(57)【要約】【課題】  生体分子と検体との弱い相互作用を検出することができる方法および装置を提供する。【解決手段】  基板に固定した生体分子と、蛍光標識した検体との相互作用を、近接場光を用いて検出する方法であって、液体中において前記生体分子と前記検体とを接触させる工程と、液体中において前記生体分子表面にＳＮＯＭプローブを用いて近接場光を照射する工程と、前記近接場光により励起された蛍光を検出する工程と、を含む方法を用いる。また、基板に固定した生体分子と、蛍光標識した検体との相互作用を、近接場光を用いて検出する装置であって、前記検体と液体中において接触した前記生体分子の表面に、近接場光を照射する照射手段と、前記近接場光により励起された蛍光を検出する検出手段と、を備えることを特徴とする、前記装置を用いる。さらに、１種または２種以上の生体分子を固定した基板を用いることもできる。【選択図】  図１ 
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板に固定した生体分子と、蛍光標識した検体との相互作用を、近接場光を用いて検出する方法であって、
液体中において前記生体分子と前記検体とを接触させる工程と、
液体中において前記生体分子表面にＳＮＯＭプローブを用いて近接場光を照射する工程と、
前記近接場光により励起された蛍光を検出する工程と、
を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
前記生体分子が、タンパク質および／または糖鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検体が、タンパク質および／または糖鎖である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
１種または２種以上の生体分子を固定した基板を用いることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
基板に固定した生体分子と、蛍光標識した検体との相互作用を、近接場光を用いて検出する装置であって、
前記検体と液体中において接触した前記生体分子の表面に、近接場光を照射する照射手段と、
前記近接場光により励起された蛍光を検出する検出手段と、
を備えることを特徴とする、前記装置。
【請求項６】
前記生体分子が、タンパク質および／または糖鎖である、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記検体が、タンパク質および／または糖鎖である、請求項５または６に記載の装置。
【請求項８】
１種または２種以上の生体分子を固定した基板を用いることを特徴とする、請求項５ないし７のいずれかに記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子と検体との、液体中における相互作用を検出する方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム時代を迎えた今日、タンパク質、糖鎖などの生体分子の機能解明についての研究が盛んに行われている。そして、これらの生体分子と検体との相互作用を検出することは、生体分子の機能解明に重要なことである。特に、癌や糖尿病などの疾患については、タンパク質への糖鎖の付加が関与すると報告されており、糖鎖の付加によるタンパク質の機能解明が重要視されている。そして、タンパク質への糖鎖の付加による生体機能解明には、どのようなタンパク質にどのような糖鎖が付加するのかの糖鎖解析をする必要がある。しかし、糖鎖については、ＤＮＡやタンパク質の解析に用いられるシークエンサーや合成機などのデバイスが開発途上にあり、糖鎖の配列決定や試料の増幅を簡易に行えないのが現状である。このため、微量の試料を用いた解析が必要となる。
【０００３】
さらに、ＤＮＡ同士やＤＮＡと検体との相互作用は一般に強いものである一方、タンパク質と検体との相互作用には非常に弱いものがある。例えば、レクチンと糖鎖は、その解離定数が１０−６Ｍ程度であり、生体内で最も弱い結合であるとされている。このように弱い相互作用を検出するためには、タンパク質および検体の双方が活性を維持しており、且つバインディングフリーでない液体中で測定する必要がある。
【０００４】
ここで、微量の生体分子と検体との相互作用を検出する方法としては、表面プラズモン共鳴を用いた検出方法が知られている。
【０００５】
また、微量の生体分子と検体との相互作用を検出する他の方法としては、光の全反射により発生するエバネッセント光を用いるものが知られている（特許文献１参照）。
【０００６】
一方、近接場光顕微鏡（ＳＮＯＭ）プローブを用いた遺伝子解析方法が、知られている（特許文献２参照）。
【特許文献１】特開平１０−２８６０号公報
【特許文献２】特開２００１−１６５８４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、上記の表面プラズモン共鳴を用いた方法では、通常分子量の小さい基質を基板に固定しておき、これに分子量の大きいタンパク質等を結合させ、それによる屈折率の変化を捉えることにより、タンパク質等と基質との相互作用を検出している。従って、例えば、分子量の大きなタンパク質を基板に固定しておいて、これに分子量の小さな糖鎖が相互作用したときには、その屈折率の変化が小さく、検出が難しくなるという問題がある。このため、既知の特定のタンパク質と相互作用する糖鎖をスクリーニングする目的には、表面プラズモン共鳴を用いることは難しい。
