(57)【要約】【課題】  遺伝子多型を検出する方法及び該方法に使用することができるオリゴヌクレオチドを提供し、さらに、該オリゴヌクレオチドを含む遺伝子多型検出用キットを提供すること。【解決手段】  オリゴヌクレオチドの３’末端から3番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のオリゴヌクレオチドは天然型のオリゴヌクレオチドからなり、３’末端部位に対象遺伝子の多型部位の基準配列のヌクレオチドに相補的なヌクレチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の３’末端を多型部位にし、３’末端から２番目のヌクレオチドを検出対象の遺伝子と相補的ではない塩基を持つヌクレオチドにし、３’末端から３番目のヌクレオチドとして2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットを用いたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いること。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩：
(ａ)オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる；
(ｂ)３’末端部位に対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有する。
【請求項２】
以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩：
(ａ)オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる；
(ｂ)３’末端部位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有する。
【請求項３】
以下の（ａ）乃至（ｄ）の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩：
（ａ）オリゴヌクレオチドの３’末端部位が対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる；
（ｂ）オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として２番目）のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる；
（ｃ）その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する；
（ｄ）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として３番目）のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる。
【請求項４】
以下の（ａ）乃至（ｄ）の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩：
（ａ）オリゴヌクレオチドの３’末端部位が対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる；
（ｂ）オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として２番目）のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる；
（ｃ）その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する；
（ｄ）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として３番目）のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる。
【請求項５】
１８乃至２５塩基長からなることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド又はその塩。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする、遺伝子多型の検出方法。
【請求項７】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする、遺伝子多型部位のヌクレオチド配列の決定方法。
【請求項８】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、遺伝子多型の検出方法：
（ａ）遺伝子多型部位を含む核酸を鋳型として、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、及び該オリゴヌクレオチドと対になってＰＣＲで目的配列部分を増幅できるオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行う工程；
（ｂ）工程（ａ）によって反応産物が生成するか否かによって、核酸中の遺伝子多型の有無を判定する工程。
【請求項９】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、遺伝子多型部位のヌクレオチド配列の決定方法：
（ａ）遺伝子多型部位を含む核酸を鋳型として、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、及び該オリゴヌクレオチドと対になってＰＣＲで目的配列部分を増幅できるオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行う工程；
（ｂ）工程（ａ）によって反応産物が生成するか否かによって、核酸中の遺伝子多型部位のヌクレオチド配列を決定する工程。
【請求項１０】
反応産物の生成の有無の検出に、電気泳動、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ及びMALDI−ＴＯＦ／ＭＳ法からなる群から選択される少なくともいずれか一つを用いることを特徴とする請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子多型が一塩基多型であることを特徴とする、請求項６乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
以下の（ａ）乃至（ｄ）を含む、遺伝子多型検出用キット：
（ａ）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、３’末端部位に対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｄ）ＰＣＲ緩衝液。
【請求項１３】
以下の（ａ）乃至（ｄ）を含む、遺伝子多型検出用キット：
（ａ）オリゴヌクレオチドの３’末端から3番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、３’末端部位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るプライマー；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｄ）ＰＣＲ緩衝液。
【請求項１４】
以下の（ａ）乃至（ｅ）を含む、遺伝子多型検出用キット：
（ａ）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、３’末端部位に対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド；
（ｂ）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、３’末端部位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド；
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｅ）ＰＣＲ緩衝液。
【請求項１５】
以下の（ａ）乃至（ｄ）を含む、遺伝子多型検出用キット：
（ａ）以下の（i）乃至（iv）の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩：
（i）オリゴヌクレオチドの３’末端部位が対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる；
（ii）オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として２番目）のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる；
（iii）その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する；
（iv）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として３番目）のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる；
（ｂ）（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｄ）ＰＣＲ緩衝液。
【請求項１６】
以下の（ａ）乃至（ｄ）を含む、遺伝子多型検出用キット：
（ａ）（i）乃至（iv）の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩；
（i）オリゴヌクレオチドの３’末端部位が対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる；
（ii）オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として２番目）のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる；
（iii）その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する；
（iv）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として３番目）のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる；
（ｂ）（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｄ）ＰＣＲ緩衝液。
【請求項１７】
以下の（ａ）乃至（ｅ）を含む、遺伝子多型検出用キット：
（ａ）以下の（i）乃至（iv）の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩；
（i）オリゴヌクレオチドの３’末端部位が対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる；
（ii）オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として２番目）のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる；
（iii）その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する；
（iv）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として３番目）のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる；
（ｂ）（i）乃至（iv）の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩；
（i）オリゴヌクレオチドの３’末端部位が対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる；
（ii）オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として２番目）のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる；
（iii）その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する；
（iv）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として３番目）のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる。
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド；
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｅ）ＰＣＲ緩衝液。
【請求項１８】
オリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチドの塩基長が１８乃至２５塩基長であることを特徴とする、請求項１２乃至１７のいずれか１項に記載の遺伝子多型検出用キット。
【請求項１９】
遺伝子多型が一塩基多型であることを特徴とする、請求項１２乃至１８のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＮＡユニットを含むオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを利用した、遺伝子多型の検出方法、遺伝子多型の検出用のオリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドを含有する遺伝子多型検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ファーマコジェノミクス研究の進展により、遺伝子多型と薬効、あるいは遺伝子多型と副作用の関係から、個々の患者に対する薬物の効果や副作用を、遺伝子診断で予測することが可能になりつつある。このような例としては、薬物代謝酵素の遺伝子多型の例が挙げられる。多型により活性が増加、あるいは、減少する薬物代謝酵素としては、シトクロムＰ４５０１Ａ２、シトクロムＰ４５０２Ａ６、シトクロムＰ４５０２Ｃ９、シトクロムＰ４５０２Ｃ１９，シトクロムＰ４５０２Ｄ６、シトクロムＰ４５０２Ｅ１などが知られている。また、チオプリンメチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルクウロノシルトランスフェラーゼ、および、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼなど抱合酵素と呼ばれる一群の酵素群にも遺伝子多型が存在し、多型により活性が減少することが報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
また、遺伝子多型と疾患との関係を調べることにより、一部の疾患の事前診断や予後の判定も可能になりつつあり、多型解析研究から見出された疾患原因遺伝子が多数報告されている。例えば、潰瘍性大腸炎の原因遺伝子としてのＨＬＡ、慢性関節リウマチの原因遺伝子としてのＴＣＲα、アルツハイマー病の原因遺伝子としてのＡＰＯＥ４、精神分裂症の原因遺伝子としてのドーパミンＤ３受容体、躁鬱病の原因遺伝子としてのトリプトファン水酸化酵素、アルブミン尿症の原因遺伝子としてのアンジオテンシン前駆体、心筋梗塞の原因遺伝子としての血液凝固因子VII、肥満の原因遺伝子としてのレプチンなどが報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００４】
遺伝子多型の検出方法として、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法と制限酵素による切断とを組み合わせたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法（例えば、非特許文献３参照。）、配列の異なる一本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡはポリアクリルアミドゲル中で異なる移動度を示すという原理に基づいたＳＳＣＰ(single-strand conformation polymorphism)法、または、オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端付近にミスマッチがあるとプライマーの伸長反応が阻止されるという原理に基づいたＡＳ−ＰＣＲ(allele-specific PCR)法などが開発されている。
【０００５】
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、検査工程に３〜２４時間の制限酵素処理を含むために、迅速な方法とは言い難い。ＳＳＣＰ法は検査対象となる塩基配列のどこかに、一個もしくは複数の変異が存在する場合に、その存在を高感度に検出できる点で優れている。しかし、微妙な移動度の差を検出するために実験条件を厳密にコントロールしなければならないので、非常に手間がかかる方法であり、かつ変異の位置を同定できない。また、実際の検体、たとえば血液や組織からＳＳＣＰ法を行うには、クローニングやＰＣＲ法を用いて、事前に大量の核酸を調製する必要があり、多数の検体を効率よく検査するには適さない方法である。
【０００６】
ＡＳ−ＰＣＲ法はＰＣＲを応用した方法であり、事前に大量の核酸を調製する必要はなく、３’末端付近にミスマッチのないプライマーを使用したときのみ増幅産物が得られることを応用したもので、多数の検体を効率よく検査するために適した方法である。しかし、通常のＰＣＲではプライマーにミスマッチが存在する場合でも増幅産物が得られる場合があり、厳密性に問題があった。
【０００７】
