(57)【要約】【課題】  従来のＡｈ受容体を利用したイムノアッセイに比べて短時間で分析することができるダイオキシン類化合物の検出方法及び検出用キットを提供する。【解決手段】  本発明はダイオキシン類化合物４とＡｈ受容体１とＡＲＮＴ２とダイオキシン応答エレメント３とにより複合体７を形成させ、複合体７を認識する抗体５、６をもって複合体７を検出することにより、ダイオキシン類化合物４を検出する方法であって、ダイオキシン類化合物４を、少なくともＡｈ受容体１とＡＲＮＴ２とダイオキシン応答エレメント３と抗体５、６とを予め混合調製し均質化した試薬に接触させることによって検出する。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイオキシン類化合物とＡｈ受容体とＡＲＮＴとダイオキシン応答エレメントとにより複合体を形成させ、当該複合体を認識する抗体をもって前記複合体を検出することにより、前記ダイオキシン類化合物を検出する方法であって、
前記ダイオキシン類化合物を、少なくとも前記Ａｈ受容体と前記ＡＲＮＴと前記ダイオキシン応答エレメントと前記抗体とを予め混合調製し均質化した試薬に接触させることによって検出するダイオキシン類化合物の検出方法。
【請求項２】
前記抗体は、前記複合体を認識する一次抗体と、当該一次抗体を認識する二次抗体とからなり、
前記試薬は、１０００ｍｌ中に、前記一次抗体を１２５μｇ以上、前記二次抗体を８７５μｇ以上含む請求項１に記載のダイオキシン類化合物の検出方法。
【請求項３】
少なくとも、ダイオキシン類化合物と結合するＡｈ受容体と、当該ダイオキシン類化合物に結合したＡｈ受容体と複合体を形成するＡＲＮＴ及びダイオキシン応答エレメントと、前記複合体を認識する抗体とを、予め混合調製し均質化した試薬として有するダイオキシン類化合物検出用キット。
【請求項４】
前記抗体は、前記複合体を認識する一次抗体と、当該一次抗体を認識する二次抗体とからなり、
前記試薬は、１０００ｍｌ中に、前記一次抗体を１２５μｇ以上、前記二次抗体を８７５μｇ以上含む請求項３に記載のダイオキシン類化合物検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａｈ受容体を利用したイムノアッセイ（Ａｈバインディングアッセイ）によるダイオキシン類化合物の検出方法および検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、人体への影響や環境保護の観点から、排出ガス及び排水に対する有害化学物質の規制が強化されつつある。中でも、ポリ塩化ジベンゾパラジオキシン、ポリ塩化ジベンゾフラン、ポリ塩化ビフェニル類等のダイオキシン類化合物は、特に人の生命及び健康に重大な影響を与えるおそれがある物質として排出基準が設定されている。このため、ガスや水を排出する際にはダイオキシン類化合物及びそれらの類似化合物の濃度を測定する必要がある。
【０００３】
ダイオキシン類化合物の濃度測定としては、高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）による方法が知られている。この測定方法では、ダイオキシン類化合物の異性体毎に高精度の測定結果が得られるという特徴を有する。しかし、この方法は分析にかかる時間が長く、分析コストが高いという課題がある。また、測定を行うためには特殊で高額な分析機器とその機器を取り扱う分析技術者の養成が必要となる。さらに現場での測定が困難であり、一般的には分析を委託することになるため、結果を得るまでに時間がかかる。
【０００４】
上記の課題に対しては、生体内での免疫反応を利用したイムノ（免疫）アッセイ（測定法）が検討されている。この種の技術としては、ダイオキシン類化合物の毒性原理とされている挙動をＥＬＩＳＡ（酵素免疫）プレート上で実現したＡｈバインディングアッセイ（例えば、特許文献１参照）が知られている。
【０００５】
