(57)【要約】【課題】簡単な手順でほぼリアルタイムで標本内の複数の測定点について信号解析を行う。【解決手段】光信号解析方法であって、試料に光を照射し、試料から発せられる光を光検出器に導き、光検出器より出力される時系列信号を複数の時系列信号に時間分割し、時間分割した時系列信号毎に信号解析を行い、試料の物理的性質を求める。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に関して指定された測定点から発せられる光を光検出器により検出する検出ステップと、
前記光検出器より出力される時系列信号を複数の時系列信号に時間分割する時分割ステップと、
前記時間分割された時系列信号毎に信号解析を行い、前記測定点の物理的性質を求める解析ステップと、
を具備することを特徴とする光信号解析方法。
【請求項２】
前記試料に関する複数の点を測定点として順次選択し、前記光が照射される位置を前記複数の測定点について順次移動し、前記光検出器より出力される時系列信号を前記複数の測定点毎に時分割して取り出し、前記時分割したデータ毎に時系列信号解析を行い、前記複数の測定点毎の物理的性質を求めることを特徴とする請求項１記載の光信号解析方法。
【請求項３】
前記光検出器より出力される時系列信号を前記複数の測定点毎に時分割して記憶し、必要に応じて前記複数の測定点毎の時系列信号を読み出して解析を行い、前記試料に関する複数の測定点毎の物理的性質を求めることを特徴とする請求項２記載の光信号解析方法。
【請求項４】
前記複数の測定点の位置情報を取得して位置情報テーブルを作成し、前記位置情報テーブルを参照して前記時系列信号の解析を行い、前記試料に関する複数の測定点毎の物理的性質を求めることを特徴とする請求項３記載の光信号解析方法。
【請求項５】
前記測定点から発せられる光は、螢光、燐光、化学発光、生物発光、反射光または散乱光であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の光信号解析方法。
【請求項６】
前記光検出器より出力される時系列信号の解析は自己相関分光解析、または光強度分布解析であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載の光信号解析方法。
【請求項７】
前記試料に関する測定点の物理的性質は分子、または粒子の並進拡散係数、回転拡散係数、あるいは前記測定領域内に存在する分子、または粒子の個数、あるいは蛍光寿命であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１つに記載の光信号解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光信号解析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、光信号解析方法として以下のような文献がある。これらの光信号解析方法において、自己相関関数を推定する場合には、１ヶ所のみの測定点について蛍光の強度の時系列信号を取得し、取得したすべての時系列信号を使用して計算により自己相関関数を推定していた。
【非特許文献１】「Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet States in Solution:             A Theoretical an Expermental Study」,J.Windengren et al.,             J.Phys. Chem 99, 13368-13379(1995)
【非特許文献２】「蛍光相関分光法による1分子検出」，金城政孝，蛋白質 核酸 酵素，1431-1438,            Vol.44  No.9 (1999).
【非特許文献３】「蛍光相関分光法による単一分子レベルの酵素反応解析」，西村吾朗，生物物理，            81-85,Vol.39 No. 2 (1999).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記した従来の方法で標本内の複数の測定点で一定時間間隔ごとに自己相関関数の推定を行おうとした場合、まず一つの測定点で自己相関関数の推定を行い、次に他の測定点に移動して、同様に自己相関関数を推定する。更にまた、別の測定点に移動し、同様に自己相関関数を推定するという作業をすべての測定点について、順次行わなければならず、推定全体に時間がかかると共に、作業も繁雑であった。また、測定点を逐次移動していくために、測定点間の時間差は大きく長時間を要し、同時に複数点について、自己相関関数を推定することが実質的に困難であった。
【０００４】
すなわち、測定点ごとに測定時刻のずれ（時間遅れ）が生じ、細胞内外で生じる速い反応、例えば、たんぱく質―たんぱく質相互作用、細胞内のシグナル伝達などをリアルタイムで測定することができなかった。
【０００５】
本発明は、このような課題に着目して行ったものであり、その目的とするところは、簡単な手順でほぼリアルタイムで標本内の複数の測定点について信号解析を行うことができる光信号解析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の目的を達成するために、第１の発明は、光信号解析方法であって、試料に関して指定された測定点から発せられる光を光検出器により検出する検出ステップと、前記光検出器より出力される時系列信号を複数の時系列信号に時間分割する時分割ステップと、前記時間分割された時系列信号毎に信号解析を行い、前記測定点の物理的性質を求める解析ステップと、を具備する。
