(57)【要約】    【課題】アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物を原料に用いる高分子量でかつ分子量分布の狭いポリペプチドを製造することが可能な製造方法、及び分子量の再現性が良好な製造方法を提供すること。    【解決手段】アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物を１回又は２回以上の再結晶により精製し、精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物を得、該精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物を重合してポリペプチドを得るポリペプチドの製造方法であって、該再結晶のうち少なくとも最後の再結晶化の操作を０℃以下の温度下で行うことを特徴とするポリペプチドの製造方法。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物を１回又は２回以上の再結晶により精製し、精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物を得、該精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物を重合してポリペプチドを得るポリペプチドの製造方法であって、該再結晶のうち少なくとも最後の再結晶化の操作を０℃以下の温度下で行うことを特徴とするポリペプチドの製造方法。
【請求項２】
前記最後の再結晶化の操作を０℃以下の温度下かつ絶対湿度０．００４ｋｇ/ｋｇ乾燥空気以下の乾燥空気中で行うことを特徴とする請求項１記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項３】
前記最後の再結晶化の操作を−２０〜−５℃の温度下で行うことを特徴とする請求項１または２記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項４】
前記最後の再結晶化で得られる該精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の重合の仕込みを０℃以下の温度下で行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項５】
前記重合の仕込みを０℃以下の温度下かつ絶対湿度０．００４ｋｇ/ｋｇ乾燥空気以下の乾燥空気中で行うことを特徴とする請求項４記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項６】
前記重合の仕込みを−２０〜−５℃の温度下で行うことを特徴とする請求項４または５記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項７】
前記最後の再結晶化におけるろ過後の該精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の表面に付着している溶剤を乾燥除去させることなく、付着させたまま、該精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の重合の仕込みを行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項８】
前記精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の重合は、該精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物を、２０℃における当該アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の溶解度が、０．０５ｍｇ／ｃｍ３以下の脱水された溶剤に浸漬し、重合開始剤の存在下で固相重合させるものであることを特徴とする請求項１〜７いずれか１項記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
前記２０℃における当該アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の溶解度が、０．０５ｍｇ／ｃｍ３以下の脱水された溶剤が、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、石油エーテル、またはこれらの混合物であることを特徴とする請求項８記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
前記精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の重合が、該精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物を、該精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の全部又は一部を溶解できる溶媒に溶解または浸漬し、重合開始剤の存在下で重合させるものであることを特徴とする請求項１〜７いずれか１項記載のポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子量の合成ペプチドを用いて材料製造を行うため、又はタンパク質の役割の研究、タンパク質の機能性の研究、医薬材料としての応用を行うために必要とされる高純度・高分子量かつ分子量分布の狭い、分子量の再現性に優れるポリペプチドの製造方法であって、アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物を原料に用いるポリペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸またはその誘導体を用いて、タンパク質モデルを合成する試みは１９００年代から色々な方法で試みられており、古くには、例えば、（１）２個のアミノ酸分子またはその誘導体（例えばカルボン酸基を酸クロリドにしたものなど）間の縮合を繰り返して一つ一つのアミノ酸残基を結合して，次第に分子鎖を長くしていく方法があった。該方法では、反応に時間がかかるため、高分子量のタンパク質モデルを合成することは不可能に近い。他には、（２）メリーフィールドの固相合成方法と呼ばれ、ポリスチレンフィルムのような高分子に反応基をつけて、１種類のアミノ酸を結合させ、そのアミノ酸を反応し易い構造に変えてから、また次の別のアミノ酸を結合させていくという方法があった。該方法は、手間がかかる上に、１００残基以上（分子量で１万以上）の高分子量のタンパク質モデルを多量につくることはできなかった。
【０００３】
また、従来より、他の高分子量のタンパク質モデルを合成する方法の１つとして、アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（以後、アミノ酸ＮＣＡとも記載する。）を有機溶剤に溶解し、主として塩基を重合開始剤とする重合法も行われてきた。
【０００４】
該アミノ酸ＮＣＡは、アミノ酸とホスゲンまたはホスゲン誘導体とから合成される、５員環を有する化合物であり、水分に極めて敏感で取り扱いが難しい化合物である。１９４０年代から、徐々に海外で世界中で盛んに該アミノ酸ＮＣＡの重合の研究がなされ、１９６０年代には日本でも盛んに検討され始めた。それは、分子量が高く（例えば１０万以上）且つ分子量のそろった合成タンパク質が作られれば、繊維用、フィルム用、医療用材料用、生体適合性材料用、神経モデル用等、高分子材料としての多くの用途が期待されたからである。
【０００５】
しかし、平均分子量が高分子量であるというタンパク質モデルができたとういう報告はあるが、反応に再現性がない、分子量がそろわない（分子量分布が広い）等の問題があった。分子量分布は、一般に、重量平均分子量Ｍｗと数重量平均分子量Ｍｎの比で表現され、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０の場合が全ての分子量がそろった理想の状態であるが、これまでに報告があった、該アミノ酸ＮＣＡを通常の方法で重合して得られたポリペプチドのＭｗ／Ｍｎの値は、多くが３〜１０程度であり、少なくとも２未満のものはなかった。また、溶液重合に限定されているため、何らかの溶媒に溶けないアミノ酸ＮＣＡは、重合させることができないという問題があった。
【０００６】
例えば、特開平５−４３５６０号公報には、システインを含むポリペプチドを合成するために、Ｓ−エチルカルバモイル−Ｎ−カルボキシ−L−システイン無水物（アミノ酸ＮＣＡの一種）単独又はこれとＮ−カルボキシ−Ｌ−アラニン無水物（アミノ酸ＮＣＡの一種）との混合物に重合開始剤を加え、重合反応を行い、その後保護基であるエチルカルバモイル基を外すことによるポリペプチドの製造方法が開示されており、３０〜４０℃の温度で数日間、当該重合反応を行うことにより、粘度平均重合度が１５０のポリペプチドを得ている。しかし、平均重合度１５０であり、分子量が低すぎて、高分子材料として用いることはできなかった。また、分子量分布の記載はない。
【０００７】
また、特開平７−４１４６７号公報には、システインを含むポリペプチドを合成するために、Ｓ−フェニルカルバモイル−Ｎ−カルボキシ−Ｌ−システイン無水物（アミノ酸ＮＣＡの一種）単独又はこれとＮ−カルボキシ−Ｌ−アラニン無水物（アミノ酸ＮＣＡの一種）との混合物に重合開始剤を加え、重合反応を行い、その後保護基であるフェニルカルバモイル基を外すことによるポリペプチドの製造方法が開示されており、３０℃の温度で十数日間、当該重合反応を行うことにより、７０〜８０数％の収率でポリペプチドを得ている。これにも、分子量分布の記載はない。
【０００８】
また、「新実験化学講座１９  高分子化学［Ｉ］」の１７１頁には、Ｌ−グルタミン酸γ−ベンジルＮＣＡ及び酢酸ニッケルを、それぞれ二股の封管容器に別々に入れておき、脱気及びアルゴン置換をし、両化合物を混合して溶液を作った後、−７８℃に冷却して、開始剤としてのトリ−ｎ−ブチルホスフィンを注射器を用いて加え、３０℃で２４時間重合させるポリペプチドの製造方法が開示されており、収率９２％、重量平均分子量５６４，０００のポリペプチドを得ている。しかし、この方法は、封管技術、高価で不安定な開始剤の使用など、難しい技術が伴い、大量生産や再現性が困難である。
【０００９】
【特許文献１】特開平５−４３５６０号公報（実施例）
【特許文献２】特開平７−４１４６７（実施例）
【非特許文献１】日本化学会編、新実験化学講座１９  高分子化学［Ｉ］（昭和５３年発行、丸善株式会社（東京））の第１７１頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
