(57)【要約】【課題】エタノールを添加した培地にグルタチオン生産酵母を接種してグルタチオンを製造する方法において、グルタチオン生産酵母を天然培地で培養する際に酵母がみずから生産したグルタチオンを培地に流出できるようにすること【解決手段】天然培地の窒素源としてコラーゲンペプチドを使用する【図面】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタノールを添加した培地にグルタチオン生産酵母を接種してグルタチオンを製造する方法において、窒素源としてコラーゲンペプチドを使用した天然培地に酵母を接種して培養するグルタチオンの製造方法。
【請求項２】
酵母がCandida tropicalis Pk233、Candida tropicalis IFO1400、Candida utilis、Pichia anomalaから選択される請求項１に記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項３】
培地にエタノールを２〜３容積％添加して酵母を接種する請求項１又は２に記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項４】
培地にエタノールを２〜５容積％添加してCandida tropicalis Pk233を接種する請求項１に記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項５】
酵母を震盪培養する請求項１、２、３、又は４に記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載の方法により培養を完了させた後、培地を加熱して酵母から培地内にグルタチオンを排出させるグルタチオンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エタノールを添加した培地にグルタチオン生産酵母を接種してグルタチオンを製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオンは、生体内において、酵素や補酵素としての作用、解毒作用、肝機能強化、放射線障害の防御、細胞膜の維持作用など、種々の生理作用を果たしていることが知られている。
このグルタチオンは酵母、牛の肝臓、羊の脳などに存在しているが、工業的生産方法としては、グルタチオンを多量に含有する酵母を培養し、ここからグルタチオンを抽出する方法が採用されている。
【０００３】
特許文献１は、γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子を導入したグルタチオン高生産酵母に変異処理を行って得たアゼセリン耐性菌を好気培養することによってグルタチオン高含有酵母が得られることを開示している。
また、特許文献２は、乳酸菌発酵下でグルタチオン生産酵母菌を麦芽エキスとグルタミン酸ナトリウムを含有する培地で好気震盪培養することによってグルタチオン生産酵母が大量に生成されることを開示している。
しかしながら、いずれの方法から得た酵母菌であっても、グルタチオンは酵母菌体内に保有されているため、酵母を培地から分離して、例えば特許文献３に開示されている破砕機などを利用して酵母の細胞膜を破壊しなければグルタチオンを得ることはできない不都合がある。
【０００４】
非特許文献１には、酵母の生産したグルタチオンを培地内に流出させる培養技術が開示されている。すなわち、エタノールを添加した合成培地にグルタチオン生産酵母であるCandida
tropicalis Pk233を接種した場合に、菌体が菌糸細胞に変化すると共にエタノールが酵母に働きかけてグルタチオンの流出を促進させ、菌体が生産したグルタチオンを培地内に流出させられることを明らかにしている。
酵母が培地中に生理活性物質を流出させることは極めて有意義なことであるが、グルタチオンの流出先が合成培地であるため、そのまま利用することはできない。複雑な精製方法によってグルタチオンを培地から分離させることを余儀なくされ、工業的な利用を図るためには問題が残されていた。
【０００５】
発明者は、非特許文献１において提案された培養技術を改良し、培地に流出したグルタチオンを精製工程を経ることなくそのまま利用できるようにするための培養方法について研究した。
最初に、表−１に示した公知の天然培地（通称ＹＰＧ培地）を使用し、エタノールを添加しないものと２容積％を添加（以下エタノールの添加量について同じ。）したものについて、グルタチオン生産酵母として知られているCandida
tropicalis Pk233、Candida  tropicalis IFO1400、Candida utilis及びPichia anomalaの四種の酵母を培養した。
（表−１）ＹＰＧ培地１００ml中の組成
ブドウ糖        ５ｇ
