(57)【要約】【課題】  接着依存性細胞用の培養装置において、簡便低コストな構成、方法により、培地成分のモニタリングを実現する。【解決手段】  プレート状の培養容器底面に細胞を接着させて培養する。低コスト、簡便、小型、培地使用量の少ない等の特長を有するフィルム状の光学式センサを使用して培地成分のモニタリングを行う。培養容器底側部に形成された凹部の天井面に、培養容器底面に対向してセンサを設置する。培地そのものや、細胞を分散させた培地を用いて、センサを校正する。【効果】  接着細胞の培養が良好に行え、センサによる細胞への悪影響を回避し、センサの校正を簡単かつ正確に遂行できる装置並びに方法を提供できる。【選択図】  図１
2005087005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞の培養容器であって、底面に対向した面に、センサが設置されることを特徴とする培養容器。
【請求項２】
動物細胞の培養容器であって、底の側に設けられた凹部の天井面に、センサが設置されることを特徴とする培養容器。
【請求項３】
請求項１乃至２に記載のセンサが、フィルム状の光学式センサであり、培地の化学成分のモニタリングを行うことを特徴とする培養容器。
【請求項４】
請求項３に記載のセンサは、前記培地を用いて校正されることを特徴とする培養容器。
【請求項５】
請求項１乃至２に記載のセンサが、細胞を含む前記培地の測定対象成分濃度を検定し、校正されることを特徴とする培養容器。
【請求項６】
請求項３乃至５に記載の培養容器を有する培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は動物細胞の培養を行うための用具や方法に係り、特に再生医療に適用するための接着依存性の幹細胞などをディッシュやフラスコなどのプレート状の培養容器底面に接着させて培養する際における培養状態をモニタリングするためのセンサと、センサの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞などをプレート状の培養容器を用いて培養する際に細胞増殖や生存率を測定する方法としては、従来各種の構成からなる計測方法が使用されていた。例えば、非特許文献１には９６ウェルＵ底オキシジェンバイオセンサープレートが記載されている。このウェル底部には蛍光性の酸素センサーを含むシリコンが埋設されており、培地中の細胞などが増殖して酸素を消費すると、シリコン中の酸素濃度が低下し、酸素センサーの蛍光強度が増加する。このプレートを蛍光計測装置と組み合わせることにより、酸素濃度のモニタリングが可能となる。
【０００３】
一方、タンク状の培養槽を用いて細胞などを培養する際に培地成分をモニタリングする方法としては、例えば特許文献１に記載の通り、ｐＨ電極などを培養槽の側面に設置し、培地のｐＨを連続的にモニタリングする方法が知られている。
【０００４】
また、非特許文献１と類似の光学的原理に基づくｐＨセンサの例としては、非特許文献２による光ファイバ型ｐＨセンサなどが知られている。この製品システムは、透過型または反射型の指示薬色素フィルム（ｐＨ指示薬色素をセルロース担体に捕捉したもの）と、それを保持する光ファイバプローブ、光源、分光器などから構成される。プローブ形状はｐＨ電極と類似であるが、検出原理はリトマス試験紙と同様であり、電線ではなく光ファイバを用いて信号を伝達する。
【０００５】
【特許文献１】特許第2643314号
【０００６】
【非特許文献１】ベクトン・ディッキンソン  バイオサイエンス社、バイオコートTM  ファルコンTM  カタログ、ｐ．２６−２７
【非特許文献２】オーシャン  オプティクス社、製品カタログ２００３、ｐ．４５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１の方法を用いて接着性細胞を培養する場合、細胞によってはウェル底面を形成するシリコン樹脂に対する接着性が不十分で、培養が良好に行えないという課題があった。例えシリコン樹脂への接着が十分な場合でも、特に再生医療応用を目的とした細胞を培養する場合、シリコン樹脂へ接着して培養された細胞の安全性を検証するのが煩雑である、という課題があった。
【０００８】
一方、特許文献１や非特許文献２の方法をプレート状の培養容器内部の培地成分のモニタリングへ応用する場合、第１にセンサコストの課題がある。即ち、特許文献１の様にタンク状の培養槽を用いて細胞を培養する場合は、例えば百Ｌの容積のタンク１つにｐＨセンサ１つを設置しても、10^10個規模の大量の細胞を得られるため、単位細胞数当たりのセンサコストは低い。一方、プレート状の培養容器では例えばＴ−７５フラスコでも約10^6個規模の細胞しか得られないため、単位細胞数当たりのセンサコストが高い、という課題がある。第２に、操作性やセンサのサイズの課題がある。即ち、センサを滅菌し、無菌性を確保しつつ確実に着脱したり、コスト低減のためにセンサを滅菌して再利用する操作が必要である。上記と類似の理由により、タンク状の培養槽では単位細胞数当たりのｐＨセンサ設置の手間は少ないが、プレート状の培養容器の場合は、単位細胞数当たりでは煩雑である。関連して、単位細胞数当たりのサイズの課題がある。上記同様、タンク状の培養槽ではセンサのサイズは相対的に小さい。一方、プレート状の培養容器の場合はセンサのサイズが相対的に大きいため、多数のプレートを同時に培養する場合など、インキュベータの内容積のかなりの部分をセンサに占有されてしまい利用効率が低い、という課題がある。第３に、培地コストの課題がある。即ちｐＨ電極の安定動作のためには電極先端の感応膜部分と参照電極の液絡部分を培地中に完全に浸す必要がある。しかし両部分を小型かつ互いに近接して形成することは一般に困難なため、両部分を培地中に完全に浸すためにはｃｍオーダーの厚さの培地が必要となる。非特許文献２に記載の光ファイバ式ｐＨセンサの場合も、試料導入孔がプローブ先端から離れているため、やはりｃｍオーダーの厚さの培地が必要である。大量の培地を使用するタンク状の培養槽ではこれは問題にならないが、プレート状の培養容器では通常培地の必要量は厚さ約数ｍｍで十分であることから、ｐＨセンサを設置するためだけに高価な培地を大量に使用するのは経済性が低いという課題がある。
