(57)【要約】【課題】  本発明は、アルツハイマー病の予防又は処置に有用な物質、それをスクリーニングするための方法、及びそのためのキットを提供する。【解決手段】  ２，７−ジメチルベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトロン等、試験化合物をＰｉｎ１に接触させる工程及び試験化合物が、Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害するか否かを決定する工程を含むＰｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法、試験化合物をリン酸化トレオニン含有ＣＴ９９及びＰｉｎ１に接触させる工程及び試験化合物がリン酸化トレオニン含有ＣＴ９９とＰｉｎ１との結合を阻害するか否かを決定する工程を含むリン酸化トレオニン含有ＣＴ９９とＰｉｎ１との結合を阻害する物質をスクリーニングする方法、Ｐｉｎ１を含むＰｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害する物質のスクリーニング用キット、及びリン酸化トレオニン含有ＣＴ９９及びＰｉｎ１を含むリン酸化トレオニン含有ＣＴ９９とＰｉｎ１との結合を阻害する物質のスクリーニング用キット。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
（１）試験化合物をＰｉｎ１に接触させる工程、及び
（２）試験化合物が、Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害するか否かを決定する工程
を含む、Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法。
【請求項２】
下記工程：
（１）試験化合物を、リン酸化トレオニン含有ＣＴ９９及びＰｉｎ１に接触させる工程、及び
（２）試験化合物が、リン酸化トレオニン含有ＣＴ９９とＰｉｎ１との結合を阻害するか否かを決定する工程
を含む、リン酸化トレオニン含有ＣＴ９９とＰｉｎ１との結合を阻害する物質をスクリーニングする方法。
【請求項３】
Ｐｉｎ１を含む、Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングするためのキット。
【請求項４】
リン酸化トレオニン含有ＣＴ９９及びＰｉｎ１を含む、リン酸化トレオニン含有ＣＴ９９とＰｉｎ１との結合を阻害する物質をスクリーニングするためのキット。
【請求項５】
２，７−ジメチルベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトロン、ジエチル−１，３，６，８−テトラヒドロ−１，３，６，８−テトラオキソベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−２，７−ジアセテート、ジエチル−１，３，８，１０−テトラヒドロ−１，３，８，１０−テトラオキソアントラ［２，１，９−ｄｅｆ：６，５，１０−ｄ’ｅ’ｆ’］ジイソキノリン−２，９−ジアセテート、ビス（１−ピペリジルチオカルボニル）スルフィド、Ｎ−［（２−ニトロ−５−チエニル）メチリデン］−２−チアゾリルアミン、４，５−ジクロロ−２−メチル−４−３（２Ｈ）−イソチアゾロンからなる群より選択される１以上の化合物を含む、ベータアミラーゼに関連する疾患の処置のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の予防や処置に有用な物質のスクリーニング方法及びそのためのキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は進行性の神経変性疾患であり、重篤な痴呆症状を引き起こすために大きな社会問題となっており、その治療や予防のための薬剤の開発が待たれている。
【０００３】
アルツハイマー病の病理的特徴としては、アミロイドベータ（Ａβ）ペプチドの細胞外沈殿と高リン酸化微小管結合タウの細胞内凝集とが挙げられる。
【０００４】
アミロイドベータは、４０〜４２個のアミノ酸からなるペプチドであり、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）が２箇所で切断されることによって生じる。ＡＰＰは、最初にベータセクレターゼ（ＢＡＣＥ）によって触媒され膜に結合したカルボキシ末端のタンパク質分解断片（ＣＴ９９）を生じ、続いてプレセニリン依存ガンマセクレターゼで切断される。
【０００５】
