(57)【要約】【課題】  簡便に製造でき、感度に優れるマイクロアレイの製造方法を提供する。【解決手段】  水素供与能を有する第１官能基を表面に有する固体基板上で、水素受容能を有する化合物と、水素供与能を有する第２官能基で官能基化された生体分子との混合物を反応させて、前記生体分子を非共有結合によって前記基板上に固定化する段階を含むことを特徴とする。【選択図】            なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水素供与能を有する第１官能基を表面に有する固体基板上で、水素受容能を有する化合物と、水素供与能を有する第２官能基で官能基化された生体分子との混合物を反応させて、前記生体分子を非共有結合によって前記基板上に固定化する段階を含む、生体分子を固体基板上に固定化する方法。
【請求項２】
前記水素供与能を有する第１官能基と第２官能基とは、同一であるか、または異なることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記水素供与能を有する第１官能基と第２官能基とは、アミノ基、チオール基及びヒドロキシル基よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記水素受容能を有する化合物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体、およびポリエチレンイミンまたはその誘導体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記生体分子は、核酸、蛋白質、多糖類及びその組合わせよりなる分子からなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記固体基板は、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＧＡＰＳ）でコーティングされており、前記水素受容能を有する化合物はポリエチレングリコールであり、前記生体分子は５’末端がアミノアルキルで官能基化されたＤＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の生体分子を固体基板上に固定化する方法。
【請求項７】
前記ポリエチレングリコールの分子量は、２００ないし１，０００，０００Ｄａであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリエチレングリコールの濃度は、０．４ｍＭないし８．０ｍＭであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡの濃度は２０μＭないし１００μＭであることを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法によって製造されるマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体分子を固体基板上に固定化する方法、具体的には非共有結合によって生体分子を固体基板上に固定化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロアレイは、特定分子が基板上に一定の面積に高密度で固定化されているものである。このようなマイクロアレイには、例えば、ポリヌクレオチドまたは蛋白質マイクロアレイがある。“ポリヌクレオチドマイクロアレイ”とは、基板上にポリヌクレオチドのグループが高密度で固定化されているものであり、前記ポリヌクレオチドグループは、それぞれ一定の領域に固定化されているマイクロアレイを意味する。このようなマイクロアレイは当業界で公知のものであるり、例えばマイクロアレイについては、例えば、特許文献１及び２に開示されている。
【０００３】
固体基板上にポリヌクレオチドを固定化する方式は、基板上で直接的に合成する方式と、既に合成されたポリヌクレオチドを一定の位置に固定化する方法（スポッティング法）とが知られている。このようなポリヌクレオチドマイクロアレイの製造方法は、例えば、特許文献２ないし４に開示されている。ポリヌクレオチドマイクロアレイ及びその製造方法に関する前記文献は、本明細書にその全体が援用される。スポッティング方法は、生体分子を共有的に固体基板上に固定化するために広く使われている。例えば、基板上の表面をアミノ基のような求核性官能基で活性化させ、それを良い脱離基で活性化されたポリヌクレオチドのような生体分子とカップリング反応させた後、未反応物を除去し、生体分子を固体基板上に固定化する過程が広く利用されてきた。したがって、非共有結合を利用して生体分子を基板上に固定化する方式は知られていない。
