(57)【要約】【課題】  がんやウイルス感染症等治療の困難な疾病治療等に用いることができる疾病抗原特異的に機能するCTL（細胞傷害性Ｔリンパ球：cytotoxic T lymphocyte）の誘導方法の提供を目的とする。【解決手段】  前記目的を達成するために、本発明のCTLの誘導方法は、少なくとも主要組織適合抗原（MHC）クラスIと補助刺激分子(co-stimulatory molecule)とを発現する細胞株を、疾病抗原ペプチドと接触させた後、又は、接触させながら、リンパ球と共培養することを特徴とする誘導方法である。本発明の方法により誘導されるCTLは、例えば、がんや感染病の薬剤や、その治療・予防方法に有用である。また、本発明の誘導方法によれば、CTLの潜在的増殖能を検査することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
CTL（細胞傷害性Tリンパ球）の誘導方法であって、少なくとも主要組織適合抗原(MHC)クラスIと補助刺激分子とを発現する細胞株を、疾病抗原ペプチドと接触させた後、又は、接触させながら、リンパ球と共培養することを特徴とする誘導方法。
【請求項２】
前記補助刺激分子が、CD80およびCD86の少なくとも一方である請求項１に記載のCTLの誘導方法。
【請求項３】
前記細胞株のMHCクラスIの型が、HLA-A2又はHLA-A24である請求項１又は２に記載のCTLの誘導方法。
【請求項４】
前記抗原ペプチドが、がん抗原ペプチド又は感染症抗原ペプチドである請求項１から３のいずれかに記載のCTLの誘導方法。
【請求項５】
前記リンパ球が、自己リンパ球又は前記細胞株のMHCクラスI分子を共有する同種異系リンパ球である請求項１から４のいずれかに記載のCTLの誘導方法。
【請求項６】
前記細胞株が、胃がん由来JR-st、腎がん由来TUHR10TKB、および、乳がん由来MDA-MB-231からなる群から選択される少なくとも１つの細胞株に由来する細胞株である請求項１から５のいずれかに記載のCTLの誘導方法。
【請求項７】
さらに、リンパ球との共培養の前に、前記細胞株を破砕する工程、又は、前記細胞株から細胞膜を分離する工程を含み、前記細胞株の代わりに前記破砕物又は前記細胞膜を用いてリンパ球との共培養を行う請求項１から６のいずれかに記載のCTLの誘導方法。
【請求項８】
CTLの誘導方法であって、少なくともMHCクラスIと疾病抗原と補助刺激分子とを発現する細胞株を、リンパ球と共培養することを特徴とする誘導方法。
【請求項９】
前記補助刺激分子が、CD80およびCD86の少なくとも一方である請求項８に記載のCTLの誘導方法。
【請求項１０】
前記細胞株のMHCクラスIの型が、HLA-A2又はHLA-A24である請求項８又は９に記載のCTLの誘導方法。
【請求項１１】
前記抗原が、がん抗原又は感染症抗原である請求項８から１０のいずれかに記載のCTLの誘導方法。
【請求項１２】
前記リンパ球が、自己リンパ球又は前記細胞株のMHCクラスI分子を共有する同種異系リンパ球である請求項８から１１のいずれかに記載のCTLの誘導方法。
【請求項１３】
前記細胞株が、胃がん由来JR-st、腎がん由来TUHR10TKB、および、乳がん由来MDA-MB-231からなる群から選択される少なくとも１つの細胞株に由来する細胞株である請求項８から１２のいずれかに記載のCTLの誘導方法。
【請求項１４】
さらに、リンパ球との共培養の前に、前記細胞株を破砕する工程、又は、前記細胞株から細胞膜を分離する工程を含み、前記細胞株の代わりに前記破砕物又は前記細胞膜を用いてリンパ球との共培養を行う請求項８から１３のいずれかに記載のCTLの誘導方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれかに記載の誘導方法によりCTLを誘導する工程を含むCTLの製造方法。
【請求項１６】
請求項１から１４のいずれかに記載のCTLの誘導方法により誘導されて産生されるCTL。
【請求項１７】
がんの治療・予防剤であって、CTLを含み、前記CTLが、疾病抗原ペプチドとしてがん抗原ペプチドを用いた請求項１から７のいずれかに記載のCTLの誘導方法により誘導されたCTLであるがんの治療・予防剤。
【請求項１８】
がんの治療・予防剤であって、CTLを含み、前記CTLが、疾病抗原としてがん抗原を用いた請求項８から１４のいずれかに記載のCTLの誘導方法により誘導されたCTLであるがんの治療・予防剤。
【請求項１９】
感染症の治療・予防剤であって、CTLを含み、前記CTLが、疾病抗原ペプチドとして感染症抗原ペプチドを用いた請求項１から７のいずれかに記載のCTLの誘導方法により誘導されたCTLである感染症の治療・予防剤。
【請求項２０】
感染症の治療・予防剤であって、CTLを含み、前記CTLが、疾病抗原として感染症抗原を用いた請求項８から１４のいずれかに記載のCTLの誘導方法により誘導されたCTLである感染症の治療・予防剤。
【請求項２１】
がんの治療・予防方法であって、CTLを用いて行われ、前記CTLが、疾病抗原ペプチドとしてがん抗原ペプチドを用いた請求項１から７のいずれかに記載のCTLの誘導方法により誘導されたCTLであるがんの治療・予防方法。
【請求項２２】
がんの治療・予防方法であって、CTLを用いて行われ、前記CTLが、疾病抗原としてがん抗原を用いた請求項８から１４のいずれかに記載のCTLの誘導方法により誘導されたCTLであるがんの治療・予防方法。
【請求項２３】
感染症の治療・予防方法であって、CTLを用いて行われ、前記CTLが、疾病抗原ペプチドとして感染症抗原ペプチドを用いた請求項１から７のいずれかに記載のCTLの誘導方法により誘導されたCTLである感染症の治療・予防方法。
【請求項２４】
感染症の治療・予防方法であって、CTLを用いて行われ、前記CTLが、疾病抗原として感染症抗原を用いた請求項８から１４のいずれかに記載のCTLの誘導方法により誘導されたCTLである感染症の治療・予防方法。
【請求項２５】
CTLの潜在的増殖能の検査方法であって、少なくともMHCクラスIと補助刺激分子とを発現する細胞株を、疾病抗原ペプチドと接触させた後、又は、接触させながら、被験者から採取したリンパ球と共培養してCTLの誘導可能性を判断することを特徴とする検査方法。
【請求項２６】
前記補助刺激分子が、CD80およびCD86の少なくとも一方である請求項２５に記載のCTLの潜在的増殖能の検査方法。
【請求項２７】
前記細胞株のMHCクラスIの型が、HLA-A2又はHLA-A24である請求項２５又は２６に記載のCTLの潜在的増殖能の検査方法。
【請求項２８】
前記抗原ペプチドが、がん抗原ペプチド又は感染症抗原ペプチドである請求項２５から２７のいずれかに記載のCTLの潜在的増殖能の検査方法。
【請求項２９】
前記細胞株が、胃がん由来JR-st、腎がん由来TUHR10TKB、および、乳がん由来MDA-MB-231からなる群から選択される少なくとも１つの細胞株に由来する細胞株である請求項２５から２８のいずれかに記載の検査方法。
【請求項３０】
さらに、リンパ球との共培養の前に、前記細胞株を破砕する工程、又は、前記細胞株から細胞膜を分離する工程を含み、前記細胞株の代わりに前記破砕物又は前記細胞膜を用いてリンパ球との共培養を行う請求項２５から２９のいずれかに記載の検査方法。
【請求項３１】
CTLの潜在的増殖能の検査方法であって、少なくともMHCクラスIと疾病抗原と補助刺激分子とを発現する細胞株を、被験者から採取したリンパ球と共培養してCTLの誘導可能性を判断することを特徴とする検査方法。
【請求項３２】
前記補助刺激分子が、CD80およびCD86の少なくとも一方である請求項３１に記載のCTLの潜在的増殖能の検査方法。
【請求項３３】
前記細胞株のMHCクラスIの型が、HLA-A2又はHLA-A24である請求項３１又は３２に記載のCTLの潜在的増殖能の検査方法。
【請求項３４】
前記抗原が、がん抗原又は感染症抗原である請求項３１から３３のいずれかに記載のCTLの潜在的増殖能の検査方法。
【請求項３５】
前記細胞株が、胃がん由来JR-st、腎がん由来TUHR10TKB、および、乳がん由来MDA-MB-231からなる群から選択される少なくとも１つの細胞株に由来する細胞株である請求項３１から３４のいずれかに記載の検査方法。
【請求項３６】
さらに、リンパ球との共培養の前に、前記細胞株を破砕する工程、又は、前記細胞株から細胞膜を分離する工程を含み、前記細胞株の代わりに前記破砕物又は前記細胞膜を用いてリンパ球との共培養を行う請求項３１から３５のいずれかに記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補助刺激分子(co-stimulatory molecule)を発現する細胞株を用いてCTL（細胞傷害性Ｔリンパ球：cytotoxic T lymphocyte）を誘導する方法に関する。更に、この方法を用いて誘導されたCTLおよびそれを用いた疾病治療・予防剤、疾病の治療・予防方法、検査方法等の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは様々な要因により発症する病気であり、その診断・治療方法として切除、放射線、抗がん剤投与等が行なわれている。しかし、最近ではこのような従来の方法以外に、遺伝子診断・治療等の遺伝子工学的手法を用いて遺伝子・タンパク質レベルでがんの発症機序を解明し、より精度良いがんの診断・治療をしようと様々な研究がなされており、その中の１つに免疫細胞療法（Cell-mediated immunotherapy）が挙げられる。
【０００３】
免疫細胞療法では、病変としてすでに発生してしまったがんを免疫細胞（リンパ球等）の力でおさえるために、免疫細胞の働きを人為的に大幅に強めてがんを治療する。具体的には患者本人の免疫細胞を体外に取り出し、活性化・増殖させ、その細胞を再び患者に戻すことで、患者本人の免疫力を高め、それによりがんを縮小・消滅、又は増殖の停止・抑制させるものである。また、感染症においても、感染した細胞に対して同様の治療が可能である。
【０００４】
ここで、免疫細胞療法には、CD3-LAK（CD3 Lymphokine-activated Killer；リンフォカイン活性化キラー）療法、CTL（Cytotoxic Lymphocytes：細胞障害性リンパ球）療法、TIL（Tumor-infiltrating Lymphocytes；腫瘍組織浸潤リンパ球）療法、DC-CTL療法等が挙げられる。
【０００５】
CD3-LAK療法は、抗CD3抗体とIL-2とを用いてリンパ球を活性化し、ウイルス等に感染した細胞若しくはがん性変異した細胞（以下、変異細胞という。）一般に対する細胞傷害活性（非特異的活性）を付与するものである。
【０００６】
CTL、TIL、DC-CTL療法は、特定のがんや感染症等に対する細胞傷害活性（特異的活性）を有するリンパ球（細胞障害性Ｔ細胞：CTL）を選択的に誘導するものである。このCTLは患者の変異細胞特異的に作用するため、免疫細胞療法の中でも治療効果が高いとされている。
