(57)【要約】【課題】  標的細胞の回収を簡単に行うことができる技術を提供する。【解決手段】  ノズル１６は、径が比較的大きい基端部１６−１と、基端部１６−１よりも先端側に設けられた小径の先端部１６−２とを有している。基端部１６−１から先端部１６−２にかけて内部を連通する導通口１６−３が形成されている。ノズル１６内に形成される導通口は、標的細胞の剥離液を滴下したり、標的細胞を吸引したりするための通路として機能する。Ｚ方向には、Ｚ方向移動機構により、ノズルの先端部１６−２をスライドグラス２３の一面に近づける。一方、スライドグラス２３の他の一面には、倒立顕微鏡が配置されている。倒立顕微鏡５により、鉛直下からスライドグラス２３を観察する状態にしておき、スライドグラス２３の上方からスライドグラス２３の表面側に向けてノズル１６を接近させ、そのノズル１６から溶液（剥離液）を滴下して、剥がれた細胞を吸い上げる。ノズル１６内を正圧又は負圧にするポンプ１６ａが設けられている。【選択図】  図５
2005207986.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象物を検査する対物レンズを備えるとともに、撮像装置と関連付けされる顕微鏡と、
前記顕微鏡における検査可能領域内に配置された試料台であって、ＸＹ移動機構を有し、標的対象物を含む試料を載せた試料板を前記顕微鏡により観察できる位置に置くことができるように形成された試料台と、
前記試料板を挟んで前記対物レンズと略対向する位置に配置され、前記試料から探索された前記標的対象物を回収するノズルと、
前記撮像装置により取得した前記標的対象物及び前記ノズルの画像データを解析する解析部と、探索済みの前記標的対象物及びノズルに関する画像データ及びその位置を記憶する記憶部と、を有する画像処理ユニットと、
前記対物レンズによる前記探索済みの標的対象物と前記ノズルに対する焦点合わせと、前記試料板と前記ノズルとのＸＹ面内における相対位置を制御する制御ユニットと
を含む標的対象物の自動探索回収装置。
【請求項２】
さらに、前記ノズルを前記試料板に対して該試料板の面内方向に固定するとともに、前記試料板の法線方向に移動可能とする移動機構を有し、前記ノズルの先端を前記顕微鏡により観察することにより前記ノズルの前記面内方向のずれを補正する面内方向位置補正機能を備えていることを特徴とする請求項１に記載の標的対象物の自動探索回収装置。
【請求項３】
前記焦点合わせ用のオートフォーカス機構を備えており、
前記試料板表面と前記ノズル先端との位置を前記オートフォーカス機構により検出することにより、前記試料板表面までの前記法線方向の距離Ｌ１と前記ノズル先端までの前記法線方向の距離Ｌ２とを求め、前記試料板表面と前記ノズル先端との間の前記法線方向の距離をＬ２−Ｌ１より算出することを特徴とする請求項２に記載の標的対象物の自動探索回収システム。
【請求項４】
前記ノズルは、前記試料板から対象試料を剥離するための適量の剥離液を溜めるとともに、前記標的対象物に対して吐出し、前記標的対象物を前記剥離液とともに吸引する連通口を有していることを特徴とする請求項１から３までのいずれか１項に記載の標的細胞の自動探索回収システム。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか１項に記載の自動探索回収システムを用いた標的対象物細胞の回収方法であって、
前記対物レンズのＺ軸方向の位置を移動させつつ、ある間隔で複数の標的対象物の画像を取得するステップと、
各画像におけるコントラストの強度を計算し、合焦点画像を検出するステップと、
合焦点画像に対応するＺ軸方向の位置を求めるステップと
を有する標的対象物細胞の回収方法。
【請求項６】
請求項１から４までのいずれか１項に記載の自動探索回収システムを用いた標的対象物細胞の回収方法であって、
回収前画像を取得するステップと、
ノズルを顕微鏡視野の中心座標に合わせるステップと、
ノズル画像を取得するステップと、
回収前画像とノズル画像の差分画像を作成するステップと、
差分画像によりノズル領域を取得するステップと、
ノズル領域の中心座標を取得するステップと、
画像中心座標までの距離（Δｘ、Δｙ）を算出するステップと、
顕微鏡視野中心座標までの距離（ΔＸ、ΔＹ）を算出するステップと、
前記（Δｘ、Δｙ）に基づいて前記（ΔＸ、ΔＹ）を補正することによりノズル先端位置を補正するステップと
を有する標的対象物細胞の回収方法。
【請求項７】
請求項１から４までのいずれか１項に記載の自動探索回収システムを用いた標的対象物細胞の回収方法であって、
前記ノズルの先端部分を前記標的対象物に位置合わせを行った後に、前記ノズルから剥離液を前記スライドグラス上の標的対象物に滴下するステップと、
該剥離液とともに前記標的対象物を前記ノズルにより回収するステップと、
回収した前記標的対象物を、前記剥離液とともにマイクロウェルプレート又はバイオチップ上に移送するステップと
を有する標的対象物細胞の回収方法。
【請求項８】
請求項５から７までのいずれか１項に記載のステップをコンピュータに実行させるためのプログラム。
