(57)【要約】【課題】  新規な骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症用モデル動物の提供と、このモデル動物を用いた骨粗鬆症や頭蓋骨癒合症の成因解明および治療手段の探索。【解決手段】  染色体上のMMP-2遺伝子の機能が欠損していることを特徴とする、骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症のための非ヒトモデル動物、および該動物を利用した骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症治療薬のスクリーニング方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体上のMMP-2遺伝子の機能が欠損していることを特徴とする、骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症のための非ヒトモデル動物。
【請求項２】
MMP-2遺伝子の機能が、MMP-2遺伝子またはその発現制御領域上における少なくとも一部の配列の欠失、置換、および／または他の配列の挿入によって欠損している、請求項１記載のモデル動物。
【請求項３】
MMP-2遺伝子のプロモーター領域と少なくとも７％のコーディング領域が欠失している、請求項１または２記載のモデル動物。
【請求項４】
MMP-2遺伝子の機能が、染色体上の両アレルで欠損している、請求項１〜３のいずれか一項に記載のモデル動物。
【請求項５】
骨細胞の機能不全を有することを特徴とする、請求項１〜４記載のいずれか一項に記載のモデル動物。
【請求項６】
骨芽細胞および破骨細胞の機能が正常であることを特徴とする、請求項５記載のモデル動物。
【請求項７】
動物がマウスである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のモデル動物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のモデル動物において、被験物質の投与条件下と非投与条件下における該動物の表現上の相違を指標として、該被験物質の骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症の治療薬としての効果を評価する方法。
【請求項９】
骨密度、骨塩量、海綿骨骨量、皮質骨骨量、および骨組織計測値から選ばれる、いずれか１つまたは２つ以上における相違を指標として評価することを特徴とする、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染色体上のMMP-2遺伝子が欠損していることを特徴とする、骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症の非ヒトモデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
マトリックスメタロプロテアーゼ（Matrix Metalloprotease：MMP）は細胞外マトリックスを分解する酵素で、種々の疾患との関連が報告されている。MMPにはいくつかのサブタイプが存在し、このうちMMP-2は、基底膜中のタイプIVコラーゲンやゼラチンを分解するゼラチナーゼ群に属し、ゼラチナーゼAとも呼ばれる。
【０００３】
生体内におけるMMPの機能を解明するためには、目的とするMMPの機能を特異的に欠損あるいは亢進させたトランスジェニックマウスを用いることが好ましい。発明者らは、これまでにアルツハイマー病とMMP-2との関係を調べるためにMMP-2欠損マウスを作製し、MMP-2の欠損はβアミロイド前駆タンパク質の分泌に影響を与えないことを報告している（例えば、非特許文献１参照）。また、発明者らはMMP-2欠損マウスでは、血管新生の未発達や腫瘍増殖の抑制がみられることから、MMP-2は血管新生や腫瘍と関連することを報告している（非特許文献３）。しかしながら、これらの報告の中には、MMP-2欠損マウスで骨粗鬆症に関連した異常が観察されたとの記載はない。
【０００４】
一方、MMP-2遺伝子の変異がヒトにおいて多中心性特発性骨溶解症候群（Multicentric osteolysis and arthritis syndrome）を発症させるという報告がある（非特許文献４）。多中心性特発性骨溶解症候群とは、顔の変化、全身性骨粗鬆症、関節リウマチ等を小児期より呈する稀少遺伝病である。しかしながら、この報告では、MMP-2欠損マウスではわずかな発育の遅れは見られるものの、骨格の異常は現れないことが記載されている。
【０００５】
骨粗鬆症は、骨量の減少によって骨の脆弱化が進み、骨折の危険性が増す疾患である。一般に骨粗鬆症は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収のアンバランスが原因と言われ、加齢や閉経等に伴って発症する。骨芽細胞と破骨細胞は、軟骨が骨化する過程で作用するが、その過程に影響を及ぼすいくつかのタンパクが同定され、骨粗鬆症の治療ターゲットとして注目されている。しかしながら、MMP-2がこうした軟骨の骨化過程に作用するという報告はない。また、遺伝子の発現解析の結果から、骨粗鬆症の発症に関与するいくつかの遺伝子が同定されているが、MMP-2遺伝子と骨粗鬆症発症の関連を直接に実証した報告はない。
【０００６】
