(57)【要約】【課題】  きわめて低コストでかつ短時間に酸化損傷物質の含有量を決定することができ、さらに、酸化損傷判断解析表を用いて、きわめて容易に、瞬時に、場所をえらばず、生体の酸化損傷の程度を知ることができる、画期的な酸化損傷物質の測定方法を提供する。【解決手段】  採取した尿の中へ、硫酸チタニウム溶液に硫酸酸性溶液を加えて調整した硫酸調整硫酸チタニウム溶液を混合して尿・硫酸チタニウム混合溶液とし、その後、当該尿・硫酸チタニウム混合溶液から求めた尿中の過酸化水素の濃度又は濃度指標により、尿中の酸化損傷物質の含有量を決定する酸化損傷物質の測定方法により課題を解決した。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
採取した尿の中へ、硫酸チタニウム溶液に硫酸酸性溶液を加えて調整した硫酸調整硫酸チタニウム溶液を混合して尿・硫酸チタニウム混合溶液とし、その後、当該尿・硫酸チタニウム混合溶液から求めた尿中の過酸化水素の濃度又は濃度指標により、尿中の酸化損傷物質の含有量を決定することを特徴とする酸化損傷物質の測定方法。
【請求項２】
尿中の酸化損傷物質の濃度と尿・硫酸チタニウム混合溶液の色調程度から求めた尿中の過酸化水素の濃度指標のいずれかを縦軸とし、他方を横軸にした二次元座標を記載し、かつ当該二次元座標上にあらかじめ測定した尿中の酸化損傷物質の濃度及びこれに対応する尿・硫酸チタニウム混合溶液の色調程度から求めた尿中の過酸化水素の濃度指標の数値データを記入し、その結果から作成した検量線を記載した酸化損傷判断解析表に基づき、尿中の酸化損傷物質の含有量を決定することを特徴とする請求項１に記載の酸化損傷物質の測定方法。
【請求項３】
酸化損傷物質は、８−ハイドロキシ−２−デオキシグアノシンであることを特徴とする請求項１又は２に記載の酸化損傷物質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿中の過酸化水素の濃度又は濃度指標により尿中の酸化損傷物質の含有量を決定する酸化損傷物質の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体で発生する活性酸素及びフリーラジカルによる生体構成成分の酸化損傷の度合い、例えば、遺伝子ＤＮＡの酸化損傷度は、試料中の８−ＯＨｄＧの含有量を定量することにより知ることができる。
【０００３】
ここで、調整した試料と抗８−ハイドロキシ−２−デオキシグアノシン（以下「８−ＯＨｄＧ」という。）モノクローナル抗体を反応させた後、酵素標識抗体を添加し、洗浄して発色液を加えると、酵素標識抗体の酵素活性により呈色（青色）するため、その後、反応停止液を混合して発色反応を停止し、吸光度を測定すると、試料に含まれる８−ＯＨｄＧの量が多いほど、吸光度は低くなることから、試料中の８−ＯＨｄＧの含有量を定量することが可能である。
【特許文献１】特開平４−１３５４８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、上述の方法は、モノクローナル抗体を使用するため、非常に正確であるという利点がある半面、測定に要する費用が高くなり、時間もかなりかかるという問題点がある。
【０００５】
本発明は、きわめて低コストかつ短時間に酸化損傷物質の含有量を決定することができ、さらに、酸化損傷判断解析表を用いて、きわめて容易に、瞬時に、場所をえらばず、生体の酸化損傷の程度を知ることができる、画期的な酸化損傷物質の測定方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記問題点を解決すべく様々な検討を重ねた結果、採取した尿の中へ、硫酸調整硫酸チタニウム溶液を混合した尿・硫酸チタニウム混合溶液から求めた尿中の過酸化水素の濃度又は濃度指標により、尿中の酸化損傷物質の含有量を決定することができることを見い出し、本願発明をするに至った。
【０００７】
即ち、本発明の酸化損傷物質の測定方法は、採取した尿の中へ、硫酸チタニウム溶液に硫酸酸性溶液を加えて調整した硫酸調整硫酸チタニウム溶液を混合して尿・硫酸チタニウム混合溶液とし、その後、当該尿・硫酸チタニウム混合溶液から求めた尿中の過酸化水素の濃度又は濃度指標により、尿中の酸化損傷物質の含有量を決定するものである。
