(57)【要約】      （修正有）【課題】被験者における平滑筋の緊張を制御する方法を提供する。【解決手段】被験者の平滑筋細胞中への、平滑筋の緊張の制御に含まれているカリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列の導入を含み、該被験者の充分な数の平滑筋細胞における該ＤＮＡ配列の発現は、該被験者において平滑筋の緊張を制御するものであり、喘息、前立腺肥大（ＢＰＨ）、環状動脈疾患、勃起不全（ＥＤ）、尿管、膀胱等の泌尿器疾患、および他の平滑筋疾患を処置するための遺伝子運搬法および製剤。【選択図】図１
2005154428.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者において平滑筋の緊張を制御する方法であって、該被験者において平滑筋の緊張を制御するために、該被験者の充分な数の平滑筋細胞において、平滑筋の緊張を制御するカリウムチャネルタンパク質をコード化する配列に結合操作可能な平滑筋特異的プロモーターである平滑筋αアクチン（ＳＭＡＡ）を含むＤＮＡ配列の導入および発現を含む方法。
【請求項２】
被験者において平滑筋の緊張を制御する方法であって、該被験者において平滑筋の緊張を制御するために、該被験者の充分な数の平滑筋細胞において、平滑筋の緊張を制御する電圧依存性カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列の導入および発現を含む方法。
【請求項３】
被験者において平滑筋の緊張を制御する方法であって、該被験者において平滑筋の緊張を制御するために、該被験者の充分な数の平滑筋細胞において、平滑筋の緊張を制御する非高コンダクタンスカルシウム感受性カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列の導入および発現を含む方法。
【請求項４】
前記平滑筋細胞が、動脈平滑筋細胞、静脈平滑筋細胞、または内臓平滑筋細胞である、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記平滑筋細胞が、前記被験者の、膀胱、血管壁、消化管路、肺の気管支、骨盤内筋膜、陰茎、前立腺、尿管、尿道、尿路、または輸精管にある、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記内臓平滑筋細胞が、膀胱平滑筋細胞、海綿体平滑筋細胞、消化管平滑筋細胞、前立腺平滑筋細胞、または尿道平滑筋細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ配列が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項８】
前記カリウムチャネルタンパク質が、前記平滑筋の弛緩を調節する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項９】
前記カリウムチャネルタンパク質が、海綿体平滑筋の弛緩を調節する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記カリウムチャネルタンパク質が、ｍａｘｉ−Ｋ、ＫＡＴＰ、Ｋｖ１．５、またはＳＫ３である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記平滑筋細胞が海綿体平滑筋細胞であり、前記カリウムチャネルタンパク質がｍａｘｉ−Ｋである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記電圧依存性カリウムチャネルタンパク質がＫｖ１．５である、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記非高コンダクタンスカルシウム感受性カリウムチャネルが、中間コンダクタンスカルシウム感受性カリウムチャネルである、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記非高コンダクタンスカルシウム感受性カリウムチャネルが、低コンダクタンスカルシウム感受性カリウムチャネルである、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記低コンダクタンスカルシウム感受性カリウムチャネルがＳＫ３である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ配列が、前記カリウムチャネルタンパク質をコード化する配列に結合操作可能なプロモーターを更に含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１７】
前記プロモーターが、平滑筋特異的プロモーターである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記平滑筋特異的プロモーターが、平滑筋αアクチン（ＳＭＡＡ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡ配列が、点滴治療、電気穿孔法、ＤＥＡＥデキストラン、カチオン性リポソーム融合、原形質融合、ｉｎ  ｖｉｖｏでの電場の創出、ＤＮＡコーティング微小噴出ボンバードメント（bombardment）、組み換え複製不能なウィルスを用いた注入、相同的な組み換え、噴霧化、および無修飾のＤＮＡの運搬からなる群から選択される方法により導入される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ配列が、無修飾のＤＮＡの運搬により導入される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ配列が、ＥＹＦＰベクターを使用して導入される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡ配列が、平滑筋壁中への直接注入により導入される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２３】
前記平滑筋が膀胱である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｅｘ  ｖｉｖｏにて細胞をトランスフェクションし、このトランスフェクションされた細胞を前記被験者中へ移植することを更に含む、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験者の平滑筋の収縮が高まっており、該平滑筋の緊張の制御が結果的に、該被験者における該平滑筋のより弱まった収縮になる、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２６】
前記平滑筋細胞が陰茎平滑筋細胞または膀胱平滑筋細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記被験者が、喘息；良性前立腺肥大（ＢＰＨ）；冠状動脈疾患；勃起不全（ＥＤ）；骨盤内筋膜、前立腺、尿管、尿道、尿路、または輸精管の泌尿器疾患；消化管運動疾患；便秘；下痢；過敏性腸症候群；偏頭痛；早産；レイノー症候群；尿失禁；膀胱不全；拡張蛇行静脈；およびバージャー病を含む群から選択される不全を有する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２８】
前記不全がＥＤである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記被験者がＥＤを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＥＤが、神経性不全、動脈性不全、および／または静脈閉塞性不全による平滑筋の不完全な弛緩から結果的にもたらされる、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記不全が膀胱不全である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記膀胱不全が膀胱の過剰な活性から結果的にもたらされる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記不全が処置される、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記カリウムチャネルタンパク質が、前記平滑筋細胞において正常に発現されない、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項３５】
被験者におけるＥＤを処置する方法であって、該被験者の海綿体の充分な数の平滑筋細胞において、該被験者の海綿体平滑筋の緊張を制御し、これにより該被験者のＥＤを処置するための、海綿体平滑筋の緊張を制御するカリウムチャネルタンパク質をコード化する配列に結合操作可能な平滑筋特異的プロモーターである平滑筋αアクチン（ＳＭＡＡ）を含むＤＮＡ配列の導入および発現を含む方法。
【請求項３６】