【０００７】
CTL療法では、生体外で患者から採取されたAPC（抗原提示細胞）若しくは変異細胞とリンパ球とを共培養することによりCTLを誘導し、ＴIＬ療法ではがん組織周辺に集まっているリンパ球を採取し、その中に含まれているCTLを活性化し、CTLを誘導している。
【０００８】
また、これら上述の方法で誘導されるCTLは、免疫細胞療法の中でも効果が高いものであるが、更に効果を高めるために、抗原提示細胞であるDC（樹状細胞：dendritic cell）表面に肺がん、肝がん、骨髄腫、リンパ腫、すい臓がん等の抗原若しくはこれらのがん等に由来する特定の抗原ペプチドを発現又は提示させてリンパ球と共培養させることでCTLを誘導し特定のがん抗原特異的に機能するCTLを誘導するDC-CTL療法の試みもなされている（例えば、特許文献１参照）。
【０００９】
特許文献１では、例えば、特異的CTLを誘導するために、主要組織適合抗原(HLA)-A24拘束性の前立腺がん抗原ペプチドをDC等の抗原提示細胞と接触させた後にリンパ球を共培養することにより、前立腺がん特異的CTLを誘導している。
【００１０】
しかしながら、これらCTLを誘導するためには、以下のような問題がある。すなわち、CTL療法の多くでは患者本人から採取したがん細胞を用いなくてはならず、TIL療法では手術のとき等限られた場合にのみ採取可能であり、しかも必ずCTLを採取できるとは限らない。また、DC-CTL療法ではDCにがん抗原ペプチドを提示させる必要があるが、DCの調製には煩雑な技術と時間を必要とし、CTLを誘導するごとに毎回DCに抗原提示をさせなくてはならず、しかも安定して提示することは困難であるという問題がある。
【００１１】
これらの問題を解決するために、CTLを誘導するために必要な分子であるCD80をがん細胞上に高発現させ、その細胞とリンパ球を共培養させることでCTLを誘導するという方法が開発されている（例えば、非特許文献１参照）。さらに、腫瘍細胞株上にB7分子を高発現させることでCTLやNK（ナチュラルキラー）細胞を誘導するという技術が開発されている（例えば、特許文献２参照）。
しかしながら、非特許文献１に記載されるように、CD80の高発現細胞を用いる場合であっても、CTLを誘導させるたびにCD80の高発現細胞を作製する必要があり、一定の性質の細胞を作製するのは困難であるという問題がある。
【００１２】
また、特許文献２では、細胞株上にB7分子を高発現させてはいるが、実際にはB7遺伝子の由来が明確でないため、分子がCD80かCD86か不明である。更に、用いている細胞株は、MHCクラスI抗原が欠損若しくは発現が低下しているものであり、このような細胞株では効率良く抗原特異的なCTLを誘導することはできるとは言えず、明確な誘導データも示されていない。また、特定のがん細胞にかかる細胞株であるため、様々ながんに対応することは不可能であり、各がん特異的なCTLを誘導するためには、そのがん細胞による細胞株を作製する若しくは抗原を細胞株表面に発現させる必要があり、その誘導効率が悪いという問題がある。
【非特許文献１】平成7,8年度科学研究費補助金 報告書 課題番号07457150
【特許文献１】特開2003-242号公報
【特許文献２】再表01-029191号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、特定の疾病抗原に対応可能なCTLを簡便かつ効率良く誘導する方法、前記方法により誘導されるCTLおよび前記CTLを含むがん治療剤等の用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
【００１５】
（１）CTLの誘導方法であって、少なくともMHCクラスIと補助刺激分子とを発現する細胞株を、疾病抗原ペプチドと接触させた後、又は、接触させながら、リンパ球と共培養することを特徴とする誘導方法、（２）前記補助刺激分子が、CD80およびCD86の少なくとも一方である(1)に記載のCTLの誘導方法、（３）前記細胞株のMHCクラスIの型が、HLA-A2又はHLA-A24である(1)又は(2)に記載のCTLの誘導方法、（４）前記抗原ペプチドが、がん抗原ペプチド又は感染症抗原ペプチドである(1)から(3)のいずれかに記載のCTLの誘導方法、（５）前記リンパ球が、自己リンパ球又は前記細胞株のMHCクラスI分子を共有する同種異系リンパ球である(1)から(4)のいずれかに記載のCTLの誘導方法、（６）前記細胞株が、胃がん由来JR-st、腎がん由来TUHR10TKB、および、乳がん由来MDA-MB-231からなる群から選択される少なくとも１つの細胞株に由来する細胞株である(1)から(5)のいずれかに記載のCTLの誘導方法、（７）さらに、リンパ球との共培養の前に、前記細胞株を破砕する工程、又は、前記細胞株から細胞膜を分離する工程を含み、前記細胞株の代わりに前記破砕物又は前記細胞膜を用いてリンパ球との共培養を行う(1)から(6)のいずれかに記載のCTLの誘導方法；
（８）CTLの誘導方法であって、少なくともMHCクラスIと疾病抗原と補助刺激分子とを発現する細胞株を、リンパ球と共培養することを特徴とする誘導方法、（９）前記補助刺激分子が、CD80およびCD86の少なくとも一方である(8)に記載のCTLの誘導方法、（１０）前記細胞株のMHCクラスIの型が、HLA-A2又はHLA-A24である(8)又は(9)に記載のCTLの誘導方法、（１１）前記抗原が、がん抗原又は感染症抗原である（8)から(10)のいずれかに記載のCTLの誘導方法、（１２）前記リンパ球が、自己リンパ球又は前記細胞株のMHCクラスI分子を共有する同種異系リンパ球である(8)から(11)のいずれかに記載のCTLの誘導方法、（１３）前記細胞株が、胃がん由来JR-st、腎がん由来TUHR10TKB、および、乳がん由来MDA-MB-231からなる群から選択される少なくとも１つの細胞株に由来する細胞株である(8)から(12)のいずれかに記載のCTLの誘導方法、（１４）さらに、リンパ球との共培養の前に、前記細胞株を破砕する工程、又は、前記細胞株から細胞膜を分離する工程を含み、前記細胞株の代わりに前記破砕物又は前記細胞膜を用いてリンパ球との共培養を行う(8)から(13)のいずれかに記載のCTLの誘導方法；
（１５）(1)から(14)のいずれかに記載の誘導方法によりCTLを誘導する工程を含むCTLの製造方法；
（１６）CTLであって、(1)から(14)のいずれかに記載のCTLの誘導方法により誘導され産生されるCTL；
（１７）がんの治療・予防剤であって、CTLを含み、前記CTLが、疾病抗原ペプチドとしてがん抗原ペプチドを用いた(1)から(7)のいずれかに記載のCTLの誘導方法により誘導されたCTLであるがんの治療・予防剤、（１８）がんの治療・予防剤であって、CTLを含み、前記CTLが、疾病抗原としてがん抗原を用いた(8)から(14)のいずれかに記載のCTLの誘導方法により誘導されたCTLであるがんの治療・予防剤；
（１９）感染症の治療・予防剤であって、CTLを含み、前記CTLが、疾病抗原ペプチドとして感染症抗原ペプチドを用いた(1)から(7)のいずれかに記載のCTLの誘導方法により誘導されたCTLである感染症の治療・予防剤、（２０）感染症の治療・予防剤であって、CTLを含み、前記CTLが、疾病抗原として感染症抗原を用いた（8)から(14)のいずれかに記載のCTLの誘導方法により誘導されたCTLである感染症の治療・予防剤；
（２１）がんの治療・予防方法であって、CTLを用いて行われ、前記CTLが、疾病抗原ペプチドとしてがん抗原ペプチドを用いた(1)から(7)のいずれかに記載のCTLの誘導方法により誘導されたCTLであるがんの治療・予防方法、（２２）がんの治療・予防方法であって、CTLを用いて行われ、前記CTLが、疾病抗原としてがん抗原を用いた（8)から(14)のいずれかに記載のCTLの誘導方法により誘導されたCTLであるがんの治療・予防方法；
（２３）感染症の治療・予防方法であって、CTLを用いて行われ、前記CTLが、疾病抗原ペプチドとして感染症抗原ペプチドを用いた(1)から(7)のいずれかに記載のCTLの誘導方法により誘導されたCTLである感染症の治療・予防方法、（２４）感染症の治療・予防方法であって、CTLを用いて行われ、前記CTLが、疾病抗原として感染症抗原を用いた(8)から(14)のいずれかに記載のCTLの誘導方法により誘導されたCTLである感染症の治療・予防方法；
（２５）CTLの潜在的増殖能の検査方法であって、少なくともMHCクラスIと補助刺激分子とを発現する細胞株を、疾病抗原ペプチドと接触させた後、又は、接触させながら、被験者から採取したリンパ球と共培養してCTLの誘導可能性を判断することを特徴とする検査方法、（２６）前記補助刺激分子が、CD80およびCD86の少なくとも一方である(25)に記載のCTLの潜在的増殖能の検査方法、（２７）前記細胞株のMHCクラスIの型が、HLA-A2又はHLA-A24である(25)又は(26)に記載のCTLの潜在的増殖能の検査方法、（２８）前記抗原ペプチドが、がん抗原ペプチド又は感染症抗原ペプチドである(25)から(27)のいずれかに記載のCTLの潜在的増殖能の検査方法、（２９）前記細胞株が、胃がん由来JR-st、腎がん由来TUHR10TKB、および、乳がん由来MDA-MB-231からなる群から選択される少なくとも１つの細胞株に由来する細胞株である(25)から(28)のいずれかに記載のCTLの潜在的増殖能の検査方法、（３０）さらに、リンパ球との共培養の前に、前記細胞株を破砕する工程、又は、前記細胞株から細胞膜を分離する工程を含み、前記細胞株の代わりに前記破砕物又は前記細胞膜を用いてリンパ球との共培養を行う(25)から(29)のいずれかに記載のCTLの潜在的増殖能の検査方法；
（３１）CTLの潜在的増殖能の検査方法であって、少なくともMHCクラスIと疾病抗原と補助刺激分子とを発現する細胞株を、被験者から採取したリンパ球と共培養してCTLの誘導可能性を判断することを特徴とする検査方法、（３２）前記補助刺激分子が、CD80およびCD86の少なくとも一方である(31)に記載のCTLの潜在的増殖能の検査方法、（３３）前記細胞株のMHCクラスIの型が、HLA-A2又はHLA-A24である(31)又は(32)に記載のCTLの潜在的増殖能の検査方法、（３４）前記抗原が、がん抗原又は感染症抗原である(31)から(33)のいずれかに記載のCTLの潜在的増殖能の検査方法、（３５）前記細胞株が、胃がん由来JR-st、腎がん由来TUHR10TKB、および、乳がん由来MDA-MB-231からなる群から選択される少なくとも１つの細胞株に由来する細胞株である(31)から(34)のいずれかに記載のCTLの潜在的増殖能の検査方法、（３６）さらに、リンパ球との共培養の前に、前記細胞株を破砕する工程、又は、前記細胞株から細胞膜を分離する工程を含み、前記細胞株の代わりに前記破砕物又は前記細胞膜を用いてリンパ球との共培養を行う(31)から(35)のいずれかに記載のCTLの潜在的増殖能の検査方法。
【００１６】