【非特許文献１】Itoh T., et al., Journal of Biological Chemistry, (1997), p22389-22392
【非特許文献２】Itoh T., et al., Cancer Research, (1998), 58, p1048-1051
【非特許文献３】Maekawa R., et al., Cancer Research, (1999), 59, p1231-1235
【非特許文献４】Martignetti J. A., et al., Nature Genetics, (2001), Jul, 28(3), p261-265
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、新規な骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症用モデル動物の提供と、このモデル動物を用いた骨粗鬆症や頭蓋骨癒合症の成因解明および治療手段の探索にある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、アルツハイマー病とMMP-2との関連を解明するために、MMP-2欠損マウスを作製して研究を進めていたところ、当該マウスが加齢に伴って骨粗鬆症や頭蓋骨癒合症に類似した特異な表現形質を呈することを見出した。さらに、このマウスの組織形態学等を詳細に研究した結果、当該マウスは骨芽細胞や破骨細胞の機能は正常であるが、骨細胞の機能不全によって骨形成異常を発症するという特徴を有することを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、染色体上のMMP-2遺伝子の機能が欠損している骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症のための非ヒトモデル動物に関する。
【００１０】
前記モデル動物において、MMP-2遺伝子の機能は、MMP-2遺伝子またはその発現制御領域上における少なくとも一部の配列の欠失、置換、および／または他の配列の挿入によって欠損させることができる。
【００１１】
例えば、MMP-2遺伝子のプロモーター領域と少なくとも７％のコーディング領域を欠失させれば、MMP-2遺伝子の機能を欠損させることができる。
【００１２】
本発明のモデル動物は、前記MMP-2遺伝子の機能を染色体上の両アレル（ホモ）で欠損していることが望ましい。
本発明のモデル動物は、骨細胞の機能不全を伴うが、骨芽細胞および破骨細胞の機能は正常であることを特徴とする。
本発明のモデル動物に用いられる非ヒト動物としては、齧歯動物、特にマウスが好ましい。
【００１３】
本発明はまた、本発明のモデル動物を利用した骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症治療薬のスクリーニング方法を提供する。該方法は、被験物質の投与条件下と非投与条件下における動物の表現上の相違を指標として、該被験物質の骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症治療薬としての効果を評価する。
【００１４】
例えば、被験物質の骨粗鬆症治療薬としての効果は、本発明のモデル動物における骨密度、骨塩量、海綿骨骨量、皮質骨骨量、骨組織計測値等を指標として行うことができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、MMP-2遺伝子の機能が欠損した骨粗鬆症モデル動物が提供される。この動物は骨粗鬆症や頭蓋骨癒合症に起因する種々の病態を呈し、したがって該疾患の成因解明や治療手段の研究に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．MMP-2遺伝子欠損モデル動物
本発明は染色体上のMMP-2遺伝子の機能が欠損している、骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症の非ヒトモデル動物に関する。
【００１７】
本発明にかかる「MMP-2」は、基底膜中のタイプIVコラーゲンやゼラチンを分解するゼラチナーゼ群に属するマトリックスメタロプロテアーゼ（Matrix Metalloprotease：MMP）の１種である。
【００１８】
本明細書中において、「MMP-2遺伝子」にはMMP-2をコードしているゲノムDNAのほか、そのmRNA、cDNAも含むものとする。該MMP-2遺伝子の塩基配列は、マウス、ラット、ヒト等の哺乳動物において公知であり、その配列はGenBank等の公共データベースを通じて容易に入手することができる（例えば、マウス：GenBank Accession No. NM_008610、ラット：GenBank Accession No. NM_031054、ヒト：GenBank Accession No. NM_004530、ブタ：GenBank Accession No. AF295805、トリ：GenBank Accession No. U07775、サカナ：GenBank Accession No. AY324195等）。また、公共データベースにその配列が登録されていない動物の場合は、常法により、既知のMMP-2遺伝子との相同性からそのMMP-2遺伝子をクローニングし、配列を決定することができる。
【００１９】
