(57)【要約】【課題】血管平滑筋収縮の情報伝達系機構におけるPI3-キナーゼの作用機序に関する知見を得ることにより、新たな循環器系医薬の開発に資することが本発明の課題である。【解決手段】血管平滑筋が収縮する機構においてPI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームが関与していることが示された。この知見を利用してクラスIIαアイソフォームのPI3-キナーゼを介して血管平滑筋の制御することができ、更には、該アイソフォームを作用標的部位とした新たな降圧剤・抗攣縮剤を開発することが可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホファチジルイノシトール3-キナーゼクラス IIαアイソフォームを介して、血管平滑筋収縮を制御する方法。
【請求項２】
ホスホファチジルイノシトール3-キナーゼクラス IIαアイソフォームの刺激剤を用いて血管平滑筋収縮を促進することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ホスホファチジルイノシトール3-キナーゼクラス IIαアイソフォームの阻害剤を用いて血管平滑筋収縮を抑制することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ホスホファチジルイノシトール3-キナーゼクラス IIαアイソフォームを介した血管平滑筋収縮を標的とした降圧剤又は抗攣縮剤を開発する方法。
【請求項５】
血管平滑筋の収縮に関与するホスホファチジルイノシトール3-キナーゼクラス IIαアイソフォームに対する抗体を用いてホスホファチジルイノシトール3-キナーゼクラス IIαアイソフォームの阻害剤をスクリーニングする方法。
【請求項６】
血管平滑筋の収縮に関与するホスホファチジルイノシトール3-キナーゼクラス IIαアイソフォームに対する抗体を含むことを特徴とする、ホスホファチジルイノシトール3-キナーゼクラス IIαアイソフォームの酵素活性の測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホファチジルイノシトール3-キナーゼクラス IIαアイソフォームを介して血管平滑筋収縮を制御する方法、およびホスホファチジルイノシトール3-キナーゼクラス IIαアイソフォームを介した血管平滑筋収縮を標的とした降圧剤又は抗攣縮剤を開発する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨格筋の興奮収縮連関におけるCa2+の役割が確立されて以来、平滑筋収縮の制御においてもCa2+が重要な役割を果たすことが示されてきた。神経伝達物質やホルモンなどの血管作動性物質の受容体のほとんどは、細胞膜7回貫通型のG蛋白質共役型受容体である。アゴニストが受容体に作用すると、三量体GTP結合蛋白質であるGq/11を介してホスホリパーゼC (PLC)の活性化と、細胞膜上の電位依存性Ca2+チャネルを含むCa2+チャネルの活性化が起こる。PLCの活性化により、細胞膜に存在するリン脂質、ホスファチジールイノシトール−4, 5‐二リン酸(PI4,5P2)が加水分解され、イノシトール‐1, 4, 5‐三リン酸(IP3)と、1, 2‐ジアシルグリセロール(DAG)が産生される。
【０００３】
IP3は細胞内Ca2+貯蔵プールからのCa2+放出を引き起こす。細胞膜Ca2+チャネルの活性化に伴う細胞内へのCa2+流入の増加も起こるために、細胞内Ca2+濃度（[Ca2+]i）は急激に上昇する。平滑筋の収縮装置は骨格筋・心筋と同様にミオシンからなる太いフィラメントと、おもにアクチンからなる細いフィラメントから構成されると一般に考えられている。平滑筋におけるCa2+の主な役割はアクチン−ミオシン相互作用の活性化である。その分子機序として、[Ca2+]i上昇により活性化されるミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)を介したミオシン軽鎖(MLC20)のリン酸化が重要である。MLC20のリン酸化によりアクチンフィラメントとミオシンフィラメント間の相互作用が可能になり、収縮が開始する。
【０００４】
一方、DAGとCa2+によってプロテインキナーゼC(PKC)が活性化され、これも収縮に寄与すると考えられている。PKCによる血管収縮の機序にはMLC20リン酸化に依存する部分と非依存的な部分の両者が存在する可能性がある。ところが近年このモデルでは説明しきれない現象が見い出され、MLC20リン酸化の調節系はより複雑であることがわかってきた。すなわち、様々な検討から、興奮性受容体アゴニストは細胞内カルシウム（[Ca2+]i）の上昇を引き起こすのみならず、[Ca2+]iの上昇に対するMLC20リン酸化のCa2+感受性を高めることによりMLC20リン酸化および収縮を増強していることが明らかとなってきた。
【０００５】
本発明者を含むいくつかの研究グループにより、この現象には低分子量GTP結合蛋白質であるRho、該Rhoにより活性化されるRhoキナーゼ、及び該Rhoキナーゼによってその活性が負に制御されるミオシンホスファターゼが関与していることが見い出された。このRho‐Rhoキナーゼ‐ミオシンホスファターゼ系からなるCa2+感受性調節系は、高血圧や冠動脈攣縮などの病的異常血管収縮と関連していることが示唆されている。
【０００６】
ところでホスホファチジルイノシトール3-キナーゼ(以下PI3-キナーゼと略する)はホスファチジルイノシトール(以下、PIと略する)及びそのリン酸化体であるPI-4-リン酸（PI-4P）及びPI-4,5-二リン酸（PI-4,5P2）のイノシトール環３位のリン酸化を触媒する酵素である。これらを基質として酵素反応を行った結果として生成する産物であるPI-3-リン酸（PI-3P）、PI-3,4-二リン酸（PI-3,4P2）及びPI-3,4,5-三リン酸（PI-3,4,5P3）は、細胞運動、細胞形態調節、遺伝子発現制御、細胞増殖、抗アポトーシス、細胞内小胞輸送、血小板凝集など多岐にわたる作用を媒介することが明らかにされている。このようにPI3-キナーゼは種々の生理現象に関与しており、蛋白質チロシンリン酸化を介した情報伝達において重要な役割を果たしている酵素である。
【０００７】
このような機能を有するPI3-キナーゼは、血管平滑筋を含む平滑筋の収縮にも関与して可能性が考えられる。しかし、PI3-キナーゼの阻害剤がMLC20リン酸化や脱リン酸化、またRho-Rhoキナーゼ―ミオシンホスファターゼ系にどのような影響を及ぼすか等の検討はこれまで行われていなかった。従って、PI3-キナーゼがどのような機序により平滑筋収縮に関与しているかは全く不明であった。
