(57)【要約】【課題】異なる蛍光体で標識した複数種類の生体物質の同時検出において、一定の露光時間で発光した蛍光を高感度に検出する光検出装置を提供する。【解決手段】サンプル中のターゲットより発光した光を対物レンズ１３で集光した後に分割し、一方を非波長分散像に用い、他方をプリズム１４による波長分散像に用いる。【選択図】図１
2005321347.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液を満たすセルと、
前記セルに励起光を照射する励起光学系と、
前記励起光の照射によって試料中の粒子から発生された蛍光を集光する集光光学系と、
前記集光光学系で集光された蛍光を２分割する光分割素子と、
第１及び第２の２次元検出器と、
前記光分割素子で分割された一方の光束を波長分散することなく前記第１の２次元検出器上に非波長分散像として結像する第１の結像光学系と、
前記光学素子で分割された他方の光束をプリズムによって波長分散して前記第２の２次元検出器上に波長分散像として結像する第２の結像光学系と、
を含むことを特徴とする光検出装置。
【請求項２】
請求項１に記載の光検出装置において、前記粒子は生体物質粒子であり、種類が同じ生体物質粒子は同じの蛍光体で標識され、種類が異なる生体物質粒子は異なる蛍光体で標識されていることを特徴とする光検出装置。
【請求項３】
請求項１に記載の光検出装置において、前記光分割素子はハーフミラーまたはプリズムであることを特徴とする光検出装置。
【請求項４】
請求項１に記載の光検出装置において、前記光分割素子は、前記非波長分散像に用いる光量が前記波長分散像に用いる光量より小さくなるように、分割比率が設定されていることを特徴とする光検出装置。
【請求項５】
請求項１に記載の光検出装置において、前記第１の２次元検出器と第２の２次元検出器は１つの２次元検出器の第１の領域と第２の領域であることを特徴とする光検出装置。
【請求項６】
請求項１に記載の光検出装置において、前記セルは試料溶液を流通させるセルであることを特徴とする光検出装置。
【請求項７】
請求項１に記載の光検出装置において、前記集光光学系で集光された蛍光を分割する光分割素子に代えて、前記集光光学系で集光された蛍光を前記一方の光束の光路と前記他方の光束の光路に切り替える光路切替手段を備えることを特徴とする光検出装置。
【請求項８】
試料溶液を満たすセルと、
前記セルに励起光を照射する励起光学系と、
前記励起光の照射によって試料中の粒子から発生された蛍光を集光する集光光学系と、
前記集光光学系で集光された蛍光を２分割する光分割素子と、
第１及び第２の２次元検出器と、
前記光分割素子で分割された一方の光束を波長分散することなく前記第１の２次元検出器上に非波長分散像として結像する第１の結像光学系と、
前記光学素子で分割された他方の光束をプリズムによって波長分散して前記第２の２次元検出器上に波長分散像として結像する第２の結像光学系と、
を含み、
前記励起光学系は、前記集光光学系の光軸方向に薄く、前記集光光学系の光軸と直交する方向に伸長したシート状の励起光を照射し、
前記光分割素子は、前記非波長分散像に用いる光量が前記波長分散像に用いる光量より小さくなるように、分割比率が設定されていることを特徴とする光検出装置。
【請求項９】
試料溶液を満たすセルと、
前記セルに励起光を照射する励起光学系と、
前記励起光の照射によって試料中の粒子から発生された蛍光を異なる２方向から集光する第１の集光光学系及び第２の集光光学系と、
第１及び第２の２次元検出器と、
前記第１の集光光学系で集光された蛍光を波長分散することなく前記第１の２次元検出器上に非波長分散像として結像する第１の結像光学系と、
前記第２の集光光学系で集光された蛍光をプリズムによって波長分散して前記第２の２次元検出器上に波長分散像として結像する第２の結像光学系と、
を含むことを特徴とする光検出装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の光検出装置において、前記第１の集光光学系の光軸と前記第２の集光光学系の光軸は一直線上にあることを特徴とする光検出装置。
【請求項１１】
