(57)【要約】【課題】タンパク質分解防止用組成物を提供し、また、タンパク質の分解を防止し、より多くのスポットを有するゲルを得るための２次元ゲル電気泳動用組成物を提供し、さらに、タンパク質の分解を防止し、より多くのスポットを有するゲルを得る２次元ゲル電気泳動法を提供することを目的とする。【解決手段】 有効量のｓＨＳＰｓを含むことを特徴とするタンパク質分解防止用組成物を提供し、また、有効量のｓＨＳＰｓを含むことを特徴とする２次元ゲル電気泳動用組成物を提供し、さらに、タンパク質の混合物に対する２次元ゲル電気泳動法において、前記タンパク質の混合物に、タンパク質の分解を防止してより多くのスポットを有するゲルを得るためにｓＨＳＰｓを加えた後、電気泳動を行うことを特徴とする２次元ゲル電気泳動法を提供し、しかも、前記組成物を用いることを特徴とする２次元ゲル電気泳動によるプロテオームの分析方法を提供する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のｓＨＳＰｓを含むことを特徴とする、タンパク質分解防止用組成物。
【請求項２】
前記ｓＨＳＰｓは、表１に記載されたタンパク質から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質分解防止用組成物。
【請求項３】
前記ｓＨＳＰｓは、ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、ＩｂｐＡＢおよびＨＳＰ２６でなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質分解防止用組成物。
【請求項４】
有効量のｓＨＳＰｓを含むことを特徴とする、２次元ゲル電気泳動用組成物。
【請求項５】
前記ｓＨＳＰｓは、表１に記載されたタンパク質から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項４に記載の２次元ゲル電気泳動用組成物。
【請求項６】
前記ｓＨＳＰｓは、ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、ＩｂｐＡＢおよびＨＳＰ２６でなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項５に記載の２次元ゲル電気泳動用組成物。
【請求項７】
タンパク質の混合物に対する２次元ゲル電気泳動法において、前記タンパク質の混合物に、タンパク質の分解を防止してより多くのスポットを有するゲルを得るためにｓＨＳＰｓを加えた後、電気泳動を行うことを特徴とする、２次元ゲル電気泳動法。
【請求項８】
前記ｓＨＳＰｓは、表１に記載されたタンパク質から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項７に記載の２次元ゲル電気泳動法。
【請求項９】
前記ｓＨＳＰｓは、大腸菌由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ及びＩｂｐＡＢとシュードモナス由来のＩｂｐＡ、およびサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＳＰ２６でなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項８に記載の２次元ゲル電気泳動法。
【請求項１０】
前記ｓＨＳＰｓの量は、タンパク質の混合物１００重量部に対し、０.１ないし５０重量部であることを特徴とする、請求項７に記載の２次元ゲル電気泳動法。
【請求項１１】
前記ｓＨＳＰｓの量は、タンパク質の混合物１００重量部に対し、０.５ないし２０重量部であることを特徴とする、請求項１０に記載の２次元ゲル電気泳動法。
【請求項１２】
前記タンパク質の混合物は特定の細胞の全体タンパク質であることを特徴とする、請求項７に記載の２次元ゲル電気泳動法。
【請求項１３】
前記特定の細胞は、原核細胞または真核細胞であることを特徴とする、請求項１２に記載の２次元ゲル電気泳動法。
【請求項１４】
前記特定の細胞は、大腸菌またはシュードモナス（Pseudomonas）属の微生物で真核細胞はヒト由来の細胞であることを特徴とする、請求項１３に記載の２次元ゲル電気泳動法。
【請求項１５】
２次元ゲル電気泳動によるプロテオームの分析方法において、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物を用いることを特徴とする方法。
【請求項１６】
プロテアーゼによる目的タンパク質の分解を阻害する阻害剤としてｓＨＳＰｓを用いる方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、、前記ｓＨＳＰｓは、表１に記載されたタンパク質から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｓＨＳＰｓ（small heat shock proteins；微小熱ショックタンパク質）を含むタンパク質分解防止用組成物、および２次元ゲル電気泳動用組成物に関する。また、本発明は、ｓＨＳＰｓを用いることを特徴とする改善された２次元ゲル電気泳動（two-dimensionalgel electrophoresis）法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト遺伝子に対する塩基配列が決定され、数多くの微生物、下等動物、植物の遺伝子情報が毎日増えつつある中で、次世代における研究の中心に浮び上がっているのが、プロテオミクス（proteomics）である。
【０００３】
このプロテオミクスは、プロテオーム（proteome）を体系的に研究する学問の領域であって、ゲノム（genome）を研究するゲノミクス（genomics）と区別される。プロテオームとは、特定の条件下でゲノムから発現されるタンパク質の種類および量に関する総体的な情報をいう。つまり、プロテオミクスとは、生命現象に係る細胞や組職内の様々なタンパク質を一遍に分析して同定することである。このようなプロテオーム分析は、ゲノム・プロジェクトやＤＮＡの研究では発見できない結果を提供するので、癌、糖尿病、痴呆、心臓および循環系疾患などのような生活習慣病や精神疾患などの診断用試薬や治療剤の開発に対する研究と共に、臓器移植のような分野に応用しようとする研究が進まれている。
【０００４】
現在まで行われているプロテオミクスの研究において、最も広く利用されている核心技術は、２次元ゲル電気泳動法である。該２次元ゲル電気泳動法は、細胞や組職内の総体的なタンパク質を分離し、定量化することのできる最適な方法である。
【０００５】
該２次元ゲル電気泳動法は、タンパク質混合物を各タンパク質の等電点（isoelectric point；ｐＩ）に従って一次的に展開し、該展開された試料のそれぞれを、垂直方向に、分子量に従って更に一回分離し、該分離された各タンパク質が平面上に２次元的に分布されるようにする方法である。すなわち、ＩＥＦ（isoelectric-focusing）法と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（sodiumdodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis）法とを順次に用いるものである。
【０００６】
現在、ＩＥＦを用いた２次元ゲル（2-dimensional gel：２Ｄ−ｇｅｌ）が開発されており、常用化された機器が続々と出現して従来の２次元ゲルの問題点であった再現性を大幅に向上させた（US6,554,991、US 2002157954、US 2002133300、US 6,416,644、US 6,398,932、WO 02/25259、US2001032786、US 2001023826、US 2001015320、US 6,245,206、US 6,136,173、US 6,123,821、US5,993,627、WO 98/59092、WO 02/90966）。また、２次元ゲルで個々のタンパク質を染色し、タンパク質分解酵素で切断するというそれぞれの段階が、自動化機器およびコンピュータを用いることによって多くの試料を簡易に処理できるようになった。
【０００７】
しかし、最初の段階である２次元ゲル電気泳動の自動化は未だに実現されていない。また、２次元ゲル電気泳動の全過程においてタンパク質の損失（loss）があるので、細胞や組職内の複雑なプロテオームの全てを分析することは不可能であるのが現状である。第一の段階で細胞を溶解（lysis）すれば、細胞内のプロテアーゼ（protease）が放出すると同時にタンパク質が分解（degradation）され、全体のタンパク質数が減少してしまう。
【０００８】
そのため、タンパク質の分離過程において、プロテアーゼの攻撃を抑制するための様々な方法が考案されている：（１）試料に、強い変性剤（denaturant）を即時に添加する方法；（２）低温やアルカリ性（ｐＨ９以上）の条件下で試料を用意；および（３）プロテアーゼ阻害剤（inhibitor）を使用。前記プロテアーゼ阻害剤として、ＰＭＳＦ（phenylmethyl-sulphonylfluoride）、ＡＥＢＳＦ（aminoethyl benzylsufonyl fluoride or PefablocTM SC）、ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraaceticacid）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、ＴＬＣＫ（tosyl lysine chloromethyl ketone）、ＴＰＣＫ（tosylphenylalanine chloromethyl ketone）などが用いられている。しかし、このような方法は、タンパク質の分解（proteolysis）を完全には抑制できず、しかも、タンパク質試料の形態や起源が様々であるので、各々の試料に応じて最適に用意する過程を経験的に決定しなければならない。