【０００８】
ところでPI3-キナーゼはファミリーを構成しており、クラスI、II、IIIのアイソフォームが存在することが知られている。PI3-キナーゼの各アイソフォームの構造と機能に関する知見については、例えば、R C Stain et al., Molecular Medicine Today, 2000, Vol.6 pp347-357（非特許文献１）やB Vanhaesebroeck et al., Experimental Cell Research, 1999, Vol.253 pp239-254（非特許文献２）において総説としてまとめられている。
【０００９】
クラスIのアイソフォームは最も研究が進んでいるタイプのPI3-キナーゼであり、110kDaの触媒サブユニットとアダプターサブユニットからなるヘテロダイマーから構成されている。なおクラスIアイソフォームはチロシンキナーゼを認識するクラスIAアイソフォームと、GTP結合蛋白質を認識するクラスIBアイソフォームに分類される。クラスIAアイソフォームは、p110触媒サブユニット（p110α、p110βなど）とp85アダプターサブユニット（p85α、p85βなど）からなるヘテロダイマー複合体から構成されるタイプのPI3-キナーゼである。そして、クラスIAのPI3-キナーゼは受容体刺激により活性化して二量体した受容体チロシンキナーゼと結合し、下流にあるエフェクターへシグナルを伝達する。
【００１０】
一方、クラスIBアイソフォームは、p110γ触媒サブユニットとp101アダプターサブユニットから構成され、GTP結合蛋白質共役型受容体の刺激により、解離した三量体GTP結合蛋白質のβγサブユニットによって活性化される。そのように、クラスIアイソフォームのPI3-キナーゼであっても、AアイソフォームとBアイソフォームでは、それらを構成する分子やそれらの活性化機序が異なっている。
【００１１】
クラスIIアイソフォームのPI3-キナーゼは200kDa程度の分子量を有し、他のクラスより大きな分子であるという特徴がある。また、クラスIアイソフォームのPI3-キナーゼが通常は細胞質に存在して活性化により膜に移行するのとは異なり、クラスIIアイソフォームは膜に結合している。クラスIIアイソフォームにはクラスIIα、クラスIIβ、クラスIIγなどが存在していることが知られているが、クラスIIαとクラスIIβは、インビトロキナーゼ活性にCa2+/ATPを利用するという特徴を有する。
【００１２】
上記において述べたように種々のアイソフォームのPI3-キナーゼが知られているが、クラスIIαのPI3-キナーゼが担っている機能や、クラスIIαのPI3-キナーゼにより情報伝達系が調節される機構についての知見はまだ多くない。クラスIIαのPI3-キナーゼの機能に関する報告としては、例えば、ヒト単球細胞株であるTHP-1細胞を用いて、単球走化性ペプチド-1（Monocyte Chemotactic Peptide-1:MCP-1）による刺激がクラスIIαのPI3-キナーゼを活性化することが報告されている（S J Turner, The Journal of Biological Chemistry, 1998, Vol.273 pp25987-25995：非特許文献３）。また、ヒト癌細胞株由来のA431細胞を用いて、上皮細胞成長因子（Epidermal Growth Factor:EGF）受容体刺激により、クラスIIαのPI3-キナーゼが活性化されることも報告されている（A Arcaro, Molecular and Cellular Biology, 2000, Vol.20 pp3817-3830：非特許文献４）。
【００１３】
ところでワートマンニンとLY294002は特異的なPI3-キナーゼの阻害剤である。それらの阻害剤はPI3-キナーゼの研究において重要なツールであり、例えば無傷細胞をワートマンニン又はLY294002で処理した後に該細胞を刺激することにより、その刺激の情報伝達系系おけるPI3-キナーゼの役割を検討することなどが行われている。
【００１４】
ワートマンニンとLY294002は共にPI3-キナーゼの阻害剤であってもその作用態様には差が認められる。ワートマンニンはPI3-キナーゼのATP結合部位をアルキル化することにより作用する非可逆的な阻害剤であるが、一方、LY294002競合的な阻害剤である。また、ワートマンニンがPI3-キナーゼを阻害するIC50値はnMオーダーであり、ワートマンニンの濃度が高くなると、阻害作用の特異性は失われる。LY294002のIC50値はμMオーダーであり、酵素阻害作用を奏するのにワートマンニンよりも高濃度が必要である。また、上記の２つの阻害剤、特にLY294002の阻害作用においてPI3-キナーゼのクラスIアイソフォームに比較して、クラスIIαのPI3-キナーゼはLY294002に対する感受性が低いと言われている（非特許文献１参照）。
【００１５】
【非特許文献１】R C Stain et al., Molecular Medicine Today, 2000, Vol.6 pp347-357
【非特許文献２】B Vanhaesebroeck et al., Experimental Cell Research, 1999, Vol.253 pp239-254
【非特許文献３】S J Turner, The Journal of Biological Chemistry, 1998, Vol.273 pp25987-25995
【非特許文献４】A Arcaro, Molecular and Cellular Biology, 2000, Vol.20 pp3817-3830
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の課題は、平滑筋の収縮の機序におけるPI3-キナーゼの役割を解明することである。より具体的には、本発明は、血管平滑筋収縮の情報伝達系機構における、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームの役割に関する知見を得ることにより、新たな循環器系医薬の開発に資することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
よって本発明の第一の観点は、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームを介して、血管平滑筋収縮を制御する方法である。
【００１８】
