(57)【要約】【課題】  陸上における大量培養により効率よく生産しうる無脊椎動物幼生に対する新規な変態促進剤を提供する。【解決手段】  紅藻植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）紅藻綱（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｃｅａｅ）オゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ）、スギノリ目（Ｇｉｇａｒｔｉｎａｌｅｓ）又はイギス目（Ｃｅｒａｍｉａｌｅｓ）に属する直立着床可能な大型海藻の塩類水溶液抽出画分を有効成分とした無脊椎動物幼生の変態促進剤とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
紅藻植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）紅藻綱（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｃｅａｅ）オゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ）、スギノリ目（Ｇｉｇａｒｔｉｎａｌｅｓ）又はイギス目（Ｃｅｒａｍｉａｌｅｓ）に属する直立着床可能な大型海藻の塩類水溶液抽出画分を有効成分としてなる無脊椎動物幼生の変態促進剤。
【請求項２】
塩類水溶液抽出画分が分子量２０，０００以上９０，０００以下の画分である請求項１記載の無脊椎動物幼生の変態促進剤。
【請求項３】
塩類水溶液抽出画分が波長４８０〜５７０ｎｍの領域に吸収極大を有する画分である請求項１記載の無脊椎動物幼生の変態促進剤。
【請求項４】
紅藻植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）紅藻綱（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｃｅａｅ）オゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ）、スギノリ目（Ｇｉｇａｒｔｉｎａｌｅｓ）又はイギス目（Ｃｅｒａｍｉａｌｅｓ）に属する直立着床可能な大型海藻を塩類含有水溶液で抽出し、次いでこの抽出液に、先ず最終濃度３０〜４０質量％になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度７０質量％程度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、沈殿として得られる粗活性成分画分を分取し、次いでゲルろ過クロマトグラフィーにより分子量２０，０００以上９０，０００以下の画分を分画し、無脊椎動物幼生に対する変態促進活性を示す画分を捕集することを特徴とする請求項２記載の無脊椎動物幼生の変態促進剤の製造方法。
【請求項５】
紅藻植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）紅藻綱（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｃｅａｅ）オゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ）、スギノリ目（Ｇｉｇａｒｔｉｎａｌｅｓ）又はイギス目（Ｃｅｒａｍｉａｌｅｓ）に属する直立着床可能な大型海藻を塩類含有水溶液で抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度３０〜４０質量％になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度７０質量％程度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、沈殿として得られる粗活性成分画分を分取し、次いでこれからクロマトグラフィー処理して波長４８０〜５７０ｎｍの領域に吸収極大を有する画分を分画し、無脊椎動物幼生に対する変態活性を示す画分を捕集することを特徴とする請求項３記載の無脊椎動物幼生の変態促進剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンゴ類のような海洋無脊椎動物幼生の変態を促進するのに有効な変態促進剤及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
藻類とは、水生の光合成を行う植物群の総称であり、単細胞で直径約０．８μｍの微小なものから長さ６０〜９０ｍ又はそれ以上の大型のものまで含まれる。この藻類は、緑藻植物、藍藻植物、緑虫植物、黄金藻植物、クリプト藻植物、炎色藻植物、緑色鞭藻植物、褐藻植物及び紅藻植物の９門に分類されるが、これらは色素組成、貯蔵物質の化学成分、鞭毛の数と位置及び物理化学的性質などにより特徴づけられ、相互に区別されている。
【０００３】
例えば、すべての藻類はクロロフィルａ、カロチン及びキサントフィルを含むが、緑藻植物と緑虫植物は、そのほかにクロロフィルｂを、また褐藻植物と大部分の炎色藻植物及び黄金色植物は、クロロフィルｃを、紅藻植物はクロロフィルｄを含んでいる。
また、藍藻植物と紅藻植物はフィコピリン色素を含むが、その中のエキネノンとミクソキサントフィルは藍藻植物に特有であり、紅藻植物にはアミロペクチンに類似の紅藻デンプンを含んでいる。
【０００４】
また、これらの藻類に特有な成分の中には、特殊の生理活性を示す物質があり、これらを抽出して種々の用途に供することも行われている。
そして、紅藻植物については、これまでそれに由来する物質の中に海洋無脊椎動物浮遊幼生の着生促進又は変態促進の作用を有するものがあることが報告されている。
【０００５】
例えば、紅藻綱サンゴモ目（Ｃｏｒａｌｌｉｎａｌｅｓ）サンゴモ科（Ｃｏｒａｌｌｉｎａｃｅａｅ）コブイシモ属（Ｈｙｄｒｏｌｉｔｈｏｎ）コブイシモ（Ｈｙｄｒｏｌｉｔｈｏｎ  ｒｅｉｎｂｏｌｄｉｉ）の粉末や紅藻綱大型海藻スギノリ目（Ｇｉｇａｒｔｉｎａｌｅｓ）イワノカワ科（Ｐｅｙｓｓｏｎｎｅｌｉａｃｅａｅ）イワノカワ属（Ｐｅｙｓｓｏｎｎｅｌｉａ  ｓｐ．）海藻の粉末がイシサンゴ類（Ｓｃｌｅｒａｃｔｉｎｉａｎｓ）ミドリイシ科（Ａｃｒｏｐｏｒｉｄａｅ）サンゴの幼生の着生あるいは変態を促進することが報告されている（非特許文献１参照）。
【０００６】
さらに、紅藻綱サンゴモ目（Ｃｏｒａｌｌｉｎａｌｅｓ）サンゴモ科（Ｃｏｒａｌｌｉｎａｃｅａｅ）コブイシモ属（Ｈｙｄｒｏｌｉｔｈｏｎ）コブイシモ（Ｈｙｄｒｏｌｉｔｈｏｎ  ｒｅｉｎｂｏｌｄｉｉ）から精製した分子量５〜１０キロダルトンの低分子量硫酸化グリコサミノグリカンが、イシサンゴ類（Ｓｃｌｅｒａｃｔｉｎｉａｎｓ）ヒラフキサンゴ科（Ａｇａｒｉｃｉｉｄａｅ）アガリシア・フミリス属（Ａｇａｒｉｃｉａ  ｈｕｍｉｌｉｓ）の幼生の着生促進あるいは変態促進活性があることも明らかになっている（非特許文献１参照）。
【０００７】
また、紅藻綱サンゴモ目（Ｃｏｒａｌｌｉｎａｌｅｓ）サンゴモ科（Ｃｏｒａｌｌｉｎａｃｅａｅ）コブイシモ属（Ｈｙｄｒｏｌｉｔｈｏｎ）コブイシモ（Ｈｙｄｒｏｌｉｔｈｏｎ  ｒｅｉｎｂｏｌｄｉｉ）から精製した分子量１４，０００ダルトン以下の低分子量硫酸化グリコサミノグリカンが、イシサンゴ類（ｓｃｌｅｒａｃｔｉｎｉａｎｓ）ヒラフキサンゴ科（Ａｇａｒｉｃｉｉｄａｅ）アガリシア・フミリス属（Ａｇａｒｉｃｉａ  ｈｕｍｉｌｉｓ）の幼生の着生促進あるいは変態促進活性があることも明らかになっている（非特許文献２参照）。
