(57)【要約】【課題】  DNAの複製に関係する酵素トポイソメラーゼを阻害し、DNA鎖に切断等の障害を引き起こさない新規なトポイソメラーゼ阻害剤の提供。【解決手段】  ベンゾイルハライド誘導体とベンゼンジアミンとを反応させ、さらに必要により脱アセチル化反応に付すことにより製造されるベンゼンジアミン誘導体を有効成分とするトポイソメラーゼ阻害剤。この阻害剤は、トポイソメラーゼIおよびIIを強く阻害し、しかもDNAへの作用が少ない性質をもつので副作用の少ない薬剤となることが期待される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)
【化１】
2005154342.tif 000008
[式(I)中、Z1およびZ2は、式(II)で示される基
【化２】
2005154342.tif 000009
（式(II)中、R1、R2およびR3は水素原子、水酸基またはアセトキシ基を表す。但し、R1、R2およびR3が２つ以上水素原子である化合物は除く。）を表す。]で示されるベンゼンジアミン誘導体を有効成分とするトポイソメラーゼ阻害剤。
【請求項２】
式(I-a)
【化３】
2005154342.tif 000010
[式(I-a)中、Z1およびZ2は、式(II-a)で示される基
【化４】
2005154342.tif 000011
（式(II-a)中、R1、R2およびR3は水素原子、水酸基またはアセトキシ基を表す。但し、R1、R2およびR3が２つ以上水素原子である化合物並びにR1およびR2が水酸基であり、R3が水素原子である化合物は除く。）を表す。]で示されるベンゼンジアミン誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はトポイソメラーゼ阻害作用を有するベンゼンジアミン誘導体およびそれらを有効成分とするトポイソメラーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高等生物は細胞の形態を形づくるのに必要な細胞増殖の度合いを調節する能力を有しているが、がん化した細胞ではこの能力に異常な変化がおこっており、正常細胞に比べて急速な増殖をするのが特徴と考えられている。がん細胞では、正常細胞に比べて主に２つの異常、すなわち「細胞分裂の制御性の異常」と「がん細胞の転移」とが存在すると考えられている。正常細胞の分裂は細胞増殖抑制遺伝子により制御されており、必要なときにだけ分裂が誘発される。がん細胞は正常細胞の制御機構から逃れ増殖を繰り返す。つまり、１個のがん病巣は繰り返し遺伝的な変化を受けた単一細胞から発生し、分裂を繰り返し無数の同じように変化した異常な細胞を作り出す。正常細胞は、その個体の全体的な形態を維持するのに必要なルールに従って、それぞれの構成組織の中に限定されている。これに対して、がん細胞はそれが生じた組織にとどまることなく、増殖しながら他の組織へ転移していく。このような性質をもつがん細胞に変化してしまう原因としては、化学物質による遺伝子の損傷、放射線による遺伝子の損傷、ウイルスによる遺伝子の変異および先天的な遺伝子の欠損等が挙げられる。
【０００３】
がんを治療する戦略として、制がん剤を用いる方法は最も一般的であり、多くの薬剤が研究開発されてきた。中でも増殖細胞に対する抑制機能を指標とし開発された制がん剤としては、アルキル化剤、抗腫瘍性抗生物質、植物アルカロイドおよびキレート剤等が知られている。しかし、これらは殆どが遺伝子に作用するものであるため、選択毒性が低く、またその効果も必ずしも満足できるものではない。また、これらの制がん剤は遺伝子の変異を引き起こすこともあり、二次的ながんを誘発する可能性も高い等の問題がある。
【０００４】
一方、がん細胞に関する分子生物学的研究の進展は、従来明らかでなかった制がん剤の作用機構に重大な手掛かりを与えている。中でも、エピポドフィロトキシン(epipodophyllotoxin)、ドキソルビシン(doxorubicin)、ストレプトニグリン(streptonigrin)等の制がん剤は、がん細胞内に多く存在する酵素であるトポイソメラーゼ(topoisomerase)の酵素活性を阻害することで、制がん効果を示すことが明らかになった(非特許文献１参照）。
【０００５】
このトポイソメラーゼは、超らせん型DNAを一時的な切断と再結合により弛緩型DNAに変換する酵素であり、DNAの複製、転写、組み換え等の過程で生じる高次構造のひずみを解消し、DNA代謝をスムーズに進行させる機能を有している。トポイソメラーゼには、超らせん２本鎖DNAの１本鎖のみを切断し開環型DNAとした後、再結合して弛緩型DNAとするトポイソメラーゼI(topoisomerase I)と、２本鎖を同時に切断し直鎖DNAとした後、再結合して弛緩型DNAとするトポイソメラーゼII(topoisomerase II)の２種類がある。がん細胞のような増殖の激しい細胞には、正常細胞に比べてこのトポイソメラーゼが多く存在することが報告されている(非特許文献２参照)。従って、トポイソメラーゼの酵素活性を阻害する薬剤は、がん細胞の増殖を抑える有効な制がん剤の一つとなり得る。
【０００６】
そこで、トポイソメラーゼに作用する制がん剤の探索研究が行われ、カンプトテシン(camptothecin)、テルペンテシン(terpentecin)、セイントピン(saintopin)、ブルガレイン(bulgarein)等、制がん剤の新しいリード化合物となりうる酵素阻害剤が近年次々に報告されている(非特許文献３参照)。しかし、これらの阻害剤は遊離のトポイソメラーゼに結合して阻害するのではなく、酵素と切断されたDNAからなるトポイソメラーゼ−DNA切断複合体(cleavable complex)に結合してトポイソメラーゼの酵素活性を阻害するものであり、そのため、DNAに切れ目や切断等の障害を引き起こし強い毒性を示す。従って、制がん剤としては、トポイソメラーゼに直接作用しDNAには障害を残さない阻害剤、つまり副作用の少ない薬剤が要求されている。
