(57)【要約】【課題】  超音波診断及び超音波を利用した治療に有用なガス封入リポソームの提供。【解決手段】  内容積の２０〜８０％リポソーム懸濁液を含有する密封容器の空隙部にフッ化物ガス又は窒素ガスを充填し、超音波処理することを特徴とするガス封入リポソームの製造法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
内容積の２０〜８０％リポソーム懸濁液を含有する密封容器の空隙部にフッ化物ガス又は窒素ガスを充填し、超音波処理することを特徴とするガス封入リポソームの製造法。
【請求項２】
リポソームが、カチオン性脂質含有リポソームである請求項１記載の製造法。
【請求項３】
リポソームが、標的細胞、標的組織又は標的病巣に対するリガンドを有するリポソームである請求項１又は２記載の製造法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の製造法により得られるガス封入リポソーム。
【請求項５】
請求項４記載のガス封入リポソームを含有する超音波診断用剤。
【請求項６】
請求項４記載のガス封入リポソームを含有することを特徴とする、投与後標的部位に低周波超音波照射することにより使用される超音波治療薬。
【請求項７】
請求項４記載のガス封入リポソーム、及び遺伝子類を含有することを特徴とする、低周波超音波処理による細胞内遺伝子導入用組成物。
【請求項８】
請求項４記載のガス封入リポソーム、及び遺伝子類を培養細胞に添加し、次いで低周波超音波照射することを特徴とする培養細胞への遺伝子類の導入方法。
【請求項９】
請求項４記載のガス封入リポソーム、及び薬効成分を含有することを特徴とする、投与後標的部位に低周波超音波照射することにより使用される超音波治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超音波診断用剤並びに超音波治療薬として有用なガス封入リポソーム及びその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
超音波診断装置は、産婦人科、循環器科、泌尿器科などの広い範囲で使用されている。これに対し、超音波イメージング剤として、気体含有微小粒子（マイクロバブル）を投与した後に超音波照射により影像して診断する方法が開発されている（特許文献１〜５参照）。
【０００３】
しかしながら、従来のマイクロバブルは、アルブミンで形成された巨大粒子中に気体を含有させるものであることから、粒子径が２〜６μmと大きく、深部組織への移行性は低かった。
【特許文献１】米国特許第４５７２２０５号
【特許文献２】米国特許第４７１８４３３号
【特許文献３】米国特許第４７７４９５８号
【特許文献４】米国特許第４８４４８５２号
【特許文献５】米国特許第４９５７６５６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明の目的は、粒子径が小さく、安定したマイクロバブルを簡便な操作で製造する方法、かくして得られたマイクロバブル及びその利用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者は、種々検討したところ、予め作成したリポソームを懸濁液とし、これを一定の空隙率を有する密封容器に添加し、この空隙部にフッ化物ガス又は窒素ガスを充填し、次いで超音波処理を行えば、粒子径の小さなガス封入リポソームが安定して調製できることを見出した。また、かくして得られたガス封入リポソームの粒子径は、予め作成したリポソームの粒子径に依存するので、粒子径が小さなガス封入リポソームが安定して得られるため、超音波診断剤として有用であることを見出した。またこのガス封入リポソームは、低周波超音波照射により容易に爆発するので、原料リポソームとして標的細胞等に対するリガンドを結合させたものを用いれば、当該細胞等に対するリガンドを有するガス封入リポソームが得られ、このリポソームは標的部位で選択的に爆発させることができ、超音波治療薬や遺伝子導入用組成物として有用であることも見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、内容積の２０〜８０％リポソーム懸濁液を含有する密封容器の空隙部にフッ化物ガス又は窒素ガスを充填し、超音波処理することを特徴とするガス封入リポソームの製造法、及びかくして得られるガス封入リポソームを提供するものである。
【０００７】
また本発明は、当該ガス封入リポソームを含有する超音波診断用剤を提供するものである。