【０００８】
また、上記のエバネッセント光を用いた方法は、生体分子を固定した基板の裏側から光を全反射させて基板表面にエバネッセント光を発生させるものであり、その照射範囲は基板上の数１００ｎｍの距離にとどまる。このため、生体分子をこの数１００ｎｍ以内に平らに固定することが必要となるが、これを精密に制御して固定することは容易ではない。さらに、基板上面に水などの液体が存在する場合は、光を全反射させることが難しく、エバネッセント光を発生させにくいという問題がある。
【０００９】
さらに、上記のＳＮＯＭプローブを用いた遺伝子解析方法は、上述のように強い相互作用を示すＤＮＡ鎖を対象として、遺伝子地図を解析するために用いられるものであり、タンパク質等による弱い相互作用を検出するものではない。
【００１０】
本発明の課題は、生体分子と検体との弱い相互作用を検出することができる方法および装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、基板に固定した生体分子と、蛍光標識した検体との相互作用を、近接場光を用いて検出する方法であって、液体中において前記生体分子と前記検体とを接触させる工程と、液体中において前記生体分子表面にＳＮＯＭプローブを用いて近接場光を照射する工程と、前記近接場光により励起された蛍光を検出する工程と、を含むことを特徴とする、前記方法である。
また、本発明は、生体分子が、タンパク質および／または糖鎖である、上記の方法である。
さらに、本発明は、検体が、タンパク質および／または糖鎖である、上記の方法である。
これらの発明により、生体分子と検体との弱い相互作用を検出することが可能となる。
【００１２】
また、本発明は、１種または２種以上の生体分子を固定した基板を用いることを特徴とする、上記の方法である。
この発明により、一つの基板において複数の生体分子について、検体との相互作用を検出することが可能となる。
【００１３】
さらに、本発明は、基板に固定した生体分子と、蛍光標識した検体との相互作用を、近接場光を用いて検出する装置であって、前記検体と液体中において接触した前記生体分子の表面に、近接場光を照射する照射手段と、前記近接場光により励起された蛍光を検出する検出手段と、を備えることを特徴とする、前記装置である。
また、本発明は、前記生体分子が、タンパク質および／または糖鎖である、上記の装置である。
さらに、本発明は、前記検体が、タンパク質および／または糖鎖である、上記の装置である。
これらの発明により、生体分子と検体との弱い相互作用を検出することが可能となる。
【００１４】
また、本発明は、１種または２種以上の生体分子を固定した基板を用いることを特徴とする、上記の装置である。
この発明により、一つの基板において複数の生体分子について、検体との相互作用を検出することが可能となる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、生体分子と検体との弱い相互作用を検出することが可能となる。また、本発明により、一つの基板において複数の生体分子について、検体との相互作用を検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して説明する。
図１は、本発明の検出方法および検出装置を模式的に示す図である。
図１において、生体分子５は、基板１に固定されている。この基板１は、蛍光標識１２により標識された検体１０を含む液体８の中におかれている。これにより生体分子５と検体１０とが接触することとなる。そして、ＳＮＯＭプローブ２０の先端に近接場光３０を発生させ、ＳＮＯＭプローブ２０によりＡＦＭモードで基板表面（生体分子表面）を走査する（図１（ａ））。検体１０と生体分子５が相互作用している箇所にＳＮＯＭプローブが到達すると、蛍光標識１２が近接場光３０により励起され、蛍光４０が発生することとなる（図１（ｂ））。この発生した蛍光４０を検出することにより、生体分子５と検体１０との相互作用を検出することが可能となる。なお、ここでＳＮＯＭプローブは、本発明の近接場光を照射する照射手段を構成する。
【００１７】
このとき、生体分子５と相互作用していない検体については、近接場光３０が照射されないため、蛍光を発生することがなく、目的の生体分子５と相互作用している検体のみを検出することが可能となる。
【００１８】
発生した蛍光を検出する手段としては、蛍光を検出できるものであれば特に制限はないが、例えば、光センサを基板１の上部若しくは基板１の裏側に設置することにより、蛍光を検出するものを用いることができる。
【００１９】