【請求項９】
前記標的対象物が妊婦血液中に含まれる胎児由来の有核赤血球であることを特徴とする請求項１から８までのいずれか１項に記載の装置又は方法、プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的対象物の探索・回収技術に関し、特に、自動的に探索された標的対象物を自動的に回収する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
出生前の診断を行う出生前診断技術としては、従来から、血清マーカーを使用したスクリーニング技術、羊水検査技術や絨毛検査技術などがある。最近、妊婦の血液中に胎児の血球が微量（例えば10の8乗分の1程度）に含まれることが明らかになってきた。母体血から上記の胎児由来の有核赤血球を回収し、ＤＮＡ診断することにより、信頼性が高く、かつ、母児へのリスクを伴わない無侵襲胎児ＤＮＡ診断が可能になりつつある。
【０００３】
現在、母体血からの胎児由来の有核赤血球を回収するための技術に関して実用化を目指した研究が世界中において盛んに行われている。これらの研究のうち主要なものとして、アメリカの研究グループによるFACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting)技術、ヨーロッパの研究グループによるMACS(Magnetic-Activated Cell Sorting)技術、金沢医科大学の高林助教授らのチームによるPercoll-micromanipulation技術（非特許文献１、以下、この技術を「パーコール技術」と略記する。）の３通りの技術が良く知られている。特に、米国においては、1994年頃から国立衛生研究所(NIH)の統括のもとでFACS法の研究開発が行われている。また、画像処理により胎児由来の有核赤血球を検出するための装置としては、カメラと顕微鏡とを用い、コンピュータ制御により試料を検査する装置が開示されている（例えば特許文献１参照）。
【０００４】
一方、標的細胞を回収する技術としては、マイクロマニピュレーションを利用する方法が上げられる。この方法は、顕微鏡下で手動によりガラスキャピラリーを操作し、周辺組織を剥離液で緩くした後、標的細胞を吸引回収する方法である。この方法を用いると、標的細胞の回収がしやすくなる。その他、レーザで切断する方法もある。この方法は、レーザで標的細胞の周辺の組織を焼きはがし、細胞を接着や串刺しにしてつまみあげる方法である。
【０００５】
【非特許文献１】高林晴夫、「出生前遺伝子検査の進歩：母体血による胎児ＤＮＡ診断」、遺伝子医学Ｖｏｌ．５、Ｎｏ．３（２００１）ｐ４１０−４１６．
【特許文献１】特表２００２−５１４７６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
血液をスライドグラスに塗布し胎児細胞を形態により識別し個々に採取するパーコール技術は、図１０（Ａ）に示すように、画像内の胎児由来赤血球（有核）を確実に胎児細胞のみを採取でき後工程であるDNA診断が行いやすいため有効かつ確実な技術である。しかしながら、この技術は、検査担当者が目視で判断を行う工程が入るため、スライドグラス全面を顕微鏡で探索するための処理に膨大な時間を要し、実用化に対して大きな問題となる。
【０００７】
また、回収段階において用いられるマイクロマニピュレーション法は、キャピラリーの位置決めや交換作業に手間がかかり、人為操作であるため操作者の技量を必要とする。また、細胞を回収するのに時間がかかるという問題がある。尚、レーザ切断法は、装置が大変高価になり、剥離するためのシートや串刺しのための微細機構が必要になるという問題がある。
【０００８】
本発明は、検索された標的細胞の回収を簡単に行うことができる技術を提供することを目的とする。さらに、標的細胞の検索作業と回収作業とを連携させ、１つの装置で自動的に行える技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一観点によれば、対象物を検査する対物レンズを備えるとともに、撮像装置と関連付けされる顕微鏡と、前記顕微鏡における検査可能領域内に配置された試料台であって、ＸＹ移動機構を有し、標的対象物を含む試料を載せた試料板を前記顕微鏡により観察できる位置に置くことができるように形成された試料台と、前記試料板を挟んで前記対物レンズと略対向する位置に配置され、前記試料から探索された前記標的対象物を回収するノズルと、前記撮像装置により取得した前記標的対象物及び前記ノズルの画像データを解析する解析部と、探索済みの前記標的対象物及びノズルに関する画像データ及びその位置を記憶する記憶部と、を有する画像処理ユニットと、前記対物レンズによる前記探索済みの標的対象物と前記ノズルに対する焦点合わせと、前記試料板と前記ノズルとのＸＹ面内における相対位置を制御する制御ユニットとを含む標的対象物の自動探索回収装置が提供される。
【００１０】
上記装置においては、標的対象物自体とその回収を行うためのノズルとのそれぞれに関する焦点合わせ（Ｚ軸方向の位置合わせ）と、ＸＹ面内の位置合わせとを自動制御で行うことができる。
