(57)【要約】【課題】  誘導的に骨細胞を欠失させることのできるトランスジェニック動物の製造に用いることのできるＤＮＡ構築物の提供。【解決手段】  宿主に対して本質的に毒性を示さない化合物を投与することにより、該宿主において骨細胞を欠失させることを可能とするＤＮＡ構築物であって、前記化合物に結合する受容体をコードするＤＮＡ、および該ＤＮＡに機能しうる形で連結されたＤＭＰ１遺伝子プロモーターを含んでなり、前記化合物と前記受容体との結合により該受容体を発現している細胞の死滅がもたらされる、ＤＮＡ構築物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主に対して本質的に毒性を示さない化合物を投与することにより、該宿主において骨細胞を欠失させることを可能とするＤＮＡ構築物であって、
前記化合物に結合する受容体をコードするＤＮＡ、および該ＤＮＡに機能しうる形で連結されたＤＭＰ１遺伝子プロモーターを含んでなり、前記化合物と前記受容体との結合により該受容体を発現している細胞の死滅がもたらされる、ＤＮＡ構築物。
【請求項２】
前記ＤＭＰ１遺伝子プロモーターが、ＤＭＰ１遺伝子において転写開始点の５’側に隣接する少なくとも１．５ｋｂｐのプロモーター領域を含んでなるものである、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３】
前記ＤＭＰ１遺伝子プロモーターが、ＤＭＰ１遺伝子において転写開始点の５’側に隣接する少なくとも９．６ｋｂｐのプロモーター領域を含んでなるものである、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４】
前記化合物がジフテリア毒素であり、前記受容体がジフテリア毒素受容体である、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項５】
前記受容体をコードするＤＮＡと前記ＤＭＰ１遺伝子プロモーターとの間に、ＤＭＰ１遺伝子の第１イントロンを含んでなるものである、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含んでなる、ベクター。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または請求項６に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または請求項６に記載のベクターを含んでなる、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項９】
前記ＤＮＡ構築物がゲノム中に含まれている、請求項８に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１０】
前記非ヒト動物が生物実験に用いるための動物である、請求項８に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物を製造する方法であって、目的とする非ヒト動物に請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または請求項６に記載のベクターを導入することを含んでなる、方法。
【請求項１２】
目的とする非ヒト動物への前記ＤＮＡ構築物の導入が、該非ヒト動物からの受精卵に該ＤＮＡ構築物を注入し、得られた受精卵を飼育することによって行なわれる、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、トランスジェニック動物に関するものであり、より詳細には、誘導的に骨細胞を欠失させることのできるトランスジェニック動物に関するものである。
【０００２】
背景技術
骨に関連する細胞としては、破骨細胞、骨芽細胞および骨細胞が知られている。破骨細胞や骨芽細胞の産生するタンパク質についてはいくつか知られており、そのうちの一部は骨代謝のマーカーとして臨床分野において利用されている。一方で、骨細胞（osteocyte）については、特異的な遺伝子産物は知られておらず、in vivoでの機能も解明されていない。骨細胞は、骨芽細胞が終末分化した細胞である。骨細胞は、休止期にあって増殖せず、硬組織に埋没している。そのため、細胞突起などの形態学的な特徴に基づいて骨細胞を単離することは可能と思われるが、その単離は極めて困難である。また、一般にin vitroでの遺伝子の発現パターンはin vivoとは異なるため、骨細胞の単離が可能であったとしても、in vivoにおける骨細胞の生物学的特性を分析することは困難とされている。
【０００３】
特定の細胞のin vivoにおける生物学的特性を分析する方法として、動物の生体内において目的の細胞を欠失させ、その影響を検討する方法が考えられる。このような方法に有用な実験動物として、ジフテリア毒素の投与により肝細胞が選択的に破壊されるトランスジェニックマウスが開発されている（特許文献１：国際公開第９８／３３８９９号パンフレット；非特許文献１：Saito M. et al., Nature Biotechnology 19, 746-750, 2001）。このトランスジェニックマウスには、肝実質細胞に特異的に発現するアルブミン遺伝子のエンハンサー／プロモーターの下流にヒトジフテリア毒素受容体遺伝子を連結したＤＮＡ構築物が導入されている。従って、このトランスジェニックマウスにジフテリア毒素を投与すると、ジフテリア毒素受容体を発現している肝細胞が特異的に破壊される。しかし、骨細胞を特異的に欠失させることのできるトランスジェニック動物は知られていない。
