(57)【要約】【課題】６−ヒドロキシピコリン酸を微生物学的に製造する方法を提供する。【解決手段】製造方法は、６−ヒドロキシピコリン酸が飽和溶解度を超えて析出した状態においても、ピコリン酸を６−ヒドロキシピコリン酸に変換する能力を有する微生物又はその処理物を用いて、ピコリン酸から６−ヒドロキシピコリン酸を微生物学的に製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピコリン酸から６−ヒドロキシピコリン酸を微生物学的に製造する方法において、６−ヒドロキシピコリン酸が飽和溶解度を超えて析出した状態においても、ピコリン酸を６−ヒドロキシピコリン酸に変換する能力を有する微生物又はその処理物を用いることを特徴とする、６−ヒドロキシピコリン酸の製造方法。
【請求項２】
前記微生物が、グルコースを資化する能力を有する微生物である、請求項１記載の６−ヒドロキシピコリン酸の製造方法。
【請求項３】
前記微生物が、シュードモナス属に属する微生物である請求項１又は２記載の６−ヒドロキシピコリン酸の製造方法。
【請求項４】
前記微生物がシュードモナス・プチダ  ＹＧＫ−７０３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７００）又はそれと同等の活性を有する変異体である請求項３記載の６−ヒドロキシピコリン酸の製造方法。
【請求項５】
シュードモナス・プチダ  ＹＧＫ−７０３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７００）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピコリン酸から６−ヒドロキシピコリン酸を微生物学的に製造する方法に関する。６−ヒドロキシピコリン酸は医薬中間体、農薬中間体、又は合成樹脂原料などとして用いられ、産業上有用な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
式（１）：
【化１】
2005323527.tif 000002
で表されるピコリン酸から、微生物学的手法によって式（２）：
【化２】
2005323527.tif 000003
で表される６−ヒドロキシピコリン酸を製造する方法は知られている（特開平４−３１６４９０号公報：特許文献１）。この特許文献１に記載の方法は、ピコリン酸から６−ヒドロキシピコリン酸を微生物学的に変換して蓄積させる方法であり、６−ヒドロキシピコリン酸がそれ以上代謝されないような濃度でピコリン酸又はその塩を供給することを特徴としている。その際のピコリン酸又はその塩の濃度は、１０ｗ／ｖ％を超えない濃度であり、好ましくは１ｗ／ｖ％以下であり、具体的には０．２２ｗ／ｖ％に保持することで、６−ヒドロキシピコリン酸を蓄積させている。なお、前記特許文献１には、種々の微生物の使用が可能である旨の記載があるが、具体的にはアルカリゲネス・フェーカリス（ＤＭＳ６２６９）を用いる方法のみが開示されているにすぎない。
また、前記特許文献１に記載の方法では、６−ヒドロキシピコリン酸の蓄積濃度は１０ｗ／ｖ％程度に止まり、実用的な工業的な製造方法とは言い難い。更に、アルカリゲネス属に属する微生物は、糖類の資化性を有しないため、炭素源として安価な培地成分である糖類を用いることができないという欠点がある。
更に、原料であるピコリン酸は金属キレート作用を有し、菌の生育に影響を与える。このため、ピコリン酸が培養液中に高濃度で存在する場合、菌の生育が停止し、変換酵素の失活に伴う反応速度の低下が生じる。また、６−ヒドロキシピコリン酸が培養液に高濃度で存在する場合においても、変換酵素の失活に伴う反応速度の低下が生じる。従って、６−ヒドロキシピコリン酸を高濃度、高収率で蓄積させるためには、６−ヒドロキシピコリン酸の蓄積能力を有する微生物を用い、培養液中のピコリン酸濃度を制御し、ピコリン酸から６−ヒドロキシピコリン酸への変換に関与する酵素活性を高く維持する必要がある。
【０００３】
【特許文献１】特開平４−３１６４９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、６−ヒドロキシピコリン酸が飽和溶解度を超えて析出した状態においても、ピコリン酸を６−ヒドロキシピコリン酸に変換する能力を有する微生物を用い、特にはグルコースを炭素源として培養することで、ピコリン酸を６−ヒドロキシピコリン酸に変換する酵素の生産効率を向上させ、培養液中のピコリン酸の濃度を酵素生産菌の生育を阻害させない濃度で供給することで、上記目的を達成することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従って、本発明は、ピコリン酸から６−ヒドロキシピコリン酸を微生物学的に製造する方法において、６−ヒドロキシピコリン酸が飽和溶解度を超えて析出した状態においても、ピコリン酸を６−ヒドロキシピコリン酸に変換する能力を有する微生物又はその処理物を用いることを特徴とする、６−ヒドロキシピコリン酸の製造方法に関する。
【０００６】
