(57)【要約】【課題】  アメリカヤマゴボウ由来のレクチンの結晶構造を解明する。【解決手段】  PL-D2の結晶は、空間群P21に属し、a＝23.24Å、b＝56.95Å、c＝29.62Å、β=109.3°の単位格子定数を有する。PL-D1の結晶は、空間群P21212に属し、a＝48.67Å、b＝49.01Å、c＝29.93Åの単位格子定数を有する。PL-Cの結晶は、三方晶系空間群R3に属し、三方晶状態でa＝b＝104.1Å、c=69.7Åの単位格子定数を有する。【選択図】  図２
2005154378.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2個の炭水化物結合ドメインを有し、第１ドメインは１個のα-ヘリクス、２個の三アミノ酸残基からなる310-ヘリクス、１個の二本鎖逆平行βストランド及び４個のS-S結合を有し、第２ドメインは１個のα-ヘリクス、１個の三アミノ酸残基からなる310-ヘリクス、１個の二本鎖逆平行βストランド及び４個のS-S結合を有しているレクチン結晶。
【請求項２】
２個のドメイン中にそれぞれ存在する２個の炭水化物結合部位が同じ側に存在するように配置されている請求項１に記載のレクチン結晶。
【請求項３】
第２ドメインに、４個の酸性アミノ酸残基からなる酸性区画を有する請求項１又は２に記載のレクチン結晶。
【請求項４】
空間群P21に属し、a＝23.24Å、b＝56.95Å、c＝29.62Å、β=109.3°の単位格子定数を有するレクチン結晶。
【請求項５】
空間群P21212に属し、a＝48.67Å、b＝49.01Å、c＝29.93Åの単位格子定数を有するレクチン結晶。
【請求項６】
炭化水素と複合した状態で、単斜晶系空間群C2に属し、a＝98.6Å、b＝26.3Å、c=65.2Å、β=109.9の単位格子定数を有するレクチンの複合体結晶。
【請求項７】
それぞれ３個の球状ドメインを有する2個のサブユニットからなり、両サブユニットは３個の球状ドメイン間の相互作用によりダイマーを形成しており、各ドメインには４個のジスルフィド結合が存在するレクチン結晶。
【請求項８】
三方晶系空間群R3に属し、三方晶状態でa＝b＝104.1Å、c=69.7Åの単位格子定数を有するレクチン結晶。
【請求項９】
レクチンの結晶の以下の(1)〜(8)の特徴の少なくとも一つを利用するレクチンの作用を調節する分子の設計方法。
(1)  2個の炭水化物結合ドメインを有し、第１ドメインは１個のα-ヘリクス、２個の三アミノ酸残基からなる310-ヘリクス、１個の二本鎖逆平行βストランド及び４個のS-S結合を有し、第２ドメインは１個のα-ヘリクス、１個の三アミノ酸残基からなる310-ヘリクス、１個の二本鎖逆平行βストランド及び４個のS-S結合を有している。
(2)  ２個のドメイン中にそれぞれ存在する２個の炭水化物結合部位が同じ側に存在するように配置されている。
(3)  第２ドメインに、４個の酸性アミノ酸残基からなる酸性区画を有する。
(4)  空間群P21に属し、a＝23.24Å、b＝56.95Å、c＝29.62Å、β=109.3°の単位格子定数を有する。
(5)  空間群P21212に属し、a＝48.67Å、b＝49.01Å、c＝29.93Åの単位格子定数を有する。
(6)  炭化水素と複合した状態で、単斜晶系空間群C2に属し、a＝98.6Å、b＝26.3Å、c=65.2Å、β=109.9の単位格子定数を有する。
(7)  それぞれ３個の球状ドメインを有する2個のサブユニットからなり、両サブユニットは３個の球状ドメイン間の相互作用によりダイマーを形成しており、各ドメインには４個のジスルフィド結合が存在する。
(8)  三方晶系空間群R3に属し、三方晶状態でa＝b＝104.1Å、c=69.7Åの単位格子定数を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アメリカヤマゴボウの根茎から得られた、N-アセチルグルコサミンを含む糖質に特異的に結合するレクチンの結晶に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖結合性タンパク質であるレクチンは、生体内で、複合糖質の糖鎖と相互作用し、細胞接着や細胞間認識、細胞内外の情報伝達等に機能することが知られている。またレクチンは、糖への結合性を利用して、細胞表面糖鎖の検索や、不溶化レクチンを用いた複合糖質の特異的精製など免疫学的、細胞生物学的に使用されている。
【０００３】
レクチンには、L-フコース結合性レクチン、D-ガラクトース結合性レクチン、D-マンノース結合性レクチン、N-アセチルグルコサミン結合性レクチンなどがある。
【０００４】
中でもアメリカヤマゴボウの根茎から得られるレクチンはN-アセチルグルコサミンを含む糖質に特異性を有し、抹消リンパ球を刺激して、その細胞表面に結合することにより有糸分裂を引き起こすことが知られている。分子サイズ及び生物学的性質が異なる４種のレクチン（PL-A、PL-B、PL-C及びPL-D）がアメリカヤマゴボウの根茎から単離されている。それらのアミノ酸配列の解析（図１参照）から、レクチンは、幾つかのキチン結合領域を含むことが分かる。このキチン結合領域は、ある種のレクチン、抗菌ペプチド、クラスIキチナーゼのようなキチン結合タンパク質に見出される構造モチーフである。
【０００５】
キチン結合タンパク質の三次元構造は、１個のドメインからなるゴムの樹Hevea brasilensisヘベイン、４個のドメインからなる小麦アグルチニン(WGA)レクチンの二量体分子、２個のドメインからなるUritica dioicaアグルチニン（UDA）のイソレクチンについて明らかにされている（Biochemistry, 32, 1407-1422 (1993); FEBS Letters, 291, 307-309 (1991); J. Mol. Biol. 297, 673-681 (2000)）。
【０００６】
最も小さいアメリカヤマゴボウレクチンは、PL-Dであり、PL-D1及びPL-D2と命名された2個のアイソマーを有する。PL-D1は、84アミノ酸残基からなり、分子量は9,317である。PL-D2は、Leu83-Thr84の二つのC末端残基が欠失している他はPL-D1と同じアミノ酸配列を有する。PL-Dは2個のキチン結合ドメインからなり、図１に示すように、それらの間のアミノ酸配列の相同性は45％である。
【０００７】
PL-Dアイソマーは天然ウサギ赤血球を凝集させないが、トリプシン処理した赤血球に対してコムギ胚芽凝集素が示す凝集活性の0.1％の凝集活性を示す。PL-D1とPL-D2と生物学的活性の最も興味深い違いは、それらのリンパ球に対する分裂促進（マイトジェン）活性である。PL-D2はマイトジェン活性を示すが、PL-D1は示さない。PL-D2ではPL-D1に比べてC末端のアミノ酸残基が2個欠失していることが、マイトジェン活性の違いの原因になっていると考えられる。
【０００８】
またPL-Cは、マイトジェン活性を有するが、赤血球の凝集作用を有さない。PLsの中でPL-Cだけが溶液中でダイマーを形成し、このことがPL-Cの機能と関連していると考えられる。
【０００９】
従って、アメリカヤマゴボウから単離されたレクチンPL-D及びPL-Cの結晶構造が明らかになれば、細胞凝集活性、マイトジェン活性、炭水化物結合活性などが向上したレクチンの作製、いずれかの機能が選択的に向上したレクチンの作製、又は、レクチンに作用してこれらの活性を促進又は抑制する分子の設計などに役立てることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、アメリカヤマゴボウから単離されたレクチンの結晶構造を解明することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、アメリカヤマゴボウから単離されたレクチンPL-Dの２種のアイソマー(PL-D1及びPL-D2)並びにPL-Cの結晶化に成功し、その結晶構造を解析した。本発明はこの研究に基づき完成されたものであり、以下のレクチンの結晶及びレクチンの作用を調節する分子の設計方法を提供する。
項１．  2個の炭水化物結合ドメインを有し、第１ドメインは１個のα-ヘリクス、２個の三アミノ酸残基からなる310-ヘリクス、１個の二本鎖逆平行βストランド及び４個のS-S結合を有し、第２ドメインは１個のα-ヘリクス、１個の三アミノ酸残基からなる310-ヘリクス、１個の二本鎖逆平行βストランド及び４個のS-S結合を有しているレクチン結晶。
項２．  ２個のドメイン中にそれぞれ存在する２個の炭水化物結合部位が同じ側に存在するように配置されている項１に記載のレクチン結晶。
項３．  第２ドメインに、４個の酸性アミノ酸残基からなる酸性区画を有する項１又は２に記載のレクチン結晶。
項４．  空間群P21に属し、a＝23.24Å、b＝56.95Å、c＝29.62Å、β=109.3°の単位格子定数を有するレクチン結晶。
