(57)【要約】【課題】  放射線処理をせずに、移植細胞の肝臓への集積性を向上させる手段、ならびに肝疾患治療に有効な遺伝子、生理活性物質、薬剤等を肝特異的かつ選択的に送達することができる手段を提供すること。【解決手段】  細胞膜表面に存在する糖タンパク質の糖鎖の先端にガラクトースを露出させ、肝臓への集積性を向上させたことを特徴とする細胞。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜表面に存在する糖タンパク質の糖鎖の先端にガラクトースを露出させ、肝臓への集積性を向上させたことを特徴とする細胞。
【請求項２】
肝疾患治療上有効な遺伝子、生理活性物質、又は薬剤を含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
肝細胞移植に用いるための、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
哺乳動物から採取した細胞を酵素又は化学処理し、細胞膜の表面にガラクトースを露出させた細胞を得ることを特徴とする、請求項１に記載の細胞の製造方法。
【請求項５】
哺乳動物から採取した細胞を酵素又は化学処理し、細胞膜の表面にガラクトースを露出させることを特徴とする、細胞の肝臓への集積性を向上させる方法。
【請求項６】
哺乳動物から採取した細胞を酵素又は化学処理し、細胞膜の表面にガラクトースを露出させた細胞を、非ヒト哺乳動物に移植することを特徴とする、細胞の移植方法。
【請求項７】
請求項１に記載の細胞に被験物質を導入して得られた細胞を、肝細胞障害を有する非ヒト哺乳動物に移植し、該動物の肝臓における肝薬物代謝酵素の発現を指標として被験物質の中から肝疾患治療用医薬をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓への集積性を向上させた細胞に関する。さらに詳しくは、本発明は、細胞膜表面に存在する糖タンパク質の糖鎖の先端にガラクトースを露出させることによって、肝臓への集積性を向上させた細胞に関する。本発明の細胞は肝への移植用細胞としてのみならず、肝疾患治療上有効な遺伝子等を包含させることによってそれらの肝送達用担体として用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞移植は種々の末期肝疾患に対して肝臓移植に代る新しい治療法として期待されている。肝細胞移植は、臓器移植と比較して侵襲が低い、一つのドナーから複数のレシピエントに埋植できる、臓器移植と比較して免疫応答が低い等の利点がある。しかしながら、移植できる肝細胞に限りがあるために、移植された肝細胞の生体内での効率のよい肝臓への集積、及び増殖が必要である。このため、骨髄細胞や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を含む様々な幹細胞や前駆細胞を用いる研究がなされている。
【０００３】
移植した骨髄細胞が肝細胞へ分化することが、肝障害を引き起こしたメスのラットに対してオスのラットの骨髄細胞を移植した結果、メスのラットの肝臓にオスのラット由来の肝細胞が存在したことから明らかとなった（非特許文献１）。また、移植した造血幹細胞が肝臓に分化することが、Fumarylacetoacete hydrolase欠損 (FAH-)マウスに対して放射線処理後に、lacZ をもつトランスジェニックマウスの骨髄より精製したKTLS (c-kithighThylowLin-Sca-1+)造血幹細胞を移植した結果、7ヶ月後には移植されたマウスの肝臓にlacZ 陽性の肝細胞が30〜50％存在してFAHを発現していたことから明らかとなった（非特許文献２）。その後も多くの研究者から骨髄に存在する間葉系細胞や造血幹細胞が肝細胞に分化することが報告された。骨髄移植されたヒトにおいても、ドナー由来の細胞が肝臓に存在して肝細胞に分化していることが報告されている。
【０００４】
