(57)【要約】【課題】、リアルタイムＰＣＲにおいて、反応液量のばらつき、容器の蛍光特性のばらつきなどを補正することができ、アッセイ結果の正確性、安定性を向上する。【解決手段】標的核酸の特定配列の増幅に必要なプライマー対の存在下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施する工程において、ＰＣＲのいずれかのステップで増幅された核酸を複数回検出する工程を含むリアルタイムＰＣＲであって、受動的内部参照（パッシブリファレンス）として水酸基を有する蛍光物質、望ましくは５−あるいは／及び６−カルボキシ  Ｘ  ローダミン（５−  ａｎｄ  ６−Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｘ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を使用することを特徴とする方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リアルタイムＰＣＲにおいて、受動的内部参照（パッシブリファレンス）として水酸基を有する蛍光物質を使用することを特徴とするリアルタイムＰＣＲ方法。
【請求項２】
受動的内部参照（パッシブリファレンス）として水酸基を有する蛍光物質を含むことを特徴とする、リアルタイムＰＣＲ用組成物。
【請求項３】
リアルタイムＰＣＲにおいて、受動的内部参照（パッシブリファレンス）として５−および／または６−カルボキシ  Ｘ  ローダミン（５−  ａｎｄ／ｏｒ  ６−Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｘ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を使用することを特徴とするリアルタイムＰＣＲ方法。
【請求項４】
受動的内部参照（パッシブリファレンス）として５−および／または６−カルボキシ  Ｘ  ローダミン（５−  ａｎｄ／ｏｒ  ６−Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｘ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を含むことを特徴とする、リアルタイムＰＣＲ用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の研究やその応用に重要な核酸増幅技術、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に関する。本発明は、遺伝子発現解析や塩基多型解析等に際して特に有用であり、研究のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、２種類のプライマーを用いて特定配列を増幅する手法である（例えば、非特許文献１を参照。）。原理的には１コピー、現実でも数コピー相当の核酸サンプルから増幅できる感度、特定部分のみを増幅する特異性などの特徴から、広く医学・生物学の研究や臨床診断等に利用されてきた。一方、増幅された核酸を検出する手法として、広く電気泳動法やプローブハイブリダイゼーション法が用いられてきた。
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４，１９８５年
【０００３】
近年、ＰＣＲを実施する工程において、同時に増幅された核酸を検出する「リアルタイムＰＣＲ」が広く実施されるようになってきた。その理由として、検出時間の短縮とともに、定量性の確保が挙げられる。ＰＣＲでは最終の増幅核酸量は基質量などで上限が規定されるが、ＰＣＲは極めて効率よく核酸を増幅させるため、一定以上の標的核酸では上限に達してしまい、最終の増幅核酸の量がもとの標的核酸の量に必ずしも比例しない事態が発生する。そこでＰＣＲを実施しながら増幅核酸を検出し、一定量以上の増幅核酸が検出されたサイクル数を指標とする定量方法が考案された。この方法によれば、４０サイクルのＰＣＲでは、理論上は最大２の３９乗（１０桁以上）のダイナミックレンジを確保することができる。
【０００４】
現在実施されている主なリアルタイムＰＣＲに、各種蛍光プローブを用いる手法と、インターカレーター蛍光色素（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｒ  ｄｙｅ）を用いる手法がある。プローブとしては、ＴａｑＭａｎ（Ｒ）（例えば、特許文献１を参照。）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ、Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅなど、いくつかの方法が提案されている。その多くが蛍光エネルギー転移などの技術を利用して、増幅核酸の量に相関して蛍光が増減するように工夫されており、結合体と遊離体の分離をすることなく検出が可能であることから、リアルタイムＰＣＲに使用されるようになった。
【特許文献１】特表２００２−５０５０７１号公報
【０００５】
一方、インターカレーター蛍光色素には、一般的にＳＹＢＲ（Ｒ）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．）などが用いられている。２本鎖核酸に結合したときに強い蛍光を発するインターカレーターを共存させておくことで、増幅核酸の検出が可能になる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これまで述べてきたように、リアルタイムＰＣＲでは多くの場合、検出を蛍光で行なう。これは、ガラスや高分子の容器越しに励起光を当て、蛍光を検出することができるという物理的な特性がリアルタイムＰＣＲに適していることに加え、既に多くの蛍光色素が開発されているので、適用が容易であるという背景がある。様々な波長の蛍光色素を用いれば、１種類の反応系で複数のアッセイを行なうことも可能であり、あるいは特定の蛍光色素を受動的内部参照（パッシブリファレンス）として使用することも可能になる。受動的内部参照を用いれば、反応液量のばらつき、容器の蛍光特性のばらつきなどを補正することができ、アッセイ結果の正確性、安定性向上に大きく寄与することになる。なお、「受動的」とは、参照分子の蛍光が、リアルタイムＰＣＲ反応が行われている間で有意に変化しないことをいう。
