(57)【要約】【課題】  ヒアルロン酸合成活性を有するタンパク質やヒアルロン酸の効率的な生産に応用可能な新規な核多核体ウイルス、ヒアルロン酸合成活性を有するタンパク質やヒアルロン酸の効率的な生産に有用な昆虫細胞、ヒアルロン酸合成活性を有するタンパク質の効率的な生産方法及びヒアルロン酸の効率的な生産方法等を提供すること。【解決手段】  ヒアルロン酸合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが保持された核多核体病ウイルス、当該ウイルスを保持する昆虫由来の細胞並びにこの細胞を用いたヒアルロン酸合成活性を有するタンパク質及びヒアルロン酸の生産方法。前記の「ヒアルロン酸合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ」としては、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡをはじめ、これと同等の機能を有するＤＮＡを例示することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが保持された、核多角体病ウイルス。
【請求項２】
ヒアルロン酸合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが、下記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の核多角体病ウイルス。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）「配列番号２に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ヒアルロン酸を合成する活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
ヒアルロン酸合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡであることを特徴とする、請求項２に記載の核多角体病ウイルス。
（ａ）配列番号１における塩基番号７〜１６８９で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１における塩基番号７〜１６８９で示される塩基配列において、その塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または転位させる塩基の変異を有し、かつ、発現されるタンパク質がヒアルロン酸を合成する活性を有することを特徴とするＤＮＡ。
【請求項４】
核多角体病ウイルスが、ＡｃＮＰＶであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核多角体病ウイルス。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の核多角体病ウイルスを保持する昆虫由来の細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の細胞を生育させ、その生育物からヒアルロン酸合成活性を有するタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、ヒアルロン酸合成活性を有するタンパク質の生産方法。
【請求項７】
請求項５に記載の細胞を生育させ、その生育物からヒアルロン酸を採取する工程を少なくとも含む、ヒアルロン酸の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸合成活性を有するタンパク質及びヒアルロン酸の新規な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願書類中で使用する略号は以下の通りである。
【０００３】
ＡｃＮＰＶ：Autographa californicaの核多角体病ウイルス
ＤＴＴ：ジチオトレイトール（dithiothreitol）
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminetetraacetic acid）
ＦＣＳ：ウシ胎仔血清（fetal calf serum）
GlcNAc：N-アセチルグルコサミン（N-acetylglucosamine）
GlcUA：グルクロン酸（glucuronic acid）
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＨＡａｓｅ：ヒアルロニダーゼ
ＨＡＢＰ：ヒアルロン酸結合性タンパク質
ＨＡ−ＢＳＡ：ウシ血清アルブミンが結合したヒアルロン酸
ＨＡＳ：ヒアルロン合成酵素（hyaluronan synthase）。なお、ヒアルロン酸合成酵素１は「ＨＡＳ１」、ヒアルロン酸合成酵素２は「ＨＡＳ２」、ヒアルロン酸合成酵素３は「ＨＡＳ３」とそれぞれ略記する。
【０００４】
ＨＥＰＥＳ：2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸（2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid）
ＮＰＶ：核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis virus）
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩液（phosphate buffered saline）
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate）
ＵＤＰ：ウリジン5'-二リン酸（uridine 5'-diphosphate）
