(57)【要約】      （修正有）【課題】血液学的対照製品中に存在する他の成分およびパラメータの機能と干渉することなく混入することができる血液学的対照品を提供する。【解決手段】血液模倣粒子の表面に付着された生体高分子を有し、フローサイトメーター又は血液分析装置において、血液細胞試料の網状赤血球又は有核赤血球成分のような、血液試料の成分を模倣している。更に、血液学的対照品を作成及び使用する方法を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子の表面に付着された生体高分子を有する粒子を含む血液学的対照品であって、該粒子が、血液試料の成分を模倣している、対照品。
【請求項２】
粒子が、ヒト網状赤血球を模倣している、請求項1記載の血液学的対照品。
【請求項３】
生体高分子が、ムコ多糖、核酸又はペプチド核酸である、請求項1記載の血液学的対照品。
【請求項４】
生体高分子が、核酸である、請求項3記載の血液学的対照品。
【請求項５】
核酸が、DNA又はRNAである、請求項4記載の血液学的対照品。
【請求項６】
粒子が、赤血球細胞を含む、請求項1記載の血液学的対照品。
【請求項７】
赤血球細胞は、哺乳類赤血球細胞である、請求項6記載の血液学的対照品。
【請求項８】
赤血球細胞は、ヒト赤血球細胞である、請求項6記載の血液学的対照品。
【請求項９】
共有的架橋結合を通じて細胞表面に付着されたRNAを有するヒト赤血球細胞を含む、血液学的対照品。
【請求項１０】
粒子表面に付着された生体高分子を有する粒子を含む血液学的対照品であって、該粒子が、血液試料中の網状赤血球を模倣している、対照品。
【請求項１１】
粒子は、光学-蛍光ベースの検出装置及び電気-光学ベースの検出装置において網状赤血球を模倣している、請求項10記載の血液学的対照品。
【請求項１２】
生体高分子が、ムコ多糖、核酸又はペプチド核酸である、請求項10記載の血液学的対照品。
【請求項１３】
粒子は、ヒト細胞である、請求項10記載の血液学的対照品。
【請求項１４】
粒子の表面に付着された生体高分子を有する粒子を含む血液学的対照品であり、該粒子が、有核赤血球細胞(NRBC)を模倣している、対照品。
【請求項１５】
前記粒子が、光学-蛍光ベースの検出装置及び電気-光学ベースの検出装置において有核赤血球細胞(NRBC)を模倣している、請求項14記載の血液学的対照品。
【請求項１６】
粒子が、70fL未満のMCVを有する、請求項14記載の血液学的対照品。
【請求項１７】
粒子が、ウマ、ヒツジ又はウシ細胞である、請求項14記載の血液学的対照品。
【請求項１８】
生体高分子の粒子の表面への付着を含む血液学的対照品を作成する方法であって、ここで該粒子が、血液試料の成分を模倣している方法。
【請求項１９】
生体高分子は、核酸である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
核酸は、DNA又はRNAである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
粒子は、哺乳類赤血球細胞である、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
赤血球細胞は、ヒト血液細胞である、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
赤血球細胞は、ウマ、ヒツジ又はウシに由来する、請求項18記載の方法。
【請求項２４】
RNAは、赤血球細胞表面に共有的架橋結合している、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
更に核酸を、核酸のアミノ基及び粒子表面の反応性部分と反応するヘテロ-又はホモ-二官能性化学架橋リンカーと反応させることを含む、請求項19記載の方法。
【請求項２６】
粒子の表面の反応性部分が、アミノ、カルボキシ又はスルフヒドリル基である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
粒子の表面上の反応性部分は、赤血球細胞の表面上のタンパク質、リポタンパク質、脂質又は糖質の一部を含む、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
