(57)【要約】【課題】  励起光と蛍光との波長域の差にかかわらず高いＳ／Ｎ比が得られ、特に微小な被検体を用いるマイクロ分析に適した蛍光検出装置を提供することを課題とする。  また、複数の被検体を一度に測定できる、多チャンネル型の蛍光検出装置を提供する。【解決手段】  レーザー光を発する光源１０と、照射光学系２０と、通過孔３０ａを有する孔明きミラー３０と、検出光学系５０と、検出器６０とを備える。また、照射光学系２０は、スキャニング鏡２３とリレーレンズ２６とを備える。  スキャニング鏡２３によって反射されたレーザー光は、リレーレンズ２６により孔明きミラー３０の通過孔３０ａで結像した後、試料ステージ４２上の各測定部に入射し被検体から蛍光が発せられる。被検体から発せられた蛍光は、孔明きミラー３０によって反射され、検出光学系５０を経て検出器６０に至る。【選択図】  図１
2005214896.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザー光を発する光源と、光源から発せられるレーザー光を被検体の方向に出射する照射光学系と、
通過孔を有し、その通過孔を照射光学系から出射されるレーザー光が通過するように該レーザー光の光路上に斜めに配置された孔明きミラーと、
孔明きミラーを通過したレーザー光により被検体から発生する蛍光が、孔明きミラーに反射した後に入射する検出光学系と、
検出光学系から出射する蛍光を検出する検出器とを備える蛍光検出装置。
【請求項２】
孔あきミラーの通過孔が、該孔明きミラーのミラー面に対して斜めに形成されている請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
照射光学系が、回転によりレーザー光の反射角度を変化させるスキャニング鏡と、該スキャニング鏡によって反射されたレーザー光を孔明きミラーの通過孔で結像させるリレーレンズとを有する請求項１又は請求項２に記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
孔明きミラーと被検体との間に、孔明きミラーを通過したレーザー光を被検体に対して垂直に入射させる対物レンズを有する請求項１から請求項３の何れかに記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
光源が、ＹＡＧレーザー又は小型ダイオード励起固体レーザーを発振器とする光源である請求項１から請求項４の何れかに記載の蛍光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光から励起光を充分に排除することにより、高いＳ／Ｎ比が得られる蛍光検出装置に関する。さらに詳しくは、励起光と蛍光との波長域の差にかかわらず高いＳ／Ｎ比が得られ、特に微量の被検体を用いるマイクロ分析に適した蛍光検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、蛍光検出装置は、医学や生物学等の分野において生物組織や細胞上で蛍光標識したタンパク質や遺伝子を検出する目的で広く使用されている。特に、近年では一分子の蛍光色素を検出する超微弱蛍光観察も行われつつあり、検出信号について高いＳ／Ｎ比が求められている。
【０００３】
蛍光検出装置として従来周知の落射蛍光顕微鏡は、励起光源、コレクターレンズ、開口・視野絞り、励起フィルタ、ダイクロイックミラー、対物レンズ、試料、対物レンズ、吸収フィルタ、ビームスプリッタ、撮影レンズ、観察光学系から構成されている（例えば、特許文献１参照。）。なお、光源は励起フィルタで必要な励起波長のみに強い強度を有する光束に変換されるが、光源としてレーザーを使用した場合には励起フィルタを必要としない。
励起フィルタを通過した光速はダイクロイックミラーで反射され対物レンズを通過して試料に照射されるようになっている。そして、試料から発した蛍光は、対物レンズを介してダイクロイックミラーを通過し、吸収フィルタで不要な蛍光波長帯を取り除かれた後、ビームスプリッタにより撮影レンズと観察光学系へと導かれるようになっている。
