(57)【要約】【課題】  遺伝子工学の手法を用いてフジツボ第７接着タンパク質遺伝子を生産すべく、その生産のもととなる遺伝子をフジツボ類より容易に取得するための手法を提供する。【解決手段】  GTN CCN CCN CCNTGY GAY YTで表されるフジツボ第７接着タンパク質遺伝子増幅用ユニバーサルプライマー。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(c)に示すオリゴヌクレオチド。
(a)配列番号１に記載されている塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又はこのオリゴヌクレオチドと相補的なオリゴヌクレオチド
(b)(a)のオリゴヌクレオチドにおいて、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは挿入されているオリゴヌクレオチドであって、フジツボ第７接着タンパク質遺伝子増幅用ユニバーサルプライマーとして機能し得るオリゴヌクレオチド
(c)(a)又は(b)のオリゴヌクレオチドの末端に別のオリゴヌクレオチドが付加したオリゴヌクレオチドであって、フジツボ第７接着タンパク質遺伝子増幅用ユニバーサルプライマーとして機能し得るオリゴヌクレオチド
【請求項２】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドをユニバーサルプライマーとして用いることを特徴とするフジツボ第７接着タンパク質遺伝子断片の増幅方法。
【請求項３】
以下の（１）及び（２）の工程を含むことを特徴とするフジツボ第７接着タンパク質遺伝子断片の増幅方法。
（１）フジツボからmRNAを調製する工程
（２）（１）で調製したmRNAと請求項１記載のオリゴヌクレオチドおよびpolyTとを混合し、前者を鋳型、後者をプライマーとするポリメラーゼ連鎖反応を行う工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は水中や湿潤な環境で使用できる接着剤や吸着剤、自己集合体の原料となるタンパク質を組み換えDNA技術を用いて製造するために用いるDNAを、各種フジツボ類より取得するために用いるPCR用プライマーに関する。本発明のプライマーを用いることにより、タンパク質精製などを経ずに直接遺伝子を取得することが可能になる。
【背景技術】
【０００２】
乾燥条件下で強い接着力を示す接着剤は様々な種類のものが開発されている。そのうちの多くのものは一旦乾燥条件下で接着してしまえば湿潤環境におかれてもその強度を維持できる。しかし、湿潤な条件下や水中で接着を開始した場合、有効な強度に達することができる接着剤は存在しなかった。
【０００３】
フジツボは、セメントと呼ばれるタンパク質を主成分とする物質を基盤に分泌して、海水中で強く付着することができる。このタンパク質は難溶解性複合体であるが、その可溶化法が開発され(Kamino, K. et al. J.Biol.Chem. (2000) 275, 27360-27365)、6種類のタンパク質が構成タンパク質として認識されている。それら6種のタンパク質に関しては、アカフジツボ(Megabalanus rosa) から5種及びタテジマフジツボ(Balanus amphitrite)から2種の計7種の遺伝子についての出願が行われている。各出願においては、便宜上、各遺伝子をそれぞれフジツボ接着タンパク質遺伝子（特許文献１参照）、フジツボ第２接着タンパク質遺伝子（特許文献２参照）、フジツボ第３接着タンパク質遺伝子（特許文献３参照）、フジツボ第４接着タンパク質遺伝子（特許文献４参照）、フジツボ第５接着タンパク質遺伝子（特許文献５参照）、フジツボ第６接着タンパク質遺伝子（特許文献６参照）、フジツボ第７接着タンパク質遺伝子（日本動物学会第７３回大会）と命名している。
【０００４】
水中接着は複数のサブ機能より構成される。例えば、それは、生体内での安定化サブ機能、海水中の基盤上の水分子との置換サブ機能、様々な基盤表層への吸着サブ機能、海水中での自己集合サブ機能、海水中での迅速な機能発現サブ機能、長期間の水解に対する安定化サブ機能、海水中の微生物分解からの安定化機能といったものが挙げられる。各水中接着複合体構成タンパク質は、それらサブ機能をいずれかを担っており、フジツボはそれらサブ機能すべてを満たして水中接着を可能にしているが、各サブ機能自体が有用であり、それぞれに実用化の可能性を有する。
【０００５】
これまで、フジツボ第７接着タンパク質遺伝子をアカフジツボ以外のフジツボから取得する際には、PCRにより増幅するためのユニバーサルプライマーが存在しなかったため、各フジツボを採取し、さらにその接着物質を十分量採取し、その接着物質を可溶化、分離精製し、蛋白質の部分アミノ酸配列を決定、degenerate primer DNAを用いたPCRにより部分遺伝子を増幅する必要があった。このため遺伝子取得には、多大な時間と労力を要した。また、数種の大型のフジツボを除きほとんどのフジツボは小さく殻が弱いため、その基盤より剥離することが困難であり、そのため接着物質の採取は通常困難である。
