(57)【要約】  【課題】簡便、安全、かつ、リアルタイムでの検出を行うことが可能な、金属表面を利用するセンサーにおいて、さらなる高感度化手段を提供すること。  【解決手段】検出対象物質を担持させた金属コロイド粒子を、「当該検出対象物質に対する結合分子を有し、かつ、前記金属の表面を有するセンサチップ」に接触させて、当該センサチップからのシグナルを指標として検出対象物質の検出を行う検出方法を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見いだした。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象物質を担持させた金属コロイド粒子を、「当該検出対象物質に対する結合分子を有し、かつ、前記金属の表面を有するセンサチップ」に接触させて、当該センサチップからのシグナルを指標として検出対象物質の検出を行う、検出方法。
【請求項２】
「検出対象物質を担持させた金属コロイド粒子が結合分子を介して結合しているセンサチップの金属表面」に対して検出対象物を接触させ、当該検出対象物中の検出対象物質と前記金属コロイド粒子との競合による、同金属コロイド粒子のセンサチップの金属表面からの解離をシグナルとして検出する、請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
金属コロイド粒子、および、センサチップの金属表面に、親水性直鎖状モノマー単位を含むポリマーが起立するように担持されている、請求項１または２記載の検出方法。
【請求項４】
金属コロイド粒子に担持された親水性直鎖状モノマー単位を含むポリマー鎖の先端近傍に検出対象物質が担持され、かつ、センサチップの金属表面に担持された当該ポリマー鎖の先端近傍に検出対象物質に対する結合分子が担持されている、請求項３記載の検出方法。
【請求項５】
親水性直鎖状モノマー単位を含むポリマーが、炭素原子数が２〜３のアルキレンオキシドをモノマー単位とする、重合数が２〜１００００のポリアルキレンオキシドである、請求項３または４記載の検出方法。
【請求項６】
ポリアルキレンオキシドが、ポリエチレンオキシドである、請求項３〜５のいずれかに記載の検出方法。
【請求項７】
センサチップの金属表面および/または金属コロイド粒子表面において、マスキング処理が行われている、請求項１〜６のいずれかに記載の検出方法。
【請求項８】
センサチップの金属表面および/または金属コロイド粒子表面におけるマスキング処理が、起立した部分の嵩高が検出対象物質または検出対象物質に対する結合分子が担持された前記ポリマーの嵩高よりも短く、かつ、前記起立部分の先端近傍が不活性化処理された当該ポリマーの担持によって行われる、請求項７記載の検出方法。
【請求項９】
金属コロイド粒子が金コロイド粒子であり、かつ、センサチップの金属が金である、請求項１〜８のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１０】
検出対象物質と結合分子の組が、抗原若しくはハプテンと抗体の組、糖とレクチンの組、基質と酵素の組、ホルモンとその受容体の組、核酸とその相補鎖の組、または、被結合タンパク質と結合タンパク質の組である、請求項１〜９のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１１】
センサチップからのシグナルの検出が、表面プラズモン共鳴を利用して、センサチップ表面の状態を検出可能な機器によって行われる、請求項１〜１０のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１２】
請求項３または４の検出方法を行うための、親水性直鎖状モノマー単位を含むポリマーが担持されている金属コロイド粒子、および、同担持金属表面を有するセンサチップのセット。
【請求項１３】
金属コロイド粒子のポリマーに検出対象物質が担持され、かつ、センサチップの金属表面のポリマーに当該検出対象物質に対する結合分子が担持されている、請求項１２記載のセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサーを用いた物質の検出方法に関する発明であり、さらに具体的には、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーの金コロイドによる増感作用を利用して、金コロイドを標識したタンパク質等の生体関連物質を高感度に検出可能とする発明である。
【背景技術】
【０００２】
従来、抗原抗体反応等の生体分子間の相互作用の検出には、蛍光分子や放射性同位元素（アイソトープ）により標識された抗体がもちいられてきた。しかしながら、このような抗体の標識は、前処理、洗浄操作等、煩雑な工程を行わなければならず、物質の検出と定量を迅速に、かつ、リアルタイムに行うには困難を伴うこととなる。また、特に、アイソトープによる標識では、実験操作時ないし廃液からの放射線被曝による人体への影響が危惧されている。これらの抗原抗体反応等の検出における問題を回避するために、簡便、安全、かつ、リアルタイムでの検出を行うことができる手段が求められている。
