(57)【要約】【課題】  夾雑物の生成を抑えるとともに失活率の少ないプラスミノーゲンの加熱処理方法を提供する。【解決手段】  塩酸Ｌ−リジン０.２５Ｍを含むプラスミノーゲン含有溶液に、１０〜２０w/v％のグリシンと、５〜１５w/v％の単糖類、寡糖類および糖アルコールからなる群から選ばれた少なくとも１種、例えばソルビトールと、グリセリンおよび／またはポリエチレングルコールを少なくとも５v/v％以上存在させて、５０〜７０℃で５〜３０時間加熱処理する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リジンおよび／またはグリシンと、単糖類、寡糖類および糖アルコールからなる群から選ばれた少なくとも１種と、グリセリンおよび／またはポリエチレングリコールの存在下に、プラスミノーゲン含有溶液を加熱処理することを特徴とするプラスミノーゲン含有溶液の処理方法。
【請求項２】
前記グリセリンおよびポリエチレングリコールの存在量がプラスミノーゲン含有溶液中５v/v％以上であることを特徴とする請求項１に記載のプラスミノーゲン含有溶液の処理方法。
【請求項３】
前記糖アルコールとして、ソルビトールを用いることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載のプラスミノーゲン含有溶液の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラスミノーゲン含有溶液の処理方法、具体的には当該溶液の加熱処理に伴うプラスミノーゲン活性低下の防止に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プラスミノーゲン製剤は、血栓溶解剤としての臨床応用が検討されており、近年注目されている製剤の一つである。この製剤に用いられるプラスミノーゲンはヒト血漿に由来したものが多く、ウイルス、例えば肝炎ウイルスやＡＩＤＳウイルスがその製剤中に混入するおそれがある。そこで、これらのウイルスを不活化するために、プラスミノーゲン含有組成物を溶液状態で加熱することが行われている。
【０００３】
しかし、このような加熱処理によりプラスミノーゲンの活性が低下する。このために、例えば、特開昭５５−１４５６１５号公報や特開昭平１−３０５０３６号公報では、安定化剤としてマンニットやソルビット等の糖アルコールやグリシン、リジン等のアミノ酸などを加えて加熱処理を行い活性の低下を抑えている。また、特開昭６２−５４２８６号公報では、グリシン、α−もしくはβ−アラニン、ヒドロキシプロリン、プロリンなどのアミノ酸と単糖類、寡糖類あるいは糖アルコールとを加えて加熱処理を行い、活性の低下を抑えている。
【特許文献１】特開昭５５−１４５６１５号公報
【特許文献２】特開平１−３０５０３６号公報
【特許文献３】特開昭６２−５４２８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、これらの方法では、後述するように、プラスミノーゲンの安定化方法として十分なものであるとは言えず、さらに失活の少ない処理方法が求められている。また、これらの方法に従って糖類（単糖類、寡糖類、糖アルコール）を添加して加熱処理すれば、添加濃度や加熱条件によっては夾雑物を生じる可能性があり、まれに処理後に着色やにごり等を生じるなど溶液の性状の悪化を招く結果、工程管理上問題があったとみなされる場合があった。
【０００５】
本発明は、このような従来技術の問題点に鑑みてなされたものであって、本発明者らはさらなる安定化を目指して鋭意努力したところ、アミノ酸と糖類の添加だけでなく、さらにグリセリンやポリエチレングリコールを添加することにより活性の低下がより一層抑制されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明の処理方法は、リジンおよび／またはグリシンと、単糖類、寡糖類および糖アルコールからなる群から選ばれた少なくとも１種と、グリセリンおよび／またはポリエチレングリコールの存在下に、プラスミノーゲン含有溶液を加熱処理することを特徴としている。
【０００７】
このとき、グリセリンおよびポリエチレングリコールをプラスミノーゲン含有溶液中５v/v％以上存在させて加熱処理するのがよく、また、糖アルコールとして、ソルビトールを用いるのが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、従来方法であるアミノ酸と糖類を併存させて加熱する方法に比べて活性の低下が少なく、処理後の着色やにごり等溶液の性状の変化も防止できる。このように本発明は、加熱処理における活性の低下を抑制し、原料となる血液のさらなる有効利用を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の処理方法は、プラスミノーゲンを含有する溶液を加熱し、製剤中への夾雑が危惧されるウイルスを不活化する方法として用いられるものである。したがって、本発明が適用される多くのプラスミノーゲンはヒト血漿に由来するものではあるが、ヒト血漿以外にヒト以外の動物、例えばブタやウシ血漿に由来するものやいわゆるバイオテクノロジー手法により動物や細菌を用いて得られたプラスミノーゲンにも適用が可能なものである。
