(57)【要約】【課題】  低分子化合物で、かつ単回投与で、血管新生、特に動脈新生を促進し、虚血性疾患の予防又は治療に有効な医薬を提供する。【解決手段】  インジゴ誘導体又はその代謝物を有効成分とする血管新生促進剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インジゴ誘導体又はその代謝物を有効成分とする血管新生促進剤。
【請求項２】
インジゴ誘導体又はその代謝物、並びに顆粒球刺激因子、当該刺激因子をコードする遺伝子及びビタミンＡ類から選ばれる１種以上を有効成分とする血管新生促進剤。
【請求項３】
インジゴ誘導体が、インジゴカルミンである請求項１又は２記載の血管新生促進剤。
【請求項４】
インジゴ誘導体又はその代謝物を有効成分とする虚血性疾患の予防又は治療剤。
【請求項５】
インジゴ誘導体又はその代謝物、並びに顆粒球刺激因子、当該刺激因子をコードする遺伝子及びビタミンＡ類から選ばれる１種以上を有効成分とする虚血性疾患の予防又は治療剤。
【請求項６】
インジゴ誘導体が、インジゴカルミンである請求項４又は５記載の虚血性疾患の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血性疾患の予防及び治療に有用な医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
狭心症、心筋梗塞等の虚血性疾患は、血管の狭窄や閉塞により発症する重篤な疾患である。これらの治療方法として、血管拡張剤、抗血小板剤、抗擬血剤等の薬剤が外科的なバイパス術や経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）等の血管形成術と共に用いられているが、その効果は十分とはいえない。
先に本発明者らは、細胞増殖因子が心筋組織の血管新生を促し、かかる疾患に有効であることを報告している（非特許文献１、２及び３参照）。また、肥大型心筋症や拡張型心筋症においても心筋の虚血が症状を悪化させる原因となっており、血管新生療法により改善されることを見出している（特許文献１参照）。
【０００３】
従来、血管新生療法としては、細胞増殖因子やその遺伝子が検討されてきたが、細胞増殖因子は高分子タンパク質のため過剰増殖や免疫上の問題がある。また、骨髄由来血管前駆細胞や幹細胞移植等の方法もその臨床的効果は十分でない。さらに、虚血を充分改善するためには、毛細血管ではなく、血液を多量に送ることができる動脈を新生させる必要があるが、選択的に動脈の新生せしめる治療法は確立されていない。
【０００４】
一方、インジゴ誘導体であるインジゴカルミンは、腎臓の排泄機能を検査する臨床検査薬として古くから用いられており、近年、マクロファージ活性化抑制を介する抗炎症作用があることや（例えば、特許文献３参照）、エバンスブルーなどの色素と同様、抗血栓作用や細胞増殖抑制作用があることが報告されている（例えば、特許文献２参照）。
しかしながら、インジゴ誘導体又はその代謝物に、虚血部位に充分な血液を供給するのに必要な血管を新生させる作用があることは全く知られていない。
【特許文献１】特開２００２−２４１３０６号公報
【特許文献２】国際公開第９１／０３２２６号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９９／４０９０９号パンフレット
【非特許文献１】Yanagisawa-Miwa A, Uchida Y, et al Science 257:1401-1403, 1992
【非特許文献２】Uchida Y, et al: Am Heart J 130:1182-1188, 1995
【非特許文献３】内田康美ら：「血管新生療法」、メジカルビュー社、東京、1995.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、低分子化合物で、かつ単回投与で、血管新生、特に動脈新生を促進し、虚血性疾患の予防又は治療に有効な医薬を提供すること目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、斯かる事情に鑑み、種々検討した結果、インジゴカルミン等のインジゴ誘導体が血管新生を促進すること、更に顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ビタミンＡ類等を併用することにより、動脈新生を選択的に促進できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、インジゴ誘導体又はその代謝物を有効成分とする血管新生促進剤、又は虚血性疾患の予防又は治療剤を提供するものである。
