(57)【要約】    【課題】 人間の皮膚よりスーパーオキサイドを直接捕捉し、またその量を定量的に正確に測定する。        【解決手段】  チトクロムＣによりスーパーオキサイドを捕捉し、このスーパーオキサイドを捕捉したチトクロムＣよりスーパーオキサイドの量を測定する。またチトクロムＣを熱可塑性樹脂シートとガス透過性シートとよりなる袋状のものに封入した捕捉具で、ガス透過性シート側を人間の皮膚に貼って皮膚よりのスーパーオキサイドを直接チトクロムＣにて捕捉する。      【選択図】            図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
人間の皮膚より発するスーパーオキサイドをチトクロムＣにて捕捉し、この捕捉されたスーパーオキサイドを測定する方法。
【請求項２】
前記のスーパーオキサイドを捕捉したチトクロムＣ中のＦｅ3+およびＦｅ2+を計量し、その計量値とチトクロムＣ中の鉄含有量から捕捉前と捕捉後のその変化量よりスーパーオキサイドを測定するようにした請求項１の方法。
【請求項３】
前記のチトクロムＣ中のＦｅ3+およびＦｅ2+の量を可視吸収スペクトルをもとに測定するようにした請求項２の方法。
【請求項４】
可視吸収スペクトルの波長５３０ｎｍおよび５５０ｎｍでの吸光度を夫々Ａ（５３０）、Ａ（５５０）とする時、Ａ（５３０）／Ａ（５５０）の値によりスーパーオキサイドの量を計量するようにした請求項３の方法。    
【請求項５】
熱可塑性樹脂シートとガス透過性のシートを重ねて袋状として、内部にチトクロムＣを充填した皮膚より発するスーパーオキサイドを捕捉するための捕捉具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人間の生体防御作用や恒常性の維持と同時に老化現象特に肌あれのような皮膚の老化現象にも密接に関係のある活性酸素種のうちのスーパーオキサイドを非観血的に測定するためのもので、人間の皮膚から放出されるスーパーオキサイドを測定する方法に関するものである。
【０００２】
また、本発明は、前記測定方法にて用いられるスーパーオキサイドの捕捉具に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
人間の血液中に含まれる活性酸素種は、スーパーオキサイドの他にヒドロキシラジカル（・ＯＨ）、１重項酸素（1Ｏ2）、過酸化水素水（Ｈ2Ｏ2）の３種類が存在する。これら活性酸素種のうち、１重項酸素以外は、いずれも１秒以下の短時間で生成、消滅を繰り返す。しかも、これら活性酸素種の濃度は、１重項酸素を除いて、極めて低濃度である。
【０００４】
そのため、これら活性酸素種の測定には、比色法、電子スピン共鳴吸収法、化学発光法等の高感度測定法が適用される。特にスーパーオキサイドは、それ自体の測定が困難であるため、スーパーオキサイドを特異的に消去する酵素、スーパーオキサイドディスミューターゼ（ＳＯＤ）の活性により評価するのが一般的である。
【０００５】
本発明の発明者らは、このスーパーオキサイドが人間の皮膚からも発生することを確かめた。そして、この人間の皮膚から発生するスーパーオキサイドが人間の皮膚の老化や肌あれと関係があることをつきとめた。そして、人間の皮膚の老化や肌あれを防止するために、このスーパーオキサイド消去活性のための塗布剤を開発し特願２００３−８４４３８号として出願した。
【０００６】
この塗布剤は、スーパーオキサイド消去活性を有する天然薬物や化学薬品を含むものであり、前記特許出願にも記載されているような各種のものが知られている。しかし、これら薬物は、その種類によりスーパーオキサイド消去活性の程度が異なる。
【０００７】
また、皮膚より発生するスーパーオキサイドの量により、皮膚の老化度つまり肌あれの度合いが異なると考えられる。
【０００８】
そのため、人間の皮膚より発するスーパーオキサイドの量を正確に測定することにより、肌あれの度合いをより正確に推測し得る。更に肌あれの状態に応じ、前記塗布剤の種類や使用量を適切なものにし得る。
【０００９】
また、皮膚より発するスーパーオキサイドの量を正確に計量することによって、肌の状態を把握し、例えば肌あれ防止のために用いる化粧用クリームの種類等その使用方法を適切なものとすることが可能になる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、人間の皮膚から放出されるスーパーオキサイドを捕捉し、定量的に測定する方法を提供するものである。
【００１１】
また、本発明は、前記スーパーオキサイドを捕捉するための捕捉具を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の方法は、人間の皮膚より発するスーパーオキサイドを捕捉し測定するためのもので、前記スーパーオキサイドをチトクロムＣにより捕捉し、このチトクロムＣにより捕捉されたスーパーオキサイドの量を測定することにより、非観血的にしかも正確に測定することを特徴とする。
【００１３】
ここでチトクロムＣにより捕捉されたスーパーオキサイドを測定するために、本発明においては、チトクロムＣ中のＦｅ3+とＦｅ2+の変化量をもとに皮膚より発生したスーパーオキサイドの量を測定する。即ち、下記の反応を原理としてＦｅ3+とＦｅ2+の差をもとにスーパーオキサイドの量を測定する。
