(57)【要約】【課題】生葉、荒茶、仕上げ茶を含む茶葉中の化学成分含量を簡易迅速に測定する測定方法を提供する。【解決手段】近赤外分光光度計を用いて目的とする化学成分濃度既知の茶葉の吸光度を測定し、この吸光度と前記茶葉中の化学成分の量との相関に関する情報に基づいて、化学成分濃度未知の茶葉の吸光度から化学成分濃度を算出することを特徴とする。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
茶葉中に含まれる化学成分の定量方法であって、１０００ｎｍから２５００ｎｍの近赤外領域の波長を用いて前記茶葉の吸光度を測定し、この吸光度と前記茶葉中の化学成分量との相関に関する情報に基づいて、化学成分濃度未知の茶葉の吸光度から化学成分濃度を算出することを特徴とする茶葉中に含まれる化学成分の定量方法。
【請求項２】
前記情報は、定期的又は常時更新するものであることを特徴とする請求項１に記載の茶葉中に含まれる化学成分の定量方法。
【請求項３】
前記化学成分は、カテキン類、プリン塩基、及びビタミン類からなる群から選ばれる１種以上の成分である請求項１又は２に記載の茶葉中に含まれる化学成分の定量方法。
【請求項４】
前記化学成分は、メチル化カテキンである請求項１から３いずれかに記載の茶葉中に含まれる化学成分の定量方法。
【請求項５】
茶葉中に含まれる化学成分の定量方法であって、
前記化学成分濃度が既知の複数の標準試料を、所定の波長を有する近赤外光を照射する近赤外分光光度計を用いて、前記標準試料の吸光度を測定する吸光度測定工程と、
この吸光度測定工程で測定したそれぞれの吸光度と、前記標準試料の化学成分濃度に基づいて単回帰法又は直線重回帰法の少なくともいずれか１つにより検量線を算出する検量線算出工程と、
化学成分濃度が未知の対象試料を前記標準試料と同じ波長における吸光度を測定し、この吸光度の値から前記検量線に基づいて前記対象試料の化学成分濃度を算出する濃度算出工程と、
を有することを特徴とする茶葉中に含まれる請求項１から４いずれかに記載の茶葉中に含まれる化学成分の定量方法。
【請求項６】
前記近赤外光の波長は、略１０００ｎｍから略２５００ｎｍである請求項５に記載の茶葉中に含まれる化学成分の定量方法。
【請求項７】
前記近赤外光の波長は、略１１００ｎｍから略２４００ｎｍである請求項５又は６に記載の茶葉中に含まれる化学成分の定量方法。
【請求項８】
前記検量線算出工程における前記検量線の精度（ＳＥＰ）が、０．４以下のものである請求項５から７いずれかに記載の茶葉中に含まれる化学成分の定量方法。
【請求項９】
茶葉中に含まれる化学成分を定量するプログラムであって、
この化学成分濃度が既知の複数の標準試料を、所定の波長を有する近赤外光を照射する近赤外分光光度計を用いて測定したそれぞれの吸光度と、前記標準試料の化学成分濃度に基づいて単回帰法又は直線重回帰法の少なくともいずれか１つにより検量線を算出するように指令する検量線算出工程と、
化学成分濃度が未知の対象試料を前記標準試料と同じ波長における吸光度の値から前記検量線に基づいて前記対象試料の化学成分濃度を算出するように指令する濃度算出工程と、
を有することを特徴とする茶葉中に含まれる化学成分の定量方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
【請求項１０】
茶葉中に含まれるメチル化カテキンを定量するプログラムであって、
このメチル化カテキン濃度が既知の複数の標準試料を、所定の波長を有する近赤外光を照射する近赤外分光光度計を用いて測定したそれぞれの吸光度と、前記標準試料のメチル化カテキン濃度に基づいて単回帰法又は直線重回帰法の少なくともいずれか１つにより検量線を算出するように指令する検量線算出工程と、
メチル化カテキン濃度が未知の対象試料を前記標準試料と同じ波長における吸光度の値から前記検量線に基づいて前記対象試料のメチル化カテキン濃度を算出するように指令する濃度算出工程と、
を有することを特徴とする茶葉中に含まれるメチル化カテキンの定量方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、茶葉中に含まれる化学成分の定量方法に関する。さらに詳しくは、メチル化カテキン、カフェイン及びビタミン類の含有量を近赤外分光光度計により簡易迅速に測定する方法を開発する。