本発明の更なる観点は、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームの刺激剤を用いて血管平滑筋収縮を促進することを特徴とする、上記の方法である。
【００１９】
本発明の更なる観点は、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームの阻害剤を用いて血管平滑筋収縮を抑制することを特徴とする、上記の方法である。
【００２０】
本発明の更なる観点は、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームを介した血管平滑筋収縮を標的として降圧剤又は抗攣縮剤を開発する方法である。
【００２１】
本発明の更なる観点は、血管平滑筋の収縮に関与するPI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームに対する抗体を用いてPI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームの阻害剤をスクリーニングする方法である。
【００２２】
本発明の更なる観点は、血管平滑筋の収縮に関与するPI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームに対する抗体を含むことを特徴とする、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームの酵素活性の測定キットである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、血管平滑筋の収縮の機構においてPI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームが関与していることが示された。この知見を利用してクラスIIαアイソフォームのPI3-キナーゼを介して血管平滑筋の収縮を制御することができる。この知見は更には、該アイソフォームを作用標的部位とした新たな降圧剤・抗攣縮剤を開発するための途を開くものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
下記の実施例における検討により、1)平滑筋収縮に関与するPI3-キナーゼアイソフォームがPI3-キナーゼクラスIIαアイソファオームであること、2)PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームはKClや受容体アゴニスト刺激によるMLC20リン酸化の増加に関与していること、3)PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームはRhoの活性化に関与していること、4）PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームはMLC20脱リン酸化反応の抑制に関与していること、が明らかになった。
【００２５】
上記の知見は、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームを介した情報伝達経路が、血管平滑筋において、受容体刺激およびKCl脱分極刺激時に惹起されるRhoを介したミオシンホスファターゼ抑制に関与し、その結果として20kDaのミオシン軽鎖（MLC20）のリン酸化及び張力発生に重要な役割を果たしていることを示すものである。よって本発明において初めて、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームが血管平滑筋の収縮に関与するという役割を担っていることが実証された。
【００２６】
よって、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームを介して、血管平滑筋の収縮を制御することが可能であると考えられる。ここで制御とは促進と抑制の両者を意味する概念である。言い換えれば、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームの刺激剤を用いて該アイソフォームを介した情報伝達系を活性化することにより、血管平滑筋の収縮を促進することが可能であると考えられる。また逆に、PI3-キナーゼIIαアイソフォームの阻害剤を用いて該アイソフォームを介した情報伝達系を不活性化することにより、血管平滑筋の収縮を抑制することが可能であると考えられる。PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームを介して血管平滑筋の収縮を制御することは、これまでにない機序によって循環器系の機能を調節するための新たな手段を提供するものである。
【００２７】
ここでPI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームの刺激剤とは、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームと結合して情報伝達系の下流にその情報を伝達する刺激薬を意味するものである。また、ここでPI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームの阻害剤とは、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームと結合するが情報伝達系の下流にその情報を伝達しない阻害薬を意味するものである。
【００２８】
本発明において、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームが血管平滑筋の収縮に関与しているという知見が得られたため、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームを介して作用する新規な機序の降圧剤・抗攣縮剤を開発できると考えられる。即ち、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームの阻害剤は、降圧剤・抗攣縮剤として有用である可能性がある。
【００２９】
降圧剤・抗攣縮剤の開発
