(57)【要約】      （修正有）【課題】  真菌を原因とする疾患に対して有効で、より安全な生物学的製剤、例えば、ワクチン組成物、減感作治療用組成物、又は診断用組成物として使用することのできる真菌抗原を提供すること。【解決手段】  カンジダ  アルビカンスに由来するワクチン活性又はアレルゲン活性を有する抗原性タンパク質であって、特定アミノ酸配列を有し、かつ分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下）が約６５，０００である抗原性タンパク質からなる真菌抗原、別の特定アミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１つを生じさせた配列を有し、かつ、ワクチン活性又はアレルゲン活性を有するペプチドからなる真菌抗原。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンジダ  アルビカンスに由来するワクチン活性又はアレルゲン活性を有する抗原性タンパク質であって、配列表の配列番号：１に示す部分アミノ酸配列を有し、かつ分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下）が約６５，０００である抗原性タンパク質からなる真菌抗原。
【請求項２】
配列表の配列番号：５に記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１つを生じさせた配列を有し、かつ、ワクチン活性又はアレルゲン活性を有するペプチドからなる真菌抗原。
【請求項３】
請求項１又は２記載の真菌抗原をコードする核酸。
【請求項４】
配列表の配列番号：７に示す塩基配列を有する、請求項３記載の核酸。
【請求項５】
請求項４記載の核酸に０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ中で、５０℃にて１２〜２０時間インキュベートした後、０．５％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中、５０℃で洗浄する条件においてハイブリダイズ可能な、ワクチン活性又はアレルゲン活性を有するペプチドをコードする核酸。
【請求項６】
カンジダ  アルビカンスに由来するワクチン活性又はアレルゲン活性を有する抗原性タンパク質であって、配列表の配列番号：３に示す部分アミノ酸配列を有し、かつ分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下）が約３０，０００である抗原性タンパク質からなる真菌抗原。
【請求項７】
カンジダ  アルビカンスに由来するワクチン活性又はアレルゲン活性を有する抗原性タンパク質であって、配列表の配列番号：４に示す部分アミノ酸配列を有し、かつ分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下）が約６２，０００である抗原性タンパク質からなる真菌抗原。
【請求項８】
請求項１、２、６、７いずれか記載の真菌抗原を含有することを特徴とする、個体に投与して真菌に対する感染防御免疫を誘導し又は治療効果を有するワクチン組成物。
【請求項９】
請求項８記載のワクチン組成物を投与することを含む、真菌に対する非ヒト脊椎動物の免疫応答を刺激する方法。
【請求項１０】
請求項１、２、６、７いずれか記載の真菌抗原を含有することを特徴とするサイトカイン放出剤。
【請求項１１】
請求項１、２、６、７いずれか記載の真菌抗原を含有することを特徴とする、個体に投与して真菌に対するアレルギー性疾患を予防し又は治療効果を有するアレルゲン組成物。
【請求項１２】
請求項１１記載のアレルゲン組成物を投与することを含む、真菌に対する非ヒト脊椎動物のアレルギー反応を抑制する方法。
【請求項１３】
請求項１、２、６、７いずれか記載の真菌抗原を含有することを特徴とする、該真菌による疾患の診断用組成物。
【請求項１４】
請求項１３記載の診断用組成物を使用することを含む、真菌による非ヒト脊椎動物の疾患を診断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞壁を有する病原性微生物である真菌による感染症、アレルギー疾患の予防又は治療、及び真菌による疾患の診断に有効な真菌抗原及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌は、ヒト、動物を始めとする脊椎動物に感染して種々の疾病を引き起こすことが知られている。例えば、ヒトの皮膚、口腔等に表在性真菌症を起こし、内臓、脳等に全身性真菌症を起こし、ペット、家畜等の動物に対しても同様の感染症を起こす。このうち、ヒトに感染して、全身性真菌症を起こす原因真菌の主なものとしては、カンジダ属（カンジダ  アルビカンス（Candida albicans）他）、クリプトコッカス属（クリプトコッカス  ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans ）他）、アスペルギルス属（アスペルギルス  フミガタス（Aspergillus fumigatus 他））、カリニ肺炎菌（ニューモシスチス  カリニ（Pneumocystis  carinii ））等が知られ、表在性真菌症では、皮膚、口腔、膣等に感染するカンジダ属、手足の皮膚に感染する白癬菌（トリコフィトン  メンタグロフィテス（Trichophyton mentagrophytes ）、トリコフィトン  ルブルム（Trichophyton rubrum ）他）等が主なものと考えられている。
【０００３】
家畜等に感染症を起こす真菌としては皮膚糸状菌（Dermophytes ）が多く、上記のトリコフィトン（トリコフィトン  ベルコーサム（Trichophyton verrucosum 他））の他に、ミクロスポルム（ミクロスポルム  カニス（Microsporum canis ）、ミクロスポルム  ジプセウム（Microsporum gypseum ）他）が知られている。生活環境中にはこれら以外にも多様な真菌が存在し、ヒト、動物に感染を引き起こすと考えられている。さらに、近年、広範囲抗生物質の多用、免疫抑制剤の使用、免疫抑制作用を持った制癌剤の使用等により、これらの薬剤の投与を受けている患者は免疫的易感染宿主（immunocompromised host）となり、健常人では病原性の低い真菌による日和見感染が増大している。また、AIDS患者においては、口腔カンジダ症が繰り返し発生する他、各種真菌症が併発する。また、血管内カテーテル留置、特に経中心高カロリー輸液法（IVH ）による治療を受けている患者では、カテーテルに起因して真菌、特にカンジダによる感染症が起こる。
【０００４】
一方、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎をはじめとするアレルギー性疾患が急激に増大しつつあるが、この中で真菌を原因とするアレルギー性疾患も非常に多い。
【０００５】
アレルギー性疾患の多くは、その疾患の原因抗原に感作されることにより、血清及び組織において、アレルゲンである抗原に特異的なＩｇＥ抗体（レアギン抗体）が産生され、該ＩｇＥ抗体が肥満細胞及び好塩基球のレセプターに結合する。再びその抗原に暴露されると、細胞に結合したＩｇＥと抗原とが細胞表面上で架橋し、ＩｇＥ−抗原相互作用の生理学的効果を生ずる。これらの生理学的効果はケミカルメディエイターであるヒスタミン、セロトニン、ヘパリン、好酸球遊送因子又は各種ロイコトリエン等の放出を介して現れる。それらの効果は抗原が体内に入る経路及び肥満細胞又は好塩基球上にＩｇＥが沈着するパターンに依存して全身的又は局所的性質であり得る。
【０００６】
全身的症状はアナフィラキシーショックが含まれ、血管内での抗原に対するＩｇＥ−好塩基球応答が起こる。その結果、主として平滑筋の収縮と毛細管の拡張が起こり、発疹、嘔吐、下痢、呼吸困難等の症状が現れ、激しい場合は死に至る。また、局所的症状は一般に抗原が体内に入った位置の上皮表面に起こり、発赤や丘疹として現れる。局所的症状が小気管支の平滑筋の収縮の場合、気管支喘息として現れる。
【０００７】
アレルギー性疾患を引き起こす原因菌としては、ペニシリウム属（Penicillium ）、カンジダ属（Candida ）、アスペルギルス属（Aspergillus ）、アルタナリア属（Alternaria）、クラドスポリウム属（Cladosporium）、マラセチア属（Malassezia）、ボトリチス属（Botrytis）、ムーコル属（Mucor ）、リゾプス属（Rhizopus）、オーレオバシジウム属（Aureobasidium ）、フザリウム属（Fusarium）、トリコデルマ属（Trichoderma ）、ヘルミンソスポリウム属（Helminthosporium）、ノイロスポラ属（Neurospora）、ワレミア属（Wallemia）、ロドトルラ属（Rhodotorula ）、トリコフィトン属（Trichophyton）が知られている。
【０００８】
真菌感染症に対する治療法としては、抗真菌剤による治療が一般的であり、表在性真菌症に対しては多くの薬剤が開発されおり、また、全身性感染症に対しても幾つかの優れた薬剤が開発されている。しかし、その効果は有効性、毒性、副作用などの面から不十分である。例えば、古くから使用されてきたアンホテリシンB は重篤な腎障害を始めとする種々の副作用が起こる。また、フルコナゾールを始めとする各種のアゾール系抗真菌剤が開発されたが、作用が静菌的であり、感染症が再発することが多い、また多用により耐性菌が出現し始めている。耐性菌が出現すると、現在実用化されている抗真菌剤の多くが類似の作用メカニズムを有しているため交差耐性となり、大きな問題となる可能性がある。表在性真菌症の場合でも、各種治療薬が開発されているが、長期の治療期間を要する、又再発を繰り返すなど、どれも十分とはいえず、さらに優れた薬剤の開発が望まれている。さらに、爪白癬のように外用剤だけの治療では不十分であるため、グリセオフルビン等の内服薬を必要とする表在性真菌症もある。この際、長期にわたる投与が必要となり、薬剤による種々の副作用が生じる。また、表在性真菌症や、AIDSにおける口腔カンジダ症のように、繰り返し感染が発生するため、有効な抗真菌剤が開発されても費用の面で大きな問題がある。このように抗真菌剤による治療はいろいろの問題がある。
【０００９】
生体には本来これらの外来からの侵入物である微生物と戦う感染防御力がある。この力を利用したものがワクチンである。病原性細菌に対してはワクチンによる感染予防が実施されており、古くから使用されかなりの効果を挙げている。細菌感染症に対するこれらのワクチンは、弱毒菌（結核菌）、死菌（コレラ菌）、トキソイド（ジフテリア菌、破傷風菌）、細胞表面の莢膜多糖体等の精製抗原（百日咳菌、肺炎球菌、インフルエンザ菌、髄膜炎菌）を抗原として使用している。ワクチンは病原菌の抗原性分子に対する抗体、及び細胞性免疫により感染防御力を宿主に与えている。抗体は病原菌により分泌される毒性物質の中和、病原菌の細胞表面分子に結合して宿主細胞への侵入を防ぐ役割を果たすと考えられる。細胞性免疫では、CD4 ＋細胞、CD8 ＋T 細胞が中心的役割を果たし、その病原菌の抗原性分子を認識し、病原菌に特異的な防御反応を活性化している。これらの病原菌の有する抗原性分子である免疫原性物質が単離同定され、これらの免疫原を感作抗原（ワクチン）として用いている研究もいくつかある。この場合、上記のように細胞表面分子である莢膜多糖体が免疫原としてよく使用されている。
【００１０】
真菌は環境中に非常に多くの数、種類が存在しており、脊椎動物はほとんど全てこれらの真菌に感作されている。また、生体に常在している真菌も多い。従って、脊椎動物では一般にこれらの真菌に対する種々の生体防御免疫反応が用意されている。真菌感染に対して重要な働きをしている免疫反応には、活性化されたマクロファージや多形核白血球（PMN ）が食菌作用や殺菌作用を示し、主役として働いているが、抗体や細胞性免疫が寄与していることも知られている。真菌は、その細胞表面にマンナン、グルカン、キチン等の多糖を主成分とする細胞壁を有しており、真菌細胞によってはその含量が全細胞の３０％近くを占める場合がある（非特許文献１）。これらの細胞壁成分の中でマンナンが最も抗原性が高い。マンナンは細胞表層に存在する多糖であり、この多糖部分に対する抗体が多量に作られる。ザイモザン（Zymosan ）を始めとする真菌細胞壁グルカンも種々の生理活性を有しており、非特異的な免疫増強作用を有することが知られている。真菌の細胞表面のマンナンを始めとする細胞壁成分が、感染においても細胞の生体への接着分子として重要な働きをしていると考えられている。
【００１１】
そして、クリプトコッカスのガラクトキシロマンナン（非特許文献２）やカンジダ  アルビカンスの接着因子であるホスホマンノプロテイン（特許文献１）がワクチンとして、またこれらの抗原性分子に対する抗体が感染防御活性を有することが報告されている。カンジダの生菌、死菌による感染防御免疫の誘導に関しても多くの報告（非特許文献３）がある。この場合も細胞表面分子である細胞壁成分に対する生体防御免疫反応が主として機能していると考えられてきた。
【００１２】
その他真菌に対するワクチンとしては、リボソームワクチン（非特許文献４）が、カンジダ  アルビカンス、トリコフィトンを始めとする真菌による感染症に対して試験され、実験動物、さらに一部ヒト、家畜に対する効果も検討されている。また、最近では、エノラーゼやストレスタンパク質HSP90 （特許文献２）が感染防御活性を誘導できることが報告されている。
【００１３】
しかし、上記の抗原性分子はいずれもまだ十分な有効性を確認されているとは言えない。また、多様性の高い哺乳類に対して、単一の抗原性分子を用いた治療により十分な有効性を得られるかは疑問である。
【００１４】
一方、アレルギー性疾患の治療法としては、抗ヒスタミン薬、ステロイド性抗炎症薬、メディエイター遊離抑制薬などが使用されている。しかし、抗ヒスタミン薬は、倦怠感、眠気、めまい等、ステロイド剤は、副腎萎縮、機能不全、胃潰瘍など様々な副作用の危険性があり、メディエイター遊離抑制剤も、問題となるアレルギー性疾患以外に関与しているメディエイターの作用をも抑制する危険性がある。この点において、抗原診断により特定されたアレルゲンとの暴露の機会を減らす予防法、及び／又はこれらの原因アレルゲンを用いた減感作療法が優れた治療法とされている。
【００１５】
従って、アレルギー疾患に対しては、まず原因となっている抗原を同定する診断が必要であり、そのためにまず100 種を超える市販のアレルゲンエキス、時には自製のものについて、疑わしい抗原エキスを皮内テストにより試験している。可能性の高い抗原が見つかると、血清中のＩｇＥ抗体価の測定、誘発テスト、又は全血やリンパ球を用いたヒスタミン遊離試験により抗原を特定することができる。
【００１６】
ヒトにアレルギー症状を惹起させるアレルゲンとしては、天然に存在する多くのものが知られているが、市販の食品などのアレルゲンエキスは天然のアレルゲンを原料とした粗抽出物である。従って、当然多くの物質の集合体であり、また複数の抗原が含有されている。近年になって、分離精製技術及びアレルゲン活性評価法が進展した結果、多くの食品アレルゲンから、アレルゲンの本体である抗原性タンパク質が単離同定されてきた。
【００１７】
また、環境中に存在するアレルゲンであるダニ、スギ花粉、ネコの毛などからもそれぞれより主要なアレルゲンとしてDer p I （非特許文献５）、Cry j I （非特許文献６）、Fel d I （非特許文献７）と命名された抗原性タンパク質が単離されている。更に、それらのアレルゲンタンパク質をコードする遺伝子も単離され、遺伝子工学的手法により純粋なアレルゲンタンパク質を大量に調製することが可能になっている。
【００１８】
一方、真菌のアレルゲンを単離する努力もなされている。真菌細胞内に存在するタンパク質から、例えばカンジダ・アルビカンスよりアルコールデヒドロゲナーゼ（Can a I ）（非特許文献８）エノラーゼ（非特許文献９）や、アスペルギルス・フミガタスよりリボトキシン（Asp f Ia）（非特許文献１０）等の抗原性タンパク質が単離同定され、これらのいくつかがアレルゲンとして作用することが知られている。
【００１９】
しかし、カンジダ、アスペルギルスを含めて一般的に真菌アレルゲンの場合、単一の主要アレルゲンといえるものが抗原性タンパク質として存在する場合は少なく、複数の抗原性タンパク質が存在し（非特許文献１１）、個人によって異なる抗原、また、各個人が複数の抗原をアレルゲンとして認識し反応している。即ち、例えば同じカンジダアレルギーといっても、各個人の反応する抗原は異なる場合が多く、しかも各個人が複数のカンジダ由来抗原に反応していることが知られている。
【００２０】
現在市販されている診断用又は治療用アレルゲンエキスは、単なる抽出物や、ほとんど精製されてなく、さらに含有成分についても管理されていないものが殆どである。真菌アレルゲンエキスとしては、カンジダ、アスペルギルス、アルタナリア、クラドスポリウム、マラセチア、ペニシリウムなどがある。しかしこれらの製造法は、前記のような食品や環境中の天然アレルゲン由来のアレルゲンエキスと異なる。つまり、原因真菌の培養細胞自体ではなく、各々の属に属する代表的菌株を、ある限定した栄養源を含む人工培地で長期培養して得られる、副次産物とも言える培養液中の菌体外分泌物を原料とする。従って、本製造法により得られる抗原は、自己細胞の消化物や細胞外分泌物であり、マンナン、グルカンを始めとする細胞壁多糖が主成分と考えられるが、これらの抗原の含量及び他の抗原性タンパク質の種類も明らかになっていない。さらに、製造者間で品質が異なるため、使用に際しては充分な注意が必要である。
【００２１】
市販の真菌アレルゲンエキスにも多く含まれる細胞壁多糖、特にマンナンは、一部のアレルギー患者において主要なアレルゲンとして働く一方、健常人でも細胞壁多糖に対するIgG 、IgM を多量に持っている。さらに、マンナン自身、特に中性マンナンは、マウスに対する致死的作用といった毒性を有していることも知られている（非特許文献１２）。また細胞壁グルカンも炎症を引き起こす等の病理学的作用を有することが知られている（非特許文献１３）。
【００２２】
従って、抗原であるマンナンを始めとする細胞壁成分や真菌細胞自身をワクチンとして利用する際には過敏症を引き起こすなどの危険性がある。また、アレルギー性疾患の減感作治療等においても、必ずしも細胞壁成分が主要なアレルゲンとして働いているわけではないので、細胞壁成分を含有するアレルゲン組成物を用いる場合、その抗原性が危惧され、人に投与する際は慎重になる必要がある。この点において、現在市販の真菌アレルゲンエキスは全く不満足なものである。さらに、有効な抗原が、十分量含有されている診断用及び／又は治療用の医薬組成物は知られていない。
【特許文献１】WO 95 ／31998 号公報
【特許文献２】特表平4-502257号公報
【非特許文献１】Klis,R.U. et al.,Yeast,Vol.10,851-869(1994)
【非特許文献２】Devi,S.J.N. et al.,Infect.Immun., Vol.59, 3700-3707,(1991)
【非特許文献３】Segal,E. et al. Critical Reviews in Microbiology Vol.14 229-271(1987)
【非特許文献４】Segal,E.,  Handbook of Applied Mycology, Volume 2:Immunizations against fungal diseases in man and animals., Humans, animals and insects.
