(57)【要約】  【課題】ＣＲＴＨ２の働きを、in vivoで検証することができるモデル動物を提供し、さらに、当該モデル動物を用いたＣＲＴＨ２に関する有用性の高い情報を検出可能な検出方法を提供すること。  【解決手段】ＣＲＴＨ２遺伝子が不活化されたマウス胚性幹細胞を導入した、初期胚由来のキメラマウスを継代して得られるＣＲＴＨ２遺伝子が不活化されているノックアウトマウスを提供し、被験物質を投与した本ノックアウトマウスの状態を指標として、ＣＲＴＨ２に対する被験物質の性質、または、ＣＲＴＨ２の生体内における働きを、in vivoにおいて検出する方法を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見いだした。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＲＴＨ２遺伝子が不活化されたマウス胚性幹細胞を導入した、初期胚由来のキメラマウスを継代して得られる、ＣＲＴＨ２遺伝子が不活化されているノックアウトマウス。
【請求項２】
ＣＲＴＨ２遺伝子が、他の遺伝子との置換により不活化されている、請求項１記載のノックアウトマウス。
【請求項３】
ＣＲＴＨ２遺伝子における対立遺伝子のいずれか一方が不活化されている、請求項１または２記載のノックアウトマウス。
【請求項４】
ＣＲＴＨ２遺伝子における対立遺伝子の双方が不活化されている、請求項１または２記載のノックアウトマウス。
【請求項５】
ＣＲＴＨ２遺伝子が不活化されたマウス胚性幹細胞をマウス初期胚に導入して得られたキメラ胚を、雌マウスの子宮に着床させて発生させることにより得られるキメラマウスを継代することにより、ＣＲＴＨ２遺伝子が不活化されたノックアウトマウスを得る、ノックアウトマウスの製造方法。
【請求項６】
被験物質を投与した、請求項１〜５のいずれかの請求項記載のノックアウトマウスの状態を指標として、ＣＲＴＨ２に対する被験物質の性質、または、ＣＲＴＨ２の生体内における働きを、in vivoにおいて検出する方法。
【請求項７】
被験物質が疾患惹起物質である、請求項６記載の検出方法。
【請求項８】
被験物質がプロスタグランジンＤ２である、請求項６記載の検出方法。
【請求項９】
被験物質が、ＣＲＴＨ２に対する調節物質か否かを検出する、請求項６記載の検出方法。
【請求項１０】
ＣＲＴＨ２に対する調節物質が、ＣＲＴＨ２に対するアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項９記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノックアウトマウス、および、これを用いる検出方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
ＣＲＴＨ２は、本発明者らがヒトリンパ球よりクローニングした、Ｇタンパク質共役型受容体様蛋白質で、特許第3144805号においてＢ１９と称して開示されており（特許文献１）、哺乳動物一般に存在していると考えられている。ヒトＣＲＴＨ２は、リンパ球の一群であるTh2細胞をはじめ、好酸球、好塩基球といったアレルギーに関与する白血球に発現がみられることが知られている(Nagataら、J.Immunol.,162:1278-1286,1999：非特許文献１、およびNagataら、FEBSLett.,459:195-199,2000：非特許文献２) 。また、本発明者らは、ヒトＣＲＴＨ２のリガンドがプロスタグランジンD2であること、プロスタグランジンD2は、ヒトＣＲＴＨ２を介してTh2細胞、好酸球、好塩基球の炎症局所への集積に関与していることを明らかにした(Hiraiら、J.Exp.Med.,193:255-261,2001：非特許文献３)。プロスタグランジンD2は、アラキドン酸代謝産物の1種であり、脳、心臓、脾臓、肺、腎臓、骨髄、胃、腸、皮膚、眼を含む多数の臓器で合成され、睡眠導入、体温調節、臭覚機能、ホルモン放出、炎症、無痛覚、血小板凝集阻害、平滑筋弛緩など種々の生理活性が報告されている(Gilesら、Prostag1andins,35:277-300,1988：非特許文献４、Itoら、Prostag1andinsLeukotriens and Essential Fatty Acids,37:219-234,1989：非特許文献５、Negishiら、Prog.Lipid Res.,32:417-432,1993：非特許文献６、およびその中の引用文献)。