(57)【要約】【課題】  ＴＣＤＤをはじめとするＡｈＲ基質の濃度をより簡易かつ高感度に測定することができ、ダイオキシン様の活性を呈する環境中の有害物質をより迅速かつ簡易・低コストで測定することのできる基質濃度測定システムを提供する。【解決手段】  酵母中で機能するプロモータ配列の下流に前記アリルハイドロカーボンレセプタの全長もしくは一部を用いた融合タンパクの発現遺伝子のコーディング領域を組み込み、前記プロモータ配列と前記タンパクの発現遺伝子との間にメッセンジャＲＮＡの転写量の制御によって前記タンパクの発現量が制御される制御配列、例えば非翻訳領域配列を挿入し、この非翻訳領域の塩基配列により前記タンパクの発現量を調整する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母を用いて構築されるアリルハイドロカーボンレセプタの基質濃度を測定する基質濃度測定システムであって、
酵母中で機能するプロモータ配列の下流に前記アリルハイドロカーボンレセプタの全長もしくは一部を用いた融合タンパクの発現遺伝子のコーディング領域が組み込まれ、かつ前記プロモータ配列と前記タンパクの発現遺伝子との間にメッセンジャＲＮＡの転写量の制御によって前記タンパクの発現量が制御される制御配列が挿入された形質転換された酵母を用いてなり、
前記制御配列は非翻訳領域配列であって、該非翻訳領域の塩基配列により前記タンパクの発現量が調整されてなることを特徴とする基質濃度測定システム。
【請求項２】
ヒトアリルハイドロカーボンレセプタのアミノ酸配列における３８１番目のバリンをアラニンに置換したレセプタの発現遺伝子、またはヒトアリルハイドロカーボンレセプタと相同性の高いレセプタであって、前記部位に相当するアミノ酸がアラニンであるレセプタの発現遺伝子を前記アリルハイドロカーボンレセプタの発現遺伝子として用いた酵母を用いてアリルハイドロカーボンレセプタの基質濃度を測定することを特徴とする請求項１に記載の基質濃度測定システム。
【請求項３】
ＡＲＡ９タンパクの少なくとも一部の発現遺伝子のコーディング領域がさらに組み込まれた酵母を用いてアリルハイドロカーボンレセプタの基質濃度を測定することを特徴とする請求項１に記載の基質濃度測定システム。
【請求項４】
前記アリルハイドロカーボンレセプタの基質濃度の測定の際に、前記酵母と被測定液とを混合した後、振盪培養を行うことを特徴とする請求項１に記載の基質濃度測定システム。
【請求項５】
前記基質が環境中の有害物質であることを特徴とする請求項１に記載の基質濃度測定システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は化学物質の濃度測定を対象とする基質濃度測定システムに関し、さらに詳しくは、化学物質がヒト中でアリルハイドロカーボンレセプタを介して生ずる転写活性化能を指標としてその基質の毒性を見積る手法を酵母細胞中で模倣する場合において、基質に対する測定感度を高めた基質濃度測定システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ダイオキシン類はヒトへの毒性は未だ全容の解明に至らないながら、肝発癌性に関与する可能性が示され、また子宮内膜症、乳癌等との関連性や、甲状腺ホルモン異常、免疫異常等の慢性毒性が強く示唆されることから環境ホルモン様物質としての機能が示唆されており、さらにモルモットにおける致死量が極めて微量であることなどから、ダイオキシン類特別措置法等により非常に厳しい規制が行われている。ダイオキシン類は廃棄物等種々の経路から生成され、しかも構造的に安定で容易には分解されないことから広く自然界に蔓延するようになっている。したがって広範な測定を容易に行う手法が求められているが、環境基準値として設定される濃度が１ｐｇ／Ｌという非常に低濃度であるため、現在この精密な測定を行うにはＧＣ／ＭＳ等の高価な装置が必要とされ、さらには実際のサンプル採取、標準添加、精製、濃縮、溶出といった多段にわたる測定操作におけるノウハウの蓄積が求められるものである。このためサンプルの測定コストが高額になり、自然界の汚染を広範に把握するためのダイオキシン類の測定は実際上行いにくいものであった。
【０００３】
