(57)【要約】【課題】  被検試料中に存在するＨＣＶであるＨＣＶ遺伝子を簡易且つ迅速に、しかも正確に分析することができる分析方法を提供する。【解決手段】  前記分析方法は、（１）被検試料を用いる逆転写反応工程、（２）５’末端が第１の標識物質で標識化されたセンスプライマーと、（ａ）第２の標識物質で標識されたデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸又は（ｂ）５’末端が第２の標識物質で標識化されたアンチセンスプライマーとを用いるＤＮＡ合成工程；及び（３）前記各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いる分析工程を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスを含む可能性のある被検試料と（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスの５’非翻訳領域である配列番号９で表される塩基配列における１番〜２４８番の塩基からなる配列を少なくとも含む領域を伸長可能なオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーとを用いて逆転写反応を実施する工程；
（２）前記逆転写反応工程（１）で得られた生成物を鋳型とし、配列番号１又は３〜８のいずれか１つの配列番号で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が第１の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドをセンスプライマーとし、（ａ）第２の標識物質で標識されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸、又は（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が第２の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーの存在下で、ＤＮＡを合成する工程；及び
（３）前記ＤＮＡ合成工程（２）で得られた生成物を、前記各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いて分析する工程
を含む、Ｃ型肝炎ウイルスの分析方法。
【請求項２】
前記分析工程（３）における分析方法が、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、又はサンドイッチ法である、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
配列番号１〜８のいずれか１つの配列番号で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項４】
（１）配列番号１又は３〜８のいずれか１つの配列番号で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が第１の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドセンスプライマー；
（２）（ａ）第２の標識物質で標識されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸、又は（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が第２の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマー；及び
（３）（ａ）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子を保持し、しかも、もう一方の標識化合物に特異的に結合可能なパートナーが固定されているイムノクロマトグラフ用ストリップ、又は（ｂ）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識化合物に特異的に結合可能なパートナーとを担持したラテックス粒子懸濁液
を含む、Ｃ型肝炎ウイルスの分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの分析方法に関する。本発明の分析方法は、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス感染患者の血液中に存在するウイルス遺伝子の分析方法として使用することができる。なお、本明細書における「分析」には、分析対象であるＣ型肝炎ウイルスの存在の有無を判定する「検出」と、Ｃ型肝炎ウイルスの量を定量的又は半定量的に決定する「測定」とが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（Hepatitis C virus；以下、ＨＣＶの略称を用いることがある）は、ヒト肝臓疾患の原因となる感染因子であり、日本における非Ａ非Ｂ肝炎の大部分がＨＣＶによることが明らかになっている。ＨＣＶに感染した慢性肝炎患者で病変が進行して肝硬変又は肝細胞癌に至ることも明らかになっており、輸血による感染も問題となっている。従って、Ｃ型肝炎に感染しているかどうかのスクリーニング検査は、感染の防止及び治療のために重要である。日本人のＨＣＶ感染者は、約２００万人と言われている。Ｃ型慢性肝炎活動型に対して保険適用の治療薬としてインターフェロンとリバビリンがあり、この治療を受けた患者の３〜４割のウイルスが駆除され、治癒している。
【０００３】
前記スクリーニング検査にはＨＣＶ抗原を用いるが、そのＨＣＶ抗原をヒトの血漿から分離することは、血液中のウイルス存在量が少ないので殆ど不可能である。
ＨＣＶの遺伝子配列はすでに解明されており（非特許文献１〜６）、約９，４００塩基よりなることがわかっている。ＨＣＶには、遺伝子型がＩ型〜IV型（又は、Ｉａ、Ｉｂ、IIａ、IIｂ）まで存在しており、血清型にはサブタイプ１型及び２型があることが明らかになっている（非特許文献７）。
ＨＣＶの５'端の非翻訳領域のヌクレオチド配列は、ウイルス間の相同性が極めて高く、塩基配列が保存されている。この塩基配列は、ウイルス遺伝子の複製に重要な役割を担っていることが示唆されており、ＨＣＶの遺伝子診断のプライマー設計に役立っている（非特許文献８及び９）。
【０００４】
ＨＣＶの分析方法としては、ＨＣＶに特異的な遺伝子の一部をＰＣＲ法で増幅し、その生成物を電気泳動した後、ＤＮＡサイズを確認する方法や、標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズすることにより、ＨＣＶを同定する方法が公知である。しかし、これらの分子生物学的手法による分析方法では、結果が出るまでに数時間必要とし、より迅速な分析方法が求められていた。
【０００５】
【非特許文献１】「ジャパン・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Japan Journal of Experimental Medicine）」，（日本），１９９０年，第６０巻，ｐ．１６７−１７７
【非特許文献２】「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシズ（Proceedings of the National Academy of Sciences）」，（米国），１９９０年，第８７巻，ｐ．９５２４−９５２８
【非特許文献３】「ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（Journal of Virology）」，（英国），１９９１年，第６５巻，ｐ．１１０５−１１１３
【非特許文献４】「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシズ（Proceedings of the National Academy of Sciences）」，（米国），１９９１年，第８８巻，ｐ．２４５１−２４５５
【非特許文献５】「ジャーナル・オブ・ジェネラル・ヴィロロジー（Journal of general Virology）」，（英国），１９９１年，第７２巻，ｐ．２６９７−２７０４
【非特許文献６】「ヴィロロジー（Virology）」，（米国），１９９２年，第１８８巻，ｐ．３３１−３４１
【非特許文献７】「ヘパトロジー（Hepatology）」，（米国），１９９２年，第１６巻，ｐ．８８６−８９１
【非特許文献８】「ジャパン・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Japan Journal of Experimental Medicine）」，（日本），１９９０年，第６０巻，ｐ．２１５−２２２
【非特許文献９】「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシズ（Proceedings of the National Academy of Sciences）」，（米国），１９９２年，第８９巻，ｐ．４９４２−４９４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の課題は、被検試料（例えば、血液、血漿、又は血清）中に存在するＨＣＶであるＨＣＶ遺伝子を簡易且つ迅速に、しかも正確に分析することができる分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題は、本発明による、（１）（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスを含む可能性のある被検試料と（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスの５’非構造遺伝子領域である配列番号９で表される塩基配列における１番〜２４８番の塩基からなる配列を少なくとも含む領域を伸長可能なオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーとを用いて逆転写反応を実施する工程（以下、逆転写反応工程と称する）；
