(57)【要約】    【課題】  本発明は、ヒト・ＤＮＡ修復蛋白およびかかる蛋白をコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）、さらに組み換え法によるかかる蛋白の製造方法を開示する。さらに本発明は、ｈＭＬＨ１、ｈＭＬＨ２および特にｈＭＬＨ３遺伝子における変化を見出す方法を提供する。    【解決手段】  ｈＭＬＨ１、ｈＭＬＨ２およびｈＭＬＨ３遺伝子配列ならびにｈＭＬＨ１、ｈＭＬＨ２およびｈＭＬＨ３遺伝子における変化を見出す方法、特にｈＭＬＨ３遺伝子配列ならびにｈＭＬＨ３遺伝子における変化を見出す方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＡＴＣＣ ７５６５０のｃＤＮＡインサートによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）ＡＴＣＣ ７５６５０のｃＤＮＡインサートのコーディング領域のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）にハイブリダイゼーションする相補鎖ポリヌクレオチドであって、ＤＮＡミスマッチ修復活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％または９５％同一であり、ＤＮＡミスマッチ修復活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；および
（ｅ）（ａ）ないし（ｄ）のいずれか１つのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであって、該フラグメントがＤＮＡミスマッチ修復活性を有するものであるポリヌクレオチド
からなる群より選択されるポリヌクレオチド。
【請求項２】
ＤＮＡである請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ｃＤＮＡである請求項２のＤＮＡ。
【請求項４】
ゲノムＤＮＡである請求項２のＤＮＡ。
【請求項５】
ＲＮＡである請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項２ないし４のいずれか１項のＤＮＡを含むベクター。
【請求項７】
該ＤＮＡが原核細胞または真核細胞中での発現を可能にする発現制御配列に作動可能に連結されている請求項６のベクター。
【請求項８】
請求項１ないし５のいずれか１項のポリヌクレオチドまたは請求項６または７のベクターで遺伝学的に操作された宿主細胞。
【請求項９】
ヒト・ＤＮＡミスマッチ修復蛋白の成熟形態ポリペプチドを製造する方法であって、
請求項８の宿主細胞を培養し、次いで、培養物からポリペプチドを回収すること
を特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１ないし５のいずれか１項のポリヌクレオチドによりコードされる、あるいは請求項９の方法により得ることのできるポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１ないし５のいずれか１項のポリヌクレオチドあるいは請求項６または７のベクターで細胞を遺伝学的に操作することを特徴とする、請求項１０のポリペプチドを発現しうる細胞の製造方法。
【請求項１２】
請求項１０のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１３】
癌に対する感受性を診断するための、請求項１ないし５のいずれか１項のポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項１４】
下記工程：
（ａ）対象から得た生物学的試料中のｈＭＬＨ３遺伝子のコーディング領域のヌクレオチド配列を決定し、次いで
（ｂ）該生物学的試料からのｈＭＬＨ３遺伝子のコーディング領域のヌクレオチド配列を、ＡＴＣＣ  ７５６５０のｃＤＮＡインサートのコーディング領域のヌクレオチド配列と比較する
を特徴とする、癌に対する感受性を調べる方法であって、該生物学的試料中のｈＭＬＨ３遺伝子のコーディング領域のヌクレオチド配列とＡＴＣＣ  ７５６５０のｃＤＮＡインサートのコーディング領域のヌクレオチド配列との間の相違が癌に対する感受性を示すものである方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、かかるポリヌクレオチドならびにポリペプチドの使用、さらにかかるポリヌクレオチドならびにポリペプチドの製造に関する。より詳細には、本発明ポリペプチドは原核細胞のｍｕｔＬ４遺伝子のヒト・相同体であり、以後、ｈＭＬＨ１、ｈＭＬＨ２およびｈＭＬＨ３という。
【背景技術】
【０００２】
原核生物および真核生物の両方において、ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子は、ＤＮＡ複製および遺伝学的組み換えの間に生じるエラーの修正において際立った役割を果たしている。現在までのところ、イー・コリ（E.coli）のメチル特異的ＤＮＡミスマッチ修復系は最もよく理解されているＤＮＡミスマッチ修復系である。イー・コリにおいて、この修復経路は、ミューテーター遺伝子ｍｕｔＳ、ｍｕｔＬ、ｍｕｔＨおよびｕｖｒＤの生成を包含している。これらの遺伝子のうちいずれか１つの変異体はミューテーター表現型を示すであろう。ＭｕｔＳは、この修復プロセスを開始するＤＮＡミスマッチ結合蛋白であり、ｕｖｒＤはＤＮＡヘリカーゼであり、ＭｕｔＨは、半メチル化ＧＡＴＣ配列の非メチル化鎖を切開する潜在的なエンドヌクレアーゼである。ＭｕｔＬ蛋白はミスマッチＤＮＡ−ＭｕｔＳ−ＭｕｔＨ複合体を認識し、これに結合してＭｕｔＨ蛋白のエンドヌクレアーゼ活性を増大させる。非メチル化ＤＮＡ鎖がＭｕｔＨにより切断された後、１本鎖ＤＮＡ結合蛋白、ＤＮＡポリメラーゼIII、エキソヌクレアーゼＩおよびＤＮＡリガーゼがこの修復プロセスの完了に必要とされる（モドリッチ,ピー（Modrich P.）、アニュ・レビュ・ジェネティクス（Annu.Rev.Genetics）、第２５巻：２２９〜２５３頁（１９９１年））。
【０００３】
イー・コリのＭｕｔＬＨＳ系のエレメントは、原核生物および真核生物の進化の過程で保存されているように思われる。遺伝学的研究分析は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は細菌のＭｕｔＬＨＳ系と同様のミスマッチ修復系を有することを示唆している。エス・セレビシエ（S.cerevisiae）において、少なくとも２つのＭｕｔＬ相同体であるＰＭＳ１およびＭＬＨ１が報告されている。それらのうちのいずれかの変異は有糸分裂ミューテーター表現型を導く（プロラ（Prolla）ら、モレ・セル・バイオロ（Mol.Cell.Biol.）第１４巻：４０７〜４１５頁（１９９４年））。少なくとも３つのＭｕｔＳ相同体、すなわち、ＭＳＨ１、ＭＳＨ２、およびＭＳＨ３がエス・セレビシエにおいて見いだされている。ＭＳＨ２遺伝子の崩壊は核変異率に影響する。エス・セレビシエにおける変異体ＭＳＨ２、ＰＭＳ１、およびＭＬＨ１は、ジヌクレオチド繰り返し配列の拡張および濃縮速度を増大させることが見いだされている（ストランド（Strand）ら、ネイチャー（Nature）、第３６５巻：２７４〜２７６頁（１９９３年））。
【０００４】
肺癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、結腸癌および胃癌のごとき多くのヒトの腫瘍は繰り返しＤＮＡ配列の不安定性を示す（ハン(Han)ら、キャンサー（Cancer）、第５３巻：５０８７〜５０８９頁（１９９３年）；チボドー（Thibodeau）ら、サイエンス（Science）、第２０６巻：８１６〜８１９頁（１９９３年）；リシンガー（Risinger）ら、キャンサー（Cancer）、第５３巻：５１００〜５１０３頁（１９９３年））。この現象は、おそらくＤＮＡミスマッチ修復の欠乏がこれらの癌の原因であろうということを示唆する。
【０００５】
最近まで、ヒトにおけるＤＮＡミスマッチ修復系についてはほとんどわかっていないが、ＭｕｔＳ遺伝子のヒト・相同体がクローン化され、遺伝性非ポリポーシス結腸癌（ＨＮＰＣＣ）の原因であることがわかった（非特許文献１および２参照）。当初は、ＨＮＰＣＣは、ジヌクレオチド不安定性を引き起こす染色体２ｐ１６における遺伝子座に関連しているとされた。次いで、ＤＮＡミスマッチ修復蛋白（ＭｕｔＳ）相同体がこの遺伝子座に位置し、いくつかの保存的領域におけるＣ→Ｔ過渡的変異が特異的にＨＮＰＣＣ患者において観察されることが報告された。遺伝性非ポリポーシス結腸癌はヒトの最もありふれた遺伝病の１つであり、西洋世界においては２００人に１人が罹患している。
【０００６】
遺伝性結腸癌はいくつかの遺伝子座における変異から生じうることが示されている。染色体５上の遺伝子に関連している家族性結腸腺腫症ポリポーシス（ＡＰＣ）は遺伝性結腸癌のごく一部の原因である。遺伝性結腸癌はガードナー症候群（Gardner's syndrome）、ターコット症候群（Turcot's syndrome）、ポイツ−ジェガーズ症候群（Peutz-Jaeghers syndrome）および幼若結腸ポリポーシスにも関連している。さらに、遺伝性非ポリポーシス結腸癌はすべてのヒトの癌の５％を占める。すべての異なるタイプの家族性結腸癌は遺伝の優性常染色体モードによって伝達されることが示されている。
染色体２の短いアームへのＨＮＰＣＣの局在化以外に、第２の遺伝子座がＨＮＰＣＣ素因に関連していた（リンドホルム（Lindholm）ら、ネイチャー・ジェネティクス（Nature Genetics）第５巻：２７９〜２８２頁（１９３３年））。染色体３の短いアーム上の多形性マーカーとその疾病遺伝子座との間において強力な関連が示された。
この知見は、おそらく、種々のＤＮＡミスマッチ修復蛋白上の変異がヒトの遺伝性の疾患および癌の発生に重大な役割を果たしていることを示唆する。
【０００７】
ＨＮＰＣＣは、結腸、子宮内膜および他の器官の癌の明らかな常染色体優性的に遺伝する素因によって臨床的に特徴づけられる（リンチ,エイチ・ティー(Lynch,H.T.)ら、ガストロエンテロロジー（Gastroenterology）、第１０４巻：１５３５〜１５４９頁（１９９３年））。特定の家族性ＨＮＰＣＣにおける疾病に関連している２ｐ１６および３ｐ２１〜２２におけるマーカーの同定により、そのメンデル則の性質が明確に確認された（ペルトマキ,ピー（Peltomaki,P.）ら、サイエンス（Science）、第２６０巻：８１０〜８１２頁（１９９３年））。ＨＮＰＣＣ患者由来の腫瘍は、単純な繰り返し配列（マイクロサテライト（microsatellites）の広範な変化により特徴づけられる（アールトネン,エル・エイ（Aaltonen,L.A.）ら、サイエンス第２６０巻：８１２〜８１６頁（１９９３年））。このタイプの遺伝学的不安定性は、もともと、部分集団中（散在性結腸直腸癌の１２ないし１８％）において観察された（上記文献）。細菌および酵母における研究により、ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子の欠陥はマイクロサテライトの同様の不安定性を引き起こす可能性があり（レビンソン,ジー（Levinson,G.）およびグートマン,ジー・エイ（Gutman,G.A.）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nuc.Acids Res.）、第１５巻：５３２５〜５３３８頁（１９８７年））、ミスマッチ修復の欠損はＨＮＰＣＣの原因であると仮定された（ストランド,エム（Strand,M.）ら、ネイチャー第３６５巻：２７４〜２７６頁（１９９３年））。ＨＮＰＣＣ腫瘍細胞系からの抽出物の分析により、ミスマッチ修復が実際に欠損しており、この推定を明確に指示するものであることが示された（パーソンズ,アール・ピー（Parsons,R.P.）ら、セル（Cell）、第７５巻：１２２７〜１２３６頁（１９９３年））。すべての家族性ＨＮＰＣＣが同一の遺伝子座に関連しているわけではなく、そして酵母において少なくとも３つの遺伝子が同様の表現型を作る可能性があるので、他のミスマッチ修復遺伝子がＨＮＰＣＣの同じケースにおいて役割を果たしている可能性があると思われる。
【０００８】
ｈＭＬＨ１は、酵母・ｍｕｔＬ−相同体ｙＭＬＨ１と最も相同性が高いが、ｈＭＬＨ２およびｈＭＬＨ３は酵母・ｍｕｔＬ−相同体ｙＰＭＳ１に対してより高い相同性を有する（ｈＭＬＨ２およびｈＭＬＨ３は、酵母・ＰＭＳ１遺伝子に対するそれらの相同性のために、時々、明細書中でｈＰＭＳ１およびｈＰＭＳ２という）。ｈＭＬＨ１以外にも、染色体２ｑ３２上のｈＭＬＨ２遺伝子および染色体７ｐ２２上のｈＭＬＨ３遺伝子は、ＨＮＰＣＣ患者の生殖系列において変異していることが見いだされた。このことは、ＨＮＰＣＣに関与する遺伝子数を２倍にし、この疾病の比較的高い発生率の説明の一助となる。
【非特許文献１】フィッシェル（Fishel）ら、セル（Cell）第７５巻：１０２７〜１０３８頁（１９９３年）
【非特許文献２】リーチ（Leach）ら、セル（Cell）、第７５巻：１２１５〜１２２５頁（１９９３年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記事情に鑑みると、ヒト・ＤＮＡ修復蛋白およびかかる蛋白をコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）、さらに組み換え法によるかかる蛋白の製造方法に対する必要性が生じている。また、ヒト・ＤＮＡ修復遺伝子における変化を調べる方法も必要となっている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の１の態様によれば、ｈＭＬＨ１、ｈＭＬＨ２およびｈＭＬＨ３である新規な推定上の成熟ポリペプチド、ならびに生物学的に活性があり診断上または治療上有用なフラグメント、アナログおよびそれらの誘導体が提供される。本発明ポリペプチドはヒト起源である。
