(57)【要約】【課題】  不均一化したmtDNAの細胞レベルでの均一化を人為的に促進する方法を提供すること。【解決手段】  MHR1遺伝子産物を細胞内に発現することを含む、ミトコンドリアＤＮＡ均一性を促進する方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
MHR1遺伝子産物を細胞内に発現することを含む、ミトコンドリアＤＮＡ均一性を促進する方法。
【請求項２】
MHR1遺伝子を含む発現ベクターを細胞内に導入してMHR1遺伝子産物を細胞内に発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
MHR1遺伝子が酵母由来のMHR1遺伝子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
細胞が酵母である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリアＤＮＡ均一性を促進する方法に関する。より詳細には、本発明は、サッカロミセスセレビシエにおいてミトコンドリアDNAの組換えおよびDNA修復に必要な遺伝子として単離されたMHR1遺伝子を用いてミトコンドリアＤＮＡ均一性を促進する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは多様かつ多数のゲノムDNAのコピーを運搬し、例えば哺乳細胞およびサッカロミセスセレビシエ細胞では、ミトコンドリアDNA（mtDNA）のコピーがそれぞれ103から105個および30〜100個存在する。mtDNAはミトコンドリアの機能に不可欠である。変異の獲得はミトコンドリアのゲノムの方が核のゲノムより約10倍速い（例えば、非特許文献１）ので、各細胞には多様な変異を伴う異質mtDNAのコピーが存在していると推測される。酵母ないしヒトでは、核ゲノムとは異なり、ミトコンドリアゲノムの対立遺伝子は細胞分裂周期中に素早く分離することが多く（図１Ａ）、酵母では細胞分裂の10〜20サイクル中に（概説として非特許文献２及び３を参照）、哺乳類では２ないし３継代中に（非特許文献４）、各細胞または個体のmtDNAは全て遺伝子的に均質になる（この現象を「ホモプラスミー」と言う、図１Ａを参照）。哺乳類の卵母細胞の分化過程でホモプラスミーが成立する（非特許文献５及び非特許文献６）。
【０００３】
変異体ホモプラスミー細胞が確立する際、mtDNAの単一コピー上の変異体対立遺伝子は増殖して、多数の細胞内小器官DANの完全なコピーの集団を形成するが、それは無作為に選択したmtDNAの1個のコピーを鋳型にして子孫mtDNAの全てを複製するかのようである（図１Ａ）。mtDNAが個別に複製して子孫に無作為に分配されるならば、細胞分裂している各酵母細胞中のmtDNAの数は２ないし６個、あるいは約３個となるはずである（非特許文献２; 非特許文献３）。しかし、計算で求めたmtDNAのコピー数はmtDNAの実際のコピー数よりもはるかに少ない。従って、ホモプラスミー細胞は能動過程により生成する。
【０００４】
ヒトでのヘテロプラスミーは、ミトコンドリア疾患として知られている重篤な遺伝性疾患に関連して、または高齢者の幾つかの組織中に観察される（概説として非特許文献７及び非特許文献８を参照）。このような疾患の原因となる遺伝子欠損はmtDNAまたは常染色体のどちらかにある。最近、ホモプラスミー形成は核遺伝子の制御下にあることが示された（非特許文献９）。このメカニズムを説明する多数の仮説が提案されているが、ヘテロプラスミー細胞からホモプラスミー細胞が生成する過程で役割を担うタンパク質または遺伝子は未だ同定されていない。
【０００５】
ヘテロプラスミー細胞からホモプラスミー細胞が産生するメカニズムに関する研究には、十分な量の再現性高く生産可能なヘテロプラスミー細胞が必要である。（哺乳類ではなく）酵母サッカロミセスセレビシエでは、ミトコンドリアの各種対立遺伝子を有する一倍体酵母細胞を接合することにより、ヘテロプラスミー細胞が再現性高くかつ効率的に産生され、このヘテロプラスミー接合体は全て数十回の細胞分裂を経る内にホモプラスミー化する（概説として図１Ａおよび非特許文献３を参照）。更に、この微生物では、各種の遺伝子工学および分子生物学上の技術が利用可能である。従って、サッカロミセスセレビシエは、ホモプラスミーの研究に適したモデル系である。
【０００６】
MHR1は、サッカロミセスセレビシエにおけるmtDNAの組換え（非特許文献１０）およびDNA修復（非特許文献１１）に必要なものとして単離された遺伝子である。最近の研究により、この遺伝子の産物（Mhr1タンパク質、Mhr1pと記載）には相同な一本鎖DNAおよび二本鎖DNAを対合させてヘテロ二本鎖を形成する活性があることが判明した（相同的DNA組換えの普遍的な中間体、非特許文献１２）。この試験管内活性、mtDNAの分配の際にMhr1pが必要とされること、また母細胞のmtDNAと芽のmtDNAとの間にはサイズ分布に相違があることから、酵母のミトコンドリアでは、Mhr1pに依存する経路により形成されるmtDNAのコンカテマー（単位長のDNAが直列につながった直鎖多量体）は、mtDNAの分配の際に環状一量体となる必須中間体であることが示唆されている（非特許文献１２）。
【０００７】
上記の通り、mtDNAに一つの変異が入ると、比較的少ない世代の間に、変異型遺伝子と正常型遺伝子は次第に分離して、その子孫の細胞または個体は、変異型のmtDNAまたは正常型のmtDNAで全て均一になる。このホモプラスミー化は、酵母から人など高等動物、高等植物にまで観察される普遍的な非メンデル型遺伝現象である。さらに、高等植物の葉緑体DNAでも同様な現象が起こる。これまでは、この均一化に働く遺伝子や蛋白質は知られておらず、人為的にmtDNAの均一化を制御することは不可能であった。
【０００８】
【非特許文献１】Brown, W.M., et al., (1979). Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76, 1967-1971
【非特許文献２】Birky,C.W., Jr. (1978). Annu.Rev.Genet. 12, 471-512
【非特許文献３】Dujon, B.(1981). Mitochondrial genetics and function. In: The molecular biology of the yeast Saccharomyces: life cycle and inheritance, eds. J.N. Strathern, et al, New York: Cold Spring harbor Laboratory Press, 505-635
【非特許文献４】Ashley, M.V., et al., (1989) Nucleic Acids Res 17, 7325-7331
【非特許文献５】Bergstrom, C.T., et al.,(1998). Genetics 149, 2135-2146
【非特許文献６】Marchington,D.R., et al., (1998). Am.J.Hum.Genet. 63, 769-775
【非特許文献７】Lightowlers, R.N., et al., (1997), Trends Genet. 13, 450-455
【非特許文献８】Shoubridge, E.A., (1998). Curr.Opin.neurol. 11, 491-496
【非特許文献９】Battersby, B.J., et al., (2003). Nat. Genet. 33, 183-186
【非特許文献１０】Ling, F., et al., (1995), EMBO J. 14, 4090-4101
【非特許文献１１】Ling F., et al., (2000), Nucleic Acids Res 28, 4956-4963
【非特許文献１２】Ling F., et al., (2002), EMBO J. 21, 4730-4740
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
