(57)【要約】【課題】  ＧＦＣモードとイオン交換モードまたは/および逆相モードが混在した分離を実現しつつ、極めてタンパク質・ペプチドの非特異的不可逆吸着が少ないクロマトグラフィー用充填剤を提供すること。【解決手段】  下記式（１）で示される化合物と、特定のイオン交換性の基や疎水性基とが基材表面に直接的に共有結合していることを特徴とするクロマトグラフィー用充填剤。（１）2005337713.tif 000035  Ｒは炭素数１〜３０の任意の修飾鎖を表す。修飾鎖の任意の位置に、枝分かれ構造、不飽和結合、ベンゼン核、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子、塩素原子、フッ素原子、臭素原子を一つ以上有しても良く、また、これらの組み合わせを有して良い。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示される化合物と、下記式（２）で示される化合物とが、基材表面に直接的に共有結合していることを特徴とするクロマトグラフィー用充填剤。
（１）
【化１】
2005337713.tif 000028
Ｒは炭素数１〜３０の任意の修飾鎖を表す。修飾鎖の任意の位置に、枝分かれ構造、不飽和結合、ベンゼン核、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子、塩素原子、フッ素原子、臭素原子を一つ以上有しても良く、また、これらの組み合わせを有して良い。
（２）
【化２】
2005337713.tif 000029
Ｒ’は炭素数１〜３０の任意の修飾鎖を表す。修飾鎖の任意の位置に、枝分かれ構造、不飽和結合、ベンゼン核、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子、塩素原子、フッ素原子、臭素原子を一つ以上有しても良く、また、これらの組み合わせを有して良い。
【請求項２】
下記式（１）で示される化合物と、下記式（３）で示される化合物とが、基材表面に直接的に共有結合していることを特徴とするクロマトグラフィー用充填剤。
（１）
【化３】
2005337713.tif 000030
Ｒは炭素数１〜３０の任意の修飾鎖を表す。修飾鎖の任意の位置に、枝分かれ構造、不飽和結合、ベンゼン核、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子、塩素原子、フッ素原子、臭素原子を一つ以上有しても良く、また、これらの組み合わせを有して良い。
（３）
【化４】
2005337713.tif 000031
Ｒ’は炭素数１〜３０の任意の修飾鎖を表す。修飾鎖の任意の位置に、枝分かれ構造、不飽和結合、ベンゼン核、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子、塩素原子、フッ素原子、臭素原子を一つ以上有しても良く、また、これらの組み合わせを有して良い。
【請求項３】
下記式（１）で示される化合物と、下記式（４）で示される化合物とが、基材表面に直接的に共有結合していることを特徴とするクロマトグラフィー用充填剤。
（１）
【化５】
2005337713.tif 000032
Ｒは炭素数１〜３０の任意の修飾鎖を表す。修飾鎖の任意の位置に、枝分かれ構造、不飽和結合、ベンゼン核、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子、塩素原子、フッ素原子、臭素原子を一つ以上有しても良く、また、これらの組み合わせを有して良い。
（４）
【化６】
2005337713.tif 000033
Ｒ’は炭素数１〜３０の任意の修飾鎖を表す。修飾鎖の任意の位置に、枝分かれ構造、不飽和結合、ベンゼン核、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子、塩素原子、フッ素原子、臭素原子を一つ以上有しても良く、また、これらの組み合わせを有して良い。
また、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は、それぞれ独立に、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基である。
【請求項４】
下記式（１）で示される化合物と、飽和アルキル基または不飽和アルキル基または芳香族化合物とが、基材表面に直接的に共有結合していることを特徴とするクロマトグラフィー用充填剤。
（１）
【化７】
2005337713.tif 000034
Ｒは炭素数１〜３０の任意の修飾鎖を表す。修飾鎖の任意の位置に、枝分かれ構造、不飽和結合、ベンゼン核、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子、塩素原子、フッ素原子、臭素原子を一つ以上有しても良く、また、これらの組み合わせを有して良い。
【請求項５】
前記基材が、球状多孔質シリカゲルであることを特徴とする請求項１〜４記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項６】
前記球状多孔質シリカゲルの平均粒径が１〜２００μｍであることを特徴とする請求項５記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項７】
前記球状多孔質シリカゲルの細孔の平均径が１０〜１０００オングストロームであることを特徴とする請求項５または６記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はクロマトグラフィー用充填剤に関する。さらに詳しくは、ホスホリルコリン基と特定のイオン交換性の基、または、ホスホリルコリン基と疎水性の基、または、ホスホリルコリン基と芳香族とが基材表面に直接的に共有結合し、ＧＦＣモードとイオン交換モードまたは/および逆相モードが混在した分離を実現しつつ、極めてタンパク質・ペプチドの非特異的不可逆吸着が少ないクロマトグラフィー用充填剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホリルコリン基を有する重合体は生体適合性高分子として検討されている。そして、この重合体を各種基剤に被覆させた生体適合性材料が開発されている。
【０００３】
例えば、特許文献１にはホスホリルコリン基を有する重合体で被覆した医療用材料が記載されている。また、特許文献２にはホスホリルコリン基を有する重合体で被覆した分離剤が開示されている。
【０００４】
上記の材料は、主に水酸基を有するアクリル系モノマーと２−クロロ−１，３，２−ジオキサホスホラン−２−オキシドを反応させ、更にトリメチルアミンにより４級アンモニウムとすることによりホスホリルコリン構造を有するモノマーを合成し、これを重合して得られる重合体により、その表面が被覆されたものである（重合体の製造方法に関しては特許文献３及び４を参照）。
【０００５】
特許文献３には、２−メタクロイルオキシエチルホスホリルコリンとメタクリル酸エステルの共重合体が製造され、特許文献４には２−メタクロイルオキシエチルホスホリルコリンの単独重合体が製造されている。
【０００６】
一方、タンパク質やタンパク質よりも分子量が小さいポリペプチド等の生体試料をサイズ排除によって分離するＧＦＣ用充填剤には、多くの市販品が存在する。このＧＦＣ用充填剤には、架橋された親水性高分子を基材とする充填剤と、シリカゲルを基材とする充填剤が存在する。
【０００７】
架橋された親水性高分子を基材とする充填剤は、適用できる移動相のｐＨ範囲が広く、汎用性が高い。しかしながら、高分子を基材とする充填剤はシリカゲルを基材とする充填剤よりも、（１）細孔径の制御が困難であるためにサイズ排除の観点でも高理論段数を得づらく、また、（２）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で使用される際にかかる高圧条件に対する強度が悪いことと移動相溶媒によって粒子が膨潤することのために再現性のよいクロマトグラムを得られないことも多い。
【０００８】
シリカゲルを基材とする充填剤は、タンパク質やポリペプチドのシリカゲル基材表面への吸着が問題となる。そこで、分析試料中のタンパク質やポリペプチドのシリカゲルへの吸着を抑制する目的で、非解離性の親水性基によって表面が修飾されたシリカゲルを用いた充填剤が市販されている。
例えば、シリカゲル系ＧＦＣ用カラムとして、昭和電工株式会社からは、Ｓｈｏｄｅｘ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＫＷ−８０３（製品名）が市販されている。このシリカゲル系カラムは、カタログに、分子量数千から１００万程度のタンパク質の分析に適したシリカゲル系のＧＦＣモードのカラムであると説明されている。
