(57)【要約】      （修正有）【課題】医療レベルにおける、ＩＬ-４およびＩＬ-１３（インターロイキン−１３）の調節の現象の、および特にこれらの２種のサイトカインのいずれかによって創製される効果を分離し、別々に制御することができるＩＬ−１３受容体ポリペプチド及びその作製方法の提供。【解決手段】ＩＬ−１３に特異的に結合することができる、特定な配列のフラグメントからなり、かつ／または細胞膜のレベルでＩＬ−１３によって特異的に生成されるシグナルの伝達に関与し、かつ／または特定な配列のポリペプチドに特異的な抗体によって認識され、ならびに／あるいは特定な配列のポリペプチドを認識する抗体を誘導することができる精製されたポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
８個のＣ−末端残基が以下の６個の残基：VRCVTLによって置換されている配列番号：２の配列のポリペプチドの変異型であるポリペプチドをコードする配列またはその相補鎖からなることを特徴とするプローブを含む、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションにより、生物試料中の、８個のＣ−末端残基が以下の６個の残基：VRCVTLによって置換されている配列番号：２の配列のポリペプチドの変異型であるポリペプチドをコードする核酸配列を検出するための、または、異型接合性または遺伝子転移の欠失のごとき異常な合成または遺伝的異常を明らかにするためのイン・ビトロ（in  vitro）診断ツール。
【請求項２】
残基３４３まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態をコードする配列またはその相補鎖からなることを特徴とするプローブを含む、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションにより、生物試料中の、残基３４３まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチドをコードする核酸配列を検出するための、または、異型接合性または遺伝子転移の欠失のごとき異常な合成または遺伝的異常を明らかにするためのイン・ビトロ（in  vitro）診断ツール。
【請求項３】
残基３３７まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態をコードする配列またはその相補鎖からなることを特徴とするプローブを含む、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションにより、生物試料中の、残基３３７まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチドをコードする核酸配列を検出するための、または、異型接合性または遺伝子転移の欠失のごとき異常な合成または遺伝的異常を明らかにするためのイン・ビトロ（in  vitro）診断ツール。
【請求項４】
８個のＣ−末端残基が以下の６個の残基：VRCVTLによって置換されている配列番号：２の配列のポリペプチドの変異型であるポリペプチドをコードするプローブを含む染色体異常を検出するための組成物。
【請求項５】
配列番号：１の配列のヌクレオチド番号１からヌクレオチド１０８１まで伸長するヌクレオチドリンケージからなるプローブを含む染色体異常を検出するための組成物。
【請求項６】
配列番号：１の配列のヌクレオチド番号１からヌクレオチド１０６３まで伸長するヌクレオチドリンケージからなるプローブを含む染色体異常を検出するための組成物。
【請求項７】
８個のＣ−末端残基が以下の６個の残基：VRCVTLによって置換されている配列番号：２の配列のポリペプチドの変異型であるポリペプチドをコードする配列またはその相補鎖からなるヌクレオチド・プローブを、所望により、前記ヌクレオチド配列の増幅の予備段階後であってもよいが、該プローブと前記のヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーション複合体の形成を許容するストリンジェントな条件下で接触させ；
形成し得るハイブリダイゼーション複合体を検出し；
所望により、本発明のプローブとハイブリダイゼーション複合体を形成するヌクレオチド配列を配列決定してもよいことを含む、８個のＣ−末端残基が以下の６個の残基：VRCVTLによって置換されている配列番号：２の配列のポリペプチドの変異型であるポリペプチドをコードする核酸配列のレベルにおける異常な合成または遺伝的異常をイン・ビトロ（in  vitro）検出するための方法。
【請求項８】
残基３４３まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチドをコードする核酸配列またはその相補鎖からなるヌクレオチド・プローブを、所望により、前記ヌクレオチド配列の増幅の予備段階後であってもよいが、該プローブと前記のヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーション複合体の形成を許容するストリンジェントな条件下で、生物試料と接触させ；
形成し得るハイブリダイゼーション複合体を検出し；
所望により、配列番号：１の配列のヌクレオチド番号１からヌクレオチド１０８１まで伸長するヌクレオチドリンケージからなるプローブとハイブリダイゼーション複合体を形成するヌクレオチド配列を配列決定してもよいことを含む、残基３４３まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチドをコードする核酸配列のレベルにおける異常な合成または遺伝的異常をイン・ビトロ（in  vitro）検出するための方法。
【請求項９】
配列番号：１の配列のヌクレオチド番号１からヌクレオチド１０６３まで伸長するヌクレオチドリンケージからなるヌクレオチド・プローブを、所望により、前記ヌクレオチド配列の増幅の予備段階後であってもよいが、該プローブと前記のヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーション複合体の形成を許容するストリンジェントな条件下で、生物試料と接触させ；
形成し得るハイブリダイゼーション複合体を検出し；
所望により、該プローブとハイブリダイゼーション複合体を形成するヌクレオチド配列を配列決定してもよいことを含む、残基３３７まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチドをコードする核酸配列のレベルにおける異常な合成または遺伝的異常をイン・ビトロ（in  vitro）検出するための方法。
【請求項１０】
８個のＣ−末端残基が以下の６個の残基：VRCVTLによって置換されている配列番号：２の配列のポリペプチドをコードする核酸配列を使用することによって特徴付けられる、８個のＣ−末端残基が以下の６個の残基：VRCVTLによって置換されている配列番号：２の配列のポリペプチドの変異型である組換えポリペプチドの作製方法。
【請求項１１】
配列番号：１の配列のヌクレオチド番号１からヌクレオチド１０８１まで伸長するヌクレオチドリンケージからなる核酸配列を使用することによって特徴付けられる、残基３４３まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態である組換えポリペプチドの作製方法。
【請求項１２】
配列番号：１の配列のヌクレオチド番号１からヌクレオチド１０６３まで伸長するヌクレオチドリンケージからなる核酸配列を使用することによって特徴付けられる、残基３３７まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態である組換えポリペプチドの作製方法。
【請求項１３】
８個のＣ−末端残基が以下の６個の残基：VRCVTLによって置換されている配列番号：２の配列のポリペプチドの変異型であるポリペプチドの発現を許容する条件下で、該ポリペプチドをコードする核酸でトランスフェクトした細胞を培養し；ついで
該組換えポリペプチドを回収することを特徴とするＩＬ−１３β受容体組換えポリペプチドを作製する方法。
【請求項１４】
残基３４３まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態である組換えポリペプチドの発現を許容する条件下で、配列番号：１の配列のヌクレオチド番号１からヌクレオチド１０８１まで伸長するヌクレオチドリンケージからなる配列を有する核酸でトランスフェクトした細胞を培養し、ついで、該組換えポリペプチドを回収することを特徴とするＩＬ−１３β受容体組換えポリペプチドを作製する方法。
【請求項１５】
残基３３７まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態である組換えポリペプチドの発現を許容する条件下で、配列番号：１の配列のヌクレオチド番号１からヌクレオチド１０６３まで伸長するヌクレオチドリンケージからなる配列を有する核酸でトランスフェクトした細胞を培養し、ついで該組換えポリペプチドを回収することを特徴とするＩＬ−１３β受容体組換えポリペプチドを作製する方法。
【請求項１６】
８個のＣ−末端残基が以下の６個の残基：VRCVTLによって置換されている配列番号：２の配列のポリペプチドの変異型であるポリペプチドを特異的に認識することができることを特徴とするモノクローナルまたはポリクローナル抗体、コンジュゲート抗体、またはそれらの断片。
【請求項１７】
残基３４３まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチドを特異的に認識することができることを特徴とするモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、コンジュゲート抗体、またはそれらの断片。
【請求項１８】
残基３３７まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチドを特異的に認識することができることを特徴とするモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、コンジュゲート抗体、またはそれらの断片。
【請求項１９】
請求項１６記載の抗体を含む、生物試料中の、８個のＣ−末端残基が以下の６個の残基：VRCVTLによって置換されている配列番号：２の配列のポリペプチドの変異型であるポリペプチドを検出するための組成物。
【請求項２０】
請求項１７記載の抗体を含む、生物試料中の、残基３４３まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチドを精製または検出するための組成物。
【請求項２１】
請求項１８記載の抗体を含む、生物試料中の、残基３３７まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチドを精製または検出するための組成物。
【請求項２２】
請求項１６、１７または１８いずれかに記載の少なくとも１の抗体を、ＩＬ−１３受容体と該抗体（または複数の該抗体）との間の特異的な免疫複合体の可能な形成を許容する条件下で接触させること、および、形成し得る特異的な免疫複合体を検出することを特徴とする、異常なレベルで発現されたＩＬ−１３受容体の異常な発現と相関する病理をイン・ビトロ（in  vitro）で検出するための方法。
【請求項２３】
