(57)【要約】      （修正有）【課題】  染色体の正常部位抑制（ＣＩＳＳ）ハイブリダイゼーションにより、哺乳動物の有糸分裂細胞または間期細胞の中で選択した個々の染色体を検出、同定および／または定量する方法、および細胞を染色体、染色体断片、または染色体異常、例えば、状態または病気に関連するものの発生についての分析に於けるその使用を提供する。【解決手段】染色体ＤＮＡを相補的核酸配列とのハイブリダイゼーシヨンに利用可能ならしめるように試料を処理し、標識したプローブＤＮＡをハイブリダイゼーシヨンさせ、それによってプローブＤＮＡの前記ＤＮＡ中に遍在する反復ＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーシヨンを抑制することを特徴とする、間期細胞からの染色体ＤＮＡを含む試料中の任意に選択された個々の標的染色体又はその小領域をその場で特異的に染色又は標識する方法。【選択図】  図１
2005245452.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）染色体ＤＮＡを相補的核酸配列とのハイブリダイゼーシヨンに利用可能ならしめるように試料を処理し、
（ｉｉ）標識したプローブＤＮＡを段階（ｉ）のＤＮＡとハイブリダイゼーシヨンさせ、それによってプローブＤＮＡの段階（ｉ）のＤＮＡ中に遍在する反復ＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーシヨンを抑制し、抑制は、遍在する反復ＤＮＡ配列にプローブＤＮＡをハイブリダイゼーシヨンさせる配列を含有する競合ＤＮＡをハイブリダイゼーシヨンさせることにより達成される、
ことを特徴とする、間期細胞からの染色体ＤＮＡを含む試料中の任意に選択された個々の標的染色体又はその小領域をその場で特異的に染色又は標識する方法。
【請求項２】
（ａ）間期細胞又はその核の試料を処理して、そこに存在する染色体ＤＮＡを相補的配列へのハイブリダイゼーシヨンに利用できるようにし、
（ｂ）該試料をＤＮＡのプール、すなわち、
ｉ）種々の標識したＤＮＡプローブであって、各ＤＮＡプローブは、各ＤＮＡプローブが光学的に区別可能なシグナルを生ずるように、単一の発蛍光団で標識したＤＮＡ断片又は異なる発蛍光団で別々に標識したＤＮＡ断片の混合物からなり、そして各プローブが該試料中に存在することが疑われる該ヒト染色体又はその領域の１つに対して特異的であるＤＮＡプローブ；及び
ｉｉ）該試料中に存在する配列及び該プローブ中に存在する配列に相補的な反復配列からなる競合ＤＮＡ断片
からなるＤＮＡのプールと、該競合ＤＮＡ断片を試料中に存在し且つ該プローブ中に存在する該相補的反復配列にハイブリダイゼーシヨンさせ、該プローブ中の該反復配列と該試料中の該反復配列との間の交差ハイブリダイゼーシヨンを抑制するのに十分であり、そして該プローブを該試料中に存在する特異的な標的染色体配列にハイブリダイゼーシヨンさせる条件下に接触させ、そして
（ｃ）ＤＮＡプローブによって生ずる光学的に区別可能なシグナルを検出し、同時に間期細胞又はその核中の各ヒト染色体又はその領域を可視化する
ことを特徴とする、間期細胞又はその核中の個々のヒト染色体又はその領域を同時に可視化するためのin  situハイブリダイゼーシヨン法。
【請求項３】
（ａ）間期細胞又はその核の試料を処理して、そこに存在する染色体ＤＮＡをそれに相補的な配列へのハイブリダイゼーシヨンに利用できるようにし、
（ｂ）該試料をＤＮＡのプール、すなわち、
ｉ）種々の標識したＤＮＡプローブであって、各ＤＮＡプローブは、各ＤＮＡプローブが光学的に区別可能なシグナルを生ずるように、単一の発蛍光団で標識したＤＮＡ断片又は異なる発蛍光団で別々に標識したＤＮＡ断片の混合物からなり、そして各プローブが該試料中に存在することが疑われる該ヒト染色体又はその領域の１つに対して特異的であるＤＮＡプローブ；及び
ｉｉ）該試料中に存在する配列及び該プローブ中に存在する配列に相補的な反復配列からなる競合ＤＮＡ断片、
ここで、標識したＤＮＡプローブ及び競合ＤＮＡ断片は１５０〜２５０ヌクレオチドの範囲にある、
からなるＤＮＡのプールと、該競合ＤＮＡ断片を試料中に存在し且つ該プローブ中に存在する該相補的反復配列にハイブリダイゼーシヨンさせ、該プローブ中の該反復配列と該試料中の該反復配列との間の交差ハイブリダイゼーシヨンを抑制するのに十分であり、そして該プローブを該試料中に存在する特異的な標的染色体配列にハイブリダイゼーシヨンさせる条件下に接触させ、そして
（ｃ）多重ハイブリダイゼーシヨンシグナルを同時に検出し、ここで、各検出したシグナルは区別可能でありそして該試料中に存在する特異的な標的染色体配列を同定する
ことを特徴とする、間期細胞又はその核からの染色体ＤＮＡ中の興味のある多重標的配列を同時に検出するためのin  situハイブリダイゼーシヨン法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染色体の正常部位抑制（ＣＩＳＳ）ハイブリダイゼーションにより、哺乳動物の有糸分裂細胞または間期細胞の中で選択した個々の染色体を検出、同定および／または定量する方法、および細胞を染色体、染色体断片、または染色体異常、例えば、状態または病気に関連するものの発生についての分析におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
染色体結合技術は、特異的ヒト染色体の同定を促進し、そして現在染色体異常の診断の主要な基礎を提供する。染色体結合のパターンの解釈は、熟練した人を必要としそして、ことに小さい構造的変化を検出することに関して、そして複雑な核型、例えば、高度に異数性の腫瘍細胞のそれらを分析するとき、しばしば技術的に困難である。追加の複雑さは、読むことの出来る分裂中期染色体の広がりは時々非常に困難であるか、あるいはある種の細胞の型または組織を調製することが不可能であるということである。染色体異常を同定する別の方法は、とくにこのような別の方法を有糸分裂細胞および間期細胞の両者の集団に適用できた場合、現在の細胞生成分析の方法を増大させるうるので、価値があるであろう。
【０００３】
過去数年にわたって、個々の染色体のＤＮＡが哺乳動物の間期の核内の極限化領域または空間的に付着性のドメインを占有することを示す、かなりの量の証拠が得られてきている。非特許文献１〜５。
【０００４】
これらの観測は染色体特異的プローブの組を使用して、非有糸分裂細胞における染色体ドメインの数的または構造的異常を検出することができたことを示唆し、このアプローチは「間期の細胞生成学（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ  ｃｙｔｏｇｅｎｉｃｓ）」と名付けられた。非特許文献６。
【０００５】
事実、最近の正常部位ハイブリダイゼーションの研究は、間期細胞を使用するトリソミー−１８の胎児の診断、およびプローブとして染色体特異的反復ＤＮＡを使用する数的染色体異常の検出を実証した。非特許文献７および８。
今日まで報告されたすべての染色体特異的反復ＤＮＡは、各染色体の離散した小区域に局在化されそして、こうして、このようなＤＮＡプローブは多数の型の染色体異常の分析に不適当である（例えば、転座または欠失）。特異的染色体からなる配列のスペクトルを独特に検出することができたならば、非有糸分裂細胞における染色体ドメインの異常の分析は可能であろう。さらに、このような一般的標識技術は、間期の核内の染色体のＤＮＡの空間的有機化に関する基本的な問題の取り扱いを可能とするであろう。
【非特許文献１】Ｃｒｅｍｅｒ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６０：４６−５６（１９８２）
【非特許文献２】Ｈｅｎｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，１４９：２５７−２６９（１９８３）
【非特許文献３】Ｓｃｈａｒｄｉｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，７１：２８１−２８７（１９８５）
【非特許文献４】Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ，Ｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，７１：２８８−２９３（１９８５）
【非特許文献５】Ｐｉｎｋｅｌ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：２９３４−２９３８（１９８６）
【非特許文献６】Ｃｒｅｍｅｒ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．,Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，７４：３４６−３５２（１９８６）
【非特許文献７】Ｃｒｅｍｅｒ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，７４：３４６−３５２（１９８６）
【非特許文献８】Ｃｒｅｍｅｒ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，  １７６：１１９−２２０（１９８８）
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、染色体の正常部位抑制（ＣＩＳＳ）ハイブリダイゼーションにより、哺乳動物の有糸分裂細胞または間期細胞の中で選択した個々の染色体を検出、同定および／または定量する方法、および細胞を染色体、染色体断片、または染色体異常、例えば、状態または病気に関連するものの発生についての分析におけるその使用に関する。本発明の方法において、染色体特異的プローブ（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を分析すべき試料と組み合わせ、ここで問題の個々の染色体が標識され、そして染色体からなる配列の複雑なスペクトルを検出できるようにする。本発明の方法において使用するプローブは、高い遺伝子の複雑さをもち、そして個々にまたはプールで使用する、適当に選択した、クローニングしたＲＮＡまたはＲＮＡの断片、あるいは染色体ライブラリーのＤＮＡであることができる。
【０００７】
本発明の方法は、ＣＩＳＳハイブリダイゼーションと呼び、個々の哺乳動物の染色体を細胞サイクルの任意の点において特異的に染色するために使用することができる。それを使用して、本発明まで、検出が、不可能でなかった場合、時間を消費するおよび／または困難であった、染色体の含量、とくに染色体異常（例えば、欠失、転位、染色体数の変化）を評価することができる。この方法は、このような評価を望む任意の関係（例えば、遺伝状態または病気の状態の診断および／または監視）において、個々の哺乳動物の染色体の急速なかつ高度に特異的な評価の提供において有用である。
発明の詳細な記述
本発明は、遍在する反復したＤＮＡ配列からのハイブリダイゼーションシグナルの抑制は、高速再アソシエーション（ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の反応速度論に基づく再アニーリングの手順において全ＤＮＡを使用することによって達成されるという、ハイブリダイゼーション法に基づく。本発明のハイブリダイゼーション法は、このようなシグナルの選択的抑制のために、染色体の正常部位抑制（ＣＩＳＳ）ハイブリダイゼーションと呼び、１または２以上の選択した個々の中部動原体下の、とくにヒト染色体を、細胞のサイクルの任意の点において、特異的に細胞染色を生じ、そして両者の有糸分裂細胞および間期細胞（すなわち、間期核）における染色体異常を検出し、同定しおよび定量するために使用された。
【０００８】
実施例において以下にかつより詳細に説明する事項は、次の通りである：
１．  本発明の方法（ＣＩＳＳハイブリダイゼーション）により、高い遺伝的複雑性（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｍｐｌｅｘｉｔｙ）をもつ染色体特異的プローブの組（すなわち、染色体ライブラリーＤＮＡ、クローニングしたＤＮＡ断片）を使用する、個々のヒト染色体の有糸分裂細胞または間期細胞における特異的染色；
２．  染色体特異的ライブラリーのプローブを使用する、ＣＩＳＳによる分裂中期および間期の腫瘍細胞の特異的染色；および
３．  ＣＩＳＳハイブリダイゼーションを使用する、遺伝状態（ダウン症候群）に関連するヒト染色体（染色体２１）における種々の異常源からの有糸分裂細胞および間期細胞における急速な検出。
４．  染色体特異的独特配列のプローブのネスチングした組を使用して、染色体異常を同一しそして遺伝病（例えば、ダウン症候群）を検出したことの実証。
個々のヒト染色体の特異的染色
ＣＩＳＳハイブリダイゼーション法の使用により、個々の（例えば、染色体１〜２２のＸおよびＹ染色体または相同性対）ヒト染色体は両者の有糸分裂細胞および間期細胞において特異的染色された。これは両者の分裂中期スプレッドおよび間期核において実施され、そして適当な検出方法と組み合わせて、それぞれ、シグナル−プローブのＣＩＳＳハイブリダイゼーションおよびマルチ−プローブのＣＩＳＳハイブリダイゼーションを使用して、多数の選択した（個々の）染色体を同時に染色または標識した。この方法は第１図に概略的に表されている。
ゲノムのＤＮＡのライブラリーおよびクローニングしたＤＮＡを使用して特異的染色体の染色
ＣＩＳＳハイブリダイゼーションを次のようにして実施して、フローサイトメトリーでソーティングしたヒト染色体およびクローニングしたＤＮＡ断片から由来した商業的に入手可能なゲノムのＤＮＡのライブラリーを使用して、個々のヒト染色体の特異的染色を生成した。バン・ディラ（ｖａｎ  Ｄｉｌｌａ）、Ｍ．Ａ．ら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、４：５３７−５５２（１９８６）。遍在する反復配列、例えば、ＡｌｕおよびＫｐｎＩ要素からのハイブリダイゼーションシグナルの抑制は、高速再アソシエーションの反応速度論に基づく再アニーリング手順において全ヒトＤＮＡを使用して達成された。同様な原理は、他の人により使用されて、サザンブロッティングおよび正常部位ハイブリダイゼーションの実験のためのコスミドＤＮＡクローンからの独特配列のサブセットの選択的ハイブリダイゼーションが促進された。シアリイ（Ｓｅａｌｅｙ）、Ｐ．Ｇ．ら、核酸（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）、１３：１９０５−１９２２（１９８５）；およびランデジェント（Ｌａｎｄｅｇｅｎｔ）、Ｊ．Ｅ．ら、ヒューマン・ジェネティックス（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｔ．）、７７：３６６−３７０（１９８７）。両者の分裂中期スプレッドおよび間期核における個々の染色体の特異的標識づけは、実施例において詳細に記載する次の方法において実施する（および起こったことを示す）。核のトポグラフィーの分析のための染色体のドメインの３−Ｄ再構成のためにコンピューターの助けを借りる光学的セクショニングの使用の可能性を、また、ＣＩＳＳハイブリダイゼーションと組み合わせて実証した。
【０００９】
最初に、１または２以上の選択した染色体からゲノムのＤＮＡをプローブＤＮＡとして使用するために調製する。ゲノムのＤＮＡはいつかの源から入手可能である。例えば、各々が問題の染色体を含有する、１または２以上のＤＮＡライブラリー（染色体誘導ライブラリー）を使用して、必要なＤＮＡプローブを生成する。このようなライブラリーは、フローサイトメトリーでソーティングしたヒト染色体から由来した、商業的に入手可能なゲノムのＤＮＡのライブラリーであるすることができる。これらはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（マリイランド州ロックビレ）から入手可能である。ヒト染色体１、４、７、８、９、１２、１３、１４、１６、１７、ｐＵＣ１８、ツイーン２０、２１、２２および染色体ＸのためのこのようなＤＮＡライブラリーを、本発明において、実施例に記載するように使用した。他の商業的に入手可能なゲノムのＤＮＡのライブラリーまたは商業的源以外からのゲノムのＤＮＡのライブラリーを、また、使用することができる。あるいは、個々のプラスミド、ファージ、酵母、非酵母ＤＮＡインサートをもつ人工的染色体、およびコスミドＤＮＡクローンを、選択した個々の染色体または多数の選択した染色体のためのＤＮＡプローブ源として使用することができる。ゲノムのライブラリーからのＤＮＡの場合において、ＤＮＡは、検出可能なシグナルで標識する前に、それを含有するベクターからのプールとして分離するか、あるいはベクターから分離しないで使用することができる。
【００１０】
プローブを検出可能なシグナルで標識し、ここでシグナルは蛍光性レセプター、特異的結合対（例えば、ビオチン−アビジンまたは配位子−抗体）の一方の構成員、または酵素であることができる。ベクターから除去したＤＮＡを、ニック翻訳（例えば、Ｂｉｏ−１１−ｄＵＴＰ）により、例えば、アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）マルチプライムＤＮＡ標識系を使用するランダムプライマー伸長（例えば、３’末端のテイリング）により、ｄＴＴＰをＢｉｏ−１１−ｄＵＴＰで置換するか、あるいは他の適当な技術により標識する。ベクターからの分離されなかったＤＮＡの場合において、ビオチンの標識づけはニック翻訳により、標準の技術を使用して直接実施する。ブリガチ（Ｂｒｉｇａｔｉ）ら、ウイルス学（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１２６：３２−５０（１９８３）。他の標識を同様な方法において（例えば、２，４−ジニトロフェノール、ジゴキシン）付加することができる。
【００１１】
