(57)【要約】      （修正有）【課題】  多数のポリヌクレオチド配列の検出のためのマイクロアレイ支持体の調製方法及び使用方法を提供する。【解決手段】  少なくとも４つの異なる標的ヌクレオチド配列（４）の検出のために用いられる、固体支持体の表面（５）上のポリヌクレオチドセット（３）のマイクロアレイの構築のための方法であって、下記工程を含む方法に関する：固体支持体の表面（５）上へのヌクレオチドライン配列（１）を固定する工程；前記固体支持体の表面（５）上の少なくとも４つの特異的位置（６）に、検出されことになる前記少なくとも４つの異なる標的ポリヌクレオチド配列（４）の１つに対して特異的な配列を有するヌクレオチドフック（２）を付着させる工程；およびヌクレオチドライン配列（１）へヌクレオチドフック（２）を、前記特異的表面位置（６）において共有結合させる工程。【選択図】  図１
2005321389.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
おそらくは生物サンプルまたはテスト溶液中に存在する、少なくとも４つの異なる標的ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列（４）の検出および／または定量化のために用いられる、固体支持体の表面（５）上のポリヌクレオチドセット３のマイクロアレイの構築のための方法であって、下記工程を含む方法：
−  固体支持体の表面（５）上へのヌクレオチドライン配列（１）を固定する工程であって、前記ヌクレオチドライン配列（１）は、少なくとも２０ヌクレオチドの長さであり、かつランダムヌクレオチド配列を有する工程；
−  前記固体支持体の表面（５）上の少なくとも４つの特異的位置（６）に、検出されるかおよび／または定量化されることになる前記少なくとも４つの異なる標的ポリヌクレオチド配列（４）の１つに対して特異的な配列を有するヌクレオチドフック（２）を付着させる工程；および
−  前記標的ポリヌクレオチド配列（４）の結合に特異的なポリヌクレオチドセット（３）を形成するために、ヌクレオチドライン配列（１）へヌクレオチドフック（２）を、前記特異的表面位置（６）において共有結合させる工程。
【請求項２】
マイクロアレイの構築のために使用される固体表面の表面（５）は、ヌクレオチドライン配列（１）で均一にカバーされる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヌクレオチドライン（１）は、これらの末端部（５’，３’）の１つによって固体支持体の表面上に共有結合され、かつ他方の末端部によってヌクレオチドフック（２）に共有結合される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
固体表面は、１ｃｍ２あたり少なくとも４つのスポットのポリヌクレオチドセット（３）のマイクロアレイを含む請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ヌクレオチドライン（１）の配列は、検出されることになる標的ポリヌクレオチド配列（４）に相補的な１５未満、好ましくは１０未満、さらに好ましくは、５未満の連続塩基を含む請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ヌクレオチドライン（１）の配列は、多数のランダム配列である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
全てのヌクレオチドライン（１）は同じランダム配列からなる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ヌクレオチドライン（１）の配列は、検出されることになる標的ポリヌクレオチド配列（４）のいずれかと１％未満、好ましくは０．１％未満、さらに好ましくは０．０１％未満ハイブリッド形成する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ヌクレオチドフック（２）は約１０〜約１２０ヌクレオチドからなる配列を有する請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ヌクレオチドライン（１）への結合後、ヌクレオチドフック（２）は、少なくとも１５０ヌクレオチドのポリヌクレオチド配列で得られるハイブリッド形成効率に等しいか又はそれより高いハイブリッド形成効率に達する請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ヌクレオチドライン（１）への結合後、ヌクレオチドフック（２）は、少なくとも２５０ヌクレオチドのポリヌクレオチド配列で得られるハイブリッド形成効率に等しいか又はそれより高いハイブリッド形成効率に達する請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ヌクレオチドフック（２）は、化学合成されたオリゴヌクレオチドである請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ヌクレオチドライン（１）は、固体支持体の表面（５）上でその場で合成される請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ヌクレオチドフック（２）に結合されたヌクレオチドライン（１）は、異なる標的ポリヌクレオチド配列（４）に対して異なる結合親和性を有する配列であり、かつ異なる固体支持体に取り付けられ、これらの固体支持体の各々は、特定の化学的または物理的特徴によって特徴づけられる請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
固体支持体は、異なる化学的または物理的特徴の異なるビーズを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
標的ポリヌクレオチド配列（４）は、増幅されたまたはコピーされたヌクレオチド配列である請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ヌクレオチドライン（１）を含む固体支持体であって、ヌクレオチドライン（１）は、少なくとも２０のヌクレオチド長さであり、かつ固体支持体の少なくとも１つの表面（５）上に均一に末端部（３’または５’）の１つによって固定されるランダムヌクレオチド配列を有する固体支持体。
【請求項１８】
全てのヌクレオチドライン（１）は、同じランダム配列からなる請求項１７に記載の固体支持体。
【請求項１９】
ヌクレオチドライン（１）の配列は多数のランダム配列である請求項１７に記載の固体支持体。
【請求項２０】
固体支持体の表面（５）に結合されないヌクレオチドライン配列（１）の末端部（５’または３’）は、別のヌクレオチド配列（２）の末端部と共有結合を作ることができる反応性基または官能基を含む請求項１７〜１９のいずれかに記載の固体支持体。
【請求項２１】
ヌクレオチドライン配列の末端部に存在する反応性化学基はアルデヒド、エポキシドおよびアクリレート基からなる群から選択される請求項２０に記載の固体支持体。
【請求項２２】
ヌクレオチドライン配列は、少なくとも１つのヌクレオチドリボースをその非結合末端部に（またはその近くに）含む請求項１７〜２１のいずれかに記載の固体支持体。
【請求項２３】
特定の位置で固体支持体に結合されたヌクレオチドライン（１）の密度は、固体支持体の１ｃｍ２あたり１０ｆモル、好ましくは１００ｆモルより大きい請求項１７〜２２のいずれかに記載の固体支持体。
【請求項２４】
固体支持体表面（５）上の特定の位置（６）で結合されたヌクレオチドライン（１）配列は、固体支持体表面（５）の前記特定位置（６）でポリヌクレオチドセット（３）を形成するためにヌクレオチドフック（２）との共有結合を与え、前記ヌクレオチドフック（２）は、検出されるおよび／または定量化されることになる１つの標的ポリヌクレオチド配列（４）に対して特異的な配列を有し、ヌクレオチドライン（１）の末端部とヌクレオチドフック（２）の末端部の間の共有結合はホスホジエステル結合でない請求項１７〜２３のいずれかに記載の固体支持体。
【請求項２５】
請求項２４に記載の固体支持体であって、その表面（５）の第一部分（７）において標的ポリヌクレオチド配列（４）の第一群の検出のために空間的に分離された少なくとも３つの固定ポリヌクレオチドセット（３）の第一群を含み、固体支持体表面（５）の第二部分（８）において前記第一群の標的ポリヌクレオチド配列を結合できないが標的ポリヌクレオチド配列（４）の第二群の検出のために特異的な標的特異的ヌクレオチドフックとの共有結合を形成することができるヌクレオチドライン（１）を含む請求項２４に記載の固体支持体。
【請求項２６】
請求項２４に記載の固体支持体であって、その表面の第一部分（７）においてヌクレオチドライン（１）によってカバーされない特定の表面位置（９）で固定されかつ標的ポリヌクレオチド配列（４）の第一群の検出のために空間的に分離された少なくとも３つの固定された標準ポリヌクレオチド配列の第一群を含み、固体支持体表面（５）の第二部分（８）において前記第一群の標的ポリヌクレオチド配列を結合できないが標的ポリヌクレオチド配列（４）の第二群の検出のために特異的な標的特異的ヌクレオチドフックとの共有結合を形成することができるヌクレオチドライン（１）を含む請求項２４に記載の固体支持体。
【請求項２７】
ガラス、電子デバイス、シリコン支持体、プラスチック支持体、シリカ支持体、金属支持体またはその混合物からなる群から選択される請求項１７〜２６のいずれかに記載の固体支持体。
【請求項２８】
前記固体支持体は、スライド、ディスク、ゲル層およびマイクロビーズからなる群から選択されたフォーマットである請求項１７〜２７のいずれかに記載の固体支持体。
【請求項２９】