【非特許文献５】Smith,W.A. et al.Clin.Exp.Allergy,Vol.24,220-228(1994)
【非特許文献６】Sone,T. et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.,Vol.199,619-625(1994)
【非特許文献７】Morgenstern,J.P. et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.88,9690-9694(1991)
【非特許文献８】Shen,H.D. et al.,Clin.Exp.Allergy,Vol.21,675-681(1991)
【非特許文献９】Ishiguro,A. et al.,Infect.Immun.,Vol.60,1550-1557(1992)
【非特許文献１０】Mosor,M. et al.,J.Immunol.,Vol.149,454-460(1992)
【非特許文献１１】Stewart,G.A. et al.,Clin.Exp.Allergy,Vol.26,1020-1044(1996)
【非特許文献１２】日本医真菌誌第36巻, 203-208,(1995)
【非特許文献１３】Kogan,G. et al. Biomedical and Biotechnological Advaneds in Industrial Polysaccarides.251-258(1989)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
上記のように、真菌症の増大に伴い、さらに現在使用されている抗真菌剤の副作用、耐性菌の出現、医療費の問題等から、有効性の高い、さらに安全性の高い、新たな真菌症の治療薬の開発が強く望まれている。抗真菌剤に比べてワクチンは多くの利点を有しており、これらの真菌による感染症に対するワクチンを見い出すことができれば、これらの感染症に感染することに伴う苦痛や衰弱を防止することができるだけでなく、これらの感染症の治療を目的とする薬剤の投与量を明確に減少させることもできる。さらに、この様に薬剤の使用を回避することにより、抗菌剤の過剰投与による病原性微生物に対する選択圧が減少し、耐性菌の出現を減少させることができる。しかし、現在のところそのような有効性の高いワクチンは発見されていない。また、単独の抗原で感作するよりも、複数の抗原で感作する方が耐性、有効性という点でより優れた感染防御を誘導することができると期待される。
【００２４】
一方、アレルギー疾患の増大に伴い、治療用或いは診断用アレルゲンエキスとして数多く市販されているが、有効成分は明らかになっていないものが多い。真菌に関しても、真菌細胞のどの部分に由来する成分であるかも明らかになっていないが、製法上、その主要成分は細胞壁由来多糖体であり、明らかに細胞内由来の抗原成分が少なく、抗原成分に非常に偏りがあると考えられる。従って、市販の真菌アレルゲンエキス、及び同様な方法で得られる抗原エキスでは十分な治療及び診断は実施できないと考えられ、従来のアレルゲンエキスに含有される成分とは異なる、しかも、その成分の含量が異なるアレルゲンエキスは高い有効性を発揮することが期待される。また、アレルギー性疾患に有効とされる減感作療法の現状は、抗原液を週１〜２回、少量ずつ皮内に投与し３〜４カ月かけて増量し、維持量に挙げ、更に１〜３年投与し続ける必要がある。従って、増量が容易及び／又は投与量を上げることが可能である抗原組成物の使用は、優れた治療効果をより容易に得られることが期待できる。また、ヒトを始めとする哺乳類は一般的に多様であり、たとえ一種類の真菌に感染又はアレルギー状態になったとしても、抗原として認識されるものは異なる可能性が高い。従って多様な抗原成分を十分量含有する抗原が望ましい。
【００２５】
さらに、原因抗原を特定することは、有効な治療法を選択する為の診断上重要であり、その抗原を用いた減感作治療などの有効性の高い、さらに安全性の高い治療も可能となる。従って未知の抗原を特定することは、これらの点から好ましい。
【００２６】
したがって本発明の目的は、このような真菌を原因とする疾患に対して有効で、より安全な生物学的製剤、例えば、ワクチン組成物、減感作治療用組成物、又は診断用組成物として使用することのできる真菌抗原を提供することにある。さらに本発明の目的は、かかる真菌抗原の製造方法、該真菌抗原をコードする核酸を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明者らは、従来主として抗原性分子として研究されてきた真菌の細胞壁成分に、生体に対し好ましくない免疫反応を引き起こすものがあるため、真菌細胞より細胞壁を取り除き、得られるプロトプラストを原料として細胞壁成分以外の抗原性、ワクチン及び／又はアレルゲンとして活性を有する物質を探索した。その結果、感染症を引き起こす真菌由来のプロトプラストより得られる細胞膜タンパク質や細胞小器官膜タンパク質を含有する不溶性画分が、意外にも強い抗原性を有しており、更に、実質的に細胞壁成分を含んでいないにも関わらずワクチンとして生の細胞と比べ同等以上の活性を有していることを明らかにした。また、この不溶性画分より界面活性剤等の可溶化剤を用いて得られる可溶化画分も強い抗原性を有しており、さらにワクチンとしても強い活性を有していることを明らかにした。
【００２８】
さらに、本発明品は数種の抗原の混合物として得られるため、特定の抗原成分単独投与よりも幅広い免疫応答が期待でき、実際従来検討されていた抗原成分のいずれよりも強いワクチン活性を有していることを明らかにした。更に該抗原はリンパ球を始めとする免疫担当細胞を刺激して細胞よりＩＦＮ−γ等のサイトカインを放出させる活性を有していることを明らかにした。なおサイトカインを放出する細胞として、例えばＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等が挙げられる。一方、アレルギー性疾患の原因真菌由来のプロトプラストより得られる不溶性画分が、強い抗原性を有しており、さらに、アレルゲンとして十分な活性を有していることを明らかにした。また、この不溶性画分より界面活性剤等の可溶化剤を用いて得られる可溶化画分も強い抗原性を有しており、アレルゲンとしても十分な活性を有していることを明らかにした。また、疾患の原因真菌由来のプロトプラストより得られる不溶性画分及び／又は不溶性画分より得られる可溶化画分が、診断用の抗原として十分な活性を有していることを明らかにした。さらにこの画分より、従来解明されていなかった抗原性を有するタンパク質を単離することに成功し、本発明を完成させた。
【００２９】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕  細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞より得られる不溶性画分であることを特徴とする真菌抗原、
〔２〕  細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞が、該真菌細胞のプロトプラスト又はスフェロプラストである前記〔１〕記載の真菌抗原、
〔３〕  不溶性画分が、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞をバーストして得られる前記〔１〕又は〔２〕記載の真菌抗原、
〔４〕  不溶性画分が、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞をバーストして得られる成分を約１０００００×ｇの条件下で遠心分離処理に付して得られる沈殿画分である前記〔１〕又は〔２〕記載の真菌抗原、
〔５〕  不溶性画分が細胞小器官を含有する前記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の真菌抗原、
〔６〕  細胞小器官がミトコンドリア、核、ライソソーム、及び液胞からなる群より選ばれる１種以上のものである前記〔５〕記載の真菌抗原、
〔７〕  不溶性画分が細胞膜タンパク質及び／又は細胞小器官の膜タンパク質を含有する前記〔１〕〜〔６〕いずれか記載の真菌抗原、
〔８〕  前記〔１〕〜〔７〕いずれか記載の不溶性画分より分別抽出される可溶化画分である真菌抗原、
〔９〕  可溶化画分が可溶性タンパク質である前記〔８〕記載の真菌抗原、
〔１０〕  界面活性剤を含有する緩衝液により分別抽出される前記〔８〕又は〔９〕記載の真菌抗原、
〔１１〕  前記〔８〕〜〔１０〕いずれか記載の真菌抗原であって、糖群特異的吸着体に対して結合性を有する真菌抗原、
〔１２〕  糖群特異的吸着体がコンカナバリンＡ固定化体である前記〔１１〕記載の真菌抗原、
〔１３〕  前記〔８〕〜〔１０〕いずれか記載の真菌抗原であって、糖群特異的吸着体に対して結合性を有しない真菌抗原、
〔１４〕  糖群特異的吸着体がコンカナバリンＡ固定化体である前記〔１３〕記載の真菌抗原、
〔１５〕  真菌細胞が、カンジダ属（Candida ）、アスペルギルス属（Aspergillus ）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、ムーコル属（Mucor ）、リゾプス属（Rhizopus）、アブシジア属（Absidia ）、ノカルジア属（Nocardia）、ヒストプラズマ属（Histoplasma ）、ブラストミセス属（Blastomyces ）、コクシジオイデス属（Coccidioides）、トリコフィトン属（Trichophyton）、ミクロスポルム属（Microsporum ）、エピダーモフィトン属（Epidermophyton）、スポロトリックス属（Sporothrix）、黒色真菌（Dematiaceous fungi）、マラセチア属（Malassezia）、ニューモシスチス属（Pneumocystis）、ペニシリウム属（Penicillium ）、アルタナリア属（Alternaria）、クラドスポリウム属（Cladosporium）、ボトリチス属（Botrytis）、オーレオバシジウム属（Aureobasidium ）、フザリウム属（Fusarium）、トリコデルマ属（Trichoderma ）、ヘルミンソスポリウム属（Helminthosporium）、ノイロスポラ属（Neurospora）、ワレミア属（Wallemia）及びロドトルラ属（Rhodotorula ）に属する真菌からなる群より選ばれる１種類以上の真菌より得られる前記〔１〕〜〔１４〕いずれか記載の真菌抗原、
〔１６〕  真菌細胞が、カンジダ  アルビカンスの少なくとも一菌株の細胞である前記〔１〕〜〔１５〕いずれか記載の真菌抗原、
〔１７〕  真菌細胞が、アスペルギルス  フミガタスの少なくとも一菌株の細胞である、前記〔１〕〜〔１５〕いずれか記載の真菌抗原、
〔１８〕  真菌細胞が、クリプトコッカス  ネオフォルマンスの少なくとも一菌株の細胞である、前記〔１〕〜〔１５〕いずれか記載の真菌抗原、
〔１９〕  真菌細胞が、トリコフィトン属、ミクロスポルム属、又はエピダーモフィトン属に属する皮膚糸状菌の一菌株の細胞である、前記〔１〕〜〔１５〕いずれか記載の真菌抗原、
〔２０〕  カンジダ  アルビカンスに由来するワクチン活性又はアレルゲン活性を有する抗原性タンパク質であって、配列表の配列番号：１に示す部分アミノ酸配列を有し、かつ分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下）が約６５，０００である抗原性タンパク質からなる真菌抗原、
〔２１〕  ワクチン活性又はアレルゲン活性を有する、配列表の配列番号：５に示すアミノ酸配列の全部又はその一部を含むペプチドからなる真菌抗原、
〔２２〕  配列表の配列番号：５に記載のアミノ酸配列、又はその一部からなるアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１つを生じさせ、かつ、ワクチン活性又はアレルゲン活性を有するペプチドからなる真菌抗原、
〔２３〕  前記〔２０〕〜〔２２〕いずれか記載の真菌抗原をコードする核酸、
〔２４〕  配列表の配列番号：７に示す塩基配列の全部又はその一部を有する、前記〔２３〕記載の核酸、
〔２５〕  前記〔２３〕又は〔２４〕記載の核酸にハイブリダイズ可能な、ワクチン活性又はアレルゲン活性を有するペプチドをコードする核酸、
〔２６〕  カンジダ  アルビカンスに由来するワクチン活性又はアレルゲン活性を有する抗原性タンパク質であって、配列表の配列番号：２に示す部分アミノ酸配列を有し、かつ分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下）が約２５，０００である抗原性タンパク質からなる真菌抗原、
〔２７〕  ワクチン活性又はアレルゲン活性を有する、配列表の配列番号：６に示すアミノ酸配列の全部又はその一部を含むペプチドからなる真菌抗原、
〔２８〕  配列表の配列番号：６に記載のアミノ酸配列、又はその一部からなるアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１つを生じさせ、かつ、ワクチン活性又はアレルゲン活性を有するペプチドからなる真菌抗原、
〔２９〕  前記〔２６〕〜〔２８〕いずれか記載の真菌抗原をコードする核酸、
〔３０〕  配列表の配列番号：８に示す塩基配列の全部又はその一部を有する、前記〔２９〕記載の核酸、
〔３１〕  前記〔２９〕又は〔３０〕に記載の核酸にハイブリダイズ可能な、ワクチン活性又はアレルゲン活性を有するペプチドをコードする核酸、
〔３２〕  カンジダ  アルビカンスに由来するワクチン活性又はアレルゲン活性を有する抗原性タンパク質であって、配列表の配列番号：３に示す部分アミノ酸配列を有し、かつ分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下）が約３０，０００である抗原性タンパク質からなる真菌抗原、
〔３３〕  カンジダ  アルビカンスに由来するワクチン活性又はアレルゲン活性を有する抗原性タンパク質であって、配列表の配列番号：４に示す部分アミノ酸配列を有し、かつ分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下）が約６２，０００である抗原性タンパク質からなる真菌抗原、
〔３４〕  （１）真菌の生細胞を得る工程、
（２）細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞を得る工程、
（３）細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞をバーストさせる工程、及び
（４）不溶性画分を得る工程、
の各工程を含むことを特徴とする、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞より得られる不溶性画分である真菌抗原の製造方法、
〔３５〕  （１）真菌の生細胞を得る工程、
（２）細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞を得る工程、
（３）細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞をバーストさせる工程、
（４）不溶性画分を得る工程、
（５）不溶性画分より可溶化画分を分別抽出する工程、
の各工程を含むことを特徴とする、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞より得られる不溶性画分を分別抽出して得られる、可溶化画分である真菌抗原の製造方法、
〔３６〕  さらに、得られる可溶化画分を糖群特異的吸着体を用いて精製する工程を設ける前記〔３５〕記載の製造方法、
〔３７〕  可溶化画分が可溶性タンパク質を含有する前記〔３５〕又は〔３６〕記載の製造方法、
〔３８〕  不溶性画分より可溶化画分を分別抽出する工程が、界面活性剤を含有する緩衝液を用いて不溶性画分を可溶化する工程を含む前記〔３５〕〜〔３７〕いずれか記載の製造方法、
〔３９〕  糖群特異的吸着体がコンカナバリンＡ固定化体である前記〔３６〕〜〔３８〕いずれか記載の製造方法、
〔４０〕  細胞壁溶解酵素処理及び／又は物理的処理により、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞を得る前記〔３４〕〜〔３９〕いずれか記載の製造方法、
〔４１〕  細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞が、該真菌細胞のプロトプラスト又はスフェロプラストである前記〔３４〕〜〔４０〕いずれか記載の製造方法、
〔４２〕  細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞をバーストして得られる成分を約１０００００×ｇの条件下で遠心分離処理に付して不溶性画分を得る前記〔３４〕〜〔４１〕いずれか記載の製造方法、
〔４３〕  前記〔１〕〜〔２２〕、〔２６〕〜〔２８〕、〔３２〕〜〔３３〕いずれか記載の真菌抗原、又は前記〔３４〕〜〔４２〕いずれか記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有する生物学的製剤、
〔４４〕  前記〔１〕〜〔２２〕、〔２６〕〜〔２８〕、〔３２〕〜〔３３〕いずれか記載の真菌抗原、又は前記〔３４〕〜〔４２〕いずれか記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とする、個体に投与して真菌に対する感染防御免疫を誘導し又は治療効果を有する医薬組成物、
〔４５〕  前記〔１〕〜〔２２〕、〔２６〕〜〔２８〕、〔３２〕〜〔３３〕いずれか記載の真菌抗原、又は前記〔３４〕〜〔４２〕いずれか記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とする、個体に投与して真菌に対する感染防御免疫を誘導し又は治療効果を有するワクチン組成物、
〔４６〕  前記〔４５〕記載のワクチン組成物を投与することを含む、真菌に対する脊椎動物の免疫応答を刺激する方法、
〔４７〕  ワクチン組成物の投与対象となる脊椎動物において、該免疫応答によりワクチン組成物の製造に使用した真菌及び／又はその近縁菌の増殖を抑制し、該真菌及び／又はその近縁菌に起因する疾病を予防または治療する前記〔４６〕記載の方法、
〔４８〕  前記〔１〕〜〔２２〕、〔２６〕〜〔２８〕、〔３２〕〜〔３３〕いずれか記載の真菌抗原、又は前記〔３４〕〜〔４２〕いずれか記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とするサイトカイン放出剤、
〔４９〕  前記〔１〕〜〔２２〕、〔２６〕〜〔２８〕、〔３２〕〜〔３３〕いずれか記載の真菌抗原、又は前記〔３４〕〜〔４２〕いずれか記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とする、個体に投与して真菌に対するアレルギー性疾患を予防し又は治療効果を有するアレルゲン組成物、
〔５０〕  前記〔４９〕記載のアレルゲン組成物を投与することを含む、真菌に対する脊椎動物のアレルギー反応を抑制する方法、
〔５１〕  アレルゲン組成物の投与対象となる脊椎動物において、該免疫応答によりアレルゲン組成物の製造に使用した真菌及び／又はその近縁菌に起因するアレルギー性疾患を予防または治療する前記〔５０〕記載の方法、
〔５２〕  前記〔１〕〜〔２２〕、〔２６〕〜〔２８〕、〔３２〕〜〔３３〕いずれか記載の真菌抗原、又は前記〔３４〕〜〔４２〕いずれか記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とする、該真菌による疾患の診断用組成物、
〔５３〕  前記〔５２〕記載の診断用組成物を使用することを含む、真菌による脊椎動物の疾患を診断する方法、に関するものである。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の真菌抗原は、真菌を原因とする、感染症に対して有効性の高いワクチン、アレルギー性疾患の減感作治療用組成物、サイトカイン放出剤、疾患の診断薬などの生物学的製剤として利用できる。すなわち、本発明の真菌抗原は、ワクチン効果で比較した場合、生菌免疫と同等の効果を示し、従来の真菌抗原に比べかなり優れている。また本発明の真菌抗原は安全性の面でも、生菌を含まない、毒性が低い他、細胞壁成分の含量が低いため、ワクチンや減感作治療用製剤に利用した場合、マンナン、グルカン等の細胞壁成分による副作用を抑え、個体に有利な免疫反応を強化することができる。また、アレルギー性疾患の検査においても、高感度である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明を説明する。
本発明の真菌抗原は、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞より得られる不溶性画分であることを特徴とするものである。かかる真菌抗原は、例えば生物学的製剤として使用される。本発明の真菌抗原は、感染症の原因真菌又はアレルギー性疾患の原因真菌より得られるものであり、感染症の原因真菌に由来するものは、脊椎動物に獲得自動免疫を誘導しうるものであるため、特にワクチン組成物として好適に使用できる。一方、アレルギー性疾患の原因真菌に由来するものは、脊椎動物の減感作に利用することができ、アレルギー性疾患の予防及び治療に好適に使用できる。さらに、かかる真菌抗原は、真菌による疾患の診断に好適に使用できる。
【００３２】
１．真菌細胞について
本発明で使用される真菌としては、ヒト、動物を始めとする脊椎動物に病原性を有する真菌又はその真菌と近縁のものであれば特に限定はない。例えば、カンジダ属（Candida ）、アスペルギルス属（Aspergillus ）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、ムーコル属（Mucor ）、リゾプス属（Rhizopus）、アブシジア属（Absidia ）、ノカルジア属（Nocardia）、ヒストプラズマ属（Histoplasma ）、ブラストミセス属（Blastomyces ）、コクシジオイデス属（Coccidioides）、トリコフィトン属（Trichophyton）、ミクロスポルム属（Microsporum ）、エピダーモフィトン属（Epidermophyton）、スポロトリックス属（Sporothrix）、黒色真菌（Dematiaceous fungi）、マラセチア属（Malassezia）、ニューモシスチス属（Pneumocystis）、ペニシリウム属（Penicillium ）、アルタナリア属（Alternaria）、クラドスポリウム属（Cladosporium）、ボトリチス属（Botrytis）、オーレオバシジウム属（Aureobasidium ）、フザリウム属（Fusarium）、トリコデルマ属（Trichoderma ）、ヘルミンソスポリウム属（Helminthosporium）、ノイロスポラ属（Neurospora）、ワレミア属（Wallemia）、及びロドトルラ属（Rhodotorula ）に属する真菌からなる群より選ばれる１種類以上の真菌が挙げられる。
