(57)【要約】      （修正有）【課題】水溶性の糖骨格を有する化合物の存在が予想される、界面活性剤含有試料中の該化合物についての信頼性の高い定性定量分析法を提供すること。【解決手段】（１）前記試料を、重水と強酸又は重強酸の混合液と混合する工程、（２）工程（１）で得られた混合物中の水溶性の糖骨格を有する化合物を加水分解する工程、及び（３）工程（２）を経た混合物をＨ−ＮＭＲ法により測定する工程、を有する、定性分析法、並びに水溶性の糖骨格を有する化合物の存在が予想される、界面活性剤含有試料中の該化合物についての定量分析法であって、（１）前記試料を、重水と強酸又は重強酸の混合液と混合する工程、（２）工程（１）で得られた混合物中の水溶性の糖骨格を有する化合物を加水分解する工程、（３）工程（２）の前若しくは後に内部標準物質を添加する工程、及び（４）内部標準物質を含む、工程（２）を経た混合物をＨ−ＮＭＲ法により測定する工程を有する。【選択図】図１
2005337958.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性の糖骨格を有する化合物の存在が予想される、界面活性剤含有試料中の該化合物についての定性分析法であって、
（１）前記試料を、重水と強酸又は重強酸の混合液と混合する工程、
（２）工程（１）で得られた混合物中の水溶性の糖骨格を有する化合物を加水分解する工程、及び
（３）工程（２）を経た混合物をＨ−ＮＭＲ法により測定する工程、を有する、定性分析法。
【請求項２】
水溶性の糖骨格を有する化合物がカルボキシメチルセルロースである請求項１記載の定性分析法。
【請求項３】
水溶性の糖骨格を有する化合物の存在が予想される、界面活性剤含有試料中の該化合物についての定量分析法であって、
（１）前記試料を、重水と強酸又は重強酸の混合液と混合する工程、
（２）工程（１）で得られた混合物中の水溶性の糖骨格を有する化合物を加水分解する工程、
（３）工程（２）の前若しくは後に内部標準物質を添加する工程、及び
（４）内部標準物質を含む、工程（２）を経た混合物をＨ−ＮＭＲ法により測定する工程、
を有する、定量分析法。
【請求項４】
水溶性の糖骨格を有する化合物がカルボキシメチルセルロースである請求項３記載の定量分析法。
【請求項５】
重水と強酸又は重強酸の混合液中の重水と強酸又は重強酸との混合比（重水／強酸又は重強酸）が容量比で１／１〜１０／１である請求項３又は４記載の定量分析法。
【請求項６】
内部標準物質がピリジンである請求項３〜５いずれか記載の定量分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性の糖骨格を有する化合物の存在が予想される、界面活性剤含有試料中の該化合物についての定性・定量分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
水溶性の糖骨格を有する化合物の１つであるカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の分析法については、そのカルボキシメチル置換度（Degree of Substitution；以下、ＤＳという）解析法として、滴定法（非特許文献１）やＮＭＲ法（非特許文献２）などによる方法が知られている。しかし、界面活性剤を含む洗剤などの混合試料では、ＣＭＣを単離しなければＤＳを解析することは困難である。一方、混合試料中でのＣＭＣ定量法として、比色法（非特許文献３と４）や透析残分などの方法が知られているが、比色法はＤＳの違いにより定量値が変わり、透析残分では、マトリックスの影響や透析膜への吸着などの問題がある。
【特許文献１】ASTM D 1439
【特許文献２】Floyd F.-L. Ho' and Daniel W. Klosiewicz, Anal. Chem. 1980, 52, p.913-916
【特許文献３】高野、津田ら、油化学 26, p.287 (1977)
