(57)【要約】【課題】  合成効率の高い無細胞タンパク質合成用細胞抽出物を工業的に効率よく製造するための方法を提供する。【解決手段】  細胞を細分化する工程、細分化された細胞と抽出溶媒とを混合して細胞抽出物を得る工程、細胞抽出物含有液を分離・精製する工程を有する無細胞タンパク質合成用細胞抽出物の製造方法であって、これらいずれかの工程中または工程後に、細胞の細分化物を活性剤で処理することを特徴とする方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を細分化する工程、細分化された細胞と抽出溶媒とを混合して細胞抽出物を得る工程、細胞抽出物含有液を分離・精製する工程を有する無細胞タンパク質合成用細胞抽出物の製造方法であって、これらいずれかの工程中または工程後に、細胞の細分化物を活性化剤で処理することを特徴とする方法。
【請求項２】
活性化剤が、酸化アルミニウム、活性酸化アルミニウム、シリカゲル、ゼオライト、活性炭、酸化チタン、酸化ジルコニウム、ゲルクロマトグラフィー用担体、及び各種リガンドが結合したカラム担体よりなる群から選ばれる少なくとも一種の活性化剤である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が、植物胚芽細胞である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
植物胚芽が、コムギ胚芽である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
植物胚芽が、植物種子を粉砕して得られた粉砕物から植物胚芽を選別した後、洗浄して得られたものである請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
細分化が、衝撃または切断により行われる請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法で製造した細胞抽出物を、翻訳鋳型に接触させることを特徴とする無細胞タンパク質合成方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法で製造した細胞抽出物、ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、Ｌ型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオンを含有することを特徴とする無細胞タンパク質合成用溶液。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法で製造した細胞抽出物または請求項８に記載のタンパク質合成用溶液を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞タンパク質合成用の細胞抽出物の製造方法に関し、更に詳しくは、合成効率の高い無細胞タンパク質合成用細胞抽出物を工業的に効率よく製造するための方法、無細胞翻訳系でタンパク質を合成する方法、タンパク質合成用溶液および無細胞タンパク質合成用試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内でおこなわれているタンパク質の合成反応は、まず遺伝情報をもつＤＮＡからその情報がｍＲＮＡに転写され、そしてリボソームがそのｍＲＮＡの情報を翻訳して、タンパク質を合成するという工程で進行している。現在、この細胞内におけるタンパク質合成を試験管内等の生体外で行う方法としては、例えばリボソームを生物体から抽出し、これらを用いて試験管内（無細胞系）でタンパク質を合成する方法の研究が盛んに行われている（例えば特許文献１〜５参照）。これらの方法には、リボソームの原料として、大腸菌（非特許文献１参照）、植物胚芽、ウサギ網状赤血球（非特許文献２参照）等が用いられてきた。
【０００３】
植物胚芽からリボソームを含有する無細胞タンパク質合成用細胞抽出物を得る方法としては、通常、植物種子を粉砕した後、種皮や胚乳画分を取り除いて粗胚芽画分を取得し、更に洗浄により胚乳成分を除去した後、粉砕、抽出、精製する方法が行われている。
【０００４】
従来の胚芽の微粉砕方法としては、リボソームやｔＲＮＡ等のタンパク質合成成分を含む水溶性成分の抽出の効率化を図るために、例えば胚芽をできるだけ細かく粉砕することが必要だと考えられていた。しかしながら、胚芽は小さく強度も高いため容易に粉砕することができない。従って、従来は、洗浄後の胚芽を予め液体窒素等で凍結した後、乳鉢、スタンプミル、ボールミル等で摩砕又は圧砕することにより微粉砕する方法が広く用いられており、このように微粉砕された胚芽に抽出溶媒を加えて攪拌した後、遠心分離等により胚芽抽出物含有液を回収、精製したものを無細胞タンパク質合成反応の酵素原液として利用していた。この酵素原液中には、タンパク質合成反応に関与しない不要な成分が多く含まれており、またタンパク質合成阻害作用を有するものが存在している可能性がある。
【０００５】
また、上記従来法によって得られた抽出液にはタンパク質合成反応に必要とされる量のｔＲＮＡが含まれていないことから、別途調製したｔＲＮＡを追加することが必須要件であった。さらに、上記従来法では短時間に大量の抽出液を得ることが困難であった。
【特許文献１】特開平６−９８７９０号公報
【特許文献２】特開平６−２２５７８３号公報
【特許文献３】特開平７−１９４号公報
【特許文献４】特開平９−２９１号公報
【特許文献５】特開平７−１４７９９２号公報
【非特許文献１】Methods in Enzymol. 1983; 101: 674-90. Prokaryotic coupled transcription-translation. Chen HZ, Zubay G. Pratt, J.M.