本発明において、「MMP-2遺伝子の機能が欠損している」とは、染色体上のMMP-2遺伝子が破壊され、その機能が正常に発現されないことを意味する。すなわち、MMP-2遺伝子産物が全く発現されない場合だけでなく、当該遺伝子産物が発現されてもMMP-2として正常な機能を有しなければ、「MMP-2遺伝子の機能が欠損している」ことになる。こうしたMMP-2遺伝子の破壊は、MMP-2遺伝子上、またはその転写調節領域やプロモーター領域を含む発現制御領域上の部分配列の欠失、置換、および／または他の配列の挿入等の改変によって生じさせることができる。
【００２０】
なお、前記欠失、置換、または挿入を行う部位や、欠失、置換、または挿入される配列は、MMP-2遺伝子の正常な機能が欠損しうる限り、特に限定されない。しかしながら、プロモーター領域とMMP-2遺伝子のコーディング領域の一部（例えば、少なくとも7％以上）、あるいはコーディング領域の大部分（例えば、50％以上、好ましくは80％以上、特に好ましくは90％以上）を欠失させるような変異は、確実にMMP-2遺伝子の機能を損なわせることができる。
【００２１】
本発明の非ヒト哺乳動物は、前記MMP-2遺伝子機能の欠損を染色体上の両方（ホモ）に有することが望ましい。しかしながら、ドミナントネガティブ型の変異を発現するトランスジーンや、RNAiを発現するトランスジーンを用いた変異導入の場合には、ヘテロに欠損を有していてもよい。
【００２２】
また、本発明にかかる「動物」は、ヒト以外の哺乳動物であれば特に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ等の齧歯動物が好ましく、特にマウスが最も好ましい。
【００２３】
２．MMP-2遺伝子欠損動物の作製方法
本発明のMMP-2遺伝子欠損動物は、ジーンターゲッティング（Capeccchi, M.R. Science, 244, 1288-1292, 1989, Thomas, K.R. & Cpeccchi, M.R. Cell, 44, 419-428, 1986）を利用することにより作製することができる。
【００２４】
１）ターゲティングベクターの構築
まず、MMP-2遺伝子を欠損させるためのターゲッティングベクターを構築する。ターゲッティングベクターの構築に先立って、使用する動物のゲノムDNAライブラリーを調製する。このゲノムDNAライブラリーは、多型等による組換え頻度の低下が起こらないよう、使用する動物のES細胞、または当該細胞が由来する系統のゲノムDNAから作製したライブラリーを用いる必要がある。そのようなライブラリーとしては市販のもの（例えば、Stratagene社製 129Svゲノムライブラリー等）を用いてもよい。ゲノムライブラリーは、標的とするMMP-2 cDNAまたはその部分配列をプローブとしてスクリーニングを行い、MMP-2ゲノムDNAをクローニングする。
【００２５】
クローニングされたゲノムDNAはシークエンシング、サザンブロッティング、制限酵素消化等を行うことにより、各エクソンの位置を明示した制限酵素地図を作成し、変異導入部位等を決定する。また、ターゲッティングベクターに使用する相同領域の外側に相同組換え体をスクリーニングするためのプローブを設定する。
【００２６】
本発明において、染色体上に導入する変異（欠失、置換、または挿入）はMMP-2遺伝子の正常な機能が損なわれる限り特に限定されない。例えば、欠失または置換される配列は、MMP-2遺伝子のイントロン領域であってもエクソン領域であっても、あるいはMMP-2遺伝子の発現制御領域であってもよい。特に、プロモーター領域やMMP-2遺伝子のコーディング領域の大部分（例えば、50％以上、好ましくは80％以上、特に好ましくは90％以上）を欠失させるような変異であれば、確実にMMP-2遺伝子の機能を欠損させることができる。また、挿入される他の配列も特に限定されず、例えば、以下のような各マーカー遺伝子配列であってもよい。
【００２７】
ターゲッティングベクターは、変異導入部位の3’および5’側の相同領域とともに、組み換え体を選択するための適当な選択マーカーを含む。該マーカーとしては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（pgk-neo等）、βラクタマーゼ遺伝子、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子等のポジティブセレクションマーカー、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（HSV-TK）、ジフテリア毒素Ａフラグメント（DT-A）等のネガティブセレクションマーカー等が挙げられるが、これらに限定されない。また、ベクターは相同領域の外側に、ベクターを直鎖化するための適当な制限酵素切断部位を含む。
【００２８】
２）ES細胞へのターゲッティングベクターの導入
次に、構築されたターゲティングベクターを胚性幹細胞（ES細胞）等の全能性を有する細胞に導入する。ES細胞は、マウス、ハムスター、ブタ等では細胞株が樹立されており、特にマウスでは、129系マウス由来のE14株、D3株、AB-1株、J1株や、R1株、TT2株等、複数の細胞株が入手可能である。また、マウスではES細胞に代えて胚性ガン腫細胞（EC細胞）を利用してもよい。
【００２９】
ES細胞は、ターゲッティングベクターの導入に先立って、適当な培地で培養しておく。例えば、マウスES細胞であれば、マウス繊維芽細胞等をフィーダー細胞として、これにES細胞用の液体培地（例えば、GIBCO製）を加えて共培養する。