このような状況を背景に、バイオアセイ法をベースとした様々な測定法が提案されている。すなわち、ダイオキシンの生体における中心的な作用は、特にヒト等の肝細胞におけるダイオキシンレセプタであるアリルハイドロカーボンレセプタ（ＡｈＲ）と結合し、種々のタンパクとの結合／解離を介して最終的にＤＮＡ上のＸＲＥ（異物応答配列）と結合し、ＤＮＡ下流の薬物代謝酵素であるＰ４５０ファミリーの発現を行う、というものである。したがって、形質転換マウス肝細胞を用い、この細胞をサンプリングされたダイオキシン含有サンプルに曝露し、これによるＰ４５０発現量を所定の手法により検出することでダイオキシン類の含有濃度を同定する、あるいはより容易な検出を行うためにＸＲＥ配列下流にルシフェラーゼをコーディングする配列を設けて同様の測定を行い、ルシフェリンを添加した際の発光量からルシフェラーゼの発現量を見積ることによりサンプル中のダイオキシン類の濃度を同定する等の手法が知られている（非特許文献１参照）。
これらの手法により、測定精度は機器分析を用いる場合に比して劣るものの、大量のサンプルについておおよそのダイオキシン類含有量を測定することが可能となっている。
【０００４】
ところが、培養細胞を用いる測定には様々な問題点もある。例えば、培養細胞の培養液中では容易に菌体が繁殖し、一度菌体の繁殖した培地から再び細胞を抽出することは不可能であるため、取扱いには無菌操作を行うためのクリーンベンチ等の大型の装置が必要である。また培養細胞はダブリングタイムが２日程度と増殖速度が遅く、大量に細胞を得るには時間を要する、またその保存においても所定のプロトコルに基づき液体窒素中に保管し、溶解後に細胞が測定に使用できるまでに１週間近くを要する、といったことから、必ずしも取扱い性に優れた手法とは言えないものであった。
【０００５】
このため、他の細胞、例えば酵母を用いた測定法が提案されている。すなわち、ヒト等の哺乳動物の細胞中でダイオキシンが作用する際に関連するタンパク群、ＤＮＡ群およびダイオキシンの作用により最終的に産生される産物としてのマーカー遺伝子等を酵母中に全て組み込み、培養細胞と同様に応答を測定するものである。具体的には、酵母中で機能するプロモータとターミネータの間にヒト肝ｃＤＮＡより調製したアリルハイドロカーボンレセプタ（ＡｈＲ）のコーディング領域を導入した配列、同様にアリルハイドロカーボンニュクリアトランスロケータ（ＡＲＮＴ）を導入した配列、および酵母中で機能するコアプロモータ配列とＸＲＥ配列を組合せた配列の下流にマーカーとなるβ―ガラクトシダーゼをコーディングするＬａｃＺ遺伝子等を導入した配列を何れも酵母中にプラスミドあるいはゲノム上への組込みにより導入したものが用いられる（非特許文献２参照）。
【０００６】
酵母を用いる利点としては、酵母の保存が非常に容易で、例えば寒天培地上に培養させたものを４℃で数ヶ月にわたり保存可能であること、取扱いも火炎滅菌環境程度で操作可能で、菌類による汚染を受けてもプレート上で再び純粋なクローンを採取できること、液体培地中で幅広い濃度で培養状態を保てることから管理が容易であること、また必要に応じて簡易に形質転換体を作製できるといった点が挙げられ、培養細胞に比して圧倒的に利便性に優れた手法といえる。
【０００７】
【非特許文献１】George C. Clarkら、Organohalogen Compounds 42 (1999) 309
【非特許文献２】Charles A Miller III ら Toxicology and Applied Pharmacology 160 (1999)297
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところが、酵母を用いて構築されるＡｈＲ基質の濃度測定系においては、その感度が培養細胞を用いた場合に比して充分に高くできないという問題点があった。すなわち、培養細胞を用いて構築される系においては、ＡｈＲとの親和性の最も高い基質として知られる2、3、7、8‐テトラクロロジベンゾパラダイオキシン（ＴＣＤＤ）に対する測定限界は１０ｎｇ／Ｌ程度であるのに対し、これまでに報告のある酵母を用いた測定においては、測定限界は３００ｎｇ〜１０μｇ／Ｌ程度となり、充分に実用性を有するものではなかった。すなわち、これらの非特許文献に示されるＴＣＤＤの検出限界は１０-9 Ｍ程度にとどまるものである。
【０００９】
