(57)【要約】  【課題】微小な粒子とベース物質との水平な方向の相対位置を数ナノメートルのオーダーで制御することを可能な装置であって、測定に至るまでの微小な粒子の取り扱いや操作が簡単な優れた微小力測定装置を提供する。  【解決手段】前記微小な粒子を固定し得る当該微小な粒子より大きなビーズ１ａとこのビーズを支持する支持部１ｂとを備えたプローブ１と、前記微小な粒子の移動に伴って位置変化するビーズ１ａを、捕捉用レーザで光学的に捕捉し、当該捕捉用レーザのビーズ１ａに対する捕捉力を利用して、前記プローブ１を所定目的位置に静止固定するようフィードバック制御するプローブ位置制御機構Ａと、前記捕捉用レーザのビーズ１ａに対する捕捉力を経時的に測定記録する測定手段Ｂと、さらに全反射蛍光観察機構Ｃを備えている微小力測定装置。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小な粒子と所定のベース物質との間に働く力学的な力を測定するためのものであって、
前記微小な粒子を固定し得る当該微小な粒子より大きな微小担体とこの微小担体を支持する支持部とを備えたプローブと、
前記微小な粒子の移動に伴って位置変化する前記微小担体を、捕捉用レーザで光学的に捕捉し、その捕捉用レーザの微小担体に対する捕捉力を利用して、前記プローブを所定目的位置に静止固定するようフィードバック制御するプローブ位置制御機構と、
前記捕捉用レーザの微小担体に対する捕捉力を経時的に測定記録する測定手段とを備えている微小力測定装置。
【請求項２】
一定のバネ定数を有する支持部を固定器に接続するとともに、前記捕捉用レーザの微小担体に対する捕捉中心を所定距離ずらして、動的な平衡が保持できるようオフセット機能を付加している請求項１記載の微小力測定装置。
【請求項３】
前記微小担体が、前記微小な粒子を化学的手法で結合或いは吸着可能なビーズである請求項１又は２記載の微小力測定装置。
【請求項４】
前記ビーズは、その径が０．５〜１μｍに設定されたものである請求項３記載の微小力測定装置。
【請求項５】
前記ビーズは、ポリスチレンを素材としたカルボキシルビーズである請求項３又は４記載の微小力測定装置。
【請求項６】
前記ベース物質を観察対象面に固定し、前記支持部を前記観察対象面に対して水平方向への移動可能に構成している請求項１乃至５何れかに記載の微小力測定装置。
【請求項７】
前記支持部を、さらに観察対象物面に対して垂直方向への移動可能に構成している請求項６記載の微小力測定装置。
【請求項８】
前記支持部を針状に成形し、その基端部を片持ち状に固定して観察対象面に対して水平をなすように配置している請求項７記載の微小力測定装置。
【請求項９】
前記支持部を、ガラスによって構成している請求項１乃至８何れかに記載の微小力測定装置。
【請求項１０】
前記プローブ位置制御機構が、
前記微小担体に捕捉用レーザを照射して光学的に捕捉する捕捉手段と、
その微小担体に対して位置検出用の光照射を行う位置検出用光照射手段と、
分割光ダイオードに前記光照射による干渉像を映し出す投影手段と、
前記干渉像により微小担体の位置を検出測定する検出手段と、
前記検出手段による検出結果より捕捉用レーザの微小担体に対する捕捉力を調節する調節手段とを備えている請求項１乃至９何れかに記載の微小力測定装置。
【請求項１１】
全反射蛍光観察機構をさらに備えたものである請求項１乃至１０何れかに記載の微小力測定装置。
【請求項１２】
前記全反射蛍光観察機構が、励起光レーザを対物レンズから観察対象物面に対して照射するものである請求項１１記載の微小力測定装置。
【請求項１３】
前記全反射蛍光観察機構が、前記微小な粒子、ベース物質、及び微小担体を蛍光観察し得るものであり、前記ベース物質と前記微小担体とを同じ波長の励起光によって蛍光観察するように構成している請求項１１又は１２記載の微小力測定装置。
【請求項１４】
前記プローブ位置制御機構を、プローブの揺らぎを二乗平均で変位換算して０．６５ナノメートル以下で保持していることを監視制御することで、熱揺らぎによるプローブの揺らぎまたは外力によるプローブの変位を防止するように構成している請求項１乃至１３何れかに記載の微小力測定装置。
【請求項１５】
微小な粒子と所定のベース物質との間に働く力学的な力を測定するためのものであって、
前記微小な粒子を固定するためのプローブを、その微小な粒子を固定し得る当該微小な粒子より大きな微小担体とこの微小担体を支持する支持部とを備えて構成し、
前記微小な粒子の移動に伴って位置変化する前記微小担体を、捕捉用レーザで光学的に捕捉し、当概捕捉用レーザの微小担体の捕捉力を利用して、前記プローブを所定目的位置に静止固定するようフィードバック制御しておいて、
前記捕捉用レーザの微小担体に対する捕捉力を経時的に測定記録して、その捕捉力に基づいて微小な粒子とベース物質との間に働く力学的な力を測定する微小力測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質分子などの微小の粒子と所定のベース物質との間に働く力学的な力を経時的に測定する微小力測定装置及び微小力測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、例えば、微小な粒子たるモータ蛋白質分子とベース物質たる蛋白質フィラメントなどが相互作用する際に発生する微小な力の大きさをｐN（ピコニュートン）の精度で測定するための微小なガラスプローブや光ピンセットを用いる方法等が知られていた。これらは、微小なガラスプローブの先端や光ピンセットを微小なバネ秤のように利用して、前記微小なガラスプローブの先端や光ピンセットで捕捉した粒子にモータ蛋白質一分子を固定し、観察対象物面に蛋白質フィラメントを固定して両者を接近させると、これらの間に相互作用が働いたときにモータ蛋白質の移動に基づく微小なガラスプローブの先端や光ピンセットで捕捉した粒子の変位が観察され、この変位を測定することにより、モータ蛋白質分子と蛋白質フィラメントとの間に働いた力の強さの経時変化を測定することができるようになっている（例えば、特許文献１及び非特許文献１参照）。
