(57)【要約】【課題】  唾液と試薬の混合後直後に判定可能な、迅速、簡便、且つ正確に唾液緩衝能を測定可能な試薬を提供する。  【解決手段】  （１）酒石酸、乳酸等の、水溶液中での酸解離指数が３．６〜４．０の範囲にある酸性基を有す酸であって、かつ該酸性基が該酸の有する酸性基中、最も酸解離指数の大きな酸性基である酸、（２）クロロフェノールレッド等の変色域がｐＨ４．５から７．０の範囲内にあるｐＨ指示薬、（３）水を含んでなり、且つ（４）防腐剤として２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンと５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの双方を含むことを特徴とする液状の唾液緩衝能検査試薬。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）酸解離指数が３．６〜４．０の範囲にある酸性基を有す酸であって、かつ該酸性基が該酸の有する酸性基中、最も酸解離指数の大きな酸性基である酸、（２）変色域がｐＨ４．５から７．０の範囲内にあるｐＨ指示薬、（３）水を含んでなり、且つ（４）防腐剤として２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンと５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの双方を含むことを特徴とする液状の唾液緩衝能検査試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は唾液の緩衝能を測定し、齲蝕発生のリスクを診断する方法に関する。具体的には、唾液と酸、ｐＨ指示薬及び防腐剤を含む試薬を混合し、ｐＨを測定することで唾液緩衝能を検査するために使用する試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
食物中に含まれる炭水化物やその分解産物である糖は歯垢中に存在する細菌によって速やかに代謝されて酸が作られ、その結果、歯垢中のｐＨが下がり、歯の表面からカルシウムイオン、リン酸イオンが歯垢や唾液中に溶出する（脱灰）が、唾液の洗浄作用や緩衝作用により歯垢中のｐＨが中性付近に戻ると、唾液や歯垢中のカルシウムイオン、リン酸イオンが再び歯面に沈着する（再石灰化）。齲蝕とは、脱灰、再石灰化のバランスが崩れエナメル質表層下の脱灰が進む現象である。
上記の理由から、齲蝕発生のリスクの判定には、唾液の分泌量と唾液緩衝能を測定することは有用である。
【０００３】
唾液分泌量検査は被験者にパラフィンペレット等の咀嚼物を噛ませ、一定時間に分泌された唾液量を測定するという簡単な方法によって実施できる。
【０００４】
唾液緩衝能は主に、唾液中の重炭酸塩量に依存する。一定量のｐＨを変化させるために必要な酸の量は唾液の緩衝能と比例し、また、一定量の酸を添加した場合の唾液のｐＨ変化量は緩衝能に反比例するので、唾液緩衝能検査は、一定のｐＨ変化に必要な酸添加量、または一定量の酸を添加した場合のｐＨを測定することで実施できる。前者のように酸添加量を測定する方法として、Ｄｒｅｉｚｅｎの方法が知られている。該方法では、一定量の唾液に乳酸を添加し、唾液のｐＨを７．０から６．０に低下させるのに必要な乳酸量により唾液緩衝能を評価する（非特許文献１）。しかし、該方法ではｐＨメーター等の機材が必要で、また滴定操作等の煩雑な操作が必要で測定に長時間を要するという問題があった。
【０００５】