一方、骨髄細胞中には3％程度肝細胞増殖因子（HGF）レセプターを発現している細胞が存在し、これらの細胞をHGFで処理することで肝細胞への分化が促進されることが報告されている（非特許文献３）。また、ヒト骨髄細胞中のCD34+の細胞をHGF存在下で培養するとアルブミン陽性の細胞になることが報告されている（非特許文献４)。従って、移植した骨髄細胞が肝細胞に分化していると考える説もあるが、一方で、移植した骨髄細胞が肝臓に集積しているのは、骨髄細胞から肝細胞へ分化したのではなく、骨髄細胞と肝細胞が細胞融合する頻度が高いとの報告もある（非特許文献５)。しかし、結論的には、分化であっても細胞融合であってもその機序は問わず、骨髄細胞を用いる移植は、肝疾患治療において臨床上有用であるといえる。
【０００５】
ところが、移植された骨髄細胞の肝細胞への分化は重篤な肝疾患状態にあるときに起こること、骨髄細胞からの肝細胞への分化頻度が低いこと、自己の骨髄を死滅させることによって、移植した骨髄細胞を肝臓に集積させるために放射線処理が必要であることなどから、骨髄細胞による肝疾患治療は現時点では困難で、臨床的応用は難しいとの見解もある（非特許文献６）。
【０００６】
これまで放射線処理をせずに移植された骨髄細胞等の肝臓への集積を飛躍的に増加させる方法はなく、加えて、先天性の遺伝子疾患等を煩った患者の肝臓に対して、移植細胞によって肝特異的かつ選択的に遺伝子を送達して遺伝子治療を行う手段もない。従って、これらに対する一刻も早い技術開発が望まれている。
【０００７】
肝細胞の細胞膜には、血中の老朽化した糖タンパク質を細胞内に取り込んで処理するためのアシアロ糖タンパク質レセプターが存在している。このアシアロ糖タンパク質レセプターは、老朽化した糖タンパク質の糖鎖先端のシアル酸が欠失することによって露出されたガラクトースを特異的に認識するメカニズムを持っている。アシアロ糖タンパク質レセプターのこの性質は、アシアロシンチ（肝シンチグラフィ製剤）に代表されるガラクトースを持たせた物質を肝臓内に取り込ませる手法などに応用されているが、細胞に応用された例はない。
【０００８】
【非特許文献１】Petersen BE et al., Science. 1999 May 14; 84(5417): 1168-1170
【非特許文献２】Lagasse E et al., Nature Medicine. 2000 Nov; 6(11): 1229-1234
【非特許文献３】Miyazaki M et al., Biochem Biophys Res Commun. 2002 Oct 18;298(1): 24-30
【非特許文献４】Fiegel HC et al., Stem Cells. 2003; 21(1): 98-104
【非特許文献５】Wang X et al., Nature. 2003 Apr 24; 422(6934): 897-901
【非特許文献６】Wang X et al., Am J Pathol. 2002 Aug; 161(2): 565-574
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の課題は、放射線処理をせずに、移植細胞の肝臓への集積性を向上させる手段を提供することにある。
【００１０】
本発明のさらなる課題は、肝疾患治療上有効な遺伝子等を肝特異的かつ選択的に送達することができる手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、細胞に対して酵素処理等を施し細胞膜表面に存在する糖タンパク質の糖鎖の先端にガラクトースを露出させることによって、該細胞の肝臓への集積性を飛躍的に向上させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
(1)  細胞膜表面に存在する糖タンパク質の糖鎖の先端にガラクトースを露出させ、肝臓への集積性を向上させたことを特徴とする細胞。
(2)  肝疾患治療上有効な遺伝子、生理活性物質、又は薬剤を含む、(1)に記載の細胞。
(3)  肝細胞移植に用いるための、(1)又は(2)に記載の細胞。
(4)  哺乳動物から採取した細胞を酵素又は化学処理し、細胞膜の表面にガラクトースを露出させた細胞を得ることを特徴とする、(1)に記載の細胞の製造方法。
(5)  哺乳動物から採取した細胞を酵素又は化学処理し、細胞膜の表面にガラクトースを露出させることを特徴とする、細胞の肝臓への集積性を向上させる方法。
