(57)【要約】    【課題】    より迅速かつ簡易な工程で、標的分子−ポリペプチドリガンド複合体の立体構造を高精度に解析できる方法を提供すること。    【解決手段】    標的分子−ポリペプチドリガンド複合体の立体構造解析方法であって、ファージディスプレイ法により標的分子に結合しうるポリペプチドをファージ表面に提示させる第一の工程と、ファージ表面に提示されたポリペプチドを切断することによりポリペプチドリガンドを得る第二の工程と、ポリペプチドリガンドと標的分子の複合体を形成させる第三の工程と、複合体の立体構造を解析する第四の工程と、を含む立体構造解析方法。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子−ポリペプチドリガンド複合体の立体構造解析方法であって、
ファージディスプレイ法により、前記標的分子に結合しうるポリペプチドをファージ表面に提示させる第一の工程と、
前記ファージ表面に提示されたポリペプチドを切断することにより、ポリペプチドリガンドを得る第二の工程と、
前記ポリペプチドリガンドと前記標的分子の複合体を形成させる第三の工程と、
前記複合体の立体構造を解析する第四の工程と、
を含む立体構造解析方法。
【請求項２】
前記ファージ表面に提示されたポリペプチドが、酵素的または化学的手段による切断に感受性を有する切断部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素的手段が、トリプシン、リジルエンドペプチダーゼ、キモトリプシンおよびＶ８プロテアーゼ、エンテロキナーゼ、トロンビン、ファクターＸａ、ＴＥＶプロテア
ーゼからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記化学的手段が、臭化シアンまたはヒドロキシルアミンのいずれかである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記第二の工程が、前記ファージを含む溶液に臭化シアンを添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第一の工程が、
前記標的分子を固定した固相担体表面にファージディスプレイ・ライブラリを含む溶液を接触させてインキュベートする工程と、
前記固相担体表面を洗浄した後、該固相担体表面に捕捉されたファージを回収しクローン化する工程と、
前記クローン化されたファージを感染させた大腸菌にヘルパーファージを感染させる工程と、を含む請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第一の工程が、
前記標的分子に結合しうるポリペプチドをコードするＤＮＡを含むファージミドを用いて形質転換した大腸菌を培養する工程と、
前記大腸菌にヘルパーファージを感染させる工程と、を含む請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ファージが、繊維状ファージである請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第四の工程が、ＮＭＲ法による解析を含む請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法を用いて、ポリペプチドリガンドが標的分子と複合体を形成した状態における、ポリペプチドリガンド分子の立体構造を決定する方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法による解析結果が蓄積されたデータベースを用いて、ポリペプチドリガンドが標的分子と複合体を形成した状態における、標的分子のリガンド結合部位の三次元構造を推定する方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法を用いて、標的分子のリガンド結合部位に結合しうる高親和性リガンドを設計する方法。
【請求項１３】
標的分子に結合しうるポリペプチドリガンドと、酵素的または化学的手段による切断に感受性を有するポリペプチドと、ファージコートタンパク質をコードするＤＮＡと、これらの上流に位置するプロモータ配列と、を含む発現ベクター。
【請求項１４】
標的分子に結合しうるポリペプチドリガンドと、酵素的または化学的手段による切断に感受性を有するように改変したファージコートタンパク質をコードするＤＮＡと、これらの上流に位置するプロモータ配列と、を含む発現ベクター。
【請求項１５】
前記ファージコートタンパク質をコードするＤＮＡが、Ｍ１３繊維状ファージに由来するｇｅｎｅ８遺伝子である、請求項１３または１４に記載のベクター。
【請求項１６】
ファージミドを用いて作製される、請求項１３から１５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１３から１６のいずれか１項に記載のベクターをファージに導入し、このファージを含む形質転換体を培養することにより、前記ＤＮＡがコードするポリペプチドをファージ表面に提示させる工程と、