【０００９】
上記課題を回避する一つの方法としては、特許文献１のｐＨ電極や非特許文献２における光ファイバ型ｐＨセンサの代わりに、非特許文献１のごとく光学式のセンサ材料をプレート底面に設置して、外部に設けた光学的測定装置を用いて計測する方法が考えられる。同様の方式によりｐＨ測定を行うには、例えば非特許文献２に記載の指示薬色素フィルムを転用し、このフィルム状の光学式センサをプレート底面に設置して使用する方法が考えられる。
【００１０】
しかしながら、フィルム状の光学式センサなどをプレート底面に設置して使用する場合、非特許文献１におけると同様の課題がある。即ちプレート底面におけるセンサ材料に対する細胞の接着性が不十分となり、培養が良好に行えない可能性がある。また例え接着が十分な場合でも、特に再生医療への応用を目的とした場合、センサ材料へ接触することによる細胞毒性は未解明であるため、センサ材料へ接着した状態で培養した細胞の安全性を検証するのが煩雑である、という課題があった。
【００１１】
さらに、従来公知の方法に共通する別の課題として、センサの校正法がある。即ち、従来例においてはｐＨセンサ類の校正については特に配慮がなされていない。従来の一般的な方法によれば、培養開始前に、まず校正液を用いてセンサを校正した後、滅菌し、培養容器に無菌的に設置するか、あるいはまずセンサを滅菌、無菌的に容器に設置し、容器内に無菌校正液を導入して校正を行い、校正液を排出する、という事前準備が必要であった。前者の場合は滅菌中に校正がずれて正確性が低下する危険性があり、後者の場合は無菌校正液が大量に必要で手間もかかる、という課題が残されていた。
【００１２】
本発明の目的は、接着依存性の幹細胞などをディッシュやフラスコなどのプレート状の培養容器底面に接着させて培養し、フィルム状の光学式センサを使用して培地成分のモニタリングを行う際、細胞の培養容器底面への接着を妨げることなく培地成分をモニタリング可能とし、またセンサに対する細胞の接触による悪影響を回避することにある。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、培養容器に設置するセンサの校正を簡単かつ正確に遂行する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、接着依存性の幹細胞などをプレート状の培養容器底面に接着させて培養し、低コスト、簡便、小型、培地使用量の少ない等の特長を有するフィルム状の光学式センサを使用して培地成分のモニタリングを行う場合において、培養容器底の側に形成された凹部の天井面に、培地をはさんで、培養容器底面に対向してセンサを設置し、培養容器もしくは培養プレートの底面にはセンサを設置しない、という特有の構成を採用した。また、本発明においては、センサを校正する場合において、培地そのものや、細胞を分散させた培地のｐＨを予め検定しておき、それらの検定値を用いてセンサを校正するか、或いは、実施例３の変形例の改良方式の通り、細胞を分散させた培地のｐＨを別途検定し、その結果を用いてセンサの校正を行うという特有の方法を採用した。本発明は、以上の構成と方法により、上記目的を達成するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、接着依存性の幹細胞などをプレート状の培養容器底面に接着させて培養し、低コスト、簡便、小型、培地使用量の少ない等の特長を有するフィルム状の光学式センサを使用して培地成分のモニタリングを行う場合において、細胞の培養容器底面への接着を妨げず、培養が良好に行える。またセンサに対する細胞の接触を防止できるため、両者の接触に基づく悪影響を回避可能である。さらに、培養容器に設置するセンサの校正を簡単かつ正確に遂行できる、という効果がある。
【実施例１】
【００１６】
本発明の第１の実施例を以下に説明する。図１は、本発明第1の実施例に基づく培養容器１の全体略図、図２は本発明第1の実施例に基づくセンサユニット７の概略平面図、図３は本発明第1の実施例に基づくセンサユニット７の概略側面図、図４は本発明第1の実施例に基づく培養容器１の概略縦断面図、図５は本発明第1の実施例に基づく培養装置の概略図である。
【００１７】
１は培養容器、２は容器側底部、３は容器天部、４は容器蓋、５は培地、６は細胞、７はセンサユニット、８はｐＨセンサ、９はセンサホルダ、１０は凹部、１１は保持機構、１２は培養装置、１３は反射プローブ、１４、１５は光ファイバ、１６は光ファイバ型分光光度計、１７は固定棚である。本培養装置１２にはこの他、温度調節機構、炭酸ガス濃度の計測制御機構が含まれる。またこの他に光ファイバ型分光光度計１６や培養装置１２など全体を統括制御する制御機構などを有するが、これら従来公知の構成要素は本発明の特徴事項ではないため、図示は省略した。
【００１８】
次に、本実施例を特徴づける要素である、培養容器１とそれに内蔵されるセンサユニット７の構造について図１〜４を用いて詳細に述べる。培養容器１は市販のＴ−７５型フラスコと類似の構造であり、容器底部内面には細胞６を接着培養可能である。また容器蓋４には通気性の膜（図示省略）が設けられ、コンタミを起こすことなくガス交換が可能である。