【０００４】
一方で、骨細胞において発現する遺伝子として、ＤＭＰ１（dentine matrix protein 1）遺伝子が知られている（非特許文献２：Toyosawa S. et al., J. Bone Miner. Res. 16, 2017-2026, 2001）。また、ラットＤＭＰ１遺伝子プロモーターにおいて、該遺伝子の発現の組織特異性を調節する配列は、転写開始点からその２．０ｋｂ上流までの領域内にあることが報告されている（非特許文献３：Thotakura S. R. et al., J. Biol. Chem. 275, 10272-10277, 2000）。
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９８／３３８９９号パンフレット
【非特許文献１】Saito M. et al., Nature Biotechnology 19, 746-750, 2001
【非特許文献２】Toyosawa S. et al., J. Bone Miner. Res. 16, 2017-2026, 2001
【非特許文献３】Thotakura S. R. et al., J. Biol. Chem. 275, 10272-10277, 2000
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、ＤＭＰ１遺伝子プロモーターの制御下において細胞毒性化合物の受容体を発現するＤＮＡ構築物を用いることにより、該ＤＮＡ構築物を導入されたトランスジェニック動物の骨細胞において特異的に前記受容体を発現させることが可能となり、さらには、宿主に対して本質的に毒性を示さない化合物を前記細胞毒性化合物として用いることにより、前記トランスジェニック動物への前記化合物の投与によって該動物における骨細胞を欠失させることが可能となることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００７】
従って、本発明の目的は、誘導的に骨細胞を欠失させることのできるトランスジェニック動物、およびその製造に用いることのできるＤＮＡ構築物を提供することにある。
【０００８】
そして、本発明によるＤＮＡ構築物は、宿主に対して本質的に毒性を示さない化合物を投与することにより、該宿主において骨細胞を欠失させることを可能とするＤＮＡ構築物であって、前記化合物に結合する受容体をコードするＤＮＡ、および該ＤＮＡに機能しうる形で連結されたＤＭＰ１遺伝子プロモーターを含んでなり、前記化合物と前記受容体との結合により該受容体を発現している細胞の死滅がもたらされる、ＤＮＡ構築物である。
【０００９】
さらに、本発明によるトランスジェニック動物は、本発明によるＤＮＡ構築物またはこれを含むベクターを含んでなる、トランスジェニック非ヒト動物である。
【００１０】
本発明によれば、化合物の投与によって誘導的に骨細胞を欠失させることのできるトランスジェニック動物が提供される。このトランスジェニック動物を用いることにより、天然の動物との比較による骨細胞での遺伝子発現およびタンパク質産生の分析が可能となり、従って、骨細胞のin vivoでの機能を分析することが可能となる。このような分析により得られる知見は、骨に関する疾病の診断または治療において極めて有用である。
【発明の具体的説明】
【００１１】
本発明によるＤＮＡ構築物は、宿主に対して本質的に毒性を示さない化合物を投与することにより、該宿主において骨細胞を欠失させることを可能とするＤＮＡ構築物である。このＤＮＡ構築物は、前記化合物に結合する受容体をコードするＤＮＡ、および該ＤＮＡに機能しうる形で連結されたＤＭＰ１遺伝子プロモーターを含んでなり、前記化合物と前記受容体との結合により該受容体を発現している細胞の死滅がもたらされる。
【００１２】
本明細書において「ＤＭＰ１遺伝子プロモーター」とは、天然の生物の体内においてＤＭＰ１（dentine matrix protein 1）遺伝子のｍＲＮＡへの転写を駆動する機能性領域を意味し、典型的には該遺伝子の転写開始点の５’側（上流側）に位置するものである。このようなＤＭＰ１遺伝子プロモーターは、当業者であれば容易に製造または単離することができる。例えば、このＤＭＰ１遺伝子プロモーターは、ＤＭＰ１遺伝子を有する生物のゲノムライブラリーから、ＤＭＰ１遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプローブを用いて単離することが可能である。ＤＭＰ１遺伝子のヌクレオチド配列およびこれによりコードされるアミノ酸配列としては様々な生物に由来するものが知られており、例えば、マウスＤＭＰ１遺伝子については、配列番号１で表されるゲノム上のヌクレオチド配列、ならびに配列番号２で表されるｃＤＮＡ配列および配列番号３で表されるアミノ酸配列が挙げられる。