2005233618.tif 000003
【００１４】
ここでＳＯはスーパーオキサイドである。
【００１５】
具体的には、Ｆｅ3+とＦｅ2+の可視部吸収スペクトル（４００〜８００ｎｍ）におけるＦｅ3+とＦｅ2+の吸光度（５３０と５５０ｍｎの吸光度）Ａ（５３０）、Ａ（５５０）を求め、吸光度比Ａ（５３０）／Ａ（５５０）を算出する。
【００１６】
ここで、反応前（スーパーオキサイド捕捉前）のチトクロムＣの吸光度比Ａ（５３０）／Ａ（５５０）と、反応後のチトクロムＣの吸光度比Ａ（５３０）／Ａ（５５０）より、チトクロムＣ中のスーパーオキサイドの量（捕捉されたスーパーオキサイドの量）とチトクロムＣ中の鉄含有量から算出する。
【００１７】
また、本発明の捕捉具は、図４に示すように熱可塑性フィルムとガスを透過する紙とよりなり、その３辺３ａ，３ｂ，３ｃをヒートシールした袋にチトクロムＣを充填し、１辺３ｄをヒートシールしたものである。
【００１８】
この捕捉具をその紙の側を腕等に貼って皮膚より発するスーパーオキサイドを紙製のガス透過膜を透して捕捉する。
【００１９】
このように、本発明の捕捉具を用いることによって、皮膚より発するスーパーオキサイドを捕捉し得る。そして、捕捉したスーパーオキサイドの量を前記の本発明の方法により測定し得る。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の方法によれば、人間の皮膚より発するスーパーオキサイドの量をより直接計測できしかもより正確に計測できるという効果を有する。
【００２１】
また、本発明の捕捉具を用いれば、人間の皮膚の所定の範囲より発するスーパーオキサイドのほとんどすべてを直接捕捉でき、捕捉したスーパーオキサイドをもれなく正確に計測することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
次に本発明の実施の形態を示す。
【００２３】
本発明の方法で用いるスーパーオキサイドの捕捉具について述べる。
【００２４】
まず、酸化エチレンガス滅菌用包装材を約３５ｍｍ×３５ｍｍの大きさとしてその有効面積が３０ｍｍ×３０ｍｍとなるようにし、これにガス透過性のシート例えば、通気性を有する紙とにより、その３辺をヒートシールにて密封して袋状にする。この袋状物に前記ヒートシールにより密封した辺以外の開口側の１辺より約１ｍｇのチトクロムＣを充填してから残りの１辺を密封する。以上のようにして形成されたものが本発明の捕捉具である。
【００２５】
次に、前記のような構成の本発明のスーパーオキサイド捕捉具を用いての人間の皮膚表面より発するスーパーオキサイドの捕捉方法および捕捉したスーパーオキサイドの測定方法について述べる。
【００２６】
まず、前記の本発明の捕捉具をそのガス透過性を有する面を、人間の腕に当てて静置し、この捕捉具を皮膚科用粘着材にて密着固定する。
【００２７】
このようにして、被験者の皮膚に密着し固定した本発明の捕捉具を、そのまま一定時間例えば１時間保持する。そして一定時間経過後にこの捕捉具を回収する。
【００２８】
この回収された捕捉具に充填されたチトクロムＣを１０ｍｌの蒸留水に完全に溶解させて、その溶液の可視部吸収スペクトルを測定する。この測定に用いられる光の波長領域は、４００〜８００ｎｍである。
【００２９】
この測定により得られた吸収スペクトルの５３０ｎｍと５５０ｎｍの吸光度比Ａ（５３０）／Ａ（５５０）を求める。
【００３０】
尚、Ａ（５３０）は波長５３０ｎｍの吸光度、Ａ（５５０）は波長５５０ｎｍの吸光度を表わす。
【００３１】
これら特定波長の帰属は、５５０ｎｍがＦｅ2+であり、５３０ｎｍがＦｅ3+である。
【００３２】
また約１ｍｇの精秤したチトクロムＣを、同様に１０ｍｌの蒸留水に溶解してスペクトルを測定した。そしてこの測定結果を反応前の値とした。
【００３３】
ここで、この測定における原理を述べる。
【００３４】
通常、人間の血液中では、スーパーオキサイドは、次の反応様式で進行する。
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530nm         550nm
【００３５】
ここでスーパーオキサイドＳＯを捕捉するために用いられるチトクロムＣを３０％の過酸化水素水と０．１規定の硝酸水溶液で、その有機成分を完全に分解した後に、水を加えて１００ｍｌにして発光プラズマ分光分析法によりチトクロムＣ中の全鉄イオン濃度を測定した。その結果、鉄イオン濃度は、４．６３ｐｐｍであった。この濃度から、もとのチトクロムＣの鉄イオン濃度を算出した。また、測定前と測定後のこのチトクロムＣの濃度における可視領域における吸収スペクトルの吸光度比Ａ（５３０）／Ａ（５５０）を求め、これより、チトクロムＣ中のＦｅ3+とＦｅ2+の量を算出した。この反応前と反応後のＦｅ3+あるいはＦｅ2+の反応前と反応後の数値の差が、皮膚から放出されるスーパーオキサイド（ＳＯ）の量に対応する。
【００３６】
以上述べた本発明の方法を用いての実験結果を次に述べる。
【００３７】
