(57)【要約】【課題】先行技術で示唆されたすべての可能性のあるパラメータのうち実際に5-FUおよび／または5-FUアナログへの感受性を示すパラメータの同定、およびどのような条件下でこれらのパラメータが可能な最も高い特異性を提供するかを決定すること。【解決手段】ａ）臨床サンプルにおけるチミジンホスホリラーゼmRNA発現の測定、ｂ）該臨床サンプルにおけるジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼmRNA発現の測定、ｃ）工程ａ）で得られた値と工程ｂ）で得られた値の比の測定、ｄ）工程ｃ）で得られた比が予め決定されたカットオフ値を超えるかどうかの測定を含む、癌に罹患している患者が5-フルオロ-ウラシルおよび／または5-FUアナログでの処置を受けやすいかどうかを測定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）臨床サンプルにおけるチミジンホスホリラーゼmRNA発現の測定
ｂ）該臨床サンプルにおけるジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼmRNA発現の測定
ｃ）工程ａ）で得られた値と工程ｂ）で得られた値の比の測定
ｄ）工程ｃ）で得られた比が予め決定されたカットオフ値を超えるかどうかの測定
を含む、癌に罹患している患者が5-フルオロ-ウラシルおよび／または5-FUアナログでの処置を受けやすいかどうかを測定する方法。
【請求項２】
カットオフ値が少なくとも３である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
カットオフ値が１０よりも高くない、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの絶対または相対mRNA発現レベルが測定され、予め測定されたカットオフ値以下の発現値が5フルオロ-ウラシルおよび／または5-FUアナログに対する感受性をさらに示すことをさらに特徴とする、請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
癌が結腸直腸癌であることを特徴とする、請求項１〜４いずれか記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマーカー分析を用いた薬物癌治療に対する感受性の予測の分野に関する。特に、本発明は、結腸直腸癌に罹患している患者の5-FUおよび／または5-FUアナログに対する感受性の予測の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
依然として西欧社会における主要な死亡原因である癌の１つである結腸直腸癌（CRC）は、原発性腫瘍の外科的切除だけによって患者の約3分の1において治癒しうる。しかし、残りの患者は、原発性腫瘍の臨床発現の時点で既に不顕性または遠隔転移を生じており、補助的（術後）化学療法および／または放射線治療を受ける。患者の臨床データと共に、腫瘍の組織病理学的分類およびTNMカテゴリーに従った病期分類が補助療法の判定基準を規定する。
【０００３】
現行基準として、リンパ節陰性腫瘍（T1−4、N0、M0）は原発性腫瘍の完全切除だけによって治療され、一方リンパ節関与（T1−4、N1−2、M0）の組織病理学的証拠が存在する症例は、原発性腫瘍の外科的切除後に化学療法および／または放射線治療を受ける。診断ツールと関連マーカーならびに治療戦略の一貫した改善にもかかわらず（非特許文献１）、補助療法に対する正確な予後および／または応答予測はいまだ解決されていない問題である（非特許文献２；非特許文献３）。
【０００４】
酵素チミジンホスホリラーゼ（TP）、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（DPD）およびチミジレートシンターゼ（TS）はピリミジンの代謝に関与し、それ故結局は正常細胞ならびに病的に転換した細胞の増殖に関わる。TSはピリミジンの新規合成にとって、それ故またRNA／DNA合成にとっても中心的な律速酵素であり、DPDはウラシルとチミンを不活性廃棄物へと分解することに関与し、TPは細胞内チミジンレベルを制御する（非特許文献４）。さらに、TPは分子、血小板由来内皮細胞増殖因子（PD−ECGF）と同一であることが示されており（非特許文献５；非特許文献６）、多くの固形腫瘍において血管新生特性を示す（非特許文献７；非特許文献８）。これらの特性は、TP、DPDおよび／またはTSの発現をCRCにおける貴重な予後および化学的予測マーカーとする可能性がある。
【０００５】
さらに、ピリミジン代謝への関与のゆえに、3つの酵素すべてが5-FUおよび5-FU関連化学療法薬の効能にとっても重要である（非特許文献４；特許文献１）。TSはそのような化学療法薬の主要標的であるが、酵素TPおよびDPDはそれぞれ、これらの薬剤およびそれらの中間体の活性化と分解において機能する。このように、3つの酵素は、個々にまたはTS／DPDおよびTP／DPD比として、CRCにおける予後および／または補助的化学療法に対する応答予測のためのマーカーとして影響する（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。実際に、高いTSレベルは5-FU化学療法に対する腫瘍の抵抗性に関連付けられており［非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８］、低いDPD発現は5-FU化学療法薬の深刻な毒性に関連付けられている（非特許文献１９；非特許文献２０）。広い範囲のTSおよびDPD発現と化学療法の結果への関連効果は、少なくとも一部には、それぞれTSプロモーターエンハンサー領域内の多型（非特許文献２１；非特許文献２２）およびDPD遺伝子のイントロン14内の共通の点突然変異（非特許文献２３；非特許文献２４）によるものであると思われる。数多くの試験がCRCにおけるTP、DPDおよびTS発現を検討しているにもかかわらず、これらの酵素の役割についてはまだ論争がある。これは主として、1）mRNA、タンパク質または酵素活性、2）原発性腫瘍または遠隔転移において、および3）様々なプロトコールの新規または補助的放射線治療／化学療法で治療された患者いずれかに関してTP、DPDおよびTS発現を分析する、試験プロトコールが多様であることに原因がある。
