(57)【要約】【課題】      培養中に経時的に変化する細胞挙動を蓄積した状態で観察するために最適化された細胞評価方法を実現する。【解決手段】  培養面に細胞を固定化する方法であって、細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質で修飾された表面粗さ（Ra）2.0〜7.0 nmの修飾凹凸培養面に、細胞を播種することを特徴とする細胞固定化方法。【選択図】    図１
2005245224.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養面に細胞を固定化する方法であって、細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質で修飾された表面粗さ（Ra）2.0〜7.0 nmの修飾凹凸培養面に、細胞を播種することを特徴とする細胞固定化方法。
【請求項２】
修飾凹凸培養面は、培養面をプラズマエッチングして得られる表面粗さ（Ra）2.0〜7.0 nmの凹凸面を、細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質で修飾したものとする請求項１の細胞固定化方法。
【請求項３】
修飾凹凸培養面は、末端に細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質を有するデンドリマー高分子化合物で培養面を修飾して得られるものとする請求項１の細胞固定化方法。
【請求項４】
デンドリマー高分子化合物は、ポリイミノアミンデンドリマーである請求項３の細胞固定化方法。
【請求項５】
デンドリマー高分子化合物は、第４世代のポリイミノアミンデンドリマーである請求項３の細胞固定化方法。
【請求項６】
細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質は、アミノ酸、糖、イオン、薬剤、Ｇタンパク結合型受容体、イオンチャンネル型受容体、チロシンキナーゼ結合型受容体、および光受容体からなる群より選択される物質とする請求項１ないし５のいずれかの細胞固定化方法。
【請求項７】
細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質は、グルコースとする請求項１ないし５のいずれかの細胞固定化方法。
【請求項８】
細胞の細胞骨格形成能を評価するための方法であって、請求項１ないし７のいずれかの方法により培養面に細胞を固定化した後、細胞培養を行い、特定時間経過後の細胞の円形度および／または倍加時間および／または変形細胞率を測定することを特徴とする細胞評価方法。
【請求項９】
請求項８の方法により培養細胞を評価し、評価結果に基づき、随時、培養の継続、中断、または条件変更を判断することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項１０】
物質の細胞膜への結合を阻害する薬剤をスクリーニングするための方法であって、結合阻害を調べたい物質で修飾された表面粗さ（Ra）2.0〜7.0 nmの修飾凹凸培養面に、細胞を播種した後、スクリーニング対象薬剤の共存下で細胞培養を行い、細胞の円形度および／または倍加時間および／または変形細胞率を測定して、細胞の円形度が高い場合および／または倍加時間が短い場合および／または変形細胞率が高い場合に、該薬剤を細胞膜と物質の結合阻害剤と判定する薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
培養面に細胞を固定化するためのキットであって、培養容器の内表面が、2.0〜7.0 nmの表面粗さ（Ra）を有し、かつ細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質で修飾されていることを特徴とする細胞固定化キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、細胞の固定化方法、細胞の評価方法および細胞の培養方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、再生医療等において有用となる細胞の固定化方法と、非襲撃的な細胞の評価方法、並びに該評価方法により得られた情報に基づき培養の継続、中断、条件変更等を判断できる細胞の培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、組織工学の飛躍的な進展により，ヒトの皮膚や軟骨等の細胞を分離・培養し、in vitroで組織の再構築を行った後、患者の患部に移植する再生医療技術が実現している。しかし、現在、培養組織作製法のほとんどは手作業によるものであり、その操作基準は作業者の経験に大きく依存しているのが実情である。
【０００３】
患者自身の細胞を用いた移植、すなわち自家培養移植では、まず、患者から最小必要量の組織片を採取し、目的とする細胞を酵素処理により分離する。次に、得られた細胞を小型の培養容器に播種し、初代培養を行う。このとき、培養面への接着を伴う足場依存性細胞は培養容器内において単層状に増殖する。細胞が培養容器のほぼ全面を覆うと、接触阻害により細胞分裂が停止する。そのため、酵素処理により培養面から細胞を剥離して再懸濁し、他の複数の培養容器に再播種する必要がある。再播種された細胞は、再び培養容器面に接着し単層状に増殖するが、この一連の継代培養では細胞寿命による継代の限界が存在する。さらに、これらの継代培養された細胞から組織を再構築させるために、適切な回数の継代培養を行った後、コラーゲンスポンジなどのスキャフォールド（足場）の中に細胞を包埋し、自己組織化（分化）を誘導して三次元的な組織培養を行う必要がある。そして、組織培養により目的とする組織に応じた力学的、生理的な機能を得た後、患者の患部に培養組織を移植し、治癒を目指す。
