(57)【要約】【課題】標的ＤＮＡ配列において一塩基変異多型の存在を検出する方法において、ＰＣＲ法、とりわけＡＳ-ＰＣＲ法の実施にあたり、一塩基多型の識別効果を充分に発揮させ、高感度で判定をより正確に行うことができる改良された方法を提供する。【解決手段】標的ＤＮＡ配列において一塩基変異多型の存在を検出する方法であって、該標的ＤＮＡ配列に対するプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）を用い、該アッパープライマー及び該ロワープライマーのいずれか一方が、その配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されていて、及び、上記のようにその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されているアッパープライマー又はロワープライマーの５′末端側に位置する更なるプライマーを用いてＰＣＲ法を実施し、次いでＰＣＲ産物を検出することを含む方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡ配列において一塩基変異多型の存在を検出する方法であって、該標的ＤＮＡ配列に対するプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）を用い、該アッパープライマー及び該ロワープライマーのいずれか一方が、その配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されていて、及び、上記のようにその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されているアッパープライマー又はロワープライマーの５′末端側に位置する更なるプライマーを用いてＰＣＲ法を実施し、次いでＰＣＲ産物を検出することを含む方法。
【請求項２】
プライマーセットを２組用いて実施する請求項１記載の方法であって、該２組のプライマーセットによるＰＣＲ産物の長さが各々異なり、（Ａ)第１のプライマーセットにおいて、ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている変異型特異プライマーであって、及び第２のプライマーセットにおいて、アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーである、又は、(Ｂ)第１のプライマーセットにおいて、ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーであって、第２のプライマーセットにおいて、アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている変異型特異プライマーである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されているアッパープライマー又はロワープライマーの配列において、一塩基変異多型部位に相当する塩基が３′末端にある、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されているアッパープライマー又はロワープライマーの配列において、一塩基変異多型部位に相当する塩基が３′末端から２番目にある、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
請求項１記載の、標的ＤＮＡ配列において一塩基変異多型の存在を検出する方法であって、以下（１）〜（６）から選ばれるいずれかの態様でＰＣＲ法を実施する方法：
（１）標的ＤＮＡ配列の変異型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマーと、該ロワープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するアッパープライマーとのプライマーセット、及び変異型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む上記部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるプライマーを用いる；
（２）標的ＤＮＡ配列の変異型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマーと、該アッパープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するロワープライマーとのプライマーセット、及び変異型のアンチセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む上記部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるプライマーを用いる；
（３）標的ＤＮＡ配列の正常型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマーと、該ロワープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するアッパープライマーとのプライマーセット、及び正常型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む上記部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるプライマーを用いる；
（４）標的ＤＮＡ配列の正常型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマーと、該アッパープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するロワープライマーとのプライマーセット、及び正常型のアンチセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む上記部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるプライマーを用いる；
（５）標的ＤＮＡ配列の変異型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマーと、該ロワープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するアッパープライマーとのプライマーセット、及び標的ＤＮＡ配列の正常型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマーと、該アッパープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するロワープライマーとのプライマーセットを用い、上記２組のプライマーセットによるＰＣＲ産物の長さが異なる；又は
（６）標的ＤＮＡ配列の正常型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマーと、該ロワープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するアッパープライマーとのプライマーセット、及び標的ＤＮＡ配列の変異型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマーと、該アッパープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するロワープライマーとのプライマーセットを用い、上記２組のプライマーセットによるＰＣＲ産物の長さが異なる。
【請求項６】
標的ＤＮＡ配列の一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマー又はアッパープライマーにおいて、一塩基変異多型部位がその３′末端になるか、又は３′末端から２番目になるように設計されている、請求項５記載の方法。
【請求項７】
プライマーが核酸である請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
プライマーがＤＮＡである請求項７記載の方法。
【請求項９】
プライマーが鋳型ＤＮＡにアニールすることができ、且つポリメラーゼによって伸長反応され得る修飾された核酸である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