ＨＡは、GlcUAとGlcNAcの二糖繰り返し構造のみを持つ超高分子多糖体であり、変形性膝関節症の治療薬や白内障手術の補助剤等の医薬品としてのみならず、化粧品や食品の素材等としても非常に有用な物質である。
ＨＡは全ての脊椎動物の様々な組織・器官及び体液中で検出される。脊椎動物以外には、ある種のバクテリア（例えば Streptococcus hyalyticum）の細胞壁多糖成分として検出されるが、昆虫のような無脊椎動物や植物には見いだされていない。
ＨＡ合成活性を有するタンパク質として、バクテリアでは１種類のＨＡＳ（Streptococcus hyalyticum由来のｈａｓ−Ａ）が、アフリカツメガエルではＨＡＳであるＤＧ４２が、哺乳類では３種類のＨＡＳ（ＨＡＳ１、２、３）が見出されている。ＨＡＳ１は非特許文献１に、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３は非特許文献２にそれぞれ開示されている。ＨＡＳ２をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ）については、ヒト由来のものは非特許文献３に、マウス由来のものは非特許文献４にそれぞれ開示されている。正常の組織中では、ＨＡＳ２のmRNA及びタンパク質の生産が最も高く、酵素活性もＨＡＳ２が最も高い傾向にある。
しかしながら、これらの以外の生物に由来する細胞等を用いて、ＨＡ合成活性を有するタンパク質を大量に生産させることについては知られていない。また現在、ＨＡは、鶏冠などの動物資源やストレプトコッカスなどのバクテリアの培養液等から製造されている。しかしながら、これらの生物以外の生物に由来する細胞等を用いて、ＨＡを大量に生産させることについては知られていない。
【０００５】
【非特許文献１】イタノ、Ｎ．（Itano, N.）ら，１９９６年，Biochem. Biophys. Res. Commun.，第２２２巻, p. ８１６−８２０
【非特許文献２】スパイサー、ＡＰ．（Spicer AP.）ら，１９９７年，Genomics，第４１巻，第３号，ｐ．４９３−４９７
【非特許文献３】ワタナベ、Ｋ．（Watanabe, K.）ら，１９９６年，J. Biol. Chem.，第２７１巻，第３８号，ｐ．２２９４５−２２９４８
【非特許文献４】スパイサー、ＡＰ．（Spicer AP.）ら，１９９６年，J. Biol. Chem.，第２７１巻，第３８号，ｐ．２３４００−２３４０６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＨＡ合成活性を有するタンパク質やＨＡの効率的な生産に有用な新規なＮＰＶ、これを保持しておりＨＡ合成活性を有するタンパク質やＨＡの効率的な生産に有用な昆虫細胞、この細胞を用いたＨＡ合成活性を有するタンパク質の効率的な生産方法及びＨＡの効率的な生産方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、特定のウイルスが保持された特定の細胞を用いることにより、ＨＡ合成活性を有するタンパク質やＨＡを効率的に製造することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、ＨＡ合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが保持された、ＮＰＶ（以下、「本発明ウイルス」という。）を提供する。
【０００９】
本発明ウイルスにおいて保持される「ＨＡ合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ」は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡであることが好ましい。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）「配列番号２に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡを合成する活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ。
【００１０】
本発明ウイルスにおいて保持される当該ＤＮＡは、なかでも下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡであることが好ましい。
（ａ）配列番号１における塩基番号７〜１６８９で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１における塩基番号７〜１６８９で示される塩基配列において、その塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または転位させる塩基の変異を有し、かつ、発現されるタンパク質がＨＡを合成する活性を有することを特徴とするＤＮＡ。
【００１１】
また、このようなＤＮＡを保持するＮＰＶは、ＡｃＮＰＶであることが好ましい。
また本発明は、本発明ウイルスを保持する昆虫由来の細胞（以下、「本発明細胞」という。）を提供する。
【００１２】
さらに本発明は、本発明細胞を生育させ、その生育物からＨＡ合成活性を有するタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、ＨＡ合成活性を有するタンパク質の生産方法（以下、「本発明タンパク質生産方法」という。）を提供する。
【００１３】