【０００７】
また、第２の発明は、第１の発明に係る光信号解析方法において、前記試料に関する複数の点を測定点として順次選択し、前記光が照射される位置を前記複数の測定点について順次移動し、前記光検出器より出力される時系列信号を前記複数の測定点毎に時分割して取り出し、前記時分割したデータ毎に時系列信号解析を行い、前記複数の測定点毎の物理的性質を求める。
【０００８】
また、第３の発明は、第２の発明に係る光信号解析方法において、前記光検出器より出力される時系列信号を前記複数の測定点毎に時分割して記憶し、必要に応じて前記複数の測定点毎の時系列信号を読み出して解析を行い、前記試料に関する複数の測定点毎の物理的性質を求める。
【０００９】
また、第４の発明は、第３の発明に係る光信号解析方法において、前記複数の測定点の位置情報を取得して位置情報テーブルを作成し、前記位置情報テーブルを参照して前記時系列信号の解析を行い、前記試料に関する複数の測定点毎の物理的性質を求める。
【００１０】
また、第５の発明は、第１〜第４のいずれか１つの発明に係る光信号解析方法において、前記測定点から発せられる光は、螢光、燐光、化学発光、生物発光、反射光または散乱光である。
【００１１】
また、第６の発明は、第１〜第５のいずれか１つの発明に係る光信号解析方法において、前記光検出器より出力される時系列信号の解析は自己相関分光解析、または光強度分布解析である。
【００１２】
また、第７の発明は、第１〜第６のいずれか１つの発明に係る光信号解析方法において、前記試料に関する測定点の物理的性質は分子、または粒子の並進拡散係数、回転拡散係数、あるいは前記測定領域内に存在する分子、または粒子の個数、あるいは蛍光寿命である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、複数測定点の物理的性質の解析を同時に行い、複数点についての測定の順序を自由に組み合わせ、試料の反応、試料間の相互作用などを解析することができる。特に、マルチポイントＦＣＳの場合は、シングルポイントＦＣＳと比較して、同時に複数のポイント点を観察することができ、生体の細胞内外の多様な反応を捉えることができる。
【００１４】
また、テーブル検索方式のマルチポイントＦＣＳを採用することにより、汎用検索方式によるチャンネル位置判断のためのすべてのデータの繰り返しスキャンを避け、一回のみのスキャンで各測定点におけるすべてのデータを取得することができる。自己相関計算の各段階でこのチャンネル位置情報テーブルを参照するだけで、計算対象以外のチャンネルのデータを飛ばし、必要最小限のデータだけを計算に取り込むことで、計算時間の短縮が図れ、複数測定点をリアルタイムに測定、観察することができる。特に、測定点（チャンネル数）の数が増えるほど、読み飛ばすデータの量は増え、計算時間の短縮が著しく図れる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
まず、本発明の概略を説明する。本発明では、マルチポイントＦＣＳのデータ解析において、複数のポイントを繰り返し測定したデータを時系列チャンネル分割することにより、各ポイントに相当するデータだけを抽出して、自己相関関数の計算を行う。ここで、抽出方法は、すべてのデータを逐次スキャンする汎用検索方式である。
【００１６】
また、マルチポイントＦＣＳのデータ解析において、特に汎用検索方式は、相関関数の演算を行う際、常にすべてのデータを繰り返しスキャンし、チャンネルの位置を判断しなければならない。相関関数の演算においては、このチャンネル位置判断、すなわち、測定点の位置判断にかなりの時間を要する。特に、計算しようとするチャンネルと異なるチャンネルへの移動、データ取得にかなりの時間を費やすことになる。その改善方法として、一回の測定で得られた全データを利用して測定点すべてのチャンネルの位置情報を盛り込んだデータテーブル（位置情報テーブル）を作成し、これを相関関数の演算毎に参照して、計算時間の大幅な短縮を図るものである。
【００１７】
以下、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。図１は、本発明が適用される光信号解析装置の構成を示す図である。本実施形態では、試料の螢光像観察を行うためにレーザ走査型共焦点光学顕微鏡に適用した場合について説明する。装置の基本的な構成として、レーザ走査型共焦点光学顕微鏡本体１０、ＣＣＤカメラ１１、試料ステージ１２、試料ステージコントローラ１３、コンピュータ（ＰＣ）１４、ＴＶモニタ１５、レーザ光源１６を備える。レーザ光源１６の波長によっては励起する螢光物質の種類が異なる。本実施形態では、励起波長の一つとして波長４８８ｎｍのアルゴンレーザを用いたが、蛍光物質のローダミン・グリーンを励起するのに適していることがわかった。
【００１８】
レーザ光源１６から発せられたレーザ光をレーザ走査型共焦点光学顕微鏡本体１０に導き、試料ステージ１２上の試料５０に照射し、ＣＣＤカメラ１１で試料５０からの螢光を受光し、ＴＶモニタ１５、あるいは顕微鏡接眼部を通して試料５０の螢光顕微鏡観察を行う。
【００１９】
レーザ走査型共焦点光学顕微鏡本体１０の試料ステージ１２には２個のステッピングモータ２０がそれぞれ９０°方向に取り付けられており、それぞれのステッピングモータ２０は試料ステージコントローラ１３に接続されている。コンピュータ１４からの指令により、２個のステッピングモータ２０を駆動し、試料ステージ１２をＸ方向及びＹ方向に移動させる。
