(57)【要約】【課題】  ｈＩＬ−４のアンタゴニストであると同時にｈＩＬ−１３のアンタゴニストでもある新規なアミノ酸配列を有する合成ペプチドの製造を提供する。更には、該合成ペプチドを含有する、アレルギー疾患を処置するのに有用な医薬組成物を提供する。【解決手段】  本発明は、新規なアミノ酸配列を有するペプチド、該ペプチドを含有するヒトインターロイキン−４およびヒトインターロイキン−１３のアンタゴニスト、並びに該ペプチドを含有するアレルギー疾患を処置するのに有用な医薬組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：
ＡＥＬＡＡＬＥＡＥＬＡＡＬＥ−ＧＧＧＧＧＧＧ−ＫＬＴＱＬＫＸ１ＫＬＴＸ２ＬＫＡＹ
（式中、
Ｘ１は任意のアミノ酸残基であって、そしてＸ２はＤまたはＡである）
を有するペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列：
ＡＥＬＡＡＬＥＡＥＬＡＡＬＥ−ＧＧＧＧＧＧＧ−ＫＬＴＱＬＫＸ１ＫＬＴＸ２ＬＫＡＹ
（式中、
Ｘ１は任意のアミノ酸残基であって、そしてＸ２はＤまたはＡである）
を有するペプチドを含有する、ヒトインターロイキン−４およびヒトインターロイキン−１３のアンタゴニスト。
【請求項３】
アミノ酸配列：
ＡＥＬＡＡＬＥＡＥＬＡＡＬＥ−ＧＧＧＧＧＧＧ−ＫＬＴＱＬＫＸ１ＫＬＴＸ２ＬＫＡＹ
（式中、
Ｘ１は任意のアミノ酸残基であって、そしてＸ２はＤまたはＡである）
を有するペプチドを含有する、アレルギー疾患を処置するのに有用な医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトインターロイキン４およびヒトインターロイキン１３のアンタゴニストである新規なペプチドに関する。本発明はまた、該ペプチドを含有するヒトインターロイキン−４およびヒトインターロイキン−１３のアンタゴニストにも関する。本発明は更に、アレルギー疾患を処置するのに有用な、該ペプチドを含有する医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
近年では多数の人がアレルギー疾患に羅病しており、さらに大気汚染、食生活、住環境においてアレルギー惹起物質はますます増加することが予測される。これに伴いアレルギー疾患にかかる人の数は増加することが推察される。そのため、アレルギーの発症や増悪に関与する過程に働きかけ、アレルギーの症状を緩和し得る薬剤の開発は重要である。これらアレルギーが生じる過程において、ヒトインターロイキン４およびヒトインターロイキン１３が関与することが知られる。
【０００３】
ヒトインターロイキン４（以下、ｈＩＬ−４と略す）は、Ｂ細胞の増殖および抗体産生誘導するＢ細胞刺激因子１（ＢＳＦ−１）、Ｔ細胞増殖因子２（ＴＣＧＦ−２）およびマスト細胞増殖因子２（ＭＣＧＦ−２）として単離された糖タンパク質であるサイトカインの一種である。該ｈＩＬ−４は、肥満細胞、好塩基球およびＴ細胞によって産生され（例えば、非特許文献１を参照）、Ｂ細胞を活性化してＢ細胞からのＩｇＥの産生増加を促すことにより、ＩｇＥが関連する炎症反応に関与している（例えば、非特許文献２を参照）。また、ｈＩＬ−４は、ヘルパーＴ細胞のＴｈ２細胞への分化において重要な役割を果たし、Ｔｈ１／Ｔｈ２のバランスをＴｈ２側に傾けることにより（例えば、非特許文献３を参照）、アレルギー性疾患を発症し易くさせる（例えば、上記非特許文献２を参照）。さらに、このものは炎症部位への炎症性細胞の浸潤を促進することも知られる。また、ｈＩＬ−４のレセプターは２種のコンポーネント、ｈＩＬ−４ＲαおよびγＣのヘテロダイマーで構成されており、Ｂ細胞やＴ細胞などに分布が見られる。ｈＩＬ−４は、ｈＩＬ−４Ｒαに対して高い親和性を持ち、一方でγＣに対しては低い親和性を持つ。ｈＩＬ−４の生物活性は両コンポーネントに結合することにより、はじめて伝達される（例えば、非特許文献４を参照）。また、ｈＩＬ−４はｈＩＬ−４レセプターだけではなく、ｈＩＬ−１３レセプターとも結合し得て、その生物活性が伝達され得ることも知られる（例えば、非特許文献５を参照）。
【非特許文献１】Lee, F.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2061, 1986.    Noma, Y.等，Nature 319, 640, 1986.    Plaut, M.等，Nature 339, 64, 1989.
