(57)【要約】  【目的】  収穫植物、組替植物を含めたオルトジフェノール含有生物材料からの蛋白質の水性溶液中への抽出・精製の改良を提供する。  【構成】  水性溶液中にイ)ベンゼンスルフィン酸誘導体の水溶性塩、ロ)蓚酸又は蓚酸の水溶性塩、及びハ)ベンゼンスルフィン酸及びその誘導体から選択される１種以上の物質の水溶性塩と蓚酸又は蓚酸の水溶性塩との混合物からなる群から選択される物質を加え実施する。但し該誘導体はベンゼン環が低級アルキル、アミノ又は低級アルコキシ基でモノ置換されているもの。  【効果】  生じてしまうオルトキノンが蓚酸又は蓚酸の水溶性塩で生成阻害され、生成したオルトキノンはベンゼンスルフィン酸誘導体水溶性塩で安定誘導体化され、その重合減退、高分子複合体と蛋白質アミノ酸残基の結合防止、蛋白質の不純度減少、障害防止、蛋白質収率向上が得られる。【選択図】  なし 【特許請求の範囲】
【請求項１】
オルトジフェノール化合物を含有する生物材料中に含まれる蛋白質を水性溶液中に抽出後、該抽出液から該蛋白質又は該蛋白質を含有する成分を任意の精製手段で精製する方法において、該水性溶液中に、
イ)  ベンゼンスルフィン酸誘導体の水溶性塩、但し該ベンゼンスルフィン酸誘導体はベンゼンスルフィン酸のベンゼン環の水素原子１個が低級アルキル基、アミノ基、又は低級アルコキシ基からなる置換基Ｒで置換されているものである、
ロ)  蓚酸又は蓚酸の水溶性塩、及び
ハ)  ベンゼンスルフィン酸及びその誘導体から選択される１種以上の物質の水溶性塩と、蓚酸又は蓚酸の水溶性塩との混合物、但し該その誘導体はベンゼンスルフィン酸のベンゼン環の水素原子１個が低級アルキル基、アミノ基、又は低級アルコキシ基からなる置換基Ｒで置換されているものである、
上記イ）ロ）ハ）からなる群から選択される物質を加えて該抽出及び／又は精製を実施することからなる方法。
【請求項２】
オルトジフェノール化合物を含有する生物材料中に含まれる蛋白質を水性溶液中に抽出後、該抽出液から該蛋白質又は該蛋白質を含有する成分を任意の精製手段で精製する方法において該抽出及び／又は精製を請求項１に記載の該選択される物質を加えて実施するが、更に
該抽出及び／又は精製を、低温で窒素ガス中で実施すること、及び／又は
該抽出及び／又は精製を、エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）等の既知のチロシナーゼ（ポリフェノールオキシダ−ゼ）を阻害する物質、システイン、ジチオスレイトール（DTT）、及びアスコルビン酸からなる還元剤、及び／又はポリビニルピロリドン（PVP）の添加と共に実施すること、
を含んでいる方法。
【請求項３】
該任意の精製手段が、硫酸アンモニウム又は有機溶媒による蛋白質の沈殿、遠心分離、クロマトグラフィー、電気泳動、及び容器中でイオン交換樹脂などのカラム充填剤と共に蛋白質を撹拌し吸着させるバッチ法からなる群から選択される１又は２以上の組み合わせからなる請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
オルトジフェノール化合物を含有する生物材料中に含まれる蛋白質を水性溶液中に抽出して該蛋白質又はそれを含有する成分の抽出液を得るにあたり、該水性溶液中に請求項１に記載の該選択される物質を加えて該抽出を実施することからなる抽出方法。
【請求項５】
請求項１に記載の該ベンゼンスルフィン酸誘導体のベンゼン環が低級アルキル基で置換されている場合の請求項１〜４のいずれか一に記載の方法。
【請求項６】
該ベンゼンスルフィン酸誘導体が、パラトルエンスルフィン酸である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載のベンゼンスルフィン酸又はその誘導体の水溶性塩がナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩である請求項１〜６のいずれか一に記載の方法。
【請求項８】
オルトジフェノール化合物を含有する生物材料中に含まれる蛋白質を水性溶液中に抽出後、該抽出液から該蛋白質又は該蛋白質を含有する成分を任意の精製手段で精製する方法において、該水性溶液中に、パラトルエンスルフィン酸のナトリウム塩、又はパラトルエンスルフィン酸のナトリウム塩と蓚酸又は蓚酸の水溶性塩との混合物を加えて該抽出及び／又は精製を実施することからなる方法。
【請求項９】
オルトジフェノール化合物を含有する生物材料中に含まれる蛋白質を水性溶液中に抽出後、該抽出液から該蛋白質又は該蛋白質を含有する成分を任意の精製手段で精製する方法において、該水性溶液中に蓚酸又は蓚酸の水溶性塩を加えて該抽出及び／又は精製を実施することからなる方法。
【請求項１０】
該蓚酸の水溶性塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩、又はそれらの２以上の混合物である請求項１〜９のいずれか一に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１又は２又は４に記載の該オルトジフェノール化合物を含有する生物材料が植物である請求項１〜１０のいずれかに一記載の方法。
【請求項１２】
該オルトジフェノール化合物を含有する生物材料が、特定の蛋白質を製造するために遺伝子組み替えされた植物である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該蛋白質が、ヒト血清アルブミンであり、該植物がヒト血清アルブミンを生産するように遺伝子組み替えされた植物である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
式
【化１】
2005154330.tif 000009
で表される基を有する化合物を含有する生物材料から、該生物材料中の蛋白質が水性溶液中に抽出される蛋白質の精製方法に於いて、該抽出及び／又は精製時に蓚酸又はその水溶性塩を存在させることによりチロシナーゼの活性を阻害して該抽出及び／又は精製を実施することを含む蛋白質の精製方法。
