(57)【要約】【課題】  細胞内におけるsiRNA種の生物学的効果を明らかにする新規な方法の提供。【解決手段】  本発明は、細胞内に存在する少なくとも1つの遺伝子に対するsiRNAの生物学的効果を調べる方法であって、所定の位置に少なくとも1つのsiRNA種をその上に含む支持体を用意するステップと；アレイ表面で細胞を、その細胞の増殖と、その細胞内へのsiRNAの侵入が可能な条件下でプレート培養するステップと；必要に応じてその細胞を注目の薬剤に曝露するステップと；細胞に対するsiRNAの生物学的効果を検出するステップを含む方法、を提供する。【選択図】      図１
2005087211.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内に存在する少なくとも1つの遺伝子に対するsiRNAの生物学的効果を調べる方法であって、
所定の位置に少なくとも1つのsiRNA種をその上に含む支持体を用意するステップと；
アレイ表面で細胞を、その細胞の増殖と、その細胞内へのsiRNAの侵入が可能な条件下でプレート培養するステップと；
必要に応じてその細胞を注目の薬剤に曝露するステップと；
細胞に対するsiRNAの生物学的効果を検出するステップを含む方法。
【請求項２】
支持体上の所定の位置に存在するsiRNAを、二本鎖のヌクレオチドを酵素で消化させることによって、あるいは化学的合成によって取得する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
二本鎖のヌクレオチドを酵素で消化させる上記操作を、支持体表面の所定の位置で行なう、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
二本鎖の上記ヌクレオチドが、対応する遺伝子の一部または全体をコードする配列に対応するRNAのコピー、あるいは対応する遺伝子のほぼ完全長のmRNAに対応するRNAのコピーである、請求項2または3に記載の方法。
【請求項５】
二本鎖の上記ＲＮＡヌクレオチドが、短鎖ヘアピンRNA（shRNA）である、請求項2または3に記載の方法。
【請求項６】
二本鎖の上記ヌクレオチドが、マイクロRNA（miRNA）である、請求項2または3に記載の方法。
【請求項７】
酵素での上記消化を、ダイサー（ＤＩＣＥＲ）を用いて、あるいはそれ以外のRNaseIIIタイプの酵素を用いて二本鎖RNAヌクレオチドに対して行う、請求項2に記載の方法。
【請求項８】
上記支持体の選択を、培養プレート、マルチウエル・プレート、ガラス、スライドガラス、円板、ビーズからなるグループの中から行なう、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
siRNAのための上記所定の位置が、物理的障壁によって互いに分離されている、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
上記障壁が、チューブまたは化学的障壁である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
siRNAが細胞に及ぼす上記生物学的効果を、細胞分裂、細胞増殖、アポトーシスおよび／または細胞分化に関係した生物学的パラメータを明らかにすることによって調べる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞の特定のタンパク質をウエスタン分析法によって分析する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
特定の位置での酵素の活性を調べる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞の特定の1個以上のmRNAをノーザン分析法によって分析する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
siRNAの生物学的効果を検出する上記ステップが、RT-PCRを実施して、所定の位置に存在するsiRNAの影響を受けた細胞の特定の遺伝子の転写物を定量する操作を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
ある化合物が細胞に及ぼす生物学的効果を検出および／または同定するためである、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
リアルタイム検出法を用いて生物学的効果を定量する、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
表面上の所定の位置にsiRNAを含む支持体を備えるマイクロアレイ。
【請求項１９】
