(57)【要約】【課題】  本発明は、シアノバクテリアが産生する新規なポリグルカン構造を有するセミアミロペクチン型（セミデンプン型）のポリグルカン、それを合成する酵素、当該酵素をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有するベクター、それによる形質転換体を提供する。【解決手段】  本発明は、明確なクラスター構造を有さないセミアミロペクチン型のポリグルカンを産生するための、シネコシスティス  アクアティリスＳＩ−２（Synechocystis aquatilis SI-2）などのシアノバクテリア由来のグリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素、それをコードする遺伝子、当該遺伝子を含有してなるベクター、及び当該遺伝子で形質転換された細胞に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明確なクラスター構造を有さないセミアミロペクチン型のポリグルカンを産生するためのシアノバクテリア由来のグリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素。
【請求項２】
シアノバクテリア由来のグリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素が、配列表の配列番号２、４、若しくは６に記載のいずれかのアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の一部のアミノ酸が欠失、付加、若しくは他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有しポリグルカンの枝作り活性を有するものである請求項１に記載のグリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のシアノバクテリア由来のグリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素をコードする遺伝子。
【請求項４】
遺伝子が、配列表の配列番号１、３、若しくは５に記載のいずれかの塩基配列、又はこれらの塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するものである請求項３に記載の遺伝子。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の遺伝子を含有してなるベクター。
【請求項６】
請求項３又は４に記載の遺伝子が導入された形質転換細胞。
【請求項７】
宿主細胞が、植物細胞である請求項６に記載の形質転換細胞。
【請求項８】
植物細胞が、デンプン産生能を有する植物からの細胞である請求項７に記載の形質転換細胞。
【請求項９】
請求項３又は４に記載の遺伝子を含有してなるベクターを構築し、当該ベクターにより宿主細胞を形質転換して形質転換細胞を製造し、次いで当該細胞を発育させることからなるセミアミロペクチン型のポリグルカンを製造する方法。
【請求項１０】
宿主細胞が、グリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素の遺伝子を欠失又は欠損した細胞である請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、明確なクラスター構造を有さないセミアミロペクチン型のポリグルカンを産生するためのシアノバクテリア由来のグリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素、それをコードする遺伝子、当該遺伝子を含有してなるベクター、及び当該遺伝子で形質転換された細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物のデンプンはアミロースとアミロペクチンから成る。デンプンの主成分であるアミロペクチンは化学結合の上からは、直鎖のα‐１，４結合と、直鎖を結合するα−１，６結合を有する巨大分子（ポリグルカン）である点において、動物やバクテリアのグリコーゲンと何ら違いはない。
しかしながら、分子全体をα‐１，６結合がランダムに形成されているグリコーゲンに比べ、デンプンはアミロペクチンの枝分れ結合の分布が規則的で、そのために、クラスター構造という基本構造が、数千、数百単位でタンデム上に連結している特有の構造（タンデムクラスター構造）をしている。アミロペクチンのこの構造のために、デンプンは結晶性を示し、糊化特性、粘度特性など特有の物性を持つことができるのである。また、コメデンプンとイモデンプンの違いや、ジャポニカ米とインディカ米の違いは、クラスター構造内部の微妙な構造の差が原因である。
このように、デンプン利用分野では、デンプン分子構造に特有の構造に基づくデンプン物性の差異を利用して、多様な食品や工業品の原材料や加工素材として、実に幅広く用いられている。
【０００３】
それでは、植物は進化の過程でどのようにしてデンプンを創造してきたのであろうか。現在、藻類は次のように分類されている（「藻類の多様性と系統」より）。
１．藍色植物門（藍藻）
２．原核緑色植物門（原核緑藻）
３．灰色植物門（灰色藻）
４．紅色植物門（紅藻）
５．クリプト植物門（クリプト藻）
６．不等毛植物門（黄金色藻、ラフィド藻、珪藻、褐藻、黄緑藻、真正眼点藻）
７．ハプト植物門
８．渦鞭毛植物門（渦鞭毛藻）
９．ユーグレナ植物門
１０．クロララクニオン植物門
１１．緑色植物門（プラシノ藻、緑藻、トレボウクシア藻、アオサ、車軸藻）
