(57)【要約】【課題】  核内受容体分解抑制物質又は核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】  試験物質が、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合を抑制又は促進できる否かを判別し、前記結合を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングし、前記結合を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験物質が、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合を抑制できる否かを判別し、前記結合を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
試験物質が、ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合を抑制できる否かを判別し、前記結合を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
試験物質が、シャペロンタンパク質と核内受容体との結合を抑制できる否かを判別し、前記結合を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
試験物質が、ＣＨＩＰによる核内受容体のユビキチン化を抑制できる否かを判別し、前記ユビキチン化を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
試験物質が、ＣＨＩＰをコードする遺伝子の発現を抑制できる否かを判別し、前記発現を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
試験物質が、シャペロンタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制できる否かを判別し、前記発現を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記核内受容体がエストロゲン受容体である請求項１〜６のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記核内受容体分解抑制物質が、核内受容体リガンド非結合型核内受容体の核内受容体リガンド非依存的な分解を抑制する物質である請求項１〜７のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
試験物質が、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合を促進できる否かを判別し、前記結合を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
試験物質が、ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合を促進できる否かを判別し、前記結合を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
試験物質が、シャペロンタンパク質と核内受容体との結合を促進できる否かを判別し、前記結合を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
試験物質が、ＣＨＩＰによる核内受容体のユビキチン化を促進できる否かを判別し、前記ユビキチン化を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
試験物質が、ＣＨＩＰをコードする遺伝子の発現を促進できる否かを判別し、前記発現を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
試験物質が、シャペロンタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進できる否かを判別し、前記発現を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
前記核内受容体がエストロゲン受容体である請求項９〜１４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
前記核内受容体分解促進物質が、核内受容体リガンド非結合型核内受容体の核内受容体リガンド非依存的な分解を促進する物質である請求項９〜１５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核内受容体分解抑制物質又は核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核内受容体は糖尿病、骨粗鬆症、高血圧、ホルモン依存性癌（例えば、乳癌、子宮体癌、前立腺癌等）等の疾患と密接に関連しているため、核内受容体に対するアゴニスト及びアンタゴニストが治療薬として注目されている。
【０００３】
しかしながら、核内受容体は組織によって機能が異なり、リガンドに対する反応性も組織によって異なる。したがって、核内受容体に対するアゴニスト及びアンタゴニストは、ある組織では治療効果を発揮するが、他の組織では副作用を発揮する可能性がある。例えば、エストロゲン受容体の場合、エストロゲン依存性乳癌の増殖を抑制するタモキシフェンは、骨ではアンタゴニストとして作用しないため、骨量の減少を招かないという利点がある一方、エストロゲン依存性子宮体癌の増殖を促進するという副作用を招く。そこで、別の視点から核内受容体の機能を制御することが求められており、その中の１つとして、核内受容体の分解を抑制又は促進することにより核内受容体の機能を制御することが考えられている。
【０００４】
一方、Ｈｓｐ９０がエストロゲン受容体α（ＥＲα）に結合すること（非特許文献１，２参照）及びＨｓｐ７０がエストロゲン受容体α（ＥＲα）に結合すること（非特許文献３〜５参照）が報告されている。また、Ｈｓｃ７０と結合することが知られているＣＨＩＰ（carboxyl-terminus of Hsc70 interacting protein）が、ＣＦＴＲ（cystic-fibrosis transmembrane-conductance regulator）（非特許文献６参照）、ＧＲ（グルココルチコイド受容体）（非特許文献７参照）、ＥｒｂＢ２（非特許文献８，９参照）、アンドロゲン受容体（非特許文献１０参照）、Ｓｍａｄ（非特許文献１１）、Ｐｅｒｌ受容体（非特許文献１２参照）等のユビキチン化・分解に関与することが報告されている。
【非特許文献１】ベリアコフ（Beliakoff）J等，「クリニカル  キャンサー  リサーチ（Clinical Cancer Research）」，2003年，9(13)，p.4961-71
【非特許文献２】リー（Lee）ＭＯ等，「モレキュラー  セルラー  エンドクリノロジー（Molecular and Cellular Endocrinology）」，2002年，188(1-2)，p.47-54
【非特許文献３】サイ  パドマ（Sai Padma）A等，「ジャーナル  オブ  セル  バイオケミストリー（Journal of Cell Biochemistry）」，2000年，78(4)，p.650-65.
【非特許文献４】クリンジ（Klinge）CM等，「ジャーナル  オブ  ステロイド  バイオケミストリー  アンド  モレキュラー  バイオロジー（Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology）」，1997年，63(4-6)，p.283-301
【非特許文献５】ランデル（Landel）CC等，「ジャーナル  オブ  ステロイド  バイオケミストリー  アンド  モレキュラー  バイオロジー（Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology）」，1997年，63(1-3)，p.59-73
【非特許文献６】ミーチャム（Meacham）GC等，「ネイチャー  セル  バイオロジー（Nature Cell Biol0gy）」，2001年，3(1)，p.100-5
【非特許文献７】コーネル（Connell）P等，「ネイチャー  セル  バイオロジー（Nature Cell Biol0gy）」，2001年，3(1)，p.93-6
【非特許文献８】Zhou P等，「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）」，2003年，278(16)，p.13829-37. Epub 2003 Feb 06
【非特許文献９】Xu W等，「米国科学アカデミー紀要（Proceedings of National Academy of Science U S A. ）」，2002年，99(20)，p.12847-52. Epub 2002 Sep 18
【非特許文献１０】Cardozo CP等，「アーカイブス  オブ  バイオケミストリー  アンド  バイオフィジクス（Archives of Biochemistry and Biophysics ）」，2003年，410(1):13，p.4-40
【非特許文献１１】Li L等，「モレキュラー  アンド  セルラー  バイオロジー（Molecular and Celluar Biology）」，2004年，24(2)，p.856-64
【非特許文献１２】今井（Imai）Y等，「モレキュラー  セル（Molecular Cell）」，2002年，10(1)，p.55-67
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、核内受容体分解抑制物質又は核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、シャペロンタンパク質を介してＣＨＩＰと核内受容体リガンド非結合型核内受容体とが結合し、シャペロンタンパク質を介して核内受容体リガンド非結合型核内受容体に結合したＣＨＩＰにより核内受容体リガンド非結合型核内受容体がユビキチン化され、核内受容体リガンド非結合型核内受容体が核内受容体リガンド非依存的に分解されるという新たな知見に基づいて完成されたものであり、上記課題を解決するために、本発明は、以下の核内受容体分解抑制物質又は核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法を提供する。
【０００７】
（１）試験物質が、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合を抑制できる否かを判別し、前記結合を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解抑制物質のスクリーニング方法。
【０００８】
（２）試験物質が、ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合を抑制できる否かを判別し、前記結合を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解抑制物質のスクリーニング方法。
【０００９】
（３）試験物質が、シャペロンタンパク質と核内受容体との結合を抑制できる否かを判別し、前記結合を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解抑制物質のスクリーニング方法。
【００１０】
（４）試験物質が、ＣＨＩＰによる核内受容体のユビキチン化を抑制できる否かを判別し、前記ユビキチン化を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解抑制物質のスクリーニング方法。
【００１１】
（５）試験物質が、ＣＨＩＰをコードする遺伝子の発現を抑制できる否かを判別し、前記発現を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解抑制物質のスクリーニング方法。
【００１２】
（６）試験物質が、シャペロンタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制できる否かを判別し、前記発現を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解抑制物質のスクリーニング方法。
【００１３】
（７）前記核内受容体がエストロゲン受容体である前記（１）〜（６）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００１４】
（８）前記核内受容体分解抑制物質が、核内受容体リガンド非結合型核内受容体の核内受容体リガンド非依存的な分解を抑制する物質である前記（１）〜（７）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００１５】
（９）試験物質が、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合を促進できる否かを判別し、前記結合を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法。
【００１６】
（１０）試験物質が、ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合を促進できる否かを判別し、前記結合を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法。
【００１７】
（１１）試験物質が、シャペロンタンパク質と核内受容体との結合を促進できる否かを判別し、前記結合を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法。
【００１８】
（１２）試験物質が、ＣＨＩＰによる核内受容体のユビキチン化を促進できる否かを判別し、前記ユビキチン化を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法。
【００１９】
（１３）試験物質が、ＣＨＩＰをコードする遺伝子の発現を促進できる否かを判別し、前記発現を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法。
【００２０】
（１４）試験物質が、シャペロンタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進できる否かを判別し、前記発現を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法。
【００２１】
（１５）前記核内受容体がエストロゲン受容体である前記（９）〜（１４）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００２２】
（１６）前記核内受容体分解促進物質が、核内受容体リガンド非結合型核内受容体の核内受容体リガンド非依存的な分解を促進する物質である前記（９）〜（１５）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、核内受容体分解抑制物質又は核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明で使用する試験物質の種類は特に限定されるものではなく、天然に存在する物質であってもよいし、人工的に合成された物質であってもよい。試験物質としては、例えば、高分子化合物、低分子化合物、抗体、タンパク質、ペプチド、核酸、糖質、無機塩類、金属錯体、これらの複合体等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、「核酸」には、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。
【００２５】