【０００７】
一方、ある種のベンゼンジアミン誘導体は、がん細胞のテロメラーゼを阻害する性質を持つことが報告されている（非特許文献４参照）。しかし、トポイソメラーゼ阻害活性をもつことは知られていない。
【０００８】
【非特許文献１】Yamashita,Cancer Res.,50,5841〜5844(1990)
【非特許文献２】Spitzner,Nucleic,Acids,Res.,16,5533〜5556(1988)
【非特許文献３】Yamashita,Biochemistry,30,5838〜5845(1991)
【非特許文献４】Hiroyuki Seimiya et al.,Molecular Cancer Therapeutics,vol.1,657-665,July 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、直接トポイソメラーゼに作用しDNAに障害を残さないトポイソメラーゼ阻害物質およびそれらの阻害物質を含有するトポイソメラーゼ阻害剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため、指標酵素としてトポイソメラーゼIを用い、直接トポイソメラーゼに作用しDNAには障害を残さないトポイソメラーゼ阻害物質の探索を行ったところ、ある種のベンゼンジアミン誘導体が優れたトポイソメラーゼ阻害作用を有し、DNAとはほとんど相互作用を示さないことを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明は、式(I)
【化５】
2005154342.tif 000002
[式(I)中、Z1およびZ2は、式(II)で示される基
【００１２】
【化６】
2005154342.tif 000003
（式(II)中、R1、R2およびR3は水素原子、水酸基またはアセトキシ基を表す。但し、R1、R2およびR3が２つ以上水素原子である化合物は除く。）を表す。]で示されるベンゼンジアミン誘導体を有効成分とするトポイソメラーゼ阻害剤に関する。
【００１３】
式(I)における２つの置換基（式(II)で示される基）の配置は、オルト位、メタ位およびパラ位のいずれでもよい。また式(II)において、R1、R2およびR3の少なくとも２つの基が水酸基またはアセトキシ基である化合物は、優れたトポイソメラーゼ阻害活性を有する。しかし、R1、R2およびR3の少なくとも２つの基が水素原子である化合物は、トポイソメラーゼ阻害活性が弱いので、トポイソメラーゼ阻害剤としては適当でない。
【００１４】
また本発明は、式(I-a)
【化７】
2005154342.tif 000004
[式(I-a)中、Z1およびZ2は、式(II-a)で示される基
【００１５】
【化８】
2005154342.tif 000005
（式(II-a)中、R1、R2およびR3は水素原子、水酸基またはアセトキシ基を表す。但し、R1、R2およびR3が２つ以上水素原子である化合物並びにR1およびR2が水酸基であり、R3が水素原子である化合物は除く。）を表す。]で示されるベンゼンジアミン誘導体に関する。これらの物質は、新規化合物であり優れたトポイソメラーゼ阻害活性を有する。
【００１６】
式(I)で示されるベンゼンジアミン誘導体は、以下の工程に従ってベンゾイルハライド誘導体(III)とベンゼンジアミン（IV）とを反応させ、さらに必要により脱アセチル化反応に付すことにより製造することができる。
【００１７】
【化９】
2005154342.tif 000006
上記反応式中、R1'、R2'およびR3'は水素原子またはアセトキシ基を、Xはハロゲン原子を表わす。
【００１８】
この反応は、ジクロロメタン等の不活性溶媒中に溶解したベンゼンジアミンに、トリエチルアミン等の有機塩基の存在下、式(III)で示されるベンゾイルハライド誘導体を徐々に添加してアミド化することにより、R1'、R2'およびR3'が水素原子またはアセトキシ基である式（V）で示されるベンゼンジアミン誘導体を得ることができる。さらにこれをジクロロメタン等の不活性溶媒中、ヒドラジンと反応させ、脱アセチル化することにより、R1'、R2'およびR3'が水素原子または水酸基である式（V）で示されるベンゼンジアミン誘導体を容易に得ることができる。なお、原料の一般式(III)で示されるベンゾイルハライド誘導体は、公知の方法（例えば、J.Med.Chem.,1989,32,2344等）に従って製造することができる。
【００１９】
このようにして得られる本発明のトポイソメラーゼ阻害剤は、後述する実施例で示すとおり、トポイソメラーゼIに対して優れた阻害作用を示す。またトポイソメラーゼIIに対しても優れた阻害作用を示す。例えば、N,N'-Bis(3,4,5-trihydroxybenzoyl)-1,2-benzenediamineは、トポイソメラーゼIIに対する阻害作用IC50が２．６×１０-7Ｍであり、公知の阻害剤であるドキソルビシン（ＩＣ50：１×１０-6Ｍ）やエトポシド（ＩＣ50：８．７×１０-5Ｍ）よりも強い阻害活性を示す。また、その阻害形式は非拮抗阻害であり、DNA自体には全く作用しない性質を示した。また、本発明のトポイソメラーゼ阻害剤はある種の培養腫瘍細胞の増殖を阻害する（例えば、PDO-h3（後記例２参照）は、30μMの濃度でHeLa細胞の増殖を50％阻害する）が、細胞周期は変化させない性質を有する。
【００２０】
以上のとおり本発明のトポイソメラーゼ阻害剤は、直接トポイソメラーゼに作用し、DNAへの作用が少ない阻害剤であり、DNAに障害を与えないことから副作用の少ない薬剤となることが期待される。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明について具体例を挙げてより詳細に説明するが、本発明をこれらの例に限定することを意図するものではない。なお、下記の例中のパーセント(％)は、特に断りのない限り、容量パーセントを示す。