【００３０】
ES細胞へのターゲッティングベクターの導入は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム法等、公知の遺伝子導入法により実施することができる。ターゲッティングベクターが導入されたES細胞は、ベクター中に挿入されたマーカーにより容易に選択することができる。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子をマーカーとして導入した細胞であれば、G418を加えたES細胞用培地で培養することにより、一次セレクションを行うことができる。
【００３１】
ターゲッティングベクターが導入されたES細胞では、相同組換えによって、染色体上のMMP-2遺伝子の一部が該ベクターで置換され、内因性のMMP-2遺伝子が破壊される。所望の相同組換えがなされたか否かは、サザンブロティングやPCR法等を利用したジェノタイプ解析によって判定できる。
【００３２】
３）キメラ動物の作製
ターゲッティングベクターが導入されたES細胞（組換えES細胞）は、ES細胞が由来する系統とは外見上明らかな相違を有する別な系統由来の初期胚に導入し、キメラ動物として発生させる。例えば、マウスであれば、Albino色の毛色を有する129系由来のES細胞に対しては、黒色の毛色を有し、マーカーとして利用できる各種遺伝子座が129系マウスとは異なっているC57BL/6マウス等の初期胚を用いることが望ましい。これにより、キメラマウスはその毛色によって、キメラ率を判断することができる。
【００３３】
ES細胞の初期胚への導入は、マイクロインジェクション法（Hogan, B. et al. ”Manipulating the Mouse Embryo” Cold Spring Habor Laboratory Press, 1988）や、アグリゲーション法（Andra, N. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8424-8428, 1993, Stephen, A.W. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 4582-4585, 1993）等により行うことができる。組換えES細胞が導入された初期胚（キメラ胚）は、仮親（偽妊娠動物）の子宮に移植し、所望のキメラ動物を得る。
【００３４】
４）MMP-2遺伝子欠損動物の作製
仮親から得られたキメラ動物は、さらに同系の野性型動物と交配する。得られる動物の約半分は、MMP-2遺伝子欠失染色体をヘテロで有するはずである。各個体のジェノタイプは、毛色等の外見上の特徴で一時判定できるほか、前述したサザンブロッティングやPCR法を利用したジェノタイプ解析によって決定することができる。こうして、ヘテロ型のMMP-2遺伝子欠損動物が同定されたら、このヘテロ型のMMP-2遺伝子欠損動物同士を交配あるいは戻し交配して、MMP-2遺伝子の欠損をホモで有する動物を得る。
【００３５】
本発明のMMP-2遺伝子欠損動物には、上記MMP-2遺伝子の欠損をヘテロで有する動物と、ホモで有する動物の両方を含むものとする。さらに、上記のようにして作製されたMMP-2遺伝子欠損動物の子孫も、染色体上のMMP-2遺伝子の機能が欠損している限り、本発明のMMP-2遺伝子欠損動物に含まれる。
【００３６】
３．コンディショナルなノックアウト
ジーンターゲッティングにバクテリオファージP1由来のCre-loxPシステムを利用して、部位特異的、時期特異的に標的遺伝子を欠損させてもよい（Kuhn R. et al., Science, 269, 1427-1429, 1995）。
【００３７】
例えば、前項に準じて欠損させるMMP-2遺伝子領域の5’側にloxP遺伝子を3’側にloxP遺伝子で挟んだマーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）を組み込んだターゲッティングベクターを作製し、ES細胞に導入する。ES細胞はマーカーによる選択の後、サザンブロッティングあるいはPCR法によるジェノタイプ解析を行って相同組換えを確認する。この相同組換えES細胞に、さらにCre蛋白を特異的プロモーターに連結したCre発現ベクターを導入する。得られたES細胞から、loxP組換えによってマーカー遺伝子のみが欠失し、MMP-2遺伝子領域は欠失していないES細胞クローンを同定する。このES細胞を動物に導入し、Cre-loxP組換え動物を得る。あるいは、MMP-2遺伝子両端にloxP遺伝子を組み込んだターゲッティングベクターを導入したloxP導入組換え動物と、Cre発現ベクターを導入したCre発現組換え動物を別個に作製し、両者を交配することによって、Cre-loxP組換え動物を作製してもよい。
【００３８】
こうして得られたCre-loxP組換え動物は、Cre蛋白の発現に応じて、部位特異的、時期特異的にMMP-2遺伝子を欠損しうる。したがって、特定時期、特定部位におけるMMP-2遺伝子の機能解析に極めて有用である。
【００３９】
４．骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症モデル動物としての利用
