(57)【要約】【課題】  実験小動物を始めとする哺乳類の細胞、筋肉等の生体組織、あるいは、心臓、肝臓等の各種臓器を生きたままの状態で、比較的長期間にわたって観察することを可能とする。【解決手段】  光源２と、該光源２から発せられた光を試料Ａ上に集光させる対物光学系３２を備えた対物ユニット３と、試料Ａから発せられ、対物光学系３２を通過した光を結像させる結像光学系６と、対物ユニット３を着脱可能に取り付ける顕微鏡本体９とを備え、対物光学系３２が、試料Ａに近接、接触させられる先端に配置された細径先端光学系２０を備え、対物ユニット３が、該対物ユニット３を顕微鏡本体９に取り付ける胴付き位置Ｃに設けられた取付ネジ１７と、細径先端光学系２０を覆う外筒２１とを備え、外筒２１の外径寸法をＤｆ、取付ネジ１７の外径寸法をＤａとして、Ｄｆ／Ｄａ≦０．３の条件を満足する顕微鏡システム１を提供する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、該光源から発せられた光を試料上に集光させる対物光学系を備えた対物ユニットと、試料から発せられ、対物光学系を通過した光を結像させる結像光学系と、該結像光学系を収納し、前記対物ユニットを着脱可能に取り付ける顕微鏡本体とを備え、
前記対物光学系が、試料に近接あるいは接触させられる先端に配置された細径先端光学系を備え、
前記対物ユニットが、該対物ユニットを顕微鏡本体に取り付ける胴付き位置に設けられた取付ネジと、前記細径先端光学系を覆う外筒とを備え、
該外筒の外径寸法をＤｆ、取付ネジの外径寸法をＤａとして、以下の条件式（１）を満足することを特徴とする顕微鏡システム。
Ｄｆ／Ｄａ≦０．３                          …（１）
【請求項２】
前記対物光学系が、前記細径先端光学系により、試料における物体像からの光を結像して形成した中間像の光を略平行にするリレー光学系を備えている請求項１に記載の顕微鏡システム。
【請求項３】
前記リレー光学系と前記細径先端光学系とを、前記中間像近傍において着脱自在に接続する接続機構を備えることを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡システム。
【請求項４】
前記接続機構が、前記リレー光学系と前記細径先端光学系とを、それらの軸線回りの任意の相対回転角度で相互に固定可能であることを特徴とする請求項３に記載の顕微鏡システム。
【請求項５】
前記細径先端光学系が、光軸方向に間隔を空けて複数の中間像を結像する延長光学系を備えることを特徴とする請求項２から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡システム。
【請求項６】
前記延長光学系が、着脱可能であることを特徴とする請求項５に記載の顕微鏡システム。
【請求項７】
前記顕微鏡本体を試料に対して任意の姿勢および位置に調節可能な姿勢調節機構を備えることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡システム。
【請求項８】
前記光源が、レーザ光源からなり、
該光源からの励起光を試料面上に走査させる光走査手段と、
該光走査手段と前記結像光学系との間に配置され、前記対物光学系の後側焦点位置を前記光走査手段の近傍に投影する瞳投影光学系と、
該瞳投影光学系を通過した光を集光するコリメート光学系と、
該コリメート光学系により集光された光を検出する光検出器とを備えることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡システム。
【請求項９】
前記光源および前記光検出器と、前記コリメート光学系との間が光ファイバにより光学的に接続されていることを特徴とする請求項８に記載の顕微鏡システム。
【請求項１０】
前記対物光学系の胴付き位置と前記中間像の位置との光軸に沿う距離をＬｍ、前記胴付き位置と前記対物光学系の後側焦点位置の結像光学系および瞳投影光学系による共役位置との光軸に沿う距離をＬｐとして、以下の条件式（２）を満足することを特徴とする請求項８または請求項９に記載の顕微鏡システム。
０．１５≦Ｌｍ／Ｌｐ≦０．５                …（２）
【請求項１１】
前記対物光学系の胴付き位置と前記中間像の位置との光軸に沿う距離をＬｍ、
前記結像光学系による結像位置と前記中間像の位置との光軸に沿う距離をＬｔｌとして、以下の条件式（３）を満足することを特徴とする請求項８または請求項９に記載の顕微鏡システム。
０．１５≦Ｌｍ／Ｌｔｌ≦０．５              …（３）
【請求項１２】
顕微鏡本体に着脱可能に取り付ける取付ネジを胴付き位置に備え、
試料に近接あるいは接触させられる先端に配置された細径先端光学系を備え、
該細径先端光学系を覆う外筒の外径寸法をＤｆ、前記取付ネジの外径寸法をＤａとして、以下の条件式（１）を満足することを特徴とする対物ユニット。
Ｄｆ／Ｄａ≦０．３                          …（１）
【請求項１３】
前記細径先端光学系により、試料における物体像からの光を結像して形成した中間像の光を略平行にするリレー光学系を備えている請求項１２に記載の対物ユニット。
【請求項１４】
前記リレー光学系と前記細径先端光学系とを組み合わせた対物光学系の像側焦点位置が、前記胴付き位置から物体側に４０ｍｍ以内の位置に配置されていることを特徴とする請求項１３に記載の対物ユニット。
【請求項１５】
前記リレー光学系と前記細径先端光学系とを、前記中間像近傍において着脱自在に接続する接続機構を備えることを特徴とする請求項１４に記載の対物ユニット。
【請求項１６】
前記接続機構が、前記リレー光学系と前記細径先端光学系とを、それらの軸線回りの任意の相対回転角度で相互に固定可能であることを特徴とする請求項１５に記載の対物ユニット。
【請求項１７】
前記細径先端光学系が、光軸方向に間隔をあけて複数の中間像を結像する延長光学系を備えることを特徴とする請求項１４から請求項１６のいずれかに記載の対物ユニット。
【請求項１８】
前記延長光学系が、相互に着脱可能な複数のリレー光学系ユニットからなることを特徴とする請求項１７に記載の対物ユニット。
【請求項１９】
前記延長光学系が、ＧＲＩＮレンズからなることを特徴とする請求項１７に記載の対物ユニット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、細胞の機能の解明やイメージング等のアプリケーションに用いられる顕微鏡システムおよび対物ユニットに関し、特に、動物を生きたままで観察するのに好適な顕微鏡システムおよび対物ユニットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体等の試料にその表面から励起光を照射して、試料の所定の深さ位置から発せられる蛍光を選択的に検出することにより、細胞の機能等を観察する装置として、レーザ走査型共焦点顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１、２参照）。
