(57)【要約】 【課題】  タンパク質、核酸、糖鎖等の生理活性分子と標的分子との間の分子間相互作用を迅速かつ定量的に測定する方法を提供すること。【解決手段】  本発明の方法は、下記工程を有する、標的分子の分子間相互作用検出方法である。（ａ）分子中にフォトクロミック化合物を結合してなる物質と、標的分子とを接触させる工程；及び（ｂ）フォトクロミック化合物の光異性化速度定数を測定する工程；【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子中にフォトクロミック化合物を結合してなるペプチド誘導体。
【請求項２】
フォトクロミック化合物がスピロピランである、請求項１に記載のペプチド誘導体。
【請求項３】
固相に結合されている、請求項１又は２に記載のペプチド誘導体。
【請求項４】
下記工程を有する、標的分子の分子間相互作用検出方法。
（ａ）分子中にフォトクロミック化合物を結合してなる物質と、標的分子とを接触させる工程；及び
（ｂ）フォトクロミック化合物の光異性化速度定数を測定する工程；
【請求項５】
標的分子がタンパク質、核酸、糖鎖又は低分子化合物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
フォトクロミック化合物がスピロピランである、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
分子中にフォトクロミック化合物を結合してなる物質が、固相に固定化されている、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
下記工程を有する、標的分子の分子間相互作用検出方法。
（ａ）分子中にフォトクロミック化合物を結合してなるペプチド誘導体と、標的分子とを接触させる工程；及び
（ｂ）フォトクロミック化合物の光異性化速度定数を測定する工程；
【請求項９】
標的分子がタンパク質、核酸、糖鎖又は低分子化合物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
フォトクロミック化合物がスピロピランである、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
分子中にフォトクロミック化合物を結合してなるペプチド誘導体が、固相に固定化されている、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド誘導体、及び分子間相互作用検出方法に関するものである。本発明のペプチド誘導体は、分子間相互作用検出方法に用いられるものであり、本発明の分子間相互作用検出方法は、物質と標的分子との相互作用の検出を容易に行うことができる。
【背景技術】
【０００２】
今日においては、ヒトゲノムをはじめとし、１００種以上の生物ゲノムの解読が完了しているか、又は進行中である。ポストゲノム時代に突入した現在においては、膨大な遺伝情報が入手可能となってきている。ＤＮＡ→ＲＮＡ→タンパク質というセントラルドグマの原則に従い、全てのＤＮＡ、ＲＮＡとタンパク質を対応させ、それらの機能を解明し、応用技術へと導く技術が必要となる。ＤＮＡの発現量の指標とされるｍＲＮＡの発現量とタンパク質の存在量との間の相関は低いと考えられていることから、タンパク質を直接検出することのできる技術の開発が急務となっている。
【０００３】
今日においては、タンパク質を検出するための補足分子として、抗体、アプタマー、融合タンパク質、ファージディスプレイペプチド等が、また、検出方法としては、化学発光、蛍光、質量分析、表面プラズモン共鳴法等が利用されている。
例えば、補足分子として蛍光色素標識化されたペプチド群を用いることによって検体の標識化を回避することができ、またタンパク質との相互作用に基づく蛍光強度変化を「プロテインフィンガープリント」として既知のタンパク質のものと比較することにより、試料中のタンパク質の同定を容易に行なうことのできる技術が開示されている（Construction of a Protein-Detection System Using a Loop Peptide Library with a Fluorescence Label” M. Takahashi, K. Nokihara, H. Mihara Chem. Biol. 2003, 10, 53-60）。該文献に開示された方法は、簡便で高感度な方法であり、安価に実施できるというものであるが、蛍光物質が直接ペプチドに結合しているため、蛍光のバックグラウンドが比較的大きいという欠点があった。従って、ペプチドを標識する化合物の最適化が必要とされている。
【０００４】
【非特許文献１】Construction of a Protein-Detection System Using a Loop Peptide Library with a Fluorescence Label” M. Takahashi, K. Nokihara, H. Mihara Chem. Biol. 2003, 10, 53-60
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
いわゆるＤＮＡ−ＤＮＡ間の相互作用の検出とタンパク質チップにおけるタンパク質−タンパク質間の相互作用の検出との違いは、タンパク質相互作用の結合する度合いの程度の差が極めて大きくおよそ１０の４乗のオーダーの強度差を検出する必要がある。本発明は、このようなタンパク質、核酸、糖鎖等の生理活性分子と標的分子との間の分子間相互作用を迅速かつ定量的に測定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、フォトクロミック化合物を結合してなる物質を用いることにより、上記目的を達成し得るという知見を得た。また、本発明者らは、上記物質と標的分子とを接触させた時の光異性化速度定数の変化に着目し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、分子中にフォトクロミック化合物を結合してなるペプチド誘導体を提供するものである。
また、本発明は、下記工程を有する、標的分子の分子間相互作用検出方法を提供するものである。
（ａ）分子中にフォトクロミック化合物を結合してなる物質と、標的分子とを接触させる工程；及び
（ｂ）フォトクロミック化合物の光異性化速度定数を測定する工程；
また、本発明は、下記工程を有する、標的分子の分子間相互作用検出方法を提供するものである。
（ａ）分子中にフォトクロミック化合物を結合してなるペプチド誘導体と、標的分子とを接触させる工程；及び
