(57)【要約】【課題】  本発明は、ノイズの影響を抑えて、標本画像の明るさ等を最適になるような測定パラメータが決定できる走査型顕微鏡の測定パラメータ決定方法を提供する。【解決手段】  レーザ光源からのレーザ光を試料に走査したときの反射光、蛍光等を、受光素子で受光し、受光した信号を光電変換したアナログ電気信号を調整するためにオフセット、増幅を行う、その後調整したアナログ信号をＡ／Ｄ変換をし、試料データをデジタル化し画像データとすることで、利用者が注目領域を指定でき、注目領域内の輝度値から面積比率により、この標本に最適な測定パラメータを算出し決定し、決定した算出データに基づき各調整部分を調整する。【選択図】  図１
2005321728.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本に照射するレーザ光の光量、前記標本からの光を受光する受光素子の感度、前記受光素子の出力信号を処理する信号処理部における信号処理パラメータのうち少なくともひとつを測定パラメータとして設定可能な走査型顕微鏡において、
取得した標本画像に対して注目領域を少なくとも１以上指定する手段と、
前記注目領域を走査することで得る輝度値を用いて前記測定パラメータを算出決定する算出決定手段と、
前記算出決定手段により算出決定された前記測定パラメータに基づいて対応する調整部位を調整する調整手段と、
を具備することを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記算出決定手段は、予め目標輝度値および目標面積比率を指定し、前記目標輝度値以上の輝度値を示す領域の前記注目領域に対する面積比率を算出し、
前記面積比率が前記目標面積比率以上となる条件を満足する前記測定パラメータを算出して決定することを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記算出決定手段は、前記注目領域の最大輝度値がＡ／Ｄ変換での変換可能な最大値を超えないという条件を満足する前記測定パラメータを算出して決定することを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記算出決定手段は、前記標本画像を取得した時の前記受光素子への印加電圧値をＶａ、そのときの受光感度をμａ、新たに設定すべき前記受光素子への印加電圧値をＶｔ、そのときの受光感度をμｔとする、
Ｖｔ＝Ｖａ×（μｔ／μａ）1/α
として算出することを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記測定パラメータは、前記受光素子の受光感度であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の走査型顕微鏡。
【請求項６】
前記測定パラメータは、前記信号処理部の前記信号処理パラメータとしてのオフセット量およびゲインの少なくとも一方であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の走査型顕微鏡。
【請求項７】
前記測定パラメータは、前記レーザ光の照射パワーであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の走査型顕微鏡。
【請求項８】
標本に照射するレーザ光の光量、前記標本からの光を受光する受光素子の感度、前記受光素子の出力信号を処理する信号処理部における信号処理パラメータのうち少なくともひとつを測定パラメータとして設定可能な測定パラメータ決定方法において、
取得した標本画像に対して注目領域を少なくとも１以上指定し、
前記注目領域を走査することで得る輝度値を用いて前記測定パラメータを算出決定し、
前記算出決定により算出決定された前記測定パラメータに基づいて対応する調整部位を調整する、
ことを特徴とする走査型顕微鏡の測定パラメータ決定方法。
【請求項９】
標本に照射するレーザ光の光量、前記標本からの光を受光する受光素子の感度、前記受光素子の出力信号を処理する信号処理部における信号処理パラメータのうち少なくともひとつを測定パラメータとして設定可能な走査型顕微鏡を制御するコンピュータに実行させる測定パラメータ決定プログラムにおいて、
