(57)【要約】【課題】  採取された糞便をバッファ液と混合し、保存、運搬して、細胞学的検査を一連の工程とするための、糞便容器等を提供する。【解決手段】  採取された自然排出便およびバッファ液を収納する液バッグ部と、前記液バッグ部の開口部周囲に設けられたシール部とから成る糞便容器であって、前記液バッグ部が自然排出便およびバッファ液を外側から手もみ又は機械もみにより混合するストマッカー部と、前記液バッグの底部に切断又は穿孔可能な糞便取り出し用切断部を有する糞便容器。【選択図】  図１
2005241543.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
採取された自然排出便及びバッファ液を収納する液バッグ部と、前記液バッグ部の開口部周囲に設けられたシール部とから成る糞便容器であって、前記液バッグ部が自然排出便およびバッファ液を外側から手もみ又は機械もみにより混合するストマッカー部と、前記液バッグの底部に切断又は穿孔可能な糞便取り出し用切断部を有することを特徴とする糞便容器。
【請求項２】
前記液バッグ部が不透明であることを特徴とする請求項１に記載の糞便容器。
【請求項３】
前記バッファ液は、血清が含まれていることを特徴とする請求項１に記載の糞便容器。
【請求項４】
前記液バッグ部に、氏名、検体番号、回収日時のいずれか１つ以上が記入されるラベルが貼付されていることを特徴とする請求項１に記載の糞便容器。
【請求項５】
前記液バッグ部に、糞便量及びバッファ液量の目安となるメモリ線を有することを特徴とする請求項１に記載の糞便容器。
【請求項６】
請求項１乃至５に記載の糞便容器の前記シール部に、シール用ふたが合わされた糞便容器。
【請求項７】
請求項６に記載の糞便容器が、前記シール用ふたと組み合わされて一体化される運搬用外筒によって格納されていることを特徴とする糞便容器。
【請求項８】
請求項７に記載の糞便容器を載置する細胞回収装置であって、前記液バッグの底部に設けられた糞便取り出し用切断部を突出させるための穴付き載置板を有することを特徴とする細胞回収装置。
【請求項９】
請求項８に記載の細胞回収装置であって、糞便取り出し用切断部を切断するための回転刃又は鋏状の切断手段を有することを特徴とする細胞回収装置。
【請求項１０】
請求項８に記載の細胞回収装置であって、糞便取り出し用切断部を切断するための錐状の穿孔手段又はレーザ照射手段を有することを特徴とする細胞回収装置。
【請求項１１】
請求項１乃至５に記載の糞便容器と、バッファ液収納容器との組み合わせからなる糞便保存キット。
【請求項１２】
請求項１１に記載の糞便保存キットであって、前記バッファ液収納容器には、血清が含まれていることを特徴とする糞便保存キット。
【請求項１３】
採取された自然排出便を糞便容器の液バッグ部に導入する工程と、バッファ液を糞便容器の液バッグ部に導入する工程と、前記糞便容器をシール用ふたでシールする工程と、前記液バッグ部をストマッカー部として外側から手もみ又は機械もみして前記自然排出便及びバッファ液を混合する工程と、前記シールした糞便容器を前記シール用ふたと組み合わされて一体化された運搬用外筒に格納・運搬する工程と、前記運搬用外筒を前記液バッグの底部に設けられた糞便取り出し用切断部を突出させるための穴付き載置板を有する細胞回収装置に載置する工程と、前記糞便取り出し用切断部を切断又は穿孔して前記自然排出便及びバッファ液混合物を回収する工程を含むことを特徴とする細胞回収方法。
【請求項１４】
採取された自然排出便を糞便容器の液バッグ部に導入する工程と、バッファ液を糞便容器の液バッグ部に導入する工程と、前記糞便容器をシール用ふたでシールする工程と、前記シールした糞便容器を前記シール用ふたと組み合わされて一体化された運搬用外筒に格納・運搬する工程と、前記液バッグ部をストマッカー部として外側から手もみ又は機械もみして前記自然排出便及びバッファ液を混合する工程と、前記運搬用外筒を前記液バッグの底部に設けられた糞便取り出し用切断部を突出させるための穴付き載置板を有する細胞回収装置に載置する工程と、前記糞便取り出し用切断部を切断又は穿孔して前記自然排出便及びバッファ液混合物を回収する工程を含むことを特徴とする細胞回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自然排出便を全便回収して、がん細胞検査等を行うための糞便容器、細胞回収装置、糞便保存キット、及びこれらを用いた細胞回収方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