そのような降圧剤・抗攣縮剤を開発することは、一例として、以下のような手段を用いることにより達成されると考えられる。まず、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームに対する免疫沈降画分におけるPI3-キナーゼの酵素活性を、種々の化合物の存在下で測定することにより、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームの阻害剤を探索する。PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームの阻害剤のスクリーニングの方法については後により詳細に述べる。PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームの阻害剤は、該アイソフォームを介した血管収縮を抑制して弛緩させる可能性があるために、血管平滑筋を標的とした新規な機序の降圧剤又は抗攣縮剤の候補可能物となり得る。
【００３０】
降圧剤を開発する目的で、上記のインビトロのスクリーニングにおいて見出されたPI3-キナーゼクラスIIαアイソフォーム阻害剤が実際に降圧効果を有するかを動物実験において確認する。具体的には、自然発症高血圧ラット、デオキシコルチコステロン・食塩負荷ラット、片腎・腎動脈狭窄ラットなどの高血圧モデル動物に上記の候補化合物を投与し、該動物の高血圧症状に対する上記阻害剤の効果を検討することによりインビボにおける効果を確認する。また抗攣縮剤を開発する目的で、イヌ大槽内自家血注入脳血管攣縮モデル、ブタ冠動脈傷害攣縮モデルに上記の候補化合物を投与することにより、その動物の血管攣縮に対する上記阻害剤のインビボにおける効果を確認する。
【００３１】
更に医薬としての安全性を確認する目的で、降圧効果または血管攣縮の抑制効果が見られた化合物につき急性毒性・慢性毒性の有無を検討する。そして降圧剤・抗攣縮剤として有効であり、かつ安全性の高い化合物を探索することにより優れた医薬を得ることができる。
【００３２】
PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォーム阻害剤のスクリーニング
なお、血管平滑筋の収縮に関与するPI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームを介した阻害剤のスクリーニングは、一例として、以下の方法ですることができる。血管平滑筋細胞の溶解液を用いて、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームに対する特異的抗体による免疫沈降を行う。なお細胞の由来は血管平滑筋細胞に限定されるものではない。特異的な抗体により免疫沈降を行うことにより、細胞溶解液中に存在するPI3-キナーゼの他のアイソフォームは除かれ、引き続いて行うPI3-キナーゼの酵素反応において、クラスIIαアイソフォームの活性のみを特異的に評価することができる。
【００３３】
なお、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームに対する特異的抗体は、例えば、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームのペプチド断片をウサギに複数回投与することにより、ポリクローナルのペプチド抗体として得ることができる。なお、投与するペプチド断片は既知のクラスIIαアイソフォームのアミノ酸配列から適宜選択して設計することができる。なお免疫沈降の効率という点から、該アイソフォームのアミノ末端をペプチド断片として用いて特異的なペプチド抗体を得ることが好ましい。
【００３４】
上記で得たPI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームの免疫沈降画分を用いて、PI3-キナーゼの酵素反応のアッセイを行う。具体的には、該免疫沈降画分に、PI3-キナーゼの酵素反応の基質であるATP（アデノシントリホスフェート）とPI（ホスファチジルイノシトール）、更にはスクリーニングの対象である阻害剤候補化合物を添加した混合液を調製する。なお、酵素反応の生成物を放射活性によって検出するために、コールドのATPと共に放射（32P）標識したATPを共存させる。該混合液を、例えば25℃で30分間などの適切な条件下でインキュベートして酵素反応を行い、メタノール/クロロホルム/11N HCl混液（2：1：0.02（V/V/V））を添加して反応を終了する。
【００３５】
例えば15,000回転で１分間などの条件で遠心分離を行い、下層の一部を等量ずつ（200μl）採取して脂質を抽出し、液体シンチレーションバイアルに採取する。抽出した脂質を風乾した後に液体シンチレーション液を加え、放射活性を測定し、酵素反応により生成したPI-3-リン酸（PI-3P）の生成量を求めることにより、PI3-キナーゼ活性を定量する。阻害剤候補化合物の効果については、阻害剤候補化合物を加えなかったコントロールとPI3-キナーゼ活性の比較をすることにより評価を行う。なお、PI3-キナーゼ活性の測定方法の詳細については、下記の実施例に記載してある条件を参照とすることができる。
【００３６】
PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームの酵素活性キット
血管平滑筋の収縮に関与するPI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームに対する抗体を含むことを特徴とする、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームの活性の測定キットを開発することもできる。このようなキットは、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームに対する抗体を必須の構成要素として含み、その他には好ましくは酵素反応の基質であるPI、ATP、放射標識されたATP、反応緩衝液やアッセイチューブも含有する。細胞の溶解液を調製し、該細胞溶解液中に含まれるPI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームをキットに添付された抗体により免疫沈降し、基質としてATPとPIを用いて、上記において述べた様にPI3-キナーゼの酵素反応を行うことにより、PI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームの活性を測定することができる。一般的に血管細胞中の情報伝達分子の活性測定は培養細胞よりもずっと困難であるが、このようなキットはかかる問題を解決するための手段を提供するものである。
【実施例】
【００３７】
（実験方法）
組織の調製と張力の測定
