(57)【要約】【課題】滅菌後においても抗体の機能を維持できる細胞吸着材の照射滅菌方法および照射滅菌方法された細胞吸着材を提供すること。【解決手段】水不溶性担体の表面に細胞の表面抗原に対する抗体が共有結合された細胞吸着材の照射滅菌方法であって、該細胞吸着材を、アスコルビン酸塩を５ｍＭ〜２Ｍの濃度で含み、ｐＨが３．０〜１１、エンドトキシン濃度が０．５ＥＵ／ｍｌ以下、且つ浸透圧比が０．５〜１２である水性溶液で浸漬又は湿潤化し、放射線により照射滅菌することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水不溶性担体の表面に細胞の表面抗原に対する抗体が共有結合された細胞吸着材の照射滅菌方法であって、該細胞吸着材を、アスコルビン酸塩を５ｍＭ〜２Ｍの濃度で含み、ｐＨが３．０〜１１、エンドトキシン濃度が０．５ＥＵ／ｍｌ以下、且つ浸透圧比が０．５〜１２である水性溶液で浸漬又は湿潤化し、放射線により照射滅菌することを特徴とする細胞吸着材の照射滅菌方法。
【請求項２】
細胞吸着材が入口と出口を有する細胞吸着器に充填されている請求項１に記載の細胞吸着材の照射滅菌方法。
【請求項３】
抗体が血液中の白血球の表面抗原に対する抗体である請求項１又は２に記載の細胞吸着材の照射滅菌方法。
【請求項４】
抗体が細胞性免疫に関与する細胞の表面抗原に対する抗体である請求項１〜３の何れかに記載の細胞吸着材の照射滅菌方法。
【請求項５】
抗体がヘルパーＴ細胞の表面抗原に対する抗体である請求項１〜４の何れかに記載の細胞吸着材の照射滅菌方法。
【請求項６】
抗体が抗ヒトＣＤ４抗体である請求項１〜５の何れかに記載の細胞吸着材の照射滅菌方法。
【請求項７】
水不溶性担体の表面への共有結合が、抗体のＦｃ部分でなされている請求項１〜６の何れかに記載の細胞吸着材の照射滅菌方法。
【請求項８】
水性溶液の酸素濃度が、２０ｐｐｍ未満である請求項１〜７の何れかに記載の細胞吸着材の照射滅菌方法。
【請求項９】
照射滅菌時の細胞吸着材の温度が、−８０〜６０℃である請求項１〜８の何れかに記載の細胞吸着材の照射滅菌方法。
【請求項１０】
水性溶液に芳香族アルコール及び／またはパラベンを含有する請求項１〜９の何れかに記載の細胞吸着材の照射滅菌方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れかに記載の照射滅菌方法により滅菌された細胞吸着材。
【請求項１２】
請求項１〜１０の何れかに記載の照射滅菌方法により滅菌された細胞吸着材が充填された細胞吸着器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液中の細胞を特異的あるいは選択的に吸着除去する細胞吸着材の滅菌方法に関するものである。さらに詳しくは、放射線、ｐＨや熱等に対して不安定な抗体を担体に固定した細胞吸着材を滅菌する際に、抗体の機能を損なわずに安定して滅菌できる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多発性硬化症，重症筋無力症，ギランバレー症候群等の神経免疫疾患の治療法として血液中の特定の細胞を吸着除去する技術の研究が行われ始めており、その治療器として特異的細胞吸着器が開発されつつある。この特異的細胞吸着器には、特定の細胞に親和性を有する抗体を表面に固定した材料（細胞吸着材）が充填されており、様々な細胞親和性抗体を固定した材料が研究されている。
【０００３】
これらの抗体は、そのアミノ酸配列や三次元構造の違い等によって、目的細胞の表面分子を認識して結合するものであるが、細胞認識が極めて特異的あるいは選択的であるゆえ、抗体に僅かな構造変化が生じてもその機能が損なわれてしまうほど繊細なものである。このように、細胞親和性抗体は化学的には決して安定なものではないが、特異的細胞吸着器を医療機器として用いる以上は滅菌する必要があり、その際に、熱や放射線の作用で抗体が分解あるいは変性する等、滅菌安定性に問題があった。
【０００４】
抗体から高分子材料を含め、いわゆる医療材料の滅菌安定性を改善する試みはこれまで数多くなされており、有機化合物や無機化合物からなる酸化防止剤、単糖類、オリゴ糖、アミノ酸、グリコールなどのラジカル捕捉剤、親水性合成ポリマー、多糖類、アルブミンなどの高次構造安定化剤を共存させる方法等が知られている。
【０００５】
例えば、特許文献１では、放射線に対して不安定な蛋白質、ペプチド、アミノ酸等で構成される体液処理装置にピロ亜硫酸ナトリウム、Ｌ‐アスコルビン酸等の抗酸化剤を含浸させた状態で放射線滅菌することで体液処理装置の損傷を大幅に低減させることが開示されている。しかし、本発明のような抗体を固定した細胞吸着材に対してはピロ亜硫酸ナトリウムを含浸させた状態でも放射線滅菌後に抗体リガンドの機能を維持できなかった。また、Ｌ−アスコルビン酸においては、特許文献１に記載の条件だけでは抗体が照射滅菌により変性してしまい、安定して滅菌することができなかった。
また、特許文献２では、生物学的物質を滅菌する際に、ラジカルスカベンジャーとしてアスコルビン酸、グリシングリシン等を共存させて生物学的物質を滅菌する方法が開示されている。しかしながら特許文献２においてはＬ−アスコルビン酸を用いて細胞吸着器を照射滅菌する詳細な検討はなされておらず、特許文献２に記載の条件だけでは抗体が照射滅菌により変性してしまい、安定して滅菌することができなかった。
