(57)【要約】【課題】組換え宿主細胞中における、タンパク質または非翻訳ＲＮＡ分子のの調節された発現のための組成物および方法を提供する。【解決手段】ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子であって、ここで該ＲＮＡ分子は、以下：  （ａ）少なくとも１つのシス作用性配列エレメント、  （ｂ）非細胞変性、温度感受性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を有する第１のオープンリーディングフレーム、および  （ｃ）以下からなる群から選択される少なくとも１つの第２のヌクレオチド配列：      （ｉ）タンパク質またはその部分をコードする第２のオープンリーディングフレーム；      （ｉｉ）（ｉ）の第２のオープンリーディングフレームの全てまたは一部に相補的な配列；および      （ｉｉｉ）翻訳されないＲＮＡ分子またはその相補体をコードする配列、を含む、ＤＮＡ分子。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子であって、ここで該ＲＮＡ分子は、以下：
（ａ）少なくとも１つのシス作用性配列エレメント、
（ｂ）非細胞変性、温度感受性のシンドビスウイルスレプリカーゼをコードする第１のオープンリーディングフレームであって、該非細胞変性は、該レプリカーゼの非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）の７２６位のプロリンを別の天然に存在するアミノ酸で置換により付与される、第１のオープンリーディングフレーム、および
（ｃ）以下からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列：
（ｉ）タンパク質またはその部分をコードする第２のオープンリーディングフレームであって、ここで該第２のオープンリーディングフレームが、１つ以上のＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象後に翻訳可能な形式である、第２のオープンリーディングフレーム；
（ｉｉ）（ｉ）の第２のオープンリーディングフレームの全てまたは一部に相補的な配列；および
（ｉｉｉ）翻訳されないＲＮＡ分子をコードする配列または該配列の相補配列、
を含み、
該（ｃ）の少なくとも１つのヌクレオチド配列が、該非細胞変性、温度感受性のシンドビスウイルスレプリカーゼによって認識されるプロモーターに作動可能に連結され、
ここで、温度感受性が、前記レプリカーゼの非構造タンパク質４（ｎｓＰ４）遺伝子における１以上の変異によって、付与される、ＤＮＡ分子。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡ分子であって、温度感受性が、前記レプリカーゼのｎｓＰ４の１５３位におけるグリシン（Ｇｌｙ）を、グルタミン酸（Ｇｌｕ）で置換することによって、付与される、ＤＮＡ分子。
【請求項３】
ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子であって、ここで該ＲＮＡ分子は、以下：
（ａ）少なくとも１つのシス作用性配列エレメント、
（ｂ）非細胞変性、温度感受性のシンドビスウイルスレプリカーゼをコードする第１のオープンリーディングフレームであって、該非細胞変性は、該レプリカーゼの非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）の７２６位のプロリンを別の天然に存在するアミノ酸で置換により付与される、第１のオープンリーディングフレーム、および
（ｃ）以下からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列：
（ｉ）タンパク質またはその部分をコードする第２のオープンリーディングフレームであって、ここで該第２のオープンリーディングフレームが、１つ以上のＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象後に翻訳可能な形式である、第２のオープンリーディングフレーム；
（ｉｉ）（ｉ）の第２のオープンリーディングフレームの全てまたは一部に相補的な配列；および
（ｉｉｉ）翻訳されないＲＮＡ分子をコードする配列または該配列の相補配列、
を含み、
該（ｃ）の少なくとも１つのヌクレオチド配列が、該非細胞変性、温度感受性のシンドビスウイルスレプリカーゼによって認識されるプロモーターに作動可能に連結され、
ここで、非細胞変性が、該ｎｓＰ２の７２６位のプロリン（Ｐｒｏ）をセリン（Ｓｅｒ）で置換することによって、付与される、ＤＮＡ分子。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡ分子であって、温度感受性が、前記レプリカーゼの前記非構造タンパク質（ｎｓＰ４）における１以上の変異によって、付与される、ＤＮＡ分子。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡ分子であって、温度感受性が、前記レプリカーゼのｎｓＰ４の１５３位におけるグリシン（Ｇｌｙ）を、グルタミン酸（Ｇｌｕ）で置換することによって、付与される、ＤＮＡ分子。
【請求項６】
ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡベクター系であって、該ＲＮＡ分子は、以下：
（ａ）少なくとも１つのシス作用性配列エレメント
（ｂ）非細胞変性、温度感受性のシンドビスウイルスレプリカーゼをコードする第１のオープンリーディングフレームであって、該非細胞変性は、該レプリカーゼの非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）の７２６位のプロリンを別の天然に存在するアミノ酸で置換することにより付与される、第１のオープンリーディングフレーム、および
（ｃ）以下からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列：
（ｉ）タンパク質またはその部分をコードする第２のオープンリーディングフレームであって、ここで該第２のオープンリーディングフレームが、１つ以上のＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象後に、翻訳可能な形式である、第２のオープンリーディングフレーム；
（ｉｉ）（ｉ）の第２のオープンリーディングフレームの全てまたは一部に相補的な配列；および
（ｉｉｉ）翻訳されないＲＮＡ分子をコードする配列または該配列の相補配列、
を含み、
該（ｃ）の少なくとも１つのヌクレオチド配列が、該非細胞変性、温度感受性ＲＮＡ依存性のシンドビスウイルスレプリカーゼによって認識されるプロモーターに作動可能に連結され、
ここで、温度感受性が、前記レプリカーゼの前記非構造タンパク質（ｎｓＰ４）遺伝子における１以上の変異によって、付与される、ＤＮＡベクター系。
【請求項７】
請求項６に記載のＤＮＡベクター系であって、ここで、温度感受性が、前記レプリカーゼのｎｓＰ４の１５３位におけるグリシン（Ｇｌｙ）を、グルタミン酸（Ｇｌｕ）で置換することによって、付与される、ＤＮＡベクター系。
【請求項８】
ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡベクター系であって、該ＲＮＡ分子は、以下：
（ａ）少なくとも１つのシス作用性配列エレメント
（ｂ）非細胞変性、温度感受性のシンドビスウイルスレプリカーゼをコードする第１のオープンリーディングフレームであって、該非細胞変性は、該レプリカーゼの非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）の７２６位のプロリンを別の天然に存在するアミノ酸に置換することにより付与される、第１のオープンリーディングフレームであって、該非細胞変性は、該レプリカーゼの非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）の７２６位のプロリンを別の天然に存在するアミノ酸で置換により付与される、第１のオープンリーディングフレーム、および
（ｃ）以下からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列：
（ｉ）タンパク質またはその部分をコードする第２のオープンリーディングフレームであって、ここで該第２のオープンリーディングフレームが、１つ以上のＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象後に、翻訳可能な形式である、第２のオープンリーディングフレーム；
（ｉｉ）（ｉ）の第２のオープンリーディングフレームの全てまたは一部に相補的な配列；および
（ｉｉｉ）翻訳されないＲＮＡ分子をコードする配列または該配列の相補配列、
を含み、
該（ｃ）の少なくとも１つのヌクレオチド配列が、該非細胞変性、温度感受性のシンドビスウイルスレプリカーゼによって認識されるプロモーターに作動可能に連結される、
ＤＮＡベクター系であって、ここで、非細胞変性が、前記ｎｓＰ２の７２６位のプロリン（Ｐｒｏ）をセリン（Ｓｅｒ）に置換することによって、付与される、ＤＮＡベクター系。
【請求項９】
請求項８に記載のＤＮＡベクター系であって、ここで、温度感受性が、前記レプリカーゼの前記非構造タンパク質（ｎｓＰ４）遺伝子における１以上の変異によって、付与される、ＤＮＡベクター系。
【請求項１０】
請求項９に記載のＤＮＡベクター系であって、温度感受性が、前記レプリカーゼのｎｓＰ４の１５３位におけるグリシン（Ｇｌｙ）を、グルタミン酸（Ｇｌｕ）で置換することによって、付与される、ＤＮＡベクター。
【請求項１１】
ＲＮＡ分子を含む組成物であって、該ＲＮＡ分子は、以下：
（ａ）少なくとも１つのシス作用性配列エレメント、
（ｂ）アルファウイルスの非細胞変性、温度感受性シンドビスウイルスリプリカーゼをコードする第１のオープンリーディングフレーム、および
（ｃ）以下からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列：
（ｉ）タンパク質またはその部分をコードする第２のオープンリーディングフレームであって、ここで該第２のオープンリーディングフレームが、１つ以上のＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象後に、翻訳可能な形式である、第２のオープンリーディングフレーム；
（ｉｉ）（ｉ）の第２のオープンリーディングフレームの全てまたは一部に相補的な配列；および
（ｉｉｉ）翻訳されないＲＮＡ分子をコードする配列またはその相補配列、
を含む、組成物であって、ここで、（ｃ）の少なくとも１つのヌクレオチドが、非細胞変性温度感受性シンドビスウイルスリプリカーゼによって認識されるプロモーターに作動可能に連結し、温度感受性が、前記レプリカーゼの前記非構造タンパク質（ｎｓＰ４）遺伝子における１以上の変異によって、付与される、組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物であって、温度感受性が、前記レプリカーゼの非構造タンパク質４（ｎｓＰ４）の１５３位におけるグリシン（Ｇｌｙ）を、グルタミン酸（Ｇｌｕ）で置換することによって、付与される、組成物。
【請求項１３】
ＲＮＡ分子を含む組成物であって、該ＲＮＡ分子は、以下：
（ａ）少なくとも１つのシス作用性配列エレメント、
（ｂ）アルファウイルスの非細胞変性、温度感受性シンドビスウイルスリプリカーゼをコードする第１のオープンリーディングフレーム、および
（ｃ）以下からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列：
（ｉ）タンパク質またはその部分をコードする第２のオープンリーディングフレームであって、ここで該第２のオープンリーディングフレームが、１つ以上のＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象後に、翻訳可能な形式である、第２のオープンリーディングフレーム；
（ｉｉ）（ｉ）の第２のオープンリーディングフレームの全てまたは一部に相補的な配列；および
（ｉｉｉ）翻訳されないＲＮＡ分子をコードする配列またはその相補配列、
を含む、組成物であって、ここで、（ｃ）の少なくとも１つのヌクレオチドが、非細胞変性温度感受性シンドビスウイルスリプリカーゼによって認識されるプロモーターに作動可能に連結し、非細胞変性が、該ｎｓＰ２の７２６位のプロリン（Ｐｒｏ）をセリン（Ｓｅｒ）で置換することによって、付与される、組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組成物であって、ここで、温度感受性は、前記レプリカーゼの前記非構造タンパク質（ｎｓＰ４）遺伝子における１以上の変異によって、付与される、組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組成物であって、ここで、温度感受性は、温度感受性が、前記レプリカーゼのｎｓＰ４の１５３位におけるグリシン（Ｇｌｙ）を、グルタミン酸（Ｇｌｕ）で置換することによって、付与される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、真核生物細胞中での遺伝子発現の強固な制御を可能にする新規な発現ベクターに関する。本発明はまた、タンパク質およびＲＮＡ分子を生成する方法、ならびにタンパク質およびＲＮＡ分子を植物または動物に投与する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連分野）
動物またはヒト細胞中で導入された遺伝子、あるいは生物全体中の遺伝子の発現を正確に制御する能力は、生物学および医学の多くの領域での進歩を可能にする。例えば、遺伝子発現の意図的な操作を可能にする方法は、その発現が構成的に許容され得ない遺伝子、または発生の特定の段階の遺伝子の分析を容易にする。これらの方法はまた、遺伝子治療のような臨床的適用にとって貴重である。このような臨床的適用においては、治療用遺伝子の発現は、患者の必要性に従って調節されなければならない。
【０００３】
広範に有益であるために、遺伝子調節技術は、遺伝子活性の迅速で、強固で、正確、かつ可逆的な誘導を可能にしなければならない。Ｓａｅｚ，Ｅ．ら（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：６０８〜６１６（１９９７））に概説されたように、理想の系は、以下の要件を満たすべきである：
１．特異性−この系は、内因性因子に対して無作用であり、かつ外因性刺激によってのみ活性化されなければならない。
【０００４】
２．非干渉性−この系の構成成分は、意図しない細胞経路に影響すべきではない。
【０００５】
３．誘導可能性−不活性状態において、この系の基底活性は最小であるべきであるが、活性状態においては、高レベルの遺伝子発現は迅速に誘導可能であるべきである。
【０００６】
４．誘導物質のバイオアベイラビリティ−誘導刺激は、目的の部位へ迅速に浸透するべきである。
【０００７】
５．可逆性−誘導刺激は、この系が迅速に不活性状態に戻ることができるように、迅速になくなるべきである。
【０００８】
動物における遺伝子発現を制御する初期の方法は、内因性エレメント（例えば、サイトカイン応答エレメントまたは熱ショックタンパク質）に基づいていた。非誘導状態での高レベルの基底発現および一般的誘導物質により引き起こされた多面発現性効果に起因して、これらの系は、哺乳動物細胞および生物中での遺伝子を調節するのに必要な特性を欠いていた。
【０００９】
より進歩的機構は、非哺乳動物エレメントに依存する変換機構を構築することによってこれらの問題を回避しようと努めてきた。これらの系の基本的原則は、合成転写因子の活性を改変する低分子（誘導物質）の存在に基づいており、この合成転写因子は、異種プロモーターを介して標的遺伝子の発現を調節する。特異性の増加は、哺乳動物の生理学に影響しない誘導物質を選択すること、および内因性哺乳動物プロモーターと相互作用しないキメラトランスアクチベーター（天然の転写因子と最小の相同性である）を組み立てることによって達成される。
【００１０】
遺伝子発現の調節のために現在使用される最も一般的系は、テトラサイクリンベースの系（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７（１９９２））である。この系は、融合タンパク質の連続発現に基づいており、この融合タンパク質中では、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）が、ＶＰ１６タンパク質の転写活性ドメインへとの融合によって、アクチベーターへと変換されている。テトラサイクリンの非存在下では、このキメラテトラサイクリントランスアクチベーター（ｔＴＡ）が、最小プロモーターの上流に位置する天然のｔｅｔＲ結合部位（ｔｅｔＯ）のマルチマーに結合することを介して遺伝子発現を活性化する。テトラサイクリンの存在下では、このｔＴＡは、ｔｅｔＯ部位に結合することを妨げる高次構造の変化を受け、それにより標的遺伝子の発現を阻止する。既存のアプローチを超えるその有意な利点が原因で、このｔＴＡ系は、誘導性遺伝子発現に非常に有用であり、そしてこの系は、多くのタンパク質の産生に首尾良く使用されてきた（Ｗｉｍｍｅｌら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：９９５（１９９４）；Ｆｒｕｅｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３２３６（１９９４）；Ｙｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：４５３０（１９９６））。
【００１１】
しかし、ｔＴＡタンパク質の毒性から生じる深刻な問題が、このｔＴＡ系について報告されており、そしていくつかの細胞型は、このｔＴＡタンパク質の発現を許容し得ないことが示されている（Ｓｃｈｏｃｋｅｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６５２２（１９９５）；Ｈｏｗｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：１４１６８（１９９５）；ＳｃｈｏｃｋｅｔおよびＳｃｈａｔｚ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：５１７３（１９９６）；Ｂｏｈｌら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：２９９（１９９７））。培養細胞中のｔＴＡの毒性は、適切なテトラサイクリン調節を有する安定なクローンの確立を妨げるが、このｔＴＡ毒性は遺伝子治療においてより重要な問題であり、そして遺伝子治療におけるこのｔＴＡ系の使用も全く妨げ得る。
【００１２】
このｔＴＡ系のさらなる問題は、その顕著な基底発現である。基底発現は、結合されるトランスアクチベーターの非存在下でのレポーター構築物の活性化、および／またはテトラサイクリンが完全にｔＴＡトランスアクチベーションを抑制し得ないことより生じ得る。高い基底発現は、この系の誘導性を制限し、そして非常に毒性なタンパク質を用いる実験の伝導力（ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ）を妨げる（Ｆｕｒｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９３０２（１９９４）；Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４６３（１９９５）、Ｋｉｓｔｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１０９３３（１９９６）；Ｈｏｆｆｍａｎｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：１０７８（１９９７））。
【００１３】
安定なクローンおよびトランスジェニック動物の場合、この基底発現のいくらかは、外来ＤＮＡが組み込む染色体領域からの干渉に帰因され得る。全ての誘導系が等しく組み込み効果に感受性ではないが、このｔＴＡ系の基底活性が、この系が転写を効率的に抑制するために、テトラサイクリンの一定の存在（常には、特にインビボでは達成し得ない）を必要とするという事実に帰因することは可能である。基底発現、ならびにテトラサイクリンが遺伝子発現を抑制するために存在するという要件が、このｔＴＡ系が遺伝子治療に使用されない理由である。
【００１４】
哺乳動物ステロイドホルモンレセプターの構成成分に基づく２つの遺伝子制御系が公知である（Ｓａｅｚ，Ｅ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：６０８〜６１６（１９９７））。両方とも、短縮型のプロゲステロンレセプターホルモン結合ドメインを酵母ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合部分、およびＶＰ１６タンパク質のトランスアクチベーションドメインと組合せている。この変異型プロゲステロンレセプター部分は、プロゲステロンと結合しないが、プロゲステロンおよびグルココルチコイドアンタゴニストミフェプリストン（ＲＵ４８６）と結合する能力を保持し、その結果、ＲＵ４８６の存在下で、この融合タンパク質（ＧＶＬＰまたはＴＡＸＩと呼ばれる）は、最小プロモーターの上流に位置するＧＡＬ４  ＤＮＡ結合部位のマルチマーを介して転写を活性化する。
【００１５】
直前に記載されたこれらの系の重要な利点は、これらが、テトラサイクリンアプローチよりも都合の良い動態学を有しているらしいことである。なぜなら、脂肪親和性ホルモンは、迅速に代謝され、かつインビボで短い半減期を有するからである。さらに、このようなホルモンはまた、テトラサイクリンよりも効率良く、接近しがたい組織に浸透し得る。しかし、これらのホルモンレセプター系の主要な不利は、その非常に高レベルの基底発現である。種々の細胞型の一過性かつ安定なトランスフェクションにおいて、高レベルの基底活性は、これらのアプローチの誘導性を低下させ、約２０倍をほとんど超えない誘導比を生じる（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８１８０（１９９４）；Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、Ｃｅｌｌ  ８３：８３５（１９９５）；Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２３９（１９９７））。
【００１６】
遺伝子発現を調節する別のアプローチは、免疫抑制剤の作用機構についての研究から派生した、タンパク質２量体化を誘導する方法に依存している（Ｓａｅｚ，Ｅ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：６０８〜６１６（１９９７））。ＦＫ５０６の合成ホモダイマーを使用して、任意の２つのペプチドに、ＦＫ５０６が結合するＦＫＢＰ１２のドメインを単に付与することによって、結合させる一般的ストラテジーが考案された。免疫抑制剤（例えば、シクロスポリンＡまたはラパマイシン）がこのアプローチにおいて使用されなければならないので、このタンパク質２量体化アプローチのインビボ適用は、非常に制限される。
【００１７】
上記の全てのストラテジーは、ｍＲＮＡの転写レベルを制御することにより発現を調節する。このｍＲＮＡ転写機構は、常に外来ＤＮＡが挿入される染色体領域によってある程度影響されるので、この組み込み機構を超える制御の欠失によって正確な調節は失敗する。相同組換えによるＤＮＡの部位特異的挿入のための技術は利用可能であるが、挿入頻度があまりにも低く、このストラテジーが一般的根拠に基づく遺伝子治療に成功することを不可能にする。
【００１８】
