(57)【要約】【課題】  エネルギー変換効率が高く、設備全体を小型化できる水素製造方法を提供する。【解決手段】  有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌を、有機酸を含む培地中で培養して、前記細菌に水素を生成させることを特徴とする水素製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌を、有機酸を含む培地中で培養して、前記細菌に水素を生成させることを特徴とする、水素製造方法。
【請求項２】
前記有機酸が、乳酸、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、コハク酸及びリンゴ酸からなる群から選ばれる少なくとも１種で構成されることを特徴とする、請求項１に記載の水素製造方法。
【請求項３】
有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌を、有機酸を含む有機性廃液中で培養して、前記細菌に水素を生成させることを特徴とする、水素製造方法。
【請求項４】
前記有機性廃液が、焼酎の製造過程に発生する有機性残渣であることを特徴とする、請求項３に記載の水素製造方法。
【請求項５】
糖を基質として水素及び有機酸を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌と、有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌とを、糖を含む培地中で培養して、両細菌に水素を生成させることを特徴とする、水素製造方法。
【請求項６】
糖を基質として水素及び有機酸を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌を、糖を含む第一の培地中で培養して、前記細菌に水素及び有機酸を生成させ、生成した有機酸を含む第二の培地中で、有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌を培養して、前記細菌に水素を生成させることを特徴とする、水素製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水素製造方法に係り、特に、微生物を用いた水素製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
水素は燃焼時に二酸化炭素を放出しないため、クリーンな燃料として広い用途が期待されている。例えば、水素を燃料電池に供給して電気エネルギーに変換することを始めとして、次世代の有力なエネルギー源の一つとして挙げられている。
【０００３】
従来、水素は、ナフサや天然ガスなどの化石燃料の改質や水の電気分解により製造されてきた。しかし、これらの製造方法は化石燃料を消費するため、製造工程において地球環境の汚染を招くという問題点がある。このため、地球環境の改善に役立つ技術として、微生物を用いたクリーンで効率のよい水素製造技術に関する研究が進められている。
【０００４】
微生物を用いた水素の製造方法には大きく分けて二種類あり、一つは光依存型、もう一つは光非依存型である。前者には、光照射下、有機物を資化する過程で水素を生成する光合成細菌を利用する方法がある。後者には、糖を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌（例えば、クロストリジウム（Clostridium）属菌）を利用する方法がある。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−２７２４９１号公報
【特許文献２】特開平７−３１９９８号公報
【特許文献３】特開平８−２９４３９６号公報
【特許文献４】特開平８−３０８５９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、光依存型の水素製造方法では、微生物を培養する際に光エネルギーを連続的に照射する必要がある。また、光合成を行わせるのに十分な光度の光を培養槽の深部に照射するのは困難であり実質的に培養槽の表面及びその近傍でしか水素が発生しないため、培養には広大な面積を必要とする。すなわち、光依存型の水素製造方法には、エネルギー効率が悪いという問題点、及び、広大な培養設備を要するため設備全体が大型化するという問題点がある。
【０００７】
他方、光非依存型の水素製造方法では、細菌は光合成ではなく発酵により水素を生成させているため、光非依存型の水素製造方法はエネルギー効率も高く、広大な培養設備も必要としない。しかし、この細菌は糖を資化して水素を生成する際に、副生成物として有機酸を生成する。したがって、この水素製造方法は、水素発酵の下流側に設けた排水処理施設等により副生成物である有機酸を処理する必要があり、設備全体が大型化するという問題点がある。