本発明のもう１つの態様によれば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを包含する、かかるペプチド、並びに生物学的に活性があり診断上または治療上有用なそのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする単離核酸分子が提供される。
本発明のさらにもう１つの態様によれば、ｈＭＬＨ１、ｈＭＬＨ２およびｈＭＬＨ３配列に特異的にハイブリダイズするに十分な長さの核酸分子からなる核酸プローブが提供される。
【００１１】
本発明のさらにもう１つの態様によれば、ｈＭＬＨ１、ｈＭＬＨ２または
ｈＭＬＨ３核酸配列を含んでいる組み換え原核および／または真核宿主細胞を、該蛋白の発現を促進する条件下で培養し、次いで、該蛋白を回収することからなる、組み換え法によるかかるポリペプチドの製造方法が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、治療目的、例えば、癌の治療のための、かかるポリペプチドおよびかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用方法が提供される。
【００１２】
本発明のもう１つの態様によれば、ｈＭＬＨ１、ｈＭＬＨ２またはｈＭＬＨ３核酸配列およびかかる核酸配列によりコードされる蛋白における変異に関連した疾病の診断方法および該疾病に対する感受性の診断方法が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、ＤＮＡの科学的研究、合成、およびＤＮＡベクターの製造に関するインビトロ目的の、かかるポリペプチドおよびかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用方法が提供される。
本発明のこれらのおよび他の態様は、本明細書の教示から当業者に明らかである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれは、３種のヒト・ＤＮＡ修復蛋白およびかかる蛋白をコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）、さらに組み換え法によるかかる蛋白の製造方法をが提供される。ヒト・ＤＮＡ修復遺伝子の１つであるｈＭＬＨ１は染色体３に対してマッピングされ、ｈＭＬＨ２は染色体２に対してマッピングされ、さらにｈＭＬＨ３は染色体７に対してマッピングされた。本発明は、ｈＭＬＨ１、ｈＭＬＨ２およびｈＭＬＨ３遺伝子における変化を診断する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の１の態様によれば、図１−６、７−１４および１５−２１（配列番号：２、４および６）の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドをコードする単離核酸（ポリヌクレオチド）、またはＡＴＣＣ寄託物７５６４９、７５６５１、７５６５０として寄託されたクローン（１９９４年１月２５日寄託）のｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。  ＡＴＣＣ寄託物７５６４９は、本明細書ではｈＭＬＨ１と呼ばれるヒト・ＤＮＡ修復蛋白をコードする全長の配列を含むｃＤＮＡクローンであり；ＡＴＣＣ寄託物７５６５１は、本明細書ではｈＭＬＨ２と呼ばれるヒト・ＤＮＡ修復蛋白をコードする全長の配列を含むｃＤＮＡクローンであり；ＡＴＣＣ寄託物７５６５０は、本明細書ではｈＭＬＨ３と呼ばれるヒト・ＤＮＡ修復蛋白をコードする全長の配列を含むｃＤＮＡクローンである。
【００１５】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、心臓、肺、前立腺、脾臓、肝臓、胆嚢、胎児の脳および精巣組織から調製された１種またはそれ以上のライブラリーから得てもよい。ｈＭＬＨ１のポリヌクレオチドはヒト・胆嚢ｃＤＮＡライブラリーから発見された。さらに、Ｎ末端においてｈＭＬＨ１と同一である６種のｃＤＮＡクローンが、ヒト・小脳、８週目の胚、胎児心臓、ＨＳＣ１７２細胞およびジャーケット細胞（Jurket cell）ｃＤＮＡのライブラリーから得られた。ｈＭＬＨ１遺伝子は、細菌および酵母のｍｕｔＬ蛋白に対して相同性を示す８５ｋＤ蛋白をコードする７５６アミノ酸の読み取り枠を含んでいる。しかしながら、その５'非翻訳領域は、オリゴヌクレオチドを設計するために非翻訳領域を伸長させる目的で胎児心臓から得たｃＤＮＡクローンから得られた。
【００１６】
ｈＭＬＨ２遺伝子はヒト・Ｔ細胞リンパ種ｃＤＮＡライブラリー由来であった。ｈＭＬＨ２のｃＤＮＡクローンは、イン−フレーム（in-frame）停止コドンが両側に隣接している２７９６塩基対の読み取り枠を含むことが同定された。それは酵母のＰＭＳ１ファミリーに構造的に関連している。それは９３４アミノ酸残基からなる蛋白をコードする読み取り枠を含んでいる。該蛋白は、蛋白全体に関して、酵母・ＰＭＳ１と２７％の同一性および８２％の類似性という最高度の相同性を示す。
３種のＰＭＳ関連蛋白の中で有意な相同性のある第２の領域はカルボキシル末端であり、コドン８００〜９００にある。この領域は、酵母・ＰＭＳ１蛋白ｈＭＬＨ２ならびにｈＭＬＨ３蛋白との間において、それぞれ、２２％および４７％の相同性を有するが、これらの蛋白と他の酵母・ｍｕｔＬ相同体であるｙＭＬＨ１との間においてはごくわずかな相同性しか観察されなかった。
【００１７】
ｈＭＬＨ３遺伝子はヒト・子宮内膜腫瘍ｃＤＮＡライブラリー由来であった。ｈＮＬＨ３クローンは２５８６塩基対の読み取り枠を有すると同定された。それは酵母のＰＭＳ２ファミリーに構造的に関連している。それは８６２アミノ酸残基からなる蛋白をコードする読み取り枠を含んでいる。該蛋白は、蛋白全体に関して、酵母・ＰＭＳ２と３２％の同一性および６６％の類似性という最高度の相同性を示す。
イー・コリ由来のｍｕｔＬ相同体において保存されているＧＦＲＧＥＡＬドメインが、ｈＭＬＨ１、ｈＭＬＨ２およびｈＭＬＨ３のアミノ酸配列において保存されていることは、ｈＭＬＨ１、ｈＭＬＨ２およびｈＭＬＨ３の推定上の同定に関して重要である。
【００１８】
本発明ポリヌクレオチドはＲＮＡ形態またはＤＮＡ形態であってよく、該ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを包含する。ＤＮＡは２本鎖または１本鎖であってよく、１本鎖がコーディング鎖であっても非コーディング鎖であってもよい。成熟ポリペプチドをコードするコーディング配列は図１−６、７−１４および１５−２１（配列番号：１）に示すコーディング配列または寄託されたクローンのコーディング配列と同じであってもよく、あるいは遺伝コードの余剰もしくは縮重の結果として、コーディング配列が、図１−６、７−１４および１５−２１（配列番号：２、４および６）のＤＮＡまたは寄託されたｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードしている別のコーディング配列であってもよい。
図１−６、７−１４および１５−２１（配列番号：２、４および６）の成熟ポリペプチドまたは寄託されたｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドに関するコーディング配列のみ；成熟ポリペプチドに関するコーディング配列（ならびに所望によりさらなるコーディング配列も）およびイントロンもしくは成熟ポリペプチドに関する配列の５'および／または３'側の非コーディング配列のごとき非コーディング配列を包含する。
よって、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチド、並びにさらなるコーディング配列および／または非コーディング配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００１９】
さらに本発明は、図１−６、７−１４および１５−２１（配列番号：２、４および６）の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする上記ポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は天然に存在するポリヌクレオチド対立遺伝子変異体または天然に存在しないポリヌクレオチドの変異体であってよい。
よって、本発明は、図１−６、７−１４および１５−２１（配列番号：２、４および６）に示すものと同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードされるのと同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに図１−６、７−１４および１５−２１（配列番号：２、４および６）に示すものと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードされるのと同じ成熟ポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードするかかるポリヌクレオチドの変異体を包含する。かかるヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体および付加もしくは挿入変異体を包含する。
上記のごとく、ポリヌクレオチドは、図１−６、７−１４および１５−２１（配列番号：１、３および５）に示すコーディング配列または寄託されたクローンのコーディング配列の天然に存在する対立遺伝子変異体であるコーディング配列を有していてもよい。当該分野において知られているように、対立遺伝子変異種は、１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有していてもよいポリヌクレオチド配列のもう１つの形態であり、コードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させない。
【００２０】
さらに本発明ポリヌクレオチドは、本発明ポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン−フレーム（in-frame）で融合したコーディング配列を有していてもよい。マーカー配列は、例えば、細菌宿主の場合にマーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を行うためのｐＱＥ−９ベクターにより提供されるヘキサ−ヒスチジンタグ（hexa-histidine tag）であってもよく、あるいは、例えば、哺乳動物宿主、例えばＣＯＳ−７細胞を用いる場合には、マーカー配列がヘマグチニン（ＨＡ）タグであってもよい。ＨＡタグは、インフルエンザ・ヘマグルチニン蛋白由来のエピトープに対応する（ウィルソン,アイ（Wilson,I.）ら、セル、第３７巻：７６７頁（１９８４年））。
【００２１】
さらに本発明は、少なくとも５０％、好ましくは７０％の配列間同一性がある場合に、上記配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。詳細には、本発明は、厳密な条件下で上記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書の用語「厳密な条件」は、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の配列間同一性がある場合にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。好ましい具体例において、上記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１−６、７−１４および１５−２１（配列番号：１、３および５）のｃＤＮＡまたは寄託されたｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持しているポリペプチドをコードする。
【００２２】
本明細書にいう寄託物とは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下に維持されるものを意味する。これらの寄託物は当業者の便宜のためのみに提供され、寄託物が３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１２の下で必要とされるという承認ではない。寄託された材料中に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、参照により本明細書に記載されているものと見なされ、本明細書の配列の記載との矛盾のイベントにおいて支配的である。該寄託材料の製造、使用または販売にはライセンスが必要でありうるし、かかるライセンスをここで認める。
【００２３】
さらに本発明は、図１−６、７−１４および１５−２１（配列番号：２、４および６）の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、または寄託されたｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びにかかるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。