【０００８】
ところで、コブイシモ属海藻のような紅藻綱サンゴモ目に属する海藻は、一般に紅藻植物の大型海藻よりも生長が遅く、陸上における大量培養で生産するのが困難であるため、これを用いてミドリイシ科（Ａｃｒｏｐｏｒｉｄａｅ）サンゴやヒラフキサンゴ科（Ａｇａｒｉｃｉｉｄａｅ）アガリシア・フミリス属（Ａｇａｒｉｃｉａ  ｈｕｍｉｌｉｓ）のようなイシサンゴ類（Ｓｃｌｅｒａｃｔｉｎｉａｎｓ）の幼生の着生促進又は変態促進活性を有する変態促進剤を工業的に大量生産するのは不適当である。
【０００９】
また、同じように生長が遅く、大量陸上培養が困難であるという理由で、イシサンゴ類（Ｓｃｌｅｒａｃｔｉｎｉａｎｓ）の幼生の着生促進あるいは変態促進活性を有する変態促進剤を紅藻綱サンゴモ目に属する海藻を用いて大量に生産させるのは不適当である。そのため、ミドリイシ科（Ａｃｒｏｐｏｒｉｄａｅ）サンゴやヒラフキサンゴ科（Ａｇａｒｉｃｉｉｄａｅ）アガリシア・フミリス属（Ａｇａｒｉｃｉａ  ｈｕｍｉｌｉｓ）などの変態促進剤の生産には直立着床可能な大型海藻を原料とするのが好ましいとされている。
【００１０】
紅藻綱スギノリ目（Ｇｉｇａｒｔｉｎａｌｅｓ）イワノカワ科（Ｐｅｙｓｓｏｎｎｅｌｉａｃｅａｅ）イワノカワ属（Ｐｅｙｓｓｏｎｎｅｌｉａ  ｓｐ．）に属する海藻については前述したとおり、ある種のサンゴの幼生に対し変態又は着生促進作用を示すことが知られているが、これは扁平な紅藻であり、直立着床可能な海藻、すなわち直立して生長する海藻に比べて一般に生長が遅い上に、培養面積が広くとられるので陸上において大量に培養するには不利である。
【００１１】
したがって、イシサンゴ類（Ｓｃｌｅｒａｃｔｉｎｉａｎｓ）の幼生の着生促進又は変態促進活性を有する変態促進剤を得るには、殻状紅藻である大型海藻スギノリ目（Ｇｉｇａｒｔｉｎａｌｅｓ）イワノカワ科（Ｐｅｙｓｓｏｎｎｅｌｉａｃｅａｅ）イワノカワ属（Ｐｅｙｓｓｏｎｎｅｌｉａ  ｓｐ．）海藻は不適当である。
【００１２】
しかも、コブイシモ属海藻などの紅藻綱サンゴモ目に属する海藻やスギノリ目（Ｇｉｇａｒｔｉｎａｌｅｓ）イワノカワ科（Ｐｅｙｓｓｏｎｎｅｌｉａｃｅａｅ）イワノカワ属（Ｐｅｙｓｓｏｎｎｅｌｉａ  ｓｐ．）に属する海藻などの殻状紅藻は、基質に付着して生長するため、これらの海藻を陸上培養すると、海藻が付着している基質が他の生物などで汚染されやすく、培養継続が困難になるという欠点も有している。
【００１３】
そのほか、紅藻綱サンゴモ目（Ｃｏｒａｌｌｉｎａｌｅｓ）サンゴモ科（Ｃｏｒａｌｌｉｎａｃｅａｅ）イシモ属（Ｌｉｔｈｏｔｈａｍｎｉｕｍ  ｓｐ．）の海藻、紅藻綱サンゴモ目（Ｃｏｒａｌｌｉｎａｌｅｓ）サンゴモ科（Ｃｏｒａｌｌｉｎａｃｅａｅ）イシゴロモ属（Ｌｉｔｈｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｓｐ．）の海藻、ベニマダラ目（Ｈｉｌｄｅｎｂｒａｎｄｉａｌｅｓ）ベニマダラ科（Ｈｉｌｄｅｎｂｒａｎｄｉａｃｅａｅ）ベニマダラ属（Ｈｉｌｄｅｎｂｒａｎｄｉａ  ｓｐ．）の海藻などの殻状紅藻由来の物質により、マキガイ綱（Ｇａｓｔｒｏｐｏｄａ）アカネアワビ（Ｈａｌｉｏｔｉｓ  ｒｕｆｅｓｃｅｎｓ）幼生の着生又は変態が促進されることが報告されているし（非特許文献３参照）、紅藻綱大型海藻ウシケノリ目（Ｂａｎｇｉａｌｅｓ）ウシケノリ科（Ｂａｎｇｉａｃｅａｅ）アマノリ属（Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｓｐ．）海藻から精製した可視部５６２ｎｍに吸収をもつ成分が、マキガイ綱（Ｇａｓｔｒｏｐｏｄａ）アカネアワビ（Ｈａｌｉｏｔｉｓ  ｒｕｆｅｓｃｅｎｓ）幼生の着生あるいは変態を促進することが知られている（非特許文献４参照）。
【００１４】
ところで、一般に基質に付着せずに、あるいは藻体のわずかな部分に相当する付着器でのみ基質に付着し、直立着床した状態で生長する海藻は、陸上培養において容器が汚染された場合に、直立部又は直立部先端部を別の容器に移し替えることにより、培養の継続が可能である。したがって、陸上培養により変態促進剤を生産させるには、紅藻綱サンゴモ目海藻や殻状紅藻は不向きであり、直立着床状態で生長する海藻、特に単藻培養株を用いるのが好ましい。
【００１５】
ここで単藻培養株とは、海洋藻類を処理し１種類の藻類にまで純化した藻類株であり、海洋藻類の室内培養などに利用されている。この単藻類培養株は、例えば成熟した藻類から胞子を単離し、人工海水や滅菌した海水や人工海水中で培養する方法により調製することができる。
【００１６】
また、一般に天然の海洋藻類は、表面の着生植物（ｅｐｉｐｈｙｔｅ）や内部植物性寄生体（ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ）を多く含んでいる。これら着生植物や内部植物性寄生体は、（１）海藻の陸上培養を継続的に行うことを困難にしたり、（２）海洋藻類由来の変態促進剤の精製工程において変態促進剤の高純度化を妨げる場合がある。そこで成熟した天然海洋藻類から胞子を単離し、人工海水や滅菌した海水中で培養して得た単藻培養株を調製することによって、天然の海洋藻類に含まれていた着生植物や内部植物性寄生体の量を効果的に減らすことができる。
【００１７】
このような理由により、生長の速い紅藻植物を用いて、陸上において大量培養することにより、効率よく変態促進剤特に無脊椎動物幼生に対する変態促進剤を製造する方法が望まれていたにもかかわらず、これまで、このような方法は知られていなかった。
【００１８】
【非特許文献１】「バイオロジカル・ブレタン（Ｂｉｏｌ．Ｂｕｌｌ．）」，１９９６年，第１９１巻，ｐ．１４９−１５４
【非特許文献２】「バイオロジカル・ブレタン（Ｂｉｏｌ．Ｂｕｌｌ．）」，１９９１年，第１８１巻，ｐ．１０４−１２２
【非特許文献３】「ジャーナル  イクスペリメンタル  マリン  バイオロジー  アンド  エコロジー（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｌ．Ｅｃｏｌ．）」，１９８４年，第７５巻，ｐ．１９１−２１５
【非特許文献４】「ハイドロバイオロジア（Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ）」，１９８４年，第１１６／１１７巻，ｐ．１５５−１５８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、陸上における大量培養により効率よく生産しうる無脊椎動物幼生に対する新規な変態促進剤を提供するという課題を解決するためになされたものである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、紅藻植物から抽出成分の生理的活性について種々研究を重ねた結果、紅藻植物に属する直立着床可能な大型海藻、換言すれば殻状紅藻以外の大型海藻から抽出される硫酸化多糖成分又は硫酸化グリコサミノグリカン成分又は硫酸化プロテオグリカン成分がイシサンゴ類のような無脊椎動物幼生に対し、変態促進作用及び着床促進作用を示すこと、これらの成分は該海藻からの抽出液の特定の画分に濃縮され、これから分離できることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【００２１】