さらに本発明は、本発明細胞を生育させ、その生育物からＨＡを採取する工程を少なくとも含む、ＨＡの生産方法（以下、「本発明ＨＡ生産方法」という。）を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明ウイルスは、これを用いることによって、ＨＡ合成活性を有するタンパク質やＨＡの効率的な生産に有用な本発明細胞が提供されることから極めて有用である。また本発明細胞は、これを用いることにより、高いＨＡ合成活性を有するタンパク質やＨＡを効率的に生産でき、またこれによって本発明生産方法が提供されることから極めて有用である。さらに、本発明タンパク質生産方法や本発明ＨＡ生産方法を用いることにより、高いＨＡ合成活性を有するタンパク質やＨＡを簡便、迅速、大量かつ安価に生産することができ、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
本発明ウイルス
本発明ウイルスは、ＨＡ合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが保持された、ＮＰＶである。
【００１６】
本発明ウイルスにおいて保持される「ＨＡ合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ」は、ＨＡを合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである限りにおいて特に限定されない。
例えば、Streptococcus hyalyticum由来のｈａｓ−ＡをコードするＤＮＡ、アフリカツメガエルのＨＡＳであるＤＧ４２の遺伝子Ｘｈａｓ−１及び−２、哺乳類のＨＡＳ（ＨＡＳ１、２、３）をコードするＤＮＡ等を用いることができるが、哺乳類のＨＡＳをコードするＤＮＡであることが好ましい。このＨＡＳは、ヒト由来のＨＡＳであることが好ましい。またＨＡＳは、ＨＡＳ２であることが好ましい。
【００１７】
本発明ウイルスにおいて保持されるＤＮＡは、なかでも、下記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡであることが好ましい。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）「配列番号２に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡを合成する活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ。
【００１８】
ここにいう「配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質」は、ヒト由来のＨＡＳ２（以下、ｈＨＡＳ２という。）である。
【００１９】
天然に存在するタンパク質には、それをコードするＤＮＡの多型や変異の他、生成後のタンパク質の細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように「（Ａ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」に対して構造的に若干の差違があってもその機能については大きな違いが認められない「（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」は、「（Ａ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」と実質的に同等なものといえる。人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（IL-2）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている(Science,224,1431(1984))。また、ある種のタンパク質は、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるタンパク質に存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型タンパク質への転換に際して除去される。このようなタンパク質は、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には「（Ａ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」と実質的に同等の機能を有するタンパク質である。上記の「（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」は、このようなタンパク質を規定するものである。
【００２０】
本明細書において「数個のアミノ酸」とは、ＨＡを合成する活性が失われない範囲で変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば６００アミノ酸残基からなるタンパク質の場合には２〜３０程度、好ましくは２〜１５、より好ましくは２〜８以下の数を示す。
【００２１】
（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質は、ＨＡを合成する活性を有していることが必要である。  
このような活性を有するか否かは、例えば、基質としてUDP-GlcNAcとUDP-GlcUAを用い、これに上記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質を含むと推定されるサンプルを作用・反応させて、ＨＡが合成されたか否かを調べることによって判定することができる。例えば、反応生成物にＨＡを分解する酵素（ヒアルロニダーゼ）を作用させ、これにより反応生成物が分解されたとすれば、反応により生成した物質はＨＡであると判定することができる。より具体的な方法の一例は、後述の実施例を参照されたい。
【００２２】