【０００８】
したがって、クリーンエネルギーとしての水素の利用価値を高めるには、光合成細菌を用いた水素製造方法や糖を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌を用いた水素製造方法の抱える上記問題点を克服する必要がある。
【０００９】
すなわち、本発明の目的は、高いエネルギー変換効率で水素を製造でき、設備全体を小型化できる水素製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、糖を資化して水素を生成する際に副生物として生成する有機酸に着目し、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌が存在することを見出した。そして、本発明者らは、さらに鋭意研究を重ねた結果、以下の発明により上記従来技術の課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌を、有機酸を含む培地中で培養して、前記細菌に水素を生成させることを特徴とする、水素製造方法を提供する。
【００１２】
本発明に係る水素製造方法によれば、培地中に有機酸が含まれるため、この有機酸を基質として前記細菌が水素を生成する。このため、高いエネルギー変換効率で水素を生成することが可能となる。また、光照射によって培養する場合と異なり、広大な培養設備を必要としない。さらに、有機酸が不要になることがないため、有機酸を処理するための排水処理設備が不要となる。
【００１３】
上記水素製造方法において、有機酸は、乳酸、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、コハク酸及びリンゴ酸からなる群から選ばれる少なくとも１種で構成されることが好ましい。上記有機酸は、他の有機酸と比較して、微生物の代謝経路に迅速に取り込まれ利用され易いという特徴を持っている。また、上記有機酸は特殊な有機酸であるというわけではなく、一般的な有機性廃棄物中に含まれている有機酸である。その他、水素源となり得る有機酸としては、ＴＣＡサイクルに関連のある有機酸やギ酸、酪酸、イソ酪酸などが考えられるが、有機性廃液中に含まれているという点を考えた場合、上記有機酸であることが好ましい。
【００１４】
本発明は、また、有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌を、有機酸を含む有機性廃液中で培養して、前記細菌に水素を生成させることを特徴とする水素製造方法を提供する。
【００１５】
本発明に係る水素製造方法によれば、有機性廃液中に有機酸が含まれるため、この有機酸を基質として前記細菌が水素を生成する。このため、高いエネルギー変換効率で水素を生成することが可能となる。また、光照射によって培養する場合と異なり、広大な培養設備を必要としない。さらに、有機酸が不要になることがないため、有機酸を処理するための排水処理設備が不要となる。加えて、本発明の水素製造方法によれば、不要となった有機性廃液が浄化処理されると同時に水素の生成源となるため、有機性廃液の有効利用が可能となる。
【００１６】
ここで、有機性廃液は、焼酎の製造過程に発生する有機性残渣であることが好ましい。焼酎の製造過程に発生する有機性残渣は、日本で年間約５０万トン以上発生している。しかし、この有機性残渣は水分を多量に含むため処理が難しく、従来は大半が海洋投棄されていた。その一方、この有機性残渣には一般に有機酸が多量に含まれている。したがって、この有機性残渣中で本発明に係る前記細菌を培養すれば、処理が困難であった有機性残渣の処理が進むと共に、より効率よく水素を製造することが可能である。
【００１７】
本発明は、さらに、糖を基質として水素及び有機酸を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌と、有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌とを、糖を含む培地中で培養して、両細菌に水素を生成させることを特徴とする水素製造方法を提供する。
【００１８】
