(57)【要約】【課題】  金ナノロッドを利用して表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく高感度で簡便なラマン分光分析を可能にする新しい技術を開発する。【解決手段】  基板上に単粒子膜状態で固定化された金ナノロッドを試料用薄膜チップとして用いる。この薄膜チップは液−液界面に金ナノロッドを凝集させ、これを基板表面に移し取ることにより作製される。この薄膜チップを用いれば該チップに被分析試料を付着させて近赤外線領域のレーザー光を照射することによりＳＥＲＳ効果の大きい高感度で簡便なラマン分光分析が実現できる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、該基板上に単粒子膜状態で固定化された金ナノロッドとから構成されていることを特徴とする表面増強ラマン散乱を利用する分光分析における試料用薄膜チップ。
【請求項２】
請求項１の分光分析試料用薄膜チップを作製する方法であって、(i)底に基板を収容し金ナノロッドが分散された純水の水溶液を調製する工程、(ii)前記純水水溶液に第１の有機溶媒を添加して、水相−有機相から成る液−液界面を形成する工程、(iii)前記液−液界面を有する溶液に、前記第１の有機溶媒よりも極性の大きな第２の有機溶媒を注入して、前記液−液界面に金ナノロッドを析出・凝集させる工程、および(iv)前記液−液界面に存在する金ナノロッドと前記基板とを接触させて、該基板に金ナノロッドの薄膜を移し取る工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１の分光分析試料用薄膜チップを用いてラマン散乱分光分析を行なう方法であって、被分析試料を付着させた該チップに近赤外領域のレーザー光を照射することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面増強ラマン散乱を利用する分光分析の技術分野に属し、特に、金ナノロッド薄膜から成る試料用チップとその作製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラマン散乱分光法は物質の振動モードを識別できる分光分析法であり、対象が有機物の場合には、化合物に含まれる官能基（芳香環、アミノ基、水酸基、カルボキシル基等）の存在を識別できる。官能基の組み合わせから化合物の構造を特定することが可能であり、夾雑物混在下でも、特別なマーカーを用いることなく、対象化合物の存在を検出できるという利点がある。ここで、凝集した金属ナノ粒子（ナノメーターサイズの超微粒子）に物質が吸着すると、その物質のラマン散乱効率（強度）の顕著な増強（表面増強ラマン散乱、Surface enhanced Raman scattering以下、ＳＥＲＳと略称することがある）が起こることが知られており、超高感度な振動分光分析法として検討されている。
【０００３】
しかし、水溶液中に分散した金属ナノ粒子の凝集体は構造が不安定であり、安定なＳＥＲＳ効果は得られにくい。実用的なＳＥＲＳセンサーを作製するには金属ナノ粒子の基板（基材）表面への固定化（不動化）が不可欠である。
【０００４】
金属ナノ粒子を基板表面に固定するためには基板と金属ナノ粒子の間をつなぐ架橋分子やリンカー分子を用いる場合が多い。例えば、Natanらは、チオール基などを持つシランカップリング剤を利用して金属ナノ粒子を基板上に固定化する手法を案出し、これがＳＥＲＳ効果も奏すると提唱している（K. C. Grabar, R. G. Freeman, M. B. Hommer, M. J. Natan, Anal. Chem.,
67, 735 (1995)：非特許文献１、特表２００３−５１１５５７号公報：特許文献１）。しかし、Natanらの手法は、「球状」の金属ナノ粒子を用いるものであり、銀ナノ粒子を基板に固定して大きなＳＥＲＳ効果を得るが金ナノ粒子を用いても十分なＳＥＲＳ効果が得られないことが報告されており、事実、このことは本発明者によっても確認されている（後述の実施例参照）。
【０００５】