また本発明は、当該ガス封入リポソームを含有することを特徴とする、投与後標的部位に低周波超音波照射することにより使用される超音波治療薬を提供するものである。
さらに本発明は、当該ガス封入リポソーム、及び遺伝子類を含有することを特徴とする、低周波超音波処理による細胞内遺伝子導入用組成物を提供するものである。
さらにまた、本発明は、当該ガス封入リポソーム、及び遺伝子類を培養細胞に添加し、次いで低周波超音波照射することを特徴とする培養細胞への遺伝子類の導入方法を提供するものである。
さらにまた、本発明は、当該ガス封入リポソーム、及び薬効成分を含有することを特徴とする、投与後標的部位に低周波超音波照射することにより使用される超音波治療薬を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明方法によれば、粒子径が原料リポソームに依存するので、小さく、かつ一定の粒子径を有するガス封入リポソームが簡便かつ安定して調製できる。また、小さい粒子径を有することから、細動脈等の血栓や動脈硬化巣へも大量のガス封入リポソームを移行させることができ、従来診断できなかった病巣部の画像化も可能となるとともに、微小血管の血栓や動脈硬化巣の治療が可能となる。
また、本発明のガス封入リポソームは、投与後標的部位に低周波超音波照射することにより、当該部位で内封されたガスの微小気泡によるキャビテーションを生じ爆発作用を有する。従って、血栓や動脈硬化巣等の破壊による治療が可能となる。また、リポソームに病巣部位に対するリガンドを結合させておけば、その治療はより部位特異的になる。in vivo又はin vitroにおいて、ガス封入リポソームと遺伝子類とを同時に標的細胞に作用させ、低周波超音波照射すれば、ガスの微小気泡が生じキャビテーションによって標的細胞に極めて効率良く遺伝子類を導入できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明においては、予めリポソームを調製しておくことに特徴がある。本発明に用いられるリポソームとは、基本的に膜構成成分として脂質類を含有するリポソームであり、その内部には薬物、遺伝子類等を有していてもよい。ここでリポソームの膜構成成分として用いられる脂質類としては、リン脂質、グリセロ糖脂質及びスフィンゴ糖脂質の他、これらの脂質に、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基又は第４級アンモニウム基が導入されたカチオン性脂質、これらの脂質にポリアルキレングリコールが導入された脂質、さらに各種細胞、組織等に対するリガンドが結合した脂質類が挙げられる。
【００１０】
リン脂質としては、例えばホスファチジルコリン（大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルエタノールアミン（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、水素添加リン脂質等の天然又は合成のリン脂質等が挙げられる。
【００１１】
グリセロ糖脂質としては、例えばスルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等が挙げられる。スフィンゴ糖脂質としては、例えばガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等が挙げられる。
【００１２】
カチオン性脂質としては、上記リン脂質、グリセロ糖脂質又はスフィンゴ糖脂質に、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアンモニウム基、モノアシルオキシアルキル−ジアルキルアンモニウム基、ジアシルオキシアルキル−モノアルキルアンモニウム基等の第４級アンモニウム基が導入された脂質が挙げられる。また、ポリアルキレングリコール修飾脂質としては、上記リン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質に、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が修飾した脂質、例えばジ−Ｃ12-24アシル−グリセロール−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−ＰＥＧ等が挙げられる。
【００１３】
また必要に応じて膜安定化剤としてコレステロール類、抗酸化剤としてトコフェロール類、ステアリルアミン、ジセチルホスフェート、ガレグリオシドを用いてもよい。
【００１４】