【非特許文献２】Eur J Biochem. 1976 AUG 1;67(1):247-56. An efficient mRNA-dependent translation system from reticulocyte lysates.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
無細胞タンパク質合成系は、ペプチド合成反応速度と翻訳反応の正確性において生細胞に匹敵する性能を保持し、かつ目的とするタンパク質を複雑な精製工程を実施することなく得ることができる有用な方法である。そのため、該合成系をより有用に産業利用するために合成効率の向上に関するいくつかの発明が開示されてきた。しかし、産業上の有用性向上のためには、合成効率のみならず、合成系に使用する各種の物質を安定に高品質を保持して大量に供給することが必要である。
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために、無細胞タンパク質合成系に使用する細胞抽出物の合成効率を上げるとともに、その抽出物を工業的に実施可能な程度に効率的に製造し、タンパク質合成に必要な因子を抽出する方法について検討した。その結果、細胞の細分化物をある種の活性剤で処理するとタンパク質合成活性が飛躍的に向上することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明によれば、（１）細胞を細分化する工程、細分化された細胞と抽出溶媒とを混合して細胞抽出物を得る工程、細胞抽出物含有液を分離・精製する工程を有する無細胞タンパク質合成用細胞抽出物の製造方法であって、これらいずれかの工程中または工程後に、細胞の細分化物を活性化剤で処理することを特徴とする方法が提供される。
【０００９】
この発明の好ましい態様により（２）活性化剤が、酸化アルミニウム、活性酸化アルミニウム、シリカゲル、ゼオライト、活性炭、酸化チタン、酸化ジルコニウム、ゲルクロマトグラフィー用担体、及び各種リガンドが結合したカラム担体よりなる群から選ばれる少なくとも一種の活性化剤である上記（１）に記載の方法、（３）細胞が、植物胚芽細胞である上記（１）または（２）に記載の方法、（４）植物胚芽が、コムギ胚芽である上記（３）に記載の方法、（５）植物胚芽が、植物種子を粉砕して得られた粉砕物から植物胚芽を選別した後、洗浄して得られたものである上記（３）または（４）に記載の方法、（６）細分化が、衝撃または切断により行われる上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法が提供される。
【００１０】
本発明の別に態様により、（７）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法で製造した細胞抽出物を、翻訳鋳型に接触させることを特徴とする無細胞タンパク質合成方法が提供される。
【００１１】
本発明の別の態様により、（８）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法で製造した細胞抽出物、ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、Ｌ型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオンを含有することを特徴とする無細胞タンパク質合成用溶液が提供される。
【００１２】
本発明の別の態様により、（９）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法で製造した細胞抽出物または上記（８）に記載のタンパク質合成用溶液を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成用試薬キットが提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、タンパク質合成に必要な因子を効率的に細胞質から抽出し、さらに活性化剤処理をすることにより、安定で活性の高い無細胞タンパク質合成用細胞抽出物を得ることができる。また、本発明の方法で得られる細胞抽出物は、高純度でタンパク質合成活性が優れるため、タンパク質の無細胞系での大量調製、例えば進化分子工学の分野での新しい酵素や抗体等の大量調製に極めて有用である。
【００１４】
本発明により、優れた特性を有する細胞抽出物含有液が得られる理由は必ずしも明確ではないが、活性化剤の処理により、細胞中のタンパク質合成物質が活性化されることによる可能性が考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
１．細胞抽出物の製造方法
１）原料細胞およびその調製
