(57)【要約】【課題】新規なプロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化する３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ、及び当該プロテインキナーゼをコードするポリヌクレオチドを得る。【解決手段】プロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化する３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼを単離、同定する。定義されているようなプロテインキナーゼをコードする組換えポリヌクレオチドを作製する。特に、新薬のためのスクリーニングにおけるプロテインキナーゼおよびポリヌクレオチドの使用方法を確立する。【選択図】図３Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化する３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼであって、
（１）前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼは、それぞれ０から４残基の保守的置換を含むペプチド配列ＡＮＳＦＶＧＴＡＱＹＶＳＰＥＬＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）、ＡＧＮＥＹＬＩＦＱＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）、ＬＤＨＰＦＦＶＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）のうちの２以上を有し、前記保守的置換とは（Ｇ，Ａ）、（Ｖ，Ｉ，Ｌ）、（Ｄ，Ｅ）、（Ｎ，Ｑ）、（Ｓ，Ｔ）、（Ｋ，Ｒ）もしくは（Ｆ，Ｙ）の間での置換である、または
（２）前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼは、塩基配列  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３によりコードされる、
３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ。
【請求項２】
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により決定される分子量が６７ｋＤａである、請求項１に記載の３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ。
【請求項３】
０から４残基の保守的置換を含む前記ペプチド配列ＡＮＳＦＶＧＴＡＱＹＶＳＰＥＬＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）はプロテインキナーゼサブドメインＶＩＩＩの一部であり、および／または、０から４残基の保守的置換を含む前記ペプチド配列ＡＧＮＥＹＬＩＦＱＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）はプロテインキナーゼサブドメインＸの一部である、請求項１または２に記載の３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ。
【請求項４】
ホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリホスフェイト依存性プロテインキナーゼである、請求項１から３のいずれか１項に記載の３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ。
【請求項５】
プロテインキナーゼＢαのＴｈｒ−３０８をリン酸化する、請求項１から４のいずれか１項に記載の３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ。
【請求項６】
Ｄ体のｓｎ−１−ステアロイル−２−アラキドニル−ホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェイトの存在下においてＰＫＢを活性化する作用を有するが、Ｌ体の前記ｓｎ−１−ステアロイル−２−アラキドニル−ホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェイトの存在下ではＰＫＢは活性化されない、請求項１から３のいずれか１項に記載の３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ。
【請求項７】
Ｄ体のｓｎ−１，２−ディパルミトイル−ホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェイトまたはｓｎ−１，２−ディパルミトイル−ホスファチジルイノシトール３，４−ビスホスフェイトによって活性化されるが、Ｌ体のｓｎ−１，２−ディパルミトイル−ホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェイトまたはｓｎ−１，２−ディパルミトイル−ホスファチジルイノシトール３，４−ビスホスフェイトによっては活性化されない請求項１に記載の３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ。
【請求項８】
ホスファチジルイノシトール３，５−ビスホスフェイト、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェイト、ホスファチジルイノシトール４−ホスフェイト、ホスファチジルイノシトール３−ホスフェイト、またはイノシトール１，３，４，５−テトラキスホスフェイトによって活性化されない請求項１から７のいずれか１項に記載の３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ。
【請求項９】
ワートマニンによって活性が影響されない請求項１から８のいずれか１項に記載の３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載の３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの断片、融合ポリペプチド、または前記断片の融合ポリペプチドであり、プロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化するプロテインキナーゼであって、
前記断片は下記のアミノ酸配列のうち、１から４５０番目、５２から５５６番目、または８３から３４２番目のアミノ酸配列を有する断片である、プロテインキナーゼ。
【表１】
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【請求項１１】
ウサギの骨格筋から単離された請求項１から１０のいずれか１項に記載のプロテインキナーゼ。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか１項に記載の組み換えプロテインキナーゼ。
【請求項１３】
プロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化する請求項１から１０及び１２のいずれか１項に記載の組み換え３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼであって、
下記のアミノ酸配列を有する、前記組み換え３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ。
【表２】
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【請求項１４】
請求項１３に記載のアミノ酸配列のうち、１から４５０番目、５２から５５６番目、または８３から３４２番目のアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの断片、または前記断片の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか１項に規定されるプロテインキナーゼをコードする、または請求項１に記載の塩基配列のポリヌクレオチドによりコードされるプロテインキナーゼをコードする組み換えポリヌクレオチドであって、
前記組み換えポリヌクレオチドは、ＨＧＭＰ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｔｅｒｅ，Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｒｉｕｍ，Ｈｉｎｘｔｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１  １ＳＢ，ＵＫより市販されるＩＭＡＧＥクローン５２６５８３またはＩＭＡＧＥクローン６２６３１１、Ｈ９７９０３、ＡＡ０１９０９８、ＡＡ１８０９７、ＡＡ０１９３９４、ＡＡ０１９３９３、Ｎ２２９０４、Ｗ９４７３６、ＥＳＴ５２９８５、Ｎ３１２９２、ＡＡ１８８１７４、ＡＡ１００２１０、Ｒ８４２７１と一致するＤＮＡではない、組み換えポリヌクレオチド。
【請求項１６】
イントロンを含まない、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１５または１６に規定されるポリヌクレオチドを有する複製可能なベクター。
【請求項１８】
請求項１５または１６に規定される組み換えポリヌクレオチドまたは請求項１７に規定される複製可能なベクターを有する宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１５に記載の組み換えポリヌクレオチドの断片を有するポリヌクレオチドであって、前記断片は少なくとも１０塩基長であるポリヌクレオチド。
【請求項２０】
プロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化する３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの調製方法において、
前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼを発現する請求項１８に規定される宿主細胞を培養することと、
前記宿主細胞の培養物から前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼを単離すること、を有する調製方法。
【請求項２１】
プロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化する請求項１から１４のいずれか１項に記載の３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼを単離する方法において、
（ａ）  前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼを含む原料を得る工程と、
（ｂ）  前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼを含む組織から無細胞抽出液を得る工程と、
（ｃ）  前記無細胞抽出液を分画する工程と、
（ｄ）  前記（ｃ）工程から、Ｄ−ｓｎ−１−ステアロイル−２−アラキドニルホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリホスフェイト、Ｄ−ｓｎ−２−アラキドニル−３−ステアロイルホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリホスフェイト、ｓｎ−１，２−ジリノレオイルホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリホスフェイトのラセミ体、Ｄ−ｓｎ−１，２ジパルミトイルホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリホスフェイト、及びＤ−ｓｎ−１，２−ジパルミトイルホスファチジルイノシトール−３，４−ジホスフェイトからなる群から選ばれる少なくとも１の化合物の存在下でプロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化することが可能な画分を選択する工程、を有する方法。
【請求項２２】
請求項２０または２１の方法により得られるプロテインキナーゼであって、プロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化する前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ、前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの融合ポリペプチドまたは請求項１５に規定されるポリヌクレオチドによりコードされるプロテインキナーゼ。
【請求項２３】
請求項１から１４及び２２のいずれか１項に記載のプロテインキナーゼに反応する抗体。
【請求項２４】
プロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化する３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性を制御する物質を特定する方法において、
３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ、３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの融合ポリペプチドもしくは下記のアミノ酸配列のうち、１から４５０番目、５２から５５６番目、または８３から３４２番目のアミノ酸配列を有する断片、または前記断片の融合ポリペプチドを特定しようとする前記物質に接触させることと、
【表３】
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前記物質の存在下における、プロテインキナーゼＢのリン酸化及び活性化または前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの基質のリン酸化が、前記物質の不存在下におけるプロテインキナーゼＢのリン酸化及び活性化または前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの基質のリン酸化と比較して変化するかどうかを決定すること、を有する方法。
【請求項２５】
前記物質が、プロテインキナーゼＢのリン酸化及び活性化または３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの基質のリン酸化を減少させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記物質が、プロテインキナーゼＢのリン酸化及び活性化または３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの基質のリン酸化を増加させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記物質は、前記３−ホスフォイノシチドと競合する請求項２４から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記物質は、ホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェイト、またはホスファチジルイノシトール３，４−ビスホスフェイトによる３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性化を阻害する請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記物質は、プロテインキナーゼＢに結合する、請求項２４から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼに対する３−ホスフォイノシチドの効果と同じ効果を持つ物質を特定する方法であって、
特定しようとする前記物質が前記３−ホスフォイノシチド依存型プロテインキナーゼを活性化するかどうかを決定するために、前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼがプロテインキナーゼＢをリン酸化及び活性化する能力または基質をリン酸化する能力について、前記能力を前記物質の存在下及び不存在下において３−ホスフォイノシチドの不存在下で比較することを有する方法。
【請求項３１】
前記３−ホスフォイノシチドは、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリホスフェイトまたはホスファチジルイノシトール−３，４−ビスホスフェイトである請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
プロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化する請求項１から９及び１１〜１３のいずれか１項に記載の３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ、３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ活性を有するその融合ポリペプチド、請求項１０もしくは１４に記載の断片、または前記断片の融合ポリペプチドの使用方法であって、
前記使用方法は、前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性または３−ホスフォイノシチドもしくはプロテインキナーゼＢとの相互作用を制御する物質のスクリーニングアッセイにおける使用方法であって、
前記スクリーニングアッセイは、前記物質を前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ、３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ活性を有するその融合ポリペプチド、前記断片、または前記断片の融合ポリペプチドに接触させることと、前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ、３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ活性を有するその融合ポリペプチド、前記断片、または前記断片の融合ポリペプチドの活性または相互作用を制御する物質を選択することを有するスクリーニングアッセイである、使用方法。
【請求項３３】
プロテインキナーゼを活性化させるための、請求項１から１４及び２２のいずれか１項に規定される３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの使用方法。
【請求項３４】
前記プロテインキナーゼはプロテインキナーゼＢである請求項３３に記載の使用方法。
【請求項３５】
プロテインキナーゼＢを活性化する方法であって、請求項１から１４及び２２のいずれか１項に規定される３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼに前記プロテインキナーゼＢを接触させることを有する方法。
【請求項３６】
３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性を制御する物質を特定するためのキットであって、
請求項１から９、１１〜１３及び２２のいずれか１項に記載の３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼもしくはその融合ポリペプチド、請求項１０もしくは１４に記載の断片、または前記断片の融合ポリペプチドと、
請求項２４から３１のいずれか１項に規定される方法を実行するための手段、を有するキット。
【請求項３７】
請求項２４から３１及び３３のいずれか１項に記載の方法において、プロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化する前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼは、プロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化する請求項１から１４及び２２のいずれか１項に記載の３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼである方法。
【請求項３８】
請求項３２から３４のいずれか１項に記載の使用において、プロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化する３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼは、プロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化する請求項１から１４及び２２のいずれか１項に記載の３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼである使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、酵素、酵素をコードするポリヌクレオチド及び酵素とポリヌクレオチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）（非特許文献１）又はＲＡＣプロテインキナーゼ（非特許文献２）は、ウィルスガン遺伝子ｖ−Ａｋｔ細胞ホモログ（非特許文献３）であり、そのため、ｃ−Ａｋｔとも呼ばれてきた。現在のＰＫＢに関する関心は、第一にインスリン及び成長因子の刺激によって急激に活性化されるということとその活性化はホスフォイノシチド−３−キナーゼ（非特許文献４〜６）の阻害因子によって阻害されるという発見によって起こり、第２にＰＫＢのイソ体は卵巣、膵臓（非特許文献５７，８）及び肺がん細胞（非特許文献２）のかなりの程度において過剰発現されているという発見から起こっている。
【０００３】
ＰＫＢは、少なくとも部分的には、インスリンによるグリコーゲンとたんぱく質合成の刺激を助長するグリコーゲンシンターゼ（非特許文献９）とたんぱく質合成開始因子ｅＩＦ２のインスリン誘導脱リン酸化と活性化の根底に有ると思われるＬ６ミオチューブの中のグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）のインスリン誘導阻害とを仲介するらしい。しかしながら、ＰＫＢは他の生理学的な基質を持っているらしく、遺伝子導入実験ではｐ７０  Ｓ６キナーゼ（非特許文献５）を活性化すること、グルコーストランスポーターＧＬＵＴ４の細胞膜への転移を刺激し且つ３Ｔ３−Ｌ１  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ（非特許文献１１）にグルコースを取り込むことを強化し、そしてアポトーシスに対するニューロン（非特許文献１２）と線維芽細胞（非特許文献１３）のＩＧＦ1誘導生存を仲介することが示された。
【０００４】
本発明の関連技術としては、以下の特許文献１〜１０及び非特許文献１〜７３が挙げられる。
【特許文献１】１９８４年４月３日に発行されたＲｕｔｔｅｒ等の米国特許４，４４０，８５９
【特許文献２】１９８５年７月２３日に発行されたＷｅｉｓｓｍａｎの米国特許４，５３０，９０１
【特許文献３】１９８６年４月１５日に発行されたＣｒｏｗｌの米国特許４，５８２，８００
【特許文献４】１９８７年６月３０日に発行されたＭａｒｋｓ等の米国特許４，６７７，０６３
【特許文献５】１９８７年７月７日に発行されたＧｏｅｄｄｅｌの米国特許４，６７８，７５１
【特許文献６】１９８７年１１月３日に発行されたＩｔａｋｕｒａ等の米国特許４，７０４，３６２
【特許文献７】１９８７年１２月１日に発行されたＭｕｒｒａｙ等の米国特許４，７１０，４６３
【特許文献８】１９８８年７月１２日に発行されたＴｏｏｌｅ，Ｊｒ．等の米国特許４，７５７，００６
【特許文献９】１９８８年８月２３日に発行されたＧｏｅｄｄｅｌの米国特許４，７６６，０７５
【特許文献１０】および１９８９年３月７日に発行されたＳｔａｌｋｅｒの米国特許４，８１０，６４８
【非特許文献１】Coffer, P.J. and Woodgett, J.R. (1991) "Molecular-cloning and characterization of a novel putative protein-serine kinase related to the camp-dependent and protein-kinase-C families" Eur. J. Biochem. 201 475-481.
【非特許文献２】Jones, P.F. et al (1991) "Molecular-cloning and identification of a serine threonine protein-kinase of the 2nd-messenger subfamily" Proc. Natl. Acad. Sci USA 88 4171-4175.
【非特許文献３】Belacossa, A. et al (1991) "A retroviral oncogene, AKT, encoding a serine-threonine kinase containing an SH2-like region" Science 254, 244-247,
【非特許文献４】Franke, T.F. et al (1995) "The protein-kinase encoded by the AKT protooncogene is a target of the PDGF-activated phosphatidylinositol 3-kinase" Cell 81, 727-736.
【非特許文献５】Burgering, B.M.T. and Coffer, P.J. (1995) "Protein-kinase-B (C-AKT) in phosphatidylinositol-3-OH kinase signal-transduction" Nature 376 599-602.
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【非特許文献７】Cheng, J.Q. et al (1992) "AKT2, a putative oncogene encoding a member of a subfamily of protein-serine threonine kinases, is amplified in human ovarian carcinomas" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 9267-9271.
【非特許文献８】Cheng, J.Q. et al (1996) "Amplification of AKT2 in human pancreatic-cancer cells and inhibition of AKT2 expression and tumorigenicity by antisense RNA" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3636-3641.
【非特許文献９】Cross, D.A.E. et al (1995) "Inhibition of glycogen-synthase kinase-3 by insulin-mediated by protein-kinase-B" Nature, 378, 785-789.
【非特許文献１０】Welsh, G.I. et al (1994) "Wortmannin inhibits the effects of insulin and serum on the activities of glycogen-synthase kinase-3 and the mitogen-activated protein-kinase" Biochem J. 303, 15-20.
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【非特許文献２４】Kohn, A.D. et al (1995) "Insulin stimulates the kinase activity of RAC-PK, a pleckstrin homology domain containing ser/thr kinase" EMBO J. 14, 4288-4295.