１番の藍色植物門（藍藻）と２番の原核緑色植物門（原核緑藻）はいずれも酸素発生型の光合成が可能な原核生物である。光合成色素としてクロロフィルａの他に、藍藻はフィコビリン色素（フィコシアニン、アロフィコシアニン、フィコエリスリン）を、原核緑藻はクロロフィルｂを有する。この色素組成の違いが分類の基準となり、２者は独立の植物門を形成すると一時は考えられたが、数多くの遺伝子配列情報が蓄積した結果、これらの生物は、シアノバクテリアと総称される細菌の一門に属することが明らかとなってきた。シアノバクテリアとならんで好気性細菌（ミトコンドリアの原型となった）はそれぞれが独立して生きていたが、同時にこれらの生物が他の生物（原始真核生物）と相互に行動的あるいは生理的に密接な結びつきを形成し、これを定常的に保って生きてゆく（共生）こともある。
【０００４】
植物は、シアノバクテリア（ラン藻）との細胞内の共生により、細胞内に葉緑体に取り込んで進化してきたとされている。即ち、有る原始真核生物がシアノバクテリアを細胞内に取り込み、細胞内共生をし、細胞内に共生していたシアノバクテリアが、葉緑体という細胞内の器官に変化することにより植物細胞の原型が形成されたと考えられている。このような細胞内共生は、一度だけでなく、何度も繰り返され、それぞれ１次細胞内共生、２次細胞内共生、・・・と呼ばれている。このようにして、前記してきた紅藻、緑藻などの各種の藻類が誕生してきた。
そして、これが次第に進化して、陸上植物となり、現在の高等植物が誕生したとされている。高等植物は、規則的に並んだタンデムクラスター構造を有するデンプンを産生している。
【０００５】
植物は、シアノバクテリアとの細胞内共生により葉緑体を獲得してきたと言われているが、葉緑体を獲得してきたどの段階からタンデムクラスター構造を有するデンプンを産生し始めたのかという疑問が生じてくる。従来は、シアノバクテリアは、グリコーゲンタイプのポリグルカンを合成するとされ、藻類からデンプンのような構造を有するポリグルカンが産生されてきたとされていた。しかし、このようなポリグルカンの産生に関与する酵素やそれをコードする遺伝子についての研究はほとんど行われておらず、シアノバクテリアや、紅藻、緑藻などの藻類のポリグルカン構造とポリグルカン合成に関わる酵素や遺伝子に関する知見は乏しく、特に近年の高度な分解能を有する分析技術で解析したデータは極めて乏しい。
【０００６】
高等植物に関してはデンプン合成酵素について広範囲な研究が行われており、例えば、顆粒結合性デンプン合成酵素のアイソタイプII（ＧＢＳＳII）の解析（特許文献１参照）、トウモロコシの可溶性デンプン合成酵素の遺伝子の解析（特許文献２参照）、コムギのデンプン合成酵素の遺伝子の解析（特許文献３参照）、デンプン合成酵素をコードする遺伝子を発現させる細胞に関するもの（特許文献４参照）、トウモロコシのデンプン合成酵素の遺伝子の発現を制御してデンプンの微細構造を改変する方法に関するもの（特許文献５参照）などが報告されている。
しかしながら、デンプン合成の起源に遡るものは無く、シアノバクテリアのデンプン合成酵素に関するものは無い。
【０００７】
【特許文献１】特表平１１−５０１５０３号
【特許文献２】特表２０００−５１１０４９号
【特許文献３】特表２００１−５０３９６４号
【特許文献４】特表２００１−５１９６６４号
【特許文献５】特表２００２−５２５０２９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、シアノバクテリアのポリグルカンの合成に関与する酵素や遺伝子を解析し、ポリグルカンをデンプンの構造にする機構を解明することにより、デンプン合成に至る酵素反応の機構を利用して新たな構造を有するデンプンの産生を可能にすることを目的としている。より具体的には、本発明は、ある種のシアノバクテリアが産生する新規なデンプン構造を有するデンプン、それを合成する酵素、当該酵素をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有するベクター、それによる形質転換体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、５７種のシアノバクテリアからポリグルカンの分子構造を解析したところ、４種のシアノバクテリアにおいて、グリコーゲンとアミロペクチンの中間的な構造を有するポリグルカン（進化途上のアミロペクチン）を合成していることを見出した。即ちこれらの種では、すでに進化途上のアミロペクチンを合成する能力を持っていることになる。このタイプのシアノバクテリアには、高等植物の完成したアミロペクチン合成システムの萌芽が見られることになり、デンプン合成の機構を解明する基礎となることから、その代表として、Synechocystis aquatilis SI-2株を材料として、遺伝子解析を行った。
【００１０】
本発明は、明確なクラスター構造を有さないセミアミロペクチン型のポリグルカンを産生するためのシアノバクテリア由来のグリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素、それをコードする遺伝子、当該遺伝子を含有してなるベクター、及び当該遺伝子で形質転換された細胞に関する。また、本発明は当該形質転換体を用いたポリグルカンの製造方法に関する。
より詳細には、本発明は、明確なクラスター構造を有さないセミアミロペクチン型のポリグルカンを産生するためのシアノバクテリア由来のグリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素が、配列表の配列番号２、４、若しくは６に記載のいずれかのアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の一部のアミノ酸が欠失、付加、若しくは他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有しポリグルカンの枝作り活性を有するものであるグリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素、それをコードする遺伝子、当該遺伝子を含有してなるベクター、及び当該遺伝子で形質転換された細胞に関する。また、本発明は当該形質転換体を発育させることからなるセミアミロペクチン型のポリグルカンを製造する方法に関する。
