(57)【要約】【課題】本発明は、関節炎患者の骨髄液中のCD34+細胞の異常を是正する骨髄液の再生方法を提供することを目的とする。【手段】以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含むことを特徴とする骨髄液の再生方法。  （ｉ）骨髄液からCD34+細胞を分離する工程  （ｉｉ）該CD34+細胞中のＮＦκＢ及び／又はＴＡＣＥのｍＲＮＡを不活化する工程  【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含むことを特徴とする骨髄液の再生方法。
（ｉ）骨髄液からCD34+細胞を分離する工程
（ｉｉ）該CD34+細胞中のNFκB及び／又はTACEのmRNAを不活化する工程
【請求項２】
NFκB及び／又はTACEのmRNAを不活化する工程が、NFκB又はTACEのsiRNAをCD34+細胞内に導入する工程である、請求項１に記載の骨髄液の再生方法。
【請求項３】
骨髄液から得たCD34+細胞について抽出したRNAをもとにcDNAを作成し、該cDNAを用いたPCRにより、NFκB及び／又はTACEのmRNAのコピー数を測定する、関節炎の検査方法。
【請求項４】
NFκB及び／又はTACEのmRNAを不活化することにより行う関節炎の治療において、CD34+細胞内に導入されるべきNFκB及び／又はTACEのsiRNA。
【請求項５】
請求項４に記載のsiRNAを導入したCD34+細胞。
【請求項６】
請求項４に記載のsiRNAを導入したCD34+細胞を含む骨髄液。  
【請求項７】
NFκB及び／又はTACEのmRNAを不活化することを特徴とする関節炎の治療方法。
【請求項８】
関節炎が関節リウマチである請求項７に記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄液の再生方法に関する。より詳しくは、関節炎の原因となる特定遺伝子を不活化させることによって骨髄液を再生させる方法に関する。また、この再生方法で用いられるsiRNA、該siRNAを導入した細胞、骨髄液、又は関節炎の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ(以下、RAと略すことがある)は関節滑膜の増殖とそれに伴う骨関節の破壊をきたす原因不明の慢性の炎症性疾患である。関節滑膜を構成する主要な細胞はマクロファージ様のA型細胞と線維芽細胞様のB型細胞である。この両者ともにその起源は骨髄に存在することが明らかになっている。
【０００３】
RA骨髄細胞からのマクロファージ様細胞の産生が充進していること、RA骨髄CD34+細胞からの線維芽細胞様細胞の産生が充進していることなど、RAでは骨髄の異常が関与することが明らかになっている。
【０００４】
従来から行われているRAの治療は、主として薬物療法であり、これらは部分的には骨髄細胞の機能を調節する作用を有するものの、RAに見られる骨髄CD34+細胞の異常を是正するものではないため、根治療法とはならない（例えば、非特許文献１）。また、RAに対して用いられている自家骨髄移植は、RA患者自身の異常を有する骨髄CD34+細胞を用いており、根治に至らず再発例がかなり見られている（例えば、非特許文献２）。
【非特許文献１】江口勝美，内科医に必要なリウマチと骨・関節疾患の理解  III．新しい治療法の考え方．2．抗リウマチ薬  日内会誌  89: 2138-2145, 2000.
