(57)【要約】【課題】プロテオーム実験等で得られた混合物資料または、純度の低い蛋白質試料等のＬＣ／ＭＳ解析の測定結果を直接解析することと可能とする【解決手段】（１）液体クロマトグラフ精製蛋白の質量分析データのピークから算出したZ-SCORE（Zscore）または、平均値を判定基準として有効ピークを選別し、（２）一定範囲の分子量および一定範囲の保持時間で区分けされた範囲に（１）で選別した有効ピーク値を集約して画像表示または数値表示させる。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の手順を含むプロテオームのディファレンシャル解析方法；
（１）液体クロマトグラフ精製蛋白の質量分析データの全ピークから算出したＺスコア（Zscore）または、平均値を判定基準として有効ピークを選別し、
（２）一定範囲の分子量および一定範囲の保持時間で区分けされた範囲に（１）で選別した有効ピーク値を集約して画像表示または数値表示させる。
【請求項２】
Ｚスコアの判定基準が負値のピークを除いて自然対数を算出し、処理結果が正値のピークを有効ピークとして選別する請求項１記載のプロテオームのディファレンシャル解析方法。
【請求項３】
以下の手順を含むプロテオームのディファレンシャル解析方法；
（１）液体クロマトグラフ精製蛋白の質量分析で検出された全ピークから各ピーク強度のＺスコア（Zscore）を算出し、Ｚスコアが負値のピークを除いて自然対数を算出し、処理結果が正値のピークを有効ピークとして選別する、
（２）（１）で選別した有効なピークを対象に、以下の(i)から(iv)の手順を含むグループ化する
方法でピーク値をグループ化する、
(i)全有効ピークリストからピークを一つ選択し１つの群とする、
(ii)(i)で形成した群に属する最小保持時間のピークの隣に等しい一定誤差範囲の
分子量(m/z)のピークがあるまたは、最大保持時間のピークの隣に等しい一定
誤差範囲の分子量(m/z)のピークがあればそれらのピークを(i)で形成した群に加える、
(iii)(ii)の操作を繰り返し、該当するピークがなければ(i)に戻る、
(iv)グループに属さないピークがなければ終了とする、
（３）（２）でグループ化したピーク群の保持時間が、１０分〜３００分のものを選抜し、
有効なピーク値とする、
（４）（３）で選抜した有効なピーク値において異なる二つのピークデータを比較し、共通な
ピークデータを抽出する、
（５）（１）〜（４）で処理をしたディファレンシャル解析をおこなう試料のピーク値の測定結果を
分子量と保持時間を軸にして区分けして表示し重ね合わせ、共通部分を抽出する、
（６）  上記の手順で得た有効ピークの強度を用いてディファレンシャル解析を行う。
【請求項４】
一定誤差範囲の分子量が±0.5Da〜±0.1Daである請求項３記載の方法。
【請求項５】
分子量が５０〜２０００である請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項６】
保持時間が３０分〜３００分である請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項７】
ディファレンシャル解析方法が、同位体ラベリング法または、サブトラクティブ法である請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項1〜７に記載された方法をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータ読み取り可能なプログラム。
【請求項９】
以下の手順を含んだステップを実施するためのプロテオームのディファレンシャル解析装置；
（１）液体クロマトグラフ精製蛋白の質量分析データのピークから算出したＺスコアを判定基準として有効ピークを選別するステップ、
（２）一定範囲の分子量および一定範囲の保持時間で区分けされた範囲に（１）で選別した有効ピーク値を集約して画像表示または数値表示させるステップ。
【請求項１０】