酵素的または化学的手段によって前記ポリペプチドを切断する工程と、
を含む、ポリペプチドリガンドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ファージディスプレイ法を応用して、標的分子に結合しうるポリペプチドを作製し、標的分子−ポリペプチドリガンド複合体の立体構造を解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在のドラッグデザインの過程では、多くの化合物群ライブラリから標的分子と親和性を示し、生物活性を示す化合物を探索することによって、リード化合物を取得している例が多い。探索の初期の段階で、標的分子に結合することがわかった結合天然リガンドや合成リガンドとその標的分子との相互作用解析を行い、結合状態での構造情報を取得することは、標的分子と効果的に相互作用する医薬化合物の分子設計に有用である。
【０００３】
化合物群ライブラリを作製する方法の一つとして、ファージディスプレイ法が挙げられる。ファージディスプレイ法は、外来ＤＮＡをファージのコートタンパク質をコードする遺伝子中に挿入し、その外来ＤＮＡの産物をコートタンパク質との融合タンパク質としてファージ粒子表面に提示（ディスプレイ）させる方法である。外来ＤＮＡとしてランダムな合成ＤＮＡを用いることによって、表面に様々なポリペプチドが提示されたファージ粒子群からなるポリペプチドライブラリを得られる。標的分子を用いて、このポリペプチドライブラリをスクリーニングすることにより、標的分子に親和性を有するポリペプチドを提示するファージ粒子を回収することができる。ここで、このファージクローンを単離すれば、該ファージ粒子が提示しているポリペプチドをコードする遺伝子が得られるので、そのＤＮＡ配列から標的分子のリガンドとなるポリペプチドのアミノ酸配列が決定される。
【０００４】
しかしながら、上述のファージディスプレイ法では、高親和性ペプチドリガンドの一次構造しか求められない。スクリーニングによって直鎖状ペプチドが選択された場合、ペプチドの立体構造の自由度が高いため、ペプチドの一次構造情報のみから標的分子に結合した状態のペプチド構造を推測するのは困難である。従って、さらに親和性の高いペプチドをデザインしたり、低分子リガンドを設計したりすることは難しい。
【０００５】
自由度の高いペプチドの構造を固定化する目的で、直鎖状ペプチドの両端付近にシステイン残基を導入し、ジスルフィド結合を形成させ、ループ状に固定したポリペプチドを用いたライブラリの構築も行われている（例えば非特許文献２を参照）。しかし、このように立体構造を固定しようとすると、ライブラリの多様性にも制限が生じるという問題がある。実際、αへリックス構造をとって標的分子に結合するペプチドが多く知られるが、ループ状ポリペプチドはαへリックス構造をとることができない。
【０００６】
一方、ペプチドを含む低分子リガンドと標的タンパク質との相互作用情報を得る構造解析手段としては、Ｘ線結晶構造解析法、ＮＭＲ法などが一般的である。Ｘ線結晶構造解析とは、Ｘ線を結晶に照射したときに生じる回折のパターンから結晶構造を解析する手法であり、試料を規則性の高い結晶にしてから行われる。ＮＭＲ法は、試料に電磁波を照射した際の核磁気共鳴を観測することによって、原子の核の周りの電子密度や分布状態を知ることができるので、一次構造が既知のペプチドについて立体構造や結合状態に関する情報を得られる。
【非特許文献１】J. Greenwood et al.; J. Mol. Biol., 220, 821-827 (1991)
【非特許文献２】W. L. Delano et al.; Science, 287, 1279-1283 (2000)
【非特許文献３】R. Kaiser et al.; Analytical Biochemistry, 266, 1-8 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、ＮＭＲ法で構造解析をする場合には測定試料を比較的大量に調製する必要がある。また、高精度の構造情報を得るためにはリガンド分子を安定同位体標識することが必要となる。汎用的な安定同位体標識ペプチドの作製方法は、目的ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むベクターを大腸菌等に導入し発現させる方法である。しかし、低分子リガンドのように短いペプチドをこの方法で発現させる場合、菌体内でペプチダーゼによる分解を避けるためグルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のようなタンパク質との融合タンパク質として発現させる必要がある。この場合、菌体内から融合体を精製し、酵素により融合タンパク質から切断し、逆相クロマトグラフィ等でペプチドを精製しなければならない。この方法では、ファージライブラリから有望なクローンの配列を得てから、同位体標識ペプチドサンプルを得るまでに、最低でも（１）組換えベクター作製、（２）ＤＮＡシーケンス確認、（３）発現実験、（４）菌体からのタンパク質粗精製、（５）酵素消化、（６）ＨＰＬＣ精製の６つの工程が必要となる。