このレーザ走査型共焦点蛍光顕微鏡は、顕微鏡の一般的な観察に加えて試料の微小スポット領域に集光させたレーザ光をガルバノミラーなどの走査手段によって走査し、試料から発せられる蛍光を検出し画像を得るものである。
このレーザ走査型共焦点顕微鏡は、解像力に優れ、観察する微小スポット以外の光を除去できるので、高いＳ／Ｎ比で鮮明な観察画像を得ることができるという利点を備えている。
【特許文献１】特開平３−８７８０４号公報（第２頁等）
【特許文献２】特開平５−７２４８１号公報（図１等）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来のレーザ走査型共焦点顕微鏡を始めとする顕微鏡は、ラットやマウス等の実験小動物の各種臓器を生きたままの状態（in vivo）で観察することについては想定していない。すなわち、これら実験小動物の各種臓器を観察するには、表皮や筋肉組織を切開し、あるいは、頭蓋骨に穿孔して内部の臓器を露出させる必要があるが、観察部位に近接配置される対物レンズのサイズが実験小動物に比較して大きいために、内部の臓器を観察する場合には、表皮や筋肉組織等を大きく切開し、あるいは、大きな孔を開ける必要がある。
【０００４】
この場合、組織の切開直後あるいは穿孔直後における観察は可能であるものの、実験小動物に大きなダメージを与えてしまうため、長期間にわたる経時的な観察は困難である。観察後縫合し、次の観察時に再度切開する方法も考えられるが、実験小動物に与えるダメージを考えると、時間が経過するにつれて正常な状態での観察は困難になるという不都合がある。
【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、実験小動物を始めとする哺乳類の細胞、筋肉等の生体組織、あるいは、心臓、肝臓等の各種臓器を生きたままの状態で、比較的長期間にわたって観察することを可能とする顕微鏡システムおよび対物ユニットを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、光源と、該光源から発せられた光を試料上に集光させる対物光学系を備えた対物ユニットと、試料から発せられ、対物光学系を通過した光を結像させる結像光学系と、該結像光学系を収納し、前記対物ユニットを着脱可能に取り付ける顕微鏡本体とを備え、前記対物光学系が、試料に近接あるいは接触させられる先端に配置された細径先端光学系を備え、前記対物ユニットが、該対物ユニットを顕微鏡本体に取り付ける胴付き位置に設けられた取付ネジと、前記細径先端光学系を覆う外筒とを備え、該外筒の外径寸法をＤｆ、取付ネジの外径寸法をＤａとして、以下の条件式（１）を満足する顕微鏡システムを提供する。
Ｄｆ／Ｄａ≦０．３                          …（１）
【０００７】
この発明によれば、対物ユニットの先端に備えられた外径寸法の小さい細径先端光学系を観察対象である試料に近接あるいは接触させるので、観察対象が実験小動物等の体内の奥深い所に配置されている場合であっても、表皮あるいは筋肉組織を大きく切開することなく、小さな開口部を設けるだけで細径先端光学系をその開口部から差し込んで観察することができる。その結果、実験小動物に大きなダメージを与えることなく、長期間にわたる経時的な観察も、生きたままの状態で行うことができる。
【０００８】
上記発明においては、前記対物光学系が、前記細径先端光学系により、試料における物体像からの光を結像して形成した中間像の光を略平行にするリレー光学系を備えていることが好ましい。
この発明によれば、細径先端光学系により一旦中間像を形成し、リレー光学系によって略平行にすることにより、細い外筒の領域を十分に長く確保することができる。
【０００９】
また、上記発明においては、前記リレー光学系と前記細径先端光学系とを、前記中間像近傍において着脱自在に接続する接続機構を備えることが好ましい。
このようにすることで、接続機構によりリレー光学系と細径先端光学系とを接続して、実験小動物等の体内の観察を生きたまま行う一方、接続機構によりリレー光学系と細径先端光学系とを切り離し、細径先端光学系を、実験小動物等の試料に位置決めした状態に維持することができる。そして、再度観察するときには接続機構によりリレー光学系と細径先端光学系とを接続することにより、細径先端光学系を一旦位置決めした試料の位置から動かすことなく、同一箇所の観察を時間間隔をおいて行うことができる。また、試料に対して細径先端光学系を移動させないので、試料を痛めることがないという利点もある。
また、着脱自在の位置を中間像位置近傍におくことで、リレー光学ユニットと細径先端光学系ユニットとを取り付けたときの位置や傾きなどの誤差に対する影響を小さくすることができる。
【００１０】
さらに、上記発明においては、前記接続機構が、前記リレー光学系と前記細径先端光学系とを、それらの軸線回りの任意の相対回転角度で相互に固定可能であることとしてもよい。
この発明によれば、細径先端光学系を試料に位置決め状態に配置しておき、時間間隔をおいて経時的に観察を行う際に、接続機構によってリレー光学系と細径先端光学系とを接続する。この場合に、接続機構は、リレー光学系と細径先端光学系とを相対的に回転させることなく相互に固定するので、リレー光学系の回転角度位置にかかわらず、試料に対して細径先端光学系を回転させることなくそのまま接続することができる。その結果、試料に損傷を与えることがないという利点がある。
【００１１】
また、上記発明においては、前記細径先端光学系が、光軸方向に間隔を空けて複数の中間像を結像する延長光学系を備えることとしてもよい。
この発明によれば、延長光学系の作動により、光軸方向に沿って複数の中間像が形成されるように光が進行させられるので、細径先端光学系の全長を長く確保することができる。その結果、実験小動物等の臓器のように体内の奥深いところに位置する観察部位にも、狭隘な開口のみを開けることで細径先端光学系の先端を到達させることができ、生きたままの観察を行うことができる。
【００１２】
さらに、上記発明においては、前記延長光学系が、着脱可能であることとしてもよい。
この発明によれば、深い位置の観察部位を観察するときには延長光学系を取り付け、浅い位置の観察部位あるいは、表皮から観察し得る観察部位を観察するときには延長光学系を取り外すことにより、観察部位に適した形態で観察を行うことができる。
【００１３】
また、上記発明によれば、前記顕微鏡本体を試料に対して任意の姿勢および位置に調節可能な姿勢調節機構を備えることが好ましい。