プローブの大きさを注意して選択し、そしてコントロールして、プローブの浸透を促進し、そして再アニーリングハイブリダイゼーションを最適化する。一般に、５００ヌクレオチドより小さい標識したＤＮＡ断片を使用し、そして、より一般的には、プローブの大部分は１５０〜２５０ヌクレオチドの長さである。この長さのプローブは、より長いヌクレオチド配列から、適当な大きさの断片を生成しそして回収するための普通に入手可能な酵素あるいは既知の技術を使用して作る。また、選択した染色体のヌクレオチド配列が知られている場合、既知の技術を使用して、その配列を有するオリゴヌクレオチドを合成することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、いったん標識されると、特異的染色体領域をデコレーションするために使用することができる。例えば、哺乳動物の染色体のテオロマーの配列に特異的にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドのプローブは同定された。モユイフ（Ｍｏｙｕｉｆ）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、Ｓｅｐ．１９８８。
【００１２】
競争（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）ＤＮＡは、遍在する反復した配列からのハイブリダイゼーションシグナルを抑制する作用するＤＮＡであり、必要に応じて選択されるであろう（例えば、その染色体を分析する動物に基づいて）。ヒト染色体の場合において、競争ＤＮＡは遍在する反復した配列、例えば、ＡｌｕおよびＫｐｎＩ要素からのハイブリダイゼーションを抑制する作用をする全ヒトＤＮＡである。それは多数の源から入手可能である。例えば、胎盤または白血球からのヒトゲノムのＤＮＡは、既知の技術、例えば、デイビス（Ｄａｖｉｓ）らにより記載されている技術により調製することができる。デイビス（Ｄａｖｉｓ）、Ｌ．Ｇ．ら、分子生物学において基本的方法（Ｂａｓｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｇｙ）、エルセビーア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、ニューヨーク／アムステルダム（１９８６）。それを標準の方法（例えば、ＤＮアーゼで）消化して、プローブＤＮＡと同一の大きさ分布内の競争ＤＮＡ断片を生成する。
【００１３】
ヒトＤＮＡの小さい部分とのみ競争しそして、必要に応じてハイブリダイゼーション混合物の合計の（最終）濃度を調節するために使用する、他の源からのＤＮＡは、また、必要に応じて含められるであろう。このＤＮＡはキャリヤーＤＮＡと呼ぶ。このＤＮＡは、標準の方法を使用して生成または処理されるので、プローブＤＮＡと同一の大きさ分布内に存在する。
【００１４】
最初に、検出可能な標識を有するプローブＤＮＡおよび競争ＤＮＡを予備アニーリングが起こるために適当な条件下に一緒にする。競争ＤＮＡと一緒にしたプローブＤＮＡの量は、染色体の標的の相対的ＤＮＡ含量を反映するように調節する。例えば、染色体１は染色体２１の中に存在するＤＮＡのほぼ５．３倍のＤＮＡを含有する。プローブの濃度は、それぞれ、３０μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌである。全ゲノムライブラリーＤＮＡをプローブ混合物として使用する（精製したＤＮＡインサート代わりに）とき、ほぼ１０倍の標識したＤＮＡを、大量で存在するベクター配列を補償するために添加する。ライブラリーＬＡＯＸＮＬＯ１（Ｘ染色体）およびＬＡ１６ＮＬ０２（染色体１６）の場合において、ヒトＤＮＡインサートは全ライブラリーＤＮＡのほとんど半分を構成するので、標識したライブラリーＤＮＡのほぼ２倍のみを添加する。キャリヤーＤＮＡ、例えば、マスまたはサケの精巣ＤＮＡを、必要に応じて、前以て決定したレベルに全ＤＮＡ濃度をするために添加する。ここに記載するように、十分なサケの精巣ＤＮＡを添加して、ハイブリダイゼーション混合物（ＤＮＡのすべての３つの型：プローブＤＮＡ、競争ＤＮＡおよび有意に競争しないＤＮＡを包含する）中のＤＮＡの最終濃度を１．０ｍｇ／ｍｌとする。
【００１５】
生ずるハイブリダイゼーション混合物を処理して（例えば、加熱により）存在するＤＮＡを変性し、そしてほぼ３７℃において十分な時間インキュベーションして部分的再アニーリングを促進する。
【００１６】
同定すべき染色体ＤＮＡ（特異的に標識した）を含有する試料を、また、処理して、例えば、加熱してＤＮＡを変性することによって、その中に存在するＤＮＡを相補的配列とのハイブリダイゼーションに有効とする。ハイブリダイゼーション混合物および試料をハイブリダイゼーションを促進する条件下にかつ十分な時間、一緒にする。十分な時間後、染色体標的の特異的標識の検出を標準の技術を使用して実施する。例えば、実施例に記載するように、ビオチニル化プローブをフルオレセイン標識アビジンまたはアビジン−アルカリ性ホスファターゼ複合体を使用して検出する。蛍光色素の検出のために、試料を、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）接合アビジンＤＣＳとともにインキュベーションする（参照、実施例１）ＦＩＴＣシグナルの増幅は、必要に応じて、ビオチン接合ヤギ抗アビジンＤ抗体とのインキュベーション、洗浄、およびＦＩＴＣ接合アビジンとの第２ハイブリダイゼーションにより実施することができる。酵素活性の検出のために、試料を、例えば、ストレプトアビジンとインキュベーションし、洗浄し、ビオチン接合アルカリ性ホスファターゼとインキュベーションし、再び洗浄し、そして予備平衡化する（例えば、ＡＰ−緩衝液中で、実施例１に記載するように）。酵素反応は、例えば、ニトロブルーテトラゾリウムおよび５’オロモ４クロロ３インドリルホスフェートを含有するＡＰ緩衝液中で実施し、そして２×ＳＳＣ中のインキュベーションにより停止する。
ＣＩＳＳハイブリダイゼーションを使用する染色体異常の検出
前述の工程を使用して、標的染色体と呼ぶ任意の選択した個々の染色体（または複数の染色体）、またはその小領域を特異的に染色または標識することができる。実施例において説明するように、本発明の方法は有糸分裂（例えば、分裂中期、前期）および間期の細胞の両者の、種々の細胞において有用であることが示された。実施例２に詳細に記載するように、本発明の方法のＣＩＳＳハイブリダイゼーション方法は、有糸分裂および間期の異数性腫瘍を個々の染色体の複雑な数および構造の異常（例えば、染色体の数の変化、欠失および転位または転座）について急速にスクリーニングするために有用である。
【００１７】
これに関して、ビオチニル化ライブラリーＤＮＡインサートをＣＩＳＳハイブリダイゼーション方法において使用してハイブリッド分子を生成し、これらの分子を既知の技術を使用して検出した。２つの神経膠腫系を異数性細胞、とくに腫瘍細胞の一般的モデルとして使用した。一方は乏突起神経膠腫系であり、そして他方は神経膠芽細胞腫系であった。これらは染色体１、４、７、１８および２２に対して特異的なビオチニル化ＤＮＡプローブを使用して分析した。ｐｔｅｒからｑｔｅｒまでの染色体の特異的標識づけは、分裂中期スプレッドにおけるおよび早期の前期および間期の核における数の変化、欠失および転位を可視化を可能とした。完全な染色体、欠失した染色体および転座した染色体のセグメントは、このような細胞の非常に複雑な核型で急速に描写された。追加の小領域のプローブを、また、使用して異常の染色体をさらに明らかにした。ディジタル画像の分析を使用して、各系の個々の分裂中期および間期の細胞における特異的染色体のＤＮＡの全補体を定量した。染色体２１のリプリゼンテイションの低下および染色体７（詳しくは７ｐ）のリプリゼンテイションの過剰が観測された。これは普通の細胞遺伝学のバウディング（ｂａｕｄｉｎｇ）技術を使用する、他の研究者により従来の観測と一致する。ビグナー（Ｂｉｇｎｅｒ）、Ｓ．Ｈ．ら、キャンサー・ジェネティックス・アンド・サイトジェネティックス（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．）、２２：１２１−１３５（１９８７）；シャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ）、Ｊ．Ｒ．、セミネス・オンコロジー（Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．）、１３：４−１５（１９８６）。
【００１８】
使用した２つの神経膠腫細胞系は、多数の神経膠腫細胞に共通のいくつかの細胞遺伝学の特徴を表す。こうして、ＣＩＳＳハイブリダイゼーション方法を、同様な方法において使用して、他の染色体を特異的にデコレーションしそして神経膠腫瘍におけるそれらの染色体を検出することができることを期待することは、合理的である。分析した２つの細胞の型は高度に異数性である（すなわち、それらは正常の４６よりむしろ１００の染色体を有する）。したがって、リン酸カルシウム方法を異数性（腫瘍）細胞の任意の型の評価において使用できることを期待することは、合理的である。
【００１９】
こうして、ＣＩＳＳハイブリダイゼーション方法は、患者における病気の診断およびその状態（例えば、処置による進行、退行または変化）の監視の両者において、癌に関連する染色体異常の評価において使用することができる。この応用において、単一の染色体または多数の染色体、およびその小領域の評価を実施することができる。各々が異なる標識を有する２つのＤＮＡプローブを使用する二重ハイブリダイゼーションは、また、実施することができる。すなわち、ビオチニル化染色体７ライブラリーＤＮＡインサート、およびアミノアセチルフルオレン（ＡＡＦ）で修飾した染色体７上のアルフォイド反復に対して特異的のプローブ（ｐａ７ｔｌ）を使用して、２つの型の腫瘍細胞（ＴＣ５９３、ＴＣ６２０）の両者の分裂中期スプレッドおよび間期核における染色体７の含量／特性を評価した。ハイブリダイゼーション後、ビオチニル化染色体７のインサートをアビジン−ＦＩＴＣを使用して検出し、そして染色体７特異的アルフォイドＡＡＦ標識配列をテトラメチルフォダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）接合第２抗体を使用して検出した。二重ＣＩＳＳハイブリダイゼーションを使用して、染色体８および１４、バーキットリンパ腫細胞、高い悪性の形態のＢリンパ球腫瘍細胞、例えば、両者の分裂中期スプレッドおよび間期細胞において見られるもの、の間の翻訳を検出した。
【００２０】
これにより、２つの腫瘍細胞の型において存在する染色体第７における類似性および差を検出することができる：ＴＣ５９３の中に存在する４つの完全な第７染色体のみが検出可能な７動原体シグナルを含有した；より小さいおよび中部動原体の第７染色体は７アルフォイド配列および７ｑ１１において異質染色質の小さいブロックを欠いた（それが特徴ある動原体の領域を欠いたことを示す）。対照的に、ＴＣ６２０のすべての４つの染色体第７は７アルフォイドプローブにより標識された。二重ＣＩＳＳハイブリダイゼーションにより、また、１つの細胞型（ＴＣ５９３）の中に存在する第７染色体を区別し、そして他方の細胞型（ＴＣ６２０）の中に存在する第７染色体の間の類似性（少なくとも評価した特徴に関して）実証することができた。
【００２１】
二重ＣＩＳＳハイブリダイゼーションを使用して、バーキットのリンパ腫細胞における染色体８と染色体１４との間の転座を検出した；バーキットのリンパ腫はＢリンパ球腫瘍の高度に悪性の形態である。転座は両者の分裂中期スプレッドおよび間期細胞において検出された。
【００２２】
適当に選択したプローブおよび／または標識を使用することによって、多数のＣＩＳＳハイブリダイゼーションを同時に使用して分析することができる、異なる染色体の数、ならびにそれらの染色体のあるまたはすべてのものの上の小領域の数を増加することができる。例えば、各々が標的染色体の小領域に対して特異的である、１より多いプローブを使用して、その単一の染色体上のいくつかの小領域を一度に分析することができる。また、各プローブの組（ＤＮＡまたはＲＮＡの断片の組）を明確な蛍光色素または異なるリポーター分子で標識することができ、これらの蛍光色素または分子は、プローブ−標的染色体のハイブリダイゼーションが起こった後、既知の技術により（例えば、特異的の蛍光または酵素試薬を使用することによって）、互いに区別することができる。
【００２３】
そのうえ、ＣＩＳＳハイブリダイゼーションの「組み合わせの」変法を使用して、同時に評価することができる染色体の数を増加することができる。すなわち、各々が異なる蛍光色素（例えば、フルオレセインおよびローダミン）で別々に標識した、２つの半分から構成されたプローブ配列の単一の組から作られたハイブリダイゼーションプローブの混合物を使用することができ、前記２つの半分は、ハイブリダイゼーションすると、もとの個々の蛍光色素の各々と光学的に区別することができる第３の蛍光性の「色」またはシグナルを生成する。この方法において２つの異なる蛍光色素の対は、３つの異なる蛍光色素の同定を可能とする。例えば、フルオレセインのみで標識したプローブの組はハイブリダイゼーションのとき１つの色を生ずるであろう；ローダミンのみで標識した同一のプローブの組はハイブリダイゼーションのとき第２の（異なる）色を生ずるであろう。プローブの組の半分が２つの一方で標識されるとき、両者の配列のサブセットは等しい確率で標的にハイブリダイゼーションすることができ、そして第３の（異なる）色として感じられることができる（混合する塗料に類似する方法で）。２つの蛍光色素を同一の分子の中に導入しないで、Ｅ転移（一方の蛍光色素のスペクトルが他方の蛍光色素のそれとオーバーラップする光を放射し、その光が第２蛍光色素により吸収される、よく知られているプロセス）の可能性を最小とすることが重要である。転移された電子は第２蛍光色素により放射され、これは第１蛍光色素のクェンチングに導く。それらのスペクトルの特性のために選択した３つの異なる蛍光色素の対となる組み合わせは、単一にそして対となる組み合わせで使用して、同様な方法において生成することができる。これは６つの異なる蛍光性の色またはシグナルを生成することができる（例えば、３つの対＋３つの単一の蛍光色素）。４つの異なる蛍光色素の同様な組み合わせは１０の異なる蛍光性の色またはシグナルを生成し、５つの異なる蛍光色素の同様な組み合わせは１５の異なる蛍光性の色またはシグナルを生成する、など。組み合わせの蛍光色素（２またはそれ以上の蛍光色素を組み合わせて同一のプローブの組を標識すること）のこの原理は、分裂中期および間期の染色体の分析に応用することができる。なぜなら、各染色体は物理学的に別々の実在物であり、こうして明確な標的であるからである。３つの異なる蛍光色素の混合物を使用する、複合プローブの標識づけは、同時にマルチパラメーターの分析において有用な、なおいっそう大きい種類の色またはシグナルを提供する。
【００２４】
同時に分析することができる染色体の数を増大する他のアプローチは、蛍光性の「時間分割（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ）」法を包含する。この場合において、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）のプローブを、ランタニド類（例えば、ユーロピウム、ツルビウム）に特異的に結合するキレート化「ケージ（ｃａｇｅ）」で標識する。このような金属のキレートは蛍光性であるように作ることができる。それらは励起された状態の寿命を示し、これらの寿命はほとんどの蛍光色素のそれら（半減期はナノ秒の範囲である）より非常に長い（マイクロまたはミリ秒）。波長および蛍光性の寿命の両者は、使用するランタニド金属のイオンの性質により影響を及ぼされる。光で数ナノ秒間励起しそして遮断を使用する、パルス化ゲーティング系（ｐｕｌｓｅｄ−ｇａｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用する場合、寿命が短い蛍光色素の崩壊をそれらの基底状態にし、励起後規定された時間（すなわち、１〜１００マイクロ秒）で検出器系を開き、そして寿命が長い蛍光色素のみを検出することができる。この方法を使用して、同一のスペクトルを有し、こうして時間因子を蛍光色素の区別に付加する、寿命が異なる２つの蛍光性色素を識別することができる。
【００２５】
同時に分析することができる異なる染色体の数を増加する他のアプローチは、染色体を取り付けた蛍光色素の柔軟性または剛性により区別する検出系に基づく。ここで、２つの一本鎖のプローブの組を同一の蛍光色素で標識することができ、一方プローブの組において、蛍光色素をＤＮＡの本体の中に導入し、これは問題の標的ＤＮＡとハイブリッドの分子を形成するであろう。第２プローブの組において、蛍光色素はＤＮＡ配列の中に導入し、これは標的ＤＮＡとハイブリダイゼーションしない（例えば、デオキシヌクレオチドの末端トランスフェラーゼでポリｄＡ−蛍光色素の３’−テイルを付加し、蛍光色素標識した異質ＤＮＡをプローブのＤＮＡに結合するか、あるいはこの分野において知られている他の普通の第２の標識づけ技術による）。プローブ−標的染色体のハイブリッドを形成する、ＤＮＡの本体内の蛍光色素は、固定化されるようになり、こうして溶液中で自由に回転することができないであろう。対照的に、ハイブリッドの形成に関係しない一本鎖ＤＮＡ中の蛍光色素は、固定化されず、そして溶液中で非常にいっそう自由に回転することができる。蛍光色素の回転の自由度の割合を測定する（例えば、偏光で照明したとき、蛍光色素が偏光をなくす速度を測定する）ことによって、２つの組のプローブを識別することができる。
遺伝学的障害および染色体損傷に関連する染色体異常の急速な評価のためのＣＩＳＳハイブリダイゼーションおよび領域的に定められたプローブの組の使用
ＣＩＳＳハイブリダイゼーション法は遺伝学的障害（例えば、染色体２１の場合において、ダウン症候群）に関連する染色体異常（例えば、染色体２１の数および構造の異常）の急速な評価のために有用であることが実証された。分裂中期および間期の細胞において末端のバンド２１ｑ２２．３を特異的に標識するか、あるいは全染色体２１の異常をデコレーションするＤＮＡプローブの組は、実施例３に記載されている。ヒト染色体２１からクローニングしたＤＮＡ断片は、種々の細胞の型において分裂中期スプレッドおよび同種の染色体領域を特異的に標識するために有用である。すなわち、染色体２１のプローブの組を使用するＣＩＳＳハイブリダイゼーションは、リンパ球、胚の慢性の絨毛細胞および神経膠腫瘍細胞系（ＴＣ６２０）において染色体２１ＤＮＡを標識／同定するとき有効であることが示された。バンド２１ｑ２２．３からの独特なプローブの組を、また、使用して充実組織（「正常の」ヒト脳組織）中の染色体２１を検出した。こうして、ＣＩＳＳハイブリダイゼーションおよび独特配列のプローブのプールを使用するハイブリダイゼーションは、ダウン症候群および他の遺伝学的障害または染色体異常に関連する他の状態の診断手段として可能性を有する。
