(57)【要約】【課題】簡単かつ安価な構成で、常に安定して超解像効果を発現できる超解像顕微鏡を提供する。【解決手段】少なくとも第２のパルス光（イレース光パルス）を出射する第２の光源手段を、連続発振レーザ１２と音響光学変調器１４とを有して構成して、連続発振レーザ１２からのコヒーレント光を音響光学変調器１４で強度変調して疑似パルス化し、音響光学変調器１４への電圧印加開始から、少なくともｔ＝０．６５×Ｄ／ｖ−（Ｌ２−Ｌ１）／ｃの後に、第１の光源手段（１１，１３，１５）から第１のパルス光（ポンプ光パルス）を出射させることで、安価な構成で、Ｓ／Ｎおよび空間分解能の高い実用性に優れた超解像顕微鏡を実現する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起するコヒーレントの第１のパルス光を出射する第１の光源手段と、
上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するコヒーレントの第２のパルス光を出射する第２の光源手段と、
上記第１のパルス光と上記第２のパルス光とを一部重ね合わせて上記試料に集光照射する光学系と、
上記光学系により集光照射される光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を走査する走査手段と、
上記光学系からの光照射により上記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段とを有する超解像顕微鏡において、
少なくとも上記第２の光源手段は、連続発振レーザと、該連続発振レーザからのコヒーレント光を電圧の印加により強度変調して上記第２のパルス光として出射する音響光学変調器とを有し、
上記第１の光源手段から上記試料までの光路長をＬ１、上記第２の光源手段から上記試料までの光路長をＬ２、上記連続発振レーザから上記音響光学変調器に入射するコヒーレント光のビーム径をＤ、上記音響光学変調器における音速をｖ、光速をｃとするとき、上記音響光学変調器への電圧印加開始から、少なくともｔ＝０．６５×Ｄ／ｖ−（Ｌ２−Ｌ１）／ｃの後に、上記第１の光源手段から上記第１のパルス光を出射させるように構成したことを特徴とする超解像顕微鏡。
【請求項２】
上記第１の光源手段から出射する上記第１のパルス光のパルス時間をｔｐとするとき、上記音響光学変調器への電圧印加開始から、少なくともｔ＝０．６５×Ｄ／ｖ−（Ｌ２−Ｌ１）／ｃ＋ｔｐの後に、該音響光学変調器への電圧印加を終了するように構成したことを特徴とする請求項１に記載の超解像顕微鏡。
【請求項３】
上記第１の光源手段は、連続発振レーザと、該連続発振レーザからのコヒーレント光を電圧の印加により強度変調して上記第１のパルス光として出射する音響光学変調器とを有し、
上記第２の光源手段の上記音響光学変調器への電圧印加開始から、少なくともｔ＝０．６５×Ｄ／ｖ−（Ｌ２−Ｌ１）／ｃの後に、上記第１の光源手段の上記音響光学変調器への電圧印加を開始するように構成したことを特徴とする請求項１または２に記載の超解像顕微鏡。
【請求項４】
上記音響光学変調器は、音響光学結晶としてＰｂＭｏＯ４結晶またはＴｅＯ２結晶を有することを特徴とする請求項１，２または３に記載の超解像顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば染色した試料を機能性の高いレーザ光源からの複数の波長の光により照明して、高い空間分解能を得る高性能かつ高機能の超解像顕微鏡に関するものであり、より詳しくはその光源装置の改良に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、更に高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択して、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観測するものである。この原理について、図４〜図７を参照して説明する。