(57)【要約】      （修正有）【課題】長期間に渡って植物に塩ストレス耐性を付与することが可能な新規な遺伝子、及び該遺伝子を導入した塩ストレス耐性形質転換植物を提供すること。【解決手段】以下の(a)又は(b)に示すタンパク質をコードする遺伝子、及び該遺伝子を導入した塩ストレス耐性形質転換植物。(a) 特定のアミノ酸配列からなるタンパク質(b) 特定のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ塩ストレス耐性を付与する活性を有するタンパク質。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)に示すタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ塩ストレス耐性を付与する活性を有するタンパク質
【請求項２】
以下の(c)又は(d)に示すDNAからなる遺伝子。
(c) 配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるDNA
(d) 配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ塩ストレス耐性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項３】
請求項１又は２に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項１若しくは２に記載の遺伝子、又は請求項３に記載の組換えベクターを導入した塩ストレス耐性形質転換植物。
【請求項５】
植物が単子葉植物である、請求項４に記載の塩ストレス耐性形質転換植物。
【請求項６】
単子葉植物がイネ科、ユリ科、又はショウガ科に属する植物である、請求項５に記載の塩ストレス耐性形質転換植物。
【請求項７】
イネ科に属する植物が、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、サトウキビ、シバ、ソルガム、アワ、及びヒエから成る群から選択される、請求項６に記載の塩ストレス耐性形質転換植物。
【請求項８】
請求項１若しくは２に記載の遺伝子、又は請求項３に記載の組換えベクターを植物に導入することを含む、塩ストレス耐性植物の作出方法。
【請求項９】
植物が単子葉植物である、請求項８に記載の作出方法。
【請求項１０】
単子葉植物がイネ科、ユリ科、又はショウガ科に属する植物である、請求項９に記載の作出方法。
【請求項１１】
イネ科に属する植物が、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、サトウキビ、シバ、ソルガム、アワ、及びヒエから成る群から選択される、請求項１０に記載の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩ストレス耐性を付与する遺伝子、及び該遺伝子を導入した形質転換植物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物が受ける環境ストレスには、塩、乾燥、高温、低温、強光、空気汚染等があるが、農業生産の観点から最も問題となっているのが、塩害及び乾燥である。塩害はもともと塩分の高い地域のみならず、灌漑を行うことによりそれまで問題のなかった農地においても発生している。現在、アジアでは1200万ヘクタールの耕地が塩害や干ばつの被害を受けており、実際に950万ヘクタールの耕地が塩害のため未使用のままになっている。特に、イネはアジアにおける主要穀物であるのでイネに塩ストレス耐性が付与できれば未使用の農地も食料生産の場に変えられて、世界の穀物生産の安定化に貢献できる。これまで、劣悪環境下や不良土壌でも栽培可能な環境ストレス耐性植物を遺伝子組換え技術を駆使して作出する種々の試みが検討されている。例えば、塩ストレスによって誘導される遺伝子を単離し、該遺伝子を発現させることで、塩ストレス耐性植物の作出が可能になると考えられる。塩ストレス耐性付与遺伝子としてこれまでコウライシバ由来のベタイン合成酵素遺伝子（特許文献１）、Arthrobacter globiformis由来のコリンオキシダーゼ遺伝子（非特許文献１）、イネ由来の葉緑体型グルタミンシンターゼ（非特許文献２）、イネ由来の転写活性因子（Os DREB）（非特許文献３）、ホソバノハマアカザ由来のNa+／H+アンチポーター遺伝子（特許文献２）等が知られている。また、糖代謝・合成に関与する酵素遺伝子では、大腸菌由来のトレハロース合成関連遺伝子（非特許文献４）、UDPガラクトースからガラクチノールを合成するガラクチノール合成酵素（AtGolS）遺伝子が、乾燥・塩・低温といった水ストレス耐性付与に関与することがシロイヌナズナにおいて報告されている（非特許文献５、非特許文献６）。双子葉植物では、シロイヌナズナ由来のNa+/H+アンチポーター遺伝子にて形質転換したトマト（非特許文献７）やBrassica植物（非特許文献８）において200mMで10週間にわたって塩ストレス耐性を評価した例があり、果実や種子の収穫が報告されている。しかしながら、単子葉形質転換植物では移植から種子を収穫するまでという長期間の塩ストレス耐性を付与した遺伝子はない。例えば、形質転換イネで塩ストレス耐性を示した条件としては100mMで13日間、150mMで２週間、300mMで３日間と短期である。従って、苗の移植から種子の収穫までといった数週間から数カ月にわたる実際の生産工程に対応した塩ストレス耐性形質を上記の遺伝子群が付与できるとは判断し難いのが現状である。
従って、長期間にわたり塩ストレス耐性を示す植物を作出することが望まれている。
【０００３】
一方、メタロチオネインは、重金属に結合する能力があるシステインの多い低分子量タンパク質であり、メタロチオネイン遺伝子は、広範囲の動物及び植物に存在することが知られ、遺伝子ファミリーを形成している。従来、動物細胞においてメタロチオネインにより核が活性酸素から防御される可能性が示唆されているが（非特許文献９〜１１）、植物における塩ストレス耐性については報告されていない。
【０００４】
【特許文献１】特開2001-309789号
【特許文献２】特開2000-157287号
