(57)【要約】【課題】  物質が有する、注射器を用いた投与における疼痛作用の優れた検出方法等を提供すること。【解決手段】  本発明は、物質が有する、注射器を用いた投与における疼痛作用の検出方法であって、（１）被験物質（但し、ホルマリンを除く）を含有する注射剤を、予め鎮痛作用を有する物質が投与されたマウスの足蹠に注射器を用いて皮下投与する工程、（２）注射器を用いて皮下投与されたマウスの行動変化として足のリフティングの出現頻度及び／又は持続時間を観察又は測定する工程、（３）観察又は測定された出現頻度及び／又は持続時間と対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の注射器を用いた投与における疼痛作用を評価する工程、を有することを特徴とする方法等に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質が有する、注射器を用いた投与における疼痛作用の検出方法であって、
（１）被験物質（但し、ホルマリンを除く）を含有する注射剤を、予め鎮痛作用を有する物質が投与されたマウスの足蹠に注射器を用いて皮下投与する工程、
（２）注射器を用いて皮下投与されたマウスの行動変化として足のリフティングの出現頻度及び／又は持続時間を観察又は測定する工程、
（３）観察又は測定された出現頻度及び／又は持続時間と対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の注射器を用いた投与における疼痛作用を評価する工程、
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
対照が、予め鎮痛作用を有する物質が投与されていないマウスでありその足蹠に前記注射剤が皮下投与されたマウスにおいて、観察又は測定された行動変化としての足のリフティングの出現頻度及び／又は持続時間であることを特徴とする請求項１又は２記載の検定方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の検定方法により評価された注射器を用いた投与における疼痛作用に基づき注射器における疼痛作用を有しない物質を選抜することを特徴とする注射剤として適する物質の探索方法。
【請求項４】
請求項３記載の探索方法により選抜された物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする注射剤。
【請求項５】
物質が有する注射器を用いた投与における疼痛作用を検出するための指標として、マウスの行動変化を観察又は測定する方法であって、
（１）被験物質（但し、ホルマリンを除く）を含有する注射剤をマウスの足蹠に注射器を用いて皮下投与する工程、及び
（２）注射器を用いて皮下投与されたマウスの行動変化として足のリフティングの出現頻度及び／又は持続時間を観察又は測定する工程、
を有することを特徴とする方法。
【請求項６】
被験物質を含有する注射剤が皮下投与されるマウスの足蹠が、予め鎮痛作用を有する物質が投与されたマウスの足蹠であることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
被験物質を含有する注射剤が皮下投与されるマウスの足蹠が、予め鎮痛作用を有する物質が投与されていないマウスの足蹠であることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項８】
請求項６記載の方法により観察又は測定された出現頻度及び／又は持続時間と、請求項７記載の方法により観察又は測定された出現頻度及び／又は持続時間とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の注射器を用いた投与における疼痛作用を評価する工程を有することを特徴とする物質が有する注射器を用いた投与における疼痛作用の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質が有する、注射器を用いた投与における疼痛作用の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、物質が有する、注射器を用いた投与における疼痛作用を検出する方法として、ラットの足蹠に被験物質(セファゾリン（cefazolin）、セファロチン（cephalothin）、セフォキシチン（cefoxitin）)を含有する注射剤を皮下投与し、例えば、足を舐める行動、体の一部に殆ど体重をかけずに足を床面等に置く行動、軽いよろめき歩く行動、床面等への足の接触を避ける行動及び/又は明らかなよろめき歩く行動等の痛みに関わる行動変化の種類及びその程度をスコア付けしながら、１分間隔で１５分間観察する方法が知られている。（例えば、非特許文献１参照）