【０００９】
一方、ｓＨＳＰｓは、小さい分子量（１５〜３０ｋＤａ）を有するＨＳＰｓ（heat shock proteins）による熱ショック（heat shock）や、特定タンパク質の過剰産生のようなストレスによって誘導され、タンパク質の変性を防止する役目をする。該ｓＨＳＰｓは、真核生物（eukaryote）から原核生物（prokaryote）に至るまでのすべての生物に、一つ以上存在する。現在まで明らかになっているｓＨＳＰｓを表１に示す。
【００１０】
【表１】
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該ｓＨＳＰｓは、進化の過程において保存された区域（conserved region）を有するので、互いにほぼ類似した機能を有する。ＡＴＰ非依存性ｓＨＳＰｓは、熱ショックにより変性されたタンパク質と結合して非可逆的にタンパク質の凝集を防ぐ機能をしながらＡＴＰ依存性熱ショックタンパク質と共に変性されたタンパク質を正確にリフォールディングさせて、タンパク質を元の状態に戻す。
【００１１】
例えば、大腸菌由来のＩｂｐＡとＩｂｐＢは、熱あるいは酸化剤によるクエン酸シンターゼの凝集を防いで不活性されないように保護すると報告されている(Kitagawa et al., Eur. J. Biochem., 269:2907-17, 2002)。豆由来のＨＳＰ１８．１は、熱ストレスの時リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（malatedehydrogenase；MDH）, グリセラールアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ（glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase；GAPDH）等のようなタンパク質の凝集を防ぐ役割をすると報告されている(Lee et al., EMBO J.,16:659-671, 1997)。ブラヂルビゾビウム  ジャポニクム（Bradyrbizobium japonicum）由来のｓＨＳＰｓは、熱によるクエン酸シンターゼの凝集を防ぐと報告された(Studerand Narberhaus, J. Biol. Chem., 275:37212-37218, 2000)。人間由来のα−クリスタリンは熱ストレスによって変性された目的タンパク質が透析過程で凝集することを防止して目的タンパク質の正確なリフォールディングを手伝うと報告されている(Horwitz，J.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10449-10453, 1992)。一方、熱に安定な有機体から精製したＰｆｕ−ｓＨＳＰは熱ストレスの時細胞のタンパク質を保護するため、ＰＣＲを行う場合、高温でＴａｑポリメラーゼ（Taqpolymerase）及び他の酵素を安定化されると報告された(WO 01/79250 A1)。また、マウス由来のｓＨＳＰｓ２５は診断分析において不安定なタンパク質やペプチドなどを安定化されると報告された(Ehrnsperger etal., Anal. Biochem.,259:218-225, 1998)。しかし、該ｓＨＳＰｓがタンパク質の分解を防止するということはまだ明らかになっていない。
【００１２】
ここで、本発明者らは、２次元ゲル電気泳動の際にタンパク質が分解されることを防止する方法を開発するために鋭意努力した結果、ｓＨＳＰｓが、タンパク質の分解を防止する効果を有することを最初に確認すると共に、該ｓＨＳＰｓを用いて２次元ゲル電気泳動を行うとき、格段に多いタンパク質スポットを有するゲルが得られることを確認し、本発明を完成した。
【特許文献１】米国特許第６，５５４，９９１
【特許文献２】米国特許出願公開番号２００２１５７９５４
【特許文献３】米国特許出願公開番号２００２１３３３００
【特許文献４】米国特許第６，４１６，６４４
【特許文献５】米国特許第６，３９８，９３２
【特許文献６】ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／２５２５９
【特許文献７】米国特許出願公開番号２００１０３２７８６
【特許文献８】米国特許出願公開番号２００１０２３８２６
【特許文献９】米国特許出願公開番号２００１０１５３２０
【特許文献１０】米国特許第６，２４５，２０６
【特許文献１１】米国特許第６，１３６，１７３
【特許文献１２】米国特許第６，１２３，８２１
【特許文献１３】米国特許第５，９９３，６２７
【特許文献１４】ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／５９０９２
【特許文献１５】ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／９０９６６
【特許文献１６】ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／７９２５０
【非特許文献１】Kitagawa et al.,Eur.J.Biochem.,269:297:2907-17,2002
【非特許文献２】Lee et al.,EMBO J.,16:659-671,1997
【非特許文献３】Studer and Narberhaus,J.Biol.Chem.,275:37212-18,2000
【非特許文献４】Horwitz et al.Proc.Natl.Acad.Sci. USA,89:10449-53,1992
【非特許文献５】Ehrnsperger et al.,Anal.Biochem.,259:218-225,1998
【非特許文献６】Sambrook et al.,Molecular Cloning,2nd ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress, NY, 1989
【非特許文献７】Hochstrasser et al.,Anal. Biochem.,173:424-35,1998;Han etal.,J.Bacteriol.,183:301-8,2001
【非特許文献８】Bradford,M.M.,Anal. Biochem.72,248-54,1976
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
結局、本発明の主な目的は、タンパク質分解防止用組成物を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、タンパク質の分解を防止し、より多くのスポットを有するゲルを得るための、２次元ゲル電気泳動用組成物を提供することである。
【００１５】
本発明の更に他の目的は、タンパク質の分解を防止し、より多くのスポットを有するゲルを得る、２次元ゲル電気泳動法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記目的を達成するために、本発明は、有効量のｓＨＳＰｓを含むことを特徴とする、タンパク質分解防止用組成物を提供する。
【００１７】
本発明は、また、有効量のｓＨＳＰｓを含むことを特徴とする、２次元ゲル電気泳動用組成物を提供する。
【００１８】
本発明は、また、タンパク質の混合物に対する２次元ゲル電気泳動法において、前記タンパク質の混合物に、タンパク質の分解を防止してより多くのスポットを有するゲルを得るためにｓＨＳＰｓを加えた後、電気泳動を行うことを特徴とする、２次元ゲル電気泳動法を提供する。
【００１９】
本発明は、また、前記組成物を用いることを特徴とする、２次元ゲル電気泳動によるプロテオームの分析方法を提供する。
【００２０】
本発明は、また、プロテアーゼによる目的タンパク質の分解を阻害する阻害剤としてｓＨＳＰｓを用いる方法を提供する。
【００２１】
本発明において、前記ｓＨＳＰｓは、表１に記載されたタンパク質から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とすることができ、より好ましくは、ＩｂｐＡ（inclusion body-associated protein Ａ）、ＩｂｐＢ、ＩｂｐＡＢおよびＨＳＰ２６でなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とすることができる。
【００２２】
本発明において、２次元ゲル電気泳動法に用いられるタンパク質の混合物は、特定の細胞の全体のタンパク質であることを特徴とすることができ、前記特定の細胞は、原核細胞（prokaryotes）または真核細胞（eukaryotes）であることを特徴とすることができ、前記原核細胞は大腸菌またはシュードモナス（Pseudomonas）属の微生物であることを、前記真核細胞はヒト由来の細胞であることを特徴とすることができる。
【００２３】
本発明において、タンパク質の分解は生体内(in vivo)または試験管内(in vitro)でプロテアーゼ等によってタンパク質のペプチド結合が加水分解されアミノ酸或いはペプチド混合物を生成する化学反応をいう。
【００２４】