【００１１】
さらに、前記ノズルを前記試料板に対して該試料板の面内方向に固定するとともに、前記試料板の法線方向に移動可能とする移動機構を有していることを特徴とする。さらに、前記ノズルの先端を前記顕微鏡により観察することにより前記ノズルの前記面内方向のずれを補正する面内方向位置補正機能を備えていることを特徴とする。これにより、ＸＹ方向のノズルのずれを自動的に補正することができる。
【００１２】
前記焦点合わせはオートフォーカス機構を備えており、前記試料板表面と前記ノズル先端との位置を前記オートフォーカス機構により検出することにより、前記試料板表面までの前記法線方向の距離Ｌ１と前記ノズル先端までの前記法線方向の距離Ｌ２とを求め、Ｌ２−Ｌ１の式により、前記試料板表面と前記ノズル先端との間の前記法線方向の距離を算出することを特徴とする。これにより、ノズル先端と標的対象物との間の距離を、精度良く自動調整できる。
【００１３】
前記ノズルは、前記試料板から対象試料を剥離するための剥離液を吐出するとともに、前記対象試料を吸引する連通口を有していることを特徴とする。
【００１４】
本発明の他の観点によれば、上記自動探索回収システムを用いた標的対象物細胞の回収方法であって、前記対物レンズのＺ軸方向の位置を移動させつつ、ある間隔で複数の標的対象物の画像を取得するステップと、各画像におけるコントラストの強度を計算し、合焦点画像を検出するステップと、合焦点画像に対応するＺ軸方向の位置を求めるステップと
を有する標的対象物細胞の回収方法が提供される。
【００１５】
また、回収前画像を取得するステップと、第１の濃度レベル画像を取得するステップと、ノズルを顕微鏡視野の中心座標に合わせるステップと、ノズル画像を取得するステップと、
第２の濃度レベル画像を取得するステップと、前記第１の濃度レベル画像と前記第２の濃度レベル画像との減算処理を行い第３の濃度レベル画像を取得するステップと、前記第３の濃度レベル画像に基づいて第１の濃度ヒストグラムを作成し、第１の２値画像（差分画像）を作成し、該第１の２値画像の連結成分ラベリングを行うステップと、ラベルの連結成分に面積がノズル領域の基準値より大きい場合に、ノズル領域の中心座標を取得するステップと、
画像中心座標までの距離（Δｘ、Δｙ）を算出するステップと、顕微鏡視野中心座標までの距離（ΔＸ、ΔＹ）を算出するステップと、前記（Δｘ、Δｙ）に基づいて前記（ΔＸ、ΔＹ）を補正することによりノズル先端位置を補正するステップとを有する標的対象物細胞の回収方法が提供される。
【００１６】
また、前記ノズルの先端部分を前記標的対象物に位置合わせを行った後に、前記ノズルから剥離液を前記スライドグラス上の標的対象物に滴下するステップと、該剥離液とともに前記標的対象物を前記ノズルにより回収するステップと、回収した前記標的対象物を、前記剥離液とともにマイクロウェルプレート又はバイオチップ上に移送するステップとを有する標的対象物細胞の回収方法が提供される。
【発明の効果】
【００１７】
従来は手動で行っていた標的対象物の回収のための操作の自動化が可能となり、操作の負担が軽減できる。手動では熟練者と初心者の差又は個人差を小さくすることができ、オペレータの経験の有無やくせなどに関係なく精度の良い定量的な結果が得られる。また、標的対象物に関する探索機能と回収機能とを併せ持つ構成としたため、装置の製造に関するコストが低減するという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明に係る標的細胞の回収技術は、マイクロマニピュレーション法において、これまで手動で行っていた剥離液の滴下や吸引回収を自動で行う技術を含む。ところで、プレパラートの厚みや取り付けノズルの鉛直度などにはばらつきがあり、１０μｍ程度のサイズの微小な細胞を回収することは困難であった。そこで顕微鏡下の画像処理を有効に利用し、ノズルの上下・水平方向の位置決めを正確に行うことで、細胞の回収の自動化を可能にするものである。またこの方法は、レーザ照射などの特別な設備を必要とせず、安価な方法である。
【００１９】
以下、本実施の形態による標的細胞自動探索回収システムについて、図面を参照しつつ説明を行う。図１Ａ、図１Ｂ及び図２は、本実施の形態による標的細胞自動探索回収システムの構成例を示す図である。
【００２０】
図１Ａ、図１Ｂ及び図２に示す装置は、血液をスライドグラスに塗布し、胎児細胞を形態により識別し、個々に確実に胎児細胞のみを採取することを目的とする有核細胞を探索する自動化された装置である。
【００２１】
図１Ａに示すように、本実施の形態による標的細胞自動探索回収システムＸは、光学搬送系Ａと、画像処理系（画像処理ＰＣ）Ｂと、制御系（制御ＰＣ）Ｃと、出力系（高精度モニタディスプレイ）Ｄとを備えている。
【００２２】