また、ＡＳ−ＰＣＲ法を改変し、3’末端から2番目に対象遺伝子とは相補的ではない塩基を持つヌクレオシドを持ち、3’末端に検出したい多型部分を設定した場合、3’末端から2番目に対象遺伝子と相補的である塩基を持つヌクレオシドをもつプライマーに比べ、  3’末端に存在する多型部位の検出が改善される報告がある（例えば、非特許文献４参照。)。しかし、この方法を用いた場合でもミスマッチが起こることがあり、より検出感度の高い遺伝子多型の検出方法の開発が求められていた。
【０００８】
2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（以下、「ＥＮＡヌクレオチド」ともいう。）は非天然型のヌクレオチドである。ＥＮＡを導入したオリゴヌクレオチドは、相補鎖ＲＮＡに対して高い結合能を有している（例えば、特許文献１参照及び非特許文献５参照。）。また、ＥＮＡヌクレオチドは糖部の2’位酸素原子と4’位炭素原子をメチレン鎖で架橋したヌクレオチドであるLNA（2’-O,4’-C-メチレンヌクレオチド（特許文献２参照。）よりもヌクレアーゼに対して高い抵抗性を有するという特徴を持っている（非特許文献６参照。）。しかしながら、ＥＮＡヌクレオチドをプライマーとして用いることによってＡＳ−ＰＣＲの測定精度を向上させることができるか否かは不明であった。
【０００９】
本発明者らは、上記、多型の検出方法の問題点を解決すべく、検討を行ったところ、３’末端から3番目にENA修飾が加えられたオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして用いた場合、ミスマッチによる増幅産物の生成量が減少し、精度が高く遺伝子多型が検出できることを見出し、更に該検出方法に用いることができるキットを提供した。
【００１０】
更に本発明者らは、多型部位を３’末端にし、３’末端から２番目のヌクレオチドを検出対象の遺伝子と相補的ではない塩基を持つヌクレオチドにし、３’末端から３番目にENA修飾が加えられたオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして用いた場合、ミスマッチによる増幅産物の生成量が減少し、精度が高く遺伝子多型が検出できることを見出し、更に該検出方法に用いることができるキットを提供し、本発明を完成させた。
【特許文献１】特許第３４２０９８４号公報
【特許文献２】特開平１０−３０４８８９号公報
【非特許文献１】中村祐輔編、「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」、中山書店、２０００年６月５日
【非特許文献２】「ネイチャー・ジェネティクス（Nature Genetics）」、１９９９年、第２２巻 、ｐ．１３９−１４４
【非特許文献３】「サイエンス（Science）」、１９９１年、第２５２巻、ｐ．１６４３−
【非特許文献４】「ジェノミックス(Genomics)」２００３年、第82巻、ｐ３９０−３９６
【非特許文献５】「バイオオルガニック＆メディカル・ケミストリー（Bioorganic & Medical Chemistry）」、２００３年、第１１巻、ｐ．２２１１−２２２６
【非特許文献６】「バイオオーガニック  メディシナル  ケミストリ-  レター（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters）」、２００２年、第１２巻、ｐ．７３−７６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、遺伝子多型を検出する方法及び該方法に使用することができるオリゴヌクレオチドを提供し、さらに、該オリゴヌクレオチドを含む遺伝子多型検出用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は鋳型となる核酸のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドプライマーを合成する際に、合成オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端のヌクレオチドを鋳型のヌクレオチドと相補的ではないヌクレオチドにするとDNAポリメラーゼによるプライマーの伸張反応が起こらず、鋳型となる核酸のヌクレオチド配列と完全に相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた場合にはDNAポリメラーゼによるプライマーの伸張反応が起きる現象を利用した遺伝子多型の検出方法に関する。
【００１３】
さらに詳しくは、本発明は、合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の３’末端を多型部位にし、さらに３’末端から3番目のヌクレオチドとして2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットを用いたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることを特徴とする遺伝子多型の検出方法に関する。
【００１４】
さらに本発明は、合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の３’末端を多型部位にし、３’末端から２番目のヌクレオチドを検出対象の遺伝子と相補的ではない塩基を持つヌクレオチドにし、３’末端から３番目のヌクレオチドとして2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットを用いたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることを特徴とする遺伝子多型の検出方法に関する。
本発明の課題を解決手段としては具体的には、
（１）  以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩：
(ａ)オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる；
(ｂ)３’末端部位に対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有する、
（２）  以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩：
(ａ)オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる；
(ｂ)３’末端部位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有する、
（３）  以下の（ａ）乃至（ｄ）の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩：
（ａ）オリゴヌクレオチドの３’末端部位が対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる；
（ｂ）オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として２番目）のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる；
（ｃ）その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する；
（ｄ）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として３番目）のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる、
（４）  以下の（ａ）乃至（ｄ）の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩：
（ａ）オリゴヌクレオチドの３’末端部位が対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる；
（ｂ）オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として２番目）のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる；
（ｃ）その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する；
（ｄ）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として３番目）のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる、
（５）  １８乃至２５塩基長からなることを特徴とする、（１）乃至（４）のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド又はその塩、
（６）  （１）乃至（５）のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする、遺伝子多型の検出方法、
（７）  （１）乃至（５）のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする、遺伝子多型部位のヌクレオチド配列の決定方法、
（８）  以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、遺伝子多型の検出方法：
（ａ）遺伝子多型部位を含む核酸を鋳型として、（１）乃至（５）のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、及び該オリゴヌクレオチドと対になってＰＣＲで目的配列部分を増幅できるオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行う工程；
（ｂ）工程（ａ）によって反応産物が生成するか否かによって、核酸中の遺伝子多型の有無を判定する工程、
（９）  以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、遺伝子多型部位のヌクレオチド配列の決定方法：
（ａ）遺伝子多型部位を含む核酸を鋳型として、（１）乃至（５）のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、及び該オリゴヌクレオチドと対になってＰＣＲで目的配列部分を増幅できるオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行う工程；
（ｂ）工程（ａ）によって反応産物が生成するか否かによって、核酸中の遺伝子多型部位のヌクレオチド配列を決定する工程、
（１０）  反応産物の生成の有無の検出に、電気泳動、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ及びMALDI−ＴＯＦ／ＭＳ法からなる群から選択される少なくともいずれか一つを用いることを特徴とする（８）又は（９）に記載の方法、
（１１）  遺伝子多型が一塩基多型であることを特徴とする、（６）乃至（１０）のいずれか１項に記載の方法、
（１２）  以下の（ａ）乃至（ｄ）を含む、遺伝子多型検出用キット：
（ａ）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、３’末端部位に対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｄ）ＰＣＲ緩衝液、
（１３）  以下の（ａ）乃至（ｄ）を含む、遺伝子多型検出用キット：
（ａ）オリゴヌクレオチドの３’末端から3番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、３’末端部位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るプライマー；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｄ）ＰＣＲ緩衝液、
（１４）  以下の（ａ）乃至（ｅ）を含む、遺伝子多型検出用キット：
（ａ）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、３’末端部位に対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド；
（ｂ）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、３’末端部位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド；
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｅ）ＰＣＲ緩衝液、
（１５）  以下の（ａ）乃至（ｄ）を含む、遺伝子多型検出用キット：
（ａ）以下の（i）乃至（iv）の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩：
（i）オリゴヌクレオチドの３’末端部位が対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる；
（ii）オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として２番目）のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる；
（iii）その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する；
（iv）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として３番目）のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる；
（ｂ）（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｄ）ＰＣＲ緩衝液、
（１６）  以下の（ａ）乃至（ｄ）を含む、遺伝子多型検出用キット：
（ａ）（i）乃至（iv）の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩；
（i）オリゴヌクレオチドの３’末端部位が対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる；
（ii）オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として２番目）のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる；
（iii）その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する；
（iv）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として３番目）のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる；
（ｂ）（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｄ）ＰＣＲ緩衝液、
（１７）  以下の（ａ）乃至（ｅ）を含む、遺伝子多型検出用キット：
（ａ）以下の（i）乃至（iv）の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩；
（i）オリゴヌクレオチドの３’末端部位が対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる；
（ii）オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として２番目）のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる；
（iii）その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する；
（iv）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として３番目）のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる；
（ｂ）（i）乃至（iv）の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩；
（i）オリゴヌクレオチドの３’末端部位が対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる；
（ii）オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として２番目）のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる；
（iii）その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する；
（iv）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として３番目）のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる。
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド；
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｅ）ＰＣＲ緩衝液、
（１８）  オリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチドの塩基長が１８乃至２５塩基長であることを特徴とする、（１２）乃至（１７）のいずれか１項に記載の遺伝子多型検出用キット、
（１９）  遺伝子多型が一塩基多型であることを特徴とする、（１２）乃至（１８）のいずれか１項に記載のキット、
からなる。
【００１５】