（ｂ）フォトクロミック化合物の光異性化速度定数を測定する工程；
【発明の効果】
【０００８】
本発明のペプチド誘導体によれば、タンパク質等の分子と標的分子との間の分子間相互作用を測定することができる。また、本発明の分子間相互作用検出方法によれば、物質と標的分子との相互作用の検出を容易に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、先ず本発明のペプチド誘導体について説明する。
本発明のペプチド誘導体は、分子中にフォトクロミック化合物を結合してなる。
フォトクロミック化合物とは、フォトクロミズムと呼ばれる現象を起こす化合物を意味する。フォトクロミズムとは、単一の化学種が２つの異なった状態間を吸収スペクトルの大きな変化を伴って可逆的に往復し、少なくとも一方の変換が光照射によって引き起こされる現象を意味する。フォトクロミック化合物の具体例として、例えば、フルギド類、ジアリルエテン類、スピロピラン類及びスピロオキサジン類等が挙げられる。これらのフォトクロミック化合物の具体例を下記に示す。
【００１０】
【化１】
2005233854.tif 000002
【００１１】
【化２】
2005233854.tif 000003
【００１２】
【化３】
2005233854.tif 000004
【００１３】
【化４】
2005233854.tif 000005
【００１４】
上記フォトクロミック化合物の異性化反応は、分子構造の大幅な再構築を伴って行われるので、光異性化速度定数はフォトクロミック化合物の周囲の微小環境変化に依存すると考えられる。すなわち、光異性化速度定数の変化を分子間相互作用の結果生じる、周囲の微小環境変化と捉えることができる。従って、上記ペプチド誘導体は、以下に述べるような、分子間相互作用検出方法に用いることができる。本発明のペプチド誘導体の用途については後述する。
【００１５】
本発明のペプチド誘導体は、分子中にフォトクロミック化合物を結合してなるが、フォトクロミック化合物は、例えば分子中のペプチド鎖のリシン残基、又はリシン残基に代えてオルニチン残基、ジアミノブタン酸残基、ジアミノプロピオン酸残基を導入し、上記残基にフォトクロミック化合物を結合させたペプチド誘導体、ペプチド主鎖にフォトクロミック化合物を挿入したペプチド誘導体が挙げられる。
【００１６】
本発明のペプチド誘導体は、後述するように、分子間相互作用を検出するために用いられる。従って、この分子間相互作用を検出するための標的分子が酵素である場合、ペプチド誘導体としては、標的分子である酵素の基質ペプチドにフォトクロミック化合物を結合したものが挙げられる。また、標的分子である酵素の基質ペプチド以外のペプチドであっても、標的分子と結合するものであればよい。
本発明のペプチド誘導体の具体例を以下に示す。
【００１７】
Ac-Cys(Acm)-Gly-Lys(SP)-Gly-Ile-Tyr-Gly-Glu-Phe-Lys-Lys-Lys-Gly-NH2     (1)
Ac-Cys(Acm)-Gly-Lys(SP)-Gly-Ile-Tyr-Ala-Ala-Pro-Lys-Lys-Lys-Gly-NH2     (2)
Ac-Cys(Acm)-Gly-Lys(SP)-Gly-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH2     (3)
Ac-Cys(Acm)-Gly-Lys(SP)-Gly-Lys-Arg-Thr-Leu-Arg-Arg-Gly-NH2     (4)
Ac-Cys(Acm)-Gly-(amino-SP)-Gly-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH2     (5)
Ac-Cys(Acm)-Gly-Gly-Leu-Arg-(amino-SP)-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH2     (6)
Ac-Cys(Acm)-Gly-Gly-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-(amino-SP)-Leu-Gly-NH2     (7)
Ac-Cys(Acm)-Gly-Orn(SP)-Gly-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH2     (8)
Ac-Cys(Acm)-Gly-Dab(SP)-Gly-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH2     (9)
Ac-Cys(Acm)-Gly-Dap(SP)-Gly-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH2     (10)
Ac-Cys(Acm)-Gly-Lys(amino-SP)-Gly-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH2     (11)
SP-Cys(Acm)-Gly-Ala-Gly-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH2     (12)
上記式（１）〜（１２）において、ＳＰはフォトクロミック化合物である。
【００１８】
上記式（１）〜（４）に示すペプチド誘導体は、それぞれ、c-Srcキナーゼ、c-Ablチロシンキナーゼ、プロテインキナーゼＡ及びプロテインキナーゼＣの基質ペプチドのＮ末端側にＧｌｙを介してＬｙｓを配置し、そのＬｙｓ側鎖に、フォトクロミック化合物であるスピロピラン分子を結合したペプチド誘導体である。
上記式（５）〜（７）に示すペプチド誘導体は、それぞれ、スピロピラン分子のニトロ基を還元し、アミノ化スピロピランを得、得られたアミノ化スピロピラン分子をプロテインキナーゼＡの基質ペプチドの主鎖骨格に挿入したペプチド誘導体である。
【００１９】
上記式（８）〜（１０）に示すペプチド誘導体は、それぞれ、式（３）に示すペプチド誘導体のスピロピラン分子が結合するＬｙｓをオルニチン（Ｏｒｎ）、ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）及びジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）に代えたペプチド誘導体であり、式（１１）に示すペプチド誘導体は、式（３）に示すペプチド誘導体のＬｙｓ側鎖に結合するスピロピラン分子をアミノ化スピロピランに代えたペプチド誘導体であり、式（１２）に示すペプチド誘導体は、式（３）に示すペプチド誘導体のLys(SP)に代えて、Ｎ末端側にスピロピラン分子を結合したペプチド誘導体である。
