(57)【要約】【課題】  本発明に従い、ヒト細胞障害性Tリンパ球抗原4（CTLA-4）に対する完全ヒトモノクローナル抗体を提供する。【解決手段】  本発明に従い、ヒト細胞障害性Tリンパ球抗原4（CTLA-4）に対する完全ヒトモノクローナル抗体が提供される。重鎖および軽鎖の免疫グロブリン分子をコードするヌクレオチド配列および該分子を含むアミノ酸配列、特に相補性決定領域（CDR）に渡る隣接する重鎖および軽鎖配列、具体的にはFR1内および/またはCDR1からCDR3および/またはFR4内に渡る配列が提供される。さらに同様の結合特性を有する抗体、および本明細書に開示される抗体と同様の機能性を有する抗体（または他のアンタゴニスト）が提供される。【選択図】図１９
2005087215.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA-4）と結合するヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
ヒトCTLA-4が約100nM以下のIC50でB7-1と結合することを阻害し、かつヒトCTLA-4が約100nM以下のIC50でB7-2と結合することを阻害する、請求項1記載の抗体又は断片であって、該抗体が、下記のa)〜f)からなる群より選択される特性を少なくとも1つ有する、抗体又は断片：
a）約10-9以上の結合親和性でヒトCTLA-4と結合する；
b）500pg/ml以上、ヒトT細胞アッセイ法におけるサイトカイン生産を増強する；
c）500pg/ml以上、ヒトT細胞アッセイ法におけるIL-2生産を増強する；
d）500pg/ml以上、ヒトT細胞アッセイ法におけるインターフェロン-γ生産を増強する；
e）マウス、ラット、又はウサギに由来するCTLA-4と結合しない；並びに
f）マカークザル及びアカゲザルに由来するCTLA-4と結合する。
【請求項３】
a）動物のB細胞においてヒト抗体を発現することができるヒト以外の哺乳動物を、CTLA-4を含む免疫原で免疫する段階；
b）哺乳動物からB細胞を単離する段階；
c）CTLA-4と結合する抗体について、該B細胞又はそれに由来する細胞株をスクリーニングする段階；
d）CTLA-4と結合する抗体を発現する細胞株を培養する段階；及び
e）CTLA-4と結合する抗体を単離する段階：を含む、CTLA-4と結合する抗体を作成するための方法。
【請求項４】
請求項3記載の方法により作製される、CTLA-4と結合する抗体。
【請求項５】
請求項1、2、及び4のいずれか一項記載の抗体又は断片であって、該抗体が、ヒトCTLA-4が約0.50nM未満のIC50でB7-1と結合することを阻害し、かつヒトCTLA-4が約0.38nM未満のIC50でB7-2と結合することを阻害する、抗体又は断片。
【請求項６】
下記のa)〜e)からなる群より選択される軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項1記載の抗体又は断片：
a）ヒトA27 VL遺伝子の生殖系列アミノ酸配列、又は少なくとも1個の変異を有する該生殖系列配列；
b）ヒト012 VL遺伝子の生殖系列アミノ酸配列、又は少なくとも1個の変異を有する該生殖系列配列；
c）ヒトA10/A26 VL遺伝子の生殖系列アミノ酸配列、又は少なくとも1個の変異を有する該生殖系列配列；
d）ヒトA17 VL遺伝子の生殖系列アミノ酸配列、又は少なくとも1個の変異を有する該生殖系列配列；及び
e）ヒトA3/A19 VL遺伝子の生殖系列アミノ酸配列、又は少なくとも1個の変異を有する該生殖系列配列。
【請求項７】
ヒトA27 VL遺伝子の生殖系列アミノ酸配列が、下記のa)〜c)からなる群より選択される変異を少なくとも1個含有する、請求項6記載の抗体又は断片：
a）ヒトA27 VL遺伝子生殖系列アミノ酸配列と比較して、CDR1内のアミノ酸が少なくとも1個欠失している；
b）ヒトVL A27遺伝子の図4に示された生殖系列CDR3内の6位のセリン残基が交換されている；および
c）ヒトVL A27遺伝子生殖系列アミノ酸配列と比較して、CDR1が、保存的又は非保存的なアミノ酸置換を少なくとも1個含有している。
【請求項８】
図4から8のいずれか一つに示された軽鎖のCDR1、CDR2、又はCDR3の配列を含む、請求項1、2、及び4から7のいずれか一項記載の抗体又は断片。
【請求項９】
CDR1、CDR2、又はCDR3のアミノ酸配列が、下記のa)〜e)からなる群より選択される、請求項8記載の抗体又は断片：
a）図4に示された抗体4.1.1、抗体4.8.1、抗体4.14.3、抗体6.1.1、抗体4.10.2、又は抗体4.13.1のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列；
b）図5に示された抗体3.1.1、抗体11.2.1、抗体11.6.1、又は抗体11.7.1のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列；
c）図6に示された抗体2.1.3のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列；
d）図7に示された抗体12.3.1のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列；並びに
e）図8に示された抗体12.9.1のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列。
【請求項１０】
配列番号：14〜26、65、67、69、又は71に示されたアミノ酸配列からなる群より選択される軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項1、2、及び4から9のいずれか一項記載の抗体又は断片。
【請求項１１】
ヒトVＨ 3-33(DP-50)遺伝子の生殖系列アミノ酸配列、又は少なくとも1個の変異を有する該生殖系列配列を含む重鎖を有する、請求項1、2、及び4から10のいずれか一項記載の抗体又は断片。
【請求項１２】
下記のa)〜c)からなる群より選択される重鎖アミノ酸配列を含む、請求項1記載の抗体又は断片：
a）ヒトVＨ 3-33(DP-50)遺伝子の生殖系列アミノ酸配列、又は少なくとも1個の変異を有する該生殖系列配列；
b）ヒトVＨ 4-31(DP-65)遺伝子の生殖系列アミノ酸配列、又は少なくとも1個の変異を有する該生殖系列配列；及び
c）ヒトVＨ DP-47遺伝子の生殖系列アミノ酸配列、又は少なくとも1個の変異を有する該生殖系列配列。
【請求項１３】
図2に示された重鎖のCDR1、CDR2、又はCDR3の配列を含む、請求項1又は11記載の抗体又は断片。
【請求項１４】
重鎖が、図2に示された抗体のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の抗体又は断片。
【請求項１５】
配列番号：1〜8、10〜13、63、66、68、又は70に示されたアミノ酸配列からなる群より選択される重鎖アミノ酸配列を含む、請求項1、2、及び4から14のいずれか一項記載の抗体又は断片。
【請求項１６】
下記のa)〜d)からなる群より選択される、請求項1記載の抗体又は断片：
a）配列番号：63に示された重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、配列番号：65に示された軽鎖可変領域アミノ酸配列をさらに含む抗体又は断片；
b）配列番号：66に示された重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、配列番号：67に示された軽鎖可変領域アミノ酸配列をさらに含む抗体又は断片；
c）配列番号：68に示された重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、配列番号：69に示された軽鎖可変領域アミノ酸配列をさらに含む抗体又は断片；及び
d）配列番号：70に示された重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、配列番号：71に示された軽鎖可変領域アミノ酸配列をさらに含む抗体又は断片。
【請求項１７】
下記のa)〜d)を含む、請求項16記載の抗体又は断片：
a）配列番号：63の重鎖アミノ酸配列、及び配列番号：65の軽鎖アミノ酸配列（該抗体は該配列に示されたシグナルペプチドを欠く）；
b）配列番号：66の重鎖アミノ酸配列、及び配列番号：67の軽鎖アミノ酸配列（該抗体は該配列に示されたシグナルペプチドを欠く）；
c）配列番号：68の重鎖アミノ酸配列、及び配列番号：69の軽鎖アミノ酸配列（該抗体は該配列に示されたシグナルペプチドを欠く）；並びに
d）配列番号：70の重鎖アミノ酸配列、及び配列番号：71の軽鎖アミノ酸配列（該抗体は該配列に示されたシグナルペプチドを欠く）。
【請求項１８】
下記のa)〜c)からなる群より選択される特性を1つ又は複数保有する、請求項1記載の抗体：
a）請求項16又は17記載の抗体によるCTLA-4との結合を競合的に阻害する；
b）請求項16又は17記載の抗体と同一のエピトープと結合する；及び
c）請求項16又は17記載の抗体と実質的に同一の結合特異性を有する。
【請求項１９】
図22に示されたアミノ酸配列を有する抗体4.1.1、4.8.1、6.1.1、又は11.2.1によるCTLA-4との結合を競合的に阻害する抗体。
【請求項２０】
図22に示された抗体のCDR配列と同一のCDR配列を含む、請求項19記載の抗体。
【請求項２１】
下記のa)またはb)のうちの少なくとも1つを含む、請求項1、2、及び4から5のいずれか一項記載の抗体又は断片：
a）ヒトVＨ 3-33遺伝子ファミリー、又は保存的置換、単一の非保存的置換、もしくはその両方を有する該遺伝子ファミリーによりコードされるヒトのFR1、FR2、及びFR3の配列；又は
b）ヒトVκ A27遺伝子ファミリー、又は保存的置換、単一の非保存的置換、もしくはその両方を有する該遺伝子ファミリーによりコードされるヒトのFR1、FR2、及びFR3の配列。
【請求項２２】
下記のa)〜c)からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、CTLA-4と結合する抗体：
a）D7-27遺伝子及びJH4遺伝子によりコードされるCDR3アミノ酸配列と機能的に連結した配列番号：5のアミノ酸残基1〜89を含むアミノ酸配列；
b）配列番号：5のアミノ酸残基1〜89の24位、40位、及び47位における変異をさらに含む該アミノ酸配列；並びに
c）CDR3アミノ酸配列の1位、3位、及び7位における変異をさらに含む該アミノ酸配列。
【請求項２３】
ラージ（Raji）細胞株と共培養されたヒトT芽細胞の培養物を含む、T細胞刺激をアッセイするための細胞培養系。
【請求項２４】
a）ヒトT芽細胞及びラージ細胞株の培養物を提供する段階；
b）該培養物を作用物質と接触させる段階；並びに
c）該培養物によるサイトカイン生産を測定する段階を含む、T細胞刺激を測定するためのアッセイ法。
【請求項２５】
請求項1、2、及び4から22のいずれか一項記載の抗体又は断片と、薬学的に許容される担体とを含む、癌、炎症、又は自己免疫の治療において使用される薬学的組成物。
【請求項２６】
請求項1、2、及び4から22のいずれか一項記載の抗体又は断片を生産する細胞株。
【請求項２７】
請求項1、2、及び4から22のいずれか一項記載の抗体もしくは断片の重鎖もしくは軽鎖をコードする単離された核酸、又は該核酸の断片。
【請求項２８】
発現調節配列と機能的に連結した、請求項27記載の単離された核酸。
【請求項２９】
請求項27又は28記載の単離核酸を含む宿主細胞。
【請求項３０】
請求項27又は28記載の単離核酸を発現する、請求項27又は28記載の単離核酸を含むトランスジェニックな哺乳動物又は植物。
【請求項３１】
請求項1、2、及び4から22のいずれか一項記載の抗体もしくは断片、又は請求項25記載の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象のT細胞におけるサイトカイン生産を増強するための方法。
【請求項３２】
請求項1、2、及び4から22のいずれか一項記載の抗体もしくは断片、又は請求項25記載の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象における細胞傷害性T細胞応答を増強するための方法。
【請求項３３】
請求項1、2、及び4から22のいずれか一項記載の抗体もしくは断片、又は請求項25記載の薬学的組成物と、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子を発現する細胞とを含む組み合わせを対象に投与する段階を含む、対象における腫瘍を治療するための方法。
【請求項３４】
抗体又は断片が、補体依存性細胞傷害に関与しない、請求項32記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
関連出願の相互参照
本出願はその開示が全体として本明細書に組み入れられる1998年12月23日出願の米国特許仮出願第60/113,647号について優先権を主張する。
【０００２】
発明の概要
本発明に従い、ヒト細胞障害性Tリンパ球抗原4（CTLA-4）に対する完全ヒトモノクローナル抗体を提供する。重鎖および軽鎖の免疫グロブリン分子、コードするヌクレオチド配列およびそれを構成するアミノ酸配列、特に相補性決定部位（CDR）に渡る隣接する重鎖および軽鎖配列、具体的にはFR1内および/またはCDR1から、CDR3および/またはFR4内に渡る配列を提供する。さらに同様の結合特性を有する抗体および、本明細書に開示される抗体と同様の機能性を有する抗体（または他のアンタゴニスト）を提供する。
【背景技術】
【０００３】
患者の免疫応答の制御は、従来の薬剤の使用においてはまれな作用の特異性を導くことができるという点でヒトの多くの病気に対する望ましい治療を提供するものである。免疫システムの反応のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションのいずれもが可能である。T細胞およびB細胞の役割が広く研究され、免疫応答の制御に関して特性が明らかにされてきている。これらの研究から、多くのケースでT細胞の役割が病気の予防と治療に特に重要な意味をもつと考えられる。
【０００４】
T細胞は、その相互作用をコントロールするため、非常に複雑なシステムを有する。T細胞同士の相互作用は、その過程で多数の受容体と可溶性因子を利用する。そのため、免疫応答において任意の特定のシグナルがもつどのような効果も一般に多様であり、その経路上で関連する特定の因子、受容体、およびカウンターレセプターに依存する。ダウンレギュレーション反応の経路は活性化に必要とされる経路と同様に重要である。T細胞寛容をもたらす胸腺学習は特定の抗原に対する免疫応答を避けるための1つのメカニズムである。他のメカニズム、例えば抑制サイトカインの分泌もまた知られている。
【０００５】
T細胞の活性化は、抗原受容体（T細胞受容体（TCR））の刺激のみならず、加えて例えばCD28のような共刺激膜表面分子からのシグナル伝達を必要とする。CD28のリガンドは、B7-1（CD80）およびB7-2（CD86）タンパク質であり、共刺激シグナルを伝達するために、T細胞のCD28またはCTLA-4と相互作用する抗原提示細胞、例えば樹状細胞、活性化B細胞、または単球等において発現する。共刺激シグナル伝達の役割は、ペリンら（Perrin）（Immunol Res 14:189〜99(1995)）により実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）において研究された。EAEはTh1細胞が髄鞘抗原に向かうことで誘導される自己免疫疾患であり、病理学的免疫応答の誘導におけるB7仲介の共刺激の役割を研究するためのインビボモデルを提供するものである。B7受容体の可溶性融合タンパク質リガンド、およびCD80かCD86のどちらかに特異的なモノクローナル抗体を用い、ペリンら（Perrin）はB7共刺激がEAEにおける病気の臨床的な転帰を決定する顕著な役割を担うことを証明した。
【０００６】
B7とCD28との相互作用は、抗原特異性のT細胞の成熟と増殖を誘発するに十分と考えられるいくつかの共刺激シグナル伝達経路の1つである。共刺激が欠け、それに付随してIL-2産生が不十分になると、それに続くT細胞の増殖が阻害され「アネルギー」と呼ばれる不反応状態が誘導される。ある種のウイルスや腫瘍がT細胞の活性化と増殖をブロックし、感染、または癌化した細胞に対する宿主の免疫システムの不十分な反応、または不反応をもたらすことがある。数ある可能性のあるT細胞障害のうち、アネルギーは宿主が病原性、または腫瘍形成性の細胞を除去することができない原因の少なくとも一部分を担っていると考えられる。
【０００７】
チェンら（Chen）（Cell 71:1093〜1102(1992)）およびタウンセンドとアリソン（Townsend and Allison）（Science 259:368(1993)）は抗腫瘍免疫仲介におけるB7タンパク質の利用について発表した。シュワルツ（Schwartz）（Cell 71:1065(1992)）はIL-2産生と免疫療法におけるCD28、CTLA-4、およびB7の役割について再検討している。ハーディングら（Harding）（Nature 356:607〜609(1994)）はCD28仲介のシグナル伝達がマウスT細胞を共刺激し、T細胞クローンにおけるアネルギーの誘導を妨げることを明らかにしている。また米国特許第5,434,131号、同第5,770,197号、および同第5,773,253号、ならびに国際特許出願である国際公開公報第93/00431号、同第95/01994号、同第95/03408号、同第95/24217号、および同第95/33770号も参照のこと。
【０００８】
前述より、T細胞が活性化し、引き続きエフェクター細胞まで分化するためには、抗原提示細胞（APC）からの2種類のシグナルを必要とすることが明らかになった。第一に、T細胞上のTCRとAPC上にペプチドを提示しているMHC分子との間の相互作用により生み出される抗原特異性シグナルが存在する。第二に、CD28とB7ファミリーのメンバー（B7-1（CD80）またはB7-2（CD86））との相互作用に仲介される抗原と独立したシグナルが存在する。CTLA-4が免疫反応性環境の正確にどこにあてはまるかは当初あいまいであった。マウスCTLA-4はブルネットら（Brunet）（Nature 328:267〜270(1987)）により、細胞障害性Ｔリンパ球上に選択的に発現される分子の研究の一部として初めて同定され、クローニングされた。ヒトCTLA-4はその後まもなくダリアバッチら（Dariavach）（Eur.J.Immunol.18:1901〜1905(1988)）により同定され、クローニングされた。マウスおよびヒトのCTLA-4分子は全配列の約76％の配列相同性があり、アプローチによりそれらの細胞質のドメインの配列同定が完了した（Dariavachら、Eur.J.Immunol.18:1901〜1905(1988)）。CTLA-4はタンパク質の免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーのひとつである。Igスーパーファミリーは、可変領域（V）または定常領域（C）のいずれかのドメインからなるIg分子という、鍵となる構造の特徴を共通してもつタンパク質群である。Igスーパーファミリーのタンパク質としては、限定ではないが、免疫グロブリン自体、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスの分子（すなわちMHCクラスＩおよびクラスII）、およびTCR分子を含む。
【０００９】
1991年、リンズレーら（Linsley）（J.Exp.Med.174:561〜569(1991)）はCTLA-4がB7の第二の受容体であると提唱した。同様にハーパーら（Harper）（J Immunol 147:1037〜44(1991)）はCTLA-4とCD28の分子は配列や遺伝子情報発現、遺伝子構造、染色体上の座位について、マウスとヒトのいずれにおいても非常に相関が高いと発表した。その他バルザノ（Balzano）ら（Int J Cancer Suppl 7:28〜32(1992)）も参照のこと。さらにこの役割についての証拠が機能的な研究を通して得られた。例えばレンショウら（Lenschow）（Science 257:789〜792(1992)）はCTLA-4-Igが膵臓の膵島移植片の生存期間を延ばすことを示した。フリーマンら（Freeman）（Science 262:907〜909(1993)）はB7欠損マウスにおけるCTLA-4の役割を研究した。CTLA-4のリガンドについての実験はレンショウら（Lenschow）（P.N.A.S. 90:11054〜11058(1993)）により発表されている。リンズレーら（Linsley）（Science 257:792〜795(1992)）はインビボでの可溶性形態のCTLA-4による免疫抑制について発表している。リンズレーら（Linsley）（J.Exp.Med.176:1595〜604(1992)）はCTLA-4に結合するがCD28とは交叉反応性を持たない抗体を調製し、CTLA-4はCD28とともに活性化したＴリンパ球上で同時発現し、B7によるT細胞の接着と活性化を共同して制御すると結論づけた。クシュルーら（Kuchroo）（Cell 80:707〜18(1995)）はB7-1およびB7-2共刺激分子はTh1/Th2発生経路を示差的に活性化することを示した。イクンら（Yiqun）（Int Immunol 8:37〜44(1996)）は、静止T細胞と可溶性の再生抗原に対して新たに活性化されたメモリーT細胞各々によるB7ファミリーの分子からの共刺激シグナルの特異的要求があることを示した。その他、デボアら（de Boer）（Eur J Immunol 23:3120〜5(1993)）も参照のこと。
【００１０】
いくつかの研究グループはCTLA-4の代替のまたは異なる受容体/リガンド相互作用をCD28と比較して提唱し、BB1抗体によって認識される第3のB7複合体についても発表した。例えばハスコックら（Hathcock）（Science 262:905〜7(1993)）、フリーマンら（Freeman）（Science 262:907〜9(1993)）、フリーマンら（Freeman）（J Exp Med 178:2185〜92(1993)）、レンショウら（Lenschow）（Proc Natl Acad Sci U S A 90:11054〜8(1993)）、ラージウルフら（Razi-Wolf）（Proc Natl Acad Sci U S A 90:11182〜6(1993)）、およびブーショティスら（Boussiotis）（Proc Natl Acad Sci U S A 90:11059〜63(1993)）を参照のこと。しかし、フリーマンら（Freeman）（J Immunol 161:2708〜15(1998)）はBB1抗体が細胞膜表面にあるCD74と同定される分子に結合することを見出し、このためBB1 mAbはB7-1と異なるタンパク質に結合し、このエピトープはB7-1タンパク質上にも存在しているということを論じた。そのためこの観察から、CD80の発現と機能の分析にBB1 mAbを用いた研究について再検討するための分野の必要が生じた。
【００１１】
研究者らはT細胞刺激におけるCTLA-4の役割をさらに追究し始め、それは1993年に始まり1995年に最高潮を迎えた。第1に、CTLA-4に対するモノクローナル抗体を用い、ワルナスら（Walunas）（Immunity 1:405〜13(1994)）はCTLA-4はT細胞活性化において負の制御因子としての機能を持ち得ることを証明した。その後、ウォーターハウスら（Waterhouse）（Science 270:985〜988(1995)）はCTLA-4が欠損したマウスではアップレギュレーション活性化マーカーで標識したT芽細胞がリンパ節と脾臓において蓄積したと発表した。芽細胞はまた肝臓、心臓、肺、および膵臓組織をも浸潤しており、T細胞受容体を介して刺激が与えられたとき、血清免疫グロブリン量は増加しT細胞は突発的にまた大量に増生した。しかし、それらはFas受容体の架橋やガンマ線照射に誘導される細胞死には感受性が高かった。ウォーターハウスら（Waterhouse）はCTLA-4はT細胞活性化における負の制御因子の働きをもち、リンパ球のホメオスタシスのコントロールには極めて重要であると結論付けた。同じ号で、アリソンとクルメル（Allison and Krummel）（Science 270:932〜933(1995)）はウォーターハウスらの研究について、CTLA-4はT細胞反応性のダウンレギュレートを行うか、またはT細胞の活性化および発達の阻害シグナルの役割を有することを示したものと論じた。ティボルら（Tivol）（Immunity 3:541〜7(1995)）もまたCTLA-4欠損マウスを生み出し、このようなマウスは多臓器のリンパ球浸潤と組織の崩壊、特に重篤な心筋炎や膵炎を伴うリンパ球増殖性の病気を急速に発達させることを示した。彼らは、CTLA-4はT細胞活性化のダウンレギュレーションと免疫的ホメオスタシスの維持について中心的役割を担っていると結論した。また、クルメルとアリソン（Krummel and Allison）（J Exp Med 182:459〜65(1995)）はさらに、CD28とCTLA-4はT細胞の刺激に対する反応について対立する効果をもつことを明らかにした。彼らは、CTLA-4に対する抗体を生み出し、高度に精製したT細胞を用いたシステムの中でその抗体がCTLA-4に結合する効果を調べた。報告の中で、彼らは新しく外植したT細胞上に低レベルのB7-2が存在するとT細胞の増殖が一部阻害され、この阻害はCTLA-4の相互作用が仲介していることを示した。CTLA-4のTCRおよびCD28との交叉結合はT細胞の増殖とIL-2分泌を著しく阻害する。最終的に、これらの研究結果によりCD28とCTLA-4は、抗原への反応の決定においてT細胞により統合されると思われる、対立するシグナルを伝達することが示された。このため、T細胞の抗原受容体刺激の結果はCD28共刺激シグナルとCTLA-4により誘導される阻害シグナルの双方に制御されると結論された。その他クルメルら（Krummel）（Int Immunol 8:519〜23(1996)）、および米国特許第5,811,097号および国際特許出願・国際公開公報第97/20574号を参照のこと。
【００１２】