取得した標本画像に対して注目領域を少なくとも１以上指定する手順と、
前記注目領域を走査することで得る輝度値を用いて前記測定パラメータを算出決定する算出決定手順と、
前記算出決定手順により算出決定された前記測定パラメータに基づいて対応する調整部位を調整する調整手順と、
をコンピュータに実行させるための測定パラメータ決定プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光源からの出射光を標本に走査したときの標本からの反射光、蛍光又は透過光を受光素子で受光して標本画像を得る走査型顕微鏡に係わり、特に標本画像の明るさ等を最適化する走査型顕微鏡の測定パラメータ決定方法の技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、走査型顕微鏡には、生物標本を観察等するために使用する生物用レーザ走査型顕微鏡や半導体ウェハ検査等に使用する工業用レーザ走査型顕微鏡等がある。いずれの走査型顕微鏡においても、持っている能力を最大限に引き出すために各種測定パラメータ（受光感度やゲイン、オフセットなど）を標本の状態に合わせて最適に調整しなければならなかった。
【０００３】
このうち工業用レーザ走査型顕微鏡では、次のように測定パラメータを決定している。まず、標本像を撮像する受光素子へ通じる光路上にシャッタを設け、このシャッタを閉じて光を遮断した状態で、受光素子の出力信号に対するオフセットを決める。
次に、シャッタを開放し、標本像を１枚撮像して受光素子から出力される画像信号を取り込み、この画像信号から標本像中の最大輝度値と最小輝度値とを求め、これら最大輝度値と最小輝度値との差であるダイナミックレンジを求める。
【０００４】
次に、このダイナミックレンジが最適になるように測定パラメータを変更し、例えばゲイン及びＮＤフィルタのフィルタ値を１段階上げ、再び、標本像を１枚撮像して受光素子の出力信号から標本像中の最大輝度値と最小輝度値とを求め、これら最大輝度値と最小輝度値との差をダイナミックレンジとして求める。
【０００５】
そして、以上のような標本像の取込みと測定パラメータの変更とをダイナミックレンジが工業用レーザ走査型顕微鏡の入力有効範囲の最大となるまで繰り返される。
一方、生物用レーザ走査型顕微鏡においても、上記工業用レーザ走査型顕微鏡での測定パラメータの決定と同様にして、測定パラメータの決定が行われる。
【０００６】
また、測定パラメータの決定方法としては、例えば特許文献１に記載されているように、以下のステップ（ａ）〜（ｅ）を含む技術がある。
（ａ）測定パラメータを初期設定したときに、標本をレーザ光で仮走査したときの標本画像を取得するステップ、（ｂ）取得した標本画像の最大輝度値と最小輝度値とからダイナミックレンジを算出するステップ、（ｃ）標本画像の最大輝度値がデジタル変換での変換可能な最大値を超えていれば、ダイナミックレンジを数倍と仮定して測定パラメータを算出し直し、再び標本画像を取得するステップ、（ｄ）ダイナミックレンジが予め設定されたダイナミックレンジの最大値と最小値との範囲内にあるかを判断し、この判断の結果ダイナミックレンジが範囲外であれば、現在のダイナミックレンジに基づいて再度測定パラメータを算出し直して再び標本画像を取得するステップ、（ｅ）標本画像の最大輝度値が前記デジタル変換での変換可能な最大値を超えないで、かつダイナミックレンジが範囲内にあれば、このときのダイナミックレンジに基づいて測定パラメータを算出して決定するステップである。
【０００７】
これらステップ（ａ）〜（ｅ）により、標本に対するレーザ光の走査回数を最小限に抑えて、標本に与えるダメージを小さくすると共に、測定パラメータの決定操作を容易にしている。
また、前記ステップ（ａ）〜（ｅ）で決定した測定パラメータの妥当性を判断する以下のステップ（ｆ）〜（ｈ）を含むこともある。（ｆ）決定された前記測定パラメータに基づいて再び標本をレーザ光で仮走査して標本画像を再取得するステップ、（ｇ）この再取得された標本画像から測定パラメータの妥当性を判断するステップ、（ｈ）この判断の結果、測定パラメータが妥当でなかった場合、この測定パラメータと妥当でなかった測定パラメータが算出、設定される直前に設定されていた測定パラメータとの間から最適な測定パラメータを探索するステップである。