この方法の具体例としては図４に示した通りである。すなわち、（ａ）ダイオキシン類化合物４と結合、変形し、複合体７を形成するたんぱく質であるＡｈ受容体（Aryl hydrocarbon）１及びＡＲＮＴ（Ah Recepter Nuclear Translocator）２と、Ａｈ受容体１とＡＲＮＴ２とともに複合体７を形成する性質を有し、複合体７をＥＬＩＳＡプレート上に固定化するＤＮＡ要素であるダイオキシン応答エレメント（ＤＲＥ：Dioxin Response Element）３とを含む試薬を調製し、ダイオキシン類化合物（検量線作成用の標準品(例えば、２，３，７，８−テトラ塩化ジベンゾパラジオキシン（ＴＣＤＤ）)又は検体）４と混合する工程、（ｂ）ダイオキシン類化合物４とＡｈ受容体１とＡＲＮＴ２とＤＲＥ３とにより複合体７を形成させ、その複合体７をＥＬＩＳＡプレートに固定化する工程、（ｃ）一次抗体５を添加し、一次抗体５に複合体７を認識させる工程、（ｄ）二次抗体６を添加し、二次抗体６に一次抗体５を認識させて抗体認識複合体８を形成させる工程、（ｅ）発色基質（図示しない。）を添加し、酵素反応により二次抗体６を発色させる工程、（ｆ）吸光度を測定する工程（図示しない。）、からなる方法である。そして、検量線作成用の標準品の吸光度の測定結果に基づき検量線を作成し、この検量線と検体の吸光度の測定結果とからダイオキシン類化合物の量を定量化することができる。この方法は、容易で、しかも簡易で安価な分析機器である吸光度計で計測が可能であるため、安価で短時間の分析が可能となる。
【０００６】
【特許文献１】特許第３１４４６８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、前記従来のＡｈ受容体を利用したイムノアッセイは前述の通り優れた測定方法であるものの、通常のイムノアッセイが３時間程度で分析できることと比べると、まだ分析時間が長いものとなっていた。
【０００８】
すなわち、上記の図４に示した測定法を例にとると、（ａ）試薬の調製及び、ダイオキシン類化合物４と混合する工程に３０〜６０分、（ｂ）複合体７を形成させ、プレートに固定化する工程に２時間、（ｃ）一次抗体５に複合体７を認識させる工程に１時間、（ｄ）二次抗体６に一次抗体５を認識させる工程に１時間、（ｅ）二次抗体６を発色させる工程に１時間、を要する。さらに各工程の間の１５〜２０分の洗浄や吸光度の測定時間を考慮すると、上記測定法では測定を完了するまでに６〜７時間を要していた。
【０００９】
したがって、Ａｈ受容体を利用したイムノアッセイについても、分析の工程が少なく、より短時間で分析できる方法が求められてきた。
【００１０】
本発明は上記問題に鑑み案出されたものであり、従来のＡｈ受容体を利用したイムノアッセイに比べて短時間で分析することができるダイオキシン類化合物の検出方法及び検出用キットを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するための本発明に係るダイオキシン類化合物の検出方法の第１特徴手段は、ダイオキシン類化合物とＡｈ受容体とＡＲＮＴとダイオキシン応答エレメントとにより複合体を形成させ、当該複合体を認識する抗体をもって前記複合体を検出することにより、前記ダイオキシン類化合物を検出する方法であって、前記ダイオキシン類化合物を、少なくとも前記Ａｈ受容体と前記ＡＲＮＴと前記ダイオキシン応答エレメントと前記抗体とを予め混合調製し均質化した試薬に接触させることによって検出する点にある。
【００１２】
つまり、この手段によれば、工程を減らすことができるため分析時間を短縮することが可能となる。また、工程が減少することに伴い各工程の間で行う洗浄の回数も減少する。このため洗浄液を減らすことができる。さらに、抗体をも含む均質化した一つの試薬となるように予め混合調製するため、抗体のみを添加する場合に必要となる希釈液が不要となる。したがって、本発明によれば、従来のＡｈ受容体を利用したイムノアッセイに比べて、分析時間を短縮できるとともに、分析にかかるコストをも下げることができる。また、少ない工程で分析できることから、分析精度も向上させることができる。
【００１３】
本発明に係るダイオキシン類化合物の検出方法の第２特徴手段は、前記抗体は、前記複合体を認識する一次抗体と、当該一次抗体を認識する二次抗体とからなり、前記試薬は、１０００ｍｌ中に、前記一次抗体を１２５μｇ以上、前記二次抗体を８７５μｇ以上含む点にある。
【００１４】
つまり、この手段によれば、短時間でもダイオキシン類化合物に対する高い反応性を得ることができる。このため、検出感度を向上させることができる。
【００１５】
本発明に係るダイオキシン類化合物検出用キットの第１特徴構成は、少なくとも、ダイオキシン類化合物と結合するＡｈ受容体と、当該ダイオキシン類化合物に結合したＡｈ受容体と複合体を形成するＡＲＮＴ及びダイオキシン応答エレメントと、前記複合体を認識する抗体とを、予め混合調製し均質化した試薬として有する点にある。
【００１６】