上述のCTLA-4の機能についてより明らかにするため、さらなる多様な研究が行われてきた。例えば、ワルナスら（Walunas）（J Exp Med 183:2541〜50(1996)）は抗CTLA-4抗体を用い、CTLA-4シグナル伝達は細胞の存続やIL-2への反応性を制御するのではなく、CD28依存性のIL-2産生を阻害すると提唱した。また、ペリンら（Perrin）（J Immunol 157:1333〜6(1996)）は、抗CTLA-4抗体は実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）において病気を増悪させ死亡率を高めたと報告した。病気の増悪は脳炎誘発性のサイトカインTNF-α、IFN-γおよびIL-2の産生促進に関連していた。このため、CTLA-4はEAEにおいて、炎症性のサイトカイン産生と臨床的症状発現を弱め、自己免疫反応の強さを制御していると結論された。その他フルウィッツら（Hurwitz）（J Neuroimmunol 73:57〜62(1997)）およびセペロら（Cepero）（J Exp Med 188:199〜204(1998））（マウスT細胞モデルにおける遺伝子導入後のCTLA-4の発現を特異的に阻害する抗CTLA-4ヘアピン型リボザイム）（an anti-CTLA-4 hairpin ribozyme that specifically abrogates CTLA-4 expression after gene transfer into a murine T-cell model）参照。
【００１３】
加えて、ブレアら（Blair）（J Immunol 160:12〜5(1998)）はCTLA-4モノクローナル抗体（mAb）の集団が、休止しているヒトCD4+T細胞に及ぼす機能的効果を評価した。この結果は、あるCTLA-4 mAbは休止CD4+細胞の増殖反応とG0からG1への細胞周期の移行を阻害する可能性があることを示した。CTLA-4の阻害効果は、細胞膜表面のCTLA-4発現が4時間に渡って検出されず明らかであった。しかし、他のCTLA-4 mAbでは阻害効果が検出されず、これによりmAbのCTLA-4への結合だけではT細胞の反応のダウンレギュレーションを仲介するには不十分であることが示された。興味深いことに、IL-2産生が遮断されることにより、阻害的な抗CTLA-4 mAbは細胞存続遺伝子bcl-X（L）を誘導および発現させた。この観察と矛盾せず、細胞は存続し続け、CTLA-4の連結後のアポトーシスは認められなかった。
【００１４】
アネルギーに関して、ペレズら（Perez）（Immunity 6:411〜7(1997)）はT細胞のアネルギーの誘導はCTLA-4をブロックすることで避けられることを示し、T細胞による抗原認識の結果はT細胞上のCD28またはCTLA-4と、B7分子との間の相互作用により決定されると結論付けた。また、ヴァンパリズら（Van Parijs）（J Exp Med 186:1119〜28(1997)）はインビボT細胞アネルギーにおけるインターロイキン12と共刺激因子の役割を研究し、アネルギー誘導においてCTLA-4の認識を阻害すると、T細胞の増生はブロックされ、完全なTh1の分化が促進されないことを見出した。しかし、IL-12と抗CTLA-4抗体の両方の存在下で寛容原性抗原にさらされたT細胞はアネルギー化せず、免疫原性の抗原にさらされたときのT細胞特有の反応を示した。これらの結果からインビボにおけるアネルギーの誘導に寄与する２つのプロセスが示唆された：CTLA-4の関わりはT細胞の増生能のブロックを導き、原型炎症性サイトカインIL-12の欠損はT細胞がTh1エフェクター細胞に分化するのを阻害する。IL-12と抗CTLA-4抗体との組み合わせは、通常は寛容性の刺激を免疫原性の刺激に転換するのに十分なものであった。
【００１５】
感染に関連してマッコイら（McCoy）（J Exp Med 186:183〜7(1997)）は、抗CTLA-4抗体がT細胞のニッポストロンギルス・ブラジリエンシス（Nippostrongylus brasiliensis）（マウスの腸管寄生虫）に対する免疫応答を著しく増強、促進し、その結果、成虫数が著しく減少し寄生虫卵産生の早期停止が認められることを示した。その他マーフィーら（Murphy）（J. Immunol.161:4153〜4160(1998)）（Leishmania donovani）参照。
【００１６】
癌に関連してウォンら（Kwon）（PNAS USA 94:8099〜103(1997)）は同系マウス前立腺癌モデルを確立し、促進されたT細胞共刺激で抗前立腺癌反応を誘発するため２つの異なる操作の実験を行った。（i）B71リガンドを発現するよう形質導入された前立腺癌細胞による直接的共刺激、および（ii）T細胞のダウンレギュレーションを妨げるような、インビボでの抗体仲介のT細胞CTLA-4のブロック。インビボでの抗体仲介のCTLA-4のブロックは抗前立腺癌免疫応答を促進させることが示された。また、ヤンら（Yang）（Cancer Res 57:4036〜41(1997)）は、CTLA-4機能のブロックが腫瘍の成長の様々なステージで抗腫瘍T細胞反応の促進を誘導するか否かを調べた。インビトロおよびインビボの結果に基づいて、彼らのモデルでは腫瘍をもつ個体においてはCTLA-4のブロックにより抗腫瘍T細胞反応の発生能が高められるが、その促進効果が表れるのは腫瘍の成長の早期ステージに限られることを見出した。さらに、フルウィッツら（Hurwitz）（Proc Natl Acad Sci U S A 95:10067〜71(1998)）は、T細胞仲介の抗腫瘍反応の発生は、T細胞受容体が主要組織適合性複合体/抗原を認識することとB7がCD28に連結することに依存していることを調べた。ある腫瘍、例えばSM1乳癌は抗CTLA-4免疫療法に不応性であった。このため、CTLA-4のブロックと顆粒球マクロファージコロニー刺激因子発現SM1細胞を含むワクチンとの併用では、そのどちらか一方のみの治療法では効果がなかったにも関わらず、親のSM1腫瘍の退縮が認められた。この併用療法は長期にわたって存続するSM1への免疫性をもたらし、CD４(+)とCD８(+)T細胞の両方に依存していた。この発見により、CTLA-4のブロックは宿主由来の抗原提示細胞のレベルにおいて作用することが示唆された。
【００１７】
糖尿病に関して、ルーダーら（Luhder）（J Exp Med 187:427〜32(1998)）は糖尿病の各異なるステージのTCRトランスジェニックマウスモデルに抗CTLA-4 mAbを注入した。彼らは、潜在的催糖尿病性のT細胞が初めに活性化されたときCTLA-4を認識することが機序の中心となる事象であることを見出した；その認識が許容された場合、膵臓の侵入が起こるが、数ヶ月は極めて無害のままである。認識のない場合は、膵島炎はより攻撃的になり、糖尿病はその後すぐ発症する。
【００１８】
ワクチンによる免疫化に関連して、ホースプールら（Horspool）（J Immunol 160:2706〜14(1998)）は完全な形の抗CTLA-4 mAb（Fabフラグメントではないもの）は、記憶応答には影響せずに、pCIA/beta galに対する液性の一次免疫応答を抑制することを見出した。このことはCTLA-4の活性化は抗体産生を阻害するがT細胞の初回抗原刺激の受容を阻害するものではないことを示唆している。CD28およびCTLA-4のリガンドである、CD80(B7-1)およびCD86(B7-2)のブロックにより、それぞれ異なる、オーバーラップしない機能性が明らかになった。初回免疫化におけるCD80のブロックは抗体の一次免疫応答および二次免疫応答を完全に抑制した一方、CD86のブロックは一次免疫応答のみ抑制し、二次応答は抑制しなかった。CD80+CD86を同時にブロックすると単独のときよりも抗体反応の抑制に効果がなかった。B7を発現しているプラスミドの同時注入により共刺激を促進すると、CTL応答が増強したが抗体反応は増強されず、Th1からTh2への頻度分布のずれも認められなかった。これらの所見は、核酸ワクチン接種後のT細胞共刺激におけるCD28、CTLA-4、CD80、およびCD86の複雑で異なる役割を示唆している。
【００１９】
同種移植拒絶反応に関連して、マーキーズら（Markees）（J Clin Invest 101:2446〜55(1998)）は、皮膚同種移植拒絶マウスモデルにおいて、最初はその受け入れがIFN-γ、CTLA-4、およびCD4(+)T細胞の存在に依存性であることを見出した。抗CTLA-4または抗IFN-γ mAbをプロトコルに加えると迅速な移植片拒絶が起こったが、抗IL-4 mAbは効果がなかった。
【００２０】
CD28に関するCTLA-4の役割に関連して、ファラリーノら（Fallarino）（J Exp Med 188:205〜10(1998)）は、抗原発現腫瘍で免疫化したTCRトランスジェニック/リコンビナーゼ活性化遺伝子2-欠損/CD28-野生型またはCD28-欠損マウスを生み出した。初回抗原刺激を受けた両型のマウスに由来するT細胞は、B7発現のない刺激細胞に反応してサイトカインを産生し、増生した。しかし、CD28+/+T細胞の反応がB7-1の共刺激により増強された一方、CD28‐/‐T細胞の反応は著しく阻害された。この阻害はB7-1またはCTLA-4に対するモノクローナル抗体により逆転した。このため、CTLA-4はCD28がない状況でT細胞の活性化を有効に阻害でき、TCR仲介のシグナルの競合作用はCTLA-4の効果の阻害を説明するに十分である。また、リンら（Lin）（J Exp Med 188:199〜204(1998)）は、CD28欠損マウスにおける心臓の同種移植片の拒絶について研究した。H-2(q)心臓を同種異型の野生型またはCD28欠損マウス（H-2(b)）に移植した。CD28欠損マウスでは野生型マウスに比べ移植片拒絶反応は遅れた。野生型レシピエントをCTLA-4免疫グロブリン（Ig）、または抗B7-1＋抗B7-2 mAbで処理すると、移植片の存続期間は有意に延長された。対照的に、CD28欠損マウスをCTLA-4-Ig、抗B7-1＋抗B7-2 mAb、またはブロッキング抗CTLA-4 mAbで処理することにより、同種移植拒絶の加速化が生じた。この移植片拒絶率の増加は、無処理の野生型マウスおよびCTLA-4-Igまたは抗CTLA-4 mAbで処理したCD28欠損マウスのドナーの心臓におけるより重篤な単核球の浸潤や、IFN-γレベルの上昇、IL-6転写のレベル上昇と関連していた。このため、CTLA-4の負の制御因子としての役割は、リガンドの競合によるCD28活性化の阻害という潜在的な能力を超えている。CD28が存在しない状況下でも、CTLA-4は同種移植片拒絶の制御において阻害的役割を担う。
【００２１】
また、CTLA-4発現のさらなる特徴解析について研究されてきた。例えば、アレグルら（Alegre）J Immunol 157:4762〜70(1996)は、表面CTLA-4は急速に内在化し、これにより通常細胞表面上に検出される発現レベルの低さは説明がつくと考えられる。彼らはCD28とIL-2のいずれもCTLA-4発現のアップレギュレーションにおいて重要な役割を担うと結論した。加えて、細胞表面のCTLA-4の蓄積は主にその迅速なエンドサイトーシスにより制御されていると考えられた。また、カスタンら（Castan）Immunology 90:265〜71(1997)は、インサイチューでのCTLA-4の発現の免疫組織学的解析に基づき、CTLA-4ポジティブである胚中心T細胞は、免疫制御に重要である可能性を示唆した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
したがって、免疫反応性においてCTLA-4が担うと思われる幅広く重要な役割を考慮して、免疫療法において効果的に利用できる、CTLA-4に対する抗体を作製することが望ましい。さらに、抗体の反復投与が必要となる慢性的な病気において使用できるような、CTLA-4に対する抗体を作製することが望ましいと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
発明の概要
本発明の第一局面に従い、ヒトVH3-33ファミリー遺伝子にコードされる、図2に示されたCDR1配列、CDR2配列、またはフレームワーク配列中の少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、FR1の配列内部からFR3配列に渡る隣接したアミノ酸配列を含む重鎖可変領域アミノ酸配列からなる、CTLA-4に結合可能な抗体を提供する。好ましい態様として、このアミノ酸配列は、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：63、配列番号：64、配列番号：66、配列番号：68、および配列番号：70からなる群より選択される1つの配列を含有する。その他の好ましい態様においてこの抗体は、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22、配列番号：23、配列番号：24、配列番号：25、配列番号：26、配列番号：65、配列番号：67、配列番号：69、および配列番号：71を含む配列からなる群より選択される１つの配列を含む軽鎖可変領域アミノ酸配列をさらに含有する。
【００２４】
本発明の第二局面に従い、配列番号：1を含む重鎖アミノ酸配列と配列番号：14を含む軽鎖可変領域アミノ酸配列とを含有する抗体を提供する。
【００２５】
本発明の第三局面に従い、配列番号：2を含む重鎖アミノ酸配列と配列番号：15を含む軽鎖可変領域アミノ酸配列とを含有する抗体を提供する。
【００２６】
本発明の第四局面に従い、配列番号：4を含む重鎖アミノ酸配列と配列番号：17を含む軽鎖可変領域アミノ酸配列とを含有する抗体を提供する。
【００２７】
本発明の第五局面に従い、CTLA-4に結合可能な単離されたヒトモノクローナル抗体を提供する。好ましい態様において、抗体はCTLA-4との結合について、3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1、および12.9.1.1からなる群より選択される抗体と競合することができる。その他の好ましい態様において、この抗体は3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1、および12.9.1.1からなる群より選択される抗体と実質的に同様のCTLA-4への結合特異性を有する。その他の好ましい態様において、この抗体は3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1、および12.9.1.1からなる群より選択される。その他の好ましい態様において、この抗体は下等哺乳動物種、好ましくはマウス、ラット、およびウサギを含む下等哺乳動物種、より好ましくはマウスおよびラット、からのCTLA-4には交叉反応性がない。その他の好ましい態様においてこの抗体は霊長類、好ましくはマカクザルおよびアカゲザルを含む霊長類からのCTLA-4には交叉反応性がある。その他の好ましい態様においてこの抗体はCTLA-4に対してCD28、B7-2、CD44、およびhIgG1よりも約100:1以上の選択度、好ましくは約500:1以上の選択度を有する。その他の好ましい態様において、この抗体の結合親和性は約10-9M以上、好ましくは約10-10M以上である。その他の好ましい態様においてこの抗体は、IC50が約100nM以下、好ましくは約0.38nM以下でCTLA-4とB7-2との結合を阻害する。その他の好ましい態様においてこの抗体は、IC50が約100nM以上の値以下、好ましくは約0.50nM以下でCTLA-4とB7-1との結合を阻害する。その他の好ましい態様においてこの抗体は、T芽細胞/ラージアッセイ法におけるIL-2産生を約500pg/ml以上、好ましくは約3846pg/ml以上促進する。その他の好ましい態様においてこの抗体は、T芽細胞/ラージアッセイ法におけるIFN-γ産生を約500pg/ml以上、好ましくは約1233pg/ml以上促進する。その他の好ましい態様においてこの抗体は、hPBMCまたは全血スーパー抗原法においてIL-2産生を約500pg/ml以上促進する。その他の好ましい態様においてこの抗体は、hPBMCまたは全血スーパー抗原法においてIL-2産生を約500pg/ml、もしくは好ましくは1500pg/ml以上、または対照に対し約30％もしくは好ましくは50％以上促進する。
【００２８】
本発明の第六局面に従い、3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1、および12.9.1.1からなる群より選択される抗体と実質的に同様のCTLA-4への結合特異性を有する、ヒト化された抗体を提供する。好ましい態様において、この抗体は下等哺乳動物種、好ましくはマウス、ラット、およびウサギを含む下等哺乳動物種、好ましくはマウスおよびラットからのCTLA-4には交叉反応性がない。その他の好ましい態様においてこの抗体は、霊長類、好ましくはマカクザルとアカゲザルを含む霊長類からのCTLA-4には交叉反応性がある。その他の好ましい態様においてこの抗体は、CTLA-4に対して、CD28、B7-2、CD44、およびｈIgG1よりも約100:1以上、好ましくは約500:1以上の選択度を有する。その他の好ましい態様において、この抗体の結合親和性は約10-9Ｍ以上、好ましくは約10-10Ｍ以上である。その他の好ましい態様においてこの抗体は、IC50が約100nM以下、好ましくは約0.38nM以下でCTLA-4とB7-2との結合を阻害する。その他の好ましい態様においてこの抗体は、IC50が約100nM以上の値以下、好ましくは約0.50nM以下でCTLA-4とB7-1との結合を阻害する。その他の好ましい態様においてこの抗体は、T芽細胞/ラージアッセイ法におけるIL-2産生を約500pg/ml以上、好ましくは約3846pg/ml以上促進する。その他の好ましい態様においてこの抗体は、T芽細胞/ラージアッセイ法におけるIFN-γ産生を約500pg/ml以上、好ましくは約1233pg/ml以上促進する。その他の好ましい態様においてこの抗体は、hPBMCまたは全血スーパー抗原アッセイ法においてIL-2産生を約500pg/ml以上促進する。その他の好ましい態様においてこの抗体は、hPBMCまたは全血スーパー抗原アッセイ法においてIL-2産生を約500pg/mlもしくは好ましくは1500pg/ml以上、または対照に対し約30％もしくは好ましくは50％以上促進する。
【００２９】
本発明の第七局面に従い、CDR1、CDR2、およびCDR3配列と読み取り枠を保持して機能的に結合したヒトVH3-33遺伝子ファミリーによってコードされるヒトFR1、FR2、およびFR3配列からなる重鎖アミノ酸配列によって構成される、CTLA-4に結合する抗体を提供する。そのCDR1、CDR2、およびCDR3配列は図2に示してあるCDR1、CDR2、およびCDR3配列から独立に選択される。好ましい態様として請求項32記載の抗体は、図2に示してあるようなFR1、FR2、およびFR3配列の体細胞変異をさらに含む。
【００３０】
本発明の第八局面に従い、CDR1、CDR2、およびCDR3配列と読み取り枠を保持して機能的に結合したヒトVH3-33遺伝子ファミリーによってコードされるヒトFR1、FR2、およびFR3配列からなる重鎖アミノ酸配列によって構成される、CTLA-4に結合する抗体を提供する。この抗体は以下の特徴を有する：CTLA-4に対する約10-9以上の結合親和性；約100nM以下のIC50でのCTLA-4とB7-1との結合阻害；約100nM以下でのIC50でCTLA-4とB7-2との結合阻害；およびヒトT細胞のアッセイ法における500pg/ml以上のサイトカイン産生の促進。
【００３１】
本発明の第九局面に従い、図2および図3に示してあるCDR1、CDR2、およびCDR3配列から独立に選択された、CDR1、CDR2、およびCDR3配列と読み取り枠を保持して機能的に結合したFR1、FR2、およびFR3配列からなる重鎖アミノ酸配列によって構成される、CTLA-4に結合する抗体を提供する。この抗体は以下の特徴を持つ：CTLA-4に対する約10-9以上の結合親和性；約100nM以下のIC50でのCTLA-4とB7-1との結合阻害；約100nM以下のIC50でのCTLA-4とB7-2との結合阻害；およびヒトT細胞のアッセイ法における500pg/ml以上のサイトカイン産生の促進。
【００３２】
本発明の第十局面に従い、ラージ細胞株と共培養されるヒトT芽細胞の培養物からなる、T細胞刺激のアッセイ法のための細胞培養系を提供する。好ましい態様において、T芽細胞はラージ細胞株との培養に先立って洗浄する。
【００３３】
本発明の第十一局面に従い、以下の段階を含む、T細胞刺激の測定のためのアッセイ法を提供する：ヒトT芽細胞およびラージ細胞株の培養物を提供する段階；培養細胞に作用物質を接触させる段階；および培養物によるサイトカイン産生を測定する段階。
【００３４】
本発明の第十二局面に従い、以下の段階を含む、T細胞刺激機能をもつ成分をスクリーニングするための機能的アッセイ法を提供する：ヒトT芽細胞およびラージ細胞株の培養物を提供する段階；培養細胞を該成分に接触させる段階；および該培養物によるサイトカイン産生を評価する段階。
【００３５】
本発明の第十三局面に従い、以下の段階を含む、CTLA-4の阻害機能のT細胞刺激アッセイ法を提供する：ヒトT芽細胞およびラージ細胞株を含む培養細胞に作用物質を接触させる段階；該培養物によるサイトカイン産生を評価する段階。
【００３６】
本発明の第十四局面に従い、以下の段階を含む、T細胞刺激活性の作用物質のスクリーニング法を提供する：ヒトT芽細胞およびラージ細胞株を含む培養細胞に作用物質を接触させる段階；および該培養物によるサイトカイン産生を評価する段階。
【００３７】
本発明の第十から第十四までの各局面では、好ましい態様として、T芽細胞はラージ細胞株との培養に先立って洗浄する。その他の好ましい態様において、サイトカインはIL-2またはIFN-γである。好ましい態様において、サイトカイン産生は培養から単離された上清で測定される。好ましい態様において、その作用物質はある抗体であり、好ましくはCTLA-4に結合する。
【００３８】
本発明の第十五局面に従い、以下の段階を含む、T細胞刺激を測定するためのアッセイ法を提供する：ヒト末梢血単核細胞集団またはブドウ球菌腸毒素Ａにより刺激を与えたヒト全血を提供する段階；培養細胞に作用物質を接触させる段階；および細胞集団によるサイトカイン産生を測定する段階。
【００３９】
本発明の第十六局面に従い、以下の段階を含む、T細胞刺激機能をもつ成分をスクリーニングするための機能的アッセイ法を提供する：ヒト末梢血単核細胞集団またはブドウ球菌腸毒素Ａにより刺激を与えたヒト全血を提供する段階；培養細胞に成分を接触させる段階；細胞集団によるサイトカイン産生を評価する段階。
【００４０】
本発明の第十七局面に従い、以下の段階を含む、CTLA-4阻害機能のT細胞刺激アッセイ法を提供する：ヒト末梢血単核細胞集団またはブドウ球菌腸毒素Ａにより刺激を与えたヒト全血に作用物質を接触させる段階、および細胞集団によるサイトカイン産生を評価する段階。
【００４１】
本発明の第十八局面に従い、以下の段階を含む、T細胞刺激活性の作用物質をスクリーニングするための方法を提供する：作用物質をヒト末梢血単核細胞集団またはブドウ球菌腸毒素Ａにより刺激を与えたヒト全血に接触させる段階；および細胞集団によるサイトカイン産生を評価する段階。
【００４２】
本発明の第十五から第十八までの各局面では、好ましい態様として、サイトカインはIL-2である。その他の好ましい態様においてサイトカイン産生は培養から単離された上清で測定される。好ましい態様において、作用物質はある抗体であり、好ましくはCTLA-4に結合する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
好ましい態様の詳細な説明
本発明に従い、ヒトCTLA-4に対する完全ヒトモノクローナル抗体を提供する。重鎖および軽鎖の免疫グロブリン分子を含む、コードするヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、特にFR1およびCDR1からCDR3およびFR4にわたる隣接した重鎖および軽鎖配列に対応する配列を提供する。さらに、同様の結合特性をもつ抗体および本明細書に開示する抗体と同様の機能性をもつ抗体（または他のアンタゴニスト）を提供する。またこのような免疫グロブリン分子およびモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを提供する。
【００４４】
定義
本明細書に他に定義されない限り、本発明に関して使われている科学的、技術的用語は当業者により広く理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈中に他に要求されない限り、単数形の用語は複数形を、複数形の用語は単数形の意味を含有するものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、およびタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学、およびハイブリダイゼーションに関連して使用されている命名法、および技術は、当技術分野においてよく知られ広く使用されているものである。組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養と形質転換（例えばエレクトロポーション、リポフェクション）については標準的技術が用いられる。酵素反応および精製技術は、製造業者の明細書に従い、または当技術分野において一般に確立されている技術または本明細書に記載の技術によって実施される。前述の技術と手順は一般に、当技術分野においてよく知られている従来の方法、および本明細書全体にわたって引用され、議論されている、多種の一般的およびより専門的な参照に記載されている方法に従い実施する。例えばサムブルックら（Sambrook）の、本明細書に参照として組み込まれている「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）」(第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)) 参照。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医学および製剤化学に関連して使用されている命名法、ならびに実験手順および技術は、当技術分野においてよく知られ、広く使用されているものである。化学合成、化学分析、薬学的調製物、剤型化、送達および患者の取り扱いについては標準的技術が用いられる。
【００４５】
本開示に従って用いられているように、以下の用語は他に指示されない限り、下記の意味をもつものと理解される；
【００４６】