Ｚスコアの判定基準が負値のピークを除いて自然対数を算出し、処理結果が正値のピークを有効ピークとして選別する請求項９記載のプロテオームのディファレンシャル解析装置。
【請求項１１】
以下の手順を含んだステップを実施するためのプロテオームのディファレンシャル解析装置；
（１）液体クロマトグラフ精製蛋白の質量分析で検出された全ピークから各ピーク強度のＺスコア（Zscore）を算出し、Ｚスコアが負値のピークを除いて自然対数を算出し、処理結果が正値のピークを有効ピークとして選別するステップ、
（２）（１）で選別した有効なピークを対象に、以下の(i)から(iv)の手順を含むグループ化する方法でピーク値をグループ化するステップ、
(i)全有効ピークリストからピークを一つ選択し１つの群とするステップ、
(ii)(i)で形成した群に属する最小保持時間のピークの隣に等しい一定誤差範囲の
分子量(m/z)のピークがあるまたは、最大保持時間のピークの隣に等しい一定
誤差範囲の分子量(m/z)のピークがあればそれらのピークを(i)で形成した群に加えるステップ、
(iii)(ii)の操作を繰り返し、該当するピークがなければ(i)に戻るステップ、
(iv)グループに属さないピークがなければ終了とするステップ、
（３）（２）でグループ化したピーク群の保持時間が、１０分〜３００分のものを選抜し、
有効なピーク値とするステップ、
（４）（３）で選抜した有効なピーク値において異なる二つのピークデータを比較し、共通な
ピークデータを抽出するステップ、
（１）〜（４）で処理をしたディファレンシャル解析をおこなう試料のピーク値の測定結果を
分子量と保持時間を軸にして区分けして表示し重ね合わせ、共通部分を抽出するステップ、
（５）  上記の手順で得た有効ピークの強度を用いてディファレンシャル解析を行うステップ。
【請求項１２】
一定誤差範囲の分子量が±０．５Ｄａ〜±０．１Ｄａである請求項１１記載の装置。
【請求項１３】
分子量が５０〜２０００である請求項９〜１１いずれかに記載の装置。
【請求項１４】
保持時間が３０分〜３００分である請求項９〜１１いずれかに記載の装置。
【請求項１５】
ディファレンシャル解析方法が、同位体ラベリング法または、サブトラクティブ法である請求項９〜１１いずれかに記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテオームのディファレンシャル解析において、液体クロマトグラフ精製蛋白の質量分析で検出された測定結果について、統計手法を用いることで有効なピーク値のみを選抜し、定性的または定量的な変化を検出可能とする方法、装置およびプログラムに関する。
詳しくは、液体クロマトグラフ精製蛋白の質量分析データの全ピークからＺスコアを判定基準として有効ピークを選別し、分子量と保持時間を軸にして区分けして先に選別したピーク値を集約させて目的のペプチドを同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムの遺伝子が産生するタンパク質の完全なセットで、生体内で機能するタンパク質の総称をプロテオームと称している。
プロテオーム研究は、ゲノム情報とそれによって作られるタンパク質の関連を生命活動に照らし合わせて包括的に行う研究で、具体的には、発見された遺伝子の機能解析、作られるタンパク質の調節機構の解析、タンパク質同士間の相互作用の研究、病気・病態とタンパク質の働きの関連性などの解明が課題とされている。
なかでも、２以上の試料間で発現が変化している蛋白質を見つけるディファレンシャル解析は、数千の蛋白質から原因遺伝子を同定することが容易になり、創薬の標的として適当な分子を選定するターゲットバリデーションの分野において有用な探索技術として注目されている。
ディファレンシャル解析には例えば、同位体ラベリング法、サブトラクティブ法などが挙げられ、例えば二次元電気泳動法や質量分析法(以下ＭＳと略) 、液体クロマトグラフ精製蛋白の質量分析（以下ＬＣ／ＭＳと略）などの測定結果を用いて解析されている。特にＬＣ／ＭＳ解析は高度に精製された蛋白質資料を液体クロマトグラフでさらに精製し、資料の分子量を同定する優れた技術である
【０００３】