【００２０】
上記ペプチド誘導体の製造方法について以下に説明する。
まず、式（１）〜（４）に示すペプチド誘導体の製造方法について説明する。まず、スピロピランを活性化し、この活性化されたスピロピラン分子を用いてペプチド誘導体を製造する。
スピロピランの活性化について、図１を参照しつつ説明する。スピロピランを、Raymo, F. M.; Giordani, S. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 4651-4652  及び Raymo, F. M.; Giordani, S. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 2004-2007に記載の方法に従って合成した（図１中の化合物１）。次いで、スピロピランを、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＡＥ）等の塩基の存在下、塩化メチレン中においてｐ−ニトロクロロフォルメートでスピロピラン（化合物１）を活性化し、化合物２を得る。
【００２１】
次いで、図２に示すように、ペプチドをＦｍｏｃ固相合成法により伸長し、樹脂上化合物２を反応させ、Ｌｙｓ側鎖にスピロピラン分子を選択的に導入する。保護基の除去及び樹脂から脱離をした後、得られたペプチド誘導体を逆相ＨＰＬＣを用いて精製することにより、上記ペプチド誘導体を得ることができる。
【００２２】
式（５）〜（７）に示すペプチド誘導体は、アミノ化スピロピラン分子がペプチドの主鎖骨格に挿入されたペプチド誘導体である。このペプチド誘導体を製造するには、図３に示すように、活性化アミノスピロピランを合成する。図３に示すように、スピロピラン１のニトロ基を塩化第一スズで還元し、Fmoc-OSu（スクシンイミドエステル）を添加して、Fmoc化アミノスピロピラン３を得る。このFmoc化アミノスピロピラン３に、塩基の存在下でｐ−ニトロフェニルクロロフォルメートを作用させて、４の化合物を得る。この４の化合物を用い、ペプチドをＦｍｏｃ固相合成法により伸長して、式（５）〜（７）に示すペプチド誘導体を得る。
【００２３】
式（８）〜（１０）に示すペプチド誘導体を製造するには、図４に示すように、Fmoc-L-Orn(SP)-OH、Fmoc-L-Dab(SP)-OHおよびFmoc-L-Dap(SP)-OHの合成を行う。図４は、式（８）〜（１０）に示すペプチド誘導体を製造するための化合物の製造工程を示す図である。図４に示すように、Fmoc-L-Orn(Mtt)-OH(Mttは４−メチルトリチル基)、Fmoc-L-Dab(Mtt)-OH又はFmoc-L-Dap(Mtt)-OHの側鎖保護基をTFA（トリフルオロ酢酸）にて除去し、図２に示す２の化合物と結合し、Fmoc-L-Orn(SP)-OH、Fmoc-L-Dab(SP)-OH又はFmoc-L-Dap(SP)-OHを得る。得られた化合物を用い、ペプチドをＦｍｏｃ固相合成法により伸長して、式（８）〜（１０）に示すペプチド誘導体を得る。
【００２４】
本発明のペプチド誘導体は、固相に結合されていてもよい。用いられる固相としては、例えばマイクロプレートのウェル、スライドガラス等のチップに設けた溝や穴等の凹部を用いることができる。
ペプチド誘導体を固相に結合させる方法としては、ペプチドのアミノ基やカルボキシル基等を固相上のアミノ基やカルボキシル基等と反応させて共有結合させることにより行なう方法が挙げられる。また、ペプチド誘導体にビオチン又はアビジンを結合し、固相上に固定化されたアビジン又はビオチンと結合させることによっても実施できる。
【００２５】
固相上に結合されるペプチド誘導体の量は、何等限定されるものではなく、用途に応じて適宜設定されるが、例えば１ｆmol〜１０００ｎmol程度である。
ペプチド誘導体の固相への結合は、物理的吸着によっても行なうことができる。この場合、ペプチド誘導体の結合は、ペプチド誘導体を緩衝液中に溶解した溶液と固相とを接触させて行う。この場合の結合反応は、従来と同様、例えば室温で１５分〜２時間程度、４℃の温度で行う場合、一夜程度で行うことができる。固相に結合する際のペプチド誘導体溶液の濃度は、ペプチド誘導体の種類や測定すべき検体中の物質の種類や濃度に応じて適宜選択することができ、例えば１ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ程度が好ましい。
【００２６】
本発明のペプチド誘導体を固相に結合する場合、１枚の固相上に複数種類のペプチド誘導体を、それぞれ特定の領域に結合することが好ましい。このようにすることによって、検体中の複数の試料を同時に測定することが可能となる。ペプチド誘導体の種類の数は、何等限定されないが、１枚の固相上に、１０〜１０，０００種類程度結合してもよい。
【００２７】
次に、本発明の標的分子の分子間相互作用検出方法について説明する。
本発明の標的分子の分子間相互作用検出方法は、下記工程を有する。
（ａ）分子中にフォトクロミック化合物を結合してなる物質と、標的分子とを接触させる工程；及び
（ｂ）フォトクロミック化合物の光異性化速度定数を測定する工程。
【００２８】
本発明において、標的分子とは、分子中にフォトクロミック化合物を結合してなる物質と相互作用する分子を意味し、タンパク質、核酸、糖鎖、低分子化合物等が挙げられる。
また、相互作用とは、通常は、標的分子とペプチド誘導体との共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、及び静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を意味するが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また、静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含まれるものとする。
【００２９】
相互作用の具体例としては、例えば、酵素と基質との結合及び解離、抗原と抗体との結合及び解離、タンパク質レセプターとリガンドとの結合及び解離、接着分子と相手方分子との間の結合及び解離、核酸とそれに結合するタンパク質との結合及び解離、情報伝達系におけるタンパク質同士の結合及び解離、糖タンパク質とタンパク質との結合及び解離、及び糖鎖とタンパク質との結合及び解離等が挙げられる。
【００３０】
以下、本発明の分子間相互作用検出方法について、酵素と基質ペプチドとの結合及び解離を例として説明する。