【００３３】
本発明における脊椎動物の真菌感染症としては、ヒトの場合、カンジダ症、アスペルギルス症、クリプトコッカス症、ムーコル症、放線菌症、ヒストプラズマ症、ブラストミセス症、各種皮膚真菌症、癜風、カリニ肺炎等が挙げられる。したがって、本発明において、ワクチン組成物に用いられる真菌は、かかる真菌感染症の原因菌であることが有用性の観点から好ましい。
【００３４】
具体的には、カンジダ症原因菌であるカンジダ  アルビカンス、カンジダ  トロピカリス（ C. tropicalis）、カンジダ  グラブラタ（Candida glabrata  ）等；アスペルギルス症原因菌であるアルペルギルス  フミガタス、アスペルギルス  フラブス（Aspergillus flavus  ）等；クリプトコッカス症原因菌であるクリプトコッカス  ネオフォルマンス等；ムーコル症原因菌であるムーコル  エスピー（Mucor sp. ）、アブシジア  エスピー（Absidia sp. ）、リゾプス  エスピー（Rhizopus sp.）；放線菌症原因菌であるノカルジア  アステロイデス（Nocardia asteroides ）等；その他内臓に真菌感染症を起こす原因菌であるトリコスポロン  クタネウム（Trichosporon cutaneum ）、ロドトルラ  グルチニス（Rhodotorula glutinis）、ゲオトリクム  カンジズム（Geotrichum candidum ）、ニューモシスティス  カリニ（Pneumocystis carinii）、コクシジオイデス  イミチス（Coccidioides immitis）、パラコクシジオイデス  ブラシリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis ）、ヒストプラズマ  カプスラツム（Histoplasma capsulatum）、ブラストミセス  デルマチチディス（ Blastomyces dermatitidis ）等；皮膚糸状菌（デルマトフィテス（Dermatophytes ））であるトリコフィトン属（トリコフィトン  メンタグロフィテス（Tricophyton mentagrophytes  ）、トリコフィトン  ルブルム（Tricophyton rubrum  ）、トリコフィトン  ベルコーサム（Tricophyton verrucosum  ））、ミクロスポルム属（ミクロスポルム  カニス（Microsporum canis ）、ミクロスポルム  ジプセウム（Microsporum gypseum ））、エピダーモフィトン  エスピー（Epidermophyton sp.）；黒色真菌（デマチアセウス  フンギ（Dematiaceous fungi））であるフィアロフォラ  エスピー（Phialophora sp. ）、クラドスポリウム  エスピー（Cladosporium sp.）；癜風菌であるマラセチア  ファーファー（Malassezia furfur ）；その他皮膚真菌症原因菌としてはスポロトリックス  シェンキ（Sporothrix schenckii）、フォンセカエア  ペドロソイ（Fonsecaea pedrosoi）等が挙げられる。
【００３５】
使用される菌株としては、治療または予防しようとする真菌症の原因菌と近縁のものであれば特に限定されないが、病原性（例えばマウスに対する致死毒性）を有する菌株が望ましい。使用される菌株の代表例としては、カンジダ症に対しては、例えば、カンジダ  アルビカンスATCC 10231、TIMM 1768 、TIMM 0239 ；アスペルギルス症に対しては、アスペルギルス  フミガタス ATCC 28212, ATCC 42202, TIMM 1776；クリプトコッカス症に対してはクリプトコッカス  ネオフォルマンス ATCC 24067 、TIMM 0354 、夾膜欠損したクリプトコッカス  ネオフォルマンス  TIMM0357が挙げられる。
【００３６】
また細胞よりのサイトカイン放出を目的として使用される場合、真菌抗原としては健常人においても免疫感作を受けている常在真菌由来であることが好ましく、特にカンジダ  アルビカンス由来の抗原が好ましい。
【００３７】
一方、アレルギー反応の抑制に使用される場合、本発明のアレルゲン組成物に含有される真菌抗原の調製に用いられる真菌は、ヒトに対しアレルギー症状を惹起する原因菌であることが有用性の観点から好ましい。
【００３８】
具体的には、カンジダ属真菌であるカンジダ  アルビカンス、カンジダ  トロピカリス、カンジダ  グラブラタ、カンジダ  ボイディニイ（Candida boidinii）等；アスペルギルス属真菌であるアスペルギルス  フミガタス、アスペルギルス  レストリクツス（Aspergillus restrictus）、アスペルギルス  ヴェルシコラ（Aspergillus versicolor）等；トリコフィトン属真菌であるトリコフィトン  メンタグロフィテス（Trichophyton mentagrophytes ）；マラセチア属真菌であるマラセチア  ファーファー；ムーコル属真菌であるムーコル  ラセモサス（Mucor racemosus ）；リゾプス属真菌であるリゾプス  オリザエ（Rhizopus oryzae ）；ペニシリウム属真菌であるペニシリウム  ノタタム（Penicillium notatum ）；アルタナリア属真菌であるアルタナリア  アルタナタ（Alternaria alternata）、アルタナリア  キクチアナ（Alternaria kikuchiana ）；クラドスポリウム属真菌であるクラドスポリウム  クラドスポリオイデス（Cladosporium cladosporioides）、クラドスポリウム  カリオニイ（Cladosporium carionii ）；ボトリチス属真菌であるボトリチス  シネラ（Botrytis cinerea）；オーレオバシジウム属真菌であるオーレオバシジウム  プルランス（Aureobasidium pullulans ）；フザリウム属真菌であるフザリウム  オキシスポルム（Fusarium oxysporum）；トリコデルマ属真菌であるトリコデルマ  ヴィリダエ（Trichoderma viridae ）；ヘルミンソスポリウム属真菌であるヘルミンソスポリウム  マイジス（Helminthosporium maydis ）；ノイロスポラ属真菌であるノイロスポラ  クラサ（Neurospora crassa ）；ワレミア属真菌であるワレミア  セビ（Wallemia sebi ）；ロドトルラ属真菌であるロドトルラ  グルチニス（Rhodotorula glutinis）等が挙げられる。
【００３９】
使用される菌株としては、治療または予防しようとするアレルギー症の原因菌と近縁のものであれば特に限定されない。代表例としては、カンジダ抗原を調製するためには、カンジダ属真菌、例えばカンジダ  アルビカンス ATCC 10231 、同TIMM 1768 、カンジダ  ボイディニイ  ATCC 18810；アスペルギルス抗原を調製するためは、アスペルギルス属真菌、例えばアスペルギルス  フミガタス ATCC 28212 、同TIMM 1776 、アスペルギルス  レストリクス ATCC 16912 ；アルタナリア抗原を調製するためは、アルタナリア属真菌、例えばアルタナリア  アルタナ IFO 31188；マラセチア抗原を調製するためは、マラセチア属真菌、例えばマラセチア  ファーファー ATCC 14521 、同TIMM 2782 が挙げられる。
【００４０】
本発明において、真菌を原因とする疾患の診断に使用される真菌抗原の場合、用いられる真菌は、疾患の原因となる上記の真菌が好ましい。
【００４１】
２．真菌抗原について
本明細書において、「細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞」における「細胞壁を実質的に除去した真菌細胞」とは、該真菌細胞のプロトプラストないしはプロトプラスト様のものをいう。また、「細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞」とは、スフェロプラストないしはスフェロプラスト様のものをいう。即ち、細胞壁を実質的に除去した真菌細胞の典型的なものは、該真菌細胞のプロトプラストであり、細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞の典型的なものは該真菌細胞のスフェロプラストである。したがって、「細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞より得られる不溶性画分」とは、不溶性画分が該真菌細胞のプロトプラスト又はスフェロプラスト等より得られるものであることを意味する。
【００４２】
また、「細胞壁の少なくとも一部を除去」するとは、細胞壁構成成分である、例えばマンナン、グルカンを、細胞壁としての機能である形態の維持、低張液に対する浸透圧耐性を失わせる程度に除去することであり、同時に細胞壁成分に起因した副作用が少なくとも生じない程度に細胞壁を除去することをいう。本発明においては、真菌細胞は細胞壁を実質的に除去したものを用いることが好ましいが、生体に投与した場合、細胞壁由来の成分が生体に対し悪影響、例えば過敏症、致死作用を示さなければ、細胞壁成分が一部残存したものを用いても良い。不溶性画分は、具体的には細胞膜、細胞小器官（ミトコンドリア、核、ライソソーム、液泡等）、および細胞小器官膜といった、比較的大きい細胞内構造体と共に、細胞膜に結合したタンパク質や細胞小器官の膜に結合したタンパク質を含有する。なお、本発明における不溶性画分は、上記の成分を全て含有する必要はなく、少なくとも一成分を含有するものであれば良い。
【００４３】
さらに、この不溶性画分には、リン脂質や糖脂質をはじめとする脂質、糖質、核酸等が含有されていてもよい。さらに、細胞壁の一部が残存している真菌細胞を用いた場合、本発明の真菌抗原を生体に投与した際、細胞壁由来の成分が量的に又は質的に生体に対し悪影響、例えば過敏症、致死作用を示さなければ、細胞壁由来の成分を含有していても良い。これら細胞壁由来抗原成分の混入量は、例えば、後述の実施例で示すように細胞壁成分に対する抗血清を用いた凝集反応に対する、阻害活性の測定等により定量することができる。
【００４４】
かかる本発明における不溶性画分は、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞を例えばバーストすることにより得ることができる。さらには、上記のようにバーストして得られる成分を約１０００００×ｇの条件下で遠心分離処理に付して得られる沈殿画分を不溶性画分として用いることもできる。
【００４５】
さらに、本発明の真菌抗原は、本発明における不溶性画分より分別抽出される可溶化画分であっても良い。該可溶化画分には主として抗原性のある可溶性タンパク質が含有されている。その他、糖質、脂質も含有されていてもよい。可溶化画分は、例えば、精製工程において濾過滅菌を実施することができ、熱や有機溶媒による滅菌操作に対し不安定な抗原成分を、可溶化工程により活性を維持した状態で調製することが可能になる。かかる可溶化画分は、可溶化剤を含有する緩衝液、例えば界面活性剤を含有する緩衝液を用いて分別抽出することにより得ることができる。
【００４６】
さらに、本発明の真菌抗原は、目的に応じた分離精製手段により不溶性画分又は可溶化画分をさらに精製した画分であっても良い。例えば、カンジダ  アルビカンス TIMM1768 を原材料として得られる可溶化画分を、糖群特異的吸着体を用いて得られる、該吸着体に対して結合性を有する分子を含有する画分も、本発明の真菌抗原として使用することができる。糖群特異的吸着体としては、例えば、コンカナバリンＡ（ConA）固定化体が挙げられる。ConAは、α−Ｄ−マンノピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、及びこれらに立体的に類似した糖残基を含む分子と結合するため、ConA固定化樹脂により、可溶化画分に含まれる成分を、各成分に含有される糖残基の違いにより、いくつかの画分にさらに分離することができる。例えば、カンジダ  アルビカンスTIMM1768可溶化画分より分離される、ConA結合性の画分（ConA結合性糖残基を有するタンパク質含量の高い画分）は、マウスに投与した場合、充分な感染防御活性を示す。
【００４７】
一方、糖群特異的吸着体に対して結合性を有しない分子よりなる画分にも各種の本発明の真菌抗原が存在する。即ち、本発明の真菌抗原としては、更に上記の様にして得られる糖群特異的吸着体に対して結合性を有しない分子よりなる画分も含むものであり、さらにこの画分を精製して得られる画分であってもよい。例えば、カンジダ  アルビカンスTIMM1768由来のConA非結合画分を、更にイオン交換クロマトグラフィー等に付すことにより、配列表の配列番号：１に示す部分アミノ酸配列を有し、分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下）約６５，０００を示す抗原性タンパク質、配列表の配列番号：２に示す部分アミノ酸配列を有し、分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下）約２５，０００を示す抗原性タンパク質、配列表の配列番号：３に示す部分アミノ酸配列を有し、分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下）約３０，０００を示す抗原性タンパク質、配列表の配列番号：４に示す部分アミノ酸配列を有し、分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下）約６２，０００を示す抗原性タンパク質を含有する精製画分が得られる。精製画分或いは単離された抗原性タンパク質は本発明の真菌抗原として用いられるものであり、真菌を原因とする疾患の治療、診断に有用である。特に単離された抗原性タンパク質は、診断における原因抗原の同定等の面で有用である。
【００４８】
これらの抗原性タンパク質は、カンジダ  アルビカンスに由来するものであり、カンジダ  アルビカンスによる感染症に対するワクチン活性、又はカンジダ  アルビカンスによるアレルギー症状の予防・治療に有用なアレルゲン活性を有する。本明細書において、ワクチン活性とは本発明の真菌抗原を用いて常法により調製されたワクチンがワクチンとして有効な薬理作用を発揮することを意味し、アレルゲン活性とは、アレルギー患者の血清を用いた、ＲＡＳＴ法等による本発明の真菌抗原に対するＩｇＥ抗体価測定試験において、異常高値を示すこと、又は本発明の真菌抗原を用いた皮膚テストにおいて陽性反応を示す作用を有することを意味する。
【００４９】
さらに、本発明は、前記のような単離された抗原性タンパク質と免疫学的に同等の性質を有する機能的同等物をも本発明の真菌抗原として包含する。例えば、各種カンジダ  アルビカンス、更にカンジダ  アルビカンス以外のカンジダ属真菌の機能的同等物も本発明に含まれる。即ち、上記４種の抗原性タンパク質のうち、分子量約６５，０００の抗原性タンパク質はサッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のミトコンドリア局在ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ＤＬＤＨ）と、分子量約２５，０００の抗原性タンパク質はサッカロマイセス  セレビシエのミトコンドリア局在スーパーオキサイドジスムダーゼ（ＳＯＤ）と、分子量約３０，０００の抗原性タンパク質はサッカロマイセス  セレビシエのシトレートシンターゼ（citrate synthase）と、分子量約６２，０００の抗原性タンパク質はサッカロマイセス  セレビシエの液胞型アミノペプチダーゼＩ（vacuolar aminopeptidase I ）とホモロジーを有するが、ワクチン活性及び／又はアレルゲン活性等の免疫学的性質が同等の抗原も本発明に包含される。
【００５０】
ここで、免疫学的に同等の性質を有する機能的同等物とは、１又は２以上のアミノ酸が置換、挿入、欠失又は付加されたタンパク質であって、ワクチン活性及び／又はアレルゲン活性等の免疫学的性質が同等のものをいう。
【００５１】
また、単離された抗原性タンパク質を基に、抗原性断片を作成することもできる。抗原性断片を作製するには、例えば、単離された抗原性タンパク質を原料として、リシルエンドペプチダーゼ、トリプシン等のプロテアーゼによる酵素消化、臭化シアン等による化学的処理による切断後、目的の抗原性を有する断片をタンパク質の精製において既知の方法により単離精製することにより得ることができる。更に、抗原性断片の化学構造に関する情報を基に、ペプチド合成技術を利用して化学合成による製造も可能である。本発明の抗原性断片には、哺乳類、特にヒトにおける免疫応答、例えば最小量のＩｇＥの刺激、ＩｇＥの結合、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体の生産の誘起、又は増殖などのＴ細胞応答及び／又はリンホカイン分泌及び／又はＴ細胞アナージー誘導などを引き起こす作用を有する、真菌由来の抗原性タンパク質の断片が含まれる。
【００５２】
抗原性断片の抗原性は、ヒトのボランティアへの皮膚試験、皮内試験の他、ＲＡＳＴ、ＥＬＩＳＡ、又はヒスタミン遊離などの試験管内試験においても評価することができる。
【００５３】
なお、真菌抗原の安定性の強化及び／又は所望の反応性の強化、すなわち治療目的からすれば、個体防御免疫能の誘導強化や、アレルギー反応を減弱化または酵素活性を消失させるのに、また診断目的からすれば、抗原と抗体の特異的結合の強化を行うために、抗原性タンパク質或いは抗原性断片を改変し、誘導体化したり、ポリエチレングリコール（PEG)法[Wie et al,Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., Vol.64, 84-99,(1981)] を用いてＰＥＧと結合させることができる。タンパク質の改変には、ピリジルエチル化、還元、アルキル化、アシル化、適当な担体への化学的カップリング、温和なホルマリン処理、又は塩酸グアニジン処理も含まれる。
【００５４】
一方、単離された抗原性タンパク質の部分アミノ酸配列の情報をもとに、ＰＣＲ等により該抗原をコードする核酸を単離することができる。以下にその一例について述べる。
【００５５】
まず目的抗原性タンパク質を発現している細胞よりｃＤＮＡライブラリーを作成する。次に該抗原性タンパク質を発現している細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とし、抗原性タンパク質の部分アミノ酸配列をコードすると推定される核酸塩基配列を基に設計された増幅用プライマーとなるオリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドと増幅用プライマー対を形成しうる適当なオリゴヌクレオチドを用いＰＣＲを行う。該ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片をプローブとしたハイブリダイゼーションによりｃＤＮＡライブラリーから目的とする抗原性タンパク質をコードするＤＮＡを選択することが出来る。例えば、配列表の配列番号：１に記載したアミノ酸配列情報、カンジダ  アルビカンスＴＩＭＭ１７６８のｃＤＮＡライブラリー及びカンジダ  アルビカンスＴＩＭＭ１７６８のゲノムＤＮＡを用いた上記方法により配列表の配列番号：５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、配列表の配列番号：７に示す塩基配列を有するＤＮＡを単離することが出来る。
【００５６】
また目的抗原性タンパク質を発現している細胞のＲＮＡ及び抗原性タンパク質の部分アミノ酸配列をコードすると推定される核酸塩基配列を基に設計された増幅用プライマー等を用いたＲＴ−ＰＣＲによっても該抗原性タンパク質をコードする核酸を単離することが出来る。例えば、配列表の配列番号：２に記載したアミノ酸配列情報及びカンジダ  アルビカンスＴＩＭＭ１７６８のＲＮＡを用いた上記方法により配列表の配列番号：６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、配列表の配列番号：８の塩基配列を有するＤＮＡを単離することができる。
【００５７】
なお、本発明において配列表の配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる真菌抗原をコードする核酸は配列表の配列番号：７に示す塩基配列を有する核酸に特に限定されない。同様に配列表の配列番号：６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質からなる真菌抗原をコードする核酸も、配列表の配列番号：８に示す塩基配列を有する核酸に特に限定されない。即ち遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組み合わせ）はアミノ酸の種類ごとに１〜６種類ずつが存在することが知られている。したがってあるアミノ酸配列をコードする核酸はそのアミノ酸配列にもよるが多数存在することができる。核酸は自然界において決して安定に存在しているものではなく、その塩基配列に変異が起こることはまれではない。核酸上に起こった変異がそこにコードされるアミノ酸配列には変化を与えない場合（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる核酸が生じたといえる。したがってある特定のアミノ酸配列をコードする核酸が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の核酸ができていく可能性は否定できない。さらに同じアミノ酸配列をコードする多種類の核酸を人為的に作製することは種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。