形状が均一な「ロッド状（棒状）」の金ナノ粒子（金ナノロッド）は可視から近赤外の領域に表面プラズモン（ＳＰ）に由来する強い二本の吸収バンドを持つ。一つは金ナノロッドの短軸方向のＳＰバンドであり、可視域（520nm付近）に吸収ピークが存在する。もう一つは長軸方向のＳＰバンドであり、赤色から近赤外域（600〜1300nm）に吸収ピークを持つ。金ナノロッドの形状制御によって二つの吸収ピーク位置を変えることができる。理論計算によると、アスペクト比（長軸／短軸）の大きな金ナノロッドはＳＥＲＳに適しており、球状の金ナノ粒子よりもＳＥＲＳ増強度が高いとされている（G. C. Schatz, Acc. Chem. Res., 17, 370 (1984)：非特許文献２）。そして、ラマン分光用のレーザー波長が測定物質の吸収波長である場合、そのラマン散乱強度が増強されることが知られている（共鳴ラマン散乱）が増強度の高い表面増強ラマン散乱の測定では、レーザー波長に吸収を持つ測定物質が選択され、共鳴ラマン散乱との相乗効果も利用し得る。
【０００６】
しかしながら、溶液中の金ナノロッドをそのままラマン分光分析に用いると、粒子の凝集や使用できる溶媒が限れられるなどの問題があり実用的ではない。これに対して、金属ナノロッド粒子を基板表面へ薄膜状に固定化して試料用チップとし、これに被分析試料を付着させて所定の光を照射することにより高感度なＳＥＲＳ分光分析が可能であると考えられる。特に、金は生化学的に不活性であるとともに表面修飾が容易であり、金ナノロッド薄膜はＳＥＲＳ分光分析に適用されるのに高い機能を有するものと期待されるが、該薄膜を得るための簡便な技術は未だ確立されていない。
【０００７】
金ナノロッドを用いたラマン分光法は学術論文として報告されている（B. Nikoobakht, J. Wang, M. A. El-Sayed, Chem. Phys. Lett., 366, 17
(2002)：非特許文献３、B. Nikoobakht,
M. A. El-Sayed, J. Phys. Chem. A, 107, 3372 (2003)：非特許文献４）。金ナノロッドなどの金属ナノ粒子の調製には、粒子の分散安定性を確保するために分散安定剤（界面活性剤）の添加が不可欠である。非特許文献３や非特許文献４の報告は1064nmのレーザー光を用いるフーリエ変換ラマン（FT-Raman）分光法による金ナノロッド表面の界面活性剤の分析が主たる目的であり、金ナノロッドによる表面増強については検討されていない。また、これらの報告では金ナノロッドはシリカの粉末に吸着しており、これを基板の表面に固定するという２段階の手法を用いている。さらに、これらの報告の手法で用いられているような1064nmのレーザーによるFT-Raman分光法では干渉計が必要であり、長時間の測定が必要となる。また、1064nmの光はわずかながら水に吸収されるという難点もある。
【０００８】
この他、金ナノ粒子固定基板を用いた表面増強赤外吸収分光法については幾つかの報告が見出される（Y. Niidome, H. Hisanabe, A. Hori, S. Yamada, Anal. Sci., 17, i1185
(2001)：非特許文献５：久鍋秀幸、新留康郎、高橋宏信、山田淳、分析化学、661 (2003)：非特許文献６）に報告されている。しかしながら、これらは赤外吸収分光法を対象とするものであり、ラマン散乱光を検出するための本発明とは物理的に異なる計測原理を用いるものであり、ナノ粒子の形状やその集合状態の信号増強度への寄与は全く異なったものになる。
【特許文献１】特表２００３−５１１５５７号公報
【非特許文献１】K. C. Grabar,R. G. Freeman, M. B. Hommer, M. J. Natan, Anal. Chem., 67, 735 (1995)
【非特許文献２】G. C. Schatz,Acc. Chem. Res., 17, 370 (1984)
【非特許文献３】B. Nikoobakht,J. Wang, M. A. El-Sayed, Chem. Phys. Lett., 366, 17 (2002)
【非特許文献４】B.Nikoobakht, M. A. El-Sayed, J. Phys. Chem. A, 107, 3372 (2003)
【非特許文献５】Y. Niidome,H. Hisanabe, A. Hori, S. Yamada, Anal. Sci., 17, i1185 (2001)