特定の位置で固体支持体に結合されたポリヌクレオチドセット（３）の密度は、固体支持体の１ｃｍ２あたり１０ｆモル、好ましくは１００ｆモルより大きい請求項２４〜２８のいずれかに記載の固体支持体。
【請求項３０】
おそらくは生物サンプルまたはテスト溶液中に存在する（微）生物またはそのヌクレオチド成分の検出、同定および／または定量化のためのパーツのキットであって、請求項１７〜２９のいずれかに記載の固体支持体、および前記（微）生物またはヌクレオチド成分から得られた標的ポリヌクレオチド配列（４）の検出のための手段および培地を含むキット。
【請求項３１】
検出および／または定量化されることになる１つ以上の異なる標的ポリヌクレオチド配列（４）に対して特異的なヌクレオチドフック配列（２）、およびおそらくはヌクレオチドフック（２）配列の末端部とヌクレオチドライン（１）配列の末端部の間の共有結合の形成を可能にするための試薬をさらに含む請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
おそらくは請求項３０または３１に記載のパーツのキットに存在する請求項１７〜２９のいずれかに記載の固体支持体を含む、生物学的試料または試験溶液におそらくは存在する（微）生物またはそのヌクレオチド成分の検出、同定および／または定量化のための装置であって、標的ヌクレオチド配列（４）が固体支持体表面（５）のポリヌクレオチドセット（３）に結合される位置に形成される信号を検出および／または定量化することができる検出および／または定量化装置、おそらくは固体支持体の表面（５）上に記録された情報を読み出すための読み取り装置、およびその対応ポリヌクレオチドセット（３）に結合された標的ポリヌクレオチド配列（４）を担持する不連続領域およびこれらの位置を検出して、これらの位置での検出されたシグナルの存在を（微）生物またはそのヌクレオチド成分の診断および／または定量と相関させるためのコンピュータプログラムをさらに含む装置。
【請求項３３】
診断および遺伝子発現分析のための請求項３０〜３２のいずれかに記載の装置またはキットの使用。
【請求項３４】
異なる遺伝的分類群（綱、科、属、種又は個体の如き）に属する遺伝子配列からおそらくはコピー工程の遺伝子増幅によって得られる複数の異なる標的ポリヌクレオチドの同定、検出および／または定量のための請求項３３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロアレイの新規調製方法、得られたマイクロアレイ支持体、これらを含むキット、および生物サンプルまたはテスト溶液中に存在する多数の標的ポリヌクレオチド（またはヌクレオチド配列）の高い効率での検出のためのこれらの使用に関する。これらの得られたマイクロアレイ支持体は、分子診断および遺伝子発現分析において特に有用である。
【０００２】
本発明のマイクロアレイ支持体によって、遺伝子増幅によって得られた多数の遺伝子または遺伝子産物（アンプリコン）の同定、検出、および／または定量化も可能になり、これらの遺伝子または遺伝子産物は、サンプル中に存在し、これらは、異なる遺伝的分類群（綱、科、属、種、個体）に属する前記遺伝子を含む（微）生物から得られる。
【背景技術】
【０００３】
多数の発現遺伝子の同定および（微）生物の同定は、遺伝物質からの特異的配列の検出を通して行なうことができる。（サンプル中に存在する）発現遺伝子の同定および定量化は通常、ｍＲＮＡのその対応ｃＤＮＡ中への逆転写、および前記ｃＤＮＡの検出後に実施される。特異的（微）生物の検出は、（サンプル中に存在する）ゲノムＤＮＡの特定の配列を増幅（またはコピー）し、次いでこれらの増幅された配列を検出および／または同定することによって容易に実施される。どちらの場合も、これらの増幅されたかまたはコピーされた配列（標的配列）は、マイクロアレイにしたがって固体支持体上に存在するか、またはこれに付着された対応捕捉分子上での特異的ハイブリダイゼーションを介して検出することができる。これらの特異的捕捉分子に結合した標的配列の定量化によって、サンプル中に存在するｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの量の評価が可能になる。好ましくは適切な対照手段が含まれ、必要な補正がなされて、異なる工程、例えば標的配列のコピーまたは増幅工程、および捕捉分子上のハイブリダイゼーションを介したこれらの結合工程の効率を考慮に入れ、マイクロアレイが形成される。
【０００４】
マイクロアレイは、主として２つの方法にしたがって生産される固体支持体である。第一方法は、米国特許第５５１０２７０号および同第５７００６３７号に記載され、固体支持体表面上の捕捉配列のフォトリソグラフィーのインサイチュ合成に基づいている。フォトリソグラフィーＤＮＡ合成は、迅速固相ホスホルアミダイト化学を利用する。位置および順序制御は、光での照射によって活性化することができる５’−光防護ホスホルアミダイトと、光が通過しうる適切な位置に穴を含んでいる一組のマスクとの組み合わせによって達成される。励起の時、このプロセスの間のより早い時期に合成された部分オリゴヌクレオチド配列上に存在する光保護基が除去され、これらのオリゴマーは、関連モノマーを添加した後で別のヌクレオチドによって伸長される。現在の共役効率（ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）は、これらのマイクロアレイに対して、約２５塩基の実際のサイズ限度を課す。この限度を超えると、アッセイの特異性を損なう不完全な産物が蓄積する。
【０００５】
この方法による捕捉オリゴヌクレオチドのサイズまたは長さの制限は、ステップ・バイ・ステップ方式で実施された合成の効率が、１００％でなく、したがって短縮されたオリゴヌクレオチドの蓄積が、同じスポット内に発生するという事実による。フォトリソグラフィー方法は結果として、支持体上の短いオリゴヌクレオチドの存在を生じる。この方法の主要な利点は、捕捉ヌクレオチド配列のこのようにして得られたものを小型化し、数千の捕捉ヌクレオチド配列を含有する高密度アレイを生成することができることである。
【０００６】
第二方法は、（固体支持体表面による）既知の特異的位置上への機械的付着（ｄｅｐｏｓｉｓｉｏｎ）前の捕捉配列の化学的または酵素的合成に基づいている。この方法を用いた場合、スポットされるか、付着されるか、または取付けられることになる配列のサイズには制限がないが、その理由は、これらは、あらゆる化学的または酵素的方法にしたがって合成することができ、これらの配列は、分析方法（通常は配列決定方法）によって確認することができるからである。インサイチュ合成方法と比べた場合、付着技術の主要な利点は、その大きい汎用性である。この方法によって、事実上、あらゆる該捕捉分子を有するマイクロアレイの生産が可能になる。これには、あらゆる長さの核酸配列、抗体、脂質、炭水化物、小さい化合物などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。さらには配列の合成は、最適化することができ、配列は精製することができ、これらの品質は、使用前にチェックすることができ、および／またはこれらの濃度は、固体表面への共役前に調節することができる。しかしながらこの方法の１つの欠点は、この方法は時間がかかることである。その理由は、各捕捉分子配列が、１つのアレイにしたがって固体支持体表面上へのスポッティング前に別々に取扱われなければならず、これによって、得られたマイクロアレイのサイズが制限されるからである。
【０００７】
オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションのマイクロアレイの化学は、長いＤＮＡ捕捉配列または分子を用いて構成されたアレイの化学とは明らかに異なる。長い特異的捕捉配列は、これらの対応する短い断片よりも、溶液またはサンプル中に存在する相補的標的配列のはるかに良好な結合を与えることが観察されている。実際、長いポリヌクレオチド捕捉配列は、長いポリヌクレオチド標的配列の直接結合に用いられる。一般的な遺伝子発現実験において、ｃＤＮＡ結合のための捕捉ヌクレオチド配列は、５０塩基またはそれ以上、例えば７０塩基を含有するか、または６００塩基またはヌクレオチドさえ含有ししてもよい。
【０００８】
１５〜２０塩基のみの短いオリゴヌクレオチドが捕捉配列として用いられる時（例えば米国特許第５５１０２７０号参照）、長いｃＤＮＡの結合はわずかであり、おそらくは検出できない。長いｃＤＮＡの適切な検出、同定、および／または定量化のために、次の追加工程を行なう必要がある。ＲＮＡ配列はまず、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位を有するプライマーを用いることによって、対応ｃＤＮＡに逆転写される。これらのｃＤＮＡ配列は次いで、インビトロでいくつかのＲＮＡコピーに再転写され、これらのコピーは次いで、小片にカットされる。これらの小さいＲＮＡ断片は次いで、これらのＲＮＡ断片の各々についての一連の捕捉配列を有するアレイ上のハイブリダイゼーションのために用いられる。非常に短い捕捉配列への標的ＲＮＡ配列の十分なアクセスを確保するために、断片化が必要である。標的ＤＮＡまたはｍＲＮＡの元の配列と、これらの異なる捕捉分子のハイブリダイゼーションパターンとを適切に相関させるために、特異的アルゴリズムが必要とされる。
特定の標的配列の特異的ハイブリダイゼーションを制御することができるように、各捕捉ヌクレオチド配列に対して制御を行なうことも必要である。これは、捕捉ヌクレオチド配列と同一であるが、１つの塩基の違いを有する対照捕捉ヌクレオチド配列の追加である。
【０００９】
