(57)【要約】【課題】外生殖器等の形態変化を観察する必要が無く、より鋭敏で、胎児の大きさの違いに影響されることも無く、さらに種間で共通して用いることができる哺乳動物における生殖器異常の検出方法等を提供すること。【解決手段】哺乳動物における生殖器異常の検出方法であって、（１）哺乳動物の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織内における細胞間マトリックスの存在量を測定する工程、及び、（２）測定された値と対照との比較による差異に基づき生殖器異常の有無又はその程度を判定する工程を有することを特徴とする方法、及び、哺乳動物における生殖器異常を検出するためのマーカーとしての哺乳動物の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織内における細胞間マトリックスの使用等。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における生殖器異常の検出方法であって、
（１）哺乳動物の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織内における細胞間マトリックスの存在量を測定する工程、及び、
（２）測定された値と対照との比較による差異に基づき生殖器異常の有無又はその程度を判定する工程
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
細胞間マトリックスが、プロテオグリカン又はコラーゲンであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞間マトリックスが、コラーゲンであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
細胞間マトリックスの存在量が、哺乳動物の結合組織を構成する主要タンパク質を構成する主要アミノ酸残基の存在量であることを特徴とする請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物の結合組織を構成する主要タンパク質が、コラーゲンであることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物の結合組織を構成する主要タンパク質を構成する主要アミノ酸残基が、ヒドロキシプロリンであることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物における生殖器異常を検出するためのマーカーとしての、哺乳動物の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織内における細胞間マトリックスの使用。
【請求項８】
哺乳動物の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織内における細胞間マトリックスの存在量を、細胞間マトリックス産生経路に作用する薬剤の投与に基づき人工的に制御する工程を有することを特徴とする哺乳動物における生殖器の発生制御方法。
【請求項９】
化学物質が有する、哺乳動物における生殖器異常を与える毒性の評価方法であって、
（１）化学物質が直接又は間接に投与された外生殖器形成期にある、妊娠雌の哺乳動物が有する胎児又は出産直後の新生児に存在する外生殖器組織内における細胞間マトリックスの存在量を測定する工程、及び、
（２）測定された値と対照との比較による差異に基づき生殖器異常の有無又はその程度を判定する工程、及び
（３）判定された生殖器異常の有無又はその程度に基づき前記化学物質が有する、前記哺乳動物における生殖器異常を与える毒性を評価する工程
を有することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物における生殖器異常の検出方法及びその利用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学物質がヒトや野生生物等の哺乳動物に及ぼす影響を調べる方法としては、例えば、当該化学物質を投与された種々の実験哺乳動物において発現した毒性兆候を解析し、得られた結果からヒトや野生生物等の哺乳動物に及ぼす影響の程度を推定する方法が知られている。そして、これらの方法のうち、生殖性や胎児・新生児の発生等に対する毒性は、総じて生殖・発生毒性と称されている。
医薬品、農業化学品及び他の化学物質においては、その製造・販売に際し、生殖・発生毒性に関する試験を実施し、ヒトや野生生物等の哺乳動物への影響を評価することが求められている。その中で、当該化学物質を哺乳動物にその妊娠期において投与し、当該哺乳動物の胎児に及ぼす形態的な変化の有無及びその程度等を調べる試験を催奇形性試験といい、一般的には、化学物質をラット、マウス、ウサギ、サル等の実験哺乳動物の妊娠雌動物に一定期間投与し、当該実験哺乳動物の胎児の外形、内臓及び骨格等を詳細に観察することにより、当該化学物質が有する胎児に対する毒性の評価を行っている。
