(57)【要約】  【課題】ベンジル類グルコシノレートの含有量を正確に測定できるベンジル類グルコシノレートの定量法を提供する。  【解決手段】マカ含有物を直接に高速液体クロマトグラフィ法にて測定する。マカ含有物をチオグルコシダーゼ処理して生成させたベンジル類イソチオシアネート量を高速液体クロマトグラフィ法にて測定する。マカ含有物中のベンジル類イソチオシアネート量を正確に定量できる。このベンジル類イソチオシアネート量からベンジル類グルコシノレートを正確に定量できる。マカ含有物におけるベンジル類グルコシノレートの含有量を正確に測定できる。  【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともベンジル類グルコシノレートを含有した被測定物をそのまま溶出液に加えて高速液体クロマトグラフィ法にて測定する
ことを特徴とするベンジル類グルコシノレートの定量法。
【請求項２】
被測定物を濾過してから高速液体クロマトグラフィ法にて測定する
ことを特徴とする請求項１記載のベンジル類グルコシノレートの定量法。
【請求項３】
少なくともベンジル類グルコシノレートを含有した被測定物をチオグルコシダーゼ処理してベンジル類イソチオシアネートを生成させ、
この生成されたベンジル類イソチオシアネートを高速液体クロマトグラフィ法にて測定し、
この高速液体クロマトグラフィ法にて測定したベンジル類イソチオシアネート測定値を、ベンジル類グルコシノレートに換算する
ことを特徴とするベンジル類グルコシノレートの定量法。
【請求項４】
被測定物にエーテル、クロロホルムおよび四塩化炭素のいずれか一つを加えて攪拌し、
この攪拌された被測定物を水層と有機溶媒層とに分離し、
この分離した水層をチオグルコシダーゼ処理してベンジル類イソチオシアネートを生成させる
ことを特徴とする請求項３記載のベンジル類グルコシノレートの定量法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくともベンジル類グルコシノレートを含有した被測定物のベンジル類グルコシノレートの定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、ペルーのアンデス地方の高地原産の根菜であるマカ(レピディウム・メイエニワルプ：Lepidium meyenii-Walp,Cruciferae)が、南米アンデスの原住民の間では、栄養不良、貧血症、不妊症、精力減退症などに有効性があるとして、民間伝承薬として用いられている。わが国においても近年、ホルモンのバランスを整える効果がみられることから、不妊症、生理不順や更年期障害で悩む女性に服用されていると伝えられている。
【０００３】
現在、日本や欧米諸国では健康食品として、マカの根の乾操粉末、有効成分を抽出し噴霧乾燥した抽出粉未であるエキスパウダ、さらに、このエキスパウダを製剤化したカプセル、錠剤あるいはドリンクなどのマカ含有製品が広く利用されている。
【０００４】
そして、マカには、ベンジル類グルコシノレートをはじめとして、ステロイド、フラボノイドおよびアルカロイドなどの多くの薬効成分の存在が知られている。これらの薬効成分の含量測定法である定量法を確立して、これらの薬効成分と生理作用および有効性との関連性を明確にすることが重要である。そして、これら薬効成分の中でも、最も薬効が期待される成分としてベンジル類グルコシノレートが存在する。このベンジル類グルコシノレートは、マカの乾燥植物体から有効成分の抽出方法および抽出条件によって定量値が大幅に変動する。したがって、このベンジル類グルコシノレートの含量を正確に把握することは品質評価の観点から重要である。
【０００５】
そこで、この種のベンジル類グルコシノレートの定量値を測定する方法としては、充分に確立されているわけではないが、所定の化合物の一般的な定性法あるいは定量法である高速液体クロマトグラフィ(High Performance Liquid Chromatography:ＨＰＬＣ)による方法などが適宜使用されている(例えば、特許文献１参照。)。
【特許文献１】特開２００２−６２２８６号公報（第２−３頁）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、ベンジル類グルコシノレートの定量値を測定する方法として高速液体クロマトグラフィによる方法などを用いたとしても、マカの植物体や、このマカの植物体の抽出物中のベンジル類グルコシノレートの含有量の正確な測定方法は未だ確立されていない。さらに、カプセルの如きマカの製剤の多くは油脂などの水不溶性物質を添加してカプセル化されているため、これらマカの製剤中のベンジル類グルコシノレート含有量の正確な測定は容易ではないという問題を有している。