【０００３】
かかる手段として、これまで下記のような技術が提案されている。
【０００４】
金属コロイドによる標識法
この方法は、標識すべき特異的な結合部分に金コロイド等の金属コロイドを結合させて、当該金属コロイドを標識として検出・測定する方法である。
金属の超微粒子は、共鳴ラマン散乱を表面シグナル増感効果により増大させることが知られるようになり[表面―強化ラマン光散乱(Surface Enhanced Raman Scatting)、表面強化共鳴ラマン散乱(SERRS:Surface Enhanced Resonance Raman Scatting)]、さらに、金属コロイドにおいても前記シグナル増感効果を示すことが見いだされた。この方法は、このような金属コロイドの特性を活用する方法である。すなわち、このようにラマン光に対する表面増感効果を伴う金属コロイドを標識試薬として用いることにより、当該金属コロイドと結合することができる種々の被検出物、例えば、抗体または結合分子を検出することができる。また、前記被検出物に、これに対する特異的結合部位および金属コロイド等のラマン増感物質を伴う物質、すなわち、媒介分子(intervening molecule)を接触させ、当該媒介分子と結合した被検出物を、ラマン光によるシグナルを指標として感度良く検出することができる。
【０００５】
ＳＰＲセンサー
物質の検出を、ノンラベルで、かつ、リアルタイムに行うため、種々のバイオセンサーが開発されている。主要なバイオセンサーの一つとして、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーが挙げられる。ＳＰＲは、煩雑な前処理がなく、ノンラベルで、迅速かつ簡便に物質の検出を行うことが可能であり、しかも高感度であることから、信頼性の高い検出技術として注目されている。
【０００６】
ＳＰＲは、近接場光学を用いた屈折率測定法である。すなわち、金を蒸着したガラスチップ表面に光りを全反射させると、反射光の一部に反射光強度が減衰した部分が生し（ＳＰＲシグナル）、この共鳴減衰の角度は、センサチップ上の質量に、屈折率をパラメータとして依存し、チップの表面に物質が結合すると、共鳴波の角度がシフトする。この共鳴角のシフトの値から、結合の量、強さ、結合速度等を算出することができる。
チップ表面処理法
金表面は、静電的相互作用等により、タンパク質や核酸等のイオン性物質を容易に吸着する性質があり、結合分子の特異性とは関係ない、いわゆる非特異吸着が、特定の物質を検出する際の大きな問題となる。従って、現状では界面近傍の質量変化を、特異的な結合の有無にかかわらず計測してしまい、検出データの再現性と信頼性に疑問が残る場合が少なくない。このような理由により、金表面を利用した検出方法は、原理的には高感度の測定が可能であるにもかかわらず、一般の臨床診断分野においてはほとんど普及していない。
このような、金表面における非特異吸着の問題に関して、金表面をポリマーや自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）でコートする方法が提案されている。また、デキストラン等の多糖類をコートしたチップが市販されているが、未だ十分な非特異吸着の抑制効果は得られていない。
金コロイド比色法
金コロイドを用いた凝集法による抗原検出法は、金コロイド比色法として、抗原抗体反応を色の変化として捉える方法であり、イムノラテックス法よりもさらに高感度が期待できる。体外診断薬として、現在実用的に用いられているものとしては、便潜血検査による大腸ガン検診、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)の検出による妊娠診断等があり、目視による判定、あるいは専用の計測機器と組み合わせて定量する方法がとられている。
また、本発明に関連すると考えられる文献として、下記の文献が挙げられる。
【特許文献１】特開２０００−５５９２０号公報
【特許文献２】特開２００２−２６７６６９号公報
【特許文献３】特開２００３−１４７６５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上述したように、簡便、安全、かつ、リアルタイムでの検出を行うことが可能な、金属表面を利用するセンサーにおいて、さらなる高感度化手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、検出対象物質を金属コロイド粒子に担持させて、これを、当該金属表面を有するセンサチップに接触させることによるシグナルにより、鋭敏に対象物質の検出を行うことが可能であることを見いだし、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、検出対象物質を担持させた金属コロイド粒子を、「当該検出対象物質に対する結合分子を有し、かつ、前記金属の表面を有するセンサチップ」に接触させて、当該センサチップからのシグナルを指標として検出対象物質の検出を行う、検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。