光学搬送系Ａは、倒立式の光学顕微鏡１であって、上部に形成された凹溝部３内に、その上方の対象物を検査する対物レンズ５を備えるとともに、ＣＣＤカメラ（撮像装置）７を備えた光学顕微鏡１と、光学顕微鏡１の上部に配置された試料台１１であってＸＹステージ機構１７を有する試料台１１と、例えばスライドグラス２３をその上面２１に置くことができるように形成された試料配置部１５と、を有しており、試料配置部１５に配置されるスライドグラス２３上の試料を、対物レンズ５とＣＣＤカメラ７とを有する光学顕微鏡１により検査することができる。
【００２３】
試料台１１上には、検査前又は検査後のスライドグラス２３を多数枚、例えば５０枚程度収容できる収容部４５を備えたストッカ４１が設けられるとともに、スライドグラス２３を試料台１１に設置して検査可能な状態にしたり、ストッカ４１の収容部４５内に収容したりする動作を行うための作動アーム３３を備えた搬送装置３１が設けられている。
【００２４】
さらに、Ｘ−Ｙ方向に固定され、Ｘ−Ｙ平面に対して法線方向であるＺ方向に移動可能なＺ方向移動機構を備えた標的細胞回収用ノズル１６が設けられている。
【００２５】
画像処理系（画像処理ＰＣ）Ｂは、データ解析、ストレージ（データの記憶）などを行う画像処理ユニット５１を含む。制御ＰＣ系Ｃは、Ｘ−Ｙステージ１７やノズル１６などの位置制御や全体の処理シーケンスを制御する制御ユニット５３を含む。出力系Ｄは、例えば、高精度モニタディスプレイ（表示装置）５５を含む。
【００２６】
複数のスライドグラス２３を収納可能なストッカ４１と自動搬送装置３１とを備えることにより、夜間運転など連続的に大量の探索を行うことができる。光学顕微鏡１に設けられたＸＹステージ１７は、高速、高精度の位置決め動作が可能な電動ステージであり、試料面内における短時間での高速ステップ送りが可能である。光学顕微鏡１に備えられた高精度デジタルカメラ（ＣＣＤカメラ）７と、標的細胞の形態的な特徴に応じた画像処理ソフトウェア（後述する）により、短時間で高精度な標的細胞の探索が可能となる。
【００２７】
試料台１１の中央付近には、内径が２段階に異なる（上の内径が大きい）開口部１５が形成されている。スライドグラス２３のサイズは、開口部１５のうちの小さい方（下方）の開口径よりも大きくなっており、開口部１５のうちの大きい方の開口径よりも小さくなっている。これにより、大きい方の開口部底面２１上にスライドグラス２３の例えば周辺部を載せることができる。
【００２８】
それぞれのスライドグラス２３において探索した指定数の標的細胞の画像、およびステージ上の位置座標(X,Y)を記憶装置（ストレージ）に記録することにより、探索後に任意のスライドグラスをステージ上に再ローディングし、指定した標的細胞を直ちに顕微鏡の視野中心に移動できる。探索後に、スライドグラス２３を試料台１１に再ローディングする際に、任意の探索済み標的細胞を過去に探索した際の位置情報と、その場で再度画像処理を行って得た位置情報との、現在と過去との標的細胞の位置情報と比較し、スライドグラス２３又はＸＹステージ機構１７を有する試料台１１等の物理的位置ずれ誤差を補正することにより、再ローディングした際におけるスライドグラス２３の位置ずれが生じても、複数の任意の探索済み標的細胞を、直ちに顕微鏡の視野中心に移動でき、作業性が向上する。上記システムを用いると、高精度かつ高価なスライドグラスや顕微鏡ステージを使用しない場合でも、スライドグラス２３の位置ずれを補正する機構（アルゴリズムを含む）を備えることにより、低コスト、かつ、高精密な検査対象の探索が可能となる。また、高精度モニタ５５による画像表示又は顕微鏡像の観察により、作業者による細胞の直接判別が可能となり、確実に標的細胞を選別することができる。
【００２９】
標的細胞の回収作業は、スライドグラス２３に塗布した細胞から特定の標的細胞を取り出す作業である。剥離液（例えばＴ＆Ｅ液（トリプシン＆ＥＤＴＡ溶液）など）を使用して、標的細胞をスライドグラス２３から引き剥がし吸い上げる。
【００３０】
図１Ｂは、図１Ａに示す標的細胞自動探索回収システムにおける、主として回収機構の構成を示す斜視図である。図１Ａと対照させつつその構成について説明する。図１Ｂに示すように、台４には、対物レンズ（倒立顕微鏡）５と、接眼レンズ５ｂと、電動ステージ（ＸＹステージ）１７と、が設けられ、ＸＹステージ１７にスライドグラス２３が載せられている。台４には、アーム４ａが設けられ、スライドグラス２３上からその上の試料を照らす照明４ｂが設けられている。台４には、さらにアーム１５が設けられ、アーム１５に、スライドグラス２３上の試料を回収するためのノズル１６が、ノズル用電動ＸＹステージ１８を介して取り付けられている。ノズル１６は、後述するように、ノズル内を正圧又は負圧にするポンプ１６ａが設けられている。ノズル用電動ＸＹステージ１８のＸＹ軸はＸＹステージ１７のＸＹ軸とは異なる平面（Ｘ’−Ｙ’平面）上を動くため、ＸＹステージ１７とノズル用電動ＸＹステージ１８とにより、ノズル先端をスライドグラス２３に対してＺ軸上において相対移動させることができる。すなわち、本発明の実施の形態による実施の形態による装置は、ＸＹステージ１７とノズル用電動ＸＹステージ１８とにより、ノズルをＸ軸Ｙ軸方向とは独立にＺ軸方向に移動させる機能を有することになる。
【００３１】