図４は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図４に示す基底状態（Ｓ０状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図５に示す第１電子励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して、図６に示す第２電子励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図７に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図５の吸収過程や図７の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図５のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図６のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１および波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図６の励起状態での蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。すなわち、図４に示される最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有なエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能であるが、一般にはいくつかの分子における吸収帯の波長領域は重複するので、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を越える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図８は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１電子励起状態であるＳ１に励起され、更に波長λ２の光で第２電子励起状態であるＳ２に励起されている様子を示している。なお、図８はある種の分子のＳ２からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図８に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図９は、図８と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図９において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図９の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を空間的に上手く重ね合わせて、波長λ２の光の照射により蛍光領域を抑制することで、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。したがって、この原理を利用することで、回折限界を越える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例えば超解像蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【００１７】
さらに、波長λ１と波長λ２との２つの光の照射タイミングを工夫することで、Ｓ／Ｎを改善でき、かつ蛍光抑制を効果的に起こす条件も提案されており、これにより超解像性をより効果的に発現することも可能である（例えば、特許文献３参照）。
【００１８】
このような超解像顕微鏡法の具体例として、蛍光ラベラー分子をＳ０状態からＳ１状態へ励起する波長λ１の光（特にレーザ光）をポンプ光とし、Ｓ１状態からＳ２状態へ励起する波長λ２の光をイレース光として、図１０に示すように、光源８１からポンプ光を、光源８２からイレース光をそれぞれ放射させ、ポンプ光はダイクロイックミラー８３で反射させた後、集光光学系８４により試料８５上に集光させ、イレース光は位相板８６で中空ビーム化した後、ダイクロイックミラー８３を透過させてポンプ光と空間的に重ね合わせて集光光学系８４により試料８５上に集光させるようにしたものが提案されている（例えば、特許文献４参照）。
【００１９】
この顕微鏡によると、イレース光の強度がゼロとなる光軸近傍以外の蛍光は抑制されるので、結果的にポンプ光の広がりより狭い領域（Δ＜０．６１・λ１／ＮＡ、ＮＡは集光光学系８４の開口数）に存在する蛍光ラベラー分子のみが観察されることになり、結果的に超解像性が発現することになる。なお、イレース光を中空ビーム化する位相板８６は、例えば、図１１に示すように、光軸に対して点対称な位置で位相差πを与えるように構成したものや、液晶面を用いた光空間変調器、あるいはミラー自身の形状を波長オーダで制御するデフォーマブルミラーを用いることができる。