従来のCTLの誘導方法では、DC(樹状細胞)を用いたり、CD80を発現する細胞を用いてCTLを誘導しようという試みはなされていたが、一回毎にDCを誘導させたり、CD80を発現する細胞を作り直す必要があり、その工程は煩雑であった。また、DCやその他のAPC(抗原提示細胞)を容易に得ることは難しく、CTLを安定して誘導することは困難であった。
【００１７】
そこで、本発明者らは、従来のような煩雑な工程を経ることなくCTLを誘導するために、DC等に代わりリンパ球等の免疫細胞を活性化させる細胞を探索した。本発明者らは、まず、補助刺激分子を発現する細胞株を樹立し、つぎに、該細胞株が細胞表面に各種接着分子およびMHCクラスI抗原を発現していることを確認し、そして、これを抗原提示細胞の代わりに用いてみたところ、恒常的に安定してCTLを誘導できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
更に、該細胞株とリンパ球との共培養時に、例えば、がん抗原ペプチドや感染症抗原ペプチド等の特定の疾病抗原ペプチドを接触させることにより、その疾病抗原に特異的なCTLを誘導できることが判明した。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のCTLの誘導方法は、例えば、従来のDC等の抗原提示細胞を用いた誘導方法よりも迅速かつ簡便に特定の疾病抗原に特異的に機能するCTLを誘導できる。また、補助刺激分子を恒常的に安定して発現する細胞株を用いれば、再現性も向上し、より簡便で精度に優れる抗原特異的CTLの誘導が可能となる。また、本発明の誘導方法によれば、従来の方法以上にCTLを誘導することができる。したがって、本発明を用いれば、これらの特性を利用して、例えば、効率良く誘導したCTLを、がんやウイルス性感染症のための薬剤やワクチンの提供や、治療効果の高い免疫細胞療法など、様々な用途に有用に用いることができ、例えば、がんやウイルス性感染症等を従来よりも精度の良い治療を行なうことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態を説明する。まず、CTLの誘導方法について説明する。
【００２１】
本発明のCTLの誘導方法（以下、「本発明の誘導方法」という。）は、上述した主要組織適合抗原（MHC）クラスIと補助刺激分子とを少なくとも発現する細胞株を、疾病抗原ペプチドと接触させ、さらに、リンパ球と共培養することを特徴とする。
【００２２】
ここで、「疾病」とは、特に制限されないが、例えば、がんや感染症等である。前記がんとしては、特に制限されず、あらゆるがんに対応可能であって、例えば、治療が困難であるがん（前がん状態を含む）等が挙げられ、前記感染症としては、特に制限されず、例えば、エイズ、Ｂ型・Ｃ型肝炎等のウイルス感染症や、細胞感染、細菌感染、真菌感染、若しくは、原虫による感染症等が挙げられる。
【００２３】
本発明の誘導方法では、少なくともMHCクラスIと補助刺激分子とを発現する細胞株を、疾病抗原ペプチドと接触させた後、もしくは、接触させながら、リンパ球と共培養するため、疾病抗原特異的なCTLを誘導することができる。ここで、「接触させる」とは、MHCクラスI分子に疾病抗原ペプチドを結合させることであり、具体的には、例えば、疾病抗原ペプチドが溶解された培養液中で該細胞株を培養することによりMHCクラスI分子に疾病抗原ペプチドを結合させることをいう。
【００２４】
CTLを誘導するためには、抗原ペプチドとMHCクラスI抗原との複合体がＴ細胞受容体に認識され、かつ、Ｔ細胞表面に発現しているCD28と補助刺激分子とが結合することにより前記T細胞が活性化される必要がある。従来、MHCクラスI抗原による抗原提示と補助刺激分子とによりCD８陽性CTLを誘導できるのは、主にAPC（抗原提示細胞）であると考えられていたが、本発明者らは、APC以外の細胞で、しかも、MHCクラスII抗原が発現していない細胞株であっても、MHCクラスI抗原による抗原提示と補助刺激分子を発現させることにより、抗原特異的なCD８陽性CTLの誘導が可能であることを初めて見出した。
【００２５】
すなわち、従来のCTLの誘導方法では、患者本人のがん組織等を用いたり、誘導の度に抗原提示細胞に抗原提示をさせなくてはならず非常に工程が煩雑であったが、本発明の方法では、抗原提示細胞として細胞株を利用できるため、誘導工程を大幅に縮小することが可能となり、また、患者の負担も減らすことができる。
【００２６】
また、エイズの場合には、HIVウイルスはDC等の抗原提示細胞およびCD8陽性T細胞（すなわちCTL）形成に必要なCD4陽性Ｔ細胞にも感染してしまうため、CTL療法を行なおうとして例えば従来どおりの方法を用いようとすると、得られるCTLもHIVに感染したものとなり、治療に使うことができなかった。しかし、本発明の誘導方法の場合には、このようなDCを用いる必要がないため、非感染のCTL（CD8陽性T細胞）を誘導することが可能となり、今までは不可能であったCTLによる治療が可能となる。
【００２７】
また、CTLを誘導するための刺激を送る補助刺激分子発現細胞株に抗原ペプチドを発現させるのではなく、個別に抗原ペプチドを接触させるため、１つの細胞株であっても、前記抗原ペプチドの種類を変えるだけで様々な疾病に特異的なCTLを誘導することができ、様々な疾病に速やかに対応することもできる。
【００２８】
更に、従来のCTLの誘導方法では、複数の疾病に対してCTLを誘導する場合にはそれぞれの抗原を発現させた細胞等を利用する必要があったが、本発明の誘導方法では、細胞株の樹立を複数行なう必要がなくなるので、簡便にCTLを誘導できる。また、得られるCTLの量も従来より多くすることが可能なため、CTLの誘導（産生）効率も向上する。
【００２９】
次に、本発明の誘導方法の構成について説明する。
【００３０】
まず、本発明の細胞株について説明する。本発明の誘導方法において使用する補助刺激分子を発現する細胞株（以下、「本発明の細胞株」という。）は、MHCクラスIと補助刺激分子とが発現する細胞であれば、特に制限されず、例えば、人為的に作製した細胞株等を使用できる。ここで、「発現する」とは、例えば、前記MHCクラスIおよび補助刺激分子が、本発明の細胞株の表面に配置され、CTL誘導能を発揮し得る程度の充分量を発現することを意味する。
【００３１】
本発明の細胞株は、後述するように、従来公知の方法で作製でき、例えば、補助刺激分子をクローニングした発現ベクターを、MHCクラスIを発現する細胞株に導入するなどして作製できる。本発明の細胞株において、MHCクラスIおよび補助刺激分子は、恒常的に安定して発現することが好ましい。CTL誘導の再現性が向上し、本発明の誘導方法をより簡便かつ効率的なものとすることが可能となるからである。したがって、例えば、前記発現ベクターを導入する場合、一過性の導入よりも、染色体に組込ませた安定型の導入が好ましい。
【００３２】
前記MHCクラスI分子は、MHCクラスI重鎖（α鎖）を含む。前記MHCクラスI重鎖としては、例えば、ヒトMHCクラスI重鎖であるHLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-FおよびHLA-G重鎖が挙げられる。これらの中でも、本発明の細胞株で発現されるMHCクラスI分子としては、HLA-A、HLA-BおよびHLA-C重鎖が好ましく、より好ましくは、HLA-A重鎖である。また、これらのMHCクラスI分子は、β2ミクログロブリンと併せて発現されることが好ましい。これらのMHCクラスI分子を発現する遺伝子は、従来公知であって、例えば、IMGT/HLA Sequence Database (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla)等のパブリックデータベースで検索可能である。例えば、HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-A*3302、HLA-A*1101、HLA-A*0101およびHLA-A*0301のGenBankアクセションNo.は、それぞれ、M84379、M64740、L06440、D16841、M24043およびU32184である。
【００３３】
前記補助刺激分子としては、例えば、CD80(B7.1)およびCD86(B7.2)等が挙げられる。これらの分子はリンパ球の免疫機能を活性化するシグナルを伝達する分子の１つであり、リンパ球表面にあるCD28分子と結合することにより、リンパ球が活性化し、CTLが誘導される。
【００３４】
本発明の細胞株では、CD80若しくはCD86どちらかが発現していれば良く、好ましくはCD80である。あるいは、CD80および86が同時に発現していても構わない。
【００３５】
また、その他種々の分子を細胞表面に発現していても良い。前記分子としては、例えば、CD54 (ICAM-1)、ICAM-2、ICAM-3もしくはLFA-3等の接着分子、又はその他の補助刺激分子が挙げられる。また、例えば、ペプチド以外のものを抗原提示するCD1bやNKT細胞の誘導を促すα-ガラクトシルセラミドを提示するCD1d等を発現させても良い。
【００３６】
また、補助刺激分子以外にも、有用な遺伝子を組み込んで発現させても良く、例えば、自殺遺伝子であるHSV-TK等を組み込めば、CTLを誘導後所定の処置を行なうことにより細胞株を除去し、CTLのみを効率良く回収することも可能となる。
【００３７】
また、本発明の細胞株は、MHCクラスIと補助刺激分子とを発現できる細胞株であれば、どのような細胞であっても好適に用いることができる。好ましくは動物細胞が良く、より好ましくはヒト細胞が良い。
【００３８】
また、これら細胞の中でも、腫瘍由来の細胞であることが好ましい。腫瘍由来の細胞は、株の樹立が容易ではないが、常に半永久的に増殖が可能であり、更に性質が安定しているからである。これら細胞株は各種細胞株の保存機関から入手することが可能であるし、従来公知の方法を用いて作製することもできる。
【００３９】
また、本発明の細胞株の主要組織適合抗原クラスIの型は、どの型のHLAクラスIが発現しても構わないが、中でもHLA-A2若しくはHLA-A24が好ましく、より好ましくはHLA-A2ホモ接合若しくはHLA-A24ホモ接合であって、さらにより好ましくは、HLA-A*0201ホモ接合若しくはHLA-A*2402ホモ接合である。
【００４０】
このような細胞株の例としては、乳がん由来のMDA-MB-231（以下、MDA-MBとも呼ぶ。）（クラスI抗原HLA-A2）、腎がん由来のTUHR10TKB（クラスI抗原HLA-A2/24）、胃がん由来のJR-st株（クラスI抗原HLA-A24）等が挙げられる。これらの細胞株は、例えば、ATCCやRIKEN BioResource Center等から入手することができる。
【００４１】