【背景技術】
【０００２】
「べにふうき」、「べにふじ」、「べにほまれ」等の茶葉は、花粉症状を抑制するメチル化カテキンを多く含有しており、アレルギー抑制効果を有する飲料や食品として幅広く使用することができる。従って、これらの茶葉（生葉、荒茶、仕上げ茶等）に含まれている化学成分の含有量は、製造工程における品質管理のため迅速に測定する必要がある。例えば、茶葉中に含まれているメチル化カテキンの含有量は、５％未満である。このため、従来では測定方法として高速液体クロマトグラフ法（以下ＨＰＬＣ法とする）を用いていた（非特許文献１参照）。
【０００３】
ＨＰＬＣ法は、各種の固体または液体を固定相とし、固定相を含むカラムに液体移動相の加圧した流れを用いて試料を通過させ、その一端に置いた試料混合物を適当な展開剤（移動相ｍｏｂｉｌｅ  ｐｈａｓｅ）で移動させて、各成分の吸着性や分配係数の差異に基づく移動速度の差を利用してこれを相互分離する方法であり、これによって、マイクログラム量からグラム量の混合物を分離することが可能となる（非特許文献２参照）。
【０００４】
【非特許文献１】村松敬一郎編「茶の化学」朝倉書店  １９９７年９月１日  ｐ．１１９
【非特許文献２】古谷圭一監訳「分析化学」丸善株式会社  平成１０年２月２８日  ｐ．１０３−１３０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、ＨＰＬＣ法による化学成分の測定は、精度は高いが測定装置が高価であるという点と測定操作や試料作成が煩雑であるという点が難点となり、迅速さや簡便さが要求される製造工程における品質管理のための測定には適していない。また、茶葉中に含まれているメチル化カテキンは数種類あるが、その総含有量は茶葉全体の数％程度である。従ってこれらのメチル化カテキンを同時に検出する場合、高い分解能を有する測定装置でなければ正確に検出することは困難である。
【０００６】
本発明は、以上の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、生葉、荒茶、仕上げ茶等を含む茶葉中の化学成分の含有量を簡易迅速に測定する測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以上のような目的を達成するために、本発明は、近赤外分光光度計を用いて化学成分濃度既知の茶葉の吸光度を測定し、この吸光度と前記茶葉中の化学成分量との相関に関する情報に基づいて、化学成分濃度未知の茶葉の吸光度から化学成分濃度を算出することを特徴とするものである。
【０００８】
本発明は具体的に以下のようなものを提供する。
【０００９】
（１）  茶葉中に含まれる化学成分の定量方法であって、１０００ｎｍから２５００ｎｍの近赤外領域の波長を用いて前記茶葉の吸光度を測定し、この吸光度と前記茶葉中の化学成分量との相関に関する情報に基づいて、化学成分濃度未知の茶葉の吸光度から化学成分濃度を算出することを特徴とする茶葉中に含まれる化学成分の定量方法。
【００１０】
（１）の発明によれば、近赤外領域の波長を用いることによって、試料を非破壊で迅速、かつ、簡便に多成分同時分析を行うことが可能となる。また、多くの化学成分が有するＣ−Ｈ、Ｏ−ＨもしくはＮ−Ｈ基が帰属する官能基は、近赤外線領域に特有の吸収領域があるため、この吸収領域の吸光度を測定することによって、茶葉中の化学成分量との相関に関する情報を得ることが可能となる。
【００１１】
（２）  前記情報は、定期的又は常時更新するものであることを特徴とする（１）に記載の茶葉中に含まれる化学成分の定量方法。
【００１２】
（２）の発明によれば、茶量と吸光度に関する情報を、定期的あるいは常時更新することで化学成分濃度未知の試料の濃度を最適化することが可能となっている。更新方法としては、年次毎にデータを取り直し、傾き等を適宜補正する方法が挙げられる。
【００１３】
（３）  前記化学成分は、カテキン類、プリン塩基、及びビタミン類からなる群から選ばれる１種以上の成分である（１）又は（２）に記載の茶葉中に含まれる化学成分の定量方法。
【００１４】