欧米では、大腸がんが癌死亡率の上位を占めている。日本でも大腸がんの患者数は近年急激に増加している。これは日本人の食生活が欧米型の肉食が中心となったことに原因があると考えられている。国内では毎年約６万人程度が大腸がんに羅患しており、臓器別の死亡数でも、胃がん、肺がんに続く３番目の多さであり、今後のさらなる増加も予想されている。しかしながら、大腸がんは他のがんと異なり、早期がんであれば手術により、１００％近く治せることが知られている。従って、大腸がんは早期がん検診の対象となり、数多くの検査法が考案されてきた。
【０００３】
大腸がんの早期発見のための検査法として注腸検査や内視鏡検査などが行なわれている。注腸検査とはバリウムを大腸内に注入し、大腸の粘膜面に付着させ、その表面の凹凸をＸ線により調べる方法である。内視鏡検査は大腸の中を直接内視鏡で調べる方法である。これらの検査法は大腸がんの発見に対して、高い感度と特異性を有している。加えて、内視鏡検査では早期がんや前がん状態のポリープを切除できる利点も有している。しかし、これらの検査法は被験者への負担が大きく、コストも高い、特に内視鏡検査では操作に熟練を要し、合併症のリスクを伴っている。そのため、無症状の一般人を対象にした大腸がん検査には向いていない。
【０００４】
そこで、一般人の大腸がん一次スクリーニング法として、便潜血検査が広く利用されている。便潜血検査とは糞便に含まれるヘモグロビンの存在を調べることにより、腸内の出血の有無を診断し、間接的に大腸がんの発生を予測する方法である。
【０００５】
便潜血検査法には大きく分けて化学的検査法と免疫検査法の２種類が存在する。化学的便潜血検査法とは、ヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性を利用した方法であり、基質として加えられた過酸化水素が分解される際に生じた活性酸素により、濾紙に含まれたグアヤックが、青緑色の酸化グアヤックに変わる反応を利用している。ヘモカルトＩＩ濾紙（藤沢薬品）や、シオノギＢ濾紙（塩野義製薬）などが市販品として検査に使用されている。
【０００６】
免疫的便潜血検査とは主に、抗ヒトヘモグロビン抗体の特異的なヒトヘモグロビンへの結合を利用しており、その特異性の高さから、現在では便潜血検査法の主流になりつつある。逆受身無血球凝集法（イムディアＨｅｍ−Ｓｐ、富士レオビ）、磁性粒子凝集傾斜法（マグストリーム Ｈｅｍ−Ｓｐ、 富士レオビ）、ラテックス凝集法（イムノカルト、中外製薬）などが知られている。
【０００７】
このように広く大腸がん検査に利用されている便潜血検査だが、検査の有用性に対しては疑問の声も上がっている。ヘモカルトＩＩを使用した化学的便潜血反応で陽性判定になるには大腸内で１日当たり２０ｍｇの出血が必要だが、実際の大腸がん患者の出血は１０ｍｇ以下であると考えられている。そのため、便潜血反応の感度は２６％程度であり、実際の大腸がん患者のおよそ１／４しか発見できず、３／４を見逃しているとの報告もある（下記非特許文献１）。更に、陽性判定被験者の中で実際に大腸がんであったのは８．３％に過ぎず、多くの擬陽性を含んでいる。
【０００８】
そこで、より精度の高い新しい一次スクリーニング用検査法の開発が切望されている。その候補として、糞便中に剥離したがん細胞を利用した検査法に注目が集まっている。大腸がんに伴い、間接的におこる腸内の出血を調べる便潜血検査法に比べて、本方法は直接がん細胞を調べるため、より信頼性の高い検査法になりうると考えられる。
【０００９】
糞便中のがん細胞を調べる検査法では、糞便から直接抽出した核酸を利用して遺伝子診断を行なう方法が下記特許文献１等に報告されている。具体的な遺伝子変異検出法としては、シークエンス法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ(polymerase chain reaction-restriction enzyme fragment length polymorphism) 法、ＳＳＣＰ(single-stranded conformational polymorphism) 法、ＰＴＴ(protein truncation test) 法などが開発されている。遺伝子変異の検出以外にもマイクロサテライトの不安定性 (MSI, microsatellite instability) やｌｏｎｇＤＮＡ (Ｌ−ＤＮＡ) の出現などを指標に診断を行なう方法が知られている。
【００１０】
