(57)【要約】      （修正有）【課題】  マラリア原虫増殖抑制能力を有する物質を探索するために必須となる、簡便なマラリア原虫増殖抑制能力の検定方法等を提供する。【解決手段】  マラリア原虫増殖抑制能力の検定方法であって、（１）マラリア原虫由来の特定のアミノ酸配列からなる蛋白質等から選択されるトリグリセライド合成酵素と被験物質との接触系内における前記トリグリセライド合成酵素の活性を測定する第一工程、及び（２）第一工程により測定された活性と対照における活性とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質のマラリア原虫増殖抑制能力を評価する第二工程、を有することを特徴とするマラリア原虫増殖抑制能力の検定方法等。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マラリア原虫増殖抑制能力の検定方法であって、
（１）下記の蛋白質群から選択されるトリグリセライド合成酵素と被験物質との接触系内における前記トリグリセライド合成酵素の活性を測定する第一工程、及び
（２）第一工程により測定された活性と対照における活性とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質のマラリア原虫増殖抑制能力を評価する第二工程、
を有することを特徴とするマラリア原虫増殖抑制能力の検定方法。
＜蛋白質群＞
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつトリグリセライド合成能力を有する蛋白質
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつトリグリセライド合成能力を有する蛋白質
（ｄ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｅ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつトリグリセライド合成能力を有する蛋白質
（ｆ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつトリグリセライド合成能力を有する蛋白質
【請求項２】
請求項１記載の検定方法により評価されたマラリア原虫増殖抑制能力に基づきマラリア原虫増殖抑制能力を有する物質を選抜することを特徴とするマラリア原虫増殖抑制物質の探索方法。
【請求項３】
請求項２記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、マラリア原虫増殖抑制剤。
【請求項４】
下記のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする蛋白質。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつトリグリセライド合成能力を有する蛋白質
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつトリグリセライド合成能力を有する蛋白質
（ｄ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｅ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつトリグリセライド合成能力を有する蛋白質
（ｆ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつトリグリセライド合成能力を有する蛋白質
【請求項５】
請求項４に記載の蛋白質のアミノ酸配列をコードする遺伝子。
【請求項６】
請求項４記載の蛋白質からなる、下記の反応の触媒。
１，２−ジアシルグリセロール＋アシル−ＣｏＡ  ⇒  トリグリセライド＋ＣｏＡ
【請求項７】
マラリア原虫増殖抑制能力を評価するための指標を提供する試薬としての、請求項４記載の蛋白質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マラリア原虫増殖抑制能力の検定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
定期的な発熱、激しい貧血、脾臓の腫大で特徴づけられるマラリアは、原生動物の中で住血胞子虫類であるPlasmodium属（例えば、Plasmodium falciparum, P.vavax, P.malariae等）等の原虫を寄生病原体とする病気で、熱帯地域を中心として現在なお世界的に広く蔓延している疾患である。マラリアによる発症は、ハマダラカを介して人体に侵入したマラリア原虫が肝臓での潜伏期を経た後、赤血球内で増殖サイクルを繰り返すことにより引き起こされる。マラリアの治療薬としてはクロロキンなどの薬剤が最も一般的に用いられるが、薬剤耐性株・多剤耐性株の出現により近年その有効性が失われつつあり、またマラリアワクチンについても有効なものはないのが現状である。
最近の研究によって、マラリア原虫は増殖の特定の時期に急激なトリグリセライド合成を行っていることが示されたことから、トリグリセライドはマラリア原虫の増殖・生存に必須の因子であると考えられる。トリグリセライド合成の最終段階はジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（以下、DGATaseと記す）によって触媒される。マラリア原虫の膜画分はDGATase活性を有しており、ラットDGATaseを阻害する薬剤がマラリア感染赤血球におけるマラリア原虫の増殖を顕著に抑制することが報告されている（特許文献１を参照）。
一方、マラリア原虫のDGATase及びDGATaseをコードする遺伝子については不明であったため、マラリア原虫のDGATase酵素に直接作用する薬剤を、広範な被験物質から簡便にスクリーニングすることは困難な状況にあった。
【特許文献１】特開２００３−１８９８９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、マラリア原虫増殖抑制能力を有する物質を探索するために必須となる、簡便なマラリア原虫増殖抑制能力の検定方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、かかる状況のもと鋭意検討した結果、配列番号１で表される塩基配列を有するマラリア原虫の遺伝子が、マラリア原虫のDGATaseであること見出した。すなわち、配列番号１で表される塩基配列を有する遺伝子がコードする蛋白質（配列番号２）は、トリグリセライド合成酵素（DGATase）活性を有していた。本発明は上記の知見を元に完成するに至ったものである。
