(57)【要約】【課題】  神経細胞の樹状突起のスパインでの局在が顕著であるＤｒａｐ１由来のアミノ酸配列を有するペプチドや該ペプチドをコードするＤＮＡや、これらペプチドやＤＮＡを利用するペプチド系薬剤等の所望のペプチドを神経細胞の樹状突起のスパイン等の細胞内小器官へデリバリーする方法を提供すること。【解決手段】  ドレブリンの結合タンパク質であるＤｒａｐ１の部分配列や変異配列をＣＯＳ７細胞又は初代培養海馬神経細胞に導入し、Ｄｒａｐ１のアミノ酸配列のうち、１番目から８９番目のアミノ酸配列が核移行配列、４３番目から４７番目のアミノ酸配列が核移行シグナル、９４０番目から１０４１番目のアミノ酸配列が核外移行配列、８２０番目から１０４１番目のアミノ酸配列がスパイン移行配列であることを見い出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するペプチドをコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するペプチドをコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号９に示される塩基配列；
（Ｅ）配列番号９に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するペプチドをコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号９に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するペプチドをコードする塩基配列；
【請求項２】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるペプチド。
（Ａ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるペプチドが神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるペプチドが神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するアミノ酸配列；
【請求項３】
請求項２記載のペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している融合ペプチド。
【請求項４】
請求項１記載のＤＮＡと所望のペプチドをコードするＤＮＡとをインフレームで連結し、請求項２記載のペプチドと所望のペプチドとの融合ペプチドを発現することができる組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを細胞内に導入することを特徴とする細胞内小器官へ所望のペプチドをデリバリーする方法。
【請求項６】
請求項２記載のペプチドと所望のペプチドとの結合ペプチドを細胞内に導入することを特徴とする細胞内小器官へ所望のペプチドをデリバリーする方法。
【請求項７】
細胞内小器官が神経細胞の樹状突起のスパインであることを特徴とする請求項５又は６記載の細胞内小器官へ所望のペプチドをデリバリーする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞の樹状突起のスパインでの局在が顕著であるＤｒａｐ１由来のアミノ酸配列を有するペプチドや該ペプチドをコードするＤＮＡや、これらペプチドやＤＮＡを利用するペプチド系薬剤等の所望のペプチドを神経細胞の樹状突起のスパイン等の細胞内小器官へデリバリーする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、発生過程の神経細胞に多量発現するアクチン結合タンパクドレブリン（Drebrin）を世界に先駆けて発見し（例えば、非特許文献１及び２参照）、このドレブリンがアクチンファイバーの性状を変えることにより神経細胞の形態形成、特に突起形成に関わっていること（例えば、非特許文献３〜５参照）や、発生中で移動している神経細胞では、細胞体と突起全体に存在するが、成熟した神経細胞では棘構造中に特異的に存在すること（例えば、非特許文献６〜８参照）を既に証明している。ドレブリンには、胚性型（embryonic type）のドレブリンＥと成体型（adult type）のドレブリンＡという２つのアイソフォームが存在しており（例えば、非特許文献９参照）、成熟した神経細胞のスパインに特異的に見られるドレブリンＡは、神経細胞にしか発現しないという特徴を有している（例えば、非特許文献１０及び１１参照）。また、本発明者らは、ドレブリンＡを初代培養神経細胞に発現させると自動的に樹状突起スパインに集まり、しかもその長さを長くすることを見い出した。この発見は、ある一つの蛋白合成量を変化させることによってスパインの形態を変化させることができることを発見した世界で最初の報告である（例えば、非特許文献１２参照）。
【０００３】
本発明者らは、また、ドレブリンの結合タンパク質であるＤｒａｐ１を酵母ツーハイブリッド（yeast two hybrid）法によりラットから単離し、Ｄｒａｐ１が１２０８アミノ酸からなり、神経細胞の核、細胞質、スパインに存在すること、核に移行するのに重要な配列がＮ末端ドメインに存在すること、及び、細胞質に移行するのに重要な配列がＣ末端ドメインに存在することを発表している（例えば、非特許文献１３〜１７参照）が、それらの詳細についてはわかっていなかった。
【０００４】
【非特許文献１】J. Neurochem. 44, 1210-1216, 1985
【非特許文献２】J. Biochem. 117, 231-236, 1995
【非特許文献３】J. Neurosci. Res. 38: 149-159, 1994
【非特許文献４】Exp. Cell Res. 215:145-153, 1994
【非特許文献５】J. Biol. Chem. 269:29928-29933, 1994
【非特許文献６】J. Neurosci. 15: 7161-7170, 1996
【非特許文献７】Dev. Brain Res. 29, 233-244, 1986
【非特許文献８】Brain Res. 413, 374-378, 1987
【非特許文献９】J. Biochem.117, 231-236, 1995