また、株式会社ワイエムシィからは、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｄｉｏｌ（製品名）が市販されている。これもシリカゲル系のＧＦＣ用カラムであり、ジオール構造を有する官能基をシリカゲル基材に共有結合したもので、分子数千から数十万のタンパク質の分離に適用できると説明されている。
【０００９】
非特許文献１には、基材上に化学的にグラフトされたホスホリルコリン基により、タンパク質の吸着が減少することが記載されている。
【００１０】
しかしながら、ホスホリルコリン基を有する重合体により、物体の表面を被覆して改質する方法では、表面全体を効果的に被覆することは難しい。また、被覆した重合体が物体から剥離するため、耐久性に問題が生じる。さらには、物体の表面が重合体により被覆されるため、ホスホリルコリン基による生体適合性等の目的とする機能を付与する目的から逸脱して、物体自体に要求されている基本的性質が失われる場合もある。
【００１１】
また、ホスホリルコリン基の誘導体を低分子として物体に導入する場合でも、物体にホスホリルコリン基の誘導体と反応させることができる官能基を先に導入し、ついでホスホリルコリン基の誘導体を反応させる方法では、未反応の官能基が物体表面に残るために生体適合性の低下に繋がる。
【００１２】
例えば、まず物体表面にアミノ基を導入し、次にホスホリルコリンのアルデヒド誘導体を物体表面のアミノ基と反応させる場合、多くの未反応のアミノ基が残存してしまう。物質表面にアミノ基が多く残存する場合、アミノ基は強い塩基性を有しているために、主に酸性のタンパク質が著しく強い静電的な相互作用を示し、そのほとんどが吸着してしまう。クロマトグラフィー用充填剤としてとらえた場合は当該タンパク質の回収率の悪化や、ピークの著しいテーリングの原因となる。さらに、タンパク質の吸着はその変性をもたらし、生体適合性素材としてとらえた場合は炎症などの原因となり、好ましくない。
【００１３】
一方、GFCカラムとは別に、イオン交換カラム、逆相カラムが、独立に既に存在し、タンパク質の分離精製に広く用いられている。
【００１４】
イオン交換カラムとは、イオン交換性を持つ官能基を修飾鎖に有する充填剤を充填したカラムである。例えば、下記のカラムが市販されている。
（１）−N（CH3）3+を結合させた強陰イオン交換（昭和電工株式会社製  製品名：Shodex  IEC QA-825）
（２）−N（C2H5）3+を結合させた弱陰イオン交換（昭和電工株式会社製  製品名：Shodex  IEC DEAE-825）
（３）−COO- を結合させた弱陽イオン交換（昭和電工株式会社製  製品名：Shodex  IEC CM-825）
（４）−SO3- を結合させた強陽イオン交換（昭和電工株式会社製  製品名：Shodex  IEC SP-825）
【００１５】
いずれのイオン交換カラムも、いったんタンパク質を吸着させ、塩濃度グラジェントまたはｐＨグラジェントによって吸着したタンパク質を溶離させることによって分離を実現する。また、充填剤基材としては、親水性ポリマー、シリカゲルの両方が製品化されている。
【００１６】
イオン交換カラムは、（１）イオン交換基に吸着したタンパク質が正常に脱離しない、（２）イオン交換基以外への望ましくない非特異的不可逆吸着、などの原因のために、特に微量タンパク質分析においてはタンパク質回収率の低さが問題となる。シリカゲルに代表される無機マトリックスを基材とする場合には、該マトリックス表面に存在する、望ましくない相互作用を及ぼす基によって（２）の現象が起こる。また、タンパク質の低回収率における原因としては、（１）よりも（２）の現象が支配的であると考えられている。無機マトリックスとしてシリカゲルを挙げる場合、望ましくない相互作用をもたらす基として代表的なものはシラノール基である。
【００１７】
特許文献５には、モノマーをシリカゲル表面に密着させ、そのままモノマーを重合させることでシラノール基を不活性化する方法が記載されている。本文献によれば、イオン交換基を有するか、またはイオン化が可能な官能基を有するモノマーと、非イオン性の極性置換基を有するモノマーを混合してシリカゲル表面に密着させ、その後マトリックス表面上に密着した該モノマー混合体を重合させることで、シリカゲル表面にイオン交換基を有し、かつシラノール基が親水性重合体で覆われ不活性化された充填剤を製造することができるとされている。
【００１８】
また、特許文献６にはイオン交換体の表面を非イオン性の極性物質で被覆したイオン交換体について記載されている。本文献によれば、イオン交換体の表面を多糖、ポリオール、ポリアミドなどにより被覆することで、タンパク質や細胞の望ましくない非特異的不可逆吸着を抑制することができると説明されている。
【００１９】
特許文献５および特許文献６に開示されているような高分子体でシリカゲル表面を被覆する方法では、シリカゲル表面に均一な単分子層を形成することが困難である。すなわちモノマーの重合時に不均一な凹凸を形成したり、細孔全体を塞ぐことがあるために、シリカゲルを基材に用いる場合の大きな利点である細孔径の均一さを活用することができない。また、基材表面を被覆しているポリマーと基材表面との間に共有結合が存在しないことから、耐久性の面で問題がある。
【００２０】
一方で、ＧＦＣカラムにイオン交換性を付与する方法も用いられている。ＧＦＣモードは分析対象物質との相互作用が実質的に排除され、分析対象物質の拡散係数の差だけで分離を行うモードである。充填剤表面との相互作用が無い場合、主に分子サイズのみが拡散係数に反映されるため、ＧＦＣカラムを用いることで溶出時間からおおよその分子量を測定することができる。このような、分析対象物質との相互作用が実質的に存在しないＧＦＣカラムにおいては、一般的にタンパク質の回収率が良好であることが知られている。
高い回収率をもたらすＧＦＣ基材に、弱い相互作用をもたらす基をあえて存在させることで良好な分離と高い回収率を両立させるという試みについては、昭和電工株式会社からＡｓａｈｉｐａｋ ＧＳ−３２０が市販されている。このカラムはポリマーを基材とし、ポリマーの主鎖であるポリビニルアルコールによって弱い疎水性を、また表面に残存するカルボキシル基によって弱いカチオン交換性を、それぞれ結果的に付与し、ユニークな分離を実現している。ただし、ポリマーを基材としているために溶媒による膨潤・収縮が避けられず、上述カラムについても使用溶媒に制限がある。具体的にはアセトニトリル濃度は５０％が上限とされている。また、残存するイオン交換性の基や、ポリマー主鎖の性質を利用するために、幅広いイオン交換性や疎水性を充填剤に付与することができない。
一方、シリカゲルを基材とする場合には、溶媒の制限は無く、さらに、ＧＦＣ基材において極めて重要な要素である細孔径の均一さについては、重合体を基材とするよりもシリカゲルを基材とする方が優れている。
【００２１】
【特許文献１】特開２０００−２７９５１２号公報
【特許文献２】特開２００２−９８６７６号公報
【特許文献３】特開平９−３１３２号公報
【特許文献４】特開平１０−２９８２４０号公報
【特許文献５】特表平７−５０９１７３号公報
【非特許文献１】Ｊｉａｎ  Ｒ．Ｌｕ等、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００１、１７、３３８２−３３８９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本願発明は、上述の問題点を解決するために、タンパク質・ペプチドの高回収率と、イオン交換相互作用または疎水性相互作用による高分離能を両立し、かつ、充填剤基材の細孔特性を失うことなく耐久性にも優れた無機マトリックスを基材とする充填剤の開発を目的とするもので、タンパク質を変性させることのない、高回収率及び高分離能の新規充填剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
すなわち、本発明は、下記式（１）で示される化合物と、下記式（２）で示される化合物とが、基材表面に直接的に共有結合していることを特徴とするクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。
（１）
【化８】
2005337713.tif 000002
Ｒは炭素数１〜３０の任意の修飾鎖を表す。修飾鎖の任意の位置に、枝分かれ構造、不飽和結合、ベンゼン核、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子、塩素原子、フッ素原子、臭素原子を一つ以上有しても良く、また、これらの組み合わせを有して良い。具体的には、炭素−炭素二重結合または三重結合、ベンゼン核、二級または三級アミン、カルボニル、エーテル結合、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、尿素結合、リン酸エステル、シロキサン結合のうち一種以上含んでも良く、そのＣ−Ｈ結合のうち一つまたはそれ以上が塩素原子、臭素原子、フッ素原子によって置換されていても良い。
