(57)【要約】【課題】  サル類精子の簡便かつ安価な凍結保存の方法等を提供すること。【解決手段】  サル類精子の凍結保存方法において、（１）単離されたサル類精子に、ラフィノース及び蛋白源を含有しかつ当該ラフィノースの含有量が１重量％〜３０重量％である凍結保存用液を添加してなる精子含有凍結保存用液を調製する第一工程、及び（２）当該精子含有凍結保存用液を凍結する第ニ工程を有することを特徴とする方法、サル類精子の凍結保存における当該精子の分散媒体としてのラフィノース及び蛋白源を含有する凍結保存用液の使用、及び、サル類精子の単離における当該精子の提供サンプルとしての血液及び脂肪を実質的に除去されてなるサル類の除雑物精巣上体の使用等。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サル類精子の凍結保存方法において、
（１）単離されたサル類精子に、ラフィノース及び蛋白源を含有しかつ当該ラフィノースの含有量が１重量％〜３０重量％である凍結保存用液を添加してなる精子含有凍結保存用液を調製する第一工程、及び
（２）当該精子含有凍結保存用液を凍結する第ニ工程
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
第一工程の前工程として、
（Ａ）サル類の精巣から精巣上体を分離する第Ａ工程、
（Ｂ）第Ａ工程により分離された精巣上体から血液及び脂肪を実質的に除去する第Ｂ工程、
（Ｃ）第Ｂ工程により調製された除雑物精巣上体から精子を単離する第Ｃ工程、
を追加的に有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
精子含有凍結保存用液の凍結工程（第ニ工程）において、当該精子含有凍結保存用液を液体窒素上方の気中で一定時間保持した後、液体窒素中に投入することを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
精子含有凍結保存用液の凍結工程（第ニ工程）において、当該精子含有凍結保存用液を液体窒素上方の気中で５分間以上１５分間未満保持することを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
精子含有凍結保存用液の凍結工程（第ニ工程）において、当該精子含有凍結保存用液を液体窒素上方の気中で５分間以上１０分間以下保持することを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
サル類がコモンマーモセットであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかの請求項に記載される方法。
【請求項７】
凍結保存用液の蛋白源の含有量が０．１重量％〜２０重量％であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかの請求項に記載される方法。
【請求項８】
蛋白源が、スキムミルク、アルブミン及び血清からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかの請求項に記載される方法。
【請求項９】
サル類精子の凍結保存における当該精子の分散媒体としての、ラフィノース及び蛋白源を含有する凍結保存用液の使用。
【請求項１０】
サル類精子の単離における当該精子の提供サンプルとしての、血液及び脂肪を実質的に除去されてなるサル類の除雑物精巣上体の使用。
【請求項１１】
請求項１記載の方法により凍結保存されてなることを特徴とするサル類精子。
【請求項１２】
サル類の受精卵の作製方法であって、請求項１１記載のサル類精子を融解してなる凍結融解精子のうちの生存精子を未受精卵へ直接注入する工程を有することを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法により作製されてなることを特徴とするサル類受精卵。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サル類精子の凍結保存方法等に関し、より詳細には、体外受精用のサル類精子の凍結保存方法、サル類精子の凍結保存における当該精子の分散媒体としてのラフィノース及び蛋白源を含有する凍結保存用液の使用、及び、サル類精子の単離における当該精子の提供サンプルとしての血液及び脂肪を実質的に除去されてなるサル類の除雑物精巣上体の使用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、サル類精子の凍結保存には、卵黄等の保護剤及びグリセロール等の耐凍剤を含む凍結保存用液が用いられていた。しかもサル類精子を凍結する際には、精子含有凍結保存用液を、自動細胞凍結機等を用いて温度管理しながら精密に凍結していた。（例えば、非特許文献１、２参照）
