(57)【要約】【課題】蛍光免疫法により高感度かつ迅速、簡便に生菌の検出を図る。【解決手段】（１）光導波路を容器中の検体に接触し、光導波路の表面に捕捉された測定対象物に蛍光性発色団を有する標識抗体を結合させ、光導波路内に励起光を導入して発生したエバネッセント波によって蛍光性発色団を励起し、光導波路内を伝播して収集された光を検出器により観測する。  （２）この観測によって、光量が前回と同じであれば、生菌は存在しないとして測定を終了する。光量が変化していれば、（３）の工程を実施する。  （３）容器中で検体を好適な条件で培養する。  （４）上記工程（１）、（２）を再度実施する。という一連の工程を少なくとも１回繰り返し、培養に伴う観測光量の変化を検出器で測定し、観測光量に増加分があれば、それは生菌の増殖によるものとする。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光導波路の表面において免疫反応を観測する蛍光免疫測定方法において、前記光導波路と検体とを接触させ、前記光導波路の表面に捕捉された測定対象物に蛍光性発色団を有する標識抗体を結合し、前記光導波路内に励起光を導入して発生したエバネッセント波によって前記蛍光性発色団を励起し、前記光導波路内を伝播して収集された光を観測する第１の工程と、該第１の工程後に前記検体を培養する第２の工程を有し、前記第１の工程を少なくとも２回繰り返し、培養に伴う観測光量の変化を測定すること特徴とする蛍光免疫測定方法。
【請求項２】
前記第１の工程に先立ち、前記標識抗体を前記光導波路の表面に接触させ、前記光導波路内に励起光を導入して発生したエバネッセント波が前記光導波路内を伝播して収集される光を観測する一連の工程を少なくとも１回行い、非特異的吸着成分に起因する観測光量を予め測定する工程を有することを特徴とする請求項１に記載の蛍光免疫測定方法。
【請求項３】
前記非特異的吸着成分に起因する観測光量が予め設定された値よりも大きい場合に、自動的に測定を中断することを特徴とする請求項２に記載の蛍光免疫測定方法。
【請求項４】
前記光導波路には前記測定対象物に特異的に結合する物質を予め固定していることを特徴とする請求項１又は２又は３に記載の蛍光免疫測定方法。
【請求項５】
前記測定対象物に特異的に結合する物質は抗体であることを特徴とする請求項４に記載の蛍光免疫測定方法。
【請求項６】
前記検体は前記光導波路との接触のための容器と同一の容器により培養することを特徴とする請求項１〜５の何れか１つの請求項に記載の蛍光免疫測定方法。
【請求項７】
前記光導波路の表面で免疫反応を観測する蛍光免疫測定装置において、蛍光信号を観測するための光学系と、検体を入れ前記光導波路とを接触させるための容器と、該容器を温度調整する温調手段と、前記検体を前記容器内で培養する手段とを備えることを特徴とする蛍光免疫測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光導波路の表面において抗原抗体反応を観測する蛍光免疫測定方法及び測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫反応を利用する分析法は、夾雑物の多い試料から特定の測定対象物を選択的かつ簡便に測定する方法として優れており、食品、医療、環境といった分野に普及しつつある。特に食品分野では、食の多様化、外食・中食の普及や流通の発達により、食中毒の発生原因が従来とは異なる傾向にあり、また大規模・広範囲にわたって病原性の強い集団食中毒が発生していることから、食中毒菌への対策として出荷前の迅速な検査等が求められている。
【０００３】
免疫反応を利用した分析法には、抗原抗体反応による結合物の直接又は間接的な測定法として沈降反応や凝集反応などが従来から用いられている。更に、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、酵素などの標識によって抗原抗体反応を定量化する標識免疫測定方法により、測定感度が飛躍的に高まっている。標識法による放射免疫測定方法、酵素免疫測定方法、蛍光免疫測定方法などが知られており、幾つかの装置が市販されている。
【０００４】
蛍光測定においては、高感度のためノイズ成分も含まれ易く、蛍光免疫測定方法においても測定値の信頼性を確保するために様々な工夫がされており、その１つの方法としてエバネッセント波による励起を用いることが挙げられる。光導波路内部に光を全反射させ、その外部表面に滲み出すエバネッセント波によって蛍光色素を励起させるこの方法は、光導波路の表面近傍においてのみ起こる反応を選択的に観測することができるので、抗原抗体反応の観測には好適である。