多数のsiRNAが、siRNAをトランスフェクトされた細胞または娘細胞に及ぼす効果をスクリーニングし、特定の遺伝子の発現に関係する生物学的パラメータの変化を調べるため、請求項15に記載のマイクロアレイを備えるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞系における短鎖干渉RNA種の生物学的効果を明らかにする新規な方法に関する。特に本発明では、短鎖干渉RNA種に相当する核酸または短鎖干渉RNA種を生み出す核酸を表面上の所定の位置に含む支持体を使用する。細胞を支持体上で層にすると、短鎖干渉RNA種がその細胞に取り込まれて生物学的効果を及ぼす。細胞内における短鎖干渉RNA種のこの生物学的効果を明らかにする。本発明は、薬または化合物が生物学的プロセスに及ぼす効果に対して短鎖干渉RNAがどのような影響を与えるかの評価にも関する。
【背景技術】
【０００２】
RNA干渉（RNAi）という用語は、dsRNAをセノラブディティス・エレガンス(Caenorhabiditis elegans)という線虫に注入すると、導入したdsRNAと配列が高度に騒動な遺伝子だけがサイレンシング（沈黙化）されるという発見にちなむ造語である（Fire他、Nature、第391巻、1998年、806〜811ページ）。RNAiは、その後、昆虫（KennerdellとCarthew、Cell、第95巻、1998年、1017〜1026ページ）、カエル（Oelgeschlager他、Nature、第405巻、2000年、757〜763ページ）、マウスを含む他の動物（Svoboda他、Developpment、第127巻、2000年、4147〜4156ページ；WiannyとZernicka-Goetz、Nat. Cell Biol.、第2巻、2000年、70〜75ページ）でも観察されており、ヒトにも存在する可能性が大きい。RNAiは、植物における共抑制および真菌における鎮静化（quelling）という転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）メカニズムと密接な関係があり（CogoniとMacino、Curr. Opin. Microbiol.、第2巻、1999年、657〜662ページ；Mourrain他、Cell、第101巻、2000年、533〜542ページ；Smardon他、Curr. Biol.、第10巻、2000年、169〜178ページ）、RNAiメカニズムのいくつかの要素は、共抑制による転写後遺伝子サイレンシングにも必要とされる（Catalanotto他、Nature、第404巻、2000年、245ページ；Dernburg他、Genes & Dev.、第14巻、2000年、1578〜1583ページ；KettingとPlasterk、Nature、第404巻、2000年、296〜298ページ）。この話題については、最近、概説が出されている（Fire、Trends Genet.、第15巻、1999年、358〜363ページ；Sharp、Genes & Dev.、第13巻、1999年、139〜141ページ；Bass、Cell、第101巻、2000年、235〜238ページ；BosherとLabouesse、Nat. Cell Biol.、第2巻、2000年、E31〜E36ページ；PlasterkとKetting、Curr. Opin. Genet. Dev.、第10巻、2000年、562〜567ページ；SijenとKooter、Bioassays、第22巻、2000年、520〜531ページ；Plant Molecular Biology、第43巻、2/3号、2000年）。
【０００３】
RNAiと共抑制の本来の機能は、ゲノムに可動性遺伝子因子（トランスポゾンやウイルス）が侵入しないようにすることらしい。というのも可動性遺伝子因子は、宿主細胞内で活性化したときに異常なRNAすなわちdsRNAを生成させるからである（Jensen他、Nat. Genet.、第21巻、1999年、209〜212ページ；Ketting他、Cell、第99巻、1999年、133〜141ページ；Ratcliff他、Plant Cell、第11巻、1999年、1207〜1216ページ；Tabara他、Cell、第99巻、1999年、123〜132ページ；Makinsky他、Genetics、第156巻、2000年、1147〜1155ページ）。特定のmRNAが分解するとトランスポゾンとウイルスの複製が阻止されるが、いくつかのウイルスは、PTGSを抑制するタンパク質を発現することにより、このプロセスに打ち勝つこと、あるいはこのプロセスを阻止することができる（Anandalakshmi他、Science、第290巻、2000年、142〜144ページ；Lucy他、EMBO J.、第19巻、2000年、1672〜1680ページ；Voinnet他、Cell、第103巻、2000年、153〜167ページ）。
【０００４】
