(57)【要約】【課題】  工業用、食品用、又は医療用酵素として利用することのできるテオブロミン蓄積性Ｎ−メチルトランスフェラーゼを効率よく生産する方法を提供する。また、カフェイン又はテオブロミン産生の植物、植物組織、又は植物細胞のカフェイン生合成代謝を改変してカフェイン代謝系の化合物を効率よく生産する方法、及びカフェイン代謝系の化合物群の生成比を改変する方法を提供する。更に、これらの方法に利用することのできる新規ポリペプチド及びそれをコードするポリペプチドを提供する。【解決手段】  前記ポリペプチドは、カカオ由来の新規Ｎ−メチルトランスフェラーゼである。前記ポリペプチドをコードするポリペプチドを含むベクターで形質転換された微生物又は植物を用いてＮ−メチルトランスフェラーゼを生産する。前記ポリペプチドのアンチセンスＲＮＡを植物に導入することにより、Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現量を抑制する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性を有する改変ポリペプチド。
【請求項２】
カカオ由来である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
（ｉ）配列番号１で表される塩基配列における４８番〜１１３９番からなる塩基を含むポリヌクレオチド、
（ii）配列番号１で表される塩基配列における４８番〜１１３９番からなる塩基において、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含み、しかも、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
（iii）配列番号１で表される塩基配列における４８番〜１１３９番からなる塩基からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドによりコードされたＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを微生物及び／又は植物の細胞内で発現させるための構成とを有する、発現ベクター。
【請求項６】
請求項３又は４に記載のポリヌクレオチドの塩基配列又はその部分配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、微生物及び／又は植物の細胞内で、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの発現を抑制するための構成とを有する、発現ベクター。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の発現ベクターで形質転換された微生物。
【請求項８】
請求項７に記載の微生物を培養する工程、及び前記培養によって得られる培養物から請求項１又は２に記載のポリペプチドを採取する工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
請求項５又は６に記載の発現ベクターで形質転換されたか、又は前記発現ベクターを感染させた植物細胞、植物組織、又は植物体。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載のポリペプチド、又は請求項９に記載の植物細胞、植物組織、若しくは植物体を用いた、植物二次代謝産物の製造方法。
【請求項１１】
植物二次代謝産物が、キサントシン、７−メチルキサントシン、７−メチルキサンチン、テオブロミン、テオフィリン、及びカフェインから選ばれる１つ以上の化合物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
植物が、ツバキ属に属する植物、コーヒー属に属する植物、コラノキ属に属する植物、コカノキ属に属する植物、モチノキ属に属する植物、ネエア属に属する植物、アオギリ属に属する植物、ポーリニア属に属する植物、又はカカオノキ属に属する植物である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カカオ由来Ｎ−メチルトランスフェラーゼ、前記酵素をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドで形質転換された微生物及び植物、前記植物又はその培養細胞若しくは組織を用いてテオブロミン又はその前駆体を製造する方法、並びに前記ポリヌクレオチドのアンチセンス配列を含む核酸構造物によりテオブロミン又はその前駆体量を変化させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カフェインは、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）等のツバキ科ツバキ属に属する植物、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）等のアカネ科コーヒー属に属する植物、又はマテ（Ｉｌｅｘ ｐａｒａｇｕａｒｉｅｎｓｉｓ）等のモチノキ属に属する植物等に含まれるプリンアルカロイドであり、医薬品原料や食品添加物として使用されている。
【０００３】
また、カフェインの前駆体であるテオブロミン（３，７−ジメチルキサンチン）を蓄積する種としてカカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）が知られている。カカオには少量のカフェインも存在するが、テオブロミンが主要なプリンアルカロイドである。テオブロミンは、中枢興奮作用が低いため、その服用によりリラックス作用をもたらすことが知られている。カカオはカフェインを蓄積せずテオブロミンを著量蓄積することから、カカオ加工品であるチョコレートなどの摂取によるリラックス効果が注目されている。
【０００４】
カフェインは、キサントシンからテオブロミンを経て３段階のＮ−メチル化反応により生合成されることが14Ｃ−トレーサー実験により明らかにされている（非特許文献１参照）。Ｎ−メチル化を触媒する酵素活性は、１９７５年にチャ葉の粗抽出液を用いた研究で最初に報告された（非特許文献２参照）。一方、コーヒーでメチルトランスフェラーゼの精製が試みられたが、その精製純度はきわめて低かった（非特許文献３参照）。チャでは、メチルトランスフェラーゼの部分精製の報告はあるが、酵素タンパク質はこれまでに単離されていなかった（非特許文献４参照）。
【０００５】
このような中で、プリンアルカロイド生合成に関与する酵素のアミノ酸配列及びそのアミノ酸配列をコードするＤＮＡが加藤等によって次々と明らかにされている。例えば、カフェインシンターゼ、すなわち、カフェイン生合成の最終反応である７−メチルキサンチン〜テオブロミン〜カフェインの２段階のメチル化反応を触媒するＮ−メチルトランスフェラーゼは、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）及びコーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）からそれぞれ単離されている（特許文献１及び特許文献２参照）。また、テオブロミンシンターゼ、すなわち、７−メチルキサンチン〜テオブロミンの一段階のメチル化を触媒するＮ−メチルトランスフェラーゼがコーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）から単離されている（特許文献３参照）。
しかしながら、カカオについては、プリンアルカロイド生合成に関与するＮ−メチルトランスフェラーゼの単離や同定、遺伝子の存在はこれまでに全く開示されていなかった。
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−３７４９０号公報
【特許文献２】特開２００２−８５０７２号公報
【特許文献３】特開２００３−８８３７２号公報
【非特許文献１】鈴木健夫（Ｔａｋｅｏ  Ｓｕｚｕｋｉ）ら，「フィトケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，（英国），１９９２年，３１巻，８号，ｐ．２５７５−２５８４
【非特許文献２】鈴木健夫（Ｔａｋｅｏ  Ｓｕｚｕｋｉ）ら，「バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」，（英国），１９７５年，１４６巻，ｐ．８７−９６
【非特許文献３】パウロ・マッアフェラ（Ｐａｕｌｏ  Ｍａｚｚａｆｅｒａ）ら，「フィトケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，（英国），１９９４年，３７巻，６号，ｐ．１５７７−１５８４
