(57)【要約】【課題】抗癌剤として使用可能な優れた免疫賦活物質を得る。【解決手段】抗癌性物質のスクリーニング方法であって、ＭＩＳＴ分子とＦｇｒ分子との会合状態を阻害する会合阻害物質を選択する。ここで前記選択は、ＭＩＳＴ分子のＣ末端側プロリンリッチ領域におけるＦｇｒ分子の会合を阻害する物質を選択するもの又は、Ｆｇｒ分子のＳＨ３ドメインにおけるＭＩＳＴ分子の会合を阻害する物質を選択するものであってもよい。また、前記会合阻害物質が、ＭＩＳＴ分子のＣ末端側プロリンリッチ領域に結合するアミノ酸であることが好ましい。また選択が、細胞内カルシウム濃度の上昇に基づいて行われることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌性物質のスクリーニング方法であって、
ＭＩＳＴ分子とＦｇｒ分子との会合状態を阻害する会合阻害物質を選択すること
を特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２】
前記選択が、ＭＩＳＴ分子のＣ末端側プロリンリッチ領域におけるＦｇｒ分子の会合を阻害する物質を選択するものであることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記選択が、Ｆｇｒ分子のＳＨ３ドメインにおけるＭＩＳＴ分子の会合を阻害する物質を選択するものであることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記会合阻害物質が、ＭＩＳＴ分子のＣ末端側プロリンリッチ領域に結合するアミノ酸であることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記選択が、細胞活性化に基づく指標物質の測定を含むことを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記指標物質が、細胞内カルシウム又はインターフェロンγであることを特徴とする請求項５記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤のスクリーニング方法に関し、特に、免疫賦活効果のある抗癌剤をスクリーニングするスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の抗癌剤の多くは、抗癌活性を有するものの免疫抑制や造血障害などの強い副作用を持ち、これに対して、抗癌治療に併用される免疫賦活剤は、副作用が少ないが効果が弱いという問題点があった。このため、強い抗癌活性を有すると共に副作用が少ない有効な抗癌剤に対する社会的な要請は依然として強い。このような抗癌剤の開発を行うにあたり、抗癌剤についてはその癌細胞選択性の問題があり、免疫賦活薬剤についてはその作用機序の解明が急がれているのが現状である。中でも特に、副作用の問題が少なく、自己治癒能力を回復させる免疫賦活薬剤の開発が急務となっている。
一方、細胞の表面ないしは内部に存在する種々のシグナル伝達分子によって、様々な細胞活性が生じることが知られている。特に、複雑な免疫反応の作用機序の解明から免疫反応に関与するいくつかの特異的な分子が同定された。
そのような分子としては、Ｂ細胞系列に特異的に発現するアダプター分子、ＢＡＳＨが挙げられる（非特許文献１）。このＢＡＳＨは、Ｔ細胞で発現するＳＬＰ−７６（非特許文献２）と分子構造的に類似しており、その構造及び機能解析を通じて、血球系列・免疫レセプターに特異的なシグナル伝達分子ファミリーが存在することを示している。
また、Ｉ型アレルギー反応に関する分子機構の解明から、高親和性ＩｇＥレセプターを介したマスト細胞の脱顆粒に関与するシグナル伝達機構が明らかにされつつあり、その中で、ＭＩＳＴ分子が同定された（特許文献１）。
【非特許文献１】J. Immunol., (1998) 161:5804-5808
【非特許文献２】J. Biol. Chem., (1995) 270:7029-7032
【特許文献１】特開２００１−７８７８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このように分子レベルの研究が進んでいるにもかかわらず、抗癌剤として使用可能なシグナル伝達関連分子の特定は充分でなく、免疫賦活薬剤の開発に結びつくような有効な分子は特定されていない。