すなわち、本発明は、紅藻植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）紅藻綱（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｃｅａｅ）オゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ）、スギノリ目（Ｇｉｇａｒｔｉｎａｌｅｓ）又はイギス目（Ｃｅｒａｍｉａｌｅｓ）に属する直立着床可能な大型海藻の塩類水溶液抽出画分を有効成分としてなる無脊椎動物幼生の変態促進剤、及び紅藻植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）紅藻綱（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｃｅａｅ）オゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ）、スギノリ目（Ｇｉｇａｒｔｉｎａｌｅｓ）又はイギス目（Ｃｅｒａｍｉａｌｅｓ）に属する直立着床可能な大型海藻を塩類含有水溶液で抽出し、次いでこの抽出液に、先ず最終濃度３０〜４０質量％になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度７０質量％程度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、沈殿として得られる粗活性成分画分を分取し、次いでゲルろ過クロマトグラフィーにより分子量２０，０００以上９０，０００以下の画分を分画するか、あるいはクロマトグラフィー処理して波長４８０〜５７０ｎｍの領域に吸収極大を有する画分を分画し、無脊椎動物幼生に対する変態活性を示す画分を捕集することを特徴とする無脊椎動物幼生の変態促進剤の製造方法を提供するものである。
【００２２】
次に、本発明をさらに詳細に説明する。なお、海藻の分類は、［吉田忠生，「新日本海藻誌」，内田老鶴圃，１９９８年］によった。
【００２３】
本発明の変態促進剤は、紅藻植物門の紅藻綱オゴノリ目、スギノリ目又はイギス目に属する直立着床可能な大型海藻からの抽出物を有効成分とするものであるが、ここで直立着床可能とは、岩石のような固体に、付着器で着床し、直立状態を保ちながら生長しうることを意味し、また大型海藻とは、葉状部の長さが５ｍｍ以上の海藻を意味する。
【００２４】
本発明の原料としては、オゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ）、スギノリ目（Ｇｉｇａｒｔｉｎａｌｅｓ）、又はイギス目（Ｃｅｒａｍｉａｌｅｓ）に属する大型海藻が好ましい。
【００２５】
このようなオゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ）海藻の例としては、オゴノリ科（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｃｅａｅ）オゴノリ属（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｓｐ．）海藻、オゴノリ科（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｃｅａｅ）オゴノリ属（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）オゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｖｅｒｍｉｃｕｌｏｐｈｙｌｌａ）あるいはオゴノリ科（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｃｅａｅ）オゴノリ属（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）ツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｃｈｏｒｄａ）などが挙げられる。
【００２６】
また、スギノリ目（Ｇｉｇａｒｔｉｎａｌｅｓ）に属する海藻の例としては、ツカサノリ科（Ｋａｌｌｙｍｅｎｉａｃｅａｅ）トサカモドキ属（Ｃａｌｌｏｐｈｙｌｌｉｓ  ｓｐ．）、ツカサノリ科（Ｋａｌｌｙｍｅｎｉａｃｅａｅ）トサカモドキ属（Ｃａｌｌｏｐｈｙｌｌｉｓ）ホソバノトサカモドキ（Ｃａｌｌｏｐｈｙｌｌｉｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、ナミノハナ科（Ｒｈｉｚｏｐｈｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）ナミノハナ属（Ｐｏｒｔｉｅｒｉａ  ｓｐ．）、ナミノハナ科（Ｒｈｉｚｏｐｈｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）ナミノハナ属（Ｐｏｒｔｉｅｒｉａ）ナミノハナ（Ｐｏｒｔｉｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、ミリン科の海藻（Ｓｏｌｉｅｒｉａｃｅａｅ）などが挙げられる。
【００２７】
さらに、イギス目（Ｃｅｒａｍｉａｌｅｓ）に属する海藻の例としては、フジマツモ科（Ｒｈｏｄｏｍｅｌａｃｅａｅ）ソゾ属（Ｌａｕｒｅｎｃｉａ  ｓｐ．）海藻、フジマツモ科（Ｒｈｏｄｏｍｅｌａｃｅａｅ）ソゾ属（Ｌａｕｒｅｎｃｉａ）ハネソゾ（Ｌａｕｒｅｎｃｉａ  ｐｉｎｎａｔａ）などが挙げられる。
本発明で用いる原料としては、天然に生育している海藻でもよいが、単藻培養株が好ましい。
【００２８】
本発明の変態促進剤は、例えば前記した紅藻綱に属する直立着床可能な大型海藻を塩類含有水溶液で抽出し、この抽出液に、先ず最終濃度３０〜４０質量％になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度７０質量％程度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、沈殿として得られる粗活性成分画分を分取し、次いでゲルろ過クロマトグラフィーにより分子量２０，０００以上９０，０００以下の画分を分画するか、あるいはこの沈殿をクロマトグラフィー処理して波長４８０〜５５０ｎｍの領域に吸収極大を有する画分を分画し、イシサンゴ類など無脊椎動物の幼生に対する変態促進の活性を示す画分を捕集することによって製造することができる。
この際用いる塩類を含む水溶液としては、例えば生理食塩水、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液などが好ましい。
【００２９】
この方法を好適に行うには、上記の原料に以下に示す（イ）水溶性画分の抽出工程、（ロ）粗活性成分画分の分取工程、及び（ハ）変態促進剤の精製工程を順次施せばよい。
【００３０】
この場合、（イ）工程においては、原料に塩類含有水溶液、例えば塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液を加えてホモゲナイズしたのち、遠心分離処理し、上澄である粗抽出液を得る。
【００３１】
次に（ロ）工程においては、前記（イ）工程で得られた抽出液に、まず最終濃度が３０〜４０質量％程度の飽和溶液になるように硫酸アンモニウムを加えて１段目の塩析を行い、生成した沈殿を遠心分離処理により除去する。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去される。次いで、上澄液を遠心分離し、これに最終濃度７０質量％程度の飽和溶液になるように硫酸アンモニウムを加えて２段目の塩析を行い、生成した沈殿を遠心分離により分別したのち、この沈殿画分を塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液などの緩衝液で再溶解して粗活性成分画分を得る。