【非特許文献１】Washbum P. M. et al., Anal. chem. 2002, 74, 1650-1657
【非特許文献２】Chelius D. et al., J. of Proteome Research 2002, 1, 317-323
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＬＣ／ＭＳ解析は分離精製度が極めて高い蛋白質試料の分析においては有用であるが、プロテオーム実験等で得られた混合物を資料として解析すると、数多くのペプチドがピークとして出現し、それ以上のベースノイズが出現するため、標準で機器に提供されているソフトウェアでは、視覚化による個々のペプチドの同定は非常に困難であった。
先述の問題に加え、LC/MS測定結果では個々のピークは非常にシャープであるため、二次元電気泳動法などによるプロテオームのディファレンシャル解析は単純な引き算で処理では困難であった。
また、蛋白質試料の分離精製度を高めるためには、多くの時間と経費を費やす必要があるため、粗精製試料を容易に分析しかつ、精度の高い解析結果が得られることが望まれている。
【０００５】
本発明の課題は、プロテオーム実験等で得られた混合物資料または、純度の低い蛋白質試料等のＬＣ／ＭＳ解析の測定結果を直接解析することと可能とするため、（１）データのノイズ処理を行い有効なピークを選別する、（２）ピークの鋭敏さによるディファレンシャル処理の困難さを補う、（３）視覚的判定に頼らず、数値処理をおこない客観的は判定を可能とする事が挙げられる。
においては多くのノイズがみられ直接解析するには困難で、プロテオーム実験等で得られた混合物資料または、純度の低い蛋白質試料等の測定結果からディファレンシャルの挙動が直接解析できるようにすることで、ディファレンシャル処理の挙動解析をする、結果の数多く出現するペプチドがピークとして出現し、それ以上のベースノイズが出現するため、標準で機器に提供されているソフトウェアでは、単純な視覚化による個々のペプチドの同定は非常に困難であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意検討の結果LC/MS 測定結果の直接比較を試み、統計手法を用いることで、膨大なピークの中から大幅にノイズを軽減させ有効なピークのみを選抜し、一定範囲の分子量と保持時間で区分けされた範囲での定性的または定量的な変化を検出可能とした。
さらに、有効なピークの直接比較によって、混合物中のペプチドを限定して、ディファレンシャル解析で目的のペプチドを同定を可能とした。
即ち本発明の要旨は以下のとおりである。
［１］   下の手順を含むプロテオームのディファレンシャル解析方法；
（１）液体クロマトグラフ精製蛋白の質量分析データのピークから算出したＺスコア（Zscore）または、平均値を判定基準として有効ピークを選別し、
（２）一定範囲の分子量および一定範囲の保持時間で区分けされた範囲に（１）で選別した有効ピーク値を集約して画像表示または数値表示させる。
［２］    Ｚスコアまたは、平均値の判定基準が負値のピークを除いて自然対数を算出し、処理結果が正値のピークを有効ピークとして選別する請求項１記載のプロテオームのディファレンシャル解析方法。
［３］    以下の手順を含むプロテオームのディファレンシャル解析方法；
（１）液体クロマトグラフ精製蛋白の質量分析で検出された全ピークから各ピーク強度のＺスコア（Zscore）を算出し、Ｚスコアが負値のピークを除いて自然対数を算出し、処理結果が正値のピークを有効ピークとして選別する、
（２）（１）で選別した有効なピークを対象に、以下の(i)から(iv)の手順を含むグループ化
方法でピーク値をグループ化する、
(i)全有効ピークリストからピークを一つ選択し１つの群とする、
(ii)(i)で形成した群に属する最小保持時間のピークの隣に等しい一定誤差範囲の
分子量(m/z)のピークがあるまたは、最大保持時間のピークの隣に等しい一定
誤差範囲の分子量(m/z)のピークがあればそれらのピークを(i)で形成した群に加える、
