(57)【要約】      （修正有）【課題】カルボキシペプチダーゼA（CPA）を殆ど過消化することなくプロカルボキシペプチダーゼA（PCPA）のプロ部分を除去して活性型のCPAに変換し得る方法、試料中の全CPAレベル又はPCPAレベルを高精度に測定し得る方法及び膵臓癌の判定方法、並びにこれらに用いられる安価なキットの提供。【解決手段】(1)PCPAに蛋白質分解酵素を酵素の非至適条件下で作用させる、PCPAのプロ部分の除去方法、(2)(i)試料と、蛋白質分解酵素とを、酵素の非至適条件下で接触させ、(ii)得られた溶液を、CPAの基質と接触させ、(iii)基質の変化に由来する光学的変化に基づいて試料中のCPA活性を測定する、試料中の全CPA活性の測定方法、(3)(i)上記(2)の方法により試料中の全CPA活性を測定し、(ii)上記(2)の方法において、蛋白質分解酵素を用いる工程を実施せずに上記(2)の方法を行うことにより、試料中のCPA活性を測定し、(iii)(i)又は／及び(ii)の値に基づいて判定を行う、膵臓癌の判定方法、及びこれらの方法に用いられるキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロカルボキシペプチダーゼAに、蛋白質分解酵素を当該酵素の非至適条件下で作用させることを特徴とする、プロカルボキシペプチダーゼAのプロ部分の除去方法。
【請求項２】
プロカルボキシペプチダーゼAに蛋白質分解酵素を作用させた後、更にこれに当該蛋白質分解酵素の阻害剤を作用させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
蛋白質分解酵素が、セリンプロテアーゼである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
非至適条件下が、蛋白質分解酵素の至適pH範囲の2以上5以下アルカリ側の範囲又は2以上5以下酸性側の範囲である請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
蛋白質分解酵素の阻害剤が、蛋白質性阻害剤である請求項２〜４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
蛋白質分解酵素がトリプシンであり、その阻害剤が、トリプシンインヒビター、アプロチニン及びロイペプチンから選ばれるものである請求項２〜４の何れかに記載の方法。
【請求項７】
生体由来試料に、蛋白質分解酵素を当該酵素の非至適条件下で作用させることを特徴とする、カルボキシペプチダーゼA活性測定用試料の前処理方法。
【請求項８】
蛋白質分解酵素を用い且つ当該酵素の非至適条件下で生体由来試料を処理し、次いで当該試料中のカルボキシペプチダーゼA活性を測定することを特徴とする、試料中の全カルボキシペプチダーゼA活性の測定方法。
【請求項９】
試料を蛋白質分解酵素で処理した後に、更にこれに当該蛋白質分解酵素の阻害剤を作用させ、次いでカルボキシペプチダーゼA活性の測定を行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
カルボキシペプチダーゼAの測定が、カルボキシペプチダーゼA特異的阻害剤の存在下及び不存在下で行われる、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
(i)試料と、蛋白質分解酵素とを、当該酵素の非至適条件下で接触させ、
(ii)次いで、得られた溶液を、カルボキシペプチダーゼAの基質と接触させ、
(iii)当該基質の変化に由来する光学的変化に基づいて当該試料中のカルボキシペプチダーゼA活性を測定する、
ことを特徴とする、試料中の全カルボキシペプチダーゼA活性の測定方法。
【請求項１２】
(i)の工程の後に、(i')得られた溶液と当該蛋白質分解酵素の阻害剤とを接触させる工程を行い、次いで(ii)の工程を行う、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
(ii)のカルボキシペプチダーゼAの基質との接触を、カルボキシペプチダーゼA特異的阻害剤の存在及び不存在下で行い、(iii)の試料中のカルボキシペプチダーゼA活性の測定が、(ii)で得られる、カルボキシペプチダーゼA特異的阻害剤の存在及び不存在下の反応液における光学的変化の差に基づいて行われる請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
蛋白質分解酵素が、セリンプロテアーゼである請求項８〜１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
非至適条件下が、蛋白質分解酵素の至適pH範囲の2以上5以下アルカリ側の範囲又は2以上5以下酸性側の範囲である請求項８〜１４の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
蛋白質分解酵素の阻害剤が、蛋白質性阻害剤である請求項９、１０、１２又は１３に記載の方法。
【請求項１７】
蛋白質分解酵素がトリプシンであり、その阻害剤が、トリプシンインヒビター、アプロチニン及びロイペプチンから選ばれるものである請求項項９、１０、１２又は１３に記載の方法。
【請求項１８】
(i)請求項８〜１７の何れかの方法により試料中の全カルボキシペプチダーゼA活性を測定し、
(ii) 請求項８〜１７において、蛋白質分解酵素を用いる工程を実施せずに請求項８〜１７の何れかの方法を行うことにより、試料中のカルボキシペプチダーゼA活性を測定し、
(iii)(i)で得られた全カルボキシペプチダーゼA活性値から(ii)で得られたカルボキシペプチダーゼA活性値を差し引くことによって試料中のプロカルボキシペプチダーゼAを活性値として測定する、
試料中のプロカルボキシペプチダーゼAの測定方法。
【請求項１９】
(i)請求項８〜１７の何れかの方法により試料中の全カルボキシペプチダーゼA活性を測定し、
(ii) 請求項８〜１７において、蛋白質分解酵素を用いる工程を実施せずに請求項８〜１７の何れかの方法を行うことにより、試料中のカルボキシペプチダーゼA活性を測定し、
(iii)(i)又は／及び(ii)の値に基づいて判定を行う、
膵臓癌の判定方法。
【請求項２０】
(iii)の判定を、(i)で得られた全カルボキシペプチダーゼA活性値に対する(ii)で得られたカルボキシペプチダーゼA活性値の比率を求め、得られた値に基づいて行う、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
(i)蛋白質分解酵素、及び
(ii)当該酵素を当該酵素の非至適条件下でプロカルボキシペプチダーゼAに作用させるための緩衝液、
を含んでなるプロカルボキシペプチダーゼAのプロ部分の除去用キット。
【請求項２２】
当該緩衝液が、蛋白質分解酵素の至適pH範囲の2以上5以下アルカリ側の範囲又は2以上5以下酸性側の範囲から選ばれるpHを有するものである請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
蛋白質分解酵素が、セリンプロテアーゼである請求項２１又は２２に記載のキット。
【請求項２４】
更に蛋白質分解酵素の阻害剤が含まれる請求項２１〜２３に記載のキット。
【請求項２５】
蛋白質分解酵素の阻害剤が、蛋白質性阻害剤である請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
蛋白質分解酵素がトリプシンであり、その阻害剤が、トリプシンインヒビター、アプロチニン及びロイペプチンから選ばれるものである請求項２４に記載のキット。
【請求項２７】
(i)蛋白質分解酵素、及び
(ii)当該酵素を当該酵素の非至適条件下で生体由来試料に作用させるための緩衝液、
を含んでなるカルボキシペプチダーゼA活性測定用試料の前処理用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロカルボキシペプチダーゼAのプロ部分の除去方法（又は、カルボキシペプチダーゼA活性測定用試料の前処理方法）、生体由来試料中の全カルボキシペプチダーゼA活性の測定方法、プロカルボキシペプチダーゼAの測定方法、膵臓癌の判定（診断）方法、及びこれらに用いられるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロカルボキシペプチダーゼA（以下、PCPAと略記する。）は、芳香族・疎水性アミノ酸を蛋白質のC末端から順次遊離させる作用をもつカルボキシペプチダーゼA（以下、CPAと略記する。）の前駆体酵素であり、膵臓で合成されて十二指腸に外分泌された後、トリプシンの作用によりプロ部分が除去されて活性型のCPAとなる。
【０００３】
一方、ヒト血清中において、血清中のCPAレベルは膵臓癌患者血清と正常人血清とで同程度であるにもかかわらず、PCPAレベルは正常人血清中に比べて膵臓癌患者血清中で著しく上昇することが判っている。
そこで、近年、膵臓癌患者血清中のPCPAレベルが、膵臓癌のマーカーとして提案されている（特許文献１）。
【０００４】
PCPAレベルを測定するには、PCPAのプロ部分を除去して活性型のCPAに変換させる必要がある。
このような方法としては、従来、トリプシン、キモトリプシン、ズブチリシン、ウロキナーゼ等の蛋白質分解酵素を用いる方法が知られている（非特許文献１）。
しかしながら、これらの酵素（特にトリプシン）はプロテアーゼ活性のコントロールが困難であるため、これらの酵素を使用した場合には、PCPAの活性化のみならず、元々存在するCPA〔以下、遊離CPA（F-CPA）と略記する。〕やPCPAから変換されたCPAを更に分解（過消化）してしまい、PCPAレベルを高精度に測定できないという問題があった（非特許文献２、特許文献１）
【０００５】
そこで、このような問題点を解消するため、上記特許文献１では、CPAの過消化を殆ど生じないクロストリパインの使用を提案している。
しかしながら、クロストリパインは、Clostridium histolyticumの培養液に由来するシステインプロテアーゼであり、製造が非常に難しく、高価であるため、安定した原料供給が困難であるという問題を有している。
【０００６】
【特許文献１】特表2001-518791号
【０００７】
【非特許文献１】Peterson et al. and Holmquist, B. (1983) Biochemistry 22: 3077-3082
【０００８】
【非特許文献２】Clinica Chimica Acta 2000; 292: 107-115
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、CPAを殆ど過消化することなくPCPAのプロ部分を除去して活性型のCPAに変換し得る方法、試料中の全CPAレベル又はPCPAレベルを高精度に測定し得る方法及び膵臓癌の判定方法、並びにこれらに用いられる安価なキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、
(1) PCPAに、蛋白質分解酵素を当該酵素の非至適条件下で作用させることを特徴とする、PCPAのプロ部分の除去方法、
(2) 生体由来試料に、蛋白質分解酵素を当該酵素の非至適条件下で作用させることを特徴とする、CPA活性測定用試料の前処理方法、
(3)蛋白質分解酵素を用い且つ当該酵素の非至適条件下で生体由来試料を処理し、次いで当該試料中のCPA活性を測定することを特徴とする、試料中の全CPA活性の測定方法、
(4)(i)試料と、蛋白質分解酵素とを、当該酵素の非至適条件下で接触させ、(ii)次いで、得られた溶液を、CPAの基質と接触させ、(iii)当該基質の変化に由来する光学的変化に基づいて当該試料中のCPA活性を測定する、ことを特徴とする、試料中の全CPA活性の測定方法、
(5)(i)上記(3)又は(4)の方法により試料中の全CPA活性を測定し、(ii) 上記(3)又は(4)の方法において、蛋白質分解酵素を用いる工程を実施せずに上記(3)又は(4)の方法を行うことにより、試料中のCPA活性を測定し、(iii)(i)で得られた全CPA活性値から(ii)で得られたCPA活性値を差し引くことによって試料中のPCPAを活性値として測定する、試料中のPCPAの測定方法、
(6)(i)上記(3)又は(4)の方法により試料中の全CPA活性を測定し、(ii) 上記(3)又は(4)の方法において、蛋白質分解酵素を用いる工程を実施せずに上記(3)又は(4)の方法を行うことにより、試料中のCPA活性を測定し、(iii)(i)又は／及び(ii)の値に基づいて判定を行う、膵臓癌の判定方法、
(7)(i)蛋白質分解酵素、及び(ii)当該酵素を当該酵素の非至適条件下でPCPAに作用させるための緩衝液、を含んでなるPCPAのプロ部分の除去用キット、及び
(8)(i)蛋白質分解酵素、及び(ii)当該酵素を当該酵素の非至適条件下で生体由来試料に作用させるための緩衝液、を含んでなるCPA活性測定用試料の前処理用キット、