プロスタグランジンD2は、免疫反応において、重要な役割もつ肥満細胞が分泌する主要なアラキドン酸代謝産物のひとつであり、アレルギー性鼻炎、気管支喘息などのアレルギー疾患の病態形成に関与していることが知られている(Negishiら、Prog.Lipid Res.,32;417-432,1993：非特許文献７、およびその中の引用文献)。これらのことより、プロスタグランジンD2は、ＣＲＴＨ２を介してアレルギー炎症の病態形成に関与していると推測され、ＣＲＴＨ２は治療薬のターゲットとしての期待が大きい。しかしながら、統制された条件下で、ＣＲＴＨ２のアレルギーへの関与を研究するモデル動物は、確立されていない。また、プロスタグランジンD2受容体としては、ＣＲＴＨ２以外に、ＣＲＴＨ２とまったく異なったアミノ酸配列をもつDP受容体と称される受容体が存在し、ヒトおよびマウスなどでの報告がある(Boieら、J.Bio1.Chem.,270:18910-18916,1995;特表平10-507930：特許文献２、およびHirataら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:11192-11196,1994:特開平7-258295：特許文献３)。
【０００３】
このため、生体内において種々のプロスタグランジンD2の作用のそれぞれについて、ＣＲＴＨ２の関わりを検証するためのモデル動物が必要とされている。
【特許文献１】特許第３１４４８０５号公報
【特許文献２】特表平１０−５０７９３０号公報
【特許文献３】特開平７−２５８２９５号公報
【非特許文献１】Nagataら、J.Immunol.,162:1278-1286,1999
【非特許文献２】Nagataら、FEBSLett.,459:195-199,2000
【非特許文献３】Hiraiら、J.Exp.Med.,193:255-261,2001
【非特許文献４】Gilesら、Prostag1andins,35:277-300,1988
【非特許文献５】Itoら、Prostag1andinsLeukotriens and Essential Fatty Acids,37:219-234,1989
【非特許文献６】Negishiら、Prog.Lipid Res.,32:417-432,1993
【非特許文献７】Negishiら、Prog.Lipid Res.,32;417-432,1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決すべき課題は、上述したＣＲＴＨ２の働きを、in vivoで検証することができるモデル動物を提供し、さらに、当該モデル動物を用いたＣＲＴＨ２に関する有用性の高い情報を検出可能な検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、この課題の解決に向けて検討を行った結果、ＣＲＴＨ２遺伝子の働きを不活化したノックアウトマウスを提供し、当該ノックアウトマウスを用いることにより、所望する検出方法を行うことが可能であることを見出して、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、ＣＲＴＨ２遺伝子が不活化されたマウス胚性幹細胞を導入した、初期胚由来のキメラマウスを継代して得られるＣＲＴＨ２遺伝子が不活化されているノックアウトマウス（以下、本ノックアウトマウスともいう）を提供する発明であり、被験物質を投与した本ノックアウトマウスの状態を指標として、ＣＲＴＨ２に対する被験物質の性質、または、ＣＲＴＨ２の生体内における働きを、in vivoにおいて検出する方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。
【０００７】
