(57)【要約】【課題】生体関連物質、環境関連物質等の標的物質を高感度に検出・測定することができる測定試薬及びそれを用いた標的物質の測定方法を提供する。【解決手段】担体に分子認識物質が吸着又は結合してなる分子認識複合体を複数種類含有し、そのうち少なくとも１種は標識物質を内包するものである測定試薬。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体に分子認識物質が吸着又は結合してなる分子認識複合体を複数種類含有し、そのうち少なくとも１種は標識物質を内包するものであることを特徴とする測定試薬。
【請求項２】
複数種類の分子認識複合体のうち少なくとも１種は、標識物質を内包しないものであることを特徴とする請求項１記載の測定試薬。
【請求項３】
複数種類の分子認識複合体は、分子認識物質が異なっていることを特徴とする請求項１又は２記載の測定試薬。
【請求項４】
分子認識物質は、蛋白質及び／又はＤＮＡであることを特徴とする請求項１、２又は３記載の測定試薬。
【請求項５】
複数種類の分子認識複合体の担体は、全て同符号の電荷を有するものであることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の測定試薬。
【請求項６】
担体に対して異符号の電荷を有する物質が吸着又は結合している分子認識複合体を含有することを特徴とする請求項５記載の測定試薬。
【請求項７】
複数種類の分子認識複合体のうち少なくとも１種は、担体が微粒子であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５又は６記載の測定試薬。
【請求項８】
複数種類の分子認識複合体のうち少なくとも１種は、担体がリポソーム又は無機表面を有する二分子構造膜からなる粒子であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６又は７記載の測定試薬。
【請求項９】
請求項１、２、３、４、５、６、７又は８記載の測定試薬と標的物質とを反応させることを特徴とする標的物質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体関連物質、環境関連物質等の標的物質を高感度に検出・測定することができる測定試薬及びそれを用いた標的物質の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗原抗体反応を利用して、血液中等に微量に存在するホルモン、酵素等を検出する免疫学的測定法は医療診断等に広く応用されている。従来、この免疫学的測定法としては、重層法、免疫拡散法、毛細管法、レーザーネフェロメトリー法等の沈降反応を利用したものや、免疫蛍光法、酵素免疫測定法及びラジオイムノアッセイ等の標識抗体を利用したものがある。これらのなかでも、とくに放射性同位元素を抗原又は抗体に標識した試薬を用いるラジオイムノアムッセイが広く用いられている。
【０００３】
これに対して放射性物質を用いない方法、すなわち酵素、バクテリオファージフリーラジカル、化学発光物質、蛍光物質等を標識とする方法も研究され、一部実用化されている。このような方法においては、測定感度を高めるためにサンドイッチ免疫測定法が応用され、たとえば最近では多孔質膜等の担体に固定化された抗体を用いて、標識物質が蛍光物質である方法（特許文献１及び特許文献２参照）や、標識物質がリン光標識物質である方法（特許文献３参照）等が報告されている。
【０００４】
しかしながら、沈降反応を利用した方法では、格子状の結合物をつくるのに多量の抗原と抗体とを必要とするため測定感度が悪いこと、また担体上に固定化された抗体に測定すべき抗原を反応させ、つぎに生成した抗原抗体複合体と標識抗体とを反応させる標識抗体を利用した方法では、標識物質の検出感度が悪いこと、抗体と抗原との親和性や抗体の純度等を高めなければ微量の抗原に対して検出感度が充分ではないこと等多くの問題点がある。
【０００５】
また、微量の抗原も感度良く検知できる測定法として特許文献４や特許文献５には、例えば蛍光物質等の標識物質を封入した抗体又は抗原結合リポソームを補体存在下で試料中の抗原又は抗体と反応させることが提案されている。この方法は、抗原−抗体と補体との結合反応を引き起こさせ、補体活性化によりリポソーム膜損傷反応が起こり、かかる反応量に比例して、リポソーム内から標識物質が放出される方法である。しかしながら、この方法では、動物の血清等から得られる補体が必須であるため、安定性、安全性、価格及び簡便性に問題があった。
【０００６】
【特許文献１】
特開昭６０−５７２５７号公報
【特許文献２】
特開昭６１−２７２６５９号公報
【特許文献３】
特開昭６１−２７５６５６号公報
【特許文献４】
特開昭６３−３０９８６４号公報
【特許文献５】
