(57)【要約】【課題】 ＰＣＲ阻害物質の作用を抑制して、試料中のＤＮＡを効率よく増幅させる新規な方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明では、試料中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法において、遺伝子増幅反応液にポリアニオン及び／又はその不溶性高分子を存在させることにより、ＰＣＲ阻害物質の作用を抑制する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の目的とする核酸を増幅する核酸合成法において、核酸増幅反応液に陰イオンを含有した繰り返し構造を持つ高分子化合物 (polyanion) およびその塩（以下総称してポリアニオンと称する）及び／又はその不溶性高分子を添加することを特徴とする核酸合成法。
【請求項２】
ポリアニオンが、硫酸基を含有した繰り返し構造を持つ高分子化合物 (polysulfate) およびその塩（以下総称して硫酸化ポリマーと称する）である請求項1記載の核酸合成法。
【請求項３】
硫酸化ポリマーがポリビニル硫酸およびその塩である請求項２記載の核酸合成法。
【請求項４】
試料中の目的とする核酸を増幅する核酸合成法において、核酸増幅反応液の接する反応容器内壁にポリアニオンをコーティング、もしくは容器そのものが不溶性ポリアニオンで構成されていることを特徴とする核酸合成法。
【請求項５】
試料が生体由来試料もしくは生体由来試料中の遺伝子包含体であり、かつ試料を直接核酸増幅反応液に添加することを特徴とする請求項１〜４に記載の核酸合成法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸合成法、特に、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction ：以下ＰＣＲと略す）法による核酸合成法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ法は、ＤＮＡ鎖の１本鎖への解離、ＤＮＡ鎖の特定の領域をはさんだプライマーの結合、ＤＮＡポリメラーゼの作用によるＤＮＡ合成反応を繰り返すことによって、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増幅できる方法である。ＰＣＲ法は、マリス氏らの発明である特許文献１に述べられている。
【０００３】
ＰＣＲ法は種々の試料中の核酸の高感度分析法として使用可能で、特に動物体液由来試料中の核酸の分析法に使用できる。従って、ＰＣＲ法は感染症や遺伝子病の診断・モニタリング等に利用される。さらに、ＰＣＲ法は移植や親子鑑定、個人の遺伝子情報に基づいた医療等でのＤＮＡタイピングの検査にも適した方法である。これらの場合末梢血液が検査対象に選ばれる場合が多い。
【０００４】
ＰＣＲ法の１つの欠点は、色素、たんぱく、糖類あるいは未知の夾雑物によって反応が阻害されることである。すなわち、代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるThermus aquaticus 由来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼをはじめ、多くのＤＮＡポリメラーゼは、微量の生体由来の夾雑物がＰＣＲ反応液中に混在しても、活性が強く阻害されることが広く知られている。
【０００５】
そこで、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅に先立って、被験物から細胞、原虫、真菌、細菌、ウィルス等（以下、遺伝子包含体と称する）を分離し、次に、その遺伝子包含体から核酸を抽出する過程が必要となる。その方法としては、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝子包含体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物から核酸を抽出する方法が従来より使用されている。最近では核酸抽出の過程において、イオン交換樹脂、ガラスフィルター、ガラスビーズあるいはタンパク凝集作用を有する試薬等が使用されている。