【００１０】
本検出方法の検出対象となる「検出対象物質」は、当該物質に対する「結合分子」が存在するものであれば特に限定されず、例えば、抗体を結合分子として用い得る抗原若しくはハプテン、レクチンを結合分子として用い得る糖、酵素を結合分子として用い得る基質、ホルモン受容体を結合分子として用い得るホルモン、相補鎖を結合分子として用い得る核酸、結合タンパク質を結合分子として用い得る被結合タンパク質等を挙げることができる。
【００１１】
また、金属コロイド粒子とセンサチップの表面を構成する金属は、例えば、金、白金、銀、銅、アルミニウム等を挙げることができるが、金が好適である。また、金属粒子の粒子経は０．５nm〜５００μm、好適には１nm〜１μm程度である。
【００１２】
なお、センサチップ表面の素材、すなわち、センサチップ表面の支持体の素材は、当該チップの基板の素材と同一（すなわち、基板自体が、センサチップ表面を形成する）とすることも可能であり、基板の表面に、金属の薄膜を形成させて、この金属を支持体とすることも可能である。
本検出方法は、本発明において規定されるセンサチップを用いる検出手段を用いて行うことが可能であり、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用したバイオセンサーにおける検出に用いるのが好適であるが、これに限定されるものではなく、前述した検出対象物質と結合分子の組における結合対の形成により、チップ表面に生ずる何らかの変化を検出することが可能なセンサーであれば、いかなる範疇のセンサーにおいても用いることができる。検出対象となる変化としては、上記の表面プラズモン共鳴以外に、放射能、接触角、沈降、紫外分光、蛍光、化学発光、電気化学発光等を挙げることができる。
［検出対象物質と結合分子の担持］
金属コロイド粒子（以下、金属粒子ともいう）に対する検出対象物質と、センサチップの金属表面（以下、金属表面ともいう）に対する結合分子の担持は、金属粒子または金属表面に対して、物理的吸着力、化学的吸着力、化学結合力等を利用して直接的に結合させることが可能である。また、金属粒子ないし金属表面に親水性直鎖状モノマー単位を含むポリマー（以下、親水性ポリマーともいう）の一端を結合させて、当該親水性ポリマー分子の他端に、検出対象物質ないし結合分子を直接的または間接的に結合させることにより行うことができる（このようにして金属粒子ないし金属表面に結合した当該親水性ポリマー分子は、金属粒子表面ないし金属表面において一端を基に起立した状態となることが一般的である）。このような親水性ポリマーの結合を行うことで、本検出方法を行う際の非特異的な反応を抑制することが可能となる。なお、上述したように、金属粒子ないし金属表面における検出対象物質ないし結合分子を直接的な担持を行い、かつ、上記の親水性ポリマーの一端の結合を行うことができる。この態様の場合は、当該親水性ポリマーの他端は非活性の状態（メトキシ化処理、エトキシ化処理等のアルコキシ化処理、カルボニル化処理等のエステル化処理等の不活性化処理がされている状態）とすることも可能であり、さらに、当該親水性ポリマーの他端近傍に検出対象物質ないし結合分子が結合していてもよい。
当該親水性ポリマー分子は、その一端に、金属に対して結合をする官能基を有し、他端に、検出対象物質ないし結合分子に対して直接的または間接的に結合する官能基を有することが必要である。なお、ここで上述した「直接的結合」とは、当該親水性ポリマー分子の他端の官能基または原子に、直接検出対象物質ないし結合分子が結合していることを意味し、「間接的結合」とは、同ポリマー分子の他端の官能基と、検出対象物質ないし結合分子が、リンカー分子を介して結合していることを意味するものである。
本発明において用い得る好適な親水性ポリマー（他端を安定させた状態）としては、下記（ａ）および（ｂ）を挙げることができる。
（ａ）式（１）で表される親水性ポリマー誘導体によって構築されるブラシ状構造物
【００１３】
Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｂ          （１）
［式中、Ａは、金属粒子ないし金属表面に配位可能な官能基であり、Ｌは、２価の基または原子価結合であり、Ｐは、親水性ポリマーセグメントであり、Ｂは、１価の基である］