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【非特許文献７３】“モノクローナル抗体：技術マニュアル”Hzola (CRC Press、1988)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一つの重要な問題はＰＩ３−キナーゼがＰＫＢの活性化を引き起こす機構に関係している。ＰＫＢの活性化は自身のリン酸化（非特許文献５、１４）を伴い、また、我々は最近インスリン又はＩＧＦ１による活性化がそのＴｈｒ３０８とＳｅｒ４７３（非特許文献１５）におけるリン酸化に基づくことを示した。さらに、両残基のインスリン又はＩＧＦ１誘導リン酸化は、阻害因子のＰＩ３−キナーゼ（非特許文献１５）であるｗｏｒｔｍａｎｎｉｎによって抑制された（was abolished）。我々は、Ｔｈｒ３０８とＳｅｒ４７３をリン酸化するプロテインキナーゼは、ＰＩ３−キナーゼ反応の生成物であるホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェイト（ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３）によって活性化されるらしいと信じている。ここに示す仕事において、我々はこれがまさにその一例であり、そしてＰＫＢを活性化する３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ（ＰＤＫ１）を精製し且つ分析を行い、ＰＤＫ１をコードするポリヌクレオチドと、ＰＤＫ１と前記ポリヌクレオチドの用法を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この発明の第１の側面は、プロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化する実質的に純粋な３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼを提供するものである。
【０００７】
“実質的に純粋”という言葉によって、我々は３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼが実質的に他のたんぱく質を含まないということを意図している。このようにして、我々は前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼとして質量でたんぱく質含量の少なくとも３０％を含むあらゆる成分構成を含み、望ましくは少なくとも５０％、さらに望ましくは少なくとも７０％、さらにもっと望ましくは少なくとも９０％、最も望ましくは少なくとも９５％のたんぱく質含有量が前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼである。
【０００８】
このようにして、この発明は、しかも３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼと混入物を含み、ここで混入物とは重量で７０％未満の混合物を含み、望ましくは５０％未満の混合物、さらに望ましくは３０％未満の混合物、さらにもっと望ましくは少なくとも１０％未満の混合物であり最も望ましくは重量で５％未満の混合物である。
【０００９】
この発明はまた、生体外で他の成分と結合した実質的に純粋な前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼを含むが、前記他の成分は前記プロテインキナーゼが見られる全ての細胞で見られる全ての成分というわけではない。
【００１０】
実質的に純粋な３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼは、実質的に純粋なホスファチジル３，４，５−トリホスフェイト依存性プロテインキナーゼ、又はホスファチジル３，４−ビスホスフェイト依存性プロテインキナーゼであることが望ましい。
【００１１】
“プロテインキナーゼＢαをリン酸化する”という言葉は、３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼがＡＴＰからリン酸基をプロテインキナーゼＢαの受容基に転移させることができるということを意味している。望ましくは、受容基はＴｈｒ３０８である。
【００１２】
“プロテインキナーゼＢα”という言葉は、あらゆるプロテインキナーゼＢαまたはそのあらゆる適当な断片、派生物、又はプロテインキナーゼＢαの融合体、又はその断片または派生物を含んでいる。たとえば、プロテインキナーゼＢαが実施例１に示すようにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとプロテインキナーゼＢαの間の融合体であることは特に望ましい（ＧＳＴ−ＰＫＢα;非特許文献２７）。
【００１３】
ＰＫＢαはヒト由来ＰＫＢαであることが望ましい。ある種又は組織由来の３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼが他種又は組織由来のＰＫＢαをリン酸化及び活性化できることは十分確かめられるべきである。
【００１４】
“プロテインキナーゼＢαの活性化”という言葉に、我々は、前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼによるリン酸化において、そのプロテインキナーゼＢαの与えられた基質への活性化がそれ程リン酸化されていないプロテインキナーゼＢαと比べて少なくとも１０倍に上昇するものであり、望ましくは少なくとも２０倍そしてさらに望ましくは少なくとも３０倍である意味を含ませている。適切には、プロテインキナーゼＢαの活性化は合成ペプチドＲＰＲＡＡＴＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１）を用いて測定される。
【００１５】
“３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ”という言葉に、我々は適切な３−ホスフォイノシチド（または３−ホスフォイノシチドの効果を類似した物質）不在下においてこのプロテインキナーゼは実質的にプロテインキナーゼＢαの活性化では不活性であることを含ませている。特に、前記プロテインキナーゼは３−ホスフォイノシチドの存在下において少なくともプロテインキナーゼＢαに対して３−ホスフォイノシチドの不存在下の活性に比べて１０倍の活性を示したが、望ましくは少なくとも１００倍であり、さらに望ましくは少なくとも１０００倍であり、そしてさらにもっと望ましくは少なくとも１００００倍である。
【００１６】
３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼはおそらく、以下でさらに詳しく示される３−ホスフォイノシチドの類似体によって活性化されることも十分に分かってくるであろう。
【００１７】
望ましくは、３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼによるＰＫＢαの活性化はＤ光学異性体のシン−１−ステアトイル−２−アラキドニルホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェイトでは実質的に加速されるが、Ｌ光学異性体の前記ホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリホスフェイトでは実質的には加速されない。
【００１８】
望ましくは、３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼによるＰＫＢαの活性化はＤ光学異性体体のシン−１，２−ディパルミトイルホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェイト又はシン−１，２−ディパルミトイルホスファチジルイノシトール３，４−ビスホスフェイトでは実質的に活性化されるが、Ｌ光学異性体の前記ホスファチジルイノシトール  ホスフェイトでは実質的には活性化されない。
【００１９】
望ましくは、３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼによるＰＫＢαの活性化はホスファチジルイノシトール３，５−ビスホスフェイト、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェイト、ホスファチジルイノシトール３−ホスフェイト、又はイノシトール１，３，４，５−テトラキスホスフェイトでは実質的には活性化されない。
【００２０】
このように，特に図６の参照と実施例１のウサギ骨格筋ＰＤＫ１では、以下の３−ホスフォイノシチドが前記３−ホスフォイノシチド依存性キナーゼを活性化することが分かっている（活性化の程度順；最も効果的なものが最初）：
【００２１】
１．脂質５：ラセミ体のシン−１，２−ジリノレオイル−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３
２．（同じ）脂質２：Ｄ光学異性体のシン−１−ステアロイル−２−アラキドニル−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３
２．（同じ）脂質３：Ｄ光学異性体のシン−２アラキドニル−３−ステアロイル−アラキドニル−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３
４．（同じ）脂質６：シン−１，２−ジパルミトイル−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３
４．同じ 脂質７：シン−１，２−ジパルミトイル−ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２
少なくとも、ウサギ骨格筋ＰＤＫ１との関係においては、以下のリン脂質は目立った活性化を示さなかった。
６．脂質：Ｌ光学異性体のシン−１−ステアロイル−２−アラキドニル−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３
７．脂質：Ｌ光学異性体のシン−２アラキドニル−３−ステアロイル−アラキドニル−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３
８．脂質：ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２
９．脂質：シン−１，２−ジパルミトイル−ＰｔｄＩｎｓ（３，５）Ｐ２
１０．脂質：シン−１，２−ジパルミトイル−ＰｔｄＩｎｓ−３Ｐ
１１．脂質：ＰｔｄＩｎｓ４Ｐ
１２．脂質：Ｉｎｓ（１，３，４，５）Ｐ４
【００２２】
我々は、ヒト由来のＰＤＫ１が上記の脂質と同様の優先傾向を実質的に持っている事を見つけた。
【００２３】
３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼは実質的にｗｏｒｔｍａｎｎｉｎに影響されない方が望ましい。
【００２４】
プロテインキナーゼＢαをリン酸化し活性化する３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼはおそらくプロテインキナーゼＢβとプロテインキナーゼＢγのような他の形状のプロテインキナーゼＢもリン酸化し活性化するだろう。我々は、ＰＤＫ１がＰＫＢαだけではなくＰＫＢβとＰＫＢγもリン酸化し活性化することを示した。プロテインキナーゼＢβは（非特許文献７）に示す。プロテインキナーゼＢγはＫｏｎｉｓｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１６，５２６−５３４（非特許文献６５）に示されている。
プロテインキナーゼＢαをリン酸化し活性化する３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼは、あらゆる都合のよい組織と下記のあらゆる哺乳類から分離されうる。酵素のイソ体は同じ哺乳類の中の異なる組織に存在し、この発明はあらゆる哺乳類の前記イソ体と前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼを含んでいると思われる。前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼはヒト由来前記酵素であることが望ましく。ウサギ由来の前記酵素であっても構わない。
【００２５】
前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で決められるように約６７ｋＤａであること望ましい。
【００２６】
特に望ましい実施例は、プロテインキナーゼＢαをリン酸化し活性化する実質的に純粋な３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼであり、３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼはＡＮＳＦＶＧＴＡＱＹＶＳＰＥＬＬ、またはＡＧＮＥＹＬＩＦＱＫ，またはＬＤＨＰＦＦＶＫ、またはこれらの配列のうち２又はそれ以上の配列を含む、又は１から４の保守的置換を有するものである。“保守的置換”が何を意味しているのかは以下で説明する。
【００２７】
特に望ましい実施例は以下のようなアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ２）を含むポリペプチド、又は変体、断片、派生物、又は融合体である。このアミノ酸配列は人のＰＤＫ１をコードするｃＤＮＡの塩基配列から決定されたヒトのＰＤＫ１のアミノ酸配列である。
【表４】
2005323611.tif 000003
【００２８】
この導かれたアミノ酸配列はさらに図１０にも記載されている。
【００２９】
少なくともヒトＰＤＫ１との関係で、もっと詳しく実施例のなかで議論すると、ＰＤＫ１とＰＫＢαの何れかのｐｅｃｓｔｒｉｎ相同性（ＰＨ）領域が削除された実験で、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３またはＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２のＰＫＢαへの結合がＰＤＫ１によるリン酸化及び活性化のためには必要とされていることが分かった。ＰＨ領域を欠損しているＧＴＳ−ＰＫＢα変位体は完全長の天然体ＧＴＳ−ＰＫＢαよりも３倍高活性であり、さらにＰＤＫ１によってＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３非依存的に活性化され且つリン酸化された。しかしながら、活性化の割合は天然体のＧＴＳ−ＰＫＢαに比べて、約２０倍に減少する。ＧＴＳ融合体たんぱく質として発現されるＣ端と推定されるＰＨ領域を欠損しているＰＤＫ１変異体はまだＧＴＳ−ＰＫＢαをＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３依存的に活性化できるが、活性化の割合は完全長の天然体ＧＴＳ−ＰＤＫ１よりも約３０倍に減少する。ＰＤＫ１によるＰＫＢαの活性化におけるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３／ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２の効果は、それ故少なくとも部分的に基質支配である。しかしながら、ＰＤＫ１のＰＨ領域が削除されたときのＰＤＫ１によるＰＫＢの活性化率の急激な減少により、ＰＤＫ１のＰＨ領域の重要性とその結果ＰＤＫ１によるＰＫＢの活性化におけるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３／ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２の重要性が示唆される。このようにしてプロテインキナーゼＢαをリン酸化し活性化する実質的に純粋な３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼは、不活性な酵素（例えば、不活性なＰＤＫ１）不活性なＰＫＢαを生体内でリン酸化するためには３−ホスフォイノシチドの存在を要求するという意味で、３−ホスフォイノシチド依存性であってもよい。この発明のプロテインキナーゼはＰＫＢαを３−ホスフォイノシチド依存的な方法でリン酸化し活性化する。
【００３０】
我々は、ＰＤＫ１がＩｎｓＰｔｄ（３，４，５）不存在下でＰ３ｐ７０Ｓ６キナーゼをリン酸化することを示してきた。ＰＤＫ１がＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３に直接結合することも示してきた。
【００３１】
この発明の第２の側面は、プロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化する３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼをコードする組換えポリヌクレオチドであって、ＩＭＡＧＥ  ｃｌｏｎｅ  ５２６５８３、又はＩＭＡＧＥ  ｃｌｏｎｅ  ６２６５１１に対応するＤＮＡではない組換えポリヌクレオチドを提供するものである。これらのクローンの挿入の少なくとも一部分のＤＮＡ配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｉｏｎ  Ｎｏ  ＡＡ１２１９９４とＡＡ１８６３２３とで与えられる。前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの選択は本発明の第１の側面と同様である。この発明は３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼをコードする変体、断片、派生物、又は融合体、又は前記断片、派生物の融合体を含む。ＥＳＴＡＡ１２９９４は膵臓組織由来であって、ＥＳＴＡＡ１８６３２３はＨｅＬａ細胞由来であった。
【００３２】
特に望ましい本発明の実施例は以下の塩基配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ３）を含むポリヌクレオチド、又は変体又は変位体である。この塩基配列はヒトのＰＤＫ１配列をコードしている配列を含んだ配列である。
【表５】
2005323611.tif 000004
【００３３】
このｃＤＮＡ配列は図１０にも示されている。
【００３４】
ＩＭＡＧＥ  ｃｌｏｎｅ  ５２６５８３、又はＩＭＡＧＥ  ｃｌｏｎｅ  ６２６５１１は学術的に知られ且つ一般にもＨＭＧＰ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｔｅｒｅ，Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｒｉｕｍ，Ｈｉｎｘｔｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１  １ＳＢ，ＵＫから利用可能である。このクローンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−に挿入された一部分長のｃＤＮＡである。これらのクローンがプロテインキナーゼをコードするｍＲＮＡ由来であることは知られていなかった。
【００３５】
このＰＤＫ１ｃＤＮＡ即ちＨ９７９０３（メラノサイト），ＡＡ０１８０９８（レチナ），ＡＡ１８０９７（レチナ），ＡＡ０１９３９４（レチナ），ＡＡ０１９３９３（レチナ），Ｎ２２９０４（メラノサイト），Ｗ９４７３６（胎児心臓），ＥＳＴ５１９８５（胆嚢），Ｎ３１２９２（メラノサイト），ＡＡ１８８１７４（ＨｅＬａ細胞），ＡＡ１００２１０（大腸）及びＲ８４２７１（レチナ）の部分をコードするいくつかの他のＥＳＴは一般にも利用可能である。これらのＥＴＳに対応するポリヌクレオチドは実質的には請求されていないが、それらはこの発明のある部分を実行するには役立つかもしれない。これらのクローンがプロテインキナーゼをコードするｍＲＮＡ由来であったことは示されていない。
【００３６】
また、この発明は、この発明の第２の側面の組換えポリヌクレオチドの断片を含んだヌクレオチドを含む。望ましくは、このポリヌクレオチドは、少なくとも１０塩基長であって、もっと望ましくは少なくとも１４塩基長であり、そしてさらにもっと望ましくは１８塩基長である断片を含んだポリヌクレオチドである。そのようなポリヌクレオチドはＰＣＲのプライマーとして有効である。
【００３７】
このポリヌクレオチドまたは組換ポリヌクレオチドはＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡが望ましい。このポリヌクレオチドはコード配列にイントロンを含んでも含まなくてもよい；望ましくはこのポリヌクレオチドはｃＤＮＡである。
【００３８】
このポリヌクレオチドの“バリエーション”は（i）前記ポリヌクレオチドによってコードされるたんぱく質に特異的に結合する抗体を用意するのに便利なたんぱく質又はその断片を精製するのに便利なもの、又は（ii）その遺伝子又はちょうど定義された（i）型のバリエーションに対応するアンチセンス配列である。例えば、異なるコドンが置換されても、その元のコドンと同様のアミノ酸をコードするコドンである。他には、その置換コドンがその活性又はそのたんぱくの生体内抗原性に影響を与えない又は向上させても良く、又はしかもその活性や生体内抗原性を制御してもよい異なったアミノ酸をコードしてもよい。例えば、ここで参照によって組み込まれる、Ｂｏｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔｌｅ“試験管内における突然変異生成の戦略と応用”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１９３−２１０（１９８５）（非特許文献６２），に書かれているような置換、挿入、欠失そして転移のような単一又は複数の突然変異を作るのに位置特異的突然変異又は他の手法が使われている。そこで記載されている指摘に知られている技術を応用することによってそのような修飾ポリヌクレオチドを入手できるので、そのような修飾ポリヌクレオチドは本発明のクレームの範囲に入る。
【００３９】
さらに、その発明のそのポリヌクレオチド配列(又は、その断片)は、高度な厳格な条件下でそれとハイブリダイズした他のポリヌクレオチド配列を入手するために使われるということがこれらの学術的な技術によって認識されるだろう。そのようなポリヌクレオチドはあらゆる遺伝子ＤＮＡ配列を含む。それ故、もしそのような相同ポリヌクレオチドが以下に記載の方法の少なくともいくつかが使用可能か又はさもなくば有効であるポリペプチドをコードするならば、本発明のポリヌクレオチドは、本発明の方法によって同定されるポリヌクレオチドと少なくとも５５％、望ましくは６０％、さらに望ましくは少なくとも７０％そして最も望ましくは少なくとも９０％の相同性を示すポリヌクレオチドを含む。
【００４０】
例えば、相同率はウィスコンシン大学遺伝子機械グループのＧＡＰプログラムによって算出した。
【００４１】
ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは０．１ＸＳＳＣから６ＸＳＳＣ含有の水溶液中において、５０℃から７０℃の間で行って構わない。これより高い温度又は低いＳＳＣの濃度ではハイブリダイゼーション要件が厳格になることが学術的に知られている。“高度な厳格性”とは、我々は２ＸＳＳＣ且つ６５度を意味している。１ＸＳＳＣとは０．１５Ｍ／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムのことである。高度な厳格性でハイブリダイズしたポリヌクレオチドは特許請求の範囲記載の本発明の範囲に含まれる。
【００４２】
ポリペプチドの“変異”は、比較的短い（例えば２０から５０塩基対）範囲が本発明のポリヌクレオチドと同様の範囲を持つ高度の相同性（少なくとも８０％そして望ましくは少なくとも９０又は９５％）を持ち、たとえその二つのポリヌクレオチドの間の全体の相同性はもっと小さくてもよい。これは、全体的なたんぱく質の構造が異なっていたとしても、重要な活性化又は結合部位はおそらく共有されているからである。
【００４３】
このポリペプチドの“変体”は、その様な変化が実質的には前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性を変えない保守的又は非保守的である、挿入、欠失及び置換を含んでいる。
【００４４】
“保守的置換”とは、それぞれＧｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間での置換である。その様な変体は、学術的に良く知られたたんぱく質工学や位置特異的変位導入の手法を使うことによって作り出せる。
【００４５】
望ましくは、同様の分析条件において、天然の前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼのプロテインキナーゼＢαに対する活性の少なくとも３０％、望ましくは少なくとも５０％そしてさらに望ましくは少なくとも７０％を有するこの３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼをポリヌクレオチドの変体又は変異がコードする。
【００４６】
“３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの派生物”という言葉に、我々は活性を維持していたり、又はその他の使用に有効な、例えば抗体を検出したり分析物に結合したりするのに役立つ、全ての派生物を含めている。
【００４７】
“３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの融合体”という言葉に、我々はその他の全てのポリペプチドに融合する前記プロテインキナーゼを含めている。例えば、前記プロテインキナーゼは前記プロテインキナーゼ純化を促進するためにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼやプロテインＡのようなポリペプチドに融合される。前記プロテインキナーゼのあらゆる変体、断片、そして派生物への融合もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００４８】
本発明の更なる側面は、プロテインキナーゼＢα又は前記プロテインキナーゼの変体、断片、派生物又は融合体、又は前記変体、断片、派生物の融合体をリン酸化及び活性化する３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼをコードする組換ポリヌクレオチドを含む複製可能なベクターを提供するものである。
【００４９】
例えば、相補的粘着末端を通してベクターにポリヌクレオチド、特にＤＮＡを実施可能に結合するために、種々の方法が開発されてきた。例えば、ベクターＤＮＡに挿入されるＤＮＡ分節に相補的ホモポリマー索が加えられ得る。そこで組換ＤＮＡ分子を形成するための相補的ホモポリマーテイル間での水素結合によってベクターとＤＮＡ分節は結合される。
【００５０】
一つ又はそれ以上の制限部位を有する合成リンカーはベクターにＤＮＡ分節をくっつける他の方法を提案してくれる。上記のようなエンド型制限消化酵素によって作られるＤＮＡ分節は、３'−５'−エキソヌクレオチック活性により突出部を取り除き、それとポリメラーゼ活性により３'末端１本鎖終結部を補うバクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ又は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１によって処理される。
【００５１】
これらの活性の組み合わせがブルント（不揃い）末端ＤＮＡ断片を作り出す。このブルント末端ＤＮＡ分節は、バクテリオファージＴ４リガーゼのような、ブルント末端ＤＮＡ分子の接合を触媒できる酵素の存在下、過剰分子量のリンカー分子とともに培養される。したがって、この反応の生成物は、その末端には重合リンカー配列を有するＤＮＡ分節である。これらのＤＮＡ分節は適当な制限酵素で開裂され、そしてこのＤＮＡ分節の終結末端と相補的な終結領域を作る酵素で開裂されている発現ベクターに接合される。
【００５２】
種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を有する合成リンカーは商業的にＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，ニューヘブン，ＣＮ，ＵＳＡを含むたくさんの原料源から利用することができる。
【００５３】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを修飾する望ましい方法は、Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９，４８７−４９１に公開されたようなポリメラーゼチェインリアクションを使うものである。この方法は、例えば適切な制限部位を設計することによって、ＤＮＡを適切なベクターに導入する個とに使われても良い、または技術的に良く知られた他の便利な方法においてそのＤＮＡを修飾するために使われても良い。
【００５４】
