(57)【要約】      （修正有）【課題】サンプル中に含まれる複数の多型核酸をハイブリダイゼーション法により検出する際、検出感度を高め、特にＳＮＰ検出の信頼性を高めることができる核酸検出方法を提供すること。【解決手段】所定の多型部位の配列が異なり且つそれ以外の配列が同一である複数の多型核酸の一つを標的として検出する方法であって、第一のハイブリダイゼーション工程で形成されたハイブリッド二本鎖を、前記プローブ核酸に対して完全に相補的な前記標的核酸のみが二本鎖核酸を形成し得る条件下に置くことで、該標的核酸以外の多型核酸を前記プローブ核酸から脱離させる第一の脱離工程と、前記多型核酸が脱離されて一本鎖になったプローブ核酸と前記サンプル中に含まれる前記多型核酸との間で、前記複数の多型核酸のすべてが一本鎖になった前記プローブ核酸とハイブリダイズする条件下において反応を行う第二のハイブリダイゼーション工程を具備したことを特徴とする方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の多型部位の配列が異なり且つそれ以外の配列が同一である複数の多型核酸の一つを標的として、サンプル中に含まれる該標的核酸をハイブリダイゼーション反応により検出する方法であって、
固相担体表面に固定された前記標的多型核酸に対して完全に相補的であるプローブ核酸と前記サンプルに含まれる前記多型核酸との間で、前記複数の多型核酸のすべてが前記プローブ核酸とハイブリダイズする条件下においてハイブリダイゼーション反応を行って、前記プローブ核酸と前記多型核酸とのハイブリッド二本鎖を形成する第一のハイブリダイゼーション工程と；
前記第一のハイブリダイゼーション工程で形成されたハイブリッド二本鎖を、前記プローブ核酸に対して完全に相補的な前記標的核酸のみが二本鎖核酸を形成し得るハイブリダイゼーション条件下に置くことにより、該標的核酸以外の多型核酸を前記プローブ核酸から脱離させる第一の脱離工程と；
前記多型核酸が脱離されて一本鎖になったプローブ核酸と前記サンプル中に含まれる前記多型核酸との間で、前記複数の多型核酸のすべてが一本鎖になった前記プローブ核酸とハイブリダイズするハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイゼーション反応を行う第二のハイブリダイゼーション工程と；
前記第二のハイブリダイゼーション反応によって新たに形成されたハイブリッド二本鎖から、前記プローブ核酸に対して完全に相補的な標的核酸以外の多型核酸を脱離させる洗浄工程と
を具備したことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第一の脱離工程と、前記第二のハイブリダイゼーション工程とからなる処理プロセスを２以上含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一の脱離工程、並びに前記第二のハイブリダイゼーション工程におけるハイブリダイゼーション条件が温度により決定されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記多型核酸を含む核酸が一塩基多型であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の多型核酸を含むサンプルから標的核酸をハイブリダイゼーション法を用いて検出する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子工学の発展に伴い、医療分野では遺伝子による病気の診断や予防が可能となっている。これは遺伝子診断と呼ばれ、病気の原因となるヒトの遺伝子欠陥、変化を検出することで、病気の発症前もしくは極めて初期の段階で診断や予測をするものである。また、ヒトゲノムの解読と共に、遺伝子型と疫病との関連に関する研究が進み、各個人の遺伝子型に合わせた治療（テーラーメイド医療）も現実化しつつある。したがって、遺伝子の検出、遺伝子型の決定を簡便に行うことは非常に重要である。
【０００３】
従来のハイブリダイゼーション法を用いた核酸検出は、用意したプローブ核酸に対して相補的な配列を有する標的核酸を検出することにより行うが、実際のハイブリダイゼーション反応は、温度を一定に保ち、数時間から数日間反応させ、プローブ核酸に対して完全に相補的な標的核酸のみならず該標的核酸に類似相補的な配列を有する核酸もプローブ核酸にハイブリダイゼーションさせる。そして、その後の洗浄反応において完全に相補的な標的核酸以外の核酸をプローブ核酸から脱離させることにより、標的核酸を検出する構成となっている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