【０００４】
以上のような組織工学製品の製造工程では、原料は患者自身もしくはドナー由来の細胞であるが、生成物そのものが製品となるため、精製工程を経ることができないという問題がある。そのため、製品の品質向上を伴った細胞培養および組織培養を行わなければならない。したがって、再生医療における組織培養は、次のような特徴を有し、微生物培養とは多くの点で異なるといえる：（ａ）患者あるいは採取部位ごとに細胞の活性や寿命が変化しやすく、また採取した原料細胞も実質的には不均質である；（ｂ）培養容器内では、気・液・固の各相が不均一である；（ｃ）多回の回分操作のため、途中で細胞の剥離、接着、伸展増殖、多層化など複数の操作を含み、これらは細胞の状態を把握しながら実施されなければならない；（ｄ）個々の患者に対応した生産スケジュールを立てる必要がある；（ｅ）全ての工程でクロスコンタミネーションなどのヒューマンエラーは許されない。（非特許文献１〜３）
したがって、組織培養は、テーラーメイド的な生産プロセスであり、プロセスの安定化を実現する上では、培養中の細胞を定量的に評価し、それらの情報に基づくプロセル設計が望まれる。また、このような細胞培養中の定量的評価には、非破壊、非襲撃性の観察・評価方法が必須である。そして、このような非襲撃性の細胞評価方法を実現するためには、細胞固定方法、細胞培養方法、および細胞評価方法が統合される必要がある。
【０００５】
しかし、これまでの細胞評価方法は、いずれも破壊的、かつ襲撃的なものであった。再生医療における培養組織の生産プロセスでは、原料が細胞であるため、それを評価のために消費することは生産性を低下させることに繋がる。したがって、培養中の細胞に接触することなく細胞を観察・評価する方法、あるいは評価後の細胞を再度原料として使用することを可能とするような細胞評価方法が望まれていた。
【０００６】
細胞評価方法については、数多くの研究がなされており、近年では創薬発見に欠かすことのできないHigh Throughput Screening System（HTS）が実用化されている。HTSは付設された検出器の種類に応じて、プレート内で培養された細胞に評価薬物を添加し、遺伝発現、細胞増殖活性などを測定できる方法であり、自動的に薬物効果を評価できる点で有用である。特に検出器として顕微鏡を備えたHTSでは、形態変化を観察することができ、従来の観察のみの画像から、数値定量化へと情報の高度化を目指すことができる。また、最近では、スクリーニング効率を求めたHTSだけではなく、一度の実験からの情報量を重視して２次スクリーニングやターゲットバリデーションなどのプロセスに威力を発揮するHigh Content Screening（HCS）システムも注目されている。HCSは複数の蛍光色素で別々に標識された複数の細胞内ターゲットが、刺激によりどのように変化するかを顕微鏡で捉え、数値化してスクリーニングする装置であり、より高次な定量化情報を取得することができる。（非特許文献４〜６）
しかし、これら従来の細胞評価方法は、いずれも蛍光観察によるものであり、顕微鏡観察ではステージが動くため浮遊物が動き、浮遊細胞や足場依存性細胞の細胞分裂直後の観察には不向きであった。また、一般に毒性の高い蛍光色素を使用するため、細胞そのものが死滅してしまい、同一細胞の継時的な変化を追尾することが不可能であった。最近では蛍光タンパクを、遺伝子導入により目的とする細胞内器官に発現させ、細胞を自家蛍光させる技術が発展しており、これにより継時的な変化を観察することが可能となったが、細胞が全て製品に使用される組織培養プロセスのための細胞評価としては不向きであった。
【０００７】
さらに、従来の細胞評価方法によって得られる情報は、ある特定の時間における観察により得られる静的評価、または細胞の動きを継時的に観察する動的評価であるが、前者では単純な細胞形態のみの観察となるため、得られるデータの次元としては低くなるという問題があり、後者では、得られるデータの次元は高くなるが、装置が複雑でかつ高価になり汎用性が低いという問題があった。
【０００８】
このような問題点に対して、この出願の発明者らは、培養面を、末端に細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質を有するデンドリマー高分子化合物で修飾し、この修飾培養面に細胞を固定化した後、培養し、特定時間経過後の細胞の円形度を測定することにより細胞の細胞骨格形成能を評価できることを明らかにし、報告している（特許文献１）。
【０００９】
このような細胞骨格形成能の評価方法は、非襲撃的であり、評価後の細胞を再利用することができるため、原料となる細胞量が限られている再生医療において、とくに有用であった。この出願の発明者らは、このような方法による細胞の観察・評価を行い、新たに、培養面を修飾するデンドリマーの世代数が低い場合に、細胞の円形度が大きくなることを見出した。すなわち、細胞の骨格形成能を正確に評価するためには、培養面の凹凸に関して、何らかの最適条件が存在することが示唆されたのである。
【特許文献１】特願２００３−４３４９６２
【非特許文献１】筏義人（編）「再生医工学」、化学同人、京都（2001）