【請求項１５】
式
【化２】
2005154330.tif 000010
で表される基を有する化合物を含有する生物材料から、該化合物の酸化によって該基の少なくとも一部がオルトキノン基に変化する条件下で、該生物材料中の蛋白質が水性溶液中に抽出されることを含む蛋白質の精製方法に於いて、
該抽出及び／又は精製時に、請求項１に記載のベンゼンスルフィン酸誘導体の水溶性塩、即ち、置換ベンゼンスルフィン酸イオン（Ｒが請求項１で定義される置換基である式  ＲＣ６Ｈ４ＳＯ２−  のイオン）を存在させることにより、該化合物の酸化により変化したオルトキノン基を該ベンゼンスルフィン酸の誘導体の水溶性塩と反応させ、式
【化３】
2005154330.tif 000011
〔式中Ｒは請求項１で定義される置換基である〕の基を有する6-置換ベンゾスルフォニル系誘導体に誘導体化して該抽出及び／又は精製を実施することからなる蛋白質の精製方法。
【請求項１６】
式
【化４】
2005154330.tif 000012
で表される基を有する化合物を含有する生物材料から、該化合物の酸化によって該基の少なくとも一部がオルトキノン基に変化する条件下で、該生物材料中の蛋白質が水性溶液中に抽出されることを含む蛋白質の精製方法に於いて、
該抽出及び／又は精製時に、蓚酸又はその水溶性塩を存在させることによりチロシナーゼの活性を阻害し、且つ、該抽出及び／又は精製時に、ベンゼンスルフィン酸の水溶性塩又は請求項１に記載の置換基Ｒで置換されたベンゼンスルフィン酸誘導体の水溶性塩を存在させることにより、該化合物の酸化により変化したオルトキノン基と反応させ、モノ置換されることもある6-ベンゾスルフォニル系誘導体
【化５】
2005154330.tif 000013
〔式中Ｒ’は水素又は上記置換基Ｒである〕に誘導体化して該抽出及び／又は精製を実施することからなる蛋白質の精製方法。
【請求項１７】
該基を有する生物材料中の化合物が、クロロゲン酸、カフェー酸、プロトカテキュ酸及び3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン（ドーパ）からなる群から選択される１種以上からなる請求項１４〜１６のいずれか一に記載の方法。
【請求項１８】
蓚酸の水溶性塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩、又はそれらの２以上の混合物である請求項１４又は１６に記載の方法。
【請求項１９】
該ベンゼンスルフィン酸誘導体の水溶性塩が、パラトルエンスルフィン酸のナトリウム塩である請求項１５又は１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、収穫された植物、植物以外の蛋白質を生産するように組み替えられた遺伝子組換え植物を含めた、オルトジフェノール化合物を含有している生物材料、加工品などを含めたオルトジフェノール化合物を含有している生物起源の材料、及びこれらに類するオルトジフェノール化合物とたんぱく質とを含有しているその他の材料（本願の明細書と特許請求の範囲中でこれらを単に「生物材料」と述べる）から、その材料中に含まれている蛋白質を水性溶液中に抽出し、抽出液から蛋白質を単離し精製する方法の改良からなる。
【背景技術】
【０００２】
生物の諸組織に含まれるフェノール性ＯＨ基を有する化合物として、動物組織と植物組織の共通成分である芳香族アミノ酸の他、植物においては、その特有な第２次代謝の産物であるフェノールカルボン酸、フラボノイド等のフェノール性化合物が多数知られている。それらの代表例は、複数のフェノール性ＯＨ基を有するポリフェノール類である。組織が傷を受ける等のストレスが加わると、ポリフェノール類のうち特にベンゼン環の隣接炭素原子上にＯＨ基を持つもの、即ちオルトジフェノール化合物は、速やかに対応するオルトキノンに酸化される。この反応は、空気中の酸素や抽出液に混在する遷位金属などの非酵素的要因によっても起きるが、主な原因はチロシナーゼ等の酸化酵素によるものである。これにより生成したオルトキノンは不安定で直ちに重合し、動物においては黒色のメラニン色素を、植物においては水に不溶・難溶な褐色のタンニン系高分子複合体を形成することが知られている。植物の場合の酸化と重合は以下の式で説明される。
【化１】
2005154330.tif 000002
【０００３】
植物をはじめ、オルトジフェノール化合物と、チロシナーゼのようなオルトジフェノール化合物酸化酵素とを含有する生物材料から、資源となる蛋白質を抽出・精製する場合に、上の式に記載されるようにオルトキノンを経て水に不溶・難溶な褐色の高分子複合体が形成され、そのような複合体がいくつかのアミノ酸残基との間にしばしば共有結合を形成するので、そのことが純粋な蛋白質を得る上で障害となっている。
【０００４】
そこで、蛋白質の抽出・精製過程におけるそのような褐変現象から蛋白質を保護する方法として、低温・窒素ガス中で処理を行うこと、防護物質を添加すること等が行われてきた。
【０００５】
防護物質としては、EDTA等のチロシナーゼの活性を阻害する物資、システイン、DTT、アスコルビン酸等のチロシナーゼの作用等によって生じたオルトキノンを元のオルトジフェノール化合物に還元する作用を持つ物質、及びチロシナーゼの基質であるフェノール類を吸着して除く作用のあるPVPなどが知られている。
【０００６】
しかし、抽出・精製に際し上に述べた低温・窒素ガス中で処理を行うことや既存の防護物質を添加することを行っても、純粋な蛋白質を得る上での障害は十分に克服することができなかった。本発明者は、この課題を解決すべく、より効果的な防護物質がないかどうか、既存の防護物質の機能を高める物質がないかどうかを調べた。
【０００７】