本明細書において使用されている「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、ゲノムDNA、cDNA、もしくは合成されたポリヌクレオチドまたはその組み合わせを意味するものとする。その由来から「単離されたポリヌクレオチド」は、（1）該「単離されたポリヌクレオチド」が自然に存在する、そのポリヌクレオチドの全部または一部分と結合していない、（2）自然界においては結合していないポリヌクレオチドと機能的に結合している、または（3）より大きな配列の一部として自然界では存在しない。
【００４７】
本明細書に使用されている「単離されたタンパク質」という用語は、cDNA、組換えRNA、もしくは合成に由来するタンパク質またはそれらの組み合わせによるものを意味するものとする。その由来または誘導過程から「単離されたタンパク質」は（1）自然界で見出されるタンパク質と結合していない、（2）同じ起源の他のタンパク質を含まない、例えばマウスのタンパク質を含まない、（3）異なる生物種の細胞で発現される、または（4）自然界に存在しない。
【００４８】
本明細書に使用されている「ポリペプチド」という用語は、総称的な用語として、ポリペプチド配列の本来のタンパク質、断片、または類似体を意味するものとする。したがって、天然のタンパク質断片、および類似体は、ポリペプチド族の種にあたる。本発明に従う好ましいポリペプチドは、図1に示されるヒト重鎖免疫グロブリン分子とヒトκ軽鎖面免疫グロブリン分子を含む。同様に重鎖免疫グロブリン分子とκ軽鎖免疫グロブリン分子のような軽鎖免疫グロブリン分子およびその逆、またその断片や類似体を含む組合わせによって形成される抗体分子を含む。
【００４９】
本明細書に使用されている「天然」という用語は、ある対象物に適用されるものとして、ある対象物が自然界に見られるということを意味する。例えば、自然界のある供給源から単離され得る（ウイルスを含む）生命体に存在し、人間によって実験室で、ないしは他の方法で意図的に改変されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は天然である。
【００５０】
本明細書に使用されている「機能的に結合された」という用語は、記述されている構成成分が意図された様式で機能するような相関位置にあることを意味する。コード配列に対する「機能的に結合された」調節配列は、コード配列の発現が調節配列に適合する条件で得られるように結合している。
【００５１】
本明細書に使用されている「調節配列」という用語は、それが結合しているコード配列の発現とプロセシングをもたらすのに必要なポリヌクレオチド配列のことを意味する。このような調節配列の性質は宿主の生物によって異なる；原核生物においてはこのような調節配列は一般にプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結の配列を含む；真核生物においては一般にこのような調節配列はプロモーター配列と転写終結配列とを含む。「調節配列」という用語は、最低でも、その存在が発現とプロセシングに必須の全ての構成要素を含むことを意図しており、また、それがあることで有益になるその他の構成要素、例えば、リーダー配列および結合する相手となる配列をも含み得る。
【００５２】
本明細書に使用されている「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはこれらどちらかの改変したヌクレオチドの、少なくとも10塩基の
【００５３】
本明細書に使用されている「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然のオリゴヌクレオチド、ならびに自然に存在するおよび自然に存在しないオリゴヌクレオチドが連結した改変型ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは一般的に200塩基以下の長さから成るポリヌクレオチドのサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは10から60塩基の長さであり、最も好ましくは12、13、14、15、16、17、18、19、または20から40塩基の長さである。オリゴヌクレオチドは、例えば遺伝子変異体を作製するために用いるときは二本鎖の場合もあるが、例えばプローブとして用いるためには通常一本鎖である。本発明のオリゴヌクレオチドはセンスまたはアンチセンスのオリゴヌクレオチドのいずれかとなりうる。
【００５４】
本明細書に使用されている「天然のヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドを含む。本明細書に使用されている「改変されたヌクレオチド」という用語は、改変された、または置換された糖鎖（sugar group）などを有するヌクレオチドを含む。本明細書に使用されている「オリゴヌクレオチド結合（linkage）」という用語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデート、ホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド結合を含む。ラプランシュら（LaPlanche） Nucl.Acids Res. 14:9081(1986); ステックら（Stec） J. Am. Chem. Soc.106:6077(1984);ステインら（Stein） Nucl. Acids Res. 16:3209(1988); ゾンら（Zon） Anti-Cancer Drug Design 6:539(1991); ゾンら（Zon）「オリゴヌクレオチドおよび類似体：実践アプローチ（Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach）」、pp.87〜108(F. Eckstein編、Oxford University Press, Oxford England(1991)); ステックら（Stec） 米国特許第5,151,510号；アールマン（Uhlmann）およびペイマン（Peyman）、Chemical Reviews 90:543(1990)参照。これらの開示は本明細書に参照として組み込まれる。オリゴヌクレオチドは必要に応じて検出のための標識を含み得る。
【００５５】
本明細書に使用されている「選択的にハイブリダイズする」という用語は、検出可能になるようにかつ特異的に結合することを意味する。本発明に従うポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびその断片は、非特異的な核酸に対する検出可能な結合の検知可能な量を最小限にするハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件で、核酸の鎖に選択的にハイブリダイズする。高ストリンジェンシー条件は、当技術分野において知られており本明細書で議論するように、選択的なハイブリダイゼーション条件を得るために用いられる。一般的に、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびその断片、ならびに目的の核酸配列の間の核酸配列の相同性は、少なくとも80％であり、より典型的には少なくとも85％、90％、95％、99％、100％と相同性が増すにつれ好ましい。2つのアミノ酸配列は、該配列間で部分的または完全に同一である場合、相同である。例えば、85％の相同性は、2個の配列が最大に適合するように整列されたときに85％のアミノ酸が同一であることを意味する。（2つの配列を適合させたときのいずれかの配列における）ギャップは、最大に適合させる際に許容される；5以下の長さのギャップが好ましく、2以下の長さはより好ましい。また、好ましくは2つのタンパク質配列（またはそれらより派生する少なくとも30アミノ酸の長さのポリペプチド配列）は、本明細書でこの用語が用いられる場合、ALIGNプログラムを用い突然変異データ行列とギャップペナルティを6以上にして整列スコアが（標準偏差単位で）5より大きければ、相同である。デイホフ（Dayhoff,M.O.）の「図解・タンパク質の配列および構造（Atlas of Protein Sequence and Structure）」 pp.101〜110（第5巻, National Biomedical Research Foundation(1972) ）および当巻の別冊2 pp.1〜10参照。2つの配列またはそれらの一部は、ALIGNプログラムを用いて最適に整列されたときそれらのアミノ酸が50％以上一致していればより好ましく相同である。本明細書に使用されている「対応する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全体または一部に相同（すなわち同一、進化的に厳密に関連していることではなく）であること、またはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味する。対比的に本明細書に使用されている「相補的な」という用語は、相補的な配列が参照ポリヌクレオチド配列の全体または一部に相同であることを意味する。例えばヌクレオチド配列「TATAC」は参照配列「TATAC」に対応し、参照配列「GTATA」に相補的である。
【００５６】
以下の用語は2個以上のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の配列関係を記述するために用いられる：「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列一致率」、および「実質的な同一性」。「参照配列」とは、配列比較の基礎として用いられる定まった配列である；参照配列は例えば、配列表にある全長のcDNAもしくは遺伝子配列のセグメントといったより長い配列のサブセットであっても、または全長のcDNAもしくは遺伝子配列からなっていてもよい。一般に、参照配列は少なくとも18ヌクレオチドまたは6アミノ酸の長さで、ときどき少なくとも24ヌクレオチドまたは8アミノ酸の長さで、しばしば少なくとも48ヌクレオチドまたは16アミノ酸の長さである。2個のポリヌクレオチドまたはアミノ酸はそれぞれ（1）2個の分子間で類似の配列（すなわち完全長ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一部）を含み得るため、またそれらは（2）さらに2個のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間で分岐した配列を含み得るため、2個（またはそれ以上）の分子間の配列比較は、配列類似性の局部的な領域を見出し比較するために、一般に2個の分子の配列を「比較ウィンドウ」において比較することによって行われる。本明細書に使用されている「比較ウィンドウ」とは、少なくとも18個の連続するヌクレオチド部位または6アミノ酸の概念的な部分を指す。そこでは、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は少なくとも18個の連続ヌクレオチドまたは6アミノ酸の参照配列と比較され、また、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の一部が、2個の配列の最適な整列をするため、（付加、欠失を含まない）参照配列と比較して、20％以下の付加、欠失、置換やそれに類するもの（すなわちギャップ）を含む。比較ウィンドウを整列するための最適な配列の整列は、スミスとウォーターマン（Smith and Waterman）の Adv. Appl. Math.2:482(1981)の局所的相同性アルゴリズム、ニードルマンとヴンシュ（Needleman and Wunsch ）J. Mol. Biol. 48:443(1970)の相同性整列アルゴリズム、ピアソンとリップマン（Pearson and Lipman）（Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.)85:2444(1988)）の同一性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis)のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTAや、GeneworksまたはMacVector ソフトウェア・パッケージ）、または視覚的検査によって行うことができる。そして、様々な方法によって得られる、一番よい整列（すなわち比較ウィンドウにわたって相同性の度合いが最も高くなるもの）が選ばれる。
【００５７】
「配列同一性」という用語は、比較ウィンドウにおいて2個のポリヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同一であること（すなわちヌクレオチドとヌクレオチドまたは残基と残基ごとにおいて）を意味する。「配列一致率」という用語は、比較ウィンドウにおいて2個の最適に整列された配列を比較し、同一の核酸塩基（例；A、T、C、G、U、またはI）または残基が存在する位置の数を決定することにより算出され、両配列において一致した位置の数を比較ウィンドウ内の全部の位置数（すなわちウィンドウサイズ）で割って100をかけることによって、配列同一性のパーセンテージが得られる。本明細書に使用されている「実質的な同一性」という用語は、少なくとも18ヌクレオチド（6アミノ酸）、しばしば少なくとも24〜48ヌクレオチド（8〜16アミノ酸）、の位置に渡る比較ウィンドウで参照配列と比較したとき、少なくとも85％の配列同一性、好ましくは少なくとも90〜95％の配列同一性、さらにより一般的には少なくとも99％の配列同一性をもつ配列からなる、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸の配列の特徴を示す。その配列一致率は、比較ウィンドウにおいて全体で参照配列の20％以下の欠失や付加を含む配列と参照配列を比較することによって計算される。参照配列はより長い配列の部分集合であり得る。
【００５８】
本明細書で用いられているように20の通常のアミノ酸とその略号は通常の使い方に従う。本明細書に参照として組み込まれる「免疫学−合成（Immunology-A Synthesis）」 (第2版、E.S.GolubおよびD.R.Gren編、Sinauer Associates, Sunderland, Mass.(1991) )参照。20個の通常のアミノ酸の立体異性体（例えばD型アミノ酸）α-、α-二重置換アミノ酸のように自然界にはないアミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸およびその他の非通常のアミノ酸もまた本発明のポリペプチドに適した構成物となり得る。非通常のアミノ酸の例として、以下のものが含まれる：4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、ε-N,N,N-トリメチルリシン、ε-N-アセチルリシン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリシン、σ- N-メチルアルギニン、およびその他の類似のアミノ酸やイミノ酸（例えば4-ヒドロキシプロリン）。本明細書で使われているポリペプチドの表記は標準的な用い方と慣習に従い、左手の方向はアミノ末端方向であり、右手の方向はカルボキシ末端方向である。
【００５９】
同様に、特に定めない限りは一本鎖のポリヌクレオチド配列の左端は5'末端；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は5'方向を意味する。新生RNA転写物の5'から3'方向への付加は転写の方向と称する；RNAと同じ配列をもっていて、RNA転写物の5'末端に対して5'側のDNA鎖上の配列領域は、「上流配列」と称する；RNAと同じ配列をもっていて、RNA転写物の3'末端に対して3'側のDNA鎖上の配列領域は、「下流配列」と称する。
【００６０】
ポリペプチドに適用されたのと同様に、「実質的な同一性」という用語は2個のペプチド配列が、デフォルトのギャップの重み付けを用いてGAPまたはBESTFITプログラム等によって最適に整列されたときに少なくとも80％の配列同一性をもつこと、好ましくは少なくとも90％の配列同一性、より好ましくは少なくとも95％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも99％の配列同一性をもっていることを意味する。好ましくは、同一ではない残基の位置は、保存的なアミノ酸置換によって異なる。保存的なアミノ酸置換は、似た側鎖をもっている残基の相互互換性のことを指す。例えば、脂肪族の側鎖をもったアミノ酸の一群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンであり；脂肪族−水酸基の側鎖をもったアミノ酸の一群はセリン、スレオニンであり；アミド基を含む側鎖をもつアミノ酸の一群はアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族の側鎖をもつアミノ酸の一群はフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性の側鎖をもつアミノ酸の一群はリシン、アルギニン、およびヒスチジンであり；イオウを含む側鎖をもつアミノ酸の一群はシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的なアミノ酸置換基は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００６１】
本明細書で議論するように、アミノ酸配列の変異が少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、90％、95％、もっとも好ましくは99％維持されていると仮定すると、抗体や免疫グロブリン分子のアミノ酸配列の小さな変異は本発明に含まれるものと考えられる。特に保存的なアミノ酸置換が企図されている。保存的な置換は、側鎖が関連しているアミノ酸のファミリーの中において生じるものである。遺伝的にコードされるアミノ酸は一般的に以下のファミリーに分けられる：（1）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（2）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（3）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（4）非電荷極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。より好ましいファミリーは以下である；セリンとスレオニンは脂肪族−水酸化ファミリー；アスパラギンおよびグルタミンはアミド含有ファミリー；アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは脂肪族ファミリー；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは芳香族ファミリーである。例えば、隔離された部位でのロイシンとイソロイシンまたはバリン、アスパラギン酸とグルタミン酸、スレオニンとセリンの置換、またはあるアミノ酸の構造的に関連したアミノ酸との同様の置換は、特に置換が骨格となる部位の中のアミノ酸を含まない場合はその結果できた分子の結合または特性に大きな影響をもたらさないと考えるのが妥当である。アミノ酸の変化の結果機能的なペプチドになっているかどうかは、ポリペプチド誘導体の特異的な活性を解析することで、容易に調べられる。解析法は本明細書に詳しく記してある。抗体または免疫グロブリン分子の断片または類似体は、当業者には容易に作成することができる。断片または類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界の近傍に生じる。構造的および機能的ドメインはヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列データを公共の、または私有の配列データベースと比較することで同定することができる。好ましくはコンピュータ化された比較方法は、構造および/または機能の明らかな他のタンパク質において見られる配列モチーフまたは推定されるタンパク質のコンフォメーションドメインを同定するのに用いられる。公知の3次元構造に折りたたまれるタンパク質配列を同定する方法は知られている。ボウイーら（Bowie）Science 253:164(1991)参照。このように前述の例は本発明に従う構造的ドメインおよび機能的ドメインを定義するのに使用可能な配列モチーフおよび構造的コンフォメーションが当業者によって認識され得るということを示している。
【００６２】
好ましいアミノ酸置換は（1）タンパク分解への感受性を減らすもの、（2）酸化感受性を減らすもの、（3）タンパク質複合体を形成する結合親和性を変えるもの、（4）結合親和性を変えるもの、および（5）このような類似体の他の物理化学的または機能的特性を与えたり改変したりするものである。類似体は天然のペプチド配列以外の配列の様々なムテインを含みうる。例えば、単一のまたは複数のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）は、天然の配列において（好ましくはポリペプチドの分子間接触を形成するドメインの外側の部分において）作られ得る。保存的アミノ酸置換は実質的に親配列の構造的特性を変えるものではない（例えば、アミノ酸置換は親配列にあるへリックス構造または親配列を特徴づける他の型の二次構造を壊すものではない）。当技術分野において認識されるポリペプチドの二次、三次構造の例は本明細書に参照として組み込まれる以下の文献に記載されている：「タンパク質、構造および分子的原理（Proteins, Structures and Molecular Principles ）」 (Creighton編、W.H. Freeman and Company, New York(1984))；「タンパク質構造入門（Introduction to Protein Structure）」 (C.BrandenおよびJ. Tooze編、Garland Publishing, New York, N.Y.(1991)；およびThorntonらのNature 354:105(1991)。
【００６３】
本明細書で用いられる「ポリペプチド断片」という用語は、アミノ末端および/またはカルボキシ末端の欠失を起こしているが、残りのアミノ酸配列が天然の配列において例えば全長のcDNA配列から推定される対応する部位に一致するポリペプチドを指す。断片は典型的には少なくとも5、6、8、または10アミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも14アミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも20アミノ酸の長さ、一般的には少なくとも50アミノ酸の長さ、さらにより好ましくは少なくとも70アミノ酸の長さである。本明細書で用いられる「類似体」という用語は、推定アミノ酸配列の一部と実質的な同一性をもつ少なくとも25アミノ酸のセグメントを含むポリペプチドで、少なくとも以下の特徴のうち1個をもつポリペプチドを指す：（1）適切な結合条件でCTLA-4に特異的に結合する（2）CTLA-4の受容体への結合を妨げる能力をもつ、または（3）インビトロもしくはインビボでCTLA-4を発現する細胞の成長を阻害する能力をもつ。典型的にはポリペプチド類似体は、天然の配列に関して保存的アミノ酸置換（または付加もしくは欠失）を含む。類似体は典型的には少なくとも20アミノ酸の長さで、好ましくは50アミノ酸またはそれ以上の長さであり、そしてしばしば天然のポリペプチドの全長と同じ長さであり得る。
【００６４】
ペプチド類似体は、製薬業界においては一般に鋳型のペプチドと類似の特徴をもつ非ペプチド薬として使われる。これらのタイプの非ペプチド化合物は「ペプチド模倣物（peptide mimeticsまたはpeptidomimetics）」と呼ばれる。本明細書に参照として組み込まれるファウシェ（Fauchere）J. Adv. Drug Res. 15:29(1986); ベーバーとフライディンガー（Veber and Freidinger）TINS p.392(1985); およびエヴァンスら（Evans）J. Med. Chem.30:1229(1987)参照。このような化合物はしばしばコンピュータ化された分子モデリングによって開発される。治療上有用なペプチドに構造的に類似したペプチド模倣物は、同等な治療の効果または予防効果をもたらすために用いることができる。一般的にペプチド模倣物は構造的にヒト抗体のようなパラダイムポリペプチド（すなわち生化学的な特性または薬理学的な活性をもつポリペプチド）に似ているが、当技術分野においてよく知られた方法によって--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH=CH-- (シスおよびトランス)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--、およびCH2SO--からなる群より選択される結合によって選択的に置きかえられる1個以上のペプチド結合をもつ。同じ型のD型アミノ酸（例えばL型リシンの代わりにD型リシン）のコンセンサス配列の1個以上のアミノ酸の体系的置換は、より安定したペプチドを作るのに用いられる。それに加えて、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異を有する抑制ペプチドは当技術分野において知られる方法によって生産できる。（RizoおよびGierasch、Ann. Rev. Biochem. 61:387(1992)、本明細書に参照として組み込まれる）；例えば、内部のシステイン残基を加えることによって、ペプチドを環化する分子内のジスルフィド架橋を形成することができる。
【００６５】
「抗体」または「抗体ペプチド」とは、完全な抗体、または特異的な結合について完全な抗体と競合する、その結合断片を指す。結合断片は組換えDNA技術により、または完全な抗体を酵素的または化学的に分断することにより作製される。結合断片はFab、Fab'、F(ab')2、Fvおよび単鎖抗体を含む。「二重特異性」または「二機能性」抗体以外の抗体は、各々が同一な結合部位を有すると理解されている。抗体は抗体の余剰によりカウンターレセプターに結合したレセプター量が少なくとも約20％、40％、60％または80％減少し、より一般的には約85％以上（インビトロ競合結合アッセイ法により測定）減少したとき、実質的にレセプターがカウンターレセプターと接着するのを阻害する。