【００２０】
次に走査系の構成について説明する。レーザ光源１６より発せられたレーザ光を２個のレンズ２３−１、２３−２から構成される拡大光学系（ビームエクスパンダ）に通してビーム直径を拡げてコリメート光とし、プレフォーカシングレンズ２４を介してダイクロイックミラー２５に導く。
【００２１】
ダイクロイックミラー２５は波長４８８ｎｍ付近以下の波長の光を反射し、４８８ｎｍ付近以上の波長の光を透過させるように形成されている。ダイクロイックミラー２５により反射されたレーザ光はＸＹスキャナ２２に入射する。レーザ光はＸＹスキャナ２２でＸ軸、Ｙ軸方向に２次元走査されて対物レンズ２１に導かれる。レーザ光はランダムに試料５０内をスキャンされ、試料５０内に存在する蛍光物質を励起することができる。
【００２２】
試料５０内で微小な共焦点領域を形成させるためにここではＮＡ(開口数)１．０の対物レンズ２１を用いる。これにより得られる共焦点領域の大きさとして、直径０．６μｍ程度、長さ２μｍ程度の中央部がくびれた略円筒状となり、測定領域に存在する蛍光分子は平均して数個程度となる。試料５０内の所望の蛍光物質から発せられた蛍光は励起光と同じ光路を通り、ダイクロイックミラー２５により入射光路から分離された後、ピンホール２６、ハーフミラー２７を介して光検出器２８により受光される。光検出器２８としてはアバランシェ・フォトダイオード(ＡＰＤ)、あるいは光電子増倍管などの微弱光検出器を用いれば良い。なお、ピンホールの直径は２００μｍとなっている。
【００２３】
光検出器２８で受光した螢光出力信号を図示せぬ画像処理装置に導き、コントラスト向上、輪郭強調などの画像処理を行った後、コンピュータ１４を通してＴＶモニタ１５上に試料５０の２次元画像、あるいは３次元画像を得る。
【００２４】
各ＸＹスキャナ２２は互いに直交する方向に走査できるように互いに垂直方向の向きに配置されており、コンピュータ１４によって制御されたそれぞれのＸＹスキャナ駆動装置（不図示）により回動運動を精確に制御される。
【００２５】
ＸＹスキャナー駆動装置にはＸＹスキャナ角度検出装置(図示しない)が装備されており、リアルタイムで走査角度が精度良く検知され、コンピュータ１４にフィードバック制御される。本実施形態ではＸＹスキャナ２２としてガルバノスキャナを用いている。なお、レーザ光をＸＹ走査する手段、すなわちＸＹスキャナとしてガルバノスキャナに限らず、音響光学変調素子(ＡＯＭ)やポリゴン鏡、ホログラムスキャナなどを用いても良い。
【００２６】
光検出器２８に入射した光強度信号は電気信号に変換され、信号処理装置（不図示）で波形整形され、on-offの２値化パルスに変換されて、コンピュータ１４に導かれる。コンピュータ１４は、入力された２値化パルス信号に対して相関演算を行って自己相関関数を算出する。さらには得られた自己相関関数から、蛍光物質の並進拡散速度や測定領域内に存在する蛍光分子の数の変化などを求める。
【００２７】
光検出器２８に入射する光強度信号が比較的大きい場合は、光検出器２８から出力される電気信号はアナログの時系列信号となる。この場合は信号処理装置でＡ／Ｄ変換し、波形整形を行い、先と同様に２値化パルス信号に変換する。
【００２８】
また対物レンズ２１を光軸方向に移動させることにより、レーザ光のフォーカス位置を光軸方向に沿って上下させることができる。これにより、３次元画像をＴＶモニタ１５上に生成させることができる。
【００２９】
なお、螢光物質についてはローダミン・グリーンに限ることなく、例えば、TMR(Tetrame-hylrhodamine)、サイファイブ(Cy5)、FITC(Fluorescein-isothiocyanate)、TOTO1、Acridine-Orange、Texas-Redなどを用いても良い。
【００３０】
（第１実施形態）
図２は、汎用検索方式によるマルチポイントＦＣＳ演算の手順を説明するためのフローチャートである。まず、図１による構成により試料５０についての測定データを取得する（ステップＳ１）。これにより、図３（Ａ）に示すような時系列信号が得られる。次に、この時系列信号を時分割して多チャンネル化（ここではチャンネルｃｈ０〜ｃｈ４）する（ステップＳ２、図３（Ｂ））。図３（Ｂ）において、ｃｈ０は、レーザ光をＸＹ走査する手段としてのガルバノスキャナの移動時のランダム測定データ範囲である。ｃｈ１は、測定ポイント１の測定データ範囲である。ｃｈ２は、測定ポイント２の測定データ範囲である。ｃｈ３は、測定ポイント３の測定データ範囲である。ｃｈ４は、測定ポイント４の測定データ範囲である。図３（Ｃ）は、各測定ポイント１〜４の一例を示している。
【００３１】
次に、チャンネル番号ＣＨ＿ＮＯに初期値としての１を代入して計算を開始する（ステップＳ３、Ｓ４）。次に、ＦＣＳ演算の第１の部分として、以下の式（２−１）を用いて、汎用検索方式による平均値計算用の有効データ数Ｍa の統計計算を行う（ステップＳ５）。
【数１】
2005337920.tif 000003
【００３２】
ここでは、単純にすべての測定データをスキャンして、チャンネル１においては、チャンネルデータが１の場合のみ＋１の統計計算を行う。チャンネル１について実際の計算に用いる有効データは、図４において、
【数２】
2005337920.tif 000004
【００３３】
に相当する部分だけである。この部分を抽出するために、測定したすべてのデータＭmax （図４参照）を逐次スキャンしてチャンネル番号を判断する。つまり、チャンネル１においては、すべてのデータＭmax を逐次スキャンしながら、チャンネル番号が１になるごとに、Ｍa の値を＋１して統計計算し、スキャンによってその他のチャンネル番号と判断した場合は、Ｍa の統計計算は行わない。