【非特許文献４】加藤美砂子（Ｍｉｓａｋｏ  Ｋａｔｏ）ら，「フィジオロジア・プランタルム（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ）」，（デンマーク），１９９６年，９８巻，ｐ．６２９−６３６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、カカオ由来のプリンアルカロイド生合成系を構成する酵素の一つであるテオブロミン蓄積性のＮ−メチルトランスフェラーゼ、それをコードするポリヌクレオチド、及びそれを用いたベクター等の提供を目的としている。更に、それらを用いることにより、工業用、食品用、又は医療用酵素として利用することのできるテオブロミン蓄積性Ｎ−メチルトランスフェラーゼを効率よく生産する微生物の提供、及び植物や植物組織又は植物細胞のカフェイン類縁物の生合成代謝を改変してカフェイン代謝系の化合物群の生成比を改変する方法の提供を目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意研究の結果、先に単離されているチャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）由来のカフェインシンターゼに保存されているＳ−アデノシルメチオニンの結合領域をもとにプライマーを作製し、このプライマーを用いてＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）法によりカカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）から新たな相同遺伝子を単離することに成功した。
次に、単離されたＤＮＡをベクターに組み込んだ後大腸菌に導入し、前記ＤＮＡに由来するタンパク質を大量に発現させた。得られた発現タンパク質の酵素学的性質を調べたところ、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性が認められ、前記ＤＮＡがＮ−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であることを確認した。
また、得られたカカオ由来Ｎ−メチルトランスフェラーゼの基質特異性を調べた結果、７−メチルキサンチンからテオブロミンを合成する活性がきわめて高い新規なテオブロミンシンターゼであることを確認し、前記ＤＮＡがカカオのテオブロミン蓄積を促進しうる遺伝子であることを見出した。本発明者らは以上の知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００９】
従って、本発明は、（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性を有する改変ポリペプチドに関する。
本発明のポリペプチドの好ましい態様によれば、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）由来である。
【００１０】
また、本発明は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
また、本発明は、（ｉ）配列番号１で表される塩基配列における４８番〜１１３９番からなる塩基を含むポリヌクレオチド、
（ii）配列番号１で表される塩基配列における４８番〜１１３９番からなる塩基において、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含み、しかも、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
（iii）配列番号１で表される塩基配列における４８番〜１１３９番からなる塩基からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
また、本発明は、前記ポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドによりコードされたＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを微生物及び／又は植物の細胞内で発現させるための構成とを有する、発現ベクターに関する。
また、本発明は、前記ポリヌクレオチドの塩基配列又はその部分配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、微生物及び／又は植物の細胞内で、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの発現を抑制するための構成とを有する、発現ベクターに関する。
また、本発明は、前記発現ベクターで形質転換された微生物に関する。
また、本発明は、前記微生物を培養する工程、及び前記培養によって得られる培養物から前記ポリペプチドを採取する工程を含む、ポリペプチドの製造方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、前記発現ベクターで形質転換されたか、又は前記発現ベクターを感染させた植物細胞、植物組織、又は植物体に関する。
また、本発明は、前記ポリペプチド、又は前記植物細胞、植物組織、若しくは植物体を用いた、植物二次代謝産物の製造方法に関する。
本発明の製造方法の好ましい態様によれば、植物二次代謝産物が、キサントシン、７−メチルキサントシン、７−メチルキサンチン、テオブロミン、テオフィリン、及びカフェインから選ばれる１つ以上の化合物である。
本発明の製造方法の別の好ましい態様によれば、植物が、ツバキ(Ｃａｍｅｌｌｉａ)属に属する植物、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属に属する植物、コラノキ（Ｃｏｌａ）属に属する植物、コカノキ（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ）属に属する植物、モチノキ（Ｉｌｅｘ）属に属する植物、ネエア（Ｎｅｅａ）属に属する植物、アオギリ（Ｆｉｒｍｉａｎａ）属に属する植物、ポーリニア（Ｐａｕｌｌｉｎｉａ）属に属する植物、又はカカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属に属する植物である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、工業用、食品用、又は医療用酵素として利用することのできるテオブロミン蓄積性Ｎ−メチルトランスフェラーゼを効率よく生産することが可能になる。また、カフェイン類縁物質産生植物、植物組織、又は植物細胞のカフェイン生合成代謝を改変してカフェイン代謝系の化合物群の生成比を改変することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼは、７−メチルキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼ活性、３−メチルキサンチンＮ１メチルトランスフェラーゼ活性、及びパラキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼ活性を有するカカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）由来のポリペプチドである。
【００１４】
本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼとして、（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を有する改変ポリペプチド、又は（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上）であるアミノ酸配列からなり、かつＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を有する相同ポリペプチド等が挙げられる。
【００１５】
本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号２）の相同性を、既知の植物由来Ｎ−メチルトランスフェラーゼと比較した結果を表１に示した。相同性の算出には、ＧＥＮＥＴＹＸ  ＭＡＣ  ｖｅｒ.９.０を用いた。本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼと既知のＮ−メチルトランスフェラーゼとの相同性は最大５４．６％であり、本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼは新規な酵素であることが明らかである。
【表１】
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【００１６】
前記（ｂ）の「改変ポリペプチド」において、改変にかかわるアミノ酸の数は、改変ポリペプチドがＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を有する限りにおいて特に制限されないが、好ましくは１〜約３０個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜３個である。