先ず、本発明者は、ベンゼンスルフィン酸（以下BSと省略する場合がある)の水溶性塩、例えばナトリウム塩（以下NaBSと省略する場合がある）を加えて植物の蛋白質の抽出・精製における処理を行った場合、その添加が、褐変の主犯物質であるクロロゲン酸などの3,4−ジフェノールカルボン酸より生じたオルトキノンを安定誘導体化することにより、抽出・精製しようとする蛋白質を防護する効果を有すること、そして他の既知防護物質と共に使用すれば、防護機能が大幅に改善されることを発見した（特願2002−209973、後に2002年8月にスイス・バ−ゼルで開催された10th IUPAC Congress on the Chemistry of Crop Protectionにて発表）。但しこの応用は、クロロゲン酸、カフェー酸、プロトカテキュ酸等の主として植物由来の3,4−ジフェノールカルボン酸に限定されるものであった。
【非特許文献１】ヒロオカ  エー．, 「オルトジフェノールの酸化により形成されるオルトキノンの安定なベンゾスルフォニル誘導体の調製」（"Preparation of Stable Benzosulfonyl Derivatives of Orthoquinones Formed by Oxidation of Orthodiphenols" ）2002年8月にスイス・バ−ゼルで開催された第１０回作物保護化学の国際純正応用化学連合会議（10th IUPAC Congress on the Chemistry of Crop Protection）の抄録（BOOK OF ABSTRACTS）volume 1, 124頁。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者は、ベンゼンスルフィン酸の水溶性塩以外の物質に、植物由来のオルトキノンによる褐変に対する同様な効果、同等以上の効果、植物由来以外の3,4−ジフェノール基を有するカルボン酸類に由来するオルトキノンによる褐変に対する効果、更にはフラボノイド類を含めたより広いオルトジフェノール化合物に由来するオルトキノンによる褐変に対する効果を有するものがないかどうか、またオルトキノンによる褐変に対して、ベンゼンスルフィン酸の水溶性塩を含めた有効物質とそれ以外の物質との併用によって更に有効な効果が得られないかどうかを調べるために、上記の発見に続き更に検討を重ね鋭意研究を行った結果、同様な効果又は同等以上の効果、及びより広いオルトジフェノール化合物に由来するオルトキノンによる褐変に対する効果を有するものを発見し、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
即ち、その後の検討の結果、植物に特有な成分でない3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン（以下、ドーパと記する）由来のオルトキノンも、同じ手法で安定誘導体化され、その重合が抑止されることがわかった。又、パラトルエンスルホン酸ナトリウム（NaPTS）もBSの水溶性塩と同様なメカニズムに基き、抽出・生成過程で、蛋白質に対して3,4−ジフェノールカルボン酸及びドーパ由来のオルトキノンからの防護作用を示すことが判明し、従ってBSのベンゼン環の１水素原子がベンゼン環に対して電子供与の誘起効果又は共鳴効果を有する置換基、例えば低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基などで置換された誘導体の水溶性塩も、同様の防護作用を示すこと思われることが判った。
【００１０】
更に、蓚酸及びその水溶性塩、例えば蓚酸ナトリウムは、種々のオルトジフェノール性化合物を基質とするチロシナーゼの活性に対する阻害作用に基いて、ドーパ、3,4−ジフェノールカルボン酸及びフラボノイドなどに由来するオルトキノンの生成を抑え、蛋白質の純度・収量の増加に貢献できることが証明された。なお、上記の蓚酸及びその水溶性塩が、ドーパその他のオルトジフェノール化合物を基質とするチロシナーゼの反応を、その活性部位にある銅原子と結合することによって非競争的に阻害することは、酵素学的実験により既に確認し、2004年７月に東京で開催される第16回日本微量元素学会で発表する予定である。
【００１１】
即ち、本発明は以下の構成からなる。
１．  オルトジフェノール化合物を含有する生物材料中に含まれる蛋白質を水性溶液中に抽出後、該抽出液から該蛋白質又は該蛋白質を含有する成分を任意の精製手段で精製する方法において、該水性溶液中に、
イ)  ベンゼンスルフィン酸誘導体の水溶性塩、但し該ベンゼンスルフィン酸誘導体はベンゼンスルフィン酸のベンゼン環の水素原子１個が低級アルキル基、アミノ基、又は低級アルコキシ基で置換されているものである、
ロ)  蓚酸又は蓚酸の水溶性塩、及び
ハ)  ベンゼンスルフィン酸及びその誘導体から選択される１種以上の物質の水溶性塩と、蓚酸又は蓚酸の水溶性塩との混合物、但し該その誘導体はベンゼンスルフィン酸のベンゼン環の水素原子１個が低級アルキル基、アミノ基、又は低級アルコキシ基から選択される置換基Ｒで置換されているものである、
上記イ）ロ）ハ）からなる群から選択される物質を加えて該抽出及び／又は精製を実施することからなる方法。
【００１２】
２．  オルトジフェノール化合物を含有する生物材料中に含まれる蛋白質を水性溶液中に抽出後、該抽出液から該蛋白質又は該蛋白質を含有する成分を任意の精製手段で精製する方法において該抽出及び／又は精製を上記１に記載の選択される物質を加えて実施するが、更に
該抽出及び／又は精製を、低温で窒素ガス中で実施すること、及び／又は
該抽出及び／又は精製を、エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）等の既知のチロシナーゼ（ポリフェノールオキシダ−ゼ）阻害物質、システイン、ジチオスレイトール（DTT）、及びアスコルビン酸からなる還元剤及び／又はポリビニルピロリドン（PVP）（フェノール吸着剤）の添加と共に実施すること、
を含んでいる方法。
【００１３】