【０００４】
また、ポリエチレングリコールは、親水性化合物としてマイクロアレイに使われた例がある。例えば、非特許文献１には、ポリエチレングリコールをＤＮＡの両末端に共有結合で結合し、それを固体基板上に固定化してマイクロアレイを製作した例が開示されている。また、特許文献５には、末端にエポキシ基を有する放射形ポリエチレングリコール誘導体で構成されるヒドロゲルに、プローブポリヌクレオチドを固定化してマイクロアレイを製造する方法が開示されている。
【特許文献１】米国特許第５，４４５，９３４号
【特許文献２】米国特許第５，７４４，３０５号
【特許文献３】米国特許第５，１４３，８５４号
【特許文献４】米国特許第５，４２４，１８６号
【特許文献５】米国特許公開ＵＳ−２００３−０１０８９１７−Ａ１
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＥｘｐｅｒＩｍｅｎｔａｌ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２００３：１１（４）：３９３−３９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、それら例はいずれも、生体分子を共有的に基板上に固定化する方法である。したがって、いずれも反応性官能基が基板上にまたは生体分子に結合されていなければならない。また、共有結合は厳しい条件下でなされるので、反応条件を調節し難く、操作が複雑であるという短所がある。また、反応が完了した後には、未反応性物質を除去せねばならない。
【０００６】
これに、本発明者らは、共有結合によらず、非共有結合によって生体分子を固体基板上に固定化する方法を研究し、得られたマイクロアレイが標的分子の分析に効率的に利用されうる優秀な品質であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明の目的は、生体分子を非共有結合によって固体基板上に固定化する方法を提供することである。
【０００８】
本発明の目的はまた、前記方法によって製造されるマイクロアレイを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、水素供与能を有する第１官能基を表面に有する固体基板上で、水素受容能を有する化合物と、水素供与能を有する第２官能基で官能基化された生体分子との混合物を反応させて、前記生体分子を非共有結合によって前記基板上に固定化する段階を含む、生体分子を固体基板上に固定化する方法を提供する。
【００１０】
本発明において、前記水素供与能を有する第１官能基と第２官能基とは、同一であってもよく、異なっていてもよい。前記水素供与能を有する第１官能基と第２官能基とは、アミノ基、チオール基及びヒドロキシル基よりなる群から選択されることが好ましいが、それら例に限定されるものではない。
【００１１】
アミノ基を有する化合物の具体例には、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＧＡＰＳ）、γ−アミノプロピルジエトキシシラン（ＧＡＰＤＥＳ）及び炭素数１〜１２のアミノアルキル基（アミノメチル、アミノブチル、アミノヘキシル、アミノオクチルなど）などがあるが、それら例に限定されるものではない。チオール基を有するものには、アルキルチオール（チオールプロピル、チオールヘキシルなど）、メルカプトチオール誘導体、チオールアセト酢酸誘導体がある。
【００１２】
前記第１官能基を有する化合物は、アセチルクロライドシラン、無水シラン、スルホニルクロライドシラン、及びイソチオシアネートシランのようなコーティング物質に、前記アミノ基、チオール基またはヒドロキシル基のような第１官能基を導入させることによって誘導してもよい。このようなコーティング物にアミノ基、チオール基またはヒドロキシル基のような第１官能基を導入する方法は、当業界に公知のものであり、当業者ならば容易に転換させることができる。
【００１３】
本発明において、水素結合受容能を有する化合物は、分子中に窒素、酸素、硫黄のような電気陰性度の高い原子を含んでおり、水素結合に必要な電子を提供する分子を意味する。このような化合物の例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体、及びポリエチレンイミンまたはその誘導体がある。ＰＥＧとポリエチレンイミンの誘導体としては、ヒドロキシ基またはアミンを有する誘導体がある。本発明において、前記ＰＥＧまたはその誘導体及びポリエチレンイミンまたはその誘導体の濃度は０．４ｍＭないし６．０ｍＭであり、分子量は２００ないし１，０００，０００Ｄａ、望ましくは、２００ないし１００，０００Ｄａ、さらに望ましいには２００ないし１０，０００Ｄａである。本発明の一具体例として、前記ＰＥＧは６．０ｍＭの濃度であり、分子量は１０，０００Ｄａである。