（２）前記逆転写反応工程（１）で得られた生成物を鋳型とし、配列番号１又は３〜８のいずれか１つの配列番号で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が第１の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドをセンスプライマーとし、（ａ）第２の標識物質で標識されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸、又は（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が第２の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーの存在下で、ＤＮＡを合成する工程（以下、ＤＮＡ合成工程と称する）；及び
（３）前記ＤＮＡ合成工程（２）で得られた生成物を、前記各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いて分析する工程（以下、分析工程と称する）
を含む、Ｃ型肝炎ウイルスの分析方法により解決することができる。
本発明の分析方法の好ましい態様によれば、前記分析工程（３）における分析方法が、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、又はサンドイッチ法である。
【０００８】
また、本発明は、配列番号１〜８のいずれか１つの配列番号で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
更に、本発明は、（１）配列番号１又は３〜８のいずれか１つの配列番号で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が第１の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドセンスプライマー；
（２）（ａ）第２の標識物質で標識されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸、又は（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が第２の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマー；及び
（３）（ａ）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子を保持し、しかも、もう一方の標識化合物に特異的に結合可能なパートナーが固定されているイムノクロマトグラフ用ストリップ、又は（ｂ）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識化合物に特異的に結合可能なパートナーとを担持したラテックス粒子懸濁液
を含む、Ｃ型肝炎ウイルスの分析用キットに関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の分析方法によれば、被検試料（例えば、血液、血漿、又は血清）中に存在するＨＣＶであるＨＣＶ遺伝子を簡易且つ迅速に、しかも正確に分析することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の分析方法は、（１）逆転写反応工程、（２）ＤＮＡ合成工程、及び（３）分析工程を含み、各工程をこの順に実施する。
【００１１】
本発明の分析方法における逆転写反応工程では、ＨＣＶを含む可能性のある被検試料と、特定のオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーとを用いて、逆転写反応を実施する。
本発明の分析方法で分析することのできる前記被検試料は、ＨＣＶを含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、血液、血漿、又は血清などを挙げることができる。
【００１２】
逆転写反応工程で用いるオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーは、ＨＣＶを鋳型として用いる逆転写反応を実施した場合に、配列番号９で表される塩基配列における１番〜２４８番の塩基からなる配列を少なくとも含む領域を伸長可能であるプライマーである限り、特に限定されるものではなく、例えば、配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを挙げることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、ＨＣＶ（ＨＣＶ−Ｊ１株）の５’非翻訳領域の配列（配列番号９で表される塩基配列における１番〜３２４番の塩基からなる配列）と、それに続くコア領域の配列（配列番号９で表される塩基配列における３２５番〜３５０番の塩基からなる配列）とを含む。また、配列番号２で表される塩基配列は、配列番号９で表される塩基配列における２２９番〜２４８番の塩基からなる配列の相補的配列であり、この塩基配列は、日本人に多く見つかるＨＣＶの遺伝子II型（又は、Ｉｂ型）を参考にした［(1)特開平６−１８１７７４; 
(2) Japan J. Exp. Med., 60, 167〜177 (1990); (3) Japan J. Exp. Med,. 60, 215〜222(1990); (4) J. Gen. Virol., 72, 2105〜2112(1991); (5) J. Virol., 65, 1105〜1113 (1991)］。参考までに、ＨＣＶ−Ｊ１株及びＨＣＶ−Ｊ４株［Japan J. Exp. Med., 60, 167〜177 (1990)］の５’非翻訳領域の配列と、それに続くコア領域の配列とを、図２に示す。
【００１３】
逆転写反応工程における逆転写反応は、逆転写酵素として、例えば、トリ赤芽球症（avian myeloblastosis）ウイルス由来の逆転写酵素、又はＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼを使用し、常法により実施することができる。Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼの両方の活性を有するため、逆転写反応工程及びＤＮＡ合成工程を１つの酵素で実施することができ、１チューブでの反応も可能である。
被検試料中にＨＣＶが含まれている場合、そのＨＣＶの５’非翻訳領域を鋳型として、その相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が合成される。
【００１４】
本発明の分析方法における逆転写反応工程では、前記逆転写反応のみを行って、次のＤＮＡ合成工程を実施することもできるが、前記逆転写反応の後、ＰＣＲ反応を実施してから、次のＤＮＡ合成工程を実施することもできる。前記ＰＣＲ反応では、プライマーセットとして、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドセンスプライマーと配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーとの組み合わせを用いることができる。このプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を実施すると、被検試料中にＨＣＶが含まれている場合には、２２１ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００１５】
本発明の分析方法におけるＤＮＡ合成工程では、（ａ）前記逆転写反応工程で得られた生成物を鋳型とし、５’末端が第１の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドセンスプライマーを用いて、第２の標識物質で標識されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸の存在下で、ＤＮＡ伸長反応を実施する（以下、本発明の第１の分析方法と称する）か、あるいは、（ｂ）前記逆転写反応工程で得られた生成物を鋳型とし、５’末端が第１の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドセンスプライマーと、５’末端が第２の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーとの組み合わせを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅反応を実施する（以下、本発明の第２の分析方法と称する）。
【００１６】