【００５８】
たとえば遺伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコードする本来のＤＮＡ上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的タンパク質の高発現を図ることが行われている（たとえば特公平７−１０２１４６号）。このように特定のアミノ酸配列をコードする多種類の核酸は人為的に作成可能なことは言うまでもなく、自然界においても生成されうるものである。
【００５９】
更に本発明における真菌抗原をコードする核酸には、配列表の配列番号：５又は６の塩基配列の全部又はその一部からなる核酸にハイブリダイズ可能で、該核酸にコードされるペプチドが本発明の真菌抗原と同等のワクチン活性又はアレルゲン活性を有する核酸も包含される。ハイブリダイズ可能とは以下の条件が例示される。
【００６０】
すなわち、ＤＮＡを固定したメンブレンを０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を示す）中で、５０℃にて１２〜２０時間、プローブとともにインキュベートする。インキュベーション終了後、０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、３７℃での洗浄から始めて、ＳＳＣ濃度は０．１倍までの範囲で、また、温度は５０℃までの範囲で変化させ、固定されたＤＮＡ由来のシグナルがバックグラウンドと区別できるようになるまでメンブレンを洗浄したうえ、プローブの検出を行う。
【００６１】
上記核酸を利用すれば、遺伝子工学的手法により大腸菌、酵母、カビ、哺乳類細胞等において組み換えタンパク質として抗原性タンパク質を製造することが出来る。また該核酸の一部を用いることにより、該抗原性タンパク質の抗原性断片を遺伝子工学的手法により製造することが出来る。
【００６２】
上記遺伝情報が得られれば、当然、抗原性タンパク質の機能的同等物を、抗原性タンパク質をコードする核酸の特定部位の突然変異誘発を用い、既知の方法により抗原性タンパク質の構造を改変し、得ることができる。例えば、タンパク質をコードする核酸の１又は２以上の塩基の置換、挿入、欠失又は付加によってアミノ酸残基の置換、挿入、欠失又は付加を起こすことができる。具体的には、配列表の配列番号：５あるいは配列番号：６に記載のアミノ酸配列、又はその一部からなるアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１つを生じさせ、かつ、ワクチン活性又はアレルゲン活性を有するペプチドからなる真菌抗原は、本発明の抗原性タンパク質の変異体であり機能的同等物の一例として本発明の範囲内である。さらに、生物活性を保持したままの変異体を選択することも可能である。
【００６３】
なお本発明の真菌抗原をコードする核酸には、本発明における抗原性タンパク質の抗原性断片や前記のような抗原性タンパク質の変異体をコードする核酸も包含される。  
【００６４】
該変異体の作製方法としては、ギャップド・デュプレックス法[Wilfried,K. et al.,Nucleic Acids Research,Vol.12, 24, 9441-9456(1984)] 、デレーション法[Celeste,Y.P. et al.,Gene,Vol.33, 103-119, 1985)、ＰＣＲ法(Gene,Vol.102, 67-70,(1991)]、ウラシルＤＮＡ法[Thomas,A.K. et al.,Methods in Enzymology,Vol.154, 367-382(1987)] やカセット変異法[James,A.W. et al.,Gene,Vol.34, 315-323(1985)]等が知られている。
【００６５】
本発明の真菌抗原（実施例１におけるCa-LSP）の毒性は低く、２０ｍｇ／ｋｇをマウスの静脈内に投与しても、全く異常は認められないものである。
【００６６】
３．真菌抗原の製造方法
細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞より得られる不溶性画分である真菌抗原を製造する方法としては、例えば、
（１）真菌の生細胞を得る工程、
（２）細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞を得る工程、
（３）細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞をバーストさせる工程、
（４）不溶性画分を得る工程、
といった工程を含む製造方法が挙げられる。
【００６７】
工程（１）
工程（１）は、真菌の生細胞を得る工程である。より具体的には、真菌を生育に適した培地で培養し、新鮮な真菌の生細胞を得る工程である。
【００６８】
まず、真菌の培養は、各々に適した炭素源、窒素源、その他の栄養源を含む栄養培地で、生育可能な温度、条件で実施すればよい。通常、真菌の培養に用いられる栄養培地としては、サブロー培地、ポテトデキストロース培地、ツァペックドックス培地、麦芽培地、イーストニトロゲンベース・グルコース合成培地等が広く用いられる。必要に応じて、血清や血清アルブミンを添加してもよい。また、癜風菌のようにオリーブオイル等を添加した培地が生育に適している真菌もある。培養温度は、15〜45℃位が一般的であるが、真菌によっては、培養温度により形態が変化する（二形性真菌と言われるものが多い）ものもあり、適宜選択する必要がある。例えば、カンジダ  アルビカンスの場合、25〜37℃が好適に使用される培養温度であるが、30℃前後では通常の培地では酵母状の生育をするが、37℃付近では菌糸状の生育をしやすい。二形性の真菌では、細胞壁構成成分、膜タンパク質を含む細胞内タンパク質等のタンパク質成分も変化するため、目的に応じて培養条件を変えてもよい。真菌は、通常の培養条件では凝集したり菌塊を形成し不均一な細胞懸濁液になるものが多く、この場合、次工程で細胞壁溶解酵素等を充分に作用させることができない。そこで、なるべく均一な細胞懸濁液を得るために、培養方法を工夫してもよい。例えば、アスペルギルス  フミガタスの場合、０．５〜１ＭのＮａＣｌを培地に添加する等、塩濃度を高めることで解消される。また、真菌としては上記に記載の真菌が挙げられる。
【００６９】
工程（２）
工程（２）は、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞を得る工程である。細胞壁の除去の程度は少なくとも浸透圧に感受性を示す程度であれば良いが、更にプロトプラストの形態になるまで細胞壁を除去するのが好ましい。よって、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞としては、該真菌細胞のプロトプラスト又はスフェロプラストが好ましい。
【００７０】
細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞を得るには、例えば、真菌細胞に細胞壁溶解酵素を作用させたり、真菌細胞を物理的に処理することにより達成できる。また、細胞壁溶解酵素処理と物理的処理とは併用しても良い。
【００７１】
細胞壁溶解酵素としては種々のものが知られているが、市販の製品としてはザイモリエース（生化学工業社製）、リチカーゼ（シグマ社製）、ヤタラーゼ（大関−宝酒造社製）、キチナーゼ（宝酒造社製）、トリコデルマ  ライジングエンザイム（ノボ−シグマ社製）、カタツムリ腸管消化酵素β−グルクロニダーゼ（シグマ社製）、ラミナリアーゼ（シグマ社製）等がある。これらの酵素は、各種の細胞壁多糖（キチン、β1,3-グルカン、マンナン、ガラクトマンナン、キシログルカン等）の溶解酵素よりなり、さらにプロテアーゼも含有しているものが多い。
【００７２】
真菌細胞の細胞壁を溶解し、浸透圧に感受性の裸の細胞、例えばプロトプラストを調製するためには、まず、培養により得られた新鮮な細胞を洗浄後、0.8 〜1.5Mのソルビトールやマンニトール、ＮａＣｌを含有する高張緩衝液中に懸濁する。これに必要量の細胞壁溶解酵素を、酵素に適した温度、緩衝液、ｐＨで１０分間〜数時間作用させ、細胞壁を除去する。この際、プロテアーゼを作用させることにより細胞壁をよりきれいに除去することができる場合もある。真菌によってはプロテアーゼを作用させる必要がない場合もあり、その際はPMSF、ペプスタチン等のプロテアーゼインヒビターを加えてもよい。
【００７３】
また、物理的処理方法としては、例えば２．５Ｍのショ糖溶液のような高張緩衝液中で目的菌体を懸濁することにより原形質分離を起こさせ、ナイフで細胞壁を切り取る方法がある。
【００７４】
工程（３）
工程（３）は、工程（２）で得られる、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞をバーストさせる工程である。細胞をバーストさせる方法として、例えば、超音波処理、フレンチプレスによる処理の他、浸透圧差を利用した低張液処理がある。低張液処理でバーストさせるには、まず細胞を高張液で充分洗浄した後、低張液、即ち生理食塩水またはイオン強度が低い緩衝液（例えば、カンジダ  アルビカンスTIMM 1768 の場合、生理食塩水）に懸濁することにより実施できる。使用される緩衝液としては、例えば、ｐＨ５〜８のリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等が挙げられる。細胞小器官をなるべく傷つけずに回収しようとする場合、イオン強度を適当に選択すればよい。例えば、ミトコンドリアを菌体内と同様の機能を有する状態で調製しようとする場合、例えば、０．５〜０．６Ｍのソルビトールや０．２５Ｍのショ糖を含有する緩衝液中で超音波やワーリングブレンダーやフレンチプレス等で処理することにより、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した細胞をバーストさせ、ミトコンドリアを菌体内と同様の機能を有する状態のまま得ることができる。
【００７５】
工程（４）
工程（４）は、不溶性画分を得る工程である。
工程（３）で得られる、バーストして得られる成分を、遠心分離又はろ過することにより沈殿や残存物を得、このものを不溶性画分とする。バーストして得られる成分は必要に応じて超音波又はガラスビーズによりさらに細かく破砕してもよい。
【００７６】
不溶性画分を得るための遠心分離の条件としては特に限定されるものではないが、好ましくは約１０００００×ｇ以下、より好ましくは１００００×ｇ以下であり、遠心分離の時間は好ましくは１０分間〜３時間である。
【００７７】
１００００×ｇ以下の遠心分離で沈殿として回収されるものとしては細胞膜及びミトコンドリア、核、ライソソーム、液泡等の細胞小器官がある。また、細胞膜タンパク質や細胞小器官膜タンパク質は、膜に結合した状態で沈殿として得られる。
【００７８】
１０００００×ｇで１時間程度遠心分離すると、リボソームも沈殿として回収されるが、これも含有していてもよい。また、遠心分離の条件を変化させ、各々の細胞小器官をある程度分離することもできる、例えば、１０００×ｇ程度の遠心分離で核を分離することもできる。また、ショ糖等を用いた密度勾配遠心分離により上記の細胞小器官を分離精製することもできる。ろ過により不溶性画分を回収したり、粒子の大きさによりある程度分別することも可能である。
【００７９】
このようにして得られる不溶性画分は、真菌細胞のプロトプラスト又はスフェロプラスト等の、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞から得られるものであるため、不溶性画分中に混入し得る細胞壁成分の量は少ないものである。例えば、本発明の不溶性画分中の細胞壁成分の量は、細胞壁成分を抗原とする、抗原抗体反応を利用することにより定量することができる。より具体的には、後述の実施例で示すように例えば真菌細胞としてカンジダ  アルビカンスTIMM 1768 を用いる場合、抗カンジダ血清である因子血清No.1（ヤトロン製）を用いて不溶性画分中の血清型Ａマンナンを定量することができる。このようにして測定される血清型Ａマンナンの量は、検出限界値（0.5mg/mL）以下であるのが好ましい。
【００８０】
上記のようにして得られる不溶性画分は、エタノール、イソプロパノール、フェノール、アセトニトリル等の有機溶媒による洗浄及び殺菌処理、または加熱処理による殺菌処理をすることもできる。
【００８１】
本発明における不溶性画分は、上記のようにして得ることができる。また、本発明においては、かかる不溶性画分を分別抽出して得られる可溶化画分も真菌抗原である。可溶化画分は、例えば以下のような工程を含む製造方法により得ることができる。
（１）真菌の生細胞を得る工程、
（２）細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞を得る工程、
（３）細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞をバーストさせる工程、
（４）不溶性画分を得る工程、
（５）不溶性画分より可溶化画分を分別抽出する工程。
【００８２】
本発明においては、さらに所望により工程（６）として可溶化画分は、目的に応じ通常の分離精製手段により分離精製してもよい。
上記の工程のうち、工程（１）〜工程（４）は、不溶性画分の製造方法と同じである。但し、本製造工程で使用する不溶性画分中の細胞壁成分は、臨床的に使用できる程度まで除去されていることが好ましいが、必ずしも不溶性画分そのものを真菌抗原として用いる場合の除去の程度と同等である必要はない。というのは、真菌細胞の細胞壁にはグルカン、キチン等が多く含まれており、これらの中には、例えば、界面活性剤により可溶化されない成分もあり、これらの成分は次の可溶化画分を得る工程で除去することができるからである。以下、工程（５）および工程（６）について説明する。
【００８３】
工程（５）
工程（５）は、不溶性画分より可溶化画分を分別抽出する工程である。分別抽出には一般に使用される可溶化方法を用いることができる。可溶化剤としては、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ等の塩、ＥＤＴＡ等のキレート剤、ブタノール等の有機溶媒や、尿素等のタンパク質変性剤を溶解した緩衝液等を用いることができるが、可溶化成分の安定性、及び抽出効率の面から界面活性剤を含有した緩衝液を用いることが好ましい。また充分な抽出効果が得られない場合、上記の有機溶媒やタンパク質変性剤を併用しても良い。一般的には、工程（４）にて得られる不溶性画分を、適当な界面活性剤等の可溶化剤を含有する緩衝液で一定時間懸濁後、遠心分離処理や濾過により不溶性成分を除去することにより可溶化画分を得ることができる。したがって、本明細書において可溶化画分には、不溶性画分に付随する水溶性成分、例えば細胞小器官内水溶性成分等、及び／又は可溶化処理にて可溶化される成分、例えば細胞膜タンパク質、脂質等が含有される。また、臨床的に使用可能な界面活性剤を使用すれば、かかる界面活性剤を除去することなく、該可溶化画分をそのまま真菌抗原として用いることができる。
【００８４】
本発明で使用する不溶性画分に含まれる膜タンパク質等の可溶化に用いる界面活性剤としては、オクチルチオグルコシド、Lubrol PX,Triton X-100,Nonidet P-40 等が好ましい。また臨床的に使用可能な界面活性剤としてはイオン性（陰イオン性、陽イオン性、両性）界面活性剤（例えばアルキルスルホネート、塩化ベンザルコニウム等）及び非イオン性界面活性剤（例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル類、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類等）が含まれる。本発明で使用する界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油としては、例えばＮＩＫＫＯＬ  ＨＣＯ−４０、ＨＣＯ−５０、ＨＣＯ−６０（日光ケミカルズ社製）、ユニオックスＨＣ−４０、ＨＣ−５０、ＨＣ−６０（日本油脂社製）などが挙げられる。
【００８５】
ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル類としては、例えばＮＩＫＫＯＬ  ＧＯ−４３０、ＧＯ−４４０、ＧＯ−４６０、ＧＬ−１、Ａｔｌｏｘ  １０４５Ａ、１１９６、Ｇ−１０４５、Ｇ−１４４１（花王アトラス社製）などが挙げられる。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類としては、ＴＷＥＥＮ  ２０、ＴＷＥＥＮ  ４０、ＴＷＥＥＮ  ６０、ＴＷＥＥＮ  ８０、ＥＭＡＳＯＬ  １１３０、ＥＭＡＳＯＬ  ３１３０、ＮＩＫＫＯＬ  ＴＬ−１０１０、ＴＰ−１０、ＴＳ−１０などが挙げられる。ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル類としては、例えばＮＩＫＫＯＬ  ＴＭＧＳ−１５、ＴＭＧＳ−５などが挙げられる。ポリエチレングリコール脂肪酸エステル類としては、例えばＮＩＫＫＯＬ  ＭＹＬ−１１０、ＭＹＳ−１０などが挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ  ＮＰ−１０、ＥＭＵＬＧＥＮ  ８１０などが挙げられる。
【００８６】
なお、抗原性維持等の面で、可溶性成分に対し最適な種類の界面活性剤及び濃度を選択するのは当然である。一般に、界面活性剤の濃度は、界面活性剤を水性溶媒に溶解したときにミセルを形成する濃度、即ち、臨界ミセル濃度（以下、ＣＭＣと略記する）以上であれば有効である。さらにＣＭＣ以上またはＣＭＣの１０倍までの濃度で好適に用いられ、特にＣＭＣからＣＭＣの５倍までの濃度で可溶化を実施すると好適に作用する。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液が挙げられる。
【００８７】
可溶化は、通常約４℃の低温で１時間〜一晩放置または攪拌することにより行われる。この際、プロテアーゼインヒビターを添加してもよい。可溶性化画分は、例えば、可溶化処理液を約１０００００×ｇで１時間程度の遠心分離処理した上清、又は濾過処理による濾液として得られる。また該上清や該濾液を可溶化剤を含まない緩衝液や臨床的に使用可能な界面活性剤を含有する緩衝液に対して透析することにより、可溶化に用いた可溶化剤を除去することもできる。可溶性化画分は、エタノール、イソプロパノール、フェノール、アセトニトリル等の有機溶媒による洗浄及び殺菌処理、または加熱処理による殺菌処理をすることもできる。
【００８８】
また、可溶化画分を、可溶化剤を含まない緩衝液に対して透析した場合、脂質を始めとする疎水性成分の一部は沈澱として得られる。本明細書においては、かかる沈澱成分及び溶液成分のいずれも可溶化画分の範疇である。
【００８９】
さらに、本発明においては、工程（６）として所望により可溶化画分は、目的に応じ通常の分離精製手段、例えば、含有成分の親和性、荷電状態、分子量、疎水性等の違いによる分離精製手段を用い、さらに精製しても良い。例えば、糖群特異的吸着体を用い、糖タンパク質に含有される糖残基の違いで分画して精製することができる。糖群特異的吸着体としては、例えば、ConA固定化体が挙げられる。特に、ConA結合性糖残基（Ｃ−３、Ｃ−４、Ｃ−６のヒドロキシル基が未置換の、α−Ｄ−グルコース残基及びα−Ｄ−マンノース残基）を有する成分、例えば、真菌に多いConA結合性マンノース残基に富む糖タンパク質等の分離には、ConA結合樹脂が好適に使用される。精製には、目的に応じた緩衝液を用いることが望ましく、界面活性剤、有機溶媒等を添加しても良い。更に、イオン交換樹脂、ゲル濾過担体を用い精製度を上げても良い。
【００９０】
また、本発明においては、前記のような本発明の真菌抗原をコードする核酸を用いて一般的な遺伝子工学的手法により容易に本発明の真菌抗原を製造することができる。
【００９１】
４．生物学的製剤について
本発明の生物学的製剤は、上記に記載の真菌抗原を有効成分として含有するものである。生物学的製剤とは、ワクチン又はこれに類似する製剤であって、感染性疾病の病原微生物に由来して、疾病又は障害の診断、予防若しくは治療に使用される製剤であり、本発明においては真菌を原材料とする。その他、本発明の抗原を利用して得られる治療血清等も含む。なかでも、多種類の真菌タンパク質を含有している本発明の真菌抗原は、脊椎動物に獲得自動免疫を誘導しうるものであり、特にワクチン組成物として好適に使用できる。即ち、本発明の、脊椎動物の真菌感染症に対し感染防御又は治療効果を有するワクチン組成物は、上記の真菌抗原を有効成分として含有するものである。本発明の生物学的製剤やワクチン組成物の有効成分として含有される真菌抗原は、例えば上記の製造方法により得ることができる。なお、本明細書において、ワクチン組成物を単にワクチンという場合がある。
【００９２】
本発明の真菌抗原をワクチン組成物として使用する際には、より強い体液性及び／または細胞性免疫を得るために、該真菌抗原を下記のようなアジュバントを含む懸濁液又は溶液として製剤化し投与することが好ましい。アジュバントは普通、抗原と共に投与されるが、抗原投与の前または後に与えてもよい。哺乳類のワクチン接種に適当なアジュバントとしては、フロイント（Freund's）の完全または不完全アジュバント；水酸化アルミニウム、みょうばん等の無機物ゲル；リゾレシチン、ジメチルオクタデシルアンモニウムブロミド、リゾレシチン等の界面活性剤；硫酸デキストラン、ポリIC等のポリアニオン；ムラミルジペプチド、タフトシン等のペプチド；Ribi社製のモノフォスフォリルリピドＡ（ＭＰＬ）；CytRx 社製のTiterMax；コレラトキシンのＢサブユニットがあるが、これらには限定されない。抗原はまたリポソームまたは他のマイクロキャリアーに取り込ませて投与することができる。当然、いくつかの異なる真菌の抗原を混合して用いることも可能である。それによって、複数の真菌感染症に対する防御免疫を誘導することもできる。本発明のワクチン組成物は、フルコナゾール、アンホテリシンＢ等の抗真菌剤やβ−ラクタム系抗生物質を始めとする各種の抗細菌性抗菌剤と併用してもよい。特に、抗真菌剤とは相加的又は相乗的に働き有効性を発揮する。