【特許文献４】M. H. Khundker, A. H. Brattacrarjee, Chemist-Analyst, 53, 109 (1964)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、水溶性の糖骨格を有する化合物の存在が予想される、界面活性剤含有試料中の該化合物についての信頼性の高い定性分析法、及び該化合物についての精度の高い定量分析法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕  水溶性の糖骨格を有する化合物の存在が予想される、界面活性剤含有試料中の該化合物についての定性分析法であって、
（１）前記試料を、重水と強酸又は重強酸の混合液と混合する工程、
（２）工程（１）で得られた混合物中の水溶性の糖骨格を有する化合物を加水分解する工程、及び
（３）工程（２）を経た混合物をＨ−ＮＭＲ法により測定する工程、を有する、定性分析法、並びに
〔２〕  水溶性の糖骨格を有する化合物の存在が予想される、界面活性剤含有試料中の該化合物についての定量分析法であって、
（１）前記試料を、重水と強酸又は重強酸の混合液と混合する工程、
（２）工程（１）で得られた混合物中の水溶性の糖骨格を有する化合物を加水分解する工程、
（３）工程（２）の前若しくは後に内部標準物質を添加する工程、及び
（４）内部標準物質を含む、工程（２）を経た混合物をＨ−ＮＭＲ法により測定する工程、
を有する、定量分析法、
に関する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、容易かつ迅速に、水溶性の糖骨格を有する化合物の存在が予想される、界面活性剤含有試料中の該化合物に関し、高い信頼性で定性分析することができ、また、高い精度で定量分析することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の定性・定量分析法においてはいずれも、水溶性の糖骨格を有する化合物（以下、分析化合物という場合がある）の存在が予想される、界面活性剤含有試料（以下、分析試料という場合がある）を、Ｈ−ＮＭＲ法による測定工程の前に、重水と強酸又は重強酸の混合液と混合し加水分解反応に供する。その理由は、該試料中の界面活性剤等を水不溶性の凝集物とする一方、該化合物の糖骨格（糖鎖）に存在するエーテル結合を切断して、その構成単位である単糖成分を水易溶化し、好ましくは分析試料中の分析化合物以外の成分が凝集除去された水相に分析化合物由来の単糖成分を集めることにある。そのような加水分解の工程を経た混合物、好ましくは該混合物の水相をＨ−ＮＭＲ法により測定することで、分析化合物の加水分解後の単糖成分のシグナルのみが実質的に得られることになり、分析試料中の分析化合物に関し、高い信頼性で定性分析することができ、また、高い精度で定量分析することができる。以下、本発明の定性・定量分析法について、それぞれ分けて説明する。
【０００７】
（Ｉ）水溶性の糖骨格を有する化合物の定性分析法
分析対象である水溶性の糖骨格を有する化合物とは、任意の単糖が脱水縮合によりエーテル結合で連結されてなる骨格構造を有し、かつ個々の単糖単位における遊離の水酸基の全てが水不溶性置換基により置換されているわけではない化合物をいう。当該化合物としては、特に限定されるものではないが、本発明の定性分析法は特にＣＭＣの分析に好適に用いられる。かかるＣＭＣの分析結果は非常に高い信頼性を有する。
【０００８】
分析試料としては、特に限定されるものではなく、例えば、洗剤、合成洗剤、シャンプー、ハミガキ剤、ハンドクリームや衣類、食品等が挙げられる。界面活性剤以外のアニオン性の化合物等が分析試料に含まれる場合、水相に当該化合物等が混入することがあるが、Ｈ−ＮＭＲ法による測定において、当該化合物等のシグナルと、分析化合物の加水分解後の単糖成分に由来するシグナルとを明確に分けて測定する観点から、例えば、分析試料を水に対し透析して前記アニオン性の化合物等を予め除去しておくのが好ましい。また、分析試料が水を含む場合は、本発明の定性分析に供する前に予め乾燥させておくのが好ましい。分析試料中の分析化合物の含有量（乾燥物重量換算）は特に限定されるものではないが、通常、分析化合物が０．０１〜１００重量％程度含まれると予想される分析試料が好適に用いられる。