【０００８】
これらステップ（ｆ）〜（ｈ）により、レーザ光を標本に走査したときの標本からの反射光、蛍光又は透過光を光電変換する測定手段が有する特性の固体差に影響されずに、測定パラメータを確実に決定できる。
また、特許文献２に記載されているように、試料画像から各画素の明るさに対する正規分布を導出し、この正規分布から得られる輝度のダイナミックレンジに基づき測定パラメータを決定することができる。
【特許文献１】特開2001-151202
【特許文献２】特開平11-271220
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、標本画像の最大輝度値、最小輝度値がノイズである可能性があり、上記の方法ではノイズであった場合、その影響で最適なパラメータの決定までの走査回数が増えたり、人が見ると最適とは言い難い画像になったりすることがある。
例えば、生物用レーザ走査型顕微鏡における蛍光試料の観察等では、走査回数が増えると標本に対するレーザ照射時間が長くなり、褪色を招く原因となる。
【００１０】
また、標本画像の最大輝度値がノイズであった場合、標本画像が十分な明るさを得られないことになる。
本発明は、上記課題に鑑みてなされたもので、ノイズの影響を抑えて、標本画像の明るさ等が最適になるような測定パラメータが決定できる走査型顕微鏡の測定パラメータ決定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
請求項１記載による発明は、標本に照射するレーザ光の光量、前記標本からの光を受光する受光素子の感度、前記受光素子の出力信号を処理する信号処理部における信号処理パラメータのうち少なくともひとつを測定パラメータとして設定可能な走査型顕微鏡において、取得した標本画像に対して注目領域を少なくとも１以上指定する手段と、前記注目領域を走査することで得る輝度値を用いて前記測定パラメータを算出決定する算出決定手段と、前記算出決定手段により算出決定された前記測定パラメータに基づいて対応する調整部位を調整する調整手段と、を具備することを特徴とする。
【００１２】
この発明では、走査型顕微鏡において測定パラメータを決定する場合に、注目領域で処理するので、ノイズの影響を抑えて最適な測定パラメータを決定することが可能となる。
請求項２記載による発明は、前記算出決定手段は、予め目標輝度値および目標面積比率を指定し、前記目標輝度値以上の輝度値を示す領域の前記注目領域に対する面積比率を算出し、前記面積比率が前記目標面積比率以上となる条件を満足する前記測定パラメータを算出して決定することを特徴とする。
【００１３】
この発明では、走査型顕微鏡において測定パラメータを決定する場合に、１点のみ輝度が高い画素(ピークノイズ)の影響を抑えて最適な測定パラメータを決定することが可能となる。
請求項３記載による発明は、前記算出決定手段は、前記注目領域の最大輝度値がＡ／Ｄ変換での変換可能な最大値を超えないという条件を満足する前記測定パラメータを算出して決定することを特徴とする。
【００１４】
この発明では、走査型顕微鏡において測定パラメータを決定する場合に、輝度値が飽和した画素がない最適な測定パラメータを決定することが可能となる。
請求項４記載による発明は、前記算出決定手段は、前記標本画像を取得した時の前記受光素子への印加電圧値をＶａ、そのときの受光感度をμａ、新たに設定すべき前記受光素子への印加電圧値をＶｔ、そのときの受光感度をμｔとする、Ｖｔ＝Ｖａ×（μｔ／μａ）1/αとして算出することを特徴とする。
【００１５】
この発明では、走査型顕微鏡において測定パラメータを決定する場合に、走査回数を最小限に抑えて、最適な測定パラメータを決定することが可能となる。
請求項５記載による発明は、前記測定パラメータは、前記受光素子の受光感度であることを特徴とする。この発明では、最適な前記受光素子の受光感度の測定パラメータに決定することが可能となる。
【００１６】