つまり、この構成によれば、ダイオキシン類化合物の検出に際し、抗体を含んだ一つの混合均質化試薬を使用することができるため、後から抗体を添加する必要がない。このため抗体を添加する場合に必要となる希釈液が不要となる。また、工程が減少することにより各工程の間で行う洗浄の回数が少なくなる。このため洗浄液を使用する量も減らすことができる。したがって、本発明によって短時間で分析することが可能な安価なダイオキシン類化合物検出用キットを提供することができる。
【００１７】
本発明に係るダイオキシン類化合物検出用キットの第２特徴構成は、前記抗体は、前記複合体を認識する一次抗体と、当該一次抗体を認識する二次抗体とからなり、前記試薬は、１０００ｍｌ中に、前記一次抗体を１２５μｇ以上、前記二次抗体を８７５μｇ以上含む点にある。
【００１８】
つまり、この構成によれば、短時間でもダイオキシン類化合物に対する高い反応性を得ることができる。このため、検出感度の高いダイオキシン類化合物の検出用キットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明に係るダイオキシン類化合物の検出方法は、ダイオキシン類化合物とＡｈ受容体とＡＲＮＴとダイオキシン応答エレメントとにより複合体を形成させ、当該複合体と結合する抗体をもって複合体を検出することにより、前記ダイオキシン類化合物を検出する方法であって、少なくとも前記Ａｈ受容体と前記ＡＲＮＴと前記ダイオキシン応答エレメントと前記抗体とを予め混合調製し均質化した一つの試薬として前記ダイオキシン類化合物に接触させることによって検出するものである。これにより、従来のＡｈ受容体を利用したイムノアッセイに比べて、分析時間を短縮できるとともに分析にかかるコストをも下げることができる。もちろん、本発明に係る検出方法は、Ａｈ受容体を利用したものに限定されるものではなく、他のレセプターバインディングアッセイにも適用することができるものである。
【００２０】
本発明に係るダイオキシン類化合物の検出方法について、特に限定されないが、その好ましい一例を示すと図１の通りである。すなわち、（ａ）Ａｈ受容体１、ＡＲＮＴ２、ＤＲＥ３、一次抗体５、二次抗体６を含む試薬を調製し、ダイオキシン類化合物（検量線作成用の標準品(例えば、２，３，７，８−ＴＣＤＤ）)又は検体）４と混合する工程、（ｂ）ダイオキシン類化合物４と、Ａｈ受容体１、ＡＲＮＴ２、ＤＲＥ３、一次抗体５、二次抗体６とにより抗体が複合体７を認識した抗体認識複合体８を形成させ、その抗体認識複合体８をＥＬＩＳＡプレートに固定化する工程、（ｃ）発色基質（図示しない。）を添加し、酵素反応により二次抗体６を発色させる工程、（ｄ）吸光度を測定する工程（図示しない。）、からなる方法である。この方法では、図４に示す従来のＡｈ受容体を利用したイムノアッセイに比べて、２つの工程を減らすことができるため３．５時間程度の短時間で分析することが可能となる。しかも、工程が少なくなった分の洗浄回数を減らすことができ、別途抗体を添加する手間も省くことができるため、より簡易な分析方法とすることができる。
【００２１】
また、本発明に係るダイオキシン類化合物検出用キットは、少なくとも、ダイオキシン類化合物と結合するＡｈ受容体と、当該ダイオキシン類化合物に結合したＡｈ受容体と複合体を形成するＡＲＮＴ及びダイオキシン応答エレメントと、前記複合体を認識する抗体とを、予め混合調製し均質化した一つの試薬として有するものである。このキットでは抗体を別途添加する必要がなくなる。このため添加する際に抗体を希釈する希釈液も不要となる。したがって、本発明により短時間で分析することが可能で安価なダイオキシン類化合物検出用キットを提供することができる。
【００２２】
前述の通り従来のＡｈ受容体を利用したイムノアッセイでは、前工程の試料、試薬が残らないように各工程の間に十分な洗浄を行って段階的に処理していた。これに対し、本発明者らは、各工程における試薬を予め混合調製し均質化した一つの試薬とすることによって分析時間を短縮できることを見出した。従来、抗体は、ＥＬＩＳＡプレート上に固定化された複合体を認識し、結合するものとされていた。したがって、当然に複合体が形成され、ＥＬＩＳＡプレート上に固定化されるに足る十分な時間を経た後に、抗体を添加するものとしていた。そして、抗体をＡｈ受容体等と同時に添加したとしても無意味であるか、むしろ複合体形成に悪影響を及ぼす可能性があるものと考えられていた。
【００２３】