【００１１】
本発明者らは、各種の藻類がどのようなポリグルカンを産生しているかを検討した。６２種のラン藻、１１種の紅藻、４８種の緑藻、２種の渦鞭毛藻、１種の真眼点藻、１種の灰色藻、及び１種のクリプト藻の合計１２６種の藻類について、これらの藻類が産生するポリグルカンの構造を解析した。
ポリグルカンは、その構造により、アミロペクチン型とグリコーゲン型に分類される。図１はこの２種類、及びアミロペクチン型の微細構造を模式的にして示す。グリコーゲン型（図１の右側）はランダムに糖鎖が延びているが、アミロペクチン型（図１の左側）は規則的なタンデムクラスター構造を有している。ひとつのクラスターの構造をアミロペクチン構造の下側（図１の左下側）に示す。クラスター内の直鎖部分の糖の長さが約１０を超えると２本の隣接する糖鎖が二重ラセン構造となり高密度となる。この二重ラセン構造の部分をクリスタル領域と言い通常は約６〜７．５ｎｍ以上の長さになっている。クラスターの根本の二重ラセンを構成していない部分をアモルファス領域と言い約３ｎｍ程度の長さである。
完全なアミロペクチン型は、二重ラセンのクリスタル領域を有しており、密度が高く疎水性となっている。しかし、セミアミロペクチン型はクリスタル領域が十分に形成されておらず、疎水性も低くなっている。即ち、二重ラセン構造の形成は不十分であり、クラスター構造も必ずしも規則的なものではない。
ポリグルカンの解析に当たり、これをグリコーゲン型、アミロペクチン型（デンプン型）、及びセミアミロペクチン型（セミデンプン型）の３種類に分類して解析した。この結果を次の表１に示す。
【００１２】
【表１】
2005073652.tif 000002
【００１３】
この結果、検出できなかったものが９種、判定できなかったものが４種有ったが、それ以外の種については、グリコーゲン型、アミロペクチン型（デンプン型）、及びセミアミロペクチン型（セミデンプン型）の３種類に分類された。シアノバクテリア（ラン藻）以外の藻類においては、グリコーゲン型は全く見られなかったが、そのほとんどはセミアミロペクチン型（セミデンプン型）のもであった。緑藻の１１種（約２５％）及び渦鞭毛藻の１種にアミロペクチン型（デンプン型）が見られたが、藻類は完全なアミロペクチン型（デンプン型）のデンプンを産生するものは少ない。これは、共生により葉緑素を獲得したもののデンプン合成の進化の過程にあるということを示すものである。
【００１４】
この解析の結果、注目すべきことが見出された。従来、シアノバクテリアと１次細胞内共生が起こってから、細胞内の器官としての葉緑体が形成され、ポリグルカンとしてデンプンが産生されはじめた。即ち、シアノバクテリアはデンプンを産生することはできず、グリコーゲンのみを産生すると考えられていたのであるが、今回の詳細な解析の結果シアノバクテリアの中にもアミロペクチン型のポリグルカンを産生するものが見出されたのである。完全なデンプンまではいかないが、デンプンに近い構造を有するポリグルカンを産生しているシアノバクテリアが４種見出された（表１参照）。
このことは、従来のデンプン合成の進化の過程についての考え方を大きく変えるものであるばかりでなく、ポリグルカンの中にデンプンまではいかないが、シアノバクテリア（ラン藻）が産生するアミロペクチン構造を有する新種のポリグルカンが存在していたことを示すものである。
そこで本発明者らは、シアノバクテリアについてさらに詳細に産生しているポリグルカンの構造を解析した。シアノバクテリアが産生しているポリグルカンの構造を解析した。この結果を次の表２、表３、及び表４に示す。
【００１５】
【表２】
2005073652.tif 000003
【００１６】
【表３】
2005073652.tif 000004
【００１７】
【表４】
2005073652.tif 000005
【００１８】
これらのラン藻類のポリグルカンの糖鎖の長さの鎖長分布を解析した結果を図２〜図５に示す。図２はシネココッカス  sp.ＰＣＣ７９４２（Synechococcus sp. PCC7942）の場合であり、図３はアナバエナ（Anabaena）の場合であり、図４はデルモカルパ（Dermocarpa）の場合であり、図５はシネコシスティス  アクアティリスＳＩ−２（Synechocystis aquatilis SI-2）の場合である。図２〜図５の各々は比較のためにイネのデンプンの鎖長分布をオレンジ色で示している。これらの図における鎖長分布は、ポリグルカンを枝分かれの箇所で切断して、直鎖状の部分を集め、この直鎖状の全部の量を１００％として各鎖長の全部に対する割合（％）を棒グラフの長さで示している。
この結果、図２のシネココッカス  sp.ＰＣＣ７９４２（Synechococcus sp. PCC7942）、図３のアナバエナ（Anabaena）、及び図４のデルモカルパ（Dermocarpa）の場合には、鎖長が５〜８程度の短いものが多く、かつデンプンの特徴である鎖長が４０付近の山が見られず、鎖長４０以上のものはほとんど検出されていない。これに対して図５のシネコシスティス  アクアティリスＳＩ−２（Synechocystis aquatilis SI-2）では、鎖長の短いものも多少はあるが、主体はイネのデンプンとほぼ同じように１０以上のところにある。そして、鎖長が４０以上のものもイネのデンプンと同様に存在している。しかし、デンプンの特徴である鎖長が４０付近の山を明確に見出すことはできない。