「核内受容体」とは、主として、標的遺伝子のプロモーター上流に結合することにより核内受容体リガンド依存的に標的遺伝子の転写を制御する因子を意味する。但し、核内受容体リガンドのない核内受容体も存在する。したがって、核内受容体リガンドのない核内受容体であっても、その構造及び機能の相同性から核内受容体遺伝子スーパーファミリーに属するものは「核内受容体」に含まれるものとする。核内受容体としては、例えば、エストロゲン受容体（ER）、ビタミンＤ受容体（VDR）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）、肝臓Ｘ受容体（LXR）、レチノイン酸受容体（RAR）、レチノイドＸ受容体（RXR）、アンドロゲン受容体（AR）、グルココルチコイド受容体（GR）、ファルネソイドＸ受容体（FXR）、ミネラルコルチコイド受容体（MR）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
本発明で使用する核内受容体は、野生型核内受容体（例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット等の哺乳動物に由来する野生型核内受容体）、野生型核内受容体に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入した変異型核内受容体、野生型核内受容体又は変異型核内受容体の誘導体、野生型核内受容体又は変異型核内受容体と他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質等のいずれであってもよい。
【００２７】
変異型核内受容体は、野生型核内受容体のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数は、シャペロンタンパク質に対する結合能が保持される限り特に限定されるものではなく、その個数は１又は複数個であり、その具体的な範囲は、通常１〜１００個、好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜２５個である。また、欠失、置換又は付加されるアミノ酸の位置は、シャペロンタンパク質に対する結合能が保持される限り特に限定されるものではない。
【００２８】
野生型核内受容体又は変異型核内受容体の誘導体の種類は、シャペロンタンパク質に対する結合能が保持される限り特に限定されるものではない。このような誘導体化としては、例えば、標識物質の付加；リン酸基、メチル基、アセチル基等による修飾等が挙げられる。標識物質の種類は特に限定されるものではないが、例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、Cy系色素、Alexa系色素、BODIPY系色素等の蛍光性化合物；ルミノール、ルシゲニン、アクリジウムエステル等の化学発光性化合物；アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；ルシフェラーゼ、ルシフェリン等の生物発光性化合物；３２Ｐ、３５Ｓ等のラジオアイソトープ（ＲＩ）等が挙げられる。
【００２９】
野生型核内受容体又は変異型核内受容体と他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質の種類は、シャペロンタンパク質に対する結合能が保持される限り特に限定されるものではない。融合させる他のタンパク質又はペプチドとしては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ヘマグルチニンタンパク質（ＨＡ−ｔａｇ）、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、Ｔ７遺伝子１０タンパク質、ウシパピローマウイルスＬ１タンパク質、ストレプトアビジン、ＶＳＶ−Ｇ−ｔａｇ等が挙げられる。
【００３０】
「核内受容体リガンド」とは、核内受容体に結合することにより、核内受容体の標的遺伝子の転写活性化能を制御する物質を意味する。核内受容体リガンドは、天然に存在する物質であってもよいし、人工的に合成された物質であってもよい。エストロゲン受容体のリガンドとしては、例えば、エストロゲンが挙げられ、ビタミンＤ受容体のリガンドとしては、例えば、ビタミンＤが挙げられる。なお、全ての核内受容体について内在性の核内受容体リガンドが明らかになっているわけではない。
【００３１】
「ＣＨＩＰ（Carboxy-terminus of Hsc70 interacting protein）」は、Ｈｓｃ７０に結合するco-chaperone（シャペロンの補助因子）として発見された分子であり、そのＮ末端側にはＨｓｃ７０と相互作用するＴＰＲ（tetratricopeptide repeat）という繰り返し構造を有しており、そのＣ末端側にはＵ−ｂｏｘというユビキチンリガーゼに特徴的な構造を有している。
【００３２】
本発明で使用するＣＨＩＰは、野生型ＣＨＩＰ（例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット等の哺乳動物に由来する野生型ＣＨＩＰ）、野生型ＣＨＩＰに対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入した変異型ＣＨＩＰ、野生型ＣＨＩＰ又は変異型ＣＨＩＰの誘導体、野生型ＣＨＩＰ又は変異型ＣＨＩＰと他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質等のいずれであってもよい。
【００３３】
野生型ＣＨＩＰとしては、例えば、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。なお、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はヒト由来タンパク質である。
【００３４】
変異型ＣＨＩＰは、野生型ＣＨＩＰのアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数は、シャペロンタンパク質に対する結合能が保持される限り特に限定されるものではなく、その個数は１又は複数個であり、その具体的な範囲は、通常１〜１００個、好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜２５個である。また、欠失、置換又は付加されるアミノ酸の位置は、野生型ＣＨＩＰのシャペロンタンパク質に対する結合能が保持される限り特に限定されるものではない。変異型ＣＨＩＰとしては、配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸配列が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつシャペロンタンパク質に結合できるタンパク質が挙げられる。
【００３５】
野生型ＣＨＩＰ又は変異型ＣＨＩＰの誘導体の種類は、シャペロンタンパク質に対する結合能が保持される限り特に限定されるものではない。このような誘導体化としては、例えば、標識物質の付加；リン酸基、メチル基、アセチル基等による修飾等が挙げられる。標識物質の種類は特に限定されるものではなく、その具体例は上記と同様である。
【００３６】
野生型ＣＨＩＰ又は変異型ＣＨＩＰと他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質の種類は、シャペロンタンパク質に対する結合能が保持される限り特に限定されるものではない。融合させる他のタンパク質又はペプチドの具体例は上記と同様である。
【００３７】
「シャペロンタンパク質」は、タンパク質の正常な折り畳み構造を維持することにより当該タンパク質の機能を維持する機能を有しており、シャペロンタンパク質としては、例えば、Ｈｓｃ７０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０等が挙げられるが、好ましいシャペロンタンパク質としてはＨｓｃ７０が挙げられる。Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ９０はヒートショック等のストレスに応答して発現するタンパク質であるのに対し、Ｈｓｃ７０タンパクは恒常的に細胞内に存在するタンパク質である。
【００３８】
本発明で使用するシャペロンタンパク質は、野生型シャペロンタンパク質（例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット等の哺乳動物に由来する野生型シャペロンタンパク質）、野生型シャペロンタンパク質に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入した変異型シャペロンタンパク質、野生型シャペロンタンパク質又は変異型シャペロンタンパク質の誘導体、野生型シャペロンタンパク質又は変異型シャペロンタンパク質と他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質等のいずれであってもよい。
【００３９】
野生型Ｈｓｃ７０としては、例えば、配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ、野生型Ｈｓｐ７０としては、例えば、配列番号６記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ、野生型Ｈｓｐ９０としては、例えば、配列番号８記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。なお、配列番号４，６及び８記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はヒト由来タンパク質である。
【００４０】
変異型シャペロンタンパク質は、野生型シャペロンタンパク質のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数は、核内受容体及びＣＨＩＰに対する結合能が保持される限り特に限定されるものではなく、その個数は１又は複数個であり、その具体的な範囲は、通常１〜１００個、好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜２５個である。また、欠失、置換又は付加されるアミノ酸の位置は、核内受容体及びＣＨＩＰに対する結合能が保持される限り特に限定されるものではない。変異型Ｈｓｃ７０、変異型Ｈｓｐ７０及び変異型Ｈｓｐ９０の具体例としては、例えば、それぞれ配列番号４、６及び８記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸配列が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ核内受容体及びＣＨＩＰに結合できるタンパク質が挙げられる。
【００４１】
野生型シャペロンタンパク質又は変異型シャペロンタンパク質の誘導体の種類は、核内受容体及びＣＨＩＰに対する結合能が保持される限り特に限定されるものではない。このような誘導体化としては、例えば、標識物質の付加；リン酸基、メチル基、アセチル基等による修飾等が挙げられる。標識物質の種類は特に限定されるものではなく、その具体例は上記と同様である。
【００４２】
野生型シャペロンタンパク質又は変異型シャペロンタンパク質と他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質の種類は、核内受容体及びＣＨＩＰに対する結合能が保持される限り特に限定されるものではない。融合させる他のタンパク質又はペプチドの具体例は上記と同様である。
【００４３】
ＣＨＩＰと核内受容体リガンド非結合型核内受容体（核内受容体リガンドが結合していない核内受容体）とは、シャペロンタンパク質を介して結合する。すなわち、シャペロンタンパク質が核内受容体リガンド非結合型核内受容体に結合し、核内受容体リガンド非結合型核内受容体に結合したシャペロンタンパク質にＣＨＩＰが結合することにより、シャペロンタンパク質を介してＣＨＩＰと核内受容体リガンド非結合型核内受容体とが結合する。シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体リガンド非結合型核内受容体との結合は、核内受容体リガンド非依存的（核内受容体リガンドの存在は不要）である。そして、シャペロンタンパク質を介して核内受容体リガンド非結合型核内受容体に結合したＣＨＩＰにより核内受容体リガンド非結合型核内受容体がユビキチン化され、核内受容体リガンド非結合型核内受容体が核内受容体リガンド非依存的に分解される。
【００４４】
ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする遺伝子は、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードするオープンリーディングフレームとその３'末端側に位置する終止コドンとを含む。ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする遺伝子は、オープンリーディングフレームの５'末端及び／又は３'末端に非翻訳領域（ＵＴＲ）を含んでいてもよい。また、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする遺伝子は、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質が融合タンパク質として発現されるように、他のタンパク質又はペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含んでいてもよい。
【００４５】
野生型ＣＨＩＰをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１記載の塩基配列のうち５７〜９６５番目の塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。ここで、配列番号１記載の塩基配列のうち５７〜９６５番目の塩基配列は、野生型ＣＨＩＰをコードするオープンリーディングフレームであり、配列番号１記載の塩基配列のうち、翻訳開始コドンは５７〜５９番目の塩基配列に位置し、終止コドンは９６６〜９６８番目の塩基配列に位置する。野生型ＣＨＩＰをコードする遺伝子の塩基配列は、野生型ＣＨＩＰをコードする限り特に限定されるものではなく、オープンリーディングフレームの塩基配列は、配列番号１記載の塩基配列のうち５７〜９６５番目の塩基配列に限定されるものではない。
【００４６】
野生型Ｈｓｃ７０をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号３記載の塩基配列のうち７９〜２０１６番目の塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。ここで、配列番号３記載の塩基配列のうち７９〜２０１６番目の塩基配列は、野生型Ｈｓｃ７０をコードするオープンリーディングフレームであり、配列番号３記載の塩基配列のうち、翻訳開始コドンは７９〜８１番目の塩基配列に位置し、終止コドンは２０１７〜２０１９番目の塩基配列に位置する。野生型Ｈｓｃ７０をコードする遺伝子の塩基配列は、野生型Ｈｓｃ７０をコードする限り特に限定されるものではなく、オープンリーディングフレームの塩基配列は、配列番号３記載の塩基配列のうち７９〜２０１６番目の塩基配列に限定されるものではない。
【００４７】
野生型Ｈｓｐ７０をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号５記載の塩基配列のうち１７８〜２１００番目の塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。ここで、配列番号５記載の塩基配列のうち１７８〜２１００番目の塩基配列は、野生型Ｈｓｐ７０をコードするオープンリーディングフレームであり、配列番号５記載の塩基配列のうち、翻訳開始コドンは１７８〜１８０番目の塩基配列に位置し、終止コドンは２１０１〜２１０３番目の塩基配列に位置する。野生型Ｈｓｐ７０をコードする遺伝子の塩基配列は、野生型Ｈｓｐ７０をコードする限り特に限定されるものではなく、オープンリーディングフレームの塩基配列は、配列番号５記載の塩基配列のうち１７８〜２１００番目の塩基配列に限定されるものではない。
