(57)【要約】【課題】  変異ナイセリアオリゴ糖構造を合成するナイセリア株、該ナイセリア株から調製された変異ナイセリアオリゴ糖構造を含むワクチン調製物、該変異ナイセリアオリゴ糖構造の製造方法、及び該ワクチン調製物の製造方法を提供すること。【解決手段】  ＬｇｔＡ、ＬｇｔＢ、ＬｇｔＣ、ＬｇｔＤ、及びＬｇｔＥからなる群から選ばれるグリコシルトランスフェラーゼをコードする読み枠を有するナイセリア株から、該読み枠が欠失しており、該グリコシルトランスフェラーゼを発現しないナイセリア株、該ナイセリア株から調製された変異ナイセリアオリゴ糖構造を含むワクチン調製物、該変異ナイセリアオリゴ糖構造の製造方法、及び該ワクチン調製物の製造方法を提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬｇｔＡ、ＬｇｔＢ、ＬｇｔＣ、ＬｇｔＤ、及びＬｇｔＥからなる群から選ばれるグリコシルトランスフェラーゼをコードする読み枠を有するナイセリア株から、該読み枠が欠失しており、該グリコシルトランスフェラーゼを発現しないナイセリア株。
【請求項２】
ナイセリア株に対して有効なワクチン調製物であって、該調製物が、請求項１記載のナイセリア株から調製された変異ナイセリアオリゴ糖構造を含むことを特徴とする上記ワクチン調製物。
【請求項３】
変異ナイセリアオリゴ糖構造の製造方法であって、ＬｇｔＡ、ＬｇｔＢ、ＬｇｔＣ、ＬｇｔＤ、及びＬｇｔＥからなる群から選ばれるグリコシルトランスフェラーゼをコードする読み枠をナイセリア株から欠失させる工程、及び該株から変異ナイセリアオリゴ糖構造を製造する工程を含むことを特徴とする上記変異ナイセリアオリゴ糖構造の製造方法。
【請求項４】
ナイセリア株に対して有効なワクチン調製物の製造方法であって、ＬｇｔＡ、ＬｇｔＢ、ＬｇｔＣ、ＬｇｔＤ、及びＬｇｔＥからなる群から選ばれるグリコシルトランスフェラーゼをコードする読み枠をナイセリア株から欠失させる工程、該株から変異ナイセリアオリゴ糖構造を製造する工程、及び該変異ナイセリアオリゴ糖構造をワクチン調製物中に処方する工程を含むことを特徴とする上記ワクチン調製物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明に導いたこの研究は、部分的にパブリックヘルスサービス(Public Health Service)からの承認番号AI-10615に基づく基金により支援された。従って、この行政機関は、本発明の権利の一部を所有することができる。
発明の分野
本発明は、オリゴ糖の生合成のために有用なグリコシルトランスフェラーゼ、このようなグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子および該酵素を製造するための組み換え法、並びに該方法によって製造したオリゴ糖に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ナイセリアおよびリポ−オリゴ糖(LOS)
ナイセリア種は、一般的に多くの哺乳動物宿主中に棲息するが、人類はこの種の構成員による侵襲性の疾患に罹患する唯一の種である。ナイセリアメニンジティディス(Neisseria meningitidis)は、流行性疾患として発生する可能性のある敗血症および髄膜炎に対する病因学的因子である。ナイセリアゴノロアエ(Neisseria gonorrhoeae)は、淋病またはその種々の合併症の原因因子である。これらの生物、特に淋菌は、その表面に露出した分子の抗原性のアレイ、特にその接着性の線毛および混濁−関連(opa)タンパクを、著しく巧みに変更することが立証されている。この線毛の変更に関する遺伝的メカニズム（メイヤー(Meyer)等，Cell，1982，30:45;ハース＆メイヤー(Haas and Meyer)，Cell 1986，44:107;クーミー(Koomey)等，Genetics，1987，117:391;スワンソン＆クーミー(Swanson and Koomey)，Americal Society for Microbiology,ワシントン，743-761)およびopa タンパクの発現(スターン(Stern)等，Cell，1986，47:61;メイヤー(Meyer)等，Ann．Rev．Microbiol.，1990，44:451; バット(Bhat)等，Molec．Microbiol.，1991，5:1889)は、十分に理解されている。その他のグラム陰性バクテリアと同様に、ナイセリアssp.は、その外皮の葉状体中にLPS をもつ〔ジョンストン＆ゴットシュリッヒ(Johnston and Gotschlich)，J．Bacteriol.，1974，119:250)。
【０００３】
多くの腸内バクテリア中に見られる、繰り返しO-鎖をもつ高分子量LPS とは対照的に、ナイセリアssp.のLPS は、中程度のサイズを有し、従ってしばしばリポオリゴ糖またはLOS と呼ばれている。LOS の分子サイズは、サルモネラ(Salmonella)ssp.の粗製LPS 変異体中に見られるものと類似するが、この物質はかなりの抗原的多様性を有する。髄膜炎菌の場合、血清学的型決定法が開発され、該方法は菌株を12の免疫型に区分する〔ゾリンガー＆マンドレル(Zollinger and Mandrell)，Infect．Immun.，1977，18:424; ゾリンガー＆マンドレル(Zollinger and Mandrell)，Infect．Immun.，1980，28:451）。髄膜炎菌LPS の構造のかなり完全な理解（最近の概説：バーヒュール(Verheul)等，Microbiol．Rev.，1993，57:34）はジェニングズ＆その共同研究者の研究によるものであった(ジェニングズ(Jennings)等，Carbohyd．Res.，1983，121:233;ミション(Michon)等，J．Biol．Chem.，1990，265:7243; ガミアン(Gamian)等，J．Biol．Chem.，1992，267:922; パブリアク(Pavliak)等，J．Biol．Chem.，1993，268:14146)。ナイセリアゴノロアエの場合には、抗原的変質性は非常に顕著であって、血清学的な分類では捕らえどころのないものである。一部には、これは特定の菌株により合成されたLOS の異質性によるものであり、LOS の調製物はしばしば間隔の近接した数個のSDS-PAGEによるバンドを含む(マンドレル(Mandrell)等，Infect．Immun.，1986，54:63)。更に、モノクローナル抗体を使用した研究は、淋菌がその発現するLOS の血清学的特徴を変えることができ、かつこの抗原的な変化が10-2〜10-3の頻度で発生することを示しており、このことは、これらの高頻度の変異を達成するには、ある遺伝的メカニズムの存在が必要であることを意味している〔シュナイダー(Schneider)等，Infect．Immun.，1988，56:942;アピセラ(Apicella)等，Infect．Immun.，1987，55:1755)。
【０００４】
淋菌により生成されるLOS の分子的異質性および抗原的変化のために、この抗原の構造化学的な決定は、困難であることが立証されており、極めて精巧な分析に基づく決定的な情報は、極最近になって初めて入手できるようになった〔ヤマサキ(Yamasaki)等，Biochemistry，1991，30:10566; カーウッド(Kerwood)等，Biochemistry，1992，31:12760;ジョン(John)等,．Boil．Chem.，1991，266:19303; ギブソン(Gibson)等，J．Bacteriol.，1993，175:2702)。これらを図１にまとめた。特に興味深いのは、四糖 Galβ1 →4 GlcNAcβ1 →3Galβ1 →4Glcβ1 →4 の存在であり、これはスフィンゴ脂質パラグロボシドのラクト-N- ネオテトラオースの完全な模倣体である〔マンドレル(Mandrell)等，J．Ex．Med.，1988，168:107; ツサイ＆シビン(Tsai and Civin)，Infect．Immun.，1991，59:3604)。LOS において、この四糖はしばしば付随的なN-アセチルガラクトースアミン残基(GalNAcβ1 →3Galβ1 →4 GlcNAcβ1 →3Galβ1 →4Glcβ1 →4)を有し、従ってガングリオシドに類似している。淋菌の幾つかの菌株においては、交互の側鎖が見られ、これは構造 Galα1 →4Galβ1 →4Glcβ1 →4hep→ Rを有する〔ジョン(John)等，J．Biol．Chem.，1991，266:19303)。これはグロボ−グリコリピッドの糖部分の類似体〔マンドレル(Mandrell)等，Infect．Immun.，1992，60:3017]であり、かつナイセリアメニンジティディスの免疫型L1中に特徴的に見られる構造である。
【０００５】
該LOS 分子は幾つかの生物学的活性をもつ。副腎皮質の壊死に関与する毒素であると考えられている、強力な内毒素分子である。これらは、正常なまたは回復期にあるヒトの血清中に存在する殺菌活性の殆どについてのターゲット抗原として作用する〔ライス(Rice)等，J．Immunol.，1980，124:2105]。淋菌は、極めて馴染みのうすいシアリルトランスフェラーゼ活性をもち、該活性は、外部から供給されたCMP-NANAの使用を可能とし、かつ該生物の表面上のLOS にN-アセチルノイラミン酸を付加することを可能とする〔ネルン(Nairn)等，J．Gen．Microbiol.，1988，134:3295; パーソンズ(Parsons)等，Microb．Pathog.，1989，7:63;マンドレル(Mandrell)等，J．Ex．Med.，1990，171:1649]。第ＢおよびＣ群髄膜炎菌はCMP-NANAを合成する能力をもち、かつしばしば外因性のCMP-NANAを必要とせずに、そのLOS をシアリル化する〔マンドレル(Mandrell)等，J．Bacteriol.，1991，173:2823]。ナイセリアメニンジティディス菌株6275免疫型L3において、そのシアル酸単位はラクト−N-ネオテトラオースの末端Gal に結合(α2 →3)している〔ヤマサキ(Yamasaki)等，J．Bacteriol.，1993，175:4565]。
【０００６】
種々の宿主環境中に見出されるCMP-NANAの濃度は、この反応を維持するのに十分である〔アピセラ(Apicella)等，J．Infect．Dis.，1990，162:506〕。このLOS のシアリル化によって、淋菌は血清の抗体−補体依存性殺菌作用に対して抵抗性となる〔パーソンズ(Parsons)等，Microb．Pathog.，1989，7:63]。この耐性は、LOS に対する抗体により媒介される上記殺菌作用に対してばかりでなく、他の表面抗原に対するものにも作用する〔ベッツラー(Wetzler)等，Infect．Immun.，1992，60:39]。ファンプッテン(van Putten)は、淋菌のCMP-NANAに対する暴露が、組織培養物中の上皮細胞に侵入する該菌の能力を顕著に減ずることを立証した〔ファンプッテン(van Putten)，EMBO J.，1993，12:4043〕。これらの発見は、該LOS の化学的性質を変える淋菌の能力が、これらに、異なる宿主環境に対処する能力を与えることを強く示唆している〔マンドレル＆アピセラ(Mandrell and Apicella)，Immunobiology.，1993，187:382〕。
【０００７】
多分最も効果的なことに、LOS 変化は人類の感染中の、インビボにおいて選別されたことが分かっている。十分に特徴付けされた淋菌の実験用菌株MS11mk変異体Ａを、志願者に接種するのに使用した〔スワンソン(Swanson)等，J．Ex．Med.，1988，168:2121］。４〜６日の期間内に感染した２名の対象において、その尿中に回収された淋菌群は、抗原的に異なるLOS を発現する２種の変異体に徐々に変化した〔シュナイダー(Schneider)等，J．Ex．Med.，1991，174:1601]。構造解析は、接種された変異体Ａが、Heplに結合したβ−ラクトシル基のみを含む切頭LOS を生成し、一方で新たに発生した変異体の一方（変異体Ｃ）は、完全なLOS を生成した〔カーウッド(Kerwood)等，Biochemistry，1992，31:12760〕。この事実は、付随的な糖GalNAcβ1 →3Galβ1 →4 GlcNAcβ1 →3 の添加が、フレーム変異メカニズムの制御下にあると考えられる、ことを示唆している。
【０００８】
ナイセリア中のLOS 合成遺伝子に関する情報は殆ど入手できない。主な進展は淋菌菌株1291の５種のピオシン変異体（1291a-e と呼ぶ）の、創製〔デュダス＆アピセラ(Dudas and Apicella)，Infect．Immun.，1988，56:499〕および生化学的特徴つけ〔ジョン(John)等，J．Biol．Chem.，1991，266:19303]であった。免疫学的および生化学的データは、1291a、1291c、1291d および1291e が、短縮されたラクト-N- ネオテトラオース鎖配列をもつLOS を製造し、変異体1291e が該ヘプトース上のグルコース置換をもたないことを示した。変異体1291b はもう一つのLOS 構造： Galα1 →4Galβ1 →4Glc（図１参照）を合成する。変異体1291e の遺伝子的基礎のみが現在明らかにされている。これは、ホスホグルコムターゼ(pgm)の変異であり、後者はUDP-グルコースの合成を、結果として該ラクト-N- ネオテトラオース単位の第一残基の付加を妨害する〔ゾウ(Zhou)等，J．Biol．Chem.，1994，269:11162; サンドリン＆ステイン(Sandlin and Stein)，J．Bacteriol.，1994，176:2930〕。また、髄膜炎菌または淋菌のgalE変異体が、UDP-ガラクトースの非−合成能を保持しつつ、切頭LOS を生成することをも示している〔ロバートソン(Robertson)等，Molec．Microbiol.，1993，8:891; ジェニングズ(Jennings)等，Molec．Microbiol.，1993，10:361]。
【０００９】
オリゴ糖の生合成 オリゴ糖は種々の残基数、結合およびサブユニットをもつポリマーである。基本的なサブユニットは、炭水化物の単糖または糖、例えばマンノース、グルコース、ガラクトース、N-アセチルグルコースアミン、N-アセチルガラクトースアミン等である。異なる可能な立体異性オリゴ糖鎖の数は莫大な値である。
オリゴ糖および多糖は、半減期調節剤として機能して、および幾つかの場合においては構造を与えることにより、タンパク機能および活性において重要な役割を演ずる。上に指摘したように、オリゴ糖は、ナイセリア、特に淋菌の抗原的な変化、および結果としての免疫忌避にとって必須である。
【００１０】
炭水化物の合成のための多数の古典的な技術が開発されているが、これらの技術に対しては、選択的な保護および脱保護を要求することは困難である。オリゴ糖の有機合成は、更に多くのグリコシド結合の不安定性、位置選択的な糖結合を達成することの困難性、および一般的に低い合成収率によって妨害される。簡単にいえば、ペプチド合成についての経験とは違い、伝統的な合成有機化学は、かなり単純なオリゴ糖でさえも、定量的かつ高信頼度でこれを合成することは不可能である。
オリゴ糖の合成における最近の進歩は、グリコシルトランスフェラーゼの単離についてなされた。これら酵素をインビトロで使用して、オリゴ糖および多糖を合成できる(例えば、1993年１月19日付けの、ロス(Roth)の米国特許第5,180,674号を参照のこと)。グリコシルトランスフェラーゼを用いた生合成の利点は、これら酵素により形成されるグリコシド結合が著しく立体並びに位置特異的である点にある。しかしながら、各酵素は特定の糖残基の、他の特定のアクセプタ分子、例えばオリゴ糖または脂質への結合を触媒する。かくして、所定のオリゴ糖の合成はグリコシルトランスフェラーゼの入手可能性によって制限されている可能性がある(1993年７月８日付けの、ロスの国際特許出願WO 93/13198 を参照のこと)。
【００１１】
生合成のもう一つの欠点は、該グリコシルトランスフェラーゼ自体が、通常は細胞中にかなり低含有率でしか存在しないことである。該酵素を工業的な実施を可能とする程に十分な量であることは困難である。
従って、当分野では、グリコシルトランスフェラーゼに対する大きな需要がある。更に、組み換え技術によるグリコシルトランスフェラーゼの制限のない源を提供するために、このようなグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に対する需要もある。
本明細書におけるあらゆる参考文献の引用は、かかる参考文献が、本発明の従来技術として入手できることの許諾であると理解すべきではない。
【００１２】
発明の概要
本発明は、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸、これによってコードされたタンパク、および該本発明のグリコシルトランスフェラーゼを利用した、オリゴ糖の合成方法を提供することを目的とする。従って、一局面においては、本発明は中程度に厳密な条件下で、ナイセリアのLOS 遺伝子座に対応する核酸、例えば図２に示されたヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1)に相当するまたはこれと相補的なヌクレオチド配列をもつ核酸とハイブリッド化できる、精製された核酸を提供する。好ましくは、本発明の該核酸は該LOS 遺伝子座の遺伝子のコード配列部分、即ち機能的に活性なグリコシルトランスフェラーゼをコードする図２に示されたヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1)の一部とハイブリッド化される。