(6)  哺乳動物から採取した細胞を酵素又は化学処理し、細胞膜の表面にガラクトースを露出させた細胞を、非ヒト哺乳動物に移植することを特徴とする、細胞の移植方法。
(7)  (1)に記載の細胞に被験物質を導入して得られた細胞を、肝細胞障害を有する非ヒト哺乳動物に移植し、該動物の肝臓における肝薬物代謝酵素の発現を指標として被験物質の中から肝疾患治療用医薬をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、細胞膜の表面にガラクトースを露出させた細胞が提供される。本発明の細胞は、その細胞膜表面に露出したガラクトースが、肝細胞のアシアロ糖タンパク質レセプターを特異的に認識することによって肝臓に集積し、その後、肝構成細胞へ分化又はレシピエント肝構成細胞と融合することできるので、肝移植用細胞として有用である。
【００１４】
また、本発明の細胞は、肝疾患治療上有効な遺伝子等を導入することによって、それらを肝臓に効率的に送達するための担体としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の細胞は細胞膜表面に存在する糖タンパク質の糖鎖の先端にガラクトースを露出させ、肝臓への集積性を向上させたことを特徴とするものである。
【００１６】
本発明の細胞は、細胞膜表面に存在する糖タンパク質の糖鎖のシアル酸を除去し、ガラクトースを露出させるための処理を行うことによって調製できる。本処理は、糖鎖非還元末端に存在するシアル酸残基を分解し、ガラクトースを露出させることができればいかなる手段であってもよく、特に限定はされないが、例えば、ノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）などによる酵素処理、金属錯体系及び有機系触媒を高分子に結合させた高分子触媒などによる化学処理等が挙げられる。また、細胞にラクトースを露出させた糖鎖を元来発現させるように遺伝子工学的操作を行ってもよく、ガラクトースを露出させた糖鎖をもつタンパク質をアダプターとして細胞表面に接着させてもよい。これらの処理のうち、酵素処理が特に好ましい。
【００１７】
上記の処理を施した本発明の細胞（以下、「ガラクトース露出細胞」という）を生体内に投与すると、該細胞は肝細胞に発現するアシアロ糖タンパク質レセプターによって特異的に認識され、その結果、該細胞は効率的に肝臓に集積する。
【００１８】
本発明のガラクトース露出細胞を調製するための原料となる細胞は、その由来(動物種、臓器、組織）は問わず、また、該細胞を移植する対象に対して自家細胞であっても他家細胞であってもよい。由来となる動物としては、ヒトを含む哺乳動物、例えば、アカゲザル、カニクイザル、チンパンジー、ヒヒ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ウサギ、ハムスター、ラット、マウス等が挙げられる。これらの動物から採取した細胞に上記のガラクトース露出処理を施した細胞を同種の動物に移植してもよく（同種移植）、又は異種の動物に移植してもよい（異種移植）。また、由来となる動物に対して遺伝子組換えが行われていてもよく、移植される動物に対しても遺伝子組換えや免疫不全化が行われていてもよい。
【００１９】
また、本発明において使用する細胞は、正常細胞（一次細胞）であっても株化細胞であってもよい。正常細胞は、細胞の分化度について限定はなく、成熟細胞又は末成熟細胞〔例えば幹細胞（胚性幹細胞、成体幹細胞、胚生殖細胞）、肝芽細胞など〕のいずれをも含み、株化細胞は、ガン由来細胞、不死化細胞などを含む。本発明において好適に使用できる細胞としては、骨髄由来細胞、胚性幹細胞、肝幹細胞、骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞、正常肝由来細胞、株化肝由来細胞、不死化肝由来細胞、白血球細胞などが挙げられる。
上記の細胞は一種を用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２０】
