(57)【要約】【課題】  乾燥肌、アトピー皮膚炎等で皮膚バリアー機能が低下したマウスをモデルとして、試験薬剤の皮膚バリアー機能回復促進作用を評価する方法を提供すること。【解決手段】  皮膚バリアー機能障害を惹起したマウスの経表皮水分蒸散量を指標とすることを特徴とする皮膚炎治療薬の評価方法。    皮膚バリアー機能障害は、皮膚炎を発症したマウスと皮膚炎を発症していないマウスを同居飼育すること及び正常マウスの吻側背部を摩擦刺激することで惹起することができる。  また、本発明は、前記の方法により皮膚バリアー機能障害を惹起したマウスを包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚バリアー機能障害を惹起したマウスの経表皮水分蒸散量を指標とすることを特徴とする皮膚炎治療薬の評価方法。
【請求項２】
皮膚炎を発症したマウスと皮膚炎を発症していないマウスを同居飼育することを特徴とする皮膚炎を発症していないマウスの皮膚バリアー機能障害の惹起方法。
【請求項３】
皮膚炎がアトピー性皮膚炎である請求項２記載の皮膚バリアー機能障害の惹起方法。
【請求項４】
正常マウスの吻側背部を摩擦刺激することを特徴とする皮膚バリアー機能障害の惹起方法。
【請求項５】
請求項２又は請求項４記載の方法により皮膚バリアー機能障害を惹起したマウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アトピー性皮膚炎、乾皮症及び肌荒れ等に伴う皮膚バリアー機能障害に関与する治療薬の評価方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
乾燥肌は、皮膚バリアー機能の低下に伴い経表皮水分蒸散量が上昇した状態である。従来、皮膚バリアー機能に関する評価技術は、試験小動物の無毛皮膚に対し有機溶媒による脱脂処理を行い、経表皮水分蒸散量を測定する方法か、セロハンテープで角質層を剥離して経表皮水分蒸散量を測定する方法であった。しかし、同評価技術では処理後の皮膚バリアー機能自然回復が早い為、処置後数時間で薬剤の作用を評価することとなり、試験薬剤の皮膚バリアー機能回復促進に対する適切な評価を行うことが困難であった。そこで近年、有機溶媒による脱脂処理及び水付加処理を繰り返すことで、掻破行動を伴い、長時間皮膚バリアー機能破壊状態が保たれる評価モデルが開発され、研究機関にて評価に用いられるようになった。また、皮膚刺激性評価及び皮膚創傷治癒評価試験として、注射針や紙やすりを用いて損傷皮膚を作成し、その後薬剤を塗布した時の紅斑の程度を肉眼によりスコア化する方法が用いられてきた。この方法は、炎症を評価することはできるが、皮膚バリアー機能の回復を評価することはできず、また評価の客観性に乏しい。
【０００３】
アトピー性皮膚炎及び老人性乾皮症の掻痒発症機序は不明な点が多く、同様に同疾患の皮膚バリアー機能破壊機序も不明な点が多い。1957年に近藤らにより樹立されたNC/Nga系マウスは、1997年には松田らによりアトピー性皮膚炎自然発症動物モデルとして報告された（非特許文献1）。しかし同マウスの掻痒発症機序及び皮膚バリアー機能破壊機序も不明な点が多い。アトピー性皮膚炎や老人性乾皮症等皮膚バリアー機能が低下した疾患では、掻破行動に伴う皮膚バリアー機能の破壊が更なる皮膚症状の増悪を来たすことが知られており、問題視されている。
【０００４】
【非特許文献１】International Immunology Vol.9,No.3, 461-466(1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、乾燥肌、アトピー皮膚炎等で皮膚バリアー機能が低下したマウスをモデルとして、試験薬剤の皮膚バリアー機能回復促進作用を評価する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題の解決を目的に鋭意検討した結果、正常マウスとアトピー性皮膚炎を自然発症したマウスを同居飼育すると正常マウスに皮膚バリアー機能障害を惹起できること及び正常マウス吻側背部をワイヤーブラシで摩擦刺激すると皮膚バリアー機能障害を惹起できること、並びにこれらのマウスを実験動物とすることで試験薬剤の皮膚バリアー機能回復促進作用を評価することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、皮膚バリアー機能障害を惹起したマウスの経表皮水分蒸散量を指標とすることを特徴とする皮膚炎治療薬の評価方法である。  
また、他の本発明は、皮膚バリアー機能障害を惹起する方法であって、皮膚炎を発症したマウスと皮膚炎を発症していないマウスを同居飼育することを特徴とする皮膚炎を発症していないマウスの皮膚バリアー機能障害の惹起方法である。  