しかし、サンプル中に複数の多型核酸が存在する場合、特に一塩基多型（ＳＮＰ）部位を含む複数の多型核酸が存在するサンプルを検出する場合、プローブ核酸に対して完全に相補的でない、標的核酸以外の配列を有する核酸もハイブリダイズしてしまうことにより、標的核酸のプローブ核酸に対するハイブリダイゼーション効率が不充分となり、検出信号が小さい、あるいは試料核酸の配列によって信号量が異なるといった減少が起こり、核酸検出の信頼性が低くなってしまうという問題があった。
【０００５】
さらに、他種類の標的核酸からの発現量を検出する場合、サンプル中に類似の配列を有する核酸が存在すると、実際の発現量よりも信号が小さくなってしまい、全体として発言量の定量性が悪化するという問題も有していた。
【０００６】
この点をＳＮＰのヘテロサンプルからの検出を例にとって説明する。ヘテロサンプル中に、標的核酸である核酸（Ａ）と、該核酸（Ａ）に対して一塩基異なる配列を持つ核酸（Ｂ）が存在する場合、このヘテロサンプルを、核酸（Ａ）と相補的な配列を有するプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせると、核酸（Ａ）、（Ｂ）双方がプローブ核酸とハイブリダイゼーションする。従来の従来のハイブリダイゼーション法を用いた核酸検出では、その後に洗浄反応を、ハイブリダイゼーション時よりも厳密な条件下において行うことにより、核酸（Ｂ）のみをプローブ核酸から脱離させ核酸（Ａ）を残してこれを検知する。しかし、サンプル中に標的核酸（Ａ）のみが存在するホモサンプルの検出と比較すると、ヘテロサンプルの検出では、核酸（Ａ）とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率が低いため、検出される信号が減少してしまうという問題があった。
【特許文献１】特開２００２−３５５０８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記問題点に鑑み開発されたものであり、サンプル中に含まれる複数の多型核酸をハイブリダイゼーション法を用いて検出する場合において、検出感度を高め、特にＳＮＰ検出の信頼性を向上させることができる核酸検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ハイブリダイゼーション工程の後にプローブ核酸から該プローブ核酸に対して完全に相補的な標的核酸以外の多型核酸を脱離させる工程と、該離脱工程により一本鎖になったプローブ核酸とサンプル中に存在する複数の多型核酸との間でのハイブリダイゼーション工程とからなる処理プロセスを設け、更には該処理プロセスを繰り返すことにより、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーション効率が向上し、検出される信号を増加させることができるとの知見に基づき見出されたものである。
【０００９】
すなわち、本発明により、所定の多型部位の配列が異なり且つそれ以外の配列が同一である複数の多型核酸の一つを標的として、サンプル中に含まれる該標的核酸をハイブリダイゼーション反応により検出する方法であって、
固相担体表面に固定された前記標的多型核酸に対して完全に相補的であるプローブ核酸と前記サンプルに含まれる前記多型核酸との間で、前記複数の多型核酸のすべてが前記プローブ核酸とハイブリダイズする条件下においてハイブリダイゼーション反応を行って、前記プローブ核酸と前記多型核酸とのハイブリッド二本鎖を形成する第一のハイブリダイゼーション工程と；
前記第一のハイブリダイゼーション工程で形成されたハイブリッド二本鎖を、前記プローブ核酸に対して完全に相補的な前記標的核酸のみが二本鎖核酸を形成し得るハイブリダイゼーション条件下に置くことにより、該標的核酸以外の多型核酸を前記プローブ核酸から脱離させる第一の脱離工程と；
前記多型核酸が脱離されて一本鎖になったプローブ核酸と前記サンプル中に含まれる前記多型核酸との間で、前記複数の多型核酸のすべてが一本鎖になった前記プローブ核酸とハイブリダイズするハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイゼーション反応を行う第二のハイブリダイゼーション工程と；
前記第二のハイブリダイゼーション反応によって新たに形成されたハイブリッド二本鎖から、前記プローブ核酸に対して完全に相補的な標的核酸以外の多型核酸を脱離させる洗浄工程と
を具備したことを特徴とする方法が提供される。
【００１０】
本発明の方法は、一態様において、前記第一の脱離工程と、前記第二のハイブリダイゼーション工程とからなる処理プロセスを２以上含むことを特徴とする。
【００１１】
また本発明の方法は、他の態様において、前記第一の脱離工程並びに前記第二のハイブリダイゼーション工程におけるハイブリダイゼーション条件が温度により決定され得る。
【００１２】
