(57)【要約】【課題】  長時間測定による培養液の濃度変化を防止しながら試料の温度を維持し、培養液中への細胞代謝老廃物の蓄積を防ぐ顕微鏡観察装置を提供する。【解決手段】  少なくとも倒立型顕微鏡、高感度冷却型ＣＣＤカメラ装置及び細胞培養チャンバーからなっており、該細胞培養チャンバーは上側ホルダー及び下側ホルダーを有しており、これらのホルダーは夫々樹脂製ホルダー及び金属製ホルダー部によって構成され、これらの金属製ホルダー部にはシートヒータが設けられると共に、細胞培養チャンバー内のシャーレの培養液は、該チャンバーを開放することなく定期的に交換可能であることを特徴とする細胞培養観察装置。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子発現をリアルタイムで長期間連続観察可能な遺伝子発現計測用細胞培養観察装置であって、少なくとも倒立型顕微鏡、高感度冷却型ＣＣＤカメラ装置及び細胞培養チャンバーからなっており、該細胞培養チャンバーは上側ホルダー及び下側ホルダーを有しており、これらのホルダーは夫々樹脂製ホルダー及び金属製ホルダー部によって構成され、これらの金属製ホルダー部にはシートヒータが設けられると共に、細胞培養チャンバー内のシャーレの培養液は、該チャンバーを開放することなく定期的に交換可能であることを特徴とする細胞培養観察装置。
【請求項２】
請求項１記載の細胞培養観察装置において、上記シャーレの培養液は培養液交換用パイプを介して行われ、該培養液交換用パイプには可逆式送液ポンプ、流路切替器及び培養液リザーバ、廃液リザーバが連結されていることを特徴とする細胞培養観察装置。
【請求項３】
請求項１又は２記載の細胞培養観察装置において、上記シャーレの蓋部には培養液交換用パイプのための開口部が設けられ、上記金属製ホルダー部を含む上側ホルダーには、該シャーレの蓋部の開口に対応する位置に該培養液交換用パイプが固定されており、該パイプの固定位置にはゴムパッキンが装着されていることを特徴とする細胞培養観察装置。
【請求項４】
上記顕微鏡の対物レンズにはリングヒータが設けられていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養観察装置。
【請求項５】
上記下側ホルダーの金属製ホルダー部に装着されたシートヒータは、ＰＩＤ温度調節器により制御されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養観察装置。
【請求項６】
上記上側ホルダーの金属製ホルダー部に設けられたシートヒータ及び上記リングヒータは、夫々定電流電源に接続されていることを特徴とする請求項５に記載の細胞培養観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホタルルシフェリンや緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子のような発光・蛍光レポーター遺伝子を導入した細胞あるいは動物組織を用いて、その細胞レベルでの遺伝子発現を数週間から１ヶ月の長期間にわたり連続観察するための顕微鏡による細胞培養観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、生細胞観察用顕微鏡観察装置は次のようなものが知られている。
例えば特開２００３−１１６５１８号のごとき従来公知の顕微鏡観察装置は、特にその温度制御装置部分の改良に関するものである。これを図３により説明する。顕微鏡ステージ１には、観察用生細胞のための観察皿４を挟んで上下に、投光部３及び対物レンズ２が設けられている。温度制御装置５は温風を供給する形式のものであって、上記の観察皿４を囲む位置にリングダクト６を有し、その下方にはスカート部７、上方にはカバー８が設けられ、該リングダクト６内において観察皿４をカバーするように、密封用プラスチックテーブル９が設けられている。そして、温度制御用の温風は図示の矢印に従って流過し、観察皿４内の温度を制御するものである。すなわち、恒温動物の生細胞を顕微鏡で観察する際に、培養液と共に観察試料である生細胞に、通常の体温と同等の温度環境を与える必要があるからである。