【００１４】
本発明において、固体基板の材質は特別に限定されるものではなく、固相のものであって表面を提供できるものならばいかなるものでもよい。たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリウレタンのようなプラスチック物質、ガラス、シリコンウェーハ及びそれらの改質された基板でもよい。本発明において、前記固体基板は、水素供与能を有する官能基を有するものであり、基板材質の特性上そのような官能基を有するか、コーティングのような化学的または物理的処理によってそのような官能基が付加されたものでもよい。
【００１５】
本発明において、生体分子は生物から由来する化合物であり、例えば、核酸、蛋白質、多糖類及びその組合わせよりなる分子で構成される群から選択されるものであり、望ましくは核酸である。このような核酸には、ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。本発明において、固体基板上に固定化される生体分子は一般的に、分析しようとする標的分子と特異的反応する特性を持っている。例えば、前記生体分子が核酸である場合、相補的なヌクレオチド配列を有する標的核酸とハイブリダイゼーションを通じて相互反応できる。前記生体分子が蛋白質である場合、抗原及び抗体反応、リガンド及び受容体間の相互反応、酵素と気質との相互反応を通じて互いに特異的に相互作用できる。また、前記生体分子が多糖類である場合、多糖類を認知するレクチンのような蛋白質または抗体によって特異的に認知されうる。このような生体分子と標的分子との特異的相互作用と、かかる相互作用の結果を検出できる検出システムを利用して、本発明の生体分子を基板上に固定化する方法によって得られるマイクロアレイを、いろいろな分析に使用できる。
【００１６】
本発明において、固定化に使われる生体分子の濃度はそれぞれの反応条件によって変わり、また得ようとするデータの種類によって変わる。したがって、反応に使われる生体分子の濃度は特別に制限されるものではない。一具体例で、前記生体分子がＤＮＡである場合、２０μＭないし１００μＭの濃度が使われるが、このような濃度範囲に限定されるものではない。
【００１７】
本発明の固体基板上に生体分子を固定化する方法は、ＤＮＡまたは蛋白質のマイクロアレイを製造するための通常の方法に応用できる。このようなマイクロアレイの製造方法には一般的に、フォトリソグラフィを利用する方法が知られている。フォトリソグラフィを利用する場合、除去可能な基で保護された単量体が塗布された基板表面上の一定の領域にエネルギーに露出させて保護基を除去し、除去可能な基で保護された単量体をカップリングさせる段階を反復することによって、ポリヌクレオチドのアレイを製造する（フォトリソグラフィ法）。この場合、ポリヌクレオチドマイクロアレイ上に固定化されるポリヌクレオチドは、単量体を一つずつ延長させる方式で合成するか、または既に合成されたポリヌクレオチドを一定の位置に固定化する方法によって固定化されうる（スポッティング法）。このようなポリヌクレオチドマイクロアレイの製造方法は、例えば、特許文献２ないし４に開示されている。ポリヌクレオチドマイクロアレイ及びその製造方法に関する前記文献は、本明細書にその全体を援用される。
【００１８】
本発明はまた、前記生体分子を固体基板に固定化する方法によって製造されたマイクロアレイを提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明による生体分子を固体基板上に固定化する方法によれば、反応性の高い反応基を持つ化学種を使用せずにプローブポリヌクレオチドを基板上に固定化できる。したがって、本発明の方法によれば、工程が簡単で、かつ低コストで、かつ製造されるマイクロアレイの品質は感度及び反応特異度に優れる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
（実施例１：アミノ基でコーティングしたガラス基板上に、ＰＥＧとアミノ基で５’末端が官能基化されたＤＮＡとの混合物を反応させたＤＮＡマイクロアレイの製造）
本実施例では、ＧＡＰＳでコーティングされたガラス基板上に、ＰＥＧと、アミノ基で５’末端が官能基化されたＤＮＡとを利用して、ＤＮＡが前記ガラス基板上にスポットで配列されたＤＮＡマイクロアレイを製造した。