本発明で原料として用いられる細胞は、微生物細胞、植物細胞、動物細胞等のタンパク質合成能力を有する細胞であればいずれの細胞であっても良い。微生物細胞としては、例えば大腸菌（Methods in Enzymol. 1983;101:674-90. Prokaryotic coupled transcription-translation. Chen HZ, Zubay G. Pratt, J.M.）が挙げられ、動物細胞としては、例えばウサギ網状赤血球（Eur J Biochem. 1976 AUG 1;67(1):247-56. An efficient mRNA-dependent translation system from reticulocyte lysates. Pelham HR, Jackson RJ.）が挙げられる。植物細胞としては、コムギ、オオムギ、イネ、コーン等のイネ科植物の細胞が挙げられ、特にこれらイネ科植物種子の胚芽細胞（以下これを、単に「植物胚芽」と称することがある）が好ましく用いられる。用い得る植物胚芽としては、上記コムギ、オオムギ、イネまたはコーンが挙げられ、特に好適なものとしてコムギが挙げられる。これら原料細胞の調製は、それ自体既知の通常用いられる方法により、容易に行うことができる。
【００１６】
以下、特に好ましく用いられる植物胚芽、例えばコムギ胚芽を原料細胞として用いる場合について、さら詳細に説明する。なお、微生物細胞や動物細胞を原料として用いる場合は、上記文献に記載されている通常用いられる方法で細胞抽出物を得ることができるので、その詳細な説明は省略する。
【００１７】
植物種子に含まれる胚芽の量は少ないため、胚芽を効率的に取得するためには胚芽以外の部分をできるだけ除去しておくことが好ましい。通常、まず、植物種子に機械的な力を加えることにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得、該混合物から、胚乳破砕物、種皮破砕物等を取り除いて粗胚芽画分（胚芽を主成分とし、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物）を得る。植物種子に加える力は、植物種子から胚芽を分離することができる程度の強さであればよい。
【００１８】
通常は、公知の粉砕装置を用いて、植物種子を粉砕することにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得る。
【００１９】
植物種子の粉砕は、通常公知の粉砕装置を用いて行うことができるが、ピンミル、ハンマーミル等の被粉砕物に対して衝撃力を加えるタイプの粉砕装置を用いることが好ましい。粉砕の程度は、使用する植物種子胚芽の大きさに応じて適宜選択すればよいが、例えばコムギ種子の場合は、通常、最大長さ４ｍｍ以下、好ましくは最大長さ２ｍｍ以下の大きさに粉砕する。また、粉砕は乾式で行うのが好ましい。
【００２０】
次いで、得られた植物種子粉砕物から、通常公知の分級装置、例えば、篩を用いて粗胚芽画分を取得する。例えば、コムギ種子の場合、通常、メッシュサイズ０．５ｍｍ〜２．０ｍｍ、好ましくは０．７ｍｍ〜１．４ｍｍの粗胚芽画分を取得する。さらに、必要に応じて、得られた粗胚芽画分に含まれる種皮、胚乳、ゴミ等を風力、静電気力を利用して除去してもよい。
【００２１】
胚芽と種皮、胚乳の比重の違いを利用する方法、例えば重液選別により、粗胚芽画分を得ることもできる。また胚芽と種皮、胚乳の転がり摩擦係数の違いを利用する方法、例えば振動分別機を用いることにより、粗胚芽画分を得ることもできる。より多くの胚芽を含有する粗胚芽画分を得るために、上記の方法を複数組み合わせてもよい。さらに、得られた粗胚芽画分から例えば目視や色彩選別機等を用いて胚芽を選別する。
【００２２】
このようにして得られた胚芽画分は、胚乳成分が付着している場合があるため、通常、胚芽純化のために更に洗浄処理することが好ましい。
【００２３】
洗浄処理としては、通常１０℃以下、好ましくは４℃以下に冷却した水又は水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させ、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄することが好ましい。また、通常１０℃以下、好ましくは４℃以下で、界面活性剤を含有する水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させて、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄するのがより好ましい。界面活性剤としては、非イオン性のものが好ましく、非イオン性界面活性剤であるかぎりは、広く利用ができる。具体的には、例えば、好適なものとして、ポリオキシエチレン誘導体であるブリッジ（Ｂｒｉｊ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）等が例示される。なかでも、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０が最適である。これらの非イオン性界面活性剤は、例えば０．５％程度の濃度で使用することができる。
【００２４】
水又は水溶液による洗浄処理および界面活性剤による洗浄処理は、どちらか一方でもよいし、両方実施してもよい。また、これらの洗浄処理は、超音波処理との組み合わせで実施してもよい。
【００２５】
２）細胞を細分化する工程