従って、本発明は、抗癌剤として使用可能な優れた免疫賦活物質を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明のスクリーニング方法は、抗癌性物質のスクリーニング方法であって、ＭＩＳＴ分子とＦｇｒ分子との会合状態を阻害する会合阻害物質を選択することを特徴としている。
ここで前記選択は、ＭＩＳＴ分子のＣ末端側プロリンリッチ領域におけるＦｇｒ分子の会合を阻害する物質を選択するもの又は、Ｆｇｒ分子のＳＨ３ドメインにおけるＭＩＳＴ分子の会合を阻害する物質を選択するものであることが好ましい。また、前記会合阻害物質が、ＭＩＳＴ分子のＣ末端側プロリンリッチ領域に結合するアミノ酸であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、ＭＩＳＴ分子とＦｇｒ分子との会合を阻害する会合阻害物質が選択されるので、抗癌剤として使用可能な優れた免疫賦活物質を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明のスクリーニング方法は、ＭＩＳＴ分子とＦｇｒ分子との会合状態を阻害する会合阻害物質を選択することを特徴としている。
ＭＩＳＴ分子は、マスト細胞のみならず、ＩＬ−２刺激ＮＫ細胞にも高発現することが知られている。このようなＭＩＳＴ分子が、Ｆｇｒ分子との会合することによってＮＫ（ナチュラルキラー）細胞の機能、特に細胞傷害機能及びＩＦＮ−γ産生機能を抑制的に制御していることが、本発明によって見出された。このことは、ＮＫ細胞におけるＭＩＳＴ分子とＦｇｒ分子との会合状態を阻害すればＭＩＳＴ分子の機能を阻害することになって、ＮＫ細胞の免疫賦活的な抗腫瘍活性を高めることができることを意味する。従って、ＭＩＳＴ分子とＦｇｒ分子との会合状態を阻害する物質を選択することによって、優れた免疫賦活物質を得ることができる。
【０００７】
ＭＩＳＴ（mast cell immunoreceptor signal transducer）分子は、Ｎ末端にリン酸化されるチロシン残基、中央部にプロリンに富む領域（プロリンリッチ領域）、Ｃ末端にＳＨ２ドメインを保有し、キナーゼ活性や酵素活性を持たない典型的なアダプター分子であることが知られており、マウスのＭＩＳＴ及びヒトのＭＩＳＴの配列は既に特定されている（マウスについて配列番号１及び２、ヒトについて配列番号３及び４）。
Ｆｇｒ分子は、血液細胞に発現するＳｒｃ型チロシンキナーゼであり、Ｎ末からＳＨ２ドメイン、ＳＨ３ドメイン、そしてＣ末にチロシンキナーゼドメインを持つ(DDBJ/GenBank/EMBL accession number; P14243)。
【０００８】
本発明における「会合」とは、ＭＩＳＴ分子の機能発現のためのシグナリングがＭＩＳＴ分子に生じるように、ＭＩＳＴ分子に対して他の分子が接触又は結合することを意味する。このため、不可逆的な化学結合及び物理的な結合のみならず、ｐＨ、温度などの条件下で結合・離脱可能な結合も含む。
また「会合状態を阻害する」とは、ＭＩＳＴ分子とＦｇｒ分子との会合を他の物質を介在させて遮断することのみならず、少なくともいずれか一方の一部を欠落又は破壊すること及び、少なくともいずれか一方の全体の発現を阻止してこれらの分子の会合が生じないようにすることも含まれる。
従って、ＭＩＳＴ分子及びＦｇｒ分子の会合状態の阻害は、それぞれの分子のタンパク質レベルでのものであってもよく、遺伝子レベルであってもよい。
【０００９】
本発明のスクリーニング方法は、ＭＩＳＴ分子のＣ末端側プロリンリッチ領域におけるＦｇｒ分子の会合を阻害する物質を選択するものであってもよい。このような選択では、ＭＩＳＴ分子のＣ末端側プロリンリッチ領域に対して特異的に結合可能な分子、例えばこの領域の塩基配列又はアミノ酸配列に対して相補的な配列を有するＤＮＡ断片やアミノ酸、低分子を選択することができる。同様にＦｇｒ分子のＳＨ３ドメインにおけるＭＩＳＴ分子の会合を阻害する物質を選択するものであってもよく、いずれの性質を有するものであってもよい。ＭＩＳＴ分子のＣ末端側プロリンリッチ領域とＦｇｒ分子のＳＨ３領域とは、ＭＩＳＴ分子の機能発現に必要な領域であることから、これらの少なくともいずれかに対して、分子の会合状態の阻害を指標とすることにより、抗癌性物質を効果的にスクリーニングすることができる。