遺伝子変異の診断の対象となる遺伝子として、Ｋ−ｒａｓ，ＡＰＣ，Ｐ５３，ＤＣＣ等が広く知られている。遺伝子の発現量の違いに目を付けた、新たな診断の対象となりうる遺伝子の探索はマイクロアレイ等を利用して現在でも活発に行なわれている。ＣＤ４４遺伝子のスプライシングバリアントの発現パターンをマーカーとする方法なども提言されている。
【００１１】
これらの検査法で問題になるのは、糞便中には様々な細菌や正常細胞由来の核酸が存在しており、糞便から回収されるがん細胞由来の遺伝子の割合が非常に微量（約０．０５％）であるという事である。これはがん細胞由来遺伝子の変異や微妙な発現パターンの変化を調べる際に大きな妨げとなり、これらの方法の実用化を困難にしている。
そこで、より確実な大腸がん診断に向けて、全部の糞便から直接がん細胞を回収し、診断する方法が考えられている。
【００１２】
【特許文献１】特表２００２−５１５９７３号公報（ＷＯ９７／２８４５０）
【非特許文献１】Jama, Vol.269,1262-7, 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
一般人を対象にした大規模な大腸がん検査では、自動化システムによる多検体の大量処理が必要である。糞便から回収した細胞を用いた大腸がんの判定では細胞学的分析を行い、大腸がんを同定する方法が非常に有効である。
【００１４】
しかしながら、従来の糞便回収法は、糞便採取から細胞学的検査に至るまでの各工程が分離されており、採取された糞便をバッファ液と混合し、保存、運搬して、細胞学的検査を一連の工程とするための、糞便容器等の開発が望まれていた。より、具体的には、本発明は、糞便中から上皮細胞特異抗体が固定化された磁気ビーズを用いて大腸がん由来の細胞を回収するプロトコルにおいて、被検査者の糞便をプライマリーに処理して、細胞回収装置に導入するまでのツールと方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記の課題を解決するために、構造も操作も簡便な糞便容器等を開発した。
即ち、第１に、本発明の糞便容器は、液バッグ部が自然排出便およびバッファ液を外側から手もみ又は機械もみにより混合するストマッカー部を有する。手もみ又は機械もみが可能なように、液バッグ部は柔軟性のある樹脂材料によって作製されている。同様に、液バッグの底部の糞便取り出し用切断部は容易に切断又は穿孔可能なように樹脂材料によって作製されている。
【００１６】
液バッグ部は、被検者及び検査員が取り扱う際に、内部が見えないように不透明とするのが好ましい。
前記バッファ液は、血清が含まれていることが好ましい。
【００１７】
前記液バッグ部にはラベルが貼付されることができる。ラベルには、氏名、検体番号、回収日時、その他の情報を記入することができる。また、前記液バッグ部にはメモリ線を付与しておくことが好ましい。メモリ線により、糞便回収容器を吊り下げることで収納された糞便の該量を容易に知ることができる。更に、前記液バッグ部に、カッターで切断可能な糞便取り出し口を有することができる。
【００１８】
前記糞便容器はシール用ふたによって密封され、保存・運搬を容易にする。更に、保存・運搬時には、糞便容器が、前記シール用ふたと組み合わされて一体化される運搬用外筒によって格納されていることが好ましい。
【００１９】
糞便容器を載置する細胞回収装置は、液バッグの底部に設けられた糞便取り出し用切断部を突出させるための穴付き載置板を有することが好ましく、穴付き載置板より突出した糞便取り出し用切断部を回転刃又は鋏状で切断したり、錐状物又はレーザ照射により穿孔して、がん細胞を含む糞便液状物を回収する。
【００２０】
第２に、本発明は、糞便保存キットであり、前記糞便容器と、バッファ液収納容器との組み合わせからなる。バッファ液収納容器には、血清が含まれていることが好ましい。
【００２１】
第３に、本発明は、前記糞便容器を用いた細胞回収方法であり、前記液バッグ部をストマッカー部として外側から手もみ又は機械もみして前記自然排出便及びバッファ液を混合する工程と、シールした糞便容器をシール用ふたと組み合わされて一体化された運搬用外筒に格納・運搬する工程と、前記運搬用外筒を前記液バッグの底部に設けられた糞便取り出し用切断部を突出させるための穴付き載置板を有する細胞回収装置に載置する工程と、前記糞便取り出し用切断部を切断又は穿孔して前記自然排出便及びバッファ液混合物を回収する工程を含むことにある。ここで、前記液バッグ部をストマッカー部として外側から手もみ又は機械もみして前記自然排出便及びバッファ液を混合する工程と、シールした糞便容器をシール用ふたと組み合わされて一体化された運搬用外筒に格納・運搬する工程は順序を入れ替えても良い。