【００２２】
例１
N,N'-Bis(3,4,5-triacetoxybenzoyl)-1,2-benzenediamine（以下、PDO-a3と略称するときがある）の製造
2mmolの1,2-ベンゼンジアミン(1,2-benzenediamine)を10mlのジクロロメタンに溶解し、これにトリエチルアミン6mmolを加えた。この溶液に氷冷下、J.Med.Chem.,1989,32,2344の記載に従って調製した3,4,5-triacetoxybenzoyl chloride 4mmolを少量ずつ加え、室温で２時間撹拌した。ジクロロメタン層を水洗して、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、ジクロロメタンを留去し、EtOAc/n-hexaneから再結晶した。融点 228 ℃，収量0.99g（収率75％）
【００２３】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,CDCl3),ppm
2.26(12H,s,acetyl at 3',5',3'' and 5''),2.27(6H,s,acetyl at 4',4''),6.99(2H,q,J=3.6Hz,H 4,5),7.36(2H,q,J=3.6Hz,H 3,6),7.70(4H,s,H 2',6',2'',6''),9.64(2H,s,2 NH)
【００２４】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,CDCl3),ppm
20.07(CH3),20.45(CH3),120.61(CH),125.61(CH),126.67(CH),130.08(C),132.06(C),137.83(C),143.49(C),164.14(C),166.54(C),167.79(C)
【００２５】
マススペクトル
FAB-MAS:m/z 665(M+1)
【００２６】
例２
N,N'-Bis(3,4,5-trihydroxybenzoyl)-1,2-benzenediamine（以下、PDO-h3と略称するときがある）の製造
例１で調製したPDO-a3 1mmolを10mlのジクロロメタンに溶解し、これにヒドラジン・１水和物7mmolを加え、室温で１時間撹拌した。ジクロロメタン層を水洗して、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、ジクロロメタンを留去し、これに適当量のメタノールを加えて再結晶した。融点 265 〜 266 ℃，収量0.50g（収率61％）
【００２７】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,CD3OD),ppm
6.87(4H,s,H 2',6',2'',6''),7.16-7.19(2H,q,J=3.6Hz,H 4,5),7.45-7.48(2H,q,J=3.6Hz,H 3,6)
【００２８】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,CD3OD),ppm
108.34(CH),125.78(C),126.87(CH),127.18(CH),132.85(C),138.85(C),146.84(C),169.04(C)
【００２９】
マススペクトル
FAB-MAS:m/z 413(M+1)
【００３０】
例３
N,N'-Bis(3,4-diacetoxybenzoyl)-1,2-benzenediamine（以下、PDO-a2と略称するときがある）の製造
3,4,5-triacetoxybenzoyl chlorideの代りに3,4-diacetoxybenzoyl chlorideを用いた以外は、例１と同様に行い、PDO-a2を製造した。
融点 206 〜 207 ℃，収量0.81g（収率74％）
【００３１】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,CDCl3),ppm
2.31(6H,s,acetyl at 3' and 3''),2.33(6H,s,acetyl at 4',4''),6.87(2H,q,J=3.6Hz,H 4,5),7.25-7.34(4H,m,H 3,6,5',5''),7.83(2H,d,J=2.1Hz,H 6',6''),7.86(2H,s,H 2',2''),9.49(2H,s,2 NH)
【００３２】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,CD3Cl),ppm
18.75(CH3),18.85(CH3),121.81(CH),121.90(CH),124.01(CH),124.09(CH),124.83(CH),130.40(C),132.09(C),142.29(C),145.32(C),164.81(C),167.64(C),167.89(C)
【００３３】
マススペクトル
FAB-MAS:m/z 549(M+1)
【００３４】
例４
N,N'-Bis(3,4-dihydroxybenzoyl)-1,2-benzenediamine（以下、PDO-h2と略称するときがある）の製造
PDO-a3の代りにPDO-a2を用いた以外は、全く例２と同様に行い、PDO-h2を製造した。
融点 276 ℃，収量0.24g（収率63％）
【００３５】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,CD3OD),ppm
6.73(2H,d,J=8.4Hz,H 5',5''),7.16-7.24(4H,m,H 4,5,6',6''),7.31(2H,d,J=2.4Hz,H 2',2''),7.48(2H,q,J=3.3Hz,H 3,6)