哺乳動物の胎児の発生過程における毒性発現に係わる事象は、初期胚の子宮への移動、着床、胎盤形成、胎児期の器官形成、胎児期の組織分化及び成長等と極めて多岐の時期に渡り関係する。それらの時期の中で、中枢神経系、心大血管をはじめ、主要器官の原基が形成される時期を器官形成期といい、短い期間に、器官、組織等を特徴付ける構造タンパク質や酵素等を合成する化学的分化が活発に起こり、細胞の増生、遊走、再構成、組織相互作用の形態形成が、厳密な時間的スケジュールと空間的制御とのもとで進行する。このため、当該器官形成期は、化学物質が哺乳動物の胎児に与える形態異常を惹起する作用（即ち、催奇形性作用）に対する感受性が最も高く、器官レベルの発生異常の大半はこの時期の侵襲によって成立する。
生殖器官、特に男性の外性器（ペニス）形成に関しては、遺伝的な原因に基づいてアンドロゲンに対する応答性の低下やアンドロゲンの産生能の障害により、アンドロゲンが当該器官形成期に正常に作用しなかった場合には、尿道下裂や停留精巣といった外生殖器官の異常が誘発されることが知られている。そしてラット、霊長類を代表とする哺乳動物において、妊娠期間中にアンドロゲンの作用を阻害する化学物質を投与した場合には、上記のような外生殖器官の異常や、雄胎児の肛門−尿道口間距離の短縮等が誘発されることも確認されている（例えば、非特許文献１及び２等参照）。
【０００３】
【非特許文献１】Clark, L. R., Endopoints of reproductive system development, In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment (Daston, G. and Kimmel, C. eds), International Life Sciences Institute, New York, 1999
【非特許文献２】Prahalada. S, et al., Effects of finasteride, a type 2 5-alpha reductase inhibitor, on fetal development in the rhesus monkey (Macaca mulatta), Teratology, 55, 119-131, 1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、このような哺乳動物における生殖器異常を検出するには、多量の妊娠雌の哺乳動物（例えば、妊娠マウス等）を用いて化学物質を投与し、当該化学物質の催奇形性作用を判定するという、著しく時間及び経費がかかる方法等を用いることが一般的であった。また、例えば、雄胎児の肛門−尿道口間距離を測定する方法を用いることもあるが、当該方法では、大きさの異なる胎児の間では結果の解釈が困難な場合があり、哺乳動物種によっては肛門−尿道口間距離の雌雄の差が小さく、当該距離を有意に測定することが困難な場合もあった。さらに、例えば、発育異常（特に顕著な外生殖器官異常）がどのように引き起こされるのか等を検討するためには、さらなる時間及び経費等が必要であった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、かかる状況下において鋭意検討した結果、外生殖器に係る器官形成期において、哺乳動物の雄胎児の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織内における細胞間マトリックスの存在量及びそれに相関関係を有する指標値が特異的に増加することを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．哺乳動物における生殖器異常の検出方法であって、
（１）哺乳動物の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織内における細胞間マトリックスの存在量を測定する工程、及び、
（２）測定された値と対照との比較による差異に基づき生殖器異常の有無又はその程度を判定する工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明検出方法と記すこともある。）；
２．細胞間マトリックスが、プロテオグリカン又はコラーゲンであることを特徴とする前項１記載の方法；
３．細胞間マトリックスが、コラーゲンであることを特徴とする前項１記載の方法；
４．細胞間マトリックスの存在量が、哺乳動物の結合組織を構成する主要タンパク質を構成する主要アミノ酸残基の存在量であることを特徴とする前項１、２又は３記載の方法；
５．哺乳動物の結合組織を構成する主要タンパク質が、コラーゲンであることを特徴とする前項４記載の方法；
