(57)【要約】【課題】  生物細胞内等に存在する極めて微細な脂質膜小胞の粒径を in vivo等で計測できる方法を提供する。【解決手段】  脂質膜小胞の脂質膜を脂溶性蛍光色素で染色し、脂質膜小胞に封入された水性液体を水溶性蛍光色素で染色し、これに多光子励起レーザー光を入射して、脂質膜小胞の体積を反映する水溶性蛍光色素の蛍光強度及び表面積を反映する脂溶性蛍光色素の蛍光強度を検出する。これに加え、半径が既知の脂質膜小胞から得た同様の蛍光強度データ、又は別途に測定した脂溶性蛍光色素の単位膜面積当たりの蛍光強度／水溶性蛍光色素の単位体積当たりの蛍光強度データと対比し、脂質膜小胞のサイズを決定する。【選択図】          図１  
2005321380.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも以下のプロセスを行うことを特徴とする脂質膜小胞のサイズ決定方法。
（１）脂溶性蛍光色素を含む脂質膜中に前記脂溶性蛍光色素とは異なる波長で発光する水溶性蛍光色素を含む水性液体が封入された脂質膜小胞を、細胞中又はマトリクスたる水性液体中において調製するプロセス。
（２）前記脂質膜小胞を含有する細胞又はマトリクスたる水性液体に対して２光子励起以上の多光子励起が可能なレーザー光を対物レンズを介して入射し、多光子励起に特有の焦点限局的励起に基づいて対物レンズの焦点面部位に位置する脂質膜小胞において生じた水溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆayと脂溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆbyとを検出するプロセス。
（３）前記蛍光強度Ｆayが焦点面部位に位置する脂質膜小胞の合計体積を反映し、前記蛍光強度Ｆbyが焦点面部位に位置する脂質膜小胞の合計表面積を反映する点を利用し、脂質膜小胞が完全球体であるとの近似的仮定のもとに蛍光強度Ｆayと蛍光強度Ｆbyとを用いて成立する、下記計算式（ａ１）から導かれる下記計算式（ａ２）と、
半径Ｒが既知である脂質膜小胞について前記と同様のプロセスによって検出された水溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆa と脂溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆb とを用いて成立する、前記と同様の下記計算式（ｂ１）から導かれる下記計算式（ｂ２）とから、
下記の方程式（ａｂ２）の演算によってサイズが未知の脂質膜小胞の半径Ｒ1
を求め、脂質膜小胞のサイズを決定するプロセス。
（ａ１）  ：〔（Ｆay）×（４πＲ1３／３）〕／〔（Ｆby）×４πＲ1２〕
（ａ２）  ：（Ｆay／３Ｆby）×Ｒ1
（ｂ１）  ：〔Ｆa ×（４πＲ３  ／３）〕／（Ｆb ×４πＲ２  ）
（ｂ２）  ：（Ｆa ／３Ｆb ）×Ｒ
（ａｂ２）：Ｒ1 ＝〔（Ｆay／３Ｆby）×Ｒ〕／（Ｆa ／３Ｆb ）
【請求項２】
前記（２）のプロセスを２光子励起以上の多光子励起方式である多光子励起顕微鏡を用いて行うことを特徴とする請求項１に記載の脂質膜小胞のサイズ決定方法。
【請求項３】
前記多光子励起顕微鏡が近赤外多光子励起顕微鏡であることを特徴とする請求項２に記載の脂質膜小胞のサイズ決定方法。
【請求項４】
前記（１）のプロセスにおける、細胞中において脂質膜小胞が調製された状態を以下のいずれかの方法によって実現することを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載の脂質膜小胞のサイズ決定方法。
（イ）前記水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素を含む水性液体に対して前記細胞又はこれを含む生体組織標本を接触させ、適宜な刺激により又は細胞の自律的作用により前記水性液体を封入した脂質膜小胞の細胞内取り込みを起こさせると共に、水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素の異なる親和性を利用して、前記脂溶性蛍光色素を含む脂質膜中に前記水溶性蛍光色素を含む水性液体が封入された脂質膜小胞を形成する。
（ロ）前記水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素を含む水性液体に対して脂質膜の構成材料を投入することにより、水性液体を封入したミセルとしての脂質膜小胞を形成させると共に、水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素の異なる親和性を利用して、前記脂溶性蛍光色素を含む脂質膜中に前記水溶性蛍光色素を含む水性液体が封入された脂質膜小胞とし、この脂質膜小胞を適宜な手段によってマトリクスたる前記水性液体から分離した後、細胞内へ注入する。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれかに記載の脂質膜小胞のサイズ決定方法を行い、前記脂質膜小胞の半径Ｒ1 の計算値がゼロであった場合には、前記細胞中又はマトリクスたる水性液体中に脂質膜小胞が存在しないと判定することを特徴とする脂質膜小胞の存否の判定方法。
【請求項６】
少なくとも以下のプロセスを行うことを特徴とする脂質膜小胞のサイズ決定方法。
（６−１）所定濃度の水溶性蛍光色素を含む水性液体に対して２光子励起以上の多光子励起が可能なレーザー光を対物レンズを介して入射し、多光子励起に特有の焦点限局的励起に基づいて対物レンズの焦点面部位の水性液体において生じた水溶性蛍光色素の蛍光強度を検出することにより、前記水性液体の単位体積当たりの蛍光強度Ｆc を計算するプロセス。
（６−２）上記（６−１）と同一濃度に前記水溶性蛍光色素を含む水性液体が脂質膜中に封入された脂質膜小胞を、細胞中又はマトリクスたる水性液体中において調製するプロセス。
（６−３）前記細胞又はマトリクスたる水性液体に対し上記（６−１）と同一のレーザー光を対物レンズを介して入射し、多光子励起に特有の焦点限局的励起に基づいて対物レンズの焦点面部位に位置する脂質膜小胞から生じた水溶性蛍光色素の蛍光強度のうち、脂質膜小胞の個数ａを特定できる視野内の蛍光強度Ｆczを検出するプロセス。
（６−４）蛍光強度Ｆczが前記特定の個数ａの脂質膜小胞の合計体積を反映する点を利用し、脂質膜小胞が完全球体であるとの近似的仮定のもとに、蛍光強度Ｆczと、個数ａと、蛍光強度Ｆc とを用いて成立する、下記計算方程式（ｃ１）から導かれる下記計算方程式（ｃ２）によって、個数ａの脂質膜小胞の平均半径Ｒ2 を求め、脂質膜小胞のサイズを決定するプロセス。
（ｃ１）：（４／３）πＲ2３・ａ＝Ｆcz／Ｆc
（ｃ２）：Ｒ2 ＝〔３・（Ｆcz／Ｆc ）／（４・ａ・π）〕１／３  
【請求項７】
前記（６−１）のプロセスにおいて、前記水性液体に対して前記レーザー光を対物レンズを介して入射した場合の前記対物レンズの焦点面部位の蛍光画像の蛍光強度をＦe とし、実際に用いた当該蛍光強度測定系において、蛍光強度の点分布関数（ Point Spread Function：Ｐxyz 〕をｚ軸について積分した時の積分値が１になるようにした場合におけるＺ＝０の時の点分布関数の値をＰxy(0) とした場合に、Ｆc ＝Ｆe ・Ｐxy(0) の式によって前記水性液体の単位体積当たりの蛍光強度Ｆc を求めることを特徴とする請求項６に記載の脂質膜小胞のサイズ決定方法。
【請求項８】
前記（６−１）及び（６−３）のプロセスを、２光子励起以上の多光子励起方式である多光子励起顕微鏡を用いて行うことを特徴とする請求項６又は請求項７に記載の脂質膜小胞のサイズ決定方法。
【請求項９】
前記多光子励起顕微鏡が、近赤外多光子励起顕微鏡であることを特徴とする請求項８に記載の脂質膜小胞のサイズ決定方法。
【請求項１０】
前記（６−２）のプロセスにおける、細胞中において脂質膜小胞が調製された状態を、以下のいずれかの方法によって実現することを特徴とする請求項６〜請求項９のいずれかに記載の脂質膜小胞のサイズ決定方法。
（ハ）前記水溶性蛍光色素を含む水性液体に対して前記細胞又はこれを含む生体組織標本を接触させ、適宜な刺激により又は細胞の自律的作用により前記水性液体を封入した脂質膜小胞の細胞内取り込みを起こさせることにより、細胞中において前記脂質膜小胞を形成させる。
（ニ）前記水溶性蛍光色素を含む水性液体に対して脂質膜の構成材料を投入することにより、水性液体を封入したミセルとしての脂質膜小胞を形成させ、この脂質膜小胞を適宜な手段によってマトリクスたる前記水性液体から分離した後、細胞内へ注入する。
【請求項１１】
少なくとも以下のプロセスを行うことを特徴とする脂質膜小胞のサイズ決定方法。
（１１−１）所定濃度の脂溶性蛍光色素を含む平面の脂質膜に対して２光子励起以上の多光子励起が可能なレーザー光を対物レンズを介して入射し、多光子励起に特有の焦点限局的励起に基づいて対物レンズの焦点面部位の脂質膜において生じた脂溶性蛍光色素の蛍光強度を検出することにより、前記脂質膜の単位膜面積当たりの蛍光強度Ｆd を計算するプロセス。
（１１−２）上記（１１−１）と同一濃度に前記脂溶性蛍光色素を含む脂質膜を持つ脂質膜小胞を、細胞中又はマトリクスたる水性液体中において調製するプロセス。
（１１−３）前記細胞又はマトリクスたる水性液体に対して（１１−１）と同一のレーザー光を対物レンズを介して入射し、多光子励起に特有の焦点限局的励起に基づいて対物レンズの焦点面部位に位置する脂質膜小胞から生じた脂溶性蛍光色素の蛍光強度のうち、脂質膜小胞の個数ａを特定できる視野内の蛍光強度Ｆdwを検出するプロセス。
（１１−４）蛍光強度Ｆdwが前記特定の個数ａの脂質膜小胞の合計表面積を反映する点を利用し、脂質膜小胞が完全球体であるとの近似的仮定のもとに、蛍光強度Ｆdwと、個数ａと、蛍光強度Ｆd とを用いて成立する下記計算方程式（ｄ１）から導かれる下記計算方程式（ｄ２）によって、個数ａの脂質膜小胞の平均半径Ｒ3 を求め、脂質膜小胞のサイズを決定するプロセス。
（ｄ１）：（４πＲ3２）・ａ＝Ｆdw／Ｆd
（ｄ２）：Ｒ3 ＝〔（Ｆdw／Ｆd ）／（４・ａ・π）〕１／２  
【請求項１２】
前記（１１−１）のプロセスにおいて、前記脂質膜に対して前記レーザー光を対物レンズを介して入射した場合における前記対物レンズの焦点面部位の蛍光画像の蛍光強度をＦm とし、実際に用いた当該蛍光強度測定系において、蛍光強度の点分布関数（ Point Spread Function：Ｐxyz 〕をｚ軸について積分した時の積分値が１になるようにした場合におけるＺ＝０の時の点分布関数の値をＰxy(0) とした場合に、Ｆd ＝Ｆm ・Ｐxy(0) の式によって前記脂質膜の単位膜面積当たりの蛍光強度Ｆd を求めることを特徴とする請求項１１に記載の脂質膜小胞のサイズ決定方法。
【請求項１３】
前記（１１−１）及び（１１−３）のプロセスを、２光子励起以上の多光子励起方式である多光子励起顕微鏡を用いて行うことを特徴とする請求項１１又は請求項１２に記載の脂質膜小胞のサイズ決定方法。
【請求項１４】
前記多光子励起顕微鏡が、近赤外多光子励起顕微鏡であることを特徴とする請求項１３に記載の脂質膜小胞のサイズ決定方法。
【請求項１５】
前記（１１−２）のプロセスにおける細胞中において脂質膜小胞が調製された状態を、以下のいずれかの方法によって実現することを特徴とする請求項１１〜請求項１４のいずれかに記載の脂質膜小胞のサイズ決定方法。
（ホ）前記脂溶性蛍光色素を含む水性液体に対して前記細胞又はこれを含む生体組織標本を接触させ、適宜な刺激により又は細胞の自律的作用により前記水性液体を封入した脂質膜小胞の細胞内取り込みを起こさせると共に、脂溶性蛍光色素の親和性を利用して脂質膜中に脂溶性蛍光色素を含ませることにより、細胞中において前記脂質膜小胞を形成させる。。
（ヘ）前記脂溶性蛍光色素を含む水性液体に対して脂質膜の構成材料を投入することにより、水性液体を封入したミセルとしての脂質膜小胞を形成させると共に、脂溶性蛍光色素の親和性を利用して脂質膜中に脂溶性蛍光色素を含ませることにより前記脂質膜小胞を構成し、この脂質膜小胞を適宜な手段によってマトリクスたる前記水性液体から分離した後、細胞内へ注入する。
【請求項１６】
少なくとも以下のプロセスを行うことを特徴とする脂質膜小胞のサイズ決定方法。
（１６−１）所定濃度の水溶性蛍光色素を含む水性液体に対して２光子励起以上の多光子励起が可能なレーザー光を対物レンズを介して入射し、多光子励起に特有の焦点限局的励起に基づいて対物レンズの焦点面部位の水性液体において生じた水溶性蛍光色素の蛍光強度を検出することにより、前記水性液体の単位体積当たりの蛍光強度Ｆc を計算するプロセス。