【００１３】
特定の態様においては、本発明は機能的に活性なグリコシルトランスフェラーゼをコードする図２に示されたヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1)の一部に相当するまたはこれと相補的なヌクレオチド配列をもつ核酸に関する。更なる局面において、該核酸は機能的に活性なグリコシルトランスフェラーゼをコードする。
特定の一態様においては、本発明は図２に示されたヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1)に相当するまたはこれと相補的なヌクレオチド配列をもつ核酸を提供することを意図する。
本発明の該機能的に活性なグリコシルトランスフェラーゼは、以下の群から選択される反応を触媒することにより特徴付けられる。
Gal β1 →4 のGlcNAcまたはGlc への付加；
GalNAcまたはGlcNAcβ1 →3 のGal への付加；および
Gal α1 →4 のGal への付加。
最も好ましくは、この核酸は、機能的に活性なグリコシルトランスフェラーゼをコードする。しかしながら、本発明の該核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)用のプライマーとして有用な、またはグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の転写のレベルおよびその存在確認のためのプローブとして有用な、オリゴヌクレオチドを含む。
【００１４】
本明細書で具体化する特定の態様において、該核酸はSEQ ID NO:３、SEQ ID NO:４、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６またはSEQ ID NO:８のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼをコードする。
本発明は、更に機能可能に発現制御配列と結合した、本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む、発現ベクターにも関連する。従って、本発明はこのような発現ベクターによって形質転換された、組み換え宿主細胞にも及ぶ。
もう一つの局面においては、本発明はグリコシルトランスフェラーゼの製造方法にも関連し、該方法は該グリコシルトランスフェラーゼの発現を可能とする条件下で、該組み換え宿主細胞を培養する工程と、該発現されたグリコシルトランスフェラーゼを回収する工程とを含む。
第一の局面において、本発明はSEQ ID NO:３、SEQ ID NO:４、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６またはSEQ ID NO:８のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼ、その機能的に活性なフラグメントの提供を意図する。
本発明は、更に固相担体に結合したグリコシルトランスフェラーゼを含有する組成物も意図し、ここで該グリコシルトランスフェラーゼは、SEQ ID NO:３のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼ、またはその機能的に活性なフラグメント、SEQ ID NO:８のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼ、またはその機能的に活性なフラグメント、SEQ ID NO:４のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼ、またはその機能的に活性なフラグメント、およびSEQ ID NO:５のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼ、またはその機能的に活性なフラグメント、並びにSEQ ID NO:６のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼ、またはその機能的に活性なフラグメントからなる群から選ばれる。
【００１５】
新規なグリコシルトランスフェラーゼおよびこれらをコードする遺伝子が提供されたので、本発明は更にオリゴ糖、例えば２またはそれ以上の糖を調製する方法をも提供する。特定の態様において、本発明は、活性化されたGalNAcまたはGlcNAcを含有する反応混合物を、SEQ ID NO:３のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、Gal 残基を含有するアクセプタ部分と接触させる工程を含む、GalNAcまたはGlcNAcβ1 →3 をGal に付加する方法；活性化されたGal を含有する反応混合物を、SEQ ID NO:８のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、GlcNAcまたはGlc 残基を含有するアクセプタ部分と接触させる工程を含む、Galβ1 →4 をGlcNAcまたはGlc に付加する方法；活性化されたGal を含有する反応混合物を、SEQ ID NO:４のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、Gal 残基を含有するアクセプタ部分と接触させる工程を含む、Galα1 →4 をGal に付加する方法；活性化されたGalNAcまたはGlcNAcを含有する反応混合物を、SEQ ID NO:５のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、Gal 残基を含有するアクセプタ部分と接触させる工程を含む、GalNAcまたはGlcNAcβ1 →3 をGal に付加する方法；および活性化されたGal を含有する反応混合物を、SEQ ID NO:６のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、GlcNAcまたはGlc 残基を含有するアクセプタ部分と接触させる工程を含む、Galβ1 →4 をGlcNAcまたはGlc に付加する方法にも関連する。
【００１６】
好ましい一態様において、該オリゴ糖は哺乳動物、特にヒトに対して無害な担体、例えば脂質イソプレノイドまたはポリイソプレノイドアルコール上で調製される。このような担体の具体的な例の一つは、ドリコールホスフェートである。
具体的な一態様においては、本発明のオリゴ糖は不安定な結合を介して該担体に付着され、かくして該脂質担体から、該オリゴ糖を化学的に分離することが可能となる。また、オリゴ糖トランスフェラーゼを使用して、例えば該オリゴ糖を脂質担体からタンパクに移すことができる。更に別の態様において、本発明のグリコシルトランスフェラーゼを真核発現系内で発現させて、このような系内で発現されたタンパクをグリコシル化することができる。
本発明の重要な利点の一つは、著しく有害な脂質Ａとは独立に、ナイセリアのオリゴ糖抗原の合成を達成することにある。理論的にはワクチンの調製のために望ましいが、ナイセリア由来の天然LOS の使用は成功しない。LOS の脂質Ａタンパクは強力な内毒素であり、著しく有害である。該LOS の、例えば加水分解による化学的処理は、該オリゴ糖の抗原性を破壊し、無用な生成物を放出する。かくして、ワクチンの調製のためには、非−毒性の脂質に付着したナイセリアオリゴ糖の源をもつことが著しく望ましい。
【００１７】
従って、本発明はグリコシルトランスフェラーゼを提供し、および多数のオリゴ糖、例えば Galα1 →4Galβ1 →4Glc、Galβ1 → 4GlcNAcβ1 →3Galβ1 →4GlcまたはGalNAcβ1 →3Galβ1 →4 GlcNAcβ1 →3Galβ1 →4Glc（但し、これらに限定されない）を調製するための方法をも提供する。
従って、オリゴ糖を合成するのに有用なグリコシルトランスフェラーゼを提供することが、本発明の主な目的である。
本発明の更なる目的は、ナイセリアメニンジティディス(Neisseria meningitidis)およびN.ゴノロアエ(gonorrhoeae)に特徴的なオリゴ糖の合成法を提供することにある。
本発明の目的は、更に血液型コアオリゴ糖を包含する、哺乳動物のオリゴ糖に特徴的なオリゴ糖の合成法を提供することにある。
更に別の本発明の目的は、LOS のオリゴ糖単位を含有するが、脂質Ａを含まないワクチンを提供することにある。
本発明の他の目的は、治療上有用なオリゴ糖を合成することにある。
これらのおよび他の本発明の目的は、以下の図面および詳細な説明を参照することにより明らかになるであろう。
【００１８】
発明の詳細な説明
前述のように、本発明は５種の新規グリコシルトランスフェラーゼ、これらのグリコシルトランスフェラーゼをコードしている遺伝子、及びこのようなグリコシルトランスフェラーゼを用いるオリゴ糖の生合成法を提供する。本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、ヒト血液型抗原の中心（コア）のオリゴ糖、すなわちラクト-N- ネオテトラオースのような、様々なオリゴ糖のin vitroの生合成に使用することができる。
本発明のグリコシルトランスフェラーゼのクローニング及び発現は、本願明細書に記載された標準的方法を用いて達成することができる。このようなグリコシルトランスフェラーゼは、in vitroでのオリゴ糖の生合成に有用であり、もしくは代わりにこのようなグリコシルトランスフェラーゼをコードしている遺伝子は、細胞、例えば酵母細胞又は真核細胞に、トランスフェクションされ、タンパク質及び脂質の別のグリコシル化を提供することができる。
【００１９】
本発明は、一つには、淋菌菌株F62 由来の淋菌のLOS 生合成に関連した遺伝子座の発見及びクローニングを基礎としている。この遺伝子座は、５個のオープンリーディングフレームを有している。それぞれ、第一及び第二の読み枠は相同であるが、第四及び第五の読み枠は同一ではない。間に配置されたのは、E.coliのrfaI及びrfaJ遺伝子との相同性が少なく、両方のグリコシルトランスフェラーゼが、LPS 中心（コア）の生合成に関連している、追加の読み枠である。第二及び第五の読み枠は、ヘモフィルス・インフルエンザのlex-1 又はlic2A 遺伝子との強い相同性を示しているが、この遺伝子中にはCAAT繰り返し配列は含まない。これらの５種の遺伝子、遺伝子の組み合わせ、及び全体の遺伝子座の欠失が構成され、かつ形質転換によって親の淋菌菌株F62 に導入される。その後、このLOS 表現型は、SDS-PAGE、及びモノクローナル抗体との反応性で分析される。この淋菌変異体の分析は、これらの４種の遺伝子が、内側の中心領域の基質Glc β1-4Hep-Rに、GalNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc β1-3Galβ1-4 が付加した、グリコシルトランスフェラーゼであることを示している。E．coli rfal/rfaJ と相同の遺伝子は、別のLOS 構造Gal α1-4Galβ1-4Gacβ1-4Hep-Rの生合成における、α- 結合したガラクトース残基の付加に関連している。これらの遺伝子は、LOS グリコシルトランスフェラーゼをコードしているので、lgtA、lgtB、lgtC、lgtD及びlgtEと命名されている。DNA 配列の解析により、lgtA、lgtC、及びlgtDが、ポリ-G域を有し、菌株F62 の場合は、各々17、10及び11bpであることが明らかになった。従って、これら３種のLOS 生合成酵素は、読み枠の変化によって、未成熟終結と潜在的になりやすい。おそらくこれらの構造的性質は、淋菌LOS の高い頻度の遺伝変動(high frequency genetic variation)の原因であろう。
【００２０】
本願明細書を通じて使用される略号を下記に記す：リポ多糖類、LPS ；リポオリゴ糖、LOS ；N-アセチル- ノイラミン酸シチジン一リン酸、CMP-NANA；野生型、wt；Gal、ガラクトース；Glc、グルコース；NAc、N-アセチル（例えば、GalNAc又はGlcNAc）。
本発明においては、当該技術分野で一般的な分子生物学、微生物学、及び組換えDNA 技術を使用することができる。このような技術は、文献に十分に記載されている。例えばSambrook、Fritsch 及びManiatisの“分子クローニング：実験マニュアル”（第二版(1989)、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）（以下、Sambrookらの論文(1989)と記す）；“DNA クローニング：実用的方法”（第I 及びII巻）(D.N.Glover 編、1985 年)；“オリゴヌクレオチド合成”（M.J.Gait編、1984年）；“核酸のハイブリダイゼーション”[B.D.Hames及びS.J.Higgins 編(1985)]；“転写及び翻訳”[B.D.Hames及びS.J.Higgins 編(1984)]；“動物細胞培養”[R.I.Freshney 編(1986)]；“固定化した細胞及び酵素”[IRLプレス(1986)]；B.Perbel、“分子クローニングの実用ガイド”(1984)を参照。
【００２１】
従って、本願明細書の下記の用語は、以下に記した定義を有す。
細胞は、外因性又は異種DNA 該細胞中に導入された場合には、このようなDNA によって“形質転換”され；この細胞は、このようなDNA でコードされた１個又は複数の遺伝子を発現することができる。この形質転換DNA は、該細胞ゲノムを構成する染色体DNA に、組込まれても組込まれなくともよく（共有結合）、もしくは自律増殖レプリコンに含まれてもよい。例えば原核生物、酵母及び哺乳類細胞においては、形質転換DNA を、プラスミドのようなエピソーム性エレメントに保持することができる。“クローン”とは、単一の細胞又は有糸分裂による共通の祖先に由来する細胞集団である。
【００２２】
“核酸分子”は、１本鎖型又は２本鎖らせんのいずれかの、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジン；“RNA 分子”）又はデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン又はデオキシシチジン；“DNA 分子”）を意味する。２本鎖DNA-DNA、DNA-RNA 及びRNA-RNA のらせんが可能である。用語核酸分子、特にDNA 又はRNA 分子は、その分子の一次又は二次構造のみを意味し、かついずれか特定の三次構造を限定するものではない。従ってこの用語は、特に直線又は環状のDNA 分子(例えば制限断片)、ウイルス、プラスミド、及び染色体において認められた２本鎖DNA を含む。特定の２本鎖DNA 分子の構造については、配列は、DNA の非転写鎖に沿った5'から3'の方向の配列のみを生じる通常の習慣に従って、本願明細書には記載される(すなわち、この鎖は、mRNAと相同な配列を有す)。“組換えDNA 分子”は、分子生物学的操作を受けたDNA 分子である。
【００２３】
核酸分子由来の１本鎖を、適当な温度及び溶液のイオン強度の条件下で、アニーリングすることができる場合には、核酸分子は、cDNA、ゲノムDNA 又はRNA のような他の核酸分子と、“ハイブリッド形成可能”である（上述のSambrookらの論文(1989)参照）。温度及びイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの“ストリンジェンシー”を決定する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによって、塩基間のミスマッチが生じる可能性があるもかかわらず、ハイブリダイゼーションには、２種の核酸が相補的配列を有することが必要である。ハイブリッド形成している核酸の妥当なストリンジェンシーは、核酸の長さ、及び相補性の程度、当該技術分野で周知の変数によって決まる。２種の核酸配列間の類似性又は相同性の程度が高まるにつれて、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのTm値がより大きくなる。核酸のハイブリダイゼーションの相対安定性（比較的高いTmに相当）は、下記の順に低下する：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。
ヌクレオチドの長さが100 以上のハイブリッドについては、Tmの計算式が得られている（上述のSambrookらの論文，9.50-9.51）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置は、更に重要となり、このオリゴヌクレオチドの長さが、その特異性を決定する（上述のSambrookらの論文，11.7-11.8）。ハイブリッド形成可能な核酸の最短の長さは、好ましくは少なくとも約10ヌクレオチドであり；より好ましくは少なくとも約15ヌクレオチドで；最も好ましい長さは少なくとも約20ヌクレオチドである。