【０００３】
図示しない他の公知のＧＦＰ技術による観察装置にあっては、細胞の温度維持のためにサーモプレートを用いる装置も知られている。このような装置にあっては、対物レンズ上方に位置する顕微鏡ステージにはサーモプレートを配置すると共に、その上面に観察皿を載置するディシュホルダーを設け、その周囲をｐＨ維持のためのＣＯ２インキュベータで囲む。更に、上面の照明光側はガラス面に設けたトップヒータを配置する。この場合、ＣＯ２インキュベータは水槽ユニットと共に構成されており、該水槽ユニットの中央部分に上記のディシュホルダーが配置される。
【０００４】
ところで、この様な従来公知の顕微鏡観察装置においても、観察に必要な期間試料温度を約３７℃に維持するためには、可成大掛かりな温度制御装置を必要とする。また、これら公知の顕微鏡観察装置にあっては、観察試料のための培養液を補充又は交換手段を有していない。
このため、上記公知の装置を用いて、例えば１ヶ月間も連続して遺伝子発現をリアルタイムで観察することはできない。
【特許文献１】特開２００３−１１６５１８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本願発明は、この様な従来公知の顕微鏡観察装置における問題点を解決し、長期連続観察するために、例えば試料温度を３７℃±０．５℃に制御すると同時に、培養液濃度、組成の変化を抑制することのできる顕微鏡観察装置を提供するものである。この場合、長時間測定による培養液の濃度変化はシャーレ蓋への結露が主要因であるため、これを防止しながら試料の温度を維持する手段を設けるとともに、長期間観察により必要となる培養液中への細胞代謝老廃物の蓄積を防ぐため、数日に１度の培養液交換を可能とする手段をも設けるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明は、遺伝子発現をリアルタイムで長期間連続観察可能な遺伝子発現計測用細胞培養観察装置であって、少なくとも倒立型顕微鏡、高感度冷却型ＣＣＤカメラ装置及び細胞培養チャンバーからなっており、該細胞培養チャンバーは上側ホルダー及び下側ホルダーを有しており、これらのホルダーは夫々樹脂製ホルダー及び金属製ホルダー部によって構成され、これらの金属製ホルダー部にはシートヒータが設けられると共に、細胞培養チャンバー内のシャーレの培養液は、該チャンバーを開放することなく定期的に交換可能であることを特徴とする細胞培養観察装置である。
また、上記シャーレの培養液は培養液交換用パイプを介して行われ、該培養液交換用パイプには可逆式送液ポンプ、流路切替器及び培養液リザーバ、廃液リザーバが連結されている。
この場合、上記シャーレの蓋部には培養液交換用パイプのための開口部が設けられ、上記金属製ホルダー部を含む上側ホルダーには、該シャーレの蓋部の開口に対応する位置に該培養液交換用パイプが固定されており、該パイプの固定位置にはゴムパッキンが装着されることができる。
更に、上記顕微鏡の対物レンズにはリングヒータが設けられ、下側ホルダーの金属製ホルダー部に装着されたシートヒータは、ＰＩＤ温度調節器により制御され、上側ホルダーの金属製ホルダー部に設けられたシートヒータ及び上記リングヒータは、夫々定電流電源に接続される。
【発明の効果】
【０００７】
本願発明にあっては、培養チャンバー装置にシャーレ底面を加温するための円形ヒータシートと、これを温度制御するための温度センサを設け、また、シャーレ蓋への結露を防止するため円型ヒータシートをシャーレ蓋に密着させている。このために、これらの円型ヒータシートとこれを装着する金属ホルダー部とが相俟って、加温効率が向上する。