（３）の発明によれば、化学成分をカテキン類、プリン塩基、及びビタミン類からなる群から選ばれる１種以上の成分としたことによって、本発明に係る定量方法の精度を上げることが可能となる。ここで「カテキン類」とは、エピカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、メチル化カテキン及びこれらの光学異性体をいい、「プリン塩基」とは、主としてカフェインをいい、「ビタミン類」とは、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＢ１及びビタミンＢ２をいう。
【００１５】
（４）  前記化学成分は、メチル化カテキンである（１）から（３）いずれかに記載の茶葉中に含まれる化学成分の定量方法。
【００１６】
（４）の発明によれば、化学成分をメチル化カテキンとしたことによって、本発明に係る定量方法の精度をより向上させることが可能となる。
【００１７】
（５）  茶葉中に含まれる化学成分の定量方法であって、前記化学成分濃度が既知の複数の標準試料を、所定の波長を有する近赤外光を照射する近赤外分光光度計を用いて、前記標準試料の吸光度を測定する吸光度測定工程と、この吸光度測定工程で測定したそれぞれの吸光度と、前記標準試料の化学成分濃度に基づいて単回帰法又は直線重回帰法の少なくともいずれか１つにより検量線を算出する検量線算出工程と、化学成分濃度が未知の対象試料を前記標準試料と同じ波長における吸光度を測定し、この吸光度の値から前記検量線に基づいて前記対象試料の化学成分濃度を算出する濃度算出工程と、を有することを特徴とする茶葉中に含まれる（１）から（４）いずれかに記載の茶葉中に含まれる化学成分の定量方法。
【００１８】
（５）の発明によれば、吸光度検出工程において、メチル化カテキン濃度が既知の試料に所定の波長を有する近赤外光を照射することによってこの試料中のメチル化カテキンの吸光度を測定することが可能となる。また、検量線算出工程及び濃度算出工程において、単回帰法又は直線重回帰法を使用することによってメチル化カテキン濃度が未知の試料の濃度を正確、かつ、迅速に算出することが可能となる。
【００１９】
ここで、「単回帰法又は直線重回帰法」とは、複数の変数間の関係を一次方程式（ｙ＝ａｘ＋ｂ）で表現する分析方法をいう。単回帰法を使用する場合は、試料に照射する近赤外光の波長は１種類であるが、直線重回帰法（ＭＬＲコンビネーションサーチ法、ステップサーチ法）を使用する場合は、複数種の試料を用いることが可能となる。そのため、同じ試料に異なる波長の近赤外光を照射し、直線重回帰法を用いることによって、より正確にメチル化カテキンの濃度を算出することが可能となる。
【００２０】
（６）  前記近赤外光の波長は、略１０００ｎｍから略２５００ｎｍである（５）に記載の茶葉中に含まれる化学成分の定量方法。
【００２１】
（６）の発明によれば、近赤外光の波長を略１０００ｎｍから略２５００ｎｍとしたことによって、各化学成分の吸収領域を効率よく検出することが可能となる。
【００２２】
（７）  前記近赤外光の波長は、略１１００ｎｍから略２４００ｎｍである（５）又は（６）に記載の茶葉中に含まれる化学成分の定量方法。
【００２３】
（７）の発明によれば、近赤外光の波長を略１１００ｎｍから略２４００ｎｍとしたことによって、各化学成分のうち特に、カテキン類の吸収領域を効率よく検出することが可能となる。スキャンタイプのＮＩＲにおいてカテキン類は、下記の波長を用いて検出することが好ましい。
【００２４】
例えば波長を、略１２２０ｎｍ、略１４００ｎｍ、略１６５０ｎｍ、略１７７０ｎｍ、略１９００ｎｍ、略２０７０ｎｍ、からなる群より選ばれる２以上としたことによってカテキン類特有の吸収領域をより効率良く検出することが可能となる。ここで「略１２２０ｎｍ」とは、１２１０ｎｍ〜１２３０ｎｍをいい、「略１４００ｎｍ」とは、１３９０ｎｍ〜１４１０ｎｍをいい、「略１６５０ｎｍ」とは、１６４０ｎｍ〜１６７０ｎｍをいい、「略１７７０ｎｍ」とは、１７６０ｎｍ〜１７９０ｎｍをいい、「略１９００ｎｍ」とは、１８９０ｎｍ〜１９２０ｎｍをいい、「略２０７０ｎｍ」とは、２０５０ｎｍ〜２０８０ｎｍをいう。
【００２５】
また波長を、略１１００ｎｍから略２４００ｎｍの任意の波長としたことによって、カテキン類の中でも、特にエピガロカテキンガレート及びエピカテキンの吸収領域をより効率良く検出することが可能となる。この場合において、測定波長は１波長であってもよいが、２以上の波長を組み合わせて用いることが好ましく、４以上の波長を組み合わせて用いることがより好ましい。例えば、１１１０〜１１４０ｎｍ、１６５０〜１６７０ｎｍ、１６２０〜１６５０ｎｍ、及び２０９０〜２１２０ｎｍの任意の波長を組み合わせて測定することが挙げられる。