これらHLAの型は世界全体でも６割程度を占めている（日本組織適合性学会ホームページ  HLAデータ集  Gene frequencies of serologically-typed HLA-A,B,C loci : (http://square.unim.ac.jp/JSHI/hla_data/freq/hla_freq.txt) 参照）。これらHLAの型を持つ細胞株で誘導されるCTLはHLA-A2若しくはHLA-A24拘束性となるため、日本はもちろん、世界中の多くの患者に用いることができるという利点がある。
【００４２】
本発明の細胞株は、中身が空、すなわち、ペプチド結合ポケットにまだ抗原ペプチドが結合されていないMHCクラスI分子を発現することが知られている細胞株から選択することができる。このような細胞株としては、例えば、ペプチドを結合するプロセスが欠損したRMA-SやT2等の細胞株が挙げられる。
【００４３】
本発明の誘導方法は、本発明の細胞株を破砕したもの、又は、本発明の細胞株から分離した細胞膜を、リンパ球と共培養する方法であってもよい。この場合、MHCクラスI分子と疾病抗原の接触は、本発明の細胞株の破砕又は膜の分離の前後いずれに行ってもよい。
【００４４】
また、本発明の誘導方法の別の態様としては、少なくとも主要組織適合抗原クラスIと、疾病抗原と、補助刺激分子とを発現している細胞株と、リンパ球とを共培養することを特徴とする。様々な疾病に対応する必要が無い場合、疾病抗原遺伝子を組み込むことにより疾病抗原を、補助刺激分子を発現する細胞株に発現させることも可能である。これにより、改めて抗原ペプチドを接触させて共培養をする必要がなくなり、CTLの誘導が、さらに簡便にできるようになる。
【００４５】
以上の構成から、本発明の誘導方法では、MHCクラスI抗原および補助刺激分子発現細胞株上の、例えば、HLA-A2と抗原ペプチドとの複合体等が、Ｔ細胞レセプターにより認識され、さらに、前記細胞株上の、例えば、CD80等の補助刺激によりリンパ球が活性化されてCTLが誘導される。その結果、前記CTLは特定のがん等の抗原特異的に反応し、その抗原以外の物質に反応する割合も従来の方法に比べて減少し、特異性が高くなる。これにより、より疾患部位特異性の高いCTLが提供可能となり、効果の高い治療を行なうことができる。
【００４６】
本発明の細胞株の例としては、例えば以下のようなものが挙げられる。
【００４７】
１）MDA-MB/CD80
２）MDA-MB/CD80，HSV-TK
３）MDA-MB/CD80，HLA-A*0201,β2M
４）MDA-MB/CD80，CD１ｂ
５）MDA-MB/CD80，CD１ｄ
６）MDA-MB/CD80，CD86
７）MDA-MB/CD80，PAP
８）MDA-MB/CD80，AFP
９）MDA-MB/CD80，MUC1
１０）MDA-MB/CD86
１１）MDA-MB/CD86，PAP
１２）MDA-MB/CD86，AFP
１３）TUHR10TKB/CD80
１４）TUHR10TKB/CD80，PAP
１５）TUHR10TKB/CD80，AFP
１６）TUHR10TKB/CD80，MUC1
１７）TUHR10TKB/CD86
１８）JR-st/CD80
１９）JR-st/CD86
上記例示３）において、β2Mとは、β2ミクログロブリンを指し、クラスI抗原が細胞表面に提示される場合、この分子と複合体を作ることが知られており、この分子の存在により、安定してクラスI抗原が発現できるようになる。つまり、前記β2Mを発現するようにすれば、クラスI抗原も安定して表面に発現でき、それにより、疾病抗原ペプチドとの複合体も安定して提示できるようになる。また、上記7)、8)、9)、11)、12)、14)、15)および16)で用いられているPAP、AFP、MUC1は、それぞれ、前立腺がん抗原、肝がん抗原、すい臓がん抗原を示す。
【００４８】
本発明の細胞株は、従来公知の方法を適宜用いて作製することができる。例えば、下記のような文献を挙げることができる。
Anal Biochem.1993 Feb 1;208(2):352-6. Maximal expression of Recombinant cDNAs IN COS cells for use IN expression cloning. Kluxen FW, Lubbert H.
具体的には、例えば、以下のような手順で行なえば良い。
１）CD80やその他の細胞株表面に発現させたい分子の遺伝子を増幅してcDNAを得た後、PCR法で増幅させ、適当な発現ベクターに組み込む。尚、がん抗原等の疾病抗原も細胞株で発現させたい場合には、これらの遺伝子も同時に組み込む。
２）用いる細胞株に該発現ベクターを導入し、培地中で培養した後、抗生物質を含む培地でセレクションを行う。
３）更に、抗体結合ビーズを用いて組換タンパク質（発現させたい遺伝子）を発現している細胞を濃縮する。
４）上記ビーズにより濃縮された細胞を選択し、該細胞を限界希釈法等によってクローニングを行い、安定して発現している細胞株を選択する。尚、疾病抗原も発現させる場合には、ウェスタンブロッティング等の方法により、その発現を確認することができる。
【００４９】
上記手法において、用いることができる発現ベクターの例としては以下のものを挙げることができる。
pRc/CMV、pZeoSV2、pBudCE4-1、pcDNA/V5-His（invitrogen社製）等。
【００５０】
また、培地の例としては以下のものを挙げることができる。
イーグルMEM、ダルベッコMEM、RPIM1640等。
【００５１】
また、抗生物質の例としては以下のものを挙げることができる。
ネオマイシン、ゼオシン、ブラストシジン(Blasticidin S)、ハイグロマイシン等。
【００５２】
本発明で用いる疾病抗原および疾病抗原ペプチド（以下、「本発明のペプチド」ともいう。）は、例えば、上述した様々な疾病に関する抗原および抗原ペプチドを用いることができ、例えば、がん抗原や感染症抗原およびそれらのペプチドを用いることにより精度の良い治療を行なうことができる。本発明のペプチドとして使用できるペプチド配列は、がんや感染症等の種類と拘束性を示すHLAタイプとに応じて、既知の抗原ペプチド配列を利用できる。また、前記ペプチド配列は、従来公知の方法、例えば、コンピュータアルゴリズムや免疫学的手法等を用いたスクリーニングにより同定することができる（例えば、文献（Kuzusima et al, BLOOD, 2003, vol.101, no.4, 1460-1468）参照）。
【００５３】
本発明のペプチドとして利用できる既知のペプチド配列は、例えば、下記文献に記載されているものが挙げられる。さらに、下記表１に、本発明のがん抗原ペプチドの一例を示す。
Romero et al (J Exp Med, 188:1641-1650, 1998), Khanna et al (Proc Natl Acad Sci USA 96 10391-10396, 1999), Oka Y et al (Immunogenetics. 51(2):99-107, 2000), Butterfield LH et al (J Immunol. 166(8):5300-8, 2001), Ferrara A et al (J Cancer Res Clin Oncol. 129(9):521-30 2003), Tan LC et al (Arthritis Res. 2(2):154-64 2000), Kawakami Y et al (J Immunol. 154(8):3961-8 1995), van der Bruggen P et al (Eur J Immunol. 24(12):3038-43 1994), Kawakami Y et al (J Exp Med. 180(1):347-52 1994), Hiltbold EM et al (Cancer Res. 58(22):5066-70 1998), Brossart P et al (Blood. 93(12):4309-17 1999), Domenech N et al (J Immunol. 155(10):4766-74 1995), JP 2003-535024 A, WO0006723A1, Parkhurst MR et al (Cancer Res. 58(21):4895-901 1998), Robbins PF et al (J Immunol. 159(1):303-8 1997), Fujie T et al (Int J Cancer. 80(2):169-72 1999), Tanaka F et al (Cancer Res. 57(20):4465-8 1997), Shichijo S et al (J Exp Med. 187(3):277-88 1998), Wang RF et al (J Immunol. 161(7):3596-606 1998), Wang RF et al. (J Exp Med. 183(3):1131-40 1996), Wang RF et al (J Exp Med. 184(6):2207-16 1996), Tissue Antigens (Immunex Corperation, Seattle, WA, USA. 60(1):16-24 2002), Brichard VG et al (Eur J Immunol. 26(1):224-30 1996), Pold M et al (Genomics. 15;59(2):161-7 1999)およびPierre G et al (Annu. Rev. Immunol. 20:621-667 2002)
【００５４】
【表１】
2005245430.tif 000002
【００５５】
がん抗原のがんの種類は問わず、どのような抗原も用いることができる。例えば、上記に例示したように、前立腺がん、肝がん、すい臓がん等のどのようながん抗原であっても利用できる。前記がん抗原としては、例えば、MAGE1、MAGE3、GAGE,BAGEおよびRAGE等のMAGE遺伝子ファミリーにコードされるものが挙げられる。他のがん抗原としては、例えば、p53、K-ras、CDK4およびbcl-c-abl遺伝子産物等の変異により生じるがん抗原、c-erb2(neu)タンパク質等のがん細胞で過剰発現されるがん抗原、および、HPV-16のE7タンパク質等の発癌ウイルス抗原等が挙げられる。さらに、癌胎児抗原（CEA）やα-フェトプロテイン(AFP)等の腫瘍胎児抗原、ならびに、前立腺特異的抗原や、白血病およびリンパ腫のＢ細胞で発現するCD-10(CALLA抗原)等の分化抗原も使用することができる。
【００５６】
また、感染症抗原の感染症の種類も、特に制限されないず、例えば、エイズやＢ型／Ｃ型肝炎、エプスタインバーウイルス(EBV)感染症、HPV感染症等のウイルス性感染症の中でも難治性疾患の抗原を用れば、従来困難であったこれら疾病に対して効果の高いCTLを誘導し、より良い治療を行なうことが可能となる。また、マラリア原虫のスポロゾイド周囲タンパク質のような寄生虫の抗原も本発明の誘導方法に用いることができる。
【００５７】
また、本発明では前記疾病抗原ペプチドとして合成ペプチドを用いることができる。これにより、自己のがん組織等から採取したがん抗原を使用してCTLを誘導した従来のCTLの誘導方法と比べて患者の負担を少なくすることが可能となる。