すなわち、式（１）は炭素骨格の炭素原子数が１〜３０であって、その修飾鎖に上記ホスホリルコリン基を一つ以上有するホスホリルコリン基含有化合物であれば良い。
（２）
【化９】
2005337713.tif 000003
Ｒ’は炭素数１〜３０の任意の修飾鎖を表す。修飾鎖の任意の位置に、枝分かれ構造、不飽和結合、ベンゼン核、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子、塩素原子、フッ素原子、臭素原子を一つ以上有しても良く、また、これらの組み合わせを有して良い。具体的には、炭素−炭素二重結合または三重結合、ベンゼン核、二級または三級アミン、カルボニル、エーテル結合、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、尿素結合、リン酸エステル、シロキサン結合のうち一種以上含んでも良く、そのＣ−Ｈ結合のうち一つまたはそれ以上が塩素原子、臭素原子、フッ素原子によって置換されていても良い。
すなわち、式（２）は炭素骨格の炭素原子数が１〜３０であって、その修飾鎖上にカルボキシル基を一つ以上有する化合物であれば良い。
【００２４】
また、本発明は、下記式（１）で示される化合物と、下記式（３）で示される化合物とが、基材表面に直接的に共有結合していることを特徴とするクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。
（１）
【化１０】
2005337713.tif 000004
Ｒは炭素数１〜３０の任意の修飾鎖を表す。修飾鎖の任意の位置に、枝分かれ構造、不飽和結合、ベンゼン核、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子、塩素原子、フッ素原子、臭素原子を一つ以上有しても良く、また、これらの組み合わせを有して良い。具体的には、炭素−炭素二重結合または三重結合、ベンゼン核、二級または三級アミン、カルボニル、エーテル結合、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、尿素結合、リン酸エステル、シロキサン結合のうち一種以上含んでも良く、そのＣ−Ｈ結合のうち一つまたはそれ以上が塩素原子、臭素原子、フッ素原子によって置換されていても良い。
すなわち、式（１）は炭素骨格の炭素原子数が１〜３０であって、その修飾鎖に上記ホスホリルコリン基を一つ以上有するホスホリルコリン基含有化合物であれば良い。
（３）
【化１１】
2005337713.tif 000005
Ｒ’は炭素数１〜３０の任意の修飾鎖を表す。修飾鎖の任意の位置に、枝分かれ構造、不飽和結合、ベンゼン核、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子、塩素原子、フッ素原子、臭素原子を一つ以上有しても良く、また、これらの組み合わせを有して良い。具体的には、炭素−炭素二重結合または三重結合、ベンゼン核、二級または三級アミン、カルボニル、エーテル結合、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、尿素結合、リン酸エステル、シロキサン結合のうち一種以上含んでも良く、そのＣ−Ｈ結合のうち一つまたはそれ以上が塩素原子、臭素原子、フッ素原子によって置換されていても良い。
すなわち、式（３）は炭素骨格の炭素原子数が１〜３０であって、その修飾鎖にスルホン酸基を一つ以上有する化合物であれば良い。
【００２５】
さらに、本発明は、下記式（１）で示される化合物と、下記式（４）で示される化合物とが、基材表面に直接的に共有結合していることを特徴とするクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。
（１）
【化１２】
2005337713.tif 000006
Ｒは炭素数１〜３０の任意の修飾鎖を表す。修飾鎖の任意の位置に、枝分かれ構造、不飽和結合、ベンゼン核、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子、塩素原子、フッ素原子、臭素原子を一つ以上有しても良く、また、これらの組み合わせを有して良い。具体的には、炭素−炭素二重結合または三重結合、ベンゼン核、二級または三級アミン、カルボニル、エーテル結合、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、尿素結合、リン酸エステル、シロキサン結合のうち一種以上含んでも良く、そのＣ−Ｈ結合のうち一つまたはそれ以上が塩素原子、臭素原子、フッ素原子によって置換されていても良い。
すなわち、式（１）は炭素骨格の炭素原子数が１〜３０であって、その修飾鎖に上記ホスホリルコリン基を一つ以上有するホスホリルコリン基含有化合物であれば良い。
（４）
【化１３】
2005337713.tif 000007
Ｒ’は炭素数１〜３０の任意の修飾鎖を表す。修飾鎖の任意の位置に、枝分かれ構造、不飽和結合、ベンゼン核、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子、塩素原子、フッ素原子、臭素原子を一つ以上有しても良く、また、これらの組み合わせを有して良い。具体的には、炭素−炭素二重結合または三重結合、ベンゼン核、二級または三級アミン、カルボニル、エーテル結合、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、尿素結合、リン酸エステル、シロキサン結合のうち一種以上含んでも良く、そのＣ−Ｈ結合のうち一つまたはそれ以上が塩素原子、臭素原子、フッ素原子によって置換されていても良い。
すなわち、炭素骨格の炭素原子数が１〜３０であって、その修飾鎖上に４級アンモニウム基を一つ以上有する化合物であれば良い。
また、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は、それぞれ独立に、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基である。
【００２６】
さらに、本発明は、下記式（１）で示される化合物と、飽和アルキル基または不飽和アルキル基または芳香族化合物とが、基材表面に直接的に共有結合していることを特徴とするクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。
なお、飽和アルキル鎖および不飽和アルキル鎖とは炭素数１〜３０のものであり、芳香族化合物とは、例えば、フェニルプロピル基やナフチル基といったベンゼン核、またはピロール環、ピリジン環といった複素環である。
（１）
【化１４】
2005337713.tif 000008
Ｒは炭素数１〜３０の任意の修飾鎖を表す。修飾鎖の任意の位置に、枝分かれ構造、不飽和結合、ベンゼン核、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子、塩素原子、フッ素原子、臭素原子を一つ以上有しても良く、また、これらの組み合わせを有して良い。具体的には、炭素−炭素二重結合または三重結合、ベンゼン核、二級または三級アミン、カルボニル、エーテル結合、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、尿素結合、リン酸エステル、シロキサン結合のうち一種以上含んでも良く、そのＣ−Ｈ結合のうち一つまたはそれ以上が塩素原子、臭素原子、フッ素原子によって置換されていても良い。
すなわち、式（１）は炭素骨格の炭素原子数が１〜３０であって、その修飾鎖に上記ホスホリルコリン基を一つ以上有するホスホリルコリン基含有化合物であれば良い。
【００２７】
また、本発明は、前記基材が、球状多孔質シリカゲルであることを特徴とする上記のクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。
【００２８】
さらに、本発明は、前記球状多孔質シリカゲルの平均粒径が１〜２００μｍであることを特徴とする上記のクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。
【００２９】
また、本発明は、前記球状多孔質シリカゲルの細孔の平均径が１０〜１０００オングストロームであることを特徴とする上記のクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤をＧＦＣモード（有機溶媒を含まず、３００ｍｍｏｌ／Ｌ程度の塩を含む移動相を用いるモード）で使用すると、タンパク質やポリペプチドの吸着が極めて少なく、高い分離能力を発揮する。
本来、イオン交換基やアルキル鎖といった生体試料との間に相互作用を及ぼす基はタンパク質の非特異的不可逆吸着をもたらすが、本発明のクロマトグラフィー用充填剤は生体試料との間に相互作用を及ぼす基および生体適合性の高いホスホリルコリン基を分子レベルで混在させることによってこれらの相互作用と高いタンパク質回収率を両立するものである。