前記カリウムチャネルタンパク質がｍａｘｉ−Ｋ、ＫＡＴＰ、Ｋｖ１．５、またはＳＫ３である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
被験者におけるＥＤを処置する方法であって、該被験者の海綿体の充分な数の平滑筋細胞において、該被験者の海綿体平滑筋の緊張を制御し、これにより該被験者のＥＤを処置するための、海綿体平滑筋の緊張を制御する電圧依存性カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列の導入および発現を含む方法。
【請求項３８】
前記電圧依存性カリウムチャネルタンパク質がＫｖ１．５である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
被験者におけるＥＤを処置する方法であって、該被験者の海綿体の充分な数の平滑筋細胞において、該被験者の海綿体平滑筋の緊張を制御し、これにより該被験者のＥＤを処置するための、海綿体平滑筋の緊張を制御する非高コンダクタンスカルシウム感受性カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列の導入および発現を含む方法。
【請求項４０】
前記非高コンダクタンスカルシウム感受性カリウムチャネルが中間コンダクタンスカルシウム感受性カリウムチャネルである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記非高コンダクタンスカルシウム感受性カリウムチャネルが低コンダクタンスカルシウム感受性カリウムチャネルである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記低コンダクタンスカルシウム感受性カリウムチャネルがＳＫ３である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列に結合操作可能な平滑筋特異的プロモーターＳＭＡＡを使用することが、被験者の平滑筋を制御することにおいて、該カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列に結合操作可能なウィルス性プロモーターを使用することと少なくとも同等に効果的である、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
海綿体平滑筋の緊張を制御するカリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列に結合操作可能な平滑筋特異的プロモーターＳＭＡＡを使用することが、被験者のＥＤを処置することにおいて、該カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列に結合操作可能なウィルス性プロモーターを使用することと少なくとも同等に効果的である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
平滑筋の緊張を制御するカリウムチャネルタンパク質をコード化する配列に結合操作可能な平滑筋特異的プロモーターである平滑筋αアクチン（ＳＭＡＡ）を含むＤＮＡ配列を含む製剤。
【請求項４６】
平滑筋の緊張を制御する電圧依存性カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列を含む製剤。
【請求項４７】
平滑筋の緊張を制御する非高コンダクタンスカルシウム感受性カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列を含む製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
平滑筋の緊張の脱制御により引き起こされる多くの生理学的不全または疾患がある。これらの中に包含されるのは、喘息；良性前立腺肥大（ＢＰＨ）；冠状動脈疾患；勃起不全（ＥＤ）；膀胱、骨盤内筋膜、前立腺、尿管、尿道、尿路および輸精管の泌尿器疾患；過敏性腸症候群；偏頭痛；早産；レイノー症候群；怒張静脈；およびバージャー病である。
【背景技術】
【０００２】
これらの不全の中でＥＤは、米国において１０，０００，０００〜３０，０００，０００人の男性に影響を及ぼすことが確かめられているよく見られる病気である（Feldman ら、Journal of Clinical Epidemiology, 47(5):457-67, 1994; および Anonymous. International Journal of Impotence Research, 5(4):181-284, 1993)。疾患に関連したＥＤの第１の原因の中には、加齢、アテローム硬化、慢性腎疾患、糖尿病、高血圧および抗高血圧医療、骨盤外科手術および放射線治療、ならびに心理学的不安がある（Feldman ら、Journal of Clinical Epidemiology, 47(5):457-67, 1994）。これらの多様で多面的な疾患状態の血管の惨状に関しての直接の治療は、近い将来にはなされなさそうである。
【０００３】
この１０年、消失した勃起能力を直接取り戻すための幾つかの処置方式の開発が見られた。しかしながら、現在利用可能な殆どの治療は、非特異的（例えば、ホルモン療法）、限られた全体的な成功（例えば、真空勃起装置）、侵襲的（例えば、海綿体内注射療法）であるか、または、非可逆的および高価（例えば、陰茎人工移植外科手術）である。これらの治療における限定に関わらず、ＥＤの体腔内処置のためのＣＡＶＥＲＪＥＣＴ（登録商標）（１９９５年７月６日）、ＥＤの処置における尿道内薬剤投与に関するＭＵＳＥ（登録商標）（１９９６年１１月１９日）、ならびにＥＤの処置のための経口剤としてのＶＩＡＧＲＡ（登録商標）（１９９８年３月２７日）およびＬＥＶＩＴＲＡ（登録商標）（２００３年８月１９日）に関する、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）による承認が、主要な進歩を代表する。ＥＤの問題の重大さ、およびより効果的な治療に関しての希望は、ＶＩＡＧＲＡ（登録商標）に関して以前に書かれた記述の数により照らし出されている。要約すると、米国連邦政府のこれらの行動は結果的に、ＥＤのこの問題の医学的性質の正式な認知となり、更にそれの臨床処置を合法化した。
【０００４】
研究は、変化した海綿体平滑筋の緊張は結果的に、高められた収縮または悪化した弛緩となり、不能の男性の大部分においてＥＤの次の原因であることを記述している。これらの研究は更に、もし患者の少数のみにて起きる深刻な動脈疾患または先天的な構造的異常が存在しなければ、海綿体平滑筋の完全な弛緩が、勃起能力を回復させるに必要かつ充分な条件であることを示唆している。直接または間接に平滑筋の弛緩をもたらすための物質−ＰＧＥ１（CAVERJECT（登録商標）、EDEX（登録商標）、および MUSE（登録商標））、Sildenafil（VIAGRA（登録商標））および Vardenafil（LEVITRA（登録商標）)−を含んでいる、ＥＤを処置するための最近認められた治療の効率は、この仮説の確認を証明するものである。
【０００５】
海綿体平滑筋細胞により演じられる勃起機能における決定的な役割は、それらをＥＤの処置における分子による仲介のための優れた標的とする。これまでの努力は、幾つかの心臓血管疾患の潜在的な治療のためのバイアスとして、血管平滑筋細胞中への遺伝子運搬に関する技術に、焦点を当てて来た。これらの中には、粥状硬化、脈管炎、バルーン血管形成術後の再狭窄、および肺高血圧がある。これらの初期の研究は、平滑筋細胞における遺伝子運搬方法の効率および持続性に関する重要な情報を提供して来た（Ｆｉｎｋｅｌら、FASEB Journal, 9:843-51, 1995; Pozeg, et al., Circulation 107: 2037-44, 2003）。ＥＤは変化した平滑筋の緊張により大部分引き起こされるので、平滑筋の緊張の変化に含まれる遺伝子を標的とする遺伝子運搬の方法が、極めて望ましい。ＥＤを緩和するための遺伝子運搬の優れた方法は大きな需要があるが、これは、現在使用されている方法に対する好ましい代替法であるからであろう。
【０００６】
異常な膀胱機能は、米国において何百万もの男性および女性の生活の質（ＱＯＬ）に有意に影響を及ぼす、もう１つ別の共通の問題である。多くの共通の疾患（例えば、ＢＰＨ、糖尿病、多硬化症、および心臓発作）は、正常な膀胱機能を変化させる。膀胱機能における、本意ではない有意な変化は、加齢による正常な結果でもある。
【０００７】
変化した膀胱の生理学の２つの原則的な臨床的兆候：弛緩した膀胱および過剰に活性な膀胱（Ａｂｒａｍｓ  Ｐら、Ｎｅｕｒｏｕｒｏｌ．Ｕｒｏｄｙｎ．２１（２）：１６７−７８，２００２）がある。弛緩した膀胱は、排尿平滑筋（膀胱壁の平滑筋）の効果的でない収縮のために、それの尿内容物を空にする能力を消失してしまっている。この弛緩状態では、消失してしまった平滑筋の収縮性は、膀胱不全の病因において、暗にそれと示唆されている。これ故に、平滑筋の緊張の薬理学的調節が、この横たわっている問題を解消するに不充分であることは、驚くに当たらない。実は、この病状を処置するために広く行われている方法は、清潔で断続的なカテーテルを使用し；これは、慢性の尿路感染、腎盂炎、および結局のところの腎不全を防ぐ優れた手段である。このように、弛緩した膀胱の処置は、疾患の症状をより良くするが、この横たわっている原因は解消しない。