【００３４】
チャンネル2、3と4においても同様な処理が行われ、結果的には、4チャンネルマルチポイントＦＣＳ汎用検索方式の平均値計算用有効データ数Ｍa の統計計算は、一つのＭτ（相関計算時の遅延時間）に対して、測定したすべてのデータＭmax を合計4回スキャンする。つまり、ｐ（相関計算時遅延時間の総数）個のＭτに対しては、それぞれＭmax 個のデータをｐ×４回スキャンして結果を得る。
【００３５】
次に、ＦＣＳ計算の第２の部分として、汎用検索方式による平均値の計算を、以下の式（２−２）を用いて行う（ステップＳ６）。
【数３】
2005337920.tif 000005
【００３６】
チャンネル１については、実際の計算に用いる有効データは、図４において、
【数４】
2005337920.tif 000006
【００３７】
に相当する部分だけである。この部分を抽出するために、同じく測定したすべてのデータＭmax （図４参照）を逐次スキャンしてチャンネル番号を判断することになる。つまり、すべてのデータＭmax を逐次スキャンしながら、チャンネル番号が１になるごとに、Ｍa の値を合計計算し、スキャンによってその他のチャンネル番号と判断した場合は、Ｍa の合計計算は行わない。チャンネル2、3と4においても同様な処理が行われ、結果的には、4チャンネルマルチポイントＦＣＳ汎用検索方式の平均値の計算は、一つのＭτに対して、測定したすべてのデータＭmax を合計4回それぞれスキャンする。つまり、ｐ個のＭτに対しては、それぞれＭmax 個のデータをｐ×４回スキャンして結果を得る。
【００３８】
次に、ＦＣＳ計算の第３の部分として、自己相関関数計算用有効データ数Ｍc の統計計算を、以下の式（２−３）を用いて行う（ステップＳ７）。この部分は、自己相関関数の計算に必要なデータ数を統計する部分である。
【数５】
2005337920.tif 000007
【００３９】
チャンネル１については、実際の計算に用いる有効データは、図４において、
【数６】
2005337920.tif 000008
【００４０】
に相当する部分だけである。自己相関計算は
【数７】
2005337920.tif 000009
【００４１】
個のデータをそれぞれＭτ個ずつずらして掛け算をした結果を合計する。Ｍc の値は自己相関計算に用いるデータの数である。Ｍc において、掛け算に用いる元のデータＤ［ｉ］と、ＭτだけずらしたデータＤ［ｉ＋Ｍτ］は同一チャンネルのデータでなければならない。
【００４２】
しかし、この部分を抽出するために、まず、測定したすべてのデータＭmax （図４参照）を逐次スキャンしてチャンネル番号を判別する。つまり、チャンネル１においては、すべてのデータＭmax を逐次スキャンしながら、Ｄ［ｉ］と、Ｄ［ｉ＋Ｍτ］のチャンネル番号が１になるごとに、Ｍc の値を＋１計算し、スキャンによってＤ［ｉ］と、Ｄ［ｉ＋Ｍτ］とのいずれかがその他のチャンネル番号と判断した場合は、Ｍc の統計計算は行わない。チャンネル2、3と4においても同様な処理が行われ、結果的には、4チャンネルマルチポイントＦＣＳ汎用検索方式の自己相関関数計算用有効データＭc の統計計算は、一つのＭτに対して、測定したすべてのデータＭmax を合計4回スキャンする。つまり、ｐ個のＭτに対しては、それぞれＭmax 個のデータをｐ×４回スキャンして結果を得る。
【００４３】
次に、ＦＣＳ計算の第４の部分として、自己相関関数を、以下の式（２−４）を用いて計算する（ステップＳ８）。
【数８】
2005337920.tif 000010
【００４４】
上記のステップＳ７でのＭc の計算と同様に、チャンネル１については、実際の計算に用いる有効データは、図４において、
【数９】
2005337920.tif 000011
【００４５】
に相当する部分だけである。自己相関計算は、
【数１０】
2005337920.tif 000012
【００４６】
個のデータをそれぞれＭτ個ずつずらして掛け算をした結果を合計する。同様に、掛け算に用いる元のデータＤ［ｉ］と、ＭτだけずらしたデータＤ［ｉ＋Ｍτ］は同一チャンネルのデータでなければならない。しかし、この部分を抽出するために、まず、測定したすべてのデータＭmax （図４参照）を逐次スキャンしてチャンネル番号を判別する。
【００４７】
つまり、チャンネル１においては、すべてのデータＭmax を逐次スキャンしながら、Ｄ［ｉ］と、Ｄ［ｉ＋Ｍτ］のチャンネル番号が１になるごとに、Ｄ［ｉ］と、Ｄ［ｉ＋Ｍτ］の掛け算をし、合計計算をする。
【００４８】
スキャンによってＤ［ｉ］と、Ｄ［ｉ＋Ｍτ］とのいずれかがその他のチャンネル番号と判断した場合は、相関計算（掛け算と合計計算）は行わない。
【００４９】
チャンネル2、3と4においても同様な処理が行われ、結果的には、4チャンネルマルチポイントＦＣＳ汎用検索方式の自己相関関数の計算は、一つのＭτに対して、測定したすべてのデータ を合計4回それぞれスキャンする。つまり、ｐ個のＭτに対しては、それぞれＭmax 個のデータをｐ×４回スキャンして結果を得る。
【００５０】
次に、ＦＣＳ計算の第５の部分として、ステップＳ５〜Ｓ８により得られた結果を以下の式（２−５）に代入して、総合計算（最終結果）を求める（ステップＳ９）。
【数１１】
2005337920.tif 000013
【００５１】