【０００６】
【特許文献１】特開昭６１−２７４６９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、これらの方法を用いて試料中の核酸の精製を行っても、不純物の完全な除去は困難であり、かつ試料中の核酸の回収量が一定しない場合も多い。このため引き続く核酸合成が、とりわけ試料中の目的とする核酸の含量が少ない場合には、うまくできない場合もある。また、これら精製法は操作が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタミネーションの機会を高めている。従って、これらの問題点を解決するためには、より簡便で、かつ効果的な試料前処理法が望まれる。
【０００８】
そこで、本発明は、核酸合成阻害物質の作用を抑制して、試料中の核酸を効率よく増幅させる新規な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
通常、血液抗凝固剤として用いられるヘパリンはＰＣＲ阻害物質として知られ、試料に添加するのに好ましくない物質とされる。しかし我々はこれらの現象を鋭意検討した結果、ヘパリンが生体試料中のＰＣＲ阻害物質の作用を抑制することを見だした。また、ヘパリンのみでなくデキストランサルフェイト等の他の硫酸化多糖やポリビニル硫酸等の硫酸化ポリマー、DNA等の燐酸化ポリマー等のポリアニオンおよびその不溶性高分子が同様の作用を示すことを見だし本発明をなすに至った。
本発明は、上記課題を解決するため、試料中の目的とする核酸を増幅する核酸合成法において、核酸増幅反応液にポリアニオン及び／又はその不溶性高分子を添加することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、核酸の分離・精製の過程を経ずに、血清・血漿・血液等のＰＣＲ阻害物質を多く含んだ生体試料から、目的の核酸を効率よく増幅することが可能となった。また、本発明により、簡便、迅速に核酸合成の操作を行えるようになり、コンタミネーションの機会の軽減が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ここで、ポリアニオンとは、陰イオンを含有した繰り返し構造を持つ高分子化合物およびその塩をいう。陰イオンとしては、例えば、硫酸基、亜硫酸基、燐酸基、カルボキシル基、チオカルボキシル基などを挙げることができるが、これらに限定されない。特に硫酸基を含有した繰り返し構造を持つ高分子化合物およびその塩（硫酸化ポリマー）、燐酸基を含有した繰り返し構造を持つ高分子化合物およびその塩（燐酸化ポリマー）が好ましい。
【００１２】
硫酸化ポリマーとしては、例えば、へパリン、デキストランサルフェイト等の硫酸化多糖（Sulfated polysaccharide）及びその塩（総称して硫酸化多糖）、ポリビニル硫酸およびその塩などを挙げることができるが、これらに限定されない。なお、その塩は、ナトリウム塩、カリウム塩などを挙げることができるが、これらに限定されない。
硫酸化ポリマーの添加量は、その種類により異なるが、例えばへパリンの場合、０．１μｇ／ｍｌ以上、好ましくは、０．４μｇ〜２５.６μｇ／ｍｌ、デキストランサルフェイトの場合、０．０５μｇ／ｍｌ以上、好ましくは、０．１２μｇ〜７.８μｇ／ｍｌであるが、これら範囲には限定されない。
【００１３】
燐酸化ポリマーとしては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを挙げることができるが、これらに限定されない。燐酸化ポリマーの添加量は、その種類により異なるが、例えばＤＮＡの場合、50μｌの反応液あたり０．２ｎｇ以上、好ましくは、１〜１０００ｎｇであるが、これら範囲には限定されない。
【００１４】
ポリアニオン及び／又はその不溶性高分子は、試料に加えてから、核酸増幅反応液に添加しても、核酸増幅反応液に予め添加しておいてもよい。また、ポリアニオン及び／又はその不溶性高分子は、核酸増幅反応液に均一に入っていない状態（たとえば試料にポリアニオン及び／又はその不溶性高分子を加えて、この試料を反応液に攪拌せずに添加した場合など）でも同様の効果がある。また、ポリアニオン及び／又はその不溶性高分子は１種でも数種を組み合わせてもよい。またポリアニオンの不溶性高分子は均質なものでなくてもよく、ポリアニオンを含む複合型の不溶性高分子や、核酸合成反応を阻害しない担体にポリアニオンを結合したものでもよい。