即ち、本発明は、
［１］マラリア原虫増殖抑制能力の検定方法であって、
（１）下記の蛋白質群から選択されるトリグリセライド合成酵素と被験物質との接触系内における前記トリグリセライド合成酵素の活性を測定する第一工程、及び
（２）第一工程により測定された活性と対照における活性とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質のマラリア原虫増殖抑制能力を評価する第二工程、
を有することを特徴とするマラリア原虫増殖抑制能力の検定方法；
＜蛋白質群＞
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつトリグリセライド合成能力を有する蛋白質
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつトリグリセライド合成能力を有する蛋白質
（ｄ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｅ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつトリグリセライド合成能力を有する蛋白質
（ｆ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつトリグリセライド合成能力を有する蛋白質
［２］［１］に記載の検定方法により評価されたマラリア原虫増殖抑制能力に基づきマラリア原虫増殖抑制能力を有する物質を選抜することを特徴とするマラリア原虫増殖抑制物質の探索方法；
［３］［２］に記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、マラリア原虫増殖抑制剤；
［４］下記のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする蛋白質；
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつトリグリセライド合成能力を有する蛋白質
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつトリグリセライド合成能力を有する蛋白質
（ｄ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｅ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつトリグリセライド合成能力を有する蛋白質
（ｆ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつトリグリセライド合成能力を有する蛋白質
［５］［４］に記載の蛋白質のアミノ酸配列をコードする遺伝子；
［６］［４］に記載の蛋白質からなる、下記の反応の触媒；
１，２−ジアシルグリセロール＋アシル−ＣｏＡ  ⇒  トリグリセライド＋ＣｏＡ
［７］マラリア原虫増殖抑制能力を評価するための指標を提供する試薬としての、［４］に記載の蛋白質の使用；
［８］配列番号１で示される塩基配列を含有する遺伝子；
［９］配列番号３で示される塩基配列を含有する遺伝子；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００５】
本発明により、マラリア原虫増殖抑制能力を有する物質を探索するために必須となる、簡便なマラリア原虫増殖抑制能力の検定方法等を提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下に本発明を詳細に説明する。
トリグリセライド合成酵素（DGATase）は、別名１，２−ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼと呼ばれている酵素であって、下記の反応を触媒するものである（以下、本酵素と記すこともある。）。
１，２−ジアシルグリセロール＋アシルＣｏＡ  ⇔  トリアシルグリセロール＋ＣｏＡ
このような酵素が有する活性は、例えば、以下のような方法（例えば、特開平８−１８２４９６、新生化学実験講座４脂質Ｉ、８５頁等に記載される方法）で測定することができる。
具体的には、例えば、まず上記反応の基質である１，２−ジアシルグリセロール及びアシルＣｏＡのいずれか一方を放射標識した後、両者の基質を含む反応液中に、トリグリセライド合成酵素（DGATase）を添加する。一定時間後、生成した放射標識トリグリセライドを通常の放射活性測定により定量する。
１，２−ジアシルグリセロールとしては、炭素数３以上の飽和または不飽和脂肪酸２基をアシル基として含有する１，２−ジアシルグリセロールを用い、また放射標識した１，２−ジアシルグリセロールを利用する場合には、前記１，２−ジアシルグリセロール中のグリセロール部分または脂肪酸部分に1個以上のトリチウムもしくは14Ｃを含むものを用いるとよい。
アシルＣｏＡとしては、炭素数３以上の飽和または不飽和脂肪酸とＣｏＡ（補酵素Ａ）とがチオエステル結合したものを用い、また放射標識したアシルＣｏＡを利用する場合には、前記脂肪酸部分に1個以上のトリチウムもしくは14Ｃを含むものを用いるとよい。
【０００７】
上記反応液としては、０ｍＭ〜１０ｍＭ（好ましくは１ｍＭ〜５ｍＭ）のエチレンジアミン四酢酸、０ｍＭ〜２００ｍＭ（好ましくは２０ｍＭ〜１００ｍＭ）のマグネシウムイオン、０μＭ〜１００μＭ（好ましくは１.８μＭ〜１８μＭ）のウシ血清アルブミン、０Ｍ〜１Ｍのショ糖等を添加したｐＨ約６〜８（好ましくはｐＨ７．５〜８.０）の緩衝液（好ましくは１０ｍＭ〜２００ｍＭのトリス塩酸緩衝液）等を用いるとよい。
反応温度としては、１０℃〜４０℃（好ましくは３７℃）をあげることができる。
反応時間としては、約１分間以上（好ましくは５分間〜１時間）があげられる。
反応液中に生成した放射標識トリグリセライドの抽出および定量は、例えば、後述の実施例に記載されるような通常の方法を用いて行えばよい。
【０００８】