【０００８】
逆に、過剰に活性な膀胱は自然に収縮し；このことは結果的に失禁をもたらすことがあり、この場合この個体は尿の通過をコントロールすることが出来ない。この過剰に活性な膀胱は、弛緩した膀胱よりも、処理するにはより難しい臨床的な問題である。この病状を処置するのに使用されて来た医療は通常、部分的に効果的なだけであり、薬剤の患者の使用および該薬剤を続けようという該患者の熱意を削いでしまう有意な副作用を有する。これらの現在受け入れられている処置の選択肢（例えば、オキシブチニンおよびトレラジン）は非常に非特異的であり、最も頻繁に、ムスカリン受容体経路および／または膀胱筋細胞上のカルシウムチャネルの閉鎖を含んでいる。体内の多くの器官システムの細胞機能におけるこれら２つの経路の中心的な重要性が与えられれば、このような非特異的な治療戦略は、膀胱平滑筋の緊張を調節するための大雑把な方法であるだけでなく；むしろ、正にそれらの作用メカニズムのために、それらは有意で望ましい全身効果を持ってしまうと視覚的にも認められる。従って、膀胱不全のための処置の改善された選択肢に対する大きな必要性がある。
【０００９】
陰茎の生理学と膀胱の生理学との間には、幾つかの生理学的に適切な比較可能な平行関係がある。例えば、排尿平滑筋の緊張は、ＥＤにおける海綿体平滑筋の緊張のよく特徴付けられた役割に似た、膀胱不全の病因における役割を演じている。特に、過剰に活性な膀胱は、亢進した収縮により特徴付けられるが、一方、弛緩した膀胱は、低下した収縮により特徴付けられる。過剰に活性な膀胱を処置するための薬理学的治療は典型的に、頻繁な膀胱内点滴を含むものであり、これは、患者がしばしば不便を感じるか、さもなくば望まない処置である。端的には、膀胱筋細胞機能を回復させるための頻繁な膀胱内点滴は望まれず、全身医療は寛容出来る特異性を尚欠くものである。にもかかわらず。排尿平滑筋細胞により演じられる膀胱不全における決定的な役割、およびそれらが、膀胱内点滴を通じて、尿路上皮を横切って影響を及ぼすことが可能であることは、それらを膀胱不全の処置における分子による仲介のための優れた標的とする。
【００１０】
ＥＤおよび膀胱不全は、変化してしまった平滑筋の緊張により大部分引き起こされるので、平滑筋の緊張の制御に含まれている遺伝子を標的とする遺伝子運搬の方法は極めて望ましく、というのも、それは膀胱不全およびＥＤを緩和する新しい手段を提供するであろうからである。同様に、平滑筋の緊張の制御に含まれている遺伝子を標的とする遺伝子運搬の方法は、喘息；ＢＰＨ；冠状動脈疾患（血管造影の間に注入される）；骨盤内筋膜、前立腺、尿管、尿道、尿路、および輸精管の泌尿器不全；過敏性腸症候群；偏頭痛；早産；レイノー症候群；拡張蛇行静脈；およびバージャー病を包含するがこれらに限定されない他の平滑筋不全を緩和する手段として、極めて有用であろう。
【００１１】
イオンチャネル活性における変化が、喘息、膀胱不全、ＥＤ、および高血圧と同様に、様々なヒト平滑筋関連疾患の病因において疑われている。これらの組織の全てにおいて、筋細胞のカリウム（Ｋ＋）チャネルは、様々な内因性物質の、平滑筋の緊張への効果を媒介することにおいて、中心的な役割を演じている。３０より多いＫ＋チャネルの遺伝子は、これらの多くが平滑筋中で発現され、同定されている（Ｌａｗｓｏｎ，Ｋ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，９１：６５１−６３，１９９６；Ｌａｗｓｏｎ，Ｋ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，７０（１）：３９−６３，１９９６；およびＡｓｈｃｒｏｆｔ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｃｈａｎｎｅｌｏｐａｔｈｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）。少なくとも４つのＫ＋チャネルのサブタイプが、ヒト海綿体（陰茎）平滑筋において同定されている。これらは、（１）代謝的に開閉されるＫ＋チャネル（つまり、ＫＡＴＰ）、（２）高コンダクタンスカルシウム感受性Ｋ＋チャネル（つまり、ＫＣａまたはｍａｘｉ−Ｋチャネル）、（３）遅延整流チャネル、および（４）電圧依存性の速い一過性「Ａ」電流チャネル（Ｃｈｒｉｓｔら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｐｏｔｅｎｃｅ  Ｒｅｓ．５：７７−９６，１９９３；Ｊ．Ａｎｄｒｏｌ．１４：３１９−２８，１９９３）を包含する。
【００１２】
Ｃｈｒｉｓｔら（米国特許第６，２７１，２１１号）は、陰茎平滑筋の亢進した収縮により引き起こされる軟弱な陰茎を処置する方法を教示し、これは、ＫＡＴＰチャネルサブユニットタンパク質Ｋｉｒ６．２をコード化するＤＮＡ配列を、被験者の陰茎の平滑筋細胞中へ直接導入することを含む。同様に、Ｇｅｌｉｅｂｔｅｒら（米国特許第６，１５０，３３８号）は、陰茎の勃起を誘導する方法を教示し、これは、ｍａｘｉ−Ｋチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡを、被験者の陰茎平滑筋細胞中へ導入することを含む。Ｃｈｒｉｓｔら（米国特許第６，２３９，１１７号）は、膀胱平滑筋の亢進した収縮により引き起こされる膀胱不全を処置する方法を教示し、これは、ｍａｘｉ−Ｋチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列を、被験者の膀胱平滑筋細胞中へ導入することを含む。しかしながら、米国特許第６，１５０，３３８号、米国特許第６，２３９，１１７号、および米国特許第６，２７１，２１１号のいずれもが、電圧依存性カリウムチャネルタンパク質；非高コンダクタンスカルシウム感受性カリウムチャネルタンパク質；または、カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡに結合操作可能な平滑筋特異的プロモーターである平滑筋αアクチン（ＳＭＡＡ）の使用による、平滑筋の緊張の制御を示唆するものではない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
［本発明の要約］
本発明は、被験者における平滑筋の緊張を制御する方法を提供し、これは、平滑筋の緊張を制御する、カリウムチャネルタンパク質をコード化する配列に結合操作可能な、平滑筋特異的プロモーターである平滑筋αアクチン（ＳＭＡＡ）を含むＤＮＡ配列の導入および発現を含み、これらは、該被験者における平滑筋の緊張を制御するに充分な数の、該被験者の平滑筋細胞におけるものである。
【００１４】
本発明はまた、被験者における平滑筋の緊張を制御する方法を提供し、これは、平滑筋の緊張を制御する、電圧依存性カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列の導入および発現を含み、これらは、該被験者における平滑筋の緊張を制御するに充分な数の、該被験者の平滑筋細胞におけるものである。
【００１５】
本発明は更に、被験者における平滑筋の緊張を制御する方法を提供し、これは、平滑筋の緊張を制御する、非高コンダクタンスカルシウム感受性カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列の導入および発現を含み、これらは、該被験者における平滑筋の緊張を制御するに充分な数の、該被験者の平滑筋細胞におけるものである。
【００１６】
本発明の更なる目的は、以下の記載から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、被験者における平滑筋の緊張を制御する方法を提供し、これは、平滑筋の緊張を制御する、カリウムチャネルタンパク質をコード化する配列に結合操作可能な、平滑筋特異的プロモーターである平滑筋αアクチン（ＳＭＡＡ）を含むＤＮＡ配列の導入および発現を含み、これらは、該被験者における平滑筋の緊張を制御するに充分な数の、該被験者の平滑筋細胞におけるものである。好ましいカリウムチャネルタンパク質は、高コンダクタンスカルシウム感受性カリウムチャネルタンパク質ｍａｘｉ−Ｋ、代謝により開閉する内向きの整流カリウムチャネルタンパク質ＫＡＴＰ、電圧依存性カリウムチャネルタンパク質Ｋｖ１．５、および低コンダクタンスカルシウム感受性カリウムチャネルタンパク質ＳＫ３である。好ましい実施形態では、これらの平滑筋細胞は、海綿体平滑筋細胞または膀胱平滑筋細胞であり、該カリウムチャネルタンパク質はｍａｘｉ−Ｋである。好ましくは、該カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列に結合操作可能な該平滑筋特異的プロモーターＳＭＡＡを使用することは、被験者において平滑筋の緊張を制御することにおいて、該カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列に結合操作可能なウィルス性プロモーターを使用することと、少なくとも同様に効果的である。