一方、一定量の酸を唾液に添加しｐＨを測定する方法は、滴定操作をする必要がなく、簡便、短時間で測定が完了する。特に、ｐＨの測定をｐＨ指示薬の呈色を目視で確認し、予め作製された各ｐＨ値での標準比色表と比較することで、ｐＨを決定し唾液緩衝能を測定する方法は、特に機器を必要とせず、簡便性、迅速性の点から特に好ましい形態の一つであると言える。例えば、山田らは、ｐＨ指示薬と酸性緩衝剤を吸収性担体に保持させ、該担体に唾液をたらし色調を目視で確認する方法を提案している（特許文献１）。また、岡崎らは、予め試薬（乳酸、pH指示薬）の乾燥粉末を入れたテストチューブに唾液を加え、蓋をして振盪して試薬を溶解し、ｐＨ指示薬の色調を目視で判定するという方法を提案している（非特許文献２）。また、現在これらの原理に基づく唾液緩衝能検査試薬が市販されている。市販の唾液緩衝能検査試薬の一つ（市販品Ａ）は酸、ｐＨ指示薬が短冊状の吸収性担体に乾燥状態で保持されたストリップに唾液を１滴たらし、５分後に肉眼で判定する。また他の市販品（市販品Ｂ）は岡崎らの方法に従って調製されており、試薬の入ったテストチューブに１ｍｌの唾液を添加し、試薬が溶解するまで振盪し、目視で判定する。
【０００６】
市販品Ａにおける測定は開放系で実施されるが、このような測定では、唾液中の二酸化炭素が空気中に放出されるためにｐＨが上昇することが知られている。開放系での測定は、二酸化酸素の放出がおさまりｐＨが安定した時点で測定する必要があるので、唾液滴下より５分後に測定する必要がある。一方、市販品Ｂは、蓋付きの１．５ｍｌ容反応チューブに唾液を１ｍｌ添加し、蓋を閉めて測定するので、二酸化炭素放出による誤差はほぼ無視できるが、粘性の高い唾液では乾燥試薬の溶解性が著しく悪くなるだけでなく、完全に溶解できないことがあり、測定時間が長くなる場合があるという問題がある。簡便迅速且つ正確に測定できる試薬が望まれていた。
【０００７】
【特許文献１】特開昭５７−１７５１２９号公報
【非特許文献１】Ｄｒｅｉｚｅｎ，Ｓ．他  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５巻，２１３−２２１頁，１９４６年
【非特許文献２】岡崎好秀  他，小児歯科学雑誌，３８巻６１５−６２１頁，２０００年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、唾液と試薬の混合直後に判定可能な、迅速、簡便、且つ正確に唾液緩衝能を測定でき、さらには長期間保存しても性能の劣化しない唾液緩衝能検査薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は上記課題を解決するために、鋭意検討し、酸及びｐＨ指示薬を予め水溶液の形態にしておけば迅速に唾液緩衝能を測定できる点に着目した。しかしながら、このような水溶液の状態では微生物の繁殖等がおき、経時的に劣化することがわかった。そして、このような酸とｐＨ指示薬の水溶液を長期に渡り安定した状態に保つ手法につき種々検討を行った結果、特定の防腐剤を配合することにより唾液緩衝能の測定性能に影響を与えず微生物の繁殖を抑えることができることを見出した。そしてさらに検討を進め、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち本発明は、（１）酸解離指数が３．６〜４．０の範囲にある酸性基を有す酸であって、かつ該酸性基が該酸の有する酸性基中、最も酸解離指数の大きな酸性基である酸、（２）変色域がｐＨ４．５から７．０の範囲内にあるｐＨ指示薬、（３）水を含んでなり、且つ（４）防腐剤として２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンと５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの双方を含むことを特徴とする液状の唾液緩衝能検査試薬である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の唾液緩衝能検査試薬は、予め水溶液として調製されているため、極めて迅速かつ簡便に唾液緩衝能を測定することができる。さらにこのような水溶液の状態においても雑菌等の繁殖が無く、長期に渡って保存等を行った後でも、調製初期と変わらぬ性能を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の唾液緩衝能検査試薬は、一定量の酸と一定量の唾液とを混合し、ｐＨの変化をｐＨ指示薬の変色により目視で判定することによって唾液緩衝能を検査する試薬である。
【００１３】