【００２６】
また波長を、略１５００ｎｍから略２４００ｎｍの任意の波長としたことによって、カテキン類の中でも、特にエピガロカテキンの吸収領域をより効率良く検出することが可能となる。この場合においても上記と同様、測定波長は１波長であってもよいが、２以上の波長を組み合わせて用いることが好ましく、４以上の波長を組み合わせて用いることがより好ましい。例えば、１５２０〜１５５０ｎｍ、１６６０〜１６８０ｎｍ、１９９０〜２０１０ｎｍ及び、２２６０〜２２８０ｎｍの任意の波長を組み合わせて測定することが挙げられる。
【００２７】
（８）  前記検量線算出工程における前記検量線の精度（ＳＥＰ）が、０．４以下のものである（５）から（７）いずれかに記載の茶葉中に含まれる化学成分の定量方法。
【００２８】
（８）の発明によれば、検量線算出工程で算出した検量線の精度（検量線評価時（予測値）の標準誤差：ＳＥＰ）を０．４以下とすることによって、メチル化カテキンの濃度をより正確に算出することが可能となる。
【００２９】
（９）  茶葉中に含まれる化学成分を定量するプログラムであって、この化学成分濃度が既知の複数の標準試料を、所定の波長を有する近赤外光を照射する近赤外分光光度計を用いて測定したそれぞれの吸光度と、前記標準試料の化学成分濃度に基づいて単回帰法又は直線重回帰法の少なくともいずれか１つにより検量線を算出するように指令する検量線算出工程と、化学成分濃度が未知の対象試料を前記標準試料と同じ波長における吸光度の値から前記検量線に基づいて前記対象試料の化学成分濃度を算出するように指令する濃度算出工程と、を有することを特徴とする茶葉中に含まれる化学成分の定量方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
【００３０】
（１０）  茶葉中に含まれるメチル化カテキンを定量するプログラムであって、このメチル化カテキン濃度が既知の複数の標準試料を、所定の波長を有する近赤外光を照射する近赤外分光光度計を用いて測定したそれぞれの吸光度と、前記標準試料のメチル化カテキン濃度に基づいて単回帰法又は直線重回帰法の少なくともいずれか１つにより検量線を算出するように指令する検量線算出工程と、メチル化カテキン濃度が未知の対象試料を前記標準試料と同じ波長における吸光度の値から前記検量線に基づいて前記対象試料のメチル化カテキン濃度を算出するように指令する濃度算出工程と、を有することを特徴とする茶葉中に含まれるメチル化カテキンの定量方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
【発明の効果】
【００３１】
以上説明したように本発明は、茶葉中の化学成分の近赤外領域における特有の吸収領域と試料中の各化学成分濃度との相関に基づいて化学成分濃度未知の試料の濃度を粉砕のみで迅速、かつ、簡便に算出することが可能となる。これによって、製造工程において製品や茶葉の十分な品質管理を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明について詳しく説明する。
【００３３】
＜測定試料＞
本発明は、測定試料に茶葉を用いる。「茶葉」とは、茶葉の一枚一枚を意味するのではなく、茶や食品の原料となる茶葉の集合体のことを意味する。使用する茶葉には「べにふうき」、「べにふじ」、「べにほまれ」、「やえほ」、「するがわせ」、「ゆたかみどり」、「くりたわせ」、「かなやみどり」、「おくむさし」、「大葉烏龍」、「青心大パン」、「青心烏龍」、「鳳凰単叢」、「鳳凰水仙」、「白葉単叢水仙」、「黄枝香」、「武夷水仙」、「紅花」、「べにひかり」、「やまかい」、「やまとみどり」、「ひめみどり」、「香駿」、及び「おくみどり」、等が挙げられ、これら数種を混合したものを用いてもよい。
【００３４】