【特許文献１】特開平１１−３５２４０９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、このように、ダイクロイックミラーを使用できるのは、励起光と蛍光との波長域が大きく異なる場合に限られる。
ところが、例えば、アンプレックスレッドは抗体を標識化した酵素でレゾルフィンに分解される。このレゾルフィンに、ＹＡＧレーザー（イットリウムアルミニウムガーネットに、Nd３＋を微量加えた単結晶を素子とするレーザー）を発振器とし、その２倍波である５３２ｎｍのレーザー光を照射すると、５８０ｎｍに最大強度を有する蛍光を発する。この場合、励起光の波長域（５３２ｎｍ）と蛍光の波長域（５８０ｎｍ）とが近接している。
そのため、従来から使用されているダイクロイックミラーでは分離不能であり、高いＳ／Ｎ比で蛍光を検出することが困難であった。
【０００５】
また、医学や生物学等の分野では、いわゆるバイオ分析（生物反応分析）を利用することが多い。このバイオ分析は、化学反応分析に比べて反応に時間がかかる一方で、反応媒体として使用する抗体や酵素などが経時的に活性劣化しやすい。
そのため、特許文献１のように、1チャンネルだけで標準液校正や試料測定を行うと、標準液校正時と試料測定時とで抗体や酵素などの活性劣化の度合いが異なり、測定精度が悪くなる恐れがあった。
そのため、本件発明者らは、試料液と標準液等の複数の被検体を一度に測定できる、多チャンネル型の蛍光検出器とすることを検討した。
【０００６】
さらに、近年医学や生物学等の分野では、分析装置のマイクロ化が進んでいる。そのため、微小な被検体に正確にレーザーを照射するためには、光源から被検体に至る光学系を精密に組む必要がある。
ところが、従来一般に使用されているアルゴンイオンレーザーやヘリカドレーザー等は大型の装置であるため、マイクロ化された分析チップと同じ台にセットすることができない。そのため、光源側の光学系と分析チップ側の光学系とが各々精密に調整されていても、両者の位置合わせを精密にしないと、照射光路がずれてしまうという問題があった。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、励起光と蛍光との波長域の差にかかわらず高いＳ／Ｎ比が得られる蛍光検出装置を提供することを課題とする。また、複数の被検体を一度に測定できる、多チャンネル型の蛍光検出装置を提供することを課題とする。さらに、光軸合わせが容易で、微小な被検体を用いるマイクロ分析の場合に適した蛍光検出装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］レーザー光を発する光源と、光源から発せられるレーザー光を被検体の方向に出射する照射光学系と、
通過孔を有し、その通過孔を照射光学系から出射されるレーザー光が通過するように該レーザー光の光路上に斜めに配置された孔明きミラーと、
孔明きミラーを通過したレーザー光により被検体から発生する蛍光が、孔明きミラーに反射した後に入射する検出光学系と、
検出光学系から出射する蛍光を検出する検出器とを備える蛍光検出装置。
【０００９】
［２］孔あきミラーの通過孔が、該孔明きミラーのミラー面に対して斜めに形成されている［１］に記載の蛍光検出装置。
［３］照射光学系が、回転によりレーザー光の反射角度を変化させるスキャニング鏡と、該スキャニング鏡によって反射されたレーザー光を孔明きミラーの通過孔で結像させるリレーレンズとを有する［１］又は［２］に記載の蛍光検出装置。
［４］孔明きミラーと被検体との間に、孔明きミラーを通過したレーザー光を被検体に対して垂直に入射させる対物レンズを有する［１］〜［３］の何れかに記載の蛍光検出装置。
［５］光源が、ＹＡＧレーザー又は小型ダイオード励起固体レーザーを発振器とする光源である［１］〜［４］の何れかに記載の蛍光検出装置。
【発明の効果】
【００１０】