本発明の方法は、前記多型核酸が一塩基多型を含む核酸である場合に特に有効である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、複数の多型核酸を含むサンプル中に含まれる標的核酸を、高信頼度で検出することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、所定の多型部位の配列が異なり且つそれ以外の配列が同一である複数の多型核酸の一つを標的として、サンプル中に含まれる該標的核酸をハイブリダイゼーション反応により検出する方法に係わる。標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション反応を利用して核酸を検出する方法であれば、検出の手段によらず好適に本発明を用いることができ、検出手段としては蛍光検出法、化学発光検出法、電流検出法等が挙げられる。
【００１５】
本発明の原理は以下の通りである。すなわち、本発明は、
(1) 固相担体表面に固定された標的多型核酸に対して完全に相補的であるプローブ核酸とサンプルに含まれる複数の多型核酸との間で、前記複数の多型核酸のすべてが前記プローブ核酸とハイブリダイズする条件下においてハイブリダイゼーション反応を行って、前記プローブ核酸と前記多型核酸とのハイブリッド二本鎖を形成する第一のハイブリダイゼーション工程と；
(2) 前記第一のハイブリダイゼーション工程で形成されたハイブリッド二本鎖を、前記プローブ核酸に対して完全に相補的な前記標的核酸のみが二本鎖核酸を形成し得るハイブリダイゼーション条件下に置くことにより、該標的核酸以外の多型核酸を前記プローブ核酸から脱離させる第一の脱離工程と；
(3) 前記多型核酸が脱離されて一本鎖になったプローブ核酸と前記サンプル中に含まれる前記多型核酸との間で、前記複数の多型核酸のすべてが一本鎖になった前記プローブ核酸とハイブリダイズする条件下においてハイブリダイゼーション反応を行う第二のハイブリダイゼーション工程と；
(4) 前記第二のハイブリダイゼーション反応によって新たに形成されたハイブリッド二本鎖から、前記プローブ核酸に対して完全に相補的な標的核酸以外の多型核酸を脱離させる洗浄工程と
を具備する。前記工程(2)及び(3)からなる処理プロセスを繰り返すことにより、ハイブリダイゼーション効率を更に向上させることができ、検出される信号量をより増加させることが可能となる。
【００１６】
本発明の一態様において、前記第一の脱離工程並びに前記第二のハイブリダイゼーション工程におけるハイブリダイゼーション条件は、温度により決定することができる。
【００１７】
すなわち、少なくとも第一及び第二の温度設定からなる温度プロファイルに従い、これを一度あるいは数度繰り返せばよい。第一の温度は、サンプル中に含まれる多型核酸のすべてがプローブ核酸とハイブリダイゼーション反応を起こし得る温度である。この温度は、プローブ核酸とサンプル中に含まれる複数の多型核酸との融点Ｔｍ（melting temperature）よりも低い温度に設定されることが好ましい。一方、温度が低すぎると、溶液中の核酸の移動速度が小さくなってしまうため、２０℃以上であることが好ましい。
【００１８】
第二の温度は、ハイブリダイゼーション工程で形成されたハイブリッド二本鎖からプローブ核酸に対して完全に相補的な標的核酸以外の多型核酸を脱離させ得る温度であり、サンプル中に含まれる多型核酸のうち、プローブ核酸に対して完全に相補的である標的核酸とプローブ核酸とのＴｍよりも低く、該標的核酸以外の多型核酸とプローブ核酸とのＴｍより高い温度であることが好ましい。第二の温度は第一の温度よりも高い温度となる。
【００１９】
第一の温度と第二の温度を設定するにあたって必要な数値であるＴｍは、種々の要因に支配されている。その要因としては、溶液中の核酸濃度、溶液の塩濃度、核酸の配列（ハイブリダイゼーション部位以外の配列も関与する）、ハイブリダイゼーション部位の塩基数、変性剤、コンジュゲート基等が挙げられる。Ｔｍの計算方法としては、最近接塩基対法（Nearest Neighbor method）、Ｗａｌｌａｃｅ法、ＧＣ法などが公知である。  
本発明において用い得る温度プロファイルの具体例を図２乃至図４にＰ１乃至Ｐ１０として示す。
【００２０】
以下に図１を用いて本発明をより具体的に説明する。図１は、標的核酸である核酸（Ａ）と、該核酸（Ａ）に対して一塩基異なる配列を有する核酸（Ｂ）とを含むサンプルについて、本発明を用いて標的核酸（Ａ）を検出する工程を概念的に示したものである。核酸プローブ（ａ）は標的核酸（Ａ）に対して完全に相補的な配列を有する。
【００２１】