この水素製造方法によれば、有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌と、糖を基質として水素及び有機酸を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌とを一緒に培養すると、培地中に含まれる糖を基質として水素及び有機酸が生成され、このとき生成される有機酸を基質として更に水素が生成される。このため、高いエネルギー変換効率で水素を生成することが可能となる。また、光照射によって培養する場合と異なり、広大な培養設備を必要としない。さらに、この水素製造方法によれば、有機酸が不要になることがない。即ち、糖を基質として水素を生成することで有機酸が生成しても、その有機酸を基質として水素が生成されて有機酸の処理が行われる。このため、有機酸を処理するための排水処理設備が不要となる。更にまた、この水素製造方法によれば、有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌の培養だけでなく、糖を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌の培養によっても水素が生成される。このため、有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌を単独で培養したときに比べて、水素の生成量をより増加させることができ、より高い効率で水素を製造することが可能である。
【００１９】
本発明は、さらに、糖を基質として水素及び有機酸を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌を、糖を含む第一の培地中で培養して、前記細菌に水素及び有機酸を生成させ、生成した有機酸を含む第二の培地中で、有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌を培養して、前記細菌に水素を生成させることを特徴とする水素製造方法を提供する。
【００２０】
この水素製造方法によれば、糖を基質として水素及び有機酸を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌を培養することにより水素及び有機酸が生成される。そして、このとき生成される有機酸を基質としてさらに水素が生成される。このため、高いエネルギー変換効率で水素を生成することが可能となる。また、光照射によって培養する場合と異なり、広大な培養設備を必要としない。さらに、この水素製造方法によれば、有機酸が不要になることがない。即ち、糖を基質として水素を生成することで有機酸が生成しても、その有機酸を基質として水素が生成されて有機酸の処理が行われる。このため、有機酸を処理するための排水処理設備が不要となる。更にまた、この水素製造方法によれば、有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌の培養だけでなく、糖を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌の培養によっても水素が生成される。このため、有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌を単独で培養したときに比べて、水素の生成量をより増加させることができ、より高い効率で水素を製造することが可能である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の水素製造方法によれば、高いエネルギー変換効率で水素を製造することができ、かつ、設備全体を小型化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２３】
本発明の第一の水素製造方法は、有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌（以下、「水素生成菌Ａ」という。）を、有機酸を含む培地中で培養して、水素生成菌Ａに水素を生成させることを特徴とする。
【００２４】
かかる水素製造方法であれば、培地中に有機酸が含まれるため、この有機酸を基質として水素生成菌Ａが水素を生成する。このため、高いエネルギー変換効率で水素を生成することが可能となる。また、光照射によって培養する場合と異なり、広大な培養設備を必要としない。さらに、有機酸が不要になることがないため、有機酸を処理するための排水処理設備が不要となる。従って、高いエネルギー変換効率で水素を製造でき、且つこの製法を実施する設備全体を小型化することができる。
【００２５】
ここで、水素生成菌Ａが基質とする有機酸は、微生物が代謝し易く、有機性廃液中に見られる有機酸から水素を取り出すという理由から、炭素数が１〜６のカルボン酸であることが好ましい。さらに、一般的に有機性廃棄物中に高頻度かつ高濃度に存在する乳酸、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、コハク酸又はリンゴ酸は特に好ましい。
【００２６】
