(57)【要約】【課題】  現在の質量分析システムでは、物質（特にタンパク質，糖鎖など）を解析する際に、解析に必要な情報が十分かどうか測定中に判定できない。また、質量が全く等しい異性体や、非常に近い質量を持つ化合物をＭＳデータのみから判定することは困難である。【解決手段】  本発明では、タンパク質を酵素分解した際に生成されるペプチドのＬＣ（またはＧＣ）の保持時間(リテンションタイム) が、ＭＳ2マススペクトルデータから予測されるアミノ酸配列から推定される予測保持時間と一致するか否かを計測の実時間内に判定し、ＭＳ2 マススペクトルデータの質（情報量）を判定する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を導入する試料導入部と試料を分離する試料分離部と、前記試料に関する試料分離部での保持時間τに関する情報を測定する質量分析部と、物質と前記試料分離部での前記物質の保持時間τに関する情報を格納する内部データベースと、前記質量分析部で測定された試料分離部での前記物質の保持時間および試料分離部での前記試料分離部で前記内部データベースに格納した保持時間τを用いて前記試料の構造の評価を実測定時間内に行う評価部とを有することを特徴とする質量分析システム。
【請求項２】
質量分析装置を制御するためのコンピューターを、質量分析部で測定された試料分離部での物質の保持時間τを用いて、前記質量分析部からの質量分析データの評価を実測定時間内に行う手段として機能させることを特徴とする質量分析プログラム。
【請求項３】
試料を導入する手順と、試料を分離する手順と、試料をイオン化する手順と、試料を質量分析する手順と、試料を構成する物質の質量数と前記試料分離手順で前記物質の保持時間τに関する情報を内部データベースに格納する手順と、質量分析データの処理手順と、前記試料分離部で内部データベースに格納した保持時間τを用いて質量分析データの評価を実測定時間内に行う評価手順とを有することを特徴とする質量分析方法。
【請求項４】
請求項１において、前記試料分離部が、液体クロマトグラフィであることを特徴とする質量分析システム。
【請求項５】
請求項１において、前記試料分離部が、ガスクロマトグラフィであることを特徴とする質量分析システム。
【請求項６】
請求項１において、前記試料分離部で測定された保持時間τおよび質量数から、物質の構成又は構造を予測することを特徴とする質量分析システム。
【請求項７】
請求項６において、物質の構成乃至は構造を予測する手段において、保持時間τおよび質量数ｍと物質の構成乃至は構造の対応データが格納されたテーブルあるいはデータベースに基づいて予測することを特徴とする質量分析システム。
【請求項８】
請求項６において、物質の構成乃至は構造を予測する手段において、保持時間τおよび質量数ｍと物質の構成又は構造の対応を表す経験式から算出して予測することを特徴とする質量分析システム。
【請求項９】
請求項１において、前記評価部は、測定対象の構造および構成の候補から予測される保持時間τ′と試料分離部で測定した保持時間τの比較を行うことで、測定対象の構造または構成を予測することを特徴とする質量分析システム。
【請求項１０】
請求項１において、前記評価部は、測定対象の構造および構成の候補から予測される保持時間τ′と試料分離部で測定した保持時間τの比較を行うことで、擬陽性の候補を排除することを特徴とする質量分析システム。
【請求項１１】
請求項１において、前記試料分離部で保持時間τを格納した際、次の質量分析データ測定で、前記試料分離部の条件が変化したとみなす場合は、格納した保持時間τに関するデータを消去することを特徴とする質量分析システム。
【請求項１２】
請求項１において、前記試料分離部で保持時間τを格納した際、次の質量分析データ測定で、前記試料分離部の条件が変化したとユーザがみなす場合は、別の名前でデータベースを保存することを特徴とする質量分析システム。
【請求項１３】
請求項１において、前記試料分離部で保持時間τを格納した際、次の質量分析データ測定で、前記試料分離部の条件が変化したと判断された場合は、別の名前でデータベースを保存することを特徴とする質量分析システム。
【請求項１４】
請求項１１において、前記試料分離部の条件が変化したとみなす場合は、前記試料分離部の条件を変更した場合、又は次の質量分析データ測定までに所定の時間が経過した場合であることを特徴とする質量分析システム。
【請求項１５】
請求項１において、分析対象の試料を質量分析し、その結果、あるｍ／ｚ値をもつ特定イオンを選択，解離し、その解離イオンを質量分析するといった多段質量分析機能を備えた場合、前記質量分析データとは、ｎ段目（ｎ≧１の整数値）の質量分析データあることを特徴とする質量分析システム。
【請求項１６】
請求項１５において、ｎ段目（ｎ≧２の整数値）の質量分析データにおいて、試料がポリペプチドである場合は、そのＭＳ2 マススペクトルデータから予測されるアミノ酸配列などのアミノ酸構成に関する情報から、ＭＳ2 マススペクトルデータを取得した際に選択したｍ／ｚ値とは異なるｍ／ｚ値を持つイオンピークを選択し、再度ｎ段目の質量分析を行うか否かを判定することを特徴とする質量分析システム。
【請求項１７】
請求項１５において、前記アミノ酸構成に関する情報から再度ｎ段目の質量分析を行うのは、（予測されるポリペプチドに含まれる塩基性アミノ酸の数）≧（ポリペプチドの価数）である場合であることを特徴とする質量分析システム。