別の遺伝子発現系は、アルファウイルスに基づく（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５７８〜５８２（１９９７））。アルファウイルスファミリーのいくつかのメンバーである、シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）（Ｘｉｏｎｇ  Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１１８８〜１１９１（１９８９）：Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｓ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１８〜２２（１９９３））、ＳＦＶ（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．およびＧａｒｏｆｆ，Ｈ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３５６〜１３６１（１９９１））ならびにその他（Ｄａｖｉｓ，Ｎ．Ｌ．らＶｉｒｏｌｏｇｙ  １７１：１８９〜２０４（１９８９））は、種々の異なるタンパク質のためのウイルスべースの発現ベクターとしての使用について、かなりの注目を受けている（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５７８〜５８２（１９９７）；Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４９５〜５００（１９９４））。
【００１９】
アルファウイルスは、（＋）鎖ＲＮＡウイルスであり、感染された細胞の細胞質中完全に、かつＤＮＡ中間体を伴わずにそのゲノムＲＮＡを複製する（Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｊ．およびＳｔｒａｕｓｓ，Ｅ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１〜５６２（１９９４））。アルファウイルスが発現ベクターとして開発され得るという考えは、１０年ほど前に最初に確立された（Ｘｉｏｎｇ，Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１１８８〜１１９１（１９８９））。それ以来、いくつかの改良により、発現ベクターとしてのこれらのＲＮＡレプリコンの使用がより実用的になってきた（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５７８〜５８２（１９９７））。
【００２０】
シンドビス（Ｈｅｒｗｅｉｊｅｒ，Ｈ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ６：１４９５〜１５０１（１９９５）；Ｄｕｂｅｎｓｋｙ、Ｔ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８〜５１９（１９９６））およびＳＦＶ（Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，Ｐ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１３０〜１３４８１９９６））の両方についてのＤＮＡベクターが開発されてきた。真核生物プロモーターが、アルファウイルスレプリカ−ゼ遺伝子（４つの非構造タンパク質遺伝子（ｎｓＰ１〜４）からなる）から上流のこれらのベクター中に導入される。アルファウイルスレプリカ−ゼ遺伝子は、１つまたは２つのポリプロテインとして翻訳され、次いでタンパク質分解により切断される（Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｊ．およびＳｔｒａｕｓｓ，Ｅ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１〜５６２（１９９４））。ＤＮＡは、核において組換え真核生物プロモーターからＲＮＡへと転写され、そして細胞質に輸送され、ここでレプリカ−ゼが、アルファウイルスＲＮＡ分子の通常の複製の間と同様に、アルファウイルスＲＮＡ分子の複製を触媒する（Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｊ．およびＳｔｒａｕｓｓ，Ｅ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１〜５６２（１９９４））。最近まで、異種配列の一過性発現のみしか、アルファウイルスレプリカ−ゼの細胞変性性に起因して可能でなかった（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５７８〜５８２（１９９７））。
【００２１】
約２０年前、Ｗｅｉｓｓら（Ｗｅｉｓｓ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３３：４６３〜４７４（１９８０））が、ＢＨＫ細胞の一貫して感染された培養を確立した。この表現型の原因である変異が、最近同定された（Ｄｒｙｇａ，Ｓ．Ａ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２８：７４〜８３（１９９７）。温度変化を介するｍＲＮＡ転写の調節を可能にする別の変異が、ＢｕｒｇｅおよびＰｆｅｆｆｅｒｋｏｒｎにより同定され（Ｂｕｒｇｅ，Ｂ．Ｗ．およびＰｆｅｆｆｅｒｋｏｒｎ，Ｅ．Ｒ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３０：２０３〜２１４（１９６６））、そしてＸｉｏｎｇらによってより詳細に記載された（Ｘｉｏｎｇ，Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４３：１１８８〜１１９１（１９８９））。
【００２２】
ＤＮＡ免疫（Ｈａｒｉｈａｒａｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９５０〜９５８（１９８８））、リボザイム発現（Ｓｍｉｔｈ  Ｓ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９７１３〜９７２１（１９９７））、および哺乳動物組織における異種タンパク質のインビボ発現における使用についての見込みを示すアルファウイルス配列を含むベクターが開発されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
（項目１）  ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子であって、ここで該ＲＮＡ分子は、以下：
（ａ）少なくとも１つのシス作用性配列エレメント、
（ｂ）非細胞変性、温度感受性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を有する第１のオープンリーディングフレーム、および
（ｃ）以下からなる群から選択される少なくとも１つの第２のヌクレオチド配列：
（ｉ）タンパク質またはその部分をコードする第２のオープンリーディングフレームであって、ここで該第２のオープンリーディングフレームが、１つ以上のＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象後に翻訳可能な形式である、第２のオープンリーディングフレーム；
（ｉｉ）（ｉ）の第２のオープンリーディングフレームの全てまたは一部に相補的な配列；および
（ｉｉｉ）翻訳されないＲＮＡ分子またはその相補体をコードする配列、を含む、ＤＮＡ分子。
（項目２）  前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがウイルス起源である、項目１に記載のＤＮＡ分子。
（項目３）  前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがアルファウイルス起源である、項目１に記載のＤＮＡ分子。
（項目４）  ３４℃以下でレプリカーゼ活性を有するか、または３４℃以上で検出可能なレプリカーゼ活性を有さないＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする、項目１に記載のＤＮＡ分子。
（項目５）  項目１（ｃ）（ｉ）に記載の第２のオープンリーディングフレームが、サイトカイン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、毒性タンパク質、プロドラッグ転換酵素、または他のタンパク質をコードする、項目１に記載のＤＮＡ分子。
（項目６）  項目１（ｃ）（ｉ）に記載の第２のオープンリーディングフレームが、ヒトエリスロポエチンまたはヒトβインターフェロンをコードする、項目１に記載のＤＮＡ分子。
（項目７）  項目１（ｃ）（ｉｉ）または１（ｃ）（ｉｉｉ）に記載の第２のヌクレオチド配列が、アンチセンスＲＮＡ分子、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、リボザイムからなる群から選択される翻訳されないＲＮＡ分子をコードする、項目１に記載のＤＮＡ分子。
（項目８）  宿主細胞に項目１に記載のＤＮＡ分子を導入する工程を包含する、組換え宿主細胞の作製方法。
（項目９）  項目８に記載の方法により作製される組換え宿主細胞を含む、インビトロ細胞培養物。
（項目１０）  項目１に記載のＤＮＡ分子を含む組換え宿主細胞を含む、インビトロ細胞培養物。
（項目１１）  項目１に記載のＤＮＡ分子のいくつかのＤＮＡ配列またはすべてのＤＮＡ配列が前記宿主細胞に安定に維持される、項目１０に記載の細胞培養物。
（項目１２）  項目１に記載のＤＮＡ分子から転写される、ＲＮＡ分子。
（項目１３）  項目１２に記載のＲＮＡ分子を含む、アルファウイルス粒子。
（項目１４）  項目１２に記載のＲＮＡ分子を含む、組換え宿主細胞を含む、インビトロ細胞培養物。
（項目１５）  配列番号１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
（項目１６）  組換え宿主細胞においてタンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子を産生するための方法であって、以下：
（ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程；
（ｂ）少なくとも１つの項目１に記載のＤＮＡ分子を該宿主細胞に導入する工程；および
（ｃ）該タンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子を回収する工程、
を包含する、方法。
（項目１７）  組換え宿主細胞においてタンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子を産生するための方法であって、以下：
（ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程；
（ｂ）少なくとも１つの項目１２に記載のＲＮＡ分子を該宿主細胞に導入する工程；および
（ｃ）該タンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子を回収する工程、
を包含する、方法。
（項目１８）  前記タンパク質がエリスロポエチンである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）  前記ＲＮＡがアルファウイルス粒子にパッケージされる、項目１７に記載の方法。
（項目２０）  項目１２に記載のＲＮＡ分子を含むアルファウイルス粒子を産生するための方法であって、以下：
（ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程；
（ｂ）アルファウイルス構造タンパク質をコードする１つ以上のオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つの項目１に記載のＤＮＡ分子を該宿主細胞に導入する工程；および
（ｃ）該アルファウイルス粒子を回収する工程、
を包含する、方法。
（項目２１）  組換え宿主細胞においてタンパク質を産生するための方法であって、以下：
（ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程；
（ｂ）項目２０に記載の方法により産生されるアルファウイルス粒子を該宿主細胞に感染させる工程；および
（ｃ）該タンパク質を回収する工程、
を包含する、方法。
（項目２２）  前記タンパク質がエリスロポエチンである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）  組換え宿主細胞においてタンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子の発現を調節するための方法であって、以下：
（ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程；
（ｂ）少なくとも１つの項目１に記載のＤＮＡ分子を該宿主細胞に導入する工程；および
（ｃ）（ｉ）該宿主細胞培養の温度を許容温度から制限的温度へ変化させる工程、または
（ｉｉ）該宿主細胞培養の温度を制限的温度から許容温度へ変化させる工程、
を包含する、方法。
（項目２４）  組換え宿主細胞においてタンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子の発現を調節するための方法であって、以下：
（ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程；
（ｂ）少なくとも１つの項目１２に記載のＲＮＡ分子を該宿主細胞に導入する工程；および
（ｃ）（ｉ）該宿主細胞培養の温度を許容温度から制限的温度へ変化させる工程、または
（ｉｉ）該宿主細胞培養の温度を制限的温度から許容温度へ変化させる工程、
を包含する、方法。
（項目２５）  個体においてタンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子の発現を調節するための方法であって、以下：
（ａ）少なくとも１つの項目１に記載のＤＮＡ分子を該個体に投与する工程；および
（ｂ）（ｉ）該個体の少なくとも一部の温度を許容温度から制限的温度へ変化させる工程、または
（ｉｉ）該個体の少なくとも一部の温度を制限的温度から許容温度へ変化させる工程、
を包含する、方法。
（項目２６）  個体においてタンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子の発現を調節するための方法であって、以下：
（ａ）少なくとも１つの項目１２に記載のＲＮＡ分子を該個体に投与する工程；および
（ｂ）（ｉ）該個体の少なくとも一部の温度を許容温度から制限的温度へ変化させる工程、または
（ｉｉ）該個体の少なくとも一部の温度を制限的温度から許容温度へ変化させる工程、
を包含する、方法。
（項目２７）  前記個体がヒトである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）  個体においてタンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子の発現を調節するための方法であって、以下：
（ａ）項目１に記載の少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む組換え宿主細胞を該個体に投与する工程；および
（ｂ）（ｉ）該個体の少なくとも一部の温度を許容温度から制限的温度へ変化させる工程、または
（ｉｉ）該個体の少なくとも一部の温度を制限的温度から許容温度へ変化させる工程、
を包含する、方法。
（項目２９）  前記組換え宿主細胞が、該宿主細胞が投与される同じ個体から得られる、項目２８に記載の方法。
（項目３０）  前記組換え宿主細胞が、ケラチノサイト、上皮細胞または線維芽細胞である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）  前記個体がヒトである、項目２８に記載の方法。
（項目３２）  少なくとも１つの項目１に記載のＤＮＡ分子および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目３３）  少なくとも１つの項目１２に記載のＲＮＡ分子および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目３４）  少なくとも１つの項目１３に記載のアルファウイルス粒子および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目３５）  少なくとも１つの項目１に記載のＤＮＡ分子を含む宿主細胞を有する遺伝的に操作された非ヒト動物。
（項目３６）  前記ＤＮＡ分子が前記宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれている、項目３５に記載の動物。
（項目３７）  少なくとも１つの項目１２に記載のＲＮＡ分子を含む宿主細胞を有する、遺伝的に操作された非ヒト動物。
（項目３８）  ＲＮＡ分子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むＤＮＡベクター系であって、該ＲＮＡ分子は、以下：
（ａ）少なくとも１つのシス作用性配列エレメント
（ｂ）非細胞変性、温度感受性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を有する第１のオープンリーディングフレーム、および
（ｃ）以下からなる群から選択される少なくとも１つの第２のヌクレオチド配列：
（ｉ）タンパク質またはその部分をコードする第２のオープンリーディングフレームであって、ここで該第２のオープンリーディングフレームが、１つ以上のＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象後に、翻訳可能な形式である、第２のオープンリーディングフレーム；
（ｉｉ）（ｉ）の第２のオープンリーディングフレームの全てまたは一部に相補的な配列；および
（ｉｉｉ）翻訳されないＲＮＡ分子またはその相補体をコードする配列、
を含む、ＤＮＡベクター系。
（項目３９）  前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがウイルス起源である、項目３８に記載のＤＮＡベクター系。
（項目４０）  前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがアルファウイルス起源である、項目３８に記載のＤＮＡベクター系。
（項目４１）  ３４℃以下の温度でレプリカーゼ活性を有するか、または３４℃以上で検出可能なレプリカーゼ活性を有さないＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする、項目３８に記載のＤＮＡベクター系。
（項目４２）  項目１（ｃ）（ｉ）に記載の第２のオープンリーディングフレームが、サイトカイン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、毒性タンパク質、プロドラッグ転換酵素、または他のタンパク質をコードする、項目３８に記載のＤＮＡベクター系。
（項目４３）  項目１（ｃ）（ｉ）に記載の第２のオープンリーディングフレームが、ヒトエリスロポエチンまたはヒトβインターフェロンをコードする、項目３８に記載のＤＮＡベクター系。
（項目４４）  項目１（ｃ）（ｉｉ）または１（ｃ）（ｉｉｉ）に記載の第２のヌクレオチド配列が、アンチセンスＲＮＡ分子、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、リボザイムからなる群から選択される翻訳されないＲＮＡ分子をコードする、項目３８に記載のＤＮＡベクター系。
（項目４５）  少なくとも１つの項目３８に記載のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する工程を包含する、組換え宿主細胞の作製方法。
（項目４６）  項目４５に記載の方法により作製された組換え宿主細胞を含む、インビトロ細胞培養物。
（項目４７）  少なくとも１つの項目３８に記載のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を含む、インビトロ細胞培養物。
（項目４８）  項目３８に記載のいくつかのポリヌクレオチド配列またはすべてのポリヌクレオチド配列が前記宿主細胞に安定に維持される、項目４７に記載の細胞培養物。
（項目４９）  項目３８に記載のベクター系の１つ以上のポリヌクレオチドから転写される、１つ以上のＲＮＡ分子を含む組成物。
（項目５０）  少なくとも１つの項目４９に記載のＲＮＡ分子を含む、アルファウイルス粒子。
（項目５１）  少なくとも１つの項目４９に記載のＲＮＡ分子を含む組換え宿主細胞を含む、インビトロ細胞培養物。
（項目５２）  組換え宿主細胞においてタンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子を産生するための方法であって、以下：
（ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程；
（ｂ）少なくとも１つの項目３８に記載のポリヌクレオチドを該宿主細胞に導入する工程；および
（ｃ）該タンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子を回収する工程、
を包含する、方法。
（項目５３）  組換え宿主細胞においてタンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子を産生するための方法であって、以下：
（ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程；
（ｂ）少なくとも１つの項目４９に記載のＲＮＡ分子を該宿主細胞に導入する工程；および
（ｃ）該タンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子を回収する工程、
を包含する、方法。
（項目５４）  前記タンパク質がエリスロポエチンである、項目５３に記載の方法。
（項目５５）  前記ＲＮＡがアルファウイルス粒子にパッケージされる、項目５３に記載の方法。
（項目５６）  項目５０に記載のＲＮＡ分子を含むアルファウイルス粒子を産生するための方法であって、以下：
（ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程；
（ｂ）アルファウイルス構造タンパク質をコードする１つ以上のオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つの項目３８に記載のポリヌクレオチドを該宿主細胞に導入する工程；および
（ｃ）該アルファウイルス粒子を回収する工程、
を包含する、方法。
（項目５７）  組換え宿主細胞においてタンパク質を産生するための方法であって、以下：
（ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程；
（ｂ）項目５６に記載の方法により産生されるアルファウイルス粒子を該宿主細胞に感染させる工程；および
（ｃ）該タンパク質を回収する工程、
を包含する、方法。
（項目５８）  前記タンパク質がエリスロポエチンである、項目５７に記載の方法。
（項目５９）  組換え宿主細胞においてタンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子の発現を調節するための方法であって、以下：
（ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程；
（ｂ）少なくとも１つの項目３８に記載のポリヌクレオチドを該宿主細胞に導入する工程；および
（ｃ）（ｉ）該宿主細胞培養の温度を許容温度から制限的温度へ変化させる工程、または
