(57)【要約】【課題】  セリンプロテアーゼHtrAの用途の提供。【解決手段】  HtrA、特にHtrA1とHtrA3のプロテアーゼ活性が、TGF-βファミリータンパク質を介するシグナル阻害活性と相関していることを発見し、それに基づいてTGF-βファミリータンパク質を介するシグナルの異常に起因する疾患の予防または処置剤をスクリーニングする方法を提供する。また、HtrAを有効成分とするTGF-βファミリータンパク質を介するシグナルの活性調節剤も提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セリンプロテアーゼＨｔｒＡを有効成分とする、ＴＧＦ−βファミリータンパク質活性の調節剤。
【請求項２】
セリンプロテアーゼＨｔｒＡがマウスＨｔｒＡ１またはヒトＨｔｒＡ１である、請求項１の調節剤。
【請求項３】
セリンプロテアーゼＨｔｒＡがマウスＨｔｒＡ３またはヒトＨｔｒＡ３である、請求項１の調節剤。
【請求項４】
セリンプロテアーゼＨｔｒＡを抗原とする抗体。
【請求項５】
セリンプロテアーゼＨｔｒＡがマウスＨｔｒＡ１またはヒトＨｔｒＡ１である、請求項４の抗体。
【請求項６】
セリンプロテアーゼＨｔｒＡがマウスＨｔｒＡ３またはヒトＨｔｒＡ３である、請求項４の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、セリンプロテアーゼＨｔｒＡ（ｈｉｇｈ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  Ａ）
の使用に関するものであり、特にそのＴＧＦ−βファミリータンパク質活性調節作用に基づいて、ＴＧＦ−βファミリータンパク質活性調節剤、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびにトランスジェニック哺乳類動物およびノックアウト哺乳類動物を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】  セリンプロテアーゼＨｔｒＡは、哺乳類に存在するタンパク質であって、これまで４種のもの、すなわちＨｔｒＡ１、ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ３およびＨｔｒＡが知られている。ｍ（マウス）ＨｔｒＡについてそれらのドメイン構造を示すならば、図１のとおりである。これらは、バクテリアのＨｔｒＡから進化してきたものと考えられ、Ｃ末端側のプロテアーゼドメインおよびＰＤＺドメインは、大腸菌から哺乳類の間でよく保存されている。哺乳類のＨｔｒＡタンパク質のうち、ＨｔｒＡ１、ＨｔｒＡ３およびＨｔｒＡ４はいずれも分泌タンパク質であり、Ｎ末端側のドメイン構造が保存されており、機能的にも似ていると考えられる。【０００３】  ＴＧＦ−βファミリータンパク質は、約３０個余りのタンパク質から構成され、さらにサブファミリーとしてＢＭＰ、ＧＤＦ、アクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）などに分けられる。ＴＧＦ−βファミリータンパク質は、細胞外に分泌されて機能するタンパク質で、発生において、胚の軸形成や細胞の分化、細胞死、また器官の形成に重要な役割を有している。また、発生だけでなく、生まれた後も体の恒常性の維持のために機能している。そのため、ＴＧＦ−βファミリータンパク質を介するシグナルが異常になることにより、種々の疾患が引き起こされる。たとえば、ＴＧＦ−β１の場合、分泌されたＴＧＦ−β１は細胞の膜上の受容体に結合し、細胞内にシグナルを伝える。細胞外に分泌されるＴＧＦ−β１の量が異常になると、肺繊維症や肝硬変、骨粗鬆症、関節炎、動脈硬化などの疾患が引き起こされる。一方、受容体側に異常が起こると、それらの疾患のために種々の癌を引き起こし、またその癌が転移しやすくなることが知られている。このように、生物にとって、ＴＧＦ−βファミリータンパク質を介するシグナルが正しく調節されることは極めて重要なことである。【０００４】  そのため、生物はＴＧＦ−βシグナルの調節機構をいくつか持っており、その一つとしてＴＧＦ−βファミリータンパク質に結合してその活性を阻害する、アンタゴニストとして働く一群のタンパク質が存在する。そのようなタンパク質の一つであるＢＭＰを例に挙げて説明すると、ＢＭＰを阻害するアンタゴニストとしてはノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、コルジン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）、フォリスタチン（Ｆｏｌｌｉｓｔｓｔｉｎ）などが知られており、これらのアンタゴニストはＢＭＰに結合することによって、ＢＭＰの受容体に対する結合を阻害する。その結果、ＢＭＰシグナルは、細胞内に伝達され得ない。
【非特許文献１】Ｚｕｍｂｒｕｎｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ＩＧＦ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＦＲＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３９８，１８７−１９２；  Ｈｕ，Ｓ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｈｕｍａｎ  ＨｔｒＡ，ａｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ａｓ  ａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，３４４０６−３４４１２；  Ｂａｌｄｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）．  Ｔｈｅ  ＨｒｔＡ１  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｓ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１，６６８４−６６８８．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  上記したように、セリンプロテーアーゼＨｔｒＡについては、既にその構造が解明されているが、それがどのような生理的活性を有しているかはこれまで充分に明らかにされていなかった。従って、本発明が対象とする技術的課題は、ＨｔｒＡタンパク質の生理的活性を明らかにし、当該タンパク質の現実的な用途を見出すことにある。以下、ＨｔｒＡ１例に挙げて、本発明を説明する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  ＨｔｒＡ１は、ＢＭＰのアンタゴニストであるフォリスタチン類似領域を有している。従って、ＨｔｒＡ１がＴＧＦ−βファミリータンパク質のアンタゴニストとして機能するのではないかとの推定の下に、研究を進めた。【０００７】  すなわち、ＧＳＴ−プルダウン法により、ＨｔｒＡ１がＴＧＦ−βファミリータンパク質に結合するかどうかを調べた。ＨｔｒＡ１としてｓｆ−９細胞で発現させたものを、ＴＧＦ−βファミリータンパク質としてＧＳＴ融合タンパク質の形で大腸菌で発現させたものを用いた。また、ＴＧＦ−βファミリータンパク質としては、それぞれのサブファミリーであるＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＢＭＰ−４，ＧＤＦ−５、アクチビンの５つを代表として用いた。【０００８】  図２はＴＧＦ−βタンパク質の発現を観察したものであって、全て発現していることが理解される。バンドが見られればＨｔｒＡ１が結合していることを示している。ＧＳＴタンパク質だけのものにはＨｒｔＡ１は結合しないが、それ以外の全てのＴＧＦ−βファミリータンパク質にはＨｒｔＡ１が結合している。この結果から、ＨｔｒＡ１はＴＧＦ−β、ＢＭＰ−４、ＧＤＦ−５、アクチビンといった広範なＴＧＦ−βファミリータンパク質に結合することが確認される。【０００９】  これまで知られているノギン、コルジン、フォリスタチンなどのアンタゴニストは、一つか多くて２つのサブファミリーにしか結合しない。従って、ＨｔｒＡ１が上記したような広範な結合活性を有する事実は、全く予想外の発見ということができる。【００１０】  次に、ＨｔｒＡ１の結合により、ＢＭＰおよびＴＧＦ−βシグナルを阻害するかどうかについて検討を行った。Ｃ２Ｃ１２細胞にＢＭＰシグナルを活性化するための遺伝子を導入すると、図３の左側のグラフに示すように、シグナルが約１０倍に活性化される。そこにＨｔｒＡ１を同時に導入すると、導入されたＨｔｒＡ１の量に応じて、この活性化が抑制されることがわかる。図３において、右側のグラフはＴＧＦ−βシグナルであるが、ＴＧＦ−βを作用させると、約２０倍の活性化が認められる。そこにＨｔｒＡ１を加えていくと、同様に抑制が起こることが理解される。このことから、ＨｔｒＡ１は、ＴＧＦ−βファミリータンパク質に結合するだけでなく、そのシグナル伝達を阻害することが確認される。【００１１】  さらにＨｒｔＡ１のどの領域がＴＧＦ−βシグナルの阻害に必要かを検討した結果、プロテアーゼドメインの領域が必要であり、かつ、プロテアーゼ活性が無い変異体は阻害活性を持たないことから、プロテアーゼ活性が阻害活性に必要であることが明らかとなった。【００１２】  さらにまた、ＨｔｒＡ１によるＴＧＦ−βシグナルの阻害にはＨｔｒＡ１のプロテアーゼ活性が必要であることから、プロテアーゼ活性の強さと阻害の活性の相関を検討した。すなわち、ＢＭＰ−４シグナルについて種々の異変体を作成し、ＢＭＰ−４に対する結合活性、シグナルに対する阻害活性、およびカゼインを基質としてプロテアーゼ活性を測定した。その結果、図４に示すように、プロテアーゼ活性と阻害活性は相関していることが明らかとなった。このことはＨｔｒＡ１のプロテアーゼ活性を操作することによりＴＧＦ−βシグナルを調節することがＢＭＰ−４できることを示している。つまり、ＨｔｒＡ１を基にした創薬が可能であることが期待される。また、フォリスタチンドメインとＰＤＺドメインはいずれもプロテアーゼ活性に対して抑制的に働いており、これらを除くとプロテアーゼ活性が上昇し阻害活性も増加する。【００１３】  以上の確認事実に基づき、次のように結論することができる：
１．ＨｔｒＡ１は、種々のＴＧＦ−βファミリータンパク質と結合する。この結合には、プロテアーゼ領域が必要である。
２．ＨｔｒＡ１は、種々のＴＧＦ−βのシグナル伝達を阻害する。この阻害には、プロテアーゼ活性が必須である。
３．ＨｔｒＡ１のＴＧＦ−βシグナル阻害活性は、プロテアーゼ活性の強さに相関している。【００１４】  現在のところ、ＨｔｒＡ１によるＴＧＦ−βシグナル阻害の分子メカニズムについて詳らかではないが、プロテアーゼ活性が阻害に必要であるところから、ＴＧＦ−βシグナルに関わる何らかのタンパク質を分解していることが予想される。実際に、ＴＧＦ−βシグナルの伝達を制御していとる考えられている２つの細胞外マトリックスタンパク質、デコリン（ｄｅｃｏｒｉｎ）とビグリカン（ｂｉｇｌｙｃａｎ）をＨｔｒＡ１が分解することが判明している。【００１５】  ＨｔｒＡ１はβ−カゼインを分解し、自己分解能も持つ。ｍＨｔｒＡ１を使用してカゼインや自己分解における切断部位を調べたところ、疎水性アミノ酸が集まった部位を認識していた。またその活性は５５℃において最も強くなる。これらの性質は熱ショックタンパク質である大腸菌のＨｔｒＡの性質と共通する。ＨｔｒＡ１は、ヒトの変形性関節炎やマウスの実験的関節炎で発現が上昇する。そこでｍＨｔｒＡ１が関節軟骨を構成する主要な蛋白質を分解するか検討したところ、プロテオグリカンであるデコリンやビグリカンが分解された。デコリンは、ＴＧＦ−βに結合して活性を制御することが示されており、ＨｔｒＡ１がＴＧＦ−βシグナルを抑制するのは、プロテオグリカンの分解を通じてである可能性が示唆された。ＨｔｒＡ１のＦＳドメインとＰＤＺドメインを除去するとそれぞれ３倍と１．５倍プロテアーゼ活性が上昇したことから、この２つのドメインがＨｔｒＡ１の活性の制御に関わっていると考えられる。また、ＦＳドメインとＳＰドメインを繋ぐリンカー領域を除去すると活性が失われ、リンカー領域に保存されているフェニルアラニンをアスパラギンに変えた変異体では活性が大幅に減少した。これは、これらの変異体が三量体形成能を失うことによるもので、ＨｔｒＡ１のプロテアーゼ活性には三量体形成が必須であることが明らかになった。大腸菌のＨｔｒＡのＰＤＺドメインには他の蛋白質が結合して活性を制御する。【００１６】  以上、専らＨｔｒＡ１について説明したが、ＨｔｒＡ３も同様の活性を有している。すなわち、ＧＳＴプルダウンアッセイおよびＣ２Ｃ１２細胞におけるレポーターアッセイを採用して調べたところ、ＨｔｒＡ３はＨｔｒＡ１と同様にＴＧＦ−ｂファミリー蛋白質に結合し、ＢＭＰ−４およびＴＧＦ−ｂ１によるシグナルを阻害した。当該実験においては、ＨｔｒＡ３に抗ｍｙｃ抗体に反応するエピトープをつけて発現させ、抗ｍｙｃ抗体を用いて結合を検出した。さらに、ＨｔｒＡ３がＨｔｒＡ１と同様にデコリンやビグリカンを切断するかを調べたところ、その２つの蛋白質を分解する活性を持つことが示された。
【発明の効果】
【００１７】  前記したように、ＴＧＦ−βシグナルの異状により多くの疾患が引き起こされることが知られている。ＨｔｒＡ１は、ＴＧＦ−βシグナル阻害活性を持ち、この阻害活性は、プロテアーゼ活性の強さに相関している。このことは、ＨｔｒＡ１のプロテアーゼ活性を調節することにより、ＴＧＦ−βシグナルを制御できることを示すものである。従って、ＨｒｔＡ１タンパク質のプロテアーゼ活性を調節することによる創薬が期待できる。たとえば、たとえば癌や癌の悪性化、転移、肺繊維症、肝硬変などでは、ＴＧＦ−βシグナルが昂進していることが疾患の原因に大きく寄与していることが明らかにされている。このような疾患に対しては、活性のあるＨｔｒＡ１そのものを作用させて、ＴＧＦ−βシグナル活性を抑制することにより、病状の改善や疾患の治癒を期待することができる。一方、骨粗鬆症、変形性関節炎、リウマチ性関節炎などでは、ＴＧＦ−βシグナル活性低下が病因となっていることが知られているので、このような疾患では、潜在的なＴＧＦ−βシグナルの阻害因子であるＨｔｒＡ１の活性を抑制し、ＴＧＦ−βシグナルの活性を回復させることにより、病状の改善や疾患の治癒が期待することができる。【００１８】  ＨｔｒＡ１はプロテアーゼであり、プロテアーゼ活性が阻害活性に必要であることから、ＨｔｒＡ１に対する特異的プロテアーゼ阻害物質を作用させることによりＨｔｒＡ１の活性を抑制することができ、その結果、ＴＧＦ−ｂｅｔａシグナルの回復を期待することができる。活性のあるＨｔｒＡ１タンパク質は、たとえば次のような方法により大量に純度良く生産することが可能である：
方法１：昆虫細胞であるｓｆ２１細胞において、バキュロウイルスのシステムを用いて全長のマウスＨｔｒＡ１タンパク質を１２個のヒスチジンｔａｇをつけて発現させ、培養上清に含まれるＨｔｒＡ１タンパク質をニッケルカラムを用いて精製する。
方法２：大腸菌において、マウスＨｔｒＡ１タンパク質のうち１−１５０アミノ酸を除いたＣ末端側３３０アミノ酸（プロテアーゼ活性、阻害活性のいずれも保持されている）をコードするマウスＨｒｔＡ１遺伝子をｐＥＴ２８ベクターに組み込み、ヒスチジンｔａｇを付加して発現させる。得られたタンパク質をニッケルカラムにより精製する。
