(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、栄養物、酸素または老廃物等を輸送する手段を有し、生体内で生存可能な人工組織体を提供することである。【解決手段】  血管層、基底膜層および組織形成細胞層を含む、in vitroで形成された組織体。【選択図】  図１
2005342112.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管層、基底膜層および組織形成細胞層を含む、in vitroで形成された組織体。
【請求項２】
基底膜層は組織形成細胞層の上に存在し、血管層は基底膜層の上に存在する、請求項１記載の組織体。
【請求項３】
血管層、基底膜層および組織形成細胞層が積層されてなるin vitroで形成された積層組織体であって、３種の層をそれぞれ少なくとも１層含む該積層組織体。
【請求項４】
基底膜層は組織形成細胞層の上に存在し、血管層は基底膜層の上に存在し、組織形成細胞層は基底膜層または血管層の上に存在する、請求項３記載の積層組織体。
【請求項５】
組織形成細胞層、基底膜層および血管層を含む組織体を製造する方法であって、
(a)培養ベース上に組織形成細胞層を形成する工程、
(b)得られた組織形成細胞層上に基底膜層を形成する工程、
(c)細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材表面の細胞接着性良好領域に血管形成細胞を接着させ、接着した血管形成細胞を基底膜層上にパターン化された状態で転写し培養する工程、ならびに
(d)組織形成細胞層、基底膜層および血管層を含む組織体を培養ベースから剥離して回収する工程を含む、前記製造方法。
【請求項６】
請求項５記載の方法によって製造された組織体を積層することにより、積層組織体を製造する方法。
【請求項７】
以下の(a)〜(d)：
(a)培養ベース上に組織形成細胞層を形成する工程、
(b)得られた組織形成細胞層上に基底膜層を形成する工程、
(c)細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材表面の細胞接着性良好領域に血管形成細胞を接着させ、接着した血管形成細胞を基底膜層上にパターン化された状態で転写し培養する工程、ならびに
(d)組織形成細胞層、基底膜層および血管層を含む第１組織体を培養ベースから剥離して回収する工程
を含む方法によって第１組織体を製造し、
以下の(e)〜(f)：
(e)培養ベース上に組織形成細胞層を形成する工程、
(f)得られた組織形成細胞層上に基底膜層を形成する工程、ならびに
(g)組織形成細胞層および基底膜層を培養ベースから剥離して回収する工程
を含む方法によって第２組織体を製造し、
第１組織体および第２組織体を積層することによって、積層組織体を製造する方法。
【請求項８】
積層組織体内の血管層に培養液を送液する工程をさらに含む請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
細胞接着性変化層が、光触媒および細胞接着性変化材料を含有する光触媒含有細胞接着性変化層である、請求項５〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
細胞接着性変化層が、光触媒を含有する光触媒処理層と、該光触媒処理層上に形成された細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有する、請求項５〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
細胞接着性変化パターンが、細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化層と光触媒を含有する光触媒含有層とを対向するように配置した後、エネルギー照射することにより形成される、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
細胞接着性変化パターンが、ライン状の細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域のスペースとが交互に配置されたパターンであり、細胞接着性良好領域のライン幅が２０〜２００μｍであり、ライン間のスペース幅が１００〜１０００μｍである請求項５〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
培養ベースが、細胞を弱い接着力で保持可能な表面を有する請求項５〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか１項記載の組織体を移植することにより組織を再生する方法。
【請求項１５】
血管層、基底膜層および組織形成細胞層を含み、前記組織形成細胞層の前記血管層形成領域のほぼ全面に前記基底膜層が形成されている組織体。
【請求項１６】
血管層、基底膜層および組織形成細胞層を含み、前記組織形成細胞層の前記血管層形成領域のほぼ全面に前記基底膜層が形成されている積層組織体であって、３種の層をそれぞれ少なくとも１層含む該積層組織体。
【請求項１７】
基底膜層は組織形成細胞層の上に存在し、血管層は基底膜層の上に存在し、組織形成細胞層は基底膜層または血管層の上に存在する、請求項１６記載の積層組織体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管層、基底膜層および組織形成細胞層を含むin vitroで形成された組織体、該組織体を含む積層組織体およびそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、人工代替物や細胞を培養して組織化させたものをそのまま移植しようという技術が注目されている。その代表的な例として、人工皮膚、人工血管および培養細胞組織等が挙げられる。合成高分子を用いた人工皮膚等は拒絶反応等が生じる可能性があり、移植用として好ましくない。一方、培養細胞組織は本人の細胞を培養して組織化したものであるため拒絶反応の心配がなく、移植用として好ましい。このような培養細胞組織は、本人から細胞を採取し、これを培養することにより作成される。
【０００３】
多くの動物細胞は、何かに接着して生育する接着依存性を有しており、生体外の浮遊状態では長時間生存することができないため、上記のような細胞組織を作成するための細胞培養においては、例えば表面処理により細胞接着性を高めた改質ポリスチレン等の高分子材料や、またはコラーゲンなどの細胞接着性タンパク質やポリLリジンなどの細胞接着性高分子をガラスや高分子材料に均一に塗布した培養皿が担体として用いられてきた。このような担体に平面状に接着し増殖した細胞は、タンパク質や糖質からなる細胞外マトリックスを培養環境下で形成し生育する。このような培養細胞を回収する為には、通常、トリプシンなどのタンパク質分解酵素や化学薬品で処理する必要があり、処理工程が煩雑になり、コンタミネーションの可能性が高くなること、細胞が変性若しくは損傷し、細胞本来の機能が損なわれる可能性がある等の問題があった。
【０００４】
そこで、特許文献１では、培養ベース上に温度応答性ポリマーによるパターンを形成した細胞培養支持体を作成し、該細胞培養支持体上で細胞を培養し、これを高分子膜に密着させて温度を変化させることにより細胞を損傷させることなく高分子膜とともに細胞を剥離して細胞シートを製造する方法を開示している。
【０００５】
しかし、ここで開示される方法によって得られる細胞シートを生体移植等行う場合は、以下の問題がある。細胞シートを複数枚積層し、数百ミクロン程度の厚みの人工組織とすると、この人工組織は栄養物、酸素または老廃物を輸送する手段を持たないため、人工組織体内の細胞が壊死してしまう。
【０００６】
組織内の細胞が壊死しない程度の厚みで人工組織体を形成して生体移植を行い、生体内で血管形成させることも考えられるが、このような手段によって一度に移植可能な細胞数は少なく、大規模に損傷した臓器機能を回復するためには生体移植を繰り返し行う必要があり、現実的ではない。
【０００７】
一方、特定の細胞培養法により人工臓器を構築する方法も知られている（特許文献２）。これは、管状の細胞培養基材に血管内皮細胞等を接着することにより人工血管を形成させるものである。しかし、この方法で多数の人工血管を作成する為には、微細加工された細胞培養基材を多数用意する必要があり、組織の形成に時間を要することからその工業生産性は低い。
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−３８１７０号公報
【特許文献２】特開２００３−２４３５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記のような従来技術における問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明の課題は、栄養物、酸素または老廃物等を輸送する手段を有し、生体内で生存可能な人工組織体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、血管層、基底膜層および組織形成細胞層をそれぞれ少なくとも１層積層させることにより、血管組織を有する人工組織体を製造できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）血管層、基底膜層および組織形成細胞層を含む、in vitroで形成された組織体。
（２）基底膜層は組織形成細胞層の上に存在し、血管層は基底膜層の上に存在する、（１）記載の組織体。
（３）血管層、基底膜層および組織形成細胞層が積層されてなるin vitroで形成された積層組織体であって、３種の層をそれぞれ少なくとも１層含む該積層組織体。
（４）基底膜層は組織形成細胞層の上に存在し、血管層は基底膜層の上に存在し、組織形成細胞層は基底膜層または血管層の上に存在する、（３）記載の積層組織体。
（５）組織形成細胞層、基底膜層および血管層を含む組織体を製造する方法であって、
(a)培養ベース上に組織形成細胞層を形成する工程、
(b)得られた組織形成細胞層上に基底膜層を形成する工程、
(c)細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材表面の細胞接着性良好領域に血管形成細胞を接着させ、接着した血管形成細胞を基底膜層上にパターン化された状態で転写し培養する工程、ならびに
(d)組織形成細胞層、基底膜層および血管層を含む組織体を培養ベースから剥離して回収する工程を含む、前記製造方法。
（６）（５）記載の方法によって製造された組織体を積層することにより、積層組織体を製造する方法。
（７）以下の(a)〜(d)：
(a)培養ベース上に組織形成細胞層を形成する工程、
(b)得られた組織形成細胞層上に基底膜層を形成する工程、
(c)細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材表面の細胞接着性良好領域に血管形成細胞を接着させ、接着した血管形成細胞を基底膜層上にパターン化された状態で転写し培養する工程、ならびに
(d)組織形成細胞層、基底膜層および血管層を含む第１組織体を培養ベースから剥離して回収する工程
を含む方法によって第１組織体を製造し、
以下の(e)〜(f)：
(e)培養ベース上に組織形成細胞層を形成する工程、
(f)得られた組織形成細胞層上に基底膜層を形成する工程、ならびに
(g)組織形成細胞層および基底膜層を培養ベースから剥離して回収する工程
を含む方法によって第２組織体を製造し、
第１組織体および第２組織体を積層することによって、積層組織体を製造する方法。
（８）積層組織体内の血管層に培養液を送液する工程をさらに含む（６）または（７）記載の方法。
（９）細胞接着性変化層が、光触媒および細胞接着性変化材料を含有する光触媒含有細胞接着性変化層である、（５）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）細胞接着性変化層が、光触媒を含有する光触媒処理層と、該光触媒処理層上に形成された細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有する、（５）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１１）細胞接着性変化パターンが、細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化層と光触媒を含有する光触媒含有層とを対向するように配置した後、エネルギー照射することにより形成される、（９）記載の方法。
（１２）細胞接着性変化パターンが、ライン状の細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域のスペースとが交互に配置されたパターンであり、細胞接着性良好領域のライン幅が２０〜２００μｍであり、ライン間のスペース幅が１００〜１０００μｍである（５）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）培養ベースが、細胞を弱い接着力で保持可能な表面を有する（５）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）（１）〜（４）のいずれかに記載の組織体を移植することにより組織を再生する方法。
（１５）血管層、基底膜層および組織形成細胞層を含み、前記組織形成細胞層の前記血管層形成領域のほぼ全面に前記基底膜層が形成されている組織体。
（１６）血管層、基底膜層および組織形成細胞層を含み、前記組織形成細胞層の前記血管層形成領域のほぼ全面に前記基底膜層が形成されている積層組織体であって、３種の層をそれぞれ少なくとも１層含む該積層組織体。