また、標的細胞、標的組織、標的病巣に対するリガンドとしては、トランスフェリン、葉酸、ヒアルロン酸、ガラクトース、マンノースなどの癌細胞に対するリガンド；ＲＧＤペプチド、sigma protein などの血栓に対するリガンド等が挙げられる。また、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体もリガンドとして使用できる。
【００１５】
また、予め作成されるリポソームの内部には、水相であればよく特に薬効成分、遺伝子類等を含有しなくてもよいが、前記治療薬や遺伝子導入用組成物として使用する場合には、含有していてもよい。このような薬効成分としては、例えばドキソルビシン、５−ＦＵ、シスプラチン、オギザリプラチン等の白金誘導体、タキソール、カンプトテシン等の癌治療薬；ｔ−ＰＡ、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ等の血栓治療薬；プロスタグランジン等の動脈硬化症治療薬；動脈閉塞症、バーチャ病に対するＮＦカッパーＢ、デコイ等が挙げられる。また、遺伝子類としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、デコイ、治療用オリゴヌクレオチド等が挙げられる。
【００１６】
リポソームの製造には、公知のリポソームの調製法を適用することができ、例えばバンガム（Bangham）らのリポソーム調製法［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.), 13, 238(1965)］、エタノール注入法［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(J. Cell. Biol.), 66, 621(1975)］、フレンチプレス法［フェブス・レター(FEBS Lett.), 99, 210(1979)］、凍結融解法［アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス(Arch. Biochem. Biophys.), 212, 186(1981)］、逆相蒸発法［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 4194(1978)］等が挙げられる。例えば、脂質類等を有機溶媒に溶解し、これに水性溶液を加え、次いで、超音波処理してリポソーム懸濁液を得る。次いで必要によりこれをエクストルーダー及び／又はメンブランフィルターを用いて、整粒する。このとき、粒子径は、１μm以下、さらに１００〜８００nm、特に１００〜６００nmに整粒するのが好ましい。
【００１７】
得られたリポソーム懸濁液は密封容器に注入する。このとき、容器の空隙率は内容積の２０〜８０％、さらに３０〜８０％、特に５０〜８０％にするのが好ましい。２０％未満では、得られるリポソームのガス導入率が低すぎる。一方、８０％を超えると経済的でない。
【００１８】
この空隙部にフッ化物ガス又は窒素ガスを充填する。フッ化物ガスとしては、硫化ヘキサフルオライド、パーフルオロ炭化水素ガス、例えば、ＣＦ4、Ｃ2Ｆ6、Ｃ3Ｆ8、Ｃ4Ｆ10、Ｃ5Ｆ12、Ｃ6Ｆ14等が挙げられ、Ｃ3Ｆ8、Ｃ4Ｆ10、Ｃ5Ｆ12が特に好ましい。また、窒素ガスも使用できる。充填した後の圧力は１気圧（ゲージ圧）以上、特に１〜１．５気圧が好ましい。充填手段としては、ゴム栓等から注射器等により、注入するのが簡便であるが、注入用シリンダーを用いてもよい。
【００１９】
次いで超音波処理する。超音波処理は、例えば、２０〜５０kHzの超音波を１〜５分照射すればよい。当該超音波処理により、リポソーム内部の水溶液とフッ化物ガス又は窒素ガスとが置換し、ガス封入リポソームが得られる。得られたガス封入リポソームの粒子径は、原料リポソームのそれとほぼ同じである。従って、リポソーム調整時に整粒しておけば、粒子径が一定範囲、例えば１μm以下、さらに５０〜８００nm、特に１００〜６００nmのガス封入リポソームが簡便に得られる。
【００２０】
なお、フッ化物ガス又は窒素ガスを充填したリポソーム懸濁液含有密封容器を調製しておき、これを病院等に供給すれば、現場で超音波処理するだけで容易にガス封入リポソームを得ることができる。
【００２１】
かくして得られたガス封入リポソームは、粒子径が小さく、その粒度分布も一定にすることができるので、微小血管、深部組織等への移行が可能である。従って、ガス封入リポソームを用いれば、従来のマイクロバブルを用いた超音波診断画像よりも、微小血管、深部組織等の画像化が可能になるばかりでなく、その画像もより鮮明になる。本発明のガス封入リポソームを用いた超音波診断は、通常の方法に従って行えばよい。すなわち、本発明のガス封入リポソームを投与後、診断用超音波（２〜６MHz）を照射することにより、組織の画像が得られる。このときの投与法としては、静脈内投与等が挙げられる。