【０００８】
そこで、本発明は、より迅速かつ簡易な工程で、標的分子−ポリペプチドリガンド複合体の立体構造を高精度に解析できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記事情に鑑みて、鋭意研究を重ねた結果、ファージディスプレイ法によって所望のアミノ酸配列を有するポリペプチドリガンドを提示させる際、そのポリペプチドとファージコートタンパク質との間に、酵素的または化学的手段による切断に感受性を有する切断部位を設けることによって、提示されたポリペプチドをその酵素的または化学的手段によってファージから容易に切り離すことができることを見出した。また、切り離されたポリペプチドリガンドが、標的分子と結合能を有し、複合体を形成することを見出して本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、
［１］標的分子−ポリペプチドリガンド複合体の立体構造解析方法であって、ファージディスプレイ法により、前記標的分子に結合しうるポリペプチドをファージ表面に提示させる第一の工程と、前記ファージ表面に提示されたポリペプチドを切断することにより、ポリペプチドリガンドを得る第二の工程と、前記ポリペプチドリガンドと前記標的分子の複合体を形成させる第三の工程と、前記複合体の立体構造を解析する第四の工程と、を含む立体構造解析方法；
［２］前記ファージ表面に提示されたポリペプチドが、酵素的または化学的手段による切断に感受性を有する切断部位を含む、上記［１］に記載の方法；
［３］前記酵素的手段が、トリプシン、リジルエンドペプチダーゼ、キモトリプシンおよびＶ８プロテアーゼ、エンテロキナーゼ、トロンビン、ファクターＸａ、ＴＥＶプロ
テアーゼからなる群から選択される、上記［２］に記載の方法；
［４］前記化学的手段が、臭化シアンまたはヒドロキシルアミンのいずれかである、上記［２］に記載の方法；
［５］前記第二の工程が、前記ファージを含む溶液に臭化シアンを添加することを含む、上記［１］に記載の方法；
［６］前記第一の工程が、前記標的分子を固定した固相担体表面にファージディスプレイ・ライブラリを含む溶液を接触させてインキュベートする工程と、前記固相担体表面を洗浄した後、該固相担体表面に捕捉されたファージを回収しクローン化する工程と、前記クローン化されたファージを感染させた大腸菌にヘルパーファージを感染させる工程と、を含む上記［１］から［５］のいずれか１項に記載の方法；
［７］前記第一の工程が、前記標的分子に結合しうるポリペプチドをコードするＤＮＡを含むファージミドを用いて形質転換した大腸菌を培養する工程と、前記大腸菌にヘルパーファージを感染させる工程と、を含む上記［１］から［５］のいずれか１項に記載の方法；
［８］前記ファージが、繊維状ファージである上記［１］から［７］のいずれか１項に記載の方法；
［９］前記第四の工程が、ＮＭＲ法による解析を含む上記［１］から［８］のいずれか１項に記載の方法；
［１０］上記［１］に記載の方法を用いて、ポリペプチドリガンドが標的分子と複合体を形成した状態における、ポリペプチドリガンド分子の立体構造を決定する方法。
［１１］上記［１］に記載の方法による解析結果が蓄積されたデータベースを用いて、ポリペプチドリガンドが標的分子と複合体を形成した状態における、標的分子のリガンド結合部位の三次元構造を推定する方法；
［１２］上記［１１］に記載の方法を用いて、標的分子のリガンド結合部位に結合しうる高親和性リガンドを設計する方法；
［１３］標的分子に結合しうるポリペプチドリガンドと、酵素的または化学的手段による切断に感受性を有するポリペプチドと、ファージコートタンパク質をコードするＤＮＡと、これらの上流に位置するプロモータ配列と、を含む発現ベクター；
［１４］標的分子に結合しうるポリペプチドリガンドと、酵素的または化学的手段による切断に感受性を有するように改変したファージコートタンパク質をコードするＤＮＡと、これらの上流に位置するプロモータ配列と、を含む発現ベクター；
［１５］前記ファージコートタンパク質をコードするＤＮＡが、Ｍ１３繊維状ファージに由来するｇｅｎｅ８遺伝子である、上記［１３］または［１４］に記載のベクター；
［１６］ファージミドを用いて作製される、上記［１３］から［１５］のいずれか１項に記載のベクター；
［１７］上記［１３］から［１６］のいずれか１項に記載のベクターをファージに導入し、このファージを含む形質転換体を培養することにより、前記ＤＮＡがコードするポリペプチドをファージ表面に提示させる工程と、酵素的または化学的手段によって前記ポリペプチドを切断する工程と、を含む、ポリペプチドリガンドの製造方法、に関する。
【００１０】
以下に、本願明細書において記載する記号、用語等の意義、本発明の実施の形態等を示して、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明にかかる標的分子−ポリペプチドリガンド複合体の立体構造解析方法は、ファージディスプレイ法により、前記標的分子に結合しうるポリペプチドを表面に提示するファージを調製する第一の工程と、前記ファージ表面に提示されたポリペプチドを切断することによりポリペプチドリガンドを得る第二の工程と、前記ポリペプチドリガンドと前記標的分子の複合体を形成させる第三の工程と、前記標的分子−ポリペプチドリガンド複合体の立体構造を解析する第四の工程と、を含む。