一方、マウス精子の凍結保存にはラフィノース及び蛋白源を含む凍結保存用液が開発されていた。そしてマウス精子を単離する際には、マウス類の精巣から分離されたそのままの状態の精巣上体から精子を単離していた。当該凍結保存の方法は大変簡便であった。（例えば、特許文献１参照）
【０００３】
【非特許文献１】J. M. Morrellら  Artificial insemination in Callithrix jacchus using fresh or cryopreserved sperm、Animal Repreoduction Science  52巻  第165頁〜第174頁  （１９９８）
【非特許文献２】Wei Siら  Cryopreservation of Rhesus Macaque (Macaca mulatta) Spermatozoa and Their Functional Assessment by in vitro fertilization、Cryobiology 41巻  第232頁〜第240頁  （２０００）
【特許文献１】特開2001-03982号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、例えば上記のようなサル類精子の凍結保存の方法を用いてサル類精子を凍結保存した場合には、工程にかかる時間及びサル類精子の融解後の十分な洗浄操作等が必要であること等から、精子の生存率及び運動性が低くなり、さらには高価な自動細胞凍結機等が必要という問題があった。
一方、例えば上記のようなマウス精子の凍結保存の方法をサル類精子の凍結保存に対して適用しようとする場合には、マウス精子とサル類精子との差異等に基づく凍結保存操作の各工程における種々の条件の実験的な試行錯誤による確認や設定を行う必要があり、しかも適用が可能か否かは当業者であっても現在の技術水準においては予測が不可能であると謂わざるを得ない状況にあった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、かかる状況下において鋭意検討した結果、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．サル類精子の凍結保存方法において、
（１）単離されたサル類精子に、ラフィノース及び蛋白源を含有しかつ当該ラフィノースの含有量が１重量％〜３０重量％である凍結保存用液を添加してなる精子含有凍結保存用液を調製する第一工程、及び
（２）当該精子含有凍結保存用液を凍結する第ニ工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明方法と記すこともある。）；
２．第一工程の前工程として、
（Ａ）サル類の精巣から精巣上体を分離する第Ａ工程、
（Ｂ）第Ａ工程により分離された精巣上体から血液及び脂肪を実質的に除去する第Ｂ工程、
（Ｃ）第Ｂ工程により調製された除雑物精巣上体から精子を単離する第Ｃ工程、
を追加的に有することを特徴とする前項１記載の方法；
３．精子含有凍結保存用液の凍結工程（第ニ工程）において、当該精子含有凍結保存用液を液体窒素上方の気中で一定時間保持した後、液体窒素中に投入することを特徴とする前項１又は２記載の方法；
４．精子含有凍結保存用液の凍結工程（第ニ工程）において、当該精子含有凍結保存用液を液体窒素上方の気中で５分間以上１５分間未満保持することを特徴とする前項３記載の方法；
５．精子含有凍結保存用液の凍結工程（第ニ工程）において、当該精子含有凍結保存用液を液体窒素上方の気中で５分間以上１０分間以下保持することを特徴とする前項３記載の方法；
６．サル類がコモンマーモセットであることを特徴とする前項１〜５のいずれかの項に記載される方法；
７．凍結保存用液の蛋白源の含有量が０．１重量％〜２０重量％であることを特徴とする前項１〜６のいずれかの項に記載される方法；
