(57)【要約】      （修正有）【課題】癌又は炎症性疾患の診断・予防・治療に有効で、しかも副作用のない新規な診断・予防・治療薬などを提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有し、生物細胞のマトリックスメタロプロテイナーゼ分泌に対する選択的抑制機能を有するポリペプチド及び機能同等のポリペプチド。これらを有効成分として含有する癌又は炎症性疾患の診断・予防・治療薬。特定の塩基配列を有し、生物細胞での発現によって生物細胞のＭＭＰ分泌に対する選択的抑制機能を示すポリヌクレオチド及び機能同等のポリヌクレオチド。これらを組み込んで構築された癌又は炎症性疾患の診断・予防・治療用ベクター。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、生物細胞のマトリックスメタロプロテイナーゼ分泌に対する選択的抑制機能を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有すると共に転写因子Ｂ−ＡＴＦ活性を示し、生物細胞のマトリックスメタロプロテイナーゼ分泌に対する選択的抑制機能を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
配列表の配列番号２に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有すると共に、転写因子Ｂ−ＡＴＦ活性を示し、生物細胞のマトリックスメタロプロテイナーゼ分泌に対する選択的抑制機能を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれかに係るポリペプチドを有効成分として含有し、癌又は炎症性疾患の診断・予防又は治療に用いられることを特徴とする疾患の診断・予防・治療薬。
【請求項５】
前記疾患の診断・予防・治療薬の効果が、生物細胞のマトリックスメタロプロテイナーゼ分泌に対する選択的抑制による、癌細胞の浸潤転移の防止、癌組織での血管新生の防止又は炎症性疾患に伴う組織破壊の防止に基づくものであることを特徴とする請求項４に記載の疾患の診断・予防・治療薬。
【請求項６】
配列表の配列番号２に示す塩基配列を有し、生物細胞での発現によって生物細胞のマトリックスメタロプロテイナーゼ分泌に対する選択的抑制機能を示すことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列表の配列番号２に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、転写因子Ｂ−ＡＴＦ活性を示すポリペプチドをコードし、生物細胞での発現によって生物細胞のマトリックスメタロプロテイナーゼ分泌に対する選択的抑制機能を示すことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項６又は請求項７に係るポリヌクレオチドを組み込んで構築され、癌又は炎症性疾患の診断・予防又は治療に用いられることを特徴とする疾患の診断・予防・治療用ベクター。
【請求項９】
前記疾患の診断・予防・治療用ベクターの効果が、前記ポリヌクレオチドの生物細胞での発現による転写因子Ｂ−ＡＴＦ活性を有するポリペプチドの産生を通じてのマトリックスメタロプロテイナーゼ分泌に対する選択的抑制による、癌細胞の浸潤転移の防止、癌組織での血管新生の防止又は炎症性疾患に伴う組織破壊の防止に基づくものであることを特徴とする請求項８に記載の疾患の診断・予防・治療用ベクター。
【請求項１０】
センス鎖としての請求項６又は請求項７に係るポリヌクレオチドに対するアンチセンス鎖たる塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０に係るポリヌクレオチドを組み込んで構築され、癌又は炎症性疾患の診断・予防又は治療に用いられることを特徴とする疾患の診断・予防・治療用ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド、疾患の診断・予防・治療薬、ポリヌクレオチド及び疾患の診断・予防・治療用ベクターに関する。更に詳しくは、本発明は、公知の転写因子であるＢ−ＡＴＦ（ Activating Transcription Factor B）について本願発明者が新規に見出した生体機能に基づき着想された、癌又は炎症性疾患の診断・予防・治療に有効でしかも副作用のないポリペプチド、疾患の診断・予防・治療薬、ポリヌクレオチド及び疾患の診断・予防・治療用ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
（転写因子ＡＰ−１について）
細胞の癌化のメカニズムに関して、近年、細胞質内シグナル伝達系による転写制御因子の調節機能、とりわけリン酸化シグナルによる転写因子の制御が重要視されている。
【０００３】
細胞膜受容体からのシグナル伝達により活性化される代表的なキナーゼ系としては、Ａ−キナーゼ系、Ｃ−キナーゼ系、ＭＡＰキナーゼ系等が例示されるが、これらのシグナル伝達系はいずれも、上流から下流へと順次に各種のキナーゼを活性化又は不活性化することでリン酸化シグナルをリレーする。このリン酸化シグナルのリレーの過程において、キナーゼの基質の種類や量によってシグナルが増幅されたり、減弱されたりする。最終的には、細胞質あるいは核内に局在する転写制御因子をリン酸化することにより、転写制御因子の機能が調節される。このようなリン酸化シグナルによる転写因子の制御が、癌化のメカニズムと密接に関係していると考えられている。
【０００４】
核内で転写制御因子がリン酸化されることによりＤＮＡ結合能が調節される例として、転写因子ＡＰ−１（Activating Protein-1）が良く知られている。ＡＰ−１は、ＤＮＡ上のエンハンサーの特定配列に結合する因子として発見された。その後、ＡＰ−１が Jun、Fos と言う核内癌遺伝子産物を含み、これらの二量体として存在することが明らかになった。 Junは、 c-Jun、 Jun-D、 Jun-B等のファミリーを形成する。Fos は c-Fos、 Fra-1、 Fra-2等のファミリーを形成する。これらはいずれもロイシンジッパー構造を持ち、これらがホモ二量体又はヘテロ二量体を形成して、特定の塩基性アミノ酸領域でＤＮＡの特定配列に結合し、転写活性を制御している。