【００２６】
結果は、核の大部分（５５〜６５％）がハイブリダイゼーションの３つの明確な焦点を示すので、三染色体の核型を間期細胞において容易に診断することができることを実証する。対照的に、二染色体の核型をもつリンパ球中の０．２％より少ない核は３つの核のシグナルを示す；興味あることには、正常のＣＶ細胞中のこのような核の百分率はより高いが、なおかなり５％より小さい。一般に、２０〜３０程度に少ない細胞は二染色体および三染色体の細胞の集団を明瞭に区別するために十分であった。しかしながら、臨床的試料における染色体２１のモザイク現象のレベルの不明確さにかんがみて、明瞭な診断を実施するために要求される細胞の数はより高いように思われる。追加の臨床的相関関係は、絶対数の確立を必要とするであろう。それにもかかわらず、この分析のアプローチは、細胞の培養または分裂中期スプレッドを得ることを必要とないで、ダウン症候群の診断を可能とするであろう。それは、また、診断の実施に要する時間を、現在の１０〜１４日から１日以下に減少するであろう。
【００２７】
独特ヒトＤＮＡのみを含有する選択したプラスミドのクローンをここで使用したが、反復配列を含有するコスミドのクローンを、また、使用して、反復配列の要素のシグナルの寄与を抑制するＣＩＳＳハイブリダイゼーションに似たハイブリダイゼーションのプロトコルを適用することによって、分裂中期および間期の細胞における、それらの同種のゲノム領域を特異的に標識することができる。したがって、コスミドの単一のまたはネスチングした組を、ここで報告するものに類似する方法で、他の遺伝学的病気のための診断道具として使用することができるであろう。染色体１３、１８および２１の三染色体性および染色体ＸおよびＹの数の変化は、一緒に、出生前の核型分析の間に同定された、数の染色体異常のほとんど大部分の原因となる。多数の非アイソトープのプローブの標識づけおよび検出系の連続する開発により、３またはそれ以上の染色体を正常部位ハイブリダイゼーションに従い同時に可視化することができるであろう。同時に評価することができる染色体の数および／または染色体領域の数を増加するＣＩＳＳハイブリダイゼーションの、前節に記載した、変法を、また、遺伝学的障害および染色体の損傷に関連する染色体異常の検出に使用することができる。こうして、羊水または慢性の絨毛細胞からの間期細胞における主要な三染色体の障害を検出するための、迅速な自動化されたスクリーニング試験の展開は、実行できる将来の目的である。正常部位ハイブリダイゼーションによる特異的ヒト染色体の分析は、高度に異数性の腫瘍系統の従来の細胞発生の研究を補足するために、既に、使用され（実施例２）、そして出生前の診断の応用への拡張は保証されていると思われる。
【００２８】
染色体２１の転座による核型の分析は、分裂中期染色体上の明瞭なシグナルによる小さい転座を迅速に同定およびなおさらに特性決定し、こうして高い分解能のバンディングにより広範な分析を回避する、領域のプローブの組の有用性を示す。対照的に、ライブラリーインサートプローブは、転座された染色体２１のＤＮＡの相対量を定めるために、いっそう適当である。間期核を分析することによって、また、染色体の領域の釣り合ったまたは釣り合わない数が存在するかどうかを決定することができる。しかしながら、核中で直接転座した染色体を検出することは、染色体２１の物質が転座したレセプター染色体を同定するために、二重の標識づけを必要とするであろう。問題の染色体の前の知識を使用すると、このような転座の事象は核のシグナルの並置を測定することによって評価することができるであろう。ラポルド（Ｒａｐｐｏｌｄ）、Ｇ．Ａ．ら、ヒューマン・ジェネティックス（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｔ．）、６７：３１７−３２５（１９８４）。
【００２９】
染色体Ｘ上の全体の筋ジストロフィー（ＭＤ）の位置に広がるコスミドのクローンを使用して、染色体Ｘと染色体４との間の転座が同定された。
【００３０】
６ｋｂの配列を含有するプローブは、高い効率で、分裂中期スプレッドおよび間期細胞の両者において局在化された。非アイソトープの試薬を使用するこの検出の感度は、他の最近報告において達成されたものに類似する。非アイソトープの正常部位ハイブリダイゼーションとＤＡＰＩまたはＢｒｄＵｒｄのバンディングまたはライブラリーＤＮＡプローブを使用して全染色体のデコレーションとの組み合わせは、こうして、遺伝子のマッピングのための簡単な一般的アプローチを提供する。組み合わせの蛍光技術は、また、いくつかの染色体の領域を同時に検査することを可能とし、こうして正常部位ハイブリダイゼーションによる遺伝子連鎖の分析を可能とするであろう。それは、また、転座の染色体上の破壊点を急速に正確に定めるための小さいＤＮＡプローブの使用を促進し、これはさらにダウン症候群のために重要なゲノムのセグメントの決定を促進するであろう。
ＣＩＳＳハイブリダイゼーションを使用する染色体特異的配列の同定および分離
本発明のＣＩＳＳハイブリダイゼーション法を、また、使用して、染色体特異的配列を同定しそして、引き続いて、それらをそれぞれの配列から、既知の技術により、分離することができる。非特異的または反復の配列から分離され、そして標識された、このような染色体特異的配列は、例えば、診断に関して、実施されるハイブリダイゼーションにおいて使用して、問題の染色体または染色体領域（例えば、遺伝学的障害に関連するか、あるいは伝染病を引き起こすもの）を同定し、検出しおよび／または定量することができる。１または２以上の選択した標的核酸配列についてアッセイすべき試料および反復配列から分離した、適当に選択した標識した染色体特異的配列（例えば、１または２以上の染色体に対して特異的の配列、一般に標的核酸配列と呼ぶ、これらは適当な条件下に試料中で検出および／または定量される）の組み合わせは、試料の中に存在する相補的配列とハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーションは、相補的配列が存在しない場合、もちろん、起こらない。
【００３１】
このような分離した染色体特異的核酸配列は、標準のハイブリダイゼーション技術を使用して、問題の染色体または染色体領域の同定、検出および／または定量のために使用するキットの中に組み込むことができる。例えば、染色体２１特異的（または染色体２１の一部分に対して特異的）であり、ＣＩＳＳハイブリダイゼーションにより同定され、そして染色体２１上に存在する反復配列から分離された、標識した核酸配列を、キットの中に、他の試薬、例えば、緩衝剤、競争ＤＮＡ、キャリヤーＤＮＡおよび試料の中に存在する染色体２１配列にハイブリダイゼーションした標識した染色体２１誘導核酸配列の検出に必要な物質と一緒に、含めることができる。このようなキットは、明らかなように、問題の１または２以上の染色体からの染色体誘導核酸配列を含むように製造することができる。ハイブリダイゼーションした配列の検出に有用な競争ＤＮＡ、キャリヤーＤＮＡおよび物質は前述した通りである。
【実施例】
【００３２】
実施例１ 
ＣＩＳＳハイブリダイゼーションにおいてゲノムのＤＮＡライブラリーを使用する個々のヒト染色体の細胞特異的染色
ＤＮＡライブラリー
次のヒトコスミドのゲノムのライブラリーは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手した：ＬＡ０１ＮＳＯ１（染色体１）、ＬＬ０４ＮＳＯ１（染色体４）、ＬＡ０７Ｎｓ０１（染色体７）、ＬＬ０８ＮＳ０２（染色体８）、ＬＡ１３ＮＳ０３（染色体１３）、ＬＬ１４ＮＳ０１（染色体１４）、ＬＬ１９ＮＳ０１（染色体１８）、ＬＬ２０ＮＳ０１（染色体２０）ＬＬ２１ＮＳＯ２（染色体２１）、ＬＡ２２ＮＳ０３（染色体２２）、ＬＡ０ＸＮＬ０１（染色体Ｘ）。寒天プレート上のこれらのライブラリーの増幅（バクテリアの宿主としてＬＥ３９２細胞を使用する）、λファージの精製およびファージ−ＤＮＡプールの抽出は標準のプロトコルに従い実施した。マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．ら、分子クローニング：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・ハーバー、ニュージャージイ州（１９８２）。
分裂中期スプレッドおよび線維芽細胞の調製
正常の大人の男性（４６、ＸＹ）からのフィトヘムアグリチニン刺激したリンパ球をマッコイの５Ａ培地［ギブコ（ＧＩＢＣＯ）］中で培養し、コルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）停止し、０．０７５モルのＫＣｌの低張溶液で処理し、酢酸−メタノール中で固定し、そして分裂中期スプレッドを標準の手順により作った。低い継代培養の正常ヒト包皮の線維芽（４６、ＸＹ）を顕微鏡のスライド上で成長させ、パラホルムアルデヒドで固定し、そしてより完全な三次元構造をもつ調製物の研究について記載されたように浸透化した。マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｅｓ）、Ｌ．アナル・オブ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、４５０：２０５−２２１（１９８５）。
正常部位ハイブリダイゼーションのためのＤＮＡの調製
インサートのＤＮＡプローブ
染色体のＤＮＡライブラリーからのゲノムのＤＮＡの断片を、シャロン２１Ａベクターアームからのプールとして適当な制限酵素［ＥｃｏＲＩ（ＬＡライブラリー）またはＨｉｎｄＩＩＩ（ＬＬライブラリー）］を使用する消化および引き続く０．６％のアガロースゲル中の調製用電気泳動により分離した。インサート断片をエルトラップ（Ｅｌｕｔｒａｐ）［シュレイヘル・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）］中の電気溶離によりゲルのスライスから分離し、そしてエルチップ（Ｅｌｕｔｉｐ）−ｄカラムのクロマトグラフィー［シュレイヘル・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）］によりさらに精製した。次いで、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出し、そしてエタノール沈澱させた。このＤＮＡ断片のプールを、Ｂｉｏ−１１−ｄＵＴＰを使用するニック翻訳によるか、あるいはｄＴＴＰを０．５ミリモルのＢｉｏ−１１−ｄＵＴＰで置換するマルチプライムのＤＮＡ標識系［アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）］を使用するランダムプライマー伸長により標識した。ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）、Ｐ．Ｒ．ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、７８：６６３３−６６３７（１９８１）およびブリガチ（Ｂｒｉｇａｔｉ）、Ｄ．Ｊ．ら、ウイルス学（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１２６：３２−５０（１９８３）。あるいは、染色体特異的ライブラリーのＤＮＡを直接ニック翻訳によりビオチン標識した（ベクターのアームを分離しないで）。
【００３３】
プローブの大きさ
プローブの浸透を促進しかつ再アニーリングハイブリダイゼーションを最適化するために、５００ヌクレオチドより小さい標識したＤＮＡ断片を有することが望ましい；プローブの大部分は一般に１５０〜２５０ヌクレオチドの長さである。ＤＮアーゼの濃度をニック翻訳反応において実験的に確立して所望の大きさの範囲の断片を生成し、そしてこれをアガロースゲルの電気泳動により評価した。ランダムプライマーの伸長を、また、匹敵するＤＮＡの大きさの分布を生ずる条件下に実施した。
【００３４】
競争ＤＮＡ
記載されたように調製した、ヒトゲノムのＤＮＡ（胎盤または白血球から）、ならびにサケの精巣のゲノムのＤＮＡ［シグマ（Ｓｉｇｍａ）］をＤＮアーゼで消化して、プローブＤＮＡと同一の大きさ分布をもつ断片を生成し、次いでフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱させた。デイビス（Ｄａｖｉｓ）、Ｌ．Ｇ．ら、「分子生物学における基本的方法（Ｂａｓｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ）」、エルセビーア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、ニューヨーク  アムステルダム（１９８６）。これらの競争ＤＮＡは、第２図を参照して記載したように、プローブ配列とともに変化する比率で使用した。
【００３５】
再アニーリングおよびハイブリダイゼーション
標準の条件下に、５μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌのライブラリーのインサートの断片を表す、ビオチン標識したＤＮＡ、および変化する量の競争ＤＮＡを一緒にし、エタノール沈澱させそしてホルムアミドの中に再懸濁した。プローブの濃度を調節して、各染色体標的の相対的ＤＮＡ含量を反映させた。例えば、染色体１は染色体２１のほぼ５．３倍のＤＮＡを含有する；こうして、使用するプローブの濃度は、それぞれ、３０μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌであった。メンデルソーン（Ｍｅｄｅｌｓｏｈｎ）、Ｍ．Ｌ．ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１７９：１１２６−１１２９（１９７３）。精製したＤＮＡインサート代わりにプローブの混合物として全体の全ライブラリーＤＮＡを使用したとき、１０倍程度に多いＤＮＡを大量のベクター配列を保証するために添加した。Ｘ−染色体ライブラリー、ＬＡ０ＸＮＬ０１、の場合において、２倍程度に多い標識したライブラリーＤＮＡを使用した。なぜなら、ヒトＤＮＡインサートは全ＤＮＡのほとんど半分を構成するからである。比較の目的で、ハイブリダイゼーション混合物中のヒト競争ＤＮＡの濃度を１〜１．０ｍｇ／ｍｌで変化させ、そしてサケの精巣ＤＮＡを必要に応じて添加して、５０％のホルムアミド、１×ＳＳＣ（０．１５モルの塩化ナトリウム、０．００１５モルのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）および１０％の硫酸デキストラン中のＤＮＡの最終濃度を１．０ｍｇ／ｍｌとした。これらの溶液を７５℃に５分間加熱してＤＮＡを変性し、次いで３７℃において種々の時間インキュベーションして部分的再アニーリングを促進した。予備アニーリング工程をエッペンドルフ管中で、検体へのハイブリダイゼーション混合物の適用直前に、実施した。ガラススライド上の核および染色体のスプレッドを７０％のホルムアミド、２×ＳＳＣ］中で７０℃において２分間インキュベーションして、染色体のＤＮＡを変性し、次いで１系列の氷冷エタノール中で脱水した（７０％、９０％および１００％、各々３分間）。予備アニーリングしたプローブ混合物（２．５μｌ／ｍ２）を４２℃予備加温したスライドに適用した後、カバースリップを添加し、そしてゴムセメントでシールした。次いで、試料を直ちに３７℃において湿った室内で１０〜２０時間インキュベーションした。
【００３６】
パラホルムアルデヒドの固定を使用して検体の３−Ｄ構造を最適に保存した場合において、スライドを５０％のホルムアミド、１×ＳＳＣ（２×５分）中で平衡化し、過剰の流体を試料を乾燥せずに除去し、プローブ混合物を添加し（５μｍ／ｃｍ２）、そしてカバースリップを取り付け、そしてゴムセメントでシールした。マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｅｓ）、Ｌ．アナル・オブ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、４５０：２０５−２２１（１９８５）。両者のプローブおよび細胞のＤＮＡの変性は７５℃において５分間実施した後、ハイブリダイゼーションを３７℃において一夜進行させた。
検出
ハイブリダイゼーション後、スライドを５０％のホルムアミド、２×ｓｃｃ（３×５分、４２℃）中で洗浄し、次いで０．１×ＳＳＣ（３×５分、６０℃）中で洗浄した。その後、スライドを３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、４×ＳＳＣと３７℃においてほぼ３０分間インキュベーションした。ビオチニル化プローブの検出は、フルオレセイン標識したアビジンまたはアビジン−アルカリ性ホスファターゼ複合体を使用して達成した。すべての検出試薬は４×ＳＳＣ、０．１％のツイーン２０、１％のＢＳＡ中で構成し、そしてすべての洗浄は４×ＳＳＣ、０．１％のツイーン２０（３×３分、４２℃）中で実施した。蛍光色素の検出のために、スライドを５μｇ／ｍｌのフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）接合アビジンＤＣＳ［ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）］と３７℃において３０分間インキュベーションし、次いで洗浄した。希な場合において、ＦＩＴＣシグナルは、５μｇ／ｍｌのビオチン接合ヤギ抗アビジンＤ抗体（ベクター・ラボラトリーズ）と３７℃において３０分間インキュベーションし、次いで洗浄し、５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ接合アビジン（３７℃、３０分）と第２回のインキュベーションを実施し、最後に洗浄することによって増幅した。ピンケル（Ｐｉｎｋｅｌ）、Ｄ．ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８３：２９３４−２９３８（１９８６）。酵素活性による検出のために、試料を２．５μｇ／ｍｌのストレプトアビジンとインキュベーションし、洗浄し、２μｇ／ｍｌのビオチン接合アルカリ性ホスファターゼ（ベクター・ラボラトリーズ）とインキュベーションし、再び洗浄し、そしてＡｐ−緩衝液９．５（１００ミリモルのトリスＨＣｌ、ｐＨ９．５、１００ミリモルのＮａＣｌ、５０ミリモルのＭｇＣｌ２）中で２×５分間室温において予備平衡化した。酵素反応を３３０μｇ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および１６５μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）を含有するＡＰ緩衝液９．５中で３７℃において０．５〜１時間実施し、そして２×ＳＳＣ中のインキュベーションにより停止した。すべての調製物は２００ｎｇ／ｍｌの４，６−ジアミジノ−７−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）、２×ＳＳＣで５分間室温において反対染色し、そして２０ミリモルのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、２．３％のＤＡＰＣＯアンチフェーソ（ａｎｔｉｆａｄｅ）、１，４−ジアザビシクロ−２（２，２，２）オクタンを含有する９０％のグリセロール中で取り付けた。ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｇ．Ｄ．ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、５５：２３１−２４２（１９８２）。