【００３１】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、ホスホリルコリン基の有するタンパク質吸着抑制効果に加えてイオン交換性または/および疎水性を有している。したがってそれらの相互作用に応じた分離が可能であり、それら相互作用の強さは移動相の塩濃度やｐＨによって調整することができる上に、充填剤表面における両官能基の混合比率によっても任意に調整することが可能である。
【００３２】
ＧＦＣモードは移動相溶媒として水だけを用いるために、タンパク質の活性を保ったままの分離・分析方法として極めて重要なモードである。イオン交換基または疎水性基といったタンパク質・ペプチドと相互作用を及ぼす基だけが基材表面に存在する場合、有機溶媒を含まない移動相を用いるＧＦＣモードではタンパク質は非特異的不可逆吸着を起こす。一方、その表面にホスホリルコリン基が存在することによってタンパク質の回収率は格段に向上し、一般のＧＦＣカラムと同等以上のタンパク質回収率を得ることができる。
【００３３】
加えて、本発明の表面修飾方法は基材表面を重合体で覆う方法とは異なり、ホスホリルコリン基および、タンパク質、ペプチドといった生体試料との間に相互作用を及ぼす基を低分子のまま導入するために、基材表面を単分子層レベルの厚みで修飾し、かつ、基材固有の細孔形状を維持することができる。グラジェントによる溶出を行わず、一定の組成の移動相を流し続けるアイソクラティックな条件においては、高理論段数を得るためには基材の細孔径の均一さが重要であり、本発明の方法ではそれを失うことなく、極めて良好なピーク形状を得ることができる。
【００３４】
さらには、本発明の表面修飾方法は基材表面を重合体で覆う方法と比べて、基材表面と修飾鎖が共有結合をしているために、耐久性が極めて良好である。
【００３５】
ＧＦＣモードは有機溶媒を用いず、酸性やイオン強度の強い溶離液を流さなくとも分析対象物質を回収することができる。したがってタンパク質を失活させずにこれらを分離、精製できることから、未知生体試料の単離や医療用途の面でも本発明のカラム充填剤の高分離能が役立つことが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤において、式（１）のホスホリルコリン基を有する化合物と、式（２）〜（４）のイオン交換性の基を有する化合物および、飽和アルキル基または不飽和アルキル基またはフェニル基・ベンゼン核とが基材表面に直接的に共有結合しているとは、両者が基材表面に化学的な結合状態によって導入されていることを意味し、両者を有する重合体で被覆することにより両者を導入した基材は含まないという意味である。化学的な結合は特に限定されない。
【００３７】
式（１）に示した官能基を導入するためには、下記式（５）または（６）で示されるホスホリルコリン基含有化合物によりシリカゲルにホスホリルコリン基を導入する方法が好ましい。導入に際しては化合物（５）だけでよく、（６）が混在しても良い。以下に下記式（５）または（６）の製造方法について説明する。
（５）
【化１５】
2005337713.tif 000009
（６）
【化１６】
2005337713.tif 000010
式中、ｍは２〜６、ｎは１〜４である。ＯＭｅは、ＯＥｔ、Ｃｌであってもよい。またＳｉと結合するＯＭｅまたはＯＥｔまたはＣｌの内、２つまではメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基でも良い。
【００３８】
「式（５）または（６）のホスホリルコリン基含有化合物の製造方法」
下記式（７）に示したホスホリルコリン誘導体を蒸留水に溶解させる。下記式（３）のホスホリルコリン誘導体は公知の化合物であり市販品を入手することができる。
（７）
【化１７】
2005337713.tif 000011
【００３９】
式（７）の化合物の水溶液を氷水浴中で冷却し、過ヨウ素酸ナトリウムを式（７）の化合物に対して２当量添加し、５時間攪拌した。反応液を減圧濃縮、減圧乾燥し、メタノールにより下記式（８）に示すアルデヒド基を有するホスホリルコリン誘導体を抽出する。構造式及び１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１に示す。なお、式（８）の化合物は、水中において式（９）の化合物と平衡状態であるので、実際のスペクトルは式（８）と（９）の双方を反映したものとなる。
（８）
【化１８】
2005337713.tif 000012
（９）
【化１９】
2005337713.tif 000013
【００４０】
次に、式（８）のメタノール溶液に３−アミノプロピルトリメトキシシランを０．５当量添加する。この混合溶液を室温で所定時間撹拌したのち、氷冷し、シアノヒドロホウ素化ナトリウムを２当量添加し、室温に戻して１６時間撹拌する。この間も反応容器には乾燥窒素を流し続ける。沈殿をろ過した後、式（５）及び／又は式（６）のメタノール溶液を得る。
【００４１】
上記の手順は、式（５）または（６）に示した化合物中のｍ、ｎが変わっても全く同様に行うことができる。ここで示した手順はｍ＝３、ｎ＝２の場合である。反応溶媒は特に限定されず、上述したメタノール以外にも水や、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（略称：ＤＭＦ）やジメチルスルホキシド（略称：ＤＭＳＯ）などの非プロトン性溶媒を用いることができる。ただし、反応中の重合を防ぐためには脱水溶媒が好ましく、なかでも脱水メタノールが好適である。
また、（５）または（６）中のメトキシ基（ＯＭｅ）がエトキシ基（ＯＥｔ）の場合はメタノールをエタノールに変えて反応を行い、Ｃｌの場合はジメチルホルムアミドやジメチルスルホキシドに変更するだけでよい。
さらには、Ｓｉと結合するＯＭｅまたはＯＥｔまたはＣｌの内、２つまたは１つがメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基のいずれかで置換されている場合も上記の手法と全く同様に製造することができる。
【００４２】
「ホスホリルコリン基とカルボキシル基が基材表面に直接的に共有結合した充填剤の製造」
式（５）及び／又は（６）の化合物のメタノール溶液と、タンパク質やペプチドなどに対して相互作用を及ぼす基を有するシランカップリング剤を混合してシリカゲルに導入することで、極めて簡便に目的の機能を有する充填剤を製造することができる。
具体的には、基材表面に存在する水酸基と、式（５）および（６）の化合物や市販のシランカップリング剤のメトキシ基、エトキシ基との脱水反応によってホスホリルコリン基および相互作用を有する基を同時に基材表面に導入する。ここで、相互作用を有する基とはイオン交換性を有するか、イオン化が可能な官能基、または疎水性相互作用を有する飽和アルキル基、不飽和アルキル基、フェニル基などを示す。
【００４３】
トリエトキシシリルプロピル無水コハク酸（アヅマックス株式会社）０．７３ｇ をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１０ｍＬ（和光純薬工業）に溶解させ、４ｍＬの蒸留水と４−ジメチルアミノピリジン０．３５ｇを添加し、１６時間室温で撹拌し、下記式（９）に示したカルボキシル基を有するシランカップリング剤を得る。本反応は無水コハク酸の４−ジメチルアミノピリジンによる加水分解反応であり、公知の反応である。
（１０）
【化２０】
2005337713.tif 000014
【００４４】
式（５）および（６）の化合物４．８ｍｍｏｌを含むメタノール溶液に上述の式（１０）に示す化合物を含む溶液を添加する。さらに蒸留水２０ｍＬと平均粒子径５μｍ、平均細孔径３００オングストローム、比表面積１００ｍ2／ｇの球状高純度シリカゲル（洞海科学製）４．０ｇを添加し、オイルバス中８０℃で５時間還流する。その後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５０％水溶液５０ｍＬと、メタノール５０ｍＬでろ過洗浄し、８０℃で３時間減圧乾燥させ、目的とする粉体を得る。反応溶媒は水-メタノール混合溶液以外にも、水、エタノール、２−プロパノール等のプロトン性溶媒や、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、トルエン、ジエチルエーテル等の非プロトン性溶媒を使用でき、さらにはこれらを単一、または組み合わせて用いることができる。
【００４５】
