(57)【要約】【課題】  自然状態の自然減衰能について確実にかつ精度良く汚染物質の分解能力を予測することが可能で、さらには汚染物質の分解過程で新たに生成される分解生成物質も加味した生物学的な分解能力を予測することができる汚染物質の自然減衰能予測方法を提供する。【解決手段】  土壌又は地下水等の処理対象中に存在し、該処理対象に含有される有機塩素化合物を分解する能力を有する脱塩素化細菌を検出することにより自然減衰能を予測する方法において、前記処理対象に有機酸、生分解性プラスチック等の徐放性電子供与体を供給し、脱塩素化細菌を増殖させた後に、該細菌が保有する特異な遺伝子配列を標的としてPCR法等により該細菌を検出し、その存在の有無により前記処理対象の自然減衰能を判定する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
土壌又は地下水等の処理対象中に存在し、該処理対象に含有される汚染物質を分解する能力を有する微生物又は微生物群（以下微生物という）を検出することにより前記汚染物質の自然減衰能を予測する方法において、
前記処理対象に徐放性電子供与体を供給し、前記微生物を増殖させた後に、該微生物が保有する特異な遺伝子配列を標的として該微生物を検出し、該微生物の存在の有無により前記処理対象の自然減衰能を判定することを特徴とする汚染物質の自然減衰能予測方法。
【請求項２】
前記汚染物質が有機塩素化合物である汚染物質の自然減衰能予測方法において、
前記徐放性電子供与体が脱塩素化細菌を増殖させる物質であり、該徐放性電子供与体の供給により増殖させた脱塩素化細菌を検出することを特徴とする請求項１記載の汚染物質の自然減衰能予測方法。
【請求項３】
前記処理対象中に、電子供与体の供給により処理対象を嫌気性化する通性嫌気性細菌又は好気性細菌と、嫌気性状態下で前記汚染物質を脱塩素化する脱塩素化細菌と、が存在し、前記脱塩素化細菌を検出することにより前記汚染物質の自然減衰能を予測する方法において、
前記徐放性電子供与体が、前記通性嫌気性細菌又は好気性細菌を活性化させる物質であり、該徐放性電子供与体の供給により嫌気性化を促進させて脱塩素化細菌を増殖させることを特徴とする請求項１記載の汚染物質の自然減衰能予測方法。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れかに記載の方法により、ＭＮＡ（Monitored natural attenuation）若しくはＥＮＡ（Enhanced natural attenuation）の適用性を評価することを特徴とする汚染物質の自然減衰能予測方法。
【請求項５】
請求項１乃至３の何れかに記載の方法において、予め複数種類の電子供与体を供給し、増殖させる微生物に最適な電子供与体を選定することを特徴とする汚染物質の自然減衰予測方法。
【請求項６】
前記特異な遺伝子配列の検出方法が、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法であることを特徴とする請求項１乃至５の何れかに記載の汚染物質の自然減衰能予測方法。
【請求項７】
前記徐放性電子供与体が、有機酸若しくは生分解性プラスチックであることを特徴とする請求項１乃至５の何れかに記載の汚染物質の自然減衰能予測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、土壌、地下水の汚染を浄化するため科学的な方法による監視下で土壌、地下水中の汚染物質を自然減衰させる方法（MNA)、若しくは電子供与体を土壌、地下水中に供給して土壌、地下水中の汚染物質の自然減衰を促進させる方法（ENA）について、事前にその効果を予測するための汚染物質の自然減衰能予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、環境破壊の要因又は生物体に対して悪影響を及ぼす要因となる有害物質が土壌、地下水等において検出されており、これらの物質による汚染が問題とされている。汚染土壌、地下水の浄化には様々な方法が利用されており、従来は汚染土壌・地下水を掘削、吸引して外部で水や溶媒により洗浄又は熱処理して無害化する方法等の物理化学的方法が多く用いられていた。しかし、このような物理化学的方法ではコストが高く、操作性が低いため、高濃度でかつ狭域の汚染帯の浄化に限られていた。
そこで、汚染地域が広範囲に亘る場合にはオンサイトでの処理が望まれており、近年は有害物質で汚染された土壌、又は地下水の浄化方法として、安価でかつ無害化処理が可能な生物処理が提案されている。
【０００３】