プライマーが標識されている請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
プライマーが酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質、抗原、抗体及び放射性物質から選ばれる標識で標識されている、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ＰＣＲ産物の検出を、ＰＣＲ産物のサイズを電気泳動、質量分析及び液体クロマトグラフィーから選ばれる手段によって検出することによって実施する請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
ＰＣＲ産物の検出を、ＰＣＲ産物の長さ及び量を同時に又は別々に検出することによって実施する請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１４】
検体中に含まれる一塩基変異多型部位を含むＤＮＡ配列を予め増幅しておくことを含む請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
一塩基変異多型部位を含むＤＮＡ配列を増幅する方法が、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＲＣＲ法及びＴＭＡ法から選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
標的ＤＮＡ配列において一塩基変異多型の存在を検出するためのＰＣＲ法の実施に使用するキットであって、
(a)標的ＤＮＡ配列に対するプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該アッパープライマー及び該ロワープライマーのいずれか一方が、その配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている；及び
(b)配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている上記(a)の該アッパープライマー又は該ロワープライマーの５′末端側に位置する更なるプライマー
を含むキット。
【請求項１７】
標的ＤＮＡ配列において一塩基変異多型の存在を検出するためのＰＣＲ法の実施に使用するキットであって、
(a)標的ＤＮＡ配列に対する第１のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている変異型特異プライマーである；及び
(b)標的ＤＮＡ配列に対する第２のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーである
を含み、第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットの各々によるＰＣＲ産物の長さが異なるキット、又は
(a)標的ＤＮＡ配列に対する第１のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーである；及び
(b)標的ＤＮＡ配列に対する第２のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている変異型特異プライマーである
を含み、第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットの各々によるＰＣＲ産物の長さが異なるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＤＮＡ（deoxyribonucleic acid）、例えば遺伝子ＤＮＡの一塩基変異多型（single nucleotide polymorphisms: SNPs）を検出するための方法に関し、より具体的には改良されたＰＣＲ法を採用した一塩基変異多型を検出する方法に関する。本発明はさらに、そのような方法に使用できるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子における一塩基変異多型が注目され、一塩基変異多型の分析が、疾患遺伝子の探索、疾患や薬剤感受性と一塩基変異多型との関連などの研究に進み、さらには、テーラーメード医療を可能とすることが期待されている。
このような注目の中、遺伝子ＤＮＡの一塩基変異多型を検出する方法が種々検討され、提案されている。
ＰＣＲ法（Polymerase Chain Reaction）を用いた遺伝子診断法の中で、点突然変異の遺伝子異常を検出する方法は２種類に分類される。一つは既知の点変異を検出する方法、他の一つは未知の点変異をスクリーニングする方法である。前者の既知の点変異を感度よく検出する方法の一つとして、アレル特異的ＰＣＲ法（Allele Specific PCR、略称ＡＳ−ＰＣＲ）が提案されていて、これはまたＭＡＳＡ法（Mutant Allele Specific Amplification）とも呼ばれている（例えば非特許文献１参照）。ＭＡＳＡ法はＰＣＲ機械と電気泳動装置ならびに反応試薬があれば比較的簡単で、適切なＰＣＲプライマー設計とＰＣＲ条件の基礎検討を充分に行うことで、再現性のよい精度の高い結果が得られるとされている。
「アレル」とは対立遺伝子のことで、倍数体のゲノムを持つ生物において、相同染色体の相同な場所に位置して機能的にも相同な遺伝子をいう。受精、接合などによって配偶子から一つずつ受け継がれるものである。
【０００３】
ＡＳ−ＰＣＲ法は、約２０塩基程度からなる変異ＤＮＡ特異的オリゴヌクレオチドを合成し、鋳型（テンプレート）となるＤＮＡと耐熱性ポリメラーゼとともにＰＣＲ反応させて、変異アレルを特異的に増幅して、ゲル電気泳動によってバンドとして検出することからなる。増幅方法は、前半で変異アレルの一塩基置換配列と相補性を持つプライマーを用いてＰＣＲ反応をさせることで変異アレルが特異的に増幅される。ＡＳ−ＰＣＲ法の応用例は複数の文献に紹介されている（例えば非特許文献２参照）。
【０００４】
ＡＳ−ＰＣＲ法の具体的手法としては次のような例がある：まず変異部分を含むＤＮＡ断片を増幅させるように、変異部分を挟むように１組のプライマーを用意する；この１組において、アンチセンス鎖の基になるプライマー（ロワープライマー）は変異部分とは別の通常ある塩基配列に相当するように設計し、及び、センス鎖の基になるプライマー（アッパープライマー）は変異型塩基に相当する塩基が３′末端になるように設計する（すなわち変異型特異プライマーとする。）；そしてＰＣＲの条件が、変異アレルは効率よく増幅するが正常アレルの増幅効率は悪いように厳密に設計する；こうしてＰＣＲ反応を実施することにより、試料中に変異アレルＤＮＡが含まれるときに、所定の長さの断片が増幅され、電気泳動の結果として陽性バンドとして検出され、増幅産物の長さを確認することで変異アレルＤＮＡを同定することができる。ここでもし試料中に正常アレルＤＮＡが含まれるときには、上記アッパープライマー（変異型特異プライマー）の３′末端が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミスマッチ）ため伸長反応が起きず、核酸の増幅が起きない。一方、試料中の遺伝子が変異アレルのときに、正常型特異プライマー（正常型塩基に相当する塩基が３′末端になるように設計されたプライマー）を用いた場合には増幅が起きないことになる。
上述にあるプライマーセットの一方である、変異型特異プライマー又は正常型特異プライマーをアレル特異的プライマー（Allele Specific primer）と呼ぶ。
このように正常型特異プライマーと変異型特異プライマーの各々のプライマーを用いた場合に、所定の長さのＤＮＡ断片の増幅が起きるか否かを調べることにより、試料遺伝子ＤＮＡが正常型か変異型かを判別することができる。
ここに添付する図１は、標的ＤＮＡ配列とプライマーセットの関係を示し、ＡＳ−ＰＣＲ法の原理を概略して説明するものである。図１はアッパープライマーがアレル特異的プライマーとなっている例を示している。
【０００５】
従来技術として、例えば塩基多型を検出するために用いるプライマーの配列に工夫が提案されている（特許文献１参照。）。
