(57)【要約】【課題】内分泌撹乱作用を有する化学物質（環境化学物質）の生物機能に対する毒性、特に生殖毒性を短時間で簡便な操作により、かつ正確に評価する方法を提供する。【解決手段】線虫（Ｃ．エレガンス）およびその新規高感受性ｂｉｓ−１変異体ＮＸ３のほか、ｄｐｙ−２、ｄｐｙ−７、ｄｐｙ−１０の各変異体を環境化学物質を含有する培地で飼育し、その産子数を数えると共に生育状況および行動を観察することにより、前記環境化学物質の生物機能に対する毒性を評価することを特徴とする環境化学物質の毒性評価方法。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
線虫またはその変異体を環境化学物質を含有する培地で飼育し、その産子数を数えると共に生育状況および行動を観察することにより前記環境化学物質の生物機能に対する毒性を評価することを特徴とする線虫を用いた環境化学物質の毒性評価方法。
【請求項２】
前記線虫が、セノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）である請求項１に記載の線虫を用いた環境化学物質の毒性評価方法。
【請求項３】
前記変異体が、ｂｉｓ−１の新規変異体ＮＸ３である請求項１に記載の環境化学物質の毒性評価方法。
【請求項４】
前記変異体が、ｄｐｙ−２、ｄｐｙ−７またはｄｐｙ−１０の各変異体である請求項１に記載の環境化学物質の毒性評価方法。
【請求項５】
前記変異体が、ｄｐｙ−２、ｄｐｙ−７、ｄｐｙ−１０およびｂｉｓ−１の各変異体から選択される変異体を交配することにより得られる二重変異体または三重変異体である請求項１に記載の環境化学物質の毒性評価方法。
【請求項６】
前記生物機能に対する毒性が、生殖毒性、神経毒性または急性毒性である請求項１に記載の環境化学物質の毒性評価方法。
【請求項７】
請求項１の線虫による環境化学物質の毒性評価方法を用いることを特徴とする環境化学物質の種類および毒性の分類方法。
【請求項８】
請求項１の環境化学物質の毒性評価方法に用いられる線虫の変異体であって、該変異体の遺伝子が、配列表１の配列番号１で表される塩基配列を含む線虫ｂｉｓ−１変異体ＮＸ３。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、線虫（Ｎｅｍａｔｏｄａ，  ｎｅｍａｔｏｄｅ）またはその変異体を用いた環境化学物質（以下「内分泌撹乱化学物質」または「環境ホルモン」ということがある。）の毒性評価方法および該毒性評価方法に用いられるｂｉｓ−１新規変異体ＮＸ３に関するものであり、さらに詳しくは、環境化学物質がヒトをはじめとする生物の内分泌系、神経系で引き起こす異常現象、特に生殖機能に対する毒性を線虫の高感受性変異体を用いて評価する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
現在、地球上の多くの地域で環境化学物質が原因とされる野生動物の異常現象が観察されている。例えば、アメリカフロリダ州アボプカ湖のワニ、フロリダ州のヒョウ、海産マキガイなどの生殖異常など、種を越えた多種類の野生動物で生殖異常、性器異常等が見られ、化学物質の暴露を受けた野生動物に生理的な撹乱が生じている。このような事例はこれに限らず生態系を構成する魚類、両性類、鳥類や無脊椎動物などの野生生物に多くの地域で観察されている。
【０００３】
また、食物連鎖の下層にいる生物も環境ホルモンによる影響を受け、食物連鎖の底辺にいる生物の減少は生態系のバランスを崩し、さらには食物連鎖の下層の生物から上層にいる生物への環境化学物質の生物濃縮も懸念されている。
人間も例外ではなく、精子の著しい減少、生殖器の異常、増加の一途をたどる乳ガン、子宮内膜症、前立腺ガンまたは機能障害、「キレる」現象等の容易に解決の糸口の見えない異常現象が報じられている。
【０００４】