［１］の態様の発明によれば、ビーム状のレーザー光が孔明きミラーの通過孔を通過して被検体に到達するのに対して、被検体から発せられる蛍光はビーム状ではないので、大部分が孔明きミラーで反射される。そのため、励起光であるレーザー光と蛍光との波長域にかかわらず、両者を充分に分離できる。
【００１１】
［２］の態様の発明によれば、通過孔がミラー面に対して斜めに形成されているので、通過孔の中心軸とレーザー光の光軸とを併せやすくなる。そのため、通過孔の口径を小さくすることができ、孔明きミラーによって、蛍光のほとんどを損失なく反射することが可能となる。
【００１２】
［３］の態様の発明によれば、スキャニング鏡を備えることにより、複数の被検体の蛍光検出を、同時平行的に行うことができる。そのため、複数の被検体の測定を短時間で行うことが可能である。
また、リレーレンズにより、スキャニング鏡の回転角度にかかわらずミラーの通過孔内で結像させる。そのため、孔明きミラーの通過孔の口径を小さくすることができ、孔明きミラーによって、蛍光のほとんどを損失なく反射することが可能となる。
したがって、特に経時変化しやすい試薬を用いる分析において、測定精度の向上がもたらされる。
【００１３】
［４］の態様の発明によれば、対物レンズによって、レーザー光を、孔明きミラーの通過孔を通過する際の角度にかかわらず、被検体に対して垂直に入射させる。これにより、被検体で反射したレーザー光のほとんどが対物レンズを介して通過孔に戻るので、検出光学系に入射するレーザー光を大幅に減少させることができる。
【００１４】
［５］の態様の発明によれば、光源に小型のＹＡＧレーザー又は小型ダイオード励起固体レーザーを用いるので、マイクロ化された分析チップと同じ台にセットすることが可能である。そのため光軸合わせが容易で微小な被検体に正確にレーザーを照射することができる。
【００１５】
したがって、本発明によれば、励起光と蛍光との波長域の差にかかわらず高いＳ／Ｎ比が得られる。また、試料液と標準液とを一度に測定できる多チャンネル型の蛍光検出装置とすることも可能である。
そのため、本発明の蛍光検出器は、特に微小な被検体、とりわけ生物反応によって得られる被検体を用いるマイクロ分析に適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の１実施形態に係る蛍光検出装置を図１から図３を用いて説明する。なお、本発明は以下に説明する実施形態に限定されるものではない。特に寸法等の具体的数値は、本実施形態をできるだけ具体的に説明するために一例として記載したものにすぎない。
【００１７】
図１に示すように、本実施形態の蛍光検出装置は、光源１０と、照射光学系２０と、孔明きミラー３０と、試料部４０と、検出光学系５０と、検出器６０と、これらが取り付けられた載置台７０とから概略構成されている。
【００１８】
本実施形態の光源１０は、ＹＡＧレーザーと光波長変換器とが組み合わされ、ＹＡＧレーザーの２倍波（５３２ｎｍ）のレーザー光を発するものである。
なお、本発明の光源はこれに限定されず、例えば、ＹＡＧレーザーの３倍波等ＹＡＧレーザーを発振器とする他の光源であってもよい。また、小型ダイオード励起固体レーザー、アルゴンイオンレーザー、エキシマレーザー、ヘリカドレーザー等、他のレーザーを発振器とする光源であってもよい。
【００１９】
照射光学系２０は、光軸指示用ピンホール２１、空間フィルタ２２、スキャニング鏡２３、スキャン域制限マスク２４、そしてこれらを光学的に結合するリレーレンズ２５、２６とを有している。
【００２０】
光軸指示用ピンホール２１は１ｍｍφのピンホールが設けられたものである。空間フィルタ２２は、０．１ｍｍの細孔が設けられたものである。
スキャニング鏡２３は、図２に示すように、鏡本体２３ａと、これを回転させる駆動部２３ｂとから構成されている。鏡本体２３ａは、駆動部２３ｂにより鏡の面中央を軸として回転するようになっている。なお、以後の説明の便宜上、スキャニング鏡２３がスキャン範囲の中央に調整されたときのレーザー光を中心光と称する。