に関する。
即ち、従来用いられている例えばトリプシン等のセリンプロテアーゼは、蛋白質分解活性が強いため、PCPAのプロ部分を除去するため（PCPAを活性化するため）に使用すると、目的の部位であるPCPAのプロ部分とCPA部分との結合部分以外の箇所も切断（過消化）してしまう。
本発明は、このような性質を有する例えばトリプシン等のセリンプロテアーゼを、その至適条件をはずして用いることにより、意外にもPCPAの目的部位を選択的に切断するようになることを見出したことにより完成された発明である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法により、CPAの過消化を殆ど生じることなくPCPAを活性化することが可能であり、その結果、試料中の全CPAレベル又は／及びPCPAレベルを高精度に測定すること、更には精度良く膵臓癌を判定することが可能となる。また、本発明の方法によれば、従来使用し得なかった、CPAを過消化してしまう蛋白質分解酵素を使用できるので、安価で且つ安定した性能を有するキットを提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
１．蛋白質分解酵素
本発明においては、PCPAのプロ部分を除去し得る作用を有する蛋白質分解酵素、換言すれば、PCPAに作用してPCPAをCPAに変換（活性化）し得る蛋白質分解酵素は全て使用可能である。
尚、本発明は、クロストリパイン等のCPAを過消化しない性質を有する蛋白質分解酵素を除く、PCPAのプロ部分を除去（PCPAを活性化）し得るものの、蛋白質分解活性が強いためにCPAを過消化してしまう性質を有する蛋白質分解酵素を用いる場合に特に有用である。
このような蛋白質分解酵素としては、PCPAのプロ部分と（活性型）CPA部分との結合を切断し得るプロテアーゼが挙げられ、なかでもエンド型のプロテアーゼが好ましい。
より具体的には、例えば、(1)アルギニン残基の結合（Arg-結合）を切断するセリンプロテアーゼ（例えばトリプシン、トロンビン、プラスミン、カリクレイン、アクロシン、ファクターXa等）、(2)Arg-結合を切断する、セリンプロテアーゼ以外のプロテアーゼ（例えばパパイン、カテプシンB等のシステインプロテアーゼ）、(3)Arg-結合以外の結合を切断するセリンプロテアーゼ（例えばキモトリプシン、エラスターゼ、ウロキナーゼ、ズブチリシン等）、(4)Arg-結合以外の結合を切断する、セリンプロテアーゼ以外のプロテアーゼ（例えばキモパパイン、フィシン、プロメライン等のシステインプロテアーゼ、例えばサーモリシン等の金属プロテアーゼ、例えばペプシン、キモシン、カテプシンD,E等のアスパルティックプロテアーゼ等）等が挙げられる。
なかでも、上記(1)、(2)及び(3)が好ましく、(1)及び(2)より好ましく、(1)が特に好ましい。
具体的には、トリプシン、トロンビン、プラスミン、カリクレイン、アクロシン、ファクターXa、パパインが好ましく、トリプシン、トロンビン、プラスミン、パパインがより好ましく、トリプシン、トロンビン、プラスミンが特に好ましい。
尚、上記した如き蛋白質分解酵素の由来も特に限定されず、通常この分野で使用し得るものであれば、微生物、動物、植物等に由来するもの、市販品、或いは細胞融合技術や遺伝子組換え技術等を利用した自体公知の方法によって得られたもの等が使用できる。
また、上記した如き蛋白質分解酵素は、単独で用いても、２種以上を適宜組み合わせて用いてもよい。
【００１３】
２．PCPAのプロ部分除去方法
２−１．非至適条件
本発明で言う「非至適条件」とは、使用する蛋白質分解酵素が有する至適条件（範囲）以外の条件（範囲）を意味し、換言すれば、実質的に全てのPCPAのプロ部分を除去（PCPAを活性化）するが実質的にCPAを過消化しないような、PCPAと蛋白質分解酵素との反応条件（範囲）を意味する。
即ち、PCPAに蛋白質分解酵素を作用させる際の反応条件（例えば反応pH、反応温度、反応時間、使用する蛋白質分解酵素濃度等）を、使用する蛋白質分解酵素が有する至適条件（範囲）〔例えば至適pH範囲、至適温度範囲、至適時間（反応時間）範囲、至適濃度範囲等〕以外の条件（範囲）とすることである。
尚、上記した如き反応条件のうち、１つの条件のみを至適条件（範囲）以外の範囲（非至適条件）としても、また、複数の条件を至適条件（範囲）以外の範囲（非至適条件）としてもよい。
上記した反応条件のうち、至適pH範囲、至適温度範囲を非至適条件（範囲）とするのが好ましく、なかでも至適pH範囲を非至適条件（範囲）とするのが特に好ましい。
【００１４】
特に、至適pH範囲以外の範囲（非至適pH条件）としては、使用する蛋白質分解酵素の至適pH範囲の通常2以上、好ましくは2.5以上アルカリ側であって、通常5以下、好ましくは4以下、より好ましくは3.5以下アルカリ側の範囲、又は通常2以上、好ましくは2.5以上酸性側であって、通常5以下、好ましくは4以下、より好ましくは3.5以下酸性側の範囲である。
尚、上記において例えば「至適pH範囲の2以上5以下アルカリ側の範囲」とは、図１に示すように、使用する蛋白質分解酵素が有する至適pH範囲のアルカリ側の限界値から2以上アルカリ側であって且つ当該至適pH範囲のアルカリ側の限界値から5以下アルカリ側の範囲を意味し、例えば「至適pH範囲の2以上5以下酸性側の範囲」とは、使用する蛋白質分解酵素が有する至適pH範囲の酸性側の限界値から2以上酸性側であって且つ当該至適pH範囲の酸性側の限界値から5以下酸性側の範囲を意味する。
【００１５】
より具体的には、例えば蛋白質分解酵素としてトリプシン（至適pH：7.6）を用いる場合には、非至適pH条件は、通常pH9.6以上、好ましくはpH10.1以上であって、通常pH12.6以下、好ましくはpH11.6以下、より好ましくはpH11.1以下の範囲（アルカリ側）又は通常pH2.6以上、好ましくはpH3.6以上、より好ましくはpH4.1以上であって、通常pH5.6以下、好ましくはpH5.1以下の範囲（酸性側）である。
同様に、ウロキナーゼ（至適pH：8.8）の場合には、非至適pH条件は、通常pH10.8以上、好ましくはpH11.3以上であって、通常pH13.8以下、好ましくはpH12.8以下、より好ましくはpH12.3以下の範囲（アルカリ側）又は通常pH3.8以上、好ましくはpH4.8以上、より好ましくはpH5.3以上であって、通常pH6.8以下、好ましくはpH6.3以下の範囲（酸性側）である。
プラスミン（至適pH：7.8〜8.5）の場合には、非至適pH条件は、通常pH10.5以上、好ましくはpH11以上であって、通常pH13.5以下、好ましくはpH12.5以下、より好ましくはpH12以下の範囲（アルカリ側）又は通常pH2.8以上、好ましくはpH3.8以上、より好ましくはpH4.3以上であって、通常pH5.8以下、好ましくはpH5.3以下の範囲（酸性側）である。
ペプシン（至適pH：1.8〜2.0）の場合には、非至適pH条件は、通常pH4以上、好ましくはpH4.5以上であって、通常pH7.0以下、好ましくはpH6以下、より好ましくはpH5.5以下の範囲である。
パパイン（至適pH：7.0）の場合には、非至適pH条件は、通常pH9以上、好ましくはpH9.5以下であって、通常pH12以下、好ましくはpH11以下、より好ましくはpH10.5以下の範囲（アルカリ側）又は通常pH2以上、好ましくはpH3以上、より好ましくはpH3.5以上であって、通常pH5以下、好ましくはpH4.5以下の範囲（酸性側）である。
トロンビン（至適pH：6.5）の場合には、非至適pH条件は、通常pH8.5以上、好ましくはpH9.0以上であって、通常pH10.0以下、好ましくはpH10.5以下、より好ましくはpH11.5以下の範囲（アルカリ側）又は通常pH1.5以上、好ましくはpH2.5以上、より好ましくはpH3.0以上であって、通常pH4.5以下、好ましくはpH4.0以下の範囲（酸性側）である。
カリクレイン（至適pH：8.5）の場合には、非至適pH条件は、通常pH10.5以上、好ましくはpH11.0以上であって、通常pH13.5以下、好ましくはpH12.5以下、より好ましくはpH12.0以下の範囲（アルカリ側）又は通常pH3.5以上、好ましくはpH4.5以上、より好ましくはpH5.0以上であって、通常pH6.5以下、好ましくはpH6.0以下の範囲（酸性側）である。
キモトリプシン（至適pH：8.0）の場合には、非至適pH条件は、通常pH10.0以上、好ましくはpH10.5以上であって、通常pH13.0以下、好ましくはpH12.0以下、より好ましくはpH11.5以下の範囲（アルカリ側）又は通常pH3.0以上、好ましくはpH4.0以上、より好ましくはpH4.5以上であって、通常pH6.0以下、好ましくはpH5.5以下の範囲（酸性側）である。
エラスターゼ（至適pH：8.8）の場合には、非至適pH条件は、通常pH10.8以上、好ましくはpH11.3以上であって、通常pH13.5以下、好ましくはpH12.5以下、より好ましくはpH12.0以下の範囲（アルカリ側）又は通常pH3.8以上、好ましくはpH4.8以上、より好ましくはpH5.3以上であって、通常pH6.8以下、好ましくはpH6.3以下の範囲（酸性側）である。
ズブチリシン（至適pH：10.0）の場合には、非至適pH条件は、通常pH12.0以上、好ましくはpH12.5以上であって、通常pH14.0以下、好ましくはpH13.5以下の範囲（アルカリ側）又は通常pH5.0以上、好ましくはpH6.0以上、より好ましくはpH6.5以上であって、通常pH8.0以下、好ましくはpH7.5以下の範囲（酸性側）である。
尚、本発明において上記した如き至適pH範囲以外の範囲（非至適pH条件）は、酸性側の範囲が特に好ましい。
即ち、酸性側の非至適pH範囲でPCPAのプロ部分を除去（PCPAを活性化）を行えば、より確実にPCPAのプロ部分を除去し得（より確実にPCPAを活性化し得）、即ち、高い確率で十分に（高度に）PCPAのプロ部分を除去（PCPAを活性化）しながらCPAの過消化も抑制することができるようになる。
【００１６】
２−２．本発明のPCPAのプロ部分除去方法
本発明のPCPAのプロ部分の除去方法は、PCPAに上記した如き蛋白質分解酵素を作用させるにあたり、上記した如き非至適条件下、即ち、使用する蛋白質分解酵素が有する至適条件以外の条件でこれを行うことを特徴とする。
これにより、蛋白質分解酵素の活性をコントロールすることができ、当該酵素が有するPCPAのプロ部分を除去する能力（PCPAを活性化する能力）を十分に維持しながら、当該酵素によるCPAの過消化を抑制することができる。
本発明のPCPAのプロ部分の除去方法を実施するには、上記した如き使用する蛋白質分解酵素の非至適条件下で、当該蛋白質分解酵素をPCPAに作用させる以外は、特に限定されない。尚、先にも述べたが、蛋白質分解酵素が有する複数の至適条件のうち、１つの条件のみを非至適条件としても、また、２以上の条件を非至適条件としてもよい。
【００１７】
以下に、例えば、非至適条件として、使用する蛋白質分解酵素の非至適pH条件下で本発明の方法を実施する場合を例にとり説明する。
即ち、使用する蛋白質分解酵素の非至適条件下でPCPAに当該蛋白質分解酵素を作用させるための緩衝液又は水（以下、本発明に係る緩衝液と略記する。）中で、PCPAに当該蛋白質分解酵素を適当な時間、適当な温度で作用させればよい。
【００１８】
ここで、本発明に係る緩衝液は、当該蛋白質分解酵素の至適pH範囲以外のpHを有する緩衝液又は水であり、より具体的には、使用する蛋白質分解酵素の至適pH範囲の通常2以上、好ましくは2.5以上アルカリ側であって、通常5以下、好ましくは4以下、より好ましくは3.5以下アルカリ側の範囲から選ばれるpHを有する緩衝液、又は通常2以上、好ましくは2.5以上酸性側であって、通常5以下、好ましくは4以下、より好ましくは3.5以下酸性側の範囲から選ばれるpHを有する緩衝液である。尚、特定の蛋白質分解酵素を使用する場合の本発明に係る緩衝液の具体的なpHについては前述と同様である。
このような本発明に係る緩衝液としては、通常この分野で用いられるものであればよく、特に限定されないが、例えば酢酸緩衝液、フタル酸緩衝液、クエン酸緩衝液、りん酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、ほう酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。尚、これら緩衝液の使用濃度についても特に限定されず、通常この分野で用いられる濃度範囲（例えば、下限が通常0.001M以上、好ましくは0.01M以上、より好ましくは0.05M以上、上限が通常5M以下、好ましくは2M以下、より好ましくは１M以下の範囲）から適宜選択される。
【００１９】