本発明方法の好ましい態様においては、前記微生物が、グルコースを資化する能力を有する微生物である。
本発明の更に好ましい態様においては、前記微生物が、シュードモナス属に属する微生物であり、特には、シュードモナス・プチダ  ＹＧＫ−７０３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７００）又はそれと同等の活性を有する変異体である。
【０００７】
更に、本発明は、シュードモナス・プチダ  ＹＧＫ−７０３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７００）にも関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明方法によれば、高濃度の６−ヒドロキシピコリン酸の存在下で増殖する能力を有する微生物を利用して、特にはグルコースを炭素源として培養することで、培養液中のピコリン酸の濃度を酵素生産菌の生育を阻害させない濃度で供給し、ピコリン酸を６−ヒドロキシピコリン酸に変換する酵素を生産させることで、きわめて高濃度、高収率で６−ヒドロキシピコリン酸を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明方法においては、出発原料としてピコリン酸を用い、６−ヒドロキシピコリン酸を得ることができる。ピコリン酸は、ピコリン酸そのものを使用してもよいし、ピコリン酸の塩を使用することもできる。ピコリン酸の塩としては、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、若しくはカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、マグネシウム塩、若しくはカルシウム塩）、又はアンモニウム塩などを挙げることができる。本明細書において、ピコリン酸に関する記載は、特に断らない限り、その塩を含むものとする。
【００１０】
本発明方法で使用する微生物は、６−ヒドロキシピコリン酸が飽和溶解度を超えて析出した状態においても、ピコリン酸を６−ヒドロキシピコリン酸に変換する能力を有する微生物であればその起源は問わない。すなわち、本発明方法で使用する微生物は、培養液内に存在する６−ヒドロキシピコリン酸濃度が飽和溶解度を超え、６−ヒドロキシピコリン酸が析出している状態においても、更にピコリン酸を６−ヒドロキシピコリン酸に変換する能力を有する。
【００１１】
更に、本発明方法で使用する微生物は、好ましくはグルコースを資化する能力を有する。ここで、「グルコースを資化する」とは、培養液中に存在するグルコースを炭素源として利用することのできる能力を有することを意味する。好ましくは、シュードモナス属に属する微生物を挙げることができ、更に具体的にはシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）  ＹＧＫ−７０３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７００）を例示することができる。本菌株は平成１６年２月２４日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に上記受託番号で寄託されている。
【００１２】
本発明方法で用いることのできるシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）  ＹＧＫ−７０３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７００）の菌学的性質は次のとおりである。
１．形態的・培養的性質（＋は陽性、−は陰性を表す。）
（１）細胞形態：桿菌
（２）幅：０．８〜１．０μｍ
（３）長さ：１．５〜２．０μｍ
（４）胞子：−
（５）運動性：＋
（６）コロニー形態
培地：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ
培養時間：２４時間
円形、全縁滑らか、凸状、光沢あり、淡黄色
【００１３】
２．生理学的性質（＋は陽性、−は陰性を表す。）
（１）グラム染色：−
（２）培養温度：３７℃  ＋、４５℃  −
（３）カタラーゼ：＋
（４）オキシダーゼ：＋
（５）酸／ガス産生（グルコース）：−／−
（６）Ｏ／Ｆテスト（グルコース）：−／−
（７）硝酸の還元：−
（８）インドール産生：−
（９）グルコース  酸化性：−
（10）アルギニンデヒドロゲナーゼ：＋
（11）ウレアーゼ：−
（12）エスクリン加水分解：−
（13）ゼラチン加水分解：−
（14）β−ガラクトシダーゼ：−
（15）各種化合物の資化性
グルコース：＋
Ｌ−アラビノース：−
Ｄ−マンノース：−
Ｄ−マンニトール：−
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：−
マルトース：−
グルコン酸カリウム：＋
ｎ−カプリン酸：＋
アジピン酸：−
ｄｌ−リンゴ酸：＋
クエン酸ナトリウム：＋
酢酸フェニル：＋
（16）チトクロームオキシダーゼ：＋