【０００５】
【非特許文献１】Eitan Shaulian and Michael Karin. AP-1 in cellproliferation and survival. Oncogene. 2001 Apr. 30;20(19):2390-400.Review.  この非特許文献１には、上記したようなＡＰ−１に関連する知見が、網羅的に解説されている。
【０００６】
（転写因子Ｂ−ＡＴＦについて）
ヒトのＢ−ＡＴＦは、造血系細胞において高い発現量で存在し、転写因子ＡＰ−１／ＡＴＦスーパーファミリーに属するロイシンジッパータンパク質である。又、Ｂ−ＡＴＦは in vitro 及び in vivoにおいて転写因子 Junファミリーのタンパク質と二量体を形成する。この二量体は、ＤＮＡに存在する転写因子結合モチーフの一種であるＴＲＥ（ＴＰＡ応答配列）とＣＲＥ（サイクリックＡＭＰ応答配列）に結合することが知られている。
【０００７】
【非特許文献２】Dorsey M. J., Tae H. J., Sollenberger K. G.,Mascarenhas N. T., Johansen L. M., Taparowsky E. J., B-ATF: a novelhuman bZIP protein that associates with member of the AP-1transcription factor family. Oncogene. 1995 Dec. 7;11(11):2255-65
【非特許文献３】Senga T., Iwamoto T., Humphery S. E., Yokota T.,Taparowsky E. J., Hamaguchi M., Stat3-dependent induction of BATF inmouse myeloid leukemia cells. Oncogene. 2002 Nov. 21;21(53):8186-91  上記の非特許文献２や非特許文献３には、ヒトのＢ−ＡＴＦが、染色体に組み込んで安定的に発現させても、細胞生存率（ Cell viability ）に影響しないが、細胞の増殖を抑制すると言う特性を示すことが報告されている。
【０００８】
（酵素ＭＭＰについて）
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）に共通する一般的な生体機能として、IV型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、変性コラーゲン等の細胞外マトリックスタンパク質を分解することが知られている。従って、細胞外マトリックスタンパク質の分解と関連する種々の疾患や症状（例えば、癌組織での血管新生、癌細胞の浸潤転移、組織破壊を伴う炎症性疾患等）とＭＭＰとの関連が種々報告されている。
【０００９】
又、ＭＭＰファミリーの酵素には４つの大きなグループとこれらに属するサブタイプが存在する。これらは、共通の１次構造を持ち、活性部位に亜鉛イオンの結合サイトがあり、活性のために２価のカルシウムイオンを必要とする、等の共通の特徴を持つ。
【００１０】
ＭＭＰ遺伝子の発現は誘導型と恒常型とに大きく分けられ、誘導型はＴＰＡや炎症性サイトカイン、増殖因子等で誘導され、主としてマクロファージ、好中球、活膜細胞等で産生される。恒常型は主として繊維芽細胞で産生される。一般的にＭＭＰ遺伝子はそのプロモーター部分に作用する転写因子により発現の制御が行われており、例えば誘導型のプロモーター領域には、増殖因子によって活性化される転写因子ＥＴＳ（レトロウイルスＥ２６から見出されたガン遺伝子産物）の結合部位や、これにより活性化される転写因子ＡＰ−１の結合部位である前記ＴＲＥが存在する。
【００１１】
【非特許文献４】Liotta L. A., Stetler-Stevenson W. G.,Metalloproteinases and cancer invasion. Semin. Cnncer Biol., 1:99-106,1990  上記の非特許文献４には、癌細胞の浸潤にＭＭＰが重要な役割を担うことが記載されている。
【００１２】
【非特許文献５】Liotta L. A., Steeg P. S., Stetler-StevensonW. G., Cancer Metastasis and angiogenesis: an imbalance of positiveand negative regulation. Cell. 1991 Jan. 25;64(2):327-36  上記の非特許文献５には、ＭＭＰに関連して、癌の浸潤、転移について記載されている。
【００１３】
【非特許文献６】Weinder N., Carrol P. R., Flax J., Blumenfeld W.,Folkman J., Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasiscarcinoma. Am. J. Pathol., 143: 401-409, 1993  上記の非特許文献６には、腫瘍の成長と浸潤には血管新生が必要である旨が記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
以上の知見から、一般論としては、ＭＭＰの発現は上記した細胞内シグナル伝達により活性化又は抑制され、特に細胞の癌化等によりシグナル系が亢進した場合に、ＭＭＰの過剰発現と過剰分泌が起こって癌の浸潤、転移を引き起こすであろうことが示唆される。
【００１５】
しかしながら、より具体的に論ずれば、現在までに既知である各種のＭＭＰｓについて、個々の遺伝子の制御配列部の内容は解明が不十分であって、かつ解明された範囲内でも互いに大きく相違している（図１参照）。そして、これらの遺伝子の発現を制御する因子、その制御の内容、遺伝子の発現によって生物細胞に生じる具体的影響等についての具体的な理解は、極めて不十分である。
【００１６】
例えば、発現が誘導型であるＭＭＰ遺伝子（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９等）については、ＡＰ−１依存性に発現が抑制される、とする報告がある一方で、発現が恒常型であるＭＭＰ遺伝子（例えば、ＭＭＰ−２）については明確に特定された発現制御因子は存在しない。更に、癌や炎症性疾患の予防や治療の見地からは、結果としてＭＭＰの細胞外分泌の抑制が必要なのであるが、そのために重要なのは細胞内でのＭＭＰの発現制御なのか、ＭＭＰの細胞外分泌の制御なのか、と言う点にも議論があり、十分に解明されていない。