【非特許文献６】久鍋秀幸、新留康郎、高橋宏信、山田淳、分析化学、661 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、金ナノロッドを利用して表面増強ラマン散乱に基づく高感度で簡便なラマン分光分析を可能にする新しい技術を開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、ラマン分光分析に際してＳＥＲＳ作用の優れた試料用薄膜チップを金ナノロッドから作製し得る手法を確立することにより上記の目的を達成したものである。
かくして、本発明に従えば、基板と、該基板上に単粒子膜状態で固定化された金ナノロッドとから構成されていることを特徴とする表面増強ラマン散乱を利用する分光分析における試料用薄膜チップが提供される。
【００１１】
さらに、本発明は、上記の分光分析試料用薄膜チップを作製する方法であって、(i)底に基板を収容し金ナノロッドが分散された純水の水溶液を調製する工程、(ii)前記純水水溶液に第１の有機溶媒を添加して、水相−有機相から成る液−液界面を形成する工程、(iii)前記液−液界面を有する溶液に、前記第１の有機溶媒よりも極性の大きな第２の有機溶媒を注入して、前記液−液界面に金ナノロッドを析出・凝集させる工程、および(iv)前記液−液界面に存在する金ナノロッドと前記基板とを接触させて、該基板に金ナノロッドの薄膜を移し取る工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
また、本発明に従えば、上記の分光分析試料用薄膜チップを用いてラマン散乱分光分析を行なう方法であって、被分析試料を付着させた該チップに近赤外領域のレーザー光を照射することを特徴とする方法も提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、表面増強ラマン散乱を利用する分光分析に当たり以下のような効果が得られる。
(1)  金ナノロッド自身を薄膜状（単粒子膜状態）で直接基板上に固定化することにより、表面増強ラマン散乱の測定が簡素化される。
(2)  試料用チップとして薄膜状の固定化された金ナノロッド基板を用いるため、適当な溶媒で洗浄することが可能であり、再利用することができる。
(3)  照射光として近赤外領域のレーザー光（700〜900nm）を用いるため、金ナノロッド粒子の長軸方向の強いＳＰ（表面プラズモン）吸収を選択的に励起することができ、効率よく表面増強ラマン散乱を測定することができる。
(4)  本発明で用いられる金ナノロッドは球状金ナノ粒子よりも表面増強効果が大きいので、測定物質の非共鳴ラマン条件下でも高感度にラマン散乱を測定できる。したがって、測定物質の吸収バンドにかかわらず、高感度のラマン散乱測定ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
金属ナノ粒子の水溶液に無機塩や有機溶媒を添加すると粒子の分散状態が不安定化して粒子の凝集が起こり、この際、粒子は溶液界面または固液界面に集まり易く、界面に局在した粒子がほぼ完全な単粒子薄膜を形成することが報告されている（K. C. Gordon, J. J. McGarvey, K. P. Taylor, J. Phys, Chem, 93, 6814
(1989)：非特許文献７）。このような２次元的にパッキングされた単粒子薄膜は３次元的に粒子がスタックした薄膜よりも構造が安定であり、耐熱性などに優れている。
【非特許文献７】K. C. Gordon,J. J. McGarvey, K. P. Taylor, J. Phys, Chem, 93, 6814 (1989)
【００１４】
本発明者は、この現象に注目し、これを応用展開することにより、ＳＥＲＳを利用する分光分析に好適な試料用薄膜チップの作製法を案出した。以下、図１に沿って、本発明に従う薄膜チップの作製技術について説明する。
【００１５】
原料となる金ナノロッドは、既知のようにカチオン性界面活性剤（例えば、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド：ＣＴＡＢ）を含有する溶液中で合成される。合成の手法は、特に限定されるものではなく、例えば、金電極を用いる電解法（Y. Y. Yu, S. S. Chang, C. L. Lee, C. R. C. Wang, J. Phys, Chem. B,
101, 6661 (1997)：非特許文献８）、化学反応による合成法（N. R. Jana, L. Gearheart and C. J. Murphy, Adv. Mater., 2001, 13,
1389：非特許文献９）、光反応を用いる方法（F.