本発明における、遺伝子多型の検出方法の１つの原理は以下の通りである。
【００１６】
（１）遺伝子多型を検出したい配列(目的配列)の多型部分にプライマーの３’末端を設定し、かつプライマーの３’末端から３番目に2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットの修飾を加える。このプライマーと遺伝子多型検出対象のヌクレオチド配列を含む核酸を反応液中で核酸合成酵素の混合物と作用させると、プライマーの３’末端が一致する（塩基が相補的である）場合は、核酸合成反応が起こる。これに対して、３’末端が一致しない場合は、核酸合成反応が起こらない。このように３’末端が一致する場合は核酸合成反応が起こり、一致しない場合は核酸合成反応が起こらない違いを利用して、ヌクレオチド配列の変異を検出することができる。この原理を図１と図２で説明する。
【００１７】
図１は、核酸配列に変異（多型）がない場合を示す。(i)は核酸配列の変異(多型)を調べようとする対象の鋳型核酸で、塩基配列の一部に3'-ATGC-5'の配列をもつ。この鋳型核酸と３’末端から３番目にENA修飾が加えられたオリゴヌクレオチド(ii)（2’-O,4’-C-エチレン-5-メチルウリジン  ユニットをeTと表記する）とがアニーリングして２本鎖を形成する。この場合、(ii)の塩基配列の内少なくとも３’末端は対応するの塩基と相補な構成になっており、(ii)と(i)とは2本鎖を形成する。この2本鎖を形成しているオリゴヌクレオチド(ii)の３’末端の部分を核酸合成酵素(iii)が認識し、核酸合成反応が続行する。ここに示した具体的な塩基配列は説明のためのものであり、この塩基配列のみに有効であることを意味するものではない。
【００１８】
図２は核酸配列に変異(多型)がある場合を示す。(i)は核酸配列の変異(多型)を調べようとする対象の鋳型核酸で、塩基配列の一部に3'-ATAC-5'の配列をもつ。この鋳型核酸と３’末端から３番目にENA修飾が加えられたオリゴヌクレオチド(ii)（2’-O,4’-C-エチレン-5-メチルウリジン  ユニットをeTと表記する）とがアニーリングして２本鎖を形成する。この場合、(ii)の塩基配列の内少なくとも３’末端は対応する塩基と相補な構成になっておらず、(ii)の3’末端のCが(i)内のAとワトソン−クリック塩基対を形成していない。このワトソン−クリック塩基対を形成していないオリゴヌクレオチド(ii)の３’末端の部分を核酸合成酵素(iii)が認識できず、核酸合成反応が続行することができない。ここに示した具体的な塩基配列は説明のためのものであり、この塩基配列のみに有効であることを意味するものではない。
【００１９】
本発明における、遺伝子多型の検出方法の他の１つの原理は以下の通りである。
【００２０】
（２）  遺伝子多型を検出したい配列(目的配列)の多型部分にプライマーの３’末端を設定し、３’末端から２番目のヌクレオチドを検出対象の遺伝子と相補的ではない塩基を持つヌクレオチドにし、かつプライマーの３’末端から３番目にENAユニットの修飾を加える。このプライマーと遺伝子多型検出対象のヌクレオチド配列を含む核酸及び該プライマーと対になってＰＣＲで目的配列部分を増幅できるオリゴヌクレオチドを反応液中で核酸合成酵素の混合物と作用させると、プライマーの３’末端が一致する（塩基が相補的である）場合は、核酸合成反応が起こり、遺伝子が増幅される。これに対して、３’末端が一致しない場合は、核酸合成反応が起こらず、遺伝子の増幅は見られない。このように３’末端の塩基が相補する場合は核酸合成反応が起こり、相補しない場合は核酸合成反応が起こらない違いを利用して、ヌクレオチド配列の変異を検出することができる。この原理を図３と図４で説明する。
【００２１】
図３は、核酸配列に変異（多型）がない場合を示す。(i)は核酸配列の変異(多型)を調べようとする対象の鋳型核酸で、塩基配列の一部に3'-ATGC-5'の配列をもつ。(ii)はプライマーである。このプライマーでは、３’末端から２番目のヌクレオシドを検出対象の遺伝子と相補的ではないヌクレオシドにし（図ではグアニン（Ｇ）。）、それ以外のヌクレオシドは検出対象の遺伝子と相補的なヌクレオシドである。また、３’末端から３番目はＥＮＡ修飾が加えられたオリゴヌクレオチド（2’-O,4’-C-エチレン-5-メチルウリジン  ユニットをeTと表記する）にしている。この場合、(ii)のヌクレオチド配列のうち３’末端から２番目以外のヌクレオチド配列は対応する(i)のヌクレオチド配列と相補な配列になっており、(ii)のヌクレオチド配列のうち３’末端から２番目でミスマッチするものの、鋳型核酸と多型検出用プライマーがアニーリングして２本鎖を形成する。この相補鎖を形成しているオリゴヌクレオチド(ii)の３’末端の部分を核酸合成酵素(iii)が認識し、核酸合成反応が続行する。
【００２２】
なお、ここに示した具体的なヌクレオチド配列は説明のための例示に過ぎず、本発明が、このヌクレオチド配列のみに有効であることを意味するものではない。
【００２３】
図４はヌクレオチド配列に変異(多型)がある場合を示す。(i)はヌクレオチド配列の変異(多型)を調べようとする対象の鋳型核酸で、ヌクレオチド配列の一部に3'-ATAC-5'の配列をもつ。(ii)はプライマーである。このプライマーでは、３’末端及び３’末端から２番目のヌクレオシドを検出対象の遺伝子と相補的ではないヌクレオシドにし（図ではグアニン（Ｇ）。）、それ以外のヌクレオシドは検出対象の遺伝子と相補的なヌクレオシドである。また、３’末端から３番目はＥＮＡ修飾が加えられたオリゴヌクレオチド（2’-O,4’-C-エチレン-5-メチルウリジン  ユニットをeTと表記する）にしている。この場合、(ii)のヌクレオオチド配列のうち、３’末端及び３’末端から２番目のヌクレオシドは対応するヌクレオシドと相補なヌクレオシドになっておらず、(ii)の3’末端部分がワトソン−クリック塩基対を形成しない。このワトソン−クリック塩基対を形成していないオリゴヌクレオチド(ii)の３’末端の部分を核酸合成酵素(iii)が認識できず、核酸合成反応は進まない。
【００２４】
なお、ここに示した具体的なヌクレオチド配列は説明のための例示に過ぎず、本発明が、このヌクレオチド配列のみに有効であることを意味するものではない。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、新規な遺伝子多型の検出方法が提供された。本発明の遺伝子多型の検出方法を用いることにより、天然型のオリゴヌクレオチドを用いる場合に比べより正確に多型を検出できるようになった。
【００２６】
また、該方法に用いることができる、遺伝子多型の検出用オリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドを含有する遺伝子多型の検出用キットも提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
１．用語の説明
本明細書中において「遺伝子多型」とは、ある遺伝子座において、（ａ）１個の塩基が他の塩基に置き換わっているもの（一塩基多型（ＳＮＰ））及び／又は（ｂ）１から数十塩基（数千塩基のこともある）が欠失や挿入をしているもの（挿入／欠失多型）を意味する。本明細書において、一塩基多型とはSNP(single nucleotide polymorphism)ともいい、個人間におけるヌクレオチド配列中の一塩基の違いをいう。
【００２８】
一塩基多型部分のヌクレオチドとしては２種類のヌクレオチドの変異が存在することが知られており（例えば、アデニンかグアニン、チミンかシトシン等）、その変異の割合は対象となる遺伝子によって異なっている。本明細書中において、「対象遺伝子」とは、遺伝子多型を検出する対象とする遺伝子のことをいう。
【００２９】
本明細書においては、対象遺伝子の一塩基多型部位の２種類の塩基の変異のうちで出現頻度の高いヌクレオチドを含む配列を基準配列とし、基準配列中の一塩基多型部位のヌクレオチドを基準ヌクレオチドとし、出現頻度の低いヌクレオチドを含む配列を変異配列とし、変異配列中の一塩基多型部位のヌクレオチドを変異ヌクレオチドとする。
【００３０】
また、多型が欠失多型の場合には欠失がない配列を基準配列とし、欠失がある配列を変異配列とする。
【００３１】
さらに、多型が挿入多型の場合には挿入がない配列を基準配列とし、挿入がある配列を変異配列とする。
【００３２】
また、本明細書中において、「多型を有する」とは、対象遺伝子の目的とする多型を含む配列が変異配列を有することを意味し、「多型を有さない」とは対象遺伝子の目的とする多型を含む配列が基準配列であることを意味する。
【００３３】
本明細書中において、「天然型のヌクレオチド」とは、アデニンヌクレオチド、グアニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド、ウラシルヌクレオチド、チミンヌクレオチドをいう。また、「天然型のオリゴヌクレオチド」とは、アデニンヌクレオチド、グアニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド、ウラシルヌクレオチド、チミンヌクレオチド等の天然型ヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドのことを示す。
【００３４】
本明細書においてはアデニンヌクレオチドをＡｐ、グアニンヌクレオチドをＧｐ、シトシンヌクレオチドをＣｐ及びチミンヌクレオチドをＴｐと表記することもある。また天然型のオリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオシド、アデニンヌクレオシドはＡｔ、グアニンヌクレオシドはＧｔ、シトシンヌクレオシドはＣｔ及びチミンヌクレオシドはＴｔと表わすことができる。
天然型のヌクレオチドの構造式を以下に示す。
【００３５】
【化１】
2005323583.tif 000002
【００３６】
本明細書中において、「ENAヌクレオチド」（以下、「ENA」ともいう。）とは、糖部の2’位酸素原子と4’位炭素原子をエチレン鎖で架橋したヌクレオチドである（特許第3420984号参照。）。
【００３７】
本明細書において2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド  ユニット及び「ＥＮＡユニット」とはＡｅ２ｐ、Ｇｅ２ｐ、Ｃｅ２ｐ、５Ｃｅ２ｐ、Ｔｅ２ｐ、または、オリゴヌクレオチドの３’末端に有する場合、ENAをヌクレオシドとして扱う場合は、Ｃｅ２ｔ、５Ｃｅ２ｔ、Ｔｅ２ｔ、から選択されるいずれかの基を意味し、その構造は下記に示すとおりである。またＬＮＡユニットとしてＣｅ１ｐの構造も示す。
【００３８】
【化２】
2005323583.tif 000003
【００３９】
本明細書中における、「相補的なヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの塩基部分が相補するヌクレオチドのことをいい、具体的には、塩基部分がアデニンとチミン、グアニンとシトシン及びアデニンとウラシルであるヌクレオチドが互いに相補的なヌクレオチドである。
【００４０】
本明細書中における、「その塩」とは、本発明の化合物は、塩にすることができるので、その塩をいい、そのような塩としては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩のようなアリ−ルスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマ−ル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及び、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。
【００４１】
なお、本発明の化合物及びその塩は、水和物としても存在することができ、本発明は、それらの水和物をも包含する。
２．検体
本発明で遺伝子多型を検出する対象となる検体としては、核酸を含む試料を用いることができる。核酸としては一例として、ゲノムＤＮＡを挙げることができるが、これに限定されない。
【００４２】
例えば、ヒトの遺伝子の多型を検出するためにはヒトゲノムＤＮＡを含む検体を用いることができ、マウスの遺伝子の多型を検出するためには、マウスゲノムＤＮＡを用いることができる。ゲノムＤＮＡは当業者に公知の方法で取得することができる。以下、ヒトのゲノムＤＮＡを例にして説明するが、他の生物由来のゲノムＤＮＡも同様に取得することができる。
【００４３】
ゲノムＤＮＡを得るための材料としては、被験者から採取されたあらゆる細胞（生殖細胞を除く）、組織、臓器等を使用することができるが、好ましくは末梢血から分離した白血球または単核球であり、最も好適には白血球である。これらの材料は、臨床検査において通常用いられる方法によって採取され得る。
【００４４】
例えば白血球を用いる場合、まず被験者より採取した末梢血から周知の方法で白血球を分離する。次いで、得られた白血球にプロテイナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えてタンパク質を分解、変性させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことによりゲノムＤＮＡ（ＲＮＡを含む）を得る。ＲＮＡは、必要に応じＲＮａｓｅにより除去することができる。ただし、本発明はこれに限定されず、ヒトゲノムＤＮＡを含む試料からのゲノムＤＮＡの抽出にあたっては、本発明の技術分野において周知の方法、すなわち文献（例えば、Sambrook, J. et al. (1989)："Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.)" Cold Spring Harbor Laboratory, NY参照）に記載されている方法や、市販のＤＮＡ抽出キット等を利用する方法も好ましく用いることができる。
【００４５】
ＤＮＡを含む検体は、ＰＣＲに用いることができる限度においてその純度は問わず、試料よりの粗抽出物、精製物等を用いることができる。
３．対象遺伝子の選択
遺伝子多型を検出する対象となる遺伝子は、少なくとも一部のヌクレオチド配列が既に知られており、その部分に多型が存在するものであればいずれでもよい。そのような遺伝子の一例として、薬効や薬の副作用に関与する薬物代謝遺伝子である、シトクロムＰ４５０１Ａ２、シトクロムＰ４５０２Ａ６、シトクロムＰ４５０２Ｃ９、シトクロムＰ４５０２Ｃ１９，シトクロムＰ４５０２Ｄ６、シトクロムＰ４５０２Ｅ１などが知られている。また、チオプリンメチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルクウロノシルトランスフェラーゼ、および、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼや、疾患との関連遺伝子として、潰瘍性大腸炎の原因遺伝子としてのＨＬＡ、慢性関節リウマチの原因遺伝子としてのＴＣＲα、アルツハイマー病の原因遺伝子としてのＡＰＯＥ４、精神分裂症の原因遺伝子としてのドーパミンＤ３受容体、躁鬱病の原因遺伝子としてのトリプトファン水酸化酵素、アルブミン尿症の原因遺伝子としてのアンジオテンシン前駆体、心筋梗塞の原因遺伝子としての血液凝固因子VII及び肥満の原因遺伝子としてのレプチンなどを挙げることができる。その他、human prothrombin等を挙げることもできる。
【００４６】
また、マウスのゲノムＤＮＡを検体として用いる場合にはマウスのアンジオポエチン関連３(Angiopoietin-like 3)遺伝子のプロ−モーター上の多型及び、欠失多型も挙げることができる。
【００４７】
なお、遺伝子中の多型の位置は翻訳領域、非翻訳領域、プロモーター、イントロン等の調節領域及びその他の領域のいずれであってもよい。
４．オリゴヌクレオチドプライマー
以下のオリゴヌクレオチドは、核酸自動合成機を用いて合成することができる。
【００４８】
天然のオリゴヌクレオチドについては天然のホスホロアミダイドを使用して合成することができる。2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチドについては特許第3420984号の実施例14(5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-6-N-ベンゾイルアデノシン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、実施例27 (5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-2-N-イソブチリルグアノシン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、実施例5（5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-4-N-ベンゾイルシチジン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）、実施例22（5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-4-N-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）、実施例9（5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-5-メチルウリジン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）に記載の化合物を用いることによって合成することができる。
【００４９】
（１）遺伝子多型検出用オリゴヌクレオチド
（１）−１  本発明で用いる遺伝子多型検出用のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ａ）及び（ｂ）を挙げることができる。
【００５０】
（ａ）基準配列に相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