【０００３】
また、レーザの放射圧を利用して、観察対象物面に垂直な方向のプローブの位置をフィードバック制御することにより、観察対象物面との距離を一定に保ちながら観察対象物面に垂直な方向の引力および斥力の非接触計測を行う分子間力顕微鏡が知られている（例えば、特許文献２参照）。
【０００４】
しかしながら、これらの方法では、プローブや粒子の熱揺らぎ及び外力に伴う変位を消失させて、水平な方向の力を測定する手段を考慮していなかったため、微小な粒子とベース物質との相対的な位置を数ナノメートルのオーダーで制御しながら水平方向の力を検出することができないという課題を残していた。そこで、その課題を解決するべく本出願人は、モータ蛋白質及び蛋白質フィラメント等、微小な粒子とベース物質との水平な方向の相対位置を数ナノメートルのオーダーで制御することを可能にした装置として、図１２に示すような微小な粒子２５を固定している探針１００ａを備えたプローブ１００と、前記微小な粒子２５の移動に伴って位置変化する前記プローブ１００を光圧用レーザの放射圧を利用して所定目的位置に静止固定するようフィードバック制御するプローブ位置制御機構と、前記光圧用レーザの放射出力を経時的に測定記録する測定手段とを備えて構成したものを開発している（例えば、特許文献３参照）。なお、図１２において、後述する本発明の一実施形態における構成と同様の構成には、同様の符号を付している。
【特許文献１】特開平９−４３４３４号公報
【特許文献２】特開平７−１２８２５号公報
【特許文献３】特願２００１−３０８７４４号公報
【非特許文献１】TREND  in  Biotechnology vol.19  no.6  June  2001  P211−P216
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、上記装置で微小な力を測定する際には、測定に係る操作の前段階において微小な粒子２５をプローブ１００の探針１００ａに固定せねばならないが、その場合には探針１００ａを複数の微小な粒子２５に接触させ所定の化学的手法によって固定するという方法を採っていた。この場合極めて微細な探針１００ａに微小な粒子２５をしかも可及的に一分子のみを固定するという作業は非常に手間がかかり、測定までに時間を要するという不具合を有していた。
【０００６】
そこで、このような短所を解決すべく、微小な粒子とベース物質との水平な方向の相対位置を数ナノメートルのオーダーで制御することを可能な装置であって、測定に至るまでの微小な粒子の取り扱いや操作が簡単な優れた微小力測定装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の装置は、微小な粒子と所定のベース物質との間に働く力学的な力を測定するためのものであって、前記微小な粒子を固定し得る当該微小な粒子より大きな微小担体とこの微小担体を支持する支持部とを備えたプローブと、前記微小な粒子の移動に伴って位置変化する前記微小担体を、捕捉用レーザで光学的に捕捉し、その捕捉用レーザの微小担体に対する捕捉力を利用して、前記プローブを所定目的位置に静止固定するようフィードバック制御するプローブ位置制御機構と、前記捕捉用レーザの微小担体に対する捕捉力を経時的に測定記録する測定手段とを備えている微小力測定装置であり、測定手段によって測定された捕捉用レーザの捕捉力に基づいて微小な粒子と所定のベース物質との間に働く力学的な力を測定することができるようにしたものである。なお、「微小な粒子を固定し得る」とは、微小な粒子を結合すること、吸着することなどができるということである。
【０００８】
より具体的には、一定のバネ定数を有する支持部を固定器に（直接的に或いは間接的に）接続するとともに、前記捕捉用レーザの微小担体に対する捕捉中心を所定距離ずらして、動的な平衡が保持できるようオフセット機能を付加するようにすれば好ましい。微小な粒子の順逆両方の方向の移動による力の測定が可能となるからである。
【０００９】
また、微小担体としての好適な具体的態様としては、前記微小な粒子を化学的手法で結合或いは吸着したビーズが挙げられる。手に入りやすく扱いが簡単だからである。
【００１０】
そして、捕捉用レーザによる力を有効に与えることができ、且つ微小担体自身の存在による液体中の粘性抵抗の増加を可及的に小さく保つようにするためには、ビーズの大きさを、その径が０．５〜１μｍのものとすることが望ましい。
【００１１】
また、ビーズとしては、ポリスチレンを素材としたカルボキシルビーズを用いることが好ましい。熱発生に対して安定である上に、例えば非常に高い親和性を持ち且つ安定なアビジン・ビオチン結合などを採用して、微小な粒子に対しても支持部に対しても簡単に固定することができるからである。