また、上記において、PCPAに蛋白質分解酵素を作用させる際の時間（反応時間）及び温度（反応温度）も特に限定されず、実質的に全てのPCPAのプロ部分を除去（PCPAを活性化）するが実質的にCPAを過消化しないような条件であればよい。より具体的には、反応時間は、下限が通常0.5分以上、好ましくは2分以上、より好ましくは5分以上、上限が通常120分以下、好ましくは60分以下、より好ましくは30分以下であり、反応温度は、下限が通常2℃以上、好ましくは15℃以上、より好ましくは25℃以上、上限が通常60℃以下、好ましくは45℃以下、より好ましくは37℃以下である。
使用される蛋白質分解酵素の濃度としては、通常この分野で用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。より具体的には、使用される蛋白質分解酵素の種類により異なるため一概には言えないが、最終濃度（PCPAに蛋白質分解酵素を作用させる際の、PCPAと蛋白質分解酵素とを含む本発明に係る緩衝液中の濃度）として、例えば、トリプシンの場合は、通常1000〜500000（BAEE）U/mL、好ましくは5000〜100000（BAEE）U/mL、より好ましくは10000〜50000（BAEE）U/mL、トロンビンの場合は、通常100〜100000U/mL、好ましくは500〜50000U/mL、より好ましくは2000〜10000U/mL、プラスミンの場合は通常0.1〜1000U/mL、好ましくは1〜100U/mL、より好ましくは10〜30U/mLからそれぞれ適宜選択され、カリクレインの場合は通常1〜40000U/mL、好ましくは10〜20000U/mL、より好ましくは50〜10000U/mL、キモトリプシンの場合は通常500〜50000（USP）U/mL、好ましくは1000〜30000（USP）U/mL、より好ましくは4000〜10000U/mL、エラスターゼの場合は通常1〜40000U/mL、好ましくは10〜20000U/mL、より好ましくは50〜10000U/mL、ズブチリシンの場合は通常0.01〜1000U/mL、好ましくは0.1〜100U/mL、より好ましくは1〜10U/mL、ウロキナーゼの場合は通常100〜100000U/mL、好ましくは500〜50000U/mL、より好ましくは2000〜10000U/mL、パパインの場合は通常1〜100000U/mL、好ましくは10〜10000U/mL、より好ましくは100〜1000U/mLからそれぞれ適宜選択される。
尚、pHを至適条件からはずしてPCPAの処理を行う場合、反応時間、反応温度、蛋白質分解酵素濃度は、使用する蛋白質分解酵素が有する至適条件（範囲）から選択しても、非至適条件（範囲）から選択してもよい。
また、蛋白質分解酵素の使用濃度が低すぎるとPCPAのプロ部分の除去（PCPAの活性化）が十分に行えない場合があり、また、使用濃度が高すぎるとCPAの過消化が生じやすくなる場合があるので注意が必要である。
【００２０】
上記において、本発明に係る緩衝液中でPCPAに蛋白質分解酵素を作用させるには、最終的に本発明に係る緩衝液中でPCPAと蛋白質分解酵素とを接触させることができればよく、一般的には蛋白質分解酵素を添加・溶解させた本発明に係る緩衝液とPCPAを含む生体由来試料とを混合させることにより行われる。
また、pH以外の条件、例えば反応時間、反応温度、蛋白質分解酵素濃度等を非至適条件としてPCPAの処理を行う場合も、pHの場合に準じた考え方で条件を適宜設定すればよい。
尚、蛋白質分解酵素を含有する溶液（例えば本発明に係る緩衝液）には、蛋白質分解酵素の自己消化を抑制するための物質（例えばトリプシンの場合にはCa2+）等を添加しておいてもよい。
【００２１】
２−３．蛋白質分解酵素阻害剤の使用
本発明のPCPAのプロ部分除去方法においては、上記したようにPCPAに蛋白質分解酵素を作用させて、実質的に全てのPCPAのプロ部分を除去（PCPAを活性化）する場合には、除去処理後の反応液に、当該蛋白質分解酵素の阻害剤を作用させるのが好ましい。
これにより、CPAの過消化をより抑制することが可能となる。
このような蛋白質分解酵素阻害剤としては、蛋白質分解酵素の活性を阻害し、且つ実質的にCPA活性を阻害しない性質を有するものであれば特に限定されない。
尚、「実質的にCPA活性を阻害しない」とは、当該蛋白質分解酵素阻害剤の不存在下でのCPA活性を100％とした場合の、当該阻害剤存在下でのCPA活性が通常50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、更に好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上保持（保存）されることを意味する。換言すれば、本発明で使用される蛋白質分解酵素阻害剤は、CPA活性に対する阻害が、通常50％以下、好ましくは30％以下、より好ましくは20％以下、更に好ましくは10％以下、特に好ましくは5％以下のものである。
また、本発明に係る蛋白質分解酵素阻害剤のCPA活性に対する阻害率を予め調べておけば、得られたCPA活性値から真のCPA活性値を計算で求めることができるようになるので、CPA活性の測定をより高精度に実施することが可能となる。
蛋白質分解酵素阻害剤としては、例えば蛋白質性阻害剤、ペプチド性阻害剤、無機物タイプ阻害剤が挙げられ、なかでも蛋白質性阻害剤が好ましい。
より具体的には、トリプシンに対する阻害剤としては、例えばトリプシンインヒビター（例えば大豆由来、ウシ膵臓、ヒツジ膵臓、鶏卵由来等）、ロイペプチン、α-N-トシルリシンクロロメチルケトン、ベンズアミジン、（p-アミジノフェニル）メタンスルホニル フルオライド・塩酸〔（p-Amidinophenyl）methansulfonul Fluoride・HCl：p-APMSF〕、アプロチニン、ジイソプロピル フルオロホスフェイト（Diisopropyl Fluorophosphate：DFP）、フェニルメチルスルホニル フルオライド（Phenylmethylsulfonyl Fluoride：PMSF）、α1-アンチトリプシン等が挙げられ、なかでもトリプシンインヒビター、アプロチニン、ロイペプチンが好ましい。
トロンビンに対する阻害剤としては、例えばアンチスロンビンIII、α1-アンチトリプシン、α2-マクログロブリン、ベンズアミジン、DFP、プロテインCaインヒビター（PCI）、ヘパリンコファクターII、ダンシルアルギニンN-（3エチル-1,5-ペンタンジイル）アミド、Val-Arg-クロロメチルケトン等が挙げられ、なかでもアンチスロンビンIII、α1-アンチトリプシン、α2-マクログロブリン、プロテインCaインヒビターが好ましい。
プラスミンに対する阻害剤としては、例えばα1-アンチトリプシン、α2-マクログロブリン、トリプシンインヒビター（大豆由来、ウシ膵臓由来）、α2-プラスミンインヒビター、C1-インアクチベーター、ε-アミノカプロン酸、t-4-アミノメチル-シクロヘキサンカルボン酸（trans-Aminomethyl cyclohexane carboxylic acid：t-AMCHA）、t-4-アミノメチル-シクロヘキサンカルボン酸-ヘキシルエステル（t-AMCHA-ヘキシルエステル）、ベンズアミジン、DFP、Nα-トシル-L-リシルクロロメチルケトン（TLCK）等が挙げられ、なかでもα2-マクログロブリン、トリプシンインヒビター（大豆由来、ウシ膵臓由来等）、α2-プラスミンインヒビターが好ましい。
カリクレインに対する阻害剤としては、例えばα1-アンチトリプシン、α2-プラスミンインヒビター、C1-インアクチベーター、アンチスロンビンIII、α2-マクログロブリン、トリプシンインヒビター（大豆由来）、DFP、Ala-Phe-Arg-CH2Cl等が挙げられ、なかでもα1-アンチトリプシン、α2-プラスミンインヒビター、C1-インアクチベーター、アンチスロンビンIII、α2-マクログロブリン、トリプシンインヒビター（大豆由来）が好ましい。
キモトリプシンに対する阻害剤としては、例えばα1-アンチキモトリプシン、インター-α-トリプシンインヒビター、Ｎ-トシル-L-フェニルアラニルクロロメチルケトン（TPCK）、DEP、等が挙げられ、なかでもα1-アンチキモトリプシン、インター-α-トリプシンインヒビター、が好ましい。
エラスターゼに対する阻害剤としては、例えばエラスタチナール、DFP、アセチル-Ala-Ala-Pro-Ala-CH2Cl、Cu2+等が挙げられ、なかでもエラスタチナール、Cu2+が好ましい。
ズブチリシンに対する阻害剤としては、例えばズブチリシンインヒビター（Streptomyces属由来）、DFP、PMSF等が挙げられ、なかでもズブチリシンインヒビター（Streptomyces属由来）が好ましい。
ウロキナーゼに対する阻害剤としては、例えばα1-アンチトリプシン、ベンズアミジン、6-アミノカプロン酸、DFP、TLCK、4-ニトロフェニル 4-グアニジノベンゾエイト（NPGB）等が挙げられ、なかでもα1-アンチトリプシンが好ましい。
パパインに対する阻害剤としては、アンチパイン、N-エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、TLCK、重金属イオン、p-クロロメルクリ安息香酸（PCMB）等が挙げられる。
尚、上記した如き蛋白質分解酵素阻害剤の由来も当該蛋白質分解酵素を阻害し得るものであれば特に限定されず、通常この分野で使用し得るものであれば、微生物、動物、植物等に由来するもの、市販品、或いは細胞融合技術や遺伝子組換え技術等を利用した自体公知の方法によって得られたもの等が使用できる。
また、上記した如き蛋白質分解酵素阻害剤は、単独で用いても、２種以上を適宜組み合わせて用いてもどちらでも良い。
【００２２】
蛋白質分解酵素阻害剤の濃度としては、蛋白質分解酵素の活性を十分に阻害（停止）し得る濃度であればよく、通常この分野で用いられる濃度範囲から適宜選択される。
また、PCPAに蛋白質分解酵素を作用させて得られた反応液に、当該蛋白質分解酵素の阻害剤を作用させる際の反応条件（時間、温度、pH等）は、通常この分野で使用される範囲から適宜選択すればよく、特に限定されないが、例えば反応時間は、下限が通常1秒以上、好ましくは0.1分以上、より好ましくは1分以上、上限が通常10分以下、好ましくは5分以下、より好ましくは2分以下であり、反応温度は、下限が通常-10℃以上、好ましくは-5℃以上、より好ましくは0℃以上、更に好ましくは2℃以上、上限が60℃以下、好ましくは45℃以下、より好ましくは37℃以下である。また、反応pHは、下限が通常pH4.5以上、好ましくはpH5.5以上、より好ましくはpH6.5以上、更に好ましくはpH7.0以上、上限が通常pH10.5以下、好ましくはpH9.5以下、より好ましくはpH8.5以下、更に好ましくはpH8.0以下である。
尚、蛋白質分解酵素をより働かなくするために、当該阻害剤を蛋白質分解酵素に上記条件下で接触させた後、冷却（氷冷）してもよい。
尚、上記において、PCPAに蛋白質分解酵素を作用させて得られた反応液に、当該蛋白質分解酵素の阻害剤を作用させるには、最終的に当該反応液中に存在する蛋白質分解酵素と当該蛋白質分解酵素阻害剤とを接触させることができればよく、一般的には蛋白質分解酵素阻害剤を添加・溶解させた溶液と当該反応液とを混合させることにより行われる。
上記において、蛋白質分解酵素阻害剤を添加・溶解させる溶液としては、前述した如き本発明に係る緩衝液と同様のものが挙げられ、その使用濃度等も同様である。
【００２３】
本発明のPCPAのプロ部分除去方法の好ましい一態様を以下に詳述する。
PCPAを含有する例えば血清又は尿等の生体由来試料と、例えばトリプシン等の蛋白質分解酵素を含有する緩衝液（蛋白質分解酵素の至適pH範囲の2以上5以下アルカリ側の範囲又は2以上5以下酸性側の範囲から選ばれるpHを有する緩衝液：トリプシンの場合pH9.6〜12.6又はpH5.6〜2.6）とを混合し、適当な温度（下限が通常2℃以上、好ましくは15℃以上、より好ましくは25℃以上、上限が通常60℃以下、好ましくは45℃以下、より好ましくは37℃以下）で適当な時間（下限が通常0.5分以上、好ましくは2分以上、より好ましくは5分以上、上限が120分以下、好ましくは60分以下、より好ましくは30分以下）加温反応して試料中に存在するPCPAのプロ部分を除去した後、更にこれに当該蛋白質分解酵素の阻害剤を含む溶液を添加して当該蛋白質分解酵素の反応を停止させる。
【００２４】
３．生体由来試料
本発明において使用される生体由来試料としては、各種体液（例えば血清、血漿、髄液、膵液、滑液、リンパ液等）、排泄物（例えば尿、唾液等）、リンパ球、血球、各種細胞類、各種生体組織の抽出液、及びこれらを水や通常この分野で用いられている緩衝液（例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等）に適宜溶解又は懸濁等させて再構成して得られた処理物等が挙げられる。
【００２５】
４．全CPA測定法