もう１つの問題は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の場合に発生する。ｄｓＤＮＡが、マイクロアレイ上で分析されることになる時、これは、固体基質表面上に存在するかまたはこれに取付けられた対応捕捉ヌクレオチド配列上でハイブリッド形成されるよりもむしろ、優先的に溶液中で再会合される。大きい二本鎖アンプリコン（遺伝子増幅後に得られたもの）の直接同定および／または定量化のための短いオリゴヌクレオチドの使用の結果、非常に低い感受性を生じるか、または感受性をまったく生じず、したがって、まったく実用的ではない。この場合も同様に、アンプリコンは、Ｔ３またはＴ７配列を有するプライマーを用いて実施される二重増幅プロセス、次いでＲＮＡポリメラーゼを用いた逆転写を用いて、ＲＮＡ中に再転写されなければならない。これらのＲＮＡは、アレイ上で検出される前に約４０塩基の断片にカットされる（例えば国際特許出願第ＷＯ９７／２９２１２号の実施例１参照）。上記の技術は本明細書において、３０未満のヌクレオチドの捕捉ヌクレオチド配列を用いて、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｒｐｏＢ遺伝子の同定のために用いられた。記載されている方法は、遺伝子増幅反応（例えばＰＣＲ）の結果生じるアンプリコンの直接検出を可能にせず、別の反応サイクル、および標的配列のコピーを必要とするという意味で複雑である。これらは各々、前記標的配列の定量化中に、特別なバイアスを導入する。
【００１０】
しかしながら、化学合成、および短いポリヌクレオチド配列の付着を介したマイクロアレイの構築は有用であるが、その理由は、これが迅速かつ低価格プロセスであるからである。これに加えて、捕捉分子または配列の設計は、分析されるかまたは区別されることになる配列の必要条件にしたがって容易に適合させることができる。しかしながら本明細書の上記で説明されているように、短いヌクレオチド捕捉プローブの使用は、長い標的ヌクレオチド断片の検出において強力な制限を生じる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、先行技術の欠点を有していないマイクロアレイ支持体を得るための、新規生産方法を提供することを目的とする。
【００１２】
本発明は特に、検出方法において、（１）検出され、同定され、および／または定量化されることになる標的ヌクレオチド配列に対して特異的な短いヌクレオチド配列の高い特異性と、（２）長いヌクレオチド配列の高い感受性（１５０塩基を超える長いヌクレオチド配列と同じ結合感受性）とを有利に組合わせる配列を有するマイクロアレイ支持体の迅速な構築の新規方法を提供することを目的とする。
【００１３】
本発明のもう１つの目的は、ｃＤＮＡまたは長い二本鎖ＤＮＡ配列の直接検出に非常に適した新規（マイクロ）アレイ支持体を提供することである。
【００１４】
本発明のさらにもう１つの目的は、異なる消費者のニーズに適合させうる、オーダーメード可能な（マイクロ）アレイのさらなる適合および構築に非常に適した標準的（マイクロ）アレイ固体支持体を得る新規構築方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第一の局面は、おそらくは生物サンプルまたはテスト溶液中に存在する、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも４つの異なる標的ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列の検出、同定、および／または定量化のために用いられる、固体支持体の表面上のヌクレオチドセットの（マイクロ）アレイを得るための新規方法に関する。
【００１６】
有利には、前記方法は次の工程を含んでいる：
−  固体支持体の表面上へのヌクレオチドライン配列の固定工程であって、前記ヌクレオチドラインは、少なくとも２０ヌクレオチドの長さであり、検出されるか、および／または定量化されることになる標的ヌクレオチド配列に関連していない（ランダム）ヌクレオチド配列を有する工程（このことは、前記配列が、前記標的ヌクレオチド配列と相補的にハイブリッド形成することができないことを意味する）；
−  前記ヌクレオチドラインによってカバーされた固体支持体の表面上の少なくとも４つの特異的位置に、検出されるか、および／または定量化されることになる標的ポリヌクレオチド配列に対して特異的な配列を有するヌクレオチドフックを付着させる工程；および
−  固体支持体表面の前記特異的位置において、前記標的ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列の結合に特異的なポリヌクレオチドセットを形成するために、ヌクレオチドラインへヌクレオチドフックを、前記特異的表面位置において共有結合させる工程。
【００１７】
これらのヌクレオチドラインは、これらの末端部（５’または３’）の１つによってかつ固体支持体の表面上の共有結合によって固定された配列であり、他方の未結合末端部によってヌクレオチドフックを固定することができる。
【００１８】
このように単純かつ高価でない方法における、長いヌクレオチドセット構築を有する得られたアレイは、（１）各ヌクレオチドフックが、少なくとも４つの異なるポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列のうちの１つの標的配列に対して特異的であるという、ヌクレオチドフックの短い特異的配列の高い特異性、および（２）１５０塩基を超え、おそらくは３５０塩基を超える長いポリヌクレオチド配列の有利な感受性に達する高い感受性の両方を提供する。
【００１９】
さらには、好ましい方法は、ヌクレオチドラインの付着によって固体支持体の表面の均一かつ効率的なカバーを得ることを目的とし、これによって、固体支持体の表面上の特異的位置において、これらのヌクレオチドラインへのヌクレオチドフックのさらなる共有結合が可能になる。この固体支持体の前記表面のすべてが、結果としてポリヌクレオチドセットの形成を生じるわけではないが、その理由は、前記固体支持体表面のいくつかの位置は、ヌクレオチドラインによってのみカバーされたままになるからである。
おそらくはこのラインヌクレオチド配列は、例えば（固体支持体表面上に既に固定された相補分子（ビオチン、抗体、抗原）へ組合わされている）ストレプトアビジン、抗原、または抗体であるアダプター分子を介して、固体支持体の表面上に固定される。したがって、検出され、同定され、および／または定量化されることになる同一または異なる標的ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列に結合しうる、同様なまたは異なる（ラインへ）結合されたヌクレオチドフックを含む固体支持体の表面上の特異的位置のみを選択することも、本発明による方法によって可能である。
【００２０】
本発明の固体支持体表面は好ましくは、１ｃｍ２あたり、少なくとも４つのポリヌクレオチドセットのスポットのマイクロアレイを含んでいる。
【００２１】
このようなアレイのヌクレオチドライン配列は、１つのランダム（同じランダム）配列であってもよく、または多数のランダム（異なるランダム）配列であってもよい。好ましくは前記ヌクレオチドラインは、用いられる条件下に、生物サンプルまたはテスト溶液中におそらくは存在する、検出されるか、および／または定量化されることになる標的ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列のいずれかとハイブリッド形成しうる配列を含まないか、またはこれらの配列から作製されていない。
【００２２】
２つのヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーションは、当業者に知られているように、これら２つの配列の同一性または類似性のパーセンテージによって規定され、用いられるハイブリダイゼーション条件（例えばストリンジェントな条件、あまりストリンジェントでない条件、または非ストリンジェントな条件）によって規定される。
この場合、「ハイブリッド形成しない」という用語の意味は、捕捉ポリヌクレオチド上でハイブリッド形成された標的が１％未満、好ましくは０．１％未満、さらに好ましくは０．０１％未満存在するであろうということを意味する。ハイブリダイゼーションを防ぐために、標的ポリヌクレオチド（またはヌクレオチド）配列と、その特異的または対応ヌクレオチドライン配列との間に約１５以下の連続した（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ）相補塩基対結合が存在するであろうし、好ましくは１０未満のこのような可能性のある対合、より好ましくは５未満の対合が存在するであろう。したがって、ヌクレオチドラインの配列は、好ましくは１５未満の塩基、より好ましくは１０未満、さらにより好ましくは検出されることになる標的配列に相補的な５つ未満の連続塩基を含有するであろう。可能性のある連続した配列の決定は、Ｇｅｎｂａｎｋによって提供されている分子データベースとこれらの配列との比較によって、およびソフトウエア、例えば、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）を用いて容易に実施される。
【００２３】
本発明のもう１つの実施形態によれば、ヌクレオチドラインは、支持体上のヌクレオチド配列のインサイチュ合成によって得られる。
【００２４】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、これらのヌクレオチドラインは、約２０〜約１０００ヌクレオチド、より好ましくは約５０〜約２００ヌクレオチド、さらにより好ましくは約６０〜約１００ヌクレオチドからなる配列を有する。
【００２５】
