(57)【要約】【課題】  生細胞を用いることなく、簡便かつ迅速、確実に増幅できる新規な鋳型ＤＮＡの増幅方法、およびそれで得られた鋳型ＤＮＡを用いた無細胞系タンパク質合成方法を提供する。【解決手段】  プロモーター配列、タンパク質をコードする構造遺伝子およびターミネーター配列を少なくとも有する鋳型ＤＮＡを増幅する方法であって、鋳型ＤＮＡを複数の領域に区分けし、この複数の領域のうち少なくともいずれかをＰＣＲによって増幅させる工程と、上記増幅後の複数の領域をライゲーションする工程とを含有する鋳型ＤＮＡの増幅方法、ならびに増幅された鋳型ＤＮＡを用いた無細胞系タンパク質合成方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター配列およびタンパク質をコードする構造遺伝子を少なくとも有する鋳型ＤＮＡを増幅する方法であって、
予め複数の領域に分割された鋳型ＤＮＡをライゲーションする工程と、
ライゲーションした後の鋳型ＤＮＡをＰＣＲによって増幅させる工程とを含有する鋳型ＤＮＡの増幅方法。
【請求項２】
鋳型ＤＮＡが翻訳活性促進活性を示す配列をさらに有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
鋳型ＤＮＡが予め２つの領域に分割されたものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法によって増幅された鋳型ＤＮＡを転写鋳型として用いて、無細胞系でタンパク質を製造する方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法によって増幅された鋳型ＤＮＡを転写して得られたｍＲＮＡを翻訳鋳型として用いて、無細胞系でタンパク質を製造する方法。
【請求項６】
節足動物由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いる、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
節足動物由来の抽出物が昆虫組織から抽出されたものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
昆虫組織がカイコ組織である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
カイコ組織がカイコ幼虫の後部絹糸腺を少なくとも含有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
節足動物由来の抽出物が昆虫培養細胞から抽出されたものである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
昆虫培養細胞がＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ卵細胞由来の培養細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
小麦胚芽由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いる、請求項４または５に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物培養細胞由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いる、請求項４または５に記載の方法。
【請求項１４】
ウサギ網状赤血球由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いる、請求項４または５に記載の方法。
【請求項１５】
大腸菌由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いる、請求項４または５に記載の方法。
【請求項１６】
酵母由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いる、請求項４または５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な鋳型ＤＮＡの増幅方法、ならびに増幅された鋳型ＤＮＡを用いた無細胞系タンパク質合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトゲノムを始め多くの生物の遺伝情報が解読されてきている。このような中、ポストゲノム研究として、これらの遺伝情報に対応するタンパク質の機能解析やゲノム創薬が注目を集めている。これらの遺伝情報に対応するタンパク質を医薬品などに応用、利用するには、莫大な種類のタンパク質を短時間で簡単に合成することが必要となってくる。
【０００３】
現在、タンパク質の生産方法には、遺伝子組換え技術によって酵母や昆虫細胞（昆虫培養細胞）などの生細胞を用いる発現系（以下、「細胞系」ということがある）が広く利用されている。しかし、生細胞は自己機能を維持するために外来タンパク質を排除する傾向があり、また生細胞で細胞毒タンパク質を発現すると細胞が生育しないなど発現が困難なタンパク質も多い。
【０００４】
一方、細胞系を使用しないタンパク質の生産方法として、細胞破砕液や抽出液に基質や酵素などを加えるなどして生物の遺伝情報翻訳系または遺伝情報転写／翻訳系を試験管内に取り揃え、反応鋳型として目的タンパク質をコードするＤＮＡ（転写鋳型）またはｍＲＮＡ（翻訳鋳型）を用いて、アミノ酸を望みの順番に必要な残基数結合させることのできる合成系を再構築する、無細胞系のタンパク質合成が知られている。このような無細胞系タンパク質合成では、上記細胞系のタンパク質合成のような制約を受けにくく、生物の命を断つことなくタンパク質の合成を行うことができ、またタンパク質の生産に培養などの操作を伴わないため細胞系と比較して短時間にタンパク質の合成を行うことができる。さらに無細胞系タンパク質合成では、生命体が利用していないアミノ酸配列からなるタンパク質の大量生産も可能となることから、有望な発現方法であると期待されている。このような無細胞系のタンパク質合成に供する抽出液（無細胞系タンパク質合成用抽出液）として、種々の生物由来のものを使用することが検討され、研究が進められている。
【０００５】
ところで従来、この無細胞系タンパク質合成においては、転写反応や翻訳反応には生細胞を用いなくとも、その反応鋳型となるＤＮＡ（転写鋳型）、ｍＲＮＡ（翻訳鋳型）の調製には、大腸菌などの生細胞を用いる場合が多かった。すなわち、目的タンパク質をコードする構造遺伝子を有するＤＮＡ（転写鋳型）を調製する場合、たとえば、無細胞系タンパク質合成用に設計されたプラスミドＤＮＡ（ベクター）に挿入し、それを用いて大腸菌を形質転換して、得られた形質転換体より回収したプラスミドＤＮＡを転写鋳型として用いる必要があった。また、目的タンパク質をコードするｍＲＮＡ（翻訳鋳型）を調製する場合にも、生体から直接単離したものを翻訳鋳型として用いる場合を除き、上記のようにして調製したＤＮＡから、転写反応により目的タンパク質をコードするｍＲＮＡを調製する必要があった。そのため、無細胞系タンパク質合成反応に用いる転写鋳型または翻訳鋳型を調製するためには、煩雑な操作と２〜３日程度の日数を要していた。
【０００６】
一方、上記煩雑な操作および所要日数を改善するために、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクション）を利用して、転写鋳型を調製する方法が開発されている（たとえば、特許文献１、２を参照）。しかしながらこれらの方法では、無細胞系タンパク質合成における転写および翻訳反応に必要なＤＮＡ配列（上記特許文献１、２では具体的にはＴ７プロモーター配列、リボソーム結合ＤＮＡ配列、目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列、ターミネーターＤＮＡ配列または変異ターミネーターＤＮＡ配列）が全て含まれているＤＮＡからのみ調製することが可能である。また、鋳型として用いるＤＮＡが上記のように塩基数が比較的多いため、この鋳型の調製にあたっては、このＴ７プロモーター配列、リボソーム結合ＤＮＡ配列、目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列、ターミネーターＤＮＡ配列または変異ターミネーターＤＮＡ配列が全て含まれるプラスミドＤＮＡを生細胞の使用により予め調製しておかねばならず、未だ煩雑な操作を殆ど軽減できていなかった。
【０００７】
近年、それらの問題点を改善するために、大腸菌抽出液の無細胞系において、Ｔ７プロモーター配列と、リボソーム結合ＤＮＡ配列、およびその３’末端領域と重複する配列と目的遺伝子開始コドン領域配列、からなる２種のセンスプライマーと、Ｔ７ターミネーター配列、およびその３’末端領域と重複する配列と目的遺伝子終止コドン領域配列、からなる２種のアンチセンスプライマーを用い、２段階のＰＣＲを行うことにより、生細胞を用いず、迅速に無細胞系タンパク質合成に用いる鋳型ＤＮＡを調製する方法が開発された（たとえば、非特許文献１を参照。）。しかしながら、この方法は、大腸菌の系用に開発されたものであるため、そのまま真核生物の細胞抽出液の系に適用することができない。また、Ｔ７プロモーター配列、リボソーム結合領域配列を導入するためのプライマーが長鎖であるため、プライマー配列とタンパク質をコードするＤＮＡ配列間においてミスマッチ領域が生じ、目的とする鋳型ＤＮＡ以外の非特異的な増幅が起こる可能性が高く、また、高価なものとなってしまっていた。さらに、この方法を真核生物抽出液の無細胞系に適用しようとすると、リボソーム結合領域配列の代わりに、翻訳反応を促進する機能を有する配列（いわゆる、エンハンサー配列）を導入することが望ましい。一般に翻訳反応を促進する配列は、リボソーム結合領域配列と比べ長鎖であり、Ｔ７プロモーターなどのプロモーター配列と合計した場合、５０−６０塩基以上となってしまい、２種類のセンスプライマーで対応することが難しくなる。さらに、これらの配列に、融合タンパク質として発現させるために、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＧＳＴ−ｔａｇ、Ｔｒｘ−ｔａｇなどをコードする配列（ｔａｇ配列）を付加するのは非常に大変である、などの問題があり実用的な方法ではなかった。
【特許文献１】特開平１１−５６３６３号公報
【特許文献２】特開平１１−１７８５８２公報
【非特許文献１】M. Watzele, C. Nemetz, T. Metzler, E. Fernholz, T. Hoffmann, and W. Mutter, BIOCHEMICA, 3, 27-28(2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、生細胞を用いることなく、簡便かつ迅速、確実に増幅できる新規な鋳型ＤＮＡの増幅方法、およびそれで得られた鋳型ＤＮＡを用いた無細胞系タンパク質合成方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕プロモーター配列およびタンパク質をコードする構造遺伝子を少なくとも有する鋳型ＤＮＡを増幅する方法であって、
予め複数の領域に分割された鋳型ＤＮＡをライゲーションする工程と、
ライゲーションした後の鋳型ＤＮＡをＰＣＲによって増幅させる工程とを含有する鋳型ＤＮＡの増幅方法。
〔２〕鋳型ＤＮＡが翻訳活性促進活性を示す配列をさらに有する、上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕鋳型ＤＮＡが予め２つの領域に分割されたものである、上記〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法によって増幅された鋳型ＤＮＡを転写鋳型として用いて、無細胞系でタンパク質を製造する方法。
〔５〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法によって増幅された鋳型ＤＮＡを転写して得られたｍＲＮＡを翻訳鋳型として用いて、無細胞系でタンパク質を製造する方法。
〔６〕節足動物由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いる、上記〔４〕または〔５〕に記載の方法。
〔７〕節足動物由来の抽出物が昆虫組織から抽出されたものである、上記〔６〕に記載の方法。
〔８〕昆虫組織がカイコ組織である、上記〔７〕に記載の方法。
〔９〕カイコ組織がカイコ幼虫の後部絹糸腺を少なくとも含有する、上記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕節足動物由来の抽出物が昆虫培養細胞から抽出されたものである、上記〔６〕に記載の方法。
〔１１〕昆虫培養細胞がＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ卵細胞由来の培養細胞である、上記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕小麦胚芽由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いる、上記〔４〕または〔５〕に記載の方法。