【００９３】
脊椎動物は、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、ヒト及びヒト以外の哺乳類であり、これらは抗原と反応して抗体を産生する。その結果、全脊椎動物がワクチン類と反応することができる。ワクチンは一般にヒトまたは家畜動物などの哺乳類に適用するが、上記の性質を有すれば、例えば魚類などの営利目的に飼育された脊椎動物も本発明の対象に含まれる。
【００９４】
投与方法としては、経口、経粘膜（鼻、膣等）、経皮（皮下または皮内）的に、または静脈内に投与すればよい。代表的な初回投与量は、タンパク質量として０．００１〜５ｍｇ／ｋｇ体重であるが、必要とする予防又は治療の程度に応じて、投与量を増加したり、投与回数を増大させればよい。
【００９５】
本発明の真菌抗原である、不溶性画分又はそれに由来する可溶化画分を投与すると、強い細胞性免疫及び／又は体液性免疫を誘導することができ、これにより真菌感染を防御又は治療することができる。防御又は治療の対象となる真菌のみならず、他の真菌に対しても不十分であるが防御効果、治療効果を誘導することができる。これは、真菌相互の抗原の共通性、及び／又は免疫系が活性化されることにより、スーパーオキサイドアニオンや、一酸化窒素、各種サイトカインが遊離され、これらが幅広い抗微生物活性を有しているからと考えられる。
【００９６】
また、本発明は、１）上記に記載の真菌抗原、又は上記に記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とする、個体に投与して真菌に対する感染防御免疫を誘導し又は治療効果を有する医薬組成物、２）上記に記載の真菌抗原、又は上記に記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とする、個体に投与して真菌に対する感染防御免疫を誘導し又は治療効果を有するワクチン組成物、３）該ワクチン組成物を投与することを含む、真菌に対する脊椎動物の免疫応答を刺激する方法、及び４）ワクチン組成物の投与対象となる脊椎動物において、該免疫応答によりワクチン組成物の製造に使用した真菌及び／又はその近縁菌の増殖を抑制し、該真菌に起因する疾病を予防または治療する、真菌に対する脊椎動物の免疫応答を刺激する方法、を提供する。
【００９７】
本発明の真菌抗原は生物学的製剤として、上記ワクチン組成物のほか、サイトカイン放出剤、アレルギー性疾患の減感作治療等に使用可能なアレルゲン組成物として用いることができる。さらに、皮膚反応による感染の経験の有無、スクラッチテストによるアレルギー性疾患、等の診断を行う為の生体内診断及び／又は実験室診断に用いることができる。実験室診断に用いる製剤には、例えばマイクロタイター試薬、ラテックス凝集試薬、免疫比濁試薬、酵素免疫試薬等の免疫学的診断薬も含む。
【００９８】
本発明のサイトカイン放出剤を、個体に対し使用する際には、凍結乾燥粉末若しくは適当な塩溶液や懸濁液、又は上記アジュバントを含む懸濁液又は溶液の形で用いることが出来る。また該サイトカイン放出剤は放出されたサイトカインが有効である疾患の治療剤として用いることも出来る。例えば、放出されたサイトカインがＩＦＮ−γである場合、該サイトカイン放出剤は癌や細菌感染症、アレルギーの治療剤として用いることが出来る。
【００９９】
投与方法としては、経皮（皮下又は皮内）、肺吸入、経粘膜（鼻、眼、膣など）、経口、舌下、又は静脈内に投与すればよい。例えば、癌の治療を目的とした場合、代表的な投与量は、ヒトの場合０．０２μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ／回であるが、対象となる疾患及び目的に応じて、投与量を増加したり、投与回数を増大させればよい。
【０１００】
本発明のアレルゲン組成物をアレルギー性疾患の予防や治療の目的で患者に投与する際には、適当な塩溶液や懸濁液の形で用いることができ、ポリエチレングリコールやフェノールを添加してもよい。更に上記のような、哺乳類のワクチン製剤化に使用されるアジュバントを含む懸濁液又は溶液として投与することもできる。アジュバントは、普通、抗原と共に投与されるが、抗原投与の前または後に与えてもよい。抗原はまたリポソームまたは他のマイクロキャリアーに取り込ませて投与することができる。当然、不溶性画分又はその可溶化画分、更にいくつかの異なる真菌の同様の画分と混合して用いることもでき、また市販の真菌アレルゲンエキス、ハウスダスト、スギなどの各種アレルゲンエキス、及び／又は精製アレルゲンと混合して用いることも可能である。それによって、複数のアレルゲンに感受性のアレルギー性患者に、複数のアレルゲンに対する減感作免疫を誘導することができる。
【０１０１】
投与方法としては、経皮（皮下または皮内）、肺吸入、経粘膜（鼻、眼、膣等）、経口、舌下、又は静脈内に投与すればよい。代表的な投与量は、治療を目的とする場合、投与ルートにより異なり、例えば０．２ｎｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇ／回であるが、必要とする予防や治療の程度に応じて、投与量を増加したり、投与回数を増大させればよい。
【０１０２】
また、本発明は、１）上記に記載の真菌抗原、又は上記に記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とする、個体に投与して真菌に対するアレルギー性疾患を予防し又は治療効果を有するアレルゲン組成物、２）アレルゲン組成物を投与することを含む、真菌に対する脊椎動物のアレルギー反応を抑制する方法、及び３）アレルゲン組成物の投与対象となる脊椎動物において、該免疫応答によりアレルゲン組成物の製造に使用した真菌及び／又はその近縁菌に起因するアレルギー性疾患を予防または治療する、真菌に対する脊椎動物のアレルギー反応を抑制する方法を提供する。
【０１０３】
本発明の真菌抗原を、生体内診断の目的で個体に対し、例えば、吸入誘発試験、皮膚テスト、鼻や眼の粘膜試験で使用する際は、凍結乾燥粉末、若くは適当な塩溶液や懸濁液の形で用いることができ、ポリエチレングリコールやフェノールを添加してもよい。パッチテストには、白色ワセリンを基剤としてラウリル硫酸ナトリウム等の界面活性剤を添加したものに上記抗原成分を溶解したものを使用することができる。
【０１０４】
また本発明の真菌抗原は、実験室診断、例えば、抗原抗体反応である凝集反応、沈降反応、中和反応、標識抗体法等を用いた診断法、ヒスタミン遊離試験、リンパ球幼若化試験、白血球遊走阻止試験等にも使用することができる。例えば、IgE 抗体価測定用の抗原として使用する際には、ペーパーディスク、セルローススポンジ、マイクロプレート等の固相体に上記抗原成分を固定化して使用することができる。
【０１０５】
また、本発明は、１）上記に記載の真菌抗原、又は上記に記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とする、真菌による疾患の診断用組成物、２）該組成物を使用することを含む、真菌による脊椎動物の疾患の診断方法、を提供する。
【０１０６】
本発明の対象となる脊椎動物は、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、ヒト及びヒト以外の哺乳類であり、これらは抗原と反応して抗体を産生する。その結果、全脊椎動物が抗原と反応することができる。本発明の真菌抗原は、一般にヒトまたは家畜動物などの哺乳類に適用するが、上記の性質を有すれば、例えば魚類などの営利目的に飼育された脊椎動物も本発明の対象に含まれる。
【実施例】
【０１０７】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【０１０８】
実施例１（カンジダ  アルビカンス細胞の細胞分画および不溶性画分の調製）
１）プロトプラスト細胞の調製：カンジダ  アルビカンスTIMM 1768 のサブロー寒天斜面培養物の一白金耳分をＹＰＤ培地（yeast extract １重量％、ポリペプトン２重量％、グルコース２重量％）を入れた試験管に植菌した。30℃で24時間振とう培養後、培養液の一部を、三角フラスコに入れたＹＰＤ培地に植菌し、35℃で一晩振とう培養した。得られた培養液から、2,000 ×g 、10分間の遠心分離処理により細胞を集めた。なお、得られた細胞は酵母型であった。細胞を滅菌水で１回洗浄後、ＳＳＢ溶液（0.8 M ソルビトール入り50 mM リン酸緩衝液pH 7.5）で１回洗浄した。細胞を再度適当量のＳＳＢ溶液に懸濁後、該ＳＳＢ溶液の１／８容量の１００ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＳＳＢ溶液、及び適当量の２−メルカプトエタノールを加え、緩やかに振とうした。続いて、この懸濁液に、終濃度 0.3 mg/ｍＬとなるようにザイモリエース２０Ｔ（生化学工業社製）を加え、35℃で１時間緩やかに振とうした。さらに、終濃度 1mg/mL となるようにトリコデルマ・ライジングエンザイム（シグマ社製）を加え、35℃で１時間緩やかに振とうした。得られた懸濁液を2,000 ×g 、10分間の遠心分離処理に付し、プロトプラスト細胞を集めた。この細胞をＳＳＢ溶液で十分に洗浄し、細胞分画に供した。
【０１０９】
２）プロトプラスト細胞からの細胞分画および抗原液の調製：上記の様にして得られたプロトプラスト細胞に、約４×１０9 cell／ｍＬとなるよう滅菌生理食塩水を加え、十分攪拌した後、氷上に10分間静置した。プロトプラスト細胞がバーストしたことを確認後、10,000×g 、30分間遠心し、得られた沈殿を不溶性画分（以下、Ca-LSPという）とした。遠心上清をさらに100,000 ×g 、60分間遠心し、得られた沈殿をリボソーム画分（以下、HSP という）、そして遠心上清を可溶性画分（以下、HSS という。この画分にHSP90 およびエノラーゼが含まれていた）とした。Ca-LSPを再度生理食塩水に懸濁後、超音波処理、さらに沸騰水浴下、５分間処理し殺菌することにより、膜タンパク質等を含有するLSP 抗原液を調製した。HSP についても、適当なタンパク質濃度になるように生理食塩水に懸濁し、抗原液とした。HSS についてもタンパク質濃度を測定し、適当量を抗原として使用した。２Ｌの培養液より得られた細胞を上記のように処理して得られたCa-LSP抗原液のタンパク質濃度は2.3 mg/mL であった（タンパク質量はBSA を標準としてビシンコニン酸（BCA ）試薬により定量した）。
【０１１０】
３）真菌細胞の細胞壁除去の程度の確認：細胞壁の除去の程度は、顕微鏡下の細胞形態観察、細胞を生理食塩水中でバーストさせた後の生菌数、及び血清因子を用いた凝集反応の阻害による相対的定量法により確認した。例えば、カンジダ  アルビカンス、アスペルギルス  フミガタスの細胞の場合、上記の方法により細胞壁が除去されると、顕著な形態の変化を起こした（第１図、第２図）。また、上記の方法で作製したプロトプラスト細胞を生理食塩水中でバーストさせたところ、含有される生菌の比率は１％未満であった。また、作製したCa-LSP抗原液を100 μl とり、YPD 寒天培地上に広げ、30℃で４日間培養したが、カンジダ  アルビカンス細胞のコロニーの出現は見られず、Ca-LSP抗原液には生菌は存在しなかった。HSP 抗原液、HSS 抗原液からもコロニーの出現は見られなかった。
【０１１１】
一方、抗カンジダ血清である因子血清No.1（ヤトロン製）はカンジダ  アルビカンスTIMM 1768 （血清型Ａ）を凝集させるが、この凝集に対する阻害活性を指標に、不溶性画分に含有される細胞壁成分の残存量を、構成成分である細胞壁マンナンの量として定量した。細胞壁マンナン含量の比較対照として、市販のカンジダアレルゲンエキスであるアレルゲンスクラッチエキス「トリイ」カンジダ（鳥居薬品社製）を用いた。
【０１１２】
陽性コントロールとして、小林らの方法[Kobayashi, H. et al., Arch. Biochem. Biophys. Vol.272, 364-375, (1989)]により、カンジダ  アルビカンスＪ−１０１２株（血清型Ａ）より精製した血清型Ａマンナンの各種濃度の溶液を用いた。その結果、市販のカンジダアレルゲンエキス（タンパク質濃度約0.4 mg/ml ）中には、4.5 mg/ml の血清型Ａカンジダ  アルビカンス細胞壁マンナン（以下、「血清型Ａマンナン」と略す。）が含有されていたが、Ca-LSP（タンパク質濃度約2.3 mg/mL ）では凝集阻害は起こらず、本発明の抗原成分中の血清型Ａマンナンの含有量は、本法による検出限界値の0.5mg/mL以下であることが明らかとなった。即ち、本発明の真菌抗原は、タンパク質量が多く、細胞壁マンナン量は前記の方法では検出限界値以下であることから従来のアレルゲンエキスと明らかに異なることが示された。
【０１１３】
得られたCa-LSP抗原液について中性糖、脂質、核酸含量を測定すると共に、一部をとり凍結乾燥後秤量した。その結果、上記の例のCa-LSP抗原液10ｍＬには、凍結乾燥残さとして約 130 mg （タンパク質23 mg 、中性糖 2 mg 、脂質 8 mg 、NaCl  計算値90 mg 、その他として核酸、水分が少量）が含まれていた。
【０１１４】
実施例２（アスペルギルス  フミガタス不溶性画分の調製）
１）アスペルギルス  フミガタス不溶性画分（Af-LSP）の調製−１：アスペルギルス  フミガタスTIMM 1776 のサブローデキストロース寒天斜面培養物に0.1 重量％ツィーン80を含む生理食塩水を加え胞子懸濁液を作製した。この懸濁液の一部を、三角フラスコに入れたポテトデキストロース培地（ディフコ社製）に植菌し、30℃で一晩振とう培養した。得られた培養液をガラスフィルターでろ過し菌体を集めた。菌体を0.8 M NaClを含む10 mM リン酸緩衝液（pH6.0 ）に懸濁後、終濃度10 mg/mLとなるようにヤタラーゼ（宝酒造社製）を加え、30℃で4 時間緩やかに振とうした。得られた懸濁液をガラスフィルターでろ過し、プロトプラスト細胞を集めた。
【０１１５】
この細胞を０．８Ｍ  ＮａＣｌで２回洗浄後、得られたプロトプラスト細胞に１×108 cell/mL となるよう滅菌生理食塩水を加え、バーストさせた。10,000×g 、30分間の遠心により、不溶性画分を回収した。この不溶性画分を再度生理食塩水に懸濁後、超音波処理、さらに沸騰水浴下、５分間処理し滅菌し、アスペルギルス  フミガタス不溶性画分Af-LSP抗原液１（タンパク質濃度約0.9 mg／mL）とした。
２）アスペルギルス  フミガタス不溶性画分（Af-LSP）の調製−２：上記の１）と同様にして作製した胞子懸濁液の一部を、三角フラスコに入れた０．８Ｍ  ＮａＣｌを含むポテトデキストロース培地（ディフコ社製）に植菌し、30℃で一晩振とう培養した。培養液の濁度は１）と同等であった。得られた培養液をガラスフィルターでろ過し菌体を集めた。菌体を0.8 M NaClを含む10 mM りん酸緩衝液（pH6.0 ）に懸濁後、ヤタラーゼ（終濃度10 mg/mL）、トリコデルマ  ライジング  エンザイム（終濃度３ｍｇ／ｍＬ）、及びザイモリエース２０Ｔ（終濃度 1mg/mL ）を加え、30℃で２時間緩やかに振とうした。細胞懸濁液をガラスフィルターでろ過し、濾液よりプロトプラスト細胞を集め細胞数を計測したところ、１）で得られた同一培養液量当たりプロトプラスト数の約２倍であった。従って、本培養方法により、プロトプラスト細胞収率が上がることが明らかとなった。この細胞を0.8M NaCl で２回洗浄後、得られたプロトプラスト細胞を、上記１）と同様に処理し、アスペルギルス  フミガタス不溶性画分Af-LSP抗原液２とした。
【０１１６】
実施例３（クリプトコッカス  ネオホルマンス不溶性画分（Crn-LSP ）の調製）
クリプトコッカス  ネオホルマンスTIMM 0354 のサブローデキストロース寒天斜面培養物の一白金耳分を三角フラスコに入れたＹＰＤ培地に植菌し、30℃で一晩振とう培養した。得られた培養液から遠心により細胞を集め、細胞を滅菌水で１回洗浄後、１M ソルビトール、100 mM EDTA 入り100 mMクエン酸緩衝液（pH 5.8）に懸濁し、終濃度 5 mg/mLとなるようにトリコデルマ・ライジングエンザイムを加え、37℃で１時間緩やかに振とうした。得られた懸濁液を、2,000 ×g 、10分間の遠心にかけ、プロトプラスト細胞を集めた。この細胞を上記の高張緩衝液で洗浄後、1 ×108cell/mLとなるよう滅菌生理食塩水を加え、プロトプラスト細胞を懸濁し、バーストさせた。10,000×g 、30分間の遠心により、不溶性画分を回収した。この不溶性画分を再度生理食塩水に懸濁後、超音波処理、さらに沸騰水浴下、５分間処理し滅菌し、その後、10,000×g 、30分間の遠心により、不溶性画分を回収した。この不溶性画分をクリプトコッカス  ネオホルマンス不溶性画分Crn-LSP 抗原液（タンパク質濃度2.9 mg／mL）とした。
【０１１７】
実施例４（カンジダ  アルビカンス不溶性画分Ca-LSPからの可溶化画分の調製）
実施例１で得られたCa-LSP抗原液（タンパク質濃度2.3 mg/mL ）100 mLに、100 mMオクチルチオグルコシドを含む40 mM ビストリス緩衝液（pH 6.5）を100 mL加えた。4 ℃で一晩攪拌後、100,000 ×g 、１時間遠心し、上清として50mMオクチルチオグルコシドによる可溶化画分（Ca-LSP-S）の溶液200 mLを得た（タンパク質濃度0.4 mg/mL ）。この溶液のうち100 mLを限外ろ過（分画分子量10,000）で濃縮後、りん酸緩衝生理食塩水に対して透析し、オクチルチオグルコシドを除去した。さらにポアサイズ0.22μｍのメンブランフィルターでろ過し、界面活性剤を除去した可溶化画分（Ca-LSP-SD ）の溶液20 mL （タンパク質濃度1.3 mg/mL ）を得た。
【０１１８】
実施例５（カンジダ  アルビカンス可溶化画分（Ca-LSP-S）のConAカラムによる分画）
実施例４で得られた、Ca-LSP-Sの残り100mL を限外ろ過により濃縮（タンパク濃度3mg/mL）後、オクチルグルコシドの終濃度が20mMになるように、１．５倍量の20mMビストリス緩衝液（pH6.5 ）を加えた。得られた溶液に、終濃度が0.25M になるようにＮａＣｌを、さらに、終濃度が1mM になるようにCaCl2 及びMnCl2 を添加した。次に、このものを緩衝液Ａ（20mMビストリス、20mMオクチルチオグルコシド、0.25M NaCl、1mM CaCl2 、1mM MnCl2 (pH6.5) ）で予め平衡化したConA sepharose4B（Pharmacia-LKB ）のカラムに供した。緩衝液Ａで非吸着成分を洗浄し、得られた通過画分及び、洗浄画分を合わせ、ConAカラム非吸着画分とした。次に、0.25M のメチル−Ｄ−グルコースを含む緩衝液ＡによりConAカラム吸着成分を溶出し、これをConAカラム溶出画分とした。得られたConAカラム非吸着画分、及びConAカラム溶出画分を限外濾過（分画分子量10000 ）で濃縮し得られた濃縮液をそれぞれ、Ca-ConA-Pass及びCa-ConA-Elute とした。
【０１１９】
実施例６（ワクチン製剤の調製）
１）油中水系（不完全フロイントアジュバント）製剤の調製
上記の、不溶性画分である各種LSP （Ca-LSP等）由来、LSP 由来の界面活性剤除去可溶化画分（Ca-LSP-SD 等）、及びConAカラム溶出画分（Ca-ConA-Elute ）の抗原液の必要量をとり、等容量の不完全フロイントアジュバント（以下、IFA と略す）（ディフコ社製）と十分に混合し、油中水系のワクチン製剤とした。
２）アラム製剤の調製
上記の、不溶性画分である上記の各種LSP 、又はLSP 由来の界面活性剤除去可溶化画分（Ca-LSP-SD 等）の抗原液の必要量をとり、攪拌しながら等量のアラム（ピアス社製）を滴下し、すべてを添加後、さらに30分間攪拌し、ワクチン製剤とした。
【０１２０】
実施例７（カンジダ  アルビカンス由来の不溶性画分Ca-LSPと、HSP 、HSS 各抗原液のワクチン活性の比較および生菌ワクチンとの比較）
１）Ca-LSP、HSP 、HSS   各抗原液のワクチン活性の比較：実施例１で得られたCa-LSP、HSP 、HSS 各抗原液を、タンパク質濃度として400 μg ／mLとなるように生理食塩水で希釈した。実施例６に従い、希釈液に等量のＩＦＡを加えワクチン製剤とし、C57BL/6 マウス（６週齢、雌、一群当たり５匹）に一匹当たり0.1 mLずつ皮下接種により免疫した。また、抗原液の代わりに生理食塩水を用いた群を対照とした。一週間後、再度同量を皮下接種した。即ち、一匹当たりの投与量はいずれの抗原も20μg タンパク質／回となる。二回目の免疫の一週間後、全ての免疫マウスに、サブロー・デキストロース液体培地で培養して得られたカンジダ  アルビカンスTIMM 1768 細胞を2.5 ×105 個ずつ静脈内感染させた。感染後、30日間生死を観察した。
結果を表１に示す。不溶性画分のCa-LSPはリボソーム画分（HSP ）や可溶性画分（HSS ）より強いワクチン活性を示した。
【０１２１】
【表１】
2005323598.tif 000002
【０１２２】
２）カンジダ  アルビカンス不溶性画分Ca-LSPと生菌ワクチンとのワクチン活性の比較：Ca-LSPの投与量が0.2 μg タンパク質相当／回、2 μg タンパク質相当／回、20μg タンパク質相当／回となるように、Ca-LSP抗原液の濃度を調製後、実施例６に従いワクチン製剤とし、実施例７−１）と同様にC57BL/6 マウス（１群当たり５匹）に一週間隔で２回皮下接種により免疫した。また、カンジダ  アルビカンス TIMM 1768をサブロー・デキストロース培地で一晩振とう培養し、細胞を遠心で回収、生理食塩水で洗浄し、得られた細胞を1 ×106 、1 ×107 、1 ×108 個／mLとなるように生理食塩水に懸濁した。各々の懸濁液に等量のIFA を加え混合後、マウスに一匹当たり0.1 mLずつ皮下接種により免疫した。一週間後、上記と同様に調製した生菌カンジダ細胞を同量ずつ皮下接種した。即ち、一匹当たりの投与量は5 ×104 、5 ×105 、5 ×106 個／回となる。対照として、生理食塩水と等量のIFA を混合したものを一週間隔で２回皮下接種により投与した。二回目の免疫の一週間後、全ての免疫マウスに、サブロー・デキストロース培地で培養して得られたカンジダ  アルビカンス TIMM 1768細胞を2.5 ×105 個ずつ静脈内感染させた。感染後、30日間生死を観察した。