本発明のもう１つの実施形態によれば、ヌクレオチドフックと結合したヌクレオチドラインは、異なる結合親和性を有し、かつ異なる固体支持体に取付けられた配列であり、これらの固体支持体の各々は、特異的な化学的または物理的状態または特徴、例えば特異的な化学的または物理的結合親和性（すなわち、異なるサイズ、蛍光、色彩、磁性などを包含する（しかしこれらに限定されない）、異なる化学的または物理的性質の異なるビーズ）を特徴とする。この技術的特徴は、これらが結合されている固体支持体の化学的または物理的性質の分析によって、これらの配列の区別を可能にする。
【００２６】
本発明によれば、検出され、同定され、および／または定量化されることになる標的ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、例えばゲノムＤＮＡまたはアンプリコンであり、おそらくはヌクレオチドフック上へのこれらの結合前に増幅またはコピーされる。
【００２７】
本発明のもう１つの局面は、おそらくは同時に生物サンプルまたはテスト溶液中に存在する、少なくとも２、少なくとも４、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも３０の異なる標的ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列の検出、同定、および／または定量化のための、本発明による方法によって入手可能なマイクロアレイに関する。
【００２８】
本発明のもう１つの局面は、少なくとも２０のヌクレオチド長さのランダム配列を有し、かつ固体支持体の表面上のこれらの配列の第一端部によって均一に共有結合的に固定されている、ヌクレオチドラインを含んでいる固体支持体に関連し、その表面は、本発明によるマイクロアレイの調製のために使用される。前記「処理された」固体支持体は、検出マイクロアレイ固体支持体の調製に適合した中間産物として、消費者によって直接使用されうる。消費者は、「処理された」固体支持体表面の特異的位置において、（ヌクレオチドラインに結合されることになる）ヌクレオチドフックの追加後、ポリヌクレオチドセットを形成しうる。
この固体支持体は、以後「オーダーメード可能なマイクロアレイ」として規定される。
【００２９】
有利には、ヌクレオチドライン配列の他方の（自由）端（表面に固定されていない端）は好ましくは、その後（おそらくは官能基化）ヌクレオチドフック配列と共有結合的に反応しうる（連結を形成する）反応性基または官能基を含む。
【００３０】
好ましくは前記ヌクレオチドフックはまた、ヌクレオチドライン（官能基化されているか、またはされていない）と反応しうる（連結を形成する）官能基の１つまたはそれ以上の反応性化学基によって終了する配列でもある。好ましくは、ヌクレオチドライン末端の前記反応性化学官能基は、ヌクレオチドフック末端のＮＨ２官能基と直接反応しうるアルデヒド、エポキシド、またはアクリレート官能基からできている。好ましい実施形態において、支持体上に固定されたヌクレオチドラインは、これらの自由端のところで（またはその近くに（この語は、別のヌクレオチド配列（フック配列）の末端との結合を可能にする距離を意味する））、ヌクレオチドリボースを含有する。このリボースは、ヌクレオチドフック末端のＮＨ２官能基の連続的固定のために、さらにアルデヒドに酸化される。
【００３１】
有利には、固体支持体の表面上のポリヌクレオチドラインおよび／またはポリヌクレオチドセットの密度は、固体支持体表面の１ｃｍ２あたり１０ｆモル、好ましくは１００ｆモルよりも大きい。
【００３２】
もう１つの好ましい実施形態において、ライン配列とフック配列との間の共有結合連結は、ホスホジエステル連結ではない。
【００３３】
本発明のもう１つの局面は、前記固体支持体であって、官能基化された配列末端を有する固定ヌクレオチドラインが、共有結合連結によってヌクレオチドフックに結合して、ポリヌクレオチドセットを形成し、前記固体支持体表面が、この固体支持体表面の特異的位置においてのみヌクレオチドラインに結合したヌクレオチドフックを含み、ほかの位置は、これらのヌクレオチドラインによってのみ依然としてカバーされている固体支持体に関する。
このことは、固体支持体表面が、次の２つの型の固定ヌクレオチド配列を含むことを意味する。すなわち、固体支持体の特異的位置上のポリヌクレオチドセット、および前記固体支持体表面のほかの位置上で反応性化学基または官能基で好ましくは官能基化されたヌクレオチドラインである。ほかの位置は、フックのさらなる固定のために利用しうる位置である。この型の固体支持体は以後、「オーダーメードされたマイクロアレイ」または「半オーダーメードされたマイクロアレイ」として規定される。
【００３４】
このことは、この型の「オーダーメードされたマイクロアレイ」が、固体支持体表面上の特異的位置において、ヌクレオチドライン上への（消費者によって選択された）特異的ヌクレオチドフックの追加後、ほかのポリヌクレオチドセットを形成するために消費者によって修正されうる、固体支持体の表面上の特異的位置を含んでいることを意味する。前記ヌクレオチドフックは、これらのヌクレオチドラインの官能基化末端と共有結合的に反応しうる。
もう１つの局面において、「半オーダーメードされたマイクロアレイ」はまた、次の２つの型の固定ヌクレオチド配列を含む固体支持体表面を含んでいる。すなわち、（先行技術のアレイにしたがって）ヌクレオチドラインによってカバーされない固体支持体の特異的位置上の標準的ポリヌクレオチド、および前記固体支持体のほかの位置上のヌクレオチドラインである。このことは、この型のオーダーメードされたマイクロアレイが、固体支持体の特異的位置上にプレスポットされている従来のポリヌクレオチド、およびヌクレオチドラインによってカバーされている固体支持体表面の特異的位置における特異的ヌクレオチドフックの追加後にポリヌクレオチドセットを形成するために消費者によって修正されうる、前記固体支持体のほかの位置上のヌクレオチドラインを含んでいることを意味する。
【００３５】
本発明のもう１つの局面は、本発明による固体支持体（オーダーメードしうるマイクロアレイまたはオーダーメードされたマイクロアレイ）、消費者用に適合させたマイクロレーを得るために選択された手段および培地を含む、部品のキットに関する。このような手段および培地は好ましくは、ヌクレオチドラインまたはヌクレオチドフックの末端と反応しうる化学基または官能基、官能基化ヌクレオチドラインと反応しうる（好ましくは官能基化された）ヌクレオチドフック、ならびに未結合ヌクレオチドフック配列を除去するために、固体支持体の表面の洗浄用に用いることができる培地（緩衝液）である。
【００３６】
本発明による部品キット中に存在するヌクレオチドフック（好ましくは官能基化ヌクレオチドフック）は、顧客用途のニーズにしたがって選択される。したがってこの部品キットは、柔軟性があり、サンプル中の多数の標的分子の、要求された検出、同定、および／または定量化に合わせて調整可能である。このことは、本発明による「オーダーメードされたマイクロアレイ」が、固体支持体表面の特異的位置において特異的ヌクレオチドフックを有するポリヌクレオチドセットを既に含み得ることを意味し、前記ポリヌクレオチドセットは、アレイにしたがって前記特異的位置に存在し、これらの位置情報は、多数の標的分子の、要求された検出、同定、および／または定量化を改良するために、ほかの特異的位置において追加の配列を有する、前記「オーダーメードされたマイクロアレイ」の調製を顧客が完了させることができるように、顧客に提供される。
【００３７】
部品キット中に存在する手段および培地はまた、１つまたはそれ以上の遺伝子増幅またはコピー工程を実施するため、および目的の多数のヌクレオチド配列の特異的検出、同定、および／または定量化を得るためにも選択される。当業者によく知られているこのような手段および培地には、プライマー、サイクラー、ポリメラーゼ、またはほかの培地、例えば標的ヌクレオチド配列の対応ヌクレオチドセット上へのこれらの結合から結果として生じるシグナルを得るために用いられる蛍光、比色、および／または放射性ラベルが含まれる。
【００３８】
多数の標的分子の検出、同定、および／または定量化は、裸眼によって実施することができるが、好ましくは特別な装置、例えば標的分子のそれぞれの捕捉分子（ポリヌクレオチドセットのフック末端）へのこれらの結合の結果生成されたシグナルの検出および／または解釈のために必要なソフトウエアを好ましくは備えた自動読み取り装置において実施される。このような装置は、完全に自動化することができる。
【００３９】
本発明の文脈において、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、「標的またはヌクレオチド配列」、「アレイ」、「ヌクレオチド配列」、「標的核酸」、「実質的に結合する」、「〜へ特異的にハイブリッド形成する」、「バックグラウンド」、「定量化する」などの用語は、国際特許出願第ＷＯ９７／２７３１７号に記載されているようなものである。この特許は、参照して本明細書に組み込まれる。本発明の文脈における「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド配列、または少なくとも２つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のヌクレオチド様配列のことを言う。「オリゴヌクレオチド」または「短いポリヌクレオチド」という用語は特に、１００未満のヌクレオチドまたはヌクレオチド様配列、および好ましくは５０未満のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のことを言う。「長いポリヌクレオチド」という用語は、１００を超えるヌクレオチドまたはヌクレオチド様配列のことを言う。ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなどへの言及には、糖−リン酸塩骨格が修飾され、および／または置換されている類似種が含まれるが、ただしそのハイブリダイゼーション特性は損なわれていないという条件がある。例として、この骨格は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれている同等の合成ペプチド、またはインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）によって置換されてもよい。
