(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｌ-グルタミンを生産する微生物のブレビバクテリウムラクトフェルメンタム変異株CJJA21(KCCM-10222)またはCJJA22(KCCM-10223)及びそれを用いたＬ−グルタミン生産方法を提供すること。【解決手段】ブレビバクテリウム属菌株の変異株であって、アジ化ナトリウムに耐性を有し且つＬ−グルタミンを生産するブレビバクテリウムラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum)CJJA21(KCCM-10222)及びＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸(DL-α-amino-n-butyric acid:α-ABA)に耐性を有し且つＬ−グルタミンを生産するブレビバクテリウムラクトフェルメンタムCJJA22(KCCM-10223)と、この微生物を振盪培養して消化器疾患治療、肝機能強化剤、脳機能強化剤、免疫増強剤、胃潰瘍治療剤、アルコール中毒治療剤、化粧品の保湿剤、運動選手用栄養剤、患者用栄養剤などの医薬品、化粧品及び健康食品などに使用するＬ−グルタミンの生産方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−グルタミンを生産し、 ＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸(DL-α-amino-n-butyric acid)に耐性を有するブレビバクテリウムラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum)変異株 CJJA22(KCCM-10223)。
【請求項２】
請求項１による微生物のブレビバクテリウムラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum)変異株 CJJA22(KCCM-10223)を活性化させた後、活性化された菌株を培養することを特徴とするＬ−グルタミン生産方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の属する技術分野）
本発明は、Ｌ−グルタミン(L-glutamine)を生産する微生物及びそれを用いたＬ−グルタミン生産方法に関し、特にブレビバクテリウム属菌株の変異株であって、アジ化ナトリウムに耐性を有し且つＬ−グルタミンを生産するブレビバクテリウムラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum)CJJA21(KCCM-10222)及びＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸(DL-α-amino-n-butyric acid:α-ABA)に耐性を有し且つＬ−グルタミンを生産するブレビバクテリウムラクトフェルメンタムCJJA22(KCCM-10223)と、それを用いたＬ−グルタミン生産方法に関する。
【０００２】
（従来の技術）
Ｌ−グルタミンは、消化器疾患治療や肝機能強化剤、脳機能強化剤、免疫増強剤、胃潰瘍治療剤、アルコール中毒治療剤、化粧品の保湿剤、運動選手用栄養剤、患者用栄養剤などの医薬品、化粧品及び健康食品などに使われるアミノ酸である。
【０００３】
従来、微細物によるＬ−グルタミンの生産方法としては、日本特公昭５３−１７６７５に記載のスルファグアニジン(Sulfaguanidine)耐性菌株から得る方法、日本特開昭５５−１４８０９４に記載のアザセリン(Azaserine)などの耐性菌株から得る方法、日本特開平０４−０８８９９４に記載のペニシリン感受性菌株を用いた方法、日本特開平０２−１８６９９４に記載のチロシン−グルタミン酸(tyr-glu)耐性株を用いる方法などがある。
【０００４】
（発明が解決しようとする課題）
本発明者等は、より生産性に優れたＬ−グルタミン生産菌を得るための研究中、呼吸抑制剤のアジ化ナトリウム、またはアミノ酸の一種であるイソロイシン(isoleucine)の類似体としてのＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸に対する耐性を有した菌株がグルタミン生産性を高めるものと期待され、従来のグルタミン菌株であるブレビバクテリウムラクトフェルメンタムKFCC-10680（韓国特許公告番号第９１−７８１８号）菌株を母菌株としてアジ化ナトリウムまたはＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸に対する耐性変異株を求めた結果、より高い収率でＬ−グルタミンを生成することを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
（課題を解決するための手段）
本発明は、Ｌ−グルタミン(L-glutamine)を生産する微生物及びそれを用いたＬ−グルタミン生産方法に関するもので、ブレビバクテリウム属菌株の変異株であって、アジ化ナトリウムに耐性を有し且つＬ−グルタミンを生産するブレビバクテリウムラクトフェルメンタムCJJA21(KCCM-10222)及びＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸(DL-α-amino-n-butyric acid:α−ＡＢＡ)に耐性を有し且つＬ−グルタミンを生産するブレビバクテリウムラクトフェルメンタムCJJA22(KCCM-10223)と、それを用いたＬ−グルタミン生産方法に関するものである。
【０００６】
（発明の実施の形態）
以下、本発明の変異株を誘導する方法を説明する。
ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムKFCC-10680に一般的な変異処理方法、即ちＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine：ＮＴＧ)処理を行った後、５００ｍｇ／Ｌのアジ化ナトリウムまたは１５ｇ／ＬのＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸が加えられた最小培地（註１）に塗抹して５００ｍｇ／Ｌのアジ化ナトリウム耐性株または１５ｇ／ＬのＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸耐性株を得た。