なお、基材表面に水酸基が存在しない場合は、式（５）および（６）の化合物を揮発性溶媒に溶解させ、その溶液を物質表面に塗布後、溶媒を乾燥させる方法が有効である。具体的には、式（５）および（６）の化合物のメタノール溶液（０．３ｍｍｏｌ／ｍＬ）を物質の比表面積応じて適量を直接物質に塗布する。次に自然乾燥、加熱乾燥等によりメタノールを気化させる。このとき、式（５）および（６）の化合物のＳｉ−ＯＭｅどうしが脱水反応を起こし、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ結合を生成し、物質表面を覆うことが可能である。この脱水反応は公知である。メタノールの揮発の際にこのように生成する膜は、ほとんどの物質表面に微量に存在する水酸基とも所々で結合を生じるために比較的強靱に表面改質を行うことができる。本法は水酸基を持たない物質のみならず、水酸基を有する物質についても極めて有効な表面改質法である。
【００４６】
すでに開示された技術である、モノマーをシリカゲル表面に密着させ、そのままモノマーを重合させることでシラノール基を不活性化する方法や、イオン交換体の表面を非イオン性の極性物質で被覆したイオン交換体を得る方法では、シリカゲル表面に均一な単分子層を形成させることが困難であり、シリカゲルを基材に用いる場合の利点である細孔径の均一さを活用することができない。すなわちモノマーの重合時に不均一な凹凸を形成することから、実効細孔径にばらつきが生じたり、細孔自体がポリマーで埋め尽くされたりする場合がある。また、基材表面を被覆しているポリマーと基材表面との間に共有結合が存在しないことから、耐久性の面で問題がある。
【００４７】
一方、本発明の方法ではシランカップリング剤による表面処理であるために基材表面に単分子層とほぼ同等の厚さで表面修飾を行うことができる。さらに、シランカップリング剤と基材表面に強固な共有結合を形成するために耐久性も極めて良好である。基材がシリカゲルである場合には強固なＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合を形成する。式（５）および（６）の化合物を用いることで、これまでは困難であったタンパク質の吸着を抑制する効果に優れたホスホリルコリン基の単分子レベルでの導入と、相互作用をもたらす一般的なシランカップリング剤との混在が容易になった。さらには式（５）および（６）の化合物と相互作用をもたらす基の混合比についても自由に設定することができる。
本発明における式（５）および（６）の化合物と、生体試料に相互作用を及ぼす基との混合比率は、（５）および（６）の化合物のモル比にして５％〜９５％である。
【００４８】
カルボキシル基をホスホリルコリン基と混在させた粉体は式（１０）に示した化合物を用いる他に、以下の示すような方法によっても可能である。具体例（Ａ〜Ｄ）を以下に示す。
Ａ：３−シアノプロピルトリメトキシシラン（アヅマックス株式会社）を、式（５）および（６）の化合物を含むメタノール溶液と所定の割合で混合し、シリカゲルを加えて８０℃で５時間還流する。次いでメタノールにてろ過洗浄し、シアノプロピル基とホスホリルコリン基の混在した粉体を得る。次に得られた粉体を５％塩酸水溶液（和光純薬工業株式会社）に分散させ、５時間、８０℃で撹拌し、シアノ基をカルボキシル基に変換することでホスホリルコリン基とカルボキシル基が混在した粉体を得ることができる。なお、シアノ基の塩酸水溶液によるカルボキシル基への変換は公知の反応である。
Ｂ：３−アミノプロピルトリメトキシシラン（アヅマックス株式会社）を、式（５）および（６）の化合物を含むメタノール溶液と所定の割合で混合し、シリカゲルを加えて８０℃で５時間還流する。次いでメタノールにてろ過洗浄し、アミノプロピル基とホスホリルコリン基の混在した粉体を得る。次に得られた粉体をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（和光純薬工業株式会社）に分散し、カルボキシル基を保護基で保護したアミノ酸と、カルボニルジイミダゾール（和光純薬工業株式会社）、トリエチルアミン（和光純薬工業株式会社）各１等量を添加、室温で２時間攪拌することでホスホリルコリン基とカルボキシル基が混在した粉体を得ることができる。なお、アミノ基同士のカルボニルジイミダゾールによる尿素結合形成反応は公知の反応である。
Ｃ：３−アミノプロピルトリメトキシシラン（アヅマックス株式会社）を、式（５）および（６）の化合物を含むメタノール溶液と所定の割合で混合し、シリカゲルを加えて８０℃で５時間還流する。次いでメタノールにてろ過洗浄し、アミノプロピル基とホスホリルコリン基の混在した粉体を得る。次に、得られた粉体をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（和光純薬工業株式会社）に分散し、無水コハク酸（和光純薬工業株式会社）または無水マレイン酸（和光純薬工業株式会社）を一当量と、ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）（和光純薬工業株式会社）１．２当量、ＷＳＣ・ＨＣｌ（１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（和光純薬工業株式会社）１．２当量を０℃下で添加することでホスホリルコリン基とカルボキシル基が混在した粉体を得ることができる。
Ｄ：Ｎ−（トリメトキシシリルプロピル）−Ｏ−ポリエチレンオキサイドウレタン（アヅマックス株式会社）を、式（５）および（６）の化合物を含むメタノール溶液と所定の割合で混合し、シリカゲルを加えて８０℃で５時間還流する。次いでメタノールにてろ過洗浄し、ヒドロキシル基とホスホリルコリン基の混在した粉体を得る。得られた粉体を１％水酸化ナトリウム水溶液に分散させ、２−ブロモ酢酸を１．２当量添加し、８０℃で５時間還流することでホスホリルコリン基とカルボキシル基が混在した粉体を得ることができる。
【００４９】
本発明で使用する基材には、シリカ、シリカゲル、活性炭、ゼオライト、アルミナ、粘土鉱物等の無機多孔質体、多孔質の有機高分子樹脂がある。基材は粉体が好ましい。好ましくは球型または破砕型多孔質シリカゲルである。球状多孔質シリカゲルの平均粒径は１〜２００μｍ、好ましくは１〜１０μｍ、球状多孔質シリカゲルの細孔の平均径が１０〜５００オングストローム、好ましくは８０〜３００オングストロームで、比表面積は５０〜８００ｍ2／ｇ、好ましくは１００〜６００ｍ2／ｇである。
【００５０】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤をＧＦＣ用カラムとして使用すると、タンパク質やポリペプチドの吸着が極めて少なく、かつ、イオン交換相互作用又は／および疎水性相互作用による高い分離能力を発揮する。相互作用を及ぼす基の配合について製造上の制約がないことから、アニオン交換性、カチオン交換性、疎水性、π電子相互作用など、様々な特性を任意の割合で導入することが可能である。
【００５１】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、試料の持つ微弱な電荷や疎水性の違いに基づいた、より高い分離能力を有するカラム充填剤である。このように、ホスホリルコリン基が相互作用を及ぼす基と分子レベルで混在した充填剤はこれまでに例が無く、全く新しいタイプのマルチモードカラム充填剤であると言える。移動相のｐＨや塩濃度を変化させることによって充填剤表面とタンパク質およびポリペプチドとの相互作用の強さを任意に制御することも可能であり、さらには幅広い条件においてＧＦＣカラムと同等以上のタンパク質回収率を有する。移動相のｐＨや塩濃度を最適化することで目的とするタンパク質やポリペプチドを自在に保持させることができる。本発明のクロマトグラフィー用充填剤で用いることのできるＧＦＣモードはタンパク質や酵素を失活させずにこれらを分離、精製できることから、未知生体試料の単離や医療用途の面でも本発明のカラム充填剤の高分離能および高回収率が役立つことが期待される。
【００５２】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、具体的には、タンパク質およびポリペプチドの吸着が極めて少ない高分離能カラム充填剤として、例えばヒト血清中のタンパク質の分離、または、タンパク質をトリプシン消化して得られた試料に含まれるポリペプチドの分離、または生体中に含まれる未知タンパク質の活性評価に基づいた分離・分取に優れている。
また、タンパク質、ペプチドのみならず、アミノ酸や生体ホルモンなど親水性の強い低分子化合物の分離にも適用することができる。ホスホリルコリン基の極めて強い親水性により、有機溶媒を含む移動相条件において、これらの分析対象物質と親水性相互作用による分離を達成することができる。この際、表面に存在するホスホリルコリン基以外の相互作用を及ぼす基によるイオン交換性や疎水性およびπ電子相互作用によって、より優れた分離を達成することができる。
【実施例】
【００５３】
次に本発明を実施例に基づきさらに詳しく説明する。なお、本発明はこれらの実施例に
限定されるものではない。
【００５４】
「合成例１  ホスホリルコリン基を含有するアルデヒド化合物」
