(57)【要約】【課題】  新規なトランスポーター遺伝子およびそのタンパク質を提供することを課題とする。【解決手段】  胎児遺伝子（fetal gene）ライブラリーの、ランダムシークエンシングによるスクリーニングを行い、有機カチオントランスポーターOCT1およびOCT2と有意な相同性を示す新規な遺伝子を単離することに成功した。これら遺伝子がコードするタンパク質は実際に種々の有機カチオンのトランスポーターとして機能した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１、３、２２若しくは２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、またはこれらタンパク質中のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列からなり、有機カチオンを輸送する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号：２、４、２３若しくは２８に記載の塩基配列からなるDNAにハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、有機カチオンを輸送する活性を有するタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質をコードするDNA。
【請求項４】
請求項３に記載のDNAが挿入されたベクター。
【請求項５】
請求項３に記載のDNAを発現可能に保持する形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１または２に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項７】
請求項１または２に記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項８】
配列番号：２、４、２３若しくは２８に記載の塩基配列からなるDNAに特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するDNA。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞外から細胞内へ、あるいは細胞内から細胞外への物質の輸送に関与するタンパク質であるトランスポーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
栄養素や内因性物質の細胞内への取り込み機構において、生体膜に存在する多種の輸送担体（トランスポーター）の関与と、その輸送機構が最近明らかになりつつある(Tsuji, A. and Tamai, I., Pharm. Res., 13, 963-977, 1996.)。これらのトランスポーターには、輸送される物質の構造認識能が備わっており、物質を選択的に輸送するが、比較的その構造認識が広いトランスポーターの場合、本来は生体異物である医薬品などについても誤認識し、積極的に細胞内へ輸送してしまうと考えられる。基本的に薬物の生体膜透過は、その分子サイズ、脂溶性、水素結合能などの物理化学的特性に依存する単純拡散に従っており、特にイオン性薬物の場合には、非解離型分子のみがpH-分配仮説に従って生体膜を透過すると考えられていた。しかし、細胞内外の効率的な物質交換活性が必要な小腸、腎尿細管、胎盤、脳脈絡叢の上皮細胞や、肝実質細胞、血液脳関門などでは、多くの薬物は単純拡散以外の特異的機構、つまりトランスポーターによる能動的な輸送により細胞膜を透過することが明らかとなってきた(玉井郁巳、辻彰：ファルマシア、31、493-497、1995.、齋藤秀之、乾賢一：医学のあゆみ、179、393-397、1996.、玉井郁巳：薬物動態、11、642-650、1996.)。例えば、非エステル型の経口用β-ラクタム抗生物質は生理的pHにおいては両性または負に荷電し、脂溶性は極めて低いにも関わらず、腸管からの吸収は良好であることが知られている。単離膜小胞系を用いた輸送研究により、これらの薬物の吸収過程には、刷子縁膜に局在するH＋駆動型ペプチドトランスポーターが関与していることが示されるようになった(Tsuji, A. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther.241, 594-601, 1987.)。ペプチド輸送系は、ジあるいはトリペプチドを認識するが、テトラペプチド以上は認識できず、ペプチドサイズについては極めて厳密であるものの、非天然のアミノ酸からなるペプチドは認識するといった比較的広い基質認識性を持つ。β-ラクタム抗生物質のペプチドトランスポーターによる輸送も、やはりこの広い基質認識性ゆえの誤認識による輸送であり、臨床的にはそれを図らずも利用していたことになる(Tsuji, A., American Chemical Society (eds. Taylor, M. D., Amidon, G. L.),Washington, D. C., 101-134, 1995.)。さらには、脂溶性の高い脂肪酸のような物質の生体膜透過においても、トランスポーターが関与している可能性が報告されている(Schaffer, J. and Lodish, H., Cell, 79, 427-436, 1994.)。
【０００３】
ところで、様々なトランスポーターは各臓器、細胞が持つ生理的役割に応じて備わっているはずであり、その分布や機能には臓器特異性が期待される。従って、薬物動態に臓器選択性をもたらす手法としてトランスポーターを利用することが期待できる。すなわち、トランスポーターを利用した臓器特異的薬物デリバリー(DDS)が可能であると考えられる。また、脂溶性をあげることによる単純拡散に頼った薬物の吸収性改善は、肝臓における初回通過効果を増大させたり、臓器移行性を非特異的に増大させる可能性が高い。しかし、トランスポーターの基質特異性を利用したドラッグデザインを行うことにより、脂溶性とは無関係に薬物の吸収性を高めることも可能であると考えられる(林喜代美  他：Drug Delivery System、11、205-213、1996.)。このような目的のためには、多くのトランスポーターを分子レベルで同定し、その性質についての詳細な解析を行うことが必須であるが、トランスポーターはその生化学的な取り扱いの難しさと、機能測定の複雑さから、膜生理学的な研究の多さに比較し、分子レベルでの同定が非常に遅れている。
【０００４】
最近になり、外来遺伝子発現系であるアフリカツメガエル(Xenopus)卵母細胞を用いた発現クローニング法によりいくつかのトランスポーターのcDNAがクローニングされるようになり、構造上の類似性が存在することが明らかになってきた(Fei, Y. -J. et al., Nature, 368, 563-566, 1994.)。例えば、1994年にKoepsellらによって、基底膜型と推定される有機カチオントランスポーターOCT1が発現クローニング法によってクローニングされた(Grundemann, D. et al., Nature, 372, 549-552, 1994.)。その後、OCT1の配列をもとにしたホモロジークローニングによってOCT2が同定された(Okuda, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 224, 500-507, 1996.)。OCT1とOCT2はお互いに67%という非常に高い相同性を示す(Grundemann, D. et al., J. Biol. Chem. 272, 10408-10413, 1997.)。両者とも腎臓に強い発現が見られるが、OCT1の場合はそれ以外にも肝臓、結腸、小腸に発現が存在するのに対し、OCT2は腎臓に特異的であり、組織分布も異なっている。
【０００５】
