(57)【要約】【課題】  生体高分子材料の標的部位に特異的なアプタマーを効率よく探し出すことができるスクリーニング方法、及び、その方法によって得られたアプタマーを提供する。【解決手段】  下記選別工程（Ａ）及び選別工程（Ｂ）：（Ａ）前記標的部位の配列又はその一部に相当する配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程；（Ｂ）高分子材料の全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程；の一方を一次選別工程とし、他方を二次選別工程とし、ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物であるライブラリを用いて一次選別工程を行った後、一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を用いて二次選別工程を行う。【選択図】      図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体起源の高分子材料の分子構造内に存在する標的部位に特異的なアプタマーをスクリーニングする方法であって、下記選別工程（Ａ）及び選別工程（Ｂ）：
（Ａ）  前記標的部位の配列又はその一部に相当する配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程；
（Ｂ）  前記高分子材料の全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程；
の一方を一次選別工程とし、他方を二次選別工程とし、
ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物であるライブラリを用いて前記一次選別工程を行った後、一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を用いて前記二次選別工程を行うことを特徴とする、アプタマーのスクリーニング方法。
【請求項２】
前記選別工程（Ａ）を一次選別工程とし、前記選別工程（Ｂ）を二次選別工程とする請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記一次選別工程により選別されたオリゴヌクレオチド群を増幅後、二次選別工程を行う請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
ランダムな配列の両端にプライマー配列を持つオリゴヌクレオチド群をライブラリとして用い、前記一次選別工程により選別されたオリゴヌクレオチド群をＰＣＲ法により増幅後、二次選別工程を行う請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
二次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群をクローニングしてモノクローナルアプタマーを得る請求項１乃至４いずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
二次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群をプラスミド法によりクローニングする請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
二次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を増幅した後、クローニングする請求項５又は６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
ランダムな配列の両端にプライマー配列を持つオリゴヌクレオチド群をライブラリとして用い、前記一次選別工程により選別されたオリゴヌクレオチド群をＰＣＲ法により増幅した後で二次選別工程を行い、前記二次選別工程により選別されたオリゴヌクレオチド群をＰＣＲ法により増幅した後でクローニングを行う請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記高分子材料が蛋白質である請求項１乃至８いずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
フィブロネクチンのインテグリン結合部位に特異的なアプタマーをスクリーニングする方法であって、下記選別工程（Ｃ）及び選別工程（Ｄ）：
（Ｃ）  前記インテグリン結合部位の配列又は少なくともArg−Gly−Asp配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程；
（Ｄ）  前記フィブロネクチンの全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程；
の一方を一次選別工程とし、他方を二次選別工程とし、
ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物であるライブラリを用いて前記一次選別工程を行った後、一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を用いて前記二次選別工程を行うことを特徴とする、アプタマーのスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記選別工程（Ｃ）を一次選別工程とし、前記選別工程（Ｄ）を二次選別工程とする請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記一次選別工程により選別されたオリゴヌクレオチド群を増幅後、二次選別工程を行う請求項１０又は１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