項５．  空間群P21212に属し、a＝48.67Å、b＝49.01Å、c＝29.93Åの単位格子定数を有するレクチン結晶。
項６．  炭化水素と複合した状態で、単斜晶系空間群C2に属し、a＝98.6Å、b＝26.3Å、c=65.2Å、β=109.9の単位格子定数を有するレクチンの複合体結晶。
項７．  それぞれ３個の球状ドメインを有する2個のサブユニットからなり、両サブユニットは３個の球状ドメイン間の相互作用によりダイマーを形成しており、各ドメインには４個のジスルフィド結合が存在するレクチン結晶。
項８．  三方晶系空間群R3に属し、三方晶状態でa＝b＝104.1Å、c=69.7Åの単位格子定数を有するレクチン結晶。
項９．  レクチンの結晶の以下の(1)〜(8)の特徴の少なくとも一つを利用するレクチンの作用を調節する分子の設計方法。
(1)  2個の炭水化物結合ドメインを有し、第１ドメインは１個のα-ヘリクス、２個の三アミノ酸残基からなる310-ヘリクス、１個の二本鎖逆平行βストランド及び４個のS-S結合を有し、第２ドメインは１個のα-ヘリクス、１個の三アミノ酸残基からなる310-ヘリクス、１個の二本鎖逆平行βストランド及び４個のS-S結合を有している。
(2)  ２個のドメイン中にそれぞれ存在する２個の炭水化物結合部位が同じ側に存在するように配置されている。
(3)  第２ドメインに、４個の酸性アミノ酸残基からなる酸性区画を有する。
(4)  空間群P21に属し、a＝23.24Å、b＝56.95Å、c＝29.62Å、β=109.3°の単位格子定数を有する。
(5)  空間群P21212に属し、a＝48.67Å、b＝49.01Å、c＝29.93Åの単位格子定数を有する。
(6)  炭化水素と複合した状態で、単斜晶系空間群C2に属し、a＝98.6Å、b＝26.3Å、c=65.2Å、β=109.9の単位格子定数を有する。
(7)  それぞれ３個の球状ドメインを有する2個のサブユニットからなり、両サブユニットは３個の球状ドメイン間の相互作用によりダイマーを形成しており、各ドメインには４個のジスルフィド結合が存在する。
(8)  三方晶系空間群R3に属し、三方晶状態でa＝b＝104.1Å、c=69.7Åの単位格子定数を有する。
項１０．  空間群P21に属し、a＝23.24Å、b＝56.95Å、c＝29.62Å、β=109.3°の単位格子定数を有する項１又は２に記載のレクチン結晶。
項１１．  空間群P21212に属し、a＝48.67Å、b＝49.01Å、c＝29.93Åの単位格子定数を有する項１又は２に記載のレクチン結晶。
項１２．  炭化水素と複合した状態で、単斜晶系空間群C2に属し、a＝98.6Å、b＝26.3Å、c=65.2Å、β=109.9の単位格子定数を有する項１又は２に記載のレクチンの複合体結晶。
項１３．  三方晶系空間群R3に属し、三方晶状態でa＝b＝104.1Å、c=69.7Åの単位格子定数を有する項７に記載のレクチン結晶。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）PL-D
全体構造
前述したように、PL-Dには２種のアイソマー(PL-D1及びPL-D2)が存在する。本発明で明らかにされたPL-D1及びPL-D2の結晶構造を、既知のレクチン結晶である、WGA結晶、UDA結晶及びhevein結晶のものと比較しながら説明する。
【００１３】
最終モデルは、PL-D1では1-82残基のポリペプチド鎖及び132個の水分子を含み、PL-D2では1-82残基のポリペプチド鎖、81個の水分子及び1個カルシウムイオンを含む。図2(a)に示されるように、PL-D2分子は、結晶においてC末端でカルシウムイオンに結合している。図2(b)に示されるように、PL-D1分子の２個のC末端残基Leu83及びThr84は明確な電子密度図を与えない。
【００１４】
図３に示すように、PL-Dのポリペプチドのフォールディング構造は2個のキチン結合ドメインからなっている。第１ドメイン(ドメインI)は、1-42残基を含み、第２ドメイン（ドメインII）は、PL-D1では43-84残基、PL-D2では43-82残基を含む。これらのドメインは、特徴的な二次構造形成体を有さないが、幾つかの短い二次構造要素を有する。2個の短いα-ヘリクスは、ドメインIではAsp29-Cys32からなっており、ドメインIIではAsp70-Cys73からなっている。3個の３残基からなる310-ヘリクスの構造特徴は、ドメインIのGlu6-Ala8及びPro14-Gly16領域とドメインIIのArg47-Phe49領域に存在する。
Cys18-Cys19、Cys25-Gly26、Cys59-Cys60、Cys66-Gly67の領域は、βストランドの特徴を有し、最初の2個及び後の2個のストランドは、ドメインI及びIIにおいてそれぞれ逆平行なβシートを採っている。
PL-Dは各ドメインにおいて4個のS-Sブリッジを有する。即ち、ドメインIではCys4-Cys19、Cys13-Cys25、Cys18-Cys32、Cys36-Cys40であり、ドメインIIではCys45-Cys60、Cys54-Cys66、Cys59-Cys73、Cys77-Cys81である。これらのS-Sブリッジ部位は他のキチン結合タンパク質のドメインに見出されるものと同じである。これらの構造要素は各ドメインを硬くしている。PL-D2のこのドメインと関係するキチン結合タンパク質のこのドメインとの構造の比較を表１に示す。
【００１５】
【表１】
2005154378.tif 000003
PL-Dにおける両ドメインを連結しているリンカー領域の長さは、関係するキチン結合タンパク質のそれらの長さの中で最も短い。図１に示すように、リンカーは最初のドメインの最後のCys残基と次のドメインの最初のCys残基で挟まれ、PL-D、UDA6及びWGA2でそれぞれ4、9及び5残基からなっている。
炭水化物結合部位
糖質と複合しているキチン結合タンパク質の幾つかの三次構造は、UDA、hevein及びWGAについて報告されている。図4(b)に示すように、トリN-アセチルキトトリオースと複合しているUDAの結晶において、糖質分子は1つのUDA6分子のドメインIの炭水化物結合部位と他のUDA6分子のドメインIIの炭水化物結合部位との間に挟まれている。
【００１６】
UDA6と糖質分子との間の主な相互作用は、糖質のピラノース環と、UDA6のドメインIのTrp21及びTrp23の芳香族側鎖およびドメインIIのHis67及びTrp69の芳香族側鎖との間の、面どうしの重なりによる相互作用である。重なり相互作用は、糖質のアセチルアミノ基とUDA6のドメインIのTyr30のフェノール環およびドメインIIのTrp76のフェノール環との間にも存在している。
【００１７】
UDA6のドメインIのTyr30のフェノール性水酸基およびドメインIIのTyr76のフェノール性水酸基は、糖質のピラノースO3水酸基と水素結合する。水素結合は、糖質のアセチルアミノ基とUDA6のドメインIのSer19の水酸基およびドメインIIのSer65の水酸基との間にも存在する。これらの相互作用は、N-グルコサミン残基の認識に重要であろう。
【００１８】
図４に示すように、トリ-N-アセチルキトトリオースと複合体形成しているUDA6のドメインと、PL-D2のそれらとの間の構造の比較により、これらの炭水化物結合性残基がUDA6及びPL-D2の双方の全てのドメインの中の殆ど全てに配置されていることが分かる。UDA、hevein、WGAで報告されている炭水化物結合性残基に対応するPL-Dにおける残基は、ドメインIではSer20、Trp22、Tyr24及びTyr31であり、ドメインIIではSer61、Trp63、Tyr65及びHis72である。
【００１９】
UDA6における幾つかの炭水化物結合性残基はPL-Dでは異なる種類の残基で置換されている。UDA6のドメインIのTrp23は、PL-DではTyr24により置換されている。図１に示すように、WGA2において、Tyr、His及びPheの芳香族残基の多様性はこの部位で見出されており、WGA1及びWGA2の複合体の糖質と相互作用する。UDA6のドメインIIのHis67は、PL-DのドメインIIではHis72により置換されており、WGA2のドメインIIIではPheにより置換されている。UDA6の炭水化物結合のための幾つかの芳香族残基はPL-Dでは芳香族残基の異なるタイプにより置換されている。PL-Dは、糖質のピラノース環と芳香族側鎖との間で面と面とを積み重ねる方法でトリ-N-アセチルキトトリオースと相互作用するであろう。これは、PL-Dのこれらの炭水化物結合性残基の配置は、UDA6複合体のそれと殆ど同じだからである。
【００２０】