【００３２】
次いで、（ハ）工程においては、前記（ロ）工程で得られた粗活性成分画分を、塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液などの緩衝液に対して透析後、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分子量２０，０００以上９０，０００以下の画分を分画し、イシサンゴ類のような無脊椎動物の幼生に対する変態促進などの活性を示す画分を捕集する。必要であれば、さらにクロマトグラフィーにより成分を分離し、高純度化した精製品を得ることができる。この際、最終段階で使用するクロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー又はゲルろ過クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィー或いはそれらの組合せを用いるのが好ましい。
【００３３】
ここでいう、分子量２０，０００以上９０，０００以下の画分とは、ゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、球状タンパク質を標準分子量物質として用いて、溶出画分の分子量を算出した結果が２０，０００以上９０，０００以下の分子量に相当する画分をいう。
【００３４】
この（ハ）工程はまた、前記（ロ）工程で得られた粗活性成分画分を、塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液などの緩衝液に対して透析後、クロマトグラフィー処理して波長４８０〜５７０ｎｍの可視部において吸収極大を示す画分を分画し、精製された赤色系色素を含む画分を捕集することによって行うこともできる。この場合も必要であれば、さらにクロマトグラフィーにより成分を分離し、高純度化した精製品を得ることができる。この際、最終段階で使用するクロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー又はゲルろ過クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィー或いはこれらの組合せで好ましい。
【００３５】
上記の４８０〜５７０ｎｍの領域に吸収極大を示す画分の回収は、例えばクロマトグラフィーカラムからの溶出液を経時的に少量の、好ましくはカラム体積以下のフラクションとして分取し、各フラクションごとに４８０〜５７０ｎｍまでの可視部領域での吸光度を測定して、この領域内で最大の吸収を示した画分を捕集することにより行うことができる。
【００３６】
このようにして得られる画分から回収される物質は、イシサンゴ類のような無脊椎動物の幼生に対する着生促進又は変態促進の生理活性を有することによって特徴づけられる文献未載の新規物質であり、これは硫酸化多糖成分又は硫酸化グリコサミノグリカン成分又は硫酸化プロテオグリカン成分或いは生理活性色素のいずれかを主体としているものと考えられる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明の変態促進剤は、紅藻綱オゴノリ目、スギノリ目、又はイギス目に属する大型海藻由来の新規物質であって、イシサンゴ類など無脊椎動物の幼生に対する変態促進活性を有し、また同じ幼生に対し着生促進活性を有している。しかも、この物質は、直立着床可能な紅藻植物由来のものであるので、大量陸上培養することにより、大量に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
次に、実施例により本発明を実施するための最良の形態を説明するが、本発明はこれによりなんら限定されるものではない。
なお、各例における「変態率」とはイシサンゴ幼生が基層に着生し、放射状の骨格形成を行うステージ（シングルポリプステージ）に達した状態のサンプルの数の全体数に対する割合（％）を意味する。
【実施例１】
【００３９】
（イ）水溶性画分の抽出工程
原料としてオゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ）オゴノリ科（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｃｅａｅ）オゴノリ属（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）ツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｃｈｏｒｄａ）（徳島県吉野川河口域産）を用い、これを０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、天日乾燥して乾燥物とした。次いで、この乾燥物１００ｇに０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）７００ｍｌを加えてホモゲナイズしたのち、このホモゲナイズした液を４℃で６時間放置後、遠心分離し、上澄として粗抽出液を得た。
【００４０】
（ロ）粗活性成分画分の分別工程
次いで、この粗抽出液に、最終濃度３５質量％飽和溶液になるように硫酸アンモニウムを加えて１段目の塩析を行った。硫酸アンモニウムを添加終了後、４℃で１時間放置したのち、生成した沈殿を遠心分離して除去した。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去された。次に、遠心分離で得た上澄に、最終濃度７０質量％飽和溶液になるように硫酸アンモニウムを添加終了後、４℃で一晩放置したのち、生成した沈殿を遠心分離して分別した。分別した沈殿画分を、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）で再溶解し、粗活性成分画分を得た。
【００４１】
（ハ）粗活性成分画分の精製工程
次に、このようにして得られた粗活性成分画分を、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）に対して透析後、遠心分離し不溶性の夾雑タンパク質を除去後、ゲルろ過クロマトグラフィーで分子量２０，０００以上９０，０００以下の画分を分画し、精製品を得た。得られた精製品中の糖質、硫酸基、タンパク質分析の結果、同質量の精製品中で比較した場合、ヘキソース含有量が約６ｍｇ（フェノール−硫酸法による）、硫酸基含有量が約１．５ｍｇ（ｒｈｏｄｉｚｏｎａｔｅ法による）、タンパク質含有量は０．２ｍｇ（Ｌｏｗｒｙ法による）以下であった。化学分析の結果から、この精製品は、硫酸化多糖成分あるいは硫酸化グリコサミノグリカン成分あるいは硫酸化プロテオグリカン成分と推定された。
【００４２】
この精製品についてイシサンゴ類（ｓｃｌｅｒａｃｔｉｎｉａｎｓ）ミドリイシ科（Ａｃｒｏｐｏｒｉｄａｅ）クシハダミドリイシ（Ａｃｒｏｐｏｒａ  ｈｙａｃｉｎｔｈｕｓ）幼生に対する変態促進活性を測定した。
【００４３】
クシハダミドリイシなどミドリイシ科サンゴの多くは雌雄同体・配偶子放出型の繁殖生態であるので、これらのサンゴは、精子と浮力をもつ複数の卵が一つに包み込まれたバンドル（ｅｇｇ−ｓｐｅｒｍｂｕｎｄｌｅ）を一斉に放出する。イシサンゴのバンドル（ｅｇｇ−ｓｐｅｒｍｂｕｎｄｌｅ）採取と受精は以下のように行った。
【００４４】