以下の(i)乃至(iii)の特徴を有する；
(i)オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として３番目）のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる、
(ii) ３’末端部位に対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有する、
(iii)オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチドの長さはPCRによって核酸を増幅できる限りにおいて特に制限はないが、好ましくは１５〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１８〜３５ヌクレオチド、更に好ましくは１８〜２５ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。
【００５１】
このような特徴を有するオリゴヌクレオチドを、以下、「Ｘ−ＰＲＩＭＥＲ」と呼ぶことにする。
【００５２】
（ｂ）変異配列に相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド
(i)オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として３番目）のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる、
(ii) ３’末端部位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有する、
(iii)オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの長さはPCRによって核酸を増幅できる限りにおいて特に制限はないが、好ましくは１５〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１８〜３５ヌクレオチド、更に好ましくは１８〜２５ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。
【００５３】
上記（ａ）及び（ｂ）中の(i)において、オリゴヌクレオチドの３’末端から3番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットであるとは、３番目のヌクレオチドを天然型のヌクレオチドではなく、ＥＮＡヌクレオチドであることをすることを意味する。例えば、Ａｐの代わりにＡｅ２ｐ、Ｇｐの代わりにＧｅ２ｐ、Ｃｐの代わりに５Ｃｅ２ｐまたはＣｅ２ｐ、Ｔｐの代わりにＴｅ２ｐを用いることを意味する。
【００５４】
このような特徴を有するオリゴヌクレオチドを、以下、「Ｙ−ＰＲＩＭＥＲ」と呼ぶことにする。
【００５５】
（１）−２  本発明で用いる遺伝子多型検出用のオリゴヌクレオチドとしては、更に以下の（ｃ）及び（ｄ）を挙げることができる。
【００５６】
（ｃ）３’末端部位から２番目のヌクレオチド以外が基準配列に相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド
以下の(i)乃至(v)の特徴を有する；
(i) オリゴヌクレオチドの３’末端部位が対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる、
(ii) オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として２番目）のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる、
(iii) その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する、
(iv) オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として３番目）のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる、
(v) オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの長さはPCRによって核酸を増幅できる限りにおいて特に制限はないが、好ましくは１５〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１８〜３５ヌクレオチド、更に好ましくは１８〜２５ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。
【００５７】
このような特徴を有するオリゴヌクレオチドを、以下、「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」と呼ぶことにする。
【００５８】
（ｄ）３’末端部位から２番目のヌクレオチド以外が変異配列に相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド
以下の(i)乃至(v)の特徴を有する；
(i) オリゴヌクレオチドの３’末端部位が対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる、
(ii) オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として２番目）のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる、
(iii) その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する、
(iv) オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として３番目）のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる、
(v) オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの長さはPCRによって核酸を増幅できる限りにおいて特に制限はないが、好ましくは１５〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１８〜３５ヌクレオチド、更に好ましくは１８〜２５ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。
このような特徴を有するオリゴヌクレオチドを、以下、「Ｐ−ＰＲＩＭＥＲ」と呼ぶことにする。
【００５９】
上記（ａ）乃至（ｄ）中の(iv)において、オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットであるとは、３番目のヌクレオチドが天然型のヌクレオチドではなく、ＥＮＡヌクレオチドであることを意味する。例えば、Ａｐの代わりにＡｅ２ｐ、Ｇｐの代わりにＧｅ２ｐ、Ｃｐの代わりに５Ｃｅ２ｐまたはＣｅ２ｐ、Ｔｐの代わりにＴｅ２ｐが用いられることを意味する。
【００６０】
なお、これらの（ａ）乃至（ｄ）のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ用フォワード・プライマー（Forward primer）と呼ぶこともある。
【００６１】
（２）対になって用いられるオリゴヌクレオチド
（ａ）ＰＣＲ用オリゴヌクレオチド
ＰＣＲにおいて上記（１）に記載の（ａ）乃至（ｄ）のいずれかのオリゴヌクレオチドと対になって用いられるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、遺伝子多型を検出する対象となる遺伝子のヌクレオチド配列において、上記（１）の（ａ）乃至（ｄ）のいずれかの遺伝子多型検出用のオリゴヌクレオチドと対になってＰＣＲによって対象の遺伝子中の目的の配列を増幅できる限りにおいて特に制限されないが、具体的には相補鎖にあたる配列中の最も５’末端側の位置よりもさらに５’末端側領域に存在する相補鎖の配列中の連続した１５〜４０ヌクレオチド、好ましくは１８乃至３５ヌクレオチド、更に好ましくは１８乃至２５ヌクレオチドの任意の部分配列からなる。ただし、遺伝子多型検出用のオリゴヌクレオチドと対になって用いられるオリゴヌクレオチドに互いに相補的な配列が存在すると、お互いにアニーリングすることにより非特異的な配列が増幅され、特異的な遺伝子多型の検出の妨げとなるおそれがあるので、そのような組み合わせを避けたオリゴヌクレオチド及び対になるオリゴヌクレオチドの設計を行うことが好ましい。
【００６２】
なお、本明細書においては、対になるオリゴヌクレオチドをリバース・プライマー（Reverse primer）と呼ぶこともある。
【００６３】
（ｂ）ＴａｑＭａｎプローブ
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲで用いる遺伝子多型検出用オリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）は５’末端はＦＡＭやＶＩＣなどの蛍光レポーター色素によって標識されており、同時に３’末端はクエンチャーで標識されており〔ジェネティク・アナリシス(Genet. Anal.), 14, p143-149 (1999), ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー(J. Clin. Microbiol.), 34, p2933-2936 (1996)〕。
【００６４】
上記（１）に記載の（ａ）乃至（ｄ）のいずれかのオリゴヌクレオチドと対になって用いられるＴａｑＭａｎプローブの配列は、遺伝子多型を検出する対象となる遺伝子のヌクレオチド配列において、上記（１）に記載の（ａ）乃至（ｄ）のいずれかの遺伝子多型検出用のオリゴヌクレオチドと対になってＰＣＲによって対象の遺伝子中の目的の配列を増幅できる限りにおいて特に制限されないが、具体的には相補鎖にあたる配列中の最も５’末端側の位置よりもさらに５’末端側領域に存在する配列中の連続した１５〜４０ヌクレオチド、好ましくは１８〜３５ヌクレオチド、更に好ましくは１８〜２５ヌクレオチドの任意の部分配列からなる。ただし、遺伝子多型検出用のオリゴヌクレオチドとＴａｑＭａｎプローブに互いに相補的な配列が存在すると、お互いにアニーリングすることにより非特異的な配列が増幅され、特異的な遺伝子多型の検出の妨げとなるおそれがあるので、そのような組み合わせを避けたオリゴヌクレオチド及びＴａｑＭａｎプローブの設計を行うことが好ましい。
５．遺伝子多型の検出方法
Ａ．ＰＣＲによる遺伝子多型の検出
（１）ＰＣＲ
上記「４．オリゴヌクレオチドプライマー」の項の「（１）遺伝子多型検出用オリゴヌクレオチド」の項目で設計した（ａ）乃至（ｄ）のいずれかの遺伝子多型検出用のオリゴヌクレオチド及び該ヌクレオチドと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとを用いたＰＣＲ反応を行うことにより、対象遺伝子の所定の位置の多型を検出することができる。ここでＰＣＲは(i) 「Ｘ−ＰＲＩＭＥＲ」及び該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、(ii) 「Ｙ−ＰＲＩＭＥＲ」及び該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、（iii） 「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」及び該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、(iv) 「Ｐ−ＰＲＩＭＥＲ」及び該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、(v) (i)と(ii)の組み合わせ、(vi) (iii)と(iv)の組み合わせのいずれかの組み合わせで行うことができる。
【００６５】
ＰＣＲの反応条件は所望の核酸配列を増幅できる限りにおいて特に制限されず、当業者が通常行う条件でＰＣＲを行うことができるが、例えば、以下のようにして行うことができる。
【００６６】
（ａ）核酸合成酵素
核酸合成酵素としては、鋳型の核酸の種類に応じて、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼおよび逆転写酵素(reverse transcriptase)から適宜選択して用いることができる。ここで、DNAポリメラーゼとしては、例えば、Thermus aquaticus由来のTaq DNAポリメラーゼ、Thermus thermophilus由来のTth DNAポリメラーゼ、Pyrococcus由来のKOD、PfuあるいはPwoDNAポリメラーゼ、あるいは前記の耐熱性ポリメラーゼの混合等があるが、これらにのみ限定されるものではない。なおTth DNAポリメラーゼはRT活性も有しているため、RT-PCRをOne tube-One stepで行うときに、１種類の酵素で賄うことが出来る特徴を有している。逆転写酵素は、RNAをcDNAに逆転写出来る酵素を意味する。逆転写酵素としては、Rous associated virus(RAV)やAvian myeloblastosis virus(AMV)等のトリのレトロウイルス由来の逆転写酵素、Moloney murine leukemia virus(MMLV)等のマウスのレトロウイルス由来の逆転写酵素あるいは前記のTth DNAポリメラーゼ等があるが、これらにのみ限定されるものではない。
【００６７】
（ｂ）ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応は例えば、以下のとおりである。
【００６８】
反応液組成の例：
塩化マグネシウム  ２乃至２．５ｍＭ（好ましくは２．５ｍＭ）；
１×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ  トリス−塩酸（２５℃におけるｐＨ８．３乃至９．０（好ましくは８．３））、５０ｍＭ  塩化カリウム；
ｄＮＴＰｓ  ０．２乃至０．２５ｍＭ（好ましくは０．２５ｍＭ）；
遺伝子多型検出用オリゴヌクレオチド及び該ヌクレオチドと対になって用いられるオリゴヌクレオチド  ０．２乃至０．５μＭ（好ましくは０．２μＭ）；
Ｔａｑポリメラーゼ  １乃至２．５単位（好ましくは２．５単位）；
滅菌水を加えて全量を８０μｌに調整し、その全量を、逆転写反応を終了した反応液全量に加えてからＰＣＲを開始する。
反応温度条件：  まず９４℃で２分間加熱した後、９０乃至９５℃（好ましくは９４℃）で３０秒間、４０乃至６５℃（好ましくは、プライマーの特性から算出される解離温度（Ｔｍ）からそれより２０度低い温度までの範囲内で３０秒間、７０乃至７５℃（好ましくは７２℃）で１．５分間の温度サイクルを２８乃至５０サイクル（好ましくは３０サイクル）繰り返してから、４℃に冷却する。
【００６９】
（２）遺伝子多型の検出
ＰＣＲ終了後、反応液を電気泳動し、目的配列の大きさのバンドが増幅されているか否かを検出する。
【００７０】
（ａ）「Ｘ−ＰＲＩＭＥＲ」を用いた場合
Ｘ−ＰＲＩＭＥＲ及び該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認できた場合には、多型部分のオリゴヌクレオチドはＸ−ＰＲＩＭＥＲの３’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドと判断することができ、多型はないと判定することができる。
【００７１】
一方目的の配列が増幅されないときは、多型部分のオリゴヌクレオチドはＸ−ＰＲＩＭＥＲの３’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドではないと判断することができ、遺伝子多型を有すると判定することができる。
【００７２】
（ｂ）「Ｙ−ＰＲＩＭＥＲ」を用いた場合
Ｙ−ＰＲＩＭＥＲと該該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認できた場合には、多型部分のオリゴヌクレオチドはＹ−ＰＲＩＭＥＲの３’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドと判断することができ、遺伝子多型を有すると判定することができる。
【００７３】
一方目的の配列が増幅されないときは、多型部分のオリゴヌクレオチドはＹ−ＰＲＩＭＥＲの３’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドではないと判断することができ、遺伝子多型を有さないと判定することができる。
【００７４】
（ｃ）「Ｘ−ＰＲＩＭＥＲ」及び「Ｙ−ＰＲＩＭＥＲ」の両方を用いた場合
Ｘ−ＰＲＩＭＥＲと該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認でき、Ｙ−ＰＲＩＭＥＲと該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認できない場合には、遺伝子多型はないと判定することができる。
【００７５】
一方、Ｘ−ＰＲＩＭＥＲと該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認できず、Ｙ−ＰＲＩＭＥＲと該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認できた場合には、遺伝子多型を有すると判定することができる。
【００７６】
（ｄ）「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」を用いた場合