【００１５】
さらに、ポリアニオンを核酸増幅反応液の接する反応容器内壁にコーティングしても、もしくは容器そのものを不溶性ポリアニオンで構成してもよい。コーティングは、スピンコーティング、ホットディップ等いずれの方法でもよく、コーティングの厚さは特に限定されない。また、不溶性ポリアニオンで容器そのものを構成する場合は、射出成形などで成形するが、これには限定されない。
【００１６】
本発明において、試料は生体由来試料もしくは生体由来試料中の遺伝子包含体をいい、生体由来試料とは、動植物組織、体液、排泄物等をいい、遺伝子包含体とは、細胞、原虫、真菌、細菌、ウィルス等をいう。体液には血液、髄液、唾液、乳が含まれ、排泄物には糞便、尿、汗が含まれるが、これに限定されるものではない。細胞には血液中の白血球、血小板が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
核酸増幅反応液は、通常、ｐＨ緩衝液並びにＭｇＣｌ2、ＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類及び核酸合成酵素を含むものである。また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用されている。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク、ジメチルスルホキシド、界面活性剤等種々の物質が添加される場合がある。
【００１８】
ｐＨ緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せであり、鉱酸の中で望ましいものは塩酸である。また、トリシン、ＣＡＰＳＯ（3ーNーCyclohexylamino −2 −hydroxypropanesulfonic acid ）あるいはＣＨＥＳ（2ー（Cyclohexylamino ）ethanesulfonic acid ）と苛性ソーダ、苛性カリとの組み合わせによるｐＨ緩衝液等種々のｐＨ緩衝液が使用され得る。ｐＨ調整された緩衝液は、核酸増幅反応液の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で使用される。
【００１９】
プライマーは、鋳型と増幅用試薬等の存在下に合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、二本鎖も使用できる。もし、プライマーが二本鎖の場合には、増幅反応に先立って一本鎖にすることが望ましい。プライマーは、公知の方法により合成することができるし、また、生物界から単離することもできる。
【００２０】
核酸合成酵素は、デオキシリボヌクレオチド類付加により核酸を合成する酵素、あるいはかような化学合成系を意味する。適切な核酸合成酵素としては、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ.litoralisＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼそして逆転写酵素などがあるが、これらにのみ限定されるものではない。
【００２１】
また、本発明では核酸増幅反応液のｐＨを調節することにより、相乗効果が得られる。例えば、ｐＨは２５℃の温度条件下で８．１以上、好ましくは８．５〜 ９．５である。
【００２２】
なお、本発明の核酸合成法の手順は、反応液中にポリアニオン及び／又はその不溶性高分子を添加する以外、通常の方法と何ら変わらない。例えば、核酸合成法としてＰＣＲ法を使用する場合においては、先ず、増幅しようとする目的の2本鎖ＤＮＡ断片を熱変性により1本鎖のＤＮＡにする（ディナチュレーション工程）。次に増幅させたい領域を挟むプライマーをハイブリダイズさせる（アニーリング工程）。次に４種類のデオキシリボヌクレオチド類（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の共存下にＤＮＡポリメラーゼを作用させ、プライマーの伸長反応を行う（ポリメライゼーション工程）。