（１７）基底膜層は組織形成細胞層の上に存在し、血管層は基底膜層の上に存在し、組織形成細胞層は基底膜層または血管層の上に存在する、（１６）記載の積層組織体。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、栄養物、酸素または老廃物等を輸送する手段を有し、生体内で生存可能な人工組織体を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、血管層、基底膜層および組織形成細胞層を含む、in vitroで形成された組織体に関する。血管層とは、血管形成細胞を含む層を意味する。血管形成細胞としては、血管内皮細胞、平滑筋細胞、壁細胞等が挙げられるが、血管中の血液成分を凝結させずに流通させる為に血管内皮細胞が好ましく、その機能や構造を維持する為に平滑筋細胞や壁細胞と共に構成されることが望ましい。血管層においては、血管形成細胞がパターン状に配列されていることが好ましい。パターンは、二次元のパターンであれば特に制限されず、例えば、ライン状、網目状、円形、四角形のパターン、円形および四角形等の図形の内部がすべて細胞で占められたパターンなどを形成することができる。ライン状または網目状のパターンが好ましい。血管形成細胞をライン状または網目状に配列して培養することにより、組織化が促進され血管の形成が促される。従って、本発明において血管層は好ましくは血管組織を含む。
【００１４】
本発明において基底膜層とは、基底膜構成タンパク質を主成分とする層であり、基底膜層とは、細胞の活動を刺激する細胞成長因子や血管層と組織形成細胞層とを結びつけ、集合体を形成する細胞外マトリックスが層状態となったもので、コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンを含む。基底膜層は生体抽出物や細胞によって産生されたものでもよく、また、人工のものを添加して形成したものでもよい。
【００１５】
組織形成細胞層とは、組織形成細胞を含む層を意味する。組織形成細胞とはin vitroで構成する組織体に必要とされる機能を有する細胞のことであり、例えば、臓器細胞、具体的には、肝実質細胞，膵臓β細胞などの代謝系臓器に由来するもの、あるいは皮膚の上皮細胞のように構造系臓器に由来するものなどが挙げられる。上記組織体において、好ましくは、基底膜層は組織形成細胞層の上に存在し、血管層は基底膜層の上に存在する。
【００１６】
本発明はまた、血管層、基底膜層および組織形成細胞層が積層されてなるin vitroで形成された積層組織体であって、３種の層をそれぞれ少なくとも１層含む該積層組織体に関する。この積層組織体において、好ましくは、基底膜層は組織形成細胞層の上に存在し、血管層は基底膜層の上に存在し、組織形成細胞層は基底膜層または血管層の上に存在する。すなわち、該積層組織体は、組織形成細胞層の上に基底膜層が存在し、該基底膜層の上に血管層が存在する三層構造、および組織形成細胞層の上に基底膜層が存在する二層構造が積層された構造を有する。
【００１７】
血管層を有する三層構造は、積層組織体中に少なくとも１個存在すればよく、好ましくは１〜５個である。組織形成細胞層の上に基底膜層が存在する二層構造は、通常０〜５個、二層構造と三層構造は、合わせて、通常５〜１０個存在する。
【００１８】
前記組織形成細胞層上において、血管層が形成された領域のほぼ全面に前記基底膜層が形成されている。ほぼ全面とは、通常９０％以上、好ましくは９５％以上を意味する。
【００１９】
本発明はまた、血管層、基底膜層および組織形成細胞層を含む組織体をin vitroで製造する方法に関する。該組織体は以下の(a)〜(d)の工程を含む方法によって製造することができる。
(a)培養ベース上に組織形成細胞層を形成する工程、
(b)得られた組織形成細胞層上に基底膜層を形成する工程、
(c)細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材表面の細胞接着性良好領域に血管形成細胞を接着させ、接着した血管形成細胞を基底膜層上にパターン化された状態で転写し培養する工程、ならびに
(d)組織形成細胞層、基底膜層および血管層を含む第１組織体を培養ベースから剥離して回収する工程。
【００２０】
上記製造方法の一態様を図１０に示す。図１０において、１０１は組織形成細胞を表し、１０２は培養ベースを表し、１０３は組織形成細胞層を表し、１０４は基底膜層を表し、１０５は細胞配列用基材を表し、１０６は血管形成細胞を表し、１０７は形成された組織体を表し、１０８は血管層を表す。
【００２１】
培養ベースは、その上に組織形成細胞層を形成しうるものであれば特に制限されないが、好ましくは、該細胞層に損傷を与えずこれを剥離可能な培養ベースを使用する。そのような培養ベースとしては、細胞を弱い接着力で保持可能な表面を有する培養ベース、例えば、ポリスチレン基材に対し細胞接着用のプラズマ処理を弱く施したものや、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンやフルオロアルキルシランのように細胞接着阻害性を有する材料を基材表面に少量導入したものなどが挙げられる。このような少量導入の方法としては、材料を吸着処理などで基材に充分に導入した後、UV処理、オゾン処理、プラズマ処理で分解する方法、または材料を希薄に溶解した溶液を薄層コーティングする等の方法が挙げられる。導入の割合については接着させる細胞の種類、基材に導入する材料の種類により異なり調整を要する。
【００２２】
また、温度応答性ポリマー材料、例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのように相転移温度以上の環境では疎水性、すなわち細胞接着性を有し、相転移温度以下の温度では親水性となり細胞接着性が失われる材料を、高分子やガラスの基材上に重合したものを挙げることができる。本発明においては、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを使用するのが好ましい。
【００２３】
組織形成細胞層の形成は、当技術分野で通常用いられる細胞培養方法によって実施することができる。例えば、培養ベース上に細胞を１０４〜１０８個／ｃｍ２の密度で播き、３７℃にて３０分〜４８時間培養することにより実施できる。培地としては、当技術分野で通常用いられるものを使用でき、例えば、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地およびＲＰＭＩ培地等、これらの培地に血清成分（ウシ胎児血清等）等を添加したもの、並びに市販の無血清培地等を用いることができる。
【００２４】
基底膜層は、組織形成細胞を培養することにより形成させることもできるし、マトリックスを添加することにより形成させてもよい。添加するマトリックスとしては、コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンを含むものであれば特に制限されないが、例えば、ＧＦＲマトリゲル，例えばメビオールゲルなどの人工高分子材料にコラーゲンやラミニン等の生体由来材料を添加したもの等が挙げられる。マトリックスを添加する場合は、添加後、約３７℃で数時間インキュベートすることにより基底膜層を形成することができる。
【００２５】
血管層は、細胞配列用基材の血管形成細胞がパターン状に配列された面を基底膜層と接触させて培養、組織化後、細胞配列用基材を剥離することにより形成することができる。培養条件は当技術分野において通常用いられるものを採用でき、例えば、３７℃で通常２〜４８時間、好ましくは４〜２４時間培養する。
【００２６】
細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材、その表面の細胞接着性良好領域への血管形成細胞の接着については後述する。最後に、組織形成細胞層、基底膜層および血管層からなる組織体を培養ベースから剥離して回収する。
【００２７】
本発明はまた、血管層、基底膜層および組織形成細胞層が積層されてなる積層組織体であって、３種の層をそれぞれ少なくとも１層含む該積層組織体をin vitroで製造する方法に関する。積層組織体は、血管層、基底膜層および組織形成細胞層を含む第１組織体を製造し、これを積層させることによって製造できる。あるいは、上記第１組織体を製造し、以下の(e)〜(f)：
(e)培養ベース上に組織形成細胞層を形成する工程、
(f)得られた組織形成細胞層上に基底膜層を形成する工程、ならびに
(g)組織形成細胞層および基底膜層を培養ベースから剥離して回収する工程
を含む方法によって基底膜層および組織形成細胞層を含む第２組織体を製造し、
第１組織体および第２組織体を積層することによって製造できる。
【００２８】
上記製造方法の一態様を図１１に示す。図１１において、１０７は組織体を表し、１０８は血管層を表し、１０９は第１組織体が積層されてなる積層組織体を表し、１１０は第１組織体と第２組織体が積層されてなる積層組織体を表す。
【００２９】
第２組織体の製造における培養ベース、組織形成細胞層の形成および基底膜層の形成については、上記の第１組織体の場合と同様である。
【００３０】
ここで、第１組織体と第２組織体の積層の順序は特に制限されないが、血管層を有しない第２組織体１〜６層、好ましくは２〜３層に対し、１層の第１組織体が存在するのが好ましい。
【００３１】
組織体を積層させた後、好ましくは、積層組織体内の血管層に培養液を送液する。これによって、血管層にパターン状に配列された血管形成細胞の組織化が促進される。
【００３２】
I．細胞配列用基材
本発明における細胞配列用基材は、基材上に細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有することを特徴とするものである。
【００３３】
細胞接着性とは、細胞を接着する強度、すなわち細胞の接着しやすさを意味する。細胞接着性良好領域とは、細胞接着性が良好な領域を意味し、細胞接着性阻害領域とは、細胞の接着性が悪い領域を意味する。従って、細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材上に細胞を播くと、細胞接着性良好領域には細胞が接着するが、細胞接着性阻害領域には細胞が接着しないため、細胞配列用基材表面には細胞がパターン状に配列されることになる。
【００３４】
細胞接着性は、接着しようとする細胞によって異なる場合もあるため、細胞接着性が良好とは、ある種の細胞に対する細胞接着性が良好であることを意味する。従って、細胞配列用基材上には、複数種の細胞に対する複数の細胞接着性良好領域が存在する場合、すなわち細胞接着性が異なる細胞接着性良好領域が２水準以上存在する場合もある。
【００３５】
細胞接着性変化パターンとしては、エネルギーの照射に伴い細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含む細胞接着性変化層を基材上に形成し、特定の領域にエネルギー照射することによって細胞接着性を変化させて、細胞接着性の異なる領域をパターン状に形成させたものが挙げられる。細胞の接着性が変化する材料には、エネルギーの照射に伴い細胞接着性を獲得または増加する材料および細胞接着性が減少または消失する材料の双方が含まれる。
【００３６】
本発明の細胞配列用基材に用いられる基材としては、その表面に細胞接着性変化パターンを形成することが可能な材料で形成されたものであれば特に限定されるものではない。具体的には、金属、ガラス、およびシリコン等の無機材料、プラスチックで代表される有機材料を挙げることができる。その形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の形状が挙げられる。
【００３７】
細胞接着性変化材料、細胞接着性変化層については、光触媒を用いる実施態様において説明する。
【００３８】
また、細胞接着性変化パターンには、細胞接着性の少ない細胞接着阻害材料を含む細胞接着阻害層とその上に形成された細胞接着性を有する細胞接着材料を含む細胞接着層から形成され、エネルギーの照射に伴い細胞接着層が分解されて消失することにより細胞接着阻害層が露出して、細胞接着性の異なる領域が形成される場合も含まれる。同様に、細胞接着層とその上に形成される細胞接着阻害層から形成され、エネルギー照射に伴い細胞接着阻害層が分解されて消失することにより細胞接着層が露出して、細胞接着性の異なる領域が形成される場合も含まれる。
【００３９】
細胞接着材料としては、各種タイプのコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、カドヘリンなどの細胞外基質、ＲＧＤペプチド、他に細胞接着性付与の為にプラズマ処理、コロナ処理、イオンビーム照射処理、電子線照射処理等の手法によりカルボニル基やカルボキシル基を導入したポリオレフィン樹脂が挙げられ、細胞接着阻害材料としては、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）等のフッ素系材料、ポリイミド、リン脂質等が挙げられる。また、インクジェット法などの方法を用いることにより、細胞接着阻害層の上に細胞接着材料をパターン状に付着形成する場合、および細胞接着層の上に細胞接着阻害材料をパターン状に付着形成する場合も含まれる。あるいは付加的に、基材上にエネルギーの照射に伴い細胞接着材料に対する親和性が変化する親和性変化材料を含有する層を形成し、エネルギーを照射することによって細胞接着材料に対する親和性を有する領域と有しない領域からなるパターンを形成し、ここに細胞接着材料を含む溶液を導入した後洗浄することにより、細胞接着材料が存在する領域（細胞接着性良好領域）と細胞接着材料が存在しない領域（細胞接着性阻害領域）を有する細胞接着性変化パターンを形成することもできる。このような態様においては、基材上で直接パターン形成できない細胞接着材料によってパターンを形成することができる。例えば、図８に示すように、ガラス等の親水性を有する基材（１）に、撥水性材料を含む層を有する領域（２０）と有しない領域からなるパターンを形成する。ここに撥水性材料に吸着しにくい親水性の細胞接着材料（２１）を導入し、その後洗浄する。これにより親水性の細胞接着材料が存在する領域（細胞接着性良好領域）と撥水性材料が存在する領域（細胞接着性阻害領域）がパターン状に形成される。この場合の親水性の細胞接着材料としては、コラーゲン等の細胞外基質を用いることができる。
【００４０】
本発明においては、細胞配列用基材上にパターン状に配列された細胞を基底膜層に転写することから、上記の細胞接着性良好領域の細胞接着力は適度な強度であることが好ましい。適度な接着強度とすることによって、細胞を特定の領域のみに接着して細胞パターンを形成できるが、これを基底膜層に容易に転写することが可能になるからである。従って、細胞配列用基材における細胞接着性良好領域の細胞接着力は、細胞接着性阻害領域の細胞接着力よりも強いが、基底膜層の細胞接着力よりも弱いものであることが好ましい。
【００４１】