【請求項１８】
請求項１５において、前記アミノ酸構成に関する情報から再度ｎ段目の質量分析を行うのは、（予測されるポリペプチドに含まれる塩基性アミノ酸の数）≧（ポリペプチドの価数）であり、予測されるペプチドのアミノ酸配列に酸性アミノ酸が含まれると考えられる質量分析データである場合であることを特徴とする質量分析システム。
【請求項１９】
請求項１５において、前記ＭＳ2 マススペクトルデータを取得した際に選択したｍ／ｚ値とは異なるｍ／ｚ値を持つイオンピークとは、質量数ｍが同じで価数ｚが異なるイオンピークであることを特徴とする質量分析システム。
【請求項２０】
請求項１９において、前記価数ｚが異なるイオンピークとは、前回選択したイオンより価数ｚが大きな値を持つイオンピークであることを特徴とする質量分析システム。
【請求項２１】
請求項１，２，３において、前記実測定時間が、１００msec以内であることを特徴とする質量分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析システムおよび質量分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
（１）質量分析方法には、試料をイオン化してそのまま分析する方法（ＭＳ分析法）と、特定の試料イオン（親イオン）を質量選択し、それを解離させて生成した解離イオンを質量分析するタンデム質量分析法がある。タンデム質量分析法には、解離イオンの中から、特定の質量対電荷比を持つイオン（前駆イオン）を選択し、更に、その前駆イオンを解離し、その際生成した解離イオンの質量分析を行うといったように、解離・質量分析を多段に行う機能（ｎ段目の計測：以降ＭＳn ）がある。
【０００３】
（２）微量かつ不純物の多い物質の定量分析には、クロマトグラフィと質量分析計とを組み合わせたシステムが用いられる。このシステムでは、定量する物質は、クロマトグラフィによって物質のカラムへの吸着度の違い等から時間的に分離され、質量分析計によって質量的に分離される。糖鎖の異性体や１つのアミノ酸と同質量を持つ２つのアミノ酸の組み合わせなどを持つ化合物の場合、質量的に分離することは困難であるが、それらの物質は物質の化学的性質，物理的性質によりクロマトグラフィによってほとんどが時間的に分離される。
【０００４】
（３）ペプチドの同定には、データベースサーチを用いる方法と、マススペクトルデータのピーク間隔からアミノ酸配列を読み取る方法がある。これらの方法はどちらも後処理として行われる。このため、得られたスペクトルの情報量が不十分であった場合、再度データを取得する必要があり、病変タンパクなどの非常に微量なサンプルには有用な方法ではなかった。
【０００５】
（４）特開２０００−２６６７３７号公報（特許文献１）は測定対象に対して、試料分離部の保持時間とマススペクトルデータを既知物質のデータと比較し、測定対象を解析する方法を示しているが、一連のデータ処理は後処理である。また、既知物質との比較から未知物質であることは判定可能だが、その未知物質を同定することは困難である。
【０００６】
（５）J. L. Meek, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77. 1632(1980)(非特許文献１) は、ペプチドの場合、ペプチドを形成するアミノ酸の構成および末端基から保持時間を予測することが可能なことを示すものである。ペプチドの予測保持時間は、ペプチドを構成するアミノ酸および末端基の保持時間係数の合計と保持されない化合物の溶出時間との和で導出される。
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−２６６７３７号公報
【非特許文献１】J. L. Meek, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77. 1632(1980)
【非特許文献２】J. Mass Spectrom. 35, 1399-1406(2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
解決しようとする課題は、現在の質量分析システムでは、物質（特にタンパク質，糖鎖など）を解析する際に、同定に必要な情報が十分かどうか計測の実時間内で判定できない点である。
【０００９】
（１）従来法では質量分析において、ｎ段目の解離イオンの計測（ＭＳn ）を実施する際に、（ｎ−１）段目（ＭＳn-1 ）の解離スペクトルから測定者の知見に基づいてＭＳn にかけるイオン種を選定していた。このため、ＭＳn 測定には手間がかかり、通常はｎ＝２の段階までのスペクトル解析しか実施しないことが多かった。ｎ＝２の段階では、同定上必要なスペクトル情報が十分得られないことがあり、その場合、同定により多くの情報を必要とする未知タンパク質を同定することは困難である。
【００１０】
（２）ペプチド鎖を構成するアミノ酸残基数をＫとし、アミノ酸の種類を２０とすると、考えられるアミノ酸配列数は２０K になる。これにアミノ酸側鎖の化学修飾を考慮するとその数は更に増大する。この中には、２つのアミノ酸が組み合わさった質量が１つのアミノ酸質量と一致する場合が多々あり、アミノ酸の解離状況によっては、質量数でその判別を行うことが困難な場合がある。
【００１１】