【０００７】
本発明は、このような点に鑑みなされたもので、ベンジル類グルコシノレートの含有量を正確に測定できるベンジル類グルコシノレートの定量法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項１記載のベンジル類グルコシノレートの定量法は、少なくともベンジル類グルコシノレートを含有した被測定物をそのまま溶出液に加えて高速液体クロマトグラフィ法にて測定するものである。
【０００９】
そして、少なくともベンジル類グルコシノレートを含有した被測定物をそのまま溶出液に加えて高速液体クロマトグラフィ法にて測定することにより、この被測定物中のベンジル類グルコシノレートを定量できるので、この被測定物におけるベンジル類グルコシノレートの含有量を正確に測定できる。
【００１０】
請求項２記載のベンジル類グルコシノレートの定量法は、請求項１記載のベンジル類グルコシノレートの定量法において、被測定物を濾過してから高速液体クロマトグラフィ法にて測定するものである。
【００１１】
そして、被測定物を濾過してから高速液体クロマトグラフィ法にて測定することにより、この被測定物中のベンジル類グルコシノレートをより正確に定量できるので、この被測定物におけるベンジル類グルコシノレートの含有量をより正確に測定できる。
【００１２】
請求項３記載のベンジル類グルコシノレートの定量法は、少なくともベンジル類グルコシノレートを含有した被測定物をチオグルコシダーゼ処理してベンジル類イソチオシアネートを生成させ、この生成されたベンジル類イソチオシアネートを高速液体クロマトグラフィ法にて測定し、この高速液体クロマトグラフィ法にて測定した測定値を、ベンジル類グルコシノレートに換算するものである。
【００１３】
そして、少なくともベンジル類グルコシノレートを含有した被測定物をチオグルコシダーゼ処理してベンジル類イソチオシアネートを生成させる。この後、この生成されたベンジル類イソチオシアネートを高速液体クロマトグラフィ法にて測定する。さらに、この高速液体クロマトグラフィ法にて測定したベンジル類イソチオシアネートの測定値を、ベンジル類グルコシノレートに換算する。この結果、この被測定物中のベンジル類グルコシノレートを定量できるので、この被測定物におけるベンジル類グルコシノレートの含有量を正確に測定できる。
【００１４】
請求項４記載のベンジル類グルコシノレートの定量法は、請求項３記載のベンジル類グルコシノレートの定量法において、被測定物にエーテル、クロロホルムおよび四塩化炭素のいずれか一つを加えて攪拌し、この攪拌された被測定物を水層と有機溶媒層とに分離し、この分離した水層をチオグルコシダーゼ処理してベンジル類イソチオシアネートを生成させるものである。
【００１５】
そして、被測定物にエーテル、クロロホルムおよび四塩化炭素のいずれか一つを加えて攪拌してから、この攪拌された被測定物を水層と有機溶媒層とに分離する。この後、この分離した水層をチオグルコシダーゼ処理してベンジル類イソチオシアネートを生成させてから、この生成されたベンジル類イソチオシアネートを高速液体クロマトグラフィ法にて測定する。さらに、この高速液体クロマトグラフィ法にて測定したベンジル類イソチオシアネートの測定値を、ベンジル類グルコシノレートに換算する。この結果、被測定物中のベンジル類グルコシノレートをより正確に定量できるので、この被測定物におけるベンジル類グルコシノレートの含有量をより正確に測定できる。
【発明の効果】
【００１６】
請求項１記載のベンジル類グルコシノレートの定量法によれば、被測定物をそのまま溶出液に加えて高速液体クロマトグラフィ法にて測定することにより、この被測定物中のベンジル類グルコシノレートを定量できるので、この被測定物におけるベンジル類グルコシノレートの含有量を正確に測定できる。
【００１７】
請求項２記載のベンジル類グルコシノレートの定量法によれば、請求項１記載のベンジル類グルコシノレートの定量法の効果に加え、被測定物を濾過してから高速液体クロマトグラフィ法にて測定することにより、この被測定物中のベンジル類グルコシノレートをより正確に定量できるので、この被測定物におけるベンジル類グルコシノレートの含有量をより正確に測定できる。
【００１８】