トランスポーターについての分子レベルでの同定については、これら報告例を含めわずかであり、いまだ臨床上有用な多くの未知のトランスポーターが存在していると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規なトランスポーター遺伝子ファミリーおよびそれら遺伝子がコードするタンパク質、並びにそれらの用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、胎児組織に特異的、あるいはより強く発現している遺伝子(fetal gene)の中には、癌をはじめとする各種疾患に関与する遺伝子が存在するとの作業仮説のもと、サブトラクション法によって作製した胎児遺伝子（fetal gene）ライブラリーのランダムシークエンシングによるスクリーニングを行ってきた。本発明者等はこの過程において、有機カチオントランスポーターOCT1およびOCT2と有意な相同性を示す未知の遺伝子の存在を見いだした。この遺伝子が新規のトランスポーターをコードしていることが予想されたことから、本発明者等は、その単離を試みた。その結果、ヒト胎児由来のcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離することに成功した。さらに、本発明者等は、単離したヒト遺伝子がコードするタンパク質のトランスポーター活性につき検討を行った。その結果、該タンパク質が実際に種々の有機カチオンのトランスポーターとして機能することを見いだした。また、本発明者らは、単離したヒト遺伝子に対応するマウス遺伝子を単離することにも成功した。
【０００８】
本発明は、新規なトランスポーター遺伝子ファミリーおよびそれら遺伝子がコードするタンパク質、並びにそれらの用途に関し、より具体的には、
（１）  配列番号：１、３、２２若しくは２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、またはこれらタンパク質中のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列からなり、有機カチオンを輸送する活性を有するタンパク質、
（２）  配列番号：２、４、２３若しくは２８に記載の塩基配列からなるDNAにハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、有機カチオンを輸送する活性を有するタンパク質、
（３）  （１）または（２）に記載のタンパク質をコードするDNA、
（４）  （３）に記載のDNAが挿入されたベクター、
（５）  （３）に記載のDNAを発現可能に保持する形質転換体、
（６）  （５）に記載の形質転換体を培養する工程を含む、（１）または（２）に記載のタンパク質の製造方法、
（７）  （１）または（２）に記載のタンパク質に結合する抗体、
（８）  配列番号：２、４、２３若しくは２８に記載の塩基配列からなるDNAに特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するDNA、に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明者等が単離した新規なヒトトランスポーターcDNAの塩基配列をそれぞれ配列番号：２（「ヒトOCTN1」と命名した）および配列番号：４（「ヒトOCTN2」と命名した）に示す。また、これらcDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１および配列番号：３に示す。本発明のトランスポータータンパク質に含まれるこれら２つのタンパク質のアミノ酸配列は全体に渡り、76%程度という非常に高い相同性を示し、ともにグルコーストランスポーターなど様々なタイプのトランスポーターに存在するコンセンサス配列[Leu, Ile, Val, Met, Ser, Thr, Ala, Gly]-[Leu, Ile, Val, Met, Phe, Ser, Ala, Gly]-Xaa<2>-[Leu, Ile, Val, Met, Ser, Ala]-[Asp, Glu]-Xaa-[Leu, Ile, Val, Met, Phe, Tyr, Trp, Ala]-Gly-Arg-[Arg, Lys]-Xaa<4-6>-[Gly, Ser, Thr, Ala]）(Maiden, M. C. et al., Nature, 325, 641-643, 1987.)を保持していた。実際に、これらタンパク質は、様々な有機カチオンを輸送する活性を有していた（実施例６から８参照）。
【００１０】
また、本発明者らは、上記「ヒトOCTN1」および「ヒトOCTN2」に対応するマウス遺伝子を単離した。単離したcDNAの塩基配列をそれぞれ配列番号：２３（「マウスOCTN1」と命名した）と配列番号：２８（「マウスOCTN2」と命名した）に、これらcDNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：２２と配列番号：２７に示す。
【００１１】
本発明のトランスポータータンパク質としては、有機カチオンを輸送する活性を有すれば足り、該活性を有する限り有機カチオン以外の他の物質を輸送する活性をさらに有するものも含まれる。有機カチオンとしては、これらに制限されないが、例えば、TEA、カルニチン、キニジン、ピリラミンが挙げられる。また、抗がん剤であるアクチノマイシンD、エトポシド、ビンブラスチン、ダウノマイシンなどが挙げられる。本発明のトランスポータータンパク質としては、細胞外から細胞内へ有機カチオンを輸送する活性を有するもののみならず、細胞内から細胞外へ有機カチオンを輸送する活性を有するものも含まれる。
【００１２】
本発明のトランスポータータンパク質は、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として、また天然のタンパク質として調製することができる。組換えタンパク質は、例えば、後述するように本発明のタンパク質をコードするDNAで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。一方、天然のタンパク質は、当業者に周知の方法、例えば、後述の本発明の抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、本発明のタンパク質の発現の高い腎臓やHeLa S3などの癌細胞株から単離することが可能である。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体であれば、例えば、本発明のタンパク質をウサギなどの小動物に免疫し血清を得て、これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、本発明のタンパク質をカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。また、モノクローナル抗体であれば、本発明のタンパク質をマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞にし、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、本発明のタンパク質に対する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、本発明のタンパク質をカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。なお、得られた抗体を人体に投与する目的で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト型化抗体またはヒト抗体を用いると有効である。抗体をヒト型化する方法としては、モノクローナル抗体生産細胞から抗体遺伝子をクローニングし、その抗原決定部位を既存のヒト抗体に移植するCDRグラフト法などが挙げられる。また、免疫系をヒトのものと入れ換えたマウスを免疫して、通常のモノクロナール抗体と同様に直接ヒト抗体を作製こともできる。
【００１３】