【００１２】
本発明において「標的分子」とは、その分子に対する高親和性リガンドを得ようとする分子を意味する。本発明における「標的分子」は、ポリペプチドをリガンドとしうる限り特に限定されないが、好ましくはタンパク質である。具体的には、Ｇタンパク質共役型受容体、イオンチャネル、核内レセプターなどの各種受容体、酵素、ホルモン様分子などが挙げられる。これらの標的分子は、特異的なリガンドが結合することにより種々の生理活性作用を伝達し発現し、医薬品開発のターゲットとなる。
【００１３】
本発明にかかる第一の工程では、標的分子に結合するポリペプチドリガンドをコードするＤＮＡを用いて、このポリペプチドリガンドを含むポリペプチドを、ファージディスプレイ法によりファージ粒子表面に提示させる。ここで、ポリペプチドリガンドとは、標的分子と複合体を形成することのできるポリペプチドをいう。第一の工程において、ファージ粒子表面に提示させるポリペプチドは、ポリペプチドリガンドと等しいか、ポリペプチドリガンドより長いアミノ酸配列からなる。
【００１４】
本発明において、ポリペプチドをファージディスプレイ法によりファージ粒子表面に提示させるためには、このポリペプチドをファージ粒子のコートタンパク質との融合タンパク質として発現させればよい。具体的には、ファージのコートタンパク質遺伝子のいずれかに上記ポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、これをファージ粒子中に組み込むことによって行うことができる。このファージ粒子を、宿主（例えば大腸菌等）に感染させることにより、ファージのゲノムＤＮＡが効率よく複製される。
【００１５】
本発明で用いるファージは特に限定されず、例えば繊維状ファージ、ラムダファージ、Ｔ４ファージ、Ｔ７ファージなどが挙げられるが、好ましくはＭ１３、ｆｄ、ｆ１などの線状ファージである。線状ファージは一本鎖ゲノムがコートタンパク質に直接覆われた構造を持ち、一本鎖ＤＮＡを大量に調製することができる。
【００１６】
形質転換した宿主は、適宜選択した培地を用いて培養することができ、これによって高濃度な融合タンパク質を有するファージ溶液を得ることができる。また、培地に安定同位体標識した炭素原や窒素原（例えば、すべての炭素を13Ｃラベルしたグルコースや、窒素を15Ｎラベルした塩化アンモニウム等）を添加しておくことにより、安定同位体標識されたポリペプチドを発現させることができる。安定同位体標識されたポリペプチドリガンドを用いれば、ポリペプチドリガンドの立体構造をＮＭＲ法により高精度に決定することができ、標的分子との複合体の解析に好適である。
【００１７】
本発明にかかる第二の工程では、上記ファージ粒子表面に提示されたポリペプチドを切断することにより、ファージからポリペプチドリガンドを切り離す。切り離す手段は特に限定されないが、例えば、ファージ表面に提示されたポリペプチドが、酵素的または化学的手段による切断に感受性を有する切断部位を含むように設計しておけば、対応する酵素又は化合物を添加することによって容易に切り離すことができる。
【００１８】
具体的には、例えば、上記ポリペプチドのファージコートタンパク質に隣接する部分にメチオニン残基が入るよう、ベクターに組み込むＤＮＡを設計しておく。即ち、発現される融合タンパク質が、ポリペプチドリガンド、メチオニン残基、ファージコートタンパク質の順に結合された構成とする。これによって、ファージ表面に提示されたポリペプチドは、臭化シアンを加えることで、メチオニン残基のＣ末端側で容易に切断される。化学的手段による切断としては、他に、ヒドロキシルアミンによるＡｓｎ−Ｇｌｙ間の切断、ＢＮＰＳ−スカトールによるトリプトファン残基Ｃ末端側の切断などが挙げられる。
【００１９】
また、切断部位はファージコートタンパク質の一部を改変することによって設けることもできる。このような例としては、ファージコートタンパク質のＮ末端をメチオニン残基に置き換え、このメチオニン残基にポリペプチドリガンドが結合された構成が挙げられる。
【００２０】
酵素的手段としては、リジンおよびアルギニン残基のＣ末端側で切断するトリプシン、リジン残基のＣ末端側で切断するリジルエンドペプチダーゼ、芳香族アミノ酸のＣ末端側で切断するキモトリプシン、グルタミン酸およびアスパラギン酸のＣ末端側で切断するＶ８プロテアーゼ、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−ＬｙｓのＣ末端側で切断するエンテロキナーゼ、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＡｒｇのＣ末端側で切断するファクターＸａ、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２１】