【０００６】
本発明の細胞と親和性を有する抗体を固定した細胞吸着材においては、抗体に比して結合する細胞がかなり大きいことから、抗体の微細な三次元構造が変化するだけで細胞の表面分子を認識する機能が失われてしまう。このように、不安定な医療材料を照射滅菌する技術は数多く知られているが、抗体を固定した細胞吸着器の様なより繊細で不安定な治療器の照射滅菌方法としては、未だ満足できる技術はなかった。
【０００７】
【特許文献１】特開平９−２２０２８１号公報
【特許文献２】米国ＵＳ２００３／００１２６８７Ａ１公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記の課題を解決するためのものであり、滅菌後においても抗体の機能を維持できる細胞吸着材の照射滅菌方法および照射滅菌方法された細胞吸着材を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記課題を解決するため、アスコルビン酸塩を用い、抗体のような繊細で不安定な物質を固定した細胞吸着材であっても、抗体を変性させず、安定して滅菌できるようにすることを目的に鋭意研究した結果、アスコルビン酸塩の濃度、ｐＨ、エンドトキシン濃度、浸透圧比がある特定の範囲にあるときのみ、抗体を変性させず、安定して照射滅菌できることを見出し、本発明を得るに至った。
即ち本発明は以下を含む。
（１）水不溶性担体の表面に細胞の表面抗原に対する抗体が共有結合された細胞吸着材の照射滅菌方法であって、該細胞吸着材を、アスコルビン酸塩を５ｍＭ〜２Ｍの濃度で含み、ｐＨが３．０〜１１、エンドトキシン濃度が０．５ＥＵ／ｍｌ以下、且つ浸透圧比が０．５〜１２である水性溶液で浸漬又は湿潤化し、放射線により照射滅菌することを特徴とする細胞吸着材の照射滅菌方法。
（２）細胞吸着材が入口と出口を有する細胞吸着器に充填されている上記（１）に記載の細胞吸着材の照射滅菌方法。
（３）抗体が血液中の白血球の表面抗原に対する抗体である上記（１）又は（２）に記載の細胞吸着材の照射滅菌方法。
（４）抗体が細胞性免疫に関与する細胞の表面抗原に対する抗体である上記（１）〜（３）の何れかに記載の細胞吸着材の照射滅菌方法。
（５）抗体がヘルパーＴ細胞の表面抗原に対する抗体である上記（１）〜（４）の何れかに記載の細胞吸着材の照射滅菌方法。
（６）抗体が抗ヒトＣＤ４抗体である上記（１）〜（５）の何れかに記載の細胞吸着材の照射滅菌方法。
（７）水不溶性担体の表面への共有結合が、抗体のＦｃ部分でなされている上記（１）〜（６）の何れかに記載の細胞吸着材の照射滅菌方法。
（８）水性溶液の酸素濃度が、２０ｐｐｍ未満である上記（１）〜（７）の何れかに記載の細胞吸着材の照射滅菌方法。
（９）照射滅菌時の細胞吸着材の温度が、−８０〜６０℃である上記（１）〜（８）の何れかに記載の細胞吸着材の照射滅菌方法。
（１０）水性溶液に芳香族アルコール及び／またはパラベンを含有する上記（１）〜（９）の何れかに記載の細胞吸着材の照射滅菌方法。
（１１）上記（１）〜（１０）の何れかに記載の照射滅菌方法により滅菌された細胞吸着材。
（１２）上記（１）〜（１０）の何れかに記載の照射滅菌方法により滅菌された細胞吸着材が充填された細胞吸着器。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のように、アスコルビン酸塩の濃度、ｐＨ、エンドトキシン濃度、浸透圧比をそれぞれ特定範囲に調整した水性溶液により、細胞吸着器に含まれる細胞吸着材を浸漬又は湿潤化して滅菌すると、細胞吸着剤に共有結合した抗体を変性させず安定して滅菌できる。その結果、滅菌後においても抗体の機能を維持し、優れた分離機能を有する細胞吸着器を提供することができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明について、以下具体的に説明する。
本発明でいう細胞吸着器とは、水不溶性担体の表面に細胞の表面抗原に対する抗体が共有結合された細胞吸着材が入口と出口を有する容器に充填されてなる。容器の入口から被処理液を導入し、細胞吸着材に接触させた後に出口から処理された液を回収することによって、目的細胞が吸着された処理後の液が得られる。また、本発明は、被処理液を容器内に導入し、細胞吸着材に接触させた後に細胞吸着材に吸着された目的細胞を分離回収して、処理液中から目的とする細胞のみを得る場合にも有効に用いられる。
【００１２】
本発明の被処理液は、吸着除去または回収を目的とする細胞を含んだ血液や骨髄液あるいは臍帯血のことであり、血液においては全血の他に、リンパ球浮遊液、単核球浮遊液、バフィーコート等の細胞分離処理を施した細胞浮遊液も含まれる。目的とする細胞とは、好ましくは白血球、リンパ球、顆粒球、単球、造血幹細胞等の血液細胞が挙げられ、免疫性疾患等の治療に用いられる場合には、細胞性免疫に関与する細胞、好ましくはヘルパーＴ細胞が挙げられる。
【００１３】