【非特許文献１０】Dev. Brain Res. 29, 233-244, 1986
【非特許文献１１】Brain Res. 413, 374-378, 1987
【非特許文献１２】J. Neurosci. 19, 3918-3925, 1999
【非特許文献１３】第７９回日本生理学会大会（広島）２００２年３月２８〜３０日
【非特許文献１４】第２５回日本神経科学大会（東京）２００２年７月７〜９日
【非特許文献１５】第４５回日本神経化学大会（札幌）２００２年７月１７〜１９日
【非特許文献１６】第２６回日本神経科学大会（名古屋）２００３年７月２３〜２５日
【非特許文献１７】第４６回日本神経化学大会（新潟）２００３年９月２４〜２６日
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
脳の神経細胞からは長い「軸索」と「樹状突起」が伸びており、軸索から別の神経細胞の樹状突起への情報伝達の場がシナプスである。記憶などを司る興奮性シナプスの受け手側の樹状突起にはスパイン（棘）と呼ばれる小さな突起が存在する。本発明の課題は、神経細胞の樹状突起のスパインでの局在が顕著であるＤｒａｐ１由来のアミノ酸配列を有するペプチドや該ペプチドをコードするＤＮＡや、これらペプチドやＤＮＡを利用するペプチド系薬剤等の所望のペプチドを神経細胞の樹状突起のスパイン等の細胞内小器官へデリバリーする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、Ｄｒａｐ１の部分配列や変異配列をＣＯＳ７細胞又は初代培養海馬神経細胞に導入し、配列番号２に示されるＤｒａｐ１のアミノ酸配列（この塩基配列が配列番号１）のうち、１番目から８９番目のアミノ酸配列（ａａ１〜８９；配列番号４／この塩基配列が配列番号３）が核移行配列、４３番目から４７番目のアミノ酸配列（ａａ４３〜４７；配列番号６／この塩基配列が配列番号５）が核移行シグナル、９４０番目から１０４１番目のアミノ酸配列（ａａ９４０〜１０４１；配列番号８／この塩基配列が配列番号７）が核外移行配列、８２０番目から１０４１番目のアミノ酸配列（ａａ８２０〜１０４１；配列番号１０／この塩基配列が配列番号９）がスパイン移行配列であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、（１）（Ａ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列；（Ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するペプチドをコードする塩基配列；（Ｃ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するペプチドをコードする塩基配列；（Ｄ）配列番号９に示される塩基配列；（Ｅ）配列番号９に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するペプチドをコードする塩基配列；（Ｆ）配列番号９に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するペプチドをコードする塩基配列；の何れかの塩基配列からなるＤＮＡや、（２）（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるペプチドが神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するアミノ酸配列；（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるペプチドが神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するアミノ酸配列；の何れかのアミノ酸配列からなるペプチドに関する。
【０００８】
また本発明は、（３）上記（２）記載のペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している融合ペプチドや、（４）上記（１）記載のＤＮＡと所望のペプチドをコードするＤＮＡとをインフレームで連結し、上記（２）記載のペプチドと所望のペプチドとの融合ペプチドを発現することができる組換えベクターに関する。
【０００９】
さらに本発明は、（５）上記（４）記載の組換えベクターを細胞内に導入することを特徴とする細胞内小器官へ所望のペプチドをデリバリーする方法や、（６）上記（２）記載のペプチドと所望のペプチドとの結合ペプチドを細胞内に導入することを特徴とする細胞内小器官へ所望のペプチドをデリバリーする方法や、（７）細胞内小器官が神経細胞の樹状突起のスパインであることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の細胞内小器官へ所望のペプチドをデリバリーする方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
神経細胞の樹状突起のスパインでの局在が顕著であるＤｒａｐ１由来のアミノ酸配列を有する本発明のペプチドや該ペプチドをコードするＤＮＡを利用すると、神経細胞の樹状突起のスパイン等の細胞内小器官へペプチド系薬剤等の所望のペプチドをデリバリーすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のＤＮＡとしては、（Ａ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列；（Ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；（Ｃ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；（Ｄ）配列番号９に示される塩基配列；（Ｅ）配列番号９に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するペプチドをコードする塩基配列；又は（Ｆ）配列番号９に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するペプチドをコードする塩基配列；の何れかの塩基配列からなるＤＮＡであれば特に制限されず、また、本発明のペプチドとしては、（Ａ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列；（Ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するアミノ酸配列；又は（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するアミノ酸配列；の何れかのアミノ酸配列からなるペプチドであれば特に制限されず、ここで「神経細胞の樹状突起のスパインへの移行活性を有するペプチド」とは、スパインへ移行し、スパインでの局在が顕著であるペプチドを意味する。