生物学的な浄化方法は、微生物の化学物質分解能力を利用した浄化技術であり、汚染土壌、地下水中に元々存在する細菌を利用して、科学的な監視の下で汚染物質を自然減衰させるＭＮＡ、又は電子供与体等を土壌、地下水中に供給して元々土壌、地下水中に存在していた微生物を活性化し、汚染物質の自然減衰を促進させるＥＮＡが知られている。ＭＮＡ及びＥＮＡでは、汚染物質が完全に分解する機能を対象地の土壌、地下水環境が保有しているかどうかが成否の鍵であるが、場所により土壌、地下水環境は多様であり、汚染物質が完全に分解する保証がないため、その効果を事前に予測する方法が期待されている。
【０００４】
電子供与体の供給による土壌、地下水の汚染物質の嫌気分解の工程として、汚染物質が有機塩素化合物である場合を例に採ると、（１）電子供与体の供給により通性嫌気性細菌又は好気性細菌が活性化し、土壌、地下水中の酸素が消費される、（２）還元環境化によって嫌気性細菌が活性化する、（３）嫌気性細菌である脱塩素化細菌が活性化して還元脱塩素化反応を促進する、という３つのステップが達成される必要がある。
自然減衰の効果については、地下水の流れの上下流方向に位置する複数地点で汚染物質の濃度やｐＨ、電気伝導度、水温、溶存酸素濃度、酸化還元電位等の一般水質を測定し、分解速度や半減期を算定する方法が主体である。
【０００５】
また、電子供与体等の土壌、地下水中への供給による汚染物質の自然減衰促進効果については、対象地の土壌、地下水中における微生物の有無を特異的な遺伝子配列を標的として特定微生物（群）を検出する方法で把握し、完全分解の潜在的な可能性を評価する方法や、対象地から採水した地下水に電子供与体等を与え、微生物を培養している間の汚染物質の濃度変化を測定して実証的に浄化能力を評価する方法等によって予測されている。
【０００６】
例えば、特許文献１（特開２００２−３４５４７３号公報）では、汚染土壌、地下水からなる試料中の新規な核酸を鋳型としてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によりを脱塩素化細菌の検出を行なう方法等が開示されている。また、特許文献２（開平１０−６６５９９号公報）では、試料からＤＮＡを抽出、精製してＰＣＲ法により土壌試料中のＤＮＡ又は微生物数を推定する方法が開示されている。これらの方法によれば、高精度でかつ容易に試料中の微生物の検出が可能となり、汚染物質の分解性能を把握することが可能である。
さらに、特許文献３（特開２００２−７８４９９号公報）では、試料中の化合物と同一の化合物であるが、安定同位体で標識されている化合物を用い、これに生物を含む試料を加えて培養した後に安定同位体成分を測定する方法が開示されている。これにより、短時間で生物の分解能力を調べることができる。
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−３４５４７３号公報
【特許文献２】特開平１０−６６５９９号公報
【特許文献３】特開２００２−７８４９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、生物を利用した汚染物質の分解処理は各種提案されているが、汚染物質の濃度や一般水質を測定し、分解速度や半減期から自然減衰能を評価する方法では、その時点での自然減衰能を定量的に評価することは可能であるが、汚染物質の分解過程で新たに生成されてくる分解生成物質の生物学的な自然減衰能を予測評価することは不可能であり、完全分解の予測まではできない惧れがある。
また、対象地の土壌、地下水中における微生物の有無を、特定微生物（群）を検出する方法で把握する場合、各方法の定量下限を超える数の汚染物質の分解菌が存在していることが把握できるが、定量下限未満の数しか存在していない場合でも完全分解の機能を果たしている可能性がある。また、自然状態では定量下限値未満の数しか存在していない分解菌であっても、電子供与体等の供給に伴って増殖し、増殖後の数は特定微生物（群）を検出する方法の定量下限値を超える可能性がある。
【０００９】
対象とする汚染物質の分解菌の有無を特定微生物（群）を検出する方法で把握する場合、分解菌が存在することの確認はできるが、対象地の土壌、地下水環境が分解菌の有効に働ける環境にあるか否か、又は電子供与体等を注入した場合に対象地の土壌、地下水環境が分解菌の有効に働ける環境になるかどうかまでを把握することは不可能である。
また、対象地から採取した地下水又は土壌に電子供与体等を与えて微生物を培養し、その間における汚染物質の濃度変化や一般水質の変化等を測定する方法では、ＥＮＡが期待できそうであるかどうかを把握することは可能であるが、得られるのは実証的な根拠のみであり、理論的な証拠を得ることはできない。そのため、室内での試験結果と同様の自然減衰促進効果が対象地の土壌、地下水環境中でも得られるという確証はなく、あくまでも可能性を評価しているに過ぎない。
