が：
(a)高悪性度の薬剤感受性；
(b)高悪性度の薬剤抵抗性；
(c)低悪性度の薬剤感受性；または
(d)低悪性度の薬剤抵抗性
のいずれであるかを判定することを特徴とする脳腫瘍の診断方法である。
【００５９】
この方法では悪性度の程度および薬剤感受性の有無が同時に診断されるため、治療法の選択等において極めて有用である。例えば、この診断によって高悪性度であっても薬剤感受性であると判定された場合には、感受性を有する抗癌剤治療を選択することができる。また高悪性度の薬剤抵抗性脳腫瘍であると判定された場合には、放射線治療や癌部の摘出術等の適切な治療を選択することが可能となる。
【００６０】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００６１】
脳腫瘍の悪性度に関連するタンパク質マーカーを同定した。
(1)  材料と方法
(1-1)  組織標本
外科切除した75個のヒト神経膠腫組織、ならびに非癌性脳組織を用いた。組織の使用については、予め患者本人または後見人からインフォームドコンセント書面を得た。WHOの基準に従って、52個の試料を、多形性神経膠芽腫（GM、グレードIV）、13個の試料を未分化星状細胞腫（AA、グレードIII）、および10個の試料を星状細胞腫（グレードII）と診断した。10個の健常な脳試料を、軸外脳腫瘍の切除またはてんかん手術を受けた患者から得た。切除した腫瘍または健常な脳試料は、外科切除後、速やかに2つの部分に分けた。一方の部分は組織病理学的診断用として10%ホルムアルデヒド中に固定し、パラフィン中に包埋した。他方の部分はタンパク質抽出用として、液体窒素中でスナップ凍結し、-80℃で保存した。この実験的研究のプロトコールは、神経膠腫におけるプロテオームプロファイリングパターンを解析することを目的とした施設内倫理委員会によって承認された。
(1-2)  2次元ゲル用試料の調製
凍結された試料は、30mMトリス-HCl（pH7.5）、150mM NａCl、1%トリトンX-100、10%グリセロールおよびプロテアーゼインヒビターカクテルを含有する溶解バッファ中に機械的にホモジナイズして、タンパク質溶解液を得た。BioRad Protein Assay（日本バイオラッド株式会社、東京）を用いたブラッドフォードアッセイを実施して、全タンパク質濃度を決定し、全ての試料に対して1μg/μlに標準化した。各タンパク質試料（100μg）を凍結乾燥し、7M尿素、2Mチオ尿素、4%（w/v）CHAPSおよび1%（w/v）DTTを含有するサンプルバッファを添加した。
(1-3)  2次元ゲル電気泳動
１次元目のタンパク質分離用等電点電気泳動法（IEF）は、Multiphore II電気泳動システム（Amersham Biosciences，米国ニュージャージー州）およびInvestigator 5000V 2次元電源（Genomic Solutions, Inc.、米国ミシガン州アナーバー）を用いて業者の指示に従って実施した。Amersham Biosciences社製Immobiline Dry IPGストリップ（7cm、pH3〜10非線形IPGストリップ）をサンプル／膨潤バッファ混液で一晩膨潤した。ストリップをランピングIPGストリップ（200〜5000V）電気泳動アルゴリズムを用いて泳動し、3500Vの最終電気泳動電圧および3700Vhを得た。IEFに続いて、ゲルストリップをSDS平衡化バッファで平衡化し、12.5%アクリルアミドを含有する縦型SDS-PAGEスラブゲル中で電気泳動した。画像解析の際のタンパク質スポットの分子量および等電点計算のために、いくつかの試料は分子量（Mr）および等電点pI較正マーカーとともに泳動した。2次元SDS-PAGEの直後に、ゲルを質量分析に適合しうるSilver Quest銀染色キットで染色した（インビトロジェン株式会社、東京）。
(1-4)  2次元ゲルの画像解析
銀染色したゲルを解像度300dpiのフラットベッドイメージスキャナを用いてデジタル化した。Phoretix 2D Advanced software（Ver 5.01; Nonlinear Dynamic, Ltd.,英国ニューキャッスル）を用いて位置特定とタンパク質スポット強度の測定、ならびにゲル対間でのスポットのマッチングを行った。スポットマッチングは、共通のアンカースポットを手動で指定した後に自動スポットマッチングを行うことによって実施した。10個の正常な脳組織試料から得たゲル画像に対してマッチングを行い、可能なスポットの大半を含んだ複合参照画像を作成した。10個の健常な脳試料に対して二重ゲル試験を行い、実験の再現性を確認した。腫瘍と対照ゲル間で存在するか／完全に存在しなかったスポットのみを変化を受けたものと定めた。本研究ではこの厳しい基準を用いて、一貫して脱調節されたタンパク質に対して、その後の確証の見込みが最も高くなるようにした。