【００２４】
DNA の“コード配列”は、適当な調節配列の制御下にある場合には、in vivo でポリペプチドに転写及び翻訳された２本鎖DNA 配列である。このコード配列の境界域は、5'（アミノ）末端の出発コドン、及び3'(カルボキシル)末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、原核生物の配列、真核生物のmRNA由来のcDNA、真核生物（例えば哺乳類）のDNA 由来のゲノムDNA 配列、更には合成DNA 配列をも含むが、これらに限定されるものではない。このコード配列の真核細胞における発現を意図する場合には、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列が、通常該コード配列の3'に位置するであろう。
【００２５】
転写及び翻訳の制御配列は、宿主細胞における、コード配列の発現のために供される、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのようなDNA 調節配列である。本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードしている個々の遺伝子が、それらの間に非常に短い非コード配列を伴い、単一の座で発見されているにもかかわらず、lgtA、lgtB又はlgtCのいずれかの欠失を生じる相変異は、その下流の遺伝子の転写の再開始を妨げることはない。従って本願明細書において提供された遺伝子座は、ナイセリアの転写開始配列の転写を含む。一方、本発明のコード配列は、異種の調節配列の制御下で発現するために操作することができる。
“プロモーター配列”は、細胞内でのRNA ポリメラーゼの結合、及び下流（3'方向）のコード配列の転写開始が可能なDNA 調節領域である。本発明を明確にする目的で、このプロモーター配列は、転写開始部位とその3'末端で結合し、かつ前述のバックグラウンドで検出可能なレベルの転写を開始するのに必要な塩基又は要素を最低数含むように、上流（5'方向）へと伸長する。このプロモーター配列内には、転写開始部位（都合の良いことに例えばヌクレアーゼS1でのマッピングによって限定された）、更にはRNA ポリメラーゼの結合に寄与するタンパク結合ドメイン（コンセンサス配列）が認められるであろう。真核生物のプロモーターは、“TATA”ボックス及び“CAT”ボックスを含むことが多いが、しかし常ではない。
【００２６】
コード配列は、RNA ポリメラーゼが、このコード配列をmRNAに転写し、その後このコード配列によってコードされたタンパク質へと翻訳される場合には、細胞の転写及び翻訳の制御配列の“制御下”にある。
“シグナル配列”は、前述のコード配列の前に含むことができる。この配列は、該ポリペプチドのN-末端のシグナルペプチドをコードし、これは宿主細胞に、該ポリペプチドの細胞表面又は細胞内オルガネラへの転移、もしくはその培地中への該ポリペプチドの分泌を指示し、かつこのシグナルペプチドは、通常タンパク質運搬機構(protein transport machinery)により選択的に切断される。シグナル配列は、原核細胞及び真核細胞に固有の様々なタンパク質に関連して見出すことができる。シグナル配列の組込みは、細菌、酵母、昆虫細胞（バキュロウイルス）、又は真核細胞による、本発明のグリコシルトランスフェラーゼの高レベルの発現にとって所望であり、宿主細胞における外因性グリコシル転移の影響を避けることができる。
【００２７】
分子は、イムノグロブリン（抗体）又はT 細胞抗原レセプターのような、免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用することが可能な場合には、“抗原性”である。前述のように、ナイセリアのLOS の炭水化物(オリゴ糖)部分は、重要な抗原決定基であり、これは髄膜炎菌の血清型を決定する（Zollinger 及びMandrellの論文、Infect.Immun．、18:424(1977)；Zollinger 及びMandrellの論文、Infect.Immun．、28:451(1980)）。分子の抗原部分は抗体に対し免疫優性の部分であることができ、もしくは免疫感作の担体分子に対する抗原部分を複合することによって、該分子に対する抗体を生成するために使用される部分であることができる。抗原性である分子は、それ自身が免疫原性である必要はなく、すなわち担体なしで免疫応答を誘発することが可能である。
【００２８】
“A”を含む組成物（ここで“A”は、単一のタンパク質、DNA 分子、ベクターなどである。）は、該組成物中の該タンパク質、DNA、ベクター（A 及びB が属する種のカテゴリーに依存する）の少なくとも約75重量％が、“A”である場合に、実質的に“B”（ここで“B”は、１種以上の汚染タンパク質、DNA 分子、ベクターなどである。）を含まない。“A”は、該組成物のA ＋B 種の少なくとも約90重量％で含まれることが好ましく、少なくとも約99重量％が最も好ましい。
更に実質的に汚染物質を含まない組成物は、関心のある種の活性又は特性を有する単一の分子量の種のみを含有することが好ましい。
【００２９】
句“医薬として許容できる”とは、分子実体及び組成物が生理学的に認容性があり、かつ典型的にはヒトに投与した際に、胃の不調、めまいなどのようなアレルギー性又は類似の有害反応をもたらさないことを意味する。好ましくは、本願明細書で使用された用語“医薬として許容できる”とは、米連邦の規制当局又は州政府によって認可されたこと、もしくは米国薬局方、又は他の動物用、特にヒト用の一般に認められた医薬品集に掲載されたことを意味する。用語“担体”は、前述の化合物と共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを意味する。このような医薬用担体は、水及び油類のような滅菌した液体で、これらは、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物又は合成を起源とする油であることができる。水又は生理食塩水、及び水性デキストロース及びグリセロール溶液が、担体として、特に注射溶液として使用するのが好ましい。本発明の医薬として許容できる組成物は、哺乳類の対象、特にヒトの対象において、反応を生じる作用があるリピドA を含まない。
【００３０】
用語“アジュバント”とは、抗原に対する免疫応答を増強する化合物又は混合物を意味する。あるアジュバントは、緩徐に抗原を放出する組織蓄積物として、及び免疫応答を非特異的に増強するリンパ系活性剤として役立つ（Hoodらの論文、Immunology，第二版、1981年、頁384、Benjamin/Cummings 社、メンロパーク、カリフォルニア）。アジュバントを用いない抗原単独での一次チャレンジは、体液性又は細胞性免疫応答の誘発に失敗することが多い。アジュバントは、完全フロイントのアジュバント、不完全フロイントのアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムのような無機質ゲル、リゾレシチンのような界面活性剤、プルロニック(pluronic)ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油又は炭化水素の乳化剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びBCG（バシル・カルメット- ゲラン）及びコリネバクテリウム・パルブム(corynebacterium parvum)のような有用な可能性があるヒトアジュバントを含むが、これらに限定されるものではない。このアジュバントは、医薬として許容できることが好ましい。
【００３１】
グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の単離
本発明は、ナイセリアのLOS 座の完全な長さのコード配列を提供すること、従って、本願明細書においてlgt と称される、その座のグリコシルトランスフェラーゼ特性をコードしている遺伝子のいずれか１種又は５種全てを得ることである。いずれかのナイセリア細菌細胞は、lgt 遺伝子の分子クローニングのための核酸源として潜在的に利用することができる。以下の具体的な実施態様において、これらの遺伝子は、ナイセリア・ゴノロエアエから単離される。このDNA は、所望の細胞から、クローン化されたDNA から（例えばDNA“ライブラリー”）、当該技術分野において公知である標準的方法によって、化学合成によって、cDNAのクローニングによって、もしくは精製されたゲノムDNA 又はそれらの断片のクローニングによって得ることができる（上述のSambrookらの論文、(1989)；Glover,D．M.(編)、1985年、DNA クローニング：実用的方法、第I、II巻、MRL プレス社、オックスフォード、英国を参照）。例えばN.ゴロノエアエのゲノムDNA は、ファージゲノムライブラリーを作成するために、Sau3A のような制限エンドヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼによって消化され、BamHI/EcoRI のような制限エンドヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼで消化されたファージベクターへと挿入される。いずれが原料であったとしても、この遺伝子は、該遺伝子の伝播に適当なベクターに、分子としてクローン化されなければならない。
【００３２】
ゲノムDNA 由来の遺伝子の分子クローニングにおいて、DNA 断片が生成され、その中の一部は所望の遺伝子をコードしていると考えられる。このDNA は、様々な制限酵素を用いて、特定の部位で切断される。代わりに、マンガンの存在下でDNAse を用いて、DNA 断片とすることもでき、もしくはDNA を、音波処理のように、物理的にせん断することができる。その後、直線DNA 断片を、アガロース及びポリアクリルアミドのゲル電気泳動、並びにカラムクロマトグラフィーを含むがこれらに限定さるものではない、標準的手法により大きさに応じて分離することができる。
【００３３】
一旦DNA 断片が生成されると、所望のlgt 遺伝子を含む特定のDNA 断片の同定は、多くの方法で達成することができる。例えば、生成したDNA 断片は、本願明細書に記載された配列で合成された標識されたプローブへの、核酸のハイブリダイゼーションによってスクリーニングすることができる（Benton及びDavis の論文、Science、196:180(1977)；Grunstein 及びHogness の論文、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．、72:3961(1975)）。該プローブと実質的に相同であるこれらのDNA 断片は、ハイブリッド形成するであろう。本発明は、グリコシルトランスフェラーゼのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができるDNA 断片の具体的な例、例えばSEQ ID NO:1 を提供する。
【００３４】
前述のようにこの遺伝子の存在は、その発現した生成物の物理的、化学的、又は免疫学的特性を基にしたアッセイによって検出することができる。例えば、電気泳動移動度、等電点電気泳動の挙動、タンパク質分解の消化地図、タンパク質分解活性、又は機能特性、特にグリコシルトランスフェラーゼ活性、受容分子への糖転移を仲介するLgt タンパク質の能力が類似又は同一のタンパク質を生成するDNA クローンである。代わりに、推定上のlgt 遺伝子を、突然変異することができ、かつグリコシルトランスフェラーゼとしてのその役割は、LOS のオリゴ糖の様々な構造を検出することによって確立される。
【００３５】
別のlgt ゲノムDNAの単離法は、Lgt をコードしている公知の配列、例えばSEQ ID No:1 の遺伝子配列そのものの化学合成を含むが、これに限定されるものではない。別の実施態様においては、lgt 遺伝子のDNA は、本願明細書に記載されたヌクレオチド配列から決定されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCR で単離することができる。他の方法も可能であり、本発明の範囲に含まれる。
【００３６】
次に同定されかつ単離された遺伝子は、適当なクローニングベクターに挿入される。当該技術分野で公知である多数のベクター- 宿主系を使用することができる。可能なベクター類は、プラスミド又は修飾されたウイルスを含むが、これらに限定されるものではなく、このベクター系は、使用した宿主細胞と適合しなければならない。本発明の特定の態様において、lgt のコード配列は、E.coliクロ−ニングベクターに挿入される。ベクターの別の例は、λ誘導体のようなバクテリオファージ、pBR322誘導体又はpUC プラスミド誘導体のようなプラスミドを含むが、これらに限定されるものではなく、例としてpGEXベクター、pmal-c、pFLAG などがある。クローニングベクターへの挿入は、例えば、該DNA 断片の、相補的付着末端を有するクロ−ニングベクターへの連結によって達成される。しかし、DNA の断片化に使用されたこの相補的制限部位が、該クローンベクターに存在しない場合には、このDNA 分子の末端は酵素的に修飾することができる。代わりに、所望のいずれかの部位を、該DNA 末端に、ヌクレオチド配列(リンカー)を連結することによって、産生することができ；これらの連結されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードしている、特異的な化学合成されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。具体的な実施態様において、このようなリンカー部位を有するPCR プライマーを用いて、クローニング用のDNA の増幅することができる。組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔法などによって、宿主細胞に導入することができ、その結果この遺伝子配列の多くのコピーが産生される。
【００３７】
単離されたlgt 遺伝子又は合成されたDNA 配列を取込んでいる組換えDNA 分子による、宿主細胞の形質転換は、該遺伝子の多数のコピーの生成を可能にする。
従って、この遺伝子は、形質転換体の増殖、組換えDNA 分子の形質転換体からの単離によって、必要であるならば、挿入された遺伝子を、単離された組換えDNA から回収することによって、大量に得ることができる。
本発明は、更に該酵素（断片）及びLgt と同じ機能活性を有するLgt's の誘導体の切断型をコードしている遺伝子を含むベクター類に関する。Lgt に関連した断片及び誘導体の生成及び使用は、本発明の範囲内である。具体的な実施態様において、この断片又は誘導体は、機能活性があり、すなわち受容分子への糖転移を仲介することができる。
【００３８】
前記グリコシルトランスフェラーゼの切断型断片は、機能活性には不用のタンパク質の、N-末端、C-末端、又は内部領域を除去することによって調製することができる。通常、除去されたこのような部分は、わずかの、例えば１〜５個のアミノ酸残基のみを含むが、より大きい断片を除去することができる。
他のタンパク質に結合した、本発明のグリコシルトランスフェラーゼを全て又は機能活性部分を含むキメラ分子、例えば融合タンパク質についても考察している。グリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質は、少なくともグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの機能活性部分に結合したペプチドを介して結合した少なくとも非グリコシルトランスフェラーゼタンパク質の機能活性部分を含む。この非グリコシルトランスフェラーゼ配列は、グリコシルトランスフェラーゼ配列の、アミノ- 又はカルボキシル- 末端であることができる。融合タンパク質の発現は、酵素的に不活性のグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質を生じることができる。このような融合タンパク質をコードしている組換えDNA 分子は、グリコシルトランスフェラーゼのコード配列のフレーム(in-frame)に結合した、非グリコシルトランスフェラーゼタンパク質の機能活性部分を少なくともコードしている配列を含み、かつ好ましくは、特定のプロテアーゼ、例えばトロンビン又はファクターXaの切断部位、好ましくはグリコシルトランスフェラーゼ-非-グリコシルトランスフェラーゼの接合部をコードしている。具体的な実施態様において、この融合タンパク質は、エシェリヒア・コリを発現することができる。
【００３９】
具体的には、Lgt 誘導体は、コードしている核酸配列を、機能的に等価の分子をもたらすような置換、付加又は欠失によって変更することによって、作成することができる。ヌクレオチドコード配列の縮重のために、lgt 遺伝子と実質的に同じアミノ酸配列をコードしている別のDNA 配列を、本発明の実施において使用することができる。これらは、該配列中の同じアミノ酸残基をコードしている、従ってサイレントの変化を生じている、別のコドンの置換によって変更された、全て又は一部のlgt 遺伝子を含むヌクレオチド配列を含むが、これに限定されるものではない。同様に、本発明のLgt 誘導体は、一次アミノ酸配列として、機能的に等価のアミノ酸残基が、保存的アミノ酸置換を生じる配列中の残基に置換されたような、変更された配列を含むLgt のアミノ酸配列の全て又は一部を有するものを含むが、これに限定されるものではない。