Ｌ−α−グリセロホスホリルコリン（４５０ｍｇ）を蒸留水１５ｍｌに溶解し、氷水浴中で冷却した。過ヨウ素酸ナトリウム（７５０ｍｇ）を添加し、５時間攪拌した。反応液を減圧濃縮、減圧乾燥し、メタノールにより目的物を抽出した。下記化合物（８）に構造を示す。式（８）の化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１に示す。なお、式（８）の化合物は、水中において式（９）の化合物と平衡状態であるので、実際のスペクトルは式（８）と（９）の双方を反映したものとなる。
（８）
【化２１】
2005337713.tif 000015
（９）
【化２２】
2005337713.tif 000016
【００５５】
「合成例２：式（５）および（６）の化合物の製造」
合成例１の化合物７．５ｇを脱水したメタノール３０ｍＬに溶解させ、容器内を乾燥窒素で置換する。次に、化合物１のメタノール溶液に３−アミノプロピルトリメトキシシランを３．６ｇ添加した。この混合溶液を、室温で５時間撹拌したのち、氷冷し、シアノヒドロホウ素化ナトリウム２．５ｇを添加し、室温に戻して１６時間撹拌した。この間も反応容器には乾燥窒素を流し続けた。沈殿をろ過した後、目的物質である下記式（１１）および（１２）の化合物のメタノール溶液を得た。
（１１）
【化２３】
2005337713.tif 000017
（１２）
【化２４】
2005337713.tif 000018
【００５６】
「合成例３：式（９）の化合物の製造」
式（２）の化合物としてトリエトキシシリルプロピル無水コハク酸（アヅマックス株式会社）０．７３ｇ をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１０ｍＬ（和光純薬工業）に溶解させ、４ｍＬの蒸留水と４−ジメチルアミノピリジン０．３５ｇを添加し、１６時間室温で撹拌し、下記式（９）に示したカルボキシル基を有するシランカップリング剤を得た。本反応は無水コハク酸の４−ジメチルアミノピリジンを触媒とする加水分解反応であり、公知の反応である。
（１０）
【化２５】
2005337713.tif 000019
【００５７】
「実施例１：クロマトグラフィー用充填剤の製造」
式（１１）および（１２）の化合物４．８ｍｍｏｌを含むメタノール溶液に上述の式（１０）に示す化合物を含む溶液を添加した。さらに蒸留水２０ｍＬと平均粒子径５μｍ、平均細孔径３００オングストローム、比表面積１４０ｍ2／ｇの球状高純度シリカゲル（洞海科学製）４．０ｇを添加し、オイルバス中８０℃で５時間還流する。その後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５０％水溶液５０ｍＬと、メタノール５０ｍＬでろ過洗浄し、８０℃で３時間減圧乾燥させ、目的とするクロマトグラフィー用充填剤を得た。反応溶媒は水-メタノール混合溶媒以外にも、水、エタノール、２−プロパノール等のプロトン性溶媒や、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、トルエン、ジエチルエーテル等の非プロトン性溶媒を使用でき、さらにはこれらを単一、または組み合わせて用いることができる。
【００５８】
「リンの定量によるＰＣ基導入の証明」
実施例１で製造したホスホリルコリン基およびカルボキシル基を表面に有する改質粉体からなるクロマトグラフィー用充填剤のリン元素の定量を行った。本発明の製造方法においてリン元素はホスホリルコリン基固有の元素であり、粉体表面に存在するリン元素を定量することで実際に導入されたホスホリルコリン基を定量することができる。
リン元素の定量はモリブデン酸発色法によって行った。以下に定量方法を説明する。
１）  所定量の粉体を十分洗浄した試験管に計りとる。
２）  １の粉体に６０％過塩素酸水溶液を３ｍＬ添加する。
３）  液の気散を避けるため、２の試験管上部に冷却管を取り付け、１２０℃で１時間、次いで１８０℃で２時間加熱する。本操作にて粉体表面の修飾鎖をすべて酸化させ、特にリン元素についてはリン酸として遊離させる。
４）  ３の溶液を遠心分離機にかけ（３０００ｒｐｍ，５分）、上清を１ｍＬサンプルチューブに移す。
５）  ４の溶液に蒸留水１ｍＬと０．５Ｍのモリブデン酸ナトリウムを５００μＬ、および０．５Ｍのアスコルビン酸を５００μＬ添加する。
６）  ５の溶液を９５℃の湯浴にて５分間熱し、その後冷水で冷却する。
７）  ６の発色済み溶液を９６穴プレートに２００μＬ滴下し、プレートリーダにて７１０ｎｍにおける発色強度を測定する。
８）  あらかじめ既知の濃度のリン酸溶液の発色強度から得た検量線を元に、サンプルに含まれるリン元素の量を定量する。
本定量で用いた検量線を図２に示す。
また、実施例１で製造したホスホリルコリン基とカルボキシル基を表面に有する改質粉体からなるクロマトグラフィー用充填剤におけるリン定量の結果を「表１」に示す。
【表１】
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「表１」より、実施例１のクロマトグラフィー用充填剤では、０．１２ｍｍｏｌ／ｇgelのリン元素を含有することが分かる。このことから、クロマトグラフィー用充填剤には、その表面に０．１２ｍｍｏｌ／ｇgelのホスホリルコリン基が直接結合して導入されたことが分かる。
【００５９】
「ＦＴ−ＩＲスペクトルによるカルボキシル基導入の証明」
次に、実施例１のクロマトグラフィー用充填剤のＦＴ−ＩＲスペクトルを図３に示す。図３によれば１７２５ｃｍ-1付近と１５６０ｃｍ-1付近にカルボキシル基の特性吸収が確認され、カルボキシル基が導入されたことが分かる。
以上、リン元素の定量およびＦＴ−ＩＲスペクトルにおけるカルボキシル基の特性吸収の存在から、実施例１のクロマトグラフィー用充填剤はホスホリルコリン基とカルボキシル基を表面に直接的に共有結合していることがわかる。
【００６０】
「実施例１のクロマトグラフィー用充填剤のカラム充填及び分離」
実施例１のクロマトグラフィー用充填剤を、通常のスラリー法により、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍのステンレス製エンプティカラムに充填した。
クロマトグラムの取得条件は次の通りである。
移動相：５０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸バッファー ＋ＮａＣｌ（所定濃度） ｐＨ６．９
流速：２００μＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
検出：ＵＶ  ２８０ｎｍ
【００６１】
「表２」に示した１２種類のタンパク質・ペプチドをそれぞれ、実施例１のクロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムに注入し、それらの溶出時間およびピーク面積から詳細な評価を行った。「表２」に、検討に用いたタンパク質・ペプチドと、それらの等電点（ｐI）、分子量、試料濃度を示す。
実施例１のカラムを、移動相のＮａＣｌ濃度が５００ｍｍｏｌ／ｌで用いた場合の分子量と溶出時間の関係を図４に示した。図４によれば本条件においては分子量の大きい物質ほど早く溶出することが分かる。移動相塩濃度が５００ｍｍｏｌ／ｌにおいてはタンパク質と充填剤表面との間に働く相互作用が極めて少ないために、結果として分子量順の溶出が起こるＧＦＣモードでの分離が行われたことが分かる。
【表２】
2005337713.tif 000021
【００６２】
次に移動相のＮａＣｌ濃度を２５０ｍｍｏｌ／ｌに低下させた条件下における分子量と溶出時間の関係を図５に示した。移動相のＮａＣｌ濃度を５００ｍｍｏｌ／ｌの場合である図４に比較して、一部のタンパク質の溶出時間が増加したことが分かる。移動相の塩濃度の低下によって具体的にどのようなタンパク質に保持が生じたかをイオン交換性の観点から明確にするために、溶出時間の増加率とタンパク質の等電点の関係を図６に示した。図６から明白なように、ホスホリルコリン基とカルボキシル基を表面に有する本発明のカラムは、等電点の高い塩基性タンパク質を保持する能力があることが分かる。この保持能力は塩濃度を低下させることで発現した。一般的にイオン交換相互作用は移動相の塩濃度が低いほど強くなることが知られている。よって、本発明のカラムによる塩基性タンパク質に対する特有の保持挙動はイオン交換性の相互作用に起因するものであり、具体的には充填剤表面に存在するカルボキシル基によるカチオン交換能が発揮された結果である。
【００６３】
次に、式（１１）および（１２）だけを導入した粉体からなるクロマトグラフィー用充填剤との比較について述べる。本比較は、ホスホリルコリン基だけを導入した場合に対する、本発明の優位性を明確にするためのものである。
まず、式（１１）および（１２）だけを導入した粉体からなるクロマトグラフィー用充填剤の製造と充填について説明する。
「比較例１：式（１１）および（１２）のみを導入した粉体からなるクロマトグラフィー用充填剤の製造及びカラム充填」