更にRNAのヒドロキシル基を酸化し、反応性アルデヒドを形成し、及びこれらのアルデヒドを、粒子表面上のアミン又はヒドロキシル分子と反応させることを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２９】
生体高分子は、赤血球細胞表面にグルタルアルデヒドを用い架橋される、請求項21記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、血液学的対照品、それらの製造及び使用の方法、特に該血液学的対照製品中に存在するいずれか他の成分及びパラメータの機能と干渉することなく血液学的対照製品に混入することができる有核赤血球細胞(NRBC)対照品及び網状赤血球細胞対照品を関連している。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
品質管理は長らく、臨床血液学において必要とされかつ日常的手法である。様々な型の血液細胞の計測における精度は、一部適切な対照製品の使用及びこの対照製品を使用する方法によって左右される。装置の誤作動の可能性は依然存在しているので、現在利用可能な粒子計測のための多くの種類の機器で対照製品を使用することによる品質管理が必要である。自動化された粒子計測機器の品質管理プログラムを維持する従来の方法は、新鮮なヒト血液を全血標準として提供することからなる。しかし、この新鮮な血液は、わずかに1日使用可能であり、その結果より長期の製品寿命を有する様々な既製の対照製品が開発されている。
【０００３】
対照製品において通常使用される粒子は、分析を受けることが意図された粒子又は細胞の種類を模倣するか又はこれによく似ている。結果的に、これらの粒子はアナログ粒子と称されることが多い。これらのアナログ粒子は、その装置において分析されるべき粒子又は細胞のものに類似しているある種の特徴を有するように、選択又はデザインされなければならない。特徴及びパラメータの例は、サイズ、容積の類似性、表面特徴、粒状度、光散乱特性及び蛍光特性を含む。
【０００４】
自動式血液用装置に関する技術分野における現在の状況は、利用者が、血液試料の成分の完全な分析、すなわち血液学的パラメータの分析を行うことを可能にしている。これらのパラメータは、以下を含むが、これらに限定されるものではない：白血球細胞数(「WBC」)、好中球細胞の百分率又は数(「NE％」又は「NE#」)、リンパ球細胞の百分率又は数(「LY％」又は「LY#」)、単球細胞の百分率又は数(「MO％」又は「MO#」)、好酸球細胞の百分率又は数(「EO％」又は「EO#」)、好塩基球細胞の百分率又は数(「BA％」又は「BA#」)、有核赤血球細胞の百分率又は数(「NRBC％」又は「NRBC#」)、赤血球細胞数(「RBC」)、ヘモグロビン濃度(「Hgb」)、ヘマトクリット(「Hct」)、平均赤血球容積(「MCV」)、赤血球分布幅(「RDW」)、血小板数(「PLT」)、平均血小板容積(「MPV」)、血小板分布幅(「PDW」)、血小板ヘマトクリット(「Pct」)、網状赤血球細胞の百分率又は数(「RET％」又は「RET#」)、平均網状赤血球容積(「MRV」)及び未熟網状赤血球画分(「IRF」)。やはり重要な、以後時折り「対照品」と称する血液学的対照の機能が、血液分析装置それ自身及び使用される試薬システムがそれらの特定化されたパラメータ内で機能していることを確実にする点にある。血液学分析システムはより複雑となるほど、そして電気的、光学的及び／又は蛍光的な分析由来のパラメータである追加パラメータの分析を供するほど、適切な対照が必要となり、このことは装置システムの利用者がこれらの新たに入手可能なパラメータの性能をモニタリングすることを可能にする。
【０００５】
様々な市販の対照製品が現在利用可能であり、これらは様々な処理された又は固定されたヒト又は動物の血液細胞をヒト血液細胞のアナログとして使用している。米国特許第5,512,485号(Youngら)は、処理され及び固定された動物赤血球細胞で作成されたいくつかの白血球細胞アナログを含む血液学的対照品を開示している。米国特許第6,187,590号及び第5,858,790号(Kimら)は、溶血され固定された鳥類又は魚類赤血球細胞から作成された白血球細胞アナログ及び有核赤血球細胞(NRBC)アナログを含む血液学的対照品を開示している。これらの粒子は、蛍光-ベース、多角度光散乱NRBC検出システムのために開発されている。米国特許第6,406,915号、第6,403,377号、第6,399,388号、第6,221,668号、及び第6,200,500号(Ryanら)は、鳥類血液細胞由来のNRBCアナログを含む血液学的対照品を開示している。米国特許出願第2003/0104630号(Ryan)は、有核を含む血液細胞を安定化することによるか、又は血液細胞から細胞質を溶解・除去することにより、有核赤血球細胞成分を含む血液学的対照品を作成する方法を開示している。Ryanの血液学的対照品は、Beckman Coulter STKS(商標)及びGEN*S(商標)装置のような装置上のNRBCフラグの誘引となるのみである。