【００２０】
一方、本発明者らは、上記の超解像顕微鏡に適用する光源装置として、高価なパルス発振レーザを用いることなく、例えば、ビームの位置安定性および波面の均一性に優れた安価な連続発振（ＣＷ）レーザを用い、このＣＷレーザから発せられるレーザ光を、音響光学結晶を用いた音響光学変調器により強度変調して擬似パルス化するようにしたものを開発している（例えば、特願２００３−１０９０１８号）。
【００２１】
ここで、音響光学結晶は、音波の伝搬で誘起される屈折率変化によって音響光学効果（例えば、偏向、回折、変調、位相シフト、周波数シフト、複屈折など）を呈するもので、音波によって光学的な屈折率を音速の周期で変動させる際に、音と光の波長によって、以下の３種類の効果が現れる。
【００２２】
１）音の波長が長いときは、十分に細い光束を音の進行方向と直角方向に通すと、屈折率勾配が生じて光線が湾曲し、音の周波数で光線が偏向走査される。
２）音の波長が短くなると、音波は光束に対して回折格子として作用する。
３）音の波長が更に短くなって、光の波長オーダになると、垂直入射では回折が生じなくなり、特定の入射角において強いブラッグ回折を起こす。
【００２３】
音響光学結晶により周波数ｆの音波で回折されるｍ次の回折光は、ドプラー効果によりｍｆだけ周波数がずれ、その回折角θｍは、光の波長をλ、音波の波長をΛとすると、sinθｍ＝ｍλ／Λ、で与えられる。
【００２４】
レーザ光偏向や変調に用いる音響光学変調器は、この効果を応用したもので、図１２はその原理的構成を示している。図１２に示すように、音響光学変調器９１は、音響光学結晶９２にトランスジューサ９３を接着して構成され、トランスジューサ９３に電圧を印加して超音波を発生させて音響光学結晶９２を伝搬させることにより、入射光を回折させるもので、図１２はブラッグ反射による回折を示している。この音響光学変調器１９は、音響光学結晶９２として、例えばＰｂＭｏＯ４結晶やＴｅＯ２結晶を用いれば、最大２５ＭＨｚ（帯域）まで変調が可能である。
【００２５】
上記の音響光学変調器９１をＣＷレーザの光路に挿入し、トランスジューサ９３を電気的に制御して音波を断続的に音響光学結晶９２に伝搬させれば、超解像顕微鏡システムと相応しいパルス光源を実現することができる。すなわち、Ｈｅ・Ｎｅレーザ、Ａｒレーザ、Ｋｒレーザ、Ｔｉサファイアレーザ等のＣＷレーザの優れたビーム品質を保持したまま、パルス化が可能となる。しかも、電気的制御により任意のパルス発振周波数を選ぶことができるので、例えばポンプ光とイレース光とのパルス発振のタイミングおよびパルス幅を電気的に簡便に制御でき、これにより超解像顕微鏡の基礎をなす蛍光抑制効果を効率的に誘起することが可能となる。
【００２６】
その結果として、超解像性も向上し、分解能において差別化された高機能な顕微鏡を提供することが可能となる。また、既にレーザ走査型顕微鏡システムにおいて幅広く導入され、実績も高いＨｅ・Ｎｅレーザ等のガスレーザの利用も可能となり、より実用面において優れたユーザーフレンドリーな顕微鏡システムを提供することが可能となる。
【特許文献１】特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】特開２００１−１００１０２号公報
【特許文献３】特開平１１−９５１２０号公報
【特許文献４】特開２００１−２７２３４５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
しかしながら、本発明者らによるその後の実験検討によると、先に開発した光源装置を用いる超解像顕微鏡では、以下に説明するような改良すべき点があることが判明した。
【００２８】
すなわち、音響光学変調器は、音響光学結晶に音波を伝搬させることにより、入射光を回折させて、その回折光の光強度を変調するため、その変調の速度は音響光学結晶を伝搬する音波の速度で決まる。例えば、トランスジューサへの電圧印加開始から変調光の強度がほぼ半分になる時間ｔは、音響光学結晶への入射光のビーム径をＤ、音響光学結晶内での音速をｖとすると、ｔ＝０．６５×Ｄ／ｖ、となる（「図解光デバイス辞典」、株式会社オプトロニクス社、平成８年７月１０日、ｐ．３２参照）。
【００２９】