図２は、図１に示す本実施の形態による標的細胞自動探索回収システムの概略構成例を示す機能ブロック図であり、以下、特に画像処理系に重点を置いて説明を行う。図２に示すように、光学顕微鏡１は、ＸＹステージ機構１７を有する電動ステージと対物レンズ制御部５と、ＣＣＤカメラ７とを有している。制御用ＰＣは、ＸＹ方向の移動を行うステージ（ＸＹ）移動部５３ａと、Ｚ方向の自動焦点合わせを行う自動焦点計算部５３ｂと、ＣＣＤカメラ７からの画像を入力する画像入力部５１ａと、画像認識部５１ｂと、画像処理結果を保存する結果保存用データベース部５１ｃと、を有している。さらに、ＸＹ方向のノズル位置を標的細胞の位置に合わせる位置決め（ＸＹ）処理部５７ａと、ノズルの位置決め（Ｚ）処理部５７ｂとを含むノズル位置決め処理部５７と、ノズルによる標的細胞の回収処理を行うためのソフトウェアにより処理が実行されるノズル回収処理部５８とを有している。
【００３２】
ＣＣＤカメラ７により撮影された画像は、画像入力部５１ａに入力され、モニタ５５に表示されるとともに、画像認識部５１ｂと自動焦点計算部５３ｂとに送られる。画像認識部５１ｂで認識された画像は、結果保存用データベース５１ｃに記憶される。自動焦点計算部５３ｂに送られた画像により、自動焦点合わせが行われる。
【００３３】
以下の説明においても、図１Ａ、図１Ｂ及び図２を適宜参照する。
まず、標的細胞探索、回収手順例について図３、図４を参照して説明する。ステップＳ１に示すように、多数のスライドグラス（例えば５０枚）２３をストッカ（カセットホルダ）４１内に収納する。ストッカ４１をエレベータ（図示せず）に取り付ける（ステップＳ２）。高精度モニタディスプレイ５５上においてステップＳ３に示すように標的の探索条件を入力し、搬送装置３１を用いて自動的にスライドグラス２３を、光学顕微鏡１上の試料台（ＸＹステージ）１７上にローディングする（ステップＳ４）。自動焦点機能によりスライドグラス２３上の試料に焦点を合わせる（ステップＳ５）。光学顕微鏡１より得られるデジタル画像を取り込み（ステップＳ６）、画像処理により標的細胞を探索する（ステップＳ７）。標的細胞の特徴となる形状、色、サイズ等により画像処理を行い、標的細胞と他の細胞を選別する。ステップＳ７で、標的細胞検索ができた場合にはステップＳ９に進み、探索した標的細胞の画像と位置座標に関する情報を記憶装置（データベース）５１ｃ（図２）に記録する。
【００３４】
電動ステージを微小ステップ送りし、スライドグラスを他の探索領域が検査できる位置まで移動し、次の探索を開始する。指定数の標的細胞の探索が完了すると（ステップＳ１０）、スライドグラスをステージからアンローディングし（Ｓ１１）、別のスライドグラス２３をストッカ４１よりローディングする（ストッカ４１内の全てのスライドグラス２３又は指定した複数（または単独）のスライドグラス２３の探索が完了するまでこれを繰り返し（ステップＳ１１からステップＳ４に戻るループ））。尚、ステップＳ７において、画像処理により標的細胞の探索ができなかった場合（ＮＧ）にはステップＳ８に進み、ステージ１７を移動し他の探索領域にステージ１７とともにスライドグラス２３を移動させ、ステップＳ６に戻る。ステップＳ１２において、指定したスライドグラスの全量の探索が終了すると、実際の探索は完了し（ステップＳ１３）、探索結果をモニタディスプレイ５５の表示画面上で確認し（ステップＳ１５）、任意のスライドグラス２３およびその上の標的細胞を表示画面上において指定し（ステップＳ１７）、ステップＳ１８において、ステップＳ１７で指定した標的細胞に関連するスライドグラス２３をＸＹステージ１７上にローディングする（ステップＳ１８）。次いで、ステップＳ１９において、指定した標的細胞の位置情報に基づいて、ＸＹステージ１７により標的細胞を光学顕微鏡１の視野の中心又はその近傍まで移動させる。光学顕微鏡１により視野の中心にある細胞が標的細胞であることを確認する（ステップＳ２０）。ステップＳ２０において、標的細胞の最終確認であると判断された場合には、ステップＳ２１に移る。ステップＳ２０において最終確認ではないと判断された場合には、ステップＳ１７に戻り、次の標的細胞を指定する。
【００３５】
ステップＳ２０において最終確認ができた場合には、マイクロマニピュレータ（図示せず）などを用いて、標的細胞をスライドグラス２３から取り出す（ステップＳ２１）。回収した標的細胞の核を用いて、染色体検査、遺伝子検査等へと進む（ステップＳ２２）。
【００３６】
図５から図１５までは、標的細胞回収用ノズルに関連する回収処理関係の構成例を示す図である。図５は、本実施の形態による標的細胞回収用ノズル（以下、単に「ノズル」と称する。）１６の概略構成例を示す図である（図１Ｂも合わせて参照する）。図５に示すように、本実施の形態によるノズルは、径が比較的大きい基端部１６−１と、基端部１６−１よりも先端側（スライドグラス２３側）に設けられた小径の先端部１６−２とを有している。基端部１６−１から先端部１６−２にかけて内部を連通する導通口（図示せず）が形成されている。例えば、１０μｍ径の標的細胞を吸い上げるためには、ノズルの導通口の内径は３０μｍから５０μｍが好ましい。
【００３７】