また、シャーレ底面表面への結露を防ぐため対物レンズ外周にリング型ヒータを設け、蓋に密着する上面ヒータには常に一定量の発熱によりシャーレ内面での結露を防止するよう定電流駆動する。蓋から底面までの距離は１２ｍｍ程度であるため、上面ヒータからの輻射熱がシャーレ培養液温度に影響を与えるが、これに対して、シャーレ内温度との温度差をあらかじめ校正した温度センサをシャーレ底面に設置して、シャーレ底面ヒータをＰＩＤ制御することにより、目的温度（動物細胞を用いる場合は３７℃）±０．５℃の精度で温度調節することができる。
【０００８】
シャーレ内培養液の交換は、シャーレ蓋に設置した培養液交換用パイプを介して数日に１回、シャーレ内培養液の吸引による排液と培養液の供給を送液ポンプを介して行うので、培養液濃度及び組成の変化を抑制でき、例えば１ヶ月間の長期連続観察が可能となった。
更に、発光レポーターによる遺伝子発現の観察には冷却型超高感度ＣＣＤカメラを用いており、これを暗箱内に設置した倒立顕微鏡に取り付け、顕微鏡試料ステージに設置したシャーレ加温機構、培養液交換機構を特徴とする培養チャンバー装置に、培養細胞、培養組織などを入れたプラスチックシャーレを設置し観察する。このため、発光レポーターが結合してある特定の遺伝子発現が起こると、同時に発生する微弱な発光を画像計測することにより、遺伝子発現をリアルタイムで長期間連続して観察することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
図１及び図２によって、本願発明の実施の形態を説明する。
図１は、本願発明に係る装置のシステム全体構成を示している。防振台１０上に設置された暗箱１１内部に倒立型顕微鏡１２を有し、防振台１０に設けられた開口部を通して顕微鏡下部のカメラポート１３に高感度冷却型ＣＣＤカメラ装置１４が取り付けてある。顕微鏡試料ステージ１５上には細胞培養チャンバー３０（図２で詳述する）が設置され、その内部にプラスチックシャーレ１７に入れた観察試料を配置する構成となっている。
【００１０】
上記プラスチックシャーレ１７には、後述する培養液交換のための培養液交換用パイプ１８を介して送液ポンプ１９が接続されており、該送液ポンプのための制御装置２０、培養液リザーバー２１、廃液リザーバー２２、流路切替器２３（図２参照）等を備えている。
また、高感度冷却型ＣＣＤカメラ装置１４は従来一般に知られている形式のもので、カメラコントローラ、ＣＣＤ冷却装置等を備えており、該カメラコントローラには、パソコン、モニター等が接続されている。更に、顕微鏡自体にも後述する温度調節器、ヒーター用電源等が接続されている。
【００１１】
図２は特に、本願発明の主要構成に係る細胞培養チャンバー３０を含む装置の断面を示している。
細胞培養チャンバー３０の基板となる顕微鏡ステージ２４には、樹脂製ホルダー３１，３１が配置されると共に、該樹脂製ホルダーの内部は夫々金属製ホルダー部３２，３２とされている。そして、該金属製ホルダー部３２，３２の内部に皿部３３Ａ及び蓋部３３Ｂからなるプラスチックシャーレ３３が収納される。同図中の符号Ｓは、該シャーレ３３内に収納された試料を模式的に表現している。
【００１２】
プラスチックシャーレ３３の皿部３３Ａ底面を加温するためのシート状円形ヒータＨ２と、該シャーレの蓋部３３Ｂ加温用のシート状円形ヒータＨ３が、それぞれ上記金属製シャーレホルダー部３２，３２に取り付けてあり、さらにそれらは、上記樹脂製ホルダー３１，３１に埋め込まれ、顕微鏡ステージ２４に固定設置されている。底面ヒータＨ２には、対物レンズ２５がシャーレ底板に接触するまで接近できるよう、その中心部に直径約１５ｍｍの観察用開口を有している。
【００１３】
上面ヒータＨ３には形態観察時の透過照明用として、直径約１０ｍｍの開口である透過照明窓３６が設けられている。底面ヒータＨ２には、温度制御用温度センサ（熱電対）３４が設置してあり、底面ヒータおよび温度センサは、暗箱１１（図１参照）の外部に設置したＰＩＤ温度調節器に接続されている。上面ヒータＨ３は、それらとは独立に定電流電源に接続されている。同様に、対物レンズ２５の外周に設置されたリングヒータＨ１も、外部定電流電源に接続されている。
【００１４】