【００１２】
支持部の具体的な態様としては、ベース物質を観察対象物面に固定するようしておき、その観察対象物面に対して水平方向へ移動できるように構成したものが挙げられる。すなわち、板状、角柱状、円柱状のものなど種々の形状のものが考えられる。
【００１３】
また、微小な粒子の観察対象物面に対して垂直方向な動きに対応させるためには、前記支持部を観察対象物面に対してさらに垂直方向への移動可能に構成するようにすればよい。そして、このように、観察対象物面に対して垂直方向への移動も可能なものとするには、例えば支持部を針状に成形しておき、その基端部を片持ち状に固定して観察対象面に対して水平をなすように配置するようにすればよい。
【００１４】
そして、支持部の素材としては、化学的、機械的に安定なものであれば種々のものが考えられるが、手に入りやすい上に加工がし易く、機械的にも安定であるという点からガラスを用いることが望ましい。
【００１５】
プローブ位置制御機構の具体的構成としては、前記微小担体に捕捉用レーザを照射して光学的に捕捉する捕捉手段と、その微小担体に対して位置検出用の光照射を行う位置検出用光照射手段と、分割光ダイオードに前記光照射による干渉像を映し出す投影手段と、前記干渉像により微小担体の位置を検出測定する検出手段と、前記検出手段による検出結果より捕捉用レーザの微小担体に対する捕捉力を調節する調節手段とを備えているものが挙げられる。
【００１６】
微小な粒子が１分子のみプローブに対して固定されたかどうかを確認できる有用な装置とするためには、全反射蛍光観察機構をさらに設けると望ましい。全反射蛍光観察機構によれば、微小な物質のプローブに対する固定の過程をリアルタイムで視覚によって直接的に観察できるからである。さらに、他の物質例えばベース物質の観察が可能な構成とすることも容易に実施でき、このようにすれば微小な物質とベース物質との位置関係の調整をも行うことができるようになり、これらの相互作用を適正な状態で測定することができるようになる。
【００１７】
このような、全反射蛍光観察機構の好適な具体的態様としては、励起光レーザを対物レンズから観察対象物面に対して照射し全反射するようにしたものが挙げられる。このようなものであれば、観察対象物面より上方に、プローブの設置空間を確保することが容易となる。
【００１８】
また、本発明によるプローブの構成を活かして、より有用な装置とするためには、前記全反射蛍光観察機構を、前記微小な粒子、ベース物質、及び微小担体それぞれを蛍光観察するようにしておき、さらに前記ベース物質と前記微小担体とを同じ波長の励起光によって蛍光観察するように構成すれば望ましい。このようにすれば、微小な粒子が１分子プローブに固定されたかどうかを確認できる上に、微小担体とベース物質とを所定波長の励起光を照射した状態で、ビデオ等で撮像することで、微小担体に固定した微小な粒子とベース物質との位置関係の変化、すなわち微小な粒子の動きを長時間にわたり観察しつつ、これらの間に働く力を測定することが可能となるからである。
【００１９】
熱によるプローブの揺らぎの抑制に関しては、前記プローブ位置制御機構において、プローブの揺らぎを二乗平均で変位換算して０．６５ナノメートル以下で保持していることを監視制御することで、熱揺らぎによるプローブの揺らぎを防止するようにすることが挙げられる。
【００２０】
要すれば、微小な粒子と所定のベース物質との間に働く力学的な力を測定するためのものであって、前記微小な粒子を固定するためのプローブを、その微小な粒子を固定し得る当該微小な粒子より大きな微小担体とこの微小担体を支持する支持部とを備えて構成し、前記微小な粒子の移動に伴って位置変化する前記微小担体を、捕捉用レーザで光学的に捕捉し、その捕捉用レーザの微小担体の捕捉力を利用して、前記プローブを所定目的位置に静止固定するようフィードバック制御しておいて、前記捕捉用レーザの微小担体に対する捕捉力を経時的に測定記録して、その捕捉力に基づいて微小な粒子とベース物質との間に働く力学的な力を測定する微小力測定方法であればよい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の装置のような構成とすれば、プローブに対して微小な粒子を固定する場合に、微小な粒子を微小担体に対して化学的手法など所定の方法で予め固定しておき、微小な粒子よりも大きな微小担体を支持部に対して固定するという手順を採用することができ、すなわち、「プローブに微小な粒子を取り付ける」という作業を、従来のプローブの探針に対して微小な粒子を固定する場合と比較して、簡単で扱い易い。加えて、「一分子」の微小な粒子を固定するという点においても、微小担体と微小な粒子とを１：１で作用させた上で、微小な粒子よりも大きな微小担体を支持部に固定するという手法を採ることで、プローブの探針に対して直接的に微小な粒子を一分子だけ固定しようとする場合と比較すれば、飛躍的に作業の煩雑さを払拭することができる。
【００２２】
また、従来のいわゆる捕捉用レーザを用いた光ピンセット法を利用して蛋白質などの微小な粒子の力学的な力を測定する際には、微小な粒子を固定したビーズが回転してしまい測定の阻害となってしまう場合があったのに対し、本発明では、微小な粒子を結合或いは吸着させた微小担体を支持部に固定して支持させることにより、微小担体自身の回転等の動きを抑制して微小な粒子の変位が確実に微小担体の重心位置の移動に反映されるようにすることができる。加えて、支持部の弾性力を利用してオフセット機能を備えることも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の一実施形態を、図面を参照して説明する。