請求項１０に記載の光検出装置において、前記励起光学系は、前記第１及び第２の集光光学系の光軸方向に薄く、前記第１及び第２の集光光学系の光軸と直交する方向に伸長したシート状の励起光を照射することを特徴とする光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子やタンパク質等の生体物質関連の分子、またはその集合体である粒子を検出し、これを分析する光検出装置に関し、特に、特定種類の生体物質分子を蛍光標識し、これを単分子計測により検出することで、特定種類の生体物質を分析する光検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、特定種類の生体分子（ターゲット）を1分子単位で観察し、これらを分析する為の手段として、単分子計測が注目されている。ターゲットを特異的に蛍光標識し、レーザ等の励起光を照射することで蛍光を発光させる。その蛍光を、開口数の高い対物レンズを用いて高い集光効率で集光し、高い分解能で結像することで、CCDカメラ等の2次元検出器で高感度に検出する。ターゲット1分子からの蛍光は、2次元検出器上で1つの輝点として結像され、その蛍光像を検出することでターゲットの分析を行う。単分子計測では、1分子単位で検出を行うため、ターゲットが微量であっても、ターゲットの増幅工程を用いることなく、迅速・正確に検出を行うことが可能となる。
【０００３】
単分子計測による検出を行うことで、様々なターゲットの分析が可能となる。例えば非特許文献1に、単分子計測を用いた遺伝子変異検出法が記載されている。ここではターゲットとして、嚢胞性繊維症に関わるCFTR遺伝子の変異部位（G542X）を用いている。野生型と変異型が混在しているサンプルに対して、それぞれを異なる蛍光体で標識して単分子計測を行っている。一定体積中に検出されたそれぞれの蛍光体の比より、野生型と変異型の比を求めている。また、非特許文献2には単分子計測を用いた免疫検査法が記載されている。ここではターゲットとして、前立腺ガンの診断に有効であるPSA（前立腺特異抗体）タンパク質の検出を行っている。従来のPSA免疫分析ではELISA法を用いるが、この方法の検出限界は100pg/mlである。しかし単分子計測を用いることで、検出限界が0.1pg/mlまで向上したことが報告されている。いずれの場合でも単分子計測の利点を生かし、それぞれの従来法に比べて微量・高速・高感度な分析を実現している。
【０００４】
以上のように、単分子計測は微量の生体物質の検出や分析を、簡便・迅速・正確・高感度に行うことが出来る優れた技術である。単分子計測を、遺伝子やタンパク質等の検出や発現定量等に応用することで、疾病マーカーのスクリーニングや病気の診断が可能となる。更に病気に関与する生体物質と、これに相互作用する分子をモニタリングすることで、新薬の創製へ繋がると期待できる。
【０００５】
単分子計測において複数種類のターゲットを同時に分析する場合、各ターゲットを異なる蛍光体で標識し、これらを識別しながら単分子計測を行う多色検出が必要となる。１種類のターゲット分子を分析する場合も、不純物由来の散乱光との区別をして、その検出精度を向上させるためには多色検出が有効となる。多色検出には、バンドパスフィルターを用いる方法と、波長分散を用いる方法がある。
【０００６】
特許文献1に、バンドパスフィルターを用いて多色検出を行う光検出装置が記載されている（従来技術1）。2種類のターゲットを異なる2種類の蛍光体で標識し、蛍光体から発光した蛍光を対物レンズによって平行光にし、ビームスプリッターで2分割する。分割した光はそれぞれ、2種類の蛍光体の蛍光波長を通すバンドパスフィルターを透過され、結像レンズによって集光され、異なる２次元検出器上で検出される。それぞれの検出器上で検出された蛍光強度を比較し、どのバンドパスフィルターを透過した光が強いのかを調べることで、2種類の蛍光体を識別することが可能となる。このように、バンドパスフィルターを用いた装置構成により、蛍光体を識別することが可能となり、2種類のターゲットを同時に検出することが出来る。
【０００７】