「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」及び該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認できた場合には、多型部分のオリゴヌクレオチドは「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」の３’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドと判断することができ、多型はないと判定することができる。
【００７７】
一方目的の配列が増幅されないときは、多型部分のオリゴヌクレオチドは「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」の３’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドではないと判断することができ、遺伝子多型を有すると判定することができる。
【００７８】
（ｅ）「Ｐ−ＰＲＩＭＥＲ」を用いた場合
「Ｐ−ＰＲＩＭＥＲ」と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認できた場合には、多型部分のオリゴヌクレオチドは「Ｐ−ＰＲＩＭＥＲ」の３’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドと判断することができ、遺伝子多型を有すると判定することができる。
【００７９】
一方目的の配列が増幅されないときは、多型部分のオリゴヌクレオチドは「Ｐ−ＰＲＩＭＥＲ」の３’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドではないと判断することができ、遺伝子多型を有さないと判定することができる。
【００８０】
（ｆ）「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」及び「Ｐ−ＰＲＩＭＥＲ」の両方を用いた場合
「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認でき、「Ｐ−ＰＲＩＭＥＲ」と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認できない場合には、遺伝子多型はないと判定することができる。
【００８１】
一方、「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認できず、「Ｐ−ＰＲＩＭＥＲ」と該ヌクレオチドと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認できた場合には、遺伝子多型を有すると判定することができる。
【００８２】
上記（ａ）乃至（ｆ）のいずれかと同様の実験をＥＮＡオリゴヌクレオチドを含まない、オリゴヌクレオチドで行うと本来バンドが出ないはずの鋳型となる核酸に対してもミスマッチによるバンドの出現が確認され、本方法は従来の方法に比べ感度よく遺伝子多型を検出できることが確認できる。また、ＥＮＡユニットの代わりにＬＮＡを用いた場合もミスマッチが確認されるが遺伝子多型の検出の精度は低下する。
【００８３】
また、ＥＮＡユニットの位置をオリゴヌクレオチドの３’末端から３番目以外にしたオリゴヌクレオチドを用いた場合には、遺伝子多型の検出の精度及び感度が低下する。
【００８４】
Ｂ．ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲによる遺伝子多型の検出
上記、「Ａ．」の項目において遺伝子多型検出用オリゴヌクレオチドと上記「４．」の項目に記載のＴａｑＭａｎプローブを用い、ABI社ABI PRISM等を用い、その添付プロトコールに従ってＴａｑＭａｎ ＰＣＲを行うことによって遺伝子多型を検出することができる。
【００８５】
（ａ）「Ｘ−ＰＲＩＭＥＲ」を用いた場合
「Ｘ−ＰＲＩＭＥＲ」とＴａｑＭａｎプローブとの組み合わせによるＴａｑＭａｎ  ＰＣＲによって蛍光強度の増加によって目的とする配列の増幅が確認できた場合には、多型部分のオリゴヌクレオチドはＸ−ＰＲＩＭＥＲの３’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドと判断することができ、遺伝子多型はないと判定することができる。
【００８６】
一方目的の配列が増幅されないときは、多型部分のオリゴヌクレオチドはＸ−ＰＲＩＭＥＲの３’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドではないと判断することができ、遺伝子多型を有すると判定することができる。
【００８７】
（ｂ）「Ｙ−ＰＲＩＭＥＲ」を用いた場合
Ｙ−ＰＲＩＭＥＲとＴａｑＭａｎプローブとの組み合わせによるＰＣＲによって蛍光強度の増加によって目的とする配列の増幅が確認できた場合には、多型部分のオリゴヌクレオチドはＹ−ＰＲＩＭＥＲの３’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドと判断することができ、遺伝子多型を有すると判定することができる。
【００８８】
一方目的の配列が増幅されないときは、多型部分のオリゴヌクレオチドはＹ−ＰＲＩＭＥＲの３’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドではないと判断することができ、遺伝子多型を有さないと判定することができる。
【００８９】
（ｃ）「Ｘ−ＰＲＩＭＥＲ」及び「Ｙ−ＰＲＩＭＥＲ」の両方を用いた場合
Ｘ−ＰＲＩＭＥＲとＴａｑＭａｎプローブとの組み合わせによるＰＣＲによって蛍光強度の増加によって目的とする配列の増幅が確認でき、Ｙ−ＰＲＩＭＥＲとＴａｑＭａｎプローブとの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認できない場合には、遺伝子多型を有さないと判定することができる。
【００９０】
一方、Ｘ−ＰＲＩＭＥＲとＴａｑＭａｎプローブとの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認できず、Ｙ−ＰＲＩＭＥＲとＴａｑＭａｎプローブとの組み合わせによるＰＣＲによって蛍光強度の増加によって目的とする配列の増幅が確認できた場合には、遺伝子多型を有さないと判定することができる。
【００９１】
（ｄ）「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」を用いた場合
「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」とＴａｑＭａｎプローブとの組み合わせによるＴａｑＭａｎ  ＰＣＲによって蛍光強度の増加によって目的とする配列の増幅が確認できた場合には、多型部分のオリゴヌクレオチドは「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」の３’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドと判断することができ、遺伝子多型はないと判定することができる。
【００９２】
一方目的の配列が増幅されないときは、多型部分のオリゴヌクレオチドは「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」の３’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドではないと判断することができ、遺伝子多型を有すると判定することができる。
【００９３】
（ｅ）「Ｐ−ＰＲＩＭＥＲ」を用いた場合
「Ｐ−ＰＲＩＭＥＲ」とＴａｑＭａｎプローブとの組み合わせによるＰＣＲによって蛍光強度の増加によって目的とする配列の増幅が確認できた場合には、多型部分のオリゴヌクレオチドは「Ｐ−ＰＲＩＭＥＲ」の３’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドと判断することができ、遺伝子多型を有すると判定することができる。
【００９４】
一方目的の配列が増幅されないときは、多型部分のオリゴヌクレオチドは「Ｐ−ＰＲＩＭＥＲ」の３’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドではないと判断することができ、遺伝子多型を有さないと判定することができる。
【００９５】
（ｆ）「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」及び「Ｐ−ＰＲＩＭＥＲ」の両方を用いた場合
「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」とＴａｑＭａｎプローブとの組み合わせによるＰＣＲによって蛍光強度の増加によって目的とする配列の増幅が確認でき、「Ｐ−ＰＲＩＭＥＲ」とＴａｑＭａｎプローブとの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認できない場合には、遺伝子多型を有さないと判定することができる。
【００９６】
一方、「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」とＴａｑＭａｎプローブとの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認できず、「Ｐ＾ＰＲＩＭＥＲ」とＴａｑＭａｎプローブとの組み合わせによるＰＣＲによって蛍光強度の増加によって目的とする配列の増幅が確認できた場合には、遺伝子多型を有さないと判定することができる。
【００９７】
Ｃ．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法による遺伝子多型の検出
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法による多型の検出法（「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」（中村祐輔編）, 中山書店, 東京, (2000)、ｐ．１０６−１１７）に記載の方法を一部改変することによって遺伝子多型を検出することができる。以下、具体的に説明する。
【００９８】
多型部位を含むＰＣＲ産物をゲノムＤＮＡより増幅する。その際、多型部位の塩基とＰＣＲプライマーは重複しないように設計する。
【００９９】
次にＰＣＲ反応系に残存しているｄＮＴＰとプライマーとして用いたオリゴヌクレオチドを除去し、精製ＰＣＲ産物とする。
【０１００】
精製ＰＣＲ産物を鋳型として、上記「４．」の「（１）遺伝子多型検出用オリゴヌクレオチド」に記載のオリゴヌクレオチドを鋳型に対して１０倍以上の過剰量加え、９０乃至９５℃でアニールさせ、サーマルサイクル反応を行う。サーマルサイクル反応はオリゴヌクレオチドの伸張反応が確認される限りにおいて特に制限されないが、例えば、９４℃と３７℃の２温度間で２５回の反応で、適当な伸張効率が得られる。
【０１０１】
得られた伸張反応産物を精製し、塩、緩衝液、界面活性剤、蛋白を除去する。この精製物をＭＡＬＤＩプレートにスポットし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによって質量を分析する。
【０１０２】
対象遺伝子の多型部位が遺伝子多型検出用オリゴヌクレオチドと相補的なオリゴヌクレオチドであるときには遺伝子多型検出用オリゴヌクレオチドにｄｄＮＴＰが付加された伸張反応産物の蓄積が確認されるが、多型部位が遺伝子多型検出用オリゴヌクレオチドと相補的でないときは伸張反応産物は蓄積されない。
【０１０３】
「Ｘ−ＰＲＩＭＥＲ」を用いた場合に伸張反応産物が確認されれば、多型部分は基準ヌクレオチドであり、多型を有さないと判定することができ、伸張反応産物が確認されなければ、多型部分は変異ヌクレオチドであり、遺伝子多型を有すると判断できる。
【０１０４】
「Ｙ−ＰＲＩＭＥＲ」を用いた場合に伸張反応産物が確認されれば、多型部分は変異ヌクレオチドであり、多型を有すると判断でき、伸張反応産物が確認されなければ、多型部分は基準ヌクレオチドであり、遺伝子多型を有さないと判断できる。
【０１０５】
「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」を用いた場合に伸張反応産物が確認されれば、多型部分は基準ヌクレオチドであり、多型を有さないと判定することができ、伸張反応産物が確認されなければ、多型部分は変異ヌクレオチドであり、遺伝子多型を有すると判断できる。
【０１０６】
「Ｐ−ＰＲＩＭＥＲ」を用いた場合に伸張反応産物が確認されれば、多型部分は変異ヌクレオチドであり、多型を有すると判断でき、伸張反応産物が確認されなければ、多型部分は基準ヌクレオチドであり、遺伝子多型を有さないと判断できる。
【０１０７】
また、キアゲン社（Qiagen）のLightCycler systemとそれを用いてPCR産物を検出するキット（Quantitect SYBR Green PCR Kit）等に応用することによって生成するPCR産物の有無を検出することなどを用いて、PCR産物を測定することも可能である。
６．遺伝子多型の存在状態の確認
本発明の方法によると鋳型となる核酸中の多型がヘテロで存在するかホモで存在するかを判定することができる。具体的には以下の（ａ）乃至（ｆ）のいずれかの方法によって判定することができる。
【０１０８】
（ａ）「Ｘ−ＰＲＩＭＥＲ」を用いた場合
「Ｘ−ＰＲＩＭＥＲ」と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認できた場合にホモであることが分かっている検体に比べ目的とするバンドの出現量が約半分になっている場合には、多型は基準ヌクレオチドと変異ヌクレオチドのヘテロであると判定することができる。
【０１０９】
（ｂ）「Ｙ−ＰＲＩＭＥＲ」を用いた場合
Ｙ−ＰＲＩＭＥＲと該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認できた場合にホモであることが分かっている検体に比べ目的とするバンドの出現量が約半分になっている場合には、多型は基準ヌクレオチドと変異ヌクレオチドのヘテロであると判定することができる。
【０１１０】
（ｃ）「Ｘ−ＰＲＩＭＥＲ」及び「Ｙ−ＰＲＩＭＥＲ」の両方を用いた場合
Ｘ−ＰＲＩＭＥＲと該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認でき、Ｙ−ＰＲＩＭＥＲと該ヌクレオチドと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲによっても目的とする配列の増幅が確認できる場合には、多型はヘテロであると判定することができる。
【０１１１】
（ｄ）「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」を用いた場合
「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認できた場合に、ホモであることが分かっている検体に比べ目的とするバンドの出現量が約半分になっている場合には、多型は基準ヌクレオチドと変異ヌクレオチドのヘテロであると判定することができる。
【０１１２】
（ｅ）「Ｐ−ＰＲＩＭＥＲ」を用いた場合
「Ｐ−ＰＲＩＭＥＲ」と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認できた場合に、ホモであることが分かっている検体に比べ目的とするバンドの出現量が約半分になっている場合には、多型は基準ヌクレオチドと変異ヌクレオチドのヘテロであると判定することができる。
【０１１３】
（ｆ）「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」及び「Ｐ−ＰＲＩＭＥＲ」の両方を用いた場合
「Ｎ−ＰＲＩＭＥＲ」と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲによって目的とする配列の増幅が確認でき、「Ｐ−ＰＲＩＭＥＲ」と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるＰＣＲによっても目的とする配列の増幅が確認できる場合には、多型はヘテロであると判定することができる。
７．遺伝子多型検出用キット
本発明の方法を行うために使用するプライマー及び試薬類を遺伝子多型検出用キットとして提供することができる。そのようなキットは以下の物を含む。
【０１１４】
キット１：（ａ）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、３’末端部位に対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｄ）ＰＣＲ緩衝液、
（１３）  以下のものを含む、遺伝子多型検出用キット：
（ａ）オリゴヌクレオチドの３’末端から3番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、３’末端部位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るプライマー；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｄ）ＰＣＲ緩衝液。
【０１１５】
キット２：
（ａ）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、３’末端部位に対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド；
（ｂ）オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、３’末端部位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド；
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｅ）ＰＣＲ緩衝液。
【０１１６】
キット３：
（ａ）以下の(i)乃至(v)の特徴を有するオリゴヌクレオチド：
(i) オリゴヌクレオチドの３’末端部位が対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる、