【非特許文献１】Mohanty A., et al., Theor. Appl. Genet., 106, pp.51-57 (2002)
【非特許文献２】Hoshida H., et al., Plant Mol. Biol., 43, pp.103-111 (2000)
【非特許文献３】Dobouzet J. G., et al., Plant J. 33, pp.751-763 (2003)
【非特許文献４】Jang I.C., et al., Plant Physiol., 131, pp. 516-524 (2003)
【非特許文献５】細胞工学, Vol.21, No.12, pp.1455-1459 (2002)
【非特許文献６】Teruaki T., et al., The Plant Journal, 29(4), pp.417-426 (2002)
【非特許文献７】Zhang H.X., Blumwald E., Nature Biotechnol., 19, pp.765-768 (2001)
【非特許文献８】Zhang H.X., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA., 98, pp.12832-12836 (2001)
【非特許文献９】Chubatsu, L.S. and R. Meneghini, Biochem. J. 291, pp.193-198 (1993)
【非特許文献１０】Sogawa, C.A. et al., Brain Res. 853, pp.310-316 (2000)
【非特許文献１１】Miura, T. et al., Life Sci. 60, pp.301-309 (1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、長期間に渡って植物に塩ストレス耐性を付与することが可能な新規な遺伝子、及びその遺伝子を導入した塩ストレス耐性形質転換植物等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、海水耐性シバ（seashore paspalum）に塩ストレスによって誘導される遺伝子があることに着目し、そのクローニングを試みたところ、その遺伝子がメタロチオネインをコードし、かつ塩ストレス耐性を付与する活性を有する遺伝子であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下の(a)又は(b)に示すタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ塩ストレス耐性を付与する活性を有するタンパク質
（２）以下の(c)又は(d)に示すDNAからなる遺伝子。
(c) 配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるDNA
(d) 配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ塩ストレス耐性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
（３）上記（１）又は（２）の遺伝子を含む組換えベクター。
（４）上記（１）若しくは（２）に記載の遺伝子、又は上記（３）の組換えベクターを導入した塩ストレス耐性形質転換植物。
（５）植物が単子葉植物である、上記（４）の塩ストレス耐性形質転換植物。
（６）単子葉植物がイネ科、ユリ科、又はショウガ科に属する植物である、上記（５）の塩ストレス耐性形質転換植物。
（７）イネ科に属する植物が、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、サトウキビ、シバ、ソルガム、アワ、及びヒエから成る群から選択される、上記（６）の塩ストレス耐性形質転換植物。
（８）上記（１）若しくは（２）の遺伝子、又は上記（３）の組換えベクターを植物に導入することを含む、塩ストレス耐性植物の作出方法。
（９）植物が単子葉植物である、上記（８）の作出方法。
（１０）単子葉植物がイネ科、ユリ科、又はショウガ科に属する植物である、上記（９）の作出方法。
（１１）イネ科に属する植物が、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、サトウキビ、シバ、ソルガム、アワ、及びヒエから成る群から選択される、上記（１０）の作出方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、塩ストレス耐性を付与できる遺伝子が提供される。本遺伝子をイネなどの植物に導入することにより、塩ストレスの環境下で長期間生育し、種子をつけることのできる塩ストレス耐性植物を作出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．遺伝子のクローニング
（１）cDNAライブラリーの作製及びスクリーニング
本発明の塩ストレス耐性を付与する遺伝子は、例えば以下のようにして取得することができる。まず、海水又は塩ストレスを加えた状態（塩処理区）と加えない状態（未処理区）でそれぞれ栽培した海水耐性シバ（Seashore Paspalum；Duedck A. E. and Peacock C. H., Agronomy Journal vol. 77, pp. 47-50 (1985)などに記述）からトータルRNAを調製し、オリゴdTを用いて作成した一本鎖cDNAを鋳型としてPCRを行い、塩処理プローブと対照区プローブを作成する。
【００１０】
次に、これらの２種のプローブ（塩処理プローブと対照区プローブ）を用いて、seashore paspalum cDNAライブラリーからディファレンシャルスクリーニング法によって塩処理区プローブでのみ特異的に検出されるクローンを選抜する。次に、そのクローンに含まれるcDNAの部分配列を基に作成したプローブを用いてノーザン解析を行い、塩ストレスによって海水耐性シバでは誘導されるがイネでは誘導されないクローンを二次選抜する。最後にこのクローンをプローブとして用いて塩ストレスを加えた海水耐性シバから調製したcDNAライブラリーから目的遺伝子を含むクローンを得る。
【００１１】