【非特許文献２】大野典也、相澤益男（編）「再生医学」、エヌ・ティー・エス、東京（2002）
【非特許文献３】日本組織培養学会（編）「組織培養の技術（第３版）」、朝倉書店、東京（1996）
【非特許文献４】Catherine Liptrot, Drug Discovery Today (DDT), (2001), 6(16), 832-834
【非特許文献５】Rober A. Blake, Current Opinion in Pharmacology, (2001), 1, 533-539
【非特許文献６】Taylor, D.L. et al., Current Opinion in Biotechnology, (2001) 12, 75-81
【非特許文献７】Spravchikov, N., et al.: Diabetes, 50, 1627-1635 (2001)
【非特許文献８】Barrandon, Y. and Green, H.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 230-2306 (1987)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、培養中に経時的に変化する細胞挙動を蓄積した状態で観察するために最適化された細胞評価方法を実現すること、および細胞刺激を効率的に行う方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、培養面に細胞を固定化する方法であって、細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質で修飾された表面粗さ（Ra）2.0〜7.0 nmの修飾凹凸培養面に、細胞を播種することを特徴とする細胞固定化方法を提供する。
【００１２】
また、この出願の発明は、第２には、修飾凹凸培養面が、培養面をプラズマエッチングして得られる表面粗さ（Ra）2.0〜7.0 nmの凹凸面を、細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質で修飾したものである細胞固定化方法を、また、第３には、修飾凹凸培養面が、末端に細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質を有するデンドリマー高分子化合物で培養面を修飾して得られるものである細胞固定化方法を提供する。
【００１３】
この出願の発明は、第４には、デンドリマー高分子化合物が、ポリイミノアミンデンドリマーである細胞固定化方法を、第５には、デンドリマー高分子化合物が、第４世代のポリイミノアミンデンドリマーである細胞固定化方法を提供する。
【００１４】
さらに、この出願の発明は、第６には、細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質が、アミノ酸、糖、イオン、薬剤、Ｇタンパク結合型受容体、イオンチャンネル型受容体、チロシンキナーゼ結合型受容体、および光受容体からなる群より選択される物質である細胞固定化方法を、また、第７には、細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質が、グルコースである細胞固定化方法を提供する。
【００１５】
さらに、この出願の発明は、第８には、細胞の細胞骨格形成能を評価するための方法であって、前記いずれかの方法により培養面に細胞を固定化した後、細胞培養を行い、特定時間経過後の細胞の円形度および／または倍加時間を測定することを特徴とする細胞評価方法を提供する。
【００１６】
第９には、この出願の発明は、前記の方法により培養細胞を評価し、評価結果に基づき、随時、培養の継続、中断、または条件変更を判断する細胞培養方法を提供する。
【００１７】
この出願の発明は、さらに、第１０には、物質の細胞膜への結合を阻害する薬剤をスクリーニングするための方法であって、結合阻害を調べたい物質で修飾された表面粗さ（Ra）2.0〜7.0 nmの修飾凹凸培養面に、細胞を播種した後、スクリーニング対象薬剤の共存下で細胞培養を行い、細胞の円形度および／または倍加時間および／または変形細胞率を測定して、細胞の円形度が高い場合、および／または倍加時間が短い場合、および／または変形細胞率が高い場合に、該薬剤を細胞膜と物質の結合阻害剤と判定する薬剤のスクリーニング方法を提供する。
【００１８】
そして、この出願の発明は、第１１には、培養面に細胞を固定化するためのキットであって、培養容器の内表面が、2.0〜7.0 nmの表面粗さ（Ra）を有し、かつ細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質で修飾されていることを特徴とする細胞固定化キットを提供する。
【発明の効果】
【００１９】
上記第１の発明の細胞固定化方法では、培養面を、表面粗さ（Ra）が2.0〜7.0 nmで細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質により修飾されたものとすることにより、接着点での培養面への細胞接着だけでなく、細胞膜の物質摂取による強固な細胞固定が可能となる。このような表面粗さの範囲では、細胞伸展が最も起こりやすいことから、細胞骨格形成能や刺激伝達を効率的に評価する上で好適な条件となる。
【００２０】