本発明の第１の分析方法におけるＤＮＡ合成工程では、５’標識オリゴヌクレオチドセンスプライマーとして、配列番号１又は３〜８のいずれか１つの配列番号で表される塩基配列からなり、且つその５’末端が第１の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドを使用する。
配列番号１又は３〜８で表される各塩基配列は、配列番号９で表される塩基配列の部分配列である。各塩基配列と、配列番号９で表される塩基配列における対応領域との関係を表１に示す。
【００１７】
《表１》
配列番号    配列番号９で表される塩基配列における対応領域  
１          ２８番〜４７番の塩基からなる配列
３          ５２番〜６５番の塩基からなる配列
４          ７３番〜８６番の塩基からなる配列
５          １１７番〜１３０番の塩基からなる配列
６          １２５番〜１３８番の塩基からなる配列
７          １４６番〜１５９番の塩基からなる配列
８          １６６番〜１７９番の塩基からなる配列        
【００１８】
配列番号１又は３〜８で表される各塩基配列は、ＨＣＶの分析に際して、ＨＣＶ遺伝子の他の塩基配列と比較して、患者サンプルを用いた陽性率が高い点で、好ましい。ＨＣＶはＲＮＡウイルスであるため、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）で分解される可能性があり、上流の５’−非翻訳領域の塩基配列を用いて検出すると陽性率が高くなるものと考えられらる。
【００１９】
第１の標識物質としては、プライマーの標識化に使用することができ、標識プライマーを用いたＤＮＡ伸長反応を抑制又は阻害することがなく、標識物質に特異的に結合可能なパートナーが存在する限り、特に限定されるものではなく、例えば、蛍光物質ＦＩＴＣ（Fluorescein isothiocyanate）、Ｃｙ３（Cyanine 3）、Ｃｙ５（Cyanine 5）、ローダミン、テキサスレッド、ＨＥＸ（Hexachloro-6-carboxyfluorescein）、ＦＡＭ（6-Carboxyfluorescein）、ＴＥＴ（Tetrachloro-6-carboxyfluorescein）、ＴＡＭＲＡ（6-Carboxytetramethylrhodamine）、ＴＲＩＴＣ（Tetramethylrhodamin）、ＲＯＸ（Carboxy-X-rhodamine）、又はＤＮＰ（Dinitrophenol）、ジゴキシゲニン、又はビオチン等を挙げることができる。
【００２０】
第２の標識物質で標識されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸におけるデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸としては、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、又はｄＧＴＰを挙げることができる。また、第２の標識物質としては、デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸の標識化に使用することができ、標識デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸を用いたＤＮＡ伸長反応を抑制又は阻害することがなく、標識物質に特異的に結合可能なパートナーが存在する限り、特に限定されるものではなく、例えば、第１の標識物質として例示した標識物質を使用することができる。
第１の標識物質と第２の標識物質との組み合わせとしては、異なる２種類の標識物質の組み合わせである限り、特に限定されるものではないが、ＦＩＴＣとビオチンとの組み合わせが好ましく、第１の標識物質がＦＩＴＣであり、第２の標識物質がビオチンであることが特に好ましい。
【００２１】
本発明による第１の分析方法のＤＮＡ合成工程におけるＤＮＡ伸長反応は、前記逆転写反応工程で得られた生成物（すなわち、ｃＤＮＡ又は二重鎖ＤＮＡ）を鋳型とし、前記５’標識オリゴヌクレオチドセンスプライマーを用いて、前記標識デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸の存在下で実施すること以外は、ＤＮＡポリメラーゼを用いる常法により、実施することができる。
【００２２】
すなわち、前記逆転写反応工程で得られた生成物を鋳型として用いる場合には、反応生成物をそのまま直接、あるいは、適当な処理を行なった処理物（例えば、適当に希釈又は濃縮した希釈物又は濃縮物）として、ＤＮＡ合成工程に用いることができる。
また、前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ジーン・タック（Gene Taq；Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エクソヌクレアーゼの欠失酵素）、又はクレノーラージフラグメントを挙げることができる。
【００２３】
被検試料中にＨＣＶが含まれており、逆転写反応工程でｃＤＮＡが合成されている場合、前記ＤＮＡ伸長反応により、前記ｃＤＮＡに相補的な配列を有するＤＮＡが合成され、前記ｃＤＮＡと一緒になって二重鎖を形成する。形成される二重鎖ＤＮＡは、５’末端が第１の標識物質で標識化され、しかも、ＤＮＡ鎖中に、第２の標識物質で標識されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸を含む二重標識ＤＮＡである。得られる二重標識ＤＮＡは、被検試料中に存在するＨＣＶの存在量に依存して形成される。
【００２４】
本発明による第１の分析方法のＤＮＡ合成工程の一態様を、図１に示す。図１に示す態様は、第１の標識物質としてＦＩＴＣを使用し、第２の標識物質で標識されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸としてビオチン標識ｄＣＴＰを使用する態様である。また、鋳型として用いる逆転写反応工程で得られた反応生成物（すなわち、２２１ｂｐ  ｃＤＮＡ）は、逆転写反応の後、配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドセンスプライマーと配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーとの組み合わせを用いてＰＣＲ反応を実施して得られた反応生成物である。
図１に示す態様では、逆転写反応工程で得られた反応生成物（２２１ｂｐ  ｃＤＮＡ）に、ＦＩＴＣ標識プライマー、ビオチン標識ｄＣＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼを添加した後、熱変性、アニーリング、及びポリメラーゼ反応を、順次実施することにより、生成物として、ＦＩＴＣ及びビオチンで標識された二重標識ＤＮＡが得られる。
【００２５】
本発明の第２の分析方法におけるＤＮＡ合成工程では、５’標識オリゴヌクレオチドセンスプライマーとして、本発明の第１の分析方法におけるＤＮＡ合成工程で使用するのと同じプライマー、すなわち、配列番号１又は３〜８のいずれか１つの配列番号で表される塩基配列からなり、且つその５’末端が第１の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドを使用する。
また、５’標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーとして、配列番号２で表される塩基配列からなり、且つその５’末端が第２の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドを使用する。第２の標識物質としては、プライマーの標識化に使用することができ、標識プライマーを用いたＤＮＡ増幅反応を抑制又は阻害することがなく、標識物質に特異的に結合可能なパートナーが存在する限り、特に限定されるものではなく、例えば、第１の標識物質として例示した標識物質を使用することができる。
【００２６】
本発明による第２の分析方法のＤＮＡ合成工程におけるＤＮＡ増幅反応は、前記逆転写反応工程で得られた生成物（すなわち、ｃＤＮＡ）を鋳型とし、前記５’標識オリゴヌクレオチドセンスプライマーと前記５’標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーとの組み合わせを用いること以外は、ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲ法により、実施することができる。
【００２７】
すなわち、前記逆転写反応工程で得られた生成物を鋳型として用いる場合には、反応生成物をそのまま直接、あるいは、適当な処理を行なった処理物（例えば、適当に希釈又は濃縮した希釈物又は濃縮物）として、ＤＮＡ合成工程に用いることができる。
また、前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ジーン・タック（Gene Taq；Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エクソヌクレアーゼの欠失酵素）、又はクレノーラージフラグメントを挙げることができる。
【００２８】
被検試料中にＨＣＶが含まれており、逆転写反応工程でｃＤＮＡが合成されている場合、前記ＤＮＡ増幅反応により、使用したプライマーセットに挟まれた領域に相当する二重鎖ＤＮＡが増幅される。合成される前記二重鎖ＤＮＡは、一方の鎖の５’末端が第１の標識物質で標識化され、もう一方の鎖の５’末端が第２の標識物質で標識化されている二重標識ＤＮＡである。得られる二重標識ＤＮＡは、被検試料中に存在するＨＣＶの存在量に依存して形成される。
