(57)【要約】【課題】  本発明は、転位ポリペプチド(translocating polypeptide)に結合された細胞プロセス改変分子に培養細胞を接触させることを特徴とする、細胞プロセスを調節するための方法を提供する。【解決手段】  例えば、一実施形態においては、転位ポリペプチドに結合された(標的遺伝子を含む)ポリヌクレオチドに培養細胞を接触させることにより、培養細胞を標的遺伝子でトランスフェクトする。別の実施形態においては、転位ポリペプチドに結合された1種以上の調節物質に培養細胞を接触させることにより、1種以上の調節エレメントの制御下に標的遺伝子を含む培養細胞中での標的遺伝子産物の発現を調節する。1種以上の調節物質は、培養細胞中に転位し、そこで1種以上の調節エレメントと相互作用し、該細胞による標的遺伝子産物の発現を調節する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上の調節エレメントの制御下に標的遺伝子を含む培養細胞中の標的遺伝子産物の発現を調節するための方法であって、適当な条件下で、転位ポリペプチドに結合された１種以上の調節物質に培養細胞を接触させ、該１種以上の調節物質を該培養細胞中に転位させ、そこで１種以上の調節エレメントと相互作用させることにより、該細胞による該標的遺伝子産物の発現を調節することを含み、１種以上の調節物質は部位特異的リコンビナーゼを含み、培養細胞は少なくとも１つの部位特異的ゲノム組換え部位を有する第１の核酸ならびに標的遺伝子および少なくとも１つの部位特異的組換え部位を含む第２の核酸を含み、リコンビナーゼは組換え部位特異的であり、部位特異的リコンビナーゼの転位が部位特異的組換え部位との間での組換えを引き起こし、その結果、標的遺伝子がゲノム組換え部位において細胞のゲノムへ安定に組込まれる、方法。
【請求項２】
部位特異的リコンビナーゼが、部位特異的リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーおよび部位特異的リコンビナーゼのリゾルバーゼ／インベルターゼファミリーからなる群から選択される部位特異的リコンビナーゼのファミリーメンバーである請求項１記載の方法。
【請求項３】
部位特異的組換え部位が、frt部位であり、部位特異的リコンビナーゼがFlpである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
部位特異的組換え部位が、lox組換え部位であり、部位特異的リコンビナーゼがCreである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
１種以上の調節エレメントの制御下に標的遺伝子を含む培養細胞中の標的遺伝子産物の発現を調節するための方法であって、適当な条件下で、転位ポリペプチドに結合された１種以上の調節物質に培養細胞を接触させ、該１種以上の調節物質を該培養細胞中に転位させ、そこで１種以上の調節エレメントと相互作用させることにより、該細胞による該標的遺伝子産物の発現を調節することを含み、１種以上の調節エレメントがプロモーターを含み、１種以上の調節物質が前記プロモーターに特異的なポリメラーゼを含む方法。
【請求項６】
ポリメラーゼがT7 RNAポリメラーゼであり、プロモーターがT7プロモーターである請求項５記載の方法。
【請求項７】
１種以上の調節エレメントの制御下に標的遺伝子を含む培養細胞中の標的遺伝子産物の発現を調節するための方法であって、適当な条件下で、転位ポリペプチドに結合された１種以上の調節物質に培養細胞を接触させ、該１種以上の調節物質を該培養細胞中に転位させ、そこで１種以上の調節エレメントと相互作用させることにより、該細胞による該標的遺伝子産物の発現を調節することを含み、１種以上の調節物質がDNA結合タンパク質を含み、DNA結合タンパク質がステロイド／甲状腺ホルモン核受容体スーパーファミリーのメンバーのDNA結合ドメイン、GAL4 DNA結合ドメイン、ホメオボックスタンパク質のDNA結合ドメイン、ジンクフィンガータンパク質のDNA結合ドメイン、ホルモン受容体のDNA結合ドメイン、ヘリックス-ターン-ヘリックスタンパク質のDNA結合ドメイン、塩基性Zipタンパク質のDNA結合タンパク質、βリボン因子のDNA結合タンパク質およびTetオペロンのDNA結合ドメインからなる群から選択されるDNA結合ドメインを有する、方法。
【請求項８】
DNA結合ドメインがGAL4 DNA結合ドメイン由来のDNA結合ドメインを有する請求項７記載の方法。
【請求項９】
DNA結合ドメインが配列番号４に表されるドメインである請求項７記載の方法。
【請求項１０】
DNA結合タンパク質がヒストン１（H1）タンパク質または非ヒストンタンパク質HMG-17である請求項７記載の方法。
【請求項１１】
１種以上の調節エレメントがプロモーターを含む請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
１種以上の調節エレメントの制御下に標的遺伝子を含む培養細胞中の標的遺伝子産物の発現を調節するための方法であって、適当な条件下で、転位ポリペプチドに結合された１種以上の調節物質に培養細胞を接触させ、該１種以上の調節物質を該培養細胞中に転位させ、そこで１種以上の調節エレメントと相互作用させることにより、該細胞による該標的遺伝子産物の発現を調節することを含み、１種以上の調節物質がHIV Revタンパク質を含み、１種以上の調節エレメントがHIV Rev調節エレメント（RRE）を含む方法。
【請求項１３】
培養細胞が哺乳類、酵母または昆虫細胞である請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
培養細胞が真核細胞である請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
１種以上の調節物質および転位ポリペプチドが非共有結合で結合している請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
転位ポリペプチドおよび１種以上の調節物質がビオチン-ストレプトアビジン複合体または大腸菌由来の１本鎖DNA結合タンパク質により結合している請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
１種以上の調節物質および転位ポリペプチドが共有結合で結合している請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
１種以上の調節物質および転位ポリペプチドがリンカーにより結合している請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
リンカーが1個以上のジスルフィド結合、サリチルヒドロキサム酸(SHA)、フェニルボロン酸(PBA)、SHA-NHSエステル、又はそれらの組合せを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
リンカーがワクシニアDNAトポイソメラーゼである請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
転位ポリペプチドがVP22ポリペプチド、AntpまたはプロテインHである請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
転位ポリペプチドがVP22ポリペプチドである請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
転位ポリペプチドおよび１種以上の調節物質が融合タンパク質のユニットである請求項１〜１４、１６〜１８および２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
標的遺伝子がさらにタンパク質タグをコードしているポリヌクレオチド内に含まれる請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
タンパク質タグがmycエピトープ、蛍光ペプチドもしくはポリHisタグ、またはそれらの２つ以上の組合わせである請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
標的遺伝子が毒素タンパク質をコードしている請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
標的遺伝子がレポーター遺伝子である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法に用いるベクターであって、転位ポリペプチドに結合された細胞プロセス改変分子をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２９】
配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項２８に記載のベクター。
【請求項３０】
配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項２８に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞間でポリヌクレオチド及びポリペプチドを転位させるための方法に関する。より具体的には、本発明は、細胞プロセスを改変させる分子を、該分子が応答性の標的部位と特異的に相互作用するように、細胞中に送達するための転位タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
転位タンパク質は、細胞膜などの生体膜を横切るその能力によって定義される。いくつかの転位タンパク質が記載されており、例えば、I型単純ヘルペスウイルスに由来するVP22 (G.Ellior及びP.O'Hare、Cell 88, 223-233 (1997))、ショウジョウバエに由来するアンテナペディアタンパク質(Antp)の断片 (D.Derossiら、Journal of Bioligical Chemistry 269, 10444-10450 (1994))、及びStreptococcus pyrogenesに由来するプロテインH (Axcronaら、Manuscript in preparation (1999))が挙げられる。
【０００３】
アンテナペディアは3つのαヘリックスから構成され、βターンがヘリックス2及び3を分離している、DNA結合ドメインを有するホメオタンパク質である。実験により、Antpと呼ばれる、第3ヘリックスに対応する16アミノ酸のペプチドが、膜を横切って転位し、細胞質及び核の中に蓄積し得ることが示された(Derossiら、上掲)。このペプチドは、4℃という低い温度で内在化するが、このことは、エンドサイトーシスがこのペプチドの内在化に関与していないことを示唆している。さらに、転位は古典的なエンドサイトーシスを必要としないため、Antpはエンドソーム及びリソソームの区画を通って移動しない。従って、Antpはタンパク質分解に対する抵抗性を有し、ほとんどの細胞区画において増強された活性を有する(D. Derossiら、J Biol Chem 271:18188-18193, 1996)。
【０００４】
逆ヘリックス(すなわち、逆の一次配列)及びD−エナンチオマーからなるヘリックスが4℃で細胞膜を横断し得ることを示す最近の実験により、Antpの内在化は、リン脂質二重層中の逆転ミセルの形成を必要とし、受容体に依存せずかつエネルギーを要することなく細胞中へ侵入することが示唆される(H. Hallら、Current Biol 6:580-587, 1996)。
【０００５】
ベクターペプチドとしてのAntpの有用性は、目的の種々のペプチドへのAntpの遺伝的融合により(F. Perezら、J Cell Sci 102:717-722, 1992、F. Perezら、Mol Endocrinol 8:1278-87, 1994、及びA. Prochiantz、Curr Opinion Neurob 6:629-634, 1996)、又はシステイン残基を介する共有結合により(D. Derossiら、上掲)、成功裏に証明されてきた。長さが41アミノ酸もあるペプチドの内在化及び荷電したホスホペプチドの内在化(B. Allinquantら、J Cell Biol 128:919-927, 1995)が神経細胞において証明されている。それぞれの場合において、Antpに融合された配列は、期待される生物学的機能を保持していた。さらに、Antpは、オリゴヌクレオチド(長さ45ヌクレオチドまで)を、培養細胞に送達するために用いられた唯一の転位ペプチドである(C.M. Troyら、J Neuro 16:253-61, 1996、G. Elliotら、J Virol 172:6448-6455, 1998)。
【０００６】
プロテインHは、ヒトの病原体であるStreptococcus pyrogenesの表面抗原である。プロテインHは、B及びTリンパ球により取り込まれ、核に転位する。細胞機能に影響しないと思われる他の転位タンパク質とは対照的に、プロテインHは、核タンパク質SET及びhnRNP A2/B1とのその会合の結果であると考えられる細胞増殖抑制効果を有する(D. Derossiら、上掲)。現在まで、他の分子に結合させたプロテインHの転位は証明されていない。
【０００７】
最もよく研究された転位タンパク質は、単純ヘルペスウイルスタンパク質VP22であり、これは培養された哺乳動物細胞間で転位する独特な能力を有する。VP22タンパク質をコードするプラスミドで細胞をトランスフェクトする場合、発現されたタンパク質は、トランスフェクトされた細胞の細胞質に蓄積し、細胞膜を横切って転位することにより、周囲のトランスフェクトされていない細胞に拡散し、その核の中に蓄積する。このプロセスは4℃でも起き、また、エネルギーを要さず、エンドサイトーシスとは無関係であるようである。細胞を通って移動するタンパク質がBrefeldin Aによって遮断される場合、依然としてVP22の輸送が起こり得る。VP22の移動中の細胞骨格エレメントに関する研究は、アクチン細胞骨格がVP22の内外輸送に関与することを示唆している(Elliot及びO'Hare、上掲)。
【０００８】