(1-5)  MALDI-TOF質量分析
ゲルからタンパク質スポットを切り出し、ZipTip C18（Millipore Co., Ltd.，米国）で処理した。ゲル内消化は、50mM NH4HCO3、5mM CａCl2、および12.5ng/(lトリプシンを含有する酵素溶液中で実施した。精製試料のアリコートを、ステンレス鋼標的上のα−シアノ−4−ヒドロキシルケイ皮酸のマトリックス結晶上にスポットし、風乾した。質量の決定は、窒素レーザ（λ＝337mm）とディレイドエクストラクションを装備したAXIMA-CFR質量分析計（株式会社島津製作所，京都）で実施した。リニアモードにて20kVで加速した後、レーザー脱離された陽イオンを解析した。外部較正は標準オリゴヌクレオチド混合物を用いて実施した。タンパク質は、Web上のMascot Search（Matrix Science, Ltd.，英国ロンドン）を用いてPMF法によって同定した。
(1-6)  統計学的解析
腫瘍および健常な組織標本に対して階層的クラスタ分析を実施した。組織学的グレードに有意に影響を及ぼしたタンパク質を見つけだすために、識別分析を実施した。全ての統計学的解析は、SPSS for Windows（登録商標）ソフトウェア（SPSS, Inc.，米国イリノイ州シカゴ）を用いて実施した。
(2)  結果
(2-1)  健常な脳組織および神経膠腫のプロテオームプロファイリングパターン
固定化pH勾配法の2次元電気泳動技術を用いて75個の神経膠腫標本においてタンパク質発現を包括的に分析した（図１）。一定のスポット強度に基づいた保存性スポット選択ソフトウェアアルゴリズムを用いて各ゲル中に約400個のタンパク質スポットを同定した。多くのタンパク質スポットは、試料ごとに異なって発現されていた（図２）。10個の健常な脳組織を含む複合参照ゲルは、全部で631個のタンパク質スポットを含んでいた。参照ゲルと神経膠腫の各標本からのゲルとを比較することにより、星状細胞腫に対しては平均で64±6.2%のマッチングが見られ、GMに対して平均で47±4.9%（p＜0.005）のマッチングが見られることが判明した。参照ゲル上のスポットのうち、181個のタンパク質スポット（28.7%）が、神経膠腫組織に由来する他のゲル上のどのスポットともマッチしなかった。これらのタンパク質は健常な脳内で特異的に翻訳されて機能するのかもしれない。残りのマッチしなかったタンパク質は1つのゲル内でのみで現れていたことから、腫瘍脱調節タンパク質は非常に試料特異的であり、タンパク質分解断片または翻訳後に修飾されたタンパク質であると考えられる。いくつかの既存の2次元ゲルデータベースからのタンパク質発現パターンとのポジティブゲルマッチングによって同定することができタンパク質スポットもあった。
(2-2)  ヒト神経膠腫のプロテオームプロファイリングパターンのクラスタ分析
タンパク質スポットの発現に基づいて75個の腫瘍標本と10個の健常な脳試料の階層的クラスタリングを実施し、ヒト神経膠腫における様々な生物学的特性に関連するプロテオームプロファイリングパターンを同定した。試料軸における系統樹が図３に示されている。健常な脳組織から得た試料は、完全に単一組織特異的分枝に類別され、プロテオーム解析の妥当性と臨床的重要性が証明された。7個の星状細胞腫の試料は健常な脳組織に近い領域に集まっており、患者は再発もなく良好な臨床経過を示していた。一方、健常な脳組織から離れたところに集まった星状細胞腫を有した残りの3人の患者のうちの2人は、手術後4年以内に再発を起こした。2年を超える比較的長い生存期間を有するGMの殆どは、低グレードの星状細胞腫に近い領域に類別された（図３）。
(2-3)  神経膠腫における悪性進行に関連するタンパク質の同定
組織学的グレードと相関するタンパク質を同定するために、タンパク質スポットの発現に基づいた識別分析を実施した。選択したタンパク質スポットを切り出し、MALDI-TOF MS分析によって分析した（図４）。25個の既知のタンパク質と12個の未知のタンパク質が分析によって抽出された。上記25個の既知タンパク質を、それらの既知または推測される生物学的性質に基づいて、シグナルトランスダクション関連タンパク質、分子シャペロン、転写および翻訳調節因子、細胞周期媒介タンパク質、細胞外マトリックス関連タンパク質、および細胞付着分子に類別した。8個のシグナルトランスダクションタンパク質が高グレードの腫瘍においてアップレギュレートされており、この8個のタンパク質のうちの5個が低分子量Gタンパク質スーパーファミリーに類別された。