また、当業者であれば、公知の方法を用いて上記本発明のトランスポータータンパク質（「ヒトOCTN1」、「ヒトOCTN2」、「マウスOCTN1」、「マウスOCTN2」）中のアミノ酸の置換などを適宜行い、これらと同等の機能を有するタンパク質を調製することが可能である。また、タンパク質のアミノ酸の変異は天然においても生じうる。このようにアミノ酸の置換、欠失、付加により上記本発明のトランスポータータンパク質に対してアミノ酸配列が改変された改変体であって、これらタンパク質と同等の機能を有するタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。ここで「同等の機能を有する」とは、タンパク質が有機カチオンを輸送する活性を有することを指す。当業者に公知のアミノ酸を改変する方法としては、例えば、PCRによる部位特異的変異誘発システム（GIBCO-BRL,Gaithersburg,Maryland）、オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異誘発法（Kramer,W.and Fritz,HJ (1987) Methods in Enzymol.,154:350-367）、Kunkel法（Methods Enzymol.85,2763-2766(1988)）などが挙げられる。なお、アミノ酸の置換は、通常、10アミノ酸以内であり、好ましくは6アミノ酸以内であり、さらに好ましくは3アミノ酸以内である。置換、欠失、付加がなされる部位は本発明のタンパク質の活性が保持される限り特に制限はない。タンパク質のトランスポーター活性は、例えば、後述の実施例６に記載の方法により検出することが可能である。
【００１４】
また、当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術（Sambrook,J et al.,Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58,Cold Spring Harbor Lab.press,1989）などを用いて、上記本発明のトランスポータータンパク質（「ヒトOCTN1」、「ヒトOCTN2」、「マウスOCTN1」、「マウスOCTN2」）をコードするDNA配列またはその一部を基に、これと相同性の高いDNAを単離して、該DNAから本発明のトランスポータータンパク質と同等の機能を有するタンパク質を得ることも常套手段である。これら本発明のトランスポータータンパク質と同等の機能を有するタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。ここで「同等の機能を有する」とは、タンパク質が有機カチオンを輸送する活性を有することを指す。ハイブリダイズするDNAを他の生物から単離する場合には、ヒトやマウス以外に、例えば、ラット、ウサギ、ウシなどが用いられ、特に腎臓などの組織が単離に適している。このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離されるDNAは、通常、上記本発明のトランスポータータンパク質をコードするDNAと高い相同性を有する。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、少なくとも70％以上、好ましくは少なくとも80％以上、さらに好ましくは少なくとも90％以上の配列の同一性を指す。配列の相同性を決定するには、文献（Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
【００１５】
このようなDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの条件の例を示せば、以下の如くである。即ち、「ExpressHyb Hybridization Solution」(CLONTECH社製)を用い、55℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、37℃から55℃で1時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、2xSSC、0.1% SDS中、室温で20分の洗浄を3回、次いで、1xSSC、0.1% SDS中、37℃で20分の洗浄を1回行う。より好ましい条件としては、「ExpressHyb Hybridization Solution」(CLONTECH社製)を用い、60℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、60℃で1時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、2xSSC、0.1% SDS中、室温で20分の洗浄を3回、次いで、1xSSC、0.1% SDS中、50℃で20分の洗浄を2回行う。さらに好ましい条件としては、「ExpressHyb Hybridization Solution」(CLONTECH社製)を用い、68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、68℃で1時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、2xSSC、0.1% SDS中、室温で20 分の洗浄を3回、次いで、0.1xSSC、0.1% SDS中、50℃で20分の洗浄を2回行う。
【００１６】
また、本発明は、上記本発明のトランスポータータンパク質をコードするDNAに関する。本発明のDNAは、cDNAであっても、ゲノムDNAでもよく、また合成DNAであってもよい。本発明のDNAは、例えば、本発明のタンパク質を組換えタンパク質として生産するために利用しうる。即ち、本発明のタンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号：２、４、２３、２８に記載の塩基配列からなるDNA）を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入して得た形質転換体を培養し、発現させたタンパク質を精製することにより本発明のタンパク質を組換えタンパク質として調製することが可能である。組換えタンパク質の生産に用いる細胞としては、例えば、COS細胞、CHO細胞、NIH3T3細胞などの哺乳類細胞、Sf9細胞などの昆虫細胞、酵母細胞、大腸菌（E.coli）が挙げられる。また、細胞内で組換えタンパク質を発現させるためのベクターは、宿主細胞に応じて変動するが、例えば、哺乳類細胞のベクターとしてはpcDNA3（Invitrogen社製）やpEF-BOS（Nucleic Acids.Res.1990,18(17),p5322）などが、昆虫細胞のベクターとしては「BAC-to-BAC baculovirus expression system」（GIBCO BRL社製）などが、酵母細胞のベクターとしては「Pichia Expression Kit」（Invitrogen社製）などが、大腸菌のベクターとしてはpGEX-5X-1（Pharmacia社製）、「QIAexpress system」（Qiagen社製）などが挙げられる。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリポソームDOTAP(ベーリンガーマンハイム社製)を用いた方法、エレクロポレーション法、塩化カルシウム法など用いて行うことができる。得られた形質転換体からの組換えタンパク質の精製は、常法、例えば、文献「The Qiaexpressionist handbook,Qiagen,Hilden,Germany」記載の方法を用いて行うことが可能である。
【００１７】
また、本発明は、本発明のタンパク質をコードするDNAと特異的にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するDNAに関する。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションが有意に生じないことを指す。このようなDNAは、本発明のタンパク質をコードするDNAを検出、単離するためのプローブとして、また増幅するためのプライマーとして利用可能である。
【００１８】
本発明の応用としては、本発明のトランスポータータンパク質を利用した、薬物の体内吸収、体内動態の制御が挙げられる。本発明のトランスポータータンパク質の基質特異性を詳細に解析することにより、このトランスポーターによって輸送され得る薬剤のドラッグデザインが可能であり、これにより本発明のトランスポータータンパク質を介して薬物の体内吸収を高めることができると考えられる。デザインされる薬物には従来の脂溶性をあげるような修飾は不要であるため、水溶性の扱いやすい薬物が迅速かつ効率的に開発できるようになると考えられる。また開発された薬物の吸収は基本的に本発明のトランスポータータンパク質の生体内分布に従うと考えられるため、臓器特異的な薬物の送達が可能である。特に本発明のトランスポータータンパク質の体内分布が、標的臓器と一致するような薬物の場合、理想的なドラッグデリバリーシステム(DDS)となると考えられる。また、他のトランスポーターによる薬物の吸収を期待しているが、本発明のトランスポータータンパク質による吸収は望ましくない場合、本発明のトランスポータータンパク質の基質特異性を考慮に入れたドラッグデザインを行うことにより、他のトランスポータータンパク質に選択的な薬物の創造が行えると考えられる。本発明のトランスポータータンパク質は腎臓に存在するため、逆に本発明のトランスポータータンパク質によって体外へ排出されやすい薬物を設計することにより、腎毒性等を軽減することも可能である。
