(57)【要約】    【課題】  複数の培養条件での測定を同時に行うことができ、参照電極のインピーダンスが小さく、ノイズの影響を受け難く、発振を誘発することがない細胞外電位測定プローブを提供すること。    【解決手段】  複数の貫通孔を有する区画枠（１）と、複数の測定電極が一表面に配置され、測定電極を取り囲むように筒状部材（３）が一表面に配置された、非導電性材料から成る電極基板（２）とを備え、貫通孔の開口部が位置する区画枠（１）の一方の表面が、筒状部材（３）によって囲まれた電極基板（２）上の領域に、複数の貫通孔の少なくとも一部が複数の測定電極の一部を取り囲むように密着され、貫通孔内に培養液が注入された場合に培養液と接触する貫通孔の内壁部分が導電性材料で形成され、培養液と接触する貫通孔の内壁部分を参照電極として、測定電極の電位が測定されることを特徴とする。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の測定電極を備えた細胞外電位測定プローブであって、
複数の貫通孔を有する区画枠と、
複数の前記測定電極が一表面に配置され、前記測定電極を取り囲むように筒状部材が前記一表面に配置された、非導電性材料から成る電極基板とを備え、
前記貫通孔の開口部が位置する前記区画枠の一方の表面が、前記筒状部材によって囲まれた前記電極基板上の領域に、複数の前記貫通孔の少なくとも一部が複数の前記測定電極の一部を取り囲むように密着され、
前記貫通孔内に培養液が注入された場合に該培養液と接触する前記貫通孔の内壁部分が導電性材料で形成され、
前記培養液と接触する前記貫通孔の前記内壁部分を参照電極として、前記測定電極の電位が測定されることを特徴とする区画アレイ型細胞外電位測定プローブ。
【請求項２】
前記区画枠の全体が導電性材料で形成されていることを特徴とする請求項１に記載の区画アレイ型細胞外電位測定プローブ。
【請求項３】
前記区画枠が非導電性材料で形成され、
前記区画枠の表面がめっき処理され、又は、前記区画枠の表面に導電性塗料が塗布若しくは吹き付けされていることを特徴とする請求項１に記載の区画アレイ型細胞外電位測定プローブ。
【請求項４】
複数の前記貫通孔の前記開口部の形状及び面積がそれぞれ同じであることを特徴とする請求項１〜３の何れかの項に記載の区画アレイ型細胞外電位測定プローブ。
【請求項５】
複数の前記貫通孔の前記開口部の形状がそれぞれ同じであり、
複数の前記貫通孔の内、一部の貫通孔の面積が、所定の貫通孔の開口部の面積を基準として、略等比数列で変化していることを特徴とする請求項１〜３の何れかの項に記載の区画アレイ型細胞外電位測定プローブ。
【請求項６】
前記筒状部材が円筒形状であり、
複数の前記測定電極が、相互に所定の間隔で前記電極基板上に配置され、
前記区画枠が、
前記筒状部材に略内接する大きさの、略直方体の格子形状であり、
粘着性撥水材料を使用して前記一側表面上に密着されていることを特徴とする請求項１〜５の何れかの項に記載の区画アレイ型細胞外電位測定プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞外電位の多点同時測定が可能な細胞外電位測定プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞の活動状態を反映した細胞表面に発生する電位を、細胞表面の複数の位置で測定する手段や、細胞表面の複数の位置で電気刺激を与える手段が知られている。例えば、下記特許文献１には、絶縁基板上に複数の微小電極が配置され、微小電極を含む領域を囲む壁部が設けられた細胞電位測定電極を用いて、壁部で囲まれた領域内で細胞を培養しながら、細胞外電位を測定、又は細胞を電気刺激する手段が開示されている。
【０００３】
また、下記特許文献２は、特許文献１に開示された細胞電位測定電極の問題、即ち、特許文献１の細胞電位測定電極では、微小電極の１つを電位測定の基準電極（以下、参照電極と記す）として用いる場合、どの微小電極を参照電極として使用するかによってノイズレベルが変動する問題、また、複数の微小電極を参照電極として使用する場合、参照電極に触れないように細胞を細胞電位測定電極に載置することが容易ではない問題を解決せんとするものである。特許文献２には、これらの問題を解決する細胞電位測定電極として、微小電極が密集配置された領域から所定距離だけ離れた位置に、微小電極よりも大きい面積の参照電極を複数配置した細胞電位測定電極が開示されている。