（３）公知であるデータベース検索では、一般的に２段目の質量分析から得られたスペクトルデータをデータベースと比較して、一致度を検証する。データベースに蓄えられているデータは、既知の物質に対する２段目の質量分析データであるため、未知物質の同定は不可能である。また、データベースに蓄えられているデータ量が膨大なため、擬陽性の候補が数多く挙げられやすい。公知であるde novo ペプチドシークエンス法では、ｎ段目（ｎ≧２）における解離スペクトルにおいて、ピークとピークの間隔からアミノ酸質量を計算し、そこからアミノ酸配列を予測するものであるが、この手法ではｍ／ｚのみを用いてアミノ酸配列を予測するため、膨大な数の候補が挙がる可能性があり、正解配列がその中に含まれていたとしても、同定精度の観点から必ずしも最適ではない。どちらの手法でも、擬陽性の候補が数多く挙がり、その中から正解を判定するには膨大な手間と経験が必要である。
【００１２】
（４）非特許文献２は、ＭＳn 解離スペクトルにおいて、モバイルプロトン（アミノ酸間を自由に動き回れるＨ+ イオン）がない場合（(ペプチドに含まれる塩基性アミノ酸数)≧（ペプチドの価数）の場合))で、ペプチドにアスパラギン酸やグルタミン酸といった酸性アミノ酸が含まれる場合、酸性アミノ酸のＣ末端側で選択的に解離したピークが強く現れることを示すものである。この場合、他のアミノ酸間で切断されたピークは非常に強度が低くなり、測定対象を精度良く同定することは困難である。
【００１３】
本発明の目的は、高効率に精度良く測定対象の構造および構成を得ることができる質量分析装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明では、試料導入手段と、試料分離部と、試料をイオン化するイオン化部と、質量分析部とを有する質量分析システムにおいて、試料分離部で計測した保持時間τを用いて、質量分析部からのタンデム質量分析データを評価することを最も主要な特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明では、質量分離部での測定対象の保持時間τを用いて、質量分析データをリアルタイムに評価するので、高効率に精度良く測定対象の構造および構成を得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に本発明の実施例を示す。
【実施例１】
【００１７】
図１は、本発明の第一の実施例である質量分析システムにおける分析内容を自動判定処理するフロー図である。質量分析データは図２に示す質量分析システム２３において計測される。質量分析システム２３では、分析対象の試料は、液体クロマトグラフィなどの前処理系１５で前処理される。たとえば、大元の試料がタンパク質である場合、前処理系
１５にて、消化酵素によりポリペプチドの大きさに分解され、ガスクロマトグラフィ(GC)または液体クロマトグラフィ（ＬＣ）により分離される。その後、イオン化部１６にてイオン化され、質量分析部１７で、イオンの質量対電荷比ｍ／ｚに応じて分離される。ここで、ｍはイオン質量、ｚはイオンの帯電価数である。分離されたイオンは、イオン検出部１８で検出され、データ処理部１９でデータ整理・処理され、その分析結果である質量分析データは表示部２０にて表示される。この一連の質量分析過程−試料の前処理，試料のイオン化，試料イオンビームの質量分析部１７への輸送及び入射，質量分離過程、及び、イオン検出，データ処理の全体を全体制御部２１で制御している。
【００１８】
質量分析方法には、試料をイオン化してそのまま分析する方法（ＭＳ分析法）と、特定の試料イオン（親イオン）を質量選択し、それを解離させて生成した解離イオンを質量分析するタンデム質量分析法がある。タンデム質量分析法には、解離イオンの中から、特定の質量対電荷比を持つイオン（前駆イオン）を選択し、更に、その前駆イオンを解離し、その際生成した解離イオンの質量分析を行うといったように、解離・質量分析を多段に行う（ＭＳn ）機能もある。つまり、大元である試料中の物質の質量分析分布をマススペクトルデータ（ＭＳ1 ）として計測後、あるｍ／ｚ値を持つ親イオンを選択し、それを解離し、得られた解離イオンの質量分析データ（ＭＳ2 ）を計測後、ＭＳ2 マススペクトルデータのうち、選択された前駆イオンを更に解離し、得られた解離イオンの質量分析データ（ＭＳ3 ）を計測するといったように、解離・質量分析を多段に行う。解離段階毎に、解離前の状態である前駆体イオンの分子構造情報が得られ、前駆体イオンの構造推定に非常に有効である。これら前駆体の構造情報が詳細になるほど、大元の構造である親イオン構造を推定する際の推定構造が向上する。
【００１９】
本実施例では、親イオンの解離方法として、まず、ヘリウムなどのバッファーガスと衝突させて解離させる衝突解離（Collision Induced Dissociation）法を採用した場合について言及する。衝突解離するためには、ヘリウムガスなどの中性ガスが必要となるため、図２に示すように、衝突解離するためのコリジョンセル（Collision Cell）１７Ａとして、質量分析部１７とは別に設けている場合もあるが、質量分析部１７に中性ガスを充満させて、質量分析部１７内で衝突解離させてもよい。その場合、コリジョンセル１７Ａは不要になる。また、解離手段として、低エネルギーの電子を照射し、親イオンに多量に低エネルギー電子を捕獲させることにより、ターゲットイオンを解離させる電子捕獲解離
（Electron Capture Dissociation）を採用しても良い。