【００４８】
野生型Ｈｓｐ９０をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号７記載の塩基配列のうち９８〜２２６９番目の塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。ここで、配列番号７記載の塩基配列のうち９８〜２２６９番目の塩基配列は、野生型Ｈｓｐ９０をコードするオープンリーディングフレームであり、配列番号７記載の塩基配列のうち、翻訳開始コドンは９８〜１００番目の塩基配列に位置し、終止コドンは２２７０〜２２７２番目の塩基配列に位置する。野生型Ｈｓｐ９０をコードする遺伝子の塩基配列は、野生型Ｈｓｐ９０をコードする限り特に限定されるものではなく、オープンリーディングフレームの塩基配列は、配列番号７記載の塩基配列のうち９８〜２２６９番目の塩基配列に限定されるものではない。
【００４９】
変異型ＣＨＩＰをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１記載の塩基配列のうち５７〜９６５番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシャペロンタンパク質と結合できるタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。
【００５０】
「ストリンジェントな条件」としては、例えば、４２℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件、好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件が挙げられ、配列番号１記載の塩基配列のうち５７〜９６５番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号１記載の塩基配列のうち５７〜９６５番目の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも５０％以上、好ましくは６５％以上、さらに好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００５１】
変異型Ｈｓｃ７０をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号３記載の塩基配列のうち７９〜２０１６番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ核内受容体及びＣＨＩＰと結合できるタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。
【００５２】
「ストリンジェントな条件」としては、上記と同様の条件が挙げられ、配列番号３記載の塩基配列のうち７９〜２０１６番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号３記載の塩基配列のうち７９〜２０１６番目の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも５０％以上、好ましくは６５％以上、さらに好ましく８０％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００５３】
変異型Ｈｓｐ７０をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号５記載の塩基配列のうち１７８〜２１００番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ核内受容体及びＣＨＩＰと結合できるタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。
【００５４】
「ストリンジェントな条件」としては、上記と同様の条件が挙げられ、配列番号５記載の塩基配列のうち１７８〜２１００番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号５記載の塩基配列のうち１７８〜２１００番目の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも５０％以上、好ましくは６５％以上、さらに好ましく８０％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００５５】
変異型Ｈｓｐ９０をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号７記載の塩基配列のうち９８〜２２６９番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ核内受容体及びＣＨＩＰと結合できるタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。
【００５６】
「ストリンジェントな条件」としては、上記と同様の条件が挙げられ、配列番号７記載の塩基配列のうち９８〜２２６９番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号７記載の塩基配列のうち９８〜２２６９番目の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも５０％以上、好ましくは６５％以上、さらに好ましく８０％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００５７】
試験物質が、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合を抑制できるか否か又は促進できるか否かは、例えば、次のようにして判別できるが、判別方法はこれに限定されるものではない。
【００５８】
ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質と核内受容体とを試験物質の存在下又は不存在下で接触させた後、ＣＨＩＰと核内受容体との結合量を測定し、試験物質の存在下における結合量と試験物質の不存在下における結合量とを比較する。その結果、試験物質の存在下における結合量が試験物質の不存在下における結合量よりも少なければ、試験物質が、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合を抑制できると判別できる。一方、試験物質の存在下における結合量が試験物質の不存在下における結合量よりも多ければ、試験物質が、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合を促進できると判別できる。
【００５９】
細胞内における核内受容体の分解は、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合を経て進行する（例えば、細胞内におけるエストロゲン受容体の分解は、Ｈｓｃ７０を介したＣＨＩＰとエストロゲン受容体との結合を経て進行する）ので、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合を抑制できる物質は核内受容体分解抑制作用を有する可能性があり、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合を促進できる物質は核内受容体分解促進作用を有する可能性がある。したがって、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合を抑制できる物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングでき、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合を促進できる物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングできる。
【００６０】
シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合を抑制又は促進できる物質は、ＣＨＩＰ、シャペロンタンパク質及び核内受容体のいずれか１種類に作用する物質であってもよいし、２種類以上に作用する物質であってもよい。また、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合を抑制できる物質には、解離状態にあるＣＨＩＰとシャペロンタンパク質（核内受容体と結合したシャペロンタンパク質であってもよいし、核内受容体と結合していないシャペロンタンパク質であってもよい）との結合を抑制できる物質、結合状態にあるＣＨＩＰとシャペロンタンパク質（核内受容体と結合したシャペロンタンパク質であってもよいし、核内受容体と結合していないシャペロンタンパク質であってもよい）とを解離させることができる物質、解離状態にあるシャペロンタンパク質と核内受容体との結合を抑制できる物質、結合状態にあるシャペロンタンパク質と核内受容体とを解離させることができる物質等が含まれる。
【００６１】
ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質と核内受容体とは、in vitroで接触させてもよいし、in vivoで接触させてもよい。
【００６２】
in vitroで接触させる場合、ＣＨＩＰ、シャペロンタンパク質及び核内受容体として、（i）目的とするタンパク質を発現している細胞又は組織から抽出した内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、当該形質転換体の培養物から抽出した組換えタンパク質、（iii）化学合成したペプチド等を使用できる。
【００６３】
in vivoで接触させる場合、ＣＨＩＰ、シャペロンタンパク質及び核内受容体として、（i）細胞内に存在する内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入することにより作製された形質転換体内に存在する組換えタンパク質等を使用できる。
【００６４】
ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質と核内受容体とを接触させる際、ＣＨＩＰとして、野生型ＣＨＩＰ、変異型ＣＨＩＰ、野生型ＣＨＩＰ又は変異型ＣＨＩＰの誘導体、野生型ＣＨＩＰ又は変異型ＣＨＩＰと他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質等を使用できる。シャペロンタンパク質及び核内受容体についても同様である。
【００６５】
ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質と核内受容体とを接触させる際、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合に影響を与える条件を調節し、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合が試験物質の有無に依存するようにする。
【００６６】
シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合に影響を与える条件としては、例えば、温度、溶媒の種類、ＣＨＩＰの濃度、シャペロンタンパク質の濃度、核内受容体の濃度、核内受容体とＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合をモジュレートする介在タンパク質（すなわち、三者の結合に直接的又は間接的に影響を与え、当該結合を促進、阻害又は調節するタンパク質）の有無等が挙げられる。
【００６７】
ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質と核内受容体とを接触させる際の温度は、例えば、０〜５０℃に設定できる。ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質と核内受容体とを接触させる際の溶媒としては、例えば、１価又は２価の塩類を含むｐＨ５．５〜８．５の緩衝液；エタノール、エチレングリコール、グリセリン、ＤＭＳＯ等を添加して疎水性を調節した緩衝液等を使用できる。ＣＨＩＰの濃度、シャペロンタンパク質の濃度及び核内受容体の濃度は、例えば０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌに設定できる。介在タンパク質としては、例えば、ＣＨＩＰが結合するシャペロンタンパク質の領域と同一の領域に結合し、ＣＨＩＰと競合するタンパク質；リン酸化その他の修飾によりＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合を制御するタンパク質；シャペロンタンパク質が結合する核内受容体の領域と同一の領域に結合し、シャペロンタンパク質と競合するコアクティベーター又はコリプレッサー；リン酸化その他の修飾によりシャペロンタンパク質と核内受容体との結合を制御するタンパク質等が挙げられる。
【００６８】
シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合は核内受容体リガンド非依存的であるので、核内受容体リガンドを共存させる必要はないが、核内受容体リガンドを共存させてもよい。
【００６９】
シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合量は、例えば、ＣＨＩＰと核内受容体との結合体量、ＣＨＩＰと核内受容体との結合によって生じるシグナル量等を指標として測定できる。
【００７０】
ＣＨＩＰと核内受容体との結合体量は、例えば、ＣＨＩＰ、シャペロンタンパク質及び核内受容体のいずれか１種類以上に標識物質を付加しておき、ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質と核内受容体とを接触させた後、ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質と核内受容体との複合体を分離し、当該複合体が有する標識物質量を指標として測定できる。具体的には、GST pull down法を利用して次のように測定できる。ＣＨＩＰ及び核内受容体のいずれか一方にＲＩを付加するとともに、他方をＧＳＴとの融合タンパク質としておき、ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質と核内受容体とを接触させた後、ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質と核内受容体との複合体をグルタチオンセファロースカラムに吸着させる。カラムを洗浄した後、カラムに結合したタンパク質を溶出する。溶出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してＣＨＩＰとシャペロンタンパク質と核内受容体との複合体を分離した後、当該複合体が有するＲＩ量を指標としてＣＨＩＰと核内受容体との結合体量を測定する。
【００７１】
また、ＣＨＩＰと核内受容体との結合体量は、公知のタンパク質解析技術、例えば、ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質と核内受容体との複合体に反応できる抗体又はその断片を使用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、組織免疫染色法等によって測定できる。なお、「抗体」には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもが含まれ、「モノクローナル抗体」及び「ポリクローナル抗体」には全てのクラスのモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれる。また、「抗体の断片」には、Fab断片、F(ab)'2断片、単鎖抗体(scFv)等が含まれる。