【非特許文献２】Izuhara, K.等，Int. J. Mol. Med. 3, 3-10, 1999.
【非特許文献３】Le Gros, G.等，J. Exp. Med. 172, 921, 1990.    Kopf, M.等，Nature 362, 245, 1993.
【非特許文献４】Wang, H. Y.等，Immunity 4, 113, 1996.
【非特許文献５】Zurawski, S. M.等，EMBO J. 12, 2663, 1993.
【０００４】
一方、ヒトインターロイキン１３（以下、ｈＩＬ−１３と略す）は、活性化Ｔ−ヘルパー細胞から産生されるリンホカインで、ＩＬ−４様の活性を持つサイトカインの一種である。該ｈＩＬ−１３はＴ細胞で産生され、Ｂ細胞に働いてＩｇＥの産生を増加させる（例えば、非特許文献６を参照）。このものはまた、動物モデルにおいて単独で喘息様の症状を惹起し得ることが報告されている（例えば、非特許文献７を参照）。ｈＩＬ−１３のレセプターは主としてＢ細胞に分布し、ｈＩＬ−４ＲαおよびｈＩＬ−１３Ｒα１のヘテロダイマーで構成されており、該レセプターとの結合を介してｈＩＬ−１３の生物活性は伝達される（例えば、非特許文献８を参照）。
【非特許文献６】de Vries, J. E.，J. Allergy Clin. Immunolo. 102, 165, 1998.
【非特許文献７】Grunig, G.等，Science 282, 2261, 1998.    Mills-Karp, M.等，Science 282, 2258, 1998.
【非特許文献８】Murata, T.等，Int. J. Mol. Med. 1, 551, 1998.
【０００５】
これまで、ｈＩＬ−４のアミノ酸配列を改変し、アンタゴニストとして用いる試みがなされている。しかしながら、例えばＹ１２４Ｄという変異体はＴ細胞においてはアンタゴニストとして作用するが、Ｂ細胞においてはアゴニスト活性を有することが知られる（例えば、非特許文献９を参照）。また、ｈＩＬ−１３の変異体ｈＩＬ−１３ Ｅ１３ＫはｈＩＬ−１３のアンタゴニストであるが、ｈＩＬ−４の作用に対しては影響を及ぼさない（例えば、非特許文献１０を参照）。
【非特許文献９】Kruse, N.等，EMBO J. 11, 3237, 1992.
【非特許文献１０】Oshima Y.等，J. B. C. 276, 15185, 2001.
【０００６】
これまで、ヘリックス−ループ−ヘリックス構造を有するために、安定なαへリックス構造を有する合成ペプチドは報告されているが（例えば、非特許文献１１を参照）、それら合成ペプチドと、ｈＩＬ−４および／またはｈＩＬ−１３のレセプターであるＩＬ−４Ｒαとの結合は報告されていない。ここで、ヘリックス−ループ−ヘリックス構造とは、αへリックスのＮ−末端およびＣ−末端アミノ酸配列がループのアミノ酸配列によって隔てられている、ＤＮＡタンパク質において見られる高次構造のことを意味する。そこで、ｈＩＬ−４およびｈＩＬ−１３の双方がレセプターに結合するのを阻害したりおよび／あるいはｈＩＬ−４およびｈＩＬ−１３の生物活性が伝達されるのを阻害する物質は、アレルギー疾患における一連の反応の連鎖を中断させ得て、その結果アレルギー性疾患をより有効に予防または治療し得ると期待される。
【非特許文献１１】Fujii, I.等，Tetrahedron Lett., 42, 3323-3325, 2001.