上記した本発明のPCPAのプロ部分除去方法を、生体由来試料に適用すれば、当該試料中に存在するPCPAのプロ部分を除去してCPAに変換することができ、且つ、当該試料中に元々存在するCPA（F-CPA）やPCPAから一旦変換されたCPAは更に分解（過消化）されることがほとんど無い。そのため、本発明のPCPAのプロ部分除去方法で処理した生体由来試料を、自体公知のCPA測定法に供すれば、当該試料中のPCPAレベル及び全CPAレベル（即ち、PCPAとF-CPAの総合的なレベル）を高精度に測定し得る。
換言すれば、本発明のPCPAのプロ部分除去方法を生体由来試料に適用すること、即ち、生体由来試料に上記した如き蛋白質分解酵素を上記した如き当該酵素の非至適条件下で作用させることは、CPA測定用の生体由来試料の前処理方法として有用である。尚、この場合、上記した如き本発明のPCPAのプロ部分除去方法におけるPCPAを生体由来試料に置換える以外は本発明のPCPAのプロ部分除去方法とまったく同様に実施すればよいことは言うまでもない。
【００２６】
４−１．CPA測定法
本発明において使用可能なCPA測定法としては、試料中のCPA量又はCPA活性を測定し得る方法であればよく、特に限定されない。
このようなCPA測定法としては、例えば基質に試料中のCPAを作用させて生成した基質分解産物を直接測定するか又は更にその他の供役酵素を作用させて酵素的にCPA活性を測定する方法（酵素的測定法）や、CPAに対する抗体を使用して免疫学的にCPA量を測定する方法（免疫学的方法）等が挙げられる。
なかでも、本発明の方法は、酵素的測定法に有用である。
酵素的測定法としては、CPA活性を測定し得るものであれば特に限定されず、例えば特開昭58-105948号公報、特開昭59-66897号公報、特開昭59-85299号公報、特開昭61-74600号公報、特開昭63-167800号公報、特開平9-313199号公報、特開平11-127894号公報、特表2001-518791号公報、Kingsbury et al. (1984) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81: 4573-4576、Brown et al. (1987) Analytical Biochemistry 161: 219-225、Bergmeyer, H. U., Ed. (1974) Methods of Enzymatic Analysis, vol. 2, 2nd ed., Academic Press, New York、Roth, M. and Rohner, A. (1983) Clin. Chim. Acta 135: 65-71、Ravin, H. A. and Seligman, A. M. (1951) J. Biol. Chem. 190: 391-402、Peterson et al. (1982) Anal. Biochem. 125: 420-426等に記載の方法が挙げられる。本発明の方法は、なかでも特表2001-518791号公報等に記載の方法に特に有用である。
また、測定原理についても、特に限定されず、レート法、エンドポイント法或いはレートアンドエンド法等自体公知の酵素活性測定法〔例えば臨床検査法提要  第３０版  金井正光編  金原出版（株）611〜618頁等〕に準じて行えばよい。
【００２７】
４−２．本発明の全CPA活性測定法
生体由来試料を上記した如き本発明のPCPAのプロ部分の除去方法で処理された試料中のCPA活性を上記した如き自体公知の酵素的測定法に準じて測定する以外は特に限定されない。
即ち、(i)先ず、試料と、蛋白質分解酵素とを、上記した本発明のPCPAのプロ部分の除去方法に準じて当該酵素の非至適条件下で接触させ、要すれば、その後、(i')得られた溶液と当該蛋白質分解酵素の阻害剤とを接触させる。(ii)次いで、得られた溶液を、自体公知のCPA測定法に準じて、CPAの基質と接触させ、(iii)当該基質の変化に由来する光学的変化に基づいて当該試料中のCPA活性を測定する。
尚、CPA活性を測定する際に使用されるCPA基質、試薬類、その他の酵素類、それらの使用濃度、反応条件、測定操作等も上記した如き自体公知の酵素的測定法に準じて適宜選択すればよい。
【００２８】
特に、本発明のPCPAのプロ部分の除去方法で処理された試料中のCPA活性を測定する方法として、CPA活性をCPA特異的阻害剤の存在下及び不存在下で行う特表2001-518791号公報に記載の方法に準じて行えば、より高感度にCPA活性を測定し得る。
即ち、本発明の全CPA活性測定法の好ましい態様としては、生体由来試料を上記した如き本発明のPCPAのプロ部分の除去方法で処理し、次いで処理された試料中のCPA活性をCPA特異的阻害剤の存在下及び不存在下で行う方法である。
より具体的には、
(i)先ず、試料と、蛋白質分解酵素とを、上記した本発明のPCPAのプロ部分の除去方法に準じて当該酵素の非至適条件下で接触させ、要すれば、その後、(i')得られた溶液と当該蛋白質分解酵素の阻害剤とを接触させる。(ii)次いで、得られた溶液を、特表2001-518791号公報に記載の方法に準じて、CPAの基質と、CPA特異的阻害剤の存在及び不存在下接触させる。即ち、(i)又は(i')で得られた溶液を、少なくとも２つ以上の部分に分け、そのうちの一方の溶液にはCPA特異的阻害剤を共存させ、当該溶液中のCPAをCPA特異的阻害剤の存在下でCPAの基質と接触させ、残りの一方の溶液にはCPA特異的阻害剤を共存させずに、当該溶液中のCPAをCPAの基質と接触させる。(iii)(ii)で得られるCPA特異的阻害剤の存在及び不存在下の反応液における当該基質の変化に由来する光学的変化の差、即ちCPA特異的阻害剤の不存在下でCPAとCPA基質とを接触させて得られた反応液における当該基質の変化から、CPA特異的阻害剤の存在下でCPAとCPA基質とを接触させて得られた反応液における当該基質の変化を差し引いた値、に基づいて当該試料中のCPA活性を測定する。
尚、CPA活性を測定する際に使用されるCPA基質、CPA特異的阻害剤（例えばα−ベンジルコハク酸、ポテトCPA阻害剤、抗CPA抗体等）、試薬類、その他の酵素類、それらの使用濃度、反応条件、測定操作等も特表2001-518791号公報に記載の方法に準じて適宜選択すればよい。
【００２９】
４−３．CPAの基質
本発明の全CPA活性測定法においては、前述した如き自体公知の酵素的測定法において使用されるCPAの基質は何れも使用可能である。
より具体的には、例えばＮ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−３−チアフェニルアラニン（N-Ac-Phe-Thiaphe）、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−グリシル−Ｌ−フェニルアラニン（Z-Gly-Phe）、ヒプリル−フェニルアラニン（Bz-Gly-L-Phe）、Ｎ−（２−フラナクリロイル）−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｈｅ（FAPP）、ｐ−ヒドロキシベンゾイル―Ｌ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ヒドロキシベンゾイルグリシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ヒドロキシベンゾイルグリシル−Ｌ−チロシン、ｏ−ヒドロキシベンゾイル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アミノベンゾイル−Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシン、ｐ−メトキシベンゾイル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニン、ベンゾイル−グリシル―Ｌ−フェニルアラニン、アセチル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−チロシン、アセチル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−フェニルアラニン、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−チロシン、アセチル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニン、アセチル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−チロシン、アセチル−Ｌ−チロシル−Ｌ−フェニルアラニン、アセチル−Ｌ−チロシル−Ｌ−チロシン、ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−チロシン、ホルミル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−フェニルアラニン、ナフトキシカルボニル−フェニルアラニン等が挙げられる。
なかでも、N-Ac-Phe-Thiaphe、Z-Gly-Phe等が好ましい。
尚、これらCPAの基質の使用濃度は、前述した如き自体公知の酵素的測定法に準じて適宜選択すればよい。
【００３０】
４−４．CPA活性の測定
CPA活性の測定は、本発明のPCPAのプロ部分の除去方法によって処理された溶液とCPAの基質とをCPA特異的阻害剤の存在又は／及び不存在下で接触させて生じた、当該基質の変化に由来する光学的変化に基づいて行われる。
即ち、本発明のPCPAのプロ部分の除去方法によって処理された溶液中に存在するCPAの作用によるCPA基質の減少又はCPAの作用により生じたCPA基質の分解産物を光学的に測定すればよい。
光学的測定は、前述した如き自体公知の測定方法に準じて行えばよく、使用されるCPA基質又は生じるCPA基質の分解産物の性質に応じて前述した如き自体公知の測定方法から適宜選択される。また、測定原理もレート法、エンドポイント法或いはレートアンドエンド法等自体公知の酵素活性測定法〔例えば臨床検査法提要  第３０版  金井正光編  金原出版（株）611〜618頁等〕に準じて行えばよいが、なかでもより正確に酵素活性を測定し得るレート法が好ましい。
尚、レート法を用いる場合は、単位時間当たりの吸光度変化量を測定する通常のレート法を用いても良く、また、特定の２点の吸光度を測定し、当該２点間（一定時間）又は単位時間当たりの吸光度変化量を求める２ポイントレート法を用いても良い。
また、使用される各種試薬類〔例えば発色剤（例えばエルマン試薬又はその類似体、カップラー及びデベロッパー等）、共役酵素、補酵素、これら以外の試薬等〕等も、使用されるCPA基質又は生じるCPA基質の分解産物の性質に応じて前述した如き自体公知の測定方法から適宜選択される。
例えば発色剤としては、CPAの作用によりスルフヒドリル基を有する分解産物を生じるCPA基質を用いる場合には、当該分解産物にエルマン試薬又はその類似体〔例えば５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（DTNB）、２，２’−ジピリジルジスルフィド、４，４‘−ビス（ジメチルアミノ）ベンズハイドロール（BDC-OH）、２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）（5-Nitro-2-PDS）、２，２‘−ジチオジピリジン（2-PDS）、４，４’−ジチオジピリジン（4-PDS）等〕を作用させて、生じるアニオン種に基づく吸光度変化（光学密度）を測定すればよい。
【００３１】
２ポイントレート法を利用する場合の本発明の全CPA活性測定法の好ましい一態様を以下に詳述する。
(1)先ず、試料中のPCPAを、以下の手順に従ってCPAに変換する。（本発明のPCPAのプロ部分の除去方法）
i)PCPAを含有する例えば血清又は尿等の生体由来試料と、例えばトリプシン等の蛋白質分解酵素を含有する緩衝液（蛋白質分解酵素の至適pH範囲の2以上5以下アルカリ側の範囲又は2以上5以下酸性側の範囲から選ばれるpHを有する緩衝液：トリプシンの場合pH9.6〜12.6又はpH5.6〜2.6）とを混合し、適当な温度（下限が通常2℃以上、好ましくは15℃以上、より好ましくは25℃以上、上限が通常60℃以下、好ましくは45℃以下、より好ましくは37℃以下）で適当な時間（下限が通常0.5分以上、好ましくは2分以上、より好ましくは5分以上、上限が通常120分以下、好ましくは60分以下、より好ましくは30分以下）加温反応して試料中に存在するPCPAのプロ部分を除去する。尚、蛋白質分解酵素を含有する緩衝液には、蛋白質分解酵素の自己消化を抑制するための物質（例えばトリプシンの場合にはCa2+）等を添加しておいてもよい。
ii)その後、更にこれに当該蛋白質分解酵素の阻害剤を含む溶液を添加して当該蛋白質分解酵素の反応を停止させる。
(2)次いで、得られた溶液中のCPA（元々試料中に存在するF-CPAおよびPCPAから変換されたCPA）の活性を以下の手順に従って測定する。