請求項６記載による発明は、前記測定パラメータは、前記信号処理部の前記信号処理パラメータとしてのオフセット量およびゲインの少なくとも一方であることを特徴とする。この発明では、オフセット演算部におけるオフセット量とアナログ増幅部におけるゲインを最適な測定パラメータに決定することが可能となる。
【００１７】
請求項７記載による発明は、前記測定パラメータは、前記レーザ光の照射パワーであることを特徴とする。この発明では、最適なレーザ光の照射パワーを測定パラメータに決定することが可能となる。
【００１８】
請求項８記載による発明は、標本に照射するレーザ光の光量、前記標本からの光を受光する受光素子の感度、前記受光素子の出力信号を処理する信号処理部における信号処理パラメータのうち少なくともひとつを測定パラメータとして設定可能な測定パラメータ決定方法において、取得した標本画像に対して注目領域を少なくとも１以上指定し、前記注目領域を走査することで得る輝度値を用いて前記測定パラメータを算出決定し、前記算出決定により算出決定された前記測定パラメータに基づいて対応する調整部位を調整すること、を特徴とする。
この発明では、走査型顕微鏡の測定パラメータを決定する場合に、注目領域で処理するので、ノイズの影響を抑えて最適な測定パラメータを決定することが可能となる。
【００１９】
請求項９記載による発明は、標本に照射するレーザ光の光量、前記標本からの光を受光する受光素子の感度、前記受光素子の出力信号を処理する信号処理部における信号処理パラメータのうち少なくともひとつを測定パラメータとして設定可能な走査型顕微鏡を制御するコンピュータに実行させる測定パラメータ決定プログラムにおいて、取得した標本画像に対して注目領域を少なくとも１以上指定する手順と、前記注目領域を走査することで得る輝度値を用いて前記測定パラメータを算出決定する算出決定手順と、前記算出決定手順により算出決定された前記測定パラメータに基づいて対応する調整部位を調整する調整手順と、を特徴とする。
【００２０】
この発明では、走査型顕微鏡において測定パラメータを決定する場合に、本発明のプログラムをコンピュータに実行させることにより、注目領域で処理するので、ノイズの影響を抑えて最適な測定パラメータを決定することが可能となる。
【発明の効果】
【００２１】
以上説明したように、本発明によれば、測定パラメータを決定するまでに必要な走査回数を最小限に抑えて標本に与えるダメージを小さくし、かつ、ノイズの影響を抑えて、標本画像の明るさ等が最適になる測定パラメータを決定できる走査型顕微鏡の測定パラメータ決定方法またはプログラムを提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（実施例１）
以下、本発明の実施例について図面を参照して説明する。走査型光学顕微鏡の光学系を使用して標本を二次元走査することにより標本画像を取得する例であり、予め目標輝度値および目標面積比率を指定し、目標輝度値以上の輝度値を示す領域の注目領域に対する割合（面積比率）を算出し、算出した面積比率が前記目標面積比率以上となり、かつ、前記注目領域の最大輝度値が前記Ａ／Ｄ変換での変換可能な最大値を超えないという条件を満足する測定パラメータを算出して決定する例である。
【００２３】
本発明の構成を説明する。図1は、本発明を適用する走査型光学顕微鏡の概略構成を示している。図１において、１は光源で、レーザ光などの点光源からなっており、ＣＰＵにより制御される光量調整機能を含んでいる。
この光源１からのスポット光を二次元走査スキャナ２に導くようにしている。二次元走査スキャナ２は、光源１からのスポット光を試料４上に二次元走査するためのもので、例えばＸ軸方向走査用のガルバノミラーまたはレゾナントスキャナとＹ軸方向走査用のガルバノミラーを有し、これらＸスキャナとＹスキャナをＸ軸方向およびＹ軸方向に振ることでスポット光を標本４上でＸＹ方向に走査するようになっている。
【００２４】
対物レンズ３を通した二次元走査されたスポット光をステージ５上の標本４に照射する。  標本４からの反射光を、対物レンズ３を通して二次元走査スキャナ２に戻し、この二次元走査スキャナ２からの反射光を受光素子６に導くようにしている。尚、透過方式で透過光を観察する場合は反射光ではなく透過光を受光素子６に導くことも可能である。