（ｉｉ）該宿主細胞培養の温度を制限的温度から許容温度へ変化させる工程、
を包含する、方法。
（項目６０）  組換え宿主細胞においてタンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子の発現を調節するための方法であって、以下：
（ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程；
（ｂ）少なくとも１つの項目４９に記載のＲＮＡ分子を該宿主細胞に導入する工程；および
（ｃ）（ｉ）該宿主細胞培養の温度を許容温度から制限的温度へ変化させる工程、または
（ｉｉ）該宿主細胞培養の温度を制限的温度から許容温度へ変化させる工程、
を包含する、方法。
（項目６１）  個体においてタンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子の発現を調節するための方法であって、以下：
（ａ）少なくとも１つの項目３８に記載のポリヌクレオチドを該個体に投与する工程；および
（ｂ）（ｉ）該個体の少なくとも一部の温度を許容温度から制限的温度へ変化させる工程、または
（ｉｉ）該個体の少なくとも一部の温度を制限的温度から許容温度へ変化させる工程、
を包含する、方法。
（項目６２）  個体においてタンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子の発現を調節するための方法であって、以下：
（ａ）少なくとも１つの項目４９に記載のＲＮＡ分子を該個体に投与する工程；および
（ｂ）（ｉ）該個体の少なくとも一部の温度を許容温度から制限的温度へ変化させる工程、または
（ｉｉ）該個体の少なくとも一部の温度を制限的温度から許容温度へ変化させる工程、
を包含する、方法。
（項目６３）  前記個体がヒトである、項目６２に記載の方法。
（項目６４）  個体においてタンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子の発現を調節するための方法であって、以下：
（ａ）少なくとも１つの項目３８に記載のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を該個体に投与する工程；および
（ｂ）（ｉ）該個体の少なくとも一部の温度を許容温度から制限的温度へ変化させる工程、または
（ｉｉ）該個体の少なくとも一部の温度を制限的温度から許容温度へ変化させる工程、
を包含する、方法。
（項目６５）  前記組換え宿主細胞は、該宿主細胞が投与される同じ個体から得られる、項目６４に記載の方法。
（項目６６）  前記組換え宿主細胞が、ケラチノサイト、上皮細胞または線維芽細胞である、項目６５に記載の方法。
（項目６７）  前記個体がヒトである、項目６４に記載の方法。
（項目６８）  少なくとも１つの項目３８に記載のポリヌクレオチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目６９）  少なくとも１つの項目４９に記載のＲＮＡ分子および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目７０）  少なくとも１つの項目５０に記載のアルファウイルス粒子および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目７１）  少なくとも１つの項目３８に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を有する、遺伝的に操作された非ヒト動物。
（項目７２）  前記ポリヌクレオチドが前記宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれている、項目７１に記載の動物。
（項目７３）  少なくとも１つの項目４９に記載のＲＮＡを含む宿主細胞を有する、遺伝的に操作された非ヒト動物。
（項目７４）  １つ以上のＲＮＡ分子を含む組成物であって、該ＲＮＡ分子は、以下：
（ａ）少なくとも１つのシス作用性配列エレメント、
（ｂ）非細胞変性、温度感受性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を有する第１のオープンリーディングフレーム、および
（ｃ）以下からなる群から選択される少なくとも１つの第２のヌクレオチド配列：
（ｉ）タンパク質またはその部分をコードする第２のオープンリーディングフレームであって、ここで該第２のオープンリーディングフレームが、１つ以上のＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象後に、翻訳可能な形式である、オープンリーディングフレーム；
（ｉｉ）（ｉ）の第２のオープンリーディングフレームの全てまたは一部に相補的な配列；および
（ｉｉｉ）翻訳されないＲＮＡ分子またはその相補体をコードする配列、
を含む、組成物。
【００２４】
（発明の要旨）
本発明は、組換え宿主細胞中における、タンパク質または非翻訳ＲＮＡ分子のの調節された発現のための組成物および方法を提供する。より詳細には、本発明は、安定にトランスフェクトされた組換え宿主細胞中で生成される特定のＲＮＡ分子の量の正確な調節を可能にする、ポリヌクレオチドおよび方法を提供する。この正確な調節は、温度感受性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（すなわち、レプリカ−ゼ）の使用によって生じる。このＲＮＡポリメラーゼは、許容温度でＲＮＡ分子のみを複製して、新しいＲＮＡ分子を形成する。
【００２５】
１つの一般的局面において、本発明のＤＮＡ発現ベクターは、インビボで転写を開始し得る５’プロモーター、ＲＮＡ分子の複製を可能にする５’および／または３’配列（シス作用配列エレメント）、および目的の遺伝子の５’側にサブゲノムプロモーター、ならびに1つ以上のＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象の後のみ翻訳可能な目的の配列を含む。これらのＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象は、調節可能なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって触媒される。このポリメラーゼは、このＤＡＮベクターの転写によって生成される同じｍＲＮＡ分子によってか、または異なるＲＮＡ分子によってコードされ得る。
【００２６】
別の局面において、本発明は、以下を含むＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子を提供する：（ａ）少なくとも１つのシス作用配列エレメント、（ｂ）非細胞障害性の、温度感受性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を有する第１のオープンリーディングフレーム、ならびに（ｃ）以下の１つをコードする、少なくとも１つの第２のヌクレオチド配列：
（ｉ）タンパク質またはその一部をコードする第２のオープンリーディングフレームであって、この第２のオープンリーディングフレームは、１つ以上のＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象の後に翻訳可能な様式である、第２のオープンリーディングフレーム；
（ｉｉ）（ｉ）の第２のオープンリーディングフレームの全てまたは一部に相補的な配列；ならびに
（ｉｉｉ）非翻訳ＲＮＡ分子（例えば、アンチセンスＲＮＡ分子、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、またはリボザイム）をコードする配列、またはその相補体。
【００２７】
本発明は、さらに、上記の第２のヌクレオチド配列を発現する、単一ベクター系または複数ベクター系を提供する。単一ベクター系において、第１のオープンリーディングフレームをコードする配列および第２のヌクレオチド配列は、同一の核酸分子上に存在する。複数ベクター系において、第１のオープンリーディングフレームもしくはその小部分をコードする配列、および第２のヌクレオチド配列は、1つ以上の別々の核酸分子上に存在する。
【００２８】
第１および第２のオープンリーディングフレームをコードする配列が、同一核酸分子上か同一ベクター（すなわち、単一ベクター系）中のいずれかに存在する場合、このオープンリーディングフレームの翻訳を阻害する領域は、第２のオープンリーディングフレームの５’側に存在する。
【００２９】
温度感受性レプリカ−ゼは、「低温（ｃｏｌｄ）」感受性または「高温（ｈｏｔ）」感受性であり得、これにより制限温度より上か下のいずれかの温度でのみ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製を効率的に触媒する。１つの実施態様において、本発明のＤＮＡ分子は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードし、このポリメラーゼは、３４℃より下の温度でレプリカ−ゼ活性を有し、そして３４℃以上の温度では低いレプリカーゼ活性または検出不可能なレプリカ−ゼ活性を有さない。
【００３０】
本発明のＤＮＡ分子のＲＮＡ転写産物、および本発明のパッケージングされたＲＮＡ分子を含むアルファウイルス粒子が、さらに提供される。パッケージングされたＲＮＡ分子が生成される場合、第２のオープンリーディングフレームは、このようなパッケージングに必要な１つ以上のタンパク質（例えば、シンドビス構造タンパク質）をコードし得る。
【００３１】
別の局面において、本発明の核酸分子は、１つ以上のサイトカイン、リンフォカイン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、毒性タンパク質、プロドラッグ転換酵素、または他のタンパク質をコードする。
【００３２】
なお別の局面において、本発明の核酸分子は、非翻訳ＲＮＡ分子（例えば、アンチセンスＲＮＡ分子、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、またはリボザイム）をコードする。
【００３３】
本発明はまた、組換え宿主細胞を作製する方法もまた提供し、この方法は、宿主細胞に本発明の核酸分子を導入する工程を包含する。本発明の核酸分子の導入によって作製される組換え宿主細胞が、さらに提供される。１つの実施態様において、これらの組換え宿主細胞のいくつかまたはすべては、安定に維持される１つ以上の本発明のＤＮＡ分子を含む。
【００３４】
本発明はさらに、配列番号１のｐＣＹＴｔｓベクター、ならびに配列番号１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。
【００３５】
本発明はまた、組換え宿主細胞中でタンパク質および非翻訳ＲＮＡ分子を生成する方法を提供し、この方法は、適切な培養条件下で宿主細胞を増殖させる工程、宿主細胞に本発明の核酸分子を導入する工程、およびこの組換え宿主細胞により生成されたタンパク質または非翻訳ＲＮＡ分子を回収する工程を包含する。
【００３６】
異種ポリペプチド（サイトカイン、リンフォカイン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、毒性タンパク質、プロドラッグ転換酵素を含む）の調節された発現のための方法もまた提供される。
【００３７】
本発明の方法により生成されるタンパク質および非翻訳ＲＮＡ分子が、さらに提供される。
【００３８】
本発明は、組換え宿主細胞中での異種タンパク質の発現を調節する方法もまた提供し、この方法は、適切な培養条件下で宿主細胞を増殖させる工程、この宿主細胞に本発明の核酸分子を導入する工程、および宿主細胞培養の温度を、許容可能な温度から制限的温度へか、または制限的温度から許容温度へのいずれかに変化させる工程を包含する。１つの実施態様において、本発明の核酸分子は、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞へ導入され、次いで、これらの細胞は、インビトロで培養される。関連する実施態様において、これらの宿主細胞は、無血清培地またはタンパク質のない培地中で培養される。
【００３９】
組換え宿主細胞中でタンパク質を生成する方法もさらに提供され、この方法は、適切な培養条件下で宿主細胞を増殖させる工程、この宿主細胞を、本発明のＲＮＡ分子を含むアルファウイルス粒子で感染させる工程、およびタンパク質を回収する工程を包含する。
【００４０】
個体内で、組換え宿主細胞中の本発明の核酸分子の導入および発現のための方法もまた提供される。これらの組換え宿主細胞が、個体中でポリペプチドまたは非翻訳ＲＮＡ配列を発現することが意図される場合、本発明の核酸分子は、インビボまたはエキソビボのいずれかで宿主細胞中へ導入され得る。この核酸分子がエキソビボで宿主細胞中へ導入される場合、この組換え宿主細胞は、それらが得られた個体へ投与されるか、または異なる個体へ投与されるかのいずれかであり得る。特定の実施態様において、この宿主細胞は哺乳動物ケラチノサイト、上皮細胞、または線維芽細胞であり、これらはこれらが得られたのと同じ哺乳動物へ再導入される。
【００４１】
本発明は、個体中でのタンパク質または非翻訳ＲＮＡ分子の発現を調節する方法をさらに提供し、この方法は、個体に本発明の核酸分子を投与する工程、およびこれらの個体の少なくとも一部の温度を、許容温度から制限的温度へか、または制限的温度から許容温度へのいずれかに変化させる工程を包含する。
【００４２】
本発明はまた、個体にタンパク質または非翻訳ＲＮＡ分子を投与する方法を提供し、この方法は、個体に本発明の核酸分子を投与する工程、およびこれらの個体の少なくとも一部の温度を、制限的温度から許容温度へ変化させる工程を包含する。
【００４３】
本発明はさらに、個体において、タンパク質または非翻訳ＲＮＡ分子の発現を調節する方法を提供し、この方法は、これらの個体に本発明の組換え宿主細胞を投与する工程、およびこれらの個体の少なくとも一部の温度を、許容温度から制限的温度へか、または制限的温度から許容温度へのいずれかに変化させる工程を包含する。
【００４４】
１つの実施態様において、宿主細胞は、組換え宿主細胞が投与されるのと同じ個体から入手される。別の実施態様において、これらの組換え宿主細胞はケラチノサイトである。
【００４５】
本発明はまた、本発明の核酸分子および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００４６】
本発明はさらに、遺伝子操作された非ヒト動物であって、少なくともそれらのいくつかの細胞に本発明の核酸分子を含む、非ヒト動物を提供する。遺伝子操作された非ヒト動物であって、その動物細胞のいくつかのゲノムまたは全てのゲノム中に安定に組み込まれた本発明のＤＮＡ分子を含む非ヒト動物もまた提供される。本発明はまた、遺伝子操作された非ヒト動物を作製する方法を提供し、この方法は、体細胞および生殖細胞系列細胞中に目的の配列を含むトランスジェニック動物を作製するために、本発明の核酸分子を含む細胞をこれらの動物に導入する工程、本発明の核酸分子をインビボでこれらの動物の細胞に導入する工程、または本発明のＤＮＡ分子を生殖細胞系細胞に導入する工程を包含する。
【００４７】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
本発明は、調節可能でかつ非細胞変性である改善された発現ベクター、ならびにこれらのベクターを使用して目的のタンパク質分子およびＲＮＡ分子を生成するための方法に関する。
【００４８】
本発明は、宿主細胞において生成される特定のＲＮＡ分子の量の正確な調節を可能にするポリヌクレオチドおよび方法を提供する。この正確な調節は、許容温度にて、さらなるＲＮＡ分子を形成するための、ＲＮＡ分子しか複製しない温度感受性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの使用により得られる。
【００４９】
本発明はさらに、誘導可能な遺伝子発現系に関し、アルファウイルスＤＮＡベクターを使用して、非細胞変性で温度感受性のウイルス非構造レプリカーゼタンパク質をコードする遺伝子を保有する安定な細胞株を作製する。例えば、以下に記載される実施例において使用される温度感受性レプリカ−ゼの活性は、トランスフェクト細胞の温度を、３７℃の温度から３４℃より低い温度に低下することによって作動する。宿主細胞の発現は３７℃では検出レベルより下であり、そしてこの誘導プロフィールは、染色体挿入部位に無関係である。
【００５０】
（定義）
以下の定義は、本発明者らが本発明であるとみなす主題を明瞭にするために提供される。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語「アルファウイルス」とは、Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ属に含まれるＲＮＡウイルスのいずれかをいう。この属のメンバーの説明は、ＳｔｒａｕｓｓおよびＳｔｒａｕｓｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５８：４９１−５６２（１９９４）に含まれている。アルファウイルスの例としては、アウラウイルス、Ｂｅｂａｒｕウイルス、Ｃａｂａｓｓｏｕウイルス、チクングニヤウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、Ｆｏｒｔ  Ｍｏｒｇａｎウイルス、Ｇｅｔａｈウイルス、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈウイルス、Ｍａｙｏａｒｏウイルス、Ｍｉｄｄｌｅｂｕｒｇウイルス、Ｍｕｃａｍｂｏウイルス、Ｎｄｕｍｕウイルス、Ｐｉｘｕｎａウイルス、Ｔｏｎａｔｅウイルス、Ｔｒｉｎｉｔｉウイルス、Ｕｎａウイルス、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス、Ｗｈａｔａｒｏａウイルス、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥ）、およびロス川ウイルスが挙げられる。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「精製した」とは、分子に関して使用され、この用語は、精製した分子の濃度が、その分子の天然の環境においてその分子に関連する分子に対して相対的に増大していることを意味する。天然に関連する分子としては、タンパク質、核酸、脂質および糖が挙げられるが、一般に、水、緩衝液、および統合性を維持するためにまたは精製する分子の精製を容易にするために添加される試薬は含まれない。例えば、ｍＲＮＡが、オリゴｄＴカラムクロマトグラフィーの間、水性溶媒で希釈された場合でさえ、天然に関連する核酸および他の生物学的な分子がカラムに結合しない場合、ｍＲＮＡ分子はこのクロマトグラフィーによって精製され、そして対象ｍＲＮＡ分子から分離される。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「単離した」とは、分子に関して使用され、この用語は、分子がその天然の環境から取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリぺプチドは、「単離」されていないが、その天然の状態の共存している材料から分離した同じポリヌクレオチドまたはポリぺプチドは「単離」されている。さらに、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために、単離されていると考えられる。単離したＲＮＡ分子は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲＮＡ複製産物を含む。単離した核酸分子はさらに、合成的に生成された分子を含む。さらに、組換え宿主細胞に含まれるベクター分子もまた、単離されている。したがって、全ての「単離」した分子が「精製」されている必要はない。
【００５４】
本明細書で使用される場合、句「低いまたは検出不可能」とは、遺伝子発現レベルに関して使用される場合、その遺伝子が最大に誘導されるときに見られる発現レベルよりも有意に低い（例えば、少なくとも５倍低い）発現レベルか、または以下の実施例の節で使用される方法によって容易に検出されない発現レベルのいずれかをいう。
【００５５】
本明細書で使用される場合、句「個体」とは、多細胞生物をいい、そして植物および動物の両方を含む。好ましい多細胞生物は動物であり、さらに好ましくは脊椎動物であり、なおさらに好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトである。
【００５６】
本明細書で使用される場合、句「シス作用」配列とは、ＲＮＡ分子のＲＮＡ依存性の複製を触媒するためにレプリカーゼが結合する核酸配列をいう。これらの複製事象は、全長ＲＮＡ分子および部分的ＲＮＡ分子の複製を生じ、したがって、アルファウイルスの部分ゲノムプロモーターもまた「シス作用」配列である。シス作用配列は、核酸分子の５’末端、３’末端、もしくは両方の末端またはその近傍、ならびに内部に位置させ得る。
【００５７】
本明細書で使用される場合、句「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」とは、別のＲＮＡ分子からのＲＮＡの生成を触媒するポリメラーゼをいう。この用語は、本明細書中において、用語「レプリカーゼ」と同じ意味で使用される。
【００５８】
本明細書で使用される場合、句「非感染性にパッケージングされたＲＮＡ分子」とは、パッケージングされたＲＮＡ分子をいい、これは、基本的に１回の宿主細胞感染のみを起こし、そして病原性ではない。したがって、これらの分子は「感染性」であるが宿主細胞への１回の感染進入のみについてであり、そしてさらなる感染性粒子を形成するための複製をし得ない。
【００５９】
本明細書で使用される場合、用語「転写」とは、ＲＮＡポリメラーゼによって触媒される、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡ分子の生成をいう。
【００６０】
本明細書で使用される場合、句「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象」とは、ＲＮＡ分子を鋳型として使用して、ＲＮＡ分子の形成を生じるプロセスをいう。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「ベクター」とは、遺伝物質を宿主細胞に感染するために使用される因子（例えば、プラスミドまたはウイルス）をいう。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかから構成され得る。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語「異種配列」とは、本発明のベクター中に存在する第二のヌクレオチド配列をいう。用語「異種配列」はまた、本発明のベクターに含まれる異種ＤＮＡ配列によってコードされる任意のアミノ酸配列、またはＲＮＡ配列をいう。異種ヌクレオチド配列は、タンパク質またはＲＮＡ分子の存在する細胞型において正常に発現されるタンパク質またはＲＮＡ分子をコードし得るか、またはその細胞型において正常に発現されない分子（例えば、シンドビス構造タンパク質）をコードし得る。
【００６３】
本明細書で使用される場合、句「翻訳されないＲＮＡ」とは、オープンリーディングフレームをコードしないか、またはオープンリーディングフレームもしくはその部分をコードするが、その構成においてアミノ酸配列を生成しない（例えば、開始コドンが存在しない）ＲＮＡ配列もしくは分子をいう。このような分子の例は、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、およびリボザイムである。アンチセンスＲＮＡは翻訳され得ないが、いくつかの場合において（実施例１１を参照のこと）、アンチセンス配列は翻訳可能なセンス鎖に転換され得、この鎖からポリぺプチドを生成する。
【００６４】