また、他の本発明は、皮膚バリアー機能障害を惹起する方法であって、正常マウスの吻側背部を摩擦刺激することを特徴とする皮膚バリアー機能障害の惹起方法である。  
また、他の本発明は、前記の方法により皮膚バリアー機能障害を惹起したマウスである。
【０００８】
本発明における皮膚炎としてはアトピー性皮膚炎、乾皮症、肌荒れ等が挙げられるが、アトピー性皮膚炎が本発明を実施する上で好ましい。  
本発明におけるマウスは特にその種別は選択されないが、NC/Nga系マウス、BALB/c系マウス、ICR系マウス、C57BL/6系マウス等が挙げられる。好ましくはBALB/c系マウスである。  
皮膚炎を発症したマウスと皮膚炎を発症していないマウスは、3日間同居飼育すると皮膚バリアー機能障害を惹起するが、好ましくは7日間以上同居飼育するのがよい。
【０００９】
ワイヤーブラシによる皮膚バリアー機能障害の程度は、経表皮水分量が約15〜25g/m2/hとなる程度が好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、試験薬剤の皮膚バリアー機能回復促進作用を評価する方法を提供する。それにより、数日間で試験薬剤の皮膚バリアー機能回復促進に対する効果が評価可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の具体的な評価法を、薬物を塗布した場合を例として、以下示す。BALB/c系マウスとアトピー性皮膚炎を自然発症したNC/Nga系マウスを2週間同居飼育させる。同居飼育中断前日にBALB/c系マウス背部を電気バリカンで剃毛（2cm×2cm）し，同居飼育中断当日に同剃毛部位の経表皮水分蒸散量を水分蒸散量測定装置で測定する。試験群の経表皮水分蒸散量の平均値が等しくなるように群分けし、試験薬剤を1回1日、100μLづつ同剃毛部位に塗布し、塗布開始4日後の経表皮水分蒸散量を測定する。
【００１２】
また、他の本発明の具体的な評価法を、薬物を塗布した場合を例として、以下示す。BALB/c系マウス吻側背部を電気バリカンで剃毛（2cm×2cm）し，翌日，同剃毛部位の経表皮水分蒸散量が約20g/m2/hになるように同剃毛部位をワイヤーブラシで約30回摩擦刺激する。試験群の経表皮水分蒸散量の平均値が等しくなるように群分けし、試験薬剤100μLを同摩擦部位に塗布する。試験薬剤の塗布は1回1日、100μLづつ行い、塗布開始日から1回1日、6日間経表皮水分蒸散量を測定する。
【実施例】
【００１３】
以下、試験例を挙げて本発明を具体的に説明する。  
試験例１[皮膚炎発症NC/Nga系マウスとの同居飼育によるNC/Nga系、BALB/c系、ICR系、C57BL/6系マウスの皮膚バリアー機能自然破壊モデル]
実験動物は通常の各種系統マウス（NC/Nga系,BALB/c系,ICR系, C57BL/6系マウス）、雄性、いずれも体重約30ｇのものを用い、１群8匹とした。飼育ケージ1ケージに、正常マウス4匹、15週齢以上のアトピー性皮膚炎を発症したNC/Nga系マウス、雄性、4匹を入れ、2週間同居飼育した。対照群として非同居飼育NC/Nga系,BALB/c系,ICR系, C57BL/6系マウス、雄性、いずれも体重約30ｇのものを用い、１群8匹とした。
同居飼育中断前日にマウス背部を電気バリカンで剃毛（2cm×2cm）し，同剃毛部位の経表皮水分蒸散量を水分蒸散量測定装置（TEWAMETER TM210,COURAGE & KHAZAKA,GERMANY）で測定し、非同居飼育マウスと比較した。
結果を表１に示した。
【００１４】
【表１】
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各系統マウス共に、非同居飼育群と比較し、同居飼育群で有意な経表皮水分蒸散量の上昇が認められた。
【００１５】
試験例２[皮膚炎発症NC/Nga系マウスとの同居飼育によるBALB/c系マウス皮膚バリアー機能自然破壊モデルに対する試験薬剤の作用]
実験動物は正常状態のBALB/c系マウス、雄性、いずれも体重約30ｇのものを用い、１群8匹とした。飼育ケージ1ケージに、正常マウス4匹、15週齢以上のアトピー性皮膚炎を発症したNC/Nga系マウス、雄性、4匹を入れ、2週間同居飼育した。正常群として非同居飼育BALB/c系マウス、雄性、体重約30ｇのものを用い、１群8匹とした。
2週間の同居飼育後、アトピー性皮膚炎を自然発症したNC/Nga系マウスを飼育ケージから取り除いた。同居飼育中断前日にBALB/c系マウス背部を電気バリカンで剃毛（2cm×2cm）し，同居飼育中断当日に同剃毛部位の経表皮水分蒸散量を水分蒸散量測定装置で測定した。試験群の経表皮水分蒸散量の平均値が等しくなるように群分けし、ワセリン、パンデル軟膏（0.1% 酢酸プロピオン酸ヒドロコルチゾン,  大正製薬株式会社）及びプロトピック軟膏（0.1% FK-506,  藤沢薬品工業株式会社）を1回1日、100μLづつ同剃毛部位に塗布し、塗布開始から４日後の経表皮水分蒸散量を測定した。
