(57)【要約】      （修正有）【課題】  栽培時・収穫時・保管時等の各段階における穀物中の特定のフザリウム属菌の有無について、簡便で、迅速な検出・識別法を提供する。【解決手段】  特定の塩基配列の一部又はその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、（ａ）第１のセグメントとして、フザリウム・グラミネアラムグループ菌のｒＲＮＡ遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の塩基配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列とを含むプライマー。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２４に示す塩基配列の一部又はその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、
（ａ）第１のセグメントとして、フザリウム・グラミネアラムグループ菌のｒＲＮＡ遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、
（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の塩基配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列と
を含むことを特徴とする、プライマー。
【請求項２】
配列番号２５に示す塩基配列の一部又はその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、
（ａ）第１のセグメントとして、フザリウム・グラミネアラムグループ菌のトランスレーション・エロンゲーション・ファクター１アルファー遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、
（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の核酸配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列と
を含むことを特徴とする、プライマー。
【請求項３】
配列番号２６に示す塩基配列の一部またはその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、
（ａ）第１のセグメントとして、トリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌のトリコテセン生合成遺伝子ｔｒｉ５にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、
（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の核酸配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列と
を含むことを特徴とする、プライマー。
【請求項４】
配列番号１〜６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、フザリウム・グラミネアラムグループ菌のｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅可能なフザリウム・グラミネアラムグループ菌検出用プライマーセット。
【請求項５】
配列番号７〜１２で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、フザリウム・グラミネアラムグループ菌のトランスレーション・エロンゲーション・ファクター１アルファー遺伝子の特定領域を増幅可能なフザリウム・グラミネアラムグループ菌検出用プライマーセット。
【請求項６】
配列番号１３〜１８又は配列番号１９〜２３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、トリコテセン生合成遺伝子ｔｒｉ５の特定領域を増幅可能なトリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌検出用プライマーセット。
【請求項７】
検体中に存在するフザリウム・グラミネアラムグループ菌の検出方法であって、フザリウム・グラミネアラムグループ菌のｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を標的とし、請求項４に記載のプライマーセットで該ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を選択的に、ＬＡＭＰ法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、フザリウム・グラミネアラムグループ菌の検出方法。
【請求項８】
検体中に存在するフザリウム・グラミネアラムグループ菌の検出方法であって、フザリウム・グラミネアラムグループ菌のトランスレーション・エロンゲーション・ファクター１アルファー遺伝子の特定領域を標的とし、請求項５に記載のプライマーセットで該トランスレーション・エロンゲーション・ファクター１アルファー遺伝子の特定領域を選択的に、ＬＡＭＰ法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、フザリウム・グラミネアラムグループ菌の検出方法。
【請求項９】
検体中に存在するトリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌の検出方法であって、フザリウム属菌のトリコテセン生合成遺伝子ｔｒｉ５の特定領域を標的とし、請求項６に記載のプライマーセットで該トリコテセン生合成遺伝子ｔｒｉ５の特定領域を選択的に、ＬＡＭＰ法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、トリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌の検出方法。