このことは、シネコシスティス  アクアティリスＳＩ−２（Synechocystis aquatilis SI-2）では、イネのデンプンと同様な鎖長分布はしているが、明確なクラスター構造をしているとは言えないポリグルカンを産生していることが明らかになった。
このような鎖長はデンプンに近いが、鎖長分布において鎖長が４０付近の山を明確に形成していないポリグルカンを、「セミアミロペクチン型」と命名した。
【００１９】
この結果、シアノセセ sp.（Cyanothece sp.）、シネコシスティス  アクアティリスＳＩ−２（Synechocystis aquatilis SI-2）、シネココッカス sp. BG043511（Synechococcus sp. BG 043511）、及びミコサルシナ  ブルメンシス（Myxosarcina burmensis）の４株においてせみアミロペクチン型のポリグルカンが産生されていることが判明した。そこで、本発明者らは、この中のシネコシスティス  アクアティリスＳＩ−２（Synechocystis aquatilis SI-2）に着目して、その合成酵素、及び代謝酵素などの代謝関連酵素群、並びにその遺伝子を解析することにした。
材料として用いた Synechocystis aquatilis SI-2株は、海洋バイオテクノロジー研究所釜石研究所から分譲された。同株を、ＢＧ‐１１液体培地（Rippka et al.1979年）により３０℃で、連続して光照射して、空気通気条件で培養した。２リットルの培養から収穫した細胞を用いて、ゲノムＤＮＡの抽出精製を行った。
このＤＮＡについて、断片化、平滑末端処理、サイズ分画を行い、長さ３ｋｂ以上の断片について、プラスミドベクターｐＵＣ１１８のＨｉｎｃII部位にクローン化した。以上の操作のうち、ＤＮＡの摘出精製から組換えプラスミドの作成までは常法にしたがって、ドラゴンジェノミクス社に依頼して行った。
【００２０】
作成した組換えプラスミドをエレクトロポレーション法により大腸菌に導入し、得られたコロニー約１０，０００個を液体培養して、プラスミドＤＮＡを単離した。以下に示す配列のユニバーサルプライマーを用いて、組換えプラスミド中の挿入断片の両端について塩基配列の決定を行った。
ユニバーサルプライマーの配列
５’‐ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’
５’‐ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ−３’
得られた塩基配列については ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）を使用して相同性検索解析を行った。
公共データベース中の既知配列と相同性が見出されたもののうち、ポリグルカン代謝に関与すると考えられる遺伝子配列を選択し、既知配列との比較に基づいてクローン間の相対的位置関係、および相同性について明らかにした。
その結果、ＡＤＰ‐グルコース・ピロフォスフォリラーゼ（ＡＧＰ）、グリコーゲン合成酵素（ＧＳ）、枝作り酵素（ＢＥ）、フォスフォリラーゼ（ＰＲＬ）、イソアミラーゼ（ＩＳＡ）、ネオプルラナーゼ（ｎＰＵＬ）、プルラナーゼ（ＰＵＬ）の各遺伝子に相同性を示すクローンが同定され、ポリグルカン代謝に関与すると考えられる遺伝子を網羅的に取得することができた。
【００２１】
この結果を図６示す。図６中のＡＧＰはＡＤＰ‐グルコース・ピロフォスフォリラーゼを示し、ＧＳはグリコーゲン合成酵素を示し、ＢＥは枝作り酵素を示し、ＰＲＬはフォスフォリラーゼを示し、ＩＳＡはイソアミラーゼを示し、ｎＰＵＬはネオプルラナーゼを示し、ＰＵＬはブルラナーゼをそれぞれ示す。図６の四角枠は各酵素の既知配列部分を示し、矢印はそれと相同性を示したSynechocystis aquatilis SI-2株のゲノミッククローンの相対位置を示している。矢印の左側の記号はSynechocystis aquatilis SI-2株のゲノミッククローンの番号を示している。
【００２２】
これらのうち、特にグリコーゲン枝作り酵素（ＢＥ）に関しては、既知遺伝子配列と相同性を示す遺伝子が３種類存在することが明らかとなった。これらの３種の酵素を仮にＳａｑＢＥｘ、ＳａｑＢＥｙ、ＳａｑＢＥｚと命名した。これらの遺伝子の塩基配列、及び翻訳領域のアミノ酸配列を配列表の配列番号１〜６に示す。配列番号１はＳａｑＢＥｘの塩基配列を示し、配列番号２はＳａｑＢＥｘのアミノ酸配列を示し、配列番号３はＳａｑＢＥｙの塩基配列を示し、配列番号４はＳａｑＢＥｙのアミノ酸配列を示し、配列番号５はＳａｑＢＥｚの塩基配列を示し、配列番号６はＳａｑＢＥｚのアミノ酸配列をそれぞれ示す。
また、これらのＢＥ酵素、ＳａｑＢＥｘ、ＳａｑＢＥｙ、及びＳａｑＢＥｚのアミノ酸配列を既知のもののアミノ酸配列と比較したものを図７に示す。図７のＥｃｏＢＥ、ＳｃｏＢＥは、それぞれ大腸菌、シネココッカスのＢＥ配列を示す。図７の黄色の網掛けの箇所は、多くの生物種で保存されている配列であることを示し、赤色の網掛けの箇所は、活性中心を示している。全種類で一致してい箇所には＊印が付されており、多数で一致している箇所には・印が付されている。
【００２３】
これまでゲノム配列が解読されたシアノバクテリアの８種においては、いずれもＢＥ遺伝子は一つしか見出されていない。従って、複数のＢＥ遺伝子を持つというS. aquatilisのゲノム構造、ならびにその代謝様式は、極めて特異的なものであることが示された。一般的なシアノバクテリアと異なり、複数のＢＥ遺伝子を持つことは、シュードアミロペクチン型ポリグルカンを合成するS. aquatilisの特性と関連があることも可能性として考えられる。
【００２４】