【０００７】
本発明は、ｈＩＬ−４のレセプターを形成するｈＩＬ−４ＲαとγＣのコンポーネント中、ｈＩＬ−４Ｒαに対するｈＩＬ−４のペプチド性アンタゴニストを設計した。該アンタゴニストは、ｈＩＬ−４がレセプターに結合するのを阻害し得ておよび／またはｈＩＬ−４の生物活性が伝達されるのを阻害し得ると考えられる。更に、上記の通り、該ｈＩＬ−４ＲαはｈＩＬ−１３レセプターを形成する１コンポーネントでもあるために、該アンタゴニストは、ｈＩＬ−１３がｈＩＬ−１３レセプターに結合するのを阻害し得ておよび／またはｈＩＬ−１３の生物活性が伝達されるのを阻害し得るとも期待される。そこで、本発明はｈＩＬ−４のアンタゴニストであると同時にｈＩＬ−１３のアンタゴニストでもある新規なアミノ酸配列を有する合成ペプチドを設計し、製造し、そして該合成ペプチドを含有する医薬組成物を用いてアレルギー疾患を処置することに成功した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ｈＩＬ−４およびｈＩＬ−１３の双方がレセプターに結合するのを阻害したりおよび／あるいはｈＩＬ−４およびｈＩＬ−１３の生物活性が伝達されるのを阻害する物質は、アレルギー疾患における一連の反応の連鎖を中断させ得て、その結果アレルギー性疾患をより有効に予防または治療し得ると期待される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、アミノ酸配列：
ＡＥＬＡＡＬＥＡＥＬＡＡＬＥ−ＧＧＧＧＧＧＧ−ＫＬＴＱＬＫＸ１ＫＬＴＸ２ＬＫＡＹ
（式中、
Ｘ１は任意のアミノ酸残基であって、そしてＸ２はＤまたはＡである）
を有するペプチドを要旨とする。
【００１０】
本発明はまた、アミノ酸配列：
ＡＥＬＡＡＬＥＡＥＬＡＡＬＥ−ＧＧＧＧＧＧＧ−ＫＬＴＱＬＫＸ１ＫＬＴＸ２ＬＫＡＹ
（式中、
Ｘ１は任意のアミノ酸残基であって、そしてＸ２はＤまたはＡである）
を有するペプチドを含有する、ヒトインターロイキン−４およびヒトインターロイキン−１３のアンタゴニストをも要旨とする。
【００１１】
本発明は更に、アミノ酸配列：
ＡＥＬＡＡＬＥＡＥＬＡＡＬＥ−ＧＧＧＧＧＧＧ−ＫＬＴＱＬＫＸ１ＫＬＴＸ２ＬＫＡＹ
（式中、
Ｘ１は任意のアミノ酸残基であって、そしてＸ２はＤまたはＡである）
を有するペプチドを含有する、アレルギー疾患を処置するのに有用な医薬組成物をも要旨とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書に記載するアミノ酸残基は、当該分野において通常用いられる一文字表記で示す。本発明の合成ペプチドは、以下のアミノ酸配列：
ＡＥＬＡＡＬＥＡＥＬＡＡＬＥ−ＧＧＧＧＧＧＧ−ＫＬＴＱＬＫＸ１ＫＬＴＸ２ＬＫＡＹ
（式中、Ｘ１は任意のアミノ酸残基であって、そしてＸ２はＤまたはＡである）
で表される（配列番号１）。上記のアミノ酸配列は、Ｎ末端側に１４個のアミノ酸残基からなるヘリックス領域、７個のグリシンからなるループ領域（(Ｇ７)と略す）およびＣ末端側に１５個のアミノ酸残基からなるヘリックス領域からなる、総計３６個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列である。式中、Ｘ１は任意のアミノ酸残基であり、このものは天然のアミノ酸残基（例えば、Ｌ−アミノ酸残基）、改変した非天然アミノ酸残基（例えば、Ｄ−アミノ酸残基）、並びに生物学的に遊離な形態もしくは組み合わさった形態で生成するが、通常タンパク質中では生成しないことが知られるアミノ酸（例えば、Roberts and Vellaccio, The Peptides, 5: 342-429 (1983)（これは、本明細書の一部を構成する）に開示されているアミノ酸）を含むが、天然のアミノ酸残基が好ましい。Ｘ１位のアミノ酸残基は、例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、チロシン、トリプロファン、プロリンおよびバリンを含むが、セリンまたはアラニンが特に好ましい。また、Ｘ２はアスパラギン酸またはアラニンのいずれかであり、アラニンが特に好ましい。
【００１３】
本明細書において使用する用語「ヒトインターロイキン４（ｈＩＬ−４）およびヒトインターロイキン１３（ｈＩＬ−１３）のアンタゴニスト」とは、ｈＩＬ−４およびｈＩＬ−１３がそれぞれのレセプターのコンポーネントであるｈＩＬ−４Ｒαに結合するのを、競合的に阻害する物質のことを意味する。
【００１４】