【特許文献１】特開平８−６２２０９号公報
【特許文献２】特開平１１−１８７８６５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記した特許文献１、２のように、細胞外電位を多点位置で測定するためのプローブは公知であり、それによって一つの検体に対して多点位置で同時に電位を測定することは可能であるが、大量のサンプルに対して同時に測定を行うことや、異なる培養条件で多くの測定を同時に行うことができない。これらの測定は、薬理効果アッセイなどで特に重要であり、多くの条件で薬理効果を解析するために、なるべく均質である培養細胞群に対して、それぞれの細胞群の電気的活動に対する様々な薬剤の効果を同時に解析するのに適したプローブが要望されている。
【０００５】
また、参照電極の取り方、即ち、如何なる形状で、如何なる配置で参照電極を形成するかが重要であり、特に、上記した目的のために、それぞれが独立の複数の小領域を備えたプローブでは、適切な参照電極を形成することが困難である。例えば、独立した小領域毎に参照電極を、測定電極と同様に基板上に形成する場合、参照電極の面積を十分に大きくすることができず、インピーダンスが大きくなり、ノイズの影響を受け易く、測定装置内の信号増幅回路で発振が生じ易くなり、さらに、正常な測定ができるように、検体が参照電極及び測定電極に同時に接触しないようにすることも困難になる。また、特許文献２に開示されている測定電極が配置された領域から離れた位置に複数の参照電極を形成する方法では、独立した小領域毎に参照電極を形成することができない。また、図８に示したように、測定電極が形成された基板の外部から、小領域毎に針状の参照電極３０を挿入する場合、取り扱いが容易ではなく、各小領域への薬液等の注入が困難である。
【０００６】
本発明の目的は、上記の課題を解決すべく、複数の培養条件での測定を同時に行うことができ、参照電極のインピーダンスが小さく、ノイズの影響を受け難く、発振を誘発することがない細胞外電位測定プローブを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的は、以下の手段によって達成される。
【０００８】
即ち、本発明に係る区画アレイ型細胞外電位測定プローブ（１）は、複数の測定電極を備えた細胞外電位測定プローブであって、複数の貫通孔を有する区画枠と、複数の前記測定電極が一表面に配置され、前記測定電極を取り囲むように筒状部材が前記一表面に配置された、非導電性材料から成る電極基板とを備え、前記貫通孔の開口部が位置する前記区画枠の一方の表面が、前記筒状部材によって囲まれた前記電極基板上の領域に、複数の前記貫通孔の少なくとも一部が複数の前記測定電極の一部を取り囲むように密着され、前記貫通孔内に培養液が注入された場合に該培養液と接触する前記貫通孔の内壁部分が導電性材料で形成され、前記培養液と接触する前記貫通孔の前記内壁部分を参照電極として、前記測定電極の電位が測定されることを特徴としている。
【０００９】
本発明に係る区画アレイ型細胞外電位測定プローブ（２）は、上記の区画アレイ型細胞外電位測定プローブ（１）において、前記区画枠の全体が導電性材料で形成されていることを特徴としている。
【００１０】
本発明に係る区画アレイ型細胞外電位測定プローブ（３）は、上記の区画アレイ型細胞外電位測定プローブ（１）において、前記区画枠が非導電性材料で形成され、前記区画枠の表面がめっき処理され、又は、前記区画枠の表面に導電性塗料が塗布若しくは吹き付けされていることを特徴としている。
【００１１】
本発明に係る区画アレイ型細胞外電位測定プローブ（４）は、上記の区画アレイ型細胞外電位測定プローブ（１）〜（３）の何れかにおいて、複数の前記貫通孔の前記開口部の形状及び面積がそれぞれ同じであることを特徴としている。
【００１２】
本発明に係る区画アレイ型細胞外電位測定プローブ（５）は、上記の区画アレイ型細胞外電位測定プローブ（１）〜（３）の何れかにおいて、複数の前記貫通孔の前記開口部の形状がそれぞれ同じであり、複数の前記貫通孔の内、一部の貫通孔の面積が、所定の貫通孔の開口部の面積を基準として、略等比数列で変化していることを特徴としている。