【００２５】
この受光素子６は、光情報を受光し、その光強度に応じたアナログ電気信号に変換するようにしている。
そして、受光素子６は、信号処理部であるオフセット演算部７とアナログ増幅器８、Ａ／Ｄ変換器９を介してＣＰＵ１０を接続している。
【００２６】
測定検出部について説明すると、受光素子６から出力されたアナログ電気信号は、オフセット演算部７に入力され、このオフセット演算部７に設定されているオフセットが加えられる。
次に、オフセット演算部７から出力されたアナログ電気信号は、アナログ増幅器８に入力され、このアナログ増幅器８に設定されているゲインで調整され、この後にＡ／Ｄ変換器９でデジタル電気信号に変換されてＣＰＵ１０に送られる。
【００２７】
ＣＰＵ１０には二次元走査スキャナ２、ステージ５の他に、メモリ１１、フレームメモリ１２を介して表示部１３を接続している。
ＣＰＵ１０は各所の制御命令を出すもので、例えば、二次元走査スキャナに対しレーザビーム走査の開始や停止を指示するとともに、Ａ／Ｄ変換器９からのデジタル電気信号を取り込み、このデジタル電気信号を処理して標本画像を表示したり、標本画像に対して目標輝度値以上の輝度値を示す領域の注目領域に対する割合（面積比率）を算出する機能などを有している。
【００２８】
また、ＣＰＵ１０は、二次元走査スキャナ２、受光素子６、オフセット演算部７、アナログ増幅器８及びＡ／Ｄ変換器９をそれぞれ制御し、これらに測定パラメータを設定する機能を有している。
受光素子６は、ＣＰＵ１０から与えられる測定パラメータとしての受光感度の調整のための印加電圧の設定によってその出力電流が制御されるものとなっている。
【００２９】
オフセット演算部７は、ＣＰＵ１０から与えられる測定パラメータとしてのオフセット設定値によってアナログ電気信号に対して加算／減算するオフセット量を変化させるものとなっている。アナログ増幅器８は、ＣＰＵ１０から与えられる測定パラメータとしてのゲイン設定値によって入力されるアナログ電気信号に対する増幅率を変化させるものとなっている。
【００３０】
また、ＣＰＵ１０は入力装置１５とも接続しており、入力装置１５の指示に従って、表示部１３に注目領域を描画し、メモリ１１に対応する注目領域を保持している。
メモリ１１は、受光素子６より検出される標本４の光強度検出値、入力装置１５の指示で生成される注目領域などを記憶している。
【００３１】
そして、表示部１３は、 ＣＰＵ１０で生成された標本画像を、フレームメモリ１２を介して表示するようにしている。
ここで、ＣＰＵ１０、メモリ１１、フレームメモリ１２等は一般的なパーソナルコンピュータを利用してもかまわない。
【００３２】
また、後述する図２、図３の処理はコンピュータプログラムにより処理可能で、その処理プログラムはＣＤ−ＲＯＭ等記録媒体やハードディスク等記憶装置１４に記録されている。必要に応じて前記パーソナルコンピュータのメモリ上に前記処理プログラムを読み出し、ＣＰＵにより実行しパーソナルコンピュータに接続されている各装置を制御している。
【００３３】
なお、記録媒体は通信回線を介してコンピュータと接続されている、プログラムサーバとして機能するコンピュータが備えている記憶装置であってもよい。
この場合には、制御プログラムを表現するデータ信号で搬送波を変調して得られる伝送信号を、プログラムサーバから伝送媒体である通信回線を通じてコンピュータヘ伝送するようにし、コンピュータでは受信した伝送信号を復調して処理プログラムを再生することでこの処理プログラムをＣＰＵで実行できるようになる。
【００３４】
以上のように構成された走査型顕微鏡における、測定パラメータ決定方法について図２を用いて説明する。
例として、オフセット演算部７のオフセット値を０、アナログ増幅器８のゲイン設定値を１倍とし、標本の光強度値の調整を受光素子６の受光感度で調整する場合について説明する。ここで、受光素子６はフォトマルチプライヤとし、フォトマルチプライヤの受光感度は、受光素子６への印加電圧にて調整し得る。
【００３５】