【００４０】
例えば、該配列中の１個以上のアミノ酸残基を、類似の極性を有する別のアミノ酸で置換することができ、これは機能的に等価に作用し、サイレントの変化を生じる。該配列中のアミノ酸の置換体は、このアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンである。極性の中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンである。正に帯電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン及びヒスチジンである。負に帯電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸である。
【００４１】
本発明のLgt 誘導体及び類似体をコードしている遺伝子は、当該技術分野で公知の様々な方法（例えば上述のSambrookらの論文(1989)）で生成することができる。この配列は、制限エンドヌクレアーゼ（複数）により、適当な部位で切断され、その後、所望であるならば、更に酵素的に修飾され、単離され、in vitroで連結される。Lgt 誘導体又は類似体をコードしている遺伝子の生成において、修飾された遺伝子が、所望の活性がコードされている遺伝子領域において、翻訳停止シグナルによって分断されていない、lgt 遺伝子と同じ翻訳の読み枠に残留していることが確実であるように注意しなければならない。
【００４２】
更にlgt 核酸配列は、in vitro又はin vivo において突然変異することができ、翻訳、開始及び／又は終結配列を、形成及び／又は破壊するか、もしくはコード領域を形成するか及び／又は新規制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するか、もしくは更なるin vitroの修飾を促進するために、既存の配列を破壊する。当該技術分野で公知の突然変異に関するいずれかの方法を使用することができ、これはin vitroでの部位特異的突然変異法（Hutchinson,C．らの論文、J.Biol.Chem.、253:6551(1978)；Zoller及びSmith の論文、DNA、3:479-488(1984)；Oliphantらの論文、Gene、44:177(1986)；Hutchinsonらの論文、Proc．Natl．Acad．Sci.U.S.A.、83:710(1986)）、TAB（登録商標）リンカー（ファルマシア社）の使用などを含むが、これらに限定されるものではない。PCR は、部位特異的突然変異法にとっては好ましい（Higuchi の論文、1989年、“PCR を用いるDNA 操作”、PCR 技術：DNA 増殖の原理及び用途、H.Erlich（編）Stockton Press、第６章、頁61-70）。lgtA、lgtB及びlgtC遺伝子は、相変異の突然変異を特に受けやすい、長いポリ-Gの伸長を含むことに注目すべきである。
【００４３】
グリコシルトランスフェラーゼの発現
Lgt をコードしている遺伝子、もしくは機能活性断片又はそれらの他の誘導体は、適当な発現ベクター、すなわち挿入されたタンパク質のコード配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含むベクターに、挿入することができる。発現ベクターも、同じく複製開始点を含む。必要な転写及び翻訳シグナルも、天然のlgt 遺伝子及び／又はそのフランキング領域によって供給することができる。様々な宿主- ベクター系は、タンパク質のコード配列を発現することができる。しかし、細菌の発現系を用いて、天然のコンホメーションの可能性がより高い、該タンパク質の高レベルの発現を提供することが好ましい。可能性のある宿主- ベクター系は、ウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）に感染した哺乳類細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含む、酵母などの微生物、もしくはバクテリオファージ、DNA、プラスミドDNA、又はコスミドDNA で形質転換された細菌を含むが、これらに限定されるものではない。ベクターの発現エレメントは、その強度及び特異性が異なる。使用された宿主- ベクター系に応じて、多くの適当な転写及び翻訳エレメントのうちのいずれか１種を使用することができる。
【００４４】
Lgt の周辺質型（シグナル配列を含む）が、エシェリヒア・コリの周辺質への、又はバチルス・スブチラスを基本にした発現系への、該タンパク質の輸送をもたらすことが好ましい。
ベクターへのDNA 断片の挿入に関する前述の方法のいずれかは、適当な転写／翻訳制御シグナル及び該タンパク質コード配列からなる、キメラ遺伝子を有する発現ベクターの構成に使用することができる。これらの方法は、in vitroでの組換えDNA 及び合成法、並びにin vivo での組換え体（遺伝的組換え）を含むことができる。
【００４５】
グリコシルトランスフェラーゼ又はペプチド断片をコードしている核酸配列の発現は、第二の核酸配列によって調節することができ、その結果これらのグリコシルトランスフェラーゼ又はペプチドが、前記組換えDNA 分子で形質転換された宿主において、発現される。例えば、グリコシルトランスフェラーゼの発現は、当該技術分野で公知であるプロモーター／エンハンサーエレメントのいずれかによって制御することができるが、これらの調節エレメントは、発現のために選択された宿主において機能しなければならない。細菌における発現に関しては、細菌性プロモーターが必要である。真核ウイルス、又は組織特異性のプロモーターを含む真核プロモーターは、以下に詳細に述べるように、lgt 遺伝子を含むベクターが、一過性の発現のために対象の中に直接注入される場合に好ましく、細菌による感染に対する異種保護(heterologous protection)を生じる。lgt 遺伝子の発現の制御に使用することができるプロモーターは、下記を含むが、これらに限定されるものではない：SV40初期プロモーター領域(Benoist 及びCharnbonの論文、Nature、290:304-310(1981))、ラウス肉腫ウイルスの3'長末端反復に含まれたプロモーター（Yamamotoらの論文、Cell、22:787-797(1980)）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerらの論文、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.、78:1441-1445(1981))、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinsterらの論文、Nature、296:39-42(1982)）；β- ラクタマーゼプロモーターのような真核発現ベクター(Villa-Kamaroffらの論文、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、75:3727-3731(1978))、又はtac プロモーター（DeBoerらの論文、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．、80:21-25(1983)）であり；更に“組換え細菌由来の有用なタンパク質”（サイエンティック・アメリカン社、242:74-94(1980)）等参照。
【００４６】
lgt 遺伝子挿入断片を含む発現ベクターは、４種の一般的方法で同定される：(a)所望のプラスミドDNA 又は特異的mRNAのPCR 増幅、(b)核酸のハイブリダイゼーション、(c)“マーカー”遺伝子機能の存在の有無、及び(d)挿入された配列の発現である。第一の方法では、核酸を、増幅された生成物の検出のために、放射性ヌクレオチドの組込み、又は臭化エチジウムによる染色を行うと共に、PCR で増幅することができる。第二の方法では、発現ベクター中の外来遺伝子の存在は、挿入されたlgt 遺伝子に相同の配列を含むプローブを用いる、核酸のハイブリダーゼーションによって検出することができる。第三の方法では、組換えベクター／宿主系を、ベクターの外来遺伝子の挿入によって生じた、特定の“マーカー”遺伝子機能（例えば、β- ガラクトシダーゼ活性、PhoA活性、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける封入体の形成）の存在の有無を基に、同定及び選択することができる。lgt 遺伝子が、ベクターのマーカー遺伝子配列中に挿入される場合は、lgt 挿入断片を有する組換え体は、そのマーカー遺伝子機能を発揮しないことで確認することができる。第四の方法では、組換え発現ベクターは、組換え体で発現されたlgt 遺伝子産物の活性についてアッセイすることによって同定することができる。このようなアッセイは、例えば、in vitroアッセイシステムにおける、lgt 遺伝子産物の生理的又は機能的特性、例えばグリコシルトランスフェラーゼ活性を基本とすることができる。一旦適当な宿主系及び増殖条件が確立されたならば、組換え発現ベクターを、増殖させ、かつ大量に調製する。
【００４７】
オリゴ糖の生合成
本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、オリゴ糖の生合成に使用することができる。本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、特異的受容分子に、特異的に活性化されたサッカライド単位が、立体特異的に複合することが可能である。このような活性化されたサッカライドは、一般にそのサッカライド類のウリジン、グアノシン、及びシチジン二リン酸誘導体からなり、これは遊離基として、ヌクレオシド二リン酸を供する。従って、これらの活性化されたサッカライドは、サッカライド-UDP、サッカライド-GDP又はサッカライド-CDPである。具体的な実施態様において、活性化されたサッカライド類は、UDP-GlcNAC、UDP-GalNAc又はUDP-Gal である。
【００４８】
本願明細書で使用される用語“受容分子”とは、グリコシルトランスフェラーゼが、活性化された糖質を転移する分子を意味する。当該技術分野において周知であるように、炭水化物の合成は、例えばドリコールリン酸のような脂質への、糖残基の連続的カップリングによって進行する。タンパク質をグリコシル化するような真核細胞において、オリゴ糖又は多糖は、活性化された脂質担体から、小胞体の内腔側のポリペプチドへと転移される。原核細胞においては、炭水化物は直接リピドA 分子上で合成される。おそらく、本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、成長する炭水化物及び脂質分子の中心部分に対して反応するのであろう。従って、好ましい態様において、受容分子又は担体は、脂質、好ましくはドリコールリン酸のようなポリイソプレノイドアルコール脂質を含む。最大の合成効率は、担体としてリピドA を使用することによってもたらされる。例えばワクチン調製物のように、対象に生成したオリゴ糖を直接投与するための担体としては、リピドA は有用ではないにもかかわらず、これは連続的切断（穏やかな条件下で）及び脂質担体からのオリゴ糖の分離のために、不安定な連結(labilelinkage)を使用する際には適している。前記グリコシルトランスフェラーゼが、天然の受容分子に相当する受容分子上での、特異的に活性化されたサッカライドの、サッカライド残基への付加に効果的に作用するのみであることは更に注目されるべきである。例えばLgtEは、Gal からGlc β1 → 4Hep への転移を触媒する。従って、グリコシルトランスフェラーゼが、GalNAcのGlc への結合(attachment)を仲介する場合には、Glc 残基（例えば、該担体に直接又は間接のいずれで結合しているかにかかわらず）の性質が、反応効率に影響するであろう。担体が存在しない、もしくは脂質担体以外を使用する状態で、効果的な合成が生じることはおそらくないであろう。しかし、非能率的な合成が所望であっても、本発明の実践は、脂質を含む受容分子の使用に限定されるものではなく、サッカライド、多糖、ポリペプチド、糖タンパク質などに及ぶ。
【００４９】
オリゴ糖の合成のために、グリコシルトランスフェラーゼを、サッカライドの受容分子への転移及び共有結合に効果的な条件下で、適当な活性化されたサッカライド及び適当な受容分子を接触させる。特定のサッカライド単位の転移に適切かつ最良の時間、温度及びpHの条件は、通常の試験を通じて決定することができ；一般に、生理的条件が受け入れられるであろう。特定の共- 試薬(co-reagent)が、所望であることもあり；例えばこれは、２価の陽イオンの存在下において、活性化されたサッカライド及び受容分子に、グリコシルトランスフェラーゼをより効率よく接触させうる。
【００５０】
本発明では、このグリコシルトランスフェラーゼ酵素は、固相支持体、例えばセファデックス、セファロース、又はポリ（アクリルアミド-コ-N- アクリルオキシスクシイミド）(PAN)樹脂上に、共有又は非共有結合で固定することができる。特定の反応を、反応生成物からの固相の酵素の容易な分離を伴う、単離された反応液中で進行することができる。酵素の固定化は、固体支持体に付着した特定のグリコシルトランスフェラーゼを伴い、カラムの中に一定の順で無作為に又は近接する領域に配置された支持体を伴い、カラムを通じる反応液の通路及び末端での所望のオリゴ糖の溶出を伴うような、連続的生合成流れも考慮する。グリコシルトランスフェラーゼの固体支持体への付着及びこのような固定化されたグリコシルトランスフェラーゼの使用の効率的方法は、全て参照として本願明細書に引用されている、Rothの、1993年1月19日に開示された米国特許第5,180,674号に記載されている。
【００５１】
本発明のグリコシルトランスフェラーゼを用いて調製されたオリゴ糖、例えば二糖類は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼ又は当該技術分野で公知のグリコシルトランスフェラーゼのいずれを使用するかにかかわらず、更なる合成の受容分子として利用することができる（例えば、Rothの米国特許第5,180,674号、及び1993年７月８日に公開されたRothの国際特許公開第WO93/13198号で、両者とも全て参照として本願明細書に引用されている。）。本発明のオリゴ糖組成物は、治療及び診断の用途で広範に有用である。例えば、このサッカライド組成物は、細胞接着に関連した多数の疾患の治療における細胞表面レセプターのための保護剤として有用であることができる。別に少し言及すると、栄養補助剤、抗菌剤、抗転移剤、抗炎症剤（例えば炎症に関連したレシチン又は細胞表面レセプターに結合）として有用なサッカライド組成物が、本発明によって予想される。前述のように、本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、当該技術分野で公知の他のグリコシルトランスフェラーゼ類と共に使用することができる、もしくは合成複合オリゴ糖又は多糖として認められる。
【００５２】
更に、本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、ナイセリアの様々な菌株で発見されたオリゴ糖のオリゴ糖呈示部(representative)の合成に使用することができる。例えば、遺伝子座からのオーブンリーディングフレームの欠失によって、もしくは合成のためのいくつかの本発明のグリコシルトランスフェラーゼのみの選択によって、別のオリゴ糖の構造を調製することができる。これらは、ナイセリア変異体に対し有効なワクチン調製物、特に淋菌又は髄膜炎菌に対するサブユニットワクチンにおいて使用することができる。
更に、本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、ヒトの糖脂質に関連したオリゴ糖に対応したオリゴ糖の調製に使用することができる。従って、具体的な実施態様において、本発明は、スフィンゴ脂質パラグロボシドのラクト-N- ネオテトラオースに相当するオリゴ糖；ガングリオシドを模倣するオリゴ糖；及び構造がナイセリア・メニンギチジス免疫型L1に特徴的に認められる、グロボ糖脂質のサッカライド部分の模倣の合成を提供する。本発明のオリゴ糖は、血液型抗原のオリゴ糖中心に対応し、従って、このような血液型抗原を調製することは、診断又は治療の目的において非常に利用度が高い。
【００５３】
従って、構造GalNAcβ1 →3Galβ1 →4GlcNAc β1 →3Galβ1 →4Glc（すなわちガングリオシド）の調製法は、下記の連続工程を含む：
a.活性化されたGal を含む反応混合物を、Glc 残基を含む受容部分に、アミノ酸配列SEQ ID NO:6を有するグリコシルトランスフェラーゼ、又はその機能活性断片の存在下で、接触する工程；