【請求項１０】
検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、請求項４に記載のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行い、フザリウム・グラミネアラムグループ菌のｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、フザリウム・グラミネアラムグループ菌の識別方法。
【請求項１１】
検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、請求項５に記載のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行い、フザリウム・グラミネアラムグループ菌のトランスレーション・エロンゲーション・ファクター１アルファー遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、フザリウム・グラミネアラムグループ菌の識別方法。
【請求項１２】
検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、請求項６に記載のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行い、トリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌のトリコテセン生合成遺伝子ｔｒｉ５の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、トリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌の識別方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のプライマー又はプライマーセット、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、反応緩衝液を少なくとも含むことを特徴とする、フザリウム・グラミネアラムグループ菌又はトリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のフザリウム（Fusarium）属菌のｒＲＮＡ遺伝子又はトランスレーション・エロンゲーション・ファクター１アルファー遺伝子、もしくはフザリウム属菌のトリコテセン生合成遺伝子ｔｒｉ５に特異的なプライマーに関する。さらに詳しくは、本発明は、フザリウム・グラミネアラムグループ菌のｒＲＮＡ遺伝子又はトランスレーション・エロンゲーション・ファクター１アルファー遺伝子、もしくはフザリウム属菌のトリコテセン生合成遺伝子ｔｒｉ５の特定領域を増幅可能な特定のフザリウム菌検出用プライマー又はプライマーセットに関する。さらに、本発明は、前記菌検出用プライマー又はプライマーセットを等温遺伝子増幅法（以下、「ＬＡＭＰ法」という。）に使用する、フザリウム・グラミネアラムグループ菌又はトリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌の検出・菌株の識別方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
フザリウム属菌に属するフザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum：完全世代名Gibberella zeae）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis：別名Fusarium crookwellense）、フザリウム・クルモラム（Fusarium culmorum）などは、ムギ類、トウモロコシなどの穀物の赤カビ病原菌として知られている植物病原菌である（以下、「フザリウム・グラミネアラムグループ菌」という。）。ムギ類、トウモロコシなどの穀物の赤カビ病は単に穀物の収量を低下させるばかりでなく、デオキシニバレノール（ＤＯＮ）などのマイコトキシンを籾などで生産・分泌される。このため、感染穀物を原料にした各種製品を食すと中毒症状を引き起こすことがあることから、赤カビ汚染が問題視されている。
【０００３】
コムギ赤カビ病などは、発病してからでは効果的な防除方法がないために、発病前に農薬の予防散布を行ったりする。このため、発病前の段階で、発生をある程度予測するための方法の開発が試みられている（非特許文献１）。しかし、非特許文献１に開示されている胞子量調査は、調査期間中のスライドグラスの設置・取替えや、顕微鏡下での胞子数計測など、多大な時間と労力を必要とする。
【０００４】
また、穀粒から病原菌を分離培養してから判定する手法もあるが、これらの方法は、判定までに長時間が必要であり、専門的な知識も必要である。さらに、目的とした病原菌を検出・同定しようとする抗原抗体反応を応用した免疫化学的手法（特許文献１）もあるが、反応の特異性そのものに限界があるという欠点がある。
【０００５】
そこで、遺伝子解析的手法を用いた菌の識別法が提案されてきた。主に、ＰＣＲ法を用いた方法（特許文献２及び非特許文献２−６）が提案されているが、高価な機器を必要とし、また、煩雑な操作を伴うため、農業現場において使用するには問題がある。
【特許文献１】特開平６−１４８１９４号公報
【特許文献２】特開平１０−２３４３８０号公報
【非特許文献１】防菌防黴, 30(6), 341-345, 2002