〔１３〕哺乳動物培養細胞由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いる、上記〔４〕または〔５〕に記載の方法。
〔１４〕ウサギ網状赤血球由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いる、上記〔４〕または〔５〕に記載の方法。
〔１５〕大腸菌由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いる、上記〔４〕または〔５〕に記載の方法。
〔１６〕酵母由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いる、上記〔４〕または〔５〕に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、細胞を用いることなく、簡便かつ迅速、確実に増幅できる新規なＤＮＡの増幅方法、およびそれで得られたＤＮＡを用いた無細胞系タンパク質合成方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、プロモーター配列、タンパク質をコードする構造遺伝子を少なくとも有する鋳型ＤＮＡを増幅する方法であって、（１）予め複数の領域に分割された鋳型ＤＮＡをライゲーションする工程と、（２）ライゲーション後のＤＮＡをＰＣＲによって増幅させる工程とを少なくとも含有することを特徴とする方法である。本発明の方法によれば、予め分割された塩基数の比較的少ない各領域のＤＮＡを、ＤＮＡ合成機やＰＣＲなどによって容易に合成することが可能であり、それら複数の領域を用い、ライゲーションとその後のＰＣＲを行うことにより、目的とする鋳型ＤＮＡを増幅することができるため、必ずしも生細胞を使用する必要がないという利点がある。また、ＰＣＲは、増幅させるＤＮＡの５’および３’末端の配列をもとに作製した塩基数の少ない安価なプライマーを用いて行うことが可能となり、従来のようにミスマッチ領域の発生などが起こることなく、鋳型ＤＮＡを正確に増幅させることが可能である。さらに、従来の方法では容易に達成できなかったｔａｇ配列の導入も安価でかつ確実に行うことが可能となる。
【００１２】
本発明の方法では、予め複数の領域に分割された鋳型ＤＮＡを用いる。ここで、領域の数は、一連のライゲーション反応とその後のＰＣＲによってつなぎ合わせて増幅させることが可能な領域は２つであり、さらに別の領域をつなぎ合わせて増幅させるためには、さらに一連のライゲーションとＰＣＲを行わなければならないため、可能な限り少ない領域に分割されたものであるのが好ましい。該領域数は、２個〜５個であるのが好ましく、２個〜３個であるのがより好ましく、２個であるのが特に好ましい。鋳型ＤＮＡは、当該鋳型ＤＮＡにおいて領域内にない塩基配列部分や、各領域において互いに重複する塩基配列部分が増幅されないように、換言すれば、全ての領域をつなぎ合わせると鋳型ＤＮＡとなるように予め分割される。分割された各領域は、プラスミドＤＮＡより制限酵素にて切断し調製したＤＮＡであってもよいし、ＰＣＲによって増幅させたＤＮＡであってもよいし、ＤＮＡ合成機にて合成したＤＮＡであってもよい。
【００１３】
まず、鋳型ＤＮＡを予め分割した領域のうち、互いに隣り合う領域をライゲーションさせる。ライゲーション反応を行う際には、予め、ＤＮＡの末端を、両方のＤＮＡは順方向で連結できるようなかたちに調製しておくとよい。具体的には、つなぎ合わせたい２つのＤＮＡの末端を平滑末端に調製しておく。あるいは、同じ制限酵素で切断した断片としておく。また、片方のＤＮＡの末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化しておき、効率よくライゲーション可能な状態に調製しておくとよい。ライゲーションの際に用いる試薬や反応条件は、当分野にて通常実施されているように行えばよい。たとえば、ＮＥＢ社製Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、プロトコルに従い、ＤＮＡ、反応バッファ、Ｑｕｉｃｋ  Ｔ４  Ｌｉｇａｓｅを混合し、２５℃にて５分間インキュベーションすればよい。
【００１４】
本発明の方法では、次に、上記ライゲーション後のＤＮＡをＰＣＲによって増幅させる。ＰＣＲは、市販のＰＣＲ用サーマルサイクラーなど、従来公知の装置を特に制限なく使用して行うことができる。ＰＣＲの条件に特に制限はなく、当分野において通常行われている条件にて行えばよい。例えば、東洋紡績社製ＫＯＤ  ｐｌｕｓを用い、そのプロトコルに従えばよい。この際用いるプライマーは、増幅させたいＤＮＡの端部の配列をもとに作製したセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いる。これにより、ライゲーションにより多種類のつなぎ合わされたＤＮＡが生じるが、ＰＣＲによって所望のＤＮＡのみが増幅される。
さらに、鋳型ＤＮＡが３つ以上の領域に分かれる場合は、上述のＰＣＲで増幅したＤＮＡとさらにつなぎ合わせたいＤＮＡを用い、ライゲーション、ＰＣＲを行い、鋳型ＤＮＡを調製する。
【００１５】
本発明の増幅方法にて増幅する対象である鋳型ＤＮＡは、プロモーター配列およびタンパク質をコードする構造遺伝子を少なくとも有するものであれば、いかなる塩基配列、塩基数のものであってもよい。構造遺伝子がコードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、生細胞で細胞毒となるタンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよいし、また糖タンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよい。鋳型ＤＮＡにおいて、通常、プロモーター配列は構造遺伝子の５’上流側に配置される。プロモーター配列としては、たとえば、従来公知のＴ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列などが挙げられる。
また、本発明の鋳型ＤＮＡは、構造遺伝子の３’下流側にターミネーター配列を有するのが好ましい。上記ターミネーター配列としては、たとえば、従来公知のＴ７ターミネーター配列、ＳＰ６ターミネーター配列、Ｔ３ターミネーター配列などが挙げられる。また、鋳型ＤＮＡは、合成されたｍＲＮＡの安定性などの観点から、構造遺伝子の３’下流側にポリＡ配列を有していてもよい。
【００１６】
また、本発明における鋳型ＤＮＡは、翻訳反応促進活性を有する配列（以下、「翻訳反応促進配列」ということがある。）をさらに有するのが好ましい。ここで「翻訳反応を促進」とは、この翻訳反応促進配列を有する鋳型ＤＮＡを使用して無細胞系タンパク質合成反応を行うことで、この翻訳反応促進配列を有しない鋳型ＤＮＡを使用して無細胞系タンパク質合成反応を行った場合と比較して、翻訳効率が１．２倍以上（好適には、２倍以上）に向上される配列を指す。
【００１７】
かかる翻訳反応促進活性配列としては、上記のような翻訳反応促進活性を有する公知の配列を適宜使用することができ、特に制限されるものではない。翻訳反応促進活性配列の具体的な例としては、後述するように節足動物由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いて行う場合には、配列表の配列番号１〜１１のいずれかに示される塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ断片、またはそれと均等な（上記配列番号１〜１１いずれかに示される塩基配列より、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された）塩基配列を有し、且つ翻訳反応促進活性を有する二本鎖ＤＮＡ断片が挙げられる。これらの配列によれば、キャップ構造に依存することなく、節足動物由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成において翻訳反応を促進する機能を発揮し得るものである。配列表の配列番号１〜１１に示す塩基配列は、それぞれ、カイコまたはバキュロウイルスにおける５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）として公知の塩基配列である。具体的には、配列番号１に示す塩基配列はカイコのフィブロインＬ鎖遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列、配列番号２に示す塩基配列はカイコのセリシン遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列、配列番号３に示す塩基配列はＡｃＮＰＶ（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus）のポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列、配列番号４に示す塩基配列はＢｍＣＰＶ（Bombyx mori cytoplasmin polyhedrosis virus）のポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列、配列番号５に示す塩基配列はＥｓＣＰＶ（Euxoa scandes cytoplasmin polyhedrosis virus）のポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列、配列番号６に示す塩基配列はＨｃＮＰＶ（Hyphantria cunea nuclear polyhedrosis virus）のポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列、配列番号７に示す塩基配列はＣｒＮＰＶ（Choristoneura rosaceana nucleopolyhedrovirus）のポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列、配列番号８に示す塩基配列はＥｏＮＰＶ（Ecotropis oblique nuclear polyhedrosis virus）のポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列、配列番号９に示す塩基配列はＭｎＮＰＶ（Malacosma neustria nucleopolyhedrovirus）のポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列、配列番号１０に示す塩基配列はＳｆＮＰＶ（Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus）のポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列、配列番号１１に示す塩基配列はＷｓＮＰＶ（Wiseana signata nucleopolyhedrovirus）のポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列として、それぞれ公知である。これらの翻訳反応促進配列は、従来公知のいかなる方法により得られてもよい。たとえば、公知のＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。
【００１８】
上記翻訳反応促進配列は、本発明における鋳型ＤＮＡにおいて、上記構造遺伝子の５’上流側に１または複数個組み込まれてなるのが好ましい。翻訳反応促進配列は、構造遺伝子の５’上流側において、順方向（５’→３’）に組み込まれてもよいし、逆方向（３’→５’）に組み込まれてもよい。また、２個以上の翻訳反応促進配列が組み込まれたものであってもよく、その場合、組み込まれた翻訳反応促進配列は同じものであっても互いに異なるものであってもよい。また、２個以上の翻訳反応促進配列が組み込まれた場合、全ての翻訳反応促進配列が同じ方向に組み込まれていなくともよい。翻訳反応促進配列は、構造遺伝子の５’上流側において、構造遺伝子に隣り合うように組み込まれてもよいし、構造遺伝子との間に１塩基以上の塩基配列を介在させた状態で組み込まれてもよい。
【００１９】
本発明の増幅方法により増幅された鋳型ＤＮＡは、無細胞系タンパク質合成における転写鋳型として好適に使用することができる。すなわち、無細胞系タンパク質合成は、一般に、ｍＲＮＡ（翻訳鋳型）の情報を読み取ってタンパク質を合成する無細胞翻訳系のみによるタンパク質合成（翻訳系）、ならびに鋳型ＤＮＡ（転写鋳型）よりｍＲＮＡを転写する転写工程と、該転写工程で得られたｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する翻訳工程とを含むタンパク質合成（転写／翻訳系）とに大きく分けられるが、本発明の増幅方法により増幅された鋳型ＤＮＡは、このうち転写／翻訳系の無細胞系タンパク質合成における転写鋳型として好適に使用することができる。
