(57)【要約】【課題】  食物や飼料等の検体に含まれるトリコテセン系マイコトキシンを簡便かつ正確に検出するための方法、および、食物や飼料等の検体に含まれるトリコテセン系マイコトキシン含量を簡便かつ正確に定量するための方法を提供する。【解決手段】  Ｔ細胞と検体とを接触させることにより当該Ｔ細胞にアポトーシスを誘導させ、誘導されたアポトーシスを測定することを特徴とする検体中のトリコテセン系マイコトキシンの検出方法、および、Ｔ細胞と検体とを接触させることにより当該Ｔ細胞にアポトーシスを誘導させ、誘導されたアポトーシスを測定することを特徴とする検体中のトリコテセン系マイコトキシン含量の定量方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞と検体とを接触させることにより当該細胞にアポトーシスを誘導させ、誘導されたアポトーシスを定量することを特徴とする検体中のトリコテセン系マイコトキシンの検出方法。
【請求項２】
Ｔ細胞と検体とを接触させることにより当該細胞にアポトーシスを誘導させ、誘導されたアポトーシスの量を定量することを特徴とする検体中のトリコテセン系マイコトキシン含量の定量方法。
【請求項３】
検体中のトリコテセン系マイコトキシンの量が、デオキシニバレノール（ＤＯＮ）、ニバレノール（ＮＩＶ）、Ｔ−２トキシン（Ｔ−２）およびベルカリンＡからなる群から選ばれるいずれかのトリコテセン系マイコトキシンの量として換算された含量である請求項２記載の方法。
【請求項４】
アポトーシスの測定が、アポトーシスの誘導により活性化されるカスパーゼの活性を測定する方法である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
カスパーゼが、カスパーゼ３である請求項４記載の方法。
【請求項６】
Ｔ細胞が、白血病患者由来のＴ細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
Ｔ細胞が、ＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性のＴ細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
Ｔ細胞がＬＭＡＴ細胞（FERM BP-08598）である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ｔ細胞を含有することを特徴とする検体中のトリコテセン系マイコトキシン検出用試薬。
【請求項１０】
Ｔ細胞およびトリコテセン系マイコトキシン標準液を含有することを特徴とする検体中のトリコテセン系マイコトキシン定量用試薬。
【請求項１１】
さらに、カスパーゼの基質を含有する請求項９または１０記載の試薬。
【請求項１２】
トリコテセン系マイコトキシンが、デオキシニバレノール（ＤＯＮ）、ニバレノール（ＮＩＶ）、Ｔ−２トキシン（Ｔ−２）およびベルカリンＡからなる群から選ばれるいずれかのトリコテセン系マイコトキシンである請求項９〜１１のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項１３】
Ｔ細胞が、白血病患者由来のＴ細胞である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項１４】
Ｔ細胞が、ＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性のＴ細胞である、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項１５】
Ｔ細胞がＬＭＡＴ細胞（FERM BP-08598）である請求項９〜１３のいずれか１項に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品、飼料等の検体に含まれるトリコテセン系マイコトキシンの検出方法および検出用試薬、ならびに、食品、飼料等の検体に含まれるトリコテセン系マイコトキシンの定量方法および定量用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９７２年米国において、乳牛に中毒症を起した飼料のトウモロコシから、その原因物質としてトリコテセン系マイコトキシンの１つであるデオキシニバレノールが単離された。その後、世界各地でマイコトキシンによる穀類を中心とする農産物や家畜飼料の自然汚染が報告されている。マイコトキシンの毒性として、生体の免疫機能を抑制することにより、ヒトや家畜に二次的な疾病を引き起こす可能性が示唆されている。汚染頻度の高いマイコトキシンの毒性研究は、欧米を中心に活発に研究が行われているが、動物実験のレベルの研究がほとんどである。
【０００３】
近年、芳澤らによりトリコテセン系マイコトキシンのひとつであるＴ−２トキシンを投与されたマウスの胸腺Ｔ細胞に、細胞死（アポトーシス）が引き起こされることが明らかにされた（非特許文献１参照）。
マイコトキシンの免疫毒性の研究は、これまで実験動物を用いて行われてきた（非特許文献１，２，３参照）。しかしながら、種差による毒性の感受性差が存在する可能性を考えると、最終的にはヒトに対する毒性を調べる必要がある。免疫毒性に関わる動物の症状としては、胸腺の萎縮が報告されており（非特許文献２参照）、表面マーカーがＣＤ４陽性／ＣＤ８陽性の未成熟Ｔ細胞のアポトーシスがその原因であることが明らかにされてきた（非特許文献１参照）。しかしながら、これら動物実験の現象を免疫毒性の検査方法に用いることは時間と手間がかかり実際的ではない。また、これらの実験系ではマウスを用いているため、ヒトに対する毒性効果を評価する適切な系とは言えない。これまでも、ヒト培養細胞を用いた研究は試みられてきたが（非特許文献４〜６参照）、マイコトキシンに対して感受性の高い細胞株が存在しないことにより、その作用機構の解明が全く進まなかった。
【０００４】