【００１０】
従って、本発明は上記従来技術の問題点に鑑み、自然状態の自然減衰能について確実にかつ精度良く汚染物質の分解能力を予測することが可能で、さらには汚染物質の分解過程で新たに生成される分解生成物質も加味した生物学的な分解能力を予測することができる汚染物質の自然減衰能予測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
そこで、本発明はかかる課題を解決するために、
土壌又は地下水等の処理対象中に存在し、該処理対象に含有される汚染物質を分解する能力を有する微生物又は微生物群（以下微生物という）を検出することにより前記汚染物質の自然減衰能を予測する方法において、
前記処理対象に徐放性電子供与体を供給し、前記微生物を増殖させた後に、該微生物が保有する特異な遺伝子配列を標的として該微生物を検出し、該微生物の存在の有無により前記処理対象の自然減衰能を判定することを特徴とする。
【００１２】
本発明によれば、元々の土壌、地下水環境が有する生物学的な汚染物質の分解能力を示す自然減衰能を予測することにより、処理対象に適した浄化方法を選択することができ、土壌、地下水に存在する微生物生態系が有している本来の浄化能力を有効に活用し、処理対象中に含有される汚染物質を確実に浄化することができる。
さらに、本発明では電子供与体を供給して微生物を増殖させているため、自然状態では定量下限値未満の数しか存在していない微生物であってもその存在の有無を精度良く検出することができ、自然減衰能の予測精度を向上させることができる。
【００１３】
また、前記電子供与体は徐放性であり、微生物が適切な速度で増殖するように、徐々に電子供与体が放出されるようになっているため、微生物周辺の電子供与体の濃度が長時間に亘り十分に維持され、微生物の活性化効率が低下することなく、高効率で微生物を増殖させることができる。
尚、本発明にて標的とする特異な遺伝子配列の例として、16SrDNA、tceAが挙げられ、また前記遺伝子配列の検出方法として、PCR法（直接法、Q-PCR法、nested-PCR法、real time-PCR法等）、DGGE（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）法、TGGE（温度勾配ゲル電気泳動）法、標識−核酸ハイブリダイゼーション法（蛍光標識、抗体標識、ラジオアイソトープ標識、DNAチップ等）等が挙げられる。
【００１４】
また、前記汚染物質が有機塩素化合物である汚染物質の自然減衰能予測方法において、
前記徐放性電子供与体が脱塩素化細菌を増殖させる物質であり、該徐放性電子供与体の供給により増殖させた脱塩素化細菌を検出することを特徴とする。
本発明によれば、電子供与体の添加により脱塩素化細菌が増殖され、該脱塩素化細菌の検出下限となる菌数を下げることが可能となるため、脱塩素化細菌の存在を検出し易くなり、自然状態の自然減衰能の予測精度を向上させることができる。
【００１５】
本発明で脱塩素化される物質として、例えばテトラクロロエチレン（PCE)、トリクロロエチレン（TCE）、シス-1,2-ジクロロエチレン（trans-1,2-ジクロロエチレン）、1,1-ジクロロエチレン（1,1-DCE）、塩化ビニル（VC）の塩素化エチレン、1,1,1-トリクロロエタン（MC又は1,1,1-TCA）、1,1,2-トリクロロエタン（1,1,2-TCA）、1,2-ジクロロエタン（EDC）等の塩素化エタン、四塩化エタン、四塩化炭素（CT）、クロロホルム（CF）、ジクロロメタン（DCM）等の塩素化メタン等が挙げられる。
また、前記脱塩素化細菌の具体的な例として、Dehalococcoides属細菌が挙げられる。特に、Dehalococcoides ethenegenes 195株はPCEをエチレンまで完全脱塩素化する細菌として単離されており好適である。
また、前記電子供与体は、代謝の過程で還元力（NADH+、NADPH+等）が生産される物質であり、本発明で用いられるものとして、酵母抽出物、有酸菌（酢酸、酪酸、乳酸、ギ酸、安息香酸、クエン酸等）、アルコール類（エタノール、メタノール等）、糖類（糖蜜、グルコース、クエン酸等）、代謝最終生成物（アセテート、水素ガス等）、市販製品（ポリ乳酸エステル、食用油、高級脂肪酸等を主成分とするもの）、生分解性プラスチック等が挙げられる。
【００１６】
さらに、前記処理対象中に、電子供与体の供給により処理対象を嫌気性化する通性嫌気性細菌又は好気性細菌と、嫌気性状態下で前記汚染物質を脱塩素化する脱塩素化細菌と、が存在し、前記脱塩素化細菌を検出することにより前記汚染物質の自然減衰能を予測する方法において、
前記徐放性電子供与体が、前記通性嫌気性細菌又は好気性細菌を活性化させる物質であり、該徐放性電子供与体の供給により嫌気性化を促進させて脱塩素化細菌を増殖させることを特徴とする。