【００１９】
また、他の本発明の応用としては、本発明のトランスポータータンパク質を標的とした薬物の開発が考えられる。栄養物質や薬物の吸収機構として、あるいは薬物や生体内代謝物の排泄機構としてのトランスポーターの重要性を考えると、その機能が損なわれること、または異常に亢進することに起因する疾患が存在すると考えられる。そのような疾患に対しては、本発明のトランスポータータンパク質の機能を阻害、あるいは亢進する化合物や、本発明のトランスポーター遺伝子の発現量や、タンパク量を調節するするような化合物を薬剤として用いると効果的であると考えられる。さらに、本発明のDNAを利用して、本発明のタンパク質の活性異常や発現量異常に起因する疾患に対する遺伝子治療を行うことも考えられる。遺伝子治療に用いる場合には、本発明のDNAをアデノウイルスベクター（例えば、pAdexLcw）やレトロウイルスベクター（例えば、pZIPneo）などに挿入して、生体内に投与する。投与方法は、ex vivo法であっても、in vivo法であってもよい。また、アンチセンス合成DNAを生体内に直接、または上記ベクターに挿入して投与して治療を行うことも考えられる。
【００２０】
特に、本発明のトランスポータータンパク質に含まれる「OCTN2」は、カルニチンを効率よく輸送する活性を有するため、低カルニチン血症を原因とする脂肪肝、心筋症、骨格筋症などの病態に対し、「OCTN2」の活性を制御する化合物による治療、あるいは「OCTN2」遺伝子を用いた遺伝子治療等が有効であると考えられる。
【００２１】
本発明のトランスポータータンパク質は種々の癌細胞株において発現しており、腫瘍細胞において本発明のトランスポータータンパク質が薬物を細胞内へ輸送し得る可能性がある。この場合には、本発明のトランスポータータンパク質によってより吸収されやすい抗腫瘍薬が創造できると考えられる。あるいは逆に、本発明のトランスポータータンパク質による物質の細胞外へ輸送、排出する機構が、腫瘍細胞においては抗腫瘍剤の排出として働き、腫瘍細胞が薬剤に対する抵抗性を獲得する可能性も考えられる。本発明のトランスポータータンパク質が腫瘍の薬剤耐性機構に関与しているならば、本発明のトランスポータータンパク質阻害剤を抗腫瘍剤と併用することにより、抗腫瘍効果を強化できると考えられる。
【００２２】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
サブトラクションライブラリーの作製
サブトラクションライブラリーはPCR-SelectTM cDNA Subtraction kit (CLONTECH社製)を用い、Luda Diatchenkoらの方法(Diatchenko, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 6025-6030, 1996.)に基本的に従って作製した。
まずヒト胎児肝臓由来polyA＋ RNA及びヒト成人肝臓由来polyA＋ RNAよりMMLV逆転写酵素を用いた標準的な方法で二本鎖cDNAを合成した。つぎにT4 DNAポリメラーゼによりこのcDNA末端を平滑化し、さらにRsaIにより切断した。胎児肝臓由来cDNA(テスター)の一部を2分割し、アダプター1とアダプター2（表１）をそれぞれ別々にライゲートした。これにそれぞれ120倍量の成人肝臓由来cDNA(ドライバー)を加え、熱変性を行ったあと68℃で8時間の１次ハイブリダイゼーションを行った。つぎにこれを熱変性せずに混合し、さらに熱変性した過剰量のドライバーを加え68℃で約16時間の2次ハイブリダイゼーションを行った。これを希釈用バッファーにて希釈し、75℃で7分インキュベートし、アダプターの短い方の鎖を取り除いたものをPCRの鋳型として用いた。アダプターに対応するプライマーであるPCRプライマー1（5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'／配列番号：５）、2（5'-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3'／配列番号：６）を用いたPCRを行うことにより、両端に異なるアダプターを持ったcDNA（サブトラクトされたcDNA）のみを選択的に増幅した（サプレッションPCR）。この一部を鋳型とし、PCRプライマー1、2のさらに内側に位置するプライマーであるNested PCRプライマー1（5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'／配列番号：７）と2（5'-AGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3'／配列番号：８）を用いたPCRを行うことにより、さらに選択性を増した生成物を得た。この生成物をQIAquick PCR Purification kit(QIAGEN社製)を用いて精製し、pT7Blue-Tベクター(Novagen社製)にTAクローニング法によりクローニングし、サブトラクションライブラリーとした。
【表１】
2005323605.tif 000002
【実施例２】
【００２４】
cDNAクローニング
胎児遺伝子の解析を目的に、胎児肝臓由来サブトラクションライブラリーの、ランダムシークエンシングによるスクリーニングを行った。得られたEST(Expressed Sequence Tag)のホモロジーサーチ(Blastx)による解析から、既知の有機カチオントランスポーターであるOCT1(Grundemann, D. et al., Nature, 372, 549-552, 1994.)、OCT2(Okuda, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 224, 500-507, 1996.)と有意な相同性を示すアミノ酸配列をコードするクローン、「OCTN1(fls631)」(292bp)が見いだされた。このクローンの配列は新規なものであり、新規のトランスポーター遺伝子由来の断片である可能性が推測されたことから、この遺伝子の全オープンリーディングフレーム(ORF)を含むcDNAのクローニングを行った。
【００２５】
胎児肝臓由来サブトラクションライブラリーより得られた「OCTN1」オリジナルクローンをプローブとし、human fetal liver 5'-stretch cDNAライブラリー(CLONTECH社製)のスクリーニングを行った。「OCTN1」オリジナルクローンのインサートを、M13 P4-22とM13 P5-22を用いたPCRにより増幅し、これをReady-to Go DNA labelling beads(Pharmacia社製)を用いたランダムプライマー法により[α-32P]dCTPでラベルし、プローブとした。ハイブリダイゼーションはExpressHyb Hybridization Solution(CLONTECH社製)中、68℃で、メーカー推奨の方法に従い行った。また、最終的な洗浄は、0.1 X SSC, 0.1% SDS、50℃で行った。約5x105個のファージクローンをスクリーニングしたところ、最終的に7個の陽性クローンが単離された。これらのクローンのインサートcDNAをλgt10ベクターの配列より設計したベクタープライマー(GT10 S1 5'-CTTTTGAGCAAGTTCAGCCT-3'／配列番号：９, GT10 A1 5'-AGAGGTGGCTTATGAGTATTTCTT-3'／配列番号：１０)、あるいは解読されたcDNAの配列より設計したプライマーを用いたPCRによって増幅し、その産物を直接シークエンシングすることにより、塩基配列を決定した。一部の増幅が困難な領域については7-deaza dGTPを基質塩基として用いたPCRによる増幅を行った(McConlogue, L. et al., Nucleic Acids Res. 16, 9869, 1988.)。