i)得られた溶液を少なくとも２つ以上の部分（ブランク用試料、テスト用試料）に分ける。
ii)そのうちの一方（ブランク用試料）と例えばベンジルコハク酸等のCPA特異的阻害剤及び発色剤（例えばDTNB等のエルマン試薬又はその類似体）を含む緩衝液（ブランク用第１試液）とを混合し、適当な温度（下限が通常2℃以上、好ましくは15℃以上、より好ましくは25℃以上、上限が通常60℃以下、好ましくは45℃以下、より好ましくは37℃以下）で適当な時間（下限が通常0.5分以上、好ましくは2分以上、より好ましくは3分以上、上限が通常15分以下、好ましくは10分以下、より好ましくは7分以下）放置した後、溶液の吸光度を、適当な波長〔例えば、CPAの作用により生じたCPA基質分解産物と使用する発色剤（DTNB等のエルマン試薬又はその類似体）の作用により生じる発色性物質（例えばアニオン種等）の特性に応じた波長〕において測定する（OD Blank(0)）。
ii')また、残りの一方（テスト用試料）と発色剤（例えばDTNB等のエルマン試薬又はその類似体）を含む（CPA特異的阻害剤不含）緩衝液（テスト用第１試液）とを混合し、上記ii)と同じ温度、時間放置した後、溶液の吸光度を、上記ii)と同じ波長において測定する（OD Test(0)）。
iii)吸光度測定後、それぞれの溶液とCPA基質（例えばN-Ac-Phe-Thiaphe等）を含む溶液とをそれぞれ混合し、適当な温度（下限が通常2℃以上、好ましくは15℃以上、より好ましくは25℃以上、上限が通常60℃以下、好ましくは45℃以下、より好ましくは37℃以下）で適当な時間（下限が通常1分以上、好ましくは10分以上、より好ましくは15分以上、上限が通常300分以下、好ましくは180分以下、より好ましくは30分以下）、適当なpH（下限が通常pH4.5以上、好ましくはpH5.5以上、より好ましくはpH6.5以上、更に好ましくはpH7.0以上、上限が通常pH10.5以下、好ましくはpH9.5以下、より好ましくはpH8.5以下、更に好ましくはpH8.0以下）で加温反応して、CPAの作用によりCPA基質を加水分解させ、更に分解したCPA基質分解産物と発色剤（例えばDTNB等のエルマン試薬又はその類似体）との作用により発色性物質（例えばアニオン種等）を生成させる。その後、それぞれの溶液の一定時間後の吸光度を上記波長において測定する（OD Blank(T)、OD Test(T)）。
iv)得られた各吸光度を下記に式に代入してΔE又はΔE/minを求め、このΔE又はΔE/minに基づいてCPA活性値を算出する。尚、ΔE/minは、ΔEを単位時間（min）当たりに換算したものである。
・OD Blank(T)−OD Blank(0)＝ΔOD Blank
・OD Test(T)−OD Test(0)＝ΔOD Test
・ΔE＝ΔOD Test−ΔOD Blank
尚、CPA活性値は、既知濃度のCPAを含む標準液を用いて上記と同様の操作を行って作成したCPA活性と吸光度（ΔE又はΔE/min）との関係を表す検量線に当てはめるか、或いはCPAの作用により生じたCPA基質分解産物と使用した発色剤（例えばDTNB等のエルマン試薬又はその類似体）の作用により生じる発色性物質（例えばアニオン種等）の分子吸光係数に基づいて算出すればよい。
【００３２】
レート法を利用する場合の本発明の全CPA活性測定法の好ましい一態様を以下に詳述する。
(1)先ず、試料中のPCPAを、以下の手順に従ってCPAに変換する。（本発明のPCPAのプロ部分の除去方法）
i)PCPAを含有する例えば血清又は尿等の生体由来試料と、例えばトリプシン等の蛋白質分解酵素を含有する緩衝液（蛋白質分解酵素の至適pH範囲の2以上5以下アルカリ側の範囲又は2以上5以下酸性側の範囲から選ばれるpHを有する緩衝液：トリプシンの場合pH9.6〜12.6又はpH5.6〜2.6）とを混合し、適当な温度（下限が通常2℃以上、好ましくは15℃以上、より好ましくは25℃以上、上限が通常60℃以下、好ましくは45℃以下、より好ましくは37℃以下）で適当な時間（下限が通常0.5分以上、好ましくは2分以上、より好ましくは5分以上、上限が通常120分以下、好ましくは60分以下、より好ましくは30分以下）、適当なpH（下限が通常pH4.5以上、好ましくはpH5.5以上、より好ましくはpH6.5以上、更に好ましくはpH7.0以上、上限が通常pH10.5以下、好ましくはpH9.5以下、より好ましくはpH8.5以下、更に好ましくはpH8.0以下）で加温反応して試料中に存在するPCPAのプロ部分を除去する。尚、蛋白質分解酵素を含有する緩衝液には、蛋白質分解酵素の自己消化を抑制するための物質（例えばトリプシンの場合にはCa2+）等を添加しておいてもよい。
ii)その後、更にこれに当該蛋白質分解酵素の阻害剤を含む溶液を添加して当該蛋白質分解酵素の反応を停止させる。
(2)次いで、得られた溶液中のCPA（元々試料中に存在するF-CPAおよびPCPAから変換されたCPA）の活性を以下の手順に従って測定する。
i)得られた溶液を少なくとも２つ以上の部分（ブランク用試料、テスト用試料）に分ける。
ii)そのうちの一方（ブランク用試料）と例えばベンジルコハク酸等のCPA特異的阻害剤及び発色剤（例えばDTNB等のエルマン試薬又はその類似体）を含む緩衝液（ブランク用第１試液）とを混合し、適当な温度（下限が通常2℃以上、好ましくは15℃以上、より好ましくは25℃以上、上限が通常60℃以下、好ましくは45℃以下、より好ましくは37℃以下）で適当な時間（下限が通常0.5分以上、好ましくは2分以上、より好ましくは3分以上、上限が通常15分以下、好ましくは10分以下、より好ましくは7分以下）放置した後、更にCPA基質を含む溶液を混合し、適当な温度（下限が通常2℃以上、好ましくは15℃以上、より好ましくは25℃以上、上限が通常60℃以下、好ましくは45℃以下、より好ましくは37℃以下）で適当な時間（下限が通常1分以上、好ましくは10分以上、より好ましくは15分以上、上限が通常300分以下、好ましくは180分以下、より好ましくは30分以下）、適当なpH（下限が通常pH4.5以上、好ましくはpH5.5以上、より好ましくはpH6.5以上、更に好ましくはpH7.0以上、上限が通常pH10.5以下、好ましくはpH9.5以下、より好ましくはpH8.5以下、更に好ましくはpH8.0以下）で加温反応させる。その後、溶液の単位時間当たりの吸光度変化を、適当な波長〔例えば、CPAの作用により生じたCPA基質分解産物と使用する発色剤（DTNB等のエルマン試薬又はその類似体）の作用により生じる発色性物質（例えばアニオン種等）の特性に応じた波長〕において測定する（ΔOD/min Blank）。
ii')また、残りの一方（テスト用試料）と発色剤（例えばDTNB等のエルマン試薬又はその類似体）を含む（CPA特異的阻害剤不含）緩衝液（テスト用第１試液）とを混合し、上記ii)と同じ温度、時間放置した後、更にCPA基質を含む溶液を混合し、上記ii)と同じ温度、時間、pHで加温反応して、CPAの作用によりCPA基質を加水分解させ、更に分解したCPA基質分解産物と発色剤（例えばDTNB等のエルマン試薬又はその類似体）との作用により発色性物質（例えばアニオン種等）を生成させる。その後、溶液の単位時間当たりの吸光度変化を、上記ii)と同じ波長〔例えば、CPAの作用により生じたCPA基質分解産物と使用した発色剤（DTNB等のエルマン試薬又はその類似体）の作用により生じる発色性物質（例えばアニオン種等）の特性に応じた波長〕において測定する（ΔOD/min Test）。
iii)得られた各吸光度を下記に式に代入してΔE/minを求め、このΔE/minに基づいてCPA活性値を算出する。
・ΔE/min＝ΔOD/min Test−ΔOD/min Blank
尚、CPA活性値は、既知濃度のCPAを含む標準液を用いて上記と同様の操作を行って作成したCPA活性と吸光度（ΔE/min）との関係を表す検量線に当てはめるか、或いはCPAの作用により生じたCPA基質分解産物と使用した発色剤（例えばDTNB等のエルマン試薬又はその類似体）の作用により生じる発色性物質（例えばアニオン種等）の分子吸光係数に基づいて算出すればよい。
尚、上記において、第１試液、第２試液等には、通常この分野で使用される塩類（NaCl等）、防腐剤、安定化剤、活性化剤、キレート剤等通常この分野でCPA活性を測定するために用いられる試薬類が含まれていても良い。
【００３３】
５．本発明のPCPA測定法
また、上記のようにして得られた本発明のPCPAのプロ部分の除去方法で処理した試料中のCPA活性（全CPA活性）から、未処理の同じ試料を用いて同様に得られた当該試料中のCPA活性（F-CPA活性）を差し引くことにより、試料中のPCPAをCPA活性として（換算して）測定し得る。
即ち、本発明のPCPAのプロ部分の除去方法で処理した試料中には元々試料中に存在するF-CPAとPCPAから変換（活性化）されたPCAが含まれているため、当該試料中のCPA活性を測定することにより試料中のPCPA及びF-PCAの総量（全CPA）を測定することができる。
一方、本発明のプロ部分の除去方法で処理しない試料中には元々試料中に存在するF-CPA と変換（活性化）されていないPCPAが含まれているため、当該試料中のCPA活性を測定すれば、元々試料中に存在するCPA（F-CPA）のみが測定されることになる。
従って、前者で得られたPCPA及びF-CPAの総活性（全CPA活性）から後者で得られたF-CPAのみの活性を差し引くことにより試料中のPCPA活性を測定し得る。
本発明のPCPA測定法は、具体的には以下のようにして実施すればよい。
(i)本発明のPCPAのプロ部分の除去方法で処理した試料中のCPA活性（全CPA活性）を、前述した如き本発明の全CPA活性測定法（又は自体公知のCPA測定法）により測定し、
(ii)本発明の除去方法で処理しない（未処理の）(i)で使用したのと同じ試料を用いて、(i)と同じ本発明の全CPA活性測定法（又は自体公知のCPA測定法）により、当該試料中のCPA活性（F-CPA活性）を測定する。〔即ち、蛋白質分解酵素の不存在下で本発明の全CPA活性測定法（又は自体公知のCPA測定法）により試料中のCPA活性を測定する。〕
(iii)(i)で得られた全CPA活性値から(ii)で得られたF-CPA活性値を差し引くことによって試料中のPCPAを活性値として、即ちCPA活性に換算して測定する。
尚、CPA活性測定法等については前述した通りである。
【００３４】
６．本発明の膵臓癌の判定方法
生体試料中のPCPAレベル及び全CPAレベルが、膵臓癌、特に初期段階の膵臓癌のマーカーとして有用であることが判っている（特表2001-518791号公報等）。
従って、上記した如き本発明のPCPAのプロ部分除去方法で処理した生体由来試料は、膵臓癌、特に初期段階の膵臓癌を判定するための試料として有用である。また、上記した如き本発明の全CPA活性測定法で得られた全CPA活性や本発明のPCPA測定法で得られたPCPA量（活性）もまた膵臓癌、特に初期段階の膵臓癌を判定するための方法として有用である。
本発明の膵臓癌の判定方法においては、(1)生体試料中の全CPA活性（全CPAレベル）、(2)生体試料中のPCPA量（活性）（PCPAレベル）、(3)生体試料中の全CPA活性（全CPAレベル）に対するPCPA量（活性）（PCPAレベル）の比率（PCPA/全CPAレベル）〔或いはPCPAに対する全CPAの比率（全CPAレベル/PCPAレベル）、(4)生体試料中のCPA活性（F-CPAレベル）に対するPCPA量（活性）（PCPAレベル）の比率（PCPA/F-CPAレベル）〔或いはPCPAに対するF-CPAの比率（F-CPA/PCPAレベル）〕、(5)生体試料中のF-CPA活性（F-CPAレベル）に対する全CPA活性（全CPAレベル）の比率（全CPA/F-CPAレベル）〔或いは全CPAに対するF-CPAの比率（F-CPA/PCPAレベル）〕に基づいて判定を行うことができる。
上記において用いられる生体試料中の全CPA活性（全CPAレベル）、PCPA量（活性）（PCPAレベル）及びF-CPA活性（F-CPAレベル）は、それぞれ以下のようにして測定される。
(i) 全CPA活性（全CPAレベル）
本発明のPCPAのプロ部分の除去方法で処理した試料中のCPA活性（全CPA活性）を、前述した如き本発明の全CPA活性測定法（又は自体公知のCPA測定法）により測定する。
(ii) PCPA量（活性）（PCPAレベル）
本発明のPCPA測定法により測定する。
(iii) F-CPA活性（F-CPAレベル）
本発明の除去方法で処理しない（未処理の）試料を用いて、本発明の全CPA活性測定法（又は自体公知のCPA測定法）により、当該試料中のF-CPA活性を測定する。〔即ち、本発明の全CPA活性測定法においてにおいて、蛋白質分解酵素を用いる工程を実施せずに本発明の全CPA活性測定法（又は自体公知のCPA測定法）を行うことにより試料中のF-CPA活性を測定する。〕