いくつかの機能性VP22融合タンパク質の送達が記載されており、そのような融合タンパク質としては、例えば、VP22-p53 (A. Phelanら、Nature Biotechnology 16:440-443, 1998)及びVP22-チミジンキナーゼ(M.S. Dilberら、Gene Therapy 6:12-21, 1999)が挙げられる。少なくとも20種の異なる哺乳動物細胞型が機能性VP22-GFP融合タンパク質を取り込むことができ(Elliot及びO'Hare、上掲、Aints A.ら、J. Gene Med. 1:275-9, 1999及びWybranietz W.A.ら、J. Gene Med. 1:265-274, 1999)、そのような細胞型としては、例えば、従来のトランスフェクション技術には抵抗するマウス骨格筋芽細胞が挙げられる(Derer W.ら、J. Mol. Med. 77: 609-6138, 1999)。
【０００９】
プラスミドDNAを用いた細胞のトランスフェクションは、生物系の研究にとって非常に貴重なツールであった。種々のトランスフェクション法(例えば、リン酸カルシウム法)が市場に存在するが、これらの方法を用いると、50％を超える細胞が、該細胞にトランスフェクトされた、プラスミド上に担持された遺伝子を発現することは稀である。ほとんどの細胞は外因性DNAを取り込むので、非効率的なトランスフェクションは、そのDNA複合体が細胞に侵入できないことに起因しないようである。大部分のDNAは、極めて少数の内在化DNAによるエンドサイトーシスによって内在化され、発現が起こる細胞質又は核に到達するる。実際、直接的に注入された脂質−DNA複合体の観察からは、エンドソームから細胞質及び核への移動がトランスフェクションの成功にとって最も重要な制約条件であることが示唆される(J.H. Richardsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. 92:3137-3141, 1995)。この観察と一致して、ヘマグルチニンの融合性ペプチド(J. Zabnerら、Journal of Biological Chemistry 270:18997-9007, 1995)などの膜融合活性を有するペプチド、又は核ターゲッティング配列(M. Wilkeら、Gene Therapy 3, 1133-1142 (1996))は、トランスフェクション効率を増加させる場合がある。
【００１０】
かくして、当業界では、標的遺伝子の細胞における発現を調節するための新規でより良い方法、並びにトランスフェクションされた遺伝子の発現に対する主要なブロック（すなわちエンドソームにおける分解及び細胞核に侵入するDNAの無能力）を克服するためのトランスフェクション試薬及びそれらの使用方法が必要とされている。
【非特許文献１】G.Ellior及びP.O'Hare、Cell 88, 223-233 (1997))
【非特許文献２】D.Derossiら、Journal of Bioligical Chemistry 269, 10444-10450 (1994))
【非特許文献３】Axcronaら、Manuscript in preparation (1999)
【発明の開示】
【００１１】
本発明の簡単な説明
本発明は、培養細胞を、適当な条件下で、転位ポリペプチドに結合された細胞プロセス改変分子と接触させることにより、該分子を培養細胞中に転位させ、そこで該分子に応答性の標的部位と特異的に相互作用させることにより、該細胞における細胞プロセスを調節することを特徴とする、培養中の細胞における細胞プロセスを調節するための方法を提供し、これにより当業界におけるこれらの問題を克服するものである。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、標的遺伝子を用いて培養細胞をトランスフェクトするための方法を提供し、該方法は、適当な条件下で、培養細胞を、転位ポリペプチドに結合された標的遺伝子を含むポリヌクレオチドと接触させることにより、該細胞を該標的遺伝子でトランスフェクトすることを特徴とする。
【００１３】
さらに別の実施形態において、本発明は、1つ以上の調節エレメントの制御下にある標的遺伝子を用いてトランスフェクトされた培養細胞において標的遺伝子産物の発現を調節するための方法を提供し、該方法は、適当な条件下で、該細胞を、転位ポリペプチドに結合された1種以上の調節物質と接触させることにより、該1種以上の調節物質を細胞中に転位させ、そこで1種以上の調節エレメントと相互作用させることにより、該細胞による標的遺伝子産物の発現を調節することを特徴とする。
【００１４】
さらに別の実施形態において、本発明は、転位ポリペプチドに結合された、細胞プロセスを改変させる分子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の詳細な説明
本発明によれば、適当な条件下で、培養細胞を、転位ポリペプチドに結合された細胞プロセス改変分子と接触させることにより、該分子を該細胞中に転位させ、そこで該分子に応答性の標的部位と特異的に相互作用させることにより、該細胞における細胞プロセスを調節することを特徴とする、細胞プロセスを調節するための方法が提供される。
【００１６】
本明細書で用いられる用語「転位タンパク質」(translocating protein)とは、生体膜を横切るタンパク質、ポリペプチド又はその機能性断片を意味する。転位タンパク質、ポリペプチド、その機能性断片及び相同体は、以下の性質を有する。すなわち、タンパク質分解に対する抵抗性、受容体に依存しない細胞膜への貫入、及び実質的にエネルギーを要しない細胞膜への貫入である。本発明の方法及び構築物において用いることができる代表的な転位タンパク質としては、1型単純ヘルペスウイルスに由来するVP22(G. Elliot及びP. O'Hare、1997、上掲)、ショウジョウバエに由来するアンテナペディアタンパク質(Antp)の断片 (アミノ酸43〜58まで) (5'-RQIKIWFQNRRMKWKK-3') (配列番号２１) (Axcronaら、上掲、1999)、Streptococcus pyrogenesに由来するプロテインH(D. Derossiら、J. Biol. Chem. 271:18188-93, (1996))などが挙げられる。各転位タンパク質は異なる性質を有するが、転位タンパク質の一般的な利用は、融合分子(例えば、融合タンパク質)を構築することによって、又は所望の分子を転位タンパク質に(例えば、共有結合もしくはリンカーによる結合で)結合させることによって、他の分子を細胞に送達することである。融合タンパク質においては、転位タンパク質を、そのN末端もしくはC末端に位置させることができる。本発明の方法の実施に用いるのに好適な融合タンパク質又はポリペプチドは、VP22ポリペプチドである。
【００１７】
本明細書で用いられる用語「VP22ポリペプチド」とは、ヘルペスウイルスのVP22タンパク質、並びに無傷の該タンパク質の転位特性を有するその機能性断片を指す。さらに、本明細書で用いられる用語「VP22ポリペプチド」は、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、ウマヘルペスウイルス(EHV)、ウシヘルペスウイルス(BHV)などに由来するものを含めた、VP22タンパク質の相同体、それらの輸送活性を有する(すなわち、「機能性」)断片、突然変異体及びキメラな組合せを包含する。
【００１８】
特に、VP22ポリペプチドは、全長HSV1 VP22配列(1〜301) (その配列はWO 97/05265の図４に開示されている)のアミノ酸60〜301及び159〜301に対応するポリペプチドを包含する。他のヘルペスウイルスに由来するVP22タンパク質相同体の配列に基づく相同体タンパク質及び断片は、米国特許第6,017,735号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「融合タンパク質」とは、同一のリーディングフレームによってコードされる、通常は天然で互いに結合していない２つの異なるタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、及び／又は断片を指し、一緒に「融合された」２つ以上の異なるタンパク質及び／又は断片をもたらす。本発明の方法で用いられる融合タンパク質は、転位ポリペプチド(例えば、VP22ポリペプチド)及び同一のリーディングフレームにある別の機能性ペプチドをコードするヌクレオチド配列から産生される。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、同一のリーディングフレームにおいて、本発明の方法で有用な追加のペプチド又はポリペプチド配列(例えば、エピトープタグをコードする配列、アフィニティー精製タグをコードする配列、さらなる機能性タンパク質をコードする配列など、又はそれらの任意の２つ以上の組合せ)を含んでいてもよい。
【００２０】
一実施形態において、本発明は、細胞を標的遺伝子でトランスフェクトするための方法を提供し、該方法は、適当な条件下で、該細胞を、転位ポリペプチドに結合された標的遺伝子を含むポリヌクレオチドと接触させることにより、該細胞を該標的遺伝子でトランスフェクトすることを特徴とする。本明細書で用いる用語「トランスフェクトされた」とは、結合した転位ポリペプチドの転位特性により培養細胞中に転位された遺伝子が、該細胞において少なくとも一過性に発現されること、すなわち、該細胞が該標的遺伝子によって一過性にトランスフェクトされることを意味する。
【００２１】
本発明の方法に従って細胞中にトランスフェクトされ得るポリヌクレオチドの大きさは、約10ヌクレオチド〜約10キロ塩基(kb)までの範囲である。例えば、約20ヌクレオチド(nt)〜約5 kb、又は約100〜500 ntの範囲のポリヌクレオチドを、本発明の方法を用いて細胞中にトランスフェクトすることができる。一般的には、標的ポリヌクレオチドを、培養（例えば、単層又は組織培養）中の細胞集団に一過性にトランスフェクトする。エレクトロポレーション、ウイルスベクターを用いる感染、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、硫酸デキストランによるトランスフェクション、リポフェクション、サイトフェクション、粒子ビーズボンバードメントなどの、トランスフェクション又はトランスダクションを補助するために用いられる従来の手段はどれも必要とされない。その代わりに、必要とされる全ては、本明細書に記載の通り、共有結合又はリンカー分子によって転位タンパク質に結合された目的のポリヌクレオチドを有する、精製された転位タンパク質又は合成的に調製された転位タンパク質と、トランスフェクトすべき細胞集団との接触(すなわち、共培養)である。あらゆる型の原核又は真核培養細胞を、本発明の方法を用いてトランスフェクトすることができ、そのような細胞としては、例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は植物細胞が挙げられる。しかしながら、培養細胞は哺乳動物細胞又は昆虫細胞の単層であるのが現在のところ好ましい。
【００２２】
転位タンパク質がプラスミドDNAに結合される(すなわち、共有結合的又は非共有結合的相互作用を介して結合される)本発明の方法においては、該DNAを遺伝子発現のために核に送達することができる。本明細書に記載される転位タンパク質を用いるDNAの送達は、極めて有用な研究ツールである。オープンリーディングフレームを含む所望のポリヌクレオチド(例えば、プラスミドに含まれるポリヌクレオチド)が本発明の転位タンパク質によって送達される最大100％の細胞において、該ポリヌクレオチドが内在化され、核に輸送された後、該オープンリーディングフレームが発現され、従って、細胞周期調節、転写調節、翻訳調節などの細胞プロセスを研究するための均一な細胞集団が得られる。
【００２３】
本発明による別の実施形態においては、1種以上の調節エレメントの制御下に標的遺伝子を含む培養細胞における標的遺伝子産物の発現を調節するための方法が提供される。この実施形態においては、本発明の方法は、適当な条件下で、転位ポリペプチドに結合された1種以上の調節物質に該細胞を接触させることにより、該1種以上の調節物質を培養中の該細胞中に転位させ、そこで1種以上の調節エレメントと相互作用させることにより、該細胞による標的遺伝子産物の発現を調節することによって実施される。
【００２４】
例えば、VP22などの転位ポリペプチドに結合されたポリヌクレオチドを、該ポリヌクレオチドの全部又は一部の発現のために、該細胞の核中に転位させることができる。一実施形態において、該ポリヌクレオチドは、目的のタンパク質(例えば、標的遺伝子産物又はリポーター遺伝子産物など)をコードするオープンリーディングフレームを含む。あるいは、該ポリヌクレオチドは、標的遺伝子をコードするクローン化されたオープンリーディングフレームを含むベクター(例えば、スーパーコイルがあるプラスミド)であってもよい。
【００２５】
転位タンパク質及び結合された細胞プロセス改変分子は、転位タンパク質を核外輸送シグナル(NES)に結合(例えば、融合)させた場合、発現のために培養細胞集団の細胞質に、そして細胞核に方向付けし得ることが見出された。最近、核からのタンパク質の輸送のためのシグナルが記載された。PKI(cAPKの熱安定性インヒビター、サイクリックAMP依存性タンパク質キナーゼA)の分析(Y. Wangら、Gene Therapy 4, 432-441 (1997))及びHIVのRevタンパク質の分析(W. Wenら、Cell 82, 463-473 (1995))により、核外及び細胞質中に異種配列を誘導するのに十分なロイシンリッチ配列が示された。さらに、正規のSV40ラージT抗原NLSを含む異種タンパク質へのNESの融合は、細胞質区画と核区画との間に該タンパク質の分布をもたらすことが示された(Wangら、上掲)。同様に、Revタンパク質は、核内輸送及び核外輸送の双方のための配列を含み、細胞の細胞質及び核の双方の区画中に見出される(Wenら、上掲)。従って、NESの組込みは、VP22などの転位タンパク質の核ターゲッティングを調節するための可能性のある方法である。というのは、特にPKI NESはSV40 NLSの非常に強力なシグナルを部分的に無効にし得るからである。核外輸送シグナルに結合した場合、転位ポリペプチド及び任意の結合されたポリヌクレオチドは、培養細胞の細胞質並びに核に安定的に導入され、それにより細胞区画間のポリヌクレオチドの分配を達成することができる。細胞質においては、該ポリヌクレオチドに含まれる遺伝子の発現を、本明細書に記載する本発明の方法を用いて調節することができる。