【特許文献１】国際公開広報第WO02／44423号
【非特許文献１】Ragnhammar, P.ら、Acta Oncol. 40（2001）282−308
【非特許文献２】Iqbal, S.とLenz, H. J., Curr. Oncol. Rep. 3（2001）102−108
【非特許文献３】Kumar, S. K.とGoldberg, R. M., Curr. Oncol. Rep. 3（2001）94−101
【非特許文献４】Diasio, R. B.とJohnson, M. R., Pharmacology 61（2000）199−203
【非特許文献５】Furukawa, T.ら、Nature 356（1992）668
【非特許文献６】Sumizawa, T.ら、J. Biochem. 114（1993）9−14
【非特許文献７】Takebayashi, Y.ら、J. Natl. Cancer Inst. 88（1996）1110−1117
【非特許文献８】Griffiths, L.とStratford, I. J., Br. J. Cancer 76（1997）689−693
【非特許文献９】Metzger, R.ら、Clin. Cancer Res. 4（1998）2371−2376
【非特許文献１０】Salonga, D.ら、Clin. Cancer Res. 6（2000）1322−1327
【非特許文献１１】Takenoue, T.ら、Ann. Surg. Oncol. 7（2000）193−198
【非特許文献１２】Araki, Y.ら、Kurume Med. J. 48（2001）93−98
【非特許文献１３】Edler, D.ら、J. Clin. Oncol. 20（2002）1721−1728
【非特許文献１４】Kornmann, M.ら、J. Gastrointest. Surg. 6（2002）331−337
【非特許文献１５】Copur, S.ら、Biochem. Pharmacol. 49（1995）1419−1426
【非特許文献１６】Wang, W.ら、Cancer Res. 61（2001）5505-5510
【非特許文献１７】Johnston, P. G.ら、Cancer Res. 55（1995）1407−1412
【非特許文献１８】Bathe, O. F.ら、Cancer J. Sci. Am. 5（1999）34−40
【非特許文献１９】Wei, X.ら、J. Clin. Invest. 98（1996）610−615；
【非特許文献２０】Johnson, M. R.ら、Clin. Cancer Res. 5（1999）2006−2011
【非特許文献２１】Marsh, S.ら、Int. J. Oncol. 19（2001）383−386
【非特許文献２２】Iacopetta, B.ら、Br. J. Cancer 85（2001）827−830
【非特許文献２３】van Kuilenburg, A. B.ら、Clin. Cancer Res. 6（2000）4705-4712
【非特許文献２４】Raida, M.ら、Clin. Cancer Res. 7（2001）2832−2839
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
概説した先行技術に鑑みて、解決すべき問題は、先行技術で示唆されたすべての可能性のあるパラメータのうち実際に5-FUおよび／または5-FUアナログへの感受性を示すパラメータの同定、およびどのような条件下でこれらのパラメータが可能な最も高い特異性を提供するかを決定することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、以下である：
〔１〕ａ）臨床サンプルにおけるチミジンホスホリラーゼmRNA発現の測定
ｂ）該臨床サンプルにおけるジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼmRNA発現の測定
ｃ）工程ａ）で得られた値と工程ｂ）で得られた値の比の測定
ｄ）工程ｃ）で得られた比が予め決定されたカットオフ値を超えるかどうかの測定
を含む、癌に罹患している患者が5-フルオロ-ウラシルおよび／または5-FUアナログでの処置を受けやすいかどうかを測定する方法；
〔２〕カットオフ値が少なくとも３、好ましくは少なくとも３．７である、〔１〕記載の方法；
〔３〕カットオフ値が１０よりも高くない、好ましくは８．２よりも高くない〔２〕記載の方法；
〔４〕ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの絶対または相対mRNA発現レベルが測定され、予め測定されたカットオフ値以下の発現値が5フルオロ-ウラシルおよび／または5-FUアナログに対する感受性をさらに示すことをさらに特徴とする、〔１〕〜〔３〕いずれか記載の方法；
〔５〕癌が結腸直腸癌であることを特徴とする、〔１〕〜〔４〕いずれか記載の方法；