【特許文献１】特開平7-265081号公報
【特許文献２】特開平9-47288号公報
【特許文献３】特開平9-299089号公報
【特許文献４】特開平10-327867号公報
【特許文献５】特開平11-332572号公報
【特許文献６】特開平11-332573号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、遺伝子工学の手法を用いてフジツボ第７接着タンパク質遺伝子を生産すべく、その生産のもととなる遺伝子をフジツボ類より容易に取得するための手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、あるオリゴヌクレオチドが、フジツボ第７接着タンパク質遺伝子断片を増幅するためのユニーバーサルプライマーとして利用できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔３〕に関するものである。
〔１〕以下の(a)〜(c)に示すオリゴヌクレオチド。
(a)配列番号１に記載されている塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又はこのオリゴヌクレオチドと相補的なオリゴヌクレオチド
(b)(a)のオリゴヌクレオチドにおいて、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは挿入されているオリゴヌクレオチドであって、フジツボ第７接着タンパク質遺伝子増幅用ユニバーサルプライマーとして機能し得るオリゴヌクレオチド
(c)(a)又は(b)のオリゴヌクレオチドの末端に別のオリゴヌクレオチドが付加したオリゴヌクレオチドであって、フジツボ第７接着タンパク質遺伝子増幅用ユニバーサルプライマーとして機能し得るオリゴヌクレオチド
〔２〕〔１〕に記載のオリゴヌクレオチドをユニバーサルプライマーとして用いることを特徴とするフジツボ第７接着タンパク質遺伝子断片の増幅方法。
〔３〕以下の（１）及び（２）の工程を含むことを特徴とするフジツボ第７接着タンパク質遺伝子断片の増幅方法。
（１）フジツボからmRNAを調製する工程
（２）（１）で調製したmRNAと〔１〕記載のオリゴヌクレオチドおよびpolyTとを混合し、前者を鋳型、後者をプライマーとするポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行う工程
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明のオリゴヌクレオチドには、以下の(a)〜(c)のオリゴヌクレオチドが含まれる。
(a)配列番号１に記載されている塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又はこのオリゴヌクレオチドと相補的なオリゴヌクレオチド
(b)(a)のオリゴヌクレオチドにおいて、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは挿入されているオリゴヌクレオチドであって、フジツボ第７接着タンパク質遺伝子増幅用ユニバーサルプライマーとして機能し得るオリゴヌクレオチド
(c)(a)又は(b)のオリゴヌクレオチドの末端に別のオリゴヌクレオチドが付加したオリゴヌクレオチドであって、フジツボ第７接着タンパク質遺伝子増幅用ユニバーサルプライマーとして機能し得るオリゴヌクレオチド
【００１１】
(a)のオリゴヌクレオチドは、アカフジツボ由来のフジツボ第７接着タンパク質と、アメリカフジツボ由来のフジツボ第７接着タンパク質のN末端側のアミノ酸配列を比較することにより特定されたフジツボ第７接着タンパク質遺伝子増幅用ユニバーサルプライマーとして機能し得るオリゴヌクレオチドである。
【００１２】
ここで、「フジツボ第７接着タンパク質」とは、フジツボのセメント中に含まれるタンパク質であって、配列番号４記載のアミノ酸配列（アカフジツボ由来のフジツボ第７接着タンパク質）と一定の相同性を示すタンパク質をいう。ここでいう「一定の相同性」とは、通常、40％以上をいい、好適には50％以上をいう。
【００１３】
また、「フジツボ第７接着タンパク質遺伝子増幅用ユニバーサルプライマーとして機能し得る」とは、アカフジツボ以外の少なくとも1種のフジツボからフジツボ第７接着タンパク質遺伝子を増幅することができることをいう。
【００１４】
(b)のオリゴヌクレオチドは、(a)のオリゴヌクレオチドに、ユニバーサルプライマーとしての機能を喪失させない範囲内で、その配列に改変を加えたオリゴヌクレオチドである。欠失等させるオリゴヌクレオチドの数は特に限定されないが、通常、3個以下であり、好適には、１個である。