【００２６】
これらのクローンのインサートcDNAの塩基配列を決定した結果、「ヒトOCTN1」遺伝子は、551アミノ酸（推定分子量約62,000）からなるORFをコードし得る配列を持つことが明らかとなった。この全アミノ酸配列を用いてデーターベースサーチを行ったところ、全体に渡ってOCT1及びOCT2と有意な相同性（約34%）を示すことが確認された。また、Kyte & Doolittleの計算式(Kyte, J. and Doolittle, R. F., J. Mol. Biol. 157, 105-132, 1982.)によって得られる疎水性プロフィールは、OCT1およびOCT2のものと非常に類似しており、11-12個の膜貫通領域と思われる疎水性領域が認められた（図１）。また、この配列中には1個の糖トランスポーターのコンセンサス配列（[Leu, Ile, Val, Met, Ser, Thr, Ala, Gly]-[Leu, Ile, Val, Met, Phe, Ser, Ala, Gly]-Xaa<2>-[Leu, Ile, Val, Met, Ser, Ala]-[Asp, Glu]-Xaa-[Leu, Ile, Val, Met, Phe, Tyr, Trp, Ala]-Gly-Arg-[Arg, Lys]-Xaa<4-6>-[Gly, Ser, Thr, Ala]）が存在した(160-175)。このコンセンサス配列は、哺乳類細胞におけるグルコースのトランスポーターであるGLUT1〜GLUT7に存在するコンセンサス配列であり、グルコーストランスポーター以外にも、様々なタイプのトランスポーターに存在することが知られている(Maiden, M. C. et al., Nature, 325, 641-643, 1987.)。「ヒトOCTN1」のアミノ酸配列中には、さらに、N型糖鎖が付加され得る配列（N-X-[ST]）が4箇所(57-59, 64-66, 91-93, 304-306)見られる。また、プロテインキナーゼCによるリン酸化を受け得るサイト（[ST]-X-[RK]）も5箇所（164-166, 225-227, 280-282, 286-288, 530-532）存在した。さらに、ATP/GTP結合サイトのコンセンサス配列([Ala, Gly]-Xaa(4)-Gly-Lys-[Ser, Thr])も存在する。このATP/GTP結合サイトのコンセンサス配列はキナーゼやrasファミリータンパク等のATP結合タンパク、あるいはGTP結合タンパク質に存在し、この部位にATP,GTPが結合することが知られている(Walker, J. E. et al. EMBO J., 1, 945-951, 1982)。また、ABC(ATP Binding Cassette)型トランスポーターと呼ばれるトランスポーターにはこの配列が存在し、ATPを加水分解することによるエネルギーを用いて物質を輸送していることが示されている(Higgins, C. F. et al., J. Bioenerg. Biomembr., 22, 571-592, 1990; Urbatsch, I. L. et al., J. Biol. Chem., 270, 26956-26961, 1995))。このコンセンサス配列の存在により、「OCTN1」タンパク質がATPあるいはGTP依存的な輸送を行うトランスポーターである可能性も考えられる。
【００２７】
なお、塩基配列の決定は、アルカリSDS法によって調製したプラスミドDNA、またはコロニーPCRなどによるPCR産物を鋳型とし、ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit With AmplyTaq DNA Polymerase,FSを用いたサイクルシークエンシング法により行い、ABI 377 DNA Sequencer（PerkinElmer社製）により解読した。コロニーPCRは、ベクタープライマーであるM13 P4-22(5'-CCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'／配列番号：１１)及びM13 P5-22(5'-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3'／配列番号：１２)を含むPCR反応溶液の中に、組み換え体を持つコロニーを直接懸濁することにより行った。PCR反応後、増幅されたインサートDNAから、ゲル濾過法などにより未反応のプライマー、ヌクレオチド等を除き、シークエンシングの鋳型として用いた。
【実施例３】
【００２８】
ノーザン解析
「ヒトOCTN1」の組織分布をノーザン解析により調べた（図２）。「ヒトOCTN1」の3'側断片（約1,100番目の塩基より後半）を、Ready-to Go DNA labelling beads (Pharmacia 社製)を用いたランダムプライマー法により[α-32P]dCTPでラベルし、プローブ として用いた。Multiple Tissue Northern (MTN) Blot - Human , Human III, Human IV, Human Fetal II, Human Cell line (CLONTECH社製)を用い、ExpressHyb Hybridization Solution (CLONTECH社製)中で、メーカー推奨の方法に従い、68℃でハイブリダイゼーションを行った。最終的な洗浄は、0.1 X SSC, 0.1% SDS、50℃で行った。その結果、胎児では肝臓に、そして成人由来の臓器では、腎臓、骨髄、気管に約2.5kbの強い発現が観察された。それ以外には胎児の腎臓、肺、そして成人の骨格筋、肺、胎盤、前立腺、脾臓、脊髄に弱い発現が見られた。また、腫瘍細胞株においてもHeLa S3、K562、SW480、A549に発現が認められ、特にHeLa S3においては非常に強く発現していることが明らかとなった。
【実施例４】
【００２９】
「ヒトOCTN2」のcDNAクローニング
「ヒトOCTN1」の全塩基配列を用いたデータベースサーチより、ヒト５番染色体q領域由来P1ファージクローン(P1 H24クローン。GenBank accession No.L43407, L43408, L46907, L81773, L43409)の塩基配列の一部に、「ヒトOCTN1」の配列と非常に類似した配列が含まれていることを見いだした。「ヒトOCTN1」の塩基配列と類似性がある部分は、全く類似性を持たない配列によって分断されているが、これを「ヒトOCTN1」の配列を参考にすることにより連結してみると、「ヒトOCTN1」と広い領域に渡って高い相同性を持つ配列になることがわかった。このことから、「OCTN1」ホモローグが存在することが示唆された。しかしデータベースに登録されているゲノム配列は全コーディング領域をカバーしていない不完全なものであったため、この配列からだけでは、そこにコードされるタンパク質の完全な構造を知ることは不可能であった。そこでこの「OCTN1」ホモローグ遺伝子(「OCTN2」)のcDNAクローニングを行い、コードされるタンパクの構造を決定した。まず、これらのP1ファージクローンの配列より631R S4プライマー(5'-GTGCTGTTGGGCTCCTTCATTTCA-3'／配列番号：１３)及び631R A1プライマー(5'-AGCTGCATGAAGAGAAGGACACTG-3'／配列番号：１４)を作製し、ヒト成人腎臓由来polyA＋ RNA(CLONTECH社製)より合成したcDNAを鋳型に、94℃で3分、「94℃で30秒、58℃で1分、72℃で2分」を35サイクル、72℃で10分という条件によるPCRを行ったところ、約900bpの断片が増幅された。この断片をpT7Blue-Tベクター(Novagen社製)にTAクローニング法によりサブクローニングし、塩基配列を決定したところ、全体に渡り「ヒトOCTN1」と非常に高い相同性を有することが明らかとなった。そこでこの遺伝子を「ヒトOCTN2」と命名し、さらに長いcDNAのクローニングを行った。
【００３０】