【非特許文献２】EBC Congress 1999, 541-549
【非特許文献３】Adv. Food Sci., 22(1/2), 38-46, 2000
【非特許文献４】Appl. Environ. Microbiol., 67(7), 2966-2972, 2001
【非特許文献５】Int. J. Food Microbiol, 71, 53-61, 2001
【非特許文献６】J. Food Prot., 65(12), 1955-1961, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の問題点に鑑み、従来技術の手法とは別の観点から、簡便で、迅速な赤カビ病菌（特に、フザリウム・グラミネアラムグループ菌）の検出および識別法の開発が望まれている。したがって、本発明の目的は、前記の課題を解決し、栽培時・収穫時・保管時等の各段階における穀物中の特定のフザリウム属菌の有無について、簡便で、迅速な検出・識別法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、かかる課題を解決するべく検討を重ね、等温の遺伝子増幅反応であるLoop-mediated isothermal amplification（ＬＡＭＰ）法（国際特許公開ＷＯ００／２８０８２号パンフレット）を利用することにより、特定のフザリウム属菌の検出、識別を簡便、迅速に行い得ることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、特定のフザリウム属菌のｒＲＮＡ遺伝子又はトランスレーション・エロンゲーション・ファクター１アルファー遺伝子、及びトリコテセン生合成遺伝子ｔｒｉ５に特異的なプライマーを提供する。本発明は、また、フザリウム・グラミネアラムグループ菌の検出・識別方法、及びトリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌の検出・識別方法を提供する。本発明は、さらに、フザリウム・グラミネアラムグループ菌の検出用キット、及びトリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌の検出用キットを提供する。
【０００９】
より特定的には、本発明は下記の（１）〜（１３）を提供する。
（１）配列番号２４に示す塩基配列の一部又はその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、（ａ）第１のセグメントとして、フザリウム・グラミネアラムグループ菌のｒＲＮＡ遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の塩基配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列とを含むことを特徴とする、プライマー。
（２）配列番号２５に示す塩基配列の一部又はその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、（ａ）第１のセグメントとして、フザリウム・グラミネアラムグループ菌のトランスレーション・エロンゲーション・ファクター１アルファー遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の核酸配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列とを含むことを特徴とする、プライマー。
（３）配列番号２６に示す塩基配列の一部またはその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、（ａ）第１のセグメントとして、トリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌のトリコテセン生合成遺伝子ｔｒｉ５にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の核酸配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列とを含むことを特徴とする、プライマー。
（４）配列番号１〜６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、フザリウム・グラミネアラムグループ菌のｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅可能なフザリウム・グラミネアラムグループ菌検出用プライマーセット。
（５）配列番号７〜１２で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、フザリウム・グラミネアラムグループ菌のトランスレーション・エロンゲーション・ファクター１アルファー遺伝子の特定領域を増幅可能なフザリウム・グラミネアラムグループ菌検出用プライマーセット。
（６）配列番号１３〜１８又は配列番号１９〜２３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、トリコテセン生合成遺伝子ｔｒｉ５の特定領域を増幅可能なトリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌検出用プライマーセット。
（７）検体中に存在するフザリウム・グラミネアラムグループ菌の検出方法であって、フザリウム・グラミネアラムグループ菌のｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を標的とし、（４）に記載のプライマーセットで該ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を選択的に、ＬＡＭＰ法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、フザリウム・グラミネアラムグループ菌の検出方法。