上記により得られたタンパク質合成能を有する細胞を細分化する。細分化方法は特に限定されず、従来から用いられている、乳鉢、スタンプミル、ボールミル等で摩砕又は圧砕することにより微粉砕する方法により行えばよい。植物胚芽は小さく強度も高いため容易に粉砕することができない。そのため、洗浄後の胚芽を予め液体窒素等で凍結した後に微粉砕することが好ましい。
【００２６】
本発明においては、細胞を細分化する際に、摩砕又は圧砕によるのではなく、衝撃または切断により細分化することがより好ましい。ここで、「衝撃または切断により細分化する」とは、植物胚芽の細胞核、ミトコンドリア、葉緑体等の細胞小器官（オルガネラ）、細胞膜や細胞壁等の破壊を、従来の摩砕又は圧砕と比べて最小限に止めうる条件で細胞を破壊することを意味する。
【００２７】
細分化する際に用いることのできる装置や方法としては、上記条件を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、ワーリングブレンダーのような高速回転する刃状物を有する装置を用いるのが好ましい。刃状物の回転数は、通常１０００ｒｐｍ以上、好ましくは５０００ｒｐｍ以上であり、また、通常３００００ｒｐｍ以下、好ましくは２５０００ｒｐｍ以下である。刃状物の回転時間は、通常５秒以上、好ましくは１０秒以上である。回転時間の上限は特に限定されないが、通常１０分以下、好ましくは５分以下である。細分化する際の温度は、胚芽のタンパク質合成能力が失われない温度であれば特に限定されないが、好ましくは１０℃以下で細分化の操作が可能な温度範囲、特に好ましくは４℃程度が適当である。
【００２８】
本発明のように衝撃または切断により細胞、特に胚芽を細分化することにより、細胞核等の細胞小器官、細胞膜や細胞壁が全て破壊されてしまうのではなく、少なくともその一部は破壊されることなく残る。即ち、特にこの細分化方法を胚芽に適用した場合、胚芽の細胞核等の細胞小器官、細胞膜や細胞壁が必要以上に破壊されることがないため、それらに含まれるＤＮＡや脂質等の不純物の混入が少なく、細胞質に局在するタンパク質合成に必要なＲＮＡやリボソーム等を高純度で効率的に胚芽から抽出することができる。
【００２９】
３）細分化された細胞と抽出溶媒とを混合して細胞抽出物を得る工程
次いで、細分化された細胞に抽出溶媒を加えて攪拌した後、細胞抽出物含有液を遠心分離等により回収し、ゲルろ過等により精製することにより細胞抽出物を得ることができる。
【００３０】
また、衝撃または切断により細胞、例えば胚芽を細分化する際に抽出溶媒を存在させることにより、胚芽を細分化する工程と細分化された胚芽と抽出溶媒とを混合して胚芽抽出物を得る工程を同時に行うことができる。この場合、胚芽と抽出に必要な量の抽出溶媒とを混合し、抽出溶媒の存在下に胚芽を細分化する。抽出溶媒の量は、洗浄前の胚芽１ｇに対して、通常０．１ミリリットル以上、好ましくは０．５ミリリットル以上、より好ましくは１ミリリットル以上である。抽出溶媒量の上限は特に限定されないが、通常、洗浄前の胚芽１ｇに対して、１０ミリリットル以下、好ましくは５ミリリットル以下である。また、細分化しようとする胚芽は従来のように凍結させたものを用いてもよいし、凍結させていないものを用いてもよいが、凍結させていないものを用いるのが好ましい。
【００３１】
抽出溶媒としては、緩衝液、カリウムイオン、マグネシウムイオン及び／又はチオール基の酸化防止剤を含む水溶液を用いることができる。また、必要に応じて、カルシウムイオン、Ｌ型アミノ酸等をさらに添加してもよい。例えば、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、Ｌ型アミノ酸及び／又はジチオスレイトールを含む溶液や、Pattersonらの方法を一部改変した溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、塩化カルシウム、Ｌ型アミノ酸及び／又はジチオスレイトールを含む溶液）を抽出溶媒として使用することができる。抽出溶媒中の各成分の組成・濃度はそれ自体既知であり、無細胞タンパク質合成用の胚芽抽出物の製造法に通常用いられるものを採用すればよい。
【００３２】
４）細胞抽出物含有液を分離・精製する工程
上記で得られた細胞抽出物をゲルろ過等により分離・精製する。ゲルろ過としては、例えば予め溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ジチオスレイトール又はＬ型アミノ酸を含む水溶液）で平衡化しておいたゲルろ過装置を用いて行うことができる。ゲルろ過溶液中の各成分の組成・濃度もそれ自体既知であり、無細胞タンパク質合成用の細胞抽出物、例えば胚芽抽出物の製造法に通常用いられるものを採用すればよい。
【００３３】