【００１８】
本発明はまた、被験者における平滑筋の緊張を制御する方法を提供し、これは、平滑筋の緊張を制御する、電圧依存性カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列の導入および発現を含み、これらは、該被験者における平滑筋の緊張を制御するに充分な数の、該被験者の平滑筋細胞におけるものである。電圧依存性カリウムチャネルタンパク質は、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．５、Ｋｖ２．１、Ｋｖ３．１ｂ、遅延整流チャネル、および速い一過性の「Ａ」電流チャネルを包含する。好ましい実施形態では、該電圧依存性カリウムチャネルタンパク質は、Ｋｖ１．５である。好ましくは、該ＤＮＡ配列は更に、該電圧依存性カリウムチャネルタンパク質をコード化する配列に結合操作可能なプロモーターを含む。好ましくは、該プロモーターは、平滑筋特異的プロモーターである。より好ましくは、該平滑筋特異的プロモーターは、平滑筋αアクチン（ＳＭＡＡ）である。
【００１９】
本発明は更に、被験者における平滑筋の緊張を制御する方法を提供し、これは、平滑筋の緊張を制御する、非高コンダクタンス性カルシウム感受性カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列の導入および発現を含み、これらは、該被験者の平滑筋の緊張を制御するに充分な数の、該被験者の平滑筋細胞におけるものである。本明細書中で使用される場合、「非高コンダクタンス性カルシウム感受性カリウムチャネルタンパク質」とは、中間コンダクタンス性カルシウム感受性カリウムチャネルタンパク質、または低コンダクタンス性カルシウム感受性カリウムチャネルタンパク質を意味する。該低コンダクタンス性カルシウム感受性カリウムチャネルタンパク質は、ＳＫ１、ＳＫ２およびＳＫ３を包含する。好ましくは、該低コンダクタンス性カルシウム感受性カリウムチャネルタンパク質は、ＳＫ３である。好ましくは、該ＤＮＡ配列は更に、該カリウムチャネルタンパク質をコード化する配列に結合操作可能なプロモーターを含む。好ましくは、該プロモーターは平滑筋特異的プロモーターである。より好ましくは、該平滑筋特異的プロモーターは、平滑筋αアクチン（ＳＭＡＡ）である。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「制御」とは、弛緩の調節または収縮の調節である。
【００２１】
遺伝子運搬方法が使用されてもよい平滑筋細胞の例は、膀胱、消化管、肺の気管支、陰茎（海綿体）、前立腺、尿管、尿道（海綿体）、尿路、および輸精管の内臓平滑筋細胞；同様に骨盤内筋膜の平滑筋細胞および／または骨格筋細胞を包含するが、これらに限定されない。ここに請求される遺伝子運搬の方法は、膀胱平滑筋細胞、海綿体平滑筋細胞、消化管平滑筋細胞、前立腺平滑筋細胞、および尿道平滑筋細胞において、使用されてもよい。平滑筋組織および他の血管組織の緊張を制御する因子における多くの全組織的および生理学的類似性がもし与えられれば、同様の原則が、遺伝子運搬の方法の、膀胱、消化管、肺の気管支、陰茎（海綿体）、前立腺、尿管、尿道（海綿体）、尿路、および輸精管の動脈平滑筋細胞への適用を可能にするであろう。遺伝子運搬に関する本方法はまた、静脈平滑筋細胞へ適用されてもよい。
【００２２】
平滑筋細胞において導入され発現される該カリウムチャネルタンパク質は、該平滑筋細胞において正常に発現されるカリウムチャネルタンパク質である必要は必ずしもない。
【００２３】
本発明は特に、遺伝子運搬の方法を提供し、ここでは平滑筋の緊張の制御に含まれているカリウムチャネルタンパク質が、平滑筋の弛緩を制御する。これらのカリウムチャネルタンパク質は、平滑筋の弛緩を促進し、また、平滑筋の緊張を減少させるであろう。特に、弛緩が陰茎平滑筋中で促進される場合、勃起はより容易に得られるであろう。同様に、平滑筋の自動的な緊張が膀胱において減少される場合、膀胱の過剰な反応性は減少されるであろう。本発明のこの実施形態において、該遺伝子運搬方法は、膀胱の空にする能力（排出能力）に影響を及ぼすことなく、過剰な反応性の膀胱を有する個体を処置するために、特に使用される。本明細書中で使用される場合、「過剰な反応性の膀胱」とは、自動的に収縮するものであり、それで個体は尿の通過をコントロールすることが出来ない。この尿疾患は、より一般に切迫尿失禁と呼ばれ、ストレス失禁と組み合わされた切迫尿失禁を包含してもよい。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、該被験者は平滑筋の亢進した収縮を有し、遺伝子運搬を介した平滑筋の緊張の制御は、該被験者における平滑筋のより弱められた収縮を結果的に与える。好ましくは、該平滑筋細胞は、陰茎平滑筋細胞または膀胱平滑筋細胞である。
【００２５】
本発明は、被験者における陰茎平滑筋の緊張を制御する方法を特に提供するものであり、これは、平滑筋の緊張の制御に含まれているカリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列の、該被験者の陰茎平滑筋細胞への導入、および、該被験者の陰茎の勃起を誘導するに充分な数の、該被験者の陰茎平滑筋細胞における発現を含む。この実施形態では、本発明の方法は、ＥＤを緩和するのに使用される。
【００２６】
本発明は、被験者におけるＥＤを処置する方法を提供し、これは、平滑筋特異的プロモーターである、海綿体平滑筋の緊張を制御するカリウムチャネルタンパク質をコード化する配列に結合操作可能な平滑筋αアクチン（ＳＭＡＡ）を含むＤＮＡ配列の導入および発現を含み、これらは、該被験者の海綿体平滑筋の緊張を制御するに充分な数の、該被験者の海綿体平滑筋細胞におけるものであり、このことによって、該被験者のＥＤを処置するものである。好ましくは、該カリウムチャネルタンパク質は、ｍａｘｉ−Ｋ、ＫＡＴＰ、Ｋｖ１．５、またはＳＫ３である。最も好ましくは、該カリウムチャネルタンパク質は、ｍａｘｉ−Ｋである。好ましくは、海綿体平滑筋の緊張を制御するカリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列に結合操作可能な平滑筋特異的プロモーターＳＭＡＡを使用することが、該被験者におけるＥＤを処置することにおいて、該カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列に結合操作可能なウィルス性プロモーターを使用することと少なくとも同様に、効果的である。
【００２７】
本発明はまた、被験者におけるＥＤを処置する方法を提供し、これは、海綿体平滑筋の緊張を制御する、電圧依存性カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列の導入および発現を含み、これらは、該被験者の海綿体平滑筋の緊張を制御するに充分な数の、該被験者の海綿体平滑筋細胞におけるものであり、このことによって、該被験者のＥＤを処置するものである。好ましくは、該電圧依存性カリウムチャネルタンパク質は、Ｋｖ１．５である。
【００２８】
本発明は、被験者におけるＥＤを処置する方法を更に提供し、これは、海綿体平滑筋の緊張を制御する、非高コンダクタンス性カルシウム感受性カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列の導入および発現を含み、これらは、該被験者の海綿体平滑筋の緊張を制御するに充分な数の、該被験者の海綿体平滑筋細胞におけるものであり、このことによって、該被験者のＥＤを処置するものである。該非高コンダクタンス性カルシウム感受性カリウムチャネルタンパク質は、中間コンダクタンス性カルシウム感受性カリウムチャネルタンパク質、または低コンダクタンス性カルシウム感受性カリウムチャネルタンパク質であり得る。好ましくは、該低コンダクタンス性カルシウム感受性カリウムチャネルタンパク質は、ＳＫ３である。
【００２９】
ＥＤは、神経性、動脈性、および静脈閉塞不全を包含する種々の疾患から結果的にもたらされることがあり、平滑筋の不完全な弛緩を引き起こす他の病状も同様である。
【００３０】