本発明において、タンパク質分解防止用として加えられるｓＨＳＰｓの量は、電気泳動の試料の全体のタンパク質１００重量部に対し、好ましくは０.１ないし５０重量部であり、より好ましくは０.５ないし２０重量部である。０.１以下の重量部である場合、タンパク質分解防止用にしては絶対量が不足であり、２０重量部以上の場合は過量のｓＨＳＰｓによって分離しようとする特定細胞のタンパク質の分離を妨げてしまったり、ｓＨＳＰｓの精製コストの側面から考えると逆効果をもたらしてしまう。
【００２５】
従って、本発明は、以下を提供する：
（項目１）  有効量のｓＨＳＰｓを含むことを特徴とする、タンパク質分解防止用組成物。
【００２６】
（項目２）  前記ｓＨＳＰｓは、表１に記載されたタンパク質から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、項目１に記載のタンパク質分解防止用組成物。
【００２７】
（項目３）  前記ｓＨＳＰｓは、ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、ＩｂｐＡＢおよびＨＳＰ２６でなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、項目２に記載のタンパク質分解防止用組成物。
【００２８】
（項目４）  有効量のｓＨＳＰｓを含むことを特徴とする、２次元ゲル電気泳動用組成物。
【００２９】
（項目５）  前記ｓＨＳＰｓは、表１に記載されたタンパク質から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、項目４に記載の２次元ゲル電気泳動用組成物。
【００３０】
（項目６）  前記ｓＨＳＰｓは、ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、ＩｂｐＡＢおよびＨＳＰ２６でなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、項目５に記載の２次元ゲル電気泳動用組成物。
【００３１】
（項目７）  タンパク質の混合物に対する２次元ゲル電気泳動法において、前記タンパク質の混合物に、タンパク質の分解を防止してより多くのスポットを有するゲルを得るためにｓＨＳＰｓを加えた後、電気泳動を行うことを特徴とする、２次元ゲル電気泳動法。
【００３２】
（項目８）  前記ｓＨＳＰｓは、表１に記載されたタンパク質から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、項目７に記載の２次元ゲル電気泳動法。
【００３３】
（項目９）  前記ｓＨＳＰｓは、大腸菌由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ及びＩｂｐＡＢとシュードモナス由来のＩｂｐＡ、およびサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＳＰ２６でなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、項目８に記載の２次元ゲル電気泳動法。
【００３４】
（項目１０）  前記ｓＨＳＰｓの量は、タンパク質の混合物１００重量部に対し、０.１ないし５０重量部であることを特徴とする、項目７に記載の２次元ゲル電気泳動法。
【００３５】
（項目１１）  前記ｓＨＳＰｓの量は、タンパク質の混合物１００重量部に対し、０.５ないし２０重量部であることを特徴とする、項目１０に記載の２次元ゲル電気泳動法。
【００３６】
（項目１２）  前記タンパク質の混合物は特定の細胞の全体タンパク質であることを特徴とする、項目７に記載の２次元ゲル電気泳動法。
【００３７】
（項目１３）  前記特定の細胞は、原核細胞または真核細胞であることを特徴とする、項目１２に記載の２次元ゲル電気泳動法。
【００３８】
（項目１４）  前記特定の細胞は、大腸菌またはシュードモナス（Pseudomonas）属の微生物で真核細胞はヒト由来の細胞であることを特徴とする、項目１３に記載の２次元ゲル電気泳動法。
【００３９】
（項目１５）  ２次元ゲル電気泳動によるプロテオームの分析方法において、項目１〜６のいずれかに記載の組成物を用いることを特徴とする方法。
【００４０】
（項目１６）  プロテアーゼによる目的タンパク質の分解を阻害する阻害剤としてｓＨＳＰｓを用いる方法。
【００４１】
（項目１７）  項目１６に記載の方法であって、、前記ｓＨＳＰｓは、表１に記載されたタンパク質から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、方法。
【発明の効果】
【００４２】
本発明は、ｓＨＳＰｓを含むタンパク質分解防止用組成物、および２次元ゲル電気泳動用組成物を提供するという効果がある。また、ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、ＩｂｐＡＢ、およびＨＳＰ２６のようなｓＨＳＰｓを用いた２次元ゲル電気泳動法によれば、電気泳動の際にタンパク質スポットが減少することを防止でき、格段に多いタンパク質スポットを含む２次元電気泳動ゲルを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は専ら本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨により、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないとのことは当業者にとっては自明なことであろう。
【００４４】
特に、下記の実施例では、ｓＨＳＰｓとして、大腸菌由来のＩｂｐＡまたはＩｂｐＢ、シュードモナス由来のＩｂｐＡ、およびサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＳＰ２６を例示したが、表１に記載されたｓＨＳＰｓなども制限なしに適用される。
【実施例】
【００４５】
（実施例１：ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢまたはＨＳＰ２６遺伝子を含む組換えプラスミドの製造）
大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３９９３６）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０（ＡＴＣＣ ４７０５４）、およびサッカロマイセス・セレヴィシエの染色体ＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法により分離精製した（Sambrooket al．Molecular Cloning，2nd ed，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，1989）。
【００４６】
大腸菌Ｗ３１１０、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０、およびサッカロマイセス・セレヴィシエのそれぞれを５００ｍＬのＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉｍｅｄｉｕｍ）で２４時間培養した。それぞれの菌株が初期の指数関数的増殖期であるとき、遠心分離によって菌体を回収した後、１０ｍｇ／ｍＬリゾチーム（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ.，ＵＳＡ）の含まれているＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７.６）５０ｍＬに懸濁させた。前記菌株の懸濁液を２４時間にかけて徐々に撹拌しながら常温で培養した。
【００４７】
菌株の破砕およびタンパク質除去のために、前記培養液に、１０％ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）溶液１６ｍＬと、２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ.，ＵＳＡ）５７０μＬとを加え、３７℃で１時間反応させた。
【００４８】
次いで、５Ｍ塩化ナトリウム溶液１４ｍＬと、０.７Ｍ塩化ナトリウム溶液に溶解されている１０％ＣＴＡＢ（cetyltrimethylammoniumbromide）（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ.，ＵＳＡ）１０.６６ｍＬとを加えた後、６５℃で１０分間反応させた。その後、前記反応液と同じ体積のクロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１の混合液を加え、常温で２時間にかけて注意しながら混合した。前記混合液を６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清液をビーカに移し、２倍量の冷却エタノールをゆっくり加えて染色体ＤＮＡを沈澱させた後、ガラス棒でＤＮＡを巻き上げた。前記ガラス棒を自然乾燥させてエタノールを取り除いた後、１ｍＬのＴＥ溶液にＤＮＡを溶解させた。
【００４９】
前記ＤＮＡ溶液に、ＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ.，ＵＳＡ）を最終濃度が５０μg／ｍＬになるように加えた後、３７℃で１時間反応させた。反応の完了後、再び前記反応液と同じ体積のクロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１の混合液を加え、常温で２時間にかけて注意しながら混合した。
【００５０】