【００２０】
図３にタンデム質量分析を用いた比較例のタンパク質同定フローを示す。図３で、図１と同じ数字の記載がある構成要素は、図１と同じ構成要素であるため、図１と異なる点について説明する。導入された試料は、ＬＣまたはＧＣによって分離された後、イオン化される。その後、質量分析（ＭＳ1）を実施し、検出されたイオンの中からＭＳ2分析を行う前駆イオンを選択する。選択された前駆イオンを解離した後、再度質量分析（ＭＳ2 ）を実施し、ＭＳ2 のマススペクトルデータを取得２４する。得られたマススペクトルデータは計測終了後に後処理２５として、ノイズピークおよび同位体ピークの除去，イオンの価数判定等のデータ処理２５−１を行い、既知の蛋白質から構成される蛋白質データベースを用いてデータベースサーチ２５−２を行う。この同定フローでは、得られたＭＳ2 マススペクトルデータの検討が後処理であるため、ＭＳ2 マススペクトルデータの有効性をリアルタイムに判定することは不可能である。また、サンプルが非常に微量な場合、再度、質量分析を行うことは困難なため、一度の測定で出来るだけ多くの情報を得ることが重要となっている。
【００２１】
試料中のペプチドの質量分析分布であるＭＳ1におけるスペクトルの中から、さらに、解離して得られたＭＳ2 マススペクトルデータに対して、既知のタンパク質から構成されるデータベースを用いてデータベースサーチを行う。この同定フローでは、得られたMS2 マススペクトルデータの検討が後処理であるため、ＭＳ2 マススペクトルデータの有効性をリアルタイムに判定することは不可能である。また、サンプルが非常に微量な場合、再度、質量分析を行うことは困難なため、一度の測定でできるだけ多くの有効な情報を得ることが重要となっている。
【００２２】
そこで、本発明では、タンパク質を酵素分解した際に生成されるペプチドのＬＣの保持時間（リテンションタイム）が、ＭＳnデータから予測されるアミノ酸配列に基づいて推定される予測保持時間と一致するか否かを計測の実時間内で自動判定する。
【００２３】
ここで、保持時間とは、試料が導入されてからＬＣにトラップされた後、ＬＣから溶出し、検出器にて検出されるまでの時間を指す。ＬＣに導入されたペプチドはその化学的性質によって、カラムの固定相と相互作用を持つ。ペプチドの種類によってその相互作用の値は異なり、例えば、強く吸着する相互作用の大きいペプチドであれば溶出にはより多くの時間を必要とし、相互作用の小さいペプチドであれば溶出時間は短くなる。このようにＬＣではペプチドの化学的性質によって試料を時間的に分離することが可能である。
【００２４】
例えば、あるマススペクトルから予測されるアミノ酸配列が複数存在する場合は、ＭＳデータのみからどれが真のアミノ酸配列かを判定することは困難であるが、ＬＣまたは
ＧＣなど分離部の保持時間を利用することで判定が可能である。試料がＬＣまたはＧＣを通過する際、物質の化学的性質によりカラムへの吸着と脱着の平衡定数が異なるため、カラムから出てくる時間（保持時間）が異なる。この点から、質量数ｍが同じでも、化学構造や化学的性質が異なれば、保持時間も異なり、区別することが可能となる。本発明では、ＬＣまたはＧＣで測定された保持時間τと予測される複数のアミノ酸配列に対してそれぞれ計算される予測保持時間τ′とを計測の実時間内に比較することで、擬陽性の候補を除くことが出来る。予測保持時間τ′は、データベースに保存されている値を用いても良い。
【００２５】
本発明のフローを、図１及び図２を用いて説明する。ここで、太線で示される内容はデータ処理部１９で実施される処理を示している。試料の導入は、試料導入１にて行われる。試料分離２は前処理系１５にてＬＣまたはＧＣを用いて実施される。ここでの前処理としてはＬＣを用いた。分離された試料は、その後、イオン化部１６にてイオン化４される。本実施例では、イオン化方法にＥＳＩ（Electro Spray Ionization）法を用いた。次に、イオン化された試料は質量分析５（ＭＳ1 ）される。質量分析５では、質量分析部１７，イオン検出部１８，データ処理部１９での処理が実施される。ここで、試料分離２の際に用いたＬＣと質量分析部１７，イオン検出部１８，データ処理部１９を同期させて、質量分析した時の時間をその物質の保持時間τとする。このため、データ処理部１９の結果を受けて、内部データベースへ試料分離２の際のＬＣの保持時間τと質量数ｍのデータ格納３を行う。内部データベースへのデータ格納は、データ処理部１９から全体制御部２１を通じて内部データベース１４に自動格納される。次に、質量分析５の結果を基に、特定のイオン（親イオン）を選択し、親イオンをコリジョンセル１７Ａ内にて解離させ（親イオンの解離反応６）、得られた解離フラグメントに対して、質量分析部１７にて再度質量分析７（ＭＳ2 ）を実施する。質量分析７においては、ＬＣの保持時間τと質量数ｍの内部データベースへの格納以外は、ＭＳ1 の際と同様の処理が実施される。次に、得られたＭＳ2マススペクトルデータに対して、データ処理部１９にてＭＳ2マススペクトルデータの解析８を実施し、アミノ酸配列候補の予測９を行う。その後、データ処理部１９にて、予測されたアミノ酸配列候補に対して予測保持時間τ′の導出１０を行う。本実施例では、予測保持時間τ′は、表１に示す構成アミノ酸の各保持時間係数とペプチドの末端（Ｎ末端，Ｃ末端）の保持時間係数と溶媒の溶出時間の和から導出した（参考文献：J. L. 