【００５８】
本発明で用いるリンパ球は、種々用いることができるが、ヒトリンパ球を用いることが好ましい。また、前記リンパ球としては、自己リンパ球又は少なくとも本発明の細胞株の少なくとも１つのMHCクラスI分子を共有する同種異系リンパ球が好ましい。前記自己リンパ球を用いる場合、特に個々の患者に特異的なCTLを誘導することができ、アロ（他家）抗原を認識され排除されることがないので、好ましい。
【００５９】
ここで、「自己リンパ球」とは、特に制限されず、例えば、患者から採取したリンパ球等を指す。患者にはがんや感染症を発症した状態のみならず、例えば、前がん状態や、感染症キャリアの状態の患者も含む。また、健常者から採取したリンパ球であってもよい。
【００６０】
CTLを誘導するための培養方法は、ヒト細胞、特にリンパ球の培養に関する公知の方法を種々用いることができる。例えば、下記の文献に記載の方法を用いて培養を行なうことが好ましい。
【００６１】
Blood,91;977-983,1998; Dendritic cell stimulate the expansion of bcr-abl specific CD8+Tcells with cytotoxic activity against leukemia cells from patients with chronic myeloid leukemia, M.Nieda ET al
Eur J Immunol. 1980 Jan;10(1):30-5. Generation of virus-specific cytotoxic cells IN vitoro.II. Induction requirements with functionally inactivated virus preparations, Koscinowski UH, Gething MJ
J Immunol. 1988 Nov 1;141(9):2975-9. A role of HLA-DQ molecules of stimulator-adherent cells IN the regulation of human autologous mixed lymphocyte reaction, M.Nieda ET al
培養時の条件は、例えば、１mlの培養液中、反応細胞（リンパ球）濃度として１〜２×１０6cells/ml，本発明の細胞株の濃度として１〜５×１０5cells/ml、ペプチド濃度として１〜１０μg/mlの範囲である。
【００６２】
また、培地としてはAIM-V培地が好適であるが、１〜１０％FCS若しくはAB血清を添加したRPMI1640培地、又は、自己血漿を用いることもできる。
【００６３】
誘導方法の例としては、例えば以下のような手順とすることができる。
１）本発明のCD80発現細胞株を抗原ペプチドと接触させることにより感作させ、マイトマイシン等の抗生物質で処理を行なう。
２）培地で懸濁した上記細胞株にリンパ球若しくはリンパ球を含む細胞分画を加え、６〜８日間培養する
３）必要に応じて、その後適当な回数抗原ペプチドを添加し、必要なCTLが得られるまで刺激・培養を行なう。
【００６４】
次に、本発明の誘導方法で誘導されたCTL（以下、「本発明のCTL」という。）について説明する。
【００６５】
本発明のCTLは、上述したように、従来誘導されたCTLと比較して、各疾病抗原に特異的に機能する割合が高いため、例えば、治療効果に優れた免疫細胞療法に使用できる。また、共培養に用いる抗原ペプチドとして目的とする疾病抗原のものを使用すれば、様々な疾病抗原に特異的なCTLを選択的に誘導することが可能となり、幅広く治療に提供することができる。
【００６６】
本発明の薬剤は、このCTLを主剤として、例えば、難治性疾患等を含む疾病の治療剤とすることができる。
【００６７】
構成としては、CTL単体のみならず、例えば、がんの治療であれば、IL-2やIL-12等がん治療に有効なサイトカインを組み合わせることが可能であり、肝炎等のウイルス性感染症等では、IFN(インターフェロン)-γ若しくはα等を組み合わせることができる。また、分子標的薬を組み合わせることも可能である。
【００６８】
特定のがん特異的に誘導されたCTLであれば、例えば、がん治療剤として、従来の抗がん剤に代わって投与することにより、副作用のほとんどない、効果の高い治療を行なうことが可能となる。
【００６９】
また、エイズやＢ／Ｃ型肝炎等のウイルス感染症特異的に誘導されたCTLであれば、例えば、現在治療そのものが困難であるこれら疾患に対しても、従来の治療方法では副作用や治療効果の低さが問題であったが、このような問題を解消できる効果の高い薬剤を提供することが可能となる。
【００７０】
また、このような構成により、本発明の薬剤は、例えば、がんに対して、転移や手術後の再発防止、あるいは前がん状態での治療等、いわゆる予防剤としても機能することが可能である。また、ウイルス感染症の場合には、発症前のいわゆる無症候性キャリア期であっても本発明の薬剤により発症を予防することが可能となる。
【００７１】
次に、本発明のCTLを用いた治療・予防方法について説明する。
【００７２】
本発明の治療・予防方法は、本発明のCTLを用いることを特徴とする。例えば、上述のように、本発明のCTLを主剤とする薬剤として用いることはもちろんのこと、誘導されたCTLをそのまま直接投与することもできる。投与する場合は、病変部に直接注入することも、点滴として全身投与することも、あるいは点滴に限定されることなく静脈や皮下等へ注射や、所属リンパ節への直接注射等により投与することも可能である。あるいは、病変部近辺の動脈から注入することも可能である。CTLを主剤とした場合の併用薬剤としては、例えば、LAK(Lymphokine Activated Killer)細胞、NK細胞、NKT細胞、γδT細胞又はサイトカイン等が挙げられる。いずれの場合であっても、注入したCTLの働きおよび該CTLにより向上された免疫力により、効率良い治療を行なうことができる。
【００７３】
本発明のCTLの誘導キットは、MHCクラスIを発現し補助刺激分子を発現する細胞株と、疾病抗原ペプチドとを具備することを特徴とする。
【００７４】
従来の誘導方法では、CTLを誘導する毎に抗原提示細胞やCD80発現細胞を作製しなくてはならず、また、患者本人からがん細胞を採取する必要がある等、簡便なキット化は不可能であったが、本発明によって、例えば、CD80発現細胞株と抗原ペプチドを用いて、キット化することも可能となった。これにより、簡便に精度良くCTLを誘導することができる。
【００７５】
また、当該キットには、上述したものの他に、培養用の培地や試薬等、適宜必要なものを含めることができる。
【００７６】
上述したCTLの誘導キットの別の態様としては、MHCクラスI、疾病抗原、および、補助刺激分子を発現する細胞株を具備するキットがあげれる。様々な疾病に対応する必要が無く、特定の疾病に対応する場合、該疾病の抗原を発現する細胞株を含む該キットであれば、改めて該抗原ペプチドを接触させる必要がなくなり、さらに簡便なCTLの誘導が可能となる。
【００７７】
本発明のCTLの潜在的増殖能の検査方法は、MHCクラスIおよび補助刺激分子を発現する細胞株と疾病抗原とを接触させた後又は接触させつつ、被験者から採取したリンパ球を共培養してCTLの誘導可能性を判断することを特徴とする。
【００７８】
CTL療法は、その他の免疫細胞療法と比較しても、その効果の高さはすでに明らかになっているところであるが、リンパ球の性質により、全ての患者からCTLを誘導することができるとは限らない。そのため、CTL療法を行なうことが可能かどうかを治療を開始する前に判断するため、本発明の検査方法を用いることができる。
【００７９】
患者から少量のリンパ球をサンプルとして採取した後、本発明の検査方法でCTLが誘導できることが確認できれば、その後実際の治療として、既存の方法や本発明の誘導方法を用いて治療用CTLを誘導することができる。これにより、今後行おうとしている免疫療法の効果についても判断することが可能となる。
【００８０】
本発明のCTLの潜在的増殖能の検査方法の別の態様としては、MHCクラスI、疾病抗原および補助刺激分子を発現する細胞株を、被験者から採取したリンパ球と共培養してCTLの誘導可能性を判断する検査方法が挙げられる。様々な疾病に対応する必要が無く、特定の疾病に対応する場合、該疾病の抗原を発現する細胞株を用いる検査方法であれば、改めて該抗原ペプチドを接触させる必要がなくなり、さらに簡便なCTLの誘導が可能となる。
【００８１】
従来の検査方法では、被験者の体内から組織を採取するかDCを調製した上で検査を行なわなければならないという不具合があったが、本発明によれば、少量の採血を行なうだけですむので、被験者の負担が大幅に軽減される。
【００８２】
このように、本発明のCTLの誘導方法および該誘導方法により誘導されたCTL、それを用いた薬剤や治療方法等の用途を用いることにより、従来よりも効果の高い治療、特にがんやウイルス感染症等の治療を行なうことが可能となる。
【００８３】
更に、がんの治療においては、手術後の転移防止・再発防止にも効果的に用いることが可能であり、これにより、治癒率や延命効果を向上させることが可能となる。また、ウイルス感染症においても、再発を防止することが可能となる。
【００８４】
以下、実施例をあげて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものでないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００８５】
＜CD80安定発現細胞株MDA-MB/CD80の樹立＞
（１）遺伝子断片のクローニング
ヒトCD80を発現している細胞から抽出したRNAを用いたRT-PCRにより得たcDNA断片を鋳型として使用し、ヒトCD80遺伝子断片をPCR法により増幅した。プライマーは、下記２種類DNAオリゴマーを合成して使用した。下記プライマー塩基配列における下線部は、ベクターに挿入するための制限酵素サイトの配列Hind III（CD80:F）およびXba I（hB7-1:R）を示す。
【００８６】
プライマーCD80:F（配列番号１）
5' -TTCAAGCTTACCATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACC- 3'
プライマーhB7-1:R（配列番号２）
5' -TAATCTAGATGCGGACACTGTTATACAGG- 3'