この発明によれば、姿勢調節機構の作動により、顕微鏡本体を試料の観察に適した位置および姿勢に調節することができる。特に、予め細径先端光学系を観察対象に取り付けている場合には、該細径先端光学系の位置および姿勢に合わせて顕微鏡本体を移動させることで、試料に損傷を与えることなく観察を行うことができる。
【００１４】
また、本発明は、上記発明において、前記光源がレーザ光源からなり、該光源からの励起光を試料面上に走査させる光走査手段と、該光走査手段と前記結像光学系との間に配置され、前記対物光学系の後側焦点位置を前記光走査手段の近傍に投影する瞳投影光学系と、該瞳投影光学系を通過した光を集光するコリメート光学系と、該コリメート光学系により集光された光を検出する光検出器とを備える顕微鏡システムを提供する。
【００１５】
この発明によれば、レーザ光源から発せられた励起光が光走査手段の作動により試料面上に走査させられる。励起光が照射されることにより試料で励起された蛍光は、対物光学系、結像光学系、瞳投影光学系を経てコリメート光学系により集光させられて光検出器により検出される。これにより、レーザ走査型共焦点顕微鏡を構成することが可能となり、実験小動物等の内臓のように生体の奥深くに配置されている観察部位の鮮明な画像を得ることが可能となる。
【００１６】
また、上記発明においては、前記光源および前記光検出器と、前記コリメート光学系との間が光ファイバにより光学的に接続されていることが好ましい。
このようにすることで、光源および光検出器を別体として光ファイバにより光学的に接続することで、顕微鏡本体に取り付けた対物ユニットの取り回しを容易にして、使いやすさを向上することができる。また、光源および光検出器を顕微鏡本体から切り離すことで、顕微鏡本体を小型軽量化することができる。
【００１７】
また、上記発明においては、前記対物光学系の胴付き位置と前記中間像の位置との光軸に沿う距離をＬｍ、前記胴付き位置と前記対物光学系の後側焦点位置の結像光学系および瞳投影光学系による共役位置との光軸に沿う距離をＬｐとして、以下の条件式（２）を満足することが好ましい。
０．１５≦Ｌｍ／Ｌｐ≦０．５                …（２）
また、上記発明においては、前記対物光学系の胴付き位置と前記中間像の位置との光軸に沿う距離をＬｍ、前記結像光学系による結像位置と前記中間像の位置との光軸に沿う距離をＬｔｌとして、以下の条件式（３）を満足することが好ましい。
０．１５≦Ｌｍ／Ｌｔｌ≦０．５              …（３）
【００１８】
これらの発明によれば、光走査手段からリレー光学系までの距離を短くすることができ、装置を小型化することができる。条件式（２），（３）の上限値を上回ると、結像光学系、瞳投影光学系の焦点距離が短くなり、瞳投影光学系と走査手段との間隔が短くなりすぎて両者が干渉してしまう不都合がある。また、条件式（２），（３）の下限値を下回ると、試料から走査手段までの全長が長くなりすぎて装置を小型化することが困難となる。
【００１９】
また、本発明は、顕微鏡本体に着脱可能に取り付ける取付ネジを胴付き位置に備え、試料に近接あるいは接触させられる先端に配置された細径先端光学系を備え、該細径先端光学系を覆う外筒の外径寸法をＤｆ、前記取付ネジの外径寸法をＤａとして、以下の条件式（１）を満足する対物ユニットを提供する。
Ｄｆ／Ｄａ≦０．３                          …（１）
【００２０】
この発明によれば、観察対象が実験小動物等の体内の奥深い所に配置されている場合であっても、表皮あるいは筋肉組織を大きく切開することなく、小さな開口部を設けるだけで細径先端光学系をその開口部から差し込んで観察することができる。その結果、実験小動物に大きなダメージを与えることなく、長期間にわたる経時的な観察も、生きたままの状態で行うことができる。
【００２１】
上記発明においては、前記細径先端光学系により、試料における物体像からの光を結像して形成した中間像の光を略平行にするリレー光学系を備えている。
また、上記発明においては、前記リレー光学系と前記細径先端光学系とを組み合わせた対物光学系の像側焦点位置が、前記胴付き位置から物体側に４０ｍｍ以内の位置に配置されていることが好ましい。
【００２２】
通常の顕微鏡システムは、対物光学系の像側焦点位置を対物レンズの胴付き位置から物体側に４０ｍｍ以内の位置に設定している。したがって、本発明によれば、細径先端光学系を有する対物ユニットの対物光学系の像側焦点位置を通常の顕微鏡システムに一致させることで、従来の顕微鏡システムと互換性を持たせることができる。
【００２３】
また、上記発明においては、前記リレー光学系と前記細径先端光学系とを、前記中間像近傍において着脱自在に接続する接続機構を備えることが好ましい。
さらに、前記接続機構が、前記リレー光学系と前記細径先端光学系とを、それらの軸線回りの任意の相対回転角度で相互に固定可能であることとしてもよい。
【００２４】
また、上記発明においては、前記細径先端光学系が、光軸方向に間隔をあけて複数の中間像を結像する延長光学系を備えることとしてもよい。
この場合、前記延長光学系が、相互に着脱可能な複数のリレー光学系ユニットからなることとしてもよく、グリンレンズからなることとしてもよい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、観察対象が体内の奥深い所に配置されている場合であっても、表皮あるいは筋肉組織を大きく切開することなく、小さな開口部を設けるだけで細径先端光学系をその開口部から差し込んで観察することができる。その結果、観察対象に大きなダメージを与えることなく、長期間にわたる経時的な観察も、生きたままの状態で行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明の一実施形態に係る顕微鏡システムおよび対物ユニットについて、図１〜図１０を参照して説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システムは、図１に示されるように、レーザ走査型共焦点蛍光顕微鏡１であって、レーザ光源部２と、交換可能な対物ユニット３と、走査手段としてのスキャナ部４と、瞳投影光学系５と結像光学系６とを備えたレンズユニット７と、検出光学系８とを顕微鏡本体９に備えている。図中、符号１０は接眼光学系、符号１１は照明光学系である。
【００２７】
レーザ光源部２は、例えば、半導体レーザからなるレーザ光源１２と、レンズ１３，１４とピンホール１５とからなるコリメート光学系と、ダイクロイックミラー１６とを備えている。
本実施形態に係る対物ユニット３は、図２および図３に示されるように、顕微鏡本体９に着脱可能な取付ネジ１７を備えるリレー光学系ユニット１８と、該リレー光学系ユニット１８の先端に着脱可能に設けられる細径先端光学系ユニット１９とを備えている。