しかし、今回、Ａｈ受容体、ＡＲＮＴ、ＤＲＥと抗体とを同時に調製し、ダイオキシン類化合物等と混合することにより、従来と同様の反応性を有することが分かった。また、Ａｈ受容体等と抗体とを同時に調製することで、従来のＡｈ受容体を利用したイムノアッセイにおいて、抗体が複合体を認識する工程分の時間が短縮されていることが判明している。このことから、Ａｈ受容体等がダイオキシン類化合物と複合体を形成する段階で、抗体は従来通りの機能を有しているものと考えられる。すなわち、抗体は、必ずしも、Ａｈ受容体等がダイオキシン類化合物と複合体を形成し、固定化されてから複合体を認識するのではなく、複合体の形成と同時もしくは固定化と同時に認識するものと考えられる。
【００２４】
上記観点に則れば、従来のＡｈ受容体を利用したイムノアッセイでは、抗体は固定化された複合体を認識するものであるのに対し、本発明においては、抗体は移動する複合体又はＡｈ受容体を認識する必要があるため認識速度が低下する場合が想定される。抗体の認識速度を高めるためには、抗体と複合体等とが接近し易いように予め調製する抗体の量を増やすことが好ましい。また、同様の観点から一次抗体とその一次抗体を認識する二次抗体とを用いる場合には、一次抗体よりも二次抗体の量を多く調製する方が好ましい。例えば、図１に示す例の場合に使用する抗体の量は、従来のＡｈ受容体を利用したイムノアッセイで使用する抗体の量の１．２倍程度以上が好ましい。もちろん、本発明の検出方法及び検出用キットによれば、抗体の濃度に関わらず本発明の目的を達成することができるが、抗体の濃度を高くすることによりダイオキシン類化合物に対してより高い反応性を得ることができる。このため、短時間であってもダイオキシン類化合物の検出感度が高い検出方法及び検出用キットを提供することができる。
【００２５】
本発明の検出方法及びキットで検出できるダイオキシン類化合物は、従来のＡｈ受容体を利用したイムノアッセイにおいて検出できるものと同様であり、特にポリ塩化ジベンゾダイオキシン類、ポリ塩化ジベンゾフラン類、ポリ塩化ビフェニル類等、及びそれらの構造類似体を好ましく検出することができる。
【００２６】
本発明においてＡｈ受容体及びＡＲＮＴとは、それぞれAryl hydrocarbon受容体及びAh Recepter Nuclear Translocatorと称される蛋白質であってダイオキシン類化合物の毒性発現に関与するものである。これらは、特に限定されるものではないが、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット等の哺乳類の肝臓等から得ることができる。また、ダイオキシン応答エレメント（ＤＲＥ）とは、Ａｈ受容体がダイオキシン類化合物と結合して変形した場合に、結合する性質を有するＤＮＡ要素である。
【００２７】
本発明で使用する抗体は、特に限定されず、従来のＡｈ受容体を利用したイムノアッセイと同様の抗ＡＲＮＴ抗体だけでなく、抗Ａｈ受容体抗体を用いることもできる。また、抗体は、複合体を認識しつつ発色機能を有する１種類からなるものに限らず、例えば、上記で示したように複合体を認識する一次抗体と、その一次抗体を認識するとともに発色機能を有する二次抗体のように複数種類からなるもの等、従来公知のものが適用可能である。
【００２８】
また、抗体はアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）修飾されたものだけでなく、例えばホースラデイシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）修飾等、従来公知の酵素によって修飾されたものが適用できる。また、発色させるために酵素反応を起こさせる発色基質についても特に限定はなく、それぞれ修飾された酵素と反応可能な公知の発色基質を用いることができる。そして、検出手段は上記例で示した吸光度を測定することによる吸光法に限らず、抗体を修飾する酵素と、その酵素と反応させる発色基質との組合せを任意に選択することによって、例えば、蛍光法や化学発光法によって検出することも可能である。
【００２９】
本発明のダイオキシン類化合物の検出方法及び検出用キットは、前述のとおり、従来のＡｈ受容体を利用したイムノアッセイよりも短時間で分析できるものである。そして、本発明の検出方法及び検出用キットで使用するＡｈ受容体、ＡＲＮＴ等は従来のＡｈ受容体を利用したイムノアッセイで使用するものが適用することができ、例えば、特許３１４４６８９号公報に記載されている方法によって得ることができる。また、市販のParacelsian社製Ａｈイムノアッセイのキットを利用することもできる。
【実施例１】
【００３０】