【００６６】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に特異的に結合することのできる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープの決定基は通常、例えばアミノ酸または糖側鎖のような、化学的に活性な表面分子群を有し、通常特異的な三次元構造と、特異的な電荷特性を有する。ある抗体は解離定数が1μM以下のとき、好ましくは100nM以下、最も好ましくは10nM以下のときある抗原に特異的に結合すると考えられる。
【００６７】
「作用物質」という用語は化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的高分子、または生物学的物質からの抽出物を指すため本明細書において用いられる。
【００６８】
本明細書で使用されている「標識」または「標識された」という用語は、検出マーカーの組込み、例えば放射性標識したアミノ酸を組込む、または標識アビジン（例えば光学的にまたは比色定量法により検出可能な蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）により検出可能なビオチニル部分のポリペプチドと連結する、等の検出マーカーの組込みを指す。ある状況では、標識またはマーカーはまた治療的でもある。ポリペプチドおよび糖タンパク質の様々な標識法が当技術分野で知られ、使用可能である。ポリペプチドの標識の例としては、限定はしないが、次のものを含む；放射性同位体または放射性核種（例；3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I）、蛍光標識（例；FITC、ローダミン、ランタニドリン）、酵素標識（例；ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ）、化学発光物質、ビオチニル基、二次リポーターにより認識される、予め決定されたポリペプチドエピトープ（例；ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ標識）。ある態様においては、標識は潜在的な立体障害を減少させるために、様々な長さのスペーサーアームに連結している。
【００６９】
本明細書において使用されている「薬学的作用物質または薬剤」という用語は、患者に適切に投与されたときに望ましい治療的効果を誘導することが可能な化学的化合物または組成物を意味する。本明細書における他の化学的用語は、「マグローヒル化学用語辞典（The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms）」（Parker,S.編、McGrow-Hill,San Francisco(1985) 、本明細書に参照として組み入れられている）に例証されているように、当技術分野における従来の使用法に従って用いられる。
【００７０】
本明細書で使用されている「抗腫瘍性物質」という用語は、ヒトにおける新生物、特に癌、肉腫、リンパ腫、または白血病のような悪性（癌性）の病変の発生または進行を阻害するという機能的特徴をもつ作用物質を意味する。抗腫瘍性物質はしばしば、転移を抑制する特性をもつ。
【００７１】
本明細書で使用されている「実質的に純粋な」とは、対象物質種が主要素として存在する（すなわちモルベースで組成物中その物質種が他の各物質種よりも多量である）、および好ましくは実質的に純粋な分画は対象物質種が存在する全ての高分子種の少なくとも約50％（モルベース）含まれる組成物であることを意味する。一般的に実質的に純粋な組成は、その組成中に存在する高分子種全体の約80％以上、より好ましくは約85％、90％、95％、および99％以上を含む。最も好ましくは、本質的に単一の高分子種から成るその組成物中では対象物質種が本質的に均一（従来の検出法により該組成物中に夾雑物質種が検出されない状態）になるよう精製されている。
【００７２】
患者という用語は、ヒトおよび獣医学上の被験者を含む。
【００７３】
抗体の構造
抗体の基本的な構造ユニットは四量体から成ることが知られている。各四量体は２個のポリペプチド鎖の一致する対から成り、各対は１個の「軽い」（約25kDa）鎖と1個の「重い」（約50〜70 kDa）鎖を有する。各鎖のアミノ末端部分は抗原認識の主な原因となる約100から110以上のアミノ酸の可変領域を含有する。各鎖のカルボキシ末端部分はエフェクター機能の主な原因となる定常領域を決定する。ヒト軽鎖はカッパ型軽鎖とラムダ型軽鎖に分類される。重鎖はミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプは各々IgM、IgD、IgG、IgA、およびIgEと定義される。軽鎖および重鎖の中で可変領域と定常領域は、約12以上のアミノ酸から成る「Ｊ」領域に連結し、重鎖はまた約10以上のアミノ酸から成る「D」領域をも含む。「基礎免疫学（Fundamental Immunology）」第7章（Paul,W.編 第2版 Raven Press,N.Y.(1989)）を概して参照のこと（あらゆる目的でその全容が参照として組み込まれる）。各軽鎖/重鎖の対の可変領域が抗体結合部位を形成している。
【００７４】
そのため、完全なIgG抗体は２個の結合部位を有する。二機能性抗体、または二重特異性抗体を除いては、この２個の結合部位は同じである。
【００７５】
鎖は全て３個の超可変領域または相補性決定領域すなわちCDRと呼ばれる領域が連結した、比較的保存された枠組み構造領域（FR）という、同じ普遍的な構造を示す。それぞれの対の2個の鎖のCDRは、特異的なエピトープに結合できるように枠組み領域によって整列される。Ｎ末端からＣ末端へ向けて軽鎖と重鎖の両者はFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR４ドメインから構成される。それぞれのドメインへのアミノ酸の割り当ては、カバット（Kabat） 「免疫学的に重要なタンパク質配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」（National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987および1991)）、またはチョシアとレスク（Chothia & Lesk）（J.Mol.Biol.196:901〜917(1987);チョシアら（Chothia）（Nature 342:878〜883(1989)）の定義に従う。
【００７６】
二重特異性抗体、または二機能性抗体は2個の異なる重鎖/軽鎖の対および2個の異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab'断片の連結を含む様々な方法によって作成することができる。例えばソングシヴィライとラックマン（Songsivilai & Lachmann）（Clin.Exp.Immunol. 79:315〜321(1990)）、コステルニーら（Kostelny）（J.Immunol.148:1547〜1553(1992)）参照。それに加えて二重特異性抗体は、「ダイアボディー」として形成することができる（Holligerら、「「ダイアボディー」：二価の抗体および二重特異性抗体の断片 （‘Diabodies':small bivalent and bispecific antibody fragments）」 PNAS USA 90:6444〜6448(1993)）または「ジャヌシン」（Trauneckerら、「二重特異性単鎖分子（ジャヌシン）は、HIV感染細胞の細胞障害性リンパ球を標的とする （Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells）」 EMBO J 10:3655〜3659(1991)およびTrauneckerら、「ジャヌシン：二重特異性試薬の新しい分子デザイン（Janusin: new molecular design for bispecific reagents）」 Int J Cancer Suppl. 7:51〜52(1992)）。二重特異性抗体の作製は従来の抗体の作製に比べて比較的労力集約的な過程となりうる。また、収量と純度は一般的に二重特異性抗体の方が低い。二重特異性抗体は、単一の結合部位を有するフラグメント（例えばFab、Fab'およびFv）の形では存在しない。
【００７７】
ヒト抗体および抗体のヒト化
ヒト抗体はマウスまたはラットの可変領域および/または定常領域を有する抗体に関わる諸問題を回避する。そのようなマウスまたはラット由来のタンパク質の存在は抗体の血中半減期を急速に短くする、または患者によるその抗体に対する免疫応答の発生を誘導する可能性がある。マウスまたはラット由来の抗体の使用を避けるために、ヒト化抗体を開発すること、または齧歯動物が完全ヒト配列をもつ抗体を産生するようにヒト抗体の機能を齧歯動物に導入することにより、完全ヒト抗体を生産することが可能であると仮定されてきた。
【００７８】
ヒト抗体
YAC中でヒトの遺伝子座をクローニングし、メガベースサイズで再構成し、それらをマウス生殖系列に導入することが可能になり、非常に大きなまたは未精製のままマップされた遺伝子座の機能的構成要素の解明、またヒトの病気の有用なモデルの作製に著しい進展が提供される。さらに、マウスの遺伝子座をヒトの同等物に置き換えるためにこのような技術を利用すると、成長の過程でのヒト遺伝子産物の発現と制御、それらの他のシステムとの相互作用、ならびに病気の誘導および進行におけるそれらの関わりについて特別の見識が得られる。
【００７９】
そのような方法の重要な実用的適用の１つがマウス液性免疫システムの「ヒト化」である。ヒト免疫グロブリン（Ig）遺伝子座を、内因性のIg遺伝子を不活性化したマウスに導入することで、プログラムされた発現と抗体の組み立ての根底にあるメカニズムの研究および、B細胞の発達におけるそれらの役割の研究を行う機会が与えられる。さらに、このような方法により完全ヒトモノクローナル抗体（mAb）産生の理想的な源、ヒトの病気の抗体治療への期待をかなえる重要なマイルストーンが得られる。完全ヒト抗体はマウスのまたはマウス起源のmAbに対する内因性の免疫応答およびアレルギー反応を最小化し、そのため投与された抗体の効果と安全性を高めることが期待される。完全ヒト抗体の使用は慢性的および再発的なヒトの病気、例えば炎症、自己免疫、および癌といった、抗体の反復投与が必要な病気の治療において実質的な利益を与えることが期待される。
【００８０】
この目標に向けた１つのアプローチは、マウスがマウス抗体を産生せずにヒト抗体の多くのレパートリーを産生することを期待して、マウス抗体産生欠損マウス系列にヒトIg遺伝子座の大きな断片を組み込むことであった。大きなヒトIg断片は大きな可変遺伝子の多様性とともに、抗体産生と発現の適切な制御能力を保存していると考えられる。抗体の多様化および選択のためにマウスの系を活用すること、ヒトタンパク質に対する免疫寛容の欠如により、これらのマウス系列で再生されたヒト抗体レパートリーはヒト抗原を含む任意の関心対象の抗原に対して高親和性の抗体を生じると考えられる。ハイブリドーマ技術を用い、望ましい特異性を有する抗原特異性ヒトmAbは、容易に産生し選択することが可能である。
【００８１】
この一般的方法は本発明者らが1994年に発表した、最初のゼノマウス（XenoMouse（商標））系列の作製に関連して示された。グリーンら（Green）Nature Genetics 7:13〜21(1994)参照。ゼノマウス（商標）系列は、245kbおよび190kbサイズの、核となる可変および定常領域配列を含有するヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の生殖系列構造断片を各々含む酵母人工染色体（YAC）を用いて操作した。同著参照。ヒトIgを含むYACは再配列および抗体の発現の両方についてマウスの系と適合性があり、不活性マウスIg遺伝子と置換可能であることがわかった。このことは、B細胞の発達を誘導する能力、完全ヒト抗体のほぼ成熟したヒトレパートリーを産生する能力、および抗原特異性ヒトmAbを産出する能力により示された。これらの結果はまた、より多くのＶ遺伝子を含むヒトIg遺伝子座のより大きな部分、その他の制御因子、およびヒトIg定常領域を導入すると、感染や免疫処置に対してヒト液性免疫応答特有の実質的に完全なレパートリーが反復再生されることを示唆した。グリーンら（Green）の研究は近年、ゼノマウス（商標）系列作製のため、メガベースサイズの、ヒト重鎖遺伝子座とκ軽鎖遺伝子座の生殖系列構造YAC断片をそれぞれ導入することにより、約80％以上のヒト抗体レパートリーの導入へと拡大された。その開示が参照として本明細書に組み入れられる、メンデスら（Mendez）Nature Genetics 15:146〜156(1997)、グリーンおよびジャコボビッツ（Green and Jakobovits）J.Exp.Med.188:483〜495(1998)、ならびに1996年12月3日出願の米国特許出願第08/759,620号参照。
【００８２】
このようなアプローチは1990年1月12日出願の米国特許出願第07/466,008号、1990年11月8日出願の同第07/610,515号、1992年7月24日出願の同第07/919,297号、1992年7月30日出願の同第07/922,649号、1993年3月15日出願の同第08/031,801号、1993年8月27日出願の同第08/112,848号、1994年4月28日出願の同第08/234,145号、1995年1月20日出願の同第08/376,279号、1995年4月27日出願の同第08/430,938号、1995年6月5日出願の同第08/464,584号、1995年6月5日出願の同第08/464,582号、1995年6月5日出願の同第08/463,191号、1995年6月5日出願の同第08/462,837号、1995年6月5日出願の同第08/486,853号、1995年6月5日出願の同第08/486,857号、1995年6月5日出願の同第08/486,859号、1995年6月5日出願の同第08/462,513号、1996年10月2日出願の同第08/724,752号、および1996年12月3日出願の同第08/759,620号においてさらに議論され、説明されている。また、メンデスら（Mendez）Nature Genetics 15:146〜156(1997)、ならびにグリーンおよびジャコボビッツ（Green and Jakobovits）J.Exp.Med.188:483〜495(1998)も参照のこと。また、1996年6月12日に公表認可された欧州特許EP 0 463 151 B1号、1994年2月3日公開の国際特許出願・国際公開公報第94/02602号、1996年10月31日公開の国際特許出願・国際公開公報第96/34096号、および1998年6月11日公開の国際公開公報第98/24893号も参照のこと。上述の各特許、出願および引用の開示はことごとく参照として本明細書に組み入れられる。
【００８３】
その他のアプローチとして、ジーンファームインターナショナル社（GenPharm International,Inc.）を含む他の研究者らは、「ミニローカス（小遺伝子座）」法を利用した。ミニローカス法ではIg遺伝子座からの断片（個々の遺伝子）を含むことで外因性Ig遺伝子座が模倣される。このため、１個以上のVH遺伝子、１個以上のDH遺伝子、１個以上のJH遺伝子、ミュー定常領域、および第二の定常領域（好ましくはガンマ定常領域）は、動物に挿入できるようなある構成物として形成される。このアプローチは米国特許第5,545,807号のスラニら（Surani）、米国特許第5,545,806号、同第5,625,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,661,016号、同第5,770,429号、同第5,789,650号、および同第5,814,318号のロンバ−グおよびケイ（Lonberg and Kay）、米国特許第5,591,669号のクリンペンフォートおよびバーンズ（Krimpenfort and Berns）、米国特許第5,612,205号、同第5,721,367号、同第5,789,215号のバーンズら（Berns）、米国特許第5,643,763号のチョイおよびダン（Choi and Dunn）、ならびに1990年8月29日出願のジーンファームインターナショナル(GenPharm International)米国特許出願第07/574,748号、1990年8月31日出願の同第07/575,962号、1991年12月17日出願の同第07/810,279号、1992年3月18日出願の同第07/853,408号、1992年6月23日出願の同第07/904,068号、1992年12月16日出願の同第07/990,860号、1993年4月26日出願の同第08/053,131号、1993年7月22日出願の同第08/096,762号、1993年11月18日出願の同第08/155,301号、1993年12月3日出願の同第08/161,739号、1993年12月10日出願の同第08/165,699号、1994年3月9日出願の同第08/209,741号に説明されており、上述の開示は参照として本明細書に組み入れられる。その他欧州特許第0 546 073 B1号、国際特許出願・国際公開公報第92/03918号、同第92/22645号、同第92/22647号、同第92/22670号、同第93/12227号、同第94/00569号、同第94/25585号、同第96/14436号、同第97/13852号、および同第98/24884号も参照のこと。これらの開示は全体にわたって参照として本明細書に組み入れられる。さらにテイラーら（Taylor）（1992年）、チェンら（Chen）（1993年）、テュイロンら（Tuaillon）（1993年）、チョイら（Choi）（1993年）、ロンバーグら（Lonberg）（1994年）、テイラーら（Taylor）（1994年）、およびテュイロンら（Tuaillon）（1995年）、フィッシュワイルドら（Fishwild）（1996年）参照。これらの開示は全体にわたって参照として本明細書に組み入れられる。
【００８４】
上述のスラニら（Surani）の発明者は、メディカルリサーチカウンシル（「MRC」）に委任されミニローカス法の使用によりIg遺伝子座を有するトランスジェニックマウスを作製した。上述のジーンファームインターナショナルの発明者ら、ロンバーグとケイ（Lonberg and Kay）は本発明者らに引き続き、実質的にスラニ（Surani）らの研究の複製と組み合わせた内因性マウスIg遺伝子座の不活性化を提案した。
【００８５】
ミニローカス法の利点はIg遺伝子座の部位を含む構成物を作製し動物に導入するときの急速性である。しかし、同時にミニローカス法の著しい不利益は、理論的には、少数のV、D、およびJ遺伝子の導入では十分な多様性が導かれないことである。事実、発表された研究結果を見るとこの見解が裏付けられると思われる。ミニローカス法の使用により得られる動物のB細胞の発達と抗体生産は、抑制を受けているように思われる。そのため、本発明の周囲では、より大きな多様性を得るため、また動物の免疫レパートリーを再構成するため、大きなIg遺伝子座部位を導入することを一貫して目指してきた。
【００８６】
ヒト抗マウス抗体（HAMA）反応により、キメラ抗体または他のヒト化抗体の工業的な産生が導かれた。キメラ抗体はヒト定常領域とマウス可変領域とを有し、ある種のヒト抗キメラ抗体（HACA）反応が、特に抗体の慢性的または多数回投与での使用の際に認められるのではないかと予想される。ゆえにHAMAまたはHACA反応の問題および/または影響をなくすために、CTLA-4に対する完全ヒト抗体を提供することが望ましい。
【００８７】
ヒト化およびディスプレイ技術
ヒト抗体の作製についてこれまで議論してきたように、免疫原性を減少させた抗体を生産することには利点がある。これはある程度までは、適当なライブラリを用い、ヒト化技術およびディスプレイ技術を関連させて達成されうる。マウス抗体または他種由来の抗体を、当技術分野でよく知られている技術を用いてヒト化または霊長類化できることは認識されていると思われる。例えばウィンターとハリス（Winter and Harris）Immunol Today 14:43〜46(1993)およびライトら（Wright）Crit.Reviews in Immunol. 12:125〜168(1992)参照。重要な抗体は、CH1、CH2、CH3、ヒンジドメイン、および/またはフレームワークドメインを、対応するヒト配列に置換するために組換えDNA技術を用いて作製可能である（国際公開公報第92/02190号、および米国特許第5,530,101号、同第5,585,089号、同第5,693,761号、同第5,693,792号、同第5,714,350号、および同第5,777,085号参照）。また、Ig cDNAをキメラ免疫グロブリン遺伝子の構築に用いられることが当技術分野で知られている（リューら（Liu）P.N.A.S. 84:3439(1987)およびJ.Immunol.139:3521(1987)）。mRNAはハイブリドーマまたは抗体を産生する他の細胞から単離され、cDNAを作製するため用いられる。重要なcDNAは特異的なプライマーを利用してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅できる（米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号）。または、重要な配列を単離するためにライブラリを作製し、スクリーニングする。抗体の可変領域をコードするDNA配列をその後ヒト定常領域配列に融合する。ヒト定常領域遺伝子配列はカバットら（Kabat）（1991）の「免疫学的に重要なタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」、N.I.H.版番号91〜3242に見られる。ヒトC領域遺伝子は既知のクローンから容易に得られる。アイソタイプの選択は、望ましいエフェクター機能、例えば補体結合または抗体依存性の細胞障害活性などが指標となる。好ましいアイソタイプはIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4である。本発明の抗体に特に好ましいアイソタイプはIgG2およびIgG4である。ヒト軽鎖定常領域のκ型またはλ型のいずれかが用いられる。その後キメラのヒト化抗体を従来法により発現する。
【００８８】
Fv、F(ab')2、およびFabなどの抗体フラグメントは完全なタンパク質を、例えばプロテアーゼ、または化学的分解等により分解することで調製できる。または、切断された遺伝子をデザインする。例えば、F(ab')2フラグメントの一部をコードするキメラ遺伝子は、重鎖のCH1ドメインおよびヒンジ領域をコードするDNA配列に続いて、切断された分子を得るための翻訳終止コドンを含む。
【００８９】
あるアプローチにおいては、V領域セグメントのヒトC領域セグメントへの連結に引き続き、有用な制限部位をJ領域に導入するプライマーとして用いるためのオリゴヌクレオチドを設計するため、重鎖および軽鎖J領域をコードするコンセンサス配列が使用できる。C領域cDNAは、部位特異的変異誘発により、制限部位をヒト配列における位置と相似した位置にもつように改変できる。
【００９０】
発現ベクターにはプラスミド、レトロウイルス、コスミド、YAC、EBV由来のエピソームなどが含まれる。便利なベクターは、任意のVHまたはVL配列が容易に導入および発現できるように操作された適当な制限部位をもった、機能的に完全なヒトCHまたはCL免疫グロブリン配列をコードするものである。このようなベクターでは、導入されたJ領域のスプライス供与部位とヒトC領域に先行するスプライス受容部位との間で、またヒトCHエクソン内のスプライス領域でも、通常スプライシングが起きる。ポリアデニル化および転写終結が、コード領域の下流の本来の染色体上の部位において起きる。その結果生じたキメラ抗体がレトロウイルスLTR、例えばSV-40早期プロモーター（Okayamaら、Mol.Cell.Bio.3:280(1983)）、ラウス肉腫ウイルスLTR（Gormanら、P.N.A.S. 79:6777(1982)）、およびモロニーマウス白血病ウイルスLTR（Grosschedlら、Cell 41:885(1985)）；天然のIgプロモーター等を含む任意の強力なプロモーターに連結可能である。
【００９１】
さらに、ヒト抗体または他生物種由来の抗体は、ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、その他の技術を含むがこれらに限定されない、ディスプレイ型技術により、当技術分野においてよく知られている技術を用いて作製することが可能である。その結果生じる分子は、当技術分野においてよく知られている技術を用いるため、例えば親和性成熟のようなさらなる成熟を加えることができる。ライトおよびハリス（Wright and Harris）、前記、ヘインズおよびプルショー（Hanes and Plucthau）（PNAS USA 94:4937-4942(1997)）（リボソームディスプレイ）、パームレーおよびスミス（Palmley and Smith）（Gene 73:305〜318(1988)）（ファージディスプレイ）、スコット（Scott）（TIBS 17:241〜245(1992)）、クウィーラら（Cwirla）（PNAS USA 87:6378〜6382(1990)）、ラッセルら（Russel）（Nucl.Acids Research 21:1081〜1085(1993)）、ホガンブームら（Hoganboom）（Immunol.Reviews 130:43〜68(1992)）、チズウェルおよびマッカファーティー（Chiswell and McCafferty）（TIBTECH 10:80〜84(1992)）、および米国特許第5,733,743号参照。非ヒト抗体を産生させるためにディスプレイテクノロジーが利用される場合、そのような抗体は前述のようにヒト化することができる。
【００９２】
これらの技術を用い、抗体はCTLA-4発現細胞、CTLA-4自体、様々な形態のCTLA-4、そのエピトープまたはペプチドに対して、および、上述の活性に関する上述のスクリーニングが後に可能な発現ライブラリ（例；米国特許第5,703,057号参照）に対して産生することができる。
【００９３】
抗体療法のためのその他の判定基準
CTLA-4発現細胞を死滅させることは一般に望ましくないと考えられる。それよりはT細胞ダウンレギュレーションを緩和するために単にCTLA-4のリガンドとの結合を阻害する方が一般的に望ましい。抗体が細胞を死滅させる主なメカニズムの一つは補体の結合およびCDCへの参入によるものである。抗体の定常領域は、補体の結合およびCDCへの参入のための抗体の能力について重要な役割を担っている。このため、一般に補体の結合能を与える、または与えないよう、抗体のアイソタイプが選択される。本発明の場合、上述のように、細胞を死滅させる抗体を使用するのは一般的に好ましくない。補体結合およびCDCの能力を有するアイソタイプは数多く存在し、例えば限定はしないが、次のようなものがある：マウスIgM、マウスIgG2a、マウスIgG2b、マウスIgG3、ヒトIgM、ヒトIgG1、およびヒトIgG3である。これらのアイソタイプは、限定はしないが、ヒトIgG2、およびヒトIgG4は含まない。