【実施例】
【００２３】
（実験例１）
ＰＣＲ反応液にヒト血漿を直接添加してＰＣＲを行う実験系で、硫酸化多糖の一種であるヘパリン添加の効果を検討した。ＰＣＲ反応液には、10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 各200μMのdATP, dCTP, dGTP及びdTTP, 各0.4μMのprimer, 1.25units/50μl のTaq DNA ポリメラーゼ（TaKaRa Taq: Takara shuzo, Kyoto, Japan）反応液を用いた。なお、鋳型ＤＮＡとしては3 fgのＰＵＣ１８プラスミドＤＮＡを、ＰＣＲのプライマーとしてはＰＵＣ１８プラスミドＤＮＡのplus鎖の塩基配列をもつオリゴヌクレオチド（ＲＶ−Ｍ：配列番号１）及びminus 鎖の塩基配列をもつオリゴヌクレオチド（Ｍ１３−４７：配列番号２）を使用した。プライマーの配列は以下の通りであり、この２種類のプライマーを用いたＰＣＲの結果、１５０bp の増幅産物を得ることができる。
ＲＶ−Ｍ： ５'ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ３'
Ｍ１３−４７：５'ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ３'
【００２４】
ＰＣＲは、９４℃、３分間のプレヒーティングの後、９４℃ ３０秒間、５５℃ １分間、７２℃ １分間の条件で４０サイクル、最後に７２℃ ７分間のポリメライゼーションを行った。
ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを用いて、２．５％アガロースを含む、０．５μｇ/ｍｌ臭化エチジウム添加ＴＡＥ（40mM Tris-acetate, 1mM EDTA） 液中で電気泳動を行い検出した。
【００２５】
ＰＣＲ反応液（50μｌ）に１μｌのヒト血漿および種々の濃度のヘパリンナトリウム塩 (Heparin Sodium: Wako, Osaka, Japan) を添加して、 ＰＵＣ１８プラスミドＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったときの増幅産物の電気泳動図を図１に示す。図中Ｍは分子量マーカー（HincIIで切断した250ng のφ X174-RF DNA）、１はヘパリンナトリウム塩無添加、２は0.025μｇ／ｍｌ、３は0.05μｇ／ｍｌ、４は0.1μｇ／ｍｌ、５は0.2μｇ／ｍｌ、６は0.4μｇ／ｍｌ、７は0.8μｇ／ｍｌ、８は1.6μｇ／ｍｌ、９は3.2μｇ／ｍｌ、１０は6.4μｇ／ｍｌ、１１は12.8μｇ／ｍｌ、１２は25.6μｇ／ｍｌ、１３は51.2μｇ／ｍｌ、１４は102.4μｇ／ｍｌ添加でＰＣＲを行った時の結果を示している。
ヘパリンを添加することによって、ＰＣＲ増幅産物が得られることが示されている。ヘパリンナトリウム塩を0.1μｇ／ｍｌ（レーン４）以上、特に0.4μｇ〜25.6μｇ／ｍｌ（レーン６〜１２）添加した時に良好な結果が得られている。
【００２６】
（実験例２）
本例は、実験例１で増幅効率の良かった0.8μｇ／ｍｌのヘパリンナトリウム塩存在あるいは非存在の条件下で、段階希釈したヒト血液を直接反応液に添加して、ＰＣＲを行った実験である。反応に用いたＰＣＲ反応液の組成は、鋳型ＤＮＡおよびプライマーを除いては実験１と同様である。
鋳型ＤＮＡとしては血液中のＤＮＡを、ＰＣＲのプライマーとしてはヒトβ−グロビン遺伝子領域内に位置するplus鎖の塩基配列をもつオリゴヌクレオチド（ＧＨ２０：配列番号３）及びminus 鎖の塩基配列をもつオリゴヌクレオチド（ＧＨ２１：配列番号４）を使用した。プライマーの配列は以下の通りであり、この２種類のプライマーを用いたＰＣＲの結果、４０８bp の増幅産物を得ることができる。
ＧＨ２０：５'ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣ３'
ＧＨ２１：５'ＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＣＡＧ３'
ＰＣＲの条件、ＰＣＲ後の電気泳動の条件は実験例１と同様である。
【００２７】
