(57)【要約】【課題】  生化学の分野において、活性酸素等の外因的酸化ストレスが引き起こす生体組織の損傷、すなわち各種炎症やガン等により血中のＣＯＨｂが増加すると推測されているが、ごく微かの血中ＣＯＨｂ濃度の変化を簡単な操作で精確に測定する技術は、現在知られていない。本発明はこの要請に対応するものである。【解決手段】ＣＯガスを発生しない弾力性素材製の栓を施したガラス製容器に、血液或いは血液を含む体液とともにＣＯ放出試薬を入れて混合し、放出されたＣＯの濃度を半導体ガスセンサーや定電位電解式ガスセンサーなど低濃度ガス測定用の機器で測定する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
密閉容器、より好ましくはガラス製容器に一酸化炭素（ＣＯ）ガスを発生しない弾力性素材製の栓を施した容器に、血液或いは血液を含む体液とともにＣＯ放出試薬を入れて混合し、放出されたＣＯの濃度を半導体ガスセンサーや定電位電解式センサーなど低濃度ガス測定用機器で測定することを特徴とする、体液中のＣＯ濃度測定方法。
【請求項２】
ＣＯ放出試薬として、一酸化窒素（ＮＯ）或いはシアンイオン（ＣＮ- ）を発生する試薬を用いるものである、請求項１記載の体液中のＣＯ濃度測定方法。
【請求項３】
シアンイオン発生試薬を用いる場合、反応はをｐＨ７〜１０で行わせるものである、請求項１記載の体液中のＣＯ濃度測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液或いは血液を含む腹水などの体液中に含まれる微量のＣＯを高感度に再現性よく測定する新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一酸化炭素（ＣＯ）は、不完全燃焼で生成される無色、無味、無臭、無刺激性の猛毒ガスである。その所以は、ＣＯのヘモグロビンとの親和性が酸素の２００〜２５０倍も大きいため、低濃度でもヘモグロビンの酸素搬送能力を大きく阻害することによる。
【０００３】
人間は一酸化炭素ヘモグロビン（ＣＯＨｂ）のヘモグロビン全体に対する割合が９０％以上で即死６５％以上でも死に至るとされているが、空気中に0.１％のＣＯ存在下で安静時６時間、運動時２時間でＣＯＨｂ濃度が６５％を越える非常に危険な存在である。勿論、それ以下でもＣＯＨｂの濃度に応じて重症から軽症（ＣＯＨｂ濃度１０％以上）まで様々な症状を示し、空気中に0.０１％以上のＣＯが存在すれば数時間の内にはこれらの症状が現れる。ただ、ＣＯは通常の空気中には殆ど存在せず、火事現場や換気不十分な場所での燃焼機器の使用などで多量に発生する。そして、これらの場合は救急医療の対象となる。
【０００４】
一方、車の排気ガスや煙草の煙を含まない（ＣＯのない）清浄な空気を呼吸している正常人（非喫煙・健常者）でも、個人差はあるが内因性ＣＯにより常時0.５〜１％程度のＣＯＨｂ濃度を示す。これは、生体の代謝過程でヘモグロビンの分解によりＣＯが発生しており、このＣＯがヘモグロビンと結合していることによる。
【０００５】
即ち、ヘモグロビンはヘム核（ヘム、ｈｅｍｅ）にグロビン蛋白が結合したものであるが、図１に示すようにヘム酸化分解酵素（ｈｅｍｅ−ｏｘｙｇｅｎａｓｅ、ＨＯ）の作用によりこの環が開裂してビリベルジンと鉄(III) イオンとなり、メテニル基はＣＯとして放出される。赤血球の寿命が１２０日であることから、毎日ヘモグロビンの１２０分の１が分解され、生成されたビリベルジンはビリルビンとなって尿から排出され、ＣＯはヘモグロビンと結合して全身を巡り、少しずつ呼気中に排出される。
【０００６】
ＣＯの呼気からの排出は、前述の火災時の煙や肺から車の排ガスなどの吸入による外因的ＣＯにより形成されるＣＯＨｂの場合も同様であるが、本発明者らは、主として内因による低濃度の呼気中のＣＯ濃度（ｐｐｍ）を正確に測定する技術を開発した（特許文献１）。呼気中のＣＯ濃度（ｐｐｍ）と全血中のＣＯＨｂ濃度（％）の相関は知られており、ＣＯＨｂが0.５％の場合呼気中のＣＯ濃度は２ｐｐｍ、0.９％の場合５ｐｐｍに相当する。尚、喫煙者の場合、個人差はあるものの呼気中のＣＯ濃度が２０〜４０ｐｐｍにもなる。ただ、ＣＯＨｂの半減期は約４時間であり、１日禁煙すれば、殆ど非喫煙者と同程度にまで低下するとされている。