【００２０】
また本発明の増幅方法により増幅された鋳型ＤＮＡを転写して得られたｍＲＮＡは、翻訳系の無細胞系タンパク質合成における翻訳鋳型として好適に使用することができる。ｍＲＮＡは、従来公知の適宜の方法にて上記増幅された鋳型ＤＮＡを転写して調製することができるが、自体公知のインビトロ転写によって上記増幅された鋳型ＤＮＡを転写し、調製するのが好ましい。インビトロ転写は、たとえば、ＲｉｂｏＭａｘ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（プロメガ社製）などを利用して行うことができる。ｍＲＮＡは、転写後、自体公知の方法にて精製して単離し、後述するように無細胞系タンパク質合成用の翻訳鋳型として、翻訳系用反応液に適用することができる。
【００２１】
上記本発明の増幅方法により増幅された鋳型ＤＮＡまたはそれを転写して得られたｍＲＮＡを反応鋳型として用いる無細胞系タンパク質合成方法（無細胞系でタンパク質を製造する方法）も、本発明に包含される。無細胞系タンパク質合成は、通常、翻訳装置としてのリボソームなどを含有する生体由来抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用反応液に、転写鋳型または翻訳鋳型を添加して行う。本発明に使用される無細胞系タンパク質合成用反応液に含まれる抽出物は、翻訳鋳型を翻訳して該鋳型にコードされるタンパク質を生成させ得るものであれば如何なるものであってもよく、従来公知の大腸菌、コムギ、オオムギ、イネ、コーン等のイネ科の植物、及びホウレンソウなど植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球などから抽出された抽出物、抽出液を特に制限なく使用することができる。これらは市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には、大腸菌、小麦胚芽またはウサギ網状赤血球由来の抽出液の場合には、「生物化学実験法４３、遺伝子発現研究法」（学会出版センター）に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販のタンパク質合成用細胞抽出液としては、大腸菌由来ではＲＴＳ１００  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＹ  Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などが挙げられ、ウサギ網状赤血球由来ではＲａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｔｒｅａｔｅｄ（プロメガ社製）など、コムギ胚芽由来ではＰＲＯＴＥＩＯＳ  ｓｅｔ（東洋紡績社製）などが挙げられる。
【００２２】
このように本発明の無細胞系タンパク質合成用反応液には、上述のような公知の抽出物、抽出液が含まれていてもよいが、本発明者らが提案してきている節足動物由来の抽出物が含まれているものであることが好ましい。
【００２３】
ここで「節足動物」とは、後生動物の一門であって、左右相称、裂体腔を有する旧口動物を指し、鋏角亜門、大顎亜門のいずれに属するものであってもよく、たとえば、昆虫綱、クモ綱などに属する動物を包含する。中でも、昆虫綱またはクモ綱（特に、クモ亜綱）に属する節足動物が好ましく、昆虫綱に属する節足動物が特に好ましい。昆虫綱に属する節足動物としては、たとえば、鱗翅目（チョウ目）、直翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目、甲虫目、脈翅目、半翅目などに属するものが挙げられ、特に制限されるものではないが、中でも、カイコガ科、ヤガ科などの鱗翅目に属するものが好適に使用される。
本発明における無細胞系タンパク質合成用反応液中に含有される上記抽出物は、上記節足動物由来であるならば、成長段階のいずれを問わずいかなる組織から抽出されたものであってもよく、また、節足動物のいずれの組織由来の培養細胞より抽出されたものであってもよい。中でも、カイコ組織または昆虫培養細胞から抽出されたものであるのが特に好ましい。
【００２４】
「カイコ」は、カイコガ科に属する鱗翅目昆虫（絹糸昆虫）と同義であり、その一生において「卵（胚）」（産卵直後より孵化直前までの間）、「幼虫」（孵化直後から繭の形成終了直前（１齢期〜５齢期に分けられる））、「蛹」（繭の形成終了直前から羽化する直前までの間）、ならびに「成虫（蛾）」（羽化直後より死亡までの間）の各状態を経るものであり、その一生にわたる形態のいずれをも含むものとする。カイコは、卵より孵化した後の幼虫の状態では、桑を食べて発育する期間（齢）と、食べずに脱皮の準備をする期間（眠）を交互に繰り返す。カイコの幼虫において、孵化してから１回目の脱皮までを１齢期、１回目の脱皮から２回目の脱皮までを２齢期といい、通常、４回脱皮して５齢期で成熟する（この成熟した状態のカイコ幼虫は「熟蚕」とも呼ばれる）。カイコの幼虫は、熟蚕になると体が透明になり絹糸を吐いて繭を形成し、蛹化する。蛹の後、羽化して成虫となる。
【００２５】
無細胞系タンパク質合成用反応液がカイコ組織由来の抽出物を含有する場合、組織としてはカイコの一生のうちのどの状態（卵、幼虫（１齢期〜５齢期）、蛹、成虫）のいずれの組織であってよい。またカイコ組織は、単一の状態における単一の組織（たとえば、５齢期のカイコ幼虫における後部絹糸腺のみ）に限らず、単一の状態における複数の組織（たとえば、５齢期のカイコ幼虫における後部絹糸腺および脂肪体）であってもよく、複数の状態における単一の組織（たとえば、３齢期、４齢期、５齢期の各カイコ幼虫における後部絹糸腺）であってもよいものとする。無論、複数の状態における複数の組織であってもよい。なおカイコ組織は、カイコ組織の全体（たとえば、後部絹糸腺全体）である必要はない。
【００２６】
ここで、カイコ組織の「絹糸腺」とは、カイコ幼虫の両体側において、頭部の下唇先端に位置する吐出口から盲管にまで連なる一対の管状の外分泌腺であり、前部絹糸腺、中部絹糸腺および後部絹糸腺に大きく分けられる。後部絹糸腺は、絹糸の中心部を為すフィブロインを分泌する。また中部絹糸腺は、セリシンを分泌する。フィブロインは中部絹糸腺に蓄積されるとともに、セリシンによってその外周を覆われて、ゲル状の絹物質となる。この絹物質は、前部絹糸腺を通って吐出口から排出され、固体化して絹糸となる。
またカイコ組織の「脂肪体」とは、カイコ幼虫において、体内の至るところに分布し、白色の柔らかい扁平な帯状、ひも状あるいは葉状の組織である。脂肪体は、ヒトの肝臓に似て栄養、エネルギー源を貯蔵する役目を果たしているので、細胞内には脂肪球、タンパク質、グリコーゲンその他の新陳代謝に関係する種々の物質を含んでいる。
また「胚」は、カイコの卵の状態の組織を指す。
【００２７】
またカイコ組織に由来する抽出物を含有する場合、カイコ幼虫の絹糸腺、脂肪体およびカイコの胚から選ばれる少なくともいずれか由来の抽出物であるのが好ましい。カイコ幼虫の絹糸腺（特に、後部絹糸腺）より調製を行うと、短時間で大量のタンパク質が合成可能であるという特に優れた利点がある。またカイコ幼虫の脂肪体から抽出液を調製すると、脂肪体が柔らかい組織であるために、すり潰す作業が短時間で済み、結果として容易に抽出液を調製できる利点がある。さらに、カイコの胚から調製を行うと、胚が１つの個体であるために他の組織とは異なり摘出する作業を要さず、結果として容易に抽出液を調製できるという利点がある。
【００２８】
カイコを抽出対象とする場合、カイコは１齢期〜５齢期の幼虫であればよいが、５齢期のカイコ幼虫が好ましい。これは、カイコ幼虫は繭の形成期に近づくにつれて組織が成熟し、特に５齢期のカイコ幼虫においては組織が１齢期〜５齢期のうちで最も成熟しているため、同量の抽出物を得るために要する数は少なくて済むためである。中でも、５齢期のカイコ幼虫の絹糸腺または脂肪体（好ましくは５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺、より好ましくは５齢期の３日〜７日のカイコ幼虫の後部絹糸腺）からの抽出物を含有すると、他の齢期のものと比べて短時間で大量のタンパク質が合成可能な無細胞系タンパク質合成用反応液が得られるという利点もあり、特に好ましい。
【００２９】
また、上述したように無細胞系タンパク質合成用反応液に含有される節足動物由来の抽出物は、従来公知の節足動物を由来とする培養細胞から得られたものであってもよい。かかる培養細胞としては、培養細胞株が多く樹立されており、また、多くの哺乳類系の培養細胞と異なり二酸化炭素雰囲気下での培養を必要とせず、無血清培地においても培養が可能であることから、鱗翅目、半翅目などの昆虫由来の培養細胞（昆虫培養細胞）を使用するのが好ましい。昆虫培養細胞も、いかなる組織由来の細胞であってもよく、たとえば、血球細胞、生殖巣由来細胞、脂肪体由来細胞、胚由来細胞、孵化幼虫由来細胞などを特に制限なく使用することができるが、中でも、タンパク質生産能が高いと考えられる生殖巣由来の昆虫培養細胞を使用するのが好ましい。特には、細胞系においてタンパク質合成能が高く、また無血清培地にて培養が可能である、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵細胞由来の細胞Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）が好適な昆虫培養細胞として例示される。
【００３０】
上記節足動物由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用反応液は、従来公知の適宜の組成の抽出用液を用いて、節足動物の組織または培養細胞より抽出操作を行って得られた抽出液（抽出液＝抽出用液＋抽出物）を調製し、これに後述するような翻訳反応に要する成分、場合によっては翻訳反応および転写反応に要する成分を適宜添加することで、調製することができる。
【００３１】
節足動物からの抽出操作に用いられる抽出用液としては、特には制限されるものではないが、プロテアーゼインヒビターを少なくとも含有するのが好ましい。プロテアーゼインヒビターを含有する抽出用液を用いると、節足動物由来の抽出物に含有されるプロテアーゼの活性が阻害され、当該プロテアーゼによる抽出物中の活性タンパクの不所望な分解を防止でき、結果として節足動物由来の抽出物が有するタンパク質合成能を有効に引き出すことができるようになるという利点がある。上記プロテアーゼインヒビターとしては、プロテアーゼの活性を阻害し得るものであるならば特に制限はなく、たとえば、フェニルメタンスルホニルフルオリド（以下、「ＰＭＳＦ」ということがある。）、アプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、Ｅ−６４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン）、エチレンジアミン四酢酸、ホスホラミドンなどを使用することができるが、節足動物由来の抽出物にはセリンプロテアーゼが含まれることが多いことから、上記中でもセリンプロテアーゼに対して特異性の高いインヒビターとして働くＰＭＳＦを使用するのが好ましい。また、１種類のプロテアーゼインヒビターのみならず、数種類の混合物（プロテアーゼインヒビターカクテル）を用いてもよい。
当該抽出用液中におけるプロテアーゼインヒビターの含有量に特に制限はないが、無細胞系タンパク質合成に必須な酵素類の分解阻害能を好適に発揮できる観点から、１μＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。プロテアーゼインヒビターが１μＭ未満であると、プロテアーゼの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またプロテアーゼインヒビターが５０ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００３２】
また本発明に用いる抽出用液は、上記プロテアーゼインヒビターに加えて、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴおよび緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。
【００３３】
上記カリウム塩としては、たとえば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化カリウム、フタル酸カリウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸カリウムを使用するのが好ましい。カリウム塩は、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