本発明は、藻類によりアミロペクチン型のポリグルカンの産生が獲得されただけでなく、既にシアノバクテリアの段階でアミロペクチン型のポリグルカンの産生がおこなわれていたことを明らかにするだけでなく、このようなシアノバクテリアのポリグルカン合成酵素を利用して新しい型のポリグルカンの製造が可能となる手法を提供するものである。本発明により提供されるポリグルカンは、グリコーゲンのような不規則な枝分かれをゆうするものではなく、ある程度の規則性を持って枝分かれが起こっているがデンプンのような明確なクラスター構造を有するものではなく、本明細書ではこれをセミアミロペクチン型のポリグルカンと称する。そして、このセミアミロペクチン型のポリグルカンには、鎖長が１０以上のものが多数存在しており、ある程度の二重ラセン構造が存在し、グリコーゲンのような親水性は有さないが、クラスター構造が明確ではなくデンプンほどの疎水性でもない。したがって、グリコーゲンとデンプンの中間のような性質を有するものであり、新しい型のポリグルカンとして今後の応用が期待されるものである。
【００２５】
本発明のセミアミロペクチン型のポリグルカンを産生するシアノバクテリアのポリグルカン合成酵素の遺伝子の分布の解析結果から、セミアミロペクチン型のポリグルカンを産生するシアノバクテリアを特徴付けている酵素がグリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素であることが判明した。即ち、この特徴的な酵素の存在により、グリコーゲンではなく、アミロペクチン型のポリグルカンの合成が可能となったものと考えられるが、完全なアミロペクチン型のポリグルカンの産生にまでは至らなかったと考えられる。
本発明のグリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素は、前記したようなセミアミロペクチン型のポリグルカンの製造に必須のもと考えられ、シアノバクテリア、より詳細にはシネコシスティス  アクアティリスＳＩ−２（Synechocystis aquatilis SI-2）から得られるものである。
シネコシスティス  アクアティリスＳＩ−２（Synechocystis aquatilis SI-2）から得られた３種類のグリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号２、４、若しくは６に記載するが、本発明のグリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素はこれらのアミノ酸配列を有するものに限定されるものではなく、本発明のセミアミロペクチン型のポリグルカンの産生を可能する機能を有するものであればよい。例えば、本発明のセミアミロペクチン型のポリグルカンの産生を可能する機能を有するものであって、配列表の配列番号２、４、若しくは６に記載のアミノ酸配列の中の一部のアミノ酸が欠失し、他のアミノ酸類が付加し、及び／又は一部のアミノ酸類が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。
本発明のグリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素は、その１種を単独で使用することもできるが、２種又は３種若しくはそれ以上を組み合わせて使用することもできる。前記したシネコシスティス  アクアティリスＳＩ−２（Synechocystis aquatilis SI-2）由来のものの場合の好ましい例としては、当該シアノバクテリアが有している３種類のグリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素を組み合わせて使用するのが好ましい。
【００２６】
また、本発明は、本発明のグリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素に対する抗体を提供する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。小ラニチジン塩酸塩の抗体は、抗体を製造する公知の手法により製造することができる。抗体を製造する際に使用される抗原としては、本発明のグリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素の全長のものを使用することもできるが、任意の部分長のものを使用してもよい。
【００２７】
本発明は、前記してきたシアノバクテリア由来のグリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素をコードする遺伝子を提供するものである。本発明の遺伝子は、翻訳領域に前記してきたグリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素のアミノ酸配列をコードし得る塩基配列を有するものであればよい。本発明の遺伝子は、翻訳領域を含有していればよく、必要に応じてプロモーター領域などの５’領域や３’領域を有することもできる。
本発明の遺伝子の好ましい例としては、シネコシスティス  アクアティリスＳＩ−２（Synechocystis aquatilis SI-2）由来の遺伝子が挙げられ、この塩基配列を配列表の配列番号１、３、又は５に記載する。本発明の遺伝子はこれらの塩基配列を有するものに限定されるものではなく、翻訳領域が前記した本発明のグリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素のアミノ酸配列をコードしているものである限り、任意の５’領域や３’領域を有することができる。また、本発明の遺伝子は、前記してきた塩基配列を有するものだけでなく、これらの塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するものも包含される。