ＡＳ−ＰＣＲ法はアレル特異的プライマーを用いて一塩基変異多型の存在を検出する方法であるが、実際には一塩基の違いによるプライマーのアニール効率の変動によってなされている。しかし、ＤＮＡの塩基対によってはこの差が僅かなため、正常型及び変異型の両者においてＰＣＲ産物が増幅する又は出現しないという同じ結果となり、正確な判定が困難となる場合が少なくない。また、用いる機器やその他の条件の違いによっても結果に大きな影響を与える。そのため、ＡＳ−ＰＣＲ法の実施には、その環境に合わせ、アレル特異的なプライマーの配列設計や反応温度などを注意深く設定する必要がある。
ＰＣＲ法は、目的となるＤＮＡ断片を飛躍的に増加させる方法であるため、ごく僅かな非特異的反応によっても、増幅を確認できるまでになる。ＡＳ−ＰＣＲ法において、上記のような厳密な条件設定を行っても、鋳型となるＤＮＡコピー数がある一定の濃度を超えた場合には、正常型および変異型の両者において増幅が起こり、一塩基変異多型の識別ができないという問題を残す。ＰＣＲ法のサイクルが一定以上の数を過ぎた場合も同様の結果が生じる。
【０００６】
また、鋳型となるＤＮＡのコピー数がごく少ない場合には、２段階のＰＣＲによって増幅する場合がある。具体的には、１段階目のＰＣＲにおいて、目的のＤＮＡ断片を含むように広い領域をＰＣＲ法で増幅し、２段階目のＰＣＲにおいてはこの産物を鋳型とし、ＡＳ−ＰＣＲ法を用いて一塩基変異多型の存在を検出する場合がある。この際に、１段階目のＰＣＲにおいて得られるＤＮＡ断片の量が一定の濃度を超える場合が生じ、２段階目に行うＡＳ−ＰＣＲによる一塩基変異多型の識別ができないという問題が生じる。
このような状況下、ＡＳ−ＰＣＲ法を効率よく実施し、且つ高感度で判定を正確に行うことが求められている。
【０００７】
【非特許文献１】Takeda, S., Ichii, S., Nakamura, Y. 著、「Hum. Mutation, 2」、1993年、p.112-117
【非特許文献２】関谷剛男、藤永恵編、「ＰＣＲ法最前線 基礎技術から応用まで」、共立出版株式会社、1997年６月15日、p.140-142
【特許文献１】特開２００２−１７１９８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、標的ＤＮＡ配列において一塩基変異多型の存在を検出する方法において、ＰＣＲ法、とりわけＡＳ-ＰＣＲ法の実施にあたり、一塩基多型の識別効果を充分に発揮させ、高感度で判定をより正確に行うことができる改良された方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を達成するために鋭意研究を重ねた結果、従来ＰＣＲ法が、ＰＣＲ反応液中に一組のプライマーセット（アッパープライマーとロワープライマー）を添加して実施するのに対し、更なるプライマーを加えてＰＣＲ法を実施することにより、検体が高濃度の遺伝子を含有するときにも一塩基多型の識別効果を充分に発揮させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明の方法によれば、一塩基多型の識別効果を充分に発揮させることから、上記プライマーセットによって増幅されることが意図されるタイプの遺伝子断片が、検体中における当該タイプの遺伝子の存在又は非存在に応じて正確に、増幅する又は出現しないという結果をもって判定することができる。
【００１０】
従って本発明は、標的ＤＮＡ配列において一塩基変異多型の存在を検出する方法であって、該標的ＤＮＡ配列に対するプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）を用い、該アッパープライマー及び該ロワープライマーのいずれか一方が、その配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されていて、及び、上記のようにそのの５′末端側に位置する更なるプライマーを用いてＰＣＲ法を実施し、次いでＰＣＲ産物を検出することを含む方法である。
本発明の上記方法において具体的に、配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている該アッパープライマー又は該ロワープライマーが、アレル特異的プライマーであって、変異型特異プライマー又は正常型特異プライマーとなる。
【００１１】
本発明の方法を適用することができる標的ＤＮＡ配列は、特に制限されるものではなく、例えば遺伝子ＤＮＡ配列などである。
本明細書中で、正常型と変異型とは、標的ＤＮＡ配列における一塩基変異多型が正常型と変異型とに分類できる場合には前者と後者をそれぞれ表し、標的ＤＮＡ配列の一塩基変異多型が正常型と変異型とに分類して呼称できないときには、一塩基変異多型の一方と他方をそれぞれ表すものとする。正常型と変異型は、例えば正常型と疾病型、あるいは野生型と変異型、に置き換えることもできる。
【００１２】
また、本発明の方法を実施するにあたって、２組のプライマーセットを同時に用いることもできる。具体的には、該２組のプライマーセットによるＰＣＲ産物の長さが各々異なり、以下の（Ａ）又は（Ｂ）の態様で実施することができる：（Ａ)第１のプライマーセットにおいて、ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されているであって、及び第２のプライマーセットにおいて、アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーである、又は、(Ｂ)第１のプライマーセットにおいて、ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーであって、第２のプライマーセットにおいて、アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている変異型特異プライマーである。
上記（Ａ）又は（Ｂ）の態様において、第１のプライマーセットに関する更なるプライマーは、第２のプライマーセットのロワープライマーとなり、第２のプライマーセットに関する更なるプライマーは、第１のプライマーセットのアッパープライマーとなる。
【００１３】
本発明の実施態様において、配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている上記アッパープライマー又はロワープライマーの配列において、一塩基変異多型部位に相当する塩基が３′末端にあるように設計することができる。
本発明の別の実施態様において、配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている上記アッパープライマー又はロワープライマーの配列において、一塩基変異多型部位に相当する塩基が３′末端から２番目にあるように設計することができる。
【００１４】
本発明はさらに、標的ＤＮＡ配列において一塩基変異多型の存在を検出するためのＰＣＲ法の実施に使用するキットであって、
(a)標的ＤＮＡ配列に対するプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該アッパープライマー及び該ロワープライマーのいずれか一方が、その配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている；及び
(b)配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている上記(a)の該アッパープライマー又は該ロワープライマーの５′末端側に位置する更なるプライマー
を含むキットに向けられている。
【００１５】
本発明はまた、標的ＤＮＡ配列において一塩基変異多型の存在を検出するためのＰＣＲ法の実施に使用するキットであって、
(a)標的ＤＮＡ配列に対する第１のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている変異型特異プライマーである；及び
(b)標的ＤＮＡ配列に対する第２のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーである
を含み、第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットの各々によるＰＣＲ産物の長さが異なるキット、又は
(a)標的ＤＮＡ配列に対する第１のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーである；及び
(b)標的ＤＮＡ配列に対する第２のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている変異型特異プライマーである