水素生成菌Ａは、様々な環境中に存在しており、特定の環境中に存在するものではない。例えば、汚泥中に水素生成菌Ａを見出すことが可能である。より具体的には、水素生成菌Ａとして、クロストリジウム属、シトロバクター（Citrobacter）属、エシェリキア（Escherichia）属又はフォトラブダス（Photorhabdus）属に属し、有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ菌が存在することを本発明者らは見出している。水素生成菌Ａを培養する場合、上記汚泥中に含まれた状態で培養してもよいし、汚泥から水素生成菌Ａを単離して培養してもよい。水素生成菌Ａを単離するには、様々な環境から採取した細菌群を、有機酸を含む培地中で培養し、水素生成能を指標にしたスクリーニングを行えばよい。かかるスクリーニングは、公知の方法によって行うことができる。
【００２７】
具体的な方法は、例えば、以下のとおりである。有機酸のみを炭素源として含有する培地をバイアル瓶に添加し、さらに様々な環境（例えば、砂、泥、海水、湖沼など）から採取したサンプルを少量添加する。ブチル栓で密閉したのち、アルゴン等の不活性ガスでバイアル瓶の気相を置換する。適切な温度のインキュベーター中でバイアル瓶をインキュベート（例えば、３６℃で２４時間）した後、バイアル瓶の気相から気体を一部採取してガスクロマトグラフィーで分析を行い、各サンプルの水素発生量を測定する。水素発生量の多いサンプルを選定し、当該サンプルの培養物の一部を取り出して、当該有機酸を含む寒天プレートに塗布する。寒天プレートを適切な条件下（例えば、３６℃、冷暗所）で嫌気ジャーを用いて培養し、コロニーを形成させる。出現したコロニーを白金線でかきとり、当該有機酸のみを炭素源として含有する培地を添加したバイアル瓶に添加して、前述と同様の操作を繰り返してインキュベートした後、水素発生量を測定する。水素発生量の多いコロニーを選定して、寒天プレート上にコロニーを形成させる。この操作を繰り返すことにより、水素生成菌Ａを単離することが可能である。
【００２８】
本発明の水素製造方法においては、水素生成菌Ａを単独で培養する必要はなく、有機酸を基質として水素を生成する能力を持たない細菌と一緒に培養して構わない。他の細菌と一緒に培養を行っても、水素生成菌Ａは、当該他の細菌によってその水素生成能力を著しく阻害されることなく水素を生成することが可能である。また、単一種の水素生成菌Ａを培養してもよく、複数種の水素生成菌Ａを培養してもよい。なお、複数種の水素生成菌Ａを培養した場合、様々な種類の有機酸が消費されるため、有機酸を有効利用できかつ水素発生量も多くなるという利点がある。
【００２９】
水素生成菌Ａを培養する培地及び培養条件は、嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌が生育できる培地及び培養条件であれば特に限定されるものではないが、例えば、３７℃（中温発酵）、ｐＨ６．８〜７．２、有機酸濃度３０００ｐｐｍ程度で水素生成菌Ａを培養すると、当該菌は水素を生成することが可能である。
【００３０】
上述した水素生成菌Ａの培養は通常、密閉された培養槽に水素生成菌Ａ及び培地を入れて行う。この場合、水素生成菌Ａが、培地中に含まれる有機酸を基質として水素を生成する。培養は、所定量の水素生成菌Ａ及び培地を培養槽に仕込み、培地に含まれる有機酸を基質として水素生成菌Ａに水素を生成させるバッチ式、培養槽内に入れた水素生成菌Ａ（担体等に固定することが好ましい）に対して培地を流し込み、培地に含まれる有機酸を基質として水素生成菌Ａに水素を生成させるフロー式のいずれでもよい。
【００３１】
培養槽に発生した水素を取り出す方法としては、例えば、水素分離膜を利用する方法が挙げられる。これは、他の気体分子と比べて著しく小さいという水素分子の性質を利用した方法である。多くの水素分離膜が市販されており、いずれをも利用することができる。具体的には、培養槽内のガスを外部に取り出し、取り出したガスを、水素分離膜に通し、水素分離膜を通過した水素を、培養槽に接続された別の槽に回収すればよい。
【００３２】
本発明の第二の水素製造方法は、水素生成菌Ａを、有機酸を含む有機性廃液中で培養して、水素生成菌Ａに水素を生成させることを特徴とする。
【００３３】
この水素製造方法によれば、有機性廃液中に有機酸が含まれるため、この有機酸を基質として水素生成菌Ａが水素を生成する。このため、高いエネルギー変換効率で水素を生成することが可能となる。また、光照射によって培養する場合と異なり、広大な培養設備を必要としない。さらに、有機酸が不要になることがないため、有機酸を処理するための排水処理設備が不要となる。加えて、本発明の水素製造方法によれば、不要となった有機性廃液が浄化処理されると同時に水素の生成源となるため、有機性廃液の有効利用が可能となる。