【００７２】
ＣＨＩＰと核内受容体との結合によって生じるシグナルの種類は特に限定されるものではないが、例えば、レポーター遺伝子の発現、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又は水晶振動子の振動数移動による局所密度変化の検出等が挙げられる。
【００７３】
ＣＨＩＰと核内受容体との結合によって生じるシグナルがレポーター遺伝子の発現である場合、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合量は、例えば、核内受容体の転写活性化能を利用して次のように測定できる。
【００７４】
ＣＨＩＰをコードする遺伝子を含む発現ベクターと、シャペロンタンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、核内受容体をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、レポーター遺伝子及び該レポーター遺伝子の上流に連結された核内受容体依存性プロモーターを含む発現ユニットとを宿主細胞に導入し、レポーター遺伝子の発現によって生じるレポーター活性量を測定する。レポーター遺伝子の上流に連結されるプロモーターとしては、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合によって、核内受容体による活性化の度合いが変化するものが選択される。したがって、シャペロンタンパク質を介してＣＨＩＰと核内受容体とが結合すると、核内受容体によるプロモーターの活性化の度合いが変化し、レポーター遺伝子の発現量が変化する。すなわち、レポーター遺伝子の発現によって生じるレポーター活性量の変化が、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合量の指標となる。
【００７５】
レポーター遺伝子としては、例えば、βガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等が挙げられ、レポーター活性としては、例えば、βガラクトシダーゼ活性、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性、ルシフェラーゼ活性、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性等が挙げられる。
【００７６】
ＣＨＩＰと核内受容体との結合によって生じるシグナルが蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）である場合、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合量は、例えば、次のように測定できる。
【００７７】
ＣＨＩＰ及び核内受容体の一方を蛍光タンパク質（ドナー）と融合するとともに他方を蛍光タンパク質（アクセプター）と融合しておき、ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質と核内受容体とを接触させた後、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合によって生じる蛍光量を測定する。この際、蛍光タンパク質（ドナー）としては、ＣＦＰ（cyan fluorescent protein）、蛍光タンパク質（アクセプター）としては、ＹＦＰ（yellow fluorescent protein）を使用できる。蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、ある分子の蛍光団（ドナー）から他の分子の蛍光団（アクセプター）へ励起エネルギーが移動する現象で、励起された蛍光団はそのエネルギーを熱や新たな蛍光として放出する。蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が効率良く起こるためには、２つの分子がある程度近くにある必要があるので、細胞内で起こるタンパク質間の相互作用を検出する有効な手段として利用できる。
【００７８】
試験物質がＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合を抑制できるか否か又は促進できるか否かは、例えば、次のようにして判別できるが、判別方法はこれに限定されるものではない。
【００７９】
ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質とを試験物質の存在下又は不存在下で接触させた後、ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合量を測定し、試験物質の存在下における結合量と試験物質の不存在下における結合量とを比較する。その結果、試験物質の存在下における結合量が試験物質の不存在下における結合量よりも少なければ、試験物質がＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合を抑制できると判別できる。一方、試験物質の存在下における結合量が試験物質の不存在下における結合量よりも多ければ、試験物質がＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合を促進できると判別できる。
【００８０】
細胞内における核内受容体の分解は、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合（すなわちＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合及びシャペロンタンパク質と核内受容体との結合）を経て進行するので、ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合を抑制できる物質は核内受容体分解抑制作用を有する可能性があり、ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合を促進できる物質は核内受容体分解促進作用を有する可能性がある。したがって、ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合を抑制できる物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングでき、ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合を促進できる物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングできる。
【００８１】
ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合を抑制又は促進できる物質は、ＣＨＩＰ及びシャペロンタンパク質のいずれか一方に作用する物質であってもよいし、両方に作用する物質であってもよい。また、ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合を抑制できる物質は、解離状態にあるＣＨＩＰとシャペロンタンパク質（核内受容体と結合したシャペロンタンパク質であってもよいし、核内受容体と結合していないシャペロンタンパク質であってもよい）との結合を抑制できる物質であってもよいし、結合状態にあるＣＨＩＰとシャペロンタンパク質（核内受容体と結合したシャペロンタンパク質であってもよいし、核内受容体と結合していないシャペロンタンパク質であってもよい）とを解離させることができる物質であってもよい。
【００８２】
ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質とは、in vitroで接触させてもよいし、in vivoで接触させてもよい。
【００８３】
in vitroで接触させる場合、ＣＨＩＰ及びシャペロンタンパク質として、（i）目的とするタンパク質を発現している細胞又は組織から抽出した内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、当該形質転換体の培養物から抽出した組換えタンパク質、（iii）化学合成したペプチド等を使用できる。
【００８４】
in vivoで接触させる場合、ＣＨＩＰ及びシャペロンタンパク質として、（i）細胞内に存在する内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入することにより作製された形質転換体内に存在する組換えタンパク質等を使用できる。
【００８５】
ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質とを接触させる際、ＣＨＩＰとして、野生型ＣＨＩＰ、変異型ＣＨＩＰ、野生型ＣＨＩＰ又は変異型ＣＨＩＰの誘導体、野生型ＣＨＩＰ又は変異型ＣＨＩＰと他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質等を使用できる。シャペロンタンパク質についても同様である。
【００８６】
ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質とを接触させる際、両者の結合に影響を与える条件を調節し、両者の結合が試験物質の有無に依存するようにする。
【００８７】
ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合に影響を与える条件としては、例えば、温度、溶媒の種類、ＣＨＩＰの濃度、シャペロンタンパク質の濃度、ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合をモジュレートする介在タンパク質（すなわち、両者の結合に直接的又は間接的に影響を与え、当該結合を促進、阻害又は調節するタンパク質）の有無等が挙げられる。
【００８８】
ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質とを接触させる際の温度は、例えば、０〜５０℃に設定できる。ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質とを接触させる際の溶媒としては、例えば、１価又は２価の塩類を含むｐＨ５．５〜８．５の緩衝液；エタノール、エチレングリコール、グリセリン、ＤＭＳＯ等を添加して疎水性を調節した緩衝液等を使用できる。ＣＨＩＰの濃度及びシャペロンタンパク質の濃度は、例えば０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌに設定できる。介在タンパク質としては、例えば、ＣＨＩＰが結合するシャペロンタンパク質の領域と同一の領域に結合し、ＣＨＩＰと競合するタンパク質；リン酸化その他の修飾によりＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合を制御するタンパク質等が挙げられる。
【００８９】
ＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合量は、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合量と同様にして測定できる。
【００９０】
試験物質がシャペロンタンパク質と核内受容体との結合を抑制できるか否か又は促進できるか否かは、例えば、次のようにして判別できるが、判別方法はこれに限定されるものではない。
【００９１】
シャペロンタンパク質と核内受容体とを試験物質の存在下又は不存在下で接触させた後、シャペロンタンパク質と核内受容体との結合量を測定し、試験物質の存在下における結合量と試験物質の不存在下における結合量とを比較する。その結果、試験物質の存在下における結合量が試験物質の不存在下における結合量よりも少なければ、試験物質がシャペロンタンパク質と核内受容体との結合を抑制できると判別できる。一方、試験物質の存在下における結合量が試験物質の不存在下における結合量よりも多ければ、試験物質がシャペロンタンパク質と核内受容体との結合を促進できると判別できる。
【００９２】
細胞内における核内受容体の分解は、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合（すなわちＣＨＩＰとシャペロンタンパク質との結合及びシャペロンタンパク質と核内受容体との結合）を経て進行するので、シャペロンタンパク質と核内受容体との結合を抑制できる物質は核内受容体分解抑制作用を有する可能性があり、シャペロンタンパク質と核内受容体との結合を促進できる物質は核内受容体分解促進作用を有する可能性がある。したがって、シャペロンタンパク質と核内受容体との結合を抑制できる物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングでき、シャペロンタンパク質と核内受容体との結合を促進できる物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングできる。
【００９３】
シャペロンタンパク質と核内受容体との結合を抑制又は促進できる物質は、シャペロンタンパク質及び核内受容体のいずれか一方に作用する物質であってもよいし、両方に作用する物質であってもよい。また、シャペロンタンパク質と核内受容体との結合を抑制できる物質は、解離状態にあるシャペロンタンパク質と核内受容体との結合を抑制できる物質であってもよいし、結合状態にあるシャペロンタンパク質と核内受容体とを解離させることができる物質であってもよい。
【００９４】
シャペロンタンパク質と核内受容体とは、in vitroで接触させてもよいし、in vivoで接触させてもよい。
【００９５】
in vitroで接触させる場合、シャペロンタンパク質及び核内受容体として、（i）目的とするタンパク質を発現している細胞又は組織から抽出した内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、当該形質転換体の培養物から抽出した組換えタンパク質、（iii）化学合成したペプチド等を使用できる。
【００９６】
in vivoで接触させる場合、シャペロンタンパク質及び核内受容体として、（i）細胞内に存在する内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入することにより作製された形質転換体内に存在する組換えタンパク質等を使用できる。
【００９７】
シャペロンタンパク質と核内受容体とを接触させる際、シャペロンタンパク質としては、野生型シャペロンタンパク質、変異型シャペロンタンパク質、野生型シャペロンタンパク質又は変異型シャペロンタンパク質の誘導体、野生型シャペロンタンパク質又は変異型シャペロンタンパク質と他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質等を使用できる。核内受容体についても同様である。
【００９８】
シャペロンタンパク質と核内受容体とを接触させる際、両者の結合に影響を与える条件を調節し、両者の結合が試験物質の有無に依存するようにする。
【００９９】
シャペロンタンパク質と核内受容体との結合に影響を与える条件としては、例えば、温度、溶媒の種類、シャペロンタンパク質の濃度、核内受容体の濃度、核内受容体とシャペロンタンパク質との結合をモジュレートする介在タンパク質（すなわち、両者の結合に直接的又は間接的に影響を与え、当該結合を促進、阻害又は調節するタンパク質）の有無等が挙げられる。
【０１００】