（１６−２）所定濃度の、前記水溶性蛍光色素とは異なる波長で発光する脂溶性蛍光色素を含む平面の脂質膜に対して、２光子励起以上の多光子励起が可能な前記（１６−１）と同一のレーザー光を対物レンズを介して入射し、多光子励起に特有の焦点限局的励起に基づいて対物レンズの焦点面部位の脂質膜において生じた脂溶性蛍光色素の蛍光強度を検出することにより、前記脂質膜の単位膜面積当たりの蛍光強度Ｆd を計算するプロセス。
（１６−３）前記（１６−１）と同一濃度に前記水溶性蛍光色素を含む水性液体が、前記（１６−２）と同一濃度に前記前記脂溶性蛍光色素を含む脂質膜を持つ脂質膜中に封入された脂質膜小胞を、細胞中又はマトリクスたる水性液体中において調製するプロセス。
（１６−４）前記細胞又はマトリクスたる水性液体に対し前記（１６−１）と同一のレーザー光を対物レンズを介して入射し、多光子励起に特有の焦点限局的励起に基づいて対物レンズの焦点面部位に位置する脂質膜小胞から生じた水溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆcz1 及び脂溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆdw1 を検出するプロセス。
（１６−５）前記蛍光強度Ｆcz1 が焦点面部位に位置する脂質膜小胞の合計体積を反映し、前記蛍光強度Ｆdw1 が焦点面部位に位置する脂質膜小胞の合計表面積を反映する点を利用し、脂質膜小胞が完全球体であるとの近似的仮定のもとに、蛍光強度Ｆcz1 と蛍光強度Ｆdw1 とを用いて成立する、下記計算式（ｅ１）から導かれる下記計算式（ｅ２）によって、脂質膜小胞の平均半径Ｒ4 を求め、脂質膜小胞のサイズを決定するプロセス。
（ｅ１）：〔（４／３）πＲ4３〕／〔４πＲ4２〕＝ (Ｆcz1/Ｆc)/(Ｆdw1/Ｆd)
（ｅ２）：Ｒ4 ＝３〔 (Ｆcz1/Ｆc)/(Ｆdw1/Ｆd)〕
【請求項１７】
前記（１６−１）、（１６−２）及び（１６−４）のプロセスを、２光子励起以上の多光子励起方式である多光子励起顕微鏡を用いて行うことを特徴とする請求項１６に記載の脂質膜小胞のサイズ決定方法。
【請求項１８】
前記多光子励起顕微鏡が、近赤外多光子励起顕微鏡であることを特徴とする請求項１７に記載の脂質膜小胞のサイズ決定方法。
【請求項１９】
前記（１６−３）のプロセスにおける細胞中において脂質膜小胞が調製された状態を、以下のいずれかの方法によって実現することを特徴とする請求項１６〜請求項１８のいずれかに記載の脂質膜小胞のサイズ決定方法。
（ト）前記水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素を含む水性液体に対して前記細胞又はこれを含む生体組織標本を接触させ、適宜な刺激により又は細胞の自律的作用により前記水性液体を封入した脂質膜小胞の細胞内取り込みを起こさせると共に、水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素の異なる親和性を利用して、前記脂溶性蛍光色素を含む脂質膜中に前記水溶性蛍光色素を含む水性液体が封入された脂質膜小胞を形成する。
（チ）前記水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素を含む水性液体に対して脂質膜の構成材料を投入することにより、水性液体を封入したミセルとしての脂質膜小胞を形成させると共に、水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素の異なる親和性を利用して、前記脂溶性蛍光色素を含む脂質膜中に前記水溶性蛍光色素を含む水性液体が封入された脂質膜小胞とし、この脂質膜小胞を適宜な手段によってマトリクスたる前記水性液体から分離した後、細胞内へ注入する。
【請求項２０】
請求項６〜請求項１０に記載の脂質膜小胞のサイズ決定方法、請求項１１〜請求項１５に記載の脂質膜小胞のサイズ決定方法、又は請求項１６〜請求項１９に記載の脂質膜小胞のサイズ決定方法のいずれかを行い、それぞれに規定する脂質膜小胞の半径Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 についての計算値がゼロであった場合には、前記細胞中又はマトリクスたる水性液体中に脂質膜小胞が存在しないと判定することを特徴とする脂質膜小胞の存否の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質膜小胞のサイズ決定方法、及び、脂質膜小胞の存否の判定方法に関する。更に詳しくは、本発明は、生物細胞内等に存在する脂質膜小胞のサイズ計測に対して蛍光色素の多光子励起技術を応用し、かつ脂質膜小胞を完全球体であると近似的に仮定することが可能である点に着目して、極めて微細な脂質膜小胞のサイズを in vivoで又は少なくとも液体中で計測可能とした、脂質膜小胞のサイズ決定方法と、この方法の結果を利用する脂質膜小胞の存否の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物細胞内には、脂質膜によって区画された極めて微細な小胞体が多数存在している。このような脂質膜小胞は、細胞外物質の細胞内への取り込み（エンドサイトーシス）や細胞内物質の細胞外への輸送（エキソサイトーシス）に関与しており、細胞の各種機能の観察・研究に重要な関わりを持つ。
【０００３】
そして、これらの脂質膜小胞の多くは、例えば５０〜３００ナノメートル程度の極めて微細なサイズであり、通常の光学顕微鏡によって肉眼的に観察することが困難又は不可能である場合が多い。従って、一定の事情から脂質膜小胞の存否を判定したい場合があっても、その判定が困難である場合が多い。
【０００４】
しかしながら、それらの脂質膜小胞の存在を特定し、かつそのサイズを正確に決定することができれば、例えば脂質膜小胞によって細胞内に取り込まれた生理活性物質、毒素、薬品等の分布を正確に測定することも可能になってくる。又、神経伝達は神経小胞によって担われているため、神経活動をモニターすることも可能になってくる。
【０００５】
従って、ドラッグスクリーニング、神経終末部の活動の研究その他の多様な生物系機能観察、医療研究等において、脂質膜小胞の正確なサイズを決定すること、とりわけ、活動している細胞内において脂質膜小胞の正確なサイズを決定することは、重要な意味を持つ。
【０００６】
従来、光学分解能（３００ナノメートル程度）以下の領域の非常に微細な細胞器管等の可視化には、一般的に電子顕微鏡が利用されて来た。一方、これとは別に、種々の粒径測定器も市場に提供され、ある程度の微細な粒子の個々の粒径や平均粒径を測定するために利用されて来た。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、上記従来の各種の粒径測定器は、例えば粒子による光の回折を利用したり、粒子の沈降定数を測定したりする方式である。粒子による光の回折を利用する粒径測定は、サブミクロン領域では測定精度がないため、例えば神経様小胞のような微小な脂質膜小胞には適用できない。粒子の沈降定数を測定する粒径測定も、一般的にマトリクス液体との明瞭な比重差を示さない脂質膜小胞には適用できない。更に、脂質膜小胞が細胞内のような特殊な制約を伴う空間内にある場合には、上記のような各種の粒径測定器では計測が不可能である。
【０００８】
電子顕微鏡は、サイズ的な面では脂質膜小胞を十分に対象とし得るが、周知のように固定した試料作成が必要であるため、生存状態（活動状態）にある細胞内の脂質膜小胞を計測することはできない。更に、脂質膜中に水性液体が封入されていると言うデリケートな脂質膜小胞の構造形態が、そもそも固定試料作成の過程において維持されるか、と言う問題がある。
【０００９】
そこで本発明は、極めて微細な脂質膜小胞について、及び／又は、活動している生物細胞内のように、計測上の制約が多くかつデリケートな配慮を要求される空間内にある脂質膜小胞について、その粒径の正確な測定手段を提供し、更には脂質膜小胞が存在するか否かを判定する簡易な手段を提供することを、解決すべき技術的課題とする。
【００１０】
ところで本願発明者らは、2002年11月の北米神経科学会において、脂溶性蛍光色素と水溶性蛍光色素によって脂質膜小胞を染色（double staining ）し、その２光子励起顕微鏡像から脂質膜小胞のサイズを決定することができた旨の研究発表を行っている。又、下記の非特許文献１及び非特許文献２にも脂質膜小胞のサイズの計測に関して類似の事項が開示されている。
【非特許文献１】"Fusion Pore Dynamics and Insulin Granule Exocytosisin the Pancreatic Islet"  Noriko Takahashi, Takuya Kishimoto, TomomiNemoto, Takashi Kadowaki, Haruo KasaiScience, Vol.297, 23 AUGUST 2002
【非特許文献２】"Sequential-replenishment mechanism of exocytosis inpancreatic acini"  Tomomi Nemoto, Ryoichi Kimura, Koichi Ito, AkiraTachikawa, Yasushi Miyashita, Masamitsu Iino, Haruo KasaiNATURE CELL BIOLOGY VOL.3, MARCH 2001  しかしながら、上記の北米神経科学会における研究発表や、非特許文献１及び非特許文献２における記載では、２光子励起顕微鏡像から如何にして脂質膜小胞のサイズを決定するか、と言う具体的な手法又はその原理を開示あるいは示唆しておらず、その手法又はその原理をうかがい知ることもできない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、少なくとも以下のプロセスを行う、脂質膜小胞のサイズ決定方法である。
【００１２】
（１）脂溶性蛍光色素を含む脂質膜中に前記脂溶性蛍光色素とは異なる波長で発光する水溶性蛍光色素を含む水性液体が封入された脂質膜小胞を、細胞中又はマトリクスたる水性液体中において調製するプロセス。
【００１３】
（２）前記脂質膜小胞を含有する細胞又はマトリクスたる水性液体に対して２光子励起以上の多光子励起が可能なレーザー光を対物レンズを介して入射し、多光子励起に特有の焦点限局的励起に基づいて対物レンズの焦点面部位に位置する脂質膜小胞において生じた水溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆayと脂溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆbyとを検出するプロセス。
【００１４】
（３）前記蛍光強度Ｆayが焦点面部位に位置する脂質膜小胞の合計体積を反映し、前記蛍光強度Ｆbyが焦点面部位に位置する脂質膜小胞の合計表面積を反映する点を利用し、脂質膜小胞が完全球体であるとの近似的仮定のもとに、蛍光強度Ｆayと蛍光強度Ｆbyとを用いて成立する下記計算式（ａ１）から導かれる下記計算式（ａ２）と、
半径Ｒが既知である脂質膜小胞について前記と同様のプロセスによって検出された水溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆa と脂溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆb とを用いて成立する前記と同様の下記計算式（ｂ１）から導かれる下記計算式（ｂ２）とから、
下記の方程式（ａｂ２）の演算によってサイズが未知の脂質膜小胞の半径Ｒ1
を求め、脂質膜小胞のサイズを決定するプロセス。
（ａ１）  ：〔（Ｆay）×（４πＲ1３／３）〕／〔（Ｆby）×４πＲ1２〕
（ａ２）  ：（Ｆay／３Ｆby）×Ｒ1
（ｂ１）  ：〔Ｆa ×（４πＲ３  ／３）〕／（Ｆb ×４πＲ２  ）
（ｂ２）  ：（Ｆa ／３Ｆb ）×Ｒ
（ａｂ２）：Ｒ1 ＝〔（Ｆay／３Ｆby）×Ｒ〕／（Ｆa ／３Ｆb ）
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明に係る（２）のプロセスを２光子励起以上の多光子励起方式である多光子励起顕微鏡を用いて行う、脂質膜小胞のサイズ決定方法である。
【００１５】