b.活性化されたGlcNAcを含む反応混合物を、Gal β1 →4Glc残基を含む受容部分に、アミノ酸配列SEQ ID NO:3 を有するグリコシルトランスフェラーゼ、又はその機能活性断片の存在下で、接触する工程；
c.活性化されたGal を含む反応混合物を、GlcNAcβ1 →3Galβ1 →4Glc残基を含む受容部分に、アミノ酸配列SEQ ID NO:8 を有するグリコシルトランスフェラーゼ、又はその機能活性断片の存在下で、接触する工程；
d.活性化されたGalNAcを含む反応混合物を、Gal β1 →4GlcNAc β1 →3Galβ1 →4Glc残基を含む受容部分に、アミノ酸配列SEQ ID NO:5 を有するグリコシルトランスフェラーゼ、又はその機能活性断片の存在下で、接触する工程である。
【００５４】
同様に、構造Gal β1 →4GlcNAc β1 →3Galβ1 →4Glc（すなわちラクト-N- ネオテオトラノース）の調製法は、下記の連続工程を含む：
a.活性化されたGal を含む反応混合物を、Glc 残基を含む受容部分に、アミノ酸配列SEQ ID NO:6を有するグリコシルトランスフェラーゼ、又はその機能活性断片の存在下で、接触する工程；
b.活性化されたGlcNAcを含む反応混合物を、Gal β1 →4Glc残基を含む受容部分に、アミノ酸配列SEQ ID NO:3 を有するグリコシルトランスフェラーゼ、又はその機能活性断片の存在下で、接触する工程；
c.活性化されたGal を含む反応混合物を、GlcNAcβ1 →3Galβ1 →4Glc残基を含む受容部分に、アミノ酸配列SEQ ID NO:8 を有するグリコシルトランスフェラーゼ、又はその機能活性断片の存在下で、接触する工程である。
【００５５】
別の実施態様において、構造Gal α1 →4Galβ1 →4Glc（すなわちグロボ糖脂質）の調製法は、下記の連続工程を含む：
a.活性化されたGal を含む反応混合物を、Glc 残基を含む受容部分に、アミノ酸配列SEQ ID NO:6を有するグリコシルトランスフェラーゼ、又はその機能活性断片の存在下で、接触する工程；
b.活性化されたGal を含む反応混合物を、Gal β1 →4Glc残基を含む受容部分に、アミノ酸配列SEQ ID NO:4 を有するグリコシルトランスフェラーゼ、又はその機能活性断片の存在下で、接触する工程である。
このようなオリゴ糖類は、担体としてリピドA を用いて調製することができる。得られる糖脂質が、ワクチンとして使用される場合には、担体として無毒の脂質、例えばドリコールリン酸が使用されることが好ましい。
【００５６】
ワクチン接種
ナイセリア菌株に対する能動免疫を、アジュバントと混合した、本発明に従って調製された免疫量のオリゴ糖で、免疫感作（ワクチン接種）することによって誘導することができ、この場合該オリゴ糖は、該ワクチンの抗原成分となる。このオリゴ糖は、担体タンパク質と複合していることが好ましい。代わりに、この抗原が糖脂質である場合には、これをリポソームに組込むことができる。
リピドA 上のこのオリゴ糖は有毒であり、かつ本発明のワクチン接種で誘導された能動免疫は、即時型の免疫応答をもたらすことができるにもかかわらず、このオリゴ糖単独では細菌感染を引き起こすことはできない。
【００５７】
アジュバントの選択は、ワクチン投与される対象によって決まる。好ましくは、医薬として許容できるアジュバントを使用する。例えば、ヒトのワクチンのためには、フロイントの完全及び不完アジュバントを含む、油又は炭化水素の乳化アジュバントは避ける。ヒトでの使用に適したアジュバントの１例は、ミョウバン（アルミナゲル）である。しかし、動物へのワクチンには、ヒトでの使用には適さないアジュバントを含むことができる。
本発明の、すなわちナイセリア菌株の抗原決定基に相当するオリゴ糖を含有するワクチンは、筋肉、腹腔、静脈への投与などを含むが、これらに限定されるものではない非経口経路で、投与することができる。
ナイセリア菌のその標的細胞への付着を阻害するのに十分な量のナイセリアオリゴ糖の投与は、髄膜炎菌又は淋菌の感染症の治療にも有効である。この必要量は、標準的方法を用いる一般的技術の１種によって決定することができる。
【００５８】
細胞内グリコシレーションのためのグリコシルトランスフェラーゼの発現
本発明は、更に、この発明のグリコシルトランスフェラーゼを有する宿主細胞の形質転換を企図する。可能な場合には、１種以上の内因性グリコシルトランスフェラーゼを欠く細胞における、グリコシルトランスフェラーゼの発現によって、このような真核細胞において脂質及びタンパク質の新規なグリコシル化並びに原核細胞における脂質の新規なグリコシル化を生じるかも知れない。
例えば、非毒性脂質分子を有する細菌の形質転換によって、そのような細菌上でナイセリア(Neisseria)オリゴサッカライドが発現し、このオリゴサッカライドは、次いで、全細胞ワクチンに直接使用することができる。
これとは別に、酵母、昆虫又は哺乳類の細胞系統(cell line)におけるグリコシルトランスフェラーゼの発現によって、これらの細胞によって発現された脂質及びタンパク質の新規なグリコシル化を生じ得る。
【００５９】
ナイセリアオリゴサッカライドに対する抗体、及びそれによる診断及び治療
このオリゴサッカライドがワクチンに使用できると同様に、このオリゴサッカライドは、それに対する抗体を産生させるのに使用することができる。この抗体は、次いで、細菌の特定の株の検定や、受動免疫に使用することができる。抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリーが含まれるが、これらに限定されるものではない。この技術分野における公知の各種方法を使用して、オリゴサッカライドに対するポリクローナル抗体を産生することができる。抗体の産生には、各種の宿主動物をオリゴサッカライドによる注射により免疫することができる。動物には、うさぎや、マウス、ラット、羊、山羊等が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
一つの態様においては、オリゴサッカライドを免疫原性のキャリア、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）や、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等に結合してもよい。各種アジュバントを使用して、宿主動物種によるが、免疫応答を増加させることができる。オリゴサッカライドに対するモノクローナル抗体、そのフラグメントや、アナログ、若しくは誘導体の調製には、培養中の連続細胞系統による抗体分子を提供する各種方法を使用することができる。これらの方法には、ケーラー及びミルシュタインにより初めに開発されたハイブリドーマ技術（1975，Nature 256:495-497）や、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら、1983，Immunology Today 4:72)、及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術(Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R．Liss.，pp.77-96)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
本発明の追加の態様においては、最近の技術を利用して、無菌動物中にモノクローナル抗体を産生させることができる（PCT/US90/02545）。本発明に従えば、ヒト抗体を使用することができるし、このヒト抗体は、ヒトハイブリドーマを使用して（Coteら、1983，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．80:2026-2030）、又はインビトロでヒトＢ細胞をＥＢＶウィルスによって形質転換する(Coleら、1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R．Liss.，pp.77-96)ことによって得ることができる。事実、本発明によれば、「キメラ抗体」の産生に対して開発された技術（オリゴサッカライドに特異的なマウス抗体分子からの遺伝子を適当な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子とともにスプライシングすることによる(Morrison ら、1984，J．Bacterol．159-870; Neuberger ら、1984，Nature 312:604-608; Takedaら、1985，Nature 314:452-454)）を使用することができる。
【００６２】
この抗体は、本発明の範囲に含まれる。このようなヒト又はヒト化キメラ抗体は、これらの抗体が外因性抗体に比べて遥に免疫応答、特に、それ自身がアレルギー応答を誘導するものではないので、ヒトの病気の治療に使用するのに好ましい。本発明によれば、単鎖抗体の生産について記述された技術(米国特許第4,946,778号明細書)を適用して、オリゴサッカライド特異的単鎖抗体を産生することができる。本発明の更に別の態様では、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に関して記載された技術(Huseら、1989，Science 246:1275-1281)を使用してオリゴサッカライドに対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメント、若しくはその誘導体、若しくはアナログを迅速にかつ容易に特定することができる。
【００６３】
抗体分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、公知の技術によって産生することができる。例えば、かかるフラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって形成することができるF(ab')2フラグメントや、F(ab')2のジスルフィド架橋を還元することによって形成することのできるＦａｂ’フラグメント、及び抗体分子をパパイン及び還元剤によって処理することによって形成することのできるＦａｂフラグメントが含まれるが、これらに限定されるものではない。
抗体の産生には、公知の技術、例えば、ラジオイムノアッセイ(ELISA)(enzyme-linked immunosorbant assay)や、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散プレシピチン反応（gel diffusion precipitin reaction)、イムノ拡散アッセイ、現場イムノアッセイ(in situ immunoassay)（コロイド金、酵素又は放射線同位体標識を例えば使用するもの）、ウェスターンブロット、プレシピテーション反応、凝集分析（例えば、ゲル凝集分析、ヘモアグルチネーション分析）、相補的固定分析、免疫蛍光分析、プロテインＡ分析、及び免疫電気泳動分析等、によって所望の抗体のスクリーニングを行うことができる。
【００６４】
一つの態様においては、抗体の結合は、一次抗体上の標識を検出することによって検知する。別の態様では、一次抗体は、二次抗体又は試薬の一次抗体への結合を検知することによって検出する。更に別の態様では、二次抗体を標識する。この分野では、免疫分析における結合の検出には、多くの技術が公知であり、本発明の範囲に含まれる。例えば、特定のオリゴサッカライドを認識する抗体を選択するためには、そのようなエピトープを含有するオリゴサッカライドと結合する物質に対して形成したハイブリドーマを分析することができる。特定の種又は株のナイセリアからのオリゴサッカライドに特異的な抗体を選択するためには、その種又は株により発現され、単離されたオリゴサッカライドとの正の結合に基づいて選択することができる。
上記抗体は、オリゴ糖の局在及び活性に関するこの技術分野で公知の方法、例えば、ウエスタンブロッティング、その場での(in situ)オリゴ糖の画像形成、適当な生理学的試料中のそれらの濃度の測定、に利用できる。
【００６５】
グラム陽性菌の感染の診断は、所望の、この技術分野で公知の免疫アッセイフォーマットを使用することができる。これらの抗体はインビトロで検出するために、例えば、酵素、蛍光物質、発色物質、ラジオアイソトープ、染料、金コロイド、ラテックス粒子、及び化学発光物質等の標識物質で標識することができる。
また、これらの抗体はインビボで検出するために、例えば、ラジオアイソトープ（好ましくはテクネチウム又はヨウ素）、磁気共鳴シフト試薬（例えば、ガドリニウム及びマンガン）、又は放射線不透過性試薬で標識することができる。
【００６６】
また、本発明の核酸及びその配列は、ナイセリア(Neisseria)感染の診断、特に、特定の株の同定、又はどのグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子が変異しているかを決定するのに使用することができる。例えば、lgt 遺伝子又はそのハイブリダイズできる断片は、ナイセリア菌感染の恐れのある患者からの試料とのin situ ハイブリダイゼーションに使用することができる。他の実施態様において、本発明のlgt 遺伝子に基づくプローブを用いたＰＣＲ増幅法を利用して、ナイセリアの特定の遺伝子セグメントを同定することができる。
本発明の一局面において、プローブ又はＰＣＲプライマーとのハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件で、又は、特定の株又は限られた数の細菌の株に特異的な配列、又は両者を用いて行うことができ、これによって、特定の株（又は複数の株）による感染の診断が可能になる。また、ハイブリダイゼーションは、よりストリンジェントでない条件で行うことができ、又は、配列は細菌の任意の株又は全ての株において一致することがあり、これによって、その種の感染の診断が可能になる。本発明は、構成及び手法の詳細を示す以下の例示的な記述からより良く理解されるであろう。
【００６７】
実施例
この実施例は、５つの遺伝子を有するナイセリアゴノロエアエ（gonorrhoeae）株Ｆ62の遺伝子座を説明する。これら遺伝子の４つは、ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→４を、内部コア領域の基質Ｇｌｃβ１→４Ｈｅｐ→Ｒに逐次付加する（ヤマサキら、1991、Biochemistry 30:10566）。５番目の遺伝子は、別のＬＯＳ構造Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→４Ｈｅｐ→Ｒの生合成において、α結合したガラクトース残基の付加に関与している（ジョンら、1991、J．Biol．Chem．266:19303）。ＤＮＡ配列分析により、第１、第３及び第４リーディングフレームが、ポリ−Ｇ域を含むことが分かった。これらは、株Ｆ62において、それぞれ、17、10及び11bpである。従って、ＬＯＳ生合成酵素の３つは、淋菌 pilＣ遺伝子について報告されているように、リーディングフレームの変化による早まった停止を受ける恐れがある（ジョンソンら、1991、EMBO J．10:477; ルデルら、1992，Molec．Microbiol．6:3439）。これらの構造的な特徴は、淋菌ＬＯＳの頻繁な遺伝的変化の原因となっているものと思われる(シュナイダーら、1988，Infect．Immun．56:942)。
【００６８】
材料と方法
試薬及び化学薬品：殆どの化学薬品は、シグマケミカル社（セントスルイス，ＭＯ）から入手した。制限酵素は、ニューイングランドバイオラボ（ビバリー，ＭＡ）から購入した。
培地及び生育条件：大腸菌株は、固体又は液体ＬＢ培地(サンブルックら,1989，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー)で生育させた。抗生物質を適宜加えた。カルベニシリンを５０μg/ml及びエリスロマイシンを２００μg/ml使用した。ナイセリアゴノロエアエ株Ｆ62をＧＣ寒天培地(スワンソン，1978，Infect．Immun．19:320)又は２μg/mlのエリスロマイシンを含むＧＣ寒天培地で生育させた。ＬＯＳ又はゲノムＤＮＡの単離のため、淋菌を１．５％プロテオースペプトンブロス（ディフコラボラトリーズ、デトロイトＭＩ）、３０mMリン酸塩、８．５mMＮａＣｌ、１％イソビタレックス（ベクトンディッキンソンマイクロバイオロジーシステムズ、コッキースビル、ＭＤ）中で生育させた。
【００６９】
組換えＤＮＡ法：プラスミドは、キアゲン（Qiagen）社(チャッツワース、ＣＡ)から入手したキアゲンカラム又はＱＩＡプレプスピンカラムを用いて精製した。
制限酵素による消化、ゲル電気泳動、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによるライゲーション及び大腸菌の形質転換は、サンブルックら（Sambrook et al.，1989,コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー）に従って行った。サザンハイブリダイゼーションは、アマーシャム社（アーリントンハイツ、ＩＬ）のＥＣＬキットを用いて標識ＤＮＡにより、ハイボンドＮ＋メンブランアマーシャム社上で行った。ゲノムＤＮＡは、モクソンら（Moxon et al．1984，J．Clin．Invest．73:298）に記載されたように単離した。