高分子量のタンパク質モデルを大量かつ安価に製造するためには、アミノ酸ＮＣＡの重合が適していると考えられるが、従来より行われてきたアミノ酸ＮＣＡの重合方法では、高い分子量の報告はあるが、現在、通常用いられる方法によれば、分子量が４〜５万程度のポリペプチドを製造することはできるが、それ以上の高分子量で且つ分子量分布の狭いポリペプチドを製造することは困難であること、また、生成するポリペプチドの分子量に再現性がない（同じ方法で行ったつもりでも、生成物の平均分子量が異なること）、また、重合反応の重合時間が長いことなどが問題であった。該問題については、「Ｔ．Ｊ．Ｄｅｍｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３９０，３８６〜３８９頁（１９９７）」でも記載されており、該記載は、従来の方法では、分子量が高いもの、分子量分布が狭いもの、分子量の再現性のよいものを製造し難いことを示唆するものである。また、該文献で、Ｄｅｍｉｎｇは、従来のアミノ酸ＮＣＡの重合方法に比べて分子量分布の狭いブロック共重合体を製造するための特殊なニッケル触媒を開示しているが、該ニッケル触媒はかなり特殊であり、その取り扱いが困難なこと、用いられるアミノ酸ＮＣＡの種類が限定されること等の問題があった。 
【００１１】
【非特許文献２】「Ｔ．Ｊ．Ｄｅｍｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３９０，３８６〜３８９頁（１９９７）」
【００１２】
従って、本発明の課題は、アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物を原料に用いるポリペプチドの製造において、安価で入手の容易な触媒または重合開始剤を用いて、高分子量で分子量分布の狭いポリペプチドを製造すること、及び分子量の再現性が良好な製造方法を提供することにある。なお、ポリペプチドとは、単一のアミノ酸残基からなるポリペプチド、複数のアミノ酸残基からなるポリペプチド（共重合体）を含めていう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記従来技術における課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、（１）従来、アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の重合反応は、重合原料と共に加える重合開始剤により促進されると考えられていたが、実際は、該重合開始剤は、あまり重合反応の促進に寄与せず、アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物が吸湿した空気中に存在する水分が重合開始剤として作用し重合反応が起こること、そのため、重合反応を制御できず、分子量の再現性が悪くなり、あるいは高分子量で分子量分布の狭いものを製造できないこと、（２）従来行われていた方法では、製造・精製されたアミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物が吸湿し、該表面での重合反応を避けることができないこと、（３）該吸湿は、アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の精製及び重合反応容器への仕込みまでを、特定の低温度で行うことにより、防ぐことができ、このようにして得られるポリペプチドは高分子量で、分子量分布が狭く、且つ分子量の再現性も良好であり、更には、重合速度が速くなること等を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明（１）は、アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物を１回又は２回以上の再結晶により精製し、精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物を得、該精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物を重合してポリペプチドを得るポリペプチドの製造方法であって、該再結晶のうち少なくとも最後の再結晶化の操作を０℃以下の温度下で行うことを特徴とするポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【００１５】
また、本発明（２）は、前記最後の再結晶化の操作を０℃以下の温度下かつ絶対湿度０．００４ｋｇ/ｋｇ乾燥空気以下の乾燥空気中で行う前記本発明（１）記載のポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【００１６】
また、本発明（３）は、前記最後の再結晶化の操作を−２０〜−５℃の温度下で行う前記本発明（１）又は（２）記載のポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【００１７】
また、本発明（４）は、前記最後の再結晶化で得られる該精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の重合の仕込みを０℃以下の温度下で行う前記本発明（１）〜（３）１〜３いずれか記載のポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【００１８】
また、本発明（５）は、前記重合の仕込みを０℃以下の温度下かつ絶対湿度０．００４ｋｇ/ｋｇ乾燥空気以下の乾燥空気中で行う前記本発明（４）記載のポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【００１９】
また、本発明（６）は、前記重合の仕込みを−２０〜−５℃の温度下で行う前記本発明（４）又は（５）記載のポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【００２０】
また、本発明（７）は、前記最後の再結晶化におけるろ過後の該精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の表面に付着している溶剤を乾燥除去させることなく、付着させたまま、該精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の重合の仕込みを行う前記本発明（１）〜（６）いずれか記載のポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【００２１】
また、本発明（８）は、前記精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の重合は、該精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物を、２０℃における当該アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の溶解度が、０．０５ｍｇ／ｃｍ３以下の脱水された溶剤に浸漬し、重合開始剤の存在下で固相重合させるものである前記本発明（１）〜（７）いずれか記載のポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【００２２】
また、本発明（９）は、前記２０℃における当該アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の溶解度が、０．０５ｍｇ／ｃｍ３以下の脱水された溶剤が、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、石油エーテル、またはこれらの混合物である前記本発明（８）記載のポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【００２３】
また、本発明（１０）は、前記精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の重合が、該精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物を、該精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の全部又は一部を溶解できる溶媒に溶解または浸漬し、重合開始剤の存在下で重合させるものである前記本発明（１）〜（７）いずれか記載のポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のポリペプチドの製造方法は、従来困難であった高分子量かつ分子量分布が狭く、且つ分子量の再現性の良好なポリペプチドを、一般に入手しやすく安全で安価な薬品を用いて得ることができる。また、重合反応の反応速度を速くすることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明に係るアミノ酸ＮＣＡは、目的とするポリペプチドの構成単位となるアミノ酸を原料として、該アミノ酸のＮ原子のカルボキシル化を経て製造される、次式（１）；
【００２６】
【化１】
2005154768.tif 000002
（式中Ｒは、ポリペプチドの構成単位となるアミノ酸により適宜定まる。）の骨格を有する化合物である。
【００２７】
当該ポリペプチドの構成単位となるアミノ酸としては、天然アミノ酸、天然アミノ酸のＬ体またはＤ体又はＬ体とＤ体の混合物、天然アミノ酸の誘導体、あるいはホスゲンまたはホスゲンを発生させられるトリホスゲン、ジクロロメチルクロロホルメート、等との反応により上記式（１）の骨格を形成することができる非天然系のアミノ酸が挙げられる。また、当該アミノ酸が、ポリペプチドの主鎖の形成に関わるアミノ酸中のアミノ基及びカルボキシル基以外の官能基を有する場合に、該官能基を保護基により保護したアミノ酸とすることもでき、例えば、Ｌ−グルタミン酸のガンマ位又はＬ−アスパラギン酸のベータ位のカルボキシル基をベンジル基で保護したＬ−グルタミン酸-γ-ベンジル又はＬ−アスパラギン酸-β-ベンジル；Ｌ-リジンのε（イプシロン）アミノ基を保護したε-カルボベンゾキシ-Ｌ-リジン；Ｌ−システインのＳＨ基をフェニルカルバモイル基で保護したＳ−フェニルカルバモイル−Ｌ−システイン；及びＬ−チロシン、Ｌ−セリンの水酸基の酸素をＯ−ベンジル基で保護した誘導体が挙げられる。また、アミノ酸のＤ体、又はＬ体及びＤ体の混合物についても、Ｌ体と同様である。
【００２８】