【００２２】
まず、ＧＡＰＳでコーティングされたガラス基板は、コーニング社（Ｃａｔ  ｎｏ．４０００４，ｗｗｗ．ｃｏｒｎＩｎｇ．ｃｏｍ）から購入した。次いで、５０％ＤＭＳＯを含む０．１ＭＮａＨＣＯ３  ｐＨ９溶液中の６ｍＭ  ＰＥＧ（ＡｌｄｒＩｃｈ社製、分子量１０，０００）溶液に５’末端がアミノヘキシル基で官能基化されたプローブポリヌクレオチド（配列番号１ないし１０）をそれぞれ２０μＭの濃度で溶解させた。固定化された使われたプローブポリヌクレオチドを下記表１に表す。青年期発病の糖尿病遺伝子ＭＯＤＹ１のエクソン７ないし１０の特定の領域との完全相補的配列（野生型プローブ）と、１個のヌクレオチドが野生型ヌクレオチドと異なるヌクレオチドに置換された不完全相補的配列（突然変異型プローブ）である。
【００２３】
【表１】
2005233955.tif 000002
【００２４】
このようにして調製した各プローブポリヌクレオチド溶液を、前記ガラス基板上にＣａｒｔｅｓＩａｎ社製のＰＩｘ５５００スポッターを使用してスポット当り５００ｐｌずつスポッティングし、７０℃、温度３０％湿度で１時間恒温項湿器内で固定化反応を行った。反応が終了し後、前記ガラス基板を蒸溜水で洗浄した後、残っているアミノ基を無水スクシン酸（遮断剤）で保護した後、エタノールで洗浄してからスピン乾燥してプローブポリヌクレオチドが固定化されたマイクロアレイを得た。得られたマイクロアレイはそれぞれ６０個のスポットよりなり、スポットが３００μｍの間隔で配列されている。
【００２５】
（実施例２：本発明のマイクロアレイを利用した標的核酸の分析）
本実施例では、実施例１に製造されたプローブポリヌクレオチドマイクロアレイを利用して、プローブポリヌクレオチドと標的核酸とのハイブリダイゼーションによりその結果を検出することによって、本発明の方法によって製作されたマイクロアレイの品質を評価した。
【００２６】
まず、分析に使われる標的ＤＮＡを増幅した。標的ＤＮＡは、配列番号１１ないし２４の１４個のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ヒト血液から分離したｇＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲで増幅し、ＭＯＤＹ１のエクソン７ないし１０を含むポリヌクレオチドを得た。
【００２７】
具体的なＰＣＲ条件は、０．２μｌ野生型ゲノムＤＮＡと、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、４０μＭのｄＴＴＰ、１６０μＭのＣｙ３−ラベル付きのｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢＩｏｓｃＩｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）と、２００ｎＭのエクソン及びプロモータ領域に対応する１０個の多重ＰＣＲプライマーセットとを混合した後、４０サイクルの反応を実施した。ＰＣＲ条件：９５℃で３０秒間変性、６４℃で１０秒間アニーリング、イクステンション７２℃、３分とした。ＰＣＲ反応生成物はキアゲン（ＱＩａｇｅｎ）キットを利用して精製した。精製後、Ａ２６０／Ａ５５０比率が１．０〜３．５であるもののみを次の段階に使用した。
【００２８】
精製された生成物を０．５Ｕ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（ＢｏｅｈｒＩｎｇｅｒ  ＭａｎｎｈｅＩｍ、ＭａｎｎｈｅＩｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて３７℃で１０分間断片化した。反応停止液（２０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１％  ＳＤＳ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ）を添加してＤＮａｓｅ  Ｉ反応を停止させた。次いで、断片化された生成物を１５０〜１８７．５ｎＭに濃度を調整して９４℃で５分間変性させた後、氷上で２分間冷やした。次いで、同量のハイブリダイゼーションバッファ（６ｘＳＳＰＥ−０．１％  ＴｒＩｔｏｎ  Ｘ−１００）と混ぜた後、それぞれマイクロアレイ上に適用した。３２℃で１２〜１６時間培養した後、洗浄バッファＩ（６ｘＳＳＰＥ−ＴｒＩｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．００５％）で５分間洗浄した後、洗浄バッファＩＩ（３ｘＳＳＰＥ−ＴｒＩｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．００５％）で５分間洗浄した。１５分間常温で乾燥した後、アクソン・インスツルメンツ社製のＧｅｎｅＰＩｘ  ４０００Ｂスキャナーを利用して５３２ｎｍで測定してイメージを生成し、ＧｅｎｅＰＩｘ  Ｐｒｏｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵｎＩｏｎＣＩｔｙ、ＣＡ）を利用してイメージ分析を行った。