また本発明ウイルスにおいて「ＤＮＡが保持された」とは、そのＤＮＡが保持されている限りにおいて、他のＤＮＡ等が更に保持されていることを妨げるものではない。したがって、そのＤＮＡのみならず、更にマーカーペプチド等をコードするＤＮＡ等が保持されていてもよい。
【００２３】
例えば、「上記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡ」と「マーカーペプチド等をコードするＤＮＡ」とが連結されたＤＮＡが保持されたベクターも、本発明ウイルスに包含される。保持されるＤＮＡをこのようにデザインすると、マーカーペプチド等との融合タンパク質として発現させることができ、その発現されたタンパク質の精製や分析を容易にすることができるというメリットがある。マーカーペプチドとしては、例えばプロテインＡ、インスリンシグナル配列、His、FLAG、CBP（カルモジュリン結合タンパク質）、GST（グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ）などが挙げられる。例えばプロテインＡとの融合タンパク質は、ＩｇＧを結合させた固相を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製することができる。同様に、Hisタグとの融合タンパク質については磁性ニッケルを結合させた固相を用いることができ、FLAGとの融合タンパク質については抗FLAG抗体を結合させた固相を用いることができる。またインスリンシグナルとの融合タンパク質は、細胞外（培地等）に分泌されることから、細胞破砕等の抽出操作が不要となる。
【００２４】
本発明ウイルスの製造方法は特に限定されず、遺伝子工学的手法によって製造してもよく、化学合成法によって製造してもよい。
【００２５】
遺伝子工学的手法によって本発明ウイルスを製造する方法は、以下の通りである。より具体的な方法については、実施例を参照されたい。
【００２６】
まず、ＨＡ合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを用意する。当該ＤＮＡとして、前記（Ａ）のＤＮＡを用いる場合には、まず「配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質」をコードするＤＮＡを用意する。また、前記（Ｂ）のＤＮＡを用いる場合には、まず「配列番号２に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡを合成する活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡを用意する。これらのＤＮＡは、それぞれ所定のタンパク質をコードするものである限りにおいて特に限定されない。これらのＤＮＡとしては、遺伝暗号の縮重によって種々の異なった塩基配列を有するものが存在するが、いずれの塩基配列を有するＤＮＡをも用いることができる。
【００２７】
前記（Ａ）の「配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質」をコードするＤＮＡとしては、なかでも、配列番号１における塩基番号７〜１６８９で示される塩基配列によって特定されるＤＮＡが好ましい。この塩基配列を含むＤＮＡは、GenBank accession No. Ｕ５４８０４として登録されている。
【００２８】
また、前記（Ｂ）の「配列番号２に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡを合成する活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡとしては、例えば前記（Ａ）のＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが例示される。
【００２９】
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等参照）。「ストリンジェントな条件」として具体的には、50％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、50mMＨＥＰＥＳ（pH7.0）、10×Denhardt's solution、100μg/mlサケ精子DNAを含む溶液中、42℃でハイブリダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液、50℃下で0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙げられる。
【００３０】
このようなＤＮＡをＮＰＶに導入することにより、本発明ウイルスを製造することができる。
【００３１】
このようなＤＮＡが導入されるＮＰＶは、ＮＰＶとして分類されるウイルスである限りにおいて特に限定されず、例えばＡｃＮＰＶや、カイコガＮＰＶ（Bombyx mori NPV、BmNPV）等を用いることができる。なかでも、ＡｃＮＰＶであることが好ましい。
【００３２】
ＮＰＶへのＤＮＡの導入は、トランスファーベクターを用いた相同的組換えにより行うことができる。トランスファーベクターの種類も特に限定されず、例えばpPSC8（プロテインサイエンス社）、pFastBac（インビトロジェン社）、pVL1393（ファーミンジェン社）等が例示されるが、なかでもpPSC8が好ましい。これらのトランスファーベクターは、市販のものを用いることもできる。
【００３３】
トランスファーベクターを用いた相同的組換えの方法も特に限定されない。その具体的な一例は、実施例を参照されたい。
【００３４】