官能基Ａにより、金属粒子ないし金属表面に対する配位を行い、親水性ポリマー誘導体（１）を金属粒子ないし金属表面に担持させることにより、当該親水性ポリマー誘導体（１）を、所望するブラシ状構造物とすることができる。
【００１４】
官能基Ａとしては、具体的には、例えば、メルカプト基、アミノ基、カルボキシル基またはスルフィド基が好適である。
【００１５】
親水性ポリマーセグメントＰとしては、例えば、ポリアルキレンオキシド、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸等を例示することができるが、ポリアルキレンオキシドが好適である。
【００１６】
特に、ポリアルキレンオキシドが、炭素原子数が２〜４のアルキレンオキシド、すなわち、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、または、ブチレンオキシドをモノマー単位とする、ポリアルキレンオキシドであることが、好適である。また、ポリアルキレンオキシドにおける、アルキレンオキシド単位の重合度は、２〜１００００が好適であり、特に好適には、１０〜３０００である。
【００１７】
１価の基Ｂは、ブラシ状構造物の先端に相当する、親水性ポリマーセグメントＰの末端を構成し得る基であることが好適である。具体的には、水素原子、炭素原子数が１〜６のアルキル基、水酸基、アセタール基等を例示することができる。
また、Ｌがとり得る２価の基としては、例えば、炭素原子数が１〜１２，好適には１〜３のアルキレン基、さらに、基（２）
【００１８】
【化１】
2005214907.tif 000002
【００１９】
［式中、Ｌ１は、−ＣＯＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−等の２価基を表し、ｐは、１〜１２、好適には、１〜３である］
等を挙げることができる。
【００２０】
親水性ポリマー誘導体（１）は、その具体的な構造に応じて、すでに公知の手段で製造することができる。例えば、親水性ポリマーセグメントＰが、ポリアルキレンオキシドの場合には、特開平７−３１６２８５号公報等に記載の方法と条件に従い、または、改変して製造することができる。
【００２１】
ここに、この親水性ポリマー誘導体（１）として、アセタール−PEG−SHの製造工程の一例を開示する。なお、この製造工程において、ｒは正の整数を意味する。
【００２２】
【化２】
2005214907.tif 000003
【００２３】
金属粒子ないし金属表面に、上記の親水性ポリマーセグメントＰに相当するブラシ状構造物を構築する際に、親水性ポリマー誘導体（１）の官能基Ａが、メルカプト基、アミノ基、カルボキシル基、または、スルフィド基である場合は、適切な緩衝化した水溶液に、親水性ポリマー誘導体（１）を溶解し、このポリマー溶液を、適温、例えば、２０〜３７℃程度で、浸漬等により、チップの支持体（金、銀、銅、アルミニウム等の金属）表面に接触させた状態で、数１０分〜数時間のインキュベートを行うことにより、所望するブラシ状構造物が設けられたチップ表面を製造することができる。このポリマー溶液における、親水性ポリマー誘導体（１）の濃度は、用いるブロックポリマーの分子量により異なるが、通常、溶液の０．１〜５mg/ml、好適には１mg/ml程度である。
（ｂ）親水性ブロックポリマー誘導体によって構築されるブラシ状構造物
親水性ポリマー誘導体の好適な態様として、金属粒子ないし金属表面上のブラシ状構造物を構成する親水性ポリマーが、下記の特徴（ａ）および（ｂ）を有するブロックポリマー（３）の第１のブロックを構成する親水性ポリマーセグメントであり、かつ、第２のブロックを構成するポリマーセグメントが、金属粒子ないし金属表面に配位能を有する官能基である態様を挙げることができる。
（ａ）上記の親水性ポリマーセグメントを第１のブロックとする。
（ｂ）金属粒子ないし金属表面に配位能を有する官能基を有するモノマーをモノマー単位とする、重合度が１〜２００のポリマーセグメントを第２のブロックとする。
【００２４】
第１のブロックにおける親水性ポリマーセグメントは、上述した親水性ポリマーセグメントＰと同一である。
【００２５】
また、第２のブロックにおけるポリマーセグメントにおける、センサチップ表面の支持体に配位能を有する官能基としては、例えば、メルカプト基、ジチオール基、スルフィド基、アミノ基、カルボキシル基、シラノール基、または、炭素原子数が１〜５のトリアルキルシリル基等を挙げることができる。これらの官能基を有するモノマー単位としては、例えば、メタクリル酸（２−ジエチルアミノエチル）、メタクリル酸（２−ジメチルアミノエチル）、ポリシステイン、ポリリジン、ポリグルタミン、メタクリル酸（３−トリメトキシシリルプロピル）等を挙げることができる。これらのモノマー単位を、常法に従い、重合反応を、当該ブロックポリマー誘導体（３）の製造工程において行うことにより、所望する官能基を有する第２のブロックを形成することができる。