当該アミノ酸を原料にアミノ酸ＮＣＡを製造する方法としては、特に制限されず、常法により行うことができる。例えば、アミノ酸をテトラヒドロフラン溶媒中、トリホスゲンと、４０℃にて反応させる方法が挙げられる。アミノ酸としてＬ−グルタミン酸ベンジルを用いてアミノ酸ＮＣＡを製造する方法の一例を次式に示す。トリホスゲンは反応中、容易にホスゲン化され、そのホスゲンがＬ−グルタミン酸ベンジルと反応するのであって、トリホスゲンの代わりに、ホスゲンまたはホスゲンダイマーでもよいし、または塩化チオニルなどでもよい。一般的なアミノ酸ＮＣＡの合成法に準じる。
【００２９】
【化２】
2005154768.tif 000003
【００３０】
本発明において再結晶は、１回又は２回以上行い、その最後の再結晶化の操作を０℃下の温度下、好ましくは０℃以下の温度下かつ絶対湿度０．００４ｋｇ/ｋｇ乾燥空気以下の乾燥空気中、特に好ましくは−２０〜−５℃、更に好ましくは−１０〜−５℃の温度下で行う。特に−１０〜−５℃の温度下で再結晶化の操作を行うと、操作性が良くなる点で好ましい。アミノ酸ＮＣＡの結晶は、純度の高いものほど、常温の実験室で扱う場合、空気中の僅かな湿気による表面での重合を避けることが困難である。従って、再結晶化の操作を上記雰囲気下で行うことにより、再結晶後の精製アミノ酸ＮＣＡの吸湿による重合を防ぐことができる。再結晶化を行う温度が０℃を超えると、当該アミノ酸ＮＣＡ等が晒される雰囲気は湿気を多く含んだ空気となるため、アミノ酸ＮＣＡが水分を吸湿し、かつ温度の影響もあり、精製アミノ酸ＮＣＡの表面で重合反応が起こる点で好ましくない。一方、余り低温過ぎると、空気中の水分の除去は十分であるものの、作業性が低下する点で好ましくない。また、前記乾燥空気の好ましい範囲は、絶対湿度０．００３ｋｇ/ｋｇ乾燥空気以下、更に好ましくは絶対湿度０．００２ｋｇ/ｋｇ乾燥空気以下である。このような乾燥空気は、フリーザーなどの低温室に乾燥剤を入れる方法によって得ることができる。
【００３１】
本発明において、再結晶化の操作を０℃以下の温度下で行うとは、１回又は２回以上行う再結晶化の内、前の結晶化で得られる、例えば溶剤と沈殿剤の混合溶液中に析出したアミノ酸ＮＣＡ結晶を含む混合物を、前記温度範囲下に冷却した状態で、アミノ酸ＮＣＡ結晶をガラスフィルターでろ過し、該結晶を採取する工程、例えば、酢酸エチルなどの溶剤に溶解する工程、その溶液に例えば、ヘキサンなどの沈殿剤を加えて結晶化する工程、例えば該結晶をろ過する工程など一連の再結晶化の操作を全て、同温度下で行うことを意味する。
【００３２】
また、２回以上の再結晶を行う場合に、少なくとも最後の再結晶化を前記温度範囲下で行うことにより、本発明の効果を奏することができるが、全ての再結晶を当該温度で行うことが、吸湿による重合を防ぐ効果が高い点で好ましい。
【００３３】
再結晶化において、溶媒中に溶解したアミノ酸ＮＣＡを析出させる方法としては、特に制限されないが、アミノ酸ＮＣＡを、該アミノ酸ＮＣＡの溶解度が高い溶媒に溶解させ、得た溶液に該アミノ酸ＮＣＡの溶解度が低い溶媒を加え析出させる方法が、温度制御のし難い低温条件下で、温度変化をさせる必要がなく、操作が容易である点で好ましい。例えば、前述の如く、酢酸エチルにアミノ酸ＮＣＡを溶解させ、得た溶液にヘキサンを加え析出させる方法が挙げられる。また、当該再結晶に用いる溶媒は、脱水処理をされたものを用いることが、溶媒中に存在する水分によるアミノ酸ＮＣＡの吸湿を防ぐことができる点で好ましい。
【００３４】
析出した結晶は、前記温度範囲下において、ろ過により溶媒から分離する際、ろ過後の結晶の表面に付着している溶媒を乾燥させることなく、付着させたまま、アミノ酸ＮＣＡの重合の仕込みを行うことが、アミノ酸ＮＣＡの表面が、空気と直接接触することがなく、吸湿を防ぐ効果が高まる点で好ましい。特に、ロイシン又はフェニルアラニン等のＮ−カルボキシ無水物は、反応性が高く、極わずかな水分の存在でも重合が起こるため、ろ過後の結晶の表面に付着している溶媒を乾燥させずに、次の操作を行うことが効果的である。ろ過後の結晶の表面に付着している溶媒とは、細かい結晶の間に存在する再結晶化に用いた溶媒と沈殿剤の混合物であり、その量の目安としては、溶剤を含有した結晶の総重量のうち、実際の結晶のみの重量％が、５０〜８０％程度、作業のしやすさから、６０〜７０％が好ましい。ろ過後の結晶の表面に付着している溶媒量を測定する方法としては、別バッチで同時に製造した溶剤を含有した結晶の一部を素早く管に入れ封じ、真空ポンプに連結して、真空乾燥後、重量をはかることによって、実際の結晶のみの重量％を求めることができる。
【００３５】
本発明において、前記最後の再結晶化で得られる該精製アミノ酸ＮＣＡの重合の仕込みを０℃以下の温度下、好ましくは０℃以下の温度下かつ０．００４ｋｇ/ｋｇ乾燥空気が以下の乾燥空気中、特に好ましくは−２０〜−５℃の温度下で行うことが、反応仕込前の重合を防ぐことができる点で好ましい。ここで、重合の仕込みとは、最後の再結晶化で得られた精製アミノ酸ＮＣＡを重合反応容器に投入するまでの一連の操作を言う。すなわち、本発明においては、最後の再結晶化から精製アミノ酸ＮＣＡの重合の仕込みまでの一連の操作過程において、精製アミノ酸ＮＣＡを前記温度範囲下におき、精製アミノ酸ＮＣＡの吸湿による重合を極力抑制するものである。また、精製アミノ酸ＮＣＡ以外の物の仕込みなど重合を開始するまでに行う精製アミノ酸ＮＣＡの仕込み以外の操作も当該温度範囲下で行うことが、精製アミノ酸ＮＣＡの吸湿による重合を確実に防ぐことができる点で好ましい。具体的には、例えば０℃以下の温度、好ましくは−２０〜−５℃の温度に制御された低温室において、重合反応容器にアミノ酸ＮＣＡを加えた後、重合開始剤及び溶剤を加え、水銀柱の連結等を行う方法、あるいは０℃以下の温度、好ましくは−２０〜−５℃の温度に制御された低温室において、重合反応容器にアミノ酸ＮＣＡを加えた後、該重合反応容器を密閉し、室温程度まで戻した後、ドライボックス中等のアミノ酸ＮＣＡの吸湿を防ぐことが可能な雰囲気下で、重合開始剤及び溶剤を加え、重合速度測定用の圧力測定のための水銀柱の連結等を行う方法が挙げられる。
【００３６】
本発明における精製アミノ酸ＮＣＡの重合方法としては、該精製アミノ酸ＮＣＡを２０℃における当該アミノ酸ＮＣＡの溶解度が、０．０５ｍｇ／ｃｍ３以下の脱水された溶剤に浸漬し、重合開始剤の存在下で重合させる方法（固相重合）、および該精製アミノ酸ＮＣＡを、該精製アミノ酸ＮＣＡの全部または一部を溶解できる溶媒に溶解または浸漬し、重合開始剤の存在下で重合させる方法（溶液または不均一系の重合）が挙げられる。本発明において、アミノ酸ＮＣＡが連続的に反応して高分子であるポリペプチドが生成する反応は、二酸化炭素の生成を伴う反応であり、正確には、「重縮合」というべきであるが、一般には慣例的に、「アミノ酸ＮＣＡの重合」と表現されることが多いため、「重合」と表現する。また、固相重合とは溶剤に不溶なアミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物が結晶の状態で重合して、そのまま固体のポリペプチドに変化する反応を意味する。固相重合では、アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物結晶の溶解度が極めて低い溶剤の中で、その結晶が溶解しないうちに重合する。本発明の固相重合では、アミノ酸ＮＣＡの結晶の大きさを整えることにより、分子量分布を狭くでき、また結晶の大きさが大きくなるほど、高分子量のポリペプチドが得られる。
【００３７】
固相重合は、アミノ酸ＮＣＡの溶解度が前記２０℃における溶解度で示されるような低い脱水された溶剤（以下、非溶剤とも言う）を用いることにより重合を行うことができ、溶液または不均一系の重合に比べ、反応速度が極めて速い。従って、重合活性の低い、アスパラギン酸エステル、グルタミン酸エステル、アラニン、又はバリン等のＮ−カルボキシ無水物であっても、当該固相重合とすることにより、良好に重合を行うことができる。また、当該固相重合は、アミノ酸ＮＣＡの純度が高い程、反応速度が速くなる。また、２０℃における該溶解度が０．０５ｍｇ／ｃｍ３を超えると一部又は全部が溶液または不均一系の重合となるため、重合は起こるが、反応速度が遅くなり、かつ、重合物の制御が困難となる。なお、この溶解度は、限りなく０に近い値であることが好ましい。
【００３８】
固相重合で用いられる非溶剤は、常温で液体の有機化合物で、目的の物質を溶解しないものであり、例えばその目的物質を溶解できる溶剤に溶かして得られる溶液に加えると、溶解している物質が析出してくる作用があり、沈殿剤とも言われるものである。非溶剤としては、当該アミノ酸ＮＣＡに対して不活性の溶剤であれば、特に制限されず、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン、石油エーテル等の直鎖状飽和炭化水素；２−メチルペンタン、２-メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２−メチルオクタン、３−メチルオクタン、４−メチルオクタン等の側鎖を持つ飽和炭化水素；シクロヘキサン等の環状飽和炭化水素；２−ヘキセン、３−ヘキセン等の不飽和炭化水素；常温では固体であっても、重合温度で液体となる炭化水素等、またはこれらの混合物等が挙げられる。また、これらの炭化水素の水素原子の一部が、塩素原子又はニトロ基で置換された溶剤のうち、該アミノ酸ＮＣＡを溶解性が０．０５ｍｇ／ｃｍ３以下であれば、好適に用いることができる。脱水溶剤中の水分量としては、０．０１重量％以下、好ましくは０．００５重量％以下であり、溶媒の脱水は、公知の脱水方法により行うことができる。
【００３９】
固相重合において用いる重合開始剤としては、アミノ酸ＮＣＡの重合で通常用いられる重合開始剤であれば、特に制限されず、例えば、ブチルアミン、ヘキシルアミン、ジブチルアミン、トリエチルアミン等のアミン類やナトリウムアルコラート類等のアルカリ、または少量の水や少量の水を含むアルコール類等が挙げられる。この使用量は、アミノ酸ＮＣＡ１モル当り１／１０〜１／１０００００ モル、好ましくは１／５０〜１／１００００ モルである。固相重合を行う雰囲気としては、特に制限されないが、吸湿を防ぐことができる条件下、すなわち、密閉された反応容器内、ドライボックス内、０℃以下、除湿剤を用いることにより水分を除去した空気又は不活性ガス等の雰囲気下などが挙げられる。
【００４０】
重合温度は、用いる脱水された非溶剤の沸点に依存するが、通常５〜１００℃であり、好ましくは２０〜８０℃である。５℃未満では、反応速度が遅くなり、また、１００℃を超えると、反応速度が速すぎることにより、反応の制御が困難となり、分子量の再現性が低下する。重合時間は、重合温度およびアミノ酸ＮＣＡの種類により異なるが、概ね３０分〜２４時間である。
【００４１】
