(57)【要約】【課題】  本発明は、孵化率が高く、必要な時機に安定してワムシを提供することが可能な高孵化率耐久卵の生産方法を提供することにある。【解決手段】  本発明の高孵化率ワムシ耐久卵の生産方法は、耐久卵孵化後のワムシを、孵化から孵化後24時間までの間において、飢餓処理を行ない、前記飢餓処理後のワムシを培養することによって得ることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
耐久卵孵化後のワムシを、孵化から孵化後24時間までの間において、飢餓処理を行ない、前記飢餓処理後のワムシを培養することによって得ることを特徴とする高孵化率ワムシ耐久卵の生産方法。
【請求項２】
孵化から孵化後12時間の間、飢餓処理を行なう請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記飢餓処理後のワムシの培養において、培養開始時のワムシの密度が、２０個体/ml未満である請求項１又は2項に記載の方法。
【請求項４】
培養の飼育水が、5〜20pptの海水である請求項１〜3項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記培養を、連続培養により行なう請求項１〜4項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記連続培養において、植物プランクトンを用いて連続給餌を行なう請求項5記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高孵化率ワムシ耐久卵の生産方法であって、特に、飢餓処理を利用した高孵化率ワムシ耐久卵の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
汽水性動物プランクトンのシオミズツボワムシ Brachionus plicatilis （以下ワムシと省略）は、産業的にも高い利用価値がある。というのは、近年では、ワムシが、種苗生産の現場で初期餌料生物として使用されているからである。
【０００３】
海産魚介類の種苗生産では、消化管の未発達な仔魚を配合飼料で飼育することができず、餌料生物の給餌が不可欠である。単性生殖により爆発的増殖をするワムシの海水馴致成功により（伊藤 1960）、仔魚飼育に必要な量の餌料生物を得ることが可能となった。現在多くの海産魚介類の種苗生産過程で、ワムシが餌料生物として用いられている（Fukusho 1983, Lubzens 1987）。従来、餌料生物としてのワムシ培養は、自家培養したNannochloropsis oculataを餌料としていた。そのため、微細藻類の培養、ワムシの培養、そして仔魚の飼育を同時に行うという労力とコストのかかる状態だった。その後、ワムシの餌料としてのパン酵母導入（平田1967）や濃縮淡水クロレラの商品化（Maruyama & Hirayama 1993）により、労力が大幅に軽減された。近年、さらなる労力削減と省スペース化、ワムシの安定供給のためのワムシ大量培養法が研究されている。
【０００４】
例えば、間引き法（Hirata 1980, Mitchell 1986, Navarro & Yufera 1998）、高密度培養法（James & Abu-rezeq 1989a, 吉村ら 1992, 1994, Yoshimura et al. 1997）、循環濾過式培養（Suantika et al. 2000, 2001）、連続培養法（Boraas 1983, Fu et al. 1997, James & Abu-rezeq 1989b,c）などが挙げられる。その中でも連続培養法は種苗生産現場において多くの利点がある。まず、労力、人件費、スペースを削減でき、活性の高いワムシを安定して得ることができる。本培養法は、基本的に装置の監視と餌料槽への餌供給のみを行えば良いため、ワムシ培養の経験がない人であっても種苗生産に必要量のワムシを培養できること（日野 1998）も魅力的なことである。また、連続培養により得られたワムシを高密度で宅配輸送し、種苗生産現場でのワムシ培養を不要にする試みも行われている（桑田 2001）。さらに、種苗生産現場でのワムシ培養の労力削減のために、耐久卵を利用する手法も研究されている。
【０００５】
ここで、ワムシの生活史を紹介すると、ワムシは、単性世代と両性世代からなる生活史を有する。単性世代では、雌個体（核相2n）が単独で雌卵を形成し、雌個体を産出する複相単性生殖が行われる。両性世代は、単性生殖雌個体から減数分裂を行う両性生殖雌個体（以下mictic female）が生じることで始まる。両性生殖では、mictic female による雄（核相n）の産出、雄と出生間もないmictic femaleとの交尾を経て耐久卵形成が行われる（Hagiwara et al. 1988）。耐久卵は外部環境の変化に強く、ワムシ類にとって適した環境になるまで休眠状態にある。天然水域では、種に固有な個体群増殖に適した水温以外の季節にワムシ類が観察されることはなく、耐久卵の状態で底泥中に存在する（Herzig 1987, 小倉ら 1982, Sudzuki et al. 1983, 1989）。季節が変わり、環境が好転することにより耐久卵から孵化したワムシ類は、単性生殖により爆発的増殖を行う。この個体群増殖が活発な時、環境の悪化に備え両性生殖を行い、耐久卵を形成する（Carmona 1995, King & Snell 1980）。これまでワムシ個体群の生殖に関わる環境要因が、多くの研究者によって研究されてきた。例えば、水温や餌、塩分がワムシの寿命や生殖に与える影響などである（Korstad et al. 1989, Lubzens et al. 1985, Snell 1986）。
【０００６】
ワムシは、耐久卵は外部環境の変化に対して強い耐久性を示し、環境条件の調節のもとに長期保存することが可能である。そのため、種苗生産の現場では、仔魚飼育の閑期にワムシを耐久卵として保存しておき、必要なときに必要量のワムシが確保できるような「タネ」として用いるなどの利用価値がある（Hagiwara et al. 1997, 萩原 1996）。これまで耐久卵形成への温度の影響（Hino & Hirano 1984）、餌料種の影響（Hamada et al. 1993）、耐久卵量産の試み（Hagiwara & Lee 1991, Hagiwara et al. 1993）や、耐久卵量産を効率化させるための間引き法導入（Balompapueng et al. 1997：Balompapueng M D, Hagiwara A, Nishi A, Imaizumi K, Hirayama K.  Resting egg formation of the rotifer Brachionus plicatilis using a semi-continuous culture method. Fisheries Science 1997; 63: 236-241.）、水温調節の手法（今村ら 1979, Kogane et al. 1997）が研究されてきた。
【０００７】
耐久卵量産のために、両性生殖の第一段階であるmictic female を多く出現させる環境要因についても研究されてきた。mictic female の出現に大きく影響を与える環境要因として、温度と塩分が検討されてきた（Hagiwara et al. 1988, 1989, Hino & Hirano 1984, 1988, Lubzens et al. 1985）。また、世代の累積や高密度下でmictic female の出現率が高くなることも知られている（Hino & Hirano 1977, 日野 1981）。