(ii) オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として２番目）のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる、
(iii) その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する、
(iv) オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として３番目）のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる、
(v) オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの長さはPCRによって核酸を増幅できる限りにおいて特に制限はないが、好ましくは１５〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１８〜３５ヌクレオチド、更に好ましくは１８〜２５ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。
（ｂ）（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るプライマー；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｄ）ＰＣＲ緩衝液。
【０１１７】
キット４：
（ａ）以下の特徴を有するオリゴヌクレオチド：
(i) オリゴヌクレオチドの３’末端部位が対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる、
(ii) オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として２番目）のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる、
(iii) その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する、
(iv) オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目（３’末端のヌクレオチドを１番目として３番目）のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる、
(v) オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの長さはPCRによって核酸を増幅できる限りにおいて特に制限はないが、好ましくは１５〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１８〜３５ヌクレオチド、更に好ましくは１８〜２５ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。
（ｂ）（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るプライマー；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｄ）ＰＣＲ緩衝液。
【０１１８】
本発明のこれらのキット１乃至４には、場合によっては電気泳動用の各種試薬、ｄＮＴＰ、電気泳動用マーカー等を含ませることもできる。
発明を実施するための最良の形態
【実施例】
【０１１９】
以下、実施例、参考例及び試験例にて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において、遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Molecular Cloning）」［Sambrook, J.,Fritsch, E.F.およびManiatis, T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊］に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【０１２０】
（実施例１）
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-5Ce2p-Tp-Ctの合成
核酸自動合成機（パーキンエルマー社製 ABI model 394 DNA/RNA synthesizer）を用い、40 nmolのプログラムで行った。各合成サイクルにおける溶媒、試薬、ホスホロアミダイトの濃度は天然オリゴヌクレオチド合成の場合と同じものを用いた。CPGは、約0.1μmol用いた。非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例22（5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-4-N-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）、の化合物を用いた。目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を濃アンモニア水で処理することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン原子上の保護基シアノエチル基と核酸塩基上の保護基をはずした。溶媒を減圧下留去し、残った残渣を逆相ＨＰＬＣ（島津製作所製LC−10VP、カラム（Merck, Chromolith Performance RP-18e (4.6×100mm)）、A溶液：5%アセトニトリル、0.1M酢酸トリエチルアミン水溶液(TEAA), pH 7.0、B溶液：アセトニトリル、B%：10%→ 50%(10min, linear gradient)；60℃；2 ml/min；254 nm）にて精製し、 ジメトキシトリチル基を有する目的物のピークを集めた。水を加え、減圧下留去することで、TEAAを除いた。80%酢酸水溶液（200μl）を加え、20分放置することで、ジメトキシトリチル基の脱保護を行った。溶媒を留去したのち逆相ＨＰＬＣ（島津製作所製LC−10VP、カラム（Merck, Chromolith Performance RP-18e (4.6×100mm)）、A溶液：5%アセトニトリル、0.1M TEAA, pH 7.0、B溶液：25%アセトニトリル, 0.1M TEAA、B%：0%→ 40%(10min, linear gradient)；60℃；2 ml/min；254 nm）にて精製し、目的物のピークを集めた。減圧下溶媒を留去後、水1mlに溶かし、（9.4 A260 units）。また、本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した（計算値：6214.11、測定値：6214.62）。
【０１２１】
本化合物の塩基配列は、human prothrombin gene（GenBank accession No.M17262 ）のヌクレオチド番号 26784-26803に相補的な配列である。
【０１２２】
（実施例２）
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-5Ce2p-Tp-Ttの合成
実施例２の化合物は、実施例１と同様に合成した（21 A260 units）。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した（計算値：6229.12、測定値：6229.21）。
【０１２３】
本化合物の塩基配列は、human prothrombin gene（GenBank accession No.M17262 ）のヌクレオチド番号 26784-26803であって、ヌクレオチド番号 26784がGからAに変異したものに相補的な配列である。
【０１２４】
（実施例３）
HO-Ap-Tp-Cp-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-5Ce2p-Ap-Ttの合成の合成
実施例３の化合物は、実施例１と同様に合成した（8.9 A260 units）。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した（計算値：8530.67、測定値：8530.75）。
【０１２５】
本化合物の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325 記載のヌクレオチド番号 60529-60556の配列であって、ヌクレオチド番号 60556のCがTになっている配列である。
【０１２６】
（実施例４）
HO-Ap-Tp-Cp-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-5Ce2p-Ap-Ctの合成の合成
実施例４の化合物は、実施例１と同様に合成した（10.1 A260 units）。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した（計算値：8515.66、測定値：8515.56）。
【０１２７】
本化合物の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325 記載のヌクレオチド番号 60529-60556の配列である。
【０１２８】
（参考例１）
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-Cp-Tp-Ct
参考例１の化合物は、核酸自動合成機を用いて常法により合成した。
【０１２９】
本化合物の塩基配列は、human prothrombin gene（GenBank accession No.M17262 ）のヌクレオチド番号 26784-26803に相補的な配列であり、配列表の配列番号１に示されている。
【０１３０】
（参考例２）
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-Cp-Tp-Tt
参考例２の化合物は、核酸自動合成機を用いて常法により合成した。
【０１３１】
本化合物の塩基配列は、human prothrombin gene（GenBank accession No.M17262 ）のヌクレオチド番号 26784-26803であって、ヌクレオチド番号 26784がGからAに変異したものに相補的な配列であリ、配列表の配列番号２に示されている。
【０１３２】
（参考例３）
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-Cp-Tp-Ce2tの合成
参考例３の化合物は、実施例１と同様に合成した（0.3 A260 units）。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例５（5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-4-N-ベンゾイルシチジン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）の化合物を用い、固相担体は、universal-Q 500 CPG(Glen Research製) 約0.1μmolを用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した（計算値：6200.08、測定値：6200.25）。
【０１３３】
本化合物の塩基配列は、human prothrombin gene（GenBank accession No.M17262 ）のヌクレオチド番号 26784-26803に相補的な配列である。
【０１３４】
（参考例４）
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-Cp-Tp-Te2tの合成
参考例４の化合物は、実施例１と同様に合成した（0.94 A260 units）。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例9（5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-5-メチルウリジン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）、の化合物を用い、固相担体は、universal-Q 500 CPG(Glen Research製) 約0.1μmolを用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した（計算値：6215.09、測定値：6215.06）。
【０１３５】
本化合物の塩基配列は、human prothrombin gene（GenBank accession No.M17262 ）のヌクレオチド番号 26784-26803であって、ヌクレオチド番号 26784がGからAに変異したものに相補的な配列である。
【０１３６】
（参考例５）
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-Cp-Te2p-Ctの合成
参考例5の化合物は、実施例１と同様に合成した（2.28 A260 units）。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例9（5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-5-メチルウリジン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）、の化合物を用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した（計算値：6200.08、測定値：6200.26）。
【０１３７】
本化合物の塩基配列は、human prothrombin gene（GenBank accession No.M17262 ）のヌクレオチド番号 26784-26803に相補的な配列である。
【０１３８】
（参考例6）
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-Cp-Te2p-Ttの合成
参考例6の化合物は、実施例１と同様に合成した（4.98 A260 units）。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例9（5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-5-メチルウリジン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）、の化合物を用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した（計算値：6215.09、測定値：6215.26）。
【０１３９】
本化合物の塩基配列は、human prothrombin gene（GenBank accession No.M17262 ）のヌクレオチド番号 26784-26803であって、ヌクレオチド番号 26784がGからAに変異したものに相補的な配列である。
【０１４０】
（参考例7）
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Ge2p-Cp-Tp-Ctの合成
参考例７の化合物は、実施例１と同様に合成した（4.32 A260 units）。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例27 (5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-2-N-イソブチリルグアノシン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、の化合物を用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した（計算値：6200.08、測定値：6199.95）。
【０１４１】
本化合物の塩基配列は、human prothrombin gene（GenBank accession No.M17262 ）のヌクレオチド番号 26784-26803に相補的な配列である。
【０１４２】
（参考例8）
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Ge2p-Cp-Tp-Ttの合成
参考例８の化合物は、実施例１と同様に合成した（8.0 A260 units）。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例27 (5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-2-N-イソブチリルグアノシン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、の化合物を用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した（計算値：6215.09、測定値：6215.06）。
【０１４３】
本化合物の塩基配列は、human prothrombin gene（GenBank accession No.M17262 ）のヌクレオチド番号 26784-26803であって、ヌクレオチド番号 26784がGからAに変異したものに相補的な配列である。
【０１４４】
（参考例9）
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-Ce1p-Tp-Ctの合成