本明細書で使用される場合、句「遺伝子治療」とは、疾患または障害の治療的な処置のために、異種の遺伝情報を細胞へ伝達することをいう。異種ヌクレオチド配列を細胞に伝達し、そしてポリぺプチド分子または翻訳されないＲＮＡ分子を生成するように発現させる。
【００６５】
本明細書で使用される場合、句「温度感受性」とは、ある温度では反応を容易に触媒するが、別の温度では同じ反応を緩やかに触媒するかまたは全く触媒しない酵素をいう。温度感受性の酵素の例は、ｐＣＹＴｔｓベクターによってコードされるレプリカーゼタンパク質であり、これは、３４℃より下の温度では容易に検出可能なレプリカーゼ活性を有し、そして３７℃では低い活性かまたは検出不可能な活性を有する。
【００６６】
本明細書で使用される場合、句「許容温度」とは、酵素が相対的に高いレベルの触媒活性を有する温度をいう。
【００６７】
本明細書で使用される場合、句「制限温度」とは、酵素が低いかまたは検出不可能なレベルの触媒活性を有する温度をいう。「高温」および「低温」感受性変異体の両方は公知であり、したがって、制限温度は、許容温度より高いかまたは低い。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「組換え宿主細胞」とは、本発明の１つ以上の核酸分子が導入された宿主細胞をいう。
【００６９】
用語「１つ（ｏｎｅ）」、「１つ（ａ）」もしくは「１つ（ａｎ）」が本明細書で使用される場合、これらは、他に示されない限り、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
【００７０】
（本発明のアルファウイルスベクター）
本発明のＤＮＡベクターは、宿主細胞において構成的に転写され、２つのオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ分子を生成する。これらのオープンリーディングフレーム（これらは、同じ核酸分子から生成されてもよいしまたは生成されなくてもよい）は、温度感受性レプリカーゼおよび目的の異種遺伝子をコードする。第１のオープンリーディングフレームは、温度依存性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを生成するように翻訳される。第２のオープンリーディングフレーム（目的の１つ以上のポリぺプチドの全てまたは部分をコードする）は、少なくとも１つのＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象の後まで翻訳されない。
【００７１】
ＤＮＡ発現ベクターは、インビボでＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、ＲＮＡ分子の複製を可能にする５’および／または３’配列（５’および３’シス作用配列エレメント）、ならびに少なくとも１つの複製事象の後にのみ転写可能になる目的の配列を含む。複製は、同じｍＲＮＡ分子上または異なるｍＲＮＡ分子上で代替的にコードされる、調節可能なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって触媒される。目的の配列は、センスにおいて、ウイルスＲＮＡプロモーターのプラス（＋）指向性下流にコードされ得る。目的の遺伝子のコード配列の翻訳は、単一ベクター系に関しては、一般にレプリカーゼ配列である５’配列によって阻害される。複数ベクター系においては、５’配列は、リボソームの解離を誘導する、会合した終止コドンを有する１つ以上の短いオープンリーディングフレームを有することによって翻訳を阻害し得る。同様に、目的の配列へのリボソームの移動または結合を阻害する任意の配列が、翻訳を阻害する５’配列として使用され得る（ＶｏｅｔおよびＶｏｅｔ，ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ（１９９０））。
【００７２】
ほとんどの生物学的な系において、ヌクレオチド配列の翻訳を防止するための別の方法は、アンチセンス方向への配列の挿入を含む。翻訳を阻害するこの方法は、一般に、センス方向においてオープンリーディングフレームを有するプラス鎖へのこのマイナス（−）鎖ＲＮＡの複製の後のみに翻訳が起こるという原理に基づく。翻訳されたセンス鎖はＲＮＡ複製によって形成され、そしてリボソームおよびタンパク質合成のための鋳型として利用される。実施例１１に示されるように、アミノ酸配列の生成は、目的の遺伝子が、サブゲノムプロモーターに対してアンチセンスＲＮＡ配列３’の形成を生じる方向でＤＮＡ分子に挿入された場合でさえ生じ得る。したがって、第２のオープンリーディングフレームはまた、上記の第２のオープンリーディングフレームの全てまたは一部に相補的な配列を含み、そしてコードされたアミノ酸配列の発現は依然として生じる。翻訳されないアンチセンスＲＮＡ配列の生成が所望される場合、このＲＮＡ分子は、これがタンパク質合成のための鋳型として利用されないように設計され得る。例えば、ＲＮＡは、開始コドンが存在しないように設計され得る。
【００７３】
翻訳されないアンチセンスＲＮＡ分子を使用して、組換え宿主細胞において発現されるｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。遺伝子発現を調節するためのアンチセンス核酸分子の使用は、当該分野において公知であり（例えば、Ｋａｗａｍａｔａ，Ｈ．ら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７７：７１−７８（１９９８）；Ｂｅｃｈｌｅｒ，Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４１：１９３−１９９（１９９７）；Ｕｒａｋａｍｉ，Ｓ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４１：２４−３０（１９９７）を参照のこと）、そしてこのような分子を宿主細胞に送達するための本発明のベクターの使用は、本発明の範囲内である。
【００７４】
さらに、第２のオープンリーディングフレームの代わりに、本発明のＤＮＡ配列の転写によって直接的に生成されたＲＮＡ分子は、アンチセンス方向に翻訳されないしまた存在もしないＲＮＡ配列をコードし得る。このような翻訳されないＲＮＡ分子の例としては、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、およびリボザイムが挙げられる。定義された触媒活性を有するかなりの数のリボザイム配列が当該分野において公知である（例えば、Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２６：３５３−３５４（１９９８）；Ｘｉｅ，Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１３７７７−１３７８１（１９９７）；Ｌａｖｒｏｖｓｋｙ．Ｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６２：１１−２２（１９９７）；Ｃｈａｐｍａｎ，Ｋ．およびＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２：３２５−３３３（１９９５）を参照のこと）。さらに、リボザイムは、リボザイム媒介メッセージ欠失ストラテジーの一部として、真核生物細胞内の特定の遺伝子の発現を「ノックアウト」するために使用されてきた（Ｘｉｅ，Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１３７７７−１３７８１（１９９７））。さらに、アルファウイルスレプリコンは、哺乳動物細胞において機能的なリボザイムを発現させるために使用されてきた（Ｓｍｉｔｈ  Ｓ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９７１３−９７２１（１９９７））。したがって、このようなリボザイム、および翻訳されない他のＲＮＡ分子の調節された発現は、本発明の範囲内である。
【００７５】
本発明は、図１に示される説明図により例示される。本発明のこれらの実施態様は、レプリカーゼおよび目的の遺伝子をコードする、２つのオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ分子を生成するように転写されるＤＮＡベクターに関する。このＤＮＡベクターは、両方のオープンリーディングフレームのコード配列を有するｍＲＮＡ分子を生成するように、これらのベクターの転写を駆動するプロモーター配列を含む。第１のオープンリーディングフレームのｍＲＮＡ配列が翻訳されて、第２のオープンリーディングフレームのＲＮＡ配列の発現に必要とされるレプリカーゼを生成する。第２のオープンリーディングフレームは、１つ以上の目的のタンパク質をコードする。
【００７６】
さらに、第１のｍＲＮＡ分子が、一旦ＤＮＡベクターから転写されると、さらなるＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象が生じて、第１のｍＲＮＡ配列を増幅し、そして第１のｍＲＮＡ配列の反対の鎖方向性を有するＲＮＡ分子を生成する。
【００７７】
図１、節（７）〜（８）、（１０）、および（１２）〜（１３）において示されるように、全長ＲＮＡ分子の部分的複製後に、本発明のＤＮＡ分子の第２のオープンリーディングフレームのみが発現される。この全長ＲＮＡ分子の部分的複製は、ＲＮＡから構成されるプロモーター配列（例えば、アルファウイルスサブゲノムプロモーター配列）によって駆動される。
【００７８】
目的の遺伝子は、レプリカーゼタンパク質と同じＲＮＡ分子によってコードされ得るが、この遺伝子はまた別のＲＮＡ分子によってコードされ得る。従って、本発明はさらに、目的の遺伝子を発現するための単一ベクター系および複数ベクター系の両方を提供する。
【００７９】
本発明の単一ベクター系において、第１のオープンリーディングフレームおよび第２のヌクレオチド配列をコードする配列は、同じ核酸分子の成分である。従って、目的の遺伝子の調節された発現のために必要とされる成分のすべては、単一の核酸分子（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に含まれる。
【００８０】
本発明の複数ベクター系において、第１のオープンリーディングフレームまたはそのサブ部分をコードする配列、および第２のヌクレオチド配列は、異なる核酸分子の成分である。従って、これらの複数ベクター系は、２つ以上の核酸分子を含み得る。例えば、ｎｓＰ２、ｎｓＰ４、および目的の遺伝子は、それぞれ異なるＤＮＡベクターによってコードされ得る。さらに、これらのＤＮＡベクターのうちの１つ以上は、宿主細胞ゲノムに安定に組み込むように設計され得る。目的の遺伝子の発現が、本発明の１つ以上の安定に組み込まれたＤＮＡ分子を含む細胞型において所望される場合、目的の遺伝子の発現は、組み込まれた分子中に存在しない系の成分をコードする核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の細胞への導入を必要とする。
【００８１】
任意の機能的プロモーターは、ＤＮＡベクターからのｍＲＮＡの転写を駆動するために使用され得るが、このプロモーターは、好ましくは構成性ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）プロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、メタロチオネインプロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒトポリオーマウイルスＢＫ（ＢＫＶ）プロモーター、またはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）プロモーター）。本発明の実施における使用のために適切なさらなるプロモーターは、当該分野において公知である（例えば、Ｌｅｅ，Ａ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ．  ７：４９５〜５０１（１９９７）；Ａｒｔｕｃ，Ｍ．ら、Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．４：３１７〜３２１（１９９５）を参照のこと）。
【００８２】
ベクターはまた、一般に、原核生物および真核生物におけるベクター配列のクローニングおよび増幅のための選択マーカーを含む。例えば、ｐＣＹＴｔｓベクターは、細菌宿主細胞におけるポジティブ選択のためのアンピシリン耐性マーカーおよびＥ．ｃｏｌｉの複製起点（すなわち、ＣｏｌＥ１）を含む。さらなる選択マーカーおよび複製起点をコードする大多数の配列が当該分野において公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｊ．ら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｈ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）を参照のこと）。
【００８３】
レプリカーゼタンパク質コード配列、５’および３’シス作用性配列（存在する場合）、およびサブゲノムプロモーターを含む結合配列は、通常、ウイルス由来、好ましくはアルファウイルス由来、最も好ましくはシンドビスウイルス由来である。
【００８４】
ほとんどの場合において、アルファウイルスレプリカーゼタンパク質を使用する場合、レプリカーゼタンパク質の細胞変性表現型を、非細胞変性表現型に変換することが望ましい。そのような表現型を付与する好ましい変異は、ｎｓｐ２遺伝子中に存在する（例えば、７２６位のプロリン残基は、セリン残基で置換される）。レプリカーゼタンパク質を非細胞変性性にする変異は当該分野において公知である（Ｗｅｉｓｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３３：４６３〜４７４（１９８０）；Ｄｒｙｇａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２８：７４〜８３（１９９７））。これらの変異は、多くの手段（部位特異的変異誘発を含む）によって導入され得る。
【００８５】
上述のように、非細胞変性性シンドビスウイルスレプリカーゼが本発明の実施において使用される場合、変異がｎｓｐ２遺伝子中に導入され得る。１つのそのような変異は、７２６位でのプロリン残基の、２０の天然に存在するアミノ酸のうちの別のものへの変換（例えば、セリン、「Ｐｒｏ  ７２６  Ｓｅｒ」と省略される）から生じる。あるいは、レプリカーゼ分子を非細胞変性性にする任意の他の変異は、本発明の範囲内である。シンドビスレプリカーゼを非細胞変性性にする変異の作製および同定は、他により詳細に記載されている（Ｗｅｉｓｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３３：４６３〜４７４（１９８０）；Ｄｒｙｇａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２８：７４〜８３（１９９７）；特許出願ＷＯ９７／３８０８７）。さらに、そのような変異を導入するための方法が当該分野において公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｊ．ら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｈ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）を参照のこと）。
【００８６】
例えば、温度感受性（ｔｓ）は、レプリカーゼのｎｓｐ４遺伝子における変異の導入によって付与され得る。好ましくは、温度感受性表現型をレプリカーゼ活性に与える変異は、相補性群Ｆ中のタンパク質中に存在する（Ｌｅｍｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：３００１〜３０１１（１９９０））。例えば、温度感受性表現型は、ｎｓｐ４のＧｌｙ１５３のＧｌｕへの変化によって付与され得る。さらに、レプリカーゼ活性を温度感受性にする任意の他の変異は、本発明の実施において使用され得る。新しい温度感受性変異体を作製および同定するための方法は、Ｐｆｅｆｆｅｒｋｏｒｎによって記載されている（ＢｕｒｇｅおよびＰｆｅｆｆｅｒｋｏｒｎ、Ｖｉｒｏｌ．３０：２０４〜２１３（１９６６）：ＢｕｒｇｅおよびＰｆｅｆｆｅｒｋｏｒｎ、Ｖｉｒｏｌ．３０：２１４〜２２３（１９６６））。さらに、レプリカーゼ活性の温度感受性調節を可能にするｔｓ変異を産生および同定するために有用な任意の方法を使用して、そのような変異体を生成および単離し得る。
【００８７】
ほとんどの温度感受性変異体が「高温（ｈｏｔ）」感受性であるが、「低温（ｃｏｌｄ）」感受性の変異体もまた公知である（例えば、Ｓｃｈｗｅｒ，Ｂ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：８０３〜８０９（１９９８）、Ｍａｔｈｅ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１１：８８７〜８９６（１９９８）、Ｄｏｅｄｅｎｓ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９０５４〜９０６４（１９９７）、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２７６１２〜２７６１７（１９９７）を参照のこと）。温度感受性レプリカーゼは、「低温」または「高温」感受性であり得、従って、制限温度より高いかまたはそれより低い温度のみのＲＮＡ複製を触媒する。１つの実施態様において、ＲＮＡ複製は、３４℃未満の温度のみで検出可能なレベルで生じる。関連する実施態様において、ｐＣＹＴｔｓベクターまたはその改変体は、挿入された目的の遺伝子を発現するために使用され、発現は、ベクターを含む細胞の温度を、３７℃から約３４℃未満の温度に下げることによって誘導される。図４Ａ〜４Ｂにおいて示されるように、ｐＣＹＴｔｓベクターによってコードされるレプリカーゼの許容温度は、約３４℃未満である。さらに、目的の遺伝子の発現は、温度が約２４℃から上昇される場合、最大発現レベルが約２９℃で達成されるまで増加する。さらに、温度が約３４℃から下降するにつれて、目的の遺伝子の発現が上昇する。従って、ｐＣＹＴｔｓベクターによってコードされるレプリカーゼ活性についての許容温度は、３４℃未満であり、そして２４℃未満の温度、ならびに２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、および３３℃、ならびに約３４℃までに介在する小数の温度を含む。
【００８８】
以前に公知のすべての調節可能なＤＮＡ発現系とは対照的に、３７℃で不活性な状態にあるｐＣＹＴＳｔｓベクターを含む組換え宿主細胞における発現の基底レベルは、標準的な方法（例えば、以下の実施例において使用される方法）を使用して、検出レベル未満である。発現のこの低いレベルは、図４Ａ〜４Ｂ、図８Ａ〜８Ｂ、図９、ならびに図１０において示されるデータから明白である。さらに、遺伝子発現の温度依存性誘導プロフィールは、染色体組込み部位およびコピー数から独立しているようである。
【００８９】
別の実施態様において、目的の配列および非細胞変性性調節可能レプリカーゼ（例えば、Ｐｒｏ  ７２６  Ｓｅｒ変異を有するｎｓｐ２、およびＧｌｙ  １５３  Ｇｌｕ変異を有するｎｓｐ４）は、２つの別のＤＮＡベクターによってコードされる。そのような場合において、目的の配列を有するＤＮＡベクターは、シス作用性配列および目的の配列の翻訳を阻害する５’領域の両方を有する。この非細胞変性性調節可能レプリカーゼ遺伝子はまた、目的の配列を有するＤＮＡ分子とは異なるＤＮＡ分子によってコードされ得る。この複数ベクター系における目的の配列の複製および翻訳は、１つのベクター系におけるように温度によって調節可能である。
【００９０】
本発明のベクターはまた、目的の１つより多い遺伝子の発現を調節するために使用され得る。例えば、組換え宿主細胞は、１つより多くの本発明の核酸分子でトランスフェクトされる。ここで、１つの核酸分子は、レプリカーゼおよび目的のポリペプチドの両方をコードし、さらなる核酸分子は、目的のさらなるポリペプチドをコードし得る。同様に、非細胞変性性および温度感受性を付与する変異の両方が使用される場合、適切な変異を有するポリペプチド（例えば、ｎｓｐ２におけるＰｒｏ  ７２６  Ｓｅｒ、およびｎｓｐ４におけるＧｌｙ  １５３  Ｇｌｕ）をコードする遺伝子は、別の核酸分子上に存在し得る。さらなる改変は、当業者に明らかである。
【００９１】
実施例１１において示されるように、目的の配列はまた、機能的プロモーター（例えば、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）プロモーター）から下流にアンチセンス方向で挿入され得る。この構築物は、目的のタンパク質の産生によって示されるようなセンス極性を有するプラス（＋）鎖に変換される。これらのデータは、アンチセンスＤＮＡフラグメントを本発明と共に使用して、機能的ポリペプチドまたはそのサブ部分を発現し得ることを示す。これらのデータはさらに、アンチセンスＤＮＡが転写のための鋳型として使用される場合、５’および３’ＣＳＥが、ウイルス転写に必要でなくともよいことを示す。
【００９２】
本発明のＤＮＡ分子はまた、ＲＮＡ分子のウイルス粒子へのパッケージングを指向するパッケージングシグナルを含み得る。これらのＲＮＡ分子は、野生型ウイルスまたは欠陥ヘルパーウイルスのＲＮＡの存在下でパッケージングされ得る。欠陥ヘルパーＲＮＡ分子の開発で有意な改良がなされた（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９〜６４４６（１９９３））。これらのＲＮＡ分子は、全長転写産物の複製に必要とされるシス作用性配列、および構造タンパク質遺伝子の発現を駆動するサブゲノムＲＮＡプロモーター配列を含む。例えば、パッケージングシグナルを有するＲＮＡ分子および欠陥ヘルパーウイルスＲＮＡの両方を含む細胞において、アルファウイルス非構造タンパク質は、翻訳されてビリオン構造タンパク質を産生する欠陥ヘルパーウイルスＲＮＡ配列の複製および増幅を可能にする。ヘルパーウイルスＲＮＡはパッケージングシグナルを欠くので、これらの分子は、アセンブリされたビリオンにパッケージングされない。従って、このような方法で産生されたビリオン粒子は、本質的に、目的の遺伝子をコードするＲＮＡ配列のみを含み、一般に遺伝子発現の温度感受性調節に必要な他の配列を含む。これらの非感染性のパッケージングされたＲＮＡ分子は、ビリオン構造タンパク質をコードする配列を含まず、従って１回のみの宿主細胞感染を受け、そして病原性ではない。
【００９３】
非感染性のパッケージングされたＲＮＡ分子は、単に、その粒子を、これらの細胞を含む培養培地に添加することによって、適切な宿主細胞の培養物を感染するために使用され得る。非感染性アルファウイルス粒子の調製は、「Ｓｉｎｄｂｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」バージョンＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｋ７５０−１）を含む、多くの供給源において記載されている。
【００９４】
この系の１つの適用は、非感染性のパッケージングされたＲＮＡ分子の温度依存性生成に関する。これらのパッケージングされたＲＮＡ分子は、２つの異なるＤＮＡ分子（例えば、本発明のＤＮＡ分子、およびヘルパーウイルスＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ分子）を含む組換え宿主細胞を用いることを含む多くの手段によって産生され得る。例えば、これらのＤＮＡ分子のうちの１つは、パッケージングシグナル配列、非細胞変性性温度感受性レプリカーゼをコードする配列、および目的の遺伝子を含むＲＮＡ分子をコードする。他のＤＮＡ分子は、アルファウイルスサブゲノムプロモーターから下流のアルファウイルス構造タンパク質をコードする配列を含む。そのような系を用いて、パッケージングシグナルを有するＲＮＡ分子のみを含むウイルス粒子が、組換え宿主細胞において許容温度で産生される。このことはそのとおりである。なぜなら、アルファウイルス構造タンパク質は、許容温度で産生されるのみだからである。上記のさらなる改変体は、当業者に明らかである。