８．蛋白源が、スキムミルク、アルブミン及び血清からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする前項１〜７のいずれかの項に記載される方法；
９．サル類精子の凍結保存における当該精子の分散媒体としての、ラフィノース及び蛋白源を含有する凍結保存用液の使用；
１０．サル類精子の単離における当該精子の提供サンプルとしての、血液及び脂肪を実質的に除去されてなるサル類の除雑物精巣上体の使用；
１１．前項１記載の方法により凍結保存されてなることを特徴とするサル類精子；
１２．サル類の受精卵の作製方法であって、前項１１記載のサル類精子を融解してなる凍結融解精子のうちの生存精子を未受精卵へ直接注入する工程を有することを特徴とする方法；
１３．前項１２記載の方法により作製されてなることを特徴とするサル類受精卵；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、サル類精子の簡便かつ安価な凍結保存の方法等を提供することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において対象となるサル類としては、真猿類を好ましいものとして挙げることができる。より好ましくは新世界ザル類が挙げられる。最も好ましくはコモンマーモセットが挙げられる。尚、これら動物、例えばコモンマーモセットは、日本クレア株式会社等から商業的に入手することができる。
【０００８】
本発明方法はサル類精子の凍結保存方法であって、（１）単離されたサル類精子に、ラフィノース及び蛋白源を含有しかつ当該ラフィノースの含有量が１重量％〜３０重量％である凍結保存用液を添加してなる精子含有凍結保存用液を調製する第一工程、及び（２）当該精子含有凍結保存用液を凍結する第ニ工程を有する。
【０００９】
本発明方法の第一工程において、単離されたサル類精子に、ラフィノース及び蛋白源を含有しかつ当該ラフィノースの含有量が１重量％〜３０重量％である凍結保存用液を添加してなる精子含有凍結保存用液を調製する。
サル類精子は、射出により得られるサル類精子であってもよいし、また下記ように、第一工程の前工程として第Ａ工程〜第Ｃ工程からなる追加的な工程により単離されたサル類精子であってもよい。
【００１０】
本発明方法は、第一工程の前工程として、（Ａ）サル類の精巣から精巣上体を分離する第Ａ工程、（Ｂ）第Ａ工程により分離された精巣上体から血液及び脂肪を実質的に除去する第Ｂ工程、及び（Ｃ）第Ｂ工程により調製された除雑物精巣上体から精子を単離する第Ｃ工程を追加的に有していてもよい。
【００１１】
本発明方法の第一工程の前工程である第Ａ工程において、サル類の精巣から精巣上体を分離する。
例えば、精巣を提供するサル類を、ケタミン、キシラジン等の麻酔薬の筋肉内投与により前麻酔した後、さらにペントバルビタールナトリウム等の麻酔薬の腹腔内投与により麻酔する。このようにして麻酔下にあるサル類を仰臥位に保定した後、当該サル類の陰嚢を0.5〜1.0cm切開することにより、精巣（精巣上体を含む）並びに輸精管及びそれに沿った血管を露出させる。露出させた輸精管及びそれに沿った血管を縫合糸で結紮した後、前記精巣を結紮部位より精巣側で切り取る。切り取られた前記精巣から精巣上体を分離すればよい。
【００１２】
本発明方法の第一工程の前工程である第Ｂ工程において、上記の第Ａ工程により分離された精巣上体から血液及び脂肪を実質的に除去する。
例えば、分離された精巣上体に付着する血液及び脂肪等をろ紙上で転がすことにより、当該雑物を除去し、除雑物精巣上体を調製すればよい。このような、血液及び脂肪を実質的に除去されてなるサル類の除雑物精巣上体は、サル類精子の単離における当該精子の好ましい提供サンプルとして使用される。
【００１３】
本発明方法の第一工程の前工程である第Ｃ工程において、上記の第Ｂ工程により調製された除雑物精巣上体から精子を単離する。
例えば、除雑物精巣上体等の除雑物精巣から精巣上体尾部を切り取り、切り取られた精巣上体尾部を後述の凍結保存用液中に入れた後、当該精巣上体尾部をハサミ等で数ヵ所に切れ込みを入れる。当該切れ込みから精子が凍結保存用液中に漏出し始めたことを確認してから約5分間程度放置した後、精子が凍結保存用液中に浮遊してなる精子懸濁液（即ち、精子含有凍結保存用液）を得る。このようにして、除雑物精巣上体から精子を単離すればよい。
【００１４】
本発明において用いられる凍結保存用液は、ラフィノース及び蛋白源を含有しかつ当該ラフィノースの含有量が１重量％〜３０重量％である凍結保存用液である。