このような細胞接着力は、表面の水接触角によって評価することができる。本発明における細胞接着性変化パターンの細胞接着性良好領域における水接触角は、１０〜４０°であることが好ましい。水接触角をこのような範囲とすることにより、細胞を細胞配列用基材に接着させ、更に基底膜層に転写する場合、細胞を細胞配列用基材に単層状に接着できるとともに、細胞配列用基材への接着が弱いことから基底膜層にも容易に転写することができる。接触角とは、静止液体の自由表面が個体壁に接する場所で液面と固体面とのなす角（液の内部にある角をとる）を意味する。
【００４２】
上記の水接触角とは、通常大気圧下で材料表面にシリンジ等の器具を用いて微小な水滴を滴下し、水滴端部の気液界面と固体面との成す角度を拡大鏡などで観察する、静止接触角測定法で測定した値を意味する。
【００４３】
上記のような細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン状に配置された細胞接着性変化パターンを形成する手段としては、特に制限されないが、例えば、グラビア印刷法、スクリーン印刷法、オフセット印刷法、フレキソ印刷法およびコンタクトプリンティング法などの各種印刷法による方法、各種リソグラフィー法を用いる方法、並びにインクジェット法による方法、他に微細な溝を彫刻等する立体整形の手法などが挙げられる。本発明においては、光触媒を用いたリソグラフィー法、すなわち、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料および光触媒を用い、必要とされるパターンに沿ってエネルギーを照射することによって細胞接着性変化パターンを形成する方法が好ましい。このような態様においては、高精細なパターンを細胞に対して悪影響を及ぼすような処理液を用いることなく、簡便な工程により形成することができる。また、細胞接着性変化材料の変性の必要性がないことから、材料選択の幅を広げることが可能であり、後述するような特異的な接着性を発現するような生物学的細胞接着性変化材料をも問題なく用いることができる。
【００４４】
形成させるパターンは、二次元のパターンであれば特に制限されず、組織体における血管層内に形成させる血管形成細胞のパターンに合わせて設計する。従って、ライン状または網目状のパターンで細胞が接着するようなパターンを形成することが好ましい。ライン状または網目状のパターンを形成する場合、パターンにおける線幅は、通常２０〜２００μｍ、好ましくは５０〜１００μｍである。特に、血管内皮細胞をライン状に配置して培養することにより毛細血管を形成する場合は、ライン状の細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域のスペースが交互に配置された細胞接着性変化パターンを形成し、血管内皮細胞をライン状に接着させることが好ましい。このような態様においては、細胞が１〜１０個、好ましくは１〜５個収まる程度のライン幅で細胞が接着されるようなパターンを形成するのが好ましい。具体的には、細胞接着性良好領域のライン幅は、通常２０〜２００μｍ、好ましくは５０〜８０μｍであり、ラインとラインの間にあたる細胞接着性阻害領域のスペース幅は通常１００〜１０００μｍ、好ましくは４００〜８００μｍである。ライン幅を上記の数値範囲とすることにより、血管内皮細胞が効率的に管組織化することができる。
【００４５】
このような細胞接着性変化パターンを形成することにより、ライン状に接着され転写された血管内皮細胞は、組織化してライン状の毛細血管を効率的に形成する。複数のラインが交わることなく並ぶような細胞パターンを形成したい場合は、細胞が接着したラインとラインの間のスペース幅を上記のように一定の値以上とすることにより、細胞が組織化する際にラインとライン間で細胞から擬足が伸びてラインにゆがみが生じるのを防ぐことができる。
【００４６】
上記の光触媒を用いたリソグラフィー法によって作成される細胞配列用基材として、例えば以下の３つの実施態様が挙げられる。これらについて、それぞれ説明する。
【００４７】
Ａ．第１実施態様
本発明の細胞配列用基材の第１実施態様は、基材上に形成され、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を有する細胞接着性変化層を基板上に有し、上記細胞接着性変化層には、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンが形成されている細胞配列用基材であって、上記細胞接着性変化層が、光触媒と上記細胞接着性変化材料とを有する光触媒含有細胞接着性変化層である点に特徴を有するものである。
【００４８】
本実施態様においては、このように細胞接着性変化層が、光触媒と上記細胞接着性変化材料とを有する光触媒含有細胞接着性変化層であるので、エネルギーが照射された際に、光触媒含有細胞接着性変化層内の光触媒の作用により細胞接着性変化材料の細胞接着性が変化し、エネルギーが照射された部分と照射されない部分とで細胞との接着性が異なる細胞接着性変化パターンを形成することができる。
【００４９】
このような本実施態様の細胞配列用基材を、用いられる部材に分けてそれぞれ説明する。
【００５０】
１．光触媒含有細胞接着性変化層
本実施態様は、基材上に光触媒含有細胞接着性変化層が形成されている点に特徴を有する。この光触媒含有細胞接着性変化層は、少なくとも光触媒と細胞接着性変化材料とを有するものである。
【００５１】
（１）細胞接着性変化材料
本実施態様に用いられる細胞接着性変化材料は、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する材料であれば特に限定されるものではない。細胞の接着性が変化するとは、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞接着性を獲得または増加する材料および細胞接着性が減少又消失する材料の双方が含まれる。
【００５２】
このような細胞接着性変化材料には、細胞との接着性を制御する態様により、物理化学的特性により細胞と接着する物理化学的細胞接着性変化材料と生物学的特性により細胞と接着する生物学的細胞接着性変化材料との主に二つの態様がある。
【００５３】
ａ．物理化学的細胞接着性変化材料
細胞をその表面に接着させるための物理化学的な因子としては、表面自由エネルギーに関する因子と、疎水性相互作用等による因子等が挙げられる。
【００５４】
このような因子により物理化学的細胞接着性を有する物理化学的細胞接着材料としては、主骨格が光触媒の作用により分解されないような高い結合エネルギーを有するものであって、光触媒の作用により分解されるような有機置換基を有するものが好ましく、例えば、（１）ゾルゲル反応等によりクロロまたはアルコキシシラン等を加水分解、重縮合して大きな強度を発揮するオルガノポリシロキサン、（２）反応性シリコーンを架橋したオルガノポリシロキサン等を挙げることができる。
【００５５】
上記の（１）の場合、一般式：
ＹｎＳｉＸ（４−ｎ）
（ここで、Ｙはアルキル基、フルオロアルキル基、ビニル基、アミノ基、フェニル基またはエポキシ基を示し、Ｘはアルコキシル基、アセチル基またはハロゲンを示す。ｎは０〜３までの整数である。）で示されるケイ素化合物の１種または２種以上の加水分解縮合物若しくは共加水分解縮合物であるオルガノポリシロキサンであることが好ましい。なお、ここでＹで示される基の炭素数は１〜２０の範囲内であることが好ましく、また、Ｘで示されるアルコキシ基は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基であることが好ましい。
【００５６】
また、有機基として、特にフルオロアルキル基を含有するポリシロキサンを好ましく用いることができ、具体的には、下記のフルオロアルキルシランの１種または２種以上の加水分解縮合物、共加水分解縮合物が挙げられ、一般にフッ素系シランカップリング剤として知られたものを使用することができる。
ＣＦ３（ＣＦ２）３ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）５ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）７ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）９ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）４ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）６ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）８ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）３（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）５（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）７（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）３ＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）５ＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）７ＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）９ＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）４ＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）６ＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）８ＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）３（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）５（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）７（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）３ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）５ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）７ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）９ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）７ＳＯ２Ｎ（Ｃ２Ｈ５）Ｃ２Ｈ４ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３
【００５７】
上記のようなフルオロアルキル基を含有するポリシロキサンを物理化学的細胞接着材料として用いることにより、光触媒含有細胞接着性変化層のエネルギー未照射部においては、表面にフッ素を有する部分が存在するため細胞接着性を有しない面となるが、エネルギー照射された部分においては、フッ素等が除去されて、表面にＯＨ基等を有する部分が存在するため細胞接着性を有する面となる。従って、エネルギー照射部とエネルギー未照射部とにおいて、細胞の接着性の異なる領域をパターン状に形成することができる。
【００５８】
また、上記の（２）の反応性シリコーンとしては、下記一般式で表される骨格をもつ化合物を挙げることができる。
【００５９】
【化１】
2005342112.tif 000003
【００６０】
ただし、ｎは２以上の整数であり、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ炭素数１〜１０の置換若しくは非置換のアルキル、アルケニル、アリール基であり、置換基としては、ハロゲン、シアノ、等が挙げられる。Ｒ１、Ｒ２の具体例としては、メチル、エチル、プロピル、ビニル、フェニル、ハロゲン化フェニル、シアノメチル、シアノエチル、シアノプロピル等が挙げられる。ビニル、フェニル、ハロゲン化フェニルは、モル比で全体の４０％以下であることが好ましい。また、Ｒ１、Ｒ２がメチル基のものが表面エネルギーが最も小さくなるので好ましく、モル比でメチル基が６０％以上であることが好ましい。また、鎖末端若しくは側鎖には、分子鎖中に少なくとも１個以上の水酸基等の反応性基を有する。
【００６１】
また、上記のオルガノポリシロキサンとともに、ジメチルポリシロキサンのような架橋反応をしない安定なオルガノシリコン化合物を別途混合してもよい。
【００６２】
一方、分解物質タイプの物理化学的細胞接着材料としては光触媒の作用により分解し、かつ分解されることにより光触媒含有極性変化層表面の極性を変化させる機能を有する界面活性剤を挙げることができる。具体的には、日光ケミカルズ（株）製ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ、ＢＣ、ＢＯ、ＢＢの各シリーズ等の炭化水素系、デュポン社製ＺＯＮＹＬ  ＦＳＮ、ＦＳＯ、旭硝子（株）製サーフロンＳ−１４１、１４５、大日本インキ化学工業（株）製メガファックＦ−１４１、１４４、ネオス（株）製フタージェントＦ−２００、Ｆ２５１、ダイキン工業（株）製ユニダインＤＳ−４０１、４０２、スリーエム（株）製フロラードＦＣ−１７０、１７６等のフッ素系あるいはシリコーン系の非イオン界面活性剤を挙げることができ、また、カチオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、両性界面活性剤を用いることもできる。
【００６３】
なお、このように物理化学的細胞接着材料を分解物質タイプとして用いた場合には、通常別途バインダ成分を用いることが好ましい。この際用いられるバインダ成分としては、主骨格が上記光触媒の作用により分解されないような高い結合エネルギーを有するものであれば特に限定されるものではない。具体的には、有機置換基を有しない、若しくは多少有機置換基を有するポリシロキサンを挙げることができ、これらはテトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン等を加水分解、重縮合することにより得ることができる。