成熟したクシハダミドリイシ４群体を高知県横浪半島沖太平洋水深５ｍないし１０ｍの間で採取した。実験室冷暗所に設置した水槽内でクシハダミドリイシが卵放出する直前まで保存した。
次いで、クシハダミドリイシを１群体ごとに個別のろ過滅菌海水の水槽に分けて収容した。ろ過滅菌海水としては、１μｍのグラスフィルターで一次ろ過した海水を、０．２２μｍのミリポアフィルターで精密ろ過したものを用いた。放卵（バンドルの放出）開始後、１群体から放出された配偶子をそれぞれ回収し、ろ過滅菌海水中へ添加した。卵と精子をろ過滅菌海水を入れた容器に移し、他の群体から分別された卵又は精子で他家受精した。得られたクシハダミドリイシの幼生をろ過滅菌海水の入った容器内で２５℃で保存した。
【００４５】
このクシハダミドリイシの幼生を８日間２５℃で維持した後、１０ｍｌのろ過滅菌海水を入れた２０ｍｌ容量のポリスチレン製カップに１０個体の幼生を入れ静置し、７２時間後のイシサンゴ幼生の変態率を求めた。この際のサンプルとしては、上記の精製品１ｍｌとろ過滅菌海水９ｍｌとの混合物を用い、またブランクとしてろ過滅菌海水１０ｍｌのものを用いた。その結果を表１に示す。
【００４６】
比較例１
原料として高知県横浪半島沖太平洋水深５ｍないし１０ｍの間で採取した褐藻類アミジグサ目（Ｄｉｃｔｙｏｔａｌｅｓ）アミジグサ科（Ｄｉｃｔｙｏｔａｃｅａｅ）ハイオオギ属（Ｌｏｂｏｐｈｏｒａ）ハイオオギ（Ｌｏｂｏｐｈｏｒａ  ｖａｒｉｅｇａｔａ）を用い、これをろ過滅菌海水で３回洗浄し、ろ紙上で軽く水分を除いた。このハイオオギ湿質量１ｇをとり、ろ過滅菌海水１０ｍｌを加えて乳鉢と乳棒を用いて４℃で粉砕し、褐藻類懸濁液を調製した。これを用いて実施例１と同様にしてクシハダミドリイシの幼生に対する生理活性を調べた。その結果を表１に示す。
【００４７】
【表１】
2005087177.tif 000002
【００４８】
表１より明らかなように、精製品（海藻由来硫酸化多糖成分又は硫酸化グリコサミノグリカン成分又は硫酸化プロテオグリカン成分）は、イシサンゴ幼生の変態を促進する活性を有している。また、ろ過滅菌海水及び褐藻類懸濁液はイシサンゴ幼生変態を促進する活性が認められなかった。
【実施例２】
【００４９】
原料としてオゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ）オゴノリ科（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｃｅａｅ）オゴノリ属（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）ツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｃｈｏｒｄａ）（徳島県吉野川河口域産）の代わりに、ナミノハナ（Ｐｏｒｔｉｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）を用いて、実施例１の（イ）、（ロ）工程を行い、粗活性成分画分を得た。スギノリ目（Ｇｉｇａｒｔｉｎａｌｅｓ）ナミノハナ科（Ｒｈｉｚｏｐｈｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）ナミノハナ属（Ｐｏｒｔｉｅｒｉａ）ナミノハナ（Ｐｏｒｔｉｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）は、高知県横浪半島沖太平洋水深５ｍないし１０ｍの間で、クシハダミドリイシが生息しているのと同じ海域から採取して使用した。
【００５０】
この粗活性成分画分をゲルろ過クロマトグラフィーに通し、分子量２０，０００以上９０，０００以下の画分を集め、濃縮し、ナミノハナ由来硫酸化糖質（硫酸化多糖成分又は硫酸化グルコサミノグリカン成分又は硫酸化プロテオグリカン成分）画分を得た。ナミノハナ由来硫酸化糖質画分について実施例１と同様にイシサンゴ類（ｓｃｌｅｒａｃｔｉｎｉａｎｓ）ミドリイシ科（Ａｃｒｏｐｏｒｉｄａｅ）クシハダミドリイシ（Ａｃｒｏｐｏｒａ  ｈｙａｃｉｎｔｈｕｓ）幼生に対する変態促進活性を測定した。２回の実験での変態率は３０％と３０％で平均値は３０％であった。
【実施例３】
【００５１】
原料としてオゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ）オゴノリ科（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｃｅａｅ）オゴノリ属（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）ツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｃｈｏｒｄａ）（徳島県吉野川河口域産）の代わりに、ホソバノトサカモドキ（Ｃａｌｌｏｐｈｙｌｌｉｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ）を用いて、実施例１の（イ）、（ロ）工程を行い、粗活性成分画分を得た。スギノリ目（Ｇｉｇａｒｔｉｎａｌｅｓ）ツカサノリ科（Ｋａｌｌｙｍｅｎｉａｃｅａｅ）トサカモドキ属（Ｃａｌｌｏｐｈｙｌｌｉｓ）ホソバノトサカモドキ（Ｃａｌｌｏｐｈｙｌｌｉｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ）は、高知県横浪半島沖太平洋水深５ｍないし１０ｍの間で、クシハダミドリイシが生息しているのと同じ海域から採取して使用した。
【００５２】
この粗活性成分画分をゲルろ過クロマトグラフィーに通し、分子量２０，０００以上９０，０００以下の画分を集め、濃縮し、ホソバノトサカモドキ由来硫酸化糖質（硫酸化多糖成分又は硫酸化グルコサミノグリカン成分又は硫酸化プロテオグリカン成分）画分を得た。ホソバノトサカモドキ由来硫酸化糖質画分について実施例１と同様にイシサンゴ類（ｓｃｌｅｒａｃｔｉｎｉａｎｓ）ミドリイシ科（Ａｃｒｏｐｏｒｉｄａｅ）クシハダミドリイシ（Ａｃｒｏｐｏｒａ  ｈｙａｃｉｎｔｈｕｓ）幼生に対する変態促進活性を測定した。２回の実験での変態率は２０％と３０％で平均値は２５％であった。
【実施例４】
【００５３】
原料としてオゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ）オゴノリ科（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｃｅａｅ）オゴノリ属（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）ツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｃｈｏｒｄａ）（徳島県吉野川河口域産）の代わりに、ハネソゾ（Ｌａｕｒｅｎｃｉａ  ｐｉｎｎａｔａ）を用いて、実施例１の（イ）、（ロ）工程を行い、粗活性成分画分を得た。イギス目（Ｃｅｒａｍｉａｌｅｓ）フジマツモ科（Ｒｈｏｄｏｍｅｌａｃｅａｅ）ソゾ属（Ｌａｕｒｅｎｃｉａ）ハネソゾ（Ｌａｕｒｅｎｃｉａ  ｐｉｎｎａｔａ）は、高知県横浪半島沖太平洋水深５ｍないし１０ｍの間で、クシハダミドリイシが生息しているのと同じ海域から採取して使用した。
【００５４】
この粗活性成分画分をゲルろ過クロマトグラフィーに通し、分子量２０，０００以上９０，０００以下の画分を集め、濃縮し、ハネソゾ由来硫酸化糖質（硫酸化多糖成分又は硫酸化グルコサミノグリカン成分又は硫酸化プロテオグリカン成分）画分を得た。ハネソゾ由来硫酸化糖質画分について実施例１と同様にイシサンゴ類（ｓｃｌｅｒａｃｔｉｎｉａｎｓ）ミドリイシ科（Ａｃｒｏｐｏｒｉｄａｅ）クシハダミドリイシ（Ａｃｒｏｐｏｒａ  ｈｙａｃｉｎｔｈｕｓ）幼生に対する変態促進活性を測定した。２回の実験での変態率は２０％と２０％で平均値は２０％であった。