【０００５】
また、前記の全反射を多重に行わせることにより、励起光をより効率良く用い、感度を向上させることもできる。この多重全反射を利用した蛍光免疫測定法の一例としては、ファイバ型光導波路を検体溶液に浸漬して用いる方式が、既に特許文献１において知られている。また、特許文献２においては、内部全反射の効率を高めるために、独特な形状部分を有するファイバ型光導波路が開示されている。
【０００６】
【特許文献１】米国特許４５８２８０９号公報
【特許文献２】米国特許６１３６６１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
抗原抗体反応による蛍光免疫測定では、特異的結合物質は測定対象物の生死を問わず捕捉するため、死滅した食中毒菌が生菌との区別なく検出されると不都合が生ずることがある。例えば、食品の製造工程において加熱処理により死滅し無害な菌を陽性と判定し、製品の回収に至った場合には、回収のコストや損害は膨大なものとなる。
【０００８】
蛍光免疫法により微生物を高感度かつ迅速、簡便に測定する方法において、生菌のみの検出を図るためには、測定における操作手順の工夫が必要である。
【０００９】
本発明の目的は、上述の問題点を解消し、生菌のみを簡便な操作により高い測定感度、信頼性で測定可能な蛍光免疫測定方法及び測定装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するための本発明に係る蛍光免疫測定方法は、光導波路の表面において免疫反応を観測する蛍光免疫測定方法において、前記光導波路と検体とを接触させ、前記光導波路の表面に捕捉された測定対象物に蛍光性発色団を有する標識抗体を結合し、前記光導波路内に励起光を導入して発生したエバネッセント波によって前記蛍光性発色団を励起し、前記光導波路内を伝播して収集された光を観測する第１の工程と、該第１の工程後に前記検体を培養する第２の工程を有し、前記第１の工程を少なくとも２回繰り返し、培養に伴う観測光量の変化を測定すること特徴とする。
【００１１】
また、本発明に係る蛍光免疫測定装置は、前記光導波路の表面で免疫反応を観測する蛍光免疫測定装置において、蛍光信号を観測するための光学系と、検体を入れ前記光導波路とを接触させるための容器と、該容器を温度調整する温調手段と、前記検体を前記容器内で培養する手段とを備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る蛍光免疫測定方法及び測定装置によれば、光導波路を用いた蛍光免疫法によって、培養により増殖した微生物を測定することで、高感度かつ迅速、簡便、確実に生菌を検出できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明を図示の実施例に基づいて詳細に説明する。
図１は光学プローブ１の側面図、図２は平面図であり、この光学プローブ１は例えばポリスチレン樹脂を射出成型して製作され、フランジ部２を境に上部はレンズ部位３とされ、下部は光導波路４とされている。また光導波路４の中間部は抗体の固定に用いるロッド部位５であり、先端は光吸収部位６とされている。
【００１４】
図３は基本的な測定光学系の構成図である。光学プローブ１を検体を入れた容器１１中にフランジ部２を用いて固定する。レンズ部位３の上方にはビームスプリッタ１２を介して６３５ｎｍのレーザー光を出射する半導体レーザー光源１３が配置され、ビームスプリッタ１２の側方には例えばフォトダイオードから成る検出器１４が配置されている。光学プローブ１はセンサ部分である光導波路４において、容器１１内で励起光の導入と蛍光の収集を併せて行い、全体の光学系がコンパクトになり、安定性を確保し易く、保守が容易となる。
【００１５】
また、容器１１内において検体がロッド部位５の外側に位置するために、浸漬、洗浄などの各種操作が行い易いという長所を持っている。しかし一方で、励起光の反射光、散乱光が蛍光に混入して収集され易いという短所がある。この短所は光導波路４の端面の光吸収部位６に黒色体を配置すること、測定光学系中に光学フィルタを導入するなどによってかなり解決されるが、微量な蛍光量を扱う場合には実質的に問題になることが多い。
【００１６】