海水耐性シバからのmRNAの抽出及びcDNAライブラリーの作製は常法に従って行うことができる。mRNAの供給源としては、例えば海水耐性シバの成葉が挙げられるが、これに限定されるものではない。mRNAの調製は、通常行われる手法により行うことができる。例えば、上記供給源から、グアニジウムチオシアネート-トリフルオロ酢酸セシウム法などによりトータルRNAを抽出した後、オリゴdT-セルロースやポリU-セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ(A)+RNA（mRNA）を得ることができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ(A)+RNAを分画してもよい。
【００１２】
次いで、得られたmRNAを鋳型として、オリゴdTプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖cDNAを合成した後、該一本鎖cDNAからDNA合成酵素Ｉ、DNAリガーゼ及びRnaseH等を用いて二本鎖cDNAを合成する。合成した二本鎖cDNAをT4DNA合成酵素によって平滑化後、アダプター（例えば、EcoRIアダプター）の連結、リン酸化等を経て、λgt11等のベクターに組み込んでin vitroパッケージングすることによってcDNAライブラリーを作製することができる。また、λファージ以外にもプラスミドを用いてcDNAライブラリーを作製することもできる。
【００１３】
上記のようにして得られる形質転換体から目的のDNAを有する株を選択するには、例えば、λファージ（λgt11等)を用いた場合は、λgt11インサート増幅用のプライマーを用いてPCRを行う方法を採用することができる。
【００１４】
ここで用いられる鋳型DNAとしては、前記mRNAから逆転写反応により合成されたcDNAが挙げられる。また、プライマーとしては、市販のランダムヘキサマー等が使用できる。
【００１５】
mRNAの抽出、cDNAライブラリーの作製、プローブの作製、cDNAライブラリーのディファレンシャルスクリーニングについては実施例１に具体例を示した。また、クローニングされた遺伝子がシバ（paspalum）で塩ストレス処理により誘導されることは、発現解析手法であるノーザンブロット解析法又はRT-PCR法などにより確認することができる。その確認については、実施例１及び３に具体例を示した。
【００１６】
（２）塩基配列の決定
上記で得られたcDNAのクローンについて、PCR産物を鋳型にしてcDNAの塩基配列を決定する。塩基配列の決定はマキサム-ギルバートの化学修飾法、又はM13ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置（例えばApplied Biosystems社製ABI373シークエンサー、同社310 DNAシークエンサー等）を用いて配列決定が行われる。得られた塩基配列を、DNASIS（日立ソフトウエアエンジニアリング社）等のDNA解析ソフトによって解析し、得られたDNA鎖中にコードされているタンパク質コード部分を見出すことができる。
【００１７】
配列番号１に、本発明の塩ストレス耐性を付与する遺伝子（以下、メタロチオネイン遺伝子ともいう）の塩基配列を、配列番号２に本発明のメタロチオネイン遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列からなるタンパク質が塩ストレス耐性を付与する活性を有する限り、そのアミノ酸配列において複数個、好ましくは1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
【００１８】
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２で表わされるアミノ酸配列に１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
【００１９】
また、配列番号２に記載のアミノ酸配列と65％以上の相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子であって、塩ストレス耐性を付与する活性を有するタンパク質もまた本発明の範囲に含まれる。上記65％以上の相同性は、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上の相同性をいう。
【００２０】
上記アミノ酸の欠失、付加、及び置換は、上記タンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K（TAKARA社製）やMutant-G（TAKARA社製））などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異が導入される。
【００２１】
ここで、「塩ストレス耐性を付与する活性」とは、塩ストレス存在下において生育し、また場合によっては着稔可能であるという塩ストレス耐性を植物に付与することができる活性をいう。ここで、「塩ストレス」とは、土壌に蓄積した塩類により土壌の水分ポテンシャルが低下して植物体が水分を吸収できなくなるなど、塩類が植物体の生理機能に損傷を与えるストレスをいう。塩類には、植物に生育阻害、収量低下、枯死を引き起こすあらゆる塩が含まれ、例えば、ナトリウム塩、マグネシウム塩等が含まれる。ある遺伝子（例えば、変異遺伝子）が「塩ストレス耐性を付与する活性」を有するか否かは、該遺伝子を導入した植物が、野生型植物では生育不可能な塩ストレス存在下において生育又は着粒できるかどうかを確認することにより判断することができる。
【００２２】
上記の「塩ストレス耐性を付与する活性を有する」とは、上記活性が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が有する活性と実質的に同等であることをいう。
【００２３】