【００１４】
３．化学分類学的性質
本菌株よりゲノムＤＮＡを抽出し、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）のうち５’末端側約５００塩基の配列を解析し、ＤＮＡ塩基配列データベース〔ＭｉｃｒｏＳｅｑ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ５００  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｖ．００２３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）〕に対して相同性を検索したところ、本菌株はシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）の１６Ｓ  ｒＲＮＡとは相同率１００％であり、シュードモナス・プチダの１６Ｓ  ｒＲＮＡと一致した。
【００１５】
本発明方法に使用される微生物としては、前記のシュードモナス・プチダ  ＹＧＫ−７０３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７００）に突然変異処理を施し、６−ヒドロキシピコリン酸の生産性が増大したものを選択して用いてもよい。そのような突然変異株としては、ピコリン酸及び６−ヒドロキシピコリン酸に対する耐性の向上した変異株、６−ヒドロキシピコリン酸を分解しなくなった変異株、あるいはピコリン酸から６−ヒドロキシピコリン酸への変換に関与する酵素類の生産性の高い変異株などを挙げることができる。
【００１６】
培養液中のピコリン酸の濃度は、酵素生産菌の生育を阻害させない濃度であれば特に限定されるものではないが、ピコリン酸の濃度が１ｗ／ｖ％以上では微生物の生育が完全に阻害されるので、１ｗ／ｖ％未満の濃度であればよく、好ましくは０．３ｗ／ｖ％以下であり、更に好ましくは０．１ｗ／ｖ％以下が望ましい。
【００１７】
培養液中へのピコリン酸の供給方法としては、連続的でも、断続的でもよい。具体的には、定量ポンプを用いて供給を行い、高速液体クロマトグラフィーなどの分析機器によりピコリン酸及び６−ヒドロキシピコリン酸の濃度を確認しながら、供給速度を調整することができる。供給時のピコリン酸の濃度としては、特に限定されるものではないが、容積効率を考慮すると、できるだけ濃い濃度が望ましく、スラリー状でもかまわない。
【００１８】
前記微生物の培地は、通常、シュードモナス属に属する微生物が生育可能な培地であれば特に制限はなく、一般的な微生物用の任意の公知培地を用いることができる。培養時における前記微生物の生育及び／又は酵素生産に必要な窒素源としては、ピコリン酸のほか、グルタミン酸などのアミノ酸を挙げることができ、炭素源としては、グルコースのほか、クエン酸などの有機酸を挙げることができる。天然物由来の炭素源又は窒素源としては、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、及び／又は糖蜜などを挙げることができる。炭素源としてグルコースを使用する際には、グルコース又はその混合物を用いることができる。すなわち、グルコースそのものを用いてもよいし、又はグルコースを含有する糖蜜などの糖類を用いてもよい。
【００１９】
炭素源及び窒素源の供給方法としては、培養を開始する前に予め培養液に添加する方法でもよいが、炭素源及び窒素源が培養液中に蓄積しない程度に供給することで、ピコリン酸を６−ヒドロキシピコリン酸に変換する酵素の生産を抑制することなく、効率よく変換酵素を誘導、及び産生させることができる。
【００２０】
培養時における前記微生物の生育及び／又は酵素生産に必要な金属としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、モリブデン、銅、亜鉛、マンガン、コバルト、及び／又はニッケルなどを挙げることができる。その供給源としては、各金属塩又は天然物由来原料でもよく、特に限定されるものではない。金属の供給方法としては、培養を開始する前に予め培養液に添加する方法でもよいが、ピコリン酸溶液に添加することで、酵素の生産効率も向上し、反応速度、及び／又は蓄積濃度も向上させることができる。
【００２１】
培養温度は、前記微生物が生育する範囲であれば特に限定されるものではない。１０〜４０℃の範囲で可能であるが、生育速度及び酵素の安定性を考慮すると２０〜３０℃で行うことが好ましい。培養液のｐＨは、前記微生物が生育する範囲であれば特に限定されるものではない。ｐＨ５〜９の範囲で可能であり、酵素の安定性や生成物の分解を考慮するとｐＨ６．５〜７．５の範囲で行うことが好ましい。ｐＨの調整は、一般的に使用される塩酸、硫酸、及び／又は水酸化ナトリウムのほか、アミノ酸、有機酸、及び／又は基質であるピコリン酸を使用してもよく、特に限定されるものではない。
【００２２】