上記第２の発明の細胞固定化方法では、培養面をプラズマエッチングすることにより培養面の表面粗さ（Ra）を2.0〜7.0 nmとし、この凹凸面に細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質を修飾することにより、細胞を好適な条件で固定化することが可能となる。
【００２１】
上記第３の発明の細胞固定化方法では、培養面を、末端に細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質を有するデンドリマー高分子で修飾することにより、表面粗さ（Ra）が2.0〜7.0 nmで、細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質により修飾された培養面を形成できる。デンドリマー高分子化合物は、培養面に固相合成したり、球状に合成したデンドリマーを培養面に固定化したりでき、デンドロンユニットの構造や世代数を調整することにより、デンドリマー修飾面の凹凸の深さをナノメートルオーダーで制御できる上、デンドリマー高分子化合物の世代数とともに、末端への物質導入量を調整することにより、細胞結合サイトの密度を制御することも可能になることから、このような細胞固定化方法は、汎用性が高いといえる。
【００２２】
前記第４の発明では、デンドリマー高分子化合物を、入手が容易なポリイミノアミンデンドリマーとすることにより、簡便に表面粗さ（Ra）が2.0〜7.0 nmの培養面を設けることが可能となる。
【００２３】
また、前記第５の発明では、デンドリマー高分子を、第４世代のポリイミノアミンデンドリマーとすることにより、表面粗さ（Ra）が2.0〜7.0 nmの培養面を設けることが可能となる。
【００２４】
前記第６および７の発明では、凹凸培養面を修飾する物質を、各種のものに変更することにより、該物質による細胞内シグナル伝達を精度高く評価できる。また、このような方法により固定化された細胞を用いることにより、該物質の細胞膜への結合を阻害する薬剤のスクリーニングも可能となる。中でも、細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質としてグルコースを有するデンドリマーでは、細胞構成物質以外の第３物質の導入を伴わないため、細胞への負担が少なく、固定化された細胞を剥離した後も再利用が可能となる。
【００２５】
上記第８の発明の細胞評価方法では、前記の方法により固定化された細胞を培養し、特定時間経過後の細胞の円形度および／または倍加時間および／または変形細胞率を測定することにより、細胞骨格形成能を精度高く、定量評価することが可能となる。細胞の円形度や倍加時間は、光学顕微鏡による観察や画像解析等の非襲撃性の測定手段により測定できるものであるため、評価後の細胞を再利用することが可能である。再生医療においては、原料となる細胞は患者自身あるいは提供者から採取されたものであり、一般に量が限られている。また、原料細胞の継代培養によって得られる細胞量も限られているため、この発明の細胞評価方法は有用となる。
【００２６】
上記第９の発明の細胞培養方法では、前記の方法で細胞を培養し、円形度および／または倍加時間および／または変形細胞率を測定することにより、培養中の細胞の状態を把握することが可能となることから、これらの細胞の培養結果をもとに、培養を継続すべきか、中断すべきか、あるいは、温度、圧力、濃度、ｐＨ、養分、雰囲気等の条件を変更すべきか判断することが可能となる。そのため、細胞培養中に継続的に細胞を観察し、最適条件での培養を実現することが可能となる。
【００２７】
上記第１０の発明のスクリーニング方法では、表面粗さ（Ra）2.0〜7.0 nmの凹凸培養面を、結合阻害を調べたい物質で修飾し、細胞を播種してスクリーニング対象薬剤の共存下で培養する。次いで、得られる細胞の円形度および／または倍加時間を測定することにより、細胞膜と物質の結合を阻害する物質をスクリーニングできる。細胞の円形度が高い場合や細胞の倍加時間が短い場合には、細胞膜がデンドリマー末端の物質を摂取できなかったことを意味することから、このとき共存させた薬剤を結合阻害剤と判定することができる。
【００２８】
上記第１１の発明の細胞固定化キットでは、培養容器の内面が、2.0〜7.0 nmの表面粗さ（Ra）を有し、かつ細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質で修飾されている。したがって、細胞膜が認識、結合できる高密度の結合サイトだけでなく、細胞の固定化に最適な深さの凹凸が存在することにより、このようなキットを用いて細胞を播種すれば、強固な細胞固定が可能となる。このようなキットは、冷蔵庫で数ヶ月間の保存が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
この出願の発明者らは、再生医療における組織培養プロセスを安定化する上で求められる細胞の非襲撃的定量的評価方法を実現するために、細胞固定化方法、細胞培養方法、および細胞評価方法の統合が必要であると考えた。そして、細胞評価の指標として、細胞移動能力に注目し、準動的評価を行うために、末端に細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質を有するデンドリマー高分子化合物により修飾された培養面に細胞を播種し、固定化した（特許文献１）。
【００３０】