このクローンのインサートをプローブとして用い、「ヒトOCTN1」cDNAクローニングの場合と同様な方法でヒト腎臓由来cDNAライブラリーをスクリーニングし、より長いクローンを単離していく操作、及びRACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)法（Chenchik, A., Moqadam, F., and Siebert, P. (1995) CLONTECHniques X, 5-8）等により、「ヒトOCTN2」の全コーディング領域を含むcDNAをクローニングしその構造を決定した（配列番号：４）。RACE法は具体的には、次のように行った。631R S6プライマー(5'-AGCATCCTGTCTCCCTACTTCGTT-3'／配列番号：１５)を作製し、ヒト成人腎臓由来Marathon-ReadyTM cDNA(CLONTECH社製)を鋳型として、94℃で2分、「94℃で30秒、60℃で1分、72℃で3分」を35サイクル、72℃で10分という条件のPCRを行ったところ、約1.7kbpの3'側cDNA断片が増幅され、これをpT7Blue-TベクターにTAクローニング法によりサブクローニングし、構造を決定した。
【００３１】
「ヒトOCTN2」は557アミノ酸からなるORFをコードしていることが明らかとなった。「ヒトOCTN1」と「ヒトOCTN2」のアミノ酸配列の比較を図３に示す。両者は全体に渡り、約76%という非常に高い相同性を示した。また「ヒトOCTN2」アミノ酸配列中には「ヒトOCTN1」と同様に1個の糖トランスポーターのコンセンサス配列（160-176）が存在した。これらのことより、「OCTN2」は「OCTN1」と構造上の関連を持った新規トランスポーターである可能性が示唆された。また、「ヒトOCTN2」アミノ酸配列中にも、「ヒトOCTN1」と同様にATP/GTP結合サイトのコンセンサス配列（218-225）が存在した。
【実施例５】
【００３２】
ノーザン解析
631R S4プライマー(5'-GTGCTGTTGGGCTCCTTCATTTCA-3'／配列番号：１３)及び631R A1プライマー(5'-AGCTGCATGAAGAGAAGGACACTG-3'／配列番号：１４)を用いたPCRによって得られた約900bpの「ヒトOCTN2」cDNAをプローブとし、「ヒトOCTN1」と同様にノーザン解析を行った。その結果を図４に示す。発現パターンは「ヒトOCTN1」のパターンと重複している部分があるが、胎児組織において腎臓に非常に強い発現が見られる点が特に異なっていた。また、「ヒトOCTN2」もまたK-562, HeLaS3, SW480等の癌細胞株で強く発現していることが判明した。これらの癌細胞において、「OCTN1」、「OCTN2」が抗癌剤などの物質の輸送に関与している可能性が示唆される。
【実施例６】
【００３３】
「ヒトOCTN1」のヒト胎児腎臓細胞(HEK293)での強制発現と活性測定
プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングによって得られた陽性ファージクローンより、QIAGEN Lambda Kit(QIAGEN社製)を用いてファージDNAを抽出した。インサートDNAをpUC18ベクターにサブクローニングした後、SmaI及びEcoRIで切り出される全ORFを含むcDNAを、哺乳類細胞用の発現ベクターであるpcDNA3(Invitrogen社製)のEcoRIサイトと、平滑末端化したHindIIIサイトとの間へ組み込み、発現用プラスミドDNA、「pcDNA3/OCTN1」を得た。プラスミドDNAは、QIAGEN PLASMID MAXI Kit(QIAGEN社製)を用いたアルカリ−SDS法で調製した。
【００３４】
pcDNA3/OCTN1、及びコントロールとしてインサートを含まないpcDNA3ベクターを、リン酸カルシウム法によりヒト胎児腎臓由来細胞株HEK293細胞に導入した。すなわち、プラスミドDNA10μg、Hepes緩衝液(137mM NaCl, 5mM KCl, 0.7mM Na2HPO4, 6mM Dextrose, 21mM Hepes pH7.1)1ml、2M CaCl2 62.5μlを混合し、30分以上室温で静置することによりリン酸カルシウム共沈物を生成させた。10cmプレート1枚あたり1.5 x 106個の細胞を蒔き、24時間培養した後、先のリン酸カルシウム共沈物を加え24時間培養し、その後PBS(Phosphate buffered saline)でプレートを洗浄し、培地を加えさらに24時間培養した。
【００３５】
プラスミドDNAを導入した細胞、あるいは未処理の細胞を用いて以下の手順に従ってトランスポート実験を行った。プレートからラバーポリスマンを用いて細胞をはがし、トランスポート緩衝液(125mM NaCl, 4.8mM KCl, 5.6mM (+)-glucose, 1.2mM CaCl2, 1.2mM KH2PO4, 1.2mM MgSO4, 25mM Hepes pH7.4)に懸濁し、20分間プレインキュベーションを行った。ついで各種基質のラベル体([14C]TEA<テトラエチルアンモニウム>(NEN)、[3H]カルニチン<L-カルニチン ヒドロクロリド>(Amersham社製)、[3H]PCG<ベンジルペニシリン>(Amersham)、[3H]キニジン(ARC)、[3H]ピリラミン<メピラミン>(Amersham社製))を適当量添加し、37℃にて一定時間インキュベートを行った。これを、3M KCl層の上にシリコンオイルと液体パラフィンの混合物（比重=1.022）を重層して作製したシリコンレイヤー上に重層し、遠心することにより細胞を分離した。細胞の放射活性を測定し、細胞内へのトランスポート能とした。なお、この際、1 x 106個の細胞を1ポイントとして用いた。また、HEK293細胞の培養は、ダルベッコMEM, 10% FCS（ウシ胎児血清）を培地とし、5% 二酸化炭素中、37℃で行った。
【００３６】
まず、TEAを基質として用い、pcDNA3/OCTN1を導入した細胞と、未処理の細胞におけるトランスポーター能を測定した（図５）。その結果、反応時間に依存した明らかな「ヒトOCTN1」導入細胞内へのTEAの取り込みが観察された。この取り込みは、未処理細胞においては見られなかった。次に、この系にラベル体ではないTEAを添加することによるコールドインヒビションの実験を行った（図６）。加えるコールドのTEAの濃度に応じて明らかな見かけ上の取り込みの低下が観察された。この実験においてはインサートを含まないpcDNA3ベクターを導入した細胞(Mock)をコントロールとしたが、未処理の細胞を用いた場合と同様に、ほとんど細胞内への基質の取り込みは認められず、この取り込み現象が「ヒトOCTN1」を導入したことによることが明らかとなった。次に、「ヒトOCTN1」のTEAに対するKm（ミカエリス定数）値を求めるために、様々な濃度の[14C]TEAを加えた場合の取り込み量を測定した（図７）。「ヒトOCTN1」を導入した細胞における取り込み量からMockの取り込み量を差し引いた正味の取り込み量をLineweaver-Burk逆数プロットすることにより、Km値は0.44±0.04mMであることが求められた。また反応の最大速度Vmaxは6.68±0.34(nmol/3 min/mg)であることが求められた。次に、TEA以外の物質に対する輸送能を検討した（図８）。有機カチオンであるカルニチン、キニジン、ピリラミンのラベル体を用い輸送能を測定したところ、Mockに対し明らかに有意な取り込み量の増加が観察され、これらの有機カチオンは「ヒトOCTN1」の基質になりうることが明らかとなった。しかし、有機アニオンであるPCG(ベンジルペニシリン)に対しては取り込み量の有意な増加は認めらなかった。
【実施例７】
【００３７】
Xenopus卵母細胞を用いた「ヒトOCTN1」の活性測定
pcDNA3/OCTN1を鋳型とし、T7 RNAポリメラーゼによりcRNAをin vitroで合成した。これを0.3ng/nlに希釈し、50nl(15ng)を一つの卵母細胞にインジェクションした。対照としては、蒸留水50nlをインジェクションした。この卵母細胞を3日間培養し、トランスポート実験に用いた。アップテイク緩衝液(0.05% Tween 80, 100mM NaCl, 2mM KCl, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 10 mM Hepes pH 7.4)中、25℃で20分卵母細胞をプレインキュベートした後、0.5mlのラベル体を含むアップテイク緩衝液中に移し、取り込みを開始した。25℃、1時間インキュベートした後、氷冷したアップテイク緩衝液で3回洗浄することにより反応を止めた。5% SDSで卵母細胞を可溶化した後、クリアゾルI（液体シンチレーションカウンター用カクテル）3mlと混合し、放射活性を測定した。また、インキュベーション時のラベル体を含んだアップテイク緩衝液（外部液）10μlの放射活性も同様に測定した。卵母細胞中の放射活性(dpm値)と、外部液中の放射活性(dpm値)の比を取り込み活性とした。