本発明の唾液緩衝能検査試薬に配合される第一の成分は（１）酸解離指数が３．６〜４．０の範囲にある酸性基を有す酸であって、かつ該酸性基が該酸の有する酸性基中、最も酸解離指数の大きな酸性基である酸である。
【００１４】
本発明において、酸解離指数が３．６〜４．０の範囲にある酸性基を有す酸とは、該酸性基の水溶液中での酸解離指数（以降ｐＫａと略す場合もある）が３．６〜４．０の範囲にある酸性基を有す酸を示す。このような水溶液中でのｐＫａ値は、例えば、化学便覧  改訂３版（１９８４年発行、丸善株式会社、日本化学会編集）  基礎編  第II分冊  ３３８−３４２ページ記載の表（水溶液中の無機化合物の解離定数、水溶液中の有機化合物の解離定数）等に記載されている。
【００１５】
本発明において、該酸は複数の酸性基を有していても良いが、その場合には、最もｐＫａの大きな酸性基のｐＫａが３．６〜４．０の範囲にある酸でなくてはならない。換言すれば、酸として最も弱い酸性基のｐＫａが３．６〜４．０の範囲にある酸でなくてはならない。ｐＫａが４．０よりも大きな酸性基を有する酸を用いた場合、たとえ該酸が、ｐＫａが３．６〜４．０の範囲にある酸性基を他に有していたとしても、唾液の緩衝能を正確に測ることができない。これは、唾液と試薬を混合した後のｐＨが、唾液中の重炭酸塩量の影響を受けにくくなり、唾液を試薬に混合後のｐＨ変化量が小さくなるためである。
【００１６】
他方、ｐＫａが３．６よりも小さな値である酸性基しか有さない酸を用いた場合でも、やはり唾液の緩衝能を正確に測ることができない。ｐＫａが３．６未満の酸性基でも唾液中の重炭酸塩と反応し得るが、このような酸性基が反応、ｐＨ変化を引き起こすｐＨ域では、重炭酸塩以外にも唾液中のタンパク質濃度が混合後のｐHに影響を与えるようになり、唾液中のタンパク質濃度が高い唾液と低い唾液において、たとえ重炭酸塩濃度が同一であっても、測定結果が異なる場合がある。
【００１７】
酸解離指数が３．６〜４．０の範囲にある酸性基を有す酸であって、かつ該酸性基が該酸の有する酸性基中、最も酸解離指数の大きな酸性基である酸を具体的に例示すると、酒石酸、乳酸、シュウ酸等が挙げられる。これらの酸は単独で用いてもよいし、適宜混合して使用しても良い。
【００１８】
本発明の唾液緩衝能検査試薬における第２の成分は（２）変色域がｐＨ４．５から７．０の範囲内にあるｐＨ指示薬である。当該ｐＨ指示薬は、酸塩基反応によりプロトン付加・脱利して変色する試薬であり、上記（１）成分である酸が唾液中の重炭酸塩と反応して起きるｐＨ変化を目視により簡便且つ迅速に判別するために配合される。
【００１９】
従って、該ｐＨ指示薬はその色調の変化するｐＨ域（変色域）が、前記（１）成分である酸と重炭酸塩の反応によりｐＨ変化を引き起こす範囲にある必要があり、よって該変色域がｐＨ４．５から７．０の範囲内にある必要がある。換言すれば、唾液中の重炭酸塩濃度に応じて、唾液と本発明の唾液緩衝能検査薬の混合後のｐHが４．５から７．０の範囲になるので、この範囲の変色域のｐＨ指示薬を使用することで、目視で正確に唾液緩衝能を測定できるようになる。
【００２０】
このようなｐＨ指示薬の変色域は、例えば、新実験化学講座９  分析化学ＩＩ（１９７７年発行  丸善株式会社  日本化学会編集）１８１ページの表（中和滴定用指示薬）等に記載されている。
【００２１】
このようなｐＨ指示薬を具体例に例示すると、クロロフェノールレッド（変色域５．０から６．６）、ブロモクレゾールパープル（変色域５．２から６．８）を表示できるが、判定のしやすさからクロロフェノールレッドが好適に使用できる。
【００２２】
本発明の唾液緩衝能検査薬における第３の成分は（３）水である。水は、上記（１）成分である酸及び（２）成分であるｐＨ指示薬を溶解している。このため、これら（１）成分及び（２）成分が固体状態で唾液と接触させられる場合よりもはるかに迅速に唾液中の重炭酸塩と反応してｐＨの変化とそれに伴う検査薬の色調変化を引き起こす。
【００２３】