ステップＳ５での平均値計算用有効データ数Ｍa の統計計算、ステップＳ６での平均値計算、ステップＳ７での自己相関関数計算用有効データ数Ｍc の統計計算およびステップＳ８の自己相関関数計算において、いずれも一つのＭτに対して、測定したすべてのデータＭmax を合計4回それぞれスキャンする。つまり、ｐ個のＭτに対しては、合計Ｍmax 個の全測定データをｐ×４×４回スキャンして結果を得る。
【００５２】
具体的には、ビンタイムを１２．５ μsecに設定して１０sec測定したデータを扱う場合は、計算用測定データの総数は７．３×１０5 個以上に及ぶ。
【００５３】
4チャンネルのマルチポイントＦＣＳの場合は、一つのＭτに対して、測定したすべてのデータ７．３×１０5 を合計４×４回スキャンし、ｐ個のＭτに対しては、７．３×１０5 個のデータをｐ×４×４回スキャンして結果を得る。
【００５４】
なお、上記の演算は、チャンネル番号ＣＨ＿ＮＯを１インクリメント（ステップＳ１０）しながら行われるが、ＣＨ＿ＮＯ＝４になったときに（ステップＳ１１）、ＦＣＳ演算を終了する（ステップＳ１２）。
【００５５】
（第２実施形態）
図５は、テーブル検索方式によるマルチポイントＦＣＳ演算の手順を説明するためのフローチャートである。まず、図１による構成により試料５０についての測定データを取得する（ステップＳ２１）。これにより、図６（Ａ）に示すような時系列信号が得られる。次に、この時系列信号を時分割して多チャンネル化（ここではチャンネルｃｈ０〜ｃｈ４）する（ステップＳ２２、図６（Ｂ））。図６（Ｂ）において、ｃｈ０〜ｃｈ４については、図３（Ｂ）を参照して説明したとおりである。
【００５６】
次に、多チャンネル化した時系列信号（図７）をもとにして、チャンネル位置情報テーブルを作成する（ステップＳ２２−１）。図７における各パラメータの内容は図８に示すとおりである。
【００５７】
ここでのチャンネル位置情報テーブルは、チャンネル分割後、データファイルの一回限りのスキャンにより作成できる。まず、図９に示すような位置情報変換テーブルを作成し、この位置情報変換テーブルの各パラメータ（図７参照）を統計計算し、配列として格納すると、図１０に示すような位置情報データテーブルになる。
【００５８】
次に、チャンネル番号ＣＨ＿ＮＯに初期値としての１を代入して計算を開始する（ステップＳ２３、Ｓ２４）。次に、ＦＣＳ演算の第１の部分として、以下の式（２−６）を用いて、テーブル検索方式による平均値計算用の有効データ数Ｍa の統計計算を行う（ステップＳ２５）。
【数１２】
2005337920.tif 000014
【００５９】
チャンネル１については、式中の各変数は上記の位置情報データテーブル（図１０）により読込み、
【数１３】
2005337920.tif 000015
【００６０】
のデータだけを平均値計算に用いる。その他の
【数１４】
2005337920.tif 000016
【００６１】
個のデータ、つまり、その他のチャンネルに相当する部分は飛ばして統計計算しない。ここでは、マルチポイントＦＣＳ汎用検索方式のような長い配列の測定データの逐次スキャンは必要としない。従って、計算時間の短縮が図れる。
【００６２】
次に、ＦＣＳ計算の第２の部分として、テーブル検索方式による平均値の計算を、以下の式（２−７）を用いて行う（ステップＳ２６）。
【数１５】
2005337920.tif 000017
【００６３】
チャンネル1においては、式中の各変数は上記の位置情報データテーブル（図１０）により読込み、
【数１６】
2005337920.tif 000018
【００６４】
個の測定値の合計を算出する。同時に、その他のチャンネルに相当するデータの部分、つまり、
【数１７】
2005337920.tif 000019
【００６５】
個のデータは飛ばす。これにより、上記のステップＳ２５と同様に計算時間を短縮することができる。
【００６６】
次に、ＦＣＳ計算の第３の部分として、自己相関関数計算用有効データ数Ｍc の統計計算を、以下の式（２−８）を用いて行う（ステップＳ２７）。この部分は、自己相関関数の計算に必要なデータ数を統計する部分である。
【数１８】
2005337920.tif 000020
【００６７】
チャンネル1において、式中の各変数は上記の位置情報データテーブル（図１０）により読込む。チャンネル１において、自己相関関数の計算は
【数１９】
2005337920.tif 000021
【００６８】
個のデータをそれぞれＭτ個ずつずらして掛け算をした結果を合計する。Ｍc の値は自己相関計算に用いるデータの数である。Ｍc において、掛け算に用いる元のデータＤ［ｉ］とＭτだけずらしたデータＤ［ｉ＋Ｍτ］は同一チャンネルのデータでなければならない。掛け算を行う際に、上記の位置情報データテーブル（図１０）を随時に参照し、式（２−８）により、同一チャンネルのデータ
【数２０】
2005337920.tif 000022
【００６９】
個だけをＭc として統計する。そして、その他のチャンネルに相当する部分の
【数２１】
2005337920.tif 000023
【００７０】
個のデータは飛ばす。つまり、一つのＭτに対して、その他のチャンネルに相当する
【数２２】
2005337920.tif 000024
【００７１】
個のデータを飛ばし、ｐ個のＭτに対しては、同じくその他のチャンネルに相当する
【数２３】
2005337920.tif 000025
【００７２】
個のデータを飛ばすことになる。従って、Ｍτの数が多いほど計算時間の短縮効果が図れる。
【００７３】
次に、ＦＣＳ計算の第４の部分として、自己相関関数を、以下の式（２−９）を用いて計算する（ステップＳ２８）。自己相関関数の計算は、Ｍc の統計計算時と類似している。