本発明の遺伝子はまた、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ塩ストレス耐性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNAを含む。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち配列番号１で表わされる塩基配列と約65％以上、好ましくは約75％以上、より好ましくは約85％以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が150〜900mM、好ましくは600〜900mMであり、温度が60〜68℃、好ましく65℃での条件をいう。
【００２４】
いったん本発明の遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたcDNAを鋳型としたPCRによって、あるいはその塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって取得することができる。さらに部位特異的誘発等によって前記遺伝子をコードする修飾されたDNAを合成することができる。
【００２５】
２．組換えベクター及び形質転換植物の作製
（１）組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、本発明の上記遺伝子を適当なベクターに挿入することによって作成できる。本発明の遺伝子を植物細胞へ導入し、発現させるためのベクターとしては、pBI系のベクター、pUC系のベクター、pTRA系のベクターが好適に用いられる。pBI系及びpTRA系のベクターは、アグロバクテリウムを介して植物に目的遺伝子を導入することができる。pBI系のバイナリーベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、例えば、pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3等が挙げられる。pUC系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入することができ、例えば、pUC18、pUC19、pUC9等が挙げられる。また、カルフラワーモザイクウイルス（CaMV）、インゲンマメモザイクウイルス（BGMV）、タバコモザイクウイルス（TMV）等の植物ウイルスベクターも用いることができる。
【００２６】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００２７】
本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、ベクターには、プロモーター、メタロチオネイン遺伝子のほか、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、5'-UTR配列、選択マーカー遺伝子などを連結することができる。
【００２８】
「プロモーター」としては、植物細胞において機能し、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるDNAであれば、植物由来のものであってもよいし、植物由来のものでなくてもよい。具体例としては、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Pnos）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来PRタンパク質プロモーター等が挙げられる。
【００２９】
「ターミネーター」は、前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよい。具体例としては、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Tnos）、カリフラワーモザイクウイルスポリＡターミネーター等が挙げられる。
【００３０】
「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、例えばCaMV35Sプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好適である。
【００３１】
「選択マーカー」は、形質転換体の選抜を容易にするために用いられ、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００３２】
（２）形質転換植物の作製
本発明の形質転換植物は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子（メタロチオネイン遺伝子）が自己の遺伝子中に組み込まれ、発現し得るように植物中に導入することにより得ることができる。
【００３３】
本発明において形質転換に用いられる植物としては単子葉植物、例えばイネ科（イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、サトウキビ、シバ、ソルガム、アワ、ヒエ等）、ユリ科（アスパラガス、ユリ、タマネギ、ニラ、カタクリ等）、ショウガ科（ショウガ、ミョウガ、ウコン等）に属する植物が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３４】
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、篩部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。植物培養細胞を対象とする場合において、得られた形質転換細胞から形質転換体を再生させるためには既知の組織培養法により器官又は個体を再生させればよい。
【００３５】
本発明の遺伝子又は組換えベクターを植物中に導入する方法としては、アグロバクテリウム法、PEG-リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。例えばアグロバクテリウム法を用いる場合は、プロトプラストを用いる場合と組織片を用いる場合がある。プロトプラストを用いる場合は、Tiプラスミドをもつアグロバクテリウムと共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、組織片を用いる場合は、リーフディスクにより対象植物の無菌培養葉片に感染させる方法（リーフディスク法）やカルス（未分化培養細胞）に感染させる等により行うことができる。
【００３６】