６．哺乳動物の結合組織を構成する主要タンパク質を構成する主要アミノ酸残基が、ヒドロキシプロリンであることを特徴とする前項４記載の方法；
７．哺乳動物における生殖器異常を検出するためのマーカーとしての、哺乳動物の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織内における細胞間マトリックスの使用；
８．哺乳動物の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織内における細胞間マトリックスの存在量を、細胞間マトリックス産生経路に作用する薬剤の投与に基づき人工的に制御する工程を有することを特徴とする哺乳動物における生殖器の発生制御方法；
９．化学物質が有する、哺乳動物における生殖器異常を与える毒性の評価方法であって、
（１）化学物質が直接又は間接に投与された外生殖器形成期にある、妊娠雌の哺乳動物が有する胎児又は出産直後の新生児に存在する外生殖器組織内における細胞間マトリックスの存在量を測定する工程、及び、
（２）測定された値と対照との比較による差異に基づき生殖器異常の有無又はその程度を判定する工程、及び
（３）判定された生殖器異常の有無又はその程度に基づき前記化学物質が有する、前記哺乳動物における生殖器異常を与える毒性を評価する工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明毒性評価方法と記すこともある。）、
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、外生殖器等の形態変化を観察する必要が無く、より鋭敏で、胎児の大きさの違いに影響されることも無く、さらに種間で共通して用いることができる哺乳動物における生殖器異常の検出方法等が提供可能となり、しかも前記生殖器異常の形成過程を効率的にモニターすることも可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明検出方法は、哺乳動物における生殖器異常の検出方法であって、（１）哺乳動物の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織内における細胞間マトリックスの存在量を測定する工程、及び、（２）測定された値と対照との比較による差異に基づき生殖器異常の有無又はその程度を判定する工程を有することを特徴とする方法であり、当該方法は、哺乳動物の雌雄の胎児から摘出された外生殖器組織内におけるヒドロキシプロリンの含量が、外生殖器の雌雄差が肉眼的に現れる直前から出生直前までの期間において、経時的に雌雄の外生殖器の重量に差が生じてくるのと相関して、哺乳動物の雄の胎児から摘出された外生殖器組織内におけるヒドロキシプロリンの含量（即ち、産生量）が増加するという新規な知見に基づいて見出されたものである。
本発明は、上記の知見や当該知見に基づいた本発明検出方法等を利用する種々の発明（例えば、マーカーとしての細胞間マトリックスの使用、哺乳動物における生殖器の発生制御方法、化学物質が有する、哺乳動物における生殖器異常を与える毒性の評価方法等）を包含している。
【０００８】
本発明において対象となる哺乳動物としては、例えば、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ハムスター、フェレット、ミニブタ、イヌ、サル等を好ましいものとして挙げることができる。より好ましいものとしては、例えば、ラット、マウス等を挙げることができる。尚、これら動物、例えばラットやマウス等は日本チャールスリバー（株）、ウサギ等は北山ラベス（株）等から商業的に入手することができる。
【０００９】
哺乳動物の外生殖器形成期に存在する「外生殖器組織」とは、外生殖器形成期にある哺乳動物が有する生殖結節から肛門周囲までの組織・器官を意味する。好ましいものとしては、例えば、肛門−尿道口間に存在する間葉細胞群等を挙げることができる。当該外生殖器組織は、組織培養等により哺乳動物の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織が有する性質を維持しながら継代培養されているような組織であってもよいが、好ましくは妊娠雌の哺乳動物の胎児から摘出された直後の組織、新生児から摘出された直後の組織や、凍結保存管理されていた組織等を挙げることができる。
上記の外生殖器組織を調製するには、例えば、妊娠雌の哺乳動物から通常の方法に従って、哺乳動物の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織を摘出すればよい。