図１−６、７−１４および１５−２１（配列番号：２、４および６）のポリペプチドまたは寄託ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドをいう場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」は、かかるポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を有するポリペプチドを意味する。よって、アナログは、プロ蛋白部分の開裂により活性化されて活性成熟ポリペプチドを生じうるプロ蛋白を包含する。  本発明ポリペプチドは、組み換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであってよく、好ましくは組み換えポリペプチドである。
図１−６、７−１４および１５−２１（配列番号：２、４および６）のポリペプチドまたは寄託ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（i）１個またはそれ以上のアミノ酸残基が保存的もしくは非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存性残基）で置換されているもの（かかる置換アミノ酸残基は遺伝コードによりコードされていてもよく、あるいはされていなくてもよい）、あるいは（ii）１個またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を有するもの、あるいは（iii）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を延ばす化合物のごとき別の化合物（例えば、ポリエチレングリコール）に融合しているもの、であってもよい。かかるフラグメント、誘導体およびアナログは本明細書の教示から、当業者の範囲内にあると思われる。
好ましくは、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは単離形態であり、好ましくは均一に精製される。
【００２４】
用語「単離」は、物質がその元の環境（例えば、天然に存在する場合には天然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きた動物中に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されなが、天然系において同時に存在する物質のいくつかまたはすべてから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離される。かかるポリヌクレオチドはベクターの一部でありうるし、さらに／またはかかるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部でありうるし、さらにかかるベクターまたは組成物がその天然環境の一部分でないという点で単離されうる。
【００２５】
本発明はまた、本発明ポリヌクレオチドを含むベクター、本発明ベクターで遺伝学的に操作された宿主細胞、および組み換え法による本発明ポリペプチドの製造に関する。
例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであってもよい本発明ベクターで宿主細胞を遺伝学的に操作する。例えば、ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態であってもよい。プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、あるいはｈＭＬＨ１、ｈＭＬＨ２およびｈＭＬＨ３遺伝子を増幅するのに適するように修飾された慣用的な栄養培地中で操作された宿主細胞を培養する。温度、ｐＨ等のごとき培養条件は、発現用に選択された宿主細胞に関して以前用いられたものであり、当業者に明らかであろう。
組み換え法によるポリペプチドの製造のために本発明ポリヌクレオチドを用いてもよい。よって、例えば、ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチド発現のための種々の発現ベクターのいずれか１つに含有されていてもよい。かかるベクターは、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドならびにファージのＤＮＡの組み合わせ由来のベクター；ワクチニア、アデノウイルス、伝染性上皮腫ウイルスならびに偽狂犬病のごときウイルスＤＮＡを包含する。しかしながら、宿主中で複製可能で製造可能である限り、他のいずれのベクターであっても使用できる。
種々の方法により適当なＤＮＡ配列をベクター中に挿入することができる。一般的には、当該分野において知られた方法によりＤＮＡ配列を適当な制限エンドヌクレアーゼ部位中に挿入する。かかる方法および他の方法は当業者の範囲内であると思われる。
発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指令するための適当な発現調節配列（プロモーター）に作動可能に結合している。かかるプロモーターの代表例として、ＬＴＲもしくはＳＶ４０プロモーター、イー・コリのｌａｃもしくはｔｒｐ、ラムダファージＰＬプロモーター、および原核細胞または真核細胞あるいはそのウイルス中で遺伝子の発現を調節することが知られている他のプロモーターが挙げられる。また、発現ベクターは、翻訳介しのためのリボゾーム結合部位および転写ターミネーターを含んでいる。また、ベクターが、発現を増幅するための適当な配列を含んでいてもよい。
さらに、好ましくは、発現ベクターは、形質転換宿主細胞の選択のための表現型の特徴を提供する１個またはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、真核細胞培養についてジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、あるいはイー・コリにおいてはテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。
【００２６】
上記の適当なＤＮＡ配列ならびに適当なプロモーターもしくは調節配列を含有するベクターを用いて適当な宿主を形質転換して、宿主が蛋白を発現しうるようにする。
適当な宿主の代表例としては、イー・コリ（E.coli）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）のごとき細菌細胞；酵母のごとき真菌細胞；ドロソフィラ（Drosophila）Ｓ２ならびにスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９のごとき昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳもしくはボウズ・メラノーマ（Bowes melanoma）；アデノウイルス；植物細胞等が挙げられる。適当な宿主の選択は、本明細書の教示から、当業者の範囲内であると思われる。
より詳細には、さらに本発明は、上記で広く述べた１またはそれ以上の配列からなる組み換え構築物を包含する。該構築物はプラスミドまたはウイルスベクターのごときベクターからなり、その中へ本発明配列が順方向または逆方向に挿入されている。この具体例の好ましい態様において、さらに構築物は、例えば、該配列に作動可能に結合したプロモーターを包含する調節配列からなる。多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、市販されている。以下のベクターを、実施例を用いて提供する。細菌のもの：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（キアジェン・インコーポレイテッド（Qiagen,Inc.）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、phagescript、ｐｓｉＸ１７４、pbluescript SK、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（ストラタジーン（Stratagene））；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（ファルマシア（Pharmacia））。真核細胞のもの：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（ストラタジーン）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（ファルマシア）。しかしながら、宿主中で複製可能で製造可能である限り、他のいずれのベクターであっても使用できる。
ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択可能マーカーを有する他のベクターを用いて、プロモーター領域をいずれの所望遺伝子からであっても選択することができる。２つの適当なベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特別に命名された細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬおよびＴＲＰを包含する。真核プロモーターは、ＣＭＶ即時初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期ならびに後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲｓ、およびマウス・メタロチオネイン−Ｉを包含する。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者の通常のレベルである。
【００２７】
さらなる具体例において、本発明は、上記構築物を含有する宿主細胞に関する。該宿主細胞は、哺乳動物のごとき高等真核細胞であってもよく、あるいは酵母細胞のごとき下等真核細胞でってもよく、また、宿主細胞は細菌細胞のごとき原核細胞であってもよい。宿主細胞中への構築物の導入を、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、またはエレクトロポーレーション（デイビス,エル（Davis,L.）、ディブナー,エム（Dibner,M.）、バティー,アイ（Battey,I.）、ベイシック・メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Basic Methods in Molecular Biology）（１９８６年））により行うことができる。
宿主細胞中の構築物を慣用的方法で使用して組み換え配列によりコードされた遺伝子産物を製造することができる。別法として、慣用的ペプチド合成装置により、本発明ポリペプチドを合成的に製造することもできる。
【００２８】
適当なプロモーターの調節下において、成熟蛋白を、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞において発現させることができる。本発明ＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用い、無細胞翻訳系を用いてかかる蛋白を製造してもよい。原核および真核宿主について用いる適当なクローニングおよび発現ベクターは、サムブルック（Sambrook）ら、モレキュラー・クローニング；ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、Ｎ.Ｙ.（１９８９年）により記載されており、参照により該開示を本明細書に記載されているものと見なす。
本発明ポリペプチドをコードしているＤＮＡの高等真核生物による転写を、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増大させる。エンハンサーはＤＮＡのシス作用性エレメントであり、通常は、約１０ないし３００ｂｐであり、プロモーターに作用してその転写を増大させる。例は、複製開始点の後期側の１００ないし２７０ｂｐのＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包含する。
一般的には、組み換え発現ベクターは、複製開始点および宿主細胞の形質転換を可能にするイー・コリのアンピシリン耐性遺伝子ならびにエス・セレビシエのＴＲＰ１遺伝子のごとき選択可能マーカー、および下流の構造配列の転写を指令する高発現遺伝子由来のプロモーターを含んでいる。かかるプロモーターは、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、α−因子、酸ホスファターゼ、または特に熱ショック蛋白をコードするオペロン由来であってもよい。異種構造配列を、翻訳開始ならびにターミネーション配列とともに適当なフェーズ（phase）中に集める。所望により、異種配列が、例えば、発現組み換え産物の安定化または精製簡単化のごとき所望の特徴を付与するＮ末端同定ペプチドを含んでいる融合蛋白をコードしていてもよい。
【００２９】
所望蛋白をコードする構造ＤＮＡ配列を適当な翻訳開始ならびにターミネーションシグナルとともに、機能的プロモーターを伴った作動可能なリーディングフェーズ（reading phase）中に挿入することにより、細菌での使用に有用な発現ベクターを構築する。ベクターは、１個またはそれ以上の表現型の選択可能マーカーおよびベクターの維持を確実なものにし、所望であれば宿主中での増幅を可能にする複製開始点からなるであろう。形質転換に適する原核宿主は、イー・コリ、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ・ティフィムリウムおよびシュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトマイセス属、およびスタフィロコッカス（Staphylococcus）属の種々の種を包含するが、他のものも選択の対象でありうる。