【００１３】
本発明に係る区画アレイ型細胞外電位測定プローブ（６）は、上記の区画アレイ型細胞外電位測定プローブ（１）〜（５）の何れかにおいて、前記筒状部材が円筒形状であり、複数の前記測定電極が、相互に所定の間隔で前記電極基板上に配置され、前記区画枠が、前記筒状部材に略内接する大きさの、略直方体の格子形状であり、粘着性撥水材料を使用して前記一側表面上に密着されていることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る区画アレイ型細胞外電位測定プローブによれば、複数の培養条件での測定を同時に行うことができ、参照電極のインピーダンスが小さく、ノイズの影響を受け難く、測定装置の発振を誘発することがない。
【００１５】
また、一つの電極基板上に多くの測定電極を密集させて配置し、これらを区画枠によって独立した複数の区画に区分しているので、多数の測定対象を１つのプローブ上で同時に観測することが可能となる。また、多数の異なる薬理条件で、同時に観測することもできるので、効率的な大量薬理効果アッセイが可能になる。
【００１６】
また、区画枠によって区分された区画の大きさが小さく、近接して配置されているので、細胞の生育条件等による測定結果の偏異を生じにくく、培養細胞群の同時観測に適する。
【００１７】
また、区画枠と電極基板とを分離して形成したことで、実験目的に応じて区画枠を交換し、培養及び細胞外電位の測定を行うことが可能となる。例えば、各区画の面積を調整した区画枠を使用すれば、培養細胞群の培養面積による薬理反応への差異を検証できる。
【００１８】
また、参照電極は、面積が大きく、インピーダンスが小さいので、細胞外電位測定時のノイズ特性や、細胞に電気刺激を与える場合の電気刺激特性に優れる。
【００１９】
また、参照電極と測定電極とを同一区画内の電極基板の表面に配置する場合のように、細胞が測定電極と参照電極（具体的には、区画枠の各区画の内壁の培養液に浸漬された部分）とに同時に接触するということがなく、正常に測定を行うことができる。
【００２０】
また、電極基板上に参照電極を配置するためのスペースを節約でき、各区画の面積を小さくすることができ、プローブ全体を小型化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明に係る実施の形態を、添付した図面に基づいて説明する。図１は、本発明の実施の形態に係る区画アレイ型細胞外電位測定プローブの構成を示す斜視図である。本区画アレイ型細胞外電位測定プローブは、導電性材料で形成された区画枠１と、円筒部材３を備え、非導電性材料で形成された電極基板２とを備えて構成され、区画枠１が円筒部材３の内側の電極基板２の表面に所定の方法で取り付けられて測定に使用される。
【００２２】
図２の（ａ）は図１に示した区画枠１の平面図であり、（ｂ）は同正面図である。図２に示したように、区画枠１の外形は略直方体であり、開口部が正方形でその面積が等しい、複数の貫通孔１２を備えている。また、区画枠１の一側壁には、電気配線を接続するリード部材１１を備えている。例えば、区画枠１は、底面が一辺約１５．４ｍｍの正方形であり、高さが約２ｍｍであり、開口部が一辺約２．６ｍｍの正方形である１６個（縦、横の配列数がそれぞれ４）の貫通孔１２が形成されており、肉厚が約１ｍｍの格子を形成している。
【００２３】
また、区画枠１は、金属などの電気導電性材料で形成されている。後述するように、この区画枠１を使用して培養液を保持するので、区画枠１の材料としては、チタン、ステンレス、ニッケル合金などの空気中で表面に酸化膜が形成されて不動態化する金属や、金、白金、銀などの貴金属など、耐腐食性の高い材料を使用することが望ましい。
【００２４】
また、リード部材１１は、電気導電性材料で形成されており、区画枠１と電気的に接続している。リード部材１１は、培養液に浸漬される場合には、区画枠１と同様に耐腐食性材料で形成されることが望ましい。
【００２５】