前記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡが保持されたＮＰＶが製造されたか否かは、例えば、製造されたＮＰＶの塩基配列を解析して、ＨＡ合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが保持されているか否か、製造されたＮＰＶから発現されたタンパク質が、ＨＡ合成活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を有しているか否か、製造されたＮＰＶから発現されたタンパク質がＨＡを合成する活性を有しているか否か、等を調べることによって確認することができる。
【００３５】
本発明ウイルスは、例えば後述する「本発明細胞」の製造に使用することができ、ひいては本発明タンパク質生産方法や本発明ＨＡ生産方法等に利用することができる。
＜２＞本発明細胞
本発明細胞は、本発明ウイルスを保持する昆虫由来の細胞である。
【００３６】
本発明ウイルスについての説明は、前記の通りである。
【００３７】
ここで用いる昆虫由来の細胞は、昆虫に由来する細胞であり、ＮＰＶが感染しうる細胞である限りにおいて特に限定されないが、Ｓｆ９細胞であることが好ましい。
【００３８】
本発明ウイルスを昆虫由来の細胞に保持させる方法も特に限定されないが、本発明ウイルスはＮＰＶとしての性質を有しているため、単に本発明ウイルスと昆虫由来の細胞とを接触させるだけで、本発明ウイルスを当該細胞に感染させることができ、本発明ウイルスを当該細胞に保持させることができる。本発明ウイルスと昆虫由来の細胞とを接触させ、当該ウイルスを当該細胞に感染させることによって当該ウイルスを当該細胞に保持させる具体的な方法の一例は、後述の実施例を参照されたい。
【００３９】
本発明細胞は、ＨＡ合成活性を有するタンパク質を生産する能力とＨＡを生産する能力を有することから、これらの性質を指標にして、本発明細胞を選択することができる。
【００４０】
本発明細胞は、例えば後述する本発明タンパク質生産方法や本発明ＨＡ生産方法等に利用することができる。
＜３＞本発明タンパク質生産方法
本発明タンパク質生産方法は、本発明細胞を生育させ、その生育物からＨＡ合成活性を有するタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、ＨＡ合成活性を有するタンパク質の生産方法である。
【００４１】
「本発明細胞」については、前記で説明した通りである。
【００４２】
本出願書類において「生育」とは、形質転換体である細胞の増殖や、形質転換体である細胞を組み込んだ生物（例えば昆虫等）の生育を含む概念である。また、本出願書類における「生育物」とは、形質転換体を生育させた後の培地（培養液の上清）、培養された細胞自体、細胞を組み込んだ生物（例えば昆虫等）からの分泌物・排出物や、これらの培地、細胞、生物、分泌物・排出物等の抽出物等を包含する概念である。なお、ここでいう抽出物は、上記の培地、細胞、生物、分泌物・排出物等から得られ、かつＨＡ合成活性を有するタンパク質を含有する限りにおいて、特に限定されない。例えば、このような抽出物の一例として、後述する実施例４に示した細胞膜画分等が例示される。
【００４３】
生育の条件（培地や培養条件等）は、本発明細胞が生育し、ＨＡＳが生産される限りにおいて特に限定されず、用いるベクターや細胞等に応じて適宜選択することができる。例えば、培養の温度としては２０〜４０℃程度を例示することができる。
【００４４】
本発明細胞の生育時間も、用いる本発明細胞の量、所望するＨＡＳの生産量、その他の生育条件等に応じて適宜調節することができる。
【００４５】
生育物からＨＡＳを採取する方法は、生育物の種類に応じて、一般的な方法のなかから当業者が適宜選択し採用することができる。
【００４６】
例えば、ＨＡＳが、培地（培養液の上清）中に分泌される可溶性の形態で産生される場合には、培地を採取し、これをそのまま用いてもよい。またＨＡＳが細胞質中に分泌される可溶性の形態、又は不溶性（膜結合性）の形態で産生される場合には、窒素キャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、又はこれらの組み合わせ等の処理操作によってＨＡ合成活性を有するタンパク質を抽出することができ、その抽出物をそのまま用いてもよい。
【００４７】
本発明タンパク質生産方法は、「本発明細胞を生育させ、その生育物からＨＡ合成活性を有するタンパク質を採取する工程」を少なくとも含む限りにおいて、他の工程をさらに含んでいてもよい。例えば、採取されたＨＡ合成活性を有するタンパク質をさらに精製する工程を含んでいてもよい。精製は、不完全な精製（部分精製）であっても、完全な精製であってもよく、ＨＡ合成活性を有するタンパク質の使用目的等に応じて適宜選択することができる。
【００４８】
精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
【００４９】
ＨＡ合成活性を有するタンパク質が製造されたか否かは、採取されたタンパク質のアミノ酸配列、ＨＡの生産能力の有無等を分析することによって確認することができる。
【００５０】
本発明タンパク質生産方法によれば、後述の実施例にも示す通り、ＨＡ合成活性を有するタンパク質を極めて効率的に生産することができる。
＜４＞本発明ＨＡ生産方法
本発明ＨＡ生産方法は、本発明細胞を生育させ、その生育物からＨＡを採取する工程を少なくとも含む、ＨＡの生産方法である。
【００５１】
「本発明細胞」については、前記＜２＞で説明した通りである。
【００５２】
生育の条件（培地や培養条件等）は、本発明細胞が生育し、ＨＡが生産される限りにおいて特に限定されず、用いるベクターや細胞等に応じて適宜選択することができる。例えば、培養の温度としては２０〜４０℃程度を例示することができる。