dsRNAは、相同なRNAを特異的に分解するが、そのとき分解されるのは、そのdsRNAと一致する領域内にある部分だけである（Zamore他、Cell、第101巻、2000年、25〜33ページ）。dsRNAは、21〜23塩基からなる複数のRNA断片にされる（Zamore、上記文献）。このような短い断片は、dsRNAをトランスフェクトした後に溶解させたショウジョウバエのシュナイダー2細胞から調製した抽出液の中（Hammond他、Nature、第404巻、2000年、293〜296ページ）、あるいは放射性標識したdsRNAをショウジョウバエの胚に注入した後（Yang他、Curr. Biol.、第10巻、2000年、1191〜1200ページ）、あるいは成虫のセノラブディティス・エレガンス（Parrish他、Mol. Cell、第6巻、2000年、1077〜1087ページ）でも検出された。サイズが似たRNA分子もPTGSを示す植物組織に蓄積する（HamiltonとBaulcombe、Science、第286巻、1999年、950〜952ページ）。21〜23塩基の断片が、標的を認識するためのガイド用RNAになっていることが示唆されている（HamiltonとBaulcombe、Science、第286巻、1999年、950〜952ページ；Hammond他、Nature、第404巻、2000年、293〜296ページ）。このことは、標的mRNAが21〜23塩基の間隔で開裂するという発見によっても裏付けられる（Zamore他、Cell、第101巻、2000年、25〜33ページ）。
【０００５】
ショウジョウバエ・インビトロ系を利用して、塩基21個と22個のRNA断片がRNAiの配列特異的メディエータであることが証明された（Elbashir他、Genes & Dev.、第15巻、2001年、188〜200ページ）。短鎖干渉RNA（siRNA）は、RNaseIIIに似た酵素であるダイサーのプロセシング反応によって長いdsRNAから生じる。3'末端が張り出している化学合成した二本鎖siRNAは、ライセート中で標的RNAを効果的に開裂させる。開裂部位は、ガイドとなるsiRNAがまたぐ（スパンする）領域の中心近くに位置する。Elbashirらは、siRNA-タンパク質複合体がセンス標的RNAとアンチセンス標的RNAのどちらを開裂させうるかをdsRNAのプロセシング方向が決めている証拠を提示している。siRNAは、生成されると、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）の形成を開始させる。複合体内のヘリカーゼがdsRNAをほどき、得られた一本鎖RNA（ssRNA）を、基質を選択するためのガイドとして用いる。ssRNAが標的mRNAと塩基対を形成すると、おそらくその複合体内のヌクレアーゼ活性により、そのmRNAが分解される。
【０００６】
siRNAを生成させる酵素メカニズムは、第2のクラスに属するコードされた小さな内在性RNA分子（マイクロRNA（miRNA）と名づけられている）の産生にも用いられるようである。miRNAは、ヘアピン構造を形成する内在性転写物から生成し、動物における他の遺伝子の翻訳制御を、その遺伝子のメッセンジャーRNAの3'末端に結合することによって行なっていると考えられている（Chi他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第100巻、2003年、6343〜6346ページ）。miRNAは、植物および動物において、発生のタイミングや幹細胞の維持のほか、それ以外の発生プロセスおよび生理学的プロセスを制御するメッセンジャーRNAコード因子の発現を干渉する。miRNAは、特異性決定基またはガイドとして機能する複合体内の負の調節物質であり、タンパク質の合成を抑制する（動物）または標的mRNAの分解を促進する（植物）（CarringtonとAmbros、Science、第301巻、2003年、336〜338ページ）。miRNAの代謝が変化した植物は、多面発現の発生に関する欠陥を有する。シロイヌナズナ(Arabidopsis)では、miRNAは“JAW”であることがわかっており、葉の成長を制御するいくつかのTCP遺伝子のメッセンジャーRNAを開裂させるガイドとして機能することができる（Palatnik他、Nature、2003年、doi:10.1038/nature01958（AOP、オンライン出版：2003年8月20日））。最近、miRNAがマウス胚性幹細胞でも同定された。したがってmiRNAは、多能細胞状態の維持と哺乳動物の初期成長の制御に関して何らかの役割を果たしている可能性がある（Houbaviy他、Dev. Cell、第5巻、2003年、351〜358ページ）。
【０００７】
このように、RNAiは、植物細胞と動物細胞において進化的に保存されたメカニズムであり、siRNAに相同なmRNAの分解を指令しているように思われる。siRNAが哺乳類の細胞で遺伝子サイレンシングを制御する能力を持っていることから、siRNAを利用して遺伝子の機能を高スループットで調べること、あるいはヒトの疾患における遺伝子の発現を調節することを実現できる可能性が大きくなった。
【０００８】
米国特許第6,506,559号には、dsRNAを生きた細胞に導入する方法が開示されている。その目的は、アンチセンス法または三本鎖法によって遺伝子の発現を抑制することにある。RNAの二本鎖領域のヌクレオチド配列と標的遺伝子の一部のヌクレオチド配列が同一であるという意味で、抑制は配列特異的である。
【０００９】
WO 02/44321には、19〜25個のヌクレオチドからなる化学合成されたsiRNA二本鎖が、標的mRNAの開裂を効果的に制御することが開示されている。WO 03/006477には、遺伝子サイレンシングを誘導する別の方法が開示されている。ここには遺伝子工学によるdsRNA前駆体が開示されている。この前駆体は、細胞内で発現したとき、その細胞によって処理されてsiRNAを生成させる。このsiRNAは、その細胞自体のRNAi経路を用い、標的とする遺伝子を選択的に沈黙させる。
