(57)【要約】【課題】  平面状試料の全面を短時間で高速に読み取りを行うことのできる蛍光読取装置を提供する。【解決手段】  光検出素子にＣＣＤラインセンサ１７を用い、１検出ライン３２を同時に検出する。検出ライン３２を同時に励起光源照射するために、シート状のレーザ光３１ａ，３１ｂを照射するライン成形レーザ１１ａ，１１ｂを用いる。【選択図】  図２
2005257313.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を保持する試料ステージと、
前記試料ステージを１検出ライン分の距離ずつ検出ラインと交差する方向に駆動するステージ駆動部と、
前記試料ステージに保持された試料の検出ライン上に第１の波長のシート状レーザ光を照射する第１のラインレーザと、
前記検出ライン上に前記第１の波長と異なる第２の波長のシート状レーザ光を照射する第２のラインレーザと、
前記第１の波長のレーザ光照射によって試料から発せられた蛍光を透過する第１の蛍光フィルタと、
前記第２の波長のレーザ光照射によって試料から発せられた蛍光を透過する第２の蛍光フィルタと、
ＣＣＤラインセンサと、
前記蛍光フィルタを透過した蛍光を前記ＣＣＤラインセンサに集光する受光光学系と、
前記ステージ駆動部、前記第１のラインレーザ及び前記第２のラインレーザを制御する制御部と
を備えることを特徴とする蛍光読取装置。
【請求項２】
請求項１記載の蛍光読取装置において、前記第１の蛍光フィルタ及び第２の蛍光フィルタを駆動する蛍光フィルタ駆動部を有し、前記制御部は、前記第１のラインレーザと前記第２のラインレーザを交互に照射するように制御し、前記第１のラインレーザが照射しているとき前記第１の蛍光フィルタが受光光路上に位置し、前記第２のラインレーザが照射しているとき前記第２の蛍光フィルタが前記ＣＣＤラインセンサの受光光路上に位置するように前記蛍光フィルタ駆動部を制御することを特徴とする蛍光読取装置。
【請求項３】
請求項１記載の蛍光読取装置において、試料から発せられた蛍光を、前記第１の蛍光フィルタを通して前記受光レンズに入射させる光路と前記第２の蛍光フィルタを通して前記受光レンズに入射させる光路に切り替える光路切り替え部を有し、前記制御部は、前記第１のラインレーザと前記第２のラインレーザを交互に照射するように制御するとともに、前記第１のラインレーザが照射しているとき試料からの蛍光が前記第１の蛍光フィルタを通って前記受光レンズに入射し、前記第２のラインレーザが照射しているとき試料からの蛍光が前記第２の蛍光フィルタを通って前記受光レンズに入射するように前記光路切り替え部を制御することを特徴とする蛍光読取装置。
【請求項４】
請求項１記載の蛍光読取装置において、前記ＣＣＤラインセンサとして、前記第１の蛍光フィルタを透過した蛍光を検出する第１のＣＣＤラインセンサと、前記第２の蛍光フィルタを透過した蛍光を検出する第２のＣＣＤラインセンサとを有し、前記受光光学系として前記第１の蛍光フィルタを透過した蛍光を前記第１のＣＣＤラインセンサに集光する受光光学系と前記第２の蛍光フィルタを透過した蛍光を前記第２のＣＣＤラインセンサに集光する受光光学系とを有し、前記制御部は、前記第１のラインレーザと前記第２のラインレーザを両者が同時に照射するように制御することを特徴とする蛍光読取装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料から発生される蛍光を高速に読み取る蛍光読取装置に関し、特にバイオチップの読み取りに用いて好適な蛍光読取装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオチップは、ＤＮＡ、蛋白質などの生体分子をガラスプレートなどの基板上に固定化したものである（ＤＮＡチップと呼ばれる場合もある）。