代表的であるが限定的でない例において、細菌での使用に有用なベクターは、選択可能マーカーおよびよく知られたクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝エレメントよりなる市販プラスミド由来の細菌の複製開始点からなる。かかる市販ベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（スゥエーデン、ウプサラ（Uppsala）のファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Pharmacia Fine Chemicals））およびＧＥＭ１（アメリカ合衆国、ウィスコンシン州、マジソン（Madison）のプロメガ・バイオテク（Promega Biotech））を包含する。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分を適当なプロモーターおよび発現すべき構造配列と結合する。
適当な宿主株の形質転換、次いで、適当な細胞密度に至る宿主株の増殖後、適当な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により選択プロモーターを誘導し、適当時間細胞を培養する。
典型的には、細胞を遠心分離により収穫し、物理的または化学的手段により破壊し、次いで、得られた粗抽出物をさらなる精製のために取っておく。
凍結−融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を包含するいずれの慣用的な方法によっても蛋白発現に用いる微生物細胞を破壊することができ、かかる方法は当業者によく知られている。
【００３０】
種々の哺乳動物細胞培養系を用いて組み換え蛋白を発現させることもできる。哺乳動物発現系の例は、グルツマン（Gluzman）、セル、第２３巻：１７５頁（１９８１年）により記載されたサル・腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７細胞系、およびＣ適合ベクターを発現させる能力のある他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系を包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターならびにエンハンサー、および必要とされるいずれかのリボゾーム結合部位、ポリアデニレーション部位、スプライスドナーならびにアクセプター部位、転写ターミネーション配列、および５'フランキング非転写配列からなるであろう。ＳＶ４０スプライス由来のＤＮＡ配列、およびポリアデニレーション部位を用いて必要な非転写遺伝エレメントを提供してもよい。
【００３１】
硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを包含する方法により、組み換え細胞培養物からポリペプチドを回収し精製することができる。成熟蛋白の配置の完成において必要に応じて蛋白再生工程を用いることができる。最後に、最終精製工程として高品質液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。
本発明ポリペプチドは当然に精製された生成物であってもよく、あるいは化学合成法の生成物であってもよく、あるいは原核もしくは真核宿主から組み換え法により製造されてもよい（例えば、培養された細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞）。組み換え製造法に用いる宿主に応じて、本発明ポリペプチドはグリコシレーションされていてもよく、あるいはされていなくてもよい。
【００３２】
本発明のさらなる態様において、ガン、詳細には、遺伝性のガンに対する感受性の決定方法が提供される。よって、ヒト・ｍｕｔＬの相同体であるヒト・修復蛋白、さらに詳細には本明細書に記載のヒト・修復蛋白における変異はガンに他する感受性を示すものであり、かかるヒト・相同体をコードする核酸配列をかかる感受性の確認のためのアッセイに用いてもよい。よって、例えば、該アッセイを用いて本明細書記載のヒト・ＤＮＡ修復蛋白における欠失、切断、挿入、フレームシフト等のごとき変異を決定してもよく、かかる変異はガン素因の指示となるものである。
例えば、ＤＮＡ配列決定アッセイにより変異を確認してもよい。血液試料（これに限定しない）を包含する組織試料をヒト・患者から得る。試料を当該分野のいて知られた方法により処理してＲＮＡを得る。ｍＲＮＡ上に存在するポリアデノシン伸長部分にハイブリダイズするポリチミジン残基からなるオリゴヌクレオチドプライマーを添加することにより第１鎖ｃＤＮＡをＲＮＡ試料から合成する。逆転写酵素およびデオキシヌクレオチドを添加して第１鎖ＤＮＡの合成を行う。本発明ＤＮＡ修復蛋白のＤＮＡ配列に基づいてプライマー配列を合成する。一般的には、プライマー配列は１５ないし３０個、好ましくは１８ないし２５個のヒト・ＤＮＡ修復遺伝子の連続した塩基からなる。表１は、ｈＭＬＨ１に基づくオリゴヌクレオチドプライマー配列の実例を示す。該プライマーをペアー（１の「センス」鎖および１の「アンチセンス鎖」)にして用いてＰＣＲ法（サイキ（Saiki）ら、ネイチャー、第３２４巻：１６３〜１６６頁（１９８６年））により患者からのｃＤＮＡを増幅して、かかる蛋白に対する患者のｃＤＮＡの３種の重複フラグメントを得る。また表１は好ましいプライマー配列ペアーのリストを示す。次いで、遺伝子全体のうちの約２００塩基対の各ポイントにおけるｃＤＮＡの塩基対に対応するように合成されたプライマー配列のセットを用いて、重複フラグメントをジデオキシ法に供する。
【００３３】
【表１】
2005323601.tif 000002
*図１−６のヌクレオチド配列に沿った位置に対応する数であり、ＡＴＧは１である。
【００３４】
好ましいプライマー配列ペアーは：
７５８、１３１３
１３１９、１３２０
６６０、１９０９
７２５、１９９５
１６８０、２５３６
１７２７、２６１０
表１に示すヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号：７から配列番号：１９までのものを表す。
【００３５】
表２は、使用できるオリゴヌクレオチドプライマー配列の代表例（センスおよびアンチセンス）を掲載するものであり、好ましくは、プライマー配列の全セットを配列決定に用いて、患者のＤＮＡ修復蛋白における変異がどの部分に存在するかを決定する。プライマー配列は１５ないし３０塩基の長さであり、好ましくは１８ないし２５塩基の間の長さである。次いで、患者から決定された配列の情報を変異していない配列と比較して変異が存在するかどうかを決定する。
【００３６】
【表２】
2005323601.tif 000003
*図１−６のヌクレオチド配列に沿った位置に対応する数であり、ＡＴＧは１である。表２に示すヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号：２０から配列番号：３３までのものを表す。
【００３７】
もう１つの具体例において、表２のプライマー配列をＰＣＲ法に用いて変異領域を増幅することができた。該領域を配列決定し、かかる変異遺伝子素因を予想するための診断として用いることができた。
別法として、変性剤の存在下または不存在下におけるゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動度の変化を検出することにより行われるＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝学的試験により、本発明遺伝子における変異に対するアッセイを行ってもよい。高分解能ゲル電気泳動により、小規模の配列欠失および挿入を可視化することができる。特異的融点または部分的融点によってゲル中の異なる位置で異なるＤＮＡフラグメントの移動が妨害される変性ホルムアミドグラジエントゲルにより、異なる配列のＤＮＡフラグメントを識別してもよい（例えば、メイヤーズ（Meyers）ら、サイエンス、第２３０巻：１２４２頁（１９８５年）参照）。
ＲＮａｓｅおよびＳ１プロテクションのごときヌクレアーゼプロテクションアッセイまたは化学的開裂法（例えば、コットン（Cotton）ら、ＰＮＡＳ,ＵＳＡ、第８５巻：４３９７〜４４０１頁（１９８５年））により、特定の位置における配列の変化を明らかにしてもよい。ＲＮａｓｅ消化または融点の相違により、完全にマッチした配列をミスマッチの２本鎖から識別することができる。
よって、ハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプロテクション、化学的開裂、ウェスタンブロット分析、直接的ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用（例えば、制限フラグメント長多型性（ＲＦＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングのごとき方法によって、特定のＤＮＡ配列の検出を行うことができる。
より慣用的なゲル電気泳動および配列決定のほかに、インシトゥ（in situ）分析により変異を検出することもできる。
【００３８】
ポリペプチドを用い、かかるポリペプチドのインビボ（in vivo）発現により癌を治療し、あるいは癌を予防してもよく、これを、しばしば、「遺伝子治療」という。
よって、例えば、患者からの細胞をエクスビボ（ex vivo）でポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いて操作し、次いで、該ポリペプチドで治療すべき患者に該操作された細胞を提供する。例えば、本発明ポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を用いることにより、当該分野において知られた方法により細胞を操作してもよい。
同様に、例えば、当該分野において知られた方法により、インビボでのポリペプチド発現よってに細胞をインビボで操作してもよい。当該分野において知られているように、本発明ポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の生産用プロデューサー細胞を、インビボでの細胞の操作およびインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与してもよい。かかる方法による本発明ポリペプチド投与のためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであるはずである。例えば、細胞の操作用の発現ビヒクルはレトロウイルス以外のものであってもよく、例えば、適当な送達ビヒクルと組み合わせた後でインビボでの細胞の操作に用いられるアデノウイルスであってもよい。
【００３９】
本明細書において同定された各ｃＤＮＡ配列またはその一部分を、ポリヌクレオチド試薬として、多様な方法で使用することができる。該配列を特定の細胞タイプにおける特定のｍＲＮＡの存在に関する診断プローブとして該配列を用いることができる。さらに、遺伝学的連関分析（多形性）における使用に適した診断プローブとしてこれらの配列を用いることができる。
また、本発明配列は染色体の同定に価値がある。該配列は特異的に標的化され、個々のヒト・染色体の特定の位置にハイブリダイズしうる。そのうえ、染色体上の特定部位を同定する必要が現在ある。実際の配列データ（繰り返し多型性）に基づくわずかの染色体マーキング試薬が染色体位置のマーキングに用いられている。本発明の染色体に対するＤＮＡのマッピングは、それらの配列を疾病に関連した遺伝子と関連づけることにおける重要な第１工程である。
簡単に説明すると、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐ）を調製することにより、配列を染色体に対してマッピングすることができる。３'非翻訳領域のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡ中の１個より多いエキソンをまたがないプライマーを迅速に選択し、かくして、増幅プロセスを複雑になる。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト・染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに用いる。プライマーに対応するヒト・遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じるであろう。
【００４０】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に対して特定のＤＮＡを帰属するための迅速方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマ−について本発明を用いて、特定の染色体または大規模なゲノムクローンのプールからのフラグメントのパネルについて、同様の方法で、下位の位置決めを行うことができる。同様に用いてその染色体に対してマッピングできる他のマッピング法は、インシトゥ・ハイブリダイゼーション、標識フロー−ソーティッド染色体（labeled flow-sorted chromosomes）でのプレスクリーニングおよび染色体特異的ｃＤＮＡライブラリー構築のためのハイブリダイゼーションによるプレセレクションを包含する。