を含み、第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットの各々によるＰＣＲ産物の長さが異なるキット
に向けられている。
【００１６】
本明細書中において一塩基変異多型とは、一塩基のみが変異している多型のほかに、一塩基変異が２ヶ所以上存在する、すなわち２塩基以上で数塩基までの変異による多型や、一塩基以上で数塩基までの挿入や欠損による多型を包含する。従って本明細書中で一塩基変異多型部位とは、一塩基のみが変異している部位、一塩基変異が２ヶ所以上存在する部位、一塩基以上数塩基までの挿入や欠損がある部位を包含して意味する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の、標的ＤＮＡ配列において一塩基変異多型の存在を検出する方法によれば、たとえ検体中にテンプレートＤＮＡが比較的高濃度で存在したとしても、又はＰＣＲ法のサイクルが一定以上の数を過ぎた場合でも、一塩基多型の識別効果を充分に発揮させることができ、その結果、標的ＤＮＡ配列における一塩基変異多型の存在を、高感度でより正確な判定をもって検出することができる。より詳しくは、本発明の方法によれば、アレル特異的プライマーを一方とするプライマーセットによって増幅されることが意図されるタイプのＤＮＡ断片が、検体中における当該タイプの一塩基多型の存在又は非存在に応じて正確に、増幅する又は出現しないという結果をもって判定することができる。
本発明の、標的ＤＮＡ配列において一塩基変異多型の存在を検出する方法は、一塩基変異多型の解析や、更に遺伝病の診断などにも有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に本発明を詳細に説明する。
先ず、従来のＡＳ−ＰＣＲ法（アレル特異的ＰＣＲ法）における一般的なプライマーセットのデザインの一例を図２に示す。図２は、アルデヒドデヒドロゲナーゼII（ALDH2）のエクソン１２にある一塩基変異多型（Ｇ又はＡ）を想定し、一塩基変異多型部位を○又は□で示している。図２では、一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されるプライマー、すなわちアレル特異的プライマー（変異型特異プライマー又は正常型特異プライマー）はロワープライマーとして設計されている。該アレル特異的プライマーは“ALDH2R Normal”、“ALDH2R Mutant”と示され、ここで RはReverseの略であって、ロワープライマーであることを意味する。一方アッパープライマーはALDH2に通常ある配列位置に設計されている。
図２の例では、ＰＣＲ反応により１５７塩基対（157bp）のＤＮＡ断片の増幅の有無が意図される。図２の上図は正常型ALDH2に対して変異型特異プライマーがミスマッチであることを示していて、検体中に正常型ALDH2があるときに変異型特異プライマーの使用によれば１５７bpのＤＮＡ断片の増幅がなく、一方正常型特異プライマーの使用によれば１５７bpのＤＮＡ断片の増幅が観察されるはずである。図２の下図では異常型ALDH2に対して正常型特異プライマーがミスマッチであることを示していて、検体中に異常型ALDH2があるときに正常型特異プライマーの使用によれば１５７bpのＤＮＡ断片の増幅がなく、一方変異型特異プライマーの使用によれば、１５７bpのＤＮＡ断片の増幅が観察されるはずである。
【００１９】
ところが、検体中に例えば正常型ALDH2遺伝子が比較的多量に存在するとき、すなわち図２の上図の場合、変異型特異プライマーを使用したプライマーセットによって実際、正常型 ALDH2の遺伝子断片の増幅が起きてしまう。このような状況から、ＰＣＲ反応の結果として157bpの遺伝子断片の増幅が電気泳動によるバンドとして確認されたからといって、検出に使用したアレル特異的プライマーに対応した型の遺伝子が検体中に必ずしも存在すると判定することができない。結局、正常型ALDH2遺伝子が存在するのか、又は、変異型ALDH2遺伝子が存在するのか判別がつかないことになり、検体における所定の遺伝子型の存在、不存在が判定できない。
【００２０】
本発明では従来のＡＳ−ＰＣＲ法に更なる追加のプライマーを用いてＰＣＲ法を実施する。本発明の方法で使用するプライマーセット及び更なるプライマーのデザインの一例を、図３に概略的に示す。図３も、アルデヒドデヒドロゲナーゼII（ALDH2）のエクソン１２にある一塩基変異多型（Ｇ又はＡ）を想定し、一塩基変異多型部位を○又は□で示している。図３でもまた、一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されるプライマー、すなわちアレル特異的プライマー（変異型特異プライマー又は正常型特異プライマー）がロワープライマー（lower primer）として設計されている。該アレル特異的プライマーは“ALDH2R Normal”、“ALDH2R Mutant”と示され、ここで RはReverseの略であって、ロワープライマーであることを意味する。一方アッパープライマー（upper primer）はALDH2に通常ある配列位置に設計されている。
図３の例では、ＰＣＲ反応によりアレル特異的プライマーを一方とするプライマーセットによって、１５７塩基対（157bp）のＤＮＡ断片の増幅の有無が意図される。本発明の方法では、上記アレル特異的プライマーの５′末端側に位置する更なるプライマーを用いる。図３中、該更なるプライマーを“ALDH2 outer”と示しており、以下、本発明で使用する該更なるプライマーを“アウタープライマー”（outer primer）とも呼ぶ。
図３の例において、アッパープライマーとアウタープライマーにより３９４塩基対（394bp）の断片の増幅があり得る。
【００２１】
本発明によれば、アウタープライマーを用いることで、アレル特異的プライマーによる一塩基多型の識別効果を向上させることができる。従って、図３でいえば、ＰＣＲ反応の結果、３９４ｂｐの断片の増幅が起こったとしても、１５７ｂｐの断片の増幅の有無が、検体における所定の遺伝子型の存在、不存在の正確な判定につながる。
例えば、標的遺伝子ＤＮＡがＡＬＤＨ２であるとき、変異型特異プライマーの使用により157bpのＤＮＡ断片の増幅がなければ、正常型ＡＬＤＨ２が存在すると判定でき、増幅があれば変異型ＡＬＤＨ２が存在すると判定できる。ＰＣＲ反応により、たとえ３９４ｂｐの断片の増幅があったとしても、電気泳動といった手段により３９４ｂｐの断片とは明らかに識別することができる、アレル特異的プライマーを一方とするプライマーセットにより増幅が意図される特定の長さの断片、すなわち１５７ｂｐ断片の増幅の有無をもって検体における所定の遺伝子型の存在、不存在が判定できることは、たいへんに有利である。
【００２２】
本発明の方法はさらに、２組のプライマーセットを用いて実施することもできる。すなわち以下の（Ａ）又は（Ｂ）の態様で実施することができる：（Ａ)第１のプライマーセットにおいて、ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている変異型特異プライマーであって、及び第２のプライマーセットにおいて、アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーである、又は、(Ｂ)第１のプライマーセットにおいて、ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーであって、第２のプライマーセットにおいて、アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている変異型特異プライマーである。ここで、第１のプライマーセットと第２のプライマーセットとによるＰＣＲ産物の長さが各々異なるものである。
【００２３】
上記（Ａ）及び（Ｂ）の態様で使用するプライマーの関係を図４に概略して示す。
上記（Ａ）又は（Ｂ）の態様において、第１のプライマーセットに関する更なるプライマーは、第２のプライマーセットのロワープライマーとなり、第２のプライマーセットに関する更なるプライマーは、第１のプライマーセットのアッパープライマーとなる。
図４で説明すると、本発明の方法によればＺ(bp）の断片の増幅が起こり得るが、Ｘ(bp）断片の増幅の有無、Ｙ(bp）断片の増幅の有無、さらにはＸ(bp）とＹ(bp）の断片の増幅を検出することよって、検体における所定の一塩基多型の存在、不存在が判定できる。