【００１７】
なお、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性は、例えば、実施例に示した方法で測定することができる。本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼは、テオブロミンの前駆物質である７−メチルキサンチンに対する基質特異性がきわめて高い特徴を有する。以下、本明細書中で、カカオ由来のＮ−メチルトランスフェラーゼを「カカオ由来テオブロミンシンターゼ」又は「ＢＴＳ１」と記載することがある。
【００１８】
本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼは、好ましくはカカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）の葉部、豆部、又は茎部などより抽出することができるが、以下に示すポリヌクレオチドを用いて発現可能な構成としたベクターを調製し、大腸菌等の微生物宿主を形質転換させ、発現されたタンパク質を採取することによって得ることも可能である。
【００１９】
本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドとして、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を有する改変ポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドも挙げられる。なお、本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドは、典型的には、下記の群から選択されるものである：
（ｉ）配列番号１で表される塩基配列における４８番〜１１３９番の塩基からなる配列を含むポリヌクレオチド（好ましくは、配列番号１で表される塩基配列における４８番〜１１３９番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチド）、
（ii）配列番号１で表される塩基配列における４８番〜１１３９番からなる塩基において、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含み、かつＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び
（iii）配列番号１で表される塩基配列における４８番〜１１３９番からなる塩基からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２１】
前記（ii）の塩基配列において、欠失、置換、若しくは付加することのできる塩基の数は、好ましくは１〜９０個、より好ましくは１〜３０個、更に好ましくは１〜９個である。なお、前記のような変異は、自然界において生じたものでもよく、あるいは、塩基配列における部位突然変異により人工的に起こしたものでもよい。
【００２２】
前記（iii）における「ストリンジェントな条件下」でのハイブリダイゼーションは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに記載の方法によって行うことができ、市販のシステムとしては、ＧｅｎｅＩｍａｇｅシステム（アマシャム）を挙げることができる。具体的には以下の操作によってハイブリダイゼーションを行うことができる。
【００２３】
試験すべきＤＮＡ又はＲＮＡ分子を転写した膜を、製品プロトコールに従って、標識したプローブとプロトコール指定のハイブリダイゼーションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションバッファーの組成は、０．１重量％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５重量％デキストラン硫酸、１／２０容のキット添付のブロッキング試薬、及び２〜７ｘＳＳＣからなる。ブロッキング試薬としては、例えば、１００ｘデンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、２％（重量／容量）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２％（重量／容量）ＦｉｃｏｌｌTM４００、及び２％（重量／容量）ポリビニルピロリドンを５倍濃度で調製したものを１／２０に希釈して使用することができる。２０ｘＳＳＣは、３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．３ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液であり、ＳＳＣは、より好ましくは、３〜６ｘＳＳＣ、更に好ましくは、４〜５ｘＳＳＣの濃度で使用する。
【００２４】
ハイブリダイゼーションの温度は、４０〜８０℃、より好ましくは５０〜７０℃、更に好ましくは５５〜６５℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行った後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温以上、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は、６ｘＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、好ましくは４ｘＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、より好ましくは２ｘＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更により好ましくは１ｘＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、最も好ましくは０．１ｘＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハイブリダイズしたＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を、プローブに用いた標識を利用して識別することができる。
【００２５】
本発明のポリヌクレオチドは、天然由来のものであっても、全合成したものであってもよく、また、天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものであってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ技術［植物のＰＣＲ実験プロトコール（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ２）秀潤社（１９９５）］を利用して、本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼを生産する細胞から分離することができる。具体的には、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡにリンカーを結合させ、Ｎ−メチルトランスフェラーゼを構成するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとリンカーを結合したｃＤＮＡ間でＰＣＲを行うこと等により、目的ｃＤＮＡの全長配列を単離することができる。また、実施例に示したように、先に単離されているチャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）やコーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）由来のカフェインシンターゼやテオブロミンシンターゼに保存されているＳ−アデノシルメチオニン（以下、ＳＡＭと記載することがある）の結合領域をもとに作製したプライマーを用いて、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）からＲＡＣＥ法により遺伝子を単離することができる。
【００２６】
本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築方法、並びに形質転換植物の作製方法及びＲＮＡｉ法によるＮ―メチルトランスフェラーゼの発現抑制方法は以下のとおりである。
【００２７】
本発明の発現ベクターには、
（ａ）（ｉ）本発明のポリヌクレオチドと、（ii）前記ポリヌクレオチドによりコードされたＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを微生物及び／又は植物の細胞内で発現させるための構成とを有する、発現ベクター、及び