デンシトメトリー
フレームグラッバー（ＩＴＥＸ  ＦＧ−１０１、画像形成技術）ａｈｖグラフィックス・ワークステーション［ＶＡＸステーションＩＩ／ＧＰＸ、ディジタル・イクウィップメント・コーポレーション（Ｄｉｇｔｉａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｔａｔｉｏｎ）］およびツァイス（Ｚｅｉｓｓ）Ｓ−プラナー（Ｐｌａｎａｒ）６０ｍｍレンズを有するデイジ（Ｄａｇｅ）−ＭＴＩ−６５ビデオカメラを、マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｌ．およびＪ．ボーデン（Ｂｏｒｄｅｎ）、クロモソーマ（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ）、９６：３９７−４１０（１９８８）に記載されているように使用した。画像をネガから直接ディジタル化し、そしてディスクに保存した。バックグラウンドを除去し、そして各染色体のまわりの多角形領域を定めた。限界の密度のレベルを使用して、定めた多角形の区域内の染色体の領域の輪郭を描いた。これらの輪郭を描いた染色体の領域、Ｒ、内の平均の密度のレベルを合計のシグナル∫Ｉ（ｘ，ｙ）ｄＲ／面積Ｒにより決定し、ここで∫Ｉ（ｘ，ｙ）は領域Ｒ内の各点における絵素の強度（０〜２２５）である。限界のバックグラウンドの強度を、標識した染色体７およびバックグラウンドの染色体の両者について、平均の領域の密度から減じた。シグナル対ノイズの比を平均の染色体７のシグナル／平均のバックグラウンドの染色体のシグナルとして計算した。
【００３７】
前述の研究の結果を下に説明する。これらの結果は、示した個々の染色体の特異的標識づけを明瞭に実証する。最初の節はビオチンで標識した染色体のライブラリーのインサートの使用を説明し、そして第２の節はＤＮＡインサートの断片の使用を説明する。
【００３８】
第２図は、後述するように、異なる濃度による、染色体７誘導ＤＮＡライブラリー内の交差反応した配列からのシグナルの抑制を示す。
【００３９】
第２図Ａは、ビオチンで標識し、そしてヒト競争ＤＮＡをもたない正常ヒトリンパ球からの分裂中期スプレッドにハイブリダイゼーションした、染色体７ライブラリーのインサートを示す。２つのＮｏ．７染色体の優勢の標識づけが観察される；さらに、ハイブリダイゼーションの明確なバンド様パターンが大部分の他の染色体上に見られ、そして２つのＥ−群の染色体はことに鮮明に染色されている。この一般的染色体のバンディングのパターンはＲ−バンディングに類似し、そしてバックグラウンドの交差ハイブリダイゼーションのシグナルの有意の部分がＡｌｕ反復配列から由来することを示唆する。従来の研究は、Ａｌｕ配列がＲ−バンディングのパターンを描写するが、ギエムサ（Ｇｉｅｍｓａ）陽性バンディング及びプロフィルはＫｐｎＩ散在反復により際立っている。マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｌ．およびＣ．Ｄ．ワード（Ｗａｒｄ）、クロモソーマ（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ）、９１：２８−３８（１９８４）。
反復要素からハイブリダイゼーションシグナルを排除する実験手順の確立
したがって、１系列のパイロットの研究を実施して、このような反復配列からハイブリダイゼーションシグナルを排除するための実験のパラメーターを確立した。溶液中の核酸の再アソシエーション（ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の反応速度論は、核酸の合計の濃度（Ｃｏ、ヌクレオチドのモル数／リットル）および復元の時間（ｔ、秒）に依存する。再アソシエーションの条件が温度（ホルムアミドの濃度を考慮する）、カチオンの濃度および緩衝系について標準化されるとき、再アソシエーションの反応速度論Ｃｏｔ値に関して比較可能である。規定された条件下に、高度に反復性のＤＮＡを含有する哺乳動物のゲノムの速い再アソシエーションの分画は１×１０−１〜５×１０−１のＣｏｔ値において完全に再アニーリングされる；中程度の反復ＤＮＡを含有する中間の分画は１×１０２のＣｏｔ値において完全に復元される。ブリッテン（Ｂｒｉｔｔｅｎ）、Ｒ．Ｊ．およびＤ．Ｅ．コーネ（Ｋｏｈｎｅ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１６１：５２９−５４０（１９６８）。こうして、１．０ｍｇ／ｍｌのヒトＤＮＡ濃度（３×１０−３モルのヌクレオチド／リットルに相当する）において、速い分画はほぼ１０秒で復元されるが、中程度の反復ＤＮＡは完全な再アニーリングに到達するために９時間以上を要するであろう。偏在する反復ＤＮＡの大部分またはすべてを含有する再アソシエーションするＤＮＡの速い分画は交差ハイブリダイゼーションシグナルを引き起こすので、１．０ｍｇ／ｍｌの合計のＤＮＡ濃度を使用し、そしてプローブ混合物の部分的アニーリングは検体への適用前に可能であった。最適な復元時間は実験的に決定した（下を参照）。これは重要であった。なぜなら、正常部位ハイブリダイゼーションは再アソシエーションの反応速度論が決定される標準の条件（例えば、３７℃における５０％のホルムアミド中のハイブリダイゼーションは約７０℃における０％のホルムアミドに相当する；硫酸デキストランは、また、再アソシエーション時間を有意に増加する）から偏るからである。さらに、中程度の反復ＤＮＡが非特異的シグナルにどの程度寄与するか、したがって、また、予備アニーリング手順によりハイブリダイゼーションから防止されるかは不明瞭であった。
【００４０】
再アニーリングおよび正常部位ハイブリダイゼーションの実験のための厳格さを、５０％のホルムアミド中で３７℃（標準の正常部位ハイブリダイゼーションのプロトコルから適合した）および１×ＳＳＣ［０．１６５モルのこのカチオン濃度は反応速度論、ブリッテン（Ｂｒｉｔｔｅｎ）、Ｒ．Ｊ．およびＤ．Ｅ．コーネ（Ｋｏｈｎｅ）の研究において使用した濃度に近い。ブリッテン（Ｂｒｉｔｔｅｎ）、Ｒ．Ｊ．およびＤ．Ｅ．コーネ（Ｋｏｈｎｅ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１６１：５２９−５４０（１９６８）］において決定した。競争ヒトＤＮＡを再アソシエーション手順において添加して、所望の最終の高いＤＮＡ濃度にしそして予備アニーリングするであろうＤＮＡ配列の高い反復レベルを維持した。合計のヒトゲノムのＤＮＡは予備アニーリングにより除去すべき高度に反復性のＤＮＡのすべてを表すが、それは、また、標的染色体の配列を含有する。こうして、過剰量のヒトＤＮＡの添加は染色体特異的シグナルを減少することが期待されるであろう。したがって、競争体として使用する合計のヒトＤＮＡの最適な濃度をまず決定した。合計のＤＮＡ濃度を１．０ｍｇ／ｍｌの一定に保持するために、ゲノムのサケＤＮＡを必要に応じて添加した。サケＤＮＡはある種の反復ＤＮＡ要素、例えば、ヒトＤＮＡに普通であるポリｄＣｄＡを共有するが、他のもの、最も顕著にはＡｌｕ−およびＫｐｎＩ反復を欠く。ハマダ（Ｈａｍａｄａ）、Ｈ．ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、７９：６４６５−６４６９（１９８２）。これは、再アソシエーション反応においてサケＤＮＡの量が増加するにつれて、後者の配列の頻度を低下する。
【００４１】
第２図は、２０μｇ／ｍｌの染色体７のプローブの組を５０μｇ／ｍｌ（Ｂ）、１００μｇ／ｍｌ（Ｃ）、２００μｇ／ｍｌ（Ｄ）または１０００μｇ／ｍｌ（Ｅ）の，２０分間予備アニーリングしたＤＮアーゼ消化ヒトゲノムのＤＮＡと一緒に変性したとき得られた、典型的な実験結果を示す。ハイブリダイゼーションおよびアビジン−ＦＩＴＣを使用する検出は、前述したように実施した。各調製物について、１０枚の黒白の写真をデンシトメトリーの研究のために標準化した写真の条件下に撮った（下を参照）。ヒトゲノムの競争体の不存在下に（Ａ）、シグナルは染色体特異的をほとんど示さなかった。しかしながら、５０および１００μｇ／ｍｌのヒト競争ＤＮＡでは、標識特異性が容易に明らかである（第２図Ｂ，Ｃ）。染色体７の特異的染色は１００および２００μｇ／ｍｌヒト競争ＤＮＡを使用してシグナルの強度のピークで達成された（第２図Ｃ、Ｄ）。より高い濃度のヒトＤＮＡは、ことに１０００μｇ／ｍｌのヒトＤＮＡにおいて、シグナルの強度の明らかな減少を引き起こした（第２図Ｅ）。しかしながら、これらの後者の条件下に得られたシグナルは観測者に合理的になお輝いているが、最適な例示には異なる露出を必要とする（図示せず）。
【００４２】
定量的デンシトメトリーのコンピューターにより助けられる方法（上を参照）を使用して、標識づけの特異性の全体のレベルを確立した。問題の標的染色体からの蛍光性シグナル対非標的染色体から発するバックグラウンドの蛍光性のノイズの比は、第２図に図解するように、ＤＮＡの滴定実験の多数の写真ネガからディジタル化した画像から決定した。ヒト競争ＤＮＡの各濃度で得られたシグナル対ノイズ比を表１に記載する。
【００４３】
【表１】
2005245452.tif 000003
【００４４】
非特異的シグナルの抑制のために最適な再アニーリング条件（２０μｇ／ｍｌの染色体７のプローブおよび１００〜２００μｇ／ｍｌのヒトゲノムのＤＮＡを使用する）は、約８：１のシグナル対ノイズの比を与えた。ハイブリダイゼーションの厳格さを増加することによって（例えば、０．×ＳＳＣ）シグナル対ノイズ比を改良する追加の試みは、明らかな改良を与えず、そしてシグナル強度の全体の減少に導いた。
【００４５】
約１００〜２００μｇ／ｍｌのヒト競争ＤＮＡは最適の特異性を与えることが示されたので、２００μｇ／ｍｌを復元時間に関するシグナルの特異性の他の分析のために使用した（上を参照）。０、２、５、１０、２０、４０および５０分の予備アニーリング後、アリコートを取り、そして前述のように正常部位ハイブリダイゼーションの実験のために使用した。第３図に示すように、特異的標識づけはすべての予備アニーリング時間について得られた。シグナルの小さい改良は復元時間を０から２０分に増加するとき見られる。６０分までのより長い再アニーリング時間（示さない）は、シグナルの強さまたは染色体特異性において有意の改良を与えなかった。２０分の予備アニーリングを使用するシグナルの主観的印象（第３図Ｄ）は、前述したように実施した、デンシトメトリーの分析により確証することができなかった。なぜなら、異なる予備アニーリング時間のシグナル対ノイズ比の有意差が観測されなかったからである（データは示されていない）。したがって、すべての引き続く実験における標準の復元時間は１０〜２０分であった。シグナルは復元時間０において明瞭に見ることができるので、プローブ混合物を顕微鏡のスライドに移すために必要な数秒は交差ハイブリダイゼーションにより非特異的標識づけを引き起こす多数の配列を有効に予備アニーリングするために十分であると思われる。さらに、大過剰の一本鎖の競争ＤＮＡはビオチニル化プローブ配列と、ハイブリダイゼーション反応の間に、偏在する染色体標的について効率よく競争することができる。これらの結果が実証するように、高度に反復性のＤＮＡ配列の大部分は十分に抑制されて、正常部位ハイブリダイゼーションによる染色体特異的標識づけを達成する。
【００４６】
ある場合において、全染色体にわたるシグナルの分布は実験毎に多少の変動を示す。全体のシグナルが減少するとき、ある染色体の小領域はより明るい染色を示す；これらのシグナルのホットスポットは一般に染色体特異的反復配列を含有する染色体部位を構成する。第２図および第３図に示す実験において、染色体７の動原体領域の優勢の染色が見られ、これはアルフォイドの反復ＤＮＡの染色体特異的シグナルに相当する。ワイ（Ｗａｙｅ）、Ｊ．Ｓ．ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、７：３４９−３５６（１９８７）および参照、実施例２。明らかなように、これらの反復配列の存在はここで使用する条件下にそれらの抑制を防止するために十分に低い。等しくないシグナルの分布は、前述したように抗体サンドイッチ技術を使用して全体のシグナルを増幅することによって克服することができる。さらに、サテライトＩＩＩＤＮＡの染色体部位に相当する領域１ｑ１２の優勢の染色は、染色体１を標識するとき頻繁に観測された。クーケ（Ｃｏｏｋｅ）、Ｈ．Ｊ．およびＪ．ヒンドレイ（Ｈｉｎｄｌｅｙ）、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、６：３１７７−３１９７（１９７９）およびゴスデン（Ｇｏｓｄｅｎ）、Ｊ．Ｒ．ら、キャンサー・ジェネティックス・アンド・サイトジェネティックス（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．）、２９：３２−３９（１９８１）および参照、実施例２。このような増幅後に見られる、釣り合ったシグナル分布の例は第４図Ａ示されている。
【００４７】
各々が単一のヒト染色体を表す、いくつかの商業的に入手可能なＤＮＡライブラリーを、前述の標準化された再アニーリングの条件下に、前述したように、染色体部位について調節したプローブ濃度で、それらが表す染色体を特異的に標識するそれらの能力について試験した。第４図に示すように、染色体１、４、７、１３、１８および２０についての、いくつかの例が明瞭に実証するように、特異的標識づけはほとんどの染色体ライブラリーを使用して達成することができる。表２は、それらの特異的に標識する相対的スコアで試験したライブラリーを記載する。すべてのスコアは、問題の染色体が常にデコレーションされたので、陽性である。他の染色体に対する有意の交差ハイブリダイゼーションが観測されないとき、最高のスコア（４＋）を使用し、そしてＣＩＳＳハイブリダイゼーションする配列の量が増加するにつれて、スコアを減少する（３＋から１＋に）。
【００４８】
【表２】
2005245452.tif 000004
【００４９】
実験の条件を変化することによって他の染色体上の追加のシグナルを減少するすべての試みは、染色体２２を使用する実施例を除外して失敗した；この場合において、より高い濃度のヒト競争ＤＮＡ（７００μｇ／ｍｌ）はシグナルの特異性を有意に改良した。最低の染色体特異性を示すライブラリーは染色体１３のライブラリーであった（第４図Ｅ）。他の染色体上の多数の小さい結合部位、ならびにＹｑ１２の例外的に輝いた染色が観測された；Ｙ染色体上のシグナルは競争体として女性または男性のヒトＤＮＡを使用して見ることができた。試験した実験のパラメーターのいずれもこのライブラリーの特異性を改良しなかった。
【００５０】
顕著なことには、弱いシグナルか、あるいはシグナルの不存在さえをある染色体の動原体領域において観測することができる（参照、染色体４および１８、第４図Ｃ、Ｄ）。染色体特異的反復要素を含有する染色体１および７と対照的に、染色体４および１８の動原体領域は、反復配列、最もアルフォイドサテライトＤＮＡと思われる反復配列を明らかに含有し、これらは非常に豊富に存在し、こうして再アニーリング技術により抑制される。しかしながら、これらの染色体領域は非常に小さく、そしてその作用は対応する染色体がかなり細長いときにのみ観測することができる。
【００５１】
ビオチニル化された合計のライブラリーＤＮＡ（ファージのベクター配列を含有する）を、また、ヒトＤＮＡインサートの量に調節した濃度で、プローブとして使用した（上を参照）。１つの例はｃ２０のライブラリーとともに第４図Ｆ示されている。問題の染色体のすぐれた染色は一般に達成されたが、全体のスライド上の有意の非特異的バックグラウンドは共通の問題であった。ラムダファージのライブラリーからスクリーニングしたヒトＤＮＡを含有するプラスミドのライブラリーを使用して、同様な結果が得られた。対照的に、全染色体ライブラリーＬＡ０ＸＮＬ０１を使用してバックグラウンドの問題は存在しなかった。このライブラリーは、ヒトＤＮＡインサートの大きさは非常に大きいので、プローブ混合物の中に有意により小さい比率のベクター配列を含有する。
【００５２】
この再アニーリング技術により反復配列の抑制は、また、間期核内の染色体のドメインの検出にフローソーテッド（ｆｌｏｗ−ｓｏｔｅｄ）染色体の表面を可能とする。染色体１、染色体７および染色体１８のプローブの組を酢酸−メタノール沈澱後の正常ヒトリンパ球にハイブリダイゼーションした後得られた結果の典型的な例を、第５図に示す。ハイブリダイゼーションシグナルの離散した焦点のドメインはが見られ、すべてのライブラリーは２＋またはそれ以上のスコアを有する（参照、表２）。
【００５３】
ほとんどの核（ｎ≧１００／推定値）は２つのドメインを示した（６０〜７０％）；しかしながら、有意の数は１つのみのドメインを示した（２０〜３０％）か、あるいはハイブリダイゼーションシグナルをまったく示さなかった（５〜１０％）。したがって、Ｘ染色体ライブラリーＤＮＡをプローブとして使用したとき、男性の核の約９５％は１つを示し、そして約５％はハイブリダイゼーションシグナルを示さなかった。顕著なように、試験した染色体のプローブの組のいずれについても、３つのドメインをもつ核は発見されなかった。対照的に、すべての分裂中期スプレッドは、例外なく両者の染色体の相同体のデコレーションを示した。この間期の変動性は、一部分、ある細胞における２つの個々のドメインの密接な並置を反映するか、あるいは核の体積内の異なる領域を実際に占有するが、二次元の画像形成方法により検査したとき分割されないドメインの分割不可能性を反映する［参照、第５図Ｄ；論考については、また、参照、クレマー（Ｃｒｅｍｅｒ）ら、エキスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．）、１７６：１９９−２２０（１９８８）］。ハイブリダイゼーションシグナルを示さない小さい数の核は、最適以下のハイブリダイゼーション条件の反映であろう。核内のドメインの大きさは同種の分裂中期染色体の相対的大きさとよく合理的に相関関係をもつことに注意することは重要である。これらの観察は、個々の染色体のＤＮＡが正常ヒト細胞の間期核において明瞭な境界の有機化を示す明確な証拠を提供する。