PCRは、LATaq DNAポリメレース（Takara社製）を用い、最初９４℃で３分間置いた後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を１サイクルとして３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で５分間反応させるという反応条件でおこなった。前記PCR法で特異的に増幅されたDNA断片を、１．５％アガロースゲル電気泳動により切り出し、制限酵素Hind IIIおよびXba I処理し、プラスミドpRc/CMV（Invitrogen社製）のHind IIIおよびXba I部位の間に挿入して、pRc/CMV-CD80を得た。挿入されたヒトCD80 cDNAの塩基配列をDNAシーケンサーで確認したところ、論文[Freeman G. J. et al. (J. Immunol.) 143 2714-2722 (1989)]で報告されているヒトCD80のcDNAの塩基配列と完全に一致した。
【００８７】
（２）CD80活性測定
CD80は、CD28と直接結合することでCD28を発現している細胞内にシグナルを伝達する。そこで、CD28を発現しているJurkat細胞におけるCD28のリン酸化を解析することで、前記pRc/CMV-CD80にクローニングされたCD80の活性測定を行った。
【００８８】
CHO細胞を直径３５ｍｍのシャーレを用いて１０％ウシ胎児血清含有のRPMI1640培地で４〜６時間培養した。この細胞に６μgの前記pRc/CMV-CD80をリポフェクション法で導入し、CHO-CD80を得た。また、CD80遺伝子をコードしないpRc/CMVを同様にCHO細胞に導入し、CHO-mockを得た。
【００８９】
１０％ウシ胎児血清含有のRPMI1640培地で培養した５×１０6細胞の前記CHO-CD80又はCHO-mock細胞と、１０％ウシ胎児血清含有のRPMI1640培地で培養した１×１０7細胞のJurkat細胞とを、それぞれ、１０％ウシ胎児血清を含有しないRPMI1640培地に置換し、１．５mlチューブ内で混合し３７℃で１０分間保温した。その後、等量の２×細胞溶解緩衝液（２０ｍＭ  Tris-HCl（pH７．５）、１３７mM NaCl、１mM MgCl2、１mM CaCl2、１０％グリセロール、１％ Nonidet P-40、１５０μM Na3VO4、２０μgアプロチニン(aprotinin)、２００μM PMSF）加えて細胞を溶解し、細胞抽出液を遠心分離して（１４０００rpm、４℃、１５min）上清を得た。
【００９０】
前記上清に、１×細胞溶解緩衝液で平衡化した５０％懸濁プロテインＧセファロースを５０μl加え４℃で１時間撹拌し、遠心分離（３０００rpm、４℃、１min）を行った。前記遠心分離により分離した上清に、２００ng/μl抗CD２８抗体を１５μl加え４℃で１時間撹拌した。その後、５０％懸濁プロテインＧセファロースを２０μl加え４℃で１時間撹拌し、ついで遠心分離（３０００rpm、４℃、１min）をかけ、得られた沈殿を９００μｌの１×細胞溶解緩衝液で５回洗浄後、残った溶液と等量の2×SDS loadIng dyeを加えSDSゲル電気泳動のサンプルとした。
【００９１】
CD28のリン酸化を検出するウェスタンブロッティングは、上記で得られたサンプルを１２％SDSゲル電気泳動(SDS-PAGE)で分離後、タンパク質をPVDF膜に転写させ、抗リン酸化チロシン抗体を用いて行った。その結果の一例を図１に示す。図１(Ａ)は、SDS-PAGE後に染色処理したゲルを示し、図１(Ｂ)は、ウェスタンブロッティングの結果を示す。両図において、レーン１は、CHO-mockのみを用いた場合、レーン２は、CHO-CD80のみを用いた場合、レーン３は、Jurkatのみを用いた場合、レーン４は、CHO-mockとJurkatとを用いた場合、レーン５は、CHO-CD80とJurkatとを用いた場合である。図１(Ｂ)のレーン５に示すように、前記pRc/CMV-CD80にクローニングされたCD80は、CD28をリン酸化できることから、補助刺激分子としての活性を有することが示された。
【００９２】
（３）CD80安定発現細胞株の樹立
MDA-MB-231細胞でヒトCD80を安定に恒常的に発現する細胞株MDA-MB/CD80の樹立は、次の方法で行った。
【００９３】
MDA-MB-231細胞を直径３５ｍｍのシャーレを用いて１０％ウシ胎児血清含有のRPMI1640培地で４〜６時間培養した。この細胞に６μｇの前記pRc/CMV-CD80をリポフェクション法で導入した。導入４８時間後、一過性のCD80を発現していることをフローサイトメーターで確認した。同時に上記の培地に抗生物質Ｇ４１８を含む培地に換えて、プラスミドが染色体に組み込まれた細胞を選択した。さらに、選択された細胞を限界希釈法によって単一細胞からクローニングし、ヒトCD80を安定に発現する細胞株MDA-MB/CD80G418を得た。
【００９４】
前記MDA-MB/CD80G418が、CD80を発現していることを、前記MDA-MB/CD80G418から抽出したmRNAを用いたRT-PCR法、および、抗CD80抗体を用いたフローサイトメトリーにより確認した。その結果の一例を、それぞれ、図２(Ａ)および図２(Ｂ)に示す。図２(Ａ)に示すように、前記MDA-MB/CD80G418（レーンｃ）は、その親細胞株であるMDA-MB-231（レーンｂ）よりもCD80のmRNAが高発現していた。また、図２(Ｂ)に示すように、フローサイトメーター（商品名:COULTER Epics XL/MCL、COULTER社製、以下同じ）により、前記MDA-MB/CD80上にCD80が発現していることが確認された。
【００９５】
（４）CD80発現細胞株と通常用いられる樹状細胞（dendritic cell；DC）とのPhenotypeの比較
次に、前記CD80発現細胞株（MDA-MB/CD80G418)とDCの細胞膜表面に発現しているマーカーを解析し、MDA-MB/CD80G418によるCTL誘導方法が、従来のDCを用いた誘導方法と異なることを示した。
【００９６】
・CD80発現細胞株MDA-MB/CD80の調製とマーカーの測定
１００μlのPBS培地に３ｘ１０5個の上記細胞株MDA-MB/CD80G418を懸濁したサンプルをFacsチューブにとり、FITC(Fluorescein isothiocyanate)若しくはPE(Phycoerythirin)で標識した様々なマーカーに対する抗体で染色し、フローサイトメーターにより測定した。前記MDA-MB/CD80の培養条件は以下の通りとした。
培養容器：FALCON製２４ウェルプレート
使用培地：AIM-V培地（１０％ FCS添加）
なお、上記培地はRPMI培地を用いても良いし、FCSの代わりに、AB血清を用いても良い。また、血清濃度は１０％に限定されない。特にAIM-Vを使う場合は血清は必要ない。
培養温度：３７℃（５％ＣＯ2）
培養装置：SANYO CO2インキュベータ
・DCの調製とマーカーの測定
単球もしくは付着細胞成分をGM-CSF（５００U/ml）とIL-4（５００U/ml）の存在下で５−８日間培養して所望のDCを得た。前記DCの培養条件は、前記MDA-MB/CD80の培養条件と同様にした。前記培養により得られた３ｘ１０5個のDCを１００μlのPBS培地に懸濁したサンプルをＦａｃｓチューブにとり、FITC若しくはPEで標識した様々なマーカーに対する抗体で染色し、フローサイトメーターにより測定した。更に、比較として、CD80を発現していない通常のMDA-MB-231細胞表面マーカーも上述と同様にして測定した。
【００９７】
図３、４に上記測定結果を示し、その結果をまとめたものを下記表２に示す。図３は従来の方法により誘導したDC上に発現しているマーカーの強度、図４は、MDA-MB/CD80G418およびMDA-MB-231の表面に発現したマーカーの強度を示すグラフである。
【００９８】
図中、表記したマーカーは以下の通りである。
CD14：DCの誘導をみるマーカー（DCでは発現していない）
CD83：同じくDCのマーカー。成熟DCの場合に陽性となる。
HLA-DR：ClassII抗原のマーカー
CD80、CD86：Ｔ細胞の補助刺激分子
CD40：Ｔ細胞の補助刺激分子
CD33：ミエロイド系の細胞マーカー
CD54：接着分子
CCR7：ケモカインレセプター（成熟DC上に発現する）
【００９９】
（表２）
MDA-MB/CD80   MDA-MB      DC    
CD14            ×        ×        ×
CD83            ×        ×        △
HLA-class1      ○        ○        ○※
HLA-DR          ×        ×        ○
CD80            ○        ×        ○
CD86            △        △        ○
CD40            ○        ○        ○
CD33            ○        ○※      ○※
CD54            ○        ○        ○※
CCR7            ×        ×        ×    
（○・発現が認められる。△・若干発現が認められる。×・発現が認められない。※・Data not shown.）
【０１００】
図４および上記表２に示すとおり、前記MDA-MB/CD80G418細胞株は、CD33が発現していることから、単球や樹状細胞のグループに属するミエロイド系の細胞であるが、CD14陰性であることから、単球ではなく、また、HLAクラスII抗原の一つであるHLA-DR抗原が発現していないことから、DCでもないことが確認できる。
【０１０１】
また、既知の抗原提示細胞（単球、DC、B細胞等）の抗原提示能の必須の分子であるMHC
クラスII抗原を細胞表面に発現していないことから、当該CD80発現細胞株は既知の抗原提示細胞グループに属さないものである。当該CD80発現細胞株のその他の表面抗原の特徴としては、HLA-クラスI抗原が発現しており、CD40およびCD54分子は発現しているが、CD83は発現しておらず、CD86は若干発現していることが挙げられる。
【０１０２】
図４に示すとおり、当該CD80発現細胞株の親株には発現が見られないCD80が大量に発現していた。このことから、本発明のCTLの誘導方法によれば、抗原提示能の必須の分子であるMHCクラスII抗原が発現していないにもかかわらず、CD80分子を発現させることによりCD８陽性Ｔ細胞を活性化増殖させることが出来ることが示された。また、当該CD80発現細胞株は本来CD40およびCD54も発現していることから、CD54分子によりリンパ球と当該細胞株との接触を高め、CD40分子からの補助刺激シグナルにより更にCD8+T細胞の活性化増殖を高めることができる。
【実施例２】
【０１０３】
＜MDA-MB/CD80を用いたEBV抗原特異的なCTL誘導＞
実施例１のCD80発現細胞株MDA-MB/CD80G418に、がん抗原ペプチドであるエプスタインバーウイルス（以下EBV）抗原ペプチドとリンパ球とを共培養させて、がん抗原特異的なCTLの誘導を確認した。前記EBV抗原ペプチドは、下記アミノ酸配列からなるペプチドを用いた。また、コントロールとして、前記MDA-MB/CD80の親株であり、CD80を発現しないMDA-MB細胞についても同様に行った。