ゲルろ過後の細胞抽出物含有液には、微生物、特に糸状菌（カビ）などの胞子が混入していることがあり、これら微生物を排除しておくことが好ましい。特に長期（１日以上）の無細胞タンパク質合成反応中に微生物の繁殖が見られることがあるので、これを阻止することは重要である。微生物の排除手段は特に限定されないが、ろ過滅菌フィルターを用いるのが好ましい。フィルターのポアサイズとしては、混入する可能性のある微生物が排除可能なサイズであれば特に限定されないが、通常０．１〜１マイクロメーター、好ましくは０．２〜０．５マイクロメーターが適当である。ちなみに、小さな部類の枯草菌の胞子サイズは０．５μｍｘ１μｍであることから、０．２０マイクロメーターのフィルター（例えばSartorius製のMinisartTM等）を用いるのが胞子の除去にも有効である。ろ過に際して、先ずポアサイズが大きめのフィルターを用い、次に混入する可能性のある微生物が排除可能なポアサイズのフィルターを用いて、ろ過するのが好ましい。
【００３４】
コムギ胚芽抽出物の場合、上記の通り得られたものは原料細胞自身が含有する又は保持するタンパク質合成機能を抑制する物質（トリチン、チオニン、リボヌクレアーゼ等の、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、翻訳タンパク質因子やリボソーム等に作用してその機能を抑制する物質）を含む胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されている。ここで、胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されているとは、リボソームが実質的に脱アデニン化されない程度まで胚乳部分を取り除いた胚芽抽出物のことであり、また、リボソームが実質的に脱アデニン化されない程度とは、リボソームの脱アデニン化率が７％未満、好ましくは１％以下になっていることをいう。
【００３５】
５）活性化剤による処理
本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出物の製造方法は、細胞を細分化する工程、細分化された細胞と抽出溶媒とを混合して細胞抽出物を得る工程、細胞抽出物含有液を分離・精製する工程のいずれかの製造工程中または工程後に、細分化された細胞（細胞の細分化物）を活性化剤で処理する点に一つの特徴を有するものである。上記の通り、活性化剤による処理時期は、これらの工程の中であれば特に限定されないが、細胞抽出物含有液を分離・精製した後に行うのが特に好ましい。
【００３６】
活性化剤としては、水不溶性の固体担体であり、該固体担体と細胞の細分化物とを接触させることにより該細分化物の蛋白質合成能が向上し得るものであれば特に限定されないが、例えば酸化アルミニウム、活性酸化アルミニウム、シリカゲル、ゼオライト、活性炭、酸化チタン、酸化ジルコニウム、ゲルクロマトグラフィー用担体、各種リガンドが結合したカラム担体等が挙げられる。酸化チタンとしては２酸化チタンが好ましく、酸化ジルコニウムとしては２酸化ジルコニウムが好ましい。ゲルクロマトグラフィー用担体としては、例えば酸化アルミニウム系担体、ポリビニルアルコール系担体、アガロース系担体、セルロース系担体、デキストラン系担体等が挙げられ、これらの中で酸化アルミニウム系担体が好ましい。また、各種リガンドが結合したカラム担体としては、例えば強陰イオン交換体の結合した担体であるＱｕａｎｔｅｒｎａｒｙ  ａｍｍｏｎｉｕｍ結合担体、Ｑｕａｎｔｅｒｎａｒｙ  ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ結合担体、弱陰イオン交換体の結合した担体であるｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ結合担体、強陽イオン交換体の結合した担体であるｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ結合担体、ｓｕｌｐｈｏｐｒｏｐｙｌ結合担体、弱陽イオン交換体の結合した担体であるｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ結合担体、表面が酸性、塩基性若しくは中性である活性酸化アルミニウム等が挙げられ、これらの中で、ｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ結合担体、ｓｕｌｐｈｏｐｒｏｐｙｌ結合担体、ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ結合担体、塩基性である活性酸化アルミニウムが好ましい。
【００３７】
これら活性化剤は、２種類以上を組み合わせて用いることもできる。これら活性化剤の中で、酸化アルミニウムが特に好ましい。また、これらの活性化剤はそれ自体既知の通常用いられるものであり、容易に入手することができる。
【００３８】
活性化剤による処理方法も特に限定されず、各工程の特徴に応じて適当な処理方法、例えば活性化剤と細胞抽出物含有液とを混合して接触させた後に、活性化剤を分離する方法等を採用すれば良い。また活性化剤を充填したカラムに細胞抽出液を通液して処理することもできる。
【００３９】
活性化剤の使用量は特に制限されず、得られた細胞抽出物のタンパク質合成活性を指標として、適宜使用量を決めれば良い。具体的には、酸化アルミニウムの場合、細胞（例えば胚芽）１ｇ当たり３〜１０００ｍｇ、好ましくは１５〜６４０ｍｇ程度が適当である。また細胞抽出物を得る工程およびそれ以降の工程においては、細胞抽出物１ｍｌ当たり、通常１０〜１０００ｍｇ、好ましくは５０〜６４０ｍｇ程度が適当である。