実験結果（電気泳動図）を図２に示す。図中Ｍは分子量マーカー、１、５は血液0.5%、２、６は0.25%、３、７は0.125%添加、４、８は無添加でのＰＣＲの結果を示している。なお１〜４はヘパリンナトリウム塩非存在下、５〜８は存在下でＰＣＲを行った結果である。本実験例により、 ＰＣＲ阻害物質の作用がヘパリンで抑制されることにより、血液を反応液に直接添加してＰＣＲを行っても、高感度に増幅産物が検出できることがわかる。
【００２８】
（実験例３）
ＰＣＲ反応液にヒト血清を直接添加してＰＣＲを行う実験系で、硫酸化多糖の一種であるデキストランサルフェイト添加の効果を検討した。反応に用いたＰＣＲ反応液の組成およびＰＣＲ後の電気泳動の条件は実験例１と同様である。ＰＣＲは９４℃、４分３０秒間のプレヒーティングの後、９４℃３０秒間、５８℃ １分間、７２℃ １分間の条件で４０サイクル、最後に７２℃７分間のポリメライゼーションを行った。
【００２９】
ＰＣＲ反応液（50μｌ）に１μｌのヒト血清および種々の濃度のデキストランサルフェイトナトリウム塩（平均分子量５、５００）(Sodium Dextran Sulfate,Nacalai tesque, Kyoto, Japan)を添加して、 ＰＵＣ１８プラスミドＤＮＡ を鋳型としてＰＣＲを行ったときの増幅産物の電気泳動図を図３に示す。図中Ｍは分子量マーカー、１はデキストランサルフェイトナトリウム塩100μg、２は25μg、３は6.3μg、４は1.6μg、５は390ng、６は97ng、７は24ng、８は6.1ng、９は1.52ng、１０は0.38ng、１１は0.095ng、１２は0.023ng、13は無添加でＰＣＲを行った時の結果を示している。なお、14はヒト血清もデキストランサルフェイトナトリウム塩も添加しない陽性対照である。
デキストランサルフェイトナトリウム塩を390ng〜6.1ng （レーン5-8） 添加してＰＣＲを行った場合に、増幅産物が検出できている。
以上の結果から、デキストランサルフェイトが血清中のＰＣＲ阻害物質の作用を抑制し、反応を回復させる効果のあることが明らかとなった。
【００３０】
本実験例で効果の認められた濃度は、0.12μg/ml (6.1ng/50μl)から7.8μg/ml (390ng/50μl)の範囲であったが、他の実験から、使用するデキストランサルフェイトの分子量や血清の添加量で、有効な濃度範囲が変動することを確認しており、効果のある濃度範囲を前記の範囲に限定するものではない。
【００３１】
（実験例４）
ＰＣＲ反応液にヒト血液を直接添加してＰＣＲを行う実験系で、デキストランサルフェイト添加の効果を検討した。反応に用いたＰＣＲ反応液の組成は実験例２と同様であり、ＰＣＲ条件はアニーリング温度を５５℃に設定した以外は実験例３と同様であり、ＰＣＲ後の電気泳動の条件は実験例１と同様である。
【００３２】
ＰＣＲ反応液（50μｌ）に0.05μｌのヒト血液および種々の濃度のデキストランサルフェイトナトリウム塩を添加して、 血液中のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったときの増幅産物の電気泳動図を図４に示す。図中Ｍは分子量マーカー、２はデキストランサルフェイトナトリウム塩無添加、３は10μg、４は2.5μg、５は0.625μg、６は156ng、７は39ng、８は9.76ng、９は2.44ng、１０は0.61ng添加してＰＣＲを行った時の結果を示している。なお、１は血液もデキストランサルフェイトナトリウム塩も添加しない陰性対照である。
デキストランサルフェイトナトリウム塩を156ng〜2.44ng （レーン6-9） 添加してＰＣＲを行った場合に、増幅産物が検出できている。
【００３３】
以上の結果から、デキストランサルフェイトが血液中のＰＣＲ阻害物質の作用を抑制し、反応を回復させる効果のあることが明らかとなった。本実験例で効果の認められた濃度は、0.049μg/ml (2.44ng/50μl)から3.1μg/ml (156ng/50μl)の範囲であったが、他の実験から、使用するデキストランサルフェイトの分子量や血清の添加量で、有効な濃度範囲が変動することを確認しており、効果のある濃度範囲を前記の範囲に限定するものではない。
【００３４】
（実験例５）