【００２８】
細径先端光学系ユニット１９は、図３に示されるように、観察対象である試料Ａに近接あるいは接触させられる先端１９ａから軸方向に配列された細径先端光学系２０を備えている。この細径先端光学系２０は、図４に示されるように、試料Ａにおける物体像からの光を一旦結像して第１中間像Ｂを形成するように構成されている。これにより、光束径を大きくすることなく、細長く導くようになっている。細径先端光学系ユニット１９は、細径先端光学系２０を覆う外筒２１を備えており、該外筒２１の外径寸法は、先端１９ａから５ｍｍの範囲において直径（Ｄｆ＝）２ｍｍ、先端１９ａから２ｍｍの範囲において直径１．３ｍｍの円筒状に形成されている。これらの寸法は一例であるが、外筒２１の先端部の外径寸法をＤｆ、リレー光学系ユニット１８の取付ネジ１７の外径寸法をＤａとして、以下の条件式（１）を満足することが好ましい。
Ｄｆ／Ｄａ≦０．３                          …（１）
【００２９】
また、リレー光学系ユニット１８は、図４に示されるように、細径先端光学系２０により形成された第１中間像Ｂの光を略平行光にするリレー光学系２２を備えている。
リレー光学系ユニット１８の取付ネジ１７は、一般的な顕微鏡の対物レンズ取付ネジと同一規格の、外径（Ｄａ＝）２０．３２ｍｍ、ピッチ０．７０６ｍｍのネジであり、他の一般の顕微鏡にも取り付けることができるようになっている。そして、このリレー光学系ユニット１８の取付ネジ１７の付け根位置に、対物ユニット３の顕微鏡本体９への胴付き位置Ｃが設定されている。
【００３０】
また、リレー光学系ユニット１８の先端側には、細径先端光学系ユニット１９との間に、両者を連結するための接続機構２３が備えられている。接続機構２３としては、例えば、図５に示されるように、リレー光学系ユニット１８または細径先端光学系ユニット１９のいずれか一方にボス部２４とナット２５とを備え、他方にボス部２４を嵌合させる嵌合孔２６とナット２５を締結する雄ネジ２７とを有する構造のものでよい。
【００３１】
この図の例では、雄ネジ２７の先端面２７ａが、ボス部２４の側面に設けた突き当て面２４ａに突き当てられることにより両者が光軸方向に位置決めされる胴付き位置Ｄが構成されている。接続機構２３としてはこれに限定されるものではなく、図６に示されるように、ボス部２４と嵌合孔２６とを嵌合させて押しネジ２８でクランプする方式のもの、図７に示されるように、すり割り付きスリーブ２９の外面にテーパネジ２９ａを形成しナット３０を締め付けることで内部のボス部３１を締め付けていく方式のものの他、スピゴットマウント方式や、バイオネット方式や、マグネットによって吸着する方式等任意の構造のものを採用することができる。この場合に、接続機構２３は、リレー光学系ユニット１８と細径先端光学系ユニット１９とを接続する際に、両者をその軸線回りに相対回転させることなく連結することができる構造のものであることが好ましい。
【００３２】
また、図６に示されるように細径先端光学系ユニット１９側に接続機構２３の大部分を設けることとすれば、リレー光学系ユニット１８として、通常の顕微鏡の対物レンズユニットを用い、該対物レンズユニットの外面を接続機構２３の嵌合孔２６に嵌合させることもできる。
【００３３】
そして、接続機構２３は、リレー光学系ユニット１８と細径先端光学系ユニット１９とを、細径先端光学系２０により形成された第１中間像Ｂの近傍において着脱自在に接続している。また、着脱自在の位置を第１中間像Ｂの位置近傍におくことで、リレー光学ユニット１８と細径先端光学系ユニット１９とを取り付けたときの位置や傾きなどの誤差に対する影響を小さくすることができる。
【００３４】
このように構成された対物ユニット３は、結像光学系６とともに、レーザ光源部２からの励起光をステージ３１上の試料Ａに集光するように機能する。また、リレー光学系２２と細径先端光学系２０とを組み合わせた対物光学系３２の像側焦点位置Ｅは、図３に示されるように、胴付き位置Ｃから試料Ａ側に、例えば、１４．６ｍｍの位置に配置されている。一般的な顕微鏡においては、対物レンズの像側焦点位置は、胴付き位置から物体側に０〜４０ｍｍの範囲内に設定されている。したがって、本実施形態における対物ユニット３もこの条件を満たし、一般的な顕微鏡の対物レンズと互換性を備えている。
【００３５】
また、対物ユニット３は、図８に示されるように、その後側焦点位置Ｅが、結像光学系６と瞳投影光学系５とによって、スキャナ部４の近傍位置Ｆにおいて共役となるように構成されている。結像光学系６は、試料Ａの第２中間像Ｇを形成する機能を有している。瞳投影光学系５は、スキャナ部４と結像光学系６との間に配置されている。
【００３６】
検出光学系８は、図１に示されるように、ダイクロイックミラー３３と、バリアフィルタ３４と、レンズ３５と、共焦点ピンホール３６と、受光センサ３７とを備えている。試料から発せられた蛍光は、対物ユニット３、結像光学系６、瞳投影光学系５およびスキャナ部４を経た後に検出光学系８の受光センサ３７によって検出されるようになっている。
また、スキャナ部４と検出光学系８およびレーザ光源部２との間には、レーザ光源部２からの励起光を試料Ａに導くとともに、試料Ａからの蛍光を受光センサ３７に導くためのダイクロイックミラー３８が設けられている。図１中符号３９はミラーである。
【００３７】
なお、レーザ走査型共焦点蛍光顕微鏡には、パーソナルコンピュータなどの処理制御手段（図示略）が接続されている。処理制御手段は、レーザ光源部２の波長制御、ダイクロイックミラー１６，３３やフィルタ３４等の波長選択、波長分離素子（図示略）の制御、検出光学系８の受光センサ３７により受光された検出情報の解析および表示、スキャナ部４の駆動制御等を行うようになっている。
【００３８】
このように構成された本実施形態に係る顕微鏡システム１によれば、レーザ光源１２から出射された励起光は、レンズ１３によってピンホール１５に集光された後、レンズ１４によって平行光に変換される。その後、ダイクロイックミラー１６，３８を経てスキャナ部４に導かれ、スキャナ部４の各ガルバノミラー４ａの回転により光束を光軸に対して２次元方向にシフトさせられる。そして、瞳投影光学系５を経て第２中間像位置Ｇに集光して結像する。第２中間像位置Ｇに集光した励起光は、結像光学系６、対物ユニット３を経て試料Ａに微小スポット状に照射される。このとき、試料Ａ面に照射される励起光は、スキャナ部４によって走査される。
【００３９】
また、対物ユニット３の後側焦点位置Ｅは、結像光学系６と瞳投影光学系５とによってスキャナ部４の近傍位置Ｆに投影される。