一方、鎮痛剤の探索方法として、予め被験物質を含有する経口剤が全身曝露経路により投与されたマウスの足蹠に炎症剤であるホルマリンを投与（皮下投与）し、例えば、バイティング（biting）、リッキング（licking）、リフティング（lifing）等の痛みに関わる行動変化を観察する方法（前述の行動の持続時間を秒単位で測定し、５分間毎の総計を記録する。）が知られている。（例えば、非特許文献２参照）
【非特許文献１】G.J.Ghellman, fundamental and applied toxicology, 15, 697-709, 1990
【非特許文献２】柴田学,他, 日薬理誌, 87, 405-415, 1986
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、前者方法（即ち、非特許文献１記載の公知方法）は、予め鎮痛作用を有する物質が投与されていないラットでありその足蹠に被験物質を含有する注射剤が皮下投与されたラットにおいて観察又は測定された種々痛みに関連する行動の出現頻度と、予め鎮痛作用を有する物質が投与されていないラットでありその足蹠に疼痛作用を有さない物質を含有する注射剤が皮下投与されたラットにおいて観察又は測定された同様の行動変化を比較し、得られる差異に基づき前記物質の注射器を用いた投与における疼痛作用を評価するというものであるために、被験物質によっては観察又は測定された行動変化に明らかな差異が発生せず、物質が有する、注射器を用いた投与における疼痛作用を検出する方法としては極めて不十分なものであり、到底満足できるものではなかった。
また、後者方法（即ち、非特許文献２記載の公知方法）は、物質が有する、注射器を用いた投与における疼痛作用の検出方法ではなく、鎮痛剤の探索方法であって、その目的のために、炎症剤であるホルマリンが足蹠に投与されるマウスでは予め被験物質を含有する経口剤が全身曝露経路により投与されるというものであった。そして、当該炎症による痛みの程度は組織障害を生じる程強いものであり、前記マウスにおいて観察又は測定された行動変化として足のリフティングの出現頻度及び／又は持続時間は主なる指標とはならず、他の指標（即ち、バイティング、リッキング等の出現頻度）を用いることが必須であった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
このような状況下、本発明者らは、物質が有する、注射器を用いた投与における疼痛作用の優れた検出方法の開発を目指して鋭意検討した結果、被験物質（但し、ホルマリンを除く）を含有する注射剤を予め鎮痛作用を有する物質が投与されていないマウスを用いて、当該マウスの行動変化として足のリフティングの出現頻度及び／又は持続時間を観察又は測定すること、そして好ましくは、対照として予め鎮痛作用を有する物質が投与されていないマウスでありその足蹠に生理食塩液などの媒体が皮下投与されたマウスを用いること、等により前記疼痛作用の正確でかつ高感度で検出できるよう改善されるとともに、その被験物質量の減少や実験動物への負担軽減も可能となることを見出し、本発明に至った。
【０００５】
即ち、本発明は、
１．物質が有する、注射器を用いた投与における疼痛作用の検出方法であって、
（１）被験物質（但し、ホルマリンを除く）を含有する注射剤を、予め鎮痛作用を有する物質が投与されたマウスの足蹠に注射器を用いて皮下投与する工程、
（２）注射器を用いて皮下投与されたマウスの行動変化として足のリフティングの出現頻度及び／又は持続時間を観察又は測定する工程、
（３）観察又は測定された出現頻度及び／又は持続時間と対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の注射器を用いた投与における疼痛作用を評価する工程、
を有することを特徴とする方法（以下、本発明検定方法と記すこともある。）；
２．対照が、予め鎮痛作用を有する物質が投与されていないマウスでありその足蹠に前記注射剤が皮下投与されたマウスにおいて、観察又は測定された行動変化としての足のリフティングの出現頻度及び／又は持続時間であることを特徴とする前項１又は２記載の検定方法；
３．前項１又は２記載の検定方法により評価された注射器を用いた投与における疼痛作用に基づき注射器における疼痛作用を有しない物質を選抜することを特徴とする注射剤として適する物質の探索方法；
４．前項３記載の探索方法により選抜された物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする注射剤；