【００１０】
本発明においては、リジンまたはグリシンの少なくとも一方、好ましくはその両者が必須成分として、加熱処理の対象であるプラスミノーゲン溶液に添加される。また、従来方法において用いられてきた糖類、具体的には、単糖類、寡糖類もしくは糖アルコールからなる群から選ばれた少なくとも１種が必須成分として添加される。そして、本発明の処理方法に特有な成分として、グリセリンまたはポリエチレングリコールの少なくとも一方もしくはその両者が添加される。
【００１１】
用いられるリジンまたはグリシンはいずれもＬ型アミノ酸であって、遊離のアミノ酸やその塩酸塩などの塩いずれでもよい。その添加量は、例えば前記各特許文献に記載された方法の範囲内で設定すればよい。具体的には、遊離のアミノ酸として０.７Ｍ〜３.０Ｍ、好ましくは１.８〜２.３Ｍである。さらに具体的に言えば、次のようになる。通常、当該加熱処理の前段階であるプラスミノーゲンの精製工程において、塩酸リジンを０.２５Ｍ程度含むプラスミノーゲン含有溶液が得られる。この溶液に対して、グリシン（遊離のアミノ酸として）が５w/v％以上、より好ましくは１０〜１５w/v％程度添加される。なお、グリシンを２０w/v％を越えて配合しても活性の維持には繋がらない。
【００１２】
単糖類は、５単糖、６単糖などいずれの炭素数の単糖であってもよく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、フラクトースなどが例示される。この中でも好ましいのはグルコースである。また、寡糖類としては、２糖類、３糖類、４〜６糖類程度のいわゆるオリゴ糖が適当であり、例えば、ショ糖、乳糖、麦芽糖などが挙げられる。この中でも好ましいのはショ糖である。糖アルコールとしては、前記単糖類の還元糖が用いられる。例えば、ソルビトール、マンニトール、ガラクチトールなどが挙げられ、この中で最も好ましいのは、ソルビトールである。これらの糖類はいずれか１種でよく、２種以上を用いても差し支えない。糖類の添加量も、前記特許文献に記載された方法の範囲内で設定すればよい。具体的に言えば、糖類として溶液中３w/v％〜１５w/v％、好ましくは５〜１０w/v％となるように添加する。
【００１３】
そして、本発明においては、さらにグリセリンまたはポリエチレングリコールあるいはその両方が添加される。その添加量は、溶液中５v/v％以上、好ましくは８v/v％以上、より望ましくは１０v/v％以上３０v/v％以下である。３０v/v％を越えてもそれ以上の安定性は望めないからである。
【００１４】
次いで、このように上記アミノ酸や糖類、グリセリン等を添加して調製したプラスミノーゲン含有溶液を加熱処理する。この加熱条件も、従来から行われている条件と何ら異なることはなく、前記特許文献に記載された範囲内であればよい。具体的には、５０〜７０℃、５〜３０時間程度、一般的には約６０℃で１０時間程度の加熱処理である。なお、本発明においては、加熱処理直前には、混合溶液のｐＨを６〜８、好ましくは６.５〜７.５となるように調製しておくのが望ましい。中性（ｐＨ７.０）付近から外れたところで、加熱処理をすれば著しく活性の低下を招く場合があるからである。
【００１５】
この方法においては、後述するように、加熱処理後の溶液に着色やにごり等が生じず、プラスミノーゲンの分解物であると思われるような夾雑物の生成も見られない。そして、活性の低下が抑制され、グリセリンやポリエチレングリコールを加えない場合に比べてプラスミノーゲンの残存活性が１.１〜１.２倍に向上する。
【００１６】
以下、本発明について実施例に基づいてさらに説明するが、本発明は下記の実施例に限られないのはいうまでもない。
【実施例１】
【００１７】
〔プラスミノーゲンの調製〕
正常人血漿からコーンの低温エタノール分画法で得られた沈殿第III画分１００ｇに２０ｍＭ塩酸Ｌ−リジンおよび１００ｍＭＮａＣｌ含有トリス緩衝液（ｐＨ９）１Ｌを加えて攪拌混合した後、静置した。得られた上清液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.５）で平衡化したリジンセファロースに負荷した。そして、５００ｍＭＮａＣｌ含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.５）で洗浄した後、１００ｍＭＮａＣｌ、０.２５Ｍ塩酸Ｌ−リジン含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）で溶出して、プラスミノーゲン含有溶液を得た。
【００１８】
〔アミノ酸又は糖類の添加による活性の低下抑制（対照例１）〕