３．  該任意の精製手段が、硫酸アンモニウム又は有機溶媒による蛋白質の沈殿、遠心分離、クロマトグラフィー、電気泳動、及び容器中でイオン交換樹脂などのカラム充填剤と共に蛋白質を撹拌し吸着させるバッチ法からなる群から選択される１又は２以上の組み合わせからなる上記１又は２に記載の方法。
【００１４】
４．  オルトジフェノール化合物を含有する生物材料中に含まれる蛋白質を水性溶液中に抽出して該蛋白質又はそれを含有する成分の抽出液を得るにあたり、該水性溶液中に上記１に記載の該選択される物質を加えて該抽出を実施することからなる抽出方法。
【００１５】
５．  上記１に記載の該ベンゼンスルフィン酸誘導体のベンゼン環が低級アルキル基で置換されている場合の上記１〜４のいずれか一に記載の方法。
【００１６】
６．  該ベンゼンスルフィン酸誘導体が、パラトルエンスルフィン酸である上記５に記載の方法。
【００１７】
７．  上記１に記載のベンゼンスルフィン酸又はその誘導体の水溶性塩がナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩である上記１〜６のいずれか一に記載の方法。
【００１８】
８．  オルトジフェノール化合物を含有する生物材料中に含まれる蛋白質を水性溶液中に抽出後、該抽出液から該蛋白質又は該蛋白質を含有する成分を任意の精製手段で精製する方法において、該水性溶液中に、パラトルエンスルフィン酸のナトリウム塩、又はパラトルエンスルフィン酸のナトリウム塩と蓚酸又は蓚酸の水溶性塩との混合物を加えて該抽出及び／又は精製を実施することからなる方法。
【００１９】
９．  オルトジフェノール化合物を含有する生物材料中に含まれる蛋白質を水性溶液中に抽出後、該抽出液から該蛋白質又は該蛋白質を含有する成分を任意の精製手段で精製する方法において、該水性溶液中に蓚酸又は蓚酸の水溶性塩を加えて該抽出及び／又は精製を実施することからなる方法。
【００２０】
１０．  上記１に記載の蓚酸の水溶性塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩、又はそれらの２以上の混合物である上記１〜９のいずれか一に記載の方法。
【００２１】
１１．  上記１又は２又は４に記載の該オルトジフェノール化合物を含有する生物材料が植物である上記１〜１０のいずれかに一記載の方法。
【００２２】
１２．  該オルトジフェノール化合物を含有する生物材料が、特定の蛋白質を製造するために遺伝子組み替えされた植物である上記１１に記載の方法。
【００２３】
１３．  該蛋白質が、ヒト血清アルブミンであり、該植物がヒト血清アルブミンを生産するように遺伝子組み替えされた植物である上記１２に記載の方法。
【００２４】
１４．  式
【化２】
2005154330.tif 000003
で表される基を有する化合物を含有する生物材料から、該生物材料中の蛋白質が水性溶液中に抽出される蛋白質の精製方法に於いて、該抽出及び／又は精製時に蓚酸又はその水溶性塩を存在させることによりチロシナーゼの活性を阻害しオルトキノンの生成を抑止して該抽出及び／又は精製を実施することを含む蛋白質の精製方法。
【００２５】
１５．  式
【化３】
2005154330.tif 000004
で表される基を有する化合物を含有する生物材料から、該化合物の酸化によって該基の少なくとも一部がオルトキノン基に変化する条件下で、該生物材料中の蛋白質が水性溶液中に抽出されることを含む蛋白質の精製方法に於いて、
該抽出及び／又は精製時に、上記１に記載のＲ置換基で環がモノ置換されたベンゼンスルフィン酸の水溶性塩を存在させること、即ち、モノ置換ベンゼンスルフィン酸イオン（Ｒが上記１で定義される置換基である式  ＲＣ６Ｈ４ＳＯ２−  のイオン）を存在させることにより、該化合物の酸化により変化したオルトキノン基と反応させ、式
【化４】
2005154330.tif 000005
〔式中Ｒは上記１で定義の置換基である〕の基を有する6-（置換ベンゾスルフォニル）系誘導体に転換し該オルトキノン基を有する化合物が重合することを防ぎながら、該抽出及び／又は精製を実施することからなる蛋白質の精製方法。
【００２６】
１６．  式
【化５】
2005154330.tif 000006
で表される基を有する化合物を含有する生物材料から、該化合物の酸化によって該基の少なくとも一部がオルトキノン基に変化する条件下で、該生物材料中の蛋白質が水性溶液中に抽出されることを含む蛋白質の精製方法に於いて、
該抽出及び／又は精製時に、蓚酸又はその水溶性塩を存在させることによりチロシナーゼの活性を阻害してオルトキノンの生成を抑止し、且つ、該抽出及び／又は精製時に、上記１に記載のベンゼン環がモノ低級アルキル置換されることもあるベンゼンスルフィン酸の水溶性塩を存在させること、即ち、上記１に記載のＲ置換基で置換されることもあるベンゼンスルフィン酸イオン（Ｒ’が水素又は上記Ｒ置換基である式  Ｒ’Ｃ６Ｈ４ＳＯ２−  のイオン）を存在させることにより、該化合物の酸化により変化したオルトキノン基と反応させ、式
【化６】
2005154330.tif 000007
〔式中Ｒ’は水素又は上記Ｒ置換基である〕の基を有する、モノ置換されることもある6-ベンゾスルフォニル系誘導体に転換し該オルトキノン基を有する化合物が重合することを防ぎながら、該抽出及び／又は精製を実施することからなる蛋白質の精製方法。
【００２７】
１７．  該基を有する生物材料中の化合物が、クロロゲン酸、カフェー酸、プロトカテキュ酸及び3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン（ドーパ）からなる群から選択される１種以上からなる上記１４〜１６のいずれか一に記載の方法。
【００２８】
１８．  蓚酸の水溶性塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩、又はそれらの２以上の混合物である上記１４又は１６に記載の方法。