【００３４】
上記有機性廃液としては、焼酎の製造過程に発生する有機性残渣のほか、食品廃棄物（例えば、生ごみ、おから等）の廃液、缶詰工場やジュース工場からの廃液、メタン発酵の残渣液などが挙げられる。
【００３５】
これらのうち、焼酎の製造過程に発生する有機性残渣が好ましい。これは、次の理由による。即ち、焼酎の製造過程に発生する有機性残渣は日本で年間約５０万トン以上発生している。しかし、この有機性残渣は水分を多量に含むため処理が難しく、従来は大半が海洋投棄されていた。その一方、この有機性残渣には一般に有機酸が多量に含まれている。したがって、この有機性残渣中で本発明に係る前記細菌を培養すれば、処理が困難であった有機性残渣の処理が進むと共に、より効率よく水素を製造することが可能である。
【００３６】
ここで、前記有機性廃液に含まれる有機酸は、炭素数が１〜６のカルボン酸であることが好ましく、乳酸、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、コハク酸又はリンゴ酸であることが特に好ましい。かかる有機性廃液で水素生成菌Ａを培養すると、効率良く水素を生成させることが可能だからである。
【００３７】
有機性廃液にそのまま水素生成菌Ａを添加して培養を行ってもよいが、水素生成菌Ａに効率良く水素を生成させるためには、以下の前処理を行うことが好ましい。まず、有機性廃液を遠心分離して懸濁固形物を除去する。次に、懸濁固形物を除去した有機性廃液にｐＨ調整剤を加えて、ｐＨを６．８〜７．２にする。さらに、還元剤（例えば、Ｌ−システインやアスコルビン酸）を加えて酸化還元電位を調整する。
【００３８】
培養槽に水素生成菌Ａ及び有機性廃液を入れ、水素生成菌の培養を行うと、有機性廃液に含まれる有機酸を基質として水素生成菌Ａが水素を生成させる。培養は、前述したとおり、バッチ式、フロー式のいずれでもよい。また、培養槽内に発生した水素を取り出す方法については、前述の通りである。
【００３９】
本発明の第三の水素製造方法は、糖を基質として水素及び有機酸を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌（以下、「水素生成菌Ｂ」という。）と、水素生成菌Ａとを、糖を含む培地中で培養して、両水素生成菌に水素を生成させるものである。
【００４０】
この水素製造方法によれば、水素生成菌Ａと、水素生成菌Ｂとを一緒に培養すると、培地中に含まれる糖を基質として水素及び有機酸が生成され、このとき生成される有機酸を基質として更に水素が生成される。このため、高いエネルギー変換効率で水素を生成することが可能となる。また、光照射によって培養する場合と異なり、広大な培養設備を必要としない。さらに、有機酸が不要になることがない。即ち、糖を基質として水素を生成することで有機酸が生成しても、その有機酸を基質として水素が生成されて有機酸の処理が行われる。このため、有機酸を処理するための排水処理設備が不要となる。更にまた、この水素製造方法によれば、水素生成菌Ａの培養だけでなく、水素生成菌Ｂの培養によっても水素が生成される。このため、水素生成菌Ａを単独で培養したときに比べて、水素の生成量をより増加させることができ、より高い効率で水素を製造することが可能である。
【００４１】
本水素製造方法に用いる水素生成菌Ｂは、糖を基質として水素及び有機酸を生成する能力を持つ菌であれば特に限定されず、例えば、クロストリジウム属菌、エンテロバクター（Enterobacter）属菌、シュードモナス（Pseudomonas）属菌、バチルス（Bacillus）属菌などが挙げられる。
【００４２】
両水素生成菌を培養する培地及び培養条件は、嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌が生育できる培地及び培養条件であれば特に限定されるものではないが、例えば、３７℃（中温発酵）、ｐＨ６．８〜７．２、糖濃度１０〜３０ｇ／Ｌ（グルコース換算）で両水素生成菌を培養すると、当該菌は水素を生成することが可能である。
【００４３】
培養槽に水素生成菌Ａ、水素生成菌Ｂ及び培地を入れ、培養を行うと、まず、培地中に含まれる糖を基質として水素生成菌Ｂが水素を生成する。そして、このとき、同時に生成される有機酸を基質として、水素生成菌Ａが水素を生成する。培養は、前述したとおり、バッチ式、フロー式のいずれでもよい。また、発生した水素を取り出す方法については、前述の通りである。
【００４４】
本発明の第四の水素製造方法は、水素生成細菌Ｂを、糖を含む第１の培地中で培養して、水素生成菌Ｂに水素及び有機酸を生成させ、生成した有機酸を含む第２の培地中で水素生成菌Ａを培養して、水素生成菌Ａに水素を生成させるものである。ここで、第１の培地と第２の培地は異なるものである。