本明細書において使用する用語「アレルギー疾患」とは、特異的なアレルゲンに接触することによって生じる過敏症状態のことを意味し、このものは即時型および遅延型に分類される過敏症、またはアレルギーＩ型〜ＩＶ型に分類されるものを含む。例えば、該アレルギー疾患としては、Ｉ型アレルギー（例えば、全身性アナフィラキシー、気管支喘息および花粉症を含む）、ＩＩ型アレルギー（例えば、血液型不適合輸血における溶血および自己免疫性溶血性貧血を含む）、ＩＩＩ型アレルギー（例えば、血清病、糸球体腎炎および関節リウマチを含む）およびＩＶ型アレルギー（例えば、接触性皮膚炎、肉芽腫および移植における拒絶反応を含む）を含むが、これらに限定されない。
【００１５】
本発明の実施態様を以下に記載するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）合成ペプチドの製造
本発明の合成ペプチドは、ペプチド合成の分野における当業者にとって通常知られる方法に従って製造することができる。特に、ペプチド合成における固相合成法（例えば、R. B. MerrifieldらによるJ. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1963)を参照）を用いて製造することができる。該合成は、オートペプチドシンセサイザ（Model 433A, Applied Biosystems製）を用いて行なう。合成の手順は、商業的なマニュアルにしたがって行なう。以下に、合成法を例示するが、該方法は例示するものであって、これらに限定されるものではない。
【００１６】
合成は、上記のペプチド合成の分野における当業者にとって通常知られる保護基、試薬および樹脂を使用することができる。保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）基または９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基を使用することができるが、Ｆｍｏｃ基が好ましい。カップリング試薬は、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）および対称混合酸無水物法を用いることができるが、ＨＢＴＵが好ましい。また、固相の樹脂は、Ｆｍｏｃ基を使用する場合には、ＨＭＰ樹脂、アミド樹脂およびＭＡＰ樹脂などを使用することができ、Ｂｏｃ基を使用する場合には、ＰＡＭ樹脂およびＭＢＨＡ樹脂などを使用することができる。装置としてオートペプチドシンセサイザを用いて、Ｃ末端アミノ酸から順番に結合させて、目的のペプチドを製造する。合成スケールは、各々のペプチドの０．１ｍｍｏｌ〜１．０ｍｍｏｌを行なうことができ、１．０ｍｍｏｌが好ましい。合成後に、Ｆｍｏｃ基を使用する場合には、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはトリメチルシリルブロミド（ＴＭＳＢｒ）を用いて、およびＢｏｃ基を使用する場合には、フッ化水素酸（ＨＦ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）またはトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（ＴＭＳＯＴＦ）を用いて、ペプチドを該樹脂からクリーベッジする。次に、該ペプチドを凍結乾燥後に、水で希釈して水溶液を調製し、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略す）により分離精製を行なう。該ＨＰＬＣよる分離精製は、逆相液体クロマトグラフィーにより行なうことが好ましい。溶出液は、水（これは、例えばトリフルオロ酢酸などの有機酸を含み得る）と有機溶媒（これは、水と混和性の有機溶媒が好ましく、アセトニトリルが特に好ましい）の混合溶液を用いる。次いで、分取したピークに含まれるペプチドの分子量を質量分析計を用いて測定する。そして、構造式から推定される予想分子量と合致するペプチドを含有する画分を集める。最後に、得られたペプチドの純度を複数の溶出系を用いるＨＰＬＣ法により測定し、得られるペプチドが単一のものであることを確認する。
【００１７】
（２）合成ペプチドの円二色性の測定
本発明で得る合成ペプチドの構造情報は、円二色性（以下、ＣＤと略す）を測定することによって得る。測定は、円二色分散計を用いて行なう。測定は、当業者にとって知られる通常の方法に従って行なう。吸収領域および各波長での吸収強度を測定する。そして、経験則を用いて、得られるペプチドについて、α−ヘリックスなどに関する構造情報を得る。更に、得られるペプチドの構造と活性相関について考察する。