（ｂ）（ｉ）本発明のポリヌクレオチドの塩基配列又はその部分配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、（ii）微生物及び／又は植物の細胞内で、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの発現を抑制するための構成とを有する、発現ベクター
が含まれる。
【００２８】
「本発明のポリヌクレオチドによりコードされたＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを微生物及び／又は植物の細胞内で発現させるための構成」、あるいは、「微生物及び／又は植物の細胞内で、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの発現を抑制するための構成」としては、例えば、遺伝子工学分野において発現カセットとして一般に用いられている核酸構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を用いることができ、その構成成分としては、例えば、微生物及び／又は植物細胞内で転写可能なプロモーター、あるいは、転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列などを挙げることができる。
【００２９】
本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ又はそのアンチセンスＲＮＡを微生物又は植物細胞内で発現させるためには、例えば、
（ｉ）微生物又は植物細胞内で転写可能なプロモーター、
（ii）プロモーターの下流にセンス方向又はアンチセンス方向に連結したＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子ＤＮＡの全部又は一部、及び
（iii）必要に応じて前記遺伝子ＤＮＡの下流に連結された転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列
を含む発現カセットを微生物又は植物細胞に導入することができる。
【００３０】
ここでアンチセンスＲＮＡの鋳型としては、例えば、Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの全部若しくは一部、又はそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡをアンチセンス方向に連結した塩基配列、あるいは、Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードするＲＮＡの全部若しくは一部、又はそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＲＮＡをアンチセンス方向に連結した塩基配列であって、カフェイン又はその前駆体を産生する宿主細胞中において発現した際に宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼの発現を阻害する機能を有するものを挙げることができる。
【００３１】
ここで、Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの一部とは、その部分に相補性を有する配列を基礎として得られる阻害用のｍＲＮＡ、すなわち、アンチセンスＲＮＡが宿主細胞中で形成された際に、これが宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼを発現させるためのｍＲＮＡと結合して、宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼの発現が阻害される部分である。この部分としては、このようなアンチセンスｍＲＮＡの形成に必要となる部分であり、例えば、少なくとも１４塩基長の長さの部分を挙げることができる。
【００３２】
アンチセンスｍＲＮＡを形成するための鋳型として用いることのできるＤＮＡ又はＲＮＡとしては、例えば、配列番号１の塩基配列における４８番〜１１３９番の塩基からなる配列の全部又は一部と相補性を有しているＤＮＡ又はＲＮＡを挙げることができる。これらの塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る変異配列の全部又は一部と相補性を有しているＤＮＡ又はＲＮＡもこのような目的に用いることができる。
これらの阻害用のＤＮＡ又はＲＮＡ自体は、必ずしも本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするものでなくともよい。
【００３３】
前記発現カセットは、挿入されているＤＮＡを恒常的又は誘導的に発現させるためのプロモーターを含有することができる。
恒常的に発現させるためのプロモーターとして、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、又はイネのアクチンプロモーターなどが挙げられる。
【００３４】
また、誘導的に発現させるためのプロモーターとして、例えば、糸状菌、細菌、若しくはウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、嫌気的条件、又は特定化合物の散布等の外因によって発現することが知られているプロモーター等が挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌、細菌、若しくはウイルスの感染や侵入によって発現するイネのキチナーゼ遺伝子のプロモーターやタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター、低温によって誘導されるイネの「ｌｉｐ１９」遺伝子のプロモーター、高温によって誘導されるシロイヌナズナの「ＨＳＰ１８．２」遺伝子のプロモーター、乾燥によって誘導されるイネの「ｒａｂ」遺伝子のプロモーター、又は嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター等が挙げられる。また、イネのキチナーゼ遺伝子のプロモーター及びタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーターは、サリチル酸等の特定の化合物によっても誘導され、イネの「ｒａｂ」遺伝子プロモーターは、植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
【００３５】
更には、発現カセットに挿入されているＤＮＡを発現させるためのプロモーターとしては、Ｎ−メチルトランスフェラーゼのプロモーターを単離して利用する方法も挙げられる。具体的なプロモーターの単離方法の一例として、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子のＤＮＡの全部又は一部をプローブとしたハイブリダイゼーション技術の利用により、ゲノムＤＮＡ断片を選択し、前記遺伝子の上流部ＤＮＡを特定する方法を挙げることができる。
【００３６】
発現カセット中の組換えＤＮＡの植物への導入に備えるために、大腸菌の複製シグナル及び形質転換された細菌の細胞を選抜するためのマーカー遺伝子を含むクローニングベクターが数多く利用することができる。このようなベクターの例には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系ベクター、又はＭ１３ｍｐ系ベクター等を挙げることができる。適当な制限酵素切断部位で、目的の配列をベクターに導入することができる。得られたプラスミドＤＮＡの特徴を明らかにするため、制限酵素切断部位分析、ゲル電気泳動、及びその他の生化学的−分子生物学的方法が一般に用いられる。各々の操作を終えた後、プラスミドＤＮＡを切断して、別のＤＮＡに結合させることができる。各プラスミドＤＮＡの配列を、同じプラスミド又は別のプラスミド中にクローニングすることができる。
【００３７】
植物宿主細胞の中に発現カセットを導入するためには、さまざまな手法を用いることができる。これらの手法には、例えば、形質転換因子としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）又はアグロバクテリウム  リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を用いたＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換、プロトプラストへの直接導入（例えば、インジェクション法又はエレクトロポレーション法等）、若しくはパーティクルガン法等、又はその他の可能性が含まれる。
【００３８】