本明細書において本発明酵素は、以下の（ａ）〜（ｅ）から選択される、マラリア原虫由来のトリグリセライド合成酵素を表す。すなわち（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつトリグリセライド合成活性を有する蛋白質、（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつトリグリセライド合成活性を有する蛋白質、（ｄ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質、（ｅ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつトリグリセライド合成活性を有する蛋白質、（ｆ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつトリグリセライド合成活性を有する蛋白質をあげることができる。
【０００９】
ここで、前記（ｂ）にある「アミノ酸の欠失、付加もしくは置換」や前記（ｃ）及び（ｅ）にある「８０％以上の配列同一性」には、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が細胞内で受けるプロセシング、該蛋白質が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。
前記（ｂ）にある「アミノ酸の欠失、付加もしくは置換」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res.,12,9441-9456(1984)）、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には1若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、ＤＧＡＴａｓｅ活性を見出すことのできる範囲であれば良い。
また前記欠失、付加又は置換のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、i)グリシン、アラニン；ii)バリン、イソロイシン、ロイシン；iii)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、iv)セリン、スレオニン；v)リジン、アルギニン；vi)フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
本発明において「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
本発明における配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。
前記（ｆ）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×SSC（１．５M  NaCl、０．１５M  クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×SSCとする）、50％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、2×SSCで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×SSCで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×SSCで５０℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）までの温度から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
【００１０】
本発明酵素の調製方法について以下に説明する。
まず、本発明酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子（以下、本発明遺伝子と記すこともある。）、例えば、（I）配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、（II）配列番号１で示される塩基配列を有する遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法（例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載されている方法）に準じて取得する。あるいは、一般的に用いられるオリゴヌクレオチド合成法に従って、人工的に目的の塩基配列を合成することも可能である。次いで、得られた本発明遺伝子を用いることにより、通常の遺伝子工学的方法に準じて本酵素を製造・取得する。このようにして本発明酵素を調製することができる。
【００１１】
例えば、本発明遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドを作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、さらに形質転換された宿主細胞（形質転換体）を培養することで得られる培養物から本発明酵素を取得すればよい。
【００１２】
本形質転換細胞は、以下のようにして調製することができる。
本発明遺伝子を、通常の遺伝子工学的手法を用いて、本発明遺伝子を導入する細胞において使用可能なベクターに発現可能な形でプロモーターと接続されるように挿入することにより、プラスミドを作製する。ここで用いられるプロモーターは、本遺伝子が導入される細胞で機能可能なものであればよく、該細胞が動物細胞である場合には、ＳＶ４０ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、Raus Sarcoma Virusプロモーター（ＲＳＶプロモーター）、βアクチン遺伝子プロモーター、ａＰ２遺伝子プロモーター等が挙げられる。尚、このようなプロモーターをマルチクローニング部位の上流に含む市販のベクターを利用してもよい。
上記プラスミドとしては、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主細胞からの単離・精製が容易であり、宿主細胞中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマーカーをもつ発現ベクターに、本発明酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子が導入されたものを好ましく挙げることができる。尚、発現ベクターとしては、各種のものが市販されている。例えば、大腸菌での発現に使用される発現ベクターは、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃなどのプロモーターを含む発現ベクターであって、これらはファルマシア社、宝酒造等から市販されている。当該発現ベクターに本酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子を導入するために用いられる制限酵素も宝酒造等から市販されている。