本発明でいう水不溶性担体とは、抗体を安定に固定できるものであれば特に限定なく様々なものを用いることができる。具体的には、多孔質体、平膜、不織布、織布、粒子等を例示できるが、細胞の選択的除去という観点から、多孔質体、不織布、粒子が好ましく、不織布が最も好ましい。
【００１４】
前記の水不溶性担体の材質は、抗体を安定に固定でき、かつ細胞と効率的に接触できる素材であれば特に限定はしない。様々な形状に加工でき、リガンドを直接または間接的に化学結合でき、且つ医療材料として安全に用いることができる固体であれば何れのものでもよい。例えば、ガラス・カオリナイト・ベントナイトなどの無機材料、セルロース・デキストラン・キチン・キトサン・デンプン・アガロース・コラーゲン・蛋白質・天然ゴムなどの天然ポリマー、ポリスチレン・ポリアミド・ポリエステル・ポリエチレン・ポリウレタン・ポリビニルアルコール・エチレンビニルアルコール共重合体・ポリメタクリル酸エステル・ポリ塩化ビニル・ポリアミノ酸などの合成ポリマー、活性炭等が挙げられ、次に述べる形状に適した素材を適宜選択すればよい。
【００１５】
水不溶性担体の形状としては、目的細胞との接触頻度を高めるために表面積が大きいものであれば何れの形状でもよく、例えば繊維状・綿状・布状・糸状・中空糸状・束状・不織布状等の繊維構造体、スポンジ等の高分子多孔質体、ビーズ状・ゲル状等の形状が挙げられる。特に、血液細胞を分離、或いは吸着する場合、吸着効率の点より、織布や不織布が好ましく用いられ、担体の構造制御がしやすいという点から不織布が最も好ましい。
【００１６】
ここで、不織布について具体的に示すと、不織布を構成する繊維の材質としては、セルロース、ポリエステル、ポリプロピレン等の繊維が強度や加工性、安全性の点から好ましく用いられる。不織布担体の構造は、例えば、これを構成する繊維の平均繊維直径を適宜選択することで制御することができ、例示すると、平均繊維直径が２．５μｍ以上５０μｍ未満の繊維からなる不織布を良好に用いることができる。平均繊維直径が２．５μｍ未満であると、不織布の目が細かくなる傾向があり、目的細胞以外の細胞を物理的に捕捉する非特異的細胞吸着が起こるため好ましくない。一方、５０μｍ以上の場合、目が粗くなる傾向があり、目的細胞との接触頻度が著しく低下して吸着効率が下がるので好ましくない。
【００１７】
また、本発明でいう表面とは細胞が接触する担体上の全ての領域を指す。例えば、担体が繊維状の場合は繊維の外周面のことであり、多孔質体の場合は多孔部を含む全表面のことをいう。
【００１８】
本発明でいう抗体とは、目的細胞と特異的あるいは選択的に結合する物質のことをいう。抗体の種類としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等のホール抗体あるいはこれら抗体の断片または抗体の断片を用いた組換え抗体が挙げられるが、前者は細胞親和性が優れている点で好ましく、後者は、体外循環の際に体内に混入することが万一生じても免疫原性が低い点で好ましい。さらに好ましくは、目的細胞への選択性がきわめて高いモノクローナル抗体あるいはその一部を用いた組み換え抗体である。
【００１９】
上記の抗体をその機能により例示すると、抗ＣＤ４，抗ＣＤ８，抗ＣＤ３，抗ＣＤ２，抗ＴＣＲ−Ｖβ，抗ＣＤ１ａ，抗ＣＤ１ｂ，抗ＣＤ５，抗ＣＤ３Ｒ、抗ＣＤ６，抗ＣＤ７，抗ＣＤ９，抗ＣＤ１０，抗ＣＤ１１ａ，抗ＣＤ１８，抗ＣＤ１９，抗ＣＤ２０，抗ＣＤ２１，抗ＣＤ２２，抗ＣＤ２３，抗ＣＤ２４，抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３７，抗ＣＤ４０，抗ＣＤ７２，抗ＣＤ７７，抗ＣＤ１６，抗ＣＤ３２，抗ＣＤ３３，抗ＣＤ３４，抗ＣＤ３５，抗ＣＤ４５ＲＯ、抗ＣＤ６４，抗ＣＤ６５，抗ＣＤｗ６５，抗ＣＤ６６ｂ，抗ＣＤ６６ｅ，抗ＣＤ８９，抗ＣＤｗ９０，抗ＣＤ５６，抗ＣＤ５７，抗ＣＤ９４，抗ＣＤ１０５，抗ＣＤ１０６，抗ＣＤ４６，抗ＣＤ３１，抗ＣＤｗ３６，抗ＣＤ４１，抗ＣＤ４２ａ、抗ＣＤ４２ｂ、抗ＣＤ６３，抗ＣＤ１１ａ，抗ＣＤ１１ｂ，抗ＣＤ１１ｃ，抗ＣＤ１８，抗ＣＤ２９，抗ＣＤ４４，抗ＣＤ４５，抗ＣＤ４８，抗ＣＤ４９ａ，抗ＣＤ４９ｂ，抗ＣＤ４９ｃ，抗ＣＤ４９ｄ，抗ＣＤ４９ｅ，抗ＣＤ４９ｆ，抗ＣＤ５０，抗ＣＤ５１，抗ＣＤ５４，抗ＣＤ５８，抗ＣＤ６１，抗ＣＤ６２Ｅ，抗ＣＤ６２Ｌ，抗ＣＤ６２Ｐ，抗ＣＤ１０３，抗ＣＤ２６，抗ＣＤ３０，抗ＣＤ６９，抗ＣＤ７０，抗ＣＤ７１，抗ＣＤ９５，抗ＣＤ９６、抗ＣＤ２５，抗ＣＤ１１７，抗ＣＤ１２２，抗ＣＤｗ１２４，抗ＣＤ１２６，抗ＣＤ１２７，抗ＩＬ−２Ｒ、抗ＣＤ６９、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＤ１５２、抗ＣＤ１７８、抗ＣＤ１８３、抗ＣＤ１８４、抗ＣＤ１９５、抗ＣＤｗ１９７、抗ＣＤ２２６等の抗体が挙げられるが、神経免疫疾患の治療に用いられる場合は、細胞性免疫に関与する細胞の表面抗原に対する抗体である抗ＣＤ２抗体，抗ＣＤ３抗体，抗ＣＤ４抗体が好ましく用いられる。中でも細胞性免疫の中枢機能を有するヘルパーＴ細胞の表面抗原に対する抗ＣＤ４抗体が最も好ましく用いられる。
【００２０】
本発明の細胞吸着材は、前に例示した抗体の何れかを担体に固定したものであるが、一度に除去したい細胞が複数種類ある場合は、その種類に応じて複数種類の抗体を固定しても良い。