【０００８】
耐久卵をワムシ培養のタネとして用いる際、幹母虫の経験する環境は、ワムシ個体群の生殖様式へ大きな影響を与えることが多分に考えられる。そこで、これを明らかにすることで、人為的に両性生殖や単性生殖を活発にすることが可能となり、耐久卵量産やワムシ大量培養などへの応用も可能である。
【（非）特許文献１】
【０００９】
Balompapueng M D, Hagiwara A, Nishi A, Imaizumi K, Hirayama K.  Resting egg formation of the rotifer Brachionus plicatilis using a semi-continuous culture method. Fisheries Science 1997; 63: 236-241。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、ワムシの耐久卵に対する研究は盛んになっているといっても、天然水域の個体群の元になる耐久卵孵化ワムシ（幹母虫）の餌料環境が、ワムシ個体群の生殖様式へ与える影響についてはほとんど知見がない（Snell & Boyer 1988）。
【００１１】
ワムシの耐久卵に対する研究によって、高い孵化率で耐久卵を提供することができれば、その後の種苗生産に対しても安定してワムシを供給することができ、ひいては、種苗生産を予定通り進めることが可能であり、水産業へ貴重な財産となる。しかし、これまで、高い孵化率でワムシ耐久卵を供給する方法について殆ど知られていない。
【００１２】
そこで、本発明は、孵化率が高く、必要な時機に安定してワムシを提供することが可能な高孵化率耐久卵の生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するために、発明者らは、ワムシ個体群の元である幹母虫に対する処理について鋭意調査研究した結果、本発明の高孵化率耐久卵の生産方法を見出すに至った。
【００１４】
本発明の高孵化率耐久卵の生産方法は、耐久卵孵化後のワムシを、孵化から孵化後24時間までの間において、飢餓処理を行ない、前記飢餓処理後のワムシを培養することによって得ることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明の高孵化率耐久卵の生産方法の好ましい実施態様において、孵化から孵化後12時間の間、飢餓処理を行なうことを特徴とする。
【００１６】
また、本発明の高孵化率耐久卵の生産方法の好ましい実施態様において、前記飢餓処理後のワムシの培養において、培養開始時のワムシの密度が、２０個体/ml未満であることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明の高孵化率耐久卵の生産方法の好ましい実施態様において、培養の飼育水が、10〜20pptの海水であることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明の高孵化率耐久卵の生産方法の好ましい実施態様において、前記培養を、連続培養により行なうことを特徴とする。
また、本発明の高孵化率耐久卵の生産方法の好ましい実施態様において、前記連続培養において、植物プランクトンを用いて連続給餌を行なうことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、高い孵化率のワムシ耐久卵を提供することができ、必要な時機に安定してワムシを提供することができるという有利な効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の高孵化率耐久卵の生産方法は、耐久卵孵化後のワムシを、孵化から孵化後24時間までの間において、飢餓処理を行ない、前記飢餓処理後のワムシを培養することによって得る。
【００２１】
耐久卵孵化後のワムシを用いたのは、耐久卵孵化ワムシと、単性生殖孵化ワムシとでは、餌料環境が両性生殖様式へ与える影響が異なり、耐久卵孵化ワムシの方が、劣悪な餌料環境により両性生殖が活発化し、ひいては、良質の耐久卵を生産する幹母虫を得ることができるからである。
【００２２】
飢餓処理の条件については、耐久卵孵化後のワムシを、孵化から孵化後24時間までの間で飢餓処理を行なうことができる。飢餓処理は、幹母虫に劣悪な餌料環境を与えるための処理であり、当該処理によって高孵化率耐久卵を得ることが可能であれば、特に限定されない。例えば、一定期間、給餌を停止してもよく、また、餌の量を極めて少量にして劣悪環境に設定しても良い。飢餓処理の時間は、好ましくは、耐久卵孵化後24時間の間において行ない、高孵化率耐久卵の生産量が高いという観点から、より好ましくは、孵化から孵化後12時間の間、飢餓処理を行なう。
【００２３】
次に、飢餓処理後の培養条件について説明すると、飢餓処理後の培養は特に限定されず、常法を適宜使用して行なうことができる。
【００２４】
ここで、まず、ワムシの生活環を説明すると、生活環には、単性生殖型又は両性生殖型による場合の2種類が存在する。雌のワムシには、単性生殖を行って個体群の増殖をもたらすタイプと、生殖細胞に減数分裂を起こして両性生殖を行うタイプとがあり、前者が単性生殖型であり、後者が両性生殖型である。これらのタイプが一つの個体群を形成している。単性生殖型では、雄無しに増殖する。両性生殖型では、交尾して受精することにより耐久卵や休眠卵と呼ばれる受精卵を形成する。
【００２５】
したがって、休眠卵、耐久卵と呼ばれる受精卵は、両性生殖を通じて形成されるため、両性生殖の誘導は、耐久卵を形成するための第一段階とも言うべきものである。耐久卵の形成過程は、（1）両性生殖型の雌の産出、（2）雄の産出、（3）雄と出生後間もない雌との交尾、（4）受精、及び（5）耐久卵の形成、という複数の段階からなる。
【００２６】
また、培養開始時のワムシの密度は、なるべく低くすることが望ましい。好ましくは、20個体／ml以下とする。培養開始時のワムシの密度を低く設定することにより、培養後の増殖時に活発な両性生殖誘導を引き起こすことができるからである。より好ましくは、培養開始時のワムシの密度が、１〜５個体/mlである。
【００２７】
培養に用いる飼育水に関しても、特に限定されず、常法の飼育水を用いることができる。例えば、活発な両性生殖の発現という観点から、培養の飼育水としては、10〜20pptの海水が好ましい。
【００２８】
また、培養方法は、バッチ式、連続式を問わないが、より孵化率が高い耐久卵を得ることができるという観点から、連続培養により行なうことが好ましい。連続培養法とは、培養槽に連続注水、連続給餌を行い、連続的にワムシを収穫する方法である。連続培養法についても、特に限定されず、常法を本発明に適用することができる。連続給餌については、餌が水中から消失することがないように留意する。また、餌は良質の餌(フレッシュな培養したての植物プランクトン)が好ましい。連続給餌に用いる餌として、植物プランクトン、パン酵母、その他の非生物餌料を挙げることができるが、ワムシの増殖率向上、又は耐久卵の生産向上等の観点から、植物プランクトンが好ましい。
【００２９】
なお、ワムシ耐久卵の採取についても、特に限定されず常法を用いることができる。例えば、飼育水から約30μmのプランクトンネットを通じてろ過し、耐久卵を採取することができる。
【００３０】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される意図ではない。
【実施例１】
【００３１】