【００２６】
本発明を実施するのに好適な核外輸送シグナルは当業界で公知であり、例えば、HIVのRevタンパク質又はcAPKの熱安定性インヒビターなどから誘導された核外輸送シグナルが挙げられる。多くの場合、転位タンパク質を含有する構築物に核外輸送シグナルを含めることで、目的の標的遺伝子を培養細胞のゲノムに安定的に組込むことができる。
【００２７】
様々な方法により、培養細胞を、本発明による細胞改変分子に結合した転位タンパク質と接触させることができる。1つの方法において、(例えば、融合タンパク質として)細胞改変分子に融合させた転位タンパク質をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされた発現細胞集団を、細胞改変分子を結合させた、発現された転位タンパク質を自発的に取り込む標的細胞集団と混合し、共培養する。発現されたタンパク質は、トランスフェクトされた発現細胞の細胞質に蓄積し、細胞膜を横切って転位することによって、周囲のトランスフェクトされていない細胞に拡散し、その核に蓄積する。例えば、発現細胞は、大腸菌などの原核細胞系であってもよく、標的細胞系は、例えば、CHOもしくはCOSなどの哺乳動物細胞系、又はショウジョウバエのS2などの昆虫細胞系などの任意の真核細胞系であってもよい。
【００２８】
あるいは、トランスフェクトされた遺伝子の発現を促進する条件下で、発現細胞集団を培養し、当業界で公知の方法及び本明細書の実施例に記載される方法を用いて、トランスフェクトされた発現細胞集団の細胞溶解物を調製し、その溶解物を培養した標的細胞集団に加えることができる。転位ポリペプチドがVP22である場合、VP22又はVP22を含む融合タンパク質は、細胞集団の実質的に100％の核に転位する。本明細書に記載の通り、精製された転位タンパク質を含む分子と共に、又は共有結合もしくはリンカーによってポリペプチドもしくはヌクレオチドに結合された転位タンパク質を含む合成的に調製された分子と共に、標的細胞を培養することもできる。転位ポリペプチド及び結合された分子は、約10分〜約72時間、より典型的には、約10分〜約50時間、好ましくは約10分〜約24時間以内に、培養細胞集団全体に転位する。しかし、細胞集団全体による転位ポリペプチド及び結合された分子の取込みには、約10分も要しない場合もある。
【００２９】
転位ポリペプチドと公知のDNA結合タンパク質との融合体を用いて、オープンリーディングフレームを含むDNA(例えば、プラスミド)を組織培養細胞に送達することもできる。本発明の方法のこの実施形態においては、該DNA結合タンパク質は、細胞改変ポリヌクレオチド(すなわち、細胞プロセスを改変するように働くポリヌクレオチドを含むプラスミド)に転位タンパク質を結合させるためのリンカーとして働く。プラスミドDNAなどのポリヌクレオチドの送達のために転位タンパク質に融合され得るタンパク質リンカーの例としては、ヒストン1(H1)タンパク質(M. Wilkeら、上掲、及びNiidomeら、J. Biol. Chem. 272, 15307-15312 (1997))並びに非ヒストンタンパク質HMG-17(高速移動群17) (S. V. Zaitsevら、Gene Ther. 4, 586-592 (1997))が挙げられる。DNAとHMG-17との相互作用は、徹底的に研究されてきており、HMG-17が非協同的、非特異的及び可逆的な様式でDNAと相互作用することを証明している(M. Bottgerら、Arch, Geschwulstforsch 60, 265-270 (1990))。いずれの場合も、DNA結合タンパク質全体又はその機能性断片(すなわち、DNA結合活性を有する断片)を用いることができる。
【００３０】
転位タンパク質又は転位タンパク質−DNA結合ドメイン融合体との混合の前に、荷電したDNAを凝縮して、中和するポリエチレンイミン(PEI)などの試薬と該DNAとを複合体化するのが好ましいかもしれない。
【００３１】
あるいは、用いる特定の系において、より短いペプチドリンカーが有利である場合、このペプチドリンカーを、化学的に合成されたペプチドとして又は原核発現系で発現される融合タンパク質をコードするヌクレオチドとして、転位タンパク質に融合することができる。化学的に合成されたペプチドとして又は融合タンパク質として転位タンパク質に融合することができる短いペプチド配列の例としては、ポリリシン配列及びペプチド配列LARLの3回以上の繰り返し配列を含む配列、例えばLARL-LARL-LARL(配列番号３)が挙げられる(J.D. Fritzら、Hum. Gene Ther, 7: 1395-1404(1996))。いくつかの場合には、本明細書に記載のように、LARL配列の3〜約100回、典型的には3〜約50回の繰り返し配列を、連結用ペプチドとして用いることができ、3〜約20回までの繰り返し配列が目下のところ好ましい。
【００３２】
転位タンパク質を細胞改変ポリヌクレオチドに結合させるための好ましいリンカーは、ワクシニアウイルスのトポイソメラーゼIタンパク質、又はその突然変異体であり、これにより安定なトポイソメラーゼI−DNAコンジュゲートの形成が可能となる。ワクシニアのDNAトポイソメラーゼは314アミノ酸からなるウイルスにコードされる真核生物I型トポイソメラーゼ(I)であり、二本鎖DNAに結合し、一方の鎖のホスホジエステル骨格を切断する(S. Shuman及びB. Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7478-7482 (1987))。この酵素は、制限エンドヌクレアーゼと同じく、高レベルの配列特異性を示す。切断は、切れやすい鎖中の共通のペンタピリミジンエレメントである5'-(C/T)CCTT-3'で起こる(S. Chengら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5695-5699 (1994)、J.M. Clark, Nucleic Acids Res. 16: 9677-9686 (1988)並びにS.G. Morham及びS.J. Shuman, Biol. Chem. 267: 15984-15992 (1992))。切断反応において、結合エネルギーは切れた鎖の3'リン酸とタンパク質のチロシン残基(Tyr-274)との間の共有結合付加物の形成を介して保存される。ワクシニアのトポイソメラーゼは、最初に切断された(DNA弛緩中に起こる)同じ結合を越えて、共有結合で保持された鎖を再連結することができ、又は異種のアクセプターDNAに再連結することができ、それにより組換え分子を作る。本発明の転位タンパク質に結合される場合、ワクシニアのトポイソメラーゼIリンカーは、Taq介在PCR中で作製されるような、単一の5'A塩基オーバーハングを有する二本鎖オリゴヌクレオチドと結合する。その後、そのようなトポイソメラーゼI−DNAコンジュゲートを細胞中に導入することができる。
【００３３】
図７は、転位タンパク質を目的の二本鎖オリゴヌクレオチドに結合させるのにワクシニアのトポイソメラーゼIリンカーが用いられている、好適なベクターを示すものである。ベクターpVP22/Myc-His TOPO(登録商標)(配列番号２)は、単一の5'A塩基オーバーハングを有する二本鎖PCR産物(すなわち、細胞プロセス改変オリゴヌクレオチド)にVP22を結合してベクターDNAとのVP22融合体を作製するために、ワクシニアのトポイソメラーゼIリンカーを利用するものである。次いで、そのようなトポイソメラーゼI−DNAコンジュゲートは細胞中に直接導入することができる。
【００３４】
別の実施形態においては、陽イオン性リポソームと共に転位タンパク質を用いてプラスミド送達の効率を増加させる。陽イオン性リポソームと容易に会合するタンパク質ドメイン、例えば、疎水性膜貫通ドメイン又はグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーへの転位タンパク質の融合により、脂質−DNA界面での相互作用が容易になる。リポソーム−DNA複合体のエンドサイトーシスの後、転位タンパク質は、該複合体を、エンドソームの膜を通って、細胞質中に転位させ、最終的には、遺伝子発現のための核に転位させる。また、リソソームのヒドロラーゼを阻害するクロロキンなどの化合物と共に転位タンパク質を用いて、トランスフェクション効率を増強することもできる(Niidomeら、J. Biol. Chem., 272: 5307-12, 1998)。
【００３５】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、標準的な分子生物学的技術(J. Sambrook, E.F. Fritsch及びT. Maniatis (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)により構築し、組織培養細胞にトランスフェクトし、免疫蛍光法などの当業界で公知の好適な方法を用いて、転位能力について試験することができる。本明細書中の実施例に記載の方法も参照されたい。
【００３６】
タンパク質発現の表現型効果を研究するためには誘導可能な系を用いる。誘導可能な系は、要求に応じたタンパク質の発現を可能にするので、そのような系は細胞プロセスを研究し、さらには組織培養において毒性タンパク質の発現を可能にするためにも研究用ツールとして用いることができる。現在の誘導可能な哺乳動物発現系は、細胞系において構成的に発現される、多様な生物由来の、例えば大腸菌(U. Fischerら、Cell 82:475-483 (1995))、又はショウジョウバエ(M. Gossenら、TIBS 18:471-475 (1993))由来の転写エレメントを、転写調節因子に応答するプロモーターを含むベクターと共に利用するものである。エフェクター分子を添加すると、誘導性プロモーターへの転写調節因子の結合が起こり、従って、遺伝子発現のスイッチが入る。
【００３７】
本発明は、1種以上の調節エレメントの制御下にある標的遺伝子でトランスフェクトされた哺乳動物細胞における標的遺伝子産物の発現を調節するための方法を提供することによって、この問題に対する新規な手法を提供する。本発明の方法においては、適当な条件下で、標的細胞を、転位ポリペプチドに結合された1種以上の調節物質と接触させ、該1種以上の調節物質を哺乳動物細胞中に転位させ、そこで1種以上の調節エレメントと相互作用させることにより、該細胞による標的遺伝子産物の発現を調節する。標的遺伝子産物の発現を調節するための本発明の方法で用いられる転位ポリペプチドは、本明細書に開示されるどのような転位ポリペプチドであってもよいが、好ましくはVP22ポリペプチドである。
【００３８】
調節物質は、ポリヌクレオチド、タンパク質もしくはポリペプチド、又は小分子であってよい。例えば、調節エレメントは、標的遺伝子に機能的に連結されたプロモーターであってもよく、その場合、該調節物質の転位は該プロモーターによる該標的遺伝子産物の発現をトランス活性化する。該調節物質は、該プロモーターに特異的なものであるのが好ましく、例えば、該プロモーターに特異的なポリメラーゼなどである。
【００３９】
本発明による代表的な誘導可能な系は、哺乳動物細胞における遺伝子発現を指令するのに用いられてきたバクテリオファージT7のRNAポリメラーゼを利用するものである。ワクシニアウイルスによるT7 RNAポリメラーゼ(T7 RNAP)の発現(A. Ramsey-Ewing及びB. Moss, J. Biol. Chem. 271: 16962-16966, 1996、T.R. Fuerstら、Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 8122-8126, 1986)もしくは安定な細胞系におけるT7 RNAポリメラーゼの発現(O. Elroy-Stein及びB. Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6743-6747, 1990並びにA. Lieberら、Nucleic Acids Res. 17: 8485-8493, 1989)、又はトランスフェクションの時点でのT7 RNAPタンパク質の導入(X. Chenら、Cancer Gene Ther. 2: 281-289, 1995及びX. Chenら、Nucleic Acids Res. 22: 2114-2120, 1994)は、小さいT7プロモーターの下流に位置する遺伝子の特異的な発現を促進する。T7 RNAPがT7プロモーターに対して有する特異性により、所望の遺伝子が発現され、非特異的な遺伝子活性化が起こらないことが確実になる。T7 RNAPを用いる発現は非常に強力であり、RSVプロモーターよりも6倍高い場合があると報告されている(A. Lieberら、Nucleic Acids Res. 17: 8485-8493, 1989)。さらに、細胞の核(Lieber, 上掲及びJ.J. Dunnら、Gene 68: 259-266, 1988)又は細胞質において、遺伝子発現をT7ポリメラーゼにより指令することができる。これらの特徴は、T7 RNAPを用いて、T7 RNAP/VP22融合タンパク質を、T7プロモーター構築物を含む細胞に添加することにより、特異的に遺伝子発現を調節することができることを示唆した。VP22技術を用いるT7 RNAPの直接的送達により、遺伝子発現の特異的制御が可能になり、非標的部位への送達の負の効果が最小になる。従って、本発明の方法により、要求に応じたタンパク質発現の表現型効果に関する研究が可能となる。本発明の誘導可能な系の特異性により、毒性タンパク質の発現を組織培養において研究することもできる。本明細書で用いる用語「毒性タンパク質」とは、生体系に対する直接的で固有の毒性能力を有するタンパク質を指し、構成的に活性な型のタンパク質をもたらすタンパク質におけるトランスドミナント変異体を含む。従って、毒性タンパク質は、毒性能力を放出するために発現後の改変を必要とする「プロドラッグ」型分子とは区別される。本発明の方法の実施に用いられる毒性タンパク質の非限定的な例は、Raf及びRas癌遺伝子産物などの種々の癌遺伝子産物である(Avruchら、Trends in Biology 19: 279-83, 1994に総括されている)。