さらなる高発現を導くことが必要な場合には、本酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子の上流にリボゾーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボゾーム結合領域としては、Guarente L.ら（Cell 20, p543）や谷口ら（Genetics of Industrial Microorganisms, p202, 講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。
【００１３】
次いで、前記プラスミドを細胞へ導入する。細胞への導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法、電気導入法、ＤＥＡＥデキストラン法、ミセル形成法等を挙げることができる。リン酸カルシウム法としてはGrimm, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 10923-10927等に記載される方法、電気導入法及びＤＥＡＥデキストラン法としてはTing, A. T. et al., EMBO J., 15, 6189-6196等に記載される方法、ミセル形成法としてはHawkins, C. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 13786-13790等に記載される方法を挙げることができる。ミセル形成法を用いる場合には、リポフェクトアミン（ギブコ製）やフュージーン（ベーリンガー製）等の市販の試薬を利用するとよい。
前記プラスミドの導入処理を施した細胞を、例えば、当該ベクターに予め含まれる選抜マーカー遺伝子を利用し、当該選抜マーカー遺伝子に応じた選抜条件の培地で培養することにより、本形質転換細胞を選抜することができる。さらに選抜を続けて、本遺伝子が染色体に導入されてなる安定形質転換体となった本形質転換細胞を取得してもよい。導入された本遺伝子が細胞中に存在する染色体上に組込まれたことを確認するには、当該細胞のゲノムＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、本遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いるＰＣＲや、本遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるサザンハイブリダイゼーション等の方法を利用して、ゲノムＤＮＡ中の本遺伝子の存在を検出・確認すればよい。
【００１４】
宿主細胞としては、原核生物もしくは真核生物である微生物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞等を挙げることができる。例えば、本酵素の大量調製が容易になるという観点では、大腸菌等を好ましく挙げることができる。
形質転換体の培養は、微生物培養、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。例えば大腸菌の場合、適当な炭素源、窒素源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
本酵素の取得は、一般の蛋白質の単離・精製に通常使用される方法を組み合わせて実施すればよい。例えば、前記の培養により得られた形質転換体を遠心分離等で集め、該形質転換体を破砕または溶解せしめ、必要であれば蛋白質の可溶化を行い、イオン交換、疎水、ゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた工程を単独で、もしくは組み合わせることにより精製すればよい。また、例えば、前記の培養により得られた形質転換体を遠心分離などで除去し、培養上清から本酵素を前記と同様にして精製してもよい。必要であれば、精製された蛋白質の高次構造を復元する操作をさらに行ってもよい。
【００１５】
本発明検定方法は、（１）トリグリセライド合成酵素（DGATase）と被験物質との接触系内における前記トリグリセライド合成酵素（DGATase）の活性を無細胞系において測定する工程、及び（２）前記工程により測定された活性と対照における活性とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質のマラリア原虫増殖抑制能力を評価する工程、を有する。
本発明検定方法では、細胞内でのマラリア原虫の増殖を直接的に観察することなく、例えば、マラリア原虫増殖抑制能力を評価するための指標となるトリグリセライド合成酵素（DGATase）阻害率（詳細は後述する）を算出することにより被験物質のマラリア原虫増殖抑制能力を評価することができる。このため、当該方法では、広範囲の被験物質を対象としながら特定の作用性に基づいてスクリーニングを簡便に行なうことができ、１次スクリーニング等に最適である。
【００１６】
本発明検定方法の第一工程において被験物質と接触させる本酵素の形態は、（Ａ）本酵素の精製物、粗精製物等であってもよいし、また（Ｂ）細胞内に含有される本酵素（例えば、本酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子が導入されてなる形質転換細胞（以下、本形質転換細胞と記すこともある。）に被験物質を接触させる方法である場合）等であってもよい。さらに細胞は、組織から分離された状態の細胞であってもよいし、また同一の機能・形態を持つ集団を形成している状態の細胞であってもよい。
例えば、上記（Ａ）の場合には、被験物質と接触させる本酵素の濃度は、例えば、５ｎｇ／ｍｌ以上で、好ましくは１μｇ／ｍｌ以上である。
また上記（Ｂ）の場合には、被験物質と接触させる本酵素の濃度は、例えば、本形質転換細胞の濃度として１×１０５細胞／ｍｌ以上で、好ましくは１×１０６細胞／ｍｌ以上である。
【００１７】
当該工程では、例えば、（Ａ）２種の基質（例えば、１，２−ジアシルグリセロール及び脂肪酸ＣｏＡ）と被験物質との３者が本酵素と接触する形態、及び（Ｂ）２種の基質のうちの一方（例えば、１，２−ジアシルグリセロール又は脂肪酸ＣｏＡ）と被験物質との２者が本酵素と接触する形態（すなわち、被験物質を前記２種の基質のうちの他の一方として取り扱う場合）、のいずれかの形態で本酵素の活性を測定すればよい。