【００１０】
US-P 20020173478号とUS-P 20030084471号には、RNAiを哺乳類の細胞（ヒトの細胞と細胞系も含む）に適用できることと、ヒト患者に投与するためのRNAiが開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従来から、細胞内におけるsiRNAの生物学的効果を明らかにすることが必要とされている。また、特定の1個の遺伝子から形成されたどのsiRNAが実際に大きな生物学的効果、または最大の生物学的効果を及ぼすかを明らかにすることも望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明により、多数のsiRNA種が生きた細胞に及ぼす生物学的効果を明らかにするための簡単かつ迅速な方法が提供される。この方法は、多数の遺伝子と多数のsiRNAが細胞内での遺伝子発現に及ぼす効果をスクリーニングするのに非常に適している。その効果は、異なるさまざまなパラメータで測定することができる。
【００１３】
特に本発明により、細胞内に存在する少なくとも1つの遺伝子に対するsiRNAの生物学的効果を調べる方法であって、所定の位置に少なくとも1つのsiRNA種をその上に含む支持体を用意するステップと；アレイ表面で細胞を、その細胞の増殖と、その細胞内へのsiRNAの侵入が可能な条件下でプレート培養するステップと；必要に応じてその細胞を注目の薬剤に曝露するステップと；細胞に対するsiRNAの生物学的効果を検出するステップを含む方法が提供される。
【００１４】
定義
【００１５】
“遺伝子”という用語は、転写されてRNA種（好ましくはmRNA）になった後、ペプチドまたはタンパク質になるゲノムDNAを意味するものとする。
【００１６】
この明細書では、“ヌクレオチド”という用語は、核酸（DNAまたはRNA）の塩基ではなく、その核酸内に存在するヌクレオチドを意味し、その具体例としては、通常の塩基を含むヌクレオチド、または修飾された塩基を含むヌクレオチドが挙げられる。
【００１７】
ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどと記載した場合、ハイブリダイゼーション特性が変化していないという条件で、糖-リン酸骨格が修飾および／または置換された類似種もその中に含まれる。例えば骨格は、ペプチド核酸（PNA）と呼ばれる同等な合成ペプチドで置換することができる。
【００１８】
ダイサー(DICER)は、RNaseIIIドメインを含むエンドリボヌクレアーゼであり、長鎖dsRNAを開裂させてsiRNAにする上で重要な役割を果たす酵素である。ダイサーによって生成したsiRNAは、長さが21〜23塩基で、5'-リン酸末端と3'-ヒドロキシル末端を持ち、3'末端ではジヌクレオチドが張り出している（参考：Bernstein他、Nature、第409巻、2001年、363〜366ページ）。
【００１９】
siRNA（短鎖干渉RNA）という用語は、2本の相補的な鎖の一方においてその少なくとも一部の配列が遺伝子の一部の配列と一致しているような二本鎖RNAに関係している。siRNAという用語には、shRNA（短鎖ヘアピンRNA）とmiRNA（マイクロRNA）も含まれる。
【００２０】
“位置”という用語は、支持体上の1つのスポットを意味するものとする。スポットは、支持体上にあって別の位置とは離れた離散領域として表わされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の主要な特徴は、アレイ形態の支持体上に存在していて、生きた細胞の中にトランスフェクトされた後に細胞調節に影響を及ぼすsiRNAを直接分析してその全体像を得ることにある。本発明では、スクリーニングするsiRNAの数に制限はない。アレイには2〜100個、好ましくは1000個までの特徴を結合させることができるため、テストするsiRNAを細胞培養物の中に入れて提供する。
【００２２】
本発明では支持体を利用する。支持体は、培養プレート、マルチウエル・プレート、ガラス、スライドガラス、円板、ビーズのいずれかの形態にすることが可能であり、この目的で一般に使用されている任意の材料（例えばプラスチック、ガラス、ケイ素、寒天）から準備することができる。支持体は、存在している生きた細胞と適合する材料でできている必要がある。そのため、その材料を外部分子でコーティングする場合がある。プラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリメタクリル酸メチル、細胞が付着できるように処理した他のポリマーなど）でできた支持体が好ましい。支持体は、親水性の三次元構造を有するプラスチック製支持体であること、あるいはそのような構造を有する基質で覆われていることが好ましい。好ましい一実施態様によれば、支持体にグラフトしたデキストランまたはポリエチレングリコールポリマーが存在している。別の実施態様では、親水性タンパク質（例えばゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン）を用いて支持体をコーティングする。