合成例２で製造した式（１１）および（１２）の化合物を含むメタノール溶液に蒸留水３５ｍＬを加え、さらに平均粒子径５μｍ、平均細孔径３０ｎｍで比表面積が１４０ｍ2／ｇのシリカゲルを１４ｇ添加した。この粉体分散溶液を８０℃で５ｈ還流させ、カップリングさせた。還流の後メタノール１００ｍＬでろ過洗浄し、目的物質を得た。以上の手順で、実施例１の表面改質剤で処理した改質粉体の元素分析値を「表３」に示す。表中のＣ％またはＮ％とは、粉体に含まれる炭素元素または窒素元素の質量％を示している。この値から、表面処理後の炭素と窒素の原子数比（Ｃ／Ｎ）は５．０８となる。式（１１）および（１２）の表面改質剤がカップリングした後のＣ／Ｎは５であるから、表面改質剤が破壊されることなく粉体に導入されたことを示している。製造した改質粉体を、クロマトグラフィー用充填剤として、通常のスラリー法により、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍのエンプティカラムに充填した。
【表３】
2005337713.tif 000022
【００６４】
「比較試験１：相互作用を及ぼす基を混在させることで得られる効果」
実施例１のクロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムと、比較例１で製造した式（１１）および（１２）のみを導入した粉体を充填したカラムとを、実施例１で評価に用いた１２種類のタンパク質により評価、比較を行った。
比較例１で製造した式（１１）および（１２）のみを導入した粉体を充填したカラムにおいて移動相ＮａＣｌ濃度を５００ｍｍｏｌ／ｌから２５０ｍｍｏｌ／ｌに低下させた場合の各タンパク質の溶出時間増加率を図７に示した。実施例１で製造したクロマトグラフィー用充填剤のカラムとは図６と図７によって比較することができる。具体的には、（１）比較例１で製造した粉体を充填したカラムでは等電点の低い酸性タンパク質が保持され（図７）、（２）実施例１のクロマトグラフィー用充填剤のカラムにおいては、等電点の高い塩基性タンパク質が保持された（図６）。（１）はホスホリルコリン基および修飾鎖に含まれる２級アミンに起因するアニオン交換相互作用による保持であり、（２）については「相互作用を及ぼす基」としてホスホリルコリン基と混在させて導入したカルボキシル基によるカチオン交換相互作用である。
【００６５】
さらに両者の違いを明確にするために、ヒト血清アルブミンとリゾチームを各塩濃度にて注入したときのクロマトグラムを図８に示す。図８から明らかなように、比較例１で製造した粉体はホスホリルコリン基およびスペーサーに存在する２級アミンの影響からアニオン交換能を有し、負の電荷を帯びたヒト血清アルブミンを低塩濃度において保持する傾向があり、一方、実施例１で製造したクロマトグラフィー用充填剤はカルボキシル基の影響からカチオン交換能を有し、正の電荷を帯びたシトクロムＣを低塩濃度において保持する傾向にあることが分かる。本発明のカラム充填剤は、従来のホスホリルコリン基のみを導入した粉体においては不可能であったカチオン交換能を付与するという、全く新しい充填剤である。
【００６６】
「比較試験２：一般的なＧＦＣ用カラムとの溶出時間および回収率の比較」
市販品のクロマトグラフィー用カラム（Ｓｈｏｄｅｘ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＫＷ８０３、昭和電工株式会社製）を市販の状態のまま用いてヒト血清試料（コンセーラＮ（製品名）を蒸留水にて二倍に希釈した）中のタンパク質の分離を試みた。比較例で挙げた本カラムは、実施例１で述べたカラムと同じ内径と長さである。
この充填剤は多孔性シリカゲルの表面に、親水性基を共有結合させたサイズ排除モード用の充填剤であると説明されている。平均細孔径３００オングストローム、平均粒子径５μｍであり、実施例１で述べた充填剤との比較に好適である。分子量１万から数十万のタンパク質の分離に適していると説明されている。
Ｓｈｏｄｅｘ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＫＷ８０３は、非解離性の親水性基を用いているために、本願発明の表面改質剤を用いて調製した充填剤と違って電荷を帯びた官能基を有していない。したがってタンパク質とのイオン的な相互作用はほとんど無いと考えられる。
実施例１と同様に、５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸バッファー（Ｎａ2ＨＰＯ4及びＫＨ2ＰＯ4から調製）に５００ｍｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウムを加えた移動相を用い、流速を０．１ｍｌ／ｍｉｎ、カラムオーブン温度２５℃にてヒト血清アルブミン（５ｍｇ／ｍｌ）およびリゾチーム（１ｍｇ／ｍｌ）を注入した。検出はＵＶ２８０ｎｍで行った。結果を図９に示す。
【００６７】
一般的なＧＦＣカラムであるＫＷ８０３では、塩濃度の低下による保持時間の変化は、酸性タンパク質であるヒト血清アルブミンおよび塩基性タンパク質であるリゾチームが共に観測されない。
一方、本願発明の実施例１では、従来のＧＦＣ用カラムとは異なり、塩基性タンパク質であるリゾチームのみが塩濃度の低下に伴って保持されることが分かる。これまで述べてきたように、この本願発明の粉体特有である塩基性タンパク質の保持は、ホスホリルコリン基と共存するカルボキシル基によるものである。これは、移動相条件を変化させることで、目的とするタンパク質を他の成分から分離できることを意味している。
【００６８】
さらに、ＫＷ８０３と本願発明の粉体を充填したカラムに各タンパク質をそれぞれ注入したときのピーク面積比較による回収率について述べる。「表２」に示したタンパク質、ペプチドの試料を用いて検討を行った。ＫＷ８０３に試料を注入したときのピーク面積を１００とした場合の、本願発明の実施例１のクロマトグラフィー用充填剤に試料を注入したときのピーク面積を「表４」に示す。
【表４】
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「表３」より明らかなように、本願発明のカラムにおいては検討したすべてのタンパク質について一般的なＧＦＣカラムと同等以上の回収率を誇る。γ-グロブリンを初めとする数種類のタンパク質については、既存のＧＦＣカラムよりも１０％以上回収率が高い。
移動相ＮａＣｌ濃度が５００ｍｍｏｌ／ｌの場合では、本願発明のカラム特有であるイオン交換性がほとんど現れないために相互作用が存在せず、回収率は極めて良好である。さらには、上述の通り塩基性タンパク質に保持が生じ始め、カチオン交換性を併発する条件である移動相ＮａＣｌ濃度が２５０ｍｍｏｌ／ｌの場合においても、一般に回収率が良いとされるＧＦＣカラム以上の回収率を誇る。本来タンパク質を吸着させる性質を有するカルボキシル基が存在しながらもこれほどまでに回収率が高いのは、カルボキシル基と分子レベルで共存するホスホリルコリン基の影響である。
このように、本来タンパク質・ペプチドの非特異的不可逆吸着をもたらす「相互作用を及ぼす基」であっても、ホスホリルコリン基と共存させることによって相互作用に基づいた分離と優れた回収率を両立させることができる。
【００６９】
「実施例２：ホスホリルコリン基およびスルホン酸基を基材表面に有するクロマトグラフィー用充填剤の製造」
式（３）の化合物はスルホン酸を有するシランカップリング剤であれば特に限定されないが、式（１３）に示す、３−（トリヒドロキシシリル）−１−プロパンスルホン酸（アヅマックス株式会社）による製造例について述べる。
（１３）
【化２６】
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合成例２で製造した式（１１）および（１２）の化合物４．８ｍｍｏｌを含むメタノール溶液に、式（３）の化合物として上記式（１３）に示す化合物を０．４０ｇ添加する。さらに蒸留水２０ｍＬと平均粒子径５μｍ、平均細孔径３００オングストローム、比表面積１４０ｍ2／ｇの球状高純度シリカゲル（洞海科学製）４．０ｇを添加し、オイルバス中８０℃で５時間還流する。その後、反応溶液をろ過し、次いで５０％メタノール水溶液５０ｍＬでろ過洗浄し、さらにメタノール５０ｍＬでろ過洗浄し、８０℃で３時間減圧乾燥させ、目的とする粉体を得る。反応溶媒は水-メタノール混合溶媒以外にも、水、エタノール、２−プロパノール等のプロトン性溶媒や、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、トルエン、ジエチルエーテル等の非プロトン性溶媒を使用でき、これらを単一、または組み合わせて用いることができる。なお、本粉体改質法は、式（１３）に示した化合物を用いずとも、スルホン酸および、シリカゲルに存在するシラノール基とシロキサン結合を形成する官能基を分子内に有するあらゆる化合物について全く同様に適用することが可能である。
【００７０】
「実施例３：ホスホリルコリン基および４級アンモニウム基を基材表面に有するクロマトグラフィー用充填剤の製造」