配列番号１は、マウスＤＭＰ１遺伝子における、転写開始点の９６１４ｂｐ上流までのプロモーター領域（第１〜９６１４残基）、第１エクソン（第９６１５〜９７０１残基）、第１イントロン（第９７０２〜１４０６４残基）、第２エクソン（第１４０６５〜１４１３９残基）、第２イントロン（第１４１４０〜１４５７８残基）、第３エクソン（第１４５７９〜１４６２６残基）、第３イントロン（第１４６２７〜１６８８６残基）、第４エクソン（第１６８８７〜１６９１９残基）、第４イントロン（第１６９２０〜１７０９０残基）、第５エクソン（第１７０９１〜１７１３５残基）、第５イントロン（第１７１３６〜１８６２７残基）および第６エクソン（第１８６２８残基〜第２１１００残基付近）を含んでおり、該遺伝子の転写開始点は第９６１５残基である。ＤＭＰ１遺伝子プロモーターは、本発明によるＤＮＡ構築物を導入する対象となる宿主動物に由来するものとすることが好ましい。
【００１３】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記ＤＭＰ１遺伝子プロモーターは、ＤＭＰ１遺伝子において転写開始点の５’側に隣接する少なくとも１．５ｋｂｐのプロモーター領域を含んでなるものとされ、より好ましくは前記転写開始点の５’側に隣接する少なくとも９．６ｋｂｐのプロモーター領域を含んでなるものとされる。
【００１４】
本明細書において「宿主に対して本質的に毒性を示さない化合物」とは、宿主となる動物が人工的に遺伝子操作されていない場合に、その動物に対して毒性を示さない化合物を意味する。このような化合物は、宿主となる動物の種に応じて、当業者であれば容易に選択することができる。また、前記化合物に結合する受容体としては、前記化合物との結合により該受容体を発現している細胞が死滅するものであればよく、特に制限されない。このような受容体およびこれをコードするＤＮＡは、当業者であれば容易に利用することが可能であり、例えば、前記化合物が毒性を示す動物から単離することができる。このような化合物と受容体との組み合わせとしては、例えば、それらの結合によって細胞内のタンパク質合成を抑制するもの、アポトーシスを起こすもの等が挙げられる。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記化合物はジフテリア毒素とされ、前記受容体はジフテリア毒素受容体とされる。ジフテリア毒素は酵素活性部位であるフラグメントＡとフラグメントＢからなるＡ−Ｂ型毒素である。フラグメントＡにはＡＤＰリボース転移酵素活性があり、真核細胞のタンパク質合成に必須なペプチド伸張因子ＥＦ−２を不活性化することにより毒性を発揮する。ジフテリア毒素は、細胞表面に存在するジフテリア毒素受容体を介して細胞内に侵入し、その細胞におけるタンパク質合成を阻害することにより該細胞を死滅させる。ジフテリア毒素受容体は、ヘパリン結合性上皮細胞増殖因子ＨＢ−ＥＧＦ膜結合型前駆体（ＨＢ−ＥＧＦ）としても知られている。ジフテリア毒素受容体およびこれをコードするＤＮＡとしては、ヒトに由来するＨＢ−ＥＧＦおよびこれをコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ等が挙げられ、例えば、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質および配列番号４で表されるヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ（ＮＣＢＩデータベースアクセス番号：ＮＭ＿００１９４５）が挙げられる。従って、ジフテリア毒素受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号４中の第２６２〜８８８残基で表されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡを用いることができる。
【００１６】
本発明によるＤＮＡ構築物においては、前記受容体をコードするＤＮＡとＤＭＰ１遺伝子プロモーターとが機能しうる形で連結されている。ここで「機能しうる形で連結され」とは、前記ＤＮＡがＤＭＰ１遺伝子プロモーターの制御下において前記受容体を発現しうるようにこれらが連結されることを意味する。このような連結は、当技術分野において周知の標準的な方法に従って行なうことができる。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明によるＤＮＡ構築物は、前記受容体をコードするＤＮＡと前記ＤＭＰ１遺伝子プロモーターとの間にイントロンを含んでなるものとされ、より好ましくはＤＭＰ１遺伝子の第１イントロンを含んでなるものとされる。
【００１８】
本発明によるＤＮＡ構築物は、宿主（宿主細胞または宿主動物）への導入の際に、ベクター中に組み込まれた形態で用いることができる。従って、本発明によれば、本発明によるＤＮＡ構築物を含んでなるベクターが提供される。
【００１９】
本発明によるベクターは、宿主動物またはその細胞において、本発明によるＤＮＡ構築物を安定して保持し、前記ＤＭＰ１遺伝子プロモーターの制御下での前記受容体の発現を可能とするものであればよい。このようなベクターは、利用される宿主への遺伝子導入法に応じて、当業者によって適宜製造される。