【００５３】
本発明細胞の生育時間も、用いる本発明細胞の量、所望するＨＡの生産量、その他の生育条件等に応じて適宜調節することができる。
【００５４】
本発明細胞の生育の際に、ＨＡの合成の基質となるUDP-GlcNAc及びUDP-GlcUA等の糖ヌクレオチドを存在させておくことが好ましい。特に、「生育物」が、前記＜３＞に示すような培地、細胞、生物、分泌物・排出物等の抽出物である場合には、その生育物中にUDP-GlcNAc及びUDP-GlcUA等の糖ヌクレオチドを存在させておくことが好ましい。
【００５５】
したがって、本発明ＨＡ生産方法には、例えば、本発明細胞を生育させて得られ、ＨＡ合成活性を有する生育物又はそのＨＡ合成活性画分と、UDP等のヌクレオチドが結合したGlcNAc及びGlcUAとを接触させる工程を含む、ＨＡの生産方法が包含される。
【００５６】
またＨＡＳの活性を増加させる物質がある場合には、その物質を添加してもよい。
【００５７】
また、例えば、本発明細胞を担体（例えば、ゲル、ビーズ、膜、プレート、ファイバー等）に固定させ、これに培養液を接触させ反応させてもよい。
【００５８】
生育物からＨＡを採取する方法は、一般的な方法のなかから当業者が適宜選択し採用することができる。例えば、ＨＡが、培地（培養液の上清）中に分泌されてくる場合には、培地を採取し、これをそのまま用いてもよい。
【００５９】
本発明ＨＡ生産方法は、「本発明細胞を生育させ、その生育物からＨＡを採取する工程」を少なくとも含む限りにおいて、他の工程をさらに含んでいてもよい。例えば、採取されたＨＡをさらに精製する工程を含んでいてもよい。精製は、不完全な精製（部分精製）であっても、完全な精製であってもよく、ＨＡの使用目的等に応じて適宜選択することができる。
【００６０】
精製方法としては、ＨＡの精製方法として一般的な方法等を採用することができる。
【００６１】
ＨＡが製造されたか否かは、例えば後述のＨＡ-ＩＢＡ法により確認することができる。詳しくは実施例を参照されたい。
【００６２】
本発明ＨＡ生産方法によれば、後述の実施例にも示す通り、ＨＡを極めて効率的に生産することができる。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。ここでは、ＨＡ合成活性を有するタンパク質の一例としてｈＨＡＳ２を用いた実施例を示す。
＜１＞材料
以下に、本実施例で用いた材料を説明する。
ＤＴＴ、ＨＥＰＥＳ、UDP-GlcNAc、及びUDP-GlcUAはシグマ社から購入した。UDP-[14C]GlcUAはパーキンエルマー社から購入した。
＜２＞方法
１．ｈＨＡＳ２をコードするcDNAのクローニング
ｈＨＡＳ２をコードするcDNAのクローニングは、J. Biol. Chem. 271, 22945-22948 (1996)に記載された方法に従って、ヒト胎児脳cDNAライブラリー（クローンテック(Clontech)社製）を用いたPCRスクリーニングによって行った。
２．ｈＨＡＳ２をコードするcDNAを導入したバキュロウイルスの調製
上記１．で得られたhHAS2をコードするcDNAに、ｈＨＡＳ２のＮ末端にFLAGが連結された融合ポリペプチドが発現されるようFLAG-tagオリゴヌクレオチドを付加した。これを発現させることにより、ｈＨＡＳ２のＮ末端にFLAGが連結された融合ポリペプチドが得られることになる。
【００６４】
FLAG-tagが付加されたcDNAをＰＣＲに付し、増幅されたことを確認した後、TAクローニングキット（インビトロジェン（Invitrogen）社製）を用いて当該cDNAが挿入されたプラスミド（pTA-FLAG-hHAS2）をサブクローニングした。
【００６５】
サブクローニングの後、作製したプラスミドから目的のcDNAを含むフラグメントを切り出し、これをトランスファーベクター（pPSC8）（プロテイン・サイエンス（Protein Science）社製）に導入して、所定の塩基配列を有するクローンを選択した。
【００６６】
選択した発現ベクター（pPSC8-FLAG-hHAS2）とバキュロウイルス（AcNPV）DNA（プロテインサイエンス社）とを昆虫細胞Sf9（インビトロジェン（Invitrogen）社製）にコトランスフェクトした。コトランスフェクトの具体的な方法は以下の通りである。
【００６７】
1.0 x 106 個のSf9細胞を、底面積25 cm2の細胞培養用フラスコに播き、28℃で１時間静置した。静置後、培養液の上清を取り除き、10 mlのSF-900 II培地（インビトロジェン（Invitrogen）社製）で細胞を２回洗浄した。
【００６８】
この細胞が入ったフラスコに、hHAS2をコードするcDNAを保持する発現ベクター pPSC8-FLAG-hHAS2 2μl（3.4μg/μl）、Linear AcNPV DNA 5μl（17 μg/μl）及びLIPOFECTIN Reagent（（インビトロジェン）Invitrogen社製）5 μlを含有するSF-900II培地 200μlを添加し、静かに揺らした後、28℃で６時間静置培養した。次いで、培養液量が5 mlとなるようにSf900II培地を加え、さらに28℃で5日間、静置培養した。培養後に培養上清を回収し、コトランスフェクション溶液とした。
【００６９】
次いで、組換えウイルスの純化を行った。組換えウイルスの純化は、プラークアッセイ法で行った。具体的な方法は以下の通りである。
【００７０】