前記混合液を６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清液をビーカに移し、２倍量の冷却エタノールをゆっくり加えて染色体ＤＮＡを沈澱させた後、ガラス棒でＤＮＡを巻き上げた。前記ガラス棒を自然乾燥させてエタノールを取り除いた後、最終的に、１ｍＬのＴＥ溶液に、精製された大腸菌Ｗ３１１０、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０、およびサッカロマイセス・セレヴィシエの染色体ＤＮＡを溶解させた。
【００５１】
ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢまたはＨＳＰ２６タンパク質の発現および精製を容易にするために、組換えプラスミドである、ｐＴａｃ９９ＩｂｐＡＨ、ｐＴａｃ９９ＩｂｐＢＨ、ｐＴａｃ９９ＰＰＩｂｐＡＨ、およびｐＴａｃ９９ＨＳＰ２６Ｈを作製した。
【００５２】
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、それぞれ配列番号１と２、および配列番号３と４のプライマーを用いてＰＣＲを行い、大腸菌由来のＩｂｐＡ−６ｈｉｓおよびＩｂｐＢ−６ｈｉｓ遺伝子を得た。
【００５３】
また、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５と６のプライマーを用いてＰＣＲを行い、シュードモナス由来のｐｐＩｂｐＡ−６ｈｉｓ遺伝子を得た。シュードモナス・プチダＫＴ２４４０のゲノムでは、ＩｂｐＢ遺伝子に対してまだ明らかになっていない。
【００５４】
サッカロマイセス・セレヴィシエの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号７と８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のＨＳＰ２６−６ｈｉｓ遺伝子を得た。
【００５５】
ＰＣＲにおいて、第１番目の変性（denaturation）は９５℃で５分間１回行い、以降の第２番目の変性は９５℃で５０秒間、アニーリング（annealing）は５５℃で１分間、伸長（extension）は７２℃で１分３０秒間行った。これを３０回繰り返した後、７２℃で５分間、最後の伸長を１回行った。
【００５６】
得られたＩｂｐＡ−６ｈｉｓ、ＩｂｐＢ−６ｈｉｓ、ｐｐＩｂｐＡ−６ｈｉｓおよびＨＳＰ２６−６ｈｉｓ遺伝子をそれぞれ、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって切断された組換えプラスミドであるｐＴａｃ９９Ａに挿入し、プラスミドｐＴａｃ９９ＩｂｐＡＨ、ｐＴａｃ９９ＩｂｐＢＨ、ｐＴａｃ９９ＰＰＩｂｐＡＨおよびｐＴａｃ９９ＨＳＰ２６Ｈをそれぞれ作製した（図１、図２、図３、および図４）。
【００５７】
前記組換えプラスミドであるｐＴａｃ９９Ａは、ｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia Biotech.，UPPsala，Sweden）のｔｒｃプロモータがｐＫＫ２２３−３（PharmaciaBiotech.，UPPsala，Sweden）のｔａｃプロモータに置き換えられたプラスミドであって、ｐＫＫ２２３−３のｔａｃプロモータを制限酵素ＰｖｕＩＩおよびＥｃｏＲＩで処理して得た後、ｔａｃプロモータ遺伝子の切片を同じ制限酵素によって切断されたｐＴｒｃ９９Ａに挿入することにより作製した。
【００５８】
配列番号1：5’-ggaattcatgcgtaactttgatttatccccg-3’
配列番号2：5’-cccaagcttttaatggtgatgatggtgatggttgatttcgatacggcgcgg-3’
配列番号3：5’-ggaattcatgcgtaacttcgatttatccccactg-3’
配列番号4：5’-cccaagcttttaatggtgatgatggtgatggctatttaacgcgggacgttcgct-3’
配列番号5：5’-ggaattcatgaccatgactactgctttc-3’
配列番号6：5’-cccaagcttttaatggtgatgatggtgatggttcagcgctggttttt-3’
配列番号7：5’-ggaattcatgtcatttaacagtccatttt-3’
配列番号8：5’-cccaagcttttaatggtgatgatggtgatggttaccccacgattcttgaga-3’。
【００５９】
（実施例２：ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、およびＨＳＰ２６タンパク質の精製）
前記実施例１によって製作されたＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、またはＨＳＰ２６タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えプラスミドである、ｐＴａｃ９９ＩｂｐＡＨ、ｐＴａｃ９９ＩｂｐＢＨ、ｐＴａｃ９９ＰＰＩｂｐＡＨまたはｐＴａｃ９９ＨＳＰ２６Ｈによって形質転換された組換え大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）を、抗生剤であるアンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）の添加されたＬＢ培地（酵母抽出物５ｇ／Ｌ，トリプトファン１０ｇ／Ｌ，塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）で培養した。
【００６０】
ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、およびＨＳＰ２６タンパク質の発現は、培養液を分光光度計（波長：６００ｎｍ）で測定して光学密度（Ｏ.Ｄ.）が０.７であるとき、培養液に１ｍＭのＩＰＴＧ（isopropyl-β-thiogalactoside）を加えることにより誘導した。誘導発現の後、４時間経過してから培養液を１ｍＬずつとり、４℃、６０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた沈殿物を０.５ｍＬのＴＥ溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ１０ｍＭ，ＥＤＴＡ １ｍＭ，ｐＨ８.０）で１回洗浄した後、再び４℃、６０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿物を得た。前記得られた沈殿物を０.２ｍＬの平衡溶液（尿素８Ｍ，ＮａＨ２ＰＯ４ １００ｍＭ，Ｔｒｉｓ １０ｍＭ，ｐＨ８.０）に懸濁させ、超音波で破砕して分画した。
【００６１】
前記懸濁溶液を、４℃、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清液をとり、あらかじめ平衡溶液によって平衡化されたＮｉ−ＮＴＡｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）に通過させた後、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。６００μｌの洗浄溶液（尿素 ８Ｍ、ＮａＨ２ＰＯ４１００ｍＭ、Ｔｒｉｓ１０ｍＭ，ｐＨ６.３）をカラムに２回通過させ、２００μｌの溶離溶液（尿素 ８Ｍ、ＮａＨ２ＰＯ４１００ｍＭ、Ｔｒｉｓ １０ｍＭ，ｐＨ４.５）をカラムに注入し、ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、およびＨＳＰ２６タンパク質を精製した。
【００６２】
以上で精製されたＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、およびＨＳＰ２６タンパク質を含有した溶液を２００μｌずつとり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル溶液（２５％グリセロール,2％ＳＤＳ，１４.４ｍＭの２−メルカプトエタノール，０.１％ブロモフェノールブルー，６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）５０μｌと混合し、１０分間沸騰させた後、これを１２％の分離用ゲル（separatinggel）でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。次いで、ゲルを染色溶液（メタノール４０％，酢酸１０％、０.２５ｇ／Ｌ クーマシーブリリアントブルーＲ）に２時間以上浸漬して染色させ、再び脱色溶液（４０％メタノール、７％酢酸）に２時間以上、２回にかけて浸漬して脱色させた（図５）。
【００６３】
図５は、それぞれの組換えプラスミドである、ｐＴａｃ９９ＩｂｐＡＨ、ｐＴａｃ９９ＩｂｐＢＨ、ｐＴａｃ９９ＰＰＩｂｐＡＨまたはｐＴａｃ９９ＨＳＰ２６Ｈによって形質転換された組換え大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅから発現されたＩｂｐＡ、ＩｂｐＢおよびＨＳＰ２６タンパク質を精製した後の電気泳動写真である。（Ａ）において、レーンＭはタンパク質の標準分子量を示し、レーン１および２は精製されたＩｂｐＡを、レーン３および４は精製されたＩｂｐＢを、レーン５は精製されたＰＰＩｂｐＡを示す。（Ｂ）において、レーンＭはタンパク質の標準分子量を示し、レーン１ないし３は精製されたＨＳＰ２６を示す。図５に示すように、精製されたＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、およびＨＳＰ２６タンパク質の純度は、ほぼ１００％であることが分かった。