【００１８】
（３）合成ペプチドとｈＩＬ−４ｓＲとの分子間相互作用の測定
本発明で得る合成ペプチドとｈＩＬ−４Ｒαとの分子間相互作用の有無について調べる。ｈＩＬ−４Ｒαについては、ｈＩＬ−４Ｒαの膜外可溶性領域部であって商業的に入手可能なｈＩＬ−４ｓＲを代わりに用いることができる。該ｈＩＬ−４ｓＲのアミノ酸配列は、ｈＩＬ−４ｓＲのアミノ酸配列の一部である２６番目から２３２番目までの２０７個のアミノ酸残基である（配列番号２）。
【００１９】
測定は、表面プラズモン共鳴（以下、ＳＰＲ）法を用いるＢＩＡｃｏｒｅシステムを用いて行なう。ここで、ＢＩＡｃｏｒｅシステムとは、物質間の相互作用の程度を検出することができる測定装置であって、溶液内の物質間の相互作用による溶液の屈折率の変化を反射光の強さの変化として検出する装置である。また、表面プラズモン共鳴（以下、ＳＰＲ）法とは、金属表面（具体的には、センサーチップ）の励起状態である表面プラズモン波を光で共鳴励起する現象が金属表面の屈折率の変化に対して高感度に応答するために、ＤＮＡやタンパク質などの生体高分子の金属表面への特異的な吸着によって起こる微小な屈折率の変化を観測するのに用いられる、ＢＩＡｃｏｒｅシステムの検出法である。該ＳＰＲ法を用いるＢＩＡｃｏｒｅシステムを用いる測定により、生体分子間の反応、結合量の測定および速度論的解析がノンラベル且つリアルタイムで可能となる。
【００２０】
該測定方法を、以下に記載する。具体的には、測定装置に付属の測定マニュアルに従って行なう。まず、センサーチップ上の官能基を活性化する。次に、ｈＩＬ−４ｓＲを適当なバッファー（例えば、酢酸バッファー）を用いて調製する。該ｈＩＬ−４ｓＲ溶液を活性化したチップにスポッティングして固定化する。対照液は、ｈＩＬ−４ｓＲ溶液を固定化しないものを用いる。反応終了後のチップの活性基を、ブロッキングする。次に、適当な濃度（Ｃ）の合成ペプチドの試料を、適当なランニングバッファー（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、ＮａＣｌを含むＨＥＰＥＳバッファー）を用いて調製する。そして、該合成ペプチド試料をｈＩＬ−４ｓＲを固定化したチップに加える。該試料の濃度を段階的に増大させ、各々の濃度における平衡時のシグナル（Ｒｅｑ）（結合量：ＲＵ）を時間経過で追跡する。最後に、得られる濃度依存的なシグナルについて、Ｒｅｑ／ＣとＲｅｑとをスキャッチャードプロットを行ない、その直線の傾きから解離定数（ＫＤ）を算出する。得られた結果より、本発明の合成ペプチドがｈＩＬ−４ｓＲと結合することを確認する。
【００２１】
（４）合成ペプチドによるｈＩＬ−４とｈＩＬ−４ｓＲとの結合の阻害作用の測定
本発明で得る合成ペプチドとｈＩＬ−４ｓＲとの阻害作用の有無について調べる。測定は、酵素結合免疫吸着法（以下、ＥＬＩＳＡと略す）を用いて行なう。ＥＬＩＳＡとは、抗原または抗体を酸素で共有結合して標識し、抗体または抗原の存在を酵素活性を利用して検出する酵素免疫検定法のことをいう。本発明におけるＥＬＩＳＡについて、以下に記載する。まず、ｈＩＬ−４ｓＲ溶液を適当なバッファーを用いて調製する。次いで、このｈＩＬ−４ｓＲ溶液をマイクロプレートのウェルに固定化する。一方で、ある濃度のｈＩＬ−４溶液および適当な濃度の合成ペプチド溶液をそれぞれ、適当な緩衝液（例えば、ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液）を用いて調製する。上記のウェルに、該ｈＩＬ−４溶液および該合成ペプチド溶液を同時に加えて反応させ、ｈＩＬ−４ｓＲと競合的に結合させる。次に、二次抗体として酵素標識化した抗ｈＩＬ−４抗体を加えて、反応させ、結合させる。該二次抗体としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略す）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびガラクトシダーゼなどで標識化した抗グロブリン抗体が挙げられ、ＨＲＰ標識の抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体が好ましい。最後に、酵素で分解されると発色する基質を加えて発色させ、発色の吸光度を測定する。得られた結果を、濃度０Ｍでの値に対するパーセント（コントロール比）で表わす。ここで、吸光度の減少は、合成ペプチドによってｈＩＬ−４が阻害されたことを意味する。