【０１０４】
EBV抗原ペプチド（配列番号３）：GLCTLVAML
細胞の培養条件は以下の通りとした。
温度：３７℃（５％ＣＯ2）
使用容器：Falcon製２４ウェルプレート
装置：CO2インキュベータ
培地：FCS若しくはAB血清を含むAIM-V培地若しくはRPMI1640培地
【０１０５】
・CTLの誘導
５×１０5個のMDA-MB/CD80G418細胞を、前記EBV抗原ペプチド（濃度１-１０μg/ml）で感作後、マイトマイシンＣ（共和発酵工業株式会社製）で処理して余分のマイトマイシンＣを洗浄除去した。
【０１０６】
このようにして得られたMDA-MB/CD80G418細胞を１mlの培養液に懸濁し、２４ウェルプレートを用いて各ウェルに加え、ここに更に２ｘ１０6個のHLA-A2（HLA-A*0201）抗原陽性Ｔ細胞もしくは、該Ｔ細胞を含む細胞分画を各ウェルに加えたのち、６−８日間培養した（初回刺激）。このとき、付加的抗原提示能を高めるために、培養液中に前記ペプチド（１−１０μg/ml）を加えた。
【０１０７】
前記培養後、前記EBV抗原特異的テトラマー（T-Select MHC Tetramer：MBL社製）を用いて、Ｔ細胞中のEBV抗原特異的CTLの割合を測定した（初回刺激後測定）。その測定方法は、後述のとおりである。さらに、初回刺激により増殖したEBV抗原特異的CTLを含む細胞集団をあらかじめ上述のように調製された５ｘ１０5個のMDA-MB/CD80G418細胞と前記EBV抗原ペプチド（１−１０μg/ml）を含むウェルに添加して、２度目の刺激を行い、６−８日間培養後に同様にペプチドに特異的なテトラマーを用いて、Ｔ細胞中のCD８陽性抗原特異的CTLの割合を測定した（２回刺激後測定）。
【０１０８】
なお、用いたMDA-MB/CD80G418細胞のHLAタイプは以下の通りである。
HLA-A*0201（HLA-A2型）
HLA-B40/41
HLA-C2/17
HLA-DR14/8
【０１０９】
・EBV抗原ペプチド特異的テトラマーを用いたCTLの定量方法
前記初回刺激および２回目の刺激後のEBV抗原特異的CTLの誘導量のテトラマーを用いた解析は、以下の手順で行なった。なお、前記テトラマーは、調製済みのEBVテトラマー（T-Select MHC Tetramer）をMBL（株式会社医学生物学研究所）より購入して用いた。
(I)テトラマーと誘導されたCTLの結合
５μlのテトラマーと、前記初回刺激および２回目の刺激後のCTL５ｘ１０6/mlを１００μl(PBS)混合し、４℃で３０分インキュベーションした。PBSを用いて５分間、４℃、１５００rpmの条件で洗浄後、５００μlのPBSに懸濁して、フローサイトメーターを用いて測定した。
(II)テトラマーを用いたCTL誘導の解析
使用したテトラマーは、HLA-A*0201のMHCクラスIおよび前記MHC拘束性EBV抗原ペプチドを結合しているため、EBV抗原特異的なCTLと結合することが可能となり、それにより、正確に前記CTLを定量することができる。前記テトラマーに標識されたPEと、FITCで標識されたCD8分子とを指標にフローサイトメトリーを行い、CTLの誘導効率を測定した。その結果の一例を図５に示し、EBV特異的CTLの割合を下記表３にまとめて示す。
【０１１０】
(表３）
MDA-MB/CD80     MDA-MB/CD80 
−              EBV-antigen   
初回刺激      0.06％          21.77％
二回刺激        −            53.36％    
【実施例３】
【０１１１】
＜MDA-MB/CD80を用いたメラノーマ(Melanoma)抗原特異的なCTL誘導＞
前記EBV抗原ペプチドに替えて、がん抗原ペプチドであるメラノーマペプチド(Mart-1)を使用し、前記EBV抗原ペプチド特異的テトラマーに替えて、Mart-1特異的テトラマー（T-Select MHC Tetramer、ＭＢＬ社製）を使用したほかは、実施例２と同様にして、メラノーマ抗原特異的CTLを誘導し、その誘導効率をフローサイトメーターにより測定した。なお、前記Mart-1ペプチドは、下記アミノ酸配列からなるペプチドである。前記測定結果の一例を図６に示し、Mart-1特異的CTLの割合を下記表４にまとめて示す。
【０１１２】
Mart-1（配列番号４）：ELAGIGILTV
【０１１３】
(表４）
MDA-MB/CD80    MDA-MB/CD80
−             Mart-1 antigen 
初回刺激      0.03％          3.18％      
【０１１４】
（比較例１）
＜自家DCを用いたEBV抗原特異的なCTL誘導＞
前記MDA-MB/CD80に替えて下記のように調製したHLA-A2（若しくはHLA-A*0201）抗原陽性のDCを用い、実施例２と同様にして、EBV抗原特異的なCTLの増殖していく割合を測定した。ただし、CTLの誘導は、前記DCを刺激細胞とし、自己単核球画分もしくはＴ細胞を高純度でふくむ細胞集団を反応細胞として用いた、前記EBV抗原ペプチドの存在下のauto MLR（自己リンパ球混合培養反応）により行った。また、CTL誘導の刺激は、培養６−８日目に２回目刺激を行い、２回目刺激から６−８日後に３回目刺激を行った。それぞれの刺激後６−８日目の一部細胞を回収し測定試料とした。その測定結果の一例を図７に示し、そのEBV特異的CTLの割合を下記表５にまとめて示す。
【０１１５】
・DCの調製
前記DCは、HLA-A2(若しくはHLA-A*0201)抗原陽性の末梢血由来の単球もしくは付着細胞成分を用いて、細胞の数に準じて、２４ウェルプレート、６ウェルプレート、２５mlフラスコ、５０ｍｌフラスコ等を用いてGM-CSF（５００ U/ml〜１０００ U/ml）IL-4（４００ U/ml〜１０００ U/ml）存在下で５−７日間培養し、所望のDCを得た。
【０１１６】
なお、前記DCのHLAタイプは以下の通りである。
HLA-A*0201、*2402
HLA-B*5101、*5102若しくは*5201
HLA-C  なし
HLA-DRB1*1501若しくは*1502
【０１１７】
(表５）
DC            DC
−            EBV-antigen   
初回刺激      0.11％         3.56％
二回刺激      0.01％         9.12％
三回刺激      0.01％        24.52％      
【０１１８】
（比較例２）
＜自家DCを用いたメラノーマ抗原特異的なCTL誘導＞
前記EBV抗原ペプチドに替えて、前記Mart-1を使用し、前記EBV抗原ペプチド特異的テトラマーに替えて、前記Mart-1特異的テトラマーを使用したほかは、比較例１と同様にして、メラノーマ抗原特異的CTLを誘導し、その誘導効率をフローサイトメトリーにより測定した。前記測定結果の一例を図８に示し、Mart-1特異的CTLの割合を下記表６にまとめて示す。
【０１１９】
(表６）
DC            DC
−            Mart-1 antigen
初回刺激      0.03％        0.85％        
【０１２０】
＜実施例２，３および比較例１，２の結果＞
図５〜８および上記表３〜６に示すとおり、前記MDA-MB/CD80は、既知の抗原提示能の必須の分子であるクラスII抗原を発現してないが、自家DCとの共培養に比べ、著しく効率よく抗原特異的CTLを誘導できた。また、自家DCとの共培養は、現在最も効率よく抗原特異的CTLを誘導すると考えられているが、３回刺激を行なった後でも、前記MDA-MB/CD80細胞株を用いて２回刺激を行なった場合よりも誘導効率がかなり低いことも示された。
【０１２１】
つまり、本発明のCD80発現細胞株と、特定の疾病抗原ペプチドを接触させてリンパ球を培養することにより、従来よりも工程を短縮することが可能となり、更に特異的CTLの誘導効率も大幅に向上させることが可能となった。
【０１２２】
なお、上述の各試験では、疾病抗原ペプチドとして、EBV抗原とメラノーマ抗原を用いたが、本発明の誘導方法はこれらに限定されることはなく、MHCクラスI分子に結合し、提示されうる総ての疾病抗原ペプチドに適応できるものである。
【０１２３】
すなわち、MHCクラスI分子上に抗原ペプチドが提示されていれば、これを認識するＴ細胞受容体を有しているT細胞は前記抗原ペプチドを認識することができる。前記認識だけではT細胞の活性化・増殖は進まないが、本発明のCD80発現細胞株は補助刺激分子であるCD80を発現しているので、このCD80がT細胞上のCD28と結合し、CD28分子を介して、補助的活性化シグナルを付加することにより、T細胞の活性化・増殖を有効に進めることができる。
【実施例４】
【０１２４】
＜CD80発現細胞株を用いたCTLの誘導におけるIL-2の付加的効果＞
実施例２に記載の初回刺激後測定における、初回刺激後の６〜８日間培養において、３日目にIL-2（５００U/ml）を付加した場合と、付加しない場合とで、T細胞中の誘導されるEBV抗原特異的CTLの割合を、実施例２と同様に測定した。その測定結果の一例を図９に示し、EBV特異的CTLの割合を下記表７にまとめて示す。
【０１２５】
(表７）
MDA-MB/CD80  MDA-MB/CD80  MDA-MB
EBV-antigen  EBV-antigen  EBV-antigen
IL-2         −           IL-2         
初回刺激    44.25％      34.11％      4.72％      
【０１２６】
図９および上記表７に示すように、CD80を発現しないMDA-MBと、CD80を発現するMDA-MB/CD80G418とでは、同量のIL-2を添加した場合、MDA-MB/CD80G418細胞株は、MDA-MB細胞株のおよそ１０倍という高い誘導効率を示している。また、同じCD80発現細胞株であっても、IL-2を添加した場合は、より特異的CTLの誘導効率が向上することが示された。
【実施例５】
【０１２７】
＜CD80安定発現株MDA-MB/CD80zeocinの樹立＞
（１）CD80遺伝子断片のクローニング
実施例１と同様にして、CD80の遺伝子断片をPCR法により増幅し、プラスミドpZeoSV2に導入し、pZeoSV2/CD80を得た。挿入されたヒトCD80 cDNAの塩基配列をDNAシーケンサーで確認したところ、論文[Freeman G. J. et al. (J. Immunol.) 143 2714-2722 (1989)]で報告されているヒトCD80のcDNAの塩基配列と完全に一致した。
【０１２８】
（２）CD80安定発現細胞株の樹立