【００１９】
本実施例ではｐＨセンサ８として非特許文献２に記載の光ファイバ型 pH センサシステムにおける反射式指示薬色素フィルムFR-PR型（フェノールレッド）を製造元から購入して使用した。このｐＨセンサ８はｐＨに応じて変色するため、反射光を分光計測することによりｐＨを求めることが出来る、いわゆるフィルム状の光学式化学センサである。開口部を有するステンレス製のセンサホルダ９にｐＨセンサ８を挟み、かしめて固定することにより、センサユニット７を製作した。このセンサホルダ９の開口部を通して、センサを観察可能であり、その吸光スペクトル変化を測定可能である。
【００２０】
本実施例では、容器側底部２をポリスチレンのインジェクション成形により製作した。容器側底部２の一部は張り出し、その下に凹部１０が形成されている。凹部１０に設けられている保持機構１１を用いて、センサユニット７を凹部１０の天井、即ち鉛直上方部分に、容器底面に対向して保持した。容器側底部２の上に容器天部３を接着し、容器蓋４と組み合わせることにより培養容器１を組み立てた。製作の過程において適宜洗浄を行った。培養容器１をアルミラミネート包装に収納して真空脱気した後、アルミラミネート包装の開口部を熱熔着し、密封した。培養容器１を収納したアルミラミネート包装に約２５キログレイのγ線を照射し、滅菌を行うことにより、センサユニット７ごと無菌化された培養容器１を製作した。
【００２１】
次に、本実施例における培養装置１２の構造について図５を用いて説明する（図５では装置前面の扉は省略した）。培養装置１２は基本的に市販の炭酸ガスインキュベータと同様であるが、培養容器１を固定可能な固定棚１７と、センサの分光計測を行うための反射プローブ１３、光ファイバ１４、１５、光ファイバ型分光光度計１６、等を備える点が本実施例の特徴事項である。光ファイバ型分光光度計１６には、励起光源が内蔵され、光ファイバ１４を通して反射プローブ１３から励起光を放射し、フィルム状の光学式センサを照射する。フィルム状の光学式センサからの反射光は反射プローブ１３、光ファイバ１５を通して光ファイバ型分光光度計１６に戻り、フィルム状の光学式センサのスペクトル計測が行われる。
【００２２】
次に、本実施例の動作の一例を図１〜４を用いて説明する。本実施例においては、準備、細胞の播種、培養、継代、回収の操作を行った。以下それぞれの操作について詳述する。なお全ての操作において、動物細胞の操作に必要な、無菌培養のための注意を払った。
【００２３】
準備の操作の詳細は以下の通り。予め培養装置１２を３７℃、炭酸ガス濃度５％、酸素濃度約２０％に設定、維持した。必要な試薬、器具を用意し、作業場所（クリーンベンチ）の準備を行った。以下１．〜５．の手順でｐＨセンサの校正を行った。
【００２４】
１．分光光度計の校正その１（100%校正試料による校正）。センサユニット７の代わりに、アルミ蒸着等により形成したミラーｆを設置した100%校正用の培養容器１ｂを用意した（図示省略）。この100%校正用の培養容器１ｂを培養装置１２の固定棚１７へ設置し、反射スペクトルを計測した。
【００２５】
反射スペクトルの計測法は以下の通り。即ち、光ファイバ型分光光度計１６に内蔵されたハロゲンランプからの光源光を光ファイバ１４を通して反射プローブ１３に導き、培養容器１ｂの底面から入射した。培養容器１ｂの内部に設置したミラーｆで反射された反射光を、反射プローブ１３で捕集し、光ファイバ１５を通して光ファイバ型分光光度計１６に導き、光ファイバ型分光光度計１６内蔵の分光光度計により可視領域のスペクトルを測定した。
【００２６】
このミラーｆによる100%反射スペクトルを、サンプルｓについてのスペクトル、即ち波長λに対する関数
w(λ,ｓ)  、ただしここでは  ｓ＝ｆ、  即ち    w(λ,ｆ)  
として記憶した。
【００２７】
２．分光光度計の校正その２（0%校正試料による校正）。センサユニット７の代わりに、アルミ表面に黒アルマイト加工などにより無反射層を形成した吸光板ｚを設置した0%校正用の培養容器１ｃを用意した（図示省略）。この0%校正用の培養容器１ｃを培養装置１２の固定棚１７へ設置し、反射スペクトルを上記同様の手順により計測した。
【００２８】
この吸光板ｚによる0%反射スペクトルを、波長λに対する関数
w(λ,ｓ)  、ただしここでは  ｓ＝ｚ、  即ち    w(λ,ｚ)  
として記憶した。
【００２９】
３．ｐＨセンサの校正。校正目的とするフィルム状の光学式センサであるｐＨセンサ８を保持したセンサユニット７を設置した培養容器１を用意し、滅菌した高ｐＨ標準液ｈ（ｐＨ10に調製したホウ酸緩衝水溶液）を培養容器１に入れ、培養装置１２の固定棚１７へ設置し、反射スペクトルを上記同様の手順により計測した。計測後、高ｐＨ標準液ｈを純水を用いて培養容器１から洗脱した。
【００３０】
この高ｐＨ標準液ｈに対するｐＨセンサの反射スペクトルを、波長λに対する関数
w(λ,ｓ)  、ただしここでは  ｓ＝ｈ、  即ち    w(λ,ｈ)
として記憶した。
【００３１】
４．透過率、吸光度、ベースライン補正ピーク吸光度の算出。上記高ｐＨ標準液ｈに対するｐＨセンサの透過率 T(λ,ｈ) 、吸光度 Ａ(λ,h) 、ベースライン補正ピーク吸光度 Ap(ｈ) を、サンプルｓに関する下記の一般式
T(λ,ｓ)  ＝  ( w(λ,ｓ) − w(λ,ｚ) )／( w(λ,ｆ) − w(λ,ｚ) )、
A(λ,ｓ)  ＝  - log T(λ,ｓ)、
Ap(ｓ)  ＝  A(ｐ,ｓ) − A(ｂ,ｓ)
において、  ｓ＝ｈ  を代入して下記の通り求めた。 
T(λ,ｈ)  ＝  ( w(λ,ｈ) − w(λ,ｚ) )／( w(λ,ｆ) − w(λ,ｚ) )、