したがって、電圧の印加開始からｔ＝０．６５×Ｄ／ｖの間（以下、過渡変化時間帯とも言う）は、最大回折効率まで到達せず、ビームの部分的領域が回折されたものとなって、回折光の波面は乱れたものとなる。
【００３０】
このため、超解像顕微鏡において、ポンプ光とイレース光とをそのまま、時間および空間領域において重複させて試料面に投射すると、時間領域において過渡変化時間帯を含むことになり、その結果、過渡変化時間帯において、イレース光の強度が蛍光抑制効果を誘起する一定の閾値を超えず、超解像効果の発現が著しく弱くなる場合がある。
【００３１】
また、イレース光を光空間変調して中空状のビームに整形する際は、もとの波面の均一性が重要な要素となり、多少の波面の乱れがあると、光軸に対して対称な中空ビームが得られない。このため、過渡変化時間帯では、回折光の波面が大きく変化することから、イレース光の空間変調が不確実なものとなり、その結果、試料集光面において空間的な蛍光消去が不十分となって、分解能が反対に低下するだけでなく、蛍光信号の総量も弱くなるおそれがある。
【００３２】
したがって、かかる事情に鑑みてなされた本発明の目的は、簡単かつ安価な構成で、常に安定して超解像効果を発現できる超解像顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
上記目的を達成する請求項１に係る発明は、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起するコヒーレントの第１のパルス光を出射する第１の光源手段と、
上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するコヒーレントの第２のパルス光を出射する第２の光源手段と、
上記第１のパルス光と上記第２のパルス光とを一部重ね合わせて上記試料に集光照射する光学系と、
上記光学系により集光照射される光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を走査する走査手段と、
上記光学系からの光照射により上記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段とを有する超解像顕微鏡において、
少なくとも上記第２の光源手段は、連続発振レーザと、該連続発振レーザからのコヒーレント光を電圧の印加により強度変調して上記第２のパルス光として出射する音響光学変調器とを有し、
上記第１の光源手段から上記試料までの光路長をＬ１、上記第２の光源手段から上記試料までの光路長をＬ２、上記連続発振レーザから上記音響光学変調器に入射するコヒーレント光のビーム径をＤ、上記音響光学変調器における音速をｖ、光速をｃとするとき、上記音響光学変調器への電圧印加開始から、少なくともｔ＝０．６５×Ｄ／ｖ−（Ｌ２−Ｌ１）／ｃの後に、上記第１の光源手段から上記第１のパルス光を出射させるように構成したことを特徴とするものである。
【００３４】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の超解像顕微鏡において、上記第１の光源手段から出射する上記第１のパルス光のパルス時間をｔｐとするとき、上記音響光学変調器への電圧印加開始から、少なくともｔ＝０．６５×Ｄ／ｖ−（Ｌ２−Ｌ１）／ｃ＋ｔｐの後に、該音響光学変調器への電圧印加を終了するように構成したことを特徴とするものである。
【００３５】
請求項３に係る発明は、請求項１または２に記載の超解像顕微鏡において、上記第１の光源手段は、連続発振レーザと、該連続発振レーザからのコヒーレント光を電圧の印加により強度変調して上記第１のパルス光として出射する音響光学変調器とを有し、
上記第２の光源手段の上記音響光学変調器への電圧印加開始から、少なくともｔ＝０．６５×Ｄ／ｖ−（Ｌ２−Ｌ１）／ｃの後に、上記第１の光源手段の上記音響光学変調器への電圧印加を開始するように構成したことを特徴とするものである。
【００３６】
請求項４に係る発明は、請求項１，２または３に記載の超解像顕微鏡において、上記音響光学変調器は、音響光学結晶としてＰｂＭｏＯ４結晶またはＴｅＯ２結晶を有することを特徴とするものである。
【００３７】
先ず、本発明の原理について、図１に示すタイムチャートを参照して説明する。
【００３８】