一方、ＷＨＯ／ＦＡＯが共催する会議が、２００１年３月スイスのジュネーブで開催され、マイコトキシン摂取許容レベルが決定された。日本においても、２００３年５月厚生労働省から、小麦中のデオキシニバレノールの基準値を１１００ｐｐｂと定める通達が出された。また、トリコテセン系マイコトキシンは、ニバレノール（以下、ＮＩＶと称する場合もある）、Ｔ−２トキシン等毒性の強さが異なる物質により、複合的に汚染を起こしていることがしばしば観察されており、試料に含まれる複数のトリコテセン系マイコトキシンの免疫毒性の総和を決定するためには、これらのトリコテセン系マイコトキシンの免疫毒性を定量的に評価する方法が必要である。
【０００５】
このような状況から、食物や飼料等の検体に含まれるトリコテセン系マイコトキシンを簡便かつ正確に検出し、当該検体中のトリコテセン系マイコトキシン量を簡便かつ正確に測定し、トリコテセン系マイコトキシンのヒトに対する免疫毒性を簡便かつ正確に評価する方法を確立することが喫緊の課題となっていた。
尚、これまでに、トリコテセン系マイコトキシンの検出方法として、トリコテセン系マイコトキシンに対する抗体を用いる方法が報告されている（特許文献１参照）。
【非特許文献１】「トキシコロジー アンド アプライド ファーマコロジー（Toxicology and Applied Pharmacology）」，アカデミック プレス，１９９８年，第１４８巻，ｐ．２０５−２１４
【非特許文献２】「トキシコロジー アンド アプライド ファーマコロジー（Toxicology and Applied Pharmacology）」，アカデミック プレス，１９９３年，第１２１巻，ｐ．８−１４
【非特許文献３】「トキシコロジック パソロジー（Toxicologic Pathology）」，ソサイエティ オブ トキシコロジック パソロジスト，１９９８年，第２６巻，ｐ．６７４−６８１
【非特許文献４】「ナチュラル・トキシンズ（Natural Toxins）」，ジョン ワイリー アンド サンズ，１９９５年，第３巻，ｐ．１２９−１３７
【非特許文献５】「トキシコロジー アンド アプライド ファーマコロジー（Toxicology and Applied Pharmacology）」，アカデミック プレス，２０００年，第１６４巻，ｐ．１４９−１６０
【非特許文献６】「ナチュラル・トキシンズ（Natural Toxins）」，ジョン ワイリー アンド サンズ，１９９６年，第４巻，ｐ．２３４−２４１
【特許文献１】国際公開第０１／０１８１９６号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、食物や飼料等の検体に含まれるトリコテセン系マイコトキシンを簡便かつ正確に検出するための方法および試薬、ならびに、食物や飼料等の検体に含まれるトリコテセン系マイコトキシン含量を簡便かつ正確に定量するための方法および試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の（１）〜（１５）に関する。
（１）  Ｔ細胞と検体とを接触させることにより当該細胞にアポトーシスを誘導させ、誘導されたアポトーシスを定量することを特徴とする検体中のトリコテセン系マイコトキシンの検出方法。
（２）  Ｔ細胞と検体とを接触させることにより当該細胞にアポトーシスを誘導させ、誘導されたアポトーシスの量を定量することを特徴とする検体中のトリコテセン系マイコトキシン含量の定量方法。
【０００８】
（３）  検体中のトリコテセン系マイコトキシンの量が、デオキシニバレノール（ＤＯＮ）、ニバレノール（ＮＩＶ）、Ｔ−２トキシン（Ｔ−２）およびベルカリンＡからなる群から選ばれるいずれかのトリコテセン系マイコトキシンの量として換算された含量である上記（２）記載の方法。
（４）  アポトーシスの測定が、アポトーシスの誘導により活性化されるカスパーゼの活性を測定する方法である上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【０００９】
（５）  カスパーゼが、カスパーゼ３である上記（４）記載の方法。
（６）  Ｔ細胞が、白血病患者由来のＴ細胞である、上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）  Ｔ細胞が、ＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性のＴ細胞である、上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の方法。
【００１０】
（８）  Ｔ細胞がＬＭＡＴ細胞（FERM BP-08598）である上記（１）〜（７）のいずれか１項に記載の方法。
（９）  Ｔ細胞を含有することを特徴とする検体中のトリコテセン系マイコトキシン検出用試薬。
（１０）  Ｔ細胞およびトリコテセン系マイコトキシン標準液を含有することを特徴とする検体中のトリコテセン系マイコトキシン定量用試薬。
【００１１】
（１１）  さらに、カスパーゼの基質を含有する上記（９）または（１０）記載の試薬。
（１２）  トリコテセン系マイコトキシンが、デオキシニバレノール（ＤＯＮ）、ニバレノール（ＮＩＶ）、Ｔ−２トキシン（Ｔ−２）およびベルカリンＡからなる群から選ばれるいずれかのトリコテセン系マイコトキシンである上記（９）〜（１１）のいずれか１項に記載の試薬。
【００１２】
（１３）  Ｔ細胞が、白血病患者由来のＴ細胞である、上記（９）〜（１２）のいずれか１項に記載の試薬。
（１４）  Ｔ細胞が、ＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性のＴ細胞である、上記（９）〜（１３）のいずれか１項に記載の試薬。
（１５）  Ｔ細胞がＬＭＡＴ細胞（FERM BP-08598）である上記（９）〜（１３）のいずれか１項に記載の試薬。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、食物や飼料等の検体に含まれるトリコテセン系マイコトキシンを簡便かつ正確に検出するための方法および試薬、ならびに、食物や飼料等の検体に含まれるトリコテセン系マイコトキシン量を簡便かつ正確に定量するための方法および試薬が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（Ｔ細胞）