【００４０】
あるいは、調節物質は、調節物質の転位が標的遺伝子産物の発現をトランス活性化するように調節エレメントに特異的な転写因子であってもよい。例えば、転位タンパク質を、Gal4タンパク質などに由来するDNA結合ドメイン及びVP16又はB42などの共通のトランス活性化ドメインに融合することができる。本発明のこの実施形態においては、転位タンパク質を含む融合タンパク質は、核に局在化した後、該融合タンパク質中に組み込まれたDNA結合ドメインに対する上流の結合部位を含むプロモーターを特異的に活性化する。
【００４１】
本明細書における使用が意図される「DNA結合タンパク質」は、DNAに直接結合することができ、転写の開始又は抑制を容易にするタンパク質の公知のクラスに属する。本明細書における使用が意図される代表的なDNA結合タンパク質としては、転写制御タンパク質(例えば、転写因子など；例えば、Conaway及びConaway, Transcription Mechanisms and Regulation, Raven Press Series on Molecular and Cellular Biology, Vol. 3, Raven Press, Ltd, New York, NY, 1994、T. Boulikas, Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression, 4(2&3): 117-321, 1994、A. Klug, Gene 135: 83-92, 1993、W.M. Krajewska, Int. J. Biochem., 24: 1885-1898, 1992を参照されたい)が挙げられる。
【００４２】
そのようなDNA結合ドメインの供給源として本明細書での使用が意図される転写因子としては、例えば、ホメオボックスタンパク質、ジンクフィンガータンパク質、ホルモン受容体、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質、ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質、塩基性Zipタンパク質(bZip)、βリボン因子などが挙げられる。例えば、S. Harrison, "A Structural Taxonomy of DNA-binding Domains," Nature, 353: 715-719を参照されたい。本明細書で使用するのに好適なホメオボックスDNA結合タンパク質としては、例えば、HOX、STF-1 (Leonardら、Mol. Endo., 7: 1275-1283, 1993)、Mat α-2、INVなどが挙げられる。Scottら、Biochem. Biophys. Acta, 989: 25-48, 1989も参照されたい。STF-1ホメオドメインを含む76アミノ酸の断片(Leonardら、1993に記載されたアミノ酸140-215に対応する)は、野生型STF-1と同じくらいかたくDNAに結合する。本明細書で使用するのに好適なジンクフィンガーDNA結合タンパク質としては、Zif268、GLI、XFinなどが挙げられる。Klug及びRhodes, Trends Biochem. Sci., 12: 464, 1987、Jacobs及びMichaels, New Biol, 2: 583, 1990及びJacobs, EMBO J., 11: 4507-4517, 1992をも参照されたい。
【００４３】
本発明の方法で用いられるDNA結合ドメインは、ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体スーパーファミリーのメンバーから取得することもでき、又は該スーパーファミリーのメンバーから取得されるものと実質的に同じものであってもよい。ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体の実質的に全てのメンバーのDNA結合ドメインが関連する。そのようなドメインは、66〜68個のアミノ酸残基からなり、約20個の不変アミノ酸残基(例えば、9個のシステイン)を保有する。該スーパーファミリーのメンバーは、これらの20個の不変アミノ酸残基を含むタンパク質として特徴付けられる。該スーパーファミリーのメンバーのDNA結合ドメインの高度に保存されたアミノ酸は、以下の通りである。
2005323619.tif 000002
（配列番号４）
式中、Xは該DNA結合ドメイン内の非保存アミノ酸を示し、星印は、ほぼ普遍的に保存されているが、いくつかの同定されたホルモン受容体においては変異が認められたアミノ酸残基を示し、括弧内の残基は任意の残基である(従って、該DNA結合ドメインは最小で長さ66アミノ酸であるが、いくつかの追加の残基を含んでもよい)。そのようなDNA結合ドメインは、2-half部位認識部位に結合し、当業界では、該認識部位を含む応答エレメントの制御下で転写をトランス活性化することが知られている。
【００４４】
GAL4 DNA結合ドメインは、2-half部位DNA認識部位と相互作用しない。酵母のGAL4タンパク質のDNA結合ドメインは、少なくともその最初の74個のアミノ末端アミノ酸を含む(例えば、Keeganら、Science 231: 699-704, 1986を参照されたい)。好ましくは、GAL4タンパク質の最初の90個又はそれ以上のアミノ末端アミノ酸、例えば、酵母GAL4の147個のアミノ末端アミノ酸残基を用いる。
【００４５】
本発明の実施に用いることができる別のDNA結合ドメインは、Tetオペロンである。テトラサイクリン誘導系は、当業界で公知である(例えば、Gossenら、Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 5547-5551 (1992)、Gossenら、TIBS 18: 471-475 (1993)、Furthら、Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 9302-9306 (1994)及びShockettら、Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 6522-6526 (1995)を参照されたい)。
【００４６】
転写調節ドメインは、本発明の系に応答する応答エレメントと機能的に結合された遺伝子配列の転写を活性化するもの(すなわち、転写活性化ドメイン)と、本発明の系に応答する応答エレメントと機能的に結合された遺伝子配列の転写を抑制又は脱活性化するもの(すなわち、転写抑制ドメイン)の2つのタイプがある。一般的には、転位タンパク質に結合された転写調節ドメインが転写活性化ドメインである場合には、標的遺伝子の転写を活性化する本発明の系の能力が増強される。本発明の実施における使用が意図される転写活性化ドメインは、種々の供給源から得ることができ、当業界で公知である。
【００４７】
そのような転写活性化ドメインは、典型的には転写因子から誘導され、適当なDNA結合ドメインと結合させたときに遺伝子発現を活性化するように機能する連続的な配列を含む。例えば、好適な活性化ドメインは、ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体スーパーファミリーのメンバーのN末端領域、転写因子活性化ドメイン(例えば、VP16、GAL4、NF-κB又はBP64活性化ドメイン)などから取得することができる(例えば、M. Manteuffel-Cymborowska, Acta Biochim Pol. 46(1) 77-89 (1999)、T. Tagamiら、Biochem Biophys Res. Commun. 253(2): 358-63 (1998)、W. Westin, Adv Pharmacol, 47: 89-112 (2000)を参照されたい)。本発明の実施で使用するのに現在好ましい活性化ドメインは、VP16タンパク質のC末端領域から得られる。
【００４８】
本発明の方法に用いることができる転写リプレッサードメインとしては、遺伝子発現のトランス活性化を抑制するものが挙げられる。本発明の方法で転写調節ドメインとして使用するのに好適な代表的な転写リプレッサードメインとしては、RAFT、CREM、MECP-2、SMRT、NcoR、mSin3A、RAR、TR、SMRTRなどが挙げられる。
【００４９】
転位タンパク質を、標的遺伝子の発現を調節するための誘導可能な発現系において使用できる別の方法は、特定の部位特異的リコンビナーゼによって特異的に認識される核酸配列である部位特異的組換え配列との遺伝子融合体又はin vitroでの共有結合リンケージを作製することである。本明細書において用いられる用語「部位特異的リコンビナーゼ」とは、核酸配列の切り出し及び／又は組換えを触媒する酵素であり、組換え事象においてトランスファー配列DNAと中間複合体を形成することができる。これらの酵素は、認識及び組換えの両方のための部位として働く、比較的短い、ユニークな核酸配列を認識する。本発明の実施において特に有用なリコンビナーゼは、広範囲の細胞型において機能するものである。何故なら、そのような酵素は、どのような宿主特異的因子も必要とせず、また機能するためにATPを必要としないからである。
【００５０】
細菌及び単細胞の酵母に由来する部位特異的リコンビナーゼの2つの主要なファミリーが記載されている。すなわち、インテグラーゼファミリーとレゾルバーゼ／インベルターゼファミリーである。これらのリコンビナーゼにおいては、部位特異的リコンビナーゼによって触媒される鎖交換が、リコンビナーゼ酵素とDNA鎖との間に形成される共有結合的なタンパク質−DNA中間体を必要とする、(1)切断及び(2)再結合の2つのステップで起こる。これらの2つのリコンビナーゼファミリーについては、酵素の触媒アミノ酸残基の性質及び求核基の進入方向が異なる。インベルターゼ／レゾルバーゼファミリーによって触媒される切断の場合は、求核基ヒドロキシルはセリンから誘導され、脱離基はデオキシリボースの3'-OHである。インテグラーゼファミリーの場合は、触媒残基はチロシンであり、脱離基は5'-OHである。両方のリコンビナーゼファミリーにおいて、再結合ステップは切断ステップの逆反応である。
【００５１】
Creのリコンビナーゼ活性は、インテグラーゼのモデル系として研究されてきた。Creは、バクテリオファージP1から単離された38 kDのタンパク質である。CreはloxPと呼ばれる核酸の34塩基対のストレッチの位置で組換え反応を触媒する。loxP部位は、配列5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3'(配列番号５、下線はスペーサー領域である)を有し、8塩基対のコア配列に隣接する2つの13塩基対のパリンドローム反復配列からなる(Hoessら、Proc. Natl. Acad. Sci USA 79: 3398, 1982及び米国特許第4,959,217号、これらの参考文献の開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)。この反復配列はCre結合部位として作用し、交差点が内部スペーサーコア中に存在する。それぞれの反復配列は、1つのタンパク質分子に結合し、DNA基質(一方の鎖)が切断され、Creと切断DNA鎖との間に3'-ホスホチロシン結合を有するタンパク質−DNA中間体が形成されるようである。結晶学その他の研究は、4つのタンパク質及び2つのloxP部位(各々が異なるDNA分子上にある)がシナプス構造（DNAが4通りのホリデイ連結中間体のモデルに類似している）を形成し、続いて第2組の鎖の交換を行なって中間体を組換え産物に分割することを示唆している(Guoら、Naure 389: 40-46, 1997を参照されたい)。loxP組換え配列のコア領域の非対称性は、組換え反応の方向性に関与している。同じDNA分子上の2つのloxP部位が、直接的に繰り返された方向にある場合、Creはこれらの2つの部位間にあるDNAを切り出し、該DNA分子上に1個のloxP部位を残す(Abremskiら、Cell 32: 1301, 1983)。従って、この反復配列は、組換え交差点がコア中に存在するCre特異的結合部位として作用する。
【００５２】
loxP部位は、その大きさが複雑であるので、それはP1ファージのゲノム中にのみ存在する。従って、本発明の方法におけるloxP部位の使用により、トランスファー配列がP1ファージのゲノムに由来するものでない限り、該酵素はトランスファー配列を該配列の内部で切断しない。酵母などの種々の細胞バックグラウンドにおけるCreの活性は、Creが、植物(Albertら、Plant J. 7: 649-659, 1995、Dale及びOw, Gene 91: 79-85, 1990、Odellら、Mol. Gen. Genet. 223: 369-378, 1990)、又はげっ歯類及びヒトの細胞などの哺乳動物細胞(van Deursenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7376-7380, 1995、Agahら、J. Clin. Invest. 100: 169-179, 1997、Sauer及びHenderson, New Biologist 2: 441-449, 1990)においては、活性のための宿主特異的因子を必要としないことを示している(Sauer、Mol. Cell. Biol. 7: 2087-2096, 1987)。
【００５３】