【００２３】
支持体上の所定の各位置に異なるsiRNA種を配置する。
【００２４】
原則として、これは、支持体そのものにsiRNA種のスポットを形成することによって、あるいは支持体上に、その後の段階でsiRNAを合成する際の原料になる分子のスポットを形成することによって実現できる。
【００２５】
第1の実施態様によれば、まず最初に、mRNAの完全長配列、またはそのコード部の配列、または調べようとする特定の遺伝子のコード部の一部の配列を含む二本鎖RNAを作ることによってさまざまなsiRNAを合成した後、支持体上にそれらsiRNAのスポットを形成する。
【００２６】
二本鎖RNAを得るためには、例えば、T7プロモータ配列を含むプライマーとT7ポリメラーゼを用いたPCRにより遺伝子を増幅した後、2本の鎖を転写する。次に、RNAの2本の鎖を溶液中でアニールし、最初の遺伝子に対応する配列を有する二本鎖RNAを形成する（参考：図1）。
【００２７】
例えば上記のようにして得られたdsRNAから出発し、開裂用のダイサー酵素を用いた消化により、siRNAを得ることができる。dsRNAの開裂は、再構成されたRNaseIIIを用いて、あるいは、dsRNAからsiRNA種をやはり形成するそれ以外の酵素を用いて実現することもできる。
【００２８】
DNAレベルであれRNAレベルであれ、遺伝子配列全体を利用してsiRNAを得る場合には、スポットにするsiRNA種／siRNAプールは、最初の遺伝子配列に由来するさまざまなsiRNA分子のすべてを含むことになろう。したがって1つのスポットは、生成したsiRNAプールに含まれる1個以上のsiRNA分子の効果に関する情報を与えることになる。
【００２９】
しかし遺伝子の一部だけを利用してsiRNAを得る場合には、その遺伝子の特定の一部に由来するsiRNA種／siRNAプールが生物学的効果に対してより大きな影響を与えるかより小さな影響を与えるかを評価することができる。このような場合には、遺伝子配列の異なる部分から形成した異なるsiRNAが細胞に及ぼす影響を分析するため、位置／スポットをいくつか利用するとよい。これらの位置のうちの1つに対する生物学的効果が明らかになると、この遺伝子に由来するsiRNA種の効果に関する証拠が得られることになる。そのような特定の位置で生じる効果は、生成したsiRNAの元になった部分の配列に関する情報も与えることになる。したがって本発明は、生成したsiRNAの元になった遺伝子の1つ以上の特定の部分を明らかにするのにも非常に適している。
【００３０】
次に、異なる遺伝子または遺伝子の異なる部分に由来するこのようにして得られたさまざまなsiRNA種をスポットにして支持体表面の所定の位置に載せ、アレイを形成する。
【００３１】
siRNAは、ロボット式のマイクロアレイ形成装置を利用して堆積させることができる。siRNAを含む液体を、接触または非接触のスポット形成（Spotting：点着）プロセスにより、表面上に堆積させる。本発明では液体堆積プロセスによってマイクロアレイを形成しているが、液体スポットを表面に形成する別のさまざまな方法が、D. BowtellとJ. Sambrookの手引き書（『DNAマイクロアレイ』、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、2003年）に記載されている。広い面積を有する個々の位置をカバーする必要がある場合、あるいは表面が物理的または化学的に分かれた複数の位置に分割されている場合には、液体をピペットで表面に堆積させることもできる。
【００３２】
別の実施態様によると、異なるsiRNAを支持体／アレイそのものの所定の位置で調製する。そのためには、まず最初に、出発材料である核酸（例えば上記のdsRNA）を支持体の表面に付着させ、次いでその核酸を上記のように酵素で分解することにより、効果を明らかにしようとするsiRNAを生成させるとよい。したがって支持体上の異なる位置には、異なる特異的二本鎖RNAが含まれる。RNAを例えば支持体の表面に付着させるダイサーで消化させ、所定の時間にわたってインキュベートすることにより、対応するsiRNAを、個々の位置に対して特異的な二本鎖RNAから得る。
【００３３】
さらに別の実施態様によると、1個の遺伝子に対して特異的なsiRNAを化学的に合成して支持体上の個々の特別な位置に堆積させることもできる。
【００３４】
さらに別の実施態様によると、siLentGene法（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州、アメリカ合衆国）に従って試験管内で転写を行なうことにより、 3'末端部に2塩基が張り出した短い（21〜23塩基の）siRNAを作ることができる。PCR増幅の後に、1つの遺伝子配列を、遺伝子工学によるU6プロモータとターミネータに付着させるとよい。このような設計により、組み換えによる3'付加部を有する正確なセンスRNAとアンチセンスRNAの転写が可能になる。次に、2本の鎖をアニールして二本鎖RNAの鎖を形成する。ターミネータは、複数のウリジンがつながった短い鎖である。これは、3'末端部に2個のウリジンが張り出して終結している元のsiRNAとの適合性がある（Farell他、Cell、第11巻、1977年、187〜200ページ）。