【０００８】
この発明の好適形態においては、尿中の酸化損傷物質の濃度と尿・硫酸チタニウム混合溶液の色調程度から求めた尿中の過酸化水素の濃度指標のいずれかを縦軸とし、他方を横軸にした二次元座標を記載し、かつ当該二次元座標上にあらかじめ測定した尿中の酸化損傷物質の濃度及びこれに対応する尿・硫酸チタニウム混合溶液の色調程度から求めた尿中の過酸化水素の濃度指標の数値データを記入し、その結果から作成した検量線を記載した酸化損傷判断解析表に基づき、尿中の酸化損傷物質の含有量を決定するものである。
【０００９】
また、上記酸化損傷物質は、８−ハイドロキシ−２−デオキシグアノシンである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の酸化損傷物質の測定方法は、きわめて低コストでかつ短時間に酸化損傷物質の含有量を決定することができるという利点を有する。
【００１１】
本発明において、あらかじめ測定した尿中の酸化損傷物質の濃度及びこれに対応する尿・硫酸チタニウム混合溶液の色調程度から求めた尿中の過酸化水素の濃度指標の数値データを記入し、その結果から作成した検量線を記載した酸化損傷判断解析表を用いた場合には、きわめて容易に、瞬時に、場所をえらばず生体の酸化損傷の程度を知ることができ、画期的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の酸化損傷物質の測定方法は、採取した尿の中へ、硫酸チタニウム溶液に硫酸酸性溶液を加えて調整した硫酸調整硫酸チタニウム溶液を混合して尿・硫酸チタニウム混合溶液とし、その後、当該尿・硫酸チタニウム混合溶液から求めた尿中の過酸化水素の濃度又は濃度指標により、尿中の酸化損傷物質の含有量を決定するものである。
【００１３】
酸化損傷物質は、８−ハイドロキシ−２−デオキシグアノシンであるのが好ましい。生体で発生する活性酸素及びフリーラジカルによる生体構成成分の酸化損傷の度合いは、生体より発生するＤＮＡの酸化分解物である８−ＯＨｄＧを定量することによって適切に把握することができるからである。
【００１４】
生体構成成分の酸化損傷の度合いは、例えば、８−ＯＨｄＧを指標として評価することができるが、尿中の８−ＯＨｄＧの濃度は、尿中の過酸化水素の濃度と相関関係があるため、尿中の過酸化水素の濃度を測定すれば、酸化損傷の度合いを知ることができる。
【００１５】
尿の中へ硫酸チタニウム溶液に硫酸酸性溶液を加えて調整した硫酸調整硫酸チタニウム溶液を混合すると、尿中に存在する過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）は、酸性溶液中でＯ２２−を発生する（Ｈ２Ｏ２→２Ｈ＋＋Ｏ２２−）。
【００１６】
発生したＯ２２−は、チタニウム塩と反応し、過酸化チタニウム複合体が発生する（Ｏ２２−＋Ｔｉ４＋＋２Ｈ２ＳＯ４→［ＴｉＯ２（ＳＯ４）２］２−＋４Ｈ＋）。
【００１７】
発生した過酸化チタニウム複合体は、４０７〜４０８ｎｍのあたりで吸収極大を持つため、発生したＯ２２−とチタニウム塩との反応後における吸光度を測定すれば、尿中に存在する過酸化水素の濃度を測定することができる。
【００１８】
例えば、試料０．８ミリリットルに、１Ｍ硫酸チタニウム溶液０．１５ミリリットルに２０重量％硫酸０．２５ミリリットルを加えた硫酸調整硫酸チタニウム溶液を加えると、Ｏ２２−の生成反応が止まり、しかも、Ｏ２２−と反応した過酸化チタニウム複合体が生成する。そして、この生成した過酸化チタニウム複合体の吸光度を決定して分子吸光度係数を求めると、尿中の過酸化水素の濃度を測定することができる。なお、試料によっては、アルキル、芳香族過酸化物も同時検出されるので、補正を行う必要がある。
【００１９】
尿中の過酸化水素の濃度指標は、尿・硫酸チタニウム混合溶液の色調程度から、例えば、以下の方法により求めることができる。
【００２０】
尿・硫酸チタニウム混合溶液の色調程度は、チタニウム塩による発色に依存するが、チタニウム塩による発色は、尿中に存在する過酸化水素の濃度と関連があり、以下の４つに分類することができる。
【００２１】
イ）きわめて薄い黄色（過酸化水素がきわめて少ない）