PL-Dの炭水化物結合性残基が他のキチン結合タンパク質と最も興味深く違っている点は、UDA6のドメインI及びIIのそれぞれTyr30及びTyr76がPL-DではHis72で置換されていることである。これらのTyr残基のそれぞれは、UDA6の糖質複合体のピラノースO3水酸基と水素結合する。図１に示すように、この部位のチロシン残基は、WGA2のドメインIIIのPhe117を除き、hevein、UDA6及びWGA2で殆ど完全に保存されている。この部位のヒスチジン残基によるチロシン残基の置換は、おそらくPL-Dの特徴である。His72のイミダゾール環のNε２原子は、UDA6-糖質複合体におけるTyr30又はTyr76のフェノール性水酸基に見出されるように、糖質のO3水酸基と水素結合により相互作用する。
【００２１】
図４に示すように、UDA-6-糖質複合体とPL-D2との構造の比較から、His72のイミダゾール環のNε２原子と糖質のピラノースO3水酸基との距離は、PL-D2（4.1Å）の方がUDA6（2.7Å）より長いことが分かる。PL-Dの糖質の位置がUDA6より少しHis72に近い場合、PL-Dは、関連タンパク質の複合体に見出されるのと同じ方法で糖質分子に結合するであろう。
ドメインの配置
PL-Dの構造の特徴の一つはドメインの配置である。ドメインの配置は、２個の推定上の炭水化物結合部位間の位置関係を決めている。図３及び図５に示すように、PL-Dにおいて、推定上の両方の炭水化物結合部位は、PL-D分子の同じ側に位置している。
【００２２】
図１に示すように、PL-Dとは異なって、UDA6の２個のドメインは、PL-Dのそれより５残基長いリンカーペプチドにより連結されている。また、図5(a)に示すように、２個の炭水化物結合部位はそれぞれ分子の反対側に配置している。UDAにおいて、炭水化物結合部位の配置はリンパ球に対するT細胞レセプターの活性化タイプを決定していると考えられている。図１に示すように、WGA二量体分子のサブユニットは、キチン結合ドメインからなっている。図5(b)に示すように、PL-D2分子のドメインIがWGA2サブユニットのそれの上に重なっているとき、PL-D2のドメインIIはWGA2のそれとは全く異なる方向に配向している。これらの比較において観察されるように、関連レクチン間のリンカーの配向の違いから、それらの間のドメインの配置の違いが導かれる。この現象が、各キチン結合レクチンに特徴的な特性を作りだしていると考えられる。
【００２３】
図６に示すように、PL-D1の２個のドメインの相対配置はPL-D2と違っていて、PL-D1の一つのドメインの推定上の炭水化物結合部位が他のドメインの推定上の炭水化物結合部位の方向とは反対側とは反対方向にPL-D2より14°回転している。PL-D1とPL-D2とのリンカーペプチドAsp41-Trp43のΦ角及びΨ角の微小な違いは、それらの間のドメインの配置の違いを引き起こす。前掲の表１に示すように、PL-D1とPL-D2との間の各ドメインの対応するCα原子のr.m.s偏差は、ドメインI及びドメインIIで、ぞれぞれ0.283Å及び0.241Åである。PL-D1及びPL-D2の対応するドメイン間には有意な構造上の違いは認められない。PL-D1とPL-D2との間の本質的な違いはC末端領域に存在するため、上記観察されるドメインの異なる配置は、結晶パッキングの違いにより引き起こされるのであろう。これらの事実により、PL-Dの２個のドメイン間のリンカーが柔軟であることが分かる。相対的なドメインの配向の違いは、UDAのリガンドフリー及び糖質複合結晶間でも認められる。即ち、三糖及び四糖複合体でそれぞれ相対的に２°及び６°回転している。ドメイン間のリンカーペプチドの柔軟性は、キチン結合レクチンの炭水化物結合部位を、血球凝集や細胞分裂促進活性化のための標的炭水化物への結合を調整するのに重要な役割を果たしている。
カルシウム結合部位
図３に示すように、PL-D2の結晶構造において、結晶溶液に含まれるカルシウムイオンは、レクチンのC末端領域に結合する。図２に示すように、隣接の分子のAsp57のβ-カルボキシル基、Asp82のα-カルボキシル基（C末端残基）、Asp48のβ-カルボキシル基及び３個の水分子は、８面体構造でカルシウムイオンに配位している。Asp57の側鎖カルボキシレート（-COO-）は、脱プロトン共鳴型でカルシウムイオンと相互作用しているように見える。リガンドとしてのカルシウムイオンにAsp48を提供する隣接の分子は、a-軸に沿って次の単位格子に属する。
【００２４】
これらの相互作用に加えて、Asp57及びAsp82は、また、それぞれ隣接の分子のArg44及びArg47とソルトブリッジを形成している。これらの相互作用は、結晶格子の形成に寄与しているようであるが、これらの相互作用の物理的な役割は不明である。
【００２５】
カルシウムイオンは動物由来のC-型レクチンでは炭水化物結合に必須である。レジューム（legume）のレクチンであるコンカナバリンAは、炭水化物結合活性に関与する２価カチオンに結合する。しかし、図4(b)に示すように、PL-D2において、カルシウム結合部位はドメインIIの推定上の炭水化物結合部位とは反対側に位置するため、カルシウムイオンは炭水化物結合に関与しないようである。
酸性残基の分布
分子表面の酸性残基群の存在は、PL-Dのもう一つの特徴である。図７(a)に示すように、Ser61、Trp63、Tyr65及びHis72からなる推定上の炭水化物結合部位の付近には、Asp70、Asp71、Glu74及びAsp75のカルボキシル側鎖の酸性区画が存在する。C末端のAsp82残基のα-及びβ-カルボキシル基、並びに、Asp57残基のβカルボキシル基は、この酸性区画から少し離れて位置している。図7（a）に示すように、さらに、Glu55及びGlu56のカルボキシル側鎖は、この部位の隣に見出される。図7（b）に示すように、これらの残基は、PL-Dの分子表面の一方の面上で酸性残基のクラスターを形成している。
【００２６】
図１に示すように、PL-ファミリーメンバー間のアミノ酸配列の比較は、PL-B及びPL-Cがおそらく酸性区画を有することを示す。幾つかのアスパラギン酸残基はグルタミン酸残基で置換されているが、PL-DのドメインIIのAsp70、Asp71、Glu74及びAsp75からなる酸性区画は、PL-CのドメインIII及びPL-BのドメインVIIで保存されている。さらに、PL-BのドメインIIIは、この部位で３個の酸性残基からなるクラスターを有する。heveinは、PLのような３個の酸性残基からなる酸性区画を有する。
【００２７】
しかし、図１に示すように、UDA6及びWGA２は、この部位に酸性残基を１個だけ有する。これらの酸性残基クラスターがキチン結合タンパク質の如何なる機能に関与するかは不明であるが、前掲の表１に示すように、WGA2及びUDA6上に比べてより多くの酸性残基がPLタンパク質上に分布している。この構造上の特徴は、PLタンパク質の何らかの機能特異性を産むと考えられる。
マイトジェン活性（細胞分裂促進活性）
PL-Dの最も重要な事柄は、PL-D2のC末端から拡張されたPL-D1のLeu83-Thr84の２個の残基の領域が、どのようにしてPL-D2のマイトジェン活性を阻害するかである。図2（b）に示すように、本発明の結晶構造にはPL-D1の拡張された領域の電子密度は認められなかった。Asp82は、PL-D2の残基と比べて、比較的不明瞭な電子密度を示した。このC末端領域は、結晶中で決まった配向を採っていないようである。PL-D1の２個の残基のC末端の拡張に起因するマイトジェン活性不能を考慮すれば、この拡張はPL-D2のC末端付近のマイトジェン活性領域とその標的分子との間の適切な相互作用を妨げる筈である。マイトジェン活性のためにPL-D2がどのような種類の分子に結合するかは不明であるが、PL-D2のC末端付近の機能性部位がその標的分子と相互作用するステップは、PL-D2によるマイトジェン活性化のメカニズムに含まれる筈である。
【００２８】
レクチンによる細胞の凝集は、細胞表面における炭水化物とレクチン分子の１又は２以上の炭水化物結合部位との相互作用を介した細胞の架橋を引き起こす。PL-D1はマイトジェン活性を有さないにもかかわらず凝集活性を有する。これは、凝集過程では標的分子とマイトジェン活性化のためのC末端領域との相互作用は存在しないことが原因であると考えられる。PL-D分子の２個の炭水化物結合部位が凝集において機能しているのであろう。
実施例
（Ｉ）PL-D1及びPL-D2
以下、実施例を示してPL-D1及びPL-D2についてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００２９】
(1)  結晶の調製
Biosci.Biotechnol.Biochem.60,1380-1382,1996に記載された方法で、PL-D1及びPL-D2を調製した。PL-D2の凍結乾燥したタンパク質を100mM Tris-HCl バッファー(pK7.5)に溶解して、10mg/mlの結晶溶液を調製した。溶解しなかった成分を遠心分離により除去した。PL-D2の結晶は、最初25℃の下で、18％ポリエチレングリコール8000、0.2M酢酸カルシウム、0.1M酢酸ナトリウムバッファー (pH4.6)のリザーバー溶液を用いて、ハンギングドロップ蒸気拡散（hanging-drop vapor-diffusion）法により成長させた。X線実験のための結晶は、シーディング法(seeding method)を併用したバッチ法により得た。