所望により支持体に結合していてもよい、請求項１６、１７または１８いずれかに記載のＩＬ−１３受容体に特異的な少なくとも１の抗体、
ＩＬ−１３受容体と該抗体（または複数の該抗体）との間の特異的な抗原／抗体複合体の形成を明らかにするための手段および／またはその複合体を定量化する手段を含む、生物試料中のＩＬ−１３受容体の異常な発現をイン・ビトロ（in  vitro）診断するためのおよび／または該試料中のＩＬ−１３受容体の発現のレベルを測定するためのキット。
【請求項２４】
８個のＣ−末端残基が以下の６個の残基：VRCVTLによって置換されている配列番号：２の配列のポリペプチドの変異型であるポリペプチド、またはその活性をモジュレートすることができる因子を同定および／または単離するための方法であって、所望により未同定であってもよい化合物または種々の化合物を含有する混合物を、８個のＣ−末端残基が以下の６個の残基：VRCVTLによって置換されている配列番号：２の配列のポリペプチドの変異型であるポリペプチドを表面に発現している細胞と、該化合物が該ポリペプチドに対して親和性を有する場合には該ポリペプチドおよび該化合物の間の相互作用を許容する条件下で接触させること、および、該ポリペプチドに結合した化合物またはその生物活性をモジュレートすることができるものを検出および／または単離することを特徴とする該方法。
【請求項２５】
残基３４３まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチド、またはその活性をモジュレートすることができる因子を同定および／または単離するための方法であって、所望により未同定であってもよい化合物または種々の化合物を含有する混合物を、残基３４３まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチドを表面に発現している細胞と、該化合物が該ポリペプチドに対して親和性を有する場合には該ポリペプチドおよび該化合物の間の相互作用を許容する条件下で接触させること、および、該ポリペプチドに結合した化合物またはその生物活性をモジュレートすることができるものを検出および／または単離することを特徴とする該方法。
【請求項２６】
残基３３７まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチド、またはその活性をモジュレートすることができる因子を同定および／または単離するための方法であって、所望により未同定であってもよい化合物または種々の化合物を含有する混合物を、残基３３７まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチドを表面に発現している細胞と、該化合物が該ポリペプチドに対して親和性を有する場合には該ポリペプチドおよび該化合物の間の相互作用を許容する条件下で接触させること、および、該ポリペプチドに結合した化合物またはその生物活性をモジュレートすることができるものを検出および／または単離することを特徴とする該方法。
【請求項２７】
８個のＣ−末端残基が以下の６個の残基：VRCVTLによって置換されている配列番号：２の配列のポリペプチドの変異型であるポリペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
【請求項２８】
残基３４３まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
【請求項２９】
残基３３７まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
【請求項３０】
８個のＣ−末端残基が以下の６個の残基：VRCVTLによって置換されている配列番号：２の配列のポリペプチドの変異型であるポリペプチドを含む、ＩＬ−１３Ｒβの活性をモジュレートすることができる因子をスクリーニングするための組成物。
【請求項３１】
残基３４３まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチドを含む、ＩＬ−１３Ｒβの活性をモジュレートすることができる因子をスクリーニングするための組成物。
【請求項３２】
残基３３７まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチドを含む、ＩＬ−１３Ｒβの活性をモジュレートすることができる因子をスクリーニングするための組成物。
【請求項３３】
８個のＣ−末端残基が以下の６個の残基：VRCVTLによって置換されている配列番号：２の配列のポリペプチドの変異型であるポリペプチドの使用によって特徴付けられる、ＩＬ−１３Ｒβの活性をモジュレートすることができる生成物の製造方法。
【請求項３４】
残基３４３まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチドの使用によって特徴付けられる、ＩＬ−１３Ｒβの活性をモジュレートすることができる生成物の製造方法。
【請求項３５】
残基３３７まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチドの使用によって特徴付けられる、ＩＬ−１３Ｒβの活性をモジュレートすることができる生成物の製造方法。
【請求項３６】
８個のＣ−末端残基が以下の６個の残基：VRCVTLによって置換されている配列番号：２の配列のポリペプチドの変異型であるポリペプチドの使用によって特徴付けられる、ＩＬ−１３β拮抗作用を有する医療生成物の合成方法。
【請求項３７】
残基３４３まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチドの使用によって特徴付けられる、ＩＬ−１３β拮抗作用を有する医療生成物の合成方法。
【請求項３８】
残基３３７まで伸長する配列番号：２の配列のポリペプチドの可溶性形態であるポリペプチドの使用によって特徴付けられる、ＩＬ−１３β拮抗作用を有する医療生成物の合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン-１３（ＩＬ-１３）に対して特異的な受容体活性を有する精製ポリペプチド、その生物学的に活性なフラグメント、および相当する核酸配列、ならびにそれらの適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ-１３は、最近同定された（１、２）、活性化Ｔリンパ球、活性化後のＢリンパ球および肥満細胞によって分泌される１１２アミノ酸のサイトカインである。
ＩＬ-４と共有するその膨大な生物特性により、ＩＬ-１３はＩＬ-４様サイトカインとして説明されている。その活性は、Ｂ-細胞（３-５）、単球（６-１０）および他の非-造血細胞（１１-１２）に対するＩＬ-４の活性に実際に類似している。一方、ＩＬ-４とは反対に、休止または活性化Ｔ細胞に対しては特異的な効果を何ら及ぼさないようである（１３）。
【０００３】
単球／マクロファージ、Ｂリンパ球およびある種の造血前駆体に対するＩＬ-１３の種々の生物活性はA.J.Mintyによって、ならびにＩＬ-１３の概説論文に詳記されている（例えば１４を参照されたし）。加えて、幾つかのデータは、このサイトカインが他の細胞型に対して多面的な効果を有することを示している。ＩＬ-１３によって直接的に影響を受けるこれらの非-造血細胞は、内皮細胞および小膠細胞、表皮ケラチン細胞、ならびに腎臓および小腸のガン腫である。
ＩＬ-１３の抗-炎症および免疫調節活性は、例えば、自己免疫疾患、腫瘍およびウイルス病理の治療に有用となり得る。
【０００４】
しかしながら、臨床レベルにおけるこれらの生物特性の利用には、関連する病理において生物特性を制御および変調させることができるように、それを介してこの効果が発揮されるシグナルおよびメカニズムの完全な認識が要求される。
細胞内の生物分子によって伝達されるシグナルの分析におけるステージの１つは、その膜受容体を同定することにある。ＩＬ-１３受容体のこの側面に対して行った研究実験により、ＩＬ-１３およびＩＬ-４が共通の受容体、または非常に少なく見積もっても共通受容体複合体の幾つかのコンポーネント、ならびに共通のシグナル伝達エレメントを有することが示されている（１５-１８）。この受容体は、考えられる細胞型によって変動し得る数で、種々の細胞型の表面に存在する。ＩＬ-１３およびＩＬ-１４受容体の比較分布が、A.J.Minty（１４）によって示されている。
【０００５】
Kondoら（１９）は、ＩＬ-４に対して高親和性を有する受容体の構造を記載している。この受容体は、１４０ｋＤａの糖蛋白質（ＩＬ-４Ｒ）とＩＬ-２受容体のγ鎖（γｃ）との会合によって形成されるダイマーである。ＩＬ-４は高親和性（５０〜１００ｐＭのＫｄ）で１４０ｋＤａの糖蛋白質サブユニット（ＩＬ-４Ｒまたはｇｐ１４０）に結合することができる（１５）。しかしながら、この親和性は、γｃ鎖がｇｐ１４０と会合した場合には、２〜３倍だけ上昇する。加えて、この会合はＩＬ-４により媒介されるある種のシグナルの伝達にも必要である（１９、２０）。
【０００６】
ＩＬ-１３またはＩＬ-４のいずれかの結合性に関する交差-競合実験により、ＩＬ-４はＩＬ-１３の結合性を通常妨害し得るが、ＩＬ-１３は一般的にＩＬ-４のその受容体に対する結合性を部分的にしか妨害できず（１７、２１）、ＩＬ-４受容体の２個のサブユニットのいずれにも、またはそれらの会合によって形成された複合体にも結合しないことが立証されている。これらの知見に基づいて、本発明者らは、ＩＬ-１３に対して特異的な受容体が、もう１個のＩＬ-１３結合性コンポーネント（ＩＬ-１３Ｒβ）と会合した受容体複合体ＩＬ-４よりなると予想した。
【０００７】
ＩＬ-１３およびＩＬ-４に応答して増殖することができる赤白血球細胞系統（ＴＦ-１系統）で行った研究実験により、これらの２種のサイトカインがそれらの受容体に結合した後に同様の細胞内事象を生成することが示された（１８）。平行して、交差-連結（cross-linking）実験により、ｇｐ１４０が、γ鎖または新たなサブユニットのいずれかと分子量５５〜７０ｋＤａのヘテロダイマーを形成し得ることが示された（１７、２１）。
【０００８】
さらに、マウス胚幹細胞系統で最近行われた研究実験により、４２４アミノ酸残基のポリペプチド（ＩＬ−１３Ｒα）をコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡを単離することが可能となったが、これは、高親和性、すなわちその定数Ｋｄが約１０ｐＭ〜１００ｐＭの値にある親和性を有する受容体（低親和性受容体は、２ｎＭ〜１０ｎＭの値にある定数Ｋｄを有している）（２２、２３）を構成するように、ＩＬ-１３受容体がＩＬ-４受容体と共通の鎖を分有していることを示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
医療レベルにおける、ＩＬ-４およびＩＬ-１３の調節の現象の、および特にこれらの２種のサイトカインのいずれかによって創製される効果を分離し、別々に制御することができる可能性の明確な理解の重要性に鑑み、本発明者らは、一方では、高親和性を有するポリペプチド特異的結合性ＩＬ-１３の特徴付けに、他方では、低親和性でＩＬ-１３に単独で特異的に結合し、ＩＬ-４受容体と会合するとＩＬ-１３に対する高親和性受容体を構成するもう１種のポリペプチドの特徴付けに関心を持った。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