（８）検体中に存在するフザリウム・グラミネアラムグループ菌の検出方法であって、フザリウム・グラミネアラムグループ菌のトランスレーション・エロンゲーション・ファクター１アルファー遺伝子の特定領域を標的とし、（５）に記載のプライマーセットで該トランスレーション・エロンゲーション・ファクター１アルファー遺伝子の特定領域を選択的に、ＬＡＭＰ法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、フザリウム・グラミネアラムグループ菌の検出方法。
（９）検体中に存在するトリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌の検出方法であって、フザリウム属菌のトリコテセン生合成遺伝子ｔｒｉ５の特定領域を標的とし、（６）に記載のプライマーセットで該トリコテセン生合成遺伝子ｔｒｉ５の特定領域を選択的に、ＬＡＭＰ法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、トリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌の検出方法。
（１０）検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、（４）に記載のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行い、フザリウム・グラミネアラムグループ菌のｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、フザリウム・グラミネアラムグループ菌の識別方法。
（１１）検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、（５）に記載のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行い、フザリウム・グラミネアラムグループ菌のトランスレーション・エロンゲーション・ファクター１アルファー遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、フザリウム・グラミネアラムグループ菌の識別方法。
（１２）検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、（６）に記載のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行い、トリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌のトリコテセン生合成遺伝子ｔｒｉ５の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、トリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌の識別方法。
（１３）（１）〜（６）のいずれか１つに記載のプライマー又はプライマーセット、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、反応緩衝液を少なくとも含むことを特徴とする、フザリウム・グラミネアラムグループ菌又はトリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌検出用キット。
【００１０】
上記の（１）〜（６）の所定のプライマー又はプライマーセットをＬＡＭＰ法に使用すると、フザリウム・グラミネアラムグループ菌のｒＲＮＡ遺伝子又はトランスレーション・エロンゲーション・ファクター１アルファー遺伝子、もしくはトリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌のトリコテセン生合成遺伝子ｔｒｉ５の特定領域にアニールする。これをＬＡＭＰ法で定める増幅条件の下で増幅すると、特定の遺伝子領域が増幅される。このような増幅産物の有無を、電気泳動法又は簡易検出法によって確認する。このようにして、特定のフザリウム属菌を検出することができる。
【００１１】
また、本発明の検出方法を特定の検体（例えば、穀物）に適用するとき、検体から採取した雑菌を培養してＤＮＡ試料を分離し、このＤＮＡ試料に上記の（１）〜（６）の所定のプライマー又はプライマーセットを作用させ、同様に増幅されたＤＮＡ増幅産物の有無を確認する。このようにして、フザリウム・グラミネアラムグループ菌又はトリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌を検出することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、配列番号１〜６、７〜１２、１３〜１８又は１９〜２３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなるプライマーセットをＬＡＭＰ法に使用して、特定のフザリウム属菌のｒＲＮＡ遺伝子又はトランスレーション・エロンゲーション・ファクター１アルファー遺伝子、もしくはトリコテセン生合成遺伝子ｔｒｉ５の特定領域を増幅して、特定のフザリウム属菌の検出を可能にする。
【００１３】
また、本発明による特定のフザリウム属菌の検出方法は、配列番号１〜６、７〜１２、１３〜１８、または１９〜２３で表される核酸配列からなるオリゴヌクレオチドセットからなるプライマーセットを用いて、検体から得られたＤＮＡ試料にＬＡＭＰ法（等温遺伝子増幅）を施し、増幅産物の有無を確認することからなるので、特定のフザリウム属菌の検出・識別を簡易、迅速かつ確実に行わしめる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１５】