シャペロンタンパク質と核内受容体とを接触させる際の温度は、例えば、０〜５０℃に設定できる。シャペロンタンパク質と核内受容体とを接触させる際の溶媒としては、例えば、１価又は２価の塩類を含むｐＨ５．５〜８．５の緩衝液；エタノール、エチレングリコール、グリセリン、ＤＭＳＯ等を添加して疎水性を調節した緩衝液等を使用できる。シャペロンタンパク質の濃度及び核内受容体の濃度は、例えば０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌに設定できる。介在タンパク質としては、例えば、シャペロンタンパク質が結合する核内受容体の領域と同一の領域に結合し、シャペロンタンパク質と競合するコアクティベーター又はコリプレッサー；リン酸化その他の修飾によりシャペロンタンパク質と核内受容体との結合を制御するタンパク質等が挙げられる。
【０１０１】
シャペロンタンパク質と核内受容体との結合量は、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合量と同様にして測定できる。
【０１０２】
試験物質が、ＣＨＩＰによる核内受容体のユビキチン化を抑制できるか否か又は促進できるか否かは、例えば、次のようにして判別できるが、判別方法はこれに限定されるものではない。
【０１０３】
シャペロンタンパク質を介してＣＨＩＰと核内受容体とを結合させた後、試験物質の存在下又は不存在下でユビキチンと反応させて核内受容体のユビキチン化量を測定し、試験物質の存在下におけるユビキチン化量と試験物質の不存在下におけるユビキチン化量とを比較する。その結果、試験物質の存在下におけるユビキチン化量が試験物質の不存在下におけるユビキチン化量よりも少なければ、試験物質が、ＣＨＩＰによる核内受容体のユビキチン化を抑制できると判別できる。一方、試験物質の存在下におけるユビキチン化量が試験物質の不存在下におけるユビキチン化量よりも多ければ、試験物質が、ＣＨＩＰによる核内受容体のユビキチン化を促進できると判別できる。
【０１０４】
細胞内における核内受容体の分解は、ＣＨＩＰによる核内受容体のユビキチン化を経て進行する（例えば、細胞内におけるエストロゲン受容体の分解は、ＣＨＩＰによる核内受容体のユビキチン化を経て進行する）ので、ＣＨＩＰによる核内受容体のユビキチン化を抑制できる物質は核内受容体分解抑制作用を有する可能性があり、ＣＨＩＰによる核内受容体のユビキチン化を促進できる物質は核内受容体分解促進作用を有する可能性がある。したがって、ＣＨＩＰによる核内受容体のユビキチン化を抑制できる物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングでき、ＣＨＩＰによる核内受容体のユビキチン化を促進できる物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングできる。
【０１０５】
ＣＨＩＰによる核内受容体のユビキチン化を抑制又は促進できる物質は、ＣＨＩＰ、核内受容体及びユビキチンのいずれか１種類に作用する物質であってもよいし、２種類以上に作用する物質であってもよい。ＣＨＩＰによる核内受容体のユビキチン化を抑制できる物質には、ＣＨＩＰのユビキチン化作用を抑制できる物質、核内受容体とユビキチンとの結合を抑制できる物質等が含まれる。
【０１０６】
ユビキチンとの反応は、in vitroで行ってもよいし、in vivoで行ってもよい。
【０１０７】
in vitroで反応させる場合、ＣＨＩＰ、シャペロンタンパク質、核内受容体及びユビキチンとして、（i）目的とするタンパク質を発現している細胞又は組織から抽出した内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、当該形質転換体の培養物から抽出した組換えタンパク質、（iii）化学合成したペプチド等を使用できる。
【０１０８】
in vivoで反応させる場合、ＣＨＩＰ、シャペロンタンパク質、核内受容体及びユビキチンとして、（i）細胞内に存在する内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入することにより作製された形質転換体内に存在する組換えタンパク質等を使用できる。
【０１０９】
in vitro又はin vivoで反応させる際、ＣＨＩＰとしては、野生型ＣＨＩＰ、変異型ＣＨＩＰ、野生型ＣＨＩＰ又は変異型ＣＨＩＰの誘導体、野生型ＣＨＩＰ又は変異型ＣＨＩＰと他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質等を使用できる。シャペロンタンパク質、核内受容体及びユビキチンについても同様である。
【０１１０】
in vitro又はin vivoで反応させる際、ＣＨＩＰによる核内受容体のユビキチン化に影響を与える条件を調節し、ＣＨＩＰによる核内受容体のユビキチン化が試験物質の有無に依存するようにする。
【０１１１】
ＣＨＩＰによる核内受容体のユビキチン化に影響を与える条件としては、例えば、温度、溶媒の種類、ユビキチン転移系タンパク質Ｅ１及びＥ２の有無、ＣＨＩＰの濃度、シャペロンタンパク質の濃度、ユビキチンの濃度、核内受容体の濃度、Ｅ１及びＥ２の濃度、Ｅ２の種類、核内受容体の種類、核内受容体の翻訳後修飾の有無と種類等が挙げられる。ＣＨＩＰによる核内受容体のユビチキン化には、ユビキチン転移系タンパク質Ｅ１（ユビキチン活性化酵素）及びＥ２（ユビキチン結合酵素）が必要である。したがって、ＣＨＩＰによる核内受容体のユビキチン化の際、Ｅ１及びＥ２を共存させる。
【０１１２】
反応温度は、例えば、０〜５０℃に設定できる。反応溶媒としては、例えば、１価又は２価の塩類を含むｐＨ５．５〜８．５の緩衝液；エタノール、エチレングリコール、グリセリン、ＤＭＳＯ等を添加して疎水性を調節した緩衝液等を使用できる。ＣＨＩＰの濃度、シャペロンタンパク質の濃度、核内受容体の濃度は、ユビキチンの濃度、Ｅ１の濃度及びＥ２の濃度は、例えば０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌに設定できる。核内受容体の翻訳後修飾としては、例えば、リン酸基、メチル基、アセチル基等による翻訳後修飾が挙げられる。
【０１１３】
ＣＨＩＰによる核内受容体のユビキチン化量は、例えば、核内受容体とユビキチンとの結合量を指標として測定できる。核内受容体とユビキチンとの結合量は、例えば、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合量と同様にして測定できる。
【０１１４】
試験物質がＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制できるか否か又は促進できるか否かは、例えば、次のようにして判別できるが、判別方法はこれに限定されるものではない。
【０１１５】
in vivoにおいては、例えば、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする遺伝子が発現しているモデル動物に試験物質を投与した後、モデル動物から検体（ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする遺伝子が発現している細胞又は組織）を採取し、当該検体における当該遺伝子の発現レベルを測定し、試験物質の投与前における発現レベルと試験物質の投与後における発現レベルとを比較する。その結果、試験物質の投与後における発現レベルが試験物質の投与前における発現レベルよりも小さければ、試験物質が当該遺伝子の発現を抑制できると判別できる。一方、試験物質の投与後における発現レベルが試験物質の投与前における発現レベルよりも大きければ、試験物質が当該遺伝子の発現を促進できると判別できる。
【０１１６】
モデル動物としては、例えば、ヒト以外の哺乳動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス等）、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする遺伝子を人為的に発現させたトランスジェニック動物を使用できる。トランスジェニック動物は、例えば、(i) ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする遺伝子と卵とを混合してリン酸カルシウムで処理する方法、(ii) 位相差顕微鏡下で前核期卵の核にＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法）、(iii) 胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いる方法等の公知の方法によって作製できる。
【０１１７】
in vitroにおいては、例えば、検体（ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする遺伝子が発現している細胞又は組織）に試験物質を接触させた後、当該検体における当該遺伝子の発現レベルを測定し、試験物質の投与前における発現レベルと試験物質の投与後における発現レベルとを比較する。その結果、試験物質の投与後における発現レベルが試験物質の投与前における発現レベルよりも小さければ、試験物質が当該遺伝子の発現を抑制できると判別できる。一方、試験物質の投与後における発現レベルが試験物質の投与前における発現レベルよりも大きければ、試験物質が当該遺伝子の発現を促進できると判別できる。
【０１１８】
試験物質を接触させる細胞としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット等由来の細胞株、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする遺伝子を人為的に発現させた細胞を使用できる。このような細胞は、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、当該ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより作製できる。
【０１１９】
細胞内における核内受容体の分解は、シャペロンタンパク質を介したＣＨＩＰと核内受容体との結合を経て進行するので、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制できる物質は核内受容体分解抑制作用を有する可能性があり、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進できる物質は核内受容体分解促進作用を有する可能性がある。したがって、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制できる物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングでき、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進できる物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングできる。
【０１２０】
ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制又は促進できる物質は、当該遺伝子の転写過程及び翻訳過程の一方を抑制又は促進できる物質であってもよいし、両方を抑制又は促進できる物質であってもよい。
【０１２１】
ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルには、当該遺伝子のｍＲＮＡへの転写レベル及びタンパク質への翻訳レベルが含まれる。したがって、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルは、ｍＲＮＡの存在量又はタンパク質の存在量に基づいて測定できる。
【０１２２】
ｍＲＮＡの存在量の測定にあたっては、公知の遺伝子解析技術、例えば、ハイブリダイゼーション技術（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法等）、遺伝子増幅技術（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ等）等を利用できる。
【０１２３】
ハイブリダイゼーション技術を利用する際には、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードするｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプローブとして利用でき、遺伝子増幅技術を利用する際には、当該オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプライマーとして利用できる。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドのいずれであってもよい。オリゴヌクレオチドの塩基長は特に限定されないが、通常７〜１００塩基、好ましくは１５〜５０塩基である。また、ポリヌクレオチドの塩基長は特に限定されないが、通常３０〜１５００塩基、好ましくは５０〜１０００塩基である。
【０１２４】
オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードするｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等に特異的にハイブリダイズできることが好ましい。「特異的にハイブリダイズできる」とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできることを意味し、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、４２℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件、好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件が挙げられる。
【０１２５】
ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードするｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基配列は、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする核酸の塩基配列に基づいて設計できる。プライマーの５'末端側には制限酵素認識配列、タグ等を付加でき、プライマー及びプローブには、蛍光色素、ラジオアイソトープ等の標識を付加できる。
【０１２６】
ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードするｍＲＮＡの存在量の具体的測定方法について、ＲＴ−ＰＣＲを利用する場合を例にして説明する。検体から全ＲＮＡを抽出し、抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードするｃＤＮＡにハイブリダイズできるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅断片を定量することによって、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードするｍＲＮＡの存在量を測定できる。この際、ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅断片生成量が初期鋳型ｃＤＮＡ量を反映するような条件（例えば、ＰＣＲ増幅断片が指数関数的に増加するＰＣＲサイクル数）で行う。
【０１２７】
ＰＣＲ増幅断片の定量方法は特に限定されるものではなく、ＰＣＲ増幅断片の定量には、例えば、ラジオアイソトープ（ＲＩ）を用いた定量方法、蛍光色素を用いた定量方法等を利用できる。
【０１２８】