本発明の細胞は、肝疾患治療上有効な遺伝子、生理活性物質、又は薬剤（以下、これらを「有効物質」という）を含んでいることが好ましい。また、上記有効物質は細胞に導入したもののみならず、細胞が本来的に有するものをも含む。本明細書において「有効物質」の用語は、例えば、正常肝細胞の増殖、抗炎症、腫瘍の消失又は縮退、GOT・GPTの低下など、肝疾患治療効果の少なくとも一つをもたらしうる物質を含んで最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。また、「肝疾患」とは、肝癌、肝硬変、肝炎、肝不全等の各種肝疾患をいう。
【００２１】
細胞へ上記有効物質を導入する場合は、前記のガラクトース露出処理の前に行っても、後に行ってもよい。
【００２２】
細胞に導入する有効物質の数や種類については特に制限はない。以下に挙げる種々の有効物質の１種又は２種以上を組み合わせても用いてもよく、また２種以上組み合わせる場合は、同じ種類であっても異なる種類であってもよい。
【００２３】
遺伝子としては、例えば、インターフェロン（IFN）群、繊維芽細胞増殖因子（FGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、組織プラスミノーゲン活性化因子（t-PA）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、エリスロポエチン（EPO）、免疫グロブリン（Ig）M及びG、インターロイキン（IL）群、トロンボポエチン（TPO）、LDLレセプター、VLDLレセプター、血液凝固因子（例えば、血液凝固第I, II, V, VII, IX, X, XI, XII, XIII因子、プレカリクレイン、高分子キニノゲン等）、凝固阻害因子（アンチトロンビンIII、プロテインC、プロテインS、α１-アンチトリプシン等）、プラスミノーゲンなどの線溶系因子、α２-プラスミンインヒビターなどの線溶系阻害因子をコードする遺伝子等が挙げられる。
【００２４】
生理活性物質としては、タンパク質、サイトカイン、ホルモン、酵素、薬物（タンパク質製剤原料やプロドラッグなど）等が含まれ、例えば、インターフェロン（IFN）群、繊維芽細胞増殖因子（FGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、組織プラスミノーゲン活性化因子（t-PA）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、エリスロポエチン（EPO）、免疫グロブリン（Ig）M及びG、インターロイキン（IL）群、トロンボポエチン（TPO）、LDLレセプター、VLDLレセプター、血液凝固因子（例えば、血液凝固第I, II, V, VII, IX, X, XI, XII, XIII因子、プレカリクレイン、高分子キニノゲン等）、凝固阻害因子（アンチトロンビンIII、プロテインC、プロテインS、α１-アンチトリプシン等）、プラスミノーゲンなどの線溶系因子、α２-プラスミンインヒビターなどの線溶系阻害因子などが挙げられる。
【００２５】
薬剤としては、抗ウイルス剤〔インターフェロン、リバビリン（製品名：レベトール）、ラミブジン（製品名：ゼフィックス）、各種ステロイド剤等〕；肝庇護剤〔強力ネオミノファーゲンＣ、各種漢方薬（小柴胡湯、肝再康等）等〕；利胆剤（ウルソ、プロへパール等）、高脂血症薬（メバロチン、リパンチル等）；抗ガン剤（5-FU、シスプラチン、アドリアマイシン等）；抗生剤（セフェム系、カルバペネム系等）；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス等）などが挙げられる。
【００２６】
上記の有効物質の細胞への導入は、有効物質の種類又は性質によっても異なるが、当業者に公知の手法により行うことができ、例えば、遺伝子の場合は、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ウイルスベクター法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法などが挙げられる。
【００２７】
細胞への上記有効物質の導入量は、ヒト患者及び非ヒト哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ等）に対する単位投与量として適当で、かつ所望の治療上の効果を付与するような量であれば特に限定はされず、細胞の移植経路、移植回数、適用疾患により適宜調整すればよい。