【００６４】
なお、本実施態様においては、このようなバインダタイプの物理化学的細胞接着材料と分解物質タイプの物理化学的細胞接着材料とを併用するようにしてもよい。
【００６５】
また、静電的相互作用の制御により、細胞との接着性を変化させる物理化学的細胞接着性変化材料もある。このような材料の場合、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、材料が含有する、正電荷を有する官能基が分解された結果、表面に存在する正電荷量が変化し、これにより細胞との接着性を変化させ、細胞接着性変化パターンを形成するものである。例えば、このような材料としてポリＬリシン等が挙げられる。
【００６６】
ｂ．生物学的細胞接着性変化材料
細胞をその表面に接着させる為の生物学的な因子としては、多くの細胞種に対して被接着性を有することができる材料、特定の細胞種にのみ被接着性を有する材料がある。前者は例えばコラーゲンＩ型であり、後者は例えば肝実質細胞を選択的に接着するポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-ガラクトピラノシル-（１→４）-Ｄ-グルコンアミド］）(以下、ＰＶＬＡ)等がある。ＰＶＬＡの場合、肝実質細胞が特異認識をするガラクトース基を構造中に有する事により、材料−細胞間の選択的かつ特異的な接着が行われるものと推測される。
【００６７】
このような材料と光触媒を混合し、光触媒含有細胞接着性変化層として用いる場合は以下の使用形態が考えられる。コラーゲンＩ型を酵素処理により可溶化した可溶化コラーゲンＩと予め焼成処理、粉砕処理をしたＴｉＯ２粒子等の光触媒を混合し、光触媒含有細胞接着性変化層用材料とする。次に、基材上に光触媒含有細胞接着性変化層用材料を塗布して光触媒含有細胞接着性変化層を形成する。この光触媒含有細胞接着性変化層に、少量のエネルギーを照射した場合には、コラーゲンの側鎖にある細胞接着性ペプチド構造の一部が破壊され、細胞接着性を減少させることができる。また、エネルギー照射量を増やす事により細胞接着性ペプチド構造を徐々に失わせることができ、細胞接着性を更に減少させることができる。
【００６８】
またさらに、過大なエネルギー照射を行う事によりコラーゲンの主鎖構造を破壊することができ、その細胞接着性を完全に失わせることができる。
【００６９】
（２）光触媒
本実施態様に用いられる光触媒としては、光半導体として知られる例えば二酸化チタン（ＴｉＯ２）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化スズ（ＳｎＯ２）、チタン酸ストロンチウム（ＳｒＴｉＯ３）、酸化タングステン（ＷＯ３）、酸化ビスマス（Ｂｉ２Ｏ３）、および酸化鉄（Ｆｅ２Ｏ３）を挙げることができ、これらから選択して１種または２種以上を混合して用いることができる。
【００７０】
本実施態様においては、特に二酸化チタンが、バンドギャップエネルギーが高く、化学的に安定で毒性もなく、入手も容易であることから好適に使用される。二酸化チタンには、アナターゼ型とルチル型があり本態様ではいずれも使用することができるが、アナターゼ型の二酸化チタンが好ましい。アナターゼ型二酸化チタンは励起波長が３８０ｎｍ以下にある。
【００７１】
このようなアナターゼ型二酸化チタンとしては、例えば、塩酸解膠型のアナターゼ型チタニアゾル（石原産業（株）製ＳＴＳ−０２（平均粒径７ｎｍ）、石原産業（株）製ＳＴ−Ｋ０１）、硝酸解膠型のアナターゼ型チタニアゾル（日産化学（株）製ＴＡ−１５（平均粒径１２ｎｍ））等を挙げることができる。
【００７２】
光触媒の粒径は小さいほど光触媒反応が効果的に起こるので好ましく、平均粒径が５０ｎｍ以下であることが好ましく、２０ｎｍ以下の光触媒を使用するのが特に好ましい。
【００７３】
本実施態様に用いられる光触媒含有細胞接着性変化層中の光触媒の含有量は、５〜６０重量％、好ましくは２０〜４０重量％の範囲で設定することができる。
【００７４】
２．基材
本発明の細胞配列用基材に用いられる基材としては、表面に光触媒含有細胞接着性変化層を形成することが可能な材料で形成されたものであれば特に限定されるものではなく、露光処理による表面処理が可能であればその形態は問わない。具体的には、金属、ガラス、およびシリコン等の無機材料、プラスチックで代表される有機材料を挙げることができる。その形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の形状が挙げられる。
【００７５】
３．細胞接着性変化パターン
本実施態様においては、上記基材上に上述した光触媒含有細胞接着性変化層を形成し、さらにエネルギーをパターン状に照射することにより、細胞との接着性が変化したパターンである細胞接着性変化パターンが形成されている。
【００７６】
このような細胞接着性変化パターンは、通常は細胞接着性の良好な細胞接着性良好領域と細胞接着性の悪い細胞接着性阻害領域とから形成される。そして、この細胞接着性良好領域に細胞が接着されることにより、高精細なパターン状に細胞を接着させることができる。このような細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域とは、用いる細胞接着性変化材料の種類に応じて決定されるものである。
【００７７】
例えば、細胞接着性変化材料が表面自由エネルギーを変化させて細胞の接着性を変化させる物理化学的細胞接着性変化材料である場合、細胞の接着性は所定の範囲内の表面自由エネルギーであると良好であり、その範囲を外れると細胞との接着性が低下する傾向にある。このような表面自由エネルギーによる細胞の接着性の変化としては例えば、ＣＭＣ出版バイオマテリアルの最先端  筏  義人(監修) p.109下部に示されるような実験結果が知られている。
【００７８】
また、上記材料の表面自由エネルギーだけでなく、どのような細胞種をどのような材料種に接触させるか等によっても、細胞の接着性を決定することができる。
【００７９】
ここで、この細胞接着性変化パターンは、上述したような細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域を含むパターンであるが、用途によっては細胞接着性変化パターンが、表面の細胞接着性が少なくとも３水準以上異なる領域を有する細胞接着性変化パターンである場合も含まれる。
【００８０】
例えば、生物学的細胞接着性変化材料を用いた光触媒含有細胞接着性変化層を用いている場合であって、細胞の接着性の良好な状態が未確定である場合等においては、連続的に光触媒含有細胞接着性変化層の表面状態を変化させることにより、接着性に最適な状態を見出すことができる等の利点を有する場合があるからである。
【００８１】
このように、本発明においては、３水準以上とは連続的に細胞の接着性が変化した状態を含むものであり、どの程度の水準とするかは、状況に応じて適宜選択されて決定される。
【００８２】
このような多水準の接着性の異なる領域を形成する場合は、光触媒含有細胞接着性変化層に対するエネルギーの照射量を変化させることにより行うことができる。具体的には、透過率の異なるハーフトーンのフォトマスクを用いる、遮光部のパターンが異なる複数のフォトマスクを用い、複数回の重ね露光を行う等の方法を挙げることができる。
【００８３】
さらに、本実施態様においては、エネルギーの照射された部分と未照射の部分との光触媒活性の差を利用した、細胞接着性変化パターンを用いることができる。すなわち、例えば分解物質として光触媒含有細胞接着性変化層内に導入された生物学的細胞接着性変化材料を用いた場合、光触媒含有細胞接着性変化層表面にエネルギーをパターン状に照射すると、照射部分の表面に滲出した生物学的細胞接着性変化材料は分解され、未照射の部分の生物学的細胞接着性変化材料は残存する。したがって、この生物学的細胞接着性変化材料が特定の細胞と接着性が良好な材料、若しくは多くの細胞と接着性が良好な細胞である場合、未照射部分が細胞接着性良好領域となるが、エネルギーが照射された部分は、細胞との接着性が良好な生物学的細胞接着性変化材料が存在しないばかりでなく、エネルギー照
射により活性化された滅菌性を有する光触媒が露出した領域となる。したがって、エネルギー照射部分が細胞接着性阻害領域となる場合は、特に本実施態様の細胞配列用基材を用いて所定の期間培養した場合、パターンが太くなる等の不具合が生じることが無いという利点を有するものである。
【００８４】
Ｂ．第２実施態様
本発明の細胞配列用基材の第２実施態様は、基材と、上記基材上に形成され、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を有する細胞接着性変化層とを有し、上記細胞接着性変化層には、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンが形成されている細胞配列用基材であって、上記細胞接着性変化層が、光触媒を有する光触媒処理層と、上記光触媒処理層上に形成され、上記細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有することを特徴とするものである。
【００８５】
本実施態様においては、このように細胞接着性変化層が、基材上に形成された光触媒処理層と、この光触媒処理層上に形成された細胞接着性変化材料層とを有するものであるので、エネルギーが照射された際に、光触媒処理層内の光触媒の作用により細胞接着性変化材料層内の細胞接着性変化材料の細胞接着性が変化し、エネルギーが照射された部分と照射されない部分とで細胞との接着性が異なる細胞接着性変化パターンを形成することができる。
【００８６】
このような本実施態様の細胞配列用基材を、用いられる部材に分けてそれぞれ説明する。
【００８７】
１．細胞接着性変化材料層
本実施態様の細胞配列用基材は、基材上に形成された光触媒処理層上に細胞接着性変化材料層が形成される。この細胞接着性変化材料層は、上記第１実施態様で説明した細胞接着性変化材料を用いることにより形成される層を用いることができる。以下、物理化学的細胞接着性変化材料を用いた細胞接着性変化材料層と生物学的細胞接着性変化材料を用いた細胞接着性変化材料層とに分けて説明する。
【００８８】
（１）物理化学的細胞接着性変化材料を用いた場合
本実施態様において、物理化学的細胞接着性変化材料により形成される細胞接着性変化材料層は、上記第１実施態様で説明した材料と同様の材料を用いた層とすることができる。このような材料を用いた場合は、光触媒の有無を除き上述したものと同様である。なお、本実施態様においては、原則的には細胞接着性変化材料層内に光触媒を含有する必要性は無いが、感度等の関係で少量含有されたものであってもよい。
【００８９】
また、本実施態様においては、光触媒処理層上に光触媒の作用により分解除去される分解除去層として細胞接着性変化材料層を形成し、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により細胞接着性変化材料層が分解された領域、すなわち光触媒処理層が露出した領域と、細胞接着性変化材料層が残存する領域とを形成し、これにより細胞接着性変化パターンとするようなタイプの細胞接着性変化材料層を用いることができる。
【００９０】
具体的には、表面自由エネルギーにより細胞の接着性を制御する場合は、表面自由エネルギーが細胞接着性に適当である物理化学的細胞接着性変化材料を用い、この材料を全面に塗布して細胞接着性変化材料層を形成し、その後エネルギーをパターン照射して細胞接着性変化材料層の有無のパターンを形成し、これにより細胞接着性変化パターンとするものである。
【００９１】
このような分解除去層としての物理化学的細胞接着性変化材料層であって、表面自由エネルギーにより細胞の接着性を制御する場合に用いることができる材料としては、例えば、再生セルロース、ナイロン１１等が挙げられる。
【００９２】
また、静電的相互作用により細胞の接着性を制御する場合は、正電荷を有する物理化学的細胞接着性変化材料を用い、上記と同様の方法により細胞接着性変化パターンとすることができる。
【００９３】
このような分解除去層としての物理化学的細胞接着性変化材料層であって、静電的相互作用により細胞の接着性を制御する場合に用いることができる材料としては、ポリアミングラフトポリ（２−ヒドロキシメチルメタクリレート）（ＨＡ−ｘ）等を挙げることができる。
【００９４】
これらの樹脂は、溶媒に溶解させ、例としてスピンコート法等の一般的な成膜方法により形成することが可能である。また、本発明においては、機能性薄膜、すなわち、自己組織化単分子膜、ラングミュア−ブロケット膜、および交互吸着膜等を用いることにより、欠陥のない膜を形成することが可能であることから、このような成膜方法を用いることがより好ましいといえる。
【００９５】
このような分解除去層としての細胞接着性変化材料層を用いて細胞接着性変化パターンを形成した場合は、分解除去された領域は後述する光触媒処理層が露出していることから、細胞の培養が大きく阻害される領域となる。したがって、このような方法により得られる細胞配列用基材は、長期間細胞を保持しても高精細なパターンを維持することができるといった利点を有するものである。
【００９６】
（２）生物学的細胞接着性変化材料を用いた場合
本実施態様において、生物学的細胞接着性変化材料により形成される細胞接着性変化材料層は、第１実施態様で説明したものと同様のものを使用することができ、例えばコラーゲンＩ型等を挙げることができる。
【００９７】
２．光触媒処理層
次に、本発明に用いられる光触媒処理層について説明する。本発明に用いられる光触媒処理層は、光触媒処理層中の光触媒がその上に形成された細胞接着性変化材料層の細胞接着特性を変化させるような構成であれば、特に限定されるものではなく、光触媒とバインダとから構成されているものであってもよいし、光触媒単体で製膜されたものであってもよい。また、その表面の特性は特に親液性であっても撥液性であってもよいが、この光触媒処理層上に、細胞接着性変化材料層等を形成する都合上、親液性であることが好ましい。
【００９８】
この光触媒処理層における、後述するような酸化チタンに代表される光触媒の作用機構は、必ずしも明確なものではないが、光の照射によって生成したキャリアが、近傍の化合物との直接反応、あるいは、酸素、水の存在下で生じた活性酸素種によって、有機物の化学構造に変化を及ぼすものと考えられている。本発明においては、このキャリアが光触媒処理層上に形成された細胞接着性変化材料層中の化合物に作用を及ぼすものであると思われる。このような光触媒としては、第１実施態様で詳述したものと同様である。