【００４０】
「相同配列」および「同族体」という用語の意味は、欧州特許第ＥＰ１２６６０３４号に記載されているとおりである。この特許は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００４１】
本発明の文脈におけるマイクロアレイを構築するための「固体支持体」という用語は、必要な反応、例えばおそらくは標的ヌクレオチド配列、または標的ヌクレオチド配列のコピーを含有するテスト溶液またはサンプルのインキュベーションを実施するために物理的に取り扱うことができる、あらゆる型の固体物質を含むものとする。この固体支持体は、唯一のものであってもよく、またはいくつかの物質からできている複合材料であってもよい。これらのうちの１つは、配列がその上に固定されてマイクロアレイを生じる基質である。この分野において用いられている基質の典型例は、捕捉分子をよりよく固定するために官能基化されうるポリマーである。ヌクレオチドラインがその上に固定されている前記基質または支持体は、多孔質または非多孔質支持体であってもよく、平滑または粗くてもよく、別の固体支持体の上に付着させられるか、または置かれてもよく、これは、例えばガラスまたはプラスチック製である。「サンプル」、「生物サンプル」、または「テスト溶液」という用語は、標的ヌクレオチド配列を含有すると推測されているあらゆるサンプルまたは溶液を含むものとする。本発明の文脈において、特に（微）生物またはこれの構成成分に特異的なポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列が検出されている。テスト溶液は、（微）生物またはこれの構成成分の増幅産物のアンプリコンを含有する溶液であってもよい。「均質性」という用語は、固体支持体の表面上に固定されたヌクレオチドラインの均質層を含むものとする。この文脈において、表面１ｃｍ２あたりのヌクレオチドラインの密度は均一であり、固体支持体の表面の異なる部分において３０％未満だけ、好ましくは１０％未満だけ異なる。ヌクレオチドフックの固定は、アレイの異なるスポットにおいて定量的かつ類似でなければならないが、その理由は、ヌクレオチドフックが、次のような多数の標的ヌクレオチドのための捕捉分子であるからである。すなわちこれらは、同じサンプル中に存在し、かつその量が定量化され、かつ互いに比較されなければならない多数の標的ヌクレオチドである。
【００４２】
本発明は、次の実施例および特定の実施形態において、添付図面を参照してさらに詳細に記載される。これらの実施例、実施形態、および図面は、特許請求されている本発明の範囲をまったく限定するものではなく、用いられている参照記号も同様である。
【００４３】
図１はヌクレオチドライン（１）でカバーされた固体支持体の表面（５）上の特異的位置（６）上の、サンプル中の多数の標的ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列（４）の特異的検出、同定、および／または定量化のための、ヌクレオチドライン（１）、ヌクレオチドフック（２）、およびポリヌクレオチドセットを有する、本発明によるアレイを示している。
【００４４】
図２は特異的位置（６）に存在するライン（１）または（ライン−フック）ポリヌクレオチド特異的セット（３）によってカバーされた、本発明によるアレイ（５）の表面を示している。（マイクロ）アレイの構築のために用いられる固体支持体の表面は、ヌクレオチドライン（１）で均一にカバーされている。
【００４５】
図３は本発明による「半オーダーメードされたアレイ」の表面を示しており、これは、１つの部分（７）が、支持体（６）の特異的位置上に存在するいくつかの標的配列の特異的ポリヌクレオチドセットでカバーされ、表面（５）のもう１つの部分（８）が、さらなる標的検出用の特異的ポリヌクレオチドセット（３）を提供するため、さらなるヌクレオチドフック（２）結合のためにヌクレオチドライン（１）でカバーされている。
図４は本発明による「半オーダーメードされたアレイ」の表面を示しており、これは、１つの部分（７）が、ヌクレオチドライン（１）によってカバーされていない支持体（９）の特異的位置上に存在する、いくつかの標的配列の特異的ポリヌクレオチドでカバーされ、表面（５）のもう１つの部分（８）が、さらなる標的検出用の特異的ポリヌクレオチドセット（３）を提供するため、さらなるヌクレオチドフック（２）結合のためにヌクレオチドライン（１）でカバーされている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
本発明は、おそらくは生物サンプルまたはテスト溶液中に存在する多数の標的ヌクレオチド配列、特にｃＤＮＡ配列または長い二本鎖ＤＮＡ配列の検出に非常に適した新規（マイクロ）アレイを生じる新規構築方法に関する。本発明による１つの実施形態において、そのようなものとして得られたアレイの固体支持体表面（５）の少なくとも一部分が、おそらくはランダムに、ヌクレオチドライン（１）として役立つヌクレオチド配列でカバーされている。この上の特異的位置（６）において、特異的ヌクレオチドフック（２）が次いで付着させられて、ポリヌクレオチドセット（３）を生じ、これによって、対応する標的ヌクレオチド配列の特異的結合が可能になる。最終的に結合された配列（ポリヌクレオチドセット（３）とも呼ばれる）は、一部分については、支持体に結合された非特異的配列、もう１つの部分については、検出されることになる標的配列（４）を特異的に認識するかまたは結合する配列を有する、長いヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドである（図１および図２参照）。前記ポリヌクレオチドセット（３）はまた、捕捉配列、特異的捕捉配列、または対応捕捉配列とも呼ばれ、これは、これらが、標的ヌクレオチド配列と相補的なその配列の一部を有する標的ヌクレオチド配列を認識することを意味する。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態において、ヌクレオチドライン（１）は、サンプルと接触している基質またはマイクロアレイ支持体の全表面（５）上に存在する。次いでこの表面は、一部または全部を、特異的ヌクレオチドフック（２）でカバーされる。
【００４８】
本発明の特別な実施形態において、すべてのヌクレオチドライン（１）は、１０を超える連続した塩基上の標的生物ゲノムと相補的でない同じランダム配列からなっていてもよい。
【００４９】
本発明のもう１つの実施形態において、ラインヌクレオチド配列（１）は同一でない。すなわちこれらのヌクレオチドラインは、すべてが同じ配列を有しているわけではなく、複数の異なる配列をカバーする。これらのヌクレオチドラインの配列は、既知であっても、または未知であってもよい。
【００５０】
１つの特別な実施形態において、ヌクレオチドライン（１）の配列は、ランダム配列、例えば、４つのヌクレオチド前駆体の混合物を用いた、インサイチュ合成によって得られたランダム配列である。当業者に知られているように、所定の配列の反応は、この反応のストリンジェンシーに依存する。交差反応の確率は主として、配列相同性または同一性に依存する。ランダム合成における別の２５ヌクレオチドの配列と同一の２５ヌクレオチドの配列を得る確率は、１／４２５または１／（１×１０１５）である。同一配列のこの非常に低い頻度から考えて、ライン（１）のランダム合成は、本発明の目的に適している。
【００５１】
好ましい実施形態において、本発明のヌクレオチドフック（２）またはフックは、アレイに付着させられる前に、したがってライン（１）上に固定される前に化学的に合成される。酵素合成も可能である。
【００５２】
本発明の特別な実施形態において、ヌクレオチドフック（２）は、約１０〜約１２０ヌクレオチド、より好ましくは約１５〜約６０ヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約４０ヌクレオチドから構成された配列を有するオリゴヌクレオチドまたは短いポリヌクレオチドである。この文脈における「約」は、記載されているものよりも、１、２、３から５個まで多いかまたは少ないヌクレオチドを有することが可能であることを意味する。
【００５３】
特別な用途において、（マイクロ）アレイは、約１００未満のヌクレオチドまたは塩基の配列を有するが、約１５０を超えるヌクレオチドまたは塩基を有する長いポリヌクレオチド配列と同じ結合効率を生じるヌクレオチドフック（２）を有する。より好ましくはこれらは、２５０を超えるヌクレオチドまたは塩基の長いポリヌクレオチド配列と同じ結合効率を与える。このことは、少なくとも約２０、約４０塩基またはヌクレオチドのヌクレオチドライン（１）へのヌクレオチドフック（２）の結合、カップリング、または共有結合連結を介して可能である。
【００５４】
特別な実施形態において、これらの（マイクロ）アレイは、検出されるか、および／または定量化されることになる、少なくとも４、１０、２０、５０の異なる標的ヌクレオチド配列に対する、ヌクレオチドラインおよび特異的ヌクレオチドフックの両方を有する、少なくとも４、１０、２０、５０、１００、１０００、１００００位置から構成されている。このようなアレイは、少なくとも４、１０、２０、５０、１００、１０００、または１００００スポット／ｃｍ２を有する。
【００５５】