図１は、イレース光およびポンプ光を、それぞれ独立したＣＷレーザおよび音響光学変調器（ＡＯＭ）を用いて得る場合の様子を示すもので、図１（ａ）は図１（ｂ）に示すパルス電圧波形をイレース光用のＡＯＭに印加したときに得られるイレース光パルスの回折強度を示しており、図１（ｃ）は図１（ｄ）に示すパルス電圧波形をポンプ光用のＡＯＭに印加したときに得られるポンプ光パルスの回折強度を示している。
【００３９】
図１（ａ）において、ＴＲ（Ｅ）は、イレース光の過渡変化時間帯で、イレース光の回折強度が弱く、しかも波面も乱れている時間帯である。また、ＴＵＳＥ（Ｅ）は、完全に音波が音響光学結晶に伝搬されて回折効率が最大になり、かつ波面も安定した状態の時間帯である。また、ＴＤ（Ｅ）は、ＡＯＭへの電圧印加が終了した後も、まだ残留する音波により回折光が漏れ出してくる時間帯で、ＴＲ（Ｅ）と同様に、イレース光の回折強度が弱く、しかもその波面も乱れている時間帯である。
【００４０】
また、図１（ｃ）において、ＴＲ（Ｐ）は、ポンプ光の過渡変化時間帯で、ポンプ光の回折強度が弱く、しかも波面も乱れている時間帯である。また、ＴＤ（Ｐ）は、ＡＯＭへの電圧印加が終了した後も、まだ残留する音波により回折光が漏れ出してくる時間帯で、ＴＲ（Ｐ）と同様に、ポンプ光の回折強度が弱く、しかもその波面も乱れている時間帯である。なお、図１（ｃ）においては、図１（ａ）のＴＵＳＥ（Ｅ）に相当する時間帯ＴＵＳＥ（Ｐ）が存在する場合もある。
【００４１】
イレース光に関しては、ＴＲ（Ｅ）およびＴＤ（Ｅ）の時間帯は、強度が不十分かつ波面も乱れているため、超解像顕微鏡のイレース光には用いることはできない。したがって、利用できる時間帯はＴＵＳＥ（Ｅ）のみとなる。
【００４２】
これに対し、ポンプ光に関しては、ビーム強度の一定性や波面の均一性は追求されないので、ＴＲ（Ｐ）およびＴＤ（Ｐ）の時間帯を超解像顕微鏡に利用することができ、ＴＲ（Ｐ）とＴＤ（Ｐ）とを合わせた時間をポンプ光パルスの照射時間ＴＵＳＥ（Ｐ）とすることができる。勿論、ＴＵＳＥ（Ｅ）に相当する時間帯を設けて、その時間帯に回折するポンプ光を用いても構わない。
【００４３】
図１から明らかなように、超解像顕微鏡においては、イレース光として実効的に使用できるのは、ＴＵＳＥ（Ｅ）の時間帯であるので、ポンプ光パルスの照射時間ＴＵＳＥ（Ｐ）は、ＴＵＳＥ（Ｅ）の時間帯以内に完了するのが理想的である。この間は、イレース光が十分な強度を有し、しかも完全な中空状のビーム形状に空間変調することができる。
【００４４】
したがって、ポンプ光およびイレース光が到達する試料面において、例えば、図１のタイムチャートで示すような照射タイミングが実現されれば、ＡＯＭを用いた超解像顕微鏡の最適化が図られ、分解能向上効果を最大に発現することができる。
【００４５】
ここで、図１に示すように、ポンプ光パルスの照射時間ＴＵＳＥ（Ｐ）を、ＴＲ（Ｅ）およびＴＤ（Ｅ）の時間帯を避けてＴＵＳＥ（Ｅ）の時間帯以内に重複させる具体的な実現手段としては、電気的手段および光学的手段がある。
【００４６】
電気的手段としては、例えばクロックジェネレータでＡＯＭの制御パルス信号を生成し、その制御パルス信号をタイムゲートジェネレータやディレイジェネレータで代表されるデジタルカウンタ回路に入力して、制御パルス信号の立ち上がりまたは立ち下がりから一定時間後に任意の長さのパルスを再発振させ、これによりＡＯＭを駆動して任意のタイミングで回折光を取り出すことができる。なお、デジタルカウンタ回路に代えて、ＲＣ回路やケーブルディレイ等のアナログ回路モジュールを用いて、制御パルス信号からＡＯＭを駆動する任意の長さのパルスを得ることもできる。
【００４７】
また、光学的手段としては、ポンプ光および／またはイレース光の光路長を変えることにより、それらの照射タイミングを調整することができる。例えば、空気中では約３０ｃｍで１nsecの遅延が可能なので、光学部品の空間的配置を変えたり、ミラー等を追加したりして光路長を変えて照射タイミングを調整したり、あるいは光ファイバを通すことで光路長を変えて照射タイミングを調整したりすることができる。
【００４８】
このように、電気的手段または光学的手段を用いて、ポンプ光パルスの照射時間ＴＵＳＥ（Ｐ）を、ＴＲ（Ｅ）およびＴＤ（Ｅ）の時間帯を避けてＴＵＳＥ（Ｅ）の時間帯以内に重複させるようにすれば、超解像顕微鏡において、その分解能向上効果を最大に発現できる試料照明条件を実現することができる。
【発明の効果】
【００４９】