しかし、その後、この出願の発明者らによる研究を通して、末端に細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質を有するデンドリマー高分子化合物で培養面を修飾することにより、細胞を強固に固定化することができるものの、固定化された細胞を培養した場合に、培養面の凹凸の状態、すなわち表面粗さ（Ra）に応じて、細胞の伸展の度合いが異なることが明らかになった。
【００３１】
そこで、この出願の発明者らは、さらに鋭意研究を進め、同一培養条件下では培養面の表面粗さが2.0〜7.0 nmの範囲のときに、とくに細胞の骨格形成能が高まることを見出し、本願発明に至った。
【００３２】
すなわち、この出願の発明の細胞固定化方法は、細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質で修飾された表面粗さ（Ra）2.0〜7.0 nmの修飾凹凸培養面に、細胞を播種して固定化するものである。
【００３３】
なお、本明細書において、「表面粗さ」「Ra」「表面粗さ（Ra）」とはいずれも、平均面粗さ（Mean roughness）を意味し、一般に、次式（１）
【００３４】
【数１】
2005245224.tif 000003
（ただし、ΔＨは絶対高さ変化量、Δｘはｘ方向変化量、Δｙはｙ方向変化量を表す）
で定義されるものである。この値は、AFM等の表面粗さ測定装置を用いて得られるものである。
【００３５】
この出願の発明の細胞固定化方法において、このような表面粗さ（Ra）を有する修飾凹凸培養面は、例えば、培養面を公知の手法によりプラズマエッチングして凹凸面を形成した後、細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質で修飾する方法や、末端に細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質を有するデンドリマー高分子化合物で培養面を修飾する方法により得られる。
【００３６】
この出願の発明の細胞固定化方法において、修飾凹凸培養面を修飾する細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質は、細胞との結合リガンドとして作用するものであり、とくに限定されない。トランスポーターを介して取り込まれる物質、例えば、グルタミン酸に代表されるアミノ酸；グルコース、フルクトース、ガラクトースなどの糖；Na+、Ca+、K+、Cl-などのイオン；OAT類やOCT類を対象とする薬剤であってもよいし、レセプターを対象とした物質、例えば、Ｇタンパク結合型受容体；イオンチャンネル型受容体；チロシンキナーゼ結合型受容体；光受容体であってもよい。特に，細胞の増殖に関与する上皮細胞増殖因子（EGF）、角化細胞増殖因子（KGF）、繊維芽細胞増殖因子（FGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、血小板由来増殖因子などの増殖因子群に対する受容体や、インターロイキン（IL）類を含むサイトカイン群の受容体、細胞接着受容体のインテグリン、ステロイドホルモン受容体、モルヒネ受容体、免疫に関与する細胞の抗原受容体、Fc受容体、補体受容体など、神経伝達に関与するαおよびβ受容体など、また光に関してチトクロム、フィトクロム、ロドプシンなどの光受容体などが例示される。
【００３７】
これらの物質の中でも、とくにグルコースは、細胞表面のグルコーストランスポーターに摂取されるため、培養面への細胞の固定化が可能となる上、本来の細胞特性を利用した形であることから、デンドリマー高分子化合物の末端に結合される細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質として好ましい。
【００３８】
また、プラズマエッチングして得られる凹凸培養面や、培養面上に修飾されたデンドリマー化合物の末端に、これらの物質を結合する方法はとくに限定されず、通常の化学反応により結合させる方法を採用すればよい。
【００３９】
この出願の発明の細胞固定化方法において、修飾凹凸培養面を、培養面をプラズマエッチングして得られる凹凸培養面に細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質を修飾させる方法により得る場合には、該物質は１種類に限定されず、複数種の物質が規則的あるいはランダムに結合したものとすることができる。
【００４０】
この出願の発明の細胞固定化方法において、修飾凹凸培養面を、末端に細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質を有するデンドリマー高分子化合物により培養面を修飾する方法により得る場合、使用されるデンドリマー高分子化合物は、培養面の表面粗さを0.2〜0.7 nmとすることのできるものであれば、どのようなものであってもよく、デンドロンユニットの構造やデンドリマーの世代数はとくに限定されない。また、デンドリマー化合物は、培養面に固相合成してもよいし、予め合成されたものを培養面に固定化してもよい。前者の場合には、デンドリマー化合物の形状は半球状となり、後者の場合には球状となる。
【００４１】
具体的には、デンドリマー化合物としては、次式（Ｉ）
【００４２】
【化１】
2005245224.tif 000004
（ただし、ｎはデンドリマーの世代数を示す１以上の整数である）
で表されるポリイミノアミンデンドリマーや、公知のポリアミドアミンデンドリマー（PAMAM）が例示される。中でも第４世代のポリイミノアミンデンドリマーは、培養面に好適な範囲の表面粗さの凹凸を付与することができ、好ましい。もちろん、デンドリマーによる修飾の方法を工夫すれば第４世代のデンドリマーを用いてさらに大きな凹凸を設けることもできる。