このように２組のプライマーセットを用いて実施する本発明の方法により、ヒトの診断等においては正常型、あるいは変異型というホモ型の検出のみならず、ヘテロ型の検出も可能となる。
【００２４】
本発明の方法の実施にあたり使用するプライマーセット及び更なるプライマーについて、以下の具体的態様がある。
（１）標的ＤＮＡ配列の変異型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマーと、該ロワープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するアッパープライマーとのプライマーセット、及び変異型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む上記部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるプライマーを用いる；
（２）標的ＤＮＡ配列の変異型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマーと、該アッパープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するロワープライマーとのプライマーセット、及び変異型のアンチセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む上記部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるプライマーを用いる；
（３）標的ＤＮＡ配列の正常型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマーと、該ロワープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するアッパープライマーとのプライマーセット、及び正常型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む上記部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるプライマーを用いる；又は
（４）標的ＤＮＡ配列の正常型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマーと、該アッパープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するロワープライマーとのプライマーセット、及び正常型のアンチセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む上記部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるプライマーを用いる；
【００２５】
（５）標的ＤＮＡ配列の変異型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマーと、該ロワープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するアッパープライマーとのプライマーセット、及び標的ＤＮＡ配列の正常型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマーと、該アッパープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するロワープライマーとのプライマーセットを用い、上記２組のプライマーセットによるＰＣＲ産物の長さが異なる；又は
（６）標的ＤＮＡ配列の正常型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマーと、該ロワープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するアッパープライマーとのプライマーセット、及び標的ＤＮＡ配列の変異型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマーと、該アッパープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するロワープライマーとのプライマーセットを用い、上記２組のプライマーセットによるＰＣＲ産物の長さが異なる。
なお、上記（５）の態様において、前者のプライマーセットに関するアウタープライマーの役目をするのが後者のプライマーセットのロワープライマーであり、後者のプライマーセットに関するアウタープライマーの役目をするのが前者のアッパープライマーである。
上記（６）の態様においても、前者のプライマーセットに関するアウタープライマーの役目をするのが後者のプライマーセットのロワープライマーであり、後者のプライマーセットに関するアウタープライマーの役目をするのが前者のアッパープライマーである。
【００２６】
本発明のキットは、(a)標的ＤＮＡ配列に対するプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該アッパープライマー及び該ロワープライマーのいずれか一方が、その配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている；及び(b)配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている上記(a)の該アッパープライマー又は該ロワープライマーの５′末端側に位置する更なるプライマーを含む。
本発明のキットの別の態様は、２組のプライマーセットを含むキットであり、具体的には、
(a)標的ＤＮＡ配列に対する第１のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている変異型特異プライマーである；及び
(b)標的ＤＮＡ配列に対する第２のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーである
を含み、第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットの各々によるＰＣＲ産物の長さが異なるキット、又は
(a)標的ＤＮＡ配列に対する第１のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーである；及び
(b)標的ＤＮＡ配列に対する第２のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている変異型特異プライマーである
を含み、第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットの各々によるＰＣＲ産物の長さが異なるキット
である。
【００２７】
本発明のキットには具体的に、上記の各態様(1)〜(6)に記載されているプライマーを含ませることができる。
本発明のキットには更に、ＰＣＲ法の実施に使用する試薬（例えば耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、塩類など）、及び上記の一塩基多型部位を増幅させる領域以外に設計したプライマー、例えば標的遺伝子以外の遺伝子の配列にアニールするように設計したプライマーなどから選ばれる少なくとも一種を含ませることができる。また、プライマーとなり得ないが標的ＤＮＡ配列にアニールすることができる核酸類（ＰＮＡなど）も含ませることができる。
【００２８】
本発明で用いるプライマーは通常、核酸であって、中でもＤＮＡが好ましく用いられる。
このプライマーは標的ＤＮＡ配列にアニールでき、且つＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応できる範囲であれば、修飾した構造を有する核酸であってもよい。また、本発明で用いるプライマーは例えば酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質、抗原、抗体、放射性物質などで標識されていてもよく、これらの標識位置はプライマーの３′末端以外であればかまわない。
【００２９】
本発明で用いるプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマーであって、そのいずれか一方がその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている。）におけるプライマーは、その長さが１０〜４０塩基が適当であり、好ましくはそれらのＴｍ値が５０〜７５℃のものである。