(iii)(ii)の操作を繰り返し、該当するピークがなければ(i)に戻る、
(iv)グループに属さないピークがなければ終了とする、
（３）（２）でグループ化したピーク群の保持時間が、１０分〜３００分のものを選抜し、
有効なピーク値とする、
（４）（３）で選抜した有効なピーク値において異なる二つのピークデータを比較し、共通な
ピークデータを抽出する、
（４）（１）〜（４）で処理をしたディファレンシャル解析をおこなう試料のピーク値の測定結果を
分子量と保持時間を軸にして区分けして表示し重ね合わせ、共通部分を抽出する。
（６）  上記の手順で得た有効ピークの強度を用いてディファレンシャル解析を行う。
［４］    一定誤差範囲の分子量が±0.5Da〜±0.1Daである請求項３記載の方法。
［５］  分子量が５０〜２０００である請求項１〜３いずれかに記載の方法。
［６］  保持時間が３０分〜３００分である請求項１〜３いずれかに記載の方法。
［７］  ディファレンシャル解析方法が、同位体ラベリング法または、サブトラクティブ法である請求項１〜３いずれかに記載の方法。
［８］    請求項1〜７に記載された方法をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータ読み取り可能なプログラム。
［９］  以下の手順を含むステップを実施するためのプロテオームのディファレンシャル解析装置；
（１）液体クロマトグラフ精製蛋白の質量分析データのピークから算出したＺスコアまたは、平均値をを判定基準として有効ピークを選別するステップ、
（２）一定範囲の分子量および一定範囲の保持時間で区分けされた範囲に（１）で選別した有効ピーク値を集約して画像表示または数値表示させるステップ。
［１０］    Ｚスコアの判定基準が負値のピークを除いて自然対数を算出し、処理結果が正値のピークを有効ピークとして選別する請求項７記載のプロテオームのディファレンシャル解析装置。
［１１］    以下の手順を含むステップを実施するためのプロテオームのディファレンシャル解析装置；
（１）液体クロマトグラフ精製蛋白の質量分析で検出された全ピークから各ピーク強度のＺスコア（Zscore）を算出し、Ｚスコアが負値のピークを除いて自然対数を算出し、処理結果が正値のピークを有効ピークとして選別するステップ、
（２）（１）で選別した有効なピークを対象に、以下の(i)から(iv)の手順を含むグループ化
方法でピーク値をグループ化するステップ、
(i)全有効ピークリストからピークを一つ選択し１つの群とするステッ、
(ii)(i)で形成した群に属する最小保持時間のピークの隣に等しい一定誤差範囲の
分子量(m/z)のピークがあるまたは、最大保持時間のピークの隣に等しい一定
誤差範囲の分子量(m/z)のピークがあればそれらのピークを(i)で形成した群に加える、
(iii)(ii)の操作を繰り返し、該当するピークがなければ(i)に戻るステップ、
(iv)グループに属さないピークがなければ終了とするステッ、
（３）（２）でグループ化したピーク群の保持時間が、１０分〜３００分のものを選抜し、
有効なピーク値とするステップ、
（４）（３）で選抜した有効なピーク値において異なる二つのピークデータを比較し、共通な
ピークデータを抽出するステップ、
（１）〜（４）で処理をしたディファレンシャル解析をおこなう試料のピーク値の測定結果を
分子量と保持時間を軸にして区分けして表示し重ね合わせ、共通部分を抽出するステップ、
（５）  上記の手順で得た有効ピークの強度を用いてディファレンシャル解析を行うステップ。
［１２］  一定誤差範囲の分子量が±0.5Da〜±0.1Daである請求項１１記載の装置。
［１３］  分子量が５０〜２０００である請求項９〜１１いずれかに記載の装置。
［１４］  保持時間が３０分〜３００分である請求項９〜１１いずれかに記載の装置。
［１５］  ディファレンシャル解析方法が、同位体ラベリング法または、サブトラクティブ法である請求項９〜１１いずれかに記載の装置。
［１６］  
【発明の効果】
【０００７】