本発明のMMP-2遺伝子欠損動物において、同腹の野生型動物とは異なる表現型が現れた場合、それはMMP-2遺伝子の欠損に起因することが予測される。本発明にかかるMMP-2遺伝子欠損動物は、骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症に特徴的な多くの表現型を呈し、該動物が骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症モデル動物として利用可能であると考えられた。
【００４０】
４．１  骨粗鬆症モデル動物
本発明にかかる「骨粗鬆症」とは、骨粗鬆症は、骨量の減少によって骨の脆弱化が進み、骨折の危険性が増す疾患である。一般に骨粗鬆症は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収のアンバランスが原因と言われ、加齢や閉経等に伴い、特に海綿骨部分で多く発症する。
【００４１】
本発明のMMP-2遺伝子欠損動物では、骨粗鬆症に特徴的な、加齢に伴う（1）骨密度の低下、（2）海綿骨骨量の低下、（3）皮質骨骨量の低下、（4）骨形態組織学的変化等が顕著に認められた。したがって、該動物は、骨粗鬆症のモデル動物として有用である。
【００４２】
ところで、ヒトでMMP-2遺伝子の変異によって発症することが報告されている多中心性特発性骨溶解症候群は、若年性に骨粗鬆症による骨量減少と関節リウマチによる関節骨溶解を併発することを特徴とする疾患である。また本症候群は、頭蓋骨癒合症（縫合部での過剰骨化）も伴うことが知られている。骨粗鬆症は、骨密度・骨量の減少を主症状とする疾患群の総称であるため、多中心性特発性骨溶解症は、骨粗鬆症に包含される疾患とも言える。しかし、MMP-2欠損マウスは抗体で誘発すると、関節炎を発症し易くなる（Itoh et al., J. Immunol., 169, 2643-2647, 2002）ものの、普通の飼育条件では関節炎を発症しない。したがって、本発明の動物は骨粗鬆症モデル動物、特に骨細胞および骨細管ネットワークに異常を有する骨粗鬆症モデル動物と位置付けることができる。
【００４３】
４．２  頭蓋骨癒合症モデル動物
本発明にかかる「頭蓋骨癒合症（craniosynostosis：狭頭症、頭蓋狭突症、頭蓋縫合早期骨化症ともいう）」は、頭蓋骨の縫合部の骨芽細胞・線維芽細胞の過増殖により、骨の形成異常を生じる遺伝疾患である。頭蓋骨癒合症では、頭蓋骨の造形、再造形に異常が生じ、頭蓋骨の硬化が起こる。特にヒトでは頭蓋骨の縫合部に特異的な硬化や白化が見られ、形態的異常（変形）が進むと脳の発育障害を生じる。
【００４４】
本発明のMMP-2遺伝子欠損動物の頭蓋骨では、頭蓋骨癒合症に特徴的な、（1）骨密度の増加、（2）頭蓋骨白化等が顕著に認められた。したがって、該動物は、頭蓋骨癒合症のモデル動物として有用である。
【００４５】
本発明のモデル動物では、骨芽細胞や破骨細胞の機能は正常であり、骨細胞の機能不全により骨や骨格の異常を呈することが確認された。上述のとおり、一般に骨粗鬆症は骨芽細胞と破骨細胞の機能のアンバランスにより発症するといわれている。しかしながら、同様の症状は骨細胞の機能不全によっても起こり得ることが本発明者の研究により実証された。より詳細にいえば、本発明のモデル動物では、骨細管ネットワーク形成に異常を生じる結果、骨細胞間の情報伝達が正常に行われず、基質骨化や骨代謝が阻害され、骨粗鬆症や頭蓋骨癒合症様の病態を発症する。
【００４６】
すなわち、本発明のモデル動物は、骨細胞の機能不全に基づく上記症状の解明に有用であり、骨細管ネットワーク異常に基づく骨粗鬆症や頭蓋骨癒合症様の病態解明や治療手段の探索に有用である。
【００４７】
５．骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症治療薬のスクリーニング
本発明のMMP-2遺伝子欠損動物は、上述のとおり、骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症のモデル動物として利用しうる。本発明は、かかるMMP-2遺伝子欠損動物を利用した骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症治療薬のスクリーニング方法も提供する。
【００４８】
例えば、被験物質の投与条件下と非投与条件下でMMP-2遺伝子欠損動物を飼育し、その表現上の相違を指標として、該被験物質の骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症治療薬としての効果を評価することができる。評価は、例えば、骨密度、骨塩量、海綿骨骨量、皮質骨骨量、骨組織計測値等を指標として行うことができる。こうした各指標の検査や測定は、当該技術分野で公知の方法により実施することができる。
【００４９】
より具体的には、本発明のMMP-2遺伝子欠損動物に被験物質を投与することにより、モデル動物の骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症の症状が改善されれば、当該被験物質は骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症の治療薬候補として有用であると判定できる。
【００５０】
６．その他
本発明のMMP-2遺伝子欠損動物は、個体レベルでのMMP-2の機能や作用メカニズムの解明に有用である。こうした個体レベルでの機能解明には、恒常的なMMP-2の発現抑制に加えて、前述したCre-loxPシステム等を利用した、部位特異的、時期特異的MMP-2の発現抑制が有用である。
【００５１】