請求項３記載のベンジル類グルコシノレートの定量法によれば、被測定物をチオグルコシダーゼ処理してベンジル類イソチオシアネートを生成させた後、この生成されたベンジル類イソチオシアネートを高速液体クロマトグラフィ法にて測定し、この測定値をベンジル類グルコシノレートに換算することにより、この被測定物中のベンジル類グルコシノレートを定量できるので、この被測定物におけるベンジル類グルコシノレートの含有量を正確に測定できる。
【００１９】
請求項４記載のベンジル類グルコシノレートの定量法によれば、請求項３記載のベンジル類グルコシノレートの定量法の効果に加え、被測定物にエーテル、クロロホルムおよび四塩化炭素のいずれか一つを加えて攪拌してから、この攪拌された被測定物を水層と有機溶媒層とに分離した後、この分離した水層をチオグルコシダーゼ処理してベンジル類イソチオシアネートを生成させ、この生成されたベンジル類イソチオシアネートを高速液体クロマトグラフィ法にて測定し、この測定値をベンジル類グルコシノレートに換算することにより、この被測定物中のベンジル類グルコシノレートをより正確に定量できるので、この被測定物におけるベンジル類グルコシノレートの含有量をより正確に測定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明のベンジル類グルコシノレートの定量法の一実施の形態を説明する。
【００２１】
まず、原料としては、栄養不良、貧血症、不妊症、精力減退症、生理不順や更年期障害などに有効とされているマカの最も期待されている有効成分であるベンジル類グルコシノレートを少なくとも含有するマカ(レピディウム・メイエニワルプ：Lepidium meyenii-Walp,Cruciferae)の原体である植物体や、この植物体の乾操物、この乾燥植物体の粉未、チップ、抽出物、マカエキスパウダなどの被測定物であるマカ含有物が用いられる。
【００２２】
そして、ベンジル類グルコシノレートの定量法は、マカ含有物中のベンジル類グルコシノレートの直接法あるいは酵素法による定量方法であり、このマカ含有物の加工品を、５０％以上９０％以下の濃度のエタノールで抽出する。このとき、抽出度の高いベンジル類グルコシノレート抽出物である抽出液を得ることができる。
【００２３】
この後、この抽出液や、この抽出液を噴霧して乾操させた粉未をチオグルコシダーゼ処理する。このとき、マカ含有物中に含有されていたベンジル類グルコシノレートにチオグルコシダーゼを作用させて、ベンジル類イソチオシアネートを生成させる。
【００２４】
次いで、このチオグルコシダーゼ処理にて生成されたベンジル類イソチオシアネート量を高速液体クロマトグラフィ(High Performance Liquid Chromatography:ＨＰＬＣ)法にて測定する。
【００２５】
そして、別途ベンジル類グルコシノレートおよびベンジル類イソチオシアネートの標準サンプルから同様にして測定してベンジル類グルコシノレートおよびベンジル類イソチオシアネートの検量線を作成する。この後、この検量線に基づいてベンジル類グルコシノレート量を算出して、この算出したベンジル類グルコシノレート量を、試料としたマカ含有物中のベンジル類グルコシノレート含量とする。
【００２６】
このとき、ベンジル類グルコシノレートおよび、このベンジル類グルコシノレートから生成されたベンジル類イソチオシアネート含有量を正確に測定できるので、マカ含有物中の有効成分であるベンジル類グルコシノレートの含有量を正確に測定できる。
【００２７】
さらに、製剤化されたマカ含有物であるマカ含有製品中のベンジル類グルコシノレート含量を測定する場合には、製剤から内容物を取り出して水に分散させた後、この水に分散させた内容物に、ジエチルエーテルなどのエーテル、クロロホルムおよび四塩化炭素などの水不溶性のいずれか１種の有機溶媒を加えて、充分に有機溶剤可溶物を抽出除去する。
【００２８】
一方、ベンジル類グルコシノレートを含有した水層、あるいはこの水層にチオグルコシダーゼを加えてベンジル類イソチオシアネートを生成させてからエーテル抽出したエーテル層を定量用試料とすることによって、製剤中のベンジル類グルコシノレートの含有量をより正確に定量できる。
【００２９】
上述したように、上記一実施の形態によれば、マカ含有物を直接に高速液体クロマトグラフィ法にて測定したり、このマカ含有物をチオグルコシダーゼ処理して生成されたベンジル類イソチオシアネート量を高速液体クロマトグラフィ法にて測定することにより、このマカ含有物中のベンジル類イソチオシアネート量を正確に定量でき、このベンジル類イソチオシアネート量からベンジル類グルコシノレートを正確に定量できるので、このマカ含有物におけるベンジル類グルコシノレートの含有量を容易かつ正確に測定できる。