また、死滅した食中毒菌は問題にならないような用途で使用される場合でも、光導波路４に固定された特異的結合物質により、測定対象物は生死の区別なく検出されてしまうことを改善するために、検体中に生菌が存在すれば培養によって増殖するようにする。即ち、検出器１４で観測される光量のうち、生菌との抗原抗体反応によって観測される蛍光標識抗体からの蛍光量は、生菌の増殖に応じて増加するものであることを利用する。本実施例の基本的な測定手順は、図４のフローチャート図に示すように、
（１）光導波路４を容器１１中の検体に接触し、光導波路４の表面に捕捉された測定対象物に蛍光性発色団を有する標識抗体を結合させ、光導波路４内に励起光を導入して発生したエバネッセント波によって蛍光性発色団を励起し、光導波路４内を伝播して収集された光を検出器１４により観測する。
（２）この観測によって、光量が前回と同じであれば、生菌は存在しないとして測定を終了する。光量が変化していれば、（３）の工程を実施する。
（３）容器１１中で検体を好適な条件で培養する。
（４）上記工程（１）、（２）を再度実施する。
という一連の工程を少なくとも１回繰り返し、培養に伴う観測光量の変化を検出器１４で測定し、観測光量に増加分があれば、それは生菌の増殖によるものとする。
【００１７】
この測定手順は標識抗体の抗原抗体反応に因らない非特異的吸着が強い場合には、これによる蛍光増加を観測してしまう場合がある。このような虞れがある場合には、本測定に先立って標識抗体のみとの接触を行い、予め非特異的吸着を飽和させておくことが望ましい。
【００１８】
また、検体中に蛍光性の不純物が存在する可能性がある場合には、本測定に先立って、本測定と同様な手順を行使して、測定対象物を含まないブランク検体の測定を行ってもよい。この操作は一旦結合した非特異的吸着成分が何らかの原因で溶出するような場合にも有効である。ブランク測定において得られる蛍光量を、引き続き行う本測定において得られる蛍光量から差し引くことによって、正味の蛍光量を導くこともできる。
【００１９】
光導波路４の表面への測定対象物の捕捉方法は、直接的な物理吸着や予め表面に準備された吸着剤による捕捉を用いることができるが、予め表面に固定された測定対象物に特異的に結合する物質による捕捉、より好ましくは抗体による捕捉が選択性の高い方法として望ましい。光導波路４と検体の接触後、光導波路４と標識抗体溶液との接触後には、次の操作に進む前に適当な液体による洗浄を行うことが有効であるが、本発明においては必ずしも必須ではない。
【００２０】
検体と光導波路４との接触は、検体を入れた容器１１を回転させ、容器１１内の回転軸上を除いて回転軸に平行する部分に棒状の光導波路４を置くという配置が好適である。蛍光信号の測定に用いた検体容器１１は取り外してインキュベータに移動し、適当な条件で培養を行うことができる。或いは、内部に温調機構を備えた容器１１を持つ蛍光免疫測定装置内で培養を行うことができ、このとき容器１１を一旦取り出す操作が不要であるので、培養を含めた蛍光免疫測定を自動化することが可能となる。
【００２１】
検体を入れる容器１１には、上部を開放したものを使用することができるが、培養を行う際の汚染を防ぐために、容器１１を移し変えることなく開閉可能な構造であることがより好ましい。
【００２２】
また、検体は食品及びそれらに関する器具、製造ライン等の環境材料、また飲料水等の水、土、糞便等を対象として、これらを含む液状培地とする。液状のものはそのまま使用することができ、粘度の高い流動体、粉末、固形の検体は、希釈液を加えてストマッカーにより均質化したものを使用することができる。布巾、まな板などの器具や製造ラインでは、スタンプ法により採取したものを使用することができ、これらを液状の一般細菌用培地、或いは選択培地に添加して検体とする。
【００２３】
図５は測定装置の構成図である。図３の構成を含む検出部２１からの出力、つまりは検出器１４の出力は信号処理部２２を介してパーソナルコンピュータ２３に接続されている。このパーソナルコンピュータ２３の出力は検体容器１１を回転させるモータ２４に接続されている。更に、検出部２１の検体容器１１に対しては温調部２５、送液ポンプ２６が接続されており、送液ポンプ２６にはリザーバタンク２７から緩衝液が供給されるようになっている。
【００２４】
光導波路４は検体が満たされた検体容器１１に浸漬され、測定対象物の捕捉を行う。この際に、検体容器１１をモータ２４により回転させることで捕捉の促進を行う。更に、標識抗体と接触することで抗原抗体反応の結合物を形成し、検出部２１の検出器１４において蛍光信号の光量を測定する。ここでは、光導波路４の洗浄、半導体レーザー光源１３からの６３５ｎｍのレーザー光の導入、蛍光の集光を行う。蛍光は光導波路４のレンズ部位３からレンズ、フィルタを通過して検出器１４で検出される。また、培養は温調部２５を用いて適当な条件で行われる。