遺伝子が植物に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換植物からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。PCRを行った後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法でもよい。
【００３７】
上記のようにして得られる形質転換植物は、塩ストレスに対して耐性を獲得する。すなわち、本発明のメタロチオネイン遺伝子を導入することにより、植物に塩ストレス耐性を付与することができる。従って、当該形質転換植物は、塩ストレス耐性植物として使用することができる。
【００３８】
塩ストレス耐性植物は、メタロチオネイン遺伝子が組み込まれた形質転換植物（トランスジェニック植物）を、上記塩ストレス耐性植物として使用し得る程度に育種することにより作出することができる。この場合、植物にとって上記塩ストレスが生じる条件において、生理機能に損傷を与えず、かつ成長阻害や枯死等をせずに耐性を示す植物を選抜すればよい。ストレス耐性植物としての使用開始時期は、耐性を示す植物を選抜した後であればいつでもよい。
【００３９】
本発明により、従来生育が不可能であった塩ストレス環境下において生育可能な塩ストレス耐性植物が提供される。例えば、実施例２で用いたイネの中で50mM NaClにおいて生存可能な品種はごく限られたものであり、コシヒカリはこの塩濃度において枯れてしまう。これに対し本発明の遺伝子を導入したコシヒカリの塩ストレス耐性は向上していた。このように、本発明のメタロチオネイン遺伝子を導入した場合には、全生育期間（発芽時期を除く）を通じた長期的な塩ストレス耐性向上効果が達成できるため、土壌に塩水が混入する地域（例えばNaCl 3000ppmの汽水域）において該植物（特にコメ）を栽培することが可能となり、また、塩汚染土壌における植生を回復（環境修復）することが可能となる。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例により限定されるものではない。
【００４１】
（実施例１）  塩ストレス下誘導シバ遺伝子のクローニング
一般的なRNA及びDNAの実験方法は、Molecular cloning-a laboratory manual-second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press New York（1989）に従いこれを常法とした。また、実験中に使用したキットの使用方法はメーカーの示すプロトコールに従った。
【００４２】
（１）植物材料の調製
海水耐性シバ（Seashore Papalum：Duedck A. E. and Peacock C. H., Agronomy Journal vol. 77, 47-50 (1985)）を砂の入った1/5000a ワグネルポットに植え付け、東京湾から採水した塩分濃度2.3〜2.7％の海水で灌水し、温室内で３〜６ケ月間栽培した。毎日一回、海水をポット上面からかけて、ワグネルポットの排水口より海水がしみ出るまで灌水を行った。この海水灌水処理により、最低５年間この海水耐性シバは生育維持し、海水耐性を示した。
【００４３】
この材料の分枝より、第１葉から第３葉、茎、及び節を含む切片（図１）を採取し、砂へ挿し芽を行い、発根させてクローン苗を温室内にて育成した。このクローン苗を以下の海水ストレスまたは水耕による塩ストレス実験に使用した。
【００４４】
海水ストレスは以下の通りに与えた。まず、育成した苗を1/5000a ワグネルポット（作土壌深15cm）で、水道水にて温室内で４ヶ月通常栽培した。土壌は、イネ用培土と赤玉を1：1に混合したものを用いた。苗がポット栽培で順調に生育した段階（植え付け４ヶ月後）で、上記の方法で海水灌水処理を開始した。
【００４５】
対照区となる材料は、海水灌水処理を開始する前（水道水栽培）にサンプリングし、−80℃に保存した。塩ストレス条件の材料は、海水灌水処理14日でサンプリングし、−80℃に保存した。サンプリング部位は地上部の葉とした。後述（３）のディファンレンシャルスクリーニング用のcDNAライブラリーおよびプローブ作成のためのRNAは、この海水栽培した材料から抽出した。
【００４６】
水耕による塩ストレス実験は以下のようにして行った。まず、上述の水道水栽培したクローン苗より、図１に示した切片を採取して水耕（蒸留水）で、挿し芽を行った。これを明期（照度5000 lx、温度30℃）16時間、暗期（照度：０lx、温度22℃）８時間の条件で、植物育成装置（トミー製、Cultivation Chamber、CU-251）にて１週間育成し発根させた。発根後、蒸留水を下記表１に示す改変・吉田水耕培地（S. Yoshida, et al., Laboratory Manual For Physiological Studies of Rice 3rd. Ed., The International Rice Research Institute, pp.61-66 (1976); 微量要素はD.R. Hoagland & Arnon, D.I., Univ. Calif. Coll. Agri. c. Exp. Sta. Circ., p.347 (1936)、 鉄分は、Murashige T. & Skoog F., Physiologia Plant., pp.473-497 (1962)のFeEDTAに改変）に置き換え、更に１週間、明期（照度10000 lx、温度30℃）16時間、暗期（照度：０lx、温度22℃）８時間の条件で育成した。
【００４７】
育成後、塩ストレスを４週間与えた。塩ストレスの条件は上述の改変・吉田水耕培地に500mMのNaClを添加したものを用いた。塩ストレスを与えて４週間後に地上部の葉を採取した。後記（４）のノーザン解析および後記（５）の全長cDNA単離のためのcDNAライブラリーは水耕した切片より抽出したRNAを使用した。
【００４８】
【表１】
2005087129.tif 000002
【００４９】
尚、上記水耕培地は5N NaOHを用いてpH5.5に調整した。２日ごとに水耕液の体積を調べ、体積が減ったら、蒸留水を加えて初期の体積（ワグネルポットの場合、４L）に戻した。また、２週間に１回、水耕液を新鮮なものと交換した。