【０００７】
内因性ＣＯは、近年、生化学研究の進歩により、フリーラジカル、活性酸素等の酸化ストレス（その結果、炎症、組織損傷、ガン化等が発症される）で誘導されるヘム酸化分解酵素（ＨＯ）の作用でヘム分解が亢進し、ＣＯ産生が増加すると推測されている。また、病的に血液が分解する場合（溶血性疾患等）や外傷で血液や筋肉が損傷した場合にも増えることが報告されている。
【０００８】
しかし、特に前者の内因性ＣＯの場合は低レベルであり、その挙動を精確に測定する技術が未開発であるため研究が進んでいないのが現状である。通常、ＣＯＨｂ濃度の測定は、救急医療などの臨床検査室で使用されるオキシメーター（ノバ・コオキシメーター、米国ＮＯＶＡ社製等）により行われている。しかし、その精度は悪く、0.５％ＣＯＨｂ濃度で変動係数（ＣＶ）が５０％程度もあり、低濃度領域での使用には限界がある。
【０００９】
一方、本発明者らが開発した呼気測定方法（特許文献１）は低濃度での測定も精確に行えるが、血液を直接分析しているわけではなく、また終末呼気の採取にも問題がある。しかも、呼気中ＣＯは肺静脈血のＣＯＨｂ濃度に依存するものであるから、全身を巡ってきた血液が対象となっている。そのため、気道部分の炎症（喘息）などでは症状の有無でＣＯ濃度差は大きくなるが、内臓でのガン化など、生体の局部的に産生しているＣＯ量は全血液量で希釈されることになるので、呼気中ＣＯとしては反映されにくいという理由で、呼気測定には重大な難点がある。
【００１０】
尚、血液を直接分析してＣＯを測定する技術も開示されている（特許文献２）が、この技術はガス検知管を使用するもので、低濃度検出には精度に問題がある。もともと、この技術は法医学分野での利用が目的で、血液などの中に含まれる高濃度のＣＯやエチルアルコールなどを簡易に検査するものであり、またガス検知管へのガスの導入はガス発生剤の圧力によっているため、正確な秤量も不可能なものである。
【００１１】
【特許文献１】特願２００３−０７１５１９号公報
【特許文献２】特開２００２−３１６３５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
血液を直接分析して低濃度のＣＯを精確に測定する技術を開発する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記に鑑み、本発明者らは、鋭意研究を行い、本発明を完成させたものである。即ち本発明は、好ましくは、ガラス製容器にＣＯガスを発生しないゴム栓を施した容器に、血液或いは血液を含む体液とともにＣＯ放出試薬を入れて混合し、放出されたＣＯの濃度を半導体センサーや定電位電解式の低濃度用の測定器で測定するものである。
【００１４】
使用する容器としてガラスが好ましいとしたのは、以下の理由による。即ち、本発明者らは或る実験において、ヘパリンＮａ入り真空採血管（容量１０ｃｃ）に２ｍｌ程度の全血をとり、これのゴム栓部分からガラス製注射器で２０ｃｃほどヘッドスペース部分の空気を吸引して採血管内に負圧をかけ、約１０秒間そのままの状態を保ってみた。次いで、注射器のピストンを離すと元には戻らず約３ｃｃ程度注射器内に残ったままであった。これは空気の漏れによると思われるが、真空採血管及び注射器の内部は常圧になっている。この状態で注射器を外し、注射器内のガス１ｍｌを後述するＣＯ濃度測定器（トライライザー）で測定してみたところ、最高７４０ｐｐｍものＣＯを検出した。
【００１５】
当初、真空にすることによりＣＯＨｂのＣＯが分離したものと思われたが、全血の代わりに血漿を用いた場合や蒸留水を用いた場合でも、略同様のかなり高濃度のＣＯが測定された。そこで、真空採血管になにも入れずそのままの状態で前記の負圧を掛けてみたところ、表１に示すように真空採血管は３種類とも３６９〜７４０ｐｐｍと非常に高いＣＯ濃度を示した。これに対し、プラスチックシリンジ（注射筒）の場合は5.１ｐｐｍ、ガラス注射器の場合は1.４ｐｐｍであった。以上のことから、プラスチックに負圧を掛けておくとＣＯが揮散してくることが推察されるが、このような現象は、本発明者らが初めて確認したものである。真空採血管は、全てポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン等のプラスチック製であり、しかも負圧にする以前に長時間真空状態にあるので、高濃度になったものと思われる。