当該抽出用液中におけるカリウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸カリウムなど１価のカリウム塩である場合、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜３００ｍＭ含有されることがより好ましい。カリウム塩が１０ｍＭ未満または５００ｍＭを越えると、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３４】
上記マグネシウム塩としては、たとえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸マグネシウムを使用するのが好ましい。マグネシウム塩も、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
当該抽出用液中におけるマグネシウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸マグネシウムなど２価の塩である場合、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。マグネシウム塩が０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３５】
上記ＤＴＴは、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該抽出用液中において０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３６】
上記緩衝剤は、抽出用液に緩衝能を付与し、たとえば酸性または塩基性物質の添加などによって起こる抽出液のｐＨの急激な変化による抽出物の変性を防止する目的で配合される。このような緩衝剤としては特に制限はなく、たとえば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳなどを使用することができる。
緩衝剤は、得られた抽出液のｐＨが４〜１０に保持されるようなものを使用するのが好ましく、ｐＨが６．５〜８．５に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。抽出液のｐＨが４未満またはｐＨが１０を越えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があるためである。このような観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を使用するのが特に好ましい。
当該抽出用液中における緩衝剤の含有量に特に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が５ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こし、抽出物が変性する傾向にあるためであり、また緩衝剤が２００ｍＭを越えると、塩濃度が高くなり過ぎ、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３７】
また抽出対象である節足動物が昆虫培養細胞である場合、上記組成に加えて、塩化カルシウムおよびグリセロールをさらに含有してなる抽出用液を用いると、タンパク質合成能がより向上された昆虫培養細胞抽出液を得ることができるため好ましい。
この場合、塩化カルシウムの含有量は特に制限されないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、０．１ｍＭ〜１０ｍＭであるのが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭであるのがより好ましい。また、グリセロールの添加量についても特に制限されるものではないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、５（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％となるように添加されるのが好ましく、１０（ｖ／ｖ）％〜５０（ｖ／ｖ）％となるように添加されるのがより好ましい。
【００３８】
抽出液を抽出する方法についても特に制限はなく、従来公知の適宜の方法にて行うことができる。
たとえば、節足動物由来の抽出物として、カイコ組織由来の抽出物または昆虫培養細胞由来の抽出物を使用する場合、上述したような組成の抽出用液を使用して、本発明者らが提案している抽出方法にて抽出液を調製するのが、好適である。
以下、それぞれの場合について詳述する。
【００３９】
〔Ａ〕カイコ組織由来の抽出物を含有する抽出液の調製方法
まず、常法にしたがって、たとえばハサミ、ピンセット、メスなどの器具を使用して、カイコより所望の組織を摘出する。この摘出によって得る後述の抽出に使用する組織量としては、特に制限はないが、通常、１ｇ〜１００ｇの範囲内である。
次に、摘出した組織を、たとえば液体窒素で凍結した後、−８０℃で凍結させた乳鉢中ですり潰し、これに上述した抽出用液を添加して抽出操作を行う。
あるいは、上記抽出用液の添加後、一旦抽出用液も凍結させた後、シャーベット状になるまで（具体的には、ウェットな黄色いシャリシャリ状態の氷になるまで）、薬さじで攪拌しながら溶解する。その後、再度液体窒素で完全に凍結させた後、シャーベット状になるまで（具体的には、ウェットな黄色いシャリシャリ状態の氷になるまで）薬さじで攪拌しながら溶解させる。かかる方法によれば、タンパク質合成に関与する成分が効率的に抽出され且つ安定化されるという利点がある。
このようにして、まず、カイコの組織からの抽出物を含有する液状物を得る。
【００４０】
次に、上記抽出処理で得られた液状物を遠心分離にかける。該遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行う。該遠心分離を１回行った後の上清（上清Ａ１）をそのまま用いて抽出液とするようにしてもよいし、また、該上清Ａ１に上記と同様の条件にて再度の遠心分離を行い、得られた上清（上清Ａ２）を抽出液としてもよい。
また、上記上清Ａ１と、上記１回目の遠心分離後の沈殿から上記抽出用液を用いてさらに抽出を行った後に、上記と同様の条件にて遠心分離して得られた上清（上清Ａ３）とを混合して、抽出液として調製するようにしてもよい。このように上清Ａ１と上清Ａ３とを混合して抽出液を調製することで、上清Ａ１、上清Ａ３を単独で抽出液とする場合と比較して、タンパク質合成効率が向上するという利点がある。またさらに、上清Ａ２を、上清Ａ３と混合して抽出液を調製してもよい。これにより上記効果はさらに増強される。勿論、上記上清Ａ１〜上清Ａ３を混合して、抽出液を調製するようにしてもよい。
この場合、調製される混合物（抽出液）における上清Ａ１および／または上清Ａ２（両方混合する場合には、その総量）と上清Ａ３との混合割合に特に制限はないが、タンパク質の合成効率の観点からは、体積比で１０：９０〜９０：１０であるのが好ましく、２０：８０〜８０：２０であるのがより好ましい。
【００４１】
なお上述のようにそれぞれ調製した後に、ゲル濾過を施し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が最も高い画分付近を分取して抽出液として調製するようにしてもよい。しかしながらタンパク質の合成効率の観点からは、当該ゲル濾過および画分の分取を経ずに抽出液として調製するのが好ましい。
【００４２】
なお、上記ゲル濾過を施し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が最も高い画分付近を分取する場合には、具体的には以下の手順にて行えばよい。
たとえば脱塩カラム  ＰＤ−１０（アマシャム  バイオサイエンス社製）を使用し、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記抽出用液にて溶出する、というような条件にて行う。上記ゲル濾過用緩衝液は、上記抽出用液に、グリセロールをさらに添加したものであることが好ましい。グリセロールは、通常、５（ｖ／ｖ）％〜４０（ｖ／ｖ）％（好ましくは、２０（ｖ／ｖ）％）となるように添加すればよい。ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６ｍＬを１画分とするのが好ましい。
次に、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する。当該処理は、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（アマシャム  バイオサイエンス社製）などの機器を用いて、各画分について上記２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、この吸光度が最も高い画分付近を分取し、これを抽出液とする。
【００４３】
〔Ｂ〕昆虫培養細胞由来の抽出物を含有する抽出液の調製方法
昆虫培養細胞から抽出液を調製する場合、本発明者らが提案する、抽出用液中に懸濁した昆虫培養細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有する方法によって調製するのが好ましい。ここで「急激に凍結」とは、１０秒以下、好ましくは２秒以下にて、昆虫培養細胞を凍結させることを指す。また昆虫培養細胞を急激に凍結させる温度としては、通常−８０℃以下であり、好ましくは−１５０℃以下である。上記昆虫培養細胞の急激な凍結は、たとえば、液体窒素や液体ヘリウムなどの不活性ガスを使用することなどによって実現できるが、入手が容易であり安価な液体窒素を用いて行うのが好ましい。
かかる方法によって昆虫培養細胞からの抽出を行うことにより、緩和な状態で細胞の破砕を行うことができ、無細胞系タンパク質合成に必須な成分を破壊することなく細胞外に取り出すことができ、従来よりもタンパク質の合成量の高い無細胞系タンパク質合成用抽出液を容易に調製することができる。さらに、使用器具などからのＲＮａｓｅなどの混入も防ぐことができ、また、界面活性剤などの試薬を用いた細胞破砕法の場合に懸念される翻訳反応を阻害するような物質の持込みもない。
【００４４】
上記本発明者らが提案する抽出液の調製方法では、上述した急激に凍結させる工程を少なくとも含有しているならば、その他の工程について特に制限はない。たとえば、乳鉢中で乳棒を用いてすり潰す方法、ダウンスホモジナイザーを用いる方法、ガラスビーズを用いる方法など、大腸菌や小麦胚芽などから無細胞系タンパク質合成用抽出液を得る際に従来より行われていた種々の手法にて昆虫培養細胞を破砕し、抽出を行えばよい。中でも、上記昆虫培養細胞を急激に凍結させた後、解凍し、遠心分離することによって昆虫培養細胞を破砕するのが好ましい。
【００４５】
上記急激に凍結した昆虫培養細胞を、解凍した後、遠心分離する場合、解凍は、たとえば−１０℃〜２０℃の水浴または氷水浴中での解凍、室温（２５℃）にての放置などによって実現できるが、タンパク質合成に必須な成分の失活を防止し、タンパク質合成能の低下を確実に防ぐことから、０℃〜２０℃（特には、４℃〜１０℃）の水浴または氷水浴中で解凍を行うのが好ましい。解凍した昆虫培養細胞の遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行えばよい。かかる遠心分離後の上清には、目的とする昆虫培養細胞の抽出物が含有される。
【００４６】
細胞破砕後、上記遠心分離後の上清（上清Ｂ１）をそのまま抽出液としてもよいし、上清Ｂ１をさらに遠心分離（１０，０００×ｇ〜１００，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜１２０分間）にかけて、得られた上清（上清Ｂ２）を抽出液としてもよい。さらに、上記上清Ｂ１または上清Ｂ２をゲル濾過し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分（吸収の大きな画分）を分取して、これを抽出液としてもよい。この場合、具体的には以下の手順にて行う。
まず、上清Ｂ１または上清Ｂ２についてゲル濾過を行うが、ゲル濾過は、たとえば脱塩カラム  ＰＤ−１０（アマシャム  バイオサイエンス社製）を好適に使用することができ、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記ゲル濾過用緩衝液にて溶出する、というような条件にて行えばよい。上記ゲル濾過用緩衝液としては、従来公知の適宜の組成のものを特に制限なく使用することができ、たとえば、１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）、５０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦを含有するゲル濾過用緩衝液を用いることができる。ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６ｍＬを１画分とするのが好ましい。