また、Creタンパク質は、大腸菌の染色体中に認められるloxB、loxL及びloxR部位などのいくつかの変異型または突然変異型lox部位(loxP配列に対して変異型)を認識する。他の変異型lox部位としては、loxP511(5'-ATAACTTCGTATAGTATACATTATACGAAGTTAT-3' (配列番号６、下線はスペーサー領域)、loxC2(5'-ACAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3' (配列番号７、下線はスペーサー領域、米国特許第4,959,217号)が挙げられる。当業者であれば、loxP部位のさらなる変異体を調製することができ、一般的には、部位特異的組換え配列を含む2つの反復配列中に合計1〜3個の点突然変異をもつにすぎない。Creは、スペーサー領域内のlox部位の切断を触媒し、6塩基対の付着端を作る。lox部位の2つの13 bpの逆反復ドメインは、Creタンパク質の結合部位を表す。この2つのlox部位は、Creが両方のlox部位を認識できる限りは異なっていてもよい。しかし、切断されたDNAのオーバーハング末端が互いに再アニーリングできないような様式で、2つのlox部位がそのスペーサー領域において異なる場合、Creはこの2つの異なるlox部位を用いて組換え事象を効率的に触媒することができない。組換え事象の効率は、結合部位における変異の程度及び位置に依存するであろう。例えば、loxC2部位をloxP部位で効率的に組換えることができる。何故なら、この2つのlox部位は、左側の結合部位中の１個のヌクレオチドで異なるからである。従って、Creが本発明の方法の実施に用いられる部位特異的リコンビナーゼである場合、部位特異的組換え配列は、loxP部位であるか、又はCre酵素により認識されるその変異体である。
【００５４】
同様の機能を有するインテグラーゼファミリーのリコンビナーゼは、2μ環状DNAを含むSaccharomyces cerevisiaeの株で同定されたリコンビナーゼであるFlpである。Flpは、FRT(Flp組換え標的部位)と呼ばれる8塩基対のコア配列(5'-GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC-3' (配列番号８)、下線はスペーサー)に隣接する2つの13塩基対の逆反復配列からなるDNA配列を認識する。3番目の反復配列は、天然配列の3'末端の後に続くが、リコンビナーゼ活性にとっては必要ではないようである。Flp遺伝子がクローニングされ、大腸菌及び哺乳動物細胞において発現され(PCT国際特許出願PCT/US92/01899、公開番号WO 92/15694、この開示は参照により本明細書に組み入れられるものとする)、精製された(Meyer-Leanら、Nucleic Acids Res. 15: 6469, 1987、Babineauら、J. Biol. Chem. 260: 12313, 1985、Gronostajski及びSadowski、J. Biol. Chem. 260: 12328, 1985)。
【００５５】
Creと同様、Flpは、細菌(Huangら、J. Bacteriology 179: 6076-6083, 1997)、昆虫(Golic及びLindquist、Cell 59: 499-509, 1989、Golic及びGolic、Genetics 144: 1693-1711, 1996)、植物(Lyznikら、Nucleic Acids Res 21: 969-975, 1993)、及び哺乳動物(米国特許第5,677,177号及び第5,654,182号)などの種々の系において機能性であり、このことは、Flpが機能性のための宿主特異的因子を必要としないことを示している。
【００５６】
本発明の方法を実施する際に使用することができるその他のインテグラーゼは、レトロウイルスインテグラーゼ、例えば、HIVおよびASVインテグラーゼである（Annu. Rev. Microbiol. 53:245-81, 1990に総説がある）。
【００５７】
標的遺伝子産物の発現を調節するために本発明の方法を実施する際に、転位タンパク質と融合した部位特異的DNAリコンビナーゼまたはインテグラーゼを、使用したリコンビナーゼまたはインテグラーゼに特異的なリコンビナーゼ組換え部位に隣接し、プロモーターと標的遺伝子をコードするオープンリーディングフレームとの間に置かれた転写阻止配列（例えば、転写終結配列）を含むプラスミドでトランスフェクトした細胞に、本明細書に記載された方法により導入する。例えば、リコンビナーゼがFlpである場合、リコンビナーゼ部位はfrt部位であり、リコンビナーゼがCreである場合、リコンビナーゼ部位はlox部位である。トランスフェクトされた細胞をリコンビナーゼまたはインテグラーゼ接合転位タンパク質に接触させると、リコンビナーゼの活性により転写ターミネーターが除去され、図１に示されるように目的の遺伝子が発現する。
【００５８】
このように、本発明の細胞プロセスを調節する方法において、１種以上の調節エレメントはリコンビナーゼ組換え部位に隣接する転写阻止配列を含んでいてよく、また、調節物質は組換え部位に特異的なリコンビナーゼであってよく、ここでリコンビナーゼの転位が組換え部位の組換えを引き起こすことにより、標的遺伝子産物の発現を調節する。
【００５９】
あるいは、切り出されるべきポリヌクレオチドセグメントに隣接する１対のリコンビナーゼ部位を入れる代わりに、標的遺伝子およびゲノムのリコンビナーゼ部位と対合する第２のリコンビナーゼ部位を含むプラスミドを含む標的細胞のゲノムに、単一のリコンビナーゼ部位が取り込まれてもよい（または天然に存在してもよい）。そのような細胞が標的細胞中のリコンビナーゼ部位（単数または複数）に特異的なリコンビナーゼ（例えば、インテグラーゼ）に接触した場合、リコンビナーゼの転位が組換え事象を誘発して、標的遺伝子はゲノムのリコンビナーゼ部位において標的細胞のゲノムに安定に取り込まれる。
【００６０】
リコンビナーゼまたはインテグラーゼは、一方は転位タンパク質-酵素（例えば、FlpまたはCre）融合体を発現し、他方は異種遺伝子を含む２つの細胞集団を混合することにより導入される。あるいは、転位タンパク質-酵素融合体を原核または真核発現系の中で生産し、公知の方法および本明細書に記載された方法を用いて精製して、異種遺伝子を含む細胞に加えてもよい。細胞は、異種遺伝子で一過性にトランスフェクトされるか、または、そのゲノムに安定的に組み込まれた異種遺伝子を有するかのいずれであってもよい。
【００６１】
あるいは、本発明の遺伝子発現を調節する方法に使用する調節物質は、調節エレメントとしてのRev調節エレメント(RRE)と対にしたHIV Revタンパク質であってもよい。本明細書中実施例５に例証されるように、RREを含む標的細胞に送達されるRevタンパク質の量を増加すると、機能的に連結された標的遺伝子の発現が増加する。
【００６２】
本発明の細胞プロセスを改変する方法の別の実施形態において、転位タンパク質に融合されるタンパク質分子はFv抗体フラグメントまたは一本鎖抗体(sFv)である。好ましくは、転位タンパク質およびsFvを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、本明細書に記載する方法で培養細胞に導入し、細胞核への転位および細胞内発現をおこなう。sFvが、細胞機能に関与する細胞内機構と関連する抗原標的、例えば細胞核内に位置する標的に特異的である場合、sFvの細胞内標的への結合により、細胞機能、例えば、Rasシグナル伝達(O. Elroy-Stein, T. R. Fuerst, B. Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 6126-6130(1989))、膜輸送(O. Cachetら、Cancer Research 58, 1170-1176(1998))、またはウイルスの複製(J. H. Richardson, J. G. Sodroski, T. A. Waldmann, W. A. Marasco, Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 3137-3141(1995))が妨害され得る。一本鎖抗体を構築して本発明の細胞プロセスを改変する方法に使用することができる細胞内標的のその他の例には、ヒトキナーゼ、転写因子、アポトーシスを制御するタンパク質、細胞周期調節物質、腫瘍タンパク質等が含まれる。
【００６３】
したがって、本発明の細胞プロセスを調節する方法に使用される１以上の調節物質は、培養細胞内の１以上の調節エレメントの成分に特異的なFvまたはsFvを含んでいてよく（調節エレメントが天然のものであっても細胞にトランスフェクトされたものであってもよい）、ここで、転位タンパク質による細胞内へのFvまたはsFvの転位および上記成分への抗体の結合が標的遺伝子産物の発現を調節する。
【００６４】
例えば、細胞内プロセスは、VP22に融合した抗ATF-2 sFvおよびVP16の転写活性化ドメインを含む融合タンパク質を作ることにより改変された（図2A-D）。ATF-2は転写因子のbZIPファミリーに属し、ホモダイマーとして、または例えばJun (S. Huguierら、Molecular and Cellular Biology 18:7020-7029, 1998)とのヘテロダイマーとして、8-bpATF/CREBモチーフを介して遺伝子発現を制御する。融合タンパク質がリポーター遺伝子、例えば、細菌ルシフェラーゼ遺伝子の上流に結合したATF-2を有するリポーター細胞系内に発現された場合、細胞核中のATF-2抗原への融合タンパク質中のsFvの結合（図2A-D）がATF-2 sFv-VP16融合体の発現を誘発するが（図2B）、CREB sFv-VP16融合体を誘発しないので（図2C）、その結果としてリポーター遺伝子が発現する。この実験は、ATF-2 sFvが細胞核に送達されて、そこでATF-2抗原に結合することを証明する。
【００６５】
本明細書において、“Fv”は、２本の鎖として発現されるが化学的に結合している、L鎖の可変領域およびH鎖の可変領域を含む遺伝子工学により作られたフラグメントを意味し、“sFv”は、適当なポリペプチドリンカーにより結合されて遺伝子的に融合した一本鎖の分子となったL鎖の可変領域およびH鎖の可変領域を含む遺伝子工学により作られた分子を意味する。
【００６６】
Fv中のL鎖およびH鎖の可変領域の結合は、Inbarら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2659-62, 1972に記載されるように、非共有結合であってよい。あるいは、可変鎖は分子間ジスルフィド結合により結合されてもよく、またはグルタルアルデヒドのような化学物質により架橋されてもよい。
【００６７】
Fvの２つのセグメントを結合するために、または他の２つのタンパク質（例えば、転位タンパク質およびDNA結合タンパク質）を結合するために使用されるリンカーの例は、N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)-アミノベンゾアート、スルホスクシンイミジル(4-ヨードアセチル)-アミノベンゾアート、4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-(2-ピリジルジチオ)トルエン、スルホスクシンイミジル-6-[α-メチル-α-(ピリジルジチオール)-トルアミド]ヘキサノアート、N-スクシンイミジル-3-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオナート、スクシンイミジル6[3(-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキサノアート、スルホスクシンイミジル6[3(-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキサノアート、3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオニルヒドラジド、エルマン試薬、ジクロロトリアジン酸、S-(2-チオピリジル)-L-システイン等のような二官能性の開裂可能な架橋剤である。さらに別の二官能性結合化合物は米国特許第5,349,066号、第5,618,528号、第4,569,789号、第4,952,394号および第5,137,877号に開示されており、これらの文献をそれぞれ全体として参照により本明細書に組み入れる。
【００６８】
これらのリンカーは当業者に公知の多くのプロトコール、例えば、実施例１および２に記載される方法を用いて、精製したタンパク質に結合させることができる（Pierce Chemicals “Solutions, Cross-linking of Proteins: Basic Concepts and Strategies,”Seminar#12, Rockford, ILを参照されたい）。
【００６９】
好ましくは、本発明の方法に使用される抗体は、ペプチドリンカーにより連結されたVHおよびVL鎖からなるsFvである。これらの一本鎖抗原結合タンパク質(sFv)は、オリゴヌクレオチドにより連結されたVHおよびVLドメインをコードするDNA配列からなる構造遺伝子を構築することにより製造される。上記構造遺伝子を発現ベクターに挿入した後、この発現ベクターを大腸菌(E. coli)のような宿主細胞に導入する。組換え宿主細胞は、２つのVドメインを橋渡しするリンカーポリペプチドを有する一本鎖のポリペプチドを合成する。sFvを製造する方法は、例えば、WhitlowおよびFilpula, Methods, 2:97-105, 1991；Birdら、Science 242:423-426, 1988；Packら、Bio/Technology 11:1271-77, 1993；およびLadnerら、米国特許第4,946,778号に記載されており、これらの文献を全体として参照により本明細書に組み入れる。これらの公知の方法を改変して、本明細書に記載するように、sFvおよび転位タンパク質からなる融合タンパク質を作ることができる。
【００７０】