Kim, J. H. Song, P. Yang, J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 14316：非特許文献１０、Y. Niidome, K. Nishioka, H. Kawasaki,
S. Yamada, Chem. Commun., 2003, 2376：非特許文献１１）などが適用可能である。いずれの場合も、界面活性剤を含む溶液を用いる手法は金ナノロッドの生成効率が高く、大量の金ナノロッドを得ることができる。
【非特許文献８】Y. Y. Yu, S.S. Chang, C. L. Lee, C. R. C. Wang, J. Phys, Chem. B, 101, 6661 (1997)
【非特許文献９】N. R. Jana,L. Gearheart and C. J. Murphy, Adv. Mater., 2001, 13, 1389
【非特許文献１０】F. Kim, J.H. Song, P. Yang, J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 14316
【非特許文献１１】Y. Niidome,K. Nishioka, H. Kawasaki, S. Yamada, Chem. Commun., 2003, 2376
【００１６】
本発明に従う分光分析試料用薄膜チップを作製するには、先ず、図１のイに示されるように、適当な容器ａ中で底に基板ｂを収容し金ナノロッドが分散された純水の水溶液を調製する。すなわち、上に例示したような手法で得られた金ナノロッド分散液を遠心分離し、界面活性剤が多く含まれている上澄み液を取り除き、純水で再分散させる。
次に、上記のようにして得られた純水水溶液に、図１のロに示すように、水と相溶性のない第１の有機溶媒ｄを添加して、水相−有機相から成る液−液界面を形成する。
【００１７】
このようにして得られた液−液界面が形成している溶液に、次の工程として、前の工程で添加した第１の有機溶媒よりも極性の大きな第２の有機溶媒ｅを勢いよく注入すると（図１のハ参照）、水相の金ナノロッド粒子が不安定化させられて、液−液界面に金ナノロッド（ｆ）が析出・凝集する（図１のニ参照）。第１の有機溶媒／第２の有機溶媒の組み合わせは、特に限定されるものではないが、好ましい組み合わせとして、ヘキサン／アセトニトリル、ヘキサン／メタノール、トルエン／メタノールなどを例示することができる。
【００１８】
次に、上記のように析出・凝集することによって液−液界面（近傍）に存在している金ナノロッドを、底に収容されていた基板と接触させることにより、該基板に金ナノロッドの薄膜を移し取る。金ナノロッドを基板と接触させる具体的手段は、一般に、基板を液−液界面と平行になるように保ちながら下の層から上の層に移動させることである。例えば、実験室におけるような小規模の作製では、図１のホに示すように、ピンセットｇで挟持しながら基板を移動させるが、規模が大きくなればロボットアームのような装置を用いて基板を移動させることもできる。この他に、下の層（水層）から液を静かに抜き出すことにより上の層を下方に移動させ、最後に金ナノロッドと基板を接触させることも可能である。
【００１９】
その後、自然乾燥することにより、金ナノロッド薄膜が基板に固定化された試料用薄膜チップが得られる（図１のヘ）。基板上に固定化された金ナノロッド薄膜は単粒子膜であり、このことは電子顕微鏡観察により確認されている（図２参照）。なお、基板としては、一般に、ガラスが用いられるが、この他に、ラマン散乱不活性な材料、たとえば金属板が利用可能である。さらに、ラマン散乱活性であっても基板由来のシグナル以外の部分で測定可能な材料、たとえば、シリコン基板、あるいはポリエチレンやポリプロピレンなどのプラスティック板も使用可能である。
【００２０】
以上のようにして作製した本発明の試料用薄膜チップを用いてラマン散乱分光分析を行なうには、被分析試料（測定物質）を付着させた該チップに所定の光を照射する。具体的には、基板上の金ナノロッド薄膜に測定物質を溶媒で溶かした液を滴下し、乾燥させ、これをサンプルとしてラマン散乱を測定する。ここで、本発明の特徴は、次にも説明するように、ラマン用光源として近赤外領域のレーザー光を用いることにある。
【００２１】
本発明において使用する金ナノロッドは、一般に、短軸の長さが5nm〜40nm、好ましくは15nm〜25nmであり、長軸の長さが50nm〜500nm、好ましくは100nm〜300nmのものである。このような金ナノロッドはその短軸方向に由来する520nm付近と長軸方向に由来する600〜1300nmの二つのプラズモン吸収バンド（表面プラズモンバンドの励起に対応するバンド）を示す。したがって、本発明においては、700〜900nm（好ましくは785nm）の近赤外領域のレーザー光を用いることにより金ナノロッドの長軸方向のＳＰ（表面プラズモン）を励起することができ、高いＳＥＲＳ増強度が得られる。なお、その際、励起レーザー光の強度は金粒子が融合しない程度に調整することが必要である。