【００１７】
又、癌や炎症性疾患の診断・予防・治療等の見地からは、多種類のＭＭＰｓの内でもＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９が特に重要視されている。なぜなら、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９は癌組織で高発現し、かつ癌の浸潤・転移に重要な役割を果たすことが知られているからである。そして、この２種類のＭＭＰについて、それらの遺伝子の発現を制御する因子や、当該因子による制御の内容（発現の促進、抑制等）等も必ずしも明確ではない。もち論、これらの２種類の遺伝子の発現を同時に制御（特に、抑制）できる因子は知られていない。
【００１８】
本願発明者は、ＳＴＡＴ−３によって発現する遺伝子をｃＤＮＡサブトラクションで調べる過程で、Ｂ−ＡＴＦ遺伝子が高率に発現していることを知り、このＢ−ＡＴＦに着目した。そして、多くのＭＭＰ遺伝子のプロモーター部分には転写因子ＡＰ−１の結合部位が存在する点、Ｂ−ＡＴＦを含むＡＰ−１ファミリータンパク質の二量体が転写因子結合モチーフに結合する点、及び、ＡＰ−１がＭＭＰ分泌における特異的なシグナル伝達系である Ras-MAPK Pathway の下流に存在する点を総合的に勘案して、Ｂ−ＡＴＦとＭＭＰ遺伝子の発現との関係に注目した。更に、Ｂ−ＡＴＦ遺伝子を染色体に組み込んで安定的に発現させても、細胞生存率に影響しないが、細胞の増殖を抑制すると言う特性にも留意した。
【００１９】
そこで、Ｂ−ＡＴＦをＭＭＴＶ−ＬＴＲの支配下に、デキサメサゾンで発現を制御できる系を構築し、この系を用いてｖ−Ｃｒｋ癌化細胞にＢ−ＡＴＦを発現した。その結果、第１に、ｖ−Ｃｒｋ癌化細胞による活性化ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の分泌が正常細胞に比較して著しく抑制されていることを確認した。第２に、癌細胞内のＣｒｋの発現、ＭＡＰキナーゼの活性化及び細胞タンパク質のチロシンリン酸化は、Ｂ−ＡＴＦの発現によって何ら影響を受けていないこと（ＡＰ−１レベルでＭＭＰの分泌抑制が起きていること）を確認した。第３に、Ｂ−ＡＴＦは癌細胞の浸潤を抑制することを確認した。
【００２０】
これらはラット細胞を用いた実験で得られた結果であるが、技術常識として、同じ哺乳動物であるヒト細胞においても高い蓋然性を以て同様の結果を得られるであろう、と考えられる。本願発明者はこれらの新規な知見に基づき本願発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、生物細胞のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）分泌に対する選択的抑制機能を有する、ポリペプチドである。
【００２２】
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有すると共に転写因子Ｂ−ＡＴＦ活性を示し、生物細胞のＭＭＰ分泌に対する選択的抑制機能を有する、ポリペプチドである。
【００２３】
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、配列表の配列番号２に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有すると共に、転写因子Ｂ−ＡＴＦ活性を示し、生物細胞のＭＭＰ分泌に対する選択的抑制機能を有する、ポリペプチドである。
【００２４】
本願の各発明において、「ポリヌクレオチド」とは、１本鎖又は２本鎖のポリヌクレオチドを言い、かつＤＮＡ、ＲＮＡあるいはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を包含する。
【００２５】
又、第３発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等の適宜なハイブリダイゼーション法において、以下の条件で一方のポリヌクレオチドに対して他方のポリヌクレオチドがハイブリダイズできることを言う。
【００２６】
即ち、フィルターに固定化された一方のポリヌクレオチドに対し、０．７〜１モルのＮａＣｌの存在下、Ｘ°Ｃと言う所定温度のもとで他方のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１５ｍＭのクエン酸ナトリウムよりなる）を用いてＸ°Ｃの条件下でフィルターを洗浄した場合に、他方のポリヌクレオチドを同定できることを言う。そして、上記の「Ｘ°Ｃ」とは、少なくとも５０°Ｃ以上であり、より好ましくは６０°Ｃ以上であり、更に好ましくは６５°Ｃ以上である。
【００２７】
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、第１発明〜第３発明のいずれかに係るポリペプチドを有効成分として含有し、癌又は炎症性疾患の診断・予防又は治療に用いられる、疾患の診断・予防・治療薬である。
【００２８】
ここにおいて、「疾患の診断・予防・治療薬」には、癌又は炎症性疾患の診断・予防・治療を直接の目的として用いるものの他、これらの疾患の診断・予防・治療の研究のために試薬として用いるものも含まれる。
【００２９】
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、前記第４発明に係る疾患の診断・予防・治療薬の効果が、生物細胞のＭＭＰ分泌に対する選択的抑制による、癌細胞の浸潤転移の防止、癌組織での血管新生の防止又は炎症性疾患に伴う組織破壊の防止に基づくものである、疾患の診断・予防・治療薬である。
【００３０】
（第６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、配列表の配列番号２に示す塩基配列を有し、生物細胞での発現によって生物細胞のＭＭＰ分泌に対する選択的抑制機能を示す、ポリヌクレオチドである。
【００３１】
（第７発明の構成）