【０００８】
また本発明は、インジゴ誘導体又はその代謝物、並びに顆粒球刺激因子、当該刺激因子をコードする遺伝子及びビタミンＡ類から選ばれる１種以上を有効成分とする血管新生促進剤、又は虚血性疾患の予防又は治療剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の血管新生促進剤、虚血性疾患の予防又は治療剤（以下、「本発明の医薬」ともいう）は、虚血部位に充分な血液を供給するのに必要な血管、特に動脈の新生を促進する。従って、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、末梢動脈閉塞症等の虚血性疾患の根治的な予防・治療剤となり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明におけるインジゴ誘導体としては、下記式（１）：
【００１１】
【化１】
2005272345.tif 000002
【００１２】
〔式中、Ｒ1〜Ｒ8は、水素原子又は−ＳＯ3Ｍ（Ｍはアルカリ金属を示す）を示す。〕
で示されるインジゴのスルホン酸置換誘導体が好適に挙げられる。
式（１）中、−ＳＯ3Ｍの置換数は２〜３が好ましく、Ｍとしては、ナトリウム、カリウムが好ましい。好適なインジゴ誘導体として、インジゴチンジスルホン酸ジナトリウム塩（インジゴカルミン）、インジゴトリスルホン酸ナトリウムが挙げられ、中でもインジゴカルミンは、血管新生促進効果が優れていることに加え、従来から化粧品中の色素や腎臓の排泄機能を検査する臨床検査薬として広く用いられており安全性が高い点で、特に好ましい。また、本発明においては、斯かるインジゴ誘導体の他、イサチン−５−スルホン酸や５−スルホアントラニル酸等の上記インジゴ誘導体の代謝物を用いることもできる。
斯かるインジゴ誘導体又はその代謝物は、公知の方法によって合成することができ、「インジゴカルミン」（Ｍｅｒｃｋ製）等の市販品を用いることもできる。
【００１３】
本発明における顆粒球刺激因子(以下、「Ｇ−ＣＳＦ」という)は、Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドであればいずれでもよく、ヒト、ウシ等の哺乳動物から抽出された天然型Ｇ−ＣＳＦ、遺伝子操作技術により作製された組換型Ｇ−ＣＳＦ（ヒト型リコンビナント、動物型リコンビナント）のいずれでもよい。また、Ｇ−ＣＳＦ活性を有する限り、そのアミノ酸配列の一部が欠失、他のアミノ酸に置換又は他のアミノ酸配列が挿入されたＧ−ＣＳＦ変異体も含まれる。
天然型Ｇ−ＣＳＦの調製は、例えば、ヒト、ウシ等の哺乳動物から抽出、精製して得ればよく、組換え型のＧ−ＣＳＦは公知の遺伝子工学的手法によりＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換え体を取得すればよい。また、「ヒト型レコンビナント顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）」（中外製薬製）等の市販品を用いることもできる。
【００１４】
本発明におけるビタミンＡ類としては、例えば、レチノール、レチノール脂肪酸エステル、３−デヒドロレチノール脂肪酸エステル等のレチノール類；レチノイン酸（ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、９−ｃｉｓ−レチノイン酸）、３−デヒドロレチノイン酸、５，６−エポイキシレチノイン酸、４−ヒドロキシレチノイン酸、４−オキソレチノイン酸および３，４−ジデヒドロレチノイン酸等のレチノイン酸類；レチナール、３−デヒドロレチナール等のレチナール類が挙げられる。また、トミバロン（Ａｍ８０）等のレチノイン酸様物質を用いることもできる。このうち、レチノイン酸類が好ましく、更にはレチノイン酸が好ましく、特にａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸が好ましい。