【００２９】
本発明の分析方法における分析工程では、前記ＤＮＡ合成工程で得られた生成物（すなわち、二重標識ＤＮＡ）を、各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いて分析する。各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナー（例えば、抗体）を用いる分析方法としては、これに限定されるものではないが、例えば、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、又はサンドイッチ法を挙げることができる。
【００３０】
標識物質に特異的に結合可能なパートナーとしては、標識物質に対する抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）又はその抗体フラグメント〔例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ等〕を挙げることができる。また、ビオチンに特異的に結合可能なパートナーとしては、抗ビオチン抗体又はそのフラグメント以外にも、例えば、アビジン又はストレプトアビジンを挙げることができる。
【００３１】
前記分析工程では、前記ＤＮＡ合成工程で得られた反応生成物を、前記の各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いて分析する。反応生成物の分析方法としては、前記の各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いる限り、特に限定されるものではなく、例えば、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、又はサンドイッチ法などを挙げることができる。なお、前記ＤＮＡ合成工程で得られた反応生成物は、そのまま直接、あるいは、適当な処理を行なった処理物（例えば、適当に希釈又は濃縮した希釈物又は濃縮物）として、分析工程にかけることができる。
【００３２】
本発明による第１の分析方法のＤＮＡ合成工程で得られた反応生成物を、分析工程にかける場合には、反応系中に未反応の標識デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸が多量に存在することがある。この場合、適当な分離処理によって、反応生成物と未反応の標識デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸とを分離することが好ましい。前記分離処理としては、フィルター濾過又はエタノール沈殿を挙げることができる。
【００３３】
以下、分析工程における分析手法として、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、及びサンドイッチ法を利用する各態様について、この順序に従って説明する。
本発明の分析方法において、分析工程における分析手法として、イムノクロマトグラフ法を用いる場合には、例えば、イムノクロマトグラフ用ストリップとして、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子（すなわち、着色粒子コンジュゲート）を、固相担体に保持し、しかも、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーが、前記固相担体に固定化（すなわち、固相化）されているイムノクロマトグラフ用ストリップを使用することができる。
【００３４】
前記固相担体としては、例えば、ニトロセルロース、セルロースアセテート、又はガラス繊維フィルター等を用いることができる。
前記着色粒子としては、例えば、金属コロイド（例えば、金コロイド等）、非金属コロイド（例えば、ポリスチレンコロイド等）、又はリポゾーム等を用いることができる。
標識物質に特異的に結合可能なパートナーとしては、例えば、標識物質に対する抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）又はその抗体フラグメント〔例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ等〕を用いることができる。また、ビオチンに特異的に結合可能なパートナーとしては、抗ビオチン抗体又はそのフラグメント以外にも、例えば、アビジン又はストレプトアビジンを挙げることができる。以下、固相担体に固定化させる前記パートナーを「固定化用パートナー」と称し、着色粒子に結合させ、着色粒子コンジュゲートとして固相担体に保持させる前記パートナーを「保持用パートナー」と称する。
【００３５】
本発明の分析方法で用いることのできる前記イムノクロマトグラフ用ストリップでは、被検試料の展開方向に関して、上流側に、着色粒子コンジュゲートの保持領域（例えば、塗布領域）を設け、下流側に、固定化用パートナーの固定領域を設ける。固定化用パートナー（例えば、抗体）の固相への結合は、例えば、約１μｇ／ｍＬの抗体溶液を固相担体に加え、室温放置することにより行なうことができる。タンパク質の非特異的吸着をブロックするために、例えば、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でブロッキングすることが好ましい。
なお、陰性コントロールとして、例えば、マウスＩｇＧ又はウサギＩｇＧを固定する領域は、固定化用パートナーの固定領域の更に下流側に設けることもできるし、設けないでおくこともできるが、検査を正確にするためには設ける方が好ましい。
【００３６】
イムノクロマトグラフ法を用いる本発明の分析方法では、固相担体に固定化された固定化用パートナーと、固相担体に保持された着色粒子コンジュゲートとを介して、ＤＮＡ合成工程で増幅した二重標識ＤＮＡ生成物を検出する。担体の役割は、被検出物（二重標識ＤＮＡ生成物）と着色粒子コンジュゲートとを展開し、固定化された固定化用パートナーと反応させ、更に、未反応物を分離することにある。
【００３７】
より具体的には、クロマトグラフ用ストリップの着色粒子コンジュゲートを塗布した側の端に、ＤＮＡ合成工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）が接触すると、この水溶液はクロマトグラフ用ストリップに吸収及び展開され、先端に向かって浸透する。前記接触方法としては、例えば、被検試料滴下部位に滴下する方法、あるいは、容器（例えば、ウェル）内の被検試料を吸着する方法などを挙げることができる。着色粒子コンジュゲートを塗布した領域に達すると、二重標識ＤＮＡ生成物は、保持用パートナーを介して着色粒子コンジュゲートと結合し、更にクロマトグラフ用ストリップ上を移動する。そして、この二重標識ＤＮＡ生成物と着色粒子コンジュゲートとの複合体が、固定化用パートナーを固定した領域に達すると、二重標識ＤＮＡ生成物は、この固定化用パートナーに結合し、トラップされる。その結果、二重標識ＤＮＡ生成物と着色粒子コンジュゲートとの複合体は、この領域で停止し、これ以上移動しない。
【００３８】
イムノクロマトグラフ法を利用する本発明の分析方法では、この着色粒子の担体上での集積を目視により観察することにより、ＤＮＡ合成工程において目的の遺伝子断片が生成したか否かを決定することができる。更には、目的遺伝子断片の生成が確認されれば、被検試料中にＨＣＶが存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。
【００３９】
なお、このように、着色粒子コンジュゲートを保持し、しかも、固定化用パートナーが固定化されているイムノクロマトグラフ用ストリップを用いる場合には、２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、異種の標識物質を用いることが必要である。仮に、両プライマーが同種の標識物質で標識化されていると、二重標識ＤＮＡ生成物が着色粒子コンジュゲート保持領域を通過し、両者の複合体を形成した際に、二重標識ＤＮＡ生成物におけるパートナー結合部位が、全て、着色粒子コンジュゲートとの結合に使用されてしまい、二重標識ＤＮＡ生成物と着色粒子コンジュゲートとの複合体が、固定化用パートナーを固定した領域に達しても、固定化用パートナーとの結合部位が残っていないことがあるからである。
【００４０】
本発明の分析方法において、分析工程における分析手法として、ラテックス凝集法を用いる場合には、ＤＮＡ合成工程で得られた反応生成物と接触させるラテックス懸濁液として、プライマーを標識化するのに用いた標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液を用いること以外は、通常のラテックス凝集法をそのまま適用して実施することができる。
【００４１】
本発明の分析方法では、標識物質として異種の標識物質を用いるため、それらの２種類の標識物質に、それぞれ、特異的に結合可能な２種類のパートナー（すなわち、一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナー）を担持したラテックス懸濁液を使用する。
【００４２】
ラテックスとしては、通常の免疫分析用試薬に使用可能なラテックスである限り、特に限定されるものではなく、例えば、ポリスチレン、又はスチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体などを挙げることができる。ラテックスの平均粒径は、測定対象物の検出濃度又は測定機器によって適宜選択することができ、例えば、０．０５〜０．５μｍであることができる。