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、前記第２発明に係る多光子励起顕微鏡が近赤外多光子励起顕微鏡である、脂質膜小胞のサイズ決定方法である。
【００１６】
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、前記第１発明〜第３発明のいずれかに係る（１）のプロセスにおける、細胞中において脂質膜小胞が調製された状態を以下のいずれかの方法によって実現する、脂質膜小胞のサイズ決定方法である。
【００１７】
（イ）前記水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素を含む水性液体に対して前記細胞又はこれを含む生体組織標本を接触させ、適宜な刺激により又は細胞の自律的作用により前記水性液体を封入した脂質膜小胞の細胞内取り込みを起こさせると共に、水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素の異なる親和性を利用して、前記脂溶性蛍光色素を含む脂質膜中に前記水溶性蛍光色素を含む水性液体が封入された脂質膜小胞を形成する。
【００１８】
（ロ）前記水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素を含む水性液体に対して脂質膜の構成材料を投入することにより、水性液体を封入したミセルとしての脂質膜小胞を形成させると共に、水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素の異なる親和性を利用して、前記脂溶性蛍光色素を含む脂質膜中に前記水溶性蛍光色素を含む水性液体が封入された脂質膜小胞とし、この脂質膜小胞を適宜な手段によってマトリクスたる前記水性液体から分離した後、細胞内へ注入する。
【００１９】
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、第１発明〜第４発明のいずれかに係る脂質膜小胞のサイズ決定方法を行い、前記脂質膜小胞の半径Ｒ1 の計算値がゼロであった場合には、前記細胞中又はマトリクスたる水性液体中に脂質膜小胞が存在しないと判定する、脂質膜小胞の存否の判定方法である。
【００２０】
（第６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、少なくとも以下のプロセスを行う、脂質膜小胞のサイズ決定方法である。
【００２１】
（６−１）所定濃度の水溶性蛍光色素を含む水性液体に対して２光子励起以上の多光子励起が可能なレーザー光を対物レンズを介して入射し、多光子励起に特有の焦点限局的励起に基づいて対物レンズの焦点面部位の水性液体において生じた水溶性蛍光色素の蛍光強度を検出することにより、前記水性液体の単位体積当たりの蛍光強度Ｆc を計算するプロセス。
【００２２】
（６−２）上記（６−１）と同一濃度に前記水溶性蛍光色素を含む水性液体が脂質膜中に封入された脂質膜小胞を、細胞中又はマトリクスたる水性液体中において調製するプロセス。
【００２３】
（６−３）前記細胞又はマトリクスたる水性液体に対し上記（６−１）と同一のレーザー光を対物レンズを介して入射し、多光子励起に特有の焦点限局的励起に基づいて対物レンズの焦点面部位に位置する脂質膜小胞から生じた水溶性蛍光色素の蛍光強度のうち、脂質膜小胞の個数ａを特定できる視野内の蛍光強度Ｆczを検出するプロセス。
【００２４】
（６−４）蛍光強度Ｆczが前記特定の個数ａの脂質膜小胞の合計体積を反映する点を利用し、脂質膜小胞が完全球体であるとの近似的仮定のもとに、蛍光強度Ｆczと、個数ａと、蛍光強度Ｆc とを用いて成立する、下記計算方程式（ｃ１）から導かれる下記計算方程式（ｃ２）によって、個数ａの脂質膜小胞の平均半径Ｒ2 を求め、脂質膜小胞のサイズを決定するプロセス。
（ｃ１）：（４／３）πＲ2３・ａ＝Ｆcz／Ｆc
（ｃ２）：Ｒ2 ＝〔３・（Ｆcz／Ｆc ）／（４・ａ・π）〕１／３  
（第７発明の構成）
上記課題を解決するための本願第７発明の構成は、前記第６発明に係る（６−１）のプロセスにおいて、前記水性液体に対して前記レーザー光を対物レンズを介して入射した場合の前記対物レンズの焦点面部位の蛍光画像の蛍光強度をＦe
とし、実際に用いた当該蛍光強度測定系において、蛍光強度の点分布関数（ Point Spread Function：Ｐxyz 〕をｚ軸について積分した時の積分値が１になるようにした場合におけるＺ＝０の時の点分布関数の値をＰxy(0) とした場合に、Ｆc ＝Ｆe ・Ｐxy(0) の式によって前記水性液体の単位体積当たりの蛍光強度Ｆc
を求める、脂質膜小胞のサイズ決定方法である。
【００２５】
（第８発明の構成）
上記課題を解決するための本願第８発明の構成は、前記第６発明又は第７発明に係る（６−１）及び（６−３）のプロセスを２光子励起以上の多光子励起方式である多光子励起顕微鏡を用いて行う、脂質膜小胞のサイズ決定方法である。
【００２６】
（第９発明の構成）
上記課題を解決するための本願第９発明の構成は、前記第８発明に係る多光子励起顕微鏡が、近赤外多光子励起顕微鏡である、脂質膜小胞のサイズ決定方法である。
【００２７】
（第１０発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１０発明の構成は、前記第６発明〜第９発明のいずれかに係る（６−２）のプロセスにおける、細胞中において脂質膜小胞が調製された状態を、以下のいずれかの方法によって実現する、脂質膜小胞のサイズ決定方法である。
【００２８】
（ハ）前記水溶性蛍光色素を含む水性液体に対して前記細胞又はこれを含む生体組織標本を接触させ、適宜な刺激により又は細胞の自律的作用により前記水性液体を封入した脂質膜小胞の細胞内取り込みを起こさせることにより、細胞中において前記脂質膜小胞を形成させる。
【００２９】
（ニ）前記水溶性蛍光色素を含む水性液体に対して脂質膜の構成材料を投入することにより、水性液体を封入したミセルとしての脂質膜小胞を形成させ、この脂質膜小胞を適宜な手段によってマトリクスたる前記水性液体から分離した後、細胞内へ注入する。
【００３０】
（第１１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１１発明の構成は、少なくとも以下のプロセスを行う、脂質膜小胞のサイズ決定方法である。
【００３１】
（１１−１）所定濃度の脂溶性蛍光色素を含む平面の脂質膜に対して２光子励起以上の多光子励起が可能なレーザー光を対物レンズを介して入射し、多光子励起に特有の焦点限局的励起に基づいて対物レンズの焦点面部位の脂質膜において生じた脂溶性蛍光色素の蛍光強度を検出することにより、前記脂質膜の単位膜面積当たりの蛍光強度Ｆd を計算するプロセス。
【００３２】
なお、このプロセスにおいて、脂溶性蛍光色素（特に好ましくは、相対的に水溶性の高い脂溶性蛍光色素、例えばＦＭ１−４３）を水になるべく多く溶解させ、この水溶液に細胞を入れると、水溶液中の脂溶性蛍光色素が低濃度であっても、細胞の脂質膜中には比較的高濃度に蓄積される。なお、上記のＦＭ１−４３等の特定の脂溶性蛍光色素は水溶液中では無蛍光で、素早く脂質膜へ移行し、かつ脂質膜中で初めて蛍光を発するので、特に便利である。そして、細胞の脂質膜における多光子励起顕微鏡のスキャン断面と平行である部分の蛍光強度を、特定された任意の面積当たりで測定することにより、前記した脂質膜の単位体積当たりの蛍光強度Ｆd を計算することができる。
【００３３】
（１１−２）上記（１１−１）と同一濃度に前記脂溶性蛍光色素を含む脂質膜を持つ脂質膜小胞を、細胞中又はマトリクスたる水性液体中において調製するプロセス。
【００３４】
（１１−３）前記細胞又はマトリクスたる水性液体に対して（１１−１）と同一のレーザー光を対物レンズを介して入射し、多光子励起に特有の焦点限局的励起に基づいて対物レンズの焦点面部位に位置する脂質膜小胞から生じた脂溶性蛍光色素の蛍光強度のうち、脂質膜小胞の個数ａを特定できる視野内の蛍光強度Ｆdwを検出するプロセス。
【００３５】
（１１−４）蛍光強度Ｆdwが前記特定の個数ａの脂質膜小胞の合計表面積を反映する点を利用し、脂質膜小胞が完全球体であるとの近似的仮定のもとに、蛍光強度Ｆdwと、個数ａと、蛍光強度Ｆd とを用いて成立する下記計算方程式（ｄ１）から導かれる下記計算方程式（ｄ２）によって、個数ａの脂質膜小胞の平均半径Ｒ3 を求め、脂質膜小胞のサイズを決定するプロセス。
（ｄ１）：（４πＲ3２）・ａ＝Ｆdw／Ｆd
（ｄ２）：Ｒ3 ＝〔（Ｆdw／Ｆd ）／（４・ａ・π）〕１／２  
（第１２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１２発明の構成は、前記第１１発明に係る（１１−１）のプロセスにおいて、前記脂質膜に対して前記レーザー光を対物レンズを介して入射した場合における前記対物レンズの焦点面部位の蛍光画像の蛍光強度をＦm とし、実際に用いた当該蛍光強度測定系において、蛍光強度の点分布関数（ Point Spread Function：Ｐxyz 〕をｚ軸について積分した時の積分値が１になるようにした場合におけるＺ＝０の時の点分布関数の値をＰxy(0) とした場合に、Ｆd ＝Ｆm ・Ｐxy(0) の式によって前記脂質膜の単位膜面積当たりの蛍光強度Ｆd を求める、脂質膜小胞のサイズ決定方法である。
【００３６】
（第１３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１３発明の構成は、前記第１１発明又は第１２発明に係る（１１−１）及び（１１−３）のプロセスを、２光子励起以上の多光子励起方式である多光子励起顕微鏡を用いて行う、脂質膜小胞のサイズ決定方法である。
【００３７】
（第１４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１４発明の構成は、前記第１３発明に係る多光子励起顕微鏡が、近赤外多光子励起顕微鏡である、脂質膜小胞のサイズ決定方法である。
【００３８】
（第１５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１５発明の構成は、前記第１１発明〜第１４発明のいずれかに係る（１１−２）のプロセスにおける細胞中において脂質膜小胞が調製された状態を、以下のいずれかの方法によって実現する、脂質膜小胞のサイズ決定方法である。
【００３９】
（ホ）前記脂溶性蛍光色素を含む水性液体に対して前記細胞又はこれを含む生体組織標本を接触させ、適宜な刺激により又は細胞の自律的作用により前記水性液体を封入した脂質膜小胞の細胞内取り込みを起こさせると共に、脂溶性蛍光色素の親和性を利用して脂質膜中に脂溶性蛍光色素を含ませることにより、細胞中において前記脂質膜小胞を形成させる。。
【００４０】
（ヘ）前記脂溶性蛍光色素を含む水性液体に対して脂質膜の構成材料を投入することにより、水性液体を封入したミセルとしての脂質膜小胞を形成させると共に、脂溶性蛍光色素の親和性を利用して脂質膜中に脂溶性蛍光色素を含ませることにより前記脂質膜小胞を構成し、この脂質膜小胞を適宜な手段によってマトリクスたる前記水性液体から分離した後、細胞内へ注入する。
【００４１】
（第１６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１６発明の構成は、少なくとも以下のプロセスを行う、脂質膜小胞のサイズ決定方法である。
【００４２】
（１６−１）所定濃度の水溶性蛍光色素を含む水性液体に対して２光子励起以上の多光子励起が可能なレーザー光を対物レンズを介して入射し、多光子励起に特有の焦点限局的励起に基づいて対物レンズの焦点面部位の水性液体において生じた水溶性蛍光色素の蛍光強度を検出することにより、前記水性液体の単位体積当たりの蛍光強度Ｆc を計算するプロセス。
【００４３】
（１６−２）所定濃度の、前記水溶性蛍光色素とは異なる波長で発光する脂溶性蛍光色素を含む平面の脂質膜に対して、２光子励起以上の多光子励起が可能な前記（１６−１）と同一のレーザー光を対物レンズを介して入射し、多光子励起に特有の焦点限局的励起に基づいて対物レンズの焦点面部位の脂質膜において生じた脂溶性蛍光色素の蛍光強度を検出することにより、前記脂質膜の単位膜面積当たりの蛍光強度Ｆd を計算するプロセス。
【００４４】
なお、脂質膜の単位体積当たりの蛍光強度Ｆd を計算する具体的な方法として、例えば「第１１発明の構成」欄で前記した方法を用いることができる。
【００４５】
（１６−３）前記（１６−１）と同一濃度に前記水溶性蛍光色素を含む水性液体が、前記（１６−２）と同一濃度に前記前記脂溶性蛍光色素を含む脂質膜を持つ脂質膜中に封入された脂質膜小胞を、細胞中又はマトリクスたる水性液体中において調製するプロセス。