請求項１の発明によると、少なくとも第２のパルス光（イレース光パルス）を出射する第２の光源手段を、連続発振レーザと音響光学変調器とを有して構成して、連続発振レーザからのコヒーレント光を音響光学変調器で強度変調して疑似パルス化し、音響光学変調器への電圧印加開始から、少なくともｔ＝０．６５×Ｄ／ｖ−（Ｌ２−Ｌ１）／ｃの後に、第１の光源手段から第１のパルス光（ポンプ光パルス）を出射させるようにしたので、安価な構成で、Ｓ／Ｎおよび空間分解能の高い実用性に優れた超解像顕微鏡を実現することができる。特に、連続発振レーザとして、ビームの波面および位置安定性の良好なガスレーザーを用いれば、イレース光パルスのビーム整形や、ビームの位置ズレよる空間分解能劣化を防止できるので、超解像性および分解能に優れた超解像顕微鏡を実現することができる。したがって、レーザを専門としない一般ユーザ、特に生物系研究者にとって作業性の良い超解像顕微鏡を提供することができる。
【００５０】
請求項２の発明によると、ポンプ光パルスのパルス時間をｔｐとするとき、音響光学変調器への電圧印加開始から、少なくともｔ＝０．６５×Ｄ／ｖ−（Ｌ２−Ｌ１）／ｃ＋ｔｐの後に、該音響光学変調器への電圧印加を終了するようにしたので、ポンプ光パルスの照射時間ｔｐを、イレース光パルスが十分な強度を有する図１のＴＵＳＥ（Ｅ）以内に完了させることができる。したがって、超解像顕微鏡の最適化が図られ、分解能向上効果を最大に発現することができる。
【００５１】
請求項３の発明によると、ポンプ光パルスを出射する第２の光源手段も、連続発振レーザと音響光学変調器とを有して構成して、連続発振レーザからのコヒーレント光を音響光学変調器で強度変調して疑似パルス化するようにし、イレース光用の音響光学変調器への電圧印加開始から、少なくともｔ＝０．６５×Ｄ／ｖ−（Ｌ２−Ｌ１）／ｃの後に、ポンプ光用の音響光学変調器への電圧印加を開始するようにしたので、より安価な構成で、Ｓ／Ｎおよび空間分解能の高い実用性に優れた超解像顕微鏡を実現することができる。
【００５２】
請求項４の発明によると、音響光学変調器の音響光学結晶として、ＰｂＭｏＯ４結晶またはＴｅＯ２結晶を用いるので、入力電気パルスに対する立ち上がり応答時間を５nsec程度と短くでき、ナノ秒パルスレーザと同等のパルス幅で、ＭＨｚオーダの繰り返し周波数を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
以下、本発明による超解像顕微鏡の一実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００５４】
図２は、本発明の一実施の形態における超解像顕微鏡の光学系の要部構成を示す図である。本実施の形態の顕微鏡は、ＣＷのポンプ光およびイレース光をともに音響光学変調器により強度変調して試料に照射するようにした超解像蛍光顕微鏡を示すものである。以下、ローダミン６Ｇで染色された生体試料を観察する場合を例にとって説明する。
【００５５】
ローダミン６Ｇは、波長５３０ｎｍ近傍に基底状態（Ｓ０）から第１電子励起状態（Ｓ１）に励起される吸収帯があり、また、波長６００ｎｍ〜６５０ｎｍの帯域に第１電子励起状態（Ｓ１）から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態（Ｓ２）に励起される二重共鳴吸収帯域が存在することが確認されている（例えば、E.Sahar and D.Treves:IEEE,J.Quantum Electron.,QE-13,692(1977)参照）。
【００５６】
そこで、本実施の形態では、ポンプ光を発生する光源として波長５４３．５ｎｍのレーザ光を連続発振するＨｅ・Ｎｅレーザ１１を用い、イレース光を発生する光源として波長６４７．１ｎｍのレーザ光を連続発振するＫｒレーザ１２を用いる。
【００５７】
Ｈｅ・Ｎｅレーザ１１からのポンプ光、およびＫｒレーザ１２からのイレース光は、それぞれ図１２と同様の構成の音響光学変調器（ＡＯＭ）１３，１４に入射させ、これらＡＯＭ１３，１４を、クロックジェネレータ３５からの基準クロックに基づいて対応するゲートジェネレータ１５，１６により制御して、それぞれ疑似パルス化する。すなわち、第１の光源手段を、連続発振するＨｅ・Ｎｅレーザ１１、ＡＯＭ１３、ゲートジェネレータ１５を有して構成し、第２の光源手段を、連続発振するＫｒレーザ１２、ＡＯＭ１４、ゲートジェネレータ１６を有して構成して、ゲートジェネレータ１５，１６におけるゲート幅および遅延時間を調整することで、図１に示したＴＵＳＥ（Ｐ）およびＴＵＳＥ（Ｅ）の重複状態を最適化し、これにより超解像効果が効果的に誘起できる条件、すなわち、パルス幅、周期、遅延時間でＡＯＭ１３，１４にパルス電圧を印加して、電圧印加時に入射光を透過させる。