【００９４】
生産された抗体が初めは特定の望ましいアイソタイプを有する必要はないが、その抗体が何らかのアイソタイプを有し、抗体が当技術分野においてよく知られる従来の方法を用いてその後アイソタイプを交換できると考えられる。そのような技術はとりわけ、直接的な組換え技術の使用（例：米国特許第4,816,397号参照）、細胞−細胞融合技術（例：1996年10月11日出願の米国特許出願第08/730,639号参照）を含む。
【００９５】
細胞−細胞融合技術においては、何らかの望ましいアイソタイプの重鎖を有する骨髄腫または他の細胞株、および軽鎖を有する他の骨髄腫または他の細胞株を調製する。このような細胞はその後融合され、完全な抗体を発現する細胞株が単離できる。
【００９６】
例として、本明細書において議論したCTLA-4抗体の多数はヒト抗CTLA-4 IgG2抗体である。このような抗体はCTLA-4分子への望ましい結合能を有するので、例えば同じ可変領域（その抗体の特異性とある程度の親和性を決定する領域）をまだ有するにも関わらず、そのような抗体のいずれもが容易にヒトIgG4アイソタイプにアイソタイプスイッチできる。
【００９７】
したがって、抗体候補が上述のような望ましい「構造的な」特質を満たすように作製されると、それらに少なくともある種の望ましいさらに別の「機能的な」特質をアイソタイプスイッチにより一般に付加することが可能である。
【００９８】
他の療法のデザインおよび作製
本発明に従い、産生され、本明細書にてCTLA-4に関する特徴を述べた抗体の活性に基づき、他の抗体、他のアンタゴニスト、または抗体以外の化学的成分を含む、他の治療様相のデザインが容易になる。このような様相には、限定はしないが、同様の結合活性または機能性をもつ抗体、進歩した抗体療法、例えば二重特異性抗体、イムノトキシン、および放射性同位元素標識療法、ペプチド療法の作製、遺伝子療法、特に体内におけるもの、アンチセンス療法、および低分子療法が含まれる。さらに、上述のように、本発明の抗体のエフェクター機能は様々な治療的用途のためにIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、またはIgMへのアイソタイプスイッチによる改変が可能である。
【００９９】
進歩した抗体療法の作製に関連して、そのような療法においては補体結合が望ましい特質の1つであるが、例えば二重特異性抗体や、イムノトキシン、または放射性同位元素等を用いることで、細胞を死滅させるための補体への依存性を回避することが可能になると考えられる。
【０１００】
二重特異性抗体に関連して、（i）一方はCTLA-4に対する特異性を有し、他方は一緒に接合する二次的分子に対する特異性を有するような２個の抗体、（ii）CTLA-4に対し特異的な第一の鎖と二次的分子に対して特異的な第二の鎖を有する１個の抗体、または（iii）CTLA-4および他の分子に対し特異性を有する単鎖抗体を含む二重特異性抗体が作製可能である。このような二重特異性抗体はよく知られている技術を用いて作製することができる。例えば、（i）（ii）に関してはフランガーら（Franger）（Immunol Methods 4:72〜81(1994)）およびライトとハリス（Wright and Harris）前記、および（iii）に関してはトローネッカーら（Traunecker）（Int.J.Cancer(Suppl.) 7:51〜52(1992)）参照。
【０１０１】
加えて、「カッパボディー」（Illら、 「重鎖および軽鎖可変領域の双方の特徴をもつハイブリッド免疫グロブリンドメインのデザインおよび構築（Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions）」 Protein Eng 10:949〜57(1997)）、「ミニボディー」（Martinら、「ヒトインターロイキン-6のミニボディーポリペプチドインヒビターの親和性選択（The affinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6）」 EMBO J 13:5303〜9(1994)）、「ダイアボディー」（Holligerら、「「ダイアボディー」：2価および二重特異性抗体断片（‘Diabodies': small bivalent and bispecific antibody fragments）」 PNAS USA 90:6444〜6448(1993)）、または「ジャヌシン」（Trauneckerら、「二重特異性単鎖分子（ジャヌシン）はHIV感染細胞の細胞障害性リンパ球を標的とする（Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells）」 EMBO J 10:3655〜3659(1991) および Traunecker「ジャヌシン：二重特異性試薬の新しい分子デザイン（Janusin: new molecular design for bispecific reagents）」 Int J. Cancer Suppl. 7:51〜52(1992)）もまた開発されている。
【０１０２】
イムノトキシンに関連して、抗体は当技術分野でよく知られる技術を用い、イムノトキシンとして作用するように改変することができる。 例えばVitetta Immunol Today 14:252(1993) 参照。米国特許第5,194,594号も参照のこと。放射性標識抗体の作製に関連して、このような改変された抗体もまた当技術分野でよく知られる技術を用いて容易に調製できる。ジャンガンズら（Junghans）の「癌の化学療法および生物学的療法（Cancer Chemotherapy and Biotherapy）」 655〜686 （第2版、ChafnerおよびLongo編、Lippincott Raven(1996)）参照。米国特許第4,681,581号、同第4,735,210号、同第5,101,827号、同第5,102,990号（RE 35,500）、同第5,648,471号、および同第5,697,902号も参照。イムノトキシンと放射性標識分子の各々がCTLA-4発現細胞、特に本発明の抗体が有効であるような細胞を死滅させる可能性が高いと考えられる。
【０１０３】
治療的ペプチドの作製に関連して、CTLA-4、および本発明の抗体のようなそれに結合する抗体（下記に低分子に関して記載するもの）に関する構造的情報、またはペプチドライブラリのスクリーニングを用いて、CTLA-4に対して指向される治療的ペプチドを生産できる。ペプチド療法のデザインとスクリーニングはホーテンら（Houghten）（Biotechniques 13:412〜421(1992)）、ホーテン（Houghten）（PNAS USA 82:5131〜5135(1985)）、ピナラら（Pinalla）（Biotechniques 13:901〜905(1992)）、ブレークおよびリッツィデヴィス（Blake and Litzi〜Davis）（BioConjugate Chem.3:510〜513(1992)）に関して議論されている。イムノトキシンおよび放射性標識分子もまた、同様の方法で、上述のような抗体関連のペプチド成分について作製可能である。
【０１０４】
ある抗体がある抗原に結合することに関しての重要な情報はファージディスプレイ試験によって収集できる。そのような試験は一般に、結合するペプチドが単離できるか否かを決定するため、本発明の抗体と結合するための任意のペプチドを発現するファージライブラリーをパニングすることにより達成される。もし成功すればその結合したペプチドからあるエピトープ情報が得られる。
【０１０５】
一般に、ランダムなペプチドを発現しているファージライブラリはニュー・イングランド・バイオラブズ社（New England Biolabs）から、バクテリオファージM13系に基づいて（7量体および12量体ライブラリ、Ph.D.-7ペプチド7量体ライブラリキット、およびPh.D.-12ペプチド12量体ライブラリキットの各々）購入できる。7量体ライブラリは約2.0×109の独立したクローンの多様性を示し、全てではないにしても最大で207=1.28×109の可能な7量体配列を表す。12量体ライブラリは約1.9×109の独立したクローンをもち、これは想定される2012=4.1×1015の12量体配列のうち、ほんの一部である。7量体および12量体ライブラリの各々はパニング法を実施する、またはスクリーニングされるが、その手順は製造業者の指示に従い、適当な抗体（例えばIgG抗体に対するヤギ抗ヒトIgG Fc）を捕らえるためにプレートを抗体で覆い、洗浄する。結合したファージは0.2M グリシン-HCl、pH2.2により溶離される。一定のストリンジェンシー（0.5％トゥイーン液）において3反復、選別/増殖した後、DNA配列決定により、そのライブラリから1個以上の抗体に反応性を有するクローンを特定することができる。ペプチドの反応性はELISA法により定量できる。ペプチドのエピトープ分析についてのその他の議論は、スコットおよびスミス（Scott,J.K. and Smith）G.P. Science 249:386〜390(1990)；クウィーラら（Cwirla）PNAS USA 87:6378〜6382(1990)；フェリッチら（Felici）J.Mol.Biol. 222:301〜310(1991)；およびクワバラら（Kuwabara）Nature Biotechnology 15:74〜78(1997)を参照のこと。
【０１０６】
遺伝子および/またはアンチセンス治療薬の従来技術によるデザインもまた、本発明により容易になる。このような様相はCTLA-4の機能を調整するために利用可能である。本発明の抗体によりデザインおよびそれに関連する機能的アッセイ法の利用が容易になる。アンチセンス治療薬のデザインおよび方法は、国際特許出願・国際公開公報第94/29444号にて詳しく検討されている。遺伝子療法のデザインおよび方法についてはよく知られている。しかし、特に体内での遺伝子療法の技術の使用はとりわけ有益であることが示されている。例としてチェンら（Chen）Human Gene Therapy 5:595〜601(1994)およびMarasco Gene Therapy 4:11〜15(1997)を参照のこと。遺伝子療法の一般的なデザインとそれに関連する考え方はまた国際特許出願・国際公開公報第97/38137号において検討されている。本発明の抗体をコードする遺伝子材料（例えば4.1.1、4.8.1、または6.1.1またはその他）は適当な発現系（ウイルス性、弱毒化したウイルス性、非ウイルス性、裸のDNA（naked）、またはその他の系）に組み入れられ、宿主における抗体のインビボ生産を目的として宿主に投与することが可能である。
【０１０７】
また本発明に従った低分子治療薬も考えられる。本発明を基盤としてCTLA-4活性を調節するための薬剤をデザインできる。CTLA-4分子の構造と、本発明に従う他の分子、例えば本発明の抗体、CD28、B7、B7-1、B7-2等との相互作用から得られる知識を用いて、その他の療法の様相を合理的にデザインすることができる。この点で、合理的な薬物デザイン技術、例えばX線結晶学、コンピューター使用（または支援）分子モデル解析（CAMM）、量的または質的構造−活性相関解析（QSAR）、および同様の技術を新たな薬剤の開拓に焦点をあてて利用できる。合理的デザインにより、CTLA-4の活性を改変または調節するために使用できる分子またはその特定の形態と相互作用できるタンパク質または合成された構造物を予測することができる。そのような構造物は化学的に、または生物的系において発現させることで合成可能である。このアプローチはキャプシーら（Capsey）の「遺伝学的操作によるヒトの治療的薬物（Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs）」（Stockton Press, NY(1988)）で再検討されている。実際に、既知の、または明らかになった、他の分子（例えば本発明に係る抗体）との構造−活性相関に基づいた、分子（ペプチド、ペプチド模倣物、低分子、または同様のもののいずれか）の合理的デザインは、一般に定常的なものとなってきている。フライら（Fry）「新しいクラスのチロシンキナーゼインヒビターによる、上皮増殖因子受容体およびerbB2の特異的・不可逆的不活性化（Specific, irreversible inactivation of the epidermal growth factor receptor and erbB2, by a new class of tyrosine kinase inhibitor）」 Proc Natl Acad Sci U S A 95:12022〜7(1998)；ホフマンら（Hoffman）「ロダネーゼ相同ドメインの存在を基盤にしたCdc25ホスファターゼ触媒ドメインおよびCdk相互作用表面モデル（A model of Cdc25 phosphatase Catalytic Domain and Cdk-interaction surface based on the presence of a rhodanese homology domain）」 J Mol Biol 282:195〜208(1998)；ジナルスキら（Ginalski）「プロテインキナーゼ：p38活性型のモデリング−ケース・スタディ（Modelling of active forms of protein kinases:p38--a case study）」 Acta Biochim Pol 44:557〜64(1997)；ジューコら（Jouko）「cskチロシンリン酸化部位の決定およびキナーゼドメイン構造に重要なチロシン残基（Identification of csk tyrosine phosphorylation sites and a tyrosine residue important for kinase domain structure）」 Biochem J 322:927〜35(1997)、シンら（Singh）「プロテインチロシンキナーゼのerbB受容体サブファミリーの触媒ドメインの有効、選択的および不可逆なインヒビターの構造に基づいたデザイン（Structure-based design of a potent, selective, and irreversible inhibitor of the catalytic domain of the erbB receptor subfamily of protein tyrosine kinases）」 J Med Chem 40:1130〜5(1997)、マンデルら（Mandel）「ABGEN：抗体構造モデリングの知識に基づいた自動化アプローチ（ABGEN: a knowledge-based automated approach for antibody structure modeling）」 Nat Biotechnol 14:323〜8(1996)、モンファルディーニら（Monfardini）「GM-CSFアンタゴニストの合理的デザイン、解析および潜在的な用途（Rational design, analysis, and potential utility of GM-CSF antagonists）」 Proc Assoc Am Physicians 108:420〜31(1996)、フュレットら（Furet）「プロテインキナーゼインヒビターのモデリング研究：スタウロスポリンの結合形態およびCGP52411の選択性の原因（Modelling study of protein kinase inhibitors: binding mode of staurosporine and origin of the selectivity of CGP 52411）」 J Comput Aided Mol Des 9:465〜72(1995)参照。
【０１０８】
さらに、高処理量スクリーニングのようなスクリーニングプログラムにおいては、コンビナトリアル・ライブラリがデザイン、合成され、使用できるようになっている。
【０１０９】
治療的投与および剤型化
本発明に従う治療単位は、移動性、輸送性、耐性などを改善するために適切な担体、賦形剤、およびその他の物質を組み込んだ剤型として投与されるものと考えられる。適切な剤型の多くは全ての製剤学化学者に知られる処方集：「レミントンの製剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」 第15版、Mack Publishing Company、Easton、PA(1975)）、特にブローグ（Blaug）、シーモア（Seymour）による第87章中に見られる。これらの剤型は例えば、散剤、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオンまたはアニオン）を含む小胞（例えばリポフェクチン（Lipofectin)(商標)）、DNA結合体、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型の乳剤、乳剤カーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固形ジェル、およびカーボワックスを含有する半固形混合物等を含む。製剤中の活性成分が製剤の形をとることで不活性化せず、その製剤が物理的に投与経路に適合し、認容されれば、前述の混合物は本発明に従う治療と療法に適当であるといえる。パウエルら（Powell）「非経口製剤の賦形剤概論（Compendium of excipients for parenteral formulations）」 PDA J Pharm Sci Technol.52:238〜311(1998)も参照。製剤学化学者に広く知られる賦形剤および担体に関するその他の情報についてはこれに記載の文献を参照のこと。
【０１１０】
抗体の調製
本発明に係る抗体は好ましくは、導入されたヒト抗体産生ゲノムの実質的な部分を有するが、内因性のマウス抗体産生能を欠損させたトランスジェニックマウスを用いて調製される。そこでそのようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を生産することが可能であり、マウス免疫グロブリン分子および抗体は生産しない。同様の結果を得るために用いられる技術は、本明細書の特許、出願、および背景中の参照に開示されている。しかし、特に、マウスおよび抗体のトランスジェニック産生の好ましい態様については、1996年12月3日出願の米国特許出願第08/759,620号にて開示されており、それらは本明細書に参照として組み込まれる。また、本明細書に参照として組み込まれるメンデスら（Mendez）Nature Genetics 15:146〜156(1997)も参照のこと。
【０１１１】
このような技術を用いて、本発明者らは多様な抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体を産生した。本質的に、本発明者らはマウスのゼノマウス（XenoMouse（商標））系列を目的の抗原により免疫化し、抗体を発現するマウスのリンパ細胞（B細胞など）を回収し、その回収した細胞と骨髄細胞タイプの細胞株とを融合して固定的ハイブリドーマ細胞株を作製し、該ハイブリドーマ細胞株を、目的の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定するためにスクリーニングおよび選択する。本発明者らは本発明に従ったこれらの技術をCTLA-4に特異的な抗体の調製に用いた。本明細書では本発明者らはCTLA-4に特異的な抗体を産生する多数のハイブリドーマ細胞株の作製について説明する。さらに、本発明者らはそのような細胞株から産生される抗体について、その抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列解析等により特性解析している。  
【０１１２】
本明細書において議論される、ハイブリドーマ細胞株由来の抗体を3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1、および12.9.1.1と称する。前記の細胞株により産生された各抗体は完全ヒトIgG2またはIgG4のいずれかの重鎖とヒトκ軽鎖とを有するものである。一般に、本発明に係る抗体は非常に高い抗原親和性をもち、固相または液相により測定した場合、典型的には約10-9から約10-11ＭのＫｄ値を有する。
【０１１３】
認識されるように、本発明に係る抗体はハイブリドーマ細胞株以外の細胞株で発現できる。特定の抗体のcDNAをコードする配列またはゲノムクローンは、適切な哺乳類または非哺乳類の宿主細胞の形質転換に用いることができる。形質転換は、例えばポリヌクレオチドをウイルス（またはウイルスベクター）に封入し、ウイルス（またはベクター）により宿主細胞に形質導入させる手法、または米国特許第4,399,216号、同第4,912,040号、同第4,740,461号、および同第4,959,455号（これらは本明細書に参照として組み込まれる）に示されているような当技術分野で知られているトランスフェクション法を含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の公知の方法によって行うことができる。使用される形質転換の方法は形質転換すべき宿主に依存する。異種ポリヌクレオチドを哺乳類の細胞に導入する方法は当技術分野で周知であり、限定はしないが、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降法、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リポソームでのポリヌクレオチドのカプセル化、ペプチドの結合、デンドリマー、および核へのDNAの直接的マイクロインジェクション法を含む。
【０１１４】
発現のための宿主として利用可能な哺乳類の細胞株は当技術分野でよく知られており、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）から得られる多くの固定された細胞株、限定はしないが例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）、NSO0、ヒーラ（HeLa）細胞、胎仔ハムスター腎臓（BHK）細胞、サル腎臓細胞（COS）、ヒト肝癌細胞（例：HepG2）、および多数の他の細胞株を含む。限定ではないが、細菌、酵母、昆虫類、および植物を含む非哺乳類細胞もまた、組換え抗体の発現に利用することができる。非ヒトグリコシル化の結果、免疫原性、薬物動態性、および/またはエフェクター機能のいずれかが変化してしまうことを避けるために、グリコシル化を除去するような抗体CH2ドメインの部位特異的突然変異誘発が好ましいと考えられる。発現の方法はどの系が最も高い発現レベルを示し、構成的なCTLA-4結合特性を有する抗体を産生するか測定することにより選択される。
【０１１５】
さらに、産生細胞株からの本発明の抗体（またはそこから得られる他の成分）の発現は、多くの公知の技術を用いて増強することが可能である。例えば、グルタミンシンテターゼおよびDHFR遺伝子の発現系は、ある条件下での発現を増強する一般的なアプローチ法である。高度な発現細胞クローンは従来法、例えば限界希釈クローニング法やマイクロドロップ法を用いて決定することが可能である。GS系は欧州特許第0 216 846号、同第0 256 055号、および同第0 323 997号および欧州特許出願第89303964.4号に関して、その全体または一部で検討されている。
【０１１６】
本発明の抗体はまた、目的の免疫グロブリンの重鎖および軽鎖配列についてトランスジェニックである哺乳動物または植物を作製し、回収可能な形態で抗体を産生させることによって、トランスジェニック技術により生産することができる。哺乳類におけるトランスジェニック生産に関連して、ヤギ、ウシ、または他の哺乳類の乳汁から抗体を生産し、回収することができる。米国特許第5,827,690号、同第5,756,687号、同第5,750,172号、および同第5,741,957号参照。
【０１１７】
本発明に係る抗体は構造的および機能的に解析されている。この抗体の構造に関連して、重鎖およびκ軽鎖のアミノ酸配列は、ハイブリドーマのRT-PCRにより得られたcDNA配列に基づき推定された。実施例3および4ならびに図1〜8を参照のこと。実施例3および4で議論された結果の確証を得るためにこの抗体のＮ末端配列決定も行った。実施例5および図9参照。抗体の動力学的解析を、親和性を測定するために行った。実施例2参照。本発明に係る抗体（特に本発明の4.1.1、4.8.1、および6.1.1抗体）は高い親和性を有する（4.1.1：1.63×1010 l/M；4.8.1：3.54×1010 l/M；および6.1.1：7.2×109 l/M）。さらに抗体を、等電点電気泳動（IEF）、還元ゲル電気泳動（SDS-PAGE）、サイズ排除クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー/質量分析、および質量分析によって分析し、ハイブリドーマによる抗体産生を評価した。実施例6および図10参照。
【０１１８】
本発明に係る抗体の機能的分析に関して、このような抗体は有効なCTLA-4阻害剤であり、そのリガンドであるB7ファミリーの分子と結合することが証明された。例えば、本発明に係る抗体はCTLA-4がB7-1またはB7-2のいずれかに結合するのをブロックすることが示された。実施例7参照。実際、本発明に係る抗体の多くがCTLA-4のB7-1やB7-2への結合阻害に関して、ナノモルおよびナノモル以下のIC50を有する。さらに、本発明の抗体は、CD28、CD44、B7-2、またはｈIgG1に比較してCTLA-4に対する著しい選択性を有する。実施例8参照。選択性はある分子の第一の物質に対する優先的な結合の程度を、第二の分子と結合した分子、および任意に他の分子と比較して表す比率である。本明細書では選択性は本発明の抗体のCTLA-4への優先的な結合の程度を、CD28、CD44、B7-2、またはhIgG1などの他の分子への抗体の結合と比較して表す。本発明の抗体の選択性の値は共通に500：1以上である。本発明の抗体はまた、T芽細胞モデルにおいて培養T細胞により、あるサイトカイン（IL-2およびIFN-γ等）の発現を誘導または増強することが示された。実施例9および実施例10ならびに図12〜17参照。さらに、本発明の抗体は適当なインビボ腫瘍モデルにおいて腫瘍の成長を阻害することが期待される。そのモデルのデザインについては実施例11および12で検討されている。