今回、本発明者らは、他の公知のヒト腎臓ガン腫系統（２１）よりもより多量にＩＬ-１３特異的受容体を発現しているヒトガン腫細胞系統を同定し、今回、ＩＬ-４／ＩＬ-１３受容体に対するＩＬ-１３の結合に寄与する、ＩＬ-１３Ｒβと称する一次サブユニットのクローニング、ならびに２種のサイトカイン間の交差-競合を許容する高親和性受容体を構成するためにＩＬ-１３受容体とＩＬ-４受容体によって分有されている、ＩＬ-１３Ｒαと称する共通鎖のクローニングを行った。しかるに、本発明はＩＬ-１３に特異的に結合する精製ポリペプチドに関する。
【００１１】
さらに特に、本発明の対象は、そのアミノ酸配列がＩＬ-１３に対して特異的な受容体（ＩＬ-１３ＲβおよびＩＬ-１３Ｒα）の配列に対応する精製ポリペプチド、またはその生物学的に活性なフラグメントである。
また、本発明の対象は、該ポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメントをコードする単離ＤＮＡ配列でもある。
加えて、本発明は、前記定義のヌクレオチド配列の少なくとも１種を含有する発現ベクター、および該ヌクレオチド配列のうちの１種の複製および／または発現を許容する条件下にてこれらの発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞に関する。
トランスフェクトした宿主細胞による組換えＩＬ-１３ＲβおよびＩＬ-１３Ｒαまたはそれらの生物学的に活性なフラグメントの産生方法も本発明の一部である。
【００１２】
また、本発明は、ＩＬ-１３によって創製される免疫および炎症メカニズムを調節するための、ＩＬ-１３Ｒβおよび／またはＩＬ-１３Ｒαまたはそれらの生物学的に活性なフラグメントを含む医薬組成物をも含む。加えて、本発明は、ＩＬ-１３Ｒβおよび／またはＩＬ-１３Ｒαの活性を変調させることができる剤を同定するための方法、およびこれらの剤をスクリーニングするためのＩＬ-１３Ｒβおよび／またはＩＬ-１３Ｒαまたはそれらのフラグメントの使用、ならびにＩＬ-１３受容体の活性を変調させることができる新規な生成物の製造方法に関する。
【００１３】
また、本発明は、ＩＬ-１３Ｒβおよび／またはＩＬ-１３Ｒαに対して特異的な抗体または抗体の誘導体をも含む。
【００１４】
最後に、本発明は、ＩＬ-１３Ｒβおよび／またはＩＬ-１３Ｒα、それらの生物学的に活性なフラグメントのうちの１種、またはこの受容体の活性を特異的に変調させることができる化合物を、医薬上許容されるビヒクルと組合せて患者に投与することを含む、ＩＬ-１３によって媒介される免疫反応を変調させるための治療処理方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本明細書に記載したＩＬ−１３ＲβおよびＩＬ−１３Ｒαのクローニングにより、ＩＬ−４によって誘導される応答に匹敵する、ＩＬ−１３によって特異的に誘導される応答に関与する因子の知識を改善することができる。加えて、ＩＬ−１３がキーとなる役割を演ずる正常および病理状態下の受容体の発現の調節を研究するためのツールを有することができた。
さらに、ｃＤＮＡの入手可能性により、ＩＬ-４／ＩＬ-１３受容体複合体の再構成に必要な他の蛋白質を容易にクローニングすることができ、また、ＩＬ-１３の活性の特異的なアンタゴニストとなり得る新規な医薬生成物の製造または合理的なモデリングにも有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以降の本発明の記載においては、以下の定義を使用する：
‐高親和性でＩＬ-１３に特異的に結合するポリペプチド（ＩＬ-１３Ｒβ）：配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのいずれかの生物学的に活性なフラグメントもしくは誘導体；
【００１７】
-低親和性でＩＬ-１３に単独で特異的に結合し、ＩＬ-４受容体と会合すると高親和性受容体を構成するポリペプチド（ＩＬ-１３Ｒα）：配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのいずれかの生物学的に活性なフラグメントもしくは誘導体；
【００１８】
-生物学的に活性な：ＩＬ-１３に特異的に結合することができ、かつ／または細胞膜のレベルでＩＬ-１３によって特異的に生成されるシグナルの伝達に関与することができ、かつ／またはＩＬ-４およびＩＬ-１３に結合することができる複合体を形成するように、ＩＬ-４に対して特異的な受容体（ＩＬ-４Ｒ／ｇｐ１４０）と相互作用することができ、かつ／または配列番号２の配列および／または配列番号４の配列のポリペプチドに対して特異的な抗体によって認識され、ならびに／あるいは配列番号２の配列および／または配列番号４の配列のポリペプチドを認識する抗体を誘導することができること；
【００１９】
-誘導体：配列番号２の配列および／または配列番号４の配列のポリペプチドの変異型であるいずれかのポリペプチド、または配列番号２の配列または配列番号４の配列の遺伝的および／または化学的性質の改変から得た、すなわち１個または限定数のアミノ酸の突然変異、欠失、付加、置換および／または化学修飾によって得たいずれかの分子、ならびにいずれかのイソ型配列、すなわち、配列番号２の配列または配列番号４の配列、それらを生物学的に活性とする少なくとも１種の保存された特性を有するＤ  エナンチオマー形、該変異型、修飾またはイソ型配列中に１または２以上のアミノ酸を含有する、それらのフラグメントのうちの１種もしくはそれらの修飾配列のうちの１種に等しい配列。
【００２０】
本発明の対象は、
ａ）配列番号２の配列または配列番号４の配列、および
ｂ）前記定義による、配列番号２および配列番号４由来のいずれかの生物学的に活性な配列；から選択されるアミノ酸配列を含む精製ポリペプチドである。
誘導体の製造は種々の対象物を有することができ、これには特にＩＬ-１３に対する受容体の親和性を上昇させるもの、ＩＬ-１３とＩＬ-４との間の交差-競合を変調させるもの、それらの産生レベルを向上するもの、プロテアーゼに対するそれらの耐性を上昇させるもの、それらの生物活性を改善するもの、あるいは新規な医薬的および／または生物学的特性をそれらに付与するものが含まれる。
前記定義のポリペプチドの生物学的に活性な変異型の中では、前記のアミノ酸配列のうちの１種をコードする遺伝子の転写物（メッセンジャーＲＮＡ）の可変スプライシング（alternate  splicing）によって生成されたフラグメントが好ましい。
【００２１】
有利な変異型においては、配列番号２の配列のポリペプチドの８個のＣ-末端アミノ酸が以下の６個のアミノ酸：ＶＲＣＶＴＬによって置換されている。
もう１つの有利な態様により、本発明は、残基３４３、好ましくは残基３３７まで伸長する配列番号２の配列のポリペプチドの細胞外ドメインを特に含む、ＩＬ-１３Ｒβｓと称するＩＬ-１３Ｒβの可溶性形態、ならびに、残基３４３、好ましくは残基３３６と３４２との間の残基まで伸長する配列番号４の配列のポリペプチドの細胞外ドメインを特に含む、ＩＬ-１３Ｒαｓと称するＩＬ-１３Ｒαの可溶性形態に関する。
【００２２】
配列番号２の配列または配列番号４の配列を含むポリペプチドは、本発明の特定の具体例を表す。実施例から明らかとなるように、このポリペプチドは、機能性ＩＬ-１３受容体を形成するようにヒト細胞の表面に発現させることができ、かつ／または、ＩＬ-２受容体のγ鎖と共に、ＩＬ-４およびＩＬ-１３に共通の受容体複合体を形成するようにＩＬ-４受容体と結合させることができる。
【００２３】
また、本発明の対象は、
ａ）配列番号１の配列、
ｂ）配列番号３の配列、
ｃ）配列番号１の配列もしくは配列番号３の配列、またはそれらの相補的配列にハイブリダイズすることができ、かつＩＬ-１３受容体活性を有するポリペプチドをコードし、またはＩＬ-１３およびＩＬ-４に対して高親和性を有する受容体を再構成することができる核酸配列、ならびに
ｄ）遺伝コードの縮重のために、配列ａ）、ｂ）およびｃ）由来となる核酸配列；から選択される単離核酸配列でもある。
【００２４】
より特には、本発明の対象は、記載した生物特性の少なくとも１つを保存している、ＩＬ-１３ＲβまたはＩＬ-１３Ｒαの可溶性部分をコードする配列、およびＩＬ-１３ＲβまたはＩＬ-１３Ｒαの転写物の可変スプライシングによって生成されるいずれかの変異型である。
【００２５】
好ましい具体例は、配列番号１の配列のヌクレオチド番号１からヌクレオチド１０８１まで、好ましくはヌクレオチド１０６３まで伸長するヌクレオチドのストレッチを含むか、またはそれからなる核酸配列によって表される。
【００２６】
もう１つの好ましい具体例は、配列番号３の配列のヌクレオチド番号１からヌクレオチド番号１０５９まで、好ましくは番号１０４１と１０５６との間のヌクレオチドまで伸長するヌクレオチドのストレッチを含むか、またはそれからなる核酸配列によって表される。
【００２７】
有利には、本発明による核酸配列は、ＩＬ-１３ＲβまたはＩＬ-１３Ｒαの成熟形態に相当する蛋白質をコードする配列であり、この成熟蛋白質はシグナルペプチドの放出の結果物である。
【００２８】
本発明の種々のヌクレオチド配列は、人工的な起源または他のものとし得る。それらは、配列番号1の配列または配列番号３の配列に基づいて作製したプローブにより配列ライブラリーをスクリーニングすることによって得られるＤＮＡまたはＲＮＡ配列とし得る。かかるライブラリーは、当業者に知られている慣用的な分子生物学的技術によって調製し得る。
【００２９】
本発明によるヌクレオチド配列は、化学合成、または別法としてライブラリーのスクリーニングによって得た配列の化学的または酵素的修飾を含む方法の組合せによっても調製し得る。
【００３０】
これらのヌクレオチド配列により、本発明によるポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメントをコードするヌクレオチド・プローブを調製することができる。適当なハイブリダイゼーション条件は、当業者によって日常的に使用されている温度およびイオン強度条件、好ましくはＴｍ-５℃とＴｍ-３０℃との間の温度条件、なおより好ましくはＴｍ-５℃とＴｍ-１０℃との間の温度条件（高ストリンジェンシー）であり、Ｔｍとは５０％の塩基対形成鎖が分離する温度として定義される溶融温度である。これらは、生物試料中の本発明のポリペプチドに特異的な転写物をハイブリダイゼーション実験によって検出するための、あるいは多形性、突然変異、または不完全な（poor）スプライシングから生じる異常な合成または遺伝的異常を検出するためのイン・ビトロ（in vitro)診断ツールとして用いることができる。
【００３１】
本発明のプローブは、少なくとも１０個のヌクレオチドを含み、最大限、配列番号１の全体のヌクレオチド配列もしくは配列番号３の全体のヌクレオチド配列、またはそれらの相補鎖を含む。
最も短いプローブ、すなわち約１０〜１５ヌクレオチドのものの中では、適当なハイブリダイゼーション条件は当業者により日常的に使用されている温度およびイオン強度条件に相当する。
【００３２】
好ましくは、本発明のプローブはその使用前に標識する。それに関しては、例えば蛍光、放射能、化学発光、または酵素標識のごとき幾つかの技術が、当業者の能力の範囲内に存在する。
【００３３】
ＩＬ-１３受容体ポリペプチドまたは生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸配列のレベルの異型接合性および遺伝子転移の欠失のごとき異常な合成または遺伝的異常の検出にこれらのヌクレオチドプローブを用いるイン・ビトロ診断方法が本発明に包含される。かかるタイプの方法は：