【００１５】
(c)のオリゴヌクレオチドは、(a)や(b)のオリゴヌクレオチドに、ユニバーサルプライマーとしての機能に喪失させない範囲内で、別のオリゴヌクレオチドを付加したオリゴヌクレオチドである。付加するオリゴヌクレオチドは、3'側でも5'側でもよい。付加するオリゴヌクレオチドの長さは特に限定されないが、通常、6個以内であり、好適には、3個以内である。
【００１６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、一般的な化学合成法により容易に製造することができる。
【００１７】
本発明のオリゴヌクレオチドをユニバーサルプライマーとして用いることにより、フジツボ第７接着タンパク質遺伝子断片を増幅することができる。
【００１８】
具体的な増幅方法としては、以下の（１）及び（２）の工程を含む方法を例示できる。
（１）フジツボからmRNAを調製する工程
この工程は、例えば、以下のように行うことができる。フジツボ第７接着タンパク質を得たいフジツボを採取し、その組織をチオシアン酸グアニディン等により可溶化し、フェノール／クロロホルムによる抽出を行い、イソプロパノールにより沈殿させることにより全RNAを得ることができる。全RNAを得る方法はこの方法に限定されるものではなく、LiCl沈殿法や塩化セシウム溶液に重層して遠心することによっても得られる。全RNAから、オリゴdTセルロースカラムを用いて、mRNAを調製できる。
【００１９】
ここで、mRNA調製の対象とするフジツボは、フジツボ第７接着タンパク質遺伝子を含むものであれば特に限定されず、例えば、アカフジツボ(Megabalanus rosa)、タテジマフジツボ(Balanus amphitrite)、シロスジフジツボ（Balanus albicostatus）、の他、Megabalanus volcano、Balanus rostratus、Balanu eburneus、Balanus improvisus、Balanus reticulates、Balanus improvisus、Balanus reticulates、Balanus kondakovi、Balanus trigonus、Semibalanus cariosus、Tetraclita japonica、Tetraclita squamosa、Tetraclita formosana、Chthamalus challengeri、Chthamalus dalli、Chthamalus malayensis、Euraphia pilsbryi、Euraphia intertexaなどを挙げることができる。
【００２０】
（２）（１）で調製したmRNAと本発明のオリゴヌクレオチドとを混合し、前者を鋳型、後者をプライマーとする3’-RACE PCRを行う工程
上記増幅方法により増幅されたフジツボ第７接着タンパク質遺伝子断片から全長遺伝子の配列を決定することができる。これは、例えば、以下のように行うことができる。フジツボ第７接着タンパク質遺伝子断片をアガロース電気泳動等により精製し、適当なベクターに挿入後、大腸菌等にクローニングし、そのプラスミドを調製して配列を決定する。配列の決定は、サンガー法やマキサム−ギルバート法等の一般的な方法によって行うことができる。遺伝子断片の配列から、採取したフジツボのフジツボ第７接着タンパク質遺伝子の塩基配列に特異的プライマーを、5'末端向きに合成し、一般的な5'RACE法を適用することで5'末端領域を増幅し、その配列を決定する。これにより遺伝子の全長配列を決定することができる。また、得られたフジツボ第７接着タンパク質遺伝子をプローブとし、cDNAライブラリーをスクリーニングし、強くハイブリダイズするクローンを選抜することでも全長遺伝子の配列情報を得ることができる。cDNAライブラリーは、cDNAを適当なベクターに挿入し、このベクターを適当な宿主に導入して増幅させると共に目的のDNAを持つクローンを選択する。ベクターはλファージ由来の各種ベクターたとえばλgt10やλZapIIなど、あるいはpBR322等のプラスミドベクターを用いることができる。
【００２１】
以上のように配列を決定したフジツボ第７接着タンパク質の全長遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、微生物や培養細胞、あるいは生体に導入して発現させることにより、フジツボ第７接着タンパク質を大量調製することが可能である。この際、全長遺伝子はシグナル部分を含むため、当該ペプチドを宿主細胞外に分泌させることができる。また、シグナル部分を除去して適当なベクターに組み込んで用いることにより細胞内で生産させることも可能である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は、フジツボ第７接着タンパク質遺伝子を得るためのユニバーサルプライマーを提供する。このプライマーを用いることにより、タンパク質精製などを経ずに直接フジツボ第７接着タンパク質遺伝子を取得することが可能になる。従って、各種フジツボから、簡易かつ迅速にフジツボ第７接着タンパク質遺伝子を得ることができ、また、採取するフジツボの量も少なくて済むようになる。