かかる異常現象は、種々の原因が複雑に絡み合って生じているものであることは容易に理解できるが、各生物について共通していえることはそれらの内分泌系に作用し、その機能を撹乱させる化学物質、いわゆる外因性内分泌撹乱化学物質のホルモン様作用またはホルモン阻害作用によるものが一つの主要な原因ではないかということが判明してきた。そして、かかる内分泌撹乱化学物質として、すでに１００種以上の合成化学物質が挙げられており、例えば、殺生物剤として使用されているＤＤＴ、ＤＤＥ、ＤＤＤ、メトキシクロル等の有機塩素系化合物、アトラジンのほか、船底塗料成分のトリブチルスズ、トリフェニルスズ等、プラスチック材料のアルキルフェノール化合物、ビスフェノールＡ、フタル酸ジ−２−エチルヘキシルまたは合成エストロゲンのＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）等の各種用途に使用されている化合物が内分泌撹乱作用を有する環境化学物質として知られている。
【０００５】
また、数万種類にも及ぶといわれる環境化学物質のなかにも、内分泌撹乱作用を有することが未だ知られていない化学物質が存在する懸念があり、さらに今後の開発される新規化学物質については内分泌撹乱作用を有するものかどうかを判定する方法を確立することが将来にわたる生物の正常な機能を維持するためには不可欠で緊急な事項である。
【０００６】
しかしながら、かかる環境化学物質の毒性を簡便な操作により正確に評価することが可能な測定用キットは未だ開発されていない。一般に化学物質の毒性評価には従来から、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、さらには豚等の高等動物を利用することが提案されているが、例えば、マウスを用いた毒性評価法では評価に２ヶ月〜３ヶ月もの長時間を要し、さらに、多大な労力を要し、操作も煩雑である。また、費用についても高額となり、多種多数の環境化学物質の毒性を迅速に評価することは現実的には困難である。
【０００７】
また、酵母菌を用いて環境化学物質の影響を検出する方法があるが、酵母菌は植物細胞であり、ヒトの如き動物の神経系、生殖器官への影響を検出するには限界があり、類似性が小さいので感度も低い。
【０００８】
かかる状況下において、線虫を用いた化学物質、特に重金属の毒性試験法が提案されている（特開平８−１１６９９１号公報参照。）。この提案は、熱ショックタンパクのプロモーターが重金属等の化学物質により活性化される現象を利用し、この熱ショックタンパクのプロモーター下流にホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を結合させた融合遺伝子を作製し、これを線虫に微量注入することにより得られたトランスジェニック線虫を被検物質に曝露し、被検物質の毒性の有無をルシフェラーゼの発光反応により検出する試験法である。
しかし、熱ショックタンパクのプロモーターを用いた毒性試験法は、あくまでそのプロモーターを活性化させる化学物質のスクリーニング方法にすぎず、被検物質がプロモーターを活性化させたとしても、その物質が毒性を有するということはいえない。その上、熱ショックタンパクは、数種類存在し、どの熱ショックタンパクのプロモーターを用いるのかが明確でなく、実用化は困難である。
【０００９】
また、内分泌撹乱作用を有する化学物質が生体内のエストロゲンレセプターに作用すると卵黄タンパク前駆体であるビテロジェニンのｍＲＮＡの発現量が増加する性質を利用して、被検物質に線虫を曝露し、そのｍＲＮＡを定量することにより、その被検物質の環境ホルモン活性を把握する方法が提案されている（特開２０００−６９９７７号公報参照。）。
【００１０】
しかしながら、かかるビテロジェニンのｍＲＮＡの発現量を指標とする方法は、検出感度は高いものの被検物質がエストロゲンレセプターを介してビテロジェニンを活性化させる化学物質のスクリーニング方法であり、ｍＲＮＡの発現量と毒性の関連が明瞭ではない。
【００１１】
【特許文献１】特開平８−１１６９９１号公報
【特許文献２】特開２０００−６９９７７号公報
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題の第一は、線虫および線虫の変異体を用いることによる環境化学物質の生物機能、特に生殖機能に対する毒性を短時間に簡便な操作で、かつ正確に判定可能な環境化学物質の毒性評価方法を提供することにある。
また、本発明の課題の第二は、環境化学物質の生物機能、特に生殖機能に対する毒性を高度の検出感度で判定可能な環境化学物質の毒性評価方法を提供することにある。
