(57)【要約】【課題】共焦点顕微鏡を適用し、マイクロリアクタの流路などにおける流体の濃度、温度、ｐＨ等の物理量を高精度、高速に２次元または３次元測定できる装置を提供する。【解決手段】ニポウディスク型のピンホールアレイを有する共焦点スキャナを用いた共焦点顕微鏡にレーザ誘起蛍光法を適応して、測定対象中の測定試料の物理量の２次元または３次元分布を測定することができるように構成する。【選択図】                    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニポウディスク型のピンホールアレイを有する共焦点スキャナを用いた共焦点顕微鏡にレーザ誘起蛍光法を適応して、測定対象中の測定試料の物理量の２次元または３次元分布を測定することができるように構成したことを特徴とする物理量計測装置。
【請求項２】
前記共焦点顕微鏡は、制御手段により、測定試料を含む測定対象が搭載されたステージまたは対物レンズの光軸方向の位置を変えながら、測定試料の蛍光画像を撮像することにより測定対象中の測定試料の物理量の３次元分布を測定できるように構成されたことを特徴とする請求項１に記載の物理量計測装置。
【請求項３】
前記測定対象は、マイクロリアクタなどのマイクロ流路を用いる構造体であることを特徴とする請求項１または２に記載の物理量計測装置。
【請求項４】
測定する前記物理量が、温度またはpHまたは流量または濃度または圧力であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の物理量計測装置。
【請求項５】
測定する前記物理量が圧力であって、透明材料で形成された直径０．１〜１０μmの中空の球形状ビーズであり、内壁面に感圧蛍光塗料が塗布されると共に内部に酸素が封入され、圧力に対応した蛍光強度が得られるように形成した圧力センシング用蛍光ビーズを用いて圧力を測定できるように構成した請求項１ないし３のいずれかに記載の物理量計測装置。
【請求項６】
前記マイクロ流路内の界面状況を測定することを特徴とする請求項３に記載の物理量計測装置。
【請求項７】
前記マイクロ流路内の反応をリアルタイムでモニタリングすることを特徴とする請求項３に記載の物理量計測装置。
【請求項８】
前記測定対象は、自己蛍光を発する物質、あるいは蛍光染料を含む物質または原料流体であることを特徴とする請求項１ないし７のいずれかに記載の物理量計測装置。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれかに記載の物理量計測装置を用い、
測定対象全体と測定試料の物理量を既知の状況に設定し、各設定状況下での測定試料の撮像画像から輝度と物理量との関係を求めて、輝度・物理量校正曲線を作成し、
未知の状況において撮像した測定試料の撮像画像から得た物理量を、前記輝度・物理量校正曲線により校正することを特徴とする、物理量計測装置を用いて行う物理量校正方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流路内の被測定試料の流れや、濃度、温度、ｐＨ等の物理量を計測する方法に関し、特にニポウディスク型の共焦点スキャナを用いてマイクロ流路内の試料の物理量を２次元または３次元的に計測できる装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロ化学分析システムやマイクロリアクタなどの化学システムをはじめ、多くのマイクロマシンの研究・開発が盛んになっている。マイクロ空間で化学反応を起させる前記マイクロリアクタにおいては、濃度や温度、ｐＨ等に依存した強さの蛍光を発生する蛍光染料を用いて物理量を測定するレーザ誘起蛍光法（Laser Induced Fluorescence : LIF）が利用される。
【０００３】
一般的なレーザ誘起蛍光法による物理量測定用の装置に関連する先行技術文献としては次のようなものがある。
【０００４】