結果を表２に示す。Ca-LSPは、投与量が２μg タンパク質相当／回でも強い感染防御活性を示し、生菌免疫より優れた感染防御作用を示した。
【０１２３】
【表２】
2005323598.tif 000003
【０１２４】
実施例８（カンジダ  アルビカンス不溶性画分Ca-LSP由来の界面活性剤除去可溶化画分の感染防御活性）
実施例４で調製したCa-LSP由来の界面活性剤除去可溶化画分（Ca-LSP-SD ）の投与量が20μg タンパク質相当／回となるように希釈後、実施例６に従いワクチン製剤とし、実施例７−１）と同様にC57BL/6 マウス（１群当たり５匹）に１週間隔で２回皮下免疫した。対照として、カンジダ  アルビカンス不溶性画分Ca-LSPのIFA との製剤、及び生理食塩水とIFA との混合物で同様に免疫した。免疫後１週目に、カンジダ  アルビカンス TIMM 1768細胞を2.5 ×105 個ずつ静脈内感染させた。感染後、30日間生死を観察した。結果は表３のとおりである。LSP 可溶化画分も不溶性画分であるLSP と同等の感染防御活性を示した。
【０１２５】
【表３】
2005323598.tif 000004
【０１２６】
実施例９（カンジダ  アルビカンス不溶性画分Ca-LSP由来Ca-ConA-Elute の感染防御活性）
実施例５で得られた、ConA結合性マンノース含有糖タンパク質含量の高い画分であるCa-ConA-Elute を、タンパク質濃度として４μg ／mLとなるように生理食塩水で希釈した。実施例６に従い、希釈液に等量のＩＦＡを加えワクチン製剤とし、実施例７−１）と同様にC57BL/6 マウス（６週齢、雌、一群当たり５匹）に投与し、カンジダ  アルビカンスTIMM 1768 感染に対する防御作用を確認した。結果を表４に示す。Ca-ConA-Elute は、投与量が０．２μg タンパク質相当／回で充分な感染防御活性を示した。
【０１２７】
【表４】
2005323598.tif 000005
【０１２８】
実施例１０（各種マウスカンジダ症全身感染モデルでのカンジダ  アルビカンス不溶性画分Ca-LSPのワクチン作用）
１）ワクチン接種マウスの免疫低下状態での感染防御：実施例１で調製したCa-LSPの投与量が20μg タンパク質相当／回となるように希釈後、実施例６に従いワクチン製剤とし、実施例７−１）と同様にC57BL/6 マウス（１群当たり５匹）に１週間隔で２回皮下免疫した。対照として、生理食塩水とIFA との混合物で同様に免疫した。２回目の免疫後、３日目に免疫マウスにサイクロフォスファミドを200 mg／kg腹腔内に投与し、免疫抑制状態にした。その４日後に、カンジダアルビカンス TIMM 1768細胞を5 ×104 個ずつ静脈内感染させた。感染後、30日間生死を観察した。結果は表５のとおりである。サイクロフォスファミドにより免疫能を低下させても、Ca-LSP免疫群では十分な感染防御作用を有していた。
【０１２９】
【表５】
2005323598.tif 000006
【０１３０】
２）Ca-LSPのワクチン作用の持続：実施例１で調製したCa-LSPの投与量が20μｇタンパク質相当／回となるように希釈後、実施例６に従いワクチン製剤とし、実施例７−１）と同様にC57BL/6 マウス（１群当たり５匹）に１週間隔で２回皮下免疫した。２回目の免疫後、３４日目にカンジダ  アルビカンスTIMM 1768 細胞を1 ×105 個ずつ静脈内感染させた。感染後、12日目に屠殺、無菌的に両腎を摘出し、６ｍＬの生理食塩水を加え、ホモゲナイザーを用いてホモジェネートを得た。これを生理食塩水で希釈後（×1,×10, ×100 ）、希釈液の１００μｌをサブロー・デキストロース寒天培地上に広げ、30℃で１日間培養し、出現するコロニー数を測定した。結果を表６に示す。この結果より明らかなように、Ca-LSPによる免疫により、免疫後34日目でも感染防御免疫は働いており、腎菌数は減少した。
【０１３１】
【表６】
2005323598.tif 000007
【０１３２】
実施例１１（カンジダ  アルビカンス TIMM 0239による感染）
実施例１で調製したCa-LSPの投与量が20μg タンパク質相当／回となるように希釈後、実施例６に従いワクチン製剤とし、実施例７−１）と同様にC57BL/6 マウス（１群当たり５匹）に１週間隔で２回皮下免疫した。また、Ca-LSPの代わりに生理食塩水を用いたものを対照とした。免疫後１週間目に、免疫した抗原の由来するカンジダ  アルビカンス TIMM 1768と異なるカンジダ  アルビカンスTIMM 0239 細胞を5 ×105 、1 ×106 個ずつマウス（各群５匹）に静脈内感染させた。感染後、30日間生死を観察した。結果は表７のとおりである。この結果よりカンジダ  アルビカンスの一菌株由来のLSP で免疫すれば、他のカンジダ  アルビカンス株に対しても感染防御免疫が誘導されることが明らかである。
【０１３３】
【表７】
2005323598.tif 000008
【０１３４】
実施例１２（カンジダ  アルビカンス生細胞で免疫されたマウスのCa-LSPに対する特異的遅延型過敏症（DTH ）反応）
実施例７−２）と同じ方法で５×104 、５×105 、５×106 個の生菌でC57BL/6 マウス（各群５匹）を１週間隔で２回皮下免疫した。また、Ca-LSPのIFA との製剤を0.2 、2 、20μg タンパク質相当／回となるようにC57BL/6 マウス（各群５匹）に１週間隔で２回皮下免疫した。免疫後６日目に200 μg タンパク質相当／mLのCa-LSP抗原液50μl を各マウスのフットパッド（foot pad）に皮下投与した。24時間後にフットパッドの腫れを測定した。
【０１３５】
結果を表８に示す。この結果より、生菌で感作されたマウス個体内で、Ca-LSPを抗原として認識するDTH 反応が誘導されている、即ち感染防御免疫が成立しているマウス個体では、Ca-LSPに対する細胞性免疫が成立していることが明らかとなった。また、Ca-LSPで免疫したマウスにおいてはCa-LSPに対する強い細胞性免疫が誘導されていた。
【０１３６】
【表８】
2005323598.tif 000009
【０１３７】
実施例１３（カンジダ  アルビカンス細胞で免疫されたマウスの脾臓リンパ球のカンジダ  アルビカンスCa-LSPに対する特異的増殖）
実施例７−２）と同じ方法で５×106 個の生菌で免疫したBALB/cマウスより、最終免疫後１５日目に脾臓を取り出し、RPMI-1640 培地中でホモゲナイズし細胞懸濁液とした。これにRPMI-1640 培地を加え洗浄遠心後、細胞を10％牛胎児血清（FCS ）添加したRPMI-1640 培地に再懸濁した。この細胞懸濁液をナイロンウールカラムに入れ、37℃で１時間培養後、10％FCS 添加RPMI-1640 培地で溶出し、Ｔ細胞リッチな画分を得た。遠心で細胞を集め、10％添加RPMI-1640 培地に１×107 個／mLとなるように懸濁した。適当に希釈したCa-LSP抗原液を100 μl ずつ96ウェルマイクロプレートに分注後、細胞懸濁液を100 μl ずつ加え、37℃、５％ＣＯ2 条件下で培養、２日後に、 3Ｈ−チミジン（0.5 μCi／ウェル）を加えた。１８時間培養後、細胞を回収し、細胞への 3Ｈ−チミジン取り込み量を測定した。
結果を表９に示す。免疫マウス由来の脾細胞はCa-LSPに対して濃度依存的な増殖を示した。
【０１３８】
【表９】
2005323598.tif 000010
【０１３９】
実施例１４（カンジダ  アルビカンス生菌で免疫または感作された哺乳動物血中のカンジダ  アルビカンス不溶性画分Ca-LSP由来のタンパク質に対する抗体）
１）カンジダ  アルビカンス生菌で免疫されたマウス血中のCa-LSP由来のタンパク質に対する抗体：実施例７−２）と同じ方法で5 ×106 個の生菌で免疫したBALB/cマウスより抗カンジダ血清を調製した。次に、Ca-LSPにSDS 電気泳動用サンプルバッファーを加え、沸騰水浴下３分間処理後、遠心し、上清を12.5％SDS-PAGEにかけた。電気泳動後、PVDF膜にブロッテイング、ブロックエースで一晩ブロッキング、その後、50倍希釈抗血清を反応させ、そして、二次抗体としてラット抗マウスIgG 抗体を用いて抗原性タンパク質を検出したところ、第３図（レーン１）に示すように、免疫され、感染防御免疫が成立しているマウス血清中には、Ca-LSPに含まれるいくつかのタンパク質に対するIgG 抗体が誘導されていることが明らかとなった。なお、分子量６５，０００付近に検出されるタンパク質は、実施例１５に示すタンパク質である。
【０１４０】
２）ウサギの抗カンジダ血清に含まれるCa-LSPに対する抗体：市販のウサギ抗カンジダ血清（大日本製薬より購入）を一次抗体として、また、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を二次抗体として用いて、実施例１４−１）と同様にCa-LSPに含まれるタンパク質をSDS-PAGEで分離、PVDF膜にブロッテイング、ウェスタンブロッティング法により抗原性タンパク質を検出したところ、第３図（レーン２）に示すように、ウサギ抗カンジダ血清中には、Ca-LSPに含まれるいくつかのタンパク質に対する抗体が誘導されていることが明らかとなった。即ち、ウサギにおいても、Ca-LSPに含まれる成分が抗原として作用することが明らかとなった。65kD付近に検出されるタンパク質は、上記と同様に実施例１５に示すタンパク質である。
【０１４１】
３）ヒト血中のCa-LSPに対する抗体：カンジダ  アルビカンスはヒトの常在菌であり、殆どのヒトがカンジダ  アルビカンス細胞に感作されていることが知られている。そこで、健常人血中にCa-LSP由来のタンパク質に対する抗体が存在するか否かを調べるために、健常ヒト血清を一次抗体として、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を二次抗体として用い、実施例１４−１）と同様にCa-LSP由来のタンパク質についてウェスタンブロッティング法により抗原性タンパク質を検出した。その結果、第３図（レーン３）に示すように、健常ヒト血清中には、Ca-LSPに含まれるいくつかのタンパク質に対するＩｇＧ抗体が検出され、ヒトにおいても、Ca-LSPに含有されるタンパク質は抗原として作用することが明らかとなった。
【０１４２】
実施例１５（カンジダ  アルビカンス可溶化画分（Ca-LSP-S）からの抗原性タパク質の精製）
１）タンパク質の単離：実施例５で得られたCa-ConA-Passを、予め緩衝液Ｂ（20mMビストリス、20mMオクチルチオグルコシド、1mM CaCl2 、1mM MnCl2 （pH6.5 ））で平衡化させたMonoQ カラム（Pharmacia-LKB 社製）に供し、緩衝液Ｂによる洗浄後、０−０．８Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配をもつ緩衝液Ｂによる溶出を行った。得られた画分について実施例１４−１）と同一条件でイムノブロッティングを行い、いくつかのマウス抗カンジダ血清に対して陽性を示すタンパク質を含む画分を集め、緩衝液Ｂによる透析を行った。
得られた透析液を、緩衝液Ｂで予め平衡化させたハイドロキシ  アパタイト（三井東圧社製）に供し、緩衝液Ｂによる洗浄後、０−０．５Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配をもつ緩衝液Ｂによる溶出を行った。溶出画分について、再度実施例１４−１）と同一条件でイムノブロッティングを行い、マウス抗カンジダ血清と強く反応する分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下）約６５，０００のタンパク質、及び抗カンジダ血清と弱く反応する分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下）約２５，０００のタンパク質を単離した。
【０１４３】
得られた２種のタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を、Ｌ−５００型高速アミノ酸分析計（日立製作所社製）を用い決定したところ、各々配列表の配列番号：１及び配列表の配列番号：２に示すアミノ酸配列を有すると予想された。得られたアミノ酸配列情報について、既知タンパク質とホモロジー検索を行ったところ、分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下）約６５，０００のタンパク質はサッカロマイセス  セレビシエのミトコンドリア局在ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ＤＬＤＨ）と、分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下）約２５，０００のタンパク質はサッカロマイセス  セレビシエのミトコンドリア局在スーパーオキサイドデスムターゼ（ＳＯＤ）とホモロジーを有し、何れもミトコンドリア由来のタンパク質であると推定された。
【０１４４】
また、一方、Ca-ConA-PassのMonoQ カラムによる分画により得られた画分について、実施例１３と同様の方法で免疫マウス脾臓リンパ球に対する増殖誘導活性を測定すると共に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の分離及び銀染色による分析を行った。Ca-ConA-PassのMonoQ カラムによる分画における０．１２Ｍ  ＮａＣｌ付近に溶出された画分を集め、再度MonoQ カラムにかけ、０−０．２４Ｍ  ＮａＣｌの直線濃度勾配を持つ緩衝液Ｂにより溶出を行った。得られた溶出画分から分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下）約３００００のタンパク質を単離することができた。
【０１４５】
同様に、Ca-ConA-PassのMonoQ カラムによる分画により、０．６４Ｍ  ＮａＣｌ付近に溶出された画分についても、再度MonoQ カラムにかけ、０．２４−０．８Ｍ  ＮａＣｌの直線濃度勾配を持つ緩衝液Ｂにより溶出を行った。得られた溶出画分から分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下）約６２，０００のタンパク質を単離することができた。これらのタンパク質は、実施例１４−１）記載のマウス抗カンジダ血清との反応性は非常に低いが、実施例１３と同様の方法で調製した生菌免疫マウス脾臓リンパ球に対しては、最終タンパク質濃度５μｇ／ｍＬで明らかな 3Ｈ−チミジンの取込みを促進し、増殖誘導活性を有することが明らかとなった。
【０１４６】
得られた２種のタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を、Ｌ−５００型高速アミノ酸分析計（日立製作所社製）を用い決定したところ、各々配列表の配列番号：３及び配列表の配列番号：４に示すアミノ酸配列を有すると予想された。得られたアミノ酸配列情報について、既知タンパク質とホモロジー検索を行ったところ、分子量約３０，０００のタンパク質はサッカロマイセス  セレビシエのシトレートシンターゼ(citrate synthase)と、分子量約６２，０００のタンパク質はサッカロマイセス  セレビシエの液胞型アミノペプチダーゼＩ(vacuolar aminopeptidase I) とホモロジーを有することが分かった。
【０１４７】
２）単離したタンパク質の抗原性試験：実施例１３と同様の方法により、上記単離された４種のタンパク質（分子量約６５，０００のタンパク質、分子量約２５，０００のタンパク質、分子量約３００００のタンパク質及び分子量約６２，０００のタンパク質）について生菌免疫マウス由来の脾臓リンパ球細胞への 3Ｈ−チミジン取り込み量を測定した。その結果、１アッセイ当たり 5μg/mlのタンパク質量で、何れのタンパク質も増殖誘導活性を示した。
【０１４８】
更に、実施例１２と同様の方法により、生菌免疫マウスのフットパッドに皮下投与しＤＴＨ反応を誘導するか試験した。上記４種の抗原性タンパク質について試験を行った結果、５μｇ／回の投与で何れのタンパク質も有意にフットパッドの腫れを検出した。
以上の結果より、単離された４種のタンパク質は、何れも感染防御免疫の成立した個体に認識されるタンパク質であることが明らかとなった。
【０１４９】
実施例１６（カンジダ  アルビカンス不溶性分画Ca-LSPで免疫されたマウス由来の脾細胞の移入による感染防御能の獲得）
実施例７−１）と同様にCa-LSPのIFA との製剤をBALB/cマウス（１群５匹）に0.1 mLずつ１週間隔で２回皮下免疫した。投与量は20μg タンパク質相当／回である。対照として、生理食塩水とIFA との混合物で同様に免疫した。２回目の免疫後１週目に、５匹の免疫したマウスより脾臓を摘出し、RPMI-1640 培地中でホモゲナイズし細胞懸濁液（約8 ×107 個／0.5 mL）とし、この0.5 mLを C.B.-17/ scidマウス（各群５匹）に移入した。１日後、カンジダ  アルビカンス TIMM 1768細胞を各マウスに5 ×104 個ずつ静脈内感染させた。さらに対照として、正常な（脾臓細胞を移入していない）C.B.-17/ scid マウス（５匹）に同数のカンジダ  アルビカンス TIMM 1768細胞を静脈内感染させた。感染後、５日目に屠殺、無菌的に両腎を摘出し、6 mLの生理食塩水を加えてホモゲナイズし、ホモジェネートを得た。これを生理食塩水で希釈後（×1,×10, ×100 ）、希釈液の100 μL をサブロー・デキストロース寒天培地上に広げ、30℃で１日間培養し、出現するコロニー数を測定した。結果を表１０に示した。
【０１５０】
【表１０】
2005323598.tif 000011
【０１５１】
Ca-LSP免疫マウス由来の脾細胞を移入することにより、正常のマウスに比べ有意に（ｐ＜０．０５）腎菌数は減少した。即ち、Ca-LSPにより免疫されたマウスの脾細胞による養子免疫が可能であることが明らかとなった。
【０１５２】
実施例１７（アスペルギルス  フミガタス不溶性画分Af-LSPのワクチン活性）
実施例２−１）で調製したAf-LSP抗原液１を用い、実施例６に従いワクチン製剤を調製し、C57BL/6 マウスに2 、20μg タンパク質相当／回、１週間隔で２回皮下免疫した。対照として、生理食塩水とIFA との混合物で同様に免疫した。免疫後、８日目にアスペルギルス  フミガタスTIMM 1776 の胞子を2 ×106 個ずつ静脈内感染させた。感染後、３０日間生死を観察した。
【０１５３】
結果は表１１のとおりである。20μｇタンパク質相当／回、２回の投与で明らかな感染防御効果が見られ、２μｇタンパク質相当／回でも有意な延命が見られた。即ち、Af-LSPもワクチンとして有用である可能性が示された。
【０１５４】
【表１１】
2005323598.tif 000012
【０１５５】
実施例１８（アスペルギルス  フミガタス生細胞を投与したマウス血中のアスペルギルス  フミガタス不溶性画分Af-LSP由来のタンパク質に対する抗体）
アスペルギルス  フミガタスTIMM 1776 の胞子懸濁液（1 ×108 個／mL）を等量の完全フロイントアジュバントと混合し、この0.1 mLを１週間隔で２回BALB/cマウスに皮下免疫した。免疫後、１週間目に採血し、抗アスペルギルス血清を得た。
【０１５６】
実施例２−１）で調製したAf-LSP抗原液１をSDS-PAGEで分離後、PVDF膜にブロッティングし、抗アスペルギルス血清を一次抗体として、ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を二次抗体として用いて、実施例１４−１）と同様にウエスタンブロッティングにより抗原性タンパク質を検出したところ、第４図（レーン１）に示すようにAf-LSP中のタンパク質に対する抗体が含まれていた。すなわち、アスペルギルス感染において、Af-LSPに含有されているタンパク質は、生体に抗原として認識される。従って、実施例１７に示したように、Af-LSPに対する免疫を誘導しておくことにより特異的な防御効果を期待できると思われる。
【０１５７】
実施例１９（真菌由来の不溶性画分間の交差反応性）
１）抗カンジダ血清または抗アスペルギルス血清の他の種類の真菌由来のタンパク質に対する交差反応性：Af-LSP抗原液１、Crn-LSP をSDS-PAGEで分離後、PVDF膜にブロッティングし、抗カンジダ血清（実施例１４−１））を一次抗体として、ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を二次抗体として用いて、実施例１４−１）と同様にウエスタンブロッティングにより抗原性タンパク質を検出したところ、抗カンジダ血清は第５図に示すようにCrn-LSP 由来のタンパク質に対して交差反応性を示した（レーン２）。また、アスペルギルス由来のAf-LSPに対しても弱い交差反応性が認められた（レーン３）。なお、レーン１は、不溶性画分としてCa-LSPを用いた例である。
【０１５８】
また、Crn-LSP をSDS-PAGEで分離後、PVDF膜にブロッティングし、抗アスペルギルス血清（実施例１８）を一次抗体として、ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を二次抗体として用いて、実施例１４−１）と同様にウエスタンブロッティングにより抗原性タンパク質を検出したところ、抗アスペルギルス血清は、クリプトコッカス由来のCrn-LSP 中に含まれるタンパク質に対しても弱いながら交差反応した（第４図、レーン２）。
【０１５９】
２）特異的な細胞性免疫の誘導およびCa-LSP免疫マウスにおけるAf-LSPに対する細胞性免疫：Ca-LSP、Af-LSP抗原液１それぞれのIFA との製剤を、C57BL/6 マウスに０．２μg タンパク質相当／回、２μg タンパク質相当／回、２０μg タンパク質相当／回、１週間隔で２回皮下免疫した。対照として、生理食塩水とIFA との混合物で同様に免疫した。免疫後、６日目にAf-LSPを20μg タンパク質相当／50μl ずつ各マウス（各群５匹）のフットパッドに皮下投与した。24時間後にフットパッドの腫れを測定した。結果を表１２に示す。Af-LSP免疫群で腫れが大きいことから、Af-LSPにかなり選択性を有するDTH 反応が誘導されていることが明らかとなった。一方、Ca-LSP  20μg タンパク質相当免疫群においてもAf-LSPに対しても有意なDTH 反応が生じており、交差反応する細胞性免疫が誘導されていることが明らかとなった。即ち、異なる真菌間で交差反応するタンパク質が存在することが示された。従って、一種のLSP を用いて異なる真菌による感染を防御できると思われる（実施例２０参照）。