工程１は第１のハイブリダイゼーション工程を示す。該工程ではサンプルに含有される核酸（Ａ）及び核酸（Ｂ）双方が核酸プローブ（ａ）とハイブリダイゼーション反応を起こし得る温度に設定され、一塩基異なる配列を持つ核酸（Ａ）、（Ｂ）が核酸プローブ（ａ）に同じ割合でハイブリダイズされる。工程２は第一の脱離工程を示す。該工程では、核酸（Ｂ）と核酸プローブ（ａ）との脱離が起こり得る温度まで上昇され、核酸プローブ（ａ）と一塩基異なる配列を有する核酸（Ｂ）が脱離する。このとき、核酸プローブに対して完全に相補的な核酸（Ａ）もある程度は脱離することもあるが、核酸（Ｂ）が優先的に脱離する条件であればよい。この段階で得られる信号量はサンプルが標的核酸（Ａ）のみを含む場合と比較して１／２となる。工程３は第二のハイブリダイゼーション工程を示す。該工程では、再び核酸（Ａ）及び核酸（Ｂ）双方が核酸プローブ（ａ）とハイブリダイゼーション反応を起こし得る温度に設定される。前記工程２において核酸（Ｂ）が脱離し一本鎖になった核酸プローブ（ａ）に再び核酸（Ａ）、（Ｂ）が同じ割合でハイブリダイズされる。次いで、一塩基異なる配列を有する核酸（Ｂ）が核酸プローブ（ａ）から脱離し得る条件で洗浄を行う。この段階で得られる信号量は３／４となり、サンプル中に存在する標的核酸（Ａ）を高信頼度において検知することが可能となる。
【実施例】
【００２２】
以下に、本発明による核酸検出方法を実施例を用いて説明する。  
（実施例１）
本実施例では、一塩基異なる配列を持つ合成オリゴ二種類を様々な割合で混合することにより作製した試料について、本発明によるハイブリダイゼーションを行った後、電流検出法によって検出を行った。
【００２３】
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
一本鎖核酸プローブ溶液にＡｕ電極表面を１時間浸漬することによって，プローブの固定化を行った。ここで用いた一本鎖核酸プローブの配列は以下の通りである。
【００２４】
核酸プローブ(i)    ATGCTTTCCGTGGCA
核酸プローブ(ii)   ATGCTTTGCGTGGCA
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、合成オリゴを用いた。配列は、一本鎖核酸プローブと相補的な配列を持つ２種である。配列は以下の通りである。
【００２５】
試料核酸(i)   TCCCATTT GTTCTCACTG CCACGGAAAG CATGTTTATA GTCTTCCAGC AGCAACGCCA GGTGTCTAGG CACAGATGAA CCCCTCCTTA GGATCCCCAC TGCTC
試料核酸(ii)   TCCCATTT GTTCTCACTG CCACCGAAAG CATGTTTATA GTCTTCCAGC AGCAACGCCA GGTGTCTAGG CACAGATGAA CCCCTCCTTA GGATCCCCAC TGCTC
試料核酸(i)と(ii)を混合比（(i)：(ii)）＝（１０：０）、（９：１）、（７：３）、（５：５）、（３：７）、（１：９）、（０：１０）となるように、終濃度で１×１０１４copy／ｍＬ含む２×ＳＳＣ溶液である試料を調整し、それぞれに、（１）で作製した核酸プローブ固定化Ａｕ電極を浸漬し、図５に示す温度プロファイル（ａ）、（ｂ）に従ってハイブリダイゼーション反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。その後、挿入剤であるヘキスト33258溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト33258分子の酸化電流応答を測定した。電気化学測定の結果を図６に示す。混合比（(i)：(ii)）＝（１０：０）、（０：１０）の試料に関しては、温度プロファイルによらず、同程度の信号が得られた。一方、混合比（(i)：(ii)）＝（９：１）、（７：３）、（５：５）、（３：７）、（１：９）の試料に関しては、温度プロファイル（ｂ）で反応させた試料で、信号量の増加が見られた。
【００２６】
（実施例２）
本実施例では、ＳＮＰ部位を含む配列を持つ核酸をＰＣＲで増幅することにより作製した試料について、本発明によるハイブリダイゼーションを行った後、電流検出法によって検出を行った。
【００２７】
（１）Ａｕ電極表面への核酸プローブの固定化
一本鎖核酸プローブ溶液にＡｕ電極表面を１時間浸漬することによって、プローブの固定化を行った。ここで用いた一本鎖核酸プローブの配列は以下の通りである。
【００２８】
核酸プローブ(i)    TCCGGGCGCAGAAAC
核酸プローブ(ii)   TCCGGGAGCAGAAAC
（２）核酸プローブ固定化表面を用いた試料核酸の検出
試料核酸は、ＰＣＲ産物を用いた。配列は、一本鎖核酸プローブと相補的な配列を持つホモ核酸２種とヘテロ核酸１種である。配列は以下の通りである。
【００２９】
試料核酸(i)     GAGCTAGGTT TCGTTTCTGC GCCCGGAGCC GCCCTCAGCA CAGGGTCTGT GAGTTTCATT TCTTCGCGGC GCGGGGCGGG GCTGGGCGCG GGGTGAAAGA GGCGAAGCGA GAGCGGAGGC C