【００２４】
この微小力測定装置は、タンパク質などの微小な粒子と所定のベース物質との間に働く力学的な力を測定するためのものであり、図１に機器構成図、図２に機能構成図を示しているように、微小な粒子を固定可能なものであって当該微小な粒子よりも大きな微小担体たるビーズ１ａとこのビーズ１ａを支持する支持部１ｂとを備えたプローブ１と、微小な粒子の移動に伴って位置変化する前記ビーズ１ａを捕捉用レーザで光学的に捕捉し、その捕捉用レーザのビーズ１ａに対する捕捉力を利用してプローブ１を所定目的位置に静止固定するようフィードバック制御するプローブ位置制御機構Ａと、捕捉用レーザの捕捉力を経時的に測定記録する測定手段Ｂとしての機能を有するものであり、さらに本実施形態においては全反射蛍光観察機構Ｃを備えている。
【００２５】
それぞれを具体的に説明する。まず、図３、図４に概略図を示しているプローブ１を構成するビーズ１ａは、本実施形態においては、ポリスチレンを素材としたカルボキシルビーズであってその径が０．５〜１μｍに設定されたものを使用している。なお、図３、図４において、符号２５を付して示している、ビーズ１ａに吸着した微小粒子たるモータ蛋白質については後述する。
【００２６】
支持部１ｂは、ガラスによって長さを５０〜１００μｍの針状に成形したもので、バネ定数（Ｋとする）が０．０５ｐＮ／ｎｍ程度となるように調整してある。この支持部１ｂの基端部に当該支持部１ｂより太くした補強部１ｃを一体的に形成し、この補強部１ｃを図示しない固定器具に対して取り付けるようにして支持部１ｂが片持ち状となるようにしている。そしてこの支持部１ｂを、観察対象物面２ａに対して平行に配置するようにし、観察対象面２ａに対して、水平方向に移動可能とするとともに、垂直方向にも移動可能な状態となるようにしている。なお、観察対象物面２ａとは、ビーズ１ｂに固定した微小な粒子が移動する場所であり、通常はスライドガラス２を用いている。
【００２７】
プローブ位置制御機構Ａは、捕捉用レーザを照射してビーズ１ａを光学的に捕捉する捕捉手段Ａ１と、前記ビーズ１ａに対して位置検出用の光照射を行う位置検出用照射手段Ａ２と、分割光ダイオードに前記位置検出用照射手段Ａ２の光照射による干渉像を映し出す投影手段Ａ３と、前記干渉像によりビーズ１ａの位置を検出測定する検出手段Ａ４と、前記検出手段Ａ４による検出結果より捕捉用レーザのビーズ１ａに対する捕捉力を調整する調整手段Ａ５とを備えて構成している。
【００２８】
捕捉手段Ａ１は、捕捉用レーザを照射する第１のレーザ光源３の光線を、ＥＯＭ（電気光学変調器）４によってその照射強度の調整を行い、捕捉用レーザレンズ５ａを通過させて、ミラーＭＲで反射させることによって光路を９０度曲げてから捕捉用レーザレンズ５ｂを通過させ、さらに第１の反射鏡６で反射させてから第１対物レンズ７に入射し集光して、ビーズ１ａに対して照射するように構成している（図４参照。なお、図中、捕捉用レーザを二点鎖線で示している）。前記ミラーＭＲを移動させることにより、光線を平行移動して観察対象面２ａでのビーズ１ａの捕捉位置を移動させることができるようにしてある。また、捕捉用レーザレンズ５ｂと第１の対物レンズ７との焦点位置は一致させている。なお、ＥＯＭ４から出力するレーザ光線を複数の集光レンズや反射鏡で反射させて第１対物レンズ７に入射するように構成してあってもよい。本実施形態においては、捕捉用レーザとして、支持部１ｂの素材であるガラス、ビーズ１ａ及び微小な粒子に吸収がほとんど見られない赤外線領域の波長のＹＡＧ（Ｙｉｔｔｒｉｕｍ  Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  Ｇａｒｎｅｔ）レーザ（１０６４ｎｍ、５００ｍＷ）を採用している。なお、図５に示すように、この捕捉用レーザ（ＥＯＭ４での調整後は２００ｍＷ）の有無で確実にプローブ１の位置が変化し再現性ある結果を示すことは確認できている。また、図４、図６に示しているように、捕捉用レーザ１のビーズ１ａに対する捕捉中心を所定距離移動させることでオフセット機能を与えて、プローブ１を動的平衡で所定目的位置に静止するようにしている。なお、オフセットに要する力として、捕捉用レーザの捕捉力がプローブ１に固定した微小な粒子が持つ力より十分大きいものになるように捕捉用レーザの照射強度を予め調節している。
【００２９】
位置検出用光照射手段Ａ２は、位置検出用の第２のレーザ光源８による光線を、ビームエクスバンダ９で広げてから、第２の反射鏡１０で反射させ、図７に示しているように前記第１対物レンズ７に入射し集光してプローブ１にフォーカス（クロス）して照射するように構成している。なお、位置検出用レーザは、ビーズ１ａ及び支持部１ｂに対しては特段の作用を及ぼさないように構成する必要があるもので、本実施形態においては、ＹＡＧレーザ（５３２ｎｍ、１００μＷ）を採用している。
【００３０】
投影手段Ａ３は、ビーズ１ａを通過した位置検出用レーザ光線を第２対物レンズ１２に入射させ、第３の反射鏡１１で反射させて分割光ダイオードたるニ分割フォトダイオード１３内でプローブ干渉像を得るように構成している。
【００３１】