次に、溶液または不均一系の重合について説明する。溶液または不均一系の重合において、固相重合と同一構成、同一方法についてはその説明を省略し、相違する点についてのみ説明する。すなわち、溶液または不均一系の重合において、固相重合と異なる点は、固相重合で用いる脱水された非溶剤に代えて、精製アミノ酸ＮＣＡの全部または一部を溶解できる溶媒を用いる点にある。該溶液または不均一系の重合は、固相重合に比べ反応速度が遅いものの、開始剤の量により重合度を制御することができ、目的とする平均分子量をもつポリペプチドを得ることができる。溶液または不均一系の重合においては、理論的には、モル比［アミノ酸ＮＣＡ］/［開始剤］＝２００ならば、生成ポリペプチドの重合度も２００になると考えられていたが（リビング重合的特徴）、これまで、そのような例が報告されていなかった。すなわち、実際には、相当、重合度が低いものしか得られていなかった。この点はＤｅｍｉｎｇの上記のＮａｔｕｒｅ誌でも指摘されている。本発明においては、原料の再結晶化の操作または精製原料の重合の仕込みを、水分の混入及び仕込前の重合を防止する雰囲気下で行うことでこれを可能にしたものである。
【００４２】
溶液または不均一系の重合で用いる精製アミノ酸ＮＣＡの全部または一部を溶解できる溶媒としては、アミノ酸ＮＣＡと反応せず、且つ重合温度で該無水物を溶解するもの、あるいは該無水物を完全溶解はしないものの、その表面を多少溶解するか膨潤するような溶媒が挙げられる。当該溶媒としては、例えば、ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、アセトニトリル等が挙げられ、更に詳細には、アミノ酸の種類により異なり、例えばグルタミン酸やアスパラギン酸のベンジルエステルＮＣＡであれば、ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが挙げられ、アミノ酸の種類によってはニトロベンゼン、トルエンなども使用できる。また、当該溶媒は、脱水処理したものが好ましい。また、溶液または不均一系の重合において、アセトニトリルやその他のニトリル類を溶媒に用いることもできる。これらアセトニトリルなどの溶媒には、ほぼ全ての一般的なアミノ酸ＮＣＡは溶けるものの、重合生成物は当該溶媒には溶けない。従って、始めに、重合は溶液中で起こり、生成物が固体となって析出し、その後の重合は固体状の析出物と溶液中のアミノ酸ＮＣＡの間で進む。即ち、重合は固相/液相の界面で進行するので、不均一重合と言われる。
【００４３】
該溶液重合では、反応仕込み時のアミノ酸ＮＣＡに対する重合開始剤のモル比（アミノ酸ＮＣＡのモル数／重合開始剤のモル数）により、該アミノ酸ＮＣＡの重合度を調整することができる。具体的には、該溶液重合では、該重合開始剤のモル比の値と同程度の重合度のポリペプチドが得られる（例えば、該重合開始剤のモル比が２００の時、重合度が２００程度のポリペプチドが得られる。）。
すなわち、該溶液重合を行うことにより、重合度が調整し易くなるという効果を奏する。
【００４４】
また、該溶液重合では、重合の原料となる該精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物は、該精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物を溶解し、且つ生成するポリペプチドを溶解しない溶媒に、該精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物を溶解させ、次いで、例えば、遠心分離操作、ろ過操作等の不溶除去操作を行い得られる精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物溶液であってもよい。該精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物を溶解し、且つ生成するポリペプチドを溶解しない溶媒としては、重合の原料が、保護基が導入されていないアミノ酸ＮＣＡである場合、例えば、アセトニトリル、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ベンゼン、トルエン、ベンゼン誘導体、テトラヒドロフラン等が挙げられ；重合の原料が、ベンジル基、Ｏ−アセチル基、Ｏ−ベンゾイロキシ基等の保護基が導入されているアミノ酸ＮＣＡである場合、例えば、アセトニトリル、アセトン等が挙げられる。また、該精製アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物及び生成するポリペプチドの溶解性が異なる複数の溶媒を混合し、溶解性を調節した混合溶媒を用いることもできる。
【００４５】
溶液または不均一系の重合において、重合温度は、通常、該溶媒の沸点以下の温度であり、好ましくは５〜１００℃であり、特に好ましくは２０〜８０℃である。５℃未満であると反応速度が遅くなり、重合に長時間を要し、また、１００℃を超えると、重合時間中に溶剤や重合開始剤が蒸発する場合が起こりやすく、分子量のコントロールが困難となる。重合時間は、重合温度により異なるが、概ね１時間〜１４日である。
【００４６】
次に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、これは単に例示であって本発明を制限するものではない。
なお、本発明で製造されたポリペプチドの分子量及び分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ値）は、常法に従い、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー分析（ＧＰＣ）で求めた。溶剤および溶離液として、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジオキサン（臭化リチウムを溶質として０．１モル／リットルの濃度で加える場合あり）を用い、水溶性のポリペプチドの場合は、ｐＨを調整した食塩水を用いた。
【実施例１】
【００４７】
＜Ｎ−カルボキシ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート（以後、ＢＬＧＮＣＡとも言う。）の固相重合＞
（粗ＢＬＧＮＣＡの製造）
Ｌ−グルタミン酸とベンジルアルコールのエステル化反応により得たγ−ベンジル−Ｌ−グルタメート１０ｇを１００ｍｌのテトラヒドロフランに入れ1時間かき混ぜる（この混合物を混合物Ａとする）。一方、活性炭０．５ｇ及びトリホスゲン４．６ｇを３００ｍｌのテトラヒドロフランに加え、およそ２時間かき混ぜる（この混合物を混合物Ｂとする）。混合物Ａと混合物Ｂを一緒にして混ぜ、約４０℃で３時間反応させた。反応混合物は、最初は白濁しているが、アミノ酸ＮＣＡの生成とともに、白濁の程度が少なくなり、反応終了時点では、透明となる。反応終了後、反応溶液を減圧して、テトラヒドロフランを蒸留によって、除去した。反応混合物の濃縮液をおよそ２０〜４０ｍｌとした後、沈殿剤としてヘキサン約２００ｍｌを加えて、ＢＬＧＮＣＡを結晶化した。結晶をろ過して、粗ＢＬＧＮＣＡ結晶８．０ｇを得た（収率７２％）。
【００４８】
（粗ＢＬＧＮＣＡの再結晶）
当該粗ＢＬＧＮＣＡ８．０ｇを、室温下、脱水処理をした酢酸エチル５０ｍｌに溶解し、該溶液にヘキサン２５０ｍｌを加えて、ＢＬＧＮＣＡを再結晶化させ、ろ過にて分離した。得たＢＬＧＮＣＡの表面に付着した溶媒を乾燥させることなく、再び酢酸エチル−ヘキサンによる再結晶を行い、該再結晶を６回行った。
【００４９】
更に重合操作直前に、−１０℃の低温室において、酢酸エチル−ヘキサンによる再結晶を行い、精製ＢＬＧＮＣＡ２．４ｇを得た。
【００５０】
（精製ＢＬＧＮＣＡの分析）
精製ＢＬＧＮＣＡの純度についてはＢＬＧＮＣＡ結晶の一部を乾燥し、秤量したうえで、ＢＬＧＮＣＡを一般的な酸素燃焼フラスコ法で燃焼して得られた水溶液について、イオンクロマトグラフィーにより測定することでＢＬＧＮＣＡの塩素含有量を求めた。求められたＢＬＧＮＣＡの塩素含有量は０．０１５重量％であった。
【００５１】
なお、ＢＬＧＮＣＡ結晶の生成の確認は、その元素分析（Ｃ、Ｈ、Ｎ）、臭化カリウム錠剤法による赤外線吸収スペクトル（以下ＩＲスペクトルともいう）、及び単結晶のＸ線解析から求められた結晶の格子定数を公知の結晶構造のデータ(H. Kanazawa他著、 “Bulletin of Chemical Society of Japan”,  51巻、2200〜2204(1978))と比較して確認した。ＢＬＧＮＣＡの場合、その元素分析は、ＢＬＧＮＣＡの分子式＝Ｃ１３Ｈ1３Ｏ５ Ｎとしての計算値：Ｃ、５９．３１；Ｈ、４．９８；Ｎ、５．３２（重量％）、及び実測値：Ｃ、５７．１１；Ｈ、５．０１；Ｎ、５．２９（％）であった。また、生成物（ＢＬＧＮＣＡであるはずのもの）のＩＲスペクトルにおいて、カルボキシ無水物（ＮＣＡ）の５員環の２個のカルボニル基に基づく特性吸収が、１８５３及び１８４０ｃｍ-1付近にみられたことからもＮＣＡの生成が確認された。単結晶のＸ線解析から、格子定数は、ａ＝７．７６６、ｂ＝２７．４７、ｃ＝５．９４８（以上、単位はオングストローム（Å）），  空間群＝Ｐ２１２１２１と求められた。また、結晶構造も公知の結晶構造と一致した。
【００５２】
（重合）
次に、−１０℃の低温室で、重合操作直前に再結晶化して得たＢＬＧＮＣＡ（精製ＢＬＧＮＣＡ）結晶を、ろ過し、乾燥しない状態で、１．４９ｇ（乾燥重量に換算すると１．０１ｇ）をとり、脱水処理したヘキサン２０ｍｌと共に、圧力測定用のマノメータに連結可能な連結部を有する重合反応容器に入れて密封した。その後、該重合反応容器を室温に戻してから、ドライボックス中で、ブチルアミンのヘキサン溶液１ｍｌを、ＢＬＧＮＣＡに対するモル比、［ＮＣＡ］/［アミン］＝２００となるように加えた。ブチルアミンの重量は１．３６ｍｇとなる。再び重合反応容器を密封し、連結部に１ｍ程度の高さに水銀を入れた毛細管をマノメータとして連結した。その後、二酸化炭素が発生しなくなるまで、３０℃で重合反応を行った。水銀の高さの変化がなくなった時点をもって終点とした。圧力の変化は約４時間で終了したが、念のため８時間置いた（重合時間８時間）。生成したポリペプチドを、ろ過し、酢酸エチルで洗浄した後、乾燥した。乾燥重量から、重合率は１００％であることを判断した。なお、圧力測定のためのマノメータとして、ガラス管に水銀を入れたもので、その高さから読み取るもの、及び市販の圧力計（コパル電子（株）製ハンディマノメータＰＧ-１００）の両方を用いて行った結果、同様な測定ができた。なお、−１０℃の低温室内は、絶対湿度０．００２ｋｇ/ｋｇ乾燥空気以下の乾燥空気雰囲気であった。
【００５３】