A(λ,ｈ)  ＝  - log T(λ,ｈ)、
Ap(ｈ)  ＝  A(ｐ,ｈ) − A(ｂ,ｈ)
ここでlogは常用対数を表す。また本実施例の場合、ベースライン波長ｂは780〜800nmとし、A(ｂ,ｈ)としてはλ＝770〜800nmにおけるA(λ,h)の平均値を使用した。また、ピーク波長ｐは568〜572nmとし、A(ｐ,ｈ)としてはλ＝568〜572nmにおけるA(λ,ｈ)の平均値を使用した。（以下同様）
５．酸解離定数pKaの決定。本実施例では、センサの酸解離定数pKaとして、文献値である7.5を採用した。以上により、ｐＨセンサの校正が完了した。
【００３２】
播種の動作の詳細は以下の通り。凍結保存された細胞接着性細胞を解凍し、直ちに培地に加え、遠心分離、上清を除去、ペレット状の細胞に培地を加えて再分散した。あるいは、継代操作の途中で得られた分散状態の細胞を使用した。細胞を分散させた培地中の生細胞の濃度（単位体積あたりの数）を計測した。接着面積あたりの生細胞数（播種密度）が所定値となるように、培養に使用する所定量の培地の中の細胞数を調節した。本実施例では培養容器１としてＴ−７５フラスコ相当のものを使用し、底面積は約75  cm^2であった。細胞播種密度は5000個／cm^2としたため、約3.8ｘ10^5個の生細胞を30mLの培地に分散させた。この細胞を分散させた培地を培養容器１へ導入し、培養容器１の容器蓋４を閉め、撹拌した。培養容器１に設けられた凹部１０に気泡がある場合、傾けて震動を与えるなどして、気泡を除去した。
【００３３】
培養の操作の詳細は以下の通り。細胞を播種した培養容器ごと培養装置１２の固定棚１７へ設置して、静置して培養を行った。
【００３４】
ここで細胞の挙動を図４により説明する。培地30ｍＬを底面積75cm^2の培養容器１に入れたため、培地５の厚さは約4mmとなった。本実施例における凹部１０の高さは約2.5mmであったため、図４に図示した通り、培地は
凹部１０の内部に完全に満たされ、凹部１０の上の培地の厚さは約1.5mmであった。当初培地５中に分散されていた細胞６は、培地より比重が大きいため、次第に沈降し、最終的には培養容器１の底面に落下、接着して成長した。本実施例においてセンサユニット７は保持機構１１により凹部１０の天井、即ち鉛直上方部分に、培地をはさんで、保持されている。従って、センサユニット７はもちろん、その構成要素であるセンサホルダ９やｐＨセンサ８は細胞とは接触することなく、培養が行われた。
【００３５】
以降３〜４日に１回の割合で培地交換を行った。また細胞の増殖の様子を適宜観察し、コンフルエントになる前に、下に述べる継代の操作を行った。培地交換や観察、継代の操作を行わない間は、下記に述べる方法でｐＨの計測を間欠的に行い、即ちｐＨのモニタリングを行いながら、培養を継続した。
【００３６】
ｐＨの計測の操作の詳細は以下の通り。
【００３７】
６．上記３と同様の手順により、ただし試料としては高ｐＨ標準液ｂの代わりに未知試料ｓを使用して、ｐＨセンサの反射スペクトルを計測し、波長λに対する関数
w(λ,ｓ)  
として記憶した。
【００３８】
７．透過率、吸光度、ベースライン補正ピーク吸光度の算出。上記４と同様の手順により、未知試料ｓに対するｐＨセンサの透過率 T(λ,ｓ) 、吸光度 Ａ(λ,ｓ) 、ベースライン補正ピーク吸光度 Ap(ｓ) を、サンプルｓに関する下記の一般式
T(λ,ｓ)  ＝  ( w(λ,ｓ) − w(λ,ｚ) )／( w(λ,ｆ) − w(λ,ｚ) )、
A(λ,ｓ)  ＝  - log T(λ,ｓ)、
Ap(ｓ)  ＝  A(ｐ,ｓ) − A(ｂ,ｓ)
として求めた。ここで上記４同様、A(ｂ,ｓ)、A(ｐ,ｓ)としてはｂ、ｐに対応するλの範囲におけるA(λ,ｓ)の平均値を使用した（以下同様）。
【００３９】
８．ｐＨの算出。下記の式により、解離度αと、ｐＨを求めた。
【００４０】
α  ＝  Ap(ｓ)／Ap(ｈ)
pH  ＝  pKa  ＋  log ( α／(1−α) )
なお、ｐＨの適正範囲は一般に7.0から7.4の範囲とされている。そこで、本実施例ではモニタリングの結果、ｐＨが7.0以下や7.4以上になった場合、最適範囲を逸脱したと見なして、培地交換を行い、その事実と日時を記録した。培地交換を行ってもｐＨが適正範囲に収まらないか、あるいは直ぐにまた適正範囲から逸脱した場合、異常事態と見なして、操作者に警報を発して、異常事態の可能性があることを連絡すると共に、原因究明と対策を促した。
【００４１】
継代の操作の詳細は以下の通り。培養容器１をクリーンベンチに移し、Trypsin-EDTAを加え、37℃で５分間加温した後、培養容器１に軽い震動を与えて細胞を剥離した。直ちに培地を加えて反応を停止し、遠心分離、上清除去し、ペレットに培地を加えて再分散した。再分散後の操作は、細胞播種の操作に準じた。
【００４２】
回収の操作の詳細は以下の通り。上記継代操作の前半部分と同様の手順で細胞を剥離し、反応停止、培地に再分散させた。このまま、或いは必要に応じて培地をPBSなどに交換した後、細胞懸濁液として細胞を回収した。
【００４３】