【００１７】
一般に、土壌又は地下水の脱塩素化を行なう際に、（１）電子供与体の供給により通性嫌気性細菌又は好気性細菌が活性化し、土壌、地下水中の酸素が消費される、（２）還元環境化によって嫌気性細菌が活性化する、（３）嫌気性細菌である脱塩素化細菌が活性化して還元脱塩素化反応を促進する、という３つのステップが進行する。従って、本発明のように、前記通性嫌気性細菌又は好気性細菌の活性化を促進する電子供与体を供給することで、（１）土壌、地下水中の酸素が消費される工程を促進し、これにより還元環境化が促進され、二次的に脱塩素化細菌の活性化を向上させることも可能である。
勿論、これらの発明において、通性嫌気性細菌、好気性細菌、及び脱塩素化細菌の全てを直接活性化させる電子供与体を利用してもよい。
【００１８】
また、これらの発明により、ＭＮＡ（Monitored  natural  attenuation）、若しくはＥＮＡ（Enhanced  natural  attenuation）の適用性を評価することもできる。このとき、本発明により予測された自然減衰能に基づき、汚染物質の浄化処理にＭＮＡを適用するか、ＥＮＡを適用するかを判断すると良い。  
また、予め複数種類の電子供与体を供給し、増殖させる微生物に最適な電子供与体を選定することにより、自然減衰能に影響を与える微生物を確実に増殖させることが可能である。
さらに、本発明では前記徐放性電子供与体が、有機酸若しくは生分解性プラスチックであることが好適である。
【００１９】
さらにまた、前記特異な遺伝子配列の検出方法が、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）法であることを特徴とする。
前記ＰＣＲ法は、増幅しようとするDNA（鋳型DNA）の両端の塩基配列に相補な塩基配列を有するプライマー及びDNAポリメラーゼを用い、熱変性工程、アニーリング（熱処理）工程、及び伸長反応工程の３段階からなるサイクルを繰り返すことにより、鋳型DNAとほぼ同じDNA断片を増幅することを可能とするものである。これにより、微量にしか存在しない細菌の１個のDNA中の所定の断片を例えば10万〜100万倍に増幅することができる。従って、本発明に適用することで、確実にかつ容易に遺伝子配列を検出することが可能となる。
【発明の効果】
【００２０】
以上記載のごとく本発明によれば、元々の土壌、地下水環境が有する生物学的な汚染物質の分解能力を示す自然減衰能を予測することにより、処理対象に適した浄化方法を選択することができ、土壌、地下水に存在する微生物生態系が有している本来の浄化能力を有効に活用し、処理対象中に含有される汚染物質を確実に浄化することを可能とする。
また本発明では、電子供与体を供給して微生物を増殖させているため、自然状態では定量下限値未満の数しか存在していない微生物であってもその存在の有無を精度良く検出することができ、自然減衰能の予測精度を向上させることができる。
さらに、前記電子供与体は徐放性であり、微生物の増殖に併せて徐々に電子供与体が放出されるようになっているため、微生物周辺の電子供与体の濃度が長時間に亘り十分に維持されるため、微生物の活性化効率が低下することなく、高効率で微生物を増殖させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、図面を参照して本発明の好適な実施例を例示的に詳しく説明する。但しこの実施例に記載されている構成部品の寸法、材質、形状、その相対的配置等は特に特定的な記載がない限りは、この発明の範囲をそれに限定する趣旨ではなく、単なる説明例に過ぎない。
本実施例では、処理対象を土壌、地下水とし、汚染の原因となる汚染物質は、例えばテトラクロロエチレン（PCE)、トリクロロエチレン（TCE）、シス-1,2-ジクロロエチレン（trans-1,2-ジクロロエチレン）、1,1-ジクロロエチレン（1,1-DCE）、塩化ビニル（VC）の塩素化エチレン、1,1,1-トリクロロエタン（MC又は1,1,1-TCA）、1,1,2-トリクロロエタン（1,1,2-TCA）、1,2-ジクロロエタン（EDC）等の塩素化エタン、四塩化エタン、四塩化炭素（CT）、クロロホルム（CF）、ジクロロメタン（DCM）等の塩素化メタン等とする。
【００２２】
また、本実施例における電子供与体は徐放性を有するもので、かつ代謝の過程で還元力（NADH+、NADPH+等）が生産される物質であり、本発明で用いられるものとして、酵母抽出物、有酸菌（酢酸、酪酸、乳酸、ギ酸、安息香酸、クエン酸等）、アルコール類（エタノール、メタノール等）、糖類（糖蜜、グルコース、クエン酸等）、代謝最終生成物（アセテート、水素ガス等）、市販製品（ポリ乳酸エステル、食用油、高級脂肪酸等を主成分とするもの）、生分解性プラスチック等が挙げられ、特に好適には有機酸、又は生分解性プラスチックとする。