【００１２】
上記配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡとしては、配列番号１に示されるＤｒａｐ１をコードするＤＮＡ配列のうち２５３０番目から３１９５番目の塩基配列を、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとしては配列番号２に示されるＤｒａｐ１のアミノ酸配列のうち８２０番目から１０４１番目のアミノ酸配列を、それぞれ挙げることができる。
【００１３】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。
【００１４】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、ＤＮＡ工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、ＤＮＡ工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。ＤＮＡ工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを得ることができる。
【００１５】
上記「配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列との相同性が６０％以上であれば特に制限されるものではなく、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上であることを意味する。
【００１６】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００１７】
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
【００１８】
本発明のＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号９に示される塩基配列情報又は配列番号２に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該ＤＮＡが存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＤＮＡを単離したり、あるいは、常法に従って化学合成により調製することができる。
【００１９】
具体的には、Ｄｒａｐ１のｃＤＮＡが単離されたラット神経細胞や脳もしくは他の臓器より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明のＤＮＡに特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明のＤＮＡを取得することができる。上記ｃＤＮＡの起源としては、各種の動物細胞または組織を例示することができ、また、これらの細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明のＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
【００２０】
また、上記（Ｂ）〜（Ｆ）のいずれかに示される塩基配列からなる本発明の変異ＤＮＡ又は相同ＤＮＡとしては、配列番号９に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の生物体等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。
【００２１】
本発明のペプチドの取得・調製方法は特に限定されず、化学合成したペプチドでも、ＤＮＡ組換え技術により作製した組み換えペプチドの何れでもよい。化学合成によりペプチドを調製する場合には、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のペプチドを合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のペプチドを合成することもできる。ＤＮＡ組換え技術によりペプチドを調製する場合には、該ペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のペプチドを調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能なＤＮＡ組換え技術による調製が好ましい。
【００２２】
例えば、ＤＮＡ組換え技術によって、本発明のペプチドを調製する場合、かかるペプチドを細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のペプチドに対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のペプチドに通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのペプチドの精製物を得ることができる。
【００２３】
さらに、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を示す配列番号１に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡをプローブとしてラット以外の動物より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、常法により配列番号９に示されるＤＮＡを取得し、これを発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるペプチドを製造することができる。