mtDNAは、各細胞に多数コピーが存在、世代当たり核染色体DNAの１０倍もの頻度で突然変異するが、酵母細胞、多くの動物株化細胞、誕生直後の動物個体全身で、全てのmtDNAは同一の塩基配列を有する（ホモプラスミー）。加齢やある種の疾患では、変異を持つmtDNAが増え不均一化することが、ヒトの神経などの特定器官の細胞で観察される。本発明は、不均一化したmtDNAの細胞レベルでの均一化を人為的に促進する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、単離したMHR1遺伝子を大量発現型のプラスミドに組み込んで、細胞に戻し、Mhr1蛋白質を大量発現させることにより、出芽酵母の細胞において不均一であったmtDNAの均一化を少なくとも２．５倍加速させることに成功した。これは、mtDNAの均一化を人為的に加速した初めての例である。mtDNAの複製と分配の機構は、酵母から高等動植物まで共通点が高いと考えられるので、同じ機能をもつ蛋白質を大量発現させることにより、mtDNAが不均一化した細胞から均一な細胞を効果的に取得する方法を提供することが可能になった。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１１】
即ち、本発明によれば、MHR1遺伝子産物を細胞内に発現することを含む、ミトコンドリアＤＮＡ均一性を促進する方法が提供される。好ましくは、MHR1遺伝子を含む発現ベクターを細胞内に導入してMHR1遺伝子産物を細胞内に発現する。好ましくは、MHR1遺伝子は酵母由来のMHR1遺伝子であり、細胞は酵母である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
異なる抗生物質耐性変異でマークしたmtDNAをもつ酵母のα細胞とａ細胞を対合させて得た接合体では、２種のmtDNAが存在するが、その後十数世代の細胞分裂の間に、それぞれの細胞はα細胞型、ａ細胞または単一の組み換え型のmtDNAのみを持つようになる（ホモプラスミー細胞）（図１ｃの丸印）。この接合体で、GAL1プロモーターの制御下に置いたMHR1遺伝子の発現を誘導し、細胞内のMhr蛋白質の量を増加させると、このmtDNAの均一化が顕著に加速される（図１ｃのパネルａの四角印）。Mhr蛋白質と同様にミトコンドリアに存在するDNA結合蛋白質であるAbf2蛋白質や、Cce1蛋白質を大量発現させても、均一化の速度は変わらない。この結果が、mtDNAの均一化の加速は、Mhr1蛋白質に特有の機能であることを示している。ちなみに、mhr1-1変異は、通常より高い温度でMhr1蛋白質の活性を失う変異であるが、活性の一部を失う３４℃で、この変異をホモに持つ接合体では、均一化の速度は顕著に遅くなる（図１ｃのパネルｃの四角印）。Mhr1蛋白質の活性の増減でmtDNAの均一化の速度が増減することは、この遺伝子が均一化において重要な働きをしていることを示している。
【００１３】
Mhr1蛋白質の分子機能は、相同DNA組み換えにおいて重要な反応である。同じ塩基配列を持つ二本鎖DNAと一本鎖DNAとを対合させ、分子間の二本鎖（ヘテロ二本鎖）をつくる反応をATPなしの条件で行う。このような蛋白質は、バクテリア、バクテリアに感染するウイルス、酵母のミトコンドリア、酵母や高等動物の細胞核から広く見つかっている。そこで、高等動物のミトコンドリアでも同様の機能を持つ蛋白質が、mtDNAの均一化に働いている可能性が極めて高く、mtDNA不均一に起因する疾患等の治療や予防のために使用できる可能性がある。
【００１４】
上記の通り、MHR1の過剰生産によりホモプラスミー細胞の生成が促進され、反対に当該遺伝子の欠損変異体（mhr1-1）によりホモプラスミー細胞の生成が遅延し、かつこれらの効果は、試験した３種類のmtDNA相互作用タンパク質の中でMhr1pのみに観察された（図１C）。これらの知見は、Mhr1pはホモプラスミー細胞の生成に重要かつ主要な役割を果たすことを実証している。
【００１５】
（１）ホモプラスミーのメカニズムに対する仮説
分離メカニズムとしては、（i）ヘテロ接合子各座でのジーンコンバーション、（ii）特定のミトコンドリア遺伝子型を持つ細胞の選択、（iii）特定の遺伝子型を持つmtDNAの細胞内選択、（iv）mtDNAのごく少数コピーが娘細胞に移動、（v）数個の選択されたmtDNA鋳型の特異的複製、および（vi）mtDNAの数クローンの選択的移動（図７、Backer, J.S., et al., (1985) Curr Genet. 9, 627-640を参照）が考えられる。
【００１６】
ミトコンドリア対立遺伝子が分離する初期段階では組換えmtDNAを持つホモプラスミー細胞が存在しないので、各ミトコンドリア対立遺伝子がジーンコンバーションにより独立に分離することがホモプラスミーの主要なメカニズムであるという可能性は排除される。連鎖していない遺伝子座（Ch1-およびOli-感受性に対する）で無作為に分離するならば、50％の頻度で、ChlS-OliS組換えミトコンドリアを持つホモプラスミー細胞が生成するからである。
【００１７】
特定のミトコンドリア遺伝子マーカーを持つ細胞の選択という可能性は低い。選択圧がなくてもホモプラスミー細胞は分離するからである。特定の遺伝子型を持つmtDNAへの細胞内選択の可能性も低い。本実施例において、２種の親mtDNAの相違は抗生物質耐性遺伝子の二つの塩基対ならびに不活性ens2の存否のみであって、当該相違によってmtDNAの一方の型が他方より複製上の有利を得る可能性はない。また、ホモプラスミー細胞集団の中でα親由来の対立遺伝子を持つ細胞とａ親由来の対立遺伝子を含有する細胞との比は、「入力比」仮説（Dujon, B.(1981). Mitochondrial genetics and function. In: The molecular biology of the yeast Saccharomyces: life cycle and inheritance, eds. J.N. Strathern, et al, New York: Cold Spring harbor Laboratory Press, 505-635）に従う座位（ChlまたはOli）とは無関係に、実験偏差の範囲内で一定のままであり、またMHR1／mhr1-1およびmhr1-1／ mhr1-1の両培地において大部分の細胞がホモプラスミー化した少なくとも最初の８継代間は一定のままであったという事実とも合致しない。
【００１８】
ごく少数個のmtDNAコピーの移動は、細胞分裂の開始前に標識した検出可能量のmtDNAの移動に関する本発明者らの以前の知見と合致しない。すなわち、G1停止の間にブロモデオキシウリジンを標識したmtDNAを持つ分裂細胞中において、少なくとも５ないし10個のミトコンドリア核様体が、ブロモデオキシウリジン含有DNAに対するフルオレスセイン共役抗体によって検出された（Ling F., et al., (2002), EMBO J. 21, 4730-4740の図１A）。更に、この実験で検出された各ミトコンドリア核様体がmtDNAの単一コピーのみを含有する可能性は低い。
【００１９】
（２）Mhr1pの生物学的機能
次に、Mhr1p（相同的組換えのための相同的対合を促進するタンパク質、Ling F., et al., (2002), EMBO J. 21, 4730-4740）の機能を検討し、上記の可能性（v）および（vi）を考察する。本発明では、mtDNAコンカテマーが豊富になるか否かはMhr1p活性のレベルに依存することが示された（図３ないし５）。相同的対合タンパク質に依存するコンカテマー形成のメカニズムは、ローリングサークル複製（コンカテマーを直接形成する；例えばE,coliファージλ中のβタンパク質に依存する後期複製）または交叉による単量体の接合（例えば、E,coliファージT4中のuvsX依存性複写）のいずれかである。ローリングサークル複製は、酵母中でのmtDNA複製に対する機構として他の研究者により（Maleszka,R., et al., (1991), EMBO J. 10, 3923-3929；Han, Z., et al., (1994), Chromosoma 103, 162-170；及びMacAlpine, D.M., et al., (1998). Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95, 6739-6743）および本発明者により（Ling F., et al., (2002), EMBO J. 21, 4730-4740）示唆された。mtDNAコンカテマーのサイズ分布が連続的であり、不連続なサイズのmtDNA種が有意に存在しなかったことは、ローリングサークル複製をコンカテマー形成のメカニズムとするのに有利である。更に、本発明では、mtDNA複製の直接の生産体は単量体ではなくてコンカテマーであることが示された（図６）。これらの結果は、mtDNAは主にMhr1p依存性のローリングサークル複製によって複製されてコンカテマーを形成するというモデルを強力に支持している。