バイオチップからの蛍光信号を読み取る従来の蛍光読取装置には、大きく分けて２つの読み取り方式がある。１つは２次元ＣＣＤ素子を用いた読み取り方式であり、他の１つはレーザ走査による光電子増倍管（ＰＭＴ）を用いた読み取り方式である。２次元ＣＣＤ素子を用いた蛍光読取装置は、近年のＣＣＤ素子の改良により高速、高感度な検出が可能となっているが、バイオチップ全面を読み取るにはバイオチップを複数の画像に分割して検出する必要があった。この時、読み取り画像ごとに感度差や画素ズレがあり、画像を結合する際に感度ムラ、画素ズレが発生していた。例えば２５×７５ｍｍ全面の読み取りを行う場合、２５×２５ｍｍずつに３分割して読み取りを行う必要があり、３つの画像間での感度ムラ、画素ズレを補正する必要があった。レーザ走査によるＰＭＴを用いた蛍光読取装置は、高感度での検出が可能であるが、読み取り範囲全面をレーザ走査する必要があり、例えば２５×７５ｍｍ全面を解像度１０μｍで読み取る場合で約５分、解像度３０μｍの場合で約２分の時間がかかっていた。
【０００３】
【特許文献１】特開２０００−３４３２５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
バイオチップの解析においては、ハイスループットが重要であり、ハイブリダイゼーション反応及び解析処理の短時間化も必要であるが、当然読み取り装置にも読み取りの高速化が求められる。しかし、従来の蛍光読取装置では、バイオチップ全面を高速に読み取るのが困難であった。
【０００５】
本発明は、バイオチップ等の平面状試料の全面を短時間で高速に読み取りを行うことのできる蛍光読取装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明では、上記課題を解決するため、光検出素子にＣＣＤラインセンサを用いた。従来のレーザ走査方式では、レーザを読み取り範囲全面（例えば２５×７５ｍｍ）に走査する必要があったが、ＣＣＤラインセンサを用いることで、１検出ラインを同時に検出することが可能であり、Ｘ軸方向のライン走査だけで読み取り範囲全面を読み取ることが可能となった。また、この際、検出ラインを同時に励起光源照射する必要があるが、本発明ではシート状のレーザ光を照射するライン成形レーザを用いることで、検出ライン上を同時にレーザ照射する。
【０００７】
本発明による蛍光読取装置は、試料を保持する試料ステージと、試料ステージを１検出ライン分の距離ずつ検出ラインと交差する方向に駆動するステージ駆動部と、試料ステージに保持された試料の検出ライン上に第１の波長のシート状レーザ光を照射する第１のラインレーザと、検出ライン上に第１の波長と異なる第２の波長のシート状レーザ光を照射する第２のラインレーザと、第１の波長のレーザ光照射によって試料から発せられた蛍光を透過する第１の蛍光フィルタと、第２の波長のレーザ光照射によって試料から発せられた蛍光を透過する第２の蛍光フィルタと、ＣＣＤラインセンサと、蛍光フィルタを透過した蛍光をＣＣＤラインセンサに集光する受光光学系と、ステージ駆動部、第１のラインレーザ及び第２のラインレーザを制御する制御部とを備える。
【０００８】
本発明の蛍光読み取り装置は、第１の蛍光フィルタ及び第２の蛍光フィルタを駆動する蛍光フィルタ駆動部を有することができ、その場合、制御部は、第１のラインレーザと第２のラインレーザを交互に照射するように制御し、第１のラインレーザが照射しているとき第１の蛍光フィルタが受光光路上に位置し、第２のラインレーザが照射しているとき第２の蛍光フィルタが前記ＣＣＤラインセンサの受光光路上に位置するように蛍光フィルタ駆動部を制御する。