【００２４】
上記本発明のペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している本発明の融合ペプチドとしては特に制限されず、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合ペプチド、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合ペプチドは、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のペプチドの精製や、本発明のペプチドの検出や、本発明のペプチドに対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００２５】
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明のＤＮＡに所望のペプチドをコードするＤＮＡをインフレームで連結し、本発明のペプチドと所望のペプチドとの融合ペプチドを発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、上記本発明のＤＮＡと所望のペプチドをコードするＤＮＡとが連結した連結体ＤＮＡとしては、本発明のＤＮＡの下流に所望のペプチドをコードするＤＮＡが連結されたものや、本発明のＤＮＡの上流に所望のペプチドをコードするＤＮＡが連結されたもののどちらでもよい。本発明の組換えベクターは、かかる連結体ＤＮＡを動物細胞用の発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、上記連結体ＤＮＡを発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。
【００２６】
動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、ＥＧＦＰ-Ｃ１（Clontech社製）、ｐＧＢＴ−９(Clontech社製)、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology, 3, 133, 1990）、ｐＣＤＭ８（Nature, 329, 840, 1987）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３（J.Blochem., 101, 1307, 1987）、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。
【００２７】
また、本発明の細胞内小器官へ所望のペプチドをデリバリーする方法としては、上記本発明の組換えベクターを細胞内に導入する方法や、前記本発明のペプチドと所望のペプチドとの結合ペプチドを細胞内に導入する方法であれば特に制限されず、上記結合ペプチドとしては、発現産物である融合ペプチドや化学反応により結合した化学結合ペプチドを例示することができる。組み換えベクターの動物細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができ、また、本発明のペプチドと所望のペプチドとの融合ペプチドの細胞内への導入には、巨大分子と非共有結合体を形成し、タンパク質等の巨大分子の構造を変化させ、タンパク質等の巨大分子を細胞内にデリバリーすることができるChariot（Active Motif社製）等の細胞毒性のない試薬を用いることができる。
【００２８】
上記細胞内小器官としては、神経細胞の樹状突起のスパインの他、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ装置、核、ライソソーム等を挙げることができる。本発明のスパイン移行配列は神経細胞突起内を輸送されるために必要な配列である。
【００２９】
上記所望のペプチドとしては、ペプチド系抗生物質、サイトカイン、造血因子、ペプチドホルモン、心臓血管系に作用する因子、中枢および末梢神経系に作用する因子、体液電解質および血液有機物質に作用する因子、骨および骨格系に作用する因子、腎臓および尿路系に作用する因子、感覚器官に作用する因子、免疫系に作用する因子、呼吸器系に作用する因子、生殖器系に作用する因子、及び酵素の群から選択された医薬活性を有するペプチドを挙げることができる。上記ペプチド系抗生物質としては、バンコマイシン、ポリミキシンＡ〜Ｄ、コリスチン等を挙げることができる。上記サイトカイン としては、インターフェロン（アルファ、ベータ、ガンマ），インターロイキン（ＩＬ−２〜ＩＬ−１１）、ＩＬ−１、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、白血病細胞阻止因子（ＬＩＦ）等を挙げることができる。上記造血因子の例としては、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン等を挙げることができる。上記ペプチドホルモンとしては、インスリン，成長ホルモン等を挙げることができる。上記心臓血管系に作用する因子としては、エンドセリン、バソプレシン、レニン、アンギオテンシン類、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）等を挙げることができる。上記中枢および末梢神経系に作用する因子の例として、エンケファリン、エンドルフィン、カルシトニン等を挙げることができる。上記体液電解質および血液有機物質に作用する因子の例として、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、アポプロテインＥ，ヒルディン等を挙げることができる。上記生殖器系に作用する因子の例として、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）等を挙げることができる。上記酵素の例としてスーパーオキサイドディスミュターゼ（ＳＯＤ）、ティッシュープラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）、カリクレイン等を挙げることができる。