【００４５】
この水素製造方法によれば、水素生成菌Ｂを第１の培地中で培養することにより第１の培地中で水素及び有機酸が生成される。そして、このとき生成される有機酸が第２の培地に移送される。そして、第２の培地中に含まれる有機酸を基質として、水素生成菌Ａによって、さらに水素が生成される。このため、高いエネルギー変換効率で水素を生成することが可能となる。また、光照射によって培養する場合と異なり、広大な培養設備を必要としない。さらに、この水素製造方法によれば、有機酸が不要になることがない。即ち、糖を基質として水素を生成することで有機酸が生成しても、その有機酸を基質として水素が生成されて有機酸の処理が行われる。このため、有機酸を処理するための排水処理設備が不要となる。更にまた、この水素製造方法によれば、水素生成菌Ａの培養だけでなく、水素生成菌Ｂの培養によっても水素が生成される。このため、水素生成菌Ａを単独で培養したときに比べて、水素の生成量をより増加させることができ、より高い効率で水素を製造することが可能である。
【００４６】
なお、同じ培地で両水素生成菌を培養すると、両菌の間でお互いに阻害関係を引き起こす可能性や水素を生成するのに適した培養条件が異なる可能性があるため、本発明の第四の水素製造方法のように、別々の培養槽で両水素生成菌を独立して培養すると、水素収率が高くなる可能性がある。
【００４７】
水素生成菌Ｂを培養する培地及び培養条件は、嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌が生育できる培地及び培養条件であれば特に限定されるものではないが、例えば、クロストリジウム属菌の好適な培養条件は、ｐＨ５．５〜５．８、培養温度２５〜３０℃、酸化還元電位−１５０〜−２５０ｍＶ、糖濃度１０〜３０ｇ／Ｌ（グルコース換算）である。
【００４８】
水素生成菌Ａを培養する培地及び培養条件は前述と同様であるが、培地には、水素生成菌Ｂを培養することによって得た有機酸が添加してある。
【００４９】
上記第四の水素製造方法は、例えば密閉された第１の培養槽に、水素生成菌Ｂ及び第１の培地を入れ、密閉された第２の培養槽に水素生成菌Ａ及び第２の培地を入れ、第１の培地で発生する有機酸を第２の培地中に入れることにより行うことができる。
【００５０】
培養は、前述したとおり、バッチ式、フロー式のいずれでもよい。フロー式の場合、水素生成菌Ａを固定した第二の培養槽は、水素生成菌Ｂを固定した第一の培養槽の下流に設置する必要がある。また、発生した水素を取り出す方法は、前述のとおりである。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例及び比較例を挙げて本発明について更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５２】
まず、様々な環境（砂、泥、海水、湖沼）から採取したサンプル中に、有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌が存在することを、以下の試験例１〜６において調べた。
【００５３】
（試験例１）
環境サンプル中に存在する、乳酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌の分離・同定を以下の方法により行った。蒸留水１Ｌに酵母エキス（３ｇ）、ペプトン（５ｇ）、硫酸アンモニウム（１ｇ）、硫酸マグネシウム７水和物（０．２ｇ）、リン酸水素二ナトリウム１２水和物（１４ｇ）、リン酸二水素カリウム（６ｇ）及び硫酸鉄７水和物（０．０１２５ｇ）を添加した溶液を調製した。この溶液に発酵基質である乳酸（３ｇ／Ｌ）を添加した。この溶液のｐＨを６．８に調整した後、滅菌処理（１２１℃、１０分間）を行った。
【００５４】
クリーンベンチ内にて、容積３０ｍＬのサンプル瓶に滅菌処理済みの溶液（８ｍＬ）を加えた。そこに、還元剤を１％（ｖ／ｖ）となるように添加した後、１％（ｖ／ｖ）となるように環境サンプルを植菌した。還元剤には、蒸留水に、２２％（ｗ／ｖ）のＬ−アスコルビン酸、１１％（ｗ／ｖ）の炭酸ナトリウム及び２％（ｗ／ｖ）のＬ−システイン塩酸塩を加えた後、ろ過滅菌して得られる溶液を用いた。
【００５５】
サンプル瓶にゴム栓及びアルミキャップで蓋をした後、サンプル瓶をクリーンベンチから取り出した。サンプル瓶内の気相部分を不活性ガスであるアルゴンに置換した後、サンプル瓶を３７℃の恒温槽に入れて２４時間培養を行った。サンプル瓶の気相部分から気体を採取し、採取した気体をガスクロマトグラフィー（島津製作所、熱伝導度検出器）で分析し、発生した水素の定量を行った。
