(57)【要約】【課題】            １α位及び２５位が水素原子であるビタミンＤ類の１α位のみを直接的に水酸基に変換することを特徴とする１α−ヒドロキシビタミンＤ類の製造方法。【解決手段】        ビタミンＤ類を水酸化する能力を有するアミコラータ（Ａｍｙｃｏｌａｔａ）属に属する放線菌の菌体、またはその産生した酵素を含有する溶液中で、１αの水素原子のみを直接水酸基に変換することを特徴とする１α−ヒドロキシビタミンＤ類の製造方法。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミコラータ（Ａｍｙｃｏｌａｔａ）属に属する放線菌菌体又はその産生する酵素を含有する溶液中に、１α及び２５位に水素原子を有するビタミンＤ２、または１α及び２５位に水素原子を有するビタミンＤ３を加えて、その１α位の水素原子を水酸基に置換することを特徴とする１α−ヒドロキシビタミンＤ２、または１α−ヒドロキシビタミンＤ３の製造方法。
【請求項２】
アミコラータ（Ａｍｙｃｏｌａｔａ）属放線菌が、アミコラータ・エスピー  Ａ２０１９（Ａｍｙｃｏｌａｔａ  ｓｐ.Ａ２０１９  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４１８４）である請求項１に記載の１α−ヒドロキシビタミンＤ２、または１α−ヒドロキシビタミンＤ３の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を利用したヒドロキシビタミンＤ類の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
有機化学的方法によるビタミンＤ類の１α位の直接的水酸化は、極めて困難とされており、文献上ではニワトリなどの動物の腎のホモジネートを用いる方法や、ミトコンドリア画分を用いる方法（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）、並びに微生物を用いる方法（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）等により、原料のビタミンＤ類の１α位に水酸基を導入できることが知られている。
【０００３】
しかしながら、上記の１α位水酸化に関する報告は、いずれも２５位に水酸基を有する２５−ヒドロキシビタミンＤ類を１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ類に変換するものであり、２５位が水酸基ではなく水素原子を有する場合のビタミンＤ類の１α位を直接水酸化することは、動植物を用いた酵素化学的方法、微生物を用いた変換法などについて、その成功例は未だ報告されていない。一方、１α−ヒドロキシビタミンＤ３は、慢性腎不全、骨粗鬆症などに使用される医薬品であり、その製造は現在では有機化学的手法により複雑なステップを経て合成されている。
【０００４】
【特許文献１】特開平０２−２３１０８９号公報
【特許文献２】特開平０４−１６６０９０号公報
【特許文献３】特開平０４−３５６１９０号公報
【特許文献４】特公平０４−６４７８号公報
【非特許文献１】「ネイチャー（Nature）」第２３０巻、第２２８頁、１９７１年
【非特許文献２】「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）」第２４７巻、第７５２８頁  １９７２年
【非特許文献３】「バイオケミストリー（Biochemistry）」第２５巻、第５５１２頁  １９８６年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
有機化学的手法による１α−ヒドロキシビタミンＤ類の合成は複雑であり、調製に困難をきたしている。本発明は、微生物を用い、より簡便な操作による１α−ヒドロキシビタミンＤ類の新規な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明において使用される微生物は放線菌に属し、新規にビタミンＤ類の１α位の水素原子を直接水酸基に変換する能力を有する菌株であって、その具体例としては、沖縄県西表島および長野県長谷村の土壌より新たに分離した特定の微生物を利用することにより、ビタミンＤ類の１α位に直接水酸基を導入できることを見いだし、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は、ビタミンＤ類を水酸化するアミコラータ（Ａｍｙｃｏｌａｔａ）属に属する放線菌菌体、若しくはそれらの産生する酵素を含有する溶液中に、１α位に水素原子を有するビタミンＤ類を加えて、その水素原子を水酸基に変換することを特徴とする１α−ヒドロキシビタミンＤ類の製造方法である。即ち本発明に依れば、１α位に水素原子を有するビタミンＤ類は、その水素原子が水酸基に変換される。