【００２８】
本発明のガラクトース露出細胞を移植する部位は、静脈注入が可能であればいかなる部位でもよいが、肝動脈、好ましくは門脈、さらに好ましくは末梢静脈が挙げられ、その移植部位から血管を通じて肝臓へ細胞が移動することにより、肝臓への細胞集積がなされる。また、静脈注入に使用する器具等は、少なくとも移植が可能であればいかなるものでもよく、また静脈注入剤を調製する場合、それに配合する成分も当分野で通常使用されるものでよい。静脈注入剤には、例えば、ショ糖、グリセリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの増粘剤、各種無機塩のｐＨ調整剤などを添加剤として加えればよい。
【００２９】
移植する細胞の量は、移植回数、移植経路、包含されている有効物質の種類、移植対象の年齢・性別・症状等により異なるが、例えば、門脈経由で移植する場合、成人に対して１回あたり、１０６〜１０９個とすればよい。
【００３０】
本発明のガラクトース露出細胞は、有効物質の導入の如何に関わらず、何れの段階で培養されてもよく、その方法も少なくともガラクトース露出細胞が死滅せずに培養できれば、いかなる培養条件、例えば培養時の温度、供給する酸素や二酸化炭素の濃度、培養液成分（塩濃度、アミノ酸混合比、サイトカイン含有量、ビタミン含有量、ホルモン含有量）、培養液のpH、培養基質、培養スケール等であってもよい。また、本発明のガラクトース露出細胞は、有効物質導入の如何に関わらず、何れの段階で保存されてもよく、その方法も少なくともガラクトース露出細胞が死滅せずに保存できれば、いかなる保存条件、例えば保存時の温度、保存液成分、保存形態等であってもよい。
【００３１】
また、本発明のガラクトース露出細胞を移植した非ヒト哺乳動物は、以下の態様で医薬品のスクリーニングに使用することができる。
【００３２】
すなわち、本発明によれば、ガラクトース露出細胞に被験物質を導入して得られた細胞を、肝細胞障害を有する非ヒト哺乳動物に移植し、該動物の肝臓における肝薬物代謝酵素の発現を指標として被験物質の中から肝疾患治療用医薬をスクリーニングする方法が提供される。ここで、ガラクトース露出細胞としては、ヒト由来のものを用い、非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ等のげっ歯類に属する動物が好ましく、その中でもマウスが特に好ましい。
【００３３】
被験物質を導入したヒト由来のガラクトース露出細胞を非ヒト哺乳動物に移植すると、ヒト由来細胞は非ヒト哺乳動物の肝臓に集積するとともに、被験物質を肝臓に送達する。
非ヒト哺乳動物の肝臓に送達された被験物質の代謝物が肝疾患治療上有効で、集積したヒト由来細胞が最終的に肝細胞に分化している場合、該動物の肝臓にヒト肝特異的な薬物代謝酵素（例えば、CYP3A4、CYP2D6等）が発現することになる。従って、顕著な肝薬物代謝酵素の発現が認められる場合の被験物質は、肝疾患治療用医薬の候補とすることができる。
【００３４】
本発明のスクリーニング方法の対象となる被験物質の種類は特に限定されない。例えば、天然に生じる分子(例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸など)；脂質、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど；あるいは天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体(例えば、ペプチド擬態物など)；及び天然に生じない分子(例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作成した低分子有機化合物)；ならびにそれらの混合物などを挙げることができる。また、被験物質としては単一の被験物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験物質を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでない。
（実施例１）  ガラクトース露出処理条件の検討