【実施例５】
【００５５】
原料としてオゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ）オゴノリ科（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｃｅａｅ）オゴノリ属（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）ツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｃｈｏｒｄａ）（徳島県吉野川河口域産）の代わりに、トゲキリンサイ（Ｅｕｃｈｅｕｍａ  ｓｅｒｒａ）を用いて、実施例１の（イ）、（ロ）工程を行い、粗活性成分画分を得た。スギノリ目（Ｇｉｇａｒｔｉｎａｌｅｓ）ミリン科（Ｓｏｌｉｅｒｉａｃｅａｅ）キリンサイ属（Ｅｕｃｈｅｕｍａ）トゲキリンサイ（Ｅｕｃｈｅｕｍａ  ｓｅｒｒａ）は、徳島県日和佐沖の太平洋で水深５ｍないし１０ｍの間で、採取したものを実験に使用した。
【００５６】
この粗活性成分画分をゲルろ過クロマトグラフィーに通し、分子量２０，０００以上９０，０００以下の画分を集め、濃縮し、トゲキリンサイ由来硫酸化糖質（硫酸化多糖成分又は硫酸化グルコサミノグリカン成分又は硫酸化プロテオグリカン成分）画分（分子量２０，０００以上）を得た。トゲキリンサイ由来硫酸化糖質画分について実施例１と同様にイシサンゴ類（ｓｃｌｅｒａｃｔｉｎｉａｎｓ）ミドリイシ科（Ａｃｒｏｐｏｒｉｄａｅ）クシハダミドリイシ（Ａｃｒｏｐｏｒａ  ｈｙａｃｉｎｔｈｕｓ）幼生に対する変態促進活性を測定した。２回の実験での変態率は２０％と２０％で平均値は２０％であった。
【００５７】
比較例２
実施例１の（ロ）の粗活性成分画分の分別工程において、硫酸アンモニウム添加による２段階の塩析による分別処理の代わりに、５０質量％エチルアルコールによる分別処理［「フィトケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９８８年，第２７巻，ｐ．２０６３−２０６７参照］を行った以外は、実施例１と同様にして粗画分を得た。この粗画分をゲルろ過クロマトグラフィーに通し、分子量２０，０００以上９０，０００以下の画分を集め、濃縮し、エチルアルコール分別画分を得た。エチルアルコール分別画分について実施例１と同様にイシサンゴ類（ｓｃｌｅｒａｃｔｉｎｉａｎｓ）ミドリイシ科（Ａｃｒｏｐｏｒｉｄａｅ）クシハダミドリイシ（Ａｃｒｏｐｏｒａ  ｈｙａｃｉｎｔｈｕｓ）幼生に対する変態促進活性を測定した。その結果、エチルアルコール分別画分には、イシサンゴ幼生変態を促進する活性が検出されなかった。
【００５８】
参考例
標準分子量タンパク質としてアマシャムバイオサイエンス社より購入したチログロブリン（質量平均分子量６６９，０００）、フェリチン（質量平均分子量４４０，０００）、ウシ血清アルブミン（質量平均分子量６７，０００）、オボアルブミン（質量平均分子量４３，０００）、及びリボヌクレアーゼＡ（質量平均分子量１３，７００）を用い、ゲルろ過クロマトグラフィーの溶出体積と質量平均分子量との関係を求めた。
このようにして得た標準タンパク質とゲルろ過クロマトグラフィーにおける溶出体積については、チログロブリンの溶出体積が６．５６ｍｌ、フェリチンの溶出体積が６．７８ｍｌ、ウシ血清アルブミンの溶出体積が７．５１ｍｌ、オボアルブミンの溶出体積が７．９１ｍｌ、及びリボヌクレアーゼＡの溶出体積が９．０５ｍｌであることが分った。
この結果より、質量平均分子量の常用対数Ｙとゲルろ過クロマトグラフィーでの溶出体積Ｘとは次式の関係を有することが分かる。
Ｙ＝１０．２４１１８４０７−０．６９１３７２０６４Ｘ  （Ｉ）
なお、この式の相関係数は−０．９７１であった。
【００５９】
次に、変態促進活性をもつ紅藻植物の大型海藻由来の硫酸化糖質成分（硫酸化多糖成分又は硫酸化グリコサミノグリカン成分又は硫酸化プロテオグリカン成分）０．１ｍｌをＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＰＷｘｌカラムに通し、ゲルろ過クロマトグラフィーカラムから０．１ｍｌずつ溶出画分を集めた。カラムからの総溶出体積が０．０５〜０．１５ｍｌまでのフラクションをフラクション番号１とした。（従ってフラクション番号５０のフラクションには、カラムからの総溶出体積が４．９５〜５．０５ｍｌまでが分画される。このフラクションの溶出体積は平均値を取って５．００ｍｌとした）。集めた各溶出画分についてフェノール硫酸法による糖定量を行い、溶出体積及び（Ｉ）式に従って計算した。
この結果に基づき、ゲルろ過クロマトグラフィーでの溶出体積と各フラクションの糖含有量との関係のグラフを図１に示す。
【００６０】
その結果、変態促進活性をもつ海藻由来硫酸化糖質成分の溶出した画分を示すピークの頂点（溶出体積７．９０ｍｌ）は分子量６０，２００に相当した。
また、（Ｉ）式より、分子量２０，０００以上９０，０００以下の成分の溶出体積範囲は７．６４７ｍｌ以上８．５９２ｍｌ以下となり、変態促進活性をもつ海藻由来硫酸化糖質成分のピークの頂点の溶出体積７．９０ｍｌは、その範囲に包含されることが分る。
【実施例６】
【００６１】
（イ）水溶性画分の抽出工程
原料としてオゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ）オゴノリ科（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｃｅａｅ）オゴノリ属（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）ツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｃｈｏｒｄａ）（徳島県吉野川河口域産）を用い、これを０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、天日乾燥して乾燥物とした。次いで、この乾燥物１００ｇに０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）７００ｍｌを加えてホモゲナイズしたのち、このホモゲナイズした液を４℃で６時間放置後、遠心分離し、上澄として粗抽出液を得た。
【００６２】
（ロ）粗活性成分画分の分別工程
次いで、この粗抽出液に、最終濃度３５質量％飽和溶液になるように硫酸アンモニウムを加えて１段目の塩析を行った。硫酸アンモニウムを添加終了後、４℃で１時間放置したのち、生成した沈殿を遠心分離して除去した。この操作で紫色色素などの夾雑物が沈殿画分として除去された。次に、遠心分離で得た上澄に、最終濃度７０質量％飽和溶液になるように硫酸アンモニウムを添加終了後、４℃で一晩放置したのち、生成した沈殿を遠心分離して分別した。分別した沈殿画分を、２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で再溶解し、粗活性成分画分を得た。
【００６３】
（ハ）活性成分の精製工程