ＲＩを用いた定量方法としては、例えば、(i) 反応液にＲＩ標識したヌクレオチド（例えば32Ｐ標識されたｄＣＴＰ等）を基質として加えておき、ＰＣＲ増幅断片に取り込ませてＰＣＲ増幅断片をＲＩ標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、(ii) ＲＩ標識したプライマーを用いることによりＰＣＲ増幅断片をＲＩ標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、(iii) ＰＣＲ増幅断片を電気泳動した後、メンブランにブロッティングし、ＲＩ標識したプローブをハイブリダイズさせ、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法等が挙げられる。放射活性は、例えば、液体シンチレーションカウンター、Ｘ線フィルム、イメージングプレート等を用いて測定できる。
【０１２９】
蛍光色素を用いた定量方法としては、(i) 二本鎖ＤＮＡにインターカレートする蛍光色素（例えば、エチジウムブロマイド（EtBr）、SYBR GreenI、PicoGreen等）を用いてＰＣＲ増幅断片を染色し、励起光の照射によって発せられる蛍光強度を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、(ii) 蛍光色素で標識したプライマーを用いることによりＰＣＲ増幅断片を蛍光色素で標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、蛍光強度を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法等が挙げられる。蛍光強度は、例えば、ＣＣＤカメラ、蛍光スキャナー、分光蛍光光度計等を用いて測定できる。
【０１３０】
ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質の存在量の測定にあたっては、公知のタンパク質解析技術、例えば、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質に反応できる抗体又はその断片を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、組織免疫染色法等を利用できる。
【０１３１】
ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質に反応できる抗体又はその断片を用いて、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質の存在量を測定する際には、例えば、放射能免疫測定法(RIA)、酵素免疫測定法(EIA)、化学発光測定法（CLIA）、蛍光免疫測定法(FIA)、組織免疫染色法等を利用できる。具体的には、物理吸着や化学結合等により抗体を結合させた固相担体（例えば、イムノプレート、ラテックス粒子等）を用いて、検体中のＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質を捕捉した後、捕捉されたＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質を、固相担体に固定化した抗体とはＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質に対する抗原認識部位が異なる標識化抗体（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、フロレッセンス、ウンベリフェロン等の蛍光物質等で標識した抗体）を用いて定量できる。
【０１３２】
ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質の存在量の測定は、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質の活性を測定することによって行うこともできる。ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質の活性は、例えば、ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質に反応できる抗体又はその断片を利用したウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法等の公知の方法によって測定できる。
【０１３３】
ＣＨＩＰ又はシャペロンタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルの測定値は、発現レベルが大きく変動しないタンパク質（例えば、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ）をコードする遺伝子の発現レベルの測定値に基づいて補正することが好ましい。
【０１３４】
目的とするタンパク質（例えば、ＣＨＩＰ、シャペロンタンパク質、核内受容体、ユビキチン等）を発現できる組換えベクターは、例えば、目的とするタンパク質のコード領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製し、このＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより作製できる。目的とするタンパク質のコード領域の塩基配列は、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように塩基を置換しておくことが好ましい。上記ＤＮＡ断片は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であり、ベクターは、プロモーターの他、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を含有できる。
【０１３５】
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用できる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pRSET、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、pUB110、pTP5）、酵母由来のプラスミド（例えば、YEp13、YEp24、YCp50）が挙げられ、ファージベクターとしては、例えば、λファージ（例えば、Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）が挙げられ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスが挙げられる。
【０１３６】
組換えベクターを導入する宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等を使用できる。また、動物個体、植物個体、カイコ虫体等を使用してもよい。
【０１３７】
宿主細胞として使用できる細菌としては、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。具体的には、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli K12、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101等の大腸菌や、Bacillus subtilis MI 114、Bacillus subtilis 207-21等の枯草菌が挙げられる。この場合のプロモーターは、大腸菌等の細菌中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターや、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターを使用できる。
【０１３８】
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入できる方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を使用できる。
【０１３９】
宿主細胞として使用できる酵母としては、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomycescerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等が挙げられる。この場合のプロモーターは、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等を使用できる。
【０１４０】
酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入できる方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を使用できる。
【０１４１】
宿主細胞として使用できる動物細胞としては、例えば、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等が挙げられる。この場合のプロモーターは、動物細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTR(Long Terminal Repeat)プロモーター、CMVプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を使用できる。
【０１４２】
動物細胞への組換えベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入できる方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を使用できる。
【０１４３】
宿主細胞として使用できる昆虫細胞としては、例えば、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等が挙げられる。Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21等、Trichoplusia niの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyx mori N4等が挙げられる。
【０１４４】
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入できる限り特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を使用できる。
【０１４５】
組換えベクターを宿主細胞に導入することにより作製された形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【０１４６】
大腸菌や酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、該微生物が資化できる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地及び合成培地のいずれを使用してもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を使用できる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物等を使用できる。無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を使用できる。
【０１４７】
形質転換体の培養は、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は通常３０〜３７℃、培養時間は通常１２〜１６時間であり、培養期間中はｐＨを６．０〜８．０に保持する。ｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。また、培養の際、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１４８】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【０１４９】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、EagleのMEM培地、α-MEM培地、DMEM培地又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を使用できる。形質転換体の培養は、通常５％ＣＯ２存在下、３０〜３７℃で１〜７日間行う。また、培養の際、必要に応じてカナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ブラストサイジン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１５０】
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地（ファーミンジェン社製）、TC-100 培地 (Gibco BRL社製)、Sf-900 II SFM培地（Gibco BRL社製）、ExCell400、ExCell405（JRHバイオサイエンシーズ社製）等を使用できる。形質転換体の培養は、通常２５〜２８℃で４８〜９６時間行う。また、培養の際、必要に応じてゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１５１】
目的とするタンパク質は、形質転換体の培養物から抽出できる。ここで、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞又は菌体の破砕物のいずれもが含まれる。目的とするタンパク質が形質転換体の細胞内に蓄積される場合、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に細胞を破砕して、目的とするタンパク質を抽出できる。目的とするタンパク質が形質転換体の細胞外に分泌される場合、培養上清から目的とするタンパク質を抽出できる。抽出したタンパク質は、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法等を利用して精製できる。
【０１５２】
目的とするタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等を利用して化学合成できる。この際、市販のペプチド合成機を使用できる。
【０１５３】
目的とするタンパク質は、in vitro転写・翻訳系を利用して合成できる。in vitro転写・翻訳系は、in vitroにおいて核酸からｍＲＮＡへの転写を行うことができるin vitro転写系と、in vitroにおいてｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を行うことができるin vitro翻訳系とからなり、in vitro転写・翻訳系には、転写及び翻訳に必要な全ての要素（例えば、ポリメラーゼ、リボソーム、ｔＲＮＡ等）が含まれる。in vitro転写・翻訳系の具体例としては、真核細胞及び原核細胞の抽出液から調製された無細胞転写・翻訳系が挙げられ、無細胞転写・翻訳系の具体例としては、大腸菌（例えば大腸菌Ｓ３０）、小麦胚芽、ウサギ網赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、出芽酵母等の細胞抽出液から調製された無細胞転写・翻訳系が挙げられる。
【０１５４】
目的とする遺伝子（例えば、ＣＨＩＰをコードする遺伝子、シャペロンタンパク質をコードする遺伝子、核内受容体をコードする遺伝子、ユビキチンをコードする遺伝子）は、例えば、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングすることにより得ることができる。
【０１５５】