-所望により、後記のヌクレオチド配列を増幅させる予備工程の後であってもよいが、本発明のヌクレオチドプローブと前記のヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーション複合体の形成を許容する条件下にて、該プローブを生物試料とを接触させ；
-形成され得るハイブリダイゼーション複合体を検出し；ついで
-所望により、本発明のプローブとハイブリダイゼーション複合体を形成するヌクレオチド配列を配列決定してもよい；
ことを含む。
【００３４】
加えて、本発明のｃＤＮＡプローブは染色体異常の検出にも有利に用いることができる。
本発明のヌクレオチド配列は、いわゆるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術またはそのいずれか他の変形により、配列決定反応または特異的な増幅反応用のセンスおよび／またはアンチセンス・オリゴヌクレオチドプライマーの製造および使用にも有用である。
【００３５】
さらに、本発明によるヌクレオチド配列は、メッセンジャーＲＮＡを包含する核酸配列と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンス配列を調製する治療分野においても用途を有し、遺伝子治療にも使用することができる。かくして、本発明の対象は、前記定義のＩＬ-１３受容体ポリペプチドの生成を、少なくとも部分的に阻害することができるアンチセンス配列である。かかる配列は、有利には、転写レベルのＩＬ-１３ＲβまたはＩＬ-１３Ｒαをコードするリーディングフレームを構成するものからなる。
それらは、より特に、アレルギーまたは炎症の治療に使用することができる。
【００３６】
さらに、本発明によるヌクレオチド配列は、ＩＬ-１３受容体活性を有する前記定義の組換えポリペプチドの生成にも使用することができる。
これらのポリペプチドは、当業者に知られている組換え産物を作製するための技術により、前記定義のヌクレオチド配列から作製することができる。この場合においては、使用するヌクレオチド配列を、細胞性宿主中のその発現を許容するシグナルの制御下に置く。使用する細胞性宿主は、細菌のごとき原核生物系、または酵母、昆虫細胞、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）または有利に商業的に入手可能ないずれかの他の系のごとき真核生物系から選択することができる。本発明のポリペプチドの発現に好ましい細胞性宿主は、繊維芽細胞系統ＣＯＳ-７またはＣＯＳ-３からなる。
【００３７】
プロモーター、アクチベーターまたは末端配列のごときポリペプチドの発現を制御するシグナルは、使用する細胞性宿主に従って選択する。この終了までに、本発明によるヌクレオチド配列を、選択した宿主内の自己複製性ベクター、または選択した宿主の組込み性ベクターに挿入することができる。かかるベクターは、当業者によって日常的に使用されている方法に従って調製され、得られたクローンは、例えばエレクトロポレーションのごとき標準的な方法によって適当な宿主に導入することができるであろう。
【００３８】
前記定義のヌクレオチド配列の少なくとも１種を含む発現ベクターも、本発明の一部である。
ＣＯＳ-７またはＣＯＳ-３細胞の場合においては、（１７）に記載されているのと同様に、ベクターｐＳＥ-１を使用してトランスフェクションを行うことができる。
【００３９】
加えて、本発明は、これらの発現ベクターによってトランスフェクトした宿主細胞にも関する。これらの細胞は、前記定義のベクターに挿入したヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、つづいてトランスフェクトしたヌクレオチド配列の複製および／または発現を許容する条件下にて該細胞を培養することによって得ることができる。
これらの細胞は、配列番号２の配列または配列番号４の配列の組換えポリペプチドあるいはその誘導体の産生方法に使用することができ、該方法はそれ自体が本発明に含まれ、配列番号２の配列もしくは配列番号４の配列の組換えポリペプチドまたは誘導体の発現を許容する条件下にて該トランスフェクトした細胞を培養し、該組換えポリペプチドペプチドを回収することを特徴とする。
【００４０】
使用する精製工程は当業者に知られている。組換えポリペプチドペプチドは、分画、クロマトグラフィー法、特異的なモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体を用いるイムノアフィニティー技術のごときを独立で、または組合せて用いる方法によって、細胞溶解物および抽出物から、培養上清から精製することができる。
【００４１】
前記定義によるＩＬ-１３Ｒβおよび／またはＩＬ-１３Ｒαを特異的に認識することができるモノ-またはポリクローナル抗体も本発明の一部である。ポリクローナル抗体は、通常の手法により、ＩＬ-１３Ｒβおよび／またはＩＬ-１３Ｒαに対して免疫化した動物の血清から得ることができる。
モノクローナル抗体は、KoehlerおよびMilstein(Nature，1975，256，495-497)によって記載されている慣用的なハイブリドーマ培養法に従って得ることができる。
【００４２】
有利な抗体は、ＩＬ-１３Ｒβおよび／またはＩＬ-１３Ｒαの細胞外ドメインに対して指向された抗体である。
本発明による抗体は、例えば、キメラ抗体、ヒト化（humanized）抗体、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントである。それらは、標識化抗体または免疫コンジュゲートの形態としても存在し得る。例えば、それらは、ジフテリア毒のごとき毒素と、または放射性物と会合していてもよい。この場合においては、これらのイムノトキシンは、ＩＬ-１３Ｒβおよび／またはＩＬ-１３Ｒαの過剰発現に関与するある種の病理の治療に使用することができる治療剤を構成し得る。
本発明の抗体、特にモノクローナル抗体は、例えば、免疫蛍光によってか、または金もしくはペルオキシダーゼ標識によって、特定の組織切片上のＩＬ-１３受容体の免疫組織化学分析にも使用することができる。
【００４３】
それらは、例えば異常な過剰発現のごときＩＬ-１３Ｒβおよび／またはＩＬ-１３Ｒαの発現を観察することが要求されたり、または膜発現の調節をモニターするいずれの状況においても有利に使用することができる。
しかるに、本発明は、異常なレベルで発現されたＩＬ−13Ｒβおよび／またはＩＬ−13Ｒαを含有し得る生物試料中の、ＩＬ−13Ｒβおよび／またはＩＬ−13Ｒαの異常な発現と関連付けられる病理のイン・ビトロ診断方法にも関し、該方法は、本発明の少なくとも１種の抗体を、ＩＬ−13Ｒβおよび／またはＩＬ−13Ｒαと該抗体（群）との間の特異的な免疫複合体の可能な形成を許容する条件下にて、該生物試料と接触させ、形成され得る該特異的な免疫複合体を検出することを特徴とする。
【００４４】
また、本発明は、生物試料中のＩＬ−13Ｒβおよび／またはＩＬ−13Ｒαの異常な発現のイン・ビトロ診断用の、ならびに／あるいは該試料中のＩＬ-１３受容体の発現レベルを測定するためのキットにも関し、該キットは、
-所望により支持体に結合されていてもよい、ＩＬ−13Ｒβおよび／またはＩＬ−13Ｒαに対して特異的な少なくとも１種の抗体、
-ＩＬ−13Ｒβおよび／またはＩＬ−13Ｒαと該抗体（群）との間の特異的な抗原／抗体複合体の形成を明らかにするための手段、および／またはこれらの複合体を定量化するための手段を含む。
【００４５】
本発明のもう１つの対象は、ＩＬ−13Ｒβおよび／またはＩＬ−13Ｒαに特異的なリガンドまたはその活性を変調させることができる剤を同定および／または単離するための方法に関し、該方法は、所望により未同定であってもよい、当該化合物が受容体に対する親和性を有するであろう場合には、化合物または種々の化合物を含有する混合物を、ＩＬ-１３受容体と該化合物との間の相互作用を許容する条件下にて、その表面にＩＬ−13Ｒβおよび／またはＩＬ−13Ｒαを発現している細胞と接触させ、ＩＬ−13Ｒβおよび／またはＩＬ−13Ｒαに結合した化合物、またはその生物活性を変調させることができるものを検出および／または単離することを特徴とする。
【００４６】
特定の具体例において、本発明のこの方法は、そのＩＬ-１３Ｒβおよび／またはＩＬ-１３Ｒα受容体についてのＩＬ-１３のアゴニストおよびアンタゴニストの同定および／または単離に適用される。
また、本発明は、医薬上許容される担体と結合した、有効成分として、好ましくは可溶性形態の、前記定義に相当するポリペプチドを含む医薬組成物をも含む。
かかるポリペプチドは、細胞表面に発現されたＩＬ−13Ｒβおよび／またはＩＬ−13Ｒαと実際に競合して作用し、それによって、ＩＬ−１３のその受容体への結合性に特異的なアンタゴニストを構成することができ、病理状態においてＩＬ-１３によって媒介される反応を変調させることを意図した医薬生成物の合成に有利に使用することができる。
【００４７】
最後に、本発明は、医薬上許容されるビヒクルと結合した、ＩＬ−13Ｒβおよび／またはＩＬ−13Ｒαを（またはそれらの生物学的に活性なフラグメントの１種を）、またはその生物活性を特異的に変調させることができる化合物を、患者に投与することを含む、ＩＬ-１３によって媒介される免疫学的反応にリンクした状態の治療処理方法を含む。
【００４８】
本発明の他の特徴および利点は、以下に説明を表す実施例および図面と残りの説明とで明らかになるであろう。
実施例
【００４９】
材料および方法
結合性および交差-連結実験：
結合性および交差-連結実験は、［１２５Ｉ］［Phe43］−ＩＬ−１３−GlyTyrGlyTyrについて記載されている（１７）のと同様にして行った。
【００５０】
ＩＬ−６の分泌の誘導：
Ｃａｋｉ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ４６）を５×１０４細胞／ウェルの密度で２４−ウェルプレートに入れ、培養３日後に、密集した単層を無ウシ胎児血清ＤＭＥＭ培地で３回洗浄した。Ｃａｋｉ−１細胞の刺激は、Ｙ１２４ＤＩＬ−４または抗−ｇｐ１４０モノクローナル抗体の不存在または存在下にて、３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４またはＩＬ−１３を用いて行った。２４時間培養した後に培養培地に放出されたＩＬ−６の量を、ＥＬＩＳＡ技術（フランス,Innotest社製）によって測定した。
【００５１】
ヒトＩＬ−１３Ｒβ  ｃＤＮＡの単離および分析
前記（２５）と同様にして、合計ＲＮＡをＣａｋｉ−１細胞から抽出した。ポリ（Ａ）ＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）２５で被覆した磁気ビーズ（Dynal社製）を用いて合計ＲＮＡから単離した。２×１０５クローンを含有するｃＤＮＡライブラリーは、プライマー−アダプター法（２６）およびベクターｐＳＥ−１（２７）を用いて構築した。用いた発現用のクローニング戦略は、以前に記載されている（１７）。
【００５２】
ヒトＩＬ−１３Ｒβ  ｃＤＮＡの調製：
ＲＮＡ試料を逆転写酵素でコピーし、それを、配列＋５２〜＋７１に相当するセンスプライマーおよび＋４８９〜＋４７０に相当するアンチセンスプライマー（番号付けは図５および６に示すｃＤＮＡ配列に基いて行った）を用いるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に付した。ＰＣＲ−増幅産物は、ｃＤＮＡの配列＋４４５〜＋４６１に相補的なプローブとハイブリダイズした。サイズマーカーを図の左に示す。