ガンマセクレターゼに関しては、神経分化に重要なＮｏｔｃｈや癌遺伝子であるＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４をも切断することが知られており、ベータセクレターゼに関しては、ＡＰＰを切断する以外の活性については現在のところまだ不明である。
【０００６】
近年、アルツハイマー病の予防又は処置のための薬物を開発するために、アミロイドベータの蓄積を低下させる方法を開発使用とする試みが行われている。その一つとして、ガンマセクレターゼやベータセクレターゼの活性を阻害することによりアミロイドベータの蓄積を低下させる方法がある。しかし、これらのセクレターゼは、ＡＰＰやＣＴ９９以外の別の重要な生理活性物質をも基質とすることから、これらのセレクターゼ阻害剤は、さまざまな副作用を生じる可能性があるという欠点がある。
【０００７】
したがって、副作用のない、アルツハイマー病の予防又は処置のための薬物を開発するために、ＡＰＰからアミロイドベータが生成される過程の詳細な解明が待たれていた。
【０００８】
ペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼ（ＰＰｌａｓｅ）でありリン酸化（セリン又はトレオニン）−プロリンモチーフに高い親和性を示すＰｉｎ１は、ヒトのタウの２３１位のホスホトレオニンと相互に作用し（非特許文献１）、また、Ｐｉｎ１ノックアウト（非特許文献２）は、ＡＤに見られるのと同様のマウスタウの高リン酸化をもたらす（非特許文献３）ことが知られている。
【０００９】
しかし、アミロイドベータ生成過程へのＰｉｎ１の関与は、全く知られていなかった。
【００１０】
【非特許文献１】ルー・ピー−ジェイ（Lu, P-J）ら著、ネイチャー（Nature）、第３９９巻、第７８４頁〜第７８８頁、１９９９年
【非特許文献２】フジモリ・エフ（Fujimori F.）ら著、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Bichemical and Biophysical Research Communications）、第２６５巻、第６５８頁〜第６６３頁、１９９９年
【非特許文献３】リュー・ワイ−シー（Liou, Y-C）ら著、ネイチャー（Nature）、第４２４巻、第５５６頁〜第５６１頁、２００３年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明解決しようとする課題は、アルツハイマー病の予防や処置に有用な物質のスクリーニング方法及びそのためのキット提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、アミロイドベータが合成される過程を解明することに成功した。すなわち、Ｐｉｎ１がβ切断部位で切断された後のＡＰＰと相互作用すること、そしてその結果、驚くべきことに、Ｐｉｎ１がＡＰＰのＣ末端断片のガンマ切断を調節することを解明し、本発明を完成させたものである。
【００１３】
すなわち、本発明は、下記に掲げるものである。
１．下記工程：
（１）試験化合物をＰｉｎ１に接触させる工程、及び
（２）試験化合物が、Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害するか否かを決定する工程
を含む、Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法。
２．下記工程：
（１）試験化合物を、リン酸化トレオニン含有ＣＴ９９及びＰｉｎ１に接触させる工程、及び
（２）試験化合物が、リン酸化トレオニン含有ＣＴ９９とＰｉｎ１との結合を阻害するか否かを決定する工程
を含む、リン酸化トレオニン含有ＣＴ９９とＰｉｎ１との結合を阻害する物質をスクリーニングする方法。
３．Ｐｉｎ１を含む、Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングするためのキット。
４．リン酸化トレオニン含有ＣＴ９９及びＰｉｎ１を含む、リン酸化トレオニン含有ＣＴ９９とＰｉｎ１との結合を阻害する物質をスクリーニングするためのキット。