かかる問題点を解決すべく本発明者等は酵母を用いた測定法の高感度化の手法を検討した結果、酵母を用いて培養細胞と同等以上の測定感度を有するダイオキシン等の基質濃度測定システムを発明するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち本発明は、酵母を用いて構築されるアリルハイドロカーボンレセプタの基質濃度を測定する基質濃度測定システムであって、
酵母中で機能するプロモータ配列の下流に前記アリルハイドロカーボンレセプタの全長もしくは一部を用いた融合タンパクの発現遺伝子のコーディング領域が組み込まれ、かつ前記プロモータ配列と前記タンパクの発現遺伝子との間にメッセンジャＲＮＡの転写量の制御によって前記タンパクの発現量が制御される制御配列が挿入された形質転換された酵母を用いてなり、
前記制御配列は非翻訳領域配列であって、該非翻訳領域の塩基配列により前記タンパクの発現量が調整されてなることを特徴とする基質濃度測定システムである。
【００１１】
本発明の基質濃度測定システムに用いられる酵母は、上記に加えてさらにヒトアリルハイドロカーボンレセプタのアミノ酸配列における３８１番目のバリンをアラニンに置換した変異を少なくとも有するレセプタの発現遺伝子、またはヒトアリルハイドロカーボンレセプタと相同性の高いレセプタであって、前記部位に相当するアミノ酸がアラニンであるレセプタの発現遺伝子を前記アリルハイドロカーボンレセプタの発現遺伝子として用いた酵母を用いることが望ましい。
【００１２】
さらに本発明の基質濃度測定システムに用いられる酵母は、ＡＲＡ９タンパクの少なくとも一部の発現遺伝子のコーディング領域がさらに組み込まれた酵母を用いることが望ましい。
【００１３】
また、前記アリルハイドロカーボンレセプタの基質濃度の測定の際には、前記酵母に基質を添加した後、振盪培養を行うことが望ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ＴＣＤＤをはじめとするＡｈＲ基質の濃度をより簡易かつ高感度に測定することができ、ダイオキシン様の活性を呈する環境中の有害物質をより迅速かつ簡易・低コストで測定することのできる基質濃度測定システムを提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明について詳述する。
本発明は（１）少なくともアリルハイドロカーボンレセプタ（AhR）の一部または全長を用いたタンパクを酵母中に発現させてレセプタの基質濃度に応じた応答が得られるように調製した酵母を用いた測定システムであって、（２）レセプタの発現量をプロモータとレセプタのコーディング配列の間の塩基配列により所望の発現量に制御することにより達成され、好ましくは、（３）レセプタ中に所定の変異を導入し、（４）酵母中にヒトARA9タンパクを発現させ、（５）測定時に所定の培養条件を用いる手法を組合わせる。
【００１６】
本発明に用いられる酵母は少なくともアリルハイドロカーボンレセプタ（AhR）を発現し、また該レセプタが基質依存的に転写活性を呈する際にこれを検出するためのレポータ遺伝子を含むものである。
すなわちこの手法はヒト細胞中においてＡｈＲが基質存在下で示す応答を模倣するものであって、例えばヒトAhRおよびアリルハイドロカーボンニュクリアトランスロケータ（Arnt）を発現し、かつ応答配列として異物応答配列（XRE）をLacZ等のレポータ遺伝子上流にコアプロモータと同時に設けることによって基質と結合したAhRが核内に移行し、Arntと結合してXRE配列に結合して示される転写活性をLacZの発現量より見積る手法（前述した非特許文献２参照）や、あるいはオペロン配列であるLEX下流にコアプロモータおよびレポータ遺伝子としてLacZ遺伝子を結合した配列を導入し、かつ該配列に結合するオペロン結合タンパクであるLexAとAhRの融合タンパクを発現させることによって、AhRの基質結合部位に基質が結合し核内に移行し、LEXと結合することで示される基質と結合したAhR部位の転写活性化能をLEX下流のLacZの転写量から見積る手法（L.A.Carverら、the Journal of Biological Chemistry、 269 (1994) 30109参照）等の系を構築した酵母が用いられる。
【００１７】
発明者等は、酵母中で稼動するプロモータと発現させるタンパクの間の塩基配列により該タンパクの発現量を任意にコントロールできることをすでに見出しているが、この手法あるいは同等の効果を有する手法を測定用酵母に適用することで応答のコントロールが可能となることを見出した。