なお、重合に用いたＢＬＧＮＣＡの結晶は柱状結晶であり平均の大きさは０．１５×０．１×０．１ｍｍであった。得られたポリペプチドをジクロル酢酸溶液として、その溶液粘度を測定して、粘度法によるＤｏｔｙの式（新実験化学講座１９  高分子化学［Ｉ］の１７１頁の註脚注）から数平均重合度および分子量を求めた。分子量は８７，３００、数平均重合度は４００であった。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー分析（ＧＰＣ）により、得られたポリペプチドの分子量分布の目安として、重量平均分子量と数平均分子量の比、Ｍｗ/Ｍｎは１．１９であった。なお、生成物がＢＬＧＮＣＡの重合生成物としてのポリペプチドであることは、元素分析の結果、及び赤外線吸収スペクトル測定において、ポリペプチドの特性吸収を示すアミドＩとアミドＩＩの領域の吸収が１６５５ｃｍ-1及び１５２５ｃｍ-1にみられたことからも証明された。
【実施例２】
【００５４】
（粗ＢＬＧＮＣＡの製造、粗ＢＬＧＮＣＡの再結晶、重合）
重合温度３０℃に代えて、２０℃としたこと、［ＮＣＡ］/［アミン］＝２００に代えて、２０００としたことおよび重合時間８時間に代えて、２４時間とした以外は、実施例１と同様の方法で行った。得られたポリペプチドの数平均分子量は、約９８，７００（数平均重合度＝４５０）、ＧＰＣより求められたＭｗ/Ｍｎ＝１．３１、ポリペプチドの収率は１００％であった。なお，数平均分子量はＧＰＣからも類似の値が得られた。
【実施例３】
【００５５】
（粗ＢＬＧＮＣＡの製造、粗ＢＬＧＮＣＡの再結晶、重合）
重合温度３０℃に代えて、４０℃としたことおよび重合時間８時間に代えて、４時間とした以外は、実施例１と同様の方法で行った。得られたポリペプチドの数平均分子量は、約９万（重合度＝４１０）、ポリペプチドの収率は１００％であった。
【実施例４】
【００５６】
（粗ＢＬＧＮＣＡの製造、粗ＢＬＧＮＣＡの再結晶、重合）
重合温度３０℃に代えて、５０℃としたことおよび重合時間８時間に代えて、３時間とした以外は、実施例１と同様の方法で行った。得られたポリペプチドの数平均分子量は、約９．３万（重合度＝４３０）、ポリペプチドの収率は１００％であった。
【実施例５】
【００５７】
（粗ＢＬＧＮＣＡの製造、粗ＢＬＧＮＣＡの再結晶、重合）
分子量の再現性の確認のため、重合温度３０℃に代えて、５０℃としたことおよび重合時間８時間に代えて、１．５時間とした以外は、実施例１と同様の方法で行った。得られたポリペプチドの数平均分子量は、約９．２万（重合度＝４２０）、ポリペプチドの収率は１００％であった。
【実施例６】
【００５８】
（粗ＢＬＧＮＣＡの製造、粗ＢＬＧＮＣＡの再結晶、重合）
分子量の再現性の確認のため、重合温度３０℃に代えて、２０℃としたことおよび重合時間８時間に代えて、１２時間とした以外は、実施例１と同様の方法で行った。得られたポリペプチドの数平均分子量は、約８５，０００（数平均重合度＝３９０）、Ｍｗ/Ｍｎ＝１．１８、ポリペプチドの収率は１００％であった。
【実施例７】
【００５９】
＜ＢＬＧＮＣＡの溶液重合＞
（粗ＢＬＧＮＣＡの製造、粗ＢＬＧＮＣＡの再結晶、重合）
ヘキサン２０ｍｌに代えて、ジオキサン２０ｍｌとしたことおよび重合時間８時間に代えて、４８時間としたこと以外は、実施例１と同様の方法で行った。得られたポリペプチドの数平均分子量は、約４．２万（重合度＝１９０）、ポリペプチドの収率は１００％であった。実施例７は溶液または不均一系の重合であり、生成ポリペプチドの重合度１９０は、仕込比２００に近いことが判る。ＧＰＣより求めたＭｗ/Ｍｎ＝１．１９であった。
【実施例８】
【００６０】
＜ＢＬＧＮＣＡの溶液重合＞
（粗ＢＬＧＮＣＡの製造）
実施例１と同様の方法で行い、粗ＢＬＧＮＣＡを得た。
（粗ＢＬＧＮＣＡの再結晶）
当該粗ＢＬＧＮＣＡ８．０ｇを、室温下、脱水処理をした酢酸エチル５０ｍｌに溶解し、該溶液にヘキサン２５０ｍｌを加えて、ＢＬＧＮＣＡを再結晶化させ、ろ過にて分離した。得たＢＬＧＮＣＡの表面に付着した溶媒を乾燥させることなく、再び酢酸エチル−ヘキサンによる再結晶を行い、該再結晶を６回行った。
【００６１】
更に重合操作直前に、−１０℃の低温室において、酢酸エチル−ヘキサンによる再結晶を行い、精製ＢＬＧＮＣＡ２．４ｇを得た。
【００６２】
（重合）
次に、−１０℃の低温室で、重合操作直前に再結晶化して得たＢＬＧＮＣＡ（精製ＢＬＧＮＣＡ）結晶をろ過し、乾燥しない状態で、１．４９ｇ（乾燥重量に換算すると１．０１ｇ）をとり、２ｍｌのアセトニトリルに加えた。このとき、ＢＬＧＮＣＡのアセトニトリル溶液は、僅かに白濁していた。次に、該アセトニトリル溶液を、遠心分離器（回転数１０００／分、時間＝５分）にかけて得られた透明な上澄み溶液のみをピペットでとり、ジオキサン２０ｍｌと混合して反応溶液とした。該反応溶液を、圧力測定用のマノメータに連結可能な連結部を有する重合反応容器に入れて密封した。その後、該重合反応容器を室温に戻してから、ドライボックス中で、ブチルアミンのヘキサン溶液１ｍｌを、ＢＬＧＮＣＡに対するモル比、［ＮＣＡ］/［アミン］＝２００となるように加えた。ブチルアミンの重量は１．４０ｍｇとなる。再び重合反応容器を密封し、連結部に１ｍ程度の高さに水銀を入れた毛細管をマノメータとして連結した。その後、３０℃で重合反応を、４８時間行った。生成したポリペプチドを、ろ過し、酢酸エチルで洗浄した後、乾燥した。乾燥重量から、重合率は７０％であることを判断した。また、得られたポリペプチドの数平均分子量は、約５３，０００（重合度＝約２４０）であった。ＧＰＣより求めたところ、Ｍｗ/Ｍｎ＝１．１８であった。生成ポリペプチドの重合度２４０は、仕込比２００に近いことが判る。なお、−１０℃の低温室内は、絶対湿度０．００２ｋｇ/ｋｇ乾燥空気以下の乾燥空気雰囲気であった。
【００６３】
（比較例１）
（粗ＢＬＧＮＣＡの製造）
実施例１と同様の方法で行った。
（粗ＢＬＧＮＣＡの再結晶）
全ての操作を、２０℃、湿度４０％の室内で行う以外は、実施例１と同様の方法で行い、精製ＢＬＧＮＣＡを得た。
（重合）
次に、２０℃、湿度４０％の室内で、得た精製ＢＬＧＮＣＡを、ろ過し、乾燥しない状態で、１．４９ｇ（乾燥重量に換算すると１．０１ｇ）をとり、脱水処理したヘキサン２０ｍｌと共に、圧力測定用のマノメータに連結可能な連結部を有する重合反応容器に入れて密封した。次いで、ドライボックス中で、ブチルアミンのヘキサン溶液１ｍｌを、ＢＬＧＮＣＡに対するモル比、［ＮＣＡ］/［アミン］＝２００となるように加えた。ブチルアミンの重量は１．３６ｍｇとなる。再び重合反応容器を密封し、連結部に１ｍ程度の高さに水銀を入れた毛細管をマノメータとして連結した。その後、３０℃で重合反応を行った。重合率が１００％となるまでに、１週間を要した。生成したポリペプチドを、ろ過し、酢酸エチルで洗浄した後、乾燥した。得られたポリペプチドの数平均分子量は、約３０，０００（重合度＝１３７）であり、Ｍｗ／Ｍｎ＝４であった。
【００６４】
（比較例２）
再現性の確認のため、比較例１と同様の方法で、ポリペプチドの重合を４回行ったところ、１回目は、数平均分子量１２，０００（重合度＝５５）、Ｍｗ／Ｍｎ＝６．２であり、２回目は、数平均分子量２２，０００（重合度＝１００）、Ｍｗ／Ｍｎ＝５．２であり、３回目は、数平均分子量３４，０００（重合度＝１５５）、Ｍｗ／Ｍｎ＝３．８であり、４回目は、数平均分子量２８，０００（重合度＝１２８）、Ｍｗ／Ｍｎ＝４．６であり、再現性はなかった。
【００６５】
（比較例３）
（粗ＢＬＧＮＣＡの製造）
実施例１と同様の方法で行った。
（粗ＢＬＧＮＣＡの再結晶）
全ての操作を、２０℃、湿度６０％の室内で行う以外は、実施例１と同様の方法で行い、精製ＢＬＧＮＣＡを得た。
（重合）
次に、２０℃、湿度４０％の室内で重合の仕込みを行うことに代え、２０℃、湿度６０％の室内で重合の仕込みを行う以外は、比較例１と同様の方法で行ったところ、重合率が１００％になるまでには、２週間を要した。得られたポリペプチドの数平均分子量は、約２０，０００（重合度＝９１）であり、Ｍｗ／Ｍｎ＝６であった。
【００６６】
（比較例４）
（粗ＢＬＧＮＣＡの製造、粗ＢＬＧＮＣＡの再結晶、重合）
３０℃で重合反応を行うことに代え、５０℃で重合反応を行う以外は、比較例１と同様の方法で行ったところ、重合率が１００％となるまでには、２４時間を要した。得られたポリペプチドの数平均分子量は、約２０，０００（重合度＝９１）であり、Ｍｗ／Ｍｎ＝８であった。
【００６７】
（比較例５）
（粗ＢＬＧＮＣＡの製造、粗ＢＬＧＮＣＡの再結晶）
実施例１と同様の方法で行い、精製ＢＬＧＮＣＡを得た。
（重合）
得られた精製ＢＬＧＮＣＡを用いて、非特許文献「E. R. Blout and M. Idelson, Journal of American Chemical Society, 80巻、4909頁（１９５８年）」に従って、ジオキサンを溶媒に、ヘキシルアミンを重合開始剤に用い、［ＮＣＡ］/［アミン］＝２００として、２５℃で、４８時間重合反応を行った。重合率は約８０％であった。次いで、再現性の確認のため、同様の方法で重合反応を１０回行った。得られたポリペプチドの数平均分子量は、約２０，０００〜３５，０００（重合度＝９０〜１８０）であり、Ｍｗ／Ｍｎ＝４．２〜５．０と再現性がなかった。
【実施例９】
【００６８】
＜Ｎ−カルボキシ−Ｌ−ロイシン無水物（以後、Ｌ−ロイシンＮＣＡとも記載する。）の固相重合＞
Ｌ−ロイシンＮＣＡを、実施例１のＢＬＧＮＣＡと同様に、Ｌ−ロイシンとトリホスゲンから合成し、実施例１と同様に、再結晶化によって精製した。精製ＢＬＧＮＣＡに代えて、得られた精製Ｌ−ロイシンＮＣＡを、乾燥しない状態で０．８８６ｇ（乾燥重量に換算すると０．６０７ｇ）としたこと、及び重合時間８時間に代えて、９０分とした以外は、実施例１と同様の方法で重合を行った。得られたポリペプチドのトリフルオロ酢酸溶液（ＴＣＦ）の２５℃での溶液粘度は２．５ｄｌ/ｇ、ポリペプチドの収率は１００％であった。なお、ポリ（Ｌ−ロイシン）の分子量を数値で示す方法はまだない。
【００６９】
Ｌ−ロイシンＮＣＡの生成の確認は、ＢＬＧＮＣＡと同様に、生成物の元素分析（Ｃ、Ｈ、Ｎ）、赤外線吸収スペクトル、及び単結晶のＸ線解析から求められた結晶の格子定数を公知の結晶構造のデータ(H. Kanazawa他著、 “Bulletin of Chemical Society of Japan”,  ５１巻、２２０５〜２２０８頁(１９７８年))と比較して確認した。単結晶のＸ線解析から、格子定数は、ａ＝６．５１８、ｂ＝２３．９８、ｃ＝５．５３１（以上、単位はオングストローム（Å）），空間群＝Ｐ２１２１２１と求められた。また、結晶構造も公知の結晶構造と一致した。
【００７０】
（比較例６）
＜Ｌ−ロイシンＮＣＡの固相重合＞
（粗Ｌ−ロイシンＮＣＡの製造）
Ｌ−ロイシンＮＣＡを、実施例１のＢＬＧＮＣＡと同様にＬ−ロイシンとトリホスゲンから合成し、粗Ｌ−ロイシンＮＣＡを得た。