試料核酸(ii)    GAGCTAGGTT TCGTTTCTGC TCCGGAGCC GCCCTCAGCA CAGGGTCTGT GAGTTTCATT TCTTCGCGGC GCGGGGCGGG GCTGGGCGCG GGGTGAAAGA GGCGAAGCGA GAGCGGAGGC C
試料核酸(iii)   GAGCTAGGTT TCGTTTCTGC GCCCGGAGCC GCCCTCAGCA CAGGGTCTGT GAGTTTCATT TCTTCGCGGC GCGGGGCGGG GCTGGGCGCG GGGTGAAAGA GGCGAAGCGA GAGCGGAGGC C
GAGCTAGGTT TCGTTTCTGC TCCGGAGCC GCCCTCAGCA CAGGGTCTGT GAGTTTCATT TCTTCGCGGC GCGGGGCGGG GCTGGGCGCG GGGTGAAAGA GGCGAAGCGA GAGCGGAGGC C
試料核酸(i)と(ii)と(iii)を、終濃度で１×１０14copy／ｍＬ含む２×ＳＳＣ溶液である試料を調整し、それぞれに、（１）で作製した核酸プローブ固定化Ａｕ電極を浸漬し、図７に示す温度プロファイル（ａ）、（ｂ）に従ってハイブリダイゼーション反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。その後、挿入剤であるヘキスト33258溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト33258分子の酸化電流応答を測定した。電気化学測定の結果を図８に示す。試料核酸(i)、(ii)に関しては、温度プロファイルによらず、同程度の信号が得られた。一方、試料核酸(iii)に関しては、温度プロファイル(ii)で反応させた試料で、信号量の増加が見られた。
【００３０】
（実施例３）
本実施例では、類似配列を含む多種類の核酸を含む試料を用いた遺伝子発現検出を、本発明によるハイブリダイゼーション法を用いて行った。まず初めに検出目的遺伝子1000種類に対して、相補的な配列を持つ一本鎖核酸プローブ溶液を、それぞれガラス基板表面に滴下し、静置ことによって、プローブの固定化を行った。試料核酸は、ＰＣＲ産物を用いた。1000種類の試料核酸中には一塩基から五塩基程度異なる類似配列を持つ核酸も数種類含まれている。この試料核酸を含む溶液中に、作製した核酸プローブ固定化ガラス基板を浸漬し、温度プロファイル（ａ）として４０℃の一定温度で、温度プロファイル（ｂ）として図２に示すＰ３に従いハイブリダイゼーション反応を行った。その後、洗浄を行った。その後、蛍光検出を行った。その結果、温度プロファイル（ｂ）で反応させた試料で、信号量の増加が見られた。
【００３１】
（実施例４）
本実施例では、類似配列を含む少種類の核酸を含む試料を、本発明によるハイブリダイゼーションを用い、定量性を検査した。一まず初めに検出目的遺伝子３種類に対して、相補的な配列を持つ一本鎖核酸プローブ溶液を、それぞれガラス基板表面に滴下し、静置ことによって、プローブの固定化を行った。試料核酸は、合成オリゴを用いた。試料核酸(i)と試料核酸(ii)は一塩基異なる配列を持ち、試料核酸(iii)は五塩基以上異なる配列を持つ。これらの試料核酸を様々な濃度含むいくつかの溶液中に、作製した核酸プローブ固定化ガラス基板を浸漬し、温度プロファイル（ａ）として４０℃の一定温度で、温度プロファイル（ｂ）として図４に示すＰ１０に従いハイブリダイゼーション反応を行った。その後、洗浄を行った。その後、蛍光検出を行った。その結果、温度プロファイル（ｂ）で反応させた試料で、濃度依存性の相関の改善が見られた。
【００３２】
なお、本発明は上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合わせにより、種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。さらに、異なる実施形態にわたる構成要素を適宜組み合わせてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の一実施の形態に係る標的核酸（Ａ）の検出工程を概念的に示す説明図。
【図２】本発明の他の実施形態において用い得る温度プロファイルの第１〜第３の例を示す図。
【図３】同温度プロファイルの第４〜第７の例を示す図。
【図４】同温度プロファイルの第８〜第１０の例を示す図。
【図５】本発明の実施例１で用いた温度プロファイルを示すグラフ。
【図６】同実施例１における電気化学測定の結果を示すグラフ。
【図７】本発明の実施例２で用いた温度プロファイルを示すグラフ。
【図８】同実施例２における電気化学測定の結果を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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