ランダムな配列の両端にプライマー配列を持つオリゴヌクレオチド群をライブラリとして用い、前記一次選別工程により選別されたオリゴヌクレオチド群をＰＣＲ法により増幅後、二次選別工程を行う請求項１２に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
二次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群をクローニングしてモノクローナルアプタマーを得る請求項１０乃至１３いずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
二次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群をプラスミド法によりクローニングする請求項１４に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
二次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を増幅した後、クローニングする請求項１４又は１５に記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
ランダムな配列の両端にプライマー配列を持つオリゴヌクレオチド群をライブラリとして用い、前記一次選別工程により選別されたオリゴヌクレオチド群をＰＣＲ法により増幅した後で二次選別工程を行い、前記二次選別工程により選別されたオリゴヌクレオチド群をＰＣＲ法により増幅した後でクローニングを行う請求項１６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
前記請求項１乃至９いずれかに記載のスクリーニング方法を用いて特定された塩基配列、又は、当該配列中の一部の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列、又は、前記いずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを修飾した修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列を含むことを特徴とするアプタマー。
【請求項１９】
前記請求項１０乃至１７いずれかに記載のスクリーニング方法を用いて特定された塩基配列、又は、当該配列中の一部の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列、又は、前記いずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを修飾した修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列を含むことを特徴とする、フィブロネクチンのインテグリン結合部位に特異的なアプタマー。
【請求項２０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５のいずれかに記載の塩基配列、又は、当該配列中の一部の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列、又は、前記いずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを修飾した修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列を含むことを特徴とする、フィブロネクチンのインテグリン結合部位に特異的なアプタマー。
【請求項２１】
請求項１乃至１７いずれかに記載のスクリーニング方法を用いて特定された塩基配列、又は、当該配列中の一部の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列、又は、前記いずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを修飾した修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列を含むアプタマーを担体に担持してなることを特徴とするバイオチップ。
【請求項２２】
生体起源の高分子材料の分子構造内に存在する標的部位に特異的なアプタマーをスクリーニングするシステムであって、一方が一次選別に用いられ他方が二次選別に用いられる下記選別手段（Ａ）及び（Ｂ）：
（Ａ）  ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物から、前記標的部位の配列又はその一部に相当する配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する手段；
（Ｂ）  ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物から、前記高分子材料の全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する手段；
を有することを特徴とするスクリーニングシステム。
【請求項２３】
前記選別手段（Ａ）を用いてランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物であるライブラリの一次選別を行った後、前記選別手段（Ｂ）を用いて前記一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を二次選別する請求項２２に記載のスクリーニングシステム。
【請求項２４】
前記一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を増幅する手段をさらに有する、請求項２２又は２３に記載のスクリーニングシステム。
【請求項２５】
前記一次選別後の増幅手段は、両端にプライマー配列を持つオリゴヌクレオチド群を増幅するＰＣＲ法を実施する手段である、請求項２４に記載のスクリーニングシステム。
【請求項２６】
前記二次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群をクローニングする手段をさらに有する、請求項２２乃至２５いずれかに記載のスクリーニングシステム。