【００１０】
スクリーニングは、既知のスクリーニング手法に基づいて行うことができる。このようなスクリーニング方法としては、１．表面プラズモンセンサーを利用した方法、２．酵母ツー・ハイブリッド（two-hybrid）法を利用した方法、３．細胞活性化に基づく指標物質を測定する方法が挙げられる。
【００１１】
例えば、表面プラズモンセンサーを利用する場合には、センサーチップ上にＭＩＳＴタンパク質を固定し、次にアナライトとしてＦｇｒタンパク質を注入することにより、ＭＩＳＴとＦｇｒ複合体をあらかじめ形成させ、そこに各種候補物質を注入して、センサーチップ上のＭＩＳＴ−Ｆｇｒ複合体の解離反応を測定することができる。
【００１２】
酵母のツー・ハイブリッド法を利用する場合には、Ｇａｌ４転写因子の転写活性化ドメインとＭＩＳＴの融合タンパク質ならびにＤＮＡ結合ドメインとＦｇｒの融合タンパク質を酵母内で発現させることにより、ＭＩＳＴとＦｇｒの会合・解離をＧａｌ４転写因子の標的となるレポーター遺伝子の活性化、例えば栄養要求性やLacZによる発色によって評価できる。この系に特定物質を添加してＧａｌ４転写因子の活性化の阻害を指標にＭＩＳＴとＦｇｒの結合阻害物質をスクリーニングできる。また、転写因子をＧａｌ４からＶＰ−１６に、レポーター遺伝子をＥＧＦＰ遺伝子に代えることにより、酵母以外にも、哺乳類細胞を用いたツー・ハイブリッド法で会合阻害物質を探索することも可能である。
【００１３】
受容体刺激による細胞活性化に基づいた指標物質の測定方法としては、細胞内カルシウム濃度やＩＦＮ−γ濃度の測定などが挙げられる。細胞内カルシウム濃度やＩＦＮ−γの測定などの細胞活性化の測定は、ＭＩＳＴ分子及びＦｇｒ分子のいずれかを発現している細胞と、両者を発現している細胞とに対して特定物質を添加し、常法に従って、受容体刺激による細胞活性化を測定することにより行うことができる。このとき、ＭＩＳＴ分子あるいはＦｇｒ分子を単独で発現している細胞では効果がなく、両者を発現している細胞では細胞内カルシウム濃度の上昇やＩＦＮ−γの産生量が変化する場合、分子間の会合が阻害されたことになるため、このような作用を有する物質を会合阻害物質として認定することができる。
ＭＩＳＴ分子あるいはＦｇｒ分子を単独で発現している細胞としてはＭＩＳＴ欠損マウス由来のＮＫ細胞、ＭＩＳＴ分子及びＦｇｒ分子を発現する細胞としては野生型マウスＮＫ細胞などを挙げることができる。また細胞内カルシウム濃度の測定やＩＦＮ−γの測定は、カルシウム蛍光指示薬や抗ＩＦＮ−γ抗体の使用を含むこの業界で周知の方法をそのまま用いることができる
【００１４】
これらのスクリーニング方法は、単独で行ってもよいが、これらを適宜組み合わせて行うことが好ましい。この場合には、上記スクリーニング方法の組み合わせ順序について特別制限はないが、細胞活性化に基づく指標物質の測定を含むスクリーニング方法を最後に用いることが、ＭＩＳＴとＦｇｒの会合阻害と細胞機能の変化に基づいて直接的に選別を行うことができるため、好ましい。
【００１５】
本発明のスクリーニング方法によって得られた会合阻害物質は、抗癌剤としての機能を有するものであることが期待できるので、スクリーニングにより得られた物質を、そのまま或いは既知の賦形剤などと併せて、抗癌剤を生成することができる。
またＭＩＳＴ分子とＦｇｒ分子との会合状態を分子モデル上で解析し、この会合状態を阻害する分子を設計することによって抗癌作用を有する物質を得ることもできる。或いは、本発明を利用して、既知の抗癌剤の活性評価を行うこともできる。
【実施例】
【００１６】
［実施例１］
ＭＩＳＴ欠損マウスの作製
マウスＭＩＳＴ遺伝子の２番目エクソン（翻訳開始コドンを含む）を含むフラグメントを、Ｅ１４ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲにより得た。