【００５０】
（２）RNAの調製とcDNAライブラリーの構築
生重量で２gの葉からトータルRNA約１mg をRneasy Mini Kit（キアゲン社製）、又はChang, S. ら(1993)の方法（Plant Mol. Biol. Report, 11, pp.113-116）を用いて抽出した。両法の場合ともに、Dnase I（タカラバイオ社製、Rnaseフリー、５mM MgSO4存在下、25℃、11時間）処理を追加した。さらに、トータルRNAからBioMag SelectaPure, mRNA Purification System（Polysciences, Inc. 社製）を用いてmRNAを10μg精製した。このmRNA５μgからオリゴ(dT)12-18によりTime Saver cDNA合成キット（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて1st strand cDNAさらに2nd strand cDNAを合成した。次に、cDNAをクローニングするためDirectional Cloning Kit（アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、λgt11のファージ用ベクターへ挿入したものを、Ready-To-Go Lambda Packaging Kit（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてパッケージングを行った。E.coli Y1088 を宿主として、タイターチェックの後、ディファレンシャルスクリーニングに供した。
【００５１】
（３）プローブの調製とディファレンシャルスクリーニング
上述の海水耐性シバを水道水栽培で挿し芽の状態から４ヶ月育成したもの（対照区）と４ヶ月育成後から海水を灌水しつづけて２週間経過したもの（塩処理区）から、それぞれトータルRNAをそれぞれ調製し、オリゴ(dT)12-18によりTime Saver cDNA合成キット（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて1st strand cDNAを作成した。この1st strand cDNAを鋳型として、同キットに添付されているランダムヘキサマー（pdN6）を用い、PCRを行った（PCR条件：Premix ExTaq（タカラバイオ社製）を用いてcDNAを94℃５分熱変性、（94℃30秒、55℃１分、72℃１分）×25サイクル、72℃１分、Gene Amp PCRシステム9600を使用）。得られたPCR産物をゲル電気泳動で確認の後、ECL direct labeling kit（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて２種類のプローブ（対照区と塩処理区）を作成した。
【００５２】
cDNAライブラリーを直径14.5cmのシャーレに撒き、2000プラークからディファレンシャルスクリーニングした。Hybond N（アマシャムバイオサイエンス社製）を使用してプラークブロッティングを行い、プラークのシグナルの検出にはECL detection system（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いた。上述の２種類のプローブで１枚のシートをそれぞれ検出し、塩処理区プローブで検出されるが、対照区プローブでは検出されないプラークを塩処理区で特異的なものとして選抜した。
【００５３】
選抜したクローンのインサート領域をプラスミドベクターへ移すため、ファージDNAを抽出した。ファージDNA を94℃10分処理して、急冷したものを鋳型とし、λgt11のフォワードプライマー（5'-GGT GGC GAC GAC TCC TGG AGC CCG-3':配列番号３）とリバースプライマー（5'-TTG ACA CCA GAC CAA CTG GTA ATG-3'：配列番号４）（タカラバイオ社製）を用いてPremix ExTaq（タカラバイオ社製）でPCRを行った（95℃１分、（94℃１分、55℃２分、72℃２分）×25サイクル、72℃２分）。得られたPCR産物をpT7 Blue T-ベクターへPerfectly Blunt Cloning Kit（Novagen社製）を用いてサブクローニングした。選抜された５個のクローンをdRhodamine dye-terminator法（AmpliTaq DNA polymerase FS；Applied Biosystems社製）によりシーケンス反応を行った後、ABI 310ジェネティックアナライザー（Applied Biosystems社製）を用いて両鎖方向からDNA配列を決定した。
【００５４】
（４）ノーザン解析による第二次スクリーニング（イネとの比較）
得られた５クローンから二次選抜用プローブを作成した。作成したプローブを用いて海水耐性シバとイネ（品種ポッカリ）での遺伝子発現の塩誘導性の比較を行い、海水耐性シバでは発現が塩ストレスにより誘導されるが、イネでは誘導されないクローンを第二次選抜した。海水耐性シバ及びイネ（ポッカリ）は上述の改変・吉田水耕培地を用い、対照区（０mM NaCl）と、海水耐性シバでは塩処理区（400 mM NaCl）及びイネ（ポッカリ）では塩処理区（50 mM NaCl）において１週間育成し、１週間後の茎葉部からトータルRNAを抽出した。トータルRNAの電気泳動、ノーザンブロッテイング及びハイブリダイゼーションを常法に従って行った。
【００５５】
５クローンのノーザン分析を行った結果、ABA誘導性のタンパクと相同性が高かったクローンなどは、海水耐性シバでもイネでも発現していたので単離対象から除外した。海水耐性シバでのみ発現し、イネでは発現していなかったクローンが２つあり、これらは海水耐性関連遺伝子である可能性が高いと考えた。そのうちの１クローン（Ps2）を、以下の実施例２における遺伝子導入対象とした。
【００５６】
（５）全長cDNAの単離と配列決定