【００４６】
（１６−４）前記細胞又はマトリクスたる水性液体に対し前記（１６−１）と同一のレーザー光を対物レンズを介して入射し、多光子励起に特有の焦点限局的励起に基づいて対物レンズの焦点面部位に位置する脂質膜小胞から生じた水溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆcz1 及び脂溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆdw1 を検出するプロセス。
【００４７】
（１６−５）前記蛍光強度Ｆcz1 が焦点面部位に位置する脂質膜小胞の合計体積を反映し、前記蛍光強度Ｆdw1 が焦点面部位に位置する脂質膜小胞の合計表面積を反映する点を利用し、脂質膜小胞が完全球体であるとの近似的仮定のもとに、蛍光強度Ｆcz1 と蛍光強度Ｆdw1 とを用いて成立する、下記計算式（ｅ１）から導かれる下記計算式（ｅ２）によって、脂質膜小胞の平均半径Ｒ4 を求め、脂質膜小胞のサイズを決定するプロセス。
（ｅ１）：〔（４／３）πＲ4３〕／〔４πＲ4２〕＝ (Ｆcz1/Ｆc)/(Ｆdw1/Ｆd)
（ｅ２）：Ｒ4 ＝３〔 (Ｆcz1/Ｆc)/(Ｆdw1/Ｆd)〕
（第１７発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１７発明の構成は、前記第１６発明に係る（１６−１）、（１６−２）及び（１６−４）のプロセスを、２光子励起以上の多光子励起方式である多光子励起顕微鏡を用いて行う、脂質膜小胞のサイズ決定方法である。
【００４８】
（第１８発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１８発明の構成は、前記第１７発明に係る多光子励起顕微鏡が、近赤外多光子励起顕微鏡である、脂質膜小胞のサイズ決定方法である。
【００４９】
（第１９発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１９発明の構成は、前記第１６発明〜第１８発明のいずれかに係る（１６−３）のプロセスにおける細胞中において脂質膜小胞が調製された状態を、以下のいずれかの方法によって実現する、脂質膜小胞のサイズ決定方法である。
【００５０】
（ト）前記水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素を含む水性液体に対して前記細胞又はこれを含む生体組織標本を接触させ、適宜な刺激により又は細胞の自律的作用により前記水性液体を封入した脂質膜小胞の細胞内取り込みを起こさせると共に、水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素の異なる親和性を利用して、前記脂溶性蛍光色素を含む脂質膜中に前記水溶性蛍光色素を含む水性液体が封入された脂質膜小胞を形成する。
【００５１】
（チ）前記水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素を含む水性液体に対して脂質膜の構成材料を投入することにより、水性液体を封入したミセルとしての脂質膜小胞を形成させると共に、水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素の異なる親和性を利用して、前記脂溶性蛍光色素を含む脂質膜中に前記水溶性蛍光色素を含む水性液体が封入された脂質膜小胞とし、この脂質膜小胞を適宜な手段によってマトリクスたる前記水性液体から分離した後、細胞内へ注入する。
【００５２】
（第２０発明の構成）
上記課題を解決するための本願第２０発明の構成は、第６発明〜第１０発明に係る脂質膜小胞のサイズ決定方法、第１１発明〜第１５発明に係る脂質膜小胞のサイズ決定方法、又は第１６発明〜第１９発明に係る脂質膜小胞のサイズ決定方法のいずれかを行い、それぞれに規定する脂質膜小胞の半径Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 についての計算値がゼロであった場合には、前記細胞中又はマトリクスたる水性液体中に脂質膜小胞が存在しないと判定する、脂質膜小胞の存否の判定方法である。
【発明の効果】
【００５３】
（第１発明の効果）
第１発明の脂質膜小胞のサイズ決定方法は、要するに、（１）のプロセスにおいて脂溶性蛍光色素を含む脂質膜中に水溶性蛍光色素を含む水性液体が封入された脂質膜小胞を調製し、（２）のプロセスにおいて脂質膜小胞に対して多光子励起が可能なレーザー光を対物レンズを介して入射して、水溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆayと脂溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆbyとを検出し、（３）のプロセスにおいて多光子励起に特有の焦点限局的励起と言う特徴と脂質膜小胞が完全球体であるとの近似的仮定とに基づいて蛍光強度値の方程式演算により脂質膜小胞の半径Ｒ1
（即ち、脂質膜小胞のサイズ）を決定する方法である。
【００５４】
この方法は、蛍光強度値の検出データに基づいて成立するので、脂質膜小胞が光の波長域より小さいようなナノメートルオーダーのサイズであっても支障なく実行できる。
【００５５】
又、脂質膜小胞が細胞内のような制約を伴う空間内にある場合にも、レーザー光の入射と蛍光の検出が可能な限りの深部までにおいて計測できる。なお、レーザー光はレーザービームとしてスキャニングする状態で入射することが好ましく、その場合、細胞の深部断層像が得られ、そのイメージングの中に脂質膜小胞の存在を示す蛍光の輝点が発現する。
【００５６】
しかも、脂質膜小胞を水溶性蛍光色素と脂溶性蛍光色素によって染色する操作は、生細胞等に対して破壊的に作用しない各種の周知の蛍光色素を選択して簡単に行うことができるので、電子顕微鏡を用いる場合とは異なり、生存状態の細胞や細胞組織の内部に存在する脂質膜小胞のサイズを決定することができる。従って、前記した本願発明の技術的課題を解決できる。
【００５７】
なお、脂溶性蛍光色素と水溶性蛍光色素とは互いに異なる波長で発光するものを選択して用いるので、両者の蛍光は互いに明瞭に区別して検出される。しかもこれらの蛍光色素は多光子励起が可能なレーザー光の対物レンズを介しての入射により焦点限局的に励起されるので、検出された脂溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆbyは対物レンズの焦点面部位に位置する脂質膜小胞の合計表面積（脂質膜の合計膜面積）を正確に反映し、検出された水溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆayは対物レンズの焦点面部位に位置する脂質膜小胞の合計体積（脂質膜に封入された水性液体の合計体積）を正確に反映する。因みに、対物レンズの焦点面部位（蛍光色素の焦点限局的励起が起こる部位）は、脂質膜小胞の一般的なサイズの数倍以上の厚さがあるため、通常は対物レンズの焦点面部位には複数ないしは多数の脂質膜小胞が位置し得る。
【００５８】
そして、脂質膜小胞においては、その構造成立のメカニズムからして、これが完全球体であるとの近似的仮定には信頼性がある。従って、この仮定に基づき、脂質膜小胞の合計表面積と合計体積とを反映した蛍光強度値を円周率（π）を用いた周知の公式に代入して行う方程式演算にも信頼性がある。
【００５９】
仮に、検出された蛍光強度Ｆay、Ｆbyが、その絶対値の信頼性において幾分の不安があるとしても、（ａｂ２）式から分かるように、演算上はこれらの蛍光強度値の比（ratio ）が正確に計算されれば問題はない。そして、蛍光強度ＦayとＦbyとは常に同一の条件下で検出されるから、これらの蛍光強度値の比には信頼性がある。
【００６０】
（第２発明の効果）
前記した第１発明における（２）のプロセスを行うに当たっては、所定のレーザー光源、レーザー光の入射装置、対物レンズ、水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素が発する２波長の蛍光の検出手段等の技術的要素を合理的に組み立てたデバイスを適宜に工夫して構成することもできるが、市販のいわゆる多光子励起顕微鏡、とりわけ、いわゆる２光子励起顕微鏡をそのまま利用することが、より便宜である。
【００６１】
（第３発明の効果）
前記した第２発明における「多光子励起顕微鏡」としては、近赤外多光子励起顕微鏡が特に好ましい。この近赤外多光子励起顕微鏡においては、レーザー光の深部到達性が特に優れ、細胞等に対する損傷も少ないため、例えば細胞や細胞組織の深部における脂質膜小胞のサイズの決定等に有効である。
【００６２】
（第４発明の効果）
前記した第１発明の（１）のプロセスでは、細胞中において脂質膜小胞を調製した状態が特に研究上の価値が高いが、このような状態は、例えば、第４発明に列挙する方法によって好ましく実現することができる。
【００６３】
（第５発明の効果）
第５発明の脂質膜小胞の存否の判定方法においては、第１発明〜第４発明に係る脂質膜小胞のサイズ決定方法によって得られた脂質膜小胞の半径Ｒ1 の計算値がゼロであった場合、論理的な帰結として脂質膜小胞が存在しないとの判定を行うものであり、リーズナブルに脂質膜小胞の存否を判定できる。
【００６４】
（第６発明の効果）
第６発明の脂質膜小胞のサイズ決定方法は、要するに、（６−１）のプロセスにおいて所定濃度の水溶性蛍光色素溶液の単位体積当たりの蛍光強度Ｆc を求めたもとで、（６−２）のプロセスにおいて同一濃度の水溶性蛍光色素溶液を封入した脂質膜小胞を調製し、（６−３）のプロセスにおいて脂質膜小胞に対して多光子励起が可能なレーザー光を対物レンズを介して入射して、特定された個数ａの脂質膜小胞の蛍光強度Ｆczを検出し、（６−４）のプロセスにおいて多光子励起に特有の焦点限局的励起と言う特徴と脂質膜小胞が完全球体であるとの近似的仮定とに基づいて蛍光強度値の方程式演算により脂質膜小胞の半径Ｒ2 （即ち、脂質膜小胞のサイズ）を決定するする方法である。
【００６５】
この第６発明の脂質膜小胞のサイズ決定方法においては、まず、蛍光強度値の検出データに基づいて成立するので、脂質膜小胞が光の波長域より小さいサイズであっても支障なく実行できるし、脂質膜小胞が細胞内のような制約を伴う空間内にある場合にも、レーザー光の入射と蛍光の検出が可能な限りの深部までにおいて計測できる。
【００６６】
しかも脂質膜小胞に封入された水性液体を水溶性蛍光色素で染色する操作は、生細胞等に対して安全な蛍光色素を選択して簡単に行うことができるので、細胞や細胞組織の内部に存在する脂質膜小胞のサイズを、細胞や細胞組織の生存状態のままで計測でき、従って前記した本願発明の技術的課題を解決できる。
【００６７】
しかも水溶性蛍光色素は多光子励起が可能なレーザー光の対物レンズを介しての入射により焦点限局的に励起されるので、検出された水溶性蛍光色素の蛍光強度は、対物レンズの焦点面部位に位置する脂質膜小胞の合計体積（脂質膜に封入された水性液体の合計体積）を正確に反映する。
【００６８】
脂質膜小胞が完全球体であるとの近似的仮定には信頼性があり、従って、脂質膜小胞の合計体積を反映した蛍光強度値を、円周率（π）を用いた周知の公式に代入して行う方程式演算にも信頼性がある。
【００６９】
レーザー光の入射により得られた走査像等のイメージングにおいて特定の視野内における脂質膜小胞の個数ａを蛍光色素の輝点により特定することは容易であり、その視野内の蛍光強度Ｆczを選択的に検出することも容易である。検出された蛍光強度Ｆcz及びＦc の絶対値の信頼性に幾分の不安があるとしても、演算上はこれらの蛍光強度値の比が正確であれば問題はなく、蛍光強度Ｆcz及びＦc は同一の水溶性蛍光色素を同一濃度に含む水性液体について同一のレーザー光を用いて計測されるので、これらの蛍光強度値の比には信頼性がある。
【００７０】
（第７発明の効果）
前記した第６発明における（６−１）のプロセスに関し、前記水性液体の単位体積当たりの蛍光強度Ｆc の求め方は特段に限定されず、例えば後述の実施例５で述べるように、「（対物レンズ焦点面部位の）断層面の厚さを０．８μｍとする」等の、実際に用いた蛍光強度測定系に対応する適宜な仮定のもとに、比較的信頼性のある蛍光強度Ｆc を算出することもできる。実施例５の場合においては、蛍光強度Ｆc は、水性液体に対してレーザー光を対物レンズを介して入射した場合における対物レンズ焦点面部位の蛍光画像の蛍光強度をＦe とすると、Ｆc