【００５８】
ＡＯＭ１３を透過するポンプ光は、ビームコンバイナ１７およびハーフミラー１８で反射させて対物レンズ１９により試料２０に集光させる。また、ＡＯＭ１４を透過するイレース光は、位相板２１に入射させて中空ビームに空間変調した後、反射ミラー２２で反射させてビームコンバイナ１７に入射させることによりポンプ光と同軸上に合成して、ハーフミラー１８および対物レンズ１９を経て試料２０に集光させる。
【００５９】
位相板２１は、例えば図３に示すように、石英基板を光軸の周りに８分割し、各々の領域をイレース光の波長に対してλ／８ずつ位相差を段階的に与えて構成する。より具体的には、化学エッチング法により、石英基板を浸食して光路長を制御する。このような位相板２１を通すことで、イレース光はビーム面において、光軸に関して反対位相をもつ位相分布を持つようになり、その結果として、光軸中央で光強度がゼロとなるイレース光が得られる。
【００６０】
試料２０は、走査手段である試料移動ステージ２３上に載置し、この試料移動ステージ２３を二次元駆動することで、ポンプ光およびイレース光により試料２０を二次元走査する。
【００６１】
一方、ポンプ光およびイレース光の照射により試料２０から発する蛍光は、対物レンズ１９を経た後、ポンプ光の波長成分（波長５４３．５ｎｍ）を除去するノッチフィルタ２４およびイレース光の波長成分（波長６４７．１ｎｍ）を除去するノッチフィルタ２５を経てハーフミラー２６に入射させ、該ハーフミラー２６で反射される試料２０からの蛍光をレンズ２７によりピンホール２８の中央に集光させて、ピンホール２８を透過した蛍光をレンズ２９により検出手段であるフォトマル３０に入射させて検出する。ここで、ピンホール２８は共焦点位置に配置されており、空間フィルタとして機能する。これは、試料２０以外から発する、例えば光学系からの蛍光や散乱光をカットして測定のＳ／Ｎを高める作用をなすのと同時に、試料２０内の特定の深さ部分から発光した蛍光のみを選別するオプティカルセクショニングの機能をもつ。
【００６２】
また、ハーフミラー２６を通過した蛍光は、結像レンズ３１を有するＣＣＤカメラ３２により結像して蛍光スポット像を直接観察できるようにし、対物レンズ１９のピント合わせ等に利用する。
【００６３】
上記構成において、ＡＯＭ１３，１４は、音響光学結晶として、例えばＰｂＭｏＯ４結晶を用いれば、対応するゲートジェネレータ１５，１６からの入力電気パルスに対する立ち上がり応答時間を５nsec程度とすることができるので、ポンプ光およびイレース光の疑似パルス光として、ナノ秒パルスレーザと同等のパルス幅で、ＭＨｚオーダの繰り返し周波数を得ることができる。
【００６４】
本実施の形態では、図１に示したように、試料２０に照射するイレース光のパルス幅をポンプ光のそれよりも長く、かつポンプ光を試料２０に照射するときはイレース光も同時に照射するように、ＡＯＭ１３，１４を対応するゲートジェネレータ１５，１６により駆動制御して、生成するポンプ光およびイレース光の疑似パルスの位相および周波数を調整する。特に、位相に関しては、ＰｂＭｏＯ４結晶の個体差により、数ナノ秒程度の変調時の位相差が発生するで、ゲートジェネレータ１５，１６により蛍光抑制効果の発現を最適化する。このようにすれば、時間領域においてポンプ光とイレース光とを確実に重複できるので、蛍光抑制効果を確実に誘導でき、超解像を実現することができる。
【００６５】
ここで、イレース光およびポンプ光の照射条件は、例えば、ノッチフィルタ２４，２５を取り外して、試料面からの散乱光をモニターしながら、例えば散乱光をフォトマル３０で受光し、その出力信号をオシロスコープでモニターしながら、ゲートジェネレータ１５，１６により調整すればよい。このようにすれば、試料面におけるポンプ光およびイレース光の照射タイミングを正確に把握した上で、確実に調整することができる。
【００６６】
あるいは、ゲートジェネレータ１５，１６による調整に代えて、以下に説明する条件を満たすように、クロックジェネレータ３５とゲートジェネレータ１５，１６とを接続するケーブル長を調整する電気的な遅延手段を用いて、クロックジェネレータ３５からゲートジェネレータ１５，１６に入力する基準クロックの遅延量を調整したり、イレース光またはポンプ光の光路に適当な長さの光ケーブルを挿入する光学的な遅延手段を用いて、イレース光またはポンプ光の光路長を調整したりして、イレース光およびポンプ光の照射条件を調整することもできる。