内皮細胞を除去した動脈を、改変したKrebs-Henseleitバッファー(mMで119 NaCl 4.7 KCl, 1.2 KH2PO4, 1.5 MgSO4, 1.5 CaCl2, 25 NaHCO3, および11 glucose)中において酸素95%と二酸化炭素5%の雰囲気下37℃で平衡化し、等張力を測定した。刺激に先だち、通常のKrebs-Henseleitバッファーを60mMのKClを含んでいるバッファー(mMで60 NaCl, 60 KCl, 1.2 KH2PO4, 1.5 MgSO4, 1.5 CaCl2, 25 NaHCO3, and 11 glucose)と交換し、続いてKrebs-Henseleitバッファーで洗浄することにより、動脈を数回予備的に収縮させた。安定した収縮が得られるまでこの予備収縮と弛緩の操作を１時間の間隔で繰り返した。測定中の張力は、最後のKCl予備収縮の間における最大力の％として示した。
【００３８】
60mMのKClバッファーに、α1アドレナリン作動性受容体阻害剤であるフェントラミン（10μM）、βアドレナリン作動性受容体阻害剤であるプロプラノロール（10μM）、ヒスタミンH1受容体アンタゴニストであるジフェンヒドラミン（10μM）、AT1受容体アンタゴニストCV-11974（1μM）、およびトロンボキサンA2受容体アンタゴニストONO-3708（1μM）を含有させ、高KClにより誘導された膜脱分極の間に血管調製物中において、神経末端や血管組織における他の型の細胞から放出される興奮性アゴニストの不適切な影響を防いだ。
【００３９】
組織GTP-RhoAの測定
等尺性に収縮させておいた血管を液体窒素中で急速に凍結した。凍結した組織を、50 mM/L Tris-HCl (pH 7.2), 1% トライトン X-100, 0.5% デオキシコール酸, 0.1% SDS, 500 mM NaCl, 10 mM MgCl2、それぞれ20 mg/mLのロイペプチン、アプロチニン、及び1mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)を含むホモゲナイズバッファー中でホモゲナイズした。遠心（蛋白質450μg）により得られた上清を、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）-Sepharose4Bビーズ（アマシャムバイオサイエンス）上に固定化した組み換えGST-マウスローテキン蛋白質（アミノ酸配列7-89）と、4℃で30分間インキュベートした。ビーズに結合したRhoAをSDS15％のポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を用いて解析し、続いて特異的なマウスモノクローナル抗RhoA抗体とアルカリホスファターゼ結合ウサギ抗マウスIgG1抗体（Zymed）を用いてウエスタンブロッティングした。
【００４０】
MLC20リン酸化の測定
等尺性の研究のために搭載した動脈ストリップを、ドライアイス含有アセトン中に浸すことにより凍結して測定した。培養細胞を用いた実験において、10％TCAを含む氷冷した反応停止バッファーにより細胞を固定化した。ミオシンを抽出し、尿素−グリセロールPAGEを行い、引き続いて特異的なマウスモノクローナル抗MLC抗体（Sigma）を用いてウエスタンブロッティングを行うことにより、解析した。
【００４１】
PI3キナーゼアッセイ
上記の方法に従ってウサギ大動脈リング標本を調整し、KCl、ノルアドレナリン等による刺激によって等尺性収縮下にあるリング標本を液体窒素を用いて急速凍結した。凍結血管リング標本を、1％NP-40、20mM Tris/HCl(pH7.5)、150mM NaCl、5ｍM EDTA、1μM Na3VO4、10mM NaFから成るホモゲナイズバッファー中でホモゲナイズし、ホモジュネートを15,000回転で4℃下、10分間遠心し、上清を取得した（約700μl）。上清の15μlをLowry法による蛋白濃度測定に使用し、残量の内600μlを免疫沈降に供した。免疫沈降は、まず試料であるホモジェネート上清にプロテインAセファロース（アマシャム-ファルマ社）10μlを加え、4℃下で30分インキュベートした後、15,000回転、5分間の遠心により上清を採取した。
【００４２】
Lowry法による蛋白濃度測定の結果に従って上清量を加減して、各試料間で蛋白重量が一定になるように調整した。あらかじめ各PI3キナーゼアイソフォーム抗体（ウサギポリクロナール抗体である、抗PI3キナ−ゼCIIαアイソフォーム抗体）、抗PI3KクラスI p110α抗体（サンタクルズ社）、抗PI3KクラスI p110β抗体（サンタクルズ社）、抗ホスホチロシン（PY20）抗体（ICI社）のいずれかを結合させたプロテインAセファロース20μlを加え、4℃下で2時間インキュベートした。4℃下で15,000回転3分間遠心し、沈降物を回収した。
【００４３】
上清を除去し、1mlの洗浄バッファー（20mM Tris/HCl (pH7.5)）、100mM NaCl、 0.5mM EGTA)で沈降物を懸濁し、再度上記条件で遠心し、沈降物を回収した。これをさらに2回繰り返した、上清を除去した沈降物に40μlのキナーゼアッセイバッファー（20mM Tris/HCl(pH7.5)、100mM NaCl、0.5mM EGTA、20mM MgCl2、10μM ATP、10 μCi/μl の[γ32P]-ATP、200μg/mlのホスファチジルイノシトール(PI)）を加え、25℃下で30分間インキュベートした。
【００４４】
反応終了時にメタノール/クロロホルム/11N HCl混液（2：1：0.02（V/V/V））を加え、ボルテックスした。15,000回転、１分間遠心後の下層を全量採取し、薄層クロマトグラフィー(TLC)プレート(Silica gel 60)にスポットし、クロロホルム/メタノール/25%NH4OH/H2O(43:38:5:7)から成るソルベント下で展開した。FujiBASバイオイメージアナライザーによって、TLCプレート上で分離されたリン酸化PIを定量した。
【００４５】
ウエスタンブロッティング
各種培養細胞及びウサギ大動脈リング標本を20mM Tris/HCl(pH7.5)、100mM NaF、1μM Na3VO4、2mM EGTA、0.1%SDS、0.5% NP-40から成るホモジュネーションバッファー中で溶解もしくはホモジェナイズし、4℃下15,000回転5分間遠心し、上清を分離回収した。上清の15μlをLowry法による蛋白濃度測定に使用し、残量の上清に対して3倍容量のバッファー（40% グリセロール、9.2%SDS、250mM Tris/HCl(pH6.8)、20% β-メルカプトエタノール）を加えて混和した後、3分間煮沸した。各試料の120μg蛋白量相当をSDS-8%ポリアクリルアミドゲル(PAGE)電気泳動にて分離し、イモビロン-Pメンブレン(ミリポア社)に電気的に転写しPI3キナーゼクラスI p110αアイソフォームp110βアイソフォーム及びγアイソフォーム各特異的抗体(サンタクルズ社)、並びにPI3キナーゼクラスIIα アイソフォーム及びβアイソフォーム各特異的抗体（トランスダクション社）用いてウエスタンブロッティンクを行った。