プロトプラストへの直接導入では、特別に必要とされるベクターはない。例えば、ｐＵＣ誘導体のような単純なプラスミドを用いることができる。目的の遺伝子を植物細胞に導入する方法によっては、他のＤＮＡ配列が必要になることもある。例えば、Ｔｉ又はＲｉプラスミドを植物細胞の形質転換に用いる場合には、Ｔｉ及びＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の少なくとも右端の配列（通常は両端の配列）を、導入されるべき遺伝子の隣接領域となるように接続しなければならない。
【００３９】
アグロバクテリウム属菌を形質転換に用いる場合には、導入すべき発現カセットを、特別のプラスミド、すなわち、中間ベクター又はバイナリーベクター中にクローニングする必要がある。
中間ベクターはアグロバクテリウム属菌の中では複製されない。中間ベクターは、ヘルパープラスミド又はエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム属菌の中に移行される。中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡの配列と相同な領域をもつため、相同組換えによって、アグロバクテリウム属菌のＴｉ又はＲｉプラスミド中に取り込まれる。宿主として使われるアグロバクテリウム属菌には、ｖｉｒ領域が含まれている必要がある。通常Ｔｉ又はＲｉプラスミドにｖｉｒ領域が含まれており、その働きにより、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞に移行させることができる。
【００４０】
一方、バイナリーベクターはアグロバクテリウム属菌の中で複製、維持され得るので、ヘルパープラスミド又はエレクトロポレーション法によってアグロバクテリウム属菌中に取り込まれると、宿主のｖｉｒ領域の働きによって、バイナリーベクター上のＴ−ＤＮＡを植物細胞に移行させることができる。
【００４１】
なお、このようにして得られた発現カセットを含む中間ベクター又はバイナリーベクター、及びこれを含む大腸菌やアグロバクテリウム属菌等の微生物も本発明の対象である。
【００４２】
本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入してＮ−メチルトランスフェラーゼタンパク質を大量に発現させるための微生物としては、例えば、遺伝子工学分野においてタンパク質発現に利用されている各種微生物を用いることができ、例えば、細菌（例えば、大腸菌又は枯草菌）又は真核微生物を挙げることができる。前記真核微生物としては、例えば、動物（例えば、哺乳動物、鳥類、又は昆虫）由来の培養細胞、植物由来の培養細胞、又は真菌（例えば、酵母）を挙げることができる。
【００４３】
また、宿主細胞の代謝を改変して特定化合物の生産性向上や特定の化合物群の生成比改変を図ることを目的に、本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡをセンス又はアンチセンスの形で組み込む植物としては、カフェイン若しくはテオブロミン又はそれらの前駆体を産生する植物であればすべて使用することができるが、中でもツバキ科ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属に属する植物（例えば、チャ）、アカネ科コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属に属する植物（例えば、コーヒー）、アオギリ科コラノキ（Ｃｏｌａ）属に属する植物（例えば、コラノキ）、コカノキ（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ）属に属する植物、モチノキ（Ｉｌｅｘ）属に属する植物、ネエア（Ｎｅｅａ）属に属する植物、アオギリ（Ｆｉｒｍｉａｎａ）属に属する植物、ポーリニア（Ｐａｕｌｌｉｎｉａ）属に属する植物、カカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属に属する植物などを例示することができる。
【００４４】
形質転換された植物細胞は、再生過程を経ることにより植物体に変換することができる。再生の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えば、イネではＦｕｊｉｍｕｒａら（Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｅｔｔ．，１９８５年，２巻，ｐ．７４−７５）の方法、トウモロコシでは、Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８９年，７巻，ｐ．５８１−５８７）の方法、又はシロイヌナズナではＡｋａｍａらの方法（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，１９９２年，１２巻，ｐ．７−１１）などが挙げられる。
【００４５】
本発明において、「植物体」とは植物に分類される生物個体の全体若しくは一部の器官（例えば、葉、茎、根、花、果実、種子等）を指す。
これらの方法により作出された植物体は、カフェイン若しくはテオブロミン又はそれらの前駆体を産生する野生型の植物体と比較して、本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼタンパク質の発現量が変化し、宿主植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物の生成量の変化や、宿主植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物群の生成比の変化が起こる。このようにして得られたトランスジェニック植物は本発明の対象である。本発明でいう植物には、前記植物体に加え、植物組織及び植物細胞なども含まれる。
【００４６】
また近年、植物のポストトランスレーショナルなジーンサイレンシングの研究から、ウイルス等の外来核酸に対して植物が本来備えている防御機構を利用して、目的遺伝子の発現を抑制することが可能なことがわかってきた（Ｃｅｌｌ，１９９８年，９５巻，ｐ．１７７−１８７；化学と生物，１９９９年，３７巻，ｐ．５３２−５３４；蛋白質核酸酵素，１９９９年，４４巻，ｐ．１３９６−１３９７）。これによれば、ＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルス等が植物に進入した場合、植物はこれらの鋳型からアベラントＲＮＡを転写し、植物が本来持っている配列の転写産物と配列特異的に二本鎖ＲＮＡを形成する。この二本鎖ＲＮＡはＲＮアーゼにより分解されることにより、目的の遺伝子の発現を抑制することが可能となる（Ｃｅｌｌ，１９９９年，９６巻，ｐ．３０３−３０６）。本方法の重要な特徴のひとつは、発現を抑制したい配列を目的植物に必ずしも形質転換させる必要がない点にある。また、本方法の更なる特徴は、植物の一部（下位葉等）に目的の核酸を感染等により導入すれば、その効果が植物体全体に広がることである。
【００４７】
具体的な発現抑制方法は、例えば、
（ｉ）Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の全配列若しくはその一部の配列、若しくはそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列の全部若しくは一部を含む二本鎖ＲＮＡ、又は
（ii）Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の全配列若しくはその一部の配列、若しくはそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列の全部若しくは一部を含む二本鎖ＤＮＡを有するアグロバクテリウム
を植物の下位葉に感染させる。ここで、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部の配列とは、その部分に相補性を有する配列を基礎として得られる阻害用のｍＲＮＡ、すなわち、アベラントなＲＮＡが宿主細胞中で形成された際に、これが宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼを発現させるためのｍＲＮＡと結合して、宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼの発現が阻害される部分である。この部分としては、このようなアベラントなｍＲＮＡの形成に必要となる部分であり、例えば、少なくとも１４塩基長の長さの部分を挙げることができる。
【００４８】
これらの方法を施された植物体は、カフェイン若しくはテオブロミン又はそれらの前駆体を産生する野生型の植物体と比較して、本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼタンパク質の発現量が変化し、宿主植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物の生成量の変化や、宿主植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物群の生成比の変化が起こる。このようにして得られた植物は本発明の対象である。本発明でいう植物には、葉、花、果実、種子など植物の特定の組織又は細胞も含まれる。