本発明において用いられるＴ細胞としては、トリコテセン系マイコトキシンとの接触によりアポトーシスが誘導されるようなＴ細胞であればいかなるものでもよいが、具体的には白血病患者由来のＴ細胞が挙げられる。Ｔ細胞としては、ＣＤ４陰性およびＣＤ８陰性のＴ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性Ｔ細胞等が挙げられるが、好ましくはＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性Ｔ細胞が挙げられ、さらに好ましくはＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性であって、かつＣＤ２陽性、ＣＤ２１陽性、ＣＤ３４陽性、ＣＤ９５陰性、ＴＣＲαβ陰性の性質を有するＴ細胞が挙げられる。具体的には白血病の患者の末梢リンパ球画分の細胞から樹立したＬＭＡＴ細胞、ヒト白血病Ｔ細胞株Jurkat細胞（ATCC No.TIB-152）、Molt-4細胞（ATCC CRL-1582）等が挙げられるがＬＭＡＴ細胞が特に好ましい。ＬＭＡＴ細胞は平成１６年１月２１日付けで独立法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1丁目1番地中央第6）にFERM BP-08598として寄託されている。
【００１５】
また、本発明において用いられるＴ細胞としては、白血病患者由来以外のＴ細胞であってもよく、当該Ｔ細胞としては、Ｔ細胞の性質を有し、かつ無限増殖する性質を有しているＴ細胞等が挙げられる。具体的には、無限増殖する性質を有するように遺伝子組換えを施した健常人由来のＴ細胞等が挙げられる。
（トリコテセン系マイコトキシン）
トリコテセン（trichothecene）系マイコトキシンは，共通骨格をもつ５０種以上のマイコトキシンのグループで、構造上の特徴から３つのグループに分類される。以下、３グループをそれぞれグループＡ、ＢおよびＣと称す。
【００１６】
グループＡとしては、Ｔ−２トキシン（以下、Ｔ−２と称す）、ＨＴ−２トキシン（以下、ＨＴ−２と称す）等が挙げられ、グループＢとしては、デオキシニバレノール（以下、ＤＯＮと称す）、ニバレノール（以下、ＮＩＶと称す）、フザレノンＸ等が挙げられ、グループＣとしては、ロリディンＡ、ベルカリンＡ等が挙げられる。上記トリコテセン系マイコトキシンの毒性の強さとしては、Ｃ＞Ａ＞Ｂといわれている。
【００１７】
（検体）
本発明に用いられる検体としては、トリコテセン系マイコトキシンを含有する可能性のある検体であれば特に制限はないが、トリコテセン系マイコトキシンを産生するカビ類が付着する可能性のある、作物、該作物の加工品、該作物の生育に影響を与える環境要因等が挙げられる。
【００１８】
作物としては、農作物であればいかなるものも包含するが、米、麦類、豆類、トウモロコシ、芋類等が挙げられる。作物は、該作物が田畑等の圃場に植生するものであっても、市場に存在するものであってもよく、その存在場所は問わない。作物の加工品としては、上記作物を原料として加工された飲食品であればいかなるものも包含する。また、家畜のための食用品であるいわゆる飼料、飼料を摂取するブタ、ウシ、鶏等の家畜の肉、乳、卵、またはそれらの加工品も本発明に用いられる検体に包含される。作物の生育に影響を与える環境要因としては、作物の環境を構成する諸要素が挙げられる。具体的には、水分、土壌等の無機的要因、当該無機的要因に付着して生息する微生物、および、空気中に浮遊する微生物の胞子、植物の切り株等の有機的残渣等が挙げられる。
【００１９】
上述の検体はそのまま測定用試料として用いることもできるが、検体を細分化したものを測定用試料として用いることもできる。さらに、検体または細分化された検体から溶媒を用いてトリコテセン系マイコトキシンを抽出し、得られた抽出液を測定用試料として使用することもできる。当該抽出液を溶媒により希釈したものも、濃縮したものも測定用試料として使用することができる。
【００２０】
検体を細分化する方法としては、トリコテセン系マイコトキシンの分解や消失を伴わない方法であればいかなる方法を用いてもよいが、例えば乳鉢と乳棒等を用いてすりつぶす方法、超音波、ミル、ハンマー等を用いて摩砕する方法、刃を用いて細かく剪断する方法等が挙げられる。
上記方法により細分化された検体、または、そのままの形態の検体から溶媒を用いてトリコテセン系マイコトキシンを抽出する方法としては、検体または細分化された検体を直接、溶媒に浸漬する方法が挙げられる。また、抽出の際、攪拌操作、超音波処理等により抽出効率を上げることもできる。
【００２１】
トリコテセン系マイコトキシンを抽出するための溶媒としては、トリコテセン系マイコトキシンが溶解し得るような溶媒であればいかなるものでもよいが、例えば水、有機溶媒、含水有機溶媒等が挙げられ、水溶性の有機溶媒や含水有機溶媒が好ましい。水溶性の有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトン、ジオキサン、ジメトキシエタン等が挙げられる。トリコテセン系マイコトキシンを抽出する際の溶媒量としては、例えば抽出物の容量と溶媒量との和（＝全抽出溶液量）に対する溶媒量の割合が２５％以上であり、５０％以上が好ましく、７５％以上がより好ましい。また、含水有機溶媒における含水量としては、例えば０．５〜５０％であるが、５〜２０％が好ましい。
【００２２】
トリコテセン系マイコトキシンを含有する抽出物としては、溶媒により検体からトリコテセン系マイコトキシンを抽出した溶液（抽出液）のみならず、当該抽出液を前記の溶媒により希釈した希釈溶液や、当該抽出液を濃縮して得た濃縮物等が挙げられる。抽出液の濃縮物は、例えば常圧下または減圧下で、抽出液中の溶媒を留去することにより得ることができる。また、これらの抽出液、希釈溶液および濃縮物はそのままでも測定に供することができるが、カラムに通塔させて不溶物等を除去した状態のものを測定に供することもできる。不溶物等の除去に使用され得るカラムとしては、例えばフロリジル・無水硫酸ナトリウム重層カラムや、シリカゲル・無水硫酸ナトリウム重層カラム等が挙げられる。