【００２０】
パルスフィールドゲル電気泳動は、正常なmtDNA（ρ+mtDNA）のサイズのコンカテマーと環状単量体(単位サイズ、約80kbp; Bendich, A.J. (1996). J.Mol..Biol. 255, 564-588)を識別できないという技術的限界があるので、十分に小さなサイズのmtDNA、すなわち呼吸欠損をもたらす変異mtDNA（ρ-mtDNA）を必要とする通常のゲル電気泳動を頼りに、単位サイズ9.5kbpのρ-mtDNA（mt-pMK2DNA；Ling F., et al., (2002), EMBO J. 21, 4730-4740を参照）を使用した。ρ+mtDNAの複製とρ-mtDNAの複製は遺伝的要件において厳密には同一ではないことが報告されている。その相違のある部分は、ρ-mtDNAを持つ細胞ではmtDNAに対する酸化的障害がなく、ρ+mtDNAを持つミトコンドリアでは酸化呼吸の副生物によりmtDNAに対する強力な酸化的障害がある（Ling F., et al., (2002), EMBO J. 21, 4730-4740を参照）ということによって説明可能である。この事実を考慮しても、両者にはやはり変異の効果において相違がある（例えば、Lockshon, D., et al., (1995), Cell 81, 947-955；Zelenaya-Troitskaya, O., et al., (1998). Genetics 148, 1763-1776；及びZuo, X.M., et al., (2002). Genetics 160, 1389-1400）。しかし、ρ+とρ-の間に以下の共通の特徴が示されたことから、ρ-mtDNAの複製と分配のメカニズムを研究したことによりρ+mtDNAのメカニズムの理解が進んだ。すなわち、ヘテロプラスミー接合体からのホモプラスミーの達成はMhr1pの活性に依存していること（本発明）；コンカテマーは母細胞の主要なmtDNA種であり、単量体は娘細胞の主要なmtDNA種であること（LingおよびShibata、2002および本研究）；ρ+細胞の相違は予想よりもかなり小さかった（結果参照）が、単量体mtDNAに対するコンカテマーmtDNAの相対的な量は細胞中のMhr1p活性に依存していること（Ling F., et al., (2002), EMBO J. 21, 4730-4740の補足データにおける図３および本発明）である。
【００２１】
（３）ホモプラスミー細胞生成のメカニズム
mtDNAコンカテマーの存在度とホモプラスミー細胞の生成速度との間に相関（図３ないし５  対  図１C）が観察されたことより、ホモプラスミーにおけるコンカテマー形成の役割が示唆される。娘細胞中の単量体mtDNAまたは全mtDNAの14C密度は分裂母細胞の全mtDNAレベル、およびG1停止の全細胞中の全mtDNAとほぼ同じであることが実証された（図６）。すなわち、コンカテマーは分配のための必須の中間体であり、母細胞から娘細胞に移動する際に単量体になる。すなわちローリングサークル複製に続いてmtDNAtがコンカテマーとして分配される(図7, vii)というのが、共通鋳型からのmtDNAコピーの数個のクローンが移動する可能なメカニズムであり、上記の仮説vi（鋳型mtDNA由来mtDNAのクローンが数個選択的に移動）に合致する。
【００２２】
（４）哺乳動物において
ミトコンドリアホモプラスミーは多数の遺伝疾患および加齢に密接に関連しているが（概説としてLightowlers, R.N., et al., (1997), Trends Genet. 13, 450-455；及び、Shoubridge, E.A., (1998). Curr.Opin.neurol. 11, 491-496を参照）、哺乳動物は生誕時にホモプラスミーであり、このホモプラスミーは卵母細胞分化の過程で達成される。またヘテロプラスミーな動物は僅か２ないし３有性世代の後にはホモプラスミーとなる（Ashley, M.V., et al., (1989) Nucleic Acids Res 17, 7325-7331）。最近、哺乳動物におけるmtDNA組換えの可能性が報告されている（Thyagarajan, B., et al., (1996). J.Biol.Chem. 271, 27536-27543；及び、Tang, Y., et al., (2000). Mol.Biol.Cell 11, 2349-2358）。従って、ミトコンドリアホモプラスミーを促進することにより、遺伝疾患や加齢に伴う障害を予防及び／又は治療することができる可能性がある。
【００２３】
（５）本発明の実施方法
本発明では、MHR1遺伝子産物を細胞内に発現することによって、ミトコンドリアＤＮＡ均一性を促進する。具体的には、MHR1遺伝子を含む発現ベクターを細胞内に導入してMHR1遺伝子産物を細胞内に発現する。MHR1遺伝子は、特開平９−２５８号公報（特願平７−１５７９４２号明細書）及び、特開平９−９８７８２号公報（特願平７−２５６１６４号明細書）に記載されている遺伝子を使用することができる。好ましくは、MHR1遺伝子は酵母由来のMHR1遺伝子であり、細胞（宿主）は酵母である。
【００２４】
発現ベクターとしては、宿主細胞内でMHR1遺伝子を発現できるベクターであれば任意のベクターを使用することができる。具体的には、MHR1遺伝子を宿主細胞中で発現させるために、該遺伝子を発現ベクター中のプロモーターの下流に挿入し、次いでこの組み換え発現ベクターを、当該発現ベクターに適合した宿主細胞（好ましくは、酵母細胞）に導入する。
【００２５】
宿主の種類に適合した各種の発現ベクターが当業者に入手可能であり、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等の酵母用プロモーターを含む発現ベクターを使用することができる。組換え発現ベクターの宿主への導入方法は、例えば、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法、リポフェクション法などが挙げられ、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
本発明の方法では、ホモプラスミー細胞の増加速度を測定することにより、ミトコンドリアＤＮＡの均一化（ホモプラスミー）の促進の程度を評価することができる。ホモプラスミー細胞の増加速度の測定は、ホモプラスミー細胞の画分を、液体培地で希釈した後、好適な条件下での培養における世代時間に対してプロットすることにより行うことができる。
【００２７】
具体的には、まず異なるミトコンドリア遺伝マーカー(ChlR-OliSもしくはChlS-OliR)を有する一倍体同士の掛け合わせからヘテロプラスミーの二倍体をＹＰＤ培地で５時間培養形成させる。その後、二倍体細胞の栄養要求性を満たすグルコースを炭素源とする最小選択培地（ＳＤ）で二倍体の細胞を選択的に増殖させる。その間、経時的に一部の細胞を取り出し、ＳＤ寒天培地上で１００〜３００コロニーを形成するように希釈後、塗布する。２３℃もしくは３０℃で３〜４日間生育させ、コロニーの出現を待つ。これらのコロニーを有する寒天培地を元のプレート（マスタープレート）としてクロラムフェニコールを含むグリセロール寒天培地(YPGly+Chl)、オリゴマイシンを含む寒天培地(YPGly+Oli)、クロラムフェニコールとオリゴマイシンの両方を含むグリセロール寒天培地(YPGly+Chl+Oli)、及びグリセロール寒天培地(YPGly)にそれぞれ複製し、各プレート上のコロニーの生育に基づいて、ミトコンドリアがホモプラスミーかヘテロプラスミーか、もしくは組換え型かを判断することにより、ホモプラスミー形成速度を定量的に測ることができる。以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