更に、本発明は、被験者中の平滑筋を制御する方法を提供し、平滑筋の緊張の制御に含まれているカリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列の、該被験者の膀胱平滑筋細胞中への導入、ならびに該被験者の膀胱の弛緩を促進するに充分な数の、該被験者の膀胱平滑筋細胞における発現を含む。この実施形態では、本発明の方法は、活性過ぎる膀胱を緩和させるために使用される。活性過ぎる膀胱は、神経性、筋肉性（つまり、増強された収縮を自ら産み出す排尿筋における変化）、または動脈性（つまり、血管不全または虚血）不全を包含する種々の原因から結果的にもたらされることがあり、膀胱平滑筋の制御の変化を促進する他の病状（例えば、糖尿病性神経症、多発性硬化、パーキンソン病、心臓発作）も同様である。神経性膀胱不全は、尿の部分的または完全な保持またはオーバーフローを自制出来ないこととして現れる。膀胱の神経性不全の例は、低圧または弛んだ膀胱、および痙攣または収縮した膀胱を包含する。これらの不全は、異常、怪我、または脳や脊髄（例えば、二分脊椎）の疾患過程、または膀胱および膀胱出口への局所神経による供給から結果的にもたらされることがある。神経性膀胱不全を結果的にもたらす疾患過程は、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）；脳血管におけるアクシデント；多発性硬化および筋萎縮性側索硬化のような硬化脱髄疾患または変性疾患；糖尿病；椎間板ヘルニア；梅毒；および脳または脊髄腫瘍を包含する。
【００３１】
更に本発明の方法により、遺伝子運搬の方法が提供され、ここでは平滑筋の緊張の制御に含まれるカリウムチャネルタンパク質は、平滑筋の収縮を調節する。
【００３２】
加えて、本発明は、被験者中の平滑筋における炎症および刺激の効果を抑制する方法を提供し、平滑筋の緊張の制御に含まれているカリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列の、該被験者の平滑筋細胞中への導入、ならびに炎症および刺激の効果を抑制するに充分な数の、該被験者の平滑筋細胞における発現を含む。例えば、本発明により提供される方法は、膀胱の間細胞性膀胱炎または照射誘導性膀胱炎のような、膀胱の膀胱炎の症状を抑制するのに使用されてもよい。間細胞性膀胱炎は、炎症および刺激の臨床的兆候を持つ膀胱の１病状である。間細胞性膀胱炎は、例えば、アレルギー反応、自己免疫疾患、またはコラーゲン疾患により引き起こされることがある。更に、本明細書中で提供される遺伝子運搬の方法は、例えば、被験者の尿管、尿道、または尿路の平滑筋細胞における炎症および刺激の効果を抑制するのに使用されてもよく、これは、バクテリア、菌、または寄生虫の感染により引き起こされることがある。
【００３３】
本発明の方法では、本明細書中で記載される遺伝子運搬は、平滑筋の性能に関する他の不全を処置するのに使用されてもよく、これは、喘息；冠状動脈疾患（血管造影の間に注入される）；尿管、尿道、尿路、および輸精管の泌尿器不全；便秘、下痢、または過敏性腸症候群を包含する消化管運動疾患；偏頭痛；早産；レイノー症候群；膀胱不全；拡張蛇行静脈；およびバージャー病を包含するが、これらに限定されない。喘息を処置するのに使用される場合、本方法の遺伝子運搬は、当業界において既知の如何なる方法を使用しても、エアロゾル送達を経由して被験者へ投与されてよい。
【００３４】
本発明の方法では、該被験者は動物またはヒトであってよく、好ましくはヒトである。好ましくは、該被験者が患っている不全は、本発明の方法により処置される。
【００３５】
興味あるＤＮＡ配列は、電気穿孔法、ＤＥＡＥデキストラン、モノカチオン性リポソーム融合、ポリカチオン性リポソーム融合、原形質融合、ＤＮＡコーティング微小噴出ボンバードメント（bombardment）、ｉｎ  ｖｉｖｏでの電場の創出、組み換え複製不能なウィルスを用いた注入、相同的な組み換え、噴霧化、ＥＹＦＰベクターの使用、および無修飾の（むき出しの、ｎａｋｅｄ）ＤＮＡの運搬のような、当業者には既知の数多くの手法により、例えば膀胱内点滴により、平滑筋細胞中へ導入されてもよい。該ＤＮＡ配列は、平滑筋壁中への直接注入により、導入されてもよい。好ましい平滑筋壁は、膀胱壁である。加えて、平滑筋細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏにて該ＤＮＡ配列を用いてトランスフェクションされ得、このトランスフェクションされた細胞は、該被験者中へ移植され得る。Ｅｘ  ｖｉｖｏにてトランスフェクションされるべきこれらの細胞は、これらのトランスフェクションされる細胞が移植される同一被験者から持ってこられる。当業者により、ＤＮＡ運搬の上記の方法のいずれもが組み合わされ得ることが、認められるはずである。該ＤＮＡ配列は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、該ＤＮＡは、哺乳類のベクターを使用して、むき出しのＤＮＡの運搬により、平滑筋細胞中へと運搬される。「むき出しのＤＮＡ」とは、本明細書中、非ウィルス性ベクター中に含有されるＤＮＡとして定義される。該ＤＮＡ配列は無菌的な水溶液と組み合わされてもよく、これは好ましくは受容者の血液と等張である。このような溶液は、該ＤＮＡを、生理学的に相容れる物質（食塩、グリシン、および同様のもののような）を含有する水中に懸濁させ、緩衝されたｐＨを生理学的条件に相容れるように維持し、該溶液を無菌化することにより調製されてもよい。本発明の好ましい実施形態では、該ＤＮＡは、平滑筋細胞中への導入のための準備において、生理食塩水中２０〜２５％スクロースと組み合わされる。
【００３７】
該ＤＮＡが膀胱平滑筋細胞中へ運搬される場合、尿道を通しての膀胱内点滴により膀胱中へ導入され得るが、これは、膀胱腫瘍の処置のためによく確立された治療である。該ＤＮＡ溶液はその後、上記の時間期間、膀胱内に、該患者により自発的に保留される。もう１つ別の実施形態では、該ＤＮＡは、点滴または注入運搬により、骨盤内筋膜、前立腺、尿管、尿道、上部尿路、または輸精管中へと導入され、尿管、尿道、または上部尿路が塞がれて、該ＤＮＡ溶液は上記の時間期間、内部上皮層に接触したままになる。発現用の該ＤＮＡ配列もまた、カチオン性リポソーム中へ取り込まれ、該患者の平滑筋細胞中へと直接注入されてよい。
【００３８】
本方法は、ウィルス性および／または非ウィルス性組み換えベクターを使用してもよい。ウィルスに基づいたベクターは：（１）その一部分がＤＮＡ配列の発現を目指すことが出来るウィルスのゲノム、または少なくとも一部分に対応する核酸；および（２）平滑筋の緊張の制御に含まれているカリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列であって、該ウィルス性核酸に結合操作可能であり、標的細胞中機能的な遺伝子産物として発現され得るものを含む。本発明の組み換えウィルスベクターは、当業者に既知の種々のウィルス性核酸、例えば、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペス単純ウィルス（ＨＳＶ）、レンチウィルス、Ｓｅｍｉｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔウィルス、ワクシニアウィルス、ならびにＲＮＡおよびＤＮＡウィルスを包含する他のウィルスのゲノム由来であってもよい。
【００３９】
本発明の組み換えベクターはまた、適切な制御エレメントをコード化するヌクレオチド配列を含有してもよく、これは、適切な宿主細胞中でのベクター構築物の発現に効果を与えるためである。本明細書中で使用される場合、「発現」とは、そのベクターが、ｍＲＮＡ中へと挿入されたそのＤＮＡ配列を転写する能力に関し、このことにより、この挿入された核酸によりコード化されるタンパク質の合成が起こり得る。当業者は、以下を認めるであろう：（１）種々のエンハンサーおよびプロモーターが、本発明の構築物における使用に適切であること；および（２）該構築物は、宿主細胞中への組み換えベクター構築物の導入時に、平滑筋の緊張の制御に含まれているカリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列の適正な転写および加工用に必要な、開始、終結、およびコントロール配列を含有するであろうということ。
【００４０】
本発明により提供される非ウィルス性ベクターは、平滑筋の緊張の制御に含まれているカリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列の平滑筋細胞中での発現用であり、当業者に既知の以下のベクターのいずれかの全てまたは一部分を含んでもよい：ｐＣＭＶβ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＴ−３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＰｒｏＥｘ−１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＳＦＶ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐｃＤＮＡ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＳＬ３０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＳＥ３８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＴｒｃＨｉｓＡ，Ｂ，Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＳＥＴ  Ａ，Ｂ，Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＣ３６０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＬ１３９２およびｐＶｌ１３９２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＤＭ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡＩ（ａｍｐ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＢＶＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、λＰｏｐ６、ＥＹＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、およびｐＢＦ。他のベクターは、当業者には明らかであろう。