上記課題を解決するための本願第７発明の構成は、配列表の配列番号２に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、転写因子Ｂ−ＡＴＦ活性を示すポリペプチドをコードし、生物細胞での発現によって生物細胞のＭＭＰ分泌に対する選択的抑制機能を示す、ポリヌクレオチドである。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」の意味は、第３発明の場合と同一である。
【００３２】
（第８発明の構成）
上記課題を解決するための本願第８発明の構成は、第６発明又は第７発明に係るポリヌクレオチドを組み込んで構築され、癌又は炎症性疾患の診断・予防又は治療に用いられる、疾患の診断・予防・治療用ベクターである。
【００３３】
（第９発明の構成）
上記課題を解決するための本願第９発明の構成は、前記第８発明に係る疾患の診断・予防・治療用ベクターの効果が、前記ポリヌクレオチドの生物細胞での発現による転写因子Ｂ−ＡＴＦ活性を有するポリペプチドの産生を通じてのＭＭＰ分泌に対する選択的抑制による、癌細胞の浸潤転移の防止、癌組織での血管新生の防止又は炎症性疾患に伴う組織破壊の防止に基づくものである、疾患の診断・予防・治療用ベクターである。
【００３４】
（第１０発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１０発明の構成は、センス鎖としての第６発明又は第７発明に係るポリヌクレオチドに対するアンチセンス鎖たる塩基配列を有する、ポリヌクレオチドである。
【００３５】
（第１１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１１発明の構成は、第１０発明に係るポリヌクレオチドを組み込んで構築され、癌又は炎症性疾患の診断・予防又は治療に用いられる、疾患の診断・予防・治療用ベクターである。
【発明の効果】
【００３６】
（第１発明の効果）
第１発明のポリペプチドは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、ヒトの転写因子Ｂ−ＡＴＦとして公知のポリペプチドである。本願発明者は、この転写因子Ｂ−ＡＴＦが転写因子ＡＰ−１に対してドミナントネガティブに働くものであり、ヒト細胞の核内においてＭＭＰの転写活性を抑制する点については直接に確認していないが、少なくとも、癌細胞を包含するヒト細胞によるＭＭＰの分泌を著しく抑制することを究明した。具体的には、実施例において後述するように、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９について、これらのことを確認している。
【００３７】
従って第１発明のポリペプチドは、細胞からのＭＭＰ過剰分泌による細胞外マトリックスタンパク質の分解を有効に抑制できる。そしてその結果、癌の成長に必要な血管新生を抑制でき、癌細胞の浸潤転移を抑制でき、更に炎症性疾患に伴う組織破壊を抑制できる。即ち、第１発明のポリペプチドは、癌又は炎症性疾患の予防・治療薬として有用である。これらの効果は、細胞からのＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の分泌を同時に抑制できることによって、特に著しい。
【００３８】
又、本願発明者は、Ｂ−ＡＴＦの発現が、癌細胞内のＣｒｋの発現、ＭＡＰキナーゼの活性化、チロシンリン酸化等に何らの影響を与えないこと、即ち、Ｂ−ＡＴＦはＡＰ−１レベルで作用してＭＭＰの分泌を選択的に抑制することを知った。このため第１発明のポリペプチドは、細胞あるいは生物体に対する予測外の好ましくない作用を伴う恐れが少ない。
【００３９】
以上の効果は本願発明者の研究によって初めて明確にされたものである。従来、Ｂ−ＡＴＦが上記の効果を有することが開示あるいは示唆されたことはなく、又、前記した各種の公知文献における知見からこれらの効果を予測することは、当業者においても困難なことである。
【００４０】
更に、この点は公知ではあるが、Ｂ−ＡＴＦは元々ヒトの体内に存在するポリペプチドであり、染色体に組み込んで安定的に発現させても、細胞生存率に影響せず細胞の増殖を抑制すると言う特性が知られている。このため、第１発明のポリペプチドは細胞あるいは生物体に対して無害であると考えられる。
【００４１】
（第２発明の効果）
第２発明に係るポリペプチド群は、第１発明に係るポリペプチドと同等の機能を有するため、第１発明に係るポリペプチドと同等の種々の効果を期待することができる。
【００４２】
（第３発明の効果）
第３発明に係るポリペプチド群も、第１発明に係るポリペプチドと同等の機能を有するため、第１発明に係るポリペプチドと同等の種々の効果を期待することができる。
【００４３】
（第４発明の効果）
第４発明の疾患の診断・予防・治療薬は、第１発明〜第３発明のいずれかに係るポリペプチドを有効成分として含有するので、癌又は炎症性疾患の診断・予防・治療や、これらの疾患の研究のために有効に利用することができる。
【００４４】
（第５発明の効果）
第５発明の疾患の診断・予防・治療薬は、生物細胞のＭＭＰ分泌に対する選択的抑制による、癌組織の血管新生の防止、癌細胞の浸潤転移の防止、又は炎症性疾患に伴う組織破壊の防止に基づく効果を発揮するので、その効果及び用途が、より明確である。
【００４５】
（第６発明の効果）
第６発明のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号２に示す塩基配列を有し、ヒトの転写因子Ｂ−ＡＴＦをコードする遺伝子として公知のポリヌクレオチドである。本願発明者は、このＢ−ＡＴＦ遺伝子をヒト細胞内で発現させると、その発現産物が転写因子ＡＰ−１に対してドミナントネガティブに働き、ヒト細胞の核内においてＭＭＰの転写活性を抑制することについては直接に確認していないが、少なくとも、癌細胞を包含するヒト細胞によるＭＭＰの分泌を著しく抑制することを知った。
【００４６】
従って第６発明のポリヌクレオチドを生体内（細胞内）で発現させると、細胞からのＭＭＰ過剰分泌による細胞外マトリックスタンパク質の分解を有効に抑制できる。その結果、癌の成長に必要な血管新生を抑制でき、癌細胞の浸潤転移を抑制でき、更に、炎症性疾患に伴う組織破壊を抑制できる。即ち、第６発明のポリヌクレオチドは、これをベクターに組み込むことにより、癌又は炎症性疾患の診断・予防・治療用ベクターとして有効に利用できる。
【００４７】