検出手段Ａ４は、前記ニ分割フォトダイオード１３に接続したＩ−Ｖ変換器１４及び差動増幅器１５を有する位置検出用増幅器１６によって、前記干渉像を位置信号として電気信号に変換し、さらにＡ−Ｄ変換器１７でデジタル信号に変換して、その出力信号をデータ収録用のコンピュータ１８に集積記録してモニターできるように構成している。
【００３２】
調整手段Ａ５は、前記位置信号をフィードバック回路１９によってフィードバック信号に変換させ、ＥＯＭ４にその信号を送信して捕捉用レーザの捕捉力を調整して、プローブ１を静止固定させるように構成している。より具体的には、フィードバック制御により微小な粒子が作用した力と反対向きに力が作用するように、照射強度を変化させることで捕捉用レーザの捕捉力に対応するレーザトラップのバネ定数を調整し、見た目の上でプローブ１が静止させるようにしている。ここで、ビーズ１ａに固定した微小な粒子の運動及びバックグラウンドとして熱による揺らぎがビーズ１ａ及び支持部１ｂに生じるが、位置信号をフィードバック回路１９へ入力し目標値信号へ追従させることにより、図９示すように、ビーズ１の揺らぎを二乗平均変位に換算して約０．６５ナノメートル以下に抑えるように設定している。なお、プローブ１（ビーズ１ａ）の位置が変位することにより、この干渉縞が変化するが、この変化量はプローブ１の位置変化と一定の相関関係を持って変化することがわかっているので、定量的にプローブ位置の測定が可能である。
【００３３】
測定手段Ｂは、前記コンピュータ１８或いは図示しない専用の制御装置等によって捕捉用レーザの捕捉力を経時的に測定し、間接的にプローブ１に懸かる力学的な負荷を測定できるようにしたものである。より具体的には、支持部１ｂの基端部側に、例えば補強部１ｃに、ピエゾ素子等を取り付けて電圧を印加し一定の振幅Ｙの変位を与えた状態として、このときに検出されるフィードバック信号の振幅Ｆが、支持部１ｂのバネ定数Ｋ及びピエゾ素子によって与えられた振幅Ｙより見積もられる力学的負荷Ｌ（Ｌ＝Ｋ×Ｙ）及びある係数αを用いてＬ＝α×Ｆという関係式で表せることを利用して、前記係数αを決めて校正を行い、支持部１ｂにかかった力を測定している。
【００３４】
全反射蛍光観察機構Ｃは、励起光を観察対象物面等の所定の面に対して全反射させることによって生じるエバネッセント場において励起される蛍光物質を観察する、いわゆる全反射蛍光観察顕微鏡の原理に基づくものである。
【００３５】
詳述すると、微小な粒子に標識した特定の蛍光物質（色素）を励起させる波長のレーザ光線を、観察対象物面２ａに対して全反射するように設定した入射角度で照射し、観察対象物面２ａから約１００ｎｍの範囲に形成されるエバネッセント場において励起される前記蛍光物質を観察するように構成している。具体的には、図示例のものでは、前記励起光としてブルーレーザ（４７３ｎｍ、５００μＷ）を採用しており、励起用レーザ光源２０の光線をビームエスクパンダ２１、集光レンズ２２に通し、励起光用レーザ反射鏡２３で反射させて第１対物レンズ７を通じて観察対象物面２ａを下方側から照射し、照射領域を例えばＣＣＤカメラ２４によって撮像して、図示しないモニターに画像として表示するようにしている。
【００３６】
以上のように構成した微小力測定装置によって、図１０に示したように微小な粒子たるモータ蛋白質（キネシン）２５とベース物質たるフィラメント蛋白質（微小管）２６との間に作用する力を測定する場合について説明する。
【００３７】
まず、プローブ１にモータ蛋白質２５を固定してその微小力を測定するまでの過程の一例について説明する。
【００３８】
あらかじめ、モータ蛋白質２５は、Ｃｙ３等の所定の蛍光物質で標識しておく。
【００３９】
プローブ１を構成する針状の支持部１ｂには、例えばアミノプロピルトリエトキシシラン処理を施すことによって表面にアミノ基を導入する。次に、例えばＢｉｏｔｉｎ―（ＡＣ５）２―Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ処理を行い、ビオチンを導入する。
【００４０】
一方、ビーズ１ａに対しては、まず表面に露出するカルボキシル基に、ビオチンカダベリンをＥＤＣ（1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl] carbodiimide
Hydrochloride)架橋させることによって、ビオチン化する。次に、このように導入されたビオチンの部位にストレプトアビジンを結合させ、ビーズ１ａの表面をアビジンでコーティングした状態とする。そして、このアビジン化されたビーズ１ａとモータ蛋白質２５とを１：１の割合となるよう混合して、一のビーズ１ａに一のモータ蛋白質２５を吸着させるようにする。なお、ストレプトアビジンを用いず、アビジン、ニュートラアビジンを用いてもよい。
【００４１】
観察対象面２ａにはフィラメント蛋白質２６を固定しておき、観察対象面２ａに形成されるフローチャンバーに上記のように蛍光標識済みのモータ蛋白質２５を１分子吸着した状態のビーズ１ａを撒布する。第３のレーザ光源２０による励起光が観察対象物面２ａに照射されると、ＣＣＤカメラ２４がその励起光による蛍光の状態を撮像し、その画像がモニターに映し出されるので、その蛍光像をモニター上で観察することで、ビーズ１ａに吸着させたモータ蛋白質２５の存在が確認できる。
【００４２】