【００４０】
細胞の細分化物と活性化剤との処理時間（細分化物と活性化剤との接触時間）に特に制限は無く、通常５〜６０分、好ましくは１０〜２０分程度が適当である。
【００４１】
細胞の細分化物と活性化剤との処理温度（細分化物と活性化剤との接触時間）に特に制限は無く、通常４〜５０℃、好ましくは２０〜２５℃程度が適当である。
【００４２】
上記活性化剤による処理を行うことにより、さらに活性が優れた無細胞タンパク質合成用細胞抽出物を得ることができる。
【００４３】
２．無細胞タンパク質合成方法
無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の合成は、上記のようにして得られた細胞抽出物を使用する点を除き、従来と同様の方法で行うことができる。この方法は、公知のバッチ法であってもよいし、Spirinら（A. S. Spirin et al. (1988), Science, 242, 1162-1164 ）や横山ら（木川ら、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）の連続式無細胞系タンパク質合成システムのようなアミノ酸、エネルギー源の連続供給系であってもよい。バッチ法ではタンパク質合成を長時間行うと反応が停止することがあるため、後者のアミノ酸、エネルギー源の連続供給系を使用することにより、反応を長時間維持させることができ、更なる効率化が可能となる。また、連続供給系でタンパク質を合成する場合には、透析法を使用することもできる。例えば、本発明の細胞抽出物を透析内液に、エネルギー源やアミノ酸を含む混合液を透析外液に用いた限外濾過膜透析系では、タンパク質を連続的に大量調製することが可能である。ここで、エネルギー源としては、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、クレアチンリン酸等が挙げられ、アミノ酸としては２０種類のＬ型アミノ酸が挙げられる。
【００４４】
本発明の胚芽抽出物にはタンパク質合成反応に必要とされる量のｔＲＮＡが含まれているため、従来のように、別途調製したｔＲＮＡを追加することは必須要件ではない。
【００４５】
３．タンパク質合成用溶液およびタンパク質合成用試薬キット
また、以上のようにして得られた本発明の細胞抽出物、例えば胚芽抽出物と、タンパク質合成に必須の成分であるＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、Ｌ型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオンとを含有する水溶液はレディーメイド型無細胞タンパク質合成溶液として、簡便に使用することができる。上記成分の含有量は特に限定されず、無細胞タンパク合成反応を行いうる濃度であればよい。本発明の無細胞タンパク質合成溶液は、タンパク質合成に際して従来のように反応溶液の調製を必要とせず、目的とする翻訳鋳型（ｍＲＮＡ）を添加するだけで、簡便に、効率的に、大量にタンパク質を合成することができる。該タンパク質合成用溶液は、溶媒として上記抽出溶媒を用い、それに必要に応じて上記成分を添加することにより調製できる。
【００４６】
本発明の試薬キットは、少なくとも上記細胞抽出物、例えば胚芽抽出物または上記タンパク質合成用溶液を含み、任意の要素として、希釈液（緩衝液）、透析液、エネルギー供給液、発現ベクター、コントロール用発現ベクター、制限酵素等を含んでいてもよい。また、該試薬キットにはＲＮＡポリメラーゼ等の転写系に用いる試薬が含まれていてもよい。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。
【００４８】
なお、以下の実施例において、ｌはリットル、ｍｌはミリリットル、Ｍはモル／リットル、ｍＭはミリモル／リットル、μｇはマイクログラムをそれぞれ表す。
［実施例１］
【００４９】
ワーリングブレンダーによる微粉砕抽出
北海道産のチホク小麦（未消毒）を用い、ＷＯ０２／０９５３７７号公報の実施例に記載の方法に準じて、胚芽を分離し、胚芽の純度（任意のサンプル１ｇ当たりに含まれる胚芽の重量割合）が９８％以上になるまで選別した。得られた小麦胚芽５０ｇを、４℃の蒸留水中に懸濁し、超音波洗浄器を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄した。次に、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０の０．５容量％溶液に懸濁し、超音波洗浄器を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄して胚乳分を除去した小麦胚芽を得た。
【００５０】