〔６〕チミジンホスホリラーゼおよび／またはジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼのmRNA発現が逆転写PCRにより測定されることを特徴とする、〔１〕〜〔５〕いずれか記載の方法；ならびに
〔７〕配列特異的チミジンホスホリラーゼおよび／または配列特異的ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼプライマーがcDNA合成工程中に伸長されることを特徴とする、〔６〕記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、先行技術で示唆されたすべての可能性のあるパラメータのうち実際に5-FUおよび／または5-FUアナログへの感受性を示すパラメータの同定、およびどのような条件下でこれらのパラメータが可能な最も高い特異性を提供するかを決定することが提供され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
発明の簡単な説明
従って、本発明は、
ａ）臨床試料におけるチミジンホスホリラーゼmRNA発現の測定
ｂ）該臨床試料におけるジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼmRNA発現の測定
ｃ）工程ａ）で得た値と工程ｂ）で得た値の比率の測定
ｄ）工程ｃ）で得た比率があらかじめ測定されたカットオフ値を超えるかどうかの測定
を含む、癌に罹患している患者が5-フルオロ−ウラシルまたは5-フルオロ−ウラシルアナログによる治療を受けやすいかどうかを測定するための方法に関する。
【００１０】
あまりに多くの偽陽性結果の発生を防止するため、TP／DPD比率についての上記カットオフ値が少なくとも3、好ましくは3.7である場合、有利であることが実証されている。
【００１１】
他方で、あまりに多くの偽陰性結果の発生を防止するため、TP／DPD比率についての上記カットオフ値が10以下、好ましくは8.2以下である場合、有利である実証されている。
【００１２】
特定の態様では、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの絶対的または相対的発現レベルのさらなる測定があり、一定のカットオフ値以下の発現値は5フルオロ−ウラシルまたはそれぞれのアナログに対する感受性をさらに示す。
【００１３】
本発明の方法は、特に、結腸直腸癌に罹患している患者の感受性を測定するために有用である。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明の基礎となる試験では、TP、DPDおよびTS mRNAの発現を、LightCycler（登録商標）システムでの定量的RT-PCR（QRT-PCR）のために顕微解剖したホルマリン固定およびパラフィン包埋原発性腫瘍試料を使用して、102名のCRC患者の独自の群において検討した。本発明者らは特に、TP、DPDおよびTS mRNA発現およびTS／DPD比およびTP／DPD比と、腫瘍組織学ならびに患者の予後と5-FU補助化学療法に対する応答予測との相関を取り上げている。
【００１５】
発明者らは、CRCにおけるチミジンホスホリラーゼ（TP）、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（DPD）およびチミジレートシンターゼ（TS）mRNA発現を、一般的な予後マーカーとしておよび5-FU化学療法についての予測マーカーとしてのそれらの数値に重点を置いて詳細に検討した。このために、TP、DPDおよびTS mRNA定量のための新規アプローチ、LightCycler（登録商標）システム（Roche Applied Science）を用いたRT-PCRを開発し、これを102のCRC症例の顕微解剖したホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍組織に対して行った。他の研究［Johnston, P. G.ら、Cancer Res. 55（1995）1407−1412］［Metzger, R.ら、Clin. Cancer Res. 4（1998）2371−2376；Salonga, D.ら、Clin. Cancer Res. 6（2000）1322−1327］とは対照的に、発明者らは原発性腫瘍においてTP、DPDおよびTS mRNA発現を回顧的に検討し、酵素レベルと患者のフォローアップとの相関によって予後への影響および5-FU化学療法に対する患者の臨床応答を評価した。TP、DPDおよび／またはTS発現は原発性CRC腫瘍において予後に関して分析されているが［Takebayashi, Y.ら、J. Natl. Cancer Inst. 88（1996）1110−1117；Araki, Y.ら、Kurume Med. J. 48（2001）93−98；Edler, D.ら、J. Clin. Oncol. 20（2002）1721−1728；Sanguedolce, R.ら、Anticancer Res. 18（1998）1515-1520；Paradiso, A.ら、Br. J. Cancer 82（2000）560−567；Findlay, M. P.ら、Br. J. Cancer 75（1997）903−909；Allegra, C. J.ら、J. Clin. Oncol. 20（2002）1735-1743］、発明者らの研究では、最初に、固有標本サイズのCRC症例の群、治療サブグループ、フォローアップデータおよび標準化した組織サンプリングと保存においてTP、DPDおよびTS mRNA発現の予後値および予測値を検討する。
【００１６】