ｃＤＮＡライブラリーを作製する際には、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット等）の細胞又は組織から全ＲＮＡを得た後、オリゴｄＴ−セルロースやポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法、バッチ法等によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。この際、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分画してもよい。次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製し、該組換えベクターを用いて大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択することにより、ｃＤＮＡのライブラリーを得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターは、宿主細胞中で自立複製できるものであればよく、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター等を使用できる。宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等を使用できる。
【０１５６】
ｃＤＮＡライブラリーの作製にあたっては、市販のキット、例えば、SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning（Gibco BRL社製）、ZAP-cDNA Synthesis Kit（ストラタジーン社製）等を使用できる。
【０１５７】
ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングする際には、目的とする遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ＰＣＲ増幅断片を得る。ＰＣＲ増幅断片は、適当なプラスミドベクターを用いてサブクローニングしてもよい。
【０１５８】
ｃＤＮＡライブラリーに対して、ＰＣＲ増幅断片をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、目的とするＤＮＡを得ることができる。プローブとしては、ＰＣＲ増幅断片をアイソトープ（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ）、ビオチン、ジゴキシゲニン等で標識したものを使用できる。目的とするＤＮＡを含むクローンは、抗体を用いたイムノスクリーニング等の発現スクリーニングによっても得ることができる。
【０１５９】
取得されたＤＮＡの塩基配列は、ＤＮＡ断片をそのまま、又は適当な制限酵素等で切断した後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法を用いて決定できるが、通常は、３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（Perkin Elmer社製）等の塩基配列分析装置を用いて配列決定する。
【０１６０】
目的とする遺伝子は、その塩基配列に従って化学合成できる。ＤＮＡの化学合成は、市販のＤＮＡ合成機、例えば、チオホスファイト法を利用したＤＮＡ合成機（島津製作所社製）、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機（パーキン・エルマー社製）を用いて行うことができる。
【０１６１】
変異型ＣＨＩＰ、変異型シャペロンタンパク質、変異型核内受容体等をコードする遺伝子は、野生型ＣＨＩＰ、野生型シャペロンタンパク質、野生型核内受容体等をコードする遺伝子に人為的に変異を導入する公知の方法、例えば、部位特異的変異誘発法等を使用できる。変異の導入は、例えば、変異導入用キット、例えば、Mutant-K（TAKARA社製）、Mutant-G（TAKARA社製）、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて行うことができる。
【０１６２】
目的とするタンパク質に反応できる抗体は、目的とするタンパク質を免疫用抗原として利用することより作製できる。
ポリクローナル抗体の作製にあたっては、免疫用抗原を用いて、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の哺乳動物を免疫する。免疫の際には、抗体産生を誘導するために、フロイント完全アジュバント等の免疫助剤を用いてエマルジョン化した後、複数回免疫する。免疫助剤としては、フロイント完全アジュバント(FCA)の他、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムゲル等を利用できる。哺乳動物１匹当たりの抗原の投与量は、哺乳動物の種類に応じて適宜設定できる。投与部位は、例えば、静脈内、皮下、腹腔内等である。最終免疫日から数日後に、目的とするタンパク質に対する抗体力価を測定し、抗体力価が上昇した後に採血し、抗血清を得る。抗体力価の測定は、酵素免疫測定法(ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)等により行うことができる。
【０１６３】
抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用できる。
【０１６４】
モノクローナル抗体の作製にあたっては、ポリクローナル抗体の場合と同様に免疫用抗原を用いて哺乳動物を免疫し、最終免疫日から数日後に抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が一般的に利用される。
【０１６５】
次いで、ハイブリドーマを得るために、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、ヒト、マウス等の哺乳動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を利用できる。利用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態では選択培地(例えばHAT培地)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、P3X63-Ag.8.U1（P3U1）、P3/NSI/1-Ag4-1、Sp2/0-Ag14等のマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
【０１６６】
細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地等の動物細胞培養用培地中に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを所定の割合で混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤の存在下で、又は電気パルス処理(例えばエレクトロポレーション)により融合反応を行う。
【０１６７】
細胞融合処理後、選択培地を用いて培養し、目的とするハイブリドーマを選別する。次いで、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法 (ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)等によってスクリーニングできる。
【０１６８】
ハイブリドーマのクローニングは、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等により行うことができ、最終的にモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得する。取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法等を利用できる。      
【０１６９】
モノクローナル抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用できる。
【０１７０】
本発明でスクリーニングされた核内受容体分解抑制物質又は核内受容体分解促進物質は、核内受容体リガンド非結合型核内受容体の核内受容体リガンド非依存的な分解を抑制又は促進する物質であり、本発明でスクリーニングされた核内受容体分解抑制物質又は核内受容体分解促進物質は、骨粗鬆症、肥満、糖尿病、高脂血症、更年期障害、ホルモン依存性癌その他のホルモン性疾患等の予防・治療に有用である。
【実施例】
【０１７１】
以下の試験例において、細胞の培養、組換えベクターの構築、一過性トランスフェクション、細胞核抽出液の調製、ＧＳＴプルダウン、免疫沈降及びウェスタンブロッティングは次のように行った。
【０１７２】
（１）細胞の培養
ＨｅＬａ細胞、ヒト乳癌由来ＭＣＦ−７細胞及びヒト胎児腎由来２９３細胞は、１０％ ＦＣＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で５％（分圧）の炭酸ガスを含む加湿空気中、３７℃で培養した。
【０１７３】
（２）組換えベクターの構築
ＣＨＩＰをコードする全長ｃＤＮＡ（配列番号１）をｐＣＤＮＡ３（invitrogen社製）に挿入して組換えベクターを構築した。また、ＥＲα又はＥＲαの欠失変異体をコードするｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ３に挿入して組換えベクターを構築した。
【０１７４】
（３）一過性トランスフェクション
目的とするＤＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ培地（Life Technologies, Inc.）１００μＬで希釈した。ＤＮＡ量はブランクのベクターを補って総量１μｇに調節した。リポフェクタミン試薬（Life Technologies, Inc.）１０μＬも同様にＯｐｔｉＭＥＭ培地１００μＬで希釈した。室温で５分静置した後、両液を混合してさらに２０分間静置して複合体を形成させた。次いで、１２穴プレートに播種し、０．２％活性炭処理ＦＣＳを含有するＤＭＥＭで４０〜５０％コンフレントまで培養した細胞に、この混合液を直接滴下してトランスフェクションを行った。トランスフェクション６時間後に通常の培地に交換し、さらに２４時間培養してからリガンドを添加した。
【０１７５】
（４）細胞核抽出液の調製
細胞核抽出液の調製は公知の方法（Yanagisawa, J. et. al., Molecular Cell (2002) Mar : 9(3) : 553-562）に修正を加えて行った。
【０１７６】
（５）ＧＳＴプルダウン及び免疫沈降
ＧＳＴプルダウンは公知の方法（Yanagisawa, J. et. al., Molecular Cell (2002) Mar : 9(3) : 553-562）に従って行った。約５０μｇのＭＣＦ−７細胞核抽出液又は２９３細胞核抽出液をそれぞれ５０μｇのグルタチオンセファロースビーズ又は抗Ｆｌａｇタグ抗体（Santa Cruz Biotechnology）ビーズとともに０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有する２５ｍＭ トリス緩衝生理食塩水（Ｔ−ＴＢＳ）中、４℃で１時間インキュベートした。タンパク質が結合したビーズを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有する２５ｍＭ トリス緩衝生理食塩水で４回洗浄し、５０００回転で１分間遠心分離してビーズを回収した。ビーズからのタンパク質の溶出は、ローディング緩衝液中で煮沸して行った。
【０１７７】
（６）ウェスタンブロッティング
各抗体を用いたウェスタンブロッティングは、公知の方法（Yanagisawa, J. et. al., Molecular Cell (2002) Mar : 9(3) : 553-562）に若干の変更を加えて行った。ＭＣＦ−７細胞又は２９３細胞の各抽出液１０μｇを８％又は１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、次いでニトロセルロース膜に転写した。その膜を、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する２５ｍＭトリス緩衝生理食塩水（Ｔ−ＴＢＳ）中に１％ＢＳＡ（bovine serum albumin）及び５％スキムミルクを加えたブロッキング溶液中で１時間インキュベートし、次いで２５℃で１時間、各抗体と反応させた。２５℃のＴ−ＴＢＳで３回、各１０分間洗浄後、膜をペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体とともに２５℃で１分間インキュベートした。抗体と反応したタンパク質は、アマシャム・ファルマシア社製の高感度化学発光検出システム（ＥＣＬ）を用いて可視化した。
【０１７８】
〔試験例１〕エストロゲン受容体α（ＥＲα）のエストロゲン非存在下における分解
エストロゲン存在下及び非存在下におけるエストロゲン受容体α（ＥＲα）のユビキチン化と分解を調べる目的で、ＭＣＦ−７細胞を１０ｎＭ エストロゲン存在下及び非存在下で２４時間培養後、核抽出液を調製し、抽出液中のＥＲα量及びユビキチン化量を測定した。核抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し抗ＥＲα抗体を用いたウェスタンブロッティングを行ったところ、培地にエストロゲンを添加した場合にＥＲα量が顕著に減少した（図１（ｂ）のレーン２参照）。これは、ＭＣＦ−７細胞にエストロゲン依存的なＥＲα分解機構が備わっていることを示す。ところが、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２を１μＭの濃度で培地に添加したところ、培地にエストロゲンを添加した場合（図１（ｂ）のレーン４参照）のみならず、培地にエストロゲンを添加しなかった場合（図１（ｂ）のレーン３参照）にもＥＲα量が顕著に増加した。この事実は、ＭＣＦ−７細胞にはエストロゲン非存在下でもＥＲαを分解する機構が備わっていることを示唆している。
【０１７９】
この分解がユビキチン化によるものであるか否かを確認する目的でＭＣＦ−７細胞核抽出液から免疫沈降法でＥＲαを精製後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開して抗ユビキチン抗体（抗Ｕｂ抗体）でウェスタンブロッティングを行い、ＥＲαのユビキチン化量を測定した。その結果、培地にエストロゲンを添加した場合（図１（ａ）のレーン４参照）のみならず、培地にエストロゲンを添加しなかった場合（図１（ａ）のレーン３参照）にもユビキチン化ＥＲα（ＥＲα−Ｕｂ）が検出された。
以上の結果から、これまで知られていなかったエストロゲン非依存的なＥＲα分解機構が存在することが示された。
【０１８０】
〔試験例２〕ＥＲαΔＡＤもエストロゲン非依存的分解を受けることを示す試験
ＥＲαのエストロゲン依存的及び非依存的な分解の機構を調べる目的で、まず、２種類の分解が同一の機構によるものか否かをＥＲαの欠失変異体を用いて調べた。ＥＲαのエストロゲン依存的な分解には、ＥＲαの分解に関与する因子との結合のために、ＥＲαのアミノ酸番号５３５以降が必要であることが発明者らの研究で明らかになっている。そこで、ＥＲαの欠失変異体として、ＥＲαのアミノ酸番号５３５以降の部分（ヘリックス１２部分）を欠失させたＥＲαΔＡＤを用いた。ＥＲα△ＡＤは、リガンドと結合するが、リガンドが結合しても転写活性に必要な構造変化は誘起されない。２９３細胞にＥＲαΔＡＤを発現させ、１０ｎＭ エストロゲン存在下及び非存在下での分解を測定した。その結果、ＥＲαΔＡＤは、エストロゲン依存的分解は受けないが（図２のレーン３参照）、エストロゲン非依存的分解は受けることが明らかになった（図２のレーン１参照）。
【０１８１】
また、この分解は全長ＥＲαの場合と同様１μＭ ＭＧ１３２（プロテアソーム抑制剤）添加で阻害されることから（図２のレーン２及び４参照）、プロテアソームによるものであることが明らかになった。
以上の結果から、ＥＲαのエストロゲン依存的分解とエストロゲン非依存的分解は異なる分子機構によって促進されていることが示唆された。