従って、そのような方法によって生産されたＨｔｒＡ１を使用して、常套の手法によりインヒビター活性を持つ化合物のスクリーニングを行うことが可能である。なお、ＨｔｒＡ１は細胞の外から作用するタンパク質であるから、創薬する上で非常に都合がよいということができる。【００１９】  人工的にリウマチ性関節炎を誘導したマウスで、ＨｔｒＡ１の発現の変化を免疫染色により調べた。正常マウスでは、関節軟骨にＨｔｒＡ１タンパク質の発現はほとんど見られなかった。しかし、関節炎マウスでは関節軟骨深部からＨｔｒＡ１の発現が誘導され、時間の経過と共に関節軟骨全体へと拡大した。ＨｔｒＡ１は変形性関節炎だけでなく、リウマチ性関節炎の発症にも関与している可能性が考えられる。【００２０】  本発明は、ＨｔｒＡ１を抗原とする抗体を提供するができる。たとえば、モノクローナル抗体は、ＨｔｒＡ１タンパク質のアミノ末端部分を使用して細菌中でＧＳＴまたはＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−Ｈｉｓ（Ｔｒｘｈ）−組換えタンパク質を産生させ、ＧＳＴ−ＨｔｒＡ１を抗原として使用してマウスを免疫化する。ハイブリドーマを、Ｔｒｘｈ−ＨｔｒＡ１を抗原とするウェスターンブロッテイングによりスクリーニングして、抗体産生クローンを取得する。当該クローンによって産生されるＩｇＧ抗体は、Ｔｒｘｈ−ＨｔｒＡ１に対して高い親和性を示す。ヒトＨｔｒＡ１蛋白質の２２−９７番目のアミノ酸を抗原としてモノクローナル抗体を作成した。得られた抗体は、ＩｇＧクラスの抗体であり、特異的にヒトのＨｔｒＡ１蛋白質を認識する、またマウスのＨｔｒＡ１と交差して反応するが、マウスのＨｔｒＡ３蛋白質には交差しない。【００２１】  本発明はまた、ＨｔｒＡ１セリンプロテアーゼをコードする遺伝子で形質転換させたり、そのような遺伝子を欠失させた、トランスジェニック動物（特に哺乳類動物）を提供することができる。ここに使用した「トランスジェニック動物」なる用語には、遺伝子組み換えにより、外来遺伝子を生殖細胞に人為的に導入された動物のみならず、広くアンチセンスＲＮＡを用いて特定の遺伝子の機能を抑えたアンチセンス・トランスジェニック動物や、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いて特定の遺伝子をノックアウトした動物、点突然変異ＤＮＡを導入した動物なども含む意味で使用される。【００２２】  トランスジェニック動物を作成するには、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接注入する方法（マイクロインジェクション法）、胚性肝細胞（ＥＳ細胞）を使用する方法などがある。ノックアウト動物を作成するには、胚性肝細胞（ＥＳ細胞）を用いて相同組み換えを行い、一方の対立遺伝子を改変・破壊したＥＳ細胞を選別する。受精卵の杯盤胞や８細胞期胚に遺伝子を操作したＥＳ細胞を注入して、ＥＳ由来の細胞と胚由来の細胞が混ざったキメラ・マウスを得る。このキメラ・マウスと正常マウスを交配すると、一方の対立遺伝子のすべてが改変・破壊されたヘテロ接合体マウスを作製できる。さらに、ヘテロ接合体マウス同士を交配することで、ホモ接合体マウスが作出される。【００２３】  ＨｔｒＡ１ノックアウトマウスおよびトランスジェニックマ��スを作成した。得られたマウスのＨｔｒＡ１の発現を調べた。１）Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇによりＨｔｒＡ１  ｍＲＮＡの発現を調べたところ、ノックアウトマウスにおいては発現が無く、正しく遺伝子の破壊が起こっていることがわかった。またトランスジェニックマウスについてはＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇによってＨｔｒＡ１蛋白質の発現を確認した。ＩＩ型コラーゲンおよびＩ型コラーゲンのプロモーターの下流にＨｔｒＡ１遺伝子を発現させるようにデザインされたマウスにおいて足の骨から抽出した蛋白質を用いて発現を確認した。その結果、それぞれのラインのトランスジェニックマウスにおいてＨｔｒＡ１蛋白質の発現上昇が認められた。【００２４】  マウスやラットなどのトランスジェニック動物は、遺伝子の機能や発現調節の研究や、ヒトの疾患のメカニズムを解明したり医薬品のスクリーニングに用いる疾患モデル動物の開発に使用することができる。
【実施例】
【００２５】  材料および方法
プラスミドおよび他の試薬
マウスＨｔｒＡ１の６０４ｂｐのフラグメントを、ＥＳＴ（ＡＡ０２８６００）配列から設計した一組のＰＣＲプライマー（ＭＳ−８Ｆ、５’−ＣＧＣＴＴＡＴＣＡＡＧＡＴＴＧＡＣＣＡＣＣ−３’およびＭＳ−８Ｒ、５’−ＴＴＧＡＴＧＡＣＡＴＣＧＣＴＧＡＣＧ−３’）を用いて増幅した。このフラグメントを、プローブとして使用して、成体マウスの脳ｃＤＮＡライブラリィー由来のマウスＨｔｒＡ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ１７２９９４）の完全長２ｋｂのｃＤＮＡを単離した。ＰｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、完全長ＨｔｒＡｌおよび該変異体を哺乳類動物細胞で発現した。ＨｔｒＡ１の欠失変異体を、適切な制限酵素フラグメントを用いて構築した。Ｓ３２８Ａ変異体を創生するために、ＰＣＲ突然変異誘発によってアミノ酸３２８位のセリンをアラニンで置換した。ヒト  ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ  ｃＤＮＡ（Ｎ．Ｕｅｎｏ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｋａｚａｋｉ）を、３’コード末端位置でヒトｍｙｃエピトープ配列を用いてタグをつけ、そしてｐｃＤＮＡ３中で複製した。使用した他のＤＮＡは次のとおりである：ルシフェラーゼ・リポーター・プラスミド、ｐＧＬ３−Ｉｄ９８５  ＷＴおよびｐＧＬ３ｔｉ−（ＳＢＥ）４（それぞれＴ．Ｋａｔａｇｉｒｉ，Ｓｈｏｗａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｏｋｙｏ  とＷ．Ｋｒｕｉｊ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｋｅｒｋｌａａｎ）；マウスＳｍａｄ  ｃＤＮＡ（Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｋｙｏ）；Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｎｏｇｇｉｎ発現ベクター（Ｙ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，ＲＩＫＥＮ，Ｋｏｂｅ）；マウスＢＭＰ−４  ｃＤＮＡ（Ｄ．Ｃｏｎｓｔａｍ，Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）；ｐＥＦ−ＢＯＳにおいて構成的に活性なＢＭＰタイプＩ受容体（ｃａＢＭＰＲ−ＩＢ）ｃＤＮＡ（Ｔ．Ｋａｔａｇｉｒｉ，Ｓｈｏｗａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｏｋｙｏ）。【００２６】  ｍＲＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
全胚および組織を、４％パラホルムアルデヒドのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で、一晩、４℃で固定した。全−マウント（ｍｏｕｎｔ）と切片のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、文献記載のように行った（Ｓａｓａｋｌｉ  ａｎｄ  Ｈｏｇａｎ  １９９３；Ｍｏｒｉｍｏｔ  ｅｔ  ａｌ，，１９９６）。ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳＩＩ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で複製した、ＨｔｒＡ１  ｃＤＮＡ、ａＢａｌ  Ｉ−ＢａｍＨＩフラグメント（ヌクレオチド６４４−１１９１）およびＢａｍＨＩ−ＨｉｎｃＩＩフラグメント（ヌクレオチド１１９１−１７５０）オーバーラップしていないフラグメントを、テンプレートとして用い、ＤＩＧＲＮＡ標識キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いて、ジゴキシゲニン標識したＲＮＡプローブを合成した。【００２７】  抗体、免疫染色およびウエスタンブロット分析
Ｅ．ｃｏｌｉ中で産生したＮおよびＣ末端ＨｔｒＡ１フラグメント（アミノ酸２８から１４３、アミノ酸３８５から４８０）を、ウサギに注射し、抗体を生じさせ、抗血清を、親和精製した。Ｎ末端フラグメントに対する精製ポリクローナル抗体を、免疫組織化学に使用した。この抗体は、マウスＨｔｒＡ３と交差反応をおこさなかった。免疫組織化学染色を、文献（Ｔｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）記載のチラミドシグナル増幅−アビジン−ビオチン−複合体法（ＴＳＡ−ＡＢＣ法）により行った。成体の骨を、１０％ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）中で脱石灰化させ、パラフィンに埋め込んだ。ウエスタンブロット分析のため、タンパク質試料を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離し、ニトロセルロース膜に移した。該膜を、適切な一次抗体、次いで、アルカリホスファターゼ標識した二次抗体でプローブし、続いてＢＣＩＰ／ＮＢＴ発色反応に供した。【００２８】  ＧＳＴ・プルダウンアッセイ
マウスＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−Ｐ２、ＢＭＰ−４、ＧＤＦ−５およびアクチビンの成熟ペプチドをコードするｃＤＮＡフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位を用いて、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）インフレームで複製した。全ＧＳＴ融合タンパク質を不溶性画分中で発現した。それらタンパク質を、文献（Ｇｒｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）の記載に従って、緩衝液を含有する８Ｍの尿素に溶解させ、変性させた。変性タンパク質を、ＧＳＴプルダウン緩衝液（２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮＰ−４０、および１０％グリコール）に透析した。ＨｔｒＡ１、その変異体およびｍｙｃタグ化フォリスタチンを、バキュロウイルス系を用いてｓｆ９細胞で産生した。各ｓｆ９培養上清を、一組のＧＳＴ融合タンパク質と混合し、４００μの、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％グリコール、０．１％ＮＰ−４０、０．３−１．０Ｍ  ＮａＣｌおよび５％子ウシ血清（ＦＢＳ）中で、一晩、４℃でインキュベートし、非特異的結合を最少にした。Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（２０μｌ）を、混合物に添加し、１時間４℃でインキュベートした。ビーズを、遠心分離によって回収し、５００μｌのＧＳＴプルダウン緩衝液で５回洗浄した。ビーズに結合したタンパク質を、上記記載のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ウエスタンブロットによって分析した。１．０Ｍ  ＮａＣｌ存在下でのプルダウンアッセイは、最も特異的かつ再現性のある結果を示した。【００２９】  固相結合アッセイ
ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）ウェルを、５０μｌの、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および５００ｍＭ  ＮａＣｌ中、１０μｇ／ｍｌのＧＳＴまたはＧＳＴ−ＢＭＰ−４により、４℃で一晩コートした。該ウェルを、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０のＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５）溶液）で２回洗浄し、非特異的結合部位を０．１％スキムミルクの洗浄緩衝液でブロッキングした。１０％ＦＢＳを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）中の種々の量のｍｙｃタグ化ＨｔｒＡ１タンパク質を、ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベトートした。次いで、該ウェルを、洗浄緩衝液で２回洗浄し、抗ｍｙｃ抗体とインキュベートし、洗浄緩衝液で５回洗浄し、アルカリホスファターゼコンジュゲート抗マウスＩｇＧとインキュベートした。結合ホスファターゼを、ｐ−ニトロフェニルホスフェートを用いてアッセイした。反応を１００ｍＭ  ＥＤＴＡで停止させ、４０５ｎｍにおける吸収を測定した。ＧＳＴ−ＢＭＰ４とＧＳＴ単独との吸収値の差異については、特異的結合を表わすものと考えられ、Ｋｄ値を決定するために使用した。培地中のＨｔｒＡ１濃度を、標準として細菌産生したＨｔｒＡ１を用いて、抗ＨｔｒＡ１抗体を用いるウエスタンブロットによって定量した。【００３０】  細胞培養、トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ
マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞を、２４ウェルプレートで１５％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中で培養した。トランスフェクションの４時間前に、培養培地を、２％ＦＢＳを含有する新しい培地にかえた。細胞のトランスフェクションを、添付図面に記載のように、内部コントロールとして１２５ｎｇのβ−ガラクトシダーゼ発現ベクターおよび他のプラスミドＤＮＡを用いるカルシウム・リン酸法により実施した。細胞抽出物を、トランスフェクションの２４時間後に調製し、Ｐｉｃａｇｅｎｅ  ｋｉｔ（Ｔｏｙｏ  Ｉｎｋ  Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｔｏｋｙｏ）を用いて、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。ルシフェラーゼ活性を、β−ガラクトシダーゼ活性を用いて、トランスフェクション効率について補正した。ＢＭＰ−４またはｃａＢＭＰＲ−ＩＢ発現ベクターによるＣ２Ｃ１２細胞のトランスフェクションは、文献（Ｐｅａｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｋａｔａｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）記載のように、ｐＧＬ３−Ｉｄ９８５ＷＴリポーターを数倍刺激した。Ｓｍａｄ１および／またはＳｍａｄ４発現は、それぞれＢＭＰ−４またはＴＧＦ−β１の存在下でｐＧＬ３−Ｉｄ９８５ＷＴまたはｐＧＬ３ｔｉ−（ＳＢＥ）４リポーターをさらに刺激した。ただし、Ｓｍａｄ発現単独では、それらのリポーターを活性化しなかった。【００３１】  ニワトリ胚におけるＨｔｒＡ１のミス発現
ＨｔｒＡ１  ｃＤＮＡを、２方向でｐＣＡＧＧＳベクターに挿入し、センスおよびアンチセンス鎖を発現した。培養した２９３Ｔ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＥＧＦＰ発現ベクターおよびセンスまたはアンチセンスｃＤＮＡを含有するｐＣＡＧＧＳベクターとともに共トランスフェクトした。ｐＥＦ−Ｂｏｓ−ｎｏｇｇｉｎベクターを用いて、ｎｏｇｇｉｎを発現した。細胞をトランスフェクションの４８時間後に集め、少量の培養培地に縣濁した。細胞縣濁液（０．１μｌ以下）を、外眼間葉に注入した。【００３２】  ｐＣＡＧＧＳ−ＨｔｒＡ１ベクターとＥＧＦＰベクターを文献（Ｋｏｓｈｉｂａ−Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）記載のように眼胞に電気穿孔した。２４−２７時間インキュベーション後、胚を１．４ｋｂ  ｃＶａｘプローブによる全マウント・イン・シチュ・ハイブリダイゼーションに付した。【００３３】  ＨｔｒＡ１の発現