【００２０】
本発明によるＤＮＡ構築物および本発明によるベクターは、宿主細胞に導入することができる。従って、本発明によれば、本発明によるＤＮＡ構築物または本発明によるベクターを含んでなる宿主細胞が提供される。
【００２１】
前記宿主細胞としては、様々な動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞を用いることができる。また、前記宿主細胞は、好ましくは非ヒト動物細胞、より好ましくは生物実験に用いるための動物からの細胞、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル等からの細胞とされ、さらに好ましくはマウスからの細胞とされる。
【００２２】
本発明による宿主細胞は、ＤＮＡ構築物またはベクターの細胞への導入に用いることのできる様々な方法によって製造することができる。このような方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃を用いる方法、エレクトロポレーション法などを挙げることができ、さらには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどの組換えウイルスベクターを用いる方法を挙げることができる。また、本発明による宿主細胞は、本発明によるＤＮＡ構築物をゲノム中に含んでいることが好ましい。ＤＮＡ構築物を細胞のゲノム中に導入する方法としては、そのＤＮＡ構築物を細胞中に長時間保持する方法が挙げられ、さらには、特定のヌクレオチド配列を認識するタンパク質とインテグラーゼとを利用する方法（Science 267, 1443-1444, 1995）が挙げられる。
【００２３】
本発明によるＤＮＡ構築物および本発明によるベクターは、宿主動物に導入することができ、これによりトランスジェニック動物を製造することができる。従って、本発明によれば、本発明によるＤＮＡ構築物または本発明によるベクターを含んでなるトランスジェニック非ヒト動物が提供される。本発明によるトランスジェニック非ヒト動物は、そのゲノム中に本発明によるＤＮＡ構築物を含んでなるものとすることが好ましい。
【００２４】
前記宿主動物は、ヒト以外の動物（非ヒト動物）であればよく、特に制限されないが、好ましくは非ヒト哺乳動物とされ、より好ましくは生物実験に用いるための動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル等とされ、さらに好ましくはマウスとされる。
【００２５】
本発明によるトランスジェニック非ヒト動物は、目的とする非ヒト動物（宿主動物）に本発明によるＤＮＡ構築物または本発明によるベクターを導入することによって製造することができる。より具体的には、前記トランスジェニック非ヒト動物は、例えば、微小ピペットを用いて前核期卵の核にＤＮＡ構築物を直接注入する方法（マイクロインジェクション法：Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 7380-7384, 1980）、組換えレトロウイルスベクターを用いる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-6152, 1985；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6927-6931, 1985；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 8587-8591, 1985）、胚性幹細胞を用いる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9065-9069, 1986）によって製造することができる。特に、トランスジェニックマウスの製造法は広く知られており（Hogan B.ら、「マウス胚の操作マニュアル」、近代出版、東京、１９８９；野村達次ら、「発生工学実験マニュアル」、講談社、東京、１９８７；山村研一、「マウスから見た分子医学」、南江堂、東京、１９９３）、これらの方法を他の動物に応用することも可能である。
【００２６】
本発明の好ましい実施態様によれば、目的とする非ヒト動物への前記ＤＮＡ構築物または前記ベクターの導入は、該非ヒト動物からの受精卵に該ＤＮＡ構築物または該ベクターを注入し、得られた受精卵を飼育することによって行なわれる。この方法は、例えば、目的とする非ヒト動物から受精卵を採取し、マイクロマニュピレーターを用いてＤＮＡ構築物を受精卵の前核中に注入し、得られた受精卵を卵管に移入することによって行なうことができる。
【００２７】
本発明によるトランスジェニック非ヒト動物においては、ＤＭＰ１遺伝子プロモーターにより、宿主（非ヒト動物）に対して本質的に毒性を示さない化合物の受容体が骨細胞に特異的に発現している。従って、このトランスジェニック非ヒト動物に対して前記化合物を投与することにより、骨細胞を特異的に死滅させることが可能である。化合物の投与量および投与の時期は特に制限されるものではない。また、化合物の投与経路も特に制限されるものではなく、腹腔内、骨髄腔内など、いずれの経路であってもよい。化合物の投与経路は、骨細胞を死滅させようとする目的の部位の近位への局所投与としてもよく、例えば、大腿骨における骨細胞を死滅させる場合には、大腿骨骨髄腔への投与とすることができる。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これら実施例は本発明を限定するものではない。