（Ａ）材料および方法
（１）酵母株および培地
実施例で使用した酵母株を表１〜３に示した。培地は既報の通りである（Ling, F., et al., (1995), EMBO J. 14, 4090-4101；Nunnari, J., et al., (1997), Mol.Biol.Cell 8, 1233-1242；及び、Ling F., et al., (2002), EMBO J. 21, 4730-4740）。
【００２９】
【表１】
2005087150.tif 000002
【００３０】
【表２】
2005087150.tif 000003
【００３１】
【表３】
2005087150.tif 000004
【００３２】
（２）ミトコンドリア対立遺伝子の栄養分裂によるヘテロプラスミー細胞生成の遺伝子測定
遺伝測定を図２に示す。連鎖していない抗生物質耐性のミトコンドリアマーカーを有する一倍体細胞を接合してヘテロプラスミー細胞を形成した。すなわち、ミトコンドリアのChlR（クロラムフェニコール耐性）−OliS（オリゴマイシン感受性）遺伝子を有するα細胞およびミトコンドリアのChlS−OliR遺伝子を有するａ細胞各2.0×107細胞個／mlを YPDまたはYPGal培地にて30℃５時間混合して接合体（これはヘテロプラスミーであり、ChlR−OliSおよびChlS−OliRの両mtDNAを有する）を形成した。接合を止めるために、プロテアーゼ（Sigma、接合因子消化用）を最終濃度20μｇ／mlになるように培地に加え、培養物を30℃で６時間インキュベートした。次に、接合した細胞を、必須アミノ酸を補充した液体SD中に100倍に希釈し、30℃（標準）または34℃（mhrl-I細胞の致死温度以下の温度）にて二倍体接合子のみが成長するように放置した。SD培地をGalSR培地に交換し、MHR1を制御するGAL1プロモータのガラクトース誘導によりMhr1pを過剰生産した。一定の間隔を置いて培地試料を採取し、希釈し、ＳＤプレート上に拡げた。プレートを23℃で3日間インキュベートし二倍体細胞のみが選択的にコロニー形成するようにした。ＳＤプレート（マスタープレート）上の各コロニーを、図２の表に示す判定基準に従い、複製プレーティングにより次のように分類した。すなわち、ＳＤプレート（マスタープレート）上のコロニーをクロラムフェニコール（４mg／ml）含有YPGlyプレート、オリゴマイシン（３μｇ／ml）含有YPGlyプレート、クロラムフェニコールとオリゴマイシンの両方を含有するYPGlyプレート、および抗生物質を含まないYPGlyプレートの上にそれぞれ複製した。複製したプレート上にコロニーを23℃で形成した。マスタープレート上にコロニーが形成される間、各コロニーの細胞は全て、出発細胞のミトコンドリアの遺伝子型に関係なくホモプラスミー化した。従って、ヘテロプラスミー細胞から誘導した各コロニーにはα−親細胞mtDNAを持つ細胞とａ−親細胞mtDNAを持つ細胞の両方が含まれ、更に組換えmtDNAを持つ細胞が含まれる場合がある。ホモプラスミー細胞から誘導した各コロニーには親のmtDNAまたは単一型の組換えmtDNAを持つ細胞が純粋に含まれる。全コロニー中のクラス２から４のコロニーの合計割合をホモプラスミー細胞の割合として計算した。
【００３３】
（３）ホモおよびヘテロプラスミーmtDNAに対するPCR測定
YKN1423（ω+, Oli1R）および55R5−Cｌ（ωn, Chl321R）を交配した後、30℃で５時間増殖（約４継代）した時点で収穫された細胞が形成したコロニーをマスタープレートから無作為に選択した。各コロニーからの細胞を増殖し、全細胞DNAを調製した。ω座位を含むDNA画分を、既報の通りPCR法によって増幅した（Ling ら、1995）。
【００３４】
（４）標準一次元または二次元ゲル電気泳動およびPFGE
MHR1細胞（AFS98-ｐMK2）、ミトコンドリア（mt-）ｐMK2 DNAを有するmhr1-1細胞(AFS984a-ｐMK2)またはρ0細胞（AFS98ρ0）から単離した全DNAを、標準ゲル電気泳動によって分離し、ゲル中のmt-ｐMK2 DNA を、既報の通り32P標識ｐMK2 DNAプローブを使用するサザンハイブリダイゼーション法により分析した（Ling F., et al., (2002), EMBO J. 21, 4730-4740）。ρ+mtDNAのパルスフィールド電気泳動は既報である（Ling F., et al., (2002), EMBO J. 21, 4730-4740）。二次元電気泳動は既報の通り実施した（Lockshon, D., et al., (1995), Cell 81, 947-955）。
【００３５】
（５）新生mtDNAの標識、および標識mtDNAの検出
AFS98-ｐMK2（MHR1）細胞は、YPGly培地で23℃で対数増殖期まで、1×105から約1×107細胞個／mlまで増殖させた。G1期にα因子により細胞周期を停止する条件下で、新生mt-ｐMK2 DNAを[メチル-14C]チミジン（1.85GBｇ／mmol、Amersham）により標識用培地中27.8MBｇ／mmolで標識した。標識操作の詳細は既報である（Ling F., et al., (2002), EMBO J. 21, 4730-4740）。電気泳動後、ゲル中の14C標識新生mt-ｐMK2 DNAは、D-ループ測定で既報（Ling F., et al., (2002), EMBO J. 21, 4730-4740）した通り、Fuji BAS2000画像分析装置で分析した。
【００３６】
（６）娘細胞と母細胞の分離、および娘細胞と母細胞からのDNAの調製
これら操作の詳細は既報の通りである（Ling F., et al., (2002), EMBO J. 21, 4730-4740）。
【００３７】
（Ｂ）結果
（１）ミトコンドリア対立遺伝子の遺伝的分離およびホモプラスミーのためのmtDNAの物理的分離
ホモプラスミーに必要な遺伝子を同定するために、液体培地試料中のホモプラスミー細胞とヘテロプラスミー細胞の割合を測定する二つの方法、すなわち遺伝学的方法および物理的方法をそれぞれ独立の原理に基づいて開発した。
【００３８】
遺伝学的方法は、各ヘテロプラスミー細胞が、別々のミトコンドリア対立遺伝子のセットを持つ多様なホモプラスミー細胞からなる混合コロニーを形成するという事実に基づいている。ホモプラスミー細胞は均質なコロニーを形成し、そのコロニーは何れかの親mtDNAあるいは単一型の組換えmtDNAを持つ単一のホモプラスミー細胞からなっている。遺伝的方法の詳細は上記（Ａ）材料および方法（図２）に記載した。
【００３９】
遺伝学的方法で検出したホモプラスミーは、DNAレベルのホモプラスミーではなく、むしろ遺伝子表現の効果、例えばミトコンドリアの各遺伝子座位における対立遺伝子のサイレンシングによる可能性がある。従って、ミトコンドリア対立遺伝子の分離のための物理的方法を開発した。物理的方法は、mtDNA上のω座位におけるDNA配列の多形に基づいている。すなわちω+は約1.1kbpのωイントロンによって分断された21SリボソームRNA遺伝子であり、ω-はイントロンのない21SリボソームRNA対立遺伝子である（Dujon, 1981（上掲）参照）。またイントロンのない他の対立遺伝子で、ω−エンドヌクレアーゼ（I-SceI）耐性変異を持つもの（ωn）を採用した。これはω+/ωnヘテロプラスミー細胞中でω+に変換せず、またヘテロプラスミー細胞中で両対立遺伝子を安定に維持することが可能である（Dujon, 1981（上掲）参照）。ω座位のmtDNAをPCR（DNAポリメラーゼによる連鎖反応）によって鋳型上に増幅した。この鋳型はω+およびωn細胞を接合後、４継代増殖した細胞を起源とするコロニーから無作為に選択したものを使用して調製した。テストした32例中、遺伝子的方法でホモプラスミーであると同定された細胞に由来する全てのコロニーではω+またはωnDNAの画分のみが検出された。これに対し、ヘテロプラスミーであると遺伝子的に同定された細胞では全てにおいてω+およびωnDNAの両画分が検出された。