【請求項２７】
前記二次選別後のクローニング手段は、プラスミド法を実施する手段である、請求項２６に記載のスクリーニングシステム。
【請求項２８】
二次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を増幅する手段をさらに有する、請求項２６又は２７に記載のスクリーニングシステム。
【請求項２９】
前記二次選別後の増幅手段は、両端にプライマー配列を持つオリゴヌクレオチド群を増幅するＰＣＲ法を実施する手段である、請求項２８に記載のスクリーニング方法。
【請求項３０】
前記高分子材料が蛋白質である請求項２２乃至２９いずれかに記載のスクリーニングシステム。
【請求項３１】
フィブロネクチンのインテグリン結合部位に特異的なアプタマーをスクリーニングするシステムであって、一方が一次選別に用いられ他方が二次選別に用いられる下記選別手段（Ｃ）及び選別手段（Ｄ）：
（Ｃ）  ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物から、前記インテグリン結合部位の配列又は少なくともArg−Gly−Asp配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する手段；
（Ｄ）  ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物から、前記フィブロネクチンの全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する手段；
を有することを特徴とするスクリーニングシステム。
【請求項３２】
前記選別手段（Ｃ）を用いてランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物であるライブラリの一次選別を行った後、前記選別手段（Ｄ）を用いて前記一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を二次選別する請求項３１に記載のスクリーニングシステム。
【請求項３３】
前記一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を増幅する手段をさらに有する、請求項３１又は３２に記載のスクリーニングシステム。
【請求項３４】
前記一次選別後の増幅手段は、両端にプライマー配列を持つオリゴヌクレオチド群を増幅するＰＣＲ法を実施する手段である、請求項３３に記載のスクリーニングシステム。
【請求項３５】
前記二次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群をクローニングする手段をさらに有する、請求項３１乃至３４いずれかに記載のスクリーニングシステム。
【請求項３６】
前記二次選別後のクローニング手段は、プラスミド法を実施する手段である、請求項３５に記載のスクリーニングシステム。
【請求項３７】
二次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を増幅する手段をさらに有する、請求項３５又は３６に記載のスクリーニングシステム。
【請求項３８】
前記二次選別後の増幅手段は、両端にプライマー配列を持つオリゴヌクレオチド群を増幅するＰＣＲ法を実施する手段である、請求項３７に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アプタマーを効率よく探し出すことができるスクリーニング方法、及び、その方法により得られた特異的アプタマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、蛋白質等の生体高分子材料の生理活性部位（生理活性の発現に関与する部位）に親和性の高い核酸由来オリゴヌクレオチドの存在が知られている。このようなオリゴヌクレオチドはアプタマーと呼ばれており、生体高分子材料の生理活性部位、例えば細胞膜上の何らかの生理活性を引き起こす受容体や、かかる受容体に特異的な細胞外基質成分の結合部位に結合して、生理活性を制御すると考えられている。
特定の生理活性部位に特異的なアプタマーを探し出して医療分野、薬理分野、バイオインダストリー等の広範な分野において研究的及び実用的に利用することが期待されている。従来、特異的アプタマーを探し出す方法としては、ＳＥＬＥＸ法（試験管内人工進化法 Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）が知られている。この方法によると、標的とする生理活性部位を有する生体高分子材料に対し、ランダムな配列をもつ多数のオリゴヌクレオチドの混合物であるオリゴヌクレオチドライブラリを作用させることにより、親和性の高いオリゴヌクレオチドを選び出し、選び出されたオリゴヌクレオチドを増幅生産して、標的とする生理活性部位に対し特異的に結合するかどうかを確認する。
【０００３】
しかしながら、この方法では、生体高分子材料の様々な部位に様々な配列のオリゴヌクレオチドが結合するので、スクリーニング後に多数の配列を含むオリゴヌクレオチド群（ポリクローナルなアプタマー）が候補として残る。従って、特異的アプタマー（モノクローナルなアプタマー）を最終的に特定するためには、スクリーニングにより選別された多数の配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ増幅生産し、標的部位に対する特異的結合性を確認する必要があり、非常に効率が悪い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は上記実情を鑑みて成し遂げられたものであり、生体高分子材料の任意に定めた標的部位に特異的に結合するアプタマーを効率よく探し出すことができるスクリーニング方法、当該方法を実施するためのシステム、当該方法又はシステムによって得られた所定の標的部位に特異的なアプタマー、及び、当該アプタマーを用いたバイオチップを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明により提供されるアプタマーのスクリーニング方法は、生体起源の高分子材料の分子構造内に存在する標的部位に特異的なアプタマーをスクリーニングする方法であって、下記選別工程（Ａ）及び選別工程（Ｂ）：