【表１】
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【００１６】
一方、ガラス管やガラス製注射器の場合も０にはならなかったが、これは未洗浄のものをそのまま使用したことによるものと思われる。本発明の場合、採血等で余り負圧を掛けることがないので、ガラス管や注射器の場合は勿論、プラスチック製のシリンジでも、ＣＯ濃度は表１の値よりは低くなると思われる。しかし、真空採血管の場合はＣＯ濃度が余りにも高すぎる。このＣＯが血中のヘモグロビンと反応してＣＯＨｂ濃度を増加させることになる。ただ、プラスチック製の反応容器や採血具でも、シリカコーティングを施したものはＣＯ発生が少なく、使用可能と思われる。また、表１において室内空気とは、郊外の実験室で窓を開けて十分に換気して測定したものであり、ＣＯは正常な空気中にも0.５ｐｐｍ程度は存在していることを示している。
【００１７】
更に、プラスチックからＣＯが揮散していることを別の方法で確認した。表２は、表１で使用したニプロ製プラスチックシリンジ（２０ｃｃ）に室内の空気をとり、直ちにシリンジ内のＣＯ濃度を測定したところ、0.５ｐｐｍであった。これは、表１における室内空気と同じ値である。表１ではプラスチックシリンジは5.１ｐｐｍであるので、負圧を掛けることによりこれだけ（5.１−0.５ｐｐｍ）増加したことになる。次に、別々のプラスチックシリンジに１日毎に室内の空気を採り（２００４年８月２１日、２２日、２３日）、２４日に測定したところ、日が経つごとにＣＯの濃度が増加していた（表２）。図２は、表２に示すプラスチックシリンジ内の空気中のＣＯ濃度の経日変化をグラフ化したものである。
【表２】
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【００１８】
これは、時間がたてばプラスチックからＣＯが溶出というか揮散していることの左証となる。プラスチックの容器やシリンジに血液を採った場合も同様と思われ、時間が経つとＣＯが溶出或いは揮散し、これがヘモグロビンに取り込まれてＣＯＨｂ濃度を高める可能性がある。従って、プラスチックの容器やシリンジを使用する場合、負圧をかけず且つ速やかに処理する必要があるが、出来得ればガラス製のものを清浄化して使用することが好ましい。また、真空採血管は絶対に使用してはならない。尚、密閉容器にするためには、容器に栓をする必要がある。栓は、注射針を挿通するために弾力性素材製のものが必要であるが、この素材からもＣＯガスを発生しないように、シリコンゴム等を使用することが望ましい。
【００１９】
次に、ＣＯ放出試薬としては、一酸化窒素（ＮＯ）或いはシアンイオン（ＣＮ- ）を発生する試薬が用いられる。ＮＯを放出する有機硝酸製剤（ｏｒｇａｎｉｃ  ｎｉｔｒａｔｅ）には、ＮＯＣ５、ＮＯＣ７、ＮＯＣ１２、ＮＯＣ１８などのＮＯドナー（株式会社同仁化学研究所製）、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）やＳ−ニトロソシステインのようなＳ−ニトロソチオール、ニトロソプルシッド、三硝酸グリセリン、アジド、ヒドロキシアミンなどが用いられる。シアンイオン発生試薬としては、フェリシアン化カリウムが用いられる。尚、ＣＮ- のヘモグロビンとの結合能はＣＯの１０倍、ＮＯの結合能はＣＯの１０００倍である。ＮＯ添加の場合、ＣＯＨｂがＮＯＨｂとなってＣＯが放出され、ＣＮ- 添加の場合、ＣＯＨｂがＣＮＨｂとなってＣＯが放出される。もっとも、ＮＯの場合反応に時間がかかるが、ＮＯがＣＯに比べて遙に毒性が低く、安全である。
【００２０】
