(57)【要約】【課題】  シロフジツボから新たな接着タンパク質遺伝子を単離する。【解決手段】  シロスジフジツボのセメント中に含まれ、分子量約12kDa、等電点8.3で、アカフジツボ由来の第３接着タンパク質と一定の相同性を示すタンパク質、及びそれをコードする遺伝子。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(c)に示すタンパク質。
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表され、かつ接着性を有するタンパク質
(c)配列番号１記載の塩基配列で表されるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするシロスジフジツボ由来のタンパク質であって、接着性を有するタンパク質
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２記載の遺伝子を含む微生物又は培養細胞を培養し、培養物中又は微生物若しくは培養細胞内に蓄積されるタンパク質を採取することを特徴とする請求項１記載のタンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は水中や湿潤な環境で使用できる接着剤や吸着剤、自己集合体の原料となるタンパク質を組み換えDNA技術を用いて製造するために用いるDNAに関する。接着タンパク質をコードするDNAを組み込んだ組み換え体DNAを含む微生物や培養細胞を培養液中で培養し、あるいは生体を飼育して、該培養物中あるいは生体内に蓄積される該タンパク質を採集することにより、得られる該タンパク質は、水中接着剤や吸着剤、自己集合体の原料や細胞培養の基質として広い用途で利用されることが期待される。
【背景技術】
【０００２】
乾燥条件下で強い接着力を示す接着剤は様々な種類のものが開発されている。そのうちの多くのものは一旦乾燥条件下で接着してしまえば湿潤環境におかれてもその強度を維持できる。しかし、湿潤な条件下や水中で接着を開始した場合、有効な強度に達することができる接着剤は存在しなかった。
【０００３】
フジツボは、セメントと呼ばれるタンパク質を主成分とする物質を基盤に分泌して、海水中で強く付着することができる。このタンパク質は難溶解性複合体であるが、その可溶化法が開発され(Kamino, K. et al. J.Biol.Chem.
(2000) 275, 27360-27365)、6種類のタンパク質が構成タンパク質として認識されている。それら6種のタンパク質に関しては、アカフジツボ(Megabalanus rosa) から5種及びタテジマフジツボ(Balanus amphitrite)から2種の計7種の遺伝子についての出願が行われている。各出願においては、便宜上、各遺伝子をそれぞれフジツボ接着タンパク質遺伝子（特許文献１参照）、フジツボ第２接着タンパク質遺伝子（特許文献２参照）、フジツボ第３接着タンパク質遺伝子（特許文献３参照）、フジツボ第４接着タンパク質遺伝子（特許文献４参照）、フジツボ第５接着タンパク質遺伝子（特許文献５参照）、フジツボ第６接着タンパク質遺伝子（特許文献６参照）、フジツボ第７接着タンパク質遺伝子（日本動物学会第７３回大会）と命名している。
【０００４】
水中接着は複数のサブ機能より構成される。例えば、それは、生体内での安定化サブ機能、海水中の基盤上の水分子との置換サブ機能、様々な基盤表層への吸着サブ機能、海水中での自己集合サブ機能、海水中での迅速な機能発現サブ機能、長期間の水解に対する安定化サブ機能、海水中の微生物分解からの安定化機能といったものが挙げられる。各水中接着複合体構成タンパク質は、それらサブ機能をいずれかを担っており、フジツボはそれらサブ機能すべてを満たして水中接着を可能にしているが、各サブ機能自体が有用であり、それぞれに実用化の可能性を有する。一方、フジツボは種によって棲息場所が大きく異なることが知られており、そのため自ずと接着する基盤も異なることとなる。アカフジツボは沖合いで棲息し、プラスティック製のブイや船の船底等に主に付着する。一方本件で扱うシロスジフジツボは沿岸に棲息し、主に岩礁帯で付着する。それぞれの種は接着する基盤に、より適応しており、その水中接着タンパク質もそれらに適した性質を有する。
【特許文献１】特開平7-265081号公報
【特許文献２】特開平9-47288号公報
【特許文献３】特開平9-299089号公報
【特許文献４】特開平10-327867号公報
【特許文献５】特開平11-332572号公報
【特許文献６】特開平11-332573号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、遺伝子工学の手法を用いてシロスジフジツボ水中接着タンパク質遺伝子を生産すべく、その生産のもととなる遺伝子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、シロスジフジツボ水中接着タンパク質の全配列を得るために、シロスジフジツボセメント由来の当該タンパク質を単離、その部分アミノ酸配列をまず決定し、それをもとにシロスジフジツボ水中接着タンパク質をコードするcDNAを単離した。研究の結果、セメントタンパク質より得られたシロスジフジツボ水中接着タンパク質のアミノ末端配列をコードする配列をもつcDNAを単離することに成功し、さらにその塩基配列を決定して本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（３）に関するものである。
（１）以下の(a)〜(c)に示すタンパク質。
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表され、かつ接着性を有するタンパク質