以下に本発明の実施例を説明する。本実施例におけるＡｈ受容体、ＡＲＮＴ、ＤＲＥ、一次抗体、二次抗体等の試薬は、市販のParacelsian社製Ａｈイムノアッセイのものを使用した。そして、ダイオキシン類化合物の標準品として、２，３，７，８−ＴＣＤＤの濃度、１６ｐｇ、３２ｐｇ、６４ｐｇに対する反応性を調べ、検量線を作成した。６４ｐｇにおける吸光度とブランクの吸光度との差が１以上を満たすことを検量線として使用できる条件とした。なお、分析は４０５ｎｍの吸光度を測定することによって行った。
【００３１】
（実施例１〜４）
市販のＡｈ受容体３０ｍｌ（７．５ｍｌ×４本）、ＡＲＮＴ５００μｌ、ＤＲＥ１２０μｌ、アクチベータ１．５ｍｌを調製した試薬に、一次抗体及び二次抗体をそれぞれ４μｇ及び２８μｇ（従来のＡｈ受容体を利用したイムノアッセイで使用する抗体量の１．２倍相当）（実施例１）、４μｇ及び５６μｇ（実施例２）、８μｇ及び２８μｇ（実施例３）、８μｇ及び５６μｇ（実施例４）添加し、それぞれの混合均質化試薬を調製した。すなわち、一次抗体及び二次抗体は、混合均質化試薬１０００ｍｌ中に、それぞれ１２５μｇ及び８７５μｇ（実施例１）、１２５μｇ及び１７５０μｇ（実施例２）、２５０μｇ及び８７５μｇ（実施例３）、２５０μｇ及び１７５０μｇ（実施例４）含むように調製した。
そして、ＥＬＩＳＡプレートであるウエルに、それぞれの混合均質化試薬と各濃度の標準品を添加し、３０±１℃の恒温槽で２時間インキュベートした。その後、ウエル内の試料を除去、洗浄し、発色基質を添加した。さらに３０±１℃の恒温槽で１時間インキュベートした後、吸光度を測定し、それぞれの混合均質化試薬に対する検量線を作成した。吸光度の測定結果を表１に示し、得られた検量線を図２に示した。その結果、実施例１〜３では、検量線としての条件を満たしていた。実施例４は、６４ｐｇにおける吸光度が測定限界を超えていたため検量線は作成できなかった。なお、本実施例における分析時間は、３．５時間程度であった。
【００３２】
（比較例）
ウエルに実施例と同様の市販の試薬と各濃度の標準品を添加し、３０±１℃の恒温槽で２時間インキュベートした。その後、ウエル内の試料を除去、洗浄し、一次抗体２μｇを２５ｍｌの希釈液で希釈したものを添加した。そして、３０±１℃の恒温槽で１時間インキュベートした後、ウエル内の試料を除去、洗浄し、二次抗体１４μｇを２５ｍｌの希釈液で希釈したものを添加した。その後、３０±１℃の恒温槽で１時間インキュベートし、ウエル内の試料を除去、洗浄し、発色基質を添加した。さらに３０±１℃の恒温槽で１時間インキュベートした後、吸光度を測定し、検量線を作成した。吸光度の測定結果を表１に示し、得られた検量線を図２に示した。その結果、特に実施例２、３においては、従来のＡｈ受容体を利用したイムノアッセイである本比較例と同等以上の反応性を示すことが分かった。なお、本比較例における分析時間は６時間程度であった。
【００３３】
【表１】
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（実施例５〜８）
実施例１〜４において、それぞれ発色基質を添加した後のインキュベートの時間を３０分にして、吸光度を測定し、検量線を作成した。吸光度の測定結果を表２に示し、得られた検量線を図３に示した。その結果、特に実施例６〜８においては発色基質添加後のインキュベートの時間を従来よりも短くしても、検量線としての条件を満たしていた。
【００３４】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明のダイオキシン類化合物の検出方法及び検出用キットは、ダイオキシン類化合物及びそれらの類似構造体の検出に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の検出方法の一例を説明する図
【図２】濃度と吸光度との関係を示す図
【図３】濃度と吸光度との関係を示す図
【図４】従来のＡｈ受容体を利用したイムノアッセイの検出方法の一例を説明する図
【符号の説明】
【００３７】
１  Ａｈ受容体
２  ＡＲＮＴ
３  ダイオキシン応答エレメント（ＤＲＥ）
４  ダイオキシン類化合物
５  一次抗体
６  二次抗体
７  複合体
８  抗体認識複合体
【図１】
2005257409.tif 000005
【図２】
2005257409.tif 000006
【図３】
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【図４】
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