【００５３】
ヒトＩＬ−１３Ｒα  ｃＤＮＡの単離および分析
１）げっ歯類ＩＬ−１３Ｒαプローブの調製
ａ）Ｂ９細胞の培養（２８）
Ｂ９細胞は、１０％ウシ胎児血清および５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ培地（Gibco社製）中で培養した。
ｂ）Ｂ９細胞のＲＮＡの調製
該細胞を、ＰＢＳ緩衝液（GIBCO−BRL社製、生理リン酸緩衝液、参照04104040）で２回洗浄した。1,000rpmで１０分間遠心分離した後に、細胞ペレットを以下の組成の溶解緩衝液中に懸濁した：４Ｍ  グアニジン−チオシアネート；２５ｍＭ  クエン酸ナトリウム  ｐＨ７；０．５％サルコシル；０．１Ｍ  β２−メルカプトエタノール。
【００５４】
その懸濁液を、UltraturaxソニケーターNo．231256（JANKE  and  KUNDEL社製）を用い、最大出力にて１分間超音波処理した。ｐＨ４の酢酸ナトリウムを添加して０．２Ｍとした。その溶液を１容量のフェノール／クロロホルム混合液（ｖ／ｖ：５／１）で抽出した。
水性相に含まれるＲＮＡを１容量のイソプロパノールの援助で−２０℃にて沈殿させた。そのペレットを溶解緩衝液中に再懸濁した。その溶液をフェノール／クロロホルム混合液で再度抽出し、イソプロパノールでＲＮＡを沈殿させた。そのペレットを７０％ついで１００％エタノールで洗浄した後に、ＲＮＡを水中に再懸濁させた。
【００５５】
ｃ）相補的ＤＮＡの調製
ｃＤＮＡは、ポリＴ１２プライマーを用いて合計ＲＮＡ５μｇから調製した。合計ＲＮＡを、３０μｌ容量の緩衝液：０．５ｍＭ  各デオキシヌクレオチド三リン酸および３０単位のＲＮアシン（Promega社製）を含有する５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、４０ｍＭ  ＫＣｌ中、３７℃にて１時間、ついで５０℃にて１０分間、さらに３７℃にて１０分間、逆転写酵素ＲＮエースＨ（Gibco−BRL社製、参照8064A）２００単位と共にインキュベートした。６５℃にて１０分間加熱することによって反応を終結させた。
【００５６】
ｄ）ＰＣＲ技術によるマウスＩＬ−１３Ｒα  ｃＤＮＡフラグメントの特異的増幅
重合は、以下の組成：１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ４種のｄＮＴＰ、２種の核酸プライマー各２μｇ／ｍｌ、および２．５Ｕ  ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（Beckman社製）；の緩衝液５０μｌ最終容量中、ｃＤＮＡ６μｌを用いて行った。プライマーのペアは、Hilton（２２）によって公開されている配列上で選択した。
【００５７】
センス・プライマー：ヌクレオチド２４９〜２６８
5’AGAGGAATTACCCCTGGATG  3’
アンチセンス・プライマー：ヌクレオチド１２５６〜１２７５
5’TCAAGGAGCTGCTTTCTTCA  3'
反応は、９４℃にて１分間、５８℃にて１分間、７２℃にて４分間の３０サイクルにつづいて、７２℃にて１０分間の最終サイクル行った。
【００５８】
ｅ）ＰＣＲ増幅産物の精製
ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭ、トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．９）中の１％アガロースゲル（Sigma社製）上、１００ボルトにて１時間流した後に、同緩衝液中の１μｇ／ｍｌ臭化エチジウム存在下にてゲルを染色した。増幅産物（１０２７塩基対（ｂｐ）のＩＬ−１３ＲαのｃＤＮＡフラグメント）に相当するバンドをGlass  Maxキット（Gibco社製）を用いて抽出した。
【００５９】
ｆ）プローブの調製
マウスＩＬ−１３Ｒα受容体に相当する１０２７ｂｐの精製ｃＤＮＡフラグメント２５ｎｇを、ＢＲＬ  Random  Primers  DNA  標識化システムキットを用いて、２．４×１０９ｄｐｍ／μｇの比活性で３２Ｐで標識するか；別法として、１００ｎｇを４×１０８ｄｐｍ／μｇの比活性でBoeringherキットを用いたニックトランスレーションによって標識した。
【００６０】
２）ヒトＩＬ−１３Ｒα  ｃＤＮＡの単離および分析
ａ）合計ＲＮＡの調製
合計ＲＮＡは、１ｂ章で前記したのと同様にしてＣａｋｉ−１細胞から抽出した。
【００６１】
ｂ）メッセンジャーＲＮＡ（ポリＡ＋画分）の精製
ＲＮＡのポリＡ＋画分の精製は、製造業者により推奨されている手法に従ってDYNAL  オリゴ（ｄＴ）２５  Dynabeadsキット（参照610.05）を用いて行った。原理は、それにポリ（ｄＴ）２５オリゴヌクレオチドが結合している超常磁性ポリスチレンビーズの使用に基く。ポリＡ＋画分は、磁性支持体に捕捉されたビーズに結合したオリゴ（ｄＴ）２５オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした。
【００６２】
ｃ）ノザンブロット
ポリＡ＋メッセンジャーＲＮＡ５μｇを、ＭＯＰＳ緩衝液（１０ｍＭ  ｐＨ７．４、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中の１％アガロース、８％ホルムアルデヒド変性ゲル上に負荷した。移動させ、２０×ＳＳＣ緩衝液中のＮ＋Hybondメンブレン（Amersham社製）上に転移させた後に、そのＲＮＡを真空下、８０℃にてオーブン中で加熱することによって固定化させた。ついでそのメンブレンを、以下の緩衝液：１Ｍ  ＮａＣｌ、３０％ホルムアミド；１％ＳＤＳ、５×デンハート溶液；１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、４２℃にて２時間、プレハイブリダイズさせた。２時間のプレハイブリダイゼーション後に、そのメンブレンを２．５×１０６ｄｐｍ／ｍｌのランダム・プライマー法によって調製した一定濃度のマウスＩＬ−１３Ｒαプローブと同緩衝液中にて１６時間ハイブリダイズさせた。ついでそのメンブレンを２×ＳＳＣ緩衝液、０．１％ＳＤＳ中、室温にて３０分間、ついで同緩衝液中、５０℃にて２時間、２回洗浄した。カセット（Molecular  Dynamics社製）中で４日間感光させた後に、ノザンブロットをInstant  Imager（Molecular  Dynamics社製）で分析した。４２００ｂｐの優勢な転写物、および１５００ｂｐと２０００ｂｐとの二重バンド（doublet）がＣａｋｉ−１細胞、Ｕ３７３およびＵ９３７で検出された。
【００６３】
ヒトＩＬ−１３ＲαおよびＩＬ−１３Ｒβの特性の特徴付け：
ＣＯＳ−７またはＣＨＯ細胞を前記（１７）と同様にしてペトリ皿中でトランスフェクトした。24時間後に、その細胞をトリプシン処理し、８×１０４細胞／ウェルの密度で２４−ウェルプレート中で培養した。３７℃にて４８時間培養させた後に、その細胞を、前記（１７）と同様のヨウ素化ＩＬ−１３を用いる結合性実験（３回行ったアッセイは、１０％未満の変動を示した）に用いた。トランスフェクションに関しては、ＣＯＳ−７またはＣＨＯ細胞を、種々のプラスミド０．６ｍｇを用いて２５−ｃｍ２プレート中でトランスフェクトした。２４時間後に、細胞単層をトリプシン処理し、８×１０４細胞／ウェルにて１２−ウェルプレート中で培養した。３日後に、標識ＩＬ−１３、ならびに非標識ＩＬ−１３および／またはＩＬ−４を用いて結合性および競合実験を行った。結果は、別々に行った少なくとも３回の実験の代表なものである。
【００６４】
ヒトＩＬ−１３Ｒαおよび／またはＩＬ−４Ｒを発現している細胞の核抽出物のＥＭＳＡにおける電気泳動移動度の比較：
２×１０６のＣＨＯ細胞を１０ｃｍペトリ皿に入れた。２４時間後に、その細胞をプラスミドＤＮＡ（３４）６μｇでトランスフェクトした。４８時間後に、その細胞を、１００ｎｇ／ｍｌ濃度のＩＬ−１３またはＩＬ−４を含むか、または含まない培地３ｍｌ中、３７℃にて３０分間インキュベートした。ついで、その細胞をＰＢＳ−０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液で２回濯ぎ、ついでＰＢＳ１．２ｍｌ中に採取した。ついで、その細胞を遠心分離し、細胞抽出物を（３５）記載と同様にして調製した。ついで、細胞抽出物１０〜２０μｇ、および３２Ｐで放射性同位元素標識化したオリゴヌクレオチド・プローブ（５０,０００−１００,０００ｃｐｍ）を用いて、（３６）記載と同様にしてＥＭＳＡを行った。ここに該プローブはヒトＣεプロモーターのＣεエレメントに相当する（３７）。合成したオリゴヌクレオチド・プローブは以下の配列を有する：
5'−GATCCACTTCCCAAGAACAGA−3’
【００６５】
実施例
実施例１：
Ｃａｋｉ−１細胞表面におけるヒトＩＬ−１３Ｒβの発現の分析
最近、ヒト腎臓ガン腫細胞が、ＩＬ−４およびＩＬ−１３により分有されている受容体に加えて、大過剰量の特異的なＩＬ−１３受容体を発現していることが発見された（２１）。これらの結果に基づいて、ヒトガン腫細胞系統の試料を前記（１７）と同様にしてＩＬ−１３の結合について実験した。ＩＬ−１３に対する結合部位を特に多数発現する特定の系統Ｃａｋｉ−１（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ４６）をより詳細に分析した。飽和実験から得たスキャッチャード曲線は、４４６±５０ｐＭのＫｄおよび７．２×１０４受容体／細胞の結合能力を有する結合部位が存在することを示した（図１）。競合実験においては、非標識ＩＬ−１３は用量−依存的な様式で標識化ＩＬ−１３を完全に置換したが、ＩＬ−４は高親和性で標識化ＩＬ−１３の約１０％を置換した。より高濃度のＩＬ−４（１００ｎＭよりも高い濃度）でも、残りの９０％の結合ＩＬ−１３を置換しなかった（図２）。
【００６６】
これらの結果は、２種の部位、すなわち２種のサイトカインによって分有されている１種と、ＩＬ−１３に特異的なもう１種；が存在することと合致した。ＩＬ−１３に対する親和性による交差-連結に対する実験は、約７０ｋＤａの複合体を示し、これは、種々の細胞型においてＩＬ−１３を用いた同様の交差-連結実験において認められた複合体（１７、２１）と一致した。標識化ＩＬ−１３はＩＬ−１３によって複合体から完全に置換されたが、ＩＬ−４によっては置換されなかった。このことは競合実験と合致した（図３）。
【００６７】
実施例２：
ＩＬ−４またはＩＬ−１３により誘導されるＩＬ−６の分泌の分析
本発明者らは、Ｃａｋｉ−１細胞でＩＬ−４またはＩＬ−１３によって誘導される分泌を分析した。２種のサイトカインは、同様なレベルのＩＬ−６の分泌を誘導し、該分泌はＩＬ−４Ｒのα鎖に特異的な抗体によって、およびアンタゴニストＹ１２４ＤＩＬ−４によって阻害された（図４）。このことは、Ｃａｋｉ−１細胞中の２種のサイトカインによって分有されている受容体がＩＬ−６の分泌の誘導に寄与していることを示している。ＩＬ−４およびＩＬ−１３によって誘導される蛋白質複合体ＩＲＳ１／４ＰＳ（１８）のリン酸化を抗−ＩＬ−４Ｒ抗体およびＩＬ−４アンタゴニストの存在または不存在下にて分析した場合にも、同様の結果が認められた。
【００６８】