そして、第３のレーザ光源２０による励起光の照射を続け、モータ蛋白質２５の位置を確認しながら、支持部１ｂを所定のプログラムに従ってスキャンさせ、モータ蛋白質２５を吸着したビーズ１ａに近づけると、そのビーズ１ａの表面のアビジンと支持部１ｂの表面のビオチンとが結合し、支持部１ｂがビーズ１ａを拾い上げることになる。このようにして、プローブ１にモータ蛋白質２５が固定された状態となったら、ビーズ１ａに固定されたモータ蛋白質２５を、スライドガラス２上の観察対象物面２ａに固定しておいたフィラメント蛋白質２６にデポジットさせる。
【００４３】
以上のように測定準備が完了した後、測定開始信号の入力により、第２のレーザ光源８はプローブ１の位置検出用として機能するように切り替えられるとともに、ビーズ捕捉用の第１のレーザ光源３の照射が開始される。そして、前記ミラーＭＲを移動することによってビーズ１ａの捕捉中心を所定距離ずらしてオフセットをかける。
【００４４】
一方、第２のレーザ光源８から出力されたレーザ光線は、ビームエクスバンダ９で広げられ、第２の反射鏡１０に反射され、第１対物レンズ７に入射し集光され、プローブ１の位置を検出する。プローブ１を通過した位置検出用レーザは、第２対物レンズ１２に入射し、第３の反射鏡１１に反射される。そして、プローブ１の位置を反映して、ニ分割フォトダイオード１３内でプローブ干渉像が得られる。ここで、プローブ１は、熱揺らぎによってランダムに変位するが、これは干渉像の動きとして検出される（図８、９参照）。この干渉像が、位置検出用増幅器１６によって位置信号として電気信号に変換され、さらにＡ−Ｄ変換器１７でデジタル化され、コンピュータ１８に入力される。コンピュータ１８では、熱揺らぎ等によるバックグラウンドを二乗平均変位に変換計算する。また、前記位置信号がフィードバック回路１９に入り、フィードバック信号に変換される。このフィードバック信号が、ＥＯＭ４に移行し、そのフィードバック信号に応じて第１のレーザ光源３の照射強度が調整され、すなわちビーズ１ａに対する捕捉力が変調される。
【００４５】
そして、フィードバック信号により調整された捕捉力によって、ビーズ１ａに固定したモータ蛋白質２５による力の発生にかかわらず、プローブ１は、見た目上、静止固定される。この際、図８に示しているフィードバックをかけなかったときの熱揺らぎによるプローブの変位が、図９に示しているように、フィードバック制御によって約０．６５ナノメートルの精度で制御して固定できたのと同様に制御できる。なお、本実施形態ではオフセット機能を付加させているので、図６に示しているように、プローブ１に固定されたモータ蛋白質２５が、レーザの捕捉中心をずらした方向と逆の向きに移動する場合には、支持部１ｂに懸かる力は、オフセットによる力と前記モータ蛋白質２５の移動に伴う力が加算された力に相当することになる。一方、前記モータ蛋白質２５がレーザの捕捉中心をずらした方向と同じ向きに移動する場合には、支持部１ｂに懸かる力は、オフセットによる力からモータ蛋白質２５の移動に伴う力を減じた力に相当することになる。
【００４６】
そして、支持部１ｂのバネ定数を用い、フィードバック信号と捕捉用レーザの捕捉力との関係を求め、フィードバック信号を解析することにより、モータ蛋白質２５とフィラメント蛋白質２６との間に作用する力を得ることができる。
【００４７】
以上のように説明した本実施形態の微小力測定装置によれば、プローブ１に対して微小な粒子（モータ蛋白質２５）を固定する場合に、微小な粒子をビーズ１ａに対して上述したようなビオチン・アビジン系など扱い易い化学的手法で予め吸着しておき、微小な粒子を吸着した状態のビーズ１ａを支持部１ｂに対してもビオチン・アビジン系を利用した化学的手法で固定させ支持することができる。すなわち、「プローブ１ａに微小な粒子を取り付ける」という作業を、図１２に示したような従来のプローブ１００の探針１００ａに対して微小な粒子を固定する場合と比較して、取り扱いが簡単である。
【００４８】
また、ビーズ１ａと微小な粒子とを１：１で混合して作用させて、支持部１ｂにビーズ１ａを固定すれば、微小な粒子をプローブ１に対して「一分子のみ固定する」ことが実現できるので、従来の方法と比較すれば、極めて簡単である。
【００４９】
また、本発明では、微小な粒子を吸着させたビーズ１ａを支持部１ｂに固定して支持させているので、ビーズ１ａ自身の回転等の動きを抑制して微小な粒子の変位が確実にビーズ１ａの重心位置の移動に反映されるようにすることができる。
【００５０】
加えて、針状の支持部１ｂの弾性力を利用して簡単にプローブ１にオフセット機能を備えることができる。そして、その結果、プローブ１に固定した微小な粒子が、観察対象物面２ａに対して左右（順方向、逆方向）何れの方向に移動しても測定できる。
【００５１】
また、ビーズ１ａに捕捉用レーザを照射する照射手段Ａ１を５００ｍＷのＹＡＧレーザとＥＯＭ４とを備えて構成したので、フィードバック制御が０．６５ｎｍ  ｒｍｓで行えることも実験で明らかとなった。すなわち、非常に高い精度での制御が行えるため、微小な粒子の力を正確に測定することが可能である。
【００５２】
ビーズ１ａの大きさを、０．５〜１μｍとしているので、捕捉用レーザによる力を有効に与えることができ、且つビーズ１ａ自身の存在による液体中の粘性抵抗の増加を可及的に小さく保つことができる。また、ビーズ１ａにカルボキシルビーズを使用したので、手に入れ易く、また親和性が高く安定的な結合が可能なビオチン・アビジン系の導入が簡単である。
【００５３】