上記の一方の樹脂ホルダー３１及び一方の金属製ホルダー部３２からなる上面側ホルダーには、培養液交換用金属パイプ１８が貫通して装着されている。また、プラスチックシャーレ３３の蓋部３３Ｂには、該培養液交換用パイプ１８を挿通可能な直径が１ｍｍ程度の開口が施されており、該パイプ１８が装着された上面側ホルダーのパイプが、該蓋部３３Ｂの開口を貫通するように、シャーレ３３の皿部３３Ａの上に被せられる。
【００１５】
培養液交換用金属パイプ１８の少なくとも先端部は、例えば注射針にて作製され、シャーレ３３の皿部３３Ａの底面に該パイプの先端が接触するよう、その長さが調節される。
また、シャーレ３３の開口部からの培養液の蒸発を防止するために、該注射針からなるパイプ１８は、上記上面側ホルダーに対してゴムパッキン３５を介して装着されており、該上面側ホルダーをシャーレ３３の蓋部３３Ｂ上に載せる毎に、該ゴムパッキン３５によって気密性を保つ構造となっている。
更に、説明の詳細は省略するけれども、シャーレ気相中の炭酸ガス濃度を保つため、５％ＣＯ２−９５％ air混合ガスを水に通して湿潤化し、シャーレホルダー内に常時流通させるものである。
【００１６】
培養液交換用金属パイプ１８は、可逆式の送液ポンプ１９に接続されており、更に、流路切替器２３を経て培養液リザーバ２１及び廃液リザーバ２２に接続されている。
なお、これらの送液パイプ１９及び流路切替器２３は、夫々図１に示す送液ポンプコントローラによって制御されるものである。
【００１７】
培養液の交換については、観察する細胞の種類により決定される間隔（数日）で、培養液の交換を間欠的に行う。送液ポンプ１９および電磁式流路切替器２３を制御する送液ポンプコントローラ２０により、まず廃液リザーバ２２へシャーレ３３内の培養液を排出する。送液ポンプ１９の毎時流量と時間から排出量を求め、全量排出した後、流路切替器２３を制御して流路を培養液リザーバ側に切り替えると共に、送液ポンプ１９を逆転し、培養液を所定量シャーレ３３内に供給する。
【実施例】
【００１８】
続いて、上記の構成に係る加温手段における１つの実施例を説明する。
底面ヒータＨ２に抵抗値が８４．４Ωの直径３１．８ｍｍ、厚さ０．３ｍｍのシートヒータを用い、上面ヒータＨ３に抵抗値１５６Ωの直径３４．３ｍｍ、厚さ０．３ｍｍのシートヒータを用い、対物レンズ用リングヒータＨ１に抵抗値９．２Ω、直径５８．４ｍｍのリングヒータを用いた場合、底面ヒータ温度設定値を４０℃、上面ヒータ電流を４７ｍＡ、対物レンズヒータを３００ｍＡとすると、シャーレ内培養液温度を３７±０．５℃で維持することができ、運転中の結露による細胞や組織試料の活性低下等の障害を与えることなく、約１ヶ月間にわたる連続観察が可能となった。ただし、この条件は室温や湿度がその温度安定性に影響するため、測定装置設置環境に応じてそれぞれ変更することは重要である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明に係る細胞培養観察装置のシステム構成説明図である。
【図２】図１に示す装置の細胞培養チャンバー部分の断面図である。
【図３】従来例に係る生細胞観察用顕微鏡観察装置の概略説明図である。
【符号の説明】
【００２０】
１０  防振台
１１  暗箱
１２  倒立型顕微鏡
１３  カメラポート
１４  高感度冷却型ＣＣＤカメラ装置
１５  顕微鏡試料ステージ
３３  プラスチックシャーレ
１８  培養液交換用金属パイプ
１９  送液ポンプ
２０  送液ポンプコントローラ
２１  培養液リザーバー
２２  廃液リザーバー
２３  流路切替器
２４  顕微鏡ステージ
２５  対物レンズ
３０  細胞培養チャンバー
３１  樹脂製ホルダー
３２  金属製ホルダー部
３３Ａ  プラスチックシャーレ皿部
３３Ｂ  プラスチックシャーレ蓋部
３４  温度制御用温度センサ（熱電対）
３５  ゴムパッキン
３６  透過照明窓
Ｈ１  リングヒータ
Ｈ２  底面ヒータ
Ｈ３  上面ヒータ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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