【００９５】
広範な種々の目的のヌクレオチド配列は、本発明の遺伝子発現系によって発現され得る。これらの配列には、以下をコードする配列が挙げられるがそれらに限定されない：リンホカイン、サイトカイン、トキシン、酵素、プロドラッグ変換酵素、免疫応答を刺激する抗原、単鎖抗体、免疫応答を刺激または阻害するタンパク質、腫瘍壊死因子、および治療的適用を有する種々のタンパク質（例えば、成長ホルモンおよび調節因子）。
【００９６】
実施例５において示されるように、本発明のベクターによって発現される異種配列はまた、エリトロポエチン（ＥＰＯ）をコードし得る。ＥＰＯは、サイトカインファミリーに属する糖タンパク質であり、そして最終の赤血球発達を誘導する。このタンパク質はまた、赤血球産生を調節する。
【００９７】
異種配列はまた、サイトカインまたはリンホカイン（例えば、β−インターフェロン）をコードし得る。造血は、種々の造血細胞の増殖および／または分化を刺激するリンホカインおよびサイトカインによって調節される。サイトカインおよびリンホカインの代表的な例には、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１４（ＩＬ−１４）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１６（ＩＬ−１６）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、およびインターフェロンが含まれる。
【００９８】
異種配列はまた、分泌型酵素（例えば、分泌型アルカリホスファターゼ）、細胞質酵素（例えば、グリーン蛍光タンパク質）、または治療的適用を有する任意の数の他のタンパク質（例えば、ヒトインスリン、ヒト凝固因子ＶＩＩＩ）をコードし得る。
【００９９】
本発明のベクターはまた、細胞傷害性ポリペプチドをコードする異種配列を発現するために使用され得る。細胞傷害性ポリペプチドは、細胞増殖または代謝を直接的または間接的に阻害するように作用する。トキシンの代表的な例は、Ｓｈｉｇｅｌｌａトキシン、リシン、Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａトキシン、Ｃｈｏｌｅｒａトキシン、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンＡ、およびＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）を含む。本発明の他の実施態様において、異種配列は、プロドラッグ変換酵素をコードする。プロドラッグ変換酵素は、ほとんどまたは全く細胞傷害性を有さない化合物を、毒性生成物に活性化する。代表的な例は、ＨＳＶＴＫ、アルカリホスファターゼ、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびペニシリン−Ｖアミダーゼである。細胞傷害性ポリペプチドおよびプロドラッグ変換酵素の両方の例は、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０６０１０、ＥＰ  ０７１６１４８、およびＷＯ９６／１７０７２を含む多くの供給源において議論されている。
【０１００】
本発明のベクターとともに使用され得るヌクレオチド配列は、アンチセンス配列のような非翻訳ＲＮＡ分子を含む。ＲＮａｓｅ  Ｐは、遺伝子ダウンレギュレーションを誘導する配列およびリボザイムを標的化した。Ｓｍｉｔｈ  Ｓ．ら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９７１３〜９７２１（１９９７））は、リボザイム配列を発現するために使用されるアルファウイルスベクターを記載する。
【０１０１】
本発明の核酸分子はまた、実質的に任意のタンパク質（今までに同定されていないが、例えばｃＤＮＡライブラリーまたは宿主細胞染色体中に含まれるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質を含む）を発現するために使用され得る。そのようなタンパク質の例は、分泌型タンパク質および種々の細胞区画由来のタンパク質を含む。本発明のベクターによって発現される異種配列は、非ヒト種（例えば、他の哺乳動物、植物、真菌、細菌、またはウイルス）由来のタンパク質およびＲＮＡ分子をコードし得る。これらの異種配列はさらに、ウイルス膜タンパク質（例えば、ＨＩＶ  ｇｐ１６０）またはウイルスポリタンパク質（例えば、シンドビス構造タンパク質）をコードし得る。
【０１０２】
上記のタンパク質の配列は、種々の供給源（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を含む）から容易に入手され得る。あるいは、上述の異種配列をコードするｃＤＮＡ配列は、そのような配列を発現する細胞から入手され得る。目的の遺伝子をコードするゲノム配列およびｃＤＮＡ配列の両方を単離するための方法は、当該分野において周知である（例えば、Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．編、ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，第２版（１９９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｈ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）を参照のこと）。例えば、ｍＲＮＡは、目的の配列を発現する細胞から単離され得、その後に目的の配列が、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、特異的プライマー、またはその組み合わせを使用する逆転写酵素を用いて逆転写される。次いで、ｃＤＮＡ配列が、熱安定なプルーフリーディングポリメラーゼを用いるＰＣＲによって増幅され得る。あるいは、合成ＤＮＡ配列は、本発明のベクターを用いて構築および発現され得る。
【０１０３】
ヌクレオチド配列が本発明のベクターに付加され得、融合タンパク質の産生を生じる。例えば、そのような配列は、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質に融合され、そして発現産物に対して１つ以上の機能的特徴を付与するアミノ酸配列をコードし得る。これらのアミノ酸配列は、細胞から（例えば、分泌配列）または細胞内区画（例えば、核）への輸送のための遺伝子産物を標的化する配列を含む。そのようなアミノ酸配列はさらに、精製を促進する配列（例えば、６Ｈｉｓ「タグ」）を含む。アミノ酸配列および融合配列によって与えられる機能に依存して、付加されたアミノ酸配列は、翻訳産物から切断されてもよいし切断されなくてもよい。
【０１０４】
融合タンパク質はまた、種々の異なるタンパク質由来のドメインまたは領域を有するタンパク質を含む。そのような融合タンパク質の例は、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンのドメインＩＩ、特定の細胞型と関連する細胞表面レセプターについての結合親和性を有するドメインまたはアミノ酸配列、および予め選択された生物学的活性を有する別のアミノ酸配列を含むタンパク質である。ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンのドメインＩＩは、細胞膜を横切って移動する。この系を用いて、特定の細胞型に結合し、これらの細胞の細胞質膜を横切って移動し、そして所定の細胞内生物学的反応を触媒する融合タンパク質を設計し得る。この型の系は、Ｐａｓｔａｎら、米国特許第５，７０５，１６３号に記載される。特定の細胞型に結合するアミノ酸配列を同定するための方法は、Ｗｕ．Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：４２９〜４３１（１９９６）において記載される。
【０１０５】
本発明のベクターはまた、選択マーカー、高コピー数の宿主細胞増幅を生じる配列、およびベクター配列の染色体組込みを可能にする配列のような、さらなる機能的特徴を付与する遺伝子エレメントを含み得る。
【０１０６】
本発明のベクターを含む原核生物細胞および真核生物細胞の選択のためのマーカーは、当該分野において周知であり、そしてテトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、およびカナマイシン耐性を含む。そのような配列を含むＤＮＡ分子は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（１１０１１  Ｎｏｒｔｈ  Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｒｏａｄ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ  ９２０３７、ＵＳＡ）、およびＰｒｏｍｅｇａ（２８００  Ｗｏｏｄｓ  Ｈｏｌｌｏｗ  Ｒｏａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１，ＵＳＡ）を含む多くの供給源から利用可能である。高コピー数増幅を生じるヌクレオチド配列はまた、当該分野において公知であり、そしてｐＣＹＴｔｓベクターに含まれるＣｏｌＥ１配列を含む。
【０１０７】
（組換え宿主細胞）
本発明のベクターを含む種々の異なる組換え宿主細胞を生成し得る。アルファウイルスは、広範な宿主範囲を有することが公知である。シンドビスウイルスは、例えば、培養された哺乳動物細胞、は虫類動物細胞、および両生類細胞、ならびにいくつかの昆虫細胞に感染する（Ｃｌａｒｋ，Ｈ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．５１：６４５（１９７３）；Ｌｅａｋｅ，Ｃ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３５：３３５（１９９７）；Ｓｔｏｌｌａｒ，Ｖ．，ＴＨＥ  ＴＯＧＡＶＩＲＵＳＥＳ，Ｒ．Ｗ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，（１９８０），５８３−６２１頁）。従って、多数の組換え宿主細胞は、本発明の実施に用いられ得る。ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞およびＣＨＯ細胞は、ヒト細胞に類似した様式において異種タンパク質をグリコシル化する可能性を有するので（Ｗａｔｓｏｎ，Ｅ．ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４：２２７（１９９４））異種タンパク質の生成に特に適しており、そして選択され得る（Ｚａｎｇ，Ｍ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３８９（１９９５））か、または遺伝的に操作されて（Ｒｅｎｎｅｒ  Ｗ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．４７：４７６（１９９５）；Ｌｅｅ  Ｋ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．５０：３３６（１９９６））、無血清培地および懸濁液において増殖し得る。
【０１０８】
目的の遺伝子を発現し得る組換え宿主細胞は、個体に挿入されることが意図される場合、これらの細胞は、一般的に、この細胞が挿入されるのと同属および同種の別個体か、または同一個体のいずれかに由来する。細胞は、外科的手段および組織生検を含むかなり多数の手段によって個体から得られ得る。
【０１０９】
宿主細胞へのポリヌクレオチドベクターの導入は、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレイプローディング（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、弾道導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、および感染のような方法を含む、標準的な実験室マニュアル（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），第９章；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｈ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９７），第１６章、を参照のこと）に記載される方法によって果たされ得る。宿主細胞への外因性ＤＮＡ配列の導入方法は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．ら、米国特許第５，５８０，８５９号に議論される。
【０１１０】
非感染性パッケージ化ＲＮＡ配列をまた用いて、宿主細胞を感染させ得る。これらのパッケージ化ＲＮＡ配列は、培養培地にこれらを添加することによって宿主細胞に導入され得る。
【０１１１】
先に示される様に、本発明のベクターはまた、ベクター配列の染色体組み込みを可能にする遺伝エレメントを含み得る。このようなエレメントは、異種配列の安定な維持のために有用であり、そして部位特異的組込み、および部位独立（ｓｉｔｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）組み込みの両方を与える配列を含む。部位特異的組み込み（例えば、相同組み込み）および部位独立組み込み（時々「無作為組み込み（ｒａｎｄｏｍ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）」と言われる）を用いて、目的の異種配列を真核生物の染色体に導入し得る。遺伝物質を真核生物染色体へ挿入するための記載および方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を含む多数の出典から利用可能である。
【０１１２】
（ポリペプチドおよびＲＮＡ分子の生成）
本発明のベクターおよび組換え宿主細胞は、ポリペプチドおよびＲＮＡ分子の生成に用いられ得る。従って、本発明は、宿主細胞におけるポリペプチドまたはＲＮＡ分子の調節された発現方法を提供し、これは本発明の核酸配列を宿主細胞へ導入する工程、および温度を調節して、目的の配列をコードするＲＮＡ分子の生成を抑制するかまたは誘導するかのいずれかの工程を含む。
【０１１３】
目的の遺伝子を発現する組換え宿主細胞は、一般的に、個体において（以下で、より詳細に記載される）かまたはインビトロでの培養においてかのいずれかでこの遺伝子を発現する。
【０１１４】
哺乳動物細胞が、ポリペプチドおよびＲＮＡ分子の生成のための組換え宿主細胞として用いられる場合、これらの細胞は、一般的に、組織培養において増殖される。培養において細胞を増殖させる方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．編、ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，第２版、（１９９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｈ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９７）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．，ＣＵＬＴＵＲＥ  ＯＦ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬＳ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８３）を参照のこと）。
【０１１５】
特定の適用に適した宿主細胞の選択は、発現されるポリペプチドまたはＲＮＡ分子を含む多数の因子によって変化する。例えば、糖タンパク質が生成される場合、一般的に、天然のタンパク質の様式に類似した様式においてタンパク質をグリコシル化する細胞型においてこのタンパク質を発現することが望ましい。
【０１１６】
１つの局面において、本発明は、組換え宿主細胞へ本発明の核酸分子を導入する工程、およびこれらの細胞を許容温度でインキュベートする工程を含む、ポリペプチドおよびＲＮＡ分子を生成する方法を提供する。関連した局面において、本発明は、本発明の方法に従って生成される精製されたポリペプチドおよびＲＮＡ分子を提供する。
【０１１７】
発現される分子に依存して、この分子は、培養上清からか、または組換え宿主細胞を溶解することによってのいずれかで得られ得る。発現産物がタンパク質である場合、しばしば、培養上清から発現産物を得ることが可能である。これは、このタンパク質がもともと会合した分泌シグナルを有さない場合でさえ、そうである。このようなシグナルをコードするコドンは、本発明のベクター配列に付加され得、そして組換え宿主細胞から分泌される融合タンパク質の発現を生じる。このようなリーダー配列をコードするヌクレオチド配列は、当該分野で公知であり、そして公に利用可能である（例えば、ｐＰｂａｃベクターおよびｐＭｂａｃベクター、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ  １９９７／１９９８カタログ、カタログ番号２１１５０３および番号２１１５０４、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，１１０１１  Ｎｏｒｔｈ  Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｒｏａｄ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ  ９２０３７，ＵＳＡを参照のこと）。
【０１１８】
宿主細胞をまた、本発明のＤＮＡ分子から転写されているか、またはこのような転写された分子から複製されているかのいずれかのパッケージ化ＲＮＡ分子または非パッケージ化ＲＮＡ分子を用いて感染させ得る。さらに、これらの宿主細胞は、制限温度で感染され得、次いで後に許容温度へシフトされ目的の遺伝子の発現を活性化し得る。次いで、目的の遺伝子産物は回収され得、そして任意の適切な手段によって精製され得る。
【０１１９】
目的の遺伝子から発現されたタンパク質は回収され得、そして硫酸アンモニウム沈殿、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、および高速液体クロマトグラフィーを含む当該分野で公知の方法によって組換え細胞培養物から精製され得る。タンパク質を精製する方法は、多数の出典に記載される（例えば、Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．編、ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，第２版、（１９９８）を参照のこと）。
【０１２０】
ＲＮＡ分子を精製する方法もまた、当該分野で公知である（例えば、Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．編、ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，第２版、（１９９８）を参照のこと）。これらの方法は、フェノール／クロロホルム抽出、ＤＮＡｓｅを用いる消化に続いて、消化されなかったＲＮＡ分子の沈殿、およびカラムクロマトグラフィー（例えば、オリゴｄＴカラムクロマトグラフィー）を含む。さらに、ＲＮＡ分子は、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７）に記載の１工程のグアニジニウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法を用いて他の細胞性物質から分離され得る。
【０１２１】
多数の異なるバイオプロセスパラメーターを、細胞培養プロセスの間に産生される発現産物の量を増加させるために変化され得る。本発明の核酸分子に曝露させるか、または遺伝子発現の誘導より先に、宿主細胞を増殖させる条件（例えば、培地の組成、ｐＨ、酸素濃度、攪拌、ならびに足場依存性細胞の場合、提供される表面およびこの表面のキャリア）は、所定の時間で達成される細胞密度および細胞の生理学的状態の両方に影響する。従って、これらの培養条件は、ベクター曝露または誘導シグナルに対する、期待される細胞応答に影響する（例えば、許容温度へシフトすること）。さらに、上記に言及される細胞培養プロセス条件を、発現産物の生成、そしてしばしば、この発現産物の特性（例えば、グリコシル化パターン）を最大にするように変化させ得る。
【０１２２】
発現産物の産生のために本発明の核酸分子を用いる細胞培養プロセス全体は、利用される宿主細胞株の要求（例えば、足場依存性、Ｏ2濃度）に適応するように、発現産物の産生を最大にするように、そしてその後の発現産物の回収および精製を容易にするように選択された、種々のバイオリアクターの配置（例えば、攪拌タンク、潅流され膜に封入されたカプセル化細胞、流動化ベット、およびエアリフトリアクター）および規模（実験Ｔフラスコから数千リットルまで）において実行され得る。
【０１２３】
本発明はまた、無血清培養培地または無タンパク質培養培地において増殖させた哺乳動物細胞を用いて、目的のタンパク質またはＲＮＡ分子の生成に関する。例えば、血清の接近を制限するか、または懸濁増殖を選択する条件下で長期間培養することによって、無血清培地においておよび／または懸濁物において増殖し得るＣＨＯ細胞株が選択される（Ｚａｎｇ，Ｍ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：３８９（１９９５））。さらに、ＣＨＯ  Ｋ１細胞の遺伝的改変によって、無タンパク質培養培地において懸濁された単細胞として増殖する、ＣＨＯ
Ｋ１：ｃｙｃＥと命名された改変化細胞株が得られた（Ｒｅｎｎｅｒ  Ｗ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．４７：４７６（１９９５））。親のＣＨＯ細胞において産生される糖タンパク質と異なるグリコシル化パターンを有する糖タンパク質を生成するＣＨＯ変異体（例えば、ＬＥＣ１０細胞）もまた単離されている（Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｐ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：９９（１９９２））。あるいは、対応する改変オリゴ糖を有する糖タンパク質を合成し得るＣＨＯ細胞が、オリゴ糖の生合成に関与する酵素の活性を変化させる遺伝的改変によって得られ得る（Ｍｉｎｃｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１１：３４８（１９９５））。
【０１２４】
さらに、多数の異なるバイオプロセスパラメーターをまた、本発明の組換え宿主細胞によって生成されるポリペプチド産物のグリコシル化パターンを変化させるために変化させ得る。これらの因子は、培地の組成、ｐＨ、酸素濃度、攪拌の欠如または存在、ならびに足場依存性細胞の場合、提供される表面を含む。従って、糖タンパク質のグリコシル化パターンは、これらのタンパク質が発現される宿主細胞および組換え宿主細胞が増殖する条件を選択することによって変更され得る。
【０１２５】
以下に説明するように、目的のポリペプチドおよびＲＮＡ分子はまた、遺伝的に操作された非ヒト動物において生成され得る。
【０１２６】
（遺伝子治療）