【００３８】
Xenopus卵母細胞を用いたトランスポート実験の結果、この系においても「ヒトOCTN1」はTEAの輸送能を示すことが明らかとなった（図９）。また、TEA以外にもキニジン、メピラミン、カルニチンといった有機カチオンを輸送する能力があることが判明した。
【００３９】
次に、抗癌剤などに対する輸送能を検討した。その結果、「ヒトOCTN1」はアクチノマイシンD、エトポシド、ビンブラスチン、ダウノマイシンを輸送する活性があることが明らかとなった（図１０）。これらは実際に臨床において抗癌剤として使用されている薬剤であるが、これらの薬剤の細胞内への移行メカニズム（細胞への吸収メカニズム）において「OCTN1」が関与している可能性があることが強く示唆される。このことから、「OCTN1」により認識されやすいといった、このトランスポーターの基質特異性を利用した薬剤を設計、スクリーニングすることにより、より細胞内への吸収性が高い、有用な薬剤を効率よく開発することが可能になると考えられる。
【実施例８】
【００４０】
「ヒトOCTN2」のHEK細胞での強制発現と活性測定
「ヒトOCTN2」の哺乳類細胞における発現用プラスミドDNAは以下のようにして作製した。
ヒト胎児腎臓由来polyA＋ RNA(CLONTECH社製)より、SuperScriptTM II(GIBCO BRL社製)逆転写酵素を用い、一本鎖cDNAを合成した。これを鋳型とし、以下の条件でPCRを行い、それぞれ「ヒトOCTN2」の5'側断片、及び3'側断片を増幅した。
【００４１】
「ヒトOCTN2」の5'側断片（約800bp）の増幅には、OCN2 3プライマー(5'-GATGGATCCCGGACGGTCTTGGGTCGCCTGCTG-3'／配列番号：１６)およびOCN2 4プライマー(5'-GATGGATCCAAATGCTGCCACATAGTTGGAGAT-3'／配列番号：１７)を用いた。DNAポリメラーゼ-ExTaq(TaKaRa)およびdNTPとして「150μM 7-deaza dGTP, 50μM dGTP, 200μM dATP, 200μM dTTP, 200μM dCTP」を用い、94℃で2分、「94℃で30秒、63 ℃で1分、72℃で2分」を35サイクル、72℃で10分の条件でPCRを行った。また、「ヒトOCTN2」3'側断片（約1.2kbp）の増幅には、OCN2 7プライマー(5'-GATGGATCCATGGGCATGCAGACAGGCTTCAGC-3'／配列番号：１８)およびOCN2 8プライマー(5'-GATGGATCCTTCCTCTTCAGTTTCTCCCTTACT-3'／配列番号：１９)を用いた。DNAポリメラーゼ-ExTaq(TaKaRa社製)およびdNTPとして「200μM dGTP, 200μM dATP, 200μM dTTP, 200μM dCTP」を用い、94℃で2分、「94℃で30秒、63℃で30秒、72℃で2分」を35サイクル、72℃で10分の条件でPCRを行った。
【００４２】
これらの断片をアガロースゲル電気泳動後にゲルから切り出して精製し、それぞれpT7Blue-Tベクターにサブクローニングした。シークエンシングすることによりPCRエラーのないクローンを選び、両クローンを、重複する領域に存在するPst Iサイトによって連結した。これを最終的にpcDNA3ベクターのBamHIサイトに組み込み、発現用プラスミドDNA「pcDNA3/OCTN2」とした。
【００４３】
pcDNA3/OCTN2を、インサートを含まないpcDNA3ベクター(Mock)及びpcDNA3/OCTN1と共に実施例６で示した方法によりHEK細胞に導入し、トランスポート実験を行った。その結果、「ヒトOCTN2」はカルニチンを非常に効率よく輸送する活性を持つことが判明した（図１１）。一方「ヒトOCTN2」は、「ヒトOCTN1」が効率よく輸送するTEAをほとんど輸送せず、両者には明らかな基質特異性があることが明らかとなった。
【００４４】
次にトランスポート緩衝液中のNaイオンをKに変更した緩衝液を用い、「ヒトOCTN2」のカルニチン輸送におけるNa依存性を調べた（図１２）。その結果、「ヒトOCTN2」のカルニチンの輸送は完全にNaの存在に依存していることが明らかとなった。このことから、「OCTN2」はNaと基質を共輸送するタイプのトランスポーターであることが示唆された。
【実施例９】
【００４５】
「マウスOCTN1」のクローニング
「ヒトOCTN1」cDNA配列を用いデータベースサーチを行ったところ、これと非常に高い相同性を有するいくつかのマウス由来EST(Expressed Sequence Tags)が見いだされた。これらのESTの配列からMONL 1プライマー(5'-CGCGCCGAATCGCTGAATCCTTTC-3'／配列番号：２０)およびMONA 4プライマー(5'-AGGCTTTTGATTTGTTCTGTTGAG-3'／配列番号：２１)を作製し、マウス腎臓由来polyA＋ RNAより作製したcDNAを鋳型としてPCRを行った。その結果、約2kbpの断片が増幅され、これをアガロース電気泳動後切り出して精製し、pT7Blue Tベクター(Novagen社製)にTA cloning法によってサブクローニングした。複数のクローンをシークエンシングし、「マウスOCTN1」の配列を決定した。決定したcDNAの塩基配列を配列番号：２３に、該cDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２２に示す。
【実施例１０】
【００４６】
「マウスOCTN2」のクローニング
まず、「ヒトOCTN2」cDNAの配列よりMONB 20プライマー (5'-CCCATGCCAACAAGGACAAAAAGC-3'／配列番号：２４) を作製し、マウス腎臓由来Marathon-ReadyTM cDNA (CLONTECH社製)を鋳型とした5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)により、このプライマーより5'側上流をクローニングした。次に、「ヒトOCTN2」配列を用いデータベースサーチをすることにより、これと非常に高い相同性を有するマウス由来ESTをいくつか見いだし、これらのESTの配列からMONB 26プライマー(5'-ACAGAACAGAAAAGCCCTCAGTCA-3'／配列番号：２５)を作製した。5'-RACEによって得られた配列からMONB 6プライマー(5'-TGTTTTTCGTGGGTGTGCTGATGG-3'／配列番号：２６)を作製し、これとMONB 26プライマーを用いたPCRにより、3'側断片を マウス腎臓由来polyA＋ RNAより作製したcDNAより増幅した。それぞれの断片をサブクローニングした後、あるいは直接にシークエンシングすることにより「マウスOCTN2」の配列を決定した。決定したcDNAの塩基配列を配列番号：２８に、該cDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２７に示す。
【実施例１１】
【００４７】
「マウスOCTN1」および「マウスOCTN1」の組織発現解析
「マウスOCTN1」および「マウスOCTN2」遺伝子の各組織における発現量をマウスMTC(Maltiple Tissue cDNA)パネル（CLONTECH社製）を用いたRT-PCR法により調べた（図１３）。用いたプライマーは、「マウスOCTN1」については「MONL 1」および「MONA 4」、「マウスOCTN2」については「MONB 6」および「MONB 26」である。その結果、「マウスOCTN1」は腎臓や肝臓に、「マウスOCTN2」は腎臓、肝臓および７日目の胚に高い発現が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明により、有機カチオンを輸送する新規なトランスポーター遺伝子ファミリーおよびこれら遺伝子がコードするタンパク質が提供された。本発明のトランスポータータンパク質は、これを介して輸送される新規なデザインの薬物の開発や、その機能異常などに起因する疾患の治療薬の開発などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、「ヒトOCTN1」と「ヒトOCTN2」の疎水性プロットを示す。Kyte&Doolittleの計算式による。Windowサイズは9アミノ酸である。数字は予想される膜貫通領域を示す。