まず、ステップＳ２０２において、フォトマルチプライヤに対して印加電圧値Ｖを、標本の状態に適するであろうと思われる値を初期値Ｖｉとして設定する。この初期値Ｖｉが分からない場合には、フォトマルチプライヤに印加できる電圧範囲で受光感度が中間レベルとなるような印加電圧値を設定する。
【００３６】
これと共に同ステップＳ２０２において、オフセット演算部7のオフセット値を０、アナログ増幅器８のゲイン設定値を１倍に初期設定する。
但し、ここでのオフセット値は、フォトマルチプライヤの暗電流分を差し引いた後の値とする。
【００３７】
次に、ステップＳ２０３において、光源１を動作させると共に二次元走査スキャナ２を駆動し、レーザ光を標本４に走査して標本画像を取得する。すなわち、光源１からレーザ光が出力されると、このレーザ光は、二次元走査スキャナ２により所定方向に走査されながら対物レンズを通して標本４に照射される。
【００３８】
この標本４からの反射光、蛍光又は透過光は、フォトマルチプライヤで受光されて初期設定された受光感度でアナログ電気信号に変化され、この後、オフセット演算部７により初期設定されたオフセット値０が加えられ、Ａ／Ｄ変換器９によりデジタル電気信号に変換されてＣＰＵ１０に送られる。
【００３９】
このＣＰＵ１０は、Ａ／Ｄ変換器９からのデジタル電気信号を取り込み、このデジタル電気信号を処理して標本画像を生成する。
次に、ステップＳ２０４において、ステップＳ２０５のフォトマルチプライヤへの印加電圧値Ｖの算出時に使用する注目領域を指示する。
【００４０】
ここで、注目領域は画像中の１画素から画像の全領域までの任意の大きさを指定してよい。また、ステップＳ２０６でパラメータが決定せず、ステップＳ２０３で再走査する場合は、注目領域はそのまま使用しても変更してもよい。注目領域として複数箇所を指定してもよい。
【００４１】
次に、ステップＳ２０５において、ステップＳ２０４で指示した領域を用いて、フォトマルチプライヤへの印加電圧値Ｖを計算する。計算処理の詳細な流れと計算式については後述する。
ステップＳ２０６において、ステップＳ２０５で測定パラメータが決定したかどうかを判断し、測定パラメータが決定した場合は、ステップＳ２０８で処理を終了する。測定パラメータが決定しなかった場合は、ステップＳ２０７でステップＳ２０５において算出した印加電圧値を設定し、ステップＳ２０３に戻り、標本を再走査し、フォトマルチプライヤへの印加電圧値Ｖを再計算する。
【００４２】
ここで、上記ステップＳ２０５におけるフォトマルチプライヤへの印加電圧値Ｖの算出について図３に示す流れ図に従って説明する。
まず、ステップＳ３０２において、標本画像の注目領域内の輝度−面積比率データを計算する。
【００４３】
次に、ステップＳ３０３からＳ３０６で、標本画像内の最大輝度値Ｉｍが飽和しているかどうか調べる。なお、ここでは、最大輝度値の面積比率が、最大輝度値の目標面積比率Ｒｓを超えていたら飽和していると判断する。最大輝度値の目標面積比率Ｒｓを用いて調べることで、１点のみ輝度が飽和している画素(ピークノイズ)の影響を排除できる。
【００４４】
従って最大輝度値の目標面積比率Ｒｓは通常数％以下の値を指定すればよい。ステップＳ３０３で標本画像内の最大輝度値Ｉｍの面積比率Ｒｍを調べ、ステップＳ３０４で面積比率Ｒｍが最大輝度値の目標面積比率Ｒｓ以上のときは飽和しているとし、ステップＳ３０５で飽和フラグFlgSaturationをＯＮする。
【００４５】
それ以外は飽和していないとして、ステップＳ３０６で飽和フラグFlgSaturationをＯＦＦにする。
次に、ステップＳ３０７において、目標面積比率Ｒｔを示した標本画像の実際の輝度値Ｉａを調べ、目標輝度値Ｉｔにするための目標印加電圧値Ｖｔを計算する。
【００４６】
目標輝度値Ｉｔおよび目標面積比率Ｒｔは予め標本の状態に適するであろうと思われる値を設定する。
標本の状態に適する値が分からない場合には、目標輝度値ＩｔはＡ／Ｄ変換器の精度の７５％程度、目標面積比率Ｒｔは２５％程度を設定し、再走査時に調整してもよい。目標印加電圧値Ｖｔの計算式の詳細は後述する。
【００４７】
続いて、ステップＳ３０８からステップＳ３１６で、条件に合うフォトマルチプライヤへの印加電圧値Ｖを決定する。