【００４６】
（実験結果）
PI3キナーゼ阻害薬はKCl及び受容体アゴニストにより誘導された収縮とMLC20のリン酸化を阻害する
KCl（60mM）は、内皮細胞を除去したウサギ大動脈の平滑筋において、迅速かつ持続的な収縮を引き起こした。平滑筋をPI3キナーゼ阻害薬であるワートマンニン（1 μM）で前処理すると、KClにより誘導された収縮の初期相と持続的な相の両者が明らかに阻害された（図１）。構造が異なるPI3キナーゼ阻害薬であるLY294002（100 μM）もまた、KClにより誘導された収縮を抑制した。ワートマンニンとLY294002は両者とも、KClにより誘導されたMLC20リン酸化の初期相と持続的な相を大きく抑制した（図２）。収縮とMLCのリン酸化の抑制は両者共に容量依存的であり、IC50値はそれぞれ、ワートマンニンについては0.5 μMであり、LY294002については70 μMであった。
【００４７】
KClにより誘導された収縮と同様に、LY294002は、トロンボキサンＡ２受容体アゴニストU46619及びノルエピネフリン（NE）により誘導された収縮を容量依存的に抑制した（図３）最大の半分の収縮は、U46619とNEについて、およそ30と20 μMであり、それらの値は、KClにより誘導された収縮よりもやや低かった。対照的に、ホルボールエステル（PDBu）により誘導された収縮に対するLY294002の抑制効果はずっと低く、LY294002について用いた最大濃度（100 μM）における最大の抑制は、活性収縮の30％にすぎなかった。LY294002（100 μM）は、U46619またはNEによって誘導されたMLC20のリン酸化も60-70%抑制したが、PDBuによって誘導されたMLC20リン酸化には影響しなかった（図４）。これらの観察は、KClと受容体アゴニストにより誘導された収縮とMLC20のリン酸化は、PI3キナーゼ依存性であることを示唆している。
【００４８】
PI3キナーゼ阻害剤はインビボにおける血圧の抑制を誘導する
種々の濃度のワートマンニンをボーラス注射により投与すると、麻酔したラットにおいて最低容量（1 mg/kg体重）を除いて容量依存的に平均動脈圧（MAP）の低下を引き起こしたが、1 mg/kg体重の容量においては最大15mmHgのMAPの持続的な増加が認められた（図５）。3 mg/kg体重と5 mg/kg体重の容量においては、注射後10分でMAPは最低に達し、その後にゆっくりと回復した。7 mg/kg体重の容量において、観察している間にMAPの低下は持続した。心拍数は、3と5 mg/kgの容量を投与されたラットにおいては相互とも増加したが、7 mg/kgを与えられたラットにおいてはやや低下した。
【００４９】
PI3キナーゼ阻害剤はインビトロにおいてCa2+により誘導されたMLC20リン酸化を直接的に阻害しなかった
LY294002ではなくワートマンニンがインビトロでMLCK阻害剤活性を有していることが報告されている。ワートマンニンによるMLCK阻害の態様はATP濃度に関して非競合的であることが示されたが、高いATP濃度においてワートマンニンによるMLCKの阻害が抑制されたという観察から証明されるようにその抑制作用はATP濃度に依存していた。そこで、ワートマンニンによる直接的なMLCKの抑制が、KClと受容体アゴニストにより誘導されたMLC20リン酸化と収縮の原因であるかもしれない。
【００５０】
しかし、細胞膜透過性の血管平滑筋細胞を、1 mMのATP、ワートマンニン又はLY294002のいずれかをそれぞれ最大0.3と300 μMの濃度で含んでいる緩衝液中でインキュベートしたところ、Ca2+により誘導されたMLC20リン酸化は阻害されなかった（図６）。これは、ワートマンニンとLY294002のいずれも、この条件下において、Ca2+により誘導されたMLCKのリン酸化を阻害しないことを示している。この観察により、無傷の動脈ストリップにおいて観察されたMLC20リン酸化のためのPI3キナーゼ阻害剤感受性の機構は、細胞膜透過性の平滑筋細胞においては作動していないことを示している。
【００５１】
更に、単離されたMLCKにおいて、インビトロのMLC20リン酸化に対して、ワートマンニンとLY294002が及ぼす効果を解析した。ワートマンニンとLY294002はいずれも、Ca2+とカルモジュリンによって活性化されたMLCKによる精製MLC20のリン酸化を、1 mMのATPの存在下において抑制しなかった（図７上）。しかし、より低い濃度の（10 μM）ATPの存在下においては、LY294002ではなくワートマンニンは、インビトロでMLC20のリン酸化を阻害した(図７下)。よって、ワートマンニンはより低いATP濃度でMLCKを阻害するように見えたが、生理的な細胞内ATP濃度により近い高いATP濃度（1mM）の存在下においてMLCKを阻害することはできなかった。ATP濃度に関わらず、LY294002は持続的にMLCK活性を阻害することはできなかった。
【００５２】
PI-3キナーゼ阻害剤は弛緩とMLC20の脱リン酸化を促進する
PI-3キナーゼがどのようにして、ミオシンホスファターゼによって触媒されるMLC20の脱リン酸化、又はMLC20のリン酸化過程、又はそれらの両者の制御に関与しているかについて試験した。60mMのKClによって予め収縮させておいた平滑筋をMLCK阻害剤ML9（30μΜ）によって処理することにより弛緩を誘導すると、LY294002を添加することにより弛緩は増加した。その弛緩はLY294002の存在下により30分後にほぼ完了し、その30分後において、LY294002処理を行っていない筋肉はなお最大収縮の50％のレベルを維持していた（図８）。これに付随して、ML-9により誘導されたMLC20リン酸化レベルの減少もまたLY294002によって増加した（図９）。LY294002の存在下で、MLC20のリン酸化レベルは30分の時点で元の無刺激レベルまで減少した。
【００５３】