【０００７】
変異株の誘導方法をより詳細に説明すると、次の通りである。
活性化培地（註２）で１６時間培養して活性化させた菌株を、１２１℃で１５分間滅菌した種菌培地（註３）で１４時間程度培養した後、このうち５ｍｌを１００ｍＭのクエン酸緩衝液(citrate buffer solution)で洗浄し、次いでＮＴＧを最終濃度が２００ｍｇ／Ｌとなるように添加した後２０分間処理し、１００ｍＭのリン酸緩衝液(phosphate buffer)で洗浄した。ＮＴＧ処理された菌株を最小培地（註１）に塗抹して死滅率を求めた結果、死滅率は８５％であった。アジ化ナトリウム耐性変異株を求めるために、ＮＴＧ処理された菌株を、アジ化ナトリウムが最終濃度５００ｍｇ／Ｌとなるように加えられた最小培地（註１）に塗抹し、３０℃で６日間培養することにより、アジ化ナトリウム耐性変異株を得た。得られた耐性変異株をグルタミン生産培地（註４）で７２時間振盪用三角フラスコに培養して、母菌株としてのブレビバクテリウムラクトフェルメンタムKFCC-10680よりグルタミンの収率が１０以上向上したアジ化ナトリウム耐性変異株を選別し、これをブレビバクテリウムラクトフェルメンタムCJJA21と命名した。
【０００８】
本出願人は、前記微生物ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムCJJA21を第３者に一般分譲できるように、韓国ソウル市西大門区弘濟洞所在の韓国微細物保存センターに２０００年１０月３日付に受託番号第KCCM-10222号で寄託した。
【０００９】
また、ＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸耐性変異株を求めるために、ＮＴＧ処理された菌株を、ＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸が最終濃度１５ｇ/Ｌとなるように加えられた最小培地（註１）に塗抹し、３０℃で６日間培養することにより、ＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸耐性変異株を得た。得られた耐性変異株をグルタミン生産培地（註４）で７２時間振盪用三角フラスコに培養して、母菌株としてのブレビバクテリウムラクトフェルメンタムKFCC-10680よりグルタミンの収率が１０％以上向上したＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸耐性変異株を選別し、これをブレビバクテリウムラクトフェルメンタムCJJA22と命名した。
【００１０】
本出願人は、前記微生物ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムCJJA22を第３者に一般分譲できるように、韓国ソウル市西大門区弘濟洞所在の韓国微細物保存センターに２０００年１０月３日付に受託番号第KCCM-10223号で寄託した。
【００１１】
（註１）最小培地：
葡萄糖１.０％、硫酸アンモニウム（(ＮＨ４)２ＳＯ４）０.４％、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ）０.０４％、リン酸第１カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）０.１％、尿素０.１％、チアミン(Thiamine、ＨＣｌ)０.０００１％、ビオチン２００μｇ/Ｌ、寒天、ｐＨ７.０。
【００１２】
（註２）活性化培地：
牛肉エキス(Beef Extract)１％、ポリペプトン(Polypeptone)１％、食塩（ＮａＣｌ）０.５％、イースト抽出物(Yeast Extract)０.５％、寒天２％、ｐＨ７.２。
【００１３】
（註３）種菌培地：
葡萄糖５％、バクトペプトン(Bacto peptone)１％、食塩（ＮａＣｌ）０.２５％、イースト抽出物１％、ビオチン３μｇ/Ｌ、尿素０.４％、ｐＨ７.０。
【００１４】
（註４）グルタミン生産培地：
葡萄糖４.０％、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）３.０％、大豆酸加水分解物(Soy Protein acid Hydrolyzate)０.３％、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３-）５％、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）０.１％、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ）０.０５％、リン酸第１カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）０.１５％、リン酸第２カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）０.１５％、尿素０.３％、チアミン（Thiamine、ＨＣｌ）２ｍｇ/Ｌ、ビオチン５μｇ/Ｌ、硫酸鉄（ＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ）２０ｍｇ/Ｌ、硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ）２０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４、７Ｈ２Ｏ）１２ｍｇ/Ｌ、ｐＨ６.８。
【００１５】
ＮＴＧを使用した突然変異誘導方法によってグルタミン生産性が向上したアジ化ナトリウム耐性変異株としてのブレビバクテリウムラクトフェルメンタムCJJA21のアジ化ナトリウムに対する耐性は、次の通りである（表１）。
【００１６】
【表１】
2005323608.tif 000002
ＮＴＧを使用した突然変異誘導方法によってグルタミン生産性が向上したＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸耐性変異株としてのブレビバクテリウムラクトフェルメンタムCJJA22のＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸に対する耐性は、次の通りである（表２）。