ステップＳ３０８→Ｓ３０９→Ｓ３１１→Ｓ３１２という流れでは、目標面積比率Ｒｔを示した標本画像の輝度値Ｉａの方が目標輝度値Ｉｔより高く、標本画像内の最大輝度値が飽和しており、標本画像取得時の印加電圧Ｖｃ が目標印加電圧Ｖｔ以上であることを示している。
【００４８】
この場合は、フォトマルチプライヤへの印加電圧値Ｖを目標印加電圧Ｖｔにして、測定パラメータが決定していないことを示す再走査フラグFlgRescanをＯＮにする。
ステップＳ３０８→Ｓ３０９→Ｓ３１１→Ｓ３１３という流れでは、目標面積比率Ｒｔを示した標本画像の輝度値Ｉａの方が目標輝度値Ｉｔより高く、標本画像内の最大輝度値が飽和しているが、標本画像取得時の印加電圧Ｖｃが目標印加電圧Ｖｔ未満であることを示している。
【００４９】
この場合は、フォトマルチプライヤへの印加電圧値Ｖを、標本画像取得時の印加電圧Ｖｃに対して予め設定しておいた調整割合Ｐｓ分下げた値（Ｖｃ×Ｐｓ）にして、測定パラメータが決定していないことを示す再走査フラグFlgRescanをＯＮにする。
ステップＳ３０８→Ｓ３０９→Ｓ３１４という流れでは、目標面積比率Ｒｔを示した標本画像の輝度値Ｉａの方が目標輝度値Ｉｔより高く、標本画像内の最大輝度値が飽和していない、すなわち測定パラメータが決定したことを示している。
【００５０】
この場合は、フォトマルチプライヤへの印加電圧値Ｖは変更せず、測定パラメータが決定していないことを示す再走査フラグFlgRescanはＯＦＦにする。
ステップＳ３０８→Ｓ３１０→Ｓ３１５という流れでは、目標面積比率Ｒｔを示した標本画像の輝度値Ｉａの方が目標輝度値Ｉｔより低いが、標本画像内の最大輝度値が飽和していることを示している。
【００５１】
この場合は、フォトマルチプライヤへの印加電圧値Ｖを、標本画像取得時の印加電圧Ｖｃに対して予め設定しておいた調整割合Ｐｓ分下げた値（Ｖｃ×Ｐｓ）にして、測定パラメータが決定していないことを示す再走査フラグFlgRescanをＯＮにする。
ステップＳ３０８→Ｓ３１０→Ｓ３１６という流れでは、目標面積比率Ｒｔを示した標本画像の輝度値Ｉａの方が目標輝度値Ｉｔより低く、標本画像内の最大輝度値が飽和していないことを示している。
【００５２】
この場合は、フォトマルチプライヤへの印加電圧値Ｖを目標印加電圧Ｖｔにして、測定パラメータが決定していないことを示す再走査フラグFlgRescanをＯＮにする。図３の全ステップが終了したら、図２ステップＳ２０６で再走査フラグFlgRescanがＯＮの場合は、算出した印加電圧値Ｖをフォトマルチプライヤへ設定し、再走査する。
【００５３】
上記で目標面積比率Ｒｔを示した実際の輝度値Ｉａを調べ、目標輝度値Ｉｔにするための印加電圧値を計算しているが、以下でその方法について説明する。
フォトマルチプライヤの受光感度（電子増倍率）μは、係数をＡ、印加電圧をＨｖ、フォトマルチプライヤの電極の材質、構成により設定される定数をｋ、フォトマルチプライヤの内部のダイノードの段数(増倍段の数)をｎとすると、
μ＝ＡＨｖkn      ・・・  （１）
により表される。なお、定数ｋやダイノードの段数ｎは、フォトマルチプライヤの受光感度特性を実験的に測定して、そこから算出された値を採用してもよい。ここで、ｋ、ｎはどちらも定数なので、式１のｋｎをαに置き換えると式２とできる。
【００５４】
μ＝ＡＨｖα      ・・・  （２）
また、画像として取得された輝度値Ｉ、印加電圧で調整可能な輝度値Ｄ、オフセット値で調整可能な輝度値Ｏ、増幅器で設定された倍率Ｇとすると、画像の輝度値は式３で表せる。
【００５５】
Ｉ＝（Ｄ−Ｏ）×Ｇ      ・・・  （３）
上記のような関係にあるとき、求めるフォトマルチプライヤへの印加電圧値Ｖｔは、目標とする輝度値をＩｔ、目標とする輝度値Ｉｔ以上の画素の注目領域に対する面積比率をＲｔとすると、目標とする輝度値Ｉｔで、Ｉｔ以上の輝度を持つ画素の面積比率がＲｔとなるような印加電圧値を算出すればよい。
【００５６】
輝度値Ｉｔとなるときのオフセット値、ゲイン設定値、フォトマルチプライヤの検出値のＡ／Ｄ変換値をそれぞれ、Ｏｔ、Ｇｔ、Ｄtとすると、目標とする輝度値をＩｔは式４で表せる。
Ｉｔ＝（Ｄｔ−Ｏｔ）×Ｇｔ      ・・・  （４）