ＨｔｒＡ１  ｍＲＮＡは、９．５ｄｐｃまたは初期胚では、ノーザン分析およびＲＴ−ＰＣＲの何れにおいても検出できなかった（データ示さず）。１０．５ｄｐｃで最初に検出され、そのレベルは１４．５ｄｐｃで増加し、生まれるまで同レベルのままであった。【００３４】  ＨｔｒＡ１発現を正確に位置づけるため、胚および成体組織のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションと免疫染色を行った。２つのオーバーラップしないプローブをｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用い、両プローブで同一の結果を得た。免疫染色では、ＨｔｒＡ１のＮ末端領域（アミノ酸２８−１４３）に対して作成したポリクローナル抗体を用いた。免疫染色の結果は、種々の組織においてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果と一致し（図６ＤおよびＥ）、この抗体の特異性を確認した。１２．５ｄｐｃの胚において、ＨｔｒＡ１  ｍＲＮＡは、脊柱および手足の骨格エレメントに極めて近いパターンで発現した（図５Ａ）。１２．５ｄｐｃの胚の矢状切片において、ＨｔｒＡ１の発現は、脳、心臓、肺、生殖腺および胸腹部領域の皮膚でも見られた（図５Ｂ）。ＨｔｒＡ１の発現は、１４．５ｄｐｃで増進された（図５Ｃ）。骨格組織では、ＨｔｒＡ１は、椎骨に沿った腱および靭帯の原基痕跡においておよび前軟骨凝集周囲の間葉細胞において発現した（図５Ｂ、ＣおよびＤ）。脳では、ＨｔｒＡ１は、脈絡膜叢の発達に伴い、前脳および後脳中の神経上皮の特定領域で発現した（図５Ｂ）。これは１４．５ｄｐｃの胚の後脳において明らかに見ることができ（図５Ｅ）、ＨｔｒＡ１の発現は形成中の脈絡膜叢に隣接する神経上皮において検出された。しかし、成熟脈絡膜叢は、ＨｔｒＡ１を発現しなかった（図５Ｅ）。ＢＭＰサブファミリーのうちの幾つかのメンバーは、各メンバーに特徴的なパターンで発達する脳において発現することが報告されている。脈絡膜叢発達部位は、すべてのＢＭＰが共発現する領域であることは興味深い（Ｆｕｒｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。【００３５】  １１．５ｄｐｃの胚の心臓において、ＨｔｒＡ１は、房室（ＡＶ）心内膜床および流出路中で発現した（図５Ｆ）。１２．５ｄｐｃでは、ＨｔｒＡ１は心内膜床で発現し（図５ＢおよびＧ）、１４．５ｄｐｃでは、弁を含む流出路で強く発現した（図５Ｃ）。ＡＶ床および流出路の発達は、ＴＧＦ−βタンパク質によるシグナル伝達に依存する。ＴＧＦ−βは、これらの領域における内皮細胞の上皮間葉移動（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）（ＥＭＴ）を誘導し、それらの領域に間葉の特性を供与する（Ｎａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。確かに、ＴＧＦ−β２ノックアウトマウスは、ディスターブ（ｄｉｓｔｕｒｂ）したＥＴＭにより心臓の隔壁および弁において欠損が見られる（Ｓａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。ＥＴＭの他のよく知られる例は、雄性生殖腺におけるＭｕｅｌｌｅｒｉａｎ管の退行に見られる（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ＴＧＦ−βファミリーの異なるメンバー、抗Ｍｕｅｌｌｅｒｉａｎホルモン（ＡＭＨ）は、Ｍｕｅｌｌｅｒｉａｎ管細胞においてアポトーシスとＥＭＴを誘導し、退行を誘導する。ＨｔｒＡ１は、雄性および雌性の生殖腺の両方においてＭｕｅｌｌｅｒｉａｎ管細胞およびその周囲の間葉で発現した（図５ＢおよびＨ）。ＨｔｒＡ１  ｍＲＮＡは、肺上皮下の間葉細胞において検出され（図５Ｂ、ＣおよびＩ）、ＴＧＦ−βファミリーメンバーにより仲介される上皮間葉相互作用は、気道の発達および枝分かれに重要な役割を果たす（Ｗａｒｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。１２．５ｄｐｃの胚の皮膚において、表皮および真皮の両方においてＨｔｒＡ１が発現した（図５Ｂ）。ＨｔｒＡ１  ｍＲＮＡは、１４．５ｄｐｃでの発達中のひげの上皮コンポーネントでも検出された（図５Ｊ）。後段階では、ＨｔｒＡ１は、表皮の基底層中におよびひげ原基を形成する侵襲上皮細胞（ｉｎｖａｄｉｎｇ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｃｅｌｌ）中に局在化した（図５Ｋ）。ＢＭＰの強力なインヒビターであるＮｏｇｇｉｎは、真皮乳頭（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ）で発現し、毛包形成を調節する（Ｂｏｔｃｈｋａｒｅｖ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。誕生後９日目で、ひげがほぼ充分に発達したとき、ＨｔｒＡ１は、アウタールートシート（ｏｕｔｅｒ  ｒｏｏｔ  ｓｈｅｅｔ）で検出された（図５Ｌ）。ＴＧＦ−βシグナル伝達は、アウタールートシートにおけるアポトーシス促進による毛包退行の間の休止期誘導を調節することが示唆されている（Ｆｏｉｔｚｉｋ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。【００３６】  ＨｔｒＡ１の発現パターンと、ＨｔｒＡ１タンパク質中のフォリスタチンに類似するドメインの存在を伴う種々のＴＧＦ−βタンパク質の機能部位との間の、顕著な相関関係は、ＨｔｒＡ１がＴＧＦ−β仲介シグナル伝達おいてある役割を果たしていることを示す。【００３７】  発達中の骨格エレメントにおけるＨｔｒＡ１発現
骨格組織は、形態形成の間のＴＧＦ−βシグナル伝達に関して最も集中的に研究された器官であり、そしてＨｔｒＡ１の発現は、ヒト関節炎患者の関節軟骨細胞で増加すると報告されているので（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、骨および関連組織の発達の間のＨｔｒＡ１発現を詳細に調べた。１２．５ｄｐｃおよび１４．５ｄｐｃの胚に関して上記したように、ＨｔｒＡ１は、前軟骨凝集周囲の未分化間葉細胞中で発現するが、凝集コアでは検出されなかった（図５Ｂ、ＣおよびＤ）。しかし、前軟骨凝集内では、後に関節腔を形成する関節帯間（ｊｏｉｎｔ  ｉｎｔｅｒｚｏｎｅ）は、ＨｔｒＡ１を発現した（図６ＡおよびＢ）。前軟骨凝集の付近の間葉から発達する腱および靭帯の原基は、ＨｔｒＡ１を発現した（図５Ｄ、図６ＢおよびＣ）。軟骨内性骨化のプロセスにおいて、成熟した軟骨細胞は、肥大し、退化し、次いで、石灰化した骨に置き換わる。前軟骨凝集および軟骨細胞は、ＨｔｒＡ１を発現しなかったが、骨化中心では強力なＨｔｒＡ１発現が見られた。図６ＤおよびＥは、それぞれ１４．５ｄｐｃおよび１５．５ｄｐｃの胚の肋骨におけるＨｔｒＡ１  ｍＲＮＡおよびそのタンパク質を発現する一次的な骨化中心を示す。これらの図はまた、ＨｔｒＡ１を発現する肋骨の軟骨膜および骨膜を示す（図６ＤおよびＥ）。１７．５ｄｐｃの胚の後足では、有意なＨｔｒＡ１発現が腱および靭帯で維持されていたが、形成中の関節での発現は減少し、弱いシグナルが関節表面の薄い層で検出されるのみであった（図６Ｆ）。成体の骨では、ＨｔｒＡ１タンパク質が骨マトリクス中に蓄積するようであるが（図６Ｇ、ＨおよびＩ）、このマトリックスはＴＧＦ−β１が高濃度で蓄積することが知られている（Ｋｒｅｓｓｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｏｅｎｈｅｒｒ，２００１）。腱の細胞は、ＨｔｒＡ１を産生し続けた（図６Ｈ）。ＨｔｒＡ１は、関節軟骨（図６ＧおよびＩ）や成長板の軟骨細胞（図６ＧおよびＨ）で有意に検出されることはなかった。しかし、実験的関節炎を誘発させるため、抗コラーゲン抗体カクテルでマウスを攻撃すると、関節軟骨細胞、特に深い層でのこの細胞は、高レベルのＨｔｒＡ１を産生し始めた（Ａ．Ｔｓｕｔｃｈｉｙａ，非公開データ）。【００３８】  観察されたＨｔｒＡ１の空間時間的発現パターンは、ＨｔｒＡ１がＴＧＦ−βタンパク質のシグナリングを調節することを強く示すものである。【００３９】  ＴＧＦ−βファミリータンパク質に対するＨｔｒＡ１の結合
ＴＧＦ−βシグナリングにおけるＨｔｒＡ１の包含を確認するため、ＴＧＦ−βファミリータンパク質に対するＨｔｒＡ１の結合活性を試験した。成熟型のマウスＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＢＭＰ−４、ＧＤＦ−５またはアクチビンを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ＧＳＴ融合タンパク質として発現させた。ＨｔｒＡ１タンパク質は、バキュロウイルス発現系で発現させた。最初に、これらのＴＧＦ−βタンパク質に対するフォリスタチンの結合を試験した。フォリスタチンは、アクチビンに最も強く結合し、ＢＭＰ−４に弱く結合したが、他のタンパク質には全く結合しなかった（図７Ａ、ａ）。フォリスタチンのこの結合特異性は、従来の報告（Ｉｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）と一致し、そのため、我々の結合アッセイの有効性が確認された。ＧＳＴプルダウンアッセイは、ＨｔｒＡ１タンパク質が、試験した全てのＴＧＦ−βファミリータンパク質と結合することを示した（図７Ａ、ｂ）。【００４０】  ＴＧＦ−βファミリーメンバーに対するＨｔｒＡ１およびフォリスタチンの親和性を、ＧＳＴプルダウンアッセイにおけるＨｔｒＡ１とフォリスタチンの回収を評価することにより比較した。ＧＳＴ−ＢＭＰ４によるＧＳＴプル−ダウンは、導入ＨｔｒＡ１の３％を超えるが（図７Ａ、ｂでレーン４と７を比較）、１０％未満（データ示さず）である回収を生じた。この回収は、フォリスタチンとＧＳＴ−アクチビンとのそれに匹敵する（図７Ａ、ａ）。これは、ＢＭＰ−４に対するＨｔｒＡ１の結合が有意であることを示す。ＴＧＦ−βタンパク質に対するＨｔｒＡ１親和性は、ＢＭＰ−４＞ＴＧＦ−β２＞ＴＧＦ−β１＞アクチビン＞ＧＤＦ５のように減少した（図７Ａ、ｂ）。ＨｔｒＡ１は、このＧＳＴプルダウンアッセイにおいて、上皮増殖因子（ＥＧＦ）および基底繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）に対する有意な親和性を示さず、これは、ＴＧＦ−βタンパク質に対するＨｔｒＡ１の特異的結合を支持するものである（データ示さず）。【００４１】  結合親和性を定量的に測定するため、ＨｔｒＡ１に対する固相結合アッセイを採用した（図７Ｃ）。ＢＭＰ−４に対するＨｔｒＡ１のＫｄ値は、１．３ｎＭと評価された。この親和性を、報告されている、フォリスタチン（ＦＳ−３１５）のアクチビンに対する親和性（Ｋｄ＝４３０ｐＭ）（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）やフォリスタチン（ＦＳ−２８８）のＢＭＰ−４に対する親和性（Ｋｄ＝２３ｎＭ）（Ｉｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）に匹敵する。【００４２】  ＢＭＰ−４およびＴＧＦ−β１シグナル伝達の阻害
ＨｔｒＡ１は、ＴＧＦ−βタンパク質により仲介されるシグナル伝達を阻害し得るかどうかを調べた。マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞細胞における転写アッセイ（Ｋａｔａｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）により、ＢＭＰ−４およびＴＧＦ−β１シグナル伝達におけるＨｔｒＡ１の効果をアッセイした。ＢＭＰシグナル伝達では、ルシフェラーゼ遺伝子がネズミＩｄ遺伝子から誘導されるＢＭＰ−応答性プロモーターエレメント（Ｋａｔａｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）により操作される、リポータープラスミドｐＧＬ３−Ｉｄ９８５ＷＴを使用した。ＢＭＰ−４発現ベクターによるＣ２Ｃ１２細胞のトランスフェクションは、Ｐｅａｒｃｅらの文献（Ｐｅａｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）の記載と同様にＩｄプロモーターを数倍刺激し、Ｓｍａｄ１およびＳｍａｄ４発現ベクターの共トランスフェクションは、更にＩｄプロモーターを１１倍にまで刺激した（図８Ａ）。ＨｔｒＡ１発現ベクターの添加は、用量依存的にＢＭＰ−４シグナリングを阻害した（図８Ａ）。ＢＭＰ−４シグナリングに対するＨｔｒＡ１の阻害活性は、Ｎｏｇｇｉｎよりも弱いように思われる（図８Ａ）。【００４３】  ＴＧＦ−β１シグナリングに対するＨｔｒＡ１の効果を、ｐＧＬ３ｔｉ−（ＳＢＥ）４リポーターを用いて調べた。このリポーターは、ルシフェラーゼ遺伝子の上流のｃ−Ｊｕｎプロモーター（Ｊｏｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）由来の４つのタンデムＳｍａｄ結合エレメントを含む。Ｓｍａｄ４発現ベクターによるＣ２Ｃ１２細胞のトランスフェクションおよび濃度１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＧＦ−βタンパク質の添加により、このリポーターは約２０倍まで活性化された（図８Ｂ）。ＨｔｒＡ１発現ベクターの共トランスフェクションは、用量依存的にＴＧＦ−β１シグナリングを阻害した。Ｎｏｇｇｉｎは、ＢＭＰの特異的アンタゴニストであるが、ＴＧＦ−β１に結合せず、またそのシグナリングも阻害しない。ｎｏｇｇｉｎ発現ベクターの共トランスフェクションは、ＴＧＦ−β１シグナリングを阻害せず、むしろ活性化した。【００４４】  構成的に活性なＢＭＰ−４レセプターであるｃａＢＭＰＲ−ＩＢは、リガンドの非存在下でＩｄプロモーターを刺激する（Ａｋｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｋａｔａｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。ＨｔｒＡ１は、ｃａＢＭＰＲ−ＩＢから生ずるシグナルを阻害しなかった（図８Ｄ）。この結果は、ＨｔｒＡ１が細胞内シグナリング経路を阻害するという可能性を排除するものである。【００４５】  ＨｔｒＡ２、哺乳類ＨｔｒＡファミリーの別のメンバーである、ＨｔｒＡ２の過剰発現は、アポトーシスを誘導することが示された（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ＨｔｒＡ１発現ベクターによるＣ２Ｃ１２のトランスフェクション後のヨウ化プロピジウム染色によって細胞死をアッセイした。死んだ細胞数は、ＨｔｒＡ１過剰発現によっては増加しなかった（データ示さず）。これは、ＨｔｒＡ１過剰発現がＣ２Ｃ１２における細胞死を誘導するという可能性を排除するものである。【００４６】  結合および阻害に必要なドメイン