本ノックアウトマウスにおける不活化の対象となるＣＲＴＨ２遺伝子は、いうまでもなく、マウスＣＲＴＨ２遺伝子である。マウスＣＲＴＨ２遺伝子の塩基配列(cDNA)は、ヒトＣＲＴＨ２のＤＮＡ配列 (データベースＤＤＢＪ，ＥＭＢＬ，ＧｅｎＢａｎｋ、アクセッションナンバーAB008535)とのホモロジークローニングによって報告されている(データベースＤＤＢＪ，ＥＭＢＬ，ＧｅｎＢａｎｋ、アクセッションナンバーAF054507)。また、本発明者は、このマウスＣＲＴＨ２をコードするｃＤＮＡの塩基配列に基づき、マウスＣＲＴＨ２遺伝子のｃＤＮＡ全長を解明した（データベースＤＤＢＪ，ＥＭＢＬ，ＧｅｎＢａｎｋ、アクセッションナンバーAF109092：配列番号１）。また、マウスＣＲＴＨ２遺伝子を含む周辺のゲノムＤＮＡについて解析し、その塩基配列ならびにマウスＣＲＴＨ２におけるイントロン−エキソン構造を解明した（データベースＤＤＢＪ，ＥＭＢＬ，ＧｅｎＢａｎｋ、アクセッションナンバーAF109091：配列番号２、第１図参照）。
【０００８】
本ノックアウトマウスの「製造」（以下、作出ともいう）は、哺乳動物に対する遺伝子改変技術を駆使して行うことができる。典型的には、ＣＲＴＨ２遺伝子が不活化されたマウス胚性幹細胞をマウス初期胚に導入して得られたキメラ胚を、雌マウスの子宮に着床させて発生させることにより得られるキメラマウスを継代することにより、ＣＲＴＨ２遺伝子が不活化された本ノックアウトマウスを作出することができる。
【０００９】
マウス胚性幹細胞は、公知の方法（例えば、
Martin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:7634-7638,1981）等に従って得ることができる。また、市販品を購入して用いることも可能である。
【００１０】
マウス胚性幹細胞における、ＣＲＴＨ２遺伝子の不活化は、例えば、ＣＲＴＨ２遺伝子の改変、例えば、当該遺伝子の特定塩基配列部分（好適には、コーディング領域）の人工的欠失、当該遺伝子の特定塩基配列部分（好適には、コーディング領域）における外来シークエンスの挿入、当該遺伝子のプロモーター等の発現に係る領域の不活化、当該遺伝子の他の遺伝子との置換等により行うことができる。
【００１１】
このＣＲＴＨ２遺伝子の改変は、公知の標的遺伝子組み換え法(ジーン・ターゲッティング、例えば、Methods in Enzymo1ogy225:803-890,1993)を用いることにより、行うことができる。
【００１２】
具体的には、例えば、公知の手法に従ってクローニングしたＣＲＴＨ２遺伝子の一部または全部を、ＣＲＴＨ２遺伝子が不活化するように改変した遺伝子断片を組み込んだターゲッティングベクターを、マウス胚性幹細胞に導入し、ＣＲＴＨ２遺伝子の不活化断片が、本来のＣＲＴＨ２遺伝子との相同組み換えにより組み込まれた、相同組み換えマウス胚性幹細胞を選別する。次いで、この相同組み換えマウス胚性幹細胞を、所望する種類のマウスの初期胚に常法に従い導入する。次いで、このマウス胚性幹細胞の導入済みの初期胚を、仮親として用いる雌マウスの子宮内に着床後、この雌マウスを、母子共々養生することにより、前記初期胚をマウス個体へと発生させることにより、導入したマウス胚性幹細胞の基となるマウスと、初期胚の基となるマウスとのキメラマウスを作出することができる。
【００１３】
なお、上述したターゲッティングベクターは、マウス胚性幹細胞に相同組み換えを起こすことが可能である限り、特に限定されない。例えば、具体的には、ＣＲＴＨ２遺伝子の上流と下流領域の相同配列を含み得るベクターを、広く、ＣＲＴＨ２遺伝子ターゲッティングベクターの基ベクターとして選択して用いることができる。当該基ベクターとしては、例えば、pBluescript、pUC18、pUC118、pBR322等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
また、相同組み換えマウス胚性幹細胞の選別は、例えば、改変遺伝子断片に、薬剤耐性遺伝子や、毒素等の哺乳動物細胞の致死的な物質をコードする遺伝子を組み込んで、これをマーカーとすることにより、候補の胚性幹細胞の選別を行うことができる。さらに、これらのマーカーにより選別した、候補の胚性幹細胞の相同組み換えの確認は、サザンブロット法等の公知の遺伝子解析法により行うことができる。