【００４０】
本実施例で使用する遺伝学的方法では、ChlR-OliR組換えmtDNAを持つホモプラスミー細胞由来のコロニー（クラス５）およびChlR-OliR組換えmtDNAを持つ細胞を含有するヘテロプラスミー細胞由来のコロニー（クラス１'；組換えmtDNAがコロニー形成中にヘテロプラスミー細胞に生ずる）は、識別されない。しかし、ChlR-OliR細胞を含有する純粋および混合コロニーの全体は、５継代までは１％以下であったので、ChlR-OliRmtDNAを持ったホモプラスミー細胞の割合は本実施例の目的では無視することができる。PCR測定の結果、ChlR-OliR組換えミトコンドリアを持つ細胞を含有する三つのコロニーのうち、二つはホモプラスミーであり（図１Ｂ、レーン６および７）、一つはヘテロプラスミーである（図１B、レーン37）ことが判明した。
【００４１】
以上の通り、遺伝学的方法および物理的方法は同一の結果を与えた。従って、ホモプラスミーは遺伝子表現の事象ではなく、ヘテロ対立遺伝子mtDNAの物理的な分離である可能性が高い。ホモプラスミーは、もともとミトコンドリア対立遺伝子の遺伝子分離により規定されたので、以下の実験において変異および過剰発現の効果を試験するために遺伝的方法を使用した。
【００４２】
（２）ミトコンドリア対立遺伝子の栄養分離によるホモプラスミー細胞の生成に対するMhr1p-過剰生産の効果
mhr1-１細胞は温度により欠損を誘起され、37℃での培養中では全ての細胞が栄養的に縮小する（ρ-またはρ0；Ling, F., et al., (1995), EMBO J. 14, 4090-4101）。縮小細胞は、ミトコンドリアでのタンパク質合成がないのでmtDNA遺伝子を発現しない(Dujon,1981（上掲）)。従って、縮小細胞が産生するとホモプラスミーの遺伝子的測定法は妨害される。そこで、Mhr1p-過剰生産の効果を調べた。
【００４３】
ヘテロプラスミー接合体をガラクトース含有液体培地（GalSR）中30℃で培養し、GAL1プロモーターを誘導した。このプロモーターはｐYESTrp１MHR1プラスミド上でのMHR1発現を制御する。この条件下では培養中に縮小細胞は産生しなかった。Mhr1pを過剰生産する細胞を接合後ホモプラスミー接合細胞の割合が増加する速度は、Mhr1p過剰生産プラスミドを欠く細胞を接合後に観察される速度よりも有意に速かった(約2.5倍)（図１Ｃ, パネルａ）。対照実験として、ABF2（ミトコンドリア核様体DNA結合性タンパク質、MacAlpine, D.M., et al., (1998). Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95, 6739-6743参照）またはCCE1（ミトコンドリア組換え接合解離酵素；Kleff,S., et al., (1992) EMBO J. 11, 699-704）を単独で過剰発現させた。これらの場合、ホモプラスミーが達成される速度に変化は検出できなかった（図１Ｃ,パネルｂ）ことから、Mhr1p過剰生産を介してホモプラスミーへの栄養分離が促進されるのは、DNAに作用するタンパク質の過剰生産の単なる一般的特性ではないことが明らかになった。
【００４４】
（３）Mhr1-1の変異によるミトコンドリア対立遺伝子の栄養分離の遅延
ミトコンドリア対立遺伝子の栄養分離が増大しても、それはMhr1pの生体内役割の反映ではなくMhr1p過剰生産によってのみ誘導される事象かもしれない。もしMhr1p依存性栄養分離がホモプラスミー細胞生成の主要な経路であるならば、欠損変異Mhr1-1が栄養分離遅延の原因となるはずである。そこで、変異Mhr1-1が栄養分離に及ぼす効果を単一コピーのMHR1対立遺伝子を持つ細胞で検討した。機能的なMhr1pを欠いている状態（例えば、mhr1-1を37℃で培養）では、培地の全細胞が栄養的縮小体となる（Ling, F., et al., (1995), EMBO J. 14, 4090-4101）。縮小体産生による妨害を回避するために、34℃ではたとえmhr1-1／mhr1-1 二倍体培地においても呼吸欠損細胞は存在しないことを確認した後、実験温度としてこの温度を選択した。MHR1の mhr1-1に対する優性（Ling, F., et al., (1995), EMBO J. 14, 4090-4101）から予想されたように、MHR1×MHR1交差から誘導した二倍体および MHR1×mhr1-1交差から誘導した二倍体の間には差異は検出されなかった。MHR1／mhr1-1二倍体培地に比べると、mhr1-1／ mhr1-1二倍体培地ではホモプラスミー細胞の出現の初速度（約２分の１）も最終頻度も明瞭に減少した（図１Ｃ, パネルｃ）。mhr1-1変異によってミトコンドリアの多形が変化を受けることはないことから、この遅延は変異によりミトコンドリアが構造的に変化した結果ではない。
【００４５】
対照実験により、親の片方のみから誘導したホモプラスミーなミトコンドリアを含有する二倍体細胞の選択的増殖、またはより急速な増殖によってホモプラスミーが達成され、かつMhr1p活性によってその選択性が変化するという可能性は排除された。すなわちSD培地での培養初期ではホモプラスミー細胞は細胞母集団の20％であり、4.5継代の間に培地中細胞の72％が34℃でホモプラスミーとなった（図１Ｃ, パネルａに示した培養）。もしホモプラスミー細胞の方がヘテロプラスミー細胞より増殖が少なくとも２倍速いと仮定すれば、上記結果は説明できる。また、もしそうであれば細胞数の対数を培養時間に対してプロットするとラグまたはシグモイド曲線が明白になるはずである。しかし、MHR1／mhr1-1またはmhr1-1／ mhr1-1細胞の増殖速度にはそのようなラグまたは変化は検出されなかった。細胞は少なくとも６継代間指数的に増殖した。
【００４６】
以上の遺伝的研究から、MHR1の過剰発現により栄養分離は促進され、またmhr1-1変異によりこの過程は遅延することが実証された。上記結果は、Mhr1pが、ヘテロプラスミー細胞のミトコンドリア対立遺伝子が栄養分離してホモプラスミー細胞を生成する際に、積極的かつ重要な役割を演じていることを示している。
【００４７】
（４）鎖状mtDNAの形成は、mhr1-1により抑制され、野生型Mhr1pの過剰生産により促進される
Mhr1p依存性の主要経路またはCcelp依存性のマイナー経路により形成されるコンカテマーは、mtDNAを娘細胞に分配するための必須中間体であることが示唆されている（LingおよびShibata,2002）。選択した数個の鋳型mtDNAから誘導した複数のコピーのクローンからなるコンカテマーが伝達されれば、ホモプラスミーな孫細胞の継代が刺激されるはずである。そこでmhr1-1およびMhr1pの過剰生産がコンカテマーの形成に及ぼす効果を検討した。サッカロミセスセレビシエのmtDNAは約80kbpであり、分析にはパルスフィールド電気泳動（PFGE）が必要である。コンカテマー以外にも、環状mtDNAは（たとえ単量体でも）PFGEにおいてゲルの中に入らない（Bedich, 1996）ので、変異体がコンカテマーの形成に及ぼす効果が不明瞭となる恐れがある。実際、野生型mtDNA（ρ+mtDNA）の34℃でのサイズ分布をMHR1細胞とmhr1-1細胞の間で比較した結果、ゲル中に入らない単量体mtDNAのmtDNAに対する相対量がmhr1-1により増加しているのに、mhr1-1の効果は以前の示唆（LingおよびShibata,2002）から期待されるものより小さかった。そこで、全細胞mtDNAのサイズ分布に及ぼすmhr1-1の効果を、通常のゲル電気泳動および単位サイズの小さなmtDNA（mt-pMK2DNA,9.5kbp、栄養縮小（ρ-）表現型；Thorsness, P.E., et al., (1990). Nature 346, 376-379）を含有する細胞を使用して検討した。（ハイパーサプレッシングでない）ρ-細胞ヘテロ対立遺伝子の交差においてさえ、活性Mhr1pが存在する場合は、34℃培地の約90％の細胞が約６継代の増殖後にいずれかの親のρ-mtDNAを持つホモプラスミーとなったが、活性Mhr1pが存在しない場合は、40％を越える細胞が同じ継代数の間にヘテロプラスミー状態のままであり、Mhr1pはρ-細胞においてもホモプラスミーの達成に機能することを示していることを確認した。