【００２１】
抗体の固定状態としては抗体が担体表面に直接結合していてもよいし、活性基を介して結合していてもよい。抗体の固定部位としては、固定後も抗体が細胞親和性を維持できる状態であればどのような部位であってもよいが、より安定した細胞親和力を維持する点から抗体のＦｃ部分であることが好ましい。
【００２２】
また、抗体の固定は抗体流出を抑制する点から共有結合が用いられる。固定時の結合方法は、抗体の活性を維持できる方法であれば公知のいずれの反応でも用いることができ、例えば、置換反応、縮合反応、開環反応等を用いて良好に実施できる。
【００２３】
本発明における細胞吸着材の抗体固定量は、吸着する細胞の数や抗体の特異性、親和力によって異なるが、細胞との接触効率の点から、担体の単位表面積当り０．７ｍｇ／ｍ２以上固定されていることが好ましい。また、ある一定量以上の抗体が固定されると抗体に吸着した細胞同士の距離が近すぎ、抗体が有効に使用されない可能性がある為、０．７〜５．０ｍｇ／ｍ２が好ましく、最も好ましくは０．７〜３．０ｍｇ／ｍ２の時に抗体が効率的に使用される。
【００２４】
本発明で用いる担体表面に抗体を固定するための活性基は、抗体と担体とを共有結合できる構造であれば公知のいずれの官能基であっても良い。例えば、Ｎ−ヒドロキシメチルハロアセトアミド、Ｎ−ヒドロキシメチルジハロアセトアミド等を用いて担体表面を活性化したα−アセトアミノハロゲン基、Ｎ−ヒドロキシメチルジハロプロピオンアミド等を用いて担体表面を活性化したα，β−プロピオンアミノハロゲン基、Ｎ−ヒドロキシメチルジハロアセトアミド等を用いて担体表面を活性化したα，α−アセトアミノジハロゲン基、Ｎ−ヒドロキシメチルトリハロアセトアミド等を用いて担体表面を活性化したα，α，α−アセトアミノトリハロゲン基等のハロアセトアミノアルカン化剤を用いた活性基、エピクロロヒドリン等を用いて担体を活性化したエポキシ基等が挙げられる。他に、イソシアネート基、イソチオシアネート基、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、ビニル基、ブロモシアンによる活性基等も挙げられるがこれらに限定されるものではない。本発明においては、抗体の機能を維持したまま穏和な条件で反応できる点より、ハロアセトアミノアルカン化剤を用いた活性基が良好に用いられる。
【００２５】
また、前記活性基の担体当りの導入量は、抗体固定量に影響する為、０．６ｎｍｏｌ／ｍ２以上が好ましいが、ある一定以上の導入量になると抗体固定時に抗体密度が増加して有効利用されないため０．６〜３０ｎｍｏｌ／ｍ２が好ましく、０．６〜１０ｎｍｏｌ／ｍ２の時に最も安定した抗体固定が可能となる。
【００２６】
このような細胞吸着材は、被処理液の入口と処理された液の出口とを有する容器に公知の方法によって充填した後、照射滅菌後も抗体の機能を維持する為に滅菌保護液で浸漬又は湿潤化する方法が用いられる。
【００２７】
ここでいう滅菌保護液とは、アスコルビン酸塩を５ｍＭ〜２Ｍの濃度で含み、ｐＨが３．０〜１１であり、エンドトキシン濃度が０．５ＥＵ／ｍＬ以下、且つ浸透圧比が０．５〜１２である水性溶液をいい、抗体のような繊細で不安定な物質を照射滅菌する際には前記条件をいずれか一つでも満足しない場合は、細胞吸着材の細胞吸着性能が著しく低下する。
【００２８】
溶解度の理由から、アスコルビン酸塩の最適濃度は５ｍＭ〜２Ｍである必要があり、５ｍＭ未満の場合、担体表面に共有結合された抗体の近傍に存在するアスコルビン酸塩濃度が低い為、照射滅菌後に抗体の機能を維持できない。また、２Mを超えるとアスコルビン酸塩の溶解度の上限を超えてしまう為に使用できない。さらに安全性の点から５ｍＭ〜２０ｍＭが好ましく、医療機器として用いられる際はプライミング時の置換性の点から５ｍM〜１０ｍMが最も好ましく用いられる。
【００２９】
また、抗体のコンフォメーションを維持するために水性溶液のｐＨは３．０〜１１の範囲である必要があり、抗体に対してより穏和な条件としては４．５〜９．０が好ましく、さらに抗体が安定する５．６〜７．４の範囲が最も好ましい。
【００３０】
さらに、抗体、細胞へのダメージひいては細胞の吸着性能の観点から、また本発明の細胞吸着器を医療機器として用いる際には、安全性の面から、滅菌保護液中のエンドトキシン濃度は０．５ＥＵ／ｍｌ以下であることが必要である。より安全性を高める点で、好ましくは０．２５ＥＵ／ｍｌ以下さらには０．１ＥＵ／ｍｌ以下が最もこのましく用いられる。
【００３１】
さらに、同様の観点から水性溶液の浸透圧比は０．５〜１２であることが必要であり、細胞、抗体の変性を低減するには１．０〜１０が好ましく、体液と接触する医療機器等に用いられる場合、１．０〜５．０の時に最も好ましく用いられる。ここでいう浸透圧比とは、浸透圧計（ＯＳＡ-２１日機装株式会社製）を用いて測定した、生理食塩液の浸透圧に対する滅菌保護液の浸透圧の比のことをいう。例えば、電解質塩やその他水溶性成分を用いて適宜調整することができる。
【００３２】