最終ベクターの相同領域は、ＭＩＳＴ翻訳開始コドンの直前（上流側）の５．７５ｋｂゲノムフラグメントと、２番目エクソンの直後（下流側）の０．８５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩイントロンＤＮＡフラグメントとで構成されていた。２番目イントロンの５’部分と最初の６アミノ酸をコードする５０ｂｐの２番目エクソンとをＥＦＧＰ−ネオマイシン耐性遺伝子カセットにより置換した。本カセットは、エンハンストグリーンフルオレセントプロテイン（ＥＧＦＰ）ｃＤＮＡ及びＳＶ４０のポリＡシグナル配列（ｐＥＧＦＰ−Ｃｌ、クローンテック社製）と、ｐＧＫｎｅｏ由来のｌｏｘＰ配列に囲まれたネオマイシン耐性遺伝子とを用いて構築した（図１参照）。
【００１７】
これらのすべてのフラグメントを、ＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）を含むｐＫＳＴＫＬｏｋＰＮｅｏターゲティングベクターへ組み込んだ。得られたＭＩＳＴターゲティングコンストラクトを、Ｅ１４ＥＳ細胞へ電気穿孔法により導入し、Ｇ４１８（０．３ｍｇ／ｍｌ）及びガンシクロビル（０．２μＭ）を用いて導入細胞のスクリーニングを行った。薬剤耐性コロニーを、ＰＣＲによって相同組換え現象についてスクリーニングして、サザンブロット解析によって確認した。ターゲットクローンをＣ５７ＢＬ／６の胚盤胞に導入した。
【００１８】
キメラマウスを得て、その子孫に対してサザンブロット解析を行い、変異体子孫をスクリーニングした。ヘテロ体（ＭＩＳＴ+/neoマウス）をＢＡＬＢ／ｃ又はＣ５７ＢＬ／６マウスと掛け戻して対照動物を作製した。ＥＧＦＰ蛍光は、挿入ネオマイシン耐性遺伝子カセットによる翻訳のサイレンシングのため、ＭＩＳＴ+/neoマウス由来のＭＩＳＴ陽性細胞において検出されなかった。そこで変異相同染色体からネイマイシンセレクションカセットを欠失させるために、オスＭＩＳＴ+/neoマウスと掛け合わせたメスＣ５７ＢＬ／６マウス由来の胚盤胞に、ｐＣｒｅ−ｐａｃプラスミドを一時的に導入して、ＭＩＳＴ+/Dneoマウスを作製した。ＢＡＬＢ／ｃ対照動物について８回掛け戻されたＭＩＳＴ+/neoマウスとＣ５７ＢＬ／６対照動物について６回掛け戻されたＭＩＳＴ+/Dneoマウスを用いて、ホモ型マウスを得た。
【００１９】
［実施例２］
ＭＩＳＴ欠損マウスにおける細胞分布
ＭＩＳＴ欠損マウスにおける種々の細胞分布を調べるために、各種抗体を使用して、フローサイトメトリーによる解析を行った（図２参照）。
４〜６週齢のＭＩＳＴ欠損マウスの胸腺（図２ａ）、骨髄（図２ｂ）、肝臓（図２ｃ）及び脾臓（図２ｄ）から細胞懸濁液を作製し、各種細胞をフローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製；ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェア）を使用して調べた。一次抗体として抗ＣＤ１８（２．４Ｇ２）、抗ＴＣＲαβ（Ｈ５７−５９７）、抗ＮＫ１．１（ＰＫ１３６）、抗ＣＤ３ε（１４５−２Ｃ１１）、抗Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）、ＤＸ−５、抗ｃ−ｋｉｔ、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８α、抗ＣＤ６２Ｌ、抗Ｌｙ４９Ａ（Ａ１）、抗Ｌｙ４９Ｄ（４Ｅ５）、抗Ｌｙ４９Ｃ／Ｉ（５Ｅ６）、抗Ｌｙ４９Ｇ２（４Ｄ１１）、抗ＣＤ９４及び２Ｂ４（それぞれ、ＢＤファーミンゲン社製、サンノゼ、米国；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、サンディエゴ、米国）を使用し、二次抗体としてＦＩＴＣ結合抗体、ＰＥ結合抗体、ビオチン結合抗体、ストレプトアビジンＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＢＤ ファーミンゲン社製、サンノゼ、米国）を使用した。
【００２０】