【００２３】
（カスパーゼ）
本発明に用いられるカスパーゼとしては、アポトーシスにより誘導され、その活性が測定されるカスパーゼであれば特に制限はなく、例えばカスパーゼ１〜カスパーゼ１４等が挙げられるが、カスパーゼ３が好ましい。
（トリコテセン系マイコトキシンの検出方法）
トリコテセン系マイコトキシンの検出方法としては、以下の工程を含有する方法が挙げられる。
［１］検体とＴ細胞とを接触させ、Ｔ細胞にアポトーシスを誘導する工程；および、
［２］誘導されたアポトーシスを検出する工程。
【００２４】
それぞれの工程の具体的態様としては、当該工程を可能とする態様である限り、特に制限はない。
［１］の工程は、Ｔ細胞が維持される培地中で行うことができる。Ｔ細胞が維持される培地であれば血清培地、無血清培地のいずれにおいても行うことができる。
検体とＴ細胞とを接触させる際の温度としては、当該細胞のアポトーシスが誘導される温度であれば特に制限はないが、例えば０〜５０℃であり、１０〜４５℃が好ましく、２５〜４０℃がさらに好ましい。
【００２５】
検体とＴ細胞とを接触させる時間としては、当該Ｔ細胞のアポトーシスが引き起こされる時間であれば特に制限はないが、例えば０．５〜３６時間であり、１〜２４時間が好ましく、５〜１２時間がさらに好ましい。
また、検体とＴ細胞との接触は、通常の好気性条件下で行うこともできるが、炭酸ガス雰囲気下等の嫌気性条件下で行うこともできる。検体とＴ細胞との接触は、適当な容器内で行うことができ、当該容器としては、例えば９６穴マイクロプレート等を挙げることができる。特に、９６穴マイクロプレートは、測定の自動化への対応が容易である点で好ましい。
【００２６】
［２］の工程におけるアポトーシスの検出方法としては、例えば細胞のアポトーシス誘導により活性化されるカスパーゼの活性を測定する方法、細胞より単離されたＤＮＡを電気泳動によりＤＮＡラダーを検出する方法、アネキシンＶにより細胞を染色する方法等が挙げられるが、細胞のアポトーシス誘導により活性化されるカスパーゼの活性を測定する方法が好ましい。以下にカスパーゼの活性を測定する方法について詳細に説明する。
【００２７】
カスパーゼの活性は、例えばカスパーゼの基質とカスパーゼとの反応により色素、蛍光、発光等を生じさせ、生成した色素、蛍光、発光等の強度を測定することにより測定することができる。カスパーゼの基質としては、カスパーゼによって切断されて、色素、蛍光、発光等を生成するものであれば特に制限はなく、例えば株式会社医学生物学研究所（ＭＢＬ）のカタログ「Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」（２０００年度版）に記載されたカスパーゼの基質や、フナコシ株式会社のカタログ「アポトーシス 研究用試薬カタログ」に記載されたカスパーゼの基質等が挙げられる。例えばカスパーゼ３の基質としては、アスパラギン酸−グルタミン酸−バリン−アスパラギン酸の部分配列を有するペプチド誘導体等があげられる。当該ペプチド誘導体においては、そのＮ末端側はアシル基等により保護されていてもよく、また、Ｃ末端側には、カスパーゼ３によって切断されて色素、蛍光、発光等を生成するような基質が結合していることが好ましい。
【００２８】
色素を生成する基質としては、例えば４−ニトロアニリン等が挙げられる。蛍光を生成する基質としては、例えばローダミン、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ＡＦＣ）、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）等が挙げられる。
色素が生成する基質の場合には、反応液の吸光度を分光光度計により測定することにより、カスパーゼの活性を測定することができる。蛍光が生成する基質の場合には、生成する蛍光の強度を蛍光強度計により測定することにより、カスパーゼの活性を測定することができる。発光が生成する基質の場合には、生成する発光の強度を発光強度計により測定することにより、カスパーゼの活性を測定することができる。
【００２９】
（トリコテセン系マイコトキシンの定量方法）
検体中のトリコテセン系マイコトキシンの定量方法としては、検体中のトリコテセン系マイコトキシンを定量できる方法であれば特に制限はないが、例えば検体中に含まれる種々のトリコテセン系マイコトキシンについて、それぞれのトリコテセン系マイコトキシンを定量する方法や、特定のトリコテセン系マイコトキシンに換算された量として定量する方法等が挙げられる。特定のトリコテセン系マイコトキシンに換算された量として定量する方法が好ましい。特定のトリコテセン系マイコトキシンとしては、トリコテセン系マイコトキシンであれば特に制限はないが、例えばＤＯＮ、ＮＩＶ、Ｔ−２、ベルカリンＡ等が挙げられる。
【００３０】
本発明の定量方法としては、例えば以下の工程を含有する方法が挙げられる。
［１］Ｔ細胞と既知濃度の特定のトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ１）の標準液とを接触させて当該Ｔ細胞のアポトーシスを誘導させ、誘導されたアポトーシスにより活性化されるカスパーゼの活性を測定し、当該トリコテセン系マイコトキシン（Ｍ１）の濃度とカスパーゼの活性との間の相関を示す検量線を作成する工程；
［２］他の数種類のトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ２〜Ｍｎ；ｎは任意の整数）について、それぞれのトリコテセン系マイコトキシンの濃度とカスパーゼの活性との間の相関を示す検量線を作成する工程；
［３］カスパーゼの活性を基に、特定のトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ１）の毒性強度に対する他のトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ２〜Ｍｎ）の毒性強度の相対値を算出する工程；