2.0 x 106 個のSf9細胞を直径60 mmのシャーレに播き、28℃で１時間静置して細胞を底面に接着させた。前記のコトランスフェクション溶液を無血清Sf-900II 培地で１０４、１０５、１０６及び１０７倍に希釈し、これらの溶液をそれぞれ１ mlずつ細胞に添加し、室温で１時間穏やかに振盪した。その後、シャーレ上清（ウイルス液）を取り除き、0.5% SeaKemGTG agarose（BMA社製）を含有するSf-900II 培地 4 ml を流し込んで、28℃で９日間静置培養した。培地ごとに、シャーレにできた組換え体のウイルス粒子を含む多角体(polyhedra)が存在しない感染昆虫細胞のプラーク６個を採取して、各々を１ mlのSf-900 II培地に懸濁させ、ウイルス原液No.１〜６とした。
【００７１】
次いで、組換えウイルスの増幅（組換えウイルス液の作製）を行った。具体的な方法は以下の通りである。
【００７２】
25 cm2 フラスコに播いた 2.0 x 106 個のSf9細胞に、上記ウイルス原液を0.5 ml ずつ添加して、28℃で１時間静置培養した。培養液量が5 ml となるように 無血清Sf-900 II培地を加え、４日間静置培養し、第１代ウイルス液No.１〜６とした。
【００７３】
75cm2フラスコに播いた 6.0 x 106 個のSf9 細胞に、第１代ウイルス液を各々全量加え、28℃で１時間静置培養した。その後、さらに無血清Sf-900 II培地を10 ml加えてさらに４日間静置培養した。培養後、セルスクレイパーを用いて細胞をフラスコ底面から剥がし、3.000 x ｇ、４℃で15分間遠心し、上清と沈殿に分画した。この培養上清を回収し、第２代ウイルス液No.１〜６とした。
【００７４】
その後、細胞へのDNAの挿入を確認した。具体的な方法は以下の通りである。
【００７５】
第２代ウイルス液を回収した際に得られた各沈殿を200μlのＴＥ緩衝液（10 mM Tris-HCl, pH 7.5/ 1 mM EDTA）に懸濁させ、QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN社製)のマニュアルに従ってウイルスＤＮＡを抽出した。抽出されたウイルスＤＮＡを鋳型として、以下のプライマー「PSC F2」及び「PSC R2」を用いて、以下の条件でＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行った。増幅酵素にはKOD DNA ポリメラーゼ（TOYOBO社）を用いた。
【００７６】
ＰＣＲは、「94℃で30秒間、50℃で30秒間、74℃で60秒間」のサイクルを３０サイクル繰り返した。
【００７７】
5μlのＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、増幅断片の長さを確認した。目的の長さの断片が得られたＰＣＲ産物を精製し、Ｎ末端側とＣ末端側のシークエンスを確認した。シークエンス反応においては、以下のプライマー「PSC F」及び「PSC R」並びにABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit Ver.3（Applied Biosystems社製）を用いた。またシークエンスの電気泳動の際にはABI Prism 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）を、シークエンス解析の際にはGenetyx（ゼネティックス社）をそれぞれ用いた。
３．発現物の生産
対数増殖期にある培養昆虫細胞 expresSF+（登録商標；プロテイン・サイエンス（Protein Science）社製）を、1.5 x 106 個/mlとなるように無血清 Sf-900 II培地で希釈し、250 ml 三角フラスコ３本に100 mlずつ用意した。これらに上記第２代ウイルス液（No.２、３、５）を1 mlずつ加え、130 rpm、28℃で72時間振盪培養した。
４．細胞の回収と、細胞膜画分の調製
上記３クローン（No.２、３、５）の感染細胞の培養液（各100ml）を、1300 rpm、４℃で５分間遠心し、沈殿（細胞画分）と培養上清に分離した。培養上清は−80℃で保存した。沈殿（細胞画分）に氷冷したＰＢＳ ３０ mlを加えて再懸濁し、上記と同様に遠心して細胞を集めた。この細胞洗浄操作を２回行い、その細胞残渣に、0.25 M ショ糖、0.5 mM ＤＴＴを含有する氷冷した10 mM HEPES-NaOH緩衝液（pH 7.1）（以下、氷冷ショ糖溶液という。）16mlを加えた。細胞を懸濁させ、 氷冷下で超音波処理装置（IKASONIC U50 control（IKA JAPAN））を用いて80% amp、0.5秒、5分間の条件で超音波処理し、細胞を破砕した。
【００７８】
その細胞破砕懸濁液を超遠心チューブに移し、34,700 rpm（105,000 x ｇ）、４℃で１時間超遠心を行った。得られた沈殿を600μlの氷冷ショ糖溶液に懸濁させて、３クローン（No.２、３、５）の細胞膜画分とした。
５．発現されたタンパク質量の測定
クローンNo.２、３、５の細胞膜画分の全タンパク質量を、ＢＣＡプロテインアッセイキット（PIERCE社製）で測定した結果を表１に示す。
【００７９】
【表１】
2005323506.tif 000002
【００８０】
６．発現されたタンパク質のＨＡＳ活性の測定