【００２９】
例１：マウスＤＭＰ１遺伝子プロモーターの制御下においてジフテリア毒素のヒト型受容体を発現するＤＮＡ構築物の作製
1.1 マウスＤＭＰ１遺伝子のプロモーター領域のクローニング
マウスＤＭＰ１遺伝子プロモーターを単離するため、マウスゲノムライブラリーから該遺伝子の転写開始点よりも５’側の配列を有するクローンをスクリーニングした。具体的には、Mouse genomic library Lambda FIX II（Stratagene社）からの1.2×106個のプラークを対象として、マウスＤＭＰ１遺伝子の第−３５００〜−３０００ヌクレオチド（５００ヌクレオチド長：ヌクレオチドに付された番号は同遺伝子の翻訳開始コドン中のアデニン残基を１とした場合におけるそのヌクレオチド残基の位置を示す）をプローブとしてスクリーニングを行ない、その結果として１４個の陽性クローンを得た。次いで、これら陽性クローンの全てのファージＤＮＡを精製し、ＮｏｔＩ消化により得られたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を決定した。その結果、最も長いプロモーター領域が含まれている２つのクローンを同定した。これらのクローンは、翻訳開始点（翻訳開始コドン中のアデニン残基）の３００ｂｐ上流から転写開始点の９６１４ｂｐ上流までを含む同一のクローンであることがわかった（図１を参照）。
【００３０】
1.2 ＤＭＰ１遺伝子プロモーターの機能解析
上述のスクリーニングにより得られたＤＭＰ１遺伝子プロモーター配列について、転写活性に必要な領域を、内在性のＤＭＰ１遺伝子を発現するマウス骨芽細胞株（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）を用いるルシフェラーゼアッセイ法によって調べた。
【００３１】
まず、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞においてＤＭＰ１遺伝子が発現することを確認するため、該細胞におけるＤＭＰ１遺伝子ｍＲＮＡの検出を行なった。陰性対照としては、マウス骨髄由来ストローマ細胞株（ＳＴ−２細胞）を用いた。具体的には、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞およびＳＴ−２細胞から、TRIzol Reagent（Invitorogen社：「TRIzol」はInvitorogen社の登録商標である）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅＩ処理により混入ゲノムＤＮＡを消化した。次に、これらの全ＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲにより、ＤＭＰ１遺伝子からのｍＲＮＡの有無を調べた。ＲＴ−ＰＣＲには、DMP1-F（5'-agagggtagaggaatcgcat-3'：配列番号６）およびDMP1-R（5'-cggtctatactggcctctgtcg-3'：配列番号７）からなるプライマーペアを用いた。ＤＭＰ１遺伝子ｍＲＮＡの存在を示すものとして予想される増幅産物のサイズは２７８ｂｐである。その結果、ＳＴ−２細胞ではＤＭＰ１遺伝子が発現していないのに対し、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞ではＤＭＰ１遺伝子が発現していることが確認された。
【００３２】
次いで、様々なヌクレオチド長を有するマウスＤＭＰ１遺伝子プロモーターの転写活性を評価するため、ルシフェラーゼアッセイを行なった。具体的には、予想される転写開始点の２３０ｂｐ下流から転写開始点の約１．０ｋｂｐ、１．５ｋｂｐおよび１．７ｋｂｐ上流までのプロモーター領域を、pGL3-Lusiferase basic vector（Promega社）のマルチクローニングサイト内にあるＸｈｏＩ部位に組み込んだ。得られた３種のベクターにおいては、ホタルルシフェラーゼ遺伝子のｃＤＮＡの上流に上述の各種プロモーター領域が連結されている（これらのＤＮＡ構築物を、それぞれ「1.0kb/F」、「1.5kb/F」および「1.7kb/F」という）。それぞれのベクターを、ＤＭＰ１遺伝子を発現するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に導入し、その４８時間後にルシフェラーゼ活性を測定することにより転写活性を調べた。この実験では、ＤＭＰ１遺伝子をほとんど発現しないＳＴ−２細胞を陰性対照とした。
【００３３】
