(57)【要約】【課題】本発明は、血圧の上昇を調節できるとされるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物及びそれを含有する組成物に関するもので、高血圧症を予防したり治療するための医薬品や医薬部外品や食品添加物や機能性食品等に広く利用できるものである。【解決手段】  【請求項３】サメ軟骨又はその処理物を蛋白質分解酵素で分解し、分解液から得られる下記（１）乃至（７）の１種若しくは２種以上のアミノ酸配列で示されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物と、当該アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物の少なくとも１つを含有する事を特徴とする食品、化粧品、医薬品又は医薬部外品。Tyr−Phe（１）、Phe−Tyr（２）、Phe−Ala（３）、Leu−Val−Gly（４）、Leu−Ile−Gly（５）、Leu−Gly−Val（６）、Ile−Val−Gly（７）。 【選択図】      図7
2005154326.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）乃至（７）の１種若しくは２種以上のアミノ酸配列で示されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物。
Tyr−Phe（１）、
Phe−Tyr（２）、
Phe−Ala（３）、
Leu−Val−Gly（４）、
Leu−Ile−Gly（５）、
Leu−Gly−Val（６）、
Ile−Val−Gly（７）。
【請求項２】
請求項１に記載するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物の１種若しくは２種以上と、無機酸若しくは有機酸若しくは無機塩基若しくは有機塩基とで形成してなる薬学的に許容される塩。
【請求項３】
サメ軟骨又はその処理物を蛋白質分解酵素で分解し、分解液から得られる下記（１）乃至（７）の１種若しくは２種以上のアミノ酸配列で示されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物。
Tyr−Phe（１）、
Phe−Tyr（２）、
Phe−Ala（３）、
Leu−Val−Gly（４）、
Leu−Ile−Gly（５）、
Leu−Gly−Val（６）、
Ile−Val−Gly（７）。
【請求項４】
請求項３に記載するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物の１種若しくは２種以上と、無機酸若しくは有機酸若しくは無機塩基若しくは有機塩基とで形成してなる薬学的に許容される塩。
【請求項５】
請求項１又は請求項３に記載するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物の１種若しくは２種以上を有効成分とすることを特徴とするアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
【請求項６】
請求項１又は請求項３に記載するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物の少なくとも１つを含有する事を特徴とする食品、化粧品、医薬品又は医薬部外品。
【請求項７】
サメ軟骨又はその処理物を蛋白質分解酵素で分解し、分解液から得られる下記（１）乃至（７）の１種若しくは２種以上のアミノ酸配列で示されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物を含む組成物。
Tyr−Phe（１）、
Phe−Tyr（２）、
Phe−Ala（３）、
Leu−Val−Gly（４）、
Leu−Ile−Gly（５）、
Leu−Gly−Val （６）、
Ile−Val−Gly（７）。
【請求項８】
サメ軟骨又はその処理物を蛋白質分解酵素と反応させて分解させ、分解液から分離処理することを特徴とする下記（１）乃至（７）の１種若しくは２種以上のアミノ酸配列で示されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物又はそれを含有する組成物の製造方法。
Tyr−Phe（１）、
Phe−Tyr（２）、
Phe−Ala（３）、
Leu−Val−Gly（４）、
Leu−Ile−Gly（５）、
Leu−Gly−Val（６）、
Ile−Val−Gly（７）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血圧の上昇を調節できるとされるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物及びそれを含有する組成物に関するもので、高血圧症を予防したり治療するための医薬品や医薬部外品や食品添加物や機能性食品等に広く利用できるものである。
【背景技術】
【０００２】
突然死を引き起こす可能性のある心筋梗塞などの冠動脈疾患の危険因子は、高血圧症、高脂血症、耐糖能低下、肥満の４つであり、死の四重奏とも言われている。当該危険因子の内の１つである高血圧症は、日本高血圧学会によれば我が国では３３００万人の患者がいるとされている。高血圧症は治療を受けずに放置しておくと、重症でない限り多くの場合無症状で進行し死に至る事が少なくない事から、サイレントキラ−と呼ばれている。このような高血圧症を改善する要請が強いため、様々な降圧剤や血圧を調節する機能性食品の開発が進められている。
【０００３】
生体において血圧を調節するメカニズムの１つには、昇圧系であるレニン−アンジオテンシン系と、降圧系であるカリクレイン−キニン系がある。前者のレニン−
アンジオテンシン系では、酵素レニンが腎臓の旁糸球体細胞から循環血液中に分泌され、肝臓で生合成され血液中に存在する基質アンジオテンシノ−ゲンに働いてアンジオテンシンＩ（Asp−Arg−Val−Tyr−Ile−His−Pro−Phe−His−Leu）を生成する。このアンジオテンシンＩをアンジオテンシンＩＩ（Asp−Arg−Val−Tyr−Ile−His−Pro−Phe）に変換する酵素は、主として血管内皮細胞や肺、腎臓近位尿細管に存在するアンジオテンシンＩ変換酵素である。このようにして生じたアンジオテンシンＩＩは、血管平滑筋を収縮させる作用がある。また、当該アンジオテンシンＩＩは副腎皮質に作用してアルドステロンの生成と分泌を促進すると共に、腎臓近位尿細管に働いて腎糸球体で濾過されたナトリウムの再吸収を高める作用がある。その結果、血圧は上昇する。
【０００４】
一方、後者のカリクレイン−キニン系では、酵素カリクレインが基質キニノ−ゲンに作用してキニンを生じる。そのキニンは血管平滑筋を拡張させて血圧を下げる働きがあるが、アンジオテンシンＩ変換酵素は当該キニンを分解する事が知られている。この様にアンジオテンシンＩ変換酵素は、昇圧系であるレニン−アンジオテンシン系の活性化と、降圧系であるカリクレイン−キニン系の不活性化を同時に行う作用を有しており、結果として血圧を上昇させる作用がある。従って、アンジオテンシンＩ変換酵素の活性を阻害する物質は、血圧の上昇を調節する事が期待できるので、各方面でこれに着目した医薬品及び機能性食品の開発が行われている。
【０００５】