【００４１】
本発明に適切なプロモーターは、構築プロモーター、組織特異的プロモーター、および誘導可能なプロモーターを包含するが、これらに限定されない。本発明の１実施形態では、平滑筋の緊張の制御に含まれているカリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡ配列の発現は、該ＤＮＡ配列が導入されている特定のベクターによりコントロールされ、影響を受ける。幾つかの真核細胞ベクターは（遺伝子）工学的に操作され、この宿主細胞内において高レベルまで、挿入された核酸を発現出来るようになる。このようなベクターは、この高レベルの発現を目指すべく、数多くの強力なプロモーターの内の１つを利用する。真核細胞ベクターは、ウィルスの遺伝子、特に腫瘍ウィルスのもののプロモーター−エンハンサー配列を使用する。本発明のこの特別の実施形態は、誘導可能なプロモーターの使用を通じて、該タンパク質をコード化するＤＮＡ配列の発現の制御を見越したものである。誘導可能なプロモーターの非限定例は、メタロチオニンプロモーターおよびマウス哺乳類腫瘍ウィルスプロモーターを包含する。該ベクターに依存して、平滑筋細胞中でのＤＮＡ配列の発現は、該細胞の成長サイクル（細胞周期）中のあるポイントにおける、特異的化合物の添加により誘導され得るであろう。本発明の組み換えベクターにおける使用に有効なプロモーターおよびエンハンサーの他の例は、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）、ＳＶ４０（サルウィルス４０）、ＨＳＶ（ヘルペス単純ウィルス）、ＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス）、レトロウィルス、およびアデノウィルスのプロモーターおよびエンハンサー、好ましくは平滑筋特異的プロモーターおよびエンハンサーを包含するが、これらに限定されない。平滑筋特異的プロモーターの１例は、ＳＭ２２αである。好ましい平滑筋特異的プロモーターは、平滑筋αアクチン（ＳＭＡＡ）である。
【００４２】
本発明は更に、平滑筋の緊張の制御に含まれているカリウムチャネルタンパク質をコード化する外因性ＤＮＡ配列を発現する平滑筋細胞を提供する。本明細書中で使用される場合、「外因性」とは、器官または細胞中へ導入される如何なるＤＮＡをも意味する。該外因性ＤＮＡ配列を含有する組み換えベクターの該平滑筋細胞中への導入は、電気穿孔法、ＤＥＡＥデキストラン、カチオン性リポソーム融合、原形質融合、ＤＮＡコーティング微小噴出ボンバードメント（bombardment）、組み換え複製不能なウィルスを用いた注入、相同的な組み換え、および無修飾のＤＮＡの運搬のような、当業者に既知の方法により、例えば膀胱内点滴により、効果を与えられてもよい。
【００４３】
本明細書中記載されるＤＮＡ運搬の方法のいずれもが、組み合わされてもよい。加えて、本明細書中記載される方法は他の治療と組み合わされて、投薬要求量を低下させて副作用を抑制する一方、処置効率を上げてもよい。例えば、ＥＤは、例えばバイアグラ（ＶＩＡＧＲＡ、登録商標）を使用する経口治療と組み合わされた、本明細書中で開示されるようなカリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡの運搬方法を使用して、処置されてもよい。
【００４４】
本発明は、以下の実験の部中の実施例に記載される。この実験の部は、本発明の理解において助けとなるように説明され、如何なる方式によっても、以降に続く請求項において定義されるように本発明を限定するように解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４５】
［実験の詳細］
［異なるカリウムチャネルサブタイプおよび平滑筋特異的プロモーターを使用するＥＤ遺伝子運搬］
勃起能力を回復させるための異なるカリウムチャネルサブタイプの効率が、平滑筋特異的プロモーターと組み合わされた電圧依存性カリウムチャネルタンパク質Ｋｖ１．５、低コンダクタンスカルシウム感受性カリウムチャネルタンパク質ＳＫ３、および高コンダクタンスカルシウム感受性カリウムチャネルタンパク質ｍａｘｉ−Ｋにより、トランスフェクションされた年老いた育成ラットにおいて実証された。
【００４６】
ラットの陰茎は、機能的に、組織学的に、および薬理学的に、ヒトの陰茎と同様であることが示されているので（Ｌｅｓｓｏｎら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｕｒｏｌｏｇｙ，３（２）：１４４−４５，１９６５）、ラットが遺伝子運搬研究用に選択された。多くの既知モデルの中でも、ラットは陰茎の勃起の研究用に優れており（Ｌｅｓｓｏｎら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｕｒｏｌｏｇｙ，３（２）：１４４−４５，１９６５；Ｑｕｉｎｌａｎら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１４１（３）：６５６−６１，１９８９；Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１４７：１１２４−２８，１９９２；Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｐｉｎｅｉｒｏら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｒｏｌｏｇｙ，２５：６２−７０，１９９４）、神経性および糖尿病性不能も同様である。
【００４７】
以下に記載される研究は、勃起能力の測定値として、体腔神経（ＣＮ）の電気刺激により惹起される海綿体内圧（ＩＣＰ）における変化を使用する。該ＣＮ刺激モデルの確認は、ｍａｘｉ−Ｋのトランスフェクション後の同様の結果が、電気ＣＮ刺激または脳の視索前野内の電気刺激を使用して得られたことを示す研究において（Ｓａｔｏら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６３（４）：Ｓｕｐｐｌ．，ｐ．１９８，２０００）、あるいは覚醒動物におけるＩＣＰにおける化学的（アポモルヒネによる）惹起変化に応じて（Ｓａｔｏら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６５（５）：Ｓｕｐｐｌ．，ｐ．２２０，２００１）実証されている。
【００４８】
［１．一般的な実験手順］
年老いた育成Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットが使用された（体重幅５００〜７００ｇ）。全てのラットが自由に（ａｄ  ｌｉｂｉｔｕｍ）ＰｕｒｉｎａＬａｂ齧歯類用食餌を給され、０７：００〜１９：００の照明サイクルを用いて個々に飼育かごへ入れられた。
【００４９】
該カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡが、以下に記載されるように麻酔されたラットの海綿体腔中へ注入された。注入１週間後、これらのラットは再び麻酔され、実験プロトコールを受け、体腔内圧（ＩＣＰ）における、陰茎の勃起に比例する変化が得られるかどうかを調べた。
【００５０】
ラットは、ペントバルビタールナトリウム（Ａｎｐｒｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）の腹腔内注入（３５ｍｇ／ｋｇ）により麻酔された。麻酔は、必要に応じて、４５〜６０分毎のペントバルビタール（５〜１０ｍｇ／ｋｇ）の引き続いての注入により、実験プロトコール（２〜３時間）の間中維持された。
【００５１】