特別な実施形態において、検出されることになる異なる標的ヌクレオチド分子に対するラインおよびフック配列は、少なくとも４、１０、２０、５０、１００、５００、または１０００の物理的に異なる支持体（好ましくはビーズである）上に存在し、各支持体は、好ましくは異なる化学的または物理的特徴（サイズ、磁性など）によって同定される。
【００５６】
特別な実施形態において、ヌクレオチドライン（１）および／またはヌクレオチドフック（２）は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、ＰＮＡ（例えば国際特許出願第ＷＯ００７５３７２号参照）、またはＩＮＡである。
【００５７】
本発明の１つの実施形態において、検出すべき標的配列（すなわちポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列（４））は、アレイ上への捕捉の前に、既知の遺伝子増幅方法、例えばＰＣＲ方法によって、多数化されるか、増幅されるか、またはコピーされる。
【００５８】
好ましい実施形態において、ヌクレオチドライン（１）の末端（５’または３’）は、化学反応によって固体支持体または基質上に固定される。
【００５９】
好ましくは、前記ヌクレオチドライン（１）は、特異的反応性化学官能基を含有するかまたは有するように官能基化されて選択され、この基は、おそらくは官能基化された支持体または基質と反応し、共有結合を生じる。化学官能基または基は、アルデヒド、アミン、エポキシド、アクリレート、チオシアネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド等であってもよく、上記リストは非網羅的である。
【００６０】
好ましい結合は、５’アミノ化末端ヌクレオチド配列と、アルデヒドカバー表面との間に得られ、これはイミン結合を生じ、次いでこれはＮａＢＨ４の存在下に還元される。
【００６１】
好ましくは前記化学官能基または基は、５’または３’末端部（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ）のどちらかに位置する。ヌクレオチドラインは、支持体上に共有結合固定され、これらのヌクレオチドラインの第二末端は、ヌクレオチドフックの固定のための化学的反応性官能基を得るように、第二工程において適切な化学的または物理的手段によって活性化される。ヌクレオチドフックは、ヌクレオチドラインに共有結合カップリングされることになる適切な基または官能基を含んでいる。反応性基または官能基はここでもまた、アルデヒド、アミン、エポキシド、アクリレート、チオシアネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどであってもよいが、これらに限定されるわけではない。末端部とは、ヌクレオチド配列の末端（最後の塩基）のところに位置するか、または末端塩基から５０塩基未満、好ましくは１０塩基未満である末端の近くに位置することを意味する。
【００６２】
本発明のもう１つの実施形態において、ヌクレオチドライン（１）は、アダプター上への結合を通してアレイ支持体上に固定されてもよい。好ましい実施形態において、ストレプトアビジンは、支持体上に固定され、ビオチン化ヌクレオチドラインは、被覆された支持体と共にインキュベーションされ、したがってこれらのラインの結合は、ビオチンとストレプトアビジンとの間の認識によって生じる。もう１つの可能性は、支持体上へのヌクレオチドラインの効率的な結合を得るための、適切な抗体−抗原ペアまたは受容体−リガンドペアの使用を包含する。当業者は、意のままに様々な代替方法を実施することができる。
【００６３】
好ましい実施形態において、ヌクレオチドライン（１）は、末端リボースを含有し、これは次いで、過ヨウ素酸塩処理によって酸化され、その結果、アルデヒド基の形成が生じる。これらのアルデヒド基は、アミノ化ヌクレオチドフック（２）の結合のために接近可能であり、これらの両方のカップリングの結果、イミン結合を生じる。このイミンは次いで、還元され、共有結合アミン安定連結を生じる。末端リボースはまた、末端塩基から５０塩基未満、好ましくは１０塩基未満を意味する、ラインの非結合末端の近くに位置するリボースも意味する。
【００６４】
もう１つの実施形態において、ホスホルアミダイト方法による固相合成は、ヌクレオチドライン（１）へヌクレオチドフック（２）を共有結合させるために用いることができる。１つの実施例において、ヌクレオチドラインは、固体支持体の表面上でインサイチュで合成される。ヌクレオチドラインの最後のヌクレオチドは、リボース上に遊離５’−ＯＨを有し、これはヌクレオチドフックの最後のヌクレオチドの３’位に存在するホスホルアミダイト基と共有結合反応しうる。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態において、ヌクレオチドフック（２）は、固体支持体表面１ｃｍ２あたり、１０ｆモルを超え、好ましくは１００ｆモルを超える密度で存在する。
【００６６】
本発明の特別な実施形態において、マイクロアレイ上での検出のために用いられた特異的な位置の各々は、１つの特別なヌクレオチドフック種によってカバーされる。１つのフック種は好ましくは、１つだけの分子から構成される。しかしながら実際、ポリヌクレオチドの合成は、１つのヌクレオチドが終わったら続けて次のヌクレオチドについて実施される連続方法である。各連続反応は１００％収率を有していないので、結果として異質混合物を生じる二次生成物の蓄積があるであろう。最終生成物中のこのような二次生成物の存在は、二次生成物による汚染レベルが、対応標的配列または分子の特異的結合および認識または同定をかき乱すほど高くないかぎり、本発明の用途にとって有害でない。
【００６７】
本発明の１つの局面は、所定の標的ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列（４）に対して特異的なヌクレオチドフック（２）を、（ヌクレオチドラインの末端上に）固定された前記固体表面（５）の所定の位置（６）に含有する固体（不溶性）支持体に関する。前記ヌクレオチドフック（２）は、少なくとも２０ヌクレオチド長さのポリヌクレオチドライン（１）へのこれらの共有結合連結後に固定され、これによって標的特異的ポリヌクレオチドセット（３）を形成し、前記アレイによって、おそらくは生物サンプルまたはテスト溶液中に存在する、多数の、好ましくは少なくとも４つの異なる標的ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列（４）の特異的検出、同定、および／または定量化が可能になる。
【００６８】
本発明のさらにもう１つの局面は、少なくとも２０ヌクレオチド長さのヌクレオチドライン（１）、およびこの表面（５）の所定の位置（６）において、検出されることになる所定の標的ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列に対して特異的なヌクレオチドフック（２）によって、その表面（５）の（限定された部分）がカバーされている固体（不溶性）支持体に関しており、前記ヌクレオチドフック（２）は、前記ヌクレオチドライン（１）へ共有結合連結され、これによって標的特異的ポリヌクレオチドセット（３）が形成され、前記アレイによって、おそらくは生物サンプルまたはテスト溶液中に存在する、多数の、好ましくは少なくとも４つの異なる標的ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列（４）の特異的検出、同定、および／または定量化が可能になる。
【００６９】
本発明の特別な実施形態は、その表面（５）の第一部分（７）に、標的ポリヌクレオチド配列（４）の第一群の検出のために空間的に分離された少なくとも３つの固定ポリヌクレオチドセット（６）の第一群；およびこの固体支持体表面（５）の第二部分（８）に、前記第一群の標的分子を結合することはできないが、空間的に分離された位置において、標的ポリヌクレオチド配列（４）の第二群の検出のために標的特異的ヌクレオチドフック（２）を固定するか、結合するか、または捕捉することができるヌクレオチドライン（１）を含んでいる固体支持体に関する（図３参照）。好ましくは第二群は、少なくとも２つの異なる捕捉分子、好ましくは少なくとも４つの異なる捕捉分子を含んでいる。本発明のもう１つの特別な実施形態は、その表面の第一部分（７）に、ヌクレオチドライン（１）によってカバーされない特異的表面位置（９）のところに固定され、かつ標的ポリヌクレオチド配列（４）の第一群の検出のために空間的に分離された、少なくとも３つの固定標準ポリヌクレオチド配列の第一群、および固体支持体表面（５）の第二部分（８）に、前記第一群の標的ポリヌクレオチド配列を結合することはできないが、標的ポリヌクレオチド配列（４）の第二群の検出に対して特異的な標的特異的ヌクレオチドフックと共有結合連結を形成しうるヌクレオチドライン（１）を含んでいる固体支持体に関する（図４参照）。
【００７０】
標的分子の両方の群は、同じサンプルまたはテスト溶液中に存在してもよい。好ましくは両方の群は、同じ効率をもって結合され、捕捉され、および／または検出される。必要であれば、前記第一および第二群の検出効率は、サンプルまたはテスト溶液中に存在する標的分子を適切に定量化するために補正される。
【００７１】
本発明の１つの実施形態において、ポリヌクレオチドセットの第一群はまず、この第二群の調製および固定とは独立して調製される。特別な実施形態において、第一群は、ラインまたは活性化ライン（１）を含有しない位置において、アレイ支持体上に存在するだけである。ポリヌクレオチドセットの第二群は、活性化されたヌクレオチドライン（１）への標的特異的フック（２）の固定を通じて得られる。
【００７２】