アンジオテンシンＩ変換酵素阻害物質としては、1977年にOndettiらが発表したカプトプリル（D−3−メルカプト−2−メチルプロパノイル−L−プロリン）に代表される合成化合物が医薬品として実用化されている。又その他、近年、種々の食品中から多数のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドが見出され、これらの内、牛乳カゼイン、発酵乳、魚肉由来のペプチドを添加した食品が特定保健用食品として実用化されている（特許文献）。
【特許文献１】特開昭58−109425号公報（特公昭60−23085号）発明の名称「アンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤」（牛由来カゼインから得られた。）特開昭59−44323号公報（特公昭59−44324号）発明の名称「アンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤」（牛由来カゼインから得られた。）特開昭59−44324号公報（特公昭61−44324号）発明の名称「アンジオテンシン変換酵素阻害剤」（牛由来カゼインから得られた。）特開昭61−36226公報（特公昭61−51562号）発明の名称「アンジオテンシン変換酵素阻害剤」（牛由来カゼインから得られた。）特開昭61−36227公報（特公昭61−51564号）発明の名称「アンジオテンシン変換酵素阻害剤」（牛由来カゼインから得られた。）特開平5−271297号公報、発明の名称「新規ペプチド&aacute;−１０００」魚肉由来の新規ペプチド&aacute;−１０００、新規ペプチド&aacute;−１０００を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤、血圧降下剤、特定保健用食品、その製造方法。
【０００６】
上述のようにアンジオテンシン変換酵素阻害物質は既に多数報告されているが、医薬品にあっては合成法で作られているため高価である。又、合成法で作られている当該アンジオテンシン変換酵素阻害物質は、強力な降圧作用を有するものの用量が不適切であると腎機能障害や低血圧をもたらす事から、医師の管理下において慎重に使用する事が求められている。
【０００７】
一方、食品由来のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドは数多く知られているが、これらの中で実用化されているものは、上述の如くごく僅かである。その理由としては、経口摂取時の作用効果が弱かったり、味、臭い、色等にそれぞれ特徴があって、実用に適していない事が多い等が挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、血圧の上昇を調節できる食品由来のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物質ペプチドを見つけ出すべく鋭意研究を進めたところ、サメ軟骨を蛋白質分解酵素で処理した蛋白質分解酵素処理物がアンジオテンシンＩ変換酵素を強く阻害することに気付き、当該蛋白質分解酵素処理物中に７種類の強力なアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドを見出した。
【０００９】
それは、下記（１）乃至（７）のアミノ酸配列で示されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物であった。
Tyr−Phe（１）、
Phe−Tyr（２）、
Phe−Ala（３）、
Leu−Val−Gly（４）、
Leu−Ile−Gly（５）、
Leu−Gly−Val（６）、
Ile−Val−Gly（７）。
【００１０】
上記７種類のアミノ酸配列で示されるペプチド化合物のうち、特に（５）のLeu−Ile−Glyは、文献未記載の新規なペプチド化合物である。その他の６種類のペプチド化合物は、蛋白質分解酵素処理法やペプチド合成や遺伝子工学手法等により得られることが報告されているが、Phe−Tyrを除いて、それらにアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性があるとの報告はされていない。
【００１１】
そこで本発明者らは、これらサメ軟骨由来の７種類のアミノ酸配列で示されるペプチド化合物について、そのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を測定したところ、それぞれに血管内への吸収性、安定性、安全性が高い強力なアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有することを新たに見出した。そこで、発明者らは、このサメ軟骨由来のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチド化合物を利用して、高血圧症を改善したり治療するための医薬品（医薬原料を含む）や医薬部外品や食品添加物や機能性食品等を開発し提供せんとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、上記課題を解決する為に、サメ軟骨の蛋白質分解酵素処理物中に存在する７種の強力なアンジオテンシンＩ変換酵素
阻害ペプチドを見出し、これを利用してアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチド化合物又はそれを含有するペプチド組成物とそれらの製造方法の発明を完成するに至ったものである。
【００１３】
本発明は、Tyr−Phe（１）、Phe−Tyr（２）、Phe−Ala（３）、Leu−Val−Gly（４）、Leu−Ile−Gly（５）、Leu−Gly−Val（６）、Ile−Val−Gly（７）のアミノ酸配列で示されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物、及びその薬学的に許容される塩、当該化合物の少なくとも１つを有効成分とする事を特徴とするアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤、少なくとも一つを含有するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物を含む組成物、更には当該化合物の少なくとも１つを含有する事を特徴とする食品、医薬品、又は医薬部外品を具現化したものである。
【００１４】
尚、本明細書中で、Tyrはタイロシン、Pheはフェニルアラニン、Alaはアラニン、Leuはロイシン、Valはバリン、Glyはグリシン、Ileはイソロイシンを意味し、その他のアミノ酸残基を表す各記号もアミノ酸化学における慣用の表示法に基づくものである。又、これらアミノ酸は特に表記しない限りは何れもＬ体である。
【００１５】
即ち、特許を受けようとする第１発明は、下記（１）乃至（７）の１種若しくは２種以上のアミノ酸配列で示されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物である。
Tyr−Phe（１）、
Phe−Tyr（２）、
Phe−Ala（３）、
Leu−Val−Gly（４）、
Leu−Ile−Gly（５）、
Leu−Gly−Val（６）、
Ile−Val−Gly（７）。
【００１６】
