(57)【要約】【課題】  多種類の生体分子の同時検出可能な集積化ピラー構造体であって、従来の集積化ピラー構造体の優れた特徴を備え、偏光分析や蛍光分析などの光学的検出方法が可能であるとともに、従来の集積化ＳＰＲ光学素子のように複雑な機器構成と煩雑な取扱いを必要とせず、ＳＰＲによる検出がそれらと同程度の簡便に実現可能である集積化ピラー構造体とする。【解決手段】  表面、好ましくはピラー上面にナノ構造を有する集積化ピラー構造体からなる光学素子、これを含むフローセル、およびこれらを用いた光学的検出方法とする。【選択図】  図１
2005337771.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面にナノ構造が形成されていることを特徴とする集積化ピラー構造体である光学素子
。
【請求項２】
ナノ構造形成部位がピラー上面であること特徴とする請求項１記載の光学素子。
【請求項３】
ナノ構造が金、白金、アルミニウムまたは銅からなる群から選択される少なくとも１種
類金属の薄膜で被覆されていることを特徴とする請求項１または２記載の光学素子。
【請求項４】
ナノ構造形成部位に、核酸、アミノ酸、タンパク質、抗体、リガンドまたは細胞からな
る群から選択される物質のうちいずれか１種が固定されていることを特徴とする請求項１から３いずれか記載の光学素子。
【請求項５】
ナノ構造が規則パターンであること特徴とする請求項１または４のいずれか記載の光学
素子。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか記載の光学素子を有するフローセル。
【請求項７】
請求項５記載の光学素子を有するフローセルであって、ナノ構造の規則パターンがフロ
ーセルの流れ方向に対して、平行、直角、４５度のいずれかの配向で光学素子が固定化されていることを特徴とするフローセル。
【請求項８】
請求項６または７記載のフローセルを使用した生体分子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、遺伝子、タンパク質あるいは細胞機能の解析における、生体分子検出デバイス及び生体分子検出方法に関するものである。より詳細には、この出願の発明は、タンパク質、核酸等の生体分子の相互作用を並列的に解析するための光学素子であるピラー構造体、およびこの構造体を備えるフローセル、さらにはこれらによる生体分子検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、臨床検査あるいは創薬をはじめする各種のバイオテクノロジー分野において、遺伝子、タンパク質や細胞の機能解析や薬利作用物質のスクリーニングを目的に、多種類の生体分子を同時に分析・検出する手段として、様々な光学素子が開発され、同時にそれらの集積化（マイクロアレイ化）が試みられている。
【０００３】
集積化された光学素子のひとつに、ピラー（柱状）構造をもつ集積化ピラー構造体がある。このピラー構造体光学素子は、柱状の微小構造がそれぞれひとつの素子を形成するため、同時多サンプル解析を可能であって、検体量を低減し、サンプル同士のコンタミネーションが低く、検出感度も高い（特許文献１、２）。検出方法には放射線や蛍光スペクトロスコピー、偏光解析（エリプソメトリー）などが一般的である。
【０００４】
いっぽう、別の光学素子として、表面プラズモン共鳴（以下ＳＰＲと称する）を利用したものがある。このＳＰＲ光学素子は、規則的パターンを有する基板上に金、白金、アルミニウム、銅等の金属をコーティングしたもので、この基板裏面への励起光の入射により基板表面で励起されたＳＰＲを観測し、基板上への結合分子を検出することを特徴とする。また、ＳＰＲ光学素子による検出は、蛍光物質や放射線同位元素などによる生体分子への修飾や標識化を必要とせず、生体分子を非標識で検出できる。
【０００５】
特許文献３〜４において、ガラス等の光ガイドを用いた集積化が試みられているが、ＳＰＲを励起するためには、基板表面から特定の角度（表面に対する垂直軸から76度）で励起光を入射する必要があるため、検出機器にプリズムカップリングなどの複雑かつ高価な光学系を必要とし、また入射角度調整にたいへん手間がかかるという問題があった。