中期染色体スプレッド（spread）に対するｃＤＮＡクローンの蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて１工程で正確な染色体上の位置がわかる。この方法は５００また６００塩基程度の短いｃＤＮＡについて用いることができる。しかしながら、それよりも長いクローンは、ユニークな染色体上の位置に結合して簡単な検出のための十分なシグナルを発する可能性がある。ＦＩＳＨは、発現配列ｔａｇまたはＥＳＴが由来するクローンの使用を必要とし、クローンが長いほどよい。例えば、２０００ｂｐがよく、４０００ｂｐがよりよいが、４０００ｂｐよりも長いものは、合理的なパーセンテージで良好な結果を得るにはおそらく必要ないであろう。この方法のレビューのためには、バーマ
（Verma）ら、ヒューマン・クロモゾームズ：ア・マニュアル・オブ・ベイシック・テクニックス（Human Chromosomes:a Manual of Basic Techniques）、パーガモン・プレス（Pergamon Press）、ニューヨーク（１９８８年）参照。
正確な染色体上の位置に配列をマッピングしたならば、染色体上の配列の物理的位置を遺伝学的マップのデータを用いて修正することができる。かかるデータは、例えば、ブイ・マクシック（V.McKusick）、メンデリアン・インヘリタンス・イン・マン（Mendelian Inheritance in Man）（ジョーンズ・ホプキンス（Jones Hopkins）大学のウェルチ・メディカルライブラリー（Welch Medical Library）からオンラインで利用できる）において見いだされる。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾病との間の関係を、連関分析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により確認する。
次いで、罹患した個体と罹患していない個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定することが必要である。変異が罹患した個体のいくつかまたはすべてにおいて観察され、正常個体には観察されない場合には、該変異は該疾病の原因である可能性がある。
現在の物理的マッピングの分解能および遺伝学的マッピング方法では、疾病に関連した１の染色体領域に正確に位置するｃＤＮＡは５０ないし５００個の原因遺伝子のうちの１個である可能性がある（このことは、１メガベースのマッピング分解能であり、２０ｋｂあたり１個の遺伝子であると仮定してのことである）。
【００４１】
ｈＭＬＨ２遺伝子の５'領域を含むゲノムＰ１クローン（１６７０）を用いてｈＭＬＨ２の局在化が示された。バンディング（banding）を明らかにするために対比染色されたヒト・中期染色体スプレッドの詳細な分析により、ｈＭＬＨ２遺伝子がバンド２ｐ３２中に存在することが示された。同様に、ｈＭＬＨ３遺伝子の３'領域を含むゲノムＰ１クローン（２０５３）を用いてｈＭＬＨ３の存在位置が決定された。バンディング（banding）を明らかにするために対比染色されたヒト・中期染色体スプレッドの詳細な分析により、ｈＭＬＨ３が染色体７上の最も遠方のバンドであるバンド７ｐ２２中に位置することが示された。種々のゲノムクローンに関する分析により、ｈＭＬＨ３は、そのすべてが染色体７上にある関連遺伝子のサブファミリーのメンバーであることが示された。
【００４２】
ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞を免疫原として用いてそれらに対する抗体を得ることができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナルでありうる。また、本発明は、キメラ、１本鎖、およびヒト化抗体、並びにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリーの生成物を包含する。当該分野において知られた種々の方法を、かかる抗体およびフラグメントの製造に使用してもよい。
ポリペプチドを動物に直接注射すること、またはポリペプチドを動物に、好ましくはヒトに投与することにより、本発明配列に対応するポリペプチドに対して生成された抗体を得ることができる。次いで、そのようにして得られた抗体はポリペプチド自体に結合するであろう。この方式で、ポリペプチドの一部分のみをコードする配列を用いてネイティブなポリペプチド全体に結合する抗体を得ることができる。次いで、かかる抗体を用いて、そのポリペプチドを発現する組織からそのポリペプチドを単離することができる。
モノクローナル抗体の製造に関して、連続細胞系培養により製造される抗体を提供するいかなる方法を用いてもよい。例は、ハイブリドーマ法（コーラー（Kohler）およびミルステイン（Milstein）、１９７５年、ネイチャー、第２５６巻：４９５〜４９７頁）、トリオーマ法、ヒト・Ｂ細胞ハイブリドーマ法（コズボール（Kozbor）ら、１９８３年、イミュノロジー・トゥデイ（Immunology Today）、第４巻：７２頁）、およびヒト・モノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法（コール（Cole）ら、１９８５年、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・キャンサー・セラピー（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）、アラン・アール・リス・インコーポレイテッド（Alan R.Liss,Inc.）、７７〜９６頁）を包含する。
１本鎖抗体の製造に関して記載された方法（米国特許第４,９４６,７７８号）を適用して本発明免疫原性ポリペプチド生成物に対する１本鎖抗体を製造することができる。さらに、トランスジェニックマウスを用いて本発明免疫原性ポリペプチド生成物に対するヒト化抗体を発現させてもよい。
【００４３】
さらに本発明は、以下の実施例に関して記載されるであろう。しかしながら、本発明はかかる実施例に限定されないことが理解されるべきである。特記しないかぎり、すべての部または量は重量である。
以下の実施例の理解を容易にするために、しばしば出てくる方法および／または用語について説明する。
「プラスミド」は、大文字および／または数字が先行および／または後に続く小文字ｐで示される。本発明の出発プラスミドは市販の、制限されずに公的に入手可能な、または公表された方法により市販プラスミドから構築可能なものであってもよい。さらに、記載されたプラスミドと等価なプラスミドが当該分野において知られており、当業者に明らかである。
ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配列においてのみ作用する制限酵素でのＤＮＡの触媒的開裂をいう。本発明において用いられる種々の制限酵素は市販されており、それらの反応条件、コファクターおよび他の必要物質は当業者に知られている。分析目的ならば、典型的には、約２０μｌの緩衝液中で、１μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２ユニットの酵素とともに使用する。プラスミド構築用のＤＮＡフラクションの単離を目的とするならば、典型的には、より大きな体積中で、５ないし５０μｇのＤＮＡを２０ないし２５０ユニットの酵素で消化する。特定の制限酵素に関する適当なバッファーおよび基質量は製造者により特定されている。３７℃において約１時間のインキュベーション時間が通常用いられるが、提供者の指示に従って変更してもよい。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して所望フラグメントを単離する。
ゲデル,ディー（Goeddel,D.）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第８巻：４０５７頁（１９８０年）により記載された８パーセントポリアクリルアミドゲルを用いて開裂フラグメントのサイズ分離を行う。
【００４４】
「オリゴヌクレオチド」は、化学合成されてもよい１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２本の相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいう。かかる合成オリゴヌクレオチドは５'リン酸を有しておらず、よって、キナーゼ存在下でＡＴＰ用いてリン酸を付加しなければ別のオリゴヌクレオチドに結合しないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、デホスホリレーションされたフラグメントに結合するであろう。
「結合」は、２種の２本鎖核酸フラグメント間にホスホジエステル結合を形成するプロセスをいう（ティー・マニアティスら、上記文献、１４６頁）。特記しない限り、１０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を０.５μｇのほぼ等モル量のＤＮＡフラグメントに対して用い、既知バッファーおよび条件下でライゲーションを行ってもよい。
特記しない限り、グラハム,エフ（Graham,F.）およびファン・デル・エブ,エイ（Van der Eb,A.）、ウイロロジー（Virology）、第５２巻：４５６〜４５７頁（１９７３年）の方法に記載のごとく形質転換を行う。
【実施例１】
【００４５】
実施例１
ｈＭＬＨ１の細菌での発現
まず、挿入フラグメントを合成するために、ＤＮＡの５'および３'末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いてヒト・ＤＮＡミスマッチ修復蛋白ｈＭＬＨ１をコードする全長のＤＮＡ配列ＡＴＣＣ＃７５６４９を増幅する。５'オリゴヌクレオチドプライマーは配列
CGGGATCCAT GTCGTTCGTG GCAGGG      （配列番号：３４）
を有し、開始コドンに続くｈＭＬＨ１コーディグ配列の１８個のヌクレオチドが続いているＢａｍＨＩ制限酵素部位を含んでいる。３'配列
GCTCTAGATT AACACCTCTC AAAGAC      （配列番号：３５）は、ＸｂａＩ部位に対する相補的配列を含み、該遺伝子の末端である。制限酵素部位は細菌発現ベクターｐＱＥ−９（キアジェン・インコーポレイテッド（Quiagen,Inc.）、カリフォルニア州チャツワース（Chatsworth））上の制限酵素部位に対応している。該プラスミドベクターは抗生物質耐性（Ａｍｐｒ）、細菌の複製開始点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ調節可能プロモーター／オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）、６−ヒスチジンタグ（６−Ｈｉｓ）および制限酵素クローニング部位をコードしている。ｐＱＥ−９ベクターをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで、細菌のＲＢＳにおいて開始する読み取り枠を維持しているｐＱＥ−９ベクター中に該挿入フラグメントを結合する。次いで、結合混合物を用いて、多コピーのプラスミドｐＲＥＰ４を含んでいるイー・コリＭ１５／ｒｅｐ４株（キアジェン・インコーポレイテッド）を形質転換する。
ｐＲＥＰ４はｌａｃＩリプレッサーを発現し、さらにカナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）を付与する。ＬＢプレート上での増殖能により形質転換体を確認し、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、制限分析により確認する。所望の構築物を含有するクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補足したＬＢ培地中で一晩（Ｏ／Ｎ）液体培養する。該一晩培養物を用いて１：１００ないし１：２５０の割合の大型培養に接種する。光学密度６００（Ｏ.Ｄ.６００）が０.４と０.６の間になるまで細胞を増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加して最終濃度１ｍＭとする。
【００４６】
ＬａｃＩリプレッサーを不活性化し、Ｐ／Ｏの読みを解除して遺伝子発現を増大させることによりＩＰＴＧは誘導を行う。細胞をさらに３ないし４時間増殖させる。次いで、遠心分離（６０００ｘｇで２０分）により細胞を収穫する。カオトロピック剤である６Ｍグアニジン塩酸中で細胞ペレットを溶解させる。清澄化後、６−Ｈｉｓタグを有する蛋白による固い結合を可能にする条件下（ホリウチ,イー（Horiuchi,E.）ら、ジェネティック・エンジニアリング、プリンシプル・アンド・メソッズ（Genetic Engineering,Principles and Methods）、第１２巻：８７〜９８頁（１９９０年））でのニッケル−キレートカラムクロマトグラフィーにより、可溶化したｈＭＬＨ１をこの溶液から精製する。いくつかのプロトコール（ジェニック,アール(Jaenicke,R.)およびルドルフ,アール（Rudolph,R.）、プロテイン・ストラクチャー−ア・プラクティカル・アプローチ（Protein Structure-A Practical Approach）、ＩＲＬプレス（IRL Press）、ニューヨーク（１９９０年））によりＧｎＨＣｌからの蛋白の再生を行うことができる。まず、段階的透析を用いてＧｎＨＣｌを除去する。別法として、Ｎｉ−キレートカラムから単離された精製蛋白を第２のカラムに結合させることができ、直線的にＧｎＨＣｌを減少させるグラジエントを行う。カラムに結合し、次いで、２５０ｍＭイミダゾール、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７.５および１０％グリセロールを含有するバッファーで溶離する間に蛋白は再生される。最後に、可溶性蛋白を、５ｍＭ重炭酸アンモニウムを含有する貯蔵用バッファーに対して透析する。精製蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【実施例２】