励起光が照射されることによって試料Ａで励起された蛍光は、対物ユニット３、結像光学系６、瞳投影光学系５、スキャナ部４、ダイクロイックミラー３８を経て検出光学系８に導かれる。そして、検出光学系８において、ダイクロイックミラー３３、バリアフィルタ３４、レンズ３５を介した後に共焦点ピンホール３６を通過した蛍光だけが、受光センサ３７によって検出されることになる。
【００４０】
この場合において、本実施形態に係る顕微鏡システム１は、対物ユニット３の先端に十分に外径寸法の小さい細径先端光学系ユニット１９を備えているので、この細径先端光学系ユニット１９を観察対象である試料Ａに近接あるいは接触させることができる。したがって、観察対象が実験小動物等の体内の奥深い所に配置されている場合であっても、表皮あるいは筋肉組織を大きく切開することなく、小さな開口部を設けるだけで細径先端光学系ユニット１９をその開口部から差し込んで観察することができる。その結果、実験小動物に大きなダメージを与えることなく、長期間にわたる経時的な観察も、生きたままの状態で行うことができるという利点がある。
【００４１】
また、本実施形態に係る顕微鏡システム１によれば、細径先端光学系２０により一旦第１中間像を形成し、リレー光学系２２によって略平行にすることにより、細径先端光学系ユニット１９の細い外筒２１の領域を十分に長く確保することができる。したがって、観察対象である試料Ａが実験小動物等の体内の深い位置にある場合においても、表皮組織等を大きく切開することなく観察を行うことができる。
【００４２】
また、本実施形態に係る顕微鏡システム１によれば、接続機構２３により、細径先端光学系ユニット１９とリレー光学系ユニット２０とを接続して、図１に示されるように、実験小動物等の体内の観察を生きたまま行う一方、図９に示されるように接続機構２３により細径先端光学系ユニット１９とリレー光学系ユニット２０とを切り離し、細径先端光学系ユニット１９を、実験小動物等の試料Ａに位置決めした状態に維持することができる。そして、再度観察するときには接続機構２３により細径先端光学系ユニット１９とリレー光学系ユニット２０とを接続することにより、細径先端光学系ユニット１９を一旦位置決めした試料Ａの位置から動かすことなく、同一箇所の観察を時間間隔をおいて行うことができる。また、試料Ａに対して細径先端光学系ユニット１９を相対的に移動させないので、試料Ａにダメージを与えないという利点もある。
【００４３】
さらに、本実施形態に係る顕微鏡システム１によれば、接続機構２３が、細径先端光学系ユニット１９とリレー光学系ユニット２０とを相対的に回転させることなく相互に固定するので、リレー光学系ユニット２０の回転角度位置にかかわらず、試料Ａに対して位置決めした細径先端光学系ユニット１９を回転させることなくそのまま接続することができる。その結果、試料Ａに損傷を与えることがないという利点がある。
【００４４】
なお、本実施形態に係る対物ユニット３においては、接続機構２３により細径先端光学系ユニット１９とリレー光学系ユニット２０とを着脱可能としたが、接続機構２３を設けることなく細径先端光学系ユニット１９とリレー光学系ユニット２０とを一体化してもよい。また、細径先端光学系ユニット１９とリレー光学系ユニット２０との間に、図１０に示されるように、延長光学系４０を配置することにしてもよい。延長光学系４０は、細径先端光学系２０により結像された第１中間像Ｂの光を再度結像させて、１つ以上の他の中間像Ｂ１，Ｂ２を形成する複数のリレーレンズ４０ａ，４０ｂと瞳リレー用レンズ４１とを外筒２１内に備えている。
【００４５】
このように構成された対物ユニット３によれば、延長光学系４０の作動により、光軸方向に沿って複数の中間像Ｂ１，Ｂ２が形成されるように光が進行させられるので、細径先端光学系２０の全長を長く確保することができる。その結果、実験小動物等の臓器のように体内の奥深いところに位置する観察部位にも、狭隘な開口のみを開けることで細径先端光学系ユニット１９の先端１９ａを到達させることができ、生きたままの観察を行うことができる。
【００４６】
また、延長光学系４０は、図１０に示されるように細径先端光学系ユニット１９の一部として構成してもよいが、リレー光学系ユニット１８の一部として構成してもよく、また、リレー光学系ユニット１８および細径先端光学系ユニット１９の両方に着脱可能に接続されるように構成してもよい。この場合、長さの異なる延長光学系４０を複数用意しておき、観察部位の深さに応じて交換することにしてもよいし、最小長さの延長光学系４０を複数用意しておいて、観察部位の深さに合わせて継ぎ足す延長光学系４０の数を変えてもよい。また、リレーレンズ４０ａ，４０ｂに代えてＧＲＩＮレンズを使用してもよい。
【００４７】
このようにすることで、深い位置の観察部位を観察するときには長い延長光学系４０あるいは多数の延長光学系４０を取り付け、浅い位置の観察部位あるいは、表皮から観察し得る観察部位を観察するときには延長光学系４０を取り外し、あるいは、短い延長光学系４０または少ない延長光学系４０を用いることにより、観察部位に適した形態で観察を行うことができる。
【００４８】
次に、本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡システム５０について、図１１および図１２を参照して以下に説明する。本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る顕微鏡システム１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を簡略化する。
【００４９】
本実施形態の顕微鏡システム５０は、図１１に示されるように、レーザ走査型蛍光顕微鏡であって、第１の実施形態の顕微鏡システム１が共焦点顕微鏡であったのに対し、本実施形態の顕微鏡システム５０は多光子励起型の観察をも行うことができる点で第１の実施形態の顕微鏡システム１と相違している。具体的には、レーザ光源５１として、高出力の近赤外のフェムト秒パルスレーザをも備えている。また検出光学系８としては、通常の励起光による測定時に用いられる第１の検出光学系８と、多光子励起用の第２の検出光学系５２とを備えている。
【００５０】
第１の検出光学系８においては、第１の実施形態において採用していた共焦点ピンホール３６に代えて、ノイズカット用ピンホール３６′が備えられている。
第２の検出光学系５２は、一対のコリメートレンズ５３，５４とその間に配置されるバンドパスフィルタ５５と、ピンホール径が回折径より十分に大きなノイズカット用ピンホール５６と、受光センサ５７とを備えている。
【００５１】