５．２，７−ジメチルベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトロン、ジエチル−１，３，６，８−テトラヒドロ−１，３，６，８−テトラオキソベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−２，７−ジアセテート、ジエチル−１，３，８，１０−テトラヒドロ−１，３，８，１０−テトラオキソアントラ［２，１，９−ｄｅｆ：６，５，１０−ｄ’ｅ’ｆ’］ジイソキノリン−２，９−ジアセテート、ビス（１−ピペリジルチオカルボニル）スルフィド、Ｎ−［（２−ニトロ−５−チエニル）メチリデン］−２−チアゾリルアミン、４，５−ジクロロ−２−メチル−４−３（２Ｈ）−イソチアゾロンからなる群より選択される１以上の化合物を含む、ベータアミラーゼに関連する疾患の処置のための医薬組成物。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明でＣＴ９９とは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）がベータセクレターゼ（ＢＡＣＥ）によって触媒され膜に結合したカルボキシ末端のタンパク質分解断片をいう。より具体的には、配列番号２のアミノ酸配列の第５９７位〜第６９５位にわたるアミノ酸配列からなるポリペプチドをいう。なお、ＣＴ９９におけるアミノ酸位置は、便宜上、ＡＰＰにおけるアミノ酸位置を用いて表す。
【００１５】
本発明でリン酸化トレオニン含有ＣＴ９９とは、ＣＴ９９の細胞外ドメインに存在するトレオニン−プロリンモチーフのトレオニンがリン酸化されたＣＴ９９をいう。ＣＴ９９の膜貫通ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列の第６２５位〜第６４８位にわたる領域であることから、ＣＴ９９の細胞外ドメインとは、配列番号２のアミノ酸配列の第６４９位〜第６９５位にわたる領域である。この細胞外ドメインに存在するトレオニン−プロリンモチーフとは、配列番号２のアミノ酸配列の第６６８位のトレオニン及び第６６９位のプロリンからなるモチーフである。したがって、ＣＴ９９の細胞外ドメインに存在するトレオニン−プロリンモチーフのトレオニンとは、配列番号２のアミノ酸配列の第６６８位のトレオニンである。
【００１６】
また、本発明でＡＰＰとは、配列番号１及び２に示した６９５個のアミノ酸からなるポリペプチドをいう（ＡＰＰ６９５、ｃＤＮＡはＮＣＢＩのアクセス番号Ａ３３２９２［ｇｉ：１５６７８５２］で示される）。このＡＰＰは、ヒト（H. sapiens）の脳で発現しているＡＰＰでは最も主要なスプライシングフォームである。なお、最長のＡＰＰは７７０アミノ酸からなるアミロイドベータＡ４である。
【００１７】
試験化合物をリン酸化トレオニン含有ＣＴ９９及び／又はＰｉｎ１に接触させる条件は、特に制限されない。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法によってスクリーニングされる試験化合物は、制限されないが、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、本発明のスクリーニングは、具体的には、これらの試験化合物又はこれらを含む試料をリン酸化トレオニン含有ＣＴ９９及び／又はＰｉｎ１と接触させることにより行われる。この試験材料は、特に制限されないが、試験化合物を含む細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられる。
【００１９】
試験化合物が、Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害するか否かを決定する方法、試験化合物が、リン酸化トレオニン含有ＣＴ９９とＰｉｎ１との結合を阻害するか否かを決定する方法は、特に制限されることなく、タンパク質等の生体高分子の相互作用を分析するための当該技術分野において公知の方法であればいかなる方法をも用いることができる。
【００２０】
本発明の一つの実施態様によれば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合させたＰｉｎ１を、適切な細胞内で発現させ、ＧＳＴ結合支持体を用いて複合物を回収する、いわゆるＧＳＴプルダウンアッセイを用いることができる。また、内在性のＰｉｎ１の影響を排除するためには、Ｐｉｎ１ノックアウトマウス（Fujimori F. et al., BBRC 265, 658-663(1999)）を用いることが好ましい。
【００２１】
また、本発明の別の実施態様によれば、ＤＮＡに転写因子が結合してタンパク質の合成が行われることを利用したいわゆる酵素ツーハイブリッド法を用いることもできる。例えば６６８位のトレオニンがリン酸化されたＣＴ９９とＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質と、Ｐｉｎ１と転写活性化ドメインとの融合タンパク質を用いてレポーター遺伝子の発現を解析する。
【００２２】