これらの結果は、全体として考慮すると、Ｃａｋｉ細胞中で発現された受容体複合体ＩＬ−４／ＩＬ−１３が以前に記載されているものと同一であること、および過剰発現しているＩＬ−１３に結合する蛋白質（ＩＬ−１３Ｒβ）がＩＬ−４Ｒを含む機能性複合体中のＩＬ−１３の認識に寄与する受容体のコンポーネントであることを示している。従って、このＩＬ−１３結合基をクローニングするためのメッセンジャーＲＮＡの供給源として、これらの細胞を使用した。
【００６９】
実施例３：
ＩＬ−１３受容体の一次サブユニット（ＩＬ−１３Ｒβ）のクローニング
クローニングおよび発現のストラテジーは以前に記載されているもの（１７）を用いた。２×１０５組換えクローンを含有するｃＤＮＡライブラリーは、Ｃａｋｉ−１細胞を用いて構築した（２６）。該ライブラリーを、各バッチのＤＮＡがプラスミド形態であって、ＣＯＳ−７細胞に導入されている（２９）１０００のｃＤＮＡのバッチに分けた。トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞に対する標識化ＩＬ−１３の結合性により、ＩＬ−１３受容体をコードするクローンのバッチを同定することが可能となった。陽性バッチを分配し、ＩＬ−１３に結合することができる細胞表面蛋白質の合成を行うことができる単一クローンが同定されるまで再スクリーニングした。２種の独立したＩＬ−１３Ｒβ  ｃＤＮＡを最後に単離した。ＩＬ−１３Ｒβ  ｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列およびそれから予想されるアミノ酸配列を図５および６に示す。該ｃＤＮＡはポリ−Ａテイルを除く１２９８塩基長、および１０６塩基の短い３’非翻訳領域を有する。典型的な（canonical）AATAAAポリアデニル化シグナルは予想された部位に存在している。ヌクレオチド５３と１１９２との間のオープンリーディングフレームは３８０アミノ酸のポリペプチドを規定する。該配列は、潜在的なシグナルペプチド、単一の貫膜ドメイン、および短い細胞質内テイルと共に膜蛋白質をコードする。
４箇所の潜在的なＮ−グリコシル化部位は細胞外領域に位置する。II型ファミリーのサイトカイン受容体の特徴として考えられている２種の共通モチーフ（３０）；第１のものはＮ−末端ジスルフィド架橋ループ構造由来であり、第２のものは細胞外領域のＣ−末端に位置するＷＳＸＷＳタイプのモチーフである；も存在していることは重要である。非常に短い細胞質配列は、なぜ細胞内のシグナルを伝達するものがＣａｋｉ細胞中のＩＬ−４およびＩＬ−１３によって分有されている受容体複合体のみであるのかを説明しているのかも知れない。
【００７０】
整列実験により、ヒトＩＬ−５Ｒα鎖との相同性（５１％類似および２７％同一、図７）および、より低い程度で、プロラクチン受容体との相同性が立証された。ＩＬ−５Ｒ複合体が、ＩＬ−５に結合するがもう１つの蛋白質を要するα鎖と、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦ受容体に共有されているβ鎖とからなり、シグナルを伝達することができる高親和性受容体を形成することは興味深い（３１）。
【００７１】
実施例４：
種々の細胞系統におけるヒトＩＬ−１３ＲβメッセンジャーＲＮＡの検出
驚くべきことには、Ｃａｋｉ−１細胞中においては、大過剰量のＩＬ−１３Ｒβが発現されているのだが、ＩＬ−１３ＲβおよびＩＬ−４Ｒに対する同様の量のメッセンジャーＲＮＡがノザンブロットによって検出された。この知見は、ＩＬ−４Ｒ転写物と比較してこのｍＲＮＡのより多量の翻訳が存在することを示しており、少数のＩＬ−１３結合部位しか発現していない細胞系統におけるＩＬ−１３Ｒβ  ｍＲＮＡの検出の欠如を説明している。ＲＴ−ＰＣＲ分析（図８）は、Ｃａｋｉ−１細胞で見出された転写物が、表皮ケラチン細胞系統Ａ４３１、前骨髄細胞ＴＦ−１、プレモサイティック細胞（premocytic  cell）Ｕ９３７、および細胞系統Ｂ  ＩＭ９においてもより低レベルで存在することを示した。JurkatＴ細胞系統またはプレ−Ｂ  ＮＡＬＭ６細胞系統においては全く転写物が検出されなかった。これらの結果は、本発明者らによって以前に記載されたこれらと同一の系統で行ったＩＬ−１３結合性実験（１７）、およびＩＬ−１３の知られている生物学的標的と合致した。
【００７２】
実施例５：
ヒトＩＬ−１３Ｒβ  ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞で行った結合性分析
ＩＬ−１３Ｒβをコードする単離ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞は、標識化ＩＬ−１３に特異的に結合した。飽和曲線のスキャッチャード解析は、２５０±３０ｐＭのＫｄ値と５．６×１０6受容体／細胞の最大結合能力とを有する単一のコンポーネント部位を示した（図９）。
【００７３】
組換え受容体の親和性は、Ｃａｋｉ−１細胞中のＩＬ−１３Ｒβについての４４６ｐＭのＫｄ値および幾つかの他の細胞において記載されているもの（１７）とよく一致した。その結果、ＩＬ−５Ｒのα鎖との配列相同性にも拘わらず、クローン化受容体は高親和性の結合部位を再構成するために第２の鎖を必要としないため、それは異なる挙動をする。
【００７４】
同様に最近記載されたＩＬ−１５に結合する蛋白質（３２）が、ＩＬ−１５Ｒ複合体の他の２種のコンポーネント不存在下にて、高親和性でＩＬ−１５に結合する特徴を有することは興味深い。
【００７５】
競合実験においては、ＩＬ−１３は、１．５±０．５ｎＭの阻害定数（Ｋｉ）で、クローン化受容体に対する標識化ＩＬ−１３の結合性を阻害することができたが、ＩＬ−４は該結合性を阻害できなかった。したがって、クローン化受容体の薬理学は、Ｃａｋｉ−１細胞中に存在するＩＬ−１３Ｒβのものと同様であった。交差-連結実験により、７０ｋＤａの放射性同位体標識化バンドが示された。このバンドは、Ｃａｋｉ細胞ならびに他の細胞（１７）で認められたものと同一の移動度を有する。この複合体は、恐らくは、標識化ＩＬ−４を用いて行った交差-連結実験におけるＩＬ−４Ｒの１４０ｋＤａバンドに加えて認められた６０−７０ｋＤａのバンドに相当する。また、このことは、機能性受容体複合体における２種の蛋白質間に強い相互作用が存在することも示している。しかるに、本発明者らは、ＩＬ−１３ＲβとＩＬ−４Ｒとが細胞膜中で相互作用し、２種のサイトカイン間の交差−競合を許容する受容体を再構成するのかをチェックした。同時発現実験の結果を図１１および１２に示す。
【００７６】
別々か同時かのいずれかの２種の受容体の発現が、２種のサイトカインのいずれかを特異的に認識する多数の受容体を生じたことは明らかなようである。しかしながら、それらが一緒に発現した場合には、少数の受容体しか（５〜１０％）２種のサイトカインを認識することができなかった。ＩＬ−４ＲおよびＩＬ−１３Ｒβとのγｃ鎖の同時トランスフェクションは、分有される結合部位の数の増加を引き起こさなかった。これらの結果は、ＩＬ−１３ＲβおよびＩＬ−４Ｒ鎖が細胞膜中で互いに相互作用して、ＩＬ−１３とＩＬ−４とが競合関係になり得る受容体を再構成し得ることを示している。再構成受容体の低い％は、ＩＬ−１３およびＩＬ−４が競合的に結合する受容体複合体の再構成に必要であるＣＯＳ細胞中に限定量でもう１つの蛋白質（ＩＬ−１３Ｒα）が存在することに賛同する論拠である。
【００７７】
γｃ鎖でのトランスフェクション実験で得られた結果は、この蛋白質が以前に示された（１５）限定因子ではないことを立証した。この結論は、Ｃａｋｉ−１細胞中にγｃメッセンジャーＲＮＡが存在しないこと（２１）によっても支持された。
【００７８】
再構成受容体の少ない数を説明するもう１つの可能な論拠は、不適当な化学量論の２種の蛋白質が細胞膜中に存在することである。しかしながら、異なる相対量のＩＬ−４ＲおよびＩＬ−１３Ｒβを用いた同時トランスフェクションは、再構成受容体の数における大きな相違は示さなかった。ＩＬ−４Ｒと相互作用するより大きな結合能力を有するもう１つのＩＬ−１３Ｒが存在するという可能性が、ＩＬ−１３Ｒα  ｃＤＮＡの単離によってマウス（２２）およびヒトで確認された（実施例７を参照されたし）。γｃの発現が、前記されている（１９）のと同様にＩＬ−４の結合性を向上したが、ＩＬ−１３の結合性は低下させたことは注意すべきであり、このことは、異なる鎖の間の複合体相互作用を示している。
【００７９】
実施例６：
可溶性形態の受容体によるＩＬ−１３のその膜受容体への結合性の阻害の実験
経時的発現（図１３）または安定系統（図１４）における結果を説明する。
ＩＬ−１３ＲβおよびＩＬ−１３Ｒβｓをコードする２種のｃＤＮＡ配列を、ＩＬ−２  ｃＤＮＡの代りにベクターｐ７０５５に挿入した（３３）。得られたプラスミドは、各々、２０３６および２０３４と称する。
【００８０】
ａ）経時的発現
ＣＨＯ細胞を３×１０５細胞／ウェルで１２−ウェルプレートに接種し、翌日、ＣＯＳ細胞についてと同様にＤＥＡＥ−デキストラン法によって、プラスミド２０３６もしくは２０３４、または対照としての空プラスミドｐＳＥ−１のいずれかでトランスフェクトした。
該細胞は、プラスミド２０３４でトランスフェクトした細胞の上清にＩＬ−１３Ｒβｓが蓄積され、プラスミド２０３６でトランスフェクトした細胞の膜中においてＩＬ−１３Ｒβが良好に発現されるように、３日間培養した。
ついで、ＩＬ−１３Ｒβｓ（２０３４）または陰性対照（空ｐＳＥ−１）でトランスフェクトした細胞の上清を回収し、ＩＬ−１３Ｒβでトランスフェクトした細胞を用いてＩＬ−１３の結合性の阻害を実験した。
ＩＬ−１３Ｒβを発現しているＣＨＯ細胞（２０３６）の表面に対するＩＬ−１３の結合性は、放射性リガンドで１．５倍に希釈したこれらの粗製上清の存在下または不存在下で測定し、あるいは過剰量の非-放射性同位元素標識化ＩＬ−１３（ＮＳＢ）存在下にて測定した。結合性は、３００ｐＭの放射性リガンドを含む最終容量５００ｍｌ中の全細胞に対して３回行った。
【００８１】
ｂ）安定系統
２種の安定な形質転換ＣＨＯ系統は、完全ＩＬ−１３Ｒβ（３８０残基のポリペプチド）または可溶性形態のＩＬ−１３Ｒβ（ＩＬ−１３Ｒβｓ、ＩＬ−１３Ｒβの残基１〜３３７に相当する切頭ポリペプチド）のコード配列でのトランスフェクションによって得た。これらの配列をベクターｐ７０５５に挿入した。
ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−細胞をプラスミド２０３６（ＩＬ−１３Ｒβ）および２０３４（ＩＬ−１３Ｒβｓ）でトランスフェクトし、組換えクローンを以前に記載されている（３３）のと同様にして選抜した。
【００８２】
細胞当たり２〜５×１０５部位を有する、得られたクローンのうちの１種ＣＨＯ−ＩＬ−１３Ｒβ（ＣＨＯ２０３６）をウェル当たり１０５細胞の密度にて１２−ウェルプレートに接種し、２日後に、その細胞をＩＬ−１３Ｒβｓ存在または不存在下の結合性実験に用いた。
それに関しては、ＣＨＯ−ＩＬ−１３Ｒβｓ（ＣＨＯ２０３４）クローンを皿当たり５×１０５細胞にて６ｃｍ皿に３回接種した。培養培地中に３日間蓄積させた後に、ＣＨＯ２０３６クローンのＩＬ−１３Ｒβに対するＩＬ−１３結合阻害実験用に培地（皿当たり５ｍｌ）を収集した。同様にして、可溶性ＩＬ−１３Ｒβを発現していないＣＨＯ細胞の上清を収集した。
【００８３】
ＣＨＯ２０３６−２２クローンの表面のＩＬ−１３の結合性は、放射性リガンドで１．５倍に希釈したこれらの粗製上清の存在下または不存在下にて、あるいは過剰量の非-放射性同位元素標識化ＩＬ−１３（ＮＳＢ）の存在下にて測定した。結合性は、３００ｐＭの放射性リガンドを含む５００ｍｌ容量中、全細胞に対して３回行った。