上記の切断部位を有するポリペプチドは、ポリペプチドリガンドと、ファージコートタンパク質とをコードするＤＮＡの間に、上記切断部位をコードするＤＮＡを挿入することにより作製することができる。またはファージコートタンパク質遺伝子のポリペプチドリガンド遺伝子に隣接する部分を、切断部位をコードするＤＮＡに置き換えることによっても作製できる。発現させたいポリペプチドリガンドをより標的分子の結合ポケットに近づける目的で、切断部位とポリペプチドリガンドとの間にリンカーペプチドを挿入してもよい。リンカーを挿入することにより、ポリペプチドのＮ末端部分がコートタンパク質のアッセンブリを阻害するのを避けられるという効果も得られる。
【００２２】
本発明における第三の工程では、後続の構造解析のために、上記ポリペプチドリガンドと標的分子との複合体を形成させる。本工程は、ポリペプチドリガンドを含む溶液に標的分子を加えることにより、自体公知の方法に従って当業者は容易に行うことができる。第二の工程で得られたポリペプチドリガンドは、ファージに提示されたポリペプチドを切断することによって得たものなので、ファージに提示された状態の立体構造をほぼ維持しており、標的分子と特異的に結合することが可能である。
【００２３】
本発明における第四の工程では、標的分子とポリペプチドリガンドとが複合体を形成した状態のままで立体構造を解析する。立体構造の解析方法としては、Ｘ線結晶構造解析やＮＭＲ法が一般的であるが、より好ましくはＮＭＲ法を用いる。ＮＭＲ法によれば、試料（標的分子−ポリペプチドリガンド複合体）を結晶化させる必要がなく、溶液中で行うことができるので、測定試料の調製が容易で、より生体内に近い条件で標的分子とポリペプチドリガンドとを相互作用させることができる。
【００２４】
本発明にかかる第一の工程は、ファージディスプレイ・ライブラリから標的分子に結合するペプチドリガンドを提示しているファージを選択し、このファージを感染させた大腸菌等に、ヘルパーファージを感染させることによって行うことができる。
【００２５】
具体的には、例えば、上記標的分子を固相担体（例えば固相基板、フィルム、テープ、ビーズ等）に固定し、この固相担体表面にファージディスプレイ・ライブラリを含む溶液を接触させてインキュベートする。続いて、この固相担体表面を洗浄することによって、標的分子に親和性を有しないポリペプチドを提示しているファージ粒子を除去した後、標的分子−ポリペプチド間の相互作用によって固相担体表面に捕捉されたファージ粒子を回収する。この一連の操作（ラウンド）によって、標的分子に親和性を有するリガンドを提示するファージが濃縮される。酸処理などによって回収したファージを、例えば宿主大腸菌に感染させて増幅させれば、標的分子に対して高い親和性を有するファージ粒子群を得ることができる。
【００２６】
また、ファージディスプレイ・ライブラリ以外のライブラリを用いて、標的分子に結合するポリペプチドリガンドを探索し、その一次構造を得ることができた場合も、本発明にかかる方法を用いることができる。この場合は、例えば、第一の工程として、該ポリペプチドリガンドをコードするＤＮＡを含むファージミドを作製し、このファージミドで形質転換した形質転換体（大腸菌等）を培養し、ヘルパーファージで感染すればよい。これにより、標的分子に結合しうるポリペプチドを表面に提示したファージを大量に得ることができる。
【００２７】
また、本発明は、本発明に係る解析方法を用いて、ポリペプチドリガンドが標的分子と複合体を形成した状態におけるポリペプチドリガンド分子の立体構造を決定する方法を含む。上述のように、本発明に係る方法によれば、ポリペプチドリガンドを安定同位体で標識しておくことができるので、高精度な構造解析を行うことができる。
【００２８】
また、本発明は、本発明に係る解析方法による解析結果が蓄積されたデータベースを用いて、ポリペプチドリガンドが標的分子と複合体を形成した状態における、標的分子のリガンド結合部位の三次元構造を推定する方法も提供する。タンパク質の一次構造を用いてそのタンパク質の立体構造を推定する方法が開発されているが、多くの方法では、タンパク質が単独で存在する場合の構造予測が目的とされている。しかし、リガンドとの結合によってコンフォメーションに変化が起こるタンパク質も存在し、タンパク質単独の立体構造が推定できても、そこに結合するリガンドを推測するのは困難である。本発明に係る解析方法によれば、標的分子とポリペプチドリガンドの結合時の立体構造情報を得るこができるので、リガンド結合時における標的分子のリガンド結合部の三次元構造と、標的分子のアミノ酸配列との関係についての情報を蓄積し、データベースを得ることができる。かかるデータベースにおいては、三次元構造は、例えば三次元座標情報として記録することができる。このデータベースを用いて、コンピュータシュミレーションによるホモロジーモデリング（in silico homology modeling）を行って、新たな標的分子についてそのアミノ酸配列からリガンド結合時におけるリガンド結合部の三次元構造を推定することができる。