【００１５】
次いで、得られたキメラマウス同士を交配することにより、１）ヘテロ接合体の本ノックアウトマウス、すなわち、ＣＲＴＨ２遺伝子における対立遺伝子のいずれか一方が不活化されている本ノックアウトマウス、または、２）ホモ接合体の本ノックアウトマウス、すなわち、ＣＲＴＨ２遺伝子における対立遺伝子の双方が不活化されている本ノックアウトマウスが提供される。また、必要に応じて、ヘテロ接合体の本ノックアウトマウスを、BALB/cマウス等の純系マウスと交配させて継代することができる。かかる継代は、通常は８代以上、好適には１０代程度である。なお、継代により得られたマウスを含めて、本ノックアウトマウスとして作出したマウスが、真に本ノックアウトマウスか否か、さらには、ヘテロ接合体のノックアウトマウスか、ホモ接合体のノックアウトマウスか、等の検証は、サザンブロット法等の公知の遺伝子解析法により行うことができる。
【００１６】
このようにして提供され得る、ホモ接合体またはヘテロ接合体として、ＣＲＴＨ２遺伝子が不活化された本ノックアウトマウスを検出指標として用いることにより、種々のＣＲＴＨ２に関連する事項を、in vivoにおいて検出する検出方法が提供され得る。
【００１７】
すなわち、本発明は、被験物質を投与した、本ノックアウトマウスの状態を指標として、ＣＲＴＨ２に対する被験物質の性質、または、ＣＲＴＨ２の生体内における働きを、in vivoにおいて検出する方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。
【００１８】
本検出方法において、本ノックアウトマウスに投与する被験物質は、本検出方法を行う目的に応じて、制限なく選択することが可能である。
【００１９】
例えば、被験物質として、疾患惹起物質を用いて、当該疾患とＣＲＴＨ２との関連性を解明して、当該疾患の予防や治療に役立てることができる。疾患惹起物質としては、例えば、アレルギー惹起物質、具体的には、卵白アルブミン、ジニトロフルオロベンゼン、ダニ抗原等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
アレルギー惹起物質に例をとると、アレルギー惹起物質を、本ノックアウトマウス、および、通常のマウスに対して投与を行い、これらのマウスの反応、具体的には、気管支喘息、皮膚のただれ等のアレルギー症状が、通常のマウスと同様に惹起されるか、緩和されるか、促進されるか、異なる生体反応を示すか否か等を、in vivoの指標として用いることにより、ＣＲＴＨ２のアレルギーとの関連する生体内における働きを検証し、ＣＲＴＨ２に対して作用する抗アレルギー薬を開発する方向性を明らかとすることができる。
【００２１】
また、前述のように、ＣＲＴＨ２は、プロスタグランジンＤ２の受容体として働くことが明らかとなっているので、プロスタグランジンＤ２を被験物質として、本ノックアウトマウス、および、通常のマウスに対して投与を行い、これらのマウスの反応を検討することにより、生体内におけるプロスタグランジンＤ２の役割を検証することができる。すなわち、例えば、プロスタグランジンＤ２の投与により通常のマウスにおいて惹起される生体反応が、本ノックアウトマウスにおいて、緩和されるか、促進されるか、異なる生体反応を示すか否か等を、in vivoの指標として用いることにより、プロスタグランジンＤ２のＣＲＴＨ２を介した働きを明らかにして、この働きに係わる薬剤を開発する方向性を提供することが可能である。
【００２２】
また、各種疾患の治療薬として有望と考えられるＣＲＴＨ２に対する調節物質の、候補物質からの選別を目的として、生体内における正確な働きが未知の物質を、本ノックアウトマウスと通常のマウスに投与し、本ノックアウトマウスを、このスクリーニング系のネガティブブコントロールとして用いることにより、当該スクリーニング系における所望の物質の選別が、さらに容易にすることができる。  
【００２３】
なお、ＣＲＴＨ２に対する調節物質としては、例えば、ＣＲＴＨ２の全部または一部の働きの促進物質（例えば、アゴニスト）、または、同抑制物質（例えば、アンタゴニスト）が挙げられる。