また、本発明の別の実施態様によれば、バクテリオファージゲノムにＤＮＡを挿入し、ファージのキャプシドタンパク質に融合した目的のペプチド又はタンパク質をファージ分子の表面に呈示させ、標的タンパク質と他のタンパク質との相互作用を解析する、いわゆるファージディスプレイ法を用いることができる。例えば、組換えにより６６８位のトレオニンがリン酸化されたＣＴ９９を表面に表示させたファージを作製し、ＣＴ９９を表面に固定したプレートを用いてパニングさせることにより、両者の相互作用を解析することができる。
【００２３】
また、本発明の別の実施態様によれば、水晶発振子が基板上に吸着した質量に比例して共鳴振動数が減少することを利用した水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）を利用することもできる。ＱＣＭは、振動数変化から生体分子間相互作用を検出するものであり、ＡｆｆｉｎｉｘＱとして市販されている。例えば、ＣＴ９９またはＡＰＰのリン酸化（ｐ）６６８Ｔｈｒ−６６９Ｐｒｏの前後のアミノ酸を含む短いペプチド配列、例えばＥＶＤＡＡＶｐＴＰＥＥＲＨＬＳをチップに固定化しておき、そこにＰｉｎ１またはＰｉｎ１のＷＷモチーフを含むリコンビナントタンパク質の結合を観察することができる。この結合反応を行うときに、あらかじめ化合物を入れておき、反応を阻害する化合物を探索することができる。
【００２４】
また、本発明には、光学現象である表面プラズモン共鳴を応用したアフィニティバイオセンサーであるビアコア（ビアコア）、蛍光ランタニドキレートによる時間分解蛍光技術(ワラック)と蛍光共鳴エネルギー転移技術を応用したＬＡＮＣＥ  ＴＲ−ＦＲＥＴ（パーキンエルマー）、生体発光ドナー分子から蛍光アクセプター分子へのエネルギートランスファーに基づくＢＲＥＴ２（バイオルミネッセンス共鳴エネルギー転移アッセイ、パーキンエルマー）、シンチレーションプロキシミティアッセイ（ＳＰＡ）なども用いることができる。
【００２５】
Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害するか否か、又はリン酸化トレオニン含有ＣＴ９９とＰｉｎ１との結合を阻害するか否かの判断基準は、当該技術分野において慣用されている方法、例えば、５０％阻害（ＩＣ５０）の濃度が１０μＭ以下である化合物を選択する方法を用いることができる。この選択の過程では、ｐ値有意差検定等の統計学的検定方法を用いることができる。
【００２６】
また、例えば、ＥＶＤＡＡＶｐＴＰＥＥＲＨＬＳ結合チップへのＰｉｎ１の結合は、ＥＶＤＡＡＶｐＴＰＥＥＲＨＬＳペプチドを添加することによって阻害されることから、このペプチド濃度の１０倍のモル数の化合物を添加して、このペプチドと同様の、Ｐｉｎ１のチップへの阻害が見られたら、その化合物を阻害活性がある化合物とみなすこともできる。
【００２７】
本発明のキットには、さらに、マイクロプレート、細胞培養用試薬、血清、ＥＶＤＡＡＶｐＴＰＥＥＲＨＬＳペプチドやリン酸化されたＣＴ９９およびその一部に対する抗体、ペプチド、アビジン、ビオチンなどを固定化したチップ、または表面に蛋白質や化合物を固定化できるようにしたチップ、プラスチック表面を被覆するために用いるスキンミルクやアルブミンなどの物質などを含むこともできる。
【００２８】
また、本発明は、本発明のスクリーニング方法によって得られた、Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害する物質を含む医薬組成物にも関する。Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害する物質としては、例えば、２，７−ジメチルベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトロン、ジエチル−１，３，６，８−テトラヒドロ−１，３，６，８−テトラオキソベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−２，７−ジアセテート、ジエチル−１，３，８，１０−テトラヒドロ−１，３，８，１０−テトラオキソアントラ［２，１，９−ｄｅｆ：６，５，１０−ｄ’ｅ’ｆ’］ジイソキノリン−２，９−ジアセテート、ビス（１−ピペリジルチオカルボニル）スルフィド、Ｎ−［（２−ニトロ−５−チエニル）メチリデン］−２−チアゾリルアミン、４，５−ジクロロ−２−メチル−４−３（２Ｈ）−イソチアゾロンが挙げられる。
【００２９】
Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害する物質は、ベータアミロイドの生成を阻害することから、ベータアミロイドに関連する疾患、例えば、アルツハイマー病の処置、例えば、予防や治療に有用である。
【実施例１】
【００３０】
Ａβペプチドは、連続したタンパク質分解によってアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から得られる。ＡＰＰは、最初にβセクレターゼであるＢＡＣＥによって触媒され膜に結合したカルボキシ末端のタンパク質分解断片（ＣＴ９９）を生じ、続いてプレセニリン依存ガンマ−セクレターゼで切断される。
【００３１】
ペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼ（ＰＰｌａｓｅ）でありホスホ（セリン又はトレオニン）−プロリンモチーフに高い親和性を示すＰｉｎ１は、ヒトのタウの２３１位のホスホトレオニンと相互に作用し、また、Ｐｉｎ１ノックアウトは、ＡＤに見られるのと同様のマウスタウの高リン酸化をもたらす。
【００３２】
また、ＡＰＰは、細胞質ドメインの６６８位のトレオニンに特有の（セリン／トレオニン）−プロリンモチーフを有する。そこで、リン酸化ｐ５３に対するＰｉｎ１の結合性試験について記載されたとおりに（Zheng, H., et al. Nature 419, 849-853(2002)、Zacchi, P., et al. Nature 419, 853-857(2002)）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−Ｐｉｎ１プルダウンアッセイによってＰｉｎ１がＡＰＰと結合するかどうかを試験した。
【００３３】
ＧＳＴ−Ｐｉｎ１を含むグルタチオンビーズをＣＯＳ７細胞で発現されたＡＰＰとインキュベーションした。
【００３４】
Ｐｉｎ１は、β切断カルボキシ末端断片であるＣＴ９９と結合したが、全長ＡＰＰとは結合しなかった。また、６６８位のトレオニンのバリンへの置換及びフォスファターゼによるＣＴ９９の処理によって、Ｐｉｎ１のＣＴ９９に対する結合性は、消滅した（図１）。
【００３５】
Ｐｉｎ１は、タイプＩＶのＷＷドメイン及びＰＰｌａｓｅドメインからなる。３４位のトリプトファンのアラニンへの突然変異（Ｗ３４Ａ突然変異）によるＷＷ領域の破壊によって、Ｐｉｎ１がＣＴ９９と結合することができなくなったのに対し、ＰＰｌａｓｅドメインの活性中心でのＲ６８／６９Ａ突然変異は、Ｐｉｎ１結合性を変化させなかった（図１）。
【００３６】
ＡＰＰへのＰｉｎ１の結合は、ＡＰＰのタンパク質分解プロセスにＰｉｎ１が関与することを示唆する。
【００３７】
Ｐｉｎ１及びＣＴ９９、又はＰｉｎ１及び全長ＡＰＰでトランスフェクションしたＰｉｎ１−／−マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の培地中に分泌されるＡβ１−４０及びＡβ１−４２ペプチドを記載されているようにＥＩＡによって測定した（Suzuki N. et al., Science 264, 1336-1340 (1994)）。この測定にはアイ・ビー・エル社のキットなど市販のものを使用することも可能である。
【００３８】
ＣＴ９９に加えてＰｉｎ１でトランスフェンクションされたＰｉｎ１−／−ＭＥＦは、Ａβ１−４０及びＡβ１−４２の両者を産生し、そして両Ａβ種の量は、Ｐｉｎ１−／−ＭＥＦをＣＴ９９のみでトランスフェクションした場合と比べて多かった（図２）。
【００３９】
ＣＴ９９の代わりに全長ＡＰＰでトランスフェクションしたＰｉｎ１−／−ＭＥＦにおいては、Ｐｉｎ１の共トランスフェクションの有無にかかわらずＡβ１−４０及びＡβ１−４２の量に有意差は認められなかった（図２）。特徴的なのは、Ａβ１−４０に対するＡβ１−４２の割合が著しく増加したことである（図２）。
【００４０】
このように、Ｐｉｎ１は、Ａβの全量のみならず、アミロイド原性であるＡβ１−４２の相対割合も増加させた。
【００４１】
本研究は、Ｐｉｎ１が、β切断部位で切断された後のＡＰＰと相互作用すること、そして結果として生じるＡＰＰのＣ末端断片のガンマ切断を調節することを示した。これは、ＣＴ９９に対するＰｉｎ１の結合性がトレオニン６６８−プロリン結合の異性化によって立体配座的変化を誘導したためと推測される。
【００４２】
したがって、Ｐｉｎ１によるガンマ切断の調節は、変化したガンマセクレターゼ活性のためよりはむしろガンマセクレターゼに対するＡＰＰの変化した感受性が原因と考えられる。
【００４３】