続いて、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（アマシャム  バイオサイエンス社製）などの機器を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分（吸収の大きな画分）をゲル濾過後の濾液より分取して、これを抽出液とする。
【００４７】
また上記ゲル濾過で得られた吸収の大きな画分を、さらに遠心分離にかけて、得られた上清（上清Ｂ３）を抽出液とするようにしてもよい。このゲル濾過後の遠心分離は、翻訳反応を阻害する不溶性の成分を除去するという理由から、３０，０００×ｇ〜１００，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間の条件で行うのが、好ましい。
【００４８】
なお、本発明の調製方法に供する昆虫培養細胞は、培養に用いる培地の翻訳反応液への持込みを避けるため、上記急激な凍結を行う前に、プロテアーゼインヒビターおよびグリセロールを含有しない以外は、上述した昆虫培養細胞用の好適な抽出用液と同じ組成の洗浄液にて予め洗浄しておくのが好ましい。洗浄液での洗浄は、昆虫培養細胞に洗浄液を添加し、これを遠心分離（たとえば、７００×ｇ、１０分間、４℃という条件）することによって行う。洗浄に用いる洗浄液の量は、培地を完全に洗い流すという理由から、湿重量１ｇの昆虫培養細胞に対し５ｍＬ〜１００ｍＬであるのが好ましく、１０ｍＬ〜５０ｍＬであるのがより好ましい。洗浄回数は、１回〜５回行うのが好ましく、２回〜４回行うのがより好ましい。
【００４９】
本発明の抽出液中における節足動物由来の抽出物の含有量に特に制限はないが、タンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬであるのが好ましく、中でも１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ未満であると、無細胞系タンパク質合成に必須な成分の濃度が低くなり、充分な合成反応が行えなくなる虞があるためであり、また当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で２００ｍｇ／ｍＬを越えると、抽出液自体が高い粘性を有し、操作しづらい虞があるためである。
なお上記範囲の量の節足動物由来の抽出物を含有する抽出液は、抽出液のタンパク質濃度測定を利用して、調製できる。当該タンパク質濃度測定は、当分野において通常行われているように、たとえばＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用し、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する、といった手順によって行う。分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用する。
【００５０】
無細胞系タンパク質合成方法においては、たとえば上述したようにして調製された抽出液を用いて、翻訳系用反応液または転写／翻訳系用反応液を調製する。翻訳系用反応液、転写／翻訳系用反応液のいずれの場合であっても、上記抽出液を１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するように調製されたものであるのが好ましい。すなわち、反応液の全体において、節足動物由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０ｍｇ／ｍＬを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
以下、節足動物由来の抽出物を含有する抽出液を用いた場合における（１）翻訳系用反応液、（２）転写／翻訳系用反応液について、それぞれ説明する。
【００５１】
（１）翻訳系用反応液
翻訳系用反応液は、上記節足動物由来抽出液を除く成分として、翻訳鋳型、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ＲＮａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。かかる翻訳系用反応液を使用して翻訳系合成反応を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。
【００５２】
なお翻訳系用反応液に用いる翻訳鋳型は、その塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならばｍＲＮＡ全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各ｍＲＮＡは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。
翻訳系用反応液中において、翻訳鋳型は、タンパク質合成の速度の観点から、１μｇ／ｍＬ〜２０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または２０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００５３】
翻訳系用反応液中におけるカリウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該翻訳系用反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５４】
翻訳系用反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出用液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該翻訳系用反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５５】
翻訳系用反応液中におけるＤＴＴは、上述した抽出用液におけるＤＴＴの場合と同様の観点から、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５６】
翻訳系用反応液中におけるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５７】
翻訳系用反応液中におけるグアノシン三リン酸（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００５８】
翻訳系用反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５９】
翻訳系用反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００６０】
翻訳系用反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜２００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００６１】
翻訳系用反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在する節足動物由来のＲＮａｓｅによって、無細胞系タンパク質合成の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００６２】
翻訳系用反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００６３】
翻訳系用反応液に含有される緩衝剤としては、上述した抽出用液に用いたものと同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出用液における緩衝剤の場合と同様の観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００６４】
また翻訳系用反応液は、さらにグリセロールを添加されたものであるのがより好ましい。グリセロールを添加すると、翻訳系合成反応においてタンパク質合成に必須な成分を安定化できるという利点があるためである。グリセロールを添加する場合、通常、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％となるように添加する。
【００６５】
さらに、翻訳系用反応液は、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（以下、「ＥＧＴＡ」ということがある。）を含有するのが好ましい。ＥＧＴＡを含有すると、ＥＧＴＡが抽出液中の金属イオンとキレートを形成することでリボヌクレアーゼ、プロテアーゼなどを不活化させることにより、無細胞系タンパク質合成に必須な成分の分解を阻害することができるためである。該ＥＧＴＡは、上記反応液中において、上記分解阻害能を好適に発揮し得る観点から０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＥＧＴＡが０．０１ｍＭ未満であると必須な成分の分解活性を充分に抑えることができない傾向にあるためであり、また、１０ｍＭを越えるとタンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００６６】
すなわち、翻訳系用反応液としては、節足動物由来抽出物を含有する抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％のグリセロール、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜２００μＭのアミノ酸成分、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、１０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬの翻訳鋳型、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を含有するように実現されるのが好ましい。また、上記に加えてさらに０．１ｍＭ〜５ｍＭのＥＧＴＡを含有するように実現されるのがより好ましい。
【００６７】
上記翻訳系用反応液を用いた無細胞系タンパク質合成反応（翻訳系合成反応）は、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。反応温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また反応温度が４０℃を越えると、必須な成分が変性する傾向にあるためである。反応の時間は、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
【００６８】
（２）転写／翻訳系用反応液
転写／翻訳系用反応液は、上記抽出液を除く成分として、転写鋳型、ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、シチジン５'−三リン酸、ウリジン５'−三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分およびｔＲＮＡを少なくとも含有するのが好ましい。かかる転写／翻訳系用反応液を使用して転写／翻訳系合成反応を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。
【００６９】
なお転写鋳型は、塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならば、その構造遺伝子が同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、転写鋳型における構造遺伝子は、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。
転写鋳型は、転写／翻訳系用反応液中において、０．１μｇ／ｍＬ〜８０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、３μｇ／ｍＬ〜６００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。転写鋳型が０．１μｇ／ｍＬ未満または８０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００７０】
転写／翻訳系用反応液に用いるＲＮＡポリメラーゼは、転写鋳型が有するプロモーター配列に応じて適宜選択することができる。たとえば、転写鋳型がＴ７プロモーター配列を有している場合は、その配列を認識するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。また転写鋳型が、ＳＰ６またはＴ３プロモーター配列を有している場合は、それぞれ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。