これまで餌料等の環境要因がワムシの両性生殖へ与える影響について調べられてきたが（Snell 1986, Snell & Hoff 1985）、これらはワムシ個体群への影響を見たものであった。休眠状態にあった耐久卵から孵化した幹母虫と、ワムシ個体群を形成する単性生殖卵からの孵化ワムシが、環境要因に対して同じ性質を示すとは考えにくい。そこで、耐久卵と単性生殖卵から孵化したワムシの餌料環境が、それぞれの両性生殖の発現に与える影響について調べた。
【００３２】
＜材料と方法＞
実験には、比較的高い頻度で両性生殖を誘導する B. plicatilis ロシア株を用いた。N. oculata を餌に用い、水温25℃、海水を蒸留水で希釈して滅菌濾過した飼育水（塩分18 ppt ）でワムシをクローン培養し、耐久卵を形成させた。N. oculata は、Erd-Schreiber 改変培養液（Table II-1）で通気培養したものを用いた。この耐久卵を2週間以上、水温25℃、光周期0 L : 24 D下で保存した。その後、耐久卵に光を照射して孵化させた幹母虫群を実験材料とした。
【００３３】
＜統計解析＞
本実施例で行った統計解析（χ2検定、分散分析、t - test 、生存分析）には、すべてStat View（SAS Institute Inc 製）を用いた。
【００３４】
＜幹母虫と単性生殖卵孵化ワムシの餌料環境が両性生殖に与える影響＞
幹母虫に対し、耐久卵孵化直後から0時間及び12時間の飢餓処理を行ったもの（耐久卵0 h区、耐久卵12 h区）をそれぞれ6個体ずつ用意した。次に、ワムシ個体群の中から無作為に単性生殖卵を携卵したワムシを取り出し、それらの携卵ワムシから孵化したワムシに対し、孵化後0時間及び12時間の飢餓処理を施した（単性生殖卵0 h区、単性生殖卵12 h区）。これを幹母虫と同様に6個体ずつ用いた。各処理区とも飢餓処理後にはN. oculata を給餌した。4区のワムシ各々6個体、計24個体を、第10世代まで以下の方法で継代培養した。
継代培養では、まず、容量0.3 mlのガラス製小試験管に塩分 18 pptの海水を0.2 ml入れ、各区のワムシを一個体ずつ収容した。収容後、海水蒸発に伴う塩分変化を避けるためにパラフィルムで密封した。水温は25 ℃、光周期0 L : 24 Dとし、餌はN. oculata を700万 細胞/mlとなるよう給餌した。孵化して約48時間後に産出した第1仔を第2世代として培養した（Hino & Hirano 1977, 1984, 1985）。第1仔が両性生殖を行う mictic female だった場合、継代培養が途絶えてしまうため、第2仔以降の単性生殖雌個体を次世代とした。この操作を第10世代まで繰り返した。24時間毎に仔ワムシを分離し、雌型の判別ができるまで飼育した。その際、親ワムシも新しい餌料懸濁水に植え継いだ。雌型の判別は、Hagiwara et al。（1988）の定義に従って、第1仔から第10仔まで行った。第10仔を分離するときに第10仔以降の仔ワムシが産まれていた場合、それらの個体も雌型判別した。雌型判別より両性生殖誘導率を求めた。両性生殖誘導率（Mixis）とは、全雌ワムシ中の両性生殖雌個体（mictic female）の割合である。また、培養期間中の両性生殖個体の出現頻度を求め、χ2検定で条件間の比較を行った。これより、両性生殖様式への餌料環境による影響が、耐久卵と単性生殖卵からの孵化ワムシの間に違いがあるか検討した。
【００３５】
＜結果＞
幹母虫と単性生殖孵化ワムシの餌料環境が両性生殖に与える影響については、以下のようであった。
【００３６】
耐久卵孵化ワムシに飢餓処理した時の両性生殖誘導率を図１に示す。第3世代以降両区とも両性生殖誘導率が高くなったが、飢餓処理がなしのもの(以下、耐久卵0 h区という)では第8世代から両性生殖誘導率が減少した。それに対し、飢餓処理を12時間行なったもの(以下、耐久卵12 h区という)では第8世代以降も高い両性生殖誘導率を示した。継代培養により産出されたワムシのうち、両性生殖個体の出現頻度を表１に示す。
【００３７】
【表１】
2005087061.tif 000002
【００３８】
耐久卵12 h区では、耐久卵0 h区より両性生殖雌個体が多く出現した（χ2検定, χ2val =5.882, p=0.0153 ）。幹母虫への飢餓処理は両性生殖の発現を高めることが示された。
【００３９】
単性生殖卵孵化ワムシに飢餓処理した結果を図2に示す。単性生殖卵0 h区では、世代の累積により両性生殖の発現が低くなる傾向が見られた。単性生殖卵12 hr区では、第2世代以降両性生殖誘導率が減少した。継代培養により産出されたワムシのうち、両性生殖個体の出現頻度を表２に示す。
【００４０】
【表２】
2005087061.tif 000003
【００４１】
両区の両性生殖雌個体の出現頻度に統計的有意差はなかったが、単性生殖卵の孵化ワムシへの飢餓処理は両性生殖頻度を抑える傾向が見られた（χ2検定, χ2val =3.578, p=0.585）。
【００４２】
以上の結果、耐久卵孵化ワムシと単性生殖卵孵化ワムシでは、餌料環境が両性生殖様式へ与える影響は異なることが示された。すなわち、幹母虫が劣悪な餌料環境を孵化後に経験すると、幹母虫に由来する個体の両性生殖は活発になった。一方、単性生殖卵からの孵化ワムシでは、飢餓経験により両性生殖が活発になることはなく、逆に衰える傾向が見られた。
【実施例２】
【００４３】
次に、幹母虫への餌料環境がワムシの増殖特性および両性生殖誘導に与える影響について調べた。
【００４４】
具体的には、餌料環境の中で最も厳しいと思われる飢餓を設定し、幹母虫に飢餓を経験させることで、幹母虫に由来する個体群の両性生殖誘導へ与える影響を調べた。
【００４５】
＜方法＞
餌密度を700万 細胞/mlとした。餌料条件は次の通りに設定した。幹母虫に対し、孵化直後からN. oculata を給餌したもの（対照区）、孵化後12時間飢餓処理した後N. oculata を給餌したもの（飢餓処理12 h区）、孵化後24時間飢餓処理した後N. oculata を給餌したもの（飢餓処理24 h区）の3通りである。この3実験区は、耐久卵から孵化直後の餌の有無が異なっており、その後はどの区も同じ餌条件である。それぞれの区について8個体ずつ継代培養を行った。雌型の判別は第1仔から第10仔に対して行った。
【００４６】
飢餓処理後の餌料には、N. oculata とパン酵母Saccharomyces cerevisae（オリエンタル酵母工業株式会社製）の2種類を用いた。N. oculata は、Erd-Schreiber 改変培養液で通気培養し、10分間遠心分離（3000 rpm）した後、滅菌濾過海水で懸濁したものを用いた。パン酵母は、市販の冷凍保存してあるものを滅菌濾過海水で懸濁して用いた。N. oculataの細胞は直径約4.3μm、パン酵母の細胞は直径約6μmでいずれもほぼ球形であることから、給餌密度は体積換算で同じになるようにN. oculata が700万 細胞/ml、パン酵母が250万 細胞/mlとした。一日一回、ワムシ飼育水中の餌密度がそれぞれの密度になるように給餌した。
【００４７】
幹母虫を二群に分け、各々N. oculataとパン酵母を餌として5日間培養し、600〜700個体まで増殖させた。その後、飼育水量100 ml 中に1 ml当たり1 個体となるように蓋付きガラス瓶（容量200 ml）に収容した。培養条件は水温25 ℃、 光周期0 L : 24 Dとした。両性生殖が起こりやすくするため、飼育水の塩分を18 ppt （Hagiwara et al. 1988; Hino & Hirano 1988）に設定した。餌の密度は前述の条件と同じにした。水流のない環境ではN. oculata 、パン酵母共に器底に沈みやすいため、少量のエアーレーションを施して餌を水中に浮遊させた。
【００４８】