参考例9の化合物は、実施例１と同様に合成した（13.28 A260 units）。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、文献Tetrahedron (1998) 54, 3607-3630. 記載の5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-メチレン-4-N-ベンゾイルシチジン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、の化合物（Ce1p）を用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した（計算値：6186.05、測定値：6186.45）。
【０１４５】
本化合物の塩基配列は、human prothrombin gene（GenBank accession No.M17262 ）のヌクレオチド番号 26784-26803に相補的な配列である。
【０１４６】
（参考例10）
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-Ce1p-Tp-Ttの合成
参考例10の化合物は、実施例１と同様に合成した（8.0 A260 units）。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、文献Tetrahedron (1998) 54, 3607-3630. 記載の5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-メチレン-4-N-ベンゾイルシチジン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、の化合物（Ce1p）を用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した（計算値：6201.07、測定値：6201.14）。
【０１４７】
本化合物の塩基配列は、human prothrombin gene（GenBank accession No.M17262 ）のヌクレオチド番号 26784-26803であって、ヌクレオチド番号 26784がGからAに変異したものに相補的な配列である。
【０１４８】
（参考例１１）
HO-Ap-Tp-Cp-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Ttの合成
参考例１１の化合物は、核酸自動合成機を用いて常法により合成した。
【０１４９】
本化合物の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325 記載のヌクレオチド番号 60529-60556の配列であって、ヌクレオチド番号 60556のCがTになっている配列であり、配列表の配列番号３に示されている。
【０１５０】
（参考例１２）
HO-Ap-Tp-Cp-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Ctの合成
参考例１２の化合物は、核酸自動合成機を用いて常法により合成した。
【０１５１】
本化合物の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325 記載のヌクレオチド番号 60529-60556の配列であり、配列表の配列番号４に示されている。
【０１５２】
（参考例１３）
HO-Ap-Tp-Cp-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Te2tの合成
参考例１３の化合物は、実施例１と同様に合成した（7.8 A260 units）。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例9（5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-5-メチルウリジン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）の化合物を用い、固相担体は、universal-Q 500 CPG(Glen Research製) 約0.1μmolを用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した（計算値：8516.64、測定値：8515.88）。
【０１５３】
本化合物の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325 記載のヌクレオチド番号 60529-60556の配列であって、ヌクレオチド番号 60556のCがTになっている配列である。
【０１５４】
（参考例１４）
HO-Ap-Tp-Cp-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-5Ce2tの合成
参考例１４の化合物は、実施例１と同様に合成した（7.4 A260 units）。但し、固相担体は、universal-Q 500 CPG(Glen Research製) 約0.1μmolを用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した（計算値：8516.66、測定値：8516.00）。
【０１５５】
本化合物の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325 記載のヌクレオチド番号 60529-60556の配列である。
【０１５６】
（参考例１５）
HO-Ap-Tp-Cp-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ae2p-Ttの合成
参考例１５の化合物は、実施例１と同様に合成した（8.4 A260 units）。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例14(5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-6-N-ベンゾイルアデノシン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)の化合物を用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した（計算値：8516.64、測定値：8516.32）。
【０１５７】
本化合物の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325 記載のヌクレオチド番号 60529-60556の配列であって、ヌクレオチド番号 60556のCがTになっている配列である。
【０１５８】
（参考例１６）
HO-Ap-Tp-Cp-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ae2p-Ctの合成
参考例１６の化合物は、実施例１と同様に合成した（7.9 A260 units）。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例14(5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-6-N-ベンゾイルアデノシン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)の化合物を用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した（計算値：8501.63、測定値：8500.70）。
【０１５９】
本化合物の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325 記載のヌクレオチド番号 60529-60556の配列である。
【０１６０】
（参考例１７）
HO-Ap-Tp-Cp-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ae2p-Cp-Ap-Ttの合成
参考例１７の化合物は、実施例１と同様に合成した（9.7 A260 units）。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例14(5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-6-N-ベンゾイルアデノシン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)の化合物を用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した（計算値：8516.64、測定値：8517.14）。
【０１６１】
本化合物の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325 記載のヌクレオチド番号 60529-60556の配列であって、ヌクレオチド番号 60556のCがTになっている配列である。
【０１６２】
（参考例１８）
HO-Ap-Tp-Cp-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ae2p-Cp-Ap-Ctの合成
参考例１８の化合物は、実施例１と同様に合成した（7.2 A260 units）。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例14(5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-6-N-ベンゾイルアデノシン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)の化合物を用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した（計算値：8501.63、測定値：8501.65）。
【０１６３】
本化合物の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325 記載のヌクレオチド番号 60529-60556の配列である。
【０１６４】
（試験例１）  Human prothrombin geneのSNPの検出 
human prothrombin gene (coagulation factor II), GenBank accession No. M17262)のSNP（F2 20210G-A）の検出のために、Reverse primer, Human DNAは、Proligo社のTrueSNP  Demo  Kitを同プロトコールに従って調製したものを使用した。Reverse primerのヌクレオチド配列はGenBank accession No.M17262 ）のヌクレオチド番号  ２６５８８−２６６０５に相当し、以下のとおりである。
5'−GGGTGAAGGCTGTGACCG-3'（配列表の配列番号５）
Forward primerとして実施例１、実施例２、参考例１、参考例２、参考例３、参考例４、参考例５、参考例６、参考例７及び参考例８のいずれかに記載の化合物(1.25 μM) 5 μL、Reverse primer 1.3μL、Premix Taq(宝酒造製)12.5 μL、Human DNA溶液1 μL、滅菌水5.2 μLを含む溶液をTakara PCR Thermal Cycler PERSONAL (TP240)を使って、PCR反応(Hot Start法)を行った。反応サイクルは、94℃ 10分間の処理の後、94℃ 1分、63℃ 1分、72℃ 1分、の反応を31サイクル繰り返した。反応後、反応液5 μLに1 μLのloading solutionを加え、10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動（1xTBE, 200V定電圧, 約1時間）を行い、SYBR Green I (Cambrex社製)で染色後、Molecular Imager FX Fluoresent Imager system (Bio-Rad)を用いバンドを可視化し、Quantity One software (Bio-Rad)を使って定量した。
【０１６５】
その結果を図５に示す。ENAユニットを3’末端から3番目に導入した化合物をForwardprimerに用いた場合では、実施例１に記載の化合物では目的の遺伝子(216 bp)の増幅が確認できたのに対し、実施例２に記載の化合物では目的の遺伝子(216 bp)の増幅が確認できなかった。一方、天然型のオリゴヌクレオチドである参考例１及び参考例２に記載の化合物をForward primerに用いた場合では、参考例１に記載の化合物だけではなく、参考例２に記載の化合物でも遺伝子の増幅が確認され、ミスマッチによる遺伝子の増幅が起きていた。また、ＥＮＡユニットを3’末端に導入した参考例３及び４の化合物、並びに、ＥＮＡユニットを3’末端から２番目に導入した参考例５及び６の化合物では目的のバンドの増幅は確認できなかった。このことからENAユニットを3’末端から3番目に導入した化合物をプライマーに用いるとミスマッチがほとんどなく選択的な遺伝子(216 bp)の増幅ができることがわかった。
【０１６６】
また、図６においては、Premix Taq(宝酒造製)のかわりに、Premix EX Taq(宝酒造製)を用いた例を示す。この場合においても、ENAユニットを3’末端から3番目に導入したプライマーにおいてミスマッチがほとんど起こらず、実施例1のプライマーを用いたものが、最も効率的に、かつ、選択的に遺伝子が増幅された。
【０１６７】
検出されたバンドの蛍光強度を数値化し、図７のようにプロットした。参考例9、10に記載の化合物は、LNAユニットを3’末端から3番目に導入した場合であり、参考例１０の化合物をForward primerに用いた場合、ミスマッチによる遺伝子の増幅が15%見られたのに対し、ENAユニットを3’末端から3番目に導入した、実施例2の化合物をForward primerに用いた場合では、ミスマッチによる遺伝子の増幅が6%に過ぎず、ENA体がミスマッチが少なく選択性が高いことが明らかになった。
【０１６８】
（試験例２）  アンジオポエチン関連３（Angiopoietin-like 3）遺伝子プロモーター内の多型の検出
（１）マウスゲノムＤＮＡの調製
マウスAKR strain、KKマウスNga strain及び KKマウスSnk strainのマウス（４週齢）より採取した尾（１．５ｃｍ）を８４０μｌの溶解液（７２０μｌの１×ＳＳＣ、８０μｌの１０％  ＳＤＳ、４０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  プロテイナーゼＫを含む）に浸漬し、５０℃で保温しながら一晩振盪した。次いで、１ｍｇ／ｍｌ  リボヌクレアーゼＡを２０μｌ加えて、５０℃で１時間保温した。その後、フェノール・クロロホルム抽出を２回、エタノール沈殿操作を１回行い、沈殿を１０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液１５０μｌに溶解した。溶液を分光光度計（Ｕ−３０００、（株）日立製作所製）で２６０ｎｍ波長における吸光度を測定し、滅菌水を加えて濃度を２５ｎｇ／μｌに調整してゲノムＤＮＡ試料とした。
【０１６９】
（２）ＰＣＲ
Angiopoietin-like protein 3遺伝子プロモーター内の多型は、direct sequenceの結果から、図８のような多型を持つ。図８では、マウスKK/Nga strain、KK/Snk strainと比べてマウスAKR  strainでは「：」で示す２塩基（ＣＡ）が欠失している多型を有することを示している。
ＰＣＲにおけるReverse primerは以下の配列：
5’-GTCACTAGACTACTGCTTACTGTCC-3’（配列表の配列番号６）
（本化合物の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325 記載のヌクレオチド番号 60658-60682に相補的な配列である）のものを用いた。Forward primerとして実施例3、実施例4、参考例11、参考例12、参考例13、参考例14、参考例15、参考例16、参考例17及び参考例18のいずれかに記載の化合物(1.25 μM) 5 μL、Reverse primer (1.25 μM) 5μL、Premix Taq(宝酒造製)12.5 μL、ゲノム DNA溶液(100 ng/1μL) 0.125 μL、滅菌水2.38 μLの溶液を、Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL (TP240)を使って、PCR反応（Hot Start法）を行った。反応サイクルは、94℃ 10分間の熱処理後、94℃ 分、63℃ 1分、72℃ 1分のサイクルを30サイクル繰り返した。反応後、反応液5 μLに1 μLのloading solutionを加え、10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動（1xTBE, 200V定電圧, 約1時間）を行い、SYBR Green I (Cambrex社製)で染色後、Molecular Imager FX Fluoresent Imager system (Bio-Rad)を用い可視化した。
【０１７０】
（３）結果
マウスAKR strain由来のゲノムDNA（AKR）を鋳型として用いた結果を図９−Ａに示す。ENAユニットを3’末端から3番目に導入した実施例3及び4に記載の化合物において、実施例３の化合物をforward primerに用いたものが、選択的に遺伝子（152 bp）を増幅できることがわかった。
【０１７１】
KKマウスNga strain由来のゲノムDNA（KK/Nga）を鋳型に用いた場合を図９−Ｂに示す。ENAユニットを3’末端から3番目に導入した実施例3及び4に記載の化合物において、実施例４に記載の化合物をForward primerに用いたものが、最も効率的に、かつ、選択的に遺伝子(154bp)を増幅できることがわかった。
【０１７２】