【００２８】
また、本発明は、前記してきた本発明の遺伝子の断片からなるオリゴヌクレオチドを提供するものである。本発明のオリゴヌクレオチドは、塩基の数で、１０〜１５０塩基、１０〜１００塩基、好ましくは１０〜５０塩基、又は１０〜３０塩基のものであり、本発明の遺伝子を特徴付ける塩基配列を有する部分からなるものである。本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明の遺伝子の存在を検出、同定するためのプローブやプライマーとして有用である。例えば、これらのオリゴヌクレオチドを放射性元素や、蛍光物質で標識化することにより、検体中から本発明の遺伝子の存在を検出したり、同定することができる。また、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることにより、各種のＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーから、本発明の遺伝子を増幅させることが可能となる。
【００２９】
本発明は、本発明の遺伝子を含有してなるベクターを提供するものである。本発明の遺伝子はプラスミドやファージなどの任意のベクターにこれを組み込むことができ、本発明の遺伝子を含有するベクターを構築することができる。本発明のベクターを構築する方法としては、通常の公知の手法を広く採用するすることができる。
本発明のベクターは、発現ベクターが好ましいがこれに限定されるものではない。発現ベクターにおけるプロモーターとしては、シネコシスティス  アクアティリスＳＩ−２（Synechocystis aquatilis SI-2）由来のプロモーター領域を使用することもできるが、必要に応じて任意のプロモーターを使用することもできる。好ましいプロモーターとしては、形質転換する宿主細胞のＢＥ酵素のプロモーターが挙げられる。
【００３０】
本発明は、本発明の遺伝子により形質転換された形質転換細胞を提供する。本発明の形質転換細胞は、公知の手法で製造することができる。例えば、前記した本発明の遺伝子を含有するベクターを宿主細胞に導入して形質転換することができる。
使用される宿主細胞としては、各種の細胞を使用することが可能であるが、好ましくは微生物や植物細胞が挙げられる。中でもデンプン産生能を有する植物細胞が好ましい。このような宿主細胞の例としては、イネ、麦、トウモロコシ、ジャガイモなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。デンプン産生能を有する細胞は、当該細胞に特有のＢＥ酵素の遺伝子を有しているので、必要によりこのＢＥ酵素の遺伝子を欠損させて形質転換することもできる。
本発明の形質転換細胞は、常法にしたがってカルスや場合によっては種子などから生育させることができる。
【００３１】
また、本発明は、本発明の遺伝子を含有してなるベクターを構築し、当該ベクターにより宿主細胞を形質転換して形質転換細胞を製造し、次いで当該細胞を発育させることからなるセミアミロペクチン型のポリグルカンを製造する方法を提供する。
本発明のこの方法により、新しいタイプのポリグルカンを製造することが可能となる。例えば、イネなどに適用した場合には、枝作り酵素以外のデンプン合成酵素はイネ由来のものであるから、デンプンにおける枝作りの部分以外はイネのデンプンの構造となるが、枝作りの部分はシアノバクテリアのものとなり、クラスター構造が不規則な列んだ新種のポリグルカンを製造することが可能となる。このようなポリグルカンを製造するためには、宿主細胞が、グリコーゲン枝作り（ＢＥ）酵素の遺伝子を欠失又は欠損した細胞であるのが好ましい。
【発明の効果】
【００３２】
本発明は、藻類によりアミロペクチン型のポリグルカンの産生が獲得されただけでなく、既にシアノバクテリアの段階でアミロペクチン型のポリグルカンの産生が行なわれていたことを明らかにするだけでなく、このようなシアノバクテリアのポリグルカン合成酵素を利用して新しい型のポリグルカンの製造が可能となる手法を提供するものである。本発明により提供されるポリグルカンは、グリコーゲンのような不規則な枝分かれをゆうするものではなく、ある程度の規則性を持って枝分かれが起こっているがデンプンのような明確なクラスター構造を有するものではなく、本明細書ではこれをセミアミロペクチン型のポリグルカンと称する。そして、このセミアミロペクチン型のポリグルカンには、鎖長が１０以上のものが多数存在しており、ある程度の二重ラセン構造が存在し、グリコーゲンのような親水性は有さないが、クラスター構造が明確ではなくデンプンほどの疎水性でもない。したがって、グリコーゲンとデンプンの中間のような性質を有するものであり、新しい型のポリグルカンとして今後の応用が期待されるものである。
【００３３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
藻類のポリグルカンの構造の解析
各種シアノバクテリアを１リットルのＢＧ−１１液体培地（実施例２参照）により培養し、１週間後に得られた藻体を遠心分離（２５００×ｇ、１０分間、室温）により収穫した。得られた沈殿を３ｍｌのＢＧ−１１液体培地に懸濁した後、これに４０ｍｌのエタノールを加えよく混和した。これを再度遠心分離（２５００×ｇ、１０分間、室温）し、得られた沈殿から１００ｍｇをとり、新しいガラス試験管に移して９０％メタノール５ｍｌを加え、よく撹拌した。これを遠心分離（１０００×ｇ、１０分間、室温）して、上澄液を取り除いた後、沈殿に再び９０％メタノール５ｍｌを加え、よく撹拌してから遠心分離（１０００×ｇ、１０分間、室温）した。上澄液を取り除いた後に、この試験管を沸騰水中に２分間おき、残存メタノールを気化させた。試験管内の沈殿を２５０ｍＭの水酸化ナトリウムに懸濁して、５分間煮沸した。放冷後、０．２％アジ化ナトリウムを含む６０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．４）を１．２ｍｌ加え、これに市販のイソアミラーゼ (Pseudomonas amyloderamosa 由来）を３μｌ加えて、撹拌しながら３７℃で７時間反応させた。この後さらにイソアミラーゼを３μｌ追加し、３７℃で８時間反応させた。この処理により、試料のポリグルカン中のα−１，６結合を切断し、直鎖状の糖鎖を生成させた。反応後、２０分煮沸し、放冷した後、１００００×ｇ、２分間遠心分離して、この上澄液１ｍｌを脱イオン樹脂 (バイオラッド社、AG 501X8(D)）１ｍｌに通した。