【００８４】
図１３および１４の柱状グラフは、ＩＬ−１３Ｒβに対するＩＬ−１３の結合性のＩＬ−１３Ｒβｓによる阻害を表す。ＩＬ−１３のその受容体に対する結合性の阻害は、幾つかのクローンで認めることができた。
【００８５】
実施例７
ヒトＩＬ−１３Ｒα受容体のクローニング
ａ）Ｃａｋｉ−１細胞のポリＡ＋メッセンジャーＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの調製
［３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した一本鎖相補的ＤＮＡ（得られた相補的ＤＮＡは３０００ｄｐｍ／ｎｇの比活性を有する）は、ポリＡ＋メッセンジャーＲＮＡ０．５μｇで出発し、３０μｌ容量の以下の緩衝液：
０．５ｍＭの各種デオキシヌクレオチド三リン酸、［α３２Ｐ］ｄＣＴＰ  ３０μＣｉ、およびＲＮアシン（Promega社製）  ３０Ｕを含有する５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、４０ｍＭ  ＫＣｌ中にて、以下の配列（ＢａｍＨＩ部位を含む）：
５’＜GATCCGGGCCCTTTTTTTTTTTT＜３’
を有する合成プライマーを用いて調製した。逆転写酵素ＲＮエースＨ（Giboco−BRL社製）２００単位と共に３７℃にて１時間、ついで５０℃にて１０分間、さらに３７℃にて１０分間インキュベートした後に、ＥＤＴＡ４μｌを添加した。ついで、２Ｎ  ＮａＯＨ溶液６μｌを添加し、６５℃にて５分間インキュベートすることによって、ＲＮＡ鋳型を分解した。
【００８６】
合成プライマーを除去するために、ＴＥ緩衝液中で平衡化したSephacryl  S400カラム（Pharmacia社製）１ｍｌ上で相補的ＤＮＡを精製した。最初の２つの放射性画分を合し、クロロホルムで抽出した後に、１０Ｍ酢酸アンモニウム溶液１／１０容量およびエタノール２．５容量で沈殿させた。ついで、ターミナルトランスフェラーゼ酵素（Pharmacia社製  27073001）２０単位と共にｄＧホモポリマー性テイルを添加することによってｃＤＮＡを５’において伸長させた。つぎに、以下の組成：３０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．６：１ｍＭ  塩化コバルト；１４０ｍＭ  カコジル酸；０．１ｍＭ  ＤＴＴ；１ｍＭ  ｄＧＴＰ；を有する緩衝液２０μｌ中、３７℃にて１５分間インキュベーションを行い、ついで０．５Ｍ  ＥＤＴＡ２μｌを添加した。水酸化ナトリウムでのさらなる処理を加熱することなく行い、つづいてS400カラム上で再精製し、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。そのペレットをＴＥ緩衝液３３μｌ中に溶解した。つぎのステージは、ＰｓｔＩで切断した後にホモポリマー性ｄＣテイルが予めそれに加えられているクローニングベクターｐＴ７Ｔ３−１８、ｃＤＮＡおよびアダプターを組合わせることにあった。ｃＤＮＡ（３３μｌ）を、ベクターｐＴ７／Ｔ３−１８  ７５ｎｇ（５μｌ）、以下の配列（Ａｐａ１部位を含む）：
５’AAAAAAAAAAAAAGGGCCCG  ３’
のアダプター１２０ｎｇ（１μｌ）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液１０μｌと接触させ、その混合物を６５℃にて５分間インキュベートし、ついでその反応物を室温まで放冷させた。つぎのステージは、以下の組成：５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ；を有する緩衝液中、酵素Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼ（Pharmacia社製）３２．５単位を用いて、反応容量１００μｌ中のクローニングベクターと一本鎖ｃＤＮＡとを１５℃にて一晩連結させることにあった。ついで、フェノールでの抽出につづいてクロロホルムで抽出することによって蛋白質を除去し、ついで１０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液１／１０容量およびエタノール２．５容量を添加した。その混合物を遠心分離し、ペレットを以下の組成：３３ｍＭ  トリス−酢酸  ｐＨ７．９、６２．５ｍＭ  酢酸カリウム、１ｍＭ  酢酸マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ；を有する緩衝液中に採取し、酵素Ｔ４ファージＤＮＡポリメラーゼ（Pharmacia社製）３０単位および１ｍＭの４種のデオキシヌクレオチド三リン酸の混合物ならびにＴ４ファージ遺伝子３２の蛋白質（Pharmacia社製）２単位を含む３０μｌ容量中、３７℃にて１時間、第２のｃＤＮＡ鎖を合成した。その混合物をフェノールで抽出し、Ｐ１０カラム（Biogel  P10−200−400メッシュ−参照15011050−Biorad社製）上に沈殿させることによって痕跡を除去した。
【００８７】
最終ステージは、製造業者により推奨されている条件下、２．５ｋＶで使用するBiorad  Gene  Pulser装置を用いた組換えＤＮＡのエレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１細胞を形質転換し、ついでその細菌を以下の組成：バクトトリプトン１０ｇ／ｌ；酵母エキストラクト５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ  １０ｇ／ｌ；を有するＬＢ培地中で１時間培養することにあった。
【００８８】
得られた独立クローンの数は、１．５％寒天（ｗ／ｖ）および１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したＬＢ培地（以後、ＬＢ寒天培地と称する）を入れた皿上で１時間インキュベーションした後の形質転換体からの１／１０００希釈液を平板することによって測定した。
得られた独立クローンの数は１，０００，０００であった。
【００８９】
ｂ）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
全体ライブラリーをBiodyne  Aメンブレン（PALL社製、参照BNNG  132）で被覆した寒天培地（直径１５０ｍｍのペトリ皿）上に平板した。３７℃にて一晩放置した後に、新たなメンブレン上に接触させることによってクローンを転移させた。その新たなメンブレンを、下記の組成の溶液に浸漬させたWathman  3MMペーパー上にそれを置くことによって処理した：０．５Ｎ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、５分間、ついで０．５Ｍ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、５分間。以下の緩衝液：１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ  プロテインキナーゼＫ；中、３７℃にて３０分間、プロテインキナーゼＫで処理した後に、そのメンブレンを２×ＳＳＣ緩衝液（クエン酸ナトリウム−ＮａＣｌ）で完全に洗浄し、ついで真空下、オーブン中、８０℃にて２０分間乾燥した。
【００９０】
ｃ）メンブレンのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション
ついで、そのメンブレンを以下の緩衝液：１Ｍ  ＮａＣｌ；３０％ホルムアミド；１％ＳＤＳ；５×デンハート溶液；１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ；中、４２℃にて２時間プレハイブリダイズさせた。２時間のプレハイブリダイゼーション後に、そのメンブレンを、２．５×１０６ｄｐｍ／ｍｌのニックトランスレーションによって調製した一定濃度のマウスＩＬ−１３Ｒαプローブを含む同緩衝液中にて１６時間ハイブリダイズさせた。そのメンブレンを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ緩衝液中、室温にて３０分間、２回洗浄し、ついで同緩衝液中、５０℃にて２時間洗浄した。Kodak  X−OMATフィルム存在下、−８０℃にて一晩感光させた後に、数個の陽性クローンが検出された。
【００９１】
ｄ）ヒトＩＬ−１３Ｒαクローンの配列決定および該配列の分析
配列は、Applied  Biosystem社製キット（参照401628）を用いて得た。ＩＬ−１３Ｒα  ｃＤＮＡの完全核酸配列およびそれから予想されるアミノ酸配列を図１５および１６に示す。ｃＤＮＡはポリ−Ａテイルを除く３９９９塩基長であり、２１４５塩基の長い非翻訳３’領域を有している。
【００９２】
典型的なポリアデニル化シグナルが予想された部位に存在している。ヌクレオチド３４と１８５１との間のオープンリーディングフレームは、４２７アミノ酸のポリペプチドを規定する。該配列は、潜在的なシグナルペプチドならびに単一の貫膜ドメインおよび短い細胞質外領域と共に膜蛋白質をコードしている。
【００９３】
１０箇所の潜在的なグリコシル化部位は、細胞外領域に位置する。サイトカイン受容体のＩＩ型ファミリーの特徴と考えられる２種の共通モチーフ：１番目のものはＮ−末端ジスルフィド架橋ループ構造由来のもので、２番目のものは細胞外領域のＣ−末端に位置するＷＳＸＷＳ型のモチーフである；も存在することは重要である。
【００９４】
実施例８
ヒトＩＬ−１３Ｒα  ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ−３またはＣＨＯ細胞に対して行った結合性分析
ＩＬ−１３Ｒαをコードする単離したｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞は、標識化ＩＬ−１３に特異的に結合した。飽和曲線のスキャッチャード解析は、４．５±０．４ｎＭのＫｄ値と２６０００受容体／細胞の最大結合能力とを有する単一のコンポーネント部位を示した（図１９Ｃおよび１９Ｇ）。
同時発現実験の結果を図１９Ｄおよび１９Ｈに示す。
【００９５】
図１９Ｃの結果の分析により、ＣＨＯ細胞のクローン２０３６においてＩＬ−１３Ｒαが良好に発現されていることが示された。ＩＬ−４Ｒは、ＩＬ−４ＲおよびＩＬ−１３Ｒα  ｃＤＮＡで同時トランスフェクトしたＣＨＯ細胞におけるＩＬ−１３の結合性の６０％を置換した（図１９Ｈ）が、ＩＬ−１３Ｒαに対する７．５ｎＭのＫｄを考慮すると、ＩＬ−４Ｒ部位よりもＩＬ−１３Ｒα部位が１０倍も多く存在するようであることは注意し得る。
【００９６】
ｈＩＬ−１３ＲαをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトしたｈＩＬ−４Ｒを発現しているＣＨＯ−ｈＩＬ４Ｒ細胞（ヒトＩＬ−４Ｒ）は、標識化ＩＬ−１３に特異的に結合した。
【００９７】
飽和曲線のスキャッチャード解析は、２種のコンポーネント部位；２３±８．９ｐＭのＫｄ値と２８０００部位／細胞の最大結合能力とを有する高親和性の１種、および４．２±１．４ｎＭのＫｄ値と１５００００部位／細胞の最大結合能力とを有する低親和性のもう１種；を明らかに示した（図１９Ｄ）。
【００９８】
特徴付けした２番目の部位は、単独で発現させたｈＩＬ−１３Ｒα（ヒトＩＬ−１３Ｒα）と同一の親和性を有し、非会合ＩＬ−１３Ｒα鎖に相当した。なぜならば、それらはｈＩＬ−４Ｒよりも多量に発現されていたからである。