【００４８】
全細胞DNAを単離し、一次元および二次元電気泳動により分析した。ゲル上で核染色体DNAと重なり合うのを減らすために、ｐMK2DNAに開列部位を有さない制限エンドヌクレアーゼClaIで全細胞DNAを処理した（図３Aのレーン２および３をレーン４および５と比較）。ρ0（mtDNAなし）細胞から単離した全DNAを検討した際にシグナルが検出されなかったので、［32P］ｐMK2DNAプローブでサザンハイブリダイゼーションして検出したシグナルはｐMK2DNA由来のみである。(図３Aおよび３B, レーン８および９；定量、図３E)。
【００４９】
MHR1細胞由来のmt-pMK2DNAの大部分は、一次元（図３B,レーン２）および二次元（図３D）の電気泳動プロフィールで示されるように、いろいろな連続的な長さで直線状に泳動し、見かけ上の中央値は35kbと70kb（４量体ないし７量体、図３B,レーン２）の間にあり、mt-pMK2DNAを一つの部位で切断する制限エンドヌクレアーゼSalIを使用して MHR1細胞由来のmt-pMK2DNAを開裂すると、ｐMK2DNAの単位サイズのDNAが主産物として生産される（図３Ｂ,レーン４）。この結果、コンカテマーはmt-pMK2DNAの主要な部分であるという以前の結果が再確認された。SalIによりmt-pMK2DNAを開裂した後に単位サイズよりも大きい画分として、ｐMK2DNAが検出された（図３B,レーン４）。これは、mtDNAには一本鎖領域および組換え接合部位があり、その結果このDNAには制限エンドヌクレアーゼによる開裂に対し抵抗性がある（Han, Z., et al., (1994), Chromosoma 103, 162-170；及びMacAlpine, D.M., et al., (1998). Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95, 6739-6743）ということを反映している可能性がある。
【００５０】
コンカテマーのサイズ分布は連続的であり、特異なサイズのバンドやドットの特徴は存在しないことが二次元（図３Ｄ）ゲルプロフィールより示唆される。サイズ分布が連続的なこのようなコンカテマーは、ローリングサークル型複製の予想産物であって、クロスオーバー型複製の産物ではない。後者の経路では多数の単位サイズを持ったコンカテマーが生産されることになる。
【００５１】
致死温度以下の34℃で増殖したmhr1-1細胞からDNAを単離した際、コンカテマーmt-pMK2DNAの量はその単量体（ニックを導入した環状）形に比較して有意に減少した（図３B、レーン３対レーン２）。mhr1-1細胞中の全mt-pMK2DNAの量は減少したように思われ（図３A対３B;  図３Eおよび３F）、以前のρ+mtDNAについての報告（Ling, F., et al., (1995), EMBO J. 14, 4090-4101）と同じであった。一次元（図３E）および二次元（図３F）のゲルプロフィールについてシグナル定量したところ、単量体に対するコンカテマーの比はMHR1細胞において27.2+/-1.8から7.8+/-0.5へと3．5倍減少した（一次元ゲルを使用した２回の実験および二次元ゲルを使用した２回の実験）。これらの結果から、コンカテマーの形成はmhr1-1変異によって大きく抑制されることが示された。
【００５２】
mhr1-1細胞中でのMhr1p過剰生産の効果を検討した。MHR1遺伝子産物を過剰生産するプラスミド（ｐYESTrp１MHR1）またはORFを持たないプラスミド（ｐYESTrp１）を有するAFS984a-ｐMK2（mhr1-1）細胞をSD培地中34℃で増殖した。次に、その細胞をガラクトースを含む培地に移してGAL1プロモーターを誘導した。ガラクトース含有培地で増殖した細胞から全細胞DNAを単離し、一次元電気泳動により分析した。ウエルには同一量の全細胞DNAを添加した（図４Aのレーン２から８）。GAL1プロモーターを誘導しなくても、MHR1過剰生産プラスミドを導入するとコンカテマーの形成が再び始まった（図４B、レーン４対レーン２）。ガラクトースによってMhr1pの産生を誘導（図４D）した時に、誘導後の時間とともに単量体mt-pMK2DNAの中にコンカテマーmt-pMK2DNAの量が僅かながら上昇した（図４B； 定量、図４C）。同様な結果が、ρ+mtDNAについて、正常MHR1細胞とMhr1p過剰生産細胞との比較において得られた（図５）。
【００５３】
これらの分析から、Mhr1pの活性は単量体mtDNA（mt-pMK2DNAおよびρ+DNA）に対するコンカテマーmtDNAの相対量に正の相関をすることが明らかになった。従って、Mhr1pはコンカテマーmtDNAの形成に主要な役割を演じており、ミトコンドリア対立遺伝子の分離の速度はコンカテマーmtDNAの相対量に正の相関している。
【００５４】
（５）コンカテマーはmtDNA複写の直接の生産体であり、娘細胞において単量体として回収される
コンカテマーは複製の直接の生産体であるのか、および/またはmtDNAが娘細胞に分配されるための中間体であるのかを調べることにした。図６Aに示されるように、新生mt-pMK2DNAを、α因子でG1期に停止した細胞内で、［14C］チミジンで特異的に標識した（従って、核染色体DNAは標識しなかった；図６C、レーン７対レーン９［ρ0］参照）。標識化剤を除去後、停止を解いて細胞を同調的に増殖させた。もし単量体がコンカテマーを形成する複製の直接の生産体であるならば、14Cは優先的に単量体に取り込まれるはずである。もしコンカテマーが複製の直接生産体であるならば、14Cは優先的にコンカテマーに取り込まれるはずである。コンカテマーの量は一般に単量体の量よりも高く、それらの相対的な量は試料の間で変化するので、実験結果は14Cの密度、すなわちmt-pMK2DNAの単位量あたりの14C量をもって評価した。DNA量は［32P］ｐMK2DNAプローブでサザンハイブリダイゼーションすることにより測定した。14C密度は優先的に標識したmt-pMK2DNAにおいて高い。予め標識したmt-pMK2DNAを持っている分裂細胞では、その娘細胞におけるmt-pMK2DNAの14C密度は、母細胞における分配のための中間体（または直接の前駆体）に等しい。従って、標識mt-pMK2DNAの14C密度を測定することにより、目的を達成することができる。
【００５５】
G1期停止解除直前および増殖1．5時間後に採取した全細胞由来のDNA、および増殖1．5時間後に採取した分裂細胞の分離母細胞および娘細胞由来のDNAを単離した。次に、DNA試料を二組に分け、一方は単量体mt-pMK2DNAの分析用、他方は全mt-pMK2DNA（すなわち、単量体とコンカテマー）の分析用とした。全mt-pMK2DNAの分析には、DNA試料を、mt-pMK2DNAを一箇所で切断する制限エンドヌクレアーゼSalIで処理した。次に、14Cをmt-pMK2DNAに取り込み（図６C）、その量（［32P］ｐMK2DNAプローブでサザンハイブリダイゼーションすることにより測定； 図６D）をゲル電気泳動により分析した。単量体および全mt-pMK2DNAの14C密度は、SalI処理をしない場合とした場合につき、それぞれ単量体pMK2DNAのバンドの14Cカウントを同一バンドの32Pカウントで割ることにより計算した。最後に、G1停止細胞または分裂細胞由来のmt-pMK2DNA試料の14C密度を、分裂細胞由来の全mt-pMK2DNAの14C密度に対して計算した。二つの独立した実験から得られた14C密度の相対値の平均値を図６Eに示す通りプロットした。
【００５６】
G1期で停止した細胞では、単量体の標識程度は全DNAより低いので、［14C］チミジンの大部分はコンカテマーに優先的に取り込まれる。従って、これらの結果から、mtDNA複製の直接生産体が単量体である可能性は排除され、コンカテマーがmtDNA複写の直接生産体であることが示された。
【００５７】
1．5時間の増殖および分裂の後の単量体の14C密度は、母細胞中の全mt-pMK2DNAの14C密度と比較すると低いままであったが、母細胞での状況とは異なり、娘細胞中の単量体mt-pMK2DNAの14C密度は母細胞中の単量体の14C密度よりもかなり高かく、かつ母細胞または全細胞の全mt-pMK2DNAの14C密度に類似している。