【００７０】
Neisseria gonorrhoeae（淋菌）株Ｆ６２ゲノムＤＮＡの遺伝子バンクは、Sau3A での不完全な消化により得られた約２０ｋｂフラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化したλ２００１（Karnら、Gene 32:217(1984)）に結合させることにより構築した。ファージライブラリーを、ランダム−プライマー−標識したプラスミドｐＲ１０ＰＩとのハイブリダイゼーションによりスクリーニングし、５つのクローンをプラーク精製(plaque purification)により単離した。これらのクローンからのファージを、ＣｓＣｌにおける沈降及びその後の浮上(DavisらのCold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1980))により精製し、ＤＮＡを単離した。これらのクローンの１つから、4.9及び3.4ｋｂの２つのＣｌａＩフラグメントを、ゲル電気泳動及びＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩ(BIO 101 Inc.，La Jolla．CA.)による回収により単離した。これらを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ(La Jolla．CA.)からのＣｌａＩ切断ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫに結合し、それぞれをｐ４９００及びｐ３４００と名付けた。ｐ４９００は、インサート(insert)にＰｓｔＩ部位を含み、かつ2.1及び2.8ｋｂのインサートを含む２つのクローンに細分された。2.8ｋｂのインサートを含むクローンはｐＰｓｔＣｌａと名付けた。ｐ３４００のインサート及びｐＰｓｔＣｌａは、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＩＩ（United States Biochemical Co.，Cleveland．OH）を用いた鎖停止方法(chain termination method)(Sanger ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74:5463(1977))により配列決定した。図２に示した全ての配列は、両方向に完成(complete)させた。
【００７１】
図６に示した挿入及び欠失(deletion)は、次のように行った。Ｉ１、Ｉ３、△１及び△２では、それぞれ、ＢｓａＢＩ、ＡｓｃＩ、ＳｔｙＩで切断及びＳｔｙＩ及びＢｓａＢＩで二重切断(double cut)したプラスミドｐＰｓｔＣｌａを用いた。１２及び△３では、ＡｇｅＩ又はＳｔｙＩで切断したプラスミドｐ３４００用いた。完全な遺伝子座は、ｐ３４００からのＣｌａＩ−ＡｐａＩフラグメントを、ＣｌａＩ及びＡｐａＩで切断したｐＰｓｔＣｌａにクローニングすることにより組み立て、そのプラスミドをｐＬＯＳ５と名付けた。欠失△４及び△５は、ｐＬＯＳ５を用い、ＳｔｙＩとＢｂｓＩでの消化又はＳｔｙＩのみでの消化で構築した。全てのケース（ＢｓａＢＩでの消化を除く）において、切断されたプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理して、末端を平滑にし、かつｅｒｍＣ’（エリスロマイシン耐性マーカー）を挿入した。ｅｒｍＣ’遺伝子を、プラスミドｐＩＭ１３(Projan らのJ．Bacteriol．169:5131(1987))から、ＣｌａＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメントとして単離し、かつプラスミドｐＨＳＳ６(SeifertらのProc．Natl．Acad．Sci．USA 83:735(1986))中の同一部位にクローニングした。このプラスミドから、それをＮｏｔＩフラグメントとして切開(excise)し、その末端を、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントでの処理により平滑にし、ゲル電気泳動及びＧｅｎｅｃｌｅａｎ ＩＩでの回収により精製した。
【００７２】
ピリエート化された(piliated)Neisseria gonorrhoeae株Ｆ６２の形質転換は、Ｅ．ｃｏｌｉ(KlugmanらのInfect．Immun．57:2066(1989))から単離したプラスミド、及びエリスロマイシン２μｇ／ｍｌを含むＧＣ寒天培地(SwansonのInfect．Immun．19:320(1978))において選択された形質転換体(transformant)を用いて行った。各淋菌形質転換体のゲノム交換の適合度は、ＰＣＲ技術を用いて、それらのゲノムＤＮＡにおけるｅｒｍＣ’遺伝子の上流及び下流ジャンクションをシークエンスすること(sequencing)により確かめた。２つのビオチン化した(biotinylated)プライマー、GCCGAGAAAACTATTGGTGGA(配列番号９)及びAAAACATGCAGGAATTGACGAT（配列番号10）を合成し：これらのそれぞれを、その上流及びその下流末端の付近のｅｒｍＣ’配列のベースとした。プライマーは、それらの3'末端がｅｒｍＣ’遺伝子から外側に向くように設計した。これらの各プライマーは、推定挿入(putative insertion)付近のＬＯＳ遺伝子座の配列に適合する適切なプライマーとともに使用した。ＰＣＲは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ(Branchburg，NJ)からのＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔの使用説明書に従って、25サイクルで行った。全てのケースにおいて、予期したサイズのプロダクトが得られた。これらのプロダクトのＤＮＡ配列は、ＰＣＲプロダクトを、Ｄｙｎａｌ社(Lake Success，NY)からのマグネティックストレプタビジンビーズ(magnetic streptavidin beads)において精製すること、及びＨｕｌｔｍａｎらにより開発された方法(HultmanらのNucleic Acids Res.17:4937(1989))をベースとして、Ｄｙｎａｌ社のプロトコールに従ってＳｅｑｕｅｎａｓｅ ＩＩキットを用いてシークエンシングすることにより決定した。配列を、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ社(Madison，WI)のＧＣＧパッケージのコンピュータープログラムにより分析した。
【００７３】
免疫学的方法
モノクローナル抗体１７−１−Ｌ１（Ｌ１）、９−２−Ｌ３７８（Ｌ３）、２−１−Ｌ８（Ｌ８）を、ろ過した腹水流体(ascites fluid)として得た。抗体１−１-Ｍを、腹水流体として得て、また、３Ｆ１１及び４Ｃ４を、組織培養の上層として得た。ＬＯＳを、各淋菌変異体から、熱フェノール−水方法(WestphalとJannのAcademic Press，New York 83-91(1965))により抽出し、かつJohnstonらのJ．Exp．Med．143:741(1976))の記載のように精製した。ＬＯＳを、Towbinら(Towbin らのProc．Natl．Acad．Sci．USA 76:4350(1979))により記載されたウェスタンブロットバッファーに２００μｇ／ｍｌとなるように希釈し、かつアリコート1.5μｌを、ブロッティングバッファーに浸透させた３ＭＭ Ｗｈａｔｍａｎろ紙上にあったＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ(Bedford，MA)からのＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜上にスポット(spot)した。スポットを、２分間にわたって膜に吸収させ、ストリップ(strip)を、ブロッキングバッファー中に少なくとも60分間置いた。ブロッキングバッファーは、１５０ｍＭのＮａＣｌ、10ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ、pH 7.5、５ｍＭのＭｇＣｌ2、0.02％のＮａＮ2に溶解したゼラチン３％からなっていた。ストリップを、１％のゼラチンを含む同一バッファー中において３回洗浄した。ストリップを、ブロッキングバッファーに希釈したモノクローナル抗体を用いて２時間処理した。腹水流体として入手可能な抗体を、１／１０００に希釈し、組織培養の上層として入手可能な抗体を１／１０に希釈した。ストリップを洗浄し、６０分間、Ｃａｐｐｅｌ(Organon Teknika Co.，West Chester，PA)からのホスファターゼ結合抗ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ（１／１０００希釈）を用いてインキュベートし、先に記載したように(BlakeらのAnalyt．Blochem．136:175(1984))、洗浄し染色した。
【００７４】
ゲル電気泳動
ＬＯＳ試料のゲル電気泳動は、Ｌｅｓｓｅら(LesseらのJ．Immunol．Meth．126:109(1990))に記載されたように行い、ゲルを銀染色した(HitchcockとBrownのJ．Bacteriol．154-269(1983))。
結果
LOS 遺伝子座のクローニング：淋菌(Neisseria gonorrhoeae)のポリン(porin)遺伝子を単離する試みの中で、コロニーブロットで、精製ポリンに対する兎の抗血清と反応した4.9kb ClaIフラグメントを含むpBR322クローンが、繰り返し単離された。免疫反応性サブクローン、即ち、1305bp RsaI-ClaIフラグメントから成るpR10PIが、誘導され、そのDNA 配列が決定された。この配列は、その種のLPS合成に関与することが知られている、ヘモフィラスインフルエンザ(Haemophilus influenzae)、所謂lex-1(Cope et al.，1991，Molec．Microbiol．5:1113)、又はlic2A(High et al.，1993，Molec．Microbiol．9:1275)から単離された遺伝子に対して相同性を有していた。プローブとしてサブクローンpR10PIを使用して、ClaIで消化した、淋菌ゲノムDNA のサザーンブロットは、２つのフラグメント、4.9及び3.4kbとのハイブリダイゼーションを示した。然しながら、その他の制限酵素での消化は、単一バンドのみを与えた。注目すべきことに、BfaIでの消化は、4.1kb の単一バンドのみを与え、２つのコピーが近接して結合している事を示唆している（データは示されていない）。
【００７５】
淋菌株F62DNAのλ2001バンクは、pR10PIとのハイブリダイゼーションによってスクリーニングされ、５つのクローンが単離された。それらのクローンの内の１つは、ClaI又はBfaIで消化し、プローブとしてpR10PIを使用したサザーンハイブリダイゼーションで試験した時に、ゲノムDNA と見られるものと同一のパターンを与えた。このλ2001クローンの適当なClaIフラグメントが単離され、pBluescript II SK-のClaI部位にクローニングされた。3400 ClaI フラグメントの全体配列が決定された。4900 bp ClaIフラグメントを含むクローンの地図化は、一端から約2.8 kbのクローン中に、単一PstI部位が存在し、２つのサブクローンに分割できる事を示した。2.1kb サブクローンの末端の部分配列は、glycyl-tRNA シンセターゼ(glyS)のαサブユニットの大腸菌COOH- 末端部と、この遺伝子のβサブユニットの大部分とに相同なコードフレームを含んでいる事を示した(Webster et al.，1983，J．Biol．Chem．258:10637)。大腸菌配列に適合する必要があるＤＮＡの予測した長さが存在した。このクローンは、更に試験はしなかった。
【００７６】
LOS 遺伝子座のDNA 配列：２つのクローンを配列分析することによって見出された特徴の纏めを、図２に示す。glyS遺伝子に続いて、５つの近接配置されたオープンリーディングフレームが見出された。最後のフレームは、停止コドンの46bp下流に、rho 独立末端シグナルに典型的な配列を有する。続いて、IS1106ナイセリア挿入配列に対して顕著な相同性を有する約１００bpの領域が存在する(Knight et al.，1992，Molec．Microbiol．6:1565)。以下に提示される、この遺伝子座の性質の更なる説明は、５つのオープンリーディングフレームが、LOS グリコシルトランスフェラーゼ(ＬＯＳ glycosyl transferase)をコードし、それ故に、それらはが、lgtA-lgtE と命名されたことを示す。
【００７７】
この遺伝子座内の内部相同の調査は、最初の２つの遺伝子(lgtA、lgtB)をコードするDNA は、第４及び第５遺伝子(lgtD、lgtE)として繰り返され、挿入されるものが、付加的オープンリーディングフレーム、lgtCである事を示した。この事は、lgtBと、lgtC遺伝子の小部分を含むpR10PIプローブが、２つのClaIフラグメントとハイブリダイズするが、唯一のBfaIフラグメント（図２のLOS 遺伝子座のBfaIの部分を参照）とのみハイブリダイズするという、先に示したサザンハイブリダイゼーションにより得られたデータと一致している。更に詳細には、tRNAシンセターゼ(glyS)の停止コドンに続く16bpは、コンセンサスリボソーム結合部位(rbs)が直ぐ後に続く幹ループ構造(stem loop structure)の開始点であり、6bp 内に、lgtAの開始コドンであると考えられるTTG がある。幹ループ(lgtC の停止コドンが直ぐに続く)の開始点から2871bp下流には、約500bp に対して極めて相同な下流配列を伴う、幹ループ構造、rbs 及びlgtDのTTG 開始コドンの殆ど完全な繰り返しが存在する。次いで、この配列は、或る程度変動する。然しながら、lgtB及びlgtEの開始点においては、相同は、約200 塩基に対して再度、殆ど完全なものとなり、次いでorf の後の部分に向かって変動する。この相同性タンパク質の類似性は図３及び４に示される。これらの比較は、分子のＮ−末端部分で一次構造がほぼ完全に保存され、タンパク質のＣＯＯＨ末端に向かって、変動が増加することを示す。
【００７８】
遺伝子座の繰り返し部分の間に挿入されるlgtC配列は、遺伝子座内では、或いは淋菌ゲノムでは繰り返されない(データは示されない)。これは、コアLPS の生合成において、グルコシルトランスフェラーゼとして働く、極めて近い関係にある遺伝子である大腸菌rfaI又はrfaJ遺伝子に相同であるように思われる(Pradel et al.，1992，J．Bacteriol．174:4736)。rfaIとlgtCの類似性は図５に示される。
それらのコードフレーム内に含まれるこれら遺伝子の３つは、グリシンの伸長をコードするグアノシンを動かす(runs of)事が分かった（図２参照）。これらのポリ−Ｇ領域は、lgtA(17bp)、lgtC(10bp)及びlgtD(11bp)において見出され、それぞれの場合、G 残基の数は、完全なリーディングフレームを維持する数であった（図３及び５参照）。３つの遺伝子のそれぞれにおいて、１又は２Ｇ塩基の変化は、転写の早すぎる終結の原因となる。
【００７９】
LOS 遺伝子座の欠失による淋菌F62 のLOS 表現型：lgt 遺伝子の機能を決定する為に、LOS 遺伝子座の挿入又は欠失が、大腸菌で増殖したプラスミドで構築された。それぞれのケースにおける挿入又は欠失が、淋菌において優れた選択的マーカーであるermC′遺伝子でマークされた(Klugman et al.，1989，Infect．Immun．57:2066)。この構築はBsaBI、AgeI及びAscI部位のそれぞれの中へのermC′遺伝子の挿入を示す、図６、Ｉ１、Ｉ２及びＩ３に纏められている。同様に、欠失は、プラスミドの一部を切取り、エリスロマイシンマーカーで置換する事によって構築された。白の矢印は、議論される遺伝子を示す。これらのプラスミドのそれぞれは、淋菌株F62 を形質転換する為に使用され、形質転換体は、エリスロマイシン含有プレート上で選択された。淋菌形質転換体のそれぞれのプロトタイプのゲノム変動の忠実度は、ermC′遺伝子の上流と下流の結合点を、配列分析する事によって検証された。この報告での命名法を簡単にする為に、淋菌変異体は、図６のプラスミド構築体を同定するのに使用したのと同じ名前が与えられた。
【００８０】