ＴＧＦ−βに対する結合およびＴＧＦ−βによるシグナリングの阻害に関係するＨｔｒＡ１タンパク質のドメインを、一連のＨｔｒＡ１変異体タンパク質を産生することによって決定した。当該変異体の模式的説明を図９に示す。野生型（ＷＴ）ＨｔｒＡ１タンパク質は、それぞれ最高および最低アフィニティでＢＭＰ−４およびＤＧＦ−５に結合するので、変異体のこれらの２種のリガンドに対する結合について調査した。ＢＭＰ−４シグナリングの阻害は、ＢＭＰ−４／Ｓｍａｄ１／Ｓｍａｄ４共トランスフェクションアッセイにより試験された。予測に反して、フォリスタチン様ドメインではなく、プロテアーゼドメインとそれに先行するリンカー領域（ａａ１５−２０２）が両方の活性に必須であることが見出された。【００４７】  ＩＧＦＢＰおよびＫＩドメインの両方において欠失を有する変異体（ΔＦＳ）（これら２つのドメインを一緒にしてＦＳと称する）は、ＷＴ  ＨｔｒＡ１と同等の親和性をもって、ＢＭＰ−４およびＧＦＦ−５に結合した（図７Ｂ、ａ）。ΔＦＳは、ＢＭＰ−４シグナル伝達を、極めて効率的に阻害した（図８Ｃ）。ＦＳドメインのみを保持する欠失変異体（Δリンカー／ＳＰ／ＰＤＺ）は、結合活性（図７Ｂ、ｃ）またはＢＭＰ−４シグナル伝達に対する阻害活性（図８Ｃ）を示さなかった。ＰＤＺドメインは、結合に関係しなかった；ＦＳドメインおよびＰＤＺドメインの両方における欠失変異体（ΔＦＳ／ＰＤＺ）は、ＢＭＰ−４およびＧＤＦ−５への結合活性ならびにＢＭＰ−４シグナル伝達に対する阻害活性を保持した（図７Ｂ、ｂおよび図８Ｃ）。他の変異体についての結果を図９に要約する。Ｎ末端欠失がリンカー領域（ΔＦＳ／リンカー）にまで及んだ場合、結合および阻害活性は減少した。ＳＰドメインを欠く変異体（ΔＳＰ／ＰＤＺ）は、結合および阻害活性を完全に欠いていた。これらの結果は、当該リンカーとＳＰドメインが、ＴＧＦ−βタンパク質に対する結合およびその阻害に必須であることを示すものである。【００４８】  次に、セリンプロテアーゼ活性が、ＴＧＦ−βファミリータンパク質に対する結合およびその阻害に必要であるかどうかを試験した。触媒中心の３２８位のセリン残基を、アラニンで置換した。この変異体Ｓ３２８Ａはプロテアーゼ活性を示さないものであった（データ示さず；Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８参照）。Ｓ３２８Ａは、ＷＴ  ＨｔｒＡ１のそれに匹敵する親和性をもって結合活性を示した（図７Ｂ、ｄ）。従って、セリンプロテアーゼ活性は結合活性について必須のものではない。対照的に、この変異体は、ＢＭＰ−４シグナリング阻害について全く不活性であった（図８Ｃ）。【００４９】  これらの結果は、リンカー領域およびＳＰドメインが結合および阻害活性の両方に必要であることおよびセリンプロテアーゼ活性がＴＧＦ−β介在シグナル伝達に対するＨｔｒＡ１の阻害活性に必要とされることを示すものである。ウェスタンブロッティングにより、Ｃ２Ｃ１２培養培地で、抗血清が検出しなかったΔＦＳ／ＰＤＺを除く全ての変異体の発現レベルを試験した（図８Ｃの挿入写真参照）。各変異体について生産レベルにいくらかのバラつきが観察されたが、顕著でものではなく、結論に影響を与えるものではない。しかし���Ｃ２Ｃ１２培地におけるΔＦＳの発現レベルは、ＷＴによるそれらの１／３より小さいことが注目された（データ示さず）。これらの発現レベルを考慮すると、ΔＦＳの阻害活性は、ＷＴのそれよりもより高いものと考えられる。また、この試験で使用した変異体のプロテアーゼ活性を測定し、プロテアーゼ活性がシグナル阻害とよく相関することを見出した。【００５０】イン・オボのにわとりヒナ眼発生の阻害
ＨｔｒＡ１がインビボでＴＧＦ−βタンパク質によるシグナル伝達を阻害するかどうかを決定する試みにおいて、我々は、インオボのにわとり眼分化中の外因性ＨｔｒＡ１の効果を試験した。この試験のもう１つの目的は、分泌ＨｔｒＡ１タンパク質が、細胞外的にＴＧＦ−βタンパク質を阻害するかどうかを試験することであった。ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７の両方は、レンズ発生の早期段階で重要な役割を演じるものである（Ｄｕｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｗａｗｅｒｓｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｆｕｒｕｔａ  ａｎｄ  Ｈｏｇａｎ，１９９８；Ｃｈｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｇ，２００１）。眼胞におけるｎｏｇｇｉｎのミス発現は、外因性ＢＭＰシグナル伝達を阻害すること、レンズおよび網膜の発生が厳しく抑制されること、そして小眼球症（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ）を生じることが示された（Ａｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｌｅｃｋｙ−Ａｄａｍｓ，２００２）。【００５１】  培養２９３Ｔ細胞を、マウスＨｔｒＡ１発現ベクターまたはＨｔｒＡ１ｃＤＮＡのアンチセンス鎖を発現するコントロールベクターのいずれかで、一過性にトランスフェクトした。２９３Ｔ細胞の懸濁物を、ステージ９−１０のにわとり胚の眼胞付近の眼外間葉内に注入した。注入した２９３Ｔ細胞をモニターするため、ＧＦＰ発現ベクターを共トランスフェクトした（図１０Ａ、Ｊ参照）。ステージ２３−２４において、胚の眼形態を調査した。ＨｔｒＡ１発現２９３Ｔ細胞を注入された胚の２３％が、非注入側よりも、注入側においてより小さいレンズを有しており（ｎ＝４３）（図１０ＢおよびＣ）、他方、コントロール２９３Ｔ細胞を注射された胚は、この表現型を示さなかった（ｎ＝２５）。網膜について、ＨｔｒＡ１発現細胞を注入した胚の３３％が、より小さい色素性網膜を有していた（図１０ＢおよびＣ）。反対に、コントロール２９３Ｔ細胞を注入した胚の８％のみが、コントロール側よりもより小さい色素性網膜を示したが、これは注入処理によって生じた物理的損傷のためとも考えられる。ｎｏｇｇｉｎ発現２９３細胞を注入したとき、胚の８０％がより小さいレンズを発生し、胚の８７％がより小さい色素性網膜を示した（ｎ＝１５）（図１０ＫおよびＬ）。ＨｔｒＡ１の影響は、このようにｎｏｇｇｉｎよりも明かに弱いものであった。ＨｔｒＡ１の効力を評価するため、ｎｏｇｇｉｎ発現細胞を、コントロール２９３Ｔ細胞で希釈した。ｎｏｇｇｉｎ発現細胞の約３−１０倍希釈物は、ＨｔｒＡ１発現細胞と同程度の阻害を示し（データ示さず）、このことはＨｔｒＡ１の効力がｎｏｇｇｉｎよりも数倍低いことを示すものである。【００５２】  眼の前面断面は、ＨｔｒＡ１処理アイカップの大きさがコントロールのそれよりずっと小さいことを明らかに示すものであった（図１０Ｄ、Ｅ）。注入側の眼はコントロール側と比較して、レンズ直径がより小さく、レンズもより薄いものであった。これは初期レンズ繊維の伸長が顕著に抑制されたためである（図１０Ｆ、Ｇ）。ＨｔｒＡ１処理の眼で見られる表現型は、ｎｏｇｇｉｎ処理の眼で見られるものと区別できなかった（図１０Ｍ−Ｐ）（Ｆａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｂｅｌｅｃｋｙ−Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。【００５３】  網膜の発生はまた、ＨｔｒＡ１またはｎｏｇｇｉｎ処理の眼において異常であった；神経網膜は、正確な層で配列されず、網膜色素上皮と隔離され（図１０Ｅ、Ｉおよび図１０Ｎ、Ｒ）、そしてある場合には網膜細胞が凝集していた（データ示さず）。ＨｔｒＡ１処理した目の腹側眼胚では、神経上皮様組織が、正常の網膜色素上皮を置換する（図１０Ｈ、Ｉ）。上皮細胞型のこの異常な遷移は、ｎｏｇｇｉｎ処理した眼で観察され（図１０Ｑ、Ｒ）、これは先に報告されたことでもある（Ａｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｌｅｃｋｙ−Ａｄａｍｓ，２００２）。【００５４】  結論として、ＨｔｒＡ１処理の眼で観察されたすべての異常は、ｎｏｇｇｉｎによって生じたものと区別できないが、重度において相違するものであった。この結果は、分泌ＨｔｒＡ１がまた、インビボのＢＭＰシグナル伝達を細胞外的に阻害することができることを示すものである。【００５５】  ＨｔｒＡ１過剰発現によるｃＶａｘ発現の誘導
ｃＶａｘの発現がインビボのＨｔｒＡ１ミス発現によって影響を受けるか否かを試験した。
網膜をｖｅｎｔｒａｌｉｚｅするｃＶａｘの発現は、網膜の腹側半分に制限され、網膜をｄｏｒｓａｌｉｚｅするＴｂｘ５の発現は、背側半分に制限される。ＢＭＰ−４シグナル伝達は、これらの２種の転写因子遺伝子の発現を制御することによって神経網膜中の背／腹側極性の決定を調節する（Ｓｃｈｕｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋｏｓｈｉｂａ−Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ｎｏｇｇｉｎまたはｖｅｎｔｒｏｐｔｉｎのようなＢＭＰアンタゴニストの過剰発現は、ｃＶａｘ発現の上方調節およびＴｂｘ５発現の下方調節につながる（Ｋｏｓｈｉｂａ−Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｓａｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ステージ１０−１１の眼胞内にＨｔｒＡ１発現ベクターをエレクトロポレーションし、ステージ１７−１８で２４−２８時間にわたって培養した後、ｃＶａｘ発現を試験した。ｃＶａｘの発現は、非処理の眼の網膜の腹側に制限された（図１０Ｔ）。しかし、ＨｔｒＡ１発現ベクターでエレクトロポレーションした網膜では、ｃＶａｘ発現は、腹側半分で上方調節され、背側半分に拡張した（図１０Ｕ）。ＧＦＰ発現ベクター単独のエレクトロポレーションは、ｃＶａｘ発現に影響を有しなかった（データ示さず）。これらのデータは、ＨｔｒＡ１ミス発現が、ＢＭＰ−４シグナル伝達を阻害することによって網膜をｖｅｎｔｒａｌｉｚｅすることを示すものである。インオボの実験から得られた結果は、ＨｔｒＡ１がＢＭＰシグナル伝達を細胞外的に減衰させる新規な阻害剤であることを示すものである。【００５６】  以上、ＨｔｒＡ１は、ＢＭＰ、ＧＤＦおよびＴＧＦ−βサブファミリーのメンバーを含む、広い範囲のＴＧＦ−βファミリーメンバーに結合することが証明された。また、ＨｔｒＡ１は、インビトロおよびインビボの両方で細胞外的にＴＧＦ−βのシグナル伝達を阻害することが出来ることが証明された。発生中の発現パターンに基づき、ＨｔｒＡ１はある範囲の組織において種々のＴＧＦ−βファミリーメンバーによるシグナル伝達の調節に生理学的に関与しているものと理解される。特に重要なことは、ＨｔｒＡ１が、ＴＧＦ−β１やＴＧＦ−β２のようなＴＧＦ−βサブファミリーメンバーの阻害剤であることである（図７および８）。これまでＴＧＦ−βサブファミリーメンバーについては、潜在−関連タンパク質（ＬＡＰ）やデコリン（ｄｅｃｏｒｉｎ）（Ｍａｓｓａｇｕｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，２０００，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）のようなごく僅かなアンタゴニストが報告されているに過ぎない。【００５７】  形態発生中のＨｔｒＡ１の発現
脳において、ＨｔｒＡ１発現が、脈絡叢が神経上皮から生じる領域で観察された。脈絡叢発生におけるＢＭＰシグナル伝達の重要性は、Ｉ型ＢＭＰレセプター（Ｂｍｐｒ１ａ）遺伝子の条件的ノックアウトマウスを使用する研究で最近実証された；終脳のＢｍｐｒ１ａの破壊は、脈絡叢の欠損につながる（Ｈｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。【００５８】  心臓および生殖腺の発生において、ＨｔｒＡ１の発現は、ＥＭＴ、ＴＧＦ−βシグナル伝達によって調節される過程と密接に関連すると考えられる。ＨｔｒＡ１とＥＭＴの間の関連性は、また、悪性癌において種々に発現される遺伝子についての幾つかの研究から提唱されている。ＨｔｒＡ１発現の下方調節が、メラノーマ（Ｂａｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）や卵巣癌（Ｓｈｒｉｄｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）の進行または転移の後期段階中に繰り返し観察されている。癌侵襲および転移の過程は、ＥＴＭに反復発生させることが証明されており、ある種の型の癌では、ＴＧＦ−βシグナル伝達によって増強される（Ｍｏｕｓｔａｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。従って、ＨｔｒＡ１がＴＧＦ−βシグナル伝達に拮抗することによって癌細胞のＥＭＴを抑制するものと理解される。【００５９】  骨およびそれらの付随組織の発生中に、ＨｔｒＡ１は、軟骨細胞分化を抑制し、間葉を非脈絡型、例えば骨膜、軟骨膜、関節、腱および靭帯に転換するものと考えられる。これは、ＢＭＰ類およびＴＧＦ−β類が、間葉細胞からの軟骨細胞の分化を増進するという事実と一致する（Ｃａｐｄｅｖｉｌａ  ａｎｄ  Ｂｅｌｍｏｎｔｅ，２００１）。腱および靭帯の発生はまた、ＢＭＰ／ＧＤＦタンパク質によるシグナル伝達に依存する。ＢＭＰシグナル伝達は、腱前駆体が生じる領域を特定するようであり、一方、追加的シグナル、例えばＧＤＦ−６、−７およびＴＧＦ−β２は、腱のさらなる成熟に要求され得る（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｗｏｌｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｍｅｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ＨｔｒＡ１は、発生のより後期段階において腱で発現されるから、ＨｔｒＡ１が腱の成熟を調節することは可能である。【００６０】  ＨｔｒＡ１は、関節間領域で発現され、そして関節発生、すなわちＢＭＰ／ＧＤＦシグナル伝達によって密接に調節される過程（Ｂｒｕｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｆｒａｎｃｉｓ−Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）を制御する。また、ＴＧＦ−βサブファミリーが介在するシグナル伝達が成人関節の維持に関与することが提唱されている。ＴＧＦ−βは、これらの正常な、非分化状態に関節軟骨細胞を維持するために必要である。優性ネガティブ、キナーゼ欠損ＴＧＦ−βＩＩ型レセプター遺伝子を有するトランスジェニックマウス（Ｓｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）またはＳｍａｄ３ノックアウトマウス（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）は、ヒト変形性関節炎に非常に類似した表現型を示した。これらのマウスでは、ＴＧＦ−βシグナル伝達の抑制はおそらく、関節軟骨細胞の末端分化を促進し、変形性関節炎様表現型につながる。興味深いことに、ヒトＨｔｒＡ１の発現は、変形性関節炎を有する患者の関節カートリッジ細胞で実質的に増加した（Ｈｕ  ｅｔ  ａ��．，１９９８）。ＨｔｒＡ１がＴＧＦ−βに拮抗し、変形性関節炎を悪化させることは可能である。【００６１】  ＨｔｒＡ１の機能ドメイン
全く予測できなかったことであるが、ＩＧＦＢＰおよびＫＩ（またはフォリスタチン様）ドメインではなく、リンカー領域およびＳＰドメインが、ＨｔｒＡ１