さらに、本発明の課題の第三は、線虫の新規変異体の提供にある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、前記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、線虫の一種であるセノラブディティス・エレガンス（通称：シー・エレガンス）  （Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）および該線虫から環境化学物質に対し感受性を示す変異体を見い出し、また、該線虫およびその変異体を用い、環境化学物質を添加した培地上で、その線虫が産む卵の数（本明細書において、「産子数」という。）を数え、これを指標とし、線虫が本来産むべきはずの産子数と対比すれば、環境化学物質の生物機能に対する毒性、特に生殖毒性を確実に評価することができ、これと同時に生育状況および行動を観察することにより神経毒性および急性毒性を評価することができる。また、完全に生物１個体の産子数が被検物質によりどのような影響を受けるかが明確になることを見出し、前記課題を解決できることに想到し、これらの知見に基いて本発明の完成に到達した。
【００１４】
かくして、本発明によれば、
線虫またはその変異体を環境化学物質を含有する培地で飼育し、その産子数を数えると共に生育状況および行動を観察することにより、前記環境化学物質の生物機能に対する毒性を評価することを特徴とする線虫を用いた環境化学物質の毒性評価方法
が提供される。
【００１５】
また、本発明によれば、
線虫の変異体であって、遺伝子が配列表１の配列番号１で表される塩基配列を含む線虫ｂｉｓ−１変異体ＮＸ３
が提供される。
【００１６】
本発明は、環境化学物質を含有する培地上で線虫または線虫変異体を該環境化学物質に曝露し、該線虫または線虫変異体が産む産子数を指標として環境化学物質の生物機能に対する毒性、特に生殖毒性を評価する方法および生育状況および行動の観察による神経毒性および急性毒性を評価する方法を提供するものであり、また、該評価方法に用いられる新規なｂｉｓ−１変異体ＮＸ３を提供するものであるが、さらに、好ましい実施の態様として次の１）〜７）に掲げるものを包含する。
【００１７】
１）前記線虫または線虫の変異体の培地上での飼育の温度が、１６℃〜２５℃の範囲に設定された温度である前記環境化学物質の毒性評価方法。
２）前記産子数が、親虫１個体当たりの一生における産子数の合計数である前記環境化学物質の毒性評価方法。
３）前記産子数が、世代交代による第一世代（Ｆ１）および第二世代（Ｆ２）における産子数の合計数である前記環境化学物質の毒性評価方法。
４）前記環境化学物質の検出試剤が、線虫に外来遺伝子を導入した場合において、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子または緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）である前記環境化学物質の毒性評価方法。
５）前記ｄｐｙ−２の変異体が、ｄｐｙ−２（ｅ８）、ｄｐｙ−２（ＳＣ３８）、ｄｐｙ−２（ｅ４８９）およびｄｐｙ−２（ｅ１３５９）  からなる群より選択された少なくとも一種である前記環境化学物質の毒性評価方法。
６）前記ｄｐｙ−７の変異体が、ｄｐｙ−７（ｅ８８）、ｄｐｙ−７（ＳＣ２７）、ｄｐｙ−７        （ｅ１３２４）およびｄｐｙ−７（ｍ３８）からなる群より選択される少なくとも一種である前記環境化学物質の毒性評価方法。
７）前記ｄｐｙ−１０の変異体が、ｄｐｙ−１０（ｅ１２８）またはｄｐｙ−１０（ｃｎ６        ４）である前記環境化学物質の毒性評価方法。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明についてさらに具体的に説明する。
本発明の環境化学物質の生物の生殖機能、神経機能等に対する毒性の評価方法において用いられる線虫（（セノラブディティス・エレガンス  （Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ））は、１５００種程度知られている中から選択された体長約１ｍｍの土壌線虫の一種である。該線虫は、飼育が容易で体細胞数が約１０００個と少なく、雌雄同体が自家受精で増殖することができるものである。
【００１９】