【０００８】
本発明の製造方法は、ビタミンＤ類の１α位に直接１工程で水酸基を導入する方法であり、側鎖部分にはいずれの置換基を有していてもよい。従って、本発明においてビタミンＤ類とは、ビタミンＤ２、Ｄ３系の化合物であり、１αおよび２５位に水素原子を有するものである。側鎖の水素原子または水酸基が、弗素などのハロゲン原子、低級アルキル基などで置換されていてもよい。
【０００９】
本発明に関与する菌株は次の菌学的性質を有する。
【００１０】
アミコラータ属放線菌Ａ２０１９について
１）形態
栄養菌糸は合成寒天培地および天然寒天培地においてよく発達し、不規則的に分岐する。直径０．５〜０．８×２．３〜２．８μｍの分断が認められる。菌核、胞子嚢、鞭毛胞子は観察されない。
【００１１】
２）培地上での生育状態
各種培地で３０℃、７日間培養したときの肉眼的観察結果を表１に示す。
【００１２】
【表１】
2005323618.tif 000002
【００１３】
３）生理的性質
（１）生育温度範囲
各種天然培地上において２０〜４０℃の範囲で良好に生育する。なお５℃以下および５０℃以上の温度範囲では生育しない。
（２）生化学的性質
ａ）好気性、嫌気性の区別          好気性
ｂ）ゼラチンの液化                陰  性
ｃ）脱脂乳の凝固                  陰  性
ｄ）脱脂乳のペプトン化            陽  性
ｅ）スターチの加水分解            疑陽性
ｆ）メラニン様色素生成            陽  性
ｇ）硝酸還元能                    陽  性
（３）炭素源の利用性
プリドハム・ゴドリーブ寒天培地により検討した結果、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−キシロース、シュクロース、マンニトール、イノシトールを利用し、Ｌ−アラビノースをわずかに利用し、ラフィノース、Ｌ−ラムノースは利用しない。
【００１４】
以上の菌学的性質から、本菌株が放線菌に属することは明白であり、バージー著「マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー」第２巻、日本放線菌学会編「放線菌の同定実験法」および「インターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー」第３６巻、第２９〜３７頁（１９８６年）に報告されている既知菌種と上記性状を比較した結果、本菌株をアミコラータ属放線菌と同定し、しかも、公知の菌とは相違することから新菌株と判断し、アミコラータ・エスピー  Ａ２０１９（Ａｍｙｃｏｌａｔａ  ｓｐ．Ａ２０１９）と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１４１８４として寄託した。
【００１５】
本発明の方法は、放線菌の菌体またはその生産する酵素を含む溶液中で、基質ビタミンＤ類を好気的条件下で反応させることによって行うものである。
【００１６】
反応に必要な放線菌の菌体を得るためには、好気的条件下で本菌の培養を培地中で行う。培地は、主として液体培地を用い、炭素源としてグルコース、マルトース、シュクロース、スターチ、アラビノースなどを単独または混合して用いる。窒素源としては、ポリペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーおよびソイビーンミールなどを単独または混合して用いる。その他、本菌株の生育を助け、１α−ヒドロキシビタミンＤ類の生産を促進する有機物および無機物を必要により添加することが出来る。培養方法は振盪培養、通気撹拌培養などの好気培養が適しており、ｐＨ６〜８で２〜８日間培養する。
【００１７】
この培養により得られた菌体を含有する溶液を１α−ヒドロキシビタミンＤ類を生産する反応に用いる。即ち、培養中の菌体を含む培養液をそのまま用いるか、培養終了後遠心分離または濾過により分離した菌体を懸濁した溶液を用いる。また、培養後に得られた菌体を破砕後、遠心分離などにより菌体を除いた溶液を用いることもできる。更にまた菌体は、κ−カラギーナンなどの多糖類などの各種固定化剤を用いて固定化してから溶液に添加してもよい。また、前記菌体の凍結乾燥したものを上記と同様に用いることも出来る。
【００１８】