次に、反応液のｐＨが重要である。本発明者らの実験によると、フェリシアン化カリウムの場合、反応液のｐＨが酸性側だとＣＯ分解反応が殆ど進まない。また、強アルカリ側だと生体試料中の蛋白質等の変質によるＣＯ産生（ａｒｔｉｆａｃｔ）があり、ヘム核のＣＯ遊離以外にＣＯが生成され、高濃度ＣＯが測定される。ｐＨは７〜１０、より好ましくは7.５〜9.１の範囲である。また、ＮＯドナーの場合、ＮＯの発生速度は溶液のｐＨが低くなるほど速くなり、アルカリ側では安定でＮＯは発生しにくい。そこで、保存はアルカリ側で行い、反応溶液中では中性以下にする必要がある。尚、ＮＯの場合、雰囲気中に酸素が存在すると酸化されてＮＯ2 になりＣＯ置換の役目をはたさなくなる。そこで、ＮＯ発生試薬を使用する場合、試料液に窒素等不活性ガスを吹き込んで酸素を完全に除去しておく必要がある。
【００２１】
被検試料としては、血液はそのまま使用できる。また、血液を含む腹水などの体液の場合、血液が希釈されているので、サンプル量はその数倍必要である。この場合、試料中の全ヘモグロビン濃度を測定しておけば、ＣＯＨｂ濃度が求められる。
【００２２】
分離されたＣＯは、半導体ガスセンサーや定電位電解式センサーなどの低濃度ガス測定用の機器で測定する。具体的装置としては、トライライザー（発売元：株式会社タイヨウ）がある。これは、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分離後、検出器（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）として半導体ガスセンサーを用いるもので、ＣＯ（一酸化炭素）が0.１〜１００ｐｐｍの範囲で測定でき、他に、ＣＨ4 （メタン）が0.１〜１００ｐｐｍ、Ｈ2 （水素）が0.１〜１５０ｐｐｍの範囲で測定できる。これにより、低ＣＯＨｂ濃度レベルを精確に測定できるものである。尚、ＣＯは５００ｐｐｍ或いはそれ以上でも測定値は示されるが、直線性があるのは１００ｐｐｍまでである。その他のガス成分でも、ガスクロマトグラフィーで分離後、半導体ガスセンサーや定電位電解式センサーなどで検出できるものであれば、使用可能である。汎用ガスクロマトグラフィーの検出器であるＦＩＤ（水素炎検出器）の場合、ＣＯを直接測定はできないので操作は煩雑である。即ち、試料を収集後、触媒層を通してＣＯを還元してＣＨ4 に変換してから測定する必要がある。
【発明の効果】
【００２３】
以上詳述したように、本発明は、血中ＣＯＨｂとして貯留されたＣＯの挙動を、少量の血液（体液）を使用して簡単な操作で迅速に測定結果が得られる方法であり、今後の生命科学研究及び臨床診断の分野で、非常に有力な技術となるものである。
【００２４】
特に、実施例で説明するように、ガン細胞の増殖を前もって把握できることは非常に有意義なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
ガラス製容器にシリコンゴム製の栓を施した密閉容器に、血液とＣＯ放出試薬を入れて混合し、放出されたＣＯの濃度を半導体ガスセンサーや定電位電解式ガスセンサーなど搭載した低濃度ガス測定用の機器で測定する。
【実施例１】
【００２６】
（ＮＯＣ７を用いるＣＯ放出方法）
以下、本発明方法を、図面に基づいて詳細に説明する。図３は、ＣＯ放出試薬として、ＮＯ発生試薬を使用した場合の説明図である。まず、容積が１1.２ｍｌになるようにシリコンゴム栓２で密閉できるガラス製試験管１を準備する。この試験管１に、ガラス製注射器で採血した静脈血３５０μｌと3.６５ｍｌのＰＢＳ（phosphate-buffered saline  ｐＨ7.４）を入れて希釈し（希釈液３）、次いでゴム栓２をする。このゴム栓２に１８Ｇの針４、５を２本刺し、片方の針４の先には試験管１の底に届くくらいのシリコンチューブ６を取り付け、この針４から窒素ガス７を注入して希釈液３をよく混和する。これは、血液中の空気（Ｏ2 ）及びヘッドスペース８中の空気（Ｏ2 ）を追い出すためである。空気や注入された余分の窒素ガス７は、もう一方の針５から放出される。
【００２７】
次に、針４からＮＯＣ７の１００ｍＭ溶液９を４０μｌ注入する。ＮＯＣ７（1-Hydroxy-2-oxo-3-(N-methyl-3-aminopropyl)-3-methyl-1-triazene）は、0.１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液に溶解したものを使用する。その後、針５を抜き、針４はパラフイルムで密封する。この状態で２時間室温で放置する。途中１時間目で軽く攪拌する。