又、第１発明の場合と同様に、Ｂ−ＡＴＦ遺伝子の発現が、癌細胞内のＣｒｋの発現、ＭＡＰキナーゼの活性化、チロシンリン酸化等に何らの影響を与えないことから、ＭＭＰの分泌を選択的に抑制することができ、換言すれば、癌又は炎症性疾患の診断・予防・治療用ベクターとして用いた際の副作用が少ない。
【００４８】
第１発明の場合と同様に、Ｂ−ＡＴＦ遺伝子についての公知の知見のみから上記の種々の効果を予測することは、当業者においても困難なことである。
【００４９】
（第７発明の効果）
第７発明に係るポリヌクレオチド群は、第６発明に係るポリヌクレオチドと同等の遺伝子機能を有するため、第６発明に係るポリヌクレオチドと同等の種々の効果を期待することができる。
【００５０】
（第８発明の効果）
第８発明の疾患予防・治療用ベクターは、第７発明又は第８発明に係るポリヌクレオチドを組み込んで構築されているので、癌又は炎症性疾患の診断・予防・治療に有効であり、更に、これらの疾患の研究のために有効に利用することができる。
【００５１】
（第９発明の効果）
第９発明の疾患予防・治療用ベクターは、生物細胞のＭＭＰ分泌に対する選択的抑制による、癌組織の血管新生の防止、癌細胞の浸潤転移の防止、又は炎症性疾患に伴う組織破壊の防止に基づく効果を発揮するので、その効果及び用途がより明確である。
【００５２】
（第１０発明の効果）
第１０発明のポリヌクレオチドは、第６発明又は第７発明に係るポリヌクレオチドに対するアンチセンス鎖であるため、例えばハイブリダイゼーションの利用等の、この種のアンチセンス鎖に適用される種々の使用方法を通じて、癌又は炎症性疾患の診断・予防・治療あるいは研究に有効に利用することができる。
【００５３】
（第１１発明の効果）
第１１発明の疾患の診断・予防・治療用ベクターは、例えば生物細胞への導入及びハイブリダイゼーションの利用等の、この種のアンチセンス鎖を含む診断・予防・治療用ベクターに適用される種々の使用方法を通じて、癌又は炎症性疾患の診断・予防・治療あるいは研究に有効に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
次に、本願の第１発明〜第１１発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。以下において単に「本発明」と言う時は、本願各発明を一括して指している。
【００５５】
〔ポリペプチド〕
本発明に係るポリペプチドの最も代表的なものは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、生物細胞のＭＭＰ分泌に対する選択的抑制機能を有するポリペプチドである。このポリペプチドは、ヒトの転写因子Ｂ−ＡＴＦとして本願の出願前に公知のポリペプチドであったが、今般、本願発明者によって、生物細胞のＭＭＰ分泌（特に、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の分泌）に対する選択的抑制機能を有することに基づき、癌又は炎症性疾患の診断・予防・治療薬として有用であることが見出された。
【００５６】
本発明に係るポリペプチドの他の例は、前記第２発明に示すように、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有すると共に転写因子Ｂ−ＡＴＦ活性を示し、生物細胞のＭＭＰ分泌（特に、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の分泌）に対する選択的抑制機能を有するポリペプチドである。
【００５７】
本発明に係るポリペプチドの更に他の例は、前記第３発明に示すように、配列表の配列番号２に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有すると共に、転写因子Ｂ−ＡＴＦ活性を示し、生物細胞のＭＭＰ分泌（特に、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の分泌）に対する選択的抑制機能を有するポリペプチドである。
【００５８】
上記のような第２発明又は第３発明に示すポリペプチド（Ｂ−ＡＴＦのアミノ酸配列変異体）は、天然において突然変異や翻訳後の修飾等により生ずることがある。又、当業者にとって、このようなアミノ酸配列変異体を遺伝子工学的手段や化学的手段により任意にかつ種々に作成することは、操作の煩雑さは別として、理論的には容易なことである。
【００５９】
〔疾患の診断・予防・治療薬〕
本発明の疾患の診断・予防・治療薬は、上記いずれかのポリペプチドを有効成分として含有し、癌又は炎症性疾患の診断・予防又は治療に用いられる。
【００６０】
本発明の疾患の診断・予防・治療薬は、任意の製造方法に基づき、使用目的に合致した任意の剤型（散剤、カプセル剤、溶液、懸濁剤等）において提供できる。そして、有効成分たるポリペプチドの医薬的に許容される各種の塩を含有することもでき、これらの有効成分を適当な無毒性の医薬担体ないし希釈剤（例えば、充填剤、増量剤、結合剤等）と共に含有しても良く、更に、タンパク質製剤に使用されることがある各種の成分、例えば、安定化剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤等を含有することもできる。
【００６１】
又、疾患の診断・予防・治療薬の投与の方法／形態としては、患部局所への投与、注射、点滴静脈注射等を挙げることができる。
【００６２】
〔ポリヌクレオチド〕
本発明に係るポリヌクレオチドの最も代表的なものは、配列表の配列番号２に示す塩基配列を有し、生物細胞での発現によって生物細胞のＭＭＰ分泌（特に、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の分泌）に対する選択的抑制機能を示すポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは、ヒトの転写因子Ｂ−ＡＴＦの遺伝子として本願の出願前に公知であったが、今般、本願発明者によって、この遺伝子を生物細胞で発現した場合には、細胞のＭＭＰ分泌に対する選択的抑制機能を有することに基づき、癌又は炎症性疾患の診断・予防・治療に有用であることが見出された。
【００６３】