ラフィノースは非還元性三糖の１種であり、メリトース、メリトリオース、ゴシポーズ又は６Ｇ−α−Ｄ−ガラクトシルスクロースとも呼ばれる。凍結保存用液のラフィノースの含有量としては、上記の如く、１重量％〜３０重量％であればよいが、好ましくは１０重量％〜２５重量％、より好ましくは１５重量％〜２１重量％である。凍結保存用液のラフィノースの含有量が１重量％より少ない場合には融解後の精子運動性が極端に低下するという現象を生じる場合があり、一方、３０重量％より多い場合には短時間の保存でも作製した凍結保存用液中にラフィノースの結晶が析出してくるという現象を生じる場合がある。
本発明において蛋白源とは、サル類精子の凍結保存用液においてラフィノースが有する精子細胞膜に対する保護効果をより高める作用を奏するタンパク質性物質等であって、例えば、スキムミルク、ウシ血清アルブミン等のアルブミン、血清等を挙げることができる。特に、スキムミルクが各種の良質タンパク質性物質（例えば、カゼイン、アルブミン、グロブリン、プロテオース、ヘプトン等）の混合物であり、これが複合的な上記の保護効果を奏する理由から好ましい。尚、これらの蛋白源は単独で使用してもよく、また、組み合わせて使用してもよい。本発明のサル類精子の凍結保存用液中の蛋白源の含有量としては、例えば、０．１重量％〜２０重量％であることがよい。好ましくは１重量％〜１０重量％、より好ましくは２重量％〜４重量％である。凍結保存用液の蛋白源の含有量が０．１重量％より少ない場合には上記の保護効果が殆ど認められないという現象を生じる場合があり、一方、２０重量％より多い場合には精子含有凍結保存用液中の浸透圧が高くなることにより精子の生存性が低下するという現象を生じる場合がある。
本発明の凍結保存用液の形態は、通常溶液であり、好ましくは水溶液である。水溶液に用いられる水としては、例えば、蒸留水、注射用蒸留水、胚操作用蒸留水等が好ましい。
【００１５】
本発明の凍結保存用液は、ラフィノース及び蛋白源を、例えば水に溶解することにより調製され、次いで、例えばミリポアろ過装置を用いてろ過滅菌され、容器（例えば、アンプル、バイアルなど）に注入され、そして封入さればよい。ラフィノース及び蛋白源は、一緒に又は両者を別個に容器（例えば、アンプル、バイアル等）に保存してもよい。その際には、少なくとも一方を水溶液としてもよく、また両者を水溶液としてもよく、さらには下記に説明するキットの構成として水のみを容器、例えばアンプル等に充填して保存し、用時に水溶液としてもよい。
【００１６】
このようなラフィノース及び蛋白源を含有しかつ当該ラフィノースの含有量が１重量％〜３０重量％である凍結保存用液に単離されたサル類精子を添加することにより、精子含有凍結保存用液を調製する。当該凍結保存用液の容量は、例えば５０μL〜３００μL、好ましくは１００μL〜２００μLを用いてサル類精子を懸濁するのが望ましい。さらに充填されるサル類精子の濃度は当該容量内に１，０００精子〜１，０００，０００精子、好ましくは１０，０００精子〜１００，０００精子が望ましい。このサル類精子凍結保存における当該凍結保存用液は、サル類精子の好ましい分散媒体として使用される。
【００１７】
本発明方法の第ニ工程において、第一工程により調製された精子含有凍結保存用液を凍結する。
当該工程（精子含有凍結保存用液の凍結工程）において、当該精子含有凍結保存用液を液体窒素上方の気中で一定時間保持した後、液体窒素中に投入することがよい。ここで「一定時間」とは、例えば、５分間以上１５分間未満、好ましくは５分間以上１０分間以下等を挙げることができる。
具体的には例えば、ストロー内に精子含有凍結保存用液を充填し、これを液体窒素内の液体窒素表面に約１０分間程度静置した後、さらに当該ストローを液体窒素中に浸漬することにより、当該精子含有凍結保存用液を凍結すればよい。凍結後はそのまま保存すればよい。
【００１８】
さらに具体的には、まず、精子含有凍結保存用液を充填するためのストローを準備する。ストローは、精子含有凍結保存用液（即ち、凍結保存用液に懸濁させたサル類精子）を充填し、凍結保存するためのいわゆる凍結保存容器として機能する。ストローの内径及び長さは特に限定されないが、精子凍結時の温度における均一性の理由から、通常、内径０．５ｍｍ〜２．０ｍｍのものを使用し、好ましくは内径１．０ｍｍ〜１．５ｍｍのものを使用する。