斯かるビタミンＡ類は、公知の方法により合成することにより得ることができ、「ａｌｌ  ｔｒａｎｓレチノイン酸」（Ｓｉｇｍａ社製）等の市販品を使用することもできる。
【００１５】
本発明のインジゴ誘導体は、後記実施例に示すように、血管内皮細胞及び平滑筋細胞の増殖を有意に促進し（実施例１）、また、心筋梗塞モデル動物において、虚血部位における動脈及び静脈を増加させる作用を有する（実施例２）。すなわち、虚血部位に充分な血液を供給するのに必要な血管を新生せしめる。そして、更に当該血管新生作用は、Ｇ−ＣＳＦ及び／又はビタミンＡ類を併用することにより、顕著に促進され、特に動脈の新生において著しい促進効果を示す（実施例２）。従って、インジゴ誘導体又はその代謝物、並びにこれらとＧ−ＣＳＦ、ビタミンＡ類等との併用は、虚血疾患の虚血部位に充分な血液を供給するのに必要な血管の新生を可能とする血管新生促進剤となり、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、血管性痴呆、閉塞性動脈硬化症などの虚血性疾患の予防又は治療に有効な医薬となり得る。
【００１６】
本発明の医薬は、上記インジゴ誘導体等の有効成分に、製薬上許容し得る担体を適宜添加し、経口又は非経口投与製剤として調製できる。非経口投与のための剤形としては、例えば、注射剤、座薬、吸入剤、外用剤等が挙げられる。注射剤は、液剤（無菌水又は非水溶液）、乳剤及び懸濁剤の形態とすることができ、これらに用いられる非水担体、希釈剤、溶媒又はビヒクルとしては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、オレイン酸エチル等の注射可能な有機酸エステルが挙げられる。また、該組成物には防腐剤、酸化防止剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤等の補助剤を適宜配合することができる。経口投与製剤としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形製剤、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、油性若しくは水性懸濁剤等の液剤を例示できる。
【００１７】
本発明の医薬は、その製剤形態に応じた適当な投与経路により投与され得るが、中でも注射剤の形態で用いるのが好ましく、特に皮下又は筋肉内投与、冠動脈内投与、心筋内投与、心膜腔内投与、静脈内投与等が好ましい。
【００１８】
また、インジゴ誘導体又はその代謝物とＧ−ＣＳＦ、ビタミンＡ類等とを併用する場合は、両薬剤を同時に投与すること以外に、間隔を置いて別々に投与することが包含される。すなわち、インジゴ誘導体又はその代謝物と、Ｇ−ＣＳＦ、ビタミンＡ類は、製剤学的に許容される希釈剤、賦形剤等と混合して単一製剤としてもよく、両薬剤を別々に製剤化してセットとして使用してもよい。両薬剤を別々に製剤化する場合には、両製剤は同一の剤形としなくてもよい。Ｇ−ＣＳＦをコードする遺伝子を併用する場合には、Ｇ−ＣＳＦをコードする遺伝子は、適当なベクター等を用いて投与されるか、或いは注射等によってそのまま投与すればよい。
【００１９】
本発明の医薬の投与量は、患者の年齢、体重、投与対象疾患、症状、投与形態、投与ルート等に応じて適宜決定されるが、通常、インジゴ誘導体又はその代謝物は、１日当たり約０．０１〜５ｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜０．５ｇ／Ｋｇ、Ｇ−ＣＳＦは、１日当たり１〜３０００μｇ／kg、好ましくは２０〜５００μｇ／Ｋｇ、ビタミンＡ類は、１日当たり１０〜１００００ｎｇ／Ｋｇ、好ましくは５０〜１０００ｎｇ／Ｋｇ投与するのがよい。また、投与は、１日１回でもよいが、２回以上に分けて投与してもよい。