【００２３】
フジツボ第７接着タンパク質は、自己集合性や水中吸着性物質として利用が可能であり、また他のフジツボ水中接着タンパク質と組み合わせることで、水中接着物質としての利用も可能である。ここで「自己集合性」は、微少サイズ（ナノスケール）の構造体を構築する際のキーテクノロジーのひとつである。細胞外で機能するタンパク質複合体には自己集合性が備わっていることが多く、それらの構築原理はナノテクロジーに新たな原理を導入するために有用である。さらにその自己集合体自体、外科治療や再生医療のキー素材であるバイオマテリアルそのものとして応用できる可能性や、化粧品基剤としての応用の可能性をもつ。また、「水中吸着性物質」は、食品接着剤、細胞培養におけるコート剤、創傷修復剤としてや、無機性インプラントなどにおける生体内非特異的細胞汚損防除剤、あるいは細胞特異的吸着剤、タンパク質チップの作製に際してのタンパク質固定化技術、特定の場所に目的のものだけを吸着させるナノテクノロジーのための技術、等の応用の可能性もある。
【実施例１】
【００２４】
［実施例1］  ユニバーサルプライマーの設計
配列解析ソフトClastalWによりアカフジツボの第7接着タンパク質アミノ酸配列（配列番号３及び４）およびアメリカフジツボのペプチド断片WCD-21のアミノ酸配列（配列番号７、Naldrett, M.J. and Kaplan, D.L.. Marine Biology(1997) 127, 629-635）のアライメントを作成し、6アミノ酸以上の連続した配列一致領域を同定した。アメリカフジツボWCD-21ではN末端側からの4番目と5番目のアミノ酸が同定されていないが、アカフジツボの配列を基に、3連続するProの同定の困難さとCysを保護していないための同定の困難さを考えあわせ、それぞれProとCysと推定した。それらアミノ酸より逆翻訳で17ないし20merDNA degenerate配列を作成し、その縮重度から適当なものを選択した。それらDNA配列のダイマー形成や非特異的吸着を模擬PCRソフトAmplify 1.0で調べ、そのような性質を示さない配列を特定した。
これらの作業を経て、以下のユニバーサルプライマーを設計した。
GTN CCN CCN CCN TGY GAY YT（配列番号１）
【００２５】
［実施例2］  ユニバーサルプライマーによる遺伝子断片の増幅
（１）シロスジフジツボmRNAの調製
静岡県清水市で採取したシロスジフジツボ1個体をチオシアン酸グアニディン、クエン酸ナトリウム、N-ラウリルザルコシン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール等の溶液中で組織を機械的に破砕し、フェノール及びクロロホルムによる抽出を行なって、タンパク質などを除去した後、イソプロパノールを加えて沈殿させることにより全RNAを抽出し、オリゴdTセルロースカラムに導通してポリアデニル酸鎖を有するRNA(ポリA-RNA)を調製した。この操作により約1μgのポリA-RNAが得られた。
（２）シロスジフジツボ第７接着タンパク質遺伝子の増幅および配列決定
（１）で得られたシロスジフジツボmRNAと本発明のユニバーサルプライマーDNAを用いた3’-RACE-PCRにより、750bpの遺伝子増幅を確認した。アガロースゲル電気泳動により当該DNAを精製し、pT7-Blue vector(Novagen)にライゲイションし、E. coli DH5alphaに形質転換した。挿入断片の配列をアプライドバイオシステムズ社製3700 DNA analyzerを用いて配列を決定した。その結果、この挿入断片がシロスジフジツボ第７接着タンパク質の部分配列であることが判明した。
（３）シロスジフジツボ第７接着タンパク質全長遺伝子の配列決定
（２）で得られた挿入断片の配列を基に、シロスジフジツボ第７接着タンパク質遺伝子に特異的な5’-RACE用プライマーDNAを調製した。プライマーの塩基配列を以下に示す。
ACTTTGGTGCCGTCT（配列番号２）
【００２６】
上記プライマーを用いて、シロスジフジツボ第７接着タンパク質遺伝子5'領域に相当するDNAを増幅した。配列を決定し、最終的にシロスジフジツボ第７接着タンパク質の成熟体の全長を含む配列を得た（配列番号５及び６）。
【配列表】
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