102のCRC症例におけるTP、DPDおよびTS mRNA発現の詳細な分析は、3つの酵素すべてについて広い範囲の発現レベルを明らかにした。これは以前にも報告されており［Iqbal, S.とLenz, H. J., Curr. Oncol. Rep. 3（2001）102−108；Metzger, R.ら、Clin. Cancer Res. 4（1998）2371−2376；Mori, K.ら、Int. J. Oncol. 17（2000）33−38］、これらの結果と共に腫瘍間の不均一性の概念を強調する。
【００１７】
最後に、TPおよびTS mRNAレベルと特定の腫瘍組織病理学の関連もTP／DPD比およびTS／DPD比に反映された。これらの所見についての１つの説明は、これらの酵素の生物学的機能に関連性があり得る：血小板由来内皮細胞増殖因子として公知であるTP［Furukawa, T.ら、Nature 356（1992）668；Sumizawa, T.ら、J. Biochem. 114（1993）9−14］は、多くの固形腫瘍における血管新生に関係しており［Takebayashi, Y.ら、J. Natl. Cancer Inst. 88（1996）1110−1117；Griffiths, L.とStratfor, I. J., Br. J. Cancer 76（1997）689−693］、一方、TSは代謝活性および細胞増殖のマーカーとみなされ得る［Pestalozzi, B. C.ら、Br. J. Cancer 71（1995）1151−1157；Backus, H. H.ら、J. Clin. Pathol. 55（2002）206−211；Pestalozzi, B. C.ら、Br. J. Cancer 71（1995）1151−1157］。それ故、「初期」腫瘍におけるより高いTPおよびTS mRNA発現は、血管の支持と腫瘍細胞増殖を促進する上でのそれらの活性を反映し得、これは、例えば腫瘍細胞の浸潤および転移に好都合なように進行時には低下する。事実上、低いレベルのTP、DPDおよびTS mRNA発現レベルは、5-FU化学療法に対する良好な応答と関連付けられている［Metzger, R.ら、Clin. Cancer Res. 4（1998）2371−2376；Salonga, D.ら、Clin. Cancer Res. 6（2000）1322−1327］。実際に、我々のデータからも、これは確かに、進行したUICC病期を有するこの腫瘍群、すなわちより低いTPおよびTS mRNAレベルを発現する補助化学療法を受けている患者である。
【００１８】
これまでの報告では、CRCにおける予後［Takenoue, T.ら、Ann. Surg. Oncol. 7（2000）193−198；Edler, D.ら、J. Clin. Oncol. 20（2002）1721−1728；Sanguedolce, R.ら、Anticancer Res. 18（1998）1515-1520；Paradiso, A.ら、Br. J. Cancer 82（2000）560−567；Allegra, C. J.ら、J. Clin. Oncol. 20（2002）1735-1743］および／または5-FU化学療法に対する応答予測［Metzger, R.ら、Clin. Cancer Res. 4（1998）2371−2376；Salonga, D.ら、Clin. Cancer Res. 6（2000）1322−1327； Araki, Y.ら、Kurume Med. J. 48（2001）93−98； Johnston, P. G.ら、Cancer Res. 55（1995）1407−1412］についての潜在的マーカーとしてTP、DPDおよびTS mRNA発現を単独でまたは組合せて考察している。加えて、TP／DPD比および／またはTS／DPD比は、最近になって予後および／または予測マーカーとして含意されている［Kornmann, M.ら、J. Gastrointest. Surg. 6（2002）331−337；Ishikawa, T.ら、Cancer Res. 58（1998）685-690］。本研究において、本発明者らは、TS／DPD比を潜在的予後マーカーとして特定することができ、より高いTS／DPD比が、切除だけを受けたCRC患者の全体的なより低い生存率と相関している。
【００１９】
より重要な点として、本研究は、DPD mRNAレベルおよびTP／DPD比と5-FU化学療法後の無病生存率との有意の相関を明らかにし、それによれば、低いDPD mRNAレベルおよび高いTP／DPD比はより長い無病生存を予測する。これは、低いDPDレベル単独または低いDPDレベルと高いTPレベル（高いTP／DPD比）が5-FUの活性レベルを安定化させるという事実に関係すると考えられる。これに対し、TP、DPDまたはTS mRNAレベルあるいはTP／DPD比またはTS／DPD比はいずれも、全生存率に関して全く予測的値を有していなかった。
【００２０】
これまでの研究は、免疫組織化学による原発性CRC腫瘍におけるTP、DPDまたはTSタンパク質発現［Takebayashi, Y.ら、J. Natl. Cancer Inst. 88（1996）1110−1117；Edler, D.ら、J. Clin. Oncol. 20（2002）1721−1728； Paradiso, A.ら、Br. J. Cancer 82（2000）560−567；Findlay, M. P.ら、Br. J. Cancer 75（1997）903−909；Allegra, C. J.ら、J. Clin. Oncol. 20（2002）1735-1743］、タンパク質含量［Sanguedolce, R.ら、Anticancer Res. 18（1998）1515-1520］または酵素活性［Araki, Y.ら、Kurume Med. J. 48（2001）93−98］を対象としてきたが、本発明者らは、定量的RT-PCRによるTP、DPDおよびTS mRNA分析に決定した。この方法は迅速であり、信頼でき、標準化しやすく、多数の一連のホルマリン固定、パラフィン包埋、顕微解剖組織試料に関して良好に機能するためである。RNAレベルでのこれらの酵素の任意の予後値および／または予測値を検出することの難しさは、転写後の固定に関連する（および付随する機能的）修飾のゆえに、予想されるものであった。［Kawakami, K.ら、Clin. Cancer Res. 7（2001）4096−4101］。