図３は、図１に示した電極基板２を示す平面図である。図３には、円で円筒部材３の位置を示し、破線で区画枠１の取り付け位置を示している。電極基板２は、一辺が約５０ｍｍの正方形で、その厚さは約１ｍｍである。電極基板２及び円筒部材３はガラス、プラスチックなどの非導電性材料で形成されている。電極基板２の表面中央付近に、導電性材料からなる複数の測定電極２１が、相互に所定の間隔で配置されている。また、電極基板２の各辺の近傍には、相互に所定の間隔で配置された複数の接続端子２３を備えている。対応する測定電極２１と接続端子２３とは、導電性の配線パターン２２を介して接続されている。
【００２６】
測定電極２１は、例えば、白金で形成され、区画枠１の各区画内に４個ずつ含まれ、各区画内で相互に約１ｍｍの間隔で配置されている。また、電極基板上への測定電極２１、
配線パターン２２、接続端子２３の形成は、特許文献１、２に開示されている方法と同様に、エッチングによって行えばよい。
【００２７】
区画枠１を円筒部材３の内側の電極基板２の表面に取り付けるには、例えば、区画枠１の底面にシリコングリスを所定量塗布し、電極基板２の表面に圧着することで行えばよい。シリコングリスの塗布量は、区画枠１の底面と電極基板２の表面とが隙間無く密着する限り、少量でよい。
【００２８】
本実施の形態に係る区画アレイ型細胞外電位測定プローブにおける細胞の培養に関しては、区画枠１を電極基板２に取り付けずに円筒部材３の内側に培養液を入れて細胞の培養を行い、薬理アッセイ直前にシリコングリスを底面に塗布した区画枠１を電極基板２の表面に圧着し、独立な複数の区画に区分する（以下、区画圧着法と記す）。また、あらかじめ区画枠１を電極基板２に接着剤を用いて十分密着させ、形成される独立な区画毎に培養液を注入して細胞の培養を行ってもよい（以下、区画培養法と記す）。接着剤には、例えばシアノアクリルレート系接着剤、エポキシ系接着剤などの生体親和性が比較的高い接着剤を使用し、接着後に十分乾燥させることが望ましい。これら、区画圧着法、区画培養法は、測定対象及び測定内容に応じて適宜選択することが望ましい。また、区画培養法の場合、培養中に細胞が死滅しないように、区画枠１の深部（電極基板の表面近傍）まで十分な酸素を供給できるように、細胞の酸素要求性に応じて高さを設計した区画枠１を使用する必要がある。
【００２９】
本実施の形態に係る区画アレイ型細胞外電位測定プローブを使用して細胞外電位を測定する場合、リード部材１１に接続した電気配線を測定装置の参照電極端子に接続する。これによって、区画枠１が、各々の測定電極に対して参照電極の役割をする。即ち、各々の測定電極の電位は、区画枠１の電位を基準として測定される。この状態で、各々の測定電極の電位は、対応する接続端子２３を介してアナログ信号として増幅器に入力され、Ａ／Ｄ変換器を介してコンピュータからなる測定装置（何れも図示せず）によってディジタルデータとして採取される。その方法は特許文献１、２などに公知であるので、詳細説明は省略する。
【００３０】
上記したように、本実施の形態に係る区画アレイ型細胞外電位測定プローブでは、区画枠１全体を参照電極として使用するので、培養液と接触する参照電極の面積を十分に大きくすることができ、インピーダンスを小さくすることができる。よって、ノイズの影響及び測定装置の発振を抑制することができる。
【００３１】
上記では、区画枠１全体が導電性材料で形成される場合を説明したが、これに限定されない。例えば、区画枠１をプラスチックなどの非導電性材料で形成し、めっき処理して表面に金属膜を形成してもよい。また、めっき処理の代わりに、導電性塗料を表面に塗布又は吹き付けて、表面に導電性膜を形成してもよい。また、区画枠１の表面全体が導電性を有していなくてもよく、少なくとも、注入された培養液と接する区画枠１の内壁部分が導電性を有し、リード部１１と電気的に接続されていればよい。
【００３２】
また、区画枠１の外形形状は、上記した略直方体に限定されない。区画枠１の外形形状は、例えば円柱であってもよく、多角柱であってもよい。
【００３３】
また、区画枠１の貫通孔１２の開口部の形状は、上記した正方形に限定されず、長方形、円形など任意の形状であってもよい。また、各々の貫通孔１２の開口部の面積は、全て略等しくなくともよい。例えば、所定の開口部の面積を基準として、各開口部の面積が略等比数列で変化してもよい。図４にその一例を示す。図４は、最小面積の開口部１２’を基準とし、開口部の面積が約２倍、約４倍、約８倍に変化する貫通孔を備えた区画枠１’