【０１６０】
【表１２】
2005323598.tif 000013
【０１６１】
実施例２０（カンジダ  アルビカンス不溶性画分Ca-LSPのマウスアスペルギルス症感染モデルでのワクチン効果）
Ca-LSPのIFA との製剤をC57BL/6 マウスに20μg タンパク質相当／回、１週間隔で２回皮下免疫した。対照として、生理食塩水とIFA との混合物で同様に免疫した。免疫後、８日目にアスペルギルス  フミガタスTIMM 1776 の胞子を2 ×106 個ずつ静脈内感染させた。感染後、30日間生死を観察した。結果は表１３のとおりである。Ca-LSPで免疫することによりアスペルギルス感染に対する感染防御免疫も誘導することができることが明らかとなった。
【０１６２】
【表１３】
2005323598.tif 000014
【０１６３】
実施例２１（菌糸型カンジダ  アルビカンス細胞の調製及び菌糸型細胞由来の不溶性画分 Ca-LSP-M の調製）
実施例１と同様に、カンジダ  アルビカンスTIMM 1768 をYPD 培地で30℃で24時間振とう培養して得られた培養液の一部を、三角フラスコに入れたFCS10 ％添加RPMI-1640 培地に植菌し、37℃で4 時間振とう培養し、菌糸型カンジダ  アルビカンス細胞を得た。培養液をガラスフィルターでろ過し細胞を回収後、SSB 溶液で洗浄、再度SSB 溶液に懸濁した。その後、実施例１と同様にザイモリエース、トリコデルマ・ライジングエンザイムで処理した。菌糸状細胞とプロトプラスト細胞を分離するために、得られた懸濁液をガラスフィルターでろ過し、ろ液を回収した。得られたろ液を1,000 ×g 、５分間遠心し、プロトプラスト細胞を集めた。この細胞をSSB 溶液で洗浄後、滅菌生理食塩水を加え、十分攪拌した後、氷上に10分間静置した。プロトプラスト細胞がバーストしたことを確認後、10,000×g 、30分間遠心し、得られた沈殿を菌糸型細胞由来の不溶性画分（以下、Ca-LSP-Mという）とした。
【０１６４】
Ca-LSP-Mは生理食塩水に懸濁後、超音波処理、さらに沸騰水浴下、５分間処理して殺菌し、培養菌体液１００ｍＬより膜タンパク質等を含有するCa-LSP-M抗原液２ｍＬを得た（タンパク質濃度1.2 mg/mL ）。Ca-LSP-M及び対照としてCa-LSP（いずれもタンパク質量として約４μg ）をSDS-PAGEで分離後、PVDF膜にブロッティングし、抗カンジダ血清（実施例１４−１））を一次抗体として、ラット抗マウスＩｇＧ抗体を二次抗体として用いて、実施例１４−１）と同様にウエスタンブロッティングにより抗原性タンパク質を検出した。その結果、第６図（レーン２）に示すように、抗カンジダ血清中にはCa-LSP-Mに含まれるいくつかのタンパク質に対するIgG 抗体が誘導されており、第３図のレーン１の酵母型細胞のCa-LSPとは異なるバンドも存在した（第６図のレーン１）。さらに、抗体量も多いと思われた。なお、本実施例で用いた菌糸型カンジダ  アルビカンス細胞の細胞壁除去処理前後の、細胞の形態の変化を第７図に示す。
【０１６５】
実施例２２（ヒト皮膚反応による診断）
実施例１で得られた Ca-LSP の生理食塩水溶液（タンパク質濃度2.3mg ／mL）を生理食塩水でタンパク質濃度1.0mg/mLになるように希釈後、さらに100 倍、1000倍に希釈した。皮膚反応は、各希釈液を20μl ずつパッチスター（鳥居薬品製）に浸み込ませたものを、ボランティア４人の腕皮膚面に２日間貼付後、パッチスターを剥がしてから１時間後の皮膚の状態を、紅斑や丘疹の有無により診断した。判定は、国際接触皮膚炎症研究グループ（ＩＣＤＲＧ）の基準に従い行った。４人のうちアレルギー体質の２人に明らかな紅斑が見られ、１人もわずかな紅斑が見られた。従って、本発明の真菌抗原が、個体のＤＴＨ反応を利用した診断に有効であることが明らかとなった。
【０１６６】
実施例２３（ヒト血漿中IgE 抗体価の測定）
臭化シアンによるペーパーディスクの活性化、及び抗原（実施例４で得られたCa-LSP-Sを、タンパク質濃度として１００μｇ／ｍＬに希釈した溶液）のペーパーディスクへのカップリングは、宮本らの方法[Miyamoto  et al.Allergy,Vol.22,584-594(1973)]を参考に実施した。ヒト血漿中IgE 抗体価の測定は、ポリスチレンチューブに抗原をカップリングさせた上記ペーパーディスク１枚とヒト血清５０μL を加えて、室温で３時間放置した。次いで、0.2 ％のツイーン２０を含む生理食塩水でペーパーディスクを３回洗浄後、RAST-RIAキット（Pharmacia 社製）の 125Ｉ標識抗ヒトIgE 抗体５０μL を加えて室温で１６時間放置した。
【０１６７】
上記洗浄液で再度３回洗浄後、ガンマカウンターで放射能を測定した。同時にRAST-RIAキットの対照試薬で作成した標準曲線からIgE 抗体価を算出した。アレルギー患者のうち、市販の診断用アレルゲン皮内エキス（鳥居薬品社製）の皮フテストで陽性の２４人について、Ca-LSP-Sに対するIgE 抗体価を測定したところ、１５人が陽性であった（０．３５PRU/mL以上を陽性とした。）。従って、アレルギー患者において、Ca-LSP-Sに対する陽性率は高く、不溶性画分からなる本発明の真菌抗原がIgE 抗体検出に有効であることが明らかとなった。
【０１６８】
実施例２４（Ｃａ−ＬＳＰによるヒト末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）からのサイトカイン産生）
ＰＢＭＣは健常人から成分採血により採血を行い、白血球画分を集めさらに以下の分離方法に従って調製した。すなわち、採血液をＲＰＭＩ−１６４０培地で約２倍希釈後、フィコール−パック（Ficoll-Paque）分離液（ファルマシア社製）上に重層し、５００×ｇで２０分間室温で遠心した。中間層のＰＢＭＣをピペットで回収、洗浄して９０％牛胎児血清（FCS 、インターゲン社製）と１０％ジメチルスルホキシド（シグマ社製）からなる保存液に懸濁した状態で液体窒素中に保存した。Ｃａ−ＬＳＰによるＰＢＭＣ処理は以下のように行った。
【０１６９】
上記保存ＰＢＭＣ検体を融解後、ヒトＡＢ血清（アーバインサイエンス社製）を終濃度５％（ｖ／ｖ）となるように添加したＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、１．５×１０6 個／ｍｌとなるように希釈し２４穴マイクロプレートに１ウェルあたり１ｍｌ分注した。次に実施例１で得られた Ca-LSP の生理食塩水溶液（タンパク質濃度2.3mg ／mL）を、添加量が５μｇタンパク質相当／ウェルになるよう生理食塩水で希釈したＣａ−ＬＳＰ抗原液を１ウェルあたり５０μｌ加え、３７℃、５％ＣＯ2 条件下で培養した。培養開始後７日目に培養上清を分取し、ＩＦＮ−γ量をヒトＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ社製）を使用して測定した。測定は製造元のプロトコールに従い実施した。なおキットの検出限界値は、０．００２ｎｇ／ｍｌである。
【０１７０】
７日目のＩＦＮ−γの量を第８図に示す。ヒトＰＢＭＣはＣａ−ＬＳＰに対して反応しＩＦＮ−γを産生した。なお１５検体のＩＦＮ−γ産生量は１．４３５±１．２１０（平均±ＳＤ）ｎｇ／ｍｌの範囲に分布した。
【０１７１】
対照としてＣａ−ＬＳＰ抗原液の代わりに生理食塩水５０μｌ／ウェルを加えて同様にしてＩＦＮ−γの量を測定した。該ウェルにおけるＩＦＮ−γの検出量はキットの検出限界値以下であった。
【０１７２】
実施例２５（真菌アレルギー皮内反応診断試薬および診断用滴定試薬の調製）
実施例１で調製されたCa-LSP抗原液を乾燥させて粉末状で採取して、真菌アレルギー疾患に対する皮内反応診断試薬及び真菌アレルギー診断用滴定試薬として用いる。皮内反応診断試薬には0.5 ％フェノールを添加した0.9 ％生理食塩水を溶媒とし、タンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬとし、これの１０００倍希釈液を調製して用いる。また、真菌アレルギー診断用滴定試薬には、タンパク質濃度として１ｍｇ／ｍＬの濃度でハンクス緩衝液に溶解し、これをヒスタミン遊離滴定用試薬の原液としてその希釈液を用いる。
【０１７３】
実施例２６（減感作治療用抗原製剤の調製）
実施例１で調製されたCa-LSP抗原液を乾燥させて粉末状で採取して、真菌アレルギー疾患に対する減感作治療剤として用いる。アレルゲン活性成分を１ｍｇ／ｍｌの濃度で0.5 ％フェノールを添加した0.9 ％生理食塩水に溶解し、減感作治療用抗原の原液とする。
【０１７４】
実施例２７（カンジダ  アルビカンス抗原性タンパク質をコードする核酸の単離）
１）分子量約６５，０００のタンパク質をコードするＤＮＡの単離：実施例１５−１）で単離した分子量約65,000のタンパク質（以下、65Kタンパク質と称す）をコードする核酸を単離するため、始めにカンジダ  アルビカンスＴＩＭＭ１７６８株のｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【０１７５】
まず菌体より全ＲＮＡを抽出、精製するため、上記の菌を２００ｍｌＹＰＤ培地で３５℃で培養後、２０００×ｇ、５分間の遠心分離処理により細胞を回収し、一度蒸留水で洗浄した。得られた細胞を液体窒素により急速凍結し、乳鉢により凍結細胞を粉末状に破砕した。この細胞粉末より、ＲＮＡエクストラクションキット(RNA extraction kit, ファルマシア社製）を用いて全ＲＮＡを回収、精製した。この全ＲＮＡからオリゴテックス−ｄＴ３０＜スーパー＞(oligotex-dT30，宝酒造社製）を用いて、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを調製した。次にタカラｃＤＮＡ合成キット（宝酒造社製）を用いて、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡ５μｇからｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡをラムダファージベクターλSCREEN-1（ノバジェン社製）と連結した後、ファージメーカーシステム、ファージパック  エクストラクト（ノヴァジェン社製）によりインビトロパッケージングを行いｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【０１７６】
実施例１５−１）のアミノ酸配列解析により６５ｋタンパク質はサッカロマイセス  セレビシエのＤＬＤＨのホモログと推定された。そこで他種生物のＤＬＤＨにおいて、高度に保存されたアミノ酸配列をコードすると推定される塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＤＬ２と配列表の配列番号１のアミノ酸配列の一部をコードすると推定される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＤＬ１を合成、精製しＰＣＲ用のプライマーとした。ＤＬ１の塩基配列を配列表の配列番号：９に、ＤＬ２の塩基配列を配列表の配列番号：１０に示す。ＰＣＲの鋳型とするため、カンジダ  アルビカンスＴＩＭＭ１７６８株からゲノムＤＮＡをＰ．フィリップセン（P. Philippsen)らの方法［メソッズ  イン  エンザイモロジー（Methods in Enzymology)、第１９４巻、第１６９〜１７５頁（１９９１）］により抽出、精製した。精製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＤＬ１とＤＬ２をプライマーとして用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は９４℃にて１分、５５℃にて１．５分、７２℃にて２分の温度シフトを３０サイクルおこなった。その結果、約１ｋｂｐの大きさのＤＮＡが増幅してきた。このＤＮＡをｐＵＣ１１８ベクター（宝酒造社製）にクローニングした後、ＤＮＡ塩基配列を決定したところ、該増幅ＤＮＡの塩基配列は配列表の配列番号：１３に示す通りであり、該塩基配列がコードすると予想されるアミノ酸配列は６５ｋタンパク質のN末端より決められたアミノ酸配列と一致した。従って得られた増幅ＤＮＡ断片は６５ｋタンパク質をコードするＤＮＡの一部分であることが明らかとなった。
【０１７７】
次に、６５ｋタンパク質をコードするｃＤＮＡ全長を得るため、上記増幅ＤＮＡ断片をプローブとして用いて、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。前記のようにして得られたｃＤＮＡライブラリーを宿主大腸菌ＥＲ１６４７株に接種し、トップアガロース（０．７％アガロースを含むＬＢ培地）と混合後、ＬＢプレート上に重層し、３７℃一夜培養することにより、プラークを形成させた。生じたプラークをナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、アマシャム社製）へ移し、プラークハイブリダイゼーションを行った。上記のＰＣＲ断片１ｋｂをランダムプライマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造社製）と［a −32Ｐ］ｄＣＴＰで標識しハイブリダイゼーションのプローブとして用いた。１．６×１０5 個のプラークをスクリーニングした結果、多数のファージクローンがプローブとハイブリダイズした。このなかから、シグナルの強い２８個のクローンについて、さらに解析した。すなわち、大腸菌内でのオートマチックサブクローニングにより、これらのファージからｃＤＮＡを含む領域を自動的にサブクローニングされたプラスミドを有する大腸菌を得た。これらの大腸菌からプラスミドを精製し、ｃＤＮＡの長さ及び制限酵素切断によるＤＮＡバンドのパターンを比較し、６５ｋタンパク質遺伝子を含むと考えられるｃＤＮＡを選び、塩基配列を決定した。そのＤＮＡ塩基配列を配列表の配列番号：７に示す通りであり、この塩基配列より６５ｋタンパク質は配列表の配列番号：５に示したアミノ酸配列を有するタンパク質であることが推定された。
【０１７８】
２）分子量約２５，０００の抗原性タンパク質をコードするＤＮＡの単離：実施例１５−１）で単離した分子量約25,000のタンパク質（以下、25Kタンパク質と称す）をコードする核酸を単離するため、先ず配列表の配列番号２のアミノ酸配列の一部をコードすると推定されるオリゴヌクレオチドＳＯ１とＳＯ２を合成、精製しＰＣＲ用のプライマーとした。配列表の配列番号：１１にＳＯ１の塩基配列を、配列表の配列番号：１２にＳＯ２の塩基配列を示す。次に１）において精製されたポリ（Ａ）+ ＲＮＡ０．５μｇを用いてＴａＫａＲａ  ＲＮＡ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（ＡＭＶ）  Ｖｅｒ．１．１（宝酒造社製）を使用し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。すなわち、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０−Ｍ４ａｄａｐｔｏｒプライマーを用いて、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡ０．５μｇから、ＡＭＶ逆転写酵素の反応（４５℃、３０分間）によりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型とし、ＳＯ１とＭ１３Ｍ４プライマー（宝酒造社製）をプライマーとして、９４℃にて０．５分、５５℃にて２分、７２℃にて２分の温度シフトを３５サイクルの条件で、ＰＣＲ反応をおこなった。さらに、上記ＰＣＲ反応液を鋳型として、２回目のＰＣＲ反応（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応）を行った。この反応では、プライマーとして、ＳＯ２とＭ１３Ｍ４プライマーを用いた。ＰＣＲの結果、約７００ｂｐの大きさのＤＮＡが増幅してきた。このＤＮＡをｐＵＣ１１８ベクターにクローニングした後、ＤＮＡ塩基配列を決定した。そのＤＮＡ塩基配列を配列表の配列番号：８に示す。該塩基配列にコードされると予想されるアミノ酸配列は配列表の配列番号：６に示す通りであり、そのN末端部分は２５ｋタンパク質より決められたアミノ酸配列と一致した。このＰＣＲ断片はＳＯＤとホモロジーを有する２５ｋタンパク質をコードするＤＮＡであることが明らかとなった。
【０１７９】
配列表
配列番号：１
配列の長さ：５０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴：３３、４４、４９  不明のアミノ酸
配列：
Ala Ser Thr Lys Lys Tyr Asp Val Val Val Ile Gly Gly Gly Pro
1               5                   10                  15 
Gly Gly Tyr Val Ala Ala Ile Lys Ala Ala Gln Leu Gly Leu Asn
20                  25                  30 
Thr Ala Xaa Ile Glu Lys Arg Gly Ala Leu Gly Gly Thr Xaa Leu
35                  40                  45 
Asn Val Gly Xaa Ile
50 
配列番号：２
配列の長さ：３０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴：２６、２９、３０  不明のアミノ酸
配列：
Lys Tyr Ser Leu Pro Glu Leu Asp Tyr Glu Phe Ser Ala Thr Glu
1               5                  10                  15
Pro Tyr Ile Ser Gly Gln Ile Asn Glu Ile Xaa Tyr Thr Xaa Xaa
20                  25                  30
配列番号：３
配列の長さ：３１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ala Ser Ala Glu Pro Thr Leu Lys Gln Arg Leu Glu Glu Ile Leu
1               5                  10                  15
Pro Ala Lys Ala Glu Glu Val Lys Gln Phe Lys Lys Glu His Gly  
20                  25                  30
Lys
配列番号：４
配列の長さ：３０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Lys Phe Thr Asp Asp Tyr Tyr Ser Lys Ile Ala Asp Asp Tyr Ile  
1               5                  10                  15
Glu Phe Thr Tyr Lys Asn Pro Thr Ile Tyr His Val Val Asn Phe
20                  25                  30
配列番号：５    
配列の長さ：４９１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Met Leu Arg Ser Phe Lys Ser Ile Pro Ala Asn Gly Lys Leu Ala
1               5                  10                  15
Gln Phe Val Arg Tyr Ala Ser Thr Lys Lys Tyr Asp Val Val Val
20                  25                  30
Ile Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Val Ala Ala Ile Lys Ala Ala
35                  40                  45
Gln Leu Gly Leu Asn Thr Ala Cys Ile Glu Lys Arg Gly Ala Leu
50                  55                  60
Gly Gly Thr Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ser Leu
65                  70                  75
Leu Asn Asn Ser His Leu Leu His Gln Ile Gln His Glu Ala Lys
80                  85                  90
Glu Arg Gly Ile Ser Ile Gln Gly Glu Val Gly Val Asp Phe Pro
95                 100                 105
Lys Leu Met Ala Ala Lys Glu Lys Ala Val Lys Gln Leu Thr Gly
110                 115                 120
Gly Ile Glu Met Leu Phe Lys Lys Asn Lys Val Asp Tyr Leu Lys
125                 130                 135
Gly Ala Gly Ser Phe Val Asn Glu Lys Thr Val Lys Val Thr Pro