【０００９】
分析試料中の界面活性剤としては、特に限定されるものではなく、公知のいずれの性質を有する界面活性剤であってもよい。
【００１０】
工程（１）においては、分析試料を、重水と強酸又は重強酸の混合液と混合し、分析試料と該混合液との混合物を得る。分析試料が乾燥物である場合には、最初少量の重水を加えて膨潤させた後、重水と強酸又は重強酸の混合液と混合してもよい。
【００１１】
強酸又は重強酸は、Ｈ−ＮＭＲ法で従来使用されているものを使用すればよい。強酸又は重強酸としては、好ましくはその解離度が０．８以上のものである。検出感度を向上させる観点から、重強酸が好ましい。重強酸としては、例えば、重硫酸、重塩酸等が挙げられる。
【００１２】
該混合液中の重水と強酸又は重強酸との混合比としては、特に限定されるものではないが、Ｈ−ＮＭＲ法による測定において、重水と強酸又は重強酸とのシグナルと、分析化合物の加水分解後の単糖成分に由来するシグナルとを明確に分けて測定する観点から、該混合液中の重水と強酸又は重強酸との混合比（重水／強酸又は重強酸）としては容量比で好ましくは１／１〜１０／１、より好ましくは３／１〜３／２である。
【００１３】
また、分析化合物を充分に加水分解し、分析化合物以外の成分を充分に凝集せしめる観点から、分析試料と混合する重水と強酸又は重強酸の混合液の量としては、強酸又は重強酸の量で、分析試料（乾燥物重量換算）１００重量部に対し、好ましくは１０〜５００重量部、より好ましくは１００〜２００重量部である。
【００１４】
工程（２）においては、工程（１）で得られた混合物中の水溶性の糖骨格を有する化合物を加水分解する。
【００１５】
加水分解は、静置状態で行っても振盪状態で行ってもよい。加水分解の条件は、好ましくは６０〜１００℃で１〜５時間程度反応させるのがよい。かかる間に、分析化合物は加水分解され、一方、分析化合物以外の成分は凝集することになる。該成分の凝集は塩析効果によるものと推定される。
【００１６】
工程（２）の後には、加水分解を経た混合物をそのまま工程（３）であるＨ−ＮＭＲ法による測定に供すればよい。ここで、工程（２）を経ることにより、工程（１）で得られた混合物が水相と凝集物とに明確に分かれる場合、水相をＨ−ＮＭＲ法による測定に供すればよいが、水相に当該測定を阻害する物質が混入する可能性が低くなるので好ましい。かかる分離を促進するために、加水分解終了後に、混合物を遠心分離操作に供してもよい。そうすることにより、実質的に分析化合物の加水分解後の単糖成分のみが含まれることとなる水相が得られる。
【００１７】
工程（３）では、工程（２）を経た混合物、好ましくは該混合物の水相を所望により冷却した後、Ｈ−ＮＭＲ法により測定する。冷却の程度としては、通常、１〜５０℃程度とすればよい。
【００１８】
Ｈ−ＮＭＲ法は、例えば、基準物質としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）等を用いて公知の方法に従って実施すればよい。
【００１９】
得られるＨ−ＮＭＲスペクトルの一例として、分析化合物がＣＭＣである場合のものを、ＣＭＣを構成する単糖構造における水素原子の位置との関係と共に図１に示す。かかる図から分かるように、通常、本発明における分析化合物では、その構成単糖成分における１位の水素原子はα構造では約５．０〜５．４ｐｐｍ、β構造では約４．４〜４．７ｐｐｍのケミカルシフト範囲に帰属され、２〜６位の水素原子は、約３．０〜４．０ｐｐｍのケミカルシフト範囲に帰属される。構成単糖成分における２、３、６位の水酸基がカルボキシメチル基に置換された場合、カルボキシメチル基のα位の水素原子Ａは２位では約４．２〜４．３５ｐｐｍ、３位では約４．３５〜４．４ｐｐｍ、６位では約４．０〜４．２ｐｐｍのケミカルシフト範囲に帰属される。
【００２０】
よって、工程（３）により得られるＨ−ＮＭＲスペクトルにより、分析化合物の単糖成分の構造、及び該単糖成分における置換基の情報が得られる。該スペクトルには、分析試料中の分析化合物以外の成分に由来するシグナルは実質的に含まれていないと言えるため、本発明によれば、少なくとも分析化合物の加水分解後の単糖成分に存在する水素原子が前記の通りのケミカルシフト範囲に帰属され得る分析試料中の分析化合物について、充分に高い信頼性で定性分析することができる。