ここで同定したタンパク質のうち、近年新しいGタンパク質ファミリーとして認識されたRalA、Rａb3Bおよび核GTP結合タンパク質が、神経膠腫の悪性形質転換に関連しているとの報告はこれまでになかった。アップレギュレートされたRhoファミリー（RhoAおよびRacl）は、アクチンフィラメント媒介性腫瘍細胞の移動ならびにアポトーシスの阻害を、一部にはタンパク質のエズリン／ラディキシン／モエシン（ERM）グループを介して引き起こすこともある。MAPKおよびPKCもまた、高グレードの腫瘍においてアップレギュレートされるタンパク質であることが同定された。リン脂質結合およびCa結合膜関連酵素に類別されるアネクシンファミリーは、高グレードの神経膠腫において頻繁にアップレギュレートされた。4個の分子シャペロンは組織学的グレードと相関関係を示した。これらの4個のタンパク質のうちの3個が、低グレードの腫瘍において有意にアップレギュレートされた。3個の代謝酵素であるホスホグリセリン酸ムターゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、およびホスホピルビン酸ヒドラターゼのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションもまた、組織学的グレードと顕著な相関関係を示した。
【実施例２】
【００６２】
脳腫瘍の薬剤感受性および薬剤抵抗性に関連するタンパク質マーカーを同定した。
【００６３】
フローサイトメトリーを用いる薬物感受性試験は文献（Iwadate,Y., et al., Int J Cancer 69:236-240, 1996; Iwadate, Y., et al., Int J Mol Med 10: 187-192, 2002）に記載されている方法に従った。すなわち、腫瘍細胞懸濁物を30種の異なる抗癌剤とともに8時間インキュベートし、続いて薬物を含まない新鮮な培地中でさらに培養した。この薬物を薬理学的な作用機序に基づいて、以下の5つのカテゴリーに分類した。
アルキル化剤：
4−ヒドロペルオキシ−シクロホスファミド(CPM)(1(g/ml)、4−ヒドロペルオキシ−イホスファミド(IFOS)(1(g/ml)、メルファラン(MPL)(0.5(g/ml)、カルボコン(CQ)(0.1(g/ml)、ニムスチン(ACNU)(2(g/ml)、ラニムスチン(MCNU)(2(g/ml)、シスプラチン(CDDP)(0.5(g/ml)、およびカルボプラチン(JM-8)(4(g/ml)
代謝拮抗剤：
メトトレキサート(MTX)(3(g/ml)、5−フルオロウラシル(5-FU)(10(g/ml)、チオイノシン(6-MRP)(3(g/ml)、およびシトシンアラビノシド(CA)(4(g/ml)
抗生物質：
マイトマイシンC(MMC)(0.2(g/ml)、ブレオマイシン(BLM)(1(g/ml)、ペプロマイシン(PEP)(0.5(g/ml)、クロモマイシンA3(TM)(0.01(g/ml)、およびネオカルジノスタチン(NCS)(0.15(g/ml)
トポイソメラーゼインヒビター：
アクチノマイシンD(ACD)(0.01(g/ml)、アクラルビシン(ACR)(0.6(g/ml)、アドリアマイシン(ADM)(0.3(g/ml)、ダウノマイシン(DM)(0.6(g/ml)、ピラルビシン(THP)(0.3(g/ml)、エピルビシン(4'-EPI)(0.4(g/ml)、ミトキサントロン(MIT)(0.06(g/ml)、エトポシド(VP-16)(3(g/ml)、およびカンプトテシン(CPT-11)(3(g/ml)
微小管阻害剤：
ビンクリスチン(VCR)(0.1(g/ml)、ビンブラスチン(VLB)(0.1(g/ml)、ビンデシン(VDS)(0.1(g/ml)、およびパクリタキセル(TAX)(0.6(g/ml)
これらのインビトロの薬物濃度を、臨床的に推奨される用量を投与した時の最高血中濃度の約1/10に設定し、そして選択した10の薬物（CPM、ACNU、CDDP、PEP、ADM、VP-16、CA、TAX、VCR）において、用量による反応の違いを評価した。これらの培養された検体を、リン酸緩衝化生理食塩水(pH7.2)／0.1% Triton X-100／0.1mg/ml RNase／0.01%アジ化ナトリウムと15分間混合し、次いで50(g/mlのヨウ化プロピジウム(Sigma,St.Louis,MO)と5分間混合した。単離された核をフローサイトメーター(FACScan:Becton Dickinson,Mountain view,CA)を用いて分析した。アポトーシスの核を、低二倍体(sub-G1)領域にシフトさせ、そして一体化した二倍体ピークにおける逆の減少を、未処理のコントロール細胞の減少と比較することによって、薬物の有効性を判定した。