なお本実施例ではセンサとして、フィルム状の光学式センサの１種である反射式指示薬色素フィルムFR-PR型を用いたが、本発明の適用範囲はこのセンサの例に限定されない。本発明に好適に適用可能な他のセンサの例としては、非特許文献２に記載の他の反射式指示薬色素フィルムなどがあり、特に目的とするｐＨ範囲が異なる場合に好適に使用可能である。また、本実施例では反射プローブ１３を使用したため反射式センサを採用したが、入射光と透過光を導く光ファイバを独立させ、それぞれを培養容器の表裏に設置することにより、透過モードでセンサの吸光スペクトルを測定することも可能である。この場合、センサとしては非特許文献２に記載の透過式指示薬色素フィルムが好適に使用可能である。ｐＨを測定可能な光学式センサは、非特許文献２に記載のフィルム以外にも各種使用可能であり、特に指示薬色素を担体に共有結合により固定化したセンサは、長期安定性が高いという特徴がある。また、ｐＨ以外の項目をフィルム状の光学式センサによりモニタリングすることも本発明の範疇である。この例としては、光学式の酸素、炭酸ガス、アンモニアセンサなど各種のガスセンサ、ナトリウムイオン、カリウムイオン、塩化物イオンなどの各種のイオンセンサ、グルコース、アルコール等の中性の生体物質に対するセンサが知られており、上記同様の方法により、本発明に好適に使用できる。
【００４４】
本発明ではフィルム状の光学式センサユニット７を、培養容器１に設けられた凹部１０の天井、即ち鉛直上方部分に、培地をはさんで保持するという特徴的な構成を採用することにより、細胞の培養容器底面への接着を妨げることなく培地のｐＨをモニタリング可能とし、またセンサに対する細胞の接触を防止し、細胞のセンサへの接触による悪影響の可能性を回避したが、本発明の精神は必ずしも上記構成に限定されない。同等の効果をもたらす他の構成の例としては、下記の変形例などがある。
【００４５】
・センサユニットの突出。センサユニット７は、必ずしも培養容器１に設けられた凹部１０の天井部分に完全に収納されている必要はない。センサユニット７の一部が凹部１０から横方向に突出していても、容器底面に対向して保持されていれば、上記同様の効果が得られる。センサホルダ９の開口部が凹部１０の外に露出する場合は、その当該部分（上面）を被覆するか、あるいは上面開口部を無くして下面開口部のみとすることにより、ｐＨセンサ８への細胞の付着を回避できる。
【００４６】
・培養容器１における凹部１０は必須の構成要素ではない。例えば上面に開口部を持たないセンサユニット７を培養容器１の側部に固定し、水平方向に保持することにより、ｐＨセンサ８を容器底面に対向して保持することが可能である。また、センサユニット７を培養容器１底面に設けた柱に固定することにより、容器底面に対向して保持することも可能である。さらに、センサホルダ９として断面が図３に示す直線状でなく、段差又は屈曲を有する形状のものを使用し、鉛直下方向の面を培養容器１底面に固定し、鉛直上方向の面にｐＨセンサ８を固定することにより、ｐＨセンサ８を容器底面に対向して保持することも可能である。
【００４７】
・センサユニットの保持。上記実施例では培養容器１に設けられた凹部１０の天井部分に保持機構１１を設け、センサユニット７を保持機構１１にはめることにより保持した。具体的には、保持機構１１として溝を使用したが、センサユニット７の固定方法はこれに限定されない。保持機構１１の他の例としては、接着材、ばねによる圧接、磁力、電磁力、ネジ、リベット、くさび、等、様々な方式がある。
【００４８】
本実施例特有の効果は、接着依存性の幹細胞などをプレート状の培養容器底面に接着させて培養しながらｐＨをモニタリングする際、上記のごときフィルム状の光学式ｐＨセンサを用いることにより、ｐＨ電極や市販の光ファイバ型ｐＨプローブを用いる場合と比較して、センサのコストが低く、センサを容易に滅菌可能であり、またコストが低いためにセンサをディスポーザブルにでき再利用の手間が省け、サイズが小さく、さらに培地コストも低い、という特長がある。また、センサが培養容器１に設けられた凹部１０の天井、即ち鉛直上方部分に、培地をはさんで保持されているるため、細胞の培養容器底面への接着を妨げることなく培地のｐＨをモニタリング可能であり、またセンサに対する細胞の接触を防止し、細胞のセンサへの接触による悪影響の可能性を回避できる、という特長がある。
【実施例２】
【００４９】
本発明の第２の実施例を以下に説明する。第２の実施例は上記第１の実施例と同様であるが、センサの校正方法が異なる。
【００５０】
即ち、第１の実施例ではセンサの校正手順のうち、手順１．から４．までを準備の操作の一環として、使用開始時に使用者が行い、Ap(ｈ)を求めるとともに、手順５．においてpKaを文献値から求めた。
【００５１】
一方、第２の実施例では製造時に製造者が製造工程の一環として製造工程の途中（センサユニット７を凹部１０の天井に保持した直後、容器側底部２の上に容器天部３を接着する前の状態）で、手順１．〜４．を行ってAp(ｈ)を求めた。また、手順１．と２．は準備の操作の一環として、使用開始時に使用者が再度行い、w(λ,ｆ)、w(λ,ｚ)を求め、手順３．と４．は省略した。またpKaについては文献値では無く、使用時に使用者が中性のｐＨ標準液ｎを測定し、その結果からpKaを推測した（手順５’）。以下、特に手順５’即ちpKaの推定手順について詳細に説明する。
【００５２】
５’．酸解離定数pKaの推定。手順３．と同様に、滅菌した中性のｐＨ標準液ｎ（ｐＨ７に調製したリン酸緩衝水溶液）を培養容器１に入れ、培養装置１２の固定棚１７へ設置し、反射スペクトルを計測した。
【００５３】
この中性のｐＨ標準液ｎに対するｐＨセンサの反射スペクトルを、波長λに対する関数
w(λ,ｓ)  、ただしここでは  ｓ＝ｎ、  即ち    w(λ,ｎ)
として記憶した。
【００５４】
次に、上記４と同様の手順により、中性のｐＨ標準液ｎに対するｐＨセンサの透過率 T(λ,ｎ) 、吸光度 Ａ(λ,ｎ) 、ベースライン補正ピーク吸光度 Ap(ｎ) を、下記の通り求めた
T(λ,ｎ)  ＝  ( w(λ,ｎ) − w(λ,ｚ) )／( w(λ,ｆ) − w(λ,ｚ) )、
A(λ,ｎ)  ＝  - log T(λ,ｎ)、
Ap(ｎ)  ＝  A(ｐ,ｎ) − A(ｂ,ｎ)