【特許文献１】WO 99/60382 A1
【特許文献２】US 2003/0128364 A1
【特許文献３】US 6,630,358
【特許文献４】WO 01/62887 A1
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上のように、従来の集積化ピラー構造体をＳＰＲ検出に供する場合、ＳＰＲ励起を行うためには、基板裏面からプリズムカップリング等の光学系を用いて励起光を入射し、例えばピラーを光ガイドとして全反射させながら、生体分子を結合した基板表面に特定角度で伝達させることが必要であり、複雑かつ精度の高い機器構成が求められるばかりでなく、入射角度調整の取扱いが煩雑で困難であった。
【０００７】
そこで、この出願の発明は、上記のような背景から、各種の光学的分析に供し、多種類の生体分子の同時検出可能な集積化光学素子、素子を利用した検出用デバイスおよび検出方法を提供することを課題としている。
【０００８】
すなわち、より詳しくは、この出願の発明は多種類の生体分子の同時検出可能な集積化ピラー構造体であって、従来の集積化ピラー構造体の優れた特徴を備え、偏光分析や蛍光分析などの光学的検出方法が可能であるとともに、従来の集積化ＳＰＲ光学素子のように複雑な機器構成と煩雑な取扱いを必要とせず、ＳＰＲによる検出がそれらと同程度の簡便に実現可能である集積化ピラー構造体を提供することを課題とし、さらには、この集積化ピラー構造体を利用したフローセルおよび生体分子検出方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この出願の発明者らは、以上の課題を鑑み、鋭意検討の結果、生体分子検出方法に関する新規なピラー構造体を見出した。すなわち、集積化ピラー構造体表面にナノ構造を作成すると、プリズムカップリングが不要で、集積化ピラー構造体裏面からその表面のナノ構造に直接入射光を導入してＳＰＲを励起することが可能であることを見出した。
【００１０】
このような知見に基づいて、この出願の発明は、第１に、表面にナノ構造が形成されていることを特徴とする集積化ピラー構造体である光学素子を提供する。また、この出願の発明は第２には、このナノ構造形成部位がピラー上面であること特徴とする前記光学素子を、第３にはこのナノ構造が金、白金、アルミニウムまたは銅からなる群から選択される少なくとも１種類金属の薄膜で被覆されていることを特徴とする前記光学素子を、さらに第４には、ナノ構造形成部位に、核酸、アミノ酸、タンパク質、抗体、リガンドまたは細胞からなる群から選択される物質のうちいずれか１種が固定されていることを特徴とする前記いずれかの光学素子を提供する。加えて、第５には、ナノ構造が規則パターンであること特徴とする前記いずれかの光学素子を提供する。
【００１１】
そして、この出願の発明は第６には前記いずれかの光学素を有するフローセルを提供する。さらには第７には、ナノ構造が規則パターンを有する場合に、フローセルの流れ方向に対して、平行、直角、４５度のいずれかの配向で光学素子が固定化されていることを特徴とする前記フローセルを提供する。また、第８に、これらフローセルを使用した生体分子検出方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
上記のとおりのこの出願の発明により、従来の偏光分析や蛍光分析等の光学検出が可能であることに加え、より簡便な装置構成と手順でＳＰＲ検出が可能である生体分子検出用の集積化ピラー構造体からなる光学素子およびフローセルが提供される。これによって、遺伝子、タンパク質、細胞、薬理活性物質、生理活性物質など各種の生体分子の同時大量並列解析において、標識化操作等を必要としないＳＰＲによる簡便かつ高精度な検出が可能となり、また、従来の光学検出法とＳＰＲの組み合わせによる多元的な解析が可能となる。その結果、この出願の発明は、未知の生体分子や細胞の機能や遺伝子発現様式の解析、また新規な薬理作用をもつ分子の探索に資するものとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