尚、本発明でいう「外生殖器形成期」とは、外生殖器がホルモンの作用により雌雄の方向付けが行われる時期（一般的には、臨界期とも呼ばれることもある。）であって、動物種により若干の差異を有する。具体的には例えば、げっ歯類の場合には分娩直前の胎児期から出産直後の新生児期（特にラットの場合には、妊娠１７日の胎児期から生後３日の新生児期）、ウサギの場合には妊娠末期の胎児期、ヒト等の霊長類の場合には妊娠中期の胎児期等を挙げることができる。
【００１０】
哺乳動物の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織内における「細胞間マトリックス」とは、例えば、「細胞間基質」、「細胞間物質」等と呼ばれることもあるものであって、外生殖器形成期にある哺乳動物が有する外生殖器組織内に存在するものである。具体的には、コンドロイチン硫酸やヒアルロン酸等のムコ多糖類を主成分とするプロテオグリカン（所謂、基質）やコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等の繊維性構造を有する結合組織を構成する主要タンパク質（所謂、繊維）等を挙げることができる。本発明検定方法における好ましい「細胞間マトリックス」としては、例えば、コラーゲンを挙げることができる。
コラーゲンには、分子内にコラーゲン三重螺旋構造を持つという化学的特徴がある。コラーゲン螺旋を構成する部位の特徴としては、例えば、
（１）グリシンがアミノ酸配列上３個目毎に存在する。（従って、螺旋構成アミノ酸残基の１／３がグリシンである。）；
（２）イミノ酸（プロリン）含量が高く、恒温動物では全体の２／９に及び、そのうちの約半分はヒドロキシル化されたヒドロキシプロリンになっている。（グリシン及びイミノ酸、特にヒドロキシプロリンはコラーゲン特有の三重螺旋構造の形成及び安定化に必要である。）；
等を挙げることができる。即ち、グリシンやヒドロキシプロリンは、哺乳動物の結合組織を構成する主要タンパク質を構成する主要アミノ酸残基ということである。本発明検定方法における好ましい「哺乳動物の結合組織を構成する主要タンパク質を構成する主要アミノ酸残基」としては、例えば、ヒドロキシプロリンを挙げることができる。
【００１１】
本発明でいう「細胞間マトリックスの存在量」とは、細胞間マトリックスの存在量に正の相関関係又は負の相関関係を有する指標値を含めた広義の意味であって、直接的に測定される細胞間マトリックスの存在量であってもよく、また上記のような相関関係に基づき測定される間接的な指標値であってもよい。
【００１２】
哺乳動物の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織内における細胞間マトリックスの存在量を測定するには、当該細胞間マトリックスに応じた通常の方法を用いて測定すればよい。
【００１３】
例えば、当該細胞間マトリックスがコラーゲンの場合、又は、当該細胞間マトリックスに相関関係を有する指標が哺乳動物の結合組織を構成する主要タンパク質であるコラーゲンや哺乳動物の結合組織を構成する主要タンパク質を構成する主要アミノ酸残基であるヒドロキシプロリンの場合には、例えば、Smith, R. E., et al., Production and function of murine macrophage inflammatory protein-1 alpha in bleomycin-induced lung injury, J. Immunol., 153, 4704-4712 (1994)等に記載されるような通常の方法に従ってヒドロキシプロリンの含量を測定すればよい。具体的には、まず採取された組織を凍結乾燥した後、これを酸加水分解する。得られた酸加水分解物を試料として、当該試料中のヒドロキシプロリンをクロラミンＴ溶液及びエールリッヒ試薬を用いて分光光度計で定量すればよい。
【００１４】
次に、このようにして測定された値と対照との比較による差異に基づき生殖器異常の有無又はその程度を判定する。
ここで対照とは、上記の測定された値の技術的意味を理解するに際して基準となり得るような値であって、実測値であってもよく、文献記載の値であってもよい。さらにまた、陽性対照であっても陰性対照であってもよい。陽性対照の代表的な例としては、すでに作用が存在することが知られている公知の化学物質（即ち、生殖器異常の有と判定される化学物質）の測定値等を挙げることができる。一方、陰性対照としては、前記陽性対照の説明に記載される化学物質を無存在とした場合やすでに作用が存在しないことが知られている公知の化学物質（即ち、生殖器異常の無と判定される化学物質）の測定値等を挙げることができる。
これらの対照と前記の測定値とを比較して、当該対照が陰性対照である場合において差異が存在する場合には生殖器異常が有る（本発明では、生殖器異常が発生する確率が高いと判定する場合も含む。）と判定し、一方、当該差異が存在しない場合には生殖器異常が無い（本発明では、生殖器異常が発生しない確率が高いと判定する場合も含む。）と判定する。さらに生殖異常が有ると判定される場合には、その差異の大きさに基づきその程度を判定することもできる。また、当該対照が陽性対照である場合において差異が存在しない場合には生殖器異常が有と判定することもできる。
