(57)【要約】【課題】  放射線感受性に関するhNp95遺伝子の変異を検出するアセイ系を確立するため、モノクローン抗体を提供する。この抗体はがんの診断、がんの放射線治療の適性化、放射線防護の基準等において有用である。【解決手段】  放射線感受性関与ヒト核たんぱく質hNP95をコードする全長cDNA、放射線感受性関与ヒト核たんぱく質hNP95、この核たんぱく質hNP95に特異的に結合するモノクローナル抗体、ならびにこのモノクローナル抗体を含む検査用試薬キットに関する。【選択図】      図９
2005087120.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線感受性関与ヒト核たんぱく質hNP95をコードする全長cDNA。
【請求項２】
放射線感受性関与ヒト核たんぱく質hNP95。
【請求項３】
放射線感受性関与ヒト核たんぱく質hNP95に特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項３記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項５】
請求項３記載のモノクローナル抗体を含む検査用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な放射線感受性関与ヒト核たんぱく質hNP95及びそれに特異的に結合するモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内のＤＮＡは、放射線、紫外線、食物や環境中の変異原などの外的な要因と、代謝の過程で生じる活性酸素などの内的な要因によって、常に損傷を受けている。これらの損傷の多くは、細胞死、突然変異をもたらし、また突然変異は、細胞の老化、がん化、遺伝病発症などの原因となる。生物は進化の過程でＤＮＡの損傷を修復する様々な機構を獲得してきた。こうしたＤＮＡ損傷の修復機構がいかに重要かということは、修復酵素の欠損が、ヒトに早期老化、種々の神経症状、発育遅滞、高発がん性、免疫異常など重篤な病態をもたらすということに如実に示されている。最近分子生物学的、生化学的手法の進歩により、高等真核生物のＤＮＡ修復酵素系の分子機構、及び機能が急速に明らかにされつつあるが、まだ不明な点も多い。
【０００３】
ヒトhNp95遺伝子は全長60kbにわたって、18のエクソンから成り立っており、北大松田教授によるFISH解析から染色体19p13.3に存在することが明らかになった。この領域には、典型的な転座(7;19)を伴っている脆弱部位（fragile site） loci 19p13.3を含む急性骨髄単球性白血病（acute myelomonocytic leukemia）がマップされている。また膵癌（pancreatic carcinomas）の発生に19p13.3と19q13.1-13.2に存在する遺伝子が関与していることが示唆されている。またポイツ・イェーガ‐ス症候群（Peutz-Jeghers syndrome）の線癌（adenocarcinoma）の発生にこの領域の遺伝子が関与していることが示されている。さらに19p13.3のD19S216に悪性線腫（adenoma malignum）に対するがん抑制遺伝子が存在することが示唆されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このようにヒトホモログhNp95遺伝子が存在する領域には、ヒトの癌や病気に関与する遺伝子の存在が推定されている。hNP95核たんぱく質に対するモノクローナル抗体が得られれば、これらの疾患との関係を明らかにすることができる。
【０００５】
またhNp95のアンチセンスcDNAをヒト細胞に導入して、hNP95核たんぱく質の発現を抑制した場合、ＤＮＡに損傷を与えるX線、紫外線、及びＤＮＡ複製阻害剤であるハイドロキシウレアに対して高感受性を示すことから、ＤＮＡ修復・複製に関係した重要な役割を行っていることが示唆される。そこでhNP95に対するモノクローナル抗体が得られれば、hNP95がどのようなたんぱく質と相互作用をしてどの様な働きをしているのか解析することができる。また抗体を使用して、ヒトのがん細胞におけるhNP95核たんぱく質の動態を調べること、及びＤＮＡ損傷に対して感受性を示す患者の細胞を解析することにより、ヒトの癌や病気の診断や放射線治療を含めた広範囲な面での応用の可能性が考えられ、ヒトがん細胞の特性解析診断技術として、またヒト放射線感受性集団の同定技術として有用であると考えられる。本発明は、がんの診断、がんの放射線治療の適性化、放射線防護の基準等において有用である、ヒトＤＮＡ複製・修復関与新規遺伝子の単離及びその遺伝子産物に対するモノクローナル抗体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、放射線感受性関与ヒト核たんぱく質hNP95をコードする全長cDNA、放射線感受性関与ヒト核たんぱく質hNP95、この核たんぱく質hNP95に特異的に結合するモノクローナル抗体、ならびにこのモノクローナル抗体を含む検査用試薬キットを要旨とする。