突然変異体のLOS をSDS-PAGEにより調べて、菌株1291e のLOS と比較した。この菌株は、デュダス（Dudas）及びアピセラ（Apicella）により（デュダス及びアピセラ、Infect．Immun.、56巻、499 頁（1988年））、菌株1291野生型のピオシン耐性突然変異体として初めて単離され、化学的、遺伝学的に広範に特性解析されているものである。化学分析により、この突然変異体がヘプトース１上のラクト-N- ネオテトラオース置換を完全に欠くことが示されている(ジョン（John）ら、J．Biol．Chem.、266 巻、19303 頁（1991年））。この突然変異体の遺伝的ベースは特定されており（ゾウ（Zhou）ら、J．Biol．Chem.、269 巻、11162 頁（1994年）、サンドリン（Sandlin）及びシュタイン（Stein）、J．Bacteriol．、176 巻、2930頁（1994年））、これはホスホグルコムターゼについてコードするpgm 遺伝子の突然変異である。この突然変異はUDP-グルコースの合成を阻害し、それによりグルコースのヘプトースへの付加を阻害する。図７に示されているように、親野生型F62 菌株は２つの主なLOS バンドをもたらしたが、それらの外観は従来他の研究者らにより発表されたSDS-PAGEパターン（シュナイダー(Schneider)ら、Amer．Soc．Microbiology、ワシントン、400 〜405 頁（1985年））から区別できない。突然変異体が含有する主なバンドのサイズに従って、突然変異体をゲル上に配列した。このサイズは、F62 wt LOSの最高バンドからΔ４又は１２のLOS のサイズまで、４個の明確な段階で減少する。１２突然変異体（遺伝子座中の最終遺伝子であるlgtEへの挿入を伴う）が、Δ４（遺伝子座が完全に欠失している）と同一の表現型を有することから、lgtE生成物は最初の生合成工程を行うことが示唆される。従って、lgtA-Dによりコードされる酵素は、完全なものではあるが、作用すべき基質を有しない。突然変異体Δ５（lgtEを除く遺伝子座が欠失）は、１段階大きなLOS をもたらし、このことはこの遺伝子が最初の生合成工程に寄与するという考え方を支持する。ラクト-N- ネオテトラオース鎖中の最初の残基であるグルコースに付加できないことが知られている菌株1291e のLOS に比べて、１２及びΔ４突然変異体のLOS はともに明らかに大きいことに留意すべきである。これらのデータから、ラクト-N- ネオテトラオースの最初のガラクトースに付加するガラクトシル基転移酵素を、lgtEがコードすることが示唆される。
【００８１】
更に、ドットブロット手法を用いて、LOS 試料をそのモノクローナル抗体との反応性に関して調べた。使用したモノクローナル抗体及びその報告されている特異性を、図１に示す。親菌株及び突然変異体から得られたLOS について観察された反応を、図８にまとめた。親F62 と1-1-M、3F11及びL8との反応性は、従来マンドレル（Mandrell）ら（マンドレルら、Amer．Soc．Microbiology、ワシントン、379〜384 頁（1985年））、及びヤマサキ（Yamasaki）ら（ヤマサキら、Mol．Immunol．、28巻、1233頁（1991年））により報告されている通りであった。
【００８２】
突然変異体Δ４及びＩ２は、いずれの抗体とも反応しなかった。しかしながら、Δ５は抗体C4C 及びL8と強く反応し、このことは最初のガラクトース残基が存在することを示している。このことはSDS-PAGEによる結果（図６参照）と一致し、lgtEのガラクトシル基転移酵素としての役割を支持するものである。このことはまた、lgtEの上流での欠失があっても、極性効果によりその機能は著しくは不活性化されないことを示している。F62 wt親のLOS は、L3との強い反応性を有し、3F11との弱い反応性を有していた。3F11の反応性が、GalNAc残基の付加により閉塞されることが知られている（シュナイダーら、J．Exp．Med.、174 巻、1601頁）が、L3抗体の場合にはこれとは異なっていた。wt LOSは、末端GalNAc残基存在する場合に反応性を有する抗体である1-1-M と反応した。1-1-M との反応性は、lgtDにおいてのみ欠失を有するΔ３においては失われていた。このことから、この遺伝子がGalNAc基転移酵素をコードすることが示唆される。
【００８３】
抗体L1（α１→4Galでキャップされた代替LOS 構造に特異的）との反応性は、wt LOSでは認められず、11及びlgtCに影響を及ぼす全ての欠失においては存在しなかった。該反応性は、lgtAの欠失のみを有するΔ１において最も強かった。この突然変異体はまた、3F11及びL3との反応性を有しないことに留意すべきである。これら２つの発見から、lgtAがGlcNAc基転移酵素についてコードし、この残基が付加されない場合には、代替LOS 構造を生成するlgtCの作用についての基質はこの不完全鎖であることが示唆される。図７に見られるLOS 生成物のサイズが、免疫学的データと一致することに留意すべきである。この結果から、lgtCがα-Gal基転移酵素をコードすることが示唆される。このことは更に、突然変異体Δ３の抗体L1との弱い反応性によっても支持されている。突然変異体Δ３はlgtDの欠失を有し、末端GalNAcに付加することができず、α-Gal基転移酵素がラクト-N- ネオテトラオース基を修飾してPi類似のグロボシドを生成することが可能となる（マンドレル、Infect．Immun.、60巻、3017頁（1992年））。突然変異体13（不活性なlgtBをともなう）は1-1-M、3F11及びL1との反応性を喪失しており、L3との弱い反応性のみが残っていた。生成物のサイズとともに、これらの観察結果から、Gal β１→４をGlcNAc残基に付加するガラクトシル基転移酵素を、lgtBがコードすることが示唆される。ヒマレクチンRCA-I は、β連鎖中の末端ガラクトースについて特異的であり（ニコルソン（Nicolson）及びブラウシュタイン（Blaustein）、Biochim．Biophys．Acta、266 巻、543 頁（1972年）、リン（Lin）及びリー（Li）、Eur．J．Biochem.、105 巻、453 頁（1980年））、LOS 試料上のこの構造の存在を確認するためにこれを使用した。ELISA 試験を用いて、野生型、Δ３、Δ２及びΔ５ LOSが、末端βGal を有すると考えられ、レクチンに結合したのに対し（図７参照）、Δ４、I2、Δ１及びI3は非反応性であった（データは示さなかった）。
【００８４】
検討
５個のオープンリーディングフレームを含有する遺伝子座をクローンした。この遺伝子座内の特定された８種の突然変異体の、淋菌の形質転換体により生成されたLOS のサイズ及び血清学的反応性への影響から、これらの遺伝子が、ラクト-N- ネオテトラオース鎖の大部分の生合成を司るグリコシル基転移酵素であることが示唆される。得られたデータから、これらの遺伝子の各々の機能を特定することが可能である。構造的に非常に深く関係するlgtBとlgtEがまた、各々Galβ１→４をGlcNAcあるいはGlc に付加するという明らかに非常に類似した生合成についての働きをするという点に着目すべきである。同様に、深く関係するlgtAとlgtDは、GlcNAcあるいはGlcNAcβ１→３を、各々Gal 残基に付加する。遺伝子座中の他の遺伝子と無関係なlgtCは、Gal α１→４の付加を司る。
【００８５】
DNA 配列から、遺伝子のうち３種類（lgtA、lgtC及びlgtD）が、タンパク質中のグリシン残基についてコードするグアノシンの領域を含有することが示された。これらは、該遺伝子の発現の高頻度の変異についての潜在的な機構を付与する。このようなポリ−Ｇ領域中のずれ（Slippage）が、淋菌pilC遺伝子の発現を制御し、その結果としてヒト上皮細胞への細毛の接着性に影響することについては、十分に報告されている（ルーデル(Rudel)ら、Molec．Microbiol．、６巻、3439頁（1992年））。菌株F62 において、３種のポリ−Ｇ領域のそれぞれにおける塩基数は、タンパク質がフレーム中にあるようなものであり、このことは、末端GalNAcの付加を含む完全LOS を生成するF62 野生型の能力と一致する。
【００８６】
ＬＯＳ生合成の３つの局面は、もしかすると高頻度変異に左右されているようである。その第１は末端 GalNAc(lgtD)の付加である。これは、モノクローナル抗体 1-1-Mとの反応性の変化を起こし、このフェーズ変異(phase variation)はヴァン パテン(Van Putten，1993,EMBO J．12:4043)により報告されている。同様に、lgtAの変化は、成長鎖へのGlcNAcの付加の失敗を起こし、ＬＯＳをβ- ラクトシル レベルに短くする。これは3.6キロダルトン分子で、淋菌におけるＬＯＳの極通常の形態であり、通常のヒト血清の殺菌効果への抵抗を与えている(シュナイダー(Schneider)ら、1985，Infect．Immun．50:672)。β−ラクトシル鎖から完全ＬＯＳへの MS11mkの変異体ＡとＣの間のin vitro変異（健常者でin vivo において選択的な利点を有していた）が、GlcNAcトランスフェラーゼlgtAの機能的発現の回復により説明できると推測してみることができる。最終的に、β−ラクトシル(pk−様グロボトリオース)又はラクト-N- ネオテトラオースグループ(Pi−様グロボシド)のいずれかへのα１→4Gal の変異性の付加（マンドレル(Mandrell)，1992，Infect．Innun．60:3017）は、lgtCの発現の制御下にあるであろう。lgtCトランスフェラーゼの活性は、前駆体のために他のトランスフェラーゼと競合するのに劣り、lgtA又はlgtDのいずれかが活動していないときにのみ、その活性が明らかである。合成される Galα１→4Galβ１→ 4Glc トリサッカライドのために、GlcNAcトランスフェラーゼlgtAは不活性であるべきで、Pi−様グロボシド Galα１→4Galβ１→4GlcNAc β１→3Galβ１→4Glcの発現のために GalNAc トランスフェラーゼlgtDは休止していていなければならない。
【００８７】
ハエモフィラス  インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)ＬＯＳの匹敵する高頻度抗原性変異もまた注目され、２種の分離した遺伝子座であるlicl（ウェイサー(Weiser)ら、1989，Cell 59:657)及びlic2（ハイ(High)ら，1993，Molec．Microbiol．9:1275）におけるＣＡＡＴの繰り返しの数におけるシフトによって引き起こされる翻訳フレームの変化に帰する。lic2遺伝子の発現を可能とするシフトは、構造 Galα１→4Galβ１→を有するエピトープの発現と相関している。lic2遺伝子はlgtB及びlgtEと相同であり、ガラクトシルトランスフェラーゼは Galβ１→４でそれぞれ Glc又はGlcNAcと結合し、これはハエモフィラス インフルエンザエＬＯＳ合成におけるその機能のようである。これら両者の粘膜病原菌はフレームシフトメカニズムを発展させてＬＯＳの抗原性変異を引き起こし、一方lic2の淋菌の相同体（lgtB及びlgtE）はポリ−G トラクトを含まないものであることは注目すべきである。
【００８８】
上記のように述べられたフレーム−シフトメカニズムは、遺伝子発現のオン／オフ調節に適している一方、その遺伝子座の構造はまた、遺伝子発現のレベルのより緻密な調節に加わる。成長速度が分子量分布及びＬＯＳ種が作る抗原特性に影響することが実証されている（モース(Morse）ら，1983，Infect．Immun．41:74）。ＲＮＡ転写物のサイズを測定していないが、lgtA、lgtB及びlgtC（例えばポリ−Ｇトラクトがそのコーディングフレームが維持されるような場合）が一緒に転写されているようである。lgtAの末端コドン及びlgtBの開始コドンは実際重複していて、lgtBのＴＡＡとlgtCのＡＴＧの間の距離はたった１１塩基対である。同様に、lgtDの終止コドンとlgtEの開始コドンはたった１８塩基対しか離れていない。この機構が、フェーズ変異にされされる３つの遺伝子のいずれかがオフ配置であるならば、転写は次の遺伝子の始めから有効に再び開始することができる。転写を再開始するこの能力は、この実験において構築される突然変異体で明らかに判る。
【００８９】
ＬＯＳの構造と機能との相関関係は未だその初期の段階である。この分野における大きな進展は、その分子構造、及び多くのよく特徴付けられたモノクローナル抗体との反応性に関連することがしばしば明らかな能力の理解の進展である。これに加えて、CMP-NANAを提供するin vivo 環境において、合成されるＬＯＳがコンピテントな受容体構造かどうかによって、生物がＬＯＳをシアリル化する(sialylate)か又はしないという現実がある。多くの菌株においてシアリル化(sialylation)が血清−抵抗状態を誘導することがよく知られている。しかしながら、局所感染におけるシアル化の効果は、よく研究されていない。ヴァン パテンはＬＯＳのシアリル化が、接着を明らかに大きく変化させることなく上皮細胞侵入への顕著な阻害効果を有することを示した(ヴァン パテン，1993，EMBO J．12:4043)。彼の研究は粘膜感染において、シアリル化され得ないＬＯＳ構造が効率の良い細胞侵入にとって重要であろうことを示唆している。この報告のコンテクストによれば、このような構造は、末端GalNAcの効率的な付加又はGlcNAcトランスフェラーゼを休止させることでＬＯＳ鎖を短くすることのいずれかによって達成することができる。ＬＯＳ化学と生物学的反応との相関関係は、ピオシン選別によって単離される実在のＬＯＳ突然変異体の漏れによって複雑になる（デューダス(Dudas)及びアピセラ(Apicella)，1988，Infect．Immun．56:499;サンドリン(Sandlin)ら、1993，Infect．Immun．61:3360）。これは実際、突然変異体1291e で例示され、大きな低分子量のバンドに加えて、付加的なより高いバンドを示す（図７参照）。淋菌ＬＯＳの生合成に関する遺伝的特徴へ供されるその新しい洞察は、漏れない突然変異体の構築を可能にするであろう。例えばΔ４及びΔ５はポリ−Ｇトラクトを伴う遺伝子をもはや含まないので安定な突然変異体である。ポリ−Ｇトラクトを含む遺伝子の発現は、グリシンを他のコドンでエンコードするように領域を設計することによって安定化されるであろう。
【００９０】
本発明は、ここに記載される特定の実施態様により、その範囲が限定されるものではない。なぜなら、そのような実施態様は本発明の一局面の単純な説明として意図され、機能的に同等の任意の実施態様は本発明の範囲内にあるからである。実際、ここで示され述べられたものに加えて本発明の多様な変形が、先にした記載及び添付する図面から当業者にとって明らかになるであろう。そのような変形は、添付する請求の範囲の範疇に入ることを意図する。また、ヌクレオチドに与えられるすべての塩基対のサイズは概算であって、記述の目的のために使用されると解される。種々の参照文献がここに引用され、それらの開示はここに全体的に参照として組み込まれている。
【００９１】
本発明の実施態様を以下に示す。
１．適度なストリンジェント条件下で、図２（配列表の配列番号１）に示されているヌクレオチド配列に対応する、又は相補的なヌクレオチド配列を有する核酸に対し、ハイブリダイズできる精製された核酸。
２．適度なストリンジェント条件下で、機能的に活性なグリコシルトランスフェラーゼをコードする図２（配列表の配列番号１）に示されているヌクレオチド配列の一部に対応する、又は相補的なヌクレオチド配列を有する核酸に対し、ハイブリダイズできる、上記１記載の核酸。
３．機能的に活性なグリコシルトランスフェラーゼをコードする上記２記載の核酸。
４．機能的に活性なグリコシルトランスフェラーゼをコードする図２（配列表の配列番号１）に示されているヌクレオチド配列の一部に対応する、又は相補的なヌクレオチド配列を有する上記１記載の核酸。
【００９２】
５．機能的に活性なグリコシルトランスフェラーゼをコードする上記４記載の核酸。
６．図２（配列表の配列番号の配列番号１）に示されているヌクレオチド配列に対応する、又は相補的なヌクレオチド配列を有する上記１記載の核酸。
７．前記機能的に活性なグリコシルトランスフェラーゼが、下記a)〜c)からなる群から選ばれた反応を触媒する上記３記載の核酸： a) Galβ1 →4 をGlcNAc又はGlc に付加する；
b) GalNAc 又はGlcNAcβ1 →3 をGal に付加する；及び c) Galα1 →4 をGal に付加する。
８．配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼをコードする上記３記載の核酸。
９．配列表の配列番号８のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼをコードする上記３記載の核酸。
10．配列表の配列番号４のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼをコードする上記３記載の核酸。
11．配列表の配列番号５のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼをコードする上記３記載の核酸。
12．配列表の配列番号６のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼをコードする上記３記載の核酸。
13．発現制御配列と機能的に結合している上記３記載の核酸を含む発現ベクター。
14．上記13記載の発現ベクターで形質転換された組換え宿主細胞。
15．下記工程を含むグリコシルトランスフェラーゼの製造方法： a) グリコシルトランスフェラーゼの発現を許容する条件下で上記14記載の組換え宿主細胞を培養する工程；及び b) 発現されたグリコシルトランスフェラーゼを回収する工程。