【０００９】
本発明の蛍光読み取り装置は、また、試料から発せられた蛍光を、第１の蛍光フィルタを通して受光レンズに入射させる光路と第２の蛍光フィルタを通して受光レンズに入射させる光路に切り替える光路切り替え部を有することができ、その場合、制御部は、第１のラインレーザと第２のラインレーザを交互に照射するように制御するとともに、第１のラインレーザが照射しているとき試料からの蛍光が第１の蛍光フィルタを通って受光レンズに入射し、第２のラインレーザが照射しているとき試料からの蛍光が第２の蛍光フィルタを通って受光レンズに入射するように光路切り替え部を制御する。
【００１０】
本発明の蛍光読み取り装置は、また、ＣＣＤラインセンサとして、第１の蛍光フィルタを透過した蛍光を検出する第１のＣＣＤラインセンサと、第２の蛍光フィルタを透過した蛍光を検出する第２のＣＣＤラインセンサとを有することができ、その場合、受光光学系として第１の蛍光フィルタを透過した蛍光を第１のＣＣＤラインセンサに集光する受光光学系と第２の蛍光フィルタを透過した蛍光を第２のＣＣＤラインセンサに集光する受光光学系とを有し、制御部は、第１のラインレーザと第２のラインレーザを両者が同時に照射するように制御する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、従来の蛍光読取装置に比べて高速で読み取りを行うことができ、読み取り時間を短縮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の一形態について図面にしたがって説明する。ここでは、バイオチップからの蛍光を読み取る場合について説明するが、蛍光読み取り試料は必ずしもバイオチップである必要はない。
【００１３】
図１は、本発明による蛍光読取装置の構成例を説明する概略図である。本発明では光源としてシート状の励起光を発生するラインレーザを用い、検出器としてＣＣＤラインセンサを用いる。図示の装置は、励起光源としてラインレーザ１０ａとラインレーザ１０ｂの２種のレーザを搭載している。これは一般にバイオチップ上のプローブとハイブリダイズしたＤＮＡ等の生体物質はＣｙ３，Ｃｙ５の２種類の蛍光で標識されているためである。本実施例では、Ｃｙ３励起用として波長５３２ｎｍ、出力１０ｍＷのラインレーザ１０ａを用い、Ｃｙ５励起用として６３５ｎｍ、出力１０ｍＷのラインレーザ１０ｂを用いた。ただし、試料によっては生体物質がＣｙ３，Ｃｙ５以外の蛍光で標識されている場合もあり、この場合には５３２ｎｍ、６３５ｎｍ以外の波長を発生するラインレーザを搭載することで、検出が可能となる。ラインレーザ１０ａは、レーザドライバ１１ａを介して、制御用ＰＣ１２によりＯＮ／ＯＦＦ及びレーザ出力が制御される。ラインレーザ１０ｂも同様に、レーザドライバ１１ｂを介して制御用ＰＣ１２によって制御される。
【００１４】
ラインレーザ１０ａ，１０ｂから発生されたシート状の励起光はサンプルステージ２１に保持されたバイオチップ２２を直線状に照射する。励起光照射によってバイオチップ２２から発生された蛍光は、蛍光フィルタ１３を通り、受光レンズ１６によってＣＣＤラインセンサ１７に集光される。蛍光フィルタ１３は、蛍光フィルタ駆動モータドライバ１４を介して制御用ＰＣにより制御される蛍光フィルタ駆動モータ１５によって、後述するように駆動される。ＣＣＤラインセンサ１７の出力信号は、制御用ＰＣのＣＣＤ制御部１８を介して、データ格納部１９に格納される。また、サンプルステージ２１は、ステージ駆動モータドライバ２３を介して制御用ＰＣによって制御されるステージ駆動モータ２４によって駆動される。
【００１５】