【００２５】
［実験例１］
光導波路４の表面にEscherichia coli O157:H7抗体（Kirkegaard & Perry Lab.Inc社製）を固定し、光導波路４の表面の抗体の未結合部を０．４％カゼインを含む０．５％Tween20（商品名）を含む０．０１Ｍりん酸緩衝液によりブロックしたものを用い、測定装置により次の操作を行った。
【００２６】
（イ）初めに、非特異的吸着分による信号を得るために、光導波路４を容器１１中の２μｇ／ｍｌの蛍光標識抗体（Amersham Biosciences社製：Cy5 bisfunctional reactive dye により抗体を標識）を含む緩衝液に浸漬して、２５℃で５分間静置した。
（ロ）容器１１を２ｍｌの緩衝液により洗浄した。
（ハ）再び、緩衝液で検体容器１１を満たして蛍光信号を３回測定した。これにより、非特異的吸着分による僅かな信号増加と飽和を予め確認した。
（ニ）続いて、抗原抗体反応による信号を得るために、ＴＳＢ培地（日水製薬社製：トリプトソーヤブイヨン）に不活化したEscherichia coli O157:H7及び生菌体を添加した試料１０ｍｌを検体容器１１に注入した。光導波路４を検体に浸漬し、検体容器１１をモータ２４により１００ｒｐｍで５分間回転した。
（ホ）容器１１を２ｍｌの緩衝液により洗浄した。
（ヘ）容器１１に２μｇ／ｍｌの蛍光標識抗体を含む緩衝液を入れ、光導波路４を浸漬して、２５℃で５分間静置した。
（ト）容器１１を２ｍｌの緩衝液で洗浄した。
（チ）再び、緩衝液を検体容器１１に満たして蛍光信号を測定した。
【００２７】
測定が終了した検体を、インキュベータにおいて４２℃で９０分間培養を行った後に、再び抗原抗体反応による蛍光信号を得るための測定を行った。また、各測定の終了後に、寒天培地を用いて検体のコロニ形成単位を計数し、菌数を求めた。
【００２８】
図６は培養前及び培養後の蛍光信号強度を、非特異的吸着分の測定値からの増加分として示している。また、それぞれの測定に用いた検体の菌数を示しており、検体の培養により信号と菌数は共に増加している。このとき、非特異的吸着による信号の増加は見られなかった。
【００２９】
［実験例２］
実験例１と同様にEscherichia coli O157:H7抗体を固定し、ブロック処理を行った光導波路４を用いて、非特異吸着分による信号増加を確認した。続いて、抗原抗体反応による信号を得るために、９倍量のＴＳＢ培地を加えてストマッカーにより均質化した生食用ホタテ貝柱に、不活化したEscherichia coli O157:H7及び生菌体を添加した試料１０ｍｌを検体容器１１に注入し、実験例１と同様にして蛍光信号を測定した。
【００３０】
測定終了後に、検体を測定装置内の温調部位に移動し、４２℃で９０分間培養を行った後に、再び抗原抗体反応による蛍光信号を得るための測定を行った。また各測定の終了後に、寒天培地を用いて検体のコロニ形成単位を計数し、菌数を求めた。
【００３１】
図７は培養前及び培養後の蛍光信号強度を、非特異吸着分の測定値からの増加分として示した。また、それぞれの測定に用いた検体の菌数を示している。検体の培養により、信号と菌数は共に増加しており、非特異吸着による信号の増加は見られなかった。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】光学プローブの側面図である。
【図２】平面図である。
【図３】測定光学系の構成図である。
【図４】測定動作のフローチャート図である。
【図５】測定装置の構成図である。
【図６】実験例１における測定データのグラフ図である。
【図７】実験例２における測定データのグラフ図である。
【符号の説明】
【００３３】
１  光学プローブ
２  フランジ部
３  レンズ部位
４  光導波路
５  ロッド部位
６  光吸収部位
１１  容器
１２  ビームスプリッタ
１３  半導体レーザー光源
１４  検出器
２１  検出部
２２  信号処理部
２３  パーソナルコンピュータ
２４  モータ
２５  温調部
２６  送液ポンプ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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