【００３０】
ハンギングドロップ蒸気拡散法により得られた結晶を針で砕いてマイクロシードを調製した。少量のマイクロシードを含む１μlのリザーバー溶液を、マイクロチューブ内の10mg/mlのPL-D2溶液の20μlに加え、チューブを25°で保存した。沈殿に現れた結晶を1-2週間成長させた。多くの結晶は外形が乱れて積み重ねられた状態になったが、幾つかの形の良い単結晶が結晶チューブ内に認められた。
【００３１】
PL-D1の凍結乾燥タンパク質を50mM Tris-HCl バッファー(pK7.5)に溶解して、5mg/mlの溶液を調製した。溶解しなかった成分を遠心分離により除去した。PL-D1の結晶は、25℃の下で、30％ポリエチレングリコール8000、0.2M酢酸カルシウム、0.1M酢酸ナトリウムバッファー (pH6.5)のリザーバー溶液を用いて、ハンギングドロップ蒸気拡散法により成長させた。タンパク質溶液の２μlとリザーバー溶液の２μｌとを混合することより調製した液滴を25°でリザーバー溶液に対して蒸気平衡化した。X線実験のための結晶は、液滴に幾つかのマイクロシード及び30%の6-アミノカプロン酸の0.3μlを添加することにより成長させた。
【００３２】
(2)データ収集・加工
PL-D2の回折データを、Fuji imaging plate(400mm×200mm)付きのscreenless Weissenberg カメラを用いて、BL18Bステーション（Photon Factory, Institute of Materials Structure Science, High Energy Accelerator Research Organization, Tsukuba, Japan）で収集した。PL-D2のデータの２セットの収集は、ガラスキャピラリ中に密閉された異なる配向の２個の結晶を用いて、291Kで行った。使用した結晶サイズは、およそ0.2mm×0.08mm×0.02mmであった。
【００３３】
スピンドル軸（spindle axis）に平行に結晶学的b-軸を向けて一つのデータを収集した。それは、１フレーム当たり18.0°の振動角、2.6°/mmのカップリング定数、１フレーム当たり360秒の暴露時間、180°を超える範囲をカバーする11フレームからなる。他のデータセットは、スピンドル軸に平行にc-軸を向けて収集した。それは、１フレーム当たり15.5°の振動角、1.3°/mmのカップリング定数、１フレーム当たり372秒の暴露時間、90°を超える範囲をカバーする８フレームからなる。これらのデータをDENZO及びSCALEPACKのプログラムで数値データ化した。
【００３４】
この結晶は、空間群P21に属し、a＝23.24Å、b＝56.95Å、c＝29.62Å、β=109.3°の単位格子定数を有し、非対称単位中に１分子を含む。
【００３５】
PL-D1の回折データは、２×２アレイタイプのADSC社製Quantum-4 CCD検出器を用いて、BL6Aステーション（Photon Factory, Institute of Materials Structure Science, High Energy Accelerator Research Organization, Tsukuba, Japan）で収集した。PL-D1のデータ収集は、液体窒素ガス流の中で瞬間的冷却結晶（flash-cooled crystal）を用いて100Kで行った。使用した結晶のサイズはおよそ約0.1ｍｍ×0.1mm×0.02ｍｍであった。
【００３６】
結晶は、抗凍結剤（cryo-protectant）として20％(v/v)ポリエチレングリコール400を含む結晶母液に約１分間浸漬したのち、ナイロンループで保持してゴニオメーター（goniometer）に載せた。これらのデータは、１フレーム当たり1.0°の振動角、１フレーム当たり60秒の暴露時間で、180°をカバーする180フレームを用いて収集した。これらのデータをDPS/MOSFLMのプログラム及びCCP4プログラムのセットで数値データ化した。
【００３７】
この結晶は、空間群P21212に属し、a＝48.67Å、b＝49.01Å、c＝29.93Åの単位格子定数を有し、非対称単位中に１分子を含む。PL-D結晶のデータ収集及び処理統計値をまとめて表２に示す。
【００３８】
【表２】
2005154378.tif 000004
(3)構造決定及び精密化
本PL-D2の構造を、CCP4プログラムセットのプログラムMOLREPを用いて分子置換法（molecular replacement method）により決定した。コムギアグルチニンイソレクチン３（WGA3、PDBコード1WGT)のドメインIV（132-169残基）の構造を出発モデルに採用した。
【００３９】
見積もられたVm値から、非対称単位は１個のPL-D2分子を含むことが期待された。アミノ酸配列の比較から、PL-D2分子は２個のキチン結合ドメインを有することが期待された。WGA3ドメインIVの２個のフラグメントが非対称単位中に存在するとの仮定で分子置換法を行った。回転関数（rotation  function）及び並進関数（translation function）は3.5Å分解能で計算された。第１の解は、回転関数及び並進関数の最も高いピークとして見出され、0.201の相関係数及び0.578のR-ファクターを与えた。第１解のフラグメントの位置を固定して、第２解は回転関数の３番目に高いピーク及び並進関数の最も高いピークとして見出され、0.370の相関係数及び0.508のR-ファクターを与えた。
【００４０】
これらの解の位置に置かれた両フラグメントは、一方のドメインのC末端と他方のN末端との間の連結ペプチドを収容するに十分な空間を有した。これにより、このフラグメントモデルが合理的な配置を採ったことが確かになった。
【００４１】
プログラムTurbo-FRODOを用いて電子密度図を観察し、モデル構築（building）を行った。構造精密化は、初期においてはプログラムX-PORで途中からCNSを用いて行った。rigid body精密化は、10-3.0Åの分解能で行った。精密化は、2000Kからの分子動力学的精密化法、並びに、2F0-Fc及びF0-Fc図を用いての手動での修正をより行った。分解能は、2.5Åから1.5Åまで徐々に拡張した。精密化の過程でモデルに水分子を加え、β-ファクター及び位置精密化を採用した。構造の精密化は、∞〜1.5Å分解能の範囲内での10,323反射に対して17.6%のR-ファクターに収束した。同じ分解能範囲内でのデータのランダムに選択された10%の反射に対するfree R-ファクターは20.7%であった（1,190反射率）。
【００４２】
PL-D1の構造は、精密化されたPL-D2モデルを出発モデルとしてプログラムMOLREPを使用した分子置換法により決定した。見積もられたVm値から、非対称単位は１個のPL-D1分子を含むことが期待された。回転関数及び並進関数は3.5Åを計算された。回転関数及び並進関数の最も高いピークとして、解が得られた。プログラムCNSを用いて精密化を行った。rigid-dody精密化において、各ドメインをrigid-bodyとして処理した。
【００４３】
構造モデルの精密化は、∞〜1.6Åの分解能範囲内で、8,226反射に対して17.5%のR-ファクターに収束した。free R-因子は、同じ分解能範囲でのデータのランダムに選択された10%に対して20.2%であった(959反射率）。PL-D1及びPL-D2の精密化の結果を前掲の表１にまとめて示す。図２は、プログラムBOBSCRIPT及びプログラムRASTER3Dを用いて描いた。図３〜６及び図7（a）は、プログラムMOLSCRIPT及びプログラムRASTER3Dを用いて描いた。図7（b）は、プログラムGRASP及びプログラムRASTER3Dを用いて描いた。
（ＩＩ）PL-C
次に、PL-Cの結晶構造をPL-D2と糖との複合体の結晶構造と比較しつつ詳細に説明する。
全体的構造
図８(a)に示すように、PL-Cの1.8Å電子密度図は、明確かつ連続した電子密度の流れを示しており、殆ど全ての部分のPL-Cの構造を規定している。PL-C結晶の非対称単位は2個のPL-Cサブユニット（A及びB）からなるダイマーを含む。Lys47A、Thr126A、Lys88B、Leu124B及びThr126Bの側鎖は電子密度図で弱く現れているが、全ての主鎖原子とともに全ての側鎖原子は、本発明の構造モデルに含まれる。Glu115A(Glu115B)を除き、ラマチャンドランプロットの禁止領域には残基は存在しない。Glu115A(Glu115B)のまれなバックボーンコンフォメーションは、そのバックボーンカルボニル酸素原子とCys118A（Cys118B)アミド窒素原子との間の水素結合により安定化している。