この方法において、酵素的に増幅されるＤＮＡは、増幅されるＤＮＡに自身が組み入れられる２つの特異的なプライマーによって側部が結合される。前記特異的プライマーは、技術的に知られた方法を使って発現ベクター中にクローニングするために使われうる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでも良い。
【００５５】
このＤＮＡ（あるいはレトロウィルスベクターにおける、ＲＮＡ）は、本発明の物質を含むポリペプチドを生成するための適切な宿主中で発現される。したがって、本発明に係るポリペプチドの発現と生成のための適当な宿主細胞を形質転換させるために使われる発現ベクターを構成するために、本発明記載の物質を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡは既知の技術に応じて使われ、ここに記載されている指示の視点から適当に修飾されても良い。このような技術は、１９８４年４月３日に発行されたＲｕｔｔｅｒ等の米国特許４，４４０，８５９（特許文献１）、１９８５年７月２３日に発行されたＷｅｉｓｓｍａｎの米国特許４，５３０，９０１（特許文献２）、１９８６年４月１５日に発行されたＣｒｏｗｌの米国特許４，５８２，８００（特許文献３）、１９８７年６月３０日に発行されたＭａｒｋｓ等の米国特許４，６７７，０６３（特許文献４）、１９８７年７月７日に発行されたＧｏｅｄｄｅｌの米国特許４，６７８，７５１（特許文献５）、１９８７年１１月３日に発行されたＩｔａｋｕｒａ等の米国特許４，７０４，３６２（特許文献６）、１９８７年１２月１日に発行されたＭｕｒｒａｙ等の米国特許４，７１０，４６３（特許文献７）、１９８８年７月１２日に発行されたＴｏｏｌｅ，Ｊｒ．等の米国特許４，７５７，００６（特許文献８）、１９８８年８月２３日に発行されたＧｏｅｄｄｅｌの米国特許４，７６６，０７５（特許文献９）、および１９８９年３月７日に発行されたＳｔａｌｋｅｒの米国特許４，８１０，６４８（特許文献１０）に開示されているものを含み、これらのすべては本明細書の一部に組み入れられる。
【００５６】
本発明に係る物質を構成するポリペプチドをコードしているＤＮＡ（あるいはレトロウィルスベクターにおける、ＲＮＡ）は、適当な宿主への導入のための広い種々のその他のＤＮＡ配列と結合されても良い。そのコンパニオンＤＮＡはその宿主の特徴、その宿主へのそのＤＮＡの導入方法、及びエピゾームの保持あるいは集合が望ましいかどうかということに依存するだろう。
【００５７】
一般に、ＤＮＡは、プラスミドのような適当な発現ベクター中の発現のための適当な開始部位と正確なリーディングフレームの中に挿入される。もし必要なら、ＤＮＡは望ましい宿主に認識される適当な転写及び翻訳制御コントロールヌクレオチド配列に接合されていても良いが、その様なコントロールは一般に発現ベクターにおいて可能である。一般に、このベクターによって形質転換されるのはこの宿主の全てではない。それ故、形質転換された宿主細胞を選ぶことが必要になるだろう。一つの選択技術は、抗生物質のような形質転換細胞中で選択特性をコードするあらゆるコントロールとともに、発現ベクター中にＤＮＡ配列を組み組むことを含む。他には、その様な選択特性のための遺伝子は、好適の宿主細胞を共形質転換するために使われる他のベクター上に置いておくこともできる。
本発明に係る組換えＤＮＡによって形質転換された宿主細胞は十分な時間と、回復され得るポリペプチドの発現を許容するためにここに公開された指摘の観点から技術的にそれらの熟練者には知られた適当な条件下とにおいて培養される。
【００５８】
バクテリア（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）や（Ｂａｃｉｌｌｕｓｕ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、酵母（例えば、（Ｓｕｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、糸状菌（例えば、（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞及び昆虫細胞を含む多くの発現系が知られている。
【００５９】
そのベクターが他の非原核的な細胞型において発現するために使われ得るとしても、そのベクターは、原核細胞中において増殖するための例えばＣｏｌ  ＥＩ  ｏｒｉのような原核細胞レプリコンを含む。そのベクターは、そこで形質転換されている例えば大腸菌のようなバクテリア宿主細胞の遺伝子の発現（転写及び翻訳）を指示することができる原核細胞プロモーターのような適切なプロモーターを含むこともできる。
【００６０】
プロモーターは、発生するためにＲＮＡポリメラーゼの結合と転写を可能とするＤＮＡ配列によって形成される発現コントロール要素である。本発明に係るＤＮＡ分節の挿入に対して便利な制限部位を有するプラスミドベクター中で、典型的なバクテリア宿主細胞と互換可能なプロモーター配列は概して供給される。
【００６１】
典型原核細胞ベクタープラスミドは、Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）から利用可能なｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２とｐＢＲ３２９、及びファルマシア、ピスカタウェイ、ＮＪ、ＵＳＡから利用可能なｐＴｒｃ９９ＡとｐＫＫ２２３‐３がある。
【００６２】
典型哺乳類ベクタープラスミドは、ファルマシア、ピスカタウェイ、ＮＪ、ＵＳＡから利用可能なｐＳＶＬがある。その発現の最高レベルは、ＣＯＳ‐１細胞のようなＴ抗原生産細胞中において見られるので、クローンされた遺伝子の発現を進行させるためにこのベクターはＳＶ４０後期プロモーターを使用する。
【００６３】
誘導性哺乳類発現ベクターの一例はｐＭＳＧであり、しかもこれはファルマシア、ピスカタウェイ、ＮＪ、ＵＳＡから利用可能である。クローンされた遺伝子の発現を進行させるためのマウス乳腺腫瘍ウィルス長終結繰り返しのグルココルチノイド誘導性プロモーターを使っている。
【００６４】
便利な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３‐４０６とｐＲＳ４１３‐４１６及び一般的にはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ９２０３７、ＵＳＡから利用可能である。プラスミドｐＲＳ４０３，ｐＲＳ４０４，ｐＲＳ４０５，ｐＲＳ４０６は酵母集合プラスミド（ＹＩｐｓ）でありＨＩＳ３，ＴＲＰ１、ＬＥＵ２及びＵＲＡ３の酵母選択マーカーを組み込んでいる。プラスミドｐＲＳ４１３‐４１６は酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐｓ）である。
【００６５】
本発明は、この発明に係るポリヌクレオチドベクター構成物で形質転換された宿主細胞にも関連する。この宿主細胞は原核細胞であるいは真核細胞でありうる。  バクテリア細胞は原核宿主細胞であることが好まれ、そして概して例えばＢｅｔｈｓｄａ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡから利用可能な大腸菌ＤＨ５株、及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）ｏｆ  Ｒｏｃｋｖｉｌｌ，ＭＤ，ＵＳＡ（ＮｏＡＴＣＣ３１３４３）から利用可能なＲＰ１がある。好まれる神格細胞宿主細胞は酵母、昆虫及び哺乳類細胞を含み、好ましくはマウス、ラット、サル、又はヒトの線維芽及び腎臓細胞系列由来の細胞のような脊椎動物細胞である。酵母宿主細胞は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ９２０３７、ＵＳＡから利用可能なＹＨＰ４９９，ＹＨＰ５００とＹＨＰ５０１とを含む。好まれる哺乳類宿主細胞は、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として利用できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＣＬ１６５８として利用できるＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、ＡＴＣＣからＣＣＬ１６５０として利用できるサル腎臓由来ＣＯＳ‐１細胞及びヒト胚腎臓細胞である２９３細胞を含む。好まれる昆虫細胞は、バキュロウィルス発現ベクターで遺伝子注入されるＳｆ９細胞である。
【００６６】
本発明に係るＤＮＡ構成物での適切な細胞宿主の形質転換は、使用されるベクター型に概して依存する良く知られた方法によって成し遂げられる。原核宿主細胞形質転換に関して、例えばＣｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６９，２１１０（非特許文献６６）及びＳａｍｖｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）分子クローニング、実験マニュアル、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．（非特許文献６７）酵母細胞の形質転換はＳｇｅｒｍａｎｅｔａｌ（１９８６）酵母遺伝子における手法、実験マニュアル、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（非特許文献６８）に記載されている。Ｂｅｇｇｓ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ２７５，１０４‐１０９（非特許文献６９）の方法も便利である。脊椎動物細胞に関して，例えばリン酸カルシウム及びＤＥＡＥ−デキストラン又はリポソーム製剤が、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、又はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｄ．，Ｇｅｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ２０８７７，ＵＳＡから利用可能である。
【００６７】
電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）はまた、細胞を形質転換及び／又は遺伝子導入するのに便利であり、そして酵母細胞、バクテリア細胞、昆虫細胞及び脊椎動物細胞に遺伝子導入するためとして学術的に良く知られている。
【００６８】
例えば、ここで参照によって組み込まれているＬｕｃｈａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２，６３７‐６４６（非特許文献６３）において記載されているこの方法で多くのバクテリア種が形質転換されているといえる。２．５ＸＰＥＢ中に懸濁されたＤＮＡ‐細胞混合物の２５μＦＤで６２５０Ｖ／ｃｍにおける電気穿孔にしたがって、一致して莫大な形質転換体が得られている。
【００６９】
電気穿孔による酵母の形質転換のための方法はＢｅｃｋｅｒ＆Ｇｕａｒｅｎｔｅ（１９９０）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１９４，１８２（非特許文献７０）に開示されている。
【００７０】
上手く形質転換された細胞、すなわち本発明にかかるＤＮＡ構成物を含む細胞は良く知られた技術によって同定される。本発明に係る発現構成物の導入の結果の細胞は本発明に係るポリヌクレオチドを生成するために育成される。細胞は回収され、溶菌され、そしてそれらのＤＮＡ構成物はＳｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３（非特許文献７１）又はＢｅｒｅｎｔｅｔａｌ（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３，２０８（非特許文献７２）に記載されるような方法を使ってそのＤＮＡの存在について調べられうる。他には、上清中のそのたんぱく質の存在が、以下に記載されるように抗体を使って検出され得る。
【００７１】
組換えＤＮＡの存在に対する直接的分析に加えて、その組換えＤＮＡがそのたんぱく質の発現を指すことができるときには、成功した形質転換は良く知られた免疫学的方法によって確かめられる。例えば、発現ベクターによって上手く形質転換された細胞は、適当な抗原性を示すたんぱく質を生成する。形質転換されたことが疑わしい細胞の試料は回収されそして適切な抗体を使ってそのたんぱく質について分析される。
【００７２】
このようにして、形質転換された宿主細胞自身に加え、本発明はしかもこれらの栄養培地中の細胞の培養、好ましくはモノクローナル（クローン的に相同的な）培養、又はモノクローナル培養由来の培養をも考慮している。
【００７３】
本発明の更なる側面は、プロテインキナーゼＢβをリン酸化および活性化する３−ホスフォイノシチド依存性キナーゼ又は、その変体、断片、派生物、又は融合体、又は変体、断片、派生物を作る方法であって、その方法は組換えポリヌクレオチド又は３−ホスフォイノシチド依存性キナーゼをコードしている複製可能ベクターを含む宿主細胞を培養すること、及び前記宿主細胞から前記たんぱく質又はその変体、断片、派生物、又は融合体、又は変体、断片、派生物の融合体を分離することを含む方法を提供している。宿主細胞の培養及び組換えたんぱく質の分離方法は技術的に良く知られている。
【００７４】
本発明のさらに別の側面は、プロテインキナーゼＢβをリン酸化及び活性化する３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ分離する方法であって、この方法は、（ａ）哺乳類から前記３−ホスフォイノシチド依存性キナーゼを含む組織を入手すること、（ｂ）前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼを有する前記組織から無細胞抽出液を得ること、（ｃ）前記無細胞抽出液を分画化すること、（ｄ）（ｃ）において、３−ホスフォイノシチド存在下でプロテインキナーゼＢβをリン酸化及び活性化することが可能な分画を集めること、のステップを含む方法である。
【００７５】
好ましくは、３−ホスフォイノシチドは本発明の第１の側面に関連において公開されるような選ばれた３−ホスフォイノシチドのどれでも良い；最も好ましくはホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェイト、ホスファチジルイノシトール３，４−ビスホスフェイトである。好ましくは、更なる段階が使われる。都合良くは、ステップ（ｅ）においてステップ（ｄ）の分画がさらに分画されそしてステップ（ｆ）において３−ホスフォイノシチド存在下でプロテインキナーゼＢβをリン酸化及び活性化することが可能な分画がステップ（ｅ）から選ばれる。ステップ（ｅ）と（ｆ）は、プロテインキナーゼＢβをリン酸化及び活性化することが可能な３−ホスフォイノシチド依存性キナーゼの実質的に純粋な調整物が得られるまで、繰り返されても良い。適切には、この分画ステップは、イオンクロマトグラフィー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿、ヘパリンクロマトグラフィーの何れか、又はその他のあらゆる分画手段を含む。好ましくは、この方法のステップは実質的に実施例１に記載されるようなものである。
【００７６】
都合良くは、この組織は骨格筋である。その組織はヒトを含むあらゆる哺乳類由来で良い。
【００７７】
本発明の更なる側面は、ここに公開された方法によって入手可能な、プロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化する３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ、又はその変体、断片、派生物、又は融合体、又は前記変体、断片、又は派生物の融合体を提供するものである。
【００７８】
本発明のその他の側面は、この発明に係るホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼに対して反応する抗体を提供するものである。
【００７９】
本発明に係る前記ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼに対して反応する抗体は、技術的に良く知られた方法によって作られても良い。特に、その抗体はポリクローナルあるいはモノクローナルのいずれでも良い。
【００８０】
前記プロテインキナーゼに対して反応的な適切なモノクローナル抗体は、例えば“モノクローナル抗体：技術マニュアル”ＨＺｏｌａ（ＣＲＣＰｒｅｓｓ、１９８８）（非特許文献７３）及び“モノクローナルハイブリドーマ抗体：技術と応用”、ＳＧＲ  Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８２）（非特許文献４５）に公開されるそれらの技術によって調整されても良い。
【００８１】
好ましい実施例において、その抗体は、ＡＮＳＦＶＧＴＡＱＹＶＳＰＥＬＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ４）、ＡＧＮＥＹＬＩＦＱＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ５），またはＬＤＨＰＦＦＶＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ６）ペプチド配列の何れか一つを使って製造される。もし抗ペプチド抗体が作られるならば好ましい。例えばＲＱＲＹＱＳＨＰＤＡＡＶＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ７）及びＬＳＰＥＳＫＱＡＲＡＮＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ８）のようなその他のペプチドが、抗体を作るために使われても良い。
【００８２】
そのたんぱく質の機能、生体内での特異的な抗体の生産が実質的に変わらない状態を維持しているならば、そのたんぱく質が合成される後あるいは前にアミノ酸残基のひとつ又はそれ以上が化学的に修飾されているたんぱく質が使われても良い。そのような修飾は、酸塩基特に生理学的に受け入れられる有機的あるいは無機的な酸と塩基で塩を形成、末端カルボキシル基のエステルあるいはアミド形成、及びＮ‐ｔ‐ブトキシカルボニルのようなアミノ酸保護基の付着を含んでいる。その様な修飾はペプチドを生体内の代謝から保護するかもしれない。そのペプチドは単一複写物あるいは多重複写物として現れる、例えばタンデムリピートである。その様なタンデムあるいは多重リピートは、運搬体の使用を避けるためにそれら自身十分に抗原的である。ペプチドがＮ末端とＣ末端とを結合させてループとして形成されること、又は抗原性を増加させるため及び／又はジスルフィルド結合を形成させることを可能とするために一つまたはそれ以上のシステイン残基をある末端に付加することは有利かもしれない。もし、好ましくはポリペプチドであるそのペプチドが、運搬体に共有的に結合されているならば、その配置は好ましくは本発明に係るペプチドはループを形成するようなものである。
【００８３】
現在の免疫学理論によれば、免疫系を刺激する又は刺激を強化するために、あらゆる免疫遺伝的な定式化において運搬体機能は明らかであるべきである。最善の運搬体はＴ細胞抗原決定基を具体化している（又は、抗原とともに、作り出す）と考えられている。このペプチドは、例えば架橋反応によって、血清アルブミン、ミオグロビン、バクテリアトキソイド及びキーホールツタノハガイヘモシアニンのような分離運搬体に結合しているかもしれない。もっと最近に開発された免疫応答においてＴ細胞援助(T-cell help)を誘導する運搬体は、Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−ＣｙｓのようなＴ細胞抗原決定基（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ９）と推測されるへパティティス−Ｂコア抗原（しかもヌクレオキャプシッドたんぱく質と呼ばれている）を含み、ベータガラクトシダーゼ及びインターロイキン−１の１６３−１７１ペプチドを含む。後者の物質は広くは運搬体又は免疫増強剤又はその両方と考えられても構わない。その他には、本発明に係るものと同じ又は異なるペプチドのいくつかの複写物は互いに架橋されていても良い。この意味においては、そのような分離運搬体は存在しない、しかしそのような架橋によって運搬体機能は提供されるかもしれない。例えば、グルタルアルデヒド、カルボジイミド及びスクシンイミジル４−（Ｎ‐マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレイト、この後者の試薬はシステイン残基（もし存在するならば）Ｃ末端上の−ＳＨ基を利用している、適切な架橋試薬は、シグマやピアースのカタログなどにおいて記載される試薬を含む。
【００８４】
もしこのペプチドが適切な宿主において適切なヌクレオチド配列の発現によって調整できるのならば、運搬体として振舞うペプチド配列との融合産物としてこのペプチドを発現することは有利かもしれない。Ｋａｂｉｇｅｎの“Ｅｃｏｓｅｃ”システムはそのような装置の一例である。本発明に係るペプチドは２重効果を提供するためにその他の抗原に結合されていても良い。
【００８５】
ペプチドは、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ（１９８１）Ｊ．ＯＲＧ．Ｃｈｅｍ．４６，３４３３（非特許文献６４）及びここでの参照によって公開されるような固相ペプチド合成のＦｍｏｃ‐ポリイミド方式によって合成されても良い。一時的Ｎ−アミノ基保護は９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基によって行われている。この高度に塩基不安定な保護基の繰り返し開裂は２０％ピペリジンのＮ−Ｎジメチルホルムアミド溶液を使いながら実行される。側鎖機能は、（セリン、トレオニン及びチロシンの場合）ブチルエーテルとして、（グルタミン酸とアスパラギン酸の場合）ブチルエステルとして、（リジンとヒスチジンの場合）ブチルオキシカルボニル派生物として、（システインの場合）トリチル派生物として、そして（アルギニン場合）４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル派生物として保護されても良い。Ｃ末端がグルタミン又はアスパラギンであるところでは、側鎖アミド機能の保護のために４、４‘−ジメトキシベンジドリル基が使われる。この固相支持体は、ジメチルアクアクリルアミド（主鎖モノマー）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋物）及びアクリロイルサルコシンメチルエステル（機能化試薬）の３つのモノマーから構成されるポリジメチル−アクリルアミドポリマー上に配置される。このペプチドと樹脂の開裂可能に結合されている使用試薬は酸不安定４‐ヒドロキシメチル−フェノキシ酢酸派生物である。全てのアミノ酸派生物は、それらの前もって形成された対称無水派生物として加えられる、アスパラギンとグルタミンは例外であり、逆転Ｎ、Ｎ−ジシクロヘキシル−カルボジイミド／１−ヒドロキシトリアゾール処理結合手法を使って加えられる。全ての結合及び脱保護反応は、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸またはイソチン試験法を使って観測される。合成の完成において、５０％の除去剤を含んだ９５％トリフロロ作酸で処理することによって側鎖保護基を付随的に除去し、ペプチドは樹脂支持体から開裂される。除去剤は一般にエタノジトイル、フェノール、アニソール及び水が使われるが、正確な選択は合成されているそのペプチドの成分アミノ酸に依存している。トリフロロ酢酸を真空エバポレーションで取り除き、その粉末とジエチルエーテルで未精製ペプチドを産生する。あらゆる存在する除去剤は簡単な抽出法で取り除かれ、その方法は水層の凍結乾燥で除去剤の無い未精製ペプチドを産生する。ペプチド合成の試薬は一般にＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＵＫ）Ｌｔｄ、ＮｏｔｔｉｎｇｈａｍＮＧ７２ＱＪ、ＵＫから利用可能である。精製は、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーそして（原理的には）逆相高性能液体クロマトグラフィーのどれか一つまたはその組み合わせによって実行される。ペプチドの分析は、薄相クロマトグラフィー、逆相高性能液体クロマトグラフィー、酸加水分解後アミノ酸分析及び高速原子分裂（ＦＡＢ）質量分析を使って行っても良い。
【００８６】
本発明の更なる側面は、プロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化する３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性を制御する物質を同定する方法であって、この方法は、前記物質を前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ、又はその変体、断片、派生物、又は融合体、又はその変体、断片、派生物の融合体に接触させること、前記物質の存在下での、プロテインキナーゼＢのリン酸化及び活性化、又は３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの適切な基質のリン酸化が、前記物質の不存在下で前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ、又は前記変体、断片、派生物、又は融合体、又はその変体、断片、派生物の融合体の活性と比べて、変化するかどうかを決定することを含んでいる。
我々は、本発明の前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼがプロテインキナーゼＢαだけでなくプロテインキナーゼＢβやプロテインキナーゼＢγ等の他の形状のプロテインキナーゼＢをもリン酸化できると信じている。我々は、ＰＫＤ１がＰＫＢα、ＰＫＢβ及びＰＫＢγをリン酸化することが出来ることを示した。このように、この方法及び以下に記す方法においてこのプロテインキナーゼＢは、プロテインキナーゼＢα、プロテインキナーゼＢβ及びプロテインキナーゼＢγのいずれであっても良い。例えばｐ７０ Ｓ６のような、３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの他の基質が本発明にかかる分析方法において使われても良い。ＰＨ領域を含んでいるＰＫＢＰが基質として使われるときＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３のような適切なリン脂質がそのスクリーン中に概して存在するが、しかし例えばｐ７０ Ｓ６キナーゼ又はＰＨ領域を含んでいないＰＫＢが基質として使われるとき３−ホスフォイノシチドがそのような状況に存在していることは必要ではない。ｐ７０ Ｓ６キナーゼのリン酸化はＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３不存在下において起こる。
【００８７】
適切なプロテインキナーゼＢ又は他の適切な基質の存在下において、この方法は３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ、又は前記変体、断片、派生物、又は融合体、又はその変体、断片、派生物の融合体試験管内において実行されうると評価されるだろう。例えばホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼとＰＫＢ又は他の適切な基質との間の相互作用を減少又は強化する物質を検出するための２−ハイブリッドシステムを使いながら、それは生体内においても実行されても良いと評価されるかもしれない。
【００８８】
ひとつの実施例において、その物質は３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性を減少させる。
他の実施例において、その物質は３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性を高める。好ましくは、その物質は３−ホスフォイノシチドと競合する。好ましくは、その物質はホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェイト、又はホスファチジルイノシトール３，４−ビスホスフェイトによって実質的に活性を減少する。好ましくは、その物質はホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェイト、又はホスファチジルイノシトール３，４−ビスホスフェイトによって実質的に活性を高める。プロテインキナーゼＢがその分析中に存在するとき、この方法が、前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ又はプロテインキナーゼＢの何れかに結合及びその活性に影響を与える物質を同定するために使われ得ることが理解されるであろう。
【００８９】