【００１８】
すなわち、AhRの酵母内の存在量が少ない場合、細胞内に浸透した基質とレセプタとの結合が生じにくく、比較的高い濃度まで応答を示さない。一方、AhRの酵母内存在量が多い場合においては、AhRは基質非依存的に核内に侵入して転写活性を示すため、基質が存在しない状態でもレポータ遺伝子の転写が常時生ずることとなり、基質濃度依存的な応答を観察することが出来ない。
そこで、レポータ遺伝子の転写量が基質の無い状態において充分に低く、かつ基質を添加することにより明確にこれより高くなる範囲になるようにAhRの存在量が制御されるべく、酵母中で稼動するプロモータおよびAhRのコーディング領域間の配列を制御する（請求項１）。
なおこの際、AhRを発現する遺伝子は酵母内でのコピー数が均一であることが望ましく、したがってセントロメアを有するプラスミドを充分低濃度で用いて作製した形質転換体を作製する、あるいはゲノム上に組み込むなどの手法と併用することが望ましい。
【００１９】
この際用いられるレポータ遺伝子の構造については任意のものが用いられ、特に限定されるものではないが、AhRとArntの複合体を用いる場合にあっては異物応答配列（XRE）およびコアプロモータを含む配列の下流にレポータ遺伝子となるLacZ遺伝子等を接続したもの、あるいはLexA融合タンパクを用いる場合においてはLEX配列およびコアプロモータ配列の下流に同様にレポータ遺伝子となるLacZ遺伝子等を接続する構造などが好適に用いられる。また基質非依存的な転写の充分に抑制されるような配列を有するものがより好適に用いられる。
【００２０】
また、AhRの基質結合能はアミノ酸変異により調整され、ヒトAhRとして一般に知られるアミノ酸配列において、３８１番目のアミノ酸をバリンよりアラニンに変異させることにより基質の結合能が有意に上昇する。本発明において、この手法をさらに適用することにより、基質結合能の上昇は２倍程度であるものの、検出限界が３０倍程度に改善した。このことより該変異の導入、あるいはヒトAhRと高い相同性を有するタンパクであって、同一部位に同様のアミノ酸配列を有するレセプタであるモルモット、マウス等由来のAhRを用いることによって大幅な応答改善を図ることができる（請求項２）。
【００２１】
また、AhRのシャペロンとして機能することが知られているタンパクARA9をAhRへの変異導入と組合わせて酵母中で発現させることにより、発現させない場合に比して基質非存在下でのいわゆるベーサルレベルに相当する転写の上昇が確認されるものの、基質応答については検出限界が発現を行わない場合に比して相当に低くなることが確認され、１０-10.5〜１０-11Ｍ程度となる。このことから、本タンパクの発現をAhRへの変異導入と組合わせてAhRの基質応答に供することにより、応答が効果的に改善される（請求項３）。
【００２２】
また、本発明においては、上記手法による酵母を用いてＴＣＤＤ応答を測定する際に、培養条件として振盪培養を行うことにより、応答が大幅に改善される。特に上記した各手法を組合わせることによって、培養細胞における検出限界である１０-11Ｍの検出限界を有する感度が酵母を用いて達成される（請求項４）。
【００２３】
本発明の基質濃度測定システムにおいては、基質としてダイオキシン類、フラボノイド類、インドール、インディルビン等を精度よく測定することが可能であり、特に環境中の有害物質の測定や生体中のAhR基質の測定に好適である。
【実施例】
【００２４】
次に、本発明の実施例について説明する。
本実施例は本発明を限定するものではなく、本発明の理解の一助とするべきものであり、同一の効果を目的とした同様の手法は何れのものも本発明に含まれるものである。
【００２５】
実施例１