【０１８２】
ＭＧ１３２に対する反応性から、ＥＲαΔＡＤのエストロゲン非依存的分解もユビキチン化からプロテオソームに至る経路によるものであることが示唆されたが、確認のためにＥＲαΔＡＤのユビキチン化を検出した。２９３細胞にＦｌａｇタグ−ＥＲαΔＡＤ融合タンパク質（Ｆｌａｇ−ＥＲα△ＡＤ）を発現させ、エストロゲン及びＭＧ１３２存在下で培養した後、核抽出液を調製し、抗Ｆｌａｇタグ抗体で免疫沈降を行った後、回収されたタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で展開し、抗ユビキチン抗体（抗Ｕｂ抗体）を用いたウェスタンブロッティングでユビキチン化ＥＲαΔＡＤ（Ｆｌａｇ−ＥＲα△ＡＤ−Ｕｂ）を検出した。その結果、エストロゲン非添加及びＭＧ１３２添加の場合（図３のレーン３参照）に強いポリユビキチンタンパク質の蓄積が観察された。エストロゲン添加及びＭＧ１３２非添加の場合（図３のレーン４参照）にはバックグラウンドと同程度のシグナルしか得られなかった。
以上の結果から、ＥＲαΔＡＤのエストロゲン非依存的分解は、全長ＥＲαの場合と同様、ポリユビキチン化後プロテアソームで分解されることが明らかになった。
【０１８３】
〔試験例３〕ＥＲαのエストロゲン非依存的分解に必要な領域の決定
ＥＲαのエストロゲン非依存的分解をさらに詳細に分析する目的で、ＥＲαのどのドメインが分解に必要であるかを解析した。ＥＲαの系統的デリーション変異体遺伝子を、Ｆｌａｇタグ融合タンパクが発現されるように作製し、２９３細胞にトランスフェクトしてエストロゲン存在下及び非存在下での分解を、抗Ｆｌａｇタグ抗体を用いたウェスタンブロッティングで検出した。ＥＲαの欠失変異体としては、図４に示すように、アミノ酸番号１〜５３４からなるＥＲα△ＡＤ（１−５３４）、アミノ酸番号３７〜５３４からなるＥＲα△ＡＤ（３７−５３４）、アミノ酸番号７３〜５３４からなるＥＲα△ＡＤ（７３−５３４）、アミノ酸番号１７８〜５３４からなるＥＲα△ＡＤ（１７８−５３４）、アミノ酸番号２８１〜５３４からなるＥＲα△ＡＤ（２８１−５３４）を用いた。その結果、エストロゲン依存的分解を受けない変異体である各ＥＲαΔＡＤはエストロゲン非依存的分解を受けた（図４のレーン１参照）。また、ＥＲαをＮ末端からアミノ酸番号２８０まで欠失させてもリガンド非依存的分解は観察され（図４のレーン１参照）、リガンド非依存的分解に必要なＥＲαの部分はアミノ酸番号２８１−５３４に存在することが明らかになった。
【０１８４】
〔試験例４〕エストロゲン非依存的にＥＲαと結合するタンパク質の同定
ＨｅＬａ細胞核粗抽出液からエストロゲン非存在時にエストロゲン受容体と結合するタンパク質を分離・精製した。既報（Yanagisawa, J., et al., Molecular Cell 2002 Mar;9(3):553-62.）に従い、ホスホセルロースカラムから１．０Ｍ 塩化カリウムを含む緩衝液で溶出するタンパク質画分を、ＥＲαのリガンド結合ドメインとＧＳＴの融合タンパク質固定したグルタチオンセファロースビーズ（アマシャム・ファルマシア社製）カラム（１００ｍＭ ＫＣｌを含む緩衝液で平衡化）に添加し、洗浄と溶出を行った。溶出画分を７．５％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で展開し、ＣＢＢ染色後各バンドを切り出した（図５参照）。切り出したバンドからタンパク質を溶出し、トリプシン分解後ＭＡＲＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（パーセプティブ社製ボイジャー）でＭＳフィンガープリントを得た。得られたフィンガープリントを公開データベース（カリフォルニア大学）で検索したところ、既知のヒートショックタンパク質であるＨｓｃ７０と一致した。ユビキチンリガーゼに特徴的なＵ−ｂｏｘを持つタンパクであるＣＨＩＰ（carboxyl-terminus of Hsc70 interacting protein）がＨｓｃ７０と結合することが知られている（Meacham, GC. et al. The Hsc70 co-chaperone CHIP targets immature CFTR for preteasomal degradation, Nat. Cell Biol.. 3, 100-105, 2001）ことから、ＥＲαのエストロゲン非依存的分解にＣＨＩＰが関与しているとの仮説を立てた。
【０１８５】
〔試験例５〕エストロゲン非存在下におけるＥＲαとＣＨＩＰの結合
ＣＨＩＰがリガンド非依存的にＥＲαと結合することを証明する目的で、免疫沈降実験を行った。２９３細胞にＥＲα遺伝子とＦｌａｇタグ−ＣＨＩＰ融合タンパク遺伝子を一過性にトランスフェクトし、リガンドを添加せず、又は１０ｎＭ エストロゲン、１μＭ タモキシフェン（ＯＨＴ）、１００ｎＭ フルベストラント（ＩＣＩ）の各リガンドを添加して２４時間培養し、核抽出液から抗Ｆｌａｇタグ抗体でＣＨＩＰと結合したタンパク質複合体を免疫沈降した。回収したタンパク質画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で展開し、抗ＥＲα抗体又は抗Ｆｌａｇタグ抗体でウェスタンブロッティングを行い、タンパク質を検出した。その結果、リガンドを添加せずに培養した場合のみＥＲαはＣＨＩＰと共沈し（図６のレーン２参照）、ＣＨＩＰがリガンド非依存的にＥＲαと結合することが明らかになった。
【０１８６】
〔試験例６〕ＣＨＩＰによるＥＲαのエストロゲン非依存的分解の促進
実際にＣＨＩＰがＥＲαの分解を促進することを確認するために、ＥＲαΔＡＤ、ＥＲα、ＣＨＩＰをそれぞれ強発現している２９３細胞をエストロゲン存在下及び非存在下で培養し、核抽出液を調製し、ウェスタンブロッティングでＥＲαΔＡＤ及びＥＲαの分解量を測定した。その結果、ＥＲαΔＡＤ及びＥＲαともにエストロゲンを添加しない場合に強く分解されていた（図７のレーン３参照）。この分解はＣＨＩＰの発現量を増やすと強くなり（図７のレーン５参照）、ＥＲαのリガンド非依存的な分解がＣＨＩＰによって行われていることが示唆された。
【０１８７】
〔試験例７〕ＥＲαの人工リガンドが結合したＥＲαの分解をＣＨＩＰは促進しないことを示す試験
ＣＨＩＰが、エストロゲンが結合したＥＲαに結合せず、分解しないことが明らかになったが、ＥＲαの人工リガンドであるタモキシフェン（ＯＨＴ）及びフルベストラント（ＩＣＩ）が結合したＥＲαを分解するか否かを確認した。すでに、図６に示したように、ＣＨＩＰがＯＨＴ又はＩＣＩが結合したＥＲαには結合しないことが明らかになっている。図６と同様、ＥＲαΔＡＤ、ＥＲα、ＣＨＩＰをそれぞれ強発現している２９３細胞を１μＭ ＯＨＴ又は１００ｎＭ ＩＣＩの存在下及び非存在下で２４時間培養し、核抽出液を調製してウェスタンブロッティングでＥＲαΔＡＤ及びＥＲαの分解量を測定した。その結果、エストロゲンの場合と同様にＯＨＴ又はＩＣＩを添加しない場合のみＥＲαの分解が検出された（図８（ａ）及び（ｂ）のレーン３参照）。この結果から、ＯＨＴ及びＩＣＩは、エストロゲンと異なりＥＲαの転写活性化を起こさないが、ＣＨＩＰによるＥＲαの分解をエストロゲン同様にブロックすることが明らかになった。ＯＨＴ及びＩＣＩはＥＲαと転写共役因子との相互作用を阻害して転写活性化を阻害するためエストロゲン依存性癌の治療薬として用いられているが、ＣＨＩＰとの相互作用に関してはエストロゲンと同様の作用を示す。
【０１８８】
〔試験例８〕ＣＨＩＰによるエストロゲン非依存的なＥＲαの分解が、細胞内ＥＲαの品質管理を担当していることを示す試験
正常型ＥＲα及びＥＲαのドミナントネガティブ変異体を共発現した細胞に、さらにＣＨＩＰ又はＣＨＩＰ△Ｕｂｏｘ（ユビキチンリガーゼ活性を消失させた変異体）を発現させ、ＥＲαの転写活性化能を測定した。すなわち、２９３細胞に、ＥＲα遺伝子を含むプラスミド、（２）ＥＲαのドミナントネガティブ変異体（４種類のいずれか）遺伝子を含むプラスミド、（３）ＣＨＩＰ遺伝子又はＣＨＩＰ△Ｕｂｏｘ遺伝子を含むプラスミド、（４）エストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）の下流にルシフェラーゼ遺伝子を接続したレポータープラスミドの４種類のプラスミドを一過的に導入し、エストロゲン添加時におけるＥＲαの転写活性化能を、ルシフェラーゼ活性を指標に測定した。この際、２９３細胞にＣＨＩＰ遺伝子又はＣＨＩＰ△Ｕｂｏｘ遺伝子を含むプラスミドを導入した後、エストロゲン非存在下で４８時間培養し、十分にＥＲαの分解が進むようにした。ルシフェラーゼ活性は、エストロゲンを投与してさらに１２時間培養した後、細胞を回収して測定した。また、同時に細胞抽出液中のＥＲα量をウェスタンブロッティングで測定した。なお、ＥＲαのドミナントネガティブ変異体としては、ＥＲα（Ｖ３６４Ｅ）、ＥＲα（Ｃ４４７Ａ）、ＥＲα△ＡＤ、ＥＲα（Ｌ５４０Ｑ）を用いた。ＥＲα（Ｖ３６４Ｅ）及びＥＲα（Ｃ４４７Ａ）は、リガンド結合領域に変異を持つ温度感受性変異体であり、タンパク質の正常な折り畳み構造を取れないために通常の生体内温度である３７℃では転写活性が低い。ＥＲα△ＡＤは、ヘリックス１２の欠失変異体であり、ＥＲα（Ｌ５４０Ｑ）は、ヘリックス１２の１残基置換変異体であり、それぞれ転写活性化因子と結合できなくなっているために転写活性が低い。ＥＲα△ＡＤ及びＥＲα（Ｌ５４０Ｑ）は温度感受性ではない。
【０１８９】
その結果、ＣＨＩＰを導入した細胞では、ＥＲα量は顕著に減少した（図９（ａ）のレーン２参照）。しかし、ＣＨＩＰ△Ｕｂｏｘを導入した細胞では、ＥＲα量の減少は見られなかった（図９（ａ）のレーン３参照）。また、ＣＨＩＰを導入した細胞では、ＥＲα量は減少しているにも関わらず（図９（ａ）のレーン２参照）、転写活性化能はほとんど変化しなかった（図９（ｂ）のレーン５参照）。そのため、ＥＲα量あたりの転写活性化能は増加した（図９（ｂ）のレーン６参照）。一方、ＣＨＩＰ△Ｕｂｏｘを導入した細胞では、転写活性化能（図９（ｂ）のレーン８参照）もＥＲα量あたりの転写活性化能（図９（ｂ）のレーン９参照）も変化しなかった。ＥＲα量あたりの転写活性化能が増加することは、ＣＨＩＰによってミスフォールディングや経時変化によって活性が低下したＥＲαが選択的に分解されたためではないかと考えられる。なお、図９（ａ）及び（ｂ）中、「ｎｏｎｅ」は、ＣＨＩＰ及びＣＨＩＰ△Ｕｂｏｘのいずれも導入していない場合の結果を示す。
【０１９０】
また、正常型ＥＲαを導入した細胞では、導入したＣＨＩＰの量に依存して転写活性化能はわずかに上昇した（図１０のレーン２〜４参照）。一方、温度感受性ドミナントネガティブ変異体であるＥＲα（Ｃ４４７Ａ）を導入し、ＣＨＩＰを導入していない場合の転写活性化能は、正常型ＥＲαを導入した場合と比較して顕著に低かった（図１０のレーン６参照）。しかし、ＣＨＩＰを導入すると転写活性化能は有意に上昇した（図１０のレーン７及び８参照）。変異によって安定性が低下したＥＲα（Ｃ４４７Ａ）では、不活性化したタンパク質が積極的に分解され、活性を維持したタンパク質が残るためドミナントネガティブ効果が解除され、転写活性化能が回復すると考えられる。
【０１９１】
また、ＥＲα（Ｖ３６４Ｅ）及びＥＲα（Ｃ４４７Ａ）は正常型ＥＲαと比較して有意にタンパク質量が低かった（図１１のレーン２及び３参照）。また、ＥＲα△ＡＤもわずかにタンパク質が減少していた（図１１のレーン４参照）。ところが、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２を細胞に投与してＥＲαの分解を阻害すると、それぞれの変異体の発現量は正常型ＥＲαと差が見られなかった（図１１のレーン１〜５参照）。
【０１９２】
また、ＣＨＩＰを導入することなく正常型ＥＲαとＥＲα変異体（mut.ERα）とを共発現させた場合、ＥＲα変異体がドミナントネガティブであるため全体の転写活性化能も低下した（図１２のレーン５参照）。ところが、ＣＨＩＰを導入すると、ＥＲα（Ｖ３６４Ｅ）及びＥＲα（Ｃ４４７Ａ）ではＣＨＩＰ発現量に依存して転写活性化能が回復した（図１２のレーン６及び７参照）。ＥＲα△ＡＤとＥＲα（Ｌ５４０Ｑ）ではこの効果は見られなかった（図１２のレーン６及び７参照）。ウェスタンブロッティングによるタンパク質量の測定で、２種類の変異体は正常型と比較して、より選択的に分解されることが明らかになった。ドミナントネガティブ変異体は正常型と共発現させると全体の転写活性化能を低下させてしまうが、選択的分解の顕著な変異体ではＣＨＩＰを発現させることで転写活性化能が回復する一方、ＣＨＩＰによる分解が顕著でない２種類の変異体では転写活性化能の回復も低いか観察できないことが明らかとなった。
【０１９３】
以上の結果から、ＣＨＩＰによるエストロゲン非依存的ＥＲα分解は翻訳時のミスフォールディングや経時変化によって本来のコンフォメーションがくずれ不活性型となったＥＲαを取り除いて細胞内ＥＲαの品質を維持する役割を担っていると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】（ａ）は、エストロゲンの存在下又は不存在下におけるユビキチン化ＥＲα（ＥＲα−Ｕｂ）の検出結果を示す図であり、（ｂ）は、エストロゲン又はプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２の存在下又は不存在下におけるエストロゲン受容体α（ＥＲα）の検出結果を示す図である。
【図２】エストロゲン又はプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２の存在下又は不存在下におけるエストロゲン受容体α（ＥＲα）又はその欠失変異体ＥＲαΔＡＤの検出結果を示す図である。
【図３】エストロゲン又はプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２の存在下又は不存在下におけるユビキチン化ＥＲαΔＡＤ（Ｆｌａｇ−ＥＲα△ＡＤ−Ｕｂ）の検出結果を示す図である。
【図４】エストロゲンの存在下又は不存在下におけるＥＲαの各種欠失変異体の検出結果を示す図である。
【図５】ＨｅＬａ細胞核粗抽出液からエストロゲン非存在時にエストロゲン受容体と結合するタンパク質を分離・精製した結果を示す図である。
【図６】リガンド（エストロゲン、タモキシフェン（ＯＨＴ）、フルベストラント（ＩＣＩ））の存在下又は不存在下におけるＥＲα及びＣＨＩＰの検出結果を示す図である。
【図７】エストロゲン又はＣＨＩＰの存在下又は不存在下におけるＥＲα又はＥＲαΔＡＤの検出結果を示す図である。
【図８】（ａ）は、ＯＨＴ又はＣＨＩＰの存在下及び非存在下におけるＥＲα又はＥＲαΔＡＤの検出結果を示す図であり、（ｂ）は、ＩＣＩ又はＣＨＩＰの存在下及び非存在下におけるＥＲα又はＥＲαΔＡＤの検出結果を示す図である。
【図９】（ａ）は、ＣＨＩＰ又はＣＨＩＰ△Ｕｂｏｘを導入した細胞におけるＥＲαの検出結果を示す図であり、（ｂ）ＣＨＩＰ又はＣＨＩＰ△Ｕｂｏｘを導入した細胞における転写活性及びＥＲα量あたりの転写活性を示す図である。
【図１０】正常型ＥＲα又は温度感受性ドミナントネガティブ変異体ＥＲα（Ｃ４４７Ａ）を導入した細胞の、エストロゲン又はＣＨＩＰの存在下又は不存在下における転写活性を示す図である。
【図１１】プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２の存在下又は不存在下におけるＥＲα、ＥＲα（Ｖ３６４Ｅ）、ＥＲα（Ｃ４４７Ａ）、ＥＲα△ＡＤ又はＥＲα（Ｌ５４０Ｑ）の検出結果を示す図である。
【図１２】正常型ＥＲαとＥＲα変異体（mut.ERα）とを共発現させた細胞の、ＣＨＩＰの存在下又は不存在下における転写活性を示す図である。
【図１０】
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【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【配列表】
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