本発明方法においては、ピコリン酸に対して前記微生物自身を作用させてもよいし、又は前記微生物の処理物を作用させてもよい。微生物の処理物とは、物理的（例えば、超音波、又は遠心分離など）又は化学的（例えば、界面活性剤、又は有機溶媒など）処理により、微生物の膜構造を部分的又は全体的に破壊する操作を行って得られた、微生物の破砕物、粗酵素、又は精製酵素などを意味する。
【００２３】
以上のようにして得られた培養液から、必要に応じて、ろ過、又は遠心分離などにより微生物を除去した後、塩酸や硫酸などの酸溶液を加えて、６−ヒドロキシピコリン酸を沈殿させ、回収することができる。粗酵素、又は精製酵素などの処理物を使用した場合などでは菌体除去操作を省略することができる。また、クロマトグラフィーなどの公知の精製方法により６−ヒドロキシピコリン酸を回収することもできる。
【実施例】
【００２４】
以下に代表的な実施例を示し、本発明の具体的な説明を行うが、実施例は本発明を限定するものではない。実施例において使用するＨＰＬＣ分析条件及び培地を以下記載する。
（１）ＨＰＬＣ分析条件
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＭＧ（４．６×２５０ｍｍ）、
溶媒：水／アセトニトリル＝９５／５（ｖ／ｖ）（リン酸でｐＨ２．５に調整）、
流速：１ｍＬ／分、
温度：４０℃、
検出：ＵＶ２３６ｎｍ、
試料：１０μＬ、
保持時間：ピコリン酸３．１分、６−ヒドロキシピコリン酸５．８分。
【００２５】
（２）培地Ａ
ピコリン酸０．１ｇ、酵母エキス０．２５ｇ、リン酸二水素カリウム０．４ｇ、リン酸水素二カリウム０．４ｇ、塩化ナトリウム１．０ｇ、及び金属混合水溶液１ｍＬをイオン交換水１００ｍＬに溶解し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．５に調整する。
【００２６】
（３）金属混合水溶液
硫酸マグネシウム七水和物１．０ｇ、モリブデン（VI）酸二ナトリウム二水和物０．２ｇ、及び硫酸鉄（II）七水和物０．１ｇをイオン交換水１００ｍＬに懸濁させる。
【００２７】
（４）培地Ｂ
グルコース８ｇ、グルタミン酸ナトリウム８ｇ、ピコリン酸０．８ｇ、酵母エキス２ｇ、リン酸二水素カリウム３．２ｇ、リン酸水素二カリウム３．２ｇ、塩化ナトリウム０．４ｇ、硫酸マグネシウム七水和物４００ｍｇ、モリブデン（VI）酸二ナトリウム二水和物４０ｍｇ、及び硫酸鉄（II）七水和物４０ｍｇをイオン交換水８００ｍＬに溶解し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．５に調整する。
【００２８】
《実施例１》
培地Ａと同組成で１．５ｗ／ｖ％寒天培地の保存スラントより、滅菌した培地Ａにシュードモナス・プチダ  ＹＧＫ−７０３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７００）を１白金耳接種し、３０℃、１８０ｒｐｍ、ロータリーシェーカーで一晩前培養を行った。
次に、容量２Ｌの培養槽を用いて、滅菌した培養液Ｂ８００ｍＬに前培養液８ｍＬを添加し、２５℃、攪拌６００〜７００ｒｐｍ、８００ｍＬ／分の通気条件下で本培養を行った。ピコリン酸２５ｗ／ｖ％、グルコース２５ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム７水和物１０ｇ／Ｌ、モリブデン（VI）酸二ナトリウム２水和物１ｇ／Ｌ、及び硫酸鉄（II）七水和物１ｇ／Ｌの混合水溶液を断続的に供給し、ＨＰＬＣ分析を行い、培養液中のピコリン酸濃度を０．１ｗ／ｖ％以下に制御した。培養液のｐＨは、硫酸又は水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７に調整した。
２５時間培養後、ピコリン酸５０ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム七水和物４ｇ／Ｌ、モリブデン（VI）酸二ナトリウム二水和物０．４ｇ／Ｌ、及び硫酸鉄（II）七水和物０．４ｇ／Ｌの混合水溶液を断続的に供給し、ＨＰＬＣ分析を行い、培養液中のピコリン酸濃度を０．１ｗ／ｖ％以下に制御した。培養液のｐＨは、硫酸又は水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７に保持した。
【００２９】
培養４６時間で、６−ヒドロキシピコリン酸濃度が１５ｗ／ｖ％に達し、析出した。培養液はスラリーの状態のまま、ピコリン酸から６−ヒドロキシピコリン酸への変換と蓄積が進行した。培養９６時間で合計３１５ｇのピコリン酸を供給し、６−ヒドロキシピコリン酸が２０．６ｗ／ｖ％濃度で３０３ｇ（収率：８０．１％対ピコリン酸）の量で蓄積した。培養液に濃塩酸を加えて、６−ヒドロキシピコリン酸を析出させ、濾取、乾燥し、２７０ｇ（収率：７６．０％対ピコリン酸）の白色結晶を得た。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明方法は、微生物を利用してピコリン酸から６−ヒドロキシピコリン酸を製造することができ、この製造方法は工業的利用が可能であるため、医農薬中間体を始め、各種ファインケミカルでの中間体として有用な６−ヒドロキシピコリン酸を効率的に提供することができる。