本発明によりLC/MS測定結果のデータから直接有効なピークを選別することが可能となった結果、視覚化が容易な緩やかな強度増減の面を得ることができた。また、ピークの鋭敏さによるディファレンシャル処理の困難さを補うことが可能となり、ディファレンシャルによる明確な差異を検出できるようになった。本発明により、ディファレンシャル処理の大まかな挙動を速やかに検出でき、HTS でプロテオーム処理をする場合のマーカー検出の有用な技術となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に、本発明における請求項中記載の語句の定義について説明する。
「液体クロマトグラフ精製蛋白の質量分析（LC/MS）」とは、蛋白質の質量分析機と液体クロマトグラフ（以下、ＬＣ）を連結させたものなどの装置を使用して蛋白質の質量を測定することをいう。質量分析（以下、ＭＳ）とは、分析する試料をイオン化させて導入し，電気力や磁気力により質量ごとの差をつくり、イオンの質量を分析することである。上記分析を行う装置である質量分析計を含め、ＭＳには、イオントラップ型ＭＳ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（FT-ICR/MS）ＭＳ、イオンスキャン法ＭＳ、 Q-TOF型ＭＳなどが挙げられる。これらは、１方法だけで分析しても複数のＭＳ（以下、ＭＳ／ＭＳ）と液体クロマトグラフを連結させて分析（以下、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析）させても良い。。
「Ｚスコア」とは、一般的に統計的解析指標の一つであるＺスコアをいう。二つの単語の共起関係（相互の結びつき）の強さを表す指標の一つで、値が大きいほど結びつきが強いことを示す。Ｚスコアの計算式は例えば、以下のように表せる。
【０００９】
【数１】
2005257483.tif 000002
「一定誤差範囲の分子量」とは、質量分析器の検出感度を考慮した検出ピークの許容範囲をいう。分析機によって検出感度はが異なるり、例えば、イオントラップ型質量分析器の場合は±0.5Da、四重極飛行時間ハイブリッド型質量分析器の場合は±0.1Da等が挙げあられる。
「保持時間」とは、分子量（m/z)のピークが検出されるために所有する時間をいう。１０分以下のものはノイズピークと考えられるので、本発明では１０分以上ピーク検出に所有されたピーク値について解析に用いる。好ましくは、３０〜３００分の保持時間が挙げられる。
【００１０】
本発明の第一の態様はプロテオームのディファレンシャル解析方法に関する。
本発明の解析方法は、LC/MS測定結果から統計的手法によってノイズ処理を行うことで有効なピークを選別し、視覚化を行ったことにより、ディファレンシャル処理の困難さを補うことが可能となったこと、さらにディファレンシャルによる明確な差異を検出できるようになったことが特徴である。。
本発明の解析方法に使用される汎用ソフトウェアで出力されるデータは、テキストファイルであればよく、例えばプロテオーム解析などで使用されているMascot、Sonar  MS/MS、LC/MS等のデータが挙げられる。以下に、本発明の方法を図１〜図６を参照して説明する。
【００１１】
図１は本発明の請求項１の方法を説明するためのフローチャートである。請求項１記載の方法で、ＬＣ／ＭＳの測定結果の直接比較データの膨大なピークの中からＺスコア（z-score）又は、平均値の判定結果を用いて大幅にノイズを軽減させ有効なピークのみを選抜し、一定範囲の分子量と保持時間で区分けされた範囲での定性的な変化を検出することができた。
１０１で液体クロマトグラフ精製蛋白の質量分析で検出された全ピークから各ピーク強度のＺスコアまたは平均値を算出し、１０２にてＺスコアが負値のピークを除いて自然対数を算出し、１０３でピークデータを統計的に判断し、１０４で、１０３の処理結果が正値のピークを有効ピークとして選別する。
１０５で、１０１〜１０４の方法で選別された各ピークを、任意に定めた一定範囲の分子量および保持時間で区分けされた範囲で１０４で選別した有効ピーク値を集約する。
１０６で、１０５で集約させた群を比較する。