当該第１発明に係る７種類のアミノ酸配列で示されるペプチド化合物は、それぞれに血管内への吸収性、安定性、安全性が高い強力なアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有している。従って、そのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物の１種でもよいし、２種以上を適宜組み合せたペプチド化合物であってもよい。
【００１７】
また、当該第１発明に係る７種類のアミノ酸配列で示されるペプチド化合物は、当該化合物と同じアミノ酸配列を有する蛋白質から上記と同様の蛋白質分解酵素処理にても得られるが、これらのペプチドはアミノ酸を段階的に導入する一般的な有機化学的液相又は固相法によるペプチド合成や遺伝子工学手法等によっても得る事ができる。
【００１８】
本発明において用いられる蛋白質分解酵素としては、例えばBacillus属（例えばBacillus  subtilis、Bacillus  thermoproteolyticus、Bacillus  licheniformis等）の産生する酵素、Aspergillus属（例えばAspergillus  oryzae、Aspergillus  niger、Aspergillus  mellens等）の産生する酵素、Rhizopus属（例えばRhizopus  niveus、Rhizopus  delemar等）の産生する酵素、ペプシン、パンクレアチン、パパイン等が挙げられる。これらの酵素は単独、又は２種以上を組み合わせてもよい。
【００１９】
特許を受けようとする第２発明は、第１発明に記載するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性のペプチド化合物の１種若しくは２種以上と、無機酸若しくは有機酸若しくは無機塩基若しくは有機塩基とで形成してなる薬学的に許容される塩である。
【００２０】
当該第２発明も、由来を問わずに得られた（蛋白質分解酵素処理やペプチド合成や遺伝子工学手法で得られるものを含む。）アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物とその薬学的に許容される塩である。当該ペプチド化合物には、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有することを、新たに見出し、本発明を完成したものである。
【００２１】
本発明で得られるペプチド化合物は必要に応じて無機酸若しくは有機酸との塩や無機塩基若しくは有機塩基との塩を形成させる事ができるが、薬学的に許容される塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、p− トルエンスルホン酸塩、更にはシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、又はフマル酸等のジカルボン酸との塩、更に、酢酸、プロピオン酸、又は酪酸等のモノカルボン酸との塩等を挙げる事ができる。又、本発明で得られるペプチド化合物の塩の形成に適した無機塩基は、例えば、アンモニア、ナトリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム等の水酸化物、炭酸塩及び重炭酸塩等である。有機塩基と
の塩としては、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミンの様なモノ−、ジ−及びトリ−アルキルアミン塩、モノ−、ジ−及びトリ−ヒドロキシアルキルアミン塩、グアニジン塩、N −メチルグルコサミン塩等を挙げる事ができる。
【００２２】
特許を受けようとする第３発明は、サメ軟骨又はその処理物を蛋白質分解酵素で分解し、分解液から得られる下記（１）乃至（７）の１種若しくは２種以上のアミノ酸配列で示されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物である。
Tyr−Phe（１）、
Phe−Tyr（２）、
Phe−Ala（３）、
Leu−Val−Gly（４）、
Leu−Ile−Gly（５）、
Leu−Gly−Val（６）、
Ile−Val−Gly（７）。
【００２３】
当該第３発明から以下第8発明は、サメ軟骨又はその処理物を蛋白質分解酵素で分解し、分解液から得られる（１）乃至（７）のアミノ酸配列で示されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物とその薬学的に許容される塩である。
【００２４】
当該第３発明に係る７種類のアミノ酸配列で示されるペプチド化合物は、それぞれ強力なアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有しており、その１種でもよいし、２種以上を適宜組合せた当該ペプチド化合物であってもよいこと勿論である。
【００２５】
ここで当該ペプチド化合物を得るサメの種類は特に限定されないが、ヨシキリザメ(Prionace  glauca)、ネズミザメ（Lamna  ditropis）、ネコザメ（Heterodontus  japonicus）、アオザメ（Isurus  oxyrinchus）、アカシュモクザメ（Sphyrna  lewini）、メジロザメ（Carcharhinus  plumbeus）、ホシザメ（Mustelus  manazo）、マオナガ（Alopias  valpinus）、ヒラガシラ（Rhizoprionodon  acutus）、フジクジラ（Etmopterus  lucifer）等が好適に用いられる。
【００２６】
また、当該第３発明における蛋白質分解酵素は、第１発明の説明に記載したのと同様の蛋白質分解酵素であり、これらの酵素は単独、又は２種以上を組合わせてもよいこと勿論である。
【００２７】
特許を受けようとする第４発明は、第３発明に記載するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物の１種若しくは２種以上と、無機酸若しくは有機酸若しくは無機塩基若しくは有機塩基とで形成してなる薬学的に許容される塩である。
【００２８】
当該第４発明は、第３発明に記載する７種類のアミノ酸配列で示されるペプチド化合物の薬学的に許容される塩の１種でもよいし、２種以上を適宜組み合せたペプチド化合物の薬学的に許容される塩である。
【００２９】
特許を受けようとする第５発明は、第１発明又は第３発明に記載するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物の１種若しくは２種以上の有効成分とすることを特徴とするアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤である。
【００３０】
特許を受けようとする第６発明は、第１発明又は第３発明に記載するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物の少なくとも１つを含有する事を特徴とする食品、化粧品、医薬品又は医薬部外品である。
【００３１】
本発明で得られるペプチド化合物は必要に応じて適宜賦形剤等の添加剤と混合して例えば注射剤、経口用液剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、坐剤、軟膏、点鼻剤、貼付剤等の形態で製剤化する事ができる。
【００３２】