【００５６】
水素発生量の多いサンプルを選び出し、その一部を乳酸を含む寒天プレートに塗布し、嫌気ジャー中で培養してコロニーを形成させた。得られたコロニー毎に、前記と同様の方法で乳酸を含む培地で培養を行い、発生した水素の定量を行った。この操作を繰り返すことにより、乳酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌の純化・分離を行った。
【００５７】
このようにして分離した細菌の同定を遺伝子解析により行った。すなわち、分離した細菌を乳酸を含む培地で培養し、その一部を軽く遠心することにより菌体を回収した。回収した菌体からＤＮＡを取り出し、ＰＣＲ法により１６ＳｒＤＮＡを増幅し、その配列を決定した。決定したＤＮＡ配列に基づいて、ＤＤＢＪでＢＬＡＳＴ検索を行い、ホモロジーが高い菌種を選定し、適合率が９６％以上であった菌の属を分離した細菌の属として同定した。
【００５８】
その結果、クロストリジウム属菌（嫌気性細菌）及びエシェリキア属菌（通性嫌気性細菌）が、乳酸を基質として水素を生成する能力を持つ菌として分離・同定された。なお、これらの菌を培養した場合、発酵副産物としてコハク酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸及び酪酸が生成することが確認された。
【００５９】
（試験例２）
環境サンプル中に存在する、酢酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌の分離・同定を試験例１と同様の方法により行った。その結果、クロストリジウム属菌及びエシェリキア属菌が、酢酸を基質として水素を生成する能力を持つ菌として分離・同定された。なお、これらの菌を培養した場合、発酵副産物としてコハク酸、ギ酸、イソ酪酸及び酪酸が生成することが確認された。
【００６０】
（試験例３）
環境サンプル中に存在する、プロピオン酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌の分離・同定を試験例１と同様の方法により行った。その結果、クロストリジウム属菌、エシェリキア属菌及びフォトラブダス属菌（通性嫌気性細菌）が、プロピオン酸を基質として水素を生成する能力を持つ菌として分離・同定された。なお、これらの菌を培養した場合、発酵副産物としてコハク酸、ギ酸、酢酸及びイソ酪酸が生成することが確認された。
【００６１】
（試験例４）
環境サンプル中に存在する、クエン酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌の分離・同定を試験例１と同様の方法により行った。その結果、クロストリジウム属菌、エシェリキア属菌及びフォトラブダス属菌が、クエン酸を基質として水素を生成する能力を持つ菌として分離・同定された。なお、これらの菌を培養した場合、発酵副産物としてコハク酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸及び酪酸が生成することが確認された。
【００６２】
（試験例５）
環境サンプル中に存在する、コハク酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌の分離・同定を試験例１と同様の方法により行った。その結果、クロストリジウム属菌及びシトロバクター属菌（嫌気性細菌）が、コハク酸を基質として水素を生成する能力を持つ菌として分離・同定された。なお、これらの菌を培養した場合、発酵副産物として酢酸及びプロピオン酸が生成することが確認された。
【００６３】
（試験例６）
環境サンプル中に存在する、リンゴ酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌の分離・同定を試験例１と同様の方法により行った。その結果、クロストリジウム属菌、エシェリキア属菌及びフォトラブダス属菌が、リンゴ酸を基質として水素を生成する能力を持つ菌として分離・同定された。なお、これらの菌を培養した場合、発酵副産物としてコハク酸、酢酸及びプロピオン酸が生成することが確認された。
【００６４】
（実施例１）
次に、汚泥から採取したサンプルを、有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌を含むサンプルとして、以下の実験に供した。なお、汚泥サンプルは、下水処理場にて下水汚泥をメタン発酵処理した後の汚泥であり、前処理は行っていない。この汚泥サンプルを用いて、焼酎の製造過程に発生する有機性残渣（焼酎蒸留粕、以下、「有機性残渣」という。）から水素を生成させることができるかを以下の方法により調べた。