この出願の発明では、集積化ピラー構造体の表面にナノ構造を形成し、光学素子機能を実現するが、以下に集積化ピラー構造体からなる光学素子、それを有するフローセル、そして測定方法等を説明する。もちろん、この出願の発明の実施形態は以下の説明によって限定されるものではない。
【００１４】
図１には、この出願の発明の集積化ピラー構造体の一例を示している。たとえばこの図１のように、基板１にピラー２を積層した集積化ピラー構造体表面にナノ構造を作成するが、より好ましくは、ピラー２の上面３にナノ構造をそれぞれ作成する（図１ａ）。基板
１は高分子材料で形成されており、好ましくはポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリカーボネート、ORMOCERR，シクロオレフィンコポリマー（TOPASR）、ポリウレタン、ポリエーテルイミド、プロビミドを用いることができる。基板１とピラー２は上記の同じ材料であってもよいし、異なる材料を組み合わせてもよい。基板１の大きさは試料量により、異なるが典型的には１センチメートル角程度である。ナノ構造が形成されたピラー構造の上面３の形状は、平面のほか半球あるいはピラミッド様の構造とすることができる。
【００１５】
また、この出願の発明の提供する集積化ピラー構造体は、基板１に負のピラーすなわちウェル６を形成した集積化ウェル構造体としてもよく、この場合、好ましくは負のピラーの上面に相当するウェル底面４にナノ構造を形成する（図１ｂ）。また、ウェル構造同士が互いに連通している場合は、図１ａとほぼ同等な構造としている場合は、好ましくは基板上面５にナノ構造を形成する。なお、この出願の発明の本質たるピラーは、個々のセンシング部であるナノ構造を明確に区分するものであり、ピラー上面は基板表面と異なる高さを有するものであればよい。したがって、この出願の発明においては図１ｂのような「集積化ウェル構造体」は集積化ピラー構造体の、「ウェル構造」はピラー構造のそれぞれ一形態である。
【００１６】
図１ａ、図１ｂのいずれの場合も、ナノ構造の形成に好ましい前記部位は、フローセルの底面より高く、ピラーに密接に関連している。このため、この出願の発明の集積化ピラー構造体においてはピラー構造が光ガイドの役割を果たし、光学的検出のための入射光をナノ構造表面に効率的に導くことができる。
【００１７】
ナノ構造表面では、生体分子や細胞固定化されており、これらと検体試料中の生体分子との相互作用により、表面近傍の屈折率や、ナノ構造の形状、散乱・蛍光などの光学特性が変化する。これにより、個々のナノ構造における前記相互作用を同時並列で検出することが可能である。この出願の発明の提供する集積化ピラー構造体のピラー間隔、高さおよび太さは適宜選択できるが、高さは２０〜２００μｍ、太さは１〜５０μｍ以下である。ひとつの集積化ピラー構造体の中でピラーの集積度を１から約２００００個程度まで変えることができる。
【００１８】
次に、この出願の発明によって提供される集積化ピラー構造体のナノ構造パターンの一形態を図２に示す。この出願の発明のナノ構造の形状は光学検出方法により、その周期、高さ、形状、デザインなどを変えることができる。例えば、矩形断面形状（図２ａ）は、蛍光標識した細胞やタンパク質の検出に適している。また、正弦波（図２ｂ）や鋸状波（図２ｃ）などの波形状断面は、ナノ構造表面におけるプラズモン、ポーラリトンの生成とこれを用いた生体分子の検出に好適である。三角波状断面（図２ｄ）は光学反射測定に用いることができる。また、ナノ構造の表面に金、白金、アンチモンおよび銅などの金属を１〜１５０ｎｍの厚さに形成することにより、表面プラズモンなど異なるモードの光学測定が可能になる。
【００１９】
上記の光学的検出は、ナノ構造の形状に関わり無く個々のナノ構造で独立に行うことができ、ナノ構造に固定化された生体分子を光学的に同時並列解析することができる。たとえば近傍に製作された２個のナノ構造を用い、一方に生体分子を固定化し、他方には何も固定化せず非特異吸着などに対する参照用として用い、この２個のナノ構造の光学的特性を比較することにより、高精度の測定が可能になる。ナノ構造は上記の光学特性の検出のほかに、生体分子の固定化面の表面積を増大させ、固定化量を増加させるという特徴を併せ持っている。この特徴により、特許文献４に開示されているピラー上面を平滑面とする場合と比較して、この出願の発明の提供する集積化ピラー構造体である光学素子では高感度の検出が可能である。また、個々のナノ構造はその形態を個別に採用することができ、