上記の各種製剤で用いられる添加剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、乳糖、デキストリン、デンプン類、メチルセルロ−ス、脂肪酸グリセリド類、水、プロピレングリコ−ル、マクロゴ−ル類、アルコ−ル、結晶セルロ−ス、ヒドロキシプロピルセルロ−ス、低置換度ヒドロキシプロピルセルロ−ス、カルメロ−ス類、ポピドン、ポリビニルアルコ−ル、ステアリン酸カルシウム等を挙げる事ができる。この際、必要に応じて、着色剤、安定化剤、抗酸化剤、防腐剤、pH 調節剤、等張化剤、溶解補助剤及び／又は無痛化剤等を添加する事ができる。顆粒剤、錠剤、又はカプセル剤は、コ−ティング基剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロ−ス、ヒドロキシプロピルメチルセルロ−スフタレ−ト等によってコ−ティングする事もできる。これらの製剤は本発明で得られるペプチド化合物を0.01%以上、好ましくは0.1
〜70%の割合で含有する事ができる。
【００３３】
製剤の調製に際しては必要に応じメント−ル、クエン酸及びその塩類、香料等の矯臭剤を用いる事ができる。更に、本発明で得られるアンジオテンシンＩ変換酵素
阻害剤は治療上有用な他の成分、例えばカプトプリル、エナラプリル等の公知の降圧剤を含有、又は併用する事もできる。
【００３４】
本発明で得られるペプチド化合物の少なくとも１つを有効成分とする事を特徴とするアンジオテンシンＩ変換酵素
阻害剤はヒトを含めた哺乳動物に経口的又は非経口的（例えば経皮、静脈内、腹腔内等）に投与される。投与量は動物種、対象となる患者の人種、性別、症状、体重、年齢、血圧の程度、投与方法等によって異なり一概には言えないが、一般的なヒトの成人に経口投与する場合は、通常、１日につき体重１kgあたり0.1〜200mg、好ましくは1〜150mgであり、これを通常１日１回又は２〜３回に分けて投与する。しかしながらその投与量は症状の程度に応じ適宜選択する事ができる。
【００３５】
本発明のペプチド化合物は優れたアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有し、血圧降下作用、ブラジキニン不活性化抑制作用を示す。しかも本発明で得られるペプチド化合物は臭い、味、色に特異な厭味が認められない事から経口摂取が容易である。その為、本発明で得られるペプチド化合物、あるいは組成物を、医薬品としてだけでなく、例えば、ゼリ−、飴、顆粒菓、錠菓、飲料、ス−プ、麺、煎餅、和菓子、洋菓子、冷菓、焼き菓子等の食品に配合、添加し提供する事ができるし、化粧品又は医薬部外品として提供することもできる。
【００３６】
特許を受けようとする第７発明は、サメ軟骨又はその処理物を蛋白質分解酵素で分解し、分解液から得られる下記（１）乃至（７）の１種若しくは２種以上のアミノ酸配列で示されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物を含む組成物である。
Tyr−Phe（１）、
Phe−Tyr（２）、
Phe−Ala（３）、
Leu−Val−Gly（４）、
Leu−Ile−Gly（５）、
Leu−Gly−Val（６）、
Ile−Val−Gly（７）。
【００３７】
特許を受けようとする第８発明は、サメ軟骨又はその処理物を蛋白質分解酵素と反応させて分解させ、分解液から分離処理することを特徴とする下記（１）乃至（７）の１種若しくは２種以上のアミノ酸配列で示されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物又はそれを含有する組成物の製造方法である。
Tyr−Phe（１）、
Phe−Tyr（２）、
Phe−Ala（３）、
Leu−Val−Gly（４）、
Leu−Ile−Gly（５）、
Leu−Gly−Val（６）、
Ile−Val−Gly（７）。
【００３８】
本発明に係るペプチド化合物を、サメ軟骨又はその処理物より製造する方法を具体的に説明する。サメ軟骨又はその処理物を蛋白質分解酵素にて分解する方法は、常法に従って行う。例えば所望によりサメ軟骨を粉砕後、精製水を加え、必要に応じてｐHと温度を至適値に調整し適当な蛋白質分解酵素を添加してインキュベ−トする。次いで必要に応じて中和した後、酵素を失活させて酵素分解液を得る。分解液を例えば濾紙及び／又は濾過助剤等を用いて濾過する事によって不溶物を除去し、得られた濾液を限外濾過等で処理して分子量５〜１万以下の粗ペプチド画分を得る。得られた粗ペプチド画分は必要に応じて活性炭処理、濾過後濃縮して粗ペプチド混合物を得る。粗ペプチド混合物は所望により液液分配等を経てカラムクロマトグラフィ−にて分画し、優れたアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物を得ることができる。
【発明の効果】
【００３９】
本発明により得られたペプチド化合物は、強いアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有し、強い血圧降下作用、ブラジキニン不活性化抑制作用を示す。従って本発明は、例えば本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧等の高血圧症の予防、治療剤、これら疾患の診断薬、各種病態で用いられる降圧剤、心筋梗塞の減少、うっ血性心不全における病態の改善剤等として有用である。
【００４０】
また、本発明で得られるペプチド化合物は、臭い、味、色に特異な厭味が認められない事から経口摂取が容易である。その為、本発明で得られるペプチド化合物、あるいは当該化合物を含有する各種製剤を、例えば、ゼリ−、飴、顆粒菓、錠菓、飲料、ス−プ、麺、煎餅、和菓子、洋菓子、冷菓、焼き菓子等の食品に配合、添加し提供する事ができる。上記の様な有用な作用を有する健康食品や特定保健用食品、機能性食品としての利用が可能である。更に、化粧品や医薬部外品としても提供することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下、本発明の実施例について詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。サメ軟骨又はその処理物を蛋白質分解酵素で分解し、分解液から得られるTyr−Phe（１）、Phe−Tyr（２）、Phe−Ala（３）、Leu−Val−Gly（４）、Leu−Ile−Gly（５）、Leu−Gly−Val（６）、Ile−Val−Gly（７）の１種若しくは２種以上のアミノ酸配列で示されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物である。
【実施例１】
【００４２】
＜製造例１＞アンジオテンシンＩ変換酵素 阻害ペプチド化合物の製造
ヨシキリザメ（Prionace glauca）軟骨3kgを粉砕、精製水9kgを加え55℃に加温した後、パパイン（Carica  Papaya）7.5gを添加して14時間攪拌し酵素分解反応を行った。反応液を95℃に加温して酵素活性を失活させ、冷却後、中間孔径7ミクロンのセライトを用いて濾過した。濾液を限外濾過膜（ロミコンHF1.0−43−PM50）を透過させて分子量５万以上の画分を除いた後、噴霧乾燥してアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチド混合物260gを得た。
【００４３】