【００９３】
16．配列表の配列番号３のアミノ酸配列、又はその機能的に活性なフラグメントを有するグリコシルトランスフェラーゼ。
17．配列表の配列番号８のアミノ酸配列、又はその機能的に活性なフラグメントを有するグリコシルトランスフェラーゼ。
18．配列表の配列番号４のアミノ酸配列、又はその機能的に活性なフラグメントを有するグリコシルトランスフェラーゼ。
19．配列表の配列番号５のアミノ酸配列、又はその機能的に活性なフラグメントを有するグリコシルトランスフェラーゼ。
20．配列表の配列番号６のアミノ酸配列、又はその機能的に活性なフラグメントを有するグリコシルトランスフェラーゼ。
21．固相支持体に結合したグリコシルトランスフェラーゼを含む組成物であって、該グリコシルトランスフェラーゼが下記a)〜e)からなる群から選ばれたものである組成物：
a) 配列表の配列番号３のアミノ酸配列、又はその機能的に活性なフラグメントを有するグリコシルトランスフェラーゼ；
b) 配列表の配列番号８のアミノ酸配列、又はその機能的に活性なフラグメントを有するグリコシルトランスフェラーゼ；
c) 配列表の配列番号４のアミノ酸配列、又はその機能的に活性なフラグメントを有するグリコシルトランスフェラーゼ；
d) 配列表の配列番号５のアミノ酸配列、又はその機能的に活性なフラグメントを有するグリコシルトランスフェラーゼ；及び e) 配列表の配列番号６のアミノ酸配列、又はその機能的に活性なフラグメントを有するグリコシルトランスフェラーゼ。
【００９４】
22．GalNAc又はGlcNAcβ1 →3 をGal に付加する方法であって、上記16記載のグリコシルトランスフェラーゼの存在下でGal 残基を含む受容体成分に、活性化されたGalNAc又はGlcNAcを含む反応混合物を接触させることを含む方法。
23．Gal β1 →4 をGlcNAc又はGlc に付加する方法であって、上記17記載のグリコシルトランスフェラーゼの存在下でGlcNAc又はGlc 残基を含む受容体成分に、活性化されたGal を含む反応混合物を接触させることを含む方法。
24．Gal α１→4 をGal に付加する方法であって、上記18記載のグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、Gal残基を含む受容体成分に、活性化されたGalを含む反応混合物を接触させることを含む方法。
25．GalNAc又はGlcNAcβ1 →3 をGal に付加する方法であって、上記19記載のグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、Gal 残基を含む受容体成分に、活性化されたGalNAc又はGlcNAcを含む反応混合物を接触させることを含む方法。
26．Gal β1 →4 をGlcNAc又はGlc に付加する方法であって、上記20記載のグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、GlcNAc又はGlc 残基を含む受容体成分に、活性化されたGal を含む反応混合物を接触させることを含む方法。
【００９５】
27．下記工程を連続的に実施することを含む、構造Gal α1 → 4Gal β1 →4Glcを有するオリゴ糖類を製造する方法：
a) 配列表の配列番号６のアミノ酸配列、又はその機能的に活性なフラグメントを有するグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、Glc 残基を含む受容体成分に、活性されたGal を含む反応混合物を接触させる工程；及び
b) 配列表の配列番号４のアミノ酸配列、又はその機能的に活性なフラグメントを有するグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、Gal β1 →4Glc残基を含む受容体成分に、活性化されたGal を含む反応混合物を接触させる工程。
28．構造Gal β1 →4 Glc を有するオリゴ糖類を製造する方法であって、上記20記載のグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、Glc 残基を含む受容体成分に、活性化されたGal を含む反応混合物を接触させることを含む方法。
29．構造GlcNAcβ1 →3Galβ1 →4Glcを有するオリゴ糖類を製造する方法であって、上記16記載のグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、Gal β1 →4Glc残基を含む受容体成分に、活性化されたGalNAcを含む反応混合物を接触させることを含む方法。
30．構造Gal β1 →4GlcNAc β1 →3Galβ1 →4Glcを有するオリゴ糖類を製造する方法であって、上記17記載のグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、GlcNAcβ1 →3Galβ1 →4Glc残基を含む受容体成分に、活性化されたGal を含む反応混合物を接触させることを含む方法。
31．構造GalNAcβ1 →3Galβ1 →4GlcNAc β1 →3Galβ1 →4Glcを有するオリゴ糖類を製造する方法であって、上記19記載のグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、Gal β1 →4GlcNAc β1 →3Galβ1 →4Glc残基を含む受容体成分に、活性化されたGalNAcを含む反応混合物を接触させることを含む方法。
【００９６】
32．下記工程を連続的に実施することを含む、構造GalNAcβ1 →3Galβ1 →4GlcNAc β1 →3Galβ1 →4Glcを有するオリゴ糖類を製造する方法：
a) 配列表の配列番号６のアミノ酸配列、又はその機能的に活性なフラグメントを有するグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、Glc 残基を含む受容体成分に、活性化されたGal を含む反応混合物を接触させる工程；
b) 配列表の配列番号３のアミノ酸配列、又はその機能的に活性なフラグメントを有するグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、Gal β1 →4Glc残基を含む受容体成分に、活性化されたGlcNAcを含む反応混合物を接触させる工程；
c) 配列表の配列番号８のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、GlcNAcβ1 →3Galβ1 →4Glc残基を含む受容体成分に、活性化されたGal を含む反応混合物を接触させる工程；及び d) 配列表の配列番号５のアミノ酸配列、又はその機能的に活性なフラグメントを有するグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、Gal β1 →4GlcNAc β1 →3Galβ1 →4Glc残基を含む受容体成分に、活性化されたGalNAcを含む反応混合物を接触させる工程。
【００９７】
33．下記工程を連続的に実施することを含む、構造Gal β1 →4GlcNAc β1 →3Galβ1 →4Glcを有するオリゴ糖類を製造する方法：
a) 配列表の配列番号６のアミノ酸配列、又はその機能的に活性なフラグメントを有するグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、Glc 残基を含む受容体成分に、活性化されたGal を含む反応混合物を接触させる工程；
b) 配列表の配列番号３のアミノ酸配列、又はその機能的に活性なフラグメントを有するグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、Gal β1 →4Glc残基を含む受容体部分に、活性化されたGlcNAcを含む反応混合物を接触させる工程；及び
c) 配列表の配列番号８のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、GlcNAcβ1 →3Galβ1 →4Glc残基を含む受容体成分に、活性化されたGal を含む反応混合物を接触させる工程。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】淋菌LOS 中に見られる交互構造。R1は２つのケト−デオキシ−オクツロソン酸(KDO)残基からなるLOS の内部コア領域を意味する。これらは、順に脂質Ａ構造に付着される。淋菌中のR2は、典型的にはGlcNAcβ1 →2Hepα1 →3 である。上部の図の構造は、パラグロボシド糖脂質中に見出されるラクト-N- ネオテトラオースと同等の四糖を含む。多くの菌株において、この四糖は末端GalNAcβ1 →3 をもつ。下方の図は、結合した末端 Galα1 →4 を有する交互三糖構造を示す。この三糖はL1血清型の髄膜炎菌および幾つかの淋菌菌株中に見出される。  本研究で使用したモノクローナル抗体により識別される、これら２つの構造の部分が示され、これらは(4C4)(デュダス＆アピセラ(Dudas and Apicella)，Infect．Immun.，1988，56:499)、3F11（マンドレル(Mandrell)等，J．Ex．Med.，1988，168:107; ヤマサキ(Yamasaki)等，Mol．Immunol.，1991，28:1233）、1-1-M(ヤマサキ(Yamasaki)等，Mol．Immunol.，1991，28:1233)、2-1-L8(Kerwood)等，Biochemistry，1992，31:12760; シュナイダー(Schneider)等，J．Ex．Med.，1991，174:1601; シュナイダー(Schneider)等，Infect．Immun.，1985，50:672)、9-2-L378および17-1-L1 である。
【図２Ａ】２ＡはDNA 配列に基づく、LOS 遺伝子座の遺伝子マップ。配列情報bp 1-2725 はプラスミドpPstCla から得たものであり、bp 2725-5859はプラスミドp3400(材料および方法の項を参照のこと)由来のものである。ISは、以前に報告されたナイセリア挿入配列IS1106に対する相同性をもつ配列の領域を意味する(ナイト(Knight)等，Molec．Microbiol.，1992，6:1565)。lgtA-Eの読み取り枠の位置が示されている。ポリ-Gの３つの広がりがlgtA(17bp)、lgtC(10bp)およびlgtD(11bp)に見られ、かつこれらは垂直の黒い棒によって示されている。
【図２Ｂ】２ＢはLgtA(SEQ ID NO:3)のアミノ酸配列。
【図２Ｃ】２ＣはLgtB(SEQ ID NO:8)のアミノ酸配列。
【図２Ｄ】２ＤはLgtC(SEQ ID NO:4)のアミノ酸配列。
【図２Ｅ】２ＥはLgtD(SEQ ID NO:5)のアミノ酸配列。
【図２Ｆ】２ＦはLgtE(SEQ ID NO:6)のアミノ酸配列。
【図２Ｇ】２Ｇはlgt 遺伝子座(SEQ ID NO:1)の核酸配列。
【図２Ｈ】２Ｈはlgt 遺伝子座(SEQ ID NO:1)の核酸配列。
【図２Ｉ】２Ｉはlgt 遺伝子座(SEQ ID NO:1)の核酸配列。
【図２Ｊ】２Ｊはlgt 遺伝子座(SEQ ID NO:1)の核酸配列。
【図２Ｋ】２Ｋはlgt 遺伝子座(SEQ ID NO:1)の核酸配列。
【図２Ｌ】２Ｌはlgt 遺伝子座(SEQ ID NO:1)の核酸配列。
【図２Ｍ】２Ｍはlgt 遺伝子座(SEQ ID NO:1)の核酸配列。
【図３Ａ】３Ａは、lgtAおよびlgtDのタンパク生成物の相同性。２種のタンパクの一次構造は、特に配列の初めの半分において極めて類似している。位置86で開始するグリシン残基は、各遺伝子中のポリ-G領域のコード化を反映している。該GCG パッケージのベストフィット(Bestfit)プログラムが使用され、シンボル(--),(・・),(・）は、デイホフ(Dayhoff)PAM-250 マトリックスに基づく類似性の程度を表している。
【図３Ｂ】３Ｂは、lgtAおよびlgtDのタンパク生成物の相同性。２種のタンパクの一次構造は、特に配列の初めの半分において極めて類似している。位置86で開始するグリシン残基は、各遺伝子中のポリ-G領域のコード化を反映している。該GCG パッケージのベストフィット(Bestfit)プログラムが使用され、シンボル(--),(・・),(・）は、デイホフ(Dayhoff)PAM-250 マトリックスに基づく類似性の程度を表している。
【図４Ａ】４Ａは、lgtBおよびlgtEのタンパク生成物の相同性。２種のタンパクの一次構造は、特に配列の初めの半分において極めて類似している。これら配列は、またヘモフィルスインフルエンザエ(Haemophilus influenzae)の、lex-1(コープ(Cope)等，Molec．Microbiol.，1991，5:1113)またはlic2A(ハイ(High)等，Molec．Microbiol.，1993，9:1275)の遺伝子に対して、かなりの相同性をも有している。シンボルの意味については、図３を参照のこと。
【図４Ｂ】４Ｂは、lgtBおよびlgtEのタンパク生成物の相同性。２種のタンパクの一次構造は、特に配列の初めの半分において極めて類似している。これら配列は、またヘモフィルスインフルエンザエ(Haemophilus influenzae)の、lex-1(コープ(Cope)等，Molec．Microbiol.，1991，5:1113)またはlic2A(ハイ(High)等，Molec．Microbiol.，1993，9:1275)の遺伝子に対して、かなりの相同性をも有している。シンボルの意味については、図３を参照のこと。
【図５Ａ】５Ａは、rfaIおよびlgtCのタンパク生成物の相同性。E.コリのrfaIおよびrfaI遺伝子は、極めて密接に関連している。これらはLPS コア領域の２つのグルコース残基のグリコシルトランスフェラーゼとして機能する（プラデル(Pradel)等，J．Bacteriol.，1992，174:4736)。lgtCの位置54-56 におけるグリシンは、該ポリ-Gの広がりによってコードされる。シンボルの意味については、図３を参照のこと。
【図５Ｂ】５Ｂは、rfaIおよびlgtCのタンパク生成物の相同性。E.コリのrfaIおよびrfaI遺伝子は、極めて密接に関連している。これらはLPS コア領域の２つのグルコース残基のグリコシルトランスフェラーゼとして機能する（プラデル(Pradel)等，J．Bacteriol.，1992，174:4736)。lgtCの位置54-56 におけるグリシンは、該ポリ-Gの広がりによってコードされる。シンボルの意味については、図３を参照のこと。
【図６】LOS 遺伝子座における欠失。LOS 遺伝子座の３つの挿入および５つの欠失は、以下の方法に関する部分に詳述するようにして構築した。使用した制限サイトが示されている。挿入は三角で示され、欠失の程度は点描のボックスで示した。白抜きの矢印は、この構築により崩壊させた読み取り枠を示す。構築物各々において、エリスロマイシンマーカーermC'を該挿入または欠失サイトに挿入した。
【図７】LOS 調製物の銀−染色SDS-PAGE。材料および方法の項に記載するようにして、精製したLOS サンプル375 ngのゲル電気泳動を実施し、かつ染色した。ゲル上方に、該調製物各々の中に存在すると推定される主バンドをもつ、該LOS の構造を示す。これらの構造は、図８に示したモノクローナル抗体との反応性に基づくものであるが、該図には観測されたパターンの説明を簡単化するように示されている。Ｒは内部コア領域および脂質Ａを表す。1291e はピオシン耐性変異体である（デュダス＆アピセラ(Dudas and Apicella)，Infect．Immun.，1988，56:499）。
【図８】菌株F62 wtおよび変異体由来のLOS とモノクローナル抗体との反応性。モノクローナル抗体を以下のように略称した: 17-1-L1(L1)、9-2-L378(L3)、2-1-L8(L8)。精製したLOS を、インモビロン(Immobilon)-P 膜に適用し、抗体と反応させ、かつ材料および方法の項に記載するように展開させた。該モノクローナル抗体の特異性は、図１にまとめた。
【図１】
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【図２Ａ】
2005296022.tif 000003
【図２Ｂ】
2005296022.tif 000004
【図２Ｃ】
2005296022.tif 000005
【図２Ｄ】
2005296022.tif 000006
【図２Ｅ】
2005296022.tif 000007
【図２Ｆ】
2005296022.tif 000008
【図２Ｇ】
2005296022.tif 000009
【図２Ｈ】
2005296022.tif 000010
【図２Ｉ】
2005296022.tif 000011
【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
2005296022.tif 000014
【図２Ｍ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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