（粗Ｌ−ロイシンＮＣＡの再結晶、重合）
得られた粗Ｌ−ロイシンＮＣＡを用いる以外は、比較例１と同様の方法で行ったところ、得られたポリペプチドのトリフルオロ酢酸溶液（ＴＣＦ）の２５℃での溶液粘度は０．８ｄｌ/ｇ、ポリペプチドの収率は１００％であった。この溶液粘度は、ポリペプチドの分子量が小さいことを示すものである。
【実施例１０】
【００７１】
＜Ｎ−カルボキシ−Ｌ−アラニン（以後、Ｌ−アラニンＮＣＡとも記載する。）の固相重合＞
Ｌ−アラニンＮＣＡを、実施例１のＢＬＧＮＣＡと同様にＬ−アラニンとトリホスゲンから合成し、実施例１と同様に再結晶化によって精製した。ＢＬＧＮＣＡの結晶に代えて、得られた精製Ｌ−アラニンＮＣＡを、乾燥しない状態で０．５８１ｇ（乾燥重量に換算すると０．４４２ｇ）としたこと、及び重合時間８時間に代えて、９０分とした以外は、実施例１と同様の方法で重合を行った。得られたポリペプチドのジクロロ酢酸溶液の２５℃での溶液粘度は３．２ｄｌ/ｇ、ポリペプチドの収率は１００％であった。
【００７２】
なお、Ｌ−アラニンＮＣＡ生成の確認は、ＢＬＧＮＣＡと同様に、生成物の元素分析（炭素、水素、窒素）、赤外線吸収スペクトル、及び単結晶のＸ線解析から求められた結晶の格子定数を公知の結晶構造のデータ(H. Kanazawa他著、  “Acta  Crystallographica,  Section   B”,  32巻、3314〜3316頁(1976年))と比較して確認した。単結晶のＸ線解析から、格子定数は、ａ＝７．７４９、ｂ＝１０．７０、ｃ＝６．０６３（以上、単位はオングストローム（Å）），空間群＝Ｐ２１２１２１と求められた。また、結晶構造も公知の結晶構造と一致した。
【実施例１１】
【００７３】
＜Ｌ−アラニンＮＣＡのアセトニトリル中の重合実験＞
非溶剤ヘキサンに代えて、アセトニトリルを用いた以外は、実施例１０と同様にＬ−アラニンＮＣＡの重合をアセトニトリル溶液中で行った。Ｌ−アラニンＮＣＡはアセトニトリルに溶解して、透明な溶液を得た。開始剤としてブチルアミンを加えた後、２０分後に反応液は白濁し、そのまま重合は進行した。但し、実施例１０よりかなり遅い速度で進んだ。圧力変化が見られなくなった重合時間２４時間後にポリペプチドを回収した。得られたポリペプチドのジクロロ酢酸溶液の２５℃での溶液粘度は２．２ｄｌ/ｇ、ポリペプチドの収率は８０％であった。
【００７４】
（比較例７）
＜Ｌ−アラニンＮＣＡのアセトニトリル中での重合の仕込を室温下で行う方法＞
採取工程、溶解工程、析出工程およびろ過工程にかかる再結晶化の全ての操作を室温下で行い得られたＬ−アラニンＮＣＡ結晶を、反応管に入れた後、室温下で真空乾燥し、室温下でアセトニトリルを加えて、実施例１１と同様に重合実験を行った。重合の仕込の段階で、Ｌ−アラニンＮＣＡ結晶をアセトニトリルに溶解した際、微量の不溶物があり、Ｌ−アラニンＮＣＡ結晶のアセトニトリル溶液は少し白濁した。これは、アミノ酸ＮＣＡの重合物であることは、別途に行った同様の実験で回収した不溶物の赤外線吸収スペクトルより判明した。重合速度は、実施例１１より速かった。圧力変化が見られなくなった重合時間２４時間後にポリペプチドを回収した。得られたポリペプチドのジクロロ酢酸溶液の２５℃での溶液粘度は１．５ｄｌ/ｇ、ポリペプチドの収率は８０％であった。分子量が低い生成物であることは、ジクロロ酢酸に素早く溶けることからも、経験上推察された。
【実施例１２】
【００７５】
＜Ｎ−カルボキシ−β−ジンジル−Ｌ−アスパルテート無水物（以後、ＢＬＡＮＣＡとも記載する。）の固相重合＞
（粗ＢＬＡＮＣＡの製造）
γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート１０ｇに代え、Ｌ−アスパラギン酸とベンジルアルコールのエステル化反応により得たβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテートとする以外は、実施例１と同様の方法で行い、粗ＢＬＡＮＣＡを得た。
（粗ＢＬＡＮＣＡの再結晶）
粗ＢＬＧＮＣＡに代えて、得られた粗ＢＬＡＮＣＡとする以外は、実施例１と同様の方法で行い、精製ＢＬＡＮＣＡを得た。
（重合）
精製ＢＬＧＮＣＡに代えて、得られた精製ＢＬＡＮＣＡを、乾燥しない状態で１．４１ｇ（乾燥重量に換算すると０．９５６ｇ）とする以外は、実施例１と同様の方法で行った。得られたポリペプチドの数平均分子量は、約１４０，０００（数平均重合度＝約６７０）、ＧＰＣより求めたところ、Ｍｗ/Ｍｎ＝１．３２、ポリペプチドの収率は１００％であった。なお、数平均分子量はＧＰＣからも類似の値が得られた。
【実施例１３】
【００７６】
＜ＢＬＡＮＣＡの溶液重合＞
（粗ＢＬＡＮＣＡの製造）
γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート１０ｇに代え、Ｌ−アスパラギン酸とベンジルアルコールのエステル化反応により得たβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテートとする以外は、実施例１と同様の方法で行い、粗ＢＬＡＮＣＡを得た。
【００７７】
（粗ＢＬＡＮＣＡの再結晶）
粗ＢＬＧＮＣＡに代え、得られた粗ＢＬＡＮＣＡとする以外は、実施例１と同様の方法で行い、精製ＢＬＡＮＣＡを得た。
（重合）
精製ＢＬＧＮＣＡに代えて、得られた精製ＢＬＡＮＣＡを、乾燥しない状態で１．４１ｇ（乾燥重量に換算すると０．９５６ｇ）とし、ヘキサン２０ｍｌに代えて、ジオキサン２０ｍｌとし、重合時間８時間に代えて、重合時間４８時間とする以外は、実施例１と同様の方法で行った。得られたポリペプチドの数平均分子量は、約４９，０００（ＧＰＣから求めた。重合度＝約２４０）、ポリペプチドの収率は７０％であった。ＧＰＣより求めたところ、Ｍｗ/Ｍｎ＝１．１７であった。
【００７８】
（比較例８）
＜ＢＬＡＮＣＡの溶液重合＞
（粗ＢＬＡＮＣＡの製造）
γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート１０ｇに代え、Ｌ−アスパラギン酸とベンジルアルコールのエステル化反応により得たβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテートとする以外は、実施例１と同様の方法で行い、粗ＢＬＡＮＣＡを得た。
（粗ＢＬＡＮＣＡの再結晶）
全操作を、２０℃、湿度４０％の室内で行う以外は、実施例１３と同様の方法で行った。
（重合）
重合の仕込みを、２０℃、湿度４０％の室内で行う以外は、実施例１３と同様の方法で行った。得られたポリペプチドの数平均分子量は、約２０，０００（ＧＰＣから求めた。重合度＝９８）、ポリペプチドの収率は７０％であった。ＧＰＣより求めたところ、Ｍｗ/Ｍｎ＝６であった。
【実施例１４】
【００７９】
＜Ｎ−カルボキシ−Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリン無水物（以後、Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡとも記載する。）の固相重合＞
（粗Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡの製造、粗Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡの再結晶）
Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡを、実施例１のＢＬＧＮＣＡと同様に、市販のＯ−ベンゾイル−Ｌ−セリンとトリホスゲンから合成し、実施例１と同様に、再結晶化によって精製した。
（重合）
精製ＢＬＧＮＣＡに代えて、得られた精製Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡを、乾燥しない状態で１．３３ｇ（乾燥重量に換算すると０．９０２ｇ）としたこと以外は、実施例１と同様の方法で重合を行った。得られた重合物のＯ−ベンゾイル基を、公知の方法（「E. R. Blout and M. Idelson, Journal of American Chemical Society, 80巻、4909-4913頁（１９５８年）」）で外して、水溶性のポリペプチド（ポリ（Ｌ−セリン））を得た。得られたポリペプチドの数平均分子量は、約１２０，０００（重合度＝１３８０）、ポリペプチドの収率は１００％であった。ＧＰＣより求めたところ、Ｍｗ/Ｍｎ＝１．３であった。
【実施例１５】
【００８０】
＜Ｎ−カルボキシ−Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシン無水物（以後、Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡとも記載する。）の固相重合＞
（粗Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡの製造、粗Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡの再結晶）
Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡを、実施例１のＢＬＧＮＣＡと同様に、Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンとトリホスゲンから合成し、実施例１と同様に、再結晶化によって精製した。
（重合）
精製ＢＬＧＮＣＡに代えて、得られた精製Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡを、乾燥しない状態で１．７７ｇ（乾燥重量に換算すると１．２０ｇ）としたこと以外は、実施例１と同様の方法で重合を行った。得られた重合物のＯ−ベンゾイル基を、公知の方法（実施例１４記載の方法）で外して、水溶性のポリペプチド（ポリ（Ｌ−チロシン））を得た。得られたポリペプチドの数平均分子量は、約１９６，０００（重合度＝１２００）、ポリペプチドの収率は１００％であった。ＧＰＣより求めたところ、Ｍｗ/Ｍｎ＝１．３であった。
【実施例１６】
【００８１】
＜ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジン無水物（以後、ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡとも記載する。）の固相重合＞
（粗ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡの製造、粗ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡの再結晶）
ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡを、実施例１のＢＬＧＮＣＡと同様に、ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンとトリホスゲンから合成し、実施例１と同様に、再結晶化によって精製した。
（重合）
精製ＢＬＧＮＣＡに代えて、得られた精製ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡを、乾燥しない状態で１．５６ｇ（乾燥重量に換算すると１．０６ｇ）としたこと以外は、実施例１と同様の方法で重合を行った。得られた重合物の保護基のカルボベンゾキシル基を、公知の方法で外して、ポリペプチド（ポリ（Ｌ−リジン））を得た。得られたポリペプチドの数平均分子量は、約１６０，０００（重合度＝６９０）、ポリペプチドの収率は１００％であった。ＧＰＣより求めたところ、Ｍｗ/Ｍｎ＝１．２０であった。
【実施例１７】
【００８２】
＜ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡの溶液重合＞
（粗ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡの製造、粗ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡの再結晶）
ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡを、実施例１のＢＬＧＮＣＡと同様に、ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンとトリホスゲンから合成し、実施例１と同様に、再結晶化によって精製した。
（重合）
精製ＢＬＧＮＣＡに代えて、得られた精製ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡを、乾燥しない状態で１．５６ｇ（乾燥重量に換算すると１．０６ｇ）とし、ヘキサン２０ｍｌに代えて、ジオキサン２０ｍｌとし、重合時間８時間に代えて、４８時間としたこと以外は、実施例１と同様の方法で行った。得られた重合物の保護基のカルボベンゾキシル基を、公知の方法で外して、ポリペプチドを得た。得られたポリペプチドの数平均分子量は、５８，３００（重合度＝２５０）、ポリペプチドの収率は９０％であった。ＧＰＣより求めたＭｗ/Ｍｎ＝１．１８であった。
【００８３】
（比較例９）
＜ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡの固相重合＞
（粗ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡの製造）
ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡを、実施例１のＢＬＧＮＣＡと同様にε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンとトリホスゲンから合成し、粗ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡを得た。
（粗ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡの再結晶）
粗ＢＬＧＮＣＡに代えて、粗ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡとする以外は、比較例１と同様の方法で行い、精製ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡを得た。
（重合）
精製ＢＬＧＮＣＡに代えて、得られた精製ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡを、乾燥しない状態で１．５１ｇ（乾燥重量１．０２ｇ）とする以外は、比較例１と同様の方法で行った。得られた重合物の保護基のカルボベンゾキシル基を、公知の方法で外して、ポリペプチドを得た。得られたポリペプチドの数平均分子量は、１５，４００（重合度＝１２０）、ＧＰＣより求めたＭｗ/Ｍｎ＝３．８２であった。
【００８４】
（比較例１０）
＜ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡの溶液重合＞
（粗ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡの製造、粗ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡの再結晶）
比較例９と同様の方法で行い、精製ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡを得た。
（重合）
精製ＢＬＧＮＣＡに代えて、得られた精製ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡを、乾燥しない状態で１．５１ｇ（乾燥重量１．０２ｇ）とする以外は、比較例８と同様の方法で行った。得られた重合物の保護基のカルボベンゾキシル基を、公知の方法で外して、ポリペプチドを得た。得られたポリペプチドの数平均分子量は、１０，０００（重合度＝７８）、ＧＰＣより求めたＭｗ/Ｍｎ＝４．０であった。
【実施例１８】
【００８５】
＜Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡとＯ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡの溶液中でのランダム共重合＞
Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡを、実施例１のＢＬＧＮＣＡと同様に、市販のＯ−ベンゾイル−Ｌ−セリンとトリホスゲンから合成し、実施例１と同様に、再結晶化によって精製した。次いで、Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡを、実施例１のＢＬＧＮＣＡと同様にＯ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンとトリホスゲンから合成し、実施例１と同様に再結晶化によって精製した。
【００８６】
（重合）
次に、−１０℃の低温室で、重合操作直前に再結晶化して得た精製Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡ結晶と精製Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡ結晶を、ろ過し、乾燥しない状態で、それぞれ、０．６６５ｇ（乾燥重量に換算すると０．４５１ｇ）、０．８８５ｇ（乾燥重量に換算すると０．６００ｇ）をとり、脱水処理したベンゼン３０ｍｌと共に、圧力測定用のマノメータに連結可能な連結部を有する重合反応容器に入れて密封した。その後、該重合反応容器を室温に戻してから、ドライボックス中で、ブチルアミンのヘキサン溶液１ｍｌを、Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡ及びＯ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡの合計モル数に対するモル比、［ＮＣＡ］/［アミン］＝２００となるように加えた。ブチルアミンの重量は１．４０ｍｇとなる。再び重合反応容器を密封し、連結部に１ｍ程度の高さに水銀を入れた毛細管をマノメータとして連結した。その後、３０℃で、４８時間重合反応を行った。なお、−１０℃の低温室内は、絶対湿度０．００２ｋｇ/ｋｇ乾燥空気以下の乾燥空気雰囲気であった。得られた重合物のＯ−ベンゾイル基を、公知の方法で外して、ポリペプチド（ポリ（Ｌ−セリン）（Ｌ−チロシン））を得た。得られたポリペプチドの数平均分子量は、１６０，０００（重合度＝１，２８０）、ＧＰＣより求めたＭｗ/Ｍｎ＝１．３であった。
【実施例１９】
【００８７】
＜Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡとＯ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡの溶液中でのブロック共重合＞
Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡを、実施例１のＢＬＧＮＣＡと同様に、市販のＯ−ベンゾイル−Ｌ−セリンとトリホスゲンから合成し、実施例１と同様に、再結晶化によって精製した。次いで、Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡを、実施例１のＢＬＧＮＣＡと同様に、Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンとトリホスゲンから合成し、実施例１と同様に、再結晶化によって精製した。
【００８８】
（重合）
次に、−１０℃の低温室で、重合操作直前に再結晶化して得た精製Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡ結晶を、ろ過し、乾燥しない状態で、１．３３ｇ（乾燥重量に換算すると０．９０２ｇ）をとり、脱水処理したベンゼン２０ｍｌと共に、圧力測定用のマノメータに連結可能な連結部を有する重合反応容器に入れて密封した。その後、該重合反応容器を室温に戻してから、ドライボックス中で、ブチルアミンのヘキサン溶液１ｍｌを、Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡに対するモル比、［ＮＣＡ］/［アミン］＝２００となるように加えた。ブチルアミンの重量は１．４０ｍｇとなる。再び重合反応容器を密封し、連結部に１ｍ程度の高さに水銀を入れた毛細管をマノメータとして連結した。その後、３０℃で、２４時間重合反応を行い、重合物Ａを得た。なお、−１０℃の低温室内は、絶対湿度０．００２ｋｇ/ｋｇ乾燥空気以下の乾燥空気雰囲気であった。
【００８９】
次に、−１０℃の低温室で、重合操作直前に再結晶化して得た精製Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡ結晶を、ろ過し、乾燥しない状態で、１．７７ｇ（乾燥重量に換算すると１．１９ｇ）をとり、脱水処理したベンゼン２０ｍｌに溶解させ、ベンゼン溶液を得た。次いで、該重合物Ａが入った該重合反応容器を、再び−１０℃の低温室に移し、低温室内で、該ベンゼン溶液を、該重合反応容器中に入れ密封した。その後、該重合反応容器を室温に戻してから、ドライボックス中で、ブチルアミンのヘキサン溶液１ｍｌを、Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡに対するモル比、［ＮＣＡ］/［アミン］＝２００となるように加えた。ブチルアミンの重量は１．４０ｍｇとなる。その後、３０℃で、４８時間重合反応を行い、重合物Ｂを得た。得られた重合物ＢのＯ−ベンゾイル基を、公知の方法で外して、ポリペプチドを得た。得られたポリペプチドの数平均分子量は、５０，０００（重合度＝４００）、ＧＰＣより求めたＭｗ/Ｍｎ＝１．３であった。