ノズル内に形成される導通口は、上記剥離液を予め蓄えていた適量だけ滴下したり、その後に標的細胞を吸引したりするための通路として機能する。Ｚ方向には、図１Ｂのノズル用電動ステージ１８により、ノズルの先端部１６−２をスライドグラス２３の一面（以下上面と称する。）に近づける。一方、スライドグラス２３の他の一面（以下、下面と称する。）には、対物レンズを含む倒立顕微鏡５が配置されている。図２に示す状態において、倒立顕微鏡５により、鉛直下からスライドグラス２３を観察する状態にしておき、スライドグラス２３の上方からスライドグラス２３の表面側に向けてノズル１６を接近させ、そのノズル１６から溶液（剥離液）を（図１Ｂ）適量だけ滴下して、剥がれた細胞を吸い上げる。ノズル１６内を正圧又は負圧にするポンプ１６ａが設けられている。
【００３８】
以下、探索した標的細胞を回収する方法の詳細について説明する。図６は、ノズル先端の位置補正に関係する図である。図６に示す略円形の境界線を有するレンズ視野内において、ノズル１６先端の位置を測定する。円形に擬されるレンズ視野内において、レンズの中心（原点Ｏ）に標的細胞が位置するように配置する。この際、実際に観察されたノズル先端Ｏ’の原点Ｏからの水平方向（ＸＹ方向）のずれが生じるため、これを補正する必要がある。
【００３９】
補正処理の手順は以下の通りである。まず、予め記憶させておいた顕微鏡視野内の原点（レンズの中心）Ｏにノズルを合わせる。通常、ノズルの交換、取付けやノズルの製作精度により、原点Ｏ（Ｘ，Ｙ）からΔＸ、ΔＹだけのずれが生じる。このように、実際に観察されたノズル先端位置を原点位置とみなすように補正を行う（Ｘ−ΔＸ，Ｙ−ΔＹ）。
【００４０】
上記補正処理手順について主として図１７を参照してより詳細に説明する。
まず、ＣＣＤカメラ７を用いて回収前画像(図２２)を取得する（ステップＳ２０１）。次いで、回収前画像に基づいて、濃度レベル画像１（L1=(R+G+B)/3）を作成する（ステップＳ２０２）。ノズルを顕微鏡視野の原点(顕微鏡視野の中心座標)に合わせる（ステップＳ２０３）。ＣＣＤカメラ７からノズル画像(図２３)を取得する（ステップＳ２０４）。次いで、ノズル画像から濃度レベル画像２（L2=(R+G+B)/3）を作成する（ステップＳ２０５）。ステップＳ２０６において、上記濃度レベル画像１と上記濃度レベル画像２とに基づいて、減算処理を行い（L3=L1-L2）、濃度レベル画像３(図２４)を作成する。ステップＳ２０７において、濃度レベル画像３から濃度ヒストグラム１を作成し、濃度ヒストグラム１から濃度基準値１を決定する。
【００４１】
濃度レベル画像３のうち、濃度基準値１より高い画素を“１”(ノズル領域)、それ以外を“０”(背景)とした２値画像１(図２５)を作成する（ステップＳ２０８）。２値画像１において、“１”の領域の連結成分を探してラベリング処理を行う（ステップＳ２０９）。ラベリング処理によって、連結成分にラベル番号(1,2,3,・・・)が付けられる。ステップＳ２１０において、ラベル番号labelを1に設定する。ステップＳ２１１において、ラベル番号labelの連結成分の面積が、ノズル領域の基準値２より大きいか否かを判断する。連結成分が基準値２より小さい場合には（Ｎｏ）、ラベル番号labelに１を加算して（ステップＳ２１２）、ステップＳ２１１の処理に戻る。連結成分の面積が基準値２より大きい場合は（Ｙｅｓ）、その連結成分の領域がノズル領域となる。続いて、そのノズル領域中心座標を取得する（ステップＳ２１３）。ステップＳ２１４において、ノズル領域中心座標から画像の中心座標までの距離を、Ｘ方向においてはΔx画素、Ｙ方向においてはΔy画素として算出する(図６)。ノズル領域中心座標から画像の中心座標までの距離(Δx画素,Δy画素)は画像上の距離であるが、前述のように、ステップＳ２１６において、これより実際の顕微鏡上の距離(ΔＸμm,ΔＹμm)を算出する(図６)。例えば、画像１画素あたりの実際の距離が、Ｘ方向はA μmであり、Ｙ方向はB μmであるとすると、ΔＸはAとΔxの積によって算出され(ΔＸ=A*Δx)、ΔＹはBとΔyの積によって算出される(ΔY=B*Δy)。顕微鏡のＸＹステージを原点方向に(ΔＸμm,ΔＹμm)移動して、ノズル先端位置を補正する（ステップＳ２１６）。
【００４２】
次に、スライドグラス２３とノズル１６先端との間の距離の測定処理について図７を参照しつつ説明する。上記のようにして、水平（ＸＹ）方向の位置補正を行った後、ノズル１６の先端を顕微鏡視野内の原点Ｏ（図６）に移動させる（図１Ｂ参照）。例えば手動操作又は自動で、ノズル１６をＺ軸方向に降ろしてスライドグラス２３の表面に近づけ、目視によりスライドグラス２３のデフォルトの位置に移動させる。
【００４３】