【００３５】
６−１．判定
本発明の判定方法において、膵臓癌、特に初期段階の膵臓癌を判定するためには、本発明の方法により得られた対象となる生体試料中の上記(1)〜(5)の各レベル又は比率と、健康（正常）な生体に由来する試料中の上記(1)〜(5)の各レベル又は比率（例えば、健康な生体に由来する試料集団から得られた上記(1)〜(5)の各レベル又は比率の平均値や平均値＋2SD値等を用いて設定された基準値）とを比較して、対象となる生体試料中の各レベル又は比率が増加（又は減少）したか否かにより判定すればよい。
尚、判定に際しては、上記(1)〜(5)の各レベル又は比率をそれぞれ単独で用いても良いし、また、何れか異なる2種以上のレベル又は比率を適宜組み合わせて用いても良い。
組み合わせる場合としては、例えば以下の如く行えばよい。
即ち、(1)生体試料中の全CPA活性（全CPAレベル）又は(2)生体試料中のPCPA量（活性）（PCPAレベル）等を用いて（に基づいて）第１次判定（予備判定）を行い、判定対象を絞り込む（選別する）。
次いで、絞り込んだ（選別された）判定対象に対して、(4)生体試料中のCPA活性（F-CPAレベル）に対するPCPA量（活性）（PCPAレベル）の比率（PCPA/F-CPAレベル）〔或いはPCPAに対するF-CPAの比率（F-CPA/PCPAレベル）〕又は(5)生体試料中のF-CPA活性（F-CPAレベル）に対する全CPA活性（全CPAレベル）の比率（全CPA/F-CPAレベル）〔或いは全CPAに対するF-CPAの比率（F-CPA/全CPAレベル）〕を用いて（に基づいて）第2次判定（本判定）を行い、膵臓癌か否かの最終判定を行う。
このように、異なる2種以上のレベル又は比率を適宜組み合わせ、それらに基づいた2段階以上の判定を行うことにより、より精度良く膵臓癌の判定が可能となる。
【００３６】
７．本発明のPCPAのプロ部分除去用キット
本発明のPCPAのプロ部分除去用キットは、前述した如き本発明のPCPAのプロ部分除去方法を実施するために用いられるものであり、(i)上記した如き蛋白質分解酵素、及び(ii)当該酵素を当該酵素の非至適条件下でPCPAに作用させるための緩衝液を含む。
尚、蛋白質分解酵素の具体例、好ましい態様、使用濃度等は前述した通りである。また、「非至適条件下でPCPAに作用させるための緩衝液」とは、前述した如き本発明に係る緩衝液と同様である。
また、上記において、(i)と(ii)とをそれぞれ別々の容器に収容させてもよく、また、(i)の蛋白質分解酵素を(ii)の緩衝液中に含有させた状態として(i)と(ii)とを一つの容器中に収容さてもよい。尚、(i)と(ii)とを別々の容器に収容させる場合には、(i)の蛋白質分解酵素を凍結乾燥状態としておくのが好ましい。
尚、蛋白質分解酵素阻害剤又は／及びそれを含む緩衝液中には、蛋白質分解酵素の自己消化を抑制するための物質（例えばトリプシンの場合にはCa2+）等を含有させておいてもよい。
【００３７】
更に、本発明のPCPAのプロ部分除去用キットには、上記の他に蛋白質分解酵素の阻害剤を含有させておくのが好ましい。
即ち、そのようなキットとしては以下の如くである。
(i)上記した如き蛋白質分解酵素、(ii)当該酵素を当該酵素の非至適条件下でPCPAに作用させるための緩衝液、(iii)当該蛋白質分解酵素の阻害剤、を含むPCPAのプロ部分除去用キット。
蛋白質分解酵素、蛋白質分解酵素阻害剤、緩衝液の具体例、好ましい態様、使用濃度、(i)及び(ii)の収容形態等は前述した通りである。
尚、この場合には、(iii)の阻害剤を、水や適当な緩衝液（本発明に係る緩衝液等）に含有させた溶液状態として容器に収容しても、また、粉末状態、乾燥状態、又は凍結乾燥状態等として容器に収容し、更に当該阻害剤を溶解するための水や適当な緩衝液（本発明に係る緩衝液等）を別に収容した容器を追加してもよい。
尚、蛋白質分解酵素阻害剤を含む溶液又はそれを溶解するための溶液は、下限が通常pH4.5以上、好ましくはpH5.5以上、より好ましくはpH6.5以上、更に好ましくはpH7.0以上、上限が通常pH10.5以下、好ましくはpH9.5以下、より好ましくはpH8.5以下、更に好ましくはpH8.0以下の範囲から選ばれるpHを有する。
本発明のPCPAのプロ部分除去用キットとしては、例えば以下のような態様のものも挙げられる。
（１） (i)上記した如き蛋白質分解酵素、(ii)PCPA活性化用緩衝液、及び(iii)前述した如き本発明のPCPAのプロ部分除去方法における当該蛋白質分解酵素の非至適条件下での使用のための説明書、を含むPCPAのプロ部分除去用キット。
（２）(i)上記した如き蛋白質分解酵素、(ii)当該酵素を当該酵素の非至適条件下でPCPAに作用させるための緩衝液、(iii)当該蛋白質分解酵素の阻害剤、及び(iv)前述した如き本発明のPCPAのプロ部分除去方法における当該蛋白質分解酵素の非至適条件下での使用のための説明書、を含むPCPAのプロ部分除去用キット
上記において、「説明書」とは、本発明のPCPAのプロ部分除去方法における特徴・原理等〔例えばPCPAに蛋白質分解酵素を作用させるにあたり、使用する蛋白質分解酵素が有する至適条件以外の条件（非至適条件下）でこれを行うこと、即ち、PCPAに蛋白質分解酵素を作用させる際の反応条件（例えば反応pH、反応温度、反応時間、使用する蛋白質分解酵素濃度等）を、使用する蛋白質分解酵素が有する至適条件（範囲）〔例えば至適pH範囲、至適温度範囲、至適時間（反応時間）範囲、至適濃度範囲等〕以外の条件（範囲）とすること。〕が文章又は図表等により実質的に記載されている当該キットの取り扱い説明書、添付文書、或いはパンフレット（リーフレット）等を意味し、また、「PCPA活性化用緩衝液」とは、PCPAの活性化の際に使用されるものであり、前記「非至適条件下でPCPAに作用させるための緩衝液」と同様の意味である。尚、各構成要件の具体例、好ましい態様、使用濃度、(i)及び(ii)の収容形態等は前述した通りである。
【００３８】
また、本発明は、前述した如き本発明のPCPA活性測定用試料の前処理方法を実施するために用いられる、PCPA活性測定用試料の前処理用キットをも包含する。
このようなキットとしては、例えば以下のような態様のものが挙げられる。
（１）(i)上記した如き蛋白質分解酵素、及び(ii)当該酵素を当該酵素の非至適条件下で生体由来試料に作用させるための緩衝液、を含んでなるPCPA活性測定用試料の前処理用キット。
（２）(i)上記した如き蛋白質分解酵素、(ii)当該酵素を当該酵素の非至適条件下で生体由来試料に作用させるための緩衝液、(iii)当該蛋白質分解酵素の阻害剤、を含むPCPA活性測定用試料の前処理用キット
（３）(i)上記した如き蛋白質分解酵素、(ii)PCPA活性化用緩衝液、及び(iii)前述した如き本発明のCPA活性測定用試料の前処理方法における当該蛋白質分解酵素の非至適条件下での使用のための説明書、を含むCPA活性測定用試料の前処理用キット。
（４）(i)上記した如き蛋白質分解酵素、(ii)当該酵素を当該酵素の非至適条件下でPCPAに作用させるための緩衝液、(iii)当該蛋白質分解酵素の阻害剤、及び(iv)前述した如き本発明のCPA活性測定用試料の前処理方法における当該蛋白質分解酵素の非至適条件下での使用のための説明書、を含むCPA活性測定用試料の前処理用キット
尚、上記において、「説明書」は本発明のPCPAのプロ部分除去用キットにおける説明書と同じ意味であり、また、各構成要件の具体例、好ましい態様、使用濃度、収容形態等も本発明のPCPAのプロ部分除去用キットと同様である。
【００３９】
８．本発明の全CPA活性測定用キット又はPCPA測定用キット
また、本発明は、前述した如き本発明の全CPA活性測定方法又はPCPA測定方法を実施するために用いられる、全CPA活性測定用キット又はPCPA測定用キットをも包含する。
このようなキットとしては、例えば以下のような態様のものが挙げられる。
(i)上記した如き蛋白質分解酵素、(ii)当該酵素を当該酵素の非至適条件下でPCPA又は生体由来試料に作用させるための緩衝液、(iii)CPAの基質、及び(iv)発色剤を含んでなる全CPA活性又はPCPA測定用キット。
尚、蛋白質分解酵素、CPA基質、発色剤の具体例、好ましい態様、使用濃度等は前述した通りである。また、「非至適条件下でPCPA又は生体由来試料に作用させるための緩衝液」とは、前述した如き本発明に係る緩衝液と同様である。
また、上記において、(i)と(ii)とをそれぞれ別々の容器に収容させてもよく、また、(i)の蛋白質分解酵素を(ii)の緩衝液中に含有させた状態として(i)と(ii)とを一つの容器中に収容さてもよい。尚、(i)と(ii)とを別々の容器に収容させる場合には、(i)の蛋白質分解酵素を凍結乾燥状態としておくのが好ましい。また、蛋白質分解酵素阻害剤又は／及びそれを含む緩衝液中には、蛋白質分解酵素の自己消化を抑制するための物質（例えばトリプシンの場合にはCa2+）等を含有させておいてもよい。
更に(iii)のCPAの基質及び(iv)の発色剤は、それぞれ水又は適当な緩衝液（本発明に係る緩衝液等）中に含有させた溶液状態として容器に収容しても、或いは粉末状態、乾燥状態、又は凍結乾燥状態等として容器に収容し、更にそれぞれを溶解するための水や適当な緩衝液（本発明に係る緩衝液等）を別に収容した容器をそれぞれ追加してもよい。
尚、上記において、(iii)のCPA基質、(iv) の発色剤（これらを含む溶液又はこれらを溶解するための溶液）には、通常この分野で使用される塩類（NaCl等）、防腐剤、安定化剤、活性化剤、キレート剤等通常この分野でCPA活性を測定するために用いられる試薬類が含まれていても良い。また、(iii)のCPA基質又は(iv) の発色剤を含む溶液又はこれらを溶解するための溶液は、下限が通常pH4.5以上、好ましくはpH5.5以上、より好ましくはpH6.5以上、更に好ましくはpH7.0以上、上限が通常pH10.5以下、好ましくはpH9.5以下、より好ましくはpH8.5以下、更に好ましくはpH8.0以下の範囲から選ばれるpHを有する。
【００４０】
更に、全CPA活性測定用キット又はPCPA測定用キットには、上記の他に蛋白質分解酵素の阻害剤を含有させておくのが好ましい。
即ち、そのようなキットとしては以下の如くである。
(i)上記した如き蛋白質分解酵素、(ii)当該酵素を当該酵素の非至適条件下でPCPA又は生体由来試料に作用させるための緩衝液、(iii)当該蛋白質分解酵素の阻害剤、(iv)CPAの基質、及び(v)発色剤を含んでなる全CPA活性又はPCPA測定用キット。
蛋白質分解酵素、蛋白質分解酵素阻害剤、緩衝液、CPA基質、発色剤の具体例、好ましい態様、使用濃度、(i)、(ii)、(iv)及び(v)の収容形態等は前述した通りである。
尚、この場合には、(iii)の阻害剤を、水や適当な緩衝液（本発明に係る緩衝液等）に含有させた溶液状態として容器に収容しても、また、粉末状態、乾燥状態、又は凍結乾燥状態等として容器に収容し、更に当該阻害剤を溶解するための水や適当な緩衝液（本発明に係る緩衝液等）を別に収容した容器を追加してもよい。
また、(iii)の蛋白質分解酵素阻害剤を含む溶液又はこれを溶解するための溶液は、下限が通常pH4.5以上、好ましくはpH5.5以上、より好ましくはpH6.5以上、更に好ましくはpH7.0以上、上限が通常pH10.5以下、好ましくはpH9.5以下、より好ましくはpH8.5以下、更に好ましくはpH8.0以下の範囲から選ばれるpHを有する。
【００４１】
更にまた、本発明の全CPA活性測定用キット又はPCPA測定用キットには、上記の他にCPA特異的阻害剤を含有させておくのがより好ましい。
そのようなキットの好ましい態様は以下の如くである。
（１）(i)上記した如き蛋白質分解酵素、(ii)当該酵素を当該酵素の非至適条件下でPCPA又は生体由来試料に作用させるための緩衝液、(iii)当該蛋白質分解酵素の阻害剤、(iv)CPAの基質、(v)発色剤、及び(vi)CPA特異的阻害剤を含んでなる全CPA活性又はPCPA測定用キット、又は
（２）(i)上記した如き蛋白質分解酵素、(ii)当該酵素を当該酵素の非至適条件下でPCPA又は生体由来試料に作用させるための緩衝液、(iii)当該蛋白質分解酵素の阻害剤、(iv)CPAの基質、(v)発色剤及び(vi)発色剤及びCPA特異的阻害剤を含んでなる全CPA活性又はPCPA測定用キット。
蛋白質分解酵素、蛋白質分解酵素阻害剤、緩衝液、CPA基質、発色剤、CPA特異的阻害剤の具体例、好ましい態様、使用濃度、(i)〜(v)の収容形態等は前述した通りである。
尚、上記（１）の場合には、(iv)のCPA特異的阻害剤を、水や適当な緩衝液（本発明に係る緩衝液等）に含有させた溶液状態として容器に収容しても、また、粉末状態、乾燥状態、又は凍結乾燥状態等として容器に収容し、更に当該阻害剤を溶解するための水や適当な緩衝液（本発明に係る緩衝液等）を別に収容した容器を追加してもよい。また、上記（２）の場合には、(iv)の発色剤及びCPA特異的阻害剤を、水や適当な緩衝液（本発明に係る緩衝液等）に含有させた溶液状態として容器に収容しても、また、粉末状態、乾燥状態、又は凍結乾燥状態等として容器に収容し、更に当該阻害剤を溶解するための水や適当な緩衝液（本発明に係る緩衝液等）を別に収容した容器を追加してもよい。