図２に示されるように、ＭＩＳＴ欠損マウスの各臓器におけるＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞を含む造血系細胞の分化に異常は認められず、ＭＨＣクラスＩに対するＬｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ／Ｉ、Ｌｙ４９Ｇ２、ＣＤ９４などの抑制受容体並びにＬｙ４９Ｄなどの活性化受容体を発現するＮＫ細胞集団の比率及び各受容体の発現レベルも、野生型マウスと比較して変化は認められなかった。
【００２１】
［実施例３］
ＮＫ細胞傷害アッセイ
次にＭＩＳＴ欠損マウス細胞について各種腫瘍細胞に対する細胞傷害性について調べた。
標準的な51Ｃｒ放出アッセイ（通常の４時間）によって細胞傷害性を調べた（J.Exp.Med.,(1997) 186; 1957-1963）。簡単に説明すれば、１×１０6個の標的細胞を１時間、１００μＣｉのＮａ251ＣｒＯ4（アマシャム社製）と共にインキュベートした後、充分に洗った。ＩＬ−２（２０００Ｕ／ｍｌ）の存在下で５〜７日間培養したＦＡＣＳ選別ＮＫ細胞（ＮＫ１．１+ＴＣＲαβ-）を、最終容量２００μＬでＵ底マイクロタイタープレートに２ウェルずつ、標的細胞（４×１０3個／ウェル）に加えた。標的細胞には、ＹＡＣ−１、Ｂ１６メラノーマ細胞（順天堂大学の高部博士より供与）（ａ）と、Ｂａ／Ｆ３細胞及びこの細胞にＭＨＣＶのｍ１５７抗原又はＲＡＥ１−γを発現させたトランスフェクタント（千葉大学の荒瀬博士より供与）（ｂ）と、抗ＮＫ１．１抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗２Ｂ４抗体、抗Ｌｙ４９Ｄ抗体の存在下におけるＦｃγＲ+のＰ８１５（順天堂大学の高部博士より供与）及びＰ８１５のみ（ｃ）とした。
【００２２】
図３に示されるように、ＩＬ−２活性化脾臓ＮＫ細胞（ＮＫ１．１+ＴＣＲαβ-）について、野生型（黒丸）及びＭＩＳＴ欠損マウス（白丸）とで比較したところ、ＹＡＣ−１細胞及びＢ１６細胞に対する細胞傷害活性に対する細胞傷害活性（図３ａ）と、Ｌｙ４９Ｈ受容体のリガンドであるマウスサイトメガロウィルスのｍ１５７抗原や、ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンドであるＲＡＥ１−γを発現させたＢａ／Ｆ３細胞に対する傷害活性（図３ａ）とはいずれも、野生型ＮＫ細胞と比べて亢進していた。さらに、Ｆｃ受容体を発現するＰ８１５と各種ＮＫ細胞受容体特異的抗体を用いて、個々の受容体を介した細胞傷害活性について解析したが、ＭＩＳＴ欠損ＮＫ細胞は、いずれの受容体を介した細胞傷害活性も、野生型ＮＫ細胞と比較して亢進していた。
【００２３】
［実施例４］
ＭＩＳＴ欠損ＮＫ細胞におけるＩＮＦ−γ産生亢進
それぞれ１×１０5個のＩＬ−２で刺激した野生型ＮＫ細胞（＋／＋）とＭＩＳＴ欠損ＮＫ細胞（−／−）とを、抗ＮＫ１．１抗体、抗Ｌｙ４９Ｄ抗体で予めコートしたマイクロタイタープレート上で６時間２μＭのモネンシン（シグマ−アルドリッヒ社）の存在下で、又はＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）＋イオノマイシン（１μＭ）の存在下でそれぞれ、インキュベートした。細胞を回収後、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＮａＮ3及び０．５％のトライトンＸ−１００を含む溶液中で透過性にした。３％のウシ血清アルブミン含有ＰＢＳでブロッキング後、細胞を抗ＩＮＦ−γ−ＰＥ抗体（ＸＭＧ１．２；ＢＤＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）で染色し、細胞内ＩＮＦ−γについてフローサイトメトリーを用いて調べた。結果を図４（Ａ）に示す。
【００２４】
またＩＬ−２存在下で培養された野生型ＮＫ細胞（黒）とＭＩＳＴ欠損ＮＫ細胞（白）とをそれぞれ５×１０4個／２００μＬで、ＩＬ−２の存在下で平底マイクロタイタープレートで培養し、抗ＣＤ３抗体、抗ＮＫ１．１抗体、ＣＤ１６抗体、Ｌｙ４９Ｄ抗体又は２Ｂ４抗体の各固定化抗体で、或いはＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。次いで、標的細胞（ＹＡＣ−１及びＢ１６）を、ＩＬ−２の存在下でＮＫ細胞と１：１の割合でＵ底プレート中で、２４時間、同時培養した。培養後、無細胞培養上清を回収して、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の量を、ＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社製）を用いて測定した。結果を図４（Ｂ）に示す。＊；Ｐ＜０．０５、＊＊；Ｐ＜０．０１。