Meek, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77. 1632(1980)）。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
導出された予測保持時間τ′は実測の保持時間τと比較１１され、その誤差が、ある許容誤差内の値であれば一致したとみなされる。一致するアミノ酸配列候補が存在する場合は、解析に必要な情報がＭＳ2 マススペクトルデータに含まれているとみなして測定を終了する。一方、許容誤差内の予測保持時間を持つアミノ酸配列候補がない場合には、解析に必要な情報がＭＳ2 マススペクトルデータに十分含まれていないとみなし、特定の解離イオン（前駆イオン）の選定１２を行い、そのイオンに対してＭＳ3分析またはＭＳ2′分析１３を行う。ここでＭＳ2′ 分析とは質量数ｍが等しく、前回の測定で選択したイオンと価数ｚが異なる値となるイオンに対して再度ＭＳ2 分析を行うことを言う。この時、前回の測定で選択したイオンよりも価数ｚが大きい値を選ぶ方が望ましい。これは、価数の大きいイオンに対して質量分析した方が、より多くの解離フラグメントを得られるという知見に基づくものである（参考文献：V. H. Wysocki, G. Tsaprailis, L. L. Smith and L.A. Breci, J. Mass Spectrom. 35, 1399(2000)）。ＭＳ3分析またはＭＳ2′分析の選択はユーザ入力部２２において、ユーザが指定しても良い。データ処理部１９にて判定した結果は、全体制御部２１を通じて次の分析情報として利用される。
【００２８】
図４を用いて、本発明フローに基づいて質量分析した例を説明する。
【００２９】
本実施例では図２に示すデータ処理部１９において実施する処理のうち、ＭＳ2 マススペクトル解析８，アミノ酸配列候補の予測９，予測保持時間τ′の導出１０，実測保持時間τと予測保持時間τ′の比較１１，一致する候補がない際の前駆イオン選定１２までの一連の処理を１０msec以内（または１００msec以内）で実施することを特徴とする。図４で、既出の図と同じ数字の記載がある構成要素は、既出のものと同じ構成要素であるため、異なる構成要素に関して説明する。導入部より導入された試料１は、ＬＣにて分離２、イオン化部にてイオン化される(４)。イオン化法にはＥＳＩ(Electro Spray Ionization)法を用いた。イオン化された試料は質量分析部にて質量分析（ＭＳ1 ）される（５）。イオン検出部１８にて検出されたイオンのうち、特定のイオン(ｍ＝１１８３.４［Ｄａ］) に対して、コリジョンセルにて解離反応を実施し（６）、再度質量分析（ＭＳ2 ）を行う（７）。ここでは、データ処理部１９において、１つのＭＳ2 マススペクトルデータに対して９つのアミノ酸配列候補が予測されたが、予測された候補に対して、ＭＳ2 マススペクトルデータのみから、どれが正解配列かを判定することは困難である。
【００３０】
本実施例ではアミノ酸配列候補の予測に、ＭＳ2 マススペクトルデータにおいてピークとピークの間隔から対応するアミノ酸質量を計算し、そこからアミノ酸配列を予測する
de novo ペプチドシークエンス法を用いた。de novo ペプチドシークエンス法では、ピーク間質量のみを用いて配列を予測するため、擬陽性の候補も数多く挙がる可能性がある。このため、本実施例のフローのように、更に、アミノ酸配列から導出される予測保持時間τ′と保持時間τの比較を行うことにより、どのアミノ酸配列候補が正解配列なのか判定することが可能である。本実施例では、候補予測９にて質量数のほぼ等しい９つのアミノ酸配列が予測され、予測されたアミノ酸配列に対して予測保持時間τ′を導出１０し、内部データベースに格納された値３と比較１１を行った。