また、上記において、(iii)のCPA基質又は／及び(iv) の発色剤（これらを含む溶液又はこれらを溶解するための溶液）には、通常この分野で使用される塩類（NaCl等）、防腐剤、安定化剤、活性化剤、キレート剤等通常この分野でCPA活性を測定するために用いられる試薬類が含まれていても良い。また、(iii)のCPA基質又は／及び(iv) の発色剤を含む溶液又はこれらを溶解するための溶液は、下限が通常pH4.5以上、好ましくはpH5.5以上、より好ましくはpH6.5以上、更に好ましくはpH7.0以上、上限が通常pH10.5以下、好ましくはpH9.5以下、より好ましくはpH8.5以下、更に好ましくはpH8.0以下の範囲から選ばれるpHを有する。
尚、上記した本発明の全CPA活性測定用キット又はPCPA測定用キットには、前述した如き本発明のPCPAのプロ部分除去方法における蛋白質分解酵素の非至適条件下での使用、前述した如き本発明の全CPA活性測定方法における蛋白質分解酵素の非至適条件下での使用、又は前述した如き本発明のPCPA測定方法における蛋白質分解酵素の非至適条件下での使用のための説明書、
を含ませておいても良い。
上記において、「説明書」とは、本発明のPCPAのプロ部分除去方法における特徴・原理等〔例えばPCPAに蛋白質分解酵素を作用させるにあたり、使用する蛋白質分解酵素が有する至適条件以外の条件（非至適条件下）でこれを行うこと、即ち、PCPAに蛋白質分解酵素を作用させる際の反応条件（例えば反応pH、反応温度、反応時間、使用する蛋白質分解酵素濃度等）を、使用する蛋白質分解酵素が有する至適条件（範囲）〔例えば至適pH範囲、至適温度範囲、至適時間（反応時間）範囲、至適濃度範囲等〕以外の条件（範囲）とすること。〕、又は本発明の全CPA活性測定方法或いは本発明のPCPA測定方法における特徴・原理等〔例えば上記した如き本発明のPCPAのプロ部分除去方法により処理されたPCPA又は生体由来試料を試料として、当該試料中のCPA（全CPA）又はPCPAを測定すること〕が文章又は図表等により実質的に記載されている当該キットの取り扱い説明書、添付文書、或いはパンフレット（リーフレット）等を意味する。
【００４２】
９．本発明の膵臓癌の判定用キット
更に、本発明は、前述した如き本発明の膵臓癌の判定方法を実施するために用いられる、膵臓癌の判定用キットをも包含する。
尚、具体的なキットの構成内容は、上記した如き本発明の全CPA活性測定用キット又はPCPA測定用キットと同様である。
また、本発明の膵臓癌の判定用キットには、上記した如き本発明の膵臓癌の判定方法における蛋白質分解酵素の非至適条件下での使用のための説明書を含ませておいても良い。
尚、本発明の膵臓癌の判定方法における特徴・原理等〔例えば上記した如き本発明のPCPAのプロ部分除去方法により処理されたPCPA又は生体由来試料を試料として、当該試料中のCPA（全CPA）又は／及びPCPAを測定し、(1)生体試料中の全CPA活性（全CPAレベル）、(2)生体試料中のPCPA量（活性）（PCPAレベル）、(3)生体試料中の全CPA活性（全CPAレベル）に対するPCPA量（活性）（PCPAレベル）の比率、(4)生体試料中のCPA活性（CPAレベル）に対するPCPA量（活性）（PCPAレベル）の比率、(5) 生体試料中の全CPA活性（全CPAレベル）に対するCPA活性（CPAレベル）の比率に基づいて判定を行うこと〕が文章又は図表等により実質的に記載されている当該キットの取り扱い説明書、添付文書、或いはパンフレット（リーフレット）等を意味する。
【００４３】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
【実施例１】
【００４４】
トリプシンによるPCPAプロ部分の除去（活性化）及びCPA過消化の検討（使用濃度及び反応pHの検討）
（１）PCPAプロ部分の除去（活性化）
〔試料〕
人血清
〔蛋白質分解酵素〕
・トリプシン（ブタ膵臓由来：和光純薬工業（株）製）
〔蛋白質分解酵素溶液〕
・トリプシン溶液A（pH4.0）：トリプシン所定濃度含有0.4M クエン酸緩衝液（pH4.0：37℃）。
・トリプシン溶液B（pH5.0）：トリプシン所定濃度含有0.4M クエン酸緩衝液（pH5.0：37℃）。
・トリプシン溶液C（pH6.0）：トリプシン所定濃度含有0.4M クエン酸緩衝液（pH6.0：37℃）。
・トリプシン溶液D（pH7.0）：トリプシン所定濃度含有0.5M 2-［4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル］エタンスルホン酸（HEPES）緩衝液（pH7.0：37℃）。
・トリプシン溶液E（pH8.0）：トリプシン所定濃度含有0.5M HEPES緩衝液（pH8.0：37℃）。
・トリプシン溶液F（pH9.0）：トリプシン所定濃度含有0.5M N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンスルホン酸（CAPSO）緩衝液（pH9.0：37℃）。
・トリプシン溶液G（pH10.0）：トリプシン所定濃度含有0.5M CAPSO酸緩衝液（pH10.0：37℃）。
尚、上記において、「所定濃度」とは、蛋白質分解酵素溶液中の濃度〔U/mL（BAEE単位）〕をいう。
〔蛋白質分解酵素阻害剤溶液〕
3mg/mLのアプロチニン（ウシ肺由来：和光純薬工業（株）製）含有100mM HEPES緩衝液（pH7.5：37℃）。
〔PCPAプロ部分除去方法（活性化方法）〕
試料50μlと蛋白質分解酵素溶液50μLとを混合し、37℃で10分間反応させた。反応後、得られた反応液に蛋白質分解酵素阻害剤溶液150μLを添加し、蛋白質分解酵素の反応をストップさせた。
尚、得られた反応液は、以下のCPA活性測定における試料として使用した。
【００４５】
（２）CPA活性の測定
〔試薬〕
・テスト用第1試薬：DTNB 0.3mM及びNaCl 1M含有0.3M トリス緩衝液（pH7.5）
・ブランク用第1試薬：DTNB 0.3mM、NaCl 1M及びD,L-ベンジルコハク酸〔MPバイオメディカルズ社（MP Biomedicals, Inc.）製〕0.8 mM含有0.3M トリス緩衝液（pH7.5）
・第2試薬：精製水にN-Ac-Phe-Thiaphe（(株)ペプチド研究所製）を5mMとなるように添加混合したもの。
〔CPA活性測定方法〕
試料10μLとブランク用第１試薬とを混合し37℃で約5分間加温した後、更に第2試薬を混合し37℃で約26分間加温反応させた。
その後、反応液の単位時間当たりの吸光度変化を測定した（ΔOD/min Blank）。
また、試料10μLとテスト用第１試薬とを混合し37℃で約5分間加温した後、更に第2試薬を混合し37℃で約26分間加温反応させた。
その後、反応液の単位時間当たりの吸光度変化を測定した（ΔOD/min Test）。
得られた各吸光度を下記に式に代入してΔE/minを求めた。
・ΔE/min＝ΔOD/min Test−ΔOD/min Blank
【００４６】
尚、実際の測定は、自動分析装置（日本電子（株）BM-8）を用い、以下の条件で測定した。
・試料量      ：  10μL
・第１試薬量  ：  50μL
・第２試薬量  ：  40μL
・反応時間    ：  31分
・分析方式    ：  RRA（レート法）
・測定波長    ：  596nm／410nm（副波長／主波長）
・演算方式設定：  主DET.P.m：65、主DET.P.n：198
【００４７】
尚、CPA活性値は、ΔE/minを下記式に代入して得られた、反応液総量１mLに対して血清100μLを用いた場合（即ち、反応液総量中の血清量／反応液総量の割合が1/10の割合となる場合）の１分間あたりの吸光度変化量を10000倍した値で表した。（以下の実施例についても同様。）
・CPA活性値＝ΔE/min×10000×5
尚、上記式中において、係数5は、実施例１で用いた反応液総量（100μL）に対する血清（2μL）の割合を10:1となるように補正するためのものである。
即ち、実施例１においては、反応液総量100μL（試料10μL＋第１試薬50μL＋第２試薬40μL）に対して、反応液総量中の血清量は2μL｛〔血清50μL／（血清50μL＋蛋白質分解酵素溶液50μL＋蛋白質分解酵素阻害剤溶液150μL）〕×試料10μL｝であり、その割合は2/100（1/50）であるので、1/10の割合とするには係数5を掛ける必要がある。
尚、上記式中において、係数10000は便宜上使用しただけである。
【００４８】
〔結果〕
得られた結果を表１及び図２にそれぞれ示す。
【００４９】
【表１】
2005323567.tif 000002
【００５０】
図２中、−×―は、トリプシン溶液A（pH4.0）を用いて得られた結果を、―■―はトリプシン溶液B（pH5.0）を用いて得られた結果を、---△---は、トリプシン溶液C（pH6.0）を用いて得られた結果を、---＋---は、トリプシン溶液D（pH7.0）を用いて得られた結果を、---□---は、トリプシン溶液E（pH8.0）を用いて得られた結果を、---○---は、トリプシン溶液F（pH9.0）を用いて得られた結果を、及び―◆―は、トリプシン溶液G（pH10.0）を用いて得られた結果をそれぞれ示す。
【００５１】
表１及び図２から明らかなように、トリプシンの至適 pHであるpH7.6付近で反応を行うと、トリプシン濃度に依存してCPAの過消化が増大することが判る〔トリプシン溶液C（pH6.0）及びトリプシン溶液F（pH9.0）を用いた場合〕。
これに対して、トリプシンの至適pHを2以上はずして反応を行うと、ある一定量以上のトリプシンを使用すればCPAの過消化は殆ど生じずにPCPAからプロ部分を除去（活性化）し得ることが判る〔トリプシン溶液A（pH4.0）、トリプシン溶液B（pH5.0）及びトリプシン溶液G（pH10.0）を用いた場合〕。
即ち、蛋白質分解酵素を至適pHからはずした条件（非至適pH条件）で使用することにより、従来ではCPAの過消化が生じるため、実用的な使用が難しかった、例えばトリプシン等の蛋白質分解酵素をPCPAのプロ部分除去（活性化）の目的に容易に使用し得るようになることが判る。
【実施例２】
【００５２】
トリプシンによるPCPAのプロ部分の除去（活性化）及びCPA過消化の検討（反応pH及び反応時間の検討）
（１）PCPAプロ部分の除去（活性化）
〔試料〕
人血清
〔蛋白質分解酵素〕
・トリプシン（ブタ膵臓由来：和光純薬工業（株）製）
〔蛋白質分解酵素溶液〕
・トリプシン溶液A（pH3.5）：30000U/mL（BAEE単位）のトリプシン含有0.4M クエン酸緩衝液（pH3.5：37℃）。
・トリプシン溶液B（pH4.0）：30000U/mL（BAEE単位）のトリプシン含有0.4M クエン酸緩衝液（pH4.0：37℃）。
・トリプシン溶液C（pH4.3）：30000U/mL（BAEE単位）のトリプシン含有0.4M クエン酸緩衝液（pH4.3：37℃）。
・トリプシン溶液D（pH4.6）：30000U/mL（BAEE単位）のトリプシン含有0.4M クエン酸緩衝液（pH4.6：37℃）。
・トリプシン溶液E（pH4.9）：30000U/mL（BAEE単位）のトリプシン含有0.4M クエン酸緩衝液（pH4.9：37℃）。
・トリプシン溶液F（pH5.2）：30000U/mL（BAEE単位）のトリプシン含有0.4M クエン酸緩衝液（pH5.2：37℃）。
・トリプシン溶液G（pH5.5）：30000U/mL（BAEE単位）のトリプシン含有0.4M クエン酸緩衝液（pH5.5：37℃）。
・トリプシン溶液H（pH6.0）：30000U/mL（BAEE単位）のトリプシン含有0.4M クエン酸緩衝液（pH6.0：37℃）。
・トリプシン溶液I（pH7.0）：30000U/mL（BAEE単位）のトリプシン含有0.5M HEPES緩衝液（pH7.0：37℃）。
・トリプシン溶液J（pH8.0）：30000U/mL（BAEE単位）のトリプシン含有0.5M HEPES緩衝液（pH8.0：37℃）。
・トリプシン溶液K（pH9.0）：30000U/mL（BAEE単位）のトリプシン含有0.5M CAPSO緩衝液（pH9.0：37℃）。
・トリプシン溶液L（pH10.0）：30000U/mL（BAEE単位）のトリプシン含有0.5M CAPSO酸緩衝液（pH10.0：37℃）。
〔蛋白質分解酵素阻害剤溶液〕
実施例１と同じ。
〔PCPAプロ部分除去方法（活性化方法）〕