【００１９】
次に、精子含有凍結保存用液をストロー内に充填するために用いられるシャーレを準備する。シャーレは、当該目的のために用いられるが、それ以外にも精子含有凍結保存用液を調製するためにも使用してもよい。シャーレとして、好ましくは４ウェルマルチディッシュ、３５ｍｍディッシュ等をあげることができる。
【００２０】
次に、このようなストローをシリンジ（例えば、約１ｍｌ）に装着し、例えば、培養液をストロー容積の約半量（例えば、約１００μｌ）吸引する。当該操作は、精子含有凍結保存用液が１本のストローに少量しか充填されないため、そのまま凍結に使用される液体窒素中に保存するとストローが液体窒素表面に浮いてしまうので、ストローの容積の約半分の培養液を「おもり」として充填することが好ましいために行うためのものである。尚、シリンジとしては、通常、容量１．０ｍＬ〜５ｍＬのものを使用すればよく、好ましくは容量１．０ｍＬ〜２．５ｍＬのものをあげることができる。また培養液としては、通常、水又は水溶液を使用すればよく、好ましくはTALP、CMRL-1066、本発明における凍結保存用液等をあげることができる。
【００２１】
次に、このように予め培養液が充填されたストローに、当該培養液との間に約１０ｍｍの空気相を挟んで精子含有凍結保存用液を充填する。尚、当該充填操作においては、精子含有凍結保存用液（例えば、１０μＬ）をシャーレに入れ、当該シャーレ内の精子含有凍結保存用液を、シリンジが装着されたストローを用いて吸引すればよい。
【００２２】
次に、精子含有凍結保存用液が充填されたストローの両端部に約１０ｍｍの空気相を作製した後、当該両端部をシーラーで封止する。尚、空気相は、培養液及び精子含有凍結保存用液が凍結することにより膨張するため、そのクッションとして設けられる。凍結用フロートに両端部が封止されたストローを入れ、液体窒素保管器内の液体窒素表面に静置する。約１０分間静置した後、当該フロートを液体窒素中に浸漬することにより、精子含有凍結保存用液を凍結保存する。
【００２３】
上記のようにして凍結保存されたサル類精子は、用時に融解され、そして例えば、凍結保存された未受精卵と共に体外受精に供され得る。未受精卵の凍結保存、精子の融解、未受精卵の融解、体外受精等は、当該分野で公知の従来の手順に従って行えばよい。
【００２４】
精子の融解は下記のように行えばよい。
凍結保存しているストローを液体窒素中から取り出し、３７℃の温水中に浸漬する。１０分間放置後、温水からストローを引き上げ、ストローの表面の水分を紙でぬぐった後、精子含有凍結保存用液側のシール部を切り取って精子含有凍結保存用液のみをシャーレに取り出す。精子含有凍結保存用液１〜２μｌを、マイクロピペッターを用いて、予め作製しておいた受精用培地（TALP）（例えば、約５０〜２００μｌ）のドロップに移し、約３０分間〜１時間程度前培養する。この精子含有凍結保存用液を体外受精等の受精卵作出に供する。
【００２５】
体外受精は下記のように行えばよい。
マイクロマニュピレーターに、ピエゾドライブユニットMODEL PMM-150FU（プライムテック社）及び微細な注入用マイクロインジェクションピペット（内径約６μm）を装着する。凍結融解精子のうち運動性の有した凍結融解精子を生存精子して選択し、これを注入用マイクロインジェクションピペット内に吸引する。次いで、予め準備しておいた未受精卵に凍結融解精子を注入するため、ピエゾパルス（例：強度4〜6，速度1〜2）を用いて不動化処理を行う。
未受精卵への精子注入操作は、まず未受精卵（コモンマーモセットMII期卵子）の透明帯を、マイクロマニュピレーターに装着された保持ピペットで固定し、続いて注入用マイクロインジェクションピペットを透明帯に密着させた状態で数回のピエゾパルス（例：強度5〜8，速度2）を適用しながら、当該ピペットを進めることにより、当該ピペットを透明帯に貫通する。注入用マイクロインジェクションピペット内にある凍結融解精子を当該ピペット先端近くまで進め、マイクロマニュピレーターを操作して当該ピペットを未受精卵の奥深くまで進め（基本的には、保持ピペット側の卵細胞膜付近まで進める）、ピエゾパルス（例：強度2〜4，速度1〜2）を適用しながら、卵細胞膜を穿孔し、穿孔後に凍結融解精子を極少量の培養液とともに卵細胞質中に排出する。注入に成功した未受精卵を５０μｌの培養液（TALP）に入れ、これを３７℃、５％炭酸ガス、５％空気の恒温培養器で２４時間培養する。培養後、倒立顕微鏡下で雌雄前核の形成を指標して前核期受精卵の作出を確認する。