【００９９】
本実施態様における光触媒処理層は、上述したように光触媒単独で形成されたものであってもよく、またバインダと混合して形成されたものであってもよい。
【０１００】
光触媒のみからなる光触媒処理層の場合は、細胞接着性変化材料層の細胞接着特性の変化に対する効率が向上し、処理時間の短縮化等のコスト面で有利である。一方、光触媒とバインダとからなる光触媒処理層の場合は、光触媒処理層の形成が容易であるという利点を有する。
【０１０１】
光触媒のみからなる光触媒処理層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、ＣＶＤ法、真空蒸着法等の真空製膜法を用いる方法を挙げることができる。真空製膜法により光触媒処理層を形成することにより、均一な膜でかつ光触媒のみを含有する光触媒処理層とすることが可能であり、これにより細胞接着性変化材料層の特性を均一に変化させることが可能であり、かつ光触媒のみからなることから、バインダを用いる場合と比較して効率的に細胞接着性変化層の細胞接着性を変化させることが可能となる。
【０１０２】
また、光触媒のみからなる光触媒処理層の形成方法の他の例としては、例えば光触媒が二酸化チタンの場合は、基材上に無定形チタニアを形成し、次いで焼成により結晶性チタニアに相変化させる方法等が挙げられる。ここで用いられる無定形チタニアとしては、例えば四塩化チタン、硫酸チタン等のチタンの無機塩の加水分解、脱水縮合、テトラエトキシチタン、テトライソプロポキシチタン、テトラ−ｎ−プロポキシチタン、テトラブトキシチタン、テトラメトキシチタン等の有機チタン化合物を酸存在下において加水分解、脱水縮合によって得ることができる。次いで、４００℃〜５００℃における焼成によってアナターゼ型チタニアに変性し、６００℃〜７００℃の焼成によってルチル型チタニアに変性することができる。
【０１０３】
また、バインダを用いる場合は、バインダの主骨格が上記の光触媒の作用により分解されないような高い結合エネルギーを有するものが好ましく、例えばこのようなバインダとしては、上述したオルガノポリシロキサン等を挙げることができる。
【０１０４】
このようにオルガノポリシロキサンをバインダとして用いた場合は、上記光触媒処理層は、光触媒とバインダであるオルガノポリシロキサンとを必要に応じて他の添加剤とともに溶剤中に分散して塗布液を調製し、この塗布液を透明基材上に塗布することにより形成することができる。使用する溶剤としては、エタノール、イソプロパノール等のアルコール系の有機溶剤が好ましい。塗布はスピンコート、スプレーコート、ディップコート、ロールコート、ビードコート等の公知の塗布方法により行うことができる。バインダとして紫外線硬化型の成分を含有している場合、紫外線を照射して硬化処理を行うことにより光触媒処理層を形成することかできる。
【０１０５】
また、バインダとして無定形シリカ前駆体を用いることができる。この無定形シリカ前駆体は、一般式ＳｉＸ４で表され、Ｘはハロゲン、メトキシ基、エトキシ基、またはアセチル基等であるケイ素化合物、それらの加水分解物であるシラノール、または平均分子量３０００以下のポリシロキサンが好ましい。
【０１０６】
具体的には、テトラエトキシシラン、テトライソプロポキシシラン、テトラ−ｎ−プロポキシシラン、テトラブトキシシラン、テトラメトキシシラン等が挙げられる。また、この場合には、無定形シリカの前駆体と光触媒の粒子とを非水性溶媒中に均一に分散させ、透明基材上に空気中の水分により加水分解させてシラノールを形成させた後、常温で脱水縮重合することにより光触媒処理層を形成できる。シラノールの脱水縮重合を１００℃以上で行えば、シラノールの重合度が増し、膜表面の強度を向上できる。また、これらの結着剤は、単独あるいは２種以上を混合して用いることができる。
【０１０７】
バインダを用いた場合の光触媒処理層中の光触媒の含有量は、５〜６０重量％、好ましくは２０〜４０重量％の範囲で設定することができる。また、光触媒処理層の厚みは、０．０５〜１０μｍの範囲内が好ましい。
【０１０８】
また、光触媒処理層には上記の光触媒、バインダの他に、界面活性剤を含有させることができる。具体的には、日光ケミカルズ（株）製ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ、ＢＣ、ＢＯ、ＢＢの各シリーズ等の炭化水素系、デュポン社製ＺＯＮＹＬ  ＦＳＮ、ＦＳＯ、旭硝子（株）製サーフロンＳ−１４１、１４５、大日本インキ化学工業（株）製メガファックＦ−１４１、１４４、ネオス（株）製フタージェントＦ−２００、Ｆ２５１、ダイキン工業（株）製ユニダインＤＳ−４０１、４０２、スリーエム（株）製フロラードＦＣ−１７０、１７６等のフッ素系あるいはシリコーン系の非イオン界面活性剤を挙げることかでき、また、カチオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、両性界面活性剤を用いることもできる。
【０１０９】
さらに、光触媒処理層には上記の界面活性剤の他にも、ポリビニルアルコール、不飽和ポリエステル、アクリル樹脂、ポリエチレン、ジアリルフタレート、エチレンプロピレンジエンモノマー、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ポリウレタン、メラミン樹脂、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリイミド、スチレンブタジエンゴム、クロロプレンゴム、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリエステル、ポリブタジエン、ポリベンズイミダゾール、ポリアクリルニトリル、エピクロルヒドリン、ポリサルファイド、ポリイソプレン等のオリゴマー、ポリマー等を含有させることができる。
【０１１０】
３．基材
本実施態様に用いられる基材は、上記光触媒処理層を形成可能であれば、特に限定されるものではなく、第１実施態様で説明したものと同様のものを用いることが可能である。
【０１１１】
４．細胞接着性変化パターン
本実施態様においては、上述した細胞接着性変化材料層に、パターン状にエネルギーを照射することにより、光触媒処理層中の光触媒の作用によって、細胞接着性変化材料層表面の細胞との接着性が変化したパターンである細胞接着性変化パターンが形成されている。
【０１１２】
Ｃ．第３実施態様
本実施態様の細胞配列用基材は、基材と、上記基材上に形成され、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を有する細胞接着性変化層とを有し、上記細胞接着性変化層には、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンが形成されている細胞配列用基材であって、上記細胞接着性変化層が、上記細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層であり、上記接着性変化パターンが、光触媒を含有する光触媒含有層と上記細胞接着性変化材料層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギーを照射することにより形成されたものであることを特徴とするものである。
【０１１３】
本実施態様においては、このように細胞接着性変化層が、細胞接着性変化材料層であり、上記接着性変化パターンが、光触媒を含有する光触媒含有層と上記細胞接着性変化材料層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギーを照射することにより形成されたものであるので、エネルギーが照射された際に、光触媒含有層内の光触媒の作用により細胞接着性変化材料層内の細胞接着性変化材料の細胞接着性が変化し、エネルギーが照射された部分と照射されない部分とで細胞との接着性が異なる細胞接着性変化パターンを形成することができる。
【０１１４】
このような本実施態様の細胞配列用基材を、用いられる部材に分けてそれぞれ説明する。
【０１１５】
１．細胞接着性変化材料層
本実施態様の細胞配列用基材は、基材上に細胞接着性変化材料層が形成される。この細胞接着性変化材料層は、上記第２実施態様で説明した材料を用いることにより形成される層と同様である。なお、本実施態様においては、原則的には細胞接着性変化材料層内に光触媒を含有する必要性は無いが、感度等の関係で少量含有されたものであってもよい。
【０１１６】
また、本実施態様においては、上述した第２実施態様と同様に、基材上に光触媒の作用により分解除去される分解除去層として細胞接着性変化材料層を形成してもよい。この場合、細胞接着性変化材料層は、光触媒含有層側基板を用いてエネルギー照射することにより、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により細胞接着性変化材料層が分解された領域、すなわち基材が露出した領域と、細胞接着性変化材料層が残存する領域とを形成し、これにより細胞接着性変化パターンとするようなタイプのものが用いられる。
【０１１７】
２．基材
本実施態様に用いられる基材は、上述した細胞接着性変化材料層が形成可能なものであれば、特に限定されるものではなく、第１実施態様で説明したものと同様のものを用いることが可能である。
【０１１８】
３．光触媒含有層
次に、本実施態様に用いられる光触媒含有層について説明する。本実施態様に用いられる光触媒含有層は、光触媒を含有する層であり、通常はガラス等の基体上に形成されて用いられる。本実施態様においては、このような光触媒含有層を、上述した細胞接着性変化材料層と対向させて配置し、エネルギー照射を行うことにより、光触媒含有層中に含有される光触媒の作用により、細胞接着性変化材料層の細胞接着性を変化させることができるのである。本実施態様においては、この光触媒含有層を、エネルギー照射の際に所定の位置に配置し、細胞接着性変化パターンを形成することが可能であることから、上記細胞接着性変化材料層中に光触媒を含有させる必要がなく、細胞接着性変化材料層が、経時的に光触媒の作用を受けることのないものとすることができる、という利点を有する。
【０１１９】
このような光触媒含有層としては、上記第２実施態様で光触媒処理層について説明した層と同様である。
【０１２０】
４．細胞接着性変化パターン
本実施態様においては、上述した細胞接着性変化材料層に、上記光触媒含有層を用いて、パターン状にエネルギーを照射することにより、光触媒含有層中の光触媒の作用によって、細胞接着性変化材料層表面の細胞との接着性が変化したパターンである細胞接着性変化パターンが形成されている。
【０１２１】
II．細胞配列用基材の製造方法
次に、本発明の細胞配列用基材の製造方法について説明する。本発明の細胞配列用基材の製造方法には、例えば、上記のような３つの実施態様があるが、いずれの実施態様においても、基材と、その基材上に形成され、かつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する層とを有するパターン形成体用基材を形成し、このパターン形成体用基材にエネルギーを照射することにより、光触媒を作用させて、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成することを特徴とするものである。
【０１２２】
本発明の細胞配列用基材の製造方法によれば、上記エネルギー照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する層を形成することから、この層に必要とされるパターン上にエネルギーを照射することにより、容易に高精細なパターン状に細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンが形成された細胞配列用基材を製造することが可能となる。したがって、高精細なパターンを細胞に対して悪影響を及ぼすような処理液を用いることなく、簡便な工程により細胞配列用基材を製造することができる。また、細胞接着性変化材料の変性の必要性がないことから、材料選択の幅を広げることが可能であり、後述するような特異的な接着性を発現するような生物学的細胞接着性変化材料をも問題なく用いることができるのである。
【０１２３】
以下、本発明の細胞配列用基材の製造方法を上記の１〜３の実施態様ごとに説明する。
【０１２４】
Ａ．第１実施態様
まず、本発明の細胞配列用基材の第１実施態様について説明する。本発明の細胞配列用基材の製造方法の第１実施態様は、基材と、上記基材上に形成され、かつ光触媒およびエネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する光触媒含有細胞接着性変化層とを有するパターン形成体用基材を形成するパターン形成体用基材形成工程と、上記光触媒含有細胞接着性変化層にエネルギーを照射し、上記光触媒含有細胞接着性変化層の、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成する細胞接着性変化パターン形成工程とを有するものである。
【０１２５】
本実施態様の細胞配列用基材の製造方法は、例えば図１に示すように、まず、基材１と、その基材１上に形成された光触媒含有細胞接着性変化層２とを有するパターン形成体用基材３を形成する（パターン形成体用基材形成工程（図１（ａ））。次に、上記光触媒含有細胞接着性変化層２に、例えばフォトマスク４を用いてエネルギー５を照射し（図１（ｂ））、光触媒含有細胞接着性変化層２の細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターン６を形成する（図１（ｃ））細胞接着性変化パターン形成工程を行うものである。
【０１２６】
本実施態様においては、光触媒と上記細胞接着性変化材料とを有する光触媒含有細胞接着性変化層を形成することから、細胞接着性変化パターン形成工程において、エネルギーを照射することにより、光触媒含有細胞接着性変化層内の光触媒の作用により細胞接着性変化材料の細胞接着性が変化し、エネルギーが照射された部分と照射されない部分とで細胞との接着性が異なる細胞接着性変化パターンを形成することができるのである。以下、本実施態様の各工程について説明する。