【００２９】
１９．  該置換されたベンゼンスルフィン酸の水溶性塩が、パラトルエンスルフィン酸（PTS）のナトリウム塩(NaPTS)である上記１５又は１６に記載の方法。
【００３０】
オルトジフェノール化合物を含有する生物材料は植物であり得、本発明は植物からその植物中に存在する蛋白質の抽出・精製方法に利用出来る。また、オルトジフェノール化合物を含有する生物材料は特定の蛋白質を製造するために遺伝子組み替えされた植物であり得る。従って、本来植物中に存在しない蛋白質を、遺伝子組み替えされた植物から抽出・精製するために本発明を利用できる。例えば、蛋白質が、ヒト血清アルブミンであり、それをヒト血清アルブミンを生産するように遺伝子組み替えされた植物から抽出・精製するのに本発明の方法を使用できる。
【００３１】
酸化されてオルトキノン基を有することとなった化合物の重合防止に対して上記のベンゼンスルフィン酸誘導体の水溶性塩が有する作用に関しては、対象となるオルトジフェノール化合物の例は、クロロゲン酸、カフェー酸、プロトカテキュ酸及びドーパからなる群から選択される１種以上が挙げられる。
【００３２】
蓚酸又はその水溶性塩を存在させることによりチロシナーゼの活性を阻害してオルトキノンの生成を抑止する作用に関しては、対象となるオルトジフェノール化合物の例は、クロロゲン酸、カフェー酸、プロトカテキュ酸、ドーパ、ルチン及びエピカテキンからなる群から選択される１種以上が挙げられる。
【００３３】
先に、公知の防護物質と共に水性溶液中にBSの水溶性の塩を加えて植物に含まれる蛋白質の抽出・精製を実施すると、蛋白質の収率が向上すると共に、蛋白質の不純度が飛躍的に減少することが確認され、この添加による3,4−ジフェノールカルボン酸由来のオルトキノンから防護効果が実証されている（特願2002−209973、上記の通り後に学会にて発表）。その後、本発明に従って、この方法は植物に特有な成分でないドーパ由来のオルトキノンに対しても有効であること、又、後述の実施例に示すようにパラトルエンスルフィン酸の水溶性塩も、BSの水溶性塩と同様なメカニズムで蛋白質を3,4−ジフェノールカルボン酸及びドーパ由来のオルトキノンから防護するからベンゼン環に対して電子供与の誘起効果又は共鳴効果を有する置換基、例えば低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基などで、好ましくはモノ低級アルキル基で置換されたベンゼンスルフィン酸の水溶性塩も同様の防護をすると思われること、及び蓚酸又はその水溶性塩は、チロシナーゼの活性を阻害して、ドーパ、3,4−ジフェノールカルボン酸及びフラボノイドなどに由来する種々のオルトキノンの生成を抑止することにより、蛋白質の純度・収量の向上をもたらし得ることが実証された。
【００３４】
本発明は如何なる理論にも限定されるものではないが、本発明者は、蛋白質の植物からの抽出・精製過程における上記の物質群の望ましい効果は、以下の理由によると考えられる。
【００３５】
蓚酸又はその水溶性塩を存在させることによる効果は、様々のオルトジフェノール化合物の酸化によるオルトキノン類の生成が、その反応を触媒するチロシナーゼの活性の阻害により抑止されるためと考えられる。その理由は蓚酸又はその水溶性塩がチロシナーゼの反応を阻害するからである。
【００３６】
ベンゼンスルフィン酸の水溶性塩による効果、又は上記のベンゼン環に対して電子供与の誘起効果又は共鳴効果を有する置換基、例えば低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基などで置換された、好ましくはモノ低級アルキル基で置換されたベンゼンスルフィン酸誘導体の水溶性塩による効果は、オルトキノンが生成してもその相当部分が安定な誘導体に変化させられることにより、重合が起こらなくなることによると考えられる。その理由は、実施例に示すように、特願2002−209973に示した「NaBS等のBSの水溶性塩の存在下での3,4−ジヒドロキシフェニル基を有するカルボン酸の酸化によるそのカルボン酸の６−ベンゾスルフォニル誘導体の合成例」で記載した以下の反応
【化７】
2005154330.tif 000008
と同様な反応が、モノ低級アルキル置換されたベンゼンスルフィン酸誘導体の水溶性塩を用いる場合にも実際に起きることを確認しているからである。
【００３７】
即ち、本発明は、水性溶液中に
イ)  ベンゼンスルフィン酸誘導体の水溶性塩、但し該ベンゼンスルフィン酸誘導体はベンゼンスルフィン酸のベンゼン環の水素原子１個が低級アルキル基、アミノ基、又は低級アルコキシ基で置換されているものである、
ロ)  蓚酸又は蓚酸の水溶性塩、及び
ハ)  ベンゼンスルフィン酸及びその誘導体から選択される１種以上の物質の水溶性塩と、蓚酸又は蓚酸の水溶性塩との混合物、但し該その誘導体はベンゼンスルフィン酸のベンゼン環の水素原子１個が低級アルキル基、アミノ基、又は低級アルコキシ基で置換されているものである、
上記イ）ロ）ハ）からなる群から選択される物質を加えてオルトジフェノール化合物を含有する生物材料中に含まれる蛋白質の抽出・精製を実施すれば、上記の反応式の反応とチロシナーゼ活性阻害によるオルトキノン生成の抑制とにそれぞれの該当する物質が適用されて効果を発揮することとなると考えられ、それらの作用によって抽出・精製過程での蛋白質の防護効果と、得られた粗蛋白画分の著しい不純度の減少効果とが得られることを発見し、それを確認したものである。
【００３８】
「ベンゼンスルフィン酸誘導体」としては、ベンゼンスルフィン酸のベンゼン環の１水素原子がベンゼン環に対して電子供与の誘起効果又は共鳴効果を有する置換基、例えば低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基で置換された誘導体が含まれる。これらの置換基はいずれもパラ及びオルト配向性であるからベンゼンスルフィン酸のパラ及びオルト誘導体が得られやすい。一方、そのような置換基として、水酸基はフェノール性ＯＨを与えるので酸化重合防止剤として不適であり、またアリール基は水性系溶媒に溶けにくくなるように作用するからこのましくない。好ましいのはベンゼンスルフィン酸のベンゼン環の１水素原子が低級アルキル基で置換された誘導体である。最も好ましい誘導体はp-トルエンスルフィン酸である。