【００３６】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,CD3OD),ppm
116.06(CH),116.12(CH),121.04(CH),126.63(C),126.88(CH),127.21(CH),132.85(C),146.54(C),150.82(C),168.68(C);FAB-MAS:m/z(M+1)
【００３７】
マススペクトル
FAB-MAS:m/z 381(M+1)
【００３８】
例５
N,N'-Bis(4-acetoxybenzoyl)-1,2-benzenediamine（以下、PDO-a1と略称するときがある）の製造
3,4,5-triacetoxybenzoyl chlorideの代りに4-acetoxybenzoyl chlorideを用いた以外は、例１と同様に行い、PDO-a1を製造した。
融点 192 〜 194 ℃，収量0.61g（収率71％）
【００３９】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,DMSO-d6),ppm
2.28(6H,s,acetyl at 4',4''),7.26-7.30(6H,m,H 4,5,3',5',3'',5''),7.66(2H,q,J=3.6Hz,H 3,6),7.98(4H,d,J=8.4Hz,H 2',6',2'',6''),10.04(2H,s,2 NH)
【００４０】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,DMSO-d6),ppm
20.85(CH3),121.99(CH),125.56(CH),125.88(CH),129.08(CH),131.30(C),131.79(C),153.08(C),164.75(C),168.94(C)
【００４１】
マススペクトル
FAB-MAS:m/z 433(M+1)
【００４２】
例６
N,N'-Bis(4-hydroxybenzoyl)-1,2-benzenediamine（以下、PDO-h1と略称するときがある）の製造
PDO-a3の代りにPDO-a1を用いた以外は、全く例２と同様に行い、PDO-h1を製造した。
融点 300 ℃，収量0.20g（収率58％）
【００４３】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,DMSO-d6),ppm
6.84(4H,d,J=8.7Hz,H 3',5',3'',5''),7.24(2H,q,J=3.45Hz,H 4,5),7.60(2H,q,J=3.6Hz,H 3,6),7.81(4H,d,J=8.4Hz,H 2',6',2'',6''),9.87(2H,s,2 OH),10.14(2H,s,2 NH)
【００４４】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,DMSO-d6),ppm
114.45(CH),124.47(CH),124.83(CH),125.18(C),128.74(CH),131.05(C),160.38(C),164.61(C)
【００４５】
マススペクトル
FAB-MAS:m/z 349(M+1)
【００４６】
例７
N,N'-dibenzoyl-1,2-benzenediamine（以下、PDO-h0と略称するときがある）の製造
3,4,5-triacetoxybenzoyl chlorideの代りにbenzoyl chlorideを用いた以外は、例１と同様に行い、PDO-h0を製造した。
融点 300 ℃，収量0.48g（収率76.5％）
【００４７】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,DMSO-d6),ppm
7.30-7.35(4H,m,H 4,5,3,6),7.50-7.63(6H,m,H 3',5',3'',5'',4',4''),7.93(4H,d,J=7.2,H 2',6',2'',6''),10.05(2H,s,2NH)
【００４８】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,DMSO-d6),ppm
125.34(CH),125.57(CH),127.24(CH),128.33(CH),131.15(C),131.58(CH),134.07(C),165.31(C)
【００４９】
マススペクトル
FAB-MAS:m/z 317(M+1)
【００５０】
例８
N,N'-Bis(3,4,5-triacetoxybenzoyl)-1,3-benzenediamine（以下、PDM-a3と略称するときがある）の製造
1,2-ベンゼンジアミンの代りに1,3-ベンゼンジアミンを用いた以外は、例１と同様に行い、PDM-a3を製造した。
融点 250 〜 251 ℃，収量1.00g（収率75％）
【００５１】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,DMSO-d6),ppm
2.32(12H,s,acetyl at 3',5',3'' and 5''),2.33(6H,s,acetyl at 4',4''),7.34(1H,t,J=8.4Hz,H 5),7.48(2H,d,J=8.4Hz,H 4,6),7.83(4H,s,H 2',6',2'',6''),8.27(1H,s,H 2),10.40(2H,s,2 NH)
【００５２】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,DMSO-d6),ppm
19.7(CH3),20.15(CH3),112.92(CH),116.33(CH),120.39(CH),128.56(CH),132.75(C),137.17(C),138.87(C),143.00(C),162.97(C),166.75(C),167.80(C)