本発明に係るポリヌクレオチドの他の例は、前記第７発明に示すように、配列表の配列番号２に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、転写因子Ｂ−ＡＴＦ活性を示すポリペプチドをコードし、生物細胞での発現によって生物細胞のＭＭＰ分泌（特に、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の分泌）に対する選択的抑制機能を示すポリヌクレオチドである。
【００６４】
上記のような第７発明に示すポリヌクレオチドは、天然において突然変異等により生ずることがある。又、当業者にとって、このようなポリヌクレオチドを遺伝子工学的手段や化学的手段により任意にかつ種々に作成することは、操作の煩雑さは別として、理論的には容易なことである。
【００６５】
上記各種の本発明に係るポリヌクレオチドは、下記の疾患予防・治療用ベクターとして利用する場合の他、ヒトに対して、次のような形態で使用することができる。即ち、ポリヌクレオチド単独で又はリポゾームに包埋し、患部局所又はその近辺へ投与したり、あるいは点滴静脈注射することができる。
【００６６】
〔疾患の診断・予防・治療用ベクター〕
本発明の疾患の診断・予防・治療用ベクターは、上記いずれかのポリヌクレオチドを組み込んで構築され、癌又は炎症性疾患の診断・予防・治療あるいは研究に用いられるものである。
【００６７】
この疾患の診断・予防・治療用ベクターにおいて、Ｂ−ＡＴＦ遺伝子たるポリヌクレオチドは、場合によっては、他の任意の機能を持つ遺伝子と連結した状態で組み込むことができる。又、Ｂ−ＡＴＦ遺伝子たるポリヌクレオチドは、通常、その発現を強化するための他のポリヌクレオチド断片と連結されていることが、より好ましい。このような発現ベクターは、転写プロモーター、転写ターミネーター、エンハンサー、実験又は研究の目的で宿主に使用する場合における組み換え体選抜用のマーカー遺伝子等を含み得る。ベクターの構築方法は特段に限定されず、例えば、ＰＣＲ法等で調製したＢ−ＡＴＦ遺伝子断片を、適当な制限酵素とリガーゼを用いる既知の方法でベクターに組み込むことができる。
【００６８】
疾患予防・治療用ベクターの用途あるいは使用方法としては、ベクター単独で又はリポゾームに包埋し、患部局所又はその近辺へ投与したり、あるいは点滴静脈注射することができる。
【実施例】
【００６９】
〔実施例１：B-ATF の導入〕
（B-ATF 発現制御系の構築）
配列番号２に示す塩基配列を有するヒトB-ATF 遺伝子を細胞内に導入するに当たり、B-ATF 遺伝子を、MMTV-LTRプロモーターの支配下にデキサメサゾンで発現を制御できる系を構築した。
【００７０】
即ち、まず、ベクターに導入するB-ATF 遺伝子としてHA（ヘマグルチニンＡ）エピトープタグを融合させたものと、 Myc〔由来 c-Myc（410-419 ）〕エピトープタグを融合させたものとの、２種類のDNA を用意した。
【００７１】
又、遺伝子導入用のベクターとして、抗生物質ブラスティシジンＳに対して抵抗性のベクターであるPMAM2-BSD （科研製薬社製）を用いた。このPMAM2-BSD は、MMTV-LTRプロモーター及びRSV 遺伝子を含むため、発現する真核生物の幅が広く、又、デキサメサゾンの存在下にMMTV-LTRが活性化して下流域の転写が行われるため、遺伝子発現の強制等の調整が容易である。更に、ブラスティシジンＳは、原核細胞から真核細胞まで広くタンパク質合成を阻害する。
【００７２】
（B-ATF 遺伝子の細胞内導入）
ラットの繊維芽細胞である3Y1 を癌遺伝子v-crk でトランスフォームして、癌化細胞 v-Crk3Y1 を作製し、これを培養しておいた。一方、上記により用意した２種類のタグ付きのB-ATF 遺伝子を、それぞれ図２に示すようにPMAM2-BSD ベクターに導入した。これらの遺伝子を導入したベクターを、タグされたエピトープの種類によって、PMAM2-BSD HA B-ATF及び PMAM2-BSD Myc B-ATFと呼び分ける。次にこれら２種類の遺伝子を導入したベクターを、それぞれ培養細胞 v-Crk3Y1
にトランスフェクトした。これらの感染細胞を、導入されたベクターの種類によって、それぞれ v-Crk HA B-ATF 及び v-Crk Myc B-ATFと呼び分ける。
【００７３】
続いて、ブラスティシジンＳを用いたドラッグセレクションにより、上記の２種類の細胞、即ち v-Crk HA B-ATF 及び v-Crk Myc B-ATFのコロニーをそれぞれ数十個選抜して、これらのコロニーの細胞のデキサメサゾン刺激下でのB-ATF の発現をウエスタンブロッティングにより確認した。
【００７４】
図３に、B-ATF 抗体の使用によりそれぞれの選抜細胞（ Clone１〜Clone ４）におけるB-ATF の発現を確認した結果を示す。なお、対照として、B-ATF 遺伝子をトランスフェクトしていない v-Crk3Y1 細胞も用いた。被検細胞には、１２時間ごとに２回のデキサメサゾン（２μＭ）による刺激を行ったもの（図３における「＋」の表記）と、このような刺激を行っていないもの（図３における「−」の表記）とがある。刺激後、これらの細胞は可溶化し、ウエスタンブロッティングの後にB-ATF 抗体による免疫染色を行い、B-ATF を検出した。
【００７５】
B-ATF は１２５個のアミノ酸からなる核タンパク質であり、これを HA エピトープでタグした場合の分子量は約１０キロダルトン、Myc エピトープでタグした場合の分子量は約２０キロダルトン弱である。図３のように、エピトープタグ付きのB-ATF 遺伝子をトランスフェクトした各クローンの細胞において、該当する分子量のところにバンドの出現( B-ATF の発現) を確認した。なお、該当するバンドがそれぞれ２本ずつ認められるが、これはリン酸化の差によるものであると考えている。この結果から、B-ATF 遺伝子を導入したベクターPMAM2-BSD-B-ATF
におけるデキサメサゾンによる刺激は、確実にB-ATF の発現を誘導できることが分かった。
【００７６】
〔実施例２：B-ATF によるAP-1レポーター遺伝子の転写阻害〕
転写因子AP-1は、Jun/Fos のヘテロ二量体からなり、発がんプロモーターTPA
誘導性遺伝子の上流制御領域 TREに結合して機能する因子である。一方、B-ATF
は転写因子Jun ファミリーのタンパク質と二量体を形成し、転写因子結合モチーフの一種TRE とCRE に結合する。そこで、Jun/Fos 二量体のAP-1に対し、B-ATF