励起光学系の詳細について、図２を用いて説明する。ラインレーザ１０ａから出射したシート状の励起光３１ａ及びラインレーザ１０ｂから出射したシート状の励起光３１ｂは、どちらもバイオチップ２２上の検出ライン３２を、例えば幅３０μｍ、長さ２５ｍｍのライン状に照射する。検出ラインとは１回のデータサンプリングで読み取りを行う範囲のことである。本装置で励起光源の照射範囲を検出ラインと同じライン状としているのは、検出ライン３２以外からのノイズの低減と、画像のぼやけを防ぎ平面分解能を向上させるための２つの理由による。ラインレーザ１０ａ及び１０ｂは、読み取り条件を同じにするため、バイオチップ２２に対する入射角が同じになるように配置されており、図示の例ではバイオチップ２２に対して約７０度の入射角で励起光を照射する。ただし、レーザ配置の角度はこれに限らず、受光光学系の構成部品に近づけ、バイオチップに対してなるべく垂直になるように配置するのが良い。これは、検出ライン幅３０μｍ内で、均一な光分布を得るためである。
【００１６】
図３は、ラインレーザの構成例の説明図である。ラインレーザ１０はレーザ発振器３２及びライン成形光学系３３で構成されている。レーザ発振器３２には、固体、液体、半導体を問わずさまざまなレーザを用いることが可能であるが、ここでは装置外寸の小型化のため、小型半導体レーザを用いた。レーザ発振器３２から出射したレーザは、コヒーレント光のままライン成形光学系３３に入射する。ライン成形光学系３３は複数のレンズから構成されており、コヒーレント光をシート状のレーザ光３４に成形する。ライン成形光学系３３は、レーザの波長及びライン幅、長さに合わせて専用設計することが可能であり、本実施例では幅３０μｍ、長さ２５ｍｍとなるように設計している。
【００１７】
図１に戻り、蛍光標識されたバイオチップ上の生体物質から発生された蛍光は、受光レンズ１６によって受光され、ＣＣＤラインセンサ１７に導かれる。ＣＣＤラインセンサ１７に導かれた蛍光は、ＣＣＤラインセンサ１７のＣＣＤ素子によって電気信号に変換される。このとき、ＣＣＤ素子の特性で、ＣＣＤ素子への蛍光の露光時間によって電気信号への変換効率が異なる。露光時間が長ければ、少ない蛍光量でも大きい電気信号に変換され、高感度での蛍光検出が可能であるが、その分ノイズも増幅されてしまい、また読み取り時間も長時間となってしまう。本装置では、ＣＣＤ制御部１８を介して制御用ＰＣ１２より露光時間の制御が可能であり、長時間露光による高感度検出、又は短時間読み取りによる低感度検出の選択が可能である。本実施例では、１ｍ秒から１秒まで１ｍ秒単位での露光時間設定を可能とした。
【００１８】
受光光学系について、図４を用いて説明する。図４は、受光光学系を真横から見た側面図である。ラインレーザによって励起されたバイオチップ２２上の検出ラインからの蛍光は、蛍光フィルタ１３を経て受光レンズ１６により受光され、ＣＣＤラインセンサ１７に集光される。本実施例では、Ｃｙ３用蛍光フィルタとして５７０ｎｍ±２０ｎｍの波長範囲を透過する蛍光フィルタ、Ｃｙ５用蛍光フィルタとして６７０ｎｍ±２０ｎｍの波長範囲を透過する２つの蛍光フィルタを用い、またＣＣＤラインセンサ１７として８，０００画素のＣＣＤラインセンサを採用した。８，０００画素のＣＣＤラインセンサを採用することにより、約３０μｍのピクセル解像度での読み取りが可能になる。この場合のピクセル解像度とは、１画素が表すバイオチップ上の実寸法のことである。
【００１９】
この場合、図５に示すように、幅３０μｍのラインは、ピクセル解像度約３０μｍ×３０μｍにて検出することが可能であり、一般のバイオチップ上のサンプル直径約２００μｍを測定するのに十分なピクセル解像度と考えられる。また、励起光源の照射幅、受光レンズの絞り、及びＣＣＤラインセンサカメラの画素数を変更することによって、ピクセル解像度を変更することも可能であるが、その場合は、ピクセル解像度に合わせた各光学系、ＣＣＤラインセンサカメラの選定が必要になる。