例えば、sFv中のリンカーは、約２から約60個のアミノ酸残基を有する、典型的には約５から約40個の、好ましくは約10から約30個のアミノ酸残基を有するペプチドであってよい。この代替手段はリガンド部分がタンパク質様である場合に特に有利である。例えば、リンカー部分は、一本鎖抗体の研究において知られているような柔軟性のスペーサーアミノ酸配列であってよい。このような公知のリンカー部分の例には、GGGGS（配列番号９）、(GGGGS)n（配列番号10）、GKSSGSGSESKS（配列番号11）、GSTSGSGKSSEGKG（配列番号12）、GSTSGSGKSSEGSGSTKG（配列番号13）、GSTSGSGKSSEGKG（配列番号14）、GSTSGSGKPGSGEGSTKG（配列番号15）、EGKSSGSGSESKEF（配列番号16）、SRSSG（配列番号17）、SGSSC（配列番号18）等が含まれる。MGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM（配列番号19）の配列を有するジフテリア毒素トリプシン感受性リンカーもまた有用である。あるいは、ペプチドリンカー部分はVMまたはAMであってもよく、または一般式AM(G2から4S)xAMで、xが１から11の整数であるもの（配列番号20）で表される構造を有していてもよい。その他のリンカー部分は、例えば、Hustonら、PNAS 85:5879-5883, 1988; Whitlow, M.ら、Protein Engineering 6:989-995, 1993; Newtonら、Biochemistry 35:545-553, 1996; A. J. Cumberら、Bioconj. Chem. 3:397-401, 1992; Ladurnerら、J. Mol. Biol. 273:330-337, 1997; および米国特許第4,894,443号に記載されており、最後の文献を全体として参照により本明細書に組み入れる。
【００７１】
培養細胞内の標的遺伝子がリポーター遺伝子である場合、例えば、当業者に公知であるように、大腸菌(E. coli)β-ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ、またはCATのような検出可能なマーカーをコードする非内在性遺伝子である場合も本発明の範囲に含まれるものとする。
【００７２】
融合分子の精製、または本発明の方法の使用により誘発される発現の検出を助けるために、リポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドの中に、抗体エピトープ（例えば、Mycに由来するもの）、蛍光ペプチド、またはポリHisタグのような、タンパク質タグをコードする追加のヌクレオチド配列を含めると好都合なことが多い。
【００７３】
ペプチドまたはオリゴヌクレオチド分子を転位タンパク質に結合させるためにさまざまな方法を用いることができる。例えば、転位タンパク質は、DNAのような巨大分子およびタンパク質に結合することができ、結合して本発明の方法に用いる融合タンパク質または融合遺伝子の製造に有用なリンカーを形成する２つの低分子量化学親和性リガンドを用いて、本発明の方法に使用するための転位タンパク質または転位ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに共有結合でコンジュゲートさせることができる。このような２つの低分子量の化学親和性リガンドはサリチルヒドロキサム酸(SHA)およびフェニルボロン酸(PBA)であって、迅速に反応して可逆的pH感受性共有結合を形成することにより（図3A-C）、転位タンパク質を別のタンパク質またはポリヌクレオチドに結合させるための便利なリンカーを提供する。例えば、PBA-NTP（ProLinx、シアトル、ワシントン州より入手可能）を用いてPBAを含む核酸分子を合成することができる。あるいは、２本鎖の場合、酵素ターミナルトランスフェラーゼを用いて、PBAを含む核酸分子をPBA-ATPにより標識することができる。また、SHA-NHSエステルを用いて、SHAを転位タンパク質中に存在するリシン残基に結合することができる。この実施形態において、PBA接合分子およびSHA接合転位タンパク質は共有結合により結合して細胞に加えられる。あるいは、他のリンカー、例えば、ジスルフィド結合（細胞質への送達に際して破壊される）または二官能性リンカー分子（例えば、本明細書に開示されるような）もまた使用することができる。これらのリンカー、または当業者に公知のおよび本明細書に開示される他のリンカーを用いた共有結合は、転位タンパク質と他の分子の比較的安定な結合を提供する。
【００７４】
さらに、いくつかの強い非共有結合による分子の相互作用を、転位タンパク質含有複合体を生成するために用いることができる。例えば、ストレプトアビジンは非常に強くビオチンに結合する（解離定数はおよそ10-15である）。この強い親和性は、通常はタンパク質を基質に結合するために用いられるが、細胞プロセス改変分子を転位ポリペプチドに結合させるリンカーを形成するために用いることができる。例えば、VP22転位タンパク質およびストレプトアビジンを含む融合タンパク質を作り、ビオチン化したオリゴヌクレオチドと複合体を形成させて、細胞プロセス改変ポリヌクレオチドを転位ポリペプチドに結合させるリンカーを形成する。ストレプトアビジンはビオチンに四量体として結合し（四量体の分子量は60,000ダルトン）、VP22は多量体として作用して、この組合せを適切なものとしていると考えられる。
【００７５】
本発明の方法に使用するための転位ポリペプチドに細胞プロセス改変分子を結合するリンカーとして使用することのできる別のポリペプチド分子は、大腸菌（E. coli）由来の１本鎖DNA結合タンパク質(SSB)である。SSBの21アミノ酸残基（アミノ酸残基２から22まで）のみがssDNAへの結合に関与していると思われる（すなわち、「SSBの機能性断片」）。さらに、SSBのssDNAへの結合は配列特異的でない。したがって、SSBの機能性断片に融合した転位タンパク質を含む融合タンパク質は、転位タンパク質をオリゴヌクレオチドまたはプラスミドDNAに結合するための非常に魅力的なリンカーである。転位タンパク質に結合するためにオリゴヌクレオチドを修飾する必要のある上記のリンカー分子（すなわち、PBAおよびSHA、またはストレプトアビジンおよびビオチンを含むもの）と異なり、SSBおよび転位タンパク質を含む融合タンパク質は修飾していないDNAに結合することができるので、時間および費用の節約という利点を提供する。
【実施例】
【００７６】
次に、以下の限定を目的としない実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。
実施例１
トランスフェクションによる培養細胞へのVP22融合タンパク質の導入
VP22タンパク質をコードする完全なオープンリーディングフレームを、真核細胞発現ベクターpcDNA3.1/myc-His（Invitrogen, San Diego, CA) にクローン化して、ベクターpVP22/Myc-His（図５、配列番号１）を作った。このベクターには、VP22 ORFとC-末端の抗mycエピトープおよびポリHisタグをコードする配列の間に位置するマルチクローニング部位に、融合パートナーのORFを挿入することができる。抗mycエピトープは抗myc抗体を用いる組換えタンパク質の検出を容易にし、ポリHisタグは精製に有用である。また、使用したベクターを、線状化したベクターDNA（例えば、pVP22 TOPO(登録商標) TA Cloning(登録商標) Kit (Invitrogen)) へのワクシニアウイルスのトポイソメラーゼIタンパク質の共有結合によるカップリングにより修飾した。このタイプのベクターにおいて、目的とする遺伝子産物（すなわち、「融合パートナー」）のORFを、PCR産物としてベクターにクローン化した。このようなVP22ポリペプチドをコードするトポイソメラーゼ接合ベクターの例は、pVP22/Myc-HisTOPO(登録商標)ベクター（図７、配列番号２）である。どちらの場合にも、次に、VP22遺伝子融合体を含むプラスミドを培養細胞にトランスフェクトした。
【００７７】
典型的なトランスフェクションにおいて、COSまたはCHO細胞を６ウェルプレートにまき、およそ50%の集密度にまで増殖した後トランスフェクトした。それぞれのウェルに対して、5μgのDNAを1.5mlのOptiMEM培地（Gibco BRL, Chagrin Falls, OH）で希釈し、COS細胞用には15μlのPfx-6脂質（Invitrogen）を、CHO細胞用には15μlのPfx-7脂質（Invitrogen）と混合した。希釈したDNAに脂質を加えたものを細胞と共に37℃で４時間インキュベートした後、適当な培地に置き換え、さらに37℃で40から48時間インキュベートした。
【００７８】
mycエピトープタグに対する抗体を用いた免疫蛍光法により、トランスフェクトされた細胞から周囲のトランスフェクトされていない細胞へのVP22融合タンパク質の拡散を検出した。典型的な免疫蛍光実験において、６ウェル組織培養プレートの１つの35mmウェルに入れたトランスフェクト細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、2mlのメタノール中で５分間インキュベートすることにより固定した。細胞をPBS（１回の洗浄に2ml）で５回洗浄し、10%のウシ胎児血清(FBS)を含むPBSを用いて15分間ブロックした後、10% FBSを含むPBS 1mlで1:500に希釈したmycエピトープタグに対する抗体(Invitrogen)を加えて20分間インキュベートした。抗体に蛍光分子を結合するために、細胞をPBSで２回洗浄し、10% FBSを含むPBS 1mlで1:500に希釈したヤギ抗マウスOregon Greenコンジュゲート（Molecular Probes, Eugene, OR; cat# O-6383)を加えて20分間インキュベートした。さらに２回洗浄した後、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)フィルターをつけたOlympus IX-70蛍光顕微鏡を用いて抗原抗体複合体を観察した。
【００７９】
このようにして調製したいくつかのVP22融合タンパク質の転位、例えば、融合パートナーとしてAequorea victoria緑色蛍光タンパク質(hoGFP)、lacZ、または部位特異的リコンビナーゼFlpを取り込んだものの転位がこの方法により達成された。
実施例２
細胞の遺伝子融合体によるトランスフェクションおよびその後のトランスフェクトされていない細胞との混合
VP22を機能遺伝子産物の発現をモジュレートするために使用し得る方法を示すために、部位特異的DNAリコンビナーゼFlpを送達する系を開発した。VP22-Flpリコンビナーゼ融合タンパク質を発現するCOS細胞を上記の通りに調製し、リポータープラスミドpFIN4/lacZを用いてトランスフェクトしたCHO細胞と混合した（図１）。リポータープラスミドにおいて、転写終結因子、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(GoodwinおよびRottman, J.Biol.Chem. 267:16330-4, 1992)を含むDNAセグメントはfrt部位（リコンビナーゼFlpにより認識される組換え部位）に隣接しており、CMVプロモーターと、リポーターとしてのβ-ガラクトシダーゼをコードする他の作動可能に結合されたリポーター遺伝子とを分離する。pFIN4/lacZを用いてトランスフェクトした細胞は、frt部位の間に位置する転写終結因子の存在のため、β-ガラクトシダーゼを発現しなかった。
【００８０】
前記リポーター遺伝子の発現が、１つの細胞集団から別の集団へのVP22-Flpリコンビナーゼ融合タンパク質の転位によって制御されることを証明するために、CHO細胞の２つの集団を調製し、一方をVP22-Flpリコンビナーゼ融合タンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトし、他方をVP22-GFP融合タンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションは上記した通りに実施した。トランスフェクトが終了してから24時間後に、トリプシン処理により細胞を回収した。次いで、これら２つの細胞系を混合し、さらに24時間インキュベートした後、β-ガラクトシダーゼ活性について染色した。
【００８１】
pFIN4/lacZでトランスフェクトしたCHO細胞は、VP22-Flp融合体を発現するCOS細胞と混合した場合、β-ガラクトシダーゼのみを発現した。Flpリコンビナーゼの存在下では、転写終結因子を含むDNAのセグメントはfrt部位の組換えにより除去され、β-ガラクトシダーゼが発現された。VP22-GFP融合タンパク質を発現するがVP22-Flp融合タンパク質を発現しないプラスミドでトランスフェクトしたCHO細胞の集団をインキュベートした結果、β-ガラクトシダーゼは発現されなかった。
【００８２】
この実験は、VP22-Flp融合タンパク質が異なる哺乳類細胞型の間で転位し、機能的FlpリコンビナーゼがVP22融合タンパク質中の融合パートナーとして細胞に送達され得ることを示している。
実施例３
細胞の遺伝子融合体によるトランスフェクションおよびその後のトランスフェクト細胞からの細胞フリーの溶解産物の調製
これらの研究において、細胞を含まない溶解産物を、pVP22/myc-Hisでトランスフェクトした細胞から以下のようにして調製した。COS細胞を、100mm皿中で50％の集密度になるまで増殖させた（およそ106個の細胞）。Pfx-6を用いて、細胞を20μgのpVP22/myc-His DNAを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの40時間後に、細胞の単層をPBSで２回洗浄し、その後すくい取って10mlのPBS中に回収した。細胞を500gで５分間遠心分離し、PBSを細胞ペレットから吸引した後、該細胞ペレットをドライアイス上で凍結させた。凍結した細胞ペレットは、溶解産物を調製するまで−80℃にて保存した。該細胞ペレットに、0.5 mlの氷冷した溶解緩衝液(10 mM HEPES、pH 7.9、400 mM NaCl、0.1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、0.5 mMジチオトレイトール(DTT)、5％グリセロール)を加えて、氷上で解凍した。次に、溶解産物を簡単にボルテックスミキサーにかけ、10000×gで5分間、4℃にて遠心分離した。
【００８３】
上清全体を、組織培養培地を除去することなく、直ちに35 mmプレート中の2×105個の細胞に加えた。37℃で10分間インキュベートした後、培地を除去し、上記の免疫蛍光法を用いて、細胞核内に位置するVP22/myc-Hisタンパク質を検出した。
【００８４】