ＲＮＡポリメラーゼは、ｍＲＮＡ合成の速度およびタンパク質合成の速度の観点から、転写／翻訳系用反応液中に０．０１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、０．１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮＡポリメラーゼが０．０１Ｕ／μＬ未満であると、ｍＲＮＡの合成量が少なくなり、結果としてタンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためであり、またＲＮＡポリメラーゼが１００Ｕ／μＬを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００７１】
転写／翻訳系用反応液中におけるＡＴＰは、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７２】
転写／翻訳系用反応液中におけるＧＴＰは、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００７３】
転写／翻訳系用反応液中におけるシチジン５'−三リン酸（以下、「ＣＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＣＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７４】
転写／翻訳系用反応液中におけるウリジン５'−三リン酸（以下、「ＵＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＵＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７５】
転写／翻訳系用反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、転写／翻訳系用反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７６】
転写／翻訳系用反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、転写／翻訳系用反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７７】
転写／翻訳系用反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
タンパク質合成の速度の観点からは、転写／翻訳系用反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜５００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７８】
転写／翻訳系用反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。ｔＲＮＡは、タンパク質合成の速度の観点からは、転写／翻訳系用反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００７９】
転写／翻訳系用反応液は、さらに、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅインヒビター、スペルミジンおよび緩衝剤を含有するのが好ましい。
【００８０】
転写／翻訳系用反応液中におけるカリウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該転写／翻訳系用反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００８１】
転写／翻訳系用反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出用液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該転写／翻訳系用反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００８２】
転写／翻訳系用反応液中におけるＤＴＴは、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜２０ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未満または１００ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００８３】
転写／翻訳系用反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在する節足動物由来のＲＮａｓｅによって、転写／翻訳系合成反応の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で添加されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００８４】
上記スペルミジンは、転写における伸張反応を促進する目的で添加されるものであり、転写／翻訳系用反応液中において０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることが好ましく、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることがより好ましい。スペルミジンが０．０１ｍＭ未満であると、ｍＲＮＡの合成速度が低下し生成するｍＲＮＡの量が少なくなり、結果としてタンパク質合成の速度が低下するというような傾向にあるためであり、またスペルミジンが１００ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００８５】
転写／翻訳系用反応液に含有される緩衝剤としては、上述した抽出用液に用いたものと同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出用液における緩衝剤の場合と同様の観点から、１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、５ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００８６】
また転写／翻訳系用反応液は、さらにグリセロールを添加されたものであるのがより好ましい。グリセロールを添加すると、転写／翻訳系合成反応においてタンパク質合成に必須な成分を安定化できるという利点があるためである。グリセロールを添加する場合、通常、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％となるように添加する。
【００８７】
すなわち、転写／翻訳系用反応液としては、当該抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、さらに３μｇ／ｍＬ〜６００μｇ／ｍＬの転写鋳型、０．１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮＡポリメラーゼ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＣＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＵＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜５００μＭのアミノ酸成分、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡを含有するのが好ましい。さらには、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜２０ｍＭのＤＴＴ、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭのスペルミジン、５ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％のグリセロールを含有するように実現されるのが好ましい。
【００８８】
上記転写／翻訳系用反応液を用いた無細胞系タンパク質合成反応（転写／翻訳系合成反応）についても、上記翻訳系合成反応の場合と同様、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行えばよい。転写工程の反応温度は、通常、１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲内である。転写工程の反応温度が１０℃未満であると、転写の速度が低下する傾向にあり、また転写工程の反応温度が６０℃を越えると、反応に必須な成分が変性する傾向にあるためである。また翻訳工程の温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。翻訳工程の反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また翻訳工程の反応温度が４０℃を越えると、反応に必須な成分が変性する傾向にあるためである。
転写／翻訳系合成反応では、転写、翻訳工程を連続して実施し得るという観点から両工程に好適な２０℃〜３０℃の範囲で反応を行うことが特に好ましい。反応の時間は、全工程あわせて、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
【００８９】
上記翻訳系用反応液、転写／翻訳系用反応液を使用して合成できるタンパク質に特に制限はない。合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。
【実施例】
【００９０】
１．無細胞系タンパク質合成に用いる鋳型ＤＮＡの調製
１−１．１回目のＰＣＲ
ルシフェラーゼの構造遺伝子を有するｐＧＥＭ−ｌｕｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）５ｎｇを鋳型とし、配列表配列番号１２に示す塩基配列を有するプライマー（ＬＵＣ−ＡＴＧ）と配列表配列番号１３に示す塩基配列を有するプライマー（ｐＧＥＭ−ｌｕｃ１１−３１）と、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃１２０秒、３０サイクルのＰＣＲを行い、ルシフェラーゼ構造遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む約１．７ｋｂｐの領域を増幅した。そして反応液より、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（プロメガ社製）を用いてＰＣＲ増幅産物を精製した。
１−２．Ｔ７プロモーターおよびエンハンサー配列を含むＤＮＡの調製
Ｔ７プロモーターおよびＥｏＮＰＶ（Ecotropis oblique nuclear plyhydrosis virus）のポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの逆方向（３’→５’）の配列を含んだ配列表配列番号１４に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７−ＥｏＮＰＶ−Ｒｖ）と、それとは相補的な配列である配列表配列番号１５に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７−ＥｏＮＰＶ−Ｒｖ−Ｒ）をそれぞれＴ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（東洋紡績社製）によってその５’末端のリン酸化を行った。反応終了後、２つのプライマーを混合し、９５℃で３分間熱処理した。これを室温になるまで静置しアニーリングさせた。二本鎖化したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分離した後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。得られたＤＮＡをＴ７−ＥｏＮＰＶ５’ＵＴＲ−Ｒｖとした。
また、Ｔ７プロモーターおよびＳｆＮＰＶ（Spodoptera frugiperda nuclear plyhydrosis virus）のポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの配列を含んだ配列表配列番号１６に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７−ＳｆＮＰＶ）と、それとは相補的な配列である配列表配列番号１７に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７−ＳｆＮＰＶ−Ｒ）を用い、上記と同じ方法で精製し、得られたＤＮＡをＴ７−ＳｆＮＰＶ５’ＵＴＲとした。
１−３．ライゲーション
上記１−１で得られたＰＣＲ増幅産物と、上記１−２で得られたＴ７−ＥｏＮＰＶ５’ＵＴＲ−ＲｖまたはＴ７−ＳｆＮＰＶ５’ＵＴＲを、それぞれ１μｌとＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＮＥＢ社製）を用い、２５℃１０分間インキュベーションすることによりライゲーションを行った。