として求めた。ここでw(λ,ｆ)、w(λ,ｚ)としては準備の操作の一環として、使用開始時に使用者が再度行った手順１．と２．の結果を用いた。
【００５５】
最後に、pKaを下記により求めた。
【００５６】
α  ＝  Ap(ｎ)／Ap(ｈ)
pKa  ＝  ｐＨ(ｎ)  −  log ( α／(1−α) )
ここでAp(ｈ)は前述の通り製造者が求めた値、またｐＨ(ｎ)は中性のｐＨ標準液ｎの検定ｐＨ値、即ち本実施例では7.0である。
【００５７】
これ以外の点については、実施例２は実施例１と同様である。
【００５８】
本実施例では、ｐＨ校正の手順の一部、即ち高ｐＨ標準液ｈを用いてAp(ｈ)を求める手順を製造工程の一環として、センサ製造時に製造者が行った。従って、使用者が高ｐＨ標準液を操作する工程と、それが終了した後に高ｐＨ標準液を培養容器１から洗脱する工程を省略でき、安全性が高く、簡便である、という特有の効果がある。また、pKaとして文献値ではなく、直前に中性のｐＨ標準液を計測して得られた実験データから求めた推定値を使用するため、ｐＨ測定結果の精度が高く信頼性が高い、という特有の効果がある。
【実施例３】
【００５９】
本発明の第３の実施例を以下に説明する。第３の実施例は上記第２の実施例と同様であるが、ｐＨセンサの校正法の一部が異なる。
【００６０】
即ち、第２の実施例では製造時に製造者が手順１．〜４．を行ってAp(ｈ)を求めた。また使用開始時に使用者が準備の操作の一環として、手順１．と２．を行ってw(λ,ｆ)、w(λ,ｚ)を求め、さらに中性のｐＨ標準液ｎを用いて手順５’．を行うことにより、pKaを求めた。
【００６１】
一方、第３の実施例では製造時に製造者が手順１．〜４．を行ってAp(ｈ)を求め、また使用開始時に使用者が準備の操作の一環として、手順１．と２．を行ってw(λ,ｆ)、w(λ,ｚ)を求めた点は第２の実施例と同様である。
その後、中性のｐＨ標準液ｎではなく、培地を用い、その結果からpKaを推測した（手順５”）。以下、特に手順５”即ちpKaの推定手順について詳細に説明する。
【００６２】
５”．酸解離定数pKaの推定。手順５’．と同様に、培地ｍを培養容器１に入れ、培養装置１２の固定棚１７へ設置し、反射スペクトルが十分に安定するのを待った後、反射スペクトルを計測した。
【００６３】
この培地ｍに対するｐＨセンサの反射スペクトルを、波長λに対する関数
w(λ,ｓ)  、ただしここでは  ｓ＝ｍ、  即ち    w(λ,ｍ)
として記憶した。
【００６４】
次に、上記４と同様の手順により、培地ｍに対するｐＨセンサの透過率 T(λ,ｍ) 、吸光度 Ａ(λ,ｍ) 、ベースライン補正ピーク吸光度 Ap(ｍ) を、下記の通り求めた
T(λ,ｍ)  ＝  ( w(λ,ｍ) − w(λ,ｚ) )／( w(λ,ｆ) − w(λ,ｚ) )、
A(λ,ｍ)  ＝  - log T(λ,ｍ)、
Ap(ｍ)  ＝  A(ｐ,ｍ) − A(ｂ,ｍ)
として求めた。ここでw(λ,ｆ)、w(λ,ｚ)としては準備の操作の一環として、使用開始時に使用者が再度行った手順１．と２．の結果を用いた。
【００６５】
最後に、pKaを下記により求めた。
【００６６】
α  ＝  Ap(ｍ)／Ap(ｈ)
pKa  ＝  ｐＨ(ｍ)  −  log ( α／(1−α) )
ここでAp(ｈ)は前述の通り製造者が求めた値、またｐＨ(ｍ)は事前に求めておいた（安定化後の）培地のｐＨ値、即ち本実施例では7.4である。
【００６７】
これ以外の点については、実施例２は実施例１と同様である。
【００６８】
なお、反射スペクトルの安定待ち時間を十分取ったのは、採用した培地が炭酸系緩衝溶液であるため、炭酸ガスインキュベータ中の炭酸ガスと十分なガス交換を行うまでは、ｐＨが安定しないからである。
【００６９】
また、本実施例の変形例として、操作５”を準備の操作の一環として、使用開始時に行わう代わりに、培養の操作の初期に行う方法も採用できる。即ち、上記５”の操作を純粋な培地ｍを用いて準備の操作の一環として行う代わりに、細胞を培養容器１に播種して培養を開始した直後（モニタリング開始前）に、細胞を分散させた培地ｍ’を用いて、上記５”同様の操作を行うことが出来る。事前検討の結果、培地ｍ’の安定化後のｐＨはｍと同じ7.4であったため、本変形例においても操作５”と同じ計算式でpKaを求めることが出来る。
【００７０】
なおこの変形例の改良方式として、ｍ’のｐＨとして事前検討結果でなく、その時点における実測値を採用することも可能である。例えばｍ’の一部を培養装置１２内に設けた（培養容器１とは異なる別の）容器に分注して、標準ｐＨ電極などの一次標準法で計測し、その値を採用する。この変形例の改良方式によると、ｍ’のｐＨを実測することにより常に真値を用いてｐＨセンサを校正可能なため、極めて高精度な結果が得られる、という特長がある。
【００７１】
本実施例特有の効果は、使用者が中性のｐＨ標準液を計測する工程を省略でき、簡便迅速であることである。また中性のｐＨ標準液等が培養容器１に残留する可能性を排除できるため、培養に用いる培地成分を厳密に制御可能である、という特有の効果がある。また、本実施例の変形例特有の効果は、使用者が培地ｍを計測する工程を一切省略できるため、さらに簡便迅速であることである。また、本実施例の変形例の改良方式特有の効果は、校正に用いる培地ｍ’のｐＨを標準法により検定することにより、極めて高精度な結果が得られることである。
【実施例４】
【００７２】
本発明の第４の実施例を以下に説明する。第４の実施例は上記第１の実施例と同様であるが、培養容器１としてＴ−７５型類似のフラスコではなく、円盤状の培養プレートを用い、また前記培養プレートを自動的に操作して細胞を自動的に培養可能な自動培養装置を用いる点が異なる。
【００７３】