【発明の効果】
【０００７】
放射線感受性に関するhNp95遺伝子の変異を検出するアセイ系を確立するために有用なモノクローン抗体を提供しうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
まず、本発明において、放射線感受性関与ヒト核たんぱく質hNP95をコードする全長cDNA、および放射線感受性関与ヒト核たんぱく質hNP95は、たとえば次のようにして取得される。マウスNP95のアミノ酸配列に基づきGenBankデータベースの検索を行うと、マウスNP95の２つの部分のアミノ酸配列と類似性を持つヒトＥＳＴクローンが存在することが示される。それらのcDNA断片塩基配列を基にして２段階ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法により、ヒトcDNAライブラリーからマウスNp95のヒトホモログhNp95 cDNAを分離した。得られたcDNAは、793アミノ酸をコードする１つの大きなオープンリーディングフレーム（ORF）を含む4327塩基対から成りたっており、マウスNP95とアミノ酸レベルで比較すると、73.3%の相同性を示した。hNP95は、N末にユビキチン様ドメインを持ち、ロイシンジッパーモチーフ、ジィンクフィンガーモチーフ、cyclin A/E-cdk2リン酸化部位、Rb-bindingモチーフを持つ核蛋白質であることが示された。図１に示すように、hNp95遺伝子は、18のエクソンから成り立ち、全長60 kbにわたって、第１９染色体p13.3に存在していることが明らかになった。
【０００９】
さらに５’非翻訳領域構造の異なるhNP95転写産物（isoform）が存在していた（図２）。図２において、５’非翻訳領域構造の内、type (1)は、胎児の胸腺、脳、肺、肝臓、腎臓、筋肉、及び成人の脳、精巣、胸腺でも発現していることが示された。また精巣においては、type (2) 〜type (4)のhNP95転写産物も発現していた。
【００１０】
次にhNp95のアンチセンスcDNAとセンスcDNAを発現ベクター（pDEST26, Invitrogen）に挿入したプラスミドを構築し、ヒトHEK293及びWI-38細胞にトランスフェクトして安定な形質転換体を得た。hNp95のアンチセンスcDNAをトランスフェクトしたヒトHEK293は、トランスフェクトしていないHEK293と比較して、著しくhNP95核タンパク質の減少が見られた。コロニー形成を指標とする生存率解析により、Ｘ線、紫外線及びDNA複製阻害剤であるハイドロキシ尿素（ＨＵ）の細胞致死作用を解析したところ、hNp95アンチセンスcDNAを発現している複数の細胞株は、ヒトHEK293及びWI-38細胞の親細胞株よりも高感受性であることがわかった。このことから、ヒト細胞においてもhNp95遺伝子の機能発現がDNA損傷及びDNA複製阻害に対する防御要因の一つであることが示される。
【００１１】
hNp95 cDNAを発現ベクターに挿入したプラスミドを、ヒト細胞あるいは昆虫細胞に導入して、多量にhNP95核蛋白を精製分離する。次に精製した蛋白をマウスに免疫し、脾臓細胞とミエローマ細胞を融合させ、ｈＮＰ９５蛋白に対する抗体を産生する融合細胞（ハイブリドーマ）を得る。免疫方法は、たとえばＢＡＬＢ/ｃ系マウスを免疫する場合、皮下、腹腔内、静脈内に注入される。免疫に際して、常法により免疫増強のために完全もしくは不完全アジュバント類を用いることができる。免疫の間隔、量も特に制限されないが、たとえば1〜１００μｇ/マウスの量で、２週間ごとに２〜５回免疫し、最終免疫後、２〜５日後に摘出した脾臓細胞が用いられる。この脾臓細胞とミエローマ等のリンパ球様細胞との融合は、たとえばケーラーおよびミルシュタインらの方法（Nature２５６，４９５〜４９７（１９７５））に準じて実施されうる。
【００１２】
このハイブリドーマは、ヒポキサンチン、アメトプテリンおよびチミンを含むＨＡＴ培地の中で成育できる能力によって融合しなかった細胞から選別されうる。適切な抗体を産生するハイブリドーマは、in vitroもしくはin vivoでクローン化され、大量のモノクローナル抗体を産生しうる。ヒトhNP95蛋白に対する反応の特異性は、ゲル電気泳動を用いるウェスタン・ブロット法により確認する。
【００１３】
上述のように、ヒトhNp95 cDNA塩基配列を基にして、ヒトhNp95遺伝子のエクソン・イントロン構造の解析を行った結果、ヒトhNp95遺伝子は全長60kbにわたって、18のエクソンから成り立っており、FISH解析から染色体19p13.3に存在することが明らかになった。この領域には、急性骨髄単球性白血病における典型的な転座(7;19)を伴う脆弱部位19p13.3がマップされており(Sherer et al.,1991)、また膵癌の発生に19p13.3と19q13.1-13.2に存在する遺伝子の関与が示唆されている(Hoglund et al., 1998)。さらにポイツ・イェーガ‐ス症候における線癌の発生にこの領域の遺伝子が関与することが示されている(Gruber et al., 1998)。さらに19p13.3のD19S216に悪性線腫に対するがん抑制遺伝子が存在することも示唆されている(Lee et al. 1998)。この様にヒトホモログhNp95が存在する領域には、ヒトの癌や疾病に関与する遺伝子の存在が推定されている。従って、hNP95核蛋白に対するモノクローナル抗体が得られれば、これらの疾患との関係を明らかにすることができ、ヒトの癌や疾病の診断ならびに放射線治療を含めた医学の広範な面における応用の可能性が考えられる。図９に本発明のスキームを示す。