【００２２】
（５）活性成分として合成ペプチドを含有する医薬組成物の製造
本発明はまた、本発明の合成ペプチドを活性成分として含有するアレルギー疾患（上記のアレルギー疾患を含む）を処置するための医薬組成物をも提供する。本発明の医薬組成物は、医薬製剤の分野においてよく知られる方法に従って、例えば通常の固体もしくは液体のビヒクルもしくは希釈剤、並びに所望の投与様式に適当な種類の医薬的な添加剤（例えば、担体、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、芳香剤など）を用いることによって製剤化することができる。減菌非毒性で医薬的に許容し得る該ビヒクルまたは希釈剤などを含有する用量単位製剤が許容され得る。
【００２３】
本発明の医薬組成物は、処置する疾患に適当ないずれかの方法によって投与することができ、該方法は部位特異的な処置または運搬される薬物の量についての要求に依存し得る。投与は、通常の方法で行なうことができ、例えば局所的に（例えば、液剤、懸濁剤、ゲル剤、クリーム剤または軟膏の形態を含む）、非経口的に（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、または胸骨非連結内注射もしくは注入法（例えば、減菌注入可能な水性または非水性液剤または懸濁剤）を含む）、鼻腔的に（例えば、吸入スプレーの形態を含む）または直腸的に（例えば、坐剤の形態を含む）行なうことができる。該製剤はまた、速効性放出または徐放性放出に適当な形態で投与することもできる。速効性放出または徐放性放出は、適当な医薬組成物を用いて達成することができ、または特に徐放性放出の場合には、皮下インプラントまたは浸透圧ポンプなどの装置を用いて達成することができる。
【００２４】
本発明の合成ペプチドの有効な量は、当該分野の当業者によって決定することができるが、例えば局所的に、非経口的に、鼻腔的にまたは直腸的に投与する場合には、用量を０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは０．０１〜１ｍｇ／ｋｇを１日あたり、１回投与または別個に分けた投与形態で使用することができる。被験者にとっての具体的な用量レベルおよび投与回数は様々な因子によって変えることができ、またそれに依存するであろう。該因子としては、例えば使用する具体的な合成ペプチドの活性、該ペプチドの代謝安定性および作用期間；被験者の種、年齢、体重、通常の健康、性別および食餌；投与の方法および時間；分泌速度；薬物の組み合わせおよび特定の疾患の激しさが挙げられる。
【実施例１】
【００２５】
以下に本発明を実施例をもって説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではないことは無論である。
本発明の合成ペプチドの製造
ペプチドは、ペプチドシンセサイザー４３３Ａ（Applied Biosystems, Sweden）を用い、固相法で合成した。試薬はすべてペプチド合成のグレードのものを用いた。合成は、保護基として９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）（Applied Biosystems製）基を、カップリング試薬としてＯ−ベンゾトリアゾール−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）を、および樹脂としてアミド樹脂（例えば、リンクアミド樹脂）を用いて、オートペプチドシンセサイザによってＣ末端アミノ酸から順番に結合させて製造した。合成スケールは、各々のペプチドの１．０ｍｍｏｌを用いた。合成終了後、ＴＦＡを用いてＦｍｏｃ基を樹脂からクリーベッジすることにより、ペプチドを該樹脂からクリーベッジし、凍結乾燥した後に蒸留水に溶解した。このものを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（日立、東京）を用いて分離精製した。該ＨＰＬＣは、Ｃ１８カラムを用いる逆相クロマトグラフィーで行ない、０．１％ＴＦＡを含む蒸留水（Ａ）および２０〜５０％グラジエントのアセトニトリル（Ｂ）を用いて３０分間かけて溶出した。次いで、分取したピークに含まれるペプチドの分子量を質量分析計（Voyager(登録商標) Elite, Perspective Biosystems, U.S.A.）で測定し、構造式から推定される分子量と合致する画分を集め、ＨＰＬＣで純度を確認した。純度は、（Ｂ）の２０〜５０％グラジエント液および、（Ｂ）の３５％アイソクラティック液について調べ、得られたペプチドが単一のピークであることを確認した。ペプチド１〜３の３種のペプチド（図１）を合成した。以下に、各ペプチドのＨＰＬＣ法によるデータおよび質量分析法のデータを示す。