【００２９】
分析結果を図１及び表２に表した。実験は、５個のマイクロアレイで、表１の野生型及び突然変異型プローブが固定化されているスポット（それぞれプローブに対して３個のスポット）について行った。得られたイメージデータ及び蛍光強度データを図１及び表２に表した。図１は、図面の上段に表示したプローブポリヌクレオチドが固定化されている、５個のマイクロアレイＳ１ないしＳ５に対して標的核酸をハイブリダイズした後、測定された蛍光イメージを示す図面である。図１の各マイクロアレイで、上段列及び下段列のスポットはＰＥＧの濃度をそれぞれ０．４ｍＭと６．０ｍＭとし、実施例１のようにして固定化し、図面の上段に表した配列番号を持つプローブに対して標的核酸をハイブリダイズし、そのイメージを測定したものである。表２は、ＰＥＧ  ０．４ｍＭとＰＥＧ  ６．０ｍＭ濃度で製作されたスポットに対して５３２ｎｍで観察した蛍光強度を表す。対照群として、固定化されたプローブポリヌクレオチドの密度が類似したものを使用する必要があるが、実質的に製造し難いため、ＰＥＧの濃度を０．４ｍＭに非常に低くして製造したマイクロアレイを使用した。
【００３０】
【表２】
2005233955.tif 000003
【００３１】
表２に表すように、ＰＥＧ濃度を６．０ｍＭとして製作したマイクロアレイスポットの蛍光強度は平均６７７４であったが、ＰＥＧ濃度を０．４ｍＭとして製作したマイクロアレイの蛍光強度は平均２６８３であった。また、ＰＥＧ濃度を０．４ｍＭとして製作したマイクロアレイの蛍光強度に対する、６．０ｍＭとして製作されたマイクロアレイのスポット蛍光強度の比率は２．８７となった。したがって、本発明の方法を使用してマイクロアレイを製作する場合、蛍光強度がＰＥＧの濃度に比例するということが分かる。すなわち、ＰＥＧを６．０ｍＭの濃度で使用した場合、ＰＥＧを０．４ｍＭの濃度で使用した場合に比べて約３倍の蛍光強度が得られる。したがって、ＰＥＧを利用してプローブを固定化することによって、蛍光強度測定の感度を高めうる。このようなＰＥＧ濃度による蛍光強度の比例関係は８ｍＭ以上まで続いたが、それ以上の濃度では、スポッティング過程でピンの穴を閉塞させるために、実用的に使われられなかった（データは表さない）。
【００３２】
また、本発明の方法によって製作されたマイクロアレイを標的核酸の分析方法に使用するに当って、十分な特異性で反応できるかを確認するために、各スポットに対して突然変異型プローブの蛍光強度値ｍｐと、野生型プローブの蛍光強度値ｗｐとを比較した。その結果を表３に表した。
【００３３】
【表３】
2005233955.tif 000004
【００３４】
突然変異型プローブの蛍光強度値ｍｐに対する野生型プローブの蛍光強度値ｗｐ、すなわち、ｗｐ／ｍｐ値は、ＰＥＧ濃度０．４ｍＭを使用して製作されたスポットでは８．０５であり、ＰＥＧ濃度６．０ｍＭを使用して製作したスポットでは１１．１５であって、約１．３１倍高かった。これは、プローブポリヌクレオチドを固定化するために使われたＰＥＧの濃度に比例して、優れた特異性で標的核酸を検出できることを表す。
【００３５】
以上のような実施例１及び２の結果から、従来のように共有結合を利用してプローブポリヌクレオチドを基板上に固定化せず、簡単に非共有結合を通じてプローブポリヌクレオチドをガラス基板上に固定することによっても、分析敏感度及び特異性の高いマイクロアレイを製作できることを確認された。
【００３６】
（実施例３：ＰＥＧ濃度がマイクロアレイに及ぼす影響）
本実施例では、他の条件を実施例１及び２の条件と同一にし、固定化されたプローブヌクレオチドの配列を異ならせてプローブポリヌクレオチドアレイを製作した後、ハイブリダイゼーションを行った。本実施例で使用したプローブポリヌクレオチドの配列は配列番号２５と同じく、標的ポリヌクレオチドは、配列番号１５に完全相補的なヌクレオチド配列を持つものを使用した。
【００３７】
その結果、ＰＥＧを０．４ｍＭの濃度で使用して製作したマイクロアレイの場合、蛍光強度は７，７００であったが、６．０ｍＭを使用して製作したマイクロアレイの場合には１５，０００であって、ＰＥＧの濃度が６．０ｍＭである場合に高い蛍光強度を得ることができた。図２及び図３は、ＰＥＧ濃度をそれぞれ０．４ｍＭ（図２）と６．０ｍＭ（図３）で使用して製作したマイクロアレイで蛍光測定した結果を表す図面である。