本発明の分子間相互作用検出方法においては、まず分子中にフォトクロミック化合物を結合してなる物質と、標的分子とを接触させる。分子中にフォトクロミック化合物を結合してなる物質としては、上述した本発明のペプチド誘導体を用いることができる。本発明の分子間相互作用検出方法においては、ペプチド誘導体を固相に結合しておくことが好ましい。ペプチド誘導体を固相に結合する方法は、上述した通りである。
【００３１】
本発明の分子間相互作用検出方法において、ペプチド誘導体と標的分子とを接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するのに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよい。好ましくは、ペプチド誘導体及び標的分子を生化学的に通常に使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を調製して用いることが好ましい。ペプチド誘導体と標的分子とを接触せしめた後、過剰に存在するペプチド誘導体及び標的分子を、ペプチド誘導体及び標的分子を溶解した緩衝液で洗浄することが好ましい。
【００３２】
次いで、本発明の分子間相互作用検出方法においては、ペプチド誘導体と標的分子との相互作用をフォトクロミック化合物の光異性化速度定数を測定することによって、ペプチド誘導体と標的分子との相互作用を検出する。フォトクロミック化合物は上述したように、フォトクロミズムを引き起こす化合物であり、このフォトクロミズムとは、単一の化学種が２つの異なった状態間を吸収スペクトルの大きな変化を伴って可逆的に往復し、少なくとも一方の変換が光照射により引き起こされる現象である。本発明においては、ペプチド誘導体と標的分子とを接触させた後、一方の化学種が変換を引き起こす波長の光を照射し、その変換した化学種が一方の化学種に戻る速度を光異性化速度定数を測定することにより測定し、ペプチド誘導体と標的分子との相互作用を求めるものである。
【００３３】
この点について、図５を参照してスピロピランを例として簡単に説明する。
フォトクロミック化合物であるスピロピランには、光異性体としてスピロピラン体とメロシアニン体が存在する（図５において、左側がメロシアニン体であり、右側がスピロピラン体である）。メロシアニン体は可視領域（５００〜６００ｎｍ）に吸収を有しており、かつ６００ｎｍ付近に蛍光を発する。また、スピロピラン体は４００ｎｍ以下の光を吸収するが蛍光を発しないという特徴を有する。タンパク質とフォトクロミック化合物を結合してなるペプチド誘導体が相互作用すると、ペプチド鎖中のスピロピラン体への光異性化速度定数に影響を及ぼすと考えられる。メロシアニン体の吸収帯（５１０ｎｍ）の波長の光で励起し、６００ｎｍの蛍光強度を測定する。ペプチド誘導体が標的分子と相互作用している場合（図５のkbound）としていない場合（図５のkunbound）とで、光異性化速度が異なってくると考えられるので、その光異性化速度定数を測定することによって、ペプチド誘導体と標的分子とが相互作用をしているか否かを検出することが可能となる。なお、ペプチド誘導体が標的分子と結合している場合、標的分子と結合していない場合と比較して、光異性化速度定数が大きくなる場合もあり、その逆の場合もある。光異性化速度定数がどのように変化するかは、ペプチド誘導体、標的分子の組み合わせによって異なってくる。
【００３４】
例えば、式（１）で示されるペプチド誘導体は、プロテインキナーゼＡ、α−アミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ライソザイム、Ｓ−１００タンパク質と相互作用した場合には、光異性化速度定数は大きくなり、ヘキソキナーゼと相互作用した場合には逆に小さくなる。また、式（２）で示されるペプチド誘導体は、プロテインキナーゼＡ、β−ガラクトシダーゼ、ライソザイム、ヘキソキナーゼ、Ｓ−１００タンパク質と相互作用した場合には光異性化速度定数が大きくなるが、α−アミラーゼと相互作用した場合にはほとんど変化がない。式（３）で示されるペプチド誘導体は、プロテインキナーゼＡと相互作用した場合には光異性化速度は大きくなるが、α−アミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ライソザイム、ヘキソキナーゼ、Ｓ−１００タンパク質と相互作用した場合には光異性化速度定数は小さくなる。また、式（４）で示されるペプチド誘導体は、プロテインキナーゼＡ、α−アミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ライソザイム、ヘキソキナーゼ、Ｓ−１００タンパク質と相互作用した場合に、光異性化速度定数は小さくなる。
【００３５】
本発明の分子間相互作用検出方法は、標的分子を含む可能性のある検体を試料として用い、その検体中に特定の分子を含むか否かの判定に用いることができる。このような検体としは、例えば、動物細胞破壊液、植物細胞破壊液、菌体破壊液、ウイルス破壊液、及び各分画成分、血液、血清、血漿、尿、便、唾液、組織液、髄液等の体液や、各種食品、飲料等が挙げられる。
【００３６】
本発明の分子間相互作用検出方法は、初期の標的分子の検出に用いることができるだけでなく、未知の標的分子のスクリーニングにも用いることができる。すなわち、種々の構成アミノ酸側鎖にフォトクロミック化合物を結合させたペプチド誘導体を作製し、これを固相に結合させ、これと種々のタンパク質を反応させ、光異性化速度定数を測定する。その結果をデータベース化しておくことにより、極めて他種類の標的分子の検出をすることが可能になる。このようにすることにより、各種疾病の診断や新薬の開発等にも大いに貢献するものと考えられる。
【００３７】
上述した本発明の分子間相互作用検出方法を、複数のペプチド誘導体について行い、各ペプチド誘導体について測定した値に応じて違いが肉眼で認識できるデータに変換し、各ペプチド誘導体についての視認的なデータを並べて出力することによって、容易、簡便に被検試料中の標的分子を検出することができ、未知の被検試料中に含まれる標的分子の同定が可能となる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