ここでは、保持時間比較の許容値を±０.３ 分としたため、候補Ｎo.９の保持時間が一致するとみなすことができる。予測保持時間と保持時間の一致する候補がある場合には、その配列を信頼性の高いアミノ酸配列候補とみなし、そこで測定を終了または次の試料の測定に移る。一方、予測保持時間と保持時間の一致する候補が一つもない場合には、そのＭＳ2 マススペクトルデータには、アミノ酸配列を予測するのに十分な情報が含まれていないものとみなして、ＭＳ３ 分析またはＭＳ2′ 分析の前駆イオンを選定１２し、分析を行うことで、解析に有用な情報を補足する事が出来る。
【００３１】
また、本実施例では予測されたアミノ酸配列候補からそれぞれ予測保持時間τ′を導出し、内部データベースに一旦格納された実測の保持時間τと比較を行ったが、実測の保持時間τと質量数ｍから、条件を満たすアミノ酸配列の構成を予測することも可能である。この場合、内部データベース１４に、実測の保持時間τ，質量数ｍに対するアミノ酸配列の構成に関するデータを対応させるテーブルなどをあらかじめ格納しておき、既知物質のデータとの比較から予測する方法と、各構成要素（ペプチドの場合はアミノ酸など）に対して経験的に決定されたパラメータを用いて予測する方法がある。
【００３２】
また、図１では内部データベースに実測の保持時間や質量数ｍを格納したが、図５の
２６に示すように内部データベースを介さず、直接メモリに保持時間τ，質量数ｍに関するデータを蓄積し、それを用いて保持時間の判定を行っても良い。
【００３３】
また、糖鎖，化学修飾されたタンパク質，化学修飾されたポリペプチド，化学修飾された糖鎖に対して同様の評価を行うことも可能である。以上のように保持時間を用いてMS2 マススペクトルデータを計測の実時間内に検証することにより、測定対象の解析精度の向上が可能となる。
【００３４】
次に本発明の第二の実施例について説明する。質量分析において、試料の分離に用いられるＬＣは、カラムや緩衝液の種類やｐＨ、流量または溶液中の塵等、様々な条件により、保持時間が大きく変化する。このため、質量分析計に内部データベース１４を設け、そこにＬＣの保持時間τや質量数ｍに関する情報を格納し、その情報を用いて予測保持時間の判定を行う場合には、以前と測定条件が異なっている場合がある。ＬＣの条件が内部データベースに格納された時と異なる場合には、試料の保持時間も異なるため、高精度な判定は困難になる。このため、ユーザがＬＣの条件を変更した場合やある一定時間（例えば２４時間、あるいはユーザ指定の値）以上が経過してしまった場合など、測定条件が異なると考えられる場合は、以前の内部データベースを判定に用いることはできない。そこで、本実施例では、図６に示すように、試料分離２の後、データ処理部１９にて、ＬＣ条件の判定２８を実施し、ＬＣ条件が同一であれば実施例一のフローへ進み、ユーザがＬＣの条件を変更した場合やある一定時間（例えば２４時間、あるいはユーザ指定の値）以上が経過してしまった場合など、ＬＣ条件が異なるとシステムが自動的に判断した場合には、内部データベースに格納したデータを消去または別の名前で保存２８し、新規に内部データベースを作成する。このとき、測定以前にユーザがＬＣ条件が異なると判断できる際には、ユーザ自身で内部データベースを消去または別名保存することも可能である。一方、以前の測定と全く条件が同じとユーザが判断した場合には、保存しておいたデータを読み込み、そのデータを内部データベースとして用いることも可能である。以上のような内部データベースを保存または自動的に消去する機能により、常に高精度な分析が可能である。
【００３５】
次に本発明の第三の実施例について説明する。質量分析におけるペプチドの解離に関して、モバイルプロトンモデルが提案されている（参考文献：V. H. Wysocki, G. 