【００３５】
別の実施態様では、短鎖ヘアピンRNA（shRNA）を処理することによってsiRNAが得られる。shRNAは、pGE-1 shRNA哺乳類発現ベクター（ストラタジーン社、ラ・フォヤ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を用いて作製することができる。shRNAは、ループ配列によって隔てられたセンス鎖とアンチセンス鎖からなるRNA転写物から生成する。RNA転写物は、折り畳まれてヘアピンを形成する。哺乳類の細胞中にshRNAを生成させるため、pGE-1発現ベクターではRNAポリメラーゼIIIプロモータであるヒトU6プロモータを用いる。U6プロモータは比較的短く、ターミネータ配列として短いポリUが用いられている。
【００３６】
別の方法として、アンプリスクライブT7-フラッシュトランスクリプション（エピセンター社、マディソン、ウィスコンシン州、アメリカ合衆国）による方法に従ってshRNAを生成させることもできる。87塩基からなる相補的な2つのDNAオリゴヌクレオチドを合成し、shRNAを生成させるための試験管内転写用鋳型にする。第1のオリゴヌクレオチドは、T7 RNAポリメラーゼ・プロモータ配列のあとに、標的メッセンジャーRNAと相補的な29塩基の配列と、8塩基の非相補的配列（ヘアピン）と、29塩基からなる前記配列の相補配列とを備えている。第2のオリゴヌクレオチドは、第1のオリゴヌクレオチドと相補的である。これら2つのオリゴヌクレオチドは、5分間にわたって95℃に加熱し、65℃で10分間にわたってアニールし、次いで37℃で10分間にわたってアニールすることによって変性する。試験管内で30分間にわたって転写を行なわせると、66塩基のshRNAが得られる。それをDNaseIで処理し、フェノール：クロロホルムで抽出する。
【００３７】
支持体上の異なる位置は障壁によって互いに分離することが好ましい。障壁は、物理的障壁であっても化学的障壁であってもよい。物理的障壁の具体例はウエルである。例えば支持体をウエルの数が96個、384個、1536個のマルチウエル・プレートにして互いに分離された複数の位置を形成し、その個々の位置にshRNAのスポットを形成するとよい。384ウエルのプレートと1536ウエルのプレートは、細胞をベースとしたアッセイ用であり、BDファルコン社（メルク・ユーロラブ社、ルーフェン、ベルギー国）またはヌンクA/S社（ロスキレ、デンマーク国）から入手することができる。6144フォーマットのマイクロタイタープレートは、パラレル・シンセシス・テクノロジーズ社（PSTI社、メンロ・パーク、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）から入手することができる。他の物理的障壁はチューブである。例えば96本、384本、1536本のチューブ、さらには6144本のチューブを支持体の表面に載せる。チューブはウエルと似た形式であるが底面が平坦ではないため、支持体の表面に載せるときに互いに隔離された位置が生まれる。化学的障壁の一例は、例えばDNAマイクロアレイが有効であることを記載してあるデンマーク国特許第0019949735A1に記載されている。この特許では、疎水性表面に区画された複数の領域を設け、親水性アンカーを用いて、さまざまな生体分子を含む溶液の正確な位置と範囲を決める。
【００３８】
支持体の上にRNAを固定した後、その表面を注意深く洗浄し、細胞をその上に置く。調べる細胞としては、既知の任意のタイプの細胞が可能であり、例えば、胚性幹細胞、心筋細胞、内皮細胞、感覚ニューロン、運動ニューロン、CNSニューロン、星状細胞、グリア細胞、シュワン細胞、マスト細胞、好酸球、平滑筋細胞、骨格筋細胞、周皮細胞、リンパ細胞、腫瘍細胞、単球、マクロファージ、泡状マクロファージ、メラノサイト、顆粒球、ケラチノサイト、滑膜細胞、線維芽細胞、上皮細胞などが挙げられる。
【００３９】
細胞は、支持体上で増殖および／または成長および／または伝播することが可能な媒体内に保持することが好ましい。さらに、この媒体は、多数のsiRNAを細胞内に組み込むことを可能にするもの、それどころか組み込むことを容易にするものでなくてはならない。適切な媒体の具体例は、カチオン性リポソームをベースとした試薬と、ポリアミンをベースとした試薬である。試薬とその試薬を使用する条件は、細胞のタイプと、トランスフェクトする分子のタイプに合わせて選択する。プラスミドDNAのデリバリーを最適にする試薬は、siRNAのデリバリーにとって最適なものではない。アンビオン社（オースチン、テキサス州、アメリカ合衆国）のsiPortアミン（ポリアミン混合物）トランスフェクション剤またはsiPort脂質（カチオンと中性脂質の混合物）トランスフェクション剤は、siRNAを多彩な哺乳類の培養細胞に導入する際に選択されるトランスフェクション剤である。タイプの異なるいろいろな細胞に対して一方または他方のトランスフェクション剤を優先的に用いてトランスフェクトする。どちらのトランスフェクション剤も毒性が小さいため、化学的合成または試験管内の転写によって生成した個々のsiRNAを導入するのにも、長いdsRNAをRNaseIIIまたはダイサー（ダイサーのほうが好ましい）で消化させることによって得られたsiRNAの集団を導入するのにも理想的な媒体である。