のＴＧＦ−βファミリーメンバーに対する結合に必要であることが見出された。【００６２】  リンカー領域は、４種のＨｔｒＡ１メンバー間で高度に保存される（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ＨｔｒＡ２のリンカー領域は、三量体形成に必須である。これは、ＨｔｒＡ１が、ＨｔｒＡ２と同様にホモ三量体を形成し得ることを示唆する。各ＨｔｒＡ１変異体のＴＧＦ−βファミリータンパク質に対する結合活性は、可能な三量体的構造を形成するその能力と密接に関連しているように理解される。例えば、リンカー領域を欠く突然変異体、ΔＦＳ／リンカーは、ＴＧＦ−βファミリータンパク質に結合することが出来なかった。対照的に、プロテアーゼ活性を保有していないが、三量体を形成することが可能と思われるＳ３２８Ａ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）は、阻害活性を欠くとはいえ、ＴＧＦ−βファミリータンパク質に対する結合活性が証明されている。【００６３】  ＨｔｒＡ１のＰＤＺドメインは、結合または阻害活性に必要ではない。ＨｔｒＡ２のＰＤＺドメインは、タンパク質分解活性を否定的に調節する。仮説的三量体アポトーシスレセプターは、ＰＤＺドメインに結合すると考えられ、そしてＨｔｒＡ２のタンパク質分解活性を増強する（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ＨｔｒＡ１のＰＤＺドメインは、類似の調節機能を有し得る。実際、ＰＤＺドメインを欠く２種の突然変異体、ΔＰＤＺおよびΔＦＳ／ＰＤＺは、野生型ＨｔｒＡ１よりもより強いＴＧＦ−βシグナル伝達阻害活性を有するようであった（図９）。酵母２ハイブリッドスクリーニングは、ＨｔｒＡ１のＰＤＺドメインに対する結合ファクターとして最も頻繁に三量体細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質を単離した（Ｍｕｒｗａｎｔｏｋｏ，非公開データ）。ＴＧＦ−βシグナル伝達は、ＥＣＭと緊密かつ相互の関連性を有する；ＥＣＭの産生はＴＧＦ−βシグナル伝達によって調節され、逆もそうである（Ｋｒｅｓｓｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｏｅｎｈｅｒｒ，２００１）。分泌ＨｔｒＡ１は、細胞周辺のＥＣＭへ結合し、充分に活性となり、その後ＴＧＦ−βシグナル伝達を調節することができる。ＨｔｒＡ１の阻害活性は、インビトロ（図８Ａ）およびインビボ実験（図１０）によると、ｎｏｇｇｉｎのそれよりも３〜１０倍弱い。１つの説明は、ＨｔｒＡ１がＥＣＭタンパク質に結合し、活性化されなければならず、かくしてそれは半自己分泌ファクターとして十分に機能することになる。【００６４】  ＩＧＦＢＰおよびＫＩドメインの機能は、なお、解明される必要がある。これらのドメインを欠くΔＦＳは、増強された、ＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害活性を有するように思われた（図１０参照）。Ｎ末端ＦＳドメインは、ＨｔｒＡ１のプロテアーゼ活性の他の調節機能を有することができる。【００６５】  ＨｔｒＡ１プロテアーゼ活性が、ＴＧＦ−βタンパク質によるシグナル伝達を阻害する機構は、さらに明確化する必要がある。ＧＳＴプルダウンアッセイ中に、ＨｔｒＡ１によるＧＳＴ−ＴＧＦ−βタンパク質の分解は、何ら検出されなかった。さらに、タグ付加されてないヒト組換えＴＧＦ−βおよびＢＭＰ−２ならびに２９３Ｔ細胞によって生産されたｍｙｃ−タグ付加ＢＭＰ−４は、すべてＨｔｒＡ１に抵抗性であった���データ示さず）。これは、インビボでのＴＧＦ−βタンパク質の分解可能性を排除するのではない。何故なら、ＴＧＦ−βタンパク質の分解は、ＰＤＺドメインに結合するＥＣＭタンパク質のような共ファクターを要求するからである。また、ＨｔｒＡ１は、ＴＧＦ−βファミリータンパク質についてのレセプターまたはＴＧＦ−βシグナル伝達を肯定的に調節する細胞外タンパク質を分解することができる。これらの場合に、ＨｔｒＡ１のＴＧＦ−βに対する特異的および高親和性結合は、ＨｔｒＡ１を基質タンパク質に接近させるものであり、かくして効率的な分解を容易にすることができる。【００６６】  考慮しなければならないもう１つの可能性は、ＴＧＦ−βタンパク質に対する結合が、シグナル伝達の明白な阻害に適切でないことである。これまで、この結合がＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害に必須であることを示す証拠は得られていない。ＨｔｒＡ１がＥＣＭを消化し、ＴＧＦ−βシグナル伝達を間接的に阻害することは可能である。実際、ＥＣＭの主要なプロテオグリカン、デコリンおよびビグリカンが、インビトロでＨｔｒＡ１によって消化されることを見出している（Ｍ．Ｙａｎｏ、未公開データ）。これらの２種のプロテオグリカンは、ＴＧＦ−β類に結合し、そして少なくともデコリンは、ＴＧＦ−β類の生理学的シグナル伝達を調節することができる。【００６７】  本明細書の上記記載中で言及した図面の内容について、以下に説明する：
図１は、ＨｔｒＡタンパク質ファミリーのドメイン構造を示す模式図である。
図２は、ＨｔｒＡ１のＴＧＦ−βファミリータンパク質に対する結合を示す電気泳動写真である。
図３は、ＨｔｒＡ１によるＢＭＰ−４およびＴＧＦ−βシグナル阻害を示すグラフである。
図４は、ＨｔｒＡ１変異体のＢＭＰ−４結合、シグナル阻害およびプロテアーゼ活性を示す図である。
図５は、ＨｔｒＡ１の発現パターンを示す写真である。
（Ａ）１２．５ｄｐｃ胚の全マウント・ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す。胚は、センスプローブ（左側）またはアンチセンスプローブ（右側）でハイブリダイズされた。
（Ｂ）１２．５ｄｐｃマウス胚の矢状（ｓａｇｉｔｔａｌ）断面のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す。ＨｔｒＡ１発現は、脊柱、後肢、脳、生殖腺、心臓、肺および腹部皮膚に見られる。
（Ｃ）１４．５ｄｐｃマウス胚の矢状（ｓａｇｉｔｔａｌ）断面のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す。（Ｂ）で言及した部位に加え、ＨｔｒＡ１発現は、椎間板、気管壁、心臓流出管および髄膜に見られる。後足において、ＨｔｒＡ１は、伸筋腱原基で発現する。
（Ｄ）脊柱と肋骨を示す（Ｂ）の拡大写真である。
（Ｅ）第４脳室近くの脳領域を示す（Ｃ）の拡大写真である。髄膜もまたＨｔｒＡ１を発現したことが注目される。
（Ｆ）１１．５ｄｐｃにおける心臓を通した横断面の免疫染色を示す写真である。ＨｔｒＡ１タンパク質はＡＶクッションおよび流出管中で検出される。
（Ｇ）心臓を示す（Ｂ）の拡大写真である。ＨｔｒＡ１はＡＶ心臓内クッションにおいて発現される。
（Ｈ）生殖腺を示す（Ｂ）の拡大写真である。ウオルフィアン（Ｗｏｌｆｆｉａｎ）管はＨｔｒＡ１を発現しないが、中腎小管は発現する。
（Ｉ）肺を示す（Ｂ）の拡大写真である。
（Ｊ）１４．５ｄｐｃ顎皮膚の断面のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼイションを示す写真である。
（Ｋ）と（Ｌ）皮膚の免疫染色を写真である。１８．５ｄｐｃ胚の目蓋（Ｋ）と９日令のパップ（ｐｕｐ）の背部からの皮膚（Ｌ）を示す。ＨｔｒＡ１タンパク質は表皮の基質層、発達している髭の上皮成分中に検出される。ＨｔｒＡ１は、また９日令パップの髭のアウタールートシートで検出される。
なお、図５における略号は次の意味を有する：ａ、心房；ａｏ、大動脈；ａｓ、腹部皮膚；ａｖ、房室隆起；ｃ、集合軟骨；ｃｐ、脈絡叢；ｄｐ、真皮；ｅ、表皮；ｅｔ、伸筋腱原基；ｇ、生殖腺原基；ｈ、心臓；ｈｂ、後脳；ｈｌ、後肢；ｈｓ、毛幹；ｉｄ、椎間板；ｉｎ、腸管；ｉｒｓ、内部ルート鞘；ｌｉ、肝臓；ｌｕ、肺；Ｍ、Ｍｕｅｌｌｅｒｉａｎ管；ｍ、髄膜；ｍｃ、後脳；ｍｅ、中腎小管；ｎｔ、神経管；ｏｔ、流出管；ｏｒｓ、外部ルート鞘；ｒ、肋骨；ｔ、腱／靭帯；ｔｃ、終脳；ｔｒ、気管；ｖ、心室；ｖｅ、脊柱；Ｗ、Ｗｏｌｆｆｉａｎ管；ｗｆ、ひげ濾胞；４ｖ、第４脳室。
図６は骨格エレメントの発達の間のＨｔｒＡ１発現を示す写真である。
（Ａ）１３．５ｄｐｃ前肢の全マウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す写真。
（Ｂ）（Ａ）の断面写真。
（Ｃ）１４．５ｄｐｃ肢の横断面のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す写真。
（Ｄ）１４．４ｄｐｃ肋骨断面のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す写真。
（Ｅ）１５．５ｄｐｃ肋骨断面の免疫染色を示す写真。ＨｔｒＡ１タンパク質の局在化は、（Ｄ）に示したｍＲＮＡのそれとよく一致する。
（Ｆ）１７．５ｄｐｃ後肢のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す写真。挿入写真は、囲んだ領域の拡大写真である。関節表面の薄層中に低い発現が見られる。
（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）は、成体脛骨の免疫染色を示す写真。ＨｔｒＡ１は、骨幹と骨端の骨マトリックスにおいて検出される。
なお、図６における略号は次の意味を有する：ａｃ、関節軟骨；ｂｍ、骨髄；ｃ、軟骨結節；ｃａ、踵骨；ｃｕ、立方骨；ｅｔ、伸筋腱原基；ｇｐ、成長板；ｈｃ、肥大軟骨；ｊ、連結発生領域：ｌ、側楔；ｏｃ、骨形成中心；ｐｃ、増殖軟骨；ｐｃｈ、軟骨膜；ｐｏ、骨膜；ｔ、腱；ＩＩＩ、ｄｉｇｉｔ  ＩＩＩ；３ｍ、第３中足骨。
図７は、種々のＴＧＦ−βファミリータンパク質に対するＨｔｒＡ１の結合を示す写真と表である。
（Ａ）ＴＧＦ−βファミリータンパク質に対するＨｔｒＡ１およびフォリスタチンの結合を示す。１．０Ｍ  ＮａＣｌの存在下、ＧＳＴ−ＴＧＦ−βタンパク質とＨｔｒＡ１またはｍｙｃ−タグ化フォリスタチンを使用して、ＧＳＴプルダウンアッセイを実施した。結合したＨｔｒＡ１またはフォリスタチンは、ウェスターン・プロッテイングによって検出した。各パネルにおける最右レーンに、３％のインプットＨｔｒＡ１またはフォリスタチンをロードした。下方のパネルは、クーマシーブルー染色した回収ＧＳＴ−ＴＧＦ−β融合タンパク質を示す。ＧＳＴ単独では、ＨｔｒＡ１ｎｉ結合しなかった。
（Ｂ）ＢＭＰ−４またはＧＤＦ−５に対する変異ＨｔｒＡ１タンパク質の結合を示す。ΔＦＳ（ａ）、ΔＦＳ／ＰＤＺ（ｂ）、Δｌｉｎｋｅｒ／ＳＰ／ＰＤＺ（ｃ）およびＳ３２８Ａ（ｃ）によるＧＳＴプルダウンアッセイの結果を示す。右側の１つまたは２つのレーンに、インプットＨｔｒＡ１変異種のアリコートをロードした；ａとｃにおいてはインプットの１０％（＊＊）または１％（＊）、ｂにおいては２０％（＊＊）または２％（＊）、ｄにおいては１５％（＊）。
（Ｃ）ＨｔｒＡ１の固相結合アッセイを示す。
ＧＳＴまたはＧＳＴ−ＢＭＰ−４でコートしたＥＬＬＩＳＡプレートウエルをｍｙｃ−タグ化ＨｔｒＡ１タンパク質（０．０１〜０．３μｇ／ｍｌ）を含む溶液１００μｌで培養した。ＧＳＴまたはＧＳＴ−ＢＭＰ−４は、抗ｍｙｃ抗体を使用するカラリメトリーアッセイにより定量した。
図８は、ＨｔｒＡ１によるＢＭＰ−４またはＴＧＦ−β１シグナリング阻害を示すグラフである。
（Ａ）ＨｔｒＡ１によるＢＭＰ−４シグナリングの阻害を示す。Ｃ２Ｃ１２細胞を、２５０ｎｇ／ＷｅｌｌのｐＧＬ３−Ｉｄ９８５ＷＴと５０ｎｇ／ｗｅｌｌのＳｍａｄ１，Ｓｍａｄ４およびＢＭＰ−４に対する発現ベクターを有する２４−Ｗｅｌｌプレート中でトランスフェクトした。ＨｔｒＡ１（ｐｃＤＮＡ３−ＨｔｒＡ１）またはｎｏｇｇｉｎ（ｐＥＦ−Ｂｏｓ−ｎｏｇｇｉｎ）に対する発現ベクターは、図の下に示すように共トランスフェクトされた。
（Ｂ）ＨｔｒＡ１によるＴＧＦ−β１シグナリングの阻害を示す。Ｃ２Ｃ１２細胞を、２５０ｎｇ／ＷｅｌｌのｐＧＬ３ｔｉ−（ＳＢＥ）４と５０ｎｇ／ｗｅｌｌのＳｍａｄ１発現ベクターを有する２４−Ｗｅｌｌプレート中でトランスフェクトした。組換えヒトＴＧＦ−β１タンパク質（１０ｎｇ／ｍｌ）をトランスフェクション後２４時間で添加した。ＨｔｒＡ１およびｎｏｇｇｉｎに対する発現ベクターは、図の下に示すように共トランスフェクトされた。
（Ｃ）種々のＨｔｒＡ１変異種によるＢＭＰ−４シグナリング阻害を示す。ΔＦＳ、ΔＦＳ／ＰＤＺ、Δｌｉｎｋｅｒ／ＳＰ／ＰＤＺまたはＳ３２８Ａ（ｃ）に対する発現ベクターを（Ａ）と同様にしてトランスフェクトさせた。挿入写真は、ΔＦＳ／ＰＤＺ以外は、野生型ＨｔｒＡ１とその変異種の５０、１００および２００ｎｇＤＮＡ／ウエルにおける発現レベルを示すウエスタンブロットの結果である。データは、３つの実験の平均である。標準偏差は、各バー上の線として示す。
（Ｄ）ＨｔｒＡ１は、構成的に活性なＢＭＰ受容体に由来するシグナルを阻害しなかった。Ｃ２Ｃ１２細胞は、ＢＭＰ−４の発現ベクターをｐＥＦ−Ｂｏｓ−ｃａＢＭＰＲ−ＩＢ（３ｎｇ／ｗｅｌｌ）で置き換えたことを除き、図４Ａに記載したようにトランスフェクトした。ｐＥＦ−Ｂｏｓ−ｃａＢＭＰＲ−ＩＢの量は、ＢＭＰ−４ベクター（５０ｎｇ／ｗｅｌｌ）と同様の転写活性化を示すように調整された（パネルの右半分参照）。
図９は、ＨｔｒＡ１変異種によるＢＭＰ−４シグナリングに対する結合と阻害を示す模式的説明図である。
各ＨｔｒＡ１変異体の模式的表示を左側に示す。数は、アミノ酸残基数である。右側の表は、ＨｔｒＡ１変異体のＢＭＰ−４に対する結合と阻害を示す活性を要約したものである。結合活性は、インプットＨｔｒＡ１変異体タンパク質の３％以上、１０％以下がＧＳＴプルダウンアッセイによって回収されたときを＋、１％未満が回収されたときを−として示す。野生型ＨｔｒＡ１の阻害活性は、ウエルに添加されたベクターＤＮＡ（５０または１００ｎｇ）の各量を１００％として示す。ＳＳはシグナル配列である。
図１０は、ＨｔｒＡ１がイン・ビボにおいてＢＭＰシグナリングを抑制することを示す写真である。ＨｔｒＡ１（Ａ−Ｉ）またはｎｏｇｇｉｎ（Ｊ−Ｒ）を発現する培養２９３Ｔ細胞をステージ９−１０のにわとり胚の右目近くに注入するか、ＨｔｒＡ１発現ベクターをステージ１０−１１のにわとり胚の右オプテイックカップ中にエレクトロポレートした（Ｓ，Ｔ，Ｕ）。ステージ２３−２４（Ａ−Ｒ）またはステージ１７−１８（Ｓ，Ｔ，Ｕ）まで培養した後、胚を採取した。（Ａ）と（Ｊ）は、ＧＦＰ蛍光でモニターすることにより、注入した細胞の局在化を示す。眼の写真は、一定の倍率でとり、大きさをイメージ解析したものである。レンズまたは網膜は、写真においてレンズまたは着色した網膜の面積が未処理側の７０％以下であったとき、小（ｓｍａｌｌ）と判定された。（Ｂ）、（Ｋ）は注入されなかった側の眼であり、（Ｃ）、（Ｌ）はＨｔｒＡ１またはｎｏｇｇｉｎ発現細胞を注入した眼であり、（Ｄ）、（Ｍ）はコントロール眼の前面断面であり、（Ｅ）、（Ｎ）は注入眼の前面断面であり、（Ｆ）、（Ｈ）、（Ｏ）、（Ｑ）は（Ｄ）と（Ｍ）の拡大写真であり、（Ｇ）、（Ｉ）、（Ｐ）、（Ｒ）はそれぞれＨｔｒＡ１とｎｏｇｇｉｎに原因するレンズと前面網膜の異常を示す（Ｅ）と（Ｎ）の拡大写真である。（Ｓ）は共エレクトロポレートされたＧＦＰの発現を示す網膜であり、（Ｔ）は未処理眼におけるｃＶａｘ発現を示し、（Ｕ）はＨｔｒＡ１のオーバー発現による網膜内のｕｐ制御ｃＶａｘ発現を示す。眼は、ＨｔｒＡ１発現ベクターによるエレクトロポレーション後、より小となる傾向がある。ｃＶａｘ発現のｕｐ制御は、正常またはわずかに小さい大きさの眼に見られた。【００６８】  本明細書の上記記載中で引用した文献は、以下のとおりである：
Ａｄｌｅｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９，３１６１−７１．
Ａｋｉｙａｍａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２３５，３６２−９．
Ｂａｌｄｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１，６６８４−８．