スライドグラス２３の表面とノズル１６の先端との間の距離を計測し、両者間の距離を算出する。すなわち、図７に示すように、倒立顕微鏡５のオートフォーカス機能（側距機能）を利用して、倒立顕微鏡５のピントをスライドグラス２３の上面に合わせ、レンズとスライドグラス２３（試料表面）との間の距離Ｚ１を測定し、Ｚ１を記憶する。次に、倒立顕微鏡５のピントをノズル１６の先端に合わせ、レンズとノズル１６先端との間の距離Ｚ２を測定し、Ｚ２を記憶する。試料表面からノズル１６先端までの距離Ｚ３を、Ｚ３＝Ｚ２−Ｚ１の計算式に基づき測定する。このように、倒立顕微鏡５のオートフォーカス機能を利用することにより、自動的に距離Ｚ３を求めることができる。求めた距離Ｚ３は、標的細胞を回収する際に、ノズル１６の先端をスライドグラス２３の先端に接触させるための移動量を決定する際に用いられる。
【００４４】
図８（Ａ）、（Ｂ）は、実際の顕微鏡写真であり、図８（Ａ）はガラスプレート表面にフォーカスを当てた場合の写真であり、ノズル先端はぼやけて見える。図８（Ｂ）はノズル先端にフォーカスを当てた際の写真であり、ノズル先端の形状が鮮明に見える。
【００４５】
以下、オートフォーカス処理についてより詳細に説明を行う。まず、オートフォーカス処理を行う自動焦点（Ｚ位置）計算部５３ｂの構成について説明する。自動焦点（Ｚ位置）計算部５３ｂは、ノズル（Ｚ）位置決め処理部５７ｂを制御するための計算を行う。図１６は、本実施の形態による自動焦点（Ｚ位置）計算部５３ｂによる処理の流れを示すフローチャート図である。自動焦点（Ｚ位置）計算部５３ｂでは、画像処理によって、最も焦点の合うＺ位置を見つけ出す。図１Ａ、図１Ｂに示すように、まず、顕微鏡の対物レンズ５のＺ位置を移動させながら（ステップＳ１０１）、画像を取得する（ステップＳ１０２）処理を繰り返す。この場合、例えば等間隔で画像を取得し、複数枚の画像を得る。次いで、得られたそれぞれの画像におけるコントラストの強度を計算し、その計算結果に基づいて合焦点画像を抽出し（ステップＳ１０３）、そのＺ位置を出力する（ステップＳ１０４）。
【００４６】
上記処理のうち合焦点画像の抽出処理について説明する。Ｚ位置の異なる画像から焦点の合った画像を抽出するために、各画像のコントラストの強度を計測する。コントラストの強度は、入力画像の空間周波数スペクトルの分布より求めることができる。空間周波数スペクトルの分布図において、グレーレベルの値が高いほど各周波数においてコントラストが高いといえる。この処理の結果の例について説明する。図１８及び図２０は、同じ視野でありＺ位置が異なる画像である。それぞれの空間周波数スペクトルを求めた図が、図１９と図２１とである。図１９と図２１との２図を比較すると、図２１の方が各周波数成分において、グレーレベルの値が高く、コントラストが高い画像であることが分かる。その結果、図２０の入力画像の方が焦点の合った画像であると判断できる。このようにして、合焦点画像を求めることができる。
【００４７】
次に、実際の測定処理に入る。標的細胞への位置決め処理について図９及び図１０（Ａ）、（Ｂ）を参照しつつ説明する。まず、標的細胞の真上にノズル先端を位置決めする。１）ノズル先端１６の水平方向の位置を上記ΔＸ，ΔＹに基づいて補正し、ノズル先端を顕微鏡視野の中心に持ってくる。２）Ｘ−Ｙステージを移動させ、スライドグラス２３上の予め標識された標的細胞を顕微鏡視野の中心に移動させる。３）図９に示すように、スライドグラス２３表面方向に向けてノズル１６を降ろし（Ｚ軸方向の移動）、顕微鏡視野内で影が映るくらいまで移動させ、標的細胞の真上にノズルが位置決めされているか否かを確認する。図１０（Ａ）は、標的細胞の拡大写真であり、図１０（Ｂ）はノズル１６先端をスライドグラス２３表面に接触させた場合、すなわち、標的細胞へのノズル位置合わせを行った状態を示す写真である。実際には、ノズル１６を降ろし、顕微鏡視野内で影が映る程度まで移動させ、標的細胞の真上にノズル１６先端が位置合わせされているか否かを確認する。尚、ノズルの導通口１６−３内には、上述のようなＴ＆Ｅ液などの剥離液が充填されている。
【００４８】
次に、標的細胞への剥離液の滴下処理について図１１及び図１２を参照しつつ説明する。図１１に示すように、ノズル１６を標的細胞に位置合わせしたところで、標的細胞をプレパラートから引き剥がすためにノズル１６から剥離液（例えばＴ＆Ｅ液）ＴＥを滴下する。剥離液ＴＥの滴下は以下のようにして行う。１）スライドグラス２３表面にノズル１６先端を軽く接することにより剥離液ＴＥを滴下する方法。２）ノズル１６内部の導通口１６−３に正圧をかけ、押し出す方法。この場合には、ノズル１６の先端は剥離液ＴＥを介してスライドグラス２３に接触することになる。図１２は、標的細胞へ剥離液ＴＥを滴下した際の顕微鏡写真である。図１０（Ｂ）と比較するとわかるように、標的細胞ＨＴ及びその周囲に剥離液ＴＥが滴下されていることがわかる。
【００４９】
次に、標的細胞をピックアップする処理について説明する。標的細胞ＨＴに滴下された剥離液ＴＥにより標的細胞ＨＴおよび周辺の固定液（図示せず）が浮遊する。そして、標的細胞ＨＴと周囲の固定液とをノズル１６により吸い上げることによって、剥離液ＴＥと一緒に標的細胞ＨＴを回収することができる。まず、ノズル１６で剥離液ＴＥを吸い上げる直前に正圧をかけつつＸ−Ｙステージを移動させ、次いで、図１３に示すように、標的細胞ＨＴを浮かせた後に剥離液ＴＥとともに標的細胞ＴＥを吸い上げる方法により、標的細胞ＨＴをより確実に回収することができる。尚、ノズル１６内の連通口１６−３による毛細管現象を利用して吸い上げる方法、図１３に示すようにノズル１６内部の連通口１６−３内に負圧をかけ、強制的に標的細胞ＨＴを吸い上げる方法もあるが、上記の方法により吸い上げの確実性が増す。図１４は、この方法により標的細胞を吸い上げた後のスライドグラス２３表面の写真である。図１４に示すように、標的細胞及びその近傍の領域が回収されていることがわかる。