また、顕微鏡本体９′は、レーザ光源部２′および第１，第２の検出光学系８，５２とは分離され、両者間は相互に光ファイバ５８，５９によって接続されている。これにより、顕微鏡本体９′は小さく構成されており、それ自体の２次元方向の位置および試料Ａに対する角度を調整するためのｘ−ｙ−θ−φ本体移動機構（図示略）が備えられている。また、顕微鏡本体９′内には、スキャナ部４において偏向された光を光ファイバ５８端面に集光させるコリメート光学系６０が備えられている。コリメート光学系６０には、該コリメート光学系６０を構成するレンズを光軸方向に位置調整する準焦機構部６２が備えられている。また、顕微鏡本体９′には、多光子励起型の蛍光観察を行う際に、スキャナ部４とコリメート光学系６０との間に配置されるダイクロイックミラー６４および励起光をカットするバリアフィルタ６５と、光ファイバ５９端面に向けて集光させる第２のコリメート光学系６１および準焦機構部６３とが設けられている。
【００５２】
多光子励起型蛍光観察用の光ファイバ５９は、共焦点ピンホールとして作用させる必要がなく、伝送する光量を確保してＳ／Ｎ比を向上するために回折限界と比較して十分コア径が大きな光ファイバ（例えば、コア径が大きなマルチモードファイバ）を採用することが好ましく、分散を小さくするためにはフォトニッククリスタルファイバを採用するのが好ましい。また、通常の蛍光観察用の光ファイバ５８は、その端面のコア径を共焦点ピンホールとして作用させる必要があり、回折限界程度のコア径を有する光ファイバ（例えば、シングルモードファイバやコア径の小さなマルチモードファイバ）を用いることが好ましい。
【００５３】
なお、図中符号６６は、パーソナルコンピュータなどの処理制御手段、符号６７はケーブルである。処理制御手段６６は、レーザ光源部２′のレーザ光源１２，５１の切換制御および波長制御、ダイクロイックミラー６，３８やフィルタ３４等の波長選択、波長分離素子（図示略）の制御、検出光学系８、５２の受光センサ３７、５７により受光された検出情報の解析および表示、スキャナ部４の駆動制御、準焦機構部６２，６３の駆動制御、ｘ−ｙ−θ−φ本体移動機構の駆動制御等を行うようになっている。
【００５４】
また、本実施形態においては、図１２に示されるように、対物ユニット３の胴付き位置Ｃと第１中間像位置Ｂとの光軸に沿う距離をＬｍ、前記胴付き位置Ｃと前記対物光学系３２の後側焦点位置Ｅの結像光学系６および瞳投影光学系５による共役位置Ｆとの光軸に沿う距離をＬｐとして、以下の条件式（２）を満足するように構成されている。
０．１５≦Ｌｍ／Ｌｐ≦０．５                …（２）
なお、結像光学系による第２中間像の結像位置Ｇと、第１中間像の結像位置Ｂとの光軸に沿う距離をＬｔｌとして、以下の条件式（３）を満足することとしてもよい。
０．１５≦Ｌｍ／Ｌｔｌ≦０．５              …（３）
【００５５】
本実施形態に係る顕微鏡システム５０によれば、レーザ光源部２′および検出光学系８，５２と顕微鏡本体９′とを別体として光ファイバ５８，５９により接続することにより、顕微鏡本体９′をレーザ光源部２′および検出光学系８，５２に対して自由に配置することができる。したがって、顕微鏡本体９′を生きたままの観察対象の観察に適した大きさに小型化することができるとともに、観察部位に適した方向に、顕微鏡本体９′に取り付けた対物ユニット３を向けることができる。
【００５６】
また、本実施形態に係る顕微鏡システム５０によれば、条件式（２）、または条件式（３）を満足するように構成されているので、スキャナ部４からリレー光学系ユニット１８までの距離を短くすることができ、顕微鏡本体９′を小型化することができる。条件式（２），（３）の上限値を上回ると、結像光学系６、瞳投影光学系５の焦点距離が短くなり、瞳投影光学系５とスキャナ部４との間隔が短くなりすぎて両者が干渉してしまう不都合がある。また、条件式（２），（３）の下限値を下回ると、試料Ａからスキャナ部４までの全長が長くなりすぎて顕微鏡本体９′を小型化することが困難となってしまう。したがって、この条件式（２）、（３）を満足する本実施形態の顕微鏡システム５０においてはそのような不都合がないという利点がある。
【００５７】
また、顕微鏡本体９′が小型であるために、この顕微鏡本体９′を観察対象部位に対して適切な位置、角度に配置することが容易にできる。つまり、例えば、実験小動物の体内の奥深い観察し難い位置の場合、小型の顕微鏡本体９′自体を適切な位置に容易に設置することができる。さらに、顕微鏡本体９′は小型であるため設置する角度も自由にすることができる。よって、観察し難い位置であっても、適切な位置で適切な方向（角度）から観察することができ、実験小動物に対して比較的負担をかけることなく適切に観察することができる。
【００５８】
また、本実施形態に係る顕微鏡システム５０によれば、レーザ光源５１としてフェムト秒パルスレーザを用いることにより、多光子励起の蛍光観察を行うことができる。その結果、観察対象部位が、例えば、実験小動物等の体内の奥深い位置に配置されている臓器の表面からさらに奥深い内部にある場合においても、細径先端光学系ユニット１９の先端１９ａを臓器の表面に押しつけるだけで、臓器を傷つけることなく臓器の内部を観察することができるという利点がある。また、それ以外の場合においも、例えば、実験小動物等の体表面に細径先端光学系ユニット１９の先端面１９ａを押しつけるだけで、非侵襲に体内を観察することができる。
また、本実施形態では、顕微鏡システム５０は第２の検出光学系５２を備えているが、多光子励起型の蛍光観察を行う必要がない場合は、第２の検出光学系５２は不要である。
この場合には、第２の検出光学系５２を設けていない分、顕微鏡本体９′をさらに小型化することができ、小型の顕微鏡本体９′により、通常の蛍光観察が可能である。
【００５９】
以下、本発明の顕微鏡システム１，５０における瞳投影光学系５、結像光学系６および対物光学系３２の実施例について説明する。なお、この実施例の光学系は、図１および図１１に示された各実施形態に係る顕微鏡システム１，５０に適用される。
【００６０】
図１３に、本発明の実施例に係る顕微鏡システム１，５０の瞳投影光学系５、結像光学系６および対物光学系３２の構成を光軸に沿って示す。また、図１４に対物光学系３２の構成を拡大して示す。
本実施例に係る顕微鏡システム１，５０では、図１３に示されるように、瞳投影光学系５は、スキャナ部４（紙面の左側）から順に、スキャナ部４側に凹面を向けた平凹レンズＬ１と第２中間像Ｇ側に凸面を向けた平凸レンズＬ２とのパワーの弱い接合正レンズと、両凸レンズＬ３とスキャナ部４側に凹面を向けた負メニスカスレンズＬ４との接合正レンズと、両凸レンズＬ５，Ｌ６と、両凹レンズＬ７とで構成されている。
【００６１】
結像光学系６は、第２中間像Ｇ側から順に、前群と後群とで構成されている。前群は第２中間像Ｇ側から順に、両凸レンズＬ８と、第２中間像Ｇ側に平面を向けた平凹レンズＬ９とで構成されている。また、後群は、第２中間像Ｇ側から順に、両凸レンズＬ１０と、試料Ａ側に凹面を向けた平凹レンズＬ１１と両凸レンズＬ１２との接合正レンズとで構成されている。