５．物質が有する注射器を用いた投与における疼痛作用を検出するための指標として、マウスの行動変化を観察又は測定する方法であって、
（１）被験物質（但し、ホルマリンを除く）を含有する注射剤をマウスの足蹠に注射器を用いて皮下投与する工程、及び
（２）注射器を用いて皮下投与されたマウスの行動変化として足のリフティングの出現頻度及び／又は持続時間を観察又は測定する工程、
を有することを特徴とする方法；
６．被験物質を含有する注射剤が皮下投与されるマウスの足蹠が、予め鎮痛作用を有する物質が投与されたマウスの足蹠であることを特徴とする前項５記載の方法；
７．被験物質を含有する注射剤が皮下投与されるマウスの足蹠が、予め鎮痛作用を有する物質が投与されていないマウスの足蹠であることを特徴とする前項５記載の方法；
８．前項６記載の方法により観察又は測定された出現頻度及び／又は持続時間と、前項７記載の方法により観察又は測定された出現頻度及び／又は持続時間とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の注射器を用いた投与における疼痛作用を評価する工程を有することを特徴とする物質が有する注射器を用いた投与における疼痛作用の検出方法；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明検定方法を使用することによって、物質が有する、注射器を用いた投与における疼痛作用の正確でかつ高感度で検出できるよう改善されるとともに、その被験物質量の減少や実験動物への負担も軽減可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明における「物質が有する、注射器を用いた投与における疼痛作用」とは、注射器を用いて当該物質を投与した際に生じる全ての痛みを包含するものである。よく知られているものとしては、例えば、はっきりとして鋭い局在の明瞭な疼痛、さらにうずくような瀰漫した不快感を主訴として起こる疼痛等を挙げることができる。
【０００９】
まず第一に、被験物質（但し、ホルマリンを除く）を含有する注射剤を、予め鎮痛作用を有する物質が投与されたマウスの足蹠に注射剤を用いて皮下投与する工程について説明する。尚、対照等として予め鎮痛作用を有する物質が投与されていないマウスを用いる場合にも同様な方法によってマウスの足蹠に注射剤を用いて皮下投与すればよい。
本発明に用いられる被験物質（但し、ホルマリンを除く）とは、ホルマリン以外の物質であって、医薬品、農薬を含む全ての天然又は合成有機化合物又は無機化合物である。好ましくは、炭素原子数２個以上の天然又は合成有機化合物のようなものがよい。
【００１０】
本発明に用いられるマウスとしては、例えば、４〜５週齢のICR系雌雄マウス等を挙げることができる。これらのマウスは、例えば、日本チャールズリバー等から購入することができる。
【００１１】
被験物質の投与方法としてはマウスの足蹠（一脚、後ろ足）に注射器（ディスポーザブルの注射器）を用いて被験物質（但し、ホルマリンを除く）を含有する注射剤（注射用水に溶解する）を皮下投与（50μl/匹）する。
【００１２】
このようにして注射器を用いて被験物質（但し、ホルマリンを除く）を含有する注射剤が皮下投与されたマウスの行動変化として足のリフティングの出現頻度及び／又は持続時間を観察又は測定する。足のリフティングの出現頻度及び／又は持続時間を観察又は測定する時期として、被験物質投与直後から開始することが好ましく、さらに、足のリフティングが消失するまでの期間が好ましい。より好ましくは前記注射剤が皮下投与された直後〜10分間が挙げられる。
【００１３】
次に、注射器を用いて皮下投与されたマウスの行動変化として足のリフティングの出現頻度及び／又は持続時間を観察又は測定する工程について説明する。
本発明における「足のリフティング」とは、動物が投与された足を床面に触れることを避けるというような行動であり、ひどい時には舐める、噛む又はキックする等の行動も発現する。そして「足のリフティングの出現頻度及び／又は持続時間を観察又は測定する」には、例えば、被験物質を動物の足蹠に皮下投与し、直ちに観察用の個別ケージに動物を移す。観察者は足のリフティングの有無をケージ越しに観察し、ストップウォッチ等のタイマーを用いてその時間を測定し、記録用紙に記録する。記録された時間は数分間隔で累積時間を算出する。
【００１４】
そして、観察又は測定された出現頻度或いは持続時間と対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の注射器を用いた投与における疼痛作用を評価する工程について説明する。