【００２５】
図４（Ａ）及び（Ｂ）に示されるように、ＮＫ細胞受容体刺激によるＩＦＮ−γ産生を、細胞内染色及びＥＬＩＳＡで解析した結果、ＮＫ１．１、Ｌｙ４９Ｄ、ＣＤ１６、２Ｂ４刺激のいずれにおいても、ＭＩＳＴ欠損ＮＫ細胞では、野生型よりも有意に高い産生が認められた。以上の結果から、ＭＩＳＴは、広範な活性化ＮＫ受容体シグナルを負に制御していることが明らかになった。
【００２６】
［実施例５］
ＭＩＳＴ欠損ＮＫ細胞におけるＮＫ受容体シグナル伝達の増強
ＭＩＳＴ欠損ＮＫ細胞に認められるＮＫ受容体刺激に伴う活性化亢進のメカニズムを解明するために、ＮＫ受容体下流のシグナル伝達について生化学的に解析した。
ＮＫ１．１仲介ＩＦＮ−γ産生について、ＳｒｃファミリーＰＴＫ阻害剤であるＰＰ２又はピセタンノールの存在下で、野生型ＮＫ細胞とＭＩＳＴ欠損ＮＫ細胞とで比較した。その結果、ＮＫ１．１刺激に伴うＰＬＣ−γ２のチロシンリン酸化の亢進、ＥＲＫ２及びｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化の亢進が観察された。またＩＦＮ−γ産生を指標に、Ｓｒｃ型チロシンキナーゼ又はＳｙｋ／ＺＡＰ−７０型チロシンキナーゼの特異的阻害剤により、ＭＩＳＴの関与するシグナル伝達経路を解析した結果、ＭＩＳＴ欠損ＮＫ細胞は、野生型細胞と比較して、Ｓｙｋ／ＺＡＰ−７０型チロシンキナーゼ阻害剤に対して高い感受性を示すことから、ＭＩＳＴ欠損ＮＫ細胞では、ＮＫ受容体刺激に伴うＳｙｋ／ＺＡＰ−７０経路の活性化亢進が存在することが示唆された（データ示さず）。
【００２７】
［実施例６］
ＮＫ受容体シグナル伝達に関与するＭＩＳＴの機能ドメインの同定
ＮＫ受容体シグナル伝達の負の制御に関与するＭＩＳＴの機能ドメインを明らかにするために、ＭＩＳＴ欠損ＮＫ細胞に、各種ＭＩＳＴ機能ドメイン変異体をレトロウィルスベクターを用いて導入した。
マウス野生型ＭＩＳＴ（ＷＴ）と、Ｎ末端側プロリンリッチ領域欠失変異体（ｄＰＲ１）及びＣ末端側プロリンリッチ領域欠失変異体（ｄＰＲ２）の各種変異体のｃＤＮＡを、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰレトロウィルスベクターに挿入した。本レトロウイルスベクターは挿入遺伝子以外に、ＥＧＦＰを発現するので、遺伝子導入された細胞をＥＧＦＰの蛍光を指標にＦＡＣＳで解析することができる。得られた各プラスミドを、パッケージ細胞株ＰＬＡＴ−Ｅに、ＦｕＧＮＥＮ６（ロッシュ社）を用いて導入して、２４時間インキュベートした後に、培養上清を回収して、ウィルスストックとして濃縮した。
【００２８】
ＦＡＣＳを用いてソートしたＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞をＩＬ−２の存在下で２４時間培養し、０．５μｇ／ｍｌのポリブレン存在下でレトロウィルスで感染させた。細胞を更に３日間、ＩＬ−２の存在下で培養して、５日目に抗ＮＫ１．１抗体又はＰＭＡ＋イオノマイシンによる刺激を６時間行って、細胞内ＩＦＮ−γ染色を行った。
結果を図５に示す。対照のウィルスを用いたＮＫ細胞（中列２段目）と比較して、野生型のＮＫ細胞ではＩＦＮ−γの産生抑制が認められた（中列３段目）。これに対して、変異型のＭＩＳＴを導入した場合には、Ｎ末端側プロリンリッチ領域を欠失させると部分的なＩＦＮ−γの産生亢進が認められた（中列４段目）のに対して、Ｃ末端側プロリンリッチ領域を欠失させると、ＩＦＮ−γの産生抑制が認められなかった（中列最下段）
これらのことから、ＭＩＳＴのＣ末端に存在するプロリンリッチ領域とそこに会合する分子が、ＮＫ受容体シグナルを負に制御するために必須であることが明らかになった。