ポリペプトン    １ｇ
酵母エキス     0.5ｇ
なお、ブドウ糖及びポリペプトンは和光純薬株式会社製、酵母エキスは武田薬品工業株式会社製のものを使用した。
【０００６】
この培養においては、１００mlのフラスコ内に培地２０mlを注ぎ、培地について各酵母を１０mgドライ／ml接種したものを培地内に０．１ml注ぎ入れ、３０℃で１００時間震盪培養した。その後、この培養液をそのまま遠心分離機に３０００rpm
／１５分かけて得られた上清と、培養液を一旦オートクレープによって１１０℃で１０分間加熱した後遠心分離機に３０００rpm ／１５分かけて得られた加熱上清とについて、グルタチオン量をＤＴＮＢ法によって測定した。
このＤＴＮＢ法は、非特許文献１に記載されているように、グルタチオンレラクターゼとグルタチオンの共存下において、５，５’−ジチィオビス（２ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）がニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ2
）で還元されるとき、その反応速度がグルタチオン存在量に比例することを利用したグルタチオン量の測定方法であり、反応開始後の４１２nmにおける吸収の増加を測定した。
培地中のグルタチオンの生成量は表−２に示した通りであった。
【０００７】
（表−２）ＹＰＧ培地におけるグルタチオンの生成量（単位μg ／ml）
2005245390.tif 000002
【０００８】
上記のＹＰＧ培地では、培地へのグルタチオンの流出が極めて少なく、上清においては、エタノールを添加しないものと２％添加したものとで流出量の差はほとんど認められなかった。
この培地においては、エタノールが酵母自体は大きく増殖せず、タンパク質成分としてのポリペプトンに含まれるイノシトールが酵母の細胞膜を強化してしまうために、エタノールによるグルタチオン流出が抑制されたためと思われる。
また、上清を加熱した場合には、菌体内に滞留しているグルタチオンは加熱しない場合に比べ増加しているが、これは、酵母がその増殖に制限を受けながらもグルタチオンを生産して菌体内に蓄積していたことを意味している。
【０００９】
【特許文献１】特開平６−７０７５２号公報
【特許文献２】特開２００３−１０２４６８公報
【特許文献３】特開平５−２５２８９４号公報
【非特許文献１】聖母女学院短期大学研究紀要第１２集「Candida 酵母による生理活性物質の発酵生産（第２報）−Candida tropicalis Pk233によるグルタチオンの生成」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、エタノールを添加した培地にグルタチオン生産酵母を接種してグルタチオンを製造する方法において、グルタチオン生産酵母を天然培地で培養する際に酵母がみずから生産したグルタチオンを培地に流出できるようにすることを課題としたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この技術的課題を解決するための第一の技術的手段は、天然培地の窒素源としてコラーゲンペプチドを使用すること、である。
天然培地の窒素源となるコラーゲンペプチドは、ゼラチン（コラーゲン）を酵素によって低分子化して高度に精製されたペプチドであり、その中にイノシトールは含有されていないから酵母は細胞膜が強化されることはない。その培地にはエタノールが添加されているから、酵母に働きかけてそれが生産したグルタチオンを細胞膜から排出させることができる。
したがって、酵母はグルタチオンを生産しながらそれを体外へ流出させることになる。このことは、同時に多糖類やタンパク質、ビタミン、ミネラル類も流出させていると推測される。
【発明の効果】
【００１２】
グルタチオン生産酵母を天然培地で培養する際に酵母がみずから生産したグルタチオンを培地に流出させられる結果、酵母の接種と培養を連続させながら培養液を取り出すことができる利点がある。
酵母は、培養中にみずから生産したグルタチオンのみならず、多糖類やタンパク質をも流出するから、菌体を除去した後、そのまま、或いは適宜濃縮したり粉末化したりして食品や医療の原料として利用できる他、培養液に残存するコラーゲンを主体とした食品や化粧品の素材としても活用できる利点もある。
【実施例１】
【００１３】
表−３に示した組成の天然培地にエタノールを添加しないもの及び２、３、４容積％添加したものを用意し、それぞれにグルタチオン生産酵母として知られているCandida
tropicalis Pk233、Candida tropicalis
IFO1400、Candida utilis及びPichia
anomalaの培養を実施した。
１００mlのフラスコ内に培地２０mlを注ぎ、各培地について各酵母を１０mgドライ／ml接種したものを培地内に０．１ml注ぎ入れ、３０℃で１００時間震盪培養させた。