上記の方法により得たアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチド混合物粗体を下記条件でＨＰＬＣ分析したところ図７に示すようなクロマトグラムを得た。
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム          Waters μBONDASPHERE C18  
3.9×150mm
カラム温度      40℃
移動相Ａ        Ｈ2Ｏ(0.1TFA含有)
移動相Ｂ        アセトニトリル(0.1TFA含有)
グラジエント    0〜60分にかけてＡ液5％からＢ液40％へのリニアグラジェント60〜75分にかけてＢ液40％
分析時間        75分
流量            0.4ml/min
注入量          15μL
検出            ＵＶ220nm
【００４４】
その結果、図７に示すように、サメ軟骨を蛋白質分解酵素で処理した蛋白質分解酵素処理物から得たアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチド混合物粗体中に７種類の強力なアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドが含まれていることを確認した。
Tyr−Phe（１）、
Phe−Tyr（２）、
Phe−Ala（３）、
Leu−Val−Gly（４）、
Leu−Ile−Gly（５）、
Leu−Gly−Val（６）、
Ile−Val−Gly（７）。
【００４５】
そこで、前記ペプチド混合物粗体中に含有している７種類の強力なアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドの夫々を分離処理することとした。
【００４６】
まず、上記ペプチド混合物60.0gを水1200mLに溶解させ1M 塩酸にてｐHを2.0に調整した。この水溶液をｎ−ブタノ−ル1200mLで抽出し、水層を更にｎ−ブタノ−ル600mLで2回抽出した。ｎ−ブタノ−ル層を減圧下濃縮して抽出物10.3gを得た。
【００４７】
この抽出物5.78gを
シリカゲルカラムクロマトグラフィ−（富士シリシア化学、BW−820MH、展開溶媒：n−ブタノ−ル−ピリジン−水−酢酸10:1:2:1）、
シリカゲルカラムクロマトグラフィ−（BW−820MH、展開溶媒：エタノ−ル−水10:1）、
イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィ−（アルドリッチ、Amberlite（商標）CG−50、展開溶媒：メタノ−ル）、
シリカゲルカラムクロマトグラフィ−（関東化学、シリカゲル60N  フラッシュクロマトグラフィ−用、展開溶媒：n−ブタノ−ル−エタノ−ル−クロロホルム−5％  アンモニア水6：4：2：1）
にて分画し、高いアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を示す画分A：45mg及び画分B：30mgを得た。
【００４８】
画分A：29mgを、5％塩化水素−メタノ−ル0.87mLに溶解し、室温にて20時間静置した後、減圧下濃縮乾固して、残留物を32mg得た。
【００４９】
これをシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（BW−820MH、展開溶媒：n−ブタノ−ル−エタノ−ル−クロロホルム−水8:1:2:1）にて分離し、画分A2：6.6mgを得た。画分A2：4.3mgを水0.22mLに溶解した後、炭酸水素ナトリウム4.5mgを加えた。これにベンジルオキシカルボニル（以下Zと略記する）クロリド3.8&micro;Lのテトラヒドロフラン溶液43&micro;Lを滴加し、室温にて6時間攪拌後、テトラヒドロフランを留去した。酢酸エチル0.2mLで2回抽出し、合わせた有機層を減圧下濃縮乾固して残留物を6.5mg得た。
【００５０】
これをシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（BW−820MH、展開溶媒：トルエン−酢酸エチル2:1及び5:1）にて分離し画分A3：0.8mgを得た。製造例４に記載の合成化合物と1H−NMRを比較した結果、画分A3の構造をZ−Tyr(Z)−Phe−メチルエステル（以下、OMeと略記する）と確定した。当該画分A3から一般的有機化学手法によりTyr−Pheを得る事ができる。このTyr−Pheは、Biochimica  et  Biophysica  Acta(1980),625(2),266−273に記載されたペプチド化合物と同一である事が判明したが、そのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性は報告されていない。
【実施例２】
【００５１】
次に、画分B：23mgを5％塩化水素−メタノ−ル0.70mLに溶解し、室温にて16時間静置したのち、減圧下濃縮乾固して、残留物を28mg得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（BW−820MH、展開溶媒：n−
ブタノ−ル−エタノ−ル−クロロホルム−水8:1:2:1）にて分離し、画分B2：4.6mg、B3：6.1mgを得た。画分B2：3.5mgを水0.25mLに溶解したのち、炭酸水素ナトリウム7.3mgを加えた。これにZクロリド6.2&micro;Lのテトラヒドロフラン溶液31&micro;Lを滴加し、室温にて5時間攪拌した後、テトラヒドロフランを留去した。その後、酢酸エチル0.3mLで2回抽出し、合わせた有機層を減圧下濃縮乾固して残留物を5.8mg得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（BW−820MH、展開溶媒：トルエン−酢酸エチル1:1）にて分離し、画分B21：0.4mgを得た。当該合成化合物と1H−NMRを比較した結果、画分B21の構造をZ−Leu−Ile−Gly−OMeと確定した。画分B21から一般的有機化学手法によりLeu−Ile−Glyを得る事ができる。Leu−Ile−Glyは文献未記載の新規ペプチド化合物である。
【実施例３】
【００５２】
次に、画分B3：5.1mgを水0.25mLに溶解したのち、炭酸水素ナトリウム5.4mgを加えた。これにZクロリド4.6&micro;Lのテトラヒドロフラン溶液25&micro;Lを滴加し、室温にて4時間攪拌した後、テトラヒドロフランを留去した。その後、酢酸エチル0.2mLで2回抽出し、合わせた有機層を減圧下濃縮乾固して残留物を7.0mg得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（BW−
820MH、展開溶媒：トルエン−酢酸エチル1:1→トルエン−酢酸エチル1:3）にて分離し、画分B31：0.7mg、画分B32：1.0mgを得た。製造例５に記載の合成化合物と1 H− NMRを比較した結果、画分B31の構造をZ−Phe−Ala−OMeと確定した。当該画分B31から一般的有機化学手法によりPhe−Alaを得る事ができる。当該Phe−AlaはScience，(1981)212(4499),1153−1155に記載されたペプチド化合物と同一である事が判明したが、そのアンジオテンシンＩ変換酵素
阻害活性は報告されていない。、
【実施例４】
【００５３】