【発明の効果】
【００２２】
糞便採取から細胞学的検査に至るまでの各工程が分離されていた従来の糞便回収法に比べて、本発明の糞便容器等は、採取された糞便をバッファ液と混合し、保存、運搬して、細胞学的検査を一連の工程とするために適している。本発明の糞便回収容器は、大腸がん検査に有効に用いることができる。本発明の糞便容器で回収された糞便より、室温で糞便から良好な生きたがん細胞を効率的に回収することが出来るようになり、回収細胞の細胞学的、免疫学的、生化学的分析を高い精度で行なうことが可能になった。又、本発明の糞便容器等を用いることにより、早期大腸がん由来の細胞や、全部の便を検体とすることにより、内視鏡検査で発見が困難な上行結腸由来のがん細胞を回収することができるため、非常に信頼性の高い検査法を提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
図１に、本発明の糞便容器の一例を示す。図１（ａ）は糞便容器の断面図であり、図２（ｂ）はシール用ふたでシールした後、ストマッカー部を手もみした状態を示す断面図である。
【００２４】
本発明の糞便容器は、シール部、ストマッカー部及び切断部から基本的になる。液バッグ部は、採取された自然排出便を収納する袋である。糞便は、例えば専用ベラとロートを使用して、液バッグの側部に設けられたメモリ線を参考にして導入される。同様に、バッファ液も、予め計量された量又は液バッグの側部に設けられたメモリ線を参考にして液バッグ部に導入される（図１（ａ））。次に、液バッグ部をストマッカー部として外側から手もみ又は機械もみして前記自然排出便及びバッファ液を混合し、液状化検体とする。この際、糞便容器をシール用ふたでシールする（図１（ｂ））。
【００２５】
シールした糞便容器をシール用ふたと組み合わされて一体化された運搬用外筒に格納し、検査部署又は検査機関へ運搬する（図２（ａ））。この際、採取された糞便のみを運搬して、バッファ液の導入後の作業を検査部署又は検査機関で行ってもよい。検査時に、運搬用外筒を液バッグの底部に設けられた糞便取り出し用切断部を突出させるための穴付き載置板を有する細胞回収装置に載置する。次に、糞便取り出し用切断部を回転刃や鋏を用いて切断するか、錐状物やレーザを用いて穿孔し、自然排出便及びバッファ液混合物（液状化検体）を回収する（図２（ｂ））。
【００２６】
液バッグ部は、検査員が取り扱う際に、内部が見えないように不透明とすることもできるが、半透明とし、液バッグの側部に設けられたメモリ線で回収された糞便の概量やバッファ液量を見ることもできる。
【００２７】
検査ミスを避けるために、液バッグ部にはラベルが貼付されており、ラベルには、氏名、検体番号、回収日時、その他の情報が記入されている。
【００２８】
本発明の糞便回収容器によって回収された糞便は、以後の免疫学的、細胞学的、又は生化学的検査に付される。以下、糞便からの細胞回収法の標準化プロトコールの一例を手順に沿って説明する。
【００２９】
（ステップ１：検体回収）
本発明に用いる糞便はヒト自然排泄便を使用する。糞便は固体状の形を保ったものを使用し、下痢便は使用しない。また被験者が下剤等の強制排出薬や腸検査用のバリウム等を使用した後に排泄した糞便は使用しない。事前に被験者が特別な食事制限をする必要性はない。
【００３０】
被験者から回収した糞便は３時間以内に使用することが望ましいが、およそ１０時間まで使用出来る。この間検体糞便は室温で保存することが可能であり、検体糞便を冷蔵もしくは冷凍する必要はない。
【００３１】
使用する糞便の量は５ｇから８０ｇ程度が望ましいが、およそ０．５ｇから２００ｇまで使用出来る。
【００３２】
バッファ液（メディウム）にはＨａｎｋｓ液を使用する。しかし、一般的に細胞を扱う実験で使用するバッファ液であれば使用出来る。具体的な例として、ＰＢＳ、ＰＢＳ（−）、各種細胞培養用メディウム（ＭＥＭ，ＤＭＥＭ，ＲＰＭＩ）などを挙げることができる。
【００３３】
加えるバッファ液の量は糞便の量や状態により変える事が可能である。しかしながら、糞便１ｇ当たり１ｍｌ以上が望ましい。本発明の糞便容器１袋当たり、２００ｍｌのバッファ液を加えれば上記のすべての便量に対応できる。
【００３４】
バッファ液には血清を加える。血清濃度は１０％が望ましいが０．５〜２０％ 程度でも可能である。血清の種類はＦＢＳ(fetal bovine serum)が望ましいがＣＳ(calf serum)でも使用できる。