【００５０】
次に、標的細胞のプレイス処理について図１５を参照しつつ説明を行う。回収した標的細胞ＨＴと剥離液ＴＥとを、図１５に示すように一緒にマイクロウェルプレート又はバイオチップＰＴなどにＸ−Ｙステージを移動させながら吐き出して移す。これを顕微鏡で確認する。これにより、１個の標的細胞に関する一連の回収処理が完了する。
【００５１】
以上、本実施の形態による標的細胞の回収装置及び回収方法によれば、手動で行っていた操作を自動化することができ、利用者の操作の負担軽減に大きく貢献する。手動では熟練者と初心者の差が大きく信頼性に欠けていたが、オペレーターの経験の有無に関係なく定量的な結果が得られるようになる。さらに、高価な機器を追加する必要がなくコスト的にメリットも大きい。
【００５２】
以上、本発明の実施の形態により本発明を説明したが、その他種々の変形・変更等が可能であることは、当業者は容易に理解できるであろう。例えば、上記探索方法をプログラムとして格納した装置、そのプログラム又はプログラムを記録した記録媒体も本発明の範疇に入ることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
標的細胞は、胎児由来の有核赤血球でなくても、他の特徴的な探索対象であれば、検査が可能である。例えば、ガン細胞やリンパ球を含む生体・生理物質を含む種々の対象である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１Ａ】本実施の形態による標的細胞自動探索回収システムの全体構成例を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ａに示す標的細胞自動探索回収システムにおける、主として回収機構の構成例を示す斜視図である。
【図２】図１に示す本実施の形態による標的細胞自動探索回収システムの概略構成例を示す機能ブロック図である。
【図３】本実施の形態による標的細胞自動探索回収システム標的細胞探索、回収手順の流れを示すフローチャート図である。
【図４】本実施の形態による標的細胞自動探索回収システム標的細胞探索、回収手順の流れを示すフローチャート図である。
【図５】本実施の形態による標的細胞回収用ノズルの概略構成例を示す図である。
【図６】ノズル先端のＸＹ位置補正に関係する図である。
【図７】スライドグラス２３とノズル１６先端との間の距離の測定処理の概略を示す図である。
【図８】実際の顕微鏡写真であり、図８（Ａ）はガラスプレート表面にフォーカスを当てた場合の写真であり、図８（Ｂ）はノズル先端にフォーカスを当てた際の写真である。
【図９】標的細胞へのノズル先端の位置合わせの概要を示す図である。
【図１０】図１０（Ａ）は標的細胞（胎児由来赤血球（有核））、（Ｂ）は、ノズル先端をスライドグラスに接触させた状態を示す写真である。
【図１１】標的細胞へのノズル先端からの剥離液滴下の様子を示す図である。
【図１２】標的細胞へのノズル先端からの剥離液滴下後の標的細胞近傍の顕微鏡写真である。
【図１３】ノズル内部の連通口内に負圧をかけ、強制的に標的細胞ＨＴを吸い上げる方法を示す図である。
【図１４】図１３に示す方法により標的細胞を吸い上げた後のスライドグラス表面のイメージ写真である。
【図１５】標的細胞のプレイス処理を示す図である。
【図１６】本実施の形態による自動焦点（Ｚ位置）計算部５３ｂによる処理の流れを示すフローチャート図である。
【図１７】ノズル先端位置のＸ、Ｙ補正方法の流れを示す図である。
【図１８】図２０と同じ視野でありＺ位置が異なる画像である。
【図１９】図１８において空間周波数スペクトルを求めた図である。
【図２０】図１８と同じ視野でありＺ位置が異なる画像である。
【図２１】図２０において空間周波数スペクトルを求めた図である。
【図２２】回収前画像である。
【図２３】ノズル画像を示す図である。
【図２４】濃度レベル画像例である。
【図２５】２値画像例である。
【符号の説明】
【００５５】
Ｘ…標的細胞自動探索回収システム、Ａ…光学搬送系、Ｂ…画像処理系（画像処理ＰＣ）、Ｃ…制御系（制御ＰＣ）、Ｄ…出力系（高精度モニタディスプレイ）、１…倒立式の光学顕微鏡、３…凹溝部、５…対物レンズ、７…ＣＣＤカメラ（撮像装置）１１…試料台、１５…試料配置部、１６…ノズル、１６ａ…ポンプ、１７…ＸＹステージ機構、１８…ノズル用電動ＸＹステージ、２３…スライドグラス。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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