これによってこの出願の発明の集積化ピラー構造体に複数の光学的検出手段に供することが可能な性質を与えることができる。
【００２０】
図３は、集積化ピラー構造体におけるピラー配置の一例を示したものである。円形の断面形状を有するピラーを整列配置することができる（図３ａ）。整列配置は格子配置であっても、千鳥配置であってもよい。また、円形ピラーと矩形ピラーを交互に配置してもよく、すなわち断面形状の異なるピラーを配置することにより、フローセル内の流れのパターンと変えることができ、生体分子同士の相互作用や反応を効率的に行わせることができる（図３ｂ）。
【００２１】
次に、この出願の発明の提供する光学素子を有するフローセルにおける好ましい形態について説明する。図４は集積化ピラー構造体のピラー構成の一形態である。ピラーの構成はフローセル、流れ特性により、円形、矩形、ダイヤモンド型の断面形状を有することができる。円形と矩形形状を組み合わせた断面形状を有するピラーを採用した場合、好ましくはフローセルの中で円形側を上流に、矩形側を下流に配置することにより、渦流の少ない流れを得ることができる（図４ａ）。また、矩形及び円形断面のピラーであり、フローセルの中で液の流れに対する抵抗を低減してもよい（図４ｂ、４ｃ）。さらにこの出願の発明は、ピラー上面７のナノ構造の方向が試料の流れに対して直角、平行または４５度の角度になるように、あらかじめナノ構造を形成する、あるいはピラーを配置することを最も好ましい形態としている。
【００２２】
図５は、この出願の発明の提供するフローセルの平面形状の模式図を例示したものである。検体試料は試料入口１１から導入し、光学素子部分１０を流れ、試料出口１２から排出される。フローセルは好ましくは、流路幅は光学素子１０の幅を有する。フローセルには光学素子が１つ以上含まれるが、２つ以上の光学素子を有するものであってもよい。
【００２３】
図６は、図５のＡ−Ａ’断面を例示したものである。光学素子部分１０を有するフローセルはフローセル蓋部１３、フローセル基部１４からなり、これらは接合部１６で接着されている（図６ａ）。接合部１６は任意の位置とすることができる。フローセル基部１４は光学素子１０の基板１であってもよく、この場合、基板１にはフローセル縁部１５を形成し、フローセル基部１４と同等の役割を与える（図６ｂ）。また、図６ａ、図６ｂの場合において、フローセル縁部１５はそれぞれフローセル基部１４、基板１と一体成形されていてもよい。この出願の発明のフローセル部材の好ましい形態として、接合面１６に対応するフローセル蓋部１３の面およびフローセル基部１４の面のいずれか、もしくは両方にナノ構造が形成されていてもよい。このナノ構造は、ピラー上面のナノ構造と同じプロセスで製作することができる。このナノ構造を利用し、フローセル蓋部１３とフローセル基部１４の接着に際し、接合面１６での二つの部材の接合状況を、光学的手法、例えば照射したレーザー光やその回折スポットそれぞれの強度や位置から容易に確認することができる。具体的には接合面のナノ構造よって干渉縞が確認される場合、接合の進行に伴い干渉縞が消失する現象が利用できる。特に、加熱あるいは超音波などの手段によって接合面１６のナノ構造を溶着し接合を行う場合にこの手法は有効である。
【００２４】
フローセル蓋部１３およびフローセル基部１４に囲まれたフローセル中の空間のうち、光学素子１０を除いた部分は試料溶液が流れる流路となり、光学素子１０に固定化された生体分子と相互作用する。光学素子のピラー構造上面と蓋部との間隔Ｄ（図６ａ、図６ｂ）は光学測定する上で重要なパラメータとなり測定モードに応じて最適化する必要がある。この間隔Ｄは光学検出にもちいる光の波長に応じて試料による吸収が無視できる程度に小さく設計する必要がある。光源としてはレーザーならびに発光ダイオード等を使用することができる。
【００２５】
この出願の発明の提供する光学素子に生体分子あるいは細胞等を固定するには、ＤＮＡチップやプロテインチップ等の反応性チップの作成において公知の方法を用いることが可能であるが、より好ましくはポリリジンを用いる方法、および金とチオールの親和性を用いる方法のいずれかを用いることができる。さらに、ナノ構造のみに特定の生体分子または細胞を固定するには、好ましくはインクジェットまたは微小ピンによる点着を行うことができる。