【００２６】
以上のように、本発明方法を用いてサル類精子を凍結保存することにより受精卵作出を行うことができる。特に、本発明方法により凍結保存されたサル類精子のうち、例えば、コモンマーモセットでは、後述する実施例の如く、融解後に生存率及び運動性を有し、それゆえ高い受精率が得られることが期待される。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明をより詳細に説明するため、実施例を挙げて説明するが本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１（凍結保存用液の調製）
ラフィノース及びスキムミルクを、それらの含有量がそれぞれ１８重量％及び３重量％となるように注射用蒸留水に溶解し、当該溶液中のスキムミルク含有巨大分子（カゼインミセル）を除去するために、当該溶液を遠心処理（２５℃、１２，０００ｒｐｍ、３０分間）することにより凍結保存溶液を調製した。
【００２９】
実施例２（コモンマーモセット精子の採取：精子含有凍結保存用液の調製）
雄コモンマーモセットを、ケタミン及びキシラジンの混合液の筋肉内投与により前麻酔した後、さらにペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与により麻酔した。このようにして麻酔下にある雄コモンマーモセットを仰臥位に保定した後、当該サルの陰嚢を0.5〜1.0cm切開することにより、精巣（精巣上体を含む）並びに輸精管及びそれに沿った血管を露出させた。露出された輸精管及びそれに沿った血管を縫合糸で結紮した後、前記精巣を結紮部位より精巣側で切り取った。切り取られた前記精巣から精巣上体を分離した。
分離された精巣上体に付着する血液及び脂肪等をろ紙上で転がすことにより、当該雑物を可能な限り除去し、除雑物精巣上体を調製した。
除雑物精巣上体を実施例１で調製された凍結保存用液中に入れた後、当該精巣上体をハサミ等で数ヵ所に切れ込みを入れた。当該切れ込みから精子が凍結保存用液中に漏出し始めたことを確認してから５分間程度放置した後、精子が凍結保存用液中に浮遊してなる精子懸濁液（即ち、精子含有凍結保存用液）を得た。
【００３０】
実施例３（精子含有凍結保存用液の凍結保存）
ストローをシリンジ（１ｍｌ）に装着し、培養液（TALP）をストロー容積の約半量（１００μｌ）吸引した。
次に、４ウェルマルチディッシュに、実施例１で得られた精子懸濁液（即ち、精子含有凍結保存用液）１０μｌを、ピペットを用いて入れた。当該シャーレ内の精子含有凍結保存用液を、予め培養液が充填されたストローで吸引することにより、当該ストロー内に、前記培養液との間に約１０ｍｍの空気相を挟みながら、精子懸濁液（即ち、精子含有凍結保存用液）を充填した。
次に、精子含有凍結保存用液が充填されたストローの両端部に約１０ｍｍの空気相を作製した後、当該両端部をシーラーで封止した。
このようにして作製された両端部が封止されたストローを、液体窒素保管器内の液体窒素上方の気相中で１０分間静置した。静置後、当該ストローを液体窒素中に浸漬することにより、精子含有凍結保存用液を凍結保存した。
【００３１】
実施例４（凍結精子の融解）
凍結保存しているストローを液体窒素中から取り出し、３７℃の温水中に１０分間浸漬した。１０分間放置後、温水からストローを引き上げ、ストローの表面の水分を紙でぬぐった後、精子含有凍結保存用液側のシール部を切り取って精子含有凍結保存用液のみをシャーレに取り出した。精子含有凍結保存用液１〜２μｌを、マイクロピペッターを用いて、予め37℃、5%炭酸ガス、5%空気の恒温培養器内で平衡させておいた受精用培地（TALP）５０μｌのドロップに移し、３０分間前培養した。このようにして得られた凍結融解精子を体外受精等に供した。
【００３２】
実施例５（凍結精子の融解後の生存性評価試験）
実施例４で得られた凍結融解精子について、LIVE/DEAD Sperm Viability kit（Molecular Probes社製）を用いて蛍光顕微鏡下にて精子の生死判別を行うことにより、凍結融解精子の生存率を求めた。当該値に基づき凍結融解精子の正常性を確認した。
その結果、凍結融解精子の生存率は約２４％という値を示し、凍結精子の融解後の生存性は高いものであった。
【００３３】