【００１５】
上述の投与量を代えた試験等を行うことにより、化学物質の有毒に関する基準濃度を境界として低濃度では無毒又は毒性が低い、高濃度では有毒と判定された場合には、当該化学物質の毒性の強さを知ることができ、化学物質を選別することが可能となる。
【００１６】
このように、哺乳動物の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織内における細胞間マトリックスは、哺乳動物における生殖器異常を検出するためのマーカーとして利用することができる。
さらに当該マーカーの利用を応用することにより、例えば、哺乳動物における生殖器の発生制御のために、哺乳動物の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織内における細胞間マトリックスの存在量を、細胞間マトリックス産生経路に作用する薬剤の投与に基づき人工的に制御する工程を有する方法も提供することが可能となる。
【００１７】
次に、本発明毒性評価方法について説明する。
本発明毒性評価方法は、化学物質が有する、哺乳動物における生殖器異常を与える毒性の評価方法であって、
（１）化学物質が直接又は間接に投与された外生殖器形成期にある、妊娠雌の哺乳動物が有する胎児又は出産直後の新生児に存在する外生殖器組織内における細胞間マトリックスの存在量を測定する工程、及び、
（２）測定された値と対照との比較による差異に基づき生殖器異常の有無又はその程度を判定する工程、及び
（３）判定された生殖器異常の有無又はその程度に基づき前記化学物質が有する、前記哺乳動物における生殖器異常を与える毒性を評価する工程
を有することを特徴とする方法である。
【００１８】
本発明毒性評価方法において用いられる化学物質としては、いかなる化学物質であってもよいが、例えば、催奇形性物質等を挙げることができる。また一般的に環境ホルモンと呼ばれるような内分泌撹乱物質、特にアンドロゲンの作用を攪乱するような化学物質等がより適する対象化合物としてあげられる。具体的には例えば、アンドロゲンの生合成阻害作用を有する化学物質（例えば、フタル酸エステル類、ケトコナゾール等の殺菌剤等）、アンドロゲンのレセプターへの結合阻害作用を有する化学物質（例えば、酢酸シプロテロン、フルタミド等）、アンドロゲンの活性代謝物の産生阻害作用を有する化学物質（例えば、フィナステリド等）等を挙げることができる。
上記の化学物質は、通常の方法に従って合成してもよいし、商業的に入手してもよい。
このような化学物質を外生殖器形成期にある、妊娠雌の哺乳動物が有する胎児又は出産直後の新生児に対する、直接又は間接的な投与に際しては、当該化学物質を生理食塩液等の溶液にて適当な濃度に希釈し、これを投与（好ましくは経口投与）すればよい。投与量は、例えば、１週間に１ｍｇ〜１ｇ／ｋｇ体重、好ましくは、１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重等とすればよい。具体的には、フルタミドの場合には１週間に１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重等とすればよい。ここで「間接的な投与」とは、母動物に投与された化学物質が胎盤を透過して胎児に達する投与方法（所謂、経胎盤暴露）等を意味し、また「直接的な投与」とは、母動物の子宮内の胎児又は出産直後の新生児への直接投与方法（所謂、直接暴露）等を意味する。尚、非げっ歯類の場合には間接的な投与方法を採用すればよく、一方、げっ歯類の場合には直接又は間接的な投与方法のいずれの投与方法を採用してもよいが、操作性及び試験精度等の点から、間接的な投与方法が好ましい。
当該化学物質の投与におけるスケジュールは、妊娠雌の哺乳動物が有する胎児又は出産直後の新生児における外生殖器形成期に影響を与えるような時期での投与であればよく、哺乳動物の種類、投与形態等によって適宜調整すればよい。勿論、前記胎児又は新生児に直接投与しても良い。具体的には例えば、ラットの場合には、腟栓の確認日を妊娠０日とした場合、妊娠１７〜２０日の間を好ましく挙げることができる。
【００１９】
このような投与スケジュール条件下で化学物質を投与しながら、外生殖器形成期に存在する外生殖器組織を提供する哺乳動物を調製すればよい。
哺乳動物の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織を調製するには、例えば、通常の方法に従って哺乳動物の胎児の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織又は新生児の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織を摘出すればよい。