２種類のパートナーをラテックス上に担持させる形態としては、例えば、２種類のパートナーを混合した状態で、同一のラテックス上に担持させることもできるし、あるいは、２種類のパートナーを、それぞれ、別々のラテックス上に担持させることもできる。
パートナーを担持するラテックス懸濁液は、公知方法、例えば、物理的又は化学的結合により感作させることにより、調製することができる。
【００４３】
ＤＮＡ合成工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）と、前記ラテックス懸濁液とを接触させると、前記反応生成物中に二重標識ＤＮＡ生成物が存在する場合には、特異的結合反応（例えば、抗原抗体反応）により凝集が生じる。
例えば、抗原抗体反応の条件は、通常の免疫学的ラテックス比濁分析方法の実施条件と同様であることができ、例えば、反応のｐＨは、６〜８．５で実施することができる。反応温度は０〜５０℃であることが好ましく、２０〜４０℃がより好ましい。反応時間は、適宜決定することができ、例えば、汎用自動分析機では１０〜１５分間で測定を完了することができる。
【００４４】
特異的結合反応（例えば、抗原抗体反応）により生じた凝集の程度は、公知の分析方法、例えば、光学的分析方法により分析することができる。前記光学的分析方法としては、例えば、反応液に光を照射して散乱光又は透過光を分析する方法を挙げることができ、より具体的には、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度を測定する光学機器を用いて分析を行なうことができる。好ましい測定波長は３００〜８００ｎｍである。前記光学機器を用いた分析では、公知の方法に従って、用いるラテックス粒子の大きさ及び／又は濃度の選択、並びに反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度の増加又は減少を測定することにより実施することができる。また、これらの方法を併用することも可能である。
ラテックス凝集法を利用する本発明の分析方法では、ラテックスの凝集の程度を観察することにより、ＤＮＡ合成工程において目的の遺伝子断片が生成したか否かを決定することができる。更には、目的遺伝子断片の生成が確認されれば、被検試料中にＨＣＶが存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。
【００４５】
本発明の分析方法において、分析工程における分析手法として、サンドイッチ法を用いる場合には、分析対象化合物に対する抗体の代わりに、プライマーを標識化するのに用いた標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いること以外は、通常のサンドイッチ法をそのまま適用して実施することができる。
本発明の分析方法では、標識物質として異種の標識物質を用いるため、それらの２種類の標識物質に、それぞれ、特異的に結合可能な２種類のパートナーを使用する。
【００４６】
具体的には、例えば、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能な第１のパートナーを、適当な不溶性担体に固定化する。次に、不溶性担体と体液試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤〔例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やゼラチン等〕で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、ＤＮＡ合成工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）を加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ、反応させる（１次反応）。続いて、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質の残る一方に特異的に結合可能な第２のパートナーに標識物質を付した標識化第２パートナーを加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ、反応させる（２次反応）。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、不溶性担体上に存在する標識化第２パートナーの量を定量する。その値から、ＤＮＡ合成工程において目的の遺伝子断片が生成したか否かを決定することができる。更には、目的遺伝子断片の生成が確認されれば、被検試料中にＨＣＶが存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。
【００４７】
前記不溶性担体としては、例えば、高分子（例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、又はポリサッカライド等）、ニトロセルロース、紙、若しくはアガロース、又はこれらの組み合わせ等を例示することができる。
第２パートナーに付す標識物質としては、例えば、酵素、蛍光物質、又は発光物質を挙げることができる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート等、また、発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル又はルシフェリン等を使用することができる。
【００４８】
本発明の分析用キットは、
（１）配列番号１又は３〜８のいずれか１つの配列番号で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が第１の標識物質（例えば、ＦＩＴＣ）で標識化されているオリゴヌクレオチドセンスプライマー；
（２）（２−ａ）第２の標識物質で標識されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸（例えば、ビオチン標識のｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、又はｄＧＴＰ）、又は（２−ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が第２の標識物質（例えば、ビオチン）で標識化されているオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマー；及び
（３）（３−ａ）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子を保持し、しかも、もう一方の標識化合物に特異的に結合可能なパートナーが固定されているイムノクロマトグラフ用ストリップ、又は（３−ｂ）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識化合物に特異的に結合可能なパートナーとを担持したラテックス粒子懸濁液
を含む。
【００４９】
本発明の分析用キットを用いて、本発明の分析方法を実施することにより、ＨＣＶを分析することができる。
例えば、前記のセンスプライマー（１）、標識デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸（２−ａ）、及びイムノクロマトグラフ用ストリップ（３−ａ）を含む分析用キットは、本発明の第１の分析方法であって、しかも、イムノクロマトグラフ法を用いて分析工程を実施する、本発明の分析方法に用いることができる。
前記のセンスプライマー（１）、標識デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸（２−ａ）、及びラテックス粒子懸濁液（３−ｂ）を含む分析用キットは、本発明の第１の分析方法であって、しかも、ラテックス凝集法を用いて分析工程を実施する、本発明の分析方法に用いることができる。
前記のセンスプライマー（１）、標識アンチセンスプライマー（２−ｂ）、及びイムノクロマトグラフ用ストリップ（３−ａ）を含む分析用キットは、本発明の第２の分析方法であって、しかも、イムノクロマトグラフ法を用いて分析工程を実施する、本発明の分析方法に用いることができる。
また、前記のセンスプライマー（１）、標識アンチセンスプライマー（２−ｂ）、及びラテックス粒子懸濁液（３−ｂ）を含む分析用キットは、本発明の第２の分析方法であって、しかも、ラテックス凝集法を用いて分析工程を実施する、本発明の分析方法に用いることができる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００５１】
実施例１：オリゴヌクレオチドの合成
３８１型ＤＮＡ自動合成装置（アプライドバイオシステムズ社）を用いて常法により、
配列番号１で表される塩基配列（塩基数２０個）からなるオリゴヌクレオチドセンスプライマー、
配列番号１で表される塩基配列（塩基数２０個）からなる５’−ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドセンスプライマー、
配列番号２で表される塩基配列（塩基数２０個）からなるオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマー、