【００６２】
対物光学系３２は、図１４に示されるように、リレー光学系２２と細径先端光学系２０とからなり、リレー光学系２２は、第２中間像Ｇ側から順に、第２中間像Ｇ側に凸面を向けた負メニスカスレンズＬ１３と第２中間像Ｇ側に凸面を向けた平凸レンズＬ１４との接合正レンズと、第２中間像Ｇ側に凸面を向けた正メニスカスレンズＬ１５と、両凹レンズＬ１６と両凸レンズＬ１７との接合正レンズと、２つの平凸レンズＬ１８，Ｌ１９の接合正レンズとで構成されている。また、細径先端光学系２０は、第１中間像Ｂ側から順に、両凹レンズＬ２０と第１中間像Ｂ側に凸面を向けた平凸レンズＬ２１との接合負レンズと、第１中間像Ｂ側に平面を向けた平凸レンズＬ２２と、両凸レンズＬ２３と負メニスカスレンズＬ２４との接合正レンズと、両凸レンズＬ２５と、両凹レンズＬ２６と両凸レンズＬ２７との接合正レンズと、第１中間像Ｂ側に凹面を向けた平凹レンズＬ２８と、両凸レンズＬ２９と、試料Ａ側に平面を向けた平凸レンズＬ３０とで構成されている。
【００６３】
次に、上記実施例の光学系を構成する光学部材Ｌ１〜Ｌ３０の数値データを示す。なお、この数値データにおいて、記号ｒはレンズ面の曲率半径、記号ｄは軸上における各レンズの肉厚または空気間隔、ｎｄは各レンズのｄ線での屈曲率、νｄは各レンズのアッベ数を表している。第１面は、対物光学系３２の瞳共役位置Ｆであり、物体無限遠からの光束が入射する。また、数字の末尾にＵを付してあるのはレンズ有効径である。
【００６４】
数値データ
r1=∞（共役面）  d1=10.6                                        1.070U
r2=-4.623        d2=1          nd2=1.48749  νd2=70.23      1.395U
r3=∞            d3=3            nd3=1.497    νd3=81.54      1.547U
r4=-6.021        d4=0.2                                        1.882U
r5=30.762      d5=4.31        nd5=1.43875  νd5=94.93      1.896U
r6=-6.181        d6=1.1        nd6=1.7725    νd6=49.6        1.889U
r7=-15.671      d7=0.2                                          1.963U
r8=15.223      d8=3.24        nd8=1.43875  νd8=94.93      1.966U
r9=-15.223      d9=1.42                                        1.860U
r10=8.835        d10=2.63      nd10=1.497    νd10=81.54      1.681U
r11=-33.393      d11=1.6699                                    1.351U
r12=-15.554      d12=1          nd12=1.741    νd12=52.64    0.974U
r13=7.459        d13=5.363                                      0.866U
r14=∞（第２中間像）  d14=9                                      0.403U
r15=40.55        d15=1.59      nd15=1.48749  νd15=70.23      1.003U
r16=-18.93      d16=1.29                                        1.069U
r17=∞            d17=1.2        nd17=1.48749  νd17=70.23      1.116U
r18=12.608      d18=32.2683                                    1.146U
r19=97.144      d19=2.9        nd19=1.43875  νd19=94.93      3.997U
r20=-28.867      d20=0.25                                      4.121U
r21=∞            d21=1.85      nd21=1.741      νd21=52.64    4.125U
r22=29.63        d22=5.04      nd22=1.43875  νd22=94.93      4.136U
r23=-34.904      d23=38.048                                    4.303U
r24=∞            d24=-14.632                                    4.447U
r25=∞（胴付き）  d25=-3.45                                      4.388U
r26=18.004      d26=1          nd26=1.7725    νd26=49.6      4.377U
r27=10.967      d27=3          nd27=1.43875  νd27=94.93      4.237U
r28=∞            d28=12.38                                      4.161U
r29=7.772        d29=1.8        nd29=1.43875  νd29=94.93    3.486U
r30=13.251      d30=16.33                                      3.234U
r31=-2.461      d31=1.63        nd31=1.6779    νd31=55.34    0.871U
r32=7.721        d32=2.5        nd32=1.43875  νd32=94.93    0.997U
r33=-3.501      d33=1.5                                          1.224U