【００１８】
さらに、上記の形態において本酵素の活性を測定する場合には、本酵素に被験物質及び基質を接触させる順序は、（ａ）本酵素と被験物質とを先ず接触させ、一定時間保温した後、２種もしくは１種の基質を添加するような形態、（ｂ）本酵素、被験物質及び２種もしくは１種の基質を同時に接触させるような形態、（ｃ）本酵素と２種もしくは１種の基質とを先ず接触させ、一定時間保温した後、被験物質を添加するような形態、のいずれの形態であってもよい。
上記（ａ）の場合には、本酵素と被験物質との接触時間として、例えば、１分間以上（好ましくは１分間以上１時間以内）をあげることができる。当該接触系における保温温度としては、例えば、１０℃〜５０℃（好ましくは２０℃〜４０℃）をあげることができる。
また上記（ｃ）の場合には、当該接触系における保温温度として、例えば、１０℃〜５０℃（好ましくは２０℃〜４０℃）をあげることができる。
【００１９】
上記の形態において本酵素の活性を測定する場合には、トリグリセライド合成酵素（DGATase）と被験物質との接触系内における当該被験物質の濃度としては、被検物質が低分子化合物の場合、例えば、０．０１μＭ〜５０ｍＭ（好ましくは０．１μＭ〜５０ｍＭ）をあげることができる。基質の濃度としては、例えば、１μＭ〜１０ｍＭ（好ましくは１０μＭ〜１ｍＭ）があげられる。一方、被験物質と接触させる本酵素の濃度としては、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ以上（好ましくは１μｇ／ｍｌ以上）をあげることができる。
【００２０】
上記の形態において本酵素の活性を測定する場合には、例えば、本酵素、被験物質及び基質を含有する混合液を一定時間反応させた後、当該反応における基質等の原料物の減少量を分析する方法、あるいは、当該反応における生成物の増加量を分析する方法等をあげることができる。これらの方法は公知のいずれかの活性測定法であってもよい。具体的には、前述のような、特開平８−１８２４９６、新生化学実験講座４  脂肪Ｉ,８５頁等に記載される方法等があげられる。
上記の形態において本酵素の活性を測定する場合には、その活性測定時の反応温度としては、例えば、１０℃〜５０℃（好ましくは２０℃〜４０℃）をあげることができる。反応時間としては、例えば、１分間以上（好ましくは５分間〜１時間）があげられる。反応ｐＨとしては、例えば、６．５〜９（好ましくはｐＨ７．５〜８）をあげることができる。
【００２１】
酵素反応における基質等の原料物もしくは生成物の検出又はその量の測定には、反応液を、例えば、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと記す。）、薄層クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー等で分離した後、当該原料物もしくは生成物の紫外線吸収や放射活性（予めラジオアイソトープで標識された前記原料物を用いた場合）等を検出したり、又は紫外線吸収度や放射活性度等を測定するような方法を用いればよい。尚、上記分析の際に反応液から蛋白質を除去しておく必要がある場合には、例えば、Methods Enzymol. 280, 211-221等に記載される方法により反応液から蛋白質を除去すればよい。
【００２２】
上記のようにして測定された活性と対照（即ち、基準物質、ネガティブコントロール等）における活性とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質のマラリア原虫増殖抑制能力を評価する。このようにして被験物質が有するマラリア原虫増殖抑制能力の検定（本発明検定方法）を行うことができる。
本発明検定方法において、測定された活性と対照における活性とを比較する場合には、異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質がマラリア原虫増殖抑制能力を有さない物質（例えば、溶媒、バックグランドとなる試験系溶液等のネガティブコントロール）とすることで、他方の被験物質が有するマラリア原虫増殖抑制能力を評価してもよいし、また前記の異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質（例えば、基準物質）が有するマラリア原虫増殖抑制能力を基準としながら他方の被験物質が有するマラリア原虫増殖抑制能力を評価してもよい。もちろん両者で評価してもよい。
【００２３】
上記の形態でおいて本酵素の活性を測定する場合において、例えば、本発明検定方法の第一工程が、２種の基質（例えば、１，２−ジアシルグリセロール及び脂肪酸ＣｏＡ）と被験物質との３者が本酵素と接触する形態（即ち、前記（Ａ））の場合であって、かつ当該工程で対照としてネガティブコントロールと基準物質（例えば、標準的な基質）との両者を用いる場合には、トリグリセライド合成酵素（DGATase）の活性測定値を用いて、下記の式に従って阻害率を求めるとよい。
阻害率（％）＝｛対照（ネガティブコントロール）値−測定（被験物質）値｝×１００／対照（ネガティブコントロール）値
そして算出された阻害率によりマラリア原虫増殖抑制能力を評価すればよい。一方、本発明検定方法の第一工程が、２種の基質（例えば、１，２−ジアシルグリセロール及び脂肪酸ＣｏＡ）と被験物質との３者が本酵素と接触する形態（即ち、前記（Ａ））の場合であって、かつ当該工程で対照としてマラリア原虫増殖抑制能力を有する物質（基準物質）を用いる場合には、対照（基準物質）値と測定（被験物質）値とを比較することで、マラリア原虫増殖抑制能力を評価すればよい。この場合、測定（被験物質）値が対照（基準物質）値よりも低い値であれば、該被験物質は該基準物質よりもマラリア原虫増殖抑制能力が高いと評価する。
また、例えば、本発明検定方法の第一工程が、２種の基質のうちの一方（例えば、１，２−ジアシルグリセロール又は脂肪酸ＣｏＡ）と被験物質との２者が本酵素と接触する形態（即ち、前記（Ｂ）のケースであって、被験物質を前記２種の基質のうちの他の一方として取り扱う場合）である場合には、対照としてマラリア原虫増殖抑制能力を有する物質（基準物質）を用い、対照（基準物質）値と測定（被験物質）値とを比較することで、マラリア原虫増殖抑制能力を評価すればよい。この場合、測定（被験物質）値が対照（基準物質）値よりも高い値であれば、当該被験物質は当該基準物質よりも本酵素の基質として優れていること、すなわち、当該被験物質は当該基準物質よりも本酵素の競合阻害剤として優れていることになることになる。