測定対象物質は、カテキン類、プリン塩基（カフェイン）、ビタミン類である。カテキン類の一種であるメチル化カテキンとは、メチル化されたカテキンをいい、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート（以下、ＥＧＣＧ３”Ｍｅという）、エピガロカテキン−３−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート（以下、ＥＧＣＧ４”Ｍｅという）、ガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート（以下、ＧＣＧ３”Ｍｅという）、又は、ガロカテキン−３−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート（以下、ＧＣＧ４”Ｍｅという）を含む。
【００３５】
ＥＧＣＧ３”Ｍｅ、ＥＧＣＧ４”Ｍｅは、以下の化学構造式で示される。
【００３６】
【化１】
2005257676.tif 000002
【００３７】
Ｒ１がメチル基（−ＣＨ３）であり、かつ、Ｒ２が水素原子（−Ｈ）である場合には、ＥＧＣＧ３”Ｍｅを示す。また、Ｒ１が水素原子（−Ｈ）であり、Ｒ２がメチル基（−ＣＨ３）である場合には、ＥＧＣＧ４”Ｍｅを示す。
【００３８】
ＧＣＧ３”Ｍｅ、ＧＣＧ４”Ｍｅは、以下の化学構造式で示される。
【００３９】
【化２】
2005257676.tif 000003
【００４０】
Ｒ１がメチル基（−ＣＨ３）であり、かつ、Ｒ２が水素原子（−Ｈ）である場合には、ＧＣＧ３”Ｍｅを示す。また、Ｒ１が水素原子（−Ｈ）であり、Ｒ２がメチル基（−ＣＨ３）である場合には、ＧＣＧ４”Ｍｅを示す。なお、ＥＧＣＧ３”Ｍｅ及びＥＧＣＧ４”Ｍｅは互いに構造異性体であり、ＧＣＧ３”Ｍｅ及びＧＣＧ４”Ｍｅは互いに構造異性体である。ＥＧＣＧ３”Ｍｅ及びＧＣＧ３”Ｍｅは互いに立体異性体であり、ＥＧＣＧ４”Ｍｅ及びＧＣＧ４”Ｍｅは互いに立体異性体である。
【００４１】
＜測定及びメチル化カテキン濃度の算出＞
本発明では、吸光度測定工程において近赤外分光高度計を用いている。「近赤外分光光度計（以下、ＮＩＲとする）」とは、試薬不要、前処理不要、多成分同時分析、定性及び定量分析可能であることを特徴とする近赤外線（７００〜２５００ｎｍ）を用いる分光光度計をいう。従来の赤外分光光度計（２５００〜１００００ｎｍ）と比べ、短波長であるため、赤外分光光度計の測定における分子の基本振動による吸収特性の、倍音、結合音での測定が可能である。使用するＮＩＲには、スキャンタイプとフィルタータイプのものが挙げられる。
【００４２】
また検量線算出工程における「検量線」とは、このＮＩＲで測定した茶葉の吸光度（ｙ）とメチル化カテキン濃度（ｘ）の相関関係を単回帰法又は直線重回帰法を用いて一次方程式（ｙ＝ａｘ＋ｂ）に表したものである。ｘ軸のメチル化カテキンの濃度は、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣとする）を用いて予め測定し、算出した値を用いている。「単回帰法又は直線重回帰法」とは一般に、幾つかの変数（独立変数又は説明変数）に基づいて、別の変数（従属変数又は目的変数）を予測することである。独立変数をｘ、従属変数をｙ、ｙの予測値をｙ´としたとき、ｘ、ｙの各点の近くを通るような直線（検量線）ｙ´＝ａｘ＋ｂが考えられる。なお、この直線式の定数は最小自乗法により求めることができる。この検量線の精度は、検量線上に乗らない点の数によって決定される。なお本発明では、測定の便宜上、独立変数をｙに従属変数をｘに設定している。更に検量線の精度は、検量線評価時（予測値）の標準誤差（ＳＥＰ）を用いて評価している。
【００４３】
以下、検量線算出工程及び濃度算出工程の具体的な方法を説明する。
【００４４】
メチル化カテキン濃度既知の標準試料を、少なくとも４点、好ましくは１０点以上についてＮＩＲにて吸光度を測定する。照射波長の範囲としては、ＮＩＲにより通常測定される７００〜２５００ｎｍ波長の範囲を含んでいればよい。なお、このスキャンタイプのＮＩＲで測定した場合、得られたスペクトルは、ピークの最大吸光度を示す波長が含まれている。ここで、最大吸光度とはスペクトルのピークの山の部分を指し、このピークの位置は、得られるスペクトルデータを目視又はコンピュータ等の情報処理装置などにより確認することができる。そして、この最大吸光度を示す波長が上記範囲の波長の中に入っていればよい。
【００４５】