【実施例】
【００１４】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
Ａ.２段階ＰＣＲ 法によるヒトホモログhNp95 cDNAのクローニング：
ヒト遺伝子の発現cＤＮＡの断片を集めたデータベースEST (expressed sequence tag)を利用して、マウスNP95核蛋白質のアミノ酸配列と類似のヒトESTを検索した。その結果、AA811055, AA903902, AA306523, AA354253, AA488755, AA488977およびAA129794のcDNA断片が、マウスNP95の核たんぱく質のアミノ酸配列の一部と良く一致することが明らかになった（BLAST network service, National Center for Biotechnology information, NCBI）。そこでこれらのcDNA断片の塩基配列を基にして、プライマー P1(hNp95-C,配列番号１)、P2(C191HU1,配列番号２), P3(N315HU7, 配列番号３)およびP4(N434HU7,配列番号４)を合成した。これらのプライマーを使用して、PCMV.SPORT. ヒト精巣 cDNAライブラリー(Invitrogen) 及びpMyr ヒト精巣cDNAライブラリー (Stratagene)のＤＮＡをテンプレートにして、hNp95 cDNAの中央部分のDNA断片の増幅を行った。ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)は、校正活性を持つアドバンテージ 2 ポリメラーゼ Mix (Clontech)を使用して、94度、３分間の熱処理後、94度、30秒, アニーリング反応60度、30秒、伸長反応72度、3分、３０サイクルの繰り返し反応で行った。このhNp95 DNA断片1.1kbを、PCR 2.1-TOPO TAクローニングベクターに挿入し、塩基配列を決定した。
【００１５】
5’領域の増幅は、pMyrヒト精巣cDNAライブラリー (Stratagene)のDNAをテンプレートにして、２段階PCR法により行った。１回目のPCRは、プライマー MyFW1(配列番号５)およびP5(N428HU1, 配列番号６)を使用して、３０サイクルの繰り返し反応で行った。次に１回目のPCR産物の一部のDNAを、２回目のPCR反応において、テンプレートとして使用し、プライマー MyFW2(配列番号７), P6(Hunp84,配列番号８)を使用して上記の反応条件で、３５サイクルのPCR反応を行った。得られたPCR産物をアガロース電気泳動にかけ、バンドを切り出してDNAを抽出し、PCR 2.1-TOPO TAクローニングベクターに挿入し、塩基配列を決定した(A23[MyFW2-Hunp84] クローン)。 また3’領域の増幅は、同様にPCMV.SPORT. ヒト精巣 cDNAライブラリー (Invitrogen)のDNAをテンプレートにして、２段階法により行った。１回目のPCRは、プライマー FWCMSP(配列番号９), P7(C292HU7,配列番号１０)を使用してPCR反応を行い、２回目のPCRは、１回目のPCR産物の１部のDNAをテンプレートにして使用し、プライマー FWCMNe(配列番号１１), P8(hn95-3,配列番号１２)を使用して、同様の反応条件でPCR反応を行った。得られたPCR産物をアガロース電気泳動にかけ、バンドを切り出してDNAを抽出し、PCR 2.1-TOPO TAクローニングベクターに挿入し、塩基配列を決定した(62-2K クローン, C末端)。上記の塩基配列を総合して、ヒト精巣で発現しているhNp95 cDNAの塩基配列を決定した。最終的に完全長のhNp95 cDNAを得るために、5’非翻訳領域の塩基配列を基にして、プライマー U479 (配列番号１３), huNp95FW1 (配列番号１４)を合成し、C末側プライマー L3030 (配列番号１５), L3064(配列番号１６)を合成して、２段階PCR法により、2.4-2.5kbのPCR産物を得た。DNAを抽出し、PCR 2.1-TOPO TAクローニングベクターに挿入し、塩基配列を決定した。その結果、5’非翻訳領域に、選択的スプライシングが生じた３種類のcDNAが存在することが明らかになった。ヒト精巣由来の完全長hNp95 cDNA(4327 bp)の塩基配列を図３〜５に示す。
【００１６】