線虫は神経系、筋肉、消化器官、生殖器官等および表皮をもち、動物としての基本的体制をもっており、その遺伝子もヒトに近く、また、ヒトと同じ真正後生動物に属することから、線虫を利用することは、環境化学物質のヒトへの毒性の影響をモニタリングするには好適なものである。
【００２０】
また、本発明に係る環境化学物質の毒性評価方法において用いられる線虫の変異体は、線虫表皮（コラーゲン等）の変異体であり、例えば、ｄｐｙ−２、ｄｐｙ−７およびｄｐｙ−１０の変異体を挙げることができる。
【００２１】
ｄｐｙ（ｄｕｍｐｙ）の遺伝子に変異をもった線虫の表現型は、野生株に比べ短く太ったようなずんぐり型の形質を示している。
かかるｄｐｙの変異体は、１９７４年シドニー・プレナーにより分離されたものであり、本発明において用いられる変異体は、現在までに発見されている約３０種類のｄｐｙ遺伝子のなかから選択したものである。ｄｐｙの遺伝子群は、主に細胞外マトリックスの構成成分であるコラーゲンに関与する遺伝子が多く、ｄｐｙ−２、ｄｐｙ−７、ｄｐｙ−１０の遺伝子産物は、コラーゲンとして同定されたものである。
【００２２】
これらのｄｐｙ−２、ｄｐｙ−７およびｄｐｙ−１０の変異体の具体例としては、次に挙げるものが好適であり、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  （ＣＧＣ）（米国）から入手することができる。
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【００２３】
なお、前記ｄｐｙ−２（ｅ８）、ｄｐｙ−１０（ｅ１２８）については、Ｌｅｖｙ  ＡＤ，  Ｙａｎｇ  Ｊ，  Ｋｒａｍｅｒ  ＪＭ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．  １９９３  Ａｕｇ；４（８）：８０３−１７．ＰＭＩＤ：８２４１５６７に、また、ｄｐｙ−７（ｅ８８）は、Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ＩＬ，  ｓｈａｆｉ  Ｙ，  Ｂａｒｒｙ  ＪＤ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９９２  Ｎｏｖ；（１１）：３８５７−６３．ＰＭＩＤ：１３９６５７９にも紹介されている。
【００２４】
また、本発明者らが新たに分離したｂｉｓ−１新規変異体ＮＸ３の塩基配列は、配列表１の配列番号１で示す通りのものであり、ＷＯＲＭＢＡＳＥ  ＯＲＧ．  から提供されたＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｏｒｔ  のＦ５６Ｄ５．１（Ｕｎｓｐｌｉｃｅｄ）の塩基配列の５５６番目のＧ（グアニン）がＴ（チミン）に変異したものである。ｂｉｓ−１変異体ＮＸ３は、環境化学物質の毒性評価において著しく顕著な高感受性を発揮する変異体である。
【００２５】
なお、該線虫ｂｉｓ−１変異体ＮＸ３については、受託範囲外の生物種のため、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター長より平成１５年６月３日付にて生物寄託に関する受託拒否証明書を得ており、本件特許出願人（株式会社バイオス医科学研究所）により分譲可能である。
【００２６】
本発明に係る新規高感受性変異体ＮＸ３は、次に示す野生株からの分離を含む各工程からなる方法により作製したものである。
すなわち、
ａ）野生株の成虫から卵のみを採取し；
ｂ）工程ａ）にて得られた卵を培養し、ふ化させ；
ｃ）ふ化後、幼虫を４齢幼虫（Ｌ４）になるまで飼育し、これを突然変異処理に供し；
ｄ）工程ｃ）にて突然変異処理を経た幼虫を第二世代（Ｆ２）が生まれるまで飼育し；
ｅ）工程ｄ）にて得られた第二世代（Ｆ２）が卵をもった成虫に成育した時点で環境化学物質に曝露させ；
ｆ）死滅した前記第二世代（Ｆ２）の成虫の卵から育成した第三世代（Ｆ３）の成虫を感受性試験に供した後、高感受性変異体を分離する各工程を含む高感受性変異体の作製方法が提供される。
【００２７】