上記で得たプラスミノーゲン含有溶液１０ｍＬに、表１に示す添加量でグリシンやグルコースなどの安定化剤を添加してバイアルに適当量充填し、６０.５℃で１６時間加熱処理した。そして、加熱前後のプラスミノーゲン活性から残存活性〔＝（加熱後プラスミノーゲン活性／加熱前プラスミノーゲン活性）×１００（％）〕を求めた。なお、プラスミノーゲン活性は、Ｈ-Ｄ-バリル-Ｌ-ロイシル-Ｌ-リジル-ｐ-ニトロアニリド・二塩酸塩合成基質を用いたテストチームＰＬＧ・２キット（第一化学薬品（株））を用いて測定した。その結果を表１に示す。
【００１９】
【表１】
2005272403.tif 000002
【００２０】
〔アミノ酸および糖類の添加による活性の低下抑制（対照例２）〕
次にアミノ酸および糖類を添加した場合における活性の低下を測定した。上記プラスミノーゲン含有溶液１０ｍＬにグリシン１５w/v％、ショ糖またはソルビトールを終濃度１０w/v％となるように添加した後、上記と同様にして加熱処理し、プラスミノーゲン活性について測定した。その結果、ショ糖添加の場合にはその残存活性は７６.１％、ソルビトール添加の場合にはその残存活性は７４.３％であった。
【００２１】
〔グリセリンの添加による活性の低下抑制（実施例１）〕
上記プラスミノーゲン含有溶液に対し、グリシン、ソルビトールおよびグリセリンの最終濃度が表２となるように、これらの各成分を含有した濃厚溶液（塩酸リジン０.２５ＭおよびＮａＣｌ０.１Ｍを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.９）で調製したもの）を加えて混合した後、さらに前記各成分の最終濃度が表２に示す濃度に調製された塩酸リジン０.２５ＭおよびＮａＣｌ０.１Ｍを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.９）を添加して、２８０ｎｍにおける吸光度が０.３となるように調製した。この溶液について上記と同様にして加熱処理し、プラスミノーゲン活性の低下抑制について測定した。その結果を表２に示す。なお、加熱直前の混合溶液のｐＨは７.０であった。
【００２２】
【表２】
2005272403.tif 000003
【００２３】
〔グリセリンの添加による夾雑物の発生抑制〕
グリセリンの添加による夾雑物発生の抑制効果を調べるため、加熱処理前後の溶液について、還元条件下ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動を行った。上記表２に示した試料のうち試料番号１〜５および１１の試料について試験を行い、分子量約５０ｋＤ付近に観察されるプラスミノーゲンの分解物と考えられるバンドの出現を観察した（図１参照）。
【実施例２】
【００２４】
〔ポリエチレングリコールの添加による活性の低下抑制（実施例２）〕
上記プラスミノーゲン含有溶液に対し、グリシン、ソルビトールおよびポリエチレングリコール４００の最終濃度が表３となるように、これらの各成分の濃厚溶液（塩酸リジン０.２５ＭおよびＮａＣｌ０.１Ｍを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.９）で調製したもの）を加えて混合した後、さらに前記各成分の最終濃度が表３に示す濃度に調製された塩酸リジン０.２５ＭおよびＮａＣｌ０.１Ｍを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.９）を添加して、２８０ｎｍにおける吸光度が０.３となるように調製した。この溶液について上記と同様にして加熱処理し、プラスミノーゲン活性の低下抑制について測定した。その結果を表３に示す。なお、加熱溶液のｐＨは７.０であった。また、参考として、ポリエチレングリコールの代わりに、プロピレングルコールを用いたものについても同様に試験し、グリセリンの場合と比較した。
【００２５】
【表３】
2005272403.tif 000004
【００２６】
これらの試験結果をまとめると次のとおりである。すなわち、グリシン単独では５７.７％、グリシンおよび糖類の添加でも７６.１％（ショ糖の場合）程度の残存活性しか得られなかったのに対して、本発明の処理方法では、グリセリンを５v/v％程度加えることにより残存活性が８０％程度になり、良好な場合（例えば試料番号４や５）には８５％以上の残存活性を得ることができた。
【００２７】
また、加熱処理による溶液の着色やにごり等が抑えられたこと、それと同時に電気泳動からも分子量約５０ｋＤ付近にあるプラスミノーゲンの分解物のバンドが消失したことが確認された。したがって、グリセリンまたはポリエチレングリコールの添加が分解物の生成を抑制していると言える。このように、アミノ酸や糖類の他にグリセリンやポリエチレングリコールを加えることが加熱時における安定性を向上させる。しかし、プロピレングリコールの添加がプラスミノーゲンの安定性を向上させることはなかった。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】加熱処理前後のプラスミノーゲン溶液を電気泳動した場合の展開図である。図中に示す矢印は、プラスミノーゲンの分解物と思われるバンドを示す。
【図１】
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