【０００６】
米国特許第6,448,085号(Wangら)は、有核赤血球細胞を伴うニワトリ血液及び固定されたヒト血液由来の有核赤血球細胞(NRBC)アナログを含む、血液学的対照品を開示している。しかし、固定された全細胞であるこの種のNRBCアナログは、典型的な5成分示差型血液学的対照製品によりモニタリングされるような検出法と著しく干渉する。
【０００７】
米国特許第5,432,089号は、浸透圧溶解(osmotic lysis)技術を用い、核酸を赤血球に負荷することによる、網状赤血球アナログの調製法を開示している。しかし、米国特許第5,432,089号に開示された浸透圧技術は、網状赤血球アナログを作成するために、RNAが十分に「負荷された」RBCを約20％生じるのみである。結果的に、8〜10％網状赤血球範囲内に適度に高レベルの対照を生じるためには、これらの処理された材料は、2〜2.5倍にしか希釈することができず、このことはそれ自身を効率的な製造プロセスには役立たせるものとしない。
【０００８】
Francisら(米国特許第5,945340号；第5,858,789号；及び、第5,736,402号)は、血液から回収した天然のブタ網状赤血球の成熟を抑さえることにより、網状赤血球アナログを調製する方法を開示している。しかしブタ網状赤血球は、ヒト網状赤血球よりも著しく小さく、すなわちこれらは著しく低いMRVを有し、いくつかの自動血液分析装置において、これらの信頼できる検出を問題があるものとしている。
【０００９】
加えて、血液用装置上の血液試料中の有核赤血球細胞を測定するためのいくつかの検出法が報告されている。米国特許第5,874,310号及び第5,917,584号(Liら)は、概して蛍光分析を使用する必要なく溶解条件下で血液試料の光散乱シグナルのふたつの角度を測定することにより、有核赤血球細胞を識別する方法を開示している。米国特許第5,874,310号及び第5,917,584号は更に、光散乱及びDCインピーダンスシグナルを測定することにより、有核赤血球細胞を識別する方法を開示している。米国特許第6,410,330号(Liら)及びその同時係属出願である米国特許出願第10/226800号(Liら)は概して、DCインピーダンス測定を用いることにより、NRBCを決定する方法を提供している。
【００１０】
米国特許第6,472,215号(Huoら)は、血液試料の第一のアリコート及び第二のアリコートを、第一の溶解試薬システム及び第二の溶解試薬システムで個別に溶解し；DCインピーダンス、高周波、及び光散乱の測定によりフローセル中の第一の試料混合物を測定し；非焦点フロー開口部の中でのDCインピーダンス測定により、第二の試料混合物中の細胞分布を測定し、そして残存する血液細胞を計測し；第一の試料混合物の測定から及び第二の試料混合物の測定から得られた血液細胞分布パターンを、各々分析し；そして更に血液試料中の別の細胞型からNRBCを識別し、NRBC数を決定するために分析を行うことによる、有核赤血球を識別する方法を開示している。
【００１１】
血液学的対照製品において有用である材料は、いくつかの重要な特性を持っている。この材料の重要な特性のひとつは、患者血液試料の血液用装置及び試薬システムとの相互作用に類似した様式で、この材料は血液用装置及び試薬システムと相互作用させることである。加えてこの材料は、血液分析装置及び試薬システムが特定されたパラメータ内で機能する限りは、一貫し及び推定可能な結果を提供する。血液分析装置及び／又は試薬システムが特定されたパラメータ内でない場合は、これは予想される推定可能な結果(output)と一致しない対照結果により示されるはずである。別の血液学的対照品の望ましい特性は、安定性である。臨床検体が試験される方法と同じ方法でこの対照品を試験する場合に利用者が回収するこれらのパラメータ値は、利用者により経済的であるとみなされるのに十分な長さである製品寿命にわたり装置の誤作動を検出する対照品の能力について利用者が自信を持つように、十分に安定していなければならない。更に別の望ましい特性は、製造法が30％より高い、及びより好ましくは40％よりもより高い製品の高収率を有することである。