下記式（１３）で示される化合物１．００ｇ（２．８４ｍmol）及びジイソプロピルエチルアミン（DIEA)（２．０ｍＬ）の塩化メチレン溶液(２０ｍＬ)に0 ℃でｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（５７２ｍｇ、２．８４ｍmol）の塩化メチレン溶液（５．０ｍL）を1分かけて滴下し、得られた混合溶液を０℃で1時間撹拌した。反応混合溶液に０℃でｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（５７２ｍｇ、２．８４mmol)の塩化メチレン溶液（５．０ｍL）を1分かけて滴下し、得られた混合溶液を０℃で1時間撹拌した。この操作をもう一度繰り返した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[酢酸エチル／石油エーテル（１：２）]、デカンテーション[酢酸エチル／石油エーテル (1:2)]で精製した後、固化[酢酸エチル/石油エーテル (1:2)]し淡桃色粉末の式（１４）で示される化合物を得た。収量：８２７ｍｇ（５６％）： MALDI-MS (SA,シナピン酸) calcd 517.5; obsd 517.9 [M + H]+
【００３９】
【化５】
2005233854.tif 000006
【００４０】
【化６】
2005233854.tif 000007
【００４１】
Fmoc-Gly-Rink amide MBHA樹脂 （２５４ｍｇ、３０．０μmol, sub = 0.118 mmol/g)を用い、文献（Chen, W. C.; White, P. D. “Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach” Oxford University Press: New York, 2000）に記載のFmoc固相合成法の常法に従い保護ペプチド付き樹脂Ac-Cys(Acm)-Gly-Lys(Mtt)-Gly-Ile-Tyr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-NH2を得た。得られた保護ペプチド付き樹脂の半分量（１５．０μmol)をTFA（トリフルオロ酢酸）/TIS（トリイソプロピルシラン）/DCM（塩化メチレン） (1/5/94)で処理しMtt基を除去した。得られた樹脂を10% DIEA/NMP （N-メチルピロリドン）(x 1)およびNMP (x 3)で洗浄し、式（１４）で示される化合物（２３ｍｇ、４５μmol）及びDIEA （１６μＬ、９０μmol)のNMP溶液 （１．０ｍＬ）を加え、室温で振とうした。６時間振とうした後DIEA（１６μＬ、９０μmol）を加え、さらに１２時間振とうした。NMP (x 3)およびクロロホルム (x 3)で洗浄した後、乾燥した樹脂をTFA/EDT（エタンジチオール）/TA（チオアニソール）/ｍ−クレゾール２．０ｍL(１０：０．７５：０．７５：０．２５)で処理し保護基の除去および樹脂からの切断を行った。反応混合液を濾過、減圧濃縮し、エーテル沈殿を行い、粗ペプチドを得た。得られた粗ペプチドをRP-HPLC [(C18 semi-preparative column, AcCN: ３５→６０％ (３０分)０．１％TFAを含有する)で精製した後、凍結乾燥し、式（１）で示されるペプチド誘導体を黄色粉末状で得た。収量：５．６mg （１９％ from Fmoc-Gly-resin): MALDI-MS (SA) calcd 1905.2; obsd 1906.1 [M + H]+, 1891.2 [M - Me]+, 1875.3 [M - (2 x Me)]+
【００４２】
実施例２
実施例１と同様な操作を行い得られた粗ペプチドをRP-HPLC （(C18 semi-preparative column, AcCN：３０→５５％（３０分）０．１％ TFAを含有する)で精製した後、凍結乾燥し、式（２）で示されるペプチド誘導体を黄色粉末状で得た。収量：６．７ｍｇ（２５％ from Fmoc-Gly-resin)： MALDI-MS (SA) calcd 1811.1; obsd 1813.3 [M + H]+, 1797.5 [M - Me]+, 1782.0 [M - (2 x Me)]+
【００４３】
実施例３
実施例１と同様な操作を行い得られた粗ペプチドを、RP-HPLC （(C18 semi-preparative column, AcCN： ３５→６０％（３０分）０．１％ TFAを含有する)で精製した後、凍結乾燥し、式（３）で示されるペプチド誘導体を黄色粉末状で得た。収量：６．７mg (28% from Fmoc-Gly-resin): MALDI-MS (SA) calcd 1607.8; obsd 1608.9 [M + H]+, 1592.8 [M - Me]+, 1577.6 [M - (2 x Me)]+
【００４４】
実施例４
実施例１と同様な操作を行い得られた粗ペプチドを、RP-HPLC （(C18 semi-preparative column, AcCN： ３０→５５%（３０分）０．１％ TFAを含有する)で精製した後、凍結乾燥し、式（４）で示されるペプチド誘導体を黄色粉末状で得た。収量：4.6 mg (28% from Fmoc-Gly-resin): MALDI-MS (SA) calcd 1722.0; obsd 1723.4 [M + H]+, 1707.9 [M - Me]+
【００４５】
実施例５
式（１３）で示される化合物（５００ｍｇ、１．４１ｍmol）及びSnCl2×2H2O （９５５ｍｇ、４．２３ｍmol）の濃塩酸溶液（９．０ｍＬ）を室温で一晩撹拌した。この溶液を５０％NaOHで中和し、Fmoc-OSu （５２４ｍｇ、１．５５ｍmol）のアセトニトリル溶液（２０ｍL）、さらに水を加えて水/アセトニトリルの割合が（１：１）になるように調製し、室温で１時間撹拌した。新たにFmoc-OSu（２６２ｍｇ、０．７８ｍmol）のアセトニトリル溶液（５ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応混合液に酢酸エチル３００ｍLを加えて有機層を水洗した後、MgSO4で乾燥した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[クロロホルム/メタノール（４９：１）]で精製後、固化（エーテル/石油エーテル）し、下記式（１５）で示される化合物を淡茶色粉末状で得た。収量：３５５ｍｇ（４６％）： MALDI-MS (SA) calcd 544.2; obsd 545.5 [M + H]+
【００４６】
【化７】
2005233854.tif 000008
【００４７】