【０１２７】
１．パターン形成体用基材形成工程
まず、本実施態様におけるパターン形成体用基材形成工程について説明する。本実施態様におけるパターン形成体用基材形成工程は、基材と、上記基材上に形成され、かつ光触媒およびエネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する光触媒含有細胞接着性変化層とを有するパターン形成体用基材を形成する工程である。
【０１２８】
本工程は、基材上に、光触媒および細胞接着性変化材料を含有する塗工液を、例えば、スピンコート、スプレーコート、ディップコート、ロールコート、ビードコート等の公知の塗布方法により塗布し、光触媒含有細胞接着性変化層を形成することにより行うことができる。またバインダとして紫外線硬化型の成分を含有している場合、紫外線を照射して硬化処理を行うことにより光触媒含有層を形成することができる。
【０１２９】
２．細胞接着性変化パターン形成工程
次に、本実施態様における細胞接着性変化パターン形成工程について説明する。本実施態様における細胞接着性変化パターン形成工程は、上記光触媒含有細胞接着性変化層にエネルギーを照射し、上記光触媒含有細胞接着性変化層の、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成する工程である。
【０１３０】
本工程により、目的とするパターン状にエネルギーを照射することにより、エネルギー照射された領域のみの光触媒含有細胞接着性変化層の細胞の接着性を変化させることができ、高精細な細胞接着性の良好な領域と悪い領域とのパターンである、細胞接着性変化パターンを形成することができるのである。
【０１３１】
ここで、本実施態様でいうエネルギー照射（露光）とは、光触媒含有細胞接着性変化層表面の細胞接着性を変化させることが可能ないかなるエネルギー線の照射をも含む概念であり、可視光の照射に限定されるものではない。
【０１３２】
通常このようなエネルギー照射に用いる光の波長は、４００ｎｍ以下の範囲、好ましくは３８０ｎｍ以下の範囲から設定される。これは、上述したように光触媒含有細胞接着性変化層に用いられる好ましい光触媒が二酸化チタンであり、この二酸化チタンにより光触媒作用を活性化させるエネルギーとして、上述した波長の光が好ましいからである。
【０１３３】
このようなエネルギー照射に用いることができる光源としては、水銀ランプ、メタルハライドランプ、キセノンランプ、エキシマランプ、その他種々の光源を挙げることができる。
【０１３４】
上述したような光源を用い、フォトマスクを介したパターン照射により行う方法の他、エキシマ、ＹＡＧ等のレーザを用いてパターン状に描画照射する方法を用いることも可能である。
【０１３５】
また、エネルギー照射に際してのエネルギーの照射量は、光触媒含有細胞接着性変化層中の光触媒の作用により、光触媒含有細胞接着性変化層表面の細胞の接着性の変化が行われるのに必要な照射量とする。
【０１３６】
光触媒含有細胞接着性変化層表面の細胞の接着性の変化は、エネルギーの照射量に依存して変化するため、例えばエネルギー照射時間を調節することによって接着性を調整することができる。そうすることによって、適度な接着性を有する表面とすることができる。細胞接着性については、既に述べたとおり表面の水接触角で評価することができるので、適した水接触角を有する表面が得られるようエネルギー照射時間を調節することにより、適度な接着性を有する表面とすることができる。例えば、細胞接着性変化材料としてフルオロアルキルシランを用い、３６５ｎｍの紫外線を強度２５．０ｍＷ／秒で照射する場合、フォトマスクの基材に石英を用いた例では、通常１２０〜６００秒、好ましくは２４０〜４８０秒照射することにより好適な接着性を有する表面とすることができる。エネルギー照射時間および照射強度等については、使用する基材の材料や細胞接着性変化材料等によって適宜調節することができる。
【０１３７】
この際、光触媒含有細胞接着性変化層を加熱しながらエネルギー照射することにより、感度を上昇させることが可能となり、効率的な細胞の接着性の変化を行うことができる点で好ましい。具体的には３０℃〜８０℃の範囲内で加熱することが好ましい。
【０１３８】
本実施態様におけるエネルギー照射方向は、上述した基材が透明である場合は、基材側および光触媒含有細胞接着性変化層側のいずれの方向からフォトマスクを介したパターンエネルギー照射若しくはレーザの描画照射を行ってもよい。一方、基材が不透明な場合は、光触媒含有細胞接着性変化層側からエネルギー照射を行う必要がある。
【０１３９】
Ｂ．第２実施態様
次に、本発明の細胞配列用基材の製造方法の第２実施態様について説明する。本発明の細胞配列用基材の第２実施態様は、基材と、上記基材上に形成された光触媒を含有する光触媒処理層と、上記光触媒処理層上に形成され、かつエネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有するパターン形成体用基材を形成するパターン形成体用基材形成工程と、上記細胞接着性変化材料層にエネルギーを照射し、上記細胞接着性変化材料層の、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成する細胞接着性変化パターン形成工程とを有するものである。
【０１４０】
本実施態様の細胞配列用基材の製造方法は、例えば図２に示すように、まず、基材１と、その基材１上に形成された光触媒処理層７と、その光触媒処理層７上に形成された細胞接着性変化材料層８とを有するパターン形成体用基材３を形成する（パターン形成体用基材形成工程（図２（ａ））。次に、上記細胞接着性変化材料層８に、例えばフォトマスク４を用いてエネルギー５を照射し（図２（ｂ））、細胞接着性変化材料層８の細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターン６を形成する（図２（ｃ））細胞接着性変化パターン形成工程を行うものである。
【０１４１】
本実施態様においては、光触媒処理層と、上記細胞接着性変化材料層を形成することから、細胞接着性変化パターン形成工程において、エネルギーを照射することにより、光触媒処理層中に含有される光触媒の作用により、細胞接着性変化材料層内の細胞接着性が変化し、エネルギーが照射された部分と照射されない部分とで細胞との接着性が異なる細胞接着性変化パターンを形成することができるのである。以下、本実施態様の各工程について説明する。
【０１４２】
１．パターン形成体用基材形成工程
まず、本実施態様におけるパターン形成体用基材形成工程について説明する。本実施態様におけるパターン形成体用基材形成工程は、上記基材上に形成された光触媒を含有する光触媒処理層と、上記光触媒処理層上に形成され、かつエネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有するパターン形成体用基材を形成する工程である。
【０１４３】
本工程で形成される光触媒処理層は、光触媒のみからなるものであってもよく、またバインダと混合して形成されるものであってもよい。
【０１４４】
光触媒のみからなる光触媒処理層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、ＣＶＤ法、真空蒸着法等の真空製膜法や、例えば光触媒が二酸化チタンの場合は、基材上に無定形チタニアを形成し、次いで焼成により結晶性チタニアに相変化させる方法等が挙げられる。真空製膜法により光触媒処理層を形成することにより、均一な膜でかつ光触媒のみを含有する光触媒処理層とすることが可能であり、これにより細胞接着性変化材料層上の細胞接着性を均一に変化させることが可能であり、かつ光触媒のみからなることから、バインダを用いる場合と比較して効率的に細胞接着性変化材料層上の細胞接着性を変化させることが可能となる。
【０１４５】
また、光触媒処理層が、光触媒とバインダとを混合させたものである場合には、光触媒とバインダとを、必要に応じて他の添加剤とともに溶剤中に分散して塗布液を調製し、この塗布液を透明基材上に塗布することにより形成することができる。使用する溶剤としては、エタノール、イソプロパノール等のアルコール系の有機溶剤が好ましい。塗布はスピンコート、スプレーコート、ディップコート、ロールコート、ビードコート等の公知の塗布方法により行うことができる。バインダとして紫外線硬化型の成分を含有している場合、紫外線を照射して硬化処理を行うことにより光触媒処理層を形成することができる。
【０１４６】
続いて、上記光触媒処理層上に、上述した細胞接着性変化材料を含有する塗工液を、例えば、スピンコート、スプレーコート、ディップコート、ロールコート、ビードコート等の公知の塗布方法により塗布し、細胞接着性変化材料層を形成することができる。またバインダとして紫外線硬化型の成分を含有している場合、紫外線を照射して硬化処理を行うことにより光触媒処理層を形成することができる。
【０１４７】
ここで、本工程に用いられる基材や光触媒処理層、および細胞接着性変化材料層については、上述した「Ｉ．細胞配列用基材」の第２実施態様の項で説明したものと同様である。
【０１４８】
２．細胞接着性変化パターン形成工程
次に、本実施態様における細胞接着性変化パターン形成工程について説明する。本実施態様における細胞接着性変化パターン形成工程は、上記細胞接着性変化材料層にエネルギーを照射し、上記細胞接着性変化材料層の、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成する工程である。
【０１４９】
本工程により、目的とするパターン状にエネルギーを照射することにより、エネルギー照射された領域のみの細胞接着性変化材料層の細胞の接着性を変化させることができ、高精細な細胞接着性の良好な領域と悪い領域とのパターンである、細胞接着性変化パターンを形成することができるのである。
【０１５０】
本工程におけるエネルギー照射方法や、照射するエネルギー、エネルギー照射量については、上述した第１実施態様と同様である。
【０１５１】
Ｃ．第３実施態様
次に、本発明の細胞配列用基材の第３実施態様について説明する。本発明の細胞配列用基材の製造方法の第３実施態様は、基材と、上記基材上に形成され、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有するパターン形成体用基材を形成するパターン形成体用基材形成工程と、上記パターン形成体用基材と、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板とを、上記細胞接着性変化材料層と上記光触媒含有層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギー照射し、上記細胞接着性変化材料層の、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成する細胞接着性変化パターン形成工程とを有するものである。
【０１５２】
本実施態様の細胞配列用基材の製造方法は、例えば図３に示すように、まず、基材１と、その基材１上に形成された細胞接着性変化材料層８とを有するパターン形成体用基材３を形成する（パターン形成体用基材形成工程（図３（ａ））。次に、基体１１と、その基体１１上に形成された光触媒含有層１２とを有する光触媒含有層側基板１３を用意する。この光触媒含有層側基板１３における光触媒含有層１２と上記細胞接着性変化材料層８とが対向するように配置し、例えばフォトマスク４を用いてエネルギー５を照射し（図３（ｂ））、細胞接着性変化材料層８の細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターン６を形成する（図３（ｃ））細胞接着性変化パターン形成工程を行うものである。
【０１５３】
本実施態様においては、上記細胞接着性変化材料層を形成することから、細胞接着性変化パターン形成工程において、光触媒含有層側基板を用いてエネルギーを照射することにより、光触媒含有層中に含有される光触媒の作用により、細胞接着性変化材料層内の細胞接着性が変化し、エネルギーが照射された部分と照射されない部分とで細胞との接着性が異なる細胞接着性変化パターンを形成することができるのである。以下、本実施態様の各工程について説明する。
【０１５４】
１．パターン形成体用基材形成工程
まず、本発明におけるパターン形成体用基材形成工程について説明する。本発明におけるパターン形成体用基材形成工程は、基材と、上記基材上に形成され、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有するパターン形成体用基材を形成する工程である。
【０１５５】
本工程は、基材上に、細胞接着性変化材料を含有する塗工液を、例えば、スピンコート、スプレーコート、ディップコート、ロールコート、ビードコート等の公知の塗布方法により塗布し、細胞接着性変化材料層を形成することにより行うことができる。またバインダとして紫外線硬化型の成分を含有している場合、紫外線を照射して硬化処理を行うことにより光触媒含有層を形成することができる。
【０１５６】
ここで、本工程に用いられる基材および細胞接着性変化材料については、上述した「Ｉ．細胞配列用基材」の第１実施態様の項で説明したものと同様のものを用いることができる。
【０１５７】
２．細胞接着性変化パターン形成工程
次に、本実施態様における細胞接着性変化パターン形成工程について説明する。本実施態様における接着性変化パターン形成工程は、上記パターン形成体用基材と、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板とを、上記細胞接着性変化材料層と上記光触媒含有層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギー照射し、上記細胞接着性変化材料層の、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成する工程である。
【０１５８】
本工程において、光触媒含有層側基板における光触媒含有層および細胞接着性変化材料層を対向するように配置し、目的とするパターン状にエネルギーを照射することにより、エネルギー照射された領域のみの細胞接着性変化材料層の細胞の接着性を変化させることができ、高精細な細胞接着性の良好な領域と悪い領域とのパターンである、細胞接着性変化パターンを形成することができるのである。
【０１５９】