【００５４】
酢酸−メタノール固定した核のスプレッド、例えば、第５図に示すものは、検査した染色体の各々のための境界の有機化を明らかに保持する；しかしながら、核の構造は最適には保存されない。パラホルムアルデヒド固定したヒト二倍体の線維芽を使用しそして３−Ｄ画像の再構成にレーザー走査共焦点蛍光顕微鏡アセブリーを使用する、３−Ｄ構造をよりよく保持する検体の追加の研究を実施した。細胞をマヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）が記載するように固定しそして浸透化し、そして上に概説したように染色体ライブラリーのプローブとハイブリダイゼーションした。マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｌ．、アナル・オブ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、４５０：２０５−２２１（１９８５）。プローブ−競争ＤＮＡ混合物をスライドに直接適用し、そして細胞ＤＮＡと同時に変性した。結果は、核中の染色体７のドメインの配置および染色体ドメイン内の頻繁に観測される標識されたらせん構造を示した。このらせん性が真のドメイン小構造を反映するか、あるいは調製および固定手順を反映する人工物である程度は、現在研究中である。それにもかかわらず、この予備的観測は、間期細胞における染色体のドメインのトポグラフィーを分析するために染色体特異的プローブの使用が可能であることを確立する。
実施例２  染色体特異的ライブラリーのプローブを使用するＣＩＳＳ
ハイブリダイゼーションにより腫瘍細胞中の染色体異常の検出
細胞
ＴＣ５９３はヒト神経膠芽細胞腫から確立された偽四倍体の細胞系
（形態上の染色体番号、８３）である；それは平らな広がる方法で成長し、そして多数のプロセスを含有する。ＴＣ６２０は形態上の染色体番号６４をもつ偽三倍体であり、そしてヒト乏突起神経膠腫から確立された；それは上皮の方法で成長する。両者の細胞系を詳細に説明する。マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｌ．およびＥ．Ｅ．マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、神経病理学における進歩（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ．４、２３５−２６６、レイブン・プレス（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９７９）。この実験は、マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）およびマヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）に従来記載されているようにして（上の参考文献を参照）、培養した本来の腫瘍系統の単細胞から反復してスクリーニングした後ほぼ１８０回の継代培養で、サブクローンＣ２Ｂ（ＴＣ５９３）およびＣ２Ｂ（ＴＣ６２０）を使用した。細胞の標準の低張処理および酸／メタノールの固定を使用した。クレマー（Ｃｒｅｍｅｒ）ら、エキスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．）、１７６：１９９−２２０（１９８８）。
ＤＮＡプローブおよびライブラリー
ソーティングしたヒト染色体からのファージＤＮＡライブラリーは、ＡＴＣＣから入手した：ＬＡ０１ＮＳ０１（染色体１）、ＬＬ０４ＮＳ０１（染色体４）、ＬＡ０７ＮＳ０１（染色体７）、ＬＬ１８ＮＳ０１（染色体１８）およびＬＡ２２ＮＳ０３（染色体２２）。これらのライブラリーの増幅、ヒトＤＮＡインサートの分離およびビオチニル化は、実施例１に記載するようにして実施した。染色体７上のアルフォイドの反復に対して特異的なプローブ（ｐａ７ｔｌ）は、Ｈ．ウィラーソ（Ｗｉｌｌａｒｄ）の贈り物であり、そして高い厳格さの条件下（６０％のホルムアミド）に染色体７の動原体周囲の異質染色質を特異的にデコレーションする。ワイ（Ｗａｙｅ）ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、７：３４９−３５６（１９８７）；クレマー（Ｃｒｅｍｅｒ）ら、エキスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．）、１７６：１９９−２２０（１９８８）。あるＤＮＡプローブをアミノアセチルフルオレイン
（ＡＡＦ）で修飾した；そしてクレマー（Ｃｒｅｍｅｒ）らにより記載されているように二重標識づけ実験のために検出した。ランデゲント
（Ｌａｎｄｅｇｅｎｔ）ら、エキスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．）、１５３：６１−７２（１９８４）；クレマー（Ｃｒｅｍｅｒ）ら、エキスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．）、１７６：１９９−２２０（１９８８）。
正常部位ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションしたプローブの検出
ビオチニル化ライブラリーのＤＮＡインサートとのＣＩＳＳハイブリダイゼーションおよびハイブリッド分子の検出は、一般に、実施例１に詳細に記載されているようにして、標準の条件を使用して実施した。ビオチニル化染色体７のライブラリーＤＮＡインサートおよびＡＡＦ修飾７アルフォイドプローブを使用する二重ＣＩＳＳハイブリダイゼーションにおいて、後者のプローブを別々に熱変性し、そして再アニーリング工程の終わりにおいて１０μｇ／ｍｌの最終濃度でハイブリダイゼーション混合物にのみ添加した（参照、実施例１）。
特異的にデコレーションした分裂中期および間期の染色体のディジタル画像の分析
ＩＴＥＸ  ＦＧ  １００−Ｑフレーム・グラバー（イメジング・テクノロジー）を有するＶＡＸステーションＩＩ／ＧＰＸグラフックス・ワークステーション（ディジタル・イクウィプメント・コーポレーション）を、前述したように、ツァイスＳ−プラナー６０ｍｍレンズおよびＤａｇｅ−ＭＴＩビデオカメラと一緒に使用した。マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｌ．およびＪ．ボーデン（Ｂｏｒｄｅｎ）、クロモソーマ（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ）、９６：３９７−４１０（１９８８）。画像を分裂中期スプレッドおよび間期核のネガからディジタル化した；バックグラウンドを除去し、そして多角形領域を特異的にデコレーションされた分裂中期の染色体または間期のドメインに定めた（参照、実施例１）。走査線のアルコリズムを使用して、多角形領域内のヒストグラムを計算した。定めた領域内の特定の強度（０〜２５５）のヒストグラムＨ（ｉ）の値はその強度ｉにおいて絵素の数であるので、強度の範囲ｉ０−ｉ１内に入る領域内の面積はｉ０−ｉ１からのヒストグラムの積分である。同様に、強度の範囲ｉ０−ｉ１により定められる領域中の２−Ｄの積分＝ΣＨ（ｉ）．ｉ０．ｉ１を各ハイブリダイゼーションのために選択して、デコレーションされた染色質を適切に輪郭を明らかにし、そしてこの区域をバックグラウンドの領域と区別した。ｉ１は最大値２５５にセットして、限界より上の全体の強度の範囲を捕捉した。
【００５５】
合計のシグナル強度対面積の測定は、間期核内の変化する染色体ドメインの拡張の潜在的存在のための対照として設計した。間期において、より拡張した染色体ドメインはより大きい面積（または体積）を有し、しかもより低い蛍光性のシグナル強度／単位面積を有することが期待できるであろう。一定量のハイブリダイゼーションしたＤＮＡが一定の合計の蛍光に相当する場合、合計のシグナル強度は標識されたＤＮＡ含量の測度である。また、核内の３−Ｄハイブリダイゼーションした体積および３−Ｄ積分した合計のハイブリダイゼーションしたシグナルを測定することができる。マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｌ．およびＪ．ボーデン（Ｂｏｒｄｅｎ）、クロモソーマ（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ）、９６：３９７−４１０（１９８８）。バックグラウンド、ｂ、は標識された領域内の明確な２−Ｄ積分∫∫Ｉ（ｘ，ｙ）ｄＡから減じて合計のシグナルを生成した：Ｓｉｇｔ＝∫∫Ｉ（ｘ，ｙ）ｄＡ−ｂ∫∫ｄＡ、ここでｄＡは単一の絵素である。同様に、領域内の平均の強度は２−Ｄ積分／面積または∫∫Ｉ（ｘ，ｙ）ｄＡ／∫∫ｄＡとして計算される。
【００５６】
前述の研究の結果を、適当な図面を参照して、次に説明する。それらはヒト神経膠腫細胞系における、全体の個々の染色体および染色体の小領域の損失および獲得を包含する、構造および量の変化を明瞭に説明する。それらは、また、各細胞系における両者の小さいおよび優勢の核型の特徴を特性決定することができたことを示す。今日まで試験したすべての染色体（すなわち、１、４、７、１８および２２）数および／または構造の異常を明瞭に際立たせ、それらのあるものは不安定であった。
【００５７】
分裂中期スプレッドにおける数および構造の染色体異常の検出
第６図〜第８図および第１２図は、ヒト染色体１、４、７、１８および２２の各々からのビオチニル化ＤＮＡインサートとのＣＩＳＳハイブリダイゼーション後の、悪性神経膠腫細胞系ＴＣ６２０およびＴＣ５９３からの典型的な分裂中期スプレッドを示す。ハイブリダイゼーションしたインサートをアビジンフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）で検出し、そして細胞を４，６−ジアミジノ−７−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）で反対染色した。「完全」と表示した染色体は明らかに正常の大きさの、動原体インデックスおよびＤＡＰＩ染色パターンを有した。この表示にかかわらず、これらの完全な染色体は追加の研究によってのみ検出可能な、繊細な構造の異常を含有することができる（下を参照）。明らかに、完全な染色体１、４、７、１８および２２は両者のＴＣ６２０およびＴＣ５９３において観測された。さらに、これらの染色体の他の相同体は、転座および欠失を包含する、有意の転位および異常を示した。これらの細胞系の各々において描写された優勢の数および構造の異常を下に記載する。最小２５のすぐれた分裂中期スプレッドは、各神経膠腫細胞系および各染色体のために評価した。これらのデータを第９図に要約する。
染色体１
ＴＣ６２０において、乏突起神経膠腫系統において、染色体１のインサートは２つの明らかに完全な１染色体および２つのマーカーの転座染色体をデコレーションした（第６図Ａ、第６図Ｂ、第９図）。一方のマーカーは中部動原体であり、そして完全にデコレーションされた１ｑアームを含有したが、そのｐアームは他の染色体（未知の由来の）からのものであった。他方のマーカー染色体は中部動原体下であり、そして１ｐアームに取り付けられた他の染色体からの小さいセグメントを示した。両者のマーカー染色体において、破壊点は１ｐ１１または１ｑ１１における動原体に密接して局在化した。１ｐセグメントの同定は、ＤＡＰＩバンディングにより（第６図Ｂ）、５’−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）のバンディングにより、そして１ｐ３６．３プローブとのハイブリダイゼーションにより（データは示さない）確立した；１ｐ３６．３プローブは、さらに、明らかに完全な１染色体の１つ中のこの小領域の試料をさらに明らかにした。全体の写真は染色体１のほぼ三染色体性の表示をもち、共通の破壊点および引き続く転座を有した。
【００５８】
ＴＣ５９３、神経膠芽細胞腫系統、において、なおいっそう複雑な数および構造の染色体１の異常のパターンが観察された。５０の分裂中期スプレッドの試料において、大部分（５２％）はデコレーションされた６つの異常染色体を示した；分裂中期の１４％は５つの異常の染色体を示し、そして３４％はより高い数の染色体１セグメント（１４までの）を示した。第６図Ｃ、Ｄおよび第９図は、最も典型的な、優勢の核型を示し、そしてこの細胞系における染色体１の異常の迅速な決定を実証する。異常は１ｐ１における首尾一貫した破壊点をもつ３つの末端動原体の染色体、１ｑの末端パーク（ｐａｒｋ）を欠失した染色体、完全な１ｑを損失した中部動原体下の転座の染色体、およびイソ（１ｐ）マーカー染色体（参照、第９図）を包含した。
染色体４
ＴＣ６２０において、染色体４特異的インサートは、１つの明らかに完全な染色体４、および染色体４のＤＮＡを含有するセグメントをもつ３つの追加の染色体をデコレーションした（第７図Ｆ、第９図）。転座染色体上のこれらの後者のセグメントは、バンディング手順単独では急速にかつ明瞭に定めることが困難であったであろう。転座した染色体４の最小のものは、ほぼ中部動原体の染色体の一部分を形成した。２つのより大きいセグメントは、異なる全体の大きさの中部動原体下の染色体上に見いだされた。より小さい染色体において、４の短いアームおよび長いアームの一部分は明らかな破壊点４ｐ２にもって存在した、すなわち、４ｐｔｅｒ−４ｑ２。より大きい中部動原体下の染色体において、４の残部を表すことができる領域（４ｑ２−ｑｔｅｒ）が現れる。こうして、ＴＣ６２０の優勢の核型はほんのわずかの２当量より大きい染色体を示した（参照、また、下に記載する面積の測定）。
【００５９】
ＴＣ５９３において、一般に染色体４のＤＮＡインサートによりデコレーションされたわずかに２つの染色体が存在し、そしてこれらの両者は正常の４染色体に匹敵した。ＴＣ５９３における分裂中期スプレッドのほぼ３０％は、染色体４の物質をもつ追加の中部動原体下の染色体を示した（第７図Ｅ）。こうして、両者の４染色体は明らかに正常であったが、この偽四倍体系統においてこの染色体の有意に低いリプリゼンテイションが存在した（第９図）。
染色体７
３つの完全な７染色体、および転座した７の物質を含有する１つのより小さい中部動原体の染色体が、典型的には、ＴＣ６２０分裂中期スプレッドの中に見いだされた（第８図Ａ、第９図）。転座した染色体７の物質は、染色体７の短いアーム（ＤＡＰＩバンディングにより示されるような；参照、第８図Ｂ）、および７ｑ１中の破壊点をもつ周辺動原体の異質染色質を包含した（また、下を参照）。
【００６０】
ＴＣ５９３において、染色体７のインサートのプローブにより完全にデコレーションされた５つの染色体は規則的に観測された（第７図Ｇ、第８図Ｅ）。これらのうちの４つは完全な染色体７を表すように思われるが、１つはより小さくそして中部動原体であった。ＤＡＰＩバンディング（第８図Ｅ、インサート）および大きさの測定（参照、第１３図）はイソ（７ｐ）と一致した。この結論は、さらに、ビオチニル化染色体７のインサート（アビジンＦＩＴＣで検出した）および染色体７特異的アルフォイドＡＡＦ標識配列（トリメチルローダミニソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）接合第２抗体で検出した）との二重正常部位ハイブリダイゼーション実験により支持された。それらが示したように、わずかに４つの完全な７染色体は検出可能な７動原体のシグナルを含有した（分裂中期、第７図Ｇ、Ｈ；間期、第７図Ｉ、Ｊ）。こうして、イソ（７ｐ）マーカー染色体は、７アルフォイド配列および７ｑ１１における異質染色質の小さいブロックの両者を欠くので、特徴ある動原体の領域をもたなかった（参照、第８図Ｅ、インサート）。対照的に、ＴＣ６２０のすべての４つの７染色体は７アルフォイドプローブにより標識された（データは示されていない）。
染色体１８
ＴＣ６２０において、２つの明らかに完全な１８染色体および切頭された小さい染色体は完全にデコレーションされた（第８図Ｃ、Ｄ、第９図）。この切頭染色体は１８ｑ−（および多分また１８ｐ−）である。
【００６１】
染色体１８を包含する３つの転座染色体は、典型的には、ＴＣ５９３の分裂中期スプレッド中の明らかに正常の染色体１８に加えて、検出された（第８図Ｆ、Ｇ、第９図）。小さい比率の分裂中期において、小さい追加の転座が観測される。この転座した１８物質が誘導された、正確な染色体の領域はＤＡＰＩ染色により分割することができなかった。したがって、１８について優勢の核型はこの細胞系において四染色体に近いが、擬三倍体のＴＣ６２０において低くリプリゼンテイションされている。
【００６２】
ＴＣ６２０における１８ｑ−マーカー染色体およびＴＣ５９３における３つの転座した１８染色体の両者は、染色体１８特異的アルフォイド反復に強くハイブリダイゼーションした。したがって、完全なおよび異常の両者の１８染色体は、また、この動原体のプローブとの正常部位抑制ハイブリダイゼーション後、カウントされることができたであろう。クレマー（Ｃｒｅｍｅｒ）、Ｔ．ら、エキスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．）、１７６：１９９−２２０（１９８８）（また、下を参照）。ＤＡＰＩバンディングおよび１８特異的アルフォイド反復へのハイブリダイゼーションは、これらの転座染色体が１８ｐに破壊点をもつ、全体の１８ｐ領域および動原体を包含することを示した。
染色体２２