【００４４】
非対称単位中の各PL-Cサブユニットは、キチン結合領域と称される３個のコンパクトな球形のドメインからなっている。PL-Cの各キチン結合ドメインは、ユニークな構造を採っており、これは、WGA、UDA、heveinのような他のキチン結合タンパク質の結晶構造で報告されているように、明確な二次構造を有しない。各ドメインで保存された4個のジスルフィド結合は独特な三次構造の形成に重要な役割を果たしている。これらのジスルフィド結合に加えて、二次構造を欠くこのドメインの構造的な堅さ（rigidity）は、一部の場所ではドメイン間の多数の水素結合により達成されている。炭水化物の結合に関与する推定上のアミノ酸残基は、ドメイン内位置22,24及び31番の芳香族残基並びにドメイン内位置20のセリン残基である。
ダイマー形成
図９(a)に示すように、PL-C結晶の非対称単位中の2個のサブユニットは、非結晶学的２回軸により互いに関係しており、推定上の炭水化物結合部位の3対で、頭と尾とが向き合うようにして（head to tail）ダイマーを形成している。従って、このサブユニット中の全ての炭水化物結合部位は、ダイマーの界面に位置している。PL-Cのダイマー形成は、このダイマー中の向かい合ったドメインの推定上の炭水化物結合部位を介して行われている。ダイマーにおいて相互作用するドメイン対は、ドメインIA/IIIB、ドメインIIA/IIB及びドメインIIIA/IBである。ドメインIA/IIIBの相互作用はドメインIIIA/IBのそれと同じである。
【００４５】
WGAは、4個の推定上のキチン結合ドメインを有する同一サブユニットのダイマーである。WGAの２個のサブユニットは、PL-Cと同様に頭と尾とが向き合うようにして会合している。PL-Cとは異なりWGAの炭水化物結合部位は溶媒に暴露しており、リガンドは２個のサブユニット間の割れ目に導かれる。ダイマー形成は、機能上の炭水化物結合部位の形成のために必要であると考えられていたが、WGA-リガンド複合体の結晶構造により、炭水化物への結合は１個のドメイン内で完全に行えることが分かった。さらに、１個のキチン結合ドメインからなるheveinがモノマー状態でキチンに結合するという事実からWGAの結晶構造に観察されるダイマー形成は、このファミリーにおける炭水化物への結合に必須ではないと結論付けられる。
【００４６】
PL-Cの結晶構造は、２個のサブユニット間の炭水化物結合部位における疎水性相互作用を介した自己会合のために、炭水化物を収容する場所を有さないことが明らかになった。従って、自己会合による炭水化物結合能の損失は、PL-Cが凝集活性を有さないことの理由になっていると考えられる。
PL-D2複合体の全体的構造
複合体化したPL-D2結晶の非対称単位は、２個のPL-D2分子（A及びB）及び２個のトリ-N-アセチルキトトリオース分子を含む。図８(b)に示すように、三糖分子は電子密度図上で旨く規定されている。非対称単位における２個のPL-D2分子は、結晶学的c-軸に沿った単位格子の半分のシフトを伴った非結晶学的並進対称により互いに関連している。結晶学的に独立な分子間のこの位置的関係は、native Patersonマップから予測された。しかし、非対称単位中の２個のPL-D分子は結晶学的c-軸に対して厳密には同一方向に配向していないため、この対称操作は結晶学的c-軸に完全に平行でない。
【００４７】
２個の三糖分子は、非対称単位中の２個のPL-D2分子に結合している。図９(b)及び図10に示すように、非対称単位内の２個の三糖分子の一つは、分子AのC末端ドメイン（ドメインII）の炭水化物結合部位及び分子A'のN末端ドメイン（ドメインI）のそれとの間で共有されている。ここで「'」は、結晶学的２回ら旋軸により関連している隣接の分子を意味する。さらに、図10に示すように、分子BからのSer9Bは、タンパク質分子A、A'間及び三糖分子間に形成されるタンパク質−炭水化物相互作用に参加している。同様に、非対称単位内の他の三糖分子は、分子BのドメインII及び分子B'のドメインIの炭水化物結合部位間で共有されている。分子AからのSer9Bはこの相互作用に参加している。その結果、ただ１個の三糖分子がPL-D2分子に結合し、非対称単位内に２個のPL-D：三糖複合分子を形成している。
【００４８】
複合PL-D2分子と複合していないPL-D2分子との間で、各ドメインのコンフォメーションの違いは観察されない。複合PL-D2分子と複合していないPL-D2分子との炭水化物結合部位の幾何学配置は同じである。このことは、炭水化物への結合が各ドメインにおいて炭水化物結合部位の幾何学配置に重大な影響を与えていないことを示す。しかし、三糖との相互作用に参加する結果、分子A及び分子BのSer9残基のΦ角及びΨ角は、複合していないPL-D2分子のそれらと異なっている。
炭水化物結合部位の構造的な堅さ(rigidity)
図11に示すように、WGA1、UDA6、PL-C、複合していないPL-D2及び複合したPL-D2の個々のドメインの構造を、PL-D2複合体の残基Cys4-Cys40のCα原子と他の全てのドメインの対応するCα原子との間での重ね合わせにより、ドメインの全ての同等の対について比較した。
【００４９】
UDAを除き上記全てのタンパク質の全てのドメインの重ね合わせは、全ての可能な比較において0.30〜0.71Åの範囲のr.m.s.d.値を与えた。個々のドメインの全体的構造は非常に類似しており、各ドメインのジスルフィド結合は、全てのドメイン間で同一に位置している。しかし、幾つかのUDA6ループにコンフォメーションの違いが見出される。最も決定的なコンフォメーションの違いは、UDA6のCys3-Cys12及びCys77-Cys82ループにある。
【００５０】
前者のループはグリシンリッチであり、後者のループはアミノ酸残基が挿入されている。他方、ドメインのコアを支配する炭水化物結合部位を含むループのコンフォメーションは、これらのドメイン間で本質的に同一である。このループのN末端は１個のジスルフィドブリッジにより堅く固定されており（例えば、PL-D2のドメインIのCys13-Cys25）、C末端は２個の連続するジスルフィドブリッジにより堅く固定されている（例えば、PL-D2のドメインIのCys4-Cys19及びCys18-Cys32）。このように、４個のジスルフィドブリッジのうちの３個は、ループの安定化に寄与している。図11に示すように、このループ上の３個の炭水化物結合性芳香族残基により形成された炭水化物結合幾何学配置は、全てのドメイン間で同一である。上述したように、複合したPL-D2と複合していないPL-D2との比較により、炭水化物結合部位は炭水化物結合にあたりコンフォメーションの変化が起こらないことが分かる。
【００５１】
嵩高い側鎖又は疎水性の側鎖を有する残基は、三次構造の炭水化物結合のための芳香族残基の周囲に集中しており、芳香族残基と積み重なっている。PL-D2では、Trp22、Tyr24、Tyr63及びTrp65の芳香環の配向は、それぞれGln21、Pro2、Lys62及びArg44の側鎖と積み重なり相互作用している。炭水化物結合部位でのこれらの嵩高い残基の高い保存レベルは、ここで考慮される他のタンパク質のそれらに匹敵する。炭水化物結合性芳香族残基の付近のこれらの保存された嵩高い残基は、直接リガンドに接触しないが、芳香族環と相互作用する。その結果、リガンドと効果的に相互作用するために、炭水化物結合性芳香族残基に適した幾何学配置が、炭水化物結合部位においてこれらの嵩高い残基を介して螺旋の束縛により堅く維持される。これらの嵩高い残基は、炭水化物結合の幾何学配置を維持するために進化の過程で優先的に保存されてきた。
PL-D2複合体におけるタンパク質−炭水化物相互作用
PL-D2複合体の炭水化物結合部位におけるタンパク質−炭水化物相互作用を表３に示す。
【００５２】
【表３】
2005154378.tif 000005
分子B(B')の場合は分子A(A')の場合と殆ど同じであるため、以下のPL-D2複合体の炭水化物結合の説明は、分子A及びA'と三糖との相互作用に焦点を当てている。さらに、トリ-N-アセチルキトトリオースの３個の糖残基は、非還元末端から還元末端へNAG-I、NAG-II及びNAG-IIIと命名した。表３に示すように、ドメインIIの炭水化物結合部位は、３個の糖残基を収容するための３個のサブサイトを有する。分子AのドメインIIにおいて、三糖と相互作用する主な残基はSre61、Tyr63A及びHis72Aである。図10に示すように、三糖とこれらの芳香族残基とのファンデルワールス力による多数の相互作用は、糖残基のピラノース環の配向を固定する。さらに、PL-D2分子中の２個のドメインを連結しているリンカー内に存在するTrp43Aは、非還元末端での三糖との疎水性相互作用に参加する。その結果、三糖の非還元末端への糖残基の付加はTrp43Aに対する立体障害を導き、一方、追加した糖残基は還元末端で収容される。従って、ドメインIIにおける炭水化物結合部位は炭水化物結合においてら旋の制約を有する。アミノ酸残基と三糖との相互作用において、Ser61A及びHis72AとNAG-IIとの水素結合は、表３及び図10に示すように、リガンドの特異性を決定する。さらに、His72Aは、NAG-IIとCH-π相互作用を形成する。