非特許文献3に、波長分散を用いて多色検出を行う光検出装置が記載されている（従来技術2）。ここでは、グレーティングを用いて蛍光の波長分散を行っている。レーザ光で励起された蛍光を対物レンズで集光し、透過型グレーティングにより波長分散を行い、2次元検出器上で結像する。このとき、2次元検出器上に0次光（非波長分散光）と1次光（波長分散光）の両方の光が検出されるように検出器を配置する。ここで0次光により得られた像を非波長分散像とし、1次光により得られた像を波長分散像とする。非波長分散像と波長分散像の位置関係、及び波長分散像の蛍光強度分布より、発光蛍光の蛍光スペクトルを取得することが出来る。このように、透過型グレーティングを用いて蛍光体を識別することで、複数ターゲットの多色検出が可能となる。
【０００８】
なお、従来技術1、2に記載の装置は、複数のターゲット分子からの複数の発光を同時かつ独立に多色検出することが可能である。
【０００９】
【特許文献１】特開2003-270147号公報
【非特許文献１】Nat.genet.,19,225-232（1998）
【非特許文献２】Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,10113-10119（2000）
【非特許文献３】Anal.Chem.,72,4640-4645（2000）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
単分子計測では、ターゲット1分子を1つの像として検出するため、非常に高感度な検出が求められる。つまり検出感度が低いと、単分子からの発光蛍光を検出することは不可能となる。感度を向上させるためには、一般的に背景光の低減、蛍光の集光効率の向上、蛍光の受光効率の向上が有効である。単分子計測を行う際には、ターゲットをバッファー等に溶解して計測するため、バッファーからの散乱が背景光の原因となる。従って、背景光を低減するためにはバッファーからの散乱を低減する、つまりレーザ照射領域の厚さを薄くすること等が有効となる。また、集光効率の向上のためには、高開口数の対物レンズを用いることが有効であり、受光効率の向上のためには、透過特性の優れた光学素子を用いることが有効である。ここで受光効率を、全集光量のうち検出器に到達し、検出に利用される光量の割合で定義する。従来法によって多色検出を行う場合、以下に説明するように、受光効率が低下するために検出感度が低下する。
【００１１】
従来技術1のようにバンドパスフィルターを用いる方法では、同時に多色（N色）検出したい場合、ビームスプリッターによって対物レンズにより集光した蛍光の光量（全集光光量）をN分割し、それぞれを異なるバンドパスフィルターに透過させる必要がある。このため、利用される蛍光光量は、全集光光量の1/Nに低下する。即ち、受光効率が１/Nに低下する。このとき、いずれのバンドパスフィルターも透過しない蛍光光量（全集光光量×（1−1/N））は、無駄にされている。その結果、装置の検出感度は低下する。また1種類のみの蛍光体を検出する場合でも、様々な種類の蛍光体に対応するためには多数のフィルターを持つ装置でなければならないため、複雑な装置構成になるという問題点も挙げられる。
【００１２】
従来技術2においては、グレーティングを用いるため、0次光と1次光以外の光を無駄にしているという問題点がある。グレーティングは、0次光と1次光以外にも2次光、3次光、−1次光等いくつにも光が分割される。回折効率はグレーティングの性能に依存するが、例えば格子周波数が110本/mmの透過型グレーティング（46073-E、エドモンド社）では、0次光、1次光の回折効率はそれぞれ28%、25％である。ここで、0次光と1次光の回折効率を足し合わせたもの、つまり全集光光量のうち検出に用いた光量の割合を受光効率（％）とすると、受光効率は53%と低く、残りの47%の光は検出に用いられていない。そのため、装置の検出感度は低下し、単分子計測において不利となる。また従来技術２では、グレーティングで波長分散した後に１つの２次元検出器上に結像させるため、光学系によっては非波長分散像と波長分散像が２次元検出器上で重なることがある。像が重なると非波長分散像と波長分散像の対応がつけられず、蛍光の識別が困難になる。