酵母用のシャトルベクタであって大腸菌中において機能する複製開始点、アンピシリン耐性部位および酵母中において機能するヒスチジンマーカ（ＨＩＳ３）、セントロメア、自己複製サイトを有するｐＲＳ３１３に、酵母ツーハイブリッドに用いられる発現ベクタｐＢＴＭ１１６よりＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩ処理により切り出されるターミネータ領域、およびｐＢＴＭ１１６をテンプレートとしてＰＣＲ法により得られるＡＤＨ１プロモータ領域（ＰADH1）を順次適切な方法によりライゲーションを行い、ＡＤＨプロモータ・ターミネータ配列を有するｐＲＳ３１３を得る。この間にヒトｃＤＮＡをテンプレートとして適切なプライマを用いてＰＣＲ法により調製したアリルハイドロカーボンレセプタ（ＡｈＲ）遺伝子の各鎖長の非翻訳領域を含むフラグメントを導入し、各フラグメントの挿入をシークエンス法により確認した。作製されたプラスミドの概要は図１に示す通りである。
【００２６】
図中、Ａｍｐ ｒはアンピシリン耐性マーカー、ＨＩＳ３はヒスチジンマーカー、ＡＲＳ、Ｏｒｉは酵母及び大腸菌における複製開始点、ＣＥＮは酵母におけるセントロメアを示し、ＰＡＤＨＩ、ＴeｒｍがアルコールデヒドロゲナーゼＩのプロモータ部位及びターミネータ部位を、ＡｈＲがヒトＡｈＲのｃＤＮＡ配列を、Ａが非翻訳領域配列を示す。
【００２７】
なお、公知のＰＡＤＨ１による転写開始点から翻訳開始配列ＡＴＧ直前までの非翻訳領域の配列は、次の式（１）〜（４）とした。
これらのプラスミドをプラスミド（１−１）〜（１−４）とする。
【００２８】
AGCTATACCAAGCATACAATCAACTCCGGTCAAGATCTTAGCCGCCGCCGTCGGCTGGGCACC  ‥（１）
AGCTATACCAAGCATACAATCAACTCCGGTCAAGATCTCCGCCAGTGCCCGGGGAGTAGCCGCCGCCGTCGGCTGGGCACC  ‥（２）
AGCTATACCAAGCATACAATCAACTCCGGTCAAGATCTGACCCGGCCGCCAGTGCCCGGGGAGTAGCCGCCGCCGTCGGCTGGGCACC  ‥（３）
AGCTATACCAAGCATACAATCAACTCCGGTCAAGATCGGCCGCGGGAATTCGATGTCCCAGCCTACACCGGGTTCCGGGGACCCGGCCGCCAGTGCCCGGGGAGTAGCC  ‥（４）
【００２９】
また同様の手法を用いて、トリプトファンマーカーを有するヒトアリルハイドロカーボンニュクリアトランスロケータ（Ａｒｎｔ）の発現プラスミドを作製し、またレポータ遺伝子にはウラシルマーカーを有する公知のプラスミドｐＲＳ３１６にチロシンキナーゼのコアプロモータ部位およびこの下流にＬａｃＺ遺伝子を導入し、さらに上流に異物応答配列（ＸＲＥ）を４回繰り返し有する配列を挿入したものを作製した。
【００３０】
続いてこれらのプラスミドを用いて酢酸リチウム法により、発芽酵母サッカロミセスセレビジアの野生株であるＹ７００株をトランスフォームした。具体的には、対数増殖期の酵母を遠心沈降し、上清を廃棄したのち酢酸リチウム−トリス緩衝溶液に懸濁し、変性サケ精子ＤＮＡ及び上述３種の各プラスミドを混合し、ポリエチレングリコールを加えて４２℃で処理した後に、Difco社製Yeast Nitrogen baseを用い必須アミノ酸類のうちヒスチジン、ウラシル、トリプトファンを含まないもの、及び炭素源としてグルコースを添加し作製した寒天培地に塗布し、形質転換された酵母株を得た。
【００３１】
このようにして作製された酵母株４クローンを採取し、寒天培地と同様の組成で寒天を含まない液体培地中で常に対数増殖期を保つように常時濃度を調整しながら３日程度培養した。その後光学濃度O.D.600nmが０．０１となるように調整し、９６ウェルプレートに２００μLずつ添加し、この溶液中にＡｈＲの基質であるβ−ナフトフラボン(β−ＮＦ)のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を、β−ＮＦの終濃度が１０−11〜１０−5 Ｍ、ＤＭＳＯの終濃度０．１％となるように添加し、２０時間静置培養した。各濃度について４クローンそれぞれ３ウェルずつ測定に用いた。
【００３２】
この後溶液を遠心して上清を吸引除去し、tritonX-トリス緩衝溶液５０μLを添加して再懸濁し凍結溶解を行った。溶解後３０℃に恒温し、各ウェルに３０℃に恒温したＭＵＧ（メチルウンベリフェリル−d−ガラクトピラノシド）−リン酸緩衝溶液を添加し、３０℃で５分インキュベートし、励起光波長 ３６０nm、観測光波長４５０nmにおいて蛍光観測によりβ-ガラクトシダーゼアセイを行い、この結果を各ウェルの光学濃度O.D.600nmにより規格化した値を用いて、各濃度ごとに平均化した値をＡｈＲ基質への応答値として用いた。