【数２４】
2005337920.tif 000026
【００７４】
式中の各変数は上記の位置情報データテーブル（図１０）により読込む。チャンネル1において、自己相関関数の計算は
【数２５】
2005337920.tif 000027
【００７５】
個のデータをそれぞれＭτ個ずつずらして掛け算をした結果を合計する。同様に掛け算に用いる元のデータＤ［ｉ］とＭτだけずらしたデータＤ［ｉ＋Ｍτ］は同一チャンネルのデータでなければならない。
【００７６】
チャンネル１においては、位置情報テーブル（図１０）の参照により、式（２−９）のように、同一チャンネルのデータ
【数２６】
2005337920.tif 000028
【００７７】
個だけを計算に取り扱い、その他のチャンネルに相当する
【数２７】
2005337920.tif 000029
【００７８】
個のデータは飛ばすことが可能である。
【００７９】
つまり、一つのＭτに対して、その他のチャンネルに相当する
【数２８】
2005337920.tif 000030
【００８０】
個のデータを飛ばし、最も計算時間を要する掛け算の回数を減らすことができる。
【００８１】
ＦＣＳ演算では、Ｍτの数が多いほどカーブフィッティングの誤差が小さい。すなわち、データの密度が高くなるためにカーブフィッティングの精度があがる。しかし、Ｍτを増やすことで、ステップＳ２５〜Ｓ２８の計算を繰り返し行うことになる。
【００８２】
従って、すべてのデータを計算に用いるのは計算時間の増加につながる。その他のチャンネルデータの部分を飛ばすのは演算スピードのアップに非常に有効である。つまり、一つのＭτに対して、その他のチャンネルに相当する
【数２９】
2005337920.tif 000031
【００８３】
個のデータを飛ばすことは、ｐ個のＭτに対しては、
【数３０】
2005337920.tif 000032
【００８４】
個のその他のチャンネルデータを飛ばすことになり、Ｍτの数が多いほど計算時間の短縮が図れる。
【００８５】
次に、ＦＣＳ計算の第５の部分として、ステップＳ２５〜Ｓ２８により得られた結果を以下の式（２−１０）に代入して、総合計算（最終結果）を求める（ステップＳ２９）。
【数３１】
2005337920.tif 000033
【００８６】
ステップＳ２５での平均値計算用有効データ数Ｍa の統計計算、ステップＳ２６での平均値計算、ステップＳ２７での自己相関関数計算用有効データ数Ｍc の統計計算およびステップＳ２８の自己相関関数計算において、チャンネル１において、いずれも一つのＭτに対して、その他のチャンネルに相当する
【数３２】
2005337920.tif 000034
【００８７】
個のデータは飛ばすことになり、ｐ個のＭτに対しては、
【数３３】
2005337920.tif 000035
【００８８】
個のその他のチャンネルのデータを飛ばすことになる。
【００８９】
具体的には、10 sec測定したデータを扱う場合は、ビンタイムを１２．５μsecに設定すると、計算用の測定データの総数は７．３×１０5 個以上に及ぶ。
【００９０】
４チャンネルのマルチポイントＦＣＳの場合は、ｐ個のＭτに対しても、測定したすべてのデータ７．３×１０5 を一回限りのスキャンで位置情報テーブル（図１０）を作成することで済む。７．３×１０5個のすべての測定データを繰り返しｐ×４×４回スキャンする汎用検索方式に比べ、計算速度は少なくともｐ×４×４倍速くなる。
【００９１】
図１１は、ＦＣＳ演算の結果を示すＦＣＳグラフである。
【００９２】
（第３実施形態）
図１２は、２つの測定データを用いたＦＣＣＳ演算の手順を説明するためのフローチャートである。まず、図１による構成により試料５０について２つの測定データを取得する（ステップＳ４１）。これにより、図１３（Ａ）、（Ｂ）に示すような時系列信号が得られる。次に、この時系列信号を時分割して多チャンネル化（ここではチャンネルｃｈ０〜ｃｈ４）する（ステップＳ４２、図１４（Ａ）、（Ｂ））。図１４（Ａ）、（Ｂ）において、ｃｈ０は、レーザ光をＸＹ走査する手段としてのガルバノスキャナの移動時のランダム測定データ範囲である。ｃｈ１は、測定ポイント１の測定データ範囲である。ｃｈ２は、測定ポイント２の測定データ範囲である。ｃｈ３は、測定ポイント３の測定データ範囲である。ｃｈ４は、測定ポイント４の測定データ範囲である。
【００９３】
次に、チャンネル番号ＣＨ＿ＮＯに初期値としての１を代入して計算を開始する（ステップＳ４３、Ｓ４４）。次に、ＦＣＣＳ演算の第１の部分として、以下の式（３−１）を用いて、汎用検索方式による平均値計算用の有効データ数Ｍa の統計計算を行う（ステップＳ４５）。
【数３４】
2005337920.tif 000036
【００９４】
ここでは、二つの測定データにおいて、それぞれ以下の方法で各自の平均値計算用有効データ数ＭAaとＭBaを計算する部分である。ここではＭAaの計算を例として説明する。
【００９５】
まず、単純にすべての測定データをスキャンして、チャンネル１については、チャンネルデータが１の場合のみについて、＋１の統計計算を行う。
【００９６】
平均値計算用有効データ数ＭAaの統計計算は、式（３−１）により行われる。チャンネル１については、実際の計算に用いる有効データは、図１４（Ａ）において、
【数３５】
2005337920.tif 000037
【００９７】