【００５３】
マススペクトル
FAB-MAS:m/z 665(M+1)
【００５４】
例９
N,N'-Bis(3,4,5-trihydroxybenzoyl)-1,3-benzenediamine（以下、PDM-h3と略称するときがある）の製造
PDO-a3の代りにPDM-a3を用いた以外は、全く例２と同様に行い、PDM-h3を製造した。
融点 > 300 ℃，収量0.25g（収率61％）
【００５５】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,CD3OD),ppm
6.87(4H,s,H 2',6',2'',6''),7.20(1H,q,J=7.2Hz,H 5),7.29-7.33(2H,m,H 4,6),7.83(1H,t,J=1.95Hz,H 2)
【００５６】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,CD3OD),ppm
108.20(CH),115.37(CH),118.33(CH),126.62(C),129.89(CH),138.44(C),140.39(C),146.72(C),169.15(C);FAB-MAS:m/z 413(M+1)
【００５７】
マススペクトル
FAB-MAS:m/z 413(M+1)
【００５８】
例１０
N,N'-Bis(3,4-diacetoxybenzoyl)-1,3-benzenediamine（以下、PDM-a2と略称するときがある）の製造
3,4,5-triacetoxybenzoyl chlorideの代りに3,4-diacetoxybenzoyl chlorideを用いた以外は、例８と同様に行い、PDM-a2を製造した。
融点 203 〜 204 ℃，収量0.83g（収率76％）
【００５９】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,DMSO-d6),ppm
2.31(6H,s,acetyl at 3'and 3''),2.32(6H,s,acetyl at 4',4''),7.32(1H,t,J=8.0Hz,H 5),7.44(2H,d,J=8.7Hz,H 5',5''),7.49(2H,dd,J=9.6,1.46Hz,H 4,6),7.87(2H,s,H 2',2''),7.92(2H,dd,J=8.4,1.83Hz,H 6',6''),8.30(1H,s,H 2),10.38(2H,s,2 NH)
【００６０】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,DMSO-d6),ppm
20.30(CH3),20.38(CH3),112.87(CH),116.22(CH),123.21(CH),123.70(CH),126.22(CH),128.68(CH),133.39(C),139.15(C),141.83(C),144.59(C),163.90(C),168.03(C),168.23(C)
【００６１】
マススペクトル
FAB-MAS:m/z 549(M+1)
【００６２】
例１１
N,N'-Bis(3,4-dihydroxybenzoyl)-1,3-benzenediamine（以下、PDM-h2と略称するときがある）の製造
PDO-a3の代りにPDM-a2を用いた以外は、全く例２と同様に行い、PDM-h2を製造した。
融点 280 〜 281 ℃，収量0.27g（収率71％）
【００６３】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,DMSO-d6),ppm
6.81(2H,d,J=8.1Hz,H 5',5''),7.23(1H,t,J=7.95Hz,H 5),7.33-7.42(6H,m,H 4,6,2',6',2'',6''),8.22(1H,s,H 2),9.41(2H,s,2 OH),9.93(2H,s,2 NH)
【００６４】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,DMSO-d6),ppm
112.94(CH),114.87(CH),115.49(CH),115.67(CH),119.66(CH),125.98(C),128.29(CH),139.57(C),144.92(C),148.82(C),165.21(C)
【００６５】
マススペクトル
FAB-MAS:m/z 381(M+1)
【００６６】
例１２
N,N'-Bis(4-acetoxybenzoyl)-1,3-benzenediamine（以下、PDM-a1と略称するときがある）の製造
3,4,5-triacetoxybenzoyl chlorideの代りに4-acetoxybenzoyl chlorideを用いた以外は、例８と同様に行い、PDM-a1を製造した。
融点 275 〜 276 ℃，収量0.70g（収率81％）
【００６７】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,DMSO-d6),ppm
2.30(6H,s,acetyl at 4',4''),7.28(4H,d,J=8.7Hz,H 3',5',3'',5''),7.32-7.35(1H,m,H 5),7.49(2H,d,J=8.1Hz,H 4,6),8.00(4H,d,J=8.7Hz,H 2',6',2'',6''),8.30(1H,s,H 2)10.31(2H,s,2NH)
【００６８】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,DMSO-d6),ppm
20.86(CH3),112.81(CH),116.04(CH),121.79(CH),128.59(CH),129.21(CH),132.47(C),139.30(C),152.88(C),164.79(C),168.99(C)