（Ａ）  前記標的部位の配列又はその一部に相当する配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程；
（Ｂ）  高分子材料の全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程；
の一方を一次選別工程とし、他方を二次選別工程とし、
ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物であるライブラリを用いて前記一次選別工程を行った後、一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を用いて前記二次選別工程を行うことを特徴とする。
また、本発明において提供されるフィブロネクチンのインテグリン結合部位に特異的なアプタマーをスクリーニングする方法は、下記選別工程（Ｃ）及び選別工程（Ｄ）：
（Ｃ）  前記インテグリン結合部位の配列又は少なくともArg−Gly−Asp配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程；
（Ｄ）  フィブロネクチンの全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程；
の一方を一次選別工程とし、他方を二次選別工程とし、
ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物であるライブラリを用いて前記一次選別工程を行った後、一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を用いて前記二次選別工程を行うことを特徴とする。
【０００６】
本発明において提供されるアプタマーは、上記選別工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む方法、又は、上記選別工程（Ｃ）及び（Ｄ）を含む方法のいずれかにより特定された塩基配列、又は、当該配列中の一部の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列、又は、前記いずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを修飾した修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列を含むことを特徴とするアプタマーである。
本発明において提供されるバイオチップは、上記本発明に係るアプタマーを担体に担持してなることを特徴とするバイオチップである。
【０００７】
さらに、本発明により提供されるアプタマーのスクリーニングシステムは、生体起源の高分子材料の分子構造内に存在する標的部位に特異的なアプタマーをスクリーニングするシステムであって、一方が一次選別に用いられ他方が二次選別に用いられる下記選別手段（Ａ）及び（Ｂ）：
（Ａ）  ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物から、前記標的部位の配列又はその一部に相当する配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する手段；
（Ｂ）  ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物から、前記高分子材料の全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する手段；
を有することを特徴とする。
【０００８】
また、本発明において提供されるフィブロネクチンのインテグリン結合部位に特異的なアプタマーをスクリーニングするシステムは、フィブロネクチンのインテグリン結合部位に特異的なアプタマーをスクリーニングするシステムであって、一方が一次選別に用いられ他方が二次選別に用いられる下記選別手段（Ｃ）及び選別手段（Ｄ）：
（Ｃ）  ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物から、前記インテグリン結合部位の配列又は少なくともArg−Gly−Asp配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する手段；
（Ｄ）  ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物から、前記フィブロネクチンの全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する手段；
を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
上記選別工程（Ａ）及び選別工程（Ｂ）からなるスクリーニング方法によれば、ＳＥＬＥＸ法によるスクリーニング工程と、利用容易な活性部位擬似体である直鎖ペプチドを用いるスクリーニング工程を組み合わせた２段階選別を行うことにより、選別終了後のライブラリ中に、標的部位に対する特異性が高く、且つ、標的部位が生理活性部位の場合には生理活性制御作用を発現しえるアプタマーを高い確率で選別することができる。
【００１０】
特に、上記選別工程（Ｃ）及び選別工程（Ｄ）を有するスクリーニング方法によれば、ＳＥＬＥＸ法によるスクリーニング工程と、利用容易な活性部位擬似体である直鎖ペプチドを用いるスクリーニング工程を組み合わせた２段階選別を経るフィブロネクチンのＲＧＤモチーフのターゲッティングにより、２段階選別後のライブラリ中に細胞接着調節因子（阻害因子）を高濃度に濃縮することができる。
【００１１】
本発明に係るスクリーニング方法は効率の良いスクリーニング方法であり、この方法で特定されたアプタマーは、医療分野、製薬分野、試薬分野等の広範な分野での利用が期待される。