式（３）の化合物は４級アンモニウム基を有するシランカップリング剤であれば特に限定されないが、式（１４）に示す、Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（アヅマックス株式会社）による製造例について述べる。
（１４）
【化２７】
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合成例２で製造した式（１１）および（１２）の化合物４．８ｍｍｏｌを含むメタノール溶液に上述の式（１４）に示す化合物を０．６２ｇ添加する。さらに蒸留水２０ｍＬと平均粒子径５μｍ、平均細孔径３００オングストローム、比表面積１４０ｍ2／ｇの球状高純度シリカゲル（洞海科学製）４．０ｇを添加し、オイルバス中８０℃で５時間還流する。その後、反応溶液をろ過し、次いで５０％メタノール水溶液５０ｍＬでろ過洗浄し、さらにメタノール５０ｍＬでろ過洗浄し、８０℃で３時間減圧乾燥させ、目的とする粉体を得る。反応溶媒は水-メタノール混合溶媒以外にも、水、エタノール、２−プロパノール等のプロトン性溶媒や、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、トルエン、ジエチルエーテル等の非プロトン性溶媒を使用でき、これらを単一、または組み合わせて用いることができる。なお、本粉体改質法は、式（１４）に示した化合物を用いずとも、４級アンモニウムおよび、シリカゲルに存在するシラノール基とシロキサン結合を形成する官能基を分子内に有するあらゆる化合物について全く同様に適用することが可能である。
また、以下の方法によっても目的とする改質粉体を得ることができる。
合成例２で製造した式（１１）および（１２）の化合物４．８ｍｍｏｌを含むメタノール溶液に３−アミノプロピルトリメトキシシラン（アヅマックス株式会社）を０．７０ｇ添加する。さらに蒸留水２０ｍＬと平均粒子径５μｍ、平均細孔径３００オングストローム、比表面積１４０ｍ2／ｇの球状高純度シリカゲル（洞海科学製）４．０ｇを添加し、オイルバス中８０℃で５時間還流する。その後、反応溶液をろ過し、次いで５０％メタノール水溶液５０ｍＬでろ過洗浄し、さらにメタノール５０ｍＬでろ過洗浄し、８０℃で３時間減圧乾燥させ、アミノプロピル基とホスホリルコリン基の混在する粉体を得る。この粉体をトルエンに分散させ、ヨウ化メチルをアミノ基に対して５当量添加し、１００℃で５時間還流し、目的とする粉体を得ることができる。
【００７１】
「実施例４：ホスホリルコリン基およびブチル基を基材表面に有するクロマトグラフィー用充填剤の製造」
疎水性基による疎水性相互作用をホスホリルコリン基と混在させる場合については、任意の鎖長のアルキル鎖を導入することができる。本実施例では式（１５）に示す、n-ブチルトリメトキシシラン（アヅマックス株式会社）による製造例について述べる。
（１５）
【化２８】
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合成例２で製造した式（１１）および（１２）の化合物４．８ｍｍｏｌを含むメタノール溶液に上述の式（１５）に示す化合物を０．２０ｇ添加する。さらに蒸留水２０ｍＬと平均粒子径５μｍ、平均細孔径３００オングストローム、比表面積１４０ｍ2／ｇの球状高純度シリカゲル（洞海科学製）４．０ｇを添加し、オイルバス中８０℃で５時間還流する。その後、反応溶液をろ過し、次いで５０％メタノール水溶液５０ｍＬでろ過洗浄し、さらにメタノール５０ｍＬでろ過洗浄し、８０℃で３時間減圧乾燥させ、目的とする粉体を得る。反応溶媒は水-メタノール混合溶媒以外にも、水、エタノール、２−プロパノール等のプロトン性溶媒や、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、トルエン、ジエチルエーテル等の非プロトン性溶媒を使用でき、これらを単一、または組み合わせて用いることができる。なお、本粉体改質法は、式（１５）に示した化合物を用いずとも、炭素数１〜３０までの飽和または不飽和アルキル鎖および、シリカゲルに存在するシラノール基とシロキサン結合を形成する官能基を分子内に有するあらゆる化合物について全く同様に適用することが可能である。具体的にはｎ−オクタデシルトリメトキシシラン（アヅマックス株式会社）やｎ−オクチルトリメトキシシラン（アヅマックス株式会社）を疎水性相互作用をもたらす修飾鎖として全く同じ方法で適用することができる。
【００７２】
「実施例５：ホスホリルコリン基および芳香族化合物を基材表面に有するクロマトグラフィー用充填剤の製造」
疎水性およびπ電子相互作用相互作用をホスホリルコリン基と混在させる場合については、芳香族を分子内に有するシランカップリング剤を適用することで実現することができる。本実施例では式（１６）に示す、フェニルトリメトキシシラン（アヅマックス株式会社）による製造例について述べる。
（１６）
【化２９】
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合成例２で製造した式（１１）および（１２）の化合物４．８ｍｍｏｌを含むメタノール溶液に上述の式（１６）に示す化合物を０．１８ｇ添加する。さらに蒸留水２０ｍＬと平均粒子径５μｍ、平均細孔径３００オングストローム、比表面積１４０ｍ2／ｇの球状高純度シリカゲル（洞海科学製）４．０ｇを添加し、オイルバス中８０℃で５時間還流する。その後、反応溶液をろ過し、次いで５０％メタノール水溶液５０ｍＬでろ過洗浄し、さらにメタノール５０ｍＬでろ過洗浄し、８０℃で３時間減圧乾燥させ、目的とする粉体を得る。反応溶媒は水-メタノール混合溶媒以外にも、水、エタノール、２−プロパノール等のプロトン性溶媒や、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、トルエン、ジエチルエーテル等の非プロトン性溶媒を使用でき、これらを単一、または組み合わせて用いることができる。なお本粉体改質法は、芳香族化合物および、シリカゲルに存在するシラノール基とシロキサン結合を形成する官能基を分子内に有するあらゆる化合物についても全く同様に適用することが可能である。芳香族化合物とは例えばフェニル基、ナフチル基、ピレン、ピリジン環、ピロール環、フラン環などを示し、具体的な化合物としてはフェネチルトリメトキシシラン（アヅマックス株式会社）、トリフェニルエトキシシラン（アヅマックス株式会社）、Ｎ−（３−トリメトキシシリルプロピル）ピロール（アヅマックス株式会社）、ｍ−フェノキシフェニルジメトキシシラン（アヅマックス株式会社）、１−ナフチルトリメトキシシラン（アヅマックス株式会社）などの適用が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤の特徴は、ＧＦＣモードに起因する分子量の違いによる分離はもちろんのこと、アニオン交換性相互作用、カチオン交換性相互作用、疎水性相互作用、π電子相互作用を任意の強度で導入することができ、かつ、タンパク質・ペプチドの回収率が極めて優れているという点である。
さらに、これらの相互作用は移動相の塩濃度やｐＨ、有機溶媒濃度に応じて調節することができるために、タンパク質に応じたユニークな分離をすることが可能である。そのうえ、タンパク質が粉体表面に非可逆的吸着を起こすことがないので、タンパク質の変成、失活を伴うことなく分離・分取・分析することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】合成例１の化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２】実施例１でのリン元素の定量に用いた検量線である。
【図３】実施例１のクロマトグラフィー用充填剤のFT-IRスペクトルである。
【図４】実施例１のクロマトグラフィー用充填剤の溶出時間-分子量プロットである（移動相ＮａＣｌ濃度５００ｍｍｏｌ／ｌ）。
【図５】実施例１のクロマトグラフィー用充填剤の溶出時間-分子量プロットである（移動相ＮａＣｌ濃度２５０ｍｍｏｌ／ｌ）。
【図６】実施例１のクロマトグラフィー用充填剤における移動相NaCl濃度の低下に伴う溶出時間増加率とタンパク質等電点の関係を示した図である。
【図７】比較例１のクロマトグラフィー用充填剤における移動相NaCl濃度の低下に伴う溶出時間増加率とタンパク質等電点の関係を示した図である。
【図８】実施例１と比較例１のクロマトグラフィー用充填剤カラムによる、各塩濃度におけるヒト血清アルブミンとリゾチームのクロマトグラムである。
【図９】実施例１のクロマトグラフィー用充填剤とＫＷ８０３による、各塩濃度におけるヒト血清アルブミンとリゾチームのクロマトグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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