【００２１】
しかし、一部の研究者らは、例えばDPDおよびTS遺伝子およびタンパク質発現の良好な相関を示した［Johnston, P. G.ら、Cancer Res. 55（1995）1407−1412；Uetake, H.ら、Clin. Cancer Res. 5（1999）2836−2839；Tanaka-Nozaki, M.ら、Clin. Cancer Res. 7（2001）2783−2787］。本発明者らのアプローチを検証するため、本発明者らは最初に、対照組織から顕微解剖細胞をスクリーニングした。その結果は、例えば炎症細胞における高いTPレベル［Fox, S. B.ら、J. Pathol. 176（1995）183−190］および肝臓における高いDPDレベル［Guimbaud, R.ら、Cancer Chemother. Pharmacol.  45（2000）477−482；Johntson, S. J.ら、Clin. Cancer Res. 5（1999）2566−2570］に関するこれまでの公開データを反映していた。さらに、腫瘍は、「正常」組織よりも低いDPDレベル［Johntson, S. J.ら、Clin. Cancer Res. 5（1999）2566−2570；Miyamoto, S.ら、Int. J. Oncol. 18（2001）705-713］および高いTPレベル［Takebayashi, Y.ら、Eur. J. Cancer 32（1996）1227−1232；Miwa, M.ら、Eur. J. Cancer 34（1998）1274−1281］を有することが報告されており、これは5-FUプロドラッグについての腫瘍特異性の基礎となる概念である。
【００２２】
本発明者らはまた、「腫瘍」細胞において「正常上皮」細胞単離物よりも低いDPDレベルを検出したが、その結果は腫瘍細胞と「正常」細胞におけるTPとTS mRNAレベルの差を明らかにしなかった。これはおそらく、「正常」細胞集団をいかに正確に定義するかという事実を反映すると考えられる。TP、DPDおよびTS発現の解釈のためには、非上皮細胞は結果に有意な影響を及ぼしうるので、形態学的に制御された組織の獲得が重要である。それ故、本発明者らが「正常結腸平滑筋細胞」（「正常上皮細胞」試料とは反対）を「腫瘍」細胞と比較したとき、後者は、これまでに報告されているように［Takebayashi, Y.ら、Eur. J. Cancer 32（1996）1227−1232；Miwa, M.ら、Eur. J. Cancer 34（1998）1274−1281］、より高いTPおよびTS mRNA発現を示した。
【００２３】
要約すると、本発明は、癌患者における5-FUおよび／または5-FUアナログ感受性を測定するための新規の定量的RT-PCRアプローチに関する。この新しい方法は、患者からのFFPE生検におけるTP／DPD比および場合によりDPD mRNA発現の測定を特徴とする。TP／DPD比は、補助的5-FU治療を受けた結腸直腸癌患者における無病生存についての予測値を有する。
【００２４】
下記の実施例、参考文献、および図面は本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神から逸脱することなく、記述された手順に修正を加えることができることは明白である。
【実施例】
【００２５】
実施例１
患者および組織
直腸結腸癌標本をthe Institute of Pathology、Klinikum rechts der Isar、Munich、Germanyのアーカイブより入手した。合計102名の患者から切除した原発性腫瘍標本（表１；臨床フォローアップ平均値＝63.5ヶ月間、8〜125ヶ月間の範囲）を、腫瘍細胞の顕微解剖後に分析した。
【００２６】
【表１−１】
2005073698.tif 000002
【００２７】
【表１−２】
2005073698.tif 000003
【００２８】
40名の患者は腫瘍の切除だけを受け（「CTXなし」群）、52名の患者は切除後に補助化学療法を受け（「CTX」群）、および10名の患者は併用補助化学／放射線療法を受けた。「CTX」群における補助レジメンは次のとおりであった：25／52患者がMayoプロトコール（425mg/m２の5-FUおよび20mg/m２のロイコボリンを6ヶ月間）［O'Connell, M. J.ら、J. Clin. Oncol. 15（1997）246−250］、7／52名の患者が「Moertel」レジメン（450mg/m２の5-FUおよび50mg/m２のレバミゾール）［Moertel, C. G.ら、N. Engl. J. Med. 322（1990）352−358］、5／52名の患者がArdalanプロトコール（2,600mg/m２の5-FUおよび500mg/m２のロイコボリンを24時間）［Ardalan, B.ら、J. Clin. Oncol. 9（1991）625-630］、14／52名の患者が修正Ardalanプロトコールおよび1／52名の患者がSAKKプロトコール（500mg/m２の5-FUおよび10mg/m２のミトマイシンC）［SAKK, Lancet 345（1995）349−353］。対照目的として、正常結腸、慢性結腸炎（下記参照）および正常肝臓の組織標本を得た。すべての組織は、慣用的なガイドラインに従ってホルマリン固定し（10％緩衝ホルマリン、24時間）、パラフィン包埋した（FFPE）。分析の前に、各々の標本の組織病理学をヘマトキシリン染色した連続切片で確認した。