その結果、図２に示すように、転写開始点から１．５ｋｂおよび１．７ｋｂ上流までの配列を含むＤＮＡ構築物（それぞれ1.5kb/Fおよび1.7kb/F）について顕著に高い転写活性が見られた。さらに、転写開始点から１．０ｋｂ未満までの配列を含むＤＮＡ構築物においては、転写活性が著しく低下した（図２中の「Promoter less」）。また、ＳＴ−２細胞では、いずれのＤＮＡ構築物についても転写活性が見られなかった。これらの結果から、マウスＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞において転写活性を示すのに必要なマウスＤＭＰ１遺伝子プロモーター領域は、転写開始点の５’側の１．５ｋｂ以内に存在することが明らかとなった。
【００３４】
1.3 ＤＮＡ構築物の作製およびその効果の確認
マウスＤＭＰ１遺伝子プロモーターの制御下においてジフテリア毒素のヒト型受容体を発現するＤＮＡ構築物を作製し、これにより付与されるジフテリア毒素感受性を確認した。
【００３５】
ＤＮＡ構築物は、次のようにして作製した。まず、標的とする骨細胞に特異的なプロモーターとして働くことが予想されたマウスＤＭＰ１遺伝子の転写開始点の上流に位置する１．５ｋｂｐを、pBluescript II SK(+)プラスミドベクターのマルチクローニングサイト内にあるＮｏｔＩ部位に導入し、さらに、β−グロビンの第２エクソン−第２イントロン−第３エクソン配列の下流にヒトＨＢ−ＥＧＦｃＤＮＡおよびβ−グロビン／ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列を連結したＤＮＡ断片を、マルチクローニングサイト内にあるＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ部位に導入した（得られたプラスミドベクターを「pDTR1.5kb」という）。また、マウスＤＭＰ１遺伝子の転写開始点の９．６１４ｋｂｐ上流から翻訳開始点（翻訳開始コドン中のＡ）の３ｂｐ上流までを含んだＤＮＡ断片（マウスＤＭＰ１遺伝子の第１エクソン、第１イントロンおよび第２エクソンを含む）を作製し（図１）、これをpBluescript II SK(+)プラスミドベクターのマルチクローニングサイト内にあるＮｏｔＩ／ＸｂａＩ（ＮｈｅＩ）部位に導入し、さらに、ヒトＨＢ−ＥＧＦｃＤＮＡの下流にβ−グロビン／ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列を連結したＤＮＡ断片を、ＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＶ部位に導入した（得られたプラスミドベクターを「pDTR9.6kb」という）。pDTR1.5kbおよびpDTR9.6kbに含まれるＨＢ−ＥＧＦ発現カセットの構造を図３に示す。
【００３６】
作製したプラスミドベクター（pDTR1.5kbまたはpDTR9.6kb）とネオマイシン耐性遺伝子を含むpDsRed2-Nuc（CLONTECH社）とを５：１の割合で、培養液（ＤＭＥＭ，１０％ＦＢＳ）４ｍｌを含む６ｃｍディッシュにおいて、６０％コンフルエントのマウスＤＭＰ１遺伝子を発現するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞およびこれを発現しないＳＴ−２細胞へリポフェクション法により遺伝子導入した。得られた細胞を、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４８時間培養し、培養液中にＧ４１８を添加し、Ｇ４１８に耐性を示す細胞のみを選択した。得られた細胞を、１０ｍｌの培養液（ＤＭＥＭ，１０％ＦＢＳ）を含む１０ｃｍディッシュに播き直した後、７０％コンフルエントになった時点で全ＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析を行なった。その結果、得られたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞において、遺伝子導入されたＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のｍＲＮＡの発現が確認された。
【００３７】
次いで、得られた細胞におけるジフテリア毒素への感受性を調べるため、毒素によるタンパク質合成阻害効率を測定した。具体的には、上述のようにネオマイシンにより選択された細胞を、１ウェルあたり培養液(ＤＭＥＭ，１０％ＦＢＳ）５００μｌおよび１×１０５個の細胞が含まれるように２４ウェルプレートに播種し、その１２時間後に、各ウェルにジフテリア毒素（Sigma社）を用量依存的に（０、０．１、１．０、または１０μｇ／ｍｌ）添加し、６時間インキュベートした。６時間後、得られた細胞を、メチオニンおよびシステインをともに含まないＤＭＥＭ（Life Technologies社）に５μＣｉ／ｍｌの［３５Ｓ］メチオニン／システインを加えた培養液中で、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１時間培養した。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶解させ、細胞溶解液中のタンパク質を１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて沈澱させ、ガラスフィルター（Whatman社）に吸着させた。このガラスフィルターをＰＢＳで３回洗浄した後、これを乾燥させ、シンチレーション溶液を加え、液体シンチレーションカウンターにてタンパク質合成に用いられた［３５Ｓ］メチオニン／システインの放射活性を測定し、タンパク質合成阻害率を評価した。