実験プロトコールのための手術準備および圧力モニターカニューラの設置：麻酔された動物が、仰向けに置かれた。膀胱および前立腺が、正中線開腹によりむき出しにされた。血圧（ＢＰ）の連続モニターのために、左頸動脈に動脈線が挿入された。右外側頸静脈線が、静脈内輸液または採血のために利用された。体腔神経は前立腺の後外側表面上に位置しており、消化管下または骨盤神経の接続により形成される骨盤神経節（ガングリオン）から発している。神経−刺激プローブは、電流刺激のために体腔神経の周りに置かれた。２つの大動脈が、両側での鼠径陰嚢切開によりむき出しにされ、陰茎の解剖も組み合わせて行われた。海綿体内圧（ＩＣＰ）をモニターするために、２３ゲージのカニューラが２５０Ｕ／ｍＬのヘパリン溶液により満たされ、ＰＥ−５０チューブ（Ｉｎｔｒａｍｅｄｉｃ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）へ接続され、右海綿体腔中へと挿入された。
【００５２】
両方の圧力線（ＢＰおよびＩＣＰ）が圧力変換器へ接続され、これが今度は、変換増幅器（ＥＴＨ４００ＣＢＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を経由して、データ表示板（ＭａｃＬａｂ／８ｅ、ＡＤＩＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＭＡ）へ接続された。圧力測定のリアルタイム表示および記録が、マッキントッシュ（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）コンピューター（ＭａｃＬａｂソフトウェアｖ３．４）上で行われた。この圧力変換器およびデータ表示板は、ｃｍＨ２Ｏにおいて較正された。
【００５３】
体腔神経の神経刺激および海綿体内圧の記録：該体腔神経の直接の電気刺激が、ステンレス鋼のバイポーラーフック電極を用いて行われた。各プローブは０．２ｍｍの直径であり；これら２つの電極は１ｍｍ離された。１相の矩形パルスが、シグナル発生器（顧客仕様、定常電流増幅器内蔵）により送られた。刺激のパラメーターは、以下の通りであった：周波数２０Ｈｚ；パルス幅０．２２ミリ秒；期間１分間。この電流のプロトコールは、以下の間隔：０．５、１、２、４および６ｍＡにて増加する電流の適用を含んでいた。海綿体内圧および全身血圧における変化は、各レベルの神経刺激にて記録された。
【００５４】
各レベルの神経刺激における統計的な比較は、Ｐｏｓｔ−ｈｏｃの対による比較用に使用されるＦｉｓｃｈｅｒ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅテストを用いて、Ｏｎｅ  Ｗａｙ  ＡＮＯＶＡに付された。全ての差違は、ｐ＜０．０５で有意であると考えられた。データは、その平均（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として表現される。
【００５５】
刺激−応答曲線が生成され、海綿体内圧における変化を平均全身血圧の関数として表現することにより（ＩＣＰ／ＢＰとして表現された）、海綿体内圧への神経刺激の効果を示し、その後この比を神経刺激の大きさの関数としてプロットした。全てのデータは、マッキントッシュコンピューター用シグマ・プロットソフトウェアを使用してプロットされた（Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ，Ｊａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）。
【００５６】
［２．Ｋｖ１．５およびＳＫ３カリウムチャネルサブタイプを用いた実験］
Ｋｖ１．５は、興奮可能な多くの細胞において見出された電圧感受性Ｋチャネルスーパーファミリーの一員である電圧依存性カリウムチャネルである（Ｈｉｌｌｅ，Ｉｎ：Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｏｆ  Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，２００２）。Ｋｖ１．５は、ラット体組織中に存在することが示されている（Ａｒｃｈｅｒ，Ｖａｓｃｕｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３８：６１−７１，２００２）。該カリウムチャネルＳＫ３は、興奮可能な細胞において見出された低インダクタンスカルシウム感受性カリウムチャネルファミリーの１つのアイソフォームであり（Ｈｉｌｌｅ，ｉｄ．；Ｈｅｒｒｅｒａ＆Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５４１（Ｐｔ２）：４８３−９２，２００２）、平滑筋を包含する（Ｒｏら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８１（４）：Ｇ９６４−７３，２００１）。ＳＫ３がラットまたはヒト体組織中に存在することは、示されていない。
【００５７】
材料および方法：ラットＳＫ３をコード化するＤＮＡが、プラスミドｐＢＦ中へとクローニングされ、Ｊｏｈｎ  Ａｄｅｌｍａｎから提供された（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３（５２８２）：１７０９−１４，１９９６）。ヒトＫｖ１．５をコード化するＤＮＡが、本発明者らによりクローニングされた。Ｋｖ１．５をコード化するこのクローニングされたＤＮＡが、３．０ｋｂのプラスミドベクターであるｐＶＡＸ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へ挿入された。該ｐＶＡＸ１は、該ｐｃＤＮＡ３．１ベクターを修飾することにより構築され、選択のために、アンピシリンの代わりにカナマイシンを使用し、ヒトにおいて注入する場合の、ペニシリンに対する感受性の潜在的な落とし穴を避けた。Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）における複製のためには、またはこのような組み換えタンパク質の発現のためには不必要な配列もまた、除去された。該Ｋｖ１．５遺伝子は、特異的なプライマーを使用するＰＣＲ増幅により単離された。それは配列化のためにｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにおいてまずクローニングされ、その後ＨｉｎｄＩＩＩＸＢａｍＨＩ制限部位を使用して、アルカリホスファターゼを用いて処理されたｐＶＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へとサブクローニングされ、そのバックグラウンドを抑えた。１００μｇのｐＶＡＸ／Ｋｖ１．５（ｎ＝５）またはｐＢＦ／ＳＫ３（ｎ＝６）が、麻酔されたラットの海綿体腔中へと注入された。注入後１週間、体腔の測定が全てのラットに関して行われた。処置ラットにおいて得られた応答は、ビヒクルのみ（つまり、２０％スクロース含有リン酸緩衝化生理食塩水）を注入された、年齢にマッチしたコントロール（ＡＭＣ）のラットを用いて得られた応答に比較された。
【００５８】
結果：これらの実験の結果は、図１に示される。この図に示されるように、体腔内神経により刺激された体腔内圧（ＩＣＰ）の応答性は、神経刺激の殆どのレベル（つまり、≧１．０ｍＡ）における、年齢にマッチしたコントロール（ＡＭＣ）におけるものよりも、Ｋｖ１．５またはＳＫ３チャネルのサブタイプを用いた両方の遺伝子運搬実験において、有意により大きかった。Ｋｖ１．５またはＳＫ３チャネルのサブタイプを用いた両方の遺伝子運搬は、陰茎平滑筋の充分な弛緩に比例する、体腔内圧（ＩＣＰ）の血圧（ＢＰ）に対する比を産み出して性交に適した陰茎の勃起を確実なものにする。ＩＣＰ／ＢＰ比＞０．６（図１中の水平破線）は、勃起を確実にするに充分である（Ｍｅｌｍａｎら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１７０（１）：２８５−９０，７月，２００３）。
【００５９】
［平滑筋特異的プロモーターと組み合わせて、ｍａｘｉ−Ｋカリウムチャネルを用いた実験］
材料および方法：実験が行われ、ｍａｘｉ−Ｋが高効率ウィルス性プロモーターまたは平滑筋特異的プロモーターと組み合わされた場合、勃起能力を回復させることにおける、カリウムチャネルタンパク質ｍａｘｉ−Ｋの効率を比較した。これらの実験における使用のために選択された平滑筋特異的プロモーターは、平滑筋αアクチン（ＳＭＡＡ）であった（Ｃｏｇａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１３１０−２１，１９９５）。使用された一般的なウィルス性プロモーターは、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）であった。ｐＣＭＶβおよびｐｃＤＮＡ３プラスミドが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入された。ｈＳｌｏのヒトｃＤＮＡ、ｍａｘｉ−Ｋのα−または孔形成サブユニットが、Ｓａｌｋｏｆｆ博士（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から提供された（ＭｃＣｏｂｂら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２６９：Ｈ７６７−Ｈ７７７，１９９５）。