１−４．二回目のＰＣＲ
ライゲーションサンプルを１０倍希釈し、その１μｌを鋳型とし、配列表配列番号１８に示す塩基配列を有するプライマー（ｐＴＮＴ  Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）と配列表配列番号１３に示す塩基配列を有するプライマー（ｐＧＥＭ−ｌｕｃ１１−３１）と、ＫＯＤ  ｐｌｕｓを用い、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃１２０秒、３０サイクルのＰＣＲを行い、Ｔ７プロモーター、ＥｏＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの逆方向の配列またはＳｆＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの配列、およびルシフェラーゼ構造遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む約１．８ｋｂの領域を増幅した。そして反応液より、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてＰＣＲ増幅産物を精製し、得られたＤＮＡをそれぞれＴ７−ＥｏＮＰＶ５’ＵＴＲ−Ｒｖ−ＬｕｃとＴ７−ＳｆＮＰＶ５’ＵＴＲ−Ｌｕｃとした。
【００９１】
２．コントロールとして用いた鋳型ＤＮＡの調製
２−１．ベクターｐＴＮＴ−Ｌｕｃの構築
ルシフェラーゼをコードする構造遺伝子を有するｐＧＥＭ−Ｌｕｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）５ｎｇを鋳型とし、配列表配列番号２１に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ  Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎ）と、配列表配列番号２２に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ  Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ）と、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、９６℃２分で鋳型を変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃１２０秒、３０サイクルのＰＣＲを行い、構造遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を増幅した。エタノール沈殿によりＰＣＲ産物を精製した後、ＫｐｎＩで消化した。これとは別に、ｐＴＮＴＴＭ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）をＫｐｎＩで消化した。これらの反応液をアガロースゲル電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ  Ｅｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（シグマ社製）を用いて精製した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて、これらをライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５α（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換した大腸菌からアルカリ−ＳＤＳ法により調製したプラスミドを、配列表配列番号１８に示す塩基配列を有するプライマー（ｐＴＮＴ  Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）およびＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてシークエンシング反応（９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分、２５サイクル）を行った。この反応液をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）に供し、塩基配列解析を行った。ｐＴＮＴＴＭ  Ｖｅｃｔｏｒ由来の５'−βグロビンリーダー配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子の開始コドンが挿入されたプラスミドをｐＴＮＴ−Ｌｕｃと命名した。
【００９２】
２−２．ｐＥｏｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃの作製
上記２−１で作成したプラスミドベクターｐＴＮＴ−Ｌｕｃを鋳型にして、配列表配列番号２３に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７ｐ  Ｒｖ）と、配列表配列番号１２に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ−ＡＴＧ）を用い、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃５分、３０サイクルのＰＣＲを行った。反応終了後、電気泳動でＰＣＲ産物を分離した後、Ｇｅｎ  Ｅｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（シグマ社製）を用いて精製し、これをライゲーション反応に用いた。このようにして、５’ＵＴＲの挿入の効果を確認すべく、プラスミドベクターｐＴＮＴ−ＬｕｃからＳＰ６プロモーター配列、５'−βグロビンリーダー配列およびルシフェラーゼをコードする構造遺伝子の５’上流側マルチクローニングサイトを欠失せしめたプラスミドベクターを得た。
配列表配列番号８に示す塩基配列を有するＥｏＮＰＶ(Ecotropis oblique nuclear polyhedrosis virus)のポリへドリン遺伝子の５’ＵＴＲのセンス鎖、アンチセンス鎖をＤＮＡ合成機で合成し、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡績社製）によってその５’末端のリン酸化を行った。反応終了後、センス鎖とアンチセンス鎖とを混合し、９５℃５分間熱処理した。これを室温になるまで静置しセンス鎖とアンチセンス鎖とをアニーリングさせた。エタノール沈殿により精製した後、水に溶解させた。ＳｉｇｍａＳｐｉｎ  Ｐｏｓｔ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（シグマ社製）によって、過剰のＡＴＰを取り除いた後、再度エタノール沈殿により精製した。得られた二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５’上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴＮＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。ＥｏＮＰＶのポリへドリン遺伝子の５’ＵＴＲが逆方向（３’→５’）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＥｏｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃと名付けた。
２−３．ｐＥｏｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ（Ａ）−の作製
Ｔ７−ＥｏＮＰＶ５’ＵＴＲ−Ｒｖ−Ｌｕｃの比較用ベクターとしてｐＥｏｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ（Ａ）−を作製した。
ｐＥｏｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃ  ５ｎｇを鋳型として、配列表配列番号１９に示す塩基配列を有するプライマー（ｐＴＮＴ１６１−１８１）と、配列表配列番号２０に示す塩基配列を有するプライマー（ｐＴＮＴ１１０−１３０−Ｒ）を用い、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃４分、３０サイクルのＰＣＲを行った。エタノール沈殿にてＰＣＲ産物を精製した後、Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（東洋紡績社製）によって５’末端のリン酸化を行った。この反応液をアガロースゲル電気泳動で分離した後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。この直鎖状ＤＮＡをＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、セルフライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５α（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換した大腸菌からアルカリ−ＳＤＳ法により調製したプラスミドＤＮＡをｐＥｏｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ（Ａ）−とした。このプラスミドＤＮＡは、ｐＥｏｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃの３０塩基あるＰｏｌｙ（Ａ）配列のみが欠損した配列を有する。
２−４．ｐＳｐｈｄ−Ｌｕｃの作製
配列表配列番号１０に示す塩基配列を有するＳｆＮＰＶ(Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus)のポリへドリン遺伝子の５’ＵＴＲを用いた以外は、上記２−２と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５’上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴＮＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。ＳｆＮＰＶのポリへドリン遺伝子の５’ＵＴＲが順方向（５’→３’）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＳｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
２−５．ｐＳｐｈｄ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ（Ａ）−の作製
Ｔ７−ＳｆＮＰＶ５’ＵＴＲ−Ｌｕｃの比較用ベクターとしてｐＳｐｈｄ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ（Ａ）−を作製した。
ｐＳｐｈｄ−Ｌｕｃ  ５ｎｇを鋳型として上記２−３と同様の方法にて作製した。
【００９３】
３．カイコ抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成
３−１．インビトロ転写反応およびｍＲＮＡの精製
作製した各ベクター（鋳型ＤＮＡ）を、ＢａｍＨＩまたはＢｇｌＩＩで消化した後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。得られたベクター１μｇを鋳型として、ＲｉｂｏＭａｘ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（プロメガ社製）を用い２０μｌスケールで３７℃４時間のインビトロ転写反応を行い、ｍＲＮＡを合成した。
転写反応終了後、１ＵのＲＱ１  ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（プロメガ社製）を添加し、３７℃１５分インキュベートし、鋳型を消化した。フェノール−クロロホルム抽出によりタンパク質を除去した後、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を１００μｌの滅菌水に溶解し、Ｎｉｃｋ  ｃｏｌｕｍｎ（アマシャム  バイオサイエンス社製）にアプライした後、滅菌水で溶出した。溶出画分に酢酸カリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、エタノール沈殿を行った。合成されたｍＲＮＡの定量は２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定して行った。
３−２．翻訳反応
（カイコ抽出液の調製）