融合タンパク質を発現する細胞から調製した、細胞を含まない溶解産物から哺乳動物細胞へのVP22融合タンパク質の取り込みを検出するための別の方法は、ウエスタンブロット法を利用する。典型的なウエスタンブロット実験では、HeLa、COSまたはCHO細胞を、60 mm皿に50％の集密度でうえた。溶解産物を適用した後、細胞をPBSで１回、次いで500 mM NaClを含むPBSで洗浄して、細胞の外側に非特異的に結合したタンパク質を除去した。該細胞をトリプシンで約５分間処理してプレートから解離させ、残存する細胞外ペプチドをすべて消化した。該細胞を可溶化し、タンパク質を4〜20％のグリシンゲル（Invitrogen, Carlsbad, CA）上で分離した。次いで、この分離したタンパク質をニトロセルロースに移して、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)に結合させた適当な抗体でプローブした。次に、VP22融合タンパク質を化学発光を用いて検出した。
【００８５】
このように、pVP22/myc-Hisでトランスフェクトした細胞の溶解産物中に含まれるVP22/myc-Hisタンパク質は、接触から10分以内にすべてのトランスフェクトされていない細胞の核に転位した。この知見は、VP22を含む溶解産物が、レセプター細胞集団のトランスフェクションを必要としないでタンパク質配列を細胞型へ送達するのに有用であることを示している。
実施例４
大腸菌(E.coli)におけるVP22融合タンパク質の発現およびそれに続く培養細胞への精製したタンパク質の適用
大腸菌(E.coli)からのVP22融合タンパク質の発現および精製を可能にするために、ベクターpCRT7/VP22-1を開発した。このベクターは、VP22融合タンパク質の細胞膜を超えての転位に十分であることが証明されているVP22タンパク質のC-末端断片（アミノ酸159-301）を利用する。上記の方法を使って、融合パートナーとしてさまざまなタンパク質（HIV Revタンパク質およびヒトタンパク質rhoAを含む）を含むVP22融合タンパク質を調製し、融合タンパク質を発現し、精製した。培養細胞による取り込みの後に、それぞれの融合パートナーの活性が証明された。従来の技術を用いて、細胞がわずかしかトランスフェクトしない場合でも細胞培養において転位がおこるような高い効率を証明するために、標準的なトランスフェクションプロトコールに不応性であることが知られているJurkat T-細胞およびPC12細胞によるVP22/GFP融合タンパク質の取り込みもまた行われた。これらの実験は、VP22融合タンパク質が精製された後、培養された哺乳動物細胞集団の実質的にすべての細胞に送達され得ることを示しており、細胞系が標準的なトランスフェクションプロトコールに不応性であることが知られている場合であっても、トランスフェクションの必要性を完全に排除するものである。
【００８６】
pCRT7/VP22-1はpET9bベクターバックボーン（Novagen, Madison, WI)に由来する。pCRT7/VP22-1の調製において、転位活性に十分なVP22のC-末端領域（アミノ酸159-301）をコードする配列、マルチクローニングサイトを含む断片およびベクターpVP22/myc-His由来のmycおよびHisタグをpET9bベクターバックボーンに挿入した。pCRT7/VP22-1のマルチクローニングサイトはpVP22/myc-Hisのものに由来した。上記のpVP22/myc-His-TOPO(登録商標）プラスミドの調製と全く同じ方法でpCRT7/VP22-1ベクターを調製してワクシニアトポイソメラーゼIとカップリングさせた。したがって、このベクターにおいて、融合パートナーのORFをコードする配列は、マルチクローニングサイトの１つに挿入されうるか、またはpVP22/myc-HisもしくはpVP22/myc-His-TOPO(登録商標）プラスミドに使用したものと同様の方法でPCR産物としてトポイソメラーゼクローニング部位にクローン化されうるかのいずれかである。
【００８７】
典型的な実験において、VP22融合タンパク質は以下のように発現された。10ngのpCRT7/VP22-1 DNAを50μlのBL21(DE3)plysS細胞に形質転換した。形質転換された細胞を200μlのSOC培地中で37℃で１時間インキュベートした後、50μg/mlのカナマイシンを加えたLuria-Burtoni(LB)培地により2mlに希釈し、37℃で一晩増殖させた。2mlの培養物を50μg/mlのカナマイシンを含むLB培地50mlに接種するために用いた。細胞を光学濃度が0.5から0.6になるまで増殖させた後、37℃または室温（およそ25℃）に下げながらのいずれかで30分間増殖を続けた。1mlの培養物を取り出して増殖を続けた。残りの培養物にイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度が1mMとなるように加えた。細胞をさらに４時間増殖させた後、誘導された（IPTGを加えたもの）培養物および誘導されない培養物からゲルサンプルを調製した。それぞれの培養物を200μl取り出し、遠心分離により細胞を回収し、ペレットを50μlの1 X SDS/PAGEサンプルバッファーに入れた。あるいは、細胞を残りの培養物から遠心分離により回収し、細胞ペレットを−80℃で保存した。
【００８８】
VP22融合タンパク質は以下のようにして精製された。細胞ペレットを氷温で解凍し、4mlの氷冷した溶解バッファー（50mMリン酸ナトリウム、pH8.0、300mM NaCl、5mMイミダゾール）に再懸濁した。細胞溶解の直前に以下のものを溶解バッファーに加えた：5mMとなるようにβ-メルカプトエタノール、0.5mMとなるようにα-トルエンスルホニルフルオリド(PMSF)、それぞれ1μg/mlとなるようにロイペプチンおよびペプスタチン、および1mg/mlとなるようにリゾチーム。溶解物を氷上で20〜30分間インキュベートした後、氷上に保ったまま3×10秒間超音波処理した。DNアーゼおよびRNアーゼをそれぞれ最終濃度が10μg/mlとなるように加えた。溶解物をさらに20分間氷上で放置した後、21ゲージの注射針を通して３回吸引し、20000gで15分間遠心分離した。遠心分離の後に、可溶性の上清からゲルサンプルを調製した。上清を溶解バッファーで平衡化された1mlのProbond樹脂を含有するカラムに入れる（Probondビーズは６ヒスチジンアレイのタグをつけたタンパク質と相互作用する）。樹脂および上清を氷上のカラムの中で１〜２時間混合した。次にカラムを垂直に固定し、樹脂を沈殿させた。
【００８９】
上清のサンプルを取り出して、SDS/PAGEにより結合していないタンパク質の存在を試験した。10mlの溶解バッファー（50mM リン酸ナトリウム、pH8.0、300mM NaCl、5mM イミダゾール）をカラムに通すことにより、樹脂を洗浄した。溶解バッファーを集めてゲルサンプルを除去した。次に、カラムを20mlの洗浄バッファー（50mM リン酸ナトリウム、pH8.0、300mM NaCl、40mMイミダゾール、10% グリセロール）で洗浄し、同じ方法でもう１つのゲルサンプルを調製した。イミダゾール濃度の増加するバッファー（イミダゾールが100mM、200mM、または500mMのいずれかの濃度である洗浄バッファー）を加えることによりタンパク質を溶出した。それぞれのバッファーを3mlずつ適用し、100mMおよび200mMイミダゾール溶出物のそれぞれ3mlずつを回収した。500mMイミダゾールの溶出物は0.5mlの画分として回収した。また、溶出後の樹脂10μgからゲルサンプルも調製され、タンパク質が結合して残っているかどうかを測定した。すべてのサンプルについて4〜20%のSDS/PAGEゲル(Novex)上で試験した後、1:2000希釈の抗myc-HRPコンジュゲート抗体(Invitrogen)を用いてクマシー染色またはウエスタンブロットを行った。精製したタンパク質はすぐに使うためには4℃で保存し、保存用には−80℃で凍結した。
【００９０】
VP22融合タンパク質の取り込みを免疫蛍光法により検出した。細胞を35mmウェルの中で飽和細胞濃度のおよそ50%まで増殖させた。次に培地を除去し、1mlの無血清培地で置き換えた。500mM イミダゾールを含む洗浄バッファー中に溶出した、およそ10μgの精製したVP22融合タンパク質を、無血清培地に直接加えた。細胞を37℃で20分間インキュベートした後、3×2mlのPBSで洗浄した。次に、細胞を固定し、メタノール中で５分間透過性を上げ、先に記載の方法で免疫蛍光法用に調製した（Invitrogen pVP22/myc-His Vector, カタログ番号 V484-1を参照されたい）。
【００９１】
あるいは、VP22融合タンパク質の取り込みは、ウエスタンブロットにより検出された。この技術は、PC12細胞およびJurkat T-細胞の核へのVP22融合タンパク質の蓄積を検出するために用いられた。それぞれの型のおよそ5×105細胞の懸濁液を15mlのFalconチューブに移した。500gで５分間遠心分離を行って細胞を回収した後、10mlのPBSの中に再懸濁した。細胞を同じ方法で再度洗浄した後、およそ10μgのVP22/GFP融合タンパク質を含む1mlの無血清培地に再懸濁し、37℃で15分間インキュベートした。インキュベーションの後、先に記載したように、細胞を遠心分離により２回洗浄し、10mlのPBSに再懸濁した。細胞を再度遠心分離をおこなうことにより回収し、100μlの氷冷溶解バッファー（10mM HEPES-KOH、pH7.9、1.5mM MgCl2、10mM KCl、0.5mM ジチオトレイトール(DTT)、1% Triton X-100）に懸濁して、氷上で10分間インキュベートした。溶解物を10000gで10分間遠心分離した。可溶性細胞質タンパク質を含む上清を取り出して、4Xタンパク質サンプルバッファーを上清に加えた。細胞核を含むペレットを100μlの1Xタンパク質サンプルバッファーに再懸濁した。サンプルを4〜20%のSDS/PAGEゲル(Novex)にかけ、ニトロセルロース膜に転写した。ウエスタンブロットは抗myc-HRP抗体コンジュゲート(Invitrogen)でプローブした。
実施例５
レシピエント細胞中でのVP22融合タンパク質の活性：VP22/Rev融合タンパク質の機能的試験
HIV Revタンパク質は、HIVゲノムRNAにコードされ、RNAスプライシングの調節を行っている。Revタンパク質はRev応答エレメント(RRE)を含む転写産物に結合することができ、この転写産物の核外輸送およびそれに続く翻訳を可能にする（V. W. Pollardら、Ann. Rev. Micobiol. 52:491-532, 1998に概説されている)。Revが存在しないと、RREを含む転写産物はHIVスプライセオソームと複合体を作るがスプライスされない。代わりに、これらは核の中に留まり分解される。
【００９２】
以下の実験において、転写産物中のRREへのRevの結合をリポーター遺伝子の発現を活性化するために用いた。スプライスド供与部位により分離されたCMVプロモーターおよびCATリポーター遺伝子を含むリポータープラスミド(pCAT/RRE)を調製した。RREはCAT遺伝子部位の3'側に位置した。したがって、Revに応答したCATの発現はVP22/Rev融合タンパク質におけるRevの活性を証明するために用いることができる。
【００９３】
CHO細胞にpCAT/RREをトランスフェクトした後、VP22/Rev融合タンパク質またはVP22myc-His対照融合タンパク質のいずれかで処理した。CATタンパク質に対する抗体を用いた、処理した細胞から調製されたタンパク質サンプルのウエスタンブロットにより、CATリポーター遺伝子の発現を試験した。RREを含まないCMV-CAT陽性対照プラスミドをトランスフェクトした細胞からもサンプルを調製した。陽性対照の発現を検出することができた。細胞にpCAT/RREをトランスフェクトした後にVP22/myc-His対照融合タンパク質で処理した場合、CATの発現は検出されなかった。けれども、pCAT/RREをトランスフェクトされた細胞をVP22/Rev融合タンパク質で処理した場合、CATの発現を検出することができた。５倍量のVP22/Revタンパク質を加えた場合、CATタンパク質のレベルの明白な増加が検出された。これらの結果はVP22が機能的Revタンパク質を核に送達してリポーター遺伝子の発現を導くことができることを示している。
【００９４】
HIVに感染した細胞において、Revタンパク質は細胞質と核の間を往復することができる。これらの細胞内区画の間でのRevの分布は、タンパク質の中に存在する核外輸送シグナルに依存する。本発明のVP22/Rev融合タンパク質において核外輸送シグナルが機能しているかどうかを決定するために、VP22/Revタンパク質の分布を、上記のmycエピトープタグに対する抗体を用いた免疫蛍光法により試験した。この方法により、VP22/Rev融合タンパク質は細胞の細胞質および核において検出され、このことは、RevのVP22への融合が、Revの細胞質および核のいずれにも分布する能力を妨げないように見えることを示している。
実施例６
細胞プロセスを改変するための細胞内への１以上の分子の送達
以下の実験は、融合パートナーとして、哺乳動物細胞のアクチン微小繊維の重合に関与する、小さいGTPアーゼ、rhoAを含むVP22融合タンパク質の細胞への送達により、細胞における細胞プロセスを改変する方法を示す。以前の研究により、Swiss 3T3細胞を16時間血清を与えない状態におくと、細胞の形を維持することに関与するアクチン微小繊維が脱重合して、可溶性アクチンモノマーを後に残すことが示されている。血清を添加すると、アクチンの迅速な再重合が起こり、微小繊維を回復する。この効果は、大腸菌(E. coli)から発現して精製された活性化rhoAタンパク質の細胞へのマイクロインジェクションにより作り出された（A. Hall, Science 279:509-514, 1998)。
【００９５】