【００４９】
前記構成のベクターで形質転換されたか、あるいは、前記構成のベクターを感染された植物細胞又は植物組織を培養して、あるいは、同様に形質転換された植物体を栽培して、カフェイン及びテオブロミン合成系にかかる二次代謝産物の製造やこれらの形質転換体で生産される二次代謝産物の組成の改変を行うことができる。この二次代謝産物としては、例えば、キサントシン、７−メチルキサントシン、７−メチルキサンチン、テオブロミン、テオフィリン、及びカフェインからなる群から選ばれる少なくとも１つの化合物を挙げることができる。
【００５０】
形質転換に用いる植物細胞、植物組織、又は植物体の供給原としては、例えば、ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属に属する植物、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属に属する植物、コラノキ（Ｃｏｌａ）属に属する植物、コカノキ（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ）属に属する植物、モチノキ（Ｉｌｅｘ）属に属する植物、ネエア（Ｎｅｅａ）属に属する植物、アオギリ（Ｆｉｒｍｉａｎａ）属に属する植物、ポーリニア（Ｐａｕｌｌｉｎｉａ）属に属する植物、又はカカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属に属する植物を挙げることができる。中でも、ツバキ科ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属に属する植物（例えば、チャ）、アカネ科コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属に属する植物（例えば、コーヒー）、アオギリ科コラノキ（Ｃｏｌａ）属に属する植物（例えば、コラノキ）、又はカカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属に属する植物などが好ましい。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００５２】
実施例１：Ｎ−メチルトランスフェラーゼのクローニングのための１本鎖ｃＤＮＡの合成
（１）総ＲＮＡの単離
１ｇの若いカカオの葉（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）を液体窒素存在下で乳棒及び乳鉢を用いて破砕した。液体窒素の昇華後、２％ＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ），０．１ｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．５）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ、１．４ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、及び５％β−メルカプトエタノールの混合溶液５ｍＬに溶かして６５℃で１０分間放置した。等量のクロロホルム液［クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）］を加えて撹拌し、総量で１０ｍＬ程度にした。１５，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、水層をとり、１０ｍｏｌ／Ｌ塩化リチウム液２．５ｍＬを加え、−２０℃に２時間放置した。４℃及び１５，０００ｒｐｍにて１０分間の遠心分離を行い、上清を除去し、沈殿をＴＥ溶液［組成：１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ，１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ−Ｎａ（ｐＨ８．０）］１ｍＬに溶解し、再度、遠心分離を行った。上清を回収し、ＴＥ飽和フェノール溶液１ｍＬを加えて転倒混和し、１５，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行った。更に、上清にフェノール／クロロホルムを加えて撹拌し、１５，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行った。水層を回収し、等量の前記クロロホルム液［クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）］を加え、撹拌した。１５，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、水層を回収し、１／４倍量の１０ｍｏｌ／Ｌ塩化リチウム液を加え、−２０℃で２時間放置した。１５，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた沈殿に７０％エタノールを加えて、再度、遠心分離を行った。沈殿を真空ポンプでドライアップした後、水２００μＬに溶解し、総ＲＮＡの画分とした。
【００５３】
（２）３’−ＲＡＣＥ法による３’末端のクローニングに必要なｃＤＮＡ合成
３’−ＲＡＣＥ法では、市販のセット（３’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔ；ＴＡＫＡＲＡ）を使用した。配列表にないプライマーはこのセットに添付されているものである。６５℃にて５分間の熱処理を行った総ＲＮＡ（１μｇ）をテンプレートにして、前記セットの取扱説明書に記載の方法でオリゴｄＴ−３−サイトアダプタープライマー（ｏｌｉｇｏ  ｄＴ−３−ｓｉｔｅｓ  Ａｄａｐｔｏｒ  Ｐｒｉｍｅｒ）を用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。反応液の組成は以下の通りである（表２）。この反応液を、市販の増幅システム（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００：Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、３０℃／１０分間、５０℃／３０分間、及び９５℃／５分間反応させる条件で反応生成物を得た。
【００５４】
【表２】
2005087036.tif 000003
【００５５】
実施例２：３’−ＲＡＣＥ法によるＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング
実施例１（２）で調製した１本鎖ｃＤＮＡをテンプレートにした以下の反応液を調製した（表３）。チャ由来のカフェインシンターゼＴＣＳ１（特開２００１−３７４９０号公報における配列番号２）で保存されているＳ−アデノシルメチオニンの結合領域を基にプライマーＴＣＳ−ＳＡＭ１（配列番号３）を設計し、ＰＣＲ反応に供試した。この反応液を、市販の増幅システム（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００：Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、９５℃／１分間の反応後、９４℃／１分間、５７℃／１分間、及び７２℃／１分３０秒間からなるサイクルを３０サイクル反応させる条件でＰＣＲを行い、反応生成物を得た。
TCS-SAM1：  GAYTTRGGITGYKCIKCIGGICCIAAYAC  （29mer）（配列番号３）
【００５６】
【表３】
2005087036.tif 000004
【００５７】
実施例３：プラスミドベクターへのサブクローニング
０．８％アガロースゲルを用いてＴＡＥ緩衝液（組成：４０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ，４０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸，１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ）中で反応生成物の電気泳動を行い、得られた目的生成物のバンドを切り取り、市販のＤＮＡ精製試薬（ＧＥＮＥ  ＣＬＥＡＮ：フナコシ）を用いてゲルからＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをｐＴ７ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５αにトランスフォーメーションした。Ｘ−ｇａｌを用いてカラーセレクションを行った後に、アンピシリンを含むＬＢ培地で液体培養を行い、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。インサートの有無はアガロース電気泳動によって確認した。