【００２４】
マラリア原虫増殖抑制物質（即ち、抗マラリア治療物質）を探索するには、本発明検定方法により評価されたマラリア原虫増殖抑制能力に基づき、マラリア原虫増殖抑制能力を有する物質を選抜すればよい（本発明探索方法）。
例えば、前記（Ａ）の場合であって、かつ対照としてネガティブコントロールを用いる場合には、被験物質のマラリア原虫増殖抑制能力を評価するための指標となる阻害率が、統計学的に有意な値を示す物質、具体的に好ましくは、例えば、上記の式における阻害率が３０％以上を示す物質、より好ましくは５０％以上を示す物質を、マラリア原虫増殖抑制能力を有する物質として選抜する。一方、前記（Ａ）の場合であって、かつ対照としてマラリア原虫増殖抑制能力を有する物質（基準物質）を用いる場合には、測定（被験物質）値が対照（基準物質）値よりも低い値を示す物質をマラリア原虫増殖抑制能力を有する物質として選抜する。また、例えば、上記（Ｂ）の場合には、測定（被験物質）値が対照（基準物質）値よりも高い値を示す物質をマラリア原虫増殖抑制能力を有する物質として選抜する。
上記の「マラリア原虫増殖抑制能力を有する物質」は、本発明酵素が有するトリグリセライド合成酵素活性を低下させる能力を有する限り、例えば、低分子化合物、ポリヌクレオチド、蛋白質又はペプチド等のいかなる物質であってもよい。
より具体的には、例えば、（ａ）本発明酵素のトリグリセライド合成酵素活性を低下させる低分子化合物、（ｂ）本発明遺伝子のアンチセンス核酸、（ｃ）本発明酵素と特異的に結合する抗体等を挙げることができる。
【００２５】
本発明探索方法によって選抜された物質はマラリア原虫増殖抑制活性を有しており、抗マラリア治療剤の有効成分として使用することができる。
【００２６】
本発明のトリグリセライド合成酵素は、上記のように、マラリア原虫増殖抑制能力を評価するための指標を提供する試薬として使用することができる。
【００２７】
トリグリセライド合成酵素（DGATase）阻害能力を有する物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とするマラリア原虫増殖抑制剤（即ち、抗マラリア治療剤：以下、本発明抑制剤と記すこともある。）は、その有効量を経口的または非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。例えば、経口的に投与する場合には、本発明抑制剤は錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の通常の形態で使用することができる。また、非経口的に投与する場合には、本発明抑制剤を溶液、乳剤、懸濁液等の通常の液剤の形態で使用することができる。前記形態の本発明抑制剤を非経口的に投与する方法としては、例えば注射する方法、坐剤の形で直腸に投与する方法等を挙げることができる。
前記の適当な投与剤型は許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等にトリグリセライド合成酵素阻害能力を有する物質を有する物質またはその薬学的に許容される塩を配合することにより製造することができる。また注射剤型で用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明抑制剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合には成人で１日あたり有効成分量として約１ｍｇ〜約２ｇ、好ましくは有効成分量として約５ｍｇ〜約１ｇを投与すればよく、注射の場合には成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
【００２８】
以下に、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
（配列番号１および２で示される配列（マラリア原虫ＤＧＡＴ１）の抽出）
マウスＤＧＡＴ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ番号：ＡＡＣ７２９１７．１）およびヒトＤＧＡＴ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ番号：ＡＡＣ６３９９７．１）の全長部分を用いて、本アミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列をＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi)のアミノ酸配列データベースから、ｔｂｌａｓｔｎプログラムによって抽出した。その結果、配列番号２に示すアミノ酸配列をマラリア原虫ＤＧＡＴ１の候補アミノ酸配列として抽出し、さらに本アミノ酸配列をコードする遺伝子配列を同ＮＣＢＩ遺伝子データベースよりマラリア原虫ＤＧＡＴ１の候補遺伝子配列（配列番号１）として抽出した。
【実施例２】
【００３０】
（配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの取得）
配列番号１で示される遺伝子の哺乳動物細胞における発現効率を上昇させるために、配列番号３に示す塩基配列を設計した。具体的には、配列番号１の中のコドンを、同一アミノ酸をコードする別のコドンに入れ替える（例：ＡＡＴ→ＡＡＣ）操作により、配列番号３の塩基配列を設計した。配列番号３で示される塩基配列の５‘末端にＡＣＧＣＧＴＧＣＣＡＣＣ配列（配列番号４）を、３‘末端にＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣ配列（配列番号５）を付加した配列から成るオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈｓｉｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によって合成した。サンガーの方法（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ、Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ、Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．(１９７７), ７４, ５４６３−５４６７）により、配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの塩基配列を決定した。合成したオリゴヌクレオチドをｐＴ７−Ｂｌｕｅ ｖｅｃｔｏｒ(Ｎｏｖａｇｅｎ社)にサブクローニングすることにより調製されたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換した。形質転換された細胞を５０μg/ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地１００ｍＬで培養することにより得られる培養菌体から前記プラスミドをＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ社)を用いて分離・精製することにより、配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプラスミドを得た。