対照としては、予め鎮痛作用を有する物質が投与されていないマウスでありその足蹠に前記注射剤が皮下投与されたマウスにおいて、観察又は測定された行動変化としての足のリフティングの出現頻度及び／又は持続時間が好ましい。また例えば、鎮痛作用の有無に関わらず、その鎮痛作用の有無やそのレベルが事前に知られている物質が投与されたマウスでありその足蹠に前記注射剤又は生理食塩液などの媒体が皮下投与されたマウスにおいて、観察又は測定された行動変化としての足のリフティングの出現頻度及び／又は持続であってもよい。さらにまた、例えば、予め鎮痛作用を有する物質が投与されていないマウスでありその足蹠に前記注射剤又は生理食塩液等の媒体が皮下投与されたマウスにおいて、観察又は測定された行動変化としての足のリフティングの出現頻度及び／又は持続時間であってもよい。通常、生理食塩液の投与では足のリフティングは殆ど観察されない。
【００１５】
本発明検定方法を用いて、その検定結果、即ち、当該検定方法により評価された注射器を用いた投与における疼痛作用に基づき注射器における疼痛作用を有しない物質を選抜すれば、注射剤として適する物質を容易に探索することもできる。このような探索方法により選抜された物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有させれば注射剤の有力な候補となりうる。尚、選抜された物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする注射剤として使用する場合には、そのまま又は自体公知の薬学的に許容されうる担体、賦形剤等と混合した医薬組成物として使用に供すればよい。投与量は、投与対象、症状等によって異なるが、例えば、１日約０．００１ｍｇ〜約５ｇ程度、好ましくは約０．０１ｍｇ〜約２ｇ程度であり、これを１日１〜数回に分けて投与してもよい。
【実施例】
【００１６】
以下に本発明を実施例及び試験例により、更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１７】
実施例１
足のリフティングが痛みの指標として適するものであることを確認するために、非麻薬性鎮痛薬であるアミノピリンが予め投与されたマウスの足蹠に、クエン酸ナトリウム緩衝液が被験物質として注射器を用いて左後肢足蹠に皮下投与された後、足のリフティングの発現頻度及び持続時間(リフティングの累積時間)を観察及び測定した。
具体的には、アミノピリン100mg/kgをICR系雄性マウス(日本チャールズリバー株式会社、4週齡)に経口投与してから30分間後に50μlのクエン酸ナトリウム緩衝液を被験物質として、図１に示す如く、２６Ｇ皮内針が付いた注射器を用いて左後肢足蹠に皮下投与した。当該被験物質を投与した後、当該マウスを観察用の個別ケージに素早く移し、タイマーをスタートさせてから、疼痛動作の指標としての「足のリフティング」の発現頻度及び持続時間(リフティングの累積時間)を観察及び測定を開始した。尚、当該「足のリフティング」の発現頻度及び持続時間の観察及び測定は、当該被験物質が投与された足を床面に触れないようにマウスが足を上げた状態、ひどい時には舐める、噛む又はキックする等の行動も含めて、このような行動が発現する毎に開始時間と終了時間(床に後肢をつける)とを記録用紙に記録することにより実施された。
その結果、アミノピリンが予め投与されたマウスの６匹中、足のリフティングが観察されたのは１匹のみであり、残りの５匹については全く観察されなかった。因みに、アミノピリンの媒体(0.5%メチルセルロース)が予め投与されたマウスの場合には、５匹中全てのマウスで足のリフティングが観察された。また、クエン酸ナトリウム緩衝液が被験物質として投与された後の10分間のリフティングの平均累積時間は、アミノピリンの媒体が予め投与されたマウスの場合には３０秒(n=10)であったのに対して、アミノピリンが予め投与されたマウスの場合には２秒(n=10)と明らかに減少した。即ち、クエン酸ナトリウム緩衝液を被験物質として、注射器を用いて左後肢足蹠に皮下投与した後に発現する足のリフティングは、マウス及びヒトで鎮痛作用を有する物質の投与により抑制される行動であり、痛みの指標として適するものであることが確認された。
【００１８】
実施例２
本発明検定方法の精度を確認するために、クエン酸ナトリウム緩衝液の疼痛作用について、当該被験物質が被験物質として投与された後の10分間の足のリフティングの累積時間を、実施例１における試験方法と同様な方法に準じた本発明検出方法を用いて動物ロット間での比較試験を行なった。
具体的には、１群10匹のICR系雄性マウス(日本チャールズリバー株式会社、4週齡)を用い、動物ロット及び実験日を変えて５回試験を行なった。