該プライマーセットによって増幅が意図される断片の長さは１００〜２０００塩基対の範囲が適当であり、好ましくは１００〜６００塩基対の範囲が適当である。
上記プライマーセットのうち、配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されるアッパープライマー又はロワープライマー（アレル特異的プライマー）において、好ましくは該一塩基変異多型部位に相当する塩基が３′末端にあるように設計される。あるいは、該一塩基変異多型部位に相当する塩基が３′末端から２番目の位置から５′末端までにあるように設計することができ、特に該一塩基変異多型部位に相当する塩基が３′末端から２番目から１０番目までにあるように設計することが適当であって、中でも該一塩基変異多型部位に相当する塩基が３′末端から２番目にあるように設計することが適当である。
また、上記アレル特異的プライマーの３′末端より５′末端までの配列において、標的ＤＮＡ配列に対して相補的でない塩基に１ヶ所以上置換することもできる。
【００３０】
一方、本発明で使用するアウタープライマーは、その長さが１０〜４０塩基が適当であり、好ましくはそれらのＴｍ値が５０〜７５℃のものである。
アウタープライマーをセッティングする位置は、後に用いる電気泳動法やその他の分析法によって識別することができる産物長に応じて変動させることができるが、上記のアレル特異的プライマーのセッティング位置から一般的に１０〜１５００塩基の範囲で離れていてよく、好ましくは２００〜８００塩基の範囲で離れているものである。
【００３１】
本発明の方法を２組のプライマーセットを同時に用いて実施するとき、すなわち上記（５）又は（６）の態様で実施するとき、各プライマーセットは上記の条件を満たすべきであり、且つアレル特異的プライマー以外のプライマーは上記のアウタープライマーの条件を満たすべきであり、それをセッティングする位置は、他方のプライマーセットにおけるアレル特異的プライマーのセッティング位置から一般的に１０〜１５００塩基の範囲で離れるように、好ましくは２００〜８００塩基の範囲で離れているようにする。
上記（５）又は（６）の態様で実施するときはまた、２組のプライマーセットによるＰＣＲ産物の長さが異なるようにプライマーセットを設計し、２組のプライマーセットのＰＣＲ産物の長さの差は後に用いる電気泳動法やその他の分析法によって充分に識別することができるものであればよい。それらのＰＣＲ産物の長さの差は一般に１塩基以上あればよい。
【００３２】
本発明の方法におけるＰＣＲ反応は、常法に従ったものでよい。例えば変性ステップ、アニーリング反応及び伸長反応の３工程からなり、又は、変性ステップと、アニーリング反応及び伸長反応を同一温度で行う工程との２工程からなる。各工程の条件、使用する試薬などは常法に従って適宜選択することができる。
ＰＣＲ反応に使用するＤＮＡポリメラーゼとして、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであれば特に制限されず、Taq ＤＮＡポリメラーゼや ExTaq ＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。一般に、突然変異の導入を防ぎ最終産物の収量を増加させるために、ExTaq ＤＮＡポリメラーゼを使用するのが好ましい。その他の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することも可能であって、例えば Pfu turbo（Stratagene製）などを使用することができる。
ＰＣＲ反応溶液の組成は常法に従うことができる。例えば、反応時 0.2〜0.3mM のデオキシヌクレオチド３リン酸、0.1〜10 pmol/μl、好ましくは0.5〜２pmol/μlの各プライマー、0.1〜10 unit/μlのＤＮＡポリメラーゼ、酵素に添付されているバッファー 1/10量程度である。
【００３３】
テンプレートＤＮＡとしては、例えば一塩基変異多型部位を含むＤＮＡ配列を有するプラスミドを用いることができ、該プラスミドは適当なものを選択することができ、市販のプラスミド調製キットを用いることが可能である。クローニングした大腸菌を増菌培養し、集菌後、溶菌操作によりプラスミドを含むＤＮＡを抽出する。逆相担体にそのＤＮＡ抽出液を保持させ、各溶出バッファーを用いてプラスミドＤＮＡを選択的に分離精製する。
また、検体中に含まれる一塩基変異多型部位を含むＤＮＡ配列を予め増幅しておくこともできる。このとき採用する核酸増幅法としては、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification Method; Nature, 1991, Vol. 350, p.91）、ＬＣＲ法（Ligase Chain Reaction; 国際公開第89/12696号パンフレット）、ＳＤＡ法（Strand Displacement Amplification Method; Nucleic Acid Research, 1992, Vol. 20, p.1691）、ＲＣＲ法（Recombinatorial Chain Reaction）、ＴＭＡ法（Transcription mediated Amplification Method; J. Clin. Microbiol, 1993, Vol. 31, p.3270）などから選択することができる。
【００３４】
ＰＣＲ産物をテンプレートとする場合、市販のＰＣＲ産物精製キットを用いることが可能である。ＰＣＲ反応液をバッファーで平衡化した逆相担体に保持させ、各溶出バッファーを用いてＰＣＲ産物を選択的に分離精製する。
また、ゲノムＤＮＡをテンプレートとすることもでき、市販のＤＮＡ抽出キットを用いることが可能である。培養細胞、血液、口内膜、髪の毛、爪などからその組織や細胞を回収し細胞膜を溶解してＤＮＡを抽出する。逆相担体にそのＤＮＡ抽出液を保持させ、各溶出バッファーを用いてゲノムＤＮＡを選択的に分離精製する。
反応溶液におけるテンプレートＤＮＡ溶液は、1/20〜1/10量ほどが適当である。また、検体中におけるテンプレートＤＮＡ濃度は、コピー数１０3以上が適当であり、少なくとも１０9程度まで問題ない。
【００３５】
本発明のＰＣＲ反応における各ステップの反応時間、温度、サイクル数は適宜選択できる。変性ステップは、２本鎖ＤＮＡを１本鎖へと変性させるのに充分な条件を適宜選択し実施すればよい。一般に変性ステップは、９０〜１００℃、１０〜９０秒の範囲で実施され、さらに９４〜９８℃、２０〜４０秒がより好ましい。変性のステップに続きアニーリングステップは、ＤＮＡプライマーのＴｍ値±１０℃程度の温度で実施され、一般的に４５〜６５℃の範囲で３０〜９０秒である。さらに伸長ステップは一般的に６８〜７２℃、３０〜１５０秒である。サイクル数は一般に２５〜５０の範囲である。
ＤＮＡプライマーのＴｍ値が比較的高い場合、アニーリングの温度が伸長反応の温度に近づくために、アニーリングと伸長反応を同一温度で行うことがある。このときは、変性ステップと、アニーリング及び伸長反応ステップの２工程でＰＣＲ反応を実施することになる。
【００３６】
こうして増幅されたＰＣＲ産物は、常法に従って検出することができる。例えば電気泳動（アガロースゲル電気泳動やポリアクリルアミドゲル電気泳動など）、質量分析、液体クロマトグラフィーなどの手段により、ＰＣＲ産物のサイズ（長さや分子量）を検出することができる。これらの操作は常法に従って実施することができる。例えば、電気泳動後、適当な色素などでＤＮＡを染色し、ＵＶで写真撮影などを行うことができる。
また、プライマーとして、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質、抗原、抗体、放射性物質などで標識した標識プライマーを用いた場合に、各標識を使い分けることによって、増幅されたそれぞれのＰＣＲ産物について、そのサイズ及び量を同時に又は別々に検出、測定することができる。
【００３７】
以下に参考例、及び実施例をもって本発明を詳細に説明する。本発明はこれらの記載に限定されるものではない。
〔参考例１〕
アルデヒドデヒドロゲナーゼII（ALDH2）の一塩基変異多型の検出を、従来のＰＣＲ法で実施した。
ALDH2の一塩基変異多型部位（変異点）：114（Ｇ又はＡ）
ALDH2の一塩基変異多型部位を含む部分的な配列は、以下のとおりである。下線部が変異点である。