【００２９】
実施例２
顕微解剖
FFPE組織からRNAを抽出する前に、ミクロトーム切片（5μm）をRNaseを含まない条件下でキシレンおよび等級付けアルコール（graded alcohol）で処理した。その後の顕微解剖のため、切片をインスタントヘマトキシリン（Shandon, Frankfurt, Germany）で個別に染色し、微細針（18ゲージ）を用いて顕微鏡観察下で腫瘍細胞を解剖した。解剖した腫瘍細胞集団の純度は80〜90％であった。
【００３０】
対照組織を同じ条件下で解剖し、それらは正常結腸粘膜（n＝8；上皮細胞）および結腸固有筋層（muscularis propria）（n＝4；筋細胞）、慢性結腸炎の反応性病巣（n＝3；クローン病、潰瘍性結腸炎およびS状結腸の憩室炎）および正常肝臓（n＝1；すべての細胞集団）を含んでいた。後者の2つの対照群については、各々の組織標本の2つの連続切片を別々に処理することにより、二重の分析を実施した。
【００３１】
実施例３
RNAの単離
52名のCRC症例において、顕微解剖した組織試料を以前に述べられたようにRNA単離に供した［Lassmann, S.ら、J. Pathol. 198（2002）198−206］。簡単に述べると、顕微解剖腫瘍細胞を、直ちに消化緩衝液（10mM Tris HCl、0.1mM EDTA、2％SDSおよび0.5mgプロテイナーゼK、すべてSigam, Taufkirchen, Germany製）を含むエッペンドルフ管に入れた。一晩インキュベート（60℃、350〜400rpm）した後、フェノール：クロロホルムで抽出し、イソプロパノール中で核酸を沈殿させた。生じたRNAペレットを、10U DNase I（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）、20μl DNase緩衝液（0.4M Tris HCl、60mM MgCl２、0.1M NaCl）および200μlまでのH２Oと共にインキュベート（45分間、37℃）することによってさらに精製した。その後RNAをフェノール：クロロホルム抽出、沈殿およびH２Oへの再懸濁によって再抽出した。50名のCRC症例および対照標本において、顕微解剖腫瘍または対照細胞を、「HighPure RNA Paraffin Kit」（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を用いて、提供されるプロトコールに従って単離した。この方法はまた、プロテイナーゼK消化工程、核酸の精製、DNase消化工程およびRNAの再精製から成る。予備実験では、上記の2つの方法によって単離した正常粘膜および腫瘍試料の各々の3つの連続する組織切片から同様の結果を得た（データは示していない）。RNAをさらに使用するまで−70℃で保存した。
【００３２】
実施例４
逆転写および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）
Roche Applied Science製の試薬およびキットを供給業者の説明書に従って使用して、LightCycler（登録商標）システムで逆転写および定量的PCRを実施した。簡単に述べると、RNA試料を4つの等しいアリコートに分配し、それらすべてにcDNA試薬とTP、DPD、TSまたは参照遺伝子特異的プライマー（カタログ番号3 302 946、3 302 938、3 302 954）のいずれかとの同じ混合物を加えた。陽性対照RNA（較正物質、「TP、DPDおよびTSについてのLC−mRNA定量キット」による）をこの工程に含めた。品質と再現性を制御するために、4つの未知の試料とともに常に１つの較正物質RNAを別個の「セット」として処理した。その後、「TP、DPDおよびTSについてのLC−mRNA定量キット」を用いて、常に3つのcDNA「セット」を1回の定量的PCRにおいて一緒に分析した。データの解析については、「Relative Quantification Software」（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を適用した。これは、Cp（酵素：参照遺伝子）試料対Cp（酵素：参照遺伝子）較正物質の相対比を算定し、それによって試料の充填（RNAの注入）および一定の参照点（較正物質）によるPCRの効率の両方を制御する。正確な定量を確保するために、20〜最大33の交差点（線形増幅範囲）を有するRNA調製物のデータだけを含めた。TP、DPD、TSおよび参照遺伝子mRNA発現の変動（交差点の平均±標準偏差）はごく小さく、それぞれ29の較正物質について26.62±0.36、28±0.51、22±0.23および23.19±0.7（29×4＝116組織試料を占める）であった。
【００３３】
実施例５
統計
定量的パラメータは、それぞれ標準偏差および範囲と共に平均値またはメジアンを用いて表わした。定性的パラメータは度数表によって検討した。正規分布からの偏差がすべてのマーカーについて認められたので、ノンパラメトリック試験を実施した（SAS（登録商標）ソフトウエア；バージョン8.02）。
【００３４】