麻酔したラットの大腿骨から骨髄細胞を単離し、ficoll溶液を用いた密度勾配遠心にて単核球画分を得た。単核球画分の細胞7.5×106個をハンクス液1000μlに懸濁させることによって調製した細胞懸濁液に、最終濃度0, 0.25, 0.50 U/mlになるようにノイラミニダーゼ溶液を加えた。その溶液を37℃で30分インキュベートした後、Doulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）を用いて1500 rpm、5分の洗浄を3回行った。ノイラミニダーゼ処理した骨髄細胞の表面において、ガラクトースの露出の有無を確認するため、蛍光物質のFITCを標識したレクチン0.2μlで染色し、フローサイトメトリー法で分析した。その結果を図１に示す（Ａ:ノイラミニダーゼ未処理の骨髄細胞、Ｂ：0.25 U/mlノイラミニダーゼで処理した骨髄細胞、Ｃ：0.50 U/mlノイラミニダーゼで処理した骨髄細胞）。図１に示すように、0.25, 0.50 U/mlのノイラミニダーゼで処理した骨髄細胞にはFITC標識レクチンが結合していることが判り、ガラクトースが露出していることが示された。ノイラミニダーゼ濃度が0.50 U/mlの場合は細胞死が観察されたため、以後ノイラミニダーゼは0.25 U/mlの濃度で処理することとした。
【００３６】
（実施例２）  ガラクトース露出処理細胞の肝臓への集積効果
Prolyl Dipeptidyl Peptidase IV (DPPIV)＋のラットの骨髄細胞を大腿骨から単離し、ficoll溶液を用いた密度勾配遠心にて単核球画分を得た。単核球画分の細胞7.5×106個をハンクス液1000μlに懸濁することによって調製した細胞懸濁液に、最終濃度0.25 U/mlになるようにノイラミニダーゼ溶液を加えた。その溶液を37℃で30分インキュベートして骨髄細胞表面にガラクトースを露出させ、DMEMを用いて1500 rpm、5分の洗浄を3回行った。4μlの細胞染色色素PKH26と1 mlのdiluent Cの混合溶液（4×10-6Mに希釈）にガラクトース露出骨髄細胞（以下、処理細胞という）、又はノイラミニダーゼ未処理骨髄細胞（以下、未処理細胞という）を混濁して3分間反応させた。反応後にウシ胎児血清（FBS）2 mlを添加し、1分間室温でインキュベートして反応を停止させることにより、処理細胞又は未処理細胞にPKH26標識を施した。標識後の各細胞混濁液は0.4 mlのFBSと3.6 mlのDMEMを添加して遠心分離を施す過程を３度繰り返すことにより洗浄した。上記操作によりPKH26染色を施した処理細胞又は未処理細胞を300μlのDMEMに2.4×107個の細胞数で分注し、DPPIV-のラットに尾静脈注射にて移植した。1時間又は3時間後にラットから肝臓を摘出してPKH26によって蛍光を発する細胞数を観察した。結果を図２に示す（ａ：処理細胞移植後1時間における位相差顕微鏡での観察写真、ｂ：未処理細胞移植後1時間における位相差顕微鏡での観察写真、ｃ：処理細胞移植後1時間における蛍光顕微鏡での観察写真、ｄ：未処理細胞移植後1時間における蛍光顕微鏡での観察写真、ｅ：処理細胞移植後3時間における位相差顕微鏡での観察写真、ｆ：未処理細胞移植後3時間における位相差顕微鏡での観察写真、ｇ：処理細胞移植後3時間における蛍光顕微鏡での観察写真、ｈ：未処理細胞移植後3時間における蛍光顕微鏡での観察写真）。図２に示すように処理細胞群で肝臓への集積が優位であった。この蛍光を発する細胞数を実際にカウントした結果、図３に示すように移植後１時間及び３時間共に処理細胞群で優位な肝臓への集積が見られた。これはガラクトース露出処理により、短時間で効率的に骨髄細胞が肝臓に集積できることを示している。
【００３７】
(実施例３）ガラクトース露出処理細胞の肝臓への接着効果