【００３９】
「水溶性塩」としては、例えばアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等が含まれるが、置換されることもあるベンゼンスルフィン酸の水溶性塩ではNaPTS、蓚酸の水溶性塩ではナトリウム塩、カリウム塩（蓚酸カリウム）、及び蓚酸アンモニウム塩が市販されており、容易に入手出来好ましい。
【発明の効果】
【００４０】
１）オルトジフェノール化合物は、チロシナーゼ等の作用による酸化で、オルトキノンを生じ、それが重合して水に不溶・難溶な高分子複合体を形成する。しかし、ベンゼン環の１つの水素原子がベンゼン環に対して電子供与の誘起効果又は共鳴効果を有する置換基、例えば低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基などで、好ましくは低級アルキル基で置換されたベンゼンスルフィン酸誘導体の水溶性塩が存在すると、オルトキノンが安定な誘導体に変化し、一方、蓚酸又はその水溶性塩が存在するとチロシナーゼ活性が阻害され、オルトキノンの生成が抑制される。更に、ベンゼンスルフィン酸の水溶性塩又は上記ベンゼンスルフィン酸誘導体の水溶性塩と蓚酸又はその水溶性塩とを組み合わせ、これらの相乗的な効果を得ることも可能である。従ってオルトキノンが重合して生じる水に不溶・難溶な高分子複合体と蛋白質中のアミノ酸残基との共有結合が生じることが防止される。
【００４１】
２）ベンゼン環に対して電子供与の誘起効果又は共鳴効果を有する置換基、例えば低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基などで、好ましくは低級アルキル基で環がモノ置換されたベンゼンスルフィン酸誘導体の水溶性塩に該当するNaPTSは、植物性フェノールカルボン酸類由来のオルトキノンに対しても動植物共通成分であるドーパ由来のオルトキノンに対しても上記安定な誘導体への誘導体化に関して反応性を示し、蛋白質を防護する。特にドーパ由来のオルトキノンに対してはベンゼンスルフィン酸の水溶性塩NaBS以上の効能を示す。
【００４２】
３）蓚酸又はその水溶性塩によるチロシナーゼ阻害作用は、ベンゼンスルフィン酸誘導体の水溶性塩が反応する3,4−ジフェノールカルボン酸及びドーパのみならず、フラボノイド骨格を有するルチン、エピカテキン等を含む広範囲のオルトジフェノール化合物の酸化を抑止する。
【００４３】
４）従って、上記１）、２）、３）を利用して、オルトジフェノール化合物を含有する生物材料中に含まれる蛋白質を抽出・精製するに際し、純粋な蛋白質を得る上での障害が大幅に克服され、収量も向上する。
【００４４】
５）エチレンジアミンテトラ酢酸などの既知のチロシナーゼ阻害物質、システイン、ジチオスレイトール、アスコルビン酸などのキノンを速やかに還元する還元剤、及びフェノール類を吸着するボリビニルピロリドンなどの既存の防護物質と共に上記の物質（群）を使用すると、蛋白質の防護機能を大幅に高めることが出来、蛋白質の純度が飛躍的に向上する。
【００４５】
６）ベンゼンスルフィン酸の水溶性塩又は環が上記の様にモノ置換されることもあるベンゼンスルフィン酸の誘導体の水溶性塩から生じたイオンが、オルトキノンと反応してオルトキノン化合物を安定誘導体化することにより、水に不溶・難溶なタンニン系重合体の生成が減少する。又、蓚酸イオンのチロシナーゼ活性阻害作用により、そのような重合体の原料であるオルトキノンの生成量が減少する。これらの要因により、蛋白質の収率が向上する。
【実施例１】
【００４６】
種々の植物試料からの蛋白質の抽出・精製におけるNaPTS及び蓚酸の、オルトキノンによる傷害に対する防護効果
市販の野菜（ホウレンソウ、レタス、及びブロッコリ−）及び果実（リンゴ及びバナナ）より、以下のように可溶性蛋白質を精製した。
【００４７】
植物組織を、同一材料につき各々異なる3つの氷冷された緩衝液系の中で摩砕・抽出した。この操作は、いずれも9.4−26.3gの材料に対して5倍量の緩衝液系を用いて行った。いずれの場合の緩衝液系も、100mMのトリス−塩酸（pH7.5）をベ−スに調整し、各材料につき3つのうち1つ（コントロ−ル）の緩衝液系には、5mMのEDTA（チロシナーゼ阻害剤）の他、野菜の場合には5ｍＭのシステイン（生成したキノンを還元する作用が有る）、果実の場合には材料の1/10の重量のポリクラール（登録商標）AT（＝不溶性PVP＝フェノール吸着剤）を添加した。これらはいずれも、植物蛋白質の抽出・精製におけるオルトキノンによる傷害に対する防護物質として現在使用されているものである。他の2種類の緩衝液系には、それらに加えて、各々10mMのNaPTS又は蓚酸をも溶解させた。各々の抽出液から濾過と遠心分離で固形物を除き、又、野菜類の場合は、更に上澄みに硫酸アンモニウムを35％飽和になるように加えて葉緑体の破片を沈殿させ、遠心分離で除去した。最後に上澄みに硫酸アンモニウムを70％飽和になるように加え、遠心分離により得られた粗蛋白質画分を、一定量のもとの緩衝液に溶解し脱塩後、蛋白質の定量を行い、可溶性蛋白質の収率を求めた。また、オルトキノンの重合により形成されたメラニン様複合体によって吸収される470nmの波長における吸光度（Ａ470nm）を測定し、それらの値より計算した蛋白質の単位含量当りのＡ470nm値をその不純度の指標とした。各材料におけるコントロ−ルにおける収率と不純度を各々１．００とした場合の、添加剤ありの緩衝液系で処理した方におけるそれらの値を評価した。その結果を次の表１にまとめてある。
【００４８】
表１
可溶性蛋白質の精製におけるNaPTSと蓚酸の添加の効果