それぞれの実験区で3回ずつ培養を繰り返した。24時間毎にワムシの計数、携卵雌ワムシの雌型判別を行った。また、5日毎の餌の切り換え時には、プランクトンネットでワムシを取り除いた飼育水を吸引濾過して再利用することにより、切り換える前の餌が残らないようにした。
【００４９】
給餌パターン間で両性生殖誘導率に違いがあるかどうか一元配置分散分析で検定し、差が認められた場合にはFisherのPLSDテストで多重比較を行った。
【００５０】
産出された仔ワムシの雌型判別により両性生殖の発現頻度を求め、χ2検定で比較した。この結果より、耐久卵孵化直後の飢餓経験が、後の世代の両性生殖発現に与える影響について検討した。
【００５１】
10世代の継代培養による両性生殖誘導率の変化をFig.III-10に示す。対照区では、10世代を通して両性生殖誘導率は低いままだった。飢餓処理12 h区では、対照区に比べて全体的に高い両性生殖誘導率を維持した。飢餓処理24 h区では、第2世代から第6世代まで高い両性生殖誘導率を示したが、以後は対照区と同様に低い割合だった。培養期間中の mictic female の個体数を表３に示す。
【００５２】
【表３】
2005087061.tif 000004
【００５３】
飢餓処理12h区と飢餓処理24 h区は、対照区に比べmictic female の出現が多かった（χ2検定, 各々χ2val =25.671, 9.510, p<0.0001, p=0.002）。また二つの飢餓処理区の間にも有意差がみられ、飢餓処理12h区の方が両性生殖誘導率は高くなった（χ2検定, χ2val =4.174, p=0.0411）。これにより、耐久卵孵化直後の飢餓はその後の両性生殖誘導率を高めることが分かり、中でも12時間の飢餓処理が最も大きな影響を与えることが分かった。
【００５４】
耐久卵孵化直後から良好な餌料環境にあるものに比べ、孵化後に飢餓状態を経験した幹母虫に由来する個体群では全体的に両性生殖誘導率は高くなった（図３）。この結果より、幹母虫の餌料環境の中でも、特に初期餌料環境が大きな影響を与えることが分かり、耐久卵孵化直後に厳しい餌料環境にあった幹母虫に由来するワムシ個体群は、両性生殖を活発に行う生殖様式を取ることが分かった。また、飢餓処理24 h区では、培養後半に両性生殖誘導率が低下したのに対し、飢餓処理12 h区では終始高い両性生殖誘導率であった。その結果、飢餓処理12 h 区は飢餓処理 24 h 区よりも mictic female の出現率が有意に高くなった。長時間の飢餓処理は、ワムシの繁殖能力へ大きな影響を与えることが考えられ、12時間の飢餓処理時間で十分に両性生殖の発現を高めることが可能であることが分かった。本実験より、耐久卵から孵化直後の餌料環境を操作することで、人為的に両性生殖を活発にすることが可能であることが新たに発見された。両性生殖の発現が高まったことから、幹母虫の飢餓経験は耐久卵形成も促進させると思われる。幹母虫に対する飢餓処理は、無給餌下で耐久卵を孵化させて、孵化して半日経過した後に餌を与えるだけの操作であって容易である。そのため、耐久卵量産のための大規模培養にもすぐに応用可能であり、大変有効な手法となる可能性が高い。
【００５５】
ワムシ類は、飢餓を経験することで耐久卵を形成するような戦略を取り、餌料環境の悪化に適応しているのではないかと考える。
【実施例３】
【００５６】
次に、幹母虫の飢餓が次世代の増殖特性へ与える影響について調べた。具体的に、幹母虫の飢餓経験が幹母虫に由来する子孫の寿命や産仔数、繁殖期間などの生活史特性値へ与える影響を調べた。
【００５７】
耐久卵孵化後に好餌料環境にあったワムシは、その後悪餌料環境に遭遇すると両性生殖誘導が大きく減少した。一方、耐久卵孵化後に悪い餌料環境下にあったワムシは、その後再び同じ餌料環境に遭っても両性生殖誘導は衰えなかったことから、耐久卵孵化直後に悪い餌料環境を経験すると、その悪環境に対する何らかの耐性が子孫に受け継がれるのではないかと考えた。
【００５８】
そこで本実施例では、飢餓を経験した幹母虫の子孫には、飢餓に対する耐性が備わっているのではないかという仮説を立て、その検証を行った。
【００５９】
＜方法＞
まず、生活史特性値への影響を調べた。幹母虫に対し、孵化直後から餌を与えたものと12時間の飢餓処理後に給餌したものをそれぞれ20個体ずつ用意した。飢餓処理を行ったのは耐久卵孵化直後だけで、他では同じ餌条件とし、N. oculata を1日1回700万cells/ml に調節した。N. oculata は藻類培養液KW21（第一製網株式会社製）を添加した2/3海水で通気培養したものを用いた。
【００６０】
培養条件は、飼育水量0.2 ml、水温25℃、塩分18 ppt、光周期0 L : 24 Dとした。上記の飢餓0時間の幹母虫（対照区）20個体と飢餓12時間の幹母虫（飢餓処理区）20個体を一個体ずつガラス製小試験管に収容し、海水蒸発による塩分変化を避けるためにパラフィルムで密封した。耐久卵から孵化したワムシ（P）を第1世代とし、その第1仔を第2世代（F1）とした。同様に第3世代（F2）まで培養した。第1仔が mictic female だった場合、第2仔以降の amictic female を次世代とした。24時間毎に観察を行い、生死、携卵の有無、産仔数を記録した。仔ワムシは分離して雌型の判別を行った。これより寿命、産仔数、繁殖開始齢・終了齢、繁殖期間、両性生殖誘導率を求めた。対照区と飢餓処理区の世代毎の各項目に違いがあるかをt - testで比較した。さらに、世代の累積による影響を知るために、3世代間の生活史特性値を一元配置分散分析で検定し、差が認められた場合にはFisher’sのPLSDテストを行った。各実験条件下での両性生殖の発現頻度を、χ2検定で比較した。
【００６１】
また、寿命と産仔数から世代毎、及び餌料条件毎に内的自然増加率（ r ）を求め、幹母虫の飢餓経験がワムシ個体群の増殖へ与える影響を検討した。内的自然増加率は次式で求めた。r = ln(Nt / N0) / t , N - ワムシ密度。生命維持と繁殖に費やすエネルギーの関係を知るために、卵サイズの測定を行った。対照区と飢餓処理区の幹母虫をさらに30個体ずつ用い、この幹母虫が最初に携卵した時の卵の長径及び短径を測定した。測定は携卵ワムシをスライドガラスに取り酢酸蒸気で固定した後、光学顕微鏡と画像解析ソフトScion Image 1.62a を用いて行った。この測定値から卵の体積を求めた。卵の形は回転楕円体に近いことから4/3×π×長径×短径2により算出した。
【００６２】
結果を以下のようにまとめる。
＜寿命＞
対照区、飢餓処理区の3世代の寿命を図４に示す。
【００６３】
（1）処理条件間の比較
幹母虫（P）の寿命は、対照区（11.05±1.96日）と飢餓処理区（10.77±1.75日）の間に有意差は認められなかった。幹母虫の次世代であるF1の寿命は、対照区（12.35±2.87日）より飢餓処理区（9.21±1.90日）の方が短くなった（t - test, t=3.910, p=0.0004）。さらに次世代のF２の寿命でも対照区（12.13±2.90日）より飢餓処理区（9.45±2.11日）の方が短くなった（t - test, t= 3.204, p=0.0029 ）。
【００６４】
（2）世代間の比較
対照区では、P, F1, F2の寿命に違いはなかった。一方、飢餓処理区では、Pの寿命に比べF1の寿命は短くなった（分散分析, df=2, F=3.218, p=0.0480; Fisher’s PLSD test, p=0.0175 ）。PよりF2の寿命が短くなる傾向があった（p=0.0685）。
【００６５】
＜産仔数＞
対照区、飢餓処理区の3世代の産仔数を図５に示す。
【００６６】
処理条件間の比較