【００２０】
次に、蛍光フィルタの構成ついて図６を用いて説明する。蛍光フィルタ１３は、蛍光フィルタ１３ａ及び１３ｂを備える。蛍光フィルタ１３ａはＣｙ３検出用であり、ラインレーザ１０ａと対で用いられる。また、蛍光フィルタ１３ｂはＣｙ５検出用であり、ラインレーザ１０ｂと対で用いられる。蛍光フィルタ１３は蛍光フィルタ駆動モータ１５と連結しており、蛍光フィルタ駆動モータドライバ１４を介して制御用ＰＣ１２からの制御が可能である。ラインレーザ１０ａを出射する際には同時に蛍光フィルタ１３ａを受光レンズ１６の前に位置付け、ラインレーザ１０ｂを出射する際には蛍光フィルタ１３ｂを受光レンズ１６の前に位置付けるよう、制御用ＰＣ１２により制御される。
【００２１】
図７は、蛍光フィルタを切り替える機構の他の例を示す概略図である。この蛍光フィルタ切り替え機構は、２枚の蛍光フィルタ１３ａ，１３ｂを機械的に駆動することなく、光路切り替えによってＣＣＤラインセンサ１７がＣｙ３からの蛍光とＣｙ５からの蛍光を時分割的に検出できるようにしたものである。
【００２２】
本例の蛍光フィルタ切り替え機構は、Ｃｙ３検出用蛍光フィルタ１３ａを挟んで配置された２枚の反射ミラー４１，４２、Ｃｙ５検出用蛍光フィルタ１３ｂを挟んで配置された２枚の反射ミラー４３，４４、及び２個のガルバノミラー４５，４６、ガルバノミラー駆動部４７から構成されている。ガルバノミラー駆動部４７は制御用ＰＣ１２からの制御信号を受けて２個のガルバノミラー４５，４６を同時に駆動する。ラインレーザ１０ａが発光しているとき、２個のガルバノミラー４５，４６は実線で示した角度位置に設定される。このとき、バイオチップ２２から発生された蛍光は、蛍光フィルタ１３ａを通って受光レンズ１６で受光され、ＣＣＤラインセンサ１７に導かれる。一方、ラインレーザ１０ｂが発光しているとき、２個のガルバノミラー４５，４６は点線で示した角度位置に設定され、バイオチップから発生された蛍光は、蛍光フィルタ１３ｂを通って受光レンズ１６で受光され、ＣＣＤラインセンサ１７に導かれる。このように、制御用ＰＣ１２は、２つのラインレーザ１０ａ，１０ｂと、２個のガルバノミラー４５，４６とを同期して駆動することによって、試料中のＣｙ３から発せられる蛍光とＣｙ５から発せられる蛍光を時間的に分離して検出することができる。この蛍光フィルタ切り替え機構を用いると、２枚の蛍光フィルタ１３ａ，１３ｂの切り替えをより高速に行うことができる。
【００２３】
図１に戻り、ＣＣＤラインセンサ１７により蛍光は電気信号に変換され、検出ライン３２ごとのデータとして制御用ＰＣ内のＣＣＤ制御部１８に転送され、制御用ＰＣ上にデータとして格納される。このとき、１ライン検出ごとにＣＣＤラインセンサ１７からデータ転送を行っているため、データはすべて制御用ＰＣ上のデータ格納部１９に格納されていく。同時に、制御用ＰＣはステージ駆動モータドライバ２３を介してステージ駆動モータ２４を制御し、サンプルステージ２１を１ライン分移動させ、次の検出ラインの検出に移る。ステージ駆動モータ２４によるサンプルステージの移動量は、ピクセル解像度に合わせて３０μｍとしている。
【００２４】