そして、フィルタータイプのＮＩＲにおいてはまず、各波長における試料の吸光度を説明変数とし、メチル化カテキン濃度を目的変数として、まず単回帰分析及び重回帰分析を行い、精度の良い回帰線の波長を少なくとも２本以上採用し、アウトライヤー（外れ値）をチェックし、その原因が明確であれば切り捨てていく。次に上記の作業で採用した検量線について他の試料での検証を行い、最も精度の良い検量線を決定する。
【００４６】
スキャンタイプのＮＩＲにおいては、得られたＮＩＲスペクトルのピークの最大吸光度を示す波長を２以上、好ましくは３以上選択し、それらの波数における吸光度を用いる。得られたスペクトルのピークの最大吸光度の波長を選択し、それらの吸光度を用いる。各波長における試料の吸光度を説明変数とし、メチル化カテキン濃度を目的変数として、重回帰分析を行う。
【００４７】
また、重回帰分析計算や主成分回帰分析計算は市販の計算ソフトもしくは自作のものでも特に限定されるものではない。更にこれら一連の作業をＮＩＲの測定プログラムに組込んでメチル化カテキン濃度検出用プログラムとしてもよい。
【００４８】
濃度算出工程では、メチル化カテキン濃度未知の試料の吸光度を測定し、その値を上記の検量線算出工程で得られた検量線に代入してメチル化カテキンの濃度を算出することが可能となる。
【００４９】
本発明に係る定量方法をプログラムとする場合は、ＮＩＲで測定した吸光度を、ケモメトリックス手法による主成分分析、クラスター分析、判別分析、重回帰分析、主成分回帰分析、ＰＬＳ（ｐａｒｔｉａｌ  ｌｅａｓｔ  ｓｑｕａｒｅｓ  ）回帰分析、ＳＩＭＣＡ（ｓｏｆｔ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｌａｓｓ  ａｎａｌｏｇｙ）、ＫＮＮ（Ｋ−ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｍｅｔｈｏｄ）、ニューラルネットワーク分析等、及びこれらを組み合わせて使用することが好ましい。
【実施例】
【００５０】
［フィルタータイプのＮＩＲを用いた場合］
＜試料＞
平成１５年産べにふうき（ｎ＝５０  １茶期１８点、２茶期１８点、３茶期８点、秋冬期６点）及びメチル化カテキンを含有する品種茶（ｎ＝１００  １茶期５０点、２茶期５０点）をＵＤＹサイクロンミル（スクリーン  φ１．０ｍｍ）で粉砕した試料をＮＩＲ（ＧＴ−８基準機（Ｄｉｃｋｅｙ  ｊｏｈｎ社製）  ＩＬ６１０Ｓ／Ｎ１１１３８）；Ｍｏｄｅ１．０，Ｄｊセル，２回測定（詰め替えあり））で測定した。また同じサンプルをＨＰＬＣ（島津製作所製  ＬＣ−１０ＡＶｐ、ＬＣ−Ｍ１０ＡＶｐ）にて測定し、Ｄｉｃｋｅｙ  ｊｏｈｎ回帰プログラムｖ２．０（直線重回帰法）を用いて２つの測定値について解析した。方法としては、試料を３群にわけ、Ｃｒｏｓｓ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ方式で作成及び検証を行なった。なお、ＮＩＲのフィルタ番号と照射波長の帰属は表１の通りである。
【００５１】
【表１】
2005257676.tif 000004
【００５２】
フィルタ７（Ｌ７）（２１３９ｎｍ）は、タンニンの吸収領域に由来し、フィルタ２（Ｌ２）（２１８０ｎｍ）は蛋白質に、フィルタ９（Ｌ９）（２３４５ｎｍ）は繊維に由来し、フィルタ４（Ｌ４）（１９４０ｎｍ）は水分に、フィルタ６（Ｌ６）（２２０８ｎｍ）は蛋白質に由来していることが判っている。
【００５３】
＜検量線作成手順＞
（１）単回帰、２波長及び３波長でラフに検量線を作成し、選択波長の構成をみる。（２）傾き（ｔ−Ｖａｌｕｅ）をチェックし、２．０以下の検量線を切り捨てる（オミット）。（３）波長の帰属、係数の符号（＋，−）、ＣＡＬ定数（２．０以下）、及び多重共線性（４０ｎｍ以下）等で組合せをチェックし、検量線を絞り込んでいく。（４）数本の検量線のなかから、統計値のよい検量線２〜３本を選び採用候補とする。統計値の評価は、ＳＥＰ：小さいほど良い、傾き（ＳＬＯＰＥ）：０．９〜１．１、寄与率（Ｒ２）：０．８５以上、変動率（ＣＶ％）：１０以下、Ｋ係数の総和（Ｓｕｍ  Ｋ）：０．１〜１．０以下、Ｋ係数の自乗和の平方根（ＲＳＳＫ）：１．０以下、及びＦ比：８０以上等を基準にして行った。（５）アウトライヤーをチェックし、原因が明確であれば切り捨てた。上記（１）〜（５）を繰り返し、採用候補を決定した（Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）。（６）他の試料群で、採用候補の検量線を検証した（Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）。このようにして一番よい結果の検量線を決定した。