DPPIV+のラットの骨髄細胞を大腿骨から単離し、ficoll溶液を用いた密度勾配遠心にて単核球画分を得た。単核球画分の細胞7.5×106個をハンクス液1000μlに懸濁することによって調製した細胞懸濁液に、最終濃度0.25 U/mlになるようにノイラミニダーゼ溶液を上記細胞縣濁液に加えた。その溶液を37℃で30分インキュベートして骨髄細胞表面にガラクトースを露出させ、DMEMを用いて1500 rpm、5分の洗浄を3回行った。そのガラクトース露出骨髄細胞（以下、処理細胞という）、ならびにノイラミニダーゼ未処理骨髄細胞（以下、未処理細胞という）を、既報（P. O. Seglen, Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13 (1976), pp. 29-83) に従ってDPPIV-のラットから単離した肝細胞と共培養した。共培養条件は、6 wellの培養皿に骨髄細胞、肝細胞とも3.0×105cells/mlの細胞濃度で播種した。共培養開始1、３時間後において、処理細胞と肝細胞の共培養系と未処理細胞と肝細胞の共培養系を比較した。その結果を図４に示す（ａ：処理細胞と肝細胞を共培養した時の、共培養開始1時間後における位相差顕微鏡での観察写真、ｂ：未処理細胞と肝細胞を共培養した時の、共培養開始1時間後における位相差顕微鏡での観察写真、ｃ：処理細胞と肝細胞を共培養した時の、共培養開始1時間後における蛍光顕微鏡での観察写真、ｄ：未処理細胞と肝細胞を共培養した時の、共培養開始1時間後における蛍光顕微鏡での観察写真）。図４に示すように、処理細胞と肝細胞の共培養系において顕著な骨髄細胞の接着が観察された。これはガラクトース露出処理により、骨髄細胞と肝細胞の接着が優位に行われることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の細胞は、肝臓への集積性が極めて高いので、効率のよい肝細胞移植が可能となり、また遺伝子等を肝特異的かつ選択的に送達する担体としての機能も有する。
【００３９】
従って、本発明は、肝癌、肝硬変、肝炎等の肝疾患に対する肝細胞移植治療、新規な肝臓へのドラッグデリバリー系として非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、ノイラミニダーゼ処理した骨髄細胞へのFITC標識レクチンの結合をフローサイトメトリー法で解析した結果を示すグラフである（Ａ:ノイラミニダーゼ未処理の骨髄細胞、Ｂ：0.25 U/mlノイラミニダーゼで処理した骨髄細胞、Ｃ：0.50 U/mlノイラミニダーゼで処理した骨髄細胞）。
【図２】図２ａは、ガラクトース露出骨髄細胞(処理細胞）移植後1時間における位相差顕微鏡での観察写真、図２ｂは、ノイラミニダーゼ未処理骨髄細胞（未処理細胞）移植後1時間における位相差顕微鏡での観察写真を示す。図２ｃは、ガラクトース露出骨髄細胞(処理細胞）移植後1時間における蛍光顕微鏡での観察写真、図２ｄは、ノイラミニダーゼ未処理骨髄細胞（未処理細胞）移植後1時間における蛍光顕微鏡での観察写真を示す。図２ｅは、ガラクトース露出骨髄細胞(処理細胞）移植後３時間における位相差顕微鏡での観察写真、図２ｆは、ノイラミニダーゼ未処理骨髄細胞（未処理細胞）移植後3時間における位相差顕微鏡での観察写真を示す。図２ｇは、ガラクトース露出骨髄細胞(処理細胞）移植後3時間における蛍光顕微鏡での観察写真、図２ｈは、ノイラミニダーゼ未処理骨髄細胞（未処理細胞）移植後3時間における蛍光顕微鏡での観察写真を示す。
【図３】図３は、ガラクトース露出骨髄細胞（処理細胞）、及びノイラミニダーゼ未処理骨髄細胞（未処理細胞）のDPPIV-ラット肝臓への移植後1時間又は3時間における細胞集積数を示す（各グラフにおいて、上部の棒線は誤差範囲を表す）。
【図４】図４ａは、ガラクトース露出骨髄細胞(処理細胞）と肝細胞を共培養した時の、共培養開始1時間後における位相差顕微鏡での観察写真、図４ｂは、ノイラミニダーゼ未処理骨髄細胞（未処理細胞）と肝細胞を共培養した時の、共培養開始1時間後における位相差顕微鏡での観察写真である。図４ｃは、ガラクトース露出骨髄細胞(処理細胞）と肝細胞を共培養した時の、共培養開始1時間後における蛍光顕微鏡での観察写真、図４ｄは、ノイラミニダーゼ未処理骨髄細胞（未処理細胞）と肝細胞を共培養した時の、共培養開始1時間後における蛍光顕微鏡での観察写真である。
【図１】
2005118005.tif 000002
【図２】
2005118005.tif 000003
【図３】
2005118005.tif 000004
【図４】
2005118005.tif 000005