【実施例３】
【００３１】
（配列番号２で示されるアミノ酸配列の蛋白質を発現するプラスミドの調製）
実施例２で得られたプラスミドを、制限酵素ＭｌｕＩとＮｏｔＩを用いて切断し、同様に切断したｐＡＰ３ｎｅｏプラスミド（宝酒造社）に挿入した。サブクローニングすることにより調製されたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換した。形質転換された細胞を５０μg/ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地１００ｍＬで培養することにより得られる培養菌体から前記プラスミドをＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ社)を用いて分離・精製することにより、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質（以下、ＰｆＤＧＡＴ１蛋白質と記すこともある。）を発現するプラスミドを得た。
【実施例４】
【００３２】
（ＰｆＤＧＡＴ１蛋白質を発現する細胞の調製）
実施例３で得られたＰｆＤＧＡＴ１蛋白質発現用プラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ試薬キット（インビトロジェン社）を用いて、当該試薬キットに添付される手順書に従って、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（大日本製薬社）に導入した。発現用プラスミドが導入されたＣＨＯ−Ｋ１の形質転換細胞を、当該細胞の購入時に配布される手順書に従って２４時間培養した。
【実施例５】
【００３３】
（ネガティブコントロールとなる細胞の調製）
対照（ネガティブコントロール）として、ＰｆＤＧＡＴ１蛋白質発現用プラスミドの代わりにｐＡＰ３ｎｅｏ（ＰｆＤＧＡＴ挿入配列を含まないもの）を用いる以外は実施例４に記載される方法と同様の方法により、形質転換細胞（対照）を得た。
【実施例６】
【００３４】
（本酵素を含む除核細胞抽出液の調製）
実施例４および５で得られた形質転換細胞を培養後、細胞をＤ−ＰＢＳ（ギブコ社）で２回洗浄した後、セルスクレイパーによりかき集め、これを遠心分離することにより細胞を回収した。回収された細胞を５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ ７．５）、０．２５Ｍスクロース、１ｍＭエチレングリコールビス２アミノエチルエーテル四酢酸（以下、ＥＧＴＡと記す。）、１００分の１容量のプロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社）を含む緩衝液（以下、緩衝液Ａと記す。）に懸濁した。この懸濁液を超音波処理（氷冷下、５秒間×６回）することにより懸濁液中の細胞を破砕した後、得られた細胞破砕液を１０００×ｇ、３０秒間、４℃で遠心分離することにより、未破砕の細胞及び核画分を沈殿として取り除いた。得られた上清について、ウシ血清アルブミンを標準としたブラッドフォード法により蛋白質の濃度を測定したものを、除核細胞抽出液とした。
【実施例７】
【００３５】
（ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性の測定）
実施例６で得られた除核細胞抽出液１０μＬを１５０μＬの反応用緩衝液（０．２５Ｍ ショ糖、１００ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ ７．５）、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１．２５ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン、０．５ｍＭ １，２−ジオレオイルグリセロール、０．６７％ ＤＭＳＯ、３０μＭ（０．０３μＣｉ）［１４Ｃ］パルミトイル−コエンザイムＡ）に懸濁した後、この混合物を室温で１０分間保温した。尚、１，２−ジオレオイルグリセロールを含まない以外は上記の同じ組成である反応用緩衝液を用いて上記と同様の操作を行った試験系をバックグラウンド区とした。
次に、当該混合物に３００μＬのヘプタン／２−プロパノール／水（＝８０：２０：２）を加えて撹拌し、１０分間放置した後、さらに当該混合物に２００μＬのヘプタン及び１００μＬの水を加えて撹拌した。攪拌後、当該混合物を遠心分離することにより下層を取り除いた後、残った上層を遠心エバポレータを用いて乾固した。このようにして得られた乾固物（脂肪画分）をクロロホルムに再溶解した。次にこの溶解液をシルカゲル１５０薄層クロマトグラフィー用ガラスプレート（Ｋ５シリカゲル１５０オングストローム、ワットマン社）にスポットし、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７５：２５：１）の展開溶媒を用いて展開することにより、当該溶解液に含まれる［１４Ｃ］トリアシルグリセロールを分離した。分離された［１４Ｃ］トリアシルグリセロールを、バイオイメージングアナライザシステムＢＡＳ−２０００（富士フィルム社）を用いて定量した。
対照（ネガティブコントロール）のプラスミドが導入された試験系及びＰｆＤＧＡＴ１蛋白質発現用プラスミドが導入された試験系において、それぞれの除核細胞抽出液中のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性を図１に示した。