なお、チロシン残基をフェニルアラニンに置換した変異体及び非機能型ＳＨ２ドメイン変異体を導入した場合は、野生型ＭＩＳＴを導入した場合と同様に、ＮＫ受容体刺激に伴うＭＩＳＴ欠損ＮＫ細胞のＩＦＮ−γの産生亢進は、野生型ＮＫ細胞レベルまで低下していた（データ示さず）。
【００２９】
［実施例７］
ＭＩＳＴのＣ末端側プロリンリッチ領域に会合する分子の同定
ヒトＭＩＳＴの１から２１３番目のアミノ酸残基をベイトとして、ヒトマスト細胞および脾臓に由来するｃＤＮＡライブラリーを用いて酵母ツー・ハイブリッド法によりＭＩＳＴと結合する分子を探索した。その結果、Ｓｒｃ型チロシンキナーゼであるＦｇｒが、ＭＩＳＴ分子と会合する分子として同定された。
ＦＡＣＳで選別された脾臓ＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋ＴＣＲαβ−）とＮＫＴ（ＮＫ１．１＋ＣＤ４＋）をＩＬ−２で５日間活性化させ、ＲＴ−ＰＣＲ解析に付した。全ＲＮＡはTＲＩＺＯＬ試薬（ＢＲＬ）を用いて単離し、次いで、SuperScriptII逆転写酵素をオリゴ（ｄＴ）プライマー（Invitorogen）と共に使用して、一本鎖ｃＤＮＡに転換した。下記のプライマーを使用し、得られたｃＤＮＡを、ＭＩＳＴ、Ｆｇｒ又はβ−アクチンのｍＲＮＡに対するＰＣＲに付した。
【００３０】
ＭＩＳＴに対して
5'-CTTACAGAGTGCTCCAGGATGCGACCGTGG-3'（配列番号：５）
5'-GAGGGGTTGGTACTTCTTGGGGAGAGTGATAGC-3'（配列番号：６）
Ｆｇｒに対して
5'-TGGTGGGGGAATACCTAATATGCAAGATCG-3'（配列番号：７）
5'-TGCCCAGTCAGGCTATGTCTGGTCTCCAGG-3'（配列番号：８）
β−アクチンに対して
5'-TACAATGAGCTGCGTGTGGC-3'（配列番号：９）
5'-TAGCTCTTCTCCAGGGAGG-3'（配列番号：１０）
【００３１】
また、このＦｇｒを、野生型（ＷＴ）又はプロリンリッチ領域欠失変異体（ｄＰＲ１及びｄＰＲ２）のいずれか若しくは双方と、ＣＯＳ−７細胞において同時発現させた。細胞溶解物（ＷＣＬ）に対して、抗ＭＩＳＴ抗体を用いた免疫沈降（ＩＰ）を行い、抗Ｆｇｒ抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc.社製）又は抗ＭＩＳＴ抗体でブロッティングした。
【００３２】
その結果、図６ａ及びｂに示されるように、ＮＫ細胞ではＭＩＳＴ分子とＦｇｒ分子とがＲＮＡレベルで共に発現し、ＭＩＳＴと共に免疫沈降することが明らかとなった。さらに図６ｃに示されるように、Ｆｇｒは、ＭＩＳＴのＣ末端側プロリンリッチ領域を欠失させると会合できなくなることから、Ｃ末端側プロリンリッチ領域にＳＨ３ドメインを介して結合することが示唆された。
【００３３】
［実施例８］
ＭＩＳＴとＦｇｒの相互作用に依存したＮＫ細胞活性化の抑制
ＮＫ細胞には、ＭＩＳＴ及びＦｇｒが共に発現しているが、ＮＫＴ細胞にはＭＩＳＴのみが発現していることが判明した。これを利用して、ＮＫＴ細胞にＦｇｒ分子を異所的に発現させることによってＭＩＳＴとＦｇｒとの相互作用のＮＫ細胞受容体刺激によるＩＦＮ−γの産生に与える影響について解析した。
ＩＬ−２存在下で培養されたＮＫＴ細胞（野生型マウスの細胞）を、ＭＩＳＴとＥＧＦＰを発現するレトロウィルスで感染させた。５日目に細胞を、抗ＮＫ１．１抗体、抗ＣＤ３抗体又はＰＭＡ＋イオノマイシンのそれぞれで６時間刺激し、細胞内ＩＦＮ−γの産生について解析した。
その結果、図７に示されるように、Ｆｇｒを発現しないＮＫＴ細胞においてはＮＫ１．１刺激によるＩＦＮ−γの産生はＭＩＳＴ欠損マウス（−／−）でも野生型マウス（＋／＋）に比べ亢進しておらず、またＦｇｒを野生型ＮＫＴ細胞に異所的に発現させるとＩＦＮ−γの産生が低下すること、さらにＭＩＳＴ欠損ＮＫＴ細胞では、Ｆｇｒ導入によるＩＦＮ−γ産生の低下が認められないことが判明し、ＮＫ細胞受容体シグナルの抑制には、ＭＩＳＴとＦｇｒの相互作用が必須であることが明らかとなった。
【００３４】
［実施例９］
ＭＩＳＴ欠損マウスにおける腫瘍肺転移に対する抵抗性の増強
ＭＩＳＴ欠損マウスにおけるＮＫ細胞機能を生体レベルで把握するために、腫瘍細胞の肺転移モデルを用いて検討した。