【００２３】
本実施例に係る汚染物質の自然減衰能予測方法のフローにつき説明する。まず、処理地の周囲に汚染物質拡散防止壁を設置する。該汚染物質拡散防止壁は、透過性バイオバリアであることが好ましい。処理地には、処理対象の土壌又は地下水を採取可能な観測井と、電子供与体を注入する電子供与体注入井を掘削する。そして、該電子供与体注入井より処理対象の存在する位置に前記電子供与体を注入する。この時、地下水が存在する場合には、地下水の流れ方向を考慮し、処理対象に均等な濃度分布で前記電子供与体が分散されるように前記注入井を設置し、電子供与体を注入する。
【００２４】
前記電子供与体の注入により処理対象中では、前記汚染物質の分解能を有する微生物が増殖する。増殖した微生物を含む処理対象は前記観測井より定期的に採取し、該採取したサンプルより前記微生物の存在の有無を検出する。この検出方法は、特定微生物が保有する特異な遺伝子配列を標的として各種特異的検出方法により検出する。
前記標的とする特異な遺伝子配列は、16SRDNA、tceAが挙げられ、また前記特異的検出方法は、PCR法（直接法、Q-PCR法、nested-PCR法、real time-PCR法等）、DGGE（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）法、TGGE（温度勾配ゲル電気泳動）法、標識−核酸ハイブリダイゼーション法（蛍光標識、抗体標識、ラジオアイソトープ標識、DNAチップ等）等が挙げられる。
【００２５】
かかる方法により検出された微生物の存在の有無又は微生物の菌数により前記処理対象の自然減衰能を判定し、該処理対象に適用する浄化方法を決定する。好適に適用できる浄化方法は、例えばＭＮＡ（Monitored natural attenuation）若しくはＥＮＡ（Enhanced natural attenuation）等である。
また、かかる方法による試験を複数種類の電子供与体について行なっても良く、これによりどの電子供与体を使用すると特定微生物がより増殖するかを把握し、処理対象に最適な電子供与体を選定すると良い。
【００２６】
本実施例によれば、土壌、地下水に存在する微生物生態系が有している本来の浄化能力を有効に活用し、処理対象中に含有される汚染物質を確実に浄化することが可能か否かを容易に予測することができ、また電子供与体を供給して微生物を増殖させているため、自然状態では定量下限値未満の数しか存在していない微生物であってもその存在の有無を精度良く検出することができ、自然減衰能の予測精度を向上させることができる。
さらに、前記電子供与体は徐放性であり、微生物が適切な速度で増殖するように徐々に電子供与体が放出されるようになっているため、微生物周辺の電子供与体の濃度が長時間に亘り十分に維持され、微生物の活性化効率が低下することなく、高効率で微生物を増殖させることができる。
【実施例１】
【００２７】
本実施例の具体的構成につき説明する。
かかる実施例１は、図１に示すような処理地に本実施例に係る自然減衰能予測方法を適用したものである。該処理地は、上層から盛土層２０、粘度層２１、玉石混じり砂礫層２２、粘土層２３の順に堆積した土壌であり、前記玉石混じり砂礫層２２が地下水の流れる帯水層となっている。また、図２に示すように、かかる処理地には水素供給剤注入井IJW１、IJW２、IJW３、IJW４、IJW５、IJW６、IJW７、及び観測井W１、W２、W３が掘削されており、夫々が図に示すような配置となっている。前記水素供給剤注入井１４から注入された水素供給剤は、Ｈ＋１４を徐放して地下水の流れに沿って分散する。
【００２８】
本実施例１では、ポリ乳酸エステルを主成分とする徐放性水素供給剤（商品名HRC）を電子供与体として帯水層、即ち玉石混じり砂礫層２２中に注入し、地下水汚染拡散防止対策として透過性バイオバリアを設置した地下水汚染現場の上流側観測井Ｗ１、下流側観測井Ｗ２及び参照用観測井Ｗ３から地下水を採水し、水素供給剤１３が与えられた後の地下水における脱塩素化細菌の存在の有無を測定した。
前記水素供給剤１３は、０日目、423日目、821日目に７本の注入井から注入している。
Ｗ１及びＷ２における地下水中の有機塩素化合物のモル濃度は図３に示すような変化を示しており、Ｗ１とＷ２における合計濃度の比較から水素供給剤注入後は有機塩素化合物のエチレンまでの完全分解が促進されていると考えられる。
【００２９】