【０１１９】
本発明に従って示された結果から、本発明の抗体が、CTLA-4に対して今日治療に用いられている抗体よりもより有効となりうるある性質を備えるものであることが示される。
【０１２０】
特に、本発明の4.1.1、4.8.1、および6.1.1抗体は、非常に望ましい特性を有する。それらの構造的特徴、機能、または活性により、上述のようにその他の抗体または他の分子のデザインまたは選択を容易にする判断基準が提供される。このような判断基準は下記の項目の一つ以上を含む：
1個以上の本発明の抗体とCTLA-4への結合について競合する能力；
1個以上の本発明の抗体と同様のCTLA-4への結合特異性；
約10-9M以上の、好ましくは約10-10M以上のCTLA-4に対する結合親和性；
好ましくはマウス、ラット、またはウサギを含む下等哺乳類のCTLA-4、好ましくはマウスまたはラットのCTLA-4に交叉反応性を有さない；
好ましくはマカクザルおよびアカゲザルのCTLA-4を含む霊長類のCTLA-4に交叉反応性を有する；
CD28、B7-2、CD44、またはhIgG1に比較して少なくとも約100：1以上、好ましくは約300、400、または500：1以上のCTLA-4に対する選択性；
CTLA-4のB7-2への結合をブロックするIC50が約100nM以下、好ましくは5、4、3、2、1、0.5、または0.38nM以下である；
CTLA-4のB7-1への結合をブロックするIC50が約100nM以下、好ましくは5、4、3、2、1、0.5または0.50nM以下である；
1個以上のインビトロアッセイ法におけるサイトカイン産生の増強、例えば：
T芽細胞/ラージアッセイ法においてIL-2産生の増強が約500pg/ml以上、好ましくは750、1000、1500、2000、3000、または3846pg/ml以上である；
T芽細胞/ラージアッセイ法においてIFN-γ産生の増強が約500pg/ml以上、好ましくは750、1000、または1233pg/ml以上である；
または
hPBMCまたは全血スーパー抗原アッセイ法においてIL-2産生の増強が約500pg/ml以上、好ましくは750、1000、1200、または1511pg/ml以上である。言いかえると、IL-2産生がこのアッセイ法における対照と比較して約30、35、40、45、50％以上増強されるのが望ましい。
【０１２１】
これらのうち1個以上の性質を備えている抗体（またはそれからデザインまたは合成された分子）は、本発明に記載されている抗体と同様の効果を有することが予期される。
【０１２２】
上述の望ましい機能的性質により、本発明の抗体と同様の方法で（すなわちCTLA-4分子の同一または同様のエピトープに結合することで）、ある分子（すなわち抗体、抗体フラグメント、ペプチド、または低分子）によるCTLA-4への結合と阻害がしばしば起こりうる。分子は直接投与も可能である（すなわち患者にそのような分子を直接投与する）。または、分子を間接的に「投与」することもできる（すなわち、同一もしくは同様のエピトープに結合する抗体の産生、または同一もしくは同様のエピトープに結合する該抗体もしくはその断片をコードする遺伝的物質の投与後にインサイチューで生産される抗体もしくは断片の産生を含む免疫応答を、被験者の体内で生じさせる（ワクチンに類似した）ペプチドなど）。そのため、本発明の抗体が結合するCTLA-4上のエピトープは、本発明に係る治療薬の調製および/またはデザインに関して有用であることが認識されると思われる。薬物デザインにおいては、否定的な情報もまたしばしば有用である（すなわち、CTLA-4に結合するある抗体がCTLA-4の阻害剤として作用するあるエピトープに結合しないようである、という事実は有用である）。このため、望ましい機能性が得られないような、本発明の抗体が結合するエピトープもまた非常に有用である。したがって、本発明の抗体と同一または同様のエピトープに結合する分子（特に抗体）も本発明に従って企図される。
【０１２３】
本発明の抗体とそれらが結合するエピトープが本発明に従って企図されることに加え、本発明者らは本発明に従ったある抗体、特に本発明の4.1.1および11.2.1抗体に関して多少の予備的なエピトープマッピング試験を行った。
【０１２４】
第一の段階として、本発明者らはBIAcore競合試験を実施し、CTLA-4への結合について本発明のある抗体間で競合する能力に関連させて、結合の大まかなマップを作製した。このために、CTLA-4はBIAcoreチップに結合し、第一の抗体が飽和条件下でそこに結合し、引き続きCTLA-4に結合する第二の抗体の競合力を測定した。この技術により、どの抗体ファミリーが分類できるかについての大まかなマップを作製することができた。
【０１２５】
この過程により、本発明者らは本発明に従うある抗体は下記のようなエピトープカテゴリーに区分できると結論した：
【表１】
2005087215.tif 000003
（＊）（＊＊）バイオストライド社（Biostride）から入手可
（＊＊＊）ファーミンゲン社（Pharmingen）から入手可 
【０１２６】
次の段階として、本発明者らは本発明の抗体がCTLA-4上の線状エピトープを認識するか否か、還元条件下および非還元条件下でのウェスタンブロット法により決定することを試みた。本発明者らは、本発明の4.1.1、3.1.1、11.7.1、11.6.1、または11.2.1のいずれの抗体も、ウェスタンブロット上の還元された形態のCTLA-4を認識しないらしいことを観察した。したがって、これらの各抗体が結合するエピトープは線状エピトープではなく、還元条件により無効にされる構造形態をもったエピトープである可能性が高いことが示された。
【０１２７】
このため、本発明者らは本発明の抗体の結合に重要であるCTLA-4分子内の残基について研究を試みた。本発明者らが用いた一つの方法は、ヒトCTLA-4分子と高度に保存された2個の霊長類CTLA-4分子（マカクザルおよびマーモセットCTLA-4）との間での解離比率の動力学的評価を行うことであった。BIAcore試験により、本発明の4.1.1抗体はヒト、マカクザル、およびマーモセットのCTLA-4に同じ比率で結合することが示された。しかし、解離比率（親和性）に関して、4.1.1抗体はヒトに対し最も高い親和性（最も遅い解離比率）を有し、マカクザルに対してはより速い解離比率、マーモセットに対してはさらに速い解離比率を示した。一方本発明の11.2.1抗体は、ヒト、マカクザル、およびマーモセットCTLA-4にほぼ同様な比率で結合し、3つのそれぞれに対してほぼ同様の解離比率を示した。この情報から、本発明の4.1.1および11.2.1抗体は、CTLA-4上の異なるエピトープに結合することがさらに示される。
【０１２８】
本発明のカテゴリーBおよびCの抗体がどのエピトープに結合するかさらに研究するため、本発明者らは部位特異的突然変異誘発試験を実施した。マーモセットCTLA-4はヒトCTLA-4と比して、残基105および106において2個の重要な差異が認められる。それは残基105におけるロイシンからメチオニンへの置換と、残基106におけるグリシンからセリンへの置換である。したがって本発明者らは、ヒトCTLA-4をコードするcDNAを、L105MおよびG106S変異を有するような変異型CTLA-4をコードするよう変異させた。相同的置換変異体CTLA-4はB7.2-IgG1融合タンパク質の結合に影響がなかった。さらに、本発明の11.2.1抗体との結合にも影響がなかった。しかし、そのような分子は本発明の4.1.1抗体との結合能が有意に阻害された（マーモセットCTLA-4と同様）。次に本発明者らは、S106G変異を有する変異体マーモセットCTLA-4を作製するため、マーモセットCTLA-4をコードするcDNAを変異させた。そのような改変により、4.1.1抗体とマーモセットCTLA-4変異体との間における安定した結合が保存される結果となった。加えて本発明者らは、M105L置換を有する変異体マーモセットCTLA-4を作製するため、マーモセットCTLA-4をコードするcDNAを変異させた。このような改変により、4.1.1抗体と変異体CTLA-4との間の結合は部分的に保存された。
【０１２９】
カテゴリーBからDの本発明の各抗体は、同様の機能的特性を備え、強力な抗CTLA-4治療的作用物質として機能する潜在性があると考えられる。さらに、各分子はCTLA-4に対する結合に関して確実に交叉競合する。しかし上述の議論から認められるように、異なるカテゴリーに属する各分子はCTLA-4上の独立した構造のエピトープに結合すると考えられる。
【０１３０】
前述から、先に議論されたエピトープ情報は、本発明の抗体と交叉競合する抗体（または上述された他の分子）が、本発明に従い、ある治療効果的な潜在性がある可能性が高いことを示唆していると考えられる。さらに、本発明の抗体と交叉競合（すなわちカテゴリーB、Cおよび/またはD抗体と交叉競合）する抗体（または上述された他の分子）は、本発明に従って、ある付加的な治療効果的な潜在性がある可能性が高いと予期される。加えて、本発明の抗体と交叉競合（すなわちカテゴリーB、Cおよび/またはD抗体と交叉競合）し、且つ（i）マーモセットCTLA-4に対する結合を減弱していない（11.2.1抗体と同様）または（ii）マーモセットCTLA-4に対する結合を減弱した（4.1.1抗体と同様）抗体（または上述された他の分子）は、本発明に従ってある種の付加的な治療効果的な潜在性を備える可能性が高いと予期される。カテゴリーAおよびEのものと競合する抗体（または上述された他の分子）もまた、ある治療効果的な潜在性を有すると考えられる。
【０１３１】
実施例
実施した実験と得られた結果を含む下記の実施例は、例証する目的のためにのみ提供されるものであり、本発明を制限するものと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１３２】
抗CTLA-4抗体産生ハイブリドーマの作製
本発明の抗体は、本実施例に従って調製、選択、および分析された。
【０１３３】
抗原の作製：
ゼノマウス（XenoMouse（商標））マウスの免疫化のために、3種の別々の免疫抗原が調製された：（i）CTLA-4-IgＧ融合タンパク質；（ii）CTLA-4ペプチド；および（iii）細胞膜上で構成要素として発現している、CTLA-4の変異体（Y201V）でトランスフェクションされた300.19マウスリンパ腫細胞。
（i）CTLA-4-IgG1融合タンパク質：
発現ベクターの構築：
ヒト胸腺cDNAライブラリ（Clontech）から、CTLA-4の成熟細胞外ドメインをコードするcDNAを、公開された配列に対して設計されたプライマーを用いてPCR増幅した（Eur. J  Immunol  18:1901〜1905(1988））。断片を、シンドビスウイルス発現プラスミドであるpSR5（InVitrogen）内の、ヒトオンコスタチンＭシグナルペプチドとヒトIgGγ1（IgG1）CH1/CH2/CH3ドメインとの間に、方向性を持つようにサブクローニングした。融合タンパク質はヒンジドメインを含まないが、CTLA-4の細胞外ドメイン内にシステイン120を含み、共有結合二量体を形成する。結果として得られたベクターをCTLA-4-IgG1/pSR5と命名した。ベクター内の完全なCTLA-4-IgG1 cDNA配列は両方のDNA鎖において確認された。CTLA4-Igタンパク質のアミノ酸配列を以下に示す。CD44の成熟細胞外ドメインを、ヒトリンパ球ライブラリ（Clontech）からPCR増幅し、同一のIgG1末端を有する対照タンパク質を作製するため、pSinRep5内にサブクローニングした。
OM-CTLA-4-IgG1融合タンパク質：
2005087215.tif 000004
下線：シグナルペプチド
太字：CTLA-4細胞外ドメイン
【０１３４】
CD28の成熟細胞外ドメインのcDNAが、ヒトリンパ球ライブラリ（Clontech）からPCR増幅され、その後トロンビン切断部位およびヒンジ部位の両方を併せ持つヒトIgG1融合タンパク質を作製するため、pCDM8内にサブクローニングされた（J.Immunol. 151:5261〜71(1993)）。マーモセット、マカクザル、およびアカゲザルのCTLA4が、PHAに刺激されたPBMCから単離されたmRNAから、一般的な縮重PCRの技術を用いてクローニングされた。配列決定により、アカゲザルとマカクザルのアミノ酸配列は、ヒト成熟CTLA4細胞外ドメインとの3つの同一な差異（S13N、I17TおよびL105M）を共通に備えていることが示された。マーモセットの配列はヒト成熟CTLA4細胞外ドメインとの10のアミノ酸の差異（V21A、V33I、A41T、A51T、54I、S71F、Q75K、T88M、L105MおよびG106S）をもつことが示された。部位特異的突然変異誘発を用いて、その抗体とヒトCTLA4-IgGとの相互作用に重要なアミノ酸のマッピングのために、マーモセットCTLA4における全ての異なるアミノ酸の単独点変異を行った。エピトープマッピングのためのヒトCTLA4-IgGおよびマーモセットCTLA4-IgGの突然変異は、マッチメーカー部位特異的突然変異誘発システム（matchmaker site-directed mutagenesis）（Promega）により引き起こされた。IgG融合タンパク質はCos7細胞の一過的トランスフェクションにより作製され、一般的なプロテインA技術を用いて精製された。免疫ブロット法とBIAcore分析法により、変異CTLA4-IgGタンパク質の、抗体に対する結合性を評価した。
【０１３５】
組換えタンパク質発現/精製：
インビトロゲン（InVitrogen）により説明された通りに、ベビーハムスター腎臓細胞（Baby Hamster Kidney cells）へのCTLA-4-IgG1/pSR5 mRNAおよびDH-26SヘルパーmRNAがインビトロで転写されたSP6のエレクトロポレーション（Gibco）を行い、組換えシンドビスウイルスを作製した。48時間後、組換えウイルスを収集し、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO-K1）内で最適なタンパク質発現を行わせた（titered）。CHO-K1細胞を、10％の熱不活性化ウシ胎児血清（Gibco）、非必須アミノ酸（Gibco）、4ｍMグルタミン（Gibco）、ペニシリン/ストレプトマイシン（Gibco）、10mM ヘペスpH7.5（Gibco）を含むDMEM/F12（Gibco）の懸濁液中で培養した。CTLA-4-IgＧを作製するため、CHO-K1細胞をDMEM/F12中に1×107細胞/mlで再懸濁し、シンドビスウイルスと共に室温で１時間培養した。その後、細胞を、プロテインAセファロース（Pharmacia）を用いてウシIgGを欠乏させた1％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、4ｍMグルタミン、12.5mM ヘペスpH7.5、およびペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM/F12中で、1mlあたり1×106となるまで希釈した。48時間感染させた後の細胞をペレット化し、馴化培地を収集して、pHが7.5に調整された完全タンパク質分解酵素抑制剤（Boehringer Mannheim）を添加し、さらに0.2μ（Nalgene）で濾過した。FPLC（Pharmacia）により、5mlのプロテインAハイトラップ（HiTrap）カラム（Pharmacia）を使用した、流速10ml/分における融合タンパク質のアフィニティー精製を行った。カラムを30ベッド容量のPBSで洗浄し、0.1Mグリシン/HCl、pH2.8により1ml/分において溶出させた。pH9のTrisにより、分画1mlを直ちにpH7.5まで中和した。CTLA-4-IgG1を含む分画をSDS‐PAGEにより同定し、その後PBSを溶媒とした、1ml/分におけるセファロース200カラム（Pharmacia）への適用の前に、セントリプラス（centriplus）50（Amicon）を用いて濃縮した。CTLA-4-IgG1を含む分画を保存し、0.2μ（Millipore）で滅菌濾過し、分注して-80℃で冷凍した。CD44-IgG1が発現し、同様の方法により精製された。CD28-IgGは一過的にトランスフェクションされたCos7細胞から得た馴化培地から精製された。
【０１３６】
CTLA-4-IgG1の特徴付け：
精製されたCTLA-4-IgG1は、コロイドクーマシー染色（Novex）を用いたSDS-PAGEにおいて、シングルバンドとして泳動した。非還元的条件下では、CTLA-4-IgG1は二量体（100kDa）であり、50mMのDTTで処理されると50kDaの単量体に還元された。溶液中の、精製されたCTLA-4-IgG1のアミノ酸配列決定により、CTLA-4のＮ末端配列（MHVAQPAVVLAS）およびオンコスタチン-Mシグナルペプチドが成熟した融合タンパク質から切り出されることが確証された。
【０１３７】
CTLA-4-IgG1は濃度依存的に固定化B7.1-IgGに結合し、結合はハムスター抗ヒト抗CTLA-4抗体（BNI3:PharMingen）により阻害された。無菌CTLA-4-IgGはエンドトキシンを含まず、吸光係数を1.4としてOD280により定量した。精製されたCTLA-4-IgGの収量はCHO-K1細胞1リットルあたり0.5mg〜3mgの間の範囲であった。
【０１３８】
（ii）CTLA-4ペプチド：
以下のCTLA-4ペプチドは後述のように調製された：
2005087215.tif 000005
【０１３９】
略語/材料：
NMP、N-メチルピロリジノン；TFE、2,2,2-トリフルオロエタノール；DCM、ジクロロメタン；FMOC、フルオレニルメトキシカルボニル。後述の例外を除き、全ての試薬はパーキンエルマー社（Perkin Elmer）から提供された：TFE、アルドリッチケミカル社（Aldrich Chemical）、FMOC-PAL-PEG樹脂、パーセプティブバイオシステムズ社（Perseptive Biosystems）。FMOC-Arg(PMC)-OH、FMOC-Asn(Trt)-OH、FMOC-Asp(tBu)-OH、FMOC-Cys(Trt)-OH、FMOC-Glu(tBu)-OH、FMOC-Gln(Trt)-OH、FMOC-His(Boc)-OH、FMOC-Lys(BOC)-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、FMOC-Thr(tBu)-OH および FMOC-Tyr(tBu)-OHを、側鎖保護基要求性の（requiring side chain protecting groups）アミノ酸のため使用した。
【０１４０】
ペプチド合成：
301nmにおけるUV吸光度によるフィードバックモニター（パーキンエルマーモデル（Perkin Elmer）759A検出器）を後付けしたパーキンエルマー（Perkin Elmer）431Aを用いて、ペプチド合成を行った。条件付きダブルカップリング周期を用いて、ペプチド配列をFMOC-PAL-PEG樹脂上で組み立てた。強制ダブルカップリングは10、11、18、19、20、および28から33の周期に行った。各々のアシル化サイクルの終了時に樹脂をDCMおよびTFEの50％混合物で洗浄し、その後NMP中で未反応のアミノ基を無水酢酸でキャップした。49周期が完了した後に樹脂を反応装置から取り除き、残りは終了するまで続けた。415mgの樹脂において、試薬K（Kingら、 International Journal of Protein and Peptide Research 36:255〜266(1990)）を用いて樹脂からのペプチド分割を６時間実施し、186mgの粗CTLA-4ペプチドを得た。
【０１４１】
ペプチドの特徴付け：
粗CTLA-4のアリコート25mgを、5mlの6Mグアニジン塩酸/100mM K2PO3 pH6.4中に溶解させ、ファルマシアハイロードスーパーデックス75 16/60カラム（Pharmacia Hi Load Superdex 75 16/60 column）（16mm×600mm、ベッド容量120ml）を用いて、pH6.4の2Mグアニジン塩酸/100mM K2PO3 で流速2ml/分、180分間溶出させ、5mlの画分を得た。画分1.7μlをNuPAGEラーメリゲル（NuPAGE Laemeligel）にロードしてMES流出緩衝液と共に流し、ダイチイ銀染色プロトコル（Daichii silver stain protocol）により視覚化することによって、画分を分析した。分子量標準から判断して、12KDaの分子量を示した画分を共に貯蔵し、4℃で保存した。混ぜ合わせた画分をUVおよびゲル電気泳動により分析した。100μlのサンプルをプロソーブカートリッジ（ProSorb cartridge）に吸収させ（PVDF膜に吸収させ）、緩衝塩を取り除くため洗浄して、アミノ酸配列決定を行った。配列決定はアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）420により行った。予想されたN末端配列（MHVAQPAVVLA）が認められた。免疫ブロット法により、ペプチドはBNI3抗ヒトCTLA-4（PharMingen）により認識されることが示された。脱塩のために、648μgの材料を含むアリコートを3500Da MWCO透析チューブ（MWCO dialysis tubing）に入れ、0.1％TFA/水に対し4℃で9日間撹拌しながら透析した。透析バッグの全ての内容物を粉末状に凍結乾燥した。
【０１４２】
（iii）CTLA-4をトランスフェクションされた300.19細胞（Y201V）
完全長のCTLA-4 cDNAを、ヒト胸腺cDNAライブラリ（Stratagene）からPCR増幅し、pIRESneo（Clontech）中にサブクローニングした。マッチメーカー突然変異誘発システム（Promega）により、構成的細胞膜表面発現を引き起こす変異をCTLA-4に導入した。Y201のチロシンからバリンへの突然変異は、CTLA-4の敏速な内在化に重要な役割を担うアダプチンタンパク質AP50の結合を阻害する（Chuangら、 J. Immunol.159:144〜151(1997)）。マイコプラズマを含まない300.19マウスリンパ腫細胞を、10％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ペニシリン/ストレプトマイシン、2mMグルタミン、12.5mMヘペスpH7.5、および25μM β-メルカプトエタノールを含むRPMI-1640中で培養した。1mlのチェンバー内の細胞（3×106/0.4mlの、血清を含まないRPMI）を、20μgのCTLA-4-Y201V/pIRESneoと共に、200V/1180uF（Gibco CellPorator）によりエレクトロポレーションした。細胞を10分間放置し、その後予め温めておいた完全RPMI培地8mlを加えた。48時間後、1mg/ml G418（Gibco）を含む完全RPMI培地により細胞を0.5×106/mlまで希釈した。耐性細胞は広げられ、フィコエリスリン（Phycoerythrin）（PharMingen）が接合したBNI3抗体により、細胞表面におけるCTLA-4の発現を示した。高レベル発現細胞を無菌選別により単離した。
【０１４３】
免疫化およびハイブリドーマの作製：
ゼノマウス（XenoMouse）マウス（8週齢から10週齢）を、（i）リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中にフロイント完全アジュバントと共に懸濁した、上述のCTLA-4を発現するようトランスフェクションされた300.19細胞1×107を用いて、尾の基部を皮下に；または、（ii）（a）CTLA-4融合タンパク質10μgもしくは（b）フロイント完全アジュバントと共に乳化させたCTLA-4ペプチド10μgを用いて、尾の基部を皮下に、免疫化した。それぞれの場合において、フロイント不完全アジュバントを用いて投与を3回または4回繰り返した。融合の4日前、PBS中の免疫原またはPBS中の細胞の最後の注射をマウスに行った。免疫化マウス由来の脾臓および/またはリンパ節リンパ球を、「マウス非分泌骨髄腫P3細胞株」と融合させ、それらを前述したHAT選別に供した（Galfre,G. and Milstein, C.,「モノクローナル抗体の調製：計画と方法（Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures.）」（Methods Enzymol. 73:3〜46(1981) ）。全てCTLA-4特異的ヒトIgG２κ抗体またはIgG４κ抗体（下記）を分泌する、ハイブリドーマの大きなパネル（panel）を回収した。
【０１４４】
ELISAアッセイ法：
抗体を捕らえるためにCTLA-4-IgG融合タンパク質を用いて、コリゲン（Coligen）ら（「免疫学における現代のプロトコール（Current protocols in immunology）」における第2.1章、「酵素と結合させた免疫吸着法（Enzyme-linked immunosorbent assays）」(1994)）により記載されたように、マウス血清中およびハイブリドーマ上清中の抗原特異的抗体の決定のためのELISA法を行った。CTLA-4-Ig融合タンパク質により免疫化された動物に対して、融合タンパク質のヒトIg部分に対する非特異的な反応について本発明者らは追加的にスクリーニングを行う。特異性の陰性対照としてヒトIgG1を塗布されたELISAプレートを用いて、これを行う。
【０１４５】
好ましいELISAアッセイ法においては、以下の技術が用いられる：
ELISAプレートはプレート被覆緩衝液（0.1Mカルボネート緩衝液pH9.6、および炭酸水素ナトリウム（分子量84）8.4g/l）中の100μl/ウェルの抗原を塗布される。その後プレートを４℃で一晩インキュベートする。インキュベーション後、被覆緩衝液を除去し、200μl/ウェルの遮断緩衝液（0.5％BSA、0.1％Tween20、1×PBS中0.01％チメロサール）によりプレートを遮断し、室温で１時間インキュベートする。一方、プレートを遮断緩衝液およびプレート充填剤と共に冷蔵庫で保存する。遮断緩衝液を除去し、50μl/ウェルのハイブリドーマ上清、血清もしくは他のハイブリドーマ上清（陽性対照）およびHAT培地または遮断緩衝液（陰性対照）を与える。プレートを室温で2時間培養する。培養後、洗浄緩衝液（1×PBS）でプレートを洗浄する。検出抗体（すなわちIgＧ2抗体に対するマウス抗ヒトIgG2-HRP（SB#9070-05）またはIgG4抗体に対するマウス抗ヒトIgG4-HRP（SB#9200-05））を100μl/ウェル加えた（マウス抗ヒトIgG2-HRPは1：2000、またはマウス抗ヒトIgG4-HRP＠1：1000（それぞれ遮断緩衝液にて希釈））。プレートを室温で1時間インキュベートし、その後洗浄緩衝液で洗浄する。その後、100μl/ウェルの新たに調製した現像溶液（10ml基質緩衝液、5mgOPD（o-フェニレンジアミン、Sigma Cat No.P-7288）、および10μlの30％過酸化水素（Sigma））をウェルに加える。陰性対照のウェルがかろうじて呈色し始めるまで、10分間から20分間プレートを現像できる。その後、100μl/ウェルの停止溶液（2M 硫酸）を加え、プレートをELISAプレートリーダーにより波長490nmにおいて読み込む。