上述のようにして得られた、式（１５）で示される化合物（３００ｍｇ、０．５５１ｍmol）及びDIEA（０．２１０ｍＬ）の塩化メチレン溶液（５ｍＬ）に室温でｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（１２４ｍｇ、０．６１３ｍmol）の塩化メチレン溶液（３．０ｍL）を１分間かけて滴下し、得られた混合溶液を室温で２時間撹拌した。反応混合溶液に室温でｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（１２４ｍｇ、０．６１３ｍmol）の塩化メチレン溶液（３．０ｍＬ）を１分かけて滴下し、得られた混合溶液を室温で２時間撹拌した。この操作をもう一度繰り返した後、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル１００ｍＬを加え、４％NaHCO3 (x 1)及び水 (x 3)で洗浄し、MgSO4で乾燥した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[酢酸エチル/石油エーテル (1:3)]で精製した後、固化（酢酸エチル/石油エーテル）し、下記式（１６）で示される化合物を淡緑色粉末状で得た。収量：２１２ｍｇ（５４％）： MALDI-MS (SA) calcd 709.7; obsd 711.3 [M + H]+, 695.6 [M - Me]+
【００４８】
【化８】
2005233854.tif 000009
【００４９】
実施例６
Fmoc-Gly-Rink amide樹脂（５４ｍｇ、３０μmol、sub = 0.56 mmol/g) を用い、実施例１と同様に操作を行い、ペプチド鎖の伸長を行った。ペプチド鎖中への式（１６）で示される化合物の縮合は、式（１６）で示される化合物のNMP溶液（６４ｍｇ、９０μmol）にDIEA (26μＬ, 150μmol)を加え室温で８時間振とうすることにより行った。得られた粗ペプチドを、RP-HPLC [(C18 semi-preparative column, AcCN：２０→３０％（３０分）０．１％TFAを含有する)で精製後、凍結乾燥し、式（５）で示されるペプチド誘導体を橙色粉末状で得た。収量：８．２ｍｇ（19% from Fmoc-Gly-resin): MALDI-MS (SA) calcd 1449.7; obsd 1450.8 [M + H]+
【００５０】
実施例７
実施例６と同様な操作を行い得られた粗ペプチドを、RP-HPLC [(C18 semi-preparative column, AcCN：２０→３０％（３０分）０．１％TFAを含有する)で精製した後、凍結乾燥し、式（６）で示されるペプチド誘導体を橙色粉末状で得た。収量：６．３ｍｇ(14% from Fmoc-Gly-resin): MALDI-MS (SA) calcd 1449.7; obsd 1449.0 [M + H]+
【００５１】
実施例８
実施例６と同様な操作を行い得られた粗ペプチドを、RP-HPLC [(C18 semi-preparative column, AcCN：２０→３０％（３０分）０．１％TFAを含有する)で精製した後、凍結乾燥し、式（７）で示されるペプチド誘導体を橙色粉末状で得た。収量：６．３ｍｇ (14% from Fmoc-Gly-resin): MALDI-MS (SA) calcd 1449.7; obsd 1451.20 [M + H]+
【００５２】
実施例９
Fmoc-L-Orn(Boc)-OH (175 mg, 0.386 mmol)のTFA (3.0ｍＬ)溶液を０℃で30 分間撹拌した。この反応混合溶液を減圧濃縮し、残渣にエーテル/石油エーテル（１：２）を５０ｍL加え固化し、真空乾燥した。得られた式（１４）で示される化合物、 (100 mg, 0.193 mmol)およびDIEA (134 iＬ, 0.772 mmol)のDMF溶液 (3.0 mL)を0 ℃で30 分間撹拌し、次いで室温で1時間撹拌した。反応混合溶液に酢酸エチル５０ｍLを加え、10%クエン酸水 (x 1)および水 (x 3)で洗浄し、MgSO4で乾燥した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[クロロホルム/メタノール/酢酸 (90:10:1)]で精製した後、固化（エーテル/石油エーテル）した。さらに酢酸エチル５０ｍＬを加え、1N HCl (x 1)および水 (x 3)で洗浄し、有機層を濃縮後、固化（エーテル/石油エーテル）し、Nα-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-Nε-(SP)-L-a-ornithine (Fmoc-L-Orn(SP)-OH)を淡黄色粉末状で得た。収量：57 mg (40%): MALDI-MS (SA) calcd 732.8; obsd 733.4 [M + H]+, 717.6 [M - Me]+, 703.4 [M - (2 x Me)]+
【００５３】
Fmoc-Gly-Rink amide樹脂 (54 mg, 30 mmol, sub = 0.56 mmol/g)を用い、実施例１と同様に操作を行い、ペプチド鎖の伸長を行った。ペプチド鎖中のFmoc-L-Orn(SP)-OH の縮合は、NMP２．０ｍＬ中にFmoc-L-Orn(SP)-OH (33 mg, 45 mmol)およびDIEA (16 mL, 90 mmol)を加え室温で1時間振とうすることにより行った。得られた粗ペプチドを、RP-HPLC [(C4 semi-preparative column, AcCN：１０→１０％（１０分）→６０％（３０分）０．１％TFAを含有する)で精製後、凍結乾燥し、式（８）で示されるペプチド誘導体を黄色粉末状で得た。Yield 1.8 mg (3.6% from Fmoc-Gly-resin): MALDI-MS (SA) calcd 1593.8; obsd 1596.8 [M + H]+, 1581.3 [M - Me]+, 1562.6 [M - (2 x Me)]+
【００５４】
実施例１０
Fmoc-L-Orn(Boc)-OHに代え、Fmoc-L-Dab-OH (79 mg, 0.232 mmol)を用いた以外は実施例９と同様に操作を行い、Nα-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-Nε-(SP)-L-a-diaminobutylic acid (Fmoc-Dab(SP)-OH)を淡黄色粉末状で得た。収量：95 mg (68%): MALDI-MS (SA) calcd 718.8; obsd 718.4 [M + H]+, 702.2 [M - Me]+, 688.4 [M - (2 x Me)]+.  