ペプチド１：
ＨＰＬＣ（リテンションタイム）：約１９．０７分（溶出液：（Ｂ）の２０〜５０％グラジエント液）、
質量分析（Ｍ＋Ｈ）＋  ３５５３．５１。
ペプチド２：
ＨＰＬＣ（リテンションタイム）：約２２．２０分（溶出液：ペプチド１と同様）、
質量分析（Ｍ＋Ｈ）＋  ３５１０．９５。
ペプチド３：
ＨＰＬＣ（リテンションタイム）：約２１．８４分（溶出液：ペプチド１と同様）、
質量分析（Ｍ＋Ｈ）＋  ３５３５．２１。
【実施例２】
【００２６】
本発明の合成ペプチドの円二色性の測定
各合成ペプチドの円二色性を、円二色性分散計（Ｊ−７２０、日本分光、東京）を使用して測定した。サンプルは１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ＮａＰｉ）（ｐＨ７．０）中、終濃度２０μＭとなるように容量２５０μＬで調製した。測定はマニュアルに従って行なった。トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）（終濃度２０％）添加条件下で、いずれのペプチドについても２０８ｎｍと２２２ｎｍでθ値が二層性に明瞭な負の極大を示すことから、これらのペプチドはα−へリックス構造をとることが可能であると示唆された（図２）。
【実施例３】
【００２７】
本発明の合成ペプチドとｈＩＬ−４ｓＲとの分子間相互作用の測定
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いたＢＩＡｃｏｒｅシステムによる、本発明の合成ペプチドとｈＩＬ−４ｓＲとの結合の測定は、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（Biacore AB, Sweden）を使用して行なった。まず、センサーチップＣＭ５上の官能基：カルボキシル基をＮ−メチル−Ｎ'−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・ハイドロクロリド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の混合液を用いて洗浄することにより、活性化した。ｈＩＬ−４ｓＲ溶液は、ｈＩＬ−４ｓＲ（Genzyme/Teche, U. S. A.）を酢酸バッファー（ｐＨ  ４．０）を用いて１０μｇ／ｍｌの濃度になるように調製した。次いで、該ｈＩＬ−４ｓＲ溶液を、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００に付属のマニュアルにしたがって、約１００００結合量（ＲＵ）となるようにセンサーチップＣＭ５のセルに固定化した。対照のセルは、何も固定化しなかった。次に、該チップ上の活性基であるカルボキシル基をエタノールアミンで洗浄することにより、ブロッキングした。各ペプチドは、ランニングバッファー（０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ  ７．４））を用いて適当な濃度に調製して用いた。モル数の算出には、２７５ｎｍにおける吸光係数として標準試料による検量線から求めた１４５０値を用いて較正した。測定は、流速２０μｌ／分、試料添加時間が２分間でマニュアルにしたがって行ない、各合成ペプチドの濃度を段階的に増大させて、各々の濃度における平衡時のシグナルを得た。得られた測定結果に基づいて、ＥＸＣＥＬを用いて結合の時間経過を作図した。ペプチド１（５０〜８００μＭ）、ペプチド２（１２．５〜１００μＭ）、ペプチド３（５０〜８００μＭ）のいずれの場合も濃度に依存して、固定化したｓＲへの結合量の増加が見られた。いずれの濃度においても、結合は短時間で平衡状態に達し、ペプチド添加終了後は速やかに解離した。３種のペプチドの中ではペプチド２が最も低濃度で、ｓＲへの結合が観察された。さらにＢＩＡｃｏｒｅで測定した、３種類の合成ペプチドのｓＲへの結合データをもとに、各ペプチドについてｓｃａｔｃｈａｒｄ ｐｌｏｔ解析を行った。いずれの合成ペプチドにおいても相関係数０．９以上で結合量とｂｏｕｎｄ／ｆｒｅｅ比との間に負の直線性が見られ、各合成ペプチドがｓＲへ特異的に結合していることが示唆された（図３、４および５）。ＢＩＡｃｏｒｅ２０００に付属の解析ソフト（BIA evaluation）を使用し、各ペプチドがｓＲへ結合する場合の解離定数（ＫＤ）を、上記マニュアルに記載の低親和性結合の場合の解析方法を用いて算出した（図６）。各ペプチド間でのＫＤ値を比較すると、ペプチド２ではペプチド１に比較してＫＤ値が小さく、ペプチド３ではペプチド１とほぼ同程度のＫＤ値が得られた。ＫＤ値の比較から、ペプチド２はペプチド１、３に比較して約１０倍、結合が強いことが示された。なお、対照のシグナルはサンプル測定時のシグナルの較正に使用した。