本発明のベクターはまた、遺伝子治療に有用である。本発明のベクターが、遺伝子治療のために細胞へ導入される場合、使用される方法およびベクターは、一般的に、組換え宿主細胞に対するベクター配列の安定な移入を提供する。このような場合において、ベクター配列は、宿主細胞において維持され、そして細胞子孫へ移入される。例えば、遺伝子移入ベクターにおけるレトロウイルスの長い末端反復配列を含むことは、組換え宿主細胞においてベクター配列の安定な維持を与えることが見出されている（Ｐｅｎｇ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．６９：１９３−１９８（１９９７）；Ｑｉｎｇ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５６６３−５６６７（１９９７））。従って、ベクター配列の染色体組み込みは、このような配列が、組換え宿主細胞において安定に維持され得る１つの機構である。これらの配列は、染色体位置を問わずにか、または１つ以上の特定の染色体遺伝子座（例えば、相同組換え）でかのいずれかで宿主細胞染色体へと組み込まれ得る。次いで、これらの組換え宿主細胞は、インビトロで培養され得るか、または個体へ導入され得る。
【０１２７】
本発明は、個体の宿主細胞へ本発明の核酸分子を導入する工程、および組換え宿主細胞の温度を調節する工程を含む、目的のポリペプチドまたはＲＮＡを生成するために個体中で目的の配列を発現するための方法を提供する。例えば、「熱」感受性レプリカーゼを発現し、そして目的のポリペプチドまたはＲＮＡをコードする配列を含む本発明のベクターは、インビトロでヒトのケラチノサイト、上皮細胞、または線維芽細胞へ導入され、次いでヒト被験体へ再導入され得る。このような例において、これらの細胞を含む組織の温度が、許容温度まで低下される場合、目的のポリペプチドまたはＲＮＡの発現が生じる。
【０１２８】
本発明はまた、宿主細胞へ本発明の核酸分子を導入する工程、これらの個体へ生じた組換え宿主細胞を導入する工程、そして目的のポリペプチドまたはＲＮＡ分子の発現を誘導する工程を含む、ポリペプチドまたはＲＮＡ分子を必要とする個体へポリペプチドまたはＲＮＡ分子を投与する方法を提供する。同様に、本発明の宿主細胞核酸分子は、インビボで個体の宿主細胞へ導入され得る。
【０１２９】
個体における遺伝子発現の誘導は、制限温度から許容温度へと温度を変化させることによって生じる。遺伝子治療をうける個体がヒトであり、そして目的の遺伝子の発現が特定の時間でのみ活性化されることが望ましい場合、３７℃が、通常、制限温度であり、そして遺伝子誘導は、許容温度へと温度を上昇または低下させることによって生じる。同様の様式において、目的の遺伝子の発現のために特定の温度のみで不活化されることが望ましい場合、３７℃が、通常、許容温度であり、そして遺伝子の不活化は、制限温度へと温度を上昇または低下させることによって生じる。
【０１３０】
個体へ導入された組換え宿主細胞は、個体において少なくとも一時的に維持される任意の細胞型か、または維持され、そして本発明のヌクレオチド配列を少なくとも一時的に保持しそして発現する任意の細胞型であり得る。組換え宿主細胞が導入される個体がヒトである場合、宿主細胞は、温度が、外的手段によって許容温度と制限温度との間で変更され得る領域へ移植され得る任意の型の細胞であり得る。例えば、組換え宿主細胞は、個体から取り出され、本発明のベクターを用いてトランスフェクトされ、そして皮膚温度が、通常３７℃または３７℃付近のままである表面付近の領域（腋窩）に再移植された、ヒトケラチノサイト、上皮細胞、または線維芽細胞であり得る。このような例において、遺伝子発現は、組換えケラチノサイトまたは繊維芽細胞を含む組織の温度を許容温度へと変化させることによって（例えば、組換え宿主細胞を含む位置を覆ってアイスパックまたはペルティエ素子を置くことによって）活性化され得る。従って、目的の遺伝子の発現の誘導は、個体の身体の一部（例えば、腋窩、腕、脚、手、足、首部など）のみの温度を、制限温度から許容温度へと変化させることを必要とする。
【０１３１】
組換え宿主細胞はまた、表面下の位置（皮膚組織）で哺乳動物に移植され得る。このような領域において組換え宿主細胞を導入する１つの利点は、これらの組織の温度が表面（皮膚組織）よりも安定に維持され、従って遺伝子発現が、気候条件における変化のような因子によってあまり活性化されそうにないことに由来する。安定な領域の位置は、個体および個体の正常な体温を含む多数の因子によって変わるが、安定な組織は、一般的に、皮膚組織、神経組織、および筋肉組織を含む。
【０１３２】
別の局面において、本発明は、個体の宿主細胞への本発明の核酸分子のインビボでの導入を含む工程、およびこれらの核酸分子によってコードされる異種ポリペプチドまたはＲＮＡ分子の発現を誘導する工程を含むポリペプチドまたはＲＮＡ分子を必要とする個体へ、ポリペプチドまたはＲＮＡ分子を投与する方法を提供する。哺乳動物組織へのアルファウイルスベクターのインビボでの導入方法は、Ａｌｔｍａｎ−Ｈａｍａｍｄｚｉｃ  Ｓ．ら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：８１５−８２２（１９９７））に記載される。
【０１３３】
さらなる局面において、個体の細胞へＲＮＡ分子を導入することによって、ポリペプチドまたはＲＮＡ分子を必要とする個体へポリペプチドまたはＲＮＡ分子を投与するための方法が提供される。これらのＲＮＡ分子は、インビトロでの転写および組換え宿主細胞発現を含む種々の方法によって得られ得る。ＲＮＡ分子は、インビトロまたはインビボでのいずれかで個体の細胞へ導入され得る。個体の宿主細胞へのＲＮＡ配列の導入方法は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．ら、米国特許第５，５８０，８５９号に記載される。
【０１３４】
本発明はまた、遺伝子治療ベクターとして有用である温度感受性レプリカーゼをコードする、非感染性パッケージ化ＲＮＡ分子を提供する。これらのベクターは、非感染性であり、組み込まれず、そして目的の遺伝子を温度感受性様式で発現するという利点を有する。この型のベクターは、目的の遺伝子産物の単一投与（例えば、ワクチン投与）が所望される種々の適用に有用である。
【０１３５】
本発明の核酸分子は、個体において安定に組み込まれた異種配列の、調節された発現に有用である。１つの適用において、糖尿病に罹患したヒト個体のケラチノサイトまたは繊維芽細胞は、組織生検によって取り除かれる。ヒトインシュリンをコードする目的の配列を含む本発明のＤＮＡ分子が、インビトロでこれらの細胞へ導入され、そして安定に組み込まれる。これらの組換え宿主細胞は、体温が比較的安定に維持される表面付近の位置（例えば、腋窩）に再移植される。食前か、またはインシュリン産生が所望される何か別の時に、個体は、組換え宿主細胞を含む位置を覆って特定の時間、アイスパックまたはペルティエ素子を置き、異種インシュリンをコードする配列の発現を誘導する。さらに、低温感受性レプリカーゼが用いられる場合、暖めるアイテム（ｗａｒｍ  ｉｔｅｍ）が個体によって使用され、許容温度へと温度を上昇させ得る。
【０１３６】
皮膚と接触するように置かれるこのアイテムの実際の温度は、用いられる温度感受性変異の型、個体、組換え宿主細胞の位置、所望される遺伝子発現のレベル、および他の因子によって変化する。
【０１３７】
（遺伝子操作された、非ヒト動物）
遺伝子操作された動物は、異種タンパク質の産生のために現在使用される（例えば、Ｊｅｎｇ、Ｓ．ら、Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．８０：３１６７−３１７５（１９９７）；Ｌｉｍｏｎｔａ  Ｊ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１：１０７−１１３（１９９５）を参照のこと）。これらのタンパク質は、しばしば、血液、乳および尿のような体液から採取される（Ｍｅａｄｅ，Ｈ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２１−２２（１９９８）；Ｋｅｒｒ，Ｄ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７５−７９（１９９８））。
【０１３８】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含む細胞を含む遺伝子操作された、非ヒト動物を提供する。これらの動物は、一般的に、それらの体細胞および生殖系細胞に安定して組み込まれた本発明の１つ以上のＤＮＡ分子を有する。生殖系細胞における本発明のＤＮＡ分子を有する動物を作製するための多くの方法は、当該分野において公知である（例えば、Ｈｅｗ，Ｃ．ら、米国特許第５，５４５，８０８号；Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒ，Ｐ．、米国特許第５，５７４，２０６号；Ｍｉｎｔｚ，Ｂ．、米国特許第５，５５０，３１６号；Ｗａｇｎｅｒ，Ｔ．ら、米国特許第４，８７３，１９１号を参照のこと）。例えば、ＤＮＡ分子は、受精した、発生学的発生の１細胞期と８細胞期との間の哺乳動物の卵母細胞に、マイクロインジェクションによって導入され得る。次いで、これらの卵母細胞は、適切な雌に移植されて、生殖系を通じて異種導入遺伝子を次世代へ安定して伝達する創始動物を産生する。一般的に、サザンブロット分析を用いて、任意の特定の個体のゲノムが、異種ＤＮＡ配列を保有するか否かを決定する。
【０１３９】
遺伝子操作された動物はまた、体細胞において排他的に本発明の核酸分子を含み得る。これらの分子を含む宿主細胞は、動物に移植され得るか、または核酸分子が、動物の宿主細胞へインビボで導入され得る。
【０１４０】
遺伝子操作された動物の細胞における目的の遺伝子の発現は、動物の全てまたは一部分の体温を制限温度から許容温度に変化させることによって誘導され得る。従って、用いられる動物の選択は、多くの因子（使用されるレプリカーゼの制限温度および許容温度、遺伝子操作されるべき動物の正常な体温、ならびに目的の遺伝子を含む）によって変化する。これらの動物は、温血かまたは冷血のいずれかであり得る。例えば、Ｈｅｗ，Ｃ．ら（米国特許第５，５４５，８０８号）は、「抗冷凍」遺伝子プロモーターに連結されるヌクレオチド配列を発現するトランスジェニック魚の作製を記載する。本発明の核酸分子を含むこのような動物における目的の配列の発現は、水温の変化により調節され得、この魚は制限温度と許容温度との間に保たれる。
【０１４１】
温血動物が本発明の核酸分子を含む場合、その動物の正常な体温は、制限温度かまたは許容温度のいずれかであり得る。さらに、多くの実例において、目的の遺伝子の発現は、任意のある時点で動物の一部分においてのみ誘導されるかまたは抑制されるかのいずれかである。例えば、温血動物の正常な体温が制限温度であり、かつ温度感受性レプリカーゼが「熱」感受性である場合、その動物は、その端部（例えば、足、腕、脚など）または表面組織が許容温度まで低下する条件下で保たれ得る。
【０１４２】
本発明の核酸分子を含む細胞を有する温血動物が、許容温度である正常な体温を有する場合、目的の遺伝子は、一般的にその動物の内部領域における細胞において発現される。このような動物は、乳腺および尿路上皮組織における目的の遺伝子の発現に特に有用である。例えば、Ｋｅｒｒ，Ｄ．ら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７５−７９（１９９８））は、尿路上皮細胞において外来遺伝子を発現するトランスジェニック動物の作製を記載する。これらの動物は、それらの尿において外来遺伝子産物を排出する。従って、目的の遺伝子産物は、そのような動物から容易に回収可能である。同様に、乳腺組織における目的の遺伝子の発現によって、遺伝子産物が動物の乳に排出されることとなり得る。
【０１４３】
従って、本発明は、少なくともいくつかの細胞中に本発明の核酸分子を含む、遺伝子操作された非ヒト動物をさらに提供する。いくつかのまたは全ての動物細胞のゲノムに安定して組込まれた本発明のＤＮＡ分子を含む、遺伝子操作された非ヒト動物もまた、提供される。本発明はまた、遺伝子操作された非ヒト動物を作製するための方法を提供し、この方法は、本発明の核酸分子を含む細胞をこれらの動物に導入する工程、本発明の核酸分子をこれらの動物の細胞にインビボで導入する工程、または本発明のＤＮＡ分子を生殖系細胞に導入して、それらの体細胞および生殖系細胞中に目的の配列を含むトランスジェニック動物を作製する工程を含む。
【０１４４】
（薬学的組成物）
本発明は、生理学的に受容可能なキャリアを含む溶液中にかつ治療学的有効量で、本発明のポリヌクレオチドを含む薬学的組成物をさらに提供する。例えば、これらの薬学的組成物の投与は、免疫原性でありそしてワクチン接種として機能することが意図される、動物の組織におけるポリペプチドの発現を生じ得る。同様に、目的の配列は、活性な苦痛の処置に必要とされるポリペプチドまたはＲＮＡ分子をコードし得る。従って、本発明の薬学的組成物の投与は、これらの場合において治療効果を有するよう意図される。
【０１４５】
本発明の核酸分子および組換え宿主細胞は、通常、薬学的に受容可能なキャリア中の個体に投与される。その投与がレシピエントの個体により寛容化され得る場合、組成物は、「薬理学的に受容可能」であるといわれる。さらに、本発明の組成物は、「治療学的有効量」（すなわち、所望の生理学的効果を生ずる量）において投与される。
【０１４６】
当業者によって理解されるように、本発明のＤＮＡ分子または組換え宿主細胞が個体に投与される場合、それらは、塩、緩衝剤、アジュバントまたは組成物の効力の改善のために所望される他の物質を含む組成物中に存在し得る。薬学的組成物の調製の際の使用に適切な材料の例は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｏｓｏｌ．Ａ．編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、（１９８０））を含む多くの出典において提供される。
【０１４７】
本発明の治療組成物は、当該分野で公知の種々の手段によって投与され得るが、通常は、注射、注入または他の適切な物理的方法により投与される。あるいは、この組成物は、筋肉内、静脈内、または皮下に投与され得る。投与のための組成物の成分としては、無菌の水性（例えば、生理食塩水）または非水性の溶液および懸濁液が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。キャリアまたは閉鎖包帯を使用して、皮膚の浸透性を増大させ得、そして抗原の吸収を増強させ得る。
【０１４８】
組換え宿主細胞が、個体に投与される場合、治療有効量を提供するために必要とされる細胞または核酸分子の数は、個体の状態、発現されることが意図されるタンパク質またはＲＮＡ分子、および個体の大きさのような因子によって変化する。
【０１４９】
（実施例）
以下の酵素および試薬を、以下の実施例において記載される実験において使用した：Ｐｗｏ  ポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび制限酵素をＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ（９１１５  Ｈａｇｕｅ  Ｒｏａｄ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ  ４６２５０）より入手した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、バクトトリプトンおよび酵母抽出物を、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  ６８、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，１４０７２、ＵＳＡ）から入手した。Ｂｓｐ１２０  Ｉを、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｉｎｃ．（３００  Ｐｅａｒｌ  Ｓｔ．Ｂｕｆｆａｌｏ、ＮＹ，１４２０２、ＵＳＡ）から入手した。ＸＬ−１  Ｂｌｕｅコンピテント細胞を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（１１０１１  Ｎｏｒｔｈ  Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｒｏａｄ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，９２０３７、ＵＳＡ）から入手した。ＤＮＡ精製キットおよびＴａｑポリメラーゼを、ＱＩＡＧＥＮ，ＩＮｃ．、（９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１、ＵＳＡ）から入手した。ＨＰ−１培地を、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。全ての標準化学物質を、Ｆｌｕｋａ（９８０  Ｓｏｕｔｈ  ２ndＳｔ．，Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ，ＮＹ，１１７７９，ＵＳＡ）、Ｓｉｇｎａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ
１４５０８、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ  ６３１７８、ＵＳＡ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（１００１  Ｗｅｓｔ  Ｓｔ．Ｐａｕｌ  Ａｖｅ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ、５３２３３、ＵＳＡ）から入手し、そして全ての細胞培養の材料を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．（１  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、０７４１７、ＵＳＡ）から入手した。
【０１５０】
（実施例１）
（ｐＣＹＴｔｓベクター系の構築）
ＤＮＡの操作および配列決定を、標準的手順により実行した。ｎｓＰ２における変異を、以下のオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲにより導入した：
オリゴ−ｎｓｐ２  １：５’−ＡＡＣＡＴＴＧＡＡＡＴＣＧＡＴＡＴＴＡＣＡＧＧＧＧ（配列番号２）、
オリゴ−ｎｓｐ２  ２：５’−ＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＧＧＧＣ（配列番号３）、
オリゴ−ｎｓｐ２  ３：５’−ＧＴＧＣＣＣＴＣＣＣＣＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＡＡＴＴＣＡＧＧＧＣＣＧＡＡＣＧＣＧ（配列番号４）、および
オリゴ−ｎｓｐ２  ４：５’−ＧＡＡＴＴＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＧ（配列番号５）（第１の分析および続くクローニングに使用される単一の制限部位（ＤｒａＩ、ＣｌａＩおよびＳａｌＩ）は下線部である）。ＰＣＲ反応を、オリゴ−ｎｓｐ２  １（配列番号２）およびオリゴ−ｎｓｐ２  ３（配列番号４）、またはオリゴ−ｎｓｐ２  ２（配列番号３）およびオリゴ−ｎｓｐ２  ４（配列番号５）のいずれかを用いて実行した。１００ｐｍｏｌの各オリゴを使用し、そして４単位のＴａｑまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰおよび１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ4を含む１００μｌ反応混合物中で５ｎｇの鋳型ＤＮＡ（ｐＳｉｎＲｅｐ５：Ｘｉｏｎｇ，Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４３：１１８８−１１９１（１９８９））を使用した。全てのＤＮＡ濃度を、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，８００  Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ  Ａｖｅ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、０８８５４）を使用して測光により決定した。ＰＣＲ反応を開始する前に、ポリメラーゼを直接添加した（開始点は９５℃であった）。温度サイクルは、以下であった：９５℃で２分間、続いて９５℃（４５秒間）、５８℃（３０秒間）、７２℃（９０秒間）を５サイクル、そして続いて９５℃（４５秒間）、６８℃（３０秒間）、７２℃（９０秒間）を２５サイクル。
【０１５１】
２つのＰＣＲフラグメントを、Ｑｉａ  ｓｐｉｎＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）を使用して精製し、そして最終的に２０単位のＳａｌＩおよびＤｒａＩ、それぞれ２０単位のＣｌａＩおよびＤｒａＩを使用して、適切な緩衝液中で消化した。この消化を、３７℃で１２時間行った。ＤＮＡフラグメントをゲル精製し（Ｇｅｎｅ−Ｃｌｅａｎ；Ｂｉｏ  １０１  Ｉｎｃ．，１０７０  Ｊｏｓｈｕａ  Ｗａｙ、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ、９２０８３、ＵＳＡ）、そして最終的に、ＣｌａＩ／ＳａｌＩで消化され、そしてゲル精製されたＳｉｎＲｅｐ５ベクター（Ｘｉｏｎｇ，Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１１８８−１１９１（１９８９））に連結した。得られたベクターの正確な配列を、ｎｓＰ２遺伝子全体のＤＮＡ配列決定により調べた。
【０１５２】
ｎｓＰ４における変異をまた、以下のオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって導入した：
オリゴ−ｎｓｐ４  １：５’−ＧＧＴＡＧＡＣＧＡＧＡＣＡＧＴＣＧＣＡＴＧＣＣＴＧＧＡＴＡＣ（配列番号６）、
オリゴ−ｎｓｐ４  ２：５’−ＧＴＡＴＣＣＡＧＧＣＡＴＧＣＧＡＣＴＧＴＣＴＣＧＴＣＴＡＣＣ（配列番号７）、
オリゴ−ｎｓｐ４  ３：５’−ＣＡＧＡＣＣＧＧＴＴＡＡＣＧＣＣＡＴＡＧＣＧＴＣＧ（配列番号８）、および
オリゴ−ｎｓｐ４  ４：５’−ＣＴＣＴＡＴＴＡＣＴＡＧＴＡＴＧＧＡＣＡＧＴＴＧＧ（配列番号９）（第１分析および最終クローニング工程について使用される単一の制限部位（ＳｐｈＩ、ＨｐａＩおよびＳｐｅＩ）は下線部である）。２つのＰＣＲ反応を、オリゴ−ｎｓｐ４  １（配列番号６）およびオリゴ−ｎｓｐ４  ３（配列番号８）かまたはオリゴ−ｎｓｐ４  ２（配列番号７）およびオリゴ−ｎｓｐ４  ４（配列番号９）のいずれかを使用して上記のように実行した。
【０１５３】
両方のＰＣＲ産物を、ゲル精製し、次いで、ｎｓＰ４遺伝子全体を増幅するためにアセンブリＰＣＲにおいて使用した。アセンブリＰＣＲについて、５０ｐｍｏｌの外側プライマー（３および４）ならびに約１０ｎｇの各ＰＣＲフラグメントを使用した。反応容量は、１００μｌであった（４単位のＴａｑまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰおよび１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む）。ＰＣＲ条件は以下であった：
９５℃で２分間、続いて９２℃（４５秒間）、５８℃（３０秒間）、７２℃（１２０秒間）の５サイクル、そして続いて９２℃（４５秒間）、６４℃（３０秒間）、７２℃（１２０秒間）の２５サイクル。
【０１５４】
得られたＰＣＲフラグメントを上記のように精製し、そして溶出液を適切な緩衝液中で、２０単位のＳｐｅＩおよびＨｐａＩを用いて消化した。このフラグメントをゲル精製し、そしてゲル精製ＳｐｅＩ／ＨｐａＩ制限ＳｉｎＲｅｐ５ベクターに連結した。得られたベクターの正確な配列を、ＤＮＡ配列決定により調べた。