＝Ｆe ・（０．８μｍ）の式によって算出している。
【００７１】
しかし、とりわけ正確に蛍光強度Ｆc を求めたい場合、断層面の厚さが顕微鏡によって変わる点や、蛍光強度Ｆc が顕微鏡のメーカー、対物レンズの種類等の測定環境の相違によって影響される点を考慮することが、更に望ましい。
【００７２】
そこで、第７発明においては、このような多様な可変因子を考慮に入れた上で正確に蛍光強度Ｆc を求めるために、実際に用いた蛍光強度測定系において具体的に定まる点分布関数（Point Spread Function ）を利用する。
【００７３】
例えば、図８はある特定の蛍光強度測定系に用いた多光子励起顕微鏡での焦点部ｚ軸方向に対する蛍光強度分布グラフであって、グラフの縦軸方向の目盛りが蛍光強度を示し、グラフの横軸方向の目盛りが焦点部中心点に対するｚ軸方向の位置（単位：μｍ）を示す。このような蛍光強度分布グラフは顕微鏡の実際の測定環境ごとに決まるものであり、しかも、図８にも見られるように、焦点部ｚ軸方向に対する蛍光強度分布グラフは一般的に、自然界に見られる標準分布であるガウス関数に極めて近似している。従って、分布グラフの積分値を１とした時の中心点（０軸）上の値を点分布関数Ｐxy(0) とすると（図８の場合においては、Ｐxy(0) ＝０．５６である）、前記の蛍光強度Ｆc をＦc ＝Ｆe ・Ｐxy(0) の式によって与えることにより、蛍光強度Ｆc を実際の蛍光強度測定系に正確に対応して求めることができる。その結果として、脂質膜小胞のサイズ決定を更に正確に行なうことができる。
【００７４】
（第８発明の効果）
前記した第６発明又は第７発明における（６−１）及び（６−３）のプロセスを行うに当たっては、所定のレーザー光源、レーザー光の入射装置、対物レンズ、水溶性蛍光色素が発する２波長の蛍光の検出手段等の技術的要素を合理的に組み立てたデバイスを適宜に工夫して構成することもできるが、市販のいわゆる多光子励起顕微鏡、とりわけ２光子励起顕微鏡をそのまま利用することが、より便宜である。
【００７５】
（第９発明の効果）
前記した第８発明における「多光子励起顕微鏡」としては、近赤外多光子励起顕微鏡が特に好ましい。この近赤外多光子励起顕微鏡においては、レーザー光の深部到達性が特に優れているため、例えば細胞や細胞組織の深部における脂質膜小胞のサイズの決定等に有効である。
【００７６】
（第１０発明の効果）
前記した第６発明の（６−１）のプロセスでは、細胞中において脂質膜小胞を調製した状態が特に研究上の価値が高いが、このような状態は、例えば、第１０発明に列挙する方法によって好ましく実現することができる。
【００７７】
（第１１発明の効果）
第１１発明の脂質膜小胞のサイズ決定方法は、要するに、（１１−１）のプロセスにおいて所定濃度の脂溶性蛍光色素を含む脂質膜の単位膜面積当たりの蛍光強度Ｆd を求めたもとで、（１１−２）のプロセスにおいて同一濃度に前記脂溶性蛍光色素を含む脂質膜を持つ脂質膜小胞を調製し、（１１−３）のプロセスにおいて脂質膜小胞に対して多光子励起が可能なレーザー光を対物レンズを介して入射して、特定された個数ａの脂質膜小胞の蛍光強度Ｆdwを検出し、（１１−４）のプロセスにおいて多光子励起に特有の焦点限局的励起と言う特徴と脂質膜小胞が完全球体であるとの近似的仮定とに基づいて蛍光強度値の方程式演算により脂質膜小胞の半径Ｒ3 を決定する方法である。
【００７８】
この第１１発明の脂質膜小胞のサイズ決定方法においては、まず、蛍光強度値の検出データに基づいて成立するので、脂質膜小胞が光の波長域より小さいサイズであっても支障なく実行できるし、脂質膜小胞が細胞内のような制約を伴う空間内にある場合にも、レーザー光の入射と蛍光の検出が可能な限りの深部までにおいて計測できる。
【００７９】
しかも脂質膜小胞の脂質膜を脂溶性蛍光色素で染色する操作は、生細胞等に対して安全な蛍光色素を選択して簡単に行うことができるので、細胞や細胞組織の内部に存在する脂質膜小胞のサイズを、細胞や細胞組織の生存状態のままで計測でき、従って前記した本願発明の技術的課題を解決できる。
【００８０】
しかも脂溶性蛍光色素は多光子励起が可能なレーザー光の対物レンズを介しての入射により焦点限局的に励起されるので、検出された脂溶性蛍光色素の蛍光強度は、対物レンズの焦点面部位に位置する脂質膜小胞の合計表面積（脂質膜合計膜面積）を正確に反映する。
【００８１】
脂質膜小胞が完全球体であるとの近似的仮定には信頼性があり、従って、脂質膜小胞の合計表面積を反映した蛍光強度値を、円周率（π）を用いた周知の公式に代入して行う方程式演算にも信頼性がある。
【００８２】
レーザー光の入射により得られた走査像等のイメージングにおいて特定の視野内における脂質膜小胞の個数ａを蛍光色素の輝点により特定することは容易であり、その視野内の蛍光強度Ｆdwを選択的に検出することも容易である。検出された蛍光強度Ｆdw及びＦd の絶対値の信頼性に幾分の不安があるとしても、演算上はこれらの蛍光強度値の比が正確であれば問題はなく、蛍光強度Ｆdw及びＦd は同一の脂溶性蛍光色素を同一濃度に含む水性液体について同一のレーザー光を用いて計測されるので、これらの蛍光強度値の比には信頼性がある。
【００８３】
（第１２発明の効果）
前記した第１１発明における（１１−１）のプロセスに関し、前記脂質膜の単位膜面積当たりの蛍光強度Ｆd の求め方は特段に限定されず、当業者であれば、ほぼ正確な蛍光強度Ｆd の求め方を幾通りかに設定することができる。
【００８４】
しかし、とりわけ正確に蛍光強度Ｆd を求めたい場合、測定環境の相違による多様な可変因子を考慮に入れ、前記第７発明の場合と同様に、実際に用いた蛍光強度測定系において具体的に定まる点分布関数を利用することが好ましい。
【００８５】
第１２発明においては、脂質膜に対してレーザー光を対物レンズを介して入射した場合における対物レンズ焦点面部位の蛍光画像の蛍光強度をＦm とし、実際に用いた当該蛍光強度測定系において、蛍光強度の点分布関数（ Point Spread
Function：Ｐxyz 〕をｚ軸について積分した時の積分値が１になるようにした場合におけるＺ＝０の時の点分布関数の値をＰxy(0) とした場合に、蛍光強度Ｆd
はＦd ＝Ｆm ・Ｐxy(0) の式によって与えられる。その結果、脂質膜小胞のサイズ決定が更に正確に行われる。
【００８６】
（第１３発明の効果）
前記した第１１発明又は第１２発明における（１１−１）及び（１１−３）のプロセスを行うに当たっては、所定のレーザー光源、レーザー光の入射装置、対物レンズ、水溶性蛍光色素が発する２波長の蛍光の検出手段等の技術的要素を合理的に組み立てたデバイスを適宜に工夫して構成することもできるが、市販のいわゆる多光子励起顕微鏡、とりわけ２光子励起顕微鏡をそのまま利用することが、より便宜である。
【００８７】
（第１４発明の効果）
前記した第１３発明における「多光子励起顕微鏡」としては、近赤外多光子励起顕微鏡が特に好ましい。この近赤外多光子励起顕微鏡においては、レーザー光の深部到達性が特に優れているため、例えば細胞や細胞組織の深部における脂質膜小胞のサイズの決定等に有効である。
【００８８】
（第１５発明の効果）
前記した第１１発明の（１１−２）のプロセスでは、細胞中において脂質膜小胞を調製した状態が特に研究上の価値が高いが、このような状態は、例えば、第１５発明に列挙する方法によって好ましく実現することができる。
【００８９】
（第１６発明の効果）
第１６発明の脂質膜小胞のサイズ決定方法は要するに、（１６−１）のプロセスにおいて所定濃度の水溶性蛍光色素を含む水性液体の単位体積当たりの蛍光強度Ｆc を求め、（１６−２）のプロセスにおいて所定濃度の脂溶性蛍光色素を含む脂質膜の単位膜面積当たりの蛍光強度Ｆd を求めたもとで、
（１６−３）のプロセスにおいては、（１６−１）と同一濃度に水溶性蛍光色素を含む水性液体が、（１６−２）と同一濃度に脂溶性蛍光色素を含む脂質膜を持つ脂質膜中に封入された脂質膜小胞を、細胞中又はマトリクスたる水性液体中において調製し、
（１６−４）のプロセスにおいて脂質膜小胞に対して多光子励起が可能なレーザー光を対物レンズを介して入射して、特定された個数ａの脂質膜小胞から生じた水溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆcz1 及び脂溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆdw1 を検出し、（１６−５）のプロセスにおいて多光子励起に特有の焦点限局的励起と言う特徴と脂質膜小胞が完全球体であるとの近似的仮定とに基づいて蛍光強度値の方程式演算により脂質膜小胞の半径Ｒ4 を決定する方法である。
【００９０】
この第１６発明の脂質膜小胞のサイズ決定方法においては、まず、蛍光強度値の検出データに基づいて成立するので、脂質膜小胞が光の波長域より小さいサイズであっても支障なく実行できるし、脂質膜小胞が細胞内のような制約を伴う空間内にある場合にも、レーザー光の入射と蛍光の検出が可能な限りの深部までにおいて計測できる。
【００９１】
しかも、脂質膜小胞に封入された水性液体を水溶性蛍光色素で染色する操作、及び脂質膜小胞の脂質膜を脂溶性蛍光色素で染色する操作は、生細胞等に対して安全な蛍光色素を選択して簡単に行うことができるので、細胞や細胞組織の内部に存在する脂質膜小胞のサイズを、細胞や細胞組織の生存状態のままで計測でき、従って前記した本願発明の技術的課題を解決できる。
【００９２】
しかも水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素は多光子励起が可能なレーザー光の対物レンズを介しての入射により焦点限局的に励起されるので、検出された水溶性蛍光色素の蛍光強度は、対物レンズの焦点面部位に位置する脂質膜小胞の合計体積（脂質膜に封入された水性液体の合計体積）を正確に反映し、検出された脂溶性蛍光色素の蛍光強度は、対物レンズの焦点面部位に位置する脂質膜小胞の合計表面積（脂質膜合計膜面積）を正確に反映する。
【００９３】
脂質膜小胞が完全球体であるとの近似的仮定には信頼性があり、従って、脂質膜小胞の合計表面積を反映した蛍光強度値を、円周率（π）を用いた周知の公式に代入して行う方程式演算にも信頼性がある。
【００９４】
レーザー光の入射により得られた走査像等のイメージングにおいて特定の視野内における脂質膜小胞の個数ａを蛍光色素の輝点により特定することは容易であり、その視野内の水溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆcz1 及び脂溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆdw1 を選択的に検出することも容易である。検出された蛍光強度Ｆcz1 及びＦdw1 の絶対値の信頼性に幾分の不安があるとしても、演算上はこれらの蛍光強度値の比が正確であれば問題はなく、蛍光強度Ｆcz1 及びＦc は同一濃度の同一水溶性蛍光色素について、蛍光強度Ｆdw1 及びＦd は同一濃度の同一脂溶性蛍光色素について、それぞれ同一のレーザー光を用いて計測されるので、これらの蛍光強度値の比には信頼性がある。
【００９５】
（第１７発明の効果）
前記した第１６発明における（１６−１）、（１６−２）及び（１６−４）のプロセスを行うに当たっては、所定のレーザー光源、レーザー光の入射装置、対物レンズ、水溶性蛍光色素が発する２波長の蛍光の検出手段等の技術的要素を合理的に組み立てたデバイスを適宜に工夫して構成することもできるが、市販のいわゆる多光子励起顕微鏡、とりわけ２光子励起顕微鏡をそのまま利用することが、より便宜である。
【００９６】
（第１８発明の効果）
前記した第１７発明における「多光子励起顕微鏡」としては、近赤外多光子励起顕微鏡が特に好ましい。この近赤外多光子励起顕微鏡においては、レーザー光の深部到達性が特に優れているため、例えば細胞や細胞組織の深部における脂質膜小胞のサイズの決定等に有効である。
【００９７】
（第１９発明の効果）
前記した第１６発明の（１６−３）のプロセスでは、細胞中において脂質膜小胞を調製した状態が特に研究上の価値が高いが、このような状態は、例えば、第１９発明に列挙する方法によって好ましく実現することができる。
【００９８】
（第２０発明の効果）
第２０発明の脂質膜小胞の存否の判定方法においては、第６発明〜第１０発明、第１１発明〜第１５発明、又は第１６発明〜第１９発明に係る脂質膜小胞のサイズ決定方法によって得られた脂質膜小胞の半径Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 の計算値がゼロであった場合、論理的な帰結として脂質膜小胞が存在しないとの判定を行うものであり、リーズナブルに脂質膜小胞の存否を判定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９９】