次いで、以下の操作を４℃で行い、小麦胚芽抽出物含有液を得た。まず洗浄した小麦胚芽を抽出溶媒（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）８０ｍＭ、酢酸カリウム２００ｍＭ、酢酸マグネシウム１０ｍＭ、塩化カルシウム４ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．６ｍＭ及びジチオスレイトール８ｍＭ）１００ｍｌとともにワーリングブレンダーに入れ、回転数５０００〜２００００rpmで３０秒粉砕した。ブレンダー内壁に付着した胚芽等をかき落とした後、再び５０００乃至２００００rpmで３０秒粉砕する作業を２回行った。得られた胚芽粉砕物の粒径分布をレーザー散乱方式粒度分布装置（堀場製作所製ＬＡ−９２０）を用いて測定した。
【００５１】
得られた抽出液と粉砕胚芽の混合物を遠心管に移し３００００ｇ、３０分間の遠心をかけ上清を採取した。これをさらに３００００ｇ、３０分間の遠心をかけ上清を採取する操作を５回繰り返し濁りのない上清を得た。これをあらかじめ溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）４０ｍＭ、酢酸カリウム１００ｍＭ、酢酸マグネシウム５ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．３ｍＭ及びジチオスレイトール４ｍＭ）で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行った。得られた液を３００００ｇ、１２分間の遠心をかけ上清を採取し、限外ろ過膜を使用して濃縮を行った。これを小麦胚芽抽出物含有液とした。試料の濃度は、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が１８０〜２５０（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．５程度）になるように調製した。
［実施例２］
【００５２】
コムギ胚芽抽出物の酸化アルミニウム処理
１）酸化アルミニウム懸濁液の調製
酸化アルミニウム（細胞破砕用、純度９５％以上、粒径１２μｍ、ナカライテスク社製）１０ｇをＢｕｆｆｅｒ−１ （３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ））１０ｍｌにて懸濁した。次に１５０００ｒｐｍ、５分、摂氏４度の条件で遠心分離を行い、上清を取り除いた。同操作を２度繰り返し、酸化アルミニウムの洗浄を行った。洗浄後の酸化アルミニウムをＢｕｆｆｅｒ−１ １０ｍｌにて懸濁し、１ｇ 酸化アルミニウム／１ｍｌ Ｂｕｆｆｅｒ−１の条件の懸濁液を調製した。
【００５３】
２）酸化アルミニウム懸濁液を用いたコムギ胚芽抽出液の処理
上記１）で作製した酸化アルミニウム懸濁液に対し、実施例１で調製したコムギ胚芽抽出液を０：１００、１：１００、２：１００、４：１００、８：１００、１６：１００、３２：１００、６４：１００、１００：１００の条件で加え懸濁し、酸化アルミニウムが沈殿しないように室温で１５分間ゆっくり攪拌した。攪拌後の懸濁液を１５０００ｒｐｍ、５分間、摂氏４度の条件で遠心分離を行い、上清を回収した。この上清を再度１５０００ｒｐｍ、５分間、摂氏４度の条件で遠心分離を行い、上清を回収し、完全に酸化アルミニウムを除去した。
【００５４】
３）酸化アルミニウム処理後のコムギ胚芽抽出液の調製
上記の条件で処理を行ったコムギ胚芽抽出物の液組成を最終濃度 ３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）になるように調製した。その後、液組成を調製したコムギ胚芽抽出液を２６０ｎｍでの吸光度が７５ＡｂｓになるようにＢｕｆｆｅｒ−２（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ））を用いて調節した。
【００５５】
以下、酸化アルミニウム処理量が、酸化アルミニウム懸濁液：胚芽抽出液＝０：１００、１：１００、２：１００、４：１００、８：１００、１６：１００、３２：１００、６４：１００および１００：１００のサンプルを、それぞれ、０ｍｇ／ＷＧＥｍｌ−１、１０ｍｇ／ＷＧＥｍｌ−１、２０ｍｇ／ＷＧＥｍｌ−１、  ４０ｍｇ／ＷＧＥｍｌ−１、８０ｍｇ／ＷＧＥｍｌ−１、１６０ｍｇ／ＷＧＥｍｌ−１、３２０ｍｇ／ＷＧＥｍｌ−１、６４０ｍｇ／ＷＧＥｍｌ−１および１０００ｍｇ／ＷＧＥｍｌ−１と称することがある。
［実施例３］
【００５６】
酸化アルミニウム処理後のコムギ胚芽抽出液の評価（回分法）
実施例２で調製したコムギ胚芽抽出液（各種サンプル）１６μｌに対して緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子をコードするｍＲＮＡを２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含む溶液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ））８μｌを混合し、タンパク質合成溶液を作製した。このタンパク質合成溶液を摂氏２６度で３時間タンパク質合成反応を行った。
【００５７】