【００５４】
＜メチル化カテキン検量線の作成と検証＞
表２は、上記の検量線作成手順によって算出した検量線の検証結果を示したものである。
【００５５】
【表２】
2005257676.tif 000005
【００５６】
これより、ＰＬＳ解析（ＰＬＳとは、Ｐａｒｔｉａｌ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｑｕａｒｅｓ解析（部分最小自乗法））をベースにしたＭＬＲ  ＣＡＬ作成作業（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｐｒｅｇｒｅｅｓｉｏｎ  Ｃａｋｅｗａｌｋ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｌａｎｇｕａｇｅ）で、全サンプルの採用候補は２、５、７のフィルタの組合せであり、メチル化カテキン群の採用候補は２、７、９の組合せであった。本発明では２、５、７のフィルタの組合せと２、７、９のフィルタの組合せを中心に解析をすすめた。
【００５７】
また、全試料を３分割し、２グループでＣＡＬ作成し、他の１グループで検証を行ったが、特別な傾向は認められなかった。３分割Ｃｒｏｓｓ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ方式でサンプル群としての差異は認められなかったことから、全試料でＣＡＬ作成（アウトライヤー９点をオミット）を行った結果、２、５、７のフィルタの組合せで、ＳＥＣ：０．３０２、Ｒ２：０．８１４、ＣＶ％：３３．８３、Ｆ  Ｒａｔｉｏ：２５９．４の精度が得られた。
【００５８】
試料が「べにふうき」のみである場合におけるＣＡＬ作成（４点オミット）の結果は、２、７、９のフィルタの組合せで、ＳＥＣ：０．２１０、Ｒ２：０．５９４、ＣＶ％：１３．１９、Ｆ  Ｒａｔｉｏ：４３．０の精度が得られたため、これをＣＡＬ採用候補とし、図１、２に示す。なお、このときのサンプル数は４６、平均吸光度は１．５９（最大値（ｌｏｇ値）：２．３３、最小値（ｌｏｇ値）：０．６５）であり、標準誤差は０．１６０、変動係数は１０．１％である。また、ＣＡＬの検証のため、上記で作成した検量線「べにふうきＣＡＬ」で乾物したべにふうきを用いてその精度を検証した結果は、ＳＥＰ：０．２０７、Ｒ２：０．５９４、ＣＶ％：１３．０％、ｓｌｏｐｅ：１．６８３、Ｆ  ｒａｔｉｏ：４２．９６であった。
【００５９】
なお参考として、カテキン類の検量線を作成してメチル化カテキンと比較を行った。その結果、含量の多いエピガロカテキンガレートやカテキン総量の変動係数の方が、含量の少ないエピガロカテキン、エピカテキン及びエピカテキンガレートよりも優れていた。また、カテキン類で選択された検量線の波長構成は、３、７、８（第一候補）、２、７、９（第二候補）のフィルタの組合せであり、べにふうきＣＡＬの波長構成の妥当性が確認された。
【００６０】
更に、普通煎茶群と乾燥生葉群とに層別してＣＡＬ作成を行ったが、普通煎茶群はべにふうきと、乾燥生葉群は全サンプルとほぼ対応しているので、ＣＡＬの精度に変化はないことが確認された。
【００６１】
［スキャンタイプのＮＩＲを用いた場合］
＜試料＞
平成１６年産べにふうき（荒茶、ｎ＝１０６、一番茶〜秋冬番茶）を用い、上述と同様の方法で粉体を測定用試料とした。試料をＮＩＲ（Ｂｒａｎ＋Ｌｕｅｂｂｅ社製  ＩｎｆｒａＡｌｙｚｅｒ  ５００）の試料用セルにセットし、１１００ｎｍから２５００ｎｍの近赤外域において２ｎｍ間隔で反射光を測定した。
【００６２】
得られたスペクトルは解析プログラムＳＥＳＡＭＩ（Ｂｒａｎ＋Ｌｕｅｂｂｅ社製）を用いて前処理（２次微分）と多変量解析した。
【００６３】
得られたスペクトルを正規化、二次微分または平準化して、ＨＰＬＣ法で測定した個別カテキン量との相関を調べたところ、二次微分により高い相関が得られた。なお、検量線の作成にはＭＬＲコンビネーションサーチ法とステップサーチ法を組み合わせて行った。
【００６４】
ＭＬＲコンビネーションサーチ法とは、直線重回帰法の１種であり、すべての波長の組み合わせを試行して、最適な波長を求め、各波長の重相関係数Ｒをそれぞれ算出して、最も高い値の組み合わせを検出する方法をいう。