前記工程ａ）において、卵のみの採取は、成虫を、例えば次亜塩素酸−水酸化アルカリ処理に供し、虫体を溶解させることにより行なうことができる。また、工程ｂ）のふ化および培養は培地中で行なわれる。培地は寒天培地などが用いられる。工程ｃ）の突然変異処理は、４齢幼虫について行なわれるものであり、メタンスルホン酸エチル等の突然変異誘起剤が用いられる。また、工程ｅ）における線虫の環境化学物質への曝露は、室温、２〜４時間の接触により行なわれる。
【００２８】
以上述べたように前記工程ａ）〜ｆ）により、環境化学物質に対して高感受性変異体を得ることができる。
また、本発明においては、かかる変異体を交配することにより作製された二重変異体、三重変異体を用いることができる。
【００２９】
二重変異体および三重変異体の作製方法は、特に限定されるものではないが、例えば、下記の▲１▼〜▲４▼；
▲１▼変異体Ａ、変異体Ｂの雌雄同体および雄が生殖能力を有する。
▲２▼変異体Ａ（遺伝子型；ａ／ａ、形質；Ａ）、変異体Ｂ（遺伝子型；
ｂ／ｂ、形質；Ｂ）は劣性ホモの変異を有する。
▲３▼変異体Ａ、変異体Ｂの変異は、異なる染色体上にある。
▲４▼組み換えが起こらないものとする。
を条件として次の如き方法により、二重変異体を作製することができる。また、変異体Ａ、Ｂの変異が同一の染色体上に存在する場合でも二重変異体は作製できる。
【００３０】
すなわち、変異体Ａ（遺伝子型；ａ／ａ、形質；Ａ）の雄と変異体Ｂ（遺伝子型；ｂ／ｂ、形質；Ｂ）の雌雄同体（または変異体Ａの雌雄同体と変異体Ｂの雄）を掛け合わせ、その子供（Ｆ１）のなかから変異体Ａ、Ｂの形質をもたない野生株（＋／＋、形質；ＷＴ）と同一の形質を示す線虫を探せばよい。
【００３１】
その子供（Ｆ１）から生まれた子供（Ｆ２）の形質はメンデルの法則により、形質ＷＴ：形質Ａ：形質Ｂ：形質ＡＢ（二重変異体）の割合が９：３：３：１、つまり１／１６の確立で変異体ＡとＢの両方の形質をもつ二重変異体（遺伝子型；ａ／ａ、ｂ／ｂ、形質；ＡＢ）が得られる。
二重変異体の作製方法の概略図およびＦ２の形質は下表の通りである。
【００３２】
【表１】
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前記変異体、特に二重変異体、三重変異体は、環境化学物質に対し高い感受性を示すことから、後述の実施例にも示すように環境化学物質の毒性評価において検出感度を著しく向上させることができ、顕著な効果を奏することができる。
【００３３】
本発明に係る環境化学物質の毒性評価方法において採用される産子数の測定は、線虫は約７２時間で成虫となり、その後約５日間のうちに雌雄同体１個体から約３００個の卵を産む生理現象を利用するものである。すなわち、本発明においては、この卵の数（産子数）を数え、その結果に基いて直接毒性評価を行なう。環境化学物質の毒性を評価するための産子数は、親虫１個体当たり一生の産子数を利用することが毒性評価にとって正確であり好ましい。かかる産子数の測定により被検物質である環境化学物質の生殖毒性を約８日間程度で判定することができる。
【００３４】
産子数の測定は、環境化学物質を含む培地上に卵またはふ化したばかりの第一齢幼虫を１個または１匹のせ、約３日後から実体顕微鏡下で５日間カウントすることにより行なう。
また、産子数測定は、通常、１つの環境化学物質当たり１０回実験を繰り返し、その平均値を算出し、標準偏差が±１０％以内のものをデータとして採用したものであり、これにより、再現性については十分高い結果を得ることができる。
【００３５】
本発明の環境化学物質の毒性評価方法において観察の対象とする線虫の生育状況は、化学物質を含む培地上で生存または死滅するか否か、野生株と比較して生育が遅れているのかいないのかが判断基準となる。また、線虫の行動については、野生株は通常サイン波に類似した曲線を描き培地上を移動するが、線虫の神経系の変異体には痙攣しているもの、体が曲がってしまうもの、神経異常によりうまく動けないものなどが存在し、主にこの行動パターンを基準として神経毒性の有無及び強度の判断を行なうことができる。
【００３６】
以上述べたように本発明の環境化学物質の毒性評価方法により、産子数の測定結果から生殖毒性を、また生育状況・行動パターンより神経毒性を判定することができる。例示すると具体的には次の如き環境化学物質の種類および毒性の分類が可能であった。
【００３７】
生殖毒性
・ビスフェノールＡおよびビスフェノールＦなどのビスフェノール化合物類