本発明でいうアスコルビン酸塩とは、アスコルビン酸でもよいし、アスコルビン酸とアルカリ性物質等の反応により生成するアスコルビン酸塩でもよい。アスコルビン酸塩は、抗体が担体表面に共有結合された細胞吸着材を照射滅菌する際に抗体を安定に保持するものである。その作用機構は推定ではあるが、滅菌時に発生するラジカルを、アスコルビン酸塩がラジカルスカベンジャーとなってトラップし、抗体の酸化、変性、切断等の影響を防ぐものと思われる。しかしながら、アスコルビン酸塩であっても前記したように、担体表面に共有結合された抗体を変性させず、高い細胞吸着性能を発揮させ、高い吸着選択性を維持するためには、アスコルビン酸塩の濃度、ｐＨ、エンドトキシン濃度、浸透圧比を上記範囲内にする必要性があることを本発明者らは見出したのである。
【００３３】
また、アスコルビン酸は中性下では酸素による酸化が促進され、容易に分解する。このような理由から、水性溶液中の酸素濃度は低い方が好ましく、より好ましくは一般的な水道水に含まれる酸素濃度である２０ｐｐｍよりも低い水性溶液を用いることが好ましい。
このような低酸素濃度の水性溶液は、例えば、減圧脱気する或いは亜硫酸塩を添加する等の公知の方法により調整すればよい。
【００３４】
さらに、アスコルビン酸塩と同様にラジカルスカベンジャー機能を有する芳香族アルコールやパラベンのような補助剤が滅菌保護液に含まれている時に、より高い滅菌保護効果が得られる。
【００３５】
前記水性溶液とは水と溶け合う溶液のことをいい、例えば、エタノール等のアルコールを用いることもできるが、抗体を変性させない観点から水系の溶液が最も好ましく用いられる。また、医療機器として用いられる場合には、使用前に生理食塩液にて置換され易い溶液であることが望ましい。例えば、蒸留水、リンゲル液等の輸液、生理食塩液やリン酸緩衝液等の水溶液が用いられるが、細胞への影響が少ないという観点から、生理食塩液あるいはリン酸緩衝液が好ましく、ｐＨの安定性からリン酸緩衝液が最も好ましい。
【００３６】
本発明の照射滅菌は、細胞吸着材を滅菌保護液で浸漬又は湿潤化して行う。そのためには、滅菌保護液を細胞吸着材に通液した後、滅菌保護液をそのまま細胞吸着器に封入してもよいし、細胞吸着器の入口もしくは出口から液が垂れない程度にエアー等でフラッシュして「湿潤状態」または「ハーフウェット状態」としても良い。
【００３７】
本発明でいう照射滅菌とは、粒子線や電磁波等の放射線による滅菌のことをいう。例えば、コバルト６０等を線源とした１０〜５０ｋＧｙのγ線による照射滅菌をいう。医療機器の滅菌としては滅菌効率等製造上の理由、ならびに、抗体安定性の理由から、より低い温度で滅菌可能であるＸ線やγ線等の放射線滅菌がより好ましく用いられ、γ線照射滅菌が最も好ましい。
【００３８】
本発明における照射滅菌時の細胞吸着器の温度は、抗体やアスコルビン酸塩が変性されにくい−８０〜６０℃の範囲が好ましく、より抗体が安定する−８０〜１０℃の範囲が好ましいが、滅菌時の温度制御の理由から、−１０〜１０℃が最も好ましい。
【００３９】
以上の方法によって処理された細胞吸着器は、照射滅菌によって抗体の機能が損なわれることがないので、体外循環や、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）等の造血因子を投与した末梢血等についても良好に用いる事が出来る。勿論、必要に応じて抗凝固剤や血液保存液等を加えても何らその機能が損なわれることなく、良好に用いることができる。
【００４０】
本発明を実施例に基づいて説明する。
【実施例１】
【００４１】
〔活性化不織布の作成〕
ガラス製のフラスコにＮ‐ヒドロキシメチルヨードアセトアミド０．６ｇ、濃硫酸５．７ｍｌ及びニトロベンゼン７．２ｍｌを加えて常温にて撹拌溶解し、更にパラホルムアルデヒド０．０３６ｇを加え、撹拌した．これにポリプロピレンからなる不織布（平均繊維直径３．５μｍ）０．３ｇを入れ常温にて２４時間遮光反応した。２４時間反応後不織布を取り出し，エタノール及び純水にて洗浄し、これを真空乾燥して活性化不織布を得た。
この活性化不織布を直径０．６８ｃｍの円に切断したもの４枚を、カルシウム、マグネシウムを含まないリン酸緩衝液（以下ＰＢＳ（−））に溶解した抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体液（以下抗ヒトＣＤ４液）４００μＬ（１６μｇ／４００μＬ）に常温で２．５時間浸し、モノクローナル抗体（以下抗体）を固定後、ＰＢＳ（−）２ｍｌで洗浄した．次に０．２％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート／ＰＢＳ（−）溶液（以下Ｔｗｅｅｎ２０溶液）を加え常温で２．５時間浸漬した後、ＰＢＳ（−）２ｍｌで洗浄し、目的の細胞吸着材を得た。
入口と出口を有する容量１ｍｌの容器に上記細胞吸着材４枚と、滅菌保護液としてエンドトキシン濃度０．０２０ＥＵ／ｍＬ、ｐＨ＝７．０、浸透圧比１．０である１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液（分子量１７６）を充填し細胞吸着器を作成した。この細胞吸着器に２５ｋＧｙのγ線を照射して滅菌した。
〔細胞吸着性の評価〕
【００４２】