ミオシンホスファターゼ阻害剤カリキュリンＡの存在下で血管平滑筋は、MLC20のリン酸化の増加を伴ってゆっくりと収縮し（図１０）、それは平滑筋における基礎のMLCキナーゼ活性を反映しているようである。LY294002を添加すると、カリキュリンＡにより誘導された張力の発達がおよそ20％抑制された。LY294002はMLC20リン酸化を低下させる傾向にあったが、統計学的な有意差は見られなかった（図１１）。これらは、LY294002がMLC20リン酸化を抑制する主たる機序は、MLC20の脱リン酸化の促進であるかもしれないことを示唆している。
【００５４】
PI-3キナーゼ阻害剤はRhoの活性化とミオシンホスファターゼのMYPT1サブユニットのリン酸化を抑制する
ミオシンホスファターゼの制御におけるPI-3キナーゼ阻害剤感受性の機構を理解するという試みにおいて、Rhoの活性化におけるLY294002の効果が示された。過去に示されたように、KClのみならず受容体アゴニストNEとU46619は、活性型であるGTP結合型のRhoA（GTP-Rho）を数倍誘導した（図１２）。LY294002（100μM）を添加すると、いずれの刺激によってもRhoの活性化は強力に阻害された。活性化されたRhoAはRhoキナーゼを刺激し、Rhoキナーゼはミオシン標的化サブユニットMYPT1をミオシンホスファターゼのThr695においてリン酸化することが良く知られている。
【００５５】
クラスIIα PI-3キナーゼは血管平滑筋に発現し、PI-3キナーゼ阻害剤に対して感受性が低い
多くのPI-3キナーゼ依存性の細胞内反応について、ワートマンニンとLY294002のIC50値は、それぞれ0.1と10μΜであると既に報告されている。例えば、ワートマンニンとLY294002は、細胞外の刺激により誘導されたクラスＩのPI-3キナーゼの下流にあるエフェクターのセリン／スレオニンキナーゼであるAkt/PKBの活性化を、これらの範囲のIC50値において効果的に抑制する。クラスＩPI-3キナーゼは実際に、PI-3キナーゼ阻害剤に非常に感受性であることが示されている。MLC20リン酸化と収縮の抑制に関するワートマンニンとLY294002のIC50値は（図１と図２）、過去に報告されたIC50値より明らかに高かった。
【００５６】
ウサギ血管平滑筋においては、しかしながら、ワートマンニンは、0.1μMという低濃度で殆ど完全にAktのリン酸化を抑制した（図１３）。つまり、KClとアゴニストにより誘導された収縮とMLC20リン酸化はAktと比較して、PI-3キナーゼ阻害剤に対する感受性が明らかに低かった。これらの観察は、クラスＩPI-3キナーゼは、MLC20脱リン酸化と収縮におけるワートマンニンとLY294002の標的ではないことを示唆している。
【００５７】
ウエスタン解析により評価すると、ウサギ血管平滑筋においてクラスＩPI-3キナーゼであるp110αとp110βと、クラスIIのαとβアイソフォームが発現しているが、クラスIIβアイソフォームの発現は非常に弱い。ウサギ血管平滑筋とウサギ血管平滑筋培養細胞もまたこれらのアイソフォームを発現し、他の細胞型においても同様である（図１４）。これらの中で、クラスIIαアイソフォームのPI-3キナーゼ阻害剤に対する感受性は、他の３つのアイソフォームと比較して少なくとも一桁は低いことが報告されている。
【００５８】
実際に、ウサギ血管平滑筋由来の抗p110α免疫沈降画分のPI-3キナーゼ活性は、10nMという低濃度のワートマンニンとインビトロでインキュベーションすることにより顕著に抑制された（図１５Ａ）が、一方、抗クラスIIαアイソフォーム免疫沈降物においては1μΜのワートマンニンによってPI-3キナーゼ活性は40％抑制された（図１５Ｃ）。抗p110β免疫沈降画分のPI-3キナーゼ活性は、ワートマンニンに対して程々に感受性を示した（図１５Ｂ）。
【００５９】
上記で述べたように、ワートマンニンは非可逆的なPI-3キナーゼ阻害剤である。ウサギ血管平滑筋を種々の濃度のワートマンニンで前処理し、その後にPI-3キナーゼを特異的な抗体で免疫沈降し、続いてインビトロPI-3キナーゼアッセイを行うと、0.1μΜのワートマンニンにより処理された血管平滑筋由来のp110αPI-3キナーゼ活性は70％以上抑制された（図１６左）が、一方、クラスIIα活性はコントロールの筋肉の活性と差がなく、3μΜのワートマンニンにより処理された筋肉由来のp110αPI-3キナーゼは90％以上抑制され、クラスIIα活性は60％抑制された（図１６右）。ウサギ血管壁においてクラスIIαPI-3キナーゼの免疫蛍光染色を行ったところ、それは平滑筋細胞層と内皮細胞の中に分布していることが示された。
【００６０】
KClと受容体アゴニストはウサギ平滑筋中のクラスIIαPI-3キナーゼ活性を刺激するが、p110αとp110βの活性は刺激しない
ウサギ血管平滑筋をKCl（60mM）（図１７）、NE（3μM）（図１８）又はU46619（100nM）（図１９）のいずれかで5分間刺激し、p110α、p110βとクラスIIαアイソフォームに特異的な抗体を用いて免疫沈降し、免疫沈降物のPI-3キナーゼ活性を測定した。予期しないことに、いずれの刺激もp110αとp110βの活性を20-60％低下させた（図１７−図１９）。最も重要なことに、全ての刺激はクラスIIα活性をわずかに（50-80％）、しかし有意に増加させた。
【００６１】
上記の結果より、KCl脱分極刺激及びノルアドレナリンやU46619の受容体刺激によって惹起されるMLC20リン酸化反応と収縮反応は、PI3-K阻害薬であるワートマンニンとLY294002により抑制されることが示された。両者の抑制の間には良い相関が見られ、MLC20リン酸化の抑制がこれら阻害薬による収縮抑制の主要な機序であることが示唆した。ワートマンニンはMLC20リン酸化酵素ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)阻害活性を有することが報告されていたが、細胞膜透過血管平滑筋細胞及び精製MLCKを用いた検討から、血管平滑筋で観察したワートマンニンによるMLC20リン酸化抑制がMLCKの阻害による可能性は否定的であった。
【００６２】
LY294002によるMLC20リン酸化レベルの抑制の機序として、LY294002がMLC20の脱リン酸化を促進することを見出した。このことは血管平滑筋では、PI3-キナーゼがMLC20脱リン酸化酵素すなわちミオシンホスファターゼに抑制的に作用しており、LY294002がこの阻害を解除したことにより、脱リン酸化が促進されたことを示唆している。  
【００６３】