に相当する部分だけである。この部分を抽出するために、測定したすべてのデータＭA max （図１４（Ａ）参照）を逐次スキャンしてチャンネル番号を判断する。つまり、チャンネル１においては、すべてのデータＭA max を逐次スキャンしながら、チャンネル番号が１になるごとに、ＭA a の値を＋１して統計計算し、スキャンによってその他のチャンネル番号と判断した場合は、ＭA a の統計計算は行わない。
【００９８】
チャンネル2、3と4においても同様な処理が行われ、結果的には、4チャンネルマルチポイントＦＣＣＳ汎用検索方式の平均値計算用有効データ数ＭA a の統計計算は、一つのＭτ（相関計算時の遅延時間）に対して、測定したすべてのデータＭA max を合計4回スキャンする。つまり、ｐ（相関計算時遅延時間の総数）個のＭτに対しては、それぞれＭA max個のデータをｐ×４回スキャンして結果を得る。
【００９９】
次に、ＦＣＣＳ計算の第２の部分として、二つの測定データの平均値を計算する。測定データＡにおいて、計算は、以下の式（３−２）を用いて行う（ステップＳ４６）。
【数３６】
2005337920.tif 000038
【０１００】
チャンネル１については、実際の計算に用いる有効データは、図１５、図１６において、
【数３７】
2005337920.tif 000039
【０１０１】
に相当する部分だけである。この部分を抽出するために、同じく測定したすべてのデータＭmax （図１５、図１６参照）を逐次スキャンしてチャンネル番号を判断することになる。つまり、チャンネル１においては、すべてのデータＭA max を逐次スキャンしながら、チャンネル番号が１になるごとに、ＭA aの値を合計計算し、スキャンによってその他のチャンネル番号と判断した場合は、ＭA aの合計計算は行わない。チャンネル2、3と4においても同様な処理が行われ、結果的には、4チャンネルマルチポイントＦＣＣＳ汎用検索方式の平均値の計算は、一つのＭτに対して、測定したすべてのデータＭA maxを合計4回それぞれスキャンする。つまり、ｐ個のＭτに対しては、それぞれＭA max個のデータをｐ×４回スキャンして結果を得る。
【０１０２】
次に、ＦＣＣＳ計算の第３の部分として、相互相関関数計算用有効データ数Ｍc の統計計算を、以下の式（３−３）を用いて行う（ステップＳ４７）。この部分は、相互相関関数の計算に必要なデータ数を統計する部分である。
【数３８】
2005337920.tif 000040
【０１０３】
チャンネル１については、実際の計算に用いる有効データは、図１５、図１６において、
【数３９】
2005337920.tif 000041
【０１０４】
に相当する部分だけである。相互相関計算は
【数４０】
2005337920.tif 000042
【０１０５】
個のデータをそれぞれＭτ個ずつずらして掛け算をした結果を合計する。ＭABcの値は相互相関計算に用いるデータの数である。ＭABcにおいて、掛け算に用いる元のデータＤA ［ｉ］と、ＭτだけずらしたデータＤB ［ｉ＋Ｍτ］は同一チャンネルのデータでなければならない。
【０１０６】
この部分の抽出は、測定したすべてのデータを逐次スキャンしてチャンネル番号を判別する。つまり、チャンネル１においては、すべてのＤA ［ｉ］と、ＤB ［ｉ＋Ｍτ］のチャンネル番号が１になるごとに、Ｍc の値を＋１計算し、スキャンによってＤA ［ｉ］と、ＤB ［ｉ＋Ｍτ］とのいずれかがその他のチャンネル番号と判断した場合は、ＭAbc の統計計算は行わない。
【０１０７】
チャンネル2、3と4においても同様な処理が行われ、結果的には、4チャンネルマルチポイントＦＣＣＳ汎用検索方式の相互相関関数計算用有効データＭABc の統計計算は、一つのＭτに対して、測定したすべてのデータＭAmax(ＭBmax)を合計4回スキャンする。つまり、ｐ個のＭτに対しては、それぞれＭmax (ＭBmax )個のデータをｐ×４回スキャンして結果を得る。
【０１０８】
次に、ＦＣＣＳ計算の第４の部分として、相互相関関数を、以下の式（３−４）を用いて計算する（ステップＳ４８）。
【数４１】
2005337920.tif 000043
【０１０９】
上記のステップＳ４７でのＭAbc の計算と同様に、チャンネル１については、実際の計算に用いる有効データは、図１５、図１６において、
【数４２】
2005337920.tif 000044
【０１１０】
に相当する部分だけである。相互相関計算は、
【数４３】
2005337920.tif 000045
【０１１１】
個のデータをそれぞれＭτ個ずつずらして掛け算をした結果を合計する。同様に、掛け算に用いる元のデータＤA ［ｉ］と、ＭτだけずらしたデータＤB ［ｉ＋Ｍτ］は同一チャンネルのデータでなければならない。
【０１１２】
この部分の抽出は、まず、測定したすべてのデータＭAmax (ＭBmax)（図１５参照）を逐次スキャンしてチャンネル番号を判別する。
【０１１３】
つまり、チャンネル１においては、すべてのデータＭAmax を逐次スキャンしながら、ＤA ［ｉ］と、ＤB ［ｉ＋Ｍτ］のチャンネル番号が１になるごとに、ＤA ［ｉ］と、ＤB ［ｉ＋Ｍτ］の掛け算をし、合計計算をする。
【０１１４】
スキャンによってＤA ［ｉ］と、ＤB ［ｉ＋Ｍτ］とのいずれかがその他のチャンネル番号と判断した場合は、相関計算（掛け算と合計計算）は行わない。
【０１１５】
チャンネル2、3と4においても同様な処理が行われ、結果的には、4チャンネルマルチポイントＦＣＣＳ汎用検索方式の相互相関関数の計算は、一つのＭτに対して、測定したすべてのデータＭAmax (ＭBmax ) を合計4回それぞれスキャンする。つまり、ｐ個のＭτに対しては、それぞれＭAmax（ＭBmax）個のデータをｐ×４回スキャンして結果を得る。