ＡＣＤ−Ａ添加ヒト新鮮血液４．０ｍｌ（血液：ＡＣＤ−Ａ＝８：１）をシリンジポンプにて細胞吸着器の入口より流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで送液し、カラム出口より処理後の血液を回収した。
このときのＣＤ４（＋）細胞の吸着率を、フローサイトメーター（ＣＯＵＬＴＥＲ  ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ  ＥＳＰ  ＡＳＳＹＮＯ．６６０５６０７８）を用いてフローサイトメトリー法で測定したところＣＤ４（＋）細胞の吸着率は９４％であった。またこのときＣＤ８（＋）細胞の吸着率は２３％、Ｂリンパ球の吸着率は２４％、血小板の吸着率は１６％であり、ＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できた。
【比較例１】
【００４３】
充填液として１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用いる代わりに、２．５ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用い、浸透圧比を０．９とした以外は実施例１と同一条件に揃えて同様の実験を行なった。
このときのＣＤ４（＋）細胞の吸着率は４０％であった。またこのときＣＤ８（＋）細胞の吸着率は１４％、Ｂリンパ球の吸着率は１７％、血小板の吸着率は０．５％であり、ＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できなかった。
【実施例２】
【００４４】
充填液として１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用いる代わりに、１．４２Ｍアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用い、浸透圧比を８．２とした以外は実施例１と同一条件に揃えて同様の実験を行なった。
このときのＣＤ４（＋）細胞の吸着率は９０％であった。またこのときＣＤ８（＋）細胞の吸着率は１１％、Ｂリンパ球の吸着率は３８％、血小板の吸着率は２１％であり、ＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できた。
【比較例２】
【００４５】
充填液として１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用いる代わりに、５．０Ｍアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用い、浸透圧比を２９とした以外は実施例１と同一条件に揃えて同様の実験を行なった。
このときのＣＤ４（＋）細胞の吸着率は４１％であった。またこのときＣＤ８（＋）細胞の吸着率は２０％、Ｂリンパ球の吸着率は１７％、血小板の吸着率は５．０％であり、ＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できなかった。
【実施例３】
【００４６】
充填液としてｐＨ＝７．０である１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用いる代わりに、ｐＨ＝４．６の１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用い、浸透圧比を１．１とした以外は実施例１と同一条件に揃えて同様の実験を行なった。
このときのＣＤ４（＋）細胞の吸着率は８９％であった。またこのときＣＤ８（＋）細胞の吸着率は２９％、Ｂリンパ球の吸着率は３６％、血小板の吸着率は８．０％であり、ＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できた。
【比較例３】
【００４７】
充填液としてｐＨ＝７．０である１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用いる代わりに、ｐＨ＝２．０である１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用い、浸透圧比を１．２とした以外は実施例１と同一条件に揃えて同様の実験を行った。
このときのＣＤ４（＋）細胞の吸着率は７．９％であった。またこのときＣＤ８（＋）細胞の吸着率は９．０％、Ｂリンパ球の吸着率は４０％、血小板の吸着率は０．１％であり、ＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できなかった。
【実施例４】
【００４８】
充填液としてｐＨ＝７．０である１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用いる代わりに、ｐＨ＝９．０の１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用い、浸透圧比を１．１とした以外は実施例１と同一条件に揃えて同様の実験を行った。
このときのＣＤ４（＋）細胞の吸着率は９１％であった。またこのときＣＤ８（＋）細胞の吸着率は２３％、Ｂリンパ球の吸着率は２９％、血小板の吸着率は８．０％であり、ＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できた。