（コントロールの収率及びA470nmをそれぞれ１とした場合の相対値）
NaPTS             蓚酸      
収率      不純度 収率      不純度 
ホウレンソウ        1.20      0.28        1.10      0.74
レタス              1.15      0.36        1.10      0.69
ブロッコリ−        1.05      0.33        1.05      0.84
リンゴ              1.10      0.22        1.05      0.65
バナナ              1.05      0.26        1.00      0.76
【００４９】
表１に要約された実験結果より、NaPTSの添加は、蛋白質の不純度の大幅な低下をもたらし、その効能は、既にその効果が証明されているNaBS（特願2002−209973）に近いことが示された。又、蓚酸の添加もNaBSやNaPTSほどではないが、蛋白質の不純度を低下させた。
【００５０】
BSの水溶性塩は、オルトフェノール類の中で、特にクロロゲン酸、カフェー酸、プロトカテキュ酸その他の3,4−ジフェノールカルボン酸類の酸化によって生じたオルトキノン類と反応して元の化合物の６−ベンゾスルフォニル誘導体を生じさせ、蛋白質をオルトキノンから防護することが証明されている（特願2002−209973、その後0007に記載した学会で発表）。表1に示されたNaPTSによる蛋白質に対するほぼそれに近い強力な防護効果も、NaPTSより生じたPTSイオンが、BSイオンと同様な作用を示してオルトキノンの重合反応を阻止したためであろうと考えられる。又、蓚酸に同様な防護効果がある程度認められたことは、上記の植物材料中に残存するチロシナーゼ活性が、蓚酸により阻害されたためであろうと考えられる。
【００５１】
又、収率も若干増加しているが、これは、NaPTSによるオルトキノンの上記の誘導体化によりタンニン系の不溶性・難溶性の重合体の生成が抑止されたか、又は蓚酸によるチロシナーゼ活性阻害により、その原料のオルトキノンの生成が減じた分、蛋白質がそのようなタンニン系成分と結合・沈殿して減らなかったためであろう。
【実施例２】
【００５２】
種々のオルトジフェノール化合物のチロシナーゼによる酵素酸化が共存するヒト血清アルブミンに及ぼす影響に対するNaPTS、蓚酸及び蓚酸ナトリウムの防護効果
今日、ヒトの蛋白質を含む多くの非植物起原蛋白質が、遺伝子組み替え技術により植物に生産させることが可能になっているが、本格的に工業化されるには至っていない。その諸原因の一つは、材料に含まれる種々のポリフェノール、特にオルトジフェノールが、チロシナーゼ等の酸化酵素等の作用よる酸化反応によってオルトキノンに変化し、その重合生成物の作用（タンニン系の高分子形成・蛋白質との結合による蛋白質の不溶化及び不純化等）が目的蛋白質の精製に悪影響を及ぼすからである。植物に生産させることに成功したという報告のあるヒト蛋白質のうち、血液蛋白の主成分で医療分野で汎用性のあるヒト血清アルブミン（HSA）は、他の物質と結合する性質が非常に強いので、抽出・精製の過程でオルトキノンの重合と関連した褐変の影響を特に受け易い。
【００５３】
100mMリン酸緩衝液(pH7.2)に、HSAを5mg/ml、クロロゲン酸、カフェー酸、プロトカテキュ酸、ドーパ、ルチン及びエピカテキンを、各々0.2mMの濃度で溶解させた。それを6分割し、そのうちの1つであるコントロ−ルには1mMのPVPのみを、他には、それ以外に以外にも、(1)NaBS（比較のため）、(2)NaPTS、(3)蓚酸、(4)蓚酸ナトリウム、又は(5)NaTS+蓚酸ナトリウムを、各化合物10mMの濃度で添加した。
コントロ−ル及び(1)−(5)の各反応液系に、チロシナーゼ25単位を加え、室温で6時間放置して塩酸で反応停止し、不溶物を遠心で除去後、セファデックス（登録商標）G-100を用いるゲル濾過にかけて粗HSA画分を得た．粗HSA画分を限外ろ過で濃縮し、蛋白質の定量とＡ470nmの測定を行って、HSAの回収率及び不純度（単位含量当りのＡ470nm値）を求め、植物材料の場合と同様に、コントロ−ル（添加無し）との比較を行った（表２）。
【００５４】
表２
種々のオルトジフェノールの酵素酸化が共存HSAに及ぼす影響に対するNaPTS、蓚酸及びそのナトリウム塩の防護効果
添加物質       回収率   不純度
コントロ−ル        可溶性PVPのみ      1.00                 1.00
(1)                  NaBS              1.35                 0.18
(2)                  NaPTS             1.20                 0.23
(3)                  蓚酸              1.10                 0.72
(4)               蓚酸ナトリウム塩     1.05                 0.71
(5)           NaPTS+蓚酸ナトリウム塩   1.40                 0.15
【００５５】
表２に示されるように、(1)においては、基質がクロロゲン酸のみの場合（特願2002−209973）よりは多少は劣るものの、回収されたHASの不純度の顕著な低下をもたらした。その原因は、特願2002−209973に記述したクロロゲン酸、カフェー酸及びプロトカテキュ酸の酸化によって生じたオルトキノンの6−ベンゾスルフォニル誘導体化及び後述するようなドーパ由来のオルトキノンとの同様な反応による誘導体化によるものであろう。(2)においては、(1)の場合ほどではないが、不純度の顕著な低下がもたらされており、NaPTSを用いた場合でもNaBSと同様なオルトキノンの安定誘導体化の反応が起きたものと推定された。遊離型の蓚酸を使用した(3)とそのナトリウム塩を用いた(4)においては、(1)(2)ほどではないが、ある程度の不純度の低下が観察され、又、(3)と(4)とでは効果に差は認められなかった。これは蛋白質の防護効果が蓚酸イオンによるチロシナーゼ阻害作用でオルトキノンの生成量が減少したことによるものと思われた。又、(5)において(2)と(4)の各々の効果が相乗していることが確認された。