特開平５−１４２２３０号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、生体関連物質、環境関連物質等の標的物質を高感度に検出・測定することができる測定試薬及びそれを用いた標的物質の測定方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、担体に分子認識物質が吸着又は結合してなる分子認識複合体を複数種類含有し、そのうち少なくとも１種は標識物質を内包するものである測定試薬である。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明者らは、補体のような成分を必要とすることなく、高い検出感度を有する測定法について鋭意研究した結果、担体に分子認識物質が吸着又は結合してなる分子認識複合体を複数種類含有し、そのうちの少なくとも１種は標識物質を内包している試薬を使用して、標的物質との分子認識相互作用により分子認識複合体の構造が変化することによって、標識物質を介して標的物質を測定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明で用いられる分子認識複合体は、担体に分子認識物質が吸着又は結合してなるものである。
上記担体としては特に限定されず、標識物質を内包することができるものであればいかなる素材、形状からなるものであってもよく、例えば、有機系高分子、無機化合物、有機無機ハイブリッド素材からなるものが挙げられる。なかでも、分子認識相互作用による構造変化の容易性を考慮すると、リン脂質や糖脂質等を主要構成成分とするリポソーム等の微粒子が好適に用いられる。
【００１１】
上記リン脂質としては特に限定されず、例えば、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルセリン類、スフィンゴミエリン類等の動物や微生物等の細胞膜に広く存在する各種リン脂質；卵黄、牛脳や大豆等から得られるホスファチジルコリン；古細菌に属する好熱性菌脂質の天然の抽出物又は人工合成物等が挙げられる。
【００１２】
上記糖脂質としては、リポソームを形成するものであれば特に限定されず、例えば、スフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質等が挙げられる。
上記グリセロ糖脂質としては、例えば、マンノシルホスファチジルイノシトール類、ガラクトシルジアシルグリセロール類、スルフォキノボシルジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セミノリピド等が挙げられ、上記スフィンゴ糖脂質としては、例えば、マンノシルグルコシルセラミド、マンノシルイノシトールホスホリルセラミド類等が挙げられる。これらの糖脂質は単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
上記リン脂質と糖脂質とは、単独で用いられてもよく、併用されてもよい。
【００１３】
上記リポソームの形状としては特に限定されず、多重層リポソーム（以下、ＭＬＶと記す）、小さな一枚膜リポソーム（以下、ＳＵＶと記す）、大きな一枚膜リポソーム（以下、ＬＵＶと記す）の何れであってもよい。また、これらのリポソームは公知の方法で製造することができる。
上記担体としてはまた、無機表面を有する二分子構造膜からなる粒子も好適に用いられる。このような二分子構造膜からなる粒子は、例えば、リポソームをシリカにより架橋することにより製造することができる。
上記複数種類の分子認識複合体の担体は、同じであってもよく、異なっていてもよいが、少なくとも１種は微粒子であることが好ましく、少なくとも１種はリポソーム又は無機表面を有する二分子構造膜からなる粒子であることがより好ましい。
【００１４】
上記分子認識物質としては、標的物質に特異的に反応するものであれば特に限定されず、例えば、抗原、抗体等の蛋白質、ＤＮＡ、シクロデキストリン、クラウンエーテル等の環状化合物等が挙げられる。
上記抗体としては、被検目的に応じて適宜選択され、例えば、Ａｎｔｉ−Ｍｉｔｅ  Ｅｘｔｒａｃｔ、Ａｎｔｉ−Ｄｅｒｐ１、Ａｎｔｉ−Ｄｅｒｆ１、Ａｎｔｉ−Ｄｅｒｐ２、Ａｎｔｉ−Ｄｅｒｆ２等のダニアレルゲン関連；Ａｎｔｉ−Ｃｒｙｊ−１、Ａｎｔｉ−Ｃｒｙｊ−２等の花粉アレルゲン関連；Ａｎｔｉ−ＨＢｓＡｂ、Ａｎｔｉ−ＨＢｃＡｂ、Ａｎｔｉ−ＨＣＶ、Ａｎｔｉ−ＨｌＶＡｂ、ヒューマン・Ｔセル・ロイケミア・ウイルス−Ｉ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ヒューマン・Ｔセル・ロイケミア・ウイルス−ＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩ）等のウイルス関連等の抗体が挙げられる。これらの抗体は単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。上記抗体の担体への吸着又は結合は、公知の方法に従えばよい。例えば、リポソームへの結合方法としては、レスルマン（Ｌｅｓｒｍａｎ）らの方法（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）誌、２８８、６０４〜６０６、１９８０）、マルチン（Ｍａｒｔｉｎ）らの方法（バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）誌、２０、４２２９〜４２３８、１９８１）等を用いることができる。本発明で用いられる複数種類の分子認識複合体は、分子認識物質が同じであってもよいが、異なっていてもよい。分子認識物質が異なっていると、分子認識複合体と標的物質との分子認識相互作用がより複雑になり、分子認識複合体の構造変化を誘導しやすい。