全102症例の群において、TP、DPDおよびTS mRNA発現ならびにTS／DPDおよびTP／DPD比を、1）患者の年齢および性別、ならびに2）原発性腫瘍の局在、TNMカテゴリー、UICC病期および分化進行度進行度に相関させた。これはスピアマン相関係数およびゼロ相関に関する試験によって実施した。個々のサブグループの比較のため、対応のない標本に関するウィルコクソン検定およびクラスカル−ウォリス検定を適用した。3つの酵素の予後への影響および／または応答予測値を評価するため、102症例を「CTXなし」（n＝40）群と「CTX」（n＝52）群に分けた。併用放射線／化学療法を受けていた患者（n＝10）は除外した。2つのサブグループ内で、TP、DPDおよびTS mRNA発現、ならびにTS／DPDおよびTP／DPD比の：再発疾患の発生率、死亡の発生率ならびに無病生存率および全生存率との相関に関して別々の統計分析を実施した。生存率分析は、有意性レベルを5％に設定して、コックス回帰およびログランク検定の両方によって実施した。
【００３５】
実施例６
結果
正常結腸、慢性結腸炎およびCRCにおけるTP、DPDおよびTS mRNA発現
最初に、一連の顕微解剖FFPE対照標本においてLightCycler（登録商標）システムを用いた定量的RT-PCRによってTP、DPDおよびTS mRNAレベルを調べた。図１に示すように、TP、DPDおよびTSについてのmRNA発現をすべての試料において検出したが、mRNAの発現レベルは組織間で異なっていた：慢性結腸炎の反応性病巣では高いTP mRNA発現が見られ、次いで正常結腸粘膜（上皮細胞）および正常肝臓（混合細胞集団）においては中等度のレベル、そして正常結腸固有筋層（筋細胞）ではさらに低い発現が見られた。DPD mRNA発現は正常肝臓において最大であり、次に正常固有筋層＞慢性結腸炎の反応性病巣＞／＝正常粘膜であった。TSは正常粘膜において高発現され、正常粘膜＞慢性結腸炎の反応性病巣＞正常肝臓および固有筋層であった。
【００３６】
比較すると、結腸腫瘍試料（n＝102、下記参照）の平均TP、DPDおよびTS mRNA発現レベルは、正常粘膜の上皮細胞と比較したとき腫瘍試料におけるより低いDPD mRNA発現を明らかにした。これに対し、正常粘膜と腫瘍組織の間でTPおよびTS mRNAレベルの有意差は検出されなかった。
【００３７】
102名の結腸直腸癌患者におけるTP、DPDおよびTS mRNA発現のスクリーニング
【００３８】
検討した患者の群には、切除だけ（40症例；「CTXなし」群）、切除およびその後の5-FU化学療法（52症例；「CTX」群）または切除および放射線治療と化学療法の併用（10症例）のいずれかで治療された、様々な進行度のCRCの102症例を含めた（表１、材料および方法）。
【００３９】
CRCの全102症例におけるTP、DPDおよびTSのmRNA発現の分析は広い範囲の酵素発現パターンを示した（図２）。相対比として表わすと、TP、DPDおよびTSについての範囲は、それぞれ1.52〜166.29、0〜24.39および0.21〜3.71であった。症例を「CTXなし」と「CTX」の群に分けたとき、TP、DPDおよびTS mRNA発現は、「CTX」群ではTP mRNA発現が低いという傾向を除いて、両方の群において同様であった。これはTP、DPDおよびTS mRNA発現レベルの統計的メジアンに反映されている（図２）。
【００４０】
患者のデータおよび組織学とのTP、DPDおよびTS mRNA発現の相関
表２Ａに要約するように、TP、DPDまたはTS mRNAレベルあるいはTS／DPDおよびTP／DPD比と、患者の年齢または性別および原発性腫瘍の位置（結腸または直腸）の間で、統計的に有意の相関は明らかにならなかった。
【００４１】
【表２】
2005073698.tif 000004
【００４２】
しかし、１）腫瘍T（p＝0.03）およびN（p＝0.04）カテゴリーおよびUICCステージ（p＝0.009）とTP mRNA発現；２）分化進行度とTS mRNA発現（p＝0.001）、３）腫瘍Tカテゴリー（p＝0.014）および分化進行度（p＝0.033）とTS／DPD比、ならびに４）腫瘍T（p＝0.007）およびN（p＝0.001）カテゴリーおよびUICCステージ（p＝0.001）とTP／DPD比に関して有意差が認められた。図３に示すように、TP mRNA発現およびTP／DPD比は、腫瘍TおよびNカテゴリーが高くなり、およびUICCステージが高くなるにつれて、有意に減少した。TS mRNA発現は、分化進行度２の腫瘍よりも分化進行度３の腫瘍において有意に低かった。最後に、TS／DPD比は、Tカテゴリーがより高い腫瘍において、ならびに分化進行度２の腫瘍よりも分化進行度３の腫瘍において低かった。
【００４３】
CRCにおけるTP、DPDおよびTS mRNA発現−予後との相関
【００４４】
TP、DPDおよびTS mRNA発現を予後と相関させるため、補助化学療法および放射線治療を受けていた患者（n＝10）を統計分析から除外した。さらに、リンパ節転移を有する患者（「N+」）は一般に「N0」［1］と分類される患者よりも予後不良であるので、残りの92名の患者を、図４Ａに示すように、補助療法を伴わない患者（n＝40；「CTXなし」）と補助化学療法を伴う患者（n＝52；「CTX」）に分けた。次に、再発疾患および死亡の発生率ならびに無病生存率および全生存率に関して2つの群内で別々に統計分析を実施した。最初に、TP、DPDまたはTS mRNA発現あるいはTS／DPDおよびTP／DPD比のいずれかと、再発疾患または死亡の発生率の間では有意の相関は明らかにされなかった（表２Ｂ）。
【００４５】
【表３】
2005073698.tif 000005
【００４６】
第二に、いずれの酵素またはTP／DPD比も、全生存率に有意な影響を及ぼさなかった（カプラン−マイヤー分析）。第三に、TPおよびDPD mRNA発現は「CTX」群において有意に（p＜0.0001）相関したにもかかわらず、TP、DPDおよびTS mRNA発現と全生存率の多変量解析は有意の相関を示さなかった。これらの所見は「CTXなし」または「CTX」群の両方に当てはまった（表２）。