【００１３】
波長分散を用いて多色検出を行う場合、非波長分散像と波長分散像の位置関係、及び波長分散像の蛍光強度分布より、発光蛍光の蛍光スペクトルを取得することで蛍光体の識別を行う。このため、多色検出には非波長分散像と波長分散像の両方が必要である。波長分散像は２次元検出器上で多数の画素に分布して検出される。そのため、非波長分散光と波長分散光を同一光量で検出する場合、波長分散像の感度が非波長分散像の感度と比較して低くなる。波長分散像の感度低下は検出系全体の感度低下となる。受光効率を高く保ちつつ、非波長分散像と波長分散像に用いる光量を自由に設定できれば全体の感度を向上することが可能となるが、グレーティングを用いた場合は実現困難である。
【００１４】
本発明の目的は、異なる蛍光体で標識した複数種類の生体物質の同時検出において、一定の露光時間で発光した蛍光を高感度に検出する光検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明による光検出装置は、試料溶液を満たすセルと、セルに励起光を照射する励起光学系と、励起光の照射によって試料中の粒子から発生された蛍光を集光する集光光学系と、集光光学系で集光された蛍光を2分割する光分割素子と、第1及び第2の2次元検出器と、光分割素子で分割された一方の光束を波長分散することなく第1の2次元検出器上に非波長分散像として結像する第1の結像光学系と、光学素子で分割された他方の光束をプリズムによって波長分散して第2の2次元検出器上に波長分散像として結像する第2の結像光学系とを備える。
【００１６】
励起光学系は、集光光学系の光軸方向に薄く、集光光学系の光軸と直交する方向に伸長したシート状の励起光を照射するのが好ましい。また、試料中の粒子から発生された蛍光を異なる2方向から集光する2つの集光光学系を備え、第1の集光光学系で集光された蛍光を波長分散することなく第1の2次元検出器上に非波長分散像として結像し、第2の集光光学系で集光された蛍光をプリズムによって波長分散して第2の2次元検出器上に波長分散像として結像するようにしてもよい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により受光効率を向上することが可能となり、蛍光標識した様々な生体物質を、高感度に多色検出することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。以下の図において、同じ構成部分には同じ符号を付して説明する。
【００１９】
本発明の光検出装置は、典型的には、サンプル中のターゲットより発光した光を対物レンズ等で集光した後に分割し、一方を非波長分散像に用い、他方をプリズムによる波長分散像に用いる。ターゲットに標識された蛍光体から発光した蛍光を1つのレンズで集光した後に、ビームスプリッター等の光分割素子によって例えば50％ずつに2分割し、一方は波長分散せずに2次元検出器上に結像させる。もう一方は、プリズムによる波長分散を行った後に、別の2次元検出器上に結像させる。光を2分割する方法として、プリズムを用いても良い。このような光学系構成により、非波長分散像と波長分散像に利用されている光量は50％ずつとなり、受光効率は100％となる。このように受光効率を上げることによって、高感度検出を行うことが可能となる。
【００２０】
また本検出法では、光分割素子による光の分割の割合を最適化することが出来る。例えば波長分散を行った結果、分散され幾つかの画素にまたがる波長分散像の中で最大蛍光強度を示す画素での蛍光強度と、非波長分散像の蛍光強度の比が1：10になる場合、レンズで集光した全集光光量に対して、非波長分散像に10%を用い、波長分散像に90%を用いることが出来るようなビームスプリッターを設計する。これにより、非波長分散像の蛍光強度と波長分散像の最大蛍光強度が等しくなるため、全体の検出感度の向上が可能となり、蛍光の識別に有利となる。更に、非波長分散像と波長分散像はそれぞれ異なる2次元検出器に結像されるため、両像が重ならず、正確な蛍光体の識別が可能となる。
【００２１】
［実施例1］