実施例６（凍結精子の融解後の運動能力確認）
実施例４で得られた凍結融解精子について、精液性状検査盤を用いて倒立顕微鏡下にて精子の前進性に係る運動能力を確認した。
その結果、全精子数に対する前進運動を呈している精子数の割合（％）は３０％という値を示し、運動能力は高いものであった。
【００３４】
実施例７（凍結精子のマイクロインジェクション法による顕微授精）
実施例４で得られた凍結融解精子のうちの生存精子を未受精卵へ直接注入する顕微授精によって前核期受精卵の作出を試みた。顕微授精は下記のように実施した。
マイクロマニュピレーターに、ピエゾドライブユニットMODEL PMM-150FU（プライムテック社）及び微細な注入用マイクロインジェクションピペット（内径約６μm）を装着した。実施例４で得られた凍結融解精子のうち、運動性の有した凍結融解精子を生存精子して選択し、これを注入用マイクロインジェクションピペット内に吸引した。次いで、予め準備しておいた未受精卵に凍結融解精子を注入するため、ピエゾパルス（例：強度4〜6，速度1〜2）を用いて不動化処理を行った。
未受精卵への精子注入操作は、まず未受精卵（コモンマーモセットMII期卵子）の透明帯を、マイクロマニュピレーターに装着された保持ピペットで固定し、続いて注入用マイクロインジェクションピペットを透明帯に密着させた状態で数回のピエゾパルス（例：強度5〜8，速度2）を適用しながら、当該ピペットを進めることにより、当該ピペットを透明帯に貫通させた。注入用マイクロインジェクションピペット内にある凍結融解精子を当該ピペット先端近くまで進め、マイクロマニュピレーターを操作して当該ピペットを未受精卵の奥深くまで進め（基本的には、保持ピペット側の卵細胞膜付近まで進める）、ピエゾパルス（例：強度2〜4，速度1〜2）を適用しながら、卵細胞膜を穿孔し、穿孔後に凍結融解精子を極少量の培養液とともに卵細胞質中に排出した。注入に成功した未受精卵を50μｌの培養液（TALP）に入れ、これを３７℃、５％炭酸ガス、５％空気の恒温培養器で２４時間培養した。培養後、倒立顕微鏡下で雌雄前核の形成を指標して前核期受精卵の作出を確認した。尚、比較例として、（ａ）非特許文献１に記載された方法に準じて、精巣を提供する対象サル類としてコモンマーモセットを用いた比較試験A（下記の実験条件参照）、及び、（ｂ）非特許文献２に記載された方法に準じて、精巣を提供する対象サル類としてコモンマーモセットを用いた比較試験B（下記の実験条件参照）における結果を記載した。
【００３５】
比較試験Aにおける実験条件：
(a) 凍結保存用液：Tris:0.23g  glucose:0.08g  Tes:0.964g  streptomycin:0.02gを4mLの蒸留水に溶解させる。当該溶液に、卵黄と蒸留水との混和物（1:3v/v）を10,000rpm、15℃で50分間超遠心分離して採取された上清16mLを加え、混和させる（modified Test yolk medium）。
(b) 精子：腟洗浄法による射出精子
【００３６】
比較試験Bにおける実験条件：
(a) 凍結保存用液：Tris:1.2g  TES:0.2g  glucose:2.0g  Lactose:2.0g  Raffinose  0.2g  streptomycin sulfate:0.005g  Penicillin-G  0.05g  卵黄:20mLを超純水で100mLに溶解させる。これを7000×g、4℃で1時間遠心分離して上清を採取する（TTE）。採取された上清（TTE）の一部に凍結時最終濃度6％グリセロールとなるようにグリセロールを添加して調製された（TTE-G）。
(b) 精子：精巣上体精子
(c) 洗浄：1500rpmで15分間遠心分離により上清を除去した後、TALP-HEPES（cAMP及びカフェイン添加）でSwim-upされた。
【００３７】
その結果を表１に示した。精子の注入後における受精率は５４％という値を示した。当該卵子を継続して培養したところ、供試卵子数に対する分裂受精卵数の割合は４９％という値を示し、分裂率は高いものであった。以上、本発明方法により凍結保存されてなるサル類精子が高い受精能力を有することが確認された。
【００３８】
【表１】
2005269919.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明により、サル類精子の簡便かつ安価な凍結保存の方法等を提供することが可能になる。