MDA-MB-231細胞でヒトCD80を安定に恒常的に発現する細胞株MDA-MB/CD80zeocinの樹立は、プラスミドとして前記pZeoSV2/CD80を用い、選択用抗生物質として、zeocinを使用した他は、実施例１と同様にして行った。得られた細胞株MDA-MB/CD80zeocinのCD80の発現確認は、フローサイトメーターによって細胞表面のCD80を検出し、RT-PCR法によりCD80mRNAの発現を検出することで行った。その結果の一例を図１０に示す。図１０(Ａ)は、フローサイトメーターの解析結果を示し、図１０(Ｂ)は、RT-PCRの結果を示す。図１０(Ｂ)において、レーン１は、前記MDA-MB/CD80zeocinの親株であるMDA-MB-231であり、レーン２が、前記MDA-MB/CD80zeocinである。G3PDHは、どの細胞でも発現しており、RT-PCRに用いたトータルRNA量が等しいことを示すために用いたマーカーである。図１０に示すとおり、CD80を安定に発現する細胞株MDA-MB/CD80zeocinの樹立が確認された。
【実施例６】
【０１２９】
＜CD86安定発現株MDA-MB/CD86の樹立＞
（１）CD86遺伝子断片のクローニング
ヒトCD86の遺伝子断片をPCR法により増幅した。鋳型には、健常人末梢血リンパ球のcDNA libraryを用い、プライマーには、文献［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002) ］のCD86cDNA塩基配列に基づき合成した下記２つのDNAオリゴマーを使用した。下記プライマー塩基配列における下線部は、ベクターに挿入するための制限酵素サイトの配列Nhe I（CD86:Ｆ）およびXba I（CD86:Ｒ）を示す。
【０１３０】
CD86:Ｆ（配列番号５）
5'-TAAGCTAGCACCATGGATCCCCAGTGCACTATGGGACTGAG-3'
CD86:Ｒ（配列番号６）
5'-TAACTCGAGTTAAAAACATGTATCACTTTTGTCGCATG-3'
【０１３１】
PCRは、実施例１と同じ反応条件でおこなった。前記PCR法で特異的に増幅されたDNA断片を、１．５％アガロースゲル電気泳動により切り出し、制限酵素Nhe IおよびXba I処理し、プラスミドpZeoSV2(Invitrogen社製)のNhe IおよびXba I部位の間に挿入して、pZeoSV2/CD86を得た。挿入されたCD86cDNAの塩基配列をDNAシーケンサーで確認したところ、前記文献で報告されているCD86cDNAの塩基配列と完全に一致した。
【０１３２】
（２）CD86安定発現細胞株の樹立
MDA-MB-231細胞を直径３５ｍｍのシャーレを用いて１０％ウシ胎児血清含有のRPMI1640培地で４-６時間培養した。この細胞に４μgの前記pZeoSV/CD86をリポフェクション法で導入した。導入４８時間後、一過的にCD86を発現していることをRT-PCR法により確認した。その結果を図１１に示す。同図に示すように、CD86のmRNAが高発現していることが確認された。これらの一過性CD86発現細胞株は、培地を抗生物質zeocinを含む培地に換えて、前記プラスミドが染色体に組み込まれた細胞を選択し、さらに、選択された細胞を限界希釈法によって単一細胞からクローニングすることで、ヒトCD86を安定に高発現する細胞株MDA-MB/CD86を得ることができる。
【実施例７】
【０１３３】
＜一過性CD86導入細胞株を用いたEBV抗原特異的なCTL誘導＞
MDA-MB/CD80に替えて、実施例６で作製した一過性CD86導入細胞株を使用したほかは、実施例２と同様にして、EBV抗原特異的CTLを誘導し、その誘導効率をフローサイトメトリーにより測定した。初回刺激後の測定結果の一例を図１２に示し、EBV特異的CTLの割合を下記表８にまとめて示す。
【０１３４】
(表８）
MDA-MB+CD86    MDA-MB+CD86
−             EBV antigen  
初回刺激        0.16％        2.28％    
【実施例８】
【０１３５】
＜一過性CD86導入細胞株を用いたメラノーマ抗原特異的なCTL誘導＞
前記EBV抗原ペプチドに替えて、がん抗原ペプチドであるメラノーマペプチド（Mart-1）を使用し、前記EBV抗原ペプチド特異的テトラマーに替えて、Mart-1特異的テトラマー（T-Select MHC Tetramer、MBL社製）を使用したほかは、実施例７と同様にして、メラノーマ特異的CTLを誘導し、その誘導効率をフローサイトメトリーにより測定した。初回刺激後の測定結果の一例を図１３に示し、Mart-1特異的CTLの割合を下記表９にまとめて示す。
【０１３６】
(表９）
MDA-MB+CD86    MDA-MB+CD86
−             Mart-1 antigen
初回刺激       0.03％          0.66％    
【０１３７】
＜実施例７および８の結果＞
図１２、１３および表８、９が示すとおり、補助刺激分子として、CD80に替えてCD86を使用しても、効率よく抗原特異的CTLが誘導できることが示された。
【実施例９】
【０１３８】
＜CD80安定発現株TUHR10TKB/CD80の樹立＞
MHCクラスIの型が、HLA-A2/24である細胞株TUHR10TKBの細胞を直径３５ｍｍのシャーレを用いて１０％ウシ胎児血清含有のRPMI1640培地で４-６時間培養した。この細胞に４μｇの前記pZeoSV2/CD80をリポフェクション法で導入した。導入４８時間後、一過的にCD80を発現していることをRT-PCR法により確認した。その結果を図１４Ａに示す。同図に示すように、CD80のmRNAが高発現していることが確認された。
【０１３９】
次に、これらの一過性CD80発現細胞株の培地を抗生物質zeocinを含む培地に換えて、前記プラスミドが染色体に組み込まれた細胞を選択し、さらに、選択された細胞を限界希釈法によって単一細胞からクローニングすることで、ヒトCD80を安定に高発現する細胞株TUHR10TKB/CD80を樹立した。前記TUHR10TKB/CD80のCD80の発現を、細胞表面上のCD80をフローサイトメーターにより検出することで確認した。図１４Ｂに、解析結果の一例を示す。同図のとおり、CD80を安定に高発現する細胞株TUHR10TKB/CD80が樹立されたことが示された。
【０１４０】
なお、用いたTUHR10TKB細胞のHLAタイプは以下の通りである。
HLA-A*0201、HLA-A*2402
HLA-B*4001、HLA-B*4002
HLA-C*0303、HLA-C*0304
【実施例１０】
【０１４１】
＜CD86安定発現株TUHR10TKB/CD86の樹立＞
前記TUHR10TKBの細胞を直径３５ｍｍのシャーレを用いて１０％ウシ胎児血清含有のRPMI1640培地で４-６時間培養した。この細胞に４μgの前記pZeoSV2-CD86をリポフェクション法で導入した。導入４８時間後、一過的にCD86を発現していることをＲＴ-ＰＣＲ法により確認した。その結果を図１５Ａに示す。同図に示すように、CD86のmRNAが高発現していることが確認された。
【０１４２】
次に、これらの一過性CD86発現細胞株の培地を抗生物質zeocinを含む培地に換えて、前記プラスミドが染色体に組み込まれた細胞を選択し、さらに、選択された細胞を限界希釈法によって単一細胞からクローニングすることで、ヒトCD86を安定に高発現する細胞株TUHR10TKB/CD86を樹立した。前記TUHR10TKB/CD86のCD86の発現を、細胞表面上のCD86をフローサイトメトリーにより検出することで確認した。図１５Ｂに、解析結果の一例を示す。同図のとおり、CD86を安定に高発現する細胞株TUHR10TKB/CD86が樹立されたことが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
以上説明したように、本発明のCTLの誘導方法は、従来のDC等抗原提示細胞を用いた誘導方法よりも迅速、簡便にかつ精度良く特定の疾病抗原に特異的に機能するCTLを誘導でき、誘導されるCTLの量も、従来の方法と比較して多いという特性も有する。したがって、本発明は、例えば、がんやウイルス性感染症のための薬剤やワクチン等の医薬製剤の分野や、免疫細胞療法等の医療分野等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】図１Ａは、免疫沈降後のSDS-PAGEの結果の一例を示す図であり、図１Ｂは、CD80の活性を示すウェスタンブロッティングの結果の一例を示す図である。
【図２】図２Ａは、本発明のCD80発現細胞株の一例におけるRT-PCRの結果を示す図であり、図２Ｂは、同細胞株のフローサイトメーターの解析図である。
【図３】図３は、樹状細胞の一例の表現型を示すフローサイトメーターの解析図である。
【図４】図４は、本発明のCD80発現細胞株の一例の表現型を示すフローサイトメーターの解析図である。
【図５】図５は、本発明のCD80発現細胞株の一例によるEBV抗原特異的CTLの誘導を測定したフローサイトメーターの解析図である。
【図６】図６は、本発明のCD80発現細胞株の一例によるMart-1抗原特異的CTLの誘導を測定したフローサイトメーターの解析図である。
【図７】図７は、樹状細胞の一例によるEBV抗原特異的CTLの誘導を測定したフローサイトメーターの解析図である。
【図８】図８は、樹状細胞の一例によるMart-1抗原特異的CTLの誘導を測定したフローサイトメーターの解析図である。
【図９】図９は、本発明のCD80発現細胞株の一例とIL-2とによるEBV抗原特異的CTLの誘導を測定したフローサイトメーターの解析図である。
【図１０】図１０Ａは、本発明のCD80発現細胞株のその他の例におけるフローサイトメトメーターの解析図であり、図１０Ｂは、同細胞株のRT-PCRの結果を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明のCD86発現細胞株の一例におけるRT-PCRの結果を示す図である。
【図１２】図１２は、本発明のCD86発現細胞株のその他の例によるEBV抗原特異的CTLの誘導を測定したフローサイトメーターの解析図である。
【図１３】図１３は、本発明のCD86発現細胞株のその他の例によるMart-1抗原特異的CTLの誘導を測定したフローサイトメーターの解析図である。
【図１４】図１４Ａは、本発明のCD80発現細胞株のさらにその他の例におけるRT-PCRの結果を示す図であり、図１４Ｂは、同細胞株のフローサイトメーターの解析図である。
【図１５】図１５Ａは、本発明のCD86発現細胞株のさらにその他の例におけるRT-PCRの結果を示す図であり、図１５Ｂは、同細胞株のフローサイトメーターの解析図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１４５】
配列番号１  プライマー：  CD80:Ｆ
配列番号２  プライマー：  hB7-1:Ｒ
配列番号５  プライマー：  CD86:Ｆ
配列番号６  プライマー：  CD86:Ｒ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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