回収率の増加は、チロシナーゼ活性阻害によるオルトキノンの生成量の減少（(3),(4)及び(5)の場合）及び／又はオルトキノンの誘導体化（(1),(2)及び(5)の場合）により、蛋白質と結合して不溶化するタンニン系の高分子重合体が生じにくくなったためであろう。
【実施例３】
【００５６】
表２の反応溶液系（１）−（５）の各々における生成物の分析によるNaPTS、蓚酸及び蓚酸ナトリウムの蛋白質に対するオルトキノンからの防護効果のメカニズムの検討
表２の反応系において、各反応液を経時的に一定量ずつとって塩酸で反応を停止し、除蛋白の後、HPLCに注入して分析した。コントロ−ルのクロマトグラム上においては、各基質（オルトジフェノール）に由来するピ−クの面積の経時的な減少と、それに伴う酸化重合体（混合物）由来と思われるピ−クの面積の経時的な増加が見られ、反応開始6時間後には、どの基質も存在しなくなった。(1)及び(2)においては、基質の経時的減少率はコントロ−ルと差はなかったが、酸化重合体の生成量は低下しており、そのかわりに別なピ−クの各々のクロマトグラム上における出現・経時的増加が見られた。それらのピ−クを与える物質を、特願2002−209973に記載したように、HPLCで単離し機器分析（FAB−MS及びプロトンNMR）で同定した。そのようにして同定された生成物は、各々、(1)においては6−ベンゾスルフォニルクロロゲン酸、6−ベンゾスルフォニルカフェー酸、6−ベンゾスルフォニルプロトカテキュ酸及び3,4−ジヒドロキシ−6−ベンゾスルフォニルフェニルアラニン、(2)においては6-パラメチルベンゾスルフォニルクロロゲン酸、6−パラメチルベンソスルフォニルカフェー酸、6−パラメチルベンゾスルフォニルプロトカテキュ酸及び3,4−ジヒドロキシ−6−パラメチルベンゾスルフォニルフェニルアラニンであった。その他、(1)及び(2)において、ベンゼンスルフォン酸及びパラトルエンスルフォン酸が、各々、標品との混合分析におけるピークの増強により同定された。
【００５７】
反応終了の時点で、(1)では、クロロゲン酸の約90%、プロトカテキュ酸の約80%、カフェー酸の約75%及びドーパの約25%が、(2)では、クロロゲン酸の約70%、プロトカテキュ酸の65%、カフェー酸の約60%及びドーパの40%が、各々、6−ベンゾスルフォニル又は6−パラメチルベンゾスルフォニル誘導体に転換していた。ルチンとエピカテキンは、(1)(2)のいずれにおいても誘導体化されなかった。(1)において検出されたベンゼンスルフォン酸及び(2)において検出されたパラトルエンスルフォン酸は、各々、BSイオン又はTSイオンがオルトキノンによって酸化される（この時にオルトキノンを、元のオルトジフェノールに還元する）ことにより生成したが、同時にオルトジフェノールの6位に縮合出来なかった残りであろうと考えられた。(3)及び(4)においては、コントロ−ルと比較して各基質の減少率が40−55%緩和され、それに伴い酸化重合体の増加率も同程度に減少したが、別なピ−クは認められなかった。(5)においては、(2)と同様な6−パラメチルベンゾスルフォニル誘導体類のピ−クの出現・経時的増強及び(3)(4)と同様な各基質の減少率と酸化重合体の増加率の低下のどちらもが観察された。
【００５８】
NaBSのようなBSの水溶性塩は、植物に特有なクロロゲン酸、カフェー酸、プロトカテキュ酸などの3,4−フェノールカルボン酸由来のオルトキノンを誘導体化する能力は優れているが（特願2002−209973）、動植物共通成分であるドーパに対する反応性は上記のように低い。したがって、特願2002−209973は、本発明と同様に、理論上は蛋白質を抽出・精製する材料を植物のみに限定してはいない（同請求項１−５）が、実際上は、その名称「植物からの蛋白質の抽出・精製における改良方法」の通り主として植物に適用されるべきものである。一方、本発明においては、低級アルキル基で環がモノ置換されたベンゼンスルフィン酸の水溶性塩に該当するNaPTSは、上記の植物性フェノールカルボン酸類由来のオルトキノンに対してはNaBSよりやや低いがほぼ近いと言える反応性を示して蛋白質を防護し、動植物共通成分であるドーパ由来のオルトキノンの誘導体化については、NaBS以上の効能を示した。
【００５９】
このことより、BSのベンゼン環に誘導する置換基の種類と位置により、特定のオルトジフェノール化合物由来のオルトキノンに対する誘導体化能・蛋白質防護能を高めることが出来るから、特定のオルトジフェノール化合物の含量の多い生物材料（植物とは限らない）から蛋白質を抽出・精製する場合に置換基の誘導されたベンゼンスルフィン酸を利用することが可能であることが示唆される。
【００６０】
又、蓚酸又はその水溶性塩によるチロシナーゼ阻害作用は、低級アルキル基で環がモノ置換されたベンゼンスルフィン酸の水溶性塩が反応する3,4−ジフェノールカルボン酸及びドーパのみならずフラボノイド骨格を有するルチン、エピカテキン等を含む広範囲のオルトジフェノール化合物の酸化を抑止する。低級アルキル基で環がモノ置換されたベンゼンスルフィン酸の水溶性塩と蓚酸又はその水溶性塩との併用による蛋白質防護作用の相乗効果も証明された（表２参照）。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
故に、本発明は、蛋白質の抽出・精製の材料として、植物のみならず、ドーパ及びチロシナーゼ活性を持つ動物組織への適用が有望である。