【比較例４】
【００４９】
充填液としてｐＨ＝７．０である１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用いる代わりに、ｐＨ＝１２である１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用い、浸透圧比を１．３とした以外は実施例１と同一条件に揃えて同様の実験を行った。
このときのＣＤ４（＋）細胞の吸着率は１２％であった。またこのときＣＤ８（＋）細胞の吸着率は９．０％、Ｂリンパ球の吸着率は３７％、血小板の吸着率は５．０％であり、ＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できなかった。
【比較例５】
【００５０】
充填液としてエンドトキシン濃度が０．０２０ＥＵ／ｍｌである１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用いる代わりに、エンドトキシン濃度が１．０ＥＵ／ｍＬである１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用い、浸透圧比を１．１とした以外は実施例１と同一条件に揃えて同様の実験を行なった。
このときのＣＤ４（＋）細胞の吸着率は２３％であった。またこのときＣＤ８（＋）細胞の吸着率は２５％、Ｂリンパ球の吸着率は３４％、血小板の吸着率は５７％であり、ＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できなかった。
【比較例６】
【００５１】
充填液として浸透圧比１．０である１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用いる代わりに浸透圧比が０．１である１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用いた以外ｐＨ、エンドトキシン濃度は実施例１と同一条件で同様の実験を行った。
このときのＣＤ４（＋）細胞の吸着率は１５％であった。またこのときＣＤ８（＋）細胞の吸着率は２０％、Ｂリンパ球の吸着率は３５％、血小板の吸着率は０．０％であり、ＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できなかった。
【実施例５】
【００５２】
充填液として浸透圧比１．０である１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用いる代わりに浸透圧比１２である１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用いた以外はｐＨ、エンドトキシン濃度は実施例１と同一条件で同様の実験を行った。
このときのＣＤ４（＋）細胞の吸着率は９４％であった。またこのときＣＤ８（＋）細胞の吸着率は１０％、Ｂリンパ球の吸着率は２２％、血小板の吸着率は２０％であり、ＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できた。
【比較例７】
【００５３】
充填液として浸透圧比１．０である１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用いる代わりに浸透圧比が２０である１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用いた以外はｐＨ、エンドトキシン濃度は実施例１と同一条件で同様の実験を行った。
このときのＣＤ４（＋）細胞の吸着率は３０％であった。またこのときＣＤ８（＋）細
【００５４】
以上の実施例１〜５と比較例１〜７の結果を表１にまとめた。
【表１】
2005323652.tif 000002
【００５５】
表１から次のことが明らかである。
実施例１、２と比較例１，２との比較から、滅菌保護液のアスコルビン酸濃度が５ｍＭ〜２Ｍの範囲内であればＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できるのに対して、その範囲外であるときはＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できないことが分かる。
また、実施例１〜５と比較例３、４の対比から、滅菌保護液のｐＨが３〜１１の範囲内であれば、ＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できるのに対して、その範囲外であるときはＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できない。
さらに、実施例１〜５と比較例５との対比から、滅菌保護液のエンドトキシン濃度が０．５ＥＵ／ｍｌ以下であれば、ＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できるのに対して、それ以上であるときはＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できない。