【００３０】
さらに、マカ含有物におけるベンジル類グルコシノレートの含有量を正確に測定できることにより、このマカ含有物の品質管理や、ベンジル類グルコシノレート含有量の規格化ができるので、極めて信頼度が高く有為な方法として用いることができる。
【００３１】
なお、上記一実施の形態では、ベンジル類グルコシノレートを含有するマカの植物原体に限らず、マカのチップ、マカの抽出物、その乾燥物、更には市場に流通しているカプセル剤、錠剤やドリンク剤などの、マカ含有製品や、マカエキスパウダなどについて含有されているベンジル類グルコシノレート含量の測定に有利に使用できる。
【００３２】
さらに、これらマカを原料としたマカ含有製品やマカエキスパウダ以外であっても、ベンジル類グルコシノレートを含有している種々の食品や薬品、化粧料などであっても、ベンジル類グルコシノレートの含有量を容易かつ正確に測定できる。
【実施例１】
【００３３】
次に、直接法によるマカ製品中のベンジル類グルコシノレート中のベンジルグルコシノレートの定量法について説明する。
【００３４】
まず、マカの植物体をチップ状に粉砕したものをアルコールに浸漬させてエキス分を抽出し、この抽出した抽出液を噴霧乾燥させたマカエキスパウダ(ＭＡＣＡＸＳ・ＨＣ：トワ商事株式会社製)の場合には、このマカエキスパウダ約０．０５ｇを取り、このマカエキスパウダ約０．０５ｇに高速液体クロマトグラフィ(ＨＰＬＣ)溶出液０．６ｍｌを直接に、すなわちそのまま加えてから、試験管用攪拌装置(Vortex Mixer)を用いて激しく攪拌して、この溶液を試料とする。
【００３５】
この後、この溶液０．５ｍｌ以上１．０ｍｌ以下を取り、０．２μｍのメンブランフィルタ(サンプレップ LCR13-LG,SJLG013,Millipore社製)で濾過してから、この濾過にて取得した濾液５μｌを高速液体クロマトグラフィ(ＨＰＬＣ)に注入し、ベンジル類グルコシノレートを分離したところ、図１に示すグラフとなった。
【００３６】
このとき、この高速液体クロマトグラフィ(ＨＰＬＣ)の条件としては、カラムをWakosil II 5C18HG(φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ)とし、溶出液を０．００５Ｍ テトラ−ノルマル−ブチルアンモニウムブロマイド添加 ０．０１Ｍ リン酸バッファ(ｐＨ７．０)／メタノール＝６５：３５(Ｖ／Ｖ)とし、流速を１．０ｍｌ／ｍｉｎとし、検出器をＵＶat235ｎｍとし、注入量を通常２０μｌとした。
【００３７】
次いで、別に作成した標準ベンジルグルコシノレートの検量線を用いて、ベンジル類グルコシノレート含量を測定した。すなわち、図２に示すベンジルグルコシノレートの標準品のグラフと、図１に示すグラフとを比較して、ベンジルグルコシノレートに換算する。
【００３８】
このときのベンジル類グルコシノレートの換算としては、図２に示すベンジルグルコシノレートの標準品のグラフ中のリテションタイムに対するピークと、図１に示すマカエキスパウダのグラフ中のピークとを比較して算出する。
【００３９】
この結果、このマカエキスパウダには、１００ｇ中に６５７ｍｇのベンジルグルコシノレートが含有されていた。
【００４０】
ここで、上記直接法によるベンジルグルコシノレートの定量法は、マカの植物体や、この植物体の乾操物、この乾燥植物体の粉未、チップ、抽出物、マカエキスパウダなどの被測定物中のベンジルグルコシノレートの含有量の測定に適している。
【実施例２】
【００４１】
次に、酵素法によるマカ製品中のベンジル類グルコシノレートの定量法について説明する。
【００４２】
まず、マカエキスパウダ(ＭＡＣＡＸＳ・ＨＣ：トワ商事株式会社製)の場合には、このマカエキスパウダ約０．２５ｇに、純水２．９ｍｌを加えてから、試験管用攪拌装置(Vortex Mixer)を用いて激しく攪拌し得られた溶液を酵素反応用試料とする。
【００４３】
また、マカエキスパウダ入りのカプセル製剤の場合には、このカプセル製剤から取り出した中身０．５ｇに純水４．０ｍｌを加えた後、サーモミキサで十分に分散させてから、試験管用攪拌装置(Vortex Mixer)を用いて常温で激しく攪拌する。なお、このカプセル製剤の組成としては、マカエキスパウダ、グレープシードオイル、亜鉛、セレン、蜜蝋、レシチンおよびイカ墨である。