【０１５５】
ＳｐｅＩ／ＨｐａＩを用いたＳｉｎＲｅｐ５−ｎｓＰ４ｍｕｔおよびＳｉｎＲｅｐ５−ｎｓｐ２ｍｕｔの一晩の消化、そしてｎｓｐ４フラグメントおよびＳｉｎＲｅｐ−ｎｓｐ２ｍｕｔベクターのゲル精製。ｎｓｐ４ｍｕｔフラグメントを、ＳｉｎＲｅｐ５−ｎｓｐ２ｍｕｔベクター中に連結した。最終工程は、ＣｌａＩおよびＨｐａＩを制限エンドヌクレアーゼとして用いての、９８７／ＳｉｎＲｅｐ５ベクター（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９−６４４６（１９９３））中へのｎｓｐ遺伝子のクローニングであった。生じたベクターをｐＣＹＴｔｓと称した（図２および図３Ａ〜３Ｄ（配列番号１））。
【０１５６】
ｐＣＹＴｔｓ構築物：５つの異なる遺伝子を、ｐＣＹＴｔｓベクターにクローニングした。グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、分泌アルカリホスホターゼ（ＳＥＡＰ）、β−インターフェロン（β−ＩＮＦ）、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、およびＨＩＶ  ｇｐ１６０。
【０１５７】
（実施例２）
（一過的発現および安定した発現におけるＧＦＰの調節された発現）
細胞質性タンパク質（例えば、本発明者らはクラゲＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａのグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用した（Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３１５−３１９（１９９６））を発現するために、ｐＣＹＴｔｓ系を首尾良く使用した。ＧＦＰを、ＸｂａＩおよびＢｓｐ１２０  Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を介してｐＣＹＴｔｓ中に連結する。正確な挿入物を有するクローンを制限消化により同定した。ＧＦＰ発現を、一過的発現および安定した発現の両方において試験した。
【０１５８】
ＢＨＫ２１細胞における一過的トランスフェクションを、ＣａＰＯ4沈殿トランスフェクションプロトコルを用いて実行した：３０μｌ  Ｈ2Ｏ中の６μｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＣＹＴｔｓ  ＧＦＰ）を、３０μｌの１Ｍ  ＣａＣｌ2溶液と混合した。６０μｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．０５）の添加後、この溶液を５秒間ボルテックスにかけ、続いて室温で２５秒間インキュベートした。直ちにこの溶液を、２％ＦＣＳを含む２ｍｌのＨＰ−１培地（２％ＦＣＳ培地）に添加した。次いで、６ウェルプレート中８０％コンフルエントなＢＨＫ２１細胞培養物の培地を、ＤＮＡを含む培地によって置換した。ＣＯ2インキュベーター中３７℃で５時間のインキュベーション後、ＤＮＡ含有培地を、２％ＦＣＳ培地中の１５％グリセロール２ｍｌにより置換した。３０秒間のインキュベーション段階の後、グリセロール含有培地を除去し、そして細胞を５ｍｌのＨＰ−１培地（１０％ＦＣＳを含む）で洗浄した。最終的に、１０％ＦＣＳを含む新鮮なＨＰ−１培地２ｍｌを添加した。
【０１５９】
ｐＣＹＴｔｓＧＦＰを用いたＢＨＫ細胞の一過的トランスフェクションの後、発現を３７℃で試験した。ＧＦＰの発現は、以下に記載の方法を用いて検出されなかった。温度が２９℃にシフトダウンされた場合、ＧＦＰは産生された。ＧＦＰ発現細胞は、少なくとも５日間生存した。
【０１６０】
ＢＨＫ２１細胞における安定したトランスフェクション。安定したトランスフェクションを、安定したトランスフェクションのために線状化プラスミドＤＮＡを用いたのを除いて、一過的トランスフェクションについて本質的に記載されるように実行する。２０μｇのｐＣＹＴｔｓＧＦＰを、適切な緩衝液中で３０単位のＮａｅＩとともに、３７℃で少なくとも４時間インキュベートした。反応を、フェノール／クロロホルム抽出、続いて線状化ＤＮＡのイソプロパノール沈殿により停止した。制限反応を、エチジウムブロマイドで染色した０．８％アガロースゲルを用いるゲル電気泳動により調べた。トランスフェクションについて、５．４μｇの線状化ｐＣＹＴｔｓＧＦＰを、３０μｌ  Ｈ2Ｏにおける０．６μｇの環状ｐＳＶｔｒｐＢ（選択プラスミド）と混合した。一過的トランスフェクションについて記載された手順が続く。
【０１６１】
安定してトランスフェクトされた細胞を選択し、そして選択培地（トリプトファンを含まず、３００μＭインドールおよび５％透析ＦＣＳが補充されているＨＰ−１培地）においてＣＯ2インキュベーター中３７℃で増殖させた。混合した集団が、コンフルエンシーまで増殖した場合、培養物を２つの部分に分け、そして両部分を３７℃でさらに１２時間培養した。次いで、一方の部分の細胞を３０℃にシフトさせて、目的の遺伝子の発現を誘導した。他方の部分は３７℃に保った。
【０１６２】
（遺伝子発現の検出）
グリーン蛍光タンパク質は、その強い蛍光に起因して、分光蛍光計において容易に検出され得る。このことは、ＧＦＰが細胞の細胞質に位置する場合に見られる。ＧＦＰ産生は蛍光顕微鏡により検出され、そして細胞全体の分光蛍光分析（分光蛍光分析器、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＲＦ−５００１ＰＣ）により定量した。剥離した細胞を５ｍｌ  ＰＢＳ（１リットルあたり：０．１３２ｇ  ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ；０．２０ｇ  ＫＣｌ；０．２０ｇ  ＫＨ2ＰＯ4；０．１０ｇ  ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ；８ｇ  ＮａＣｌ；１．１５ｇ  Ｎａ2ＨＰＯ4；ｐＨ７．２）を用いて洗浄し、そして１ｍｌ  ＰＢＳ中に再懸濁した。励起波長は、３９７ｎｍであり、そして発光波長は５１０ｎｍであった。蛍光検出についての直線的範囲における測定を実行するために、細胞を希釈して、０．０５と１．０との間の放射単位の蛍光を得た。
【０１６３】
最適な誘導温度を決定するために、安定してトランスフェクトされた細胞の混合集団の培養物を、ＦＣＳを含まない選択培地において異なる温度で４８時間インキュベートした。培養物を３４℃以下にシフトさせた場合、発現が誘導された。最も高い発現は、２９℃で検出された（図４Ａ）。安定してトランスフェクトされた細胞を３０℃で４時間誘導し、続いて、３７℃で２４時間増殖させた場合、緑色の細胞が、蛍光顕微鏡法により観察され得た。このことは、明らかに、目的の遺伝子の発現が、４時間の誘導後に始まることを示した（図６Ａ）。
【０１６４】
（時間依存性）
この系の反応速度を、誘導後の異なる時点での測光により決定した。ＧＦＰ発現は上記のように検出された。誘導１０時間後、ＧＦＰの明らかな発現は、２９℃で検出可能である（図５Ａ）。誘導後、細胞を３７℃にシフトして戻した場合、新しいｍＲＮＡ生成は、妨げられるべきであるが、しかし、目的のタンパク質の翻訳は、高い発現レベルで生じるべきである。誘導の４、６、８、または１０時間後、細胞を３７℃にシフトし戻し、２４時間後、ＧＦＰの発現は上記のように検出された（図６Ａ）。従って、転写は、誘導後短時間で始まる。
【０１６５】
（細胞株の長期安定性）
目的の遺伝子の長期発現を決定するために、安定してトランスフェクトされた細胞を、３７℃で少なくとも８週間培養した。ＧＦＰの発現を、細胞を２９℃にシフトすることによって試験した。安定したトランスフェクション後に直接使用した細胞と少なくとも４週間培養した細胞との間では、ＧＦＰの発現レベルにおいて差異が観察されなかった。
【０１６６】
（実施例３）
（一過的発現および安定した発現におけるＳＥＡＰの調節された発現）
ｐＣＹＴｔｓ系を首尾良く用いて、分泌タンパク質（本発明者らは、ヒト起源の分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、１０２０  Ｅａｓｔ  Ｍｅａｄｏｗ  Ｃｉｒｃｌｅ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、９４３０３、ＵＳＡ）を例として使用した）を発現させた。ＳＥＡＰコード配列を、ＸｂａＩおよびＳｔｕＩを介してｐＣＹＴｔｓ中に連結する。正確な挿入物を有するクローンを、制限消化により同定した。ＳＥＡＰ発現を、一過的発現および安定した発現の両方について試験した。
【０１６７】
ＢＨＫ２１細胞における一過的トランスフェクションを、実施例２に記載されるように、ＣａＰＯ4共沈トランスフェクションプロコトルを用いて実行した。
【０１６８】
（ＢＨＫ２１細胞における安定したトランスフェクション）
安定したトランスフェクションを、線状化プラスミドＤＮＡを使用したことを除いて、本質的に、一過的トランスフェクションについて記載された通り、実行した。２０μｇのｐＣＹＴｔｓＳＥＡＰを、３０単位のＭｌｕＩと共に適切な緩衝液中で、３７℃で少なくとも４時間インキュベートした。１０μｇのｐＳＶｎｅｏを、３０単位のＳｃａＩを用いて、３７℃で少なくとも４時間消化した。両方の反応を、フェノール／クロロホルム抽出、続いて線状化ＤＮＡのイソプロパノール沈殿により停止させた。この制限反応を、エチジウムブロマイドで染色した０．８％アガロースゲルを用いたゲル電気泳動により調べた。トランスフェクションのために、５．８８μｇの線状化ｐＣＹＴｔｓＳＥＡＰを、３０μｌ  Ｈ2Ｏ中の０．１２μｇの線状化ｐＳＶｎｅｏ（選択プラスミド）と混合する。一過的トランスフェクションについて記載された手順が続く。
【０１６９】
（遺伝子発現の検出）
ｐＣＹＴｔｓＳＥＡＰを含む、一過的にトランスフェクトされた細胞および安定してトランスフェクトされた細胞を、３日間の誘導後、ドットプロットによってＳＥＡＰ発現について試験した。２．５μｌの細胞培養上清を、ニトロセルロース膜上にスポットした。この膜を室温、１０分間で乾燥した後、アルカリホスファターゼ検出試薬（５０μｌ  ＮＢＴ溶液（７０％  ジメチルホルムアミド中、７．７％ニトロブルーテトラゾリウム（Ｓｉｇｍａ））および３７μｌのＸ−リン酸溶液（ジメチルホルムアミド中、５％の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）を含有する１０ｍｌ  ＡＰ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５））を用いて、発色反応を行った。
【０１７０】
ＳＥＡＰ活性を比色酵素活性試験において定量した。ＳＥＡＰを含む５００μｌの培養上清を６５℃で５分間インキュベートし、そして最終的には遠心分離した（２０，０００ｇ；２０秒間）。ＳＥＡＰ活性を決定するために、遠心分離して得られた上清の４００μｌを、キュベット中で、５００μｌの２×ＳＥＡＰ緩衝液（２０ｍＭ  Ｌ−ホモアルギニン、２Ｍ  ジエタノールアミン、および１ｍＭ  ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ｐＨ９．８）と混合した。１００μｌニトロフェニルホスフェート（１２０ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ  １０４、Ｓｉｇｍａ）をサンプルに添加した後、ＳＥＡＰ活性を分光光度計において、４０５ｎｍで追跡した。吸光度を１０分間にわたって３０秒毎に測定した。異なる時点で得られた値を、時間に対してプロットし、そして線形の傾きを有するプロットが得られた。
【０１７１】
混合された集団において、１細胞あたり産生されるＳＥＡＰ分子の量は、１細胞あたり約１０7分子であると見積もられた。ＳＥＡＰの安定した発現を得るために、クローン化された細胞をセルソーター中において自動的に分別し、そして最終的にはＳＥＡＰ活性について分析した。２０クローンのうち約１つがＳＥＡＰ発現を示した。ＳＥＡＰ発現は、混合された集団中よりも１桁大きいと見積もられた。
【０１７２】
最も高いＳＥＡＰ発現は、２９℃で検出された（図４Ｂ）。ＳＥＡＰ活性は、２９℃でのインキュベーションの１５時間後、検出され得た。しかし、ＳＥＡＰの発現は、図６Ｂに示されるように、ずっと早く始まった。ＳＥＡＰ発現細胞を４、６、８または１０時間の誘導後３７℃にシフトし戻し、２４時間後、ＳＥＡＰの発現が上記のように検出された。ＳＥＡＰ発現は、誘導後６時間という早いときに検出され得た（図６Ｂ）。従って、ＳＥＡＰ発現はまた、誘導後短時間で始まった。
【０１７３】
（実施例４）
（一過性および安定な発現におけるβ−ＩＮＦの調節された発現）
ヒト起源のβ−インターフェロン遺伝子を使用して、ｐＣＹＴｔｓ系が抗ウイルス性分泌タンパク質を発現するために使用され得ることを実証した。β−インターフェロンは、抗ウイルス活性を有し、そしてＲＮＡ複製を妨げる。ｐＣＹＴｔｓ系は、遺伝子がＲＮＡ複製を妨げるタンパク質をコードする場合であっても、これらの遺伝子の発現を厳密に調節する。
【０１７４】
β−インターフェロンをコードする遺伝子を、Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕ．Ｃ．およびＰｅａｒｌ．Ｌ．（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．５：８２７〜８２９（１９９２））において記載されるように生成した。プライマーを、ＧｅｎＢａｎｋの報告Ｖ００５３４、Ｊ００２１８、Ｋ００６１６、およびＭ１１０２９において開示されるヒトβ−インターフェロンヌクレオチド配列を使用して生成した。β−インターフェロンｃＤＮＡを、ＸｂａＩおよびＢｓｐ１２０Ｉを用いた制限後にｐＣＹＴｔｓ中に連結した。β−インターフェロンの発現を、一過性および安定な発現系において試験した。
【０１７５】
β−ＩＮＦの一過性および安定（混合された集団）な発現をウエスタンブロッティングによって測定した。０．５ｍｌの培養培地をメタノール／クロロホルム沈殿し、そしてペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中に再懸濁した。サンプルを１５％アクリルアミドゲルにアプライする前に、５分間９５℃で加熱した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、タンパク質をＰｒｏｔａｎニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ．Ｉｎｃ．、１０  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ａｖｅ．、Ｋｅｅｎｅ．ＮＨ０３４３１．ＵＳＡ）にトランスファーした。この膜をＴＢＳ（１０×ＴＢＳ、１リッターあたり：８７．７ｇ  ＮａＣｌ、６６．１ｇ
Ｔｒｉｚｍａ塩酸塩（Ｓｉｇｍａ）および９．７ｇ  Ｔｒｉｚｍａベース（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４）中の１％ウシアルブミン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、１時間室温でブロックし、その後、マウス抗ヒトβ−ＩＮＦ抗体（０．２μｇ／ｍｌ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を用いて１時間インキュベートした。このブロットを３回、１０分間、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）で洗浄し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ−抗マウスＩｇＧ結合体（０．１μｇ／ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）とともに、１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔを用いて１０分間２度洗浄した後、ＴＢＳを用いて１０分間２度洗浄し、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて発色した。
【０１７６】
２９℃でのインキュベーションの３または５日後、サンプルをブロットのために採取した。培養物の別の部分を、３７℃に保ち、そしてサンプルを５日後に採取した。図８Ａは、β−ＩＮＦが２９℃での３日後に生成され、一方、３７℃でのインキュベーションは、検出可能なβ−ＩＮＦ産生を生じなかったことを示す。
【０１７７】
（実施例５）
（一過性発現におけるＥＰＯの調節された発現）
ｐＣＹＴｔｓ系を、首尾よく使用して、薬学的に関連する分泌タンパク質を発現した。そのような発現の例として、発明者らは、ヒト起源のエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする遺伝子を使用した。この遺伝子は、実施例４に記載されるようにＰＣＲによって生成された。プライマーを、ＧｅｎＢａｎｋの報告Ｘ０２１５８において開示されるヒトＥＰＯヌクレオチド配列を使用して生成した。ＥＰＯをコードする遺伝子を、ＸｂａＩおよびＢｓｐ１２０Ｌ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いた制限の後に、ｐＣＹＴｔｓ中に連結した。正確な挿入物を有するクローンを制限消化によって同定した。ＥＰＯ発現を一過性および安定な発現系の両方において試験した。
【０１７８】
ＢＨＫ２１細胞を、実施例２に記載のように、ＣａＰＯ4共沈殿プロトコールに従って、一過性にトランスフェクションした。
【０１７９】
ＥＰＯ産生を、実施例４に記載のように、ウエスタンブロッティングによって測定した。この検出を、ニトロセルロース膜を、１０ｍｌのＴＢＳ−Ｔ中の２μｇのウサギ抗ヒトＥＰＯ抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）で１時間インキュベートし、その後ＴＢＳ−Ｔを用いて各１０分間３回の洗浄によって行った。最後に、このニトロセルロース膜を、ＴＢＳ−Ｔ中に１：５０００に希釈したアルカリホスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｉｎｃ．）とともに、１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔでの１０分間の２度の洗浄およびＴＢＳでの１０分間の２度の洗浄の後、このブロットを実施例３に記載のように、アルカリホスファターゼ染色によって発色した。一過性のトランスフェクションした細胞は、４日間、２９℃で、検出可能な量のＥＰＯの産生を誘導した（図８Ｂ）。
【０１８０】
（実施例６）
（安定な発現におけるＥＰＯの調節された発現）
ｐＣＹＴｔｓ５０４ＥＰＯ発現ベクターにおいて、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）コード配列（増殖培地中への分泌のためのその天然のリーダーペプチドを含む）をシンドビスウイルスカプシドタンパク質（Ｃタンパク質）をコードする配列と、インフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）で、融合した。この構築物の合理性は、Ｃタンパク質のコード領域内に位置する翻訳エンハンサーを欠く構築物と比較すると１０倍から２０倍増加した発現レベルをもたらすことが示されているエンハンサー（Ｆｒｏｌｏｖら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１３７１〜１１３７７（１９９６））を含むということであった。この融合遺伝子は、発現ベクターｐＣＹＴｔｓのサブゲノムプロモーターから発現される。Ｃタンパク質の自己タンパク質分解活性によって触媒される、融合タンパク質からのＥＰＯ前駆体の同時翻訳の放出の際に、ＥＰＯは、そのＮ末端リーダーペプチドによって分泌経路に方向付けされる。
【０１８１】
安定なトランスフェクションのために、３：１の割合のｐＣＹＴｔｓ５０４ＥＰＯ（ＭｌｕＩを用いる制限切断により直線化された）およびネオマイシン耐性付与プラスミド９８７ＢＢｎｅｏ（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９〜６４４６（１９９３））（ＳｃａＩを用いる制限切断により直線化された）を、実施例２に記載のリン酸カルシウム共沈殿プロトコールを用いて、ＢＨＫ２１細胞に導入した。選択条件（１０％ＦＣＳおよび２００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ネオマイシン）を補充したＨＰ−１培地）下における３７℃での１週間のインキュベーションの後、単一のコロニーを分離して、さらに同一の条件下で増殖した。
【０１８２】
ＥＰＯ分泌クローンをスクリーニングするために、細胞を、１２ウェルプレート中で、３７℃で８０％コンフルエンスまで増殖し、そしてさらに４日間、３０℃でインキュベートした。各培養物上清の３μｌを、抗ＥＰＯウサギＩｇＧおよび抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ結合体を用いて、ドットブロット分析によって分泌されたＥＰＯについて分析した。調査した２７クローンの内、１つのＥＰＯ分泌クローンを同定した。ＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、上清１リッターあたり２．５ｍｇのＥＰＯのおよその濃度を推定した。分泌されたタンパク質の同定をウエスタンブロット分析によってさらに確認した。その目的のために、細胞を、Ｇ４１８（２００μｇ／ｍｌ）を補充した３０μｌのＨＰ−１培地（ＦＣＳなし）を含むＴ−７５細胞培養フラスコ中で、３７℃で、８０％コンフルエンスまで増殖させ、次に３０℃でさらに４日間インキュベートした。培養上清の２０μｌを１５％  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、そしてニトロセルロース膜上にブロットした。抗ＥＰＯウサギＩｇＧ／抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ結合体系を使用して、異なる供給源由来の本物のＥＰＯサンプルと同一の電気泳動移動度（見かけの分子量、約２９ｋＤａ）を示す単一のタンパク質を特異的に検出した（図９）。生じた細胞株を、１Ｃ４と称した。
【０１８３】
（実施例７）
（ＥＰＯ  ＲＮＡを含有するシンドビスウイルス粒子の生成）
ＲＮＡａｓｅを含有しない１μｇのベクター（ｐＤＨ−ＥＢ；Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１１：６４３９〜６４４６（１９９３））を、ＥｃｏＲＩ消化によって直線化した。続いて、ＳＰ６インビトロ転写キット（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるＩｎｖｉｔｒｏｓｃｒｉｐＣＡＰ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
ＢＶ、ＮＶ  Ｌｅｅｋ．Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、インビトロの転写を行った。生じる５’−キャップされたｍＲＮＡを還元アガロースゲル上で分析した。
【０１８４】
５μｇのインビトロ転写したｍＲＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのマニュアル（シンドビス発現系、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＶ．Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に従い、１Ｃ４細胞株（実施例６）にエレクトロポーレーションした。３７℃での１０時間のインキュベーションの後、ＦＣＳ含有培地を、ＦＣＳを含有しないＨＰ−１培地に交換して、続いて、３０℃で７２時間さらにインキュベーションをした。上清をＢＨＫ２１細胞層に継代して、２時間４℃でインキュベートして、そして最後に捨てた。この細胞をＨＰ−１緩衝液で４回洗浄し、そして２４時間３０℃でインキュベートした。この培養上清の３μｌを、抗ＥＰＯウサギＩｇＧおよび抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ結合体を使用するドットブロット分析によって分泌されたＥＰＯについて分析した（図１０）。