【００５３】
PL-D2のドメインIIの位置61のセリン残基は、ここで取り上げる全てのキチン結合タンパク質で完全に保存されている。セリン残基とN-アセチル基のカルボニル炭素原子との間に形成される水素結合は、他のキチン結合タンパク質の結晶構造でも観察されている。極性芳香族残基は、PL-D2のHis72に対応する位置で硬度に保存されている。この極性芳香族残基は、しばしば,WGA1のドメインIIIの非極性芳香族残基Pheにより置換される。しかし、結晶学的な証拠は、上述した炭水化物結合性はこのケースでも未だ可能であることを示す。N-アセチル基のメチル基と芳香族環との間のCH-π相互作用は、インフルエンザヴィールスヘムアグルチニン及びAmaranthus caudatusアグルチニンで観察されてきた。これらの事実から判断して、PL-D2のドメインIIの残基72に対応する芳香族残基は、水素結合を介して、N-アセチル基の隣のC'3水酸基の認識よりむしろCH-π相互作用を介したN-アセチル基の認識に要求されているようである。このように、Ser61A及びHis72は、N-アセチル基の特異性決定に重要な役割を果たしている。
【００５４】
分子A'のドメインIIにおける三糖結合部位及び炭水化物結合部位間の相互作用スキームは、それらの部位に結合する糖残基の数は違うが、分子AのドメインIIのそれに類似している。表３に示すように、分子A'のドメインIの炭水化物と相互作用するアミノ酸残基は、Ser20A'、Trp22A'、Tyr24A'及びTyr31A'である。ドメインIの炭水化物結合部位は、三糖の非還元末端の２個の糖残基（NAG-I及びNAG-II）に特異的である。図10に示すように、還元末端の糖残基（NAG-III）は、ドメインIの炭水化物結合部位における相互作用がない。三糖と炭水化物結合部位との界面に埋没している表面領域は、ドメインIで480Å2であり、ドメインIIで583Å2である。このことは、ドメインIIの炭水化物結合部位が、ドメインIのそれより三糖とより広範囲な相互作用を形成する。ドメインIIと異なり、糖残基モデルは、ドメインIの炭水化物結合部位の三糖のどちらの末端にも加えられることができる。図12に示すように、PL-D2複合体の２個の三糖結合領域の重ね合わせから、ドメインIの炭水化物結合部位とドメインIIの炭水化物結合部位に結合した三糖との間の関係が理解できる。ドメインIの炭水化物結合部位は、還元末端で糖残基（NAG-II及びNAG-III)に特異的であり、非還元末端で糖残基(NAG-I)は結合しない。この場合、炭水化物結合部位と三糖との界面に埋没した表面領域は495Å2であり、結晶構造のそれ（480Å2)に匹敵する。このように、PL-D2のドメインIの炭水化物結合部位は、糖残基を収容する２個のサブユニットだけを本来的に有する。
【００５５】
溶液中でのUDAの炭水化物結合の研究により、２個の結合部位間の炭水化物結合親和性の違いが分かってきている。Harataらは、結合親和性の違いは、炭水化物結合部位を形成するアミノ酸残基の違いによると提案している。Saulらは、結合親和性の違いは、炭水化物結合部位での糖に特異的な螺旋制限の違いによると提案している。UDA-三糖複合体の結晶構造は、本発明のPL-D2−三糖複合体の結晶構造と類似している。隣接のタンパク質分子との間の１個の三糖分子の共有は、PL-D2複合体の結晶に見出されるように、UDA-三糖複合体の結晶に観察される。しかし、UDAのドメインI及びIIの三糖の炭水化物結合状態は、PL-D2のそれらとは反対側を向いている。即ち、UDAの炭水化物結合部位は、３個の糖残基と相互作用しているが、ドメインIのそれであり、三糖の非還元末端からの２個の糖残基とのみ相互作用している炭水化物結合部位は、ドメインIIのそれである。炭水化物と結合するためのアミノ酸残基に関してUDAのドメインIとII間との唯一の違いは、ドメインIのTrp21がドメインIIではHis67に置換されていることである。図8に示すように、PL-D2において、炭水化物結合のための３個の芳香族残基は、ドメイン間でタイプが異なる。Trp65はドメインIIの三糖と広範囲に相互作用するが、ドメインIの対応する位置でTyr24により置換されており、その結果、これらの２個のドメイン間での炭水化物結合性の違いを決定している。ドメインIのTyr24は、Trpのインドール環より小さいフェノール環を介して唯一の糖残基と相互作用している。ドメインIIのTyr63が、ドメインIでは、Tyrより嵩張るTrp22により置換されているにもかかわらず、Trp22は、そのコンフォメーションが炭水化物結合部位の取り巻くアミノ酸残基により制限されていることから、唯一の糖残基と相互作用する。従って、PL-D2のドメインIの位置24に対応する位置の芳香族残基の側鎖は、炭水化物結合親和性にとって重要であるように見える。PL-D2の２個の結合部位間の炭水化物結合親和性の違いは、報告されていない。しかし、PL-D2複合体の結晶構造及びUDA複合体は各タンパク質の２個の結合部位間の違いを反映しているだろう。結晶成長の過程で、１個のタンパク質分子の、強い親和性を有する炭水化物結合部位は、最初に、一方の側で１個の三糖分子の３個の糖残基と結合し、複合体を形成する。１個の複合分子の、弱い親和性を有する炭水化物結合部位が、次に、他の側で他の複合分子の三糖分子の２個の糖残基と結合し、２個の部位間で三糖を共有して、無限の分子鎖を形成する。
PL-Cダイマーにおけるタンパク質−タンパク質相互作用
図13に示すように、PL-D2複合体の三糖と直接相互作用する残基に対応するPL-Cの芳香族残基は、ドメインIA（Ｂ）とドメインIIIB（B）との間の疎水性結合並びにドメインIIAとドメインIIBとの間の疎水性結合に含まれる。
【００５６】
PL-Cダイマーの炭水化物結合部位の主なサブユニット間相互作用を表４に示す。
【００５７】
【表４】
2005154378.tif 000006
PL-Cのダイマー形成に関与するこれらの芳香族残基は、糖残基に似せたもののようである。PL-Cの炭水化物結合部位がPL-D2複合体のそれらと重なっている場合、PL-CダイマーのTrp22A(B)のインドール環及びGlu30A(B)の側鎖は、それぞれ、PL-D2複合体のNAG-III及びNAG-IIのピラノース環と完全にオーバーラップしている。同様に、Tyr63A(B)のフェノール環は、PL-D2複合体においてNAG-IIIのピラノース環とオーバーラップしている。図13(a)及び13(b)に示すように、PL-CのHis113Bは、GluA(B)のカルボニル酸素原子と静電的に相互作用している。図13(a)に示すように、これは、PL-D2複合体においてNAG-IIのC'3水酸基と水素結合しているHis72に類似している。全てのドメインで保存されているSer20,Ser61及びSer102のセリン残基は、PL-Cダイマーにおいて水和されている。PL-Cにおけるこれらのセリン残基と水素結合している全ての水分子は、PL-D2複合体では、糖残基のN-アセチル基のカルボニル酸素原子により置換されている。このように、PL-Cダイマーにおける炭水化物結合部位間のタンパク質−タンパク質相互作用スキームは、PL-D2複合体のタンパク質−炭水化物相互作用と極めて類似している。
【００５８】
PL-Cダイマー化及びPL-D2の複合体形成に際して、溶媒に接近できる表面領域の損失を図14に示す。図14から、PL-Cのダイマー化に関与するアミノ酸残基はPL-D2の炭水化物結合に関与するアミノ酸残基と対応しているにもかかわらす、炭水化物結合部位当たりの接触領域は、PL-CダイマーとPL-D2複合体とで決定的に異なっている。PL-Cダイマーの炭水化物結合部位の相互作用対間の接触面積は、ドメインIA／ドメインIIIBで705Å2、ドメインIIA／ドメインIIBで580Å2、ドメインIIIA／ドメインIBで614Å2である。他方、三糖とPL-D2との間の接触面積は、ドメインIで480Å2、ドメインIIで583Å2である。明らかに、PL-Cダイマーのタンパク質−タンパク質間相互作用は、PL-D2複合体のタンパク質−炭水化物間相互作用より広範囲である。
生物学的意味
【００５９】