〔第１発明〜第５発明の実施形態〕
次に、本願の第１発明〜第５発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。この項で以下において単に「本発明」と言う時は、本願の第１発明〜第５発明の各発明を一括して指している。
【０１００】
（脂質膜小胞のサイズ決定方法）
本発明に係る脂質膜小胞のサイズ決定方法は、所定の種類の蛍光色素で染色された脂質膜小胞に所定のレーザー光を入射し、多光子励起に特有の焦点限局的励起を利用して励起された蛍光色素の蛍光強度を計測したもとで、蛍光強度の演算処理によって脂質膜小胞のサイズを決定する。又、蛍光強度の演算処理を、脂質膜小胞が完全球体であると言う近似的仮定に基づいて行う。
【０１０１】
更に詳しくは、この方法は、脂質膜小胞の脂質膜とその封入物である水性液体とを脂溶性蛍光色素と水溶性蛍光色素とによって二重染色（double staining ）する。そして、計測対象たる脂質膜小胞の個数に関しない。
【０１０２】
本発明に係る脂質膜小胞のサイズ決定方法においては、少なくとも以下（１）〜（３）のプロセスを行う。適宜の前処理や後処理を含め、これらのプロセス以外のプロセスを任意に付加することもできる。
【０１０３】
（１）脂溶性蛍光色素を含む脂質膜中に前記脂溶性蛍光色素とは異なる波長で発光する水溶性蛍光色素を含む水性液体が封入された脂質膜小胞を、細胞中又はマトリクスたる水性液体中において調製するプロセス。
【０１０４】
（２）前記脂質膜小胞を含有する細胞又はマトリクスたる水性液体に対して２光子励起以上の多光子励起が可能なレーザー光を対物レンズを介して入射し、多光子励起に特有の焦点限局的励起に基づいて対物レンズの焦点面部位に位置する脂質膜小胞において生じた水溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆayと脂溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆbyとを検出するプロセス。
【０１０５】
（３）前記蛍光強度Ｆayが焦点面部位に位置する脂質膜小胞の合計体積を反映し、前記蛍光強度Ｆbyが焦点面部位に位置する脂質膜小胞の合計表面積を反映する点を利用し、脂質膜小胞が完全球体であるとの近似的仮定のもとに、蛍光強度Ｆayと蛍光強度Ｆbyとを用いて成立する、下記計算式（ａ１）から導かれる下記計算式（ａ２）と、
半径Ｒが既知である脂質膜小胞について前記と同様のプロセスによって検出された水溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆa と脂溶性蛍光色素の蛍光強度Ｆb とを用いて成立する、前記と同様の下記計算式（ｂ１）から導かれる下記計算式（ｂ２）とから、
下記の方程式（ａｂ２）の演算によってサイズが未知の脂質膜小胞の半径Ｒ1
を求め、脂質膜小胞のサイズを決定するプロセス。
（ａ１）  ：〔（Ｆay）×（４πＲ1３／３）〕／〔（Ｆby）×４πＲ1２〕
（ａ２）  ：（Ｆay／３Ｆby）×Ｒ1
（ｂ１）  ：〔Ｆa ×（４πＲ３  ／３）〕／（Ｆb ×４πＲ２  ）
（ｂ２）  ：（Ｆa ／３Ｆb ）×Ｒ
（ａｂ２）：Ｒ1 ＝〔（Ｆay／３Ｆby）×Ｒ〕／（Ｆa ／３Ｆb ）
（脂質膜小胞とその調製）
本発明の脂質膜小胞のサイズ決定方法においては、脂溶性蛍光色素を含む脂質膜中に前記脂溶性蛍光色素とは異なる波長で発光する水溶性蛍光色素を含む水性液体が封入された脂質膜小胞を、細胞中又はマトリクスたる水性液体中において調製するプロセスを含む。
【０１０６】
細胞中にはもともと脂質膜小胞が多数存在しているが、これらの脂質膜小胞は所定の蛍光色素で染色されていないし、かつ細胞中でこれらの脂質膜小胞のみを選択的に染色することも困難であるから、所定の蛍光色素で染色された脂質膜小胞が細胞中において存在するように、別途の手だてを施す必要がある。
【０１０７】
上記の「水性液体」とは、水又は水をベースとする液体を言う。水をベースとする液体としては、細胞や細胞組織に対して好適な緩衝液や、これに対して更に細胞培地成分を添加した溶液等を例示することができる。
【０１０８】
蛍光色素で染色されたこれらの脂質膜小胞を水性液体中において調製する方法は、可能な方法である限りにおいて限定されないが、水性液体に対して脂質膜の構成材料を投入することにより、水性液体を封入したミセルとしての脂質膜小胞を形成させる方法が、特に好ましい。その際、水性液体に水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素を含ませておくことにより、これらの蛍光色素の親和性に基づいて、それぞれ目的とする脂質膜小胞が得られる。
【０１０９】
蛍光色素で染色された上記の脂質膜小胞を細胞中で形成又は存在させる方法としては、上記のようにマトリクスたる水性液体中で調製された脂質膜小胞を細胞内へ注入する方法が例示される。注入方法としては、微小ガラスピペットを用いて注入する方法、細胞膜を機械的に一時的に破って注入する方法等を例示することができる。
【０１１０】
脂質膜小胞を細胞内へ注入する際には、予め脂質膜小胞をマトリクスたる水性液体から分離しておかないと、後のプロセスにおける蛍光強度の計測値に信頼性がなくなる。このように脂質膜小胞をマトリクスたる水性液体から分離する方法として、超遠心分離する方法、脂質特異的吸着カラムにより分離する方法、サイズ排除カラムにより分離する方法、濾過膜により分離する方法等を例示することができる。
【０１１１】
蛍光色素で染色された上記の脂質膜小胞を細胞中で形成又は存在させる他の方法として、所定の蛍光色素を含む水性液体に対して生存状態の細胞又はこれを含む生体組織標本を接触させ、適宜な刺激により又は細胞の自律的作用により前記水性液体を封入した脂質膜小胞の細胞内取り込みを起こさせることにより、細胞中において前記脂質膜小胞を形成させる、と言う方法も好ましい。上記の「所定の蛍光色素」とは、水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素である。又、上記の「接触」の態様は、目的を達成できる限りにおいて限定されないが、例えば、細胞又はこれを含む生体組織標本を所定の蛍光色素を含む水性液体中で還流する方法を例示できる。更に、上記の「適宜な刺激」としては、アゴニスト刺激、脱分極刺激その他の公知の刺激手段を例示できる。
【０１１２】
（蛍光色素）
本発明に係る脂質膜小胞のサイズ決定方法においては水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素を用いるが、この両者は、励起時に互いに異なる波長で発光するものを選択する必要がある。水溶性蛍光色素の種類は限定されないが、スルホローダミン、フルオレシンデキストラン、ＨＴＰＳ等を例示できる。脂溶性蛍光色素の種類も限定されないが、ＦＭ１−４３、ＦＭ４−６４、ＲＨ４１４等を例示することができる。互いに異なる波長で発光する水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素の組み合わせとして、スルホローダミンとＦＭ１−４３との組み合わせ、ＨＴＰＳとＦＭ４−６４との組み合わせ等を例示できる。
【０１１３】
（レーザー光による多光子励起／多光子励起顕微鏡）
多光子励起顕微鏡（特に２光子励起顕微鏡）、即ち多光子励起過程（特に２光子励起過程）を利用したレーザー蛍光顕微鏡が、本発明のようなユニークな利用方法は別として、一般的に細胞の機能解析に適していることは、当該技術分野の研究者間において良く知られている。「レーザー光による多光子励起」とは、簡単に述べると、光子密度が高められた場において、分子に複数の光子が同時に吸収されて、単一の量子過程として励起されることを言う。特に近赤外多光子励起顕微鏡は、前記のように深部到達性が良好であり、しかも細胞等を損傷させる恐れが少ないため、細胞内深部の脂質膜小胞の観測に好適である。
【０１１４】
研究ツールとしての多光子励起顕微鏡の一般的利点は、空間解像度の高い深部断層像を、生存状態にある細胞等に特段の障害を与えずに、長時間にわたって取得できる点にある。更に、その深部断層像はレーザー光の対物レンズ焦点面部位に沿って得られるが、レーザー光の焦点限局的励起により、光学的スライスの厚さは１ミクロン以下である。
【０１１５】
レーザー光の種類、使用条件、スキャン方法等に関して、以下に説明する。
近赤外超短パルスレーザー：５３２ｍｍのポンプ光により、チタンサファイアレーザーを発振させ、フェムト秒パルスレーザー光を得る。発振波長７００〜９５０ｍｍ、繰り返し周波数８３ＭＨｚ、パルス幅８０ｆｓ。
スキャン方法：Ｘ軸Ｙ軸のガルバノミラーを用いて走査する。
【０１１６】
（蛍光強度の演算処理）
前記した（ａ１）ないし（ａｂ２）に到る計算式は、要するに球体の半径と円周率「π」とを利用して球体の表面積や体積を求める周知の公式を応用したものである。これらの計算式による演算の結果として求まる脂質膜小胞のサイズは、通常は入射レーザー光の対物レンズ焦点面部位に位置する多数の脂質膜小胞の平均値である。
【０１１７】
エンドサイトーシス（脂質膜小胞の細胞内取り込み）を利用して計測対象たる脂質膜小胞を細胞内に形成させる場合、細胞の種類によって、単一のサイズの脂質膜小胞のみを形成する場合と、複数通りのサイズの脂質膜小胞を形成する場合とがある。しかし、後者の場合でも、２次元画像を利用するため、細胞内の部位を特定することで、２〜３通りのサイズの脂質膜小胞を個別の集団として識別することが可能である。従って、それぞれの集団に由来する平均値は実質的に信頼できる。
【０１１８】
所定の蛍光色素を含む水性液体に対して脂質膜の構成材料を投入することにより水性液体を封入したミセルとしての脂質膜小胞を形成させる方法においては、それらのミセルのサイズは必ずしも一定していない、と考えられる。その場合に、脂質膜小胞サイズの演算結果に信頼性を持たせる手段として、次の事項が考えられる。
【０１１９】
即ち、多光子励起顕微鏡等による蛍光強度の検出においては、前記したように、視覚的観察を併用することによって、脂質膜小胞の個数ａを特定できる視野内の蛍光強度を選択的に検出することが可能である。従って、例えば単一の脂質膜小胞が含まれる視野内の蛍光強度を選択的に検出すれば、サイズのバラツキに基づく平均値の信頼性不足と言う問題は起こらない。又、同様の方法で、多光子励起顕微鏡像における蛍光の輝点の強度（視覚上の蛍光強度）がほぼ同等である小数個の脂質膜小胞が含まれる顕微鏡視野を選び、その視野内の蛍光強度を選択的に検出すれば、実質的に信頼性のある平均値サイズが得られる。
【０１２０】
（脂質膜小胞の存否の判定方法）
本発明に係る脂質膜小胞の存否の判定方法は、前記したように、第１発明〜第４発明のいずれかに係る脂質膜小胞のサイズ決定方法を行い、脂質膜小胞の半径Ｒ1 の計算値がゼロであった場合には細胞中又はマトリクスたる水性液体中に脂質膜小胞が存在しないと判定する方法である。
〔第６発明〜第１８発明の実施形態〕
次に、本願の第６発明〜第２０発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。この項で以下において単に「本発明」と言う時は、本願の第６発明〜第２０発明の各発明を一括して指している。
【０１２１】
（脂質膜小胞のサイズ決定方法）
本発明に係る脂質膜小胞のサイズ決定方法には、前記第６発明〜第１０発明に係る第１のサイズ決定方法と、第１１発明〜第１５発明に係る第２のサイズ決定方法と、第１６発明〜第１９発明に係る第３のサイズ決定方法とがある。
【０１２２】
いずれの方法も、所定濃度の水溶性蛍光色素を含む水性液体の単位体積当たりの蛍光強度を求め、及び／又は、所定濃度の脂溶性蛍光色素を含む油性液体又は有機性液体の単位面積当たりの蛍光強度を求め、一方では、水溶性蛍光色素及び／又は脂溶性蛍光色素で染色された脂質膜小胞の蛍光強度を求め、これらの両者のデータから脂質膜小胞のサイズを決定する点で共通している。
【０１２３】
（第１のサイズ決定方法）
第１のサイズ決定方法では、前記第６発明に係る（６−１）〜（６−４）のプロセスを、少なくとも行う。
【０１２４】