【００５８】
この結果は、母細胞中に形成されたコンカテマーmtDNAは娘細胞に分配するにあたり単量体になるというモデルにより簡単に説明できる。しかし、その前に、標識化剤を除去して細胞増殖を開始した後に、細胞内DNA前駆体プール由来の染色体に［14C］チミジンの取り込みが残存したという観察結果を考察する必要がある。すなわち、mt-pMK2DNAプローブにハイブリダイズしていない(図6D）、14C標識した染色体DNAがmtDNA欠損（ρ0）分裂細胞（ただしG1期のρ0細胞中ではない；図６Cのレーン８とレーン９を比較）に検出された。［14C］チミジンの除去後１時間かつG1停止から開放する前に、α因子および過剰の非標識チミジンの存在下に細胞をインキュベートする段階を行っても、この残存取り込みは回避できなかった。染色体DNAへの14Cの取り込みにより［14C］mt-pMK2DNAからのシグナルの計算は影響を受けたが、mtDNAのない対照試料（ρ0細胞由来DNA）では、単量体mt-pMK2DNAのバンドに対応する位置の染色体から誘導されたシグナル（図６C；各試料の単量体mtDNAの対照に関するレーン８、および各試料のSalIで開裂した全mtDNAの対照に関するレーン14）は非常に小さかった（レーン14のシグナルは、レーン12のSalIで開裂したmt-pMK2DNA由来の単量体から誘導された14Cカウントの3％よりも小さかった）。従って、染色体DNAから誘導される存在可能なシグナルは、単量体mt-pMK2DNAおよび全mt-pMK2DNAへの14Cの取り込みを計算するにあたり無視することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、栄養分離してホモプラスミー細胞を生成するMhr1pの活性機能を示す。  図１のAは、栄養分離およびホモプラスミーの概念を示す。ヘテロプラスミー細胞は一般に変異によって生成し、酵母および菌では、細胞が異なる組のミトコンドリア対立遺伝子と接合することにより作成される。大部分が減数分裂によって1:1で分離する(メンデルの分離)核対立遺伝子と異なり、細胞のmtDNAのコピー（102-105コピー）に生じた変異体および親対立遺伝子が栄養増殖のN（10−20）継代の間に分離し、最終的には各子孫においてmtDNAコピーの全てが変異体遺伝子型または親遺伝子型となる。丸印は各単位サイズmtDNAコピーを表し、棒印は各染色体を表す。長さの同じ一対の棒印は一対の相同的染色体を示す。青シンボルおよび赤シンボルはそれぞれ親対立遺伝子を持つDNAおよび変異対立遺伝子を持つDNAを表す。N継代後には２N個の子細胞が得られる。  図１のＢは、mtDNAホモプラスミーのPCR測定を示す。YKN1423（α、ω+、Oli1R）細胞および55R5-C1（ａ、ωn、Chl321R）細胞の交配から誘導した二倍体細胞の32個のコロニーを、マスタープレートから無作為に選択した。各コロニーから細胞を増殖し、全細胞のDNAを調製した。ω座位を含むDNA画分をPCRによって増幅し、電気泳動で分析した。最上段にmtDNA上のω+（ωイントロンを含む）およびω-（ωイントロンなし）座位での物理的マップの模式図を示す。ωnはω-座でのcis変異であり、ωエンドヌクレアーゼによる開裂を防止する。図面での水平矢印の対はPCRに使用するプライマーを示す。遺伝子的方法およびPCRベースのDNA方法により測定するホモプラスミーまたはヘテロプラスミー細胞は、〇（ホモプラスミー）、He（ヘテロプラスミー）および？（不明確）として示す。レーン4−19およびレーン24−39は酵母DNA試料。対照、レーン2および22はYKN1423（ω+、Oli1R）；レーン3および23は55R5-C1（ωn、Chl321R）。レーン1および21はλDNAHindIIIダイジェスト；レーン20および40は100bpDNAラダー。矢印はω+およびωnの位置を示す。  図１のＣは、タンパク質中のMhr1pの過剰発現および変異体mhr1-1が栄養分離に及ぼす効果を示す。ホモプラスミー細胞の計算で求めた割合を30℃または34℃における接合体の生成時間に対してプロットした。黒色、影付き、横線、斜線、および白抜きの記号はそれぞれ独立の実験からのデータを示す。各パネルには少なくとも二つの独立した実験が含まれる。  パネルａおよびｂはGalSR培地30℃で指定のタンパク質を過剰発現する細胞。丸印は親株の二倍体（YKN1423／ｐYESMHR1×W303ａ-187）；四角印はMhr1pを過剰生産する二倍体（YKN1423／ｐYESMHR1×W303ａGalMHR1）；逆三角印はCcelpを過剰生産する二倍体（W303ａGalCCE1×W303ａGalCCE1）；菱形印はAbf2pを過剰生産する二倍体（W303ａGalABF2×W303ａGalABF2）。過剰発現プラスミドを持たない細胞は30℃で生成時間約1.2時間で増殖し、ラグはなかった。  パネルｃはSD培地34℃で増殖した細胞。丸印はMHR1／mhr1-1二倍体（YKN1423×FL67-2c）；四角印はmhr1-1／mhr1-1二倍体（FL67-1423×FL67-2c）。細胞はMHR1／mhr1-1細胞およびmhr1-1／mhr1-1細胞に対し共に生成時間1.2時間で増殖し明白なラグはなかった。
【図２】図２は、ホモプラスミーの遺伝的測定を示す。α細胞（mt[ChlR−OliS]）およびａ細胞（mt[ChlS−OliR]）を接合してヘテロプラスミー細胞を得た。二倍体接合体のみを30℃または34℃で増殖させた。培地試料を採取し、希釈し、SDプレートに拡げてコロニーを形成させた。マスタープレートのコロニーを、クロラムフェニコールおよび／またはオリゴマイシンが存在または不存在の四つのYPGlyプレート上に複製した。マスタープレートのコロニーを図中の表に示す指標に従って分類し、全コロニー中のクラス2から4の総コロニーの割合を計算し、ホモプラスミー細胞の割合とした。この測定ではクラス5のコロニーは、クラス1'のコロニーと区別できないが、その割合は非常に小さかったので無視した。YPGly＋Xは抗生物質X（ChlおよびOliはそれぞれクロラムフェニコールおよびオリゴマイシンを示す）を補充したYPGlyプレートを示す。＋は細胞がコロニーを形成することを示し、−は細胞がコロニーを形成しないことを示す。
【図３】図３は、ｍhr1-1が34℃でコンカテマー形成を防止することを示す。図３のＡおよびＢは、mt-pMK2DNAの一次元ゲル電気泳動分析を示す。mt-pMK2DNAを持つMHR1（レーン2および4）およびmhr1-1（レーン3および5）細胞（AFS98-ｐMK2［MHR1］およびAFS984a-ｐMK2［mhr1-1］）およびρ0細胞（mtDNAなし細胞：AFS98ρ0；レーン8および9）をYPD中34℃で1.0×105細胞／mlから5.0×107細胞／mlまで増殖させた。全DNAを単離し、制限エンドヌクレアーゼClaI（ｐMK2DNAには開裂部位なし）または制限エンドヌクレアーゼSalI（ｐMK2DNAに１個の開裂部位あり；レーン4、5および9）で処理した。次に、処理したDNAを一次元電気泳動により分析した。CCは閉環状単量体、LNは直鎖状単量体、NCおよびｍ（領域）はニックのある環状単量体、ｅ（領域）はコンカテマーを示す。レーン6および7は、単離し、制限エンドヌクレアーゼClaIおよびSalIでそれぞれ処理したｐMK2DNAを示す。レーン1はサイズマーカーとしての5kbラダーを示す。図Ａは、臭化エチジウムで染色したゲルを示し、図Ｂは、［32P］ｐMK2DNAプローブを使用したサザンハイブリダイゼーションで得られたmt-pMK2DNA由来のシグナルを示す。  図３のＣおよびＤは、mt-pMK2DNAの二次元ゲル電気泳動分析を示す。全細胞DNAを単離し、ＡおよびＢで記載の通り制限エンドヌクレアーゼClaI（ｐMK2DNAには開裂部位なし）で処理して核染色体ＤＮＡを消化した。第一の二次元電気泳動でサイズによって分離し、次の第二の二次元電気泳動で形態により分離した後、［32P］ｐMK2DNAプローブを使用するサザンハイブリダイゼーションでmt-pMK2DNAを検出した。図Ｃは、略図において、１は直鎖状単量体；ｍ（区域）はニックのある環状単量体；２は環状多量体；ｃ（区域）は直鎖状コンカテマー；１Ｄは１回目の二次元展開；２Ｄは２回目の二次元展開を示す。図Ｄは34℃で増殖したMHR1細胞から単離したmt-pMK2DNAの二次元ゲルプロフィールを示す。  図３のＥおよびＦは、一次元ゲルおよびＤ二次元ゲルにおけるシグナルの定量を示す。サザンハイブリダイゼーション実験に基づいて、ＢまたはＣ（ｍ、環状単量体；ｃ、コンカテマー）に示す領域からの32Pカウントをプロットした。Ｅでは、各種サイズの直鎖状分子からのカウントは領域ｍの環状単量体からのカウントと重なっている（ＣおよびＤにおける１Ｄ参照）ので、領域ｍの前面および背面の同一面積に出現するカウントの平均を領域ｍの全カウントから差引いて、環状単量体からのカウントを算出した。この補正をしないと、Ｃの領域ｍに出現するカウントは、Ｄの単量体ｍｔＤＮＡのカウントに比べて過大算定となるので、上記補正は必要である。実験を二回（各1Dおよび2Dからの１回の実験結果はBおよびCに示した）行い、結果に再現性あることを確認した。各DNAのカウント数は実験間で変動したが、単量体に対するコンカテマーの相対カウントには再現性があった。