【００２０】
本発明毒性評価方法における「外生殖器組織内における細胞間マトリックスの存在量を測定する」には、前述の本発明検定方法における測定方法と同様な方法を用いればよい。
本発明毒性評価方法における「測定された値と対照との比較による差異に基づき生殖器異常の有無又はその程度を判定する」には、前述の本発明検定方法における判定方法と同様な方法を用いればよい。
このようにして判定された生殖器異常の有無又はその程度に基づき前記化学物質が有する、前記哺乳動物における生殖器異常を与える毒性を評価する。
具体的には例えば、化学物質の妊娠雌の哺乳動物への投与或いは化学物質の胎児又は新生児への直接投与により、雄胎児又は雄新生児由来の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織内においてヒドロキシプロリンの存在量が対照（化学物質の妊娠雌の哺乳動物への非投与系での雄胎児又は雄新生児由来の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織内におけるヒドロキシプロリンの存在量）との比較において減少すれば、正常な雄型の外生殖器の発生に影響が及ぼされている、即ち、生殖器異常が有りと判定され、その結果として当該化学物質は前記哺乳動物における生殖器異常を与える毒性を有すると評価することができる。一方、化学物質の妊娠雌の哺乳動物への投与或いは化学物質の胎児又は新生児への直接投与により、雌胎児又は雌新生児由来の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織内においてヒドロキシプロリンの存在量が対照（化学物質の妊娠雌の哺乳動物への非投与系での雌胎児又は雌新生児由来の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織内におけるヒドロキシプロリンの存在量）との比較において増加すれば、本来存在しないはずのアンドロゲン作用が正常な雌型の外生殖器の発生に影響が及ぼされている、即ち、生殖器異常が有りと判定され、その結果として当該化学物質は前記哺乳動物における生殖器異常を与える毒性を有すると評価することができる。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明をより詳細に説明するため、実施例を挙げて説明するが本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００２２】
実施例１  （試験材料の調製）
１）哺乳動物の外生殖器形成期に存在する外生殖器組織の摘出
雌ラット（Crj:CD(SD)系）を同系の雄ラットと交配させることにより、妊娠雌ラット（腟栓確認日＝妊娠0日）を得た。この妊娠雌ラットはそのまま飼育を継続した。妊娠雌ラットから、妊娠17、18、19及び20日の午前10時に胎児を摘出した。
同様に、雌ウサギ（Kbl:NZW種）を同系の雄ウサギから得た精液を用いて人工授精させることにより、妊娠雌ウサギ（人工授精日＝妊娠0日）を得た。この妊娠雌ウサギはそのまま飼育を継続した。妊娠21、23、25及び28日の午前10時に胎児を摘出した。
摘出された胎児について、当該胎児の内生殖器（精巣又は卵巣）の存在確認により雌雄判別を行った後、外生殖器組織部位を切り出し、これを10％中性緩衝ホルマリン液で固定した。
【００２３】
２）細胞間マトリックスの存在の確認
次に、固定された外生殖器組織部位を材料とし、通常の方法に従い、当該部位をパラフィンに包埋し、薄切切片（矢状断）を作成した。作成された薄切切片を市販のスライドグラスに付着させた後、細胞間マトリックスからなる繊維を選択的に染め出す目的で、医歯薬出版株式会社編、染色法のすべて、医歯薬出版（1990）記載の方法に準じて、マッソントリクローム染色を実施した。即ち、薄切切片を脱パラフィンした後、これを媒染剤（武藤化学薬品）で処理した。処理済み薄切切片を流水で洗浄した後、さらにカラッチ・ヘマトキシリンで染色した。染色された薄切切片を再度流水で洗浄した後、0.75％オレンジＧ液（武藤化学薬品）で染色し、さらに1%酢酸水溶液で処理した。次いで、処理済み薄切切片をマッソン染色液Ｂ（武藤化学薬品）で染色し、１％酢酸水溶液で処理した。さらに、処理済み薄切切片をアニリン青液（武藤化学薬品）で染色し、１％酢酸水溶液で処理した。全ての染色工程が終了した後、得られた薄切切片を１００％エタノールで脱水し、カバーガラスで封入することにより観察標本を調製した。
【００２４】
各観察標本について、外生殖器、特に肛門−尿道口間に存在する間葉細胞群における細胞間マトリックスからなる繊維を示す青色の染色部位に着目しながら観察を実施した。