【００３８】
図４および図５に示すように、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞では、pDTR1.5kbを導入した細胞およびpDTR9.6kbを導入した細胞の双方において、遺伝子導入していない細胞に比べて最大で７０％のタンパク質合成阻害が見られた。一方で、図６に示すように、ＳＴ−２細胞では、顕著なタンパク質合成阻害は見られなかった。以上の結果から、構築された二種類のＤＮＡ構築物は、ＤＭＰ１遺伝子を発現する細胞においてのみジフテリア毒素受容体を発現し、このジフテリア毒素受容体が発現した細胞においては、ジフテリア毒素の作用によりタンパク質合成が阻害されることが明らかとなった。
【００３９】
例２：トランスジェニックマウスの作製
2.1 ＤＮＡ構築物を含むマウスの作出
プラスミドベクターpDTR1.5kbおよびpDTR9.6kbを制限酵素ＳａｃＩＩ／ＣｌａＩで消化し、アガロースゲル抽出を行なうことにより、ＤＮＡ構築物DTR1.5kbおよびDTR9.6kb（図３）を単離した。その後、これらＤＮＡ構築物のいずれかを、マウス受精卵へ注入した。
【００４０】
各マウスにおけるＤＮＡ構築物の存否は、離乳後、尻尾から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法によって確認した。DTR1.5kbの導入確認用プライマーとしては、β-globinE3-F：5'-ctgggcaacgtgctgg-3'（配列番号８）およびHB-EGF-1R：5'-cgccagtcaccagtgccgag-3'（配列番号９）からなるプライマーペアを用い、DTR9.6kbの導入確認用プライマーとしては、DMP1E2-F：5'-gtatcatgaagtgaaacatc-3'（配列番号１０）およびHB-EGF-2R：5'-gagggtccgggttgctggttcc-3'（配列番号１１）からなるプライマーペアを用いた。
【００４１】
DTR1.5kbの導入については、１回目の実験では、受精卵２１５個より、６匹のマウス（雄４匹および雌２匹）の離乳に成功した。このうち、３匹のマウス（雄２匹および雌１匹）においてDTR1.5kbの存在が確認された。２回目の実験では、受精卵１０５個より、１１匹のマウス（雄８匹および雌３匹）の離乳に成功し、このうち、２匹のマウス（雄２匹）においてDTR1.5kbの存在が確認された。
【００４２】
DTR9.6kbの導入については、１回目の実験では、受精卵２１６個より、９匹のマウス（雄３匹および雌６匹）の離乳に成功し、このうち、２匹のマウス（雄１匹および雌１匹）においてDTR9.6kbの存在が確認された。２回目の実験では、受精卵１３３個より、６匹のマウス（雄３匹および雌３匹）の離乳に成功し、このうち、１匹のマウス（雌１匹）においてDTR9.6kbの存在が確認された。３回目の実験では、受精卵２３６個より、９匹のマウスの離乳に成功し、このうち、１匹のマウス（雄１匹）においてDTR9.6kbの存在が確認された。
【００４３】
すなわち、DTR1.5kbの導入については５匹（雄４匹および雌１匹）のトランスジェニックマウスを作出し、DTR9.6kbの導入については４匹（雄２匹および雌２匹）のトランスジェニックマウスを作出した。このうち、系統として安定したものは、DTR1.5kbについては雄３匹であり、DTR9.6kbについては雄２匹および雌２匹であった。DTR1.5kbを導入したマウスを「DTR1.5Tg」と命名し、DTR9.6kbを導入したマウスを「DTR9.6Tg」と命名した。
【００４４】
2.2 トランスジェニックマウスにおけるＨＢ−ＥＧＦの発現
３系統のDTR1.5Tgマウスのうちの１系統（DTR1.5#1）および４系統のDTR9.6Tgマウスのうちの１系統（DTR9.6#1）について、ＨＢ−ＥＧＦの発現の有無を確認した。具体的には、DTR1.5#1マウスおよびDTR9.6#1マウスから各種主要臓器を取り出し、TRIzol Reagent（Invitorogen社：「TRIzol」はInvitorogen社の登録商標である）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅＩ処理により混入ゲノムＤＮＡを消化した。次に、これらの全ＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲにより、ＨＢ−ＥＧＦのｍＲＮＡ発現の有無を調べた。ＲＴ−ＰＣＲにおいて、DTR1.5#1マウスについては、HB-EGF-2F：5'-gtatccacggaccagctgctac-3'（配列番号１２）およびHB-EGF-3R：5'-gggtccctcttcttccctagc-3'（配列番号１３）からなるプライマーペアを用い、DTR9.6#1マウスについては、DMP1E1-F：5'-cgagaacttcgctgagg-3'（配列番号１４）およびHB-EGF-2R：5'-gagggtccgggttgctggttcc-3'（配列番号１１）からなるプライマーペアを用いた。
【００４５】