(c)配列番号１記載の塩基配列で表されるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするシロスジフジツボ由来のタンパク質であって、接着性を有するタンパク質
（２）（１）記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（３）（２）記載の遺伝子を含む微生物又は培養細胞を培養し、培養物中又は微生物若しくは培養細胞内に蓄積されるタンパク質を採取することを特徴とする（１）記載のタンパク質の生産方法。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明のタンパク質には、以下の(a)〜(c)に示すタンパク質が含まれる。
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表され、かつ接着性を有するタンパク質
(c)配列番号１記載の塩基配列で表されるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするシロスジフジツボ由来のタンパク質であって、接着性を有するタンパク質
【００１０】
(a)のタンパク質は、シロスジフジツボ由来の接着タンパク質である。このタンパク質は、これまで単離されたいずれの水中接着複合体構成タンパク質とも異なる接着サブ機能を有する新規なフジツボ水中接着複合体構成タンパク質である。相同性検索では、唯一アカフジツボより単離されたフジツボ第３接着タンパク質（特開平9-299089号公報）と124アミノ酸の領域で34％の相同性を示すが、分子量においてはフジツボ第３接着タンパク質が20kDaであるのに対し、本タンパク質は12kDaであり、またこのタンパク質の特徴である電荷が前者で酸性（等電点4.7）であるのに対して、後者では塩基性（等電点8.3）である。その等電点の差は配列内の酸性アミノ酸クラスターが塩基性アミノ酸クラスターに置き換わっていることに起因するもので、このタンパク質の吸着性や自己集合性に大きな影響を与えている。
【００１１】
(b)のタンパク質は、(a)のタンパク質に、接着性を失わせない程度の変異が導入されたタンパク質である。ここでいう「接着性」には、(b)のタンパク質が単独で接着性を発揮する場合だけでなく、他のフジツボ接着タンパク質（前述したフジツボ第１〜第７接着タンパク質など）との組み合わせで接着性を発揮する場合も含まれる。(b)のタンパク質の変異には、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異も含まれる。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic
Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異アミノ酸の数は、接着性を失わせない限り、その個数は制限されないが、通常は、30アミノ酸以内であり、好ましくは20アミノ酸以内であり、更に好ましくは10アミノ酸以内であり、最も好ましくは5アミノ酸以内である。
【００１２】
(c)のタンパク質は、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られるシロスジフジツボ由来の接着タンパク質である。(c)のタンパク質における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」程度であり、好ましくは「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」程度であり、更に好ましくは「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは、配列番号１記載の塩基配列で表されるDNAと通常高い相同性を有する。高い相同性とは、60％以上の相同性、好ましくは75％以上の相同性、更に好ましくは90％以上の相同性を指す。
【００１３】
本発明の遺伝子は以下の手順で得ることができる。まず、シロスジフジツボ水中接着タンパク質を得るために、シロスジフジツボの底殻より分泌されるセメントを集め7Mグアニディン塩酸水溶液等により可溶化される画分を遠心により上清として回収する。この可溶化画分を逆相高速液体クロマトグラフィーによって分離し、該当するフラクションを分取、プロテインシークエンサーによりアミノ末端からのアミノ酸配列を決定する。シロスジフジツボ全組織をチオシアン酸グアニディン等により可溶化し、フェノール／クロロホルムによる抽出を行い、イソプロパノールにより沈殿させることにより全RNAを得ることができる。全RNAを得る方法はこの方法に限定されるものではなく、LiCl沈殿法や塩化セシウム溶液に重層して遠心することによっても得られる。全RNAから、オリゴdTセルロースカラムを用いてポリアデニル酸鎖を有するRNA(ポリA-RNA)を調製する。このポリA-RNAを鋳型として逆転写酵素を用いて２本鎖DNAを調製する。この２本鎖DNAの合成はS1ヌクレアーゼ法やオカヤマーバーグ法により行ないえるが、市販のcDNA合成キットを用いて合成することも可能である。次いで、得られたcDNAを適当なベクターに挿入し、このベクターを適当な宿主に導入して増幅させると共に目的のDNAを持つクローンを選択する。ベクターはλファージ由来の各種ベクターたとえばλgt10やλZapIIなど、あるいはpBR322等のプラスミドベクターを用いることができる。目的クローンの選択には、シロスジフジツボ水中接着タンパク質由来のアミノ酸配列の一部に相当するオリゴヌクレオチドを合成してプローブとして用い、これに強く結合するクローンを選択すればよい。配列の決定はサンガー法やマキサム−ギルバート法等の一般的な方法によって決定できる。以上の手順により翻訳開始コドンから終始コドン、さらにポリアデニル酸鎖付加シグナルを含むセメントタンパク質cDNAの全長を単離することができる。