【特許文献１】特開平８−２７８２５１号公報
【０００５】
図６は特許文献１に記載のレーザ誘起蛍光法による物理量測定装置の一例を示す構成図である。この装置の構成について、特許文献１には次のように記載してある。図示のように、励起用パルスレーザ０１より色素レーザ０２を発振させて、測定分子の電子エネルギー差に対応した波長の光を出力させると、そのレーザ光はシリンドリカルレンズ０３にてシート状にされた後、図中破線で囲まれた測定場０８に照射される。
【０００６】
測定場０８において励起された測定分子により生じる蛍光は、フィルタ０４を通過した後、レンズ０５で集光され、ＣＣＤカメラ０６で計測される。ＣＣＤカメラ０６は、同期ライン０７を介して、色素レーザ０２の発振と同期して、測定分子の蛍光強度を計測する。ここで、測定分子の濃度と蛍光強度は比例するため、ＣＣＤカメラ０６により測定分子の蛍光強度を計測すると、測定分子の密度が決定される。
なお、同様の構成により、流速を測定することもできることが記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
通常、マイクロリアクタの流路幅は数十から数百μm、深さは数十から数百mである。このようなマイクロリアクタの流路内（上記装置の測定場に相当する）の物理量を測る場合、上記従来のレーザ誘起蛍光法による測定装置では、流路の深さ方向の分解能が得られず、平均値を求めることとなる。
流路の断面形状が四角で、位置により深さが変化しない場合には、蛍光材料の量が一定になるため平均値測定でも問題はないが、断面形状が円形などであり、深さが場所によって変る流路の場合には、蛍光材料の量が場所により変るため、正確な測定ができないという課題があった。
【０００８】
本発明の目的は、このような課題を解決するもので、共焦点顕微鏡を適用し、マイクロリアクタの流路などにおける流体の濃度、温度、ｐＨ等の物理量を高精度、高速に２次元または３次元測定できる装置を提供することにある。
本発明の他の目的は、上記のような装置により測定対象の蛍光画像の輝度から測定対象の物理量を測定する際、輝度と物理量との校正曲線を予め測定しておき、この校正曲線に基づいて測定した物理量を校正することにより高精度の物理量を求めることができるようにした校正方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このような課題を達成するために、本発明のうち請求項１に記載の発明は、
ニポウディスク型のピンホールアレイを有する共焦点スキャナを用いた共焦点顕微鏡にレーザ誘起蛍光法を適応して、測定対象中の測定試料の物理量の２次元または３次元分布を測定することができるように構成したことを特徴とする。
【００１０】
ニポウディスク型のピンホールアレイを有する共焦点スキャナを用いることにより、高分解能で、高速に測定試料の２次元分布を測定でき、また容易にマイクロ空間での３次元計測もできる。
【００１１】
この場合、共焦点顕微鏡は、請求項２のように、制御手段により、測定試料を含む測定対象が搭載されたステージまたは対物レンズの光軸方向の位置を変えながら、測定試料の蛍光画像を撮像することにより測定対象中の測定試料の物理量の３次元分布を測定できるように構成する。
また、測定対象は、請求項３のように、マイクロリアクタなどのマイクロ流路を用いる構造体である。
【００１２】
本発明の装置で測定する物理量としては、請求項４のように、温度またはpHまたは流量または濃度または圧力である。圧力を測定する場合は、例えば、請求項５のように、透明材料で形成された直径０．１〜１０μmの中空の球形状ビーズであり、内壁面に感圧蛍光塗料が塗布されると共に内部に酸素が封入され、圧力に対応した蛍光強度が得られるように形成した圧力センシング用蛍光ビーズを用いる。
【００１３】
また、測定は、請求項６のように、マイクロ流路内の界面状況を測定することもできる。
また、請求項７のように、マイクロ流路内の反応をリアルタイムでモニタリングすることも可能である。