大腸癌細胞Ｃｏｌｏｎ−２６細胞（２．４×１０4個）及び黒色細胞種Ｂ１６−ＢＬ６（２×１０5個）をそれぞれＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５６ＢＬ／６系統のＭＩＳＴ欠損マウス及び野生型マウスに経静脈投与した。２週間後に肺に転移した腫瘍細胞の結節数を解剖顕微鏡を用いて計測した。
その結果、図８ａ及び図９に示されるように、いずれの腫瘍細胞投与群においても、ＭＩＳＴ欠損マウス（黒）では野生型マウス（白）に比べて、肺転移結節数の有意な低下が認められた（＊；ｐ＜０．０１）。
次いで、ＮＫ細胞の除去の影響を調べるために、抗アシアロＧＭ１抗体を２日目、３日目及び８日目に腹腔投与した。ＮＫ細胞除去は、処理マウスの脾臓内におけるＮＫ１．１+ＣＤ３-細胞が存在しないことによって確認した。その結果、このようにＮＫ細胞を除去することにより、ＭＩＳＴ欠損マウスにおける転移抵抗性が消失した（図８ｂ参照）。
これらのことから、生体レベルにおいてもＭＩＳＴ欠損によるＮＫ細胞機能亢進が存在し、抗腫瘍活性の増強に繋がることが明らかとなった。
【００３５】
このように、ＭＩＳＴ分子とＦｇｒ分子との会合状態を阻害することによって、ＭＩＳＴ分子の抑制的な機能の発揮が阻害されて、免疫賦活的な抗癌作用が生じることが明らかである。このため、ＭＩＳＴ分子とＦｇｒ分子との会合状態を阻害する物質を、種々の手法によってスクリーニングすることにより、抗癌剤として有用な物質を得ることができる。例えば、表面プラズモンセンサーを利用する手法や、酵母のツー・ハイブリッド法を利用する手法、細胞内カルシウム濃度やＩＦＮ−γ濃度を測定する手法を用いて、ＭＩＳＴ分子とＦｇｒ分子との会合状態を阻害するか否かを指標として、有用な抗癌物質を容易に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、本実施例に係るＭＩＳＴ欠損マウスを作製するために用いられたターゲッティングコンストラクトの構成図である。
【図２】図２は、ＭＩＳＴ欠損マウスの脾臓（ａ）、骨髄（ｂ）、肝臓（ｃ）及び脾臓（ｄ）における各種の細胞分布を示すフローサイトメトリーの分析図である。
【図３】図３は、ＭＩＳＴ欠損マウス細胞におけるＢａ／３細胞（ａ）、Ｂａ／３細胞にＭＨＣＶのｍ１５７抗原又はＲＡＥ１−γを発現させたトランスフェクタント（ｂ）及びＩｇＧに対する受容体を発現するＰ８１５細胞に各種ＮＫ受容体に特異的な抗体を結合させた時の（ｃ）細胞傷害性を比較したグラフである。
【図４】図４Ａは、ＭＩＳＴ欠損ＮＫ細胞における細胞内ＩＮＦ−γの発現を示すフローサイトメートリーの分析図であり、図４Ｂは、ＩＬ−２存在下で培養された野生型ＮＫ細胞（黒）とＭＩＳＴ欠損ＮＫ細胞（白）におけるＩＮＦ−γの産生を比較したグラフである。
【図５】図５は、細胞内ＩＮＦ−γの産生状態を比較したフローサイトメートリーの分析図である。
【図６】ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞におけるＭＩＳＴ分子及びＦｇｒ分子のｍＲＮＡの発現状態を示すゲル電気泳動写真（ａ）、免疫沈降後の染色図（ｂ）及び、ＭＩＳＴ分子の特定部位とＦｇｒ分子との会合状態を説明する免疫沈降後の染色図（ｃ）である。
【図７】ＭＩＳＴ分子とＦｇｒ分子との相互作用によるＩＮＦ−γの産生を示すフローサイトメートリーの分析図である。
【図８】各種腫瘍細胞に対して（ａ）及び、抗アシアロＧＭ１抗体存在下での（ｂ）、ＭＩＳＴ欠損マウス（黒）と野生型マウス（白）における腫瘍肺転移の比較を示すグラフである。
【図９】ＭＩＳＴ欠損マウス（黒）と野生型マウス（白）における腫瘍肺転移の状態を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図５】
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【図９】
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【配列表】
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