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、粒子の表面に付着された生体高分子を有する粒子を含む血液学的対照品に関し、該粒子は、血液試料の成分を模倣している。ひとつの態様において、血液学的対照品は、粒子の表面に付着された生体高分子を有する粒子を含み、該粒子は、血液試料中の網状赤血球を模倣している。同様に更なる態様は、粒子の表面に付着された生体高分子を有する粒子を含む血液学的対照品に関し、該粒子は、血液試料中のNRBCを模倣している。更なる態様において、粒子は、赤血球細胞、好ましくは哺乳類のそれを含む。より更なる態様において、血液学的対照品は、架橋結合を通じ細胞の表面に付着されたRNAを有するヒト赤血球細胞を含む。
【００１３】
本発明の追加の態様は、光学-蛍光ベースの検出装置及び電気-光学ベースの検出装置において網状赤血球を模倣する血液学的対照品である。同様に更なる態様は、光学-蛍光ベースの検出装置及び電気-光学ベースの検出装置においてNRBCを模倣する血液学的対照品に関する。
【００１４】
本発明は更に、粒子の表面に生体高分子を付着し、ここで該粒子は血液試料の成分を模倣していることを含む、血液学的対照品を作成する方法を説明している。
【００１５】
より更に本発明は、血液学的対照品を使用する方法を説明している。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、血液学的対照品及びそれらの製造法を説明している。本発明の血液学的対照品は、粒子から製造され、これは血液分析装置及びフローサイトメーター(マイクロフルオロメーター)での使用のために、それらの外側表面が生体高分子で被覆されている。本発明は、血液分析装置又はフローサイトメーターで使用するためのNRBC対照品又は網状赤血球対照品を作成するために、生体高分子で被覆されたそれらの外側表面を有する粒子の種類としての、赤血球細胞に特に関連している。
【００１７】
本発明において使用される生体高分子は、細胞の望ましい局面に由来する合成もしくは天然の材料、又は細胞の望ましい局面を模倣することが可能であり及び標的粒子の外側表面に安定した付着を形成する能力を有する合成もしくは天然の材料であることができる。適当な生体高分子の例は、天然及び合成のムコ多糖及び核酸(RNA又はDNA)並びに適当な標的粒子に安定して架橋結合することができるいずれかの材料を含む。網状赤血球又はNRBCアナログを作成する目的のための生体高分子は、核酸結合リガンド(例えば、色素)がそれと安定した複合体を形成するようないずれかの化合物であることができ、これはDNA、RNA、ペプチド核酸(「pNA」)、並びに検出者リガンド、例えば色素と十分安定している非共有的複合体を形成する適当なイオン領域又は疎水領域を伴うポリマーを含むが、これらに限定されるものではない。RNAは本発明に良く適しており、その理由は、リボ核酸は、本発明のデザインに関して、隣接ヒドロキシル基を示す分子の3側のプライマー(three prime)(3')末端に単糖単位のみが存在する点が独自であるような、高分子複合糖質であるからである。
【００１８】
この生体高分子は、共有的又はイオン性架橋結合のいずれかを用い、好ましくは共有的架橋結合により、粒子に付着することができる。通常の架橋結合化学を使用し、生体高分子を粒子の外側表面に共有結合することができる。この生体高分子が核酸-ベースの生体高分子であるならば、適当なヘテロ-及びホモ-二官能性化学架橋リンカーは、他方の標的細胞表面上(例えば、タンパク質、リポタンパク質、脂質又は糖質内)に認められる、一方の末端の個々のヌクレオチド塩基(アデニン、グアニン、及びシトシンのものなど)のアミノ基並びに反応性部分(アミノ、カルボキシ又はスルフヒドリル基など)と反応するものである。適当な二官能性化学架橋リンカーは、Means,G. E.及びFeeney, R.E.の「Chemical Modification of Proteins」、1971年、Holden-Day社、又は「Pierce Chemical社カタログ」(Pierce Endogen社、ロックフォード、IL)に説明されている。