以下、本工程に用いられる光触媒含有層側基板、およびエネルギー照射についてそれぞれ説明する。
【０１６０】
（１）光触媒含有層側基板
まず、本実施態様に用いられる光触媒含有層側基板について説明する。
【０１６１】
本実施態様に用いられる光触媒含有層側基板は、少なくとも光触媒含有層と基体とを有するものであり、通常は基体上に所定の方法で形成された薄膜状の光触媒含有層が形成されてなるものである。また、この光触媒含有層側基板には、パターン状に形成された光触媒含有層側遮光部やプライマー層が形成されたものも用いることができる。
【０１６２】
本実施態様においては、エネルギーを照射する際に、上記細胞接着性変化材料層と、上記光触媒含有層側基板における光触媒含有層とを所定の間隙をおいて対向させ、光触媒含有層側基板の光触媒含有層の作用により、細胞接着性変化材料層の細胞接着性を変化させ、エネルギー照射後、光触媒含有層側基板を取り外すことにより細胞接着性変化パターンが形成されるのである。以下、この光触媒含有層側基板の各構成について説明する。
【０１６３】
ａ．光触媒含有層
本実施態様に用いられる光触媒含有層は、少なくとも光触媒を含有するものであり、バインダを有していても、有していなくてもよく、上述した第２実施態様の光触媒処理層と同様である。
【０１６４】
ここで、本実施態様において用いられる光触媒含有層は、例えば図３に示すように、基体１１上に全面に形成されたものであってもよいが、例えば図４に示すように、基体１１上に光触媒含有層１２がパターン状に形成されたものであってもよい。
【０１６５】
このように光触媒含有層をパターン状に形成することにより、エネルギーを照射する際に、フォトマスク等を用いてパターン照射をする必要がなく、全面に照射することにより、細胞接着性変化材料層上に細胞接着性変化パターンを形成することができる。
【０１６６】
この光触媒含有層のパターニング方法は、特に限定されるものではないが、例えばフォトリソグラフィー法等により行うことが可能である。
【０１６７】
また、光触媒含有層と細胞接着性変化材料層とを例えば密着させてエネルギー照射を行う場合には、実際に光触媒含有層の形成された部分のみの特性が変化するものであるので、エネルギーの照射方向は上記光触媒含有層と細胞接着性変化材料層とが対向する部分にエネルギーが照射されるものであれば、いかなる方向から照射されてもよく、さらには、照射されるエネルギーも特に平行光等の平行なものに限定されないという利点を有するものとなる。
【０１６８】
ｂ．基体
本実施態様においては、図３に示すように、光触媒含有層側基板１３は、少なくとも基体１１とこの基体１１上に形成された光触媒含有層１２とを有するものである。この際、用いられる基体を構成する材料は、後述するエネルギーの照射方向や、得られる細胞配列用基材が透明性を必要とするか等により適宜選択される。
【０１６９】
また本実施態様に用いられる基体は、可撓性を有するもの、例えば樹脂製フィルム等であってもよいし、可撓性を有しないもの、例えばガラス基材等であってもよい。さらには、別の形態の基体として、光ファイバ等の光導波路を用いることもできる。これらは、エネルギー照射方法により適宜選択されるものである。
【０１７０】
なお、基体表面と光触媒含有層との密着性を向上させるために、基体上にアンカー層を形成するようにしてもよい。このようなアンカー層としては、例えば、シラン系、チタン系のカップリング剤等を挙げることができる。
【０１７１】
ｃ．光触媒含有層側遮光部
本実施態様に用いられる光触媒含有層側基板には、パターン状に形成された光触媒含有層側遮光部が形成されたものを用いてもよい。このように光触媒含有層側遮光部を有する光触媒含有層側基板を用いることにより、エネルギー照射に際して、フォトマスクを用いたり、レーザ光による描画照射を行う必要がない。したがって、光触媒含有層側基板とフォトマスクとの位置合わせが不要であることから、簡便な工程とすることが可能であり、また描画照射に必要な高価な装置も不必要であることから、コスト的に有利となるという利点を有する。
【０１７２】
このような光触媒含有層側遮光部を有する光触媒含有層側基板は、光触媒含有層側遮光部の形成位置により、下記の二つの態様とすることができる。
【０１７３】
一つが、例えば図５に示すように、基体１１上に光触媒含有層側遮光部１４を形成し、この光触媒含有層側遮光部１４上に光触媒含有層１２を形成して、光触媒含有層側基板とする態様である。もう一つは、例えば図６に示すように、基体１１上に光触媒含有層１２を形成し、その上に光触媒含有層側遮光部１４を形成して光触媒含有層側基板とする態様である。
【０１７４】
いずれの態様においても、フォトマスクを用いる場合と比較すると、光触媒含有層側遮光部が、上記光触媒含有層と細胞接着性変化材料層との配置部分の近傍に配置されることになるので、基体内等におけるエネルギーの散乱の影響を少なくすることができることから、エネルギーのパターン照射を極めて正確に行うことが可能となる。
【０１７５】
さらに、上記光触媒含有層上に光触媒含有層側遮光部を形成する態様においては、光触媒含有層と細胞接着性変化材料層とを所定の位置に配置する際に、この光触媒含有層側遮光部の膜厚をこの間隙の幅と一致させておくことにより、上記光触媒含有層側遮光部を上記間隙を一定のものとするためのスペーサとしても用いることができるという利点を有する。また、スペーサとしての高さが不足する場合、遮光部に別途スペーサを設けてもよい。
【０１７６】
すなわち、所定の間隙をおいて上記光触媒含有層と細胞接着性変化材料層とを対向させた状態で配置する際に、上記光触媒含有層側遮光部と細胞接着性変化材料層とを密着させた状態で配置することにより、上記所定の間隙を正確とすることが可能となり、そしてこの状態で光触媒含有層側基板からエネルギーを照射することにより、細胞接着性変化材料層上に細胞接着性変化パターンを精度良く形成することが可能となるのである。
【０１７７】
このような光触媒含有層側遮光部の形成方法は、特に限定されるものではなく、光触媒含有層側遮光部の形成面の特性や、必要とするエネルギーに対する遮蔽性等に応じて適宜選択されて用いられる。
【０１７８】
例えば、スパッタリング法、真空蒸着法等により厚み１０００〜２０００Å程度のクロム等の金属薄膜を形成し、この薄膜をパターニングすることにより形成されてもよい。このパターニングの方法としては、スパッタ等の通常のパターニング方法を用いることができる。
【０１７９】
また、樹脂バインダ中にカーボン微粒子、金属酸化物、無機顔料、有機顔料等の遮光性粒子を含有させた層をパターン状に形成する方法であってもよい。用いられる樹脂バインダとしては、ポリイミド樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ゼラチン、カゼイン、セルロース等の樹脂を１種または２種以上混合したものや、感光性樹脂、さらにはＯ／Ｗエマルジョン型の樹脂組成物、例えば、反応性シリコーンをエマルジョン化したもの等を用いることができる。このような樹脂製遮光部の厚みとしては、０．５〜１０μｍの範囲内で設定することができる。このよう樹脂製遮光部のパターニングの方法は、フォトリソ法、印刷法等一般的に用いられている方法を用いることができる。
【０１８０】
なお、上記説明においては、光触媒含有層側遮光部の形成位置として、基体と光触媒含有層との間、および光触媒含有層表面の二つの場合について説明したが、その他、基体の光触媒含有層が形成されていない側の表面に光触媒含有層側遮光部を形成する態様も採ることが可能である。この態様においては、例えばフォトマスクをこの表面に着脱可能な程度に密着させる場合等が考えられ、細胞接着性変化パターンを小ロットで変更するような場合に好適に用いることができる。
【０１８１】
ｄ．プライマー層
次に、本実施態様の光触媒含有層側基板に用いられるプライマー層について説明する。本実施態様において、上述したように基体上に光触媒含有層側遮光部をパターン状に形成して、その上に光触媒含有層を形成して光触媒含有層側基板とする場合においては、上記光触媒含有層側遮光部と光触媒含有層との間にプライマー層を形成してもよい。
【０１８２】
このプライマー層の作用・機能は必ずしも明確なものではないが、光触媒含有層側遮光部と光触媒含有層との間にプライマー層を形成することにより、プライマー層は光触媒の作用による細胞接着性変化材料層の細胞接着性変化を阻害する要因となる光触媒含有層側遮光部および光触媒含有層側遮光部間に存在する開口部からの不純物、特に、光触媒含有層側遮光部をパターニングする際に生じる残渣や、金属、金属イオン等の不純物の拡散を防止する機能を示すものと考えられる。したがって、プライマー層を形成することにより、高感度で細胞接着性変化の処理が進行し、その結果、高解像度のパターンを得ることが可能となるのである。
【０１８３】
なお、本実施態様においてプライマー層は、光触媒含有層側遮光部のみならず光触媒含有層側遮光部間に形成された開口部に存在する不純物が光触媒の作用に影響することを防止するものであるので、プライマー層は開口部を含めた光触媒含有層側遮光部全面にわたって形成されていることが好ましい。
【０１８４】
本実施態様におけるプライマー層は、光触媒含有層側基板の光触媒含有層側遮光部と光触媒含有層とが接触しないようにプライマー層が形成された構造であれば特に限定されるものではない。
【０１８５】
このプライマー層を構成する材料としては、特に限定されるものではないが、光触媒の作用により分解されにくい無機材料が好ましい。具体的には無定形シリカを挙げることができる。このような無定形シリカを用いる場合には、この無定形シリカの前駆体は、一般式ＳｉＸ４で示され、Ｘはハロゲン、メトキシ基、エトキシ基、またはアセチル基等であるケイ素化合物であり、それらの加水分解物であるシラノール、または平均分子量３０００以下のポリシロキサンが好ましい。
【０１８６】
また、プライマー層の膜厚は、０．００１μｍから１μｍの範囲内であることが好ましく、特に０．００１μｍから０．１μｍの範囲内であることが好ましい。
【０１８７】
（２）エネルギー照射
次に、本工程におけるエネルギー照射について説明する。本実施態様においては、上記細胞接着性変化材料層と、上記光触媒含有層側基板における光触媒含有層とを、対向するように配置し、所定の方向からエネルギーを照射することにより、細胞接着性変化材料層の細胞接着性が変化したパターンを形成することができる。
【０１８８】
上記の配置とは、実質的に光触媒の作用が細胞接着性変化材料層表面に及ぶような状態で配置された状態をいうこととし、実際に物理的に接触している状態の他、所定の間隔を隔てて上記光触媒含有層と細胞接着性変化材料層とが配置された状態とする。この間隙は、２００μｍ以下であることが好ましい。
【０１８９】
本実施態様において上記間隙は、パターン精度が極めて良好であり、光触媒の感度も高く、したがって細胞接着性変化材料層の細胞接着性変化の効率が良好である点を考慮すると特に０．２μｍ〜１０μｍの範囲内、好ましくは１μｍ〜５μｍの範囲内とすることが好ましい。このような間隙の範囲は、特に間隙を高い精度で制御することが可能である小面積の細胞接着性変化材料層に対して特に有効である。
【０１９０】
一方、例えば３００ｍｍ×３００ｍｍ以上といった大面積の細胞接着性変化材料層に対して処理を行う場合は、接触することなく、かつ上述したような微細な間隙を光触媒含有層側基板と細胞接着性変化材料層との間に形成することは極めて困難である。したがって、細胞接着性変化材料層が比較的大面積である場合は、上記間隙は、１０〜１００μｍの範囲内、特に１０〜２０μｍの範囲内とすることが好ましい。間隙をこのような範囲内とすることにより、パターンがぼやける等のパターン精度の低下の問題や、光触媒の感度が悪化して細胞接着性変化の効率が悪化する等の問題が生じることなく、さらに細胞接着性変化材料層上の細胞接着性変化にムラが発生しないといった効果を有するからである。
【０１９１】
このように比較的大面積の細胞接着性変化材料層をエネルギー照射する際には、エネルギー照射装置内の光触媒含有層側基板と細胞接着性変化材料層との位置決め装置における間隙の設定を、１０μｍ〜２００μｍの範囲内、特に１０μｍ〜２０μｍの範囲内に設定することが好ましい。設定値をこのような範囲内とすることにより、パターン精度の大幅な低下や光触媒の感度の大幅な悪化を招くことなく、かつ光触媒含有層側基板と細胞接着性変化材料層とが接触することなく配置することが可能となるからである。
【０１９２】
このように光触媒含有層と細胞接着性変化材料層表面とを所定の間隔で離して配置することにより、酸素と水および光触媒作用により生じた活性酸素種が脱着しやすくなる。すなわち、上記範囲より光触媒含有層と細胞接着性変化材料層との間隔を狭くした場合は、上記活性酸素種の脱着がしにくくなり、結果的に細胞接着性変化速度を遅くしてしまう可能性があることから好ましくない。また、上記範囲より間隔を離して配置した場合は、生じた活性酸素種が細胞接着性変化材料層に届き難くなり、この場合も細胞接着性変化の速度を遅くしてしまう可能性があることから好ましくない。
【０１９３】
このような極めて狭い間隙を均一に形成して光触媒含有層と細胞接着性変化材料層とを配置する方法としては、例えばスペーサを用いる方法を挙げることができる。そして、このようにスペーサを用いることにより、均一な間隙を形成することができると共に、このスペーサが接触する部分は、光触媒の作用が細胞接着性変化材料層表面に及ばないことから、このスペーサを上述した細胞接着性変化パターンと同様のパターンを有するものとすることにより、細胞接着性変化材料層上に所定の細胞接着性変化パターンを形成することが可能となる。
【０１９４】
本実施態様においては、このような配置状態は、少なくともエネルギー照射の間だけ維持されればよい。
【０１９５】
ここで、照射されるエネルギーの種類や、照射方法、照射量等については、上述した第１実施態様で説明したものと同様である。
【０１９６】
なお、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。上記実施形態は例示であり、本発明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、同様な作用効果を奏するものは、いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含される。
【０１９７】
III．細胞配列用基材への血管形成細胞の接着