本発明の更なる側面は、プロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化する３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼに対する３−ホスフォイノシチドの効果を模倣した物質を同定する方法を提供するものであり、この方法は、それがプロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化し又はあらゆる適当な基質をリン酸化できるように、前記物質が前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ、又は適当なその変体、断片、派生物、又は融合体、又はその変体、断片、派生物の融合体を活性化できるかどうかを決定することを含んでいるが、ただし前記物質による活性化は３−ホスフォイノシチドの不存在下においてである。
【００９０】
プロテインキナーゼＢの活性はあらゆる適切な基質を使って測定され得る；例えば、ペプチドＲＰＲＡＡＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １）好ましい基質であるが、ミエリン塩基たんぱく質及びあるヒストンもまたＰＫＢの基質である。
【００９１】
好ましくは、３−ホスフォイノシチドは、ホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェイト、又はホスファチジルイノシトール３，４−ビスホスフェイトである。
【００９２】
我々は、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３又は適切な３−ホスフォイノシチドはＰＤＫ１がＰＫＢαのＴｈｒ３０８をリン酸化しこのプロテインキナーゼを活性化するためにＰＫＢのＰＨ領域と相互作用すると信じている。我々の情報では、ＰＨ領域を持たないＰＫＢ分子はＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３に依存せず活性化及びリン酸化された。薬品（本発明に係るキナーゼ例えばＰＤＫ１及びＰＫＢ間の相互作用を妨害する）が働くらしい機構はいくつかある。一つの機構において、ＰＫＢに結合しそしてＰＫＢが本発明に係るキナーゼ例えばＰＤＫ１によって活性化されることを阻害するかもしれない。もう一つ別の機構では、その薬品は本発明に係るキナーゼ（ＰＤＫ１のような）に結合しそしてＰＤＫ１の活性を阻害するかもしれない。さらに別の機構では、その薬品はＰＤＫ１に結合しそしてそれがＰＫＢを活性化することを阻害するのかもしれない。もし本発明に係るスクリーニング試験が完全長ＰＫＢ分子（例えばＧＳＴ‐ＰＫＢ融合体）又は完全長ではないが実質的にＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３のような適切なリン脂質に結合することができるＰＨ領域を維持している分子と、そのＰＫＢが実質的にＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３のような適切なリン脂質に結合することができないようにＰＨ領域が修飾されてしまっているＰＫＢと、の両方を使って実行されるならば好ましい。適切な修飾にはＰＨ領域の全部又は部分的な欠損又は実質的に適切なリン脂質の結合を阻害するＰＨ領域における突然変異を含む。ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３がＰＫＢと相互作用することを阻害する物質はスクリーンにおいて検出され、特に選択されている。
【００９３】
その代りに、本発明に係るスクリーニング分析において機能性ＰＨ領域を欠いたＰＫＢを使うことは有用かもしれない、この場合、ＰＤＫ１がＰＫＢを活性化するために３−ホスフォイノシチド無しで使われる必要がある。
【００９４】
本発明に係るさらに別の側面は、ここに公開されるスクリーニング法によって同定可能な物質を提供するものである。
【００９５】
この方法は、前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ又はその３−ホスフォイノシチドと又はプロテインキナーゼＢとの相互作用を調節する物質に対するスクリーニング分析である。
【００９６】
このようにして、本発明に係るスクリーニング方法は、３−ホスフォイノシチド（特に３−ホスフォイノシチドはホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェイト、又はホスファチジルイノシトール３，４−ビスホスフェイト）と競合する及び前記の不活性化又は活性化、又はその酵素活性の他の調節を導く物質を同定するための方法を含む；しかもそれらは、３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼに結合し、且つプロテインキナーゼＢ又はその他の適切の基質（例えば、前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼに結合しそしてそれがプロテインキナーゼＢと相互作用することを阻害するような）の活性化を減少又は強化する物質についてスクリーニングする方法を含む；しかもそれらは、プロテインキナーゼＢに結合し、且つその前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼとの相互作用を減少あるいは強化する物質についてのスクリーニング法を含む。本発明に係るスクリーニング法は、ＰＫＢと本発明に係るプロテインキナーゼ（例えば、ＰＤＫ１）の触媒部位をブロックする物質を同定するための方法を含む。この種のスクリーニング分析を実行するための方法はこの技術分野において良く知られている。
【００９７】
前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼが要求され、且つ特異な基質のリン酸化が３−ホスフォイノシチドの存在を要求するそのような分析において、３−ホスフォイノシチドが存在していることが理解されるであろう。あらゆる適切な３−ホスフォイノシチドは有用であるが、しかし３−ホスフォイノシチドがホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェイト、又はホスファチジルイノシトール３，４−ビスホスフェイトであればより好ましい。しかしながら、前述から明らかなように、いくつかの分析システムはＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３のような３−ホスフォイノシチドの存在を要求しない。
【００９８】
この方法において同定された物質はそれ自身薬品として有用であり、又それらは３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性化又はその３−ホスフォイノシチド又はプロテインキナーゼＢとの相互作用を調節するより効果のある物質の設計を合成のための先行物質を表しているかもしれない。
【００９９】
このように、本発明に係る別の側面は、前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性化又はその３−ホスフォイノシチド又はプロテインキナーゼＢとの相互作用を調節することを含む方法を提供するものであり、この方法は上記のスクリーニング分析において同定可能な物質を細胞中に導入することを含む方法を提供する。好ましくは、その細胞はヒト患者のものである。
【０１００】
好ましくは、ホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェイト、又はホスファチジルイノシトール３，４−ビスホスフェイトである３−ホスフォイノシチドの効果を模倣した、このスクリーニング法において同定可能な物質は、糖尿治療に有用であると考えられている。ＰＫＢ、ＰＤＫ１又はＰＫＢのＰＤＫ１による活性化を阻害する、本発明に係るこのスクリーニング法において同定可能な物質は、ガン治療に有用であると考えられている。ＰＫＢは白血病に関連するｖ‐ａｋｔの細胞相同体である。ＰＫＢの２つのイソ体は卵巣ガン、膵臓ガン及び乳ガンにおいてか上に発現されている。ＰＫＢは、例えばＩＧＦ−１によって引き起こされるアポトーシスへの細胞の防御を仲介すると考えられている。ＰＫＢの過剰発現は、アポトーシスを停止することによってガン細胞が増殖することを可能にしているかもしれない。
【０１０１】
このスクリーニングに法において見つけられたある物質は有益な方法において細胞増殖を強化することができるかもしれないし、そして例えば神経の再生又は創傷治癒において有用かもしれない。
【０１０２】
本発明に係る更なる側面は、前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ又はその３−ホスフォイノシチドと又はプロテインキナーゼＢとの相互作用を調節する物質に対するスクリーニング分析において、前記プロテインキナーゼの活性と、特にその３−ホスフォイノシチド又はプロテインキナーゼＢとの相互作用を制御する物質のスクリーニング分析において、３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ、又はその変体、断片、派生物、又は融合体、又はその変体、断片、派生物の融合体の使用を提供するものである。この発明は、プロテインキナーゼＢをリン酸化及び活性化するためにＰＤＫ１のような３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼの使用を含み、さらにそれはＰＤＫ１のような３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼを使いながらＰＫＢを活性化する方法を含む。
本発明に係る更なる側面は、スクリーニング分析を行うのに有用な装備一式を提供する。簡易的には、その装置一式は前記３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ、又は適切なその変体、断片、派生物、又は融合体、又はその変体、断片、派生物の融合体（又はこれらの全てをコードするポリヌクレオチド）及びプロテインキナーゼＢ、又は適切なその変体、断片、派生物、又は融合体、又はその変体、断片、派生物の融合体（又はこれらの全てをコードするポリヌクレオチドを含む。加えて、使用されるスクリーニングに依存して、プロテインキナーゼＢに対する適切な３−ホスフォイノシチド又は適切な基質を含んでも良い。
【０１０３】
短縮形：  ＰＫＢ，プロテインキナーゼＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｂ）；ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３，ホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェイト（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２，ホスファチジルイノシトール３，４−ビスホスフェイト（Ｐｈｏｓｕｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３，４−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；ＰＩ３−ｋｉｎａｓｅ，３−ホスフォイノシチド（Ｐｈｏｓｐｈａｉｎｏｓｉｔｉｄｅ３−ｋｉｎａｓｅ）
；ＰｔｄＣｈｏ，ホスファチジルコリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）；ＰｔｄＳｅｒ，ホスファチジルセリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）；ＰＨ，プレクストリン相同体（ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）。
【実施例１】
【０１０４】
プロテインキナーゼＢαをリン酸化及び活性化する３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ（ＰＤＫ１）の精製及び特性分析
【０１０５】
要約
背景：
ｃ−Ａｋｔとしても知られるプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）は、細胞がインスリン及び成長因子で刺激されると、急激に活性化され、そして、この酵素における現在の関心の多くは、この酵素がホスフォイノシチド  ３−キナーゼの下流にあるという報告から生じている。最近、私たちは、インスリン又はＩＧＦ１が、Ｔｈｒ３０８及びＳｅｒ４７３におけるＰＫＢのリン酸化を引き起こすことを示した。両残基のリン酸化は、ＰＫＢを最大限に活性化するために必要とされ、両残基のインスリン又はＩＧＦ１誘導リン酸化は、ＰＩ−３キナーゼの阻害因子を用いて細胞を培養することによって、阻害される。
【０１０６】
結果：
プロテインキナーゼは、Ｔｈｒ３０８のプロテインキナーゼＢα（ＰＫＢα）をリン酸化し、そのプロテインキナーゼの活性化を３０倍より大きく増加させる、ウサギ骨格筋抽出物から５００，０００倍で精製されてきた。そのキナーゼは、ホスファチジルイノシトール３，４、５−トリホスフェイト［ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３］あるいはホスファチジルイノシトール３，４−ビスホスフェイト［ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２］の低マイクロモル濃度での存在下でのみ、活性化し、それゆえ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３−依存性プロテインキナーゼ−１（ＰＤＫ１）といわれてきた。ｓｎ−１−ステアロイル−２−アラキドニル  ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３及びｓｎ−２−アラキドニル３−ステアロイル  ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３のＤ体光学異性体は、ＰＤＫ１を強力に活性化したが、これらの誘導体のＬ光学異性体はほとんど作用しなかった。ｓｎ−１，２−ディパルミトイル  ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３とｓｎ−１，２−ディパルミトイル  ＰｔｄＩｎｓ（３，４，）Ｐ２では、ＰＤＫ１は同程度まで活性化されたが、ｓｎ−１−ステアロイル−２−アラキドニル及びｓｎ−２−アラキドニル３−ステアロイルの誘導体でよりも、３倍弱の効果しかなかった。ＰｔｄＩｎｓ（３，５）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐそしてイノシトール１，３，４，５−テトラキスホスフェイトでは、全くＰＤＫ１は活性化されなかった。テストされたイノシトールリン脂質のいずれも、ＰＫＢαを活性化、あるいは阻害せず、あるいは、同じ状態下では、そのリン酸化を誘導しなかった。ＰＤＫ１の活性化は、ＰＤＫ１がＰＩ３−キナーゼの同系族ではないであろうと示しており、ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎによって影響を受けなかった。
【０１０７】
結論：
ＰＤＫ１は、インスリンと成長因子によるＰＫＢの活性化を仲介するプロテインキナーゼの一つのようである。したがって、ＰＤＫ１は、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３及び／又はＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２の第２伝達物質の作用のほとんどを仲介する重要な役割を担っているかもしれない。
【０１０８】
材料と方法
材料：
ＰｔｄＳｅｒ（ブタの脳）は、ドーサン  セーダリー（Ｄｏｏｓａｎ  Ｓｅｒｄａｒｙ）  調査研究所（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）から入手され、ｓｎ−１−ステアロイル２−アラキドニル  ＰｔｄＣｈｏは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）から入手された。記述したように、ＰｔｄＩｎｓ  ４ＰとＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２は、ウシの脳（シグマ）（非特許文献２６）のフォルコ分画タイプ１抽出物から精製された。ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３，５）Ｐ２、そしてＰｔｄＩｎｓ３Ｐの合成物質ｓｎ−１，２−ディパルミトイル類似体は、記述したように精製された（非特許文献１８）。ｓｎ−１−ステアロイル−２−アラキドニル  ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３、ｓｎ−２−アラキドニル３−ステアロイル  ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３、そしてｓｎ−１−リノレオイル−２−リノレオイル  ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の合成物質Ｄ及びＬ光学異性体は、イノシトールから合成された（Ｇａｆｆｎｅｙ  ａｎｄ  Ｒｅｅｃｅ  １９９７、公開された報告書）。全リン脂質は、９７−９８％の純度がある。合成物質ホスファチジルイノシトール  ビスホスフェイトは、ジメチル  スルフォキシド（ＤＭＳＯ）中に、溶液として−２０℃で保存され、ホスファチジルイノシトール  トリホスフェイトは、ＤＭＳＯあるいは水中に保存された。他、全てのリン脂質は、クロロホルム−メタノール溶媒に、保存された。ＰＫＢαを分析するために使用されるペプチドは、ＲＰＲＡＡＴＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１）（非特許文献１６）とＴＴＹＡＤＦＩＡＳＧＲＴＧＲＲＮＡＩＨＤ（（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  １０）ＰＫＩといわれる、サイクリックＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの特異ペプチド阻害因子）とが、Ｍｒ  Ｆ．Ｂａｒｒｙ  Ｃａｕｄｗｅｌｌ（ＭＲＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ，Ｄｕｎｄｅｅ）により、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ  ペプチド合成装置で、合成された物質である。そして、それらの濃縮液は、定量アミノ酸分析によって測定される。グルタチオン  セファロースは、ファルマシア（Ｍｉｌｔｏｎ，ＵＫ）から入手され、そして、アルキル化トリプシンは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ）から入手された。
【０１０９】
緩衝溶液：
緩衝溶液Ａ；５０ｍＭ  トリス／ＨＣ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１容量％  トリトン  Ｘ−１００、１ｍＭ  ナトリウム  オルトバナデイト、１０ｍＭ  ナトリウム  β−グリセロホスフェイト、５０ｍＭ  ＮａＦ、５ｍＭ  ナトリウム  ピロリン酸、１μＭ  Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ（ミクロシスチン）−ＬＲ、０．２７Ｍ  蔗糖、１ｍＭ  ベンズアミジン（ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ）、０．２ｍＭ  フェニルメチルスルフォニルフロライド（ＰＭＳＦ）、１０μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、０．容量％ ２−メルカプトエタノール。
【０１１０】
緩衝溶液Ｂ；５０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．０３容量％ Ｂｒｉｊ−３５、０．２７Ｍ  セルロース、０．１容量％ ２−メルカプトエタノール。
【０１１１】
緩衝溶液Ｃ；５０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＦ、０．１容量％ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ベンズアミジン。
２９３細胞でのＧＳＴ−ＰＫＢαの発現。  ＰＫＢαをコードしているＤＮＡ配列は、ＥＦ１αプロモーター下で真核細胞においてＧＳＴ融合体タンパク質を過剰発現するために使用されてきた、真核細胞発現ベクターＰＥＢＧ２Ｔ内で、サブクローン化された（非特許文献２７）。ＰＣＲ反応は、ヒトＰＣＭＶ５−ＨＡ−ＰＫＢαプラスミドを使って、完全長ｃＤＮＡを生成するために行われた。その完全長ｃＤＮＡは、ＰＥＢＧ２ＴベクターのＧＳＴ配列及びＰＫＢαのＡＴＧ開始コドンでフレームにあるｃＤＮＡの５’末端にあるＢａｍＨ１部位そして３’末端にあるＫｐｎＩ部位を有するＰＫＢα遺伝子をコードしている（非特許文献１５）。ＢａｍＨ１／ＫｐｎＩ  ｃＤＮＡ断片のＤＮＡ配列は確認されてから、ｐＥＢＧ  ２Ｔ発現ベクターの特殊なＢａｍＨ１／ＫｐｎＩ制限部位内でサブクローン化された。ＧＳＴ−ＰＫＢαを用意するために、ヒト胚腎臓２９３細胞の４０枚の，１０ｃｍ径ディッシュを継代した。そして、各ディッシュは、記述したような、２９３細胞でヘマグルチニン標識されたＰＫＢαを過剰発現のために改良されたリン酸カルシウム法を使って、２０μｇのＧＳＴ−ＰＫＢα発現構成物を移入された（非特許文献１５）。移入の２４時間後、細胞は１６時間、無血清であったが、細胞の各ディッシュは、１ｍｌの氷冷緩衝溶液Ａ内に置かれた。４０枚分の溶菌液が溜められ、１３，０００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離された。そして、その上清は、緩衝溶液Ａで事前に平衡化された８００μｌのグルタチオン−セファロースで、回転試料台上において、６０分間、培養された。懸濁液は３０００ｘｇで１分間、遠心分離され、ビーズは０．５ＭのＮａＣｌを含む１０ｍｌの緩衝溶液Ａで３回洗浄され、そしてそれから、ＰＤＫ１によってＧＳＴ−ＰＫＢαの活性化を妨げる全てのトリトンＸ−１００を確実に全て取り除くためにさらに１０ｍｌの緩衝溶液Ｂで１０回洗浄された（図３Ｂ）。ＧＳＴ−ＰＫＢαは、周囲の温度で樹脂から溶出された。混合溶出物は分割され、液体窒素中で急速凍結され、そして−８０℃で保存された。
【０１１２】
リン脂質小胞の調整
１ｍＭ  ＰｔｄＣｈｏ、１ｍＭ  ＰｔｄＳｅｒ、そして０．１ｍＭ  ＰｔｄＩｎｓ脂質を含んでいるリン脂質小胞が、調整され、真空下でフィルムに乾燥され、そして１０ｍＭのｐＨ７．３ヘペス中でかき混ぜて再懸濁された。小さな単一ラメラ小胞の透明懸濁液が入手されると、複数ラメラと大きな単一ラメラ小胞の濁った溶液が、２０分間、浴槽音波処理された。溶液は、分析で必要とされるよりも１０倍高い濃縮状態で、４℃で保存され、そして２日から４日で使用された。
【０１１３】
ウサギ骨格筋からのＰＫＤ１の精製
第１日。  ニュージーランドホワイトラビットのメスは、ナトリウムペントバルビトンの致死量で殺された。後ろ手足と背中の骨格筋（５００ｇ）は、迅速に切り取られ、氷上に移された。全行程は、０−４℃で行われた。筋肉は細かく刻まれ、２５ｍＭ  トリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．５、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＦ、０．１％（容量に関して）２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、そして１ｍＭ  ベンズアミジンの２．５倍量中で相同化され、そして４２００ｘｇで３０分間円心分離された。上清はガラスウールでろ過され、緩衝溶液Ｃで平衡化された１０ｇのＱＡＥセファデックスを含むビュフナー漏斗を通して注がれた。カラムは５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１リットルの緩衝溶液Ｃで洗浄され、そしてＰＤＫ１を溶出するために、０．２ＭのＮａＣｌを含む７００ｍｌの緩衝溶液Ｃで洗浄された。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の５０％（質量に関して）溶液は、ＰＥＧの４％最終濃縮液を生成するために、溶出液に加えられた。６０分間、氷上でかき混ぜると、その懸濁液は、１０，０００ｘｇで１５分間、遠心分離された。その上清をデカントし、さらに５０％（質量に関して）ＰＥＧの追加によって、ＰＥＧ中で１５％（濃度）にされた。さらに、氷上で６０分間、かき混ぜると、その懸濁液は再び、１０，０００ｘｇで１５分間、遠心分離された。その上清はデカントされ、そして、その沈殿物は、５０ｍｌの氷冷緩衝溶液に溶解され、０．２５μｍフィルターでろ過され、そしてそれから緩衝溶液Ｂで平衡化されたＳＰセファロースカラム（１１×１．６ｃｍ）上で、クロマトグラフされた。そのカラムは、流速３ｍｌ／ｍｉｎで、０．５ＭまでのＮａＣｌの３００ｍｌ線形勾配で展開され、その６ｍｌの分画が収集された（図２Ａ）。その活性化分画は貯留され、そして０．１ＭのＮａＣｌを含む緩衝溶液Ｂで平衡化された５ｍｌのヘパリン−セファロースカラム（ＨｉＴｒａｐ）に直接加えられた。そのカラムは、流速２ｍｌ／ｍｉｎで、０．１ＭまでのＮａＣｌの９０ｍｌ線形塩勾配溶液で、展開され、１ｍｌの分画が収集された。ＰＤＫ１活性化は２つのピークとして溶出した。活性化の〜３０％を含むピーク１は０．５ＭのＮａＣｌで溶出され、一方、活性化の〜７０％を含むピーク２は０．７ＭのＮａＣｌで溶出された（図２Ｂ）。
【０１１４】
第２日。  ピーク２の活性分画は、限外ろ過によって、０．２ｍｌに濃縮されて貯留され、緩衝溶液Ｂで２．０ｍｌまで希釈され、そして緩衝溶液Ｂで平衡化されたＭｏｎｏＳカラム（５ｃｍ×１．６ｍｍ）に装填された。そのカラムは、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎで、４．０ｍｌ線形塩勾配にしたがって、０．１５ＭのＭｇＣｌ２まで発現され、０．１ｍｌ分画は収集された。ＰＫＤ１を含む分画は分割され、液体窒素中で急速凍結され、そして−８０℃で保存された。解凍によって、活性化の重大な低下は起こらなかった。
【０１１５】
ＰＤＫ１の分析。  その分析は２段階で行われた；第１に、ＧＳＴ−ＰＫＢαは、ＧＳＴ−ＰＫＢαの活性化を許すＭｇＡＴＰとリン脂質小胞の存在下においてＰＫＤ１と培養された。第２段階で、溶液はトリトンＸ１００において、Ｍｇ［γ３２Ｐ］ＡＴＰ及び特異的ＰＫＢα基質ペプチドＲＰＲＴＡＡＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１）とともに、０．５容量％ 生成された（非特許文献１６）（トリトンＸ１００は、ＧＳＴ−ＰＫＢαの活性化に影響することなく、ＧＳＴ−ＰＫＢαのリン酸化及び活性化を完全に阻害する。図３Ｂ参照）。
【０１１６】
第１段階で、１８μｌ反応混合物は、５０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１容量％ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２．５μＭ  ＰＫＩ、１μＭ  ミクロシステイン−ＬＲ、１０ｍＭ  Ｍｇ（Ａｃ）２、１００μＭ  未標識ＡＴＰ、０．６μＭ  ＧＳＴ−ＰＫＢα、１００μＭ  ＰｔｄＳｅｒ、１００μＭ  ＰｔｄＣｈｏを含んで、１０μＭ  ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の存在あるいは不在下で、引き起こされた。その分析は、２μｌのＰＤＫ１を加えることによって開始され、そして３０℃での３０分間の培養後、分析の第２段階は、５０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１容量％ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２．５μＭ  ＰＫＩ、１μＭ  ミクロシステイン−ＬＲ、１０ｍＭ  Ｍｇ（Ａｃ）２、１００μＭ  ［γ３２］ＡＴＰ（２００−４００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、１００μＭ  ペプチド  ＲＰＲＴＡＡＦ、そして１．２５容量％トリトンＸ−１００を含む、３０μｌの混合物を加えることによって開始された。３０℃で１０分後、その反応は、ｐ８１ホスフォセルロースペーパー上に反応混合物を点状に置くことによって終結された。そのペーパーは、リン酸で洗浄され、記述したように分析された（非特許文献２８）。ＧＳＴ−ＰＫＢαを除外する制御反応は、ブランクとしてみなされ、その活性化の５％より少ない活性化は、いつもＧＳＴ−ＰＫＢαの存在下で測定された。その基礎ＧＳＴ−ＰＫＢα活性化は、ＰＤＫ１の存在下で測定される活性化である。ＰＤＫ１活性化の１単位は、活性化の１単位によってＧＳＴ−ＰＫＢαの基礎活性化を増加するために必要とされる量として定義された。ＧＳＴ−ＰＫＢα活性化の１単位は、１分で１ｎｍｏｌのペプチドＰＲＰＴＡＡＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１）のリン酸化を触媒するために必要とされる酵素の量であった。その分析は、その分析におけるＰＤＫ１活性化の２Ｕ／ｍｌの最終濃縮に至る時間の線形であった。