特に、上記選別工程（Ｃ）及び選別工程（Ｄ）を有する方法により得られた特異的アプタマーは、比較的強いＲＧＤ阻害効果を有している。
【００１２】
本発明のアプタマーは、担体に担持させたバイオチップとして、様々な目的で利用することができる。
【００１３】
さらに、本発明のスクリーニング方法を実施するために、前記選別工程（Ａ）を実施するための手段及び前記選別工程（Ｂ）を実施するための手段を含むシステムを利用者に提供してもよい。
特に、フィブロネクチンに特異的なアプタマーをスクリーニングするために、前記選別工程（Ｃ）を実施する手段と、前記選別工程（Ｄ）を実施する手段を組み合わせてスクリーニングキットを構成し、利用者に提供してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明に係るスクリーニング方法の一例として、インテグリンに対するフィブロネクチンの結合部位に特異的なアプタマーをスクリーニングする手順を説明する。なお、本発明においてアプタマーとは、生体起源の高分子材料の生理活性部位又は何らかの目的で意図した部位に特異的に結合する能力を持つオリゴヌクレオチドを意味するものとする。
【００１５】
フィブロネクチンは、細胞外基質に存在する２量体蛋白質（それぞれのサブユニットは２３０ｋＤａ程度）であり、タイプＩ−ＩＩＩとして知られる連続した繰返し要素で構成され、フィブリン、ヘパリン、コラーゲン及びインテグリンなどの様々な物質に対する多数の結合部位を有している（図１）。細胞表面インテグリンα５β１、αγβ３とαＶｂβ３などに対するフィブロネクチンの結合部位の最小アミノ酸配列（critical ligand）は、トリペプチドのＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフである。統計的な観点から言えば、フィブロネクチン結合性アプタマーが活性なＲＧＤモチーフに対し必ずしも特異的な親和性を有するとは限らない。結合部位擬似体としてのＲＧＤ誘導体は、もちろん、アプタマー検索の標的として使用できる。しかし、結合部位擬似体と未変性フィブロネクチンの結合部位とはコンフォメーション及び／又は立体状態における違いがありうるので、擬似体に結合性をもつアプタマーの全てが未変性フィブロネクチンのインテグリン結合部位に確実に結合する保証はない。
【００１６】
このような状況下、我々は、まず第１に活性部位を反映している単純な直鎖状オリゴペプチドをベースとし、次にフィブロネクチン蛋白の全体をベースとする２段階選別を経る蛋白質活性部位ターゲッティングに注目した（図２）。フィブロネクチンを選択したのは、ＲＧＤモチーフの象徴的な単純さだけでなく、潜在的な細胞生理機能学的意義、及び、接着、形態、シグナリング、成長、分化、及び増殖、移動／輸送、血管形成、及びがん細胞の転移など、多様な細胞活動に関与するフィブロネクチン−インテグリン相互作用の調節又は阻害の治療法への応用を考慮したからである。
【００１７】
スクリーニングに用いたライブラリは、ランダムな配列を有する中間領域の両端にプライマーとなる一定配列を有する一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮｓ）の混合物であり、具体的には、個々のＯＤＮは、全長が８６ｍｅｒ（８６塩基）であり、中間領域Ｎ４０が４０ｍｅｒのランダムな配列であり、５’末端のプライマー領域が２１ｍｅｒの一定配列であり、３’末端のプライマー領域が２５ｍｅｒの一定配列である、以下に示すような配列を有している。また、一次選別に用いるライブラリ全体としては、１０１５程度の異なる配列を含む混合物である。
５’−ＡＴＡＧＧＡＧＴＣＧＡＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡ−Ｎ４０−ＴＡＴＧＴＧＣＧＴＣＴＡＣＡＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＴ−３’
【００１８】
第１段階の選別工程では、このＯＤＮｓライブラリをその配列がフィブロネクチンのインテグリン結合領域のペプチド配列であるＲＧＤペプチド、Ｈ２Ｎ−ＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰ−ＣＯＯＨを固定化したアガロースゲルカラム（ペプチド−ＣＯＮＨ−カラム）に通した。１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，及び２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＰＢＳ（＋）緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出を行うと、ほとんど（〜９９％）のＯＤＮｓがカラムを通過した。カラムに吸着された少量（〜１％）の結合ＯＤＮｓを、７Ｍの尿素と３ｍＭのＥＤＴＡを含むトリス−アセテート溶出液（ｐＨ５．８）で注意深く回収した。エタノール沈殿を行い、非対称ＰＣＲ法で増幅した。
【００１９】
この第１段階の選別工程を５回繰返し得られた濃縮したＯＤＮｓライブラリを、ネガティブ選別としてペプチドフリーカラムに通し、フィブロネクチン結合性について調べた。ゲルシフトアッセイでは、未変性フィブロネクチンに対して、特異的な結合親和性を示したのは、得られたＲＧＤ結合性アプタマーのわずか５％以下であった。しかし、未変性フィブロネクチンの活性ＲＧＤモチーフに課せられる立体配座的／立体的制約は直鎖ペプチド擬似体の場合には当てはまらないので、この段階での結合親和性を有するものの割合が５％以下であることは驚くべきことではない。
【００２０】
第２段階の選別工程は、吸着フィブロネクチンを用いて行った。上記第１段階の選別工程で得られた濃縮ライブラリを、フィブロネクチンをプレコートした９６−ウェルプレート内ＰＢＳ（＋）中でインキュベーションした。そして、プレートをＰＢＳ（＋）で洗浄した。洗浄後のプレート上に残ったアプタマーを、溶出液で解離させ、上記のようにＰＣＲ増幅した。このインキュベーション／洗浄／ＰＣＲサイクルを、条件を厳しくしながら５回繰返し、２段進化させたＯＤＮｓライブラリを得た。