本発明の唾液緩衝能検査薬における第４の成分は防腐剤であり、該防腐剤として、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンと５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの双方を含むことを必須とする。この２種の防腐剤を組み合わせて配合することにより、本発明の唾液緩衝能検査薬は水溶液の状態であるにもかかわらず、微生物等が繁殖することなく、また該防腐剤は前記（１）成分等の存在下でも安定であるため、長期に渡って安定に初期の性能を発現する。さらに、この防腐剤は、その配合により唾液の緩衝能に影響を及ぼすこともなく、よって正確な唾液緩衝能の測定が可能である。
【００２４】
本発明の唾液緩衝能検査薬における上記（１）〜（４）成分の配合割合は、該試薬と測定対象である唾液との混合比率にもよるが、例えば、体積比１：１で混合する場合には以下のような配合量とすることが好適である。即ち（１）成分の酸の配合量は、試薬中の濃度が０．００５〜０．０３Ｎとなるように配合するとよい。従って、２塩基酸の場合には、０．００２５〜０．０１５ｍｏｌ／Ｌ、３塩基酸の場合には０．００１７〜０．０１ｍｏｌ／Ｌとするのが良い。より好ましくは、試薬中の濃度が０．０１〜０．０２Ｎとなる量である。
【００２５】
（２）成分のｐＨ指示薬は、目視での判定しやすさという観点から、試薬中の濃度が１０〜１０００ｐｐｍで使用するのが好適である。また（４）成分は、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンのいずれも、１〜１００ｐｐｍの濃度とすることが好ましい。より好ましくは１〜１０ｐｐｍである。
【００２６】
上記（１）成分及び（２）成分の好適な配合量は、混合する唾液の割合に併せて増減させれば良い。一方、（４）成分は、混合する唾液の割合にかかわり無く上記範囲とすることが好ましい。
【００２７】
本発明の唾液緩衝能検査試薬には、上記（１）〜（４）成分に加えて、必要に応じて、本発明の効果に影響を及ぼさない範囲で他の成分が配合されていてもよい。例えば、唾液との混合性を増す目的で、ｐＨを変動させることのない物質を添加することもできる。このような物質としては例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０等の各種ノニオン系界面活性剤、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン等の非イオン性水溶性高分子を挙げることができる。
【００２８】
本発明の唾液緩衝能検査薬の製造方法は特に限定されず、一般的には、配合される各成分を秤取り、均一な状態とすればよい。また、保存にあたっては、大気中の二酸化炭素の吸収や、水の揮発を防止するために密封系で保存するのが好ましい。
【００２９】
本発明の唾液緩衝能検査薬の使用方法は通常、以下のようである。即ち、検査を迅速且つ正確に行うという観点からガラス、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン製等の所定容量の蓋付きの密閉可能な容器内に１回分の試薬を収納した形態で使用する。本発明の唾液緩衝能検査薬と唾液との混合比率は特に限定されるものではないが、計量しやすく、また計量誤差が生じてもその影響を少なくできる点で、体積比で１：２〜２：１とすることが好ましく、１：１程度とすることが特に好ましい。検査に使用する唾液が、高齢者、小児においては少量しか採取できない場合があるという点を考慮すると、１ｍｌ以下の唾液で検査ができることが好ましく、従って、本発明の唾液緩衝能検査薬の一回分の使用量は０．１〜１ｍｌの範囲とするのが良い。
【００３０】
唾液の採取は、例えば、パラフィンペレット等の咀嚼物を３０秒〜１０分間噛ませ、分泌された唾液を回収し、検体として使用する。該検体はそのまま唾液緩衝能検査薬に加えても良いが、歯垢等の不溶分をろ過等により除去して検査に供することも、より正確な緩衝能を判定しやすい点で好ましい。
【００３１】