P及びF1の産仔数は、両者とも対照区（P - 22.85±3.25個体、F1 - 22.63±5.03個体）より飢餓処理区（P - 19.12±4.30個体、F1 - 18.16±4.26個体）が少なくなった（t - test, P - t=3.005, p=0.0049, F1 - t=2.846, p= 0.0076）。F2では、対照区、飢餓処理区の産仔数（各々 18.50±5.43個体、17.50±4.20個体）に有意差はなかった。
【００６７】
世代間の比較
対照区では、PおよびF1に比べF2の産仔数は減少した（分散分析, df=2, F=4.806, p=0.0124; Fisher’s PLSD test, 各々p<0.05）。PとF1の産仔数は変わらなかった。飢餓処理区では、世代間に産仔数の違いはなかった。
【００６８】
＜繁殖開始齢＞
対照区、飢餓処理区の3世代の繁殖開始齢を図６に示す。
処理条件間の比較
Pでは、対照区（3.05±0.22日）より飢餓処理区（3.82±0.39日）が遅く繁殖を開始した（t - test, t=7.501, p<0.0001 ）。また、飢餓処理を行った孵化後12時間を除外し、給餌開始時から繁殖開始に至るまでの期間の齢で比較しても同様の結果となった（t - test, t=2.652, p=0.0119 ）。このことから、飢餓処理時間の12時間のために繁殖が遅れたのではなく、飢餓の影響で繁殖が遅れたことが分かる。F1（対照区 - 2.81±0.40日、飢餓処理区 - 2.11±0.32日）では、Pとは逆に飢餓処理区の方が若齢で繁殖を開始した（t - test, t=5.824, p<0.0001 ）。
【００６９】
（2）世代間の比較
対照区では、F2の繁殖開始までの齢がPに比べ短縮された（分散分析, df=2, F=4.662, p=0.0137; Fisher’s PLSD test, p=0.0040）。飢餓処理区では、PよりF1, F2の繁殖開始までの齢が短縮された（分散分析, df=2, F=81.252, p<0.0001; Fisher’s PLSD test, 各々p<0.001）。
【００７０】
＜繁殖終了齢＞
対照区、飢餓処理区の3世代の繁殖終了齢を図７に示す。
（1）処理条件間の比較
F1, F2では、対照区の繁殖終了までの期間（10.19±2.04日、10.67±2.55日）より飢餓処理区（8.90±1.66日、9.05±1.88日）の方が短くなった（t - test, F1-  t=2.066, p=0.0468, F2- t=2.161, p=0.0380）。
【００７１】
（2）世代間の比較
対照区の繁殖終了齢に世代間での違いはなかった。飢餓処理区では、Pの繁殖終了齢（10.29±1.65日）に比べ、F1, F2の繁殖終了は若齢になった（分散分析, df=2, F=3.448, p=0.0391; Fisher’s PLSD test, 各々p<0.05）。F1とF2の間には差がなかった。
【００７２】
＜繁殖期間＞
対照区、飢餓処理区の3世代の繁殖期間を図８に示す。
（1）処理条件間の比較
繁殖期間にはどの世代でも有意な違いが認められなかった。しかし、F2では、対照区の繁殖期間より飢餓処理区の方が短くなる傾向が見られた（p=0.0532）。
【００７３】
（2）世代間の比較
繁殖期間には対照区、飢餓処理区共に世代間の違いはなかった。
＜繁殖期間と産仔数＞
繁殖期間と産仔数のデータより、繁殖期間一日当たりの産仔数を求めた。対照区の一日あたりの産仔数は3.11個体、飢餓処理区は2.86個体であり、対照区の方が多くなる傾向が見られた（p=0.0915）。
【００７４】
＜両性生殖誘導率＞
対照区、飢餓処理区の3世代の両性生殖誘導率を図９に示す。
（1）処理条件間の比較
対照区では、P, F1, F2の各世代に出現した全ワムシに対する両性生殖個体の割合は、それぞれ3.7 %（17 / 457）、3.0 %（11 / 368）、6.6 %（22 / 333）であった。飢餓処理区のそれは、P - 1.7 %（6 / 360）、F1 - 5.4 %（19 / 351）、F2 - 7.7 %（27 / 350）であった。両区の両性生殖の出現割合をそれぞれ世代毎に比較したが、違いはなかった。
【００７５】
（2）世代間の比較
対照区では、F1に比べるとF2の両性生殖誘導率が高くなった（χ2検定, χ2val =4.634, p=0.0313 ）。しかし、PとF2の両性生殖誘導率を比べると違いはなかった。飢餓処理区では、Pに比べてF１, F2の両性生殖誘導率が高くなった（χ2検定, F1-χ2val =6.852, p=0.0089, F2-χ2val =13.345, p=0.0003, n=350 - 360）。F1とF2の間には有意差はなかったが、飢餓処理区では、世代の累積に伴い両性生殖誘導率が高くなる傾向が見られた。
【００７６】
＜内的自然増加率＞
寿命と産仔数より求めた内的自然増加率（ r ）を表４に示す。
【００７７】
【表４】
2005087061.tif 000005
【００７８】
幹母虫の r 値は、対照区より飢餓処理区の方が小さかった。しかし、Ｆ1及びＦ2では逆に飢餓処理区の方が高い値だった。3世代通しての両区の r 値は、ほぼ同じだった。
【００７９】
＜卵サイズ＞
対照区では、幹母虫が生じた卵の長径、短径はそれぞれ117.98±7.72μｍ、84.00±9.06μｍ（n=30）であった。飢餓処理区の幹母虫が生じた卵の長径、短径は121.64±8.91μｍ、81.77±7.08μｍ（n=30）であった。これより求めた卵の体積は、対照区、飢餓処理区の各条件で（4.42±1.02）×105μm3、（4.28±0.54）×105μm3であった。両者に差は見られなかった（t - test, t=0.639, p=0.5256）。
【００８０】
幹母虫が飢餓を経験することで生活史特性値に様々な影響が現れた。幹母虫の寿命には、対照区と飢餓処理区の間で違いは無かった。幹母虫の飢餓経験は、幹母虫の寿命に影響しないことが示された。しかし、次世代以降では対照区に比べ飢餓処理区の寿命が短くなった。また、飢餓処理区では幹母虫に比べＦ1, Ｆ2のワムシの寿命が短くなった。これより、幹母虫が飢餓を経験すると、次世代以降の個体の寿命に影響を与えることが分かった。
【００８１】
寿命の場合と同様、飢餓は産仔数にも強い影響を与えた。飢餓処理区の産仔数は各世代とも対照区より少なくなった。これより、幹母虫の飢餓経験は、幹母虫自身の他、直接飢餓処理していないF1, F2の産仔数も減少させることが分かった。III−3節で述べたように、Snell & Boyer（1988）の研究でも長時間の幹母虫への飢餓処理で幹母虫の産仔数が減少することが分かっている。本実験で、幹母虫に限らず、後の世代の産仔数も減少させることが示された。寿命が短縮され、産仔数が減少したことから、幹母虫の飢餓経験はワムシ個体群の増殖を抑制すると想像されるが、内的自然増加率（ r ）では、逆の傾向が見られた。飢餓経験により幹母虫の r 値は小さくなったが、Ｆ1とＦ2では逆に対照区より高い値になった。これは、繁殖開始までの期間が早くなったことが原因と考えられる。これより、幹母虫の飢餓経験は後の世代の単性生殖も活性化させることが示唆された。
【００８２】
飢餓処理によって個体の寿命が短くなり、産仔数が減少した現象は、仔ワムシ一個体を産出するのに消費するエネルギーが大きくなることに基づくのではないかと考えたが、卵サイズには、対照区と飢餓処理区の間に違いは無かった。そのため、仔ワムシ一個体を産出するのに消費するエネルギー量は変わらないように思われる。
【００８３】