r34=5.772        d34=1.8        nd34=1.43875  νd34=94.93    1.196U
r35=∞            d35=1.48      nd35=1.51633    νd35=64.14    1.071U
r36=-12.005      d36=4.524                                      0.970U
r37=∞（第２中間像）  d37=1.02                                    0.281U
r38=-1.869      d38=0.51        nd38=1.51633  νd38=64.14      0.347U
r39=1.425        d39=1          nd39=1.7725    νd39=49.6      0.412U
r40=∞            d40=0.56                                        0.457U
r41=∞            d41=1          nd41=1.7725    νd41=49.6      0.504U
r42=-3.746      d42=1.03                                        0.549U
r43=10.104      d43=0.8        nd43=1.6779    νd43=55.34    0.536U
r44=-0.804      d44=0.34        nd44=1.7725    νd44=49.6      0.519U
r45=-5.961      d45=0.2                                          0.528U
r46=2.681        d46=0.7        nd46=1.51633  νd46=64.14    0.520U
r47=-2.406      d47=0.2                                          0.473U
r48=-2.406      d48=0.29        nd48=1.6134    νd48=44.27    0.425U
r49=0.674        d49=0.7        nd49=1.43875  νd49=94.93    0.394U
r50=-1.218      d50=0.15                                        0.399U
r51=-3.637      d51=0.45        nd51=1.6134    νd51=44.27    0.387U
r52=∞            d52=0.15                                      0.392U
r53=1.273        d53=0.6        nd53=1.741      νd53=52.64    0.399U
r54=-3.469      d54=0.15                                        0.342U
r55=0.614        d55=0.55      nd55=1.51633    νd55=64.14  0.278U
r56=∞            d56=0.1        nd56=1.33304    νd56=55.79  0.108U
r57=∞（物体面）
【００６５】
次に、上記実施例の顕微鏡システムの条件式に用いる数値パラメータを表１および表２に示す。
【表１】
2005241671.tif 000003
【表２】
2005241671.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明の第１実施形態に係る顕微鏡システムの概略構成図である。
【図２】図１の顕微鏡システムに使用される第１の実施形態に係る対物ユニットを示す正面図であり、（ａ）は分離状態、（ｂ）は結合状態を示している。
【図３】図２の対物ユニット内部の光学部材を示す概略図である。
【図４】対物光学系の光路を示す模式図である。
【図５】図２の対物ユニットの接続機構の一例を示す縦断面図である。
【図６】図２の対物ユニットの接続機構の他の例を示す縦断面図である。
【図７】図２の対物ユニットの接続機構の他の例を示す縦断面図である。
【図８】図１の顕微鏡システムの物体面からスキャナ部までの光路を示す模式図である。
【図９】図２の対物ユニットの適用例を示す模式図である。
【図１０】図２の対物ユニットの変形例として延長光学系を有する場合を示す模式図である。
【図１１】本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡システムを示す概略構成図である。
【図１２】図１１の顕微鏡システムの物体面からスキャナ部までの光路を示す模式図である。
【図１３】本発明の一実施例に係る顕微鏡システムにおける瞳投影光学系、結像光学系および対物光学系の構成を光軸に沿って示す図である。
【図１４】図１３の対物光学系を拡大して示す図である。
【符号の説明】
【００６７】
Ａ  試料
Ｂ  第１中間像（中間像）
Ｂ１，Ｂ２  中間像
Ｃ  胴付き位置
Ｅ  後側焦点位置
Ｆ  共役位置
１，５０  顕微鏡システム
３  対物ユニット
４  スキャナ部（光走査手段）
５  瞳投影光学系
６  結像光学系
９  顕微鏡本体
１２，５１  レーザ光源（光源）
１７  取付ネジ
１９  外筒
２０  細径先端光学系
２２  リレー光学系
２３  接続機構
３２  対物光学系
３５、５３  レンズ（コリメート光学系）
３６  共焦点ピンホール（コリメート光学系）
３７，５７  光検出器
４０  延長光学系
５８，５９  光ファイバ
【図１】
2005241671.tif 000005
【図２】
2005241671.tif 000006
【図３】
2005241671.tif 000007
【図４】
2005241671.tif 000008
【図５】
2005241671.tif 000009
【図６】
2005241671.tif 000010
【図７】
2005241671.tif 000011
【図８】
2005241671.tif 000012
【図９】
2005241671.tif 000013
【図１０】
2005241671.tif 000014
【図１１】
2005241671.tif 000015
【図１２】
2005241671.tif 000016
【図１３】
2005241671.tif 000017
【図１４】
2005241671.tif 000018