【００６９】
マススペクトル
FAB-MAS:m/z 433(M+1)
【００７０】
例１３
N,N'-Bis(4-hydroxybenzoyl)-1,3-benzenediamine（以下、PDM-h1と略称するときがある）の製造
PDO-a3の代りにPDM-a1を用いた以外は、全く例２と同様に行い、PDM-h1を製造した。
融点 300 ℃，収量0.23g（収率66％）
【００７１】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,DMSO-d6),ppm
6.86(4H,d,J=8.4Hz,H 3',5',3'',5''),7.26(1H,t,J=8.1Hz,H 5),7.44(2H,dd,J=9.9Hz,H 4,6),7.87(4H,d,J=8.7Hz,H 2',6',2'',6''),8.25(1H,s,H 2),10.00(2H,s,2 OH),10.10(2H,s,2 NH)
【００７２】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,DMSO-d6),ppm
112.95(CH),114.90(CH),115.76(CH)125.46(C),128.39(CH),129.76(CH),139.57(C),160.53(C),165.09(C)
【００７３】
マススペクトル
FAB-MAS:m/z 349(M+1)
【００７４】
例１４
N,N'-dibenzoyl-1,3-benzenediamine（以下、PDM-h0と略称するときがある）の製造
3,4,5-triacetoxybenzoyl chlorideの代りにbenzoyl chlorideを用いた以外は、例８と同様に行い、PDM-h0を製造した。
融点 > 300 ℃，収量0.48g（収率76％）
【００７５】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,DMSO-d6)
7.31(1H,t,J=8.1Hz,H 5),7.48-7.58(8H,m,H 4,6,3',3',4',5',3'',4'',5''),7.96(4H,d,J=6.9Hz,H 2',6',2'',6''),8.33(1H,s,H 2)10.30(2H,s,2 NH)
【００７６】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,DMSO-d6)112.95(CH),116.08(CH),127.67(CH),128.34(CH),128.55(CH),131.52(CH),134.94(C),139.34(C),165.54(C)
【００７７】
マススペクトル
FAB-MAS:m/z 317(M+1)
【００７８】
例１５
N,N'-Bis(3,4,5-triacetoxybenzoyl)-1,4-benzenediamine（以下、PDP-a3と略称するときがある）の製造
1,2-ベンゼンジアミンの代りに1,4-ベンゼンジアミンを用いた以外は、例１と同様に行い、PDP-a3を製造した。
融点 273 ℃，収量0.90g（収率68％）
【００７９】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,DMSO-d6),ppm
2.32(12H,s,acetyl at 3',5',3''and 5''),2.33(6H,s,acetyl at 4',4''),7.73(4H,s,H 2,3,5,6),7.82(4H,s,H 2',6',2'',6'')10.36(2H,s,2 NH)
【００８０】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,DMSO-d6),ppm
20.27(CH3),20.72(CH3)120.86(CH),121.27(CH),133.33(C),135.27(C),137.69(C),143.58(C),163.32(C),167.32(C),168.37(C)
【００８１】
マススペクトル
FAB-MAS:m/z 665(M+1)
【００８２】
例１６
N,N'-Bis(3,4,5-trihydroxybenzoyl)-1,4-benzenediamine（以下、PDP-h3と略称するときがある）の製造
PDO-a3の代りにPDP-a3を用いた以外は、全く例２と同様に行い、PDP-h3を製造した。
融点 > 300 ℃，収量0.23g（収率56％）
【００８３】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,DMSO-d6),ppm
6.94(4H,s,H 2',6',2'',6''),7.65(4H,s,H 2,3,5,6)
【００８４】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,DMSO-d6),ppm
106.90(CH),119.95(CH),120.05(CH),124.86(C),134.50(C),136.14(C),144.99(C),164.76(C)
【００８５】
マススペクトル
FAB-MAS:m/z 413(M+1)
【００８６】
例１７
N,N'-Bis(3,4-diacetoxybenzoyl)-1,4-benzenediamine（以下、PDP-a2と略称するときがある）の製造
3,4,5-triacetoxybenzoyl chlorideの代りに3,4-diacetoxybenzoyl chlorideを用いた以外は、例１５と同様に行い、PDP-a2を製造した。
融点 288 〜 290 ℃，収量0.85g（収率78％）
【００８７】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,DMSO-d6),ppm