【００５５】
次いで、実施例９と同様に操作を行い、Fmoc-Dab(SP)-OHの縮合を行い、得られた粗ペプチドを、RP-HPLC [(C18 semi-preparative column, AcCN：３０→６０％（３０分）0.1% TFAを含有する)で精製後、凍結乾燥し、式（９）で示されるペプチド誘導体を黄色粉末状で得た。収量：１．８mg (3.8% from Fmoc-Gly-resin): MALDI-MS (SA) calcd 1579.8; obsd 1582.3 [M + H]+, 1566.0 [M - Me]+
【００５６】
実施例１１
Fmoc-L-Orn(Boc)-OHに代え、Fmoc-L-Dap-OH  (80 mg, 0.232 mmol)を用いた以外は実施例９と同様に操作を行い、Nα-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-Nε-(SP)-L-a-diaminopropionic acid (Fmoc-Dap(SP)-OH)を、淡黄色粉末状で得た。収量：83 mg (61%): MALDI-MS (SA) calcd 704.7; obsd 704.6 [M + H]+, 688.8 [M - Me]+, 674.5 [M - (2 x Me)]+
【００５７】
次いで、実施例９と同様に操作を行い、Fmoc-Dap(SP)-OHの縮合を行い、得られた粗ペプチドを、RP-HPLC [(C18 semi-preparative column, AcCN：３０→６０％（３０分）0.1% TFAを含有する)で精製後、凍結乾燥し、式（１０）で示されるペプチド誘導体を黄色粉末状で得た。収量：１．９mg (4.0% from Fmoc-Gly-resin): MALDI-MS (SA) calcd 1565.8; obsd 1566.6 [M + H]+, 1551.0 [M - Me]+
【００５８】
実施例１２
実施例１で得られた保護ペプチド付き樹脂の半分量（１５．０μmol)を用い、実施例１と同様に操作を行い、ペプチドの伸長、及びLys側鎖のMttの保護基を除去した。ペプチド鎖中Lys側鎖及び式（１６）で示される化合物の縮合はNMP２．０ｍＬ中に式（１６）で示される化合物（３０ｍｇ、４５μmol)およびDIEA（１５μL、９０μmol)を加え、室温で２時間振とうし、さらにDIEA （１５μL、９０μmol)を加え、室温で一晩振とうすることにより行った。得られた粗ペプチドを、RP-HPLC [(C4 semi-preparative column, AcCN：２０→５０％（３０分）0.1% TFAを含有する)で精製後、凍結乾燥し、式（１１）で示されるペプチド誘導体を黄色粉末状で得た。収量：11.8 mg (50% from Fmoc-Gly-resin): MALDI-MS (SA) calcd 1577.9; obsd 1580.4 [M + H]+
【００５９】
実施例１３
Fmoc-Gly-Rink amide樹脂 （５４ｍｇ、３０μmol, sub = ０．５６ｍmol/g)を用い、実施例１と同様に操作を行い、ペプチド鎖を伸長した。ペプチド鎖中N末端と式（１４）で示される化合物の縮合はNMP２．０ｍＬ中に式（１４）で示される化合物 (47 mg, ９０μmol）およびDIEA (31μＬ、１８０μmol)を加え、室温で2時間振とうし、さらにDIEA (31μＬ, １８０μmol)を加え、室温で一晩振とうすることにより行った。得られた粗ペプチドを、RP-HPLC [(C4 semi-preparative column, AcCN；３０→６０％（３０分）0.1％TFAを含有する)で精製後、凍結乾燥し、式（１２）で示されるペプチド誘導体を黄色粉末状で得た。収量：3.3 mg (７．３％ from Fmoc-Gly-resin): MALDI-MS (SA) calcd 1508.7; obsd 1509.9 [M + H]+, 1494.9 [M - Me]+, 1478.2 [M - (2 x Me)]+
【００６０】
実施例１４
式（１）〜（４）で示されるペプチド誘導体と、標的分子としての各種タンパク質とを接触させ、ペプチド誘導体中のスピロピランのメロシアニン体からスピロピラン体への光異性化を調べた。測定は以下のように行った。なお、タンパク質としては、プロテインキナーゼＡ、α−アミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ライソザイム、ヘキソキナーゼ、Ｓ−１００タンパク質を用いた。
【００６１】
２．０〜２．２μMの式（１）〜（４）で示されるペプチド誘導体、及び０．７６ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含む２０ｍＭTris HCl (pH 7.4), 150 mM NaClの試料溶液1 ｍＬを暗所で調製し、この試料溶液を冷暗所(４℃)で一晩放置した。この試料溶液を暗所で蛍光分光光度計の測定セル中に移し、30分間暗所、4℃で放置した。測定試料室のシャッターを開けると同時に５１０ｎｍの励起光により生じる６００ｎｍの蛍光強度の時間変化をHitachi F-2500蛍光分光光度計で４℃で測定した。得られた減衰曲線をＦ=（Ｆ０−Ｆ∞）exp（−ｋｔ）＋Ｆ∞でフィッティングし、光異性化速度定数を求めた。分子間相互作用の指標としては、光異性化速度定数の変化（ｋ／ｋ０、ここで、ｋ＝タンパク質添加時の光異性化速度定数、ｋ０＝タンパク質無添加時の光異性化速度定数）及び変化率[（ｋ−ｋ０）＝Δｋ／ｋ０]を用いた。式（１）で示されるペプチド誘導体についての結果を図６に、式（２）で示されるペプチド誘導体についての結果を図７に、式（３）で示されるペプチド誘導体についての結果を図８に、式（４）で示されるペプチド誘導体についての結果を図９に示す。