測定は、健常被験者３３名（男性１６名、女性１７名）について行なった。即ち、被験者の左右のいずれかの上腕部に本発明の捕捉具を１時間、密着固定した。１時間後に捕捉具を回収して、前記のように夫々Ａ（５３０）／Ａ（５５０）の値を求め、これにもとづいて、被験者の皮膚の単位面積、単位時間当たりに放出されたスーパーオキサイドの量（ｇ／ｃｍ2・ｈｒ）を算出した。
【００３８】
以上の測定により算出した前記３３名の被験者のうち、１６名の男性の被験者の測定結果は、次の表に示す通りである。
【００３９】
吸光度
５３５ｎｍ      ５５０ｎｍ            Ｏ 2 −（ＳＯ）
（ｍｍ）        （ｍｍ）          （ｇ／ｃｍ2・ｈｒ）
ブランク    ５４．０          ７．０
１        ４６．０        １５．０          ６．６０３１×１０-8
２        ６０．０        １０．０          １．４１４９×１０-8
３        ６０．０        １９．０          ６．３３１４×１０-8
４        ５９．５        １３．０          ３．２５０３×１０-8
５        ４８．０          ８．０          １．４１４９×１０-8
６        ３２．０          ２．０        −２．８１６１×１０-8
７        ４０．０          ６．５          １．２６０２×１０-8
８        ４６．０        １３．０          ５．３１６０×１０-8
９        ４８．５        １５．０          ６．１１５６×１０-8
１０        ５０．０        １０．０          ２．６１３７×１０-8
１１        ４４．０        １１．０          ４．２９２０×１０-8
１２        ４０．０        １２．０          ５．８４１２×１０-8
１３        ６４．０        ２１．５          ６．８８３０×１０-8
１４        ５９．０        １３．０          ３．３１３０×１０-8
１５        ６３．５          ９．０          ４．７２４２×１０-9
１６        ６１．５        １３．０          ３．００７９×１０-8
また、前記測定データのうちの測定番号Ｎｏ．３，Ｎｏ．７の被験者の分光吸収特性、およびチトクロムＣのみの分光吸収特性を示すと、図１、２、３の通りである。尚、これら図において横軸は波長（ｍｍ）、縦軸は吸光度である。
【００４０】
この図および表のデータ中のＮｏ．３，Ｎｏ．７を比べ得るとわかるように、Ａ（５３０）／Ａ（５５０）の値の大小関係は次の通りである。
【００４１】
ブランク＞Ｎｏ．３＞Ｎｏ．７
この結果より、Ｎｏ．３の被験者よりＮｏ．７の被験者のスーパーオキサイドが大であることがわかる。
【００４２】
つまり、男性被験者１６名中のスーパーオキサイドの発生量の多いＮｏ．３の被験者と比較的少ないＮｏ．７の被験者との老化度等の実際の比較と一致している。
【００４３】
また、Ｎｏ．３の外、Ｎｏ．１，Ｎｏ．８，Ｎｏ．９，Ｎｏ．１２，Ｎｏ．１３の被験者は、いずれも皮膚表面よりのスーパーオキサイドの発生量の多いグループである。
【００４４】
逆に、Ｎｏ．２，Ｎｏ．５，Ｎｏ．１０，Ｎｏ．１５等の被験者は、Ｎｏ．７と同様に皮膚表面より発生するスーパーオキサイドの発生量が少ないことがデータからわかる。
【００４５】
実際上、前者のグループの被験者に比べて、後者のグループの被験者は、いずれも肌の状態がより良好である。
【００４６】
以上の被験者は、男性、女性共に健康な人である。そしてこの被験者の測定結果から皮膚より発するスーパーオキサイドが１０-8〜１０-9ｇ／ｃｍ2・ｈｒの範囲内の人は、健康であることが明らかになった。また、前述のように、健康な被験者の中でも、スーパーオキサイドの発生量が比較的大であるグループは、小であるグループよりも健康状態が若干劣ることもわかった。
【００４７】
尚、Ｎｏ．６の被験者のスーパーオキサイドの発生量はマイナスである。これは、測定中の被験者の汗によるもので、不適切なデータである。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の測定方法によれば、人間の皮膚より発するスーパーオキサイドの量を比較的正確に測定することができ、したがってその測定値を利用することにより、被験者の肌荒れ等の皮膚の状態を正確に計測できる。そしてこれをもとに化粧用クリーム等の適切な使用が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】測定番号３の被験者の分光吸収特性
【図２】測定番号７の被験者の分光吸収特性
【図３】チトクロムＣのみの分光吸収特性
【図４】本発明の捕集具の一例を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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