本発明において用いられる反応液は、前記培地を用いて培養した培養液であるか、あるいはトリス−酢酸、トリス−塩酸、コハク酸ナトリウム−コハク酸、コハク酸カリウム−コハク酸、クエン酸ナトリウム−クエン酸、リン酸塩（カリウム塩、ナトリウム塩など）、カコジル酸ナトリウム−塩酸、イミダゾール−塩酸、ホウ酸−ホウ砂などの緩衝液を単独または混合したものである。その他、溶液には目的のビタミン類の生産を促進する界面活性剤、有機物および無機物を必要により添加することが出来る。
【００１９】
本発明は、前記菌体を含有する溶液中に基質となるビタミンＤ類を適量添加し、振盪操作、通気撹拌操作など好気的条件下で行うことが適しており、ｐＨ６〜９、２０〜４０℃に保持しつつ、およそ２４〜９６時間を要する。培養中の菌体を含む培養液を用いる場合は、基質ビタミンＤ類を添加後、更に同条件下で２４〜９６時間振盪して本反応を行う。
【００２０】
以上の反応により製造された１α−ヒドロキシビタミンＤ類の単離は、反応液を有機溶媒により抽出して濃縮乾固し、これをアセトンなど適当な溶媒に再溶解し、不溶物を遠心分離または濾過などにより除いた後、シリカゲル順層カラム（例えばゾルバックスＳＩＬ：米国デュポン社製）を用いた高速液体クロマトグラフィーまたはシリカゲル逆層カラム（例えばバイオシルＣ１８：米国バイオラッド社製）を用いた高速液体クロマトグラフィーに付することにより目的のヒドロキシビタミン類を単離することができる。
【００２１】
また、セファデックスＬＨ−２０（スウェーデン：ファルマシア社製）などを用いたゲル濾過クロマトグラフィーやローバーカラム（スイス：メルク社製）を用いたシリカゲルクロマトグラフィーなどによっても目的のヒドロキシビタミン類を単離することができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の方法により、ビタミンＤ類の１α位へ直接水酸基を導入することが可能になった。即ち、本発明の微生物を用いる方法では、反応溶液などの調製に手間がかからず、しかも１段階で短時間に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これによって本発明が限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
グルコース１．５％、ソイビーンミール１．５％、コーンスチーブリカー０．５％、塩化ナトリウム０．５％、炭酸カルシウム０．２％、ｐＨ７の液体培地５ｍＬを直径２４ｍｍの試験管に入れ、１２０℃、２０分間加圧殺菌した。これにアミコラータ属放線菌Ａ２０１９を１白金耳植菌し、３０℃で２日間振盪培養した。これに１ｍｇのビタミンＤ３を２００μＬのエタノールに溶解したものと、１０ｍｇのβ−シクロデキストリンを１ｍＬの水に溶解したものを加え、さらに３０℃で２日間振盪しつつ反応させた。反応後の培養液に集めて等量のメタノールおよびジクロロメタンを加え、撹拌後遠心分離によりジクロロメタン層を回収した。これを窒素気流下で濃縮乾固後、ｎ−ヘキサン：イソプロパノール＝２２：３の混合溶媒に溶解し、不純物を濾別後、ゾルバックスＳＩＬ高速液体クロマトグラフィーに供した。
溶離液：ｎ−ヘキサン：イソプロパノール＝９２：８
カラムサイズ：φ４．６ｍｍ×２５ｃｍ
溶出速度：２．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：フォトダイオードアレイ検出器ウォーターズ９９１Ｊ（日本ミリポアリミテッド社製）
ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンを示す溶出時間７分付近のピーク画分を集めて濃縮し、次にバイオシルＣ１８高速液体クロマトグラフィーに供した。
溶離液：メタノール：水＝９０：１０
カラムサイズ：φ４．６ｍｍ×１５ｃｍ
溶出速度：２．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：フォトダイオードアレイ検出器ウォーターズ９９１Ｊ（日本ミリポアリミテッド社製）
溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンを示す溶出時間１０．５分付近のピーク画分を集め、減圧濃縮した。この結果、精製１α−ヒドロキシビタミンＤ３０．５μｇを得た。これは、市販の１α−ヒドロキシビタミンＤ３（和光純薬工業（株）製）の標品と各種高速液体クロマトグラフィー（ゾルバックスＳＩＬ、バイオシルＣ１８）の保持時間、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一致した。
極大紫外部吸収：λｍａｘ＝２６５ｎｍ（エタノール）
ＥＩ−ＭＳ（ｍ/ｚ）４００（Ｍ＋），３８２（Ｍ＋−Ｈ２０），３６４，２８７，１９７，１７４，１５２，１３４，１０５，９５
同じ紫外部吸収パターンを示し、またマススペクトル開裂パターンも同じであったことから、１α−ヒドロキシビタミンＤ３と同定した。