次に、このようにして得た粗活性成分画分を、２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に対して透析したのち、遠心分離し、不溶性の夾雑物タンパク質を除去した再溶解活性成分画分を調製した。この再溶解活性成分画分１２０ｍｌを充填剤（東ソー社製，商標名「ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｓ」）を詰めたゲルろ過用カラム（内径２．６ｃｍ、ゲル高さ２１．０ｃｍ、ゲル体積約１２０ｍｌ）を用い、移動相中の塩化ナトリウムの濃度を０から０．２１Ｍまで上昇させてイオン交換クロマトグラフィー処理を行った。この間、イオン交換クロマトグラフィーカラムから１０ｍｌずつ溶出画分を捕集し、１０ｍｍのセルで可視部５４０ｎｍの吸光度を測定した。このようにして、可視部５４０ｎｍの吸光度が０．０１以上のフラクションＮｏ１７４から２７２までを採取し、精製品を得た。図２にこのフラクションと吸光度との関係を示す。この精製品について吸収スペクトルを測定した結果、４８０〜５７０ｎｍの間に可視部の吸収極大を有する成分であることが確認された。図３にフラクションＮｏ２２０の吸収スペクトルを示す。溶出画分のフラクションＮｏ２２０の吸収極大データは、４８０〜５７０ｎｍまでの可視部領域では、４９７ｎｍ、５４１ｎｍ及び５６４ｎｍであった。
【００６４】
この例におけるイオン交換クロマトグラフィーの移動相条件は以下のとおりである。
すなわち、再溶解活性成分画分をイオン交換カラムに添加終了後、カラム体積の約１０倍量の２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）でカラムを洗浄したのち、緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を０から０．２１Ｍまで直線的に上昇させてカラムに吸着した赤色活性成分を採取した。この際の塩化ナトリウム濃度を０から０．２１Ｍまで上昇させたときの移動相の合計体積はカラム体積の約１３倍であった。
【００６５】
このようにして得た精製品についてイシサンゴ類（ｓｃｌｅｒａｃｔｉｎｉａｎｓ）ミドリイシ科（Ａｃｒｏｐｏｒｉｄａｅ）クシハダミドリイシ（Ａｃｒｏｐｏｒａ  ｈｙａｃｉｎｔｈｕｓ）幼生に対する変態促進活性を測定した。
【００６６】
クシハダミドリイシなどミドリイシ科サンゴの多くは雌雄同体・配偶子放出型の繁殖生態であるので、これらのサンゴは、精子と浮力をもつ複数の卵が一つに包み込まれたバンドル（ｅｇｇ−ｓｐｅｒｍｂｕｎｄｌｅ）を一斉に放出する。この実験においては、イシサンゴのバンドル（ｅｇｇ−ｓｐｅｒｍｂｕｎｄｌｅ）採取と受精を以下のように行った。
【００６７】
成熟したクシハダミドリイシ４群体を高知県横浪半島沖太平洋水深５ｍないし１０ｍの間で採取し、実験室冷暗所に設置した水槽内でクシハダミドリイシが卵放出する直前まで保存した。次いで、クシハダミドリイシを１群体ごとに個別の水槽（ろ過滅菌海水が入ったもの）に分けて収容した。ろ過滅菌海水としては、１μｍのグラスフィルターで一次ろ過した海水を、０．２２μｍのミリポアフィルターで精密ろ過したものを用いた。放卵（バンドルの放出）開始後、１群体から放出された配偶子をそれぞれ回収し、ろ過滅菌海水中へ添加した。卵と精子を別の容器（ろ過滅菌海水を収容）に移し、他の群体から分別された卵あるいは精子で他家受精した。得られたクシハダミドリイシの幼生をろ過滅菌海水の入った容器内で２５℃で保存した。
【００６８】
このクシハダミドリイシの幼生を８日間２５℃で維持した後、１０ｍｌのろ過滅菌海水を入れた２０ｍｌ体積のポリスチレン製カップに１０個体の幼生を入れ静置し、７２時間後のイシサンゴ幼生の変態数を求めた。
【００６９】
試料としては、精製品１ｍｌとろ過滅菌海水９ｍｌとの混合物を用い、ブランクとしてはろ過滅菌海水のみ１０ｍｌを用いた。この結果を表２に示す。
【００７０】
比較例３
原料として、高知県横浪半島沖太平洋水深５ｍないし１０ｍの間で採取した褐藻類アミジグサ目（Ｄｉｃｔｙｏｔａｌｅｓ）アミジグサ科（Ｄｉｃｔｙｏｔａｃｅａｅ）ハイオオギ属（Ｌｏｂｏｐｈｏｒａ）ハイオオギ（Ｌｏｂｏｐｈｏｒａ  ｖａｒｉｅｇａｔａ）を用い、これをろ過滅菌海水で３回洗浄し、ろ紙上で軽く水分を除いた。このハイオオギ湿質量１ｇをとり、ろ過滅菌海水１０ｍｌを加えて乳鉢と乳棒を用いて４℃で粉砕し、褐藻類懸濁液を調製した。これらの試料について実施例６と同様にして変態率を求め、その結果を表２に示す。
【００７１】
【表２】
2005087177.tif 000003
【００７２】
表２より明らかなように、精製品（４８０〜５７０ｎｍの間に可視部の吸収極大を有する成分）は、イシサンゴ幼生の変態を促進する活性を有している。また、ろ過滅菌海水及び褐藻類懸濁液についてはイシサンゴ幼生変態を促進する活性は全く認められなかった。
【実施例７】
【００７３】
原料としてオゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ）オゴノリ科（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｃｅａｅ）オゴノリ属（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）ツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｃｈｏｒｄａ）（徳島県吉野川河口域産）の代わりに、ナミノハナ（Ｐｏｒｔｉｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）を用いて、実施例１の（イ）、（ロ）工程を行い、粗活性成分画分を得た。スギノリ目（Ｇｉｇａｒｔｉｎａｌｅｓ）ナミノハナ科（Ｒｈｉｚｏｐｈｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）ナミノハナ属（Ｐｏｒｔｉｅｒｉａ）ナミノハナ（Ｐｏｒｔｉｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）は、高知県横浪半島沖太平洋水深５ｍないし１０ｍの間で、クシハダミドリイシが生息しているのと同じ海域から採取して使用した。
【００７４】
この粗活性成分画分を実施例６と同様にイオン交換クロマトグラフィー処理し、可視部５４０ｎｍの吸光度が０．０１以上のフラクションを集めることにより、ナミノハナ由来変態促進成分として精製品を得た。この精製品について実施例６と同様にイシサンゴ類（ｓｃｌｅｒａｃｔｉｎｉａｎｓ）ミドリイシ科（Ａｃｒｏｐｏｒｉｄａｅ）クシハダミドリイシ（Ａｃｒｏｐｏｒａ  ｈｙａｃｉｎｔｈｕｓ）幼生に対する変態促進活性を測定したところ、２回の実験での変態率は２０％と２０％で平均値は２０％であった。
【実施例８】
【００７５】
原料としてオゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ）オゴノリ科（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｃｅａｅ）オゴノリ属（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）ツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｃｈｏｒｄａ）（徳島県吉野川河口域産）の代わりに、ホソバノトサカモドキ（Ｃａｌｌｏｐｈｙｌｌｉｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ）を用いて、実施例６の（イ）、（ロ）工程を行い、粗活性成分画分を得た。スギノリ目（Ｇｉｇａｒｔｉｎａｌｅｓ）ツカサノリ科（Ｋａｌｌｙｍｅｎｉａｃｅａｅ）トサカモドキ属（Ｃａｌｌｏｐｈｙｌｌｉｓ）ホソバノトサカモドキ（Ｃａｌｌｏｐｈｙｌｌｉｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ）は、高知県横浪半島沖太平洋水深５ｍないし１０ｍの間で、クシハダミドリイシが生息しているのと同じ海域から採取して使用した。