ロ）薄い黄色（過酸化水素が多少ある）
ハ）黄色（過酸化水素がかなりある）
ニ）オレンジ色（過酸化水素がきわめて多くある）
例えば、きわめて薄い黄色を１、薄い黄色を２、黄色を３、オレンジ色を４とし、これらの色調を、例えば、ＤＩＣカラーガイド（登録商標）やＤＩＣカラーチャートなどの標準色で置き換えて色調見本を作成すると、この標準色に置き換えられた色調見本から、容易かつ迅速に、尿・硫酸チタニウム混合溶液の色調程度を数値化することができる。この尿・硫酸チタニウム混合溶液の色調程度を数値化した値は、尿中の過酸化水素の濃度指標とすることができる。
【００２２】
本発明においては、尿中の酸化損傷物質の濃度と尿・硫酸チタニウム混合溶液の色調程度から求めた尿中の過酸化水素の濃度指標のいずれかを縦軸とし、他方を横軸にした二次元座標を記載し、かつ当該二次元座標上にあらかじめ測定した尿中の酸化損傷物質の濃度及びこれに対応する尿・硫酸チタニウム混合溶液の色調程度から求めた尿中の過酸化水素の濃度指標の数値データを記入し、その結果から作成した検量線を記載した酸化損傷判断解析表に基づき、尿中の酸化損傷物質の含有量を決定することは好ましい。このような酸化損傷判断解析表に基づいて尿中の酸化損傷物質の含有量を決定すると、多少精度が劣るが、場所をえらばず、きわめて容易かつ瞬時に、尿中の酸化損傷物質の含有量を知ることができ、上述した吸光度測定も行なう必要もなくなるからである。
【００２３】
ここにいう、「あらかじめ測定する尿中の酸化損傷物質の濃度」は精度が高い方がよいため、酸化損傷物質が８−ＯＨｄＧの場合には、例えば、以下の方法により測定するのが望ましい。
【００２４】
（１）８−ＯＨｄＧを固相化したマイクロプレートに調整した試料又は８−ＯＨｄＧ標準液と抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体を加える。この抗体は８−ＯＨｄＧと特異的に反応するため、固相化８−ＯＨｄＧおよび試料中の８−ＯＨｄＧに対し競争的に反応するので、試料中の８−ＯＨｄＧ量が多いと、そこに結合する抗体が多くなり、固相化された８−ＯＨｄＧと結合する抗体量は減少する。
【００２５】
（２）マイクロプレートを洗浄する。洗浄することにより、試料中の８−ＯＨｄＧと結合した抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体が除去される。したがって、固相化された８−ＯＨｄＧと結合した抗体のみがここに残る。
【００２６】
（３）酵素標識抗体を加える。この酵素標識抗体は固相化された８−ＯＨｄＧと結合した抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体と結合する。
【００２７】
（４）マイクロプレートを洗浄する。洗浄することにより、結合しなかった酵素標識抗体が除去される。
【００２８】
（５）発色液を加える。発色液を加えことにより、酵素標識抗体の酵素活性により呈色（青色）する。
【００２９】
（６）反応停止液を加えて発色反応を停止させて、吸光度を測定する。試料中の８−ＯＨｄＧの量が多いほど、吸光度は低くなる。
【００３０】
本発明に用いることができる酸化損傷判断解析表としては、例えば、酸化損傷物質（８−ＯＨｄＧ）の濃度を縦軸とし、尿・硫酸チタニウム混合溶液の色調程度から求めた尿中の過酸化水素の濃度指標を横軸とした二次元座標上に、上述の方法で測定した酸化損傷物質（８−ＯＨｄＧ）の測定値及びこれに対応した尿・硫酸チタニウム混合溶液の色調程度から求めた尿中の過酸化水素の濃度指標の数値データを複数記入し、その結果から検量線を作成したものを挙げることができる。
【００３１】
本発明の酸化損傷物質の測定方法において、前記酸化損傷判断解析表を用いると、きわめて容易に、瞬時に、場所をえらばず生体の酸化損傷の程度を決定できるようになる。
【実施例】
【００３２】
（実施例１）
あらかじめ、ビタミンＢ群を含有する医薬品やサプリメントを摂取していない１２名の人を選択し、採尿した。ビタミンＢ群を含有する医薬品やサプリメントを摂取している人の尿は最初からかなりの黄色を呈しているので誤差が大きくなるからである。
【００３３】
その後、採尿により得られた尿を二分割した。