【００４３】
このようなデンドリマー高分子化合物で培養面を修飾する方法としては、培養面にデンドリマーを直接固相合成する方法が挙げられる。例えば、培養面がガラスの場合には、ガラス表面のＯＨ基を起点としてデンドリマーをDivergent法により成長させてもよいし、ガラス表面のＯＨ基にConvergent法で合成したデンドリマーを結合させてもよい。さらに、ガラス表面のＯＨ基にリンカーを結合させ、このリンカーを介してデンドリマーを固相合成してもよい。
【００４４】
このように、修飾凹凸培養面を、末端に細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質を有するデンドリマー高分子化合物で培養面を修飾したものとする場合には、デンドリマー高分子化合物は１種類に限定されず、目的に応じて複数種類を段階的に培養面に固相合成してもよい。つまり、一つの培養面に複数種のデンドリマー高分子化合物が修飾されていてもよい。また、デンドリマー高分子化合物の末端に結合される物質も、１種類に限定されず、１つのデンドリマーの末端に複数種の物質を個別に結合したり、デンドリマー毎に異なる物質を結合させたりしてもよい。
【００４５】
細胞接着は、細胞膜貫通型の接着タンパクであるインテグリンが、培養面上に吸着しているフィブロネクチンなどの接着タンパクに接することにより生じることが知られている。また、細胞が培養面に接着するとき、細胞の下側の表面は培養面に一様に接するのではなく、ちりばめられたような独立した部位、すなわち、接着点付近でのみ培養面に接しており、その他のところでは細胞と培養面の間に数十nmほど隙間が存在することが知られている。
【００４６】
後述の実施例にも示されるとおり、この出願の発明者らは、表面粗さが2.0〜7.0 nmであり、かつ細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質で修飾されている培養面に細胞を固定化し、培養した場合に、細胞の伸展がとくによいことを明らかにしている。
【００４７】
つまり、この出願の発明の細胞固定化方法では、修飾凹凸培養面の深さが細胞と培養面の間隔と一致しており、細胞が播種された際には、細胞膜と修飾凹凸培養面との接触面積が最大となり、接着点での培養面への細胞接着だけでなく、細胞膜の高密度な物質摂取による強固な細胞固定が可能となると考えられる。
【００４８】
この出願の発明では、また、細胞の細胞骨格形成能を評価するための方法が提供される。このような評価方法では、前記いずれかの方法により培養面に細胞を固定化した後、培養し、特定時間経過後の細胞の円形度および／または倍加時間および／または変形細胞率を測定する。
【００４９】
細胞の円形度は、後述の実施例にも示されるように、光学顕微鏡写真を撮影し、画像解析により細胞の面積と外周を求めることにより計算できる。一方、細胞の倍加時間は、後述の実施例に示されるように、光学顕微鏡写真を撮影し、細胞数をカウントすることにより得られる。同様に、変形細胞率は、任意の時間における変形している細胞数をカウントすることにより得られる。これらの測定方法は、いずれも非襲撃的であるため、評価後の細胞を再利用することも可能となる。したがって、原料細胞の量が限られている再生医療における組織培養プロセスなどでは、このような細胞評価方法は有用といえる。
【００５０】
この出願の発明では、また、以上のとおりの方法により固定化された細胞を培養する方法が提供される。このような細胞培養方法は、前記の修飾凹凸培養面に細胞を播種し、適当な培養液中で培養を行うものであるが、このとき、前記の細胞骨格形成能の評価方法により得られる知見をもとに、随時、培養を継続したり、中断したり、培養液の組成、培養温度、時間、雰囲気等を変更したりできる点が特徴的である。このような細胞培養方法は、角化細胞、繊維芽細胞、軟骨細胞などの足場依存性細胞や、神経幹細胞、リンパ細胞などの浮遊系細胞を含むあらゆる動物細胞に適用でき、再生医療に関わる様々な細胞の培養に応用できるものである。
【００５１】
再生医療における培養組織の生産プロセスでは、原料は患者自身もしくはドナー由来の細胞であるが、生成物そのものが製品となるため、精製工程を経ることができない。そのため、製品の品質向上を伴った細胞培養および組織培養を行う必要がある。この出願の発明の細胞培養方法では、生産プロセスを、細胞の状態を把握しながら進めることができ、かつ中止や条件の変更などを早期に的確に判断することが可能となる。したがって、原料や時間のロスが少なく、個々の患者に対応した生産スケジュールを立てることも可能となる。
【００５２】
また、この出願の発明では、物質の細胞膜への結合を阻害する薬剤をスクリーニングする方法も提供される。このようなスクリーニング方法では、培養容器の内表面を、細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質ではなく、結合阻害を調べたい物質で修飾し、細胞を播種した後、スクリーニング対象薬剤の共存下で細胞培養を行い、細胞の円形度および／または倍加時間および／または変形細胞率を測定する。
【００５３】