また、測定対象は、請求項８のように、自己蛍光を発する物質、あるいは蛍光染料を含む物質または原料流体である。
【００１４】
請求項９に記載の発明は、
請求項１ないし８のいずれかに記載の物理量計測装置を用い、
測定対象全体と測定試料の物理量を既知の状況に設定し、各設定状況下での測定試料の撮像画像から輝度と物理量との関係を求めて、輝度・物理量校正曲線を作成し、
未知の状況において撮像した測定試料の撮像画像から得た物理量を、前記輝度・物理量校正曲線により校正することを特徴とする物理量校正方法である。
【００１５】
この校正方法によれば、測定試料の輝度・物理量の関係のいかんにかかわらず、物理量を容易に高精度に測定することができる。
【発明の効果】
【００１６】
以上説明したことから明らかなように、本発明によれば次のような効果がある。
レーザ誘起蛍光法を共焦点顕微鏡へ適応することにより、深さ方向の位置を制限した物理量の計測が可能となる。１回測定で共焦点平面の物理量の分布が測定可能で、ピンホールアレイを用いた共焦点用スキャナを用いることにより迅速な測定が可能となる。
また、ステージ１４の位置をコンピュータ１７で制御しながら撮像することにより、３次元分布も容易に測定できる。
また、本発明は、流路Ｃ１２０の温度分布の測定に有効である。試料Ａ１０１および試料Ｂ１１１から蛍光染料を含んだ溶液を流すことにより、チップ１００の温度調整手段１２３の３次元温度分布を測定できる。これにより、温度調整方法の評価も可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下図面を用いて本発明を詳しく説明する。図１は、共焦点用スキャナを使用してレーザ誘起蛍光法により物理量の測定を行う本発明に係る物理量計測装置の一実施例を示す構成図である。
【００１８】
図１において、１０は光源、１１は光源からの光を平行光にするコリメータレンズ、３０はニポウディスク型の共焦点用スキャナ、１２は対物レンズ、１３は測定試料、１４は測定試料を搭載するステージ、１５は測定試料１３から発せられた蛍光を集束するためのレンズ、１６はレンズ１５からの蛍光を受けて測定試料の蛍光像を撮像するカメラ、１７はカメラ１６で撮像した画像を基に物理量を求める演算やステージ１４移動の制御を行う手段（通常コンピュータが使用される）である。
【００１９】
ニポウディスク型の共焦点用スキャナ３０は、透過波長を制限するフィルタ３１と、同期して回転するマイクロレンズアレイ３２とピンホールアレイ３３と、ダイクロイックミラー３４より構成されている。
ステージ駆動手段４０は、コンピュータ１７の指令に基づいてステージ１４を光軸方向に移動する。なお、ここでは、ステージ駆動手段４０とコンピュータ１７が行う指令機能部分を併せて、制御手段と呼ぶ。
【００２０】
このような構成における動作を説明する。光源１０より測定試料６に照射する励起光２１が発生する。共焦点スキャナではレーザが主に使われ、波長は測定対象に応じて選ぶ。光源１０から出射された励起光２１はコリメータレンズ１１で平行光となり、フィルタ３１で波長が制限される。この平行光はマイクロレンズアレイ３２に入射し、各マイクロレンズにより個別にそのビームが絞られ、マイクロレンズアレイ３２とピンホールアレイ３３に挟まれたダイクロックミラー３４を通って、ピンホールアレイ３３の各ピンホールに集束する。
なお、光源１０がレーザなどの単色光であればフィルタ３１を省略することができる。
【００２１】
マイクロレンズアレイ３２とピンホールアレイ３３により測定対象の収束光点のみを走査することで深さ方向の分解能を高めることができる。ピンホールアレイ３３から出射された励起光２１は、対物レンズ１２に入る。対物レンズ１２で絞られた励起光２１は測定試料１３に入射する。
【００２２】