【００１４】
単離した配列は適当な発現ベクターに挿入し、微生物や培養細胞、あるいは生体に導入して発現させることにより、当該ペプチドを大量調製することが可能である。この際、当該DNAはシグナル部分を含むため、当該ペプチドを宿主細胞外に分泌させることができる。また、シグナル部分を除去して適当なベクターに組み込んで用いることにより細胞内で生産させることも可能である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明はシロスジフジツボ水中接着タンパク質遺伝子を提供する。本発明の遺伝子から作られるタンパク質は、自己集合性や水中吸着性物質として利用が可能であり、また他のフジツボ水中接着タンパク質と組み合わせることで、水中接着物質としての利用も可能である。
【００１６】
ここで「自己集合性」は、微少サイズ（ナノスケール）の構造体を構築する際のキーテクノロジーのひとつである。細胞外で機能するタンパク質複合体には自己集合性が備わっていることが多く、それらの構築原理はナノテクロジーに新たな原理を導入するために有用である。さらにその自己集合体自体、外科治療や再生医療のキー素材であるバイオマテリアルそのものとして応用できる可能性や、化粧品基剤としての応用の可能性をもつ。また、「水中吸着性物質」は、食品接着剤、細胞培養におけるコート剤、創傷修復剤としてや、無機性インプラントなどにおける生体内非特異的細胞汚損防除剤、あるいは細胞特異的吸着剤、タンパク質チップの作製に際してのタンパク質固定化技術、特定の場所に目的のものだけを吸着させるナノテクノロジーのための技術、等の応用の可能性もある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【実施例】
【００１８】
［実施例１］  シロスジフジツボ水中接着タンパク質の部分アミノ酸配列の決定
静岡県清水市で採取したシロスジフジツボの底殻より分泌されるセメントを集め、7Mグアニディン塩酸水溶液に懸濁した。２０００００Xgで１時間遠心し、得られた上清を逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離し、そのタンパク質のN末端アミノ酸配列をプロテインシークエンサーにより決定した。
【００１９】
［実施例２］  シロスジフジツボcDNAライブラリーの作製
静岡県清水市で採取したシロスジフジツボ3個体をチオシアン酸グアニディン、クエン酸ナトリウム、N-ラウリルザルコシン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール等の溶液中で組織を機械的に破砕し、フェノール及びクロロホルムによる抽出を行なって、タンパク質などを除去した後、イソプロパノールを加えて沈殿させることにより全RNAを抽出し、オリゴdTセルロースカラムに導通してポリアデニル酸鎖を有するRNA(ポリA-RNA)を調製した。この操作により約２μgのポリA-RNAが得られた。次にこのポリA-RNAを鋳型として逆転写酵素を用いて２本鎖cDNAを調製した。この操作はアマシャム社のcDNA合成キットを用いて添付のプロトコールに従って行なった。次いで得られた２本鎖DNAにEcoRI−NotI−BamHIアダプターを付加し、ファージベクターλZapIIに挿入した。この操作は、アマシャム社のcDNA合成システムを用いて添付のプロトコールに従って行なった。挿入の完了したファージベクターは同キットに添付のインビトロパッケージング溶液を用いて組み換えDNAをファージ内に封入させた。封入の完了した組み換えファージは、大腸菌XL-I blueに感染させ、増幅した。
【００２０】
［実施例３］  接着タンパク質cDNAを含む組み換えファージの選択
実施例２で得られた組み換えファージを増幅させ、得られた1万個のプラークをナイロンメンブレン  ハイボンドN+(Amersham社)上に固定した。次いでシロスジフジツボのセメントタンパク質N末端配列の一部に相当する下記のオリゴヌクレオチドを合成した。
CAYAARCAYCAYGAYCAYGG（配列番号３）
TGRTTRCAYTCRCARTCNGT（配列番号４）
【００２１】
上記オリゴヌクレオチドをプライマーに、シロスジフジツボcDNAを鋳型にしたPCRでDNAを増幅した。増幅された73bpのDNA断片をランダムプライムキット（Takara社）とα32P-ATPにより標識し、プラークハイブリダイゼーションを行なった。その結果、1万クローンより、プローブと結合する8個のプラークが得られた。EXASSIST system (Stratagene社)を用いてプラスミドベクターを切り出し、これらに挿入されているcDNAの長さをアガロース電気泳動により調べ、最も長い挿入断片を持つものについて配列を決定した。
【００２２】
［実施例４］  接着タンパク質遺伝子の配列決定
実施例３で得られた挿入断片の配列をアプライドバイオシステムズ社製3700-DNA analyzerを用いて配列を決定した。その結果、この挿入断片がシロスジフジツボ水中接着タンパク質の成熟体の全長を含む配列であることが判明した。得られた接着タンパク質遺伝子は配列番号１に示した通り、成熟体のN末端アミノ酸から翻訳終了コドンまで125アミノ酸配列（配列番号２）をコードする全長706 bpの配列である。
【００２３】
なお、このシロスジフジツボ水中接着タンパク質遺伝子を含む微生物は、「Balcp 20k」という名称で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（受託番号：FERM P-19517、受託日：平成15年9月9日）。
【配列表】
2005087106000001.app