【００１５】
本発明で用いられる複数種類の分子認識複合体のうち少なくとも１種は、標識物質を内包するものである。
上記標識物質としては、その物質の物理的、化学的シグナルを測定できるものであれば特に限定されず、例えば、ラジオイムノアッセイで用いられる１２５Ｉや１３１Ｉ等の放射性同位元素；β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、グルコース−６−リン酸脱水酵素、アルコール脱水酵素等の酵素；カルシウムイオン等の金属；フルオレセインイソチオシアネート、フルオレセインイソシアネート、テトローダミンイソチオシアネート、５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルフォニルクロリド等の蛍光物質；エオシンＹやオーラミンＯ等の発光物質；磁性物質、導電性物質、色素類等が挙げられる。なかでも、上記の各種酵素やカルシウムイオン等が好適に使用される。上記の各種酵素やカルシウムイオン等の金属を抗体結合一枚膜リポソームに封入し、４−メチルウムベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトシド、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸、４−メチルウムベリフェリルフォスフェート、グルコース−６−リン酸、エタノール等の基質や、カルパイン、プロテインキナーゼＣ、トランスグルタミナーゼ等のカルシウム依存性酵素を反応液中に入れておけば、抗原とリポソーム表面の抗体の反応によりリポソームが破壊され、外部に流出した酵素やカルシウムが、基質やカルシウム依存性酵素と生化学的増幅反応系を構成し、極微量の抗原に対して高感度に応答することができる。
【００１６】
上記標識物質を上記分子認識複合体に内包させる方法としては特に限定されないが、担体が膜構造を有する場合は該担体に封入し、担体が発泡体である場合には該担体の内部に含浸させる等の手法を用いることができる。
【００１７】
上記標識物質を内包する分子認識複合体の製造方法としては特に限定されないが、例えば、抗体感作リポソームは以下のようにして製造することができる。即ち、リン脂質や糖脂質をフラスコに入れ、溶媒を加えて反応させた後、溶媒を留去し、吸引乾燥する。しかる後に壁面に薄膜が形成されたフラスコ内に所定の標識物質及びリポソーム分解酵素の水溶液を加え、密栓をして振盪し、標識物質とリポソーム分解酵素が封入されたリポソームを得る。このとき、完成したリポソームを直ちに凍結乾燥させる必要がある。直ちに凍結乾燥されたリポソームは、内封されたリポソーム分解酵素により破壊されることなく保存される。一方、抗体と架橋剤とを緩衝液中で反応させて抗体に架橋剤を導入し、しかる後、必要に応じ、例えばジチオスライトール（ＤＴＴ）等の架橋基を還元する試薬と反応させて、修飾抗体を得る。標識物質及びリポソーム分解酵素が封入されたリポソームと修飾抗体とを緩衝液中で反応せしめることにより、抗体感作リポソームが得られる。
【００１８】
上記の製造例における架橋剤としては、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート（ＳＭＰＡ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）プロピオネート（ＳＭＰＰ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、グルタルアルデヒド、テレフタルアルデヒド等のジアルデヒド等が挙げられる。これらは単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
【００１９】
上記複数種類の分子認識複合体のうち標識物質を内包しないものがあってもよい。このような標識物質を内包しない分子認識複合体は、例えば、下記に詳述するように、担体に対して異符号の電荷を有する物質を吸着又は結合させて、上記分子認識複合体の標的物質との分子認識相互作用による構造変化を促進させる役割を担うことができる。
【００２０】
上記複数種類の分子認識複合体の担体は、全て同符号の電荷を有するものであることが好ましい。複数種類の分子認識複合体の担体が同符号の電荷を有することにより、標的物質を介して強制的に近づく以前に、分子認識複合体同士が直接接触して構造変化を起こす確率が低くなる。