適当な架橋剤の例は、アミンからスルフヒドリル、アミノからカルボキシ及びアミンからアミンへのリンカーを含む。アミンからスルフヒドリルへのリンカーは、N-β-マレイミドプロピオン酸及びマレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシニメートを含む。アミンからカルボキシへのリンカーは、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド(EDAC)を含む。アミンからアミンへのリンカーは、グルタルアルデヒド、ジ(アデニンジアルデヒド)三リン酸(DAD-TP)、及びジメチルアジポイミデート、エチレングリコビス(スルホスクシンイミジルスクシネート)を含む。
【００１９】
別の態様において、生体高分子がRNA又はRNA-ベースのポリマーである場合は、RNAは、3'-OH(すなわち、隣接ヒドロキシル)基の酸化でアルデヒドを形成した後、粒子表面に連結することができる。例えば、隣接ヒドロキシル基の過ヨウ素酸塩による酸化は当該技術分野において周知である(「Organic Chemistry」、Morrison及びBoyd、第2版、1966年、Allyn and Bacon社、879、989頁)。リガンドの反応性アルデヒドへのカップリングの目的で反応性アルデヒドを形成するための、アガロース又はグルコースのような複合糖質又は単糖内に含まれる隣接ヒドロキシル基を酸化するための過ヨウ素酸塩の使用も、周知である。
【００２０】
この生体高分子は、合成又は天然のいずれかの給源から得ることができる。RNAが生体高分子として使用される場合、都合の良い給源は、パン酵母及びトルラ酵母である。一般にこのRNAは、適当な緩衝溶液、例えば酢酸又はホウ酸緩衝した溶液に、約0.5％〜20％(w/v)の範囲に及ぶRNA濃度、好ましくは1％〜10％(w/v)で、溶解することができ、この溶解反応は、温度範囲約1℃〜100℃、好ましくは10℃〜60℃、最も好ましくは18℃〜40℃、及びpH範囲1〜14、好ましくは4〜12、最も好ましくは8〜10での、緩衝溶液中のRNA溶解度により左右される。溶解されたRNAは、約10℃〜60℃、好ましくは18℃〜30℃の温度で、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、又は過ヨウ素酸テトラブチルアンモニウムなどの過ヨウ素酸塩と、過ヨウ素酸イオン濃度が約0.125mM〜200mM、好ましくは0.25mM〜5mM、pH範囲が2〜12、好ましくは4.0〜6.0で反応される。消費されない過ヨウ素酸イオンは更に、1モル過剰な単純なグリコール、例えばグリセロールと反応することができる。ギ酸及びあらゆる残留過ヨウ素酸塩は、等浸透圧緩衝溶液を使用し、pH範囲2〜12、好ましくは4.0〜6.0で、透析、透析ろ過、脱塩クロマトグラフィー、又は当業者に公知の他の同様の手段により除去される。この反応は、アミン及びアルコールと反応するために利用可能であるRNA鎖の3'末端に活性化されたアルデヒドを伴うRNA調製物を生成する。アルコール(ヒドロキシル)よりもアルデヒドとより反応性である第1級アミンは、哺乳類赤血球細胞を含む、無脊椎動物及び脊椎動物の細胞の表面のタンパク質及びアミノ糖から豊富に入手可能であり、並びにRNAを細胞表面に架橋するために使用することができる。このアルデヒドとアミンの間の反応は、シッフ塩基を生成し、これは還元され、第2級又は第3級アミンを形成し、これは非還元シッフ塩基よりもより安定している。当業者に公知の適当な還元剤は、β-メルカプトエタノール、アスコルビン酸、及び水素化シアノホウ素ナトリウムを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
本発明において使用される粒子は、生体高分子で安定して被覆され得、並びに最新の血液分析装置又はフローサイトメトリーを用い分析される場合血液学試料の正常な成分の代表であるという判定基準に合致するような適当な天然又は合成の材料に由来することができる。好ましくは、そのように被覆される場合にこれらの粒子は、そのように混入されたいずれか他の対照アナログと干渉することなく、多パラメータの血液学的対照製品に混入することができる。本発明において使用するための好ましい粒子は、哺乳類赤血球細胞である。しかし望ましいアナログが、細胞型に特異的な生体高分子による被覆を必要とする場合は、鳥類、爬虫類、又はブタのRBCを使用することができる。この例は、ムコ多糖及びアラキドン酸代謝産物(リポキシゲナーゼ及びシクロオキシゲナーゼ経路の生成物を含む)のような、好塩基性顆粒において認められた分子によりアリゲーターRBCを被覆することにより、好塩基球アナログを作成するであろう。加えてポリスチレン、ラテックス又は他の合成材料に加え、アミノデキストランから製造された粒子は、適当に修飾された化学架橋リンカーを用い、被覆することができる。