１クローンにつき細胞膜画分 30 μl と、反応溶液（5 mM ＤＴＴ、15 mM MgCl2、2 mM UDP-GlcNAc、0.1 mM UDP-GlcUA、25 mM HEPES-NaOH(pH 7.1)）240μlとを混合し、その混液を 90μlずつ３本の反応チューブに分注し、それぞれに0.2μCiのUDP-[14C]GlcUA（10 μl）を添加した。HAase添加群には、同時に各クローンについて１本の反応チューブに１ＴＲＵ（１ＴＲＵ(Turbidity Reducing Unit)は、pH6.0、60℃、30分間に、660nmにおける吸光度を５０％減少させる酵素量を意味する。）の放線菌由来ＨＡａｓｅ（生化学工業株式会社製）を添加した。反応液に20% ＳＤＳを添加し、熱湯水中で５分間加熱処理をして酵素を失活させた。反応液を 50μlずつ 3MM濾紙（ワットマン社製）にスポットし、乾燥させた後、1 M 酢酸アンモニウム(pH 5.5)とエタノールとの混合液（35:65 v/v）を用いて室温で３日間展開した。濾紙を乾燥させた後、スポットした原点を切り抜き、原点の14C放射活性を シンチレーションカウンターLSC-5100（Aloka社製）により測定した。タンパク質量で補正したＨＡＳ活性の測定結果を図１に示す。縦軸は14Cのカウント(cpm)を示し、横軸はＨＡａｓｅの有無（「＋」はＨＡａｓｅ有り、「−」はＨＡａｓｅ無し。）を示す。ＨＡａｓｅ「−」と「＋」における14Cのカウントの差が、ＨＡＳ活性を示すこととなる。
【００８１】
図１に示す通り、いずれのクローンの細胞膜画分においても高いＨＡＳ活性が検知されたことから、hHAS2をコードするcDNAを保持するベクターとバキュロウイルスＡｃＮＰＶとがコトランスフェクトされた細胞によって、高い活性を有するhHASを製造できることが示された。
７．細胞によって生産されたＨＡ量の測定
前記３．で得られたウイルス感染細胞expresSF+の培養液上清（各 100 ml）中におけるＨＡ量を、以下に示すＨＡ−ＩＢＡ法によって測定した。
【００８２】
96ウエルのイムノプレート（Nunc社製）に10 μg/mL ＨＡ−ＢＳＡ（生化学工業株式会社製）を100 μL添加して、４℃で一晩放置してコーティングした。このプレートのウエルをＰＢＳで３回洗浄した後、これに培養液上清（50 μl）及び200 ng/mlのビオチン化HABP（生化学工業株式会社製）（50 μl）を添加して、37℃で１時間インキュベートした。その後ウエルをTween 20を0.05%含有するPBS（Ｔ−ＰＢＳ）で３回洗浄し、0.25 ug/mL ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（フナコシ株式会社製）を100 ul添加して、37℃で１時間インキュベートした。その後ウエルをＴ−ＰＢＳで3回洗浄し、H2O2を含有するＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン）発色液を100μl添加して、室温暗所で30分静置して発色させた。その後、１Ｍ 塩酸を100 μl添加して発色反応を停止させ、492 nm（対照波長 630 nm）の吸光度を測定した。サンプル中のＨＡ濃度は、ＨＡ標準液を用いて同様に測定した吸光度から得られた標準曲線をもとに算出した。
【００８３】
ＨＡ量の測定結果を、ウイルス非感染細胞と、バキュロウイルス（AcNPV）のみを感染させた細胞の培養液上清を用いて同様に測定した結果と併せて表２に示す。
【００８４】
【表２】
2005323506.tif 000003
【００８５】
表２に示すように、ウイルス非感染細胞や、バキュロウイルス（AcNPV）のみを感染させた細胞の培養液上清においては、ＨＡは検出されなかった。しかし、hHAS2をコードするcDNAを保持するベクターとバキュロウイルス（AcNPV）とをコトランスフェクトした感染細胞（クローン No.２、３、５）の培養上清では、いずれも高いレベルのＨＡの産生が確認された。
８．動物細胞を用いた場合の参考例
以下に、動物細胞を用いてＨＡＳ２を発現させた際の結果を示す。
【００８６】
ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶＰベクター（イーストマンコダック社製）に、ＨＡＳ２をコードするｃＤＮＡを挿入し、動物細胞用発現プラスミドｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ２を作製した。これをサル腎臓由来のＣＯＳ−１細胞にエレクトロポレーション法によりトランスフェクトした。その細胞を採取し、細胞膜画分のタンパク質量及びＨＡＳ活性を、前記の実施例５．及び６と同様に測定した。
【００８７】
その結果、動物細胞を用いてＨＡＳ−２を発現させた場合の細胞膜画分のタンパク質量は、培養液２００ ｍｌあたり約５ ｍｇであった。したがって、前記５．に示した結果から明らかな通り、少なくとも本実施例に記載された方法を用いると、従来の動物細胞を用いた方法に比して、培養液あたり約６０倍量のタンパク質が得られるといえる。
【００８８】
また、ＣＯＳ−１細胞で発現させたＨＡＳ−２の活性は、約５０００cpm/ｍｇタンパク質であった。実施例６．に示した通り、本実施例の方法によって発現されたＨＡＳ２の活性は約２０００〜５０００cpm/ｍｇタンパク質であったことから、本発明タンパク質生産方法を用いた場合、従来の方法である動物細胞を用いる場合に比べて、少なくとも約２４〜６０倍の活性に相当するＨＡＳ２が得られるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明により、通常ＨＡを全く産生しない昆虫細胞を使って、高いＨＡ合成活性を有するタンパク質を大量に発現させるためのツールや方法が提供されることができる。ＨＡ合成活性を有するタンパク質は、ＨＡの製造、ＨＡ合成活性を有するタンパク質の阻害剤や促進剤のスクリーニング、立体構造解析、診断用キット開発及び酵素療法などに使用しうる。また、本発明によってＨＡを製造するツールや方法も提供される。ＨＡは、医薬品、化粧品、食品などの素材として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】本発明タンパク質生産方法により発現されたタンパク質の、ＨＡ合成活性を示す図である。
【図１】
2005323506.tif 000004
【配列表】
2005323506000001.app