DTR1.5#1マウスでは、脳、心臓、肺、肝臓、膵臓および骨においてＨＢ−ＥＧＦのｍＲＮＡの発現が確認され、一方で、腎臓、骨髄および歯牙においては前記ｍＲＮＡの発現は確認されなかった。これに対し、DTR9.6#1マウスでは、骨および歯牙にのみ前記ｍＲＮＡの発現が確認され、一方で、脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、卵巣および骨髄においては前記ｍＲＮＡの発現は確認されなかった。この結果から、約９．６ｋｂｐのＤＭＰ１遺伝子プロモーターおよびＤＭＰ１遺伝子の第１イントロン中のサイレンサーの機能により、骨に対する組織特異性が高まるものと考えられる。
【００４６】
2.3 トランスジェニックマウスへのジフテリア毒素投与による骨細胞の死滅
DTR1.5#1マウスおよびDTR9.6#1マウスに、ジフテリア毒素（Sigma社）を腹腔内投与するか、または関節から大腿骨骨髄腔に投与した。投与量は５０μｇ／体重ｋｇまたは５００μｇ／体重ｋｇとし、投与回数は１回または２回とした。最終投与の２日後に脛骨および大腿骨を取り出し、脱灰液（１０％ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）に２週間浸して脱灰し、脱水した後にパラフィン包埋薄切標本を作製した。得られた骨標本をＨＥ染色し、顕微鏡で観察することにより、骨細胞の死滅の有無を確認した。
【００４７】
その結果として、両方のトランスジェニックマウスからの骨標本において、ジフテリア毒素投与後に骨細胞の死滅が確認された。骨細胞は、脛骨において特に顕著に死滅しており、また、骨細胞の死滅は、海綿骨に比べて皮質骨で多く見られた。同濃度の毒素（５０μｇ／体重ｋｇ）投与による骨細胞の死滅の割合は、DTR1.5#1マウスに比べてDTR9.6#1マウスの方が高かった。毒素を大腿骨に直接投与した動物では、大腿骨の皮質骨における骨細胞の死滅が観察された。
【００４８】
より詳細には、DTR1.5#1マウスの腹腔へ５０μｇ／体重ｋｇのジフテリア毒素を一回投与した場合においては、変形した脛骨骨細胞の像は確認されたが、脛骨骨細胞が完全に死滅して空になった骨小腔の割合は少なかった。なお、野生型マウスに同様に毒素を投与した場合には、このような変形した脛骨骨細胞および空になった骨小腔はほとんど認められなかった。DTR1.5#1マウスの腹腔へ５００μｇ／体重ｋｇのジフテリア毒素を一回投与した場合においては、脛骨骨細胞が死滅して空になった骨小腔の像が広範囲にわたって確認された。
【００４９】
DTR9.6#1マウスの腹腔へ５０μｇ／体重ｋｇのジフテリア毒素を一回投与した場合においては、脛骨骨細胞が死滅して空になった骨小腔の像が確認された。さらに、同マウスの腹腔へ５０μｇ／体重ｋｇのジフテリア毒素を二回投与した場合においては、著しく変形した脛骨骨細胞が確認され、また、脛骨骨細胞の完全な死滅によって空になった骨小腔が広範囲にわたって確認された。
【００５０】
これらの結果から、DTR9.6Tgマウスは、DTR1.5Tgマウスに比べて、骨におけるジフテリア毒素に対する感受性が高いものと考えられる。
【００５１】
腹腔内にジフテリア毒素を投与したDTR1.5#1マウスおよびDTR9.6#1マウスの大腿骨では骨細胞の死滅がほとんど確認できなかったため、大腿骨骨髄腔にジフテリア毒素を直接投与した。その結果、両トランスジェニックマウスの骨髄腔側の大腿骨において、骨細胞の完全な死滅が広範囲にわたって見られた。ジフテリア毒素の大腿骨骨髄腔への直接投与は、他の臓器への毒素の影響が少ないという点においても、好ましい投与方法であると思われる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、マウスＤＭＰ１遺伝子プロモーターの構造を示す図である。
【図２】図２は、様々なヌクレオチド長を有するマウスＤＭＰ１遺伝子プロモーターのＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞における転写活性を示すルシフェラーゼアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図３】図３は、ジフテリア毒素ヒト型受容体（ヒトＨＢ−ＥＧＦ）を発現させるためのＤＮＡ構築物の構造を示す図である。
【図４】図４は、pDTR9.6kbでトランスフェクトしたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞における、ジフテリア毒素によるタンパク質合成阻害を示すグラフである。
【図５】図５は、pDTR1.5kbでトランスフェクトしたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞における、ジフテリア毒素によるタンパク質合成阻害を示すグラフである。
【図６】図６は、pDTR1.5kbまたはpDTR9.6kbでトランスフェクトしたＳＴ−２細胞における、ジフテリア毒素によるタンパク質合成阻害を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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