【００４７】
実施例２
ｈＭＬＨ１、ｈＭＬＨ２ならびにｈＭＬＨ３の発現およびイー・コリｍｕｔ１に対する相補の検出のための自発的変異アッセイ
ｐＱＥ９ｈＭＬＨ１、ｐＱＥ９ｈＭＬＨ２またはｐＱＥ９ｈＭＬＨ３／ＧＷ３７３３形質転換体を自発的変異アッセイに供した。さらにプラスミドベクターｐＱＥ９をＡＢ１１５７（k-12,argE3 hisG4,LeuB6proA2 thr-1 ara-1 rpsL31 supE44 tsx-33）およびＧＷ３７３３に形質転換して、それぞれ陽性および陰性対照として用いた。
約１００ないし１０００個のイー・コリを接種した１５個の２ｍｌ培養物を、ＬＢアンピシリン培地中３７℃においてｍｌあたり２ｘ１０８個まで増殖させた。各培養物１０μｌを希釈し、アンピシリンプレートに撒いて生細胞数を測定した。次いで、各培養物の残りの細胞をセイライン中に濃縮し、アルギニンを欠いた最少培地のプレートに撒いてＡｒｇ−の復帰を測定した。表３において、等式（ｒ／ｍ）−Ｉｎ（ｍ）＝１.２４（リー（Lea）ら、ジャーナル・オブ・ジェネティクス（J.Genetics）、第４９巻：２６４〜２８５頁（１９４９年））に従って、分散あたりの変異株のメジアン数(ｒ)から、培養物あたりの平均変異数（ｍ）を計算した。１世代あたりの変異率をｍ／Ｎとして記録した。ここに、Ｎは培養物あたりの細胞の平均数を表す。
【００４８】
表３
自発的変異率
株                                変異／世代
ＡＢ１１５７＋ベクター              （５.６±０.１）ｘ１０−９ａ
ＧＷ３７３３＋ベクター              （１.１±０.２）ｘ１０−６ａ
ＧＷ３７３３＋ｐｈＭＬＨ１          （３.７±１.３）ｘ１０−７ａ
ＧＷ３７３３＋ｐｈＭＬＨ２          （３.１±０.６）ｘ１０−７ｂ
ＧＷ３７３３＋ｐｈＭＬＨ３          （２.１±０.８）ｘ１０−７ｂ
ａ：３系の実験の平均
ｂ：４系の実験の平均
【００４９】
機能相補の結果は、ヒト・ｍｕｔＬは部分的にイー・コリのｍｕｔＬミューテーター表現型を救済することを示し、ヒト・ｍｕｔＬは細菌発現系においてうまく発現されるのみならず細菌中で機能することが示された。
【実施例３】
【００５０】
実施例３
ｈＭＨＬ１の染色体マッピング
ｈＭＨＬ１に関するｃＤＮＡの５'末端における配列に従ってオリゴヌクレオチドプライマーのセットを設計した。このプライマーのセットは９４ｋｂセグメントに及ぶ。下記条件のセットにおいてこのプライマーのセットをポリメラーゼ連鎖反応に使用した：
３０秒、９５℃
１分、５６℃
１分、７０℃
このサイクルを３２回繰り返し、次いで、７０℃で５分のサイクルを１回行った。体細胞ハイブリッドパネル（ビオス・インコーポレイテッド（Bios,Inc.）のほかに、ヒト、マウス、およびハムスターを鋳型として用いた。８％ポリアクリルアミドゲルまたは３.５％アガロースゲルのいずれかにより反応物を分析した。染色体３に対応するヒト・ゲノムＤＮＡ試料および体細胞ハイブリッド試料中において９４塩基対のバンドが観察された。さらに、種々の他の体細胞ハイブリッドゲノムＤＮＡを用いてｈＭＬＨ１遺伝子の染色体３ｐへの局在化が示された。
【実施例４】
【００５１】
実施例４
ＨＮＰＣＣ血族におけるｈＭＬＨ１遺伝子の変異の決定方法
ＨＮＰＣＣ血族である人からの組織試料から得たＲＮＡからｃＤＮＡを得て、該ｃＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用いた。ＰＣＲはにはプライマー
GCATCTAGAC GTTTCCTTGG C      （配列番号：３６）
および
CATCCAAGCT TCTGTTCCCG      （配列番号：３７）
（図１−６のコドン１から３９４までを増幅）；
GGGGTGCAGC AGCACATCG      （配列番号：３８）
および
GGAGGCAGAA TGTGTGAGCG      （配列番号：３９）
（図１−６（配列番号：２）のコドン３２６から７２９までを増幅）；さらに
TCCCAAAGAA GGACTTGCT      （配列番号：４０）、
および
AGTATAAGTC TTAAGTGCTA CC      （配列番号：４１）
（図１−６（配列番号：２）のコドン６０２から７５６まで、および３’非翻訳配列の１２８ヌクレオチドを増幅）
を用いた。すべての分析に関して用いたＰＣＲ条件は、サン・シドランスキ,ディー（San Sidransky,D.）ら、サイエンス、第２５２巻：７０６頁（１９９１年）に記載の緩衝液中、９５℃で３０秒、５２〜５８℃で６０〜１２０秒、次いで、７０℃で６０〜１２０秒を３５サイクル行うことからなっていた。SequiThermポリメラーゼ（エピセンター・テクノロジーズ（Epicentre Technologies））を用い、５'末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識したプライマーを用いて
ＰＣＲ生成物を配列決定した。選択されたエキソンのイントロン−エキソン境界も決定し、ゲノムＰＣＲ生成物を分析して結果を確認した。次いで、変異と思われるものを有するＰＣＲ生成物をクローン化し、配列決定して直接配列決定の結果を確認した。ホルトン,ティー・エイ（Holton,T.A.）およびグラハム,エム・ダブリュ（Graham,M.W.）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１９巻：１１５６頁（１９９１年）に記載のごとくＰＣＲ生成物をＴ−テイルドベクター（T-tailed vector）中にクローン化し、Ｔ７ポリメラーゼ（ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル（United States Biochemical））を用いて配列決定した。７つの血族からの罹患した個体はすべて、ｈＭＬＨ１遺伝子のコドン５７８から６３２までのヘテロ接合欠失を示した。これらの７つの血族のうちの５人は共通の祖先にたどり着くことができた。製造者により記載されたようにして、プライマーをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識して、さらにゲノムＤＮＡのＰＣＲ生成物を配列決定することにより、SequiThermポリメラーゼを用いてＰ１クローン（全ｈＭＬＨ１遺伝子を含むヒト・ゲノムＰ１ライブラリー（ジェノム・システムズ（Genome Systems））をサイクルシークエンシング（cycle-sequencing）することにより、コドン５７８〜６３２周辺のゲノム配列を決定した。コドン５７８〜６３２を含むエキソンを増幅するのに用いたプライマーは、
TTTATGGTTT CTCACCTGCC      （配列番号：４２）
および
GTTATCTGCC CACCTCAGC      （配列番号：４３）であった。ＰＣＲ生成物は、該エキソンの上流の１０５ｂｐのイントロンＣ配列およびエキソンの１１７ｂｐ下流を含んでいた。ＰＣＲ生成物中の変異は該血族においては観察されず、ゆえにＲＮＡにおける欠失は単なるスプライス部位の変異のせいではなかった。コドン５７８〜６３２は、上記血族における遺伝子生成物から欠失されている単一エキソンを構成することがわかった。このエキソンはいくつかの非常に保存的なアミノ酸を含んでいる。
【００５２】
第２の家族（Ｌ７）において、上記プライマーを用いてＰＣＲを行ったところ、コドン７２７の最初のヌクレオチド（ｎｔ）から始まる４ｂｐの欠失が観察された。この欠失は１６６ヌクレオチド下流の新たなストップコドンを伴うフレームシフトにより起こり、ｈＭＬＨ１のカルボキシ末端の２９個のアミノ酸が５３個のアミノ酸（通常は、そのうちのいくつかは３'非翻訳領域のヌクレオチドによりコードされている）により置換された。
上記プライマーを用いるＰＣＲの後、別の血族（Ｌ２５１６）において別の変異が見られ、該変異はコドン７５５と７５６との間の４ｂｐの挿入からなっていた。この挿入はフレームシフトおよび正常なターミネーションコドンから１０２ヌクレオチド（３４アミノ酸）下流までを含むＯＲＦの拡張を引き起こした。それゆえ、血族Ｌ７およびＬ２５１６両方における変異はｈＭＬＨ１のＣ末端を変化させると予想された。
連関の研究には血族が少なすぎたので、コードされる蛋白のサイズの変化からｈＭＬＨ１における可能な変異を決定した。ｈＭＬＨ１の組み合わせ転写−翻訳（coupled transcription-translation）に用いたプライマーは、図１−６のコドン１から３９４までについては
GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAC CACCATGGCA TCTAGACGTT TCCCTTGGC
（配列番号：４４）
および
CATCCAAGCT TCTGTTCCCG      （配列番号：４５）であり、図１−６（配列番号：２）のコドン３２６から７２９までについては
GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAC CACCATGGGG GTGCAGCAGC ACATCG
（配列番号：４６）
および
GGAGGCAGAA TGTGTGAGCG      （配列番号：４７）であった。得られたＰＣＲ生成物は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写に関するシグナルおよびそれらの５'末端における翻訳開始に関するシグナルを有していた。１８の血族からの患者のリンパ芽球細胞由来のＲＮＡを用いて２種の生成物（それぞれ、コドン１からコドン３９４まで伸長、またはコドン３２６からコドン７２９まで伸長）を増幅した。次いで、ＰＣＲプライマー中に取り込まれている転写−翻訳シグナルを用いてインビトロでＰＣＲ生成物を転写し、翻訳した。パウエル,エス・エム（Powell,S.M.）ら、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（New England Journal of Medicine）、第３２９巻、１９８２頁（１９９３年）により記載されたようにして、かつ４０マイクロＣｉの３５Ｓ標識メチオニンを用いて行われた組み合わせ転写−翻訳反応において、ＰＣＲ生成物を鋳型として用いた。試料を同じバッファーで希釈し、５分間煮沸し、次いで、１０％から２０％までのアクリルアミドのグラジエントを有するドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により分析した。ゲルを乾燥し、ラジオグラフィーに供した。すべての試料は予想されたサイズのポリペプチドを示したが、異常に移動するポリペプチドが１つのケースにおいてさらに見いだされた。関連のあるＰＣＲ生成物の配列を決定し、コドン３４７の最初のヌクレオチドから始まる３７１ｂｐの欠失を有することが見いだされた。この変化はヘテロ接合形態において存在し、コドン３４６の３０ヌクレオチド下流の新たな停止コドンにおけるフレームシフトを生じ、かくして、観察された切断ポリペプチドが説明された。
マイクロサテライト不安定性を示す４種の結腸腫瘍細胞系を試験した。４種のうち１種（細胞系Ｈ６）はこのアッセイにおいて正常ペプチドを示さず、２７ｋｄのところに移動する短い生成物のみを生産した。対応ｃＤＮＡの配列を決定し、コドン２５２におけるＣのＡへのトランスバージョンを有することが見いだされ、セリンに代わってターミネーションコドンが生じていた。翻訳の分析と一致して、正常なＣの位置におけるバンドはこの腫瘍由来のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡにおいて同定されず、それが機能的ｈＭＬＨ１遺伝子を欠くことが示された。
表４はこれらの配列決定アッセイの結果を示す。結腸癌の家族歴を有する人において欠失が見いだされた。より詳細には、１０家族のうち９家族がｈＭＬＨ１の変異を示した。
【００５３】
【表３】
2005323601.tif 000004
【実施例５】
【００５４】
実施例５
ｈＭＬＨ２の細菌での発現および精製
まず、挿入フラグメントを合成するために、ＤＮＡ配列の５'および３'末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いてｈＭＬＨ２をコードするＤＮＡ配列ＡＴＣＣ＃７５６５１を増幅する。５'オリゴヌクレオチドプライマーは配列
CGGGATCCAT GAAACAATTG CCTGCGGC      （配列番号：４８）を有しており、この配列は、開始コドンに続くｈＭＬＨ２の１７個のヌクレオチドが続いているＢａｍＨＩ制限酵素部位を含んでいる。３'配列