【００２９】
さらに、本発明は、上述のホモロジーモデリング法を用いて、標的分子のリガンド結合部位に結合しうる高親和性リガンドを設計する方法を含む。高親和性リガンドの立体構造は、標的分子のリガンド結合部位の三次元座標情報に基づき、自体公知の方法に従って、コンピュータによるin silico screeningで求めることができる。高親和性リガンドはポリペプチドに限定されず、医薬品開発の候補化合物として、特に低分子化合物であることが好ましい。
【００３０】
本発明はまた、本発明にかかる第一の工程に用いるベクターも提供する。このベクターは、ポリペプチドリガンドと、酵素的または化学的手段による切断に感受性を有するポリペプチドと、ファージコートタンパク質をコードするＤＮＡを含み、これらのタンパク質およびポリペプチドを融合タンパク質として発現させることができる。さらに、これらのタンパク質およびポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の上流に、プロモータ配列を含むことにより、融合タンパク質の発現の度合いを調節することが可能となる。
【００３１】
また、本発明に係る上記ベクターの別の態様として、ポリペプチドリガンドと、酵素的または化学的手段による切断に感受性を有するように改変したファージコートタンパク質をコードするＤＮＡとを含む構成としてもよい。この場合も、これらのＤＮＡ配列の上流にプロモータ配列を導入することにより、融合タンパク質の発現の度合いを調節することができる。
【００３２】
プロモータ配列は公知のものを用いることができ、例えばｌａｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、λプロモータなどが挙げられる。ｌａｃプロモータおよびｔａｃプロモータにはイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）、ｔｒｐプロモータにはインドリル−３−アクリル酸などの誘導物質を用いることができ、λプロモータは４２℃への温度シフトやＤＮＡ合成阻害剤によってリプレッサーをはずし、転写を誘導することができる。
【００３３】
本発明で用いるベクターは、線状ファージの一本鎖ゲノムをそのまま用いてもよく、また、外来のプラスミドベクターを用いてもよい。外来のプラスミドベクターとしては、例えば、ファージの一本鎖ＤＮＡの生成に必要な複製起点を組み込んだファージミドベクターを用いることができる。ファージミドベクターはヘルパーファージを感染させるだけで一本鎖ＤＮＡとしてファージ粒子へとパッケージングされ、培養上清から一本鎖ＤＮＡを得ることができる。ファージミドを用いた方法は、例えば非特許文献１に開示されている方法に従って行うことができる。
【００３４】
本発明で用いられるファージディスプレイ法に、Ｍ１３線状ファージを用いる場合、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子は、５種類（ｇｅｎｅ３、６、７、８、９）あり、いずれを用いることもできるが、特にｇｅｎｅ８遺伝子が好ましい。ｇｅｎｅ８タンパク質以外のコートタンパク質は、ファージ粒子あたりのコピー数が５コピーであるところ、ｇｅｎｅ８タンパク質は１粒子あたり約２７００コピーである。従って、目的ポリペプチドが融合した改変ｇｅｎｅ８も他のタンパク質と比較して圧倒的に多く発現することができる。
【００３５】
本発明は、上記ベクターをファージに導入し、ベクターが含むＤＮＡがコードするタンパク質およびポリペプチドを発現させる工程と、酵素的または化学的手段による切断に感受性を有するポリペプチドを、酵素的または化学的手段によって切断する工程とを含む、ポリペプチドの製造方法も含む。
【００３６】
この方法によれば、目的のアミノ酸配列を有するポリペプチドを、効率的かつ大量に製造することができる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明にかかる解析方法により、医薬品開発等の標的分子に結合能を有するポリペプチドを効率よく大量に得て、ポリペプチドリガンド−標的分子複合体の三次元構造をＮＭＲ法等によって測定することが可能となった。本解析方法によって得られた
解析結果が蓄積されたデータベースを用いることによって、標的分子のアミノ酸配列に基づいて、リガンド結合時における標的分子のリガンド結合部の三次元構造を、in silico homology modelingによって推定することができる。さらに、in silico homology modelingによって得られたリガンド結合時の三次元座標情報を用いたin silico screeningにより、標的分子に高い親和性を有する化合物の探索も行うことができ、医薬品開発の効率化に寄与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
以下に示す本発明の実施例、参考例等は例示的なものであり、本発明は以下の具体例に制限されるものではない。当業者は、以下に示す実施例に様々な変更を加えて本発明を最大限の実施することができ、かかる変更は本願特許請求の範囲に包含される。