本発明は、栽培時・収穫時・保管時等の各段階における穀物中のフザリウム・グラミネアラムグループ菌又はトリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌が存在するか否かを判定するために、前記菌に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＬＡＭＰ法による等温遺伝子増幅により、特定のフザリウム属菌のｒＲＮＡ遺伝子又はトランスレーション・エロンゲーション・ファクター１アルファー遺伝子、もしくはトリコテセン生合成遺伝子ｔｒｉ５の特定領域の増幅を行い、増幅産物の有無を確認することを基礎としている。
【００１６】
本発明の検出・識別法には、サンプルとして、フザリウム属菌の検出でよく使用されるＣＺＩＤ（Czapek Iprodion Dicloran）寒天培地で出現した菌や、穂、穀粒中などに存在する菌を供することができる。
【００１７】
なお、本明細書で使用する「検体」とは、特定のフザリウム属菌を含む可能性があり、本発明の検出・識別法の対象となるサンプルであるが、特に限定はない。例えば、栽培時・収穫時・保管時等の各段階における穀物等を挙げることができる。また、本明細書で使用する「識別」とは、フザリウム属菌の１種以上が存在する検体において、フザリウム・グラミネアラムグループ菌又はトリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌などの特定のフザリウム属菌とその他のフザリウム属菌を区別して、検出することを特に指す場合もあるが、一般的には複数の菌種のなかで検出対象である特定のフザリウム属菌を識別することを指す。また、本明細書で使用する「判定」とは、検出した菌が特定のフザリウム属菌であるか否かを判定することを指し、検出と同義に使用されることもある。
【００１８】
本発明で使用されるＬＡＭＰ法は、ＰＣＲ法と異なり、増幅工程での温度調節（サイクル）を不要とし、一種類のＤＮＡ合成酵素を用いて、一定温度（等温）で増幅する遺伝子増幅法である（国際特許公開ＷＯ００／２８０８２号パンフレット、前掲）。
【００１９】
本発明の該フザリウム属菌のターゲット遺伝子に特異的なプライマーは、その特定領域を標的として、ループを形成する２種類の内部プライマー（ＦＩＰ、ＢＩＰ）と２種類の外部プライマー（Ｆ３、Ｂ３）の計４種類のセットとして、設計する。増幅する遺伝子の特定領域は、１００〜５００ｂｐ程度である。
【００２０】
ここで、内部プライマーは、標的領域の塩基配列を増幅し、（ａ）第１のセグメントとして、標的遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の塩基配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列と、を含むことを特徴とする。
【００２１】
また、増幅反応の起点となるダンベル構造の５’末端側のループの１本鎖部分に相補的な配列を持つループプライマー（ＬｏｏｐＢ、ＬｏｏｐＦ）を用いることにより、ＤＮＡ合成の起点を増やすことが可能となる。このため、ループプライマーを利用すると、増幅効率が上がり、増幅に要する時間を１／３〜１／２に短縮することが可能である。そして、外部プライマーは、標的領域３’末端側にある塩基配列を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を有する。
【００２２】
プライマーのオリゴヌクレオチドの核酸配列が決定されると、オリゴヌクレオチド自身の合成は、公知の手段、例えば、パーキンエルマー社製の自動ＤＮＡ合成装置を用いて実施できる。
【００２３】
本発明において、フザリウム・グラミネアラムグループ菌又はトリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌に特異的なプライマーセットとして、例えば下記の４組のプライマーセット［ＩＴＳプライマーセット（配列番号１〜６）、ＴＥＦプライマーセット（配列番号７〜１２）、Ｔｒｉ５プライマーセット（配列番号１３〜１８）、ｎＴｒｉ５プライマーセット（配列番号１９〜２３）という］を挙げることができる。ここで、フザリウム・グラミネアラムグループ菌又はトリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌に特異的なプライマーとは、その菌のｒＲＮＡ遺伝子、又はトランスレーション・エロンゲーション・ファクター１アルファー遺伝子、もしくはトリコテセン生合成遺伝子ｔｒｉ５の特定領域を特異的に増幅可能なプライマーである。なお、ｒＲＮＡ遺伝子、トランスレーション・エロンゲーション・ファクター１アルファー遺伝子、及びトリコテセン生合成遺伝子ｔｒｉ５の核酸配列（部分配列）を配列表の配列番号２４〜２６にそれぞれ示す。
【００２４】
検体中に存在するフザリウム・グラミネアラムグループ菌もしくはトリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌の検出は、上記した４組のプライマーセットの少なくとも１組のセットを用いて、ＬＡＭＰ法に従い、等温遺伝子増幅（通常６０〜６５℃で１５分〜１時間）を行う。すなわち、検体から採取した菌株又は穀物検体そのものを、適当な培地中で培養し遠心分離等で集菌した後、公知の方法によって菌株のＤＮＡを分離して、このＤＮＡに対して前記プライマーセットを用いて増幅反応を行う。増幅したＤＮＡ増幅産物の有無は、ＬＡＭＰ法での簡易検出、又は通常の電気泳動によって検出できる。前者の簡易検出には、１）増幅反応液の白濁による目視確認（国際特許公開ＷＯ０１／８３８１７号パンフレット）および２）蛍光インターカレーターの目視確認がある。いずれも、目視により増幅産物（標的遺伝子の存在）の有無を確認することができる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例を挙げて本発明について更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】