幹母虫の飢餓経験は、繁殖期間に対しても様々な影響を与えていた。幹母虫の繁殖開始までの期間は、飢餓処理によって長くなった。飢餓処理時間の12時間を除外した時にも違いがあったことから、給餌開始が遅れたことが原因ではなく、飢餓によって生じた結果である。飢餓処理区のＦ1, Ｆ2の繁殖開始齢は幹母虫の繁殖開始齢より早くなった。しかし、対照区でも同様の現象が起こっていたことから、飢餓の影響ではなく世代の累積によるものと考えられる。繁殖終了齢についても、幹母虫の飢餓経験により次世代以降の繁殖終了が早い時期に起こった。飢餓処理区の繁殖期間はどの世代でも対照区より短くなった。Snell & King（1977）は、Asplancha brightwelli （フクロワムシ類）で、寿命と産仔数、繁殖期間の相関について研究している。寿命が長い個体は繁殖期間が長く産仔数も多くなる。寿命が短い個体は繁殖期間が短いが、繁殖期間一日当たりの産仔数が多くなる。本実験では、飢餓により寿命が短くなり繁殖期間も短くなった。しかし、繁殖期間一日当たりの産仔数は、飢餓処理区の方が少なくなった。A. brightwelli は繁殖期間が短い分、一日当たりの産仔数を増加させることで個体群の増殖を維持する戦略を取っている。一方B. plicatilisでは、幹母虫が飢餓を経験すると、幹母虫のみならずF1, F2の繁殖期間は短縮され、産仔数、一日当たりの産仔数どちらも減った。仔ワムシを数多く産出するのではなく、短い繁殖期間で、次世代を早く産出する戦略と考えられる。
【００８４】
両性生殖の発現は、幹母虫の飢餓経験により世代の累積と共に増加した。
【００８５】
本実施例では幹母虫の飢餓経験によって、寿命と繁殖期間が短縮され、産仔数も減少することが明らかになった。両者の間で異なる結果が得られた原因として考えられることは、実験に用いたワムシが単性生殖卵からの孵化ワムシであるか幹母虫であるかということである。上述の実施例の結果で示唆されたように、単性生殖卵からの孵化ワムシと幹母虫では、餌料環境による生殖様式への影響が異なる。Yoshinaga et al. (2000) が用いたB. plicatilis石川株は両性生殖をほとんど行わないワムシ株であるため、飢餓条件下では繁殖を抑制し、その分寿命を延長して餌料条件の好転に備えたのではないだろうか。Kirk (1997) は、9種のワムシ類を用い、飢餓がワムシ類の寿命と産仔数に与える影響を調べた。9種のワムシ類のうち8種は飢餓経験により寿命が短くなった。飢餓条件下の個体の産仔数は、9種のうち6種が減少し、2種で増加した。寿命と産仔数の関係を見ると、寿命が短くなり産仔数が減少したのが5種、寿命が短くなり産仔数が増加したのが2種となった。ツボワムシ類3種（B. calyciflorus, B. caudatus, B. havanaensis ）は、寿命が短くなり産仔数が減少した。同じワムシ類でも種により飢餓に対する生殖様式は異なっており、それぞれ個体群の維持、増殖を図っている。その中で本実験材料に用いたB. plicatilis ロシア株は、単性生殖による個体群の維持だけでなく、両性生殖を活発に行い外部環境の変化に強い耐久卵を多く形成することで、悪条件を凌ぐ戦略を取っていると考えられる。
【００８６】
飢餓を経験した幹母虫群により形成された耐久卵からの孵化ワムシには、高い飢餓耐性が備わっていた。悪条件下での戦略として、次世代に高い飢餓耐性を与えることで生残を高めていると推察される。周期的な飢餓条件下にある単性生殖卵孵化ワムシの仔は飢餓耐性が高いと報告されている（Yoshinaga et al. 2001）。飢餓状態が周期的に生じる時、仔ワムシに飢餓条件下でも生存できる高い飢餓耐性を与えていると考えられる。本実験では幹母虫孵化後の12時間だけが飢餓状態であり、その後は十分量の餌が存在していた。仔ワムシが飢餓状態に曝されることは少ない環境である。このような時、何世代か後の子孫が飢餓に遭遇した場合に備え、耐久卵から孵化するワムシに対し高い飢餓耐性を残すのではないだろうか。試験の結果、幹母虫の寿命が短くなった上、産仔数も減少したが、悪条件を凌ぐために卵質を変化させ、次世代に飢餓への高い耐性を与えることにエネルギーを費やしていたとすれば、ワムシ個体群を維持するために、有効な戦略と思われる。
【実施例４】
【００８７】
次に、幹母虫の飢餓経験が次世代の飢餓耐性へ与える影響を調べた。
幹母虫に対し孵化直後からN. oculata を給餌したもの（対照区）と、12時間飢餓処理したもの（飢餓処理区）を20個体ずつ用意した。対照区、飢餓処理区共に携卵した幹母虫を塩分18 ppt の滅菌海水へ移し替え、これにより孵化後全く摂餌していない第1仔を得た（各々 n=20）。その後、仔ワムシを水温25℃、光周期0 L : 24 D、無給餌下で飼育し、すべての個体が死ぬまで毎日2回、約12時間毎に観察を続け、寿命を求めた。寿命の違いを生存分析により解析した。
【００８８】
対照区、飢餓処理区それぞれの生残曲線を図10に示す。無給餌下での対照区と飢餓処理区の生存に違いは認められなかった。また、供試した2区の計40個体は、いずれも繁殖を行わなかった。
【実施例５】
【００８９】
次に、飢餓経験のある幹母虫に由来する個体群が形成する耐久卵の質について調べた。実験には培養履歴の異なる耐久卵を用いた。一つは耐久卵から孵化後、飢餓を経験していない幹母虫に由来する個体群が形成した耐久卵（対照区）で、もう一つは耐久卵孵化直後に12時間の飢餓を経験した幹母虫に由来する個体群が形成した耐久卵（飢餓処理経験区）である。それぞれの耐久卵から幹母虫を孵化させた（各々 n=20, 22）。孵化した幹母虫を水温25℃、塩分18 ppt 、光周期0 L : 24 D、無給餌下で飼育し、すべての個体が死ぬまで毎日2回観察を続け、寿命を求めた。両区の寿命の違いを生存分析で解析した。
【００９０】
対照区、飢餓処理経験区それぞれの生残曲線を図１１に示す。無給餌下での対照区と飢餓処理経験区の生存を生存分析により検定したところ有意差が検出され（Logrank検定, p=0.0445 ）、飢餓処理区の方が飢餓条件下での生残が高いことが分かった。また、供試した2区の計42個体は、いずれも繁殖を行わなかった。
【実施例６】
【００９１】
本実施例では、幹母虫への飢餓処理が耐久卵量産の手法として応用できるか検討した。
【００９２】
まず、幹母虫への飢餓処理が耐久卵形成へ与える影響を調べた。単一クローンの個体群に形成させた耐久卵を分離、孵化させて幹母虫を得た。幹母虫を二群に分け、孵化直後からN. oculataを給餌したもの（対照区）と12〜16時間飢餓処理後、N. oculata を給餌したもの（飢餓処理区）を用意した。
【００９３】
蓋付きガラス瓶（容量200 ml）に塩分 18 ppt の海水を100 ml入れたものを12個用意し、対照区と飢餓処理区それぞれ6個ずつ用いた。対照区、飢餓処理区ともに1 ml 当たり1 個体となるように幹母虫を収容した。培養期間は20日間、水温は25℃、餌にはN. oculata とChlorella vulgaris を用い、酸素供給と餌料の器底への沈殿を防ぐために少量のエアーレーションを施した。N. oculata は藻類培養液KW21（第一製網株式会社製）を添加した2/3海水で通気培養したものを用い、C. vulgaris はクロレラ工業社の市販製品（生クロレラ−V12）を用いた。24時間毎にワムシ計数と残餌の計数を行った。培養開始時の餌密度はN. oculata 700万細胞 /ml とし、その後残餌量とワムシの増殖率をもとに、24時間毎に給餌量を適時調節した。ワムシ個体数の増加をもとに餌を増やし、ワムシ個体数が減り残餌が多くなれば給餌量を減らすようにした。ワムシ個体群の増加によりN. oculata 単独給餌では賄いきれなくなった時、C. vulgaris を併用した。