【００３４】
二分割した一方は、過酸化水素の濃度を測定した。即ち、プラスチック製の透明円筒型容器（直径２２ｍｍ、長さ５５ｍｍ）を１２本準備して、円筒型容器１〜１２とし、そのそれぞれに、尿１ミリリットルを入れた後、１Ｍの硫酸チタニウム溶液０．４ミリリットルに硫酸酸性溶液を加えて調整した硫酸調整硫酸チタニウム溶液１ミリリットルを添加し、尿・硫酸チタニウム混合溶液１〜１２を得た。
【００３５】
５分後、あらかじめ過酸化水素の濃度がわかっている尿についての尿・硫酸チタニウム混合溶液の色調程度を、１（きわめて薄い黄色、過酸化水素がきわめて少ない）、２（薄い黄色、過酸化水素が多少ある）、３（黄色、過酸化水素がかなりある）、４（オレンジ色、過酸化水素がきわめて多くある）に分類し、これらの色調をＤＩＣカラーガイド（登録商標）の標準色で置き換えて作成した色調見本に基づき、尿・硫酸チタニウム混合溶液１〜１２の色調程度を数値化し、尿中の過酸化水素の濃度指標とした。
【００３６】
二分割した他方は、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体を用い、上述した方法により遺伝子損傷物質である８−ＯＨｄＧの濃度を測定した。
【００３７】
酸化損傷物質（８−ＯＨｄＧ）の濃度を縦軸とし、尿・硫酸チタニウム混合溶液の色調程度から求めた尿中の過酸化水素の濃度指標を横軸とした二次元座標上に、上述の方法により得られた数値データを記入し、その結果から検量線を引いて酸化損傷判断解析表を作成した。
【００３８】
この酸化損傷判断解析表を図１に示す。相関係数Ｒは０．８８であり、かなり強い相関関係を有することがわかった。
【００３９】
また、図１から、尿中の過酸化水素の濃度が高くなれば、生体構成成分の酸化損傷項目である８−ＯＨｄＧの濃度も高くなることは明らかである。
【００４０】
さらに、図１により、尿中の過酸化水素の濃度と８−ＯＨｄＧの濃度は直線関係にあるため、図１のような酸化損傷判断解析表を用いて、尿・硫酸チタニウム混合溶液の色調程度から求めた尿中の過酸化水素の濃度指標により、吸光度測定を行なわず、きわめて容易かつ瞬時に、尿中の酸化損傷物質の含有量を知ることができることがわかった。
【００４１】
（実施例２）
あらかじめ、ビタミンＢ群を含有する医薬品やサプリメントを摂取していない１２名の人を選択し、採尿した。その後、採尿により得られた尿を二分割した。
【００４２】
二分割した一方は、実施例１と同様の操作を繰り返し、尿・硫酸チタニウム混合溶液の色調程度から尿中の過酸化水素の濃度指標を求めた。そして、実施例１で得られた図１の酸化損傷判断解析表を用いて尿中の８−ＯＨｄＧの含有量を決定した。
【００４３】
これとは別に、二分割した他方も、実施例１と同様の操作を繰り返し、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体を用いて尿中の８−ＯＨｄＧの含有量を測定した。
【００４４】
その後、尿・硫酸チタニウム混合溶液の色調程度から求めた尿中の過酸化水素の濃度指標により決定した尿中の８−ＯＨｄＧの含有量と、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体を用いて測定した尿中の８−ＯＨｄＧの含有量とを比較した。
【００４５】
その結果、両者は概ね一致した。これにより、吸光度測定を行なうことなく、酸化損傷判断解析表を用いた場合であっても、尿中の８−ＯＨｄＧの含有量を多少精度が劣る程度で把握することができることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の酸化損傷物質の測定方法は、特に、スポーツやトレーニング中又はその前後による尿中の酸化損傷の度合いを簡便にかつ瞬時に知り、ビタミンや抗酸化物質を摂取させて酸化損傷を低下させる目安に利用することができる有用な手段である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明に使用可能である酸化損傷判断解析表の一例を示すグラフ。
【図１】
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