【００６７】
すなわち、イレース光およびポンプ光の照射条件を調整するにあたっては、ポンプ光光源であるＨｅ・Ｎｅレーザ１１から試料２０までの光路長Ｌ１と、イレース光光源であるＫｒレーザ１２から試料２０までの光路長Ｌ２とには光路差があるため、光速をｃとすれと、空気中では（Ｌ２−Ｌ１）／ｃに相当する光の到達時間差がある。また、ＡＯＭ１３，１４は、電圧の印加開始からｔ＝０．６５×Ｄ／ｖまでは過渡変化時間帯にあり、イレース光はこの過渡変化時間帯を経て安定した回折光になる。
【００６８】
したがって、上記のことを考慮して、過渡変化時間帯にポンプ光が重複しないようにするためには、図１に示したように、ポンプ光用のＡＯＭ１３に対するパルス電圧の立ち上がりを、イレース光用のＡＯＭ１４に対するパルス電圧の立ち上がりから、ｔ＝０．６５×Ｄ／ｖ−（Ｌ２−Ｌ１）／ｃの後となるように調整する。また、ポンプ光パルスの照射時間をＴＵＳＥ（Ｐ）とすると、ＡＯＭ１４に対するパルス電圧の立ち下がりは、ｔ＝０．６５×Ｄ／ｖ−（Ｌ２−Ｌ１）／ｃ＋ＴＵＳＥ（Ｐ）以後とする。
【００６９】
このようにすれば、ポンプ光パルスの照射時間ＴＵＳＥ（Ｐ）を、イレース光パルスの安定した回折光が得られるＴＵＳＥ（Ｅ）の時間帯以内に重複させることができるので、超解像蛍光顕微鏡において、その分解能向上効果を最大に発現することができる。
【００７０】
なお、本発明は上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、上記実施の形態では、ＣＷのポンプ光およびイレース光の双方を、それぞれ音響光学変調器により強度変調して疑似パルス化したが、イレース光のみを音響光学変調器を用いて疑似パルス化し、ポンプ光については音響光学変調器を用いることなく、パルス発振型レーザを用いてパルス光を得るように構成することもできる。この場合でも、ポンプ光およびイレース光の双方にパルス発振型レーザを用いる場合よりも安価にできる。また、音響光学変調器に代えて電気光学素子を用いて疑似パルス化することもできる。この場合も、過渡変化時間帯があって波面の乱れ等の問題が生じるので、光路長や電気光学素子の応答時間を実測して、試料面におけるポンプ光およびイレース光のタイミングを図１で説明したように調整することにより、超解像性の発現効果を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明の原理を説明するためのタイムチャートである。
【図２】本発明の一実施の形態を示す超解像蛍光顕微鏡の概略構成図である。
【図３】図２に示す位相板の構成を示す図である。
【図４】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図５】図４の分子の第１励起状態を示す概念図である。
【図６】同じく、第２励起状態を示す概念図である。
【図７】同じく、第２励起状態から基底状態に戻る状態を示す概念図である。
【図８】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図９】同じく、二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１０】従来の超解像顕微鏡の一例の構成を示す図である。
【図１１】図１３に示す位相板の構成を示す平面図である。
【図１２】本発明に係る超解像顕微鏡に使用可能な音響光学変調器の原理的構成を示す図である。
【符号の説明】
【００７２】
１１  Ｈｅ・Ｎｅレーザ
１２  Ｋｒレーザ
１３，１４  音響光学変調器（ＡＯＭ）
１５，１６  ゲートジェネレータ
１７  ビームコンバイナ
１８，２６  ハーフミラー
１９  対物レンズ
２０  試料
２１  位相板
２２  反射ミラー
２３  試料移動ステージ
２４，２５  ノッチフィルタ
２７，２９  レンズ
２８  ピンホール
３０  フォトマル
３１  結像レンズ
３２  ＣＣＤカメラ
３５  クロックジェネレータ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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