（実施例１）  既知菌株の遺伝子（ｒＲＮＡ遺伝子、トランスレーション・エロンゲーション・ファクター１アルファー遺伝子、トリコテセン生合成遺伝子）の増幅
（使用したプライマーセット）
ＩＴＳプライマーセット［ITS-FIP（配列番号１）、ITS-BIP（配列番号２）、ITS-F3（配列番号３）、ITS-B3（配列番号４）、ITS-LoopF（配列番号５）、ITS-LoopB（配列番号６）］、ＴＥＦプライマーセット［TEF-FIP（配列番号７）、TEF-BIP（配列番号８）、TEF-F3（配列番号９）、TEF-B3（配列番号１０）、TEF-LoopF（配列番号１１）、TEF-LoopB（配列番号１２）］、Ｔｒｉ５プライマーセット［Tri5-FIP（配列番号１３）、Tri5-BIP（配列番号１４）、Tri5-F3（配列番号１５）、Tri5-B3（配列番号１６）、Tri5-LoopF（配列番号１７）、Tri5-LoopB（配列番号１８）］、ｎＴｒｉ５プライマーセット［nTri5-FIP（配列番号１９）、nTri5-BIP（配列番号２０）、nTri5-F3（配列番号２１）、nTri5-B3（配列番号２２）、nTri5-LoopB（配列番号２３）］の４種類のプライマーセットを使用した。これらのプライマーセットによるフザリウム・グラミネアラムグループ菌又はトリコテセン系カビ毒産生フザリウム属菌の遺伝子の増幅、および近縁菌の遺伝子の増幅について検討した。供試菌株は、各菌株に対する結果と共に表１にまとめて示した。
【００２７】
（ゲノムＤＮＡの調製）
フザリウム属菌及び近縁菌をポテトデキストロース寒天培地（バレイショ浸出液：２０％、グルコース：２％、寒天：１．５％、ｐＨ５．６±０．２、栄研化学社製）に植菌し、２０℃で３〜１０日間培養を行い、試験に供した。ＤＮＡ抽出液PrepMan（商標）Ultra（アプライド・バイオシステム社製）を用いて菌体からゲノムＤＮＡを抽出した。
【００２８】
（ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅）
ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅はLoopamp DNA増幅試薬キット（栄研化学社製）を用いて行った。試薬反応液に上記ＤＮＡ溶液、および各プライマーセットを加え、遺伝子の増幅反応を行った。増幅反応は６５℃で、６０分間行った。
【００２９】
（増幅産物の検出）
増幅反応が進むにつれ、遊離してくるピロリン酸が、反応液中に存在するマグネシウムイオンとピロリン酸マグネシウムを形成する。増幅が起こっている場合のみ反応液が白濁する。この白濁を観察することで、増幅産物の有無を判断した。また、一部の菌株については、反応液１μＬをポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。エチジウムブロマイド溶液で１０分間染色した後、紫外線を照射してＤＮＡのバンドを観察・確認した（図１に結果を示した）。
【００３０】
各プライマーセットについての増幅結果をまとめたものが表１である。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
表１に示したように、ＩＴＳまたはＴＥＦプライマーセットを用いたとき、フザリウム・グラミネアラム（完全世代名：Gibberella zeae）及びフザリウム・セレアリス（別名：Fusarium crookewllense）に属する供試菌株において、増幅産物を確認することができた。一方、Ｔｒｉ５またはｎＴｒｉ５プライマーセットを用いたとき、デオキシニバレノール（ＤＯＮ）を産生する供試菌株のみにおいて、増幅産物を確認することができた。そして、４つのプライマーセットのいずれを用いても、特定のフザリウム属菌以外の菌において、増幅産物は確認されなかった。
【００３３】
（実施例２）  穂中における汚染の検出
（切り穂検定試験）
圃場から接種適期の大麦の穂（開花数日後の穂）を第１節の下で切り取り、１穂当り、０．７〜１．２ｍＬのFusarium graminearum OUGZ 027の分生子懸濁液を散布し、穂に胞子を接種した。接種後、１８℃、１２時間日長に設定した加湿器付き陽光低温庫で７日間穂を培養した。本検定法で使用した大麦はミカモゴールデンであり、試験１の７日目における罹病粒の割合はＲ（０〜１０％）からＲＭ（１０〜２０％）であり、試験２の７日目における罹病粒の割合はＭ（２０〜３０％）からＳＭ（３０〜５０％）であった。
【００３４】
（各プライマーセットによる検出）
胞子接種後０、１、３及び７日目に、培養中の穂からランダムに６穂選び、各穂の先端近辺にある１粒をサンプルとして使用した。サンプル１粒をＤＮＡ抽出液PrepMan（商標）Ultra（アプライド・バイオシステム社製）（１００μＬ）に浸漬し、９５℃、１０分間の加熱によりＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ抽出液の１μＬをＬＡＭＰ反応（６５℃、６０分）に供し、各プライマーセットによる検出可否を判定した。
【００３５】
各プライマーセットの検出結果を表２に示した。
【００３６】
【表２】
2005245257.tif 000003
【００３７】
ＴＥＦプライマーセット及びｎＴｒｉ５プライマーセットは、胞子接種後０日目から３日目における汚染粒からフザリウム属菌を検出することができなかったが、接種７日目の罹病状態に近い粒からフザリウム属菌を検出することが出来た。ＩＴＳプライマーセットでは、胞子接種後１日目〜３日目位でもフザリウム属菌汚染を検出ことが可能であったが、胞子状態のフザリウム属菌は検出できない可能性が高いと考えられる。