2.31(6H,s,acetyl at 3'and 3''),2.32(6H,s,acetyl at 4',4''),7.44(2H,d,J=8.4Hz,H 5',5''),7.74(4H,s,H 2,3,5,6),7.86(2H,s,H 2',2''),7.92(2H,dd,J=8.1Hz,H 6',6''),10.32(2H,s,2NH)
【００８８】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,DMSO-d6),ppm
20.29(CH3),20.35(CH3),120.60(CH),120.70(CH),123.13(CH),123.68(CH),126.08(CH),133.40(C),134.86(C),141.83(C),144.51(C),163.64(C),168.00(C),168.19(C)
【００８９】
マススペクトル
FAB-MAS:m/z 549(M+1)
【００９０】
例１８
N,N'-Bis(3,4-dihydroxybenzoyl)-1,4-benzenediamine（以下、PDP-h2と略称するときがある）の製造
PDP-a3の代りにPDP-a2を用いた以外は、全く例２と同様に行い、PDP-h2を製造した。
融点  >  300  ℃，収量0.26g（収率68％）
【００９１】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,DMSO-d6),ppm
6.81(2H,d,J=8.4Hz,H 4',4''),7.32(2H,dd,J=2.25Hz,H 6',6''),7.37(2H,s,H 2',2''),7.66(4H,s,H 2,3,5,6),9.25(2H,s,2 OH),9.87(2H,s,2 NH)
【００９２】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,DMSO-d6),ppm
114.87(CH),115.38(CH),119.52(CH),120.43(CH),125.99(C),134.93(C),144.92(C),148.73(C),164.99(C)
【００９３】
マススペクトルFAB-MAS:m/z 381(M+1)
【００９４】
例１９
N,N'-Bis(4-acetoxybenzoyl)-1,4-benzenediamine（以下、PDP-a1と略称するときがある）の製造3,4,5-triacetoxybenzoyl chlorideの代りに4-acetoxybenzoyl chlorideを用いた以外は、例１５と同様に行い、PDP-h0を製造した。
融点 > 300 ℃，収量0.69g（収率80％）
【００９５】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,DMSO-d6),ppm
2.30(6H,s,acetyl at 4',4''),7.28(4H,d,J=8.4Hz,H 3',5',3'',5''),7.74(4H,s,H 2,3,5,6),8.00(4H,d,J=8.4Hz,H 2',6',2'',6''),10.25(2H,s,2 NH)
【００９６】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,DMSO-d6),ppm
20.85(CH3),120.49(CH),120.59(CH),121.79(CH),129.11(CH),132.48(C),134.92(C),152.83(C),164.53(C),168.96(C)
【００９７】
マススペクトル
FAB-MAS:m/z 433(M+1)
【００９８】
例２０
N,N'-Bis(4-hydroxybenzoyl)-1,4-benzenediamine（以下、PDP-h1と略称するときがある）の製造
PDO-a3の代りにPDP-a1を用いた以外は、全く例２と同様に行い、PDP-h1を製造した。
融点 > 300 ℃，収量0.23g（収率66％）
【００９９】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,DMSO-d6),ppm
6.85(4H,d,J=8.7Hz,H 3',5',3'',5''),7.68(4H,s,H 2,3,5,6),7.84(4H,d,J=8.7Hz,H 2',6',2'',6''),9.93(2H,s,2 OH),10.07(2H,s,2 NH)
【０１００】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,DMSO-d6),ppm
114.88(CH),120.51(CH),125.46(C),129.61(CH),134.94(C),160.44(C),164.85(C);
【０１０１】
マススペクトル
FAB-MAS:m/z 349(M+1)
【０１０２】
例２１
N,N'-dibenzoyl-1,4-benzenediamine（以下、PDP-h0と略称するときがある）の製造
3,4,5-triacetoxybenzoyl chlorideの代りにbenzoyl chlorideを用いた以外は、例１５と同様に行い、PDP-h0を製造した。
融点 > 300 ℃，収量0.48g（収率76％)
【０１０３】
1H核磁気共鳴スペクトル(300MHz,DMSO-d6),ppm
7.49-7.58(6H,m,H 3',4',5',3'',4'',5''),7.75(4H,s,H 2,3,5,6),7.94-7.96(4H,m,H 2',6',2'',6''),10.23(2H,s,2 NH)
【０１０４】
13C核磁気共鳴スペクトル(75MHz,DMSO-d6),ppm
120.64(CH),127.57(CH),128.35(CH),131.46(CH),134.94(C),134.97(C),165.30(C)