【００２８】
２時間後、もう１度針５をゴム栓２に刺して、ヘッドスペース８のガスをガラス製のシリンジで１ｍｌ採取し、トライライザーで測定する。
【実施例２】
【００２９】
（フェリシアン化カリウム水溶液を使用するＣＯ放出方法）
図示は省略するが、実施例１と同様にして採血した静脈血２０μｌをシリコン栓付き１０ｍｌバイアルビンに採る。この際、採血は抗凝固剤を使用しなくてもよい。次に、ｐＨ9.１の緩衝液を１ｍｌ添加し、続けてフェリシアン化カリウムの飽和水溶液５００μｌを添加する。これを、シェーカーで激しく攪拌する（３０秒間）。次いで１０分間室温で静置しヘッドスペースガスを１ｍｌ採取し、トライライザーで測定する。
【実施例３】
【００３０】
（腫瘍増殖に伴う血中ＣＯ濃度の経時的変化  その１：マウス肉腫）
マウス肉腫（sarcoma-180 (S180) 2×106 cells ）をｄｄＹマウス（ｎ＝３  ５Ｗ  雄）の皮下に移植後、７日おきに開腹して、腸管膜静脈より５００μｌ程度ヘパリン採血し、実施例１の方法で、ＣＯの測定を行った。その結果を、図４及び図５に示す。
【００３１】
図４は、ＣＯ濃度（p mol/ml血液）、図５は肉腫（Tumor volume）の体積（ｍｍ3 ）を、移植経過日数毎にプロットしたものである。これらの図から判るように、肉腫の大きさは１４日以後急速に大きくなっているが、呼気中ＣＯ濃度は、７日後から増加傾向を示し、ＣＯ濃度が肉腫の先行指標として優れていることを示している。
【実施例４】
【００３２】
（腫瘍増殖に伴う血中ＣＯ濃度の経時的変化  その２：ラット腹水肝癌）
ラットの腹水癌細胞（ＡＨ１３６Ｂ）１×106 cells を、ラット（ｎ＝３、５Ｗ雄）の腹腔に移植後、５日おきに尾静脈より５００μｌ程度ヘパリン採血し、実施例２の方法で、ＣＯの測定を行った。その結果を、図６及び図７に示す。
【００３３】
図６は、ＣＯ濃度（p mol/ml血液）、図７はラットの体重（ｇ）を、移植経過日数毎にプロットしたものである。これらの図から判るように、呼気中ＣＯ濃度は、１１日後に急激な増加を示した。これは、この前後においてガン化の活動が活発になっていることを示す。これに対し、癌細胞移植の体重の変化は１１日経過前後ではＧ  ＨＶ  降下が進みすぎ、緩やかであり、ＣＯ濃度が腫瘍増殖の先行指標として優れていることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
生化学の分野において、外因的酸化ストレスによる生体損傷、すなわち炎症やガンなどの発現進行を、血液特に局所的な血液中の微量のＣＯを測定することにより、簡単な操作で確実に予想、把握することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ヘム核の分解説明図である。
【図２】プラスチックシリンジ内の空気中のＣＯ濃度の経日変化をグラフである。
【図３】血中ＣＯ濃度の測定方法を示す説明図である。（実施例１）
【図４】マウス肉腫移植後の腸管膜静脈血中ＣＯ濃度の経日変化を示すグラフである。（実施例３）
【図５】同じくマウス肉腫移植後の肉腫の体積の経日変化を示すグラフである。（実施例３）
【図６】ラット腹水肝癌細胞植後の尾静脈血中ＣＯ濃度の経日変化を示すグラフである。（実施例４）
【図７】同じくラット腹水肝癌細胞植後の体重の経日変化を示すグラフである。（実施例４）
【符号の説明】
【００３６】
２    シリコンゴム栓
１    ガラス製試験管
３    希釈液
４    針
５    針
６    シリコンチューブ
７    窒素ガス
８    ヘッドスペース
９    ＮＯＣ７溶液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005337813.tif 000009
【図６】
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【図７】
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