マッソントリクローム染色の結果、妊娠雌ラットから摘出された胎児の外生殖器組織の場合には、妊娠17日では雄胎児と雌胎児との間で細胞間マトリックスからなる繊維を示す青色の染色部位の差は殆ど認められなかった。妊娠18日では当該雌胎児の外生殖器組織に比較して当該雄胎児の外生殖器組織における青色の染色部位の増加が認められた。妊娠19日以降では当該雌胎児の外生殖器組織に比較して当該雄胎児の外生殖器組織における青色の染色部位の増加は顕著となった（図１参照）。
一方、妊娠雌ウサギから摘出された胎児の外生殖器組織の場合には、妊娠21及び23日では雄胎児と雌胎児との間で細胞間マトリックスからなる繊維を示す青色の染色部位の差は殆ど認められなかった。妊娠25日では当該雌胎児の外生殖器組織に比較して当該雄胎児の外生殖器組織における青色の染色部位の増加が認められた。妊娠28日では当該雌胎児の外生殖器組織に比較して当該雄胎児の外生殖器組織における青色の染色部位の増加は顕著となった（図２参照）。
【００２５】
実施例２  （試験材料の調製）
１）化学物質が（直接又は）間接に投与された外生殖器形成期にある、妊娠雌の哺乳動物が有する胎児（又は出産直後の新生児）に存在する外生殖器組織の摘出
雌ラット（Crj:CD(SD)系）を同系の雄ラットと交配させることにより、妊娠雌ラット（腟栓確認日＝妊娠0日）を得た。この妊娠雌ラットのうち一部ものは、化学物質非投与対照群としてそのまま飼育を継続した。化学物質投与群及び化学物質非投与群の両系の妊娠雌ラットから、妊娠17、18及び20日の午前10時に胎児を摘出した（各妊娠日において摘出された胎児はn=3であった。）。残りの妊娠雌ラットは、陽性対照群として妊娠17日の午前中に抗アンドロゲン剤であるフルタミドを、妊娠６日の体重を基準にして、100mg/kg・bwの投与量で単回強制経口投与しながら飼育を継続した。陽性対照群の妊娠雌ラットから、妊娠18及び20日の午前10時に胎児を摘出した（各妊娠日において摘出された胎児はn=3であった。）。
摘出された胎児の内生殖器（精巣又は卵巣）の存在確認により雌雄判別を行った後、当該胎児から雌雄別に外生殖器組織（生殖突起から肛門周辺までの組織）を摘出した。但し、フルタミドを投与された妊娠雌ラットから摘出された雌胎児については、その胎児からの外生殖器の摘出を行わなかった。
摘出された外生殖器組織は、予め風袋重量を測定したエッペンドルフチューブ(1.5 mL)に雌雄別に１腹単位で入れて新鮮重量を測定した後、後述するヒドロキシプロリンの存在量の測定まで-20℃で凍結保存した。
【００２６】
２）細胞間マトリックスの存在量又はそれに相関関係を有する指標値の測定
エッペンドルフチューブ中に凍結保存された外生殖器組織に、エッペンドルフチューブ当たり0.5 mLの6N HClを加え、これを105℃で1昼夜加水分解した。加水分解終了後、当該加水分解物を4℃で30分間冷却し、10,000 rpmで遠心分離した後、上清を蓋付きガラス製試験管に回収した。回収された上清を凍結乾燥し、これに1.0 mL 酢酸−クエン酸緩衝液（pH 6.0）を加え懸濁した。得られた懸濁液を0.22μmのフィルターを用いてろ過した後、得られたろ液を測定試料とした。
50μLの測定試料をエッペンドルフチューブに分取し、これに0.5 mLのクロラミンT溶液（564 mg クロラミンT、4 mL n-プロパノール、4 mL 蒸留水、32 mL 酢酸−クエン酸緩衝液（pH 6.0））を加え撹拌した後、この混合物を室温で20分間静置した。静置後、当該混合物に0.5 mLのエールリッヒ試薬（6.75 g 4-（ジメチルアミノ）ベンズアルデヒド、27.9 mL n-プロパノール、11.7 mL 70%過塩素酸）を加え撹拌した後、この混合物を65℃で15分間加熱した。加熱後、当該混合物を4℃で10分間冷却した後、2,000 rpmで15分間遠心分離した。得られた上清を分光光度計に供し、550 nmにおける吸光度を測定した。尚、検量線はヒドロキシプロリンの標準溶液（1.25〜20 μg/mL）を用いて作成し、当該検量線を用いて、測定試料中のヒドロキシプロリンの濃度を算出した。
測定値の解析では、外生殖器重量（新鮮、乾燥）及び組織乾燥重量当たりのヒドロキシプロリンの含量を算出し、さらに雌雄別に１腹毎に胎児１匹当たりの値を算出して、これを１単位として化学物質非投与群の妊娠雌ラットから摘出された雄胎児に対する統計学的解析に用いた。
上記の統計学的解析では、まずF検定（有意水準：25%）で等分散検定を実施し、等分散であればt検定を、不等分散であればWelch検定を実施した。有意水準は５又は１％に設定した。
【００２７】
化学物質非投与群の妊娠雌ラットから摘出された雄胎児の場合における外生殖器の新鮮重量（生殖突起から肛門周辺までの組織）に関して、妊娠17日では化学物質非投与群の妊娠雌ラットから摘出された雌胎児との間での重量差は殆ど認められなかった。妊娠18日では当該雌胎児に比較して当該雄胎児では約40％の有意な重量増加が認められた。妊娠20日には当該雌胎児に比較して当該雄胎児では約200％の有意な重量増加が認められた（図３参照）。