図1は、本発明を用いて単分子計測を行う光検出装置の概略図である。キャピラリー6は石英製で、外表面にポリイミドコーティングがなされ、全長36cm、外径360μm、内径50μmの角型キャピラリーであり、その内部にはサンプル溶液が満たされている。サンプルには蛍光標識されたターゲットが含まれている。キャピラリー6の一方の端面から18cmの位置をレーザ照射領域とし、その部分のキャピラリーのポリイミドコーティングを除去してある。キャピラリー６の片方の末端を500μlのサンプル溶液で満たされたサンプルチューブ7に浸し、もう一方の末端を500μlのバッファーが入ったバッファーチューブ8に浸した。サンプルチューブ７をバッファーチューブ8よりも高い位置に配置し，高低差によりサンプルチューブ7からバッファーチューブ8の方向へサンプル溶液をキャピラリー６内部に連続的に流した。レーザ光源1から発振したレーザ光2（488nm）を、第1シリンドリカルレンズ4と第2シリンドリカルレンズ5によって集光し、キャピラリー6のレーザ照射領域へキャピラリー６の長手方向に対して直角に照射し、キャピラリー6内のターゲットに標識してある蛍光体を励起した。なお、レーザ光2は図2に示すように、前記2つのシリンドリカルレンズによって、z軸方向に短く（20μm）、サンプルが流れる方向であるx軸方向に長い（150μm）シート状に加工されている（Anal.Chem.,74,5033-5038（2002））。
【００２２】
レーザ照射領域に存在するターゲット分子は、標識蛍光体が励起され、発光点12より蛍光を発光する。これを対物レンズ13（20×、0.75NA）で平行光にし、励起光をカットする光学フィルター11を透過させ、ビームスプリッター15によって50％ずつに2分割する。本実施例ではハーフミラーによるビームスプリッターを用いたが、プリズムによるビームスプリッターを用いてもよい。分割された光のうち、片方は波長分散せずに結像レンズ16（f = 10mm）で2次元検出器18（512×512画素、0.5μm/画素）上に結像した。ここで得られた像を、非波長分散像と呼ぶ。もう片方は、プリズム14（材質：FK3、頂角：30°）で波長分散を行った後に、結像レンズ17（f = 10mm）で2次元検出器19（512×512画素、0.5μm/画素）上に結像した。ここで得られた像を、波長分散像と呼ぶ。なおここでは、ターゲットより発光した蛍光を、対物レンズ13で平行光にした後に結像レンズ16、17によって2次元検出器18、19上に結像させる方法を示したが、対物レンズ13のみで結像させる方法を用いても良い。
【００２３】
本装置による多色検出の方法について説明する。キャピラリー6の照射領域に、キャピラリー6を装置から外して直径10μmのピンホールを設置し、前記ピンホールに対して対物レンズ13とは反対方向から単一基準波長λ0となるHe-Neレーザ（594nm）を照射した。その時、２次元検出器18および19で得られた画像を図3（A）、（B）にそれぞれ示す。前記画像に対して、図中に示すようにx軸、y軸を設定した（単位：画素）。なお、図3（B）のy軸は、波長分散方向となる。ピンホールより射出された光は、それぞれの検出器上で、（a、b）および（a+m、b+n）に結像される。任意のa、bに対してm、nが一定値になるようにビームスプリッター15、結像レンズ17、および2次元検出器19を配置しておく。
【００２４】
プリズム14を用いた場合、波長範囲が480nm〜650nmの光であれば、波長とプリズムによる屈折の関係は線形近似可能であるため、入射波長をλ（nm）、プリズムからの出射角をθ（rad）とすると、△θ≒ 2 × 10−5 ×△λとなる。そのため、2次元検出器19におけるy軸上の波長分解能（r：nm/画素）は、
【数１】
2005321347.tif 000003