このときの読み取り処理の流れを図８にまとめる。読み取り開始に当たっては、まず読み取り条件（読み取り範囲、露光時間）の入力を行う（Ｓ１１）。次に、制御用ＰＣはレーザ出射を開始し、同時にレーザ出射に合わせて蛍光フィルタの選択を行う（Ｓ１２）。その後、ステージ駆動モータ２４を制御してサンプルステージ２１を読み取り開始位置まで移動する（Ｓ１３）。その後、ユーザによって設定された時間だけＣＣＤラインセンサカメラの露光を行い（Ｓ１４）、露光終了後、ＣＣＤラインセンサカメラから制御用ＰＣ内のデータ格納部へのデータ転送を行う（Ｓ１５）。その後、ステージ移動モータ制御２４によりサンプルステージ２１を１ライン分移動させる（Ｓ１６）。このとき、全読み取り範囲の読み取りが終了していなければ（Ｓ１７）、再度ＣＣＤラインセンサカメラの露光、データ転送、ライン移動を行い、これを全読み取り範囲の読み取りが終了するまで繰り返し行う。この間のラインごとのデータは、制御用ＰＣ１２のデータ格納部１９に格納される。全読み取り範囲の読み取りが終了すると、レーザ出射を終了し（Ｓ１８）、読み取り終了となる。このとき、２波長順次で読み取る場合は、読み取り開始から読み取り終了までの処理を、出射するレーザごとに２回行い、２波長同時で読み取る場合は、２つのレーザを同時に出射するため１回の処理となる。
【００２５】
読み取り終了後は、データ格納部に格納されているラインごとのデータを結合し、２次元画像データとして出力する。またこの時、１検出ライン当たりの読み取り時間を１０ｍ秒とした。これにより、バイオチップ全面２５×７５ｍｍの範囲を２５秒で読み取り可能になる。また、低感度モードとして、１検出ライン当たりの検出時間を１ｍ秒とした場合、２．５秒での読み取りが可能になる。
【００２６】
図９は、２波長同時読み取りの場合の受光光学系の例を示す図である。ラインレーザ１０ａ及び１０ｂは同時に出射されていて、バイオチップ２２上の蛍光試薬Ｃｙ３，Ｃｙ５は同時に蛍光を発光している。このとき、Ｃｙ３の発生する蛍光はラインレーザ１０ａと対を成す蛍光フィルタ１３ａ、受光レンズ１６ａ及びＣＣＤラインセンサ１７ａにより検出され、Ｃｙ５の発生する蛍光はラインレーザ１０ｂと対を成す蛍光フィルタ１３ｂ、受光レンズ１６ｂ及びＣＣＤラインセンサ１７ｂによって検出される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明による蛍光読取装置の構成例を示す概略図。
【図２】励起光学系を説明する図。
【図３】ラインレーザの構成例を説明する図。
【図４】受光光学系を説明する図。
【図５】バイオチップ上のレーザ照射幅及びピクセル解像度を説明する図。
【図６】蛍光フィルタの構成例を説明する図。
【図７】蛍光フィルタ切り替え機構の他の例を示す概略図。
【図８】読み取り処理の流れを説明する図。
【図９】２波長同時読み取りの場合の受光光学系の概略図。
【符号の説明】
【００２８】
１０ａ，１０ｂ…ラインレーザ、１１ａ，１１ｂ…レーザドライバ、１２…制御用ＰＣ、１３…蛍光フィルタ、１４…蛍光フィルタ駆動モータドライバ、１５…蛍光フィルタ駆動モータ、１６…受光レンズ、１７…ＣＣＤラインセンサ、１８…ＣＣＤ制御部、１９…データ格納部、２１…サンプルステージ、２２…バイオチップ、２３…ステージ駆動モータドライバ、２４…ステージ駆動モータ、３１ａ，３１ｂ…シート状の励起光、３２…レーザ発振器、３３…ライン成形光学系、３４…シート状のレーザ光、４１〜４４…反射ミラー、４５，４６…ガルバノミラー、４７…ガルバノミラー駆動部
【図１】
2005257313.tif 000003
【図２】
2005257313.tif 000004
【図３】
2005257313.tif 000005
【図４】
2005257313.tif 000006
【図５】
2005257313.tif 000007
【図６】
2005257313.tif 000008
【図７】
2005257313.tif 000009
【図８】
2005257313.tif 000010
【図９】
2005257313.tif 000011