スキャン域制限マスク２４は、レーザー光の光路を途中から１０ｍｍφのマスク孔の径に絞ったものである。スキャニング鏡２３によって、レーザー光をマスク孔を通過できる位置から大きく偏向させことにより、レーザー光が遮断されてバックグラウンドを測定できるようになっている。
リレーレンズ２５は一対のトリプレットレンズ２５ａ、２５ｂとから、リレーレンズ２６は一対のトリプレットレンズ２６ａ、２６ｂとから、各々構成されている。
【００２１】
孔明きミラー３０は、図１における下側がミラー面（反射面）とされている。図１に示すように、孔明きミラー３０は中心光の光軸に対して４５°の角度で設置される。この孔明きミラー３０は、図３に示すように、略円盤状のミラー中央に、孔径２ｍｍの通過孔３０ａがミラー面に対して４５°の角度をもって設けられている。その結果、通加孔３０ａの中心軸と中心光の光軸とが重なるようになっている。
なお、孔明きミラー３０の設置角度及び通過孔３０ａの角度は、いずれも４５゜に限られない。設置角度と通過孔３０ａの角度との関係は、通加孔３０ａの中心軸と中心光の光軸とが重なるように調整することが好ましい。
【００２２】
試料部４０は、テレセントリック型の対物レンズ４１と試料ステージ４２とを有している。試料ステージ４２上には、マイクロ化された分析チップが配置されるようになっている。本実施形態では、スキャニング鏡２３によるスキャン可能域を６ｍｍとした。
分析チップとしては、シリコン等に複数の測定部が形成されたものが用いられる。例えば、シリコン基板に、幅１ｍｍの溝からなる測定部が、０．５ｍｍの間隔を空けて４本形成された分析チップを用いることができる。この場合、全体で５．５ｍｍ幅の中に測定部が収まり、上記６ｍｍのスキャン可能域によってカバーできる。
【００２３】
被検体は、溶液中に含まれる蛍光物質でもよいが、測定精度を上げるためには、ビーズ等の固定層に固定された蛍光物質を被検体とすることが好ましい。
また、抗原抗体反応や抗体に標識した酵素の反応等の生物反応を利用して得られた蛍光物質を被検体とした場合、微量の測定対象物質を精度良く検出することが可能となり好ましい。例えば、ダイオキシンに蛋白質を結合させた複合体に、一次抗体、二次抗体を結合させ、その後蛍光発色剤を作用させることによって、測定対象物質であるダイオキシン類の濃度に応じた蛍光物質を得て、これを被検体とすることができる。
【００２４】
検出光学系５０は、アパーチャ５１、瞳絞り５２、レーザー光リジェクションフィルタ５３、カットフィルタ５４、そしてこれらを光学的に結合するリレーレンズ５５とを有している。
アパーチャ５１は、ラマン散乱光等の外乱光を除去するためのもので、１０ｍｍφの孔が設けられたものである。瞳絞り５２もノイズカット用に設けられたものである。本実施形態においては、瞳径１４ｍｍとされている。
【００２５】
レーザー光リジェクションフィルタ５３はレーザー光を除去するためのもので、除去波長532 nm、半値幅20 nmのノッチフィルタである。
カットフィルタ５４は、分析チップから発生するラマン散乱光（分析チップがシリコン製の場合、５２０ｃｍ−１のストークス線）を除去するためのもので、ロングパスフィルターあるいは干渉フィルタが用いられる。
リレーレンズ５５は一対のトリプレットレンズ５５ａ、５５ｂとから構成されている。
検出器６０は、光電子増倍管であり、本実施形態では、光電面有効エリア２５ｍｍのものが用いられている。
【００２６】
載置台７０は、足部７１と、この足部７１に立設された取付部７２とを有している。上述の光源１０、照射光学系２０、孔明きミラー３０、試料部４０、検出光学系５０、検出器６０は、いずれも載置台７０（主として取付部７２）に固定されているので、互いの位置関係がずれることがない。そのため、使用時の光路調整が容易となっている。
【００２７】
本実施形態の蛍光検出装置によれば、光源１０から発せられた５３２ｎｍのレーザー光は、光軸指示用ピンホール２１を通過した後、トリプレットレンズ２５ａにより空間フィルタ２２の細孔に集光される。このとき、外乱光は集光されないため、細孔を通過することができず除去される。