【００２１】
（ＩＩ）水溶性の糖骨格を有する化合物の定量分析法
分析化合物及び分析試料等については前記（Ｉ）定性分析法の場合と同様である。なお、定量分析を行う場合、分析試料を透析により前処理すると、透析膜に分析化合物が一部吸着するおそれがあるため、透析処理によりどの程度の損失が生ずるか予め検討しておくのが好ましい。
【００２２】
本発明の定量分析法における工程（１）及び（２）は前記（Ｉ）定性分析法の場合と同様にして行えばよい。なお、前記（Ｉ）定性分析法の場合、工程（２）における加水分解終了後、所望により混合物を遠心分離操作に供してもよいが、本発明の定量分析法においては、以下に説明する工程（３）で内部標準物質を工程（２）の前に工程（１）で得られた混合物に添加していない場合には、操作の迅速の観点から、むしろ当該操作に供しないのがよい。
【００２３】
本発明の定量分析法では、工程（２）における加水分解の前若しくは後に、工程（３）において、所望により冷却した、分析試料と、重水と強酸又は重強酸の混合液との混合物に対し内部標準物質を添加する。
【００２４】
本発明においては内部標準物質として、ｉ）酸性条件で分解・反応・重合しない、ii）Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、そのシグナルが、分析化合物の加水分解後の単糖成分に由来するシグナルと重ならない、iii ）酸性条件で水溶性である、という３つの条件を満たし得る物質を用いる。そのような物質であれば、特に限定されるものではないが、例えば、ピリジン、トリメチルシリルプロピオン酸ナトリウム−ｄ４、テトラメチルシラン、酢酸等が挙げられ、中でもピリジンが好ましい。なお、Ｈ−ＮＭＲ法による測定において、重水と強酸又は重強酸とのシグナルと、内部標準物質のシグナルとを明確に分けて測定する観点からも、重水と強酸又は重強酸の混合液中における両者の混合比は前記範囲であるのが好ましい。
【００２５】
内部標準物質は、直接、分析試料と、重水と強酸又は重強酸との混合物に添加してもよいし、該物質を予め重水に溶解しておいてから該混合物に添加してもよい。内部標準物質の添加量としては、分析試料（乾燥物重量換算）１００重量部に対し、好ましくは０．０１〜１０重量部、より好ましくは０．１〜１重量部である。
【００２６】
工程（２）を経た混合物では分析化合物以外の成分は凝集しており、例えば、静置しておくのみで充分に水相と凝集物とは分離するが、操作の迅速の観点からは、内部標準物質を添加した後、該混合液を遠心分離操作に供するのが好ましい。
【００２７】
工程（４）において、前記（Ｉ）定性分析法と同様にして工程（２）を経た混合物、好ましくは該混合物の水相をＨ−ＮＭＲ法により測定することで、図１と同様なＨ−ＮＭＲスペクトルが得られる。
【００２８】
本発明の定量分析法においては、分析試料中における分析化合物の含有量、及び分析化合物を構成する単糖成分の遊離の水酸基の置換度（例えば、ＣＭＣの場合、ＤＳ）を求めることができる。Ｈ−ＮＭＲスペクトルには、分析試料中の分析化合物以外の成分に由来するシグナルは実質的に含まれていないと言えるため、本発明によれば、少なくとも分析化合物の加水分解後の単糖成分に存在する水素原子が前記の通りのケミカルシフト範囲に帰属され得る分析試料中の分析化合物について、充分に高い精度で定量分析することができる。
【００２９】
分析試料中における分析化合物の含有量、及び分析化合物を構成する単糖成分の遊離の水酸基の置換度のＨ−ＮＭＲスペクトルからの算出法につき、分析化合物がＣＭＣ、内部標準物質がピリジンである場合を例に、図１を参照して説明する。なお、以下の各式における丸で囲んだ数字は図１におけるものに対応する。
【００３０】
すなわち、分析試料中のＣＭＣの含有量は、以下の式：
【００３１】
【数１】
2005337958.tif 000003
【００３２】
により求められる。〔数１〕の式中、各シグナルの積分値は積分曲線より得られる。ＭＷ１はＣＭＣの構成単糖の分子量であり、以下の式：