で求めることが出来る。ここで、fは結像レンズの焦点距離（10mm）であり、Lは2次元検出器の1画素あたりのサイズ（0.5μm/画素）である。本実施例での波長分解能（使用波長範囲：480nm〜650nm）は、r = 2.5nm/画素であった。非波長分散像の任意の位置（a、b）に結像する波長分布を持つ蛍光の波長分布像での結合位置は、x座標はa+mであるが、y座標は波長分散によって複数の画素に広がる（図3（C））。r＝2.5nm/画素であるため、波長分散像においてy = y1（y1は任意）で計測される光の波長は、λ=λ0 ＋( y1−( b＋n )) × rで与えられる。従って、y軸方向の光強度分布（図3（D））を波長分布（図3（E））に変換することが出来るため、発光蛍光種の同定が可能となる。つまり非波長分散像と波長分散像の両方を解析することで、計測される任意の発光を多色検出することができる。なお、図3では1個の発光点について示しているが、これが複数個の発光点であっても、それぞれの発光点について同様の方法を用いて同時かつ独立に多色検出することが可能である。
【００２５】
本実施例では、異なる2種類のDNAが未知濃度で混在しているサンプルに対して、これらのターゲットDNAを定量する方法について説明する（図4）。ターゲットへの蛍光体の標識には、ターゲットAとターゲットBに、特異的にハイブリダイズでき、異なる2種類の蛍光体で標識してあるプローブAとプローブBを用いた。プローブA、Bには、BF分離を必要としないモレキュラービーコンを用いた（Nat.Biotech.,14,303-308（1996））。1本鎖DNAであるモレキュラービーコンの両末端には、蛍光体と消光体がそれぞれ結合されている。通常では自己ハイブリダイゼーションにより、蛍光体と消光体が近接するため蛍光は発光しないが、モレキュラービーコンがターゲットにハイブリダイズすると、蛍光体と消光体の距離が離れるため蛍光が発光する。プローブAには、蛍光体としてFITC（励起波長495nm、蛍光波長520nm）を、プローブBにはCy3（励起波長550nm、蛍光波長570nm）を標識した。未知濃度のターゲットA、Bが混在するサンプル中に、プローブA、Bを添加し、それぞれをターゲットに特異的にハイブリダイズさせた。
【００２６】
その後、キャピラリー6内に前記サンプル溶液を満たし、レーザ照射による蛍光体の励起を行った。得られた非波長分散像（図5（A））と波長分散像（図5（B））を用いて、前記方法によりそれぞれの像に対して蛍光スペクトルを取得し、図5（C）のように520nmにピークを持つスペクトルであるとFITCであり、図5（B）のように570nmにピークを持つスペクトルであるとCy3 であると認識できる。以上のように蛍光体の識別を行い、一定時間内に検出されたFITCとCy3の数をそれぞれカウントした。キャピラリー６内を流れるサンプル溶液の流速とレーザが照射されている領域の体積より、検出したサンプル溶液の体積が分かり、その体積中に上記カウント数だけターゲットが存在することより、ターゲットの濃度をそれぞれ求めることができる。
【００２７】
このように、ビームスプリッターとプリズムを用いて単分子計測を行うことにより、対物レンズで受光した蛍光の100%を2次元検出することが可能となり、未知濃度のターゲットAとターゲットBを同時かつ高感度に検出し、定量することができた。
【００２８】
［実施例2］
本実施例では、実施例1において、非波長分散像と波長分散像に用いる光の分割率を最適化することで、より高感度な多色検出を行う方法について説明する。図１に示したビームスプリッター15以外は、実施例１と同等である。
【００２９】
前述したように、単分子計測での波長分散を用いた多色検出の場合、非波長分散像と波長分散像の検出感度を同等にすることが、全体の感度向上に繋がる。そのため、非波長分散像の蛍光強度と波長分散像の最大蛍光強度がほぼ等しくなるように、ビームスプリッター15の光の分割率を設定した。FITCとCy3の蛍光スペクトルの半値幅は約40nmであるため、2次元検出器19上での半値幅は16画素となり、最大強度を示す画素での蛍光強度は、2次元検出器18上で検出される蛍光強度に比べ約1/10に低下する。そこで、非波長分散像と波長分散像に用いる光の分割率が1：9となるビームスプリッター15を用いた。本実施例ではミラーによるビームスプリッターを用い、透過率と反射率の比率を制御することで上記分割率を設定したが、プリズムによるビームスプリッターを用いた場合でも、上記分割率を任意に設定することが可能である。
【００３０】