【００２１】
２段階選別（各工程でそれぞれ５回のサイクル）されたライブラリ中のアプタマーから任意に７種のアプタマーを選び、プラスミド法によりＥ．ｃｏｌｉ中に形質導入してモノクローン化し、大量増幅した後、塩基配列決定し、ゲルアッセイを行った。
任意に取り出してクローン化された７つのアプタマーのうち、５つのアプタマー（両端のプライマー配列の間に中間配列Ｎ４０として配列番号１から５の塩基配列を有する各アプタマー）が未変性フィブロネクチンのインテグリン結合部位に明確に結合した。特にアプタマー１（配列番号１の塩基配列を含むもの）と、アプタマー２（配列番号２の塩基配列を含むもの）は、互いに１塩基のみ異なる配列を有しており、最も強い結合を示した。なお、上記５つのアプタマーの全配列を配列番号６から１０に示す。具体的には、配列番号１の塩基配列を含むもの（アプタマー１）の全配列は配列番号６、配列番号２の塩基配列を含むもの（アプタマー２）の全配列は配列番号７、配列番号３の塩基配列を含むものの全配列は配列番号８、配列番号４の塩基配列を含むものの全配列は配列番号９、そして配列番号５の塩基配列を含むものの全配列は配列番号１０に示す。
【００２２】
本実験では、ＲＧＤベースの第１段進化ライブラリが終了した段階では、選別されたアプタマーのうち、未変性フィブロネクチンに特異的に結合することがゲルアッセイにより確認されたものの割合は５％以下であり、あまり濃縮されていなかった。これとは対照的に、フィブロネクチンそのものを用いた第２段進化ライブラリが終了した段階では、選別されたアプタマーは約７０％の確立（７つ中５つ）で未変性フィブロネクチンに特異的に結合することがゲルアッセイにより確認され、非常に高い確率であった。
【００２３】
アプタマー１と、中間配列Ｎ４０＝ｄ（ＴＧＡＣ）１０（すなわち、アプタマー１と共通のプライマー配列を両端に有し、配列番号１１の中間配列を有するＯＤＮ）であるコントロールＯＤＮ１について、フィブロネクチン固定化チップを備えたＳＰＲ（表面プラズモン分析）による定量的結合分析を行った。図３に示すように、アプタマー１は、非常に遅い解離（ｋｄ＝１．７ｘ１０−４ｓ−１）の特徴的な相互作用（ｋａ＝２．５ｘ１０２Ｍ−１ｓ−１）を示し、一方、コントロールはほとんど応答がなかった。固定化フィブロネクチンとアプタマー１の、Ｋｄ＝ｋｄ／ｋａ＝６８０ｎＭの強い結合は、未変性フィブロネクチン−インテグリン結合に匹敵する。
【００２４】
次に、フィブロネクチンのＲＧＤモチーフに特異的なアプタマーによる細胞接着調節又は阻害作用について実験した。１０μＭのＯＤＮ（アプタマー１、コントロールＯＤＮ１、又はコントロールＯＤＮ２としてのｄ（Ａ）８６）の存在下、及び非存在下（ブランク）で、ハムスターの胎児の肝臓（ＢＨＫ）細胞をフィブロネクチンをプレコートした９６−ウェルプレート中で、別々にインキュベーションした。２時間、３７℃でのインキュベーション後、混合物を、細胞の形状、及び、接着／浮遊細胞数について、光学顕微鏡で観察した。その観察結果を図４に示す。ＯＤＮ無し（図４ａ）、コントロールＯＤＮ１（図示せず）又はＯＤＮ２（図４ｂ）の存在下では、数回の洗浄後でも接着誘導による特異的な伸長形状が観察され、細胞は強固にプレートに接着していた。これらの実験例では、さらに洗浄を行っても細胞がプレートから剥がれ落ちなかった。これとは対照的に、アプタマー１の存在下では、伸長は完全に抑えられており、フィブロネクチン−インテグリン細胞接着を停止させた（図４ｃ）。アプタマー１の実験例では、いくつかの細胞は、プレートに弱く結合しているが、明らかに弱い結合であり、さらなる洗浄によりプレートから容易に剥がれ落ちた（図４ｄ）。この結果から、アプタマー１がフィブロネクチンの活性ＲＧＤドメインを認識して特異的に結合することによって、該活性ＲＧＤドメインによるインテグリン結合活性を調節又は阻害していると推測される。細胞接着の阻害が、２次選別後にクローン化したアプタマーのうち７０％程度で観察されたことも、注目すべきことである。
【００２５】
以上の実験をまとめると、ＳＥＬＥＸ法によるスクリーニング工程と、利用容易な活性部位擬似体である直鎖ペプチドを用いるスクリーニング工程を組み合わせた２段階選別を経るフィブロネクチンのＲＧＤモチーフのターゲッティングを試み、２次選別後のライブラリ中に、細胞接着調節因子（阻害因子）を７０％程度に濃縮した。
【００２６】
ＯＤＮが、その塩基配列中に、上記５つのアプタマーの中間配列Ｎ４０（配列番号１から５）のいずれかを有する場合には、フィブロネクチンに対して高い特異性を示す可能性が高いと考えられる。
また、上記実験により得られた特異的アプタマー１及び２の比較的強いＲＧＤ阻害効果は、潜在的な薬理学活性を示唆しており、医療分野、製薬分野、試薬分野等の広範な分野での利用を期待することができる。
【００２７】
上記実験により示したフィブロネクチンのインテグリン特異的結合部位のスクリーニング方法は、ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物であるライブラリを用いて、選別工程（Ｃ）：
（Ｃ）  前記インテグリン結合部位の配列又は少なくともArg−Gly−Asp配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程；
を行った後、この一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を用いて下記選別工程（Ｄ）：
（Ｄ）  フィブロネクチンの全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程；
を行うことを基本的手順とするが、本発明の目的を逸脱しない限り様々な改変を行うことができる。
例えば、前記選別工程（Ｄ）を一次選別工程として先に行い、その後、前記選別工程（Ｃ）を二次選別工程として行っても、スクリーニングの確立を上げることが可能である。
【００２８】