【００６４】
（実施例３：目的タンパク質を分離・精製する際のｓＨＳＰｓの効果）
目的タンパク質は細胞の溶解溶液（lysis solution）の中でプロテアーゼに攻撃されやすいから損失が多かった。本発明では同量の目的タンパク質のヒト血清アルブミンを溶解溶液に希釈した後２時間常温で多様な濃度のトリプシンと共に反応させた。プロテアーゼの濃度は基質（目的タンパク質）に対して０，１／１０、１／２０、１／３０または１／５０で変化させた。ｓＨＳＰｓは大腸菌由来のＩｂｐＡおよびＩｂｐＢ、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のＨＳＰ２６を使用した（図６）。
【００６５】
図６は同じ濃度のヒト血清アルブミンが添加された溶液でｓＨＳＰｓのプロテアーゼ阻害効果を示す電気泳動写真であって、（Ａ）はｓＨＳＰｓが添加されてない対照群溶液であって、レーンＭはタンパク質標準分子量を示し、レーン１は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンだけを添加した溶解溶液、レーン２は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０.０５μｇ／μｌのトリプシンが添加された溶液、レーン３は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．１２５μｇ／μｌのトリプシンが添加された溶液、レーン４は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０１７μｇ／μｌのトリプシンが添加された溶液、レーン５は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０１μｇ／μｌのトリプシンが添加された溶液を示す。(Ｂ)はＩｂｐＡが添加された溶液を示し、（Ｃ）はＩｂｐＢが添加された溶液を示し、（Ｄ）はＨＳＰ２６が添加された溶液を示す。レーンＭはタンパク質標準分子量を示す。（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）において、レーン１は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．００５μｇ／μｌ  ｓＨＳＰだけを添加した溶解溶液、レーン２は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０.０５μｇ／μｌのトリプシンと０．００５μｇ／μｌのｓＨＳＰが添加された溶液、レーン３は0.5μg/μlのヒト血清アルブミンに０．１２５μｇ／μｌのトリプシンと０．００５μｇ／μｌのｓＨＳＰが添加された溶液、レーン４は0.5μg/μlのヒト血清アルブミンに０．０１７μｇ／μｌのトリプシンと０．００５μｇ／μｌのｓＨＳＰが添加された溶液、レーン５は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０１μｇ／μｌのトリプシンと０．００５μｇ／μｌのｓＨＳＰが添加された溶液を示して、（Ｅ）は種々のプロテアーゼ阻害剤が添加された溶解溶液であって、レーンＭはタンパク質標準分子量を示し、レーン１は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンだけを添加した溶解溶液、レーン２は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０.０５μｇ／μｌのトリプシンが添加されている溶液、レーン３は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０.０２５μｇ／μｌのトリプシンが添加されている溶液、レーン４は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０.０５μｇ／μｌのトリプシンと１ｍＭのＰＭＳＦが添加されている溶液、レーン５は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０.０２５μｇ／μｌのトリプシンと１ｍＭのＰＭＳＦが添加されている溶液、レーン６は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０５μｇ／μｌのトリプシンと４ｍＭのペファブロクＳＣ（PefablocSC）が添加されている溶液、レーン７は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０.０２５μｇ／μｌのトリプシンと４ｍＭのペファブロクＳＣ（Pefabloc SC）が添加されている溶液、レーン８は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０.０５μｇ／μｌのトリプシンとカクテル阻害剤(７ml/tablet)が添加されている溶液、レーン９は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０.０２５μｇ／μｌのトリプシンとカクテル阻害剤(７ml/tablet)が添加されている溶液、レーン１０は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０５μｇ／μｌのトリプシンと１ｍＭのＥＤＴＡが添加されている溶液、レーン１１は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０.０２５μｇ／μｌの���リプシンと１ｍＭのＥＤＴＡが添加されている溶液を示す。矢印はヒト血清アルブミンを示す。
【００６６】
図６に示すように、ｓＨＳＰが添加された溶液では目的タンパク質であるヒト血清アルブミンの殆んどが分解されなかった反面、対照群ではプロテアーゼの攻撃によってヒト血清アルブミンの殆んどが分解された。図６の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）のレーン２を比較するとヒト血清アルブミンが分解されやすいことを観察できる。しかし、少量のｓＨＳＰｓを添加すればヒト血清アルブミンはほぼ分解されなかった。また、図６（B）から(D)までのレーン２およびレーン３と図６（Ｅ）のレーン４ないしレーン１１を比較すると、一般的に使用されるプロテアーゼ阻害剤よりｓＨＳＰｓのほうがずっと効果的にプロテアーゼによる目的タンパク質の分解を防止した。
【００６７】
本発明では他のプロテアーゼであるプロテイナーゼＫで上記と同じ実験を行った。同じ濃度の目的タンパク質であるヒト血清アルブミンを溶解溶液に希釈した後２時間の間常温で多様な濃度のプロテイナーゼＫと共に反応させた。プロテアーゼの濃度は基質（目的タンパク質）に対して０，１／３００、１／１０００、１／３０００または１／１００００で変化させた。ｓＨＳＰｓは大腸菌由来のＩｂｐＡおよびＩｂｐＢ、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のＨＳＰ２６を使用した（図７）。
【００６８】
図７は、同じ濃度のヒト血清アルブミンが添加された溶解溶液でｓＨＳＰｓによるプロテアーゼ抑制効果を示す電気泳動写真である。（Ａ）は、対照群でｓＨＳＰｓが添加されてない溶解溶液であって、レーンＭはタンパク質標準分子量を示し、レーン１は０．５μg/μlのヒト血清アルブミンだけを添加した溶解溶液、レーン２は０．５μg/μlのヒト血清アルブミンに１．５×１０−３μg/μlのプロテイナーゼＫが添加された溶液、レーン３は０．５μg/μlのヒト血清アルブミンに０．５×１０−３μg/μlのプロテイナーゼＫが添加された溶液、レーン４は０．５μg/μlのヒト血清アルブミンに１．５×１０−４μg/μlのプロテイナーゼＫが添加された溶液、レーン５は０．５μg/μlのヒト血清アルブミンに０．５×１０−４μg/μlのプロテイナーゼＫが添加された溶液を示す。（Ｂ）はＩｂｐＡが添加された溶液を示し、（Ｃ）はＩｂｐＢが添加された溶液を示し、（Ｄ）はＨＳＰ２６が添加された溶液を示す。（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）において、レーンＭはタンパク質標準分子量を示し、レーン１は０．５μg/μlのヒト血清アルブミンに０．００５μg/μlのｓＨＳＰだけを添加した溶解溶液、レーン２は０．５μg/μlのヒト血清アルブミンに１．５×１０−３μg/μlのプロテイナーゼＫと０．００５μg/μlのｓＨＳＰが添加された溶液、レーン３は０．５μg/μlのヒト血清アルブミンに０．５×１０−３μg/μlのプロテイナーゼＫと０．００５μg/μlのｓＨＳＰが添加された溶液、レーン４は０．５μg/μlのヒト血清アルブミンに１．５×１０−４μg/μlのプロテイナーゼＫと０．００５μg/μlのｓＨＳＰが添加された溶液、レーン５は０．５μg/μlのヒト血清アルブミンに０．５×１０−４μg/μlのプロテイナーゼＫと０．００５μg/μlのｓＨＳＰが添加された溶液を示す。（Ｅ）は様々なプロテアーゼ阻害剤が添加された溶解溶液であって、レーンＭはタンパク質標準分子量を示し、レーン１は０．５μg/μlのヒト血清アルブミンだけを添加した溶解溶液、レーン２は０．５μg/μlのヒト血清アルブミンに０．５×１０−３μg/μlのプロテイナーゼＫと４ｍＭのペファブロクＳＣ（PefablocSC）添加されている溶液、レーン３は０．５μg/μlのヒト血清アルブミンに１．５×１０−４μg/μlのプロテイナーゼＫと４ｍＭのペフアブロクＳＣ（PefablocSC）添加されている溶液、レーン４は０．５μg/μlのヒト血清アルブミンに０．５×１０−３μg/μlのプロテイナーゼＫとカクテル阻害剤(７ml/tablet)が添加されている溶液、レーン５は０．５μg/μlのヒト血清アルブミンに１．５×１０−４μg/μlのプロテイナーゼＫとカクテル阻害剤(７ml/tablet)が添加されている溶液、レーン６は０．５μg/μlのヒト血清アルブミンに０．５×１０−３μg/μlのプロテイナーゼＫと１ｍＭのＥＤＴＡが添加されている溶液、レーン７は０．５μg/μlのヒト血清アルブミンに１．５×１０−４μg/μlのプロテイナーゼＫと１ｍＭのＥＤＴＡが添加されている溶液を示す。矢印はヒト血清アルブミンを示す。