【００１７】
【表２】
2005323608.tif 000003
本発明は下記実施例によってより具体的に例示されるが、これらの実施例は本発明の具現例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００１８】
（実施例）
（参考例１）
使用菌株：
ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムCJJA21
醗酵培地：
葡萄糖４.０％、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）３.０％、大豆酸加水分解物０.３％、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）５％、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）０.１％、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ）０.０５％、リン酸第１カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）０.１５％、リン酸第２カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）０.１５％、尿素０.３％、チアミン（Thiamine、ＨＣｌ）２ｍｇ/Ｌ、ビオチン５μｇ/Ｌ、硫酸鉄（ＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ）２０ｍｇ/Ｌ、硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ）２０ｍｇ/Ｌ、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４、７Ｈ２Ｏ）１２ｍｇ/Ｌ、ｐＨ６.８（註４と同一）。
【００１９】
醗酵方法及び結果：
前記醗酵培地２０ｍｌを２５０ｍｌの振盪用三角フラスコに分株し、１２１℃で１５分間滅菌した後、３０℃の活性化培地（註２）で１６時間培養して活性化させた菌株を接種（１loopful）して３０℃で４８時間振盪培養した。
醗酵終了液の結果は表３に示す。
【００２０】
【表３】
2005323608.tif 000004
（参考例２）
使用菌株：
ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムCJJA21
醗酵培地：
葡萄糖１０％、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）４.５％、大豆酸加水分解物(Soy Protein acid hydrolyzate)０.５％、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）５％、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）０.１％、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ）０.０５％、リン酸第１カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）０.１５％、リン酸第２カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）０.１５％、尿素０.３％、チアミン（Thiamine、ＨＣｌ）２ｍｇ/Ｌ、ビオチン５μｇ/Ｌ、硫酸鉄（ＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ）２０ｍｇ/Ｌ、硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ）２０ｍｇ/Ｌ、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４、７Ｈ２Ｏ）１２ｍｇ/Ｌ、ｐＨ６.８。
【００２１】
醗酵方法及び結果：
前記醗酵培地２０ｍｌを２５０ｍｌの振盪用三角フラスコに分株し、１２１℃で１５分間滅菌した後、３０℃の活性化培地（註２）で１６時間培養して活性化させた菌株を接種（１loopful）して３０℃で７２時間振盪培養した。醗酵終了液の結果は表４に示す。
【００２２】
【表４】
2005323608.tif 000005
表４から分かるように、本発明のブレビバクテリウムラクトフェルメンタムCJJA21は、既存のブレビバクテリウムラクトフェルメンタムKFCC-10680より１０％以上高い収率でＬ−グルタミンを生産した。
【００２３】
（実施例１）
ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムCJJA22を参考例１と同じ方法で培養した。醗酵培地の組成物も参考例１と同一である。
醗酵終了液の結果を表５に示す。
【００２４】
【表５】
2005323608.tif 000006
（実施例２）
使用菌株のブレビバクテリウムラクトフェルメンタムCJJA22を参考例２と同じ方法で培養した。醗酵培地の組成物も参考例２と同一である。
醗酵終了液の結果は表６に示す。
【００２５】
【表６】
2005323608.tif 000007
（発明の効果）
本発明はＬ-グルタミンを生産する微生物のブレビバクテリウムラクトフェルメンタム変異株CJJA21(KCCM-10222)またはCJJA22(KCCM-10223)及びそれを用いたＬ−グルタミン生産方法に関するもので、ブレビバクテリウム属菌株の変異株であって、アジ化ナトリウムまたはＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸に耐性を有し且つＬ−グルタミンを生産する微生物のブレビバクテリウムラクトフェルメンタム変異株 CJJA21(KCCM-10222)またはCJJA22(KCCM-10223)及びこれらの微生物を醗酵培地で３０℃にて１６時間活性化させた後、さらに７２時間振盪培養してＬ−グルタミンを生産する方法に関するものである。このように生産されたＬ−グルタミンは、消化器疾患治療、肝機能強化剤、脳機能強化剤、免疫増強剤、胃潰瘍治療剤、アルコール中毒治療剤、化粧品の保湿剤、運動選手用栄養剤、患者用栄養剤などの医薬品、化粧品及び健康食品などに使用することができる。