上記の各プロセスを含む第１のサイズ決定方法において、脂質膜小胞の個数ａの特定は、励起された蛍光像に対する視覚的観察の併用によって容易に行うことができる。即ち、多光子励起顕微鏡像においては、個々の脂質膜小胞に基づく蛍光の輝点を視覚的に認識することが可能であり、従って個数ａの脂質膜小胞が含まれる顕微鏡視野を特定することができる。そしてこの視野内の蛍光強度を選択的に検出することは、ガルバノスキャナーによりレーザー光を走査することによって、光電子倍増管により容易である。
【０１２５】
次に、所定濃度の水溶性蛍光色素を含む水性液体の単位体積当たりの蛍光強度（Ｆc ）の計算は、種々の方法によって可能であるが、例えば、多光子励起顕微鏡に特有の焦点限局的励起を利用し、所定濃度の水溶性蛍光色素を含む水性液体中を観察することで、励起される焦点の体積から算出すれば良い。
【０１２６】
上記の蛍光強度Ｆc を求めるに当たり、脂質膜小胞のサイズを特に正確に決定するため好ましい方法として、レーザー光を対物レンズを介して入射した場合における対物レンズの焦点面部位の蛍光画像の蛍光強度をＦe とし、実際に用いた当該蛍光強度測定系において、蛍光強度の点分布関数（ Point Spread Function：Ｐxyz 〕をｚ軸について積分した時の積分値が１になるようにした場合におけるＺ＝０の時の点分布関数の値をＰxy(0) とした場合に、Ｆc ＝Ｆe ・Ｐxy(0)
の式によって蛍光強度Ｆc を求めることができる。
【０１２７】
（第２のサイズ決定方法）
第２のサイズ決定方法では、前記第１１発明に係る（１１−１）〜（１１−４）のプロセスを、少なくとも行う。第２のサイズ決定方法において、脂質膜小胞の個数ａの特定は、上記の第１のサイズ決定方法の場合と同様に行うことができる。
【０１２８】
次に、所定濃度の脂溶性蛍光色素を含む脂質膜の単位膜面積当たりの蛍光強度（Ｆd ）の計算は、種々の方法によって可能であるが、例えば、「第１１発明の構成」欄において前記した方法によって行うことができる。
【０１２９】
上記の蛍光強度Ｆd を求めるに当たり、脂質膜小胞のサイズを特に正確に決定するために好ましい方法として、脂質膜に対してレーザー光を対物レンズを介して入射した場合の対物レンズ焦点面部位の蛍光画像の蛍光強度をＦm とし、実際に用いた当該蛍光強度測定系において、蛍光強度の点分布関数（ Point Spread
Function：Ｐxyz 〕をｚ軸について積分した時の積分値が１になるようにした場合におけるＺ＝０の時の点分布関数の値をＰxy(0) とした場合に、Ｆd ＝Ｆm ・Ｐxy(0) の式によって蛍光強度Ｆd を求める方法を採用することができる。
【０１３０】
（第３のサイズ決定方法）
第３のサイズ決定方法では、前記第１６発明に係る（１６−１）〜（１６−４）のプロセスを、少なくとも行う。第３のサイズ決定方法において、脂質膜小胞の個数ａを特定する必要はない。
【０１３１】
次に、所定濃度の水溶性蛍光色素を含む水性液体の単位体積当たりの蛍光強度（Ｆc ）の計算は上記の第１のサイズ決定方法の場合と同様に行うことができ、所定濃度の脂溶性蛍光色素を含む脂質膜の単位膜面積当たりの蛍光強度（Ｆd ）の計算は上記の第２のサイズ決定方法の場合と同様に行うことができる。
【０１３２】
第３のサイズ決定方法でも、第１のサイズ決定方法と同様に蛍光強度Ｆc を求め、かつ第２のサイズ決定方法の場合と同様に蛍光強度Ｆd を求めるのであるが、その際に上記の「Ｆc ＝Ｆe ・Ｐxy(0) 」、「Ｆd ＝Ｆm ・Ｐxy(0) 」の式を用いたとしても、演算上、蛍光強度Ｆc の項におけるＰxy(0) と蛍光強度Ｆd の項におけるＰxy(0) の項とが相殺されるため、実質的に意味がない。
【０１３３】
（脂質膜小胞とその調製）
第１のサイズ決定方法においては、水溶性蛍光色素を含む水性液体が脂質膜中に封入された脂質膜小胞を細胞中又はマトリクスたる水性液体中において調製するプロセスを含む。第２のサイズ決定方法においては、脂溶性蛍光色素を含む脂質膜を持つ脂質膜小胞を細胞中又はマトリクスたる水性液体中において調製するプロセスを含む。第３のサイズ決定方法においては、水溶性蛍光色素を含む水性液体が、前記脂溶性蛍光色素を含む脂質膜を持つ脂質膜中に封入された脂質膜小胞を細胞中又はマトリクスたる水性液体中において調製するプロセスを含む。
【０１３４】
細胞中には予め脂質膜小胞が多数存在しているが、これらの脂質膜小胞は所定の蛍光色素で染色されていないし、かつ細胞中でこれらの脂質膜小胞のみを選択的に染色することも困難であるから、所定の蛍光色素で染色された脂質膜小胞が細胞中において存在するように、別途の手だてを施す必要がある。
【０１３５】
上記の「水性液体」とは、水又は水をベースとする液体を言う。水をベースとする液体としては、細胞や細胞組織に対して好適な緩衝液や、これに対して更に細胞培地成分を添加した溶液等を例示することができる。
【０１３６】
蛍光色素で染色されたこれらの脂質膜小胞を水性液体中において調製する方法は、可能な方法である限りにおいて限定されないが、水性液体に対して脂質膜の構成材料を投入することにより、水性液体を封入したミセルとしての脂質膜小胞を形成させる方法が、特に好ましい。その際、第１のサイズ決定方法においては水性液体に水溶性蛍光色素のみを含ませておくことにより、第２のサイズ決定方法においては水性液体に脂溶性蛍光色素のみを含ませておくことにより、第３のサイズ決定方法においては水性液体に水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素を含ませておくことにより、それぞれ目的とする脂質膜小胞が得られる。
【０１３７】
蛍光色素で染色された上記の脂質膜小胞を細胞中で形成又は存在させる方法としては、上記のようにマトリクスたる水性液体中で調製された脂質膜小胞を細胞内へ注入する方法が例示される。注入方法としては、微小ガラスピペットを用いて注入する方法、細胞膜を機械的に一時的に破って注入する方法等を例示することができる。
【０１３８】
脂質膜小胞を細胞内へ注入する際には、予め脂質膜小胞をマトリクスたる水性液体から分離しておかないと、後のプロセスにおける蛍光強度の計測値に信頼性がなくなる。このように脂質膜小胞をマトリクスたる水性液体から分離する方法として、超遠心分離する方法、脂質特異的吸着カラムにより分離する方法、サイズ排除カラムにより分離する方法、濾過膜により分離する方法等を例示することができる。
【０１３９】
蛍光色素で染色された上記の脂質膜小胞を細胞中で形成又は存在させる他の方法として、所定の蛍光色素を含む水性液体に対して生存状態の細胞又はこれを含む生体組織標本を接触させ、適宜な刺激により又は細胞の自律的作用により前記水性液体を封入した脂質膜小胞の細胞内取り込みを起こさせることにより、細胞中において前記脂質膜小胞を形成させる、と言う方法も好ましい。
【０１４０】
上記の「所定の蛍光色素」とは、第１のサイズ決定方法においては、水溶性蛍光色素であり、第２のサイズ決定方法においては、脂溶性蛍光色素であり、第３のサイズ決定方法においては、水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素である。
【０１４１】
又、上記の「接触」の態様は、目的を達成できる限りにおいて限定されないが、例えば、細胞又はこれを含む生体組織標本を所定の蛍光色素を含む水性液体中で還流する方法を例示できる。更に、上記の「適宜な刺激」としては、アゴニスト刺激、脱分極刺激その他の公知の刺激手段を例示できる。
【０１４２】
（蛍光色素）
第１のサイズ決定方法ないしは第２のサイズ決定方法においては、水溶性蛍光色素及び／又は脂溶性蛍光色素を用いるが、この両者を同時に用いる第３のサイズ決定方法においては、水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素として、励起時に互いに異なる波長で発光するものを選択する必要がある。
【０１４３】
水溶性蛍光色素の種類は限定されないが、スルホローダミン、フルオレシンデキストラン、ＨＴＰＳ等を例示できる。脂溶性蛍光色素の種類も限定されないが、ＦＭ１−４３、ＦＭ４−６４、ＲＨ４１４等を例示することができる。互いに異なる波長で発光する水溶性蛍光色素及び脂溶性蛍光色素の組み合わせとして、スルホローダミンとＦＭ１−４３との組み合わせ、ＨＴＰＳとＦＭ４−６４との組み合わせ等を例示できる。本発明に係る第２のサイズ決定方法で用いる水溶性蛍光色素の種類は、上記と同様である。
【０１４４】
（レーザー光による多光子励起／多光子励起顕微鏡）
多光子励起顕微鏡（特に２光子励起顕微鏡）、即ち多光子励起過程（特に２光子励起過程）を利用したレーザー蛍光顕微鏡が、本発明のようなユニークな利用方法は別として、一般的に細胞の機能解析に適している事は当該技術分野の研究者間において良く知られている。「レーザー光による多光子励起」とは、簡単に述べると、光子密度が高められた場において、分子に複数の光子が同時に吸収されて、単一の量子過程として励起されることを言う。特に近赤外多光子励起顕微鏡は、前記のように深部到達性が良好であり、しかも細胞等を損傷させる恐れが少ないため、細胞内深部の脂質膜小胞の観測に好適である。
【０１４５】
研究ツールとしての多光子励起顕微鏡の一般的利点は、空間解像度の高い深部断層像を、生存状態にある細胞等に特段の障害を与えずに、長時間にわたって取得できる点にある。更に、その深部断層像はレーザー光の対物レンズ焦点面部位に沿って得られるが、レーザー光の焦点限局的励起により、光学的スライスの厚さは１ミクロン以下である。
【０１４６】
レーザー光の種類、使用条件、スキャン方法等に関して、以下に説明する。
近赤外超短パルスレーザー：５３２ｍｍのポンプ光により、チタンサファイアレーザーを発振させ、フェムト秒パルスレーザー光を得る。発振波長７００〜９５０ｍｍ、繰り返し周波数８３ＭＨｚ、パルス幅８０ｆｓ。
スキャン方法：Ｘ軸Ｙ軸のガルバノミラーを用いて走査する。
【０１４７】
（蛍光強度の演算処理）
前記した第１のサイズ決定方法ないし第３のサイズ決定方法で用いる計算式は、要するに球体の半径と円周率「π」とを利用して球体の表面積や体積を求める周知の公式を応用したものである。これらの計算式による演算の結果として求まる脂質膜小胞のサイズは、通常は入射レーザー光の対物レンズ焦点面部位に位置する多数の脂質膜小胞の平均値である。
【０１４８】
エンドサイトーシス（脂質膜小胞の細胞内取り込み）を利用して計測対象たる脂質膜小胞を細胞内に形成させる場合、細胞の種類によって、単一のサイズの脂質膜小胞のみを形成する場合と、複数通りのサイズの脂質膜小胞を形成する場合とがある。しかし、後者の場合でも、２次元画像を利用するため、細胞内の部位を特定することで、２〜３通りのサイズの脂質膜小胞を個別の集団として識別することが可能である。従って、それぞれの集団に由来する平均値は実質的に信頼できる。
【０１４９】
所定の蛍光色素を含む水性液体に対して脂質膜の構成材料を投入することにより水性液体を封入したミセルとしての脂質膜小胞を形成させる方法においては、それらのミセルのサイズは必ずしも一定していない、と考えられる。その場合に、脂質膜小胞サイズの演算結果に信頼性を持たせる手段として、次の事項が考えられる。
【０１５０】
即ち、多光子励起顕微鏡等による蛍光強度の検出においては、前記したように、視覚的観察を併用することによって、脂質膜小胞の個数ａを特定できる視野内の蛍光強度を選択的に検出することが可能である。従って、例えば単一の脂質膜小胞が含まれる視野内の蛍光強度を選択的に検出すれば、サイズのバラツキに基づく平均値の信頼性不足と言う問題は起こらない。又、同様の方法で、多光子励起顕微鏡像における蛍光の輝点の強度（視覚上の蛍光強度）がほぼ同等である小数個の脂質膜小胞が含まれる顕微鏡視野を選び、その視野内の蛍光強度を選択的に検出すれば、実質的に信頼性のある平均値サイズが得られる。
【０１５１】
（脂質膜小胞の存否の決定）
本発明に係る脂質膜小胞の存否の決定方法は、前記したように、第１のサイズ決定方法ないし第３のサイズ決定方法において、脂質膜小胞の半径Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 についての計算値がゼロであった場合には、細胞中又はマトリクスたる水性液体中に脂質膜小胞が存在しないと判定する方法である。
【実施例】
【０１５２】
次に、本発明に係る実施例を説明する。これらの実施例が本発明の技術的範囲を限定するものでないことは、もちろんである。
【０１５３】
（実施例１）
測定対象として、小胞を持つ細胞である神経のモデル株化細胞のＰＣ１２細胞を選定し、この細胞を底面が０．１ｍｍの厚さのガラスでできた容器Ａの底面ガラス上に培養した。この容器Ａには、細胞が生息できる栄養を持った下記の組成の細胞外液に対して脂溶性蛍光色素（２５μＭ  ＦＭ１−４３）と水溶性蛍光色素（０．５ｍＭＳＲＢ）とを加えたものを満たしておいた。