【０１０５】
マススペクトル
FAB-MAS:m/z 317(M+1)
【０１０６】
例２２
トポイソメラーゼI阻害活性測定
トポイソメラーゼＩは、二重鎖ＤＮＡに切断を導入することにより超らせんを弛緩する活性を有しているので、トポイソメラーゼＩによるＤＮＡ弛緩（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）活性の減少を測定して、例１〜２１において製造したベンゼンジアミン誘導体の阻害活性を算出した。９６穴プレートに２倍濃度のトポイソメラーゼＩ活性測定用緩衝液（２×ＴｏｐｏＩ  ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ；１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、２４０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール、６０μｇ／ｍｌ  牛血清アルブミン（ＢＳＡ））１０μｌ、ベンゼンジアミン誘導体試料溶液８．３μｌ（ＤＭＳＯを１０％含むＭｅＯＨに溶解）、子牛胸腺由来のトポイソメラーゼＩ（２ｕｎｉｔ／μｌ）０．５μｌを添加後、３７℃で５分間プレインキュベーションする。次に、基質ＤＮＡであるｐＢＲ３２２（０．１２５μｇ／μｌ）１．２μｌを添加し、３７℃、４０分間反応させる。反応後、電気泳動試料用緩衝液（２倍濃度のＴＢＥ緩衝液（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２００ｍＭホウ酸、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）、１０％ブロムフェノールブルー、５０％グリシン）１０μｌを添加し、その反応液１２μｌをアガロースゲル電気泳動に用いた。
【０１０７】
電気泳動は、次のようにして行った。アガロース０．３ｇにＴＢＥ緩衝液３０ｍｌを加え、加熱溶解する。電気泳動用プレートにアガロース液を流し入れ、固化後、アガロースゲルの溝に試料溶液を添加し、１００Ｖ、１時間、ＴＢＥ緩衝液中で電気泳動を行う。泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド溶液（５０μｇ／ｍｌ）２００ｍｌで１分間染色し、次に水５００ｍｌで５分、１０分および１０分間隔で３回脱色する。泳動および染色後、ｐＢＲ３２２の弛緩ＤＮＡ（ｒｅｌａｘｅｄ  ＤＮＡ）のバンドと超らせんＤＮＡ（ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ  ＤＮＡ）のバンドとは移動度の違いにより別バンドとして現れるので、各バンドをＵＶトランスイルミネーター（ＴＭ３６（商品名、フナコシ（株））とデンシトメーター（ＡＥ−６９００Ｍ（商品名、アトー（株）））で測定し、反応前後における各ＤＮＡ量の変化を求める。すなわち、ベンゼンジアミン誘導体によってトポイソメラーゼＩが阻害されるために現れる未反応のｐＢＲ３２２のバンド（超らせんＤＮＡ量）から、トポイソメラーゼＩのＤＮＡ弛緩（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）活性の減少を求め、阻害活性を算出した。例１〜２１において製造したベンゼンジアミン誘導体のトポイソメラーゼＩ阻害活性を表１に示す。
【０１０８】
【表１】
2005154342.tif 000007
【０１０９】
例２３
トポイソメラーゼＩＩ阻害活性測定
トポイソメラーゼＩＩによるＤＮＡ弛緩（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）活性が、ベンゼンジアミン誘導体によって減少する程度を測定し、ベンゼンジアミン誘導体の阻害活性を算出した。阻害活性の測定は以下のようにして行った。ＤＮＡ弛緩活性の阻害を測定するための反応混合液は、９６穴プレートに２倍濃度のトポイソメラーゼＩＩ活性測定用緩衝液（２×Ｔｏｐｏ  ＩＩ  ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（商品名、トポゲン（ＴｏｐｏＧｅｎ）社）；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐΗ８．０、２４ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ΜｇＣｌ2、０．１ｍＭ  ＡＴＰ、０．１ｍΜ  ジチオスレイトール、６μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）１０μｌ、ベンゼンジアミン誘導体試料溶液８．３μｌ、ヒト胎盤由来のトポイソメラーゼＩＩ（２ｕｎｉｔ／μｌ）０．５μｌおよびｐＢＲ３２２（０．１２５μｇ／μｌ）１．２μｌを添加後、３７℃で４０分間反応させたものである。反応後、前記の電気泳動試料用緩衝液４μｌを添加し、その１２μｌをアガロースゲル電気泳動に用いた。泳動後、ｐＢＲ３２２の超らせんＤＮＡ（ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ  ＤＮＡ）量の変化をデンシトメーターで測定し、ＤＮＡ弛緩（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）活性の減少から、ベンゼンジアミン誘導体の阻害活性を求めた。
【０１１０】
ベンゼンジアミン誘導体の、トポイソメラーゼＩＩのＤＮＡ弛緩（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）活性に対する阻害活性（ＩＣ50）は以下のとおりである。ベンゼンジアミン誘導体はトポイソメラーゼＩＩのＤＮＡ弛緩活性を強く阻害する。ＰＤＯ−ｈ３  ０．０９μＭ、ＰＤＭ−ｈ３  ０．２２μＭ、ＰＤＰ−ｈ３  ０．１５μＭ