【００６９】
図７に示すように、ｓＨＳＰが添加された溶液では目的タンパク質であるヒト血清アルブミンの殆んどが分解されなかった反面、対照群ではプロテアーゼの攻撃によってヒト血清アルブミンの殆んどが分解された。図７（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）のレーン３と４を比較するとヒト血清アルブミンがほとんど完全に分解されることが観察できる。しかし、少量のｓＨＳＰｓを添加すればヒト血清アルブミンはほぼ分解されなかった。また、図７の（Ｂ）から（Ｄ）までのレーン３と（Ｅ）のレーン２、レーン４、およびレーン６を比較すれば、一般的に使用されているプロテアーゼ阻害剤よりｓＨＳＰｓのほうがずっと効果的にプロテアーゼの攻撃を防止した。
【００７０】
（実施例４：プロテオーム研究のための２次元ゲル電気泳動の際の細胞内におけるＩｂｐＡおよび／またはＩｂｐＢの効果）
既存のＩｂｐＡおよび／またはＩｂｐＢ発現プラスミドである、ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡ、ｐＡＣＴａｃＩｂｐＢまたはｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢと、対照群のプラスミドｐ１８４△Ｃｍとを、ＩｂｐＡＢ遺伝子の除去された突然変異大腸菌ＷＩＢ１０１（ＰＣＴ／ＫＲ０３／０１３７１）にそれぞれ導入した後、前記実施例２と同様の方法で細胞培養を行った。ＩｂｐＡおよび／またはＩｂｐＢタンパク質の発現は培養液を分光光度計（波長：６００ｎｍ）で測定した光学密度（Ｏ.Ｄ.）が０.７であるとき、１ｍＭのＩＰＴＧを添加して誘導した。誘導発現の後、４時間経過してから培養液を１ｍＬずつとり、４℃、６０００ｒｐｍで５分間遠心分離して沈殿物を得た後、−２０℃で保管した。
【００７１】
それぞれの形質変換された大腸菌に対する２次元ゲル電気泳動を下記のような方法で行った。２次元ゲル電気泳動法は、２次元空間に、タンパク質の固有の特性である分子量および電荷量の差を利用し、細胞内の全体のタンパク質を展開する方法である（Hochstrasser et al.，Anal.  Biochem.，173：424-35，1988；Han et al.，J.Bacteriol.183：301-8，2001）。
【００７２】
本実施例においては、ＰＲＯＴＥＡＮ ＩＥＦ ｃｅｌｌおよびＰＲＯＴＥＡＮＩＩ ｘｉ ｃｅｌｌ（Bio-Rad Laboratories Inc.，Herculules，ＣＡ）を用い、２次元ゲル電気泳動を行った。
【００７３】
２次元ゲル電気泳動のための試料は、次のように処理して用意した。細胞培養液を４℃、６０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清液を捨て、５００μｌの低塩緩衝溶液（ＫＣｌ３ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ １.５ｍＭ、ＮａＣｌ ６８ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４９ｍＭ）で沈殿物中の残存の培地を洗浄した。前記沈殿物を１００μｌ細胞溶解溶液（cell lysis buffer；尿素 ８Ｍ，ＣＨＡＰＳ ４％（ｗ／ｖ），ＤＴＴ６５ｍＭ、Ｔｒｉｓ ４０ｍＭ）に懸濁させた後、４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、全体のタンパク質を得た。
【００７４】
タンパク質はＢｒａｄｆｏｒｄ法（Bradford， Ｍ．Ｍ．，Anal．Biochem．72，248-254，1976）を用いて定量した。タンパク質２００μｇをＩＥＦ変性溶液（尿素８Ｍ、ＣＨＡＰＳ ０.５％（ｗ／ｖ）、ＤＴＴ １０ｍＭ、Ｂｉｏ−ｌｙｔｅ ｐＨ３〜１０ ０.２％（ｗ／ｖ）、ブロモフェノールブルー ０.００１％（ｗ／ｖ））３４０μｌに溶かした後、１７ｃｍＲｅａｄｙＳｔｒｉｐＴＭ ＩＰＧ Ｓｔｒｉｐｓ ｐＨ ３〜１０（Bio-Rad Laboratories Inc.，Herculules，ＣＡ）に入れ、２０℃で１２時間水和させた後、等電点電気泳動法（isoelectricfocusing）を行った。
【００７５】
その後、ストリップ（strip）を平衡緩衝溶液Ｉ（尿素 ６Ｍ、ＳＤＳ ２％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.８）０.３７５Ｍ、グリセロール ２０％（ｖ／ｖ）、ＤＴＴ１３０ｍＭ）に約１５分間振盪させながら浸した後、再び平衡緩衝溶液ＩＩ（尿素 ６Ｍ、ＳＤＳ ２％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.８）０.３７５Ｍ、グリセロール２０％（ｖ／ｖ）、ヨードアセトアミド １３５ｍＭ、ブロモフェノールブルー ３.５Ｍ）に約１５分間振盪させながら浸漬した後、ストリップをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにのせて分子量による分離を行った。
【００７６】
タンパク質は銀染色キット（silver staining kit；Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden）で染色し、２次元ゲルはＧＳ７１０Calibrated Imaging Densitometer（Bio-Rad Laboratories Inc.，Herculules，ＣＡ）でスキャンし、MelanieII（Bio-RadLaboratories Inc.，Herculules，ＣＡ）のソフトウェアでゲル上のタンパク質のスポット数（spot number）を測定した（図８）。
【００７７】
図８は、過量のＩｂｐＡおよび／またはＩｂｐＢが発現される形質転換された大腸菌ＷＩＢ１０１の２次元ゲル電気泳動写真であって、（Ａ）は大腸菌ＷＩＢ１０１（ｐ１８４△Ｃｍ）を、（Ｂ）は大腸菌ＷＩＢ１０１（ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡ）を、（Ｃ）は大腸菌ＷＩＢ１０１（ｐＡＣＴａｃＩｂｐＢ）を、（Ｄ）は大腸菌ＷＩＢ１０１（ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢ）をそれぞれ示す。また、２次元ゲル上に示した円は、ＩｂｐＡおよび／またはＩｂｐＢタンパク質を示す。
【００７８】
図８に示すように、対照群である大腸菌ＷＩＢ１０１（ｐ１８４△Ｃｍ）よりＩｂｐＡおよび／またはＩｂｐＢタンパク質が過量に発現される、形質転換された大腸菌ＷＩＢ１０１（ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡ）、ＷＩＢ１０１（ｐＡＣＴａｃＩｂｐＢ）またはＷＩＢ１０１（ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢ）において、格段に多くのタンパク質スポットを有する２次元ゲルを得ることができた。
【００７９】
（実施例５：大腸菌Ｗ３１１０の２次元ゲル電気泳動の際のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、およびＨＳＰ２６の効果）
前記実施例４と同様の方法で大腸菌Ｗ３１１０に対する２次元ゲル電気泳動を行った。まず、精製されたＩｂｐＡまたはＩｂｐＢタンパク質１０μｇに対する純度を確認するために、２次元ゲル電気泳動を行った（図９）。
【００８０】
図９は、精製されたＩｂｐＡおよびＩｂｐＢタンパク質の２次元ゲル電気泳動写真であって、（Ａ）はＩｂｐＡを示し、（Ｂ）はＩｂｐＢを示す。図９に示すように、２次元ゲル電気泳動の結果、ＩｂｐＡおよびＩｂｐＢタンパク質以外の他のタンパク質はほとんど存在していなかった。したがって、ＩｂｐＡおよびＩｂｐＢの純度は、ほぼ１００％であることが分かった。
【００８１】
ｓＨＳＰｓの効果を確認するために、定量化された大腸菌Ｗ３１１０タンパク質２００μｇにＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、およびＨＳＰ２６タンパク質をそれぞれ１０μｇ加え、２次元ゲル電気泳動を行った。また、ｓＨＳＰとタンパク質の分解を抑制するために一般的に使用されるプロテアーゼ阻害剤の効果を比較するため電気泳動を行った（図１０）。対照群として、定量化された大腸菌Ｗ３１１０タンパク質２００μｇを用いた。
【００８２】