【非特許文献２】Tyndall A, EBMT/EULAR International data base.  Autologous  hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune disease with  special reference to rheumatoid arthritis.  J Rheumatol 28(Suppl.64): 5-7,  2001.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、関節炎患者の骨髄液中のCD34+細胞の異常を是正する骨髄液の再生方法を提供することを目的とする。また、特に関節リウマチ（RA）を根治に導く有効性および安全性が高い手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、斯かる実情に鑑み、RA骨髄中のCD34+細胞において、異常に発現の増加している遺伝子について鋭意研究した結果、NFκB(p50)とTNF-α convertase enzyme (以下、TACE ということがある)の遺伝子(mRNA)をいずれか一方、あるいは両者を不活化した場合に、RA骨髄細胞に見られていた異常が是正されるという知見を得た。これにより、患者骨髄中のCD34+細胞において、これらの遺伝子を不活化することがRAの治療法として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
【０００７】
（１）以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含むことを特徴とする骨髄液の再生方法。
（ｉ）骨髄液からCD34+細胞を分離する工程
（ｉｉ）該CD34+細胞中のNFκB及び／又はTACEのmRNAを不活性化する工程
（２）NFκB及び／又はTACEのmRNAを不活化する工程が、NFκB及び／又はTACEのsiRNAをCD34+細胞内に導入する工程である、上記（１）に記載の骨髄液の再生方法。
（３）骨髄液から得たCD34+細胞について抽出したRNAをもとにcDNAを作成し、該cDNAを用いたPCRにより、ＮＦκＢ及び／又はＴＡＣＥのｍＲＮＡのコピー数を測定する、関節炎の検査方法。
（４）NFκB及び／又はTACEのmRNAを不活化することにより行う関節炎の治療において、CD34+細胞内に導入されるべきNFκB及び／又はTACEのsiRNA。
（５）上記（４）に記載のsiRNA を導入したCD34+細胞。
（６）上記（４）に記載のsiRNA を導入したCD34+細胞を含む骨髄液。  
（７）NFκBあるいはTACEのmRNAを不活性化することを特徴とする関節炎の治療方法。
（８）関節炎が関節リウマチである上記（７）に記載の治療方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、関節炎を安全に、かつ、有効に根治に導くことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の骨髄液の再生方法は、関節炎の患者の骨髄CD34+細胞中のNFκB(p50)及び／又はTACEの遺伝子を不活化するものである。
NFκBとは、種々のサイトカイン、炎症性蛋白、表面抗原など多数の生理活性物質の遺伝子発現を調節する転写因子である。
TACEとは、ADAM17と呼ばれる酵素(マトリックスメタロプロテアーゼ)であり、TNFαやその他の細胞表面に発現する種々の蛋白の切断によるプロセッシングによってその生物学的活性を調節するものである。
これらは、RAの病態形成に何らかの形で関与することがこれまでも報告されてきたが、RA骨髄CD34+細胞でそれらのmRNAの発現の上昇していること、さらに、そのmRNAを不活化することでCD34+細胞の異常機能が是正されることは全く予測することが出来なかった。
【００１０】
本発明の骨髄液の再生方法に用いられる、NFκBおよびTACEの遺伝子(mRNA)の不活化方法としては、従来から用いられてきた方法で、NFκB(p50)の結合部位と同一の塩基配列を有するDNAオリゴヌクレオチドを用いてもよく、またNFκB(p50)およびTACEのmRNAを不活化するsiRNAを用いてもよい。
後者の場合既に市販されているものを用いるか、あるいは、既知の塩基配列より新たにデザインした21〜23塩基のsiRNAを単独もしくは混合して用いてもよい。
【００１１】
患者骨髄液からのCD34+細胞の分離は、既知の方法によって行うことができる。すなわち、市販キット(Histopaque;Sigma社製など)を用いて、骨髄液から比重遠心法により単核球を分離し、この単核球から市販の磁気ビーズキット(Dynal CD34 progenitor cells selection system; Dynal社製など)を用いてCD34陽性細胞(CD34+)を得ることができる。
【００１２】
DNAオリゴヌクレオチドあるいはsiRNAをCD34+細胞内に導入する方法としては、既知の市販のウィルスベクターを用いてもよいし、あるいは市販の非ウィルスベクター単独かエレクトロポレーション（Electroporation）とを組合わせた方法を用いてもよい。
【００１３】
本発明による関節炎の検査方法は、骨髄液から得たCD34+細胞について抽出したRNAをもとにcDNAを作成し、該cDNAを用いたPCRにより、NFκB及び／又はTACEのmRNAのコピー数を測定することにより行うことができる。
【００１４】
NFκBあるいはTACEのmRNAを不活化したCD34+細胞、あるいはNFκB(p50)の結合部位と同じ配列のDNAオリゴヌクレオチドを導入したCD34+細胞を用いての自家骨髄移植は既知の方法によって行うことができる。
【００１５】
本発明でいう、関節炎には、関節リウマチ（RA）の他に、変形性関節症（OA）も含まれる。