【００２２】
また、本発明のガス封入リポソームは、０．５〜２MHzの共振周波数を含む低周波超音波を照射すると、リポソームの崩壊とガスの微小気泡によるキャビテーションを生じる。このキャビテーションが血栓部位でおこれば血栓が破壊される。従って、リポソームが、標的病巣、例えば血栓や動脈硬化巣に対するリガンドを有する場合には、投与された本発明のガス封入リポソームは、血栓や動脈硬化巣に結合する。この様子は、診断用超音波照射により追跡可能である。ガス封入リポソームが血栓や動脈硬化巣に結合した時点で、その部位に低周波超音波を照射すれば、当該ガス封入リポソームを爆発させ、血栓等を破壊し、治療することができる。このようなガス封入リポソームの爆発により治療できる疾患としては、血栓、動脈硬化症、血管炎、癌組織等が挙げられる。
【００２３】
また、前述の如く、本発明のガス封入リポソームには、種々の薬効成分、遺伝子類を内包させることができるので、これらの薬効成分又は遺伝子内包リポソームを用いれば、ガス封入リポソームを投与後、標的部位に到達するのを診断用超音波により追跡し、標的部位に到達した時点で低周波超音波を照射すれば、リポソームに内封されたガスの微小気泡から生じるキャビテーションにより、標的部位で薬効成分又は遺伝子類を放出させ、標的細胞に導入することができる。このとき、薬効成分又は遺伝子類は、本発明のガス封入リポソームに内包されている必要はなく、同時に投与すればよい。ここで遺伝子類導入用リポソームとしては、カチオン性脂質を用いたリポソームを用いるのが好ましい。また、このときプロタミン、ポリリジン等も遺伝子類と同時に投与すると、遺伝子の導入効率はさらに向上する。
【００２４】
ここで遺伝子類は、ガス封入リポソームの爆発により標的細胞への導入効率が向上する。従って、本発明ガス封入リポソームと遺伝子類を投与後、標的部位に低周波超音波照射すれば、標的細胞へ遺伝子類を効率良く導入することができる。また、この遺伝子類の細胞への導入は、in vitro、すなわち、培養細胞に対しても行うことができる。この場合には、本発明のガス封入リポソームと遺伝子類を培養細胞に添加し、次いで低周波超音波照射すればよい。
【００２５】
なお、薬効成分や遺伝子類を標的細胞、標的組織、標的病巣等に効率良く到達させるには、本発明ガス封入リポソームとして、これらの標的部位に対するリガンドが結合したリポソームを用いるのが好ましい。
【実施例】
【００２６】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
以下、実施例で用いる略語は次のとおりである。
ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＥ：ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール
Ｍａｌ：マルトース
ＤＣ−Ｃｈｏｌ：３β−［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン］カルバモイル］コレステロール
ＤＯＰＥ：ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＯＴＡＰ：１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン
ＤＰＴＭＡ：Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド
ＤＤＡＢ：ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド
【００２７】
実施例１
（１）血栓ターゲティング用リポソームの調製方法
ＤＰＰＣ：コレステロール：ＤＰＰＥ−ＰＥＧ：ＤＰＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｌ（１：１：０．１１：０．０２（m／m））の脂質をクロロホルム：イソプロピルエーテル（１：１v／v）の有機溶媒に溶解し、生理食塩水などの水溶液（又は薬物を含む水溶液）を有機溶媒の１／２容量を加えて（このとき、クロロホルム：イソプロピルエーテル：水溶液＝１：１：１v／v）混和しエマルジョンとした。これを用いて逆相蒸発法（ＲＥＶ法）でリポソームを調製した。エクストルーダーで４００nm、２００nm、１００nmのポリカーボネート膜を通過させて粒径を揃える。ＰＥＧ−リポソームとすることで、長期間（２年間）分散状態で保つことが可能となる。ただし、ガス封入時には、超音波で封入するので、どのようなリポソームでも分散状態が得られるので、ガス封入には脂質組成は関係しない。