【０１４６】
BIAcore法による完全ヒトMabの親和定数の決定：
製造業者により概説された一般的手順により、精製ヒトモノクローナル抗体、Fab断片、またはハイブリドーマ上清の、プラスモン共鳴による親和性測定をBIAcore2000装置を用いて行った。
【０１４７】
低密度でセンサー表面に固定化した抗原を用い、抗体の反応速度分析を実施した。製造業者（BIAcore,Inc）から供給されたアミンカップリングキットを使用し、pH5.0で酢酸ナトリウム10ｍM中の20μg/mlまたは50μg/mlのCTLA-4-Ig融合タンパク質を用い、BIAcoreセンサーチップの3つの表面を約390〜900の範囲の濃度のCTLA-4-Ig融合タンパク質で固定化した。BIAcoreセンサーチップの４つ目の表面をIgG1（900RU）で固定化し、非特異的結合のための陰性対照表面として用いた。反応速度分析を、流速25μl/分または50μl/分にて行い、製造業者から供給された、世界的に適合する計算（global fitting calculations）のためのソフトウェア（BIA evaluation 3.0）を用いて解離率（kdまたはkoff）および会合率（kaまたはkon）を決定した。
【実施例２】
【０１４８】
抗CTLA-4抗体の親和性の測定
以下の表において、このように選択されたいくつかの抗体の親和性の測定値を提供する：
【表２】
2005087215.tif 000006
【０１４９】
示されたように、本発明に従って調製された抗体は高い親和性と結合定数を有している。
【実施例３】
【０１５０】
本発明に従って作製された抗CTLA-4抗体の構造
次に本発明に従って作製された抗体の構造について検討する。
【０１５１】
本発明に従って作製された抗体の構造を分析するため、本発明者らは特定のハイブリドーマから重鎖断片と軽鎖断片をコードする遺伝子をクローニングした。遺伝子のクローニングおよび配列決定は以下の通りに行った：
【０１５２】
ファストトラックキット（Fast-Track kit）（InVitrogen）を用い、免疫化されたゼノマウス（XenoMouse）マウス由来のハイブリドーマ細胞約2×105からポリ(A)＋mRNAを単離した。ランダムプライマーによるcDNA作製の後、続いてPCRを行った。ヒトVHファミリーもしくはヒトVκファミリー特異的な様々な領域プライマー（Marksら、「ヒト免疫グロブリン可変遺伝子のPCR増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー、およびファミリー特異的なオリゴヌクレオチドプローブの設計（Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes.）」 Eur.J.Immunol. 21:985〜991(1991)）または汎用ヒトVHプライマーであるMG-30（CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG）を、ヒトCγ2定常領域（MG-40d; 5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3'）もしくはCκ定常領域（hκP2; 1994年にグリーンら（Green）により記載された）に対して特異的なプライマーと共に用いた。ハイブリドーマからの、ヒトMab由来の重鎖およびκ鎖の転写産物の配列は、上述のプライマーを用いてポリ(A)＋mRNAから作製されたPCR産物を直接配列決定することにより得られた。PCR産物はまた、TAクローニングキット（InVitrogen）を使用してpCRIIにクローニングされ、両DNA鎖はプリズム・ダイターミネーター・シーケンシングキット（Prism dye-terminator sequencing kit）およびABI377配列決定装置を用いて配列決定された。全ての配列はマックベクター（MacVector）およびジーンワークス（Geneworks）ソフトウェアプログラムを用い、「V BASE シーケンスディレクトリ（V BASE sequence directory）」（Tomlinsonら、MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK）との配列比較により分析された。
【０１５３】
さらに、抗体4.1.1、抗体4.8.1、抗体11.2.1、および抗体6.1.1の各々を、全長DNA配列決定に供した。そのような配列決定のために、mRNAダイレクトキット（Direct kit）（Dynal）を使用してハイブリドーマ細胞約4×106からポリ(A)＋mRNAを単離した。オリゴ-dT(18)およびアドバンテージRT/PCRキット（Advantage RT/PCR kit）（Clonetech）を使用してｍRNAを逆転写した。可変領域データベース（Vベース(V Base)）を用い、重鎖DP50遺伝子のATG翻訳開始点（5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTG-3'）から始まって、IgG2定常領域のストップコドン（5'-TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGCT-3'）までを増幅するプライマーを設計した。ATG翻訳開始点の5'側に最適コザック配列（Kozak sequence）（ACCGCCACC）を付加した。同様の方法を用いてκ鎖A27遺伝子のATG翻訳開始点（5'-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAG-3'）から、κ定常領域のストップコドン（5'-TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3'）に対応するプライマーを設計した。ATG翻訳開始点（5'-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCT-3'）に対応したプライマーおよび上述のκ定常領域ストップコドンプライマーを用いて012cDNAをクローニングした。部位特異的突然変異誘発によりNheIサイトが可変Jドメイン末端に付加され、ゲノムIgG2 CH1/ヒンジ/CH2/CH3領域を含むNheI断片がサブクローニングされたゲノム構築物として、重鎖cDNAもまたクローニングされた。NheIサイトを作製するための点変異は、生殖細胞系のアミノ酸配列を変化させない。アドバンテージ高忠実度PCRキット（Advantage High Fidelity PCR Kit）（Clonetech）を使用してcDNAを増幅させるため、プライマー対を用いた。ダイターミネーター・シーケンシングキットおよびABI配列決定装置を用いた直接配列決定により、PCR産物の塩基配列を得た。PCR産物をpEEグルタミンシンセターゼ哺乳類発現ベクター（Lonza）にクローニングし、体細胞変異を確認するため3個のクローンを配列決定した。各クローンにおける両鎖の配列を、少なくとも3回の反応において検証した。CH2ドメイン中のN294Qの部位特異的突然変異誘発により、非グリコシル化された（aglycosylated）4.1.1抗体を作製した。組換え抗体を、IgGが欠乏したFCS中でのCos7細胞の一過性トランスフェクションにより産生し、標準プロテインAセファロース技術を用いて精製した。マウスNSO細胞のエレクトロポレーション、およびグルタミンを含まない培地における選抜により、安定したトランスフェクタントを作製した。グリコシル化した、またはしなかった組換え4.1.1は、インビトロELISAアッセイ法およびBIAcoreアッセイ法において、CTLA4に対し同一の特異性および親和性を示した。
【０１５４】
遺伝子利用分析
以下の表は本発明に従って選抜された、抗体のハイブリドーマクローンにより立証された遺伝子利用を示す：
【表３】
2005087215.tif 000007
【０１５５】
示されたように、本発明に従って作製された抗体には、DP-50重鎖可変領域の利用への強い傾向があった。DP-50遺伝子はまた、VH3-33ファミリー遺伝子と呼ばれる。CTLA-4結合アッセイ法およびインビトロでの予備機能アッセイ法に基づいて選抜された1個の抗体のみが、DP-50ではない重鎖遺伝子の利用を示した。該クローン2.1.3は、DP-65重鎖可変領域を利用しており、IgG4のアイソタイプであった。DP-65遺伝子はまたVH4-31ファミリー遺伝子と呼ばれる。一方、クローン4.9.1はCTLA-4に結合するDP-47重鎖可変領域を有するが、B7-1またはB7-2への結合を阻害しない。ゼノマウス（XenoMouse）マウスにおいては、抗体を産生する、30以上の独特の機能的重鎖可変遺伝子がある。そのため利用傾向は、組み合わされた、抗原への結合および機能的活性の特性に関して、抗体-抗原相互作用の好ましい結合モチーフを示唆するものである。
【０１５６】
突然変異分析
理解されるように、遺伝子利用分析では抗体構造の限られた概観しか得られない。確率論的にゼノマウス（XenoMouse）動物のB細胞はV-D-J重鎖またはV-Jκ型軽鎖の転写産物を作製するため、これらに限定されるわけではないが、体細胞過剰変異、n付加、およびCDR3の伸張を含む、多くの二次的過程が生じる。例えば、メンデス（Mendez）らのNature Genetics 15:146〜156(1997)および1996年12月3日出願の米国特許出願第08/759,620号を参照されたい。したがって、抗体の構造をさらに研究するため、抗体の推定アミノ酸配列を、クローンから得られたcDNAから作製した。加えて、タンパク質配列決定によりＮ末端アミノ酸配列を得た。
【０１５７】
図1はクローン4.1.1（図1A）、4.8.1（図1B）、4.14.3（図1C）、6.1.1（図1D）、3.1.1（図1E）、4.10.2（図1F）、2.1.3（図1G）、4.13.1（図1H）、11.2.1（図1I）、11.6.1（図1J）、11.7.1（図1K）、12.3.1.1（図1L）、および12.9.1.1（図1M）の重鎖およびκ型軽鎖のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を提供する。図1A、図1B、および図1Dにおいて、上述の全長cDNAのクローニングにより抗体4.1.1、4.8.1、および6.1.1の伸張配列が得られた。これらの図において、シグナルペプチド配列（または同様にコードする塩基）を太字で、5'PCR反応に使用された配列を下線で示す。
【０１５８】
図2はクローン4.1.1、4.8.1、4.14.3、6.1.1、3.1.1、4.10.2、4.13.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1、および12.9.1.1の推定重鎖アミノ酸配列と、生殖細胞系DP-50（3〜33）アミノ酸配列との配列比較を提供する。DP-50生殖細胞系配列とクローン配列の間の相違点を太字で示す。図はまた、抗体のCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列の位置を陰で示す。
【０１５９】
図3はクローン2.1.3の推定重鎖アミノ酸配列と、生殖細胞系DP-65（4〜31）アミノ酸配列との配列比較を提供する。DP-65生殖細胞系配列とクローン配列の間の相違点を太字で示す。図はまた、抗体のCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列の位置を下線で示す。
【０１６０】
図4はクローン4.1.1、4.8.1、4.14.3、6.1.1、4.10.2、および4.13.1の推定κ型軽鎖アミノ酸配列と、生殖細胞系A27アミノ酸配列との配列比較を提供する。A27生殖細胞系配列とクローン配列の間の相違点を太字で示す。図はまた、抗体のCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列の位置を下線で示す。クローン4.8.1、4.14.3、および6.1.1の、CDR1における明らかな欠失を「0」で示す。
【０１６１】
図5はクローン3.1.1、11.2.1、11.6.1、および11.7.1の推定κ型軽鎖アミノ酸配列と、生殖細胞系012アミノ酸配列との配列比較を提供する。012生殖細胞系配列とクローン配列の間の相違点を太字で示す。図はまた、抗体のCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列の位置を下線で示す。
【０１６２】
図6はクローン2.1.3の推定κ型軽鎖アミノ酸配列と、生殖細胞系A10/A26アミノ酸配列との配列比較を提供する。A10/A26生殖細胞系配列とクローン配列の間の相違点を太字で示す。図はまた、抗体のCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列の位置を下線で示す。
【０１６３】
図7はクローン12.3.1の推定κ型軽鎖アミノ酸配列と、生殖細胞系A17アミノ酸配列の配列比較を提供する。A17生殖細胞系配列とクローン配列の間の相違点を太字で示す。図はまた、抗体のCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列の位置を下線で示す。
【０１６４】
図8はクローン12.9.1の推定κ型軽鎖アミノ酸配列と、生殖細胞系A3/A19アミノ酸配列の配列比較を提供する。A3/A19生殖細胞系配列とクローン配列の間の相違点を太字で示す。図はまた、抗体のCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列の位置を下線で示す。
【０１６５】
図22は以下の抗CTLA-4抗体鎖の、その他の一連のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を提供する：
4.1.1：
4.1.1重鎖の全長（cDNA配列22A(a)、ゲノムDNA配列22(b)、およびアミノ酸配列22(c)）；
非グリコシル化された4.1.1重鎖の全長（cDNA配列22(d)およびアミノ酸配列22(e)）；
4.1.1軽鎖（cDNA配列22(f)およびアミノ酸配列22(g)）；
4.8.1： 
4.8.1重鎖の全長（cDNA配列22(h)およびアミノ酸配列22(i)）；
4.8.1軽鎖（cDNA配列22(j)およびアミノ酸配列22(k)）；
6.1.1：
6.1.1重鎖の全長（cDNA配列22(l)およびアミノ酸配列22(m)）；
6.1.1軽鎖（cDNA配列22(n)およびアミノ酸配列22(o)）；
11.2.1：
11.2.1重鎖の全長（cDNA配列22(p)およびアミノ酸配列22(q)）；および
11.2.1軽鎖（cDNA配列22(r)およびアミノ酸配列22(s)）。
【０１６６】
シグナルペプチド配列を太字の大文字で示す。全長4.1.1ゲノムDNA配列（図22(b)）のオープンリーディングフレームを下線で示す。さらに、非グリコシル化4.1.1重鎖を作製するための変異およびその結果生じた改変（N294Q）を二重下線および太字で示す（cDNA（図22(b)）アミノ酸（図22(c)））。
【実施例４】
【０１６７】
重鎖および軽鎖のアミノ酸置換分析 
図2は、クローン4.1.1、4.8.1、4.14.3、6.1.1、3.1.1、4.10.2、4.13.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1、および12.9.1.1の推定重鎖アミノ酸配列と生殖細胞系DP-50(3〜33)アミノ酸配列の間の配列比較を提供するものであり、興味深いパターンを示している。ほとんどのクローンで重鎖DP-50への偏りがあるという事実に加え、生殖細胞系DP-50遺伝子と比べて、抗体における過剰変異は比較的限られている。例えば、クローン3.1.1および11.2.1に突然変異はない。その上、他のクローンにおける突然変異は一般に、生殖細胞系のアミノ酸と同様の性質をもつアミノ酸への置換に関わる保存性変異である。多くのCDR1配列およびCDR2配列中の突然変異は特に本質的に保存的である。図2で示した3個の重鎖、4.10.2、4.13.1、および4.14.3は、明らかに一度の組換え事象に由来しており（すなわち同一の胚中心由来）、配列はほぼ同一である。これら3個を単一の配列と考えると、DP50重鎖を含む10個の異なる抗体の中で、非極性残基が他の非極性残基に置換された3箇所、極性無電荷残基が他の極性無電荷残基に置換された12箇所、および極性電荷残基が他の極性電荷残基に置換された1箇所が、CDR1およびCDR2内に存在する。さらに、構造的に非常に類似した2個の残基、グリシンとアラニンが互いに置換した箇所が2つある。厳密に保存的ではない突然変異には、極性無電荷残基の極性電荷残基への3つの置換および、極性残基の非極性残基への1つの置換だけが含まれる。
【０１６８】
これらの抗体の軽鎖は5個の異なるVｋ遺伝子に由来する。A27遺伝子が最も大量に発現しており、6個の異なる軽鎖の供給源となる。これらの6配列の比較により、2つの注目すべき特徴が示される。第一に、それらのうち3個、4.8.1、4.14.3、および6.1.1は、CDR1内で1個または2個の残基の欠失を含み、これはまれな事象である。第二に、CDR3における第6位の生殖細胞系のセリンに対して強い置換傾向があり、セリンは全ての配列において置換されている。このことから、この位置のセリンはCTLA4結合と不適合であることが示された。
【０１６９】
同定された前述のアミノ酸置換の多くが、CDRの近傍、またはCDR内に存在することが見出された。そのような置換は、抗体のCTLA-4分子への結合に何らかの影響を与えると考えられた。さらに、そのような置換は、抗体の親和性に重大な影響をもたらす可能性があった。
【実施例５】
【０１７０】
本発明に係る抗体のＮ末端アミノ酸配列解析
上記のように同定された、本発明に係る抗体の組成と構造をさらに検証するため、本発明者らはパーキンエルマーシーケンサー（Perkin-Elmer sequencer）を用い、抗体のうちのあるものを配列決定した。抗体の重鎖とκ型軽鎖の両方を単離し、予備的なゲル電気泳動およびエレクトロブロッティング技術を用いて精製し、その後、実施例6に説明したように直接配列決定を行った。重鎖配列の大多数はアミノ末端がブロックされていた。従って、このような抗体はまずピログルタミン酸アミノペプチターゼで処理し、その後、配列決定した。
【０１７１】
実験結果を図9に示す。図9はまた、質量分光法（MALDI）により測定した重鎖および軽鎖の分子量を提供する。
【実施例６】
【０１７２】
本発明に係る抗体のその他の特徴付け
図10は本発明に係るいくつかについての抗体のいくつかのその他の特徴付けについての情報を提供する。この図では、クローン3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.14.3、および6.1.1に関するデータが要約されている。以下のデータが提供される：濃度、等電点電気泳動（IEF）、SDS-PAGE、ゲル濾過クロマトグラフィー、FACS、質量分光法（MALDI）、および軽鎖Ｎ末端配列。
【０１７３】
一般に、データは以下のように得られた：
【０１７４】
材料および方法
タンパク質濃度を、UVスキャン（200〜350nm）により280nmにおいて決定し、280nmにおける吸光度単位1.58を1mg/mlとして換算した。
【０１７５】
SDS-PAGEを、ノベックスNuPAGE電気泳動システム（Novex NuPAGE electrophoresis system）を用い、10％NuPAGEゲルおよびMES泳動緩衝液により行った。4×NuPAGE試料緩衝液（+/-）β-メルカプトエタノールを用いて3：1希釈により試料を調製し、加温して、5μg以内のタンパク質をゲルにロードした。その後ゲルをブリリアントブルーR染色溶液（Sigma cat.#B-6529）で染色し、染色されたバンドを「完全タンパク標識（Perfect Protein Marker）」（Novagen cat.#69149-3）との比較により分子量を推定した。
【０１７６】
N末端配列決定のため、サンプルを上述の通りNuPAGEゲルに流し、プロブロット固定膜（Applied Biosystems）に転写し、その後クーマシーブルーR-250で染色した。染色されたタンパク質バンドを切り出し、アプライドバイオシステムズ494プロサイスHTシーケンサー（Applied Biosystems 494 Procise HT Sequencer）を用いた自動エドマン分解による配列分析に供した。
【０１７７】
等電点電気泳動（IEF）はファルマシアIEF3-9 pHastゲル（Pharmacia IEF 3-9 pHast gels）（cat#17-0543-01）を用いて行った。試料を10％グリセロールで0.8mg/ml以下に希釈し、1μlをゲルにロードした後、銀染色を行った。染色されたバンドを広範囲（pH3〜pH10）IEF標準（broad range IEF standard）（Pharmacia cat#17-0471-01）と比較し推定等電点を得た。
【０１７８】
サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）は、スーパーデックス75 PC 3.2/30カラム（Superdex 75 PC 3.2/30 column）を用いたファルマシアSMARTシステム（Pharmacia SMART system）により、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で行った。推定分子量を、ピーク保持時間とゲルの保持時間との比較により得た。
【０１７９】
FACS（蛍光細胞分析分離装置）による研究のため、ヒト末梢T細胞を調製し48時間刺激した。T細胞を1度洗浄し、FACS緩衝液中に1×106細胞/100μlで再懸濁し、CD3の表面発現のため抗CD3-FITC（Immunotech, Marseille, France）10μlを用いて室温で30分間染色した。細胞を2度洗浄し、その後固定して易透化し（Fix and Perm, Caltag）、細胞内CTLA-4発現のため抗CD152-PE（Pharmingen）10μlにより染色した。フローサイトメトリーは、ベクトンディキンソンFACSort（Becton Dickinson FACSort）を用いて行った。適切なアイソタイプの対照抗体（Caltag）の分析により、カドラントを設定した。
【０１８０】
上述のように、抗CTLA-4抗体がある種の強力な免疫調節活性を有することが示された。以下の実験を、本発明に係る抗体がそのような活性をもつか否かを決定するために行った。一般に抗体が、CTLA-4とB7分子の間の、またはCTLA-4およびB7分子とCD28の間の相互作用を阻害する能力、ならびにこれに限定されるわけではないが、例えばIL-2および/またはIFN-γ発現を含む、T細胞によるサイトカイン産生の促進能力を評価するために実験を設計した。さらに、本発明の抗体と、ある種のヒト組織ならびに他種（例えばマウスおよび霊長類）由来のCTLA-4分子との交叉感受性の試験を行った。
【実施例７】
【０１８１】
競合ELISA：本発明に係る抗体による、CTLA-4/B7-1またはB7-2の相互作用の阻害
本発明に係る抗体が、CTLA-4とB7-1およびB7-2のいずれかとの結合を阻害できるか否かを決定するため、インビトロアッセイ法を行った。評価されたように、CTLA-4のB7分子との結合を阻害できる本発明の抗体は、CTLA-4経路を介した免疫調節のための候補として期待されると考えられた。このアッセイ法においては、以下の材料と方法が用いられた。
【０１８２】
材料および方法
ダルベッコのPBC（Dulbecco's PBC）中の3nMのB7.1-Ig（G1）またはB7.2-Ig（G1）（Repligen, Inc. Needham, MA）を96ウェルのMaxiSorpプレート（Nunc,Denmark, #439454）に塗布し、4℃で一晩培養した。2日目にB7-Igを除去し、プレートをD-PBSに1％BSAおよび0.05％Tween20を加えたもので2時間ブロックした。プレートを洗浄緩衝液（D-PBSに0.05％Tween20を加えた）で3回洗浄した。適当な試験濃度の抗体およびCTLA-4-Ig（G4）（最終濃度0.3nM）（Repligen, Inc. Needham, MA）を予め15分間混合し、その後B7-Igを塗布されたプレート（総体積60μl）に加え、室温で1.5時間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、HRP標識したマウス抗ヒトIgG4抗体（Zymed, San Francisco, CA, #05-3820）を1倍から1000倍までの希釈液50μlを加え、室温で1時間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、TMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（TMB Microwell peroxidase substrate）（Kirkegaad & Perry, Gaithersburg, MD, #50-76-04）50μlを加え、室温で20分間インキュベートした後、1N硫酸50μlをプレートに加えた。Molecular Devices プレートリーダー（plate reader）（Sunnyvale, CA）を用いて、450nmにおいてプレートを読み込んだ。全てのサンプルについて2通り試験した。シグナルの最大値を、試験抗体非存在下でのCTLA-4-Ig結合と定義した。非特異的結合を、CTLA-4-Igおよび試験抗体非存在下での吸光度を示すものと定義した。
【０１８３】
このアッセイ法による結果を表４Aおよび表４Bに提供する。表４Aにおいては、本発明に係る様々な抗体についての結果を示す。表４Bにおいては、独立の実験より得られた本発明の抗体4.1.1と本発明の抗体11.2.1の結果を比較して示す。
【表４Ａ】
2005087215.tif 000008
【表４Ｂ】
2005087215.tif 000009
【実施例８】
【０１８４】
CTLA-4に関わる本発明の抗体の、CD28またはB7-2に対する選択率
CD28またはB7-2に対して、CTLA-4に関わる本発明抗体の選択性を決定するため、他のインビトロアッセイ法を実施した。実験に関して以下の材料および方法を用いた：