測定試料１３には励起光２１の照射により励起光とは波長の異なる蛍光２３を発生する蛍光染料が含まれており、濃度、温度、pH等に依存した強さの蛍光を発する蛍光染料が使われる。ステージ駆動手段４０によりステージ１４を上下方向に動かすことにより、測定試料１３に対して焦点位置を上下方向（深さ方向または光軸方向）に調整できる。
【００２３】
励起光２１の反射光と蛍光２３を含む光２２が対物レンズ１２およびピンホールアレイ３３を通り、ダイクロックミラー３４で反射してフィルタ３５に入射する。フィルタ３５では波長制限により蛍光２３のみが透過され、レンズ１５を通り、カメラ１６で撮像される。カメラ１６で撮像した画像はコンピュータ１７に取り込まれ、画像の明るさ（輝度）と物理量の関係をあらかじめ測定した校正曲線と比較して、物理量が校正される。
【００２４】
図２は測定対象となるマイクロリアクタの一例であり、Ｙ字型マイクロ流路を用いた例である。蛍光染料を含んだ試料Ａ１０１と試料Ｂ１１１は、ポンプＡ１０２とポンプＢ１１２により、コネクタＡ１０３とコネクタＢ１１３を通して測定対象となるチップ１００に導入される。
【００２５】
流路Ａ１０４と流路Ｂ１１４は合流して流路Ｃ１２０となり、この流路Ｃ１２０で合成が行なわれる。流路Ｃ１２０はコネクタＣ１２１を通してチップ１００から出て、合成出力１２２に蓄えられる。チップ１００の上面は励起光と蛍光を透過する物質で作られており、対物レンズの仕様に適合した厚さとなっている。
【００２６】
流路Ｃ１２０は温度調整手段１２３により温度が制御される。温度調整手段１２３には、ペルチェ素子や白金製ヒータのような電気で温度を制御する方式や、温度の違う溶媒で熱交換する方式などが用いられている。図２では、流路Ｃ１２０のみ温度調整する例を示してあるが、チップ１００全体の温度制御を行なう場合もある。
【００２７】
レーザ誘起蛍光法の温度計測に使われる蛍光染料に、ローダミンＢがある。ローダミンＢの励起波長のピークは554nm、蛍光波長のピークは575nmである。したがって、ローダミンＢを用いる場合は、これに適合したレーザとフィルタ３１，３５を用いる。
【００２８】
図３は校正曲線を求めるフローチャートである。図１に示すカメラ１６から得られるのは輝度であり、これは蛍光の強さに値する。蛍光の強さは、励起光の強さや、カメラのシャッタースピード、蛍光染料の濃度、レンズの開口比等に影響される。既知の状況で輝度を測り、校正曲線を作ることで、物理量と輝度を一致させることができる。
【００２９】
輝度・温度校正曲線は、流路Ｃ１２０内の試料が測定できるようにステージ１４上にチップ１００をセットしておき、図３のフローチャートに示すように、次の手順に従って作成する。
（１）まず、測定対象全体と試料Ａ，Ｂの温度を所定の値に設定する。
（２）一定濃度の蛍光染料を含む試料Ａ，Ｂを流路に流し、流路Ｃ１２０で合成する。
（３）設定した温度において流路Ｃ１２０中の試料の蛍光画像をカメラ１６で撮影する。撮影した画像の輝度データは当該温度データと関連づけてコンピュータ１７に記憶される。
（４）予め定めた温度範囲内の各温度での画像撮影が終了していない場合は、温度を変更して再び上記（２）から繰り返す。
（５）温度範囲内のすべての温度において画像撮影が終了していれば、コンピュータ１７において、記憶した輝度データと温度データから該蛍光染料の輝度・温度校正曲線を作成する。作成された輝度・温度校正曲線のデータはコンピュータ１７に保存される。
【００３０】
試料の温度は、図４のフローチャートに示すように、次の手順により校正する。
（１）ステージ１４に搭載したチップ１００に、一定濃度の蛍光染料を含んだ試料Ａ，Ｂを流す。
（２）流路Ｃ１２０中の試料の画像をカメラ１６で撮像する。その輝度データはコンピュータ１７に保存される。
（３）コンピュータ１７では、先に保存してある輝度・温度校正曲線のデータを参照して該試料の輝度データから温度を求める。
【００３１】
このようにして、蛍光画像から流路Ｃ１２０中の試料１３の温度を求めることができる。この場合、ステージ１４を上下方向に動かすことにより、試料１３の温度分布の３次元測定ができる。