【００４０】
培養時間（例えば3〜6時間）が経過した後、トランスフェクション剤を培養物に添加し、細胞をさらに3〜6時間にわたって培養すると、siRNA分子が細胞の中に入る。
【００４１】
トランスフェクションの効率は、細胞の性質、細胞の培養密度、トランスフェクトされる材料によって異なる。siRNAは、カチオン性リポソーム、またはポリアミンをベースとした分子を用いてトランスフェクトすることが好ましい（Dometerco他、J. Clin. Endocrinol. metab.、第87巻、2002年、3475〜3485ページ；Harbort他、J. Cell Science、第114巻、2001年、4557〜4565ページ）。
【００４２】
次に、細胞の増殖が可能な条件下で、支持体上での細胞の培養を、siRNAが生物学的効果を及ぼすのに十分な時間にわたって行なう。時間は、例えば約6〜72時間であるが、12〜48時間であることが好ましく、12〜24時間であることがより好ましい。この出願における増殖とは、少なくとも細胞の活性が持続することを意味する。したがって、細胞が成長または増殖する必要はなく、siRNAの生物学的効果をあるレベルで（すなわちRNAレベルまたはタンパク質レベルで、場合によっては表現型のレベルで）観察できさえすればよい。
【００４３】
インキュベーション後、細胞を調べて注目の生物学的効果（例えば細胞分裂、増殖、アポトーシス、細胞分化に関する効果）を明らかにする。原則として、このステップは、表現型レベル、タンパク質レベル、RNAレベルで行なうとよい。そのための方法としては、免疫標識、RT-PCR、ノーザン分析、ウエスタン分析、酵素活性、DNAプローブ標識（FISH）、遺伝子発現マイクロアレイ分析などの方法があるが、ここに挙げたものに限定されるわけではない。
【００４４】
好ましい一実施態様によると、siRNAの位置で培養してsiRNAに曝露した細胞を除去し、特定の遺伝子についてのmRNAのレベル低下を、その位置のsiRNAが生み出される元になった特定の遺伝子に対して特異的なプライマーを用いたリアルタイムRT-PCRによって明らかにする。別の方法として、溶解溶液を特定の位置の限定された領域に導入して細胞抽出液を取得し、その細胞抽出液を分析することもできる。SiRNAが存在するある1つの位置の特定の遺伝子のレベルを、siRNAのない他の対照位置と比べると、この位置に存在するsiRNAの効率がわかる。
【００４５】
次に、生物学的効果が変化した細胞が含まれる位置を明らかにし、siRNAが生み出される元になった遺伝子と関係づける。次に、この遺伝子に関係するsiRNAと生物学的効果を関係づける。また、siRNAが生み出される元になった遺伝子の転写および／または翻訳は、他の遺伝子にも影響を及ぼす可能性があり、本発明ではそれを明らかにすることができる。一般に、注目の遺伝子が抑制されると別の遺伝子のmRNAの量が増加および／または減少し、生物学的な表現型に対する効果につながる可能性がある。したがって本発明により、細胞活動のネットワークと、1つの遺伝子の転写が別の遺伝子に及ぼす影響を調べることができる。同様のことが、細胞を化学物質（例えば潜在的な薬）と接触させた後にsiRNAをトランスフェクトする場合にもあてはまる。この場合には、化合物が細胞に及ぼす効果に対してsiRNAが与える影響を明らかにすることができる。
【００４６】
本発明の方法は、特定の遺伝子の配列の異なる部分に対応するさまざまなsiRNAをスクリーニングするのに非常に適している。そのためこの方法は、最大の効果をもたらす特定の1つの遺伝子からのさまざまなsiRNAを同定する1つの手段となる。
【００４７】
本発明により、多数の遺伝子について考えられる多重トランスフェクションでの、多重RNAiによる細胞のトランスフェクション、RNAiの影響を受けた遺伝子を有するまたは特定のRNAiを有する細胞の挙動と生物学的効果との関係の同定のための新規な方法も提供される。
【００４８】
一実施態様では、トランスフェクションに関する正の対照もアレイに含まれている。対照としては、検出可能な任意のタンパク質をコードするDNA配列が可能である。このタンパク質は例えば酵素であり、グリーン蛍光タンパク質（GFT）であることが好ましい。GFTを用いると、トランスフェクトされたことを蛍光測定によって容易に検出できる。
【００４９】
診断および／または定量を行なうキットの一部として、この明細書に記載した方法と支持体／マイクロアレイを利用することができる。このキットは、支持体上に存在するsiRNAを分析するための手段および媒体と、生きた細胞にsiRNAをトランスフェクトするのに必要な試薬および溶液とを備え、必要に応じてさらに、細胞に対するsiRNAの生物学的効果を明らかにするツールを備えている。
【００５０】
本発明により、多数のsiRNAが、本発明に従ってsiRNAをトランスフェクトされた細胞または娘細胞に及ぼす効果をスクリーニングし、特定の遺伝子の発現に関係する生物学的パラメータの変化を調べるためのキットも提供される。