がJun と結合してその活性を拮抗阻害するか否かを確認することとした。
【００７７】
前記の２種類の細胞 v-Crk HA B-ATF 及び v-Crk Myc B-ATFの、それぞれ数個の代表的なクローンを選別した。そしてこれらの細胞においてB-ATF を強制的に発現させ、実際にB-ATF がAP-1の転写因子阻害に影響を及ぼすか否かをデュアルルシフェラーゼアッセイにより検討した。
【００７８】
即ち、 TRE（ 12-O-tetradecanolyphorbol-13-acetate-response element）領域をレポーター遺伝子として、上記２種類の細胞にプラスミドを導入した。又、内部標準活性として、pRL-TKベクターを、上記２種類の細胞に対して、上記のコントロールレポーターベクターと共にコトランスフェクションした。
【００７９】
なお、上記のpRL-TKベクターにはウミシイタケルシフェラーゼ（Rluc）をコードする cDNA が組み込まれており、その上流に単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSV-TK）プロモーター領域が組み込まれている。HSV-TKプロモーターは、胚及び成熟哺乳動物組織細胞のいずれにおいても、低レベルの安定的な発現を誘導する。
【００８０】
プロモーター活性により転写され、産生されるホタルルシフェラーゼ（その遺伝子は試験用レポーターベクターに含まる）とウミシイタケシフェラーゼ（その遺伝子はpRL-TKコレポーターベクターに含まれる）のそれぞれの蛍光強度を測定し、それぞれの細胞におけるB-ATF の転写活性阻害を蛍光強度の減少により評価した。
【００８１】
評価の結果を図４に示す。図４のグラフにおいて、縦軸には蛍光強度を示すが、この蛍光強度は、レポータープラスミドから産生されるホタルルシフェラーゼの蛍光強度から、内部標準活性として測定されるウミシイタケシフェラーゼの蛍光強度を差し引いた値であり、即ち、細胞間におけるトランスフェクション効率の違いによって生じるであろう蛍光強度の誤差を訂正した値になっている。又、 Clone１〜Clone ４の各欄での「＋」、「−」の区別の意味は図３の場合と同様である。
【００８２】
〔実施例３：AP-1転写活性阻害の MMP分泌への影響〕
実施例２の結果から、B-ATF によるAP-1遺伝子の転写活性の阻害が確認されたので、次に、B-ATF による細胞内での MMP産生量の減少又はその細胞外への分泌量の減少を検討した。
【００８３】
即ち、２種類の細胞 v-Crk HA B-ATF 及び v-Crk Myc B-ATFに対してそれぞれ、１２時間ごとに２回のデキサメサゾン（２μＭ）による刺激を行い、 B-ATFを強制発現させた。そして、細胞の培養上清（Condition Medium）中の MMPの活性をゼラチンザイモグラフィーにより求め、AP-1転写活性阻害の MMP分泌への影響を検討した。その結果を図５に示す。一方で、第１対照として、B-ATF 遺伝子をトランスフェクトしていないが v-crkにより癌化させた3Y1 細胞（v-Crk3Y1）、第２対照として、B-ATF 遺伝子をトランスフェクトせず、かつ v-crkにより癌化させていない細胞（3Y1 ）にも同様のデキサメサゾンによる刺激を行い、同様のゼラチンザイモグラフィーを行った。なお、図５において、「＋」、「−」の区別の意味は図３の場合と同様である。
【００８４】
図５より明らかなように、Clone １〜Clone ４に係るv-Crk HA B-ATF細胞及び v-Crk Myc B-ATF細胞において、デキサメサゾンの刺激によりB-ATF を強制発現させた「＋」の細胞は、B-ATF が発現していないコントロールの「−」の細胞に比較して、 MMP-9（分子量約９２キロダルトン）の分泌活性が著しく抑制されていることが分かる。更に注目すべきことに MMP-2（分子量約７２キロダルトン）の分泌も同時に抑制されていることが明らかになった。
【００８５】
公知の知見によれば、AP-1による MMP分泌の制御はプロモーターにTRE 領域を持つ MMP（例えば、 MMP-9）に対して特異的なものであり、プロモーターにTRE
領域を持たない MMP（例えば、 MMP-2）には関係しないと予測される。従って、B-ATF による MMP分泌の制御においても同様であると予測される。
【００８６】
しかしながら、実施例３の結果はこのような予測に反するものであった。その意味するところ（例えば、 MMP分泌の過程において、タンパク質の生成とは別途に働く新たな因子が存在する可能性など）の議論はさておき、少なくとも実施例３の結果は従来の予測を覆す新規な知見であり、かつ、B-ATF が癌や炎症性疾患に関連して MMPファミリーの内でも特に重要視される MMP-9と MMP-2との分泌を同時に抑制すると言う点で、非常に有益な知見である。
【００８７】
〔実施例４： MMP-9の細胞内産生量の検討〕
実施例３のように、B-ATF による MMP分泌量への抑制効果が確認されたので、次に、B-ATF による MMPの細胞内産生量への影響を MMP-9について検討することとした。
【００８８】
そのために、第１に、v-Crk HA B-ATF細胞及び v-Crk Myc B-ATF細胞の可溶化液を調製し、ウエスタンブロッティング及び MMP-9抗体による免疫染色によって、細胞可溶化液中に含まれる MMP-9の発現量を確認した。
【００８９】
第２に、 MMP-9遺伝子のプロモーター領域中の TREモチーフにおける転写レベルでの阻害は、 MMP-9をコードする mRNA の発現量にも大きな変化を引き起こす、との推測から、同様に細胞可溶化液中から mRNA を抽出した。そして mRNA をノーザンブロッティングによりニトロセルロース膜に転写させ、この膜上において MMP-9の cDNA をプローブとして Total mRNA から MMP-9の mRNA を検出し、 B-ATFによる MMP-9の転写レベルでの発現を検討した。
【００９０】
それらの結果を図６に示す。対照として3Y1 細胞を用いたこと、デキサメサゾンによる刺激の有無をレーンごとに「＋」、「−」の表記で区別したことは、前記と同様である。図６によれば、驚くべきことに、 MMP-9の発現量、 mRNA の発現量のいずれにおいても、AP-1転写活性の阻害によって引き起こされるような大きな抑制効果は認められなかった。