【００３３】
この結果を図２に示す。図中、Ａは式１の非翻訳領域配列を有するプラスミド（１−１）を用いた結果を示し、Ｂは式２の非翻訳領域配列を有するプラスミド（１−２）を用いた結果を示し、Ｃは式３の非翻訳領域配列を有するプラスミド（１−３）を用いた結果を示し、Ｄは式４の非翻訳領域配列を有するプラスミド（１−４）を用いた結果を示す。
図２から、酵母中で稼動するプロモータおよびＡｈＲのコーディング領域間の配列を制御することにより、基質濃度依存的な応答がなされ、またこの検出限界が制御されることが分かる。
【００３４】
実施例２
実施例１で用いたＡｈＲの発現プラスミドのうち、式２を用いて作製したプラスミド（１−２）について、ＡｈＲの基質結合能を上昇させることの知られる変異を導入して、実施例１と同様の測定を行った。導入した変異は３８１番目アミノ酸であるバリンのアラニンへの置換に相当する。変異導入は、下記式（５）および式（６）に示すプライマを用いて、定法に基き行われ、シークエンスにより確認された。
【００３５】
GACCAGATTATATCATTGCAACTCAGAGACCAC  ‥（５）
GTGGTCTCTGAGTTGCAATGATATAATCTGGTC  ‥（６）
【００３６】
このプラスミドを用いて実施例１と同様の手法により酵母の形質転換体を得て、β-ＮＦに対する応答を測定した結果を図３に示す。図中、Ｂは変異を導入しない結果を示し、Ｂ−Ｈは変異を導入した結果を示す。 
【００３７】
実施例３
実施例１に示すのと同様の手法によりＡＲＡ９タンパクの塩基配列を調整し、これをロイシンマーカーを有する公知のプラスミドであるｐＲＳ３１５に、ＡｈＲと同様の手法によりＡＤＨプロモータとターミネータを挿入した後に導入した。このプラスミドを用いて実施例１と同様にして酵母の形質転換を行い、ウラシル、トリプトファン、ヒスチジンおよびロイシンを含まない培地培地を用いて形質転換体を得、また測定を行った。測定に用いたレポータプラスミドは実施例２で用いたものを使用している。また、ＡｈＲの発現プラスミドとしては実施例２のものを用いた。
この結果を、ＡＲＡ９を発現させないものをＢ−Ｈ、発現させたものをＢ−Ｈ−Ｔとして、図４に示した。
【００３８】
実施例４
実施例３で得られた形質転換された酵母を用い、実施例３と同様の手法によりβ−ＮＦおよびＴＣＤＤに対する応答を測定した。測定の際、２００μLずつ９６ウェルプレートに分取し、２０時間静置培養を行ったものと、１．５ｍLずつ１０mL容量のポリスチレンチューブに分取し、９６ウェルプレートの場合と基質およびＤＭＳＯの濃度が同一となるように調製を行い、その後振盪しながら２０時間培養を行い、次いで２００μLずつ９６ウェルプレートに分取したものとをβ―ガラクトシダーゼ活性測定およびＴＣＤＤ測定した。
この結果を図５に示す。図中、Ｎ−静はβ−ＮＦの測定を静置培養で行ったものを示し、Ｎ−振はβ−ＮＦの測定を振盪培養で行ったものを示す。また、Ｔ−静はＴＣＤＤの測定を静置培養で行ったものを示し、Ｔ−振はＴＣＤＤの測定を振盪培養で行ったものを示す。ＴＣＤＤの場合には水に溶け難いため、振盪による効果が顕著に表れていると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】実施例１で作製されたプラスミドの概要を示す図である。
【図２】種々の非翻訳領域配列を有するプラスミドを用いた酵母によるβ-ＮＦに対する応答を測定した結果を示す図である。
【図３】ＡｈＲに変異を導入してβ-ＮＦに対する応答を測定した結果を、変異を導入しない結果をＢ、導入した結果をＢ−Ｈとして示す図である。
【図４】ＡＲＡ９タンパクを発現させた酵母によるβ-ＮＦに対する応答を測定した結果を、ＡＲＡ９を発現させないものをＢ−Ｈ、発現させたものをＢ−Ｈ−Ｔとして示す図である。
【図５】β−ＮＦおよびＴＣＤＤに対する応答を、静置培養で行ったものと振盪培養を行ったものとで比較して測定した結果を示す図である。
【図１】
2005323538.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月28日(2005.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005323538000001.app