［４］Ｔ細胞と検体とを接触させてＴ細胞にアポトーシスを誘導させ、誘導されたアポトーシスにより活性化されるカスパーゼの活性を測定する工程；
［５］［４］の工程において測定されたカスパーゼ活性と、［１］の工程において作成した検量線とを用いて、検体中のトリコテセン系マイコトキシン含量を特定のトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ１）の換算含量として表す工程；
それぞれの工程の具体的態様としては、当該工程を可能とする態様である限り、特に制限はない。
【００３１】
上記［１］の工程においてトリコテセン系マイコトキシンについて、Ｔ細胞のアポトーシス誘導により活性化されるカスパーゼの活性を測定する方法としては、例えば検体として当該特定のトリコテセン系マイコトキシンの既知濃度の標準液を用いた前述のトリコテセン系マイコトキシンの検出方法等が挙げられる。［１］の工程におけるＴ細胞のアポトーシスの誘導、カスパーゼ活性の測定は、例えば前述のトリコテセン系マイコトキシンの検出方法において用いた方法により行うことができる。
【００３２】
［２］の工程における他のトリコテセン系マイコトキシンとしては、特定のトリコテセン系マイコトキシンがＤＯＮである場合にはＮＩＶ、Ｔ−２等が挙げられ、特定のトリコテセン系マイコトキシンがＮＩＶである場合にはＤＯＮ、Ｔ−２等が挙げられ、特定のトリコテセン系マイコトキシンがＴ−２である場合にはＤＯＮ、ＮＩＶ等が挙げられる。他のトリコテセン系マイコトキシンについて、Ｔ細胞のアポトーシスによって活性化されるカスパーゼの活性を測定する方法としては、例えば検体として当該他のトリコテセン系マイコトキシンの既知濃度の標準液を用いた前述のトリコテセン系マイコトキシンの検出方法等が挙げられる。
【００３３】
［３］の工程における特定のトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ１）の毒性強度に対する他のトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ２〜Ｍｎ）の毒性強度の相対値を算出する方法としては、例えば［１］および［２］の工程で作成したそれぞれのトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ１〜Ｍｎ）についての検量線を基に、検量線の傾きから算出する方法、ある特定の濃度における特定のトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ１）と比較の対象となるトリコテセン系マイコトキシン（Ｍｉ）のカスパーゼ活性値の比から算出する方法等が挙げられる。
【００３４】
検量線の傾きから毒性強度の相対値を算出する方法としては、例えば次の方法が挙げられる。特定のトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ１）における検量線の傾きをａ１、他のトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ２〜Ｍｎ）における検量線の傾きをａ２〜ａｎとすると、特定のトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ１）の毒性強度に対するトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ１〜Ｍｎ）の毒性強度の相対値（ｆ１〜ｆｎ）は、それぞれ式（１）
（数１）
【００３５】
ｆｉ＝ａｉ／ａ１  （ｉ：１〜ｎ  ｎは整数）                    （１）
で表すことができる（ｆ１＝１）。
カスパーゼ活性の比から毒性強度の相対値を算出する方法としては、例えば次の方法が挙げられる。特定のトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ１）における検量線から、ある特定の濃度（Ｘ）（当該濃度としては、当該検量線において、定量関係が認められている濃度が好ましい）における毒性強度（Ｙ１）を決定する。同様に、他のトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ２〜Ｍｎ）における検量線から、当該濃度（Ｘ）における毒性強度（Ｙ２〜Ｙｎ）をそれぞれのトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ２〜Ｍｎ）について決定する。特定のトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ１）の毒性強度に対するトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ１〜Ｍｎ）の毒性強度の相対値（ｆ１〜ｆｎ）は、それぞれ式（２）
（数２）
【００３６】
ｆｉ＝Ｙｉ／Ｙ１  （ｉ：１〜ｎ  ｎは整数）                  （２）
で表すことができる（ｆ１＝１）。
［４］の工程におけるカスパーゼ活性の測定方法としては、例えば前述のトリコテセン系マイコトキシンの検出方法において用いられる方法等が挙げられる。
【００３７】
［５］の工程における検体中のトリコテセン系マイコトキシン含量を特定のトリコテセン系マイコトキシンの量に換算する方法としては、例えば［４］の工程で得られたカスパーゼ活性（Ｆ）と、［１］で作成したトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ１）についての検量線とから、カスパーゼ活性値（Ｆ）に対応するトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ１）量を算出する方法等が挙げられる。この場合、算出された値が検体中のトリコテセン系マイコトキシン含量のトリコテセン系マイコトキシン（Ｍ１）換算含量となる。当該算出値に相対値ｆｉを乗じた値が、検体中のトリコテセン系マイコトキシン含量のトリコテセン系マイコトキシン（Ｍｉ）換算含量となる。
【００３８】