１０６にて集約した有効ピーク群は、テキストデータ、画像データ等で記述され、視覚的に容易なように表示する。表示方法は例えば、表形式、グラフなどが挙げられ、好ましくはグラフ表示が挙げられる。また、ピークの集約毎に色調を変化させて表示させることにより、容易に視覚判断でき、ディファレンシャルによる明確な差異を検出できる。また、その格子を選択することで拡大させることができ、さらに詳細な違いを調べることが可能になった。表示例を図２に示す。
【００１２】
さらに、１０６で集約した有効ピーク群の解析を視覚的判定に頼らず、数値処理による集約を検討した。本発明者らは、質量分析器の分子量測定精度は非常に高いため誤差は小さいが、液体クロマトグラフィの保持時間は、状況により多少の変化が発生する知見を得、１０７で、１０６にてふるいわけした有効なピークを対象に 例えば、イオントラップ型 や 四重極飛行時間ハイブリッド型 などの質量分析器の精度にあわせ任意に定めたの一定範囲の分子量を有し、かつ任意に定めた一定の保持時間範囲内に収まる各ピークを一つの群として集約させることで、群を簡略化させることができた。
前記の群を比較することによって、二つのスペクトルの違いを迅速に判定することが可能になり、プロテオーム実験でのディファレンシャル解析に応用させることが可能になった。
また、LC/MS 測定結果の膨大なピークの中から大幅にノイズを軽減させ有効なピークのみを選抜し、一定範囲の分子量と保持時間で区分けされた範囲での定性的な変化を検出することで、LC/MS 測定結果の直接比較が可能であることが示唆された。
本発明で用いた「ディファレンシャル解析」の方法は、例えば同位体ラベリング法または、サブトラクティブ法等が挙げられる。同位体ラベリング法は、同一試料中で、ラベル化したペプチド中に含まれる同位体の存在により、検出される分子量(m/z)に差が生じることを用いて、両者のピーク面積を比較する手法である。例えば、18Oラベリングの場合は、分子量(m/z)が一価で検出されたなら両者の間隔は4Da、二価で検出されたなら両者のそれは2Daの差が生じることを用いて比較する。
サブトラクティブ法は、異なる試料同士で、保持時間と分子量(m/z)が近接したピークを対としてピーク面積を比較する方法である。
【００１３】
次に、図３〜図５を用いて本発明の請求項３記載の方法を説明する。請求項３記載の方法では、ノイズを除去し選抜された有効なピーク値をさらに保持時間の大きさでピークを比較し目的のピークの検出を行うことにより、混合物中のペプチドを限定して、ディファレンシャル解析で目的のペプチドの同定または、定量性が見出せることが示唆された。
先ず、図１の１０１〜１０４の方法でノイズピークを除去し選別した有効なピーク（３０１ａ）を対象に有効なピークは数秒間出現すると仮定して、複数の実験結果の共通部を取得しピーク値をグループ化した。
図３の３０１で３０１ａのピークデータから一つを選別し、
３０２で保持時間一定の分子量(m/z)範囲にある隣接ピークを一群としてグループ化する。一定の保持時間は１０分以上であれば良く、好ましくは３０分〜３００分の範囲が上げられる。
目的のピークは数分の保持時間を伴って複数箇所にわたって検出されるピークの示す分子量が一定の誤差範囲にあり隣接して存在すれば、それらのピークは一つの大きなピーク群としてグループ化した。一定の分子量範囲は、１０〜２０００が上げられ、好ましくは、５０〜２０００の範囲が上げられる。
３０３で、３０２でグループ化したピーク群について一定時間に出現していないピーク値を除外し、それ以外のピーク値で近接しているピーク値を一群としてグループ化する（３０１ｂ）。
３０２〜３０３の操作を繰り返し、該当するピークがなければ３０１に戻り、全ピーク群のグループ化が完了するまで３０１〜３０３を繰り返し、グループ化されたピーク群を３０５とする。グループに属さないピークがなければ終了とする。
図４の４０１で、図３の３０５でグループ化したピークデータの保持時間を分析する。
４０２で保持時間が、１０分以上のものを選抜し、有効なピーク値とする（４０３）。保持時間は１０分以上であれば良く、好ましくは１０分〜３００分の範囲が挙げられ、より好ましくは３０分〜３００分の範囲が挙げられる。