本実施例により、波長分散像の検出感度が高くなり、より高感度に単分子計測を行うことができる。スループット向上のためにレーザの照射体積を大きくしたいとき、または発光効率の低い蛍光体などを用いるときには、本実施例は非常に効果的である。
【００３１】
［実施例3］
本実施例では、実施例1において装置構成を簡略化するために、1つの2次元検出器のみで検出することを目的とした。図１において、対物レンズ13から2次元検出器までの検出部以外は、実施例１と同等である。図6に本実施例の検出部の概略を示す。
【００３２】
キャピラリー6内を流れるサンプル溶液中のターゲットに標識された蛍光をレーザ励起し、発光した蛍光を対物レンズ13により平行光にした。前記平行光を、励起光をカットする光学フィルター11に透過させ、像分割プリズム22により50％ずつに2分割した。分割された一方の光は、結像レンズ10で集光し、図6に示す2次元検出器19上の右半分に結像させた。もう一方の光は，波長分散プリズム14を用いて波長分散させた後に結像レンズ10で集光し、図6に示す2次元検出器19上の左半分に結像させた。上記構成により、2次元検出器19の右半分が非波長分散像領域となり、左半分が波長分散像領域となる。蛍光体の識別方法は、実施例1と同等である。
【００３３】
以上の装置構成により、1つの2次元検出器で未知濃度のターゲットAとターゲットBを同時かつ高感度に検出し、定量することが可能となる。このように簡単な装置構成にすることで、装置のコスト低減に大きく寄与する。
【００３４】
本実施例においても、実施例2と同様に、非波長分散像の蛍光強度と波長分散像の最大蛍光強度がほぼ等しくなるように、像分割プリズム22による分割率を設定するとよい。像分割プリズム22による分割率を変更するには、対物レンズ13の光軸に垂直な方向に像分割プリズム22を移動すればよい。図示の例では、像分割プリズム22を対物レンズ13の光軸に垂直に右方に移動すると、プリズム14に入射する光量が相対的に多くなるため、波長分散像の蛍光強度が増し、非波長分散像の蛍光強度は逆に減少する。
【００３５】
［実施例4］
本実施例では、実施例1において更に受光効率を高くすることによって、より高感度に多色検出することを目的とした。図7は本実施例に用いた検出部の概略図である。検出部以外の構成は、実施例1と同等である。
【００３６】
本実施例で用いる検出部は、ターゲット分子に標識されている蛍光体が発光する発光点12を挟んで、対向する2方向から検出を行う構成を採用する。キャピラリー6に対して一方の方向では、光を対物レンズ13で集光し、励起光をカットする光学フィルター11を透過させた後に、2次元検出器18上に非波長分散像として結像させた。一方、キャピラリー6に対して非波長分散像結像光学系と対向する方向では、光を対物レンズ21で平行光にし、光学フィルター20を透過させた後に、波長分散プリズム14により波長分散し、結像レンズ17を用いて2次元検出器19上に波長分散像として結像させた。なおここでは、上部では対物レンズ13のみで結像しているが、対物レンズ13で平行光にした後に結像レンズで集光しても良い。また、下部では対物レンズ21で平行光にした後に結像レンズ17で集光する方法を示したが、対物レンズ21のみで結像する方法を用いても良い。
【００３７】
対物レンズ13の光軸と対物レンズ21の光軸は一直線上にあるのが好ましい。また、キャピラリー6に照射するシート状の励起光は、対物レンズ13、21の光軸方向には薄く、対物レンズ13、21の光軸と直交する方向に伸長した形状を有する。
【００３８】
また、実施例1と同様に蛍光体の識別を行うことで、ターゲットの分析を行った。以上の装置構成により、実効的な受光効率を実施例1の場合の2倍、即ち200％にすることが可能となり、より高感度な多色検出を行うことが出来た。
【００３９】
［実施例5］
本実施例では、実施例1において光を2分割する代わりに、光を時分割することで非波長分散像と波長分散像の両方を取得し、高感度な多色検出を行う方法について説明する。図8は本実施例に用いた検出部の概略図である。検出部以外の構成は、実施例１と同等である。
【００４０】