細胞の円形度は、細胞がデンドリマー修飾面に強く固定化されて伸張した場合に低く、細胞膜がデンドリマー末端の物質を摂取できずに伸張しなかった場合に高い。また、細胞の倍加時間は、細胞がデンドリマー修飾面に強く固定化された場合に長く、細胞膜がデンドリマー末端の物質を摂取できなかった場合に短い。したがって、高い円形度が得られた場合に使用された薬剤、および／または細胞の倍加時間が短かった場合、および／または変形細胞率が低かった場合に使用された薬剤が、細胞膜と物質の結合阻害剤として有効なものと判定される。
【００５４】
この出願の発明では、さらに、前記の細胞固定化方法において使用される内表面が細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質で修飾された表面粗さ（Ra）2.0〜7.0 nmの修飾凹凸培養面となっている培養容器を、細胞固定化キットとして提供する。この出願の発明者らの研究によれば、このような培養容器は、冷蔵庫で数ヶ月間の保存が可能である。したがって、このようなキットを使用して細胞を播種すれば、接着点での培養面への細胞接着と細胞膜の効率的な物質摂取により強固に細胞を固定でき、細胞培養や細胞評価への適用が可能となる。
【００５５】
以下、実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【実施例】
【００５６】
＜参考例１＞  デンドリマーの固相合成
（ａ）  75μmolのカリウムt-ブトキシド（以下t-BuOKとする）を25 cm2のＴ−フラスコ（Nunclon Delta Flask; Nunc, Roskilde, Denmark）に添加し、室温で1時間静置した後、t-BuOK溶液を取り除いた。
【００５７】
（ｂ）  次いで、360 μmolのグルタルアルデヒド水溶液を各フラスコに添加し、室温で1時間静置した。グルタルアルデヒド溶液を取り除き、滅菌水でフラスコ内を3回洗浄した。
【００５８】
（ｃ）  さらに、360μmolのトリス（２−アミノエチル）アミンの溶液（1 N NaOHによりpH 9.0に調整）（18.0 ml）を各々フラスコに添加し、室温で１時間静置した後、フラスコ内を滅菌水にて2回洗浄した。
【００５９】
これら（ｂ）および（ｃ）の工程を繰り返すことにより、デンドリマーの世代数を高めた。さらに、得られたデンドリマーの末端にグルコース（細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質としてのリガンド分子）を、次の手順により結合させた。
【００６０】
（ｄ）  各フラスコに100 nmolのグルコース溶液を添加し、次いで各フラスコに500 nmolの水素化ホウ素ナトリウムを添加した。さらに、フラスコ内を滅菌水で3回洗浄した。
＜参考例２＞  球状デンドリマーの固定化
（ａ）  50 mMのt-BuOKを8 wellに1 mL添加し、室温で１時間静置した。20分毎に25 cm2のＴ−フラスコを揺らし攪拌した。
（ｂ）  t-BuOKを除去した後、滅菌水にて8 wellを洗浄した。
（ｃ）  0.36 Mのグルタルアルデヒド水溶液を各wellに1.0 mlずつ添加し、室温で1時間静置し、30分毎にプレートを揺らして攪拌した。
（ｄ）  グルタルアルデヒド溶液を取り除き、滅菌水でフラスコ内を3回洗浄した。
（ｅ）  PAPAMデンドリマー（世代数４）1 gをメタノール10 mLに溶解し、PAPAMデンドリマー溶液を調製した。これを1 mLとり、滅菌水10 mLで希釈し、1 mLずつを8 wellに注入した。
（ｆ）  室温で約１時間静置し、液を除去して滅菌水で２回洗浄した。
【００６１】
以上より、8 well表面が第４世代のPAPAMデンドリマーにより修飾された。
（ｇ）  各wellにグルタルアルデヒド溶液を1.0 mL添加し、約１時間整地し、30分毎にプレートを揺らして攪拌した。
（ｈ）  グルタルアルデヒドを除去した後、滅菌水にてwellを3回洗浄し、Tris-amine溶液（Tris-amine 1mL／滅菌水 18 mL）を1.0 mLを添加した。さらに60分間室温で静置した後、滅菌水にてwellを2回洗浄した。
【００６２】
これにより、球状デンドリマーの表面にデンドリマー１世代がコーティングされた。
（ｉ）  0.1×2n-1μmol/ml（ただし、nはデンドリマーの世代数）の濃度のグルコース溶液を調製し、これを各wellに1.0 mLずつ添加した。さらに、各wellにグルコース溶液の５倍濃度の水素化ホウ素ナトリウム溶液を1.0 mL添加し、常温で一晩放置した。滅菌水にてwellを2回洗浄した。
＜参考例３＞  グラフトエッチングによる修飾凹凸培養面の作成
（ａ）  12 wellプレートを、窒素置換もしくはアルゴン置換されたプラズマ重合装置にてプラズマ照射し、容器表面のエッチングを行い粗面培養面を作成した。
（ｂ）  50 mMのt-BuOK溶液を各wellに1.5 mLずつ添加し、60分間静置して20分毎にプレートを揺らして攪拌した。
（ｃ）  t-BuOK溶液を除去した後、滅菌水にてwellを１回洗浄し、0.36 Mのグルタルアルデヒド溶液を1.0 mL添加して60分間静置し、30分毎にプレートを揺らして攪拌した。
（ｄ）  各wellにTris amine溶液を1.0 mL添加し、60分間静置した後、滅菌水で各wellを2回洗浄した。
（ｆ）  0.1×2n-1μmol/ml（ただし、nはデンドリマーの世代数）の濃度のグルコース溶液を調製し、これを各wellに1.0 mLずつ添加した。
（ｇ）  各wellにグルコース溶液の５倍濃度の水素化ホウ素ナトリウム溶液を1.0 mLゆっくり添加し、常温で一晩放置した後、滅菌水にてwellを2回洗浄した。