ＣＧＧＧＲＧＤＦペプチドをこのリポソーム溶液に加えて１時間室温で反応させた。そのあと、超遠心分離でＲＧＤ修飾ＰＥＧ−リポソームを得た。
【００２８】
（２）遺伝子導入用カチオニックリポソームの調製
ｉ）ＤＣ−Ｃｈｏｌリポソーム
ＤＯＰＥ：ＤＣ−Ｃｈｏｌ＝２：３m／mをクロロホルムに溶解し、梨型フラスコ中に入れ、ロータリーエバポレートで回転しながら有機溶媒をエバポレートして脂質の薄い膜を壁に作製した（lipid filmの作製）。生理食塩水などの溶媒で水和（hydration）して、リポソームを作製した。超音波処理によってサイズを小さくする。又は、エクストルーダーで４００nm、２００nm、１００nmのポリカーボネート膜を通過させて粒径を揃える。
【００２９】
ii）ＤＯＴＡＰリポソーム
ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ＝１：１w／wをクロロホルムに溶解し、梨型フラスコ中に入れ、ロータリーエバポレートで回転しながら有機溶媒をエバポレートして脂質の薄い膜を壁に作製した（lipid filmの作製）。生理食塩水などの溶媒で水和（hydration）して、リポソームを作製した。超音波処理によってサイズを小さくする。又は、エクストルーダーで４００nm、２００nm、１００nmのポリカーボネート膜を通過させて粒径を揃える。
【００３０】
市販のカチオニックリポソームからなる遺伝子導入用の試薬として、以下の試薬を用いた。
LipofectinTM(DOTMA:DOPE=1：1 w/w)
LipofectACETM(DDAB:DOPE=1：1.25 w/w)
【００３１】
（３）各種リポソームに対するガスの封入法
バイアル瓶（５mL、１０mL、２０mLなど）に容量の３０％（１．５mL、３mL、６mL）に相当するリポソーム水溶液（脂質濃度は５mg／mL）を入れ、パーフルオロプロパンを空気と置換するように入れた。ゴム栓をしてシールしゴム栓を通じて注射器でさらにパーフルオロプロパンを加えた。パーフルオロプロパンは全量で内容積の１．５倍で１．５気圧程度の加圧状態にした。バス型超音波装置（４２kHz）に水を張り静置し、１分間照射処理した。
【００３２】
（４）血栓の造影
ウサギ腸骨動脈にバルーンカテーテルを導入し、内皮に擦る刺激を与えて人工的に血栓を作製する。ＲＧＤ−ＰＥＧ−リポソームを静注し、診察用超音波装置（３．５MHz）で血栓部位を観測すると輝度が上昇し血栓部位が確認できた。
【００３３】
（５）血栓の破砕
試験管内に血栓を作製し上記（３）で得たガス封入ＲＧＤ−ＰＥＧ−リポソームを添加後３０分放置した。リポソーム溶液を除去し、生理食塩水を加えて、１MHzの治療用超音波を照射したところ、表面の破砕が観測された。一方、ガス封入ＰＥＧ−リポソームで同様の操作をした場合、破砕が観測されなかった。この違いは、ＲＧＤペプチドによるガス封入リポソームの血栓への結合が生じたためで、ターゲティングが出来た。
【００３４】
（６）４８穴のプレートにヒト膵臓癌ＡｓＰＣ−１細胞（４×１０4細胞／well）を培養し、ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド（１８核酸残基）と上記（３）で得たガス封入ＰＥＧ−リポソームを添加し、１MHzの超音波を３秒間パルス照射し、直ちに培養液を３〜４回繰り返し洗浄した。その後、蛍光顕微鏡で細胞内の蛍光強度を観測した。低周波照射により細胞内の蛍光が観測され、その結果、ガス封入リポソームと遺伝子を細胞に添加し、次いで低周波照射すれば標的細胞に目的遺伝子を導入できることが判明した。
【００３５】
（７）ルシフェラーゼをコードしたプラスミドＤＮＡとプロタミンを混合し、ＤＮＡ−プロタミン複合体を作製し、コンパクトなサイズにする。４８穴のプレートにAsPC−１細胞（４×１０4細胞／well）培養し、ＤＮＡ−プロタミン複合体（１マイクロg  DNA、lipid：DNA＝12:1 w/w）とガス封入ＰＥＧ−リポソームを添加し、１MHzの超音波を３秒間パルス照射し、直ちに培養液を３〜４回繰り返し洗浄し、培養液を加えて２日間培養した。その後、ルシフェラーゼ活性を常法により測定した。得られた結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
表１から明らかようにガス封入リポソームと遺伝子を細胞に添加し、次いで低周波超音波照射することにより、遺伝子が効率良く細胞に導入できることがわかった。