【００５８】
実施例４：塩基配列の決定
単離したプラスミドを用いて下記のターミネーションミックス反応液（表４及び表５）中でプライマーエクステンションを行った。反応条件は９８℃／５分間反応させた後、９８℃／１分間、５０℃／４５秒間、及び７２℃／１．５分間からなるサイクルを２５サイクル行った後に７２℃／１分間反応させた。
【００５９】
【表４】
2005087036.tif 000005
【００６０】
【表５】
2005087036.tif 000006
【００６１】
反応終了後、各チューブに反応停止液を８μＬずつ加えた。９８℃／５分間の熱変性を行い、サンプルを氷中で急冷した後に、島津ＤＳＱ−２０００Ｌ（Ｓ）システムを用いて分析し、塩基配列を決定した。試薬は、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  に添付されているものを用いた。得られた塩基配列を以下に示した。
GACATTGGGGTGTTCGGCGGGGCGAATACTTTCACTGTGATGTCAACAGTGATAGAGAGCACAAGGGACAAATGCAGTGAATTGAACTGGCAGATGCCAGAAATCCAGTTCTACTTGAATGATTTAGTAGGGAATGATTTCAACACACTGTTCAAAGGGTTATCTGTCATTCAAGATAAATATAAGAATGTTTCATGCTTTGCTATGGGTGCCCCTGGTTCCTTTCACGGCCGGCTTTTCCCTCAGAACTCCATGCATCTCATCCATTCCTCTTATGGTGTACAATGGCTCTCTAAGGTACCCAAAATGACAAGTGAAGGAGGGTTATCACCACCAAACAAAGGGAAGATCTACATATCGAAAACCAGTCCTCCTGCAGTGTGGAAGGCATACCTTTCTCAGTTTCAGGAAGACTTCCTTTCATTCTTGAGATGTCGATCTCCCGAGCTGGTACCTGATGGCCGCATGGTCTTGATAATTCATGGAAGGAAATCCGCAGATCCCACAACCAGAGAGAGCTGCTACACATGGGAAGTTCTAGCTGATGCCATCTCCTACCAGGTTTCACAGGGACTGATTGATGAAGAGAAACTAAACTCCTTCAATGTACCATACTATATTCCCTCCCAGGAAGAAGTTCGGGATTTAGTGAACAAGGAGGGTTCTTTCTTAACTGAGTTTGTAGACACAATTGAAGTTGAACTTGAAGGTATATGGACGGGACCGGAAAATGGAGCTAAAAACTTGAGATCCTTCACAGAGCCCATGATTTCTCACCAGTTTGGAGAAGAGGTAATGGACAAGCTATATGATAAGGTAAAAGATATTCTAGTAGAGGATTGCAAGCAGGAAAAACAATCAACCAGGGGAGTTAGTATTGTTCTTGAATTGAAAAAGAAAGAATCCCACCTCAGCTAAATGTATCATCATTCAGGAAACATTGAAGAAAACAATGTAGCAAAAGAATCAAGGTGATGAACATATGTAAAGAGTATTATTATTAATTAATTTGCTAAGGAATCGAGAAGAAAAAAAAAAAAAAAGGATCCGGTACCTCTAGATCAG  （配列番号９）
【００６２】
実施例５：５’−ＲＡＣＥ法によるＮ−メチルトランスフェラーゼｍＲＮＡの５’上流域の単離
５’上流域の単離には、市販のセット（５’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔ：ＴＡＫＡＲＡ）を用いた。３’−ＲＡＣＥの結果から得られた配列情報をもとに、以下のプライマーを設計した。
BCSn-RT：ACCCTCCTTGTTCACTAA（18mer）（配列番号４）
BCSn-AR：ACCTTAGAGAGCCATTGTA（19mer）（配列番号５）
BCSn-B：GCAGTGTGGAAGGCATACC（19mer）（配列番号６）
BCSn-CR：AAGAGGAATGGATGAGATGC（20mer）（配列番号７）
BCSn-D：GGACTGATTGATGAAGAGAA（20mer）（配列番号８）
プライマーＢＣＳｎ−ＲＴ（配列番号４）を用いて第１鎖ｃＤＮＡ合成を行い、ハイブリッドＲＮＡの分解と、ライゲーション反応による１本鎖ｃＤＮＡの環化の後に、プライマーＢＣＳｎ−ＡＲ（配列番号５）及びＢＣＳｎ−Ｂ（配列番号６）を用いてＰＣＲ反応を行った。反応条件は９４℃／３分間の反応後、９４℃／３０秒間、５５℃／３０秒間、及び７２℃／１分間からなるサイクルを３０サイクルとし、反応生成物を得た。更に、これを鋳型としてプライマーＢＣＳｎ−ＣＲ（配列番号７）及びＢＣＳｎ−Ｄ（配列番号８）を用いて９４℃／３分間の反応後、９４℃／３０秒間、５８℃／３０秒間、及び７２℃／３０秒間からなるサイクルを３０サイクルとし、反応生成物を得た。アクリルアミド電気泳動により反応生成物のバンドを分離し、ゲルからＤＮＡを回収し、ｐＴ７ｂｌｕｅベクターにサブクローニングし、市販のシークエンスキット（ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ：島津製作所）を用いてサンプルを調製した後に、島津ＤＳＱ−２０００Ｌ（Ｓ）システムを用いてＤＮＡの塩基配列を決定した。得られた塩基配列を以下に示した。
ACACAAAGCAAGTTACATGCTTCAGAACAGAGAAAAGAAAATTATCAATGGAGGTGAAGGAAATGCTCTTCATGAACAAAGGAGATGGAGAAAATAGCTATGTTAAGACTTCAGGATACACGCAAAAAGTGGCAGCTGTAACCCAGCCAGTAGTTTACAGGGCAGCTCAATCTCTCTTCACAGGGAGGAATTCTTGCTCATACCAAGTCCTAAACGTGGCTGACTTGGGGTGTTCTTCAGGTCCAAACACTTTCACTGTGATGTCAACAGTGATAGAGAGCACAAGGGACAAATGCAGTGAATTGAATGGCAGATGCCAGAAATCCAGTTCTACTTGAATGATTTAGTAGGGAATGATTTCAACACACTGTTCAAAGGGTTATCTGTCATTCAAGATAAATATAAGAATGTTTCATGCTTTGCTATGGTGCCCCTGGTTCCTTTCACGGCCGGCTTTTCCCTCAGAACTCCATGCATCTCATCCATTCCTCTT  （配列番号１０）
【００６３】
実施例６：Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子ＢＴＳ１の調製
実施例３で得られたカカオ由来Ｎ−メチルトランスフェラーゼ断片を挿入したｐＴ７ｂｌｕｅベクター（３’／ｐＴ７Ｂｌｕｅサンプル）を鋳型に、ＢＣＳｎ−Ｆ及びＬＣＳ１−ＥＲをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、３’末端側にＥｃｏＲＩサイトを付加した断片を調製した。反応条件は、９５℃／１分間の反応後、９４℃／１分間、５３℃／１分間、及び７２℃／２分間からなるサイクルを３０サイクルとした。反応液組成を以下に示した（表６）。
BCSn-F：GGTTATCTGTCATTCAAG（18mer）（配列番号１１）
LCS1-ER：GGAATTCCTAGAGGTACCG（19mer）（配列番号１２）
【００６４】
【表６】
2005087036.tif 000007
【００６５】
また、実施例５で得られたカカオ由来Ｎ−メチルトランスフェラーゼ断片を挿入したｐＴ７ｂｌｕｅベクター（５’／ｐＴ７Ｂｌｕｅサンプル）を鋳型に、ＢＣＳｎ−Ｎ１及びＢＣＳｎ−ＣＲをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、５’末端側にＮｃｏＩサイトを付加した断片を調製した。反応条件は、９５℃／１分間の反応後、９４℃／１分間、５３℃／１分間、及び７２℃／２分間からなるサイクルを３０サイクルとした。反応液組成を以下に示した（表７）。
BCSn-N1：GCCATGGAGGTGAAGGAAA（19mer）（配列番１３）
BCSn-CR：AAGAGGAATGGATGAGATGC（20mer）（配列番号１４）
【００６６】
【表７】
2005087036.tif 000008
【００６７】