【００６５】
有機性残渣として芋焼酎の蒸留粕を用いた。この有機酸の組成を分析したところ、コハク酸：１２３７ｐｐｍ、乳酸：５３６５ｐｐｍ、ギ酸：６８ｐｐｍ、酢酸：１９１５ｐｐｍ、プロピオン酸：１３２ｐｐｍ、全糖量：４１１６ｐｐｍ、ブドウ糖：０ｐｐｍであった。なお、芋焼酎の蒸留粕は、サザングリーン協同組合（鹿児島県）より入手した。
【００６６】
有機性残渣に水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨを６．８に調整した後、滅菌処理（１２１℃、１０分間）を行った。クリーンベンチ内にて、容積３０ｍＬのサンプル瓶に滅菌処理した有機性残渣（８ｍＬ）を加えた。培養液中の酸化還元電位を下げるために１％（ｖ／ｖ）となるように還元剤を有機性残渣に加えた後、１％（ｖ／ｖ）となるように汚泥サンプルを植菌した。還元剤には、蒸留水に、２２％（ｗ／ｖ）のＬ−アスコルビン酸、１１％（ｗ／ｖ）の炭酸ナトリウム及び２％（ｗ／ｖ）のＬ−システイン塩酸塩を加えた後、ろ過滅菌して得られる溶液を用いた。
【００６７】
サンプル瓶にゴム栓及びアルミキャップで蓋をした後、サンプル瓶をクリーンベンチから取り出した。サンプル瓶内の気相部分を不活性ガスであるアルゴンに置換した後、サンプル瓶を３７℃の恒温槽に入れて培養を行った。培養開始２４時間後及び４８時間後にサンプル瓶の気相部分から気体を採取し、採取した気体をガスクロマトグラフィー（島津製作所、熱伝導度検出器）で分析し、発生した水素及び二酸化炭素の定量を行った。結果を図１に示す。
【００６８】
図１に示すように、２４時間及び４８時間培養した場合に、それぞれ、３．９ｍＬ及び４．４ｍＬの水素が発生した。また、２４時間及び４８時間培養した場合に、それぞれ、６．１ｍＬ及び７．７ｍＬの二酸化炭素が発生したが、他の気体（硫化水素など）の発生は確認されなかった。
【００６９】
実施例１の結果から、焼酎製造過程に発生する有機性残渣中で、有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌を培養することにより、水素を製造できることが確認された。
【００７０】
（実施例２〜７）
汚泥サンプルを用いて、有機酸を含む培地中から水素を生成させることができるかを以下の方法により調べた。
【００７１】
まず、蒸留水１Ｌに酵母エキス（３ｇ）、ペプトン（５ｇ）、硫酸アンモニウム（１ｇ）、硫酸マグネシウム７水和物（０．２ｇ）、リン酸水素二ナトリウム１２水和物（１４ｇ）、リン酸二水素カリウム（６ｇ）及び硫酸鉄７水和物（０．０１２５ｇ）を添加した溶液を調製した。この溶液に発酵基質（３ｇ／Ｌ）を添加して、得られた溶液を焼酎製造過程で発生する有機性残渣模擬液（以下、「模擬液」という。）とした。発酵基質には、乳酸、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、コハク酸又はリンゴ酸を用いた（順に、実施例２〜７とする）。模擬液のｐＨを６．８に調整した後、滅菌処理（１２１℃、１０分間）を行った。
【００７２】
クリーンベンチ内にて、容積３０ｍＬのサンプル瓶に滅菌処理済みの模擬液（８ｍＬ）を加えた。そこに、実施例１と同じ還元剤を１％（ｖ／ｖ）となるように添加した後、１％（ｖ／ｖ）となるように汚泥サンプルを植菌した。
【００７３】
サンプル瓶にゴム栓及びアルミキャップで蓋をした後、サンプル瓶をクリーンベンチから取り出した。サンプル瓶内の気相部分を不活性ガスであるアルゴンに置換した後、サンプル瓶を３７℃の恒温槽に入れて２４時間培養を行った。サンプル瓶の気相部分から気体を採取し、採取した気体を実施例１と同様の方法で分析し、発生した水素の定量を行った。結果を図２に示す。
【００７４】
図２は、様々な有機酸を発酵基質として培養した場合の、発生水素量を表すグラフである。また、各有機酸を用いた場合の最大水素発生量を表１にまとめた。
【００７５】
【表１】
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【００７６】
実施例２〜７の結果から、有機酸を含む培地中で、有機酸を基質として水素を生成する能力を持つ嫌気性細菌又は通性嫌気性細菌を培養することにより、水素を製造できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】有機性残渣中で培養した場合の水素発生量を表すグラフである。
【図２】様々な有機酸を発酵基質として培養した場合の水素発生量を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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