【００２６】
ポリリジンを用いた固定方法においては、集積化ピラー構造体光学素子の表面にポリリジンをコーティングし、ＤＮＡは静電的相互作用により、タンパク質または細胞の場合には化学結合生成によって固定する。後者の化学結合による固定は、より詳しくは、ポリリジンをコーティングしたナノ構造表面に、グルタルアルデヒド水溶液を反応させてアルデヒド基を導入し、これにタンパク質および細胞表面のアミノ基との間に化学結合を生成し固定する。なお、固定化操作後に未反応の正電荷またアルデヒド基をブロッキングするために、グリシンを反応させて、ナノ構造表面を安定化させる。
【００２７】
いっぽう、金とチオールの親和性を用いた固定方法においては、集積化ピラー構造体光学素子に金の薄膜をコーティングし、あらかじめチオール基を化学修飾した生体分子の末端に、金薄膜が形成された金とチオールは高い親和性を示すので、チオールで化学修飾した生体分子が金薄膜上に固定化される。
【００２８】
次にこの出願の発明の提供する光学素子あるいはフローセルにおける検出手段および測定系に関する好ましい形態を説明する。いずれの検出手段においても、ナノ構造ごとに個別の生体分子や細胞を固定化して、同時並列的に大量のサンプルを解析することが可能である。また、検出対象はフローセルとして説明するが、この出願の発明の光学素子を含む構成であればフローセルに限定されることはない。
【００２９】
この出願の発明の検出手段の好ましい形態のひとつは反射測定あるいは偏光解析である。反射測定に用いる光学測定系を図７ａ、図７ｂにそれぞれ例示する。
【００３０】
図７ａにおいて、光源２０は白色ＬＥＤあるいは標準的なタングステンランプである。入射光は光源側ポーラライザ２１に入射して極性のある光成分を選択し、レンズ２２を介してフローセル３０の光学素子のナノ構造に入射する。ナノ構造で反射した光はコリメーションレンズ２３、検出側ポーラライザ２４を介して検出器２５で検出される。検出器フォトマルチプライヤまたはＣＣＤカメラが好ましい。フローセル３０と上記光学系の相対位置を変化させることができる。
【００３１】
図７ｂは反射測定の第２の方法である。光源２０は白色または特定波長のＬＥＤである。光源からの入射光は0.0122インチのピンホール２６を通過してカメラレンズ２７で集光され、ポーラライザ２１を介して特定の入射角でフローセル３０の光学素子のナノ構造に入射し、その反射光が干渉フィルター２４を介して検出器２５で検出される。検出器２５にはＣＣＤカメラが好ましい。
【００３２】
これらの場合は、ナノ構造に固定化された生体分子や細胞と検体試料中の各種分子との相互作用や複合体形成によって個々にナノ構造の表面状態が変化するのに基づいて、反射光の強度や偏光性の変化として検出する。本願の光学素子ではナノ構造により光の回折が発生し、規則整列された集積化ピラー上面の個々のナノ構造に色が連続スペクトル状に分布し、生体分子による複合体の形成がある場合はスペクトルに変化が生じるため、それをスペクトル情報として取得することも可能である。
【００３３】
この出願の発明の別の好ましい検出手段は蛍光解析である。蛍光解析では、目的分子や
物質への蛍光標識を行い、ナノ構造に固定化された生体分子や細胞とこれら蛍光標識分子との相互作用や複合体形成の有無を、励起光の照射による蛍光発光として観測する。蛍光解析に用いる光学測定系を例示したものが図８である。光源４５はレーザーまたは水銀ランプである。光源光は空間フィルター４０、ビームエキスパンダー４１、ビームスプリッター４２を通過し、フローセル３０の光学素子のナノ構造に励起光を入射する。蛍光標識を行った分子等が結合しているナノ構造から発せられた蛍光発光は、ビームスプリッター４２を透過し、光学フィルター４３を介して検出器２５で検出される。検出器４４には冷却ＣＣＤカメラが好ましい。目的分子や物質への蛍光標識は公知の方法を用いることができ、細胞やタンパク質の場合にはＧＦＰやＥＧＦＰ等の蛍光タンパク質マーカー遺伝子をあらかじめ組み換え導入し、それらを標的細胞中で発現させる、または標的タンパク質との融合タンパク質することで検出に供することも可能である。