【図４】図４は、Mhr1pの過剰生産によりmhr1-1細胞中に34℃でコンカテマー形成が促進されることを示す。  図４のＡおよびＢは、mt-pMK2DNAの一次元ゲル電気泳動を示す。MHR1遺伝子を含む過剰発現プラスミド（ｐYESTrp1MHR1）又はORFのないプラスミド（ｐYESTrp1）を含むAFS984a-ｐMK2（mhr1-1）細胞を、トリプトファン以外の全ての必須アミノ酸を補充したSD培地中で34℃で1.0×105細胞／mlから5.0×107細胞／mlまで増殖させた（レーン2〜8）。細胞を２％ガラクトース含有ラフィノース培地に移し、GAL1プロモーターを誘導し、34℃でインキュベートする間、図示した各時点で単位試料を採取した。全細胞DNAを単離し、制限エンドヌクレアーゼ処理をせずに一次元電気泳動により分析した。Ａは臭化エチジウムで染色したゲルを示す。Ｂは［32P］ｐMK2DNAプローブを使用したサザンハイブリダイゼーションで得られたmt-pMK2DNA由来のシグナルを示す。CCは閉環状単量体、NCおよびｍ（領域）はニックのある環状単量体、ｅ（領域）はコンカテマーを示す。レーン1はサイズマーカーとしての5kbラダーを示す。レーン9は単離したｐMK2DNAを示す。  図４のＣは、Ｂのシグナルの定量を示す。サザンハイブリダイゼーション実験に基づいて、図ＢまたはＣ（ｍ、環状単量体；ｃ、コンカテマー）に示す領域からのｐMK2DNA プローブの32Pカウントをプロットした。黒四角及び白四角はコンカテマーmtDNA；黒菱形及び白菱形は単量体mtDNAを示す。黒塗りはMHR1発現プラスミドを含有するmhr1-1細胞；白抜きはMHR1のないベクターを含有するmhr1-1細胞を示す。単量体のネットカウントを図３Ｅで説明した通り補正した。実験を２回行い、結果に再現性あることを確認した。１回の実験結果を示した。  図４のＤは、酵母タンパク質キット（Zymo Reseach）を使用して採取細胞（約2×105）からタンパク質を抽出し、免疫ブロッティングを行った結果を示す。抽出物中のMhr1pおよびmhr1-1pを抗Mhr1p抗血清で検出した。ミトコンドリアタンパク質の量をミトコンドリア外膜タンパク質、ポーリンの量に対して示してあり、ポーリンはその抗血清で検出した。
【図５】図５は、Mhr1pを過剰産生するMHR1細胞中のρ+mtDNAのPFGEプロフィールを示す。ベクターpYES2のみを持つMHR1細胞（W303a/pYES2）およびGALプロモーター（pYESMHR1）の制御下に挿入したMHR1を含むプラスミドDNAを持つMHR1細胞（W303a/pYESMHR1）をガラクトース含有培地（YPGal）中で30℃で培養し、半対数期にした（1.0×105から約5.0×106細胞／ml）。次に、PFGEのための全細胞DNAの調製およびPFGEをLingおよびShibata（2002）に記載の通り実施した。  図５のＡは、32P標識し精製したρ+mtDNAをプローブとして使用してｍｔＤＮＡ由来シグナルを検出した結果を示す。  図５のＢは、臭化エチジウム染色後にUV光線でDNAを検出した結果を示す。λラダーDNA（コンカテマー）およびHindIIIで消化したλDNAをサイズマーカーとして使用した。正常MHR1細胞に比べMhr1p過剰生産性細胞では、ウエルに結合したDNAに対してゲノムサイズmtDNA（約80kbp）の相対強度は弱かった。
【図６】図６は、G1期でのmtDNA標識のパターンおよび標識mtDNAの細胞分裂（出芽）中の運命を示す。  図６のＡは、実験の概要を示す。α因子でG1期に停止したAFS98-pMK2細胞中の新生mt-pMK2DNAを［14C］チミジンにより30℃で8時間特異的に標識した。次に、放射活性チミジンを除去し、過剰の非標識チミジン（0.5mg／ml）を加え、インキュベーションを1時間行った。α因子を除去してG1停止を開放した後に、細胞をYPD培地中30℃で1.5時間同調的に増殖させた。細胞を集め母細胞と娘細胞を分離した。  図６のＢは、臭化エチジウム染色によるゲルプロフィールを示す。全細胞、母細胞および娘細胞からDNAを別々に調製し（レーン4〜9）、分取した各DNA試料を、mt-pMK2DNAを1箇所で開裂する制限エンドヌクレアーゼSalIで処理した（レーン10〜15；全DNA／SalI）。DNA試料を0.5％アガロースゲルの中で電気泳動し、ゲルを臭化エチジウムで染色した。レーン1はサイズマーカーとしての5kbラダー、レーン2はE.coli由来でSalIで消化した14C標識pMK2DNA、レーン3はE.coli由来で14C標識pMK2DNAを示す。  図６のＣは、14C標識DNAのプロフィールを示す。電気泳動後、ゲルを乾燥し、ゲルの14Cを検出し定量した。  図６のＤは、［32P］ｐMK2DNAプローブで検出したmtDNAのプロフィールを示す。mt-pMK2DNA量を算出するために、ゲルを［32P］ｐMK2DNAプローブを使用したサザンハイブリダイゼーションに供し、32Pの量を定量した。  図６のＥは、mtDNA中の相対14C密度を示す。ＣおよびＤに示したレーン4から7のゲルにおける単量体mt-pMK2DNAの正味の14Cシグナルおよび32Pシグナルを図３Ｅに記載した補正を加えて計算した。総mt-pMK2DNA（単量体とコンカテマー）の正味の14Cシグナルおよび32Pシグナルは、レーン10から15のエンドヌクレアーゼSalI処理mt-pMK2DNAの単量体由来の総14Cカウントおよび総32Pカウント（14CはCにおよび32PはDに）からρ0細胞のDNA（レーン14および15）の対応するゲル領域由来の総14Cカウントおよび総32Pカウントをバックグラウンドとして差引いたものである。正味の14Cカウントを正味の32Pカウントで割ることにより各DNAの14C密度を計算した。全増殖細胞（1.5時間増殖；黒棒印）における全mtDNAに対する各DNA種の14C密度相対値をプロットした。灰色棒印は全mt-pMK2DNA；白抜き棒印は単量体mt-pMK2DNA。各棒印は二つの独立した実験の平均を示す。
【図７】図７は、ヘテロプラスミー細胞からホモプラスミー細胞が生成するメカニズムに対する仮説を示す。  （i）各ヘテロ接合座位での極性ジーンコンバーション。コンバーションの結果、3以上の座位で対立遺伝子を調べてみると組換えmtDNAとなる；（ii）特定のミトコンドリア遺伝子型を持つ細胞の選択的増殖；（iii）特定の遺伝子型を持つmtDNAへの細胞内選択、すなわち特定の遺伝子型を持ったmtDNAは優先的に複製する、例えばハイパーサプレッシブρ-mtDNA；（iv）mtDNAコピーのごく少数個（約3）のコピーが娘細胞に移動；（v）数個の選択したmtDNA鋳型の特定複製；（vi）mtDNAの数個のクローンの選択的移動；（vii）本発明が支持するモデル、すなわち共通鋳型上に複製されたmtDNAの数個のクローンが、ローリングサークル複製により形成されたコンカテマーとして娘細胞中に選択的に移動して単量体になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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