図１０は、試験管内（in vitro）において、ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢまたはＨＳＰ２６が添加された大腸菌Ｗ３１１０の２次元ゲル電気泳動写真であって、（Ａ）は対照群として大腸菌Ｗ３１１０を、（Ｂ）は大腸菌Ｗ３１１０に１ｍＭのＰＭＳＦを添加した溶液、（Ｃ）は大腸菌Ｗ３１１０に４ｍＭのＡＥＢＳＦ（PefablocSC）を添加した溶液、（Ｄ）は大腸菌Ｗ３１１０に１ｍＭのＥＤＴＡを添加した溶液、（Ｅ）は大腸菌Ｗ３１１０にカクテル阻害剤(7ml/tablet)を添加した溶液、（Ｆ）は大腸菌Ｗ３１１０に１０μｇのＩｂｐＡを添加した溶液、（Ｇ）は大腸菌Ｗ３１１０に１０μｇのＩｂｐＢを添加した溶液、（Ｈ）は大腸菌Ｗ３１１０に１０μｇのシュードモナス由来ＩｂｐＡを添加した溶液、（Ｉ）は大腸菌Ｗ３１１０に１０μｇのサッカロマイセス・セレヴィシエ由来ＨＳＰ２６を添加した溶液を示す。
【００８３】
図１０−１〜３に示すように、大腸菌の溶解溶液に対したプロテアーゼ阻害能力はｓＨＳＰｓ＞カクテル阻害剤＞ＡＥＢＳＦ＞ＥＤＴＡ＞ＰＭＳＦの順序だった。ＰＭＳＦは溶液の中で早く不活性化されるし、ＤＤＴまたは２−メルカプトエタノールのようなチオール剤の存在時に効果が減少するため、２次元ゲル電気泳動には適切ではなかった。カクテル阻害剤またはＡＥＢＳＦは大腸菌の２次元電気泳動に普通用いられるプロテアーゼ阻害剤で、プロテアーゼ阻害剤は目的タンパク質の性質によっての選択するものである。一方、ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢまたはＨＳＰ２６を用いた２次元電気泳動ゲルには既存の方法より多いタンパク質のスポットが観察された。
【００８４】
図１１は、ｓＨＳＰｓを使用した電気泳動ゲルの結果を比較するため、ゲルの小さい面積を拡大した写真である。（Ａ）は対照群として大腸菌Ｗ３１１０を、（Ｂ）は大腸菌Ｗ３１１０にカクテル阻害剤(7ml/tablet)を添加した溶液、（Ｃ）は大腸菌Ｗ３１１０に１０μｇのＩｂｐＡを添加した溶液、（Ｄ）は大腸菌Ｗ３１１０に１０μｇのサッカロマイセス・セレヴィシエ由来ＨＳＰ２６を添加した溶液を示す。
【００８５】
図１１に示すように、ｓＨＳＰｓを添加した２次元ゲルは、ｓＨＳＰｓを添加しなかった２次元ゲルよりタンパク質スポットの数が多くて、遥かにきれいだった。これはｓＨＳＰｓを添加したゲルが定量的と定性的に向上したタンパク質スポットを持っていることである。また、ｓＨＳＰｓは高い分子量及び小さい分子量を持つタンパク質の損失を防止した。
【００８６】
市販されているプロテアーゼ阻害剤とｓＨＳＰｓの２次元電気泳動間のプロテアーゼ阻害能力を比較するとｓＨＳＰｓは次のような長所がある。一番は阻害能力がもっと高いことである。タンパク質の分解を減少させて、全ての種類の試料に対して最大数のタンパク質スポットを見せられる。二番目は市販されているプロテアーゼ阻害剤よりずっと経済的である。三番目は添加されたｓＨＳＰｓの量を標準タンパク質として用いてタンパク質試料を定量することができる。ｓＨＳＰｓは植物抽出物、膵臓、胃、肝臓、脾臓などの動物器官及び液胞、リソゾムなどの小器官を含む試料などのプロテアーゼが多い試料を使用する場合有用である。また、ｓＨＳＰｓはタンパク質を精製する場合にも新たなプロテアーゼ阻害剤として使用することができる。
【００８７】
（実施例６：シュードモナスの２次元ゲル電気泳動の際のＩｂｐＡの効果）
前記実施例４と同様の方法でシュードモナス・プチダＫＴ２４４０に対する２次元ゲル電気泳動を行った。ＩｂｐＡ効果を確認するために、定量化されたシュードモナス・プチダＫＴ２４４０タンパク質２００μｇにＩｂｐＡタンパク質１０μｇを加え、２次元ゲル電気泳動を行った（図１２）。対照群として、定量化されたシュードモナス・プチダＫＴ２４４０タンパク質２００μｇを用いた。
【００８８】
図１２は、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０に対する２次元ゲル電気泳動写真であって、（Ａ）はシュードモナス・プチダＫＴ２４４０を、（Ｂ）はシュードモナス・プチダＫＴ２４４０にＩｂｐＡタンパク質１０μｇを添加した場合を示す。図１２に示すように、ＩｂｐＡタンパク質が加えられた２次元ゲル電気泳動写真では格段に多いタンパク質スポットが現われることを確認することができた。
【００８９】
（実施例７：ヒト血清（Human serum）の２次元ゲル電気泳動の際のＩｂｐＡの効果）
前記実施例４と同様の方法でヒト由来の血清に対する２次元ゲル電気泳動を行った。ＩｂｐＡおよびＩｂｐＢの効果を確認するために、定量化されたヒト由来の血清タンパク質２００μｇにＩｂｐＡタンパク質およびＩｂｐＢタンパク質を各々１０μｇを添加し、２次元ゲル電気泳動を行った。対照群として、定量化されたヒト由来の血清タンパク質２００μｇを用いた（図１３）。
【００９０】
図１３は、ヒト由来の血清に対する２次元ゲル電気泳動写真であって、（Ａ）はヒト由来の血清を、（Ｂ）はヒト由来の血清にＩｂｐＡタンパク質１０μｇを添加した場合を、（Ｃ）はヒト由来の血清にＩｂｐＢタンパク質１０μｇを添加した場合を示す。図１３に示すように、ＩｂｐＡタンパク質およびＩｂｐＢタンパク質の加えられた２次元ゲル電気泳動写真では、格段に多いタンパク質スポットが現われていることを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、ＩｂｐＡＢ、およびＨＳＰ２６のようなｓＨＳＰｓを用いた２次元ゲル電気泳動法によれば、電気泳動の際にタンパク質スポットが減少することを防止でき、格段に多いタンパク質スポットを含む２次元電気泳動ゲルを得ることができる。よって、本発明は、細胞内タンパク質の研究における效率の改善に画期的に寄与できる。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、プラスミドｐＴａｃ９９ＩｂｐＡＨの遺伝子地図である。
【図２】図２は、プラスミドｐＴａｃ９９ＩｂｐＢＨの遺伝子地図である。
【図３】図３は、プラスミドｐＴａｃ９９ＰＰＩｂｐＡＨの遺伝子地図である。
【図４】図４は、プラスミドｐＴａｃ９９ＨＳＰ２６Ｈの遺伝子地図である。
【図５】図５は、それぞれの組換えプラスミドである、ｐＴａｃ９９ＩｂｐＡＨ、ｐＴａｃ９９ＩｂｐＢＨ、ｐＴａｃ９９ＰＰＩｂｐＡＨまたはｐＴａｃ９９ＨＳＰ２６Ｈによって形質転換された組換え大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅから発現されたＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、またはＨＳＰ２６タンパク質を精製した後の電気泳動写真である。（Ａ）において、レーンＭはタンパク質の標準分子量を示し、レーン１および２は精製されたＩｂｐＡを、レーン３および４は精製されたＩｂｐＢを、レーン５は精製されたＰＰＩｂｐＡを示す。（Ｂ）において、レーンＭはタンパク質の標準分子量を示し、レーン１ないし３は精製されたＨＳＰ２６を示す。
【図６】図６は、同じ濃度のヒト血清アルブミンが添加された溶液でｓＨＳＰｓのプロテアーゼ阻害効果を示す電気泳動写真であって、（Ａ）はｓＨＳＰｓが添加されてない対照群溶液であって、レーンＭはタンパク質標準分子量を示し、レーン１は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンだけを添加した溶解溶液、レーン２は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０５μｇ／μｌのトリプシンが添加された溶液、レーン３は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．１２５μｇ／μｌのトリプシンが添加された溶液、レーン４は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０１７μｇ／μｌのトリプシンが添加された溶液、レーン５は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０１μｇ／μｌのトリプシンが添加された溶液を示す。（Ｂ）はＩｂｐＡが添加された溶液を示す。（Ｃ）はＩｂｐＢが添加された溶液を示す。（Ｄ）はＨＳＰ２６が添加された溶液を示す。レーンＭはタンパク質標準分子量を示す。（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）において、レーン１は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．００５μｇ／μｌ  ｓＨＳＰだけを添加した溶解溶液、レーン２は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０５μｇ／μｌのトリプシンと０．００５μｇ／μｌのｓＨＳＰが添加された溶液、レーン３は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．１２５μｇ／μｌのトリプシンと０．００５μｇ／μｌのｓＨＳＰが添加された溶液、レーン４は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０１７μｇ／μｌのトリプシンと０．００５μｇ／μｌのｓＨＳＰが添加された溶液、レーン５は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０１μｇ／μｌのトリプシンと０．