【０１５４】
細胞外液の組成：
１４０ｍＭ  ＮａＣｌ
５ｍＭ  ＫＣｌ
２ｍＭ  ＣａＣｌ２  
１ｍＭ  ＭｇＣｌ２  
１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）
１０ｍＭ  グルコース
（実施例２）
上記の容器Ａを２光子励起レーザー走査顕微鏡に設置して測定した。この２光子励起レーザー走査顕微鏡は、対物レンズに Uplan Apo60×(Olympus) を用いた倒立顕微鏡(1×70;Olympus) と共焦点レーザースキャナー装置（ FV300 ; Olympus）を組み合わせて用いた。２光子励起レーザー走査顕微鏡に導入する励起光源レーザーには、モードロックフェムト秒パルスレーザー(Tsunami ; Spectra Physics) を用いた。レーザーは、観察面で１０ｍＷのエネルギーで８３０ｎｍの波長、パルス幅は７０から１００フェムト秒に調整した。
【０１５５】
２光子励起レーザー走査顕微鏡の共焦点レーザースキャナー装置によって測定対象の細胞を走査した。上記の共焦点レーザースキャナー装置と、付属の画像取得ソフトウェアにより、画像化を行った。即ち、ガルバノスキャナーでレーザー光を走査し、走査点からの蛍光を光電子倍増管で検出し、蛍光強度に応じた疑似カラーコードに変換し、画像に構築した。ただし、共焦点レーザースキャナー装置は、共焦点光学系のピンホールは除去してある。
【０１５６】
脂溶性蛍光色素（２５μＭ  ＦＭ１−４３）の蛍光強度は４００ｎｍから５５０ｎｍの波長を測定した。水溶性蛍光色素（０．５ｍＭ  ＳＲＢ）の蛍光強度は５７０ｎｍから６５０ｎｍの波長を測定した。光電子倍増管の印加電圧はＳＲＢの蛍光には６２０Ｖに、ＦＭ１−４３の蛍光には６５０Ｖに設定した。
【０１５７】
（実施例３）
図１では、測定対象のＰＣ１２細胞に７０ｍＭ高カリウム刺激液を吹きかけて、細胞を脱分極させ、小胞の開口放出を起こさせた。図１中のａ１〜ａ３は、演算を行っていないＳＲＢ由来の蛍光強度画像である。黒く抜けている部分に細胞体がある。又、図１中のａ１〜ａ３には、細胞に刺激を与えた時を０秒とした際の、その基準時に対する時間経過を示している。即ちａ１は基準時の１．８秒前、ａ２は基準時の１．２秒後、ａ３は基準時の５．２秒後を示す。
【０１５８】
観察している断層面は、細胞がガラス面と接しているところより数μｍ細胞側にあり、ガラス面と平行に断層画像を得た。図１中のａ２、ａ３の矢印で示した輝点のそれぞれが、開口放出を起こした小胞である。小胞が開口放出を起こし細胞外液と通じることによって、小胞内に細胞外液のＳＲＢが入り込み、その小胞内が満たされている。細胞の外の白い部分は細胞外液中のＳＲＢによる蛍光である。
【０１５９】
図１中のｂ１〜ｂ３は刺激前の蛍光画像である図１中のａ１を、図１中のａ１、ａ２、ａ３それぞれから差し引いたものを差分像としたものである。この差分画像を、実施例６で後述する方法Ａ１による小胞の半径の計測に用いた。
【０１６０】
（実施例４）
図２は、図１中の「ｂ」に示された単一の小胞（単一の輝点、即ち、水溶性蛍光色素と脂溶性蛍光色素とを取り込んだ単一の小胞の蛍光画像）を拡大して、時間０秒と３秒の時点を示したものである。図１中の「ｂ」と同様に、背景の光ノイズを除去してある。
【０１６１】
時間０秒では、小胞が出現していないため、蛍光強度はゼロであるが、３秒の時点の図では小胞が開口放出を起こし、小胞に蛍光色素が取り込まれていることを示している。図２中の時間０秒と３秒の画像のうち、「Ａ」で示す画像はＳＲＢ由来の蛍光画像であり、「Ｂ」で示す画像はＦＭ１−４３由来の蛍光画像であって、それぞれＳＲＢとＦＭ１−４３の蛍光波長によって分離して得られたものである。この図２中の「Ｂ」の差分画像を、下記の方法Ｂ１による小胞の半径の計測に用いた。
【０１６２】
（実施例５）
図３のグラフは、図２と同様に単一の小胞を特定し、この小胞が開口放出によって外液と通じ、脂溶性蛍光色素ＦＭ１−４３及び水溶性蛍光色素ＳＲＢを同時に取り込んだ時点をグラフの横軸の時間０秒とし、時関経過を追って、ＳＲＢから計算された小胞の体積Ａと、ＦＭ１−４３から計算された小胞の表面積Ｂとの変化（縦軸方向）を示した。
【０１６３】
次に、具体的に体積Ａと表面積Ｂの計算方法を示す。便宜的に時間０秒から４秒まで蛍光強度の平均値を用いる。グラフでは各時間の蛍光強度の値を用いている。小胞の体積Ａを算出するには、小胞の出現により増加したＳＲＢの蛍光強度４５０ＡＵを、別途に測定しておいた同一濃度のＳＲＢの単位体積あたりの蛍光強度１８７５００ＡＵ／μｍ３  で除算し、０．００２４μｍ３  を得た。
【０１６４】
又、小胞の表面積Ｂを算出するには、小胞の出現により増加したＦＭ１−４３の蛍光強度２１２．５ＡＵを、別途に測定しておいた同一濃度のＦＭ１−４３の単位面積あたりの蛍光強度２５００ＡＵ／μｍ２  で除算し、０．０８５μｍ２  を得た。ここで用いたＡＵは蛍光強度を表す任意の単位である。これらの体積Ａと表面積Ｂの値より、小胞の半径を計算できる。
【０１６５】
なお、上記のＦＭ１−４３の単位面積あたりの蛍光強度（Ｆd ）の測定に当たり、脂質膜に対してレーザー光を対物レンズを介して入射した場合の対物レンズ焦点面部位の蛍光画像の蛍光強度をＦm とし、当該蛍光強度測定系において、蛍光強度の点分布関数（ Point Spread Function：Ｐxyz 〕をｚ軸について積分した時の積分値が１になるようにした場合におけるＺ＝０の時の点分布関数の値をＰxy(0) とした場合に、Ｆd ＝Ｆm ・Ｐxy(0) の式によって蛍光強度Ｆd を求めることもできる。
【０１６６】
上記したＳＲＢの単位体積あたりの蛍光強度は、細胞がないところの細胞外液の蛍光断層画像を取得し、断層面の厚さを０．８μｍとして、蛍光画像の蛍光強度から算出した。また、ＦＭ１−４３の単位面積あたりの蛍光強度は、細胞の細胞膜が蛍光画像を取得する断層面と平行である細胞膜に着目し、ここから取得した蛍光画像から得た蛍光強度に基づいて算出した。断層面の厚さは顕微鏡によって変わってくる。
【０１６７】
ＳＲＢの単位体積あたりの蛍光強度（Ｆc ）の算出に当たり、断層面の厚さを０．８μｍとして算出する上記方法に代え、レーザー光を対物レンズを介して入射した場合における対物レンズ焦点面部位の蛍光画像の蛍光強度をＦe とし、当該蛍光強度測定系において、蛍光強度の点分布関数（ Point Spread Function：Ｐxyz 〕をｚ軸について積分した時の積分値が１になるようにした場合におけるＺ＝０の時の点分布関数の値をＰxy(0) とした場合に、Ｆc ＝Ｆe ・Ｐxy(0) の式によって蛍光強度Ｆc を求めることもできる。
【０１６８】
（実施例６）
図４のグラフには、上記の図３で得られた小胞の体積Ａ及び小胞の表面積Ｂの値から、下記の方法Ａ１、Ｂ１、Ｃ１により小胞の半径を求めた値を、小胞の出現時点を０秒として、時間経過を追って示してある。グラフ中の白抜き四角形のプロットは方法Ａ１により、白抜き丸形のプロットは方法Ｂ１により、黒丸形のプロットは方法Ｃ１により算出した。
【０１６９】
次に、具体的にその方法を示す。便宜的に、時間０秒から４秒まで蛍光強度の平均値を用いる。
【０１７０】
方法Ａ１では、小胞を完全球体であると近似的に仮定することにより、球体の体積の公式を用いて算出した。即ち、小胞の体積である０．００２４μｍ３  （図３のデータ）を数値３で乗算し、次いで数値４で除算し、更に円周率πで除算した値の立方根を計算して、小胞の半径０．０８３１μｍを得た。
【０１７１】
方法Ｂ１では、小胞を完全球体であると近似的に仮定することにより、球体の表面積の公式を用いて算出した。即ち、小胞の表面積である０．０８５μｍ２  （図３のデータ）を数値４で除算し、更に円周率πで除算した値の立方根を計算して、小胞の半径０．０８２３μｍを得た。
【０１７２】
方法Ｃ１では、小胞を完全球体であると近似的に仮定することにより、球体の体積の公式と球体の表面積の公式を用いて算出した。図３のデータに基づき、小胞の体積である０．００２４μｍ３  を小胞の表面積である０．０８５μｍ２  で除算し、次いで数値３で乗算して、小胞の半径０．０８４７μｍを得た。
【０１７３】
（実施例７）
図５のグラフは、上記した方法Ａ１、Ｂ１、Ｃ１を個々の小胞に適用し、得られた複数の小胞の半径の値について、横軸に半径値、縦軸に頻度分布を示したものである。図５において、方法Ａ１で得られた結果は「方法Ａ」で示す斜線入りの棒グラフで、方法Ｂ１で得られた結果は「方法Ｂ」で示す白抜きの棒グラフで、方法Ｃ１で得られた結果は「方法Ｃ」で示す黒塗りの棒グラフで、それぞれ示す。それぞれの方法で求めた小胞の半径は、良く一致した。
【０１７４】
（実施例８）
図６の「ａ」、「ｂ」、「ｃ」の画像は、前記の実施例と同様に、水溶性蛍光色素と脂溶性蛍光色素とが併存する細胞外液中にある細胞（生体組織中の細胞）に対して分泌刺激を与え、これらの蛍光色素を小胞に取り込ませたもとで取得した細胞（図６の画像中央）の蛍光画像である。細胞外液は、細胞間隙に入り込むことにより、目的の細胞に到達することができる。
【０１７５】
図６中の「ａ」はＳＲＢ由来の蛍光強度を示した画像である。図６中の「ｂ」はＦＭ１−４３由来の蛍光強度を示した画像である。図６中の「ｃ」は、図６中の「ａ」と図６中の「ｂ」との蛍光画像全体に基づいて前記した方法Ｃ１の演算を行い、小胞の半径を画像上の濃淡トーンに再定義した画像である。
【０１７６】
図６中の「ａ」の画像において、矢印は大型有髄小胞を示している。又、図６中の「ｃ」の画像において、白抜きの枠線で囲んだ関心領域１には半径２５ｎｍな小胞が存在していることが示されている。このように、細胞内に複数種の大きさの小胞が存在していても、それぞれの小胞の半径を測定することができる。
【０１７７】
細胞の中心部は中間濃度トーンであって、小胞が存在しない。この場合、本発明に係る脂質膜小胞のサイズ決定方法によって「小胞の半径がゼロ」との結果が得られ、従って「小胞が存在しない」との判定を行うことができる。本実施例の場合はたまたま、常識判断によって「ここに細胞の核があるため、小胞が存在しない」ことを推定できるが、このような推定ができないケースにおいては、本発明に係る脂質膜小胞の存否の判定方法が有効に利用される。
【０１７８】
（実施例９）
本実施例においては、細胞内に存在することが知られている３種類の大きさの小胞（神経様小胞、構成性小胞及び大型小胞）について、電子顕微鏡による測定と、本発明に係る脂質膜小胞のサイズ決定方法による測定とを対比した。
【０１７９】
図７中の「ａ」には、電子顕微鏡像によって測定した小胞の大きさ（横軸）と、その頻度分布（縦軸）の関係を示した。又、図７中の「ｂ」には、本発明に係る脂質膜小胞のサイズ決定方法によって測定した小胞の大きさ（横軸）と、その頻度分布（縦軸）の関係を示した。図７中の「ａ」と「ｂ」とが良好に対応していることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１８０】
本発明によって、細胞の機能に重要な関わりを持つ脂質膜小胞の新規で有利な研究手段が提供される。その結果、ドラッグスクリーニング、神経終末部の活動の研究、その他の多様な生物系機能観察、医療研究等の促進が期待される。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】実施例に係る蛍光像及び差分像を示す図である。
【０１８２】
【図２】図１の一部を拡大した蛍光像及び差分像を示す図である。
【０１８３】
【図３】実施例における小胞の体積と表面積の演算を示すグラフである。
【０１８４】
【図４】図３で得た値から小胞の半径を求めた値を示すグラフである。
【０１８５】
【図５】小胞の半径と出現頻度の関係を示すグラフである。
【０１８６】
【図６】細胞の中央付近の断層面についての蛍光強度画像である。
【０１８７】
【図７】電子顕微鏡の測定結果と本発明方法の測定結果を対比した図である。
【０１８８】
【図８】点分布関数の概念を説明するための例示のグラフである。
【図１】
2005321380.tif 000003
【図２】
2005321380.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2005321380.tif 000008
【図７】
2005321380.tif 000009
【図８】
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