【０００７】
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（ＴＭ）（アプライドバイオシステムズ社）など、既に販売されているリアルタイムＰＣＲ装置の多くに、この受動的内部参照を使用するメカニズムが採用されている。装置側の対応は比較的容易といえる。しかし、実際に試薬に添加される受動的内部参照は、それ自体の安定性、水への溶解性、ＰＣＲへの影響などから、わざわざオリゴヌクレオチドとのコンジュゲイトを使用する（例えば、特許文献２を参照。）など、作製にコストや手間が掛かるものに限られていた。
【特許文献２】特許３４５４４３２号公報
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、リアルタイムＰＣＲ法においてより安価な受動的内部参照を使用する手法を開発し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１
リアルタイムＰＣＲにおいて、受動的内部参照（パッシブリファレンス）として水酸基を有する蛍光物質を使用することを特徴とするリアルタイムＰＣＲ方法。
項２  
受動的内部参照（パッシブリファレンス）として水酸基を有する蛍光物質を含むことを特徴とする、リアルタイムＰＣＲ用組成物。
項３
リアルタイムＰＣＲにおいて、受動的内部参照（パッシブリファレンス）として５−および／または６−カルボキシ  Ｘ  ローダミン（５−  ａｎｄ／ｏｒ  ６−Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｘ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を使用することを特徴とするリアルタイムＰＣＲ方法。
項４  
受動的内部参照（パッシブリファレンス）として５−および／または６−カルボキシ  Ｘ  ローダミン（５−  ａｎｄ／ｏｒ  ６−Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｘ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を含むことを特徴とする、リアルタイムＰＣＲ用組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、リアルタイムＰＣＲにおいて安価な受動的内部参照を提供できることが明らかとなった。本発明の方法は従来の方法に比べて極めて簡便で安価であり、リアルタイムＰＣＲを実施するものに経済的に多大の利益をもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
従来、特許３４５４４３２号（特許文献２）などでは、ＰＣＲに関与しないオリゴヌクレオチドに６−カルボキシ  Ｘ  ローダミンなどを結合したものを受動的内部参照として使用してきた。コストや手間を削減するには、オリゴヌクレオチドのゴンジュゲイトではなく、単品で合成できる分子をそのまま使用することが望ましい。
【００１２】
そこで、本発明者らは鋭意研究の結果、６−カルボキシ  Ｘ  ローダミンの官能基が水酸基の状態であれば、ＰＣＲへの影響もなく、安定性を確保し、更にコンジュゲイトの状態と同じ蛍光特性を発揮することを見出した。このとき、官能基が水酸基であることが決定的に重要である。すなわち、水酸基は、ＰＣＲ反応液などの中性に近い水溶液中では他の官能基、物質に対して反応性に乏しいことが原因と考えられる。反応性の低さなどを考慮すればヒドロキシル基やメチル基などでも良いはずであるが、６−カルボキシ  Ｘ  ローダミンは構造上親水性に乏しいので、メチル基では水への溶解性が更に悪くなりＰＣＲの受動的内部参照として使えない。このような複数の特性を満たすために、水酸基は特に適当である。蛍光物質はそれ自体疎水的である場合が多いので、このような手法は他の物質にも十分適用でき、蛍光特性に影響を及ぼすことなく安定性を確保し、なおかつ水溶性を高めるには水酸基の導入が望ましい。この技術は、他の蛍光物質をＰＣＲの受動的内部参照に使用する場合などに応用できる。本願発明者らは更に研究を重ね、受動的内部参照として使用するのに最適な条件を調整して、本発明を完成した。本発明は、インターカレーターアッセイ、各種のプローブアッセイなど蛍光を使用したリアルタイムＰＣＲのどれにも適用可能である。
【００１３】
本願発明で用いる、５−および／または６−カルボキシ  Ｘ  ローダミン（５−  ａｎｄ／ｏｒ  ６−Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｘ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）は、例えば、市販のＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，  Ｉｎｃ．社製のものなどを使用できる。化学合成の際、カルボキシル基が５位にあるものと６位にあるものの混合物が生成されるが、本発明における使用ではどちらも全ての点で問題はなく、混合物をそのまま使用することができる。ただしそれ以外の誘導体が含まれることは好ましくなく、純度は９０％以上、さらには９５％以上が好ましい。
【００１４】
本願発明において、５−および／または６−カルボキシ  Ｘ  ローダミン（５−  ａｎｄ／ｏｒ  ６−Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｘ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を受動的内部参照に適用できるリアルタイムＰＣＲ方法は、特に制限されない。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉのような各種インターカレーターアッセイ、ＴａｑＭａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ、消光プローブのような各種プローブアッセイ、あるいは消光プライマーアッセイなどのいずれにも適用可能である。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様は、さらにリアルタイムＰＣＲのために必要な組成物を含む。以下、本願発明の実施形態を具体的に説明する。５−および／または６−カルボキシ  Ｘ  ローダミンは水酸基の導入により水への溶解性が高まっているが、１０ｍＭ程度の高濃度液を作製するには十分でなかった。検討の結果、アルカリ性の緩衝液で溶解性が高まることが確認され、その後のＰＣＲへの影響も検討して、例えばｐＨ８．８程度の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで溶解するのが適当である。