Tsaprailis, L. L. Smith and L. A. Breci, J. Mass Spectrom. 35, 1399(2000)）。
【００３６】
モバイルプロトンモデルに関して、図７，図８を用いて説明する。
【００３７】
図７に示すように、モバイルプロトンモデルとは、アミノ酸３０間のペプチド結合が自由に動き回れるプロトン２９（Ｈ+ ：モバイルプロトン）によって解裂されるというモデルである。モバイルプロトン２９は主鎖のＣＯＮＨ結合の窒素に付加して主鎖の解裂を引き起こすというモデル３１が提案されている(参考文献：V. H. Wysocki, G. Tsaprailis,L. L. Smith and L. A. Breci, J. Mass Spectrom. 35, 1399(2000))。図７に示すように、モバイルプロトン２９が存在する場合は、図１０に示すように、様々なアミノ酸間の解離フラグメントが得られる。一方、図８に示すように、モバイルプロトン２９はアルギニンなどの塩基性のアミノ酸３２と強く相互作用し、塩基性アミノ酸３２にトラップされること３３が報告されている。トラップされたプロトン３３はトラップされたサイトから自由に動き回ることは出来ない (参考文献：V. H. Wysocki, G. Tsaprailis, L. L. Smith 
and L. A. Breci, J. Mass Spectrom. 35, 1399(2000))。このため、ペプチドの価数以上にペプチドに塩基性アミノ酸３２（特にアルギニン）が含まれている場合には、モバイルプロトン２９は全て塩基性アミノ酸３２にトラップされ、存在しない。この場合、アミノ酸間の解裂は生じにくくなり、解離断面積が小さくなる（解離して得られるイオンのイオン強度が小さくなる）傾向がある。また、図９に示すように、モバイルプロトン２９が無く、アスパラギン酸やグルタミン酸などの酸性アミノ酸３４が存在する場合には、酸性アミノ酸３４のＣ末端側で選択的に解裂が生じることが報告されている(参考文献：V. H. 
Wysocki, G. Tsaprailis, L. L. Smith and L. A. Breci, J. Mass Spectrom. 35, 1399
(2000)）。このような場合、一部分の解離が選択的に生じるため、図１１に示すようなマススペクトルデータが得られる。この場合、他のアミノ酸間で解離したフラグメントピークは非常に強度が低くなり、測定対象を精度良く解析することは困難になると考えられる。また、ここで必ずしも酸性アミノ酸３４が含まれていなくてもモバイルプロトン２９が存在しない場合は、解離ピーク数あるいはピーク強度の減少が予想される。
【００３８】
図１２，図１３を用いて、本実施例を説明する。塩基性アミノ酸であるアルギニンと酸性アミノ酸であるアスパラギン酸を一つずつ含むペプチドに対してＭＳ2 分析した例を説明する。図１２において、質量分析(ＭＳ1) スペクトルデータ３５において、質量数ｍが１０００のペプチドが、価数が１価及び２価で検出された場合に、各イオンに対してそれぞれＭＳ2 分析を実施する。価数が１価のイオンでは、（塩基性アミノ酸数：１）≧（ペプチド価数：１）となり、モバイルプロトンは存在しない。一方、価数が２価であるイオンでは、（塩基性アミノ酸数：１）＜（ペプチド価数：２）となり、モバイルプロトンが存在する。１価のペプチドをＭＳ2 分析のターゲット（親イオン）に選択し、ＭＳ2 分析を実施した際には、モバイルプロトンが存在しないため、図９に示したように酸性アミノ酸のＣ末端側で選択的な解離が生じ、その他のアミノ酸間での解離フラグメントは十分に得られない（３６）。一方、２価のぺプチドをＭＳ2分析のターゲット（親イオン）に選択し、ＭＳ2 分析を実施した場合には、モバイルプロトンが存在するため、様々なアミノ酸間の解離フラグメントが得られる(３７)。本実施例では、図１３に示すように、ＭＳ2 マススペクトルデータから、データ処理部１９にて実施されるアミノ酸配列候補予測９により予測されるペプチドのアミノ酸配列及びペプチドの価数から、モバイルプロトンが存在せず、ペプチド中に酸性アミノ酸が含まれると考えられるデータであると３９において判定された場合には、データ処理部１９にて、前回の測定で選択したイオンと質量数ｍが等しく、前回の測定で選択したイオンよりも価数ｚが大きな値となるイオンを前駆イオンに選定１２し、ＭＳ2′ 分析４０を行う。本実施例では、前駆イオンの選定１２において、イオンの価数も考慮しているため、質量分析５から内部データベース１４へデータを格納する際に保持時間τ，質量数ｍとともに価数ｚに関する情報も格納する（３８）。以上の操作により、解離フラグメントが増える可能性が増加し、蛋白質同定精度の向上が見込める。ただし、図１３の判定３９として、酸性アミノ酸の有無に関わらず、単なるモバイルプロトンの有無のみで判定しても良い。
【００３９】
次に本発明の第四の実施例について、図１４，図１５を用いて説明する。前記実施例三において、ペプチドの質量分析では、モバイルプロトンの存在する可能性の高い、価数の高いイオンをＭＳn 分析（ｎ≧２）の前駆イオンに選択すると解離フラグメントが検出されやすいことを示した。しかし、ノイズとピークの判定をするには、ある程度以上（例えば、検出イオン数１００／sec など）のイオン強度をもつピークに対して質量分析を実施する必要がある。このため、図１４に示すように、質量数がＭである１価の親イオンを対象にＭＳ2 分析を実施した際に、価数の高いイオンの強度が非常に低い、またはない場合には、より多価のイオンを選択することは不可能である（４１）。このような場合は図