また、支持部１ｂを針状に形成して、観察対象面２ａに対して水平方向に移動できるとともに垂直方向にも移動できるようにしたので、微小な粒子が移動する際の観察対象物面２ａに対して垂直方向への力が生じた場合に、その力をこの支持部１ｂの動きにより吸収することができるので、ビーズ１ａ固定した微小な粒子をつぶすことなく測定を行うことができる。
【００５４】
また、支持部１ｂ及び補強部１ｃを、ガラスを素材として成形したので、化学的、機械的に安定なものであれば種々のものが考えられるが、手に入りやすい上に加工がし易く、機械的にも安定である。
【００５５】
本実施形態においては、全反射蛍光観察機構Ｃを組み込んだので、ビーズ１ａを支持部１ｂに固定する際にリアルタイムで直接視覚によって観察・確認することができ、微小な粒子一分子のみがビーズ１ａに固定できたかどうかを確実に確認することができる。その結果、微小な粒子一分子あたりの力（滑り力）を適正に測定できる。
【００５６】
また、微小な粒子を観察するための励起用レーザを、第１対物レンズ７から観察対象物面２ａに対して下方から照射して全反射するように構成したので、観察対象物面２ａに載置したベース物質の上方に、プローブ１を配置する空間が容易に確保でき、装置の設計・製造がし易くなる。
【００５７】
加えて、捕捉用レーザ、位置検出用レーザ、励起用レーザの全てを、第１対物レンズ７を通じて観察対象面２ａの下方から照射するように設計しているため、装置が嵩張らずコンパクトなものとすることができる。
【００５８】
本発明は、上記実施形態に限られない。
【００５９】
特に、支持部、微小担体の形状や素材などの態様については、様々種類が考えられ、それに応じた固定方法も複数種類考えられる。
【００６０】
例えば、上記実施形態では、支持部のビオチン化には、Ｂｉｏｔｉｎ―Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ、Ｂｉｏｔｉｎ―ＡＣ５―Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕなど、スルホン基がついているものが液中の溶解性が高く扱い易いが、Ｂｉｏｔｉｎ−ＯＳｕタイプのものであってもよい。また、支持部にアミノ基を導入してビオチン化させたが、チオール基やアルデヒド基を導入して、ビオチン化させてもよいし、酵素を利用したビオチン化などであってもよい。
【００６１】
また、支持部に対してニッケルＮＴＡを付けるとともに、Ｈｉｓタグをビーズに取り付けて支持部とビーズとを結合するようにしてもよい。このような金属を利用した化学的固定手法を採用すれば、ＥＤＴＡなどのキレート剤を用いてビーズを取り外することができるため、支持部を取り替えることなく再利用することができ、非常に有用である。
【００６２】
微小担体は、液中に大きな粘性抵抗を与えないようなものであれば、上記実施形態のようなビーズ以外の微細な粒子を利用したものであってもよい。また、ビーズとしてもカルボキシル基以外の官能基を有するものであっても構わない。
【００６３】
その他、例えば、図１１に示しているように、微小な粒子たるモータ蛋白質２５のみならずベース物質たるフィラメント蛋白質２６及びビーズ１ａも、蛍光観察できるようにした全反射蛍光観察機構を備えたものであってもよい。なお、図中、上記実施形態と同様の構成には、特に説明することなく同じ符号を付している。
【００６４】
詳述すると、本実施形態では、フィラメント蛋白質２６及びビーズ１ａにも所定の蛍光物質で標識し、これらを、励起光として前記第３のレーザ光源２４を用い、すなわちブルーレーザ（４７３ｎｍ、５００μＷ）を利用して蛍光観察できるようにしている。機器構成としては、上記実施形態と同様に、第３のレーザ光源２０の光線を、ビームエキスパンダ２１、集光レンズ２２に通し、第３の反射鏡２３で反射させて第１対物レンズ７を通じて観察対象物面２ａを下方側から照射するようにしている。
【００６５】
微小な粒子を観察するための励起光には、前記位置検出用照射手段Ａ２を構成する第２のレーザ光源８を用い、すなわちＹＡＧレーザ（５３２ｎｍ、５００μＷ）を利用している。具体的には、第２のレーザ光源８からの光線を、ビームスプリッタ２７によって分岐し、その反射光をビームエキスパンダ２８で広げ、集光レンズ２９を通し、ミラーＭＲ２で反射して、再びビームスプリッタ３０によって反射し、さらに全反射光学系の光へ戻してから前記第２の反射鏡１０で反射させて、第１対物レンズ７へ通し下方から観察対象物面２ａを照射するようにしている。前記集光レンズ２９によって第１対物レンズ７の後焦点面へ集光するように調整することにより、観察対象物面２ａにおいて平行光を得、ミラーＭＲ２の位置を調整することにより、観察対象物面２ａに対して全反射する入射角度を得るようにしている。また、前記第２のレーザ光源８を、位置検出用光源として機能させる場合と励起用光源として機能させる場合とで使い分けるために、例えば図示しないシャッタを設置して照射のｏｎ・ｏｆｆを調整できるようにしている。
【００６６】
なお、このような全反射蛍光観察機構を設けた場合は、前記プローブ位置調整機構Ａの位置検出用光照射手段Ａ２は、図示したように、第２のレーザ光源８からの光線を、前記ビームスプリッタ２７を通し、ビームエキスパンダ９で広げ、さらにビームスプリッタ３０を通し、その透過光を第２の反射鏡１０で反射させて、観察対象面２ａに照射するようにすればよい。
【００６７】