全てのピークを分析するまで４０１〜４０３の手順を繰り返す。
図５は図４の４０３で得られた有効ピーク値について保持時間一定の分子量(m/z)範囲にある隣接ピーク値を比較（５０１）しさらにグループ化して共通ピークを抽出し、（５０２）有効ピークとする（５０３）。５０３にて得た有効ピーク群は、テキストデータ、画像データ等で記述され、視覚的に容易なように表示する。
上記の方法で処理をしたディファレンシャル解析をおこなう。
表示方法は例えば、表形式、グラフなどが挙げられ、好ましくはグラフ表示が挙げられる。また、ピークのグループ化毎に色調を変化させて表示させることにより、容易に視覚判断でき、ディファレンシャルによる明確な差異を検出できる。表示例を図６に示す。
【００１４】
表示例図６は、３０１〜５０３の手順で、数種類のペプチドからなる混合物のLC/MS測定結果を直接比較することにより、目的のペプチドを同定できるか検討した結果である。
これらの結果により、LC/MSディファレンシャル解析において、分子量についての誤差は僅少だが保持時間は大きく異なるという前提条件でピークを比較することで、目的の候補ピーク対の検出が可能であることが示唆された。
【００１５】
本発明の第２の態様は、本発明の解析方法を実行させる装置である。  
本発明解析方法を実行させる装置を図７に示す。７０１は、本発明の解析方法に使用される汎用ソフトウェアで出力されるデータを入力するための装置である。この装置は、電子計算機であればよく、サーバーでも、パーソナルコンピュータ（以下ＰＣ）等が挙げられ、計算機の能力は制限しない。本発明解析方法を実行させるプログラムを動作させるオペレーションシステムも汎用ソフトウェア（例えば、マイクロソフトウインドウズ（登録商標）シリーズ等）でよい。
７０２の装置で、７０１で入力されたデータをｚ-SCOREの判定をおこない、７０２で、７０１の判定結果に基づいて有効ピークを抽出する。７０３の装置で図３の３０１〜３０５の判定に基づき、有効ピーク値をグループ化し、７０４に出力する。
７０５で、７０４で出力されたデータ図４の４０２〜４０３の判定基準で選別し、有効なピークデータを抽出する。
７０６の装置で図５の５０１〜５０２のデータ分析を行い、７０７の装置で７０１の装置〜２０６の装置で実行した実行結果をを出力する。
出力結果は７０７の装置で表示することもでき、紙などの記録媒体に印刷することもでき、ＦＤ，ＭＯ，ＣＤ−ＲＷ，ＤＶＤ−ＲＷ等の磁気または、磁気光ディスク、光ディスク等の記録媒体に出力することもできる。
７０１〜７０７の装置は、全てが一体した装置でも、各が分離した装置でも、一部が一体化した装置またそれらを組み合わせた装置であってもよい。
本発明の第３の態様は、本発明の解析方法をコンピュータで読みとり可能なプログラムである。
図１〜図５のフローチャートの１０１〜５０２の解析方法を実行させるプログラムで、これらは、図１〜図５に示したアルゴリズムの手順にそって１つのモジュールであっても、それぞれのパート事に書かれたモジュールを組み合わせて使用してもよい。これらは磁気ディスク等の記録媒体に記録されている。
以下、本発明解析方法の実施例を挙げる。但し、本実施例によって本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００１６】
1) HGH + βカゼイントリプシン消化系での結果の再比較
HGH + βカゼイントリプシン消化系の直接比較を行なう前に、有効ピークのグルーピングを行なった。これは、目的のピークは数分の保持時間を伴って複数箇所にわたって検出されると想定し、検出されたピークの示す分子量が一定の誤差範囲にあり隣接して存在すれば、それらのピークは一つの大きなピークとしてまとめた。この変換データを元にして、両者を比較をした。そして、どの程度の許容範囲を与えれば両者のピークを差し引けるかを調べた。