【００３９】
図１に、本発明にかかる解析方法のスキームの一例を示す。
【００４０】
まず、図１（Ｉ）に示されるように、ファージディスプレイ・ライブラリ１を作製し
、（ＩＩ）に示されるように、標的分子３０を用いてスクリーニングを行う。（ＩＩ）は、ファージディスプレイ・ライブラリ１に含まれる６種類のポリペプチドを提示したファージのうち、２種類のファージ１０および２０が標的分子３０に結合した例を表している。
【００４１】
次に、選択されたファージ１０および２０をクローン化し、これを大腸菌に感染させることによって、ファージ１０およびファージ２０が大量に調製され、（ＩＩＩ）に示すように、ファージ群１２および２２を得る。次に、臭化シアン４０を加えることによって、ファージ群１２および２２のファージが提示するポリペプチドに含まれるメチオニン残基が切断され、（ＩＶ）に示されるようにポリペプチドリガンド１４および２４が得られる。
【００４２】
（Ｖ）に示されるように、まずポリペプチドリガンド１４と標的分子３０とを結合させ、ＮＭＲ法により解析する。これにより、ポリペプチドリガンド１４と標的分子３０との結合時における、ポリペプチドリガンド１４の立体構造を決定し、標的分子３０におけるリガンド１４との結合部位３２の立体構造を推定することができる。同様にポリペプチドリガンド２４と標的分子３０とを結合させ、ＮＭＲ法により解析することによって、結合時のポリペプチドリガンド２４の立体構造を決定し、標的分子３０におけるポリペプチドリガンド２４との結合部位３４の立体構造を推定することができる。
【００４３】
（Ｖ）で得られたデータをもとに、標的分子３０のリガンド結合部位の立体構造をより詳細に推定することができ、（ＶＩ）この結合部位に高い親和性を有するリガンドを設計することが可能となる。
【実施例１】
【００４４】
モデルリガンドの大量発現実験および標的分子との結合実験
ｈｕｍａｎＩｇＧＦｃに強く結合することが報告されている（非特許文献２）、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる環状ペプチドから、直鎖状ペプチドを設計し、結合が弱くなっていることを確かめた。
【００４５】
この直鎖状ペプチド（１４ｍｅｒ）をファージに提示させ、これを切断して、モデルリガンドを得た。そしてこのモデルリガンドと標的分子としてのｈｕｍａｎＩｇＧとの結合実験を行い、ＮＭＲにより立体構造を解析した。以下に各工程を示す。
（１）ベクターの調製
Ｍ１３線状ファージから、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるコートタンパク質をコードする遺伝子（シグナル配列を含む）をクローニングし、Ｍ１３ｏｒｉを有するＴＶ１１８Ｎベクター（ＴａＫａＲａ社製）のｌａｃプロモータ下流に導入し、ファージミドベクターとした。臭化シアンを用いて切断するため、切断サイトとして、ｇｅｎｅ８タンパク質の１番目のＡｌａがＭｅｔとなるように、ＤＮＡ配列を改変した。さらに、ＭｅｔのＮ末とモデルリガンドとの間に４ｍｅｒのリンカーペプチド（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）が挿入されるように、モデルリガンドとリンカーペプチドをコードするＤＮＡを上記ファージミドベクターに挿入した。
（２）モデルペプチドの大量発現実験および標的分子との結合実験
上記ファージミドベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換した。シングルコロニーをＬＢ培地２ｍｌで培養後、ラベル化Ｍ９培地（炭素源を13Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｅ、窒素源を１５Ｎ−ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｌｏｒｉｄｅとした最小培地）１０ｍｌに植え継ぎ、さらに５０ｍｌに拡大した。
【００４６】
Ｏ／Ｎ培養した菌を９００ｍｌにうつして培養し、ＯＤ６００＝０．４でＩＰＴＧによる発現誘導を行った。２時間後ＫＯ７ヘルパーファージを感染させ、さらにＯ／Ｎ培養した。遠心により、上清を回収しポリエチレングリコールを用いて沈殿させ、ファージを回収した。ファージをＵｒｅａで可溶化し、塩酸で酸性にして、非特許文献３に従って、臭化シアン分解を行った。
【００４７】
得られたモデルリガンドは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる、コートタンパク質、リンカーペプチド、およびモデルリガンドの融合タンパク質を臭化シアン分解したものであるが、臭化シアン分解により切断部位のＭｅｔは、ホモセリンラクトンに変換されるので（非特許文献３を参照）、配列番号：３に記載のアミノ酸配列のＣ末端にホモセリンラクトンが結合した１９ｍｅｒのモデルリガンドが得られたものと推定された。そこで、得られたモデルリガンドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで解析したところ、推定したモデルリガンドの分子量と一致し、この推定が正しいことが確認された。そこで、得られたモデルリガンドを、逆相クロマトグラフィで精製し、目的のポリペプチドリガンドを得た。