・オクチルフェノールやノニルフェノールなどのアルキルフェノール化合物類
・フタル酸ブチルベンジルやフタル酸ジ−２−エチルへキシルなどのフタル酸類
・トリブチルスズやトリフェニルスズなどの有機スズ化合物
神経毒性
・ダイオキシン
・ポリ塩化ビフェニル
・有機リン系殺虫剤
【００３８】
次に、本発明の環境化学物質の毒性評価方法において線虫の飼育に用いられる培地は、寒天培地（ＮＧ  ａｇａｒ）（組成；寒天、ペプトン、ＮａＣｌ、コレステロール、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２、リン酸カリウム系緩衝液）、Ｍ９緩衝液（組成；Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ４）、Ｓ緩衝液（組成；ＮａＣｌ、リン酸カリウム緩衝液）等を挙げることができる。
また、線虫の餌としては大腸菌（エッシェリヒア・コリ，  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が用いられる。
【００３９】
本発明の環境化学物質の毒性評価方法における線虫の飼育は、環境化学物質を添加した培地に線虫またはその変異体を加え、温度１６℃〜２５℃の範囲に保持することにより行なわれるが、使用する変異体により温度条件を変えてもよい。飼育温度が、前記温度範囲外においては、線虫の生育が悪化し産子数の測定が正確かつ効率に行なえないなどのおそれが生じる。
また、培地に対する被検物質としての環境化学物質の濃度は、化学物質の化学構造等により線虫に与える影響が相違するので毒性判定が明確になるように任意に決定される。
【００４０】
【実施例】
以下、本発明について実施例よりさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は、実施例等により限定されるものではない。
【００４１】
実施例１（産子数の測定）
卵をもった成虫（野生株）を次亜塩素酸−水酸化ナトリウム処理することにより虫体を溶解させ、卵だけを取り出し寒天培地に移した。２０℃で約１５時間保持することにより、その卵からふ化した幼虫が得られたので、ふ化したばかりの一齢幼虫を各濃度に調製した９種類のアルキルフェノール化合物を添加した培地に１匹ずつ移し、２０℃で飼育した。培地には線虫の餌として大腸菌を加えた。ふ化後約７２時間で成虫（これを親虫とする。）になり、卵を産み始めたので、実体顕微鏡下で５日間、卵および卵からふ化した幼虫を数え、これを産子数とした。親虫を毎日新しい培地に移し換えることにより、毎日の産子数およびその合計をその親虫の１個体あたりの一生の産子数とした。なお、産子数は１化合物当たり１０回の実験を行ないその平均値を算出し、標準偏差が±１０％以内のものを採用した。各アルキルフェノール化合物の生殖毒性として培地中の各アルキルフェノール化合物の濃度の変化による産子数の変化を図１に示す。
なお、前記アルキルフェノール化合物はすべてジメチルスルホキシドに溶解させ、その溶液を培地に添加した。なお、ジメチルスルホキシドは線虫に影響のない濃度（０．１％）に調整した。
【００４２】
また、寒天培地（ＮＧ  Ａｇａｒ）は、次の組成のものを用い、水で１リットルと
し、オークレーブで滅菌処理をした。
寒天                                            １７ｇ
ぺプトン                                      ０．５ｇ
ＮａＣｌ                                          ３ｇ
コレステロール（５ｍｇ／ｍｌ）                      １ｍｌ
ＭｇＳＯ４  （１Ｍ）                                            １ｍｌ
ＣａＣｌ２  （１Ｍ）                                            １ｍｌ
リン酸カリウム緩衝液（１Ｍ，ｐＨ６．０）        ２５ｍｌ
【００４３】
図１によれば、アルキルフェノール化合物の影響は、フェノール核に付加するアルキル鎖が長くなるほど産子数が減少する傾向がみられた。また、炭素数４個の４−ｎ−ブチルフェノールを境にアルキル鎖が長い化合物は、０．１ｍＭの濃度で致死となり、これより短かい化合物は、１ｍＭで致死となり、アルキル鎖が長くなるほど致死性が増加する傾向がみられた。このようにアルキルフェノール化合物の毒性は、アルキル鎖の長さに依存して増加することが示された。