【００２４】
以上述べたように、本ノックアウトマウスは、生体内でのＣＲＴＨ２ならびにそのリガンドであるプロスタグランジンＤ２の生理学的役割を個体レベルで解析するためのモデル動物や、ＣＲＴＨ２の欠損あるいは不全に関連する哺乳類における疾患解析のためのモデル動物や、ＣＲＴＨ２をターゲットとした薬物開発における候補物質の哺乳類の生体内における作用を解析するためのモデル動物として有用である。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、ＣＲＴＨ２の働きを、in vivoで検証することができるモデル動物が提供され、さらに、当該モデル動物を用いたＣＲＴＨ２に関する有用性の高い情報を検出可能な検出方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明の実施例を用いて、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、この実施例により本発明の技術範囲を限定して解釈されるべきものではない。
【００２７】
［実施例1］マウスＣＲＴＨ２遺伝子に対するターゲッティングベクターの構築
前述したマウスＣＲＴＨ２遺伝子（配列番号２：コード領域1ｋｂを含む16.9ｋｂのＤＮＡ断片）をクローニングし、さらに、そのＤＮＡ断片においてＣＲＴＨ２遺伝子よりも上流に存在する、２種の制限酵素Nde IサイトとEco RVサイトに挟まれた領域のＤＮＡ断片と、同遺伝子の下流に存在する、２種の制限酵素Dra IサイトとBg1 IIサイトに挟まれた領域のＤＮＡ断片を、それぞれ、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ遺伝子）の両端に結合する形になるように、予め、ｎｅｏ遺伝子を組み込んだpBluescript II SK(-)プラスミドにライゲーションを行い、本来はＣＲＴＨ２遺伝子である領域（ＣＲＴＨ２のコーディング領域を含む第３エクソン）が、ｎｅｏ遺伝子に置換されているＤＮＡ領域を含むプラスミドを作成した。なお、本来、ＣＲＴＨ２遺伝子の下流側に存在するDra IサイトとBg1 IIサイトに挟まれた領域のＤＮＡ断片をライゲーションする際、Bam HIの認識配列である「GGATCC」を含むオリゴヌクレオチドをリンカーとして結合させ、ｎｅｏ遺伝子近傍（下流側）にも、本来は存在しないBg1 IIサイトを設けた。さらに、そのDra IサイトとBg1 IIサイトに挟まれた領域のＤＮＡ断片の下流に、ジフテリア毒素遺伝子(ＤＴ遺伝子：Yagi T et al.,Analytical Biochemistry 214:77-86(1993))を連結させた。
【００２８】
このようにして、ＣＲＴＨ２遺伝子の代わりにｎｅｏ遺伝子を組み込んで構築したプラスミドは、制限酵素処理によるマッピング及び部分的な塩基配列の解析により、方向性および各ＤＮＡ断片の順序を確認した。さらに、このプラスミドを、制限酵素Not Iで処理して線状化し、これを精製して、ターゲッティングベクターとした。
【００２９】
［実施例２］ノックアウトマウスの作出
実施例１で得たターゲッティングベクターを、エレクロポレーション法で、常法に従い、マウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞：北里大学医学部  東貞宏氏より入手、上述したように、他の手段でも入手可能）に導入した。
【００３０】
ターゲッティングベクターが導入されたＥＳ細胞内で、ターゲッティングベクターの遺伝子と、ＥＳ細胞の遺伝子との間の相同組み換えが起こると、ＥＳ細胞の遺伝子が本来持っていたＣＲＴＨ２遺伝子は、ターゲッティングベクターがもつ改変された遺伝子と置換され、その結果、当該ＥＳ細胞の遺伝子に本来存在するＣＲＴＨ２遺伝子が不活化されることとなる。
【００３１】