図６はこの自動培養装置と円盤状の培養プレートの概略図、図７は円盤状の培養プレートの概略断面図である。１８は円盤状の培養プレート、１９は自動培養装置である。
【００７４】
図６に示したとおり、円盤状の培養プレート１８は自動培養装置１９に内蔵される。自動培養装置１９にはこの他、反射プローブ１３、光ファイバ１４、１５だけでなく、光ファイバ型分光光度計１６も内蔵される。また図示は省略したが、本自動培養装置１９にはこの他、培養プレート１８の保持回転機構、培地等の試薬の自動分注機構、自動排出機構、温度調節機構、炭酸ガス濃度の計測制御機構、全体の制御機構などを有するが、これらの構成要素は本発明の特徴事項ではないため、図示は省略した。
【００７５】
図７に示したとおり、円盤状の培養プレート１８の断面は概ね前記培養容器１と同等の構造を有する。最大の相違点は、培養容器１が単一の培養区画を有する容器であるのに対し、円盤状の培養プレート１８は、中央部から外周部に向かって順次大きい区画が形成されていることである。中央部から外周部に向かう区画の間は流路で結合されており、不要な廃液を排出するための流路や、最外周部には細胞を回収する区画も形成されている（何れも図示省略）。また、継代数が同じ区画についても複数の区画に区分されており、それらの区画は互いにリブ状構造を有する容器側底部２’によって互いに分離されている。図７には、容器側底部２’により、２つの隣接する区画の間が区分されている様子を模式的に示した。以下簡単のため、主に個々の区画について説明するが、以下の説明は全ての区画に適用される。容器側底部２’の一部は張り出し、その下に凹部１０が形成され、凹部１０に設けられている保持機構１１を用いて、センサユニット７を凹部１０の天井、即ち鉛直上方部分に保持した点は、前記第１から第３の実施例同様である。容器側底部２’の上に容器天部３を接着することにより円盤状の培養プレート１８を組み立てた。センサユニットを有する区画の割合は、全区画数の半分とした。なお、本実施例による円盤状の培養プレート１８には、センサユニット７だけでなく、校正用のミラーｆや、吸光板ｚなどを別途形成してある点も、第１から第３の実施例と異なる。ミラーｆや、吸光板ｚは、センサユニット類似の形状とし、容器側底部２’の別の部分に上記同様に形成した凹部ならびに保持機構を用いて、凹部の天井に保持した。
【００７６】
本発明の動作は、前記第１ないし第３の実施例と基本的に類似であるが、最初の細胞播種の操作と、最後の細胞回収の操作を手作業により行う以外は、全ての操作を円盤状の培養プレート１８を回転又は揺動させることにより生じる遠心力を用いて自動的に行った点が、前記第１から第３の実施例と異なる。特に、剥離した細胞と上清との分離や、廃液の廃棄や、培地に再分散した細胞の移送などは回転による遠心力を利用して行った。また、上清から分離した細胞の培地への再分散、細胞を播種する際の均一化などは円盤状の培養プレート１８を揺動させることにより行った。試薬の分注などは自動分注機構を用いて行った。
【００７７】
センサによるモニタリングは、基本的には第３の実施例の変形例の改良方式と同様の手順で行ったが、準備の操作以降、全ての操作を自動化した点が異なる。
【００７８】
即ち、まず製造時に製造者が自動培養装置１９と同等の機能を有する自動検査装置１９’（図示省略）に円盤状の培養プレート１８（ただしセンサユニット７を凹部１０の天井に保持した直後、容器側底部２’の上に容器天部３を接着する前の状態）を設置した。自動検査装置１９’は、自動的に手順１．〜４．を行い、Ap(ｈ)を求めた。具体的には、手順１．において、センサユニット７と同一円周上に形成した校正用のミラーｆに対して反射プローブ１３が相対する様に円盤状の培養プレート１８を回転させ、光ファイバ型分光光度計を用いて自動的に分光計測を行った。手順２．も同様に、吸光板ｚについて分光計測を行った。以上により、測光系の校正を完了した。手順３．は、自動分注機構を用いて高ｐＨ標準液ｈを円盤状の培養プレート１８に導入し、全てのセンサユニット７について分光計測を行った。手順４．は、全てのセンサユニット７に関して自動的に計算を行い、それぞれについてのAp(ｈ)を求めた。こうして求めた各々のAp(ｈ)を、円盤状の培養プレート１８に内蔵したメモリ（図示省略）に記録した。円盤状の培養プレート１８を洗浄し、容器側底部２’の上に容器天部３を接着後、アルミラミネート包装に収納して真空脱気した後、アルミラミネート包装の開口部を熱熔着し、密封した。円盤状の培養プレート１８を収納したアルミラミネート包装に約２５キログレイのγ線を照射し、滅菌を行うことにより、センサユニット７ごと無菌化された円盤状の培養プレート１８を製作した。
【００７９】
円盤状の培養プレート１８を受領した使用者は、使用開始時に準備の操作の一環として、円盤状の培養プレート１８を自動培養装置１９に設置した。以降、自動培養装置１９は上記同様に自動的に手順１．と２．を行い、w(λ,ｆ)、w(λ,ｚ)を求め、即ち測光系の校正を完了した。
【００８０】
次に、細胞の播種、培養の操作を自動的に開始した。播種、培養の動作は、前記第３の実施例の変形例と同様である。培養の初期の動作について詳細に説明すると、まず使用開始するセンサユニット７の全てについて、細胞を分散させた培地ｍ’を用いて、操作５”の操作を行った。なおここでAp(ｈ)としては製造者が製造時に自動検査装置１９’を用いて上述の通り行った手順１．〜４．結果として得られた値を円盤状の培養プレート１８のメモリから読み出して使用した。またw(λ,ｆ)、w(λ,ｚ)としては使用開始時に自動培養装置１９が準備の操作の一環として、上述の通り行った手順１．と２．の結果として得られた値を用いた。また培地ｍ’に関する事前検討の結果得られたｐＨ値を用いて、センサユニット７の全てについて、pKaを求めた。