【０１８５】
CTLA-4選択性ELISA：材料および方法
96ウェルのFluroNUNCプレート（Nunc Cat No.475515）に4つの抗原を塗布した：CTLA-4/Ig、CD44/Ig、CD28/Ig、およびB7.2/Ig（抗原は自社内で作製された）。0.1M重炭酸ナトリウム緩衝液中に1μg/ml、100μl/ウェル、pH9.6において、抗原を一晩4℃でプレートに塗布した。その後プレートをNUNCプレートウォッシャーを用いてPBST（PBSおよび0.1％Tween20）で3回洗浄した。PBSTおよび0.5％BSAにより150μl/ウェルでプレートをブロックした。プレートを室温で1時間インキュベートし、PBSTで3回洗浄した。次に本発明の抗CTLA-4抗体をブロック液で1μg/mlに希釈し、プレートに加えた。プレートを室温にて１時間インキュベートし、PBSTで3回洗浄した。その後本発明の抗体を加えたウェルを、ブロック液中1：4000の希釈度の抗ヒトIgG2-HRP（Southern Biotech Cat No.9070-05）100μl/ウェルにより処理した。また、1列をプレートコーティング用に標準化するため抗ヒトIgG（Jackson Cat No.209-035-088）で処理した。この抗体をブロック液中1：5000に希釈し、100μl/ウェルで添加した。また、1列は陽性対照として、抗ヒトCTLA-4-HRP（Pharmingen Cat No.345815/Custom HRPが接合）で処理した。この抗体はブロック液中0.05μg/mlに希釈されて用いられた。プレートを室温にて1時間インキュベートし、その後PBSTで3回洗浄した。LBA化学発光基質（LBA chemiluminescent substrate）（Pierce）を100μl/ウェルで加え、プレートシェーカー上でプレートを5分間インキュベートした。その後発光検出器で、2分間の曝露によりプレートを読み込んだ。
【０１８６】
IGEN CTLA-4-Ig選択性結合アッセイ法：材料および方法
M-450ダイナビーズ（Dynabeads）（Dynal A.S.,Oslo, Norway#140.02）をpH7.4のリン酸ナトリウム緩衝液で3回洗浄し、リン酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁した。CTLA-4-Ig（G1）1.0μg、CD28-Ig（G1）1.0μgまたは、B7.2-Ig（G1）1.0μgから3.0μg（Repligen, Inc.Needham, MA）を100μlのビーズに添加し、回転板上で4℃で一晩培養した。2日目に、1％BSAおよび0.05％Tween20を含むダルベッコのPBSでビーズを3回洗浄し、30分間ブロックした。ビーズをブロック緩衝液で1倍から10倍に希釈し、塗布されたビーズ25μlを12×75mmのポリプロピレンチューブに加えた。全ての試料を2通り試験した。50μlの試験抗体（最終濃度1μg/ml）またはブロック緩衝液をチューブに加え、オリゲン1.5分析器カルーセル（Origen 1.5 Analyzer carousel）（IGEN International, Inc.,Gaithersburg, MD）にて室温、100rpmで撹拌して30分間インキュベートした。ルテニレートした（ruthenylate）マウス抗ヒトIgG1、IgG2、またはIgG4（Zymed, Inc.,San Francisco, CA#05-3300, 05-3500, および 05-3800）（最終濃度は、総体積100μl中に3μg/ml）を25μl、チューブに加えた。チューブを室温で30分間、100rpmのカル−セルでインキュベートした。各チューブに200μlのオリゲンアッセイ法緩衝液（Origen assay buffer）（IGEN International, Inc.,Gaithersburg, MD#402-050-03）を加えて軽く撹拌し、その後オリゲン分析器（Origen Analyzer）で計測して各チューブのECL（電気化学発光）ユニットを決定した。融合タンパク質のダイナビーズへの結合における差異を補正するために標準化因子を決定し、選択率の計算の前に、ECLユニットを非特異的結合について補正した。
【０１８７】
アッセイ法の結果を表５Aおよび表５Bに提供する。
【表５Ａ】
2005087215.tif 000010
【表５Ｂ】
2005087215.tif 000011
【実施例９】
【０１８８】
ヒトT細胞シグナルモデル
免疫調節因子として作用する、本発明に係る抗体の活性をさらに定義するため、本発明者らは、CTLA-4シグナルを抗体でブロックしたときのT細胞IL-2産生の促進を定量するためのある種のT細胞アッセイ法を開発した。実験に関して、以下の材料および方法を用いた。
【０１８９】
材料および方法
ヒストパック（Histopaque）（Sigma, St.Louis, MO#A-70543）およびT-kwik（Lympho-Kwik, One Lambda, Canoga Park, CA, #LK-50-T）を用いて、新しく単離したヒトT細胞を調製し、PHA（1μg/ml）（精製フィトヘマグルチニン、Murex Diagnostics Ltd. Dartford, England, #HA16）を1×106細胞/mlの濃度で加えた培地（L-グルタミン、MEM非必須アミノ酸、ペニシリン、ストレプトマイシン、25mMヘペスおよび10％FBSを含むRPMI 1640）で刺激し、37℃で2日間インキュベートした。細胞を洗浄し、2×106細胞/mlとなるよう培地で希釈した。ラージ（Raji）細胞（Burkitt lymphoma, ヒトATCC No.:CCL 86 Class II American Type Culture Collection Rockville, MD）をミトマイシンC（Sigma, St.Louis, MO#M-4287）（25μg/ml）で、37℃において1時間処理した。ラージ細胞をPBSで4回洗浄し、2×106細胞/mlで再懸濁した。様々な濃度のヒトT芽細胞（5×105/ml）、ラージ細胞（5×105/ml）および抗CTLA-4抗体またはアイソタイプ適合対照抗体を、96ウェルのマイクロタイタープレートに加え、該プレートを37℃で72時間インキュベートした。ウェル当たりの総体積は200μlであった。刺激開始72時間後、プレートをスピンダウンして上清を除き、後のIL-2測定（Quantikine IL-2 ELISA kit, R&D Systems, Minneapolis, MN, #D2050）およびIFN-γ測定（Quantikine IFN-g ELISA kit, R&D Systems）のために冷凍した。サイトカインの増大は、抗CTLA-4ブロックmAbを含む培養物に対する、アイソタイプ適合性対照抗体を含む培養物のサイトカインレベルの差異として定義した。フローサイトメトリー実験のため、ラージ細胞をFACS緩衝液（2％の熱不活性化FCS、0.025％アジ化ナトリウムを含むPBS）で1回洗浄した。細胞ペレットをFACS緩衝液に1×106細胞/100μlで再懸濁し、10μlの抗CD80-PE（Becton Dickinson, San Jose,CA）または抗CD86-PE（Pharmingen, San Diego, CA）と共に室温で30分間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、1ml FACS緩衝液中に再懸濁した。Becton Dickinson FACSortを用いてフローサイトメトリーを実施した。適切なアイソタイプ対照抗体（Caltag, Burlingame, CA）の分析によりヒストグラムマーカーを設定した。
【０１９０】
一般的に、本発明者らはT細胞のIL-2アップレギュレーションの迅速な測定に使用されうるアッセイ法を開発した。理解されるように、T細胞の刺激はB7依存性およびCD28依存性である。さらに、洗浄されたT芽細胞は検出可能なIL-2を産生せず、ラージ細胞はLPSまたはPWMによって刺激を受けた場合でさえ、検出可能なIL-2を産生しない。しかし、ラージ細胞と共培養され、組み合わされたT芽細胞は、B7、CTLA-4、およびCD28のシグナル伝達事象をモデル化することができ、抗体の与える影響が評価されうる。
【０１９１】
図11は実施例6で述べたフローサイトメトリー（FAC）による、抗CD80-PE mAbおよび抗CD86-PE mAbを用いた、ラージ細胞におけるB7-1およびB7-2の発現を示す。
【０１９２】
図12はT芽細胞/ラージアッセイ法において、CTLA-4ブロッキング抗体（BNI3(PharMingen)ならびに、本発明の抗体4.1.1、4.8.1および6.1.1）により誘導されたIL-2産生の濃度依存性増大を示す。
【０１９３】
図13はT芽細胞/ラージアッセイ法において、CTLA-4ブロッキング抗体（BNI3(PharMingen)ならびに、本発明の抗体4.1.1、4.8.1および6.1.1）により誘導されたIFN-γ産生の濃度依存性増大を示す（同じ供与T細胞）。
【０１９４】
図14はT芽細胞/ラージアッセイ法において、CTLA-4ブロッキング抗体により誘導された6つの供与体由来のT細胞におけるIL-2産生増大の平均値を示す。興味深いことに、mAb CT4.9.1はCTLA-4に結合するが、B7の結合をブロックしないと考えられる。したがって、単なるCTLA-4への結合だけでは、それが本発明の機能的な抗体を供給するのには不十分である。
【０１９５】
図15はT芽細胞/ラージアッセイ法において、CTLA-4ブロッキング抗体により誘導された6つの供与体由来のT細胞におけるIFN-γ産生増大の平均値を示す。
【０１９６】
図19は、濃度30μg/mlの、実施例9に記載した72時間のT芽細胞/ラージアッセイ法および実施例10に記載した超抗原アッセイ法における、本発明の抗体4.1.1および11.2.1の比較を示す。
【０１９７】
図20はT芽細胞/ラージアッセイ法において、本発明のCTLA4抗体4.1.1、および11.2.1により誘導されたIL-2産生の濃度依存性増大を示す。
【０１９８】
以下の表５Cは、本発明のラージアッセイ法およびSEAアッセイ法における、サイトカイン応答の増大の平均および増大の範囲に関する情報を提供する。結果に含まれる各実験は、用量30μg/mlの抗体および72時間後の測定に基づく。実験および反応に用いられた供与体の数を示す。
【表５Ｃ】
2005087215.tif 000012
【実施例１０】
【０１９９】
ヒトT細胞シグナルモデル
本発明者らは、抗体によるCTLA-4シグナルのブロックにおけるT細胞IL-2アップレギュレーションの増大を定量するための第二の細胞アッセイ法を開発した。実験に関して以下の材料および方法を用いた。
【０２００】
材料および方法
ヒトPBMCをアキュスピン（Accuspin）を用いて調製した。マイクロタイタープレートに抗CD3抗体（leu4, Becton Dickinson）（60ng/ml）を予め塗布し、37℃で2時間インキュベートした。hPBMCを200,000細胞/ウェルで、ウェルに添加した。ブドウ球菌エンテロトキシンA（SEA）（Sigma）を100ng/mlでウェルに添加した。抗体は、通常30μg/mlでウェルに加えた。その後細胞を48時間、72時間または96時間刺激した。所望の時点でプレートを遠心分離し、上清をウェルから除去した。その後、ELISA（R&D Systems）を用い、上清のIL-2産生を調べた。
【０２０１】
これらの実験の結果を図16、図17、および図21に示す。図16において、5つの供与体由来のhPBMCにおけるIL-2産生の誘導を、刺激から72時間後に測定した。図17においては、全血の測定結果を示し、刺激後72時間、および96時間で測定した3つの供与体由来の血液におけるIL-2産生の誘導について、差異を分析したものである。
【０２０２】
図21においては、刺激後72時間で測定値された、2つの供与体由来の全血におけるIL-2産生の増大を示している。
【実施例１１】
【０２０３】
腫瘍動物モデル
本発明者らは抗マウスCTLA-4抗体による腫瘍の成長阻害をインビボで分析するための動物腫瘍モデルを確立した。モデルにおいては、マウス線維肉腫腫瘍を成長させ、動物を抗CTLA-4抗体で処理する。モデルの確立のための材料および方法を以下に提供する。
【０２０４】
材料および方法
メスのA/Jマウス（6週齢〜8週齢）に対し、0.2mlのSa1N腫瘍細胞（1×106）（Baskar 1995）を首の背側に皮下注射した。腫瘍細胞の注射後0日、4日、7日および14日に、抗マウスCTLA-4抗体またはアイソタイプ適合対照抗体（PharMingen, San Diego, CA, 200μg/動物）を腹腔内に注射した。腫瘍の測定はスターレットSPCプラス電子キャリパー（Starrett SPC Plus electronic caliper）（Athol, MA）を使用して、3週間〜4週間の実験期間中に行い、腫瘍の大きさは、腫瘍の成長により覆われた表面領域（mm2）として表した。
【０２０５】
図18はマウス線維肉腫腫瘍モデルにおける抗マウスCTLA-4抗体による腫瘍成長の阻害を示す。図18に示すように、抗マウスCTLA-4抗体で処理した動物では、アイソタイプ対照抗体で処理した動物に比べ、腫瘍成長が減少した。したがって、マウス腫瘍モデルにおいて、抗マウスCTLA-4 mAbはマウス線維肉腫の成長を阻害できる。
【０２０６】
マウスCTLA-4に対して交叉感受的な抗体は、モデルにおいて同様にはたらくと考えられる。しかし、交叉感受性を調べた本発明の抗体の中で、マウスCTLA-4と交叉感受的なものはなかった。
【実施例１２】
【０２０７】
腫瘍動物モデル
本発明に係る抗体の活性をさらに調べるために、確立された腫瘍およびそれら由来の転移の根絶を試験するため、異種移植SCIDマウスモデルを設計した。モデルにおいて、ヒトT細胞が移植されたSCIDマウスが提供され、患者由来の非小細胞肺細胞（NSCL）または直腸癌細胞が移植される。移植片はSCIDマウスの生殖腺の脂肪パッドに加工される。腫瘍を成長させ、その後除去する。マウスはヒト様の腫瘍および肝臓への転移を進行させる。このようなモデルはバンパーズ（Bumpers）ら（J. Surgical Res.61:282〜288(1996)）により説明されている。
【０２０８】
本発明の抗体がこのようなマウス内で形成された腫瘍の成長を阻害することが考えられる。
【０２０９】
参考文献としての組込み
特許、特許出願、論文、テキストブックなどを含む本明細書にて引用した全ての参考文献、およびまだ組み込まれない程度でそこに引用されている参考文献は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。加えて、以下の参考文献は、該参考文献に引用されている参考文献をも含むその全体にわたって、本明細書に参照として組み込まれる：
2005087215.tif 000013
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【０２１０】
等価物
前述の説明および実施例により、本発明の特定の好ましい態様を詳細に記し、本発明者らが企図する最良の形態を記載している。しかし、文章中の前述の記載がどれほど詳細であるとしても、本発明は様々な形で実現可能であり、本発明は添付する特許請求の範囲およびそれらのあらゆる等価物に従って解釈されるべきであることが認識されると思われる。
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】図1は本発明に従う免疫グロブリン分子の重鎖およびκ軽鎖の一連のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す：4.1.1（図1Ａ）、4.8.1（図1Ｂ）、4.14.3（図1Ｃ）、6.1.1（図1Ｄ）、3.1.1（図1Ｅ）、4.10.2（図1Ｆ）、2.1.3（図1Ｇ）、4.13.1（図1Ｈ）、11.2.1（図1Ｉ）、11.6.1（図1Ｊ）、11.7.1（図1Ｋ）、12.3.1.1（図1Ｌ）、および12.9.1.1（図1Ｍ）。
【図２】図2はクローン4.1.1、4.8.1、4.14.3、6.1.1、3.1.1、4.10.2、4.13.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1、および12.9.1.1から推定される重鎖のアミノ酸配列と生殖系列DP-50（3〜33）アミノ酸配列との配列アラインメントを示す。DP-50生殖系列配列とクローンから推定される配列とにおいて異なるアミノ酸は太字で示されている。この図ではまた抗体のCDR1、CDR2、およびCDR3配列の位置を陰付きで示してある。
【図３】図3はクローン2.1.3の推定される重鎖のアミノ酸配列と生殖系列DP-65（4〜31）のアミノ酸配列との配列アラインメントを示す。DP-65生殖系列配列とクローンの配列とにおいて異なるアミノ酸は太字で示されている。この図ではまた抗体のCDR1、CDR2、およびCDR3配列の位置を下線で示してある。
【図４】図4はクローン4.1.1、4.8.1、4.14.3、6.1.1、4.10.2、および4.13.1の推定されるκ型軽鎖のアミノ酸配列と生殖系列A27のアミノ酸配列との配列アラインメントを示す。A27生殖系列配列とクローンの配列とにおいて異なるアミノ酸は太字で示されている。この図ではまた抗体のCDR1、CDR2、およびCDR3配列の位置を下線で示してある。クローン4.8.1、4.14.3、および6.1.1のCDR1領域における明らかな欠失は「0」で示してある。
【図５】図5はクローン3.1.1、11.2.1、11.6.1、および11.7.1の推定されるκ型軽鎖のアミノ酸配列と生殖系列012のアミノ酸配列との配列アラインメントを示す。012生殖系列配列とクローンの配列とにおいて異なるアミノ酸は太字で示されている。この図ではまた抗体のCDR1、CDR2、およびCDR3配列の位置を下線で示してある。
【図６】図6はクローン2.1.3の推定されるκ型軽鎖のアミノ酸配列と生殖系列A10/A26のアミノ酸配列との配列アラインメントを示す。A10/A26生殖系列配列とクローンの配列とにおいて異なるアミノ酸は太字で示されている。この図ではまた抗体のCDR1、CDR2、およびCDR3配列の位置を下線で示してある。
【図７】図7はクローン12.3.1の推定されるκ型軽鎖のアミノ酸配列と生殖系列A17のアミノ酸配列との配列アラインメントを示す。A17生殖系列配列とクローンの配列とにおいて異なるアミノ酸は太字で示されている。この図ではまた抗体のCDR1、CDR2、およびCDR3配列の位置を下線で示してある。
【図８】図8はクローン12.9.1の推定されるκ型軽鎖のアミノ酸配列と生殖系列A3/A19のアミノ酸配列との配列アラインメントを示す。A3/A19生殖系列配列とクローンの配列とにおいて異なるアミノ酸は太字で示されている。この図ではまた抗体のCDR1、CDR2、およびCDR3配列の位置を下線で示してある。
【図９】図9は抗体の重鎖と軽鎖の直接的アミノ酸配列決定によって得られたＮ末端のアミノ酸配列の概要を示す。
【図１０】図10は本発明に従うある抗体に関するさらに別の特徴を表すある情報を示す。図10Aではクローン3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.14.3、および6.1.1に関するデータが要約されている。濃度、等電点電気泳動（IEF）、SDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー/質量分光計測（LCMS）、質量分光計測（MALDI）、軽鎖のＮ末端配列に関するデータが提供されている。その他のＩＥＦに関する詳細は図10Bに示してある；SDS‐PAGEに関するものは10Cに；4.1.1抗体のSECは10Dに示してある。
【図１１】図11は抗CD80-PEおよび抗CD86-PE mAbを用いた、ラージ細胞におけるB7-1およびB7-2の発現を示している。
【図１２】図12は抗CTLA-4ブロック抗体（BNI3、4.1.1、4.8.1、および6.1.1）に誘導されたT芽細胞/ラージアッセイ法における濃度依存性IL-2産生の増強を示している。
【図１３】図13は抗CTLA-4ブロック抗体（BNI3、4.1.1、4.8.1、および6.1.1）に誘導されたT芽細胞/ラージアッセイ法における濃度依存性IFN-γ産生の増強を示している（同じドナーのT細胞）。
【図１４】図14は6ドナーからのT細胞における、抗CTLA-4ブロック抗体に誘導されたT芽細胞/ラージアッセイ法におけるIL-2産生の増強の平均値を示している。
【図１５】図15は6ドナーからのT細胞における、抗CTLA-4ブロック抗体に誘導されたT芽細胞/ラージアッセイ法におけるIFN-γ産生の増強の平均値を示している。
【図１６】図16は5ドナーからのhPBMCにおける、抗CTLA-4ブロックmAbに誘導されたIL-2産生の増強を、SEAによる刺激72時間後の測定値として示している。
【図１７】図17は3ドナーからの全血における、抗CTLA-4ブロックmAbに誘導されたIL-2産生の増強を、SEAによる刺激72時間後および96時間後の測定値として示している。
【図１８】図18はマウス線維肉腫モデルにおける抗マウスCTLA-4抗体による腫瘍の成長阻害を示している。
【図１９】図19は72時間のT芽細胞/ラージ細胞およびスーパー抗原（6ドナーからの全血および末梢血単核細胞）アッセイ法における本発明の抗CTLA-4抗体（4.1.1および11.2.1）に誘導されたIL-2産生の増強を示している。
【図２０】図20は72時間のT芽細胞/ラージアッセイ法における、本発明の抗CTLA-4抗体（4.1.1および11.2.1）に誘導されたIL-2産生の用量依存的な増強を示している。
【図２１】図21は100ng/mlのスーパー抗原により刺激を与えた72時間のスーパー抗原全血アッセイ法における、本発明の抗CTLA-4抗体（4.1.1および11.2.1）に誘導されたIL-2産生の用量依存的な増強を示している。
【図２２】図22は以下の抗CTLA-4抗体鎖の一連のその他のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示している：4.1.1重鎖の全長（cDNA配列22(a)、ゲノムDNA配列22(b)、およびアミノ酸配列22(c)）、糖鎖を除いた4.1.1重鎖の全長（cDNA配列22(d)およびアミノ酸配列22(e)）、4.1.1軽鎖（cDNA配列22(f)およびアミノ酸配列22(g)）、4.8.1重鎖の全長（cDNA配列22(h)およびアミノ酸配列22(i)）、4.8.1軽鎖（cDNA配列22(j)およびアミノ酸配列22(k)）、6.1.1重鎖の全長（cDNA配列22(l)およびアミノ酸配列22(m)）、6.1.1軽鎖（cDNA配列22(n)およびアミノ酸配列22(o)）、11.2.1重鎖の全長（cDNA配列22(p)およびアミノ酸配列22(q)）、および11.2.1軽鎖（cDNA配列22(r)およびアミノ酸配列22(s)）。
【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ｂ−１】
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【図１Ｂ−２】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ−１】
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【図１Ｄ−２】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図１Ｌ】
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【図１Ｍ】
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【図２−１）】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２２（ａ）】
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【図２２（ｂ）】
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【図２２（ｃ）】
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【図２２（ｄ）】
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【図２２（ｅ）】
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【図２２（ｆ）】
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【図２２（ｇ）】
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【図２２（ｈ）】
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【図２２（ｉ）】
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【図２２（ｊ）】
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【図２２（ｋ）】
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【図２２（ｌ）】
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【図２２（ｍ）】
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【図２２（ｎ）】
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【図２２（ｏ）】
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【図２２（ｐ）】
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【図２２（ｑ）】
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【図２２（ｒ）】
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【図２２（ｓ）】
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【配列表】
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