本発明のMMP-2遺伝子欠損動物は、骨細管ネットワーク形成異常により、骨細胞間の情報伝達が阻害され、基質骨化や骨代謝異常を引き起こすと考えられる。したがって、骨粗鬆症や頭蓋骨癒合症の研究にとどまらず、骨細管ネットワークの役割やその形成異常に起因する種々の病態の研究に利用しうる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
【００５３】
〔実施例１〕MMP-2欠損マウスの作製
１．試験方法
Itohらの方法（Itoh T., et al., Journal of Biological Chemistry, (1997), p22389-22392）に従い、MMP-2欠損マウスを作製した。すなわち、129SVマウスのゲノムライブラリー（Stratagene製）から、mouse MMP-2 cDNA配列（配列番号１）をプローブとしてスクリーニングを行い、マウスMMP-2ゲノムクローンを単離した。得られたクローンより、プロモーター末端領域を含む約2.0kbのHindIIIフラグメントと4.5kbのXba-SacIフラグメントを切り出し、ターゲッティングベクターを構築した。
【００５４】
図５に構築したターゲッティングベクターの概略を示す。ベクターは、マウスMMP-2遺伝子のプロモーター領域およびエクソン１（マウスMMP-2遺伝子コーディング領域の約7.2％に相当）が欠失するように構築されている。ベクターには、ポジティブセレクションマーカーとしてpgk-neo geneカセット（pGKプロモーターに連結されたネオマイシン耐性遺伝子）、およびネガティブセレクションマーカーとしてジフテリア毒素Ａフラグメントが挿入されている。
【００５５】
調製したターゲッティングベクターはマウスES細胞株：E14株（M. Hooperより供与を受けた）に導入し、選抜、培養後、相同組換え体の同定を行った。相同組換えが確認されたES細胞は、C57B6/Jマウスのブラストシストに注入してキメラ胚を作製し、これによりキメラマウスを樹立した。上記の手順は、Gomiらの方法（Gomi H., et al., Neuron, 14, p29-41）に記載の方法にしたがって行った。
【００５６】
得られたキメラマウスは野性型マウスと交配し、MMP-2遺伝子欠損を有するマウス（MMP-2遺伝子欠損をヘテロで有する：ヘテロマウス）を選別した。さらにこのヘテロマウスをC57B6/Jマウスと9〜10回戻し交配してMMP-2遺伝子欠損をホモで有するマウスを樹立した。
なお、ESクローンおよび各マウスのGenotypingは、サザンブロッティングにより確認した。
【００５７】
〔実施例２〕MMP-2欠損マウスにおける表現型の変化
実施例２にしたがって作製したMMP-2遺伝子欠損マウスをconventionalな条件下で飼育し、その表現型の変化を同腹の野生型マウスと比較評価した。
１．方法
（１）ラジオグラフィー
MBD計測は、全身および単離された骨をLunar PIXImus2 densitometer (GE Yokogawa Medical Systems, Tokyo, Japan)を用いてスキャンした。
【００５８】
（２）組織形態学
脛骨および大腿骨を70％エタノールで固定し、脱灰しない骨をメチルメタクリレートに包埋した。海綿骨については、脛骨の縦断面をトルイジンブルーで染色した。測定は骨端成長板から450および1650μmの間、ならびに二次海綿側皮質から150μmの領域において、最小20視野、400倍で行った。皮質骨については、大腿骨中央部の断面（厚さ25μm）をトルイジンブルーで染色した。測定は最小30視野、400倍で行った。
MAR（mineral apposition rate）はカルセインを２回腹腔内投与した後、２本のカルセインラベル間隔を測定することによって、計算した。
【００５９】
（３）骨髄細胞（in vitro）
骨髄細胞は大腿骨から洗い出し、1 x 106 cells/wellでプレートに播種して培養し、以下の項目について評価した。
i) ミネラル化小節形成：
細胞を50μg/mlのアスコルビン酸および10 mMのβグリセロフォスフェートを含むD-MEMで25日間培養し、ミネラル化された小結節をアリザリンレッドで染色して可視化して観察した。
ii) 破骨細胞形成：
細胞を10 nM 1.25(OH)2 vitamin D3および100 nM デキサメタソンを含むD-MEMで10日間培養し、TRAP染色で可視化して観察した。
【００６０】
（４）免疫染色
単離した骨は4 %パラホルムアルデヒドで固定し、25％ギ酸で4〜14日間室温で脱灰後、パラフィンに包埋した。MMP-2の免疫染色は、10 μg/ml 抗ヒトMMP-2モノクローナル抗体42-5D11 (Daiichi, Takaoka, Japan)を用いて行った。
【００６１】
（５）Bodian染色（骨細管の染色）
Bodian染色は、Kusuzakiらの方法（Acta Orthop Scand. 66, 166-168 (1995), Bone. 27, 655-659 (2000)）に基づいて行った。
【００６２】
（６）生化学的分析
単離したMMP-2欠損マウスの皮質骨は液体窒素中で粉砕し、0.5 M EDTA (E-ext) と4 M グアニジン-HCl (G2-ext)で順次抽出した。各フラクションは脱塩し、凍結乾燥した。抽出されたタンパクは生成したヒトMMP-2 (CC071, Chemicon) で 37℃24時間処理し、電気泳動後銀染色して観察した。