アガロースゲル電気泳動により反応後のサンプルを分離し、目的の断片を回収した。実施例３で得られた断片を含むものを制限酵素ＥｃｏＲＩで、実施例５で得られた断片を含むものを制限酵素ＮｃｏＩで切断し、プラスミドｐＥＴ２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の該当する制限酵素サイトに連結した。得られたプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに導入し、前記の２つの断片を挿入したプラスミドを得た。塩基配列の分析を行ったところ、以下に示した塩基配列（以下、「ＢＴＳ１」と称することがある）がｐＥＴ２３ｄに挿入されていることを確認した。このプラスミドｐＥＴ−ＢＣＳ１の制限酵素地図を図１に示した。
ACACAAAGCAAGTTACATGCTTCAGAACAGAGAAAAGAAAATTATCAATGGAGGTGAAGGAAATGCTCTTCATGAACAAAGGAGATGGAGAAAATAGCTATGTTAAGACTTCAGGATACACGCAAAAAGTGGCAGCTGTAACCCAGCCAGTAGTTTACAGGGCAGCTCAATCTCTCTTCACAGGGAGGAATTCTTGCTCATACCAAGTCCTAAACGTGGCTGACTTGGGGTGTTCTTCAGGTCCAAACACTTTCACTGTGATGTCAACAGTGATAGAGAGCACAAGGGACAAATGCAGTGAATTGAACTGGCAGATGCCAGAAATCCAGTTCTACTTGAATGATTTAGTAGGGAATGATTTCAACACACTGTTCAAAGGGTTATCTGTCATTCAAGATAAATATAAGAATGTTTCATGCTTTGCTATGGGTGCCCCTGGTTCCTTTCACGGCCGGCTTTTCCCTCAGAACTCCATGCATCTCATCCATTCCTCTTATGGTGTACAATGGCTCTCTAAGGTACCCAAAATGACAAGTGAAGGAGGGTTATCACCACCAAACAAAGGGAAGATCTACATATCGAAAACCAGTCCTCCTGCAGTGTGGAAGGCATACCTTTCTCAGTTTCAGGAAGACTTCCTTTCATTCTTGAGATGTCGATCTCCCGAGCTGGTACCTGATGGCCGCATGGTCTTGATAATTCATGGAAGGAAATCCGCAGATCCCACAACCAGAGAGAGCTGCTACACATGGGAAGTTCTAGCTGATGCCATCTCCTACCAGGTTTCACAGGGACTGATTGATGAAGAGAAACTAAACTCCTTCAAtGTACCATACTATATTCCCTCCCAGGAAGAAGTTCGGGATTTAGTGAACAAGGAGGGTTCTTTCTTAACTGAGTTTGTAGACACAATTGAAGTTGAACTTGAAGGTATATGGACGGGACCGGAAAATGGAGCTAAAAACTTGAGATCCTTCACAGAGCCCATGATTTCTCACCAGTTTGGAGAAGAGGTAATGGACAAGCTATATGATAAGGTAAAAGATATTCTAGTAGAGGATTGCAAGCAGGAAAAACAATCAACCAGGGGAGTTAGTATTGTTCTTGAATTGAAAAAGAAAGAATCCCACCTCAGCTAAATGTATCATCATTCAGGAAACATTGAAGAAAACAATGTAGCAAAAGAATCAAGGTGATGAACATATGTAAAGAGTATTATTATTAATTAATTTGCTAAGGAATCGAGAAGAAAAAAAAAAAAAAA  （配列番号１）
【００６８】
実施例７：Ｎ−メチルトランスフェラーゼの大腸菌での発現
単離したＢＴＳ１遺伝子を発現ベクターｐＥＴ２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込み、このプラスミド（ｐＥＴ−ＢＣＳ１）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフォーメーションした。得られた大腸菌を３７℃で２時間培養した後に、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．３ｍｍｏｌ／Ｌになるように加え、３０℃で更に４．５時間培養を行った。培養終了後集菌し、１００ｍＬの培養液の菌体に対し、１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、及び１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ−Ｎａ2混合液０．４５ｍＬ中で１分間断続的に超音波破砕を行った。これを１４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を酵素液とした。この酵素液を用いて以下に示す方法で活性を測定したところ、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（テオブロミンシンターゼ）活性が認められた。
【００６９】
なお、前記プラスミドｐＥＴ−ＢＣＳ１は大腸菌Ｋ１２に導入し、２００３年（平成１５年）９月１１日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に国内寄託されている。その受託番号は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５２２である。
【００７０】
Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（テオブロミンシンターゼ）活性測定に用いる反応液は、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ2、１ｍｍｏｌ／Ｌ−７−メチルキサンチン、及び４６μｍｏｌ／Ｌ［メチル−14Ｃ］Ｓ−アデノシルメチオニン（１．８５ｋＢｑ）に酵素液５６μＬを加えたものとし、反応液の体積は１００μＬとした。２７℃で３０分間反応を行い、得られた反応生成物を１ｍＬのクロロホルムを加えて抽出した。クロロホルム層を濃縮し、セルロース薄層プレートを用いてブタノール−酢酸−水（４：１：１）で展開した後、オートラジオグラフィを行って反応生成物を同定した。予想される反応生成物が７−メチルキサントシンの場合は、反応液を凍結乾燥した後、５０％メタノールに溶解し、同様に薄層クロマトグラフィーで分離後、オートラジオグラフィにより同定した。対照として、反応液から７−メチルキサンチンを除いたものを用いた。活性測定の結果、１０５．９ｐｍｏｌのテオブロミンが生成したことが判明した。
【００７１】
前記酵素液を用いて、得られたＮ−メチルトランスフェラーゼ酵素の基質特異性を表８に示した。表中の数値は、７−メチルキサンチンに対する活性を１００としたときの相対活性（％）とした。また、表２における「ｎ．ｄ．」は、検出限界以下であったことを意味する。測定方法は、表２に示した基質を用いる点以外は前記と同様の条件とした。比較のため、チャ(Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ)葉由来カフェインシンターゼＴＣＳ１の基質特異性も記載した。
【００７２】
【表８】
2005087036.tif 000009
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明は、工業用、食品用、又は医療用酵素として利用することのできるテオブロミン蓄積性Ｎ−メチルトランスフェラーゼの製造の用途に適用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７４】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列番号３で表される塩基配列は、プライマーＴＣＳ−ＳＡＭ１であり、配列番号４で表される塩基配列は、プライマーＢＣＳｎ−ＲＴであり、配列番号５で表される塩基配列は、プライマーＢＣＳｎ−ＡＲであり、配列番号６で表される塩基配列は、プライマーＢＣＳｎ−Ｂであり、配列番号７で表される塩基配列は、プライマーＢＣＳｎ−ＣＲであり、配列番号８で表される塩基配列は、プライマーＢＣＳｎ−Ｄであり、配列番号１１で表される塩基配列は、プライマーＢＣＳｎ−Ｆであり、配列番号１２で表される塩基配列は、プライマーＬＣＳ１−ＥＲであり、配列番号１３で表される塩基配列は、プライマーＢＣＳｎ−Ｎ１であり、配列番号１４で表される塩基配列は、プライマーＢＣＳｎ−ＣＲである。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】カカオ由来Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＢＴＳ１）を導入したプラスミドの構造を示す説明図である。
【図１】
2005087036.tif 000010
【配列表】
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