次に、標本を走査して取得した標本画像の注目領域において、面積比率がＲｔとなる輝度値をＩａとする。
【００５７】
このときのオフセット値、ゲイン設定値、フォトマルチプライヤの検出値のＡ／Ｄ変換値をそれぞれ、Ｏａ、Ｇａ、Ｄａとすると、標本画像の輝度値Ｉａは式５で表せる。
Ｉａ＝（Ｄａ−Ｏａ）×Ｇａ      ・・・  （５）
ここで、式２のμと式３の画像輝度値は、μ∝（画像輝度値  ＋  画像オフセット値）の関係であることから、式４、式５は、目標とするフォトマルチプライヤの受光感度をμt、標本画像のフォトマルチプライヤの受光感度をμａとすると、式６、式７という関係にあるといえる。
【００５８】
μｔ∝Ｄｔ＝（Ｉｔ／Ｇｔ）＋Ｏｔ      ・・・  （６）
μａ∝Ｄａ＝（Ｉａ／Ｇａ）＋Ｏａ      ・・・  （７）
続いて、標本画像のフォトマルチプライヤの受光感度μａをμｔ／μａ倍すれば目標とするフォトマルチプライヤの受光感度μｔとなることから、標本画像のフォトマルチプライヤの印加電圧値をＶａとすると、求めるフォトマルチプライヤの印加電圧値Ｖｔはμｔおよびμａから式８のように計算できる。
【００５９】
μｔ／μａ＝（Ｖｔ／Ｖａ）α
Ｖｔ＝Ｖａ×（μｔ／μａ）1/α      ・・・  （８）
またμｔ／μａは、式６、式７の関係から、式９のようにも計算できる。
μｔ／μａ＝（（Ｉｔ／Ｇｔ）＋Ｏｔ）／（（Ｉａ／Ｇａ）＋Ｏａ）      ・・・  （９）
ここで、オフセット値およびゲイン設定値は、走査画像取得時のまま変更しないので、 Ｇｔ＝Ｇａ、Ｏｔ＝Ｏａの関係にあり、式９は式１０のように置き換えられる。
【００６０】
μｔ／μａ＝（（Ｉｔ／Ｇａ）＋Ｏａ）／（（Ｉａ／Ｇａ）＋Ｏａ）
μｔ／μａ＝（Ｉｔ＋Ｏａ×Ｇａ）／（Ｉａ＋Ｏａ×Ｇａ）      ・・・  （１０）
したがって、式（８）、式（１０）より、求めるフォトマルチプライヤへの印加電圧値Ｖｔは式１１のようになる。
【００６１】
Ｖｔ＝Ｖａｘ（（Ｉｔ＋Ｏａ×Ｇａ）／（Ｉａ＋Ｏａ×Ｇａ））1/α ・・・（１１）
このように上記実施の形態により、フォトマルチプライヤへの印加電圧値Ｖの決定操作を容易にして操作者の負担を軽減し、確実に最適な測定パラメータを決定できる。
【００６２】
なお、上記実施の形態では、フォトマルチプライヤヘの印加電圧を算出しているがゲイン設定値等を算出してもよい。また、測定パラメータとしてレーザの出力パワーを調整してもかまわない。例えば、光パワーの調整が可能なレーザ光源として、ガスレーザと、調光手段としてＮＤフィルタ、音響光学可変フィルタ（ＡＯＴＦ）等を用いてもよい。本実施例では光源１の光源は半導体レーザを利用しＣＰＵによって調光手段を制御または半導体レーザの駆動制御を行っている。
【００６３】
さらに、上記測定パラメータの算出時間を制限する必要がある時に、二分検索法と組み合わせることで算出時間を短くし、試料への影響を最小限にすることができる。
また、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々の改良、変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明の実施例の、実施の形態の概略構成を示す図であるo
【図２】本発明の実施例の、実施の形態の動作を説明するための概略の流れ図である。
【図３】本発明の実施例の、実施の形態の印加電圧値を計算するための流れ図である。
【符号の説明】
【００６５】
１・・・光源
２・・・二次元走査スキャナ
３・・・対物レンズ
４・・・標本
５・・・ステージ
６・・・受光素子（フォトマルチプライヤ）
７・・・オフセット演算部
８・・・アナログ増幅器
９・・・Ａ／Ｄ変換器
１０・・・ＣＰＵ
１１・・・メモリ
１２・・・フレームメモリ
１３・・・表示部
１４・・・記憶装置
１５・・・入力装置
【図１】
2005321728.tif 000003
【図２】
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【図３】
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