試料50μlと蛋白質分解酵素溶液50μLとを混合し、37℃で所定時間（1、3、5、7、10、20分間）反応させた。反応後、得られた反応液に蛋白質分解酵素阻害剤溶液150μLを添加し、蛋白質分解酵素の反応をストップさせた。また、蛋白質分解酵素溶液50μLと蛋白質分解酵素溶液150μLとを混合し、これと試料50μLとを混合したものを、反応時間0分間の反応液とした。
尚、得られた反応液は、以下のCPA活性測定における試料として使用した。
【００５３】
（２）CPA活性の測定
〔試薬〕
実施例１と同じ。
〔CPA活性測定方法〕
実施例１と同じ。
【００５４】
〔結果〕
得られた結果を表２及び図３にそれぞれ示す。
【００５５】
【表２】
2005323567.tif 000003
【００５６】
図３中、---□---はトリプシン溶液A（pH3.5）を用いて得られた結果を、−×―はトリプシン溶液B（pH4.0）を用いて得られた結果を、―■―はトリプシン溶液C（pH4.3）を用いて得られた結果を、―●―はトリプシン溶液D（pH4.6）を用いて得られた結果を、―◆―はトリプシン溶液E（pH4.9）を用いて得られた結果を、---△---はトリプシン溶液F（pH5.2）を用いて得られた結果を、---○---はトリプシン溶液G（pH5.5）を用いて得られた結果を、---◇---はトリプシン溶液H（pH6.0）を用いて得られた結果を、---＋---はトリプシン溶液I（pH7.0）を用いて得られた結果を、及び---×---はトリプシン溶液J（pH8.0）を用いて得られた結果をそれぞれ示す。
【００５７】
表２及び図３から明らかなように、トリプシンの至適 pHであるpH7.6付近で反応を行うと、反応時間に依存してCPAの過消化が増大することが判る〔トリプシン溶液I（pH7.0）及びトリプシン溶液J（pH8.0）を用いた場合〕。
これに対して、トリプシンの至適pHをはずす（非至適pH条件とする）ことにより〔トリプシン溶液A〜H（pH3.5〜6.0）、CPAの過消化が抑制されることが判る。特に、トリプシンの至適pHを2以上はずして反応を行うと、反応時間を伸ばしても経時的なCPAの過消化が抑制されており、CPA活性が一定に保たれていることが判る〔トリプシン溶液A〜G（pH3.5〜5.5）を用いた場合〕。
なかでも、pH4.0〜4.9（トリプシン溶液B〜E）の場合には、CPAの活性値も高く、PCPAを十分に活性化しながらCPAの過消化も抑制されていることが判る。
このように、本発明に係る非至適条件、特に非至適pH条件でPCPAのプロ部分の除去（PCPAの活性化）を行えば、経時的なCPAの過消化が抑制されてCPA活性が一定に保たれるので、容易に再現性良く安定したCPA活性値を得ることができることが判る。
【実施例３】
【００５８】
各種蛋白質分解酵素によるPCPAのプロ部分除去（活性化）及びCPA過消化の検討
（１）PCPAプロ部分の除去（活性化）
〔試料〕
人血清
〔蛋白質分解酵素〕
・トリプシン（ブタ膵臓由来：和光純薬工業（株）製）
・プラスミン〔ヒト血漿由来：カルビオケム社（CALBIOCHEM）製〕
・キモトリプシン（ウシ膵臓由来：和光純薬工業（株）製）
〔蛋白質分解酵素溶液〕
・トリプシン非至適pH溶液（pH4.5）：17000(BAEE)U/mLのトリプシン含有0.4M クエン酸緩衝液（pH4.5：37℃）。
・プラスミン至適pH溶液（pH8.5）：4.3U/mLのプラスミン含有0.5M HEPES緩衝液（pH8.5：37℃）。
・プラスミン非至適pH溶液（pH5.5）：4.3U/mLのプラスミン含有0.4M クエン酸緩衝液（pH4.5：37℃）。
・キモトリプシン至適pH溶液（pH8.0）：1200(USP)U/mLのキモトリプシン含有0.5M HEPES緩衝液（pH8.5：37℃）。
・キモトリプシン非至適pH溶液（pH4.0）：1200(USP)U/mLのキモトリプシン含有0.4M クエン酸緩衝液（pH4.5：37℃）。
〔蛋白質分解酵素阻害剤溶液〕
1mg/mLのトリプシンインヒビター（ウシ膵臓由来：シグマアルドリッチジャパン（株）製）含有100mM HEPES緩衝液（pH7.5：37℃）。
〔PCPAプロ部分除去方法（活性化方法）〕
試料50μlと蛋白質分解酵素溶液50μLとを混合し、37℃で所定時間（1、3、5、10、20、30分間）反応させた。反応後、得られた反応液に蛋白質分解酵素阻害剤溶液150μLを添加し、蛋白質分解酵素の反応をストップさせた。また、蛋白質分解酵素溶液50μLと蛋白質分解酵素溶液150μLとを混合し、これと試料50μLとを混合したものを、反応時間0分間の反応液とした。
尚、得られた反応液は、以下のCPA活性測定における試料として使用した。
【００５９】
（２）CPA活性の測定
〔試薬〕
実施例１と同じ。
〔CPA活性測定方法〕
実施例１と同じ。
【００６０】
〔結果〕
得られた結果を表３及び図４にそれぞれ示す。
尚、表及び図中の％は、トリプシン溶液を用いて試料を10分間処理した場合のCPA活性値を100％とした場合の相対値をそれぞれ示す。
【００６１】
【表３】
2005323567.tif 000004
【００６２】
また、図４中、−×―は、トリプシン非至適pH溶液（pH4.5）を用いて得られた結果を、―■―はプラスミン至適pH溶液（pH8.5）を用いて得られた結果を、―□―はプラスミン非至適pH（pH5.5）を用いて得られた結果を、―●―はキモトリプシン至適pH溶液（pH8.0）を用いて得られた結果を、及び―○◇−はキモトリプシン非至適pH溶液（pH4.0）を用いて得られた結果をそれぞれ示す。
【００６３】
表３及び図４から明らかなように、蛋白質分解酵素が有する至適pH付近のpHでPCPAの活性化を行った場合（図４において、―■―及び―●―で示されるデータ参照）には、経時的にCPA活性値が減少していること、即ち、CPAの過消化が起こっていることが判る。
これに対して、蛋白質分解酵素が有する至適pH以外のpHでPCPAの活性化を行った場合（図４において、―×―、―□―及び―○―で示されるデータ参照）には、CPAの経時的過消化が殆ど起こらないことが判る。
このことから、蛋白質分解酵素が有する至適条件からずらしてPCPAの活性化を行えば、CPAの経時的過消化が殆ど起こらず、安定したCPA活性の測定を行い得るようになることが判る。
【実施例４】
【００６４】
人血清中のPCPA、全CPA活性の測定
〔試料〕
・浸潤性膵管癌患者血清10検体
・慢性膵炎患者血清7検体
・膵嚢胞患者血清10検体
・正常血清23検体
〔蛋白質分解酵素〕
トリプシン（ブタ膵臓由来：和光純薬工業（株）製）
〔蛋白質分解酵素溶液〕
30000(BAEE)U/mLのトリプシン含有0.4M クエン酸緩衝液（pH4.5：37℃）。
〔蛋白質分解酵素阻害剤溶液〕
3mg/mLのアプロチニン（ウシ肺由来：和光純薬工業（株）製）含有100mM HEPES緩衝液（pH7.5：37℃）。
〔試薬〕
実施例１と同じ。
（１）F-CPA活性の測定
血清検体50μLと生理食塩水200μLとを混合して血清を5倍希釈した溶液10μLを試料とした以外は、実施例１の「（２）CPA活性の測定」で用いた試薬と同じものを用い、同様の方法でCPA活性（F-CPA活性）の測定を行った。
（２）全CPA（T-CPA）活性の測定
上記血清検体、蛋白質分解酵素、蛋白質分解酵素溶液、蛋白質分解酵素阻害剤溶液を用いた以外は、実施例１の「（１）PCPAプロ部分の除去（活性化）」と同様の方法でPCPAのプロ部分の除去（活性化）を行った。その後、実施例１の「（２）CPA活性の測定」で用いた試薬と同じものを用い、同様の方法でCPA活性（全CPA活性：T-CPA活性）の測定を行った。
（３）PCPAの測定
上記（２）で得られた全CPA活性値から（１）で得られたF-CPA活性値を差し引くことによってPCPA（活性）を算出した。
【００６５】
〔結果〕
上記で得られたF-CPA活性値、全CPA活性値、PCPA（活性）、及びこれらから算出したT-CPA/F-CPA比並びにPCPA/F-CPA比を表４、表５、図５及び図６にそれぞれ示す。
【００６６】
【表４】
2005323567.tif 000005
【００６７】
【表５】
2005323567.tif 000006
【００６８】
また、図５及び６中、●は浸潤性膵管癌患者血清を用いて得られた結果を、■は慢性膵炎患者血清を用いて得られた結果を、◆は膵嚢胞患者血清を用いて得られた結果を、及び×は正常血清を用いて得られた結果をそれぞれ示す。
【００６９】
〔判定〕
（１）第1次判定（予備判定）
先ず、最初に、T-CPA活性値に基づいて予備判定を行った。
図５に示すように、正常血清23検体を用いて得られたT-CPA活性値の平均＋2SD（77.1）を算出し、これをカットオフ値Aとして設定した。
全検体から当該カットオフ値A以上の検体を選び出した（検体No.1〜10、14〜17、26、27及び50）。
（２）第２次判定（本判定）
次いで、T-CPA/F-CPA比に基づいて判定を行った。
図６に示すように、選出した検体のうち、浸潤性膵管癌、即ち、膵臓癌以外の検体（検体14〜17、26、27及び50）のT-CPA/F-CPA比の平均＋2SD（70.0）を算出し、これをカットオフ値Bとして設定した。
選出した検体のうち、当該カットオフ値B以上のT-CPA/F-CPA比を有する検体を膵臓癌陽性と判定した。
その結果、慢性膵炎患者、膵嚢胞患者及び正常者を膵臓癌と判定することはなかった。更に、膵臓癌患者については、その70％を膵臓癌と判定し得たので、本発明の判定方法によれば、従来よりも精度よく膵癌とその他の膵臓疾患とを分別判定し得ることが判る。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明の至適pH範囲以外の範囲（非至適pH条件）を説明する図である。
【図２】実施例１で得られた、異なるpHを有するトリプシン溶液を用いた場合の、CPA活性値とトリプシン濃度との関係を示す図である。
【図３】実施例２で得られた、異なるpHを有するトリプシン溶液を用いた場合の、CPA活性値と反応時間との関係を示す図である。
【図４】実施例３で得られた、異なる各蛋白質分解酵素を用いた場合の、異なる反応pHにおける反応時間とCPA活性（相対活性）を示す図である。
【図５】実施例４で得られた、正常血清23検体を用いて得られたT-CPA活性値の平均＋2SD（77.1）をカットオフ値Aとして第１次判定（予備判定）を行った結果を示す図である。
【図６】実施例４で得られた、膵臓癌以外の検体（検体14〜17、26、27及び50）のT-CPA/F-CPA比の平均＋2SD（70.0）をカットオフ値Bとして第２次判定（本判定）を行った結果を示す図である。
【符号の説明】
【００７１】
図２において、−×―は、トリプシン溶液A（pH4.0）を用いて得られた結果を、―■―はトリプシン溶液B（pH5.0）を用いて得られた結果を、---△---は、トリプシン溶液C（pH6.0）を用いて得られた結果を、---＋---は、トリプシン溶液D（pH7.0）を用いて得られた結果を、---□---は、トリプシン溶液E（pH8.0）を用いて得られた結果を、---○---は、トリプシン溶液F（pH9.0）を用いて得られた結果を、及び―◆―は、トリプシン溶液G（pH10.0）を用いて得られた結果をそれぞれ示す。
【００７２】
図３において、---□---はトリプシン溶液A（pH3.5）を用いて得られた結果を、−×―はトリプシン溶液B（pH4.0）を用いて得られた結果を、―■―はトリプシン溶液C（pH4.3）を用いて得られた結果を、―●―はトリプシン溶液D（pH4.6）を用いて得られた結果を、―◆―はトリプシン溶液E（pH4.9）を用いて得られた結果を、---△---はトリプシン溶液F（pH5.2）を用いて得られた結果を、---○---はトリプシン溶液G（pH5.5）を用いて得られた結果を、---◇---はトリプシン溶液H（pH6.0）を用いて得られた結果を、---＋---はトリプシン溶液I（pH7.0）を用いて得られた結果を、及び---×---はトリプシン溶液J（pH8.0）を用いて得られた結果をそれぞれ示す。
【００７３】
図４において、−×―は、トリプシン非至適pH溶液（pH4.5）を用いて得られた結果を、―■―はプラスミン至適pH溶液（pH8.5）を用いて得られた結果を、―□―はプラスミン非至適pH（pH5.5）を用いて得られた結果を、―●―はキモトリプシン至適pH溶液（pH8.0）を用いて得られた結果を、及び―○◇−はキモトリプシン非至適pH溶液（pH4.0）を用いて得られた結果をそれぞれ示す。
【００７４】
図５及び６において、●は浸潤性膵管癌患者血清を用いて得られた結果を、■は慢性膵炎患者血清を用いて得られた結果を、◆は膵嚢胞患者血清を用いて得られた結果を、及び×は正常血清を用いて得られた結果をそれぞれ示す。
【図１】
2005323567.tif 000007
【図２】
2005323567.tif 000008
【図３】
2005323567.tif 000009
【図４】
2005323567.tif 000010
【図５】
2005323567.tif 000011
【図６】
2005323567.tif 000012