ターゲッティングベクターを導入したマウスＥＳ細胞は、ネオマイシンを200μg/ml含有させたDMEM培地（20％FCS、2mM L-glutamine、Non-essential amino acids(1×)、10units/ml LIF(leukemia inhibitory factor)、100units/ml Penicillin、100μg/ml Streptomycin、10mM Hepes buffer）において、５％ＣＯ２下で３７℃にて培養を行った。
【００３２】
この培養では、ネオマイシンを培地中に添加することによって、ｎｅｏ遺伝子を持たない細胞は死滅するという陽性選択と、ＤＴ遺伝子を保持したままの細胞はその産物によって死滅するという陰性選択により、所望するＣＲＴＨ２遺伝子とｎｅｏ遺伝子との相同組み換えが、生存細胞中に起こっている確率を高めた。生存細胞がコロニーを形成したところで、上記と同様の条件でDMEM培地において、個別に分離培養し、ＤＮＡを抽出してサザンブロット法による解析を行い、所望の相同組み換えＥＳ細胞を得た。なお、サザンブロット解析のプローブには、第１図に示しているように、３'側は、ＣＲＴＨ２遺伝子の下流のBg1 IIとBam HIの処理により得られるＤＮＡ断片であり、５'側は、マウスゲノムＤＮＡを鋳型として、GAAATAGGAGGCATCAGTGT（配列番号３）とATTCGAAAGTAGAAGAATGA（配列番号４）をプライマーとして用いて、ＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行い当該増幅産物をクローニングして得た、ＣＲＴＨ２遺伝子の上流のBg1 IIサイトとBam HIサイト間の領域内のＤＮＡ断片を用いた。ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡにおけるＣＲＴＨ２遺伝子に相当する領域における、３'側の配列の確認には、Bam HIで消化後、同５'側の確認には、Bg1 IIで消化後、電気泳動を行い、ナイロンメンブレンに転写後、それぞれの３２Ｐ標識されたプローブを用いて検出をおこなった。３'側プローブでは、正常ＣＲＴＨ２遺伝子では、5.4Ｋｂのサイズのシグナルが検出されたが、対立遺伝子の一方に相同組み換えが起こり、改変遺伝子を持つものは3.6Ｋｂのサイズのシグナルも同時に検出された。同様に、５'側プローブでは、正常ＣＲＴＨ２遺伝子では、16Ｋｂのサイズのシグナルが検出されたが、改変遺伝子を持つものは11Ｋｂのサイズのシグナルも同時に検出された。この確認作業を行うことにより、目的どおりに相同組み換えを起こし、改変遺伝子を有するＥＳ細胞クローンを選択した。
【００３３】
なお、第１図に、マウスＣＲＴＨ２遺伝子の構造（中段：Wild-type allele）、ターゲッティングベクターにおける変異配列の構造（上段：Targeting Vector）、および相同組み換え後のマウスゲノムＤＮＡ構造（下段：Mutated allele）を示す模式図である。図中、BaはBam HI制限サイトを示し、BgはBgl II制限サイトを示し、NdはNde I制限サイトを示し、DrはDra I制限サイトを示し、EcはEco RV制限サイトを示し、mCRTH2は、ＣＲＴＨ２蛋白のコーディング領域を示し、neoは、ネオマイシン遺伝子を示し、DTは、ジフテリア毒素遺伝子を示している。また、５'プローブと３'プローブは、サザンブロット解析をする際に用いるそれぞれのプローブの位置を示している。また、Bgl II digestとあるのは、５'側のサザンブロット解析において、改変遺伝子において得られるヌクレオチド鎖（−鎖）の大きさと対応位置、ＣＲＴＨ２遺伝子をそのまま有する遺伝子において得られるヌクレオチド鎖（＋鎖）の大きさと対応位置を示している。また、Bam HI digestとあるのは、3'側のサザンブロット解析において、改変遺伝子において得られるヌクレオチド鎖（−鎖）の大きさと対応位置、ＣＲＴＨ２遺伝子をそのまま有する遺伝子において得られるヌクレオチド鎖（＋鎖）の大きさと対応位置を示している。
【００３４】