レクチンの多価性は、多様な相互作用、細胞の架橋及び複合糖質の凝集のための重要な因子である。事実、４個のジスルフィドブリッジを有する標準的な43残基のキチン結合ドメインであるhevein、及び、heveinより短く３個のジスルフィドブリッジを含むAc-AMPsは、キチンに結合するが、赤血球を凝集させない。PL-D2複合体の結晶構造はトリ-N-アセチルキトトリオースを介してヘリクスにより架橋しているPL-D2分子の無限の鎖を明らかにしており、レクチンが細胞表面レセプターと相互作用するときに架橋が起こる可能なメカニズムを与えている。レクチンと炭水化物との間の架橋により形成される無限の鎖の多くの例は、レクチンと炭水化物複合体の結晶構造に見出される。さらに、レクチン−オリゴ糖沈殿の顕微鏡を用いた観察は、特殊なレクチン−オリゴ糖複合体に特徴的な明確な格子パターンを明らかにする。これらの観察により、細胞表面でのレクチンに媒介されるクロスリンクを視化しないが、レクチン−炭水化物複合体で観察されるこれらの結合状態は、生体において細胞表面で起こるレクチンとリガンドとの多価性の相互作用を示す。
【００６０】
近年、レクチンに結合する炭水化物に似せたペプチドの研究により、可能性のある薬学的適用の観点から、非常に興味が持たれている。機能模倣を導く構造の類似性は、免疫認識に重要な役割を果たしている。あるレクチンでは、炭水化物に似せたペプチドが、レクチンの生物学的活性を完全に阻害することを示している。さらに、レクチン−ペプチド複合体の結晶構造は、炭水化物に似せたペプチドがレクチンの炭水化物結合部位に結合することを示している。炭水化物とペプチドとの間の機能上の模倣性は従来研究されてきたが、さらに完成された。PLsの中ではPL-Bが最も高い生物学的活性を示す。PL-Bの極めて高い生物学的活性は、その７個のドメイン構造によるものでさる。PL-D2は極めて低いヘムアグルチニン活性を示す。理由の一つは、PL-D2がPLsの中で最も小さい２価レクチンだということである。しかし、PL-Cは、３個のキチン結合ドメインからなるサブユニットを有するダイマータンパク質であるにもかかわらず、ヘムアグルチニン活性を示さない。本発明のPL-Cの結晶構造により、炭水化物結合部位の芳香族環を介した、炭水化物に似せたユニークなダイマー化が明らかになった。さらに、PL-C及びPL-D2の両複合体は、PL-Cのタンパク質−タンパク質相互作用が、PL-D2複合体内のタンパク質−炭水化物相互作用より広範囲にわたっていることを示している。タンパク質−タンパク質相互作用を介したユニークなダイマー化は、PL-Cがヘムアグルチニン活性を示すのを妨げていると考えられる。
実施例
以下、実施例を挙げてPL-Cについてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００６１】
(1)  結晶の調製
Biosci.Biotechnol.Biochem.59,1384-1385,1995に記載された方法でPL-Cを精製し、凍結乾燥した。結晶化の前に、凍結乾燥したタンパク質を100mM Tris-HCl バッファー(pK7.5)に溶解して、10mg/ml濃度の溶液を調製した。PL-Cの結晶は、最初25℃の下で、ハンギングドロップ蒸気拡散（hanging-drop vapor-diffusion）法により成長させた。リザーバー溶液としては、20mM硫酸アンモニウムを含む0.1M酢酸ナトリウムバッファー (pH4.6)を用いた。液滴は、１μlのタンパク質溶液と１μlのリザーバー溶液とを混合することにより調製した。しかし、得られた結晶の強度分布の分析により、強く対を形成している（twinnig）ことが分かった（対関数（twin function）；α＝0.20）。対形成を回避するために種々の添加剤が試みられた。X-回折実験に適した単結晶が、１μlのタンパク質溶液と1.0%(v/v)のジオキサンを含むリザーバー溶液の１μlとを混合することにより調製された液滴内で生成した。
【００６２】
この結晶は、三方晶系空間群R3に属し、三方晶状態で、単位格子定数がa＝b＝104.1Å、c=69.7Åである。また非対称単位に２個の分子を含む。各重原子試薬を含むリザーバー溶液内に結晶を浸漬することにより、重原子誘導結晶が調製された。２種類の重原子（U及びHg）誘導結晶が位相決定のために得られた。
【００６３】
(2)データ収集・加工
天然及び水銀誘導結晶の回折データを、Quantum-4 CCD検出器（ADSC）を用いて、BL18Bステーション（Photon Factory, Institute of Materials Structure Science, High Energy Accelerator Research Organization, Tsukuba, Japan）で、波長１.000Åで収集した。各振動フレームは、50秒間に1.5°の回転で採られた。結晶と検出器との距離は、115mmにセットされた。回折強度は、MOSFLM及びSCALAのプログラムで数値データ化した。高い余分（redundancy)とともに1.80Åの解像度まで殆ど完全なデータセット(99.9%)を天然単結晶から得た。ウラニウム誘導結晶の回折データをR-AXIS IIcイメージングプレートシステム上で集め、DENZO及びSCALEPACKパッケージで処理した。データ収集の統計を後掲の表５に示す。
【００６４】
最初の位相は、3.0Åの分解能まで、CCP4セットの中のプログラムMLPHAREを用いて、多重同形置換により計算された。最初のHg部位の位置は、Difference Patterson mapに容易に見出される。誘導体の他方の部位は、Difference Fourier mapから得られた。重原子結晶パラメーターは精密化され、0.66のFigure-of-Meritとともに位相セット（phase set）が解像度3.0Åで得られた。Hg誘導結晶からの変則的な散乱情報（scattering information）がこのプロセスで利用された。密度修正が、溶媒領域平坦化及びCCP4セット中のプログラムDMを用いたヒストグラムマッピング法により行われた。分子境界は、非対称単位当たり２個のポリペプチドと仮定して計算された53.5%の値より小さい45.0%の溶媒含有量の値を適用することにより、電子密度図において決定された。位相は、3.0Åの解像度で改良され、次いで1.8Åの分解能まで拡張された。これらの位相角で計算された電子密度図の質は、カルボニル酸素原子を含む主鎖原子の位置で非常に良かった。また、全てのアミノ酸残基の側鎖配向は図において明確に同定された。
【００６５】
PL-C構造の最初のモデルは、Xtal-Viewソフトウェアパッケージ中のプログラムXfitを用いて改良された図中に構築された。構造の精密化は、プログラムCNSを用いて行われた。全反射の10%を含むサブセットは、free R-因子（Rfree)をモニターするために用いられた。全体的なB因子の修正及び嵩高い溶媒の修正を以下の手順で行った。即ち、rigid-body精密化の後、3.0Åから1.8Åまで分解能を徐々に拡張させることにより、動力学的精密化法のプロトコールを用いてモデルを精密化した。モデル構築の繰り返し、溶媒分子の添加及びCNS57精密化は、PROCHECKで調べたときに非常に良好な最終モデルを与えた。最終的なR-ファクター及びRfreeファクターは、21.5Å-1.80Åのデータでは、それぞれ17.6%及び20.3%であった。結晶学的解析の結果を表５に示す。
【００６６】
【表５】
2005154378.tif 000007
表５中の記号は以下のことを意味する。
a：かっこ内の値は各場合の最も高い分解能のシェルの値である。
b：Ｒmerge＝Σi｜Ii−<Ii>｜/ΣiIiであり、<Ii>は全ての対称な同等物の平均である。
c：Ｒiso＝Σ‖FPH｜−｜FP‖/Σ｜FP｜であり、｜FPH ｜及び ｜FP｜ はそれぞれ誘導体及び天然体の構造ファクター増幅物である。
d：Phasing Powerは、<｜FH｜>/ <E>として決定され、<｜FH｜>は重原子の構造増幅物について計算されたr.m.s.であり、<E>はr.m.s.lack-of-closureエラーである。
e：Figure-of-Meritは、位相決定の信頼性の測定であり、m=＜cosΔαi＞として決定される。αiは、反射率iの位相角におけるエラーである。
f：Rcryst＝Σ‖F0｜−｜Fc‖/Σ｜F0｜であり、｜F0｜及び｜Fc｜が観察され、それぞれ構造ファクター振幅が計算される。
g：Rfreeは、構造精密化の前に除去された反射率の10%ランダムに選択したサンプルについて計算される。
h：最も好ましい、追加的に許容される、そして寛容的に許容される領域がPROCHECK60により決定される。
PL-D2複合体の結晶調製及びX-線結晶解析
(1)  結晶の調製
Biosci.Biotechnol.Biochem.60,1380-1382,1996に記載された方法でPL-D2を調製した。結晶化の前に、凍結乾燥したタンパク質を100mM Tris-HCl バッファー(pK7.5)に溶解して、10mg/ml濃度の溶液を調製し、この溶液に３〜10倍のモル比でリガンドであるトリ-N-アセチルキトトリオースをタンパク質に添加して、298Kで１時間インキュベートした。このモル比により、トリ-N-アセチルキトトリオースはPL-D2に殆ど完全に結合する。
【００６７】