このようにして得られた唾液を、上記のような容器内に収納されている唾液緩衝能検査薬に所定量添加し、蓋を閉め密閉した後に、試薬と唾液を軽く混合し、ｐＨを測定することによって実施される。ｐＨの測定は、試薬と唾液の混合液の色調を目視で確認することで実施される。本発明の唾液緩衝能検査薬は液状であるため、唾液と極めて容易に混合され、通常は僅か１０秒程度で反応が完了する。また閉鎖系とすることにより、開放系で見られるようなｐＨの変動もほぼ無視できる程度になる。
【００３２】
このようにして唾液を混合・反応させる前後の色調を、予め各ｐＨでの色調を調べて作成した比色表と比較することでｐＨを判定し、唾液緩衝能を判定する。例えば、酒石酸とクロロフェノールレッドにより検査試薬を調製した場合、該検査薬と唾液の混合液は、ｐＨに依存して以下の表に示したような色調を呈す。唾液緩衝能が高いほど、上記混合液のｐＨも高くなるため。従って、その色調に応じて表１に示したように判定することができる。
【００３３】
【表１】
2005257513.tif 000002
【実施例】
【００３４】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３５】
実施例１［防腐剤による防腐効果］
酒石酸の濃度が０．０１２Ｎ、クロロフェノールレッドの濃度が１６０ｐｐｍとなるようこれらをイオン交換水に溶解した。ここに表２に示す防腐剤を添加し、表３に示す微生物を１０５〜１０６ｃｆｕ／ｍｌとなるように植菌し、２５℃（真菌）、または３０℃（細菌）で２週間培養し、菌の生育を観察した。結果を表４に示す。なお表中、「無添加」とあるのは防腐剤を一切添加しなかったものである。
【００３６】
【表２】
2005257513.tif 000003
【００３７】
【表３】
2005257513.tif 000004
【００３８】
【表４】
2005257513.tif 000005
【００３９】
上記結果から、本唾液緩衝能試薬は防腐剤無添加でも細菌は繁殖できないが、真菌類が繁殖することが分かった。また、これらの繁殖は、防腐剤の添加により抑制できることが分かった。
【００４０】
実施例２［唾液緩衝能の測定］
実施例１で調製した試薬を用いて唾液緩衝能を測定した。即ち、０．５ｍｌの試薬を１．５ｍｌ容のポリプロピレン製テストチューブに入れ、ここに０．５ｍｌの唾液を加え、蓋を閉め、１０秒間混合した直後に比色表と比較することで判定した。また、各々同じ唾液検体について、市販の唾液緩衝能検査薬であるＤｅｎｔｂｕｆｆ  Ｓｔｒｉｐ（オーラルケア社製）を用いて唾液緩衝能を判定した。Ｄｅｎｔｂｕｆｆによる測定は取扱説明書に従い、唾液をストリップに１滴たらし、５分放置後に色見本と比較することで判定した。結果を表５に示す。
【００４１】
【表５】
2005257513.tif 000006
【００４２】
本発明の液状試薬は、ＤｅｎｔＢｕｆｆと同じ結果であった。防腐剤を添加した試薬でも防腐剤の影響は受けずに、防腐剤無添加試薬と同一の結果であった。
【００４３】
実施例３［防腐剤の保存安定性］
実施例１で調製した唾液緩衝能検査試薬の０．５ｍｌを１．５ｍｌ容ポリプロピレン製テストチューブに入れ蓋を密閉し、５０℃で３ヶ月保存した。２週間毎に１５ｍM  リン酸緩衝液ｐＨ７．６を０．５ｍｌ添加しｐＨを測定した。結果を表5に示す。
【００４４】
【表６】
2005257513.tif 000007
【００４５】
防腐剤無添加試薬、本発明で規定する防腐剤を配合したＮｏ．１の試薬(表２参照)はｐHの変動は観察されなかったが、防腐剤としてｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルエステルを配合したＮｏ．２の試薬は保存期間に比例してｐＨが低下した。これは防腐剤が分解したためと思われた。
【００４６】
これらの検討により、防腐剤としては２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンと５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンが、防腐効果、保存安定性、唾液緩衝能検査に対する影響の点から最適であることと、当該防腐剤を含む液状試薬は長期間保存可能で、迅速簡便に唾液緩衝能が測定できることが明らかである。