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【実施例１】
【００１６】
(1)CD34+細胞の分離
活動型関節リウマチ(RA)患者あるいは変形性関節症(OA)患者の骨髄検体から、市販キット(Histopaque; Sigma社製)を用いて、比重遠心法により単核球を分離した。分離した単核球から磁気ビーズ(Dynal CD34 progenitor cells selection system; Dynal社製)を用いてCD34+細胞を得た。分離回収した細胞は、CD34+細胞が約95%でCD19+B細胞は0.5%以下であった。また、正常人の骨髄CD34+細胞は市販のものを購入した。
【００１７】
(2) TACE、NFκB(p50)の定量的PCR
得られたCD34+細胞から市販キット(Trizol; Invitrogen社製)を用いてRNAを抽出し、同じく市販キット(SuperScripTMIII First-Strand Synthesis System for RT-PCR; Invitrogen社製)を用いてcDNAを作成した。このcDNAを用いて、β-actin、TACE、NFκB(p50)の各々について定量的PCRを行った。定量的PCRのプライマーは既知の遺伝子配列より設定した。定量的PCR（条件を表1に示す）は、日本ロッシュ社のLight Cyclerを用いて行った。結果を図1，２に示す。
【表１】
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【００１８】
（３）結果
図１より、RAおよびOAにおいては、いずれも健常人に比し骨髄CD34+細胞中のTACEのmRNAのコピー数が有意に上昇していた。なお、RAおよびOA間では有意差が認められなかったが、RA患者のほとんどが転写抑制効果のあるプレドニゾロンを内服していたことを考慮すると、RAでは実際はOAよりもTACE mRNAのコピー数が高い可能性が十分に考えられた。
【００１９】
図２より、RAにおいては、健常人に比し、骨髄CD34+細胞中のNFκB(p50)のmRNAのコピー数が有意に上昇していることが示された。しかし、OAにおいては、健常人との間には有意差はなかった。また、RAにおいては、OAに比し骨髄CD34+細胞中のNFκB(p50)のmRNAのコピー数が有意に上昇していた。
【実施例２】
【００２０】
（１）TACE mRNAの不活化
RA患者骨髄中のCD34+細胞を、24ウェル平底マイクロプレー(No.3524;Costar)に2.O×105/ウェルになるようにSCF(10ng/ml)とGM-CSF(1ng/ml)を添加した培地に調整し、24時間培養後Ambion社製のTransfectionキットを用いて、TACEのsiRNA(25nM)(SMARTpool; Dharmacon社製)を導入した後、SCF(10ng/m1)とGM-CSF(1ng/m1)とTNF-α(10ng/ml)を添加して３週間培養した後、形態学的変化を観察した。形態学的変化を表す写真を図３及び４に示す。
【００２１】
（２）結果
TACE mRNA をsiRNAにて不活化したCD34+細胞（図３）に比し、controlのsiRNAを導入したCD34+細胞（図４）は、有意に効率よく線維芽細胞様細胞へと分化した。また、これと平行して、TACE mRNA をsiRNAにて不活化した場合、培養上清中のMMP-1濃度も約50%に低下した。従って、RA骨髄CD34+細胞からのB型滑膜細胞類似の線維芽細胞様細胞への分化にはTACEのmRNA発現が重要な役割を果たすことが示された。
【実施例３】
【００２２】
（１）NFκB(p50) mRNA の不活化
NFκB(p50) mRNAのsiRNA(25nM)(SMARTpool;Dharmacon社製)を導入した以外は、実施例２と同様に行い、形態学的変化を観察した。形態学的変化を表す写真を図５及び６に示す。
（２）結果
NFκB(p50) mRNA をsiRNAにて不活化したCD34+細胞（図５）からは線維芽細胞様細胞は全く分化しなかったが、controlのsiRNAを導入したCD34+細胞（図６）は、効率よく線維芽細胞様細胞へと分化した。これより、RA骨髄CD34+細胞からのB型滑膜細胞類似の線維芽細胞様細胞への分化にはNFκB(p50)のmRNA発現が極めて重要な役割を果たすことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明のRAの治療手段は、RA骨髄CD34+細胞からのB型滑膜細胞様細胞(線維芽細胞様細胞)への分化を有意に抑制することから、関節リウマチを含む関節炎の根治療法として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】関節炎患者及び健常者における骨髄CD34+細胞中のTACEのmRNAのコピー数(β-actinのmRNAのコピー数に対する比)を表す図である。
【図２】関節炎患者及び健常者における骨髄CD34+細胞中のNFκB(p50)のmRNA(β-actinのmRNAのコピー数に対する比)のコピー数を表す図である。
【図３】TACE mRNAをsiRNAにて不活化したCD34+細胞をSCF+GM-CSF+TNF-αの存在下に3週間培養した後の写真である。
【図４】controlのsiRNAを導入したCD34+細胞をSCF+GM-CSF+TNF-αの存在下に3週間培養した後の写真である。
【図５】NFκB(p50) mRNAをsiRNAにて不活化したCD34+細胞をSCF+GM-CSF+TNF-αの存在下に3週間培養した後の写真である。
【図６】controlのsiRNAを導入したCD34+細胞をSCF+GM-CSF+TNF-αの存在下に3週間培養した後の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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