Ｇ型テンプレート部分配列：
5′tgcaggcata cactgaagtg aaaactgtga  3′
Ａ型テンプレート部分配列：
5′tgcaggcata cactaaagtg aaaactgtga  3′
【００３８】
[材料の調製]
以下のＤＮＡプライマーセットを用意した。なお、ロワープライマーをアレル特異的プライマーとした。
アッパープライマー
5′caaattacag ggtcaactgc t  3′(21mer)（配列番号１）
ロワープライマー
正常型  5′ccacactcac agttttctct tc  3′(22mer)（配列番号２）
変異型  5′ccacactcac agttttctct tt  3′(22mer)（配列番号３）
これらのプライマーセットで増幅される断片の長さは１５７塩基対である。
これらのプライマーのデザインの概略は、図２に示されるとおりである。
【００３９】
テンプレートＤＮＡには、pGEM（登録商標）-T Easy Vector(3015bp)プラスミドを用いて、ALDH2のＧ型及びＡ型のそれぞれの配列をインサートしたものを用意した。ここで用いたpGEM-T Easy Vectorを図５に示し、及びＧ型（正常型）及びＡ型（変異型）の各々のインサート配列を図６及び図７に示す（それぞれ配列番号４及び５参照）。図６及び図７で四角で囲んだ箇所が一塩基変異多型部位である。
【００４０】
［ＰＣＲ法の実施］
以下のＰＣＲ条件を採用した。
PCR反応溶液の組成
10× Ex Taq バッファー(TaKaRa)     2μl
2.5mM dNTP ミックス                2μl
10pmol/μl アッパープライマー      2μl
10pmol/μl ロワープライマー        2μl
Ex Taq DNA ポリメラーゼ(TaKaRa)    0.2μl
（プラスミド）DNA溶液              2μl
滅菌水                             9.8μl  
計                                20μl
なお、この反応系においてテンプレートが１０3、１０4、１０5、１０6、１０7コピー存在するように調製する。
【００４１】
ＰＣＲサイクル条件は以下のとおり行う。
98℃ １分
↓
(1)98℃ ２０秒
(2)63℃ ２０秒
(3)72℃ ４５秒
（上記(1)〜(3)を３５回繰り返す。）
↓
72℃ ５分
上記の条件でPCR反応を行い、反応液５μlを３％アガロースゲル電気泳動に供する。そしてエチジウムブロマイドによりDNAを染色し、UVで写真撮影する。
【００４２】
上記の系及び操作に従って、使用するテンプレートのタイプ及びロワープライマー（アレル特異的プライマー）のタイプの組合せを４種類とし、各組合せにおいて、反応溶液におけるテンプレートのコピー数を１０3〜１０7コピーの範囲で変動させた条件で、ＰＣＲ反応を実施した。以下の表１に各試験の条件をまとめる。
【００４３】
【表１】
2005323565.tif 000003
【００４４】
ＵＶで写真撮影した結果を図８に示す。図８中、レーンＭはマーカーを表し、レーン１〜１０はそれぞれ上記試験No.１〜１０に相当する。
この結果から、ＡＳ−ＰＣＲ法の原理によれば電気泳動による陽性バンドが現われるはずのない試験No.６〜１０において、反応溶液におけるテンプレートコピー濃度が比較的高い１０7〜１０4コピー（試験No.６〜９）で陽性バンドが観察された。同じく陽性バンドが現われるはずのない試験No.１１〜１５において、反応溶液におけるテンプレートコピー濃度が比較的高い１０7〜１０5コピー（試験No.１１〜１３）で陽性バンドが観察された。
【００４５】
〔実施例１〕
参考例１で使用したテンプレートＤＮＡ、及び上記参考例１で使用したプライマーセットに加えて、以下の配列のアウタープライマーを用い、アルデヒドデヒドロゲナーゼII（ALDH2）の一塩基変異多型の検出を、ＰＣＲ反応にて行った。
ALDH2 アウタープライマー
5'  ctactaattt cccattttaa gcct  3'(24mer)（配列番号６）
実施例１で使用するプライマーのデザインの概略は、図３に示されるとおりである。
アッパープライマーとアウタープライマーにより増幅される断片の長さは３９４塩基対である。
【００４６】
［ＰＣＲ法の実施］
以下のＰＣＲ条件を採用した。
PCR反応溶液の組成
10× Ex Taq バッファー(TaKaRa)     2μl
2.5mM dNTP ミックス                2μl
10pmol/μl アッパープライマー      2μl
10pmol/μl ロワープライマー        2μl
10pmol/μl アウタープライマー      2μl
Ex Taq DNA ポリメラーゼ(TaKaRa)    0.2μl
（プラスミド）DNA溶液              2μl
滅菌水                             7.8μl  
計                                20μl
なお、この反応系においてテンプレートが１０3、１０4、１０5、１０6、１０7コピー存在するように調製する。
【００４７】
ＰＣＲサイクル条件は以下のとおり行う。
98℃ １分
↓
(1)98℃ ２０秒
(2)63℃ ２０秒
(3)72℃ ４５秒
（上記(1)〜(3)を３５回繰り返す。）
↓
72℃ ５分
上記の条件でPCR反応を行い、反応液５μlを３％アガロースゲル電気泳動に供する。そしてエチジウムブロマイドによりDNAを染色し、UVで写真撮影する。
【００４８】
上記の系及び操作に従って、使用するテンプレートのタイプ及びロワープライマー（アレル特異的プライマー）のタイプの組合せを４種類とし、各組合せにおいて、反応溶液におけるテンプレートのコピー数を１０3〜１０7コピーの範囲で変動させた条件で、ＰＣＲ反応を実施した。以下の表２に各試験の条件をまとめる。
【００４９】
【表２】
2005323565.tif 000004
【００５０】
ＵＶで写真撮影した結果を図９に示す。図９中、レーンＭはマーカーを表し、レーン１〜１０はそれぞれ上記試験No.１〜１０に相当する。
この結果から、試験No.６〜１０において、反応溶液のテンプレート コピー数１０3〜１０7のすべてのケースで157bpの陽性バンドは現われておらず、また試験No.１１〜１５においても、反応溶液のテンプレート コピー数１０3〜１０7のすべてのケースで157bpの陽性バンドは現われていなかった。従って本発明によりアウタープライマーを用いることで、検体におけるテンプレートの濃度が比較的高くても、アレル特異的プライマーによる一塩基多型の識別効果が充分に発揮され、ひいては、所定の長さの断片の増幅の有無を確認することで、特定の遺伝子型の存在、不存在の正確な判定ができることが判る。
【００５１】
〔参考例２〕
チトクロームp-450ファミリー 2D6遺伝子における一塩基変異多型（Cyp2D6*10）の検出を、従来のＰＣＲ法により行った。
Cyp2D6*10の一塩基変異多型部位（変異点）：100（Ｃ又はＴ）
Cyp2D6*10の一塩基変異多型部位を含む部分的な配列は、以下のとおりである。下線部が変異点である。
Ｃ型テンプレート部分配列：
5′tgggctgcac gctaccacca ggccccctgc  3′
Ｔ型テンプレート部分配列：
5′tgggctgcac gctactacca ggccccctgc  3′
【００５２】
[材料の調製]
以下のＤＮＡプライマーセットを用意した。なお、アッパープライマーをアレル特異的プライマーとした。
アッパープライマー
正常型  5′ggctgcacgc taccc  3′(15mer)（配列番号７）
変異型  5′gggctgcacg ctactc  3′(16mer)（配列番号８）
ロワープライマー
5′catgcccact gccaagtc  3′(18mer)（配列番号９）
これらのプライマーセットで増幅される断片の長さは３１３塩基対又は３１４塩基対である。
これらのプライマーのデザインの概略は、図１０に示されるとおりである。図１０中、アレル特異的プライマーは“2D6F Normal”、“2D6F Mutant”と示され、ここで FはForwardの略であって、アッパープライマーであることを意味する。
【００５３】