本実験により、アルキルフェノール化合物は、そのホルモン様作用により産子数を減少させるばかりでなく、致死性の高い毒物としての作用を有することが明らかになった。
【００４４】
実施例２（環境化学物質高感受性変異体の分離）
野生株（Ｎ２）の成虫の次亜塩素酸−水酸化ナトリウム処理により虫体を溶解させて卵を取り出し実施例１の寒天培地の組成と同一の組成の寒天培地に移し、２０℃で培養した。ふ化約２．５日経過後、生殖器官を形成し始めた線虫約１５０００匹を突然変異誘起剤であるメタンスルホン酸エチル（０．１Ｍ）に室温で３時間浸し突然変異処理を行なった。突然変異処理をした線虫を寒天培地に移し、孫の代（Ｆ２）が生まれるまで飼育を継続した。この孫（Ｆ２）が卵をもった成虫に成育した時点で環境化学物質である２．５ｍＭビスフェノールＡ  溶液に曝露させ、死んでいく成虫から順番に１匹ずつ独立で約１００匹を寒天培地に移した。死んだ成虫は卵をもっているので、親が死んでもその親からふ化してきた成虫（Ｆ３世代）が生き残り、このＦ３世代を増加させ、それぞれについてビスフェノールＡに対する感受性を調べ、高感受性変異体を分離した。高感受性変異体のビスフェノールＡに対する感受性試験は、卵からふ化した線虫を各濃度に調製したビスフェノールＡに室温で３時間曝露させ、その生存率を算出した。その結果、変異株は、野生株（Ｎ２）に対し、５倍以上の高感受性を示した（図２参照。）。
【００４５】
実施例３（各変異体の環境化学物質感受性試験）
線虫変異体ｄｐｙ−２（ｅ８）、ｄｐｙ−７（ｅ８８）およびｄｐｙ−１０（ｅ１２８）（米国Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＣ））から入手。）それぞれ１００〜２００匹を環境化学物質であるビスフェノールＡ（０．６ｍＭ溶液）に室温で３時間曝露させた後、生存している変異体を数え、その生存率を算出した。野生株（Ｎ２）についても、同様の条件で感受性試験を行なった。これらの結果を図２に示す。同図によれば、各変異体は、野生株に対し、いずれも約５倍の感受性を示していることがわかる。
【００４６】
実施例４（神経毒性の評価）
ビスフェノールＡの代わりにダイオキシンを用いたこと以外すべて実施例３と同様に処理したところ、変異体にはいずれも痙攣が生じ、体が屈曲し、神経異常が生じていることを把握した。
【００４７】
【発明の効果】
本発明によれば、被検物質の生殖毒性を約８日程度で判定することができるため、従来のマウスを用いる方法に比較して１０倍近い時間の短縮を行なうことができる。また、線虫の飼育には特別の技術を必要とせず、産子数を数えることも容易な作業であり、マウスを用いる場合の特別な実験施設は必要とせず、飼育にかかる手間もマウスに比較して大幅に軽減し、その費用も１００倍以上軽減させることができる。
【００４８】
さらには、被検物質の毒性およびその種類を正確に再現性よく評価することができ、被検物質がある特定の遺伝子を活性化させるか否か判定する前記従来法に比較し毒性評価における信頼性を向上させることができる。
【００４９】
従って、本発明に係る環境化学物質の毒性評価方法は、その簡便性から化学工業会社、石油化学工業会社、薬品工業会社、土壌汚染、河川および海の水質を評価する調査団体等でも容易に採用することができるので、該分野への普及が見込まれ、環境問題の改善に寄与するところが大きい。
【配列表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】アルキルフェノール化合物の種類・濃度の産子数に対する影響を標準株示す図である。
【図２】ｂｉｓ−１変異体ＮＸ３のビスフェノールＡに対する感受性を示す図である。
【図３】線虫変異体ｄｐｙ−２（ｅ８）、ｄｐｙ−７（ｅ８８）およびｄｐｙ−１０（ｅ１２８）のビスフェノールＡ（０．６ｍＭ）に対する各感受性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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