このように、アルツハイマー病におけるＰｉｎ１の関与は、タウの神経原線維変化に対する予防とＡβによる老人班の形成という対照的な２つの面によって比類なきほど複雑である。アルツハイマー病におけるＰｉｎ１関与についてのさらなる研究は、Ａβ病理とタウ病理との機能的なつながりのためのメカニズムへの見識を与えると思われる。
【００４４】
Ｐｉｎ１、３４位のトリプトファンのアラニンへの突然変異（Ｗ３４Ａ突然変異）によるＷＷ領域の破壊をしたPin1、ＰＰｌａｓｅドメインの活性中心でのＲ６８／６９Ａ突然変異によるPPIase活性を失ったPin1と3種類のＧＳＴと融合したPin1タンパク質の調製法（図１で用いられたＰｉｎ１）
【００４５】
リコンビナントＰｉｎ１をZacchi, P. et al (2002) Nature, 419: 853-857及びZheng, H et al (2002) Nature, 419: 849-853に記載されたとおりに調製した。ｐＧＥＸ４Ｔ−Ｐｉｎ１を導入した大腸菌株を一晩培養し、１／１０量の培養液を新たな培地に加え、２時間培養した。１００mM  ＩＰＴＧを添加して３７℃で３時間培養し、ＧＳＴ−Ｐｉｎ１融合タンパクの発現を誘導した。遠心（４℃、３，０００rpm、１０分間）して菌体を回収し、ＰＢＳ（−）で洗浄後、菌体をソニケーションバッファー（５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）、５０mM  ＮａＣｌ、１mM  ＥＤＴＡ、１mM  ＤＴＴ）に懸濁した。この懸濁液を超音波処理（出力３、サイクル５０％、６分間）して菌体を破砕し、遠心（４℃、１５，０００rpm、１０分間）によって上清を回収した（粗抽出液）。得られた粗抽出液にソニケーションバッファーで平衡化したグルタチオンセファロースビーズ（Glutathion-Sepharose 4B［Pharmacia Biotech］）を加え、攪拌（４℃、２時間）した。ソニケーションバッファーでグルタチオンセファロースビーズを３回洗浄し、溶出緩衝液（１６mM還元型グルタチオン、５０mMＮａＣｌ、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ〔pH  ８．０〕）で溶出した。得られた溶出液を１×ＰＢＳ（−）で透析し、ＧＳＴ−Ｐｉｎ１タンパク質を得た。
【００４６】
ウェスタンブロット（結合性試験）
２×１０６個のＣＯＳ７細胞またはを直径１０cmの組織培養ディッシュに播種し、２４時間培養した。
リポフェクトアミン（登録商標）（ギブコ）＋プラス試薬を用いて、ｐＣＴ９９（１０μg）をトランスフェクションした（ＤＮＡ比；ＡＰＰ：ＧＳＫ＝８：２）。ｐＣＴ９９は、ＰＣＲでクローニングしてｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン）にＣＤ５シグナル配列を導入して作製した（参考；Farzan, S et al, (2000) PNAS, 17: 9712-9717）。またリン酸化を促進するために、ＧＳＫ３ｂキナーゼのｃＤＮＡをＰＣＲでクローニングしてｐｃＤＮＡ３．１に導入したものを同様にトランスフェクションした。この細胞をさらに４８時間培養した。
【００４７】
細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄し、５００μlのＮＰ４０溶解バッファー（５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１５０mMＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、５mMＥＤＴＡ、１mMＰＭＳＦ、２μg/mlアプロチニン、５０mMＮａＦ、２５mMβ−グリセロフォスフェート、１mMＮａ３ＶＯ４）を加え、氷浴上で３０分静置した。（ＣＩＰ処理するサンプルにはフォスファターゼインヒビターを加えなかった）。細胞を収集し、超音波処理（出力２．５、サイクル３０％、１０秒間）し、遠心（４℃、１５，０００rpm、３０分）し、得られた上清をサンプルとした（インプット用に一部回収した）。ＣＩＰ処理（ＤＮＡ末端の脱リン酸化）するサンプルには、３０ＵのＣＩＰ（仔牛小腸アルカリホスファターゼ、ニッポンジーン）を加え、インキュベーション（３７℃、１時間）した。
【００４８】
ＮＰ４０溶解バッファーで平衡化した（１サンプルあたり）１０μlのグルタチオンセファロースビーズと１０μgのＧＳＴ融合タンパク質をＮＰ４０溶解バッファーで５００μlにメスアップし、攪拌（４℃、１時間）した。