００５μｇ／μｌのｓＨＳＰが添加された溶液を示し、（Ｅ）は種々のプロテアーゼ阻害剤が添加された溶解溶液であって、レーンＭはタンパク質標準分子量を示し、レーン１は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンだけを添加した溶解溶液、レーン２は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０５μｇ／μｌのトリプシンが添加されている溶液、レーン３は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０２５μｇ／μｌのトリプシンが添加されている溶液、レーン４は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０５μｇ／μｌのトリプシンと１ｍＭのＰＭＳＦが添加されている溶液、レーン５は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０２５μｇ／μｌのトリプシンと１ｍＭのＰＭＳＦが添加されている溶液、レーン６は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０５μｇ／μｌのトリプシンと４ｍＭのペファブロクＳＣ（Ｐｅｆａｂｌｏｃ  ＳＣ）が添加されている溶液、レーン７は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０２５μｇ／μｌのトリプシンと４ｍＭのペファブロクＳＣ（Ｐｅｆａｂｌｏｃ  ＳＣ）が添加されている溶液、レーン８は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０５μｇ／μｌのトリプシンとカクテル阻害剤（７ｍｌ／ｔａｂｌｅｔ）が添加されている溶液、レーン９は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０２５μｇ／μｌのトリプシンとカクテル阻害剤（７ｍｌ／ｔａｂｌｅｔ）が添加されている溶液、レーン１０は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０５μｇ／μｌのトリプシンと１ｍＭの  ���ＤＴＡが添加されている溶液、レーン１１は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．０２５μｇ／μｌのトリプシンと１ｍＭの  ＥＤＴＡが添加されている溶液を示す。矢印はヒト血清アルブミンを示す。
【図７】図７は、同じ濃度のヒト血清アルブミンが添加された溶解溶液でｓＨＳＰｓによるプロテアーゼ抑制効果を示す電気泳動写真である。（Ａ）は対照群でｓＨＳＰｓが添加されてない溶解溶液であって、レーンＭはタンパク質標準分子量を示し、レーン１は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンだけを添加した溶解溶液、レーン２は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに１．５×１０−３μｇ／μｌのプロテイナーゼＫが添加された溶液、レーン３は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．５×１０−３μｇ／μｌのプロテイナーゼＫが添加された溶液、レーン４は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに１．５×１０−４μｇ／μｌのプロテイナーゼＫが添加された溶液、レーン５は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．５×１０−４μｇ／μｌのプロテイナーゼＫが添加された溶液を示す。（Ｂ）はＩｂｐＡが添加された溶液を示して、（Ｃ）はＩｂｐＢが添加された溶液を示して、（Ｄ）はＨＳＰ２６が添加された溶液を示す。（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）において、レーンＭはタンパク質標準分子量を示し、レーン１は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．００５μｇ／μｌのｓＨＳＰだけを添加した溶解溶液、レーン２は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに１．５×１０−３μｇ／μｌのプロテイナーゼＫと０．００５μｇ／μｌの  ｓＨＳＰ  が添加された溶液、レーン３は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．５×１０−３μｇ／μｌのプロテイナーゼＫと０．００５μｇ／μｌのｓＨＳＰが添加された溶液、レーン４は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに１．５×１０−４μｇ／μｌのプロテイナーゼＫと０．００５μｇ／μｌのｓＨＳＰが添加された溶液、  レーン５は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．５×１０−４μｇ／μｌのプロテイナーゼＫと０．００５μｇ／μｌの  ｓＨＳＰが添加された溶液を示す。（Ｅ）は様々なプロテアーゼ阻害剤が添加された溶解溶液であって、レーンＭはタンパク質標準分子量を示し、レーン１は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンだけを添加した溶解溶液、レーン２は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．５×１０−３μｇ／μｌのプロテイナーゼＫと４ｍＭのペファブロクＳＣ（Ｐｅｆａｂｌｏｃ  ＳＣ）添加されている溶液、レーン３は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに１．５×１０−４μｇ／μｌのプロテイナーゼＫと４ｍＭのペフアブロクＳＣ（Ｐｅｆａｂｌｏｃ  ＳＣ）添加されている溶液、レーン４は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．５×１０−３μｇ／μｌのプロテイナーゼＫとカクテル阻害剤（７ｍｌ／ｔａｂｌｅｔ）が添加されている溶液、レーン５は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに１．５×１０−４μｇ／μｌのプロテイナーゼＫとカクテル阻害剤（７ｍｌ／ｔａｂｌｅｔ）が添加されている溶液、レーン６は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに０．５×１０−３μｇ／μｌのプロテイナーゼＫと１ｍＭの  ＥＤＴＡが添加されている溶液、レーン７は０．５μｇ／μｌのヒト血清アルブミンに１．５×１０−４μｇ／μｌのプロテイナーゼＫと１ｍＭの  ＥＤＴＡが添加されている溶液を示す。矢印はヒト血清アルブミンを示す。
【図８】図８は、ＩｂｐＡ及び／またはＩｂｐＢが過発現された大腸菌Ｗ３１１０の２次元ゲル電気泳動写真であって、（Ａ）は大腸菌ＷＩＢ１０１（ｐ１８４△Ｃｍ）を、（Ｂ）は大腸菌ＷＩＢ１０１（ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡ）を、（Ｃ）は大腸菌ＷＩＢ１０１（ｐＡＣＴａｃＩｂｐＢ）を、（Ｄ）は大腸菌ＷＩＢ１０１（ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢ）を示す。
【図９】図９は、精製されたＩｂｐＡ及びＩｂｐＢタンパク質の２次元ゲル電気泳動写真であって、（Ａ）はＩｂｐＡタンパク質を、（Ｂ）はＩｂｐＢタンパク質を示す。
【図１０−１】図１０−１は、試験管内（in vitro）において、ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢまたはＨＳＰ２６が添加された大腸菌Ｗ３１１０の２次元ゲル電気泳動写真であって、（Ａ）は対照群として大腸菌Ｗ３１１０を、（Ｂ）は大腸菌Ｗ３１１０に１ｍＭのＰＭＳＦＦを添加した溶液、（Ｃ）は大腸菌Ｗ３１１０に４ｍＭのＡＥＢＳＦ（PefablocSC）を添加した溶液、（Ｄ）は大腸菌Ｗ３１１０に１ｍＭのＥＤＴＡを添加した溶液を示す。
【図１０−２】図１０−２は、図１０−１の続きであって、（Ｅ）は大腸菌Ｗ３１１０にカクテル阻害剤（７ｍｌ／ｔａｂｌｅｔ）を添加した溶液、（Ｆ）は大腸菌Ｗ３１１０に１０μｇのＩｂｐＡを添加した溶液、（Ｇ）は大腸菌Ｗ３１１０に１０μｇのＩｂｐＢを添加した溶液、（Ｈ）は大腸菌Ｗ３１１０に１０μｇのシュードモナス由来ＩｂｐＡを添加した溶液を示す。
【図１０−３】図１０−３は、図１０−２のさらに続きであって、（Ｉ）は大腸菌Ｗ３１１０に１０μｇのサッカロマイセス・セレヴィシエ由来ＨＳＰ２６を添加した溶液を示す。
【図１１】ｓＨＳＰｓを使用した電気泳動ゲルの結果を比較するため、ゲルの小さい面積を拡大した写真である。（Ａ）は対照群として大腸菌Ｗ３１１０を、（Ｂ）は大腸菌Ｗ３１１０にカクテル阻害剤(7ml/tablet)を添加した溶液、（Ｃ）は大腸菌Ｗ３１１０に１０μｇのＩｂｐＡを添加した溶液、（Ｄ）は大腸菌Ｗ３１１０に１０μｇのサッカロマイセス・セレヴィシエ由来ＨＳＰ２６を添加した溶液を示す。
【図１２】対照群およびｓＨＳＰｓによるシュードモナス・プチダＫＴ２４４０の２次元ゲル電気泳動写真であって、（Ａ）はシュードモナス・プチダＫＴ２４４０を、（Ｂ）はシュードモナス・プチダＫＴ２４４０にＩｂｐＡタンパク質１０μｇを添加した場合を示す。
【図１３】試験管内において、対照群およびｓＨＳＰｓによるヒト血清の２次元ゲル電気泳動写真であって、（Ａ）はヒト由来の血清を、（Ｂ）はヒト由来の血清にＩｂｐＡタンパク質１０μｇを添加した場合を（C）はヒト由来の血清にＩｂｐＢタンパク質１０μｇを添加した場合を示す。
【化１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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