【００３４】
この出願の発明の別の好ましい検出手段は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定である。図９はＳＰＲ検出のための測定系を例示したものである。光源５０は好ましくはレーザーまたはＬＥＤである。光源からの励起光はコリメーションレンズ５１、ポーラライザ５２、シリンドリカルレンズ５３を介して一定の角度で光学素子のナノ構造に入射する。入射角はナノ構造を形成するピラー２の高さと周期に依存して適宜決定されるが、好ましくは4.8〜20度の範囲である。ナノ構造で発生するＳＰＲは検出側ポーラライザ５４、コリメ
ーションレンズ５５を介して、検出器５６でＳＰＲの強度を検出して画像データとして可視化する。検出器５６は好ましくはＣＣＤカメラまたはフォトマルチプライヤである。
【００３５】
ナノ構造表面で固定化分子や細胞に標的物質が結合すると、表面近傍の屈折率が変化する。ＳＰＲは試料の屈折率に依存するので、ＳＰＲ強度を測定することにより屈折率変化、したがって複合体形成の有無を解析することができる。ＳＰＲ測定用光学素子に用いる材料の屈折率は1.335-1.58が望ましく、光学素子には金薄膜または白金薄膜を形成する。
【００３６】
この出願の発明の新たな知見であるナノ構造によるＳＰＲでない一般的なＳＰＲ検出の構成においては、表面からの励起光入射ではＳＰＲが励起されず、裏面から入射による励起は入射角θが約76度に限定されていた。特にこの出願の発明のようなピラー構造体を光学素子としてＳＰＲに用いる場合は、個々のピラーにおいてそれぞれを光ガイドとして、入射光を全反射させながら基板表面に伝達すること事態は可能であっても、プリズムカップリング等による複雑な光学機構を用いても入射角θを一定に制御することは非常に困難で実現不可能であった。
【００３７】
いっぽう、この出願の発明においては、励起光を基板裏面から照射する場合、ナノ構造により非常に広い範囲の入射角でＳＰＲを励起することができるため、プリズムカップリングが不要である。また、従来、表面からの励起光照射ではＳＰＲは励起されなかったが、この出願の発明では光学素子の上面から励起光を照射した場合、ナノ構造自身がグレーティングとして作用することから、グレーティングカップリングにより基板に励起光を導入して、ＳＰＲを励起することができる。
【００３８】
すなわち、この出願の発明は入射側のカップリング素子とセンシング部がナノ構造に集積化されているため、光学系の複雑な調整は必要とせず、ＳＰＲ測定系の構成も非常に簡単である。この出願の発明は、従来の不可能とされていた集積化ピラー構造体による光学素子によるＳＰＲ検出を可能としたが、ＳＰＲ検出は標識操作が不要であり、特に多検体の同時並列分析に好適である。さらに、この出願の発明はピラー上のセンシング部のナノ構造が、従来の平坦構造で見られるnear field effect（Marowsky，G. et al.，WO99/40415，1999）によるノイズを減少させ、より高感度な検出を可能としている。
【００３９】
以下に実施例を示して説明するが、この出願の発明はこの実施例によって限定されるも
のではない。
【実施例】
【００４０】
＜実施例１＞
図１０の電子顕微鏡像に例示したように、約１００μｍ角の正方断面を有し、ポリメチルメタクリレートより基板表面からそれぞれの１００μｍの高さを有する集積化ピラー構造を有する光学素子を作成した。図１０ａは、整列配置したピラーの像を示しており、図１０ｂは、ピラー上面のナノ構造を拡大した像を示している。たとえばこのように、規則的なピラー配置が認められ、ピラー上面にナノ構造が確認された。
＜実施例２＞
この出願の発明に基づき、ＤＮＡ検出用の光学素子を有するフローセルを作成し、ナノ構造にヒトのアルコールデヒドロゲナーゼ関連遺伝子に対するＤＮＡプローブをポリリジンによって固定化した。フローセルは、あらかじめブランク試料として水を導入して４４０ｎｍおよび６０５ｎｍの入射光に対する反射光特性を観察し、試料存在下の測定に問題がないことを確認した。
【００４１】