【０１１７】
ＰＤＫ１によるＧＳＴ−ＰＫＢαのリン酸化。  その培養は、［γ３２Ｐ］ＡＴＰ（２００−４００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）が未標識ＡＴＰの代わりに使用されたことを除いて、上述した第１段階と同等であった。その反応はＳＤＳにおいて１容量％溶液を生成することによって終結させられた。その試料は、７．５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で適用され、クマシーブルーでの染色後、そのゲルはオートラジオグラフされた。ＧＳＴ−ＰＫＢαに対応するクマシーブルー染色帯は削除され、各帯に関係する３２Ｐ放射活性が定量化された。
【０１１８】
ＰＤＫ１によってリン酸化されたＧＳＴ−ＰＫＢαのマッピング部位。  ＧＳＴ−ＰＫＢαは、反応スケールが１０倍に増加され、［γ３２Ｐ］ＡＴＰの特異活性が１５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌまで増加されることを除いて、ｓｎ−１−ステアロイル−２−アラキドニル  ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３のＤ体光学異性体の存在下でリン酸化された。その反応は、１％（質量に関して）及び１％（容量に関して）の最終濃縮のためにＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールを加えることによって停止され、そして９５℃で５分間、加熱された。周囲の温度まで下がると、４−ビニルピリジンは２．５％（容量対容量）濃縮液に加えられ、その試料はアルキル化システイン残基のため３０℃で１時間、攪拌試料台に残された。それからその試料は、７．５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動され、３２Ｐ標識ＧＳＴ−ＰＫＢαはゲルから抽出され、記述したようにトリプシンで消化された（非特許文献１５）。
【０１１９】
結果
２９３細胞からのＧＳＴ−ＰＫＢαの精製
ＰＫＢαは、Ｎ−末端において２９３細胞にグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現し、グルタチオンセファロースで精製された。標品はＧＳＴ−ＰＫＢαに対応する明白な分子量８５ｋＤａの主たるクマシーブルー染色タンパク質バンドを示した（図１）。ゲルの比重分析によって推定された純度は７０％を超え、２ｍｇの精製されたＧＳＴ−ＰＫＢαが、２９３細胞の４０、１０ｃｍディッシュで作られた各標品で一定に得られた。刺激されない２９３細胞からのＧＳＴ−ＰＫＢαは非常に低活性であったが、インシュリン、ＩＧＦ１による２９３細胞の刺激後は２０倍、４５倍にそれぞれ活性化されたので（データは示されていない）、これは、生体内でＰＫＢαを活性化する上流プロテインキナーゼによって認識されることを示す。刺激されない２９３細胞からのＧＳＴ−ＰＫＢαは従って、その上流活性化因子を同定するための基質として利用された。
【０１２０】
ＰＫＢαを活性化するＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３依存性プロテインキナーゼの同定
骨格筋細胞質中のＧＳＴ−ＰＫＢαの活性化因子を、０．２５Ｍ塩のＱＡＥ−セファデックスから溶出し、そのＱＡＥ−セファデックス溶出液からさらに３０，０００倍に精製して同定した（表１）。活性化因子は完全にＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３依存性活性であって、ＰＫＢαをリン酸化するので（以下参照）、以下、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３依存性プロテインキナーゼ１（ＰＤＫ１）という。
【０１２１】
ＰＤＫ１は粘性細胞質には検出できなかったが、ＱＡＥ−セファデックスでの最初のバッチ状クロマトグラフィーを通じて回収率５０％と仮定し、全体の精製は約５００，０００倍で、完全な精製は３６時間以内で完了できた。ＰＤＫ１はＳセファロースから単一のピークとして溶出されたが（図２Ａ）、ヘパリンセファロースで２種に分割された。小さい成分（ピーク１）は０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出し、大きな成分（ピーク２）は０．７Ｍ ＮａＣｌで溶出した（図２Ｂ）。さらなる実験の全てはその他の点で述べられない限り、ヘパリンセファロースからのピーク２の酵素をＭｏｎｏ Ｓ（図２Ｃ）でさらに精製されたものについて行われた。最終ステップの後、ピーク２の酵素は、ＰＫＢ活性が欠けていたのだが、明確な分子量８５、６７、４５ｋＤａの３つの主要なタンパク質染色バンドを示した。６７ｋＤａバンドのみがＭｇＡＴＰによる培養でリン酸化され、リン酸化はＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３存在下で非常に増大した。６７ｋＤａバンドからの２つのトリプシンペプチドの配列は、他のプロテインキナーゼの触媒領域の領域と高い相同性であった（データは示されていない）。データは、ＰＤＫ１は新規な６７ｋＤａのプロテインキナーゼを示しており、ＰＫＣεやＰＫＣζのようなＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３によって活性化されると報告されている他のプロテインキナーゼとは異なる。
【表６】
2005323611.tif 000005
【０１２２】
ＰＤＫ１によるＧＳＴ−ＰＫＢαのリン酸化と活性化
精製されたＰＤＫ１はＭｇＡＴＰと、ＰｔｄＣｈｏ、ＰｔｄＳｅｒ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を含有するリン脂質小胞存在下でＧＳＴ−ＰＫＢαを０．７ｍｏｌの３２Ｐ／ｍｏｌタンパク質のレベル近くまでリン酸化した（図３Ａ）。リン酸化は、３０倍を超えて増加し８０Ｕ／ｍｇの比活性に到達した活性化（図３Ａ）と平行していた。これはＴｈｒ３０８をアスパラギン酸に変異させることにより一部活性化されているＰＫＢαの活性に類似している（非特許文献１５，１６）。反応からのＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３、ＰＤＫ１またはＡＴＰのいずれかの除去は、ＧＳＴ−ＰＫＢαの活性化とリン酸化を停止した（図３Ｂ）。さらに、その分析への０．５％（容量）トリトンＸ１００の添加も５５℃で２分間のＰＤＫ１の培養と同様に、ＰＤＫ１によるＧＳＴ−ＰＫＢαの活性化とリン酸化を阻害した（図３Ｂ）。ＰｔｄＣｈｏ／ＰｔｄＳｅｒ小胞の非存在下では、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３のＰＤＫ１活性化は少なくとも１５倍少ない効果となった（図３Ｂ）。
【０１２３】
ＰＤＫ１をＰｔｄＣｈｏ、ＰｔｄＳｅｒ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を含有するリン脂質小胞とＭｇＡＴＰの存在下、３０℃で３０分間培養し、そしてＰＤＫ１を５５℃で２分間培養したところ、リン脂質小胞はさらにＰＤＫ１が添加されない限りＧＳＴ−ＰＫＢαを活性化もしくはリン酸化できなかった（データは示されない）。これらの観察結果は、ＰＤＫ１はＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３をＧＳＴ−ＰＫＢαの自己リン酸化と自己活性化を促進する他の生成物に転換させることによって、間接的にＧＳＴ−ＰＫＢαを活性化しないことを立証している。
【０１２４】
ＰＤＫ１のＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３濃度依存性
次に、ＰＤＫ１のＧＳＴ−ＰＫＢαに対する活性化能（図４Ａ）とリン酸化能（図４Ｂ）におけるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の濃度変化の効果を調査した。これらの実験は、ＰｔｄＣｈｏ、ＰｔｄＳｅｒの濃度をともに１００μＭに維持しつつ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の濃度を変化させるか、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３に対して１０倍過剰のＰｔｄＣｈｏ、ＰｔｄＳｅｒを維持するかのどちらかで行われた。どちらの条件下でも、半最大活性化またはリン酸化に要求されるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の濃度は１〜２μＭであって、１０μＭで最適効力だった。
【０１２５】
ＰＫＤ１はＰＫＢαのＴｈｒ３０８をリン酸化する
ＰＫＤ１によってリン酸化されたＰＫＢαの残基を同定するため、０．４〜０．６ｍｏｌ／ｍｏｌのＰＤＫ１でリン酸化され、３２Ｐ標識されたＧＳＴ−ＰＫＢαがトリプシンで消化され、Ｃ１８カラム（非特許文献１５）のクロマトグラフィーにかけられた。２６％アセトニトリルで溶出された１つの主要な３２Ｐ標識ペプチドが観察された（図５Ａ）。このペプチドは、Ｔｈｒ３０８（非特許文献１５）を含有する３２Ｐ標識トリプシンペプチドとともに溶出されたのであるが、ホスフォトレオニンのみを含むことが分かった（データは示されない）。このペプチドが固相配列読み取りされる時、放射性３２ＰはＴｈｒ３０８（非特許文献１５）に対応するエドマン分解の最初のサイクルで放出される（図５Ｂ）。重要なのは、２４％アセトニトリルで溶出する、Ｓｅｒ４７３を含有するトリプシンペプチドに対応する位置では、３２Ｐ標識ペプチドは全く溶出しなかったことである（図５Ａ、ｒｅｆ１５）。これらのデータは、ＰＤＫ１は試験管内ではＰＫＢαをＴｈｒ３０８のところのみでリン酸化すると立証している。
【０１２６】
ＰＫＤ１の脂質特異性
次に、ＰｔｄＣｈｏ／ＰｔｄＳｅｒを含有する小胞バックグラウンド存在下での、ＰＤＫ１を活性化するためのＰｔｄＩｎｓ派生物のパネルの能力を研究した。天然に存在するＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の有力な形体は圧倒的にｓｎ１ステアロイル，２アラキドニルＤホスファチジルイノシトール３，４，５トリホスフェイト（非特許文献１７）（天然ＰｔｄＩｎｓの構造と脂肪酸組成を基にして）らしい。合成ｓｎ１ステアロイル，２アラキドニルＤ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３（図６の脂質１）はＰＤＫ１活性を１３倍に活性し、非常に効果があるとわかった。対照的に、この脂質のＬ光学異性体はＰＤＫ１活性を１．７倍のみしか誘導しないが、これはＤ光学異性体による微量汚染のためと考えられる。ヘッド基（Ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）の光学異性立体配座はＰＤＫ１を活性化するための臨界的な重要性があるが、グリセロール部位のそれにはない。それゆえ、ｓｎ２アラキドニル，３ステアロイルＤ及びＬ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３はｓｎ１，２派生物（それぞれ１６、２．３倍）と区別できない信号をだす。ｓｎ１，２ジリノレオイルＤ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３（リノレン酸はＣ１８：２）はテストされた脂質では最も効果的でＧＳＴ−ＰＫＢα活性を３６倍増大させ、一方、ｓｎ１，２ジパルミトイルＤ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３（パルミチン酸はＣ１６：０）は５．５倍の活性しか起こさないという事実から、ジアシルグリセロール部位での不飽和脂肪酸の重要性が強力に示される。これらの各実験でＧＳＴ−ＰＫＢαのリン酸化（図６Ｂ）は活性化の程度（図６Ａ）と相関した。
【０１２７】
おもしろいことに、ｓｎ１，２ジパルミトイルＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２（図６、脂質７）とｓｎ１，２ジパルミトイルＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３（図６、脂質６）はＰＤＫ１を同程度に活性化し、両イノシトールリン脂質はＧＳＴ−ＰＫＢα活性を約６倍に増大した。しかし、ＰｔｄＩｎｓ（３，５）Ｐ２（図６、脂質８）、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２（図６、脂質９）、ＰｔｄＩｎｓ４Ｐ（図６、脂質１０）、ＰｔｄＩｎｓ３Ｐ（図６、脂質１１）とＩｎｓ（１，３，４，５）Ｐ４はＰＤＫ１を活性化しないか、ＧＳＴ−ＰＫＢαのリン酸化を誘導しなかった。ＰＤＫ１の非存在下では、テストされたＰｔｄＩｎｓ派生物はどれもＧＳＴ−ＰＫＢαの活性化またはリン酸化を誘導しなかった（図６）。
【０１２８】
考察
ＰＤＫ１の同定と精製はＰＫＢα（非特許文献１６）に対して特異なペプチド基質（ＲＰＲＡＡＴＦ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １）の開発によって、非常に促進された。ヒストンＨ２Ｂ、ミエリン塩基性タンパク質、クロスチド(Crosstide)のようなＰＫＢの分析に使用された他の基質は、細胞抽出液内で多くのプロテインキナーゼによってリン酸化されＰＤＫ１の検出を見えなくした。免疫沈殿されたＨＡ−ＰＫＢはＰＤＫ１によって効果的にリン酸化されなかったため、基質としての可溶性ＧＳＴ−ＰＫＢαの使用も同様に重要であった。ＰＤＫ１はＰＫＢαをＴｈｒ３０８でリン酸化し、その活性度が３０倍を超えるように増大することが分かった。生体内でのインスリンまたはＩＧＦ１誘導Ｔｈｒ３０８のリン酸化は、ＰｔｄＩｎｓ３キナーゼの阻害因子によって阻害され、ＰＤＫ１はＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３またはＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２を絶対必要要件とするので、ＰＤＫ１は生体内でＰＫＢαをＴｈｒ３０８のところでリン酸化する酵素らしい。ＰＤＫ１活性は２μＭまではワートマニン(wortmannin)の影響を受けないので（データは示さず）、これはＰｔｄＩｎｓ３キナーゼファミリーメンバーではないことを示している。
【０１２９】
試験管内でのＰＫＢαの完全な活性化はＴｈｒ３０８と同様にＳｅｒ４７３のリン酸化を必要とする（非特許文献１５）。ゆえに、Ｔｈｒ３０８またはＳｅｒ４７３のどちらかのアスパラギン酸への変異はＰＫＢαを約５倍刺激するが、もし両残基がアスパラギン酸に変異させられると活性は１８倍に増加する。同様に、Ｓｅｒ４７３のリン酸化はＰＫＢα活性を７倍に刺激するが、もしＳｅｒ４７３のリン酸化がＴｈｒ３０８のアスパラギン酸への変異と結びつくと活性は２５倍に増大する（非特許文献１５）。Ｔｈｒ３０８のリン酸化によって、またはこの残基のアスパラギン酸への変異によって部分的に活性化されているＰＫＢαは、試験管内ではＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の存在下でＭｇＡＴＰによる培養ではＳｅｒ４７３のところでリン酸化されず（非特許文献１５、図５）、これはＳｅｒ４７３が自己リン酸化せず、ＰＫＢα自身で触媒されていることを示す。Ｓｅｒ４７３は試験管内でＭＡＰキナーゼ活性プロテインキナーゼ２によってリン酸化されることができるが、この酵素はＰＫＢαのＳｅｒ４７３におけるインスリンまたはＩＧＦ１誘導リン酸化を（非特許文献１５）に述べられた理由により媒介できない。インスリン／ＩＧＦ１誘導Ｓｅｒ４７３リン酸化はＰｔｄＩｎｓ３キナーゼの阻害剤によって阻害されるので、この残基は別の３ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ（図７、ＰＤＫ２）によってリン酸化されるのかもしれない。しかし、Ｓｅｒ４７３キナーゼはヘパリンセファロースからのＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３依存性ピーク１活性には見えない（図２Ｂ）、なぜならこの酵素もまたＰＫＢをＴｈｒ３０８のところでリン酸化するからである（データは示されない）。ピーク１はピーク２（またはその逆）のまたはＰＤＫ１の別のイソ体のタンパク質分解断片である。ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３／ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２はＳｅｒ４７３キナーゼを間接的に活性化することも可能である。例えば、Ｓｅｒ４７３のリン酸化は、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３／ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２とＰＫＢのＰＨ領域の結合に依存するだろう（非特許文献１８，２１）（しかし、以下参照）。あるいはまた、Ｓｅｒ４７３キナーゼはＰＤＫ１によって活性化されるだろう。インスリンがＰＫＢαの活性化を誘導するメカニズムは図７に概略的に示されている。
【０１３０】
ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３によるＰＤＫ１の活性化は、非常に特異的である、なぜならＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３のＤ体光学異性体のみが有効であり、他の多くのＰｔｄＩｎｓリン脂質は不活性だからである。グリセロール部位の光学異性立体配座は重要ではないが、１またはそれ以上の不飽和脂肪酸の存在はＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３相同体によるＰＤＫ１の活性化の程度に非常に影響する（図６）。不飽和脂肪酸は隣接するリン脂質分子のタイトパッキング（ｔｉｇｈｔ ｐａｃｋｉｎｇ）を妨げるので、この配置が膜挿入ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３とその作用因子間のより効果的な相互作用を可能とすることができ、これはイノシトールリン脂質に特有な脂肪酸組成の生物学的な有意についてのおそらく最初の解明であろう。
【０１３１】
ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３と／またはＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２は、我々の先の発見と一致する（非特許文献１８）これらのイノシトールリン脂質がＰＤＫ１を強力に活性化する（図６）条件下では、ＰＫＢαの活性に何ら影響を持たない。この観察は、インスリンまたはＩＧＦ１によるＰＫＢαの活性化はＴｈｒ３０８とＳｅｒ４７４でのそのリン酸化の結果によるものであるという発見とあいまって（非特許文献１５）、生体内でのその活性化のメカニズムとしての３ホスフォイノシチドによるＰＫＢαの直接活性化を除外するように見える。我々の結果は、ＰＫＢαはＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２によって直接活性化されると主張している最近の報告と異なる（非特許文献１９〜２１）。ＰＤＫ１活性によるＰＫＢα調整のコンタミがこの矛盾を説明できるかもしれず、サイクリックＡＭＰによるリン酸化キナーゼの活性化は（非特許文献２２）、のちに分離サイクリックＡＭＰ依存性プロテインキナーゼのコンタミの結果であると示された（非特許文献２３）ことを思い出す。ＰＫＢαはＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３によって阻害されるとも報告されているが（非特許文献２１，２２）、我々がテストした４つのＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３派生物のどれも基礎ＰＫＢα活性を阻害せず、４つすべてがＰＤＫ１の活性化が可能であった。（非特許文献２０，２１）で使用された合成ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３は、ＰＫＢαと、またはＰＤＫ１を阻害する不純物を含んでいるかもしれない。
【０１３２】
ＰＫＢはＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３またはＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２によって直接活性化はされないが、Ｎ末端プレクストリン相同性（ＰＨ）領域において分子間力でこれらのイノシトールリン脂質と結合するのである（非特許文献１８，２１）。対照的に、ＰＫＢはＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２と１０倍低い力で結合し、他のテストをしたイノシトールリン脂質とは結合しなかった（非特許文献１８，２１）。これらの発見によりいくつかの興味ある可能性がある。１つめは、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３と／またはＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２とＰＫＢの相互作用は、ＰＤＫ１とＳｅｒ４７３キナーゼによるリン酸化を促進するためのような方法でその立体配座を変えるかもしれない。２つめは、細胞膜内でのＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３と／またはＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２の生成はこの膜にＰＫＢを補充し、ＰＤＫ１とＳｅｒ４７３キナーゼによるその活性化も促進するかもしれない。しかし、ＰＨ領域欠失の変異体でも、少なくとも天然ＰＫＢと同様にインスリンに応答して活性化され得るため（非特許文献２４，２５）、これらのメカニズムはどちらも生体内でのＰＫＢの活性化に必須要件ではないように見える。そのかわり、細胞膜へのＰＫＢの補充は膜結合ＰＫＢ基質のリン酸化を促進するメカニズムとなるだろう。しかし、ＰＤＫ１は骨格筋の細胞質から精製されたことを注意するべきである。ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３とＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２の濃度上昇のきっかけとなる作動物質で細胞が刺激される時、ＰＤＫ１が細胞膜に局在かするのかどうか調べることは明らかに重要であろう。
【実施例２】
【０１３３】
ＰＤＫ１のクローニング
我々はウサギ骨格筋から精製したＰＤＫ１由来の９つのペプチドのアミノ酸配列を得た。これらは以下のとおりであった。
ＬＤＨＰＦＦＶＫ；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ６）
ＡＮＳＦＶＧＴＡＱＹＶＳＰＥＬＬ；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ４）
ＡＧＮＥＹＬＩＦＱＫ；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ５）
ＡＨＰＦＦＥＳＶＴＷＥＮＬＨＱＱＴＰＰＫ；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１１）
ＳＧＳＮＩＥＱＹＩＨＤＬＤＳＮＳＦＥＬＤＬ；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１２）
ＱＡＧＧＮＰＷＨＱＦＶＥＮＮＬＩＬＫ；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１３）
ＱＬＬＬＴＥＧＰＨＬＹＹＶＤＰＶＮＫ；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１４）
ＴＦＦＶＨＴＰＮＲ；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１５）
ＹＱＳＨＰＤＡＡＶＱ；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１６）
【０１３４】
そして、これらの配列をインターネットでＢＬＡＳＴｎｃｂｉデータベースサーチにかけ、９つのペプチドの配列すべてが２つのＥＳＴ配列によってコードされていることを我々は発見した。インターネットから入手可能なこれらのＥＳＴ配列に関する情報は、図８と９に与えられる。そして我々はＵＫ ＨＧＭＰ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、ヒンクストン、ケンブリッジ ＣＢ１ １ＳＢ、ＵＫ（メディカルリサーチカウンシルによって資金援助されるコンソーシアムパート）からのＥＳＴを求めた。
【０１３５】
そして、我々はＥＳＴの両ＤＮＡ鎖の配列読み取りをすることにより、ＥＳＴクローンのヌクレオチド配列を決定した。インターネットで入手できるＥＳＴ配列には多くの間違いがあった。得られたデータからＥＳＴ配列はＰＤＫ１の２つの重複するクローンを表していることが明らかである。ＰＤＫ１のオープンリーディングフレームのほとんどは、国立生物情報センターでのｄｂｅｓｔデータベースの問い合わせによって取り出された。ＰＤＫ１の完全長ｃＤＮＡクローンは、ベクターλＺＡＰ内で、ヒト乳がん細胞系ＭＣＦ７（Ｐ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ寄贈、インスティテュートオブキャンサーリサーチ、サットン、ＵＫ）から作られたｃＤＮＡライブラリーのハイブリッドスクリーニングによって分離された。スクリーニングのためのＰＤＫ１プローブは、鋳型としてＭＣＦ７ｃＤＮＡを用い、ＰＤＫ１配列のヌクレオチド１１３８―１５６７に対応するプライマーＣＴＧＡＧＣＣＡＧＴＴＴＧＧＣＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１７）とＡＣＧＴＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＧＴＧＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１８）を用いたＲＴ−ＰＣＲによって発生した。ＤＮＡ配列読み取りはＴａｑ染色ターミネーターサイクルシーケンスキットを用い、アプライドバイオシステムズ社、３７３ＡモデルのＤＮＡ自動配列読取装置によっておこなわれた。
【０１３６】
ＰＤＫ１のヌクレオチドとアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１と２）は図１０に示されている。配列は予想分子量６３．１ｋＤａの５５６残基のタンパク質をコードする。Ｍｙｃ抗原決定基タグを有するＰＤＫ１タンパク質を２９３細胞で発現させた（以下の実施例参照）、それは６８−７０ｋＤａバンドとして移動し、できたＰＤＫ１抗体は２９３細胞溶菌液での６９ｋＤａバンドとわかる（データは示さず）。この理由と開始メチオニンが良好なコザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列にあることから、図１０に示される配列はＰＤＫ１全体を表しているように見える。
【０１３７】
ＰＤＫ１の完全長コード配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、図１０で与えられるヌクレオチド配列をベースとする適当なＰＣＲプライマーを使い、適当なｃＤＮＡライブラリーから、または逆転写されるｍＲＮＡからＰＤＫ１ｃＤＮＡを増幅することにより容易に得られる。
【０１３８】
ＰＤＫ１のコード配列を含む１つのポリヌクレオチドもまた、適当な制限エンドヌクレアーゼでの消化に続いてＩＭＡＧＥクローン６２６５１１とＩＭＡＧＥクローン５２６５８３の適当な部分を接合するか、ＩＭＡＧＥクローン５２６５８３とＩＭＡＧＥクローン６２６５１１の適当な部分を結合するＰＣＲベースの方法を用いて得られる。