を示す平面図である。このように、区画枠に異なる大きさの貫通孔を設けることによって、例えば、培養細胞群の培養面積による薬理反応への差異を検証する実験などを容易に行うことができる。
【００３４】
また、リード部材１１の区画枠１への取り付け位置は、上記した区画枠１の外側壁に限定されない。リード部材１１と区画枠１との接続部のインピーダンスが十分に小さければよく、例えば、リード部材１１が、区画枠１の貫通孔１２の開口部を有する上面の中心位置などの任意の位置に取り付けられていてもよい。
【００３５】
また、区画圧着法における区画枠１の電極基板２の表面への取り付け手段は、シリコングリスに限定されず、他の撥水性及び粘着性がある生体親和性の高い材料を使用してもよい。
【００３６】
また、電極基板２上の測定電極２１、配線パターン２２及び接続端子２３の大きさ、配置、数量は、上記で説明したものに限定されず、種々の変更を行ってもよい。
【００３７】
また、電極基板２に取り付けた培養液を保持するための壁は、上記した円筒部材３に限定されず、区画枠１全体を収容できる形状及び大きさであれば、任意の形状であってもよい。
【実施例】
【００３８】
以下に実施例を示し、本発明の特徴とするところをより一層明確にする。
【００３９】
実際に試作した生体神経回路網を対象とする薬理効果アッセイ用の区画アレイ型細胞外電位測定プローブを図５に示す。この区画アレイ型細胞外電位測定プローブを市販の細胞外電位記録システム（ＭＥＤ−６４インテグレーテッドシステム：アルファメッドサイエンス社製）に接続して測定電極の電位を観測し、その有効性を確認した。
【００４０】
先ず、電極基板上の各々の区画内の領域に、４つの測定電極と１つの参照電極とを配置し、電位測定を行った。この時、電位測定プローブに培養液を注入しているが、神経細胞は培養せずに測定した。その結果を図６に示す。図６では、各々の測定電極の観測信号を枠で囲み、電極基板上での配置と対応させて示しており、各枠において、横軸は時間、縦軸は電位を表す。図６からわかるように、全ての測定電極の観測信号において、参照電極のインピーダンスの高さに起因する発振現象（黒く塗り潰された部分が、測定レベルを超えた高周波信号に該当）が認められた。
【００４１】
次に、図５に示した区画アレイ型細胞外電位測定プローブを用いて、同様の測定を行った。その結果を、図６と同様に図７に示す。図７からわかるように、全ての測定電極の観測信号において、微小レベルのノイズが観測されただけで、発振現象は観測されなかった。よって、本発明に係る区画アレイ型細胞外電位測定プローブを使用すれば、安定した電位測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の実施の形態に係る区画アレイ型細胞外電位測定プローブの概略構成を示す斜視図である。
【図２】本実施の形態に係る区画アレイ型細胞外電位測定プローブの区画枠を示す平面図（ａ）及び正面図（ｂ）である。
【図３】本実施の形態に係る区画アレイ型細胞外電位測定プローブの電極基板の平面図である。
【図４】本発明の別の実施の形態に係る区画アレイ型細胞外電位測定プローブの区画枠を示す平面図である。
【図５】本発明の実施例を示す斜視図である。
【図６】細胞外電位測定基板の底面に参照電極を配置した場合に観測される信号波形を示す図である。
【図７】本発明に係る区画アレイ型細胞外電位測定プローブを使用した場合に観測される信号波形を示す図である。
【図８】従来技術に係る複数の針状の参照電極を使用するプローブを示す斜視図である。
【符号の説明】
【００４３】
１    区画枠
２    電極基板
３    円筒部材
１１  リード部材
１２  貫通孔
２１  測定電極
２２  配線パターン
２３  接続端子
３０  参照電極
【図１】
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【図２】
2005233641.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005233641.tif 000009
【図８】
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