【００３５】
本発明の糞便容器等を用いた検体回収のステップは、室温で行った。但し、検体の回収からろ過までに時間を要する場合には、クーラーボックス等で冷却保管しておいても良い。
【００３６】
（ステップ２：ろ過）
懸濁液はドラフト内で、フィルタ付きろ過装置を使用してろ過し、残渣物を取り除く。
【００３７】
（ステップ３：磁気ビーズ反応）
ろ液中に含まれるがん細胞を、がん細胞にアフィニティーをもった担体を用いて回収する。担体にはがん細胞に対するアフィニティーを持った抗体が表面に結合した磁気ビーズを使用する。具体的にはダイナル社から市販されているＢｅｒ−ＥＰ４抗体結合磁気ビーズ（Dynabeads Epithelial Enrich、ダイナル社）を使用する。Ｂｅｒ−ＥＰ４以外にも大腸がん細胞に対するアフィニィティーを持った抗体ならば適応可能である。抗体以外にも大腸がん細胞にアフィニィティーのあるアプタマー、リガンドなどが使用できる。
【００３８】
分注したろ液が約２０〜４５ ｍｌ 入ったチューブ一本当たり、４０μｌの磁気ビーズを加える。磁気ビーズの量は２０〜４００μｌ程度の範囲で変えることが可能である。
【００３９】
磁気ビーズを加えたろ液はミックスローターを用いて混和し、ろ液中の細胞を磁気ビーズに結合させる。混和は室温もしくは４℃のコールドルーム内で行なうことが望ましい。混和時間は３０分間以上が望ましい。この磁気ビーズ反応のステップは、室温で行った。
【００４０】
（ステップ４：磁気分離）
混和したろ液入りチューブは磁気スタンドに設置した後、１５分間振とうし、磁気ビーズをチューブ側面に集める。振とう時間は１０分間以上が望ましい。振とう方法はシーソー運動、回転、旋回など、ろ液が緩やかに混和する条件であれば問題ない。
【００４１】
磁気ビーズが壁面に付着した後、ろ液は取り除く。ろ液除去後、磁気スタンドからチューブを外し、上記バッファ液で洗浄し、ビーズ洗浄液を回収する。バッファ液の量はチューブ当たり５００μｌ使用するが、次の実験を想定して、任意に量を変動させることが出来る。この磁気分離のステップは、室温で行った。
【００４２】
（ステップ５：磁気分離，エッペンチューブ）
洗浄液は先に使用したチューブよりも小型のエッペンチューブ等に回収する。洗浄液の入ったチューブは直ちに専用磁気スタンドに設置し、エッペンチューブの側壁に磁気ビーズを集めた後、上清を除去し、細胞-ビーズ複合体のペレットを得る。この磁気分離、エッペンチューブのステップは、室温で行った。
【００４３】
＜大腸がん診断＞
本標準化プロトコールで回収したペレットは、続いて大腸がん判定用の検体として使用する。がんの判定には細胞そのものを利用する場合と細胞から抽出した物質を利用する場合がある。細胞そのものを利用する場合は回収後、直ちに使用する。抽出物質を利用する場合は−８０℃にペレットを凍結保存することが可能である。
【００４４】
細胞そのものを利用する場合はパパニコロウ染色により、細胞を染色し、顕微鏡で観察し判定する。細胞質に対する核の比率（Ｎ／Ｃ比）が高く、クロマチンが凝集した異型性の細胞が確認できた場合、がん細胞であると判定を下す。染色法はその他にもがん細胞を同定できるものであれば適応可能である。一般染色以外にもがん細胞特異的抗体を利用した免疫染色が適応可能である。
【００４５】
細胞からはＤＮＡもしくはＲＮＡを抽出して、がん判定に利用することが可能である。ＤＮＡ、ＲＮＡの抽出には各社から発売されている核酸抽出キットが使用出来る。具体的にはＤＮＡの抽出にはダイナル社のＤｙｎａｂｅａｄｓＤＮＡ ＤＩＲＥＩＣ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ，キアゲン社のＱＩＡａｍｐＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、三光純薬社のセパジーンなどが挙げられる。ＲＮＡの抽出にはニッポンジーン社のＩＳＯＧＥＮ,インビトロジェン社のＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔなどが挙げられる。抽出した核酸は従来技術の項で示したような様々な方法に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の糞便容器の一例を示す。
【図２】本発明の糞便容器を外筒に格納した図、及び本発明の糞便容器を細胞回収装置に載置した図である。
【図１】
2005241543.tif 000003
【図２】
2005241543.tif 000004