細胞配列用基材において、血管形成細胞は、基材上に細胞接着性の異なる領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する上記の細胞配列用基材の細胞接着性良好領域に接着されている。本発明の細胞配列用基材は、上記のとおり細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域からなる細胞接着性変化パターンを有するものであるから、細胞配列用基材の表面に細胞を均一に播き、一定時間インキュベートすると、細胞接着性良好領域には細胞が接着しているが、細胞接着性阻害領域には細胞が接着していない細胞パターンが形成された細胞接着基材が得られる。この際、インキュベート後の基材を液洗浄する事により、基材に弱く付着している細胞を除去し、より綺麗な細胞パターンが得られる。
【０１９８】
血管形成細胞を含む培養試料は、予め、生体組織を細かくして液体中に分散させる分散処理や、生体組織中の目的の細胞以外の細胞、その他試験を阻害する物質を除去する分離処理などを行っておくことが好ましい。
【０１９９】
細胞配列用基材への細胞の播種に先だって、目的とする細胞を含む培養試料を、予め、各種の培養方法で予備培養して、目的とする細胞を増やすことが好ましい。予備培養には、単層培養やコートディッシュ培養、ゲル上培養などの通常の培養方法が採用できる。予備培養において、細胞を支持体表面に接着させて培養する方法の一つに、いわゆる単層培養法として既に知られている手段がある。具体的には、例えば、培養容器に培養試料と培養液を収容して一定の環境条件に維持しておくことにより、特定の生細胞のみが、培養容器などの支持体表面に接着した状態で増殖する。使用する装置や処理条件などは、通常の単層培養法などに準じて行う。細胞が接着して増殖する支持体表面の材料として、細胞の接着や増殖が良好に行われる材料を選択したり、支持体表面に、細胞の接着や増殖が良好に行われる化学物質、いわゆる細胞接着因子を塗布しておくことも行われる。
【０２００】
培養後に、培養容器中の培養液を除去することで、培養試料中の支持体表面に接着しない不要成分が除去され、支持体表面に接着した生細胞のみを回収できる。支持体表面に接着した生細胞の回収には、ＥＧＴＡ−トリプシン処理などの手段が適用できる。
【０２０１】
上記のように予備培養した細胞を、培養液中の細胞配列用基材上に播種する。細胞の播種方法や播種量については特に制限はなく、例えば朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の技術（１９９９年）」２６６〜２７０頁等に記載されている方法が使用できる。細胞を細胞配列用基材上で増殖させる必要がない程度に十分な量で、細胞が単層で接着するように播種することが好ましい。細胞が凝集すると細胞の組織化が阻害され、基底膜層に転写して培養しても機能が低下するからである。具体的には、４００ｍｍ２あたり
２×１０５個程度で播種する。
【０２０２】
細胞を播種した細胞配列用基材を培養液中でインキュベートすることにより、細胞を細胞接着性良好領域に接着させることが好ましい。培養液としては、当技術分野で通常用いられる培地を使用することができ、例えば、用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地およびＲＰＭＩ培地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編 組織培養の技術第三版」５８１頁に記載の基礎培地、これらの培地に血清成分（ウシ胎児血清等）等を添加したもの、並びに市販の無血清培地等を用いることができる。
【０２０３】
インキュベートを行う時間は、通常３０分〜４８時間、好ましくは４〜２４時間である。適度な時間でインキュベートを行うことによって、洗い流したときに細胞配列用基材の細胞接着性良好領域に細胞が接着するが、細胞接着性阻害領域には細胞が接着せず、さらに基底膜層に容易に細胞を転写することが可能になる。
【０２０４】
インキュベートを行う温度は、接着させる細胞の種類によって異なるが、通常３７℃である。ＣＯ２細胞培養装置などを利用して、ＣＯ２雰囲気下でインキュベートを行うのが好ましい。インキュベートした後、細胞配列用基材を洗浄することにより、接着していない細胞が洗い流され、細胞をパターン状に配列することができる。
【０２０５】
図７に、細胞配列用基材上に血管形成細胞をパターン状に接着させ、接着した血管形成細胞を基底膜層に転写する工程の一態様を示す。細胞接着性良好領域（１７）と細胞接着性阻害領域（１８）がパターン状に形成された細胞配列用基材（１５）に血管形成細胞を播種して細胞をパターン状に接着させる。続いてこの血管形成細胞が接着した細胞配列用基材を、組織形成細胞層上において血管ネットワークを形成しようとする領域のほぼ全面に設けられた基底膜層に密着させて細胞を転写し培養する。そして必要により細胞刺激因子（２２）で細胞を刺激する。なお、基底膜層は、図示のように、組織形成細胞層の全面に形成されている必要はなく、血管ネットワークが転写される領域に形成されていればよい。
【０２０６】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【０２０７】
（実施例１）細胞配列用基材の作成
フルオロアルキルシランＴＳＬ８２３３（ＧＥ東芝シリコーン）１．５ｇ、テトラメトキシシランＴＳＬ８１１４（ＧＥ東芝シリコーン）５．０ｇ、５．０×１０−３ＮＨＣｌ  ２．４ｇを１２時間混合し、これをイソプロピルアルコールで１０倍希釈した。
【０２０８】
次に、この溶液２．０ｇを１０００ｒｐｍ、５秒でスピンコーターにより１０ｃｍ×１０ｃｍのソーダガラス基材に塗布し、その基材を１５０℃の温度で１０分間乾燥させた。
【０２０９】
次に、イソプロピルアルコールで３倍希釈した酸化チタンゾル液（石原産業ＳＴＫ−０３）３．０ｇを光触媒含有層用組成物とした。
【０２１０】
前記光触媒含有層用組成物を、幅６０μｍのライン部および幅４００μｍのスペース部が交互に配置されたライン＆スペースのネガ型フォトマスク（石英）のパターン面上にスピンコーターにより７００ｒｐｍ、３秒で塗布し、１５０℃で１０分間の乾燥処理を行うことにより、透明な光触媒含有層を有するフォトマスクを形成した。
【０２１１】
前記フォトマスクの光触媒含有層面と前記基材の細胞接着性変化材料層面とを１０μｍの間隙で配置し、フォトマスク側から水銀ランプ（波長３６５ｎｍ）により２５．０ｍＷ／ｃｍ２の照度で所定の時間紫外線露光を行い、幅６０μｍのライン状の細胞接着性良好領域および幅４００μｍの細胞接着性阻害領域のスペースが交互に配置された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材を得た。
【０２１２】
（実施例２）血管内皮細胞の培養および細胞配列用基材上への接着
培養細胞として、ウシ頚動脈由来血管内皮細胞（Onodera M, Morita I, Mano Y, Murota S ：Differential effects of nitric oxide on the activity of prostaglandin endoperoxide h synthase-1 and-2 in vascular endothelial cells、Prostag Leukotress 62: 161-167, 2000）で継代数５代から２０代のものを用いた。
【０２１３】
１０ｃｍディッシュでコンフレント状態になったウシ頚動脈由来血管内皮細胞を０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡで処理して剥がした。コールターカウンターTM ZM（Coulter Counter）で細胞数を調べ、１０６個／ｍｌとした。実施例１で作成した細胞配列用基材（露光時間３６０秒のもの）をオートクレーブにて滅菌した。培養液（５％ウシ胎児血清含有ＭＥＭ培地）を含む培養ディッシュ（Heraeus QuadripremTM ７６×２６ｍｍ、１９７６ｍｍ２）にこの細胞配列用基材を入れ、上記内皮細胞を１ウェル当たり１０６個／５ｍｌで播き、２４時間ＣＯ２細胞培養装置でインキュベートした。
【０２１４】
５％ウシ胎児血清含有ＭＥＭ培地に対しカルボシアニン蛍光色素（ＤｉＩ，Invitrogen社）を１０μｇ／ｍｌの濃度で溶解する。細胞が配列された上記細胞配列用基材をこの培地に浸漬し、３７℃で１時間培養した。その後、細胞配列用基材を、５％ウシ胎児血清含有ＭＥＭ培地に戻した。
【０２１５】
（実施例３）
i）マウス肝実質細胞を採取し、市販の９６穴ＮＩＰＡＡｍ（ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）シャーレ上で培養した。上述の濃度のカルボシアニン蛍光色素（ＤｉＯ, Invitrogen社）で染色後、５％ウシ胎児血清含有ＭＥＭ培地に戻した。
【０２１６】
ＧＦＲマトリゲル（ベクトン・ディッキンソン社）を５％ウシ胎児血清含有ＭＥＭ培地で１０倍希釈した。このゲル含有培地をマウス肝実質細胞を培養したシャーレに、1穴当たり２５μｌ添加した後、３７℃で１時間培養した。これにより細胞上にゲル薄膜層からなる基底膜層を形成した。
ii)  i)で作成した肝実質細胞培養シャーレに実施例２で作成した血管内皮細胞が配列された基材を浸漬し、肝実質細胞上の基底膜層と血管内皮細胞とを接触させた。３７℃で２４時間培養を行い、細胞配列用基材を剥離した。
iii)  シャーレを約２０℃で３０分間振とうし、軽くピペッティングした後、形成された組織体をピンセットで剥離した。
iv)  免疫不全マウスを麻酔し、背部を切開し、iii)までで作成した組織体をマウスの肝臓に移植した。移植部を縫合し、１日後および３日後に移植部を再切開し、移植組織を共焦点レーザー顕微鏡で観察した（ＤｉＩ→励起波長５３０ｎｍ／観察波長５９０ｎｍ、ＤｉＯ→励起波長４８０ｎｍ／観察波長５１０ｎｍ）。
【０２１７】
結果
励起波長４８０ｎｍにおける観察で移植した肝実質細胞の成育が確認された。また、励起波長５３０ｎｍにて移植した血管内皮細胞を観察したところ、予め血管内皮細胞をパターニングした通りに、毛細血管が形成されていることが確認された。
【０２１８】
（実施例４）
実施例１及び２と同様の手順にて血管内皮細胞を細胞配列基材上に配列した。更に実施例３のi)〜iii)部を行い、肝実質細胞，基底膜,血管からなる組織体を作成した。
【０２１９】
次に作成した組織体を３、５、７枚重ね、積層組織体を作成し、直ちに免疫不全マウスの肝臓に移植した。移植部を縫合し、１日後および３日後に移植部を再切開して移植組織を観察した。
【０２２０】
結果
励起波長４８０ｎｍにおける観察により移植した肝実質細胞の成育が確認された。また、励起波長５３０ｎｍにて移植した血管内皮細胞を観察したところ、予め血管内皮細胞をパターニングした通りに、毛細血管が形成されていることが確認された。摘出組織のヘモグロビン量を分析した結果、移植部もマウス肝臓の非移植部とほぼ同等のヘモグロビンが確認された。
【０２２１】
（比較例４）
実施例３のi)及びiii)の工程により肝実質細胞と基底膜層からなる組織体を形成し、次に作成した組織体を３、５、７枚重ね、積層組織体を作成し、直ちに免疫不全マウスの肝臓に移植した。移植部を縫合し、１日後および３日後に移植部を再切開し、移植組織を観察した。
【０２２２】
結果
積層枚数が５枚または７枚になると、励起波長４８０ｎｍにおける観察で移植した肝実質細胞の壊死が観察された。また、摘出組織のヘモグロビン量を分析した結果、移植部にはヘモグロビンはほとんど観察されなかった。
【０２２３】
(実施例５)
実施例１及び２と同様の手順にて血管内皮細胞を細胞配列基材上に配列した。更に実施例３のi)〜iii)部を行い、肝実質細胞，基底膜,血管からなる第1組織体を作成した。次に実施例３のi)及びiii)の工程により肝実質細胞と基底膜層からなる第2組織体を形成した。
【０２２４】
作成した第１組織体と第２組織体を交互に３枚ずつ、計６枚の組織体を重ね積層し、積層組織体を形成した。この積層組織体を直ちに免疫不全マウスの肝臓に移植した。移植部を縫合し、１日後および３日後に移植部を再切開して移植組織を観察した。
【０２２５】
励起波長４８０ｎｍにおける観察で移植した肝実質細胞の成育が確認された。また、励起波長５３０ｎｍにて移植した血管内皮細胞を観察したところ、予め血管内皮細胞をパターニングした通りに、毛細血管が形成されていることが確認された。摘出組織のヘモグロビン量を分析した結果、実施例４の半分強のヘモグロビン量が確認された。
【図面の簡単な説明】
【０２２６】
【図１】本発明の細胞配列用基材の製造方法の一例を示す工程図である。
【図２】本発明の細胞配列用基材の製造方法の他の例を示す工程図である。
【図３】本発明の細胞配列用基材の製造方法の他の例を示す工程図である。
【図４】本発明における光触媒含有層側基板の一例を示す概略断面図である。
【図５】本発明における光触媒含有層側基板の他の例を示す概略断面図である。
【図６】本発明における光触媒含有層側基板の他の例を示す概略断面図である。
【図７】細胞配列用基材上に血管形成細胞をパターン状に接着させ、接着した血管形成細胞を基底膜層に転写する工程の一態様を示す。
【図８】本発明の方法の一例を示す概略図である。
【図９】細胞配列用基材に配列された細胞を表す写真である。
【図１０】血管層、基底膜層および組織形成細胞層を含む組織体をin vitroで製造する方法の一態様を表す。
【図１１】血管層、基底膜層および組織形成細胞層が積層されてなる積層組織体をin vitroで製造する方法の一態様を表す。
【符号の説明】
【０２２７】
1…基材、2…光触媒含有細胞接着性変化層、3…パターン形成体用基材、4…フォトマスク、5…エネルギー、6…細胞接着性変化パターン、15…細胞配列用基材、16…基底膜層、17…細胞接着性良好領域、18…細胞接着性阻害領域、19…細胞、20…撥水性材料、21…細胞接着材料、22…細胞刺激因子、101…組織形成細胞、102…培養ベース、103…組織形成細胞層、104…基底膜層、105…細胞配列用基材、106…血管形成細胞、107…組織体、108…血管層、109…第１組織体が積層されてなる積層組織体、110…第１組織体と第２組織体が積層されてなる積層組織体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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