薬物誘引による細胞死を形態学的に確認するため、細胞を70%エタノールで固定し、そしてスライドガラス上でギムザ染色した（Iwadate, Y., et al., Int J Mol Med 10: 187-192, 2002）。クロマチンの分解および凝縮を、アポトーシスのマーカーとして判定し、フィッシャーの直接確率検定によって量的に評価した。この形態学的検査によって、調製物中の腫瘍細胞の平均の割合が、一貫して95％を上回っていたことが示された。FCMによって評価されたDNAの統合性は、アポトーシスの形態学的変化とよく相関していた。偽陰性の結果を回避するために、アッセイのうちいずれかが陽性であると判定された場合、最終的に、薬物をインビトロで有効であると決定した。
【００６４】
以上の方法によって得られた薬剤感受性の程度とプロテオームプロファイリングパターンとの関連を調べた。薬剤感受性は症例毎に多様性を示していた（図５）。実施例１（２）と同様にして得られた試料軸における系統樹上において、薬剤感受性は特徴的な分布を示した（図６）。すなわち、アルキル化剤は健常な脳組織近傍に集まった腫瘍に対して有効率が高いが、健常脳組織から離れた所に集まった腫瘍に対しては全く無効であった。アルキル化剤の一つであるACNUに感受性を有する腫瘍は、微小管阻害剤の一つであるVCRに対して一般的に抵抗性であった。全ての薬剤に抵抗性の腫瘍の多くは、健常脳組織から離れた所に集まっていた。
【００６５】
全ての薬剤に対して抵抗性の腫瘍は、アポトーシスによる細胞死のメカニズムを喪失した腫瘍と考えられるため、実施例１（２）と同様に有効薬剤の有無による識別分析を施行した。その結果、30個の既知のタンパク質と12個の未知のタンパク質が抽出された。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、脳腫瘍の悪性度の程度および／または薬剤感受性を正確に診断することが可能となり、より有効な治療法の選択が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】健常な脳組織（A）、星状細胞腫（B）、未分化星状細胞腫（C）および多形性神経膠芽腫（D）の代表的な2次元電気泳動像である。
【図２】4個の異なるタンパク質スポットにおいて、低グレードの星状細胞腫と高グレードの星状細胞腫（多形性神経膠芽腫または未分化星状細胞腫）の間で、2次元電気泳動ゲル上に異なって発現されたタンパク質スポットである。
【図３】75個の神経膠芽腫試料および10個の健常な脳試料において測定したプロテオームプロファイリングデータに基づいて、それぞれの場合について階層的クラスタリングを適用した。階層グレードは、健常な脳組織（Normａl）、星状細胞腫（A）、未分化星状細胞腫（AA）、および多形性神経膠芽腫（GM）の4つの群に類別した。各患者の生存期間を、最大5年として右欄に示した。
【図４】低グレードの星状細胞腫と高グレードの星状細胞腫の間で異なって発現されたタンパク質スポットに対するマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)。決定されたアミノ酸配列は、タンパク質（αクリスタリン）の全長配列上に下線を付して示した。
【図５】代表的抗癌剤に対する薬剤感受性試験の具体例を示す。AはCPM、ACNU、BはCPM、ACNU、TAX、CはVCRがそれぞれ有効であり、Dは全薬剤無効例である。試料軸における系統樹上において、AとBは健常な脳組織に近い部位に位置し、Cは健常な脳組織からやや離れた部位に、Dは健常な脳組織からより遠い部位に位置している。
【図６】75個の神経膠芽腫試料および10個の健常な脳試料に加え、比較的薬剤感受性の高いことが知られている８個の乏突起神経膠種において測定したプロテオームプロファイリングデータに基づいて、それぞれの場合について階層的クラスタリングを適用した。階層グレードは、健常な脳組織（Normａl）、星状細胞腫（A）、未分化星状細胞腫（AA）、多形性神経膠芽腫（GM）、および乏突起神経膠種(Oligo)の5つの群に類別した。右欄に、用量反応関係を評価した10の代表的薬剤（CPM、ACNU、CDDP、PEP、ADM、VP-16、CA、TAX、VCR）に対する感受性を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図５】
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【配列表】
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