結果を図１に示した。
【００１６】
プロトピック軟膏及びパンデル軟膏の作用を検討したところ、いずれの薬剤においても塗布後有意に皮膚バリアー機能の回復が認められた。
【００１７】
試験例３[摩擦刺激によるマウス皮膚バリアー機能破壊モデル]
実験動物はBALB/c系、雄性、体重約30ｇのものを用い、１群6匹とした。
吻側背部を電気バリカンで剃毛（2cm×2cm）し，翌日，同剃毛部位をワイヤーブラシで10〜50回摩擦刺激し、刺激直後の経表皮水分蒸散量を測定した。摩擦回数による経表皮水分蒸散量の変化を無刺激群とで比較した。経表皮水分蒸散量は水分蒸散量測定装置（TEWAMETER TM210,COURAGE & KHAZAKA,GERMANY）で測定した。
結果を図２に示した。
【００１８】
摩擦回数の増加に伴い経表皮水分蒸散量は増加した。摩擦回数0と比較し、摩擦30〜50回で有意な経表皮水分蒸散量の増加が認められた。
【００１９】
試験例４[摩擦刺激によるマウス皮膚バリアー機能破壊モデルと有機溶媒による皮膚バリアー機能破壊モデルの比較]
実験動物はBALB/c系、雄性、体重約30ｇのものを用い、１群5〜8匹とした。
１．摩擦刺激によるマウス皮膚バリアー破壊モデル（摩擦モデル）：実験動物はBALB/c系、雄性、体重約30ｇのものを用い、１群8匹とした。マウスの吻側背部を電気バリカンで剃毛（2cm×2cm）し，翌日，経表皮水分蒸散量が約20g/m2/hになるように同剃毛部位をワイヤーブラシで摩擦刺激した．試験群の経表皮水分蒸散量の平均値が等しくなるように群分けし、摩擦刺激群と無刺激群（Pre）とで比較した。経表皮水分蒸散量は水分蒸散量測定装置（TEWAMETER TM210,COURAGE & KHAZAKA,GERMANY）で測定した。
【００２０】
２．有機溶媒による皮膚バリアー機能破壊モデル（脱脂モデル）：実験動物はBALB/c系、雄性、体重約30ｇのものを用い、１群5匹とした。マウスの吻側背部の4cm2（2cm×2cm）を電気バリカンで剃毛し、アセトン：ジエチルエーテル＝1：1混液を浸した脱脂綿（2cm×2cm）で15秒間被覆した。上記皮膚バリアー機能破壊（バリアー破壊）処理を一日2回、連続して３日間及び4日目に1回、合計7回行った。7回目のバリアー破壊処理30分後 (day0) 及び翌日から一日１回同部位の経表皮水分蒸散量を測定した。
結果を図３に示した。
【００２１】
摩擦モデルは、摩擦処理前のTEWL値（2.6g/m2/h）と比較し処理後のTEWL値（20.3±0.3g/m2/h）は有意に高値を示した。その後、TEWL値は徐々に低下したがその自然回復速度は遅く、処理後5日においても処理前との間に有意差が認められた。処理後6日で処理前との間に有意差は認められなくなった。一方、脱脂モデルは、脱脂処理前のTEWL値（1.6±0.1g/m2/h）と比較し処理後のTEWL値（6.7±0.3g/m2/h）は有意に高値を示したが、その値は摩擦モデルと比し低値であった。また、処理後3日で処理前との間に有意差は認められなくなった。
【００２２】
試験例５[摩擦刺激によるマウス皮膚バリアー機能破壊モデルに対するワセリンの作用]
実験動物はBALB/c系、雄性、体重約30ｇのものを用い、１群8匹とした。
吻側背部を電気バリカンで剃毛（2cm×2cm）し、翌日、同剃毛部位の経表皮水分蒸散量が約20g/m2/hになるように同剃毛部位をワイヤーブラシで摩擦刺激した。刺激群とワセリン塗布群の経表皮水分蒸散量の平均値が等しくなるように群分けし、ワセリン100μLを同摩擦部位に塗布し、1時間後の経表皮水分蒸散量を測定した。経表皮水分蒸散量は水分蒸散量測定装置（TEWAMETER TM210,COURAGE & KHAZAKA,GERMANY）で測定し、無刺激群と刺激群及び刺激群とワセリン塗布群とで比較した。
結果を図４に示した。
【００２３】
無刺激と比較し刺激群の経表皮水分蒸散量は有意に高値を示した。刺激群と比較し、ワセリン塗布群の経表皮水分蒸散量は有意に低値を示した。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明により、数日間で試験薬剤の皮膚バリアー機能回復促進に対する効果が評価可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】試験例２における経表皮水分蒸散量の測定結果を示す。
【図２】試験例３における経表皮水分蒸散量の測定結果を示す。
【図３】試験例４における経表皮水分蒸散量の測定結果を示す。
【図４】試験例５における経表皮水分蒸散量の測定結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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