ｈＳｌｏのｃＤＮＡのヌクレオチド配列もまた、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ２３７６７にて利用（入手）可能である。ヒトｍａｘｉ−ＫチャネルのｃＤＮＡ（約３，９００ヌクレオチド、換言すれば、３．９ｋｂ長）（ＭｃＣｏｂｂら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２６９：Ｈ７６７−Ｈ７７７，１９９５）が、該ｐｃＤＮＡ３ベクターのＸｈｏＩ−ＸｂａＩクローニング部位中へと挿入され、ここで発現が、該サイトメガロウィルスＣＭＶβプロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から消し去られた。該ベクターＳＭＡＡ／ＥＹＦＰ（John Szucsik, Medical Centre of Cincinnati, USA）において、該ＥＹＦＰ遺伝子が除去され、ｈＳｌｏが該プラスミドＳＭＡＡ／ｈｓｌｏを与えるそれの場所中へ挿入された。ｐＳＭＡＡ／ＥＹＦＰそれ自体は、該ＳＭＡＡプロモーター配列を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されているＥＹＦＰベクター中へ挿入することにより、ｐＳＭＰ８（Ｃｏｇａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１３１０−２１，１９９９）に由来するものであった。該プラスミドＳＭＡＡ／ｈｓｌｏは、該ＳＭＡＡプロモーターからｈｓｌｏを発現し、ｐＶＡＸにおいて見出されたものと同一のカナマイシン耐性遺伝子を持っている。１００μｇのｐＶＡＸ／ｈＳｌｏ（ｎ＝７）またはＳＭＡＡ／ｈＳｌｏ（ｎ＝５）が、麻酔されたラットの海綿体腔中へと注入された。実験はまた、異なるタイプの細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏにて行われ、ＳＭＡＡ／ｈＳｌｏの特異性を実証した。
【００６０】
結果：ＳＭＡＡ／ｈＳｌｏは、ｉｎ  ｖｉｖｏにて培養されたヒト海綿体平滑筋細胞において特に発現したが、非平滑筋タイプの細胞、すなわち、汎用される細胞発現系であるヒト胚腎（ＨＥＫ）細胞においては特に発現しなかった。これらのデータは、ヒト平滑筋細胞におけるＳＭＡＡ／ｈＳｌｏ発現の選択性を論証するものである。
【００６１】
図２に示されるように、両タイプのプロモーターを用いた、海綿体腔中へのｉｎ  ｖｉｖｏにおける遺伝子運搬は、勃起に比例したＩＣＰ／ＢＰ比を作り出し、すなわち、ＩＣＰ／ＢＰ比＞０．６である。これ故に、両方のケースにおいて、これらの変化は統計的に有意であるだけでなく、生理学的に適切である。平滑筋特異的ベクターの使用は、高効率ウィルス性プロモーターを使用するのと等価な効果を産み出し得る。
【００６２】
［４．一般的な議論］
本発明により提供される遺伝子運搬の方法は、収縮および弛緩刺激間のバランスにおける相対的に僅かな変化が、平滑筋の緊張および機能における大きな変化を結果もたらし得るという事実の長所を採るようデザインされる（Ｃｈｒｉｓｔら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１０１（２）：３７５−８１，１９９０；Ａｚａｄｚｏｉら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１４８（５）：１５８７−９１，１９９２；Ｌｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１４９（５．２）：１２４６−５５，１９９３；Ｔａｕｂら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．，４２：６９８，１９９３；およびＣｈｒｉｓｔ，Ｇ．Ｊ．、Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，２２（４）：７２７−４５，１９９５）。遺伝子運搬のゴール（最終目的）は、平滑筋において、生理学的に関連したカリウムチャネルタンパク質をコードする外因性遺伝子の発現後、収縮および弛緩刺激間のより正常なバランスを回復させることである。ヒトにおける勃起および膀胱不全の多因性の観点では、実は、勃起能力または膀胱不全の回復において有効であろう１つより多い区別可能な遺伝子治療戦略があるかも知れない。トランスフェクションされたカリウムチャネルタンパク質の発現は、６ヶ月もの長い期間テストされても維持されている（Ｍｅｌｍａｎら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１７０（１）：２８５−９０，７月，２００３）。これ故に、患者は、この期間中、如何なる他の外因性操作なしであっても、「正常な」勃起または「正常な」膀胱機能を得ることが出来るであろう。明らかに、このことは、他の全ての現在利用可能な治療を凌駕するより大きな進歩であろう。実際にも、泌尿器の影響の受けやすさ、および平滑筋の緊張における微妙な変化が、ヒトの泌尿器疾患の多くの態様に対して応答性であるという事実は全て、泌尿器疾患を処置するための遺伝子運搬の使用へ、明らかな長所を提供する。
【００６３】
研究は今や、主要なカリウムチャネルファミリーからのカリウムチャネルサブタイプが、陰茎平滑筋の弛緩を促進させることにおいて効果的であることを示した。特に、テストされたこれらのカリウムチャネルは、低コンダクタンスカルシウム感受性ＳＫ３（図１）、高コンダクタンスカルシウム感受性ｍａｘｉ−Ｋ（米国特許第６，２７１，２１１号）、電圧依存性Ｋｖ１．５（図１）、および内向きの整流ＫＡＴＰ（米国特許第６，１５０，３３８号）カリウムチャネルである。総合すると、前述のデータは、増加したカリウムチャネル活性が、該カリウムチャネルタンパク質をコード化するＤＮＡの海綿体内単回注入後、海綿体平滑筋細胞の幾つかの分画中のより多数のＫ＋チャネルの存在から結果得られるという推定に一致している。今度は、この結果は結果的に、如何なる所与のレベルの内因性または外因性刺激に対しても、より大きな過分極を与え、細胞内のカルシウムの可動化／恒常性を恐らく変化させ、そしてこのことにより、海綿体平滑筋の弛緩をより促進させる。ヒトＫ＋チャネルのｃＤＮＡを有する平滑筋細胞の相対的に安定なトランスフェクションが、例えば、ＥＤおよび膀胱不全のような平滑筋疾患の処置における平滑筋の緊張の分子的操作のための重要かつ生理学的に適切な戦略を代表するものであるということを仮定することは、合理的に思われる。
【００６４】
本発明はまた、平滑筋特異的プロモーターを使用するカリウムチャネルタンパク質の遺伝子運搬は、より一般的なウィルス性プロモーターを使用して得られるものから仮想上区別不可能に思われる方式にて、勃起能力を回復させることが出来る。しかしながら、非組織特異的プロモーターとは反対のような、平滑筋特異的プロモーターを含有するベクターの使用は、更なる安全性の利点を、平滑筋疾患の処置への遺伝子運搬アプローチへ与え、このことは、ヒト被験者の処置にとって明らかに有利である。
【００６５】
本明細書中以上に引用された全ての刊行物および引用文献は、それらの全体をもって、本明細書中へ援用される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】複数のカリウムチャネルのサブタイプの治療効率。年老いた育成ラットにおける異なる強度の体腔内神経刺激時の、体腔内圧（ＩＣＰ）の血圧（ＢＰ）に対する比が示され、該ラット内へは、カリウムチャネルタンパク質Ｋｖ１．５またはＳＫ３をコード化する核酸が、海綿体平滑筋細胞中へと導入された。カリウムチャネルタンパク質遺伝子運搬を受けなかった、年齢にマッチしたコントロール（ＡＭＣ）からの結果も示される。陰茎の勃起に比例している０．６よりも大きなＩＣＰ／ＢＰ比（水平破線）が、ＳＫ３またはＫｖ１．５を用いてトランスフェクションされた実験動物において得られたが、コントロールの動物（ラット）においては得られなかった。ｍＡ＝ミリアンペア。
【図２】平滑筋特異的プロモーターの治療効率。年老いた育成ラットにおける異なる強度の体腔内神経刺激時の、体腔内圧（ＩＣＰ）の血圧（ＢＰ）に対する比が示され、該ラット内へは、カリウムチャネルタンパク質ｍａｘｉ−Ｋをコード化する核酸（ｈＳｌｏ）が、一般のウィルス（サイトメガロウィルス）性プロモーター（ｐＶＡＣ／ｈＳｌｏ）または平滑筋特異的プロモーター（平滑筋αアクチン、ＳＭＡＡ／ｈＳｌｏ）と組み合わされて、海綿体平滑筋細胞中へと導入された。２０％スクロースを有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を注入された、年齢にマッチしたコントロール（ＡＭＣ）からの結果も示される。陰茎の勃起に比例している０．６よりも大きなＩＣＰ／ＢＰ比（水平破線）が、実験動物の両方のグループにおいて得られたが、コントロールにおいては得られなかった。ｍＡ＝ミリアンペア。
【図１】
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【図２】
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