最も好ましくは、第二群からのポリヌクレオチドセットの支持体への取付けに用いられる試薬は、ポリヌクレオチドセットの前記第一群の完全な脱離および／または不活性化を生じない。好ましくは前記脱離および／または不活性化は、できるだけ低く保たれる。
【００７３】
もう１つの好ましい実施形態において、セットの第一群は、長いポリヌクレオチドであり、セットの第二群は、本発明によるライン（１）およびフック（２）から構成され、これらのフック（２）は、優先的に小さいかまたは短い標的特異的ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。好ましくはポリヌクレオチドセット（３）は、固体支持体表面の第二部分上に存在する反応性化学基または官能基を介して、支持体またはアレイに共有結合され、この固体支持体表面は、好ましくは、この支持体の境界が画定された表面である。前記化学官能基は、化学処理によって活性化されてもよい。
【００７４】
本発明のもう１つの局面は、おそらくは生物サンプルまたはテスト溶液中に存在する（微）生物またはこれの構成成分の検出、同定、および／または定量化のためのキット、または部分キット（ｋｉｔ−ｉｎ−ｐａｒｔｓ）に関しており、前記キットは、上記のような支持体またはマイクロレーを含んでいる。
【００７５】
このキットはさらに、前記支持体またはマイクロアレイ上に捕捉された時、標的分子の検出のために必要な溶液および試薬を含んでいてもよい。
【００７６】
このキットはさらに、ヌクレオチドラインに連結された標的特異的ヌクレオチドフックを含んでいる標的特異的ポリヌクレオチドセットを有する、本発明のアレイを得るために本発明の方法を実施するための手段および培地を含んでいてもよく、前記捕捉ポリヌクレオチドセットは好ましくは、固体支持体表面１ｃｍ２あたり好ましくは少なくとも４つの一本鎖捕捉ヌクレオチド配列の密度を有するアレイの形態で、前記固体支持体の表面上に付着させられる。
【００７７】
本発明のアレイまたは支持体は、おそらくはテスト溶液またはサンプル中に存在する異なる標的配列、すなわち少なくとも１つ、好ましくは少なくとも４つの標的ヌクレオチド配列の検出に非常に適している。第一および第二群に属する標的配列は、同じ生物サンプル中に存在してもよく、本発明によるアレイを用いて同時に検出されてもよい。
【００７８】
本発明はまた、その表面の少なくとも一部分上に、第一端が前記支持体の表面へ固定されている少なくとも２０ヌクレオチドの配列を有し、かつヌクレオチドフックと反応するか、または活性化されてこれと共有結合的に反応させることができる他方の端に、反応性化学基を有する、均一に固定されたヌクレオチドラインを有する固体支持体もカバーする。特別な実施形態において、本発明のアレイまたは支持体は、半オーダーメードされたアレイの調製のために用いられてもよい。半オーダーメードされたアレイは、固定数の本発明による所定のポリヌクレオチドセット、またはこの支持体の別の部分において、選ばれたほかの標的に対して特異的な配列が補足されていてもよい、先行技術の標準的ポリヌクレオチド配列を有するアレイである。このアレイの第一部分上に標準的ポリヌクレオチド配列またはセットを有し、かつ選ばれたポリヌクレオチドセットの第二群の調製の準備ができている、第二部分上に存在するラインを有するマイクロアレイは次いで、用途のニーズにしたがってその上に標的特異的フックをスポットすることができる、標準的産物として送達されるであろう。本発明は、このような半オーダーメードされたアレイに関する。
【００７９】
本発明の方法は、支持体の一部上に、所定数の特異的標的配列のための標準的ポリヌクレオチドセットを有し、反対側に、非標準であり、かつ用途に応じて異なる標的配列の検出のための柔軟性部分を有するマイクロアレイの標準的生産のために特に有用である。このようにして、標準的アレイは、使用者のニーズにしたがって、不定数の異なるアレイに転換することができる。このようなアレイは、長いポリヌクレオチドセットが、アレイの第一位置で用いられ、かつ容易に合成される小さいオリゴヌクレオチド配列が、第二位置で用いられる時に特に有用である。ポリヌクレオチドセットの２つの集団についての結合効率の比較によって、テスト溶液またはサンプル中に存在する標的分子の各々の当初量の比較が可能になる。好ましくは、割当てられた標準物質（ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｄ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ）がテスト溶液またはサンプルに添加され、ポリヌクレオチドセットの両方の群の結合効率の補正が可能になる。
【００８０】
本発明のもう１つの局面は、一つの部分上で、または第一部分のところで、所定の標的分子の検出のための捕捉分子が結合され、別の部分上で、おそらくは、ほかの標的分子の検出に適合しうるフックの結合のために活性化されたラインが結合されている、アレイ支持体または基質をカバーする。
【００８１】
本発明のこれらのアレイは、おそらくは、少なくとも一部、ｃＤＮＡ鎖中に標的遺伝子をコピーし、かつ本発明にしたがって提供された特異的捕捉分子上へのｃＤＮＡのハイブリダイゼーション後、細胞によって発現された遺伝子の検出および／または定量化に非常に適している。本発明の方法は、非常に感受性の高い方法を必要とする、互いに相同なｃＤＮＡ配列の検出に特に適している。相同またはほぼ同一な配列間の区別は、良好な結合効率を有しつつ、このような区別を可能にする、小さいかまたは短い特異的配列の使用によって可能である。本発明の方法によって、１つまたは２〜３のヌクレオチドにおいてのみ異なり、したがって１つまたは２〜３のＳＮＰ（単一ヌクレオチド多形性）を含有する標的配列間の区別が可能になる。
【００８２】
有利には、本発明の方法およびアレイは、生物またはこの一部から直接得られた、すなわち先行する増幅工程を用いないか、あるいはまた、そのゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの一部の増幅後得られた、ＤＮＡ配列、一本鎖または二本鎖配列の同定および／または定量化のために用いることができる。標的配列の増幅は、当業者に知られているあらゆる方法によって達成することができる。これらの方法には、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ローリングサークル、または所定の配列のかなり信頼しうるコピーの生成を可能にするその他のあらゆる方法が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００８３】
マイクロアレイ上に捕捉された標的配列の検出は、当該分野で知られているあらゆる物理的または化学的検出方法によって実施することができる。この方法には、蛍光、比色、生物ルミネセンス、化学ルミネセンス、電気、表面プラズモン共鳴、電磁信号などの使用が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００８４】
本発明によるマイクロアレイの構築のための固体支持体または基質は、好ましくは、スライド、ディスク、ゲル層、および／またはビーズから選択されたフォーマットにおいて調製された、ガラス、電子デバイス、シリコン支持体、シリカ、金属、またはこれらの混合物からなる群から選択される。ビーズは、互いからこれらを区別することができる特徴を有するかぎり、アレイとして考えられ、したがってビーズの同定は、所定のフック配列の同定と相互関連して、おり、標的配列についてもそうである。上記の例は、網羅的ではない。
【００８５】
本発明の１つの実施形態において、捕捉された標的配列の検出、同定、および／または定量化は、（微）生物からの標的配列がアレイ上で捕捉されている位置に形成されたシグナルを検出するか、および／または定量化するための少なくとも１つの検出および／または定量化デバイス、おそらくは前記固体支持体の表面上に記録された情報のための読み取りデバイス、その対応ポリヌクレオチドセットおよびこれらの位置上に結合された標的配列を有する離散領域を認識するためのコンピュータプログラム、おそらくはこれらの位置に存在するシグナルの定量化プログラム、および前記（微）生物または構成成分の診断および／または定量化と、これらの位置におけるシグナルの存在とを相互関連させるためのプログラムを含んでいる装置の使用によって容易にされる。本発明は、これらの目的に適合し、かつ本発明のマイクロアレイを読み取って、その結果を解釈することができる装置にも及ぶ。
【実施例】
【００８６】
実施例１：支持体上へのヌクレオチドラインの固定
ガラス支持体の機能化
ガラススライドを、欧州特許出願第ＥＰ１１８４３４９号に記載されている方法にしたがって、アルデヒドの存在に対して機能化する。
【００８７】
支持体上へのヌクレオチドラインの固定
アルデヒド支持体上へのアミノ化ラインの固定は、次のように実施する。５’末端にアミノ基、３’末端にリボヌクレオチドを有するＤＮＡヌクレオチドラインを、化学合成によって合成する（ベルギー国リエージュのユーロジェンテック（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ））。これらを、ミリＱ純水中に１ｍｇ／ｌ希釈する。各バイオチップを、室温で、６０分間、攪拌下（＋／−２００ｒｐｍ）、ＤＮＡ溶液が入っているシルバーグリーンの管においてインキュベーションする。これらのスライドを室温で洗浄する。すなわち、水中０．２％ＳＤＳ溶液で２分間３回、純水で２分間２回、水素化ホウ素ナトリウム溶液（２．５ｍｇ／ｍｌＮａＢＨ４、ＰＢＳ／無水エタノール比７５／２５で）で５分間１回、純水で２分間１回である。これらのスライドを、次いで３分間純水で９５℃において洗浄する。これらのスライドを、４℃での貯蔵前に、室温で乾燥する。
【００８８】