観測井（Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３）から採水した地下水について、Dehalococcoides属細菌の特異的PCR法による検出を試み、W２ではその後３回に亘って１ヶ月毎に採水した地下水を同様に試験した。採水を実施したのは初回水素供給剤注入後918日目、946日目、981日目、1016日目である。DNAは、地下水サンプル50mlを孔径0.22μｍのメンブレンフィルタでろ過し、サンプル中の微生物を濃縮、捕集して抽出した。脱塩素化細菌の特異的PCR法による検出ではLofflerらが用いたDehalococcoides属細菌特異的プライマーにGCクランプを付加したもの（フォワード側プライマーが5'-GCクランプ-AAGGCGGTTTTCTAGGTTGTCAC-3'、リバース側プライマーが5'-CGACACTCAGTACGCTAGGTA-3'）を用いた（GCクランプ：CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG）。
【００３０】
図４に示すようにPCR法では、地下水サンプル１０を菌体濃縮、DNA抽出した抽出DNA１１をそのまま鋳型DNAとする直接増幅法と、サンプル１０より調整したDNAに対して16SrDNAのほぼ全長をPCR増幅して得られたPCR産物を精製し、これを鋳型DNAとするnested-PCR法の２種類の方法を用いた。
16SrDNAの増幅に用いたプライマーは、フォワード側プライマーが5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、リバース側プライマーが5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'である。PCR反応はアニーリング温度を徐々に下げるタッチダウン法とし、表１に示す反応温度条件とした。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
図５に示すように、直接増幅法では何れのサンプルからもPCR増幅産物は得られず、nested-PCR法ではW２の２ヶ月目及び３ヶ月目のみ目的とするDehalococcoides属細菌のPCR産物が得られた。このことは、Dehalococcoides属細菌が直接的に有機塩素化合物の脱塩素化している証拠とはならないが、有機塩素化合物の分解にDehalococcoides属細菌が関与することの一つの傍証であると考えられる。この間、W２での有機塩素化合物濃度に大きな変化は見られず、同様の自然減衰促進効果が確認されたが、W２で２ヶ月目と３ヶ月目のみDehalococcoides属細菌が検出され、１ヶ月目と４ヶ月目には検出されなかったことから、１ヶ月目と４ヶ月目はDehalococcoides属細菌の数がnested-PCR法による検出下限未満の数であったためであると考えられる。また、自然状態を示すW１及びW３においても、Dehalococcoides属細菌が存在していないのではなく、存在している数が少ないだけである可能性もある。エチジウムブロミド染色により直接計測された全菌数が106cell/ml以上であったことから、nested-PCR法による検出下限はその0.1％に相当する103cell/ml前後であったものと推定される。
【００３３】
この結果から、W２では電子供与体として与えた水素供与体により、通性嫌気性細菌が土壌又は地下水中の酸素を消費して嫌気性環境を作り、嫌気性の脱塩素化細菌であるDehalococcoides属細菌が活性化されて有機塩素化合物の還元脱塩素が促進されていると推察できる。
尚、本実施例では、この実施例１において処理地で確認した内容を下に、事前に室内で予測評価するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本実施例に係る自然減衰能予測方法を適用する処理対象地下水の断面図である。
【図２】本実施例における処理対象に配置した観測井及び水素供給剤注入井の概要図である。
【図３】地下水中の有機塩素化合物濃度の変化を示すグラフである。
【図４】PCR法による特異的検出方法を示す説明図である。
【図５】図４のnested-PCR法による脱塩素化細菌の検出結果である。
【符号の説明】
【００３５】
１０    サンプル
１１    抽出DNA
１３    水素供給剤
１４    Ｈ＋
１５    水素供給剤注入井
【図１】
2005245344.tif 000004
【図２】
2005245344.tif 000005
【図３】
2005245344.tif 000006
【図４】
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【図５】
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