この溶出液について還元糖の定量を行った。すなわち、試料２μｌに蒸留水９８μｌを加え、さらにシアン化カリウム溶液、フェリシアン化カリウム溶液を各５０μｌ加えて１５分間煮沸し、さらに１０分間水冷した後、０．３％鉄ミョウバン溶液を２５０μｌ加えて２０分後に、７１５ｎｍにおける吸光度を測定した。グルコース標準液を用いて検量線を作成し、各試料中の還元糖の濃度を算出した。
各試料について還元糖５ｎｍｏｌ相当をとり、遠心濃縮により乾燥させた。この沈殿に１−アミノピレン−３，６，８−トリスルホン酸−３ナトリウム塩（ＡＰＴＳ）の酢酸溶液２μｌを加えて撹拌し、さらにシアノボロヒドリドナトリウム（ＣＢＮａ）のテトラヒドロフラン溶液を２μｌ加えて混合した後、５５℃にて９０分間反応させ、ラベル化を行った。これに蒸留水４６μｌを加えて混合し、その１０μｌをとって１０倍希釈した試料について、キャピラリー電気泳動装置を用いて鎖長分布の解析を行った。
結果を、表１〜４、及び図２〜５に示す。
【実施例２】
【００３５】
シネコシスティス  アクアティリスＳＩ−２（Synechocystis aquatilis SI-2）の培養
以下の組成の ＢＧ−１１ 液体培地を用いてシネコシスティス  アクアティリスＳＩ−２（Synechocystis aquatilis SI-2）を培養した。
培地の組成
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ                    ２．３８ ｇ／ｌ
ＮａＮＯ３                             １．５   ｇ／ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４                            ４０ ｍｇ／ｌ
ＭｇＳＯ４                             ７５ ｍｇ／ｌ
ＣａＣｌ２                             ３６ ｍｇ／ｌ
Ｃｉｔｒｉｃ Ａｃｉｄ                 ６ ｍｇ／ｌ
Ｆｅ ＮＨ４ Ｃｉｔｒａｔｅ             ６ ｍｇ／ｌ
Ｎａ２ＥＤＴＡ                         １ ｍｇ／ｌ
Ｈ３ＢＯ３                              ２．８６ ｍｇ／ｌ
ＭｎＣｌ２                             １．８１ ｍｇ／ｌ
ＺｎＳＯ４                             ０．２２２ ｍｇ／ｌ
Ｎａ２ＭｏＯ４                          ０．３９ ｍｇ／ｌ
ＣｕＳＯ４                             ０．０７９ ｍｇ／ｌ
Ｃｏ（ＮＯ３）２                        ０．０４９４ ｍｇ／ｌ
【００３６】
シネコシスティス  アクアティリスの保存、継代は上記組成に１．５％の寒天を加えた平板培地で行った。５０ｍｌ容のガラス扁平培養瓶にＢＧ−１１液体培地を入れ、これに平板培地上から掻き取った細胞塊を懸濁し培養した。培養温度は３０℃とし、蛍光灯２本により連続光照射を行い、光強度は１００μｍｏｌ／ｍ２・秒とした。ガラス細管を通じて１００ｍＬ／分の流速で空気を通気することにより、炭酸ガスの供給と撹拌を行った。培養  ５日目に５００ｍＬのＢＧ−１１液体培地により希釈し、大型の培養瓶に移してさらに５日間、同条件で培養を継続した。その結果、２Ｌ相当の培養から、湿重２ｇの菌体が得られた。
【実施例３】
【００３７】
組換えプラスミドの大腸菌への導入とプラスミドＤＮＡの単離
抽出精製したシネコシスティス アクアティリスのゲノミックＤＮＡに超音波処理を施して、平均３ｋｂの長さに断片化した後、ファージＴ４由来のＤＮＡポリメラーゼを作用させて末端を平滑化した。このようにして得られたＤＮＡ断片の長さにはばらつきがあるので、アガロースゲル電気泳動により断片長に従ってサイズ分画を行い、３ｋｂ相当の部分を切り出して、ゲルからのＤＮＡ精製を行った。
一方、プラスミドベクターｐＵＣ１１８は、制限酵素ＨｉｎｃIIにより切断した後、アルカリフォスファターゼ処理を行い、自己再連結がおきないようにした。
上記操作で得られたゲノムＤＮＡ断片とプラスミドベクターを混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを加えて１６℃にて１２時間、連結反応を行った。
大腸菌ＤＨ１０Ｂ株を１０％グリセロールで洗浄した後、同溶液で懸濁し、これに連結処理を行った組換えＤＮＡを加え、４℃、３０秒間静置した。この懸濁液をエレクトロポレーション・チャンバーに移し、電気パルスをかけた。処理後の菌にＳＯＣ培地を加えて３７℃で１時間振盪した後、２０×２０ｃｍの角形シャーレ中のＬＢ寒天培地上に塗布し３７℃で終夜培養した。