テンプレートＤＮＡには、pGEM（登録商標）-T Easy Vector(3015bp)プラスミドを用いて、Cyp2D6*10のＣ型及びＴ型のそれぞれの配列をインサートしたものを用意した。ここで用いたpGEM-T Easy Vectorは図５に示したものである。及びＣ型（正常型）及びＴ型（変異型）の各々のインサート配列を図１１及び図１２に示す（それぞれ配列番号１０及び１１参照）。図１１及び図１２で四角で囲んだ箇所が一塩基変異多型部位である。
【００５４】
［ＰＣＲ法の実施］
以下のＰＣＲ条件を採用した。
PCR反応溶液の組成
10× Ex Taq バッファー(TaKaRa)     2μl
2.5mM dNTP ミックス                2μl
10pmol/μl アッパープライマー      2μl
10pmol/μl ロワープライマー        2μl
Ex Taq DNA ポリメラーゼ(TaKaRa)    0.2μl
（プラスミド）DNA溶液              2μl
滅菌水                             9.8μl  
計                                20μl
なお、この反応系においてテンプレートが１０3、１０4、１０5、１０6、１０7コピー存在するように調製する。
【００５５】
ＰＣＲサイクル条件は以下のとおり行う。
96℃ ２分
↓
(1)96℃ ３０秒
(2)70℃ ６０秒
（上記(1)〜(2)を３０回繰り返す。）
上記の条件でPCR反応を行い、反応液５μlを３％アガロースゲル電気泳動に供する。そしてエチジウムブロマイドによりDNAを染色し、UVで写真撮影する。
【００５６】
上記の系及び操作に従って、使用するテンプレートのタイプ及びアッパープライマー（アレル特異的プライマー）のタイプの組合せを４種類とし、各組合せにおいて、反応溶液におけるテンプレートのコピー数を１０3〜１０7コピーの範囲で変動させた条件で、ＰＣＲ反応を実施した。以下の表３に各試験の条件をまとめる。
【００５７】
【表３】
2005323565.tif 000005
【００５８】
ＵＶで写真撮影した結果を図１３に示す。図１３中、レーンＭはマーカーを表し、レーン１〜１０はそれぞれ上記試験No.１〜１０に相当する。
この結果から、ＡＳ−ＰＣＲ法の原理によれば電気泳動による陽性バンドが現われるはずのない試験No.６〜１０において、反応溶液におけるテンプレートコピー濃度が比較的高い１０7〜１０6コピー（試験No.６、７）で陽性バンドが観察された。同じく陽性バンドが現われるはずのない試験No.１１〜１５において、反応溶液におけるテンプレートコピー濃度が比較的高い１０7〜１０6コピー（試験No.１１、１２）で陽性バンドが観察された。
【００５９】
〔実施例２〕
参考例２で使用したテンプレートＤＮＡ、及び参考例２で使用したプライマーセットに加えて、以下の配列のアウタープライマーを用い、Cyp2D6*10の一塩基変異多型の検出を、ＰＣＲ反応にて行った。
Cyp2D6*10 アウタープライマー
5'  gccgggtcca ctgaaac  3'(17mer)（配列番号１２）
実施例２で使用するプライマーのデザインの概略は、図１４に示されるとおりである。図１４中、アレル特異的プライマーは“2D6F Normal”、“2D6F Mutant”と示され、ここで FはForwardの略であって、アッパープライマーであることを意味する。
ロワープライマーとアウタープライマーにより増幅される断片の長さは７６８塩基対である。
【００６０】
［ＰＣＲ法の実施］
以下のＰＣＲ条件を採用した。
PCR反応溶液の組成
10× Ex Taq バッファー(TaKaRa)     2μl
2.5mM dNTP ミックス                2μl
10pmol/μl アッパープライマー      2μl
10pmol/μl ロワープライマー        2μl
10pmol/μl アウタープライマー      2μl
Ex Taq DNA ポリメラーゼ(TaKaRa)    0.2μl
（プラスミド）DNA溶液              2μl
滅菌水                             7.8μl  
計                                20μl
なお、この反応系においてテンプレートが１０3、１０4、１０5、１０6、１０7コピー存在するように調製する。
【００６１】
ＰＣＲサイクル条件は以下のとおり行う。
96℃ ２分
↓
(1)96℃ ３０秒
(2)70℃ ６０秒
（上記(1)〜(2)を３０回繰り返す。）
上記の条件でPCR反応を行い、反応液５μlを３％アガロースゲル電気泳動に供する。そしてエチジウムブロマイドによりDNAを染色し、UVで写真撮影する。
【００６２】
上記の系及び操作に従って、使用するテンプレートのタイプ及びアッパープライマー（アレル特異的プライマー）のタイプの組合せを４種類とし、各組合せにおいて、反応溶液におけるテンプレートのコピー数を１０3〜１０7コピーの範囲で変動させた条件で、ＰＣＲ反応を実施した。以下の表４に各試験の条件をまとめる。
【００６３】
2005323565.tif 000006
【００６４】
ＵＶで写真撮影した結果を図１５に示す。図１５中、レーンＭはマーカーを表し、レーン１〜１０はそれぞれ上記試験No.１〜１０に相当する。
この結果から、試験No.６〜１０において、反応溶液のテンプレート コピー数１０3〜１０7のすべてのケースで314bpの陽性バンドは現われておらず、また試験No.１１〜１５においても、反応溶液のテンプレート コピー数１０3〜１０7のすべてのケースで313bpの陽性バンドは現われていなかった。従って、実施例２の結果からも、本発明によりアウタープライマーを用いることで、検体におけるテンプレートの濃度が比較的高くても、アレル特異的プライマーによる一塩基多型の識別効果が充分に発揮され、ひいては、所定の長さの断片の増幅の有無を確認することで、特定の遺伝子型の存在、不存在の正確な判定ができることが判る。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ＡＳ−ＰＣＲ法の原理を表す概略図である。
【図２】従来のＡＳ−ＰＣＲ法における一般的なプライマーセットのデザインの一例を概略的に表す図である。
【図３】本発明の方法で使用するプライマーセット及び更なるプライマーのデザインの一例を、概略的に表す図である。
【図４】本発明の方法で使用する２組のプライマーセットのデザインの一例を、概略的に表す図である。
【図５】参考例及び本発明の実施例のＰＣＲ法のテンプレートに用いたベクター配列を表す図である。
【図６】参考例１及び実施例１で用いたテンプレートにおける、ALDH2の一塩基変異多型Ｇ型のインサート配列である。
【図７】参考例１及び実施例１で用いたテンプレートにおける、ALDH2の一塩基変異多型Ａ型のインサート配列である。
【図８】参考例１で、電気泳動により検出されたバンドを表す写真である。
【図９】実施例１で、電気泳動により検出されたバンドを表す写真である。
【図１０】参考例２におけるプライマーセットのデザインを表す概略図である。
【図１１】参考例２及び実施例２で用いたテンプレートにおける、チトクロームp-450ファミリー 2D6遺伝子における一塩基変異多型（Cyp2D6*10）Ｃ型のインサート配列である。
【図１２】参考例２及び実施例２で用いたテンプレートにおける、チトクロームp-450ファミリー 2D6遺伝子における一塩基変異多型（Cyp2D6*10）Ｔ型のインサート配列である。
【図１３】参考例２で、電気泳動により検出されたバンドを表す写真である。
【図１４】実施例２におけるプライマーセット及びアウタープライマーのデザインを表す概略図である。
【図１５】実施例２で、電気泳動により検出されたバンドを表す写真である。
【図１】
2005323565.tif 000007
【図２】
2005323565.tif 000008
【図３】
2005323565.tif 000009
【図４】
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【図５】
2005323565.tif 000011
【図６】
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【図７】
2005323565.tif 000013
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2005323565.tif 000021
【配列表】
2005323565000001.app