【００８１】
以降３〜４日に１回の割合で培地交換を行った。また細胞の増殖の様子を適宜観察し、コンフルエントになる前に、第１の実施例に述べた継代の操作を行った。培地交換や観察、継代の操作を行わない間は、第１の実施例に述べた方法と同様のでｐＨの計測を間欠的に行い、即ちｐＨのモニタリングを行いながら、培養を継続した。またｐＨのモニタリング結果を自動的に判断し、許容範囲逸脱などの際は、自動的に培地交換や警報発令などの対処を行った。
【００８２】
なお、ｐＨの計測の際のパラメータとしては、Ap(ｈ)としては製造者が製造時に自動検査装置１９’を用いて上述の通り行った手順１．〜４．結果得られた値を培養プレート１８のメモリから読み出して使用した。またw(λ,ｆ)、w(λ,ｚ)としては使用開始時に自動培養装置１９が準備の操作の一環として、上述の通り行った手順１．と２．の結果得られた値を用いた。またpKaとしては、培養開始時に自動培養装置１９が上述の通り行った手順５”の結果得られた値を用いた点が、第１の実施例と異なる。
即ち、本実施例においてはｐＨセンサの校正やそれを用いた培地のｐＨ測定など、操作は基本的に全て自動培養装置１９等が自動的に執り行い、操作者は円盤状の培養プレート１８を自動培養装置１９に設置するだけでよい。なお本実施例においては円盤状の培養プレートと回転式の自動培養装置を用いたが、本発明の精神はこの特定の形状、方式の培養プレートや自動培養装置ばかりでなく、他の形状、方式の培養プレートや自動培養装置にも適用可能であることはいうまでもない。
【００８３】
なお本実施例４の改良方式として、実施例３の変形例の改良方式と同様、ｍ’のｐＨとして事前検討結果でなく、その時点における実測値を採用することも可能である。例えばｍ’の一部を自動培養装置１９内に設けた（円盤状の培養プレート１８とは異なる別の）容器に分注して、標準ｐＨ電極などの一次標準法で計測し、その値を採用する。この実施例４の改良方式によると、ｍ’のｐＨを実測することにより常に真値を用いてｐＨセンサを校正可能なため、極めて高精度な結果が得られる、という特長がある。
【００８４】
次に、本発明の効果について説明する。前述の通り、接着依存性の幹細胞などをディッシュやフラスコなどのプレート状の培養容器底面に接着させて培養し、低コスト、簡便、小型、培地使用量の少ない等の特長を有するフィルム状の光学式センサを使用して培地成分のモニタリングを行うする際、本発明は従来例と比較して以下の効果がある。
１．本発明は培養容器底の側に形成された凹部の天井面に、培地をはさんで、培養容器底面に対向してセンサを設置し、培養容器もしくは培養プレートの底面にはセンサを設置しない、という新規な構成を有する。従って、培養容器もしくは培養プレートの底面に対する細胞の接着性は良好で、培養が良好に行える、という特有の効果がある。
２．本発明は培養容器もしくは培養プレートの底面にはセンサを設置しないため、細胞はセンサ材料へ接触しない状態では培養される。従ってセンサへの接触による細胞毒性の心配が無く、細胞の安全性を容易に検証可能であり、再生医療などの用途へ好適に応用可能である、という特有の効果がある。
３．本発明の実施例３や、その変形例の通り、培地そのものや、細胞を分散させた培地のｐＨを予め検定しておき、それらの検定値を用いてセンサを校正するか、或いは、実施例３の変形例の改良方式の通り、細胞を分散させた培地のｐＨを別途検定し、その結果を用いてセンサの校正を行うことにより、校正液の導入、排出工程を省略可能であり、校正の正確性が高く、また校正のためだけの専用液を大量に必要としない、という特有の効果がある。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明は、動物細胞の培養のために広く一般に利用可能であり、特に再生医療に適用するための接着依存性の幹細胞などをプレート状の培養容器底面に接着させて培養する際における培養状態をモニタリングする際に、極めて好適に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】第1の実施例に基づく培養容器１の全体略図。
【図２】第1の実施例に基づくセンサユニット７の概略平面図。
【図３】第1の実施例に基づくセンサユニット７の概略側面図。
【図４】第1の実施例に基づく培養容器１の概略縦断面図。
【図５】第1の実施例に基づく培養装置の概略図。
【図６】第４の実施例に基づく自動培養装置と円盤状の培養プレートの概略図。
【図７】第４の実施例に基づく円盤状の培養プレートの概略断面図。
【符号の説明】
【００８７】
１…培養容器、１ｂ…100%校正用の培養容器、１ｃ…0%校正用の培養容器、２…容器側底部、２’…リブ状構造を有する容器側底部、３…容器天部、４…容器蓋、５…培地、６…細胞、７…センサユニット、８…ｐＨセンサ、９…センサホルダ、１０…凹部、１１…保持機構、１２…培養装置、１３…反射プローブ、１４、１５…光ファイバ、１６…光ファイバ型分光光度計、１７…固定棚、１８…円盤状の培養プレート、１９…自動培養装置。
ｆ…ミラー、ｚ…吸光板、ｈ…高ｐＨ標準液、ｎ…中性のｐＨ標準液、ｂ…ベースライン波長、ｐ…ピーク波長、ｓ…サンプル又は未知試料、ｍ…培地、ｍ’…細胞を分散させた培地。
【図１】
2005087005.tif 000003
【図２】
2005087005.tif 000004
【図３】
2005087005.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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