【００６５】
ステップアップサーチとは、ＭＬＲコンビネーションサーチ法と同様、直線重回帰法の１種である。まず、第１波長だけはコンビネーションサーチ法により求め、次の新しい波長を決めるのに、コンビネーションサーチで決定した波長は固定しておき、重相関係数Ｒが最高値を示すような波長を検索する。第３波長までＲが最高となる波長を検索し、その後、第２、第３波長を固定するまで第１波長を再度変動させる。新しい波長を使ってもそれ以上相関が向上しなくなるまで、同様の操作を繰り返す（ＭＬＲ変数増加法）。
【００６６】
なお、検量線を作成する際、目的変数を増加させることによりＳＥＣ（検量線作成時の標準誤差）を小さくすることができる。しかし、ＳＥＰ（予測値の標準誤差）は一度小さくなるが目的変数をさらに増加させると増加する。これは、オーバーフィッティングとよばれており、多変量解析において目的変数の決定に用いられている。その結果、メチル化カテキンで４波長、ＥＧＣＧ、ＥＣＧで３波長、ＥＧＣで４波長を選択することが妥当であることがわかった。メチル化カテキンには、ヒドロキシ基および、メチル基が含まれており、この波長選択は妥当であることがわかる。
【００６７】
〔一番茶を用いた茶葉中のメチル化カテキン定量法〕
ＮＩＲの波長として１２２０ｎｍ±５０ｎｍ、２０６８ｎｍ±５０ｎｍ、２３６４ｎｍ±５０ｎｍ、２４６８ｎｍ±５０ｎｍの波長を選択し、ＭＬＲ変数増加法を適用して検量線を作成すると、キャリブレーションのＲ＝０．９８３、ＳＥＣ＝０．１０３、ＳＥＰ＝０．１７の精度で測定できるようになった（図３）。
【００６８】
＜ＥＧＣＧ定量法＞
ＮＩＲの波長として１６６０±５０ｎｍ、１６３２±５０ｎｍ、１１２８±５０ｎｍを選択してＭＬＲ変数増加法を適用して検量線を作成すると、キャリブレーションのＲ（重相関係数）＝０．９７、ＳＥＣ＝０．５４９、ＳＥＰ＝０．６３の精度で測定できるようになる（図４）。
【００６９】
＜ＥＣＧ定量法＞
ＮＩＲの波長として２１８６±５０ｎｍ、２０６２±５０ｎｍ、１５４６±５０ｎｍを選択してＭＬＲ変数増加法を適用して検量線を作成すると、キャリブレーションのＲ＝０．９６３、ＳＥＣ＝０．１７、ＳＥＰ＝０．２４の精度で測定できるようになる（図５）。
【００７０】
＜ＥＧＣ定量法＞
ＮＩＲの波長として１５３４±５０ｎｍ、２０００±５０ｎｍ、２２７０±５０ｎｍ、２３５６±５０ｎｍを選択してＭＬＲ変数増加法を適用して検量線を作成すると、キャリブレーションのＲ＝０．９７８、ＳＥＣ＝０．２１５、ＳＥＰ＝０．３２８の精度で測定できるようになる（図６）。
【００７１】
＜ＥＣ定量法＞
ＮＩＲの波長として１１２４±５０ｎｍ、１４７０±５０ｎｍ、２２０８±５０ｎｍを選択してＭＬＲ変数増加法を適用して検量線を作成すると、キャリブレーションのＲ＝０．８８４、ＳＥＣ＝０．１１２、ＳＥＰ＝０．１２８の精度で測定できるようになる（図７）。
【００７２】
以上より、本発明は製造工程における茶葉の品質管理、育種選抜システムの目的の下では十分な精度を有していることがわかった。また、本発明による検量線を組み込んだプログラム、オプションキットとしてそれぞれの波長フィルタを従来からある茶葉分析計等の測定装置に搭載することにより、機能性に関わるカテキン類を高精度、簡易に測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明の分析方法により算出したカテキン類の検量線を示した図である。
【図２】本発明の分析方法により算出したカテキン類の検量線を示した図である。
【図３】本発明の分析方法により算出したカテキン類の検量線を示した図である。
【図４】本発明の分析方法により算出したエピガロカテキンカテキンガレートの検量線を示した図である。
【図５】本発明の分析方法により算出したエピカテキンガレートの検量線を示した図である。
【図６】本発明の分析方法により算出したエピガロカテキンの検量線を示した図である。
【図７】本発明の分析方法により算出したエピカテキンの検量線を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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