【００９１】
〔実施例５：細胞内シグナル伝達への影響〕
以上の各実施例の事実を考え併せるとき、詳細な議論は避けるが、細胞内のシグナル伝達系に関与する MMP以外の主要タンパク質のリン酸化レベルがB-ATF によって影響されるか否かを検討することが有益である。
【００９２】
そこで、以下の４種類の抗体、即ち１）抗リン酸化チロシン抗体 PY20 HRPO、２）Phospho-44/42 MAPK(Thr202Tyr204)E10 モノクローナル抗体、３）抗ERK1抗体、４）抗 Crk抗体、をそれぞれ使用したイムノブロッティングにより、細胞内シグナル伝達系の主要タンパク質のリン酸化レベルとその存在量を比較、検討した。その結果を図７に一括して示した。
【００９３】
具体的には、実施例３と同様に v-Crk HA B-ATF 及び v-Crk Myc B-ATFの２種類の細胞と、対照としての v-Crk3Y1 細胞及び3Y1 細胞とに対して、前記同様のデキサメサゾンによる刺激を行ったもの（図７で「＋」と表記）と、デキサメサゾンによる刺激を行わないコントロール（図７で「−」と表記）を設定した。
【００９４】
図７の左側欄外において「α-pTY」の表記で示すイムノブロッティング図は、上記の１）の抗体を用いた細胞内タンパク質のチロシンリン酸化の同定結果である。この結果によれば、 FAK（ Focal Adhesion Kinase）や EGFR （ Epidermal Growth Factor Receptor ）等に代表されるチロシンリン酸化タンパク質のバンドが約１３０キロダルトン付近に見られるが、デキサメサゾン刺激（B-ATF の発現）の有無による大きな差異は認められない。主に Srcファミリーに属するタンパク質の約６０キロダルトン付近のバンドや、その下のアダプター系タンパク質のバンドについても同様の結果である。従って、B-ATF の発現は細胞タンパク質のチロシンリン酸化を阻害しないし、デキサメサゾンによって他のタンパク質のリン酸化レベルが亢進されることもないことが分かった。
【００９５】
次に、図７の左側欄外に「α-pMAPK」の表記で示すイムノブロッティング図は、上記２）の抗体を用いたものであるが、４４キロダルトン付近に見られるバンド P44MAPK及び４２キロダルトン付近に見られるバンド P42MAPKにおいて、デキサメサゾン刺激の有無による大きな差異は認められなかった。従って、B-ATF の発現は MAPK シグナル伝達系を抑制しないし、デキサメサゾンによって MAPK シグナル伝達系の活性化が亢進されることもないことが分かった。
【００９６】
更に、図７の左側欄外に「α-ERK1 」の表記で示すイムノブロッティング図は、上記３）の抗体を用いたものであるが、４４キロダルトン付近に見られるバンド ERK1 及び４２キロダルトン付近に見られるバンド ERK2 において、デキサメサゾン刺激の有無による大きな差異は認められなかった。
【００９７】
更に、図７の左側欄外に「α-Crk」の表記で示すイムノブロッティング図は、上記４）の抗体を用いたものであるが、細胞 3Y1をトランスフォームさせるのに使用した遺伝子 v-crkがデキサメサゾンの刺激により発現が抑制されているかも知れない、と言う予測を否定するものである。この結果から、デキサメサゾンがタンパク質 V-Crkを抑制しているとは考え難い。
【００９８】
実施例５における以上の結果を総合的に勘案すれば、B-ATF の発現又はデキサメサゾンによる刺激が、細胞に対して好ましくない不測の影響を与えてはいないと判断される。即ち、B-ATF は MMP（特に MMP-2及び MMP-9）の細胞外分泌の抑制と言う作用を選択的にもたらすことができ、癌又は炎症性疾患の診断・予防・治療において不測の副作用を生じる恐れが少ない。
【００９９】
〔実施例６：癌細胞の浸潤〕
癌細胞の MMP分泌と基底膜組織への浸潤能との関係の、定量的評価を試みた。即ち、ボイデンチャンバーを利用したトランスウエル（COASTER 社製）を使用し、培地中の被検細胞がトランスウエルの下端開口部に設けたマトリゲル膜〔人工の間質膜（マトリゲル）をコートした膜〕を浸潤・通過する個数によって浸潤能を評価するものである。
【０１００】
被検細胞としてはv-Crk HA B-ATF細胞、 v-Crk Myc B-ATF細胞及び v-Crk3Y1
細胞を用い、前記同様のデキサメサゾンによる刺激を行ったもの（「＋」で表記）と、デキサメサゾンによる刺激を行わないコントロール（「−」で表記）とについて比較した。その評価結果を図８に示す。図８の縦軸の「 Cell Number」とは、カウントされた浸潤細胞数を示す。
【０１０１】
図８より明らかなように、 B-ATFを発現した癌細胞においては、基底膜組織を模したマトリゲル膜に対する浸潤能が著しく抑制されていることが分かる。即ち、 B-ATFによる MMP（特に MMP-2及び MMP-9）細胞外分泌の抑制が、癌細胞の浸潤能を著しく低下させている。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明は、細胞による MMP（とりわけ、 MMP-2及び MMP-9）分泌の抑制を通じて、癌組織における血管新生、癌細胞の浸潤転移あるいは炎症性疾患に伴う組織破壊に対する新規で有効な診断・予防・治療手段を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】マトリックスメタロプロテイナーゼファミリーの幾つかの酵素の構造遺伝子に対する上流制御配列部の概略を示す模式図である。
【０１０４】
【図２】B-ATF遺伝子を含んで構築されたベクターの一例を示す図である。
【０１０５】
【図３】実施例１の評価結果を示す図である。
【０１０６】
【図４】実施例２の評価結果を示す図である。
【０１０７】
【図５】実施例３の評価結果を示す図である。
【０１０８】
【図６】実施例４の評価結果を示す図である。
【０１０９】
【図７】実施例５の評価結果を示す図である。
【０１１０】
【図８】実施例６の評価結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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