140                 145                 150
Ile Asp Gly Ser Glu Ala Gln Glu Val Glu Ala Asp His Ile Ile
155                 160                 165
Val Ala Thr Gly Ser Glu Pro Thr Pro Phe Pro Gly Ile Glu Ile
170                 175                 180
Asp Glu Glu Arg Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ser Leu Lys
185                 190                 195
Glu Val Pro Glu Arg Leu Ala Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly
200                 205                 210
Leu Glu Met Ala Ser Val Tyr Ala Arg Leu Gly Ser Lys Val Thr
215                 220                 225
Val Ile Glu Phe Gln Asn Ala Ile Gly Ala Gly Met Asp Ala Glu
230                 235                 240
Val Ala Lys Gln Ser Gln Lys Leu Leu Ala Lys Gln Gly Leu Asp
245                 250                 255
Phe Lys Leu Gly Thr Lys Val Val Lys Gly Glu Arg Asp Gly Glu
260                 265                 270
Val Val Lys Ile Glu Val Glu Asp Val Lys Ser Gly Lys Lys Ser
275                 280                 285
Asp Leu Glu Ala Asp Val Leu Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Pro
290                 295                 300
Phe Thr Glu Gly Leu Asn Phe Glu Ala Ile Gly Leu Glu Lys Asp
305                 310                 315
Asn Lys Gly Arg Leu Ile Ile Asp Asp Gln Phe Lys Thr Lys His
320                 325                 330
Asp His Ile Arg Val Ile Gly Asp Val Thr Phe Gly Pro Met Leu
335                 340                 345
Ala His Lys Ala Glu Glu Glu Gly Ile Ala Ala Ala Glu Tyr Ile
350                 355                 360
Lys Lys Gly His Gly His Val Asn Tyr Ala Asn Ile Pro Ser Val
365                 370                 375
Met Tyr Thr His Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Leu Asn Glu Glu
380                 385                 390
Gln Leu Lys Glu Gln Gly Ile Lys Tyr Lys Val Gly Lys Phe Pro
395                 400                 405
Phe Ile Ala Asn Ser Arg Ala Lys Thr Asn Met Asp Thr Asp Gly
410                 415                 420
Phe Val Lys Phe Ile Ala Asp Ala Glu Thr Gln Arg Val Leu Gly
425                 430                 435
Val His Ile Ile Gly Pro Asn Ala Gly Glu Met Ile Ala Glu Ala
440                 445                 450
Gly Leu Ala Leu Glu Tyr Gly Ala Ser Thr Glu Asp Ile Ser Arg
455                 460                 465
Thr Cys His Ala His Pro Thr Leu Ser Glu Ala Phe Lys Glu Ala
470                 475                 480
Ala Leu Ala Thr Phe Asp Lys Pro Ile Asn Phe
485                 490
配列番号：６    
配列の長さ：１８８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Ala Thr Glu Pro Tyr Ile Thr Gly Gln Met Asn Glu Ile His Tyr
1               5                  10                  15
Thr Lys His His Gln Thr Tyr Val Asn Asn Leu Asn Ala Ser Ile
20                  25                  30
Glu Gln Ala Val Glu Ala Lys Ser Lys Gly Glu Val Lys Lys Leu
35                  40                  45
Val Ala Leu Gln Lys Ala Ile Asn Phe Asn Gly Gly Gly Tyr Leu
50                  55                  60
Asn His Cys Leu Trp Trp Lys Asn Leu Ala Pro Val Ser His Gly
65                  70                  75
Gly Gly Gln Pro Pro Ser Glu Asp Ser Lys Leu Gly Lys Gln Ile
80                  85                  90
Val Lys Gln Phe Gly Ser Leu Asp Lys Leu Ile Glu Ile Thr Asn
95                 100                 105
Gly Lys Leu Ala Gly Ile Gln Gly Ser Gly Trp Ala Phe Ile Val
110                 115                 120
Lys Asn Lys Ala Asn Gly Asp Thr Ile Asp Val Ile Thr Thr Ala
125                 130                 135
Asn Gln Asp Thr Val Thr Asp Leu Asn Leu Val Pro Leu Ile Ala
140                 145                 150
Ile Asp Ala Trp Lys His Ala Tyr Tyr Leu Gln Tyr Gln Asn Val
155                 160                 165
Lys Ala Asp Tyr Phe Lys Asn Leu Trp His Val Ile Asn Trp Lys
170                 175                 180
Glu Ala Glu Arg Arg Phe Glu Phe
185
配列番号：７  
配列の長さ：１７５０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA  
配列：
CTCAGAGAGA CCGGACTAAA GATTCTATAA ATATTCTTTC TTTCTGTTCA CATTATATAT   60
TCTTCTCAAC AAATGTTAAG ATCATTCAAA TCTATTCCAG CCAATGGAAA ATTGGCCCAG  120
TTTGTTAGAT ATGCATCAAC CAAGAAATAC GACGTTGTTG TCATTGGTGG TGGACCAGGT  180
GGGTACGTTG CTGCCATCAA GGCCGCTCAA TTAGGATTAA ACACTGCCTG TATTGAAAAA  240
AGAGGTGCAT TGGGTGGTAC TTGTTTGAAT GTTGGTTGTA TCCCATCCAA ATCTTTATTG  300
AACAACTCCC ATTTATTACA CCAAATCCAA CACGAAGCCA AAGAAAGAGG TATTTCCATC  360
CAAGGTGAAG TTGGCGTTGA TTTTCCAAAA TTGATGGCTG CCAAGGAAAA AGCCGTCAAA  420
CAATTGACCG GTGGTATTGA AATGTTGTTC AAAAAGAACA AGGTTGACTA CTTGAAAGGA  480
GCCGGTTCTT TTGTTAACGA AAAAACCGTC AAAGTCACTC CAATTGACGG CAGCGAAGCA  540
CAAGAAGTTG AAGCCGACCA CATCATCGTT GCTACTGGGT CTGAACCAAC TCCATTCCCA  600
GGTATTGAAA TAGATGAAGA AAGAATTGTC ACTTCTACTG GTATTTTATC ATTGAAAGAA  660
GTACCAGAAA GATTAGCCAT CATTGGTGGA GGTATCATTG GTTTGGAAAT GGCTTCCGTT  720
TACGCAAGAT TGGGCTCTAA AGTCACTGTT ATCGAATTCC AGAACGCTAT TGGTGCCGGT  780
ATGGATGCTG AAGTTGCTAA ACAATCTCAA AAATTATTGG CCAAACAAGG TTTGGACTTC  840
AAATTAGGTA CAAAGGTTGT TAAAGGTGAA AGAGATGGTG AAGTGGTCAA GATCGAAGTT  900
GAAGATGTCA AATCCGGTAA AAAATCTGAC CTTGAAGCCG ATGTCTTGTT GGTTGCCATT  960
GGTAGAAGAC CATTTACTGA AGGTTTGAAC TTTGAAGCCA TTGGTTTAGA GAAAGATAAC 1020
AAGGGAAGAT TGATTATTGA CGACCAATTC AAGACTAAAC ATGACCACAT CAGAGTTATT 1080
GGGGATGTCA CATTCGGTCC TATGTTGGCC CACAAGGCTG AAGAAGAAGG TATCGCTGCT 1140
GCTGAATACA TCAAGAAAGG TCACGGTCAT GTAAACTATG CTAACATCCC TTCTGTTATG 1200
TATACTCACC CAGAAGTTGC CTGGGTTGGT TTAAACGAAG AACAATTGAA AGAACAAGGC 1260
ATCAAATACA AAGTAGGTAA ATTCCCATTC ATTGCCAACT CCAGAGCTAA AACCAACATG 1320
GACACTGATG GTTTCGTGAA ATTCATTGCT GATGCCGAAA CCCAAAGAGT GTTGGGTGTC 1380
CACATTATTG GTCCAAATGC AGGTGAAATG ATTGCTGAAG CTGGTTTGGC CTTAGAATAT 1440
GGTGCTTCCA CCGAAGACAT TTCAAGAACA TGTCATGCTC ATCCAACTTT ATCTGAAGCT 1500
TTCAAGGAAG CTGCTTTGGC CACCTTTGAT AAGCCAATCA ACTTTTAAAA GTGATACTGA 1560
ATACAACAGT AATGAAAAGT AAATACTAAA ATAATTTGAT TTGATTTTTT TTACTTTTTT 1620
TTCACTCTTT TGCTCTCATT TTTAAGGTTA TCTAAATACT GAATTATCTG AGCCATATAA 1680
GACAATCACA TCTATACATA AATACACAAA TAATAACACA TATATATTTA TTTTGAAAAA 1740
AAAAAAAAAA                                                        1750
配列番号：８  
配列の長さ：７２１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA  
配列：
GCCACTGAAC CGTACATCAC AGGACAAATG AACGAAATTC ACTACACTAA ACATCACCAA   60
ACTTATGTTA ACAACCTTAA TGCTTCAATT GAACAAGCCG TTGAAGCCAA ATCTAAAGGT  120
GAAGTTAAAA AATTGGTTGC CTTACAAAAA GCCATCAATT TCAACGGTGG TGGTTACCTC  180
AATCATTGTT TGTGGTGGAA AAACTTGGCT CCTGTCTCTC ACGGTGGTGG TCAACCACCA  240
AGTGAAGATT CCAAATTAGG TAAACAAATC GTCAAACAAT TTGGTTCTTT GGATAAATTG  300
ATTGAAATCA CCAATGGCAA ATTGGCTGGT ATTCAAGGTT CTGGATGGGC TTTTATTGTT  360
AAAAACAAAG CCAATGGTGA TACTATTGAT GTCATCACCA CTGCTAACCA AGATACTGTT  420
ACTGATCTAA ACTTGGTTCC ATTGATTGCT ATTGATGCTT GGAAACATGC TTATTATTTG  480
CAATACCAAA ATGTTAAAGC TGATTACTTC AAGAACCTTT GGCATGTTAT CAACTGGAAG  540
GAAGCTGAAA GAAGATTTGA ATTTTAAGTT ACTGGACAAA AGTCAAGTAC ATATTTAAAT  600
CCAATATTAG AAAATAAAAG AGTTACTTCC GATAGTGCTG ATTTTGTTTA ATATTTCCCC  660
ATTGTATATA AGTATATATG CAAGAATATA TTCCTGATTG TGATGTAAAA AAAAAAAAAA  720
A                                                                  721
配列番号：９
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の種類（合成ＤＮＡ）
配列の特徴：３（イノシン）、９（イノシン）、１２（イノシン）、１５（イノシン）
配列：
GGNTAYGTNG CNGCNATHAA RGC    23
配列番号：１０
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の種類（合成ＤＮＡ）
配列の特徴：６（イノシン）、１５（イノシン）、１８（イノシン）
配列：
TCYTCNGCYT TRTGNGCNAR CAT    23
配列番号１１
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の種類（合成ＤＮＡ）
配列：
AARTAYWSNY TNCCNGARYT NGAYTAYGAR TT   32
配列番号１２
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の種類（合成ＤＮＡ）
配列：
GCNACNGARC CNTAYATHWS NGGNCA   26
配列番号：１３  
配列の長さ：９４４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA  
配列：
GGGTACGTGG CGGCGATCAA GGCCGCTCAA TTAGGATTAA ACACTGCCTG TATTGAAAAA   60
AGAGGTGCAT TGGGTGGTAC TTGTTTGAAT GTTGGTTGTA TCCCATCCAA ATCTTTATTG  120
AACAACTCCC ATTTATTACA CCAAATCCAA CACGAAGCCA AAGAAAGAGG CATTTCTATC  180
CAAGGTGAAG TTGGCGTTGA TTTTCCAAAA TTGATGGCTG CCAAGGAAAA AGCCGTCAAA  240
CAATTGACCG GTGGTATTGA AATGTTGTTC AAAAAGAACA AGGTTGACTA CTTGAAAGGA  300
GCCGGTTCTT TTGTTAACGA AAAAACCGTC AAAGTCACTC CAATTGACGG CAGCGAAGCA  360
CAAGAAGTTG AAGCCGACCA CATCATCGTT GCTACTGGGT CTGAACCAAC TCCATTCCCA  420
GGTATTGAAA TAGATGAAGA AAGAATTGTC ACTTCTACTG GTATTTTATC ATTGAAAGAA  480
GTACCAGAAA GATTAGCCAT CATTGGTGGA AGTATCATTG GTTTGGAAAT GGCTTCCGTT  540
TACGCAAGAT TGGGCTCTAA AGTCACTGTT ATCGAATTCC AGAACGCTAT TGGTGCCGGT  600
ATGGATGCTG AAGTTGCTAA ACAATCTCAA AAATTATTGG CCAAACAAGG TTTGGACTTC  660
AAATTAGGTA CAAAGGTTGT TAAAGGTGAA AGAGATGGTG AAGTGGTCAA GATCGAAGTT  720
GAAGATGTCA AATCCGGTAA AAAATCTGAC CTTGAAGCCG ATGTCTTGTT GGTTGCCATT  780
GGTAGAAGAC CATTTACTGA AGGTTTGAAC TTTGAAGCCA TTGGTTTAGA GAAAGATAAC  840
AAGGGAAGAT TGATTATTGA CGACCAATTC AAGACTAAAC ATGACCACAT CAGAGTTATT  900
GGGGATGTCA CATTCGGTCC TATGCTCGCC CACAAAGCCG AAGA                   944
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】第１図は、カンジダ  アルビカンスＴＩＭＭ１７６８細胞（酵母型）の細胞壁除去前後の形態を示す図である。微分干渉顕微鏡（ニコン社製）を用い、倍率はいずれも１０００倍である。Ａは細胞壁除去前の細胞であり、Ｂは細胞壁除去後の細胞である。
【図２】第２図は、アスペルギルス  フミガタス細胞の細胞壁除去前後の形態を示す図である。微分干渉顕微鏡（ニコン社製）を用い、倍率はいずれも４００倍である。Ａは細胞壁除去前の細胞であり、Ｂは細胞壁除去後の細胞である。
【図３】第３図は、マウスの抗カンジダ血清（レーン１）、ウサギの抗カンジダ血清（レーン２）、及び健常ヒト血清（レーン３）に含まれる、カンジダ  アルビカンス不溶性画分Ca-LSP由来のタンパク質に対する抗体の存在を示す図である。
【図４】第４図は、マウスの抗アスペルギルス血清に含まれる、アスペルギルス  フミガタス不溶性画分 Af-LSP 由来のタンパク質（レーン１）及びクリプトコッカスネオホルマンス不溶性画分 Crn-LSP由来のタンパク質（レーン２）に対する抗体の存在を示す図である。
【図５】第５図は、マウスの抗カンジダ血清に含まれる、カンジダ  アルビカンス不溶性画分Ca-LSP由来のタンパク質（レーン１）、クリプトコッカス  ネオホルマンス不溶性画分 Crn-LSP由来のタンパク質（レーン２）及びアスペルギルス  フミガタス不溶性画分 Af-LSP 由来のタンパク質（レーン３）に対する抗体の存在を示す図である。
【図６】第６図は、マウスの抗カンジダ血清に含まれる、酵母型カンジダ  アルビカンス不溶性画分Ca-LSP由来のタンパク質（レーン１）及び菌糸型カンジダ  アルビカンス不溶性画分Ca-LSP-M由来のタンパク質（レーン２）に対する抗体の存在を示す図である。
【図７】第７図は、菌糸型カンジダ  アルビカンス細胞の細胞壁除去前後の形態を示す図である。微分干渉顕微鏡（ニコン社製）を用い、倍率はいずれも４００倍である。Ａは細胞壁除去前の細胞であり、Ｂは細胞壁除去後の細胞である。
【図８】第８図は、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地にCa-LSP抗原液を添加し、培養開始後７日目のヒトＩＦＮ−γ産生量を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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