20日間の培養終了後、形成された耐久卵を計数した。1日毎のワムシ計数値と耐久卵形成数から、幹母虫の飢餓経験が両性生殖に与える影響を検討した。また、形成された耐久卵を約5か月冷蔵保存（4℃）後孵化させ、孵化率を実験区間で比較した。この時、水量3 ml 中に耐久卵を20個収容し、これを各区に10個ずつ用意した（各区計200個）。これらを、連続照明下（白色蛍光灯、約6000 Lux）で2日間静置し、耐久卵の孵化率を求めた。
【００９４】
＜幹母虫の飢餓経験が個体群増殖へ与える影響＞
培養期間中の密度変化を図１２に示す。対照区、飢餓処理区共に10日目に増殖が衰えたため、50%の換水を行った。対照区では、10日目にのみ停滞したが15日目まで増殖した。15日目の1224個体 /mlを最大にその後減少した。18日目以降は変化しなかった。飢餓処理区も同様に10日目に停滞したが16日目まで増殖した。16日目の1215個体 /mlを最大にその後減少し、18日目以降は変化しなかった。培養期間の20日間を通して対照区と飢餓処理区ではほぼ同じ密度変化であった。
【００９５】
ワムシ個体群の増減による対照区の給餌量の変化を図１３に示す。対照区と飢餓処理区での給餌量は、培養開始初期に僅かな違いはあったが、20日間を通して同じ量の餌を与えた。4日目までN. oculata のみの給餌で、5日目から18日目まではN. oculata 単独給餌では必要量が得られなかったためC. vulgaris を併用した。5日目以降、通常より高密度給餌であったが、残餌はほとんど無かった。19日目以降ではワムシ密度が減少し、残餌も多くなったため、給餌量を減らし、N. oculata 単独給餌とした。
【００９６】
（２）幹母虫の飢餓経験が両性生殖発現へ与える影響
20日間の両性生殖誘導率の経日変化を図１４に示す。対照区の両性生殖は2日目から発現し、両性生殖誘導率は8日目まで増加した。8日目以降は減少し、16日目以降両性生殖個体はほとんど見られなかった。飢餓処理区では、2日目から両性生殖が活発になり増減を繰り返した。培養後半では両性生殖誘導率は減少した。20日間を通して飢餓処理区の両性生殖誘導率は、対照区のそれより高かった。
【００９７】
20日間の mictic female 個体数の変化を図１５に示す。対照区は、9日目まで mictic female 個体数が増加し、1233個体を最大に減少した。飢餓処理区は、9日目に2200個体、13日目に2166個体まで増加し両性生殖誘導率の低下に伴って減少した。Mictic female の個体数は3日目を除き飢餓処理区が対照区よりも多かった。
【００９８】
単性生殖個体数とmictic female 個体数から、培養期間全体の両性生殖誘導率を求めた（図１６）。飢餓処理区の両性生殖誘導率（7.3±1.3 %）は、対照区（3.2±1.0 %）よりも高かった（t - test, t=6.209, p=0.0001）。
【００９９】
（３）幹母虫の飢餓経験が耐久卵形成に与える影響
培養終了後に計数した耐久卵形成数を図１７に示す。対照区の耐久卵形成数は1001±135個、飢餓処理区では1546±229個であった（t - test, t=5.015, p=0.0005）。これにより、幹母虫の飢餓経験は耐久卵形成を活発にすることが分かった。
【０１００】
（４）孵化率
培養終了後から約5か月間冷蔵保存した耐久卵の孵化率は、対照区が平均45.5 %、飢餓処理区が平均47.0 % であった。幹母虫の飢餓経験は、耐久卵孵化率には影響を与えないことが分かった。
【実施例７】
【０１０１】
さらに、耐久卵の量産効率を向上させることを目標に、本実施例では連続培養法の有効性について調べた。連続培養法は流水式であるため、バッチ培養より培養槽内の環境を良好に維持できる（日本栽培漁業協会 2000）。このため、増殖期のワムシを長期間維持することが可能である。連続培養を用いることで、バッチ培養よりも耐久卵を量産できると考えた。
【０１０２】
これまでの実施例と同様に、単一クローンの個体群により形成された耐久卵を実験に用いた。この耐久卵から孵化した幹母虫に対し、両性生殖が活発になるよう12〜18時間の飢餓処理を施した。その後餌を与え、培養開始に必要量のワムシを確保するために2 日間培養した。
【０１０３】
容量 5 L のポリ容器に塩分 18 ppt の海水を 3 L 入れ、飢餓処理した幹母虫由来の個体群のワムシを 1 ml 当たり 1 個体となるように収容した。これを二つ用意し、一つはバッチ培養、もう一つは連続培養に供した。培養期間は25日、水温は25℃、餌にはC. vulgarisを用い、ワムシの増減と残餌の状況から給餌量を調節するようにした。酸素供給と餌の沈殿を少なくするために二箇所からエアーレーションを施し、器底の沈殿物が舞い上がらない程度の水流が生じるようにした。24時間毎にワムシ計数と残餌計数を行い、ワムシ増殖の衰える傾向が現れた時、連続培養を開始した。連続培養は換水率約 18 % とした。定量ポンプ（アトー株式会社製）と飼育容器をシリコンチューブ（内径2 mm）で接続し、ワムシ培養水から一日約550 ml を回収し、同量の新しい餌料懸濁海水を注水するようにした（図１８）。連続培養実施期間に注水する餌料懸濁水は、回収水量と同量の550 ml の海水にC. vulgaris を加え、一定量（20×106 cells / ml）の餌を与えるようにした（図１９）。連続培養法が培養槽内の水質に与える影響を知る目安として、培養開始時と培養終了時の培養水のアンモニア態窒素濃度を測定した。アンモニアの測定には、アンモニア電極（Model 701 A , ORION RESEARCH製）を用い、総アンモニア濃度（NH4-N ＋ NH3-N）を測定した。この総アンモニア濃度測定値と、pH、塩分、水温からNH4-N とNH3-N濃度を算出した（Bower & Bidwell 1978）。収穫した培養水から数日毎に耐久卵を計数し、培養終了後には培養槽内の耐久卵を計数した。培養終了後、形成された耐久卵の孵化が問題なく起こるかどうかを確認するために、耐久卵を約2か月間冷蔵保存（4℃）し、その後耐久卵の孵化率を測定した。耐久卵の孵化は、水量3 ml 中に耐久卵を20個収容し、これを各区につき6個ずつ用意した（各区計120個ずつ）ものを、連続照明下（白色蛍光灯、約6000 Lux）で2日間静置して行った。
【０１０４】
結果を以下に示す。
（１）培養開始から連続培養への移行経過
24時間毎に計数した結果より培養期間中の密度変化、携卵個体の割合（1個携卵している場合と複数個の場合）、残餌量をそれぞれ図２０〜２３に示す。バッチ培養区及び連続培養区の密度は培養開始後順調に増加し、10日目には 1 ml 当たり500個体を越えた（図２０）。携卵率は 21〜42 % の間で変動していたが、複数の卵を携卵している個体が 9〜10日目に大きく減少した（図２１，２２）。残餌量は10日目に急増した(図２３)。以上のことからワムシの増殖が低下していると判断し、10日目に、一つの実験水槽を連続培養に切り換えた。
【０１０５】
連続培養法が個体群増殖へ与える影響
10日目以降も、バッチ培養区ではワムシの増殖が続き、12日目に1100個体/mlに達した後減少した。連続培養区では連続培養開始直後の11日目は828個体 /mlであったが、12日目には大きく減少し（308個体 /ml）、13日目に792個体 /ml、14日目に478個体 /mlとなり、変動が大きく安定しなかった。しかし、14日目以降は、400〜520個体 /mlで安定した状態を保った。22日目以降は僅かに減少し230〜370個体 /mlであった（図２０）。
【０１０６】
（３）連続培養法が両性生殖発現に与える影響