その結果、予め鎮痛作用を有する物質が投与されていないマウスでの試験系において、当該被験物質が投与された後の10分間の足のリフティングの累積時間は16.9秒、26.7秒、24.5秒、30.1秒及び33.3秒(各試験10匹の平均)であった。一方、予め鎮痛作用を有する物質が投与されていないマウスでの試験系における陰性対照（当該被験物質の代わりに生理食塩液が投与された試験系）では足のリフティングは全く観察されなかった。以上より、若干ばらつきは存在しているものの略同じ精度で、物質が有する、注射器を用いた投与における疼痛作用を検出できることが確認された。
【００１９】
実施例３
被験物質として、カプシロン(血液凝固阻止剤)又は牛血清アルブミンが有する、注射器を用いた投与における疼痛作用を検出するために、実施例１における試験方法と同様な方法に準じた本発明検出方法を用いて試験を行なった。
その結果、カプシロンが被験物質として投与されたマウスの場合には、予め鎮痛作用を有する物質が投与されていないマウスでの試験系において、５匹中全てのマウスで足のリフティングが観察され、その平均累積時間は29.8±25.1秒(平均時間±標準偏差)であった。一方、牛血清アルブミンが被験物質として投与されたマウスの場合には、予め鎮痛作用を有する物質が投与されていないマウスでの試験系において、１匹を除いて足のリフティングは観察されなかった。因みに、カプシロンの有効成分はヘパリンナトリウムであり、臨床試験では皮下投与部位の疼痛性血腫が報告されている。
【００２０】
実施例４
ICR系雄性マウス(日本チャールズリバー株式会社、4週齡)を個別ケージに入れ、環境馴化のため30分間以上放置した。マウスをケージから取り出し、ヒトで投与部位の痛みが報告されているクエン酸ナトリウム緩衝液又はセファロチン(セファム系抗菌剤)溶液を被験物質として、図１に示す如く、２６Ｇ皮内針が付いた注射器を用いて左後肢足蹠に各溶液50μlを皮下投与した。
当該被験物質を投与した後、当該マウスを観察用の個別ケージに素早く移し、タイマーをスタートさせてから、疼痛動作の指標としての「足のリフティング」の発現頻度及び持続時間(リフティングの累積時間)を観察及び測定を開始した。尚、当該「足のリフティング」の発現頻度及び持続時間の観察及び測定は、当該被験物質が投与された足を床面に触れないようにマウスが足を上げた状態、ひどい時には舐める、噛む又はキックする等の行動も含めて、このような行動が発現する毎に開始時間と終了時間(床に後肢をつける)とを記録用紙に記録することにより実施された。
その結果、ヒトでは痛みを起こさないと考えられる生理食塩液が被験物質として投与されたマウスの場合（即ち、陰性対照）には、予め鎮痛作用を有する物質が投与されていないマウスでの試験系において、当該被験物質投与後30分間まで足のリフティングは全く観察されなかった。一方、クエン酸ナトリウム緩衝液又はセファロチン溶液が被験物質として投与されたマウスの場合には、予め鎮痛作用を有する物質が投与されていないマウスでの試験系において、当該被験物質投与後直ちに足のリフティングが観察され、前者では１０例中９例に、後者では１０例中全例に当該行動変化が観察された。また、クエン酸ナトリウム緩衝液が被験物質として投与されたマウスの場合には、予め鎮痛作用を有する物質が投与されていないマウスでの試験系において、当該被験物質投与後10分間以降、足のリフティングは観察されなかったが、セファロチンが被験物質として投与されたマウスの場合には、予め鎮痛作用を有する物質が投与されていないマウスでの試験系において、当該被験物質投与後25分間まで足のリフティングが観察された。
外見上、セファロチンが被験物質として投与された後肢には浮腫、発赤等の明らかな炎症症状が観察されたが、クエン酸ナトリウム緩衝液が被験物質として投与された後肢には何ら変化も観察されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００２１】
本発明検定方法を使用することによって、物質が有する、注射器を用いた投与における疼痛作用の正確かつ高感度で検出できるよう改善されるとともに、その被験物質量の減少や実験動物への負担軽減も可能となる検定方法を提供可能とした。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、被験物質（但し、ホルマリンを除く）を含有する注射剤をマウスの足蹠に注射器を用いて皮下投与する方法を模式化した図である。当該方法において用いられた注射器は２６Ｇ皮内針が付いた注射器であり、当該注射器を用いてマウスの左後肢足蹠に皮下投与するものである。
【図１】
2005214922.tif 000002