一方、フルタミド投与群の妊娠雌ラットから摘出された雄胎児の場合における外生殖器の新鮮重量（生殖突起から肛門周辺までの組織）に関して、妊娠18日では化学物質非投与群の妊娠雌ラットから摘出された雄胎児との間での重量差は認められなかった。しかしながら、妊娠20日には化学物質非投与群の妊娠雌ラットから摘出された雄胎児に比較して有意な差（低い値）が認められた。これに対して化学物質非投与群の妊娠雌ラットから摘出された雌胎児との間での重量差は認められなかった（図３参照）。
【００２８】
また化学物質非投与群の妊娠雌ラットから摘出された雄胎児の場合における外生殖器組織の乾燥重量（生殖突起から肛門周辺までの組織）に関して、妊娠17日及び18日では化学物質非投与群の妊娠雌ラットから摘出された雌胎児との間での重量差は殆ど認められなかった。妊娠20日には当該雌胎児に比較して当該雄胎児では約47％の有意な重量増加が認められた（図４参照）。
一方、フルタミド投与群の妊娠雌ラットから摘出された雄胎児の場合における外生殖器組織の乾燥重量（生殖突起から肛門周辺までの組織）に関して、妊娠18日では化学物質非投与群の妊娠雌ラットから摘出された雄胎児又は雌胎児との間での有意な重量差は認められなかった。これに対して妊娠20日では、化学物質非投与群の妊娠雌ラットから摘出された雌胎児との間での重量差は認められなかったが、化学物質非投与群の妊娠雌ラットから摘出された雄胎児に比較して有意な差（低い値）が認められた（図４参照）。
【００２９】
また化学物質非投与群の妊娠雌ラットから摘出された雄胎児の場合における外生殖器組織（生殖突起から肛門周辺までの組織）の乾燥重量当たりのヒドロキシプロリン量に関して、妊娠17日では化学物質非投与群の妊娠雌ラットから摘出された雌胎児との間でのヒドロキシプロリンの差は殆ど認められなかった。妊娠18日では当該雌胎児の比較して当該雄胎児においてヒドロキシプロリン量の増加の傾向が認められた。妊娠20日には当該雌胎児に比較して当該雄胎児では有意なヒドロキシプロリン量の増加が認められた（図５参照）。
一方、フルタミド投与群の妊娠雌ラットから摘出された雄胎児の場合における外生殖器組織（生殖突起から肛門周辺までの組織）乾燥重量あたりのヒドロキシプロリン量に関して、妊娠18日では化学物質非投与群の妊娠雌ラットから摘出された雄胎児又は雌胎児との間での有意なヒドロキシプロリン量の差は認められなかった。これに対して妊娠20日では、化学物質非投与群の妊娠雌ラットから摘出された雌胎児との間でのヒドロキシプロリン量の差は認められなかったが、化学物質非投与群の妊娠雌ラットから摘出された雄胎児に比較して有意な差（低い値）が認められた（図５参照）。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明により、外生殖器等の形態変化を観察する必要が無く、より鋭敏で、胎児の大きさの違いに影響されることも無く、さらに種間で共通して用いることができる哺乳動物における生殖器異常の検出方法等が提供可能となり、しかも前記生殖器異常の形成過程を効率的にモニターすることも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、ラット胎児の外生殖器組織内における細胞間マトリックスの存在量の経時的変化を、化学物質非投与群の雄胎児及び雌胎児の外生殖器組織内における細胞間マトリックスの存在について顕微鏡を用いて観察された際の観察標本写真を示す図である。
【図２】図２は、ウサギ胎児の外生殖器組織内における細胞間マトリックスの存在量の経時的変化を、化学物質非投与群の雄胎児及び雌胎児の外生殖器組織内における細胞間マトリックスの存在について顕微鏡を用いて観察された際の観察標本写真を示す図である。
【図３】図３は、外生殖器の新鮮重量の経時的変化を化学物質非投与群の雄胎児、化学物質非投与群の雌胎児及び化学物質（フルタミド）投与群の雄胎児について、その平均値を示す図である。（**：1%で有意差有りということを意味する。）
【図４】図４は、外生殖器の乾燥重量の経時的変化を化学物質非投与群の雄胎児、化学物質非投与群の雌胎児及び化学物質（フルタミド）投与群の雄胎児について、その平均値を示す図である。（**：1%で有意差有りということを意味する。）
【図５】図５は、組織乾燥重量当たりのヒドロキシプロリンの存在量の経時的変化を化学物質非投与群の雄胎児、化学物質非投与群の雌胎児及び化学物質（フルタミド）投与群の雄胎児について、その平均値を示す図である。（*：5%で有意差有りということを意味する。）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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