また、前記の方法で得た画分B32の構造をZ−Leu−Val−Gly−OMeと確定した。当該画分B32から一般的有機化学手法によりLeu−Val−Glyを得る事ができる。このLeu−Val−GlyはJournal  of  Experimental  Medicine(1985),161(4),805−815に記載されたペプチド化合物と同一である事が判明したが、そのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性は報告されていない。
【実施例５】
【００５４】
上記と同様の方法により、画分Aと画分Bとの混合物0.12gを得た。これを5％塩化水素−メタノ−ル3.6mLに溶解し、室温にて24 時間静置した後、減圧下濃縮乾固して、残留物を0.13g得た。これを33%ジオキサン水4.0mLに溶解し、炭酸水素ナトリウム0.11gとZクロリド92&micro;Lを加えて室温にて16時間攪拌した。溶媒を取り除き残留物を95mg得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（関東化学、シリカゲル60N  フラッシュクロマトグラフィ−用、展開溶媒：トルエン−酢酸エチル2:1→トルエン−酢酸エチル1:3→酢酸エチル→メタノ−ル）にて分離し、Z−Phe−Tyr(Z)−OMeとZ−Tyr(Z)−Phe−OMeの混合物10mg、及びZ−Phe−Tyr−OMeとZ−Tyr−Phe−OMeの混合物2.3mgを得た。尚、これらの構造は製造例３及び製造例４に記載の合成化合物と1H−NMRを比較し確定した。これらから、一般的有機化学手法によりそれぞれPhe−Tyr、Tyr−Pheを得る事ができる。Phe−TyrはJournal  of  Nutritional  Biochemistry(1998),9(7),415−419にニンニク由来のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドとして報告されている化合物と同一である事が判明した。
【実施例６】
【００５５】
アンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチド混合物粗体を下記条件でＨＰＬＣ分析したところ図７のクロマトグラムを得た。そこで、ＨＰＬＣ条件にて、Leu−Gly−Valを分取したうえ、これを製造法８で合成した表品と比較して、その構造を決定した。しかるにこのLeu−Gly−ValについてアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性は報告されていない。
【実施例７】
【００５６】
＜製造例２＞Phe−Tyrの合成
Z−Phe−Tyr  30mgをジオキサン1.2mLに溶解し、水0.6mLを加えた。10％パラジウム−炭素6mgを加えた後、水素雰囲気下４時間攪拌した。綿栓濾過にて触媒を取り除いた後、濾液を減圧下で濃縮乾固して残留物を24mg得た。これをG−25カラムクロマトグラフィ−（1.2g、展開溶媒：水−酢酸20:1、1分画0.3mL）にて精製して、Phe−Tyrを17mg得た（収率81%）。
【実施例８】
【００５７】
＜製造例３＞Z−Phe−Tyr(Z)−OMeの合成
Z−Phe−Tyr  10mgを5 ％塩化水素メタノ−ル溶液0.50mLに溶解し、室温にて2時間静置した後、減圧下濃縮乾固してZ−Phe−Tyr−OMeを10mg得た（収率定量的）。Z−Phe−Tyr−OMe
10mgをテトラヒドロフラン0.50mLに溶解し、0℃にてトリエチルアミン7&micro;LとZクロリド6&micro;Lを加えて、室温にて30分間攪拌した。減圧下で濃縮してテトラヒドロフランを留去した後、酢酸エチル2mL、水0.5mL、飽和硫酸水素カリウム水溶液0.2mLを加えて、有機層を分離した。水層を酢酸エチル1mLで1回抽出した後、合わせた有機層を減圧下で濃縮乾固した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（BW−
820MH  1.0g 、トルエン−酢酸エチル4:1、1分画0.5mL）にて精製し、Z−Phe−Tyr(Z)−OMeを6.2mg得た（収率48%）。
【実施例９】
【００５８】
＜製造例４＞Z−Tyr(Z)−Phe−OMeの合成
Tyr−Phe  20mgを5％塩化水素メタノ−ル溶液0.60mLに溶解し、室温にて12
時間静置した後、減圧下濃縮乾固してTyr−Phe−OMe・HClを23mg得た（収率定量的）。当該Tyr−Phe−OMe・HCl  23mgをジクロロメタン0.60mLに溶解し、0℃にてトリエチルアミン23&micro;LとZクロリド21&micro;Lを加えて、室温にて3.5 時間攪拌した。トリエチルアミン23&micro; Lを追加して室温にて30 分間撹拌し、減圧下濃縮してジクロロメタンを留去した後、酢酸エチル2mL、飽和硫酸水素カリウム水溶液0.5mLを加えて、有機層を分離した。水層を酢酸エチル1mLで1回抽出した後、合わせた有機層を減圧下濃縮乾固した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（BW−820MH  1.9g、クロロホルム−酢酸エチル10:1、1分画1mL）にて精製し、Z−Tyr(Z)−Phe−OMeを11mg得た（収率30%）。
【実施例１０】
【００５９】
＜製造例５＞Z−Phe−Ala−OMe及びPhe−Alaの合成
Phe  0.31gを水3.1mLに懸濁し、0℃にて炭酸水素ナトリウム0.32gとZクロリド0.27mLを加えた。0℃にて1時間、室温にて18時間攪拌した。ジエチルエ−テル4mLで1回洗浄し、2M塩酸3mLを加えて、酢酸エチル8mLで1回抽出し、減圧下で濃縮乾固して、Z−Pheを0.49g得た（収率88%）。Z−Phe  0.49gをテトラヒドロフラン15mLに溶解し、市販のAla−OMe・HCl  0.22gを加えた。0℃にて1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（以下、EDCI・HClと略記する）0.31g、トリエチルアミン0.22mLを加えて、0℃にて2時間、室温にて63時間攪拌した。水2mLを加えた後、減圧下で濃縮してテトラヒドロフランを留去した。酢酸エチル20mL、水1mL、飽和硫酸水素カリウム水溶液0.5mLを加えて、有機層を分離した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液4mLで1回、飽和塩化ナトリウム水溶液4mLで1回洗浄し、減圧下で濃縮乾固した。
【００６０】
残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（BW−820MH  15g、トルエン−酢酸エチル  3:2、1分画4mL）にて精製し、Z−Phe−Ala−OMeを0.34g得た（収率53％）。Z−Phe−Ala−OMe  0.15gをテトラヒドロフラン6mLに溶解した後、水1.5mLを加えた。更に、水酸化リチウム9mgを加えて、室温にて2.5時間攪拌した後、水酸化リチウム1mgを追加して、室温にて6時間攪拌した。水酸化リチウム1mgを追加して、更に室温にて10時間攪拌した後、減圧下で濃縮乾固した。残留物に酢酸エチル5mL、水1mL、飽和硫酸水素カリウム水溶液0.5mLを加えて、有機層を分離した。水層を酢酸エチル2mLで1回抽出した後、合わせた有機層を減圧下で濃縮乾固して、Z−Phe−Alaを0.14g得た（収率定量的）。