次いで、この相同組み換えＥＳ細胞を、ＣＬ５７ＢＬ／６系マウスの初期胚に常法により注入し、仮親雌マウスの子宮内に着床させてこの胚の養生を行い、マウス個体へと発生させた。その結果、ＥＳ細胞に由来する野ネズミ色の体毛を含む５匹のキメラマウスが誕生した。このうち、比較的ＥＳ細胞に由来する野ネズミ色の割合が高い雄マウスを、雌ＣＬ５７ＢＬ／６マウスと交配し、生まれたＦ１マウスの尾部の一部（１ｃｍ程度）切断し、ＤＮＡを抽出し、サザンブロット解析により、相同組み換えが起こっている染色体を持つものを選択し、対立遺伝子のうち片方のＣＲＴＨ２遺伝子を欠損するヘテロ接合体マウスを得た。このヘテロ接合体マウスの雌雄を交配することによってＦ２マウスを得ることができた。これら、Ｆ２マウスの尾部の一部の細胞について、上記の3'側プローブを用いたサザンブロット解析により、対立遺伝子両方に変異配列が確認されたホモ接合体および片方に変異配列が確認されたヘテロ接合体を選別し（第２図：レーン−／−はホモ接合体、レーン＋／−はヘテロ接合体、レーン＋／＋は野生型から得られた遺伝子断片の電気泳動の内容を示している）、本ノックアウトマウスを作出した。
【００３５】
このＦ２の本ノックアウトマウスの肺より、ｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法[プライマー：マウスＣＲＴＨ２(TGGTCTCAACCAATCAGCA：配列番号５とCTGTGGTTTGGAAGCTGGACC：配列番号６)、（対照）β−アクチン(GGACTCCTATGTGGGTGACGAGG：配列番号７とGGGAGAGCATAGCCCTCGTAGAT：配列番号８)]で、ＣＲＴＨ２の発現を解析した結果(第３図)、ホモ接合体マウスにおいてはＣＲＴＨ２の発現はまったく確認されなかった。なお、Ｆ２の本ノックアウトマウスの野生型：ヘテロ接合体：ホモ接合体の比は、約１：２：１であり、雌雄比は、約１：１であった。また胎仔性致死はみられなかった。
【００３６】
［実施例３］本ノックアウトマウスを用いた疾患モデルでの解析
マウス［ホモ接合体本ノックアウトマウス（−／−）、ヘテロ接合体本ノックアウトマウス（＋／−）、ＣＬ５７ＢＬ／６マウス（＋／＋）］の腹腔に、それぞれ、５０μｇの卵白アルブミンを２００μ１の市販のアラム溶液と共に、２週間の間隔をあけて２回注入し、免疫をおこなった。
【００３７】
次に、免疫１週間後に、３％の卵白アルブミンを含むリン酸緩衝液をネブライザーで気化させて、免疫をおこなったそれぞれのマウスに吸入させることにより、抗原の暴露をおこなった。これを４日目ごとにさらに２回おこない、最終暴露の翌日に肺洗浄液と血清を回収した。そして肺洗浄液中の好酸球のカウント（第４図）と、血清中のＩｇＥを定量（第５図）することによりアレルギー症状の程度を調べた。その結果、ＣＲＴＨ２遺伝子ノックアウトマウスでは、ホモ接合体とは、野生型に比べて、好酸球の浸潤が低下しており、また血清中のＩｇＥも低い値を示した。
【００３８】
このことは、ＣＲＴＨ２がアレルギーの促進に関係していることを示すとともに、本ノックアウトマウスを用いた解析（本検出方法）が、ＣＲＴＨ２と疾患との関わりを明らかにするために有益であることを示すものである。
【００３９】
なお、ヘテロ接合体は、好酸球の浸潤、および、血清中のＩｇＥ量とも、有意差は認められず、低下傾向を示すに止まった（図示せず）。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】野生型のマウスＣＲＴＨ２遺伝子近傍と、ターゲッティングベクターにおける変異配列と、相同組み換え後の遺伝子配列の関連性を、各々の特定の制限酵素地図として示した図面である。
【図２】本ノックアウトマウスの作出に際して、被験マウスの尾部から抽出したＤＮＡの、サザンブロット分析の結果を示す図面である。
【図３】本ノックアウトマウスにおける、ＣＲＴＨ２の肺での発現を、ホモ接合体とヘテロ接合体と野生型とで比較した結果を示す図面である。
【図４】アレルギー性喘息を惹起した被験マウスの肺洗浄液における好酸球の数をカウントした結果を示す図面である。
【図５】アレルギー性喘息を惹起した被験マウスの血中トータルＩｇＥの解析結果を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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