【０１８５】
（実施例８）
（一過性発現におけるｇｐ１６０の調節された発現）
ｐＣＹＴｔｓ系を使用して、ｇｐ１６０（ＨＩＶエンベロープタンパク質）を発現した。ｇｐ１６０遺伝子を、ｐＡｂＴ４６７４（ＡＴＣＣ４０８２９）より増幅し、そしてＸｂａＩおよびＢｓｐ１２０Ｌを介して、ｐＣＹＴｔｓ中にクローン化した。ＢＨＫ２１細胞をリポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して一過性にトランスフェクトした。１５０μｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中の０．８μｇ  ｐＣＹＴｔｓ  ｇｐ１６０  ＤＮＡを、２．５μｌのリポフェクタミンを含有する１５０μｌのＤＭＥＭと混合した。この溶液を室温で１５分インキュベートして、そして２４ウェルプレート中の８０％コンフルエントのＢＨＫ細胞層に添加した。ＣＯ2インキュベーター中の３７℃での５時間のインキュベーションの後、この細胞を洗浄して、さらに１２時間３７℃でインキュベートした。細胞を分け、そして一部を２９℃でインキュベートし、一部を３７℃で５日間インキュベートした。細胞を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で溶解した。サンプルを９５℃で５分間加熱し、そして８％アクリルアミドゲルに供した。ｇｐ１６０発現を、実施例４に記載のように、ウエスタンブロッティングによって分析した。ニトロセルロース膜を、１０ｍｌのＴＢＳ−Ｔ中に１：３０００に希釈したウサギ抗ヒトｇｐ１６０抗体（Ｓｃｈａｗａｌｌｅｒ博士、Ｄｉａｍｅｄ  ＡＧ．Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄより親切に提供された）とともに１時間インキュベートし、次にＴＢＳ−Ｔとともに１０分間、３回洗浄した。次に、この膜を、１０ｍｌのＴＢＳ−Ｔ中に１：５０００に希釈したアルカリホスファターゼ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｉｎｃ．）とともに１時間インキュベートした。この膜をＴＢＳ−Ｔで１０分間２度洗浄し、そしてＴＢＳで１０分間２回洗浄した。実施例３に記載のように発色を行った。一過性にトランスフェクトした細胞は、検出可能な量のｇｐ１６０を産生した（データ示さず）。
【０１８６】
（実施例９）
（ヒト包皮線維芽細胞におけるＧＦＰの調節された発現）
ｐＣＹＴｔｓ系を使用して、ヒト包皮線維芽細胞においてグリーン蛍光タンパク質を発現させた。リポフェクタミンを実施例８に記載されるように使用して細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの１２時間後に、この細胞の一部を３７℃でインキュベートして、他方の一部を２９℃でインキュベートした。４８時間後、明るい緑色の細胞が、２９℃でインキュベートした培養物において、蛍光顕微鏡で観察された。一方、３７℃では、ＧＦＰの発現は全く検出されなかった。
【０１８７】
（実施例１０）
（センス方向における挿入物を有するマルチベクター系）
本発明の調節可能なベクター系を、非細胞障害性ウイルス粒子の生成のために使用した。目的の遺伝子として、本発明者らは、シンドビスウイルスの構造タンパク質を選択し、そしてマーカータンパク質として本発明者らはＧＦＰを選択した。細胞を、実施例２に記載のように、ｐＣＹＴｔｓＧＦＰを用いて安定にトランスフェクトした。安定にトランスフェクトした細胞を、実施例２に記載のプロトコールに従って、シンドビスウイルス構造タンパク質を保有する欠損ヘルパー構築物（ｐＤＨＢＢ；Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１１：６４３９〜６４４６（１９９３））を用いて、一過性のトランスフェクトをした。
【０１８８】
トランスフェクトした細胞を３７℃で一晩増殖した。次に、この細胞を２９℃に移し、ウイルス遺伝子発現を誘導した。形成されたウイルス粒子は、パッケージされたｐＣＹＴｔｓＧＦＰ  ＲＮＡ配列を含有し、そしてＧＦＰを、パッケージされたウイルス粒子が新たな標的細胞に感染する場合に発現する。新たな感染を行うために、発現の４日後に、培地を回収し、そして遠心分離（１８００ｒｐｍ；３分）した。上清を８０％コンフルエントのＢＨＫ細胞層上に配置し、そして２９℃で４時間インキュベートした。インキュベートの期間の後、この培地を捨て、そしてこの細胞を５ｍｌのＨＰ−１培地で３回洗浄し、次に、２９℃でさらに２４時間インキュベーションした。最後に、マーカー遺伝子ＧＦＰの発現レベルを、実施例２に記載のように、蛍光顕微鏡で測定した。
【０１８９】
約１０％のＢＨＫ細胞が初めにＧＦＰを産生し、２９℃でのさらなる２４時間のインキュベーションの後、全ての細胞がＧＦＰを産生した。これらの細胞の馴化培地を再度回収し、遠心分離し、そしてＢＨＫ細胞の８０％コンフルエント層の上に配置した。２９℃でのインキュベーションの４８時間後、これらの細胞の１００％がＧＦＰを発現したことが見出された。
【０１９０】
コントロールとして、トランスフェクトした細胞を、馴化培地を回収し、そして遠心分離（１８００ｒｐｍ、３分間）した後、３７℃で５日間増殖した。上清を８０％コンフルエントのＢＨＫ細胞層上に配置した。２９℃でのインキュベーションの８時間後、この培地を取り除き、そしてこの細胞を５ｍｌのＨＰ−１培地で３回洗浄し、そして２９℃でさらに２４時間インキュベートした。最後に、ＧＦＰの発現レベルを測定する。ＧＦＰ発現細胞は、検出されなかった（図７Ａおよび７Ｂ）。
【０１９１】
（実施例１１）
（アンチセンス方向における挿入物を有するマルチベクター系）
モデル系として、本発明者らは、ウイルス粒子の産生をともなう調節可能な系を試験した。目的の遺伝子として、本発明者らは、シンドビスウイルスの構造タンパク質を選択し、そしてマーカータンパク質として本発明者らはＧＦＰを選択した。細胞を、実施例２に記載のように、ｐＣＹＴｔｓＧＦＰを用いて安定にトランスフェクトした。
【０１９２】
アンチセンスヘルパーベクターを以下のように構築した：
構造タンパク質を、ｐＨＤＢＢベクター（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ  Ｐ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９〜６４４６（１９９３））をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより、得た。このフラグメントをゲル電気泳動により精製し、そしてＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＭＰＳＶＨＥベクター（Ａｒｔｅｌｔ  Ｐ．ら、Ｇｅｎｅ  ６８：２１３〜２１９（１９８８））中にクローン化した。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限部位は、これらのベクターにおいて反対の配向なので、構造タンパク質フラグメントを、ｐＭＰＳＶＨＥ中にアンチセンス配向にクローン化した。得られたベクターを、ｐＭＰＳＶアンチＤＨＢＢと呼ぶ。
【０１９３】
安定にトランスフェクトした細胞を、実施例１０に記載のｐＭＰＳＶアンチＤＨＢＢを用いて、一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を３７℃で一晩増殖させた。次に、この細胞を２９℃に移し、ウイルス遺伝子発現を誘導した。誘導の４日後に、馴化培地を収集し、そして遠心分離（１８００ｒｐｍ；３分間）した。この上清を８０％コンフルエントのＢＨＫ細胞層上に配置し、そして２９℃で４時間インキュベートした。インキュベートの期間の後、この培地を捨て、そしてこの細胞を５ｍｌのＨＰ−１培地で３回洗浄し、そして、２９℃でさらに２４時間インキュベーションした。最後に、マーカー遺伝子ＧＦＰの発現レベルを、実施例２に記載のように、蛍光顕微鏡で測定した。
【０１９４】
約１％のＢＨＫ細胞が初めにＧＦＰを産生し、そして２９℃でのさらなる１２０時間のインキュベーションの後、３０％の細胞がＧＦＰを産生した。従って、アンチセンスＤＮＡフラグメントでさえ、本発明において使用され、機能的タンパク質を産生し得る。
【０１９５】
（結論）
上記の実施例において記載される発現系は、Ｓａｅｚ．Ｅ．ら（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：６０８〜６１６（１９９７））において記載される理想的な誘導性遺伝子発現系のほとんどの全ての基準を満たす。この系は、温度が３４℃未満にシフトした場合にのみスイッチが入るという点において非常に特異的である。いくつかの実験において示される基礎発現は、上記の実施例において使用される標準的な検出方法を用いて検出不可能である。ウイルス感染の非常に感度の高い系を用いる場合でさえ（図７Ａ〜７Ｂおよび図９）、３７℃での基礎発現は検出され得なかった。このことは、高度な調節の厳密性を示す。なぜなら、機能的なレプリカーゼ分子は、目的のタンパク質の高発現レベルを生じるＲＮＡ複製および転写の自己触媒的サイクルを開始するからである。
【０１９６】
さらに、図６Ａ〜６Ｂにおいて示されるように、遺伝子発現は、誘導後迅速に開始し、そして温度が制限的な温度に戻った後に迅速に停止する。インデューサーのバイオアベイラビリティーにともなう問題は存在しない。なぜなら、２９℃への温度シフトは、迅速に拡がり、そして非毒性だからである。一旦、制限温度に到達すると、遺伝子発現の持続は、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡまたは目的のＲＮＡの安定性に依存するのみである。
【０１９７】
テトラサイクリン系と比較して、上記の実施例に記載されるこの系は、検出可能な基礎発現が存在しないこと、および温度シフトのバイオアベイラビリティーが、抗生物質テトラサイクリンまたはｔＴＡタンパク質の発現よりも、かなり有害でないという利点を有する。本明細書において記載される調節可能なＤＮＡベクター系のさらなる利点は、１つのベクターのみが宿主細胞中に導入される必要があるという点である。なぜなら、発現および調節に必要とされる全ての関連するタンパク質は、この１つのベクターにコードされ得るからである。このことは、２つのベクターが細胞中にトランスフェクトされなければならないテトラサイクリン系とは対照的である（Ｇｏｓｓｅｎ．Ｍ．＆  Ｂｕｊａｒｄ．Ｈ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７〜５５５１（１９９２））。
【０１９８】
すでに言及したように、ｐＣＹＴｔｓ系のスイッチを切ることは、レプリカーゼおよび目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性に依存する。レプリカーゼの半減期は、発現後１．５時間であることが示されている（ＤｅＧｒｏｏｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８９６７〜８９７１（１９９１））。従って、ｍＲＮＡの安定性は、この系がいかに迅速にスイッチを切られるのかを決定する限定因子である。例えば、ＳＥＡＰ  ｍＲＮＡを、制限温度にシフトした後、約１０時間翻訳した（図６Ａ〜６Ｂ）。この高度な安定性もまた、ＣＡＴ  ｍＲＮＡについて見出された（Ｘｉｏｎｇ、Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１１８８〜１１９１（１９８９））。このことは、シンドビスウイルス由来のｍＲＮＡは、このｍＲＮＡにコードされるタンパク質にかかわらず、非常に安定であることを示唆する。
【０１９９】
この系を、混合した集団において試験し、この発現系が、挿入部位およびコピー数に依存しないことを証明した（図４Ａ〜４Ｂおよび図５Ａ〜５Ｂにおいて示される）。
【０２００】
結論として、上記の実施例に記載されたｐＣＹＴｔｓ温度調節可能遺伝子発現系は、一般的に使用される調節可能な系に対して有意な利点を有する。その非常に低い基礎発現レベルに起因して、今のところ、従来のインビトロ遺伝子発現系において困難な課題であるＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１６０の発現において示されるように、この系は宿主毒性タンパク質の発現に使用され得る。この系はまた、長期の発現および再誘導性について試験されているので、遺伝子治療のためにも有用である。遺伝子治療におけるその可能性のある使用が、温度調節が容易に達成可能である、ヒト皮膚細胞におけるＧＦＰの一過性の発現において示されている。
【０２０１】
本発明が上記の記載および実施例において特定して記載された以外に、実施され得ることは明らかである。
【０２０２】
本発明の多数の変更および改変が、上記の教示を考慮して可能であり、従って、添付の特許請求の範囲内である。
【０２０３】
本明細書において引用される全ての刊行物（特許、特許出願、科学文献、実験室マニュアル、書籍、または他の文献）の全開示は、本明細書によって参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】ｐＣＹＴｔｓのＤＮＡ（１）は、核に挿入される。真核生物プロモーター（実線の水平方向の矢印）は、ｍＲＮＡ（３）への転写（２）を駆動する。ｍＲＮＡの第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の転写（４）は、温度感受性レプリカーゼ（ｔｓ−レプリカーゼタンパク質）（５）の生成を生じる。目的の遺伝子をコードする第２のオープンＯＲＦは、リボゾームに接近し得ない。したがって、目的の遺伝子の翻訳（６）は生じない。低温度にてｔｓ−レプリカーゼは、ｍＲＮＡ（３）の全長（−）鎖ＲＮＡ（８）への複製（７）を触媒する。このｔｓ−レプリカーゼはまた、全長（＋）鎖ＲＮＡ（１１）およびサブゲノムＲＮＡ（１２）への部分配列複製（９、１０）を触媒する。次いで、このサブゲノムＲＮＡ（１２）は、目的のタンパク質（示していない）に翻訳される（１３）。ＲＮＡの増幅および質的変化の組み合わせは、目的の遺伝子発現の前例のない緊張および調節能力を生じる。図１の略語を以下に示す：ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ  ｐｒ．）、シス作用配列エレメント（ＣＳＥ）、非構造タンパク質１〜４（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）、目的の遺伝子（Ｇ．Ｏ．Ｉ．）、およびサブゲノムプロモーター（Ｓ．Ｇ．）。
【図２】図２は、ｐＣＹＴｔｓベクターの略図である。ｐＣＹＴｔｓベクターは、図１に示されるエレメントに加えて、細菌細胞選択のためのアンピシリン耐性マーカーおよび高コピー数細菌増幅を指向するＣｏｌＥ１配列を含む。ｐＣＹＴｔｓベクターは、実施例１に記載されるようにして調製した。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、ｐＣＹＴｔｓの完全ｃＤＮＡ配列を示す（配列番号１）。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｄは、ｐＣＹＴｔｓの完全ｃＤＮＡ配列を示す（配列番号１）。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｄは、ｐＣＹＴｔｓの完全ｃＤＮＡ配列を示す（配列番号１）。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、ｐＣＹＴｔｓの完全ｃＤＮＡ配列を示す（配列番号１）。
【図４】異なる温度でのＧＦＰ（図４Ａ）およびＳＥＡＰ（図４Ｂ）生成。ｐＣＹＴｔｓＧＦＰまたはｐＣＹＴｔｓＳＥＡＰで安定にトランスフェクトされた細胞を、示される温度（黒菱形および白四角）で４８時間増殖させた。２つの独立した実験を、図４Ａおよび図４Ｂの各々に示す。ＧＦＰ蛍光（図４Ａ）は、実施例２に記載されるように決定した。ＳＥＡＰ活性（図４Ｂ）は、実施例３に記載されるように比色定量的に決定した。最大のタンパク質発現は、両方のタンパク質について２９℃であることが決定された。タンパク質の活性は、２９℃での最大値に対して相対的に算出した。
【図５】ｐＣＹＴｔｓＧＦＰ（図５Ａ）およびｐＣＹＴｔｓＳＥＡＰ（図５Ｂ）で３０℃にて安定にトランスフェクトされたＢＨＫ細胞におけるＧＦＰ生成（図５Ａ）およびＳＥＡＰ生成（図５Ｂ）の時間経過。ＧＦＰ産生を、実施例２に記載されるように、分光蛍光分析によって測定し、そして１０6細胞あたりの蛍光ユニットを定量した。１０6細胞あたりのＳＥＡＰ生成を、実施例３に記載されるようにして、ｐ−ニトロフェニルホスフェートを基質として使用して酵素活性を測定することにより決定した。８０時間後に生成されたＳＥＡＰの量は、細胞あたり１０7分子を超えることが推定された。
【図６】ｐＣＹＴｔｓＧＦＰまたはｐＣＹＴｔｓＳＥＡＰで安定にトランスフェクトされたＢＨＫ細胞の混合集団における、ＧＦＰ（図６Ａ）またはＳＥＡＰ（図６Ｂ）のｍＲＮＡ転写の開始を、生成されたＧＦＰまたはＳＥＡＰの量を測定することによって決定した（実施例２および３を参照のこと）。細胞を２９℃で２時間、４時間、６時間、８時間および１０時間インキュベート（黒棒）し、次いで、さらに、３７℃で２４時間増殖させた（白棒）。
【図７Ａ】これらの図は、安定にｐＣＹＴｔｓＧＦＰでトランスフェクトされたＢＨＫ細胞（シンドビスウイルスの構造タンパク質をコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトされた）を使用して得られた実験の結果を示す。実験条件は以下であった：（Ｉ）トランスフェクトされたＢＨＫ細胞の２９℃または３７℃での４８時間のインキュベーション段階；（ＩＩ）細胞の上清を新しいＢＨＫ細胞層上に置き、そして示された温度まで細胞をシフトした；（ＩＩＩ）新しいＢＨＫ細胞層の２９℃または３７℃のいずれかでの６時間のインキュベーション；ならびに（ＩＶ）細胞の洗浄そして２９℃または３７℃での４８時間の最後のインキュベーション。感染事象を、実施例２に記載されるようにしてマーカー遺伝子ＧＦＰの発現によって可視化した。図７Ａは、上記に記載されるようにして行った２つの別々の実験の結果を示す。蛍光はＧＦＰ発現を示すのに対し、蛍光が見られないものはＧＦＰ発現が検出不能であることを示す。
【図７Ｂ】これらの図は、安定にｐＣＹＴｔｓＧＦＰトランスフェクトされたＢＨＫ細胞（シンドビスウイルスの構造タンパク質をコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトされた）を使用して得られた実験の結果を示す。実験条件は以下であった：（Ｉ）トランスフェクトされたＢＨＫ細胞の２９℃または３７℃での４８時間のインキュベーション段階；（ＩＩ）細胞の上清を新しいＢＨＫ細胞層上に置き、そして示された温度まで細胞をシフトした；（ＩＩＩ）新しいＢＨＫ細胞層の２９℃または３７℃のいずれかでの６時間のインキュベーション；ならびに（ＩＶ）細胞の洗浄そして２９℃または３７℃での４８時間の最後のインキュベーション。感染事象を、実施例２に記載されるようにしてマーカー遺伝子ＧＦＰの発現によって可視化した。図７Ｂは、上記に記載されるようにして行った４つの別々の実験の結果を示す。＋および−記号は、ＧＦＰ発現が検出されたか否かを示す。
【図８Ａ】ｐＣＹＴｔｓ系において発現されたβインターフェロン（β−ＩＮＦ）（図８Ａ）およびエリトロポイエチン（ＥＰＯ）（図８Ｂ）のウエスタンブロット。図８Ａは、レーン１：マーカー、レーン２：陽性コントロール、レーン３：３７℃にて３日間のインキュベーション後にβ−ＩＮＦを発現している細胞の上清、レーン４：２９℃にて３日間のインキュベーション後にβ−ＩＮＦを発現しているＢＨＫ細胞（一過性のトランスフェクション）の上清、レーン５：ＧＦＰを発現しているＢＨＫ細胞の上清、レーン６：マーカー、レーン７：２９℃にて３日間のインキュベーション後にβ−ＩＮＦを発現しているＢＨＫ細胞（混合集団）の上清、およびレーン８：マーカーを示す。
【図８Ｂ】ｐＣＹＴｔｓ系において発現されたエリトロポイエチン（ＥＰＯ）（図８Ｂ）のウエスタンブロット。図８Ｂは、レーン１：マーカー、レーン２：２９℃にて５日間のインキュベートション後にＥＰＯを発現している細胞（一過性のトランスフェクション）の上清、レーン３：３７℃にて５日間のインキュベーション後にＥＰＯを発現している細胞の上清、レーン４：ＧＦＰを発現しているＢＨＫ細胞の上清、およびレーン５：マーカーを示す。
【図９】図９は、ＥＰＯのウエスタンブロットを示す。各レーンのサンプルは以下である；レーン１：ＥＰＯ標準；レーン２：３７℃にて４日間、安定にｐＣＹＴｔｓ５０４−Ｅｐｏトランスフェクトされた細胞の上清；レーン３：２９℃にて４日間、安定にｐＣＹＴｔｓ５０４−Ｅｐｏトランスフェクトされた細胞の上清；レーン４：マーカー。
【図１０】図１０は、ＥＰＯのドットブロットを示す。スポット＋は、ＥＰＯ標準；スポット２および１０は、ＢＨＫ細胞の上清（２）；スポット３は、３０℃にてインキュベートされた、ＧＦＰを発現しているＢＨＫ細胞；スポット４は、３７℃にてインキュベートされた、１Ｃ４細胞；スポット８は、３７℃にて２日間インキュベートされた、ウイルス粒子を含むＣＹＴｔｓ５０４Ｅｐｏ  ＲＮＡで感染されたＢＨＫ細胞の上清；スポット９は、３０℃にて２日間インキュベートされた、ウイルス粒子を含むＣＹＴｔｓ５０４Ｅｐｏ  ＲＮＡで感染されたＢＨＫ細胞の上清を示す。
【図１１】図１１は、本発明の１つの実施態様の概要を示す。この実施態様は、生後まもないハムスターの腎臓（ＢＨＫ）細胞株１Ｃ４／４によって産生される、パッケージングされたＲＮＡレプリコンで感染された宿主細胞を使用する、組換えヒトＥＰＯの産生に関する。このＢＨＫ細胞株は、実施例６に記載されるように産生された。
【図１２】図１２は、本発明の１つの実施態様のフローチャートを示す。この図に記載されるプロセスしたがって、ＲＮＡレプリコンは、ＥＰＯを安定にパッケージングするＢＨＫ細胞株１Ｃ４／４によって産生され、そして培養培地から単離される。次いで、野生型のＢＨＫ細胞（この細胞は、血清を含まない培養培地かまたはタンパク質を含まない培養培地のいずれかで培養され得る）を、このレプリコンで感染させる。次いで、感染した細胞によって産生されるタンパク質を、従来のプロセスによって精製する。この図に概説されるプロセスは、ヒトＥＰＯまたは他のタンパク質の多量の産生のために容易にスケールアップされ得る。
【図１】
2005323620.tif 000002
【図２】
2005323620.tif 000003
【図３Ａ】
2005323620.tif 000004
【図３Ｂ】
2005323620.tif 000005
【図３Ｃ】
2005323620.tif 000006
【図３Ｄ】
2005323620.tif 000007
【図４】
2005323620.tif 000008
【図５】
2005323620.tif 000009
【図６】
2005323620.tif 000010
【図７Ａ】
2005323620.tif 000011
【図７Ｂ】
2005323620.tif 000012
【図８Ａ】
2005323620.tif 000013
【図８Ｂ】
2005323620.tif 000014
【図９】
2005323620.tif 000015
【図１０】
2005323620.tif 000016
【図１１】
2005323620.tif 000017
【図１２】
2005323620.tif 000018