【００２１】
上記分子認識複合体の担体が全て同符号の電荷を有する場合、本発明の測定試薬は担体に対して異符号の電荷を有する物質が吸着又は結合している分子認識複合体を含有していることが好ましい。分子認識複合体の担体がリポソームや無機表面を有する二分子構造膜からなる粒子のような電荷のバランスにより膜を形成する構造である場合、異符号の電荷を有する物質が近づくと、分子認識複合体の担体は破壊されて、内部の標識物質が外部に漏出してくる。例えば、分子認識物質の担体が正の電荷を持った粒子である場合、本発明の測定試薬に含まれる分子認識複合体のうち少なくとも１種には負の電荷を持った物質が吸着又は結合していることが好ましい。上記負の電荷を持った物質としては、例えば、末端にポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボン酸等のカルボン酸やスルホン酸等の酸性基を有するものや全体として負電荷を有するＤＮＡのような物質が好適に用いられる。
【００２２】
上記分子認識複合体は、標的物質との分子認識相互作用によりその構造が変化する。上記分子認識複合体の構造が変化することにより、例えば、分子認識複合体が破壊されるか若しくは収縮することにより内部の標識物質が外部に漏出するか、又は、複数種類の分子認識複合体が融合して標識物質と標識物質を増感させる物質とが反応し、これにより標識物質を介して標的物質量を測定することができる。例えば、複数種類の分子認識複合体のうちの１種に、酵素に対する基質を含有させておき、別の１種に酵素を含有させて、分子認識相互作用により、分子認識複合体が融合又は破壊されることにより、増幅反応をおこさせることも可能である。
【００２３】
本発明の測定試薬と標的物質とを反応させることにより標的物質を検出又は標的物質量を測定することができる。このような測定方法もまた、本発明の１つである。
本発明の測定方法で測定可能な標的物質としては、分子認識物質と分子認識相互作用を起こすものであれば特に限定されないが、抗体又はレセプターを作製できるものが好ましく、例えば、抗原等の蛋白質、ダイオキシン類等の内分泌撹乱物質、ウイルス、ペプチド等が挙げられる。
【００２４】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００２５】
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）グリシンを無水塩化メチレンに溶解し、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドとジヘキサデシルアミンを加え１６時間撹拌し、Ｎ，Ｎ−ジヘキサデシル−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）グリシンアミドを得た。これにトリフルオロ酢酸を加え、室温で４時間撹拌して得たＮ，Ｎ−ジヘキサデシルグリシンアミドトリフルオロ酢酸塩に６−ブロモヘキサン酸クロリドとトリエチルアミンを加えて、Ｎ，Ｎ−ジヘキサデシル−Ｎ−（６−ブロモヘキサノイル）グリシンアミドを得た。これにジメチルアミンを加え反応させた後、ブロモプロピルトリエトキシシランと反応させて、正に荷電したシリカ架橋リポソームを形成できるＮ，Ｎ−ジヘキサデシル−Ｎ−（６−［（３−トリエトキシシリルプロピル）ジメチルアンモニオ］ヘキサノイル）グリシンアミドブロミドを得た。
【００２６】
得られた正に荷電したシリカ架橋リポソーム形成化合物に、標識物質としてフルオレセインイソチオシアネートを加えて撹拌し、シリカ架橋リポソームに内包させた。次に、分子認識物質であるＡｎｔｉ−Ｄｅｒｆ１（２Ｅ１；アサヒビール薬品社製）を化学的に固定化して、分子認識複合体１を得た。
【００２７】
また、得られた正に荷電したシリカ架橋リポソームに、分子認識物質であるＡｎｔｉ−Ｄｅｒｆ１（６Ｇ１；アサヒビール薬品社製）を化学的に固定化し、更に、ポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボン酸Ｎａのポリオキシエチレン部分を化学的に固定化して分子認識複合体２を得た。
【００２８】
分子認識複合体１及び２を１０ｍＭリン酸緩衝液に混合し、更に、抗原であるＤｅｒｆ１を１０〜１００００ｎｇ／ｍｌ濃度になるようにリン酸緩衝液に添加した。３７℃、２時間作用させて測定用サンプルとした。測定は公知の蛍光強度測定法（励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）により行った。結果を図１に示した。
【００２９】
【発明の効果】
本発明は、上述の構成よりなるので、生体関連物質、環境関連物質等を高感度に検出、測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例における蛍光強度測定法の結果を示す図である。
【図１】
2005010043.tif 000002