低分子量GTP結合蛋白であるRhoはKCl脱分極刺激や受容体刺激によって活性化されるシグナル伝達分子である。活性化されたRhoはRhoキナーゼを次に活性化し、これはミオシンホスファターゼをリン酸化する。このリン酸化により、ホスファターゼ活性の抑制を来す。上記の結果において、LY294002がKClやノルアドレナリンによるRho活性化を強く抑制することが示された。このことは、血管平滑筋ではPI3-キナーゼがRhoの活性化に関わっており、この作用を介してミオシンホスファターゼ活性の抑制を引き起こすことを示唆している。
【００６４】
PI3-キナーゼにはいくつかのアイソフォームが存在するために、どのアイソフォームPI3-キナーゼがワートマンニン及びLY294002による抑制作用に関与しているか検討を行った。ここで観察された血管収縮及びMLC20リン酸化の阻害に要したワートマンニン及びLY294002の濃度は、多くの培養細胞を対象とした研究で報告されている濃度よりも約10倍高濃度である。またウサギ大動脈においても、PI3-キナーゼで活性化される蛋白リン酸化酵素であるAktの活性化はMLC20リン酸化や収縮反応とは異なり、培養細胞に関して報告されているものと同等の比較的低濃度のワートマンニンで抑制された。これらの事実から、ワートマンニン及びLY294002に対して感受性の低いPI3-Kアイソフォームが、血管平滑筋のRho活性化、MLC20リン酸化並びに収縮に関与していると考えられる。
【００６５】
そこで、血管平滑筋に発現しているPI3-キナーゼアイソフォームを検討したところ、クラスIに属するp110αとp110β、及び、クラスIIに属するα及びβが発現していることが見出された。この中で、クラスIIαのみがワートマンニン及びLY294002に対して低い感受性を示すことが知られている。実際にウサギ血管から免疫沈降したクラスIIαのPI3-キナーゼを用いてこのことを確認した。
【００６６】
ところで、LY294002とは異なり、ワートマンニンは非可逆的にPI3-キナーゼを不活性化する。そこであらかじめ種々の濃度のワートマンニンで処理したウサギ血管からクラスIIαやクラスI p110αを免疫沈降してその活性を測定したところ、培養細胞で通常使用される比較的低濃度のワートマンニンはクラスI p110αのみを抑制し、クラスIIαは抑制しなかった。一方、その30倍高濃度のワートマンニン、すなわち収縮やMLC20のリン酸化を抑制できる濃度のワートマンニンはクラスIIαとクラスI p110αの両者を抑制した。また、KClやノルアドレナリンはクラスIIαのPI3-Kを活性化したが、クラスI p110αはむしろ抑制した。
【００６７】
以上、KCｌ脱分極刺激や受容体刺激により、PI3-キナーゼクラスIIαが活性化され、これはRhoの活性化に関与してミオシンホスファターゼ活性の抑制を来たし、この結果MLC20リン酸化を促進するように働いていることが新たに見出された。これらの検討により示された血管平滑筋の収縮を制御する経路を図２０に示す。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明により、血管平滑筋の収縮機構においてPI3-キナーゼクラスIIαアイソフォームが関与していることが示された。この知見を利用してクラスIIαアイソフォームのPI3-キナーゼを介して血管平滑筋の制御することができ、更には、該アイソフォームを作用標的部位とした新たな降圧剤・抗攣縮剤を開発することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、KClにより誘導された収縮に対するワートマンニンとLY294002の効果を示した図である。
【図２】図２は、KClによるMLCのリン酸化に対するワートマンニンとLY294002の効果を示した図である。
【図３】図３は、NE、U46619及びPDBuにより誘導された収縮を示した図である。
【図４】図４は、NE、U46619及びPDBuにより誘導された収縮に対するLY294002の効果を示した図である。
【図５】図５は、種々の濃度でワートマンニンを投与されたラットにおける平均動脈圧（MAP）の変化を示した図である。
【図６】図６は、細胞膜透過血管平滑筋細胞におけるMLCリン酸化に対して、ワートマンニンとLY294002が及ぼす影響を示した図である。
【図７】図７は、インビトロにおけるMLCリン酸化に対して、ワートマンニンとLY294002が及ぼす影響をしめした図である。
【図８】図８は、KClにより誘導された収縮に対するML9の効果と、ML9とLY294002の併用時の効果を示した図である。
【図９】図９は、KClによるMLCのリン酸化に対するML9の効果と、ML9とLY294002の併用時の効果を示した図である。
【図１０】図１０は、KClにより誘導された収縮に対するカリキュリンAの効果と、カリキュリンAとLY294002の併用時の効果を示した図である。
【図１１】図１１はKClによるMLCのリン酸化に対するカリキュリンAの効果と、カリキュリンAとLY294002の併用時の効果を示した図である。
【図１２】図１２は、KCl、NEとU46619の刺激によるGTP結合型のRhoA （GTP-Rho）レベルの変化を示した図である。
【図１３】図１３は、ウサギ血管平滑筋におけるAktのリン酸化に対するワートマンニンの影響を示したウエスタンブロットの写真である。
【図１４】図１４は、ウサギ血管平滑筋と他の細胞におけるPI-3キナーゼの種々のアイソフォーム（p110α、p110β、p110γとクラスIIαとβ）の発現を示したウエスタンブロットの写真である。
【図１５】図１５は、ウサギ血管平滑筋の抗p110α、抗p110βとクラスIIα免疫沈降物におけるPI-3キナーゼ活性に対するワートマンニンの効果を示した写真である。
【図１６】図１６は、ウサギ血管平滑筋をワートマンニンで前処理した抗p110αとクラスIIα免疫沈降物におけるPI-3キナーゼ活性に対するワートマンニンの効果を示した図である。
【図１７】図１７は、ウサギ血管平滑筋をKCl、NE又はU46619で刺激を行い、p110α免疫沈降物におけるPI-3キナーゼ活性を示した図である。
【図１８】図１８は、ウサギ血管平滑筋をKCl、NE又はU46619で刺激を行い、p110β免疫沈降物におけるPI-3キナーゼ活性を示した図である。
【図１９】図１９は、ウサギ血管平滑筋をKCl、NE又はU46619で刺激を行い、クラスIIα免疫沈降物におけるPI-3キナーゼ活性を示した図である。
【図２０】図２０は、本発明により示された血管平滑筋制御の情報伝達経路を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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