２つの明らかに正常の２２染色体は、ほとんどのＴＣ６２０およびＴＣ５９３分裂中期スプレッドにおいて可視化された（第１０図Ｅ）。この染色体の小さい転座を確認することは困難であった。なぜなら、染色体２２インサートとのハイブリダイゼーションは他の染色体に対する多少の交差ハイブリダイゼーション生じたからである。この交差ハイブリダイゼーションのあるものは、多分、核の有機化領域からの共有された配列（５つの正常の末端動原体のヒト染色体上の）および動原体における共有された配列のモチーフのためである。マクダーミド（ＭｃＤｅｒｍｉｄ）。Ｈ．Ｅ．ら、クロモソーマ（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ）、９４：２２８−２３４（１９８６）および参照、実施例１。最後に、普通のバンディング分析と対照的に、現在の実験のアプローチは、非常に劣った量の分裂中期スプレッドにおいて（第１０図Ｇ、Ｈ）あるいは早期の前期核において（第１０図Ａ）数および構造の染色体異常を明瞭に描写することにことに注意すべきである。これらの調製物は、染色体が広範に互いに重なるので、バンディング分析が不可能である。
間期核中の染色体ドメインの評価
正常部位の方法の１つの潜在的な利点は、個々のヒト染色体を間期核中で明確な境界として直接可視化し、こうして充実腫瘍の検体の分析において価値を有することができることである。マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｌ、ヒューマン・ジェネティックス（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｔ．）、７１：２８８−２９３（１９８５）；シャーディン（Ｓｃｈａｒｄｉｎ）、Ｍ．ら、ヒューマン・ジェネティックス（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｔ．）、７１：２８１−２８７（１９８５）；ピンケル（Ｐｉｎｋｅｌ）、Ｄ．ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８３：２９３４−２９３８（１９８６）。核トポグラフィーのこの特徴は、また、ここで検査した悪性細胞において明らかであり（第７図Ａ−Ｄ、Ｉ、第１０図Ｂ−Ｆ）、その精度および診断的有用性について評価された。第１０図Ａは、３つの明らかに完全な７染色体および前期のＴＣ６２０核中の１つの切頭された７Ｐアームを示す。第３図および第１０図Ｂは、分裂中期スプレッドにおいて前に描写された、ＴＣ５９３の間期核における５つの染色体７のドメインを示す。第１０図Ｃは、正常二倍体核において見られたものに匹敵する大きさの２つの１８ドメインをもつ、ＴＣ６２０間期核を示す（参照、実施例１）。第３の、認められ得るほどに小さい、デコレーションされた１８ドメインは、また、検出され、そして前述の分裂中期スプレッドの中に見られた切頭１８染色体を表す。第１０図Ｄは、ＴＣ５９３の間期核中の４つの染色体１８のドメインを示し、これは再び分裂中期核における数に匹敵する。第１０図Ｅは４つの染色体１のドメインをもつＴＣ６２０の間期核を示すが、第１０図Ｆは少なくとも５つの別々の染色体１ドメインをもつＴＣ５９３を示す（参照、それぞれ、第６図Ａ、ＢおよびＣ、Ｄ）。
【００６３】
第１０図示されている核のハイブリダイゼーションパターンは各細胞系について高度に特徴をもつが、間期染色体のドメインのカウントはある固有の困難性を有する。１例として、第１１図Ａ（暗い柱）は、７ライブラリーインサートとハイブリダイゼーションした二倍体のヒトリンパ球の不規則的に選択した核における、標識された間期ドメインのカウントの分析を表す。染色体特異的ドメインの数および相対的大きさは大部分の核において正確に評価することができるが、すべての核が染色体の構成の信頼性ある指数を表すわけではない。なぜなら、核のかなりの分画は１つのみのデコレーションされたドメインを明らかにし、そして場合に応じて核はシグナルを全く示さないからである。さらに、すべてのドメインはこれらの２−Ｄの調製物において常に明瞭に分離可能であるわけではない。
【００６４】
第１１図は、これらの調製物の代表的なカウントを示す。染色体４のＴＣ５９３分裂中期のカウントと一致して、核のカウントは一般に３つの明瞭に分離されたドメインを示した（第１１図Ｅ）。しかしながら、２つのシグナルの調製物は分裂中期におけるより間期において小さかった（４５．３％対６４％）。この人工的減少は、大きく、ただ１つのデコレーションされたドメインを示すか、あるいはシグナルをまったく示さない核の対応する百分率の増加のためであった。０または１のドメインのカウントは分裂中期スプレッドにおいて存在しなかった。有意には、間期のＴＣ５９３の１９．３％は３つの明瞭に分離された染色体４のドメインを表し、そしてこれらの余分のドメインは同一の条件下にこれまたは他のライブラリーにハイブリダイゼーションした二倍体のヒトリンパ球の間期核の中に存在しなかった（第１０図Ａ；実施例１）。最後に、２つ対３つのドメインの比は両者の分裂中期および間期の細胞について同一であった。こうして、間期核は単一の染色体または染色体のセグメントの余分コピーの検出のために信頼性をもって使用することができるが、染色体のコピーの損失の検出について制限された信頼性を有する。
【００６５】
間期染色体の小領域からのプローブの正常部位ハイブリダイゼーションは、適当に高い厳格さの条件下に実施されるかぎり、ライブラリーのプローブより正確に染色体の構成の一般的カウントを反映することができる。ラポルド（Ｒａｐｐｏｌｄ）、Ｇ．ら、ヒューマン・ジェネティックス（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｔ．）、６７：３１７−３２５（１９８４）；クレマー（Ｃｒｅｍｅｒ）、Ｔ．ら、ヒューマン・ジェネティックス（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｔ．）、７４：３４６−３５２（１９８６）；クレマー（Ｃｒｅｍｅｒ）、Ｔ．ら、エキスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．）、１７６：１９９−２２０（１９８８）。しかしながら、このような領域のセグメントのプローブは、このセグメントを欠く、転座した要素または異常の染色体を描写しない。したがって、このようなプローブは、また、完全には正確ではない。例えば、１ｑ１２に対して特異的なプローブを使用するＴＣ６２０およびＴＣ５９３中の染色体１のカウントは、ＣＩＳＳハイブリダイゼーションを使用してここで示したより少ない１染色体を示した。クレマー（Ｃｒｅｍｅｒ）、Ｔ．ら、エキスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．）、１７６：１９９−２２０（１９８８）。動原体の配列のみを使用する染色体７のカウントは、この点を強調する（上を参照）。ＡＡＦ増幅した７アルフォイドのプローブおよび染色体７ライブラリーのインサートを使用する二重正常部位ハイブリダイゼーションは、典型的には、５ドメインをもつ間期核を示し、それらのうち４つのみは動原体のプローブで同時に標識された（第７図Ｉ、Ｊ、第１１図Ｃ）。しかしながら、ＴＣ６２０において、両者のプローブは同一の結果を与えた（第１１図Ｂ）。
特異的染色体の過度のリプリゼンテイションおよび低いリプリゼンテイション
これらの神経膠腫系における相対的染色体の投与量を、また、とくに興味ある染色体７を使用して評価し、この染色体７は一般に神経膠腫中で過度にリプリゼンテイションされることが認められた。ビグナー（Ｂｉｇｎｅｒ）、Ｓ．Ｈ．ら、キャンサー・ジェネティックス・アンド・サイトジェネティックス（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．）、２９：１６５−１７０（１９８６）；シャピロ（Ｓｈａｐｉｔｏ）、Ｊ．Ｒ．Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１３：４−１５（１９８６）。比較のため、他の個々の染色体のプローブを対照として使用した。分裂中期の染色体のカウントは、ＴＣ６２０が６４染色体の形態状の数をもつ擬三倍体であるが、ＴＣ５９３は８３の形態状の数をもつ偽四倍体であることを示した。マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｌ、およびマヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｅ．Ｅ．、神経病理学における進歩（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ．４、ｐｐ．２３５−２６６、レイブン・プレス（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９７９）。したがって、３つの完全なコピーがＴＣ６２０の中に存在し、そして４つがＴＣ５９３の中に存在する場合、染色体およびそのセグメントは一緒に釣り合った状態で存在するであろう。
【００６６】
これらのそれぞれのコピーの数より多くを実証することができる場合、相対的に過剰のリプリゼンテイションが存在する。期待した（三染色体または四染色体）の値よりより少ない数は、染色体が核型において相対的に低いリプリゼンテイションにあることを示す。追加のＤＡＰＩバンディングの情報が選択的にデコレーションされた異常の染色体を定めるために十分であった場合、染色体特異的インサートにより標識された染色体の片は分析のために一緒にされた（第９図）。第２のアプローチにおいて、コンピューターの分析を使用して、これらの結果を独立に評価した（下を参照）。
【００６７】
バンディングにより分析したＴＣ６２０は、同等の３つの１染色体を示し、こうしてこの染色体について釣り合った状態を示した。同一のことは４つのコピーの中に存在するＴＣ５９３中の１ｐアームついて真実であった。しかしながら、１ｑの末端部分はＴＣ５９３において低くリプリゼンテイションされた（参照、上の詳細な説明）。両者の神経膠腫系において、７ｑは釣り合っていると思われるが、７ｐはＴＣ６２０において過度にリプリゼンテイションされ、そしてＴＣ５９３において２倍にリプリゼンテイションされた。さらに、両者の神経膠腫系において、染色体２２は明らかに低くリプリゼンテイションされた。この発見を確証するために、染色体７および２２のインサートを使用する二重正常部位ハイブリダイゼーションを実施した。この例は第１２図示されており、そして同一の細胞における７のＤＮＡの過度のリプリゼンテイションおよび２２のＤＮＡの低いリプリゼンテイションを実証する。この分析方法により両者の細胞系において実施した分裂中期のカウントは第１１図Ｂにおいて染色体７について（暗い柱）および第１１図Ｅにおいて染色体２２について描写されている。要約すると、これらの両者の神経膠腫は相対的な染色体２２の低いリプリゼンテイションおよび７ｐアームの過度のリプリゼンテイションを示す。ＴＣ５９３において染色体４およびＴＣ６２０において４の一部分の低いリプリゼンテイションが、また、認められる。
【００６８】
ディジタル化した画像を、また、使用して、分裂中期の集団および間期細胞においてデコレーションされた区域を定量的測定し、ここで染色体のドメインはよく分割された。
【００６９】
染色体の同等体の定量的評価（表３）は、６つの例のうちで５つにおいて間期対分裂中期について高度に調和した数を示した；１８インサートでデコレーションされたＴＣ５９３においてのみ不一致が存在した。これは試料の大きさが小さいためでであろう。
表３
染色体４、７および１８のライブラリーからのＤＮＡインサートでデコレーションされた優勢の数を示す、２４の分裂中期スプレッドを、同一のプローブを使用してよく分離されたドメインをもつ２８の間期核と比較した。同一の（線状のフィルム）条件下に画像を取り、そしてディジタル化した。各分裂中期スプレッドにおいて、各々正常および異常の染色体について得られた面積を明らかに完全な染色体について得られた平均の面積で割った。間期核において、最大のｎ−標識されたドメインが完全な（正常の）間期染色体を表したと仮定して、ドメインを比較した。こうして、これらの正規化された値の合計は単一の細胞における特異的染色体の同等体の数の測度を表す。いくつかの細胞の平均値を各場合について示す。間期および分裂中期の細胞について得られた染色体同等体の平均の数は、ｒ＝＋０．９５の強い全体の相関関係の係数を示す。面積の測定と比較して、２−Ｄの強度の積分により決定された染色体同等体の平均の数（上を参照）はｒ＝＋０．９９の全体の相関関係の係数を示した。
【００７０】
【表３】
2005245452.tif 000005
【００７１】
ディジタル画像分析から誘導された染色体同等体は、ＤＡＰＩバンディングにより両者の神経膠腫系において認められた標的染色体の相対的リプリゼンテイションを独立に確証する。合計の分裂中期シグナルからなるセグメントをさらに第１３図に詳細にグラフで表示する。コンピューター分析は、転座したセグメントが明瞭に定めることができない場合において、ことに有用であった。コンピューター分析は、また、間期−分裂中期の相関関係、および明確に異なる大きさをもつ正常および異常の染色体の定量的評価において価値を有した。
実施例３  正常部位ハイブリダイゼーションによるヒト染色体２１の迅速な検出
ＤＮＡプローブ
すべてのプラスミドは２１ｑ２２．３にマッピングされたヒト染色体のインサートを含有する。モイサン（Ｍｏｉｓａｎ）、Ｊ．Ｐ．、メッテイ（Ｍｅｔｔｅｉ）、Ｍ．Ｇ．、ベテマン−ボルケル（Ｂａｅｔｅｍａｎ−Ｖｏｋｅｌ）、Ｍ．Ａ．、マッテイ（Ｍａｔｔｅｉ）、Ｊ．Ｆ．、ブラウン（Ｂｒｏｗｂ）、Ａ．Ｍ．Ｃ．、ガーニーア（Ｇａｒｎｉｅｒ）、Ｊ．Ｍ．、フェルツシュ（Ｊｅｌｔｓｃｈ）、Ｊ．Ｍ．、マシアコウスキー（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｙ）、Ｐ．、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）、Ｍ．およびマンデル（Ｍａｎｄｅｌ）、Ｊ．Ｌ．（１９８５）、サイトジェネティックス・アンド・セル・ジェネティックス（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．）、４０、７０１−７０２（アブストラクツ）。タンジ（Ｔａｎｚｉ）、Ｒ．、ワトキンス（Ｗａｔｏｋｉｎｓ）、Ｐ．、ギボンス（Ｇｉｂｏｎｓ）、Ｋ．、ファリニアルズ（Ｆａｒｙｎｉａｒｚ）、Ａ．、ワレイス（Ｗａｌｌａｃｅ）、Ｍ．、ハレウェル（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ）、Ｒ．、コンネアリイ（Ｃｏｎｎｅａｌｌｙ）、Ｐ．Ｍ．およびグセラ（Ｇｕｓｅｌｌａ）、Ｊ．（１９８５）、サイトジェネティックス・アンド・セル・ジェネティックス（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．）、４６、６６７（アブストラクツ）。ムンケ（Ｍｕｎｋｅ）、Ｍ．、フェルマー（Ｆｏｅｌｌｍｅｒ）、Ｂ．、ワトキンス（Ｗａｔｋｉｎｓ）、Ｐ．Ｃ．、コウワン（Ｃｏｗａｎ）、Ｊ．Ｍ．、カロール（Ｃａｒｒｏｌｌ）、Ａ．Ｊ．、グセラ（Ｇｕｓｅｌｌａ）、Ｊ．Ｆ．およびフラケ（Ｆｒａｋｅ）、Ｕ．（１９８８）、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）、４２、５４２−５４９。すべてのインサートは既知であるか、あるいはサザンブロット分析により単一のコピーのＤＮＡであることを評価した：ｐＳ２以外のプラスミドはλファージのライブラリーまたはコスミドのライブラリーから誘導したサブクローンである。ファン・ケウレン（Ｖａｎ  Ｋｅｕｒｅｎ）、Ｍ．Ｌ．、ワトキンス（Ｗａｔｋｉｎｓ）、Ｐ．Ｃ．、ドラブキン（Ｄｒａｂｋｉｎ）、Ｈ．Ａ．、ジャブス（Ｊａｂｓ）、Ｅ．Ｗ．、グセラ（Ｇｕｓｅｌｌａ）、Ｊ．Ｆ．およびパターソン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）、Ｄ．（１９８６）、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）、３８、７９３−８０４。マシアコウスキー（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉ）、Ｐ．、ブレスナチ（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ）、Ｒ．、ブロチ（Ｂｌｏｃｈ）、Ｊ．、ガンノン（Ｇａｎｎｏｎ）、Ｆ．、クルスト（Ｋｕｒｕｓｔ）、Ａ．およびチャンボン（Ｃｈａｍｂｏｎ）、Ｐ．（１９８２）核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１０、７８９５−７９０３。ワトキンス（Ｗａｔｋｉｎｓ）、Ｐ．Ｃ．、タンジ（Ｔａｎｚｉ）、Ｒ．Ｅ．、ギボンス（Ｇｉｂｂｏｎｓ）、Ｋ．Ｔ．、トリコリ（Ｔｒｉｃｏｌｌｉ）、Ｊ．Ｖ．、ランデス（Ｌａｎｄｅｓ）、Ｇ．、エディ（Ｅｄｄｙ）、Ｒ．、ショウズ（Ｓｈｏｗｓ）、Ｔ．Ｂ．およびグセラ（Ｇｕｓｅｌｌａ）、Ｊ．Ｆ．（１９８５）核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１��、６０７５−６０８８。ワトキンス（Ｗａｔｋｉｎｓ）、Ｐ．Ｃ．、ワトキンス（Ｗａｔｋｉｎｓ）、Ｐ．Ａ．、ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）、Ｎ．およびスタンニソロビチス（Ｓｔａｎｉｓｌｏｖｉｔｉｓ）、Ｐ．（１９８５）サイトジェネティックス・アンド・セル・ジェネティックス（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．）、４０、７７３−７７４（アブストラクツ）。プラスミドを表４に、ヒト遺伝子マッピングのワークショップの記号および近似の断片長さと一緒に記載する。カプラン（Ｋａｐｌａｎ）、Ｊ．Ｃ．およびカリット（Ｃａｒｒｉｔ）、Ｂ．（１９８７）サイトジェネティックス・アンド・セル・ジェネティックス（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．）、４６、２５７−２７６。
【００７２】
【表４】
2005245452.tif 000006
【００７３】
プラスミドＤＮＡの調製は標準のプロトコルに従った。マニアチス
（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ．、フリトシ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、Ｅ．Ｆ．およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｊ．（１９８２）分子クローニング：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク）。種々のプローブの組をプラスミドをプールし（等しいモル量）、９５ｋｂ（すべてのプラスミドを列挙した）、７５ｋｂ（星印で標識したプラスミド）または２９ｋｂ（ダガーで標識したプラスミド）のＤＮＡプローブ複合体を生成することによって得た。