【００３０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
（ドレブリン結合タンパク質Ｄｒａｐ１のｃＤＮＡクローニング）
配列番号２に示されるドレブリンのアミノ酸配列のうち１番目から２３３番目のアミノ酸配列（ａａ１〜２３３）をコードするＤＮＡを、ｐＡＳ４０４(Clontech社製ｐＡＳ１を改変したもの。Sekiguchi etal, J. Biol. Chem. 276:7246-7257.)
に組み入れ、得られたプラスミドを酵母ツーハイブリッドシステムのスクリーニング用のベイト（bait）として使用した。まず、得られたプラスミドを酵母（Ｙ１９０株）にトランスフォームし、これを用いてラット神経細胞のｃＤＮＡライブラリー（Clontech社製）をスクリーニングした。上記酵母を選択培地（a3-aminotriazole (25 mM) plus SD-Trp, Leu, and His plate）上で培養し、生長してきた酵母コロニーを採取した。その結果、８９個の独立したクローンが得られた。これらクローンからプラスミドを採取しシィークエンスを行ったところ、そのうち６４個が同じタンパク質をコードしていることがわかった。このクローンを用いて、より長いクローンを得るため、ラット神経細胞のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。さらに５′／３′ＲＡＣＥキット（ＴＡＫＡＲＡ社製)に提示されたプロトコールに基づき、指定のプライマーを使用し、５′ＲＡＣＥ (Rapid Amplification of cＤＮＡ ends)（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002, 1988）反応を行い、不足部分の配列を取得して全長配列を得た。この遺伝子がコードするドレブリン結合タンパク質をＤｒａｐ１（Drebrin-associated protein 1）と命名した。
【実施例２】
【００３２】
（トランスフェクション及び細胞内局在の観察）
Ｄｒａｐ１の全長配列（ａａ１〜１２０８）と部分配列（ａａ１〜８８，ａａ８８〜１２０８，ａａ５２２〜５９６，ａａ３８３〜４８８，ａａ８２０〜１０４１，ａａ９４０〜１０４１，Δ９４０〜１０４１）及びＤｒａｐ１の全長配列の４５，４６番目のリシンをトレオニンに置換した変異配列（mutNSL-ａａ１〜１２０８）をコードするＤＮＡをそれぞれ調製し、ＥＧＦＰ-Ｃ１ベクター(Clontech社製)のマルチクローニングサイトにサブクローニングした（図１参照）。これら組換えベクターを、リン酸カルシウム法を用いて、ＣＯＳ７細胞又は初代培養海馬神経細胞に導入し、次いで免疫化染色を行い蛍光顕微鏡で観察した。
【００３３】
Ｄｒａｐ１のｃＤＮＡを上記７個のフラグメントにして、それらの細胞内局在を観察した。その結果、Ｎ末端領域に核局在配列が存在することが示された。図２には、特徴的な３つの像が示されている。すなわち、ＣＯＳ７細胞にＧＦＰ標識Ｄｒａｐ１及び欠失配列を導入して蛍光顕微鏡で観察したところ、Ｎ末端が欠失したａａ８８〜１２０８では、ａａ１〜１２０８（全長配列）やＮ末端配列ａａ１〜８８に比べて核局在性が認められず、Ｄｒａｐ１の核への局在にはＮ末端領域が重要であることがわかる。
【００３４】
Ｎ末端の核局在配列と予想される配列のアミノ酸を２箇所置換した変異体、すなわちＤｒａｐ１の全長配列の４５，４６番目のリシンをトレオニンに置換した変異体（mutNSL-ａａ１〜１２０８）は、図３に示されるように核局在性が認められず、ＣＯＳ７細胞及び初代培養海馬神経細胞（14DIV neuron）の核にはいることができないことがわかった。
【００３５】
同様にして、Ｄｒａｐ１のフラグメントの核外移行性について調べた。一般に分子量の小さいタンパク質は拡散によって核膜孔を通過して核内にはいることができる。図４に示されるように、ａａ５２２〜５９６やａａ３８３〜４８８のようなフラグメントは核内にも局在するが、ａａ９４０〜１０４１は核内よりも核外での局在が顕著であることがＣＯＳ７細胞で観察された。また、ａａ９４０〜１０４１を欠失した変異体であるΔ９４０〜１０４１は核外に移行することができないことも観察された。以上の観察結果は、ａａ９４０〜１０４１に核外移行配列が存在することを示唆している。図５に示すように、同様の結果が、初代培養海馬神経細胞においても観察された。
【００３６】
Ｄｒａｐ１の部分配列の樹状突起における局在を調べたところ、ａａ８２０〜１０４１はスパインでの局在が顕著であることが観察された（図６）。これに対して、ａａ３８３〜４８８，ａａ５２２〜５９６等の短いフラグメントは樹状突起では広汎に局在することが観察された。以上の観察結果は、Ｄｒａｐ１のスパインでの局在にはａａ８２０〜１０４１が重要な働きをしており、この部位にスパイン局在配列があることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】実施例に用いたＥＧＦＰ-Ｃ１ベクターの概略構造を示す図である。図１中、ｐＣＭＶはサイトメガロウイルスのプロモータを、ＧＦＰはグリーン蛍光タンパク質を、ＭＣＳはマルチクローニングサイトを、ＳＶ４０poly ＡはＳＶ４０ポリアデニル化シグナルをそれぞれ示す。
【図２】Ｄｒａｐ１及びその部分配列のＣＯＳ７細胞内局在を蛍光顕微鏡観察した結果を示す図である。
【図３】Ｄｒａｐ１の全長配列の４５，４６番目のリシンをトレオニンに置換した変異体（mutNSL-ａａ１〜１２０８）の細胞内局在を蛍光顕微鏡観察した結果を示す図である。
【図４】Ｄｒａｐ１の部分配列（ａａ９４０〜１０４１など）のＣＯＳ７細胞内局在を蛍光顕微鏡観察した結果を示す図である。
【図５】Ｄｒａｐ１及びその欠失変異体（Δ９４０〜１０４１）配列の細胞内局在を蛍光顕微鏡観察した結果を示す図である。図５中、上段左の小さな四角は露光時間を短くして撮影した像を示す。また、緑はＧＦＰ蛍光を、赤はドレブリン染色像を示す。
【図６】Ｄｒａｐ１の部分配列（ａａ８２０〜１０４１）の樹状突起におけるスパインでの蛍光顕微鏡観察した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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