【００７６】
この粗活性成分画分を実施例６と同様にイオン交換クロマトグラフィー処理し、可視部５４０ｎｍの吸光度が０．０１以上のフラクションを集めることにより、ホソバノトサカモドキ由来活性成分として精製品を得た。この精製品について実施例６と同様にイシサンゴ類（ｓｃｌｅｒａｃｔｉｎｉａｎｓ）ミドリイシ科（Ａｃｒｏｐｏｒｉｄａｅ）クシハダミドリイシ（Ａｃｒｏｐｏｒａ  ｈｙａｃｉｎｔｈｕｓ）幼生に対する変態促進活性を測定したところ、２回の実験での変態率は２０％と２０％で平均値は２０％であった。
【実施例９】
【００７７】
原料としてオゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ）オゴノリ科（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｃｅａｅ）オゴノリ属（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）ツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｃｈｏｒｄａ）（徳島県吉野川河口域産）の代わりに、ハネソゾ（Ｌａｕｒｅｎｃｉａ  ｐｉｎｎａｔａ）を用いて、実施例１の（イ）、（ロ）工程を行い、粗活性成分画分を得た。イギス目（Ｃｅｒａｍｉａｌｅｓ）フジマツモ科（Ｒｈｏｄｏｍｅｌａｃｅａｅ）ソゾ属（Ｌａｕｒｅｎｃｉａ）ハネソゾ（Ｌａｕｒｅｎｃｉａ  ｐｉｎｎａｔａ）は、高知県横浪半島沖太平洋水深５ｍないし１０ｍの間で、クシハダミドリイシが生息しているのと同じ海域から採取して実験に使用した。
【００７８】
この粗活性成分画分を実施例１と同様にイオン交換クロマトグラフィー処理し、可視部５４０ｎｍの吸光度が０．０１以上のフラクションを集めることにより、ハネソゾ由来活性成分として精製品を得た。ハネソゾ由来活性成分について実施例１と同様にイシサンゴ類（ｓｃｌｅｒａｃｔｉｎｉａｎｓ）ミドリイシ科（Ａｃｒｏｐｏｒｉｄａｅ）クシハダミドリイシ（Ａｃｒｏｐｏｒａ  ｈｙａｃｉｎｔｈｕｓ）幼生に対する変態促進活性を測定したところ、２回の実験での変態率は２０％と２０％で平均値は２０％であった。
【実施例１０】
【００７９】
原料としてオゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ）オゴノリ科（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｃｅａｅ）オゴノリ属（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）ツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｃｈｏｒｄａ）（徳島県吉野川河口域産）の代わりに、トゲキリンサイ（Ｅｕｃｈｅｕｍａ  ｓｅｒｒａ）を用いて、実施例６の（イ）、（ロ）工程を行い、粗活性成分画分を得た。スギノリ目（Ｇｉｇａｒｔｉｎａｌｅｓ）ミリン科（Ｓｏｌｉｅｒｉａｃｅａｅ）キリンサイ属（Ｅｕｃｈｅｕｍａ）トゲキリンサイ（Ｅｕｃｈｅｕｍａ  ｓｅｒｒａ）は、徳島県日和佐沖の太平洋で水深５ｍないし１０ｍの間で、採取したものを実験に使用した。
【００８０】
この粗活性成分画分を実施例６と同様にイオン交換クロマトグラフィー処理し、可視部５４０ｎｍの吸光度が０．０１以上のフラクションを集めることにより、トゲキリンサイ由来活性成分として精製品を得た。この精製品について実施例６と同様にイシサンゴ類（ｓｃｌｅｒａｃｔｉｎｉａｎｓ）ミドリイシ科（Ａｃｒｏｐｏｒｉｄａｅ）クシハダミドリイシ（Ａｃｒｏｐｏｒａ  ｈｙａｃｉｎｔｈｕｓ）幼生に対する変態促進活性を測定したところ、２回の実験での変態率は２０％と２０％で平均値は２０％であった。
【００８１】
比較例４
実施例６の（ロ）の粗活性成分画分の分別工程において、硫酸アンモニウム添加の２段階の塩析による分別処理の代わりに、５０質量％エチルアルコールによる分別処理［「フィトケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９８８年，第２７巻，ｐ．２０６３−２０６７参照］を行った以外は、実施例６と同様にして粗画分を得た。この粗画分について実施例６と同様にイシサンゴ類（ｓｃｌｅｒａｃｔｉｎｉａｎｓ）ミドリイシ科（Ａｃｒｏｐｏｒｉｄａｅ）クシハダミドリイシ（Ａｃｒｏｐｏｒａ  ｈｙａｃｉｎｔｈｕｓ）幼生に対する変態促進活性を測定したところ、エチルアルコール分別画分には、イシサンゴ幼生変態を促進する活性が検出されなかった。
【００８２】
比較例５
原料としてオゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ）オゴノリ科（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｃｅａｅ）オゴノリ属（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）ツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｃｈｏｒｄａ）（徳島県吉野川河口域産）の代わりに、紅藻綱大型海藻ウシケノリ目（Ｂａｎｇｉａｌｅｓ）ウシケノリ科（Ｂａｎｇｉａｃｅａｅ）アマノリ属海藻（Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｓｐ．）を用いて、実施例６の（イ）、（ロ）工程を行い、粗赤色系色素画分を得た。
【００８３】
この粗赤色系色素画分を実施例６と同様にイオン交換クロマトグラフィー処理し、可視部５４０ｎｍの吸光度が０．０１以上のフラクションを集めることにより、アマノリ属海藻由来赤色系色素成分として精製品を得た。この精製品について実施例６と同様にイシサンゴ類（ｓｃｌｅｒａｃｔｉｎｉａｎｓ）ミドリイシ科（Ａｃｒｏｐｏｒｉｄａｅ）クシハダミドリイシ（Ａｃｒｏｐｏｒａ  ｈｙａｃｉｎｔｈｕｓ）幼生に対する変態促進活性を測定したところ、２回の実験での変態率は０％と０％で平均値は０％であった。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の変態促進剤は、水産業分野、医療分野、生化学工業分野などにおいて、例えばイシサンゴ類幼生着生促進剤、イシサンゴ類幼生変態促進剤、イシサンゴ類種保存剤、サンゴ礁保存剤や検査用試薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】参考例におけるゲルろ過クロマトグラフィーでの溶出体積と各フラクションの糖含有量との関係を示すグラフ。
【図２】実施例６において得られた粗活性成分画分の溶出画分について長さ１０ｍｍのセルで測定した可視部５４０ｎｍの吸光度を示すグラフ。
【図３】実施例６における粗活性成分の溶出画分のフラクション番号２２０の吸光スペクトルを示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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