GCTCTAGACC AGACTCATGC TGTTTT      （配列番号：４９）はＸｂａＩ部位に対する相補的配列を含み、ｈＭＬＨ２の１８個のヌクレオチドが後に続いている。制限酵素部位は細菌発現ベクターｐＱＥ−９（キアジェン・インコーポレイテッド（Qiagen,Inc.）、カリフォルニア州チャツワース（Chatworth））の制限酵素部位に対応している。ｐＱＥ−９は、抗生物質耐性（Ａｍｐｒ）、細菌の複製開始点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ−調節可能プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグおよび制限酵素部位をコードしている。次いで、増幅された配列およびｐＱＥ−９をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化する。増幅された配列をｐＱＥ−９中に結合し、ヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードしている配列を伴うフレーム中に挿入する。次いで、結合混合物を用いて、多コピーのプラスミドｐＲＥＰ４を含んでいるイー・コリＭ１５／ｒｅｐ４株（キアジェン・インコーポレイテッド）を形質転換する。ｐＲＥＰ４はｌａｃＩリプレッサーを発現し、さらにカナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）を付与する。ＬＢプレート上での増殖能により形質転換体を確認し、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、制限分析により確認する。所望の構築物を含有するクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補足したＬＢ培地中で一晩（Ｏ／Ｎ）液体培養する。該一晩培養物を用いて１：１００ないし１：２５０の割合の大型培養に接種する。光学密度６００（Ｏ.Ｄ.６００）が０.４と０.６の間になるまで細胞を増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加して最終濃度１ｍＭとする。
【００５５】
ＬａｃＩリプレッサーを不活性化し、Ｐ／Ｏの読みを解除して遺伝子発現を増大させることによりＩＰＴＧは誘導を行う。細胞をさらに３ないし４時間増殖させる。次いで、遠心分離（６０００ｘｇで２０分）により細胞を収穫する。カオトロピック剤である６Ｍグアニジン塩酸中で細胞ペレットを溶解させる。清澄化後、６−Ｈｉｓタグを有する蛋白による固い結合を可能にする条件下（ホリウチ,イー（Horiuchi,E.）ら、ジェネティック・エンジニアリング、プリンシプル・アンド・メソッズ（Genetic Engineering,Principles and Methods）、第１２巻：８７〜９８頁（１９９０年））でのニッケル−キレートカラムクロマトグラフィーにより、可溶化したｈＭＬＨ１をこの溶液から精製する。いくつかのプロトコール（ジェニック,アール(Jaenicke,R.)およびルドルフ,アール（Rudolph,R.）、プロテイン・ストラクチャー−ア・プラクティカル・アプローチ（Protein Structure-A Practical Approach）、ＩＲＬプレス（IRL Press）、ニューヨーク（１９９０年））によりＧｎＨＣｌからの蛋白の再生を行うことができる。まず、段階的透析を用いてＧｎＨＣｌを除去する。別法として、Ｎｉ−キレートカラムから単離された精製蛋白を第２のカラムに結合させることができ、直線的にＧｎＨＣｌを減少させるグラジエントを行う。カラムに結合し、次いで、２５０ｍＭイミダゾール、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７.５および１０％グリセロールを含有するバッファーで溶離する間に蛋白は再生される。最後に、可溶性蛋白を、５ｍＭ重炭酸アンモニウムを含有する貯蔵用バッファーに対して透析する。精製蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【実施例６】
【００５６】
実施例６
ｈＭＬＨ３の細菌での発現および精製
まず、挿入フラグメントを合成するためにＤＮＡ配列の５'および３'末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ｈＭＬＨ３をコードするＤＮＡ配列ＡＴＣＣ＃７５６５０を増幅する。５'オリゴヌクレオチドプライマーは配列
CGGGATCCAT GGAGCGAGCT GAGAGC      （配列番号：５０）を有しており、この配列は、開始コドンに続くｈＭＬＨ３の１８個のヌクレオチドが続いているＢａｍＨＩ制限酵素部位を含んでいる。３'配列
GCTCTAGAGT GAAGACTCTG TCT      （配列番号：５１）はＸｂａＩ部位に対する相補的配列を含み、ｈＭＬＨ３の１８個のヌクレオチドが後に続いている。制限酵素部位は細菌発現ベクターｐＱＥ−９（キアジェン・インコーポレイテッド（Qiagen,Inc.）、カリフォルニア州チャツワース（Chatworth））の制限酵素部位に対応している。ｐＱＥ−９は、抗生物質耐性（Ａｍｐｒ）、細菌の複製開始点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ−調節可能プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグおよび制限酵素部位をコードしている。次いで、増幅された配列およびｐＱＥ−９をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化する。増幅された配列をｐＱＥ−９中に結合し、ヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードしている配列を伴うフレーム中に挿入する。次いで、結合混合物を用いて、多コピーのプラスミドｐＲＥＰ４を含んでいるイー・コリＭ１５／ｒｅｐ４株（キアジェン・インコーポレイテッド）を形質転換する。ｐＲＥＰ４はｌａｃＩリプレッサーを発現し、さらにカナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）を付与する。ＬＢプレート上での増殖能により形質転換体を確認し、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、制限分析により確認する。所望の構築物を含有するクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補足したＬＢ培地中で一晩（Ｏ／Ｎ）液体培養する。該一晩培養物を用いて１：１００ないし１：２５０の割合の大型培養に接種する。光学密度６００（Ｏ.Ｄ.６００）が０.４と０.６の間になるまで細胞を増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加して最終濃度１ｍＭとする。
【００５７】
ＬａｃＩリプレッサーを不活性化し、Ｐ／Ｏの読みを解除して遺伝子発現を増大させることによりＩＰＴＧは誘導を行う。細胞をさらに３ないし４時間増殖させる。次いで、遠心分離（６０００ｘｇで２０分）により細胞を収穫する。カオトロピック剤である６Ｍグアニジン塩酸中で細胞ペレットを溶解させる。清澄化後、６−Ｈｉｓタグを有する蛋白による固い結合を可能にする条件下（ホリウチ,イー（Horiuchi,E.）ら、ジェネティック・エンジニアリング、プリンシプル・アンド・メソッズ（Genetic Engineering,Principles and Methods）、第１２巻：８７〜９８頁（１９９０年））でのニッケル−キレートカラムクロマトグラフィーにより、可溶化したｈＭＬＨ１をこの溶液から精製する。いくつかのプロトコール（ジェニック,アール(Jaenicke,R.)およびルドルフ,アール（Rudolph,R.）、プロテイン・ストラクチャー−ア・プラクティカル・アプローチ（Protein Structure-A Practical Approach）、ＩＲＬプレス（IRL Press）、ニューヨーク（１９９０年））によりＧｎＨＣｌからの蛋白の再生を行うことができる。まず、段階的透析を用いてＧｎＨＣｌを除去する。別法として、Ｎｉ−キレートカラムから単離された精製蛋白を第２のカラムに結合させることができ、直線的にＧｎＨＣｌを減少させるグラジエントを行う。カラムに結合し、次いで、２５０ｍＭイミダゾール、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７.５および１０％グリセロールを含有するバッファーで溶離する間に蛋白は再生される。最後に、可溶性蛋白を、５ｍＭ重炭酸アンモニウムを含有する貯蔵用バッファーに対して透析する。精製蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【実施例７】
【００５８】
実施例７
遺伝性の癌におけるｈＭＬＨ２およびｈＭＬＨ３の変異の決定方法
ゲノムクローンの単離
ｈＭＬＨ２およびｈＭＬＨ３のｃＤＮＡ配列に関して選択されたプライマーを用いるＰＣＲにより、ヒト・ゲノムＰ１ライブラリー（ジェノミック・システムズ・インコーポレイテッド（Genomic Systems,Inc.））をスクリーニングした。プライマー
AAGCTGCTCT GTTAAAAGCG      （配列番号：５２）
および
GCACCAGCAT CCAAGGAG      （配列番号：５３）
を用いてｈＭＬＨ２に関して２個のクローンを単離し、１３３ｂｐの生成物を得た。プライマー
CAACCATGAG ACACATCGC      （配列番号：５４）
および
AGGTTAGTGA AGACTCTGTC      （配列番号：５５）
を用いてｈＭＬＨ３に関して３個のクローンを単離し、１２１ｂｐの生成物を得た。ジゴキシゲニンデオキシ−ウリジン５'−トリホスフェート（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Manheim））を用いてゲノムクローンをニックトランスレーションし、ジョンソン,シー（Johnson,C.）ら、メソッズ・セル・バイオロ（Methods Cell Biol.）、第３５巻：７３〜９９頁（１９９１年）に記載のごとくＦＩＳＨを行った。発現されたｈＭＬＨ３遺伝子座への特異的ハイブリダイゼーションのために大過剰のヒト・ｃｏｔ−１  ＤＮＡを用いてｈＭＬＨ３プローブとのハイブリダイゼーションを行った。４,６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびヨウ化プロピジウムを用いて染色体を対比染色し、Ｃ−およびＲ−バンドの組み合わせを得た。クールド・チャージ−カップルド・デバイス・カメラ（cooled charge-coupled device camera）（フォトメトリクス（Photometrics）、アリゾナ州タクソン（Tucson））および可変励起波長フィルター（ジョンソン,シー（Johnson,C.）ら、ジェネティ・アナリ・テク・アプリ（Genet.Anal.Tech.Appl.）、第８巻：７５頁（１９９１年）と組み合わせたトリプル−バンド・フィルター・セット（Triple-band filter set）（クロマ・テクノロジー（Chroma Technology）、バーモント州ブラットレボロ(Brattleboro))を用いて、正確なマッピングのために配置されたイメージを得た。イメージの収集、分析および染色体断片長の測定を、ＩＳｅｅグラフィカル・プログラム・システム（ISee Graphical Program System）（イノビジョン・コーポレイション（Inovision Corporation）、ノースカロライナ州ダラム（Durham））を用いて行った。
【００５９】
転写にカップリングした翻訳の変異の分析
ＩＶＳＰ分析の目的で、ｈＭＬＨ２遺伝子を３つの重複セグメントに分けた。第１のセグメントはコドン１から５００までを含んでいたが、中間のセグメントはコドン２７０から７５５まで、最後のセグメントはコドン４８５からコドン９３３における翻訳終結部位までを含んでいた。第１のセグメントに関するプライマーは、
GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAC CACCATGGAA CAATTGCCTG CGG
（配列番号：５６）
および
CCTGCTCCAC TCATCTGC      （配列番号：５７）であり、中間のセグメントに関しては、
GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAC CACCATGGAA GATATCTTAA AGTTAATCCG
（配列番号：５８）
および
GGCTTCTTCT ACTCTATATG G      （配列番号：５９）であり、最後のセグメントに関しては、
GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAC CACCATGGCA GGTCTTGAAA ACTCTTCG
（配列番号：６０）
および
AAAACAAGTC AGTGAATCCT C      （配列番号：６１）であった。患者ＣＷにおける停止変異をマッピングするために用いたプライマーは、すべて第１のセグメントと同じ５'プライマーであった。３'ネスティッドプライマーは：
AAGCACATCT GTTTCTGCTG
（配列番号：６２）コドン１から３６９
ACGAGTAGAT TCCTTTAGGC
（配列番号：６３）コドン１から２９０
CAGAACTGAC ATGAGAGCC
（配列番号：６４）コドン１から２１４
であった。
【００６０】
ｈＭＬＨ３の分析のために、ｈＭＬＨ３のｃＤＮＡを全長生成物として、あるいは２つの重複セグメントとして増幅した。全長のｈＭＬＨ３に関するプライマーは、
GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAC CACCATGGAG CGAGCTGAGA GC
（配列番号：６５）
および
AGGTTAGTGA AGACTCTGTC      （配列番号：６６）（コドン１から８６３まで）であった。セグメント１に関しては、センスプライマーは上記のものと同じで、アンチセンスプライマーは
CTGAGGTCTC AGCAGGC      （配列番号：６７）（コドン１から４７２まで）であった。セグメント２のプライマーは
GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAC CACCATGGTG TCCATTTCCA GACTGCG