【００４８】
続いて、このポリペプチドリガンド単独でＮＭＲ測定を行った。ＨＳＱＣスペクトルを図２に示す。
【００４９】
また、このポリペプチドリガンドの標的分子である、ｈｕｍａｎＩｇＧを加えたサンプルのＮＭＲを測定し、結合状態での構造を解析した。結果を図３に示す。
【００５０】
臭化シアン分解によって得られたポリペプチドリガンドが標的分子に親和性を有し、またポリペプチドリガンドが安定同位体標識され、感度良くＮＭＲ測定を行えることが確認された。
【実施例２】
【００５１】
ファージディスプレイ法によるペプチドライブラリの作製と、抗体によるスクリーニング実験
（１）ファージディスプレイ法によるペプチドライブラリの作製
１０ｍｅｒのランダムペプチドからなるペプチドライブラリをファージ表面に提示する、ファージディスプレイ・ペプチドライブラリを構築した。具体的には、Ｍ１３ＫＥベクター（ＴａＫａＲａ社製）からｇｅｎｅ８遺伝子（シグナル配列を含む）をＰＣＲで増幅、その際ＰＣＲプライマーにＮｃｏＩサイト、ＨｉｎｄＩＩＩサイトを含むように設計し、そのＰＣＲ断片を両酵素で消化する。同様の切断サイトで切断したベクターに組み換えることで、ｇｅｎｅ８の発現ベクターが完成した。ポイントミューテーションで、シグナル配列の後ろにリンカー部Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＡｓｐとＭｅｔを挿入した。このリンカーのＧｌｙ−Ｓｅｒをコドンでは、ＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨＩサイト）とした。このベクターがライブラリ構築の際のライブラリ部分のみが欠落したベクターである。このライブラリを、上記ＮｃｏＩサイトをもつプライマーとランダム配列の下流にＢａｍＨＩサイトを持つプライマーで増幅する。このＰＣＲ断片をＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで消化し、同様に消化した上記ベクターに組み換えることでペプチドライブラリをコードコードするファージミドが得られた。このファージミドを用いて、Ｅ．ＣｏｌｉＸＬ１−ｂｌｕｅを形質転換し、培養後、ヘルパーファージを感染させてペプチドを提示したファージライブラリが完成した。スクリーニングに用いるペプチドライブラリを作製する場合は、発現誘導を行わなかった
（２）抗体によるスクリーニング
続いて、抗Ｆａｓリガンド抗体（化血研より供与）を用いて、このファージライブラリをスクリーニングした。
【００５２】
具体的には、抗Ｆａｓリガンド抗体をプロテインＡ結合アガロースビーズに結合させた。この抗Ｆａｓ抗体ビーズと上記ライブラリを室温で１時間インキュベートした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ  １ｍＬで３〜５回、５〜２０分洗浄した。このビーズを２μｇ／ｍｌのＦａｓリガンド１時間インキュベートし、ビーズから溶出されたファージを回収した。回収したファージはＥ．ｃｏｌｉＸＬ１−ｂｌｕｅに感染させ、１時間後さらにヘルパーファージを感染させた。１Ｏ／Ｎ培養した菌の上清からＰＥＧ沈殿でファージを回収した。上述の工程を１ラウンドとして、４ラウンドのパニングの後、抗Ｆａｓリガンドに結合するクローンを得た。このうち２つのクローンについて、上記（２）と同様の方法で、誘導をかけ、ラベル化培地を用いてファージの大量培養を行った。ポリエチレングリコールで沈殿させた後、臭化シアン分解し、安定同位体標識されたポリペプチド（１５ｍｅｒ）を得た。それぞれのペプチドについてＮＭＲスペクトルを測定した結果を図４および５に示す。
【００５３】
ファージディスプレイ・ライブラリを用いたスクリーニングによって選択されたポリペプチドを、新たにファージディスプレイ法によって大量発現させ、これを切断処理することによって、構造解析にもちいるポリペプチドリガンドを得られることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、本発明にかかる解析方法のスキームを示す。
【図２】図２は、臭化シアン分解により得られたポリペプチドリガンドのＮＭＲによる構造解析結果を示す。
【図３】図３は、モデルリガンドとｈｕｍａｎＩｇＧの結合状態における、ＮＭＲによる構造解析結果を示す。
【図４】図４は、臭化シアン分解により得られたポリペプチドのＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】図５は、臭化シアン分解により得られたポリペプチドのＮＭＲスペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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