５齢期４日目のカイコ幼虫１５匹よりハサミ、ピンセット、メス、スパーテルを使用して、後部絹糸腺３．０７ｇを摘出し、これを−８０℃で凍結させた乳鉢ですり潰し、下記組成の抽出用液を用いて、抽出を行った。
〔抽出用液の組成〕
・２０ｍＭ        ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ      酢酸カリウム
・２ｍＭ          酢酸マグネシウム
・２ｍＭ          ＤＴＴ
・０．５ｍＭ      ＰＭＳＦ
抽出後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３（日立工機社製））にて、３０，０００×ｇ、３０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。
遠心分離後、上清のみを単離し、再び３０，０００×ｇ、１０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離した。脱塩カラム  ＰＤ−１０（アマシャム  バイオサイエンス社製）に、２０％グリセロールを含む抽出用液を加えカラムを平衡化した後、上清を供給し、上記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行った。
ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取して、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の無細胞系タンパク質合成用抽出液を得た。
得られた抽出液について、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用い、タンパク質濃度を測定した。まず反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとして、ＢＳＡを用い、検量線を作成した。
抽出液中におけるカイコ幼虫の後部絹糸腺の含有量は、タンパク質濃度で１７．５ｍｇ／ｍＬであった。
（反応）
調製したカイコ抽出液を用い、上記３−１で得られた各ｍＲＮＡそれぞれについて、下記組成の翻訳系用反応液を調製し、翻訳反応を行った。
〔翻訳系用反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％  カイコ抽出液
・１６０μｇ／ｍＬ  ｍＲＮＡ
・３０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ        酢酸カリウム
・１．０ｍＭ        酢酸マグネシウム
・０．５ｍＭ        ＤＴＴ
・１０（ｖ／ｖ）％  グリセロール
・０．５ｍＭ        ＡＴＰ
・０．５ｍＭ        ＧＴＰ
・０．２５ｍＭ      ＥＧＴＡ
・２５ｍＭ          クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ  クレアチンキナーゼ
・４０μＭ          アミノ酸（２０種）
・２Ｕ／μＬ        ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。翻訳反応は反応温度２５℃で６時間行い、反応液量は２５μＬとした。合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
【００９４】
４．昆虫細胞抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成
４−１．インビトロ転写反応およびｍＲＮＡの精製
上記作製した各ベクター（鋳型ＤＮＡ）を、ＢａｍＨＩまたはＢｇｌＩＩで消化した後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。得られたベクター１μｇを鋳型として、ＲｉｂｏＭａｘ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（プロメガ社製）を用い２０μｌスケールで３７℃４時間のインビトロ転写反応を行い、ｍＲＮＡを合成した。
転写反応終了後、１ＵのＲＱ１  ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（プロメガ社製）を添加し、３７℃１５分インキュベートし、鋳型を消化した。フェノール−クロロホルム抽出によりタンパク質を除去した後、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を１００μｌの滅菌水に溶解し、Ｎｉｃｋ  ｃｏｌｕｍｎ（アマシャム  バイオサイエンス社製）にアプライした後、滅菌水で溶出した。溶出画分に酢酸カリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、エタノール沈殿を行った。合成されたｍＲＮＡの定量は２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定して行った。
４−２．翻訳反応
（昆虫培養細胞抽出液の調製）
細胞数２．１×１０７個の昆虫培養細胞Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、Ｌ−グルタミンを添加したＥｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を入れた培養フラスコ（６００ｃｍ２）内で２７℃で６日間培養した。結果、細胞数１．０×１０８個、湿重量１．２１ｇとなった。
次いで上記培養した昆虫培養細胞を集菌し、下記組成の洗浄液で３回洗浄（７００×ｇ、４℃、１０分間の条件で遠心分離）した。
〔洗浄液の組成〕
・６０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・２００ｍＭ        酢酸カリウム
・４ｍＭ            酢酸マグネシウム
・４ｍＭ            ＤＴＴ
洗浄後の昆虫培養細胞に、下記組成の抽出用液を１ｍＬ加え、懸濁した。
〔抽出用液の組成〕
・４０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ        酢酸カリウム
・２ｍＭ            酢酸マグネシウム
・２ｍＭ            塩化カルシウム
・２０（ｖ／ｖ）％  グリセロール
・１ｍＭ            ＤＴＴ
・１ｍＭ            ＰＭＳＦ
この懸濁液を液体窒素中にて急速に凍結させた。充分に凍結させた後、約４℃の氷水浴中で解凍した。完全に解凍した後、３０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）し、上清を回収した。回収した上清１．５ｍＬを下記組成のゲル濾過用緩衝液で平衡化したＰＤ−１０脱塩カラム（アマシャム  バイオサイエンス社製）にアプライした。
〔ゲル濾過用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ        酢酸カリウム
・２ｍＭ            酢酸マグネシウム
・１ｍＭ            ＤＴＴ
・１ｍＭ            ＰＭＳＦ
アプライした後、ゲル濾過用緩衝液４ｍＬにて溶出し、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分を回収し、昆虫培養細胞抽出液とした。
（反応）
調製した昆虫培養細胞抽出液を用い、上記４−１で得られた各ｍＲＮＡそれぞれについて、下記組成の翻訳系用反応液を調製し、翻訳反応を行った。
〔翻訳系用反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％  昆虫培養細胞抽出液
・３２０μｇ／ｍＬ  ｍＲＮＡ
・３０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ        酢酸カリウム
・２ｍＭ            酢酸マグネシウム
・２ｍＭ            ＤＴＴ
・０．５ｍＭ        ＡＴＰ
・０．２５ｍＭ      ＧＴＰ
・２０ｍＭ          クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ  クレアチンキナーゼ
・４０μＭ          アミノ酸（２０種）
・０．２５ｍＭ      ＥＧＴＡ
・１Ｕ／μＬ        ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・２００μｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター(宝酒造社製)、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。翻訳反応は反応温度２５℃で８時間行い、反応液量は２５μＬとした。
合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
【００９５】
５．実験結果
５−１．カイコ抽出液を用いた無細胞翻訳反応
カイコ抽出液を用いた無細胞翻訳反応におけるルシフェラーゼ合成量を図１に示す。コントロールとして用いたｐＳｐｈｄ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ（Ａ）−を鋳型ＤＮＡとした場合の生産量を１００とした場合、ライゲーションとＰＣＲにより調製したＴ７−ＳｆＮＰＶ’ＵＴＲ−Ｌｕｃでは、約６９％の合成量であった。
５−２．昆虫細胞抽出液（ＨｉｇｈＦｉｖｅ抽出液）を用いた無細胞翻訳反応
ＨｉｇｈＦｉｖｅ抽出液を用いた無細胞翻訳反応におけるルシフェラーゼ合成量を図２に示す。コントロールとして用いたｐＥｏｐｈｄ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ（Ａ）−を鋳型ＤＮＡとした場合の生産量を１００とした場合、ライゲーションとＰＣＲにより調製したＴ７−ＥｏＮＰＶ’ＵＴＲ−Ｌｕｃでは、約８４％の合成量であった。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】カイコ抽出液を用いた無細胞翻訳反応におけるルシフェラーゼ合成量を示した図である。コントロールとして用いたｐＳｐｈｄ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ（Ａ）−を鋳型ＤＮＡとした場合の生産量を１００％とした場合の相対合成量を縦軸に示している。
【図２】昆虫細胞抽出液（ＨｉｇｈＦｉｖｅ抽出液）を用いた無細胞翻訳反応におけるルシフェラーゼ合成量を示した図である。コントロールとして用いたｐＥｏｐｈｄ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ（Ａ）−を鋳型ＤＮＡとした場合の生産量を１００％とした場合の相対合成量を縦軸に示している。
【配列表フリーテキスト】
【００９７】
配列番号１：カイコフィブロインＬ鎖遺伝子５’ＵＴＲの塩基配列
配列番号２：カイコセリシン遺伝子５’ＵＴＲの塩基配列
配列番号３：ＡｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子５’ＵＴＲの塩基配列
配列番号４：ＢｍＣＰＶポリヘドリン遺伝子５’ＵＴＲの塩基配列
配列番号５：ＥｓＣＰＶポリヘドリン遺伝子５’ＵＴＲの塩基配列
配列番号６：ＨｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子５’ＵＴＲの塩基配列
配列番号７：ＣｒＮＰＶポリヘドリン遺伝子５’ＵＴＲの塩基配列
配列番号８：ＥｏＮＰＶポリヘドリン遺伝子５’ＵＴＲの塩基配列
配列番号９：ＭｎＮＰＶポリヘドリン遺伝子５’ＵＴＲの塩基配列
配列番号１０：ＳｆＮＰＶポリヘドリン遺伝子５’ＵＴＲの塩基配列
配列番号１１：ＷｓＮＰＶポリヘドリン遺伝子５’ＵＴＲの塩基配列
配列番号１２：プライマー  ＬＵＣ−ＡＴＧ
配列番号１３：プライマー  ｐＧＥＭ−ｌｕｃ１１−３１
配列番号１４：プライマー  Ｔ７−ＥｏＮＰＶ−Ｒｖ
配列番号１５：プライマー  Ｔ７−ＥｏＮＰＶ−Ｒｖ−Ｒ
配列番号１６：プライマー  Ｔ７−ＳｆＮＰＶ
配列番号１７：プライマー  Ｔ７−ＳｆＮＰＶ−Ｒ
配列番号１８：プライマー  ｐＴＮＴ  Ｔ７プロモーター
配列番号１９：プライマー  ｐＴＮＴ１６１−１８１
配列番号２０：プライマー  ｐＴＮＴ１１０−１３０−Ｒ
配列番号２１：プライマー  Ｌｕｃ  Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎ
配列番号２２：プライマー  Ｌｕｃ  Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ
配列番号２３：プライマー  Ｔ７ｐ  Ｒｖ
【図１】
2005073609.tif 000002
【図２】
2005073609.tif 000003
【配列表】
2005073609000001.app