【００２０】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明する。
【実施例】
【００２１】
実施例１  ヒト臍帯静脈内皮細胞及び冠動脈平滑筋細胞増殖促進作用
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ  ＫＴ３−Ｔ２）１×１０4個を、ＭＣＤＢ−１０４、１０％ＦＢＳ、ＥＣＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）  ヘパリン（１００μｇ／ｍＬ）の混合培地に蒔き、各種濃度のインジゴカルミン（Ｍｅｒｃｋ）を蒸留水に溶解して加えて培養し、３日後に細胞数を数えた。
次いで、ヒト冠動脈平滑筋細胞（ＣＡＳＭＣ−２）１×１０4個を、ＭＣＤＢ−１０４、１０％ＦＢＳ、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）の混合培地に蒔き、インジゴカルミンを加えて培養し、３日後に細胞数を数えた。
図１に示すように、内皮細胞及び平滑筋細胞の増殖はインジゴカルミンにより有意に促進された。
【００２２】
実施例２  冠血管新生促進作用
ビーグル犬をネンブタール麻酔し、右総頚動脈を介し、カテーテルを左冠動脈に挿入し、合成樹脂性球により閉塞せしめ急性心筋梗塞モデルを作成した。梗塞モデル犬を４群に分け、左心室内に針付カテーテルを挿入し、下記の薬剤又は細胞を梗塞領域に直接注入した。
第１群（対照群）：生理食塩水  １ｍＬを心筋内に注入。
第２群（インジゴカルミン群）：１０％インジゴカルミン  １ｍＬを心筋内に注入。
第３群（自己骨髄単核細胞群）：大腿骨骨髄を穿刺し骨髄液２０ｍｌを吸引し、それをHanks液に希釈し、遠沈器で単核球を分離した。これにより、細胞数１×１０6個の単核球を得た。その浮遊液１ｍＬを、同様にして、心筋内に移植した。
第４群（インジゴカルミン、レチノイン酸、G-CSF群）：１０％インジゴカルミン１ｍＬを注入し、ａｌｌ  ｔｒａｎｓレチノイン酸（ＡＴＲＡ）の５％アルブミン溶液  １ｍＬ（ａｌｌ  ｔｒａｎｓレチノイン酸として３００ｎｇ／ｋｇ）とＧ−ＣＳＦ  １０μｇ／ｋｇとを隔日に皮下注射した。
【００２３】
４週間後、麻酔により心拍を停止せしめ、心臓を摘出し、ホルマリン固定を行い、梗塞部位における、単位面積（２５０×２５０μｍ2）当たりの血管数を数え、群間比較を行った。Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定を行い、ｐ＜０．０５をもって、有意とみなした。
図２に、インジゴカルミン投与例と非投与例の心筋梗塞領域の実例を示す。動脈、静脈及び毛細血管それぞれの上段は非投与例であり下段がインジゴカルミン投与例である。  投与例では、血管が増加していることがわかる。
図３に、非投与群（対照群）６例、骨髄単核細胞移植群６例、インジゴカルミン単独投与群６例、インジゴカルミン、ａｌｌ  ｔｒａｎｓレチノイン酸及びＧ−ＣＳＦ併用群における単位面積当たりの血管数を比較し示した。
インジゴカルミン投与群では、対照群と比べ動脈及び静脈が有意に増加した。また、骨髄単核球移植群と動脈、静脈増加作用では有意差は認められなかった。併用群では、インジゴカルミン単独群と比べ、動脈数は有意に増加した。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、インジゴカルミンによる血管内皮細胞及び平滑筋細胞増殖作用を示した図である。
【図２】図２は、インジゴカルミンのイヌ心筋梗塞部位での血管新生作用を示した図である。上段：対照例の動脈、静脈、毛細血管。下段：投与例の動脈、静脈、毛細血管。
【図３】図３は、各群の梗塞部位における単位面積当たりの血管数の比較を示した図である。*：P<0.05、**：P<0.01、***：P<0.001、****：P<0.0001（対照群との比較）、†：P<0.05（骨髄群との比較）、#：P<0.05（インジゴカルミン単独群との比較）。
【図１】
2005272345.tif 000003
【図２】
2005272345.tif 000004
【図３】
2005272345.tif 000005