【００４７】
これに対し、「CTXなし」群の中で、全生存率はTS／DPD比と有意に相関し（p＝0.032）、TS／DPD比が高いほど死亡の危険度が上昇する。
【００４８】
TP、DPDおよびTS mRNA発現−応答予測のためのマーカー
【００４９】
TP、DPDおよび／またはTS mRNAレベルあるいはTP／DPDまたはTS／DPD比が5-FU化学療法に対する臨床応答を予測できるかどうかを評価するために、「CTX」群内の患者に関して詳細な統計分析を実施した。「CTX」患者を「低」および「高」TP、DPDおよびTS mRNAレベル（図２に示すように、カットオフ＝メジアン）を有する患者に細分し、その後カプラン−マイヤー分析を実施したとき、全生存率に関しては相関が認められなかった（図４Ｂ）。同様に、低または高TS／DPDまたはTP／DPD比のいずれも、2つの「CTX」サブグループにおける全生存率を予測しなかった（示していない）。
【００５０】
しかし、DPD mRNAレベルおよびTP／DPD比については、無病生存率に関して有意の相関が認められた（図４Ｃ）。従って、8.2のカットオフmRNAレベルを使用すると、低いDPD mRNA発現はp＝0.05で無病生存率と相関した。
【００５１】
さらに、無病生存率とTP／DPD比の間で正の相関が特定された。図５に示すように、3.7（図５ｂ）、5.0（図５ｃ）、6.2（図５ｄ）および8.1（図５ｅ）のカットオフ値を使用すると、高いTP／DPD比はp＝0.002で無病生存率と有意に相関した。
【００５２】
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WO 02/44423
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】顕微解剖組織におけるTP、DPDおよびTS mRNA発現。正常結腸粘膜（n＝8）および固有筋層（muscularis propria）（n＝3）、慢性結腸炎（n＝3）、結腸直腸癌（CRC；n＝102）および正常肝臓（n＝1、二回測定）。mRNAレベルを相対比として表わす（平均±標準偏差）。
【図２】102名のCRC患者におけるTP、DPDおよびTS mRNA発現。各々の記号は１つの症例を表わし、バーと数字は：すべての症例（正方形、n＝102）、「CTXなし」（三角、n＝40）および「CTX」（丸、n＝52）についてのメジアンmRNAレベル（相対比）を示す。
【図３】TP、DPDおよびTS mRNA発現と腫瘍組織学の関連性。統計的に有意の相関の図示概要。カラムは各々のサブグループ内のメジアンレベルを表わす。Y軸は相対的mRNAレベルまたは酵素比を示す。p値については表２参照。
【図４Ａ】TP／DPD比と全体的および無病生存率との相関。「CTXなし」（n＝40）および「CTX」（n＝52）群についての全生存率に関するカプラン−マイヤー分析（Ａ）。
【図４Ｂ】TP／DPD比と全体的および無病生存率との相関。TP、DPDあるいはTS mRNAレベルはいずれも、5-FU治療（「CTX」）患者における全生存率についての予測値ではなかった（Ｂ、カットオフ値＝mRNA発現のメジアン）。
【図４Ｃ】TP／DPD比と全体的および無病生存率との相関。しかし、低いDPD mRNAレベル比は5-FU治療患者における無病生存率と有意に相関していた（Ｃ、カットオフ値は表示されている通りである）。
【図５ａ】TP／DPD比mRNAレベルと全体的および無病生存率との相関。無病生存率およびそのTP／DPD比との相関に関するカプラン−マイヤー分析。高いTP／DPD比は5-FU治療患者における無病生存率と有意に相関していた（カットオフ値：A＝0.39）。
【図５ｂ】TP／DPD比mRNAレベルと全体的および無病生存率との相関。無病生存率およびそのTP／DPD比との相関に関するカプラン−マイヤー分析。高いTP／DPD比は5-FU治療患者における無病生存率と有意に相関していた（カットオフ値： B＝3.7）。
【図５ｃ】TP／DPD比mRNAレベルと全体的および無病生存率との相関。無病生存率およびそのTP／DPD比との相関に関するカプラン−マイヤー分析。高いTP／DPD比は5-FU治療患者における無病生存率と有意に相関していた（カットオフ値： C＝5.0）。
【図５ｄ】TP／DPD比mRNAレベルと全体的および無病生存率との相関。無病生存率およびそのTP／DPD比との相関に関するカプラン−マイヤー分析。高いTP／DPD比は5-FU治療患者における無病生存率と有意に相関していた（カットオフ値： D＝6.2）。
【図５ｅ】TP／DPD比mRNAレベルと全体的および無病生存率との相関。無病生存率およびそのTP／DPD比との相関に関するカプラン−マイヤー分析。高いTP／DPD比は5-FU治療患者における無病生存率と有意に相関していた（カットオフ値：E＝8.1）。
【図１】
2005073698.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
2005073698.tif 000009
【図４Ｂ】
2005073698.tif 000010
【図４Ｃ】
2005073698.tif 000011
【図５ａ】
2005073698.tif 000012
【図５ｂ】
2005073698.tif 000013
【図５ｃ】
2005073698.tif 000014
【図５ｄ】
2005073698.tif 000015
【図５ｅ】
2005073698.tif 000016
【外国語明細書】
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