本発明の定量方法の妥当性については、上述の［１］〜［５］に加えて、以下の［６］および［７］の工程を行なうことにより、検証することができる。
［６］他の定量方法（例えば、ELISAなどの免疫学的測定法）により試料中のＭ１〜Ｍｎを測定する工程；および、
［７］［６］の工程において定量された試料中の各種トリコテセン系マイコトキシン含量に［３］の工程で得られた相対値を乗じて得られた数値の和を特定トリコテセン系マイコトキシン量として、［５］の工程で算出された特定のトリコテセン系マイコトキシン換算含量との相関関係を調べる工程。
【００３９】
［６］の工程における本発明以外の定量方法としては、例えば、ELISAなどの免疫学的測定法などが挙げられる。具体的には、国際公開第０１／０１８１９６号パンフレットに開示された免疫学的測定方法に基づき、ＤＯＮおよびＮＩＶを特異的に認識するモノクローナル抗体、ＮＩＶを特異的に認識するモノクローナル抗体、Ｔ−２を特異的に認識するモノクローナル抗体をそれぞれ用いることにより、試料中のＤＯＮ、ＮＩＶ、Ｔ−２の定量を行なうことができる。
【００４０】
［７］の工程において、［６］の工程において定量された試料中の各種トリコテセン系マイコトキシン含量に［３］で得られた相対値を乗じた数値の和は、試料中の特定のトリコテセン系マイコトキシン含量を表すこととなる。そこで、複数の試料について、以上の方法により得られた特定のトリコテセン系マイコトキシン含量と、本発明の方法により算出された特定のトリコテセン系マイコトキシン換算含量とをそれぞれ算出し、それらの数値の相関関係を調べることにより、本発明の定量方法の数値の妥当性を検証することができる。
【００４１】
本発明の方法においては、緩衝液、界面活性剤、安定化剤等を適宜用いることができる。緩衝液に用いる緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に限定されないが、ｐＨ１〜１１の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸［（Ｈ）ＥＰＰＳ］、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等のグッド緩衝剤等が挙げられる。緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましく、０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌが特に好ましい。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。安定化剤としては、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）等が挙げられる。
【００４２】
（トリコテセン系マイコトキシンの検出用試薬）
本発明のトリコテセン系マイコトキシンの検出用試薬としては、トリコテセン系マイコトキシンとの接触によりアポトーシスが誘導されるようなＴ細胞を含有する試薬であれば特に制限はない。当該Ｔ細胞としては、例えば前述の（Ｔ細胞）であげられたＴ細胞等が挙げられる。
【００４３】
アポトーシス検出用試薬としては、例えばカスパーゼ活性測定用試薬、ＤＮＡラダー検出用試薬、細胞染色用試薬等が挙げられるが、カスパーゼ活性測定用試薬が好ましい。カスパーゼ活性測定用試薬としては、例えばカスパーゼの基質を含有する試薬が挙げられ、細胞染色用試薬としては、例えばアネキシンＶ等が挙げられる。カスパーゼの基質としては、例えば前述のカスパーゼの基質等が挙げられる。
【００４４】
（トリコテセン系マイコトキシン定量用試薬）
本発明のトリコテセン系マイコトキシン定量用試薬としては、トリコテセン系マイコトキシンとの接触によりアポトーシスが誘導されるようなＴ細胞およびトリコテセン系マイコトキシン標準液を含有する試薬であれば特に制限はない。当該Ｔ細胞としては、例えば前述の（Ｔ細胞）であげられたＴ細胞等が挙げられる。
【００４５】
トリコテセン系マイコトキシン標準液としては、例えば既知濃度のＤＯＮ試薬、既知濃度のＮＩＶ試薬、既知濃度のＴ−２試薬、既知濃度のベルカリンＡ試薬等が挙げられる。トリコテセン系マイコトキシンの定量においては、これらの標準液は、予め調製された溶液として使用されるが、定量直前に、固体状態のトリコテセン系マイコトキシン（既知量）を既知容量の溶媒に溶解し、または、既知容量の溶媒を固体状態のトリコテセン系マイコトキシン（既知量）に添加して調製される溶液としても使用される。
【００４６】
アポトーシス検出用試薬としては、例えばカスパーゼ活性測定用試薬、ＤＮＡラダー検出用試薬、細胞染色用試薬等が挙げられるが、カスパーゼ活性測定用試薬が好ましい。カスパーゼ活性測定用試薬としては、例えばカスパーゼの基質を含有する試薬が挙げられ、細胞染色用試薬としては、例えばアネキシンＶ等が挙げられる。カスパーゼの基質としては、例えば前述のカスパーゼの基質等が挙げられる。
【００４７】
本発明の試薬には、緩衝液、界面活性剤、安定化剤等が適宜含有されていてもよい。当該緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えば前述の緩衝剤等が挙げられる。当該界面活性剤および当該安定化剤としては、例えばそれぞれ、前述の界面活性剤および安定化剤等が挙げられる。また、本発明の試薬は、キットの形態で保存、運搬されてもよい。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例においては、下記メーカーの試薬および機器を使用した。
【００４８】
ＤＯＮ（シグマ社製）、ＮＩＶ（シグマ社製）、Ｔ−２（シグマ社製）、ベルカリン Ａ（シグマ社製）、胎児仔牛血清（シグマ社製）、ペニシリン（シグマ社製）、ストレプトマイシン（シグマ社製）、ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＩＣＮバイオメディカルズ社製）、ＨＥＰＥＳ（和光純薬社製）、シュークロース（和光純薬社製）、ＤＴＴ（和光純薬社製）、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（シグマ社製）、ＣＨＡＰＳ（和光純薬社製）、Ac-Asp-Glu-Val-Asp-amino-4-methylcoumarin（カスパーゼ３の基質；ファーミンゲン インターナショナル社製）、９６穴マイクロプレート（ファルコン社製）、フルオロスキャン・アセント（ライフ サイエンシーズ インターナショナル カンパニー社製）。