アルコールデヒドロゲナーゼ関連遺伝子には一塩基多型が存在することが知られており、その一塩基多型部位をはさんで前後８塩基を有する１７塩基長の第１ＤＮＡプロープ（５'-CATACACTAAAGTGAAA-３'）及び第２ＤＮＡプローブ（５'-CATACACTGAAGTGAAA-３'）を５'末端から９番目の部位が上記塩基多型部位であり、第１プローブではその部位の塩基
がＡ、いっぽう第２プローブではＧとなっている。それぞれのプローブの５'末端をアミ
ノ基で修飾し、隣接するピラーのナノ構造のポリリジン表面に固定化した。いっぽう別のピラー上面のナノ構造には参照用として、何も固定化せず、この３通りのナノ構造を含む光学素子に含むフローセルを分析に供した。
【００４２】
検体試料として、ヒト血液中の白血球からヒトゲノムを抽出し、上記塩基多型部位を含む１００塩基長の領域を定法によりＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ断片は第１プローブに相補する塩基配列を有し、これを試料とし、上記フローセル中に導入して、ナノ構造に固定化されたＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせた。
【００４３】
ハイブリダイゼーション前後の反射光強度の変化を測定した結果、第１プローブを固定化したピラーの光学特性が変化し、第２プローブを固定化したピラー及び参照用ピラーの光学特性にはほとんど変化は認められなかった。これより前述の相補的塩基配列を有する試料中のＤＮＡが、固定化されている第１プローブのみと特異的に複合体を形成し、対応するナノ構造の光学特性に変化を与えたと考えられる。これより、この出願の発明の光学素子を有するフローセルにより生体分子の特異的検出が可能であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】光学素子の模式図である。それぞれ、（ａ）集積化ピラー構造体、（ｂ）集積化ウェル構造体を例示している。
【図２】ナノ構造パターンの模式図である。それぞれ、（ａ）矩形パターン、（ｂ）正弦波パターン、（ｃ）鋸状波パターン、（ｄ）三角波パターン例示している。
【図３】ピラーの集積化配置を説明した模式図である。各々、（ａ）円形、（ｂ）円形と矩形の組み合わせを例示している。
【図４】ピラーの形状とフローセル中の配向を説明した模式図である。各々、（ａ）円形−矩形の組み合わせ、（ｂ）矩形、（ｃ）円形を例示している。
【図５】集積化ピラー構造体を含むフローセルの平面模式図である。
【図６】図５Ａ−Ａ’断面に対応するフローセルの断面模式図である。（ａ）、（ｂ）ではフローセル基部の形態が異なっている。
【図７】光学的検出手段の模式図である。それぞれ、（ａ）、（ｂ）は反射測定の異なる方式を例示している。
【図８】光学検出手段の別の模式図であり、蛍光解析の方式を例示している。
【図９】光学検出、手段のさらに別の模式図であり、ＳＰＲによる方式を例示している。
【図１０】約１００μｍ角の正方断面を有し１００μｍの高さを有する集積化ピラー構造体光学素子の電子顕微鏡像である。（ａ）整列配置したピラーの像、（ｂ）ピラー上面のナノ構造を拡大した像を示している。
【符号の説明】
【００４５】
１  基板
２  ピラー
３  ピラー上面
４  ウェル底面
５  基板表面
６  ウェル
１０  光学素子
１１  試料入口
１２  試料出口
１３  フローセル蓋部
１４  フローセル基部
１５  フローセル外縁部
１６  接合面
１７  試料間隔
２０  光源
２１  ポーラライザ
２２  レンズ
２３  コリメーションレンズ
２４  検出器
２５  ピンホール
２６  カメラレンズ
２７  干渉フィルター
２８  シリンドリカルレンズ
３０  フローセル
４０  空間フィルター
４１  ビームエキスパンダー
４２  ビームスプリッター
４３  光学フィルター
４４  検出器
４５  光源
５０  光源
５１  コリメーションレンズ
５２  ポーラライザ
５３  シリンドリカルレンズ
５４  ポーラライザ
５５  コリメーションレンズ
５６  検出器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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