続いて、この実施形態における微小力測定装置によって、モータ蛋白質２５とフィラメント蛋白質２６との間に働く力を測定するまでの過程について説明する。
【００６８】
あらかじめ、モータ蛋白質２５をＣｙ３等の所定の蛍光物質で標識するとともに、フィラメント蛋白質２６及びビーズ１ａをＡｌｅｘａ４８８等の所定の蛍光物質で標識しておく。まず、第３のレーザ光源２０による励起光が観察対象物面２ａに照射されると、ＣＣＤカメラ２４がその励起光による蛍光の状態を撮像し、その画像がモニターに映し出され、観察対象物面２ａに固定した蛍光標識済みのフィラメント蛋白質２６及びビーズ１ａの位置を確認することができる。次に、第２のレーザ光源８が、励起光用光源として観察対象物面２ａに対して全反射するように照射されると、ＣＣＤカメラ２４がこの励起光による蛍光の状態も同様に撮像し、その画像がモニターに映し出される。これにより、モータ蛋白質２５の位置を確認することができる。そして、支持部１ｂは、所定のプログラムに従ってスキャンしてモータ蛋白質２５を吸着したビーズ１ａを拾い上げる。この際、前記第２のレーザ光源８による励起光を照射し続けておき、蛍光スポットが一段階で消えることが観察されれば、一個のビーズ１ａには一分子のモータ蛋白質２５が吸着され、その結果「プローブ１に１分子のモータ蛋白質２５が固定された」ことが確認できることになる。その後で、第３のレーザ光源２０から光線が照射されるとともにこの励起光に基づく蛍光状態がモニターに表示されるので、フィラメント蛋白質２６及びビーズ１ａの位置を画面上で確認しながら、そのフィラメント蛋白質２６上にプローブ１に固定したモータ蛋白質２５をデポジットすることができる。
【００６９】
この実施形態の全反射蛍光観察機構によれば、ベース物質たるフィラメント蛋白質２６及びビーズ１ａをも観察することができるものとしたため、フィラメント蛋白質２６の位置を確認しながらモータ蛋白質２５を固定したプローブ１を適正な位置にデポジットすることができる。すなわち、その結果、モータ蛋白質２５とフィラメント蛋白質２６との間に作用する力を正確に測定できる。加えて、フィラメント蛋白質２６及びビーズ１ａを同じ蛍光物質で標識しておき、第３のレーザ光源２０での励起光による蛍光像をビデオ等で撮像することで、フィラメント蛋白質２６に対するモータ蛋白質１ａの位置変化を長時間にわたり観察しながらこれら二つの間に働く力学的な力を測定することができる。
【００７０】
また、全反射蛍光観察機構が、さらにモータ蛋白質の移動時におけるＡＴＰ（蛍光標識済み）を観察できるようにしたものであってもよい。このようなものであれば、モータ蛋白質の力学的な力とＡＴＰの化学反応との関係を測定することができる。
【００７１】
また、微小な粒子としては、蛋白質に限らず、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＡＴＰなど他の微小粒子、細胞などであってもよい。
【００７２】
その他、各部の具体的構成についても上記実施形態に限られるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変形が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明の一実施形態を示す機器構成図。
【図２】同実施形態を示す機能構成図。
【図３】同実施形態におけるプローブを示す説明図。
【図４】同実施形態における捕捉用レーザが観察対象物面を通してプローブに照射された様子を示す説明図。
【図５】同実施形態において、捕捉用レーザの放射によるプローブの位置変化の影響をを示すグラフ。
【図６】同実施形態におけるオフセット機能を示す説明図。
【図７】同実施形態における位置検出用レーザがプローブに照射される様子を示す説明図。
【図８】同実施形態において、フィードバック制御をかけなかった場合のプローブの熱揺らぎによる変位の経時的変化を示すグラフ。
【図９】同実施形態において、フィードバック制御をかけた場合のプローブの熱揺らぎによる変位の経時的変化を示すグラフ。
【図１０】同実施形態において、モータ蛋白質とフィラメント蛋白質との間に作用する力を測定する場合を示す図。
【図１１】本発明の別の実施形態を示す機器構成図。
【図１２】従来の装置を示す説明図。
【符号の説明】
【００７４】
１・・・プローブ
１ａ・・・微小担体（ビーズ）
１ｂ・・・支持部
２ａ・・・観察対象物面
７・・・対物レンズ（第１対物レンズ）
１３・・・分割光ダイオード（ニ分割フォトダイオード）
２５・・・微小な粒子（モータ蛋白質）
２６・・・ベース物質（フィラメント蛋白質）
Ａ・・・プローブ位置制御機構
Ａ１・・・捕捉手段
Ａ２・・・位置検出用照射手段
Ａ３・・・投影手段
Ａ４・・・検出手段
Ａ５・・・調整手段
Ｂ・・・測定手段
Ｃ・・・全反射蛍光観察機構
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005241465.tif 000009
【図８】
2005241465.tif 000010
【図９】
2005241465.tif 000011
【図１０】
2005241465.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
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