１５に示すように、ＭＳ2 マススペクトルデータから、データ処理部１９にて実施されるアミノ酸配列候補予測９により予測されるペプチドのアミノ酸配列およびペプチドの価数から、モバイルプロトンが存在せず、ペプチド中に酸性アミノ酸が含まれると考えられるデータであるかの判定３９をデータ処理部１９にて実施する。モバイルプロトンが存在せず、ペプチド中に酸性アミノ酸が含まれると考えられるデータであると判定した場合には、データ処理部１９にて、前回の測定で選択したイオンと質量数ｍが等しく、前回の測定で選択したイオンよりも価数ｚが大きな値となるイオン（前駆イオン）が存在するかの判定４４を実施する。本実施例では、前駆イオンの選定４４においてイオンの価数も考慮しているため、質量分析５から内部データベース１４へデータを格納する際に保持時間τ，質量数ｍとともに価数ｚに関する情報も格納する（３８）。強度一定値（例えば検出イオン個数１００／sec）以上の前駆イオンが存在する場合には、ＭＳ2′分析４０を実施する。本実施例で、より多価の（例えば２価）のイオンが存在しないあるいは強度が非常に低いと判定した場合には、ＭＳ2′ 分析を行うことは不可能であるため、イオン化部１６のイオン化条件の変更４３を実施する。イオン化条件を変更４３することによりイオンの価数分布の変化が見込め、モバイルプロトンが存在すると考えられる２価のイオンに対して
ＭＳn （ｎ≧２）分析を実施できる可能性が増加する。これにより、解離フラグメントが増える可能性が増加し、タンパク質同定精度の向上が見込める。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の第一実施例による質量分析フローの自動判定処理の流れの概略図である。
【図２】本発明の第一実施例による質量分析データを計測する質量分析システム全体の概略図である。
【図３】従来の質量分析フローの概略図である。
【図４】本発明の保持時間判定処理内容の概略図である。
【図５】本発明の第一実施例による内部データベースを含まない質量分析フローの自動判定処理の流れの概略図である。
【図６】本発明の第二実施例による質量分析データを計測する質量分析システムの概略図である。
【図７】モバイルプロトンモデルにおける解離モデルの概念図（その１）である。
【図８】モバイルプロトンモデルにおける解離モデルの概念図（その２）である。
【図９】モバイルプロトンモデルにおける解離モデルの概念図（その３）である。
【図１０】モバイルプロトンが存在するペプチドとモバイルプロトンが存在しないペプチドに対して、ＭＳ2分析を実施した時の質量分析スペクトルの概念図（その１）である。
【図１１】モバイルプロトンが存在するペプチドとモバイルプロトンが存在しないペプチドに対して、ＭＳ2分析を実施した時の質量分析スペクトルの概念図（その２）である。
【図１２】本発明の第三実施例におけるモバイルプロトンイオン選定の概念図である。
【図１３】本発明の第三実施例による質量分析データを計測する質量分析システムの概略図である。
【図１４】本発明の第四実施例におけるイオン化条件変化の概念図である。
【図１５】本発明の第四実施例による質量分析データを計測する質量分析システムの概略図である。
【符号の説明】
【００４１】
１…試料導入、２…試料分離、３…内部データベースへのデータ格納（実測保持時間τ，質量数ｍ）、４…イオン化、５…質量分析測定（ＭＳ1 ）、６…親イオンの解離反応、７…質量分析測定（ＭＳ2）、８…ＭＳ2 のマススペクトル解析、９…候補予測、１０…予測保持時間τ′の導出、１１…実測保持時間τと予測保持時間τ′の比較、１２…前駆イオンの選定、１３…ＭＳ3，ＭＳ2′分析、１４…内部データベース、１５…前処理系、１６…イオン化部、１７…質量分析部、１７Ａ…コリジョンセル、１８…イオン検出部、１９…データ処理部、２０…表示部、２１…制御部、２２…ユーザ入力部、２３…質量分析システム全体、２４…ＭＳ2 マススペクトルの取得、２５…後処理、２５−１…データ処理、２５−２…データベースサーチ、２６…メモリへのデータ蓄積（保持時間τ，質量数ｍ）、２７…ＬＣ条件の判定（条件が変化しているか）、２８…内部データベースの消去or別名保存、２９…モバイルプロトン、３０…アミノ酸、３１…プロトン付加サイト、３２…塩基性アミノ酸、３３…トラップされたプロトン、３４…酸性アミノ酸、３５…
ＭＳ1 スペクトルデータ、３６…１価イオンを解離させた際のＭＳ2 マススペクトルデータ、３７…２価イオンを解離させた際のＭＳ2マススペクトルデータ、３８…内部データベースへのデータ格納（保持時間τ，質量数ｍ，価数ｚ）、３９…モバイルプロトンが存在せず、ペプチド中に酸性アミノ酸が存在するかどうかの判定、４０…ＭＳ2′ 分析、
４１…一定のイオン化条件下でのマススペクトル、４２…イオン化条件を変更させた際のマススペクトル、４３…イオン化条件変更、４４…前駆イオンの選定（強度一定値以上のＭＳ2′ の対象イオンがあるか）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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