【実施例１】
【００４９】
カスパーゼ３活性の測定方法
（１）ＬＭＡＴ細胞の培養
１０％胎児仔牛血清、１００ＩＵ／ｍＬペニシリンおよび０．１％ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて、小児白血病細胞株であるＬＭＡＴ細胞［「リューケミア（Leukemia）」，１９９６年，第１０巻，ｐ．１０２−１０５参照］を、空気−炭酸ガス（９５：５）の雰囲気下で、３７℃にて培養した。
【００５０】
（２）カスパーゼ３活性の定量方法
ＬＭＡＴ細胞を、血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、ペトリ皿に播き、一晩炭酸ガスインキュベーターで３７℃で培養した。細胞を遠心分離（９００回転／分；５分間）により集め、１×１０６／ｍＬとなるように、血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁させた。９６穴マイクロプレート（型番：７０３３）の各ウェルに、懸濁液１００μＬ（１×１０５細胞を含有）を分注した後、検体をウェルに加え、プレートを３７℃にて１２時間、炭酸ガスインキュベーターでインキュベートした。インキュベーション終了後、直ちに各ウェルから培地（７５μＬ）を抜き取り、抜き取った後のウェルに残った細胞を−８０℃にて３０分間凍結させた。凍結細胞を氷上で解凍した後、ｐＨ７．２５の溶解緩衝液（Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）（５０μＬ）［ＨＥＰＥＳ（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）、シュークロース（１０％）、ＤＴＴ（２ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（１０−６ｖ／ｖ％）、ＣＨＡＰＳ（０．１％）を含有］を解凍した細胞に加えて軽く混合した［「フェブス レターズ（FEBS Letters）」，１９９７年，第４１４巻，ｐ．５５２−５５６、および、「フェブス レターズ（FEBS Letters）」，１９９８年，第４２９巻，ｐ．３５１−３５５］。次いで、カスパーゼ３の特異的基質であるAc-Asp-Glu-Val-Asp-amino-4-methylcoumarin［「ネイチャー（Nature）」，１９９５年，第３７６巻，ｐ．３７−４３参照］の２．５ｍｍｏｌ／Ｌ水溶液（１μＬ）を各ウェルに添加し、直ちに３７℃で反応を開始した。反応により遊離した７−アミノ−４−メチルクマリンに由来する蛍光強度を、フルオロスキャン・アセントを用いて、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで定量し［「ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）」，１９９７年，第２７２巻，ｐ．１９６５−１９６９参照］、カスパーゼ３の活性を反応初速度（ｐｍｏｌ／分／１０６細胞）で表した。
【実施例２】
【００５１】
ＤＯＮによるＬＭＡＴ細胞のアポトーシス
検体として、ＰＢＳ、５００μｍｏｌ／Ｌ、１０００μｍｏｌ／Ｌ、１５００μｍｏｌ／Ｌおよび２０００μｍｏｌ／Ｌの各濃度のＤＯＮのＰＢＳ溶液を１μＬ用いる以外は実施例１と同様の方法により、ＬＭＡＴ細胞のアポトーシスにおけるカスパーゼ３の活性を定量した。その結果、図１に示すように、ＤＯＮの濃度が増加するに従って、カスパーゼ３の活性も増大することが判明した。ＤＯＮの濃度（ｘ）とカスパーゼ３の活性（ｙ）との間には、式（３）
(数３）
【００５２】
ｙ＝２２８１＊ｅｘｐ（０．０２２２＊ｘ）                  （３）
の関係が認められた。
【実施例３】
【００５３】
ＮＩＶによるＬＭＡＴ細胞のアポトーシス
検体として、１％  ＤＭＳＯ−ＰＢＳ、２５０μｍｏｌ／Ｌ、５００μｍｏｌ／Ｌ、７５０μｍｏｌ／Ｌおよび１０００μｍｏｌ／Ｌの各濃度のＮＩＶの１％ＤＭＳＯ−ＰＢＳ溶液を１μＬ用いる以外は実施例１と同様の方法により、ＬＭＡＴ細胞のアポトーシスにおけるカスパーゼ３の活性を定量した。その結果、図２に示すように、ＮＩＶの濃度が増加するに従って、カスパーゼ３の活性も増大することが判明した。ＮＩＶの濃度（ｘ）とカスパーゼ３の活性（ｙ）との間には、式（４）
（数４）
【００５４】
ｙ＝１３１１＊ｅｘｐ（０．０２１２＊ｘ）                  （４）
の関係が認められた。
【実施例４】
【００５５】
Ｔ−２によるＬＭＡＴ細胞のアポトーシス
検体として、ＤＭＳＯ、５μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、１５μｍｏｌ／Ｌおよび２０μｍｏｌ／Ｌの各濃度のＴ−２のＤＭＳＯ溶液を１μＬ用いる以外は実施例１と同様の方法により、ＬＭＡＴ細胞のアポトーシスにおけるカスパーゼ３の活性を定量した。その結果、図３に示すように、Ｔ−２の濃度が増加するに従って、カスパーゼ３の活性も増大することが判明した。Ｔ−２の濃度（ｘ）とカスパーゼ３の活性（ｙ）との間には、式（５）
（数５）
【００５６】
ｙ＝２０．８８５＊ｅｘｐ（０．０２３５＊ｘ）                  （５）
の関係が認められた。
【実施例５】
【００５７】
ベルカリンＡによるＬＭＡＴ細胞のアポトーシス
検体として、１％  ＤＭＳＯ−ＰＢＳ、２．５μｍｏｌ／Ｌ、５μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌおよび１５μｍｏｌ／Ｌの各濃度のベルカリンＡの１％  ＤＭＳＯ−ＰＢＳ溶液を１μＬ用いる以外は実施例１と同様の方法により、ＬＭＡＴ細胞のアポトーシスにおけるカスパーゼ３の活性を定量、評価した。その結果、図４に示すように、ベルカリンＡの濃度が増加するに従って、カスパーゼ３の活性も増大することが判明した。ベルカリンＡの濃度（ｘ）とカスパーゼ３の活性（ｙ）との間には、式（６）