【００３２】
なお、本発明では、温度分布の測定ばかりでなく、以下のように各種の物理量を測定することができる。
（１）pH分布の３次元測定
ローダミンＢなどpHに依存して蛍光強度が変わる蛍光染料を用いることにより、微小空間内のpH分布を３次元測定することができる。
（２）流量分布の３次元測定
蛍光染料の濃度が一定の場合、蛍光強度は一定空間内の蛍光染料の割合に露光時間を掛けた値に比例する。よって、流量分布の３次元測定が可能である。
【００３３】
（３）濃度分布の３次元測定
蛍光強度は一定空間内の蛍光染料の割合に比例する。よって、濃度分布の３次元測定が可能である。
（４）圧力分布の３次元測定
圧力に依存して蛍光強度が変わる蛍光染料を用いることにより、微小空間内の圧力分布の３次元測定が可能である。
【００３４】
図５に圧力に依存して蛍光強度の変る蛍光染料を用いた圧力センシング用蛍光ビーズ（以下単にビーズという）の一実施例構成図を示す。図において、２００は透明材料で形成された直径０．１〜１０μmの中空の球形状ビーズである。ビーズ２００は、内壁面に感圧蛍光塗料２０１が塗布され、内部には酸素が封入されている。この感圧蛍光塗料の蛍光強度は酸素の濃度に比例し、そして酸素の濃度は圧力に対応する。したがって、蛍光強度からこのビーズに加わった圧力を知ることができる。
【００３５】
（５）マイクロ流路内の界面状況の測定
図２で試料Ａ１０１と試料Ｂ１１１が異なる場合、流路Ｃ１２０では界面が生ずる。試料Ａ１０１あるいは試料Ｂ１１１のどちらか一方に蛍光染料を混合して測定することにより、界面の形状などの界面状況を３次元で測定できる。界面では拡散で反応が起きるため、蛍光強度から反応の進展状況を３次元で測定することができる。
なお、試料Ａ１０１と試料Ｂ１１１に、反応後に蛍光を発生する物質を用いることにより、反応の進展状況を３次元で測定できる。
【００３６】
なお、本発明は上記実施例に限定されることなくその本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。
例えば、３次元測定の際、上記実施例ではステージを光軸方向に移動させたが、本発明はこれに限定されない。３次元測定では、測定試料に対する励起光の焦点位置が高速に光軸方向に移動できればよく、例えば、対物レンズを光軸方向に移動させる方式、あるいは、焦点距離が可変な対物レンズを用いて焦点位置を光軸方向に変化させる方式としても構わない。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明に係る物理量計測装置の一実施例を示す構成図である。
【図２】測定対象となるマイクロリアクタの一例を示す構成図である。
【図３】校正曲線を求める動作のフローチャートである。
【図４】物理量を校正する動作のフローチャートである。
【図５】圧力センシング用蛍光ビーズの一実施例構成図である。
【図６】従来の物理量測定装置の一例を示す構成図である。
【符号の説明】
【００３８】
１０  光源
１１  コリメータレンズ
１２  対物レンズ
１３  測定試料
１４  ステージ
１５  レンズ
１６  カメラ
１７  コンピュータ
２１  励起光
２２  光
３０  共焦点用光スキャナ
３１  フィルタ
３２  マイクロレンズアレイ
３３  ピンホールアレイ
３４  ダイクロイックミラー
３５  フィルタ
４０  ステージ駆動手段
１００  チップ
１０１  試料Ａ
１０２  ポンプＡ
１０３  コネクタ
１０４  流路Ａ
１１１  試料Ｂ
１１２  ポンプＢ
１１３  コネクタＢ
１１４  流路Ｂ
１２０  流路Ｃ
１２１  コネクタＣ
１２２  合成出力
１２３  温度調整手段
２００  ビーズ
２０１  感圧蛍光塗料
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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