VP22-rhoA融合タンパク質が同様の効果を生み出すことができるかどうかを試験するために、VP22-rhoA融合タンパク質を、pCRT7/VP22-1-TOPO（登録商標）プラスミドを用いて大腸菌(E. coli)から発現させ、精製した。Swiss 3T3細胞を以下のようにして精製されたタンパク質で処理した。3T3細胞を35mmウェルの中で飽和細胞濃度のおよそ50%まで増殖させた。次に、培地を除去して1mlの無血清培地に置き換えた。細胞を37℃でさらに20時間インキュベートした。次いで、およそ１μgの精製したVP22/rhoAもしくはVP22myc-Hisのいずれかの融合タンパク質を細胞に適用した。20分後、細胞を3×2mlのPBSで洗浄した後、4%ホルムアルデヒド中で5分間固定した（Invitrogen、β-ガラクトシダーゼ染色キットより）。細胞を再び3×2mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)により洗浄し、PBS中0.1%のTween-20（登録商標）界面活性剤により５分間透過性を上げた後、2×2ml PBSで再度洗浄した。細胞をPBS中10%のウシ胎児血清(FBS)で30分間ブロッキングした後、PBS/10% FBS中FITCコンジュゲートファロイジン(Sigma P-5282)を最終濃度が0.1μg/mlとなるように加えて30分間インキュベートした。
【００９６】
ファロイジンは脱重合したアクチンよりも重合したアクチンにより強く結合するので、再重合した微小繊維を可視化することができる。細胞を2×2mlのPBSで再度洗浄した後、Olympus蛍光顕微鏡およびFITCフィルターを用いて観察した。精製した融合タンパク質を血清を与えない3T3細胞に適用した。あらかじめ血清を与えずにおいた後VP22/myc-His対照融合タンパク質で処理された細胞では、アクチン微小繊維を検出することができず、細胞はいずれの融合タンパク質でも処理されていない血清を与えない細胞と同様に見えた。これに対して、VP22-rhoA融合タンパク質で20分間処理した細胞では、アクチン微小繊維をファロイジンの結合により明白に検出することができた。VP22-rhoA融合タンパク質で処理された細胞の中でのアクチン微小繊維の分布は、融合タンパク質処理と血清を与えない処理のどちらもおこなっていない細胞において見られるものと同様に見えた。これらの結果は、VP22を機能的rhoA融合タンパク質を細胞に送達するために使用することができることを示している。
【００９７】
野生型のrhoAタンパク質は細胞膜からアクチン微小繊維の重合を刺激するように見えるが、VP22タンパク質は通常細胞核に輸送される。VP22/rhoAは同様の方法でアクチン微小繊維の重合を刺激することができるので、VP22/rhoAタンパク質のmycエピトープタグに対する抗体(Invitrogen)を用いた免疫蛍光法によりVP22/rhoAタンパク質の分布を試験した。VP22/rhoA融合タンパク質のほとんどをレシピエント細胞の細胞質で検出することができ、ごくわずかのタンパク質しか核に達していないように見えた。これらの研究は、VP22/rhoAタンパク質はrhoA活性の部位に保持され、核には完全には転位しないことを示している。
実施例７
VP22の修飾によるVP22融合タンパク質の特定の細胞区画への送達
以下の実験は、VP22融合タンパク質を、融合パートナーの特定の細胞区画内への分布を調節するために使用することを実証する。HIV Revタンパク質（C. M. Troyら、Neuroscience 16:253-61, 1996）は、異種配列を核から出て細胞質に入るように指令するのに十分なロイシンリッチな配列を含む。さらに、核外輸送シグナル(NES)を正規のSV40 larger T抗原核局在化シグナルを含む異種タンパク質に融合すると、タンパク質が細胞質および核区画の間に分布する（W. Wenら、Cell 82:463-473, 1995）。同様に、Revタンパク質は核内輸送および核外輸送の両方の配列を含み、細胞質および核区画の両方に見いだされる(U. Fischerら、Cell 82:475-483, 1995)。
【００９８】
この実験において、転位タンパク質の融合パートナーを細胞核以外の細胞の位置に送達する能力を試験するために、VP22 ORFとmycエピトープタグの間に挿入された11アミノ酸Rev Nesを有するVP22/myc-Hisからなる融合タンパク質を上記のように大腸菌(E. coli)に発現させ、精製して、培養細胞に適用した。
【００９９】
培養細胞の中の細胞内区画の間での融合タンパク質の分布を、上記の免疫蛍光法によって試験した。融合タンパク質の分布は、以下のようにして処理された細胞のウエスタンブロット分析により証明された。5×105細胞の懸濁液を15mlのFalconチューブに移した。500gで５分間の遠心分離により細胞を回収した後、10mlのPBS中に再懸濁した。細胞を同様の方法で再度洗浄した後、およそ10μgのVP22/GFP融合タンパク質を含む、無血清培地１mlに再懸濁し、37℃で15分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を先におこなったとおり、遠心分離と10mlのPBSへの再懸濁により２回洗浄した。細胞を再度の遠心分離により回収し、100μlの氷冷溶解バッファー（10mM HEPES-KOH、pH7.9、1.5mM MgCl2、10mM KCl、0.5mM DTT、1% Triton X-100（登録商標）界面活性剤）に懸濁して氷上で10分間インキュベートした。溶解物を10000gで10分間遠心分離した。可溶性細胞質タンパク質を含む上清を取り出して、4Xタンパク質サンプルバッファーで補足した。細胞核を含むペレットを100μlの1Xタンパク質サンプルバッファーに再懸濁した。サンプルを4〜20%のSDS/PAGEゲル(Novex)にかけ、ニトロセルロース膜に転写した。ウエスタンブロットは抗myc-HRP抗体コンジュゲート(Invitrogen)でプローブした。これらの試験は、Rev NES接合-VP22-含有融合タンパク質は処理された細胞の細胞質および核の中に分布し得ることを示している。
実施例８
誘導性遺伝子発現系の成分としてのVP22融合タンパク質の使用
転位タンパク質を大きな特異性を有する誘導性遺伝子発現系に使用することができるという理論を試験するために、他のVP22融合タンパク質について上記したものと同様のプロトコールを用いてT7 RNAP/VP22融合タンパク質を大腸菌(E. coli)から発現させ、精製した。in vitroの転写アッセイにより、RNAポリメラーゼ活性を試験した。すべての試薬はin vitro転写キット(Ambion, Austin, TX)より得たもので、製造者の指示に従って使用した。T7 RNAP/VP22融合タンパク質の存在により産生されたRNAの量は、キットに含まれるT7 RNAPのものと同様であることが見いだされた。
【０１００】
T7プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼ遺伝子を含むリポーター構築物もまた構築された。この構築物をCOS細胞にトランスフェクトし、24時間後に精製したT7 RNAP/VP22融合タンパク質を細胞に適用した。さらに24時間後に、細胞溶解物を調製し、ルシフェラーゼアッセイキット(Promega)を用いて、製造者の指示に従ってルシフェラーゼ酵素活性を試験した。リポーター遺伝子をトランスフェクトされた細胞にT7 RNAP/VP22融合タンパク質を添加すると、ルシフェラーゼ発現のレベルがバックグラウンドの５倍〜10倍に増加し、このことは、この系が真核細胞において異種遺伝子の発現を制御するように機能することを示している。
実施例９
転位タンパク質への共有結合および非共有結合によるカップリング
ペプチドまたはオリゴヌクレオチド分子は、低分子量化学親和性リガンドのサリチルヒドロキサム酸(SHA)およびフェニルボロン酸(PBA)を用いるLinx（登録商標）化学親和性系(Invitrogen)を用いて転位タンパク質に共有結合によりコンジュゲートしてもよい。この系において、低分子量化学親和性リガンドが、可逆的pH感受性共有結合により、転位タンパク質をポリヌクレオチドに結合させる二官能基リンカーを形成するために用いられる。
【０１０１】
PBAを含む核酸分子はPBA-NTPs(ProLinX, Seattle, WA)を用いて合成することができ、または、２本鎖の場合、酵素末端トランスフェラーゼを用いてPBA-ATPで標識することができる。SHA-NHSエステルを、SHAを転位タンパク質中に存在するリシン残基に結合させるために用いることができる（図3A-C)。次に、PBA接合分子およびSHA接合転位タンパク質を共有結合により連結させ、細胞に投与する。この系を用いてタンパク質を連結するために用いられる手順および条件の詳細な説明は公開されている（LinxTM Rapid Protein Conjugation Kit、カタログ番号 K8050-01〜K8060-01、Invitrogen, San Diego, CA)。
実施例10
転位タンパク質：オリゴヌクレオチドコンジュゲートの取り込みのアッセイ
転位タンパク質とさまざまな長さのオリゴヌクレオチドをコンジュゲートさせ、哺乳動物組織培養細胞に外因的に加えることができる。PBA-ATPを含むさまざまな長さの１本鎖DNA(ssDNA)を、PCRを用いて合成することができる。ストレパビジンカラム上でPBA-ATPを含む１本鎖分子を精製できるように、ビオチン化した5'プライマーをデザインすることができる。一連の3'リバースプライマーを作製し、20〜2000ヌクレオチドの長さの多くのssDNA分子の合成を促進することができる。次に、精製されたPBAを含むssDNA分子を転位タンパク質-SHAと混合する。次いで、さまざまな濃度のタンパク質：オリゴヌクレオチドコンジュゲートを細胞に加えて４時間までインキュベートすることができる。インキュベーションの後、細胞を洗浄、固定した後、ストレパビジン-FITCコンジュゲートを用いてプローブすることができる。取り込まれたオリゴヌクレオチドはいずれもストレパビジン-FITCに結合し、蛍光により検出されるだろう。短いオリゴヌクレオチドが非常に効率的に取り込まれ（すなわち、100%の細胞に送達され）、核内に濃縮されると予想される。
【０１０２】
発明をその特定の好ましい実施形態を参照して詳細に説明したが、修正および改変は、詳細な説明および特許請求の範囲に記載された発明の意図および範囲に含まれるものと理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、CMVプロモーター及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)を分離するFlp認識部位(flt)に隣接する介在配列(inv)を有するpFIN4/lacZを示す図である。FlpリコンビナーゼとpFIN4との相互作用により、inv配列が除去され、β−ガラクトシダーゼが発現される。
【図２】図２A〜Dは、VP22、抗ATF-2一本鎖抗体(sFv)及びVP16から構成される融合タンパク質を、細胞（それがATF-2に結合し、転写を活性化させる）の核に送達する過程を示す図である。図２Aは、ATF-2/LexA DNA結合ドメイン(DBD)融合タンパク質が、最少のTKプロモーター及びルシフェラーゼリポーター遺伝子の上流のLexAオペレーター(Op)に結合するが、転写を活性化しないことを示す。図２Bは、ATF-2 sFv-VP16融合タンパク質がATF-2に結合し、転写を活性化することを示す。図２Cは、CREB sFv-VP16融合タンパク質がATF-2に結合せず、転写を活性化できないことを示す。図２Dは、VP22、ATF-2 sFv及びVP16から構成される融合タンパク質が、核に送達され、そこでATF-2に結合し、転写を活性化することを示す。
【図３】図３A〜Cは、二官能性リンカー分子の作製による、オリゴヌクレオチド(oligo)への転位タンパク質(VP22)の結合を示す。図３Aは、フェニルボロン酸(PBA)−接合ヌクレオチド(PBA-dUTP)の化学構造を示す。図３Bは、サリチルヒドロキサム酸(SHA)−接合アミノ酸(R＝リシン)の化学構造を示す。図３Cは、オリゴヌクレオチドをVP22に結合させる二官能性リンカー分子を作製するためのPBA接合ヌクレオチド及びSHA接合アミノ酸の反応を示す。
【図４】図４は、VP22-T7 RNAポリメラーゼ(T7 pol)発現系を説明する図である。VP22-T7Polは組織培養細胞への外因的添加の際に核中に蓄積する。核において、VP22-T7 pol融合タンパク質は、T7プロモーターを認識し、遺伝子Xの転写を活性化する。
【図５】図５は、ベクターpVP22/Myc-Hisのマップであり、T7プロモーター(T7)、VP22のオープンリーディングフレーム(VP22)、マルチクローニング部位、mycエピトープ(myc)、及びポリヒスチジンタグ(6xHis)を含む。
【図６Ａ】図６Aは、ベクターpVP22/Myc-Hisのヌクレオチド配列(配列番号１)を示す。
【図６Ｂ】図６Bは、ベクターpVP22/Myc-Hisのヌクレオチド配列(配列番号１)を示す。
【図７】図７は、pVP22/Myc-His-TOPO(登録商標)ベクターのマップであり、T7プロモーター(T7)、VP22のオープンリーディングフレーム(VP22)、ワクシニアウイルスのトポイソメラーゼ1タンパク質(T)の線状化ベクターDNAへの共有結合により改変されたマルチクローニング部位、mycエピトープ(myc)、及びポリヒスチジンタグ(6xHis)を含む。単一の3'A塩基オーバーハングを有するPCR産物をトポイソメラーゼ接合部位中に挿入することができる。
【図８Ａ】図８Aは、pVP22/Myc-His-TOPO(登録商標)ベクターのヌクレオチド配列(配列番号２)を示す。
【図８Ｂ】図８Bは、pVP22/Myc-His-TOPO(登録商標)ベクターのヌクレオチド配列(配列番号２)を示す。
【図１】
2005323619.tif 000003
【図２】
2005323619.tif 000004
【図３】
2005323619.tif 000005
【図４】
2005323619.tif 000006
【図５】
2005323619.tif 000007
【図６Ａ】
2005323619.tif 000008
【図６Ｂ】
2005323619.tif 000009
【図７】
2005323619.tif 000010
【図８Ａ】
2005323619.tif 000011
【図８Ｂ】
2005323619.tif 000012
【配列表】
2005323619000001.app