Ｂａｌｅｍａｎｓ，Ｗ．ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｈｕｌ，Ｗ．（２００２）．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５０，２３１−５０．
Ｂｅｌｅｃｋｙ−Ａｄａｍｓ，Ｔ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９，３７９５−８０２．
Ｂｏｔｃｈｋａｒｅｖ，Ｖ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１，１５８−６４．
Ｂｒｕｎｅｔ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０，１４５５−７．
Ｃａｐｄｅｖｉｌａ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７，８７−１３２．
Ｃｌａｕｓｅｎ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １０，４４３−５５．
Ｃｈｏｗ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７，２５５−９６．
Ｄｕｄｌｅｙ，ＡＴ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９，２７９５−８０７．
Ｆａｂｅｒ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ，（２００２）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９，３７２７−３７．
Ｆｏｉｔｚｉｋ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｆａｓｅｂ  Ｊ．１４，７５２−６０．
Ｆｒａｎｃｉｓ−Ｗｅｓｔ，Ｐ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２９６，１１１−９．
Ｆｕｒｕｔａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ，（１９９７）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４，２２０３−１２．
Ｆｕｒｕｔａ，Ｙ．ａｎｄ  Ｈｏｇａｎ，Ｂ．Ｌ．（１９９８）．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２，３７６４−７５．
Ｇｒｏｐｐｅ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２９０５２−６５．
Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  １２，５６５−７１．
Ｈｅｂｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｎｅｕｒｏｎ３５，１０２９−４１．
Ｈｕ，Ｓ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，３４４０６−１２．
Ｉｅｍｕｒａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，９３３７−４２．
Ｊｏｎｋ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２１１４５−５２．
Ｋａｔａｇｉｒｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２７，１７５５−６６．
Ｋａｔａｇｉｒｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ７，９４９−６０．
Ｋａｔｏ，Ｍ．Ｖ．（２０００）．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６，１２６−３５．
Ｋｏｓｈｉｂａ−Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｓｃｉｅｎｃｅ２８７，１３４−７．
Ｋｒｅｓｓｅ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８９，２６６−７４．
Ｋｒｏｊｅｒ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ４１６，４５５−９．
Ｌｉ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９，４３６−４１．
Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４，６２７−４４．
Ｍｅｒｉｎｏ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２００，３５−４５．
Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．２６，２３５−６９．
Ｍｏｕｓｔａｋａｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．８２，８５−９１．
Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．２５８，１１９−２７．
Ｏｈ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，３０３２２−５．
Ｐｅａｒｃｅ，Ｊ．Ｊ．，Ｐｅｎｎｙ，Ｇ．，Ｒｏｓｓａｎｔ，Ｊ．（１９９９）．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０９，９８−１１０．
Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９，１４８７−９６．
Ｓａｋｕｔａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｓｃｉｅｎｃ  ２９３，１１１−５．
Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｌ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４，２６５９−７０．
Ｓａｓａｋｉ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｈｏｇａｎ，Ｂ．Ｌ．（１９９４）．Ｃｅｌｌ  ７６，１０３−１５．
Ｓｃｈｏｅｎｈｅｒｒ，Ｅ．，Ｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５５，２４１−８．
Ｓｃｈｕｌｔｅ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．Ｎｅｕｒｏｎ２４，５４１−５３．
Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８，３８５５−６６．
Ｓｅｒｒａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ１．１３９，５４１−５２．
Ｓｈｒｉｄｈａｒ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２，２６２−７０．
Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ８，６１３−２１．
Ｔｏｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．Ｐａｔｈｏｌ．Ｉｎｔ．４９，４７９−８３．
Ｗａｒｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９２，５５−８１．
Ｗａｗｅｒｓｉｋ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０７，１７６−８８．
Ｗｏｌｆｍａｎ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００，３２１−３０．
Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）．Ｎａｔｕｒｅ  ３４６，２８１−４．
Ｙａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５３，３５−４６．
Ｚｕｍｂｒｕｎｎ，Ｊ．ａｎｄ  Ｔｒｕｅｂ，Ｂ．（１９９６）．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３９８，１８７−９２．
【産業上の利用可能性】
【００６９】  本発明は、ＨｔｒＡのプロテアーゼ活性が、ＴＧＦ−βファミリータンパク質のシグナル阻害活性と相関していることを発見し、それに基づいてＴＧＦ−βファミリータンパク質異常に起因する疾患の予防または処置剤をスクリーニングする方法を提供するものであって、医薬の開発に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ＨｔｒＡタンパク質ファミリーのドメイン構造を示す模式図。
【図２】ＨｔｒＡ１のＴＧＦ−βファミリータンパク質に対する結合を示す電気泳動写真。
【図３】ＨｔｒＡ１によるＢＭＰ−４およびＴＧＦ−βシグナル阻害を示すグラフ。
【図４】ＨｔｒＡ１変異体のＢＭＰ−４結合、シグナル阻害およびプロテアーゼ活性を示す図。
【図５】ＨｔｒＡ１の発現パターンを示す写真。
【図６】骨格エレメントの発達の間のＨｔｒＡ１発現を示す写真。
【図７】種々のＴＧＦ−βファミリータンパク質に対するＨｔｒＡ１の結合を示す写真と表。
【図８】ＨｔｒＡ１によるＢＭＰ−４またはＴＧＦ−β１シグナリング阻害を示すグラフ。
【図９】ＨｔｒＡ１変異種によるＢＭＰ−４シグナリングに対する結合と阻害を示す模式的説明図。
【図１０】ＨｔｒＡ１がイン・ビボにおいてＢＭＰシグナリングを抑制することを示す写真。
【図１】
2005154399.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
2005154399000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成15年12月2日(2003.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セリンプロテアーゼHtrAを有効成分とする、TGF-βファミリータンパク質を介するシグナル活性の調節剤。
【請求項２】
セリンプロテアーゼHtrAがマウスHtrA1またはヒトHtrA1である、請求項１の調節剤。
【請求項３】
セリンプロテアーゼHtrAがマウスHtrA3またはヒトHtrA3である、請求項１の調節剤。
【請求項４】
セリンプロテアーゼHtrAを抗原とする抗体。
【請求項５】
セリンプロテアーゼHtrAがマウスHtrA1またはヒトHtrA1である、請求項４の抗体。
【請求項６】
セリンプロテアーゼHtrAがマウスHtrA3またはヒトHtrA3である、請求項４の抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、セリンプロテアーゼHtrA(high temperature requirement A)
の使用に関するものであり、特にそのTGF-βファミリータンパク質を介するシグナル活性調節作用に基づいて、TGF-βファミリータンパク質を介するシグナル活性調節剤、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびにトランスジェニック哺乳類動物およびノックアウト哺乳類動物を提供するものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
前記したように、TGF-βシグナルの異常により多くの疾患が引き起こされることが知られている。HtrA1は、TGF-βシグナル阻害活性を持ち、この阻害活性は、プロテアーゼ活性の強さに相関している。このことは、HtrA1のプロテアーゼ活性を調節することにより、TGF-βシグナルを制御できることを示すものである。従って、HrtA1タンパク質のプロテアーゼ活性を調節することによる創薬が期待できる。たとえば癌や癌の悪性化、転移、肺繊維症、肝硬変などでは、TGF-βシグナルが昂進していることが疾患の原因に大きく寄与していることが明らかにされている。このような疾患に対しては、活性のあるHtrA1そのものあるいはHtrA1プロテアーゼの活性化剤を作用させて、TGF-βシグナル活性を抑制することにより、病状の改善や疾患の治癒を期待することができる。一方、骨粗鬆症、変形性関節炎、リウマチ性関節炎などでは、TGF-βシグナル活性低下が病因となっていることが知られているので、このような疾患では、潜在的なTGF-βシグナルの阻害因子であるHtrA1の活性を抑制し、TGF-βシグナルの活性を回復させることにより、病状の改善や疾患の治癒が期待することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
HtrA1はプロテアーゼであり、プロテアーゼ活性が阻害活性に必要であることから、HtrA1に対する特異的プロテアーゼ阻害物質を作用させることによりHtrA1の活性を抑制することができ、その結果、TGF-βシグナルの回復を期待することができる。活性のあるHtrA1タンパク質は、たとえば次のような方法により大量に純度良く生産することが可能である：
方法１：昆虫細胞であるｓｆ２１細胞において、バキュロウイルスのシステムを用いて全長のマウスHtrA1タンパク質を１２個のヒスチジンtagをつけて発現させ、培養上清に含まれるHtrA1タンパク質をニッケルカラムを用いて精製する。
方法２：大腸菌において、マウスHtrA1タンパク質のうち１−１５０アミノ酸を除いたC末端側３３０アミノ酸（プロテアーゼ活性、阻害活性のいずれも保持されている）をコードするマウスHrtA1遺伝子をｐET28ベクターに組み込み、ヒスチジンtagを付加して発現させる。得られたタンパク質をニッケルカラムにより精製する。
従って、そのような方法によって生産されたHtrA1を使用して、常套の手法によりインヒビター活性あるいはアクチベーター活性を持つ化合物のスクリーニングを行うことが可能である。なお、HtrA1は細胞の外から作用するタンパク質であるから、創薬する上で非常に都合がよいということができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
ｍＲＮＡのin situハイブリダイゼーション
全胚および組織を、４％パラホルムアルデヒドのリン酸緩衝液(ＰＢＳ)で、一晩、４℃で固定した。全-マウント（mount）と切片のin situハイブリダイゼーションを、文献記載のように行った(Sasakli and Hogan 1993; Morimoto et al., 1996)。ＢluescriptＫＳII(+) (Stratagene)で複製した、HtrA1 cＤＮＡのうち、ＢaｌＩ-ＢamＨＩフラグメント(ヌクレオチド６４４−１１９１)およびＢamＨＩ-ＨincIIフラグメント(ヌクレオチド１１９１-１７５０)をテンプレートとして用い、ＤＩＧ ＲＮＡ標識キット(Boehringer)を用いて、ジゴキシゲニン標識したＲＮＡプローブを合成した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
ＧＳＴ・プルダウンアッセイ