【０１１６】
次に、ＦＣＣＳ計算の第５の部分として、ステップＳ４５〜Ｓ４８により得られた結果を以下の式（３−５）に代入して、総合計算（最終結果）を求める（ステップＳ４９）。
【数４４】
2005337920.tif 000046
【０１１７】
ステップＳ４５での平均値計算用有効データ数Ｍa の統計計算、ステップＳ４６での平均値計算、ステップＳ４７での相互相関関数計算用有効データ数Ｍc の統計計算およびステップＳ４８での相互相関関数計算結果を式（３−５）に代入して、総合計算（最終結果）を求める。
【０１１８】
上記した実施形態によれば、マルチポイントＦＣＳ、ＦＣＣＳのデータ解析において、同時に複数測定点の自己相関関数、相互相関関数の推定を行い、複数点についての測定の順序を自由に組み合わせ、細胞の反応、たんぱく質間の相互作用などを解析することができる。特に、シングルポイントＦＣＳ、ＦＣＣＳと比較する場合、マルチポイントＦＣＳ、ＦＣＣＳの場合は、同時に複数のポイント点を観察することができ、生体の細胞内外の多様な反応を捉えることができる。
【０１１９】
また、テーブル検索方式マルチポイントＦＣＳ、ＦＣＣＳを採用することにより、汎用検索方式によるチャンネル位置判断のためのすべてのデータの繰り返しスキャンを避け、一回のみのスキャンで各測定点におけるすべてのデータを取得することが可能になる。自己相関、相互相関計算の各段階でこのチャンネル位置情報テーブルを参照するだけで、計算対象以外のチャンネルのデータを飛ばし、必要最小限のデータだけを計算に取り込むことで、計算時間の短縮が図れ、複数測定点をリアルタイムに測定、観察することができる。特に、測定点（チャンネル数）の数が増えるほど、読み飛ばすデータの量は増え、計算時間の短縮が著しく図れる。
【０１２０】
さらに、従来の単一点での自己相関関数、相互相関関数を推定する方法と同様な原理で構成された測定装置で、複数測定点について短時間交替測定し、逐次測定データの解析を行うことで、単一の測定点でありながら、ほぼリアルタイムで標本内の複数の測定点について、分子挙動、反応などを捉えることができる。すなわち、測定する点を順次細胞内外で移動し、得られた測定データを各測定点ごとに一連の時系列データに時分割し、時分割された測定データごとに自己相関関数、相互相関関数を推定し、ほぼ同時に複数の測定点での自己相関関数、相互相関関数の値を推定することができる。
【０１２１】
さらにまた本発明により、得られた時系列信号から光強度分布解析を行うこともできる。これにより異なる蛍光分子の結合状態や密度分布を求めることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】本発明が適用される光信号解析装置の構成を示す図である。
【図２】汎用検索方式によるマルチポイントＦＣＳ演算の手順を説明するためのフローチャートである。
【図３】（Ａ）は試料についての測定データ（時系列信号）を示し、（Ｂ）は時系列信号を時分割して多チャンネル化したようすを示し、（Ｃ）は各測定ポイント１〜４の一例を示す図である。
【図４】平均値計算用有効データ数Ｍａの統計計算に用いられる図である。
【図５】テーブル検索方式によるマルチポイントＦＣＳ演算の手順を説明するためのフローチャートである。
【図６】（Ａ）は試料についての測定データ（時系列信号）を示し、（Ｂ）は時系列信号を時分割して多チャンネル化したようすを示す図である。
【図７】チャンネル位置情報テーブル作成に用いられる図である。
【図８】チャンネル位置情報テーブルにおける各パラメータを示す図である。
【図９】位置情報変数テーブルを示す図である。
【図１０】位置情報データテーブルを示す図である。
【図１１】ＦＣＳ演算の結果を示すＦＣＳグラフである。
【図１２】２つの測定データを用いた汎用方式ＦＣＣＳ演算の手順を説明するためのフローチャートである。
【図１３】試料についての測定データ（時系列信号）を示す図である。
【図１４】図１３に示す時系列信号を時分割して多チャンネル化したようすを示す図である。
【図１５】２つの測定データについての平均値計算用有効データ数ＭAａの統計計算に用いられる図である。
【図１６】２つの測定データについての平均値計算用有効データ数ＭBｂの統計計算に用いられる図である。
【符号の説明】
【０１２３】
１０…レーザ走査型共焦点光学顕微鏡本体、１１…ＣＣＤカメラ、１２…試料ステージ、１３…試料ステージコントローラ、１４…コンピュータ（ＰＣ）、１５…ＴＶモニタ、１６…レーザ光源。
【図１】
2005337920.tif 000047
【図２】
2005337920.tif 000048
【図３】
2005337920.tif 000049
【図４】
2005337920.tif 000050
【図５】
2005337920.tif 000051
【図６】
2005337920.tif 000052
【図７】
2005337920.tif 000053
【図８】
2005337920.tif 000054
【図９】
2005337920.tif 000055
【図１０】
2005337920.tif 000056
【図１１】
2005337920.tif 000057
【図１２】
2005337920.tif 000058
【図１３】
2005337920.tif 000059
【図１４】
2005337920.tif 000060
【図１５】
2005337920.tif 000061
【図１６】
2005337920.tif 000062