【００９９】
２種のｈＩＬ−１３ＲαおよびｈＩＬ−４Ｒ鎖存在下にて再構成したこれらの高親和性受容体は、２種のサイトカインを認識することができた（図１９Ｄおよび１９Ｈ）。このことは、ＩＬ−４が全ての結合性ＩＬ−１３を置換する匹敵量で２種のｈＩＬ−１３ＲαおよびｈＩＬ−４Ｒ鎖を同時発現しているＣＯＳ／ｐＳＥ１細胞でさえより明らかであった。
【０１００】
組換えヒトＩＬ−１３Ｒαの親和性は、マウスＩＬ−１３Ｒα受容体について記載されているもの（２−１０ｎＭ）（参照２２）に匹敵した。
以前に記載されたｈＩＬ−１３Ｒβ鎖とは反対に、ヒトＩＬ−１３Ｒαはそれ自体の上に高親和性結合部位を構成しなかった。
したがって、ＩＬ−１３ＲαおよびＩＬ−４Ｒは、細胞膜中で相互作用して高親和性受容体を再構成する。
【０１０１】
実施例９
ｈＩＬ−１３ＲαおよびｈＩＬ−４Ｒを同時発現しているＣＨＯ細胞におけるＩＬ−１３およびＩＬ−４によるＳＴＡＴ蛋白質の活性化
ヒトＰＢＭＣ細胞において、ｈＩＬ−４およびＩＬ−１３は、後期転写因子であるＳＴＡＴ６をリン酸化するJAK(janus)ファミリーの２種のチロシンキナーゼ、Ｊａｋ１およびＪａｋ２を活性化した。この活性化された因子は核に入り、ＩＬ−４によって調節された遺伝子のプロモーター中の特異的エレメントに結合した。
【０１０２】
本発明者らは、電気泳動移動度スイッチアッセイ（ＥＭＳＡ）におけるプローブとしてヒトＣεプロモーターのＣεエレメントを選択して、ＳＴＡＴ６と同様な結合因子のＩＬ−１３による活性化を立証した。
【０１０３】
１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１３またはＩＬ−４で、３７℃にて１０分間刺激した、ＩＬ−１３Ｒ単独、ＩＬ−４Ｒ単独、または２種の鎖を一緒に発現しているＣＨＯ細胞の核抽出物を、放射性同位元素標識化Ｃεエレメントと共にインキュベートした。
【０１０４】
ｈＩＬ−１３ＲαおよびｈＩＬ−４Ｒを同時発現している細胞の核抽出物は、当該細胞がＩＬ−４またはＩＬ−１３のいずれで誘導されていようが、ＥＭＳＡにおいて同一の移動度を有する複合体を形成した（図２０を参照されたし）。一方、いずれかの鎖を単独で発現している細胞を用いると、複合体は全く検出されなかった。
【０１０５】
したがって、ｈＩＬ−１３ＲαおよびｈＩＬ−４Ｒαを発現しているＣＨＯ細胞においては、ＩＬ−１３およびＩＬ−４が同一のシグナリング経路を始動させる。
【０１０６】
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【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】Ｃａｋｉ-１細胞中に存在するヒトＩＬ-１３Ｒβ受容体の特徴付けを示す。［１２５Ｉ］で標識したＩＬ-１３の飽和曲線のスキャッチャード解析（挿入図）。
【図２】Ｃａｋｉ-１細胞中に存在するヒトＩＬ-１３Ｒβ受容体の特徴付けを示す。上昇してゆく濃度の非標識ＩＬ-１３（・）およびＩＬ-４（○）存在下における［１２５Ｉ］［Phe43］-ＩＬ-１３-GlyTyrGlyTyrの結合性。
【図３】Ｃａｋｉ-１細胞中に存在するヒトＩＬ-１３Ｒβ受容体の特徴付けを示す。非標識ＩＬ−１３不存在下（レーンａ）、および１００倍過剰量の非ＩＬ−１３（レーンｂ）またはＩＬ-４（レーンｃ）存在下にて放射性ＩＬ-１３を用いた交差-連結実験。
【図４】Ｃａｋｉ-１細胞中に存在するヒトＩＬ-１３Ｒβ受容体の特徴付けを示す。ＩＬ−４Ｒ鎖に対して特異的なモノクローナル抗体およびＩＬ−４アンタゴニストＹ１２４ＤＩＬ−４存在下における、ＩＬ−１３およびＩＬ−４によって誘導されるＩＬ−６の分泌の阻害。
【図５】ＩＬ-１３ＲβのｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。ＩＬ-１３ＲβのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。核酸配列の予想シグナルペプチドに相当するアミノ酸はイタリックで示し、貫膜ドメインに相当するアミノ酸は太字で示す。潜在的なＮ−グリコシル化部位（Asn-X-Ser/Thr）には下線を引いている。
【図６】ＩＬ-１３ＲβのｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。ＩＬ-１３ＲβのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。核酸配列の予想シグナルペプチドに相当するアミノ酸はイタリックで示し、貫膜ドメインに相当するアミノ酸は太字で示す。潜在的なＮ−グリコシル化部位（Asn-X-Ser/Thr）には下線を引いている。
【図７】ＩＬ-５ＲおよびＩＬ-１３Ｒβの蛋白質配列の比較を示す。ＩＬ−１３ＲβおよびＩＬ−５Ｒ配列のアミノ酸の整列を示す。ＩＬ−１３ＲおよびＩＬ−５Ｒの蛋白質配列を前記（２４）と同様に整列させている。受容体のこのファミリーに特徴的なシステイン残基およびＷＳＸＷＳモチーフは四角で囲んでいる。
【図８】ＩＬ−１３Ｒβ  ｍＲＮＡの発現パターンを示す。ＲＮＡは以下の細胞から調製した：Ｃａｋｉ−１（レーンａ）、Ａ４３１（レーンｂ）、ＴＦ−１（レーンｃ）、Ｕ９３７（レーンｄ）、Ｊｕｒｋａｔ（レーンｅ）およびＩＭ９（レーンｆ）。
【図９】ＩＬ−１３についての組換えＩＬ−１３Ｒβ受容体の特徴付けを示す。ＣＯＳ−７細胞をＩＬ−１３Ｒβ  ｃＤＮＡでトランスフェクトし、飽和曲線のスキャッチャード解析による放射性同位元素標識化ＩＬ−１３の結合性に関する実験（挿入図）。
【図１０】ＩＬ−１３についての組換えＩＬ−１３Ｒβ受容体の特徴付けを示す。ＣＯＳ−７細胞をＩＬ−１３Ｒβ  ｃＤＮＡでトランスフェクトし、不存在（レーンａ）、および１００倍過剰量の非標識ＩＬ−１３存在（レーンｂ）下にて放射性同位元素標識化ＩＬ−１３を用いた交差-連結実験。
【図１１】クローン化ＩＬ−１３Ｒβ、ＩＬ−４Ｒ（ｇｐ１４０）およびγｃ鎖を用いた同時トランスフェクション実験につづく放射性同位元素標識化ＩＬ−１３の結合性を示す。斜線棒グラフおよび白抜き棒グラフは、ＩＬ−１３の特異的結合性を表す。
【図１２】クローン化ＩＬ−１３Ｒβ、ＩＬ−４Ｒ（ｇｐ１４０）およびγｃ鎖を用いた同時トランスフェクション実験につづく放射性同位元素標識化ＩＬ−４の結合性を示す。斜線棒グラフおよび白抜き棒グラフは、ＩＬ−４の特異的結合性を表す。
【図１３】経時発現の可溶性形態の受容体（ＩＬ−１３Ｒβｓ）によるＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒβへの結合性の阻害。２０３４でトランスフェクトした細胞上清中のＩＬ−１３Ｒβｓの発現を、ＩＬ−１３Ｒβ（２０３６）でトランスフェクトした細胞に対するＩＬ−１３の結合性の阻害によって試験したグラフを示す。該上清は、ヨウ素化リガンド中でそれを１．５倍に希釈することによって粗製状態で試験した。  ２０３６ＮＳＢ：過剰量の非標識ＩＬ−１３存在下における非特異的結合性。  ２０３６ＢＴ：２０３６でトランスフェクトした細胞に対する合計結合性。  ２０３６＋ｓｇｔ２０３４：２０３４でトランスフェクトした細胞の上清存在下における、２０３６でトランスフェクトした細胞に対する結合性。  ２０３６＋ｓｇｔ  ｐＳＥ１：対照
【図１４】安定系統上の可溶性形態の受容体（ＩＬ−１３Ｒβｓ）によるＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒβへの結合性の阻害を示す。Ｔ２０３６−２２：ＩＬ−１３Ｒβｓを分泌するクローン上清不存在下における、ＩＬ−１３Ｒβ（２０３６−２２）に対する合計結合性（参照  １００％）  ２０３４−４  ２０３４−６  ２０３４−１９                        ４種のクローン  ＩＬ−１３Ｒβｓ  ２０３４−２１  １２７４−２０：ＩＬ−１３Ｒβｓを発現していないＣＨＯ細胞の上清存在下（対照）。
【図１５】ＩＬ-１３Ｒα  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。ＩＬ-１３Ｒα  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列。核酸配列から予想されるシグナルペプチドに相当するアミノ酸には点線の下線が引かれており、貫膜ドメインに相当するアミノ酸には二重線の下線が引かれている。潜在的なＮ−グリコシル化部位（Asn-X-Ser/Thr）は四角で囲んでいる。
【図１６】ＩＬ-１３Ｒα  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。ＩＬ-１３Ｒα  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列。核酸配列から予想されるシグナルペプチドに相当するアミノ酸には点線の下線が引かれており、貫膜ドメインに相当するアミノ酸には二重線の下線が引かれている。潜在的なＮ−グリコシル化部位（Asn-X-Ser/Thr）は四角で囲んでいる。
【図１７】ヒトＩＬ−１３Ｒαおよびげっ歯類ＩＬ−１３Ｒαのアミノ酸の整列を示す。ヒトＩＬ−１３Ｒαおよびげっ歯類ＩＬ−１３Ｒαの蛋白質配列を前記（２４）と同様に整列している。受容体のこのファミリーに特徴的なシステイン残基およびモチーフＷＳＸＷＳは四角で囲んでいる。
【図１８】ＩＬ−１３についての組換えＩＬ−１３Ｒα受容体の特徴付けを示す。ＣＨＯまたはＣＯＳ−３細胞をＩＬ−１３Ｒαおよび／またはＩＬ−４Ｒ  ｃＤＮＡでトランスフェクトし：ＩＬ−１３Ｒβ  ｃＤＮＡでトランスフェクトした（図ＡおよびＥ）、ＩＬ−１３Ｒβ  ｃＤＮＡおよびＩＬ−４Ｒ  ｃＤＮＡでトランスフェクトした（図ＢおよびＦ）ＣＨＯ細胞を用いた飽和曲線のスキャッチャード解析および該ＣＨＯ細胞に対する［１２５Ｉ］−ＩＬ−１３の結合性の競合実験。白抜きおよび横線棒グラフは、各々、過剰量（1,000倍多い）のＩＬ−１３またはＩＬ−４存在下の放射性同位元素標識化ＩＬ−１３の特異的結合性を表し、黒塗り棒グラフは合計結合性を表している。
【図１９】ＩＬ−１３についての組換えＩＬ−１３Ｒα受容体の特徴付けを示す。ＣＨＯまたはＣＯＳ−３細胞をＩＬ−１３Ｒαおよび／またはＩＬ−４Ｒ  ｃＤＮＡでトランスフェクトし：ＩＬ−１３Ｒα  ｃＤＮＡでトランスフェクトした（図ＣおよびＧ）、およびＩＬ−１３Ｒα  ｃＤＮＡおよびＩＬ−４Ｒ  ｃＤＮＡでトランスフェクトした（図ＤおよびＨ）ＣＨＯ細胞を用いた飽和曲線のスキャッチャード解析および該ＣＨＯ細胞に対する［１２５Ｉ］−ＩＬ−１３の結合性の競合実験。白抜きおよび横線棒グラフは、各々、過剰量（1,000倍多い）のＩＬ−１３またはＩＬ−４存在下の放射性同位元素標識化ＩＬ−１３の特異的結合性を表し、黒塗り棒グラフは合計結合性を表している。
【図２０】ＩＬ−４ＲまたはＩＬ−１３存在下にてＣＨＯ細胞を活性化した後の（４または１３）ＩＬ−４単独に対する受容体を（ＣＨＯ−４）、ＩＬ−１３Ｒα単独に対する受容体を（ＣＨＯ−１３）、または結合受容体ＩＬ−１３ＲαおよびＩＬ−４Ｒを（ＣＨＯ−４−１３）発現している細胞抽出物のＥＭＳＡにおける電気泳動移動度の比較。ｃは非活性化対照を表している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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