上記選別工程（Ｃ）において、アガロースゲルカラムに固定化する活性部位擬似体としては、フィブロネクチンのインテグリン結合領域全体のペプチド配列を用いる必要はなく、決定的な配列であるＲＧＤモチーフを含んでさえいればもっと短い断片的配列であっても良い。例えば、ＲＧＤモチーフを含む結合領域の一部に相当する、様々な長さの配列を用いることができるほか、ＲＧＤモチーフを含む結合領域の一部に相当する配列にインテグリン結合領域とは関係ないペプチド配列が付加したものも用いることができる。
【００２９】
上記選別工程（Ｃ）において、活性部位擬似体に対する親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する手段としては、上記実験例で用いたアガロースゲルカラムや他の適切なカラムを用いるカラムクロマトグラフィーのほか、ＲＧＤ−ペプチドが固定された磁気ビーズを用いる選別又はＲＧＤ−ペプチドが固定されたマイクロプレートを用いる選別などを行っても良い。
【００３０】
一次選別後に行う増幅法としては、対称ＰＣＲ法や非対称ＰＣＲ法等のＰＣＲ法を用いることができる。オリゴヌクレオチド群がＤＮＡの場合には非対称ＰＣＲ法が一般的には好ましい。また、オリゴヌクレオチド群がＲＮＡの場合には逆転写ＰＣＲ法が好ましく、その場合には、先ずＲＮＡを用いる逆転写ＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅し、そのＤＮＡからＲＮＡを転写する方法によりＲＮＡを増幅できる。なお、本発明において「ＰＣＲ法により増幅」とは、ＰＣＲ法の手技を含み、方法全体としてオリゴヌクレオチドを増幅できる一連の工程群を意味する。例えば、ＲＮＡを増幅する場合に、上記したように、逆転写ＰＣＲ法を行った後にＤＮＡからＲＮＡを転写する付随的手順を行う場合も、全ての手順を含めて「ＰＣＲ法により増幅」する方法に該当する。
【００３１】
さらに本発明においては、ＰＣＲ法以外の方法により一次選別後の増幅を行ってもよく、例えば、等温で遺伝子増幅可能なタカラバイオ（株）のＩＣＡＮ法（登録商標）を挙げることができる。
【００３２】
また、上記選別工程（Ｄ）において、フィブロネクチンの全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する手段としては、上記実験例で用いたフィブロネクチン固定化ウェルプレートを用いる方法のほか、フィブロネクチンとコンプレックスを作らせた後ゲルで精製を行う方法、フィブロネクチンとコンプレックスを形成させた後にニトロセルロースフィルタ等で分子量分画を行う方法、フィブロネクチンを固定化したアガロースカラム及びビーズを用いる方法、或いは細胞自身を用いる方法などを行っても良い。
【００３３】
二次選別されたオリゴヌクレオチド群は、最終的にクローニングを行い、その塩基配列が特定される。このクローニングの確実性を高めるために、二次選別後、又は、二次選別を２回以上繰り返して行う場合には二次選別手段と交互に、選別されたオリゴヌクレオチド群を増幅することが有効であり、そのような増幅を必要に応じて行うことが好ましい。二次選別後に行う増幅法としては、一次選別後と同様の方法を適用可能であり、この場合も、オリゴヌクレオチド群がＤＮＡの場合には非対称ＰＣＲ法を行うことが一般的には好ましく、一方、オリゴヌクレオチド群がＲＮＡの場合には逆転写ＰＣＲ法を行うことが好ましい。
【００３４】
さらに最終的にアプタマーとして特定されたオリゴヌクレオチドをクローニングするための方法としては、上記実験例で用いたプラスミド法等の公知のクローニング法を用いることができる。
【００３５】
本発明に係るアプタマーのスクリーニング方法は、フィブロネクチンのインテグリン結合部位以外の広範な標的部位に対して応用することができる。本発明のスクリーニング方法は、生体起源の高分子材料の分子構造内に存在する標的部位を対象とし、下記選別工程（Ａ）及び選別工程（Ｂ）：
（Ａ）  前記標的部位の配列又はその一部に相当する配列を含む断片的構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程；
（Ｂ）  高分子材料の全体構造に対して親和性が高いオリゴヌクレオチドを選別する工程；
の一方を一次選別工程とし、他方を二次選別工程とし、
ランダムな配列のオリゴヌクレオチドの混合物であるライブラリを用いて一次選別工程を行った後、一次選別により選別されたオリゴヌクレオチド群を用いて二次選別工程を行うことによって、当該標的部位に特異的なアプタマーを選別する。
【００３６】
上記方法において、生体起源の高分子材料としては、フィブロネクチン等の蛋白質だけでなく、例えば糖タンパクやシグナル伝達に関与する膜タンパク等の様々な高分子材料を対象とし、癌細胞のような生命体であってもよい。また、生体から採取した高分子材料と同等の培養又は合成材料も生体起源の高分子材料として対象に含まれる。
また、高分子材料の分子構造内に存在する標的部位は、生理活性部位に限られず、何らかの目的を持って決定した部位であればよく、例えば、反応性試薬を結合させることを意図して特定された本来は生理活性に関与していない部位なども標的部位とすることができる。
【００３７】
選別工程（Ａ）において用いられる標的部位擬似体は、フィブロネクチンのＲＧＤモチーフと同様、標的部位の全体配列であっても良いし、決定的な配列（critical ligand）を含んでいる限り、その一部に相当する配列を含む断片的構造であってもよいが、スクリーニングの確率を上げるためには、ある程度の長さをもった配列を用いることが好ましい。例えば、標的部位が蛋白質の場合には少なくとも３個のアミノ酸が連結した配列が必要である。
【００３８】
選別工程（Ａ）において標的部位擬似体に対して親和性の高いオリゴヌクレオチドを選別する手段、選別工程（Ｂ）において高分子材料の全体構造に対して親和性の高いオリゴヌクレオチドを選別する手段、及び、その他の増幅やクローニング等の手順については、フィブロネクチンのインテグリン結合部位を対象とする上記方法に準じて行えばよい。
【００３９】