さらに、第２のブロックの好適な態様の一つとして、式（４）
【００２６】
【化３】
2005214907.tif 000004
【００２７】
［式中、ｍは１〜１０の整数、ｎは１〜１００の整数を表し、Ｒ４およびＲ５は、互いに独立して、炭素原子数が１〜５のアルキル基、アミノ基、メルカプト基、または、スルフィド基を表す］で表される、メタクリル酸ポリマーのセグメントを挙げることができる。
【００２８】
このメタクリル酸ポリマーセグメント（４）を第２のブロックとする、ブロックポリマー誘導体（３）の製造工程については、特開２００２−８０９０３号公報において詳細に開示されており、この製造工程に従い、当該メタクリル酸ポリマーセグメントを第２のブロックとする、ブロックポリマー誘導体を製造することができる。
【００２９】
すなわち、例えば、式
Ａ−Ｌ−Ｐ−ＯＨ          （６）
［式中のＡ、Ｌ、Ｐの定義は、それぞれ、親水性ポリマー誘導体（１）における定義と同一である］
の化合物（６）［この化合物（６）の製造方法自体も、公知である（例えば、特開平７−３１６２８５号公報、特開平１１−３２２９１６号公報、特開２００１−２０００５０号公報等を参照のこと）］に対して、ポリメタクリル酸ジメチルアミノエチルを、所望する重合度になるように、重合反応することにより、ブロックポリマー誘導体（３）を得ることができる。
【００３０】
上述のようにして得られるブロックポリマー誘導体（３）を、第１のブロックをブラシ状構造物となるように担持する際には、上述した親水性ポリマー誘導体（１）についての担持工程と実質的には同一の担持工程を行うことができる。すなわち、金属粒子ないし金属表面に配位可能な官能基を有する第２のブロックをセグメントとするブロックポリマー誘導体（３）を用いることで、容易に、ブロックポリマー誘導体（３）を、金属粒子ないし金属表面に固定することができる。
【００３１】
担持を行う際には、ブロックポリマー誘導体（３）を含有する溶液に、金属粒子ないし金属表面を有するセンサチップを混合・浸漬等させることにより、第２のブロックの官能基が金属粒子ないし金属表面に結合して、ブロックポリマー誘導体（３）を、チップ表面に固定することができる。その結果、ブロックポリマー誘導体（３）の第１のブロック側がブラシ状に起立した、金属粒子または金属表面を製造することができる。前記のポリマー溶液における、ブロックポリマー誘導体（３）の濃度は、用いるブロックポリマーの分子量により異なるが、通常、溶液の０．１〜５mg/ml、好適には１mg/ml程度である。
【００３２】
（ｃ）マスキング処理
上記のようにして提供される、親水性ポリマーを担持した金属粒子ないし金属表面にマスキング処理を行うことにより、さらに非特異的な反応を抑制することができる。このマスキング処理は、親水性ポリマーを担持した金属粒子ないし金属表面を、マスキング剤の溶液と接触させることにより行うことができる。マスキング剤としては、２−メルカプトエタノールを好適な態様の一つとして挙げることができる。また、親水性セグメントＰが、検出対象物質または結合分子を担持させるブラシ状構造物の嵩高よりも短く、かつ、当該起立部分の先端近傍が、メトキシ化処理、エトキシ化処理等のアルコキシ化処理、カルボニル化処理等のエステル化処理等の不活性化処理が行われている、親水性ポリマー誘導体（１）を挙げることができる。この場合のマスキング剤の親水性セグメントは、検出対象物質または結合分子を担持させる親水性セグメントの１０〜７０％長程度となる分子量が好適である。
【００３３】
これらの場合のマスキング剤の溶液におけるマスキング剤の濃度は、マスキング剤の種類等によっても異なるが、概ね、０．００１〜１０００ｍＭ，好適には、０．１〜１０ｍＭ程度である。また、マスキング処理の時間は、好適には、３分〜１日程度である。さらに、マスキング処理は、２０〜３７℃程度の温度下で行うことが好適である。
【００３４】
（ｄ）検出対象物質と結合分子の担持
この担持を行う前提として、金属粒子または金属表面において担持した親水性ポリマーの他端の官能基を、直接的または間接的に検出対象物質ないし結合分子を結合し得る官能基へと変換することにより活性化する（例えば、アセタール基のアルデヒド基への変換）ことが必要である場合が多い。この活性化させた官能基に、直接的または間接的に検出対象物質または結合分子を結合させることにより、所望の担持を行うことができる。
【００３５】
［本検出方法の態様］
上述したように、本検出方法は、検出対象物質を担持させた金属粒子を、当該検出対象物質に対する結合分子が担持された金属表面を有するセンサチップに接触させて、当該センサチップからのシグナルを指標として検出対象物質の検出を行う検出方法である。
かかる本検出方法の典型的な態様として、下記の工程を行う方法を挙げることができる。