ＧＳＴ融合Ｐｉｎ１またはＰｉｎ１のＷＷまたはＰＰＩａｓｅドメインに変異を導入した変異Ｐｉｎ１を結合させたグルタチオンセファロースビーズを、１mlのＮＰ４０溶解バッファーで１回洗浄後（全ての遠心条件：４℃，２０００rpm，５分）、回収した細胞溶解物と混ぜて、４℃で１時間撹拌して反応させた。その後、１mlのＮＰ４０溶解バッファーで５回洗浄し、グルタチオンセファロースビーズに１０μlの２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、一晩放置した。
【００４９】
サンプルを５分ボイルした後、ＳＤＳ電気泳動し、メンブランにトランスファー後（セミドライ：ＢｉｏＲａｄ）、ブロッキング液（３％スキムミルク−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳ）で１時間以上ブロッキングした。所定のブロッキング液で希釈した１次抗体を加えて４℃で一晩反応させた。
【００５０】
ブロッキング液で３回洗浄後、ブロッキング液で希釈した２次抗体で、室温で１時間反応させた。ブロッキング液で３回、ＴＢＳ−Ｔ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳ）で３回洗浄後、ＥＣＬで発色させ、ＬＡＳ３０００（富士フィルム）で解析した。試験結果を図１に示した。
【００５１】
結合阻害剤のスクリーニング
Ｐｉｎ１−ＧＳＴ−ビーズと細胞溶解液を反応させるときに化合物を混入して、それが結合阻害をＰｉｎ１が結合していないＧＳＴ−ビースと同程度低下さえる化合物を選択した。
【００５２】
Ｐｉｎ１のＰＰＩａｓｅ活性阻害物質のスクリーニング
基質としてＳｕｃ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡを用いて、ＭＣＡ蛍光の測定を行った。下記の反応は、コールドルーム中で９６穴マルチプレート内で行った。化合物（自家製化学物質ライブラリー）のＤＭＳＯ溶液１μl、アッセイバッファー（５０mMＨＥＰＥＳ、１００mMＮａＣｌ、pH７．０）６５μl、Ｐｉｎ１溶液１０μl（１１μg）及び６０mg/mlキモトリプシン０．００１ＮＨＣｌ溶液１０μlを用事に混合し、１００μg/ml基質（Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ：日本ペプチド研究所）４８０mMＬｉＣｌを含むトリフルオロエタノール溶液５μlを加えた。この混合物を２０秒間反応させ、酢酸（１００％）／メタノール（１：１）１００μlを用いて反応を停止させ、次いで、蛍光マイクロプレートリーダー（マルチラベルカウンター１４２０；Ｗａｌｌａｃ）を用いてＭＣＡ蛍光（励起波長／発光波長＝３６５nm／４６０nm）を測定した。
【００５３】
その結果、ＰｉＡ：２，７−ジメチルベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトロン、ＰｉＢ：ジエチル−１，３，６，８−テトラヒドロ−１，３，６，８−テトラオキソベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−２，７−ジアセテート、及び、ＰｉＪ：ジエチル−１，３，８，１０−テトラヒドロ−１，３，８，１０−テトラオキソアントラ［２，１，９−ｄｅｆ：６，５，１０−ｄ’ｅ’ｆ’］ジイソキノリン−２，９−ジアセテートが、Ｐｉｎ１のＰＰＩａｓｅ活性阻害物質として検出され、ＩＣ５０は、それぞれ２．０、１．０、１．０μＭであった。
【００５４】
１．ＤＡＡＶｐＴＰＥペプチド−センサーセルの作成；ＡｆｆｉｎｉｘＱのセンサーセルを用いて相互作用実験をおこなった。まず、アビジンをＮ−エチル−Ｎ’−［（ジメチルアミノ）プロリル］カルボジイミドでセンサーセル表面に固定した。このセンサーセルに１２個の炭素鎖スペーサーとビオチンを末端に付加したＡＰＰ由来ペプチド、ビオチン−ＥＶＤＡＡＶｐＴＰＥＥＲＨＬＳペプチドをビオチン−アビジン結合で固定化した。
【００５５】
２．１で作製したＤＡＡＶｐＴＰＥペプチドセンサーセルをＡｆｆｉｎｉｘＱ４にセットし、結合測定用緩衝液（１０mMＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、pH７．４、１５０mMＮａＣｌ、３mMＥＤＴＡ）と１／４０容量の４×ＡｆｆｉｎｉｘＱ用ブロッキングバッファーで満たした（全量４５０μl）。ここに、Ｐｉｎ１、Ｐｉｎ１（Ｗ３４Ａ突然変異）、Ｐｉｎ１（Ｒ６８，６９Ａ変異）−ＧＳＴ融合タンパク質（０．１μg/μl）を、１μl，  ５μl，  １０μlずつ順次添加した。また、同時にあらかじめＰｉｎ１をＶｐＴＰＥペプチド（１００ｕＭ）と１０分間混合しておいたものも同時に添加した。ＱＣＭの測定値がほぼ安定した１５分後に低下したＨｚを測定し、添加前後で低下した振動Ｈｚを計測した。結果を表１に示した。