【００６３】
（７）統計解析
全ての結果はMann-Whitney U-testで解析した。平均値はmean ± s.e.mで示し、p<0.05を有意とした。
【００６４】
２．評価結果
２．１  顔
MMP-2欠損マウスは、若年から老齢まで、短い鼻、両眼隔離、ドーム型の頭といった、異常な顔を呈していた(図１aおよびb)。また、老齢マウスの頭蓋骨は野性型とは異なる特徴、すなわち前側の頭蓋骨が広く、矢状縫合が短く、色が白い、を呈していた(図１c)。また、顎は野性型マウスより12％狭かった。
【００６５】
２．２  ラジオグラフィー解析
ラジオグラフィー解析により、頭部の異常と骨粗鬆症が確認された(図２a)。大腿骨では、髄質の拡大と皮質の縮小が観察された。さらに、DXA解析の結果、若年および老齢マウスで、全身の骨密度の減少が認められた。性ホルモンの影響による雌雄の違いは認められなかった。また、MMP-2欠損マウスでは野性型より身長（鼻先から肛門）が短かかった(図２a)。
【００６６】
一方、野性型と比較した上顎骨を含む頭蓋部骨密度は、若年マウスでは減少しているにもかかわらず、老齢マウスでは上昇していた(図２b)。しかし、顎の骨密度はいずれにおいても有意に減少していた(図２b)。これらのデータは、骨密度の増加は、頭蓋冠や下顎の骨にみられる結合組織内骨化（骨芽細胞により結合組織が直接骨化される骨化様式）とは直接関連したものでないことを示す。MMP-2欠損マウスにおける硬化は、頭蓋冠でのみ認められた(図１d)。
【００６７】
２．３  組織形態学
細胞レベルでの骨の異常を調べるために、7週齢と55週齢のマウスについて、脛側海綿骨の縦断面の組織形態学的解析を行った。予測に反して、MMP-2欠損マウスの海綿骨量（BV/TV）は野性型と有意な差は無く(図３a)、海綿骨のパラメーターのいずれにも有意な変化が認められなかった。
【００６８】
長骨の構造的変化は皮質において顕著であった。そこで、大腿骨中央部の断面の組織形態学を調べた。大腿骨皮質の海綿骨量（BV/TV）は55週齢でのみ劇的に減少していた(図３dおよびe)。しかしながら、ＣＴ解析では若年マウスでさえすでに皮質海綿骨量（BV/TV）の減少が認められた。マウス皮質骨では、骨は骨内膜および骨膜皮質で形成されるが骨内膜皮質のみ吸収される。両皮質において、mineral apposition rate (MAR)の有意な違いは認められなかった。MARは１日あたりの骨付加の量を示すので、この結果はMMP-2活性は骨付加される骨芽細胞のスピードとは関係しないことを示す。
【００６９】
一方、bone formation rate (BFR)は老齢MMP-2欠損マウスの骨内膜および骨膜傍で特異に増加および減少していた(図３ｆおよびh)。他方、破骨細胞によって侵食された表面(ES)は老齢MMP-2欠損マウスの骨内膜で有意に増加していた（図３g）。結果として、骨代謝は老齢MMP-2欠損マウスの皮質において加速され、基質骨化は低下し、年を取るにつれてMMP-2欠損マウスの大腿骨皮質骨幹における骨形成と骨吸収のアンバランスが生じる。
なお、MMP-2欠損マウスに関節炎は認められなかった。
【００７０】
２．４  骨芽細胞小節および破骨細胞形成（in vitro）
さらに、in vitroでの骨芽細胞小節形成と破骨細胞形成を調べるために、骨髄細胞を培養した。55週齢のMMP-2欠損マウスの骨髄細胞の培養では、野生型マウスのそれと同程度に骨芽細胞小節と破骨細胞の形成が見られた(図３bおよびc)。MMP-2欠損マウスの培養骨髄細胞は小管のない、正常な骨化された小節形成を示した。in vitroデータは組織形態学データと一致するものだった。これらの結果は、MMP-2欠損マウスでは骨芽細胞や破骨細胞に大きな変化はないことを示すものである。この培養法では小管が形成されないので、小管非依存的なプロセスを評価できる。したがって、この結果はMMP-2が骨の骨化を小管を形成することによってコントロールすることを支持する。
【００７１】
２．５  MMP-2と表現型との関係
i）MMP-2免疫染色
野性型マウスにおけるMMP-2の分布を免疫染色により調べた。MMP-2の免疫シグナルは長骨の表面と基質の両方で検出された(図４aおよびb)。骨表面では、MMP-2は成熟骨芽細胞または若い骨細胞を示す大きな立方骨細胞内に検出された。MMP-2はまた、成熟骨細胞に囲まれた骨小腔やその周辺でもみとめられた。さらに、骨基質中で検出されたまばらなシグナルは骨細胞や小管の細胞周辺基質の形を示す(図４b)。これらの結果は、MMP-2が骨細胞の骨細管ネットワーク形成に関与することを強く支持する。加えて、MMP-2は軟骨基質に局在化していた(図４c)
【００７２】
ii）Bodian染色
骨細管ネットワーク形成におけるMMP-2の役割を評価するために、骨断面をBodianの方法で染色し、骨細管を可視化した。その結果、野性型マウスの大腿骨皮質骨細胞では、細かい細長い構造の骨細管ネットワークが観察された(図４d)。一方、MMP-2欠損マウスでは、ひどく乱れた構造のネットワークしか観察されなかった(図４d)。これらの結果から、骨細胞間の細胞間連絡はMMP-2欠損マウスの骨では、かなり悪化していることが予測された。異常は若年および老齢マウスの両方で認められた。
【００７３】
iii）MMP-2による基質タンパクの分解