【０１３９】
ＰＤＫ１の完全長コード配列が図１０で与えられるプローブを作るための配列情報を用いて適当なｃＤＮＡライブラリーから容易に得られて、この方法で得られるどのクローンの配列もサンガージデオキシシーケンス法を用いて決定され得ることは評価されるだろう。
【０１４０】
ＰＤＫ１をコードするヒトＥＳＴは多くの異なるヒト組織から分離され（以下の表Ａ）、ＰＤＫ１は偏在的に発現されることを示している。興味あることには、ＰＤＫ１のヌクレオチド配列は、１型多環式腎臓疾患と２型管硬化疾患に応答し得る遺伝子と近い、ヒト染色体１６ｐ１３．３の７００ｋｂ領域に配置いる遺伝子の一部の配列と１００％同一性を有していた（非特許文献４１）。この遺伝子は心臓、脳、胎盤、肺、骨格筋、腎臓、膵臓で大きな８ｋｂ転写物として発現されることが知られている（非特許文献４１）。
【表７】
2005323611.tif 000006
【実施例３】
【０１４１】
ＰＤＫ１の代替的なクローニング方法
ＰＤＫ１に対応する６７ｋＤａバンドはトリプシンで切断されその消化物はバイダック（Ｖｙｄａｃ）Ｃ１８カラムでクロマトグラフにかけられトリプシンペプチドに分解された。以下の３つのペプチドの配列が立証された。
１．ＡＮＳＦＶＧＴＡＱＹＶＳＰＥＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ４）
２．ＡＧＮＥＹＬＩＦＱＫ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ５）
３．ＬＤＨＰＦＦＶＫ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ６）
【０１４２】
これらのペプチドは他のプロテインキナーゼの触媒領域で発見された配列と相同である。ペプチド１はサブ領域VIIIの領域と、ペプチド２はサブ領域Ｘの領域と、ペプチド３はサブ領域ＸＩの領域と相同である。これらの配列は標準的なＰＣＲベースの方法を用いてＰＤＫ１のクローニングに用いられる。
【０１４３】
ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）はペプチド１と３（またはそのわずかな変種、例えば、位置ＩがイノシンまたはＧ、Ｃ、Ａ、Ｔの様々な組み合わせであってもよい）をコードする以下のオリゴヌクレオチドを用いて行われる。
【０１４４】
ペプチド１の下線で示される部分（ＦＶＧＴＡＱＹＶ）をコードする５’ＴＴＴＧＴ（Ｇ／Ｔ）ＧＧＩＡＣＩＧＣＩＣＡ（Ａ／Ｇ）ＴＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＴ３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１９）。
【０１４５】
ペプチド３をコードする５’ＴＴＩＡＣ（Ａ／Ｇ）ＡＡ（Ａ／Ｇ）ＡＡＩＧＧ（Ａ／Ｇ）ＴＧ（Ａ／Ｇ）ＴＣ３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２０）。
【０１４６】
得られるＰＣＲ断片はペプチド２をコードする領域を含み、サザンブロットと、以下のペプチド２（またはわずかな変種、例えば、位置ＩがイノシンまたはＧ、Ｃ、Ａ、Ｔの様々な組み合わせであってもよい）をコードするオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションで解析される。
５’ＡＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＡ（Ａ／Ｇ）ＴＡ（Ｔ／Ｃ）（Ｃ／Ｔ）ＴＩＡＴ（Ｔ／Ｃ／Ａ）ＴＴ（ＴＣ）ＣＡ（Ａ／Ｇ）ＡＡ３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２１）
【０１４７】
陽性ＰＣＲ断片をサブクローンし、骨格筋と他のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用い、ＰＤＫ１の完全長クローンを分離する。
【０１４８】
ＰＤＫ１の完全長クローンはサンガージデオキシ法で配列読み取りされる。
【０１４９】
ウサギＰＤＫ１ｃＤＮＡがまず得られてもよく、これが完全長ヒトＰＤＫ１ｃＤＮＡを分離するためにヒト骨格筋ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いられる。用いられた分子生物学的技術は基本的にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（１９８９）、分子クローニング、ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに述べられている。
【実施例４】
【０１５０】
さらに代替的なＰＤＫ１のクローニング法
実施例１で述べられたように精製されたＰＤＫ１に対して抗体を産生する。
【０１５１】
抗体は、ヒトまたはウサギ骨格筋ｍＲＮＡから複写されたｃＤＮＡから作成されたλｇｔ１１発現ライブラリーをスクリーニングするため用いられる。
【０１５２】
陽性クローンは同定され、実施例２と同様サンガー法によって挿入断片は配列読み取りされる。
【実施例５】
【０１５３】
ヒトＰＤＫ１の発現とＰＫＢαの活性化;ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ） ＤＳＴＰＫ６１との相同性
生体内でのＰＤＫ１の役割を明らかにし、それがＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３とＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２によって調整されるメカニズムを決定するために、まずこの酵素の構造とＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３／ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２がＰＤＫ１を刺激してＰＫＢをリン酸化するメカニズムを決定することは明らかに有益であった。この実施例と前の実施例において、ヒトＰＤＫ１のクローニング、配列読み取りと発現について述べ、発現した酵素は筋肉から精製されたＰＤＫ１と同じ方法でＰＫＢαを生体内で活性化すると実証する。ＰＤＫ１はまた共移入実験でもＰＫＢαを活性化し、ＩＧＦ１誘導Ｔｈｒ３０８のリン酸化を可能とした。驚いたことに、ＰＤＫ１は、ショウジョウバエの性発達の調整と関係があるショウジョウバエプロテインキナーゼＤＳＴＰＫ６１と構造的かつ機能的に相同性であるとわかった。
【０１５４】
材料と方法
材料
すべてのリン脂質は、既に述べた原料源（非特許文献３９）から得られた。グルタチオンセファロース、ｐＧＥＸ−３Ｘ発現ベクターと１ｍｌヘパリンセファロースカラム（ＨｉＴｒａｐ）はファルマシア（ミルトン、キーネス、ＵＫ）から、モノクローナル抗体１２ＣＡ５と９Ｅ１０はボーアリンガーマンハイム（リューエス、ＵＫ）から、アルキル化トリプシンとｐＳＰ７２クローニングベクターはプロメガ（サウスハンプトン、ＵＫ）から購入した。ＧＳＴ−ＰＫＢαと他の全ての材料のソースは（非特許文献３９）に述べられている。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯクローニングベクターはインビトロゲン（リーク、オランダ）からである。
【０１５５】
緩衝溶液
緩衝溶液Ａ：５０ｍｌ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ １ｍＭ ＥＧＴＡ、１容量％ トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ１００、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭ βグリセロリン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＦ、５ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１μＭ マイクロシスチン（ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ）ＬＲ、０．２７Ｍ蔗糖、１ｍＭ ベンズアミジン（ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ）、０．２ｍＭ フェニルエチルスルホニルフロライド（ＰＭＳＦ）、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン、０．１容量％ ２メルカプトエタノール。緩衝溶液Ｂ：５０ｍｌ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．０３容量％ Ｂｒｉｊ−３５、０．２７Ｍ 蔗糖、０．１容量％ ２メルカプトエタノール。
【０１５６】
ＧＳＴ−ＰＤＫ１、Ｍｙｃ−ＰＤＫ１をコードするＤＮＡ発現構築物の調整
ＰＤＫ１（ＰＤＫ１（図１）のヌクレオチド９８から７０８と４６７から１８１１までに対応するＧｅｎバンク 受託番号 ＡＡ１２１９９４とＡＡ１８６３２３）をコードする２つの重複するヒトＥＳＴはＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソーシアム（非特許文献５９）から得られ、配列読み取りされた。この２つの配列は各ＥＳＴクローンのＳｃａＩ制限酵素消化物によって組み合わされ、これらの消化物から得られた適当な制限断片は接合され、ヌクレオチド１５４〜１６７０までの連続的なＰＤＫ１配列を含むプラスミドが発生した。この構築物はＰＣＲ反応の鋳型として使用され、Ｎ末端抗原決定基標識Ｍｙｃ−ＰＤＫ１（アミノ酸残基５２〜５５６）構築物が発生した。これはＢｇｌIIサイト（下記下線部ＡＧＡＴＣＴ）とＫｐｎIサイト（下記下線部ＧＴＡＣＣ）を取り込むオリゴヌクレオチドＧＣＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＡＣＧＧＣＡＣＴＧＣＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＣＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２２）とＧＣＧＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＣＣＧＧＧＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２３）を用いて成功した。得られるＰＣＲ断片はｐＳＰ７２クローニングベクターのＢｇｌII／ＫｐｎI部位へサブクローンされ、ヌクレオチド配列はＤＮＡ配列読み取りで確認された。Ｍｙｃ−ＰＤＫ１コード配列は、２９３細胞でＧＳＴ−ＰＤＫ１の発現構築物を発生させるため、このベクターからＢｇｌII−ＫｐｎI断片として真核生物発現ベクターｐＥＢＧ２Ｔ（非特許文献２７）のＢａｍＨＩとＫｐｎI部位へサブクローニングされた。同じ断片がベクターｐＣＭＶ５（非特許文献６０）のＢｇｌIIとＳａｌＩ部位へ接合され、２９３細胞でＭｙｃ−ＰＤＫ１発現構築物が発生した。各構築物の構造はＤＮＡシーケンスで立証され、遺伝子導入プラスミドＤＮＡは製造者プロトコルに従ってキアゲンプラスミドメガキットを用いて精製された。
【０１５７】
完全長タンパク質（残基１から５５６）をコードし、ＰＨ領域（残基１から４５０）欠失であるＮ末端Ｍｙｃ抗原決定基標識ＰＤＫ１構築物は、ＭＣＦ７ライブラリーから分離された完全長完全長ＰＤＫ１ ｃＤＮＡを用いてのＰＣＲ法によって発生した。これは５’プライマー  gcggagatctgccaccatggagcagaagctgatctctgaagaggacttggccaggaccaccagccagctgtatgacg（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２４）（完全長とΔＰＨ−ＰＤＫ１構築物の両方のため）、３’プライマー  gcggggtacctcactgcacagcggcgtccgggtg（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２３）（完全長ＰＤＫ１のため）と  gcggggtacctcagtgccaagggtttccgccagcctgctt（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２５）（ΔＰＨ−ＰＤＫ１構築物のため）を用いて達成された。得られたＰＣＲ断片はｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターへクローニングされ、続いて、ＢｇｌII−ＫｐｎＩ断片としてｐＥＧＢ−２Ｔベクターへ、ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片としてｐＣＭＶ５へサブクローニングされた。中でＡｓｐ２２３がアラニンへ変化した完全長の触媒的に不活性なＰＤＫ１構築物は、ＰＣＲを基礎とするのメガプライマー方法（Ｔａｏ ＆ Ｌｅｅ（１９９４）Ｉｎ：Ｇｒｉｆｆｉｎ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｎ（ｅｄｓ）ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，ＣＰＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，ｐｐ６９−８３）によって作り出され、そして、上述したようにｐＣＭＶ５とｐＥＢＧ−２Ｔへサブクローニングされた。各構築物の構造はＤＮＡ読み取りで立証され、遺伝子導入プラスミドＤＮＡは製造者プロトコルに従ってキアゲンプラスミドメガキットを用いて精製された。
【０１５８】
バクテリア発現ベクターＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ由来のＤｓｔｐｋ６１ｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ断片をｐＧＥＸ−３Ｘ発現ベクターのＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位へ接合することによって調整された。
【０１５９】
ＧＳＴ−ΔＰＨ−ＰＫＢαをコードするＤＮＡ発現構築物の調整
ヒト骨格筋ｃＤＮＡライブラリーから分離され、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクターへサブクローンされた完全長ヒトＰＫＢα構築物の鋳型として用いるＧＳＴ−ΔＰＨ−ＰＫＢα（１１８〜４７９ＰＫＢα残基をコードする）構築物の調整にＰＣＲに基づく方法が用いられた。ＧＳＴ−ΔＰＨ−ＰＫＢα構築物は５’プライマーcgggatccatggacttccggtcgggctcaを用いて得られ、３’プライマーはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクターのＴ７オリゴヌクレオチドであった。得られたＰＣＲ断片はＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ断片としてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫへ、続いて、ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ断片としてｐＥＢＧ−２Ｔへクローニングされた。
【０１６０】
ＧＳＴ−ＰＤＫ１、ＧＳＴ−ΔＰＨ−ＰＤＫ１、ＧＳＴ−Ｄ２２３Ａ−ＰＤＫ１、ＧＳＴ−ΔＰＨ−ＰＫＢα、ＧＳＴ―ＤＳＴＰＫ６１の発現
ヒト胎児の腎臓２９３細胞が直径１０ｃｍのディッシュ２０枚で培養され、各ディッシュに改変したリン酸カルシウム方法（非特許文献３８）を用いてＧＳＴ−ＰＤＫ１（５２から５５６残基）、ＧＳＴ−ＰＤＫ１（１から５５６残基）、ＧＳＴ−ΔＰＨ−ＰＤＫ１、ＧＳＴ−Ｄ２２３Ａ−ＰＤＫ１、又はＧＳＴ−ΔＰＨ−ＰＫＢαのいずれかをコードするＤＮＡ２０μｇが遺伝子導入された。遺伝子導入の２４時間後、細胞は１６時間の間無血清にされ、各ディッシュの細胞を１ｍｌの氷冷緩衝溶液Ａに溶菌した。２０個の溶菌液が溜められ、４℃で１０分間、１３，０００ｘｇで遠心分離し、上清を既に緩衝溶液Ａ内で平衡化した１ｍｌのグルタチオンセファロースで、回転試料台の上で６０分間培養した。懸濁液を３０００ｘｇで１分間遠心分離し、ビーズは０．５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍｌの緩衝溶液Ａで３回洗浄し、さらに１０ｍｌの緩衝溶液Ｂで１０回洗浄して、ＰＤＫ１によるＧＳＴ−ＰＫＢαの活性化を阻害する（非特許文献３９）トリトンＸ１００を完全に除去した。室温でｐＨ８．０の２０ｍＭグルタチオンを含む緩衝溶液Ｂの１ｍｌ画分で３回、樹脂からＧＳＴ−ＰＤＫ１αを溶出した。合わせられた溶出液（０．８ｍｇ／ｍｌのタンパク質）を分割量に分割し、液体窒素内で急速冷凍し、８０℃で保存した。０．５から２．０ｍｇの各ＧＳＴ融合タンパク質が得られ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により９０％以上の相同性であると判定された。
【０１６１】
ＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１をコードする発現プラスミドで形質転換された大腸菌はＬＢ培地で３７℃において６００ｎｍでの吸光度が０．６になるまで培養した。イソプロピルβ−Ｄチオピラノシドを３０μＭ添加し、バクテリアを２５℃で１６時間培養し、その後４０００ｘｇで１０分間遠心分離した。バクテリアを１５ｍｌの緩衝溶液Ａに再懸濁し、氷冷で４分間の音波処理で溶菌した。懸濁液を３０，０００ｘｇで３０分間遠心分離し、ＧＳＴ−ＰＤＫ１で上述したように、ＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１を１ｍｌのグルタチオンセファロースでアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。これ（０．３５ｍｇ／ｍｌ）から取り出されたＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１を分割量に分割し、液体窒素で急速冷凍して８０℃で保存した。
【０１６２】
ＧＳＴ−ＰＤＫ１とＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１活性の分析
ＧＳＴ−ＰＤＫ１とＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１はウシ血清アルブミン１ｍｇ／ｍｌを含む緩衝溶液Ｂで適度に希釈され、ＧＳＴ−ＰＫＢαに対する活性化能及びリン酸化能を分析された（非特許文献３９）。ＰＤＫ１活性の１単位は、１分間に活性の１単位によってＧＳＴ−ＰＫＢαの基礎活性を増加するために要求される量として定義された。ＧＳＴ−ＰＫＢα活性の１単位は、０．１ｍＭのＲＰＲＡＡＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１）を含む分析で、１分間に１ｎｍｏｌのペプチドＲＰＲＡＡＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１）のリン酸化を触媒するために要求される酵素の量である（非特許文献１６）。時間に対して分析が線形であることを確かめるために、ＧＳＴ−ＰＤＫ１又はＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１の濃度は２Ｕ／ｍｌ以下にした。この濃度で、ＰＢＫαのリン酸化のレベルは、３０分の分析で、０．４モルリン酸塩／タンパク質モルよりも小さかった。
【０１６３】
ＨＡ標識ＰＢＫαとＭｙｃ−ＰＤＫ１を２９３細胞へ移入
ヒト胎児腎臓２９３細胞を直径１０ｃｍのディッシュで培養し、ＨＡ−ＰＫＢα又はＨＡ−ＰＫＢα＋Ｍｙｃ−ＰＤＫ１をコードする２μｇ／ｍｌのｐＣＭＶ５ＤＮＡ構築物を移入した（非特許文献３８）。２４時間後、細胞はさらに１６時間血清から取り出され、そして、１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１か緩衝溶液のどちらかで１０分間刺激した。細胞を１．０ｍｌの氷冷緩衝溶液Ａで溶菌し、溶菌液は４℃、１３，０００ｘｇで１０分間遠心分離し、ＨＡ−ＰＫＢαを上清（１０μｇのタンパク質）の分割量から免疫沈殿して（非特許文献３８）、先に述べたように（非特許文献３８）ペプチドＲＰＲＡＡＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１）でＰＫＢαの分析をした。
【０１６４】
ＨＡ−ＰＫＢα又はＭｙｃ−ＰＤＫ１を移入された２９３細胞の３２Ｐ標識
これは本質的に既述のように（非特許文献３８）行われた。手短に言うと、２９３細胞にＨＡ−ＰＫＢα、又はＨＡ−ＰＫＢα＋Ｍｙｃ−ＰＤＫ１を移入し、リン酸フリーのＤＭＥＭで洗浄し、［３２Ｐ］オルトリン酸（１ｍＣｉ／ｍｌ）で４時間培養し、その後ＩＧＦ１（５０ｎｇ／ｍｌ）で５分間刺激した。細胞は溶菌され、ＨＡ−ＰＫＢαが免疫沈殿（細胞の１０ｃｍディッシュ毎に１０μｇの１２ＣＡＳ抗体を用いた）、またはＭｙｃ−ＰＤＫ１が免疫沈殿された（細胞の１０ｃｍディッシュ毎に１０μｇの９Ｅ１０抗体を用いた）。免疫沈殿されたタンパク質は４ビニルピリジンでアルキル化され、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけられ、トリプシンで消化され、Ｃ１８カラムでクロマトグラフィーによって分析された（非特許文献３８）。
【０１６５】
結果
ＰＤＫ１は、ショウジョウバエＤＳＴＰＫ６１プロテインキナーゼのヒト相同体(human homologue)である
ＰＤＫ１の触媒領域(catalytic domain)は、残基８３−３４２にまでわたり（図１０）、すべての古典キナーゼサブ領域(classical kinase subdomains)Ｉ−ＸＩを含む（非特許文献４２）。それは、ＰＫＡ（触媒領域と３９％の相同性(identity)）と、ＰＫＣ（ζ（ゼータ）イソ体と３５％の相同性）と、ＰＫＢ（３５％の相同性）とを含むプロテインキナーゼのサブファミリー(subfamily)と最も類似している。ＰＤＫ１触媒領域は、未知の機能(function)を有する２つの酵母プロテインキナーゼ(yeast protein kinases)に今までになくより類似していた。触媒領域は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号１４３１５８８が付与されているＳ．ｐｏｍｂｅプロテインキナーゼと５３％の相同性を有し、受入番号１０７８２９０が付与されているＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプロテインキナーゼと４８％の相同性を有した。しかしながら、ＰＤＫ１と触媒領域の外部にあるこれら酵母プロテインキナーゼとの間に相同性(homology)がなかった。対照的に、ショウジョウバエセリン／トレオニンプロテインキナーゼ６１（ＤＳＴＰＫ６１，受入番号Ｙ０７９０８、非特許文献４０）と命名されたショウジョウバエプロテインキナーゼは、触媒領域中で５４％の相同性を有しただけでなく、非触媒Ｃ末端領域の中でも非常に類似していた（図１１）。この相同性は、ＰＤＫ１の残基４５０から５５０の間で最も顕著で、ＤＳＴＰＫ６１との相同性は６１％（７９％の類似性(similarity)）であった。これらの観察から、ＤＳＴＰＫ６１がＰＤＫ１のショウジョウバエ相同体であるかもしれないことが暗示された。しかしながら、ＤＳＴＰＫ６１はＰＤＫ１中では見られない６０残基Ｃ末端Ｃ末端伸長(60 residue C-terminal extension)を含み、そして、ＰＤＫ１のＮ末端７０残基(N-terminal extension 70 residues)とＤＳＴＰＫ６１のＮ末端１５０残基(N-terminal extension 150 residues)との間で相同性がほとんどない（図１１）。ＰＤＫ１には、ＤＳＴＰＫ６１のＮ末端（残基１２０−１５０）の近くに存在するポリグルタミン挿入配列と、キナーゼ領域(kinase domain)のサブ領域ＶＩＩとＶＩＩＩ（残基３１２から３７０まで）との間に配置されるさらなる多酸挿入(polyacidic insertion)とが欠けている（図１１）。ＤＳＴＰＫ６１の生理学的な役目は、考察(Discussion)以下でさらに考察されるであろう。
【０１６６】
ＰＤＫ１とＤＳＴＰＫ６１は、Ｃ末端プレクトリン相同領域(C-terminal Plecktrin Homology domain)を有する
ＰＤＫ１の残基４５０−５５０（図１１）から、ＰＤＫ１とＳＴＫ６１との間に存在する高レベルの配列保存(sequence conservation)によって、この領域が重要な機能を有する傾向にあることが暗示された。これらの配列の観察によって、これらがプレクトリン相同（ＰＨ）領域の一部を形成する傾向にあることが示唆された。〜１００の残基を有するこれらの領域は、他の７０以上のプロテイン中で発見されている。また、これらの領域は、類似３次元構造(similar 3-demensional structures)に畳み込んでいると予測され、また、プロテイン−脂質、プロテイン−プロテイン相互作用、あるいは、両方が媒介となっているだろう（非特許文献４３，４４）。我々は、決められた三次構造、ペルクトリン、スペクトリン(spectrin)、ダイナミン(dynamin)およびホスフォリパーゼＣ−δ(phospholipase C-d)のＰＨ領域からの配列と、他の７１の知られているＰＨ領域配列（データ省略）とともに、ＰＤＫ１とＳＴＫ６１の両方にある残基４５０−５５０の配列アラインメント(sequence alignment)を実行してきた。一般的に両者のＰＨ領域での相同性率(percentage identity)は低いけれども、高レベルの残基型保存(residue type conservation)を示すある決まった位置(positions)がある。ＰＤＫ１とＤＳＴＰＫに関して、ある一つの位置（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，１１３番目，ＰＤＫ１のポジションＴｒｐ−５３５）は、領域ファミリーの至る所で完全な相同性を示す。しかしながら、ＰＨ領域の定義された領域で多くの類似したアミノ酸がある（図１７）。二次構造予測(secondary structure predictions)によって、５３１から５５０までの残基（８０−１００番目）が伸長されたαヘリックス(extended a-helix)を形成する傾向があるが、ＰＤＫ１の残基４５０−５３０（１−８０番目）がβシートの領域を含む傾向があることが示唆された。予測は、他のＰＨ領域の知られた構造と一致している（非特許文献４３，４４）。
【０１６７】
ＧＳＴ−ＰＤＫ１とＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１との発現
ＰＤＫ１の残基５２−５５６はヒト胚腎臓２９３細胞(human embryonic kidney 293 cells)内で発現され、ＤＳＴＰＫ６１の残基１−７５２は、Ｎ末端でグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とともに融合プロテイン(fusion proteins)として大腸菌内で発現され（以下、ＧＳＴ−ＰＤＫ１、ＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１と呼ぶ）、双方ともにグルタチオンセファロース(glutathione-Sepharose)で精製された。ＧＳＴ−ＰＤＫ１調製物は、８７と８５ｋＤａである明白な分子質量(molecular masses)を有する２つのバンドを示し（図１８、レーン１）、２ｍｇのＧＳＴ−ＰＤＫ１精製プロテインが細胞の２０枚の（直径１０ｃｍ）ディッシュから得られた。ＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１調製物は、多くの微量分解生成物とともに、予期された分子質量（１０５ｋＤａ）で拡散バンド(diffuse band)を示した（図１８、レーン２）。０．３５ｍｇのＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１がバクテリア培養液０．５リットルから得られた。
【０１６８】
ＧＳＴ−ＰＤＫ１およびＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１は、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３またはＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２依存状態でＰＫＢαを活性化、および、リン酸化する
ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３またはＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２が含まれていたという条件で、ＧＳＴ−ＰＤＫ１とＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１の両方が、ホスファチジルコリン（ＰｔｄＣｈｏ）とホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）とを含む小胞バックグラウンド(vesicle background)の存在下で、ＧＳＴ−ＰＫＢαを活性化およびリン酸化した。ＧＳＴ−ＰＫＢαの活性化の広がりはリン酸化の広がりと関連性があり（図１２）、もしＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３またはＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２がＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２とＰｔｄＩｎｓ３−Ｐのうちどちらか一方に置き代われていたならば、活性化またはリン酸化は起こらなかった（図１２）。相同性に関する結果(identical results)が、ウサギ骨格筋からの精製されたＰＤＫ１と２９３細胞内で発現された完全長ＧＳＴ−ＰＤＫ１（残基１−５５６）とを使用することによって得られた（（非特許文献３９）とデータ省略）。Ａｓｐ２２３がアラニンに変化した触媒不活性なＧＳＴ−ＰＤＫ１変異体は、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を含むＰｔｄＣｈｏ／ＰｔｄＳｅｒ脂質小胞の存在下で、リン酸化または活性化しなかった（データ省略）。ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の存在下でＧＳＴ−ＰＫＢαに対するＧＳＴ−ＰＤＫ１（残基５２から５５６まで、７７８００Ｕ／ｍｇ）とＧＳＴ−ＰＤＫ１（残基１から５５６まで、８９０００Ｕ／ｍｇ）の特異的な活性は、ウサギ骨格筋（１０００００Ｕ／ｍｇ）から精製されたＰＤＫ１に類似しており、バクテリア的に発現されたＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１（２８０Ｕ／ｍｇ）のそれより２００倍以上高かった。大腸菌内で発現されたとき、この違いがＤＳＴＰＫ６１の誤った畳み込みによって生じるのか、または、重要な翻訳後の修飾の欠損（ｌａｃｋ）によって生じるのか、または、ＤＳＴＰＫ６１がヒトＰＤＫ１と同様にヒトＰＫＢαを認識しないかどうかを立証するために、さらなる研究が必要とされる。
【０１６９】
ＧＳＴ−ＰＫＢαの活性化およびリン酸化は、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３またはＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２が存在しない状態で、超高濃度のＧＳＴ−ＰＤＫ１またはＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１を使用することによって得られた。しかしながら、ＰＤＫ１の活性は、これらイノシトールリン脂質の存在下で約１０００倍に強められた。ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の存在下で、さらに、高ＧＳＴ−ＰＤＫ１およびＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１濃度の条件下で、ＧＳＴ−ＰＫＢαのリン酸化は０．７５モルリン酸毎モルプロテイン(mol phosphate per mol protein)に達し、活性度の３５倍の増加に匹敵した。これは、ウサギ骨格筋からのＰＤＫ１を使用することによって得られたＧＳＴ−ＰＫＢαの最大の活性化(maximal activation)に類似していた（非特許文献３９）。
【０１７０】
発現されたＰＤＫ１とＤＳＴＰＫ６１は、Ｔｈｒ３０８でＰＫＢαをリン酸化する
ＧＳＴ−ＰＤＫ１（図１３Ａ）またはＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１（図１３Ｂ）の一方を用いて最大限リン酸化された３２Ｐ標識ＧＳＴ−ＰＫＢαがトリプシンで消化され、そして、Ｃ１８カラム上でクロマトグラフされた。ある重要な３２Ｐ標識ペプチドがそれぞれのケースで得られた。このペプチドは、Ｔｈｒ３０８を含む３２Ｐ標識トリプシンホスフォペプチド(32P-labelled tryptic phosphopeptide)と同じ位置に存在し２５％アセトニトリルによって抽出され（非特許文献３８，３９）、ホスフォトレオニンを含み、さらに固相配列読み取りが行われたとき、３２Ｐ放射能がエドマン分解(Edman degradation)の第１サイクルの後に放出された(released)。これらからこのペクチドは実にＴｈｒ３０８でリン酸化されたＰＫＢαのペプチドであることが確認された（データ省略）。
【０１７１】
ＰＫＢαは、２９３細胞内にＰＤＫ１とともに共移入(cotransfection)されることによって活性化され、Ｔｈｒ３０８でリン酸化される
ＰＤＫ１が細胞コンテクスト(cellular context)内でＰＫＢαを活性化させることが可能であるかどうかを確定するために、我々は、２９３細胞内に赤血球凝集素抗原決定基標識ＰＫＢα(haemaglutinnin epitope-tagged PKBa)（ＨＡ−ＰＫＢα）を単独で、または、Ｍｙｃ抗原決定基標識ＰＤＫ１(Myc-epitope tagged PDK1)（Ｍｙｃ−ＰＤＫ１）とともに移入した。以前に報告されたように、ＨＡ−ＰＫＢαのみが２９３細胞内に移入されたとき、ＨＡ−ＰＫＢαは低い基底活性度(basal activity)を有するが、それは、ＩＧＦ１によって刺激された後４０倍に増加した（図１４、（非特許文献３８））。しかしながら、２９３細胞がＨＡ−ＰＫＢαとＭｙｃ−ＰＤＫ１の両方を移入したとき、ＨＡ−ＰＫＢαの活性度は刺激されていない細胞の中で２０倍に増加し、ＩＧＦ１によって刺激された後には７０倍に増加した（図１４）。２９３細胞内にＨＡ−ＰＫＢαと触媒不活性なＰＤＫ１の変異体（Ｍｙｃ−Ｄ２２３Ａ−ＰＤＫ１）の両方が移入されたとき、意味深いことに、ＨＡ−ＰＫＢαは活性化されなかった（図１４）。
【０１７２】
２９３細胞内のＰＤＫ１の過剰発現がＰＫＢαの活性化を誘導するメカニズムを確立するために、細胞が３２Ｐリン酸塩(32P-phosphate)で培養され、緩衝溶液またはＩＧＦ１で刺激され、そして、３２Ｐ標識ＨＡ−ＰＫＢαが溶菌液から免疫沈殿された。トリプシンで消化後、生じたペプチドは、Ｃ１８クロマトグラフィーによって分析された（図１５）。以前に観測されたように、ＨＡ−ＰＫＢαが刺激されていない細胞の中でＳｅｒ−１２４とＴｈｒ−４５０でリン酸化され、ＩＧＦ１による刺激がＴｈｒ３０８とＳｅｒ４７３のリン酸化を誘導する（図１５Ａおよび図１５Ｃ）。対照的に、ＰＤＫ１とともに共移入されたとき、ＨＡ−ＰＫＢαが刺激されていない２９３細胞の中で一部リン酸化され、ＨＡ−ＰＫＢαのみが移入されたＩＧＦ−１刺激細胞(IGF1-stimulated cells)内で観測されたレベルの７０％に達した。このＴｈｒ３０８のリン酸化は、ＩＧＦ１の応答によってさらに４倍に増加した（図１５）。重大なことに、ＨＡ−ＰＫＢαとＭｙｃ−ＰＤＫ１との共移入によって、刺激されていない細胞の中においてＳｅｒ４７３でのＨＡ−ＰＫＢαのリン酸化が誘導されず、さらに、ＩＧＦ１による刺激後にもＳｅｒ４７３のリン酸化のレベルが高くならなかった（図１５）。
【０１７３】
ＰＤＫ１によるＰＫＢαの活性化におけるＰＨ領域の役目
変異体ＰＨ領域を欠いているＧＳＴ−ＰＫＢα変異体(a mutant GST-PKBa mutant lacking the PH domain)（ＧＳＴ−ΔＰＨ−ＰＫＢα、残基１１８−４７９）は、完全長天然型ＧＳＴ−ＰＫＢαより３倍高い基底活性度を有し、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３独立状態でＰＤＫ１によって活性化され（図１６Ａ）、リン酸化された（データ省略）。しかしながら、活性化速度(rate of activation)は天然型ＧＳＴ−ＰＫＢαと比較して約２０倍に減少した（図１６Ａ）。ウサギ骨格筋抽出物から精製されたＰＤＫ１もまた、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３独立状態で活性化され、そして、リン酸化された（データ省略）。
【０１７４】
推定Ｃ末端ＰＨ領域(putative C-terminal PH domain)を欠いているＰＤＫ１変異体が、２９３細胞内でＧＳＴ融合プロテインとして発現された（ＧＳＴ−ΔＰＨ−ＰＤＫ１、残基１−４５０）。我々は、このＰＤＫ１の形状がいまだＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３依存状態でＧＳＴ−ＰＫＢαを活性化することが可能であるが、しかし活性化速度が完全長天然型ＧＳＴ−ＰＤＫ１と比較して約３０倍に減少したことが分かった（図１６Ｂ）。ウサギ骨格筋から精製されたＰＤＫ１（実施例１参照）または完全長ＧＳＴ−ＰＤＫ１（データ省略）とともに観測されたように、ＧＳＴ−ΔＰＨ−ＰＤＫ１は、ｓｎ−１，２−ジパルミトイルＤ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３のＤ−光学異性体よりも、ｓｎ−１−ステアロイル，２−アラキドニルＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３のＤ−光学異性体によって効果的に活性化され、さらに、ｓｎ−１−ステアロイル，２−アラキドニルＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３のＬ−光学異性体によって、活性化は誘導されなかった（図９Ｂ）。対照的に、完全長ＧＳＴ−ＰＤＫ１（データ省略）とウサギ骨格筋から精製されたＰＤＫ１（実施例１参照）のうちどちらか一方によるＧＳＴ−ＰＫＢαの活性化の刺激に関してｓｎ−１，２−ジパルミトイルＤ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２がｓｎ−１，２−ジパルミトイルＤ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３と同じぐらいの効果があるという条件下で、ｓｎ−１，２−ジパルミトイルＤ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２は、ＧＳＴ−ΔＰＨ−ＰＤＫ１によるＧＳＴ−ＰＫＢαの活性化の誘導性に乏しかった（図９Ｂ）。
【０１７５】
ＰＤＫ１は、ＩＧＦ１によって活性化またはリン酸化されない
２９３細胞は１６時間無血清培養され(serum starved)、ＩＧＦ１で刺激され、溶解され、さらに、細胞溶菌液(cell lysates)中に存在する内因性ＰＤＫ１活性度が、ヘパリン−セファロースのクロマトグラフィー後に決定された（方法参照）。１０分間行われた細胞のＩＧＦ１刺激によって、ＰＤＫ１の活性化または阻害が起こらなかった（データ省略）。
【０１７６】
ＩＧＦ１刺激がＰＤＫ１のリン酸化を誘導したか否かを確かめるために、２９３細胞内に（残基５２から５５６までをコードする）Ｍｙｃ−ＰＤＫ１が移入され、３２Ｐリン酸塩で培養され、５分間緩衝溶液またはＩＧＦ１で刺激され、さらに、３２Ｐ標識Ｍｙｃ−ＰＤＫ１が溶菌液から免疫沈殿された。トリプシンで消化後、生じたペプチドは、Ｃ１８クロマトグラフィーによって分析された。これら実験によって、ＰＤＫ１が刺激されていない細胞内で４つのトリプシン性ペプチド(tryptic peptides)（セリン残基上のみ）でリン酸化され、さらに、ＩＧＦ１がこれらどのペプチドのリン酸化を変化させない（データ省略）ことが実証される。高濃度セリン／トレオニン特異的プロテインホスファターゼ２Ａ(serine/threonine-specific protain phosphatase 2A)と高濃度プロテインチロシンホスファターゼ１Ｂとを用いてウサギ骨格筋から精製されたＰＤＫ１の処理によって、活性度に対して効果が現れなかった（データ省略）。ＰＤＫ１上にある生体内でリン酸化される部位のうちの一つが、キナーゼ領域内のＰＫＢのＴｈｒ−０８と同位置にあるＳｅｒ−２４１であると同定された。
【０１７７】
考察(Discussion)
骨格筋から５００，０００倍精製されたＰＤＫ１（非特許文献３９）は、８５ｋＤａと６７−６９ｋＤａと４５ｋＤａである明白な分子質量を有する３つのプロテインを含み、さらに、この実施例の中で、我々は、６７−６９ｋＤａ成分がＰＤＫ１であり、さらに、それがゲルろ過(gel filtration)で７０ｋＤａの明白な質量分子とともに移動するので（データ省略）、それが単量体プロテイン(monomeric protein)であるらしきことを立証した。このプロテインがクローンされ、さらに２９３細胞内で発現されたとき、このプロテインがＰＫＢαを活性化しおよびＴｈｒ３０８でそのリン酸化を誘導し、活性化とリン酸化の両方がＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３またはＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２に依存していた。ＰＤＫ１はまた、共移入実験でＰＫＢαを活性化し、ＩＧＦ１によるＴｈｒ−３０８のリン酸化力を強化した。これら観察と、ＰＫＢのように、ＰＤＫ１をコードするｍＲＮＡが検査されたすべての組織（表Ａ）内で発現されるという研究結果は、ＰＤＫ１が生体内でＰＫＢの”上流”に存在するという見解と一致する。
【０１７８】
ＰＫＢαは、インスリンまたはＩＧＦ１に応答して生体内でＴｈｒ−３０８と同様にＳｅｒ４７３でリン酸化される。さらに、Ｓｅｒ−４７３のリン酸化は、ＰＫＢαの完全活性化(full activation)に必須であり、さらに、Ｔｈｒ−３０８のリン酸化のように、ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎによって予防される（非特許文献３８）。重要なことに、ＰＤＫ１とともに共移入されたとき、ＰＫＢαはＳｅｒ−４７３でリン酸化されず、さらに、ＰＤＫ１の移入が、ＩＰＦ１による刺激後のＳｅｒ−４７３リン酸化のレベルに影響しなかった。これら実験によって、Ｓｅｒ−４７３でＰＫＢαをリン酸化するプロテインキナーゼがＰＤＫ１によって活性化されず、細胞内でのＰＫＢαのＴｈｒ−３０８のリン酸化によってＰＫＢαがＳｅｒ−４７３でリン酸化せず、さらに、Ｓｅｒ−４７３のリン酸化の引き金となるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３／ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２の必要性は異なったメカニズムによって比較される(conferred)ことが実証される。
【０１７９】
ＰＤＫ１がＰＫＢと同一のプロテインキナーゼのサブファミリーに属することは興味深い。さらに、ＰＫＢとは対照的に、ＰＨ領域がＣ末端から触媒領域の間に位置づけられるけれども（非特許文献３４）、ＰＫＢのようにＰＤＫ１はＰＨ領域を含む。ＰＫＢ内のＰＨ領域は、マイクロモル濃度(micromolar concentrations)でＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３およびＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２と結合することが可能である。このことによって、信号複合体(signalling complex)を形成するためにＩＧＦ１（非特許文献４６）またはＥＬ４−ＩＬ−２細胞のインターロイキン−２刺激（非特許文献４７）に応答して発生する細胞膜(plasma membrane)への移動が促進されるであろう。しかしながら、ＰＤＫ１がＩＧＦ１によって活性化されず、さらに、ＰＨ領域を欠いているＰＫＢαの変異体がＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３から独立して活性化およびリン酸化される（図１６Ａ）というこの論文 (paper)に記述されている研究結果より、ＰＤＫ１によるＰＫＢαのＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３誘導性活性化は少なくとも部分的には基質指向性(substrate  directed)であることが実証される。ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３とＰＫＢαのＰＨ領域との結合によって、Ｔｈｒ−３０８がＰＤＫ１によるリン酸化に対して影響されやすくするようにＰＫＢαのコンホメーションを変化させることが可能になる。このモデルとの一致、ＰＤＫ１のＰＨ領域の欠失によって、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３依存状態でＰＫＢαを活性化およびリン酸化させることが可能な酵素が生じる（図１６Ｂ）。
【０１８０】
しかしながら、ＰＤＫ１のＰＨ領域が欠失するとき、ＰＤＫ１によるＰＫＢαの活性化速度が３０倍に減少する。したがって、ＰＤＫ１のＰＨ領域がＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３と結合し、さらに、このことによってＰＫＢαの活性化速度がかなり大きくなることがいまだ可能な状態にある。ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３がホスファチジルコリンとホスファチジルセリンとを含む脂質小胞の中に存在するとき（実施例１）、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３が唯一ＰＤＫ１によるＰＫＢαの活性化を刺激することができ、さらに、ＰＨ領域を欠いているＰＤＫ１変異体が脂質と相互作用することができず、それゆえ、効率的にこれら小胞に浸透する(penetrate)ことができない。このことによって、ＰＨ領域を欠いているＰＤＫ１がＰＫＢαを活性化する速度がかなり減少することが説明されるだろう。ＰＨ領域を欠いているＰＫＢαは恐らく脂質小胞に浸透することができず、さらに、このことによって、完全長ＰＫＢαよりも２０倍の低速度でこの変異体がＧＳＴ−ＰＤＫ１によってリン酸化される理由が説明できる（図１６Ａ）。
【０１８１】
２９３細胞内へのＰＤＫ１の共移入によってＰＫＢαが活性化されるけれども、ＰＤＫ１の過剰発現によって、ＩＧＦ１によるＰＫＢαの活性化が強化されない（図１４）。この理由として、ＰＫＢαの活性化にはＳｅｒ−４７３のリン酸化が要求され、さらに、Ｔｈｒ−３０８とＳｅｒ−４７３とのリン酸化が活性化に対して相乗効果をもたらすからである（非特許文献３８）。現在の研究の中から分かった重要な所見は、ＰＤＫ１とともに共移入されたときＰＫＢαがＳｅｒ−４７３でリン酸化されず、さらに、ＰＤＫ１の移入が、ＩＦＧ１による刺激後に成し遂げられたＳｅｒ−４７３のリン酸化のレベルに影響を及ぼさないことである。これらの実験によって、Ｓｅｒ−４７３でＰＫＢαをリン酸化するプロテインキナーゼがＰＤＫ１によって活性化されず、さらに、細胞コンテクスト内におけるＴｈｒ−３０８でのＰＫＢαのリン酸化によってＰＫＢαがＳｅｒ４７３で自己リン酸化しないことが実証される。Ｔｈｒ−３０８のリン酸化のように、Ｓｅｒ−４７３リン酸化は、インスリンまたはＩＧＦ１による刺激前にｗｏｒｔｍａｎｎｉｎで細胞を培養することによって予防される。Ｓｅｒ−４７３キナーゼがＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３によって活性化されるかどうか、または、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３とＰＫＢαとの結合がＳｅｒ−４７３キナーゼによるリン酸化を許容するようにコンホメーションを変化させるかどうかを知ることは興味深いことになるだろう。
【０１８２】
ＰＤＫ１は、ショウジョウバエ (fruit fly)の性分化、卵子生成(oogenesis)および精子生成(spermatogenesis)の制御に関連しているショウジョウバエプロテインキナーゼであるＤＳＴＰＫ６１と相同性を有することが分かった（非特許文献４０）。ＰＤＫ１とＤＳＴＰＫ１との相同性は、触媒領域内で５４％であったが、推定ＰＨ領域（図１１）ではさらに大きく（６１％の相同性）、このことによって、ＰＤＫ１のＰＨ領域に関する重要な機能的役目が暗示された。大腸菌内で発現されたＤＳＴＰＫ６１が、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３／ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２依存状態で、ヒトＰＫＢαを活性化し、さらに、特異的にＴｈｒ−３０８でそれをリン酸化した（図１２）。これら研究結果によって、ＤＳＴＰＫ６１がＰＤＫ１のショウジョウバエ相同体であることが示唆され、その役目の一つが数年前に同定されたＰＫＢのショウジョウバエ相同体（ＤＰＫＢと呼ばれる）を活性化させることであることが暗示される（非特許文献４８，４９）。フライ内でのＤＳＴＰＫ１の生理学的役目が何であるかがいまだ知られていないけれども、この論文に記述されている研究結果より、ＤＰＫＢが性分化および卵子生成を制御する信号経路中でＤＳＴＰＫの下流に位置しているだろうと暗示される（非特許文献４０）。ＰｔｄＩｎｓ３キナーゼが哺乳類細胞の中でＰＫＢの活性化に重要な役目を果たすことが知られているので（非特許文献４〜６，３４）、ショウジョウバエホスフォイノシチド３キナーゼ（ＰｔｄＩｎｓ３キナーゼ）もまたＤＰＫＢの活性化に重要な役目を果たすであろう。これもまた、フライ内でのＰｔｄＩｎｓ３キナーゼの役目についてほとんど知られていない（非特許文献５０）。Ｄｐ１１０と呼ばれるショウジョウバエＰｔｄＩｎｓ３キナーゼの触媒サブユニット(catalytic subunit)が、通常、構成性アクティブ、および、ドミナントネガティブ（優性陰性）形態(in a normal, a constitutively active and a dominant negative form)で、ショウジョウバエの羽および眼成虫原基(eye imaginal dises)内に過剰発現されたというこの論点に日付を付与するためにおよびこの論点に関して講演するために(to date to address this issue)、唯一の研究が出版された（非特許文献５１）。これら研究の結果によって、ＰｔｄＩｎｓ３キナーゼが、細胞成長を制御する中で役目を果たす傾向にあることが示された（非特許文献５１）。興味深いことに、インスリン受容体のショウジョウバエ相同体内における機能の損失変異体(loss of function mutations)、Ｉｎｒもまた眼成虫原基内で細胞成長を阻害し、その結果、天然型フライよりかなり小さくなった（非特許文献５２）。ひとまとめに考えてみると、これらの結果によって、ショウジョウバエＰｔｄＩｎｓ３キナーゼはインスリン受容体の重要なターゲットであり、恐らくは細胞成長を調整するだろうＤＰＫＢ全体に作用したことによって上記の結果になることが暗示された。
【０１８３】
ＤＳＴＰＫ６１遺伝子はショウジョウバエ（非特許文献４０）のオスとメスとでは異なるスプライシングをされる。全て同じオープンリーディングフレームを持つたくさんの異なる転写産物を生み出し、したがって同様のたんぱく質を産生するが、しかしそれらの５‘および３’非翻訳領域においてかなり異なる。ショウジョウバエ（非特許文献４０）のオスとメスとではＤＳＴＰＫ６１たんぱく質の発現レベルが異なるという結果になるかもしれない。哺乳類細胞におけるアポトーシスの制御におけるＰＫＢの役割の観点から見ると（導入部参照）、卵子生成、精子生成期中及び成人メスにおける性決定に関連におけるＤＳＴＰＫ６１の機能は細胞の生存又は細胞死の決定に関連しているかもしれないということも可能である。ある人は、ＤＳＴＰＫ６１の性別非特異的転写産物の低水準が細胞（非特許文献５１）中におけるＤｐ１１０の過剰発現の役割と一致した一般的成長に大きな役割があり、女性の死体(carcasses)と子宮及び男性の精巣において見られる特異的にスプライシングされた構造が特異的な時期にたんぱく質の高レベルの生成を翻訳的に導きながら操作されていることを想像できるかもしれない。ＭＡＰキナーゼカスケードの活性化の程度と期間は、ある信号がＰＣ１２細胞の増殖又はそれらの表現型のような交感神経ニューロンへの分化を誘導するかどうかを決定するのに重要である（非特許文献５２，５４）。同様に、ＤＳＴＰＫ６１の発現の異なる程度はその程度と期間に影響を与えるらしい。生体内におけるＰＫＢの活性化の程度と期間に影響を与えるようであり、それ故このキナーゼカスケードの正確な機能を決定するかもしれない。そのような状況が働くかもしれない性分化において取り込まれる２つの信号経路がある。一つめは交尾の間メスのハエを押さえておくために必要とされている腹部の成人オス特異的筋肉の発育が含まれる（非特許文献５５）。この筋肉は、隣接する神経細胞によって生産される未知の信号に応答してオスの中でのみ発育する。メスのハエのその領域における筋肉細胞をアポトーシスさせる信号経路だが、オスのハエにおいてはこれらの筋肉細胞の成長が促進される（非特許文献５５）。第２の経路は、体細胞由来の信号が生殖系列細胞の細胞生存を促進しそれらの精子と卵子への分化を誘導する信号経路を開始するオス及びメスの生殖腺における体細胞と生殖細胞の間で働く未知の信号機構を含む（非特許文献５６，５７）。これらの信号経路の両方の仲介因子は現在のところ知られていない、しかしこの論文において表される発見の中においてその未知の信号がＰｔｄＩｎｓ３‐キナーゼ、ＤＳＴＰＫ及びＤＰＫＢの活性化を導きこと、そしてこの経路の役割がアポトーシスを阻害することによって細胞生存の仲介をすることだろうと言いと得る。これらの信号経路の機能を理解するための将来の仕事はこれらの経路を切り替える特異的信号を同定することだけでなく、ショウジョウバエＤＳＴＰＫ６１、ＰＫＢ及びＰｔｄＩｎｓ３‐キナーゼ遺伝子の変異体を得ることに集中しなければならくなるだろう。卵子生成、精子生成及び性特異的筋肉分化の間のＩｎｒ，Ｄｐ１１０，ＤＳＴＫＰ６１及びＤＰＫＢの本質的な活性と優勢陰性体発現の効果を比較することはかな���面白いだろう。
【０１８４】
要約
背景
（ＰＫＢ、しかもｃ‐Ａｋｔとして知られる）プロテインキナーゼの活性化はインスリン又は成長因子によって刺激されてから数分以内に引き起こされ、Ｔｈｒ‐３０８及びＳｅｒ‐４７３でのリン酸化の結果である。ＰＫＢの活性化及びその両残基におけるリン酸化はホスフォイノシチド３−キナーゼの阻害因子によって阻害される、そして我々は最近Ｔｈｒ‐３０８でＰＫＢをリン酸化するプロテインキナーゼを同定及び精製した。この酵素は、ホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェイトＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３又はホスファチジルイノシトール３，４−ビスホスフェイトＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２を含んだ脂質小胞の存在下においてのみ活性化し、それ故ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３依存性プロテインキナーゼ‐１（ＰＤＫ１）と名づけられた。
【０１８５】
結果
我々は、ヒトＰＤＫ１の配列を読み取りそしてクローンした。その５５６残基、６３．１ｋＤａの酵素は、ＰＫＡ、ＰＫＢ及びＰＫＣを含むプロテインキナーゼのサブファミリーに最も類似している触媒部位（８３−３４４残基）を有し、そしてＣ末端プレクストリン相同（ＰＨ）領域（４５０‐５５０）を有する。ＰＤＫ１をコードするその遺伝子はヒト染色体１６ｐ１３．３に位置し、ヒト組織において偏在的に発現する。性分化、卵子生成及び精子生成の制御において、触媒領域において５４％の相同性があり、ＰＨ領域において６１％の相同性を有することで暗示されるように、ヒトＰＤＫ１はショウジョウバエプロテインキナーゼＤＳＴＰＫ６１に高度に相同的である。２９３細胞で発現されたＧＳＴ‐ＰＤＫ１及び大腸菌で発現されたＧＳＴ‐ＤＳＴＰＫ６１はグルタチオンセファロースクロトマトグラフィーによって精製され、そしてそれらの特性はウサギ骨格筋から分離されたＰＤＫ１から区別できないことで発見された。ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２又はＰｔｄＩｎｓ（３）ＰではなくＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３又はＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２の存在下において、ＧＳＴ‐ＰＤＫ１及びＧＳＴ‐ＤＳＴＰＫ６１両方はＧＳＴ‐ＰＢＫαをＴｈｒ‐３０８でリン酸化し、試験管内におけるその活性を化学量論的に３５倍に増加した。Ｍｙｃ抗原決定基標識ヒトＰＤＫ１は、２９３細胞における共遺伝子導入実験においてＨＡ標識ＰＫＢαを２０倍に活性化し、Ｔｈｒ‐３０８でのＨＡ標識ＰＫＢαのＩＧＦ‐１誘導リン酸化を可能に(potentiate)した。