【実施例４】
【００２８】
本発明の合成ペプチドによるｈＩＬ−４とｈＩＬ−４ｓＲとの結合の阻害作用の測定
本発明の合成ペプチドによるｈＩＬ−４とｓＲとの結合の阻害作用の測定は、ＥＬＩＳＡ法によって行なった。ｈＩＬ−４ｓＲ（Genzyme/Teche, U. S. A.）をリン酸緩衝液（０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ  ９．０）を使用して１．０または１．２μｇ／ｍＬになるように調製し、その５０μＬをマイクロプレートのウェルに添加して４℃で終夜、固相化した。さらに１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングを行なって測定用プレートとした。このウェルに、０．２５μｇ／ｍＬのｈＩＬ−４（０．２％ ＢＳＡを含む０．０６７Ｍ  リン酸緩衝液ｐＨ７．０（以下、ＰＢＳと略）から調製）（２５μＬ）および適当な濃度に調製した合成ペプチド（２５μＬ）を同時に添加して、室温で２時間、振盪しながらインキュベーションを行なった。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴと略）で洗浄後、０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳで２μｇ／ｍｌの濃度に調製した抗ＩＬ−４モノクローナル抗体（R&D Systems, Inc., U.S.A.）（５０μＬ）を添加し、室温で２時間、振盪しながらインキュベーションを行なった。ＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで５００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（１００μＬ）を添加し、振盪しながら室温で９０分間インキュベーションを行なった。ＰＢＳＴで洗浄後にＨＲＰ基質のＯ−フェニレンジアミン（１００μＬ）を添加し、適当な時間静置した後に、反応停止液（５０μＬ）を添加し、プレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果は、濃度０Ｍでの値に対するパーセンテージ（コントロール比、％）で表した。合成ペプチド１および３は、終濃度１００〜１０００μＭの間で、ペプチド２は終濃度１〜１００μＭの間で吸光度を減少させ、これら合成ペプチドがｈＩＬ−４とｓＲとの結合をｈＩＬ−４と競合的に阻害することが示された。更に、ペプチド２はペプチド１および３よりも低濃度で抑制し、阻害作用がより強い事が示された（図７）。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明によって、ヒトインターロイキン４およびヒトインターロイキン１３のアンタゴニストである新規なペプチドを得ることに成功した。更に、該ペプチドを含有するアレルギー疾患を処置するのに有用な医薬組成物を得ることに成功した。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の合成ペプチド１、２および３のアミノ酸配列を示す図面である。
【図２】本発明の合成ペプチド１、２および３のＣＤスペクトル測定の結果を示す図面である。
【図３】本発明の合成ペプチド１とｈＩＬ−４ｓＲとの分子間相互作用の測定結果を示す図面である。
【図４】本発明の合成ペプチド２とｈＩＬ−４ｓＲとの分子間相互作用の測定結果を示す図面である。
【図５】本発明の合成ペプチド３とｈＩＬ−４ｓＲとの分子間相互作用の測定結果を示す図面である。
【図６】本発明の合成ペプチド１、２および３とｈＩＬ−４ｓＲとの結合の解離定数（ＫＤ）を示す図面である。
【図７】本発明の合成ペプチド１および２による、ｈＩＬ−４とｈＩＬ−４ｓＲとの結合の阻害作用の測定結果を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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