得られたコロニーを無作為に拾って１００μｇ／Ｌアンピシリンを加えたＳＯＣ培地１．２ｍＬに一つずつ懸濁し、３７℃で終夜振盪培養した。培養した大腸菌からのプラスミドＤＮＡの単離はアルカリ溶菌法に則って行い、菌懸濁、アルカリによる溶菌、酢酸カリウムによる中和処理の後、限外濾過膜を通すことによって精製を行った。一クローンあたり約５μｇのプラスミドＤＮＡが得られた。
【実施例４】
【００３８】
得られたクローンからのＰＣＲとＰＣＲ産物の塩基配列
実施例３で得られた精製プラスミドについて２６０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、ＤＮＡを定量した。５０から１００ｎｇ相当のプラスミド（鋳型ＤＮＡ）を４０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１ｍＭ塩化マグネシウム溶液とし、５ｎｍｏｌのプライマーＤＮＡ、および１μｌの酵素試薬（アプライド・バイオシステムズ社、BigDyeターミネーター）を加えて混合し全量を５μｌとした。ここで用いたプライマーＤＮＡの配列は、以下の通りであり、一つの試料についてプライマーを変えて二通りの反応を行った。
５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’
５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ−３’
反応は、パーキンエルマー社製９６００型サーマルサイクラー装置を用いて行い、反応条件は９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分とした。このサイクルを２５回繰り返した。反応後の溶液に蒸留水２５μｌ、およびイソプロパノール４５μｌを加え、撹拌した後１５分後に遠心分離を行いＤＮＡを沈殿させた。上澄液を取り除いた後に沈殿を１５０μｌの７０％エタノールで洗浄した。沈殿に、ＨｉＤｉホルムアミド試薬を３μｌ加えて懸濁した後、９５℃２分間の熱処理を行い、ＤＮＡを変性させた。この後直ちに試料を氷冷し、解析まで氷中で保存した。ＰＣＲ産物についての塩基配列の解析は、アプライド・バイオシステムズ社３１００型ＤＮＡシークエンサーを用いて行った。結果として得られた塩基配列を配列表の配列番号１、３及び５に示す。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、グリコーゲンやデンプンとは異なるアミロペクチン型の新たなポリグルカン、それを製造するためのグリコーゲン枝作り酵素（ＢＥ）を提供するものであり、本発明により従来のもには見られない新たな性質を有するポリグルカンが提供され、食糧、工業用デンプンなどにおいて有用なポリグルカンを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、ポリグルカンの構造を模式的に示したものである。図１に左側はデンプンの糖鎖構造を模式的に示し、右側はグリコーゲンの糖鎖構造を模式的に示したものである。
【図２】図２は、シネココッカス  sp.ＰＣＣ７９４２（Synechococcus sp. PCC7942）のポリグルカンの糖鎖の長さの鎖長分布を解析した結果を示したものである。図中のオレンジ色は比較のために示したイネのデンプンの鎖長分布である。
【図３】図３は、アナバエナ（Anabaena）のポリグルカンの糖鎖の長さの鎖長分布を解析した結果を示したものである。図中のオレンジ色は比較のために示したイネのデンプンの鎖長分布である。
【図４】図４は、デルモカルパ（Dermocarpa）のポリグルカンの糖鎖の長さの鎖長分布を解析した結果を示したものである。図中のオレンジ色は比較のために示したイネのデンプンの鎖長分布である。
【図５】図５は、シネコシスティス  アクアティリスＳＩ−２（Synechocystis aquatilis SI-2）のポリグルカンの糖鎖の長さの鎖長分布を解析した結果を示したものである。図中のオレンジ色は比較のために示したイネのデンプンの鎖長分布である。
【図６】図６は、シネコシスティス  アクアティリスＳＩ−２（Synechocystis aquatilis SI-2）のゲノミッククローンの各酵素に対する相対位置を示している。矢印の左側の記号はSynechocystis aquatilis SI-2株のゲノミッククローンの番号を示している。図６中のＡＧＰはＡＤＰ‐グルコース・ピロフォスフォリラーゼを示し、ＧＳはグリコーゲン合成酵素を示し、ＢＥは枝作り酵素を示し、ＰＲＬはフォスフォリラーゼを示し、ＩＳＡはイソアミラーゼを示し、ｎＰＵＬはネオプルラナーゼを示し、ＰＵＬはブルラナーゼをそれぞれ示す。
【図７】図７は、本発明のＢＥ酵素であるSynechocystis aquatilis SI-2株由来の３種のグリコーゲン枝作り酵素（ＢＥ）のアミノ酸配列と、大腸菌（ＥｃｏＢＥ）及びシネコッカス（ＳｃｏＢＥ）のＢＥ酵素のアミノ酸配列を比較したものである。
【配列表フリーテキスト】
【００４１】
配列番号１：ＳａｑＢＥｘの塩基配列、
配列番号２：ＳａｑＢＥｘのアミノ酸配列、
配列番号３：ＳａｑＢＥｙの塩基配列、
配列番号４：ＳａｑＢＥｙのアミノ酸配列、
配列番号５：ＳａｑＢＥｚの塩基配列、
配列番号６：ＳａｑＢＥｚのアミノ酸配列。
【図１】
2005073652.tif 000006
【図２】
2005073652.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
2005073652.tif 000010
【図６】
2005073652.tif 000011
【図７】
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【配列表】
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