実施例２：支持体の特異的位置上のヌクレオチドフック固定
支持体上の機能化ラインの活性化
ＤＮＡヌクレオチドライン上に存在するリボヌクレオチドを、次のようにしてアルデヒド基に酸化する。これらのスライドを、０．１Ｍ  ｐＨ５．２酢酸ナトリウム溶液（ＣＨ３ＣＯＯＮａ・３Ｈ２Ｏ、メルク（Ｍｅｒｃｋ）、ｒｅｆ．−１．０６２６７）、および新たに調製された２５μｌの０．４５Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液（ＮａＩＯ４、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ｒｅｆ．−Ｓ１８７８）を含有する溶液でインキュベーションする。この溶液を、支持体上で、室温において２時間、暗所でインキュベーションする。これらのスライドを、１ｍｌアセテート緩衝液で洗浄し、次いで使用するまで、４℃で酸化形態に保持する。
【００８９】
フック固定化
５’末端でアミノ化されたヌクレオチドフックを、ユーロジェンテック（ベルギー国リエージュ）によって化学的に合成する。これらを、スポッティング溶液（ベルギー国ナミュール（Ｎａｍｕｒ）のイート（ＥＡＴ））中に希釈する。これらのＤＮＡ溶液を、支持体上のプレーンピンを用いてアレイヤー（ａｒｒａｙｅｒ）でスポットする。これらのスライドを、室温で１時間乾燥する。これらのスライドを、洗浄緩衝液で２分間２回、水で３回洗浄する。これらのスライドを、使用するまで、エバーグリーン管中に４℃で保持する。アミノ化されたヌクレオチドを、３つのラット遺伝子の特異的なものになるように設計するが、これらは次の配列を有する：
配列番号１（フック１）：ラットＦａｓ抗原リガンド（受入れ番号：Ｕ０３４７０）
2005321389.tif 000003
配列番号２（フック２）：ラット未カップリングタンパク質２（受入れ番号：ＡＢ０１０７４３）
2005321389.tif 000004
配列番号３（フック３）：ラットリボソームタンパク質Ｌ１９（受入れ番号：Ｊ０２６５０）
2005321389.tif 000005
【００９０】
実施例３：比色分析によるバイオチップ上のｃＤＮＡの検出
捕捉分子を含有する支持体の表面は、標的配列を含有する溶液と接触している支持体の表面を画定するハイブリダイゼーションフレームで取囲まれている。このアレイを、Ｄｅｌｏｎｇｕｅｖｉｌｌｅら、２００２（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６４：１３７−１４９）によって説明されているように、ラットの肝臓からのビオチン化されたｃＤＮＡと共にインキュベーションする。標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション後、これらのアレイを洗浄し、室温で４５分間、ブロッキング緩衝液（ドイツ国ハンブルグ、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ））中に１／１００希釈された、２０ｎｍ金粒子（ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ｒｅｆ．ＢＬ−ＧＡＢ２０）に結合された１５ｍｌ抗ビオチン抗体が入っているエバーグリーン管においてインキュベーションする。次いでこれらのバイオチップを、Ｂ１緩衝液（ドイツ国ハンブルグ、エッペンドルフ）で２分間５回洗浄する。各バイオチップを、新しいエッペンドルフ管で、室温において暗所で、１０分間シルバークワント（Ｓｉｌｖｅｒｑｕａｎｔ）溶液（ドイツ国ハンブルグ、エッペンドルフ）中でインキュベーションする。顕色は、７００μｌミリＱ水で２回洗浄して停止する。次いでバイオチップを走査し、比色スキャンアレイ（Ｓｃａｎａｒｒａｙ）（ドイツ国ハンブルグ、エッペンドルフ）において定量化する。写真をデジタル化した後、スポット表面を画定し、各スポットについてシグナルを統合し、各スポットの周りの局部バックグラウンドを差し引き、これらのスポットの局在性を同定し、標的の同一性とこの局在性とを相関させるために、ソフトウエアプログラム（ドイツ国ハンブルグ、エッペンドルフ）を用いる。定量化は、スパイクされた内部標準を用いて得られたシグナルと、異なる標的ヌクレオチドスポットのシグナルとの比較によって得られる。
【００９１】
実施例４：蛍光によるバイオチップ上のｃＤＮＡの検出
実験は、本質的に実施例３のように実施されるが、ビオチン化標的ｃＤＮＡでのハイブリダイゼーション後であり、これらのアレイを、ブロッキング緩衝液中に１／１０００希釈された抗シアニン抗体（ジャクソン・イミュノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、Ｃｙ３：ｒｅｆ．−２００．１６２．０９６、Ｃｙ５：ｒｅｆ．−２００．１７２．０９６）と共にインキュベーションする。次いでこれらのバイオチップを、Ｂ１緩衝液で、２分間４回洗浄する。これらのバイオチップを室温で乾燥し、ＧＭＳ４１８スキャンアレイ（ジェネラル・スキャニング（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ））で走査する。写真のデジタル化後、スポット表面を画定し、各スポットについてシグナルを統合し、各スポットの周りの局部的バックグラウンドを差し引き、これらのスポットの局在性を同定し、標的配列の同一性とこの局在性とを相関させるために、イマジーン（Ｉｍａｇｅｎｅ）ソフトウエア（米国マリナ・デル・レイのバイオディスカバリー（Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｍａｒｉｎａ  Ｄｅｌ  Ｒｅｙ））を用いる。サンプル中に存在する標的配列の定量化は、本質的にＤｅｌｏｎｇｕｅｖｉｌｌｅら、２００２（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６４：１３７−１４９）の出版物に記載されているように得られる。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】ヌクレオチドライン（１）でカバーされた固体支持体の表面（５）上の特異的位置（６）上の、サンプル中の多数の標的ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列（４）の特異的検出、同定、および／または定量化のための、ヌクレオチドライン（１）、ヌクレオチドフック（２）、およびポリヌクレオチドセットを有する、本発明によるアレイを示している。
【図２】特異的位置（６）に存在するライン（１）または（ライン−フック）ポリヌクレオチド特異的セット（３）によってカバーされた、本発明によるアレイ（５）の表面を示している。
【図３】本発明による「半オーダーメードされたアレイ」の表面を示している。
【図４】本発明による「半オーダーメードされたアレイ」の表面を示している。
【配列表フリーテキスト】
【００９３】
配列番号１はラットＦａｓ抗原リガンド（受入れ番号：Ｕ０３４７０）の配列である。
配列番号２はラット未カップリングタンパク質２（受入れ番号：ＡＢ０１０７４３）の配列である。
配列番号３はラットリボソームタンパク質Ｌ１９（受入れ番号：Ｊ０２６５０）の配列である。
【図１】
2005321389.tif 000006
【図２】
2005321389.tif 000007
【図３】
2005321389.tif 000008
【図４】
2005321389.tif 000009
【配列表】
2005321389000001.app
【外国語明細書】
2005321389.tif 000010
2005321389.tif 000011
2005321389.tif 000012
2005321389.tif 000013
2005321389.tif 000014
2005321389.tif 000015
2005321389.tif 000016
2005321389.tif 000017
2005321389.tif 000018
2005321389.tif 000019
2005321389.tif 000020
2005321389.tif 000021
2005321389.tif 000022
2005321389.tif 000023
2005321389.tif 000024
2005321389.tif 000025
2005321389.tif 000026
2005321389.tif 000027
2005321389.tif 000028
2005321389.tif 000029
2005321389.tif 000030
2005321389.tif 000031
2005321389.tif 000032
2005321389.tif 000033
2005321389.tif 000034
2005321389.tif 000035
2005321389.tif 000036
2005321389.tif 000037
2005321389.tif 000038
2005321389.tif 000039
2005321389.tif 000040
2005321389.tif 000041
2005321389.tif 000042
2005321389.tif 000043
2005321389.tif 000044
2005321389.tif 000045
2005321389.tif 000046
2005321389.tif 000047
2005321389.tif 000048
2005321389.tif 000049
2005321389.tif 000050
2005321389.tif 000051
2005321389.tif 000052
2005321389.tif 000053
2005321389.tif 000054
【配列表】
2005321389000002.app