【０１８６】
刺激しない２９３細胞においてのＰＤＫ１の過剰発現はＰＫＢアルファの２０倍の活性化をもたらしそしてＴｈｒ‐３０８でのＰＫＢαのＩＧＦ‐１誘導リン酸化を可能にした。ＰＤＫ１あるいはＰＫＢαいずれかのＰＨ領域が欠失される実験は、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３あるいはＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２のＰＫＢαへの結合がＰＤＫ1によるリン酸化及び活性化に対して必要とされることを示した。２９３細胞のＩＧＦ１活性化はＰＤＫ１の活性化又はリン酸化状態に影響を与えなかった。
【０１８７】
結論
ＰＤＫ１は、インスリン又は成長因子によるＰＫＢの活性化を仲介するらしい。ＤＳＴＰＫ６１はＰＤＫ１のショウジョウバエ相同体である、そして及びＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３／ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２又はこの生物内の性分化においてまだ特定されていない役目として振舞っているらしい。ＰＫＢαの活性化におけるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３／ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２の効果は少なくとも部分的には基質指向(directed)である。
【実施例６】
【０１８８】
ＰＤＫ１を活性化する物質についての分析
３−ホスフォイノシチドなしで、ＰＤＫ１、ＧＳＴ‐ＰＫＢα及びその基質ＲＰＲＡＡＴＦ（ＳＥＱＩＤＮｏ１）（実施例１に記載されるように）とともに実験を行った。ＰＫＢαの活性は見られなかった。物質はこの分析で試験され、ＰＤＫ１を通したＰＫＢαの活性化を引き起こす物質は更なる研究について選別される。ホスファチジルイノシトール−３，４，５‐トリホスフェイトはポジティブコントロールとして使われる。
【実施例７】
【０１８９】
ＰＤＫ１を不活性化する物質についての分析
分析がホスファチジルイノシトール−３，４，５‐トリホスフェイトを含むこと以外は上記と同様に行われる、そしてそれ故ＰＤＫ１は、ＰＫＢαをリン酸化することに関して活性である。
【０１９０】
物質はこの分析で試験され、ＰＤＫ１を通したＰＫＢαの不活性化を引き起こす物質は更なる研究について選別される。
【実施例８】
【０１９１】
この分析は、ＰＫＢαがＰＫＢβによって置き換えられていること以外実施例６と同様である。
【実施例９】
【０１９２】
この分析は、ＰＫＢαがＰＫＢγによって置き換えられていること以外実施例６と同様である。
【実施例１０】
【０１９３】
この分析は、ＰＫＢαがＰＫＢβによって置き換えられていること以外実施例７と同様である。
【実施例１１】
【０１９４】
この分析は、ＰＫＢαがＰＫＢγによって置き換えられていること以外実施例７と同様である。
【実施例１２】
【０１９５】
ＰＤＫ１のホスファチジルイノシトール−３，４，５‐トリホスフェイト結合に対して競合する物質についての分析
ＰＤＫ１は、試験物質の存在下放射標識されたホスファチジルイノシトール−３，４，５‐トリホスフェイトとともに培養される。その試験物質の存在下でのリン脂質のＰＤＫ１への結合はその試験物質の不存在下における結合と比較される。
【０１９６】
その結合を減少あるいは強化する物質は更なる研究のために選ばれる。
【０１９７】
その実験は、放射標識されていないＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を用いて実行されても良い。
【実施例１３】
【０１９８】
ＰＤＫ１を活性化する物質についての分析
実験は、ＰＤＫ１とｐ７０Ｓ６０キナーゼを用いて実行される。３−ホスフォイノシチドは存在しないことが必要である。この分析において物質は分析され、そしてＰＤＫ１（及びｐ７０Ｓ６キナーゼのリン酸化の向上を導く）を活性化する物質が選別される。
【実施例１４】
【０１９９】
ＰＤＫ１を活性化する物質についての分析
機能性ＰＨ領域を欠失するＰＤＫ１及びＰＫＢαを用いて分析は行われる。３−ホスフォイノシチドは存在しないことが必要である。この分析において物質は分析され、そしてＰＤＫ１（及び機能性ＰＨ領域を欠失するＰＫＢαのリン酸化の向上を導く）を活性化する物質が選別される。
【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１】精製されたＧＳＴ‐ＰＫＢαのＳＤＳポリアクリルアミドゲル。２９３細胞は一時的にＧＳＴ‐ＰＫＢαを発現するｐＥＢＧ２ＴＤＮＡ構成物を用いて遺伝子導入された、無血清で１６時間、そして細胞の後、ＧＳＴ‐ＰＫＢαはグルタチオン−セファロースのアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。“セファロース”は商標である。グルタチオン−セファロース溶出物（３μｇたんぱく質）は１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動され、そしてクマシーブルーで染色された。“クマシー” は商標である。分子質量マーカーの位置は、グリコーゲンホスフォリラーゼ（９７ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン(６７ｋＤａ)、オバアルブミン（４３ｋＤａ）が指示される。
【図２】ＧＳＴ‐ＰＫＢαを活性化するＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３依存性プロテインキナーゼ（ＰＤＫ１）の同定と精製。続いてＰＥＧ沈殿ＰＤＫ１はＳＰ‐セファロース(Ａ)及びヘパリン−セファロース(Ｂ) で順次クロマトグラフされて、そしてその後者のカラムからのピーク２（Ｐｅａｋ２）はＭｏｎｏＳでクロマトグラフされた(手順参照)。“ＭｏｎｏＳ” は商標である。１００μＭＰｔｄＣｈｏ、１００μＭＰｔｄＳｅｒ、１０μＭＤ体のシン−１−ステアロイル−２−アラキドニル−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３（開環）を含むリン脂質小胞あるいは１００μＭＰｔｄＣｈｏ、１００μＭＰｔｄＳｅｒ（閉環）のみを含む小胞の存在下においてＰＤＫ１活性は分析された。破線は塩勾配を示しておりそして実線は２８０ｎｍにおける吸光度を示している。ＭｏｎｏＳカラムから流出されたたんぱく質の量は少なすぎて２８０ｎｍでの吸光度は見られなかった。
【図３Ａ】ＰＫＤ１はＧＳＴ‐ＰＫＢαをリン酸化及び活性化する。ＧＳＴ‐ＰＫＢαは、緩衝溶液Ｂ中でＰＤＫ１（１２Ｕ／ｍｌ）、１０ｍＭＭｇ（Ａｃ）２，１００μＭ｛γ３２Ｐ｝ＡＴＰ、及び１００μＭＰｔｄＣｈｏ、１００μＭＰｔｄＳｅｒ、１０μＭＤ体のシン−１−ステアロイル−２−アラキドニル−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を含んだ小胞とともに培養された。様々な時間について、分割量が取り出され、そしてＰＫＢ活性（閉環）あるいはＰＫＢα（開環）中へのリン酸塩の組み込みについて分析された。ＰＤＫ１が反応混合物から取り除かれたコントロール実験に比較して活性は表されている。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ後ＧＳＴ‐ＰＫＢαのバンドに関連するγ３２Ｐ放射活性を計測することによりリン酸化は評価された。
【図３Ｂ】ＰＫＤ１はＧＳＴ‐ＰＫＢαをリン酸化及び活性化する。ＰＤＫ１、ＡＴＰ、及びＰｔｄＳｅｒ／ＰｔｄＣｈｏ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を除くこと、ＰＤＫ１を５５度で２分間加熱すること、またはＰＤＫ１中において０．５％のトリトンＸ‐１００（質量に関して）を加えることの効果を除いた場合の（Ａ）と同様の分析が研究された。この分析は６０分間行われた。裸のバーはＧＳＴ‐ＰＫＢαの活性を示し、ハッチバーはＰＤＫ１、ＡＴＰ、及びＰｔｄＳｅｒ／ＰｔｄＣｈｏ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の存在していたコントロール分析に比較したリン酸化を示している。その結果は、±ＳＥＭ（２回の独立実験についての６回の測定に対する）の形で表す。
【図４】ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３に対するＰＤＫ１活性の独立性。ＧＳＴ‐ＰＫＢα（０．５μＭ）が、一定濃度のＰｔｄＣｈｏおよびＰｔｄＳｅｒ（開環ごとに１００μＭ）あるいはＰｔｄＳｅｒ／ＰｔｄＣｈｏ（閉環）の１０モル倍過剰量において、ＰＤＫ１（１２Ｕ／ｍｌ）、１０ｍＭＭｇＡｃ，１００μＭ｛γ３２Ｐ｝ＡＴＰ及び指示された濃度のＭＤ体のシン−１−ステアロイル−２−アラキドニル−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３をとともに培養された。３０分後反応（Ａ）及びのリン酸化（Ｂ）の程度は材料と手段において記載されるように評価される。その結果は、３測定づつ行われる２回の実験に対して±ＳＥＭの形で表す。
【図５】Ｔｈｒ‐３０８でＰＫＢαをリン酸化するＰＫＤ１。（Ａ）ＧＳＴ‐ＰＫＢαはＰＤＫ１（１２Ｕ／ｍｌ）と、及び１００μＭＰｔｄＣｈｏ、１００μＭＰｔｄＳｅｒ、１０μＭＤ体のシン−１−ステアロイル−２−アラキドニル−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３とＭｇ［γ３２Ｐ］ＡＴＰ（図３の凡例参照）を含むリン酸小胞とともに６０分間培養することによってリン酸化され、そのときアルカリ化されそしてトリプシンで（手法参照）によって消化された。この消化物は０．１％（ｖ／ｖ）トリフロロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液中で平衡化されたＶｙｄａｃ２１８ＴＰ５４カラム（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ、Ｈｅｓｐａｒｉａ、ＣＡ）、に適用された。このカラムはアセトニトリル勾配（対角線状）で０．８ｍｌ／分の流率で展開され、０．４ｍｌの分画が回収された。このカラムに用いられた放射活性の３５％は２６％のアセトニトリルにおける（その放射活性の残存物はたくさんの小さなピークとして流出した）主要な３２Ｐ含有ペプチドから回収された。Ｔｈｒ‐３０８とＳｅｒ‐４７３を含むトリプシン性たんぱく質の流出位置は印付けされている（非特許文献１５）。（Ｂ）Ａからの主要な３２Ｐ含有たんぱく質の一部分はＳｅｑｕｅｌｏｎアリルアミン膜に共有的に結合され、（非特許文献３０）に記載される改良されたプログラムを使ってＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７０Ａ配列読取装置で分析された。３２Ｐ放射活性は各エドマン分解毎に測定された。
【図６】ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３とＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２脂質による特異的且つ立体特異的に活性化されるＰＤＫ１。ＧＳＴ−ＰＫＢαはＭｇ［γ３２Ｐ］ＡＴＰとともに３０分３０度でＰＤＫ１と、１００μＭＰｔｄＣｈｏ、１００μＭＰｔｄＳｅｒ、種々のＰｔｄＩｎｓ脂質（１−１１に番号付けられた、以下参照）又はＩｎｓ（１，３，４，５）Ｐ４とを分析中全て１０μＭの最終濃度において含むリン酸小胞の存在下（実バー）及び不存在下（空バー）において培養された。反応は１％（質量に関して）のトリトンＸ−１００を加えることによって終結されそして（Ａ）においてＧＳＴ−ＰＫＢαの活性は手法の後に記載されるようにして決定された。（Ｂ）ＧＳＴ−ＰＫＢαのリン酸化はＧＳＴ‐ＰＫＢα（図１）に対応するクマシー染色体のラジオグラフィーによって評価された。その結果はＧＳＴ‐ＰＫＢαの活性の数倍±ＳＥＭ（３回の独立実験についての６−８回の測定に対する）の形で表す。脂質１と２はそれぞれＤおよびＬ体のシン−１−ステアロイル−２−アラキドニル−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３であり、脂質３及び４はそれぞれＤおよびＬ体のシン−２−アラキドニル−３−ステアロイル−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３である。脂質５はシン−１，２−ジリノレオイル−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３のラセミ体である。残りの脂質は全てＤ体である。脂質６はシン−１，２−ジパルミトイル−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３、脂質７はシン−１，２−ジパルミトイル−ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２、脂質８はシン−１，２−ジパルミトイル−ＰｔｄＩｎｓ（３，５）Ｐ２である。脂質９はＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２、脂質１０はＰｔｄＩｎｓＰ４これらはともに１型脳抽出物フォルク分画由来の精製された脂質である。脂質１１はシン−１，２−ジパルミトイル−ＰｔｄＩｎｓＰ３である。ＩＰ４はＩｎｓ（１，３，４，５）Ｐ４である。
【図７】インスリンがＰＫＢαの活性化を誘導する提案機構。インスリンによるインスリン受容体の活性化はその受容体のいくつかのチロシン残基において自身をリン酸化させる。これはインスリン受容体気質−１（ＩＲＳ−１）とＩＲＳ−２の合体およびインスリン受容体による複数のチロシン残基でのそれらのリン酸化とを導く。  ＰＩ３キナーゼのｐ１１０触媒サブユニットの細胞膜への補充とその活性化（非特許文献３１）とを導きながら、ＩＲＳ‐１およびＩＲＳ−２上のいくつかのリン酸化されたチロシン残基はＰＩ３キナーゼのｐ８５サブユニット上のＳＨ２領域と相互作用する。そこでＰＩ３キナーゼはイノシトール環のＤ‐３位置でＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２をリン酸化する、結果として第２伝達ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の値（典型的細胞において）は細胞膜（非特許文献３１）おいて０．１％から１−２％の含量である第２伝達ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の構成となる。Ｔｈｒ３０８でリン酸化することによってＰＫＢαをある程度活性化するＰＤＫ１とＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３は相互作用しそして活性化する。未知のキナーゼによるＳｅｒ−４７３のリン酸化をＰＫＢαの最大限の活性化には必要とする。Ｔｈｒ−３０８のような、Ｓｅｒ−４７３のインスリン誘導リン酸化はＰｔｄＩｎｓ３キナーゼの阻害因子によって阻害される、そして明らかな３−ホスフォイノシチド依存性プロテインキナーゼ（ＰＤＫ２）によりＳｅｒ−４７３がリン酸化されるかもしれないということを提起している。しかしながら、Ｓｒｅ−４７３がこの文章中で議論されている機構によって３−ホスフォイノシチドによって間接的に活性化されるかもしれない。このため、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３からＳｅｒ−４７３のリン酸化までの経路は、ＰＤＫ２以後のクエスションマークをつけた破線によって示されている。骨格筋において、ＰＫＢαの活性化はグルコース摂取（非特許文献９）およびグリコーゲン合成率（非特許文献７）を上昇させ、且つたんぱく質翻訳（非特許文献８）をも刺激するかもしれない。ニューロンおよび他の細胞において、ＰＫＢαはアポトーシスを抑制（非特許文献１０，１１）することによって生存信号を与えるかもしれない。
【図８】ＩＭＡＧＥ協会クローンＩＤ５２６５８３の詳細。
【図９】ＩＭＡＧＥ協会クローンＩＤ６２６５１１の詳細。
【図１０】ＰＤＫ１（ＳＥＱＩＤＮｏ２、ＳＥＱＩＤＮｏ３）の塩基配列及びアミノ酸配列。
【図１１】ヒトＰＤＫ１およびショウジョウバエＤＳＴＰＫ６１のアミノ酸配列のアラインメント。このアラインメントはＣｌｕｓｔａｌＷプログラム（非特許文献６１）を使って実行された。あすたりすくはＰＤＫ１とＳＴＫ６１間の相同性を示している。この触媒領域はＰＤＫ１の８３−３４２残基及びＳＴＫ６１の１６５−４８７残基を含んでいる。推測上のＰＨ領域はＰＤＫ１の４５０−５５０残基間及びＳＴＫ６１の５８１−６８４残基間にある。
【図１２】ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３  又はＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２依存的な方法において、ＧＳＴ−ＰＤＫ１およびＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１はＰＫＢαを活性化およびリン酸化する。ＧＳＴ−ＰＫＢαは５Ｕ／ｍｌＧＳＴ−ＰＤＫ１（パネルＡ、Ｂ）又はＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１（パネルＣ，Ｄ）と、Ｍｇ［γ３２Ｐ］ＡＴＰと１００μＭＰｔｄＣｈｏ、１００μＭＰｔｄＳｅｒ、種々のＰｔｄＩｎｓ脂質（１−５に番号付けられた、以下参照）ただし分析中全て１０μＭの最終濃度において含むリン酸小胞体とともに３０分間３０度で培養された。これらの条件下では、ＰＫＢαの活性化及びリン酸化の増加は時間に対して線形的だった（手法参照）。パネルＡおよびＣにおいて、反応は１％（質量に関して）のトリトンＸ−１００（非特許文献３９）中で培養することによって終結され，そしてＧＳＴ−ＰＫＢαの特異的活性における増加が決定された。パネルＢ、Ｄにおいて、その反応はその溶液を１％のＳＤＳ溶液にすることで停止され、その試料はＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動に任され、そのリン酸化はＧＳＴ−ＰＫＢαに対応するクマシーブルー染色体のラジオグラフィーによって評価された。その結果はパネルＡおよびＣにおいてはＧＳＴ−ＰＫＢα（Ｕ／ｍｇ）の特異的活性におけるＧＳＴ−ＰＤＫ１およびＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１が除去されたコントロール培養と比較した増加として表された（±ＳＥＭは３回の独立実験についての６−９回の測定に対する）。あらゆる条件下において、ＧＳＴ−ＰＫＢαの活性化及びリン酸化における上昇は時間と線形的だった。トラック１、緩衝溶液コントロール；トラック２、シン−１−ステアロイル−２−アラキドニル−Ｄ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３；トラック３、シン−１，２−ジパルミトイル−Ｄ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２；トラック４、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２（フォルク脳分画から精製された）；トラック５、シン−１，２−ジパルミトイル−Ｄ−ＰｔｄＩｎｓ３Ｐ。
【図１３】ＰＫＤ１はＰＫＢαをＴｈｅ３０８でリン酸化する。ＧＳＴ−ＰＫＢαは２５Ｕ／ｍｌのＧＳＴ‐ＰＫＤ１（Ａ）あるいはＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１（Ｂ）とＰｔｄＣｈｏ、ＰｔｄＳｅｒ、シン−１−ステアロイル−２−アラキドニル−Ｄ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３、Ｍｇ［γ３２Ｐ］ＡＴＰ（１０６ｃｐｍ ／ｎｍｏｌ）を含むリン脂質小胞体とともに３０分間培養することによって最大限にリン酸化された。３０分後、その試料は４−ビニルピリジンでアルキル化され、トリプシン（非特許文献３９）で消化され、そして０．１％(ｖ／ｖ)のトリフロロ酢酸(ＴＦＡ)で平衡化されたＶｙｄａｃ２１８ＴＰ５４  Ｃ１８カラム(Ｓｅｐａｐａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ、Ｈｅｓｔｅｒｉａ、ＣＡ)に適用した。そのカラムは流率０．８ｍｌ／分でアセトニトリルの線形勾配（対角線）で展開され、０．４ｍｌの分画が回収された。このカラムに適用された放射活性の３８％（パネルＡ）と４５％（パネルＢ）が２６％のアセトニトリルで流出してきた主要な３２Ｐから回収されたが、それはＴｈｒ３０８を含んでいる。Ｓｅｒ４７３を含んでいるトリプシン性のペプチドの流出位置はしかも印付けられている（非特許文献３８及び図１５参照）。
【図１４】２９３細胞においてＰＤＫ１での共遺伝子導入によってＰＫＢαは活性化される。（Ａ）２９３細胞は、ＨＡ−ＰＫＢα又はＨＡ−ＰＫＢαとＭｙｃ−ＰＤＫ１の両方を発現しているＤＮＡ構成物を一時的に遺伝子導入された。その細胞はそこで１０分間５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１で又はそれなしで刺激され、ＨＡ−ＰＢＫαは溶菌液から免疫沈澱され、そして分析された。その結果は、刺激されていない２９３細胞（０．０３±０．５Ｕ／ｍｇ）において天然型ＨＡ−ＰＫＢαの特異的活性と比較して表された。無ＰＫＢα活性は、ＰＣＭＶ５ベクターのみで遺伝子導入された細胞における擬似遺伝子導入において検出された（データは記載しない）。（Ｂ）各溶菌液から６マイクロｇのたんぱく質が１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルで電気泳動され、ＨＡ−ＰＫＢαを検出するためのモノクローナルＨＡ抗体あるいはＭｙｃ−ＰＫＤを検出するためのモノクローナルＭｙｃ抗体を使って免疫ブロットとされた。分子質量マーカーは、グリコーゲンホスフォリラーゼ（９７ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン(６７ｋＤａ)、オバアルブミン（４３ｋＤａ）である。
【図１５】細胞内のＰＤＫ１の過剰発現はＴｈｒ３０８でのリン酸化を誘導する。天然型ＨＡ−ＰＫＢα（パネルＡとＣ）あるいはＨＡ‐ＰＫＢαとＭｙｃ−ＰＤＫ１（パネルＢとＤ）を用いて一時的に遺伝子導入された２９３細胞は，３２  Ｐ‐オルトホスフェイトを用いて培養され、そして５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１無し（パネルＡとＢ）又は有り（パネルＣとＤ）で１０分間処理される。３２  Ｐ標識されたＨＡ−ＰＫＢαは溶菌液から免疫沈澱され、４−ビニルピリジンで処理され、そして１ １０％のポリアクリルアミドゲルで電気泳動された。そのＨＡ‐ＰＢＫαはそのゲルから切り取られ、トリプシンで消化され、そしてＳｅｒ−１２４、Ｓｅｒ４７３、Ｔｈｒ３０８とＴｈｒ４５０それぞれの位置（非特許文献３８）でリン酸化されている４つの主要なホスフォペプチドを分離するためにＣ１８カラム（図１３の凡例参照）でクロマトグラフされた。それぞれのホスフォペプチドの同一性はリン酸−アミノ酸分析及び固相配列分析によって確定された。類似の結果は２つの別個の実験（パネルＡとＢ）及び別個の３つの実験（パネルＢとＤ）から得られた。
【図１６】ＰＫＢαとＰＫＤ１のＰＨ領域の役割。（Ａ）２０μｌの実験において、０．５μｇのＧＳＴ−ＰＫＢαあるいはＧＳＴ−ΔＰＨ−ＰＫＢαは２．３ｎＭのＧＳＴ‐ＰＫＤ１（１−５５６残基）とＭｇ［γ３２Ｐ］ＡＴＰと１００μＭＰｔｄＣｈｏ、１００μＭＰｔｄＳｅｒ含むリン酸小胞とともに、１０μＭのＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の存在下あるいは不存在下において３０℃で３９分間培養された。この分析は、実施例１のように１％（質量に関して）のトリトンＸ‐１００を加えることによって終結され、ＧＳＴ−ＰＫＢαの特異的活性の上昇が決定された。ＧＳＴ−ＰＫＢαの基礎活性は２．５Ｕ／ｍｇであり、ＧＳＴ−ΔＰＨ−ＰＫＢα基礎活性は８Ｕ／ｍｇである。この分析に使われたＧＳＴ−ＰＫＢαの高濃度において、天然型完全長ＧＳＴ−ＰＫＢαの活性化率は時間と線形的にはならないが、しかしＧＳＴ−ΔＰＨ−ＰＫＢαの活性化は線形的である。ＧＳＴ−ＰＫＤ１の２０倍定濃度においてこの実験が実行されると、２．３ｎＭ  ＧＳＴ−ＰＫＤ１対するＧＳＴ‐ΔＰＨ−ＰＫＢαについての図において示されるように、天然型ＧＳＴ−ＰＫＢαの類似の活性化の程度が達成される。０．５μｇのＧＳＴ−ＰＫＢαを除いては（Ａ）と同様に、２．５ｎＭのＧＳＴ−ΔＰＨ−ＰＤＫ１（１−４５０残基）とともに１００μＭＰｔｄＣｈｏ、１００μＭＰｔｄＳｅｒと１０μＭのどちらか；シン−１−ステアロイル−２−アラキドニル−Ｄ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３（トラック１）；シン−１−ステアロイル−２−アラキドニル−Ｌ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３（トラック２）；シン−１，２−ジパルミトイル−Ｄ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２（トラック３）；シン−１，２−ジパルミトイル−Ｄ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３（トラック４）；ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２（フォルク脳分画から精製された  トラック５）；シン−１，２−ジパルミトイル−Ｄ−ＰｔｄＩｎｓ３Ｐ（トラック６）含むリン酸小胞の存在下あるいは不存在下において培養された。この結果は，ＧＳＴ−ＰＤＫ１が除去されたコントロール培養と比較したＧＳＴ−ＰＫＢα（Ｕ／ｍｇ）の特異的活性における増加として表される。
【図１７】ＰＤＫ１とＤＳＴＰＫ６１がペクストリン相同領域を有する証拠。ＰＨ領域の配列アラインメントは、ＰＤＫ１及びＤＳＴＯＫ６１の推測上のＰＨ領域を有する既知の三次元構造をもっている。アラインメントはＡＭＰＳ（Ｂａｒｔｏｎ＆Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１２，３８９‐４０２）を使い行われ、そしてＡＭＡＳ（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ＆Ｂａｒｔｏｎ（１９９３）Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏ．Ｓｃｉ．９，７４５−７５６）を使いながら２次構造領域の一致を確かめるためいくつかの手動調整を用いて初期化された。保存されている残基は緑に着色され、不変トリプトファン（Ｔｒｐ−５３５）は赤く着色される。２次構造の一般領域は青（ベータストランド）及び緑（αへリックス）結合によって記載される。プレクストリン相同配列はヒトプレクストリン、ＰＬＳ；ヒトスペクトリン、ＳＰＣ；ヒトダイナミンＤＮＹ、及びラットホスフォリパーゼＣ−δ、ＰＬＣδにおいて見つかる配列である。（図１０）
【図１８】精製されたＧＳＴ−ＰＤＫ１及びＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１のＳＤＳポリアクリルアミドゲル。５２−５５６残基をコードしているＧＳＴ−ＰＤＫ１（レーン１．３μｇたんぱく質）及びＧＳＴ−ＤＳＴＰＫ６１（レーン２．６μｇたんぱく質）は１７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動され、そしてく、クマシーブルーで染色された。分子質量マーカーは、グリコーゲンホスフォリラーゼ（９７ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン(６７ｋＤａ)、オバアルブミン（４３ｋＤａ）で指示される。この研究で使用されるＧＳＴ−ＰＤＫ１構成物は全てレーン１において示されるＧＳＴ−ＰＤＫ１調整のように同様の水準の純粋さで発現された。（データは示さない）
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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