【００６１】
Z−Phe−Ala  50mgをジオキサン2mLに溶解し、水1mLを加えた。10％パラジウム−炭素10mgを加えた後、水素雰囲気下で3時間攪拌した。綿栓濾過にて触媒を取り除いた後、濾液を減圧下で濃縮乾固して残留物を38mg得た。これをG−25カラムクロマトグラフィ−（1.2g、水のみ、1分画0.4mL）にて精製して、Phe−Alaを32mg得た（収率定量的）。
【実施例１１】
【００６２】
＜製造例６＞Z−Leu−Val−Gly−OMe及びLeu−Val−Glyの合成
Val  0.25gを水2.5mLに懸濁し、0℃にて炭酸水素ナトリウム0.35gとZクロリド0.30mLを加えた。0℃にて1時間、室温にて18時間攪拌した。ジエチルエ−テル4mLで1回洗浄し、2M塩酸3mLを加えて、酢酸エチル8mLで1回抽出し、減圧下濃縮乾固して、Z−Valを0.54g得た（収率定量的）。
【００６３】
当該Z−Val  0.54gをテトラヒドロフラン16mLに溶解し、市販のGly−OMe・HCl  0.30gを加えた。0℃にてEDCI・HCl  0.49g、トリエチルアミン0.36mLを加えて、0℃にて2時間、室温にて17時間攪拌した。水2mLを加えた後、減圧下濃縮してテトラヒドロフランを留去した。酢酸エチル15mL、水2mL、飽和硫酸水素カリウム水溶液0.5mLを加えて、有機層を分離した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液3mLで1回、飽和塩化ナトリウム水溶液3mLで1回洗浄し、減圧下濃縮乾固した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（BW−820MH  13g、トルエン−酢酸エチル3:2、1分画4mL）にて精製し、Z−Val−Gly−OMeを0.32g得た（収率46
％）。Z−Val−Gly−OMe 73mgを33%臭化水素−酢酸溶液0.51mLに溶解し、室温にて2.5時間静置した後、減圧下濃縮した。
【００６４】
残留物にジエチルエ−テル2mLを加え、良く振とうして静置した後、上澄み液を取り除いて、メタノ−ル1mLに溶解した。この溶液のpHは4であった。これを減圧下濃縮乾固して、クル−ドのVal−Gly−OMe・HBrを69mg得た（粗収率113％）。Val−Gly−OMe・HBr  68mgに、Z−Leu  67mgのテトラヒドロフラン溶液2mLを加えた。0℃にてEDCI・HCl
58mg、トリエチルアミン42&micro;Lを加えて、0℃にて2時間、室温にて24時間攪拌した。水1mLを加えた後、減圧下濃縮してテトラヒドロフランを留去した。酢酸エチル4mL、水1mL、飽和硫酸水素カリウム水溶液0.2mLを加えて、有機層を分離した後、減圧下で濃縮乾固した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（BW−820MH  4.3g、トルエン−酢酸エチル1:1、1分画1.5mL）にて精製し、Z−Leu−Val−Gly−OMeを39mg得た（収率35
％）。
【００６５】
Z−Leu−Val−Gly−OMe 30mgをテトラヒドロフラン1.2mLに溶解した後、水0.3mLを加えた。水酸化リチウム2mgを加えて、室温にて1.5時間攪拌した後、減圧下濃縮乾固した。残留物に酢酸エチル1mL、水0.3mL、飽和硫酸水素カリウム水溶液0.1mLを加えて、有機層を分離した。水層を酢酸エチル1mLで1回抽出した後、合わせた有機層を減圧下で濃縮乾固して、Z−Leu−Val−Glyを29mg得た（収率定量的）。
【実施例１２】
【００６６】
Z−Leu−Val−Gly  28mgをジオキサン1.2mLに溶解し、水0.6mLを加えた。10％パラジウム−炭素6mgを加えた後、水素雰囲気下で4時間攪拌した。綿栓濾過にて触媒を取り除いた後、濾液を減圧下で濃縮乾固して残留物を23mg得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（BW−820MH1.2g、n−ブタノ−ル−エタノ−ル−クロロホルム−水を6:4:2:1、1分画0.6mL）にて精製して、Leu−Val−Glyを10mg得た（収率52％）。
【実施例１３】
【００６７】
＜製造例７＞Z−Leu−Gly−Val−OMe 及びLeu−Gly−Valの合成
タ−シャリ−ブトキシカルボニルオキシ（以下Bocと略記する）−Gly  0.88gをテトラヒドロフラン26mLに溶解し、市販のVal−OMe・HCl  0.84gを加えた。0℃にてEDCI・HCl  0.96g、トリエチルアミン0.69mLを加えて、0℃にて2時間、室温にて20時間攪拌した。水5mLを加えた後、減圧下濃縮してテトラヒドロフランを留去した。酢酸エチル30mL、飽和硫酸水素カリウム水溶液1mLを加えて、有機層を分離した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液5mLで1回洗浄し、減圧下で濃縮乾固した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（BW−820MH
14g、トルエン−酢酸エチル1:1、1分画4mL）にて精製し、Boc−Gly−Val−OMeを1.2g得た（収率86％）。
【００６８】
Boc−Gly−Val−OMe  0.50gをトリフルオロ酢酸5.0mLに溶解し、室温にて20分間静置した後、減圧下濃縮乾固して、Gly−Val−OMe・TFAを0.64g得た（粗収率123%）。Gly−Val−OMe・TFA  0.64gにZ−Leu0.43gのテトラヒドロフラン溶液13mLを加えた。0℃にてEDCI・HCl  0.40g
、トリエチルアミン0.29mLを加えて、0℃にて2時間、室温にて14 時間攪拌した。水2mLを加えた後、減圧下で濃縮してテトラヒドロフランを留去した。酢酸エチル15mL、水2mL、飽和硫酸水素カリウム水溶液0.5mLを加えて、有機層を分離した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液3mLで1回洗浄し、減圧下濃縮乾固した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（BW−820MH  23g、トルエン−酢酸エチル1:2、1分画8mL）にて精製し、Z−Leu−Gly−Val−OMeを0.59g得た（収率84
％）。
【００６９】
Z−Leu−Gly−Val−OMe  100mgをテトラヒドロフラン4mLに溶解した後、水1mLを加えた。水酸化リチウム6mgを加えて、室温にて16時間攪拌した後、水酸化リチウム3mgを追加して、室温にて6時間攪拌した。それに水酸化リチウム2mgを追加して、更に室温にて22
時間攪拌した後、減圧下で濃縮乾固した。残留物に酢酸エチル3mL、水1mL、飽和硫酸水素カリウム水溶液0.5mLを加えて、有機層を分離した。水層を酢酸エチル2mLで1回抽出した後、合わせた有機層を減圧下濃縮乾固して、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（BW−820MH  5.0g、酢酸エチルのみ、1分画1mL）にて精製し、70％程度の純度のZ−Leu−Gly−Valを31mg得た（収率23％）。
【実施例１４】
【００７０】