本実施例で用いる検出部は、実施例1におけるビームスプリッター15の代わりに可動のミラー23を配置した。非波長分散像を取得する場合は、図8(A)に示すようにミラー23を光路からはずし、結像レンズ16を用いて2次元検出器18上に結像した。波長分散像を取得する場合は、図8(B) に示すようにミラー23を光路に配置することで、プリズム14による波長分散を行い、結像レンズ17によって2次元検出器19上に結像した。実施例2に示したように、波長分散像の最大波長を示す画素での蛍光強度は、非波長分散像の蛍光強度に比べ約1/10に低下する。そのため、非波長分散像と波長分散像を取得する時間の割合を1：10とし、波長分散像の取得においてはその蛍光強度を積算することで感度を向上させた。以上の装置構成により、波長分散像の検出感度が高くなり、より高感度な多色検出を行うことが出来た。
【００４１】
［実施例6］
本実施例では、実施例1においてターゲットが異なる2種類の細胞A、細胞Bである場合について、多色検出による定量を行う方法について説明する。装置構成は実施例1と同等である。
【００４２】
サンプル中には、細胞数の不明な細胞Aと細胞Bが混在しており、これらの細胞を予め異なる蛍光体で標識後、キャピラリー6内に注入し、計測を行った。細胞への蛍光体の標識には、細胞A、Bに特異的に結合し、FITCとPycoerythrinをそれぞれ標識してある抗体A、Bを用いた。これら抗体A、Bをサンプル中に添加し、4℃の暗所で45分間インキュベーションし、細胞と抗体を特異的に結合させた。その後、PBS（リン酸バッファー）を加えて450×gで5分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。この遠心分離操作を2回行うことで、フリーの抗体を取り除いた。サンプルをPBSに再浮遊させ、これをキャピラリー6内に満たし、レーザによって各細胞に標識されている蛍光体を励起した。その後、実施例1と同様に発光している蛍光体の識別を行い、細胞Aと細胞Bをそれぞれ定量することが出来た。このように、本発明による高感度な多色検出は単分子に限らず、細胞などの分子の集合体にも適用することが可能である。
【００４３】
上記の実施例では、ターゲットにDNAと細胞を用いたが、これに限らずタンパク質やRNA等の生体分子を用いても良い。また、蛍光に限らず化学発光を検出に用いても良い。
【００４４】
上記の実施例では蛍光体の励起法としてレーザビームを横から入射する方法を用いたが、その他の方法を用いても良い。更に励起光はレーザでなくLEDやキセノンランプ等を用いても良い。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明による単分子計測による2次元蛍光像検出装置の構成例を示す概略図である。
【図２】シート状レーザ照射の概略図である。
【図３】蛍光体の識別方法を示した図である。
【図４】ターゲットAとターゲットBの定量法を説明するフロー図である。
【図５】画像と蛍光スペクトルを示した図である。
【図６】本発明による2次元蛍光像検出装置の検出部の他の例を示す概略図である。
【図７】本発明による2次元蛍光像検出装置の検出部の他の例を示す概略図である。
【図８】本発明による2次元蛍光像検出装置の検出部の他の例を示す概略図である。
【符号の説明】
【００４６】
1…レーザ光源
2…レーザ光
3…キャピラリー内壁
4…第1シリンドリカルレンズ
5…第2シリンドリカルレンズ
6…キャピラリー
7…サンプルチューブ
8…バッファーチューブ
10、16、17…結像レンズ
11、20…光学フィルター
12…ターゲットの発光点
13、21…対物レンズ
14…波長分散プリズム
15…ビームスプリッター
18、19…2次元検出器
22…像分割プリズム
23…ミラー
25…単一波長の光を波長分散無しで結像した画像
26…単一波長の光を波長分散有りで結像した画像
28…ターゲットからの蛍光を波長分散有りで結像した画像
29…横軸を画素で表した蛍光スペクトル
30…横軸を波長で表した蛍光スペクトル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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