本発明の方法により得られるアプタマーが標的部位に対して特異性を有するためには、その全体配列中に少なくとも３つの塩基からなるランダムな配列部位を含むことが必要である。従って、全体配列の最短長さはランダムな配列を有する３ｍｅｒであるが、全体配列の好ましい長さは標的部位に合わせて決定される。また、本発明に方法により特定されるアプタマーは、標的部位に対する特異性を失わない限り、選別の根拠となったランダムな配列部位のみからなる全体配列を有するものであってもよいし、ランダムな配列の一端又は両端に任意の配列を有していてもよい。例えば、ライブラリに存在するオリゴヌクレオチド群が増幅のためのプライマー部位を有する場合には、二次選別工程により選別された特異性の高いオリゴヌクレオチドを、プライマー部位を有するままアプタマーとして利用してもよいし、必要に応じて当該オリゴヌクレオチドからプライマー部位を全て切断除去してランダムな配列部位のみをアプタマーとして利用してもよいし、プライマー部位の一部のみ切断除去したものをアプタマーとして利用してもよい。ランダムな配列の一端又は両端に任意の配列を意図的に付加することにより、標的部位に対する特異性の強化を図ってもよい。
【００４０】
上記選別工程（Ａ）及び選別工程（Ｂ）からなる本発明のスクリーニング方法によれば、ＳＥＬＥＸ法によるスクリーニング工程と、利用容易な活性部位擬似体である直鎖ペプチドを用いるスクリーニング工程を組み合わせた２段階選別を行うことにより、選別終了後のライブラリ中に、標的部位に対する特異性が高く、且つ、標的部位が生理活性部位の場合には生理活性制御作用を発現しえるアプタマーを高い確率で残すことができる。本発明によれば、対象とする標的部位にもよるが、標的部位に対する特異性が高いアプタマーの割合を、２段階選別終了後のライブラリ中に存在するオリゴヌクレオチドの少なくとも５０％程度にまで濃縮することが可能である。
【００４１】
なお、所定の標的部位に対する特異性を失っていない限り、本発明のスクリーニング方法によって選び出されたアプタマーの塩基配列中の１個乃至数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列を有するアプタマーも、本発明により得られるアプタマーに包含される。
また、実用上又は研究上の利便性を高める目的で、オリゴヌクレオチドであるアプタマーに修飾を行って酵素耐性など何らかの特性を付与してもよく、そのような修飾オリゴヌクレオチドからなるアプタマーも、本発明により得られるアプタマーに包含される。
【００４２】
従って、本発明により提供される方法は効率の良いスクリーニング方法であり、この方法で選別され、その配列が特定されたアプタマー（選別されたオリゴヌクレオチドの配列に、必要に応じて他の配列を付加したもの、選別されたオリゴヌクレオチドの配列の一部を必要に応じて切断除去したもの、及び、修飾オリゴヌクレオチドを含む）は、医療分野、製薬分野、試薬分野等の広範な分野での利用が期待される。
【００４３】
本発明のアプタマーは、適当な材質からなる基板やカラム等の担体に担持させて、標的部位を有する高分子材料との特異的結合性を利用したバイオチップとして、様々な目的で利用することが出来る。さらに、本発明のアプタマーを用いて作製したバイオチップを含むシステムやキットを提供することも可能である。
【００４４】
例えば、臨床検査の分野において、特定の異常蛋白や癌細胞のような検査上意義ある高分子成分が生体試料中に存在するか否かを検出し、或いは、その存在量を測定するために、標的成分に特異的なアプタマーを予め基板に固定したバイオチップを利用することができる。この場合、標的成分の検出方法は特に限定されないが、例えば、生体試料を蛍光試薬により前処理した試料液をバイオチップ上に滴下し、洗浄した後、バイオチップ上に発現した蛍光の程度により、標的成分を検出又は定量することができる。また、このような検査に利用するバイオチップに、検査の実施に付随して必要となる蛍光試薬その他の材料や器具を適宜組み合わせて検査キットを構成し、利用者に提供してもよい。
【００４５】
さらに、本発明のスクリーニング方法を実施するために必要な少なくとも２つの工程を実施するための手段、すなわち前記選別工程（Ａ）を実施するための手段及び前記選別工程（Ｂ）を実施するための手段を含むシステム又はキットを利用者に提供してもよい。
【００４６】
例えば、フィブロネクチンに特異的なアプタマーをスクリーニングするためのシステム又はキットの一例として、フィブロネクチンのインテグリン結合領域に対応するペプチド断片、例えばペプチド配列ＲＧＤを含むペプチドを固定化したアガロースゲルカラム（選別工程（Ｃ）を実施する手段）と、フィブロネクチンをプレコートしたウェルプレート（選別工程（Ｄ）を実施する手段）を組み合わせてスクリーニングキットを構成し、利用者に提供してもよい。このキットには、さらに、オリゴヌクレオチドライブラリを含有する試験液を調整するためのＰＢＳ（＋）緩衝液を含めてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】多様な接着ドメインを持つフィブロネクチン（サブユニット）構造の説明図。
【図２】ランダムオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮｓ）の細胞接着因子への２段進化選別の説明図。
【図３】２５℃で、ランニングバッファーとしてＰＢＳ（＋）（１０μＬ／ｍｉｎ）を流した時の、アプタマー１及びコントロールＯＤＮ１と、固定化フィブロネクチンとの相互作用のＳＰＲトレース。
【図４】フィブロネクチン−コートプレート中、ＰＢＳ（＋）バッファー中でのＢＨＫ細胞の光学顕微鏡像。洗浄前のＯＤＮ無し（４ａ）、洗浄前のコントロールＯＤＮ２存在下（４ｂ）、洗浄前のアプタマー１存在下（４ｃ）、洗浄後のアプタマー１存在下（４ｄ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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