（数６）
【００５８】
ｙ＝２．２０４３＊ｅｘｐ（０．０４１７＊ｘ）                  （６）
の関係が認められた。
【実施例６】
【００５９】
ＤＯＮに対する各トリコテセン系マイコトキシンの相対的毒性強度
実施例２〜５において各トリコテセン系マイコトキシンについての濃度（ｘ）とカスパーゼ３の活性（ｙ）との関係を示す検量線から、ＤＯＮ、ＮＩＶ、Ｔ−２、ベルカリンＡについての比例定数より、ＤＯＮに対するＮＩＶ、Ｔ−２、ベルカリンＡの相対値はそれぞれ１．８３、１０２および４００と算出された。また、各種トリコテセン系マイコトキシン50nMのときのカスパーゼ活性より算出されたＤＯＮに対するＮＩＶ、Ｔ−２の相対値はそれぞれ１．６、４０であった。この結果から、トリコテセン系マイコトキシンの毒性は、ＤＯＮ＜ＮＩＶ＜Ｔ−２＜ベルカリンＡの順に強くなることが判明し、一般にいわれているトリコテセン系マイコトキシンの毒性の順と一致した。
【実施例７】
【００６０】
小麦粉砕物中のトリコテセン系マイコトキシン含量の定量（ＤＯＮ換算含量の定量）
定量用検体は次のような手順で調製した。小麦粉砕物（５ｇ）に８５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル（４０ｍＬ）を加えて９０分間振盪し、得られた抽出液の一部（８ｍＬ）を乾固し、当該乾固物をＤＭＳＯ（１００μＬ）で溶解し検体とした。
このようにして小麦粉砕物１〜９から調製した検体１〜９を、それぞれ１％ＤＭＳＯ−ＰＢＳにて５倍希釈し、得られた５倍希釈検体を０．２μＬ用いて、実施例１の方法によりカスパーゼ３活性を定量した。定量されたカスパーゼ３活性の値と実施例２で作成したＤＯＮについての検量線とから、各検体中のトリコテセン系マイコトキシンのＤＯＮ換算濃度を決定した。当該濃度から検体調製の元となった小麦粉砕物中のトリコテセン系マイコトキシンのＤＯＮ換算含量を計算したところ、表１の通りとなった。
【００６１】
【表１】
2005245211.tif 000002
【００６２】
ここで、検体中のトリコテセン系マイコトキシンのＤＯＮ換算濃度［ｘ（μｍｏｌ／Ｌ）］から、検体調製の元となった小麦粉砕物中のトリコテセン系マイコトキシンのＤＯＮ換算含量［ｙ（ｐｐｍ）］は式（７）
（数７）
【００６３】
ｙ＝ｘ＊１００＊２９６．３＊２５００＊１０−６        （７）
により算出される。
一方、各検体（検体１〜９）中のＤＯＮ、ＮＩＶおよびＴ−２濃度を、ＦＡ・マイコトキシン［ＤＯＮ＋ＮＩＶ］（協和メデックス社製；ＤＯＮ＋ＮＩＶ包括的定量用キット）、ＦＡ・マイコトキシン［ＮＩＶ］（協和メデックス社製；ＮＩＶ定量用キット）およびＦＡ・マイコトキシン［Ｔ−２＋ＨＴ−２］（協和メデックス社製；Ｔ−２＋ＨＴ−２包括的定量用キット）を用いて、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）により定量したところ、表２に示す通りの結果となった。
【００６４】
【表２】
2005245211.tif 000003
【００６５】
ＥＬＩＳＡ法により得られた表２の結果と、実施例６で決定されたＤＯＮに対するＮＩＶおよびＴ−２の相対値（それぞれ１．６、４０）とから、各検体調製の元となった小麦粉砕物中のトリコテセン系マイコトキシンのＤＯＮ換算含量を式（８）
（数８）
【００６６】
ｗ＝ｘ＋１．６＊ｙ＋４０＊ｚ        （８）
［式中、ｗは、小麦粉砕物中のトリコテセン系マイコトキシンのＤＯＮ換算含量（ｐｐｍ）を表し、ｘ、ｙ、ｚはそれぞれ、ＥＬＩＳＡ法により決定した検体中のＤＯＮ、ＮＩＶ、Ｔ−２＋ＨＴ−２の濃度を表す］により算出したところ、表２に示す通りの結果となった。
【００６７】
表１および表２との比較から、ＬＭＡＴ法で算出した小麦粉砕物中のトリコテセン系マイコトキシンのＤＯＮ換算含量と、ＥＬＩＳＡ法で算出した小麦粉砕物中のトリコテセン系マイコトキシンのＤＯＮ換算含量との間で１５〜８４倍の相違が認められるが、図５に示す通り、２つの定量法間に良好な相関関係が認められた。このことは、ＬＭＡＴ法での定量値が、当該定量値にある定数を乗ずることによりＥＬＩＳＡ法での定量値に変換されることを意味している。すなわち、ＬＭＡＴ法による定量が、ＥＬＩＳＡ法での値付けに有効であることを示している。また、アフラトキシンやダイオキシン等の環境汚染物質の定量においては、定量法間での値の相違が場合によっては２桁程度許容されている現状を考慮すると、ＬＭＡＴ法は検体中のトリコテセン系マイコトキシン含量の定量に適した簡便な方法ということができる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明によれば、食物や飼料等の検体に含まれるトリコテセン系マイコトキシンの検出および定量に有用な方法および試薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ＤＯＮによるＬＭＡＴ細胞のアポトーシスにおけるＤＯＮの濃度とカスパーゼ３の活性との関係を表す図である。
【図２】ＮＩＶによるＬＭＡＴ細胞のアポトーシスにおけるＮＩＶの濃度とカスパーゼ３の活性との関係を表す図である。
【図３】Ｔ−２によるＬＭＡＴ細胞のアポトーシスにおけるＴ−２の濃度とカスパーゼ３の活性との関係を表す図である。
【図４】ベルカリンＡによるＬＭＡＴ細胞のアポトーシスにおけるベルカリンＡの濃度とカスパーゼ３の活性との関係を表す図である。
【図５】小麦粉砕物中のトリコテセン系マイコトキシンのＤＯＮ換算含量定量に関するＬＭＡＴ法とＥＬＩＳＡ法との相関関係を表す図である。
【図１】
2005245211.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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