【００１６】
さらにリアルタイムＰＣＲへの添加濃度を、実際のリアルタイムＰＣＲ反応液でスペクトル解析などにより検討した。受動的内部参照は最低限、他の蛍光色素のノイズレベルより高い必要がある。一方で、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭなどでは受動的内部参照の蛍光値を目的の蛍光シグナル（陽性シグナル）の分母として使うため、高すぎると陽性シグナルが数値上低下する弊害がある。勿論、極端に高すぎると他の蛍光シグナルへの影響やＰＣＲへの影響がある。ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉなど多くの蛍光試薬との組み合わせを検討した結果、ＰＣＲ反応液中に５−および／または６−カルボキシ  Ｘ  ローダミンが最低限２００ｎＭ以上必要であることが判明、それ以上なら受動的内部参照として有効に機能した。２０００ｎＭ程度でも使用に問題はないが、数値上陽性シグナルが低下するため、実際の使用は５００ｎＭ程度が適当である。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１８】
実施例１  インターカレーター検出によるリアルタイムＰＣＲへの適用
（１）ヒトベータアクチン遺伝子を検出するプライマーの合成
配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー１と示す）および配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー２と示す）を合成した。合成はプロリゴ・ジャパン株式会社に依頼した。
【００１９】
（２）リアルタイムＰＣＲ試薬の調製
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡、コードＴＡＰ−２０１）、抗Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体（東洋紡、コードＴＣＰ−１０１）、蛍光インターカレーターとしてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．）を用いて、以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。その際、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼには抗Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体を２．５Ｕあたり１μｇ投入し、緩やかに混和しておく。この反応液に、受動的内部参照として５−  ａｎｄ  ６−Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｘ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（商品名：Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｘ  Ｒｅｄ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，  Ｉｎｃ．））を最終濃度５００ｎＭ添加する。
プライマー１              ２ｐｍｏｌ
プライマー２              ２ｐｍｏｌ
×１０緩衝液                     １μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                           １．２μＬ
２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                      １μＬ
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（３０００倍希釈）     １μＬ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ       ０．５Ｕ
Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｘ  Ｒｅｄ  （５μＭ）         １μＬ
サンプル                         １μＬ
サンプルは、ＨｅＬａ細胞（ヒト由来の細胞）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを５倍毎に希釈した溶液（７本）と、ブランクとしての蒸留水（１本）である。ｃＤＮＡの作製にはＭＭＬＶ由来の逆転写酵素を用いたｃＤＮＡ合成キット（「ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  −α−」、東洋紡、コードＦＳＫ−１０１）を用い、手順は取扱説明書に従った。
【００２０】
（３）リアルタイムＰＣＲの実施
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（ＴＭ）（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、以下の条件でリアルタイムＰＣＲを実施した。詳細は機器の取扱説明書に従った。
増幅条件
９５℃・１分
９５℃・１５秒、６０℃・６０秒（４０サイクル）
【００２１】
（４）結果
図１に示すような結果が得られた。
【００２２】
Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｘ  Ｒｅｄが受動的内部参照として機能し、良好な増幅曲線が得られた。一方、Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｘ  Ｒｅｄを添加しない場合、参照シグナルがゼロあるいはマイナスになるために増幅曲線を得ることができなかった（データは示さず）。これらの結果から、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いたインターカレーターアッセイにおいて本発明の効果が明らかとなった。
【００２３】
実施例２  ＴａｑＭａｎプローブ検出によるリアルタイムＰＣＲへの適用
（１）ＴａｑＭａｎプローブ及びプライマーの準備
アプライドバイオシステムズ社Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ＴａｑＭａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  β−ａｃｔｉｎを用いた。本製品は、２０倍濃度のプライマー・プローブ混合液である。含まれるＴａｑＭａｎプローブのレポーターはＶＩＣ、クエンチャーはＴＡＭＲＡである。
【００２４】
（２）リアルタイムＰＣＲ試薬の調製
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡、コードＴＡＰ−２０１）、抗Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体（東洋紡、コードＴＣＰ−１０１）、ＴａｑＭａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  β−ａｃｔｉｎを用いて、以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。その際、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼには抗Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体を２．５Ｕあたり１μｇ投入し、緩やかに混和しておく。この反応液に、受動的内部参照として５−  ａｎｄ  ６−Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｘ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（商品名：Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｘ  Ｒｅｄ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，  Ｉｎｃ．））を最終濃度５００ｎＭ添加する。
ＴａｑＭａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ            ２μＬ
×１０緩衝液                     １μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                           １．２μＬ
２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                      １μＬ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ       ０．５Ｕ
Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｘ  Ｒｅｄ  （５μＭ）         １μＬ
サンプル                         １μＬ
サンプルは、ＨｅＬａ細胞（ヒト由来の細胞）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを５倍毎に希釈した溶液（７本）と、ブランクとしての蒸留水（１本）である。ｃＤＮＡの作製にはＭＭＬＶ由来の逆転写酵素を用いたｃＤＮＡ合成キット（「ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  −α−」、東洋紡、コードＦＳＫ−１０１）を用い、手順は取扱説明書に従った。
【００２５】
（３）リアルタイムＰＣＲの実施
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（ＴＭ）（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、以下の条件でリアルタイムＰＣＲを実施した。詳細は機器の取扱説明書に従った。
増幅条件
９５℃・１分
９５℃・１５秒、６０℃・６０秒（４０サイクル）
【００２６】
（４）結果
図２に示すような結果が得られた。
【００２７】
Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｘ  Ｒｅｄが受動的内部参照として機能し、良好な増幅曲線が得られた。一方、Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｘ  Ｒｅｄを添加しない場合、参照シグナルがゼロあるいはマイナスになるために増幅曲線を得ることができなかった（データは示さず）。これらの結果から、ＴａｑＭａｎアッセイにおいて本発明の効果が明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明によって、ＲＮＡの定量や一塩基多型のタイピングなどを迅速・正確に実施することが可能となり、ポストゲノムの生物学研究に貢献することができるばかりでなく、臨床検査や食品分析など幅広い用途分野に利用することが出来、産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は実施例１、インターカレーター検出によるリアルタイムＰＣＲへ適用した結果を示す。良好な増幅曲線が得られている。同一条件で本願発明を使用しなかった場合は、シグナルが激しく変動して増幅曲線が得られない。
【図２】図２は実施例２、ＴａｑＭａｎプローブ検出によるリアルタイムＰＣＲへ適用した結果を示す。良好な増幅曲線が得られている。同一条件で本願発明を使用しなかった場合は、シグナルが激しく変動して増幅曲線が得られない。
【図１】
2005245310.tif 000002
【図２】
2005245310.tif 000003
【配列表】
2005245310000001.app