また、蛍光を検出する他の手段としては、例えば、図２に示すように、ＳＮＯＭプローブにより、蛍光を検出するものでもよい。即ち、図２において、レーザ発生器５０で発生したレーザ光５２は、ダイクロイックミラー５５を介してＳＮＯＭプローブ２０に入射し、その先端部分で図示しない近接場光が発生する。この近接場光が検体１０を標識した蛍光標識１２に照射され、蛍光４０が発生する。発生した蛍光４０の一部は、ＳＮＯＭプローブ２０、ダイクロイックミラー５５を介して、光センサ６０に到達し、蛍光が検出される。
【００２０】
なお、本発明の検出装置において、液体中で各々の処理を行うための液体貯留手段をさらに備えてもよい。
【００２１】
本発明に用いる生体分子としては、検体と相互作用するものであれば特に制限はないが、例えば、タンパク質、糖鎖等を挙げることができる。また、本発明に用いる検体としては、生体分子と相互作用するものであれば特に制限はないが、例えば、糖鎖、タンパク質等を挙げることができる。さらに、生体分子と検体との組み合わせの具体例としては、例えば、レクチンと糖鎖等を挙げることができる。これらのレクチンと糖鎖との結合は非常に弱いことが知られており、このような弱い相互作用も、本発明によって検出することが可能となる。
【００２２】
本発明に用いられる、検体への蛍光標識としては、蛍光を発生するものであれば特に制限はないが、例えば、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）やカルシウム指示タンパク質試薬（ｃａｍｅｌｅｏｎ）などの蛍光タンパク質を挙げることができる。
【００２３】
本発明に用いられる基板としては、生体分子を固定できるものであれば特に制限はないが、例えば、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＥ膜、金属、ガラスなどから成るものを挙げることができる。特に、ガラス等の透明の材料を用いた場合には、基板の裏面から蛍光を検出することが可能となる。
【００２４】
基板に生体分子を固定する方法としては、基板に生体分子を固定できるものであれば特に制限はないが、例えば、アミノ結合させる方法、物理的吸着をさせる方法、チオール結合させる方法、抗原抗体反応をさせる方法等を挙げることができる。
【００２５】
本発明に用いられる液体としては、生体分子と検体との相互作用を検出できるものであれば特に制限はないが、例えば、緩衝液等を挙げることができる。緩衝液を用いることにより、生体分子および検体の活性を失うことなく、これらの相互作用を検出することが可能となる。
【００２６】
本発明における生体分子と検体とを接触させる方法としては、生体分子と検体が接触できるものであれば特に制限はないが、例えば、検体を含む液体中に、生体分子を固定した基板を浸漬する方法を挙げることができる。これにより、検体が生体分子と接触し、相互作用が比較的強い場合は、より多くの検体が生体分子に吸着または結合することとなる。また、これらの相互作用が比較的弱い場合は、より少ない検体が生体分子に吸着または結合することとなる。
【００２７】
本発明に用いられるＳＮＯＭプローブとしては、近接場光を発生させることができるものであれば特に制限はない。ＳＮＯＭプローブ先端では、半径約数１０ｎｍの範囲において近接場光を発生させることができ、標的とする生体分子付近の微小領域のみにおいて、検体との相互作用を検出することが可能となる。
【００２８】
この場合、生体分子を固定したスポットについて、ＳＮＯＭプローブを走査させて、検出することが好ましい。なお、生体分子を基板に平坦に固定することは容易ではないため、ＳＮＯＭプローブを走査させる方法としては、ＡＦＭモードによることが好ましい。ＡＦＭモードによれば、基板に固定した生体分子のスポットが平坦でない場合でも、その凹凸に応じて、ＳＮＯＭプローブと、生体分子または検体とを等距離に保つことができ、精度よく検体と生体分子との相互作用を検出することが可能となる。
【００２９】
本発明に用いられる生体分子を固定した基板としては、１種類の生体分子を固定したもののほか、例えば、図３に示すような、２種以上の生体分子を固定したものを挙げることができる。即ち、図３において、複数の生体分子５は、各々異なる種類のものが基板１に固定されている。この基板１を、検体を含む液体中に浸漬し、ＳＮＯＭプローブを走査させることにより、各々のスポットの生体分子について、検体との相互作用を検出することが可能となる。これによって、１つの検体について、複数種類の生体分子との相互作用を１つの基板を用いることにより、検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、本発明の検出方法および検出装置の概略を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明に用いる蛍光の検出方法および検出装置の１例を示す図である。
【図３】図３は、２種以上の生体分子を固定した基板の例である。
【符号の説明】
【００３１】
１  基板
５  生体分子
８  液体
１０  検体
１２  蛍光標識
２０  ＳＮＯＭプローブ
３０  近接場光
４０  蛍光
５０  レーザ発生器
５２  レーザ光
５５  ダイクロイックミラー
６０  光センサ
【図１】
2005257274.tif 000003
【図２】
2005257274.tif 000004
【図３】
2005257274.tif 000005