【００３８】
上記の結果より、罹病に至る前に、初期感染の状態にて、赤カビ病菌の感染を検出することが可能と考えられる。一方、ＴＥＦプライマーセットやｎＴｒｉ５プライマーセットは、罹病粒割合とほぼ一致していることより、圃場における罹病粒の把握等に利用できる。さらに、ＩＴＳプライマーセットとＴＥＦプライマーセットやｎＴｒｉ５プライマーセットと組合せて検査することにより、例えば、ＩＴＳプライマーセットで陽性、ＴＥＦプライマーセットで陰性であれば汚染（感染）初期の状態、ＩＴＳ及びＴＥＦプライマーセットとも陽性であれば、汚染（感染）がかなり進んだ状態というように、赤カビ汚染の進行度や、汚染の程度も推定できると考えられる。
【００３９】
（実施例３）  非汚染穀粒中における汚染穀粒の検出
赤カビ病菌の汚染が見られない大麦２０ｇ（約５００粒）に、Fusarium graminearum OUGZ 027 を汚染させた粒１粒又は３粒を混ぜた後、滅菌水３０ｍＬに懸濁した。１〜２分間、手で振盪させた後、上清１ｍＬを遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５分）を行った。その残査にＤＮＡ抽出液PrepMan（商標）Ultra（アプライド・バイオシステム社製）（１００μＬ）を加え、９５℃、１０分間加熱し、ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ抽出液の１μＬをＬＡＭＰ反応（６５℃、６０分）に供し、各プライマーセットによる検出可否を判定した。
【００４０】
各プライマーセットの検出結果を表３に示した。
【００４１】
【表３】
2005245257.tif 000004
【００４２】
ＩＴＳプライマーセットを用いた場合、大麦２０ｇ（約５００粒）中に汚染粒１粒が混入していた場合（混入率０．２％）でも、汚染の検出が可能であることが判明した。したがって、極少量の汚染粒をも検出可能な感度を有していることが分かる。また、ＩＴＳプライマーセットとＴＥＦプライマーセットとを組合せて検査することにより、ある程度汚染の程度も推定できると考えられる。
【００４３】
（実施例４）  大麦、麦芽中の赤カビ汚染状況推測
（サンプル調製）
大麦又は麦芽２０ｇをブレンダーで粉砕し、滅菌水５０ｍＬに懸濁した。よく振盪した後、ろ紙（アドバンテック社製Ｎｏ．２）にて濾過を行い、サンプル溶液とした。
【００４４】
（デオキシニバレノール（ＤＯＮ）の検出）
上記サンプル溶液０．１ｍＬを使用し、Neogen社製Veratox5/5キットにてＤＯＮの定量を行った。本キットの検出限界は５０ｐｐｂであり、この検出限界を超えたサンプルを陽性とし、検出限界以下のものを陰性とした。
【００４５】
（ＩＴＳプライマーセットによる検出）
上記サンプル溶液１ｍＬを遠心分離し（１０，０００ｒｐｍ、５分）、遠心残査にＤＮＡ抽出液PrepMan（商標）Ultra（アプライド・バイオシステム社製）（１００μＬ）を加え、９５℃で１０分間加熱し、ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ抽出液の１μＬをＬＡＭＰ反応（６５℃、６０分）に供した。
【００４６】
大麦及び麦芽１６サンプルについて、ＤＯＮ含量及びＬＡＭＰ法による赤カビ検出を行った結果を表４にまとめた。
【００４７】
【表４】
2005245257.tif 000005
【００４８】
１６サンプル中１０サンプルにＬＡＭＰ法により赤カビが検出された。この１０サンプル中８サンプルにＤＯＮが検出された。一方、ＬＡＭＰ法で赤カビが検出されなかった６サンプルには、ＤＯＮも検出されなかった（検出限界（50ppb）以下）。さらに、ＬＡＭＰ法にて赤カビ未検出となったサンプルで、ＤＯＮが検出されたサンプルはなかった。
【００４９】
したがって、ＩＴＳプライマーセットを用いることで、サンプル中におけるＤＯＮ生産赤カビを感度良く検出することができると供に、ＤＯＮ含有の可能性の有無も推測できると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
マイコトキシンを産生する赤カビ病原菌である特定のフザリウム属菌を選択的、迅速、簡便に、識別、検出することが可能となった。
【００５１】
したがって、本発明のプライマーセットおよびそれを用いる特定のフザリウム属菌などの検出方法は、穀物中における赤カビ汚染粒の検出のみでなく、栽培時・収穫時・保管中等の各段階においても、使用することが可能と考えられる。つまり、赤カビ病菌の汚染拡大の防止処置（感染初期における農薬散布、栽培中・収穫時における汚染穀物の選別、穀物保管場所の微生物状態把握など）を施すための検査法となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ＩＴＳプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により遺伝子増幅を行った結果を示す電気泳動図である。レーン１：Fusarium equseti NBRC30198、レーン２：Fusarium crookwellense NBRC32585、レーン３：Fusarium tricinctum NBRC33238、レーン４：Fusarium sporotorichioides NBRC33237、レーン５：Fusarium solani JCM11488、レーン６：Gibeberella zeae JCM9873、レーンＭ：マーカー。
【図１】
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【配列表】
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