ＰＣＲ反応液にヒト血漿を直接添加してＰＣＲを行う実験系で、硫酸化ポリマーの一種であるポリビニル硫酸添加の効果を検討した。ＰＣＲ反応液の組成およびＰＣＲ後の電気泳動の条件は実験例１と同様であり、ＰＣＲの条件は実験例３と同様である。
【００３５】
ＰＣＲ反応液（50μl）に種々の量のヒト血漿を直接添加して、1ngのポリビニル硫酸カリウム塩 (Polyvinylsulfuric Acid Potassium Salt: Nacalai tesque)存在下もしくは非存在下でPUC18プラスミドＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行ったときの増幅産物の電気泳動図を図５に示す。図中Ｍは分子量マーカー、１は血漿2μl、２は１μｌ、以下３〜10は、順次2倍段階で量を減らした血漿を直接反応液に添加してＰＣＲを行った時の結果を示している。なお、11は血漿を添加しない時の結果である。ポリビニル硫酸カリウム塩添加の場合（図中Ａ）では血漿０．5μｌ（レーン３）以下の添加量でＰＣＲ産物が検出されているが、無添加の場合（図中Ｂ）では、０．０１２５μｌ（レーン５）以下の添加量でＰＣＲ産物が検出されている。 このことは、ポリビニル硫酸をＰＣＲ反応液に添加することにより、添加しない場合に比べ、約４倍量の血漿中ＰＣＲ阻害物質に対応できることを示している。
【００３６】
（実験例６）
ＰＣＲ反応液にヒト血清を直接添加してＰＣＲを行う実験系で、燐酸化ポリマーの一種であるＤＮＡ添加の効果を検討した。
ＰＣＲ反応液の組成およびＰＣＲ後の電気泳動の条件は実験例１と同様であり、ＰＣＲの条件は実験例３と同様である。
【００３７】
ＰＣＲ反応液（５０μｌ）に１μｌのヒト血清および種々の濃度のヒトゲノムＤＮＡを添加して、ＰＵＣ１８プラスミドＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行ったときの増幅産物の電気泳動図を図６に示す。図中Ｍは分子量マーカー、１はＤＮＡ100ng, 2は10ng, 3は1ng, 4は0.1ng, 5は0.01ng添加, 6は無添加でＰＣＲを行った時の結果を示している。
ＤＮＡをＰＣＲ反応液に1ng（レーン３）以上添加してＰＣＲを行った場合にＰＣＲ産物が検出されている。以上の結果は、ＤＮＡを添加してＰＣＲを行うことにより血清由来のＰＣＲ阻害物質の作用を抑制したことを示している。
【００３８】
（実験例７）
ＰＣＲ反応液にヒト血漿を直接添加してＰＣＲを行う実験系で、ポリアニオンの不溶性高分子の一種であるデキストランサルフェイトゲル添加の効果を検討した。反応に用いたＰＣＲ反応液の組成は、鋳型ＤＮＡおよびプライマーを除いては実験１と同様である。
【００３９】
鋳型DNAとしてはpBR322プラスミド由来テトラサイクリン耐性遺伝子配列をもつコントロールＲＮＡ（ Takara shuzo）1000コピーより逆転写したｃＤＮＡを、ＰＣＲのプライマーとしてはテトラサイクリン耐性遺伝子領域内に位置するplus鎖の塩基配列をもつオリゴヌクレオチド（Ｆ−１、 Takara shuzo：配列番号５）及びminus 鎖の塩基配列をもつオリゴヌクレオチド（Ｒ−１、 Takara shuzo：配列番号６）を使用した。プライマーの配列は以下の通りであり、この２種類のプライマーを用いたＰＣＲの結果、４６２bp の増幅産物を得ることができる。
Ｆ−１：５'ＣＴＣＧＴＣＧＣＴＴＣＧＣＡＴＣＴＴＧＧＡ３'
Ｒ−１：５'ＣＧＧＣＡＣＣＴＧＴＣＣＴＡＣＧＡＧＴＴＧ３'
ＰＣＲの条件はアニーリング温度を64℃に設定した以外は実験例１と同様であり、ＰＣＲ後の電気泳動の条件は実験例１と同様である。
【００４０】
ＰＣＲ反応液（50μｌ）に0.125μｌのヒト血漿および種々の量のデキストランサルフェイトゲル (Dextran beads, sulfated D5650:SIGMA, Missouri, USA)を添加して、ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った時の増幅産物の電気泳動図を図７に示す。 このデキストランサルフェイトゲルには安定剤として乳糖が添加されているため、蒸留水にて洗浄後乾燥したものを用いた。 図中Ｍは分子量マーカー、１はデキストランサルフェイトゲル無添加、２は0.2μｇ 、３は0.4μｇ 、４は0.8μｇ 、５は1.6μｇ 、６は3.2μｇ 、７は6.3μｇ 、８は12.5μｇ 、９は25μｇ 、１０は50μｇ添加でＰＣＲを行った時の結果を示している。