マウスTGF-β１、ＴＧＦ-Ｐ２、ＢＭＰ-４、ＧＤＦ-５およびアクチビンの成熟ペプチドをコードするcＤＮＡフラグメントを、ＢamＨＩおよびＥcoＲＩ部位を用いて、ｐＧＥＸ-４Ｔ-１ベクター(Stratagene)にインフレームで挿入した。すべてのＧＳＴ融合タンパク質を不溶性画分中で発現した。それらタンパク質を、文献(Groppe et al., 1998)の記載に従って、緩衝液を含有する８Ｍの尿素に溶解させ、変性させた後再構築した。それらのタンパク質を、ＧＳＴプルダウン緩衝液(２０ ｍＭ Ｔris-ＨＣl(pＨ ８.０)、５００ｍＭ ＮaＣｌ、０.０５％ ＮＰ-４０、および１０％グリコール)に透析した。HtrA1、その変異体およびｍｙｃタグ付きフォリスタチンを、バキュロウイルス系を用いてsf９細胞で産生した。各sf９培養上清を、一組のＧＳＴ融合タンパク質と混合し、４００μの、２０ｍＭ Ｔris-ＨＣｌ(pＨ ８.０)、１.５ｍＭ ＣaＣｌ２、３ｍＭ ＭgＣｌ２、５％グリコール、０.１％ＮＰ-４０、０.３-１.０Ｍ ＮaＣｌおよび５％子ウシ血清(ＦＢＳ)中で、一晩、４℃でインキュベートし、非特異的結合を最少にした。Ｇlutathion−Ｓepharose 4B beads (Amersham Pharmacia Biotech) (２０μｌ)を、混合物に添加し、１時間４℃でインキュベートした。ビーズを、遠心分離によって回収し、５００μｌのＧＳＴプルダウン緩衝液で５回洗浄した。ビーズに結合したタンパク質を、上記記載のようにＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分離し、ウエスタンブロットによって分析した。１.０ Ｍ ＮａＣｌ存在下でのプルダウンアッセイは、最も特異的かつ再現性のある結果を示した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
HtrA1発現を正確に位置づけるため、胚および成体組織のin situハイブリダイゼーションと免疫染色を行った。２つのオーバーラップしないプローブをin situハイブリダイゼーションに用い、両プローブで同一の結果を得た。免疫染色では、HtrA1のＮ末端領域(アミノ酸２８−１４３)に対して作成したポリクローナル抗体を用いた。免疫染色の結果は、種々の組織においてin situハイブリダイゼーションの結果と一致し(図６ＤおよびＥ)、この抗体の特異性を確認した。１２．５ｄｐｃの胚において、HtrA1  ｍＲＮＡは、脊柱および手足の骨格エレメントに極めて近いパターンで発現した(図５Ａ)。１２．５ｄｐｃの胚の矢状切片において、HtrA1の発現は、脳、心臓、肺、生殖腺および胸腹部領域の皮膚でも見られた(図５Ｂ)。HtrA1の発現は、１４．５ｄｐｃで増強された(図５Ｃ)。骨格組織では、HtrA1は、椎骨に沿った腱および靭帯の原基および軟骨原基周囲の未分化間葉細胞において発現した(図５Ｂ、ＣおよびＤ)。脳では、HtrA1は、脈絡膜叢の発達に伴い、前脳および後脳中の神経上皮の特定領域で発現した（図５B）。これは１４．５ｄｐｃの胚の後脳において明らかに見ることができ(図５Ｅ)、HtrA1の発現は形成中の脈絡膜叢に隣接する神経上皮において検出された。しかし、成熟脈絡膜叢は、HtrA1を発現しなかった(図５Ｅ)。ＢＭＰサブファミリーのうちの幾つかのメンバーは、各メンバーに特徴的なパターンで発達する脳において発現することが報告されている。脈絡膜叢発達部位は、すべてのＢＭＰが共発現する領域であることは興味深い(Furuta et al., 1997)。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
１１．５ｄｐｃの胚の心臓において、HtrA1は、房室(ＡＶ)心内膜床および流出路中で発現した(図５Ｆ)。１２．５ｄｐｃでは、HtrA1は心内膜床で発現し(図５ＢおよびＧ)、１４．５ｄｐｃでは、弁を含む流出路で強く発現した(図５Ｃ)。ＡＶ床および流出路の発達は、TGF-βタンパク質によるシグナル伝達に依存する。TGF-βは、これらの領域における内皮細胞の上皮―間葉形質転換 (epithelial mesenchymal transition)(ＥＭＴ)を誘導し、それらの領域に間葉の特性を供与する(Nakajima et al., 2000)。確かに、TGF-β２ノックアウトマウスは、ＥＭＴの障害により心臓の隔壁および弁において欠損が見られる(Sanford et al., 1997)。ＥＭＴの他のよく知られる例は、雄性生殖腺におけるミュラー管の退行に見られる(Roberts et al., 2002)。TGF-βファミリーの異なるメンバー、抗Muellerianホルモン(ＡＭＨ)は、ミュラー管細胞においてアポトーシスとＥＭＴを誘導し、退行を誘導する。HtrA1は、雄性および雌性の生殖腺の両方においてミュラー管細胞およびその周囲の間葉で発現した(図５ＢおよびＨ)。HtrA1  ｍＲＮＡは、肺上皮下の間葉細胞において検出され(図５Ｂ、ＣおよびＩ)、TGF-βファミリーメンバーにより仲介される上皮間葉相互作用は、気道の発達および枝分かれに重要な役割を果たす(Warburton et al., 2000)。１２．５ｄｐｃの胚の皮膚において、表皮および真皮の両方においてHtrA1が発現した(図５Ｂ)。HtrA1  ｍＲＮＡは、１４．５ｄｐｃでの発達中のひげの上皮コンポーネントでも検出された(図５Ｊ)。後段階では、HtrA1は、表皮の基底層中におよびひげ原基を形成する表皮細胞(invading epidermal cell)中に局在化した(図５Ｋ)。ＢＭＰの強力なインヒビターであるNogginは、真皮乳頭(dermal papilla)で発現し、毛包形成を調節する(Botchkarev et al, 1999)。誕生後９日目で、ひげがほぼ充分に発達したとき、HtrA1は、外根鞘(outer root sheet)で検出された(図５Ｌ)。TGF-βシグナル伝達は、外根鞘におけるアポトーシス促進による毛包退行の間の休止期誘導を調節することが示唆されている(Foitzik et al. 2000)。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
HtrA1の発現パターンの解析の結果明らかとなった、フォリスタチンに類似するドメインの存在を伴うHtrA1タンパク質と種々のTGF-βタンパク質の機能部位との間の、顕著な相関関係は、HtrA1がTGF-β仲介シグナル伝達おいて何らかの役割を果たしていることを示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
発達中の骨格エレメントにおけるHtrA1発現
骨格組織は、形態形成の間のTGF-βシグナル伝達に関して最も集中的に研究された器官であり、そしてHtrA1の発現は、ヒト関節炎患者の関節軟骨細胞で増加すると報告されているので(Hu et al., 1998)、骨および関連組織の発達の間のHtrA1発現を詳細に調べた。１２．５ｄｐｃおよび１４．５ｄｐｃの胚に関して上記したように、HtrA1は、軟骨原基周囲の未分化間葉細胞中で発現するが、原基中心部では検出されなかった(図５Ｂ、ＣおよびＤ)。しかし、後に関節腔を形成する領域 (joint interzone)は、HtrA1を発現した(図６ＡおよびＢ)。軟骨原基付近の間葉から発達する腱および靭帯の原基は、HtrA1を発現した(図５Ｄ、図６ＢおよびＣ)。軟骨内性骨化のプロセスにおいて、成熟した軟骨細胞は、肥大し、退化し、次いで、石灰化した骨に置き換わる。軟骨原基および軟骨細胞は、HtrA1を発現しなかったが、骨化中心では強力なHtrA1発現が見られた。図６ＤおよびＥは、それぞれ１４．５ｄｐｃおよび１５．５ｄｐｃの胚の肋骨におけるHtrA1  ｍＲＮＡおよびそのタンパク質を発現する一次的な骨化中心を示す。これらの図はまた、HtrA1を発現する肋骨の軟骨膜および骨膜を示す(図６ＤおよびＥ)。１７．５ｄｐｃの胚の後足では、有意なHtrA1発現が腱および靭帯で維持されていたが、形成中の関節での発現は減少し、弱いシグナルが関節表面の薄い層で検出されるのみであった(図６Ｆ)。成体の骨では、HtrA1タンパク質が骨マトリクス中に蓄積するようであるが(図６Ｇ、ＨおよびＩ)、このマトリックスはTGF-β１が高濃度で蓄積することが知られている(Kresse and Schoenherr, 2001)。腱の細胞は、HtrA1を産生し続けた(図６Ｈ)。HtrA1は、関節軟骨(図６ＧおよびＩ)や成長板の軟骨細胞(図６ＧおよびＨ)で有意に検出されることはなかった。しかし、実験的関節炎を誘発させるため、抗コラーゲン抗体カクテルとLPSをマウスに投与すると、関節軟骨細胞、特に深い層の細胞は、高レベルのHtrA1を産生し始めた(A. Tsutchiya, 非公開データ)。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
ＢＭＰ−４およびTGF-β１シグナル伝達の阻害
HtrA1は、TGF-βタンパク質により仲介されるシグナル伝達を阻害し得るかどうかを調べた。マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞における転写アッセイ(Katagiri et al., 1994)により、ＢＭＰ−４およびTGF-β１シグナル伝達におけるHtrA1の効果をアッセイした。ＢＭＰシグナル伝達の測定には、マウスのＩｄ遺伝子のプロモーター中のＢＭＰ−応答性エレメント(Katagiri et al., 2002)の下流にルシフェラーゼ遺伝子を挿入したリポータープラスミド、ｐＧＬ３−Ｉｄ９８５ＷＴを使用した。ＢＭＰ−４発現ベクターをＣ２Ｃ１２細胞にトランスフェクションすると、Pearceらの文献(Pearce et al., 1999)の記載と同様にＩｄプロモーターを数倍刺激し、Ｓｍａｄ１およびＳｍａｄ４発現ベクターの共トランスフェクションは、更にＩｄプロモーターを１１倍にまで刺激した(図８Ａ)。HtrA1発現ベクターの添加は、用量依存的にＢＭＰ−４シグナリングを阻害した(図８Ａ)。ＢＭＰ−４シグナリングに対するHtrA1の阻害活性は、Nogginよりも弱いように思われる(図８Ａ)。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
結合および阻害に必要なドメイン
TGF-βに対する結合およびTGF-βによるシグナリングの阻害に関係するHtrA1タンパク質のドメインを、一連のHtrA1変異体タンパク質を産生することによって決定した。当該変異体の模式的説明を図９に示す。野生型（ＷＴ）HtrA1タンパク質は、ＢＭＰ−４に最も親和性が高く、GDF-5に対して最も親和性が低いので、これらの２種のリガンドに対する変異体の結合について調査した。ＢＭＰ−４シグナリングの阻害は、ＢＭＰ−４／Ｓｍａｄ１／Ｓｍａｄ４共トランスフェクションアッセイにより試験された。予測に反して、フォリスタチン様ドメインではなく、プロテアーゼドメインとそれに先行するリンカー領域（ａａ１５−２０２）が結合と阻害の両方の活性に必須であることが見出された。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
眼の前面断面は、HtrA1処理眼盃の大きさがコントロールのそれよりずっと小さいことを明らかに示すものであった（図１０Ｄ、Ｅ）。注入側の眼はコントロール側と比較して、レンズ直径がより小さく、レンズもより薄いものであった。これは一次レンズ繊維の伸長が顕著に抑制されたためである（図１０Ｆ、Ｇ）。HtrA1処理の眼で見られる表現型は、noggin処理の眼で見られるものと区別できなかった（図１０Ｍ−Ｐ）（Faber et al., 2002; Belecky-Adams et al., 2002）。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
網膜の発生はまた、HtrA1またはnoggin処理の眼において異常であった；神経網膜は、正確な層構造を作らず、網膜色素上皮と隔離され（図１０E、Iおよび図１０Ｎ、Ｒ）、そしてある場合には網膜細胞が凝集していた（データ示さず）。HtrA1処理した目の腹側眼胞では、網膜色素上皮が神経上皮様組織により置換されていた（図１０Ｈ、Ｉ）。上皮細胞のこの異常な遷移は、noggin処理した眼で観察され（図１０Q、R）、これは先に報告されたことでもある（Adler and Belecky-Adams, 2002）。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
HtrA1過剰発現によるｃＶａｘ発現の誘導
ｃＶａｘの発現がHtrA1の過剰発現によって影響を受けるか否かを試験した。網膜を腹側化するｃＶａｘの発現は、網膜の腹側半分に限局し、網膜を背側化するＴｂｘ５の発現は、背側半分に限局している。ＢＭＰ−４シグナル伝達は、これらの２種の転写因子遺伝子の発現を制御することによって神経網膜中の背／腹側極性の決定を調節する（Schutle et al., 1999; Koshiba-Takeuchi et al., 2000）。nogginまたはventroptinのようなＢＭＰアンタゴニストの過剰発現は、ｃＶａｘ発現の増強およびＴｂｘ５発現の減弱につながる（Koshiba-Takeuchi et al., 2000; Sakuta et al., 2001）。ステージ10-11の眼胞内にHtrA1発現ベクターをエレクトロポレーションし、２４−２８時間にわたって培養した後、ステージ17-18でｃＶａｘ発現を調べた。ｃＶａｘの発現は、非処理の眼の網膜の腹側に限局していた（図１０Ｔ）。しかし、HtrA1発現ベクターをエレクトロポレーションした網膜では、ｃＶａｘ発現は、腹側で増強し、背側半分に拡張した（図１０Ｕ）。ＧＦＰ発現ベクター単独のエレクトロポレーションは、ｃＶａｘ発現に影響しなかった（データ示さず）。これらのデータは、HtrA1の過剰発現が、ＢＭＰ−４シグナル伝達を阻害することによって網膜を腹側化することを示すものである。インオボの実験から得られた結果は、HtrA1がＢＭＰシグナル伝達を細胞外から減衰させる新規な阻害剤であることを示すものである。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
心臓および生殖腺の発生において、HtrA1の発現は、ＥＭＴ、TGF-βシグナル伝達によって調節される過程と密接に関連すると考えられる。HtrA1とＥＭＴの間の関連性は、また、悪性癌において種々に発現される遺伝子についての幾つかの研究から提唱されている。HtrA1発現の低下が、メラノーマ（Baldi et al., 2002）や卵巣癌（Shridhar et al., 2002）の進行または転移の後期段階中に繰り返し観察されている。癌侵襲および転移の過程は、EMTが関わることが証明されており、ある種の型の癌では、TGF-βシグナル伝達によって増強される（Moustakas et al., 2002）。従って、HtrA1がTGF-βシグナル伝達に拮抗することによって癌細胞のＥＭＴを抑制するものと理解される。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
骨およびそれらの付随組織の発生中に、HtrA1は、軟骨細胞分化を抑制し、間葉系細胞を軟骨ではない細胞、例えば骨膜、軟骨膜、関節、腱および靭帯に転換するものと考えられる。これは、ＢＭＰおよびTGF-βが、間葉細胞から軟骨細胞への分化を促進するという事実と一致する（Capdevila and Belmonte, 2001）。腱および靭帯の発生はまた、ＢＭＰ／ＧＤＦタンパク質によるシグナル伝達に依存する。ＢＭＰシグナル伝達は、腱前駆体が生じる領域を特定するようであり、一方、追加的シグナル、例えばＧＤＦ−６、−７およびTGF-β２により、腱細胞は成熟する（Schweitzer et al., 2001; Wolfman et al., 1997; Merino et al., 1998）。HtrA1は、発生のより後期段階において腱で発現されるから、HtrA1が腱の成熟を調節している可能性がある。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