【００３６】
１）「検出対象物質を担持させた金属粒子が結合分子を介して結合しているセンサチップの金属表面」を作出する工程、すなわち、「当該検出対象物質に対する結合分子が担持されたセンサチップの金属表面に対して、検出対象物質を担持させた金属粒子を接触させることにより、金属粒子上の検出対象物質と金属表面上の結合分子の間の結合力を働かせて、金属表面に検出対象物質が担持された金属粒子を、好適には飽和状態となるまで結合させた状態の金属表面」を作出する工程。
【００３７】
２）上記の工程１）により、検出対象物質を担持させた金属粒子を結合させた金属表面に対して、検出対象物［いわゆる検体（血液、尿、リンパ液、髄液等の体液検体は勿論のこと、農作物、土壌、海水、湖沼水等に由来する検体も含む）が該当する、これらの検体中の特定の検出対象物質の検出（定量または定性）を行うことにより、医療診断分野、環境検査分野、品質検定分野等の検査分野における、本発明の有用性が認められる］を接触させて、当該検出対象物中の検出対象物質と前記金属粒子とを、金属表面上の結合分子に対して競合させる工程。
【００３８】
３）上記の工程２の競合により、金属表面から前記金属粒子の解離をシグナルとして検出する工程。
【００３９】
上述したように、この解離のシグナルは、ＳＰＲセンサーで検出し得る表面プラズモン共鳴以外にも、放射能、接触角、沈降、紫外分光、蛍光、化学発光、電気化学発光等の各種のセンサーで検出可能なシグナルであり得る。
【００４０】
この解離のシグナルの有無または強弱によって、検出対象物中の検出対象物質の定性または定量を、検量線等を基準として行うことが可能となる。
【００４１】
また、検出対象物質が担持された金属表面に、同検出対象物質が担持された金属粒子を検出対象物として接触させ、プラズモン共鳴のエンハンス効果等による増感反応を惹起させることにより、微量の検出対象物質を高感度に検出することも可能である。
【００４２】
このような態様で行われる本検出方法を行うために、例えば、１）特定物質が担持されていない親水性ポリマーが担持されている金属コロイド粒子、および、２）同親水性ポリマーが担持された金属表面を有するセンサチップ、のセット（以下、非担持セットともいう）。
【００４３】
あるいは、
１）a)特定物質が担持されている親水性ポリマーが担持されている金属コロイド粒子、または、b)特定物質が粒子表面に直接的に担持され、かつ、特定物質が担持若しくは非担持の親水性ポリマーが担持されている金属コロイド粒子、および、２）a)センサチップの金属表面に、前記特定物質に対する結合分子が担持された親水性ポリマーが担持された金属表面を有するセンサチップ、または、b)特定物質が金属表面に直接的に担持され、かつ、特定物質が担持若しくは非担持の親水性ポリマーが担持されている金属表面を有するセンサチップのセット（以下、担持セットともいう）。
【００４４】
等を挙げることができる。
【００４５】
非担持セットは、当該セットの使用者が、検出対象物と検出対象物質、さらに、当該物質に対する結合分子を選択して、上述の要領に従って、本検出方法を個別的に行うのに適している検出用のセットである。
【００４６】
担持セットは、定まった検出対象物質を担持させた金属粒子と当該物質に対する結合分子を担持させた金属表面を有するセンサチップを、予め確保して、汎用性がある検査項目を、上記の要領に従い、効率的に行うのに適している検査用のセットである。
【発明の効果】
【００４７】
本発明により、簡便、安全、かつ、リアルタイムでの検出を行うことが可能な、金属表面を利用するセンサーにおいて、さらなる高感度化手段が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
以下に、本発明の実施例を記載して本発明をさらに具体的に説明するが、この記載は、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００４９】
１．ビオチンを結合分子としたストレプトアビジンの検出方法
１）末端のアルデヒド基を有するPEG化金コロイドの調製
平均粒径40nmの金コロイド分散液(ポリサイエンス社製)に、アセタール-PEG-SH(分子量10,000)を添加し、室温で3時間反応させた。さらに、メトキシ-PEG-SH(分子量2,000)を加え、50℃で3時間反応させた後、HClでpH2まで下げ、2時間インキュベートすることにより、アセタール基を加水分解して、金コロイド表面にアルデヒド基を導入した。
【００５０】
２）PEG化金コロイドヘのストレプトアビジンの導入
ストレプトアビジンと、ヘテロリンカーであるN−スクシンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(以下、SPDPという)をモル比1:3で混合し、ｐＨ7.5として室温で60分反応させ、ストレプトアビジンに、ピリジルジスルフィド基を導入した。