【００５６】
その結果、表１に見られるように野生型Ｐｉｎ１がＤＡＡＶｐＴＰＥペプチドに結合することがＡｆｆｉｎｉｘＱによる実験で明らかになった。またこの結合がＰｉｎ１のＰＰＩａｓｅでなくてＷＷドメインで起こることもしめされた。この結果はウェスタンブロットの結果と整合した。また、このＤＡＡＶｐＴＰＥペプチドとＰｉｎ１の結合は、より短いペプチド鎖である、ＶｐＴＰＥペプチドによって阻害された。この結果はＶｐＴＰＥがＣＴ９９とＰｉｎ１の結合を阻害することを示している。
【００５７】
表１  ＤＡＡＶｐＴＰＥペプチドセンサーセル
減少した共鳴振動数（Ｈｚ）
タンパク質    Pin1    Pin1W34A  Pin1R68,69A    Pin1+VpTPEペプチド
１          １２０        ３０        １０３        ４０
５          ２５０        ３４        ２４３        ５３
１０        ６５０        ６０        ６６３      １００
１５      １３００      １００      １１１３      ２５０
【００５８】
Ｐｉｎ１のＰＰＩａｓｅ活性阻害物質、ＰｉＡ：２，７−ジメチルベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトロン、ＰｉＢ：ジエチル−１，３，６，８−テトラヒドロ−１，３，６，８−テトラオキソベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−２，７−ジアセテート、ＰｉＪ：ジエチル−１，３，８，１０−テトラヒドロ−１，３，８，１０−テトラオキソアントラ［２，１，９−ｄｅｆ：６，５，１０−ｄ’ｅ’ｆ’］ジイソキノリン−２，９−ジアセテート、ＰｉＴ：ビス（１−ピペリジルチオカルボニル）スルフィド、ＰｉＵ：Ｎ−［（２−ニトロ−５−チエニル）メチリデン］−２−チアゾリルアミン、ＰｉＺ：４，５−ジクロロ−２−メチル−４−３（２Ｈ）−イソチアゾロンをＤＭＳＯに溶解して、各化合物を各最終濃度  １．０  ｍｉｃｒｏＭになるように培地に混入して、Ａβ４０およびＡβ４２を００３５−３７に記載したＥＩＡ法で定量し、低下率を調べた（表２）。表２に示したようにこれらのＰｉｎ１ＰＰＩａｓｅ阻害剤は、Ａβ４０およびＡβ４２の産生を低下させた。
【００５９】
表２  Ｐｉｎ１ＰＰＩａｓｅ阻害剤によるＡβ４０およびＡβ４２の産生低下
阻害剤      コントロール   PiA   PiB   PiJ   PiT   PiU   PiZ
Ａβ４０      １００      ９０  ７５  ８７  ９７  ８０  ８０
Ａβ４２      １００      ８７  ７０  ８０  ９０  ７４  ７７
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は、アルツハイマー病の予防又は処置に有用な物質をスクリーニングするために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、Ｐｉｎ１と、β切断カルボキシ末端ＡＰＰ断片との相互作用である。グルタチオンビーズを含むリコンビナントＧＳＴ−Ｐｉｎ１又はＧＳＴ突然変異体Ｐｉｎ１（Ｐｉｎ１Ｗ３４Ａ及びＰｉｎ１Ｒ６８／６９Ａ）、及びＣＴ９９／ＡＰＰ又は突然変異体（ＣＴ９９／ＡＰＰ）Ｔ668Ｖをトランスフェクションした細胞の溶解液をインキュベーションした。いくつかの実験において、ＣＴ９９／ＡＰＰをインキュベーションの前にアルカリホスファターゼで処理し、そして抗ＡＰＰ［ｐＴ６６８］リン酸特異的抗体（Biosource）を用いて免疫ブロット分析に付した。リン酸化、非リン酸化型の両方のＡＰＰを検出するためのＣ末端に結合するＵＴ−１８抗体（ＡＰＰ６７６−６９５を抗原）をコントロールに用いて同様のウェスタンブロット解析を行った。
【図２】図２は、ＣＴ９９又はＡＰＰでトランスフェクションしたＭＥＦ  Ｐｉｎ１−／−の倍地中のＡβ１−４０及びＡβ１−４２ペプチドレベルの測定結果である。培養ディッシュあたりのペプチド量（培地容量当たりのピコグラム）を平均±標準偏差で示した（ｎ＝６）。
【図１】
2005214832.tif 000002
【図２】
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【配列表】
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