以上より、ＰｆＤＧＡＴ１蛋白質発現用プラスミドが導入された試験系では、対照（ネガティブコントロール）のプラスミドが導入された試験系と比較して、除核細胞抽出液中のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性が上昇したことから、配列番号２に示したアミノ酸配列からなる蛋白質がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性を示すことが確認された。
【実施例８】
【００３６】
（細胞のトリグリセライド合成の測定）
実施例４および５で得られた細胞を６穴プレート中でコンフルエント状態になるまで培養した。この細胞の培地を、１０％ ウシ血清、１０ｎｇ／ｍＬ ウシインシュリン、終濃度６．４５μＭ［Ｕ−１４Ｃ］Ｄ−グルコース（アマシャム社製、放射活性４ｍＣｉ／Ｌ）を含むＦ−１２培地（シグマ社製）に交換後、３７℃で４時間培養した。培養後の細胞をＰＢＳ緩衝液で１回洗浄後、細胞を１ｍｌのヘプタン・イソプロパノール（２：１）で１０分間処理した。細胞中のトリグリセライドを含むヘプタン・イソプロパノール液をピペットで回収し、回収液を遠心エバポレータを用いて乾固した。このようにして得られた乾固物（脂肪画分）をクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）３０μｌに再溶解した。次にこの溶解液をシリカゲル１５０薄層クロマトグラフィー用ガラスプレート（Ｋ５シリカゲル１５０オングストローム、ワットマン社）にスポットした。密閉容器にヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７５：２５：１、ｖ／ｖ）の展開溶媒を入れ、当該展開溶媒を用いて前記ＴＬＣプレートを展開した後、当該ＴＬＣプレートを室温で乾燥した。乾燥された当該ＴＬＣプレートにイメージングプレート（富士フィルム社）を１６時間露光させた。露光終了後、イメージングプレートをバイオイメージアナライザー（ＢＡＳ２５００、富士フィルム社）で分析し、前記ＴＬＣプレート上のトリアシルグリセロールの展開位置に相当する部分の［１４Ｃ］放射活性を測定した。
対照（ネガティブコントロール）のプラスミドが導入された試験系及びＰｆＤＧＡＴ１蛋白質発現用プラスミドが導入された試験系において、それぞれの細胞のトリグリセライド合成量の測定結果を図２に示した。
その結果、ＰｆＤＧＡＴ１蛋白質発現用プラスミドが導入された試験系では、対照（ネガティブコントロール）のプラスミドが導入された試験系と比較して、細胞内において合成されたトリアシルグリセロール量が有意に増加していたことから、配列番号２に示したアミノ酸配列からなる蛋白質が、細胞内においてトリグリセライド合成に寄与することが確認された。
【実施例９】
【００３７】
（マラリア原虫ＤＧＡＴ１（ＰｆＤＧＡＴ１）阻害剤のスクリーニング例）
本発明酵素（ＰｆＤＧＡＴ１）の阻害剤は、例えばＪ．Ｂ．Ｒｏｄｇｅｒｓらの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０、ｐ４２７−４３２）に準じてスクリーニングすることが可能である。本方法は、ＤＧＡＴによって触媒される反応によって遊離したコエンザイムＡのＳＨ基を、５，５‘−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（以下、ＤＴＮＢと記す）と反応させ、反応産物の発色を定量する方法である。具体的には、実施例６で得られるＰｆＤＧＡＴ１発現細胞の除核細胞抽出液１０μＬを、被験物質（１％  ジメルスホキシド（以下、ＤＭＳＯと記す。）溶解液）を含む３００μＬの反応用緩衝液（６７ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ ８．０）、１ｍＭ ＤＴＮＢ、０．６７％ ウシ血清アルブミン、０．１ｍＭ １，２−ジオレオイルグリセロール、０．６７％ ＤＭＳＯ、３０μＭ パルミトイル−コエンザイムＡ）に懸濁した後、この混合物を３０℃で保温する。尚、被験物質無添加区では、前記の被験物質のＤＭＳＯ溶液に代えて１％のＤＭＳＯのみを添加すること以外は前記と同様な方法を用いた。また、バックグラウンド区では、前記の被験物質及び１、２−ジオレオイルグリセロールに代えてＤＭＳＯのみを添加すること以外は、被験物質及び１、２−ジオレオイルグリセロール添加区と同様な方法を用いた。
反応開始１０分後に反応液に１００ｍＭ 酢酸ナトリウム溶液を添加することにより反応停止し、４１２ｎｍの吸光度を測定する。被験物質添加区の測定値を、被験物質を添加した場合のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性（測定値Ａと記す）とする。被験物質無添加区及びバックグラウンド区についても、同様な方法を用いてＤＧＡＴａｓｅ活性を測定し、それぞれ測定値Ｂ、測定値Ｃとする。これらの測定値から、被験物質のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ阻害能力を阻害率（（測定値Ｂ−測定値Ａ）×１００／（測定値Ｂ−測定値Ｃ））として算出することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明により、マラリア原虫増殖抑制能力を有する物質を探索するために必須となる、簡便なマラリア原虫増殖抑制能力の検定方法等を提供することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】対照（ネガティブコントロール）のプラスミドが導入された細胞（Ｖｅｃ）および、ＰｆＤＧＡＴ１蛋白質発現用プラスミドが導入された細胞（ＰｆＤＧＡＴ１）の除核細胞抽出液について、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性を測定した。ＤＧＡＴの基質無添加（ＤＭＳＯ）および基質添加（１，２−ＤＯＧ）時のＤＧＡＴ活性をそれぞれ示す図である。
【図２】対照（ネガティブコントロール）のプラスミドが導入された細胞（Ｖｅｃ）および、ＰｆＤＧＡＴ１蛋白質発現用プラスミドが導入された細胞（ＰｆＤＧＡＴ１）について、グルコース標識によるトリグリセライド合成量を測定した結果を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００４０】
配列番号３
配列番号１に記載の遺伝子の変異体
配列番号４
制限酵素：ＭｌｕＩ認識配列及びコザック配列
配列番号５
終始コドン及び制限酵素：ＮｏｔＩ認識配列
【図１】
2005087012.tif 000002
【図２】
2005087012.tif 000003
【配列表】
2005087012000001.app