PL-D2の結晶は、最初25℃の下で、ハンギングドロップ蒸気拡散（hanging-drop vapor-diffusion）法により成長させた。リザーバー溶液としては、20%(v/v)ポリエチレングリコール8000、0.2M 酢酸マグネシウム及び0.1Mカコジル酸ナトリウム(pH6.5)を用いた。結晶は、１μlの複合タンパク質溶液と１μlのリザーバー溶液とを含むハンギングドロップ内で成長させた。最も見込みのある結果が、三糖の３倍モル比で得られた。過剰量の三糖はPL-D複合体の結晶化を妨げるようだった。
(2)データ収集・加工
回折データを、Quantum-4 CCD検出器（ADSC）を用いて、BL18Bステーション（Photon Factory, Institute of Materials Structure Science, High Energy Accelerator Research Organization, Tsukuba, Japan）で、波長１.000Åで収集した。各振動フレームは、60秒間に1.5°の回転で採られた。結晶と検出器との距離は、150mmにセットされた。回折像は、MOSFLMのプログラムで処理し、integrated intensityは、SCALAのプログラムで数値データ化した。
【００６８】
この結晶は、単斜晶系空間群C2に属し、単位格子定数がa＝98.6Å、b＝26.3Å、c=65.2Å、β=109.9である。
【００６９】
三糖と複合したPL-D2複合体の構造は、CCP4セット中のプログラムMOLREPを用いて分子置換法により決定した。複合していないPL-D2（PDBコード、１UHA）が、分子置換法におけるサーチモデルとして用いられた。この結晶のMatthews係数（2.17Å3Da-1）60に基づき、非対称単位内に存在することが期待された。しかし、自己回転関数（self rotaion function）の計算は、非対称単位内にタンパク質分子の多様なコピーが存在することを示さなかった。クロス回転サーチ（cross rotaion search）は、１個の明瞭な解を与えた（平均を超える7.8σピーク）。第２の分子の解はこのサーチでは見出されなかった。このことは、第２の分子が第１分子と同じ配向を採る可能性を意味している。XZ平面における並進サーチは、（x=0.859、z=0.035）の位置で第１分子の明瞭な解答（平均を超える6.0σのピーク）を与えた。並進サーチの一連の解は、注意深く調べられた。次いで、65.2%のR-ファクターのピークは、（x=0.859、z=0.535）の位置に観察された。この位置は、最初に得られたピークから結晶学的c-軸に沿って0.5並進した位置である。Native Patterson マップは、（u=0、v=0、w=0.5)の位置に明瞭なピーク（17.0σ）を示した。このことは、結晶学的c-軸に沿って非結晶学的な並進対称が存在することを示す。非結晶学的な並進対称により関連付けられた２分子がこれらの観察から非対称単位内に存在することが期待されたため、R-ファクターは許容できる値より高いが、この解は許容できる。
【００７０】
非対称単位内のPL-D2分子の位置は、rigid-body精密化を用いて最適化された。XtalView56を用いてモデルが構築され、動力学的精密化法、位置及び個々のB-ファクター精密化のサイクルを用いてCNS57で精密化が行われた。異方性スケーリング、嵩高い溶媒の修正が精密化を通して用いられた。全てのデータの10%のランダムサンプリングをRfreeファクターのために行った。水分子及び２個の三糖分子は、精密化の引き続くサイクルに含まれた。最後に、本構造の精密化は、24.2-1.8Åの分解能でのすべてのデータについて、R-ファクター19.5%、Rfreeファクター23.4%に集約された。最終モデルは、PROCJECK58で調べたところ、良好な幾何学を示した。データ収集及び精密化の結果を以下の表６に示す。
【００７１】
【表６】
2005154378.tif 000008
本発明において、PL-C及びPL-D2の同等物は、RCSBタンパク質データバンクに、それぞれIDコード1ULK及び1ULMとして登録されている。
（ＩＩＩ）レクチンの作用を調節する分子の設計方法
本発明のレクチンの作用を調節する分子の設計方法は、上述したレクチンの結晶構造の特徴を利用して、このタンパク質の作用に影響を与える分子を設計する方法である。結晶状態のレクチンに対して影響を及ぼすと考えられる分子は、工業的に利用される溶液状態のレクチン又は生体内での溶液状態のレクチンに対して同様の影響を及ぼすことが予測される。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明のレクチンの結晶は、細胞凝集活性、マイトジェン活性、炭水化物結合活性などが促進又は抑制されたレクチンの作製、又は、レクチンに作用してこれらの活性を促進又は抑制する分子の設計などに好適に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】アメリカヤマゴボウのレクチンと関連タンパク質との間のアミノ酸配列のアラインメント図である。図１中、PLはアメリカヤマゴボウレクチンを示し、Heveinはゴムの樹(Hevea brasiliensis)由来の抗真菌タンパク質を示し、UDA6はUrtica dioicaアグルチニンイソレクチン６を示し、WGA2はコムギアグルチニンイソレクチン２を示す。
【図２】PL-DsのC末端の電子密度図である。図(a)は、PL-D2結晶のカルシウムイオンとの配位状態を示し、図(b)はLeu83-Thr84を失ったPL-D1のC末端領域を示す。
【図３】図(a)はPL-D2の全体構造を示し、図(b)はPL-D1の全体構造を示す。
【図４】炭水化物結合部位間の構造を比較した図である。図(a)はPL-D2のドメインIであり、図(b)はPL-D2のドメインIIであり、図(c)はトリ-N-アセチルキトトリオースと複合したUDA6のドメインIであり、図(d)はトリ-N-アセチルキトトリオースと複合したUDA6のドメインIIである。
【図５】図(a)はUDA6のドメインIとPL-D2のドメインIとの重なりを示し、図(b)はWGA2のドメインIとPL-D2のドメインIとの重なりを示す。
【図６】PL-D1の各ドメインとPL-D2の対応するドメインとの重なりを示す図である。図(a)はドメインIであり、図(b)はドメインIIである。
【図７】PL-D2の酸性残基の分布を示す図である。図(a)は荷電残基のCαトレースモデルであり、図(b)は静電電位表面である。
【図８】ボールアンドスティックモデルと最終電子密度図の一部である。図(a)は1.4σレベルにされたPL-CのσA−荷重2F0-Fc電子密度図であり、図(b)はトリ-N-アセチルキトトリオースを除去した後計算され、また3.0σレベルにされたPL-D2複合体のσA−荷重F0-Fc電子密度オミット図である。
【図９】図(a)はPL-Cダイマーの立体的外観であり、図(b)はトリ-N-キトトリオースと複合したPL-D2の立体的外観である。
【図１０】PL-D2複合体の結晶におけるPL-D2のトリ-N-アセチルキトトリオースへの結合状態を示す図である。
【図１１】キチン結合領域のCαトレースの重なりの立体的外観を示す図である。
【図１２】PL-D2の炭水化物結合部位のトリ-N-アセチルキトトリオースの位置の比較を立体的に示す図である。
【図１３】タンパク質−タンパク質相互作用と、タンパク質−炭水化物相互作用との間の類似性を示す図である。図(a)はトリ-N-アセチルキトトリオースとPL-D2との複合体におけるタンパク質−炭水化物相互作用を示し、図(b)、(c)及び(d)は、それぞれドメインIIIAとドメインIBとの界面、ドメインIIAとドメインIIBとの界面、ドメインIIIBとドメインIAとの界面におけるPL-Cダイマーのタンパク質−タンパク質相互作用を示す。
【図１４】PL-Cのダイマー形成及びPL-D2の複合体形成に際しての溶媒が接近可能な表面面積の損失を示す図である。図(a)はPL-CのサブユニットA内に埋没した表面であり、図(b)はPL-D2複合体の分子A内に埋没した表面である。
【図１】
2005154378.tif 000009
【図２】
2005154378.tif 000010
【図３】
2005154378.tif 000011
【図４】
2005154378.tif 000012
【図５】
2005154378.tif 000013
【図６】
2005154378.tif 000014
【図８】
2005154378.tif 000015
【図９】
2005154378.tif 000016
【図１０】
2005154378.tif 000017
【図１１】
2005154378.tif 000018
【図１２】
2005154378.tif 000019
【図１３】
2005154378.tif 000020
【図１４】
2005154378.tif 000021
【図７】
2005154378.tif 000022