集光されたレーザー光は、トリプレットレンズ２５ｂにより平行光に戻された後、スキャニング鏡２３に入射する。このとき、光軸指示用ピンホール２１がスキャニング鏡２３の鏡面に結像する。
【００２８】
スキャニング鏡２３の鏡面で反射されてリレーレンズ２６に向かうレーザー光の光路は、スキャニング鏡２３のスキャン角度に応じて図中実線で示す範囲で変異する。その後レーザー光は、リレーレンズ２６のトリプレットレンズ２６ａで平行光となり、トリプレットレンズ２６ｂにより通過孔３０ａにおいて結像されて、これを通過する。
スキャニング範囲の全レーザー光を通過させることが可能な通過孔３０ａの孔径が最小となり、測定する蛍光の損失を最小限に抑えることが可能となる。
【００２９】
孔明きミラー３０を通過し、対物レンズ４１に入射されるレーザー光は、図中実線で示すように、スキャニング鏡２３のスキャン角度に応じて変異する。そして、対物レンズ４１によって、試料ステージ４２上の各測定部に垂直に入射される。
その後、試料ステージ４２から反射されたレーザー光は、そのほとんどが入射時の光路を逆に辿り、孔明きミラー３０の通過孔３０ａに戻る。そのため、検出光学系５０に入射するレーザー光を最小限に抑えることができる。
【００３０】
一方、入射されたレーザー光により試料ステージ４２上の各測定部の被検体から蛍光が発せられる。図１に破線で示すように、スキャン範囲の両端、及び中央に各々配置された被検体から発生する蛍光の光路は、各々広がりをもって対物レンズ４１に入射し、孔明きミラー３０に至る。そして、スキャン角度に応じた角度で孔明きミラー３０により反射されてリレーレンズ５５に入射する。
なお、試料ステージ４２上をスキャンするレーザー光の走査速度は、１０ｍｍ／秒とされている。この場合、例えば、各測定部間の間隔が０．５ｍｍであった場合、ある測定部への入射が終了してから、隣の測定部に入射されるまで５０ｍ秒を要することとなる。この時間は、蛍光寿命の長い被検体を考慮しても、残留蛍光の影響を排除するために充分なものである。
【００３１】
リレーレンズ５５のトリプレットレンズ５５ａに入射した蛍光は、アパーチャ５１において集光される。このとき、ラマン散乱光等の外乱光は集光されないため、アパーチャ５１の孔を通過することができず除去される。
集光された蛍光は、トリプレットレンズ５５ｂにより平行光に戻された後、瞳絞り５２に入射してその瞳を通過する。
そして、レーザー光リジェクションフィルタ５３によってレーザー光が、カットフィルタ５４によってラマン散乱光が、各々除去された後、検出器６０に入射して検出される。
本実施形態では、リレーレンズ５５によって、検出器６０の検出面において、１４ｍｍの範囲に焦点を合わせることができた。そのため、光電面有効エリア２５ｍｍの範囲に充分に入り、全スキャン範囲について、同一感度で検出が可能であった。
なお、光源１０からのレーザー光の照射及び検出器６０による検出は連続的であってもよいが、各測定部上をスキャンするタイミングと同期させて照射と検出とをおこなってもよい。
【００３２】
なお、本実施形態で用いたリレーレンズは、いずれも一対のトリプレットレンズで構成することとしたが、一対のアクロマティックレンズで構成してもよいし、異なる種類の複数レンズを組み合わせて構成してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の１実施形態に係る蛍光検出装置の正面図である。
【図２】本発明の１実施形態に係る蛍光検出装置の側面図である。
【図３】本発明の１実施形態に係る蛍光検出装置の孔明きミラー３０を示すものであり、（ａ）は縦断面図、（ｂ）は平面図である。
【符号の説明】
【００３４】
１０・・・・光源、２０・・・・照射光学系、３０・・・・孔明きミラー、４０・・・・試料部、
５０・・・・検出光学系、６０・・・・検出器、７０・・・・載置台
【図１】
2005214896.tif 000003
【図２】
2005214896.tif 000004
【図３】
2005214896.tif 000005