【００４４】
この後、この攪拌したものにエーテル、クロロホルムおよび四塩化炭素のいずれか一つ４ｍｌを加えてから、さらに試験管用攪拌装置(Vortex Mixer)を用いて激しく攪拌する。この攪拌の後、遠心分離機を用いて水層と有機溶媒層とに分離する。そして、この水層から２．９ｍｌを取って酵素反応用試料とする。
【００４５】
さらに、上述した前処理で得られた各酵素反応用試料溶液に２．５ｍｇの酵素(例えば、チオグルコシダーゼ：thioglucosidase(EC3.2.3.1),Sigma社製 T4528)を含有した水溶液１００μｌを加えてから、試験管用攪拌装置(Vortex Mixer)を用いて攪拌した後、攪拌機(Micro mixer MT,TAITEC社製)で攪拌して酵素反応させて反応液とする。
【００４６】
次いで、これら反応液にジエチルエーテル３ｍｌを加えてから、試験管用攪拌装置(Vortex Mixer)にて激しく攪拌して抽出する。さらに、これら抽出液を所定の間静置した後、試験管用攪拌装置(Vortex Mixer)を用いて激しく攪拌して再度抽出する。
【００４７】
この後、これら抽出液を遠心分離機にてエーテル層と水層とに分離する。そして、エーテル層より５μｌを高速液体クロマトグラフィ(ＨＰＬＣ)に注入して、ベンジル類イソチオシアネートを分離したところ、図３および図４に示すグラフとなった。
【００４８】
このとき、この高速液体クロマトグラフィ(ＨＰＬＣ)の条件としては、カラムをODSpak F511(φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ,Shodex社製)とし、溶出液をアセトニトリル(ＣＨ３ＣＮ)／２．５％酢酸(ＣＨ３ＣＯＯＨ)＝１５／１０(Ｖ／Ｖ)とし、流速を１．０ｍｌ／ｍｉｎとし、検出器をＵＶat254ｎｍとし、注入量を５μｌ以上１０μｌ以下(通常５μｌ)とした。
【００４９】
次いで、別に作成した標準ベンジル類イソチオシアネートの検量線を用いて、ベンジル類イソチオシアネート含量を測定した。すなわち、図５および図６に示すベンジル類イソチオシアネートの標準品のグラフと、図３および図４に示すグラフとを比較して、ベンジル類グルコシノレートに換算する。
【００５０】
このときのベンジル類グルコシノレートの換算としては、図５に示すベンジルイソチオシアネートの標準品のグラフ中および図６に示すパラヒドロキシベンジルイソチオシアネートの標準品のグラフ中それぞれのリテションタイムに対する各ピークと、図３に示すマカエキスパウダのグラフ中のピークおよび図４に示すマカエキスパウダ入りカプセル製剤のグラフ中のピークそれぞれとを比較して算出されたベンジル類イソチオシアネートを３倍する。
【００５１】
この結果、このマカエキスパウダには、１００ｇ中に６８８ｍｇのベンジル類グルコシノレートが含有されており、マカエキスパウダ入りカプセル製剤の場合には１００ｇ中に２２０ｍｇのベンジル類グルコシノレートが含有されていた。
【００５２】
ここで、上記酵素法によるベンジル類グルコシノレートの定量法は、マカの植物体や、この植物体の乾操物、この乾燥植物体の粉未、チップ、抽出物、マカエキスパウダ、マカの抽出液を含有したカプセル剤、錠剤、ドリンク剤などの被測定物中のベンジル類グルコシノレートの含有量の測定に適している。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明の一実施の形態の直接法によるベンジル類グルコシノレートの定量法にてマカエキスパウダを測定した場合を示すグラフである。
【図２】同上ベンジル類グルコシノレートの定量法にてベンジルグルコシノレートの標準品を測定した場合を示すグラフである。
【図３】本発明の一実施の形態の酵素法によるベンジル類グルコシノレートの定量法にてマカエキスパウダを測定した場合を示すグラフである。
【図４】同上ベンジル類グルコシノレートの定量法にてマカエキスパウダ入りのカプセル製剤を測定した場合を示すグラフである。
【図５】同上ベンジル類グルコシノレートの定量法にてベンジルイソチオシアネートの標準品を測定した場合を示すグラフである。
【図６】同上ベンジル類グルコシノレートの定量法にてパラヒドロキシベンジルイソチオシアネートの標準品を測定した場合を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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