（配列番号：６８）
および
AGGTTAGTGA AGACTCTGTC      （配列番号：６９）（コドン４１５から８６３まで）であった。増幅を下記のごとく行った。
【００６１】
ＰＣＲ生成物は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよび５'末端における翻訳開始の認識シグナルを含んでいた。４０μＣｉの３６Ｓ−メチオニン（ＮＥＮ、デュポン（Dupont））を含有するカップリングした転写−翻訳反応においてＰＣＲ生成物を鋳型として用いた。試料をＳＤＳ試料バッファーで希釈し、１０％から２０％までのアクリルアミドのグラジエントを含有するＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により分析した。ゲルを固定し、ＥｎＨａｎｃｅ（デュポン）で処理し、乾燥し、次いで、オートラジオグラフィーに供した。
【００６２】
ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ生成物の直接配列決定
Superscript II（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）を用いてリンパ芽球または腫瘍細胞のＲＮＡからｃＤＮＡを得た。次いで、ｃＤＮＡをＰＣＲ用鋳型として用いた。すべての増幅の条件は、バッファー中、９５℃で３０秒、５２℃ないし６５℃で６０秒ないし１２０秒、次いで、７０℃で６０秒ないし１２０秒で、３５サイクルであった。ＰＣＲ生成物を直接配列決定し、Ｔ−テイルドクローニングベクターＰＣＲ２０００（インビトロジェン（Invitrogen））中にクローン化し、Ｔ７ポリメラーゼ（ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル）を用いて配列決定した。ＰＣＲ生成物の直接配列決定のために、ＰＣＲ反応物をまずフェノールクロロホルム抽出し、次いで、エタノール沈殿した。製造者により説明されているようにSequithermポリメラーゼ（エピセンター・テクノロジーズ）およびガンマ−３２Ｐ標識プライマーを用いて鋳型を直接配列決定した。
【００６３】
変異のイントロン／エキソン境界およびゲノム分析
製造者により説明されているようにガンマ−３２Ｐ標識プライマーおよびSequithermポリメラーゼを用いてＰ１クローンをサイクル配列決定（cycle-sequencing）することによりイントロン／エキソン境界を決定した。コドン１９５から２３３までを含むｈＭＬＨ２エキソンを増幅するために用いたプライマーはTTATTTGGCA GAAAAGCAGA G      （配列番号：７０）
および
TTAAAAGACT AACCTCTTGC C      （配列番号：７１）であり、２１５ｂｐの生成物が得られた。プライマー
CTGCTGTTAT GAACAATATG G      （配列番号：７２）を用いて生成物をサイクル配列決定した。患者ＧＣにおけるｈＭＬＨ３のゲノム欠失を分析するために用いたプライマーは：
５'領域増幅用には
CAGAAGCAGT TGCAAAGCC      （配列番号：７３）と
AAACCGTACT CTTCACACAC      （配列番号：７４）
（ｈＭＬＨ３のコドン２３３から２５７を含む７４ｂｐの生成物が得られる）、
GAGGAAAAGC TTTTGTTGGC      （配列番号：７５）と
CAGTGGCTGC TGACTGAC      （配列番号：７６）
（ｈＭＬＨ３のコドン３４７から３７７を含む９３ｂｐの生成物が得られる）、さらに
TCCAGAACCA AGAAGGAGC      （配列番号：７７）と
TGAGGTCTCA GCAGGC      （配列番号：７８）
（ｈＭＬＨ３のコドン４３９から４７２を含む９９ｂｐの生成物が得られる）であった。
【００６４】
表５
ＨＮＰＣＣに罹患した患者からのＨＭＬＨ２およびＨＭＬＨ３における変異のまとめ
試料          コドン    ヌクレオチド    ゲノム変化    予想コーディング
ｃＤＮＡ変化                  変化
ＨＭＬＨ２
ＣＷ          ２３３    スキップした    CAGからTAGへ  ＧＬＮから停止
エキソン                      コドンへ
ＨＭＬＨ３
ＭＮ、ＮＳ、  ２０      CGGからCAGへ    CGGからCAGへ  ARGからGLNへ
ＴＦ
ＧＣ        ２６８から  １２０３ｂｐの    欠失        イン−フレーム
６６９まで  欠失                          欠失
ＧＣｘ      ２６８から  １２０３ｂｐの    欠失        フレームシフト、
６６９まで  欠失                          切断
【００６５】
上記教示を考慮すれば本発明に対する多くの修飾および変更可能が可能であり、それゆえ、添付した請求の範囲に範囲内であり、本発明を特別に説明したのとは別なように実施してもよい。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本願発明は、癌の診断薬の製造、癌の発症機構の研究などの分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、ヒト・ＤＮＡ修復蛋白ｈＭＬＨ１のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。３７３自動ＤＮＡシークエンサー（アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド（Applied Biosystems,Inc.）を用いて配列決定を行った。配列決定の精度は９７％より高いと予想される。
【図２】図２は、ヒト・ＤＮＡ修復蛋白ｈＭＬＨ１のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。３７３自動ＤＮＡシークエンサー（アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド（Applied Biosystems,Inc.）を用いて配列決定を行った。配列決定の精度は９７％より高いと予想される。
【図３】図３は、ヒト・ＤＮＡ修復蛋白ｈＭＬＨ１のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。３７３自動ＤＮＡシークエンサー（アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド（Applied Biosystems,Inc.）を用いて配列決定を行った。配列決定の精度は９７％より高いと予想される。
【図４】図４は、ヒト・ＤＮＡ修復蛋白ｈＭＬＨ１のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。３７３自動ＤＮＡシークエンサー（アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド（Applied Biosystems,Inc.）を用いて配列決定を行った。配列決定の精度は９７％より高いと予想される。
【図５】図５は、ヒト・ＤＮＡ修復蛋白ｈＭＬＨ１のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。３７３自動ＤＮＡシークエンサー（アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド（Applied Biosystems,Inc.）を用いて配列決定を行った。配列決定の精度は９７％より高いと予想される。
【図６】図６は、ヒト・ＤＮＡ修復蛋白ｈＭＬＨ１のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。３７３自動ＤＮＡシークエンサー（アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド（Applied Biosystems,Inc.）を用いて配列決定を行った。配列決定の精度は９７％より高いと予想される。
【図７】図７は、ｈＭＬＨ２のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。
【図８】図８は、ｈＭＬＨ２のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。
【図９】図９は、ｈＭＬＨ２のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。
【図１０】図１０は、ｈＭＬＨ２のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。
【図１１】図１１は、ｈＭＬＨ２のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。
【図１２】図１２は、ｈＭＬＨ２のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。
【図１３】図１３は、ｈＭＬＨ２のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。
【図１４】図１４は、ｈＭＬＨ２のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。
【図１５】図１５は、ｈＭＬＨ３のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。
【図１６】図１６は、ｈＭＬＨ３のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。
【図１７】図１７は、ｈＭＬＨ３のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。
【図１８】図１８は、ｈＭＬＨ３のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。
【図１９】図１９は、ｈＭＬＨ３のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。
【図２０】図２０は、ｈＭＬＨ３のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。
【図２１】図２１は、ｈＭＬＨ３のｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な１文字略記法により表す。
【図２２】図２２は、ＭＡＣＡＷ（バージョン１.０）プログラムを用いて、エス・セレビシエ（S.cerevisiae）のＰＭＳ１（ｙＰＭＳ１）の推定アミノ酸配列と、ｈＭＬＨ２ならびにｈＭＬＨ３アミノ酸配列とを並べたものである。保存性のあるブロックのアミノ酸は大文字で示され、それらのペア−ワイズ・スコア（pair-wise scores）の平均上に影をつけた。
【図２３】図２３は、ＭＡＣＡＷ（バージョン１.０）プログラムを用いて、エス・セレビシエ（S.cerevisiae）のＰＭＳ１（ｙＰＭＳ１）の推定アミノ酸配列と、ｈＭＬＨ２ならびにｈＭＬＨ３アミノ酸配列とを並べたものである。保存性のあるブロックのアミノ酸は大文字で示され、それらのペア−ワイズ・スコア（pair-wise scores）の平均上に影をつけた。
【図２４】図２４は、ＭＡＣＡＷ（バージョン１.０）プログラムを用いて、エス・セレビシエ（S.cerevisiae）のＰＭＳ１（ｙＰＭＳ１）の推定アミノ酸配列と、ｈＭＬＨ２ならびにｈＭＬＨ３アミノ酸配列とを並べたものである。保存性のあるブロックのアミノ酸は大文字で示され、それらのペア−ワイズ・スコア（pair-wise scores）の平均上に影をつけた。
【図２５】図２５は、ｈＭＬＨ２の変異分析である。（Ａ）ＨＮＰＣＣ患者のＣＷにおける転写停止変異に関するＩＶＳＰ分析およびマッピング。コドン１から３６９までの翻訳（レーン１）、コドン１から２９０までの翻訳（レーン２）、コドン１から２１４までの翻訳（レーン３）。ＣＷは患者ＣＷのｃＤＮＡから翻訳され、ＮＯＲは正常個体のｃＤＮＡから翻訳される。矢じりは、潜在的な停止変異により切断されたポリペプチドを示す。矢印は分子量マーカーをキロダルトンで示す。（Ｂ）ＣＷの配列分析により、コドン２３３におけるＣのＴへのトランジション変異が示される（矢印により示す）。レーン１およびレーン３は対照患者由来の配列；レーン２はＣＷのゲノムＤＮＡ由来の配列である。各配列混合物からのｄｄＡ混合物を隣のレーンに負荷してｄｄＣ、ｄｄＤ、およびｄｄＴ混合物との比較を容易にする。
【図２６】図２６は、ｈＭＬＨ３の変異分析である。（Ａ）患者ＧＣからのｈＭＬＨ３のＩＶＳＰ分析。レーンＧＣは個体ＧＣの線維芽細胞由来；レーンＧＣｘは患者ＧＣの腫瘍由来；レーンＮＯＲ１および２は正常対照個体由来である。ＦＬは全長の蛋白を示し、矢じりは生殖系列の切断されたポリペプチドを示す。矢印は分子量マーカーをキロダルトンで示す。（Ｂ）患者ＧＣからのＤＮＡについてのＰＣＲ分析は、障害が腫瘍細胞中の両方のｈＭＬＨ３対立遺伝子に存在することを示す。ｃＤＮＡ中の欠損領域の５'側、３'側、またはその中間（ＭＩＤ）を増幅するプライマーを用いて増幅を行った。レーン１,患者ＧＣの線維芽細胞由来のＤＮＡ；レーン２,患者ＧＣの腫瘍由来のＤＮＡ；レーン３,正常対照患者由来のＤＮＡ；レーン４,ＤＮＡ鋳型なしの反応。矢印は分子量を塩基対で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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