【００３８】
本実施例の結果もやはり、プローブポリヌクレオチドの固定化に使われるＰＥＧの濃度に比例して高い蛍光強度を得られるということを表している。
【００３９】
（実施例４：シリコンウェーハ上に、ＰＥＧとアミノ基で５’末端が官能基化されたＤＮＡとの混合物を反応させた、ＤＮＡマイクロアレイの製造）
本実施例では、固体基板としてシリコンウェーハ（ＬＧ  ＳＩｌｔｒｏｎ社製のホウ素ドーピングされたＰ型シリコンウェーハ）にＧＡＰＳコーティングしたもの使用したことを除いて、実施例１と同じ条件で製作したマイクロアレイで標的核酸をハイブリダイズした後、蛍光強度を測定した。使用したプローブ及び標的ポリヌクレオチドは実施例３と同一であった。
【００４０】
シリコンウェーハ上にＧＡＰＳをコーティングする過程は次のように行った。エタノール中のＧＡＰＳ溶液（濃度２０％（ｖ／ｖ））をスピンコーティングした。スピンコーティングはＣＥＥ社製のスピンコーターモデルＣＥＥ  ７０を利用した。スピンコーティングは初期コーティング５００ｒｐｍ／１０ｓｅｃ及び主コーティング２，０００ｒｐｍ／１０ｓｅｃによって行った。スピンコーティングが完了した後、基板をテフロンウェーハキャリアに固定して１２０℃で４０分間硬化させた。硬化した基板は水に１０分間浸漬させた後、１５分間超音波洗浄、再び水で１０分間浸漬させた後に乾燥した。乾燥はスピン乾燥によって行った。乾燥した基板は、実験のために正方形または長方形に切って利用した。あらゆる実験は大部分のホコリ粒子が十分に除去されたクリーンルーム・クラス１，０００で行った。このように製作されたＧＡＰＳがコーティングされたシリコンウェーハ基板を利用して実施例１と同じ方法でマイクロアレイを製作し、実施例２と同じ方法でハイブリダイゼーションを行って、その結果を測定した。
【００４１】
その結果を図４に図示した。図４は、各ＰＥＧの濃度を６．０ｍＭと０．４ｍＭとし、シリコンウェーハ上にプローブポリヌクレオチドを固定化したマイクロアレイを使用して測定された蛍光強度を表す図面である。図４に表すように、シリコンウェーハを使用し、ＰＥＧを利用して非共有的にプローブを固定化しても高い蛍光強度を得ることができ、その強度は、使われるＰＥＧの濃度に比例するということが分かった。
【００４２】
（実施例５：プローブポリヌクレオチドの濃度が蛍光強度に及ぶ影響）
本実施例では、固定化に使われるプローブポリヌクレオチドの種類とその濃度とを変更したことを除いて、実施例１及び２に記載するようにマイクロアレイを製作し、標的核酸をハイブリダイズした後、蛍光強度を測定した。プローブポリヌクレオチドは、２０μＭ及び１００μＭの濃度で固定化反応に使用した。本実施例に使われたプローブポリヌクレオチドの配列は配列番号２６と同じである。
【００４３】
その結果、測定された蛍光強度は２０μＭの場合に１２，２３８であり、１００μＭの場合に８，３２１であった。
【００４４】
本実施例の結果から、約２０μＭの濃度のプローブポリヌクレオチドを使用する場合に最適の蛍光強度を得られるということが分かった。これは、通常的に共有結合によってプローブポリヌクレオチドを固定化する場合、普通２０μＭより高い濃度で反応を行うが、本発明の方法によれば、使われるプローブポリヌクレオチドの量を減少させうる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の生体分子を固体基板上に固定化する方法、具体的には非共有結合によって生体分子を固体基板上に固定化する方法は、マイクロアレイ用の基板及び前記マイクロアレイの製造に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ＰＥＧ濃度をそれぞれ０．４ｍＭ及び６．０ｍＭで製作されたマイクロアレイを使用して蛍光測定した、実施例２の結果を示す図面である。
【図２】ＰＥＧ濃度を０．４ｍＭで製作したマイクロアレイを使用して蛍光測定した、実施例３の結果を示す図面である。
【図３】ＰＥＧ濃度を６．０ｍＭで製作したマイクロアレイを使用して蛍光測定した、実施例３の結果を示す図面である。
【図４】実施例４の結果を示す図である。
【図１】
2005233955.tif 000005
【図２】
2005233955.tif 000006
【図３】
2005233955.tif 000007
【図４】
2005233955.tif 000008
【配列表】
2005233955000001.app