MMP-2の骨組織における役割は、骨基質における骨細管を形成する基質構造タンパクの分解と思われる。MMP-2は主要な基質タンパクであるタイプＩコラーゲンを分解することが知られている。MMP-2が本当に細胞外マトリックスを分解することを知るために、骨から基質タンパクを抽出し、そのMMP-2に対する影響を調べた。細胞外マトリックスタンパクを豊富に含む、塩酸グアニジンで抽出した種々のフラクションはほとんど完全にMMP-2によって分解された(図４e)。この結果は、基質タンパクによる骨細管ネットワーク形成にMMP-2が寄与していることを強く裏付けるものであった。
【００７４】
３．結果
MMP-2欠損マウスでは、加齢に伴い有意な全身骨密度の低下、海綿骨量の低下が認められ、骨粗鬆症および頭蓋骨癒合症のモデル動物として有用と考えられた。
【００７５】
MMP-2欠損マウスにおける骨芽細胞と破骨細胞の正常な成長を考慮すると、骨密度や海綿骨量の低下を含む種々の骨格異常は、骨芽細胞や破骨細胞の機能不全によるものではなく、骨細胞間の連絡の遮断により引き起こされるものと推定された。骨細胞間の連絡は、外界からの刺激に応答した骨の柔軟性やフレキシビリティーの制御において特に重要である。以上の結果から、基質骨化には適切な骨細管形成が必要であり、MMP-2はその骨細管形成に関与している可能性が示唆される。ちなみに、基質骨化は骨芽細胞の樹状骨細胞への分化を進めるが、基質骨化に対する骨細管の関与はこれまで明らかにされてはいない。
【００７６】
老齢MMP-2欠損マウスにおける頭蓋冠硬化は、身体骨における骨減少とは対照的であった。ヒトにおけるMMP-2機能不全では、繊維形成誘導性細胞の過剰増殖がしばしば観察される。同様に、本マウスにおいても、MMP-2は繊維形成誘導性細胞の増殖を他のファクターに応答してネガティブに調節し、頭蓋冠縫合で過剰な繊維形成誘導性現象を生じ、骨形成を促進させた。これを裏付けるように、頭蓋冠縫合では高レベルのMMP-2発現と骨形成促進が観察された。
【００７７】
これまで、骨疾患の病理は骨芽細胞か破骨細胞の機能不全によって説明されることが多かった。しかし、本試験の結果より、骨細胞の細胞間ネットワークが骨基質骨化や骨代謝を調節し、骨を厳密に制御しているという仮説が提唱される。この知見について研究を進めれば、骨疾患の病態解明や新しい治療の手がかりとなる。本発明のMMP-2欠損マウスは、骨粗鬆症や頭蓋骨癒合症のモデル動物としても有用であるが、上述した骨形成メカニズムの研究においても、有用なツールとなりうる。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明にかかるMMP-2遺伝子欠損モデル動物は、骨粗鬆症および／または頭蓋骨癒合症の成因解明や治療手段の探索に利用できる。さらに、本発明のモデル動物は、骨細管ネットワークを介した基質骨化や骨代謝など、骨研究のためのツールとしても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、MMP-2欠損マウスと野性型マウスの顔を比較した結果を示す。図中、-/-はMMP-2欠損マウス、+/+は野性型マウスを示す。ａは、老齢マウス（35週齢）の顔の写真である。ｂは、顔の特徴の定量的解析結果（眉間の幅/顔の長さの比、*, p < 0.05; ***, p < 0.001）である。ｃは、頭蓋骨の写真である。ｄは、頭蓋骨、冠状縫合部分の写真である。
【図２】図２は、MMP-2欠損マウスのラジオグラフィー解析結果を示す。図中、-/-はMMP-2欠損マウス、+/+は野性型マウスを示す。ａは、25週齢マウスのレントゲン撮影の結果を示す写真（上は全身、下左カラムは鎖骨、下右カラムは大腿骨）である。ｂは、骨密度を示すグラフである［全身（Body）：Young:7-wk(n=5), Aged:+/+ 35-wk(n=13), -/- 35-wk(n=12), 頭蓋骨（skull）および下顎（Jaw）：Young:5-wk(n=6),Aged：+/+ 45-wk(n=7), -/- 60-wk(n=7)、*, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001］。
【図３】図３は、組織形態学および細胞観察結果を示す。図中、-/-はMMP-2欠損マウス、+/+は野性型マウスを示す。ａは、脛骨海綿骨量（BV/TV）を示す。ｂは、老齢マウス（55週齢）骨髄細胞の骨化領域（野性型：n=6、MMP-2欠損：n=5）を示す。ｃは、老齢マウス（55週齢）骨髄細胞のTRAP陽性多核細胞の数（、野性型：n=6、MMP-2欠損：n=6））を示す。ｄは、大腿骨皮質の海綿骨量（BV/TV）を示す。ｅは、大腿骨切断面の写真である。ｆは、骨内膜BFR/BSを示す。ｇは、骨内膜ES/BSを示す。ｈは、骨膜傍BFR/BSを示す。ｅ〜ｈにおいて、上：7週齢（n=6）、下：55週齢（n=6）。*, p < 0.05; **, P < 0.01; ***, p < 0.001。
【図４】図４は、MMP-2の骨細胞への関与を示す。図中、-/-はMMP-2欠損マウス、+/+は野性型マウスを示す。ａ〜ｃ：野性型マウス骨組織におけるMMP-2の免疫組織化学的染色、ｄ：皮質断面のBodian染色、ｅ：銀染色
【図５】図５は、MMP-2欠損マウス作製用ターゲッティングベクターのコンストラクトを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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