それぞれの図は、ペプチド誘導体と各種タンパク質との光異性化速度定数を調べた結果を示すグラフであり、縦軸はｋ／ｋ０を示す。ｋはタンパク質添加時の光異性化速度定数であり、ｋ０はタンパク質無添加時の光異性化速度定数である。
【００６２】
図６に示すように、式（１）で示されるペプチド誘導体は、プロテインキナーゼＡ、α−アミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ライソザイム、Ｓ−１００タンパク質と相互作用した場合には、光異性化速度定数は大きくなり、ヘキソキナーゼと相互作用した場合には逆に小さくなる。
図７に示すように、式（２）で示されるペプチド誘導体は、プロテインキナーゼＡ、β−ガラクトシダーゼ、ライソザイム、ヘキソキナーゼ、Ｓ−１００タンパク質と相互作用した場合には光異性化速度定数が大きくなるが、α−アミラーゼと相互作用した場合にはほとんど変化がない。
図８に示すように、式（３）で示されるペプチド誘導体は、プロテインキナーゼＡと相互作用した場合には光異性化速度は大きくなるが、α−アミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ライソザイム、ヘキソキナーゼ、Ｓ−１００タンパク質と相互作用した場合には光異性化速度定数は小さくなる。
また、図９に示すように、式（４）で示されるペプチド誘導体は、プロテインキナーゼＡ、α−アミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ライソザイム、ヘキソキナーゼ、Ｓ−１００タンパク質と相互作用した場合に、光異性化速度定数は小さくなる。
【００６３】
上記の結果より、各々のタンパク質における、光異性化速度定数の変化率Δｋ／ｋ０を図１０に示す。図１０は、各種ペプチド誘導体と各種タンパク質とを相互作用させた際に光異性化速度定数の変化率を示すグラフである。図１０に示すように、式（１）〜（４）で示されるペプチド誘導体の順に、プロテインキナーゼＡ（＋／＋／＋／−）、α−アミラーゼ（−／＋／０／−）、β−ガラクトシダーゼ（−／＋／＋／−）、ライソザイム（−／＋／＋／−）、ヘキソキナーゼ（−／−／＋／−）、Ｓ−１００タンパク質（−／＋／＋／−）のように、タンパク質を特徴づける結果が得られた。このことから、本発明の方法を利用した作製した「プロテインフィンガープリント」の有用性が示された。
【００６４】
実施例１５
式（１）で示されるペプチド誘導体のメロシアニン体からスピロピラン体への光異性化速度定数のタンパク質濃度依存性について検討した。操作は実施例１４と同様に行い、タンパク質濃度を０、０．０９５、０．１９、０．３８及び０．７６ｍｇ／ｍＬとして測定を行った。タンパク質としてはプロテインキナーゼＡ及びα−アミラーゼを用いた。結果を図１１に示す。図１１は、ペプチド誘導体のメロシアニン体からスピロピラン体への光異性化速度定数のタンパク質濃度依存性を調べた結果を示すグラフであり、横軸はタンパク質濃度、縦軸は光異性化速度定数の変化率を示す。図１１に示すように、プロテインキナーゼＡを添加したときには、濃度上昇に伴い、速度定数の増大が見られた。一方、α−アミラーゼを用いたときには、濃度上昇に伴い、速度定数の減少が見られた。この結果より、本発明の方法により、タンパク質濃度の定量性があることが示された。
【００６５】
実施例１６
２種類のタンパク質が混在する場合の光異性化速度定数に与える影響を調べた。測定条件は実施例１４と同様にして行い、ペプチド誘導体として式（１）で示されるペプチド誘導体を用い、タンパク質としては、プロテインキナーゼＡ及びα−アミラーゼを用いた。結果を図１２に示す。図１２に示すように、プロテインキナーゼＡを用いた場合は、＋０．０４６の変化率が示され、α−アミラーゼを用いた場合は−０．０７１の変化率が示された。プロテインキナーゼＡ及びα−アミラーゼを用いた場合は−０．００５１の変化率が示された。プロテインキナーゼＡを用いた場合と、α−アミラーゼを用いた場合の和は−０．０２５であり、両者を混合した場合の方が値が小さいことから、タンパク質の混合系においては、タンパク質間のペプチドとの親和性の強弱によって、光異性化速度定数の加速／減速効果が分配されることがわかった。このことから、試料中に既知のタンパク質を添加することにより、多次元の「プロテインフィンガープリント」によるタンパク質の検出の可能性が示された。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】活性化スピロピランの合成を示す図である。
【図２】ペプチド誘導体の製造方法の簡略図である。
【図３】スピロピランのアミノ化と活性化アミノスピロピランの合成を示す図である。
【図４】式（８）〜（１０）に示すペプチド誘導体を製造するための化合物の製造工程を示す図である。
【図５】ペプチド誘導体とタンパク質との相互作用様式を示す図である。
【図６】ペプチド誘導体とタンパク質との相互作用を調べた結果を示すグラフである。
【図７】ペプチド誘導体とタンパク質との相互作用を調べた結果を示すグラフである。
【図８】ペプチド誘導体とタンパク質との相互作用を調べた結果を示すグラフである。
【図９】ペプチド誘導体とタンパク質との相互作用を調べた結果を示すグラフである。
【図１０】各種ペプチド誘導体と各種タンパク質とを相互作用させた際に光異性化速度定数の変化率を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ペプチド誘導体のメロシアニン体からスピロピラン体への光異性化速度定数のタンパク質濃度依存性を調べた結果を示すグラフである。
【図１２】ペプチド誘導体とタンパク質混合系との相互作用した際の光異性化速度定数の変化率を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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