翻訳鋳型となるｍＲＮＡは、ＳＰ６プロモーター配列に連結させた翻訳開始反応配列であるタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）のオメガ（Ω）配列、さらに３’下流に連結させたＧＦＰ遺伝子ＤＮＡを含むプラスミドＧＦＰ／ｐＥＵ（ＷＯ０１／２７２６０号公報）を鋳型として、定法に従いＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて転写を行い、得られたＲＮＡをエタノール沈殿により定法に従い精製して用いた。
【００５８】
反応後のタンパク質合成溶液を５倍に希釈して、蛍光強度を測定した。これらの結果を図１（蛍光強度は測定値を５倍し原液の値を表示）に示す。図１に示すように、最適な条件下での酸化アルミニウムの処理によりコムギ胚芽抽出液のタンパク質合成能が回分法にて上昇していることが確認された。
［実施例４］
【００５９】
酸化アルミニウム処理後のコムギ胚芽抽出液の評価（重層法）
実施例２で調製したコムギ胚芽抽出液（各種サンプル）１６．６μｌに対してＧＦＰ遺伝子をコードするｍＲＮＡを２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含む溶液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ））８．４μｌを混合し、タンパク質合成溶液を作製した。
【００６０】
このタンパク質合成溶液を１２５μｌのＢｕｆｆｅｒ−１（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ））に対して重層を行い、摂氏２６度で１７時間タンパク質合成反応を行った。
【００６１】
翻訳鋳型となるｍＲＮＡは、ＳＰ６プロモーター配列に連結させた翻訳開始反応配列であるタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）のオメガ（Ω）配列、さらに３’下流に連結させたＧＦＰ遺伝子ＤＮＡを含むプラスミドＧＦＰ／ｐＥＵ（ＷＯ０１／２７２６０号公報）を鋳型として、定法に従いＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて転写を行い、得られたＲＮＡをエタノール沈殿により定法に従い精製して用いた。
【００６２】
反応後のタンパク質合成溶液を５倍に希釈して、蛍光強度を測定した。これらの結果を図２（蛍光強度は測定値を５倍し原液の値を表示）に示す。図２に示すように、最適な条件での酸化アルミニウムの処理により、コムギ胚芽抽出液のタンパク質合成能が重層法にて顕著に上昇することが確認された。
［実施例５］
【００６３】
酸化アルミニウム処理後のコムギ胚芽抽出液の評価（透析法）
実施例２で調製したコムギ胚芽抽出液（各種サンプル）４０μｌに対してＧＦＰ遺伝子をコードするｍＲＮＡを２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含む溶液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ））２０μｌを混合し、タンパク質合成溶液を作製した。
【００６４】
このタンパク質合成溶液を透析膜に入れ、Ｂｕｆｆｅｒ−１（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ））２．５ｍｌを透析外液として用い、摂氏２６度でタンパク質合成反応を行った。
【００６５】
翻訳鋳型となるｍＲＮＡは、ＳＰ６プロモーター配列に連結させた翻訳開始反応配列であるタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）のオメガ（Ω）配列、さらに３’下流に連結させたＧＦＰ遺伝子ＤＮＡを含むプラスミドＧＦＰ／ｐＥＵ（ＷＯ０１／２７２６０号公報）を鋳型として、定法に従いＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて転写を行い、得られたＲＮＡをエタノール沈殿により定法に従い精製して用いた。
【００６６】
反応後のタンパク質合成溶液を１００倍に希釈して、蛍光強度を測定した。これらの結果を図３（蛍光強度は測定値を１００倍し原液の値を表示）に示す。
【００６７】
図３に示すように、最適な条件での酸化アルミニウムの処理により、コムギ胚芽抽出液のタンパク質合成能が透析法にて著しく上昇することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】酸化アルミニウム処理後のコムギ胚芽抽出液の回分法による評価結果を示す図である。図中、縦軸はＧＦＰの蛍光強度（タンパク質合成量）を示し、横軸はサンプルの種類を示す。
【図２】酸化アルミニウム処理後のコムギ胚芽抽出液の重層法による評価結果を示す図である。図中、縦軸はＧＦＰの蛍光強度（タンパク質合成量）を示し、横軸はサンプルの種類を示す。
【図３】酸化アルミニウム処理後のコムギ胚芽抽出液の透析法による評価結果を示す図である。図中、縦軸はＧＦＰの蛍光強度（タンパク質合成量）を示し、横軸はサンプルの種類を示す。
【図１】
2005087208.tif 000002
【図２】
2005087208.tif 000003
【図３】
2005087208.tif 000004