（表−３）天然培地組成（１００ｍｌ中）
ブドウ糖                  ５ｇ
ＫＨ2 ＰＯ4             ４０ｍｇ
ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2 Ｏ      ２０ｍｇ
コラーゲンペプチド        ４ｇ
ビタミンＢ1             １２μｇ
ビタミンＢ2               ５μｇ
ビタミンＢ6             ５０μｇ
ＰＡＢＡ                ２５μｇ
ニコチン酸            ２５０μｇ
パントテン酸Ｃａ        ２５μｇ
ビオチン                  ５μｇ
なお、ブドウ糖は和光純薬株式会社製、コラーゲンペプチドは新田ゼラチン株式会社製、その他はナカライテスク株式会社製である。
【００１４】
培養後、この培養液をそのまま遠心分離機に３０００rpm ／１５分かけ、得られた上清におけるグルタチオンを前記のＤＴＮＢ法によって測定したものを表−４に示した。
表−４における０％及び３％欄における括弧内の数字は増殖した酵母量（単位：mgドライ／ml）を示している。
（表−４）  未加熱上清におけるグルタチオン量（単位μｇ／ml）
2005245390.tif 000003
【００１５】
他方、培養後の培養液をオートクレープによって１１０℃で１０分間加熱し、その後遠心分離機に３０００rpm ／１５分かけ、得られた上清におけるグルタチオンを測定したものを表−５に示した。
（表−５）  加熱上清におけるグルタチオン量（単位μｇ／ml）
2005245390.tif 000004
【００１６】
上記の表−４、５の測定結果は、同一条件で３回行った培養液に対して行った測定の平均値を示している。
表−４においても確認できるように、酵母の培養に際してエタノールを添加すると、酵母の増殖率が大きくなっていないことが理解できる。
測定結果からエタノールを添加することによってグルタチオンが培地へ多量に流出していることを認めることができるが、このことは、酵母の増殖によってグルタチオンが増加するのではなく、酵母は増殖を阻害されながらもグルタチオンを多量に生産しながらその一部を培養液に流出させていたことを意味している。
【００１７】
測定結果から、Candida tropicalis Pk233については、エタノール４％添加時の上清についての測定値が不十分ではあるが、加熱上清におけるグルタチオン量が際立って多いことを容易に理解することができる。
他方、Candida tropicalis IFO1400、Candida utilis及びPichia anomalaについては、上清、加熱上清共にエタノールを３％添加時の生産量がもっとも多く４％添加の場合には、添加しないときとほぼ同じ結果となっている。したがって、これらの三つの酵母については、エタノールを２〜３％添加するのがもっとも望ましいといえる。
【実施例２】
【００１８】
上記の生産量が相違する原因を追求するために酵母の形態の変化を調べたところ、Candida tropicalis
Pk233だけが菌糸型で、他の酵母はいずれも酵母型のものであることが判明した。
そこで、発明者は、実施例１に示した天然培地にエタノールを無添加及び２、３、４、５、６％添加したものを作成し、１００mlのフラスコ内にこの培地２０mlを注ぎ、各培地にCandida
tropicalis Pk233を１０mgドライ／ml接種したものを培地内に０．１ml注ぎ入れ、３０℃で１６０時間震盪培養させた。
実施例１と同様に、３回培養を実施した培養液の上清及び加熱上清を得て測定したグルタチオン量の平均値を表−６に示す。
【００１９】
（表−６）１６０時間培養後のCandida tropicalis Pk233のグルタチオン量
2005245390.tif 000005
【００２０】
上記の測定結果では、酵母量はエタノールの添加量が増加するに伴って減少している。また、グルタチオンの生産量は、上清及び加熱上清のいずれにおいても、エタノールの添加量が６％に増えた段階で急激に低下しており、菌糸型となるCandida
tropicalis Pk233についてはエタノールの添加量を５％にまで増加してもグルタチオンの生産が活発に行われるが、６％になるとエタノールによる阻害作用によって菌体の生存、増殖が限界になると思われる。
なお、エタノールを添加しない場合には、未加熱の上清ではグルタチオン量が少ないため、連続培養には適しない。
【００２１】
実施例１、２は、酵母の培養を完了させた後、培地を加熱した場合に菌体内に残留しているグルタチオンの細胞膜からの流出が促進され、菌体内に保有されていたグルタチオンが多量に培地内に排出されることをも明らかにしている。