【００７４】
ヒト染色体２１のゲノムのライブラリーＬＬ２１ＮＳ０２はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手し、そして寒天プレート上で推奨されるように増幅した。ファージＤＮＡを調製し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＤＮＡインサートをベクターのアームから調製用ゲル電気泳動により０．５％のアガロース中で分離した。ＤＮＡをゲルのスライスから電気溶離により分離した；エルチップ（Ｅｌｕｔｉｐ）−ｄクロマトグラフィーにより精製した（シュレイヘル・アンド・シュエル）；フェノール／クロロホルム、１：１（ｖ／ｖ）で抽出した；そしてエタノールで処理した。
ヒト細胞
分裂中期スプレッドおよびｉｐｃは次のものから調製した：（ｉ）正常の（４６、ＸＹ）個体のリンパ球培養物、（ｉｉ）ダウン症候群の
（４７、＋２１）個体のリンパ球、（ｉｉｉ）出生前の診断のために培養した慢性の絨毛試料［ｉｉおよびｉｉｉはＴ．ヤン−ゲング（Ｙａｎ−Ｇｅｎｇ）、エール大学（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の細胞遺伝学研究所、から提供された］、および（ｉｖ）ＴＣ６２０、乏突起神経膠腫誘導擬三倍体細胞系、の培養物。マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｌ、およびマヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｅ．Ｅ．、神経病理学における進歩（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、ジンンマーマン（Ｚｏｍｍｅｒｍａｎ）、Ｈ．Ｍ．編、Ｖｏｌ．４、ｐｐ．２３５−２６６、レイブン・プレス（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９７９）．コスミド処理、低張処理、およびメタノール／酢酸の固定の標準の技術を使用した。「正常」ヒト脳（４６、ＸＹ）の皮質領域からのバイオプシー物質を、記載したように、固定し、切片にし、そして浸透化した。マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｌ．およびボーデン（Ｂｏｒｄｅｎ）、Ｊ．、クロモソーマ（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ）、９６：３９７−４１０（１９８８）。
正常部位ハイブリダイゼーション
Ｂｉｏ−１１−ｄＵＴＰでニック翻訳により標識したプラスミドＤＮＡの種々の組み合わせを、プールの大きさに依存して２〜１５μｇ／ｍｌの範囲の濃度でハイブリダイゼーションに使用した。ブリガチ（Ｂｒｉｇａｔｉ）、Ｄ．Ｊ．、ミエルソン（Ｍｙｅｒｓｏｎ）、Ｄ．、レラリー（Ｌｅａｒｙ）、Ｊ．Ｊ．、スパルホルズ（Ｓｐａｌｈｏｌｚ）、Ｂ．、トラビス（Ｔｒａｖｉｓ）、Ｓ．Ｚ．、フォング（Ｆｏｎｇ）、Ｃ．Ｋ．Ｌ．、ヒシウング（Ｈｓｉｕｎｇ）、Ｇ．Ｄ．およびワード（Ｗａｒｄ）、Ｄ．Ｃ．（１９８３）ウイルス学（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１２６、３２−５０。例えば、プローブ混合物が９４キロ塩基（ｋｂ）のインサートＤＮＡを含有する場合、１５μｇ／ｍｌを使用した；プローブの濃度はプローブ混合物の配列の複雑性に対して比例して減少した。プローブＤＮＡの大きさは、実験的に、ニック翻訳反応におけるＤＮアーゼの濃度を変化させることによって１５０〜２５０ヌクレオチドの長さに調節した。ハイブリダイゼーションのカクテルは、また、５０％のホルムアミド、０．３０モルのＮａＣｌ、０．０３モルのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）、１０％（ｗ／ｖ）の硫酸デキストランを含有し、そして場合に応じて０．５ｍｇ／ｍｌの超音波処理したサケ精液のＤＮＡを含有した。プローブおよび標的ＤＮＡの同時の変性を７５℃において６時間（分裂中期スプレッド）または９４℃において１１分（組織のスライス）実施した。ハイブリダイゼーション反応は３７℃において一夜インキュベーションした。
【００７５】
ソーティングしたヒト染色体から誘導されたＤＮＡプローブを使用する個々の染色体の描写は、前述したように（ＣＩＳＳ）ハイブリダイゼーションにより実施した。簡単に述べると、ビオチニル化染色体２１ライブラリーＤＮＡインサート（５μｇ／ｍｌ）、ＤＮアーゼ消化したヒト気体（２００μｇ／ｍｌ）およびサケ精液ＤＮＡ（８００μｇ／ｍｌ）をハイブリダイゼーション溶液中で一緒にし、加熱変性し、そして１０〜３０分間３７℃において予備ハイブリダイゼーションした後、変性した検体に別々に適用した。
【００７６】
ハイブリダイゼーション後の洗浄、アルカリ性ホスファターゼ接合アビジンまたはフルオレセインイソチオシアナート接合アビジンを使用するハイブリダイゼーションしたプローブの検出、および写真の条件は実施例１に記載する通りであった。２９ｋｂ以下の標的配列を含有するプローブの組を使用したとき、フルオレセインイソチオシアナートの検出は一般に実施例１に記載するように１サイクルのシグナルの増幅により増強した。
【００７７】
間期シグナルのすべての定量的分析はいくつかの独立の実験からのスライドを使用することによって実施し、１００／スライドより多い核を分析した。正常および三染色体の試料におけるシグナルの比較は盲検試験の方法で実施した。
【００７８】
この研究において、ＣＩＳＳハイブリダイゼーションは、記載する条件下に、分裂中期および間期の両者の細胞における染色体２１の数および構造の異常を迅速に検出することが実証された。
リンパ球の分裂中期スプレッドおよび間期核中の染色体を特異的に標識するためのヒト染色体２１からのクローニングしたＤＮＡ断片の使用
プローブ中の独特配列のＤＮＡの最大量は約９４ｋｂであった；このプローブの組は染色体２１の相同体の両者の染色分体の末端領域の明瞭に可視の標識を生じた（参照、第１４図Ｂ）。これらのシグナルは、すべての分裂中期スプレッドにおいて、少ない量のスプレッドにおいてさえまたは前期細胞からのものにおいてさえ、明瞭にかつ例外なく見えた（図示せず）。正常の間期細胞において、核の大部分（６５〜７５％）は２つのシグナルを示し（参照、第１４図Ｃ）、２５〜３０％は１つのシグナルを示し、そして５％より少ないものはシグナルを示さなかった。３つのシグナルをもつ核は希にのみ見いだされ（＜０．２％）、そして試料中のわずかの四倍体細胞に対する不完全なハイブリダイゼーションを反映することができる。同様な結果は２９または７５ｋｂのＤＮＡを含有するプローブの組を使用して得られた。２０ｋｂより少ないインサートＤＮＡを含有するプローブの組では、２より少ないシグナルをもつ細胞の数は増加した。こうして、これらのプローブの組は診断の目的に不適当であると思われた。しかしながら、このようなプローブは、なお、染色体２１の大部分について、６ｋｂの単一のコピーのＤＮＡを使用してさえ（参照、第１４図Ａ）、ことにシグナルの増幅を使用するとき、特異的シグナルを生じた。
染色体２１を検出するための染色体ライブラリーＤＮＡのＣＩＳＳハイブリダイゼーションの使用
染色体２１は正常リンパ球の分裂中期スプレッドにおいて特異的かつ完全にデコレーションされたが、ある追加の小さい結合部位は他の末端動原体の染色体、ことに染色体１３の動原体またはその付近に見られた（正常核型は示されていない；第１４図Ｆ）。染色体１３および２１の動原体領域に主として位置する反復ＤＮＡを検出する、プラスミドＬ１．２６を包含する追加のＤＮＡを使用して抑制は、小さい非２１染色体のシグナルを効率的に抑制しなかった。デビリー（Ｄｅｖｉｌｅｅ）、Ｐ．、クレマー（Ｃｒｅｍｅｒ）、Ｔ．、スラグブーム（Ｓｌａｇｂｏｏｍ）、Ｐ．、バッカー（Ｂａｋｋｅｒ）、Ｅ．、ショイル（Ｓｈｏｉｌ）、Ｈ．Ｐ．、ヘイガー（Ｈａｇｅｒ）、Ｈ．Ｄ．、ステベンソン（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ）、Ａ．Ｆ．Ｇ．、コーネリッセ（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅ）、Ｃ．Ｊ．およびパーソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｐ．Ｌ．（１９８６）サイトジェネティックス・アンド・セル・ジェネティックス（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．）、４１、１９３−２０１。間期核のシグナルの定量的評価は、再び、３つのシグナルをもつ無視できる部分を示した；しかしながら、２つより小さいシグナルをもつ核の有意の増加は観測された（２つのシグナルをもつ５０〜６０％、１つのシグナルををもつ３５〜４５％、およびシグナルをもたない５〜１０％）。２つの異なるプローブを使用して観測された数の差は、一部分、後者の分析から排除された核の数（３つのうちの１つまで）により説明することができる。なぜなら、それらは二次元のリプリゼンテイションにおいて２つの別々の染色体ドメインとして明瞭に分割することができなかった、より大きくかつより多い拡散シグナル、最もありうることには１より多い染色体を示したからである。前述の小さい交差ハイブリダイゼーションする部位は第２実験の複雑さを表すが、データの解釈に悪影響を与えなかった。
染色体２１の異常を含有する細胞の試験
最適な（９４ｋｂ）プラスミドのプールおよび染色体２１ライブラリーのインサートを使用するＣＩＳＳハイブリダイゼーションを、さらに、染色体２１の異常を含有する細胞を使用することによって試験した。両者のプローブの組は、ダウン症候群のリンパ球の培養物からのすべての分裂中期スプレッドにおいて三染色体２１の速い明瞭な診断を可能とした（参照、第１４図ＤおよびＥにおける例）。さらに、前述のように分析したのと同一の調製物の間期核中のハイブリダイゼーションシグナルの定量的分布は、いずれかの型のプローブを使用しても類似した［細胞の＜５％シグナルなし、５〜１５％１つのシグナルをもつ、２５〜３５％２つのシグナルをもつ、および５５〜６５％３つのシグナルをもつ
（第１４図Ｆ−Ｊ）］。ライブラリーのＤＮＡインサートは１５％までの４つのシグナルの核を与え（比較、第１４図ＦおよびＧ）、最もありそうなことには他の染色体上の小さい結合部位のために、プラスミドのプールは４つのシグナルをもつ無視できる百分率の核（＜０．２％）明らかにした。これらの結果が示すように、三染色体２１は小さい集団の非有糸分裂細胞を使用して診断的に意味ある方法で検出することができる。
胚の慢性絨毛細胞中の染色体２１のＤＮＡの局在化
胚の慢性絨毛（ＣＶ）細胞を、また、父親が逆ｔ（４：２１）転座を有した場合、９４ｋｂのプラスミドプローブを使用して研究した。ＣＶ細胞の分裂中期スプレッドへのハイブリダイゼーションは、転座した染色体（４ｐｔｅｒ→４ｑ３３：：２１ｑ１１．２→２１ｑｔｅｒ）が事実胎児により遺伝されることが示された（参照、第１３図ＬおよびＭ）。ＣＶ細胞の間期細胞核中のシグナル（参照、第１４図Ｋ）は、正常核型をもつ細胞のそれ（上を参照）と平行する分布を有し、２１ｑ２２．３の釣り合ったリプリゼンテイションを示しそして可能な診断としてダウン症候群を排除した。正常のリンパ球のそれを越える３つおよび４つのシグナルの小さい増加（両者＜５％）がまた観測され、これは多分このようなＣＶ試料中のより高い部分の四倍体細胞を反映する。
神経膠腫細胞中の染色体２１のＤＮＡの局在化
染色体２１のプローブの診断の可能性を、高度に転位したゲノムをもつ擬三倍体であることが知られている、神経膠腫細胞系、ＴＣ６２０、を使用することによってさらに試験した。クレマー（Ｃｒｅｍｅｒ）、Ｔ．ら、エキスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．）、１７６：１９９−２２０（１９８８）；クレマー（Ｃｒｅｍｅｒ）、Ｔ．ら、ヒューマン・ジェネティックス（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｔ．）、印刷中（１９８８）；マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｌ、およびマヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｅ．Ｅ．、神経病理学における進歩（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、ジンンマーマン（Ｚｏｍｍｅｒｍａｎ）、Ｈ．Ｍ．編、Ｖｏｌ．４、ｐｐ．２３５−２６６、レイブン・プレス（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９７９）。分裂中期スプレッドは２つの明らかに正常の染色体２１および１つの転座染色体明らかにした（参照、第１４図ＮおよびＯ）。興味あることには、ライブラリーのプローブにより標識された転座染色体上の染色体２１ＤＮＡは、正常の２１ｑ領域に等しい大きさを有し、こうしてロバートソン転座の事象を示唆する。しかしながら、２１ｑの繊細な構造の異常（すなわち、小さい欠失など）はこの分析により排除することができない。両者のプラスミドのプローブの組およびライブラリーのインサートを使用して見られた間期シグナルは、それぞれ、三染色体２１ｑ２２．３および三染色体２１と一致した。
充実組織における染色体２１のＤＮＡ配列の局在化
９４ｋｂのプラスミドのプローブの組の充実組織中の染色体２１ＤＮＡ配列を局在化する能力を、また、評価した。両者の染色体２１はプローブにより明瞭に標識され、そして核付近に位置した；この核の位置は染色体２１が通常核の中に局在化されるリボソームの遺伝子のクラスターを含有するという事実と一致する。この観測が示唆するように、これらのプローブは、また、特異的細胞または組織の型中の染色体２１のモザイク性の頻度を評価ために有用であることを証明することができる。さらに、ダウン症候群の表現型に関連する種々の核型の変化が神経組織中の染色体２１の正常の核のトポグラフィーを変更するかどうかを見ることは興味あるであろう。
同等の実施態様
当業者は、ここに記載した発明の特定の実施態様と同等の多くの実施態様を認識するか、あるいは日常の実験を越えない実験を使用して確証することができるであろう。このような同等の実施態様は次の請求の範囲により包含されることを意図する。
なお、本発明の主たる特徴及び態様は以下のとおりである。
【００７９】
１．個々の哺乳動物の染色体を有糸分裂細胞または間期細胞の中で染色体特異的プローブと、哺乳動物の染色体中の反復した配列へのハイブリダイゼーションを抑制する条件下に、正常部位ハイブリダイゼーションさせて、約９０％またはそれより大きい特異性をもつ特異的シグナルを生成することによって、個々の哺乳動物の染色体を標識する方法。
【００８０】
２．個々のヒトの染色体を有糸分裂細胞または間期細胞の中で染色体特異的プローブと、ヒト染色体中の反復した配列へのハイブリダイゼーションを抑制する条件下に、正常部位ハイブリダイゼーションさせて、約９０％またはそれより大きい特異性をもつ特異的シグナルを生成することによって、個々のヒトの染色体を標識する方法。
【００８１】
３．染色体特異的である標識したＤＮＡプローブを、約９０％またはそれより大きい特異性をもつヒト有糸分裂細胞またはヒト間期細胞の中でＤＮＡに正常部位抑制ハイブリダイゼーションすることからなる、個々のヒト標的染色体の高度に特異的なデコレーションを生成する方法。
【００８２】
４．ＤＮＡプローブが全組み換えライブラリーのＤＮＡ、染色体誘導組み換えＤＮＡライブラリーから精製したＤＮＡインサート、および染色体から誘導した特異的ＤＮＡ断片から成る群より選択される上記第３項記載の方法。
【００８３】
５．標識したＤＮＡプローブが少なくとも１種の蛍光色素で標識したＤＮＡプローブ、特異的結合対の少なくとも１つの構成員で標識したＤＮＡプローブ、および酵素で標識したＤＮＡプローブから成る群より選択される上記第４項記載の方法。
【００８４】
６．蛍光色素がフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド
（Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ）、ルシファーイエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ  ｙｅｌｌｏｗ）、フィコビリンタンパク質およびシアニン色素から成る群より選択され、そして特異的結合対の構成員がビオチンである上記第５項記載の方法。
【００８５】
７．約９０％またはそれより大きい特異性をもつ標識を生成する条件下に、染色体の正常部位ハイブリダイゼーションにより、ヒト細胞中の染色体異常を評価する方法。
【００８６】
８．ヒト細胞が分裂中期細胞、前期細胞および間期細胞から成る群より選択される上記第７項記載の方法。
【００８７】
９．工程：
ａ）  １）存在する核酸配列を相補的核酸配列とのハイブリダイゼーションに利用可能に処理したヒト異数性細胞；および
２）特異的染色体から誘導された標識したヒトＤＮＡ、競争ＤＮＡ、およびヒト以外のゲノムのＤＮＡからなるハイブリダイゼーション混合物を、相補的核酸配列の特異的ハイブリダイゼーションが約９０％またはそれより大きい特異性をもって起こるために適当な条件下に一緒にし、そして
ｂ）  前記異数性細胞からの核酸配列にハイブリダイゼーションした特異的染色体から誘導された標識したヒトＤＮＡを検出すること、
からなるヒト異数性細胞中の染色体異常を検出する方法。
【００８８】
１０．異数性細胞がヒト腫瘍細胞である上記第９項記載の方法。
【００８９】
１１．ヒト腫瘍細胞が分裂中期細胞、前期細胞および間期細胞から成る群より選択される上記第１０項記載の方法。
【００９０】
１２．ヒト腫瘍細胞がヒトグリオーム細胞である上記第１０項記載の方法。
【００９１】
１３．工程：
ａ）  １）試料の中に存在する核酸配列を相補的核酸配列とのハイブリダイゼーションに利用可能に処理した試料；および