HGHをトリプシン消化したものを図８に、HGH + βカゼインをトリプシン消化したものを図９に、図８、図９を重ね合わせたものを図１０として表示する。図１０を見ると、いくつかの個所でパターンの類似性が認められ、保持時間の許容度を1分前後にし、分子量のそれを1Daと与えることで合致させることが可能と考えた。
【実施例２】
【００１７】
数種のペプチドの混合系での比較
本プログラムの検証には、HGH + βカゼイントリプシン消化系は複雑すぎて不適当であるため、より簡略化した系ということで、7種類のペプチド混合系の LCQ を測定し、その結果の比較解析を試みた。
Bradykinin、Dynorphin、Substance P、Renin Substrate、Angiotensin、Leu-enkepharin、Fibrinopeptideの7種類のペプチドが混合したMS(LCQ)結果をノイズ処理してプロットした結果を図１１に示す。ここで、保持時間が10分までと43分以降に現れるピークの多くは、ブランクでも出現するノイズである。ノイズ処理後の数値データから、目的の7つのペプチドを帰属したのが図１２である。
Fibrinopeptideはちょうど44分あたりに出現し、本測定系固有のノイズと重なるため、Fibrinopeptideの検出は困難であると判断した。また、ノイズについては、目的のペプチドは少なくとも3スキャンにわたって出現するが10分以上にはならないと仮定することにより大幅に除去することができた(図１３)。
【実施例３】
【００１８】
１８Ｏ の混合系での定量性比較
前処理した18O混合系 LCQ ピークデータを対象に、Mascot の検索結果から同定されたペプチド情報をもとに、目的のピーク対を選抜し定量性を調べた。
１８ＯのLCQ測定結果をノイズ処理してプロットしたのが図１４である。同試料のMascot解析した結果から16Oと18Oの同位体の対を抽出したのが図１５である。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
本発明によりLC/MS測定結果のデータから直接有効なピークを選別することが可能となった結果、視覚化が容易な緩やかな強度増減の面を得ることができた。また、ピークの鋭敏さによるディファレンシャル処理の困難さを補うことが可能となり、ディファレンシャルによる明確な差異を検出できるようになった。本発明により、ディファレンシャル処理の大まかな挙動を速やかに検出でき、HTS でプロテオーム処理をする場合のマーカー検出の有用な技術となった。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は本発明の解析方法の手順を示したフローチャートである。
【図２】図２は汎用ソフトでの解析結果を表示した画面のハードコピー
【図３】図３は本発明請求項３の解析方法のグループ化手順を示したフローチャートである。
【図４】図４は本発明請求項３の解析方法の有効ピーク値の選別手順を示したフローチャートである。
【図５】図５は本発明請求項３の解析方法の有効ピーク値の選別手順を示したフローチャート手順である。
【図６】図６は本発明方法で解析した結果を表示させた図である。
【図７】図７は本発明の解析方法を実行するための装置の構成を示した図である。
【図８】図８は実施例１でHGH をトリプシン消化した系を解析し表示した図である。
【図９】図９は実施例１HGH + βカゼインをトリプシン消化した系を解析し表示した図である。
【図１０】図１０は図８と図９を重ね合わせたものである。
【図１１】図１１は実施例２の7種のペプチド混合物のLC/MS結果である。
【図１２】図１２は実施例２の7種のペプチドの帰属を表示した結果である。
【図１３】図１３は実施例２のノイズ処理後の7種ペプチド混合物のLC/MSプロット図である。
【図１４】図１４は実施例３の18O測定結果のプロットである。
【図１５】図１５はMascotの結果で16Oと18Oのペプチド対を帰属をプロットしたものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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