HtrA1は、関節の発生過程で関節間領域で発現され、ＢＭＰ／ＧＤＦシグナル伝達によって密接に調節される過程（Brunet et al., 1998; Francis-West et al., 1999）を制御する。また、TGF-βサブファミリーが介在するシグナル伝達が成体の関節軟骨の維持に関与することが提唱されている。TGF-βは、正常な関節軟骨細胞を維持するために必要である。ドミナントネガティブ型のキナーゼ欠損TGF-βＩＩ型レセプター遺伝子を有するトランスジェニックマウス（Serra et al., 1997)またはSmad3ノックアウトマウス（Yang et al., 2001)は、ヒト変形性関節炎に非常に類似した表現型を示した。これらのマウスでは、TGF-βシグナル伝達の抑制はおそらく、関節軟骨細胞の分化を促進し、変形性関節炎様の表現型につながる。興味深いことに、ヒトHtrA1の発現は、変形性関節炎を有する患者の関節軟骨細胞で増加した（Hu et al.,1998）。HtrA1がTGF-βに拮抗し、変形性関節炎を悪化させる可能がある。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
HtrA2のリンカー領域は、三量体形成に必須である。リンカー領域は、４種のHtrA1メンバー間で高度に保存されている（Li et al., 2002)。これは、HtrA1が、ＨｔｒＡ２と同様にホモ三量体を形成し得ることを示唆する。各HtrA1変異体のTGF-βファミリータンパク質に対する結合活性は、三量体的構造を形成する能力と密接に関連しているように理解される。例えば、リンカー領域を欠く突然変異体、ΔＦＳ／リンカーは、TGF-βファミリータンパク質に結合することが出来なかった。対照的に、プロテアーゼ活性を保有していないが、三量体を形成することが可能と思われるＳ３２８Ａ（Li et al., 2002）は、阻害活性を欠くとはいえ、TGF-βファミリータンパク質に対する結合活性が証明されている。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
HtrA1のＰＤＺドメインは、結合または阻害活性に必要ではない。HtrA2のＰＤＺドメインは、タンパク質分解活性を負に調節する。仮説的三量体アポトーシスレセプターは、ＰＤＺドメインに結合すると考えられ、そしてHtrA2のタンパク質分解活性を増強する（Li et al., 2000）。HtrA1のＰＤＺドメインは、類似の調節機能を有し得る。実際、ＰＤＺドメインを欠く２種の突然変異体、ΔＰＤＺおよびΔＦＳ／ＰＤＺは、野生型HtrA1よりもより強いTGF-βシグナル伝達阻害活性を有するようであった（図９）。酵母を用いたツーハイブリッドスクリーニングにより、HtrA1のＰＤＺドメインに対する結合ファクターとして最も頻繁に三量体細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質が単離された（Murwantoko, 非公開データ）。TGF-βシグナル伝達は、ＥＣＭと緊密かつ相互の関連性を有する；ＥＣＭの産生はTGF-βシグナル伝達によって調節され、逆もまた真である（Kresse and Schoenherr, 2001）。分泌されたHtrA1は、細胞周辺のＥＣＭへ結合し、充分に活性型となり、その後TGF-βシグナル伝達を調節する可能性が考えられる。HtrA1の阻害活性は、インビトロ（図８Ａ）およびインビボ実験（図１０）によると、nogginのそれよりも３〜１０倍弱い。その理由の１つの説明は、HtrA1がＥＣＭタンパク質に結合し、活性化される必要があるからかもしれない。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
ＩＧＦＢＰおよびＫＩドメインの機能は、なお、解明される必要がある。これらのドメインを欠くΔFSは野生型より強いTGF-βシグナル伝達の阻害活性を有するように思われた（図１０参照）。Ｎ末端ＦＳドメインは、HtrA1のプロテアーゼ活性の他の調節機能を有しているのかも知れない。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
HtrA1プロテアーゼ活性が、TGF-βタンパク質によるシグナル伝達を阻害する機構は、さらに明確化する必要がある。ＧＳＴプルダウンアッセイ中に、HtrA1によるＧＳＴ−TGF-βタンパク質の分解は、何ら検出されなかった。さらに、タグ付加されてないヒト組換えTGF-βおよびＢＭＰ−２ならびに２９３Ｔ細胞によって生産されたｍｙｃ-タグ付加ＢＭＰ−４は、すべてHtrA1プロテアーゼに対して抵抗性であった（データ示さず）。これは、インビボでのTGF-βタンパク質の分解可能性を排除するのではない。何故なら、TGF-βタンパク質の分解は、ＰＤＺドメインに結合するＥＣＭタンパク質のような共ファクターを要求する可能性があるからである。また、HtrA1は、TGF-βファミリータンパク質についてのレセプターまたはTGF-βシグナル伝達を促進的に調節する細胞外タンパク質を分解する可能性がある。これらの場合に、HtrA1のTGF-βに対する特異的および高親和性結合は、HtrA1を基質タンパク質に接近させるものであり、かくして効率的な分解を容易にすることができる。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
本明細書の上記記載中で言及した図面の内容について、以下に説明する：
図１は、HtrAタンパク質ファミリーのドメイン構造を示す模式図である。
図２は、HtrA1のTGF-βファミリータンパク質に対する結合を示す電気泳動写真である。
図３は、HtrA1によるBMP-4およびTGF-βシグナル阻害を示すグラフである。
図４は、HtrA1変異体のBMP-4結合、シグナル阻害およびプロテアーゼ活性を示す図である。
図５は、HtrA1の発現パターンを示す写真である。
（A)１２．５ｄｐｃ胚の全マウント・in situハイブリダイゼーションを示す。胚は、センスプローブ（左側）またはアンチセンスプローブ（右側）でハイブリダイズされた。
（B)１２．５ｄｐｃマウス胚の矢状（sagittal）断面のin situ ハイブリダイゼーションを示す。HtrA1発現は、脊柱、後肢、脳、生殖腺、心臓、肺および腹部皮膚に見られる。
（C)１４．５ｄｐｃマウス胚の矢状（sagittal）断面のin situ ハイブリダイゼーションを示す。（B）で言及した部位に加え、HtrA1発現は、椎間板、気管壁、心臓流出管および髄膜に見られる。後足において、HtrA1は、伸筋腱原基で発現する。
（Ｄ）脊柱と肋骨を示す（Ｂ）の拡大写真である。
（Ｅ）第４脳室近くの脳領域を示す（Ｃ）の拡大写真である。髄膜もまたHtrA1を発現したことが注目される。
（Ｆ）１１．５ｄｐｃにおける心臓を通した横断面の免疫染色を示す写真である。HtrA1タンパク質はＡＶクッションおよび流出管中で検出される。
（Ｇ）心臓を示す（Ｂ）の拡大写真である。HtrA1はＡＶ心臓内クッションにおいて発現される。
（Ｈ）生殖腺を示す（Ｂ）の拡大写真である。ウオルフィアン（Ｗｏｌｆｆｉａｎ）管はHtrA1を発現しないが、中腎小管は発現する。
（Ｉ）肺を示す（Ｂ）の拡大写真である。
（Ｊ）１４．５ｄｐｃ顎皮膚の断面のin situハイブリダイゼーションを示す写真である。
（Ｋ）と（Ｌ）皮膚の免疫染色を写真である。１８．５ｄｐｃ胚の目蓋（Ｋ）と９日令のパップ（pup）の背部からの皮膚（Ｌ）を示す。HtrA1タンパク質は表皮の基質層、発達している髭の上皮成分中に検出される。HtrA1は、また生後９日めの髭の外根鞘で検出される。
なお、図５における略号は次の意味を有する：ａ、心房；ａｏ、大動脈；ａｓ、腹部皮膚；ａｖ、房室隆起；ｃ、軟骨原基；ｃｐ、脈絡叢；ｄｐ、真皮；ｅ、表皮；ｅｔ、伸筋腱原基；ｇ、生殖腺原基；ｈ、心臓；ｈｂ、後脳；ｈｌ、後肢；ｈｓ、毛幹；ｉｄ、椎間板；ｉｎ、腸管；ｉｒｓ、内根鞘；ｌｉ、肝臓；ｌｕ、肺；Ｍ、ミューラー管；ｍ、髄膜；ｍｃ、後脳；ｍｅ、中腎小管；ｎｔ、神経管；ｏｔ、流出管；ｏｒｓ、外根鞘；ｒ、肋骨；ｔ、腱/靭帯；ｔｃ、終脳；ｔｒ、気管；ｖ、心室；ｖｅ、脊柱；Ｗ、Wolffian管；ｗｆ、ひげ濾胞；４ｖ、第４脳室。
図６は骨格エレメントの発達の間のHtrA1発現を示す写真である。
（Ａ）１３．５ｄｐｃ前肢の全マウントin situ ハイブリダイゼーション
を示す写真。
（Ｂ）（Ａ）の断面写真。
（Ｃ）１４．５ｄｐｃ肢の横断面のin situ ハイブリダイゼーションを示す写真。
（Ｄ）１４．４ｄｐｃ肋骨断面のin situ ハイブリダイゼーションを示す写真。
（Ｅ）１５．５ｄｐｃ肋骨断面の免疫染色を示す写真。HtrA1タンパク質の局在化は、（Ｄ）に示したｍＲＮＡのそれとよく一致する。
（Ｆ）１７．５ｄｐｃ後肢のin situ ハイブリダイゼーションを示す写真。挿入写真は、囲んだ領域の拡大写真である。関節表面の薄層中に低い発現が見られる。
（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）は、成体脛骨の免疫染色を示す写真。HtrA1は、骨幹と骨端の骨マトリックスにおいて検出される。
なお、図６における略号は次の意味を有する：ａｃ、関節軟骨；ｂｍ、骨髄；ｃ、軟骨結節；ｃａ、踵骨；ｃｕ、立方骨；ｅｔ、伸筋腱原基；ｇｐ、成長板；ｈｃ、肥大軟骨；ｊ、関節発生領域：ｌ、側楔；ｏｃ、骨形成中心；ｐｃ、増殖軟骨；ｐｃｈ、軟骨膜；ｐｏ、骨膜；ｔ、腱；ＩＩＩ、digit III；３ｍ、第３中足骨。
図７は、種々のTGF-βファミリータンパク質に対するHtrA1の結合を示す写真と表である。
（Ａ）TGF-βファミリータンパク質に対するHtrA１およびフォリスタチンの結合を示す。１．０M  NaClの存在下、GST-TGF-βタンパク質とHtrA1またはｍｙｃ−タグ化フォリスタチンを使用して、GSTプルダウンアッセイを実施した。結合したHtrA1またはフォリスタチンは、ウェスターン・ブロッテイングによって検出した。各パネルにおける最右レーンに、３％のインプットHtrA1またはフォリスタチンをロードした。下方のパネルは、クーマシーブルー染色した回収GST-TGF-β融合タンパク質を示す。GST単独では、HtrA1に結合しなかった。
（Ｂ）BMP-4またはGDF-5に対する変異HtrA１タンパク質の結合を示す。ΔFS(a)、ΔFS/PDZ(b)、Δlinker/SP/PDZ(c)およびS328A(c)によるGSTプルダウンアッセイの結果を示す。右側の１つまたは２つのレーンに、インプットHtrA1変異種のアリコートをロードした；aとｃにおいてはインプットの１0%  (**)または1%(*)、ｂにおいては20%(**)または2%(*)、ｄにおいては15%(*)。
（Ｃ）HtrA1の固相結合アッセイを示す。
GSTまたはGST-BMP-4でコートしたELLISAプレートウエルをmyc-タグ付きHtrA1タンパク質（０．０１〜０．３μg/ml)を含む溶液１００μｌで培養した。GSTまたはGST-BMP-4は、抗ｍｙｃ抗体を使用するカラリメトリーアッセイにより定量した。
図８は、HtrA1によるBMP-4またはTGF-β１シグナリング阻害を示すグラフである。
（Ａ）HtrA1によるBMP-4シグナリングの阻害を示す。C2C12細胞を、250 ng/wellのpGL3-Id985WTと50 ng/wellのSmad1,Smad4およびBMP-4に対する発現ベクターを有する24-wellプレート中でトランスフェクトした。HtrA1(pcDNA3- HtrA1)またはnoggin （pEF-Bos-noggin)に対する発現ベクターは、図の下に示すように共トランスフェクトされた。
（Ｂ）HtrA1によるTGF-β1シグナリングの阻害を示す。C2C12細胞を、250 ng/wellのpGL3ti-(SBE)4と50 ng/wellのSmad1発現ベクターを有する24-wellプレート中でトランスフェクトした。組換えヒトTGF-β1タンパク質(10 ng/ml)をトランスフェクション後２４時間で添加した。HtrA1およびnogginに対する発現ベクターは、図の下に示すように共トランスフェクトされた。
（Ｃ）種々のHtrA1変異種によるBMP-4シグナリング阻害を示す。ΔFS、ΔFS/PDZ、Δlinker/SP/PDZまたはS328A(c)に対する発現ベクターを（A)と同様にしてトランスフェクトさせた。挿入写真は、ΔFS/PDZ以外は、野生型HtrA1とその変異種の５０、１００および２００ng ＤＮＡ/ウエルにおける発現レベルを示すウエスタンブロットの結果である。データは、３つの実験の平均である。標準偏差は、各バー上の線として示す。
（Ｄ）HtrA1は、構成的に活性なＢＭＰ受容体に由来するシグナルを阻害しなかった。C2C12細胞は、BMP-4の発現ベクターをpEF-Bos-caBMPR-IB (3 ng/well)で置き換えたことを除き、図４Ａに記載したようにトランスフェクトした。pEF-Bos-caBMPR-IBの量は、BMP-4ベクター(50 ng/well)と同様の転写活性化を示すように調整された（パネルの右半分参照）。
図９は、HtrA1変異種によるBMP-4シグナリングに対する結合と阻害を示す模式的説明図である。
各HtrA1変異体の模式的表示を左側に示す。数は、アミノ酸残基数である。右側の表は、HtrA1変異体のBMP-4に対する結合と阻害を示す活性を要約したものである。結合活性は、インプットHtrA1変異体タンパク質の３％以上、１０％以下がGSTプルダウンアッセイによって回収されたときを＋、１％未満が回収されたときを−として示す。野生型HtrA1の阻害活性は、ウエルに添加されたベクターDNA (50または100 ng)の各量を１００％として示す。ＳＳはシグナル配列である。
図１０は、HtrA1がイン・ビボにおいてBMPシグナリングを抑制することを示す写真である。HtrA1(A-I)またはnoggin(J-R)を発現する培養293T細胞をステージ９−１０のにわとり胚の右目近くに注入するか、HtrA1発現ベクターをステージ１０−１１のにわとり胚の右オプテイックカップ中にエレクトロポレートした（Ｓ，Ｔ，Ｕ）。ステージ２３−２４（Ａ−Ｒ）またはステージ１７−１８（Ｓ，Ｔ，Ｕ）まで培養した後、胚を採取した。（Ａ）と（Ｊ）は、ＧＦＰ蛍光でモニターすることにより、注入した細胞の局在化を示す。眼の写真は、一定の倍率でとり、大きさをイメージ解析したものである。レンズまたは網膜は、写真においてレンズまたは着色した網膜の面積が未処理側の７０％以下であったとき、小（small）と判定された。（Ｂ）、（Ｋ）は注入されなかった側の眼であり、（Ｃ）、（Ｌ）はHtrA1またはnoggin発現細胞を注入した眼であり、（Ｄ）、（Ｍ）はコントロール眼の前面断面であり、（Ｅ）、（Ｎ）は注入眼の前面断面であり、（Ｆ）、（Ｈ）、（Ｏ）、（Ｑ）は（Ｄ）と（Ｍ）の拡大写真であり、（Ｇ）、（Ｉ）、（Ｐ）、（Ｒ）はそれぞれHtrA1とnogginに原因するレンズと前面網膜の異常を示す（Ｅ）と（Ｎ）の拡大写真である。（Ｓ）は共エレクトロポレートされたＧＦＰの発現を示す網膜であり、（Ｔ）は未処理眼におけるｃＶａｘ発現を示し、（Ｕ）はHtrA1のオーバー発現による網膜のｃＶａｘ発現増強を示す。眼は、HtrA1発現ベクターによるエレクトロポレーション後、より小となる傾向がある。ｃＶａｘ発現の増強は、正常またはわずかに小さい大きさの眼に見られた。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
本発明は、HtrAのプロテアーゼ活性が、TGF-βファミリータンパク質のシグナル阻害活性と相関していることを発見し、それに基づいてTGF-βファミリータンパク質を介するシグル異常に起因する疾患の予防または処置剤およびそのをスクリーニング法を提供するものであって、医薬の開発に有用である。
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月6日(2004.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005154399000001.app