配列番号２で表される塩基配列（塩基数２０個）からなる５’ビオチン標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマー、及び
配列番号３〜８で表される各塩基配列（塩基数１４個）からなる５’ビオチン標識オリゴヌクレオチドプライマー
を合成した。
【００５２】
実施例２：ＨＣＶ遺伝子の単離
ＨＣＶ抗体陽性［ＨＣＶＡｂ  ＥＬＩＳＡテスト（オーソダイアグノスチック社）でＯＤ値が２以上］の血漿を用いた。この血漿約１０ｍＬを２０％シュクロース１０ｍＬにのせ、超遠心分離（日立ＲＰ−４５；３７，０００ｒｐｍ×１６時間）を４℃で行い、ペレットを集めた。このペレットに、グアニジウムチオシアネート法［Anal. Biochem. 162, 156-159(1987)］に準じて、４ｍｏｌ／Ｌグアニジウムチオシアネート、２５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．５％ラウロイルザルコシンナトリウム、０．１ｍｏｌ／Ｌメルカプトエタノール２０ｍＬ、及び２ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）２ｍＬを加えてフェノール／クロロフォルム抽出を行い、この上層に等量のイソプロピルアルコールを加えて沈澱させ、ＲＮＡを単離した。
【００５３】
実施例３：ＲＴ−ＰＣＲ反応
血漿から単離したＲＮＡを７０℃で１分加熱後、室温に戻し、使用した。逆転写酵素反応は、配列番号２で表される塩基配列からなるアンチセンスプライマー５０ｐｍｏｌ、逆転写酵素（avian myeloblastosis；BRL）１０Ｕ、ＲＮアーゼインヒビター（宝酒造）１０Ｕ、及び１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｄＮＴＰ（ファルマシア）を添加した５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）／８ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ2／３０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ／１ｍｍｏｌ／Ｌ−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）緩衝液中で、４２℃にて３０分間反応を行った。
【００５４】
次に、配列番号１又は２で表される塩基配列からなる２種類のプライマーを用いてＰＣＲを行った。１サイクルは、
（ａ）ＤＮＡの変性工程［９５℃で１分］、
（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニーリング工程［５５℃で２分３０秒］、及び
（ｃ）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Gene Taq；ニッポンジーン）によるＤＮＡ合成工程［７２℃で３分］
からなり、このサイクルを３５回繰り返した。
【００５５】
実施例４：プラスミドの作製
（１）ライゲーション
市販のプラスミドベクターｐＺＥｒＯ−１（Invitrogen社）を制限酵素ＥｃｏＲＶ（３７℃，２時間）で消化して、増幅したＰＣＲ産物がベクターに挿入できるようにした。この制限酵素で切断したベクター２．８ｋｂｐと、ＰＣＲにより合成した２２１ｂｐのＤＮＡとを、ライゲーション・キット（宝酒造）を用いて、１６℃で３０分間反応させた。
【００５６】
（２）大腸菌の形質転換
組み換えプラスミドと、市販の大腸菌ＤＨ５α株（宝酒造）を５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ2で処理して作成したコンピテント細胞とを、氷中で３０分間インキュベートし、４２℃で３０秒間熱処理した後、３７℃でＳＯＣ培地にて１時間培養した。この大腸菌を、５０μｇ／ｍＬゼオシン（Zeocin；Invitrogen社）及び１ｍｍｏｌ／Ｌイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むＹＴ寒天平板上にまき、３７℃で一夜培養を行なった。
【００５７】
（３）形質転換体に含まれるＨＣＶ非コード領域を含む遺伝子の単離
前記工程（２）で得られた形質転換体のコロニーを、５０μｇ／ｍＬゼオシンを含むＹＴ−ブロスに接種し、３７℃で一夜培養を行った。この培養液１．５ｍＬをエッペンドルフチューブに入れ、遠心分離で菌体を集め、アルカリ溶菌法（Molecular Cloning, A Laboratory Mannual 2nd Edition, J.Sambrook, E.F.Fritsch, T.Maniatis; Cold Spring Harbor Laboratory, New York）にてプラスミドＤＮＡを単離した。
【００５８】
（４）塩基配列の決定
前記ＤＮＡを８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にアプライし、１ｘＴＢＥ（0.089mol/L Tris-Borate/0.089mol/L Boric Acid/0.002mol/L EDTA）で泳動後、ＤＮＡマーカー（123bp DNA Ladder；GIBCO BRL製）から判断し、２２１ｂｐバンドに相当するバンドを切り取り、市販のキット（Ultrafree-DA；ミリポア社）を用いてＤＮＡを精製した。このＤＮＡと市販のシークエンスキット（BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit；アプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲ反応を行った。未反応の低分子基質は  スピンカラム（Qick Spin 50；ロシュ社）で除去し、ＤＮＡシークエンサー（３７３Ａ−１８  ＤＮＡシークエンサー装置；アプライドバイオシステムズ社）にアプライし、ジデオキシ法で塩基配列を決めた。
【００５９】
実施例５：二重標識ＤＮＡの生成
（１）逆転写酵素反応
実施例２で単離したＲＮＡ（ＨＣＶ遺伝子）を７０℃で１分加熱後、室温に戻し、使用した。逆転写酵素反応は、配列番号２で表される塩基配列からなる無標識プライマー、ＲＮアーゼインヒビター（宝酒造）１０Ｕ、逆転写酵素（avian myeloblastosis；ＢＲＬ）１０Ｕ、及び１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｄＮＴＰ（ファルマシア）を添加した５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）／８ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ2／３０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ／１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＤＴＴ緩衝液中で、４２℃にて１時間反応させ、ＨＣＶ遺伝子のＲＮＡに相補的なＤＮＡを伸長させた。
【００６０】
（２）二重標識のＤＮＡの生成
（２−ａ）５’−ビオチン標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーを用いるＤＮＡ増幅反応
前記工程（１）で作製したＤＮＡに、配列番号１で表される塩基配列からなる５’−ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドセンスプライマーと、配列番号２で表される塩基配列からなる５’−ビオチン標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーとのプライマーセット、及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Gene Taq；ニッポンジーン）を用い、実施例３に記載したＰＣＲ反応を行なうことにより、二重標識ＤＮＡを得た。また、配列番号１で表される塩基配列からなる５’−ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドセンスプライマーの代わりに、配列番号３〜８の塩基配列からなる各５’−ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドセンスプライマーのいずれか１つを用いること以外は、前記ＰＣＲ反応を繰り返すことにより、各二重標識ＤＮＡを得た。
【００６１】
（２−ｂ）ビオチン−ｄＣＴＰを用いるＤＮＡ伸長反応
前記工程（１）で作製したＤＮＡに、配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドセンスプライマーと、配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーとの無標識プライマーセットを加え、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Gene Taq；ニッポンジーン）を用いて、実施例３に記載したＰＣＲ反応を行った。このＤＮＡ生成物をＰＣＲ装置にて９５℃で熱変性し、配列番号３〜８の塩基配列からなる各５’−ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドセンスプライマーのいずれか１つと、ビオチン標識ｄＣＴＰ［１０ｘＰＣＲ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ：１．５ｍｍｏｌ／Ｌ−ビオチン−ｄＣＴＰ，０．５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｄＣＴＰ，２ｍｍｏｌ／Ｌ−ｄＡＴＰ，２ｍｍｏｌ／Ｌ−ｄＧＴＰ，２ｍｍｏｌ／Ｌ−ｄＴＴＰ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ］、又はDetector PCR DNA Biotinylation Kit（ＫＰＬ社）とを添加し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Gene Taq；ニッポンジーン）を用いてＤＮＡの伸長反応を行った。このＤＮＡ生成物に含まれる未反応のビオチン−ｄＣＴＰは、スピンカラム（Mini Elute PCR purification Kit；キアゲン社）で除去した。