【００５１】
本発明により、ある化合物の、siRNAのトランスフェクトされた生細胞における特定の遺伝子の発現に与える効果をスクリーニングするためキットも提供する。このキットは、標的遺伝子と同じ配列または相補的な配列を有するsiRNAが付着した固体支持体を備える。
【００５２】
以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明がこの実施例に限定されることはない。
【実施例】
【００５３】
ある1つの遺伝子に関係するsiRNAの調製
【００５４】
T7リボマックス発現RNAi系（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州、アメリカ合衆国）を用いてdsRNAを調製した。
【００５５】
クローニングした遺伝子を特異的プライマーを用いて増幅した。プライマーの1つは、5'-TAATACGACTCACTATAGGN-3'（プライマー）（配列番号１）というタイプのT7プロモータを含んでいた。2つのクローンを用いた。一方はオルニチンデカルボキシラーゼ1（ODC）をコードしており、他方はbcl-2をコードしている。特異的プライマーは以下のものであった。
ODCに関しては、
5'-AGAGGAACAGGATGCCAGC-3'（配列番号２）と、
5'-TTAAAAACAGGTCACAACACTAA-3'（配列番号３）、
bcl-2に関しては、
5'-AGCACAGAAGATGGGAACAC-3'（配列番号４）と、
5'-CAGCCACCTCTTAAAAGTATC-3'（配列番号５）である。  
【００５６】
得られたアンプリコンは、1本の鎖にT7プロモータを含んでいた。そのためこの鎖を転写することができる。転写は、リボマックス・エクスプレスを用い、製造者の指示に従ってT7配列を含む鎖のそれぞれをトランスクリプターゼとともにインキュベートすることによって行なった。反応は、37℃で30分間にわたって行なわせた。転写後、RNaseなしの状態でDNaseを用いて消化させることによってDNA鋳型を除去する。2本のRNA鎖のアニールは、同じ濃度、同じ体積の2本のRNA鎖を70℃にて10分間にわたってインキュベートすることによって実現した。次に、一本鎖RNAを消化するRNaseとともにインキュベートすることにより、一本鎖RNAを除去した。次に、二本鎖DNAを冷たいエタノール（-70℃）の中で沈殿させて精製し、アンビオン社（オースチン、テキサス州、アメリカ合衆国）のサイレンサー／siRNAカクテル・キットを含む消化用溶液中で遠心分離した後に回収した。次に、RNA1マイクログラムにつき1UのRNaseを用いて37℃にて1時間インキュベートすることにより、二本鎖DNAを消化させた。1時間消化させた後、二本鎖DNAを30塩基よりも短い小さな断片にした。過半数は12〜15塩基の断片であった。
【００５７】
製造者による実験プロトコルを利用し、siRNAを96ウエル・プレートのウエルに移し、CHO細胞を、アンビオン社（オースチン、テキサス州、アメリカ合衆国）のsiPortアミン・トランスフェクション剤を含むウエルに移した。トランスフェクション剤はプレートの表面積1cm2につき3μlの濃度、細胞は1cm2につき105個の密度にした。
【００５８】
2日後、細胞のmRNAを回収し、2つの遺伝子の発現レベルを、2つのmRNAに特異的なプライマーを用いてリアルタイムPCRで調べた。
【００５９】
Bcl-2をコードしているmRNAのレベルが、Bcl-2配列に対して特異的なsiRNAを含むウエルにてトランスフェクトされた細胞において低下していることを明らかにできた。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】異なる複数の遺伝子配列に由来するsiRNAが生きた細胞に及ぼす効果のスクリーニング法に関する一実施態様である。ダイサー酵素を用いて長い二本鎖RNAを消化させることによってsiRNAを生成させ、放出された断片をアレイ上に固定化した後、細胞内にトランスフェクトし、求める効果に関するシグナルを検出した。
【図２】異なる遺伝子配列に由来するsiRNAが生きた細胞に及ぼす効果のスクリーニング法に関する一実施態様である。dsRNAを支持体上に固定化した後、ダイサー酵素を用いてそのdsRNAを消化させ、細胞内にトランスフェクトした。
【図３】多数のsiRNAが生きた細胞に及ぼす効果のスクリーニング法に関する一実施態様である。化学的合成によってsiRNAを作製してアレイ上に固定化した後、そのsiRNAを細胞内にトランスフェクトした。
【図４】特定の1個の遺伝子配列の異なる部分に対応する複数のsiRNAに関するスクリーニング法についての一実施態様である。化学的合成によってsiRNAを作製して個々のsiRNAをアレイ上の異なる位置に固定化した後、そのsiRNAを細胞内にトランスフェクトした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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