さらにまた、実施例１〜５と比較例２、７との対比から、滅菌保護液の浸透圧比が０．５〜１２であればＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できるのに対して、その範囲外であるときはＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できない。
【比較例８】
【００５６】
充填液として１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用いる代わりに７．５ｍMピロ亜硫酸ナトリウムを用いた以外はｐＨ、エンドトキシン濃度は実施例１と同一条件で同様の実験を行った。
このときのＣＤ４（＋）細胞の吸着率は３．６％であった。またこのときＣＤ８（＋）細胞の吸着率は８．０％、Ｂリンパ球の吸着率は２３％、血小板の吸着率は１９％であり、ＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できなかった。
【００５７】
この結果を実施例１の結果とともに表２に示す。
【表２】
2005323652.tif 000003
【００５８】
以上の結果から、細胞吸着材を、アスコルビン酸塩を５ｍＭ〜２Ｍの濃度で含み、ｐＨが３．０〜１１、エンドトキシン濃度が０．５ＥＵ／ｍｌ以下、且つ浸透圧比が０．５〜１２である水性溶液で保護して照射滅菌する場合には、その表面に結合したＣＤ４抗体の機能がよく保持されていることが分かる。
【実施例６】
【００５９】
抗体として抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体液（以下抗ヒトＣＤ４液）を用いる代わりに、抗ヒトＣＤ１４抗体液を用いた以外は実施例１と同一条件に揃えて同様の実験を行なった。
このときのＣＤ１４（＋）細胞の吸着率は８３．４％であった。またこのとき顆粒球の吸着率は７．２％、血小板の吸着率は０．０％でありＣＤ１４（＋）細胞を特異的に吸着できた。
【比較例９】
【００６０】
抗体として抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体液（以下抗ヒトＣＤ４液）を用いる代わりに、抗ヒトＣＤ１４抗体液を用いたことと、充填液として１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用いる代わりにＰＢＳ（−）溶液を用いた以外は実施例１と同一条件に揃えて同様の実験を行なった。
このときのＣＤ１４（＋）細胞の吸着率は１０．８％であった。またこのとき顆粒球の吸着率は１．７％、血小板の吸着率は４３．３％でありＣＤ１４（＋）細胞を特異的に吸着できなかった。
【実施例７】
【００６１】
抗体として抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体液（以下抗ヒトＣＤ４液）を用いる代わりに、抗ヒトＣＤ２５抗体液を用いた以外は実施例１と同一条件に揃えて同様の実験を行なった。
ことのときのＣＤ２５(+)細胞の吸着率は８５．０％であった。またこのとき顆粒球の吸着率は５．８％、血小板の吸着率は５．７％でありＣＤ２５（＋）細胞を特異的に吸着できた。
【比較例１０】
【００６２】
抗体として抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体液（以下抗ヒトＣＤ４液）を用いる代わりに、抗ヒトＣＤ２５抗体液を用いたことと、充填液として１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用いる代わりにＰＢＳ（−）溶液を用いた以外は実施例１と同一条件に揃えて同様の実験を行なった。
ことのときのＣＤ２５(+)細胞の吸着率は２１．８％であった。またこのとき顆粒球の吸着率は４．６％、血小板の吸着率は０．５％でありＣＤ２５（＋）細胞を特異的に吸着できなかった。
【００６３】
実施例６〜７と比較例９〜１０の結果を表３にまとめた。
【表３】
2005323652.tif 000004
【実施例８】
【００６４】
充填液として１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液を用いる代わりに１０ｍＭアスコルビン酸ＰＢＳ（−）溶液にベンジルアルコールを１ｍＭ含む溶液を用いた以外は実施例１と同一条件に揃えて同様の実験を行なった。  
このときのＣＤ４（＋）細胞吸着率は、９９．０％であった。またこのときＣＤ８（＋）細胞の吸着率は３０％、Ｂリンパ球の吸着率は３０％、血小板の吸着率は２３％であり、ＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着できた。
【００６５】
【表４】
2005323652.tif 000005
【産業上の利用の可能性】
【００６６】
本発明によれば、細胞吸着材に共有結合した不安定な抗体の機能を損なわずに滅菌できるため、滅菌後も優れた細胞分離性能を発揮する細胞吸着器の提供が可能となる。このように、化学的に不安定な医療材料の滅菌方法としての有用性を有している。