吉田・水耕培地により塩ストレス（400mM NaCl）を１週間与えた海水耐性シバよりmRNA 10μgを取得し、ZAP Express cDNA Gigapack III Gold Cloning kit（Stratagene社製）を用いて、cDNA合成、Zap Express ベクターへのクローニング、及びパッケージングを行った。cDNAライブラリーを14×９cmの角形シャーレ10枚に撒き、約100,000プラークから選抜を行った。Hybond N（アマシャムバイオサイエンス社製）を使用したプラークブロッティングを行い、前記（４）でノーザン解析に使用したPs2プローブをECL direct labeling kit（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて標識し、プラークのシグナルの検出にはECL detection system（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いた。１〜３次スクリーニングの結果、Ps2プローブで検出されるプラークを単離した。in vivo excisionにより、それぞれのcDNAをpBK-CMV phagemid vector（Stratagene社製）に移した。選抜されたcDNAをdRhodamine dye-terminator法（AmpliTaq DNA polymerase FS ： Applied Biosystems社製）によりシーケンス反応を行った後、ABI 310ジェネティックアナライザー（Applied Biosystems社製）を用いて両鎖方向からDNA配列を決定した。シーケンスにはT7 とT3のプライマー、及び各cDNAに特異的なプライマーを用いた。配列の解析は、Genentyx Mac.Ver.11（Soft ware Development Co. LTD, 2000）を用いた。
【００５７】
シーケンスの結果、Ps2の配列とほぼ一致するcDNAクローン（Ps2）が得られた。Ps2の塩基配列を配列番号１に、それよりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。このPs2は、タイプIIのメタロチオネインと相同性が高かった（約85％）。
【００５８】
（実施例２）  形質転換体の作製及び導入遺伝子の確認
（１）遺伝子導入用ベクターの構築
実施例１で得られたPs2の全長cDNAを、アクチンプロモーター及びNosターミネーターと連結し、遺伝子導入用ベクターを構築し、以下のように形質転換体を作製した。
【００５９】
（２）Ps2形質転換イネの作製
イネ（品種：日本晴、滋賀県農協より種籾を入手可能）の完熟種子由来の再分化能を有する液体培養系からプロトプラストを単離し供試材料とした。プロトプラストの調製およびエレクトロポレーションの方法は経塚らの方法（Kyozuka et al., Mol. Gen. Gnet., 206, pp. 408-413, 1987）、鳥山らの方法（Toriyama et al., Bio/Technology 6, pp.1072-1074）、赤木らの方法（Akagi et al., Mol. Gen. Gnet., 215, pp.501-506, 1989）等に準じて行った。
【００６０】
プロトプラストを２×106/mL、上記（１）で構築した遺伝子導入用ベクターDNAを50μg/mLになるように0.4Mマンニトール、70mMアスパラギン酸カリウム、５mMグルコン酸カルシウム、５mM MESの導入バッファーに懸濁しエレクトロポレーションを行った。電気パルスは電界強度450V/cm、時定数約40msの減衰波とした。なお導入装置には島津社製のGTE-10を、導入チャンバーにはFTC-54を使用した。
【００６１】
R2P培地（伊藤紀美子、1996、植物細胞工学シリーズ、モデル植物の実験プロトコール、秀潤社、pp.82-88）を基本としたアガロース培地により包埋したプロトプラストを、液体培地を加えナース細胞と共に培養した。導入14日後ナース細胞および液体培地を除きハイグロマイシン50μg/mLを添加したR2P培地を加え形質転換体の選抜を開始した。耐性カルスが１〜２mmに成長後、選抜された形質転換カルスをハイグロマイシン50μg/mLのRS2A培地（伊藤紀美子、同上）に移植した。10〜14日間培養し増殖させた後、ハイグロマイシン50μg/mLの再分化培地（西村哲と島本功、1996、植物細胞工学シリーズ、モデル植物の実験プロトコール、pp.78-81、秀潤社）にカルスを移植し、植物体を再生させた。
【００６２】
再分化植物体をカルス塊からはずし、50μg/Lハイグロマイシンを含むホルモンフリー培地（西村と島本、同上）に置床し、発根してくる個体を選抜し、シャーレの蓋を開けて滅菌水をシャーレの培地上に注ぎ、１週間馴化を行った。この時、培地が乾かないように２日に１回滅菌水を供給した。馴化後、選抜された植物体（日本晴To世代とする）をイネ育成用土壌（三菱化学製）：赤玉（１：１）を入れたジフィーポット（縦×横×高さ：５cm×５cm×６cm）に植え付け、１〜２ヶ月後にプラスチック製のポット（幅×奥行き×高さ：15cm×5.5cm×9.5cm）へ移植してさらに４〜１０ヶ月育成し、自殖又は交配し、種子を得た。育成は隔離温室にて行った。T1世代は、Ps2導入遺伝子組換え系統T0世代の自殖により作出し、またBC1F1世代は、T1世代とコシヒカリとを交配したF1世代に、もう一度コシヒカリを戻し交配して作出した。
【００６３】
（３）Ps2遺伝子導入及び発現の確認
形質転換イネ当代（T0）、T1世代及びBC1F1世代を用いて、PCR法によりPs2遺伝子の確認を行った。形質転換イネからのゲノムDNAの抽出は、若葉を１〜３cmの長さに切り、滅菌したエッペンドルフチューブに入れ、100μLのTE 緩衝液（10mM Tris HCl、pH8.0、１mM EDTA）を更に添加し、エッペンドルフチューブ用のホモジェナイザーで１〜３分磨砕することによって行った。磨砕後は氷上に保管し、４℃、15,000rpmで２分間遠心し、上清を新しい滅菌チューブに移した。この上清をゲノムDNA画分とした。
【００６４】