次に、還元剤ジチオスレイトール(以下DTT)を加え、ｐＨ7.5下、室温でジスルフィドを開裂させることにより、SH化ストレプトアビジンを調製した。このSH化ストレプトアビジンに、ヘテロリンカーであるN−(マレイミドカプロン酸)ヒドラジド(以下、EMCHという)をモル比1:1で加え、ｐＨ6.5、4℃の条件で、一晩インキュベートすることにより、ストレプトアビジンにヒドラジドを導入した。
このようにして、合成したストレプトアビジンヒドラジドを、金コロイド表面のアルデヒド基と反応させ(PEG:SA=10:1、pH5.5、overnight)、還元アミノ化法により、金コロイド粒子表面にストレプトアビジンを導入した。
３）センサチップ表面のPEG修飾とビオチンの導入
金を支持体とするセンサチップ表面を、アセタール−PEG-SH(分子量5,OOO)およびメトキシ−PEG-SH(分子量2,000)で修飾した(室温、30分×2回)。次に、0.1NのHClでアセタールを加水分解し、アルデヒドに変換(室温、3時間)した後、ビオシチンヒドラジドを用いて、センサチップ表面にビオチンを導入した (pH5.5、4℃、overnight)。また、対照として、ＰＥＧに代えてデキストランゲル（CM5：ビアコア社製）を用いて修飾を行った
４）表面プラズモン共鳴(SPR)センサーによる相互作用の測定
SPRは、以下の条件により行った。
測定装置:BIACORE1000(日本ビアコア社製)
ランニング緩衝液:10mMリン酸緩衝液、pH7.4、0.15M  NaCl
アナライト:a)ストレプトアビジン−PEG−金コロイド
b) CHO-PEG−金コロイド
c) 1μMストレプトアビジン
センサチップ表面: a)ビオチン−PEG
b)ビオチン−CM5(ビアコア社製)
測定条件:流速5μL/1min、25℃
結果
上記の試験の結果を表１−１（ビオチン−PEGを用いた例：単位Δθ[°]）と、−２（ビオチン−CM5を用いた例：単位Δθ[°]）、さらに、図１に記載する。
【００５１】
【表１−１】
2005214907.tif 000005
【００５２】
【表１−２】
2005214907.tif 000006
これらの結果から明らかなように、ストレプトアビジンを金コロイドと複合化することにより、著しく検出感度が上昇することが判明した。しかも、この効果は、現在汎用されている高分子(デキストラン)ゲル修飾センサチップでは全く認められなかった。このことにより、センサチップ表面にPEG等の親水性ポリマーを起立した状態で結合させることにより、金属表面の物質の結合と解離により惹起される表面プラズモン共鳴の増大効果が発揮されることが明らかとなった。よって、センサチップ表面に結合させる親水性ポリマーとして、ブラシ構造を有するPEGを選択することは、極めて有用であることがわかる。
【００５３】
２．抗原抗体反応を利用した抗原の検出（FITC-PEG-金コロイドのSPRチップヘの結合と解離）
方法
１）SPR金基板のPEG修飾[PEG5000（acetal）,PEG2000(Methoxy)]と抗体の導入
オゾン洗浄した金を支持体とするセンサチップをシャーレに入れ、pH7.4、1M NaCl含有50mMリン酸緩衝液に溶かした分子量5000のaceta1-PEG-SH(1mM/ml)を加え、室温で30分振盪した。終了後、PEG溶液を捨て、50mMNaOHで30秒、リン酸緩衝液で3回洗浄し、この一連の操作を計2回行なった。次に、リン酸緩衝液に溶かした分子量2000のMethoxy-PEG-SH(0.2mg/ml)を加え、30分室温で振盪した。終了後、PEG溶液を捨て、上記と同様の洗浄操作を3回繰り返した。
【００５４】
次に、上記の方法で得られたPEG修飾基板をシャーレに入れ、O.1N  HCl(pH2)溶液に浸し3時間振盪し、アセタール基を加水分解し、チップ表面にアルデヒド基を導入した。反応終了後、蒸留水で洗浄し、乾燥させた。
【００５５】
次に、基板が浸るようにジメチルホルムアミド(DMF)を加え、最終的に2mMとなるように、N−(ε−Maleimidocaproic acid)hydrazide(EMCH)を加え、室温で2時間振盪し、その後、15分おきにジメチルアミンボラン溶液(溶媒；DMF)を加えて2時間振盪を続けた。反応終了後、DMFで洗浄したのち、蒸留水で洗浄し乾燥させ、表面マレイミド化金チップを作成した。
【００５６】
本チップをSPR装置に装着し、3μM anti-FITC(ab')2をSPRにインジェクトし、チップ表面に抗体を導入した。未反応のマレイミド基は、100nMメルカプトエタノールをインジェクトすることによりブロッキングした。
【００５７】
２）FITC-PEG-金コロイドの調製