さらに、精巣以外の組織で発現しているhNp95 cDNAを解析するために、Marathon-Ready ヒト胎児胸腺cDNAライブラリー (Clontech)をテンプレートにして、5’領域の増幅を２段階PCR法により行った。１回目のPCRは、プライマー AP1(配列番号１７)とP9(L46,配列番号１８)を使用し、２回目のPCRは、AP2(配列番号１９)とL24(配列番号２０)を使用して、上記のPCR反応条件で行った。同様に得られたPCR産物をアガロース電気泳動にかけ、バンドを切り出してDNAを抽出し、PCR 2.1-TOPO TAクローニングベクターに挿入し、塩基配列を決定した。この塩基配列を基にして、5’側プライマー AP1及びUP26(配列番号２１)、3’C末側プライマー L3064及びL3030を使用して、２段階PCR法を使用して、胎児胸腺で発現している完全長のhNp95 cDNA (3229 bp)（図６および７）を得た。このcDNAは、プロモータ領域の5’非翻訳領域が、精巣由来のもの（図３〜５）と異なっていた。胸腺発現型hNP95は、脳、肝臓、肺および白血球で発現していた。以上の結果より、組織により発現様式の異なっている5’非翻訳領域に選択的スプライシングを生じている４種類のhNp95 cDNAが存在していることが明らかになった。
Ｂ. ヒトhNP95核たんぱく質の産生：
バキュウロウイルス対応ベクターであるpFast-BAC1を使用して、昆虫細胞由来の培養細胞Sf9を大量規模で培養して核たんぱく質を抽出し、アフィニテイ・カラム及びイオン交換カラム等で精製し、ウェスタン・ブロット解析で確認した。得られたたんぱく質は、モノクローナル抗体作成における抗原として使用した。図８にヒトhNP95核たんぱく質のアミノ酸配列を１文字コードで示す。A：Ala、C：Cys、D：Asp、E：Glu、F：Phe、G：Gly、H：His、I：Ile、K：Lys、L：Leu、M：Met、N：Asn、P：Pro、Q：Gln、R：Arg、S：Ser、T：Thr、V：Val、W：TrpおよびY：Tyrを示す。ヒト精巣由来、及びヒト胎児胸腺由来のhNp95 cDNAのオープンリーディングフレーム(ORF)は、同じアミノ酸配列を持ち、hNP95核たんぱく質は、793アミノ酸から成り立っている。
Ｃ.モノクローナル抗体の取得：
（ｉ）ハイブリドーマの取得
ケーラーおよびミルシュタインらの方法（Nature 256, 495-497, 1975）に準じて、マウスを抗原（ヒトhNp95核蛋白）で免疫し、血清中の抗体価が上昇したことを確認後、脾臓細胞を調整し、融合剤としてポリエチレングリコールを使用してミエローマ細胞と細胞融合することにより、ハイブリドーマを樹立した。免疫方法は、皮下に注入して行なった。５０μｇ/マウスの量で、２週間ごとに４回免疫し、最終免疫後、５日後に摘出した脾臓細胞が用いられた。
（ii）ヒトhNP95核たんぱく質に特異的な抗体の取得
蛍光ELISA及びウェスターン・ブロット解析を用いる常法により、ヒトhNP95核たんぱく質に特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマをクローニングした。得られたハイブリドーマ株について、マウス（BALB/c）の腹腔内に接種し、１０日後に腹水を採取して、遠心分離した。上清をアフィニティクロマトグラフィを用いて精製し、モノクローナル抗体を得た。このモノクローナル抗体はヒト hNP95核たんぱく質に特異的に反応することはゲル電気泳動を用いるウェスタンブロット法により確認された。
【産業上の利用可能性】
【００１７】
放射線感受性に関するhNp95遺伝子の変異を検出するアセイ系を確立するためのモノクローン抗体を提供する。この抗体はがんの診断、がんの放射線治療の適性化、放射線防護の基準等において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】hNp95遺伝子のエクソン・イントロン構造。
【図２】４種の異なるhNp95転写産物の５’ 非翻訳領域構造。
【図３】ヒト精巣由来の完全長hNp95 cDNA (4327 bp)の塩基配列（その１）。
【図４】ヒト精巣由来の完全長hNp95 cDNA (4327 bp)の塩基配列（その２）。
【図５】ヒト精巣由来の完全長hNp95 cDNA (4327 bp)の塩基配列（その３）。
【図６】ヒト胎児胸腺由来の完全長hNp95 cDNA (3229 bp)の塩基配列（その１）。
【図７】ヒト胎児胸腺由来の完全長hNp95 cDNA (3229 bp)の塩基配列（その２）。
【図８】ヒトhNP95核たんぱく質のアミノ酸配列。
【図９】本発明のスキームを示す。
【図１】
2005087120.tif 000003
【図２】
2005087120.tif 000004
【図３】
2005087120.tif 000005
【図４】
2005087120.tif 000006
【図５】
2005087120.tif 000007
【図６】
2005087120.tif 000008
【図７】
2005087120.tif 000009
【図８】
2005087120.tif 000010
【図９】
2005087120.tif 000011
【配列表】
2005087120000001.app