【００３３】
【数２】
2005337958.tif 000004
【００３４】
により求められる。分析試料量は乾燥物換算の値である。一方、ＤＳは、以下の式：
【００３５】
【数３】
2005337958.tif 000005
【００３６】
により求められる。なお、Ａとはカルボキシメチル基中のメチレン基の水素原子を表わす。
【００３７】
工程（４）で得られたＨ−ＮＭＲスペクトルからの情報に基づき、以上の式に準じて計算を行うことにより、分析試料中における分析化合物の含有量、及び分析化合物を構成する単糖成分の遊離の水酸基の置換度を容易に求めることができる。
【実施例】
【００３８】
実施例１
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム  ３０重量％、パラトルエンスルホン酸Ｎａ  １重量％、硫酸ナトリウム  ６０重量％、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）アルキルエーテル  ５重量％、水  ４重量％からなる混合物に対し分析化合物としてＣＭＣ（ＤＳ：０．７）を添加し、ＣＭＣ添加後の混合物（乾燥物重量換算）の全量中、ＣＭＣの含有量が２．４重量％となるようにしたものをモデル分析試料として用いた。
【００３９】
モデル分析試料を８５℃で２時間維持して乾燥させた後、乾燥物（５ｇ）に重水を４ｍＬ加えて膨潤させ、次いで重水と重硫酸の混合液〔混合比（容量比）：１／１〕１０ｍＬと混合した（分析試料１００重量部に対し重水と重硫酸の混合液３９０重量部）。得られた混合物をときどき振盪しながら９０℃で２時間維持し、加水分解反応を行った。該混合物は水相と凝集物に分離した。次いで、室温まで冷却後、内部標準物質としてピリジンを、その０．６重量％重水水溶液として２ｍＬ添加した（分析試料１００重量部に対しピリジン０．２４重量部）。ピリジン添加後の混合物を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）に供し、水相を得た。次いで該水相についてＨ−ＮＭＲ測定を行った。Ｈ−ＮＭＲ測定の条件は以下の通りであった。
【００４０】
装置：ＩＮＯＶＡ−５００（ＶＡＲＩＡＮ社製）
パルス幅：９０°
データポイント：６５５３６
Relax. delay：３０秒以上
温度：２５℃
積算回数：１００回程度
観測幅：１００００Ｈｚ
【００４１】
得られたＨ−ＮＭＲスペクトルにより、ＣＭＣの単糖成分の構造、及び該単糖成分における置換基の存在が確認された。また、該スペクトルに基づき、前記〔数１〕〜〔数３〕の式によりモデル分析試料中のＣＭＣの含有量を求めたところ２．４重量％となり、一方、ＤＳは０．７となった。よって、本発明の定量分析法によれば、高い精度で分析化合物の定量分析が行えることが分かる。
【００４２】
実施例２〜７
ＣＭＣの配合されていない衣料用粉末洗剤（前記モデル分析試料とＣＭＣ以外同じ組成のもの）にＣＭＣを分析化合物として配合し、モデル分析試料１〜６を作製した。モデル分析試料１〜６中のＣＭＣの配合量を表１に示す。当該モデル分析試料１〜６につき、実施例１と同様にしてＣＭＣについて定量分析を行い、分析精度について検討した。モデル分析試料１〜６中のＣＭＣのＨ−ＮＭＲ測定による定量結果と、配合量に対する定量値の比〔回収率（％）〕を併せて示す。
【００４３】
【表１】
2005337958.tif 000006
【００４４】
表１に示すように、回収率は１００±５％であり、本発明の定量分析の精度は非常に高いことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明は、水溶性の糖骨格を有する化合物の存在が予想される、界面活性剤含有試料中の該化合物についての信頼性の高い定性分析法、及び該化合物についての精度の高い定量分析法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】分析化合物がＣＭＣである場合のＨ−ＮＭＲスペクトルの一例を示す。
【図１】
2005337958.tif 000007