図１０に、実施例３及び４に記載の化合物のいずれかをForward primerとして用い、AKRのゲノムＤＮＡ、KK/NgaのゲノムＤＮＡ 、 KKマウスSnk strain (KK/Snk)のゲノムＤＮＡ、並びに、AKRとKK/NgaのゲノムDNAを等量づつ混ぜたDNA（Mix）を鋳型としたＰＣＲの結果を示した。図１０Ａに示したように、AKRでは実施例３に記載の化合物をForward primerとして用いたもので選択的な遺伝子の増幅が確認され、またKK/Nga, KK/Snkでは実施例４に記載の化合物をForward primerとして用いたもので選択的な遺伝子の増幅が確認された。Mixでは、実施例３及び４に記載のいずれの化合物をForward primerとして用いた場合にも遺伝子の増幅が確認され、多型がヘテロである場合でも、見分けがつくことが示された。また、図１０Ｂに示したように、すべてが天然型DNAプライマーである参考例11及び12に記載の化合物をForward primerとして用いた場合、目的のバンドの増幅以外に副生成物が見られ、ENAユニットを3’末端から3番目に導入した実施例3及び4に記載の化合物の組み合わせの方が遺伝子多型検出に優れていることがわかった。
【０１７３】
（実施例５）
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ge2p-Tp-Gt
の合成
核酸自動合成機（パーキンエルマー社製 ABI model 394 DNA/RNA synthesizer）を用い、40 nmolのプログラムで
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ge2p-Tp-Gtを合成した（以下、「プライマーＡ」とする。各合成サイクルにおける溶媒、試薬、ホスホロアミダイトの濃度は天然オリゴヌクレオチド合成の場合と同じものを用いた。CPGは、約0.1μmol用いた。非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例27 (5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-2-N-イソブチリルグアノシン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)の化合物を用いた。目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を濃アンモニア水で処理することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン原子上の保護基シアノエチル基と核酸塩基上の保護基をはずした。溶媒を減圧下留去し、残った残渣を逆相ＨＰＬＣ（島津製作所製LC−10VP、カラム（Merck, Chromolith Performance RP-18e (4.6×100mm)）、A溶液：5%アセトニトリル、0.1M酢酸トリエチルアミン水溶液(TEAA), pH 7.0、B溶液：アセトニトリル、B%：10%→ 50%(10min, linear gradient)；60℃；2 ml/min；254 nm）にて精製し、 ジメトキシトリチル基を有する目的物のピークを集めた。水を加え、減圧下留去することで、TEAAを除いた。80%酢酸水溶液（200μl）を加え、20分放置することで、ジメトキシトリチル基の脱保護を行った。溶媒を留去したのち逆相ＨＰＬＣ（島津製作所製LC−10VP、カラム（Merck, Chromolith Performance RP-18e (4.6×100mm)）、A溶液：5%アセトニトリル、0.1M TEAA, pH 7.0、B溶液：25%アセトニトリル, 0.1M TEAA、B%：0%→ 40%(10min, linear gradient)；60℃；2 ml/min；254 nm）にて精製し、目的物のピークを集めた。減圧下溶媒を留去後、水1mlに溶かし、MALDI-TOF質量分析により同定した（計算値：7625.0、測定値：7624.1）。
【０１７４】
本化合物（プライマーＡ）の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325.14 記載のヌクレオチド番号 60499-60523の配列であって、ヌクレオチド番号 60522のCがTであって、ヌクレオチド番号 60523のAがGになっている配列である。
【０１７５】
（実施例６）
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ge2p-Tp-At
の合成
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ge2p-Tp-At
（以下「プライマーＢ」とする。）を、実施例５と同様の方法で合成し、MALDI-TOF質量分析により同定した（計算値：7609.0、測定値：7609.2）。
【０１７６】
本化合物（プライマーＢ）の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325.14 記載のヌクレオチド番号 60499-60523の配列であって、ヌクレオチド番号 60522のCがTになっている配列である。
【０１７７】
（実施例７）
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ge2p-Gp-Gt
の合成
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ge2p-Gp-Gt
（以下、「プライマーＣ」とする。）を、実施例１と同様の方法で合成し、MALDI-TOF質量分析により同定した（計算値：7650.0、測定値：7649.4）。
【０１７８】
本化合物（プライマーＣ）の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325.14 記載のヌクレオチド番号 60499-60523の配列であって、ヌクレオチド番号 60522のCがGであって、ヌクレオチド番号 60523のAがGになっている配列である。
【０１７９】
（実施例８）
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ge2p-Gp-At
の合成
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ge2p-Gp-At（以下、「プライマーＤ」とする。）を、実施例５と同様の方法により合成し、MALDI-TOF質量分析により同定した（計算値：7634.1、測定値：7634.2）。
【０１８０】
本化合物（プライマーＤ）の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325.14 記載のヌクレオチド番号 60499-60523の配列であって、ヌクレオチド番号 60522のCがGになっている配列である。
【０１８１】
（参考例１９）
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Gt
の合成
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Gt
（以下、「プライマーＥ」とする。）を核酸自動合成機を用いて常法により合成した。本化合物（プライマーＥ）の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325.14 記載のヌクレオチド番号 60499-60523の配列であって、ヌクレオチド番号 60522のCがTであって、ヌクレオチド番号 60523のAがGになっている配列であり、配列表の配列番号７に示されている。
【０１８２】
（参考例２０）
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Atの合成
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-At（以下、「プライマーＦ」とする。）を核酸自動合成機を用いて常法により合成した。本化合物（プライマーＦ）の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325.14 記載のヌクレオチド番号 60499-60523の配列であって、ヌクレオチド番号 60522のCがTになっている配列であり、配列表の配列番号８に示されている。
【０１８３】
（参考例２１）
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Gp-Gp-Gtの合成
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Gp-Gp-Gt本（以下、「プライマーＧ」とする。）は核酸自動合成機を用いて常法により合成した。
【０１８４】
プライマーＧの塩基配列は、GenBank accession No.AL935325.14 記載のヌクレオチド番号 60499-60523の配列であって、ヌクレオチド番号 60522のCがGであって、ヌクレオチド番号 60523のAがGになっている配列であり、配列表の配列番号９に示されている。
【０１８５】
（参考例２２）
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Gp-Gp-At
の合成
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Gp-Gp-At本（以下、「プライマーＨ」とする。）を核酸自動合成機を用いて常法により合成した。
【０１８６】
プライマーＨの塩基配列は、GenBank accession No.AL935325.14 記載のヌクレオチド番号 60499-60523の配列であって、ヌクレオチド番号 60522のCがGになっている配列であり、配列表の配列番号１０に示されている。
【０１８７】
（試験例３）  アンジオポエチン関連３（Angiopoietin-like 3）遺伝子プロモーター内のSNPの検出
マウスAKR 系統（strain）及びKKマウスNga 系統（strain）由来マウス（４週齢）より採取した尾（１．５ｃｍ）を８４０μｌの溶解液（７２０μｌの１×ＳＳＣ、８０μｌの１０％  ＳＤＳ、４０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  プロテイナーゼＫを含む）に浸漬し、５０℃で保温しながら一晩振盪した。次いで、１ｍｇ／ｍｌ  リボヌクレアーゼＡを２０μｌ加えて、５０℃で１時間保温した。その後、フェノール・クロロホルム抽出を２回、エタノール沈殿操作を１回行い、沈殿を１０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液１５０μｌに溶解した。その後、分光光度計（Ｕ−３０００、（株）日立製作所製）で２６０ｎｍ波長における吸光度を測定し、滅菌水を加えて濃度を２５ｎｇ／μｌに調整してゲノムＤＮＡ試料とした。
【０１８８】
Angiopoietin-like 3遺伝子プロモーター内のSNPは、direct sequenceの結果から、図１１のようなSNPを持つ。
【０１８９】
リバース・プライマー（Reverse primer）のヌクレオチド配列は：
5’-GTCACTAGACTACTGCTTACTGTCC-3’（配列表の配列番号６）、
（本化合物の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325 記載のヌクレオチド番号 60658-60682に相補的な配列である。）である。
【０１９０】
Premix Taq(宝酒造製)12.5 μL、ゲノム DNA溶液(100 ng/1μL) 0.125 μL、リバース・プライマー(1.25 μM) 5μL、滅菌水2.38 μL、フォワード・プライマー（forward primer）として実施例または、参考例に記載の化合物（プライマーＡ、プライマーＢ、プライマーＣ、プライマーＤ、プライマーＥ、プライマーＦ、プライマーＧ及びプライマーＨ）(1.25 μM)を5 μLになるように調製し、Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL (TP240)を使って、PCR反応（Hot Start法）を行った。反応サイクルは、94℃、10分後、94℃ 1分、63℃ 1分、72℃ 1分、これを30サイクル繰り返した。
【０１９１】
反応後、反応液5 μLに1 μLの添加液（loading solution）を加え、10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動（1xTBE, 200V定電圧, 約1時間）を行い、SYBR Green I (Cambrex社製)で染色後、Molecular Imager FX Fluoresent Imager system (Bio-Rad)を用い可視化した。
【０１９２】
ＰＣＲ反応が正確に行われた場合、マウスAKR 系統（strain）由来のゲノムDNA（AKR）を用いた場合、選択的に遺伝子（182 bp）が増幅され、KKマウスNga 系統（strain）由来のゲノムDNA（KK/Nga）を用いた場合、選択的に遺伝子（184 bp）が増幅されると予想された。
【０１９３】
結果を図１２に示す。プライマーＥ又はプライマーＦをフォワード・プライマーとしてＰＣＲを行ったところ、マウスAKR 系統由来のゲノムＤＮＡでは、プライマーＥをプライマーとして用いた場合に遺伝子の増幅が確認された。一方、KKマウスNga 系統由来のゲノムＤＮＡにおいては、プライマーＦをプライマーとして用いた場合及びプライマーＥをプライマーとして用いた場合の両方で遺伝子の増幅が観察された。
【０１９４】
またプライマーＡ又はプライマーＢをプライマーとしてＰＣＲを行ったところ、マウスAKR 系統由来のゲノムＤＮＡでは、プライマーＡをプライマーとして用いた場合に遺伝子が増幅され、KKマウスNga 系統由来のゲノムＤＮＡにおいては、プライマーＢをプライマーとして用いた場合に遺伝子の増幅が観察された。
【０１９５】
プライマーＧ又はプライマーＨをプライマーとして用いた場合、マウスAKR 系統由来のゲノムＤＮＡでは、プライマーＧをプライマーとして用いた場合に目的の遺伝子産物が増幅されたが、プライマーＨをプライマーとした場合には、目的の大きさより小さい副生成物と考えられる増幅産物が得られた。また、KKマウスNga 系統由来のゲノムＤＮＡにおいては、プライマーＨをプライマーとした場合には、目的の遺伝子産物だけでなく、目的よりも小さい鎖長を持つ副生成物と考えられる増幅産物が得られた。
【０１９６】
プライマーＣ又はプライマーＤをプライマーとして用いた場合、マウスAKR 系統由来のゲノムＤＮＡでは、プライマーＣをプライマーとして用いた場合に遺伝子が増幅され、さらに、KKマウスNga 系統由来のゲノムＤＮＡにおいては、プライマーＤをプライマーとして用いた場合に遺伝子の増幅が観察された。
【０１９７】
以上のことからENAユニットを3’末端から3番目に導入したプライマーを用いることにより、ＥＮＡユニットを導入していない、従来のプライマーと比べて検出効率が向上することが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１９８】
本発明の方法により、遺伝子多型の検出が可能となる。また、本発明の遺伝子多型の検出方法を用いることにより、天然型のオリゴヌクレオチドを用いる場合に比べより正確に多型を検出できるようになる。
【０１９９】
また、該方法に用いることができる、遺伝子多型の検出用オリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドを含有する遺伝子多型の検出用キットによって、種々の遺伝子多型を検出できる。本発明は、医療、農業、食品、工業等の種々の産業に利用することができるが、遺伝子多型の検出を必要とする限りにおいて産業分野は制限されない。
【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１】遺伝子多型の検出方法の原理を示す図であり、多型がない場合を示す。
【図２】遺伝子多型の検出方法の原理を示す図であり、多型がある場合を示す。
【図３】遺伝子多型の検出方法の原理を示す図であり、多型がない場合を示す。
【図４】遺伝子多型の検出方法の原理を示す図であり、多型がある場合を示す。
【図５】Premix Taqを用いて各種プライマーを用いたＰＣＲの結果を示す図である。
【図６】Premix EX Taqを用いて各種プライマーを用いたＰＣＲの結果を示す図である。
【図７】ＰＣＲによって検出されたバンドの蛍光強度を数値化した図である。
【図８】アンジオポエチン関連３遺伝子プロモーター内の多型を示す図である。
【図９】図９−ＡはマウスAKR strain由来のゲノムDNA（AKR）を鋳型としたＰＣＲの結果を示す図である。図９−ＢはKKマウスNga strain由来のゲノムDNA（KK/Nga）を鋳型としたＰＣＲの結果を示す図である。
【図１０】AKRのゲノムＤＮＡ、KK/NgaのゲノムＤＮＡ 、 KKマウスSnk strain (KK/Snk)のゲノムＤＮＡ、並びに、AKRとKK/NgaのゲノムDNAを等量づつ混ぜたDNAを鋳型としたＰＣＲの結果を示す図である。
【図１１】アンジオポエチン関連３遺伝子プロモーター内の多型を示す図である。
【図１２】Premix Taqを用いて各種プライマーを用いたＰＣＲの結果を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０２０１】
配列番号７：プライマーＥ
配列番号８：プライマーＦ
配列番号９：プライマーＧ
配列番号１０：プライマーＨ
【図１】
2005323583.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2005323583.tif 000011
【図９】
2005323583.tif 000012
【図１０】
2005323583.tif 000013
【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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