Ps2遺伝子の存在を確認するために、ゲノムPCRを5'- CTC ACA AAG CAA AGG CAA TC -3'（配列番号５）をセンスプライマー、5'- GGA TCA GGA GGC TAC TAT TC -3'（配列番号６）をアンチセンスプライマーとし、1.25Uの酵素KOD-Dash（東洋紡社製）、10pmoleのプライマー、0.2mMのdNTP、反応用緩衝液（終濃度：20mM Tris-HCl (pH7.5)、８mM MgCl2、7.5mM DTT、2.5μg/50μL BSA）を用いて行った。上述したゲノムDNAは20μLのPCR反応液全量に対して10μLを使用した。反応装置は、ABI社製のGene Amp PCRシステム9600又はGene Amp PCRシステム9700を使用し、PCR条件は98℃２分、（98℃30秒、55℃２秒、74℃30秒）×30サイクル、74℃５分、４℃∞で保持とした。
【００６５】
また、47個体についてはRT-PCRを行って遺伝子発現を確認した。RT-PCRは、配列番号５（同上）をセンスプライマー、配列番号６（同上）をアンチセンスプライマーとし、1.25Uの酵素KOD-Dash（東洋紡社製）、10pmoleのプライマー、0.2mMのdNTP、反応用緩衝液（終濃度：20mM Tris-HCl (pH7.5)、８mM MgCl2、7.5mM DTT、2.5μg／50μL BSA）を用いて行った。上述したトータルRNAより1st strand cDNA合成キット（Life Science社製）を用いて作成した1st strand cDNAを20μLのPCR反応液全量に対して0.2〜10μLを使用した。反応装置は、ABI社製のGene Amp PCRシステム9600又はGene Amp PCRシステム9700を使用し、PCR条件は98℃２分、（98℃30秒、55℃２秒、74℃30秒）×30サイクル、74℃５分、４℃∞で保持とした。
【００６６】
以上のPCR及びRT-PCRの結果、試験した87.5％の個体において発現を確認することができた。また、ゲノムPCRを用いて、これらの個体をPs2保有個体（Ps2+）とPs2非保有個体（Ps-）に分類した。
【００６７】
（実施例３）  Ps2遺伝子を導入した形質転換イネの塩ストレス耐性の評価
（１）遺伝子組換え系統（T1系統）及び非組換え系統の塩ストレス耐性の評価
塩ストレス耐性試験は、横浜市戸塚区に設置した隔離温室で行った。試験期間は10月〜１月で、平均気温は28℃、最高気温は32℃、最低気温24℃、平均湿度60〜80％であった。日長は平均９時間で照度は5000〜10000 lxであった。
【００６８】
塩ストレス耐性評価は、コシヒカリが枯死する50mM NaCl相当に対する耐性とし、人工海水（NaCl 500mM）を10倍希釈して用いた。真水で発芽させた供試個体であるPs2遺伝子組換え系統（T1系統）のPs2発現有系統及び発現無系統、並びに非組換え系統（ポッカリ、IR28、及び日本晴）を２〜３葉期まで通常栽培（湛水水田状況）した。２葉期に個体別・系統別に移植し、一週間真水湛水状態で養生栽培した。培土は肥料入りのイネ用育苗土（みまき培土）を用い、ジフィーポット（３cm×３cm）に１本植えした。養生栽培１週間で、真水を10倍希釈海水に換え、湛水栽培を継続した。ポットを入れたステンレス水槽を希釈海水で冠水し、ポンプ攪拌で水槽内塩分を0.3％（50mM NaCl）に保った。
【００６９】
その結果を図２に示す。図２において、非組換え系統（１〜３）は、コントロールと比較して、塩ストレス存在下において枯れた部分が多かった。一方、Ps2導入遺伝子組換え系統−発現有（４）は、発現無の系統（５）と比較して、枯死していない部分が多く、塩ストレス存在下においても生育可能であった。
【００７０】
また、遺伝子組換え系統（T1世代）６系統33個体と、非組換え系統３系統30個体（コシヒカリ、日本晴及びポッカリ）を用いて、塩ストレス負荷後６週目及び10週目における塩ストレス耐性評価を行った結果を表２に示す。
【００７１】
【表２】
2005087129.tif 000003
【００７２】
表２において、コシヒカリは10週目において完全枯死（生存率０％）しているが、Ps2（+）系統は生存率25.0％から50.0％まで、様々な塩ストレス耐性程度を示し、Ps2遺伝子導入による塩ストレス耐性向上効果が示唆された。
【００７３】
（２）遺伝子組換え系統BC1F1世代の塩ストレス耐性の評価
続いて、T1//コシヒカリのBC1F1世代13系統149個体を用いた塩ストレス耐性評価を行った。BC1F1個体集団は、Ps2(+)グループ82個体、Ps2(-)グループ67個体であり１：１の比に適合した。希釈海水処理２週間目、４週間目及び８週間目の生存率を図３に示した。Ps2（-）及びPs2（+）の両グループでは、コシヒカリが完全枯死した４週目で10〜20％の生存率を示し、８週間目ではPs2（-）グループがほとんど枯死したのに対し、Ps(+)グループの生存率は11％と有意に高かった（χ2=4.95）。
【００７４】
さらに、塩ストレス存在下における植物の着粒を表３にまとめた。Ps2を導入した組換え系統（Ps2+）において、８週間目まで生存した９個体中６個体で出穂が認められ、50〜100％の稔実率を示した。
【００７５】
【表３】
2005087129.tif 000004
【００７６】
本発明によれば、塩ストレス耐性を付与できる遺伝子が提供される。本遺伝子をイネなどの植物に導入することにより、塩ストレスの環境下で長期間生育し、種子をつけることのできる塩ストレス耐性植物を作出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】海水耐性シバの第１葉から第３葉、及び茎と節を含む切片を示す図である。
【図２】Ps2遺伝子組換え系統の塩ストレス耐性評価試験の結果を示す写真である。
【図３】Ps2遺伝子組換え系統の交配集団（BC1F1世代）における塩ストレス耐性評価試験の結果を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【００７８】
配列番号３〜６：合成オリゴヌクレオチド
【図１】
2005087129.tif 000005
【図２】
2005087129.tif 000006
【図３】
2005087129.tif 000007
【配列表】
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