【実施例２０】
【００９０】
＜ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡとＢＬＧＮＣＡの溶液中でのランダム共重合＞
実施例１と同様の方法で、精製ＢＬＧＮＣＡを得た。次に、ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡを、実施例１のＢＬＧＮＣＡと同様に、ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンとトリホスゲンから合成し、実施例１と同様に、再結晶化によって精製した。
【００９１】
（重合）
精製Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡと精製Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡに代えて、得られた精製ＢＬＧＮＣＡを、乾燥しない状態で１．４９ｇ（乾燥重量に換算すると１．０１ｇ）と精製ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡを、乾燥しない状態で１．５６ｇ（乾燥重量に換算すると１．０６ｇ）とする以外は、実施例１８と同様の方法で行った。得られた重合物の保護基のカルボベンゾキシル基を、公知の方法で外して、ポリペプチドを得た。得られたポリペプチドの数平均分子量は、３４，０００（重合度＝１９５）、ＧＰＣより求めたＭｗ/Ｍｎ＝１．２８であった。
【実施例２１】
【００９２】
＜ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡとＢＬＧＮＣＡの溶液中でのブロック共重合＞
実施例１と同様の方法で、精製ＢＬＧＮＣＡを得た。次に、ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡを、実施例１のＢＬＧＮＣＡと同様にε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンとトリホスゲンから合成し、実施例１と同様に再結晶化によって精製した。
【００９３】
（重合）
精製Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡに代えて、得られた精製ＢＬＧＮＣＡを、乾燥しない状態で１．４９ｇ（乾燥重量に換算すると１．０１ｇ）とし、精製Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡに代えて、得られた精製ε−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンＮＣＡを、乾燥しない状態で１．５６ｇ（乾燥重量に換算すると１．０６ｇ）とする以外は、実施例１９と同様の方法で行った。得られた重合物の保護基のカルボベンゾキシル基を、公知の方法で外して、ポリペプチドを得た。得られたポリペプチドの数平均分子量は、３６，５００（重合度＝２１０）、ＧＰＣより求めたＭｗ/Ｍｎ＝１．１８であった。
【００９４】
（比較例１１）
＜Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡの固相重合＞
（粗Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡの製造）
Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡを、実施例１のＢＬＧＮＣＡと同様に市販のＯ−ベンゾイル−Ｌ−セリンとトリホスゲンから合成し、粗Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡを得た。
（粗Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡの再結晶）
粗ＢＬＧＮＣＡに代えて、得られた粗Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡとする以外は、比較例１と同様の方法で行った。
（重合）
精製ＢＬＧＮＣＡに代えて、得られた精製Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡを、乾燥しない状態で１．３３ｇ（乾燥重量に換算すると０．９０２ｇ）とし、重合時間を１週間に代えて、２４時間とする以外は、比較例１と同様の方法で行った。得られた重合物のＯ−ベンゾイル基を、公知の方法で外して、水溶性のポリペプチド（ポリ（Ｌ−セリン））を得た。得られたポリペプチドの数平均分子量は、約１２，０００、ポリペプチドの収率は７０％であった。ＧＰＣより求めたところ、Ｍｗ/Ｍｎ＝５．０であった。
【００９５】
（比較例１２）
＜Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡの固相重合＞
（粗Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡの製造）
Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡを、実施例１のＢＬＧＮＣＡと同様に、Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンとトリホスゲンから合成し、粗Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡを得た。
（粗Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡの再結晶）
粗ＢＬＧＮＣＡに代えて、得られた粗Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡとする以外は、比較例１と同様の方法で行った。
（重合）
精製ＢＬＧＮＣＡに代えて、得られた精製Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡを、乾燥しない状態で１．７７ｇ（乾燥重量に換算すると１．２０ｇ）とし、重合時間を１週間に代えて、１日とする以外は、比較例１と同様の方法で行った。得られた重合物のＯ−ベンゾイル基を、公知の方法で外して、水溶性のポリペプチド（ポリ（Ｌ−チロシン））を得た。得られたポリペプチドの数平均分子量は、約２５，０００（重合度＝１５３）、ポリペプチドの収率は７０％であった。ＧＰＣより求めたところ、Ｍｗ/Ｍｎ＝３．２であった。
【００９６】
（比較例１３）
＜Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡの溶液重合＞
（粗Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡの製造）
Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡを、実施例１のＢＬＧＮＣＡと同様に、市販のＯ−ベンゾイル−Ｌ−セリンとトリホスゲンから合成し、粗Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡを得た。
（粗Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡの精製、重合）
該粗Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡの採取工程、溶解工程、析出工程及びろ過工程にかかる再結晶化の全ての操作を、２０℃、湿度４０％の室内で行い、得られたＯ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡを、反応管に入れた後、室温下で真空乾燥し、２０℃、湿度４０％の室内でアセトニトリルを加えて、実施例１１と同様に重合実験を行った。この時、重合時間は２４時間とした。得られた重合物のＯ−ベンゾイル基を、公知の方法で外して、水溶性のポリペプチド（ポリ（Ｌ−チロシン））を得た。得られたポリペプチドの数平均分子量は、約９，６００（重合度＝１１０）、ポリペプチドの収率は１００％であった。ＧＰＣより求めたところ、Ｍｗ/Ｍｎ＝３．４であった。
【００９７】
（比較例１４）
＜Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡとＯ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡの溶液中でのランダム共重合＞
再結晶及び重合の仕込みを、２０℃、湿度４０％の室内で行うこと、重合時間を２０時間とする以外は、実施例１８と同様の方法で行ったところ、得られたポリペプチドの数平均分子量は、約１２，０００（重合度＝９６）、ポリペプチドの収率は９５％であった。ＧＰＣより求めたところ、Ｍｗ/Ｍｎ＝６．２であった。
【００９８】
（比較例１５）
＜Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−セリンＮＣＡとＯ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンＮＣＡの溶液中でのブロック共重合＞
再結晶及び重合の仕込みを、２０℃、湿度４０％の室内で行うこと、重合時間を２４時間とする以外は、実施例１９と同様の方法で行ったところ、得られたポリペプチドの数平均分子量は、約１，０００（重合度＝８０）、ポリペプチドの収率は８５％であった。ＧＰＣより求めたところ、Ｍｗ/Ｍｎ＝６．０であった。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明のポリペプチドの製造方法によれば、アミノ酸ＮＣＡを原料に用いて、高分子量で分子量分布の狭いポリペプチドを、一般に入手しやすく安全で安価な薬品のみを用いて，これまでになく容易な方法で製造することが可能になり、また、分子量の再現性が良好となる。従って、本発明の製造方法により製造された高分子量の合成ポリペプチドを用いて、高強度のタンパク質類似の繊維やフィルムをはじめとした材料の製造、生体適合性の材料としての応用，タンパク質の機能性の研究、医薬材料としての応用等に有用である。