Acetal-PEG-SHを0.86mg(金濃度の100倍量)に、NaBH4をPEGの10倍量加え、1時間攪拌した。水溶液のpHを6.5に調整し、金コロイド溶液10mL加え、室温で１時間、75℃で2時間攪拌し、超遠心(100,000×ｇ、4℃、20分)を4回行うことにより、PEG化金コロイド粒子を回収した。本コロイド粒子を純水10mLに再分散させ、pHを2に調整し、2時間攪拌することにより、acetalを加水分解して、表面にアルデヒド基を導入した。
水溶液のpHを再度6.5に調整し、フルオレセインヒドラジドをPEGの10倍量加え、6時間攪拌し、さらに、NaBH4をPEGの10倍量加え、4時間攪拌した。精製は、100,000×ｇ、4℃、20分の条件で10回行った。
結果（SPR測定およびFITC添加後の解離挙動の観察）
上記の方法により調製した金コロイドをSPRセンサー[BIACORE1000(日本ビアコア社製)]にインジェクトし、その応答挙動を調べた。また、対照として、acetal-PEG-金コロイドを用いた。それぞれの金濃度は11.2pmol/ml,11.6pmol/mlでSPRにインジェクトした。抗体を流すところから最後にFITCを流すまでの一連のSPRレスポンスの様子を表２（pmol/ml以外の単位Δθ[°]）と図２に示す。
【００５８】
【表２】
2005214907.tif 000007
対照でほぼ同濃度のacetal-PEG-金コロイドを用いたところ、表２と図２からもわかるように、非特異的な吸着として確認されず、金粒子結合のレスポンスはほぼ認められないことが観察された。一方、FITC-PEG-金コロイドの方は金粒子の結合のレスポンスが0.4979°と大きい値を得た。対照でレスポンスが認められないことから、この値は抗体との結合によるものであると考える。また50mMのFITCを添加した後、抗体からの金粒子の解離と考えられるレスポンスとして−0.1399°という値を得た。
【００５９】
この結果より、金粒子に抗原を担持して用いる本検出方法により、鋭敏に当該抗原を検出し得ることが認められた。
【００６０】
３．レクチンを結合分子とした糖の検出
オゾン洗浄した金を支持体とするセンサチップの表面に、常法によりラクトース特異的RCAレクチンを固定し、その後、上記２(1)の方法に準じて、PEG5000（Methoxy）を当該表面に起立した状態で担持して、表面にレクチンが担持され、かつ、PEG5000でブロッキングされたセンサチップを作製した。
【００６１】
また、上記の２(2)の方法に準じて、PEG6000（acetal）を起立した状態で担持した金微粒子（粒径20nm）からなる金コロイド分散液に、0.5mM p-アミノフェニルラクトースを加え、pHを７に調整した後、0.7mM ジメチルアミノボラン溶液と混合して、還元アミノ化反応により、金コロイド表面にラクトースを導入した。得られた粒子は、超遠心分離(360.6×g)を３回行い、精製した。なお、得られた金微粒子には200個／１金粒子程度の割合で、ラクトース分子が担持された。
【００６２】
上記のようにして作製したレクチンが固定され、PEGによりブロックされた金表面を有するセンサチップを、SPRセンサー[BIACORE1000(日本ビアコア社製)]に装着し、これに特定濃度の上記のラクトース担持金コロイドを10μl／minで５分間流し、その後、リン酸バッファーを２分間流し、０〜40μg／mlの濃度のガラクトース水溶液を５分間流して、先行してセンサチップ表面に担持されている金コロイドとの交換反応を、SPRセンサーにおけるガラクトースを流す前と流した後のＳＰＲ数値の差を指標として検討した。
【００６３】
なお、対照として、金粒子に担持された親水性ポリマーを、PEG6000に代えて、デキストランゲル（CM5：ビアコア社製）として、40μg／mlのガラクトース水溶液を流した例を用いた。
【００６４】
結果を表３に示す。
【００６５】
【表３】
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この結果により、ＰＥＧを介してガラクトースが担持されている金粒子を結合させた金表面に、ガラクトースを接触させると、ガラクトース量に依存して金コロイドが脱離し、かつ、初期の金コロイドの担持量が著しく多いデキストランゲルを用いた対照よりも、金コロイドの脱離量が多いことが明らかになった。このことより、ＰＥＧを担持させた金粒子を用いると格段に検出感度が鋭敏となることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明を用いたビオチンを結合分子としたストレプトアビジンの検出の結果を示した図面である。
【図２】本発明において抗原抗体反応を利用した結果を示した図面である。
【図１】
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【図２】
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