【００４１】
デキストランサルフェイトゲルを添加することによって、ＰＣＲ増幅産物が得られることが示されている。デキストランサルフェイトゲルを1.6μｇ （レーン５）以上、特に３．２〜２５μｇ （レーン６〜９）添加した時に良好な結果が得られている。
本実験例で効果の認められた量は、反応液５０μlあたり1.6μｇから５０μｇの範囲であったが、使用するデキストランサルフェイトゲルへの硫酸基の導入率の違い等により、有効量の範囲は変動するため、効果のある量を前記の範囲に限定するものではない。
【００４２】
（実験例８）
本例は、実験例７で増幅効率の良かった１２．５μｇ／５０μlのデキストランサルフェイトゲル存在下あるいは非存在下で、段階希釈した血漿を直接反応液に添加して、 ｐＢＲ３２２由来テトラサイクリン耐性遺伝子のｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った実験である。反応に用いたＰＣＲ反応液の組成およびＰＣＲの条件は実験例７と同様であり、 ＰＣＲ後の電気泳動の条件は実験例１と同様である。
ＰＣＲ反応液（50μｌ）に１２．５μgのデキストランサルフェイトゲルおよび段階希釈したヒト血漿を添加して、ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った時の増幅産物の電気泳動図を図８に示す。
図中Ｍは分子量マーカー、１、７は血漿無添加、２、８は0.063%、３、９は0.125%、４、１０は0.25%、５、１１は0.5%、６、１２は１%添加でＰＣＲを行った時の結果を示している。 なお１〜6はデキストランサルフェイトゲル無添加、７〜１2はデキストランサルフェイトゲルを添加したものである。
【００４３】
本実験例により、 ＰＣＲ阻害物質の作用がデキストランサルフェイトゲルで抑制されることにより、血漿を反応液に直接添加してＰＣＲを行っても、高感度に増幅産物が検出できることがわかる。
実験例７および８の結果より、反応液中にポリアニオンを溶液として添加する場合のみでなく、不溶性のポリアニオンを添加する場合でも阻害物質の作用が抑制できることがわかる。なお、このことは本例のようにゲルとして不溶性ポリアニオンを添加する場合だけでなく、反応液の接する反応容器内壁にポリアニオンをコーティングした場合や容器そのものが不溶性ポリアニオンで構成されている場合も有効である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ＰＣＲ反応液（50μｌ）に１μｌのヒト血漿および濃度の異なるヘパリンナトリウム塩を添加し、ＰＣＲを行った電気泳動図
【図２】実験例１で増幅効率の良かった0.8μｇ／ｍｌのヘパリンナトリウム塩を反応液に加えた場合と加えない場合において、ヒト血液を段階希釈して反応液に添加しＰＣＲを行った電気泳動図
【図３】ＰＣＲ反応液（50μｌ）に１μｌのヒト血清および濃度の異なるデキストランサルフェイトナトリウム塩を添加し、ＰＣＲを行った電気泳動図
【図４】ＰＣＲ反応液（50μｌ）に0.05μｌのヒト血液および濃度の異なるデキストランサルフェイトナトリウム塩を添加し、ＰＣＲを行った電気泳動図
【図５】ＰＣＲ反応液（50μｌ）に種々の量のヒト血漿および1ngのポリビニル硫酸カリウム塩を添加し、ＰＣＲを行った電気泳動図
【図６】ＰＣＲ反応液（50μｌ）に１μｌのヒト血清および濃度の異なるヒトゲノムＤＮＡを添加し、ＰＣＲを行った電気泳動図
【図７】ＰＣＲ反応液（50μｌ）に０．１２５μｌのヒト血漿および量の異なるデキストランサルフェイトゲルを添加し、ＰＣＲを行った電気泳動図
【図８】実験例７で増幅効率の良かった１２．５μｇ／ｍｌのデキストランサルフェイトゲルを反応液に加えた場合と加えない場合において、ヒト血漿を段階希釈して反応液に添加しＰＣＲを行った電気泳動図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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