培養期間中の両性生殖誘導率、mictic female 個体数、unfertilized mictic female（雄を産出する個体）個体数、fertilized mictic female（耐久卵を産出する個体）個体数、雄密度をそれぞれ図２４〜図２８に示す。
【０１０７】
両性生殖誘導率は、両区とも培養開始からワムシ個体群の増殖と共に増加した。バッチ培養区では10日目から減少していった。培養21及び22日目に両性生殖誘導率は高くなったが、mictic female の個体数が増加したのではなくワムシ密度と携卵個体が共に減少したことによるものであった。連続培養区では10日目に減少した両性生殖誘導率が、連続培養を開始後一時増加した。その後増減を繰り返しながら徐々に減少した。培養1〜10日及び10〜25日の期間の両性生殖誘導率をTableＶ-1 に示す。バッチ培養区の両性生殖誘導率は、1〜10日（15.1 %）に比べ、11〜25日（7.9 %）で大きく減少した。一方、連続培養区では、1〜10日と11〜25日の期間の両性生殖誘導率は変わらず高い率であった（1〜10 - 13.4 %, 11〜25 - 11.6 %）。mictic female 、unfertilized mictic female 、fertilized mictic female 個体数は連続培養移行後一時バッチ培養より多くなったが、その後連続培養区でも減少し、対照区との間に大きな違いはなかった。両性生殖の発現により産出される雄の密度は、両区とも同じように増加していたが、バッチ培養区では10日目以降減少し、14日目以降はほとんど見られなかった。それに対し、連続培養区では連続培養移行後、雄の数はさらに増加し、13日目に75個体 /mlまでに達した。その後徐々に減少したがバッチ培養区に比べ明らかに多くの雄ワムシが出現した（図２８）。雄を産出するunfertilized mictic female の寿命を8日、雄の寿命を2日と想定し（Hagiwara et al. 1988）、unfertilized mictic female一個体が産出した雄個体数を求めた。バッチ培養区のunfertilized mictic female一個体当たりの雄産出数は、1〜10日目では12.6個体、10〜25日目では6.4個体、培養期間全体では7.7個体であった。連続培養区では、それぞれ11.5個体、10.9個体、10.9個体であった。連続培養移行後、連続培養区のunfertilized mictic femaleが、バッチ培養区より高い産卵活性を示し、多くの雄を産出したことが分かった。
【０１０８】
（４）アンモニア濃度
アンモニアの測定結果をTable Ｖ-2に示す。培養開始時の両区のNH4-N、NH3-N 濃度はそれぞれ0.21、0.016 ppm だった。培養終了時のNH4-N、NH3-N 濃度は、バッチ培養区では 34.7、4.9 ppm 、連続培養区では 16.8、1.9 ppm だった。連続培養により、アンモニア濃度は抑えられることが分かった。
【０１０９】
（５）連続培養法が耐久卵形成に与える影響
培養期間中に形成された耐久卵数を図２９に示す。バッチ培養区では、39087個の耐久卵が形成された。連続培養区では、培養槽において70380個形成され、さらに収穫槽にも15816個の耐久卵が見られた。15日間の連続培養により、バッチ培養の2倍以上の耐久卵が形成された。
【０１１０】
（６）孵化率
培養終了後から約2か月間冷蔵保存した耐久卵の孵化率は、バッチ培養区が平均41.7 %、連続培養区が平均65.0 %で、連続培養区の方が高かった（t - test, t=5.813, p=0.0002）。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
用途として、種苗生産の現場において、必要時に安定して提供できる初期餌料生物が考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１は、耐久卵孵化ワムシに飢餓処理した時の両性生殖誘導率を示す。図中、灰色の方は、飢餓処理無しのもの(飢餓処理0時間)、黒色の方は、飢餓処理12時間行なったものを示す。
【図２】図２は、単性生殖卵孵化ワムシに飢餓処理した結果を示す。
【図３】図３は、餌料環境がワムシの増殖特性及び両性生殖誘導に与える影響を示す。
【図４】図４は、対照区、飢餓処理区の３世代の寿命を示す。C：対照区、S:飢餓処理区
【図５】図５は、対照区、飢餓処理区の3世代の産仔数を示す。C：対照区、S:飢餓処理区
【図６】図６は、対照区、飢餓処理区の3世代の繁殖開始齢を示す。C：対照区、S:飢餓処理区
【図７】図７は、対照区、飢餓処理区の3世代の繁殖開始齢を示す。C：対照区、S:飢餓処理区
【図８】図８は、対照区、飢餓処理区の3世代の繁殖終了齢を示す。C：対照区、S:飢餓処理区
【図９】図９は、対照区、飢餓処理区の3世代の両性生殖誘導率を示す。C：対照区、S:飢餓処理区
【図１０】図１０は、対照区、飢餓処理区それぞれの生残曲線を示す。破線が対照区を、実線が12時間飢餓処理区を示す。
【図１１】図１１は、対照区、飢餓処理経験区それぞれの生残曲線を示す。破線が対照区を、実線が12時間飢餓処理区を示す。
【図１２】図１２は、培養期間中の全ワムシの密度変化を示す。○が対照区を示し、□が孵化後１２〜１６時間飢餓処理したものを示す。各プロットは、６回の平均を示す。
【図１３】図１３は、ワムシ固体群の増減による対照区の給餌量の変化を示す。黒四角がN.oculata、□がC.vulgarisを示す。各プロットは、６回の平均を示す。
【図１４】図１４は、２０日間の両性生殖誘導率の経時変化を示す。○が対照区を、□が孵化後１２〜１６時間飢餓処理したものを示す。各プロットは、６回の平均を示す。
【図１５】図１５は、２０日間のmictic female個体数の変化を示す。○が対照区を、□が孵化後１２〜１６時間飢餓処理したものを示す。各プロットは、６回の平均を示す。
【図１６】図１６は、培養中の両性生殖誘導率を示す。
【図１７】図１７は、培養終了後に計数した耐久卵形成数を示す。
【図１８】図１８は、連続培養用に設計された装置の一例を示す。
【図１９】図１９は、培養期間中の供給量の変化を示す。
【図２０】図２０は、培養期間中の全ワムシの密度を示す。○がバッチ式、□が連続式を示す。破線は、連続培養の開始を示す。
【図２１】図２１は、培養期間中の携卵個体(１個)の割合を示す。○がバッチ式、□が連続式を示す。破線は、連続培養の開始を示す。
【図２２】図２２は、培養期間中の携卵個体(複数個)の割合を示す。○がバッチ式、□が連続式を示す。破線は、連続培養の開始を示す。
【図２３】図２３は、概要期間中の残餌量を示す。○がバッチ式、□が連続式を示す。破線は、連続培養の開始を示す。
【図２４】図２４は、培養期間中の両性生殖誘導率の変化を示す。○がバッチ式、□が連続式を示す。破線は、連続培養の開始を示す。
【図２５】図２５は、培養期間中のmictic femalesの数を示す。○がバッチ式、□が連続式を示す。破線は、連続培養の開始を示す。
【図２６】図２６は、培養期間中の雄を産出する個体の数を示す。○がバッチ式、□が連続式を示す。破線は、連続培養の開始を示す。
【図２７】図２７は、培養期間中の耐久卵を産出する個体の数を示す。○がバッチ式、□が連続式を示す。破線は、連続培養の開始を示す。
【図２８】図２８は、培養期間中の雄個体の数を示す。○がバッチ式、□が連続式を示す。破線は、連続培養の開始を示す。
【図２９】図２９は、培養期間中に形成された耐久卵数を示す。黒色の部分が培養槽を示し、斜線の部分が収穫槽での耐久卵の数を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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