更に、70％程度の純度のZ−Leu−Gly−Val  29mgをジオキサン1.2mLに溶解し、水0.6mLを加えた。10％パラジウム−炭素6mgを加えた後、水素雰囲気下で4時間攪拌した。綿栓濾過にて触媒を取り除いた後、濾液を減圧下で濃縮乾固して残留物を22mg得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（BW−820MH  1.1g、n−ブタノ−ル−エタノ−ル−クロロホルム−水6:4:2:1、1分画0.4mL）にて精製して、純粋なLeu−Gly−Valを8mg得た（収率
36％）。Leu−Gly−Valは特表2003−504062号に記載されたペプチド化合物と同一である事が判明したが、そのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性は報告されていない。
【００７１】
＜試験例１＞アンジオテンシンＩ変換酵素阻害物質の阻害活性の測定
アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物の阻害性の測定は、Cushmann らの方法（Biochemical Pharmacology,20,1637− 1648（1971 ）を一部改変して行った。
【００７２】
即ち、1.5mLエッペンドルフチュ−ブに5mMのBenzoyl−Glycyl−L−Histidyl−L−Leucine（ペプチド研究所製）の0.2Mホウ酸−リン酸カリウム緩衝液（0.4MのNaCl含有、pH8.3）を250μL、所定濃度に調製した供試化合物水溶液30μLを加え、37℃で5分間プレインキュベ−ションした。この溶液に対して、アンジオテンシンＩ変換酵素
（ウサギ肺由来、シグマ社製、酵素番号EC3.4.15.1）溶液（60mU/mL 0.2M  ホウ酸−リン酸カリウム緩衝液）を添加し、酵素反応を開始した。37℃で60分間、シェ−カ−バス内で100rpmにて反応を行った後、1N塩酸250μLを加え、反応を停止した。これに酢酸エチル580μLを加え、45秒間振とうさせた後、3000rpm
、10分間遠心分離を行い、上清の酢酸エチル層を500μL採取した。水層へ更に520μLの酢酸エチルを加え、２０秒間振とうさせた後、3000rpmで10分間遠心分離を行い、上清の酢酸エチル層を500μL採取した。この操作を再度繰返し、得られた酢酸エチル層合計1.5mL
を遠心エバポレ−タ−にて3000rpmで30分間、減圧条件下にて乾固し、酢酸エチルを完全に除去した。乾固物を高速液体クロマトグラフィ−緩衝液（20 ％アセトニトリル/0.1
％トリフルオロ酢酸水溶液）3mLに溶解した。
【００７３】
生成した馬尿酸を逆相系高速液体クロマトグラフィ−（HPLC）にて分析し、酵素反応で生成した馬尿酸のピ−ク面積を228nmの吸光度を測定する事で求めた。又、酵素反応時に予め1N塩酸を添加して同様の操作を行ったものをブランクとして作成した。HPLCはカラムにμBONDASPHERE  C18  φ3.9
×150mm（Waters 社製）を、移動相に20 ％アセトニトリル/0.1 ％トリフルオロ酢酸水溶液を用いた。
【００７４】
阻害率は次式を用いて算出した。
アンジオテンシンＩ変換酵素 阻害率（％）＝｛1−B−C）÷A｝×100
A：蒸留水添加時のピ−ク面積（228nm）
B：阻害剤添加時のピ−ク面積（228nm）
C：阻害剤添加時のブランクのピ−ク面積（228nm）
【００７５】
表１に実施例１及び実施例２に記載した各試料60μg/mLにおけるアンジオテンシンＩ変換酵素 阻害率（％）を示した。
【００７６】
【表１】
2005154326.tif 000003
【００７７】
＜試験例２＞自然発症高血圧ラットに対する尾静脈投与による降圧効果
試験には体重250±50g、収縮期血圧200±20mmHg、心拍数400±50 回/分の雄性自然発症高血圧ラット（Wister−Okamoto  derived  Spontaneously  Hypertensive  Rat、以下SHRと記す）を用いた。試験開始前に明暗周期12時間（午前９時〜午後９時点灯）、室温21〜23℃、湿度50〜70％、飼料（PMI
Nutrition  International  社製Lab  Diet）及び飲水（水道水質基準適合自家揚水）自由摂取の環境下で45×23×21ｃｍのケ−ジにSHR6匹を入れ1週間馴化飼育した。製造例１で得られたペプチド混合物のｎ−ブタノ−ル抽出液濃縮物をSHR体重1kgあたり30mgの用量で、SHR体重1kgあたり5mLの0.9％食塩水に溶解し、SHR（1群3
匹）に対して尾静脈単回投与して32±1℃の環境下で飼育した。対照群としてはSHR（1群3匹）に同用量の0.9 ％食塩水のみを尾静脈投与した。試料投与直前、及び投与30、60、240分後に血圧を非観血血圧測定装置（Model  59,IITC,CA,USA）を用いて測定した。表２には、その収縮期血圧の経時的変化を示した。
【００７８】
＜試験例３＞SHR に対する強制経口投与による降圧効果
試験例１と同様の方法でSHRを用意し、製造例１で得られたペプチド混合物のｎ−ブタノ−ル抽出液濃縮物をSHR体重1kgあたり300mgの用量で、SHR 体重1kgあたり10mLの0.9
％食塩水に溶解し、SHR （1群3匹）に対して経口単回投与して32±1℃の環境下で飼育した。対照群としてはSHR（1群3匹）に同用量の0.9％食塩水のみを経口投与した。試料投与直前、及び投与30、60、240分後に血圧を非観血血圧測定装置（Model  59,IITC,CA,USA
）を用いて測定した。表２に収縮期血圧の経時的変化を示した。
【００７９】
【表２】
2005154326.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明により得られたペプチド化合物は、強力なアンジオテンシンＩ変換酵素 阻害活性を有し、強い降圧作用を示すため、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧等の高血圧症の予防、治療剤、これら疾患の診断薬、各種病態で用いられる降圧剤、心筋梗塞の減少、うっ血性心不全における病態の改善剤等の医薬品として有用であるとともに、本発明のペプチド化合物は、経口摂取が可能である事から、上記の様な有用な作用を有する健康食品や特定保健用食品や機能性食品としての利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】ペプチド化合物Phe−Tyrの1H−NMR スペクトルを示す。
【図２】ペプチド化合物Phe−Ala 1H−NMR スペクトルを示す。
【図３】ペプチド化合物Leu−Val−Glyの1H−NMR スペクトルを示す。
【図４】ペプチド化合物Leu−Ile−Glyの1H−NMR スペクトルを示す。
【図５】ペプチド化合物Leu−Gly−Valの1H−NMR スペクトルを示す。
【図６】ペプチド化合物Ile−Val−Glyの1H−NMR スペクトルを示す。
【図７】ペプチド化合物Tyr−Phe 誘導体Z−Tyr(Z)−Phe−OMe の1H−NMR スペクトルを示す。
【図８】ペプチド化合物粗体のＨＰＬＣ分析した際のクロマトグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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