【図２】図２は、「ヒトOCTN1」のノーザン解析の結果を示す電気泳動像である。
【図３】図３は、「ヒトOCTN1」と「ヒトOCTN2」のアミノ酸配列の比較を示す。一致するアミノ酸は影付きで表す。糖トランスポーターのコンセンサス配列に一致する配列を「＋」で、ATP/GTP結合サイトのコンセンサス配列に一致する配列を「＊」で示す。
【図４】図４は、「ヒトOCTN2」のノーザン解析の結果を示す電気泳動像である。
【図５】図５は、「ヒトOCTN1」のTEAの吸収活性を示す。白丸は未処理の細胞、黒丸は「ヒトOCTN1」を導入した細胞を示す。
【図６】図６は、図５の実験系に対するコールドTEAの添加による影響を示す。図中の黒丸は「ヒトOCTN1」を導入した細胞、白丸はインサートを含まないベクターを導入した細胞、白三角は黒丸の値から白丸の値を差し引いた、正味の「ヒトOCTN1」による取り込み量を指す。
【図７】図７は、「ヒトOCTN1」におけるTEA吸収活性のTEA濃度依存性を示す。
【図８】図８は、「ヒトOCTN1」を導入した細胞におけるTEA以外の物質の吸収活性を示す図である。
【図９】図９は、Xenopus卵母細胞を用いたトランスポート実験の結果を表す。「OCTN1」、「Water」と示したバーはそれぞれ、「ヒトOCTN1」cRNAをインジェクトした場合、及びcRNAを含まない水をインジェクトした場合の取り込み活性を示す。「ヒトOCTN1」cRNAをインジェクトした卵母細胞へのTEA、カルニチン、メピラミン、及びキニジン及びアクチノマイシンDの取り込みが観察された。一方、cRNAを含まない水をインジェクトした卵母細胞はほとんど取り込み活性を示さなかった。
【図１０】図１０は、Xenopus卵母細胞を用いた抗癌剤のトランスポート実験の結果を表す。「OCTN1」、「Water」と示したバーはそれぞれ、「ヒトOCTN1」cRNAをインジェクトした場合、及びcRNAを含まない水をインジェクトした場合の取り込み活性を示す。「ヒトOCTN1」cRNAをインジェクトした卵母細胞へのアクチノマイシンD、エトポシド、ビンブラスチン、及びダウノマイシンの取り込みが観察された。
【図１１】図１１は、HEK293細胞における「ヒトOCTN1」と「ヒトOCTN2」のトランスポート実験の結果を表す。「ヒトOCTN1」はTEAを、また「ヒトOCTN2」はカルニチンを効率よく輸送する活性を持つことがわかる。
【図１２】図１２は、「ヒトOCTN2」のカルニチン輸送活性に対するNaの依存性を調べた結果を示す。「ヒトOCTN2」はNa存在下、時間に依存したカルニチンの輸送活性を示す（白丸）が、この活性はNa非存在下には全く見られず（黒丸）、「ヒトOCTN2」のカルニチン輸送活性はNaの存在に依存していることがわかる。
【図１３】図１３は、「マウスOCTN1」および「マウスOCTN2」遺伝子の発現を各組織においてRT-PCRによって検出した図である。G3PDHはコントロールであり、各cDNA量がそろっていることを示す。
【図１】
2005323605.tif 000003
【図２】
2005323605.tif 000004
【図３】
2005323605.tif 000005
【図４】
2005323605.tif 000006
【図５】
2005323605.tif 000007
【図６】
2005323605.tif 000008
【図７】
2005323605.tif 000009
【図８】
2005323605.tif 000010
【図９】
2005323605.tif 000011
【図１０】
2005323605.tif 000012
【図１１】
2005323605.tif 000013
【図１２】
2005323605.tif 000014
【図１３】
2005323605.tif 000015
【配列表】
2005323605000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年7月20日(2005.7.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２２または２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、またはこれらタンパク質中のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列からなり、有機カチオンを輸送する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載のDNAがコードするタンパク質であって、有機カチオンを輸送する活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号：２３または２８に記載の塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号：２３または２８に記載の塩基配列からなるDNAにハイブリダイズするDNA
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質をコードするDNA。
【請求項４】
請求項３に記載のDNAが挿入されたベクター。
【請求項５】
請求項３に記載のDNAを発現可能に保持する形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１または２に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項７】
請求項１または２に記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項８】
配列番号：２３または２８に記載の塩基配列からなるDNAに特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するDNA。
【手続補正書】
【提出日】平成17年9月30日(2005.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１、２２または２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、またはこれらタンパク質中のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列からなり、有機カチオンを輸送する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載のDNAがコードするタンパク質であって、有機カチオンを輸送する活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号：２、２３または２８に記載の塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号：２、２３または２８に記載の塩基配列からなるDNAにハイブリダイズするDNA
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質をコードするDNA。
【請求項４】
請求項３に記載のDNAが挿入されたベクター。
【請求項５】
請求項３に記載のDNAを発現可能に保持する形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１または２に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項７】
請求項１または２に記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項８】
配列番号：２、２３または２８に記載の塩基配列からなるDNAに特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するDNA。