＜実施例１＞  細胞の固定化および培養
（１）デンドリマー世代数と表面粗さ
参考例１の方法により、フラスコ内表面を末端にグルコースを有する世代数１〜６のデンドリマーで修飾し、ＡＦＭにより非接触で修飾凹凸培養面を走査し、表面粗さを測定した。
【００６３】
図１に各世代数のデンドリマーで修飾された修飾凹凸培養面の観察結果を示した。また、デンドリマー世代数と表面粗さ（Ra）を表１に示した。
【００６４】
【表１】
2005245224.tif 000005
図１および表１より、デンドリマーの世代数が０（コントロール）から４までは、修飾凹凸培養面の表面粗さが世代数の上昇に伴い増大することが明らかになった。これにより、デンドリマーの世代数を変化させることにより、ナノスケールで培養面の凹凸を制御できることが確認された。
（２）細胞培養
テロメラーゼにより不死化させたヒト角化細胞（hTERT-HME1）を凍結細胞としてClontec Laboratories, Inc.（CA, USA）より購入した。バイアル中の細胞は、販売者の指示に従い解凍し、末端にグルコースを有するデンドリマーで修飾した25 cm2のＴ−フラスコ（Nunclon Delta Flask; Nunc, Roskilde, Denmark）を用いて、無血清培養液（HuMedia-KG2; クラボウ株式会社）中、5 % CO2下、37℃で培養した。
【００６５】
トリパンブルー染色により染色生細胞の数を数え、生存細胞の培養サイズをX0 = 0.5×104 cells/cm2に設定した。
【００６６】
前記（１）で準備された各世代数のデンドリマーで修飾されたフラスコにおいて、培養液の深さが約4 mmに保持されるようにし、使用後の培養液は72時間毎に全量交換した。フラスコ底面における細胞が80 % confluentとなったところで0.1 %トリプシン1:250と0.02 % EDTA（Sigma Aldrich, St. Louis, MO, U.S.A.）で処理し、遠心分離（200 g, 25℃）により回収した。
【００６７】
以上の操作を繰り返し、継代培養を行った。
（３）修飾凹凸培養面における細胞評価
前記（２）において培養されたヒト角化細胞を、フラスコ底面の３箇所で、光学顕微鏡に配設された８ビットＣＣＤカメラ（東京電子工業株式会社；品番CS8330）により撮影した。細胞濃度を記録し、次式（２）
【００６８】
【数２】
2005245224.tif 000006
（tdは倍加時間(h)、Xaは細胞濃度(cells/cm2)、Δtは培養時間を表す）
を用いて細胞の倍加時間を算出した。デンドリマー世代数と倍加時間の関係を図２に示した。
【００６９】
また、培養１日後に各細胞の投影面積（Ac）および外周（Lp）を、IMAQ Vision Builder（National Instruments, Austin, TX, U.S.A.）の線−描画ツールを用いて求め、個別細胞の細胞形態を円形度として次式（３）
【００７０】
【数３】
2005245224.tif 000007
（Rnは円形度(-)、Acは細胞面積(μm2)、lpは細胞周(μm)を表す）
を用いて算出した。なお、円形度は、識別可能なすべての細胞（30〜138 cells）について測定した。各円形度頻度分布を図３に示した。
【００７１】
図３より、デンドリマー面で培養した細胞の倍化時間はデンドリマー世代数の増加に伴い増加し、４世代ではコントロール面（０世代）の1.5倍となることが示された。
【００７２】
また、デンドリマーの世代数の増加に伴い、Rn＝0.8から1.0の円い形態の細胞の頻度が減少し、４世代のデンドリマー面上では、伸展した細胞（Rn値の小さな細胞）の割合が多くなることが確認された。
【００７３】
以上の結果より、細胞の増殖（倍化時間）と細胞形態の変化（円形度の分布）は、培養面の凹凸特性により影響されることが示唆された。
【００７４】
そこで、細胞骨格形成能の評価パラメータとして、次式（４）
【００７５】
【数４】
2005245224.tif 000008
（ただし、Rnの閾値＝対照（処理なし）面でのRnの平均値）
で表される変形細胞率（Dc）を定義した。
【００７６】
表面粗さと倍加時間およびDcの関係を各々図４に示した。
【００７７】
図４より、倍加時間および変形細胞率は表面粗さの増大に伴って一義的に上昇することが確認された。これより、細胞が培養面の凹凸を感受することにより刺激伝達量が変化することが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】実施例において、各世代数のデンドリマーを固相合成して得られた修飾凹凸培養面の表面状態を示した図である。（controlはデンドリマーなしの培養面、Ｇは、デンドリマーの世代数を表す）
【図２】実施例において、培養面に固相合成されたデンドリマーの世代数と、この出願の発明の方法により培養されたヒト角化細胞の倍加時間の関係を示した図である。
【図３】実施例において、この出願の発明の方法により培養されたヒト角化細胞の細胞接種１日後における各世代数のデンドリマーを固相合成して得られた修飾凹凸培養面の円形度頻度分布を示した図である。
【図４】実施例において、修飾凹凸培養面の表面粗さとDcおよび倍加時間の関係を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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