【００６２】
実施例６：イムノクロマトグラフ用ストリップの作製
本実施例では、二重標識ＤＮＡ捕捉用抗体として、モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体（ZYMED Laboratories製）又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体（ZYMED Laboratories製）を用い、金コロイド標識物としてストレプトアビジン（TRINA Bioreactives製）を用いて、二重標識ＤＮＡ測定用イムノクロマトグラフ用ストリップを作製した。
【００６３】
（１）イムノクロマトグラフ用メンブレンの作製
ポリアミド（ナイロン６６）製メンブレン（Immunodyne ABC，孔径＝３．０μｍ；Pall Corporation製）を５ｍｍ×２０ｍｍのサイズに裁断した。
メンブレンの上流側の一端から８ｍｍの位置に、二重標識ＤＮＡの検出ゾーンとして、モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体溶液又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体溶液［各々濃度０．５ｍｇ／ｍＬ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈］を幅１ｍｍの線状に塗布した。
また、メンブレンの上流側の一端から１３ｍｍの位置に、陰性コントロールゾーンとして、マウスモノクローナルＩｇＧ溶液［各々濃度０．５ｍｇ／ｍＬ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈］を、幅１ｍｍの線状に塗布した。
室温下で１時間、３７℃下で３０分間静置し、各々の抗体を固相化した。メンブレンを０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に浸し、室温及び相対湿度２０％以下の条件下で３０分間緩やかに振とうし、ブロッキングした。メンブレンの過剰のブロッキング液を除き、室温下で一夜静置し、乾燥させ、二重標識ＤＮＡのイムノクロマトグラフ用抗体固相化メンブレンとした。
【００６４】
（２）金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液の作製
ストレプトアビジン（濃度１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを２ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｎａ2Ｂ4Ｏ7緩衝液（ｐＨ６．５）（以下、Ｂｏｒａｘ緩衝液と称する）３，０００ｍＬ中で４℃下で一夜透析した。ストレプトアビジン溶液は、４℃下、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した後、その上清を、１００，０００×ｇで１時間遠心分離したＢｏｒａｘ緩衝液で１００μｇ／ｍＬとなるように希釈した。金コロイド液（GOLD COLLOID 20nm；British BioCell International製）１００ｍＬを、０．２ｍｏｌ／Ｌ−Ｋ2ＣＯ3溶液及び０．２ｍｏｌ／Ｌ−Ｈ3ＰＯ4溶液でｐＨ６．５に調整した。金コロイド液２０ｍＬを撹拌しながら、希釈したストレプトアビジン溶液２ｍＬを徐々に滴下し、室温下で３０分間撹拌した。更に、撹拌しながら１０％ＢＳＡ溶液（ｐＨ９．０；４℃下、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した上清）２．５ｍＬを滴下した後、室温下で３０分間撹拌した。１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）（０．４５μｍフィルター濾過）２０ｍＬに再懸濁させ、１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。更に、沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）（０．４５μｍフィルター濾過）２０ｍＬに再懸濁させ、１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。最後に、沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）（０．４５μｍフィルター濾過）に再懸濁させた後、波長５２０ｎｍにおける吸光度が約１０になるように濃度調整し、表面をシリコン処理したガラス試験管に移し、密栓し、４℃下に保存し、二重標識ＤＮＡのイムノクロマトグラフ法用金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液とした。
【００６５】
金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液は、波長５２０ｎｍにおける吸光度が３．０になるように、５．０％ショ糖を含む２ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で希釈した後、その７μＬを、吸収パッドアキュウィックＡＷ１４−２０Ｔ４（Pall Corporation製）を５ｍｍ×５ｍｍのサイズに裁断したものに塗布し、シリカゲルデシケーター内で室温下、一夜減圧（≦５０ｍｍＨｇ）乾燥したものを、二重標識ＤＮＡのイムノクロマトグラフ法用金コロイド標識ストレプトアビジンパッドとした。
【００６６】
（３）イムノクロマトグラフ法用吸収パッドの作製
グラスファイバーパッド（タイプＡ／Ｂ；Pall Corporation製）を５ｍｍ×１８ｍｍのサイズに裁断したものを、二重標識ＤＮＡのイムノクロマトグラフ法用試料添加パッドとした。グラスファイバーパッド（タイプＡ／Ｅ；Pall Corporation製）を５ｍｍ×２５ｍｍのサイズに裁断したものを、二重標識ＤＮＡのイムノクロマトグラフ法用吸収パッドとした。
【００６７】
（４）イムノクロマトグラフ用ストリップ
５ｍｍ×６０ｍｍのサイズに裁断したプラスティック粘着シート（BioDot製）に、上流側より、試料添加パッド、金コロイド標識ストレプトアビジンパッド、抗体固相化メンブレン、及び吸収パッドの順に、各々その両端を隣接する部材と１ｍｍ重ね合わせて貼付し、二重標識ＤＮＡ測定用イムノクロマトグラフ用ストリップとした。
【００６８】
実施例７：イムノクロマトグラフ法による二重標識ＤＮＡの測定
本実施例では、実施例６で作製したイムノクロマトグラフ用ストリップを用いて、二重標識ＤＮＡのイムノクロマトグラフ法を実施した。
（１）ＰＣＲ産物の希釈溶液を用いた二重標識ＤＮＡの測定
実施例３でＰＣＲを３５回行った反応液を、市販の緩衝液（Gene Taq Universal Buffer；ニッポンジーン）で、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、及び１０００倍希釈を行った。それぞれの希釈溶液に、実施例１で合成した５’−ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドセンスプライマー（配列番号１）、実施例１で合成した６種類の５’ビオチン標識オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３〜８）のいずれか１つ、及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Gene Taq；ニッポンジーン）０．５Ｕを加え、７２℃で３０分反応させた。この反応生成物１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、室温下で１０分間展開した。
【００６９】
表２に、モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したメンブレンを組み込んだ  二重標識ＤＮＡ測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでの測定結果を示す。
表３に、ポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したメンブレンを組み込んだ  二重標識ＤＮＡ測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでの測定結果を示す。
表１及び表２において、「−」は陰性、「±」は擬陽性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性、「＋＋＋」は強陽性であることを示す。
ポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化した二重標識ＤＮＡ測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでは、元の被検液を５００倍希釈したものまで検出可能であった。
【００７０】
《表２》
検出ゾーン          ＰＣＲ希釈液を用いたＤＮＡ伸長反応液            リン酸塩
１０    ５０  １００  ２００  ５００  １０００       緩衝液 
二重標識ＤＮＡ   ＋＋＋   ＋＋   ＋＋     ＋      ±       −            −
陰性コントロール   −      −     −      −      −       −            −   
【００７１】
《表３》
検出ゾーン          ＰＣＲ希釈液を用いたＤＮＡ伸長反応液              リン酸塩
１０    ５０    １００  ２００  ５００  １０００       緩衝液 
二重標識ＤＮＡ   ＋＋＋  ＋＋＋   ＋＋＋   ＋＋    ＋＋      ±            −
陰性コントロール   −      −       −      −      −       −            −   
【００７２】
（２）患者試料から得られた二重標識ＤＮＡの測定
本実施例で用いた患者試料は、ＨＣＶ  ＲＮＡ陽性血漿として、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡの５’非翻訳領域について配列番号１及び２で表される塩基配列からなるプライマーセットを用いてＰＣＲ法を行い［Okamoto, H. et al. Japan J. Exp. Med. 60, 197 (1990)］、アガロースゲル電気泳動でＤＮＡのバンドが確認することができた陽性５検体を用いた。
患者試料又は実施例２で単離したＲＮＡ（ＨＣＶ遺伝子）を用いて、実施例５に示した逆転写酵素反応後、実施例１で合成した６種類の標識プライマー（配列番号３〜８で表される各塩基配列からなる５’ビオチン標識オリゴヌクレオチドプライマー）及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Gene Taq；ニッポンジーン）０．５Ｕを加え、ＤＮＡの伸長反応を行った。これらのＤＮＡ伸長反応液１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを、水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、室温下で１０分間展開した。
【００７３】
メンブレンのモノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化した部分、及び陰性コントロール抗体を固相化した部分の金コロイドの捕捉に基づく赤紫〜紫色の着色の有無を目視観察し、二重標識ＤＮＡの有無を判定した。
実施例２で単離したＲＮＡについて、ポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体固相化イムノクロマトグラフ用ストリップでの６種類のプライマーを用いた二重標識ＤＮＡの測定結果を表４に示す。患者検体を用いた二重標識ＤＮＡの測定結果を表５に示す。表４及び表５において、「−」は陰性、「±」は擬陽性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性であることを示す。
【００７４】
《表４》
プライマー                    検出ゾーン                
二重標識ＤＮＡ    陰性コントロール    
配列番号３                ＋＋                −
配列番号４                ＋＋                −
配列番号５                ＋＋                −
配列番号６                ＋＋                −
配列番号７                ＋＋                −
配列番号８                ＋＋                −        
【００７５】
《表５》
検体                      検出ゾーン                
二重標識ＤＮＡ    陰性コントロール    
Ｎｏ．１                  ＋＋                −
Ｎｏ．２                  ＋                  −
Ｎｏ．３                  ＋＋                −
Ｎｏ．４                  ＋                  −
Ｎｏ．５                  ±                  −        
【００７６】
実施例８：ＰＣＲ反応生成物の確認
本実施例では、ビオチン−ｄＣＴＰを用いる本発明の第１の分析方法におけるＤＮＡ合成工程、あるいは、ビオチン標識センスプライマーを用いる本発明の第２の分析方法におけるＤＮＡ合成工程により生成されるＰＣＲ反応生成物（すなわち、二重標識ＤＮＡ）が、実際に合成されているか否かを確認するために、ＰＣＲ反応生成物のポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。
【００７７】
結果を図３に示す。図３において、レーン１は、ＤＮＡマーカー（123bp DNA Ladder；GIBCO BRL製）であり、レーン２及び３は、ビオチン−ｄＣＴＰを用いた場合（本発明の第１の分析方法）の結果であり、レーン４及び５は、ビオチン標識センスプライマーを用いた場合（本発明の第２の分析方法）の結果である。レーン３及び５は、ＰＣＲ反応生成物をそのまま泳動した結果であり、レーン２及び４は、ＰＣＲ反応生成物にストレプトアビジンを添加した混合物を泳動した結果である。
【００７８】
ビオチン−ｄＣＴＰを用いた場合（レーン２及び３）、ＦＩＴＣ標識プライマー及びビオチン−ｄＣＴＰを用いて得られたＰＣＲ反応生成物１０μＬにストレプトアビジン溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを加え、３０分間反応後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なうと、ストレプトアビジン（分子量：約６０，０００）と結合するビオチン−ｄＣＴＰが取り込まれたＰＣＲ生成物のバンドが上の方にシフトした（レーン２）。なお、ＰＣＲ生成物にビオチンが数箇所入るため、レーン２のバンドは上の位置に２箇所へシフトするが、ビオチン−ｄＣＴＰが取り込まれていないＰＣＲ生成物（ストレプトアビジンと反応しないＰＣＲ生成物）のバンドも存在した。また、電気泳動バンドでは示すことができないが、未反応のビオチン−ｄＣＴＰが過剰に存在した。
この場合、ＦＩＴＣとビオチンの二重標識ＰＣＲ生成物ができているが、イムノクロマト法で直接検出することができないことがあった。これは、未反応のビオチン−ｄＣＴＰがイムノクロマト片と反応したためと考えられるが、ＰＣＲ生成物に含まれる未反応のビオチン−ｄＣＴＰを、例えば、エタノール沈殿で除去、又はスピンカラムで除去した後、イムノクロマト片と反応させることにより検出が可能であった。
【００７９】
ビオチン標識センスプライマーを用いた場合（レーン４及び５）、ＦＩＴＣ標識プライマー及びビオチン標識プライマーを用いて得られたＰＣＲ反応生成物１０μＬにストレプトアビジン溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを加え、３０分間反応後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なうと、ストレプトアビジンと結合するバンドの大部分が上の方にシフトした（レーン４）。ＰＣＲ生成物にビオチンが入るため、レーン５と比較して、レーン４ではバンド濃度が薄くなり、バンドが上の方にシフトした。
この場合、ＦＩＴＣとビオチンの二重標識ＰＣＲ生成物ができ、イムノクロマト法で直接検出することができた。ビオチン標識プライマーを用いて合成した二重標識ＰＣＲ生成物は、ビオチン標識プライマーの影響を受けず、そのままのＰＣＲ生成物でイムノクロマト片と反応させ、検出することができた。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の分析方法は、ＨＣＶの分析、例えば、ＨＣＶ感染患者の血液中に存在するウイルス遺伝子の分析に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】本発明の第１の分析方法におけるＤＮＡ合成工程において、二重標識ＤＮＡの作製手順を示す説明図である。
【図２】ＨＣＶ−Ｊ１株及びＨＣＶ−Ｊ４株の５’非翻訳領域の配列と、それに続くコア領域の配列とを示す説明図である。
【図３】ＰＣＲ反応生成物を電気泳動した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図１】
2005087133.tif 000002
【図２】
2005087133.tif 000003
【図３】
2005087133.tif 000004
【配列表】
2005087133000001.app