【００２２】
本発明に従って用いられるような700〜900nmの光は水に吸収されないことに加えてポリペプチド、核酸などにもほぼ完全に透明であり、この点は測定対象物（被分析試料）に不要の熱や摂動を加えないという意味で大変有利である。さらに、本発明で用いる785nmのレーザー光は電子冷却ＣＣＤカメラで検出可能であり、ＦＴ−ラマン分光法におけるような干渉計を必要としない。
【００２３】
使用後の試料用薄膜チップは、適当な溶媒、例えばアルコールやアセトンに基板を浸漬することにより、金ナノロッド薄膜に吸着している測定物質のみを取り除くことができ、これによって再利用が可能である。
以下、本発明の実施例を示すが、この実施例は本発明の特徴をさらに具体的に例示するためのものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２４】
薄膜チップの作製
図１に示す手順に従い、基板上に金ナノロッド薄膜が固定化された試料用薄膜チップを作製した。あらかじめ内径32mmのサンプル管の底に1cm角のガラス基板を置き、電解法によって作製した金ナノロッド（以下ＡｕＮＲと記すことがある）分散液（非特許文献８）を20mL入れた。その後、ヘキサンを10mL静かに加えた。5〜10mLのアセトニトリルを勢いよく注入すると、数十秒後にはコロイド水溶液−ヘキサン界面にＡｕＮＲ粒子膜が生成した。サンプル管の底のガラス基板をその平面が界面とほぼ平行になるように引き上げ、ＡｕＮＲ薄膜をガラス基板上に移し取った。その後、自然乾燥することにより、金ナノロッド薄膜が基板に固定化された薄膜チップを得た。また、比較サンプルとして、クエン酸還元による球状の金ナノ粒子（以下ＡｕＮＳと記すことがある）分散液を用いて、上記と同様の方法でＡｕＮＳ薄膜を作製した。図２に示す走査型電子顕微鏡像から、基板上に固定化されたＡｕＮＲは、単粒子膜を形成していることがわかった。
【実施例２】
【００２５】
ラマン散乱測定
実施例１で作製したＡｕＮＲおよびＡｕＮＳ薄膜のそれぞれに、測定物質（被分析試料）としてローダミン６Ｇ（以下、Ｒ６Ｇと記すことがある）のエタノール溶液（3.5×10−6M）を50μＬ滴下し、自然乾燥させた。また、参照用としてガラス基板のみに同量のＲ６Ｇをキャスト（付着）したサンプルも作製した。
以上の各サンプルについてラマン散乱分光測定を行なった。ラマン分光用の励起光源の波長は785nm、レーザー強度は30mWであり、この強度では金ナノロッド薄膜の熱的な溶解は起きなかった。Ｒ６Ｇは近赤外領域には吸収を持たないため、本測定条件ではＲ６Ｇの共鳴ラマン散乱はない。
【００２６】
図３にＲ６ＧをキャストしたＡｕＮＲ薄膜、ＡｕＮＳ薄膜、Ｒ６Ｇをキャストしたガラス基板、Ｒ６Ｇ粉末のラマン散乱スペクトルを示す。本発明に従いＲ６ＧをキャストしたＡｕＮＲ薄膜のスペクトル（図３の最上部に示す）は、Ｒ６Ｇ粉末のスペクトル（図３の最下部）とピークバンドが一致すること、そしてＲ６Ｇをキャストしたガラス基板ではガラス基板由来の散乱しか観測されなかったことから、ＡｕＮＲ薄膜を用いることにより、Ｒ６Ｇのラマン散乱が増強したことが確認された。一方、ＡｕＮＳ薄膜ではガラス基板由来の散乱しか観測されない。このように、ＡｕＮＲ薄膜の表面増強効果は、ＡｕＮＳ薄膜（非特許文献１に相当するもの）に比較して、少なくとも100倍の効果があることを確認できた。本発明に従いＡｕＮＲ薄膜を用いたＳＥＲＳの増強度はＡｕＮＲの表面効果のみを反映したものであり、その形状が重要であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
以上の記述から明らかなように、本発明に従い金ナノロッド薄膜を用いれば、産業のいろいろな分野における物質測定に利用できる高感度で簡便なＳＥＲＳに因るラマン散乱分光分析が実現される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明に従い、基板に金ナノロッド薄膜が固定化された試料用薄膜チップを作製する方法を模式的に示す。
【図２】本発明に従って作製された金ナノロッド薄膜の走査型電子顕微鏡像を示す。
【図３】本発明の特徴を示す一例として、Ｒ６Ｇをキャストした金ナノロッド薄膜、球状金粒子薄膜、ガラス基板およびＲ６Ｇ粉末のラマン散乱スペクトルを示す。
【符号の説明】
【００２９】
ｂ  基板
ｃ  金ナノロッド分散液
ｄ  第１の有機溶媒
ｅ  第２の有機溶媒
ｆ  金ナノロッド薄膜
【図１】
2005233637.tif 000003
【図２】
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【図３】
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