２）選択した染色体から誘導された標識したヒトＤＮＡ、競争ＤＮＡ、およびヒト以外のゲノムのＤＮＡからなるハイブリダイゼーション混合物を、相補的核酸配列の特異的ハイブリダイゼーションが約９０％またはそれより大きい特異性をもって起こるために適当な条件下に一緒にし、そして
ｂ）  試料の中に存在する核酸配列にハイブリダイゼーションした選択した染色体から誘導された標識したヒトＤＮＡを検出すること、
からなる試料の中に存在するヒトコスミドの数の変更を試料の中で検出する方法。
【００９２】
１４．選択したヒト染色体が、染色体１３、１８、２１、ＸおよびＹから成る群より選択される上記第１３項記載の方法。
【００９３】
１５．選択したヒト染色体が染色体番号２１であり、そして選択した染色体から誘導された標識したヒトＤＮＡが染色体誘導組み換えＤＮＡライブラリーから精製したＤＮＡインサートである上記第１３項記載の方法。
【００９４】
１６．工程：
ａ）  １）ヒト腫瘍細胞の中に存在する核酸配列を相補的核酸配列とのハイブリダイゼーションに利用可能に処理したヒト腫瘍細胞；および
２）選択した染色体から誘導された標識したＤＮＡ断片、競争ＤＮＡ、およびヒト以外のゲノムのＤＮＡからなるハイブリダイゼーション混合物を、相補的核酸配列の特異的ハイブリダイゼーションが約９０％またはそれより大きい特異性をもって起こるために適当な条件下に一緒にし、そして
ｂ）  前記腫瘍細胞からの核酸配列にハイブリダイゼーションした標識したヒト染色体特異的ＤＮＡ断片を検出すること、
からなるヒト腫瘍細胞中の選択した染色体またはその一部分のリプリゼンテイションの過剰または低下を検出する方法。
【００９５】
１７．工程：
ａ）  次の配列：
１）選択した哺乳動物の染色体を含有する間期の核、
２）検出可能な標識を有する選択した哺乳動物の染色体から誘導したＤＮＡ断片、
３）競争ＤＮＡおよびキャリヤーＤＮＡを、相補的核酸配列の特異的ハイブリダイゼーションが約９０％またはそれより大きい特異性をもって起こるために適当な条件下に一緒にして、検出可能な標識を有するＤＮＡ断片と選択した哺乳動物の染色体との複合体を形成し、そして
ｂ）  工程（ａ）において形成した複合体を検出すること、
からなる選択した哺乳動物の染色体の中に存在する染色体特異的ＤＮＡを同定する方法。
【００９６】
１８．工程（ａ）において一緒にした残りの物質から形成した複合体を分離することによって、選択した哺乳動物の染色体中の染色体特異的ＤＮＡを単離することをさらに含む上記第１７項記載の方法。
【００９７】
１９．存在するＤＮＡが相補的核酸配列との特異的ハイブリダイゼーションに利用可能とするように予備処理された、哺乳動物の有糸分裂細胞または哺乳動物の間期細胞を、２またはそれ以上の選択した検出可能に標識した、高い遺伝的複雑性をもつ、染色体特異的ヌクレオチドプローブと、ＣＩＳＳハイブリダイゼーション条件下に一緒にして、約９０％またはそれより大きい特異性をもつ選択した染色体を標識し、そして標識した選択した染色体を検出する、ことからなる哺乳動物の有糸分裂細胞または哺乳動物の間期細胞の中で選択した染色体を同定する方法。
【００９８】
２０．存在するＤＮＡが相補的核酸配列とのハイブリダイゼーションに利用可能とするように予備処理された、哺乳動物の有糸分裂細胞または哺乳動物の間期細胞を、同定すべき異なる染色体の１つに対して相補的な少なくとも第１の検出可能に標識した核酸プローブ２および同定すべき異なる染色体の第２のものに対して相補的な第２の検出可能に標識した核酸プローブからなる、検出可能に標識した染色体特異的プローブの組と、ＣＩＳＳハイブリダイゼーション条件下に一緒にして、約９０％またはそれより大きい特異性をもつ検出可能に標識した選択した染色体を生成せしめ、前記第１の検出可能に標識した核酸プローブ上の検出可能な標識は前記第２の検出可能に標識した核酸プローブ上の検出可能な標識と異なり、そして標識した選択した染色体を検出する、ことからなる哺乳動物の有糸分裂細胞または哺乳動物の間期細胞の中で少なくとも２つの異なる選択した染色体を同定する方法。
【００９９】
２１．検出可能に標識した染色体特異的プローブが蛍光的に標識されている上記第２０項記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】第１図は、本発明のＣＩＳＳハイブリダイゼーションを概略的に示す。
【図２】第２図は、異なる濃度のヒト競争ＤＮＡによる染色体７誘導ＤＮＡライブラリー内の交差反応性配列からの抑制を示す。ビオチン標識した染色体７のＤＮＡインサート（２０μｇ／ｍｌ）をヒトゲノムのＤＮＡと２０分間予備ハイブリダイゼーションし、次いで分裂中期の染色体のスプレッド（ｓｐｒｅａｄｓ）とハイブリダイゼーションしそしてＦＩＴＣ標識したアビジンで検出した。ヒトＤＮＡ濃度は次の通りであった：Ａ、０μｇ／ｍｌ；Ｂ、５０μｇ／ｍｌ；Ｃ、１００μｇ／ｍｌ；Ｄ、２００μｇ／ｍｌ；Ｅ、１０００μｇ／ｍｌ；Ｆ、ＤＡＰＩｄｅ後染色したＥにおけるのと同一の分裂中期のスプレッド。ゲノムのサケＤＮＡを各試料に添加して、最終ＤＮＡ濃度を１．０ｍｇ／ｍｌに調節した（参照、詳細についてテキスト）。矢印は標的染色体７を指し、そして矢印のヘッドは非７染色体上の追加の強いシグナル指す。すべてのプリントされた陰性のものは、同一の写真条件下に露出しそして現像した。
【図３】第３図は、ハイブリダイゼーションのシグナルの特異性および強さへの予備アニーリング時間の効果を示す。ビオチン標識した染色体７のＤＮＡインサート（２０μｇ／ｍｌ）を、分裂中期へのハイブリダイゼーションの前に、次の時間の間、２００μｇ／ｍｌのヒト競争ＤＮＡと予備アニーリングした、Ａ、０分；Ｂ、２分；Ｃ、５分；Ｄ、２０分。
【図４】第４図は、正常ヒトリンパ球中のＡ染色体１、Ｂ染色体７、Ｃ染色体４、Ｄ染色体１８、Ｅ染色体１３およびＦ染色体２０のデコレーション（ｄｅｃｏｒａｔｉｏｎ）を示す。染色体１３のインサートＤＮＡのプールのみが、予備ハイブリダイゼーション抑制工程後に、他の染色体への有意の交差ハイブリダイゼーションを示す。染色体２０（Ｆ）の検出は、全染色体ライブラリー（λファージのアームを包含する）を使用して実施し、そして酵素基質混合物としてニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＮＢＴ−ＢＣＩＰ）を使用してアビジン−アルカリ性ホスファターゼで検出した。染色体１（Ａ）のシグナルをピンケル（Ｐｉｎｋｅｌ）ら（１９８６）のサンドイッチ技術により増幅した。
【図５】第５図は、予備アニーリングした染色体ライブラリーＤＮＡインサートにより描写されたヒトリンパ球核中の染色体ドメインを示す。酢酸−メタノール固定した核へのハイブリダイゼーションは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）接合アビジン（Ａ〜Ｅ）またはアルカリ性ホスファターゼ接合アビジン（Ｆ）により検出された。ドメインは染色体１（Ａ、Ｂ）、染色体７（Ｃ、Ｄ）および染色体１８（Ｅ、Ｆ）について示す。中心粒の領域の優勢な染色は染色体７ドメインの中に見られ、染色体７特異的アルフォイド（ａｌｐｈｏｉｄ）のＤＮＡ反復の優先的ハイブリダイゼーションを反映する；分裂中期染色体上の同様なシグナル分布は、また、この特定の実験において観測された。
【図６】第６図は、アビジン−ＦＩＴＣで検出した（Ａ、Ｃ）そして４，６−ジアミジノ−７−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）で後染色した（Ｂ、Ｄ）の神経膠腫細胞系の分裂中期のスプレッドへの染色体１の挿入の正常部位抑制（ＣＩＳＳ）ハイブリダイゼーションを示す。Ａ、Ｂ  ＴＣ６２０は、２つの明らかに完全な１染色体（Ｂ中の小さい矢印）およびこれらのインサートにより特異的にデコレーションされた２つのマーカーの転座染色体（矢印ヘッド）（Ａ）を示す。２つのマーカー染色体の１つは１ｐ（下の左）を含有し、他方は１ｑアーム（下の右）を含有する；１ｐ２つの正常染色体および中部動原体下の（ｓｕｂｍｅｔａｃｅｎｔｒｉｃ）マーカーの１ｐターミナル（相対的ＧＣに富んだ領域）は完全には描写されない。また、１ｑ１２領域はここで大部分の実験と対照的にほとんどデコレーションを示さない。Ｘ９５０。Ｃ、Ｄ典型的なＴＣ５９３分裂中期スプレッドは、６つの特異的にデコレーションされた染色体を示す。３つの末端動原体のマーカーの染色体は、すべて１ｐの切頭をもち、１ｑ１２（Ｃにおける矢印）に局在化する反復のとくに強い蛍光を示す。これらのうち２つにおいて、１ｑアームは完全であるように思われるが、主要な欠失は第３において明らかである（Ｄにおける矢印）。第４のデコレーションされた染色体（Ｃ、Ｄにおいて小さい矢印）は、再び、１ｑの末端部分の主要な欠失を示すが、明らかに完全な１ｐアームを保持した。第５の中部動原体下の染色体（大きい矢印ヘッド）は、明らかに完全な１ｐアームを含有する；その短いアームのＤＮＡは同定されなかった。前述のＴＣ６２０（１ｐ）のマーカー染色体の１つに対するこのマーカーの類似性に注意されたい。第６の完全にデコレーションされた染色体は、ＤＡＰＩバンディング（白抜きの矢印）により実証されたようにイソ（１ｐ）である。Ｘ１２００。
【図７】第７図は、アビジン−ＦＩＴＣで検出された染色体４ライブラリーのインサートのＣＩＳＳハイブリダイゼーションを示す；ＴＣ５９３（Ａ〜Ｃ）およびＴＣ６２０（Ｄ）の間期核。２つの明らかに完全な間期ドメインは互いに接近しているが、ＡおよびＣにおいて広く分離していることに注意されたい。ＴＣ６２０間期核（Ｄ）は、大きく異なる大きさの４つの染色体４間期ドメインを示す。ＴＣ５９３（Ｅ）の分裂中期スプレッドは、２つの明らかに完全な４つの染色体、および中部動原体下の染色体中の小さいデコレーションされた領域（矢印）を示す。転座した４つの配列をもつマーカーは、スプレッドの約３０％において観測された。ＴＣ６２０分裂中期スプレッド（Ｆ）は、１つの明らかに完全な染色体４および異なる量の染色体４物質を含有し３つの転座マーカー（ｔ）を示す。Ｇ〜Ｊビオチニル化染色体７のインサートおよびアミノアセチルフルオレン（ＡＡＦ）修飾７特異的アルフォイド反復の二重ハイブリダイゼーション。Ｇ染色体７のインサートは５つの完全にデコレーションされた分裂中期染色体を描写する。それらのうちの４つは、完全７つの染色体であり、第５（矢印）はイソ（７ｐ）である（参照、第３図Ｅ）。Ｈわずかに４つのデコレーションされた染色体上のＡＡＦ−７アルフォイドシグナルを示すＧと同一の場；イソ（７ｐ）上にシグナルは検出さない。ＩＴＣ５９３の間期核は、染色体７のインサートにより描写された５つのドメインを示す；これらのうちの４つは７アルフォイドプローブにより標識される（Ｊ）。Ｉ中の矢印は間期のイソ（７ｐ）マーカーを表す。
【図８】第８図は、アビジン−ＦＩＴＣで検出された神経膠腫細胞系の分裂中期スプレッドに対する染色体７および１８のライブラリーインサートのＣＩＳＳハイブリダイゼーションを示す。Ｘ８７５。Ａ、Ｂ  ＴＣ６２０は染色体７のインサートへハイブリダイゼーションした。３つの明らかに正常の７染色体および追加の７配列を含有する転座染色体がＡにおいて大きい矢印ヘッドで示されている；ＤＡＰＩ染色された完全な染色体はＢにおいて小さい矢印で示されている。他の研究（参照、テキスト）は、マーカー染色体中の７ｐｔｅｒ−ｑ１１の転座を示した（大きい矢印ヘッド）。Ｄ、対応するフレームはＤＡＰＩで反対染色された。Ｅ、擬四倍体ＴＣ５９３からの分裂中期スプレッドは、７ライブラリーのインサートにより際立った５つの染色体を示す。中部動原体の染色体（ｍ）は、この系統に典型的なイソ（７ｐ）マーカーを表す（参照、また、第２図Ｇ）。インサートの染色体（小さい矢印）は、ＤＡＰＩ染色した正常および中部動原体の７染色体を示す。陸標のバンド７ｑ２１および７ｑ１１における構成的ヘテロクロマチンのブロックは、両者共正常の染色体７インサート上で優性である（矢印）が、マーカー染色体上に存在しない。その代わり、後者の両者のアームは、７ｐ２１にかすかな末端のバンドをもつ、鏡に似た染色のパターンを示す。Ｆ、Ｇ  ＴＣ５９３は染色体１８のインサートにハイブリダイゼーションした。４つのデコレーションされた１８染色体はＦに示されており、そしてＤＡＰＩ染色によりＧにおいてそれらのうちの３つは明瞭に転座される（ｔ）。
【図９】第９図は、神経膠腫細胞系ＴＣ６２０（左）およびＴＣ５９３（右）における染色体１、４、７、１８および２０のＣＩＳＳハイブリダイゼーションにより検出された、完全なおよび異常の染色体の要約した染色体のイディオグラムである。Ｇ−バンド（黒色）はわれわれのデータにより示唆される近似の破壊点をもつことが示されている；波状のパターンで陰影を付けた区域は、マーカー転座染色体の一部分を構成する他の染色体からのものである。ＴＣ６２０転座した４セグメントの２つを除外した黒い点は、染色体４の物質の割り当てが環境の証拠（例えば、大きさの測定）に基づくことを示す。ＴＣ５９３分裂中期スプレッド（＋）の約２０％の中の染色体１８の物質の小さい転座は、また、それ以上同定することができなかった。両者の細胞系における７ｐの過剰のリプリゼンテイションに注意されたい。
【図１０】１０図は、神経膠腫細胞系における分裂中期の異常を反映する代表的な前期の核（Ａ）および間期の核（Ｂ〜Ｆ）を示す（参照、第１図〜第３図）。Ａ、前期ＴＣ６２０核中の７ｐ転座（ｔ）の検出。Ｘ１，０００。Ｂ、ＴＣ５９３において検出された５つのよく分離した染色体７のドメイン。Ｘ１，２４０。Ｃ、ＴＣ６２０における２つの大きいおよび１つの非常に小さい１８ドメイン（矢印ヘッドにより示す）。Ｘ１，４５０。Ｄ、ＴＣ５９３において検出された４つの染色体１８のドメイン；これらのシグナルの１つ（矢印）はより小さいように思われる。Ｘ、１，４５０。Ｅ、ＴＣ６２０における４つの染色体１のドメイン（参照、第１図Ａ、Ｂ）。Ｆ、ＴＣ５９３における少なくとも５つの染色体１のドメイン；１つ（矢印ヘッド）は他のものより認められ得るほどに小さい。Ｘ１，２５０。Ｇ、Ｈ、ＤＡＰＩで後染色されたＴＣ５９３の技術的に劣った分裂中期のスプレッドのＣＩＳＳハイブリダイゼーション（Ｇ）は、１８配列を有する４つの明確な染色体をなお際立たせる（Ｈ）。Ｘ１，０００。
【図１１】第１１図は、ＣＩＳＳハイブリダイゼーションにより染色体７（Ａ〜Ｃ）、２２（Ｄ）および４（Ｅ）の間期および／または分裂中期のカウントのグラフの表示である。間期のカウントは、よくハイブリダイゼーションした調製物の１５０の核について実施した。分裂中期のカウント＞２５について、完全なＤＡＰＩ染色したスプレッドを評価した。７つの特異的アルフォイドのＡ〜Ｃのカウント（白い棒）を７つのライブラリーのインサート（陰影をつけた棒）と比較した：Ａ、フィトヘムアグリチニン刺激ヒトリンパ球の間期核（４６．、ＸＹ）；Ｂ、間期核（７−特異的アルフォイド反復）および分裂中期スプレッド（７ライブラリーのインサート）；Ｃ、ＴＣ５９３間期核（７−特異的アルフォイド反復）および分裂中期スプレッド（７ライブラリーのインサート）。７アルフォイド反復の高い厳格さハイブリダイゼーション（参照、材料および方法）を使用して、他の染色体への交差ハイブリダイゼーションを回避した。両者の７ライブラリーのインサートおよびアルフォイド反復を使用する二重ハイブリダイゼーション（第２図Ｇ〜Ｉに示す）の場合において、５０％のホルムアミドを使用する標準の条件は、多分ヒト競争ＤＮＡの存在のために、交差ハイブリダイゼーションを回避するために十分であった。Ｄ、ＴＣ６２０（黒い棒）およびＴＣ５９３（陰影を付けた棒）の分裂中期スプレッドにおける染色体２２のカウント。比較のために、これらの実験において内部対照として７ライブラリーのインサートを使用して、交差ハイブリダイゼーションを同時に実施した（参照、Ｃ、Ｄおよび第７図）。Ｅ、間期カウント（白色の棒）および分裂中期カウント（陰影を付けた棒）を染色体４のインサートとハイブリダイゼーションしたＴＣ５９３において比較した。シグナル調製物の比２：３は分裂中期および間期において同一であることに注意されたい。
【図１２】第１２図は、染色体７および２２（両者はビオチンで標識しそしてアビジン−ＦＩＴＣで検出した）からのインサートとの二重ハイブリダイゼーション後のＴＣ６２０分裂中期スプレッドを示す。２つの強くデコレーションされた２２染色体（矢印）、３つの完全な７染色体、および７ｐｔｅｒ−ｑ１１を含有する中部動原体のマーカー染色体が、また、見られる。
【図１３】第１３図は、神経膠腫細胞系ＴＣ５９３およびＴＣ６２０からの典型的な分裂中期スプレッドにおけるデコレーションした正常および異常の染色体４、７および１８の相対的大きさのグラフの表示である。個々の面積は正規化し、こうして完全な染色体は１の面積により表されている（参照、表１に対する凡例）。合計の添加したシグナルは、存在する特異的染色体の同等体を反映する。白色の領域は明らかに正常の染色体に相当し、黒色の領域は特異的ライブラリーのインサートによりデコレーションされた小さい遊離の染色体セグメントを示し、そして転座されたセグメントに陰影を付けた。ＴＣ５９３における３つの転座した１８染色体のうちの１つはこの測定により完全な染色体を表す（黒い点により示されている）が、２つの他の転座は、多分小さい試料の大きさのために、わずかに小さい。
【図１４】第１４図は、ビオチニル化されたＤＮＡプローブの組とのＣＩＳＳハイブリダイゼーションによるヒト染色体２１の特異的標識つけを示す。Ａ、プラスミドｐＰＷ５１９−１Ｒ（６−Ｋｂのインサート）は正常のリンパ球の分裂中期スプレッドにハイブリダイゼーションした。シグナルは、ＤＡＰＩバンディング（図示せず）により評価して、２１ｐの末端に位置する（参照、インサート中の４’，６−ジアミジノ−７−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色した染色体）。ＢおよびＣ、９４Ｋｂのプラスミドのプールのプローブの組とのハイブリダイゼーション後の、正常ヒトリンパ球分裂中期（Ｂ）および核（Ｃ）。ＤおよびＥ、ＣＩＳＳハイブリダイゼーション（１４）のプロトコルによる９４Ｋｂのプローブの組（Ｄ）または染色体２１ライブラリーＤＮＡインサートとのハイブリダイゼーション後のトリソミー２１（４７、＋２１）リンパ球分裂中期スプレッド上のシグナル。（Ｅ）３つの染色体２１はライブラリーのインサートにより完全に描写される；追加の小さいシグナル（参照、テキスト）は矢印ヘッドにより示されている（また、Ｇにおいて）。（Ｆ〜Ｊ）ライブラリーのインサートによるトリソミー２１リンパ球ｃｎｌの標識づけ（ＦおよびＧ；Ｅと比較）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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