【００２２】
赤血球細胞は、周知の標準的手法を用い、ウシ、ゾウ、ヤギ、ウマ、又はヒト血液を含む、哺乳類血液から得ることができる。例えば、エチレンジアミン四酢酸(「EDTA」)、クエン酸リン酸デキストロースアデニン(「CPDA-1」)又はクエン酸デキストロース(「ACD」)により凝血防止された哺乳類血液は、等浸透圧の緩衝された生理食塩水により洗浄され、バッフィーコート、血小板及び血漿が除去される。これらの赤血球細胞は、活性化された核酸(DNA又はRNA)の透析又は透析ろ過に使用される同じ等浸透圧生理食塩水に、濃度範囲約0.5〜4.0 X 106個細胞／μLで懸濁され得る。ヘモグロビンの緩衝能を補償するために、望ましいpHを約4.0〜約6.0の範囲に維持するために必要な、この緩衝液の共役酸を少量添加することができる。
【００２３】
電気、光及び／又は蛍光をベースにした検出システムのために、本発明は、有核赤血球細胞及び網状赤血球によりもたらされる主要な属性を基にしている。これらの属性は、a)NRBCについて約50〜65fL、及び網状赤血球について95〜120fLの容積；b)核酸(DNA又はRNA又は両方)を含むこと、並びにc)ヘモグロビンを含むことである。ひとつの態様において、本発明は、それと核酸(DNA又はRNA)又は核酸結合リガンド(例えば、色素)が安定した複合体を形成する材料との共有的又はイオン的付着により外側表面が被覆されている哺乳類赤血球細胞により構成される。
【００２４】
粒子が網状赤血球アナログとして機能することが望ましい態様において、適当な哺乳類赤血球細胞は、ヒトRBCの正常MCVとほぼ同等又はより大きいMCVを有する。この態様において、適当な給源は、ヒトRBC(MCV約85〜95fL、ゾウRBC(MCV約120〜125fL)、及びクジラ(MCV約115〜125fL)を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
この粒子がNRBCアナログとして機能することが望ましい態様において、適当な哺乳類RBCは、蛍光をベースとしないシステムであるVCS検出システムを利用するBeckman Coulter STKS及びGEN*Sのような装置における検出に関して、正常なヒトRBCよりも顕著に小さいMCVを有する。好ましくは、粒子MCVは、70fL未満である。適当な給源は、ブタRBC(MCV約50〜65fL)、ウマRBC(MCV約35〜50fL)、ウシRBC(MCV約35〜50fL)、及びウシRBC(MCV約30〜40fL)を含むが、これらに限定されるものではなく、ウマRBCが好ましい。
【００２６】
結果として、これらの粒子は、VCSシステムのような電気-光学ベースのシステム、フローサイトメトリー(マイクロフルオロメトリー)システムのような光学-蛍光ベースのシステム、更には網状赤血球又はNRBCを同定するために、核酸結合リガンド(色素)に頼っても良くもしくは頼らなくとも良いような光学ベースのシステム及び電気-光学-蛍光ベースのシステムにおいて、NRBC又は網状赤血球として検出することができる。このようなリガンドは、当業者に周知であり、並びに蛍光(アクリジンオレンジ、ヨウ化プロピジウム、臭化エチジウム、シアニン色素)及び非-蛍光色素(新規メチレンブルー、クマシーブリリアントブルー)を含む。
【００２７】
等容量の活性化されたRNA及び洗浄されたRBCは一緒に混合され、カップリング反応が、室温で、該反応の完了に十分な時間の、連続した穏やかな混合により進行することができる。好ましい反応時間は、少なくとも10分〜約24時間、好ましくは約20分〜約18時間、及び最も好ましくは1〜5時間である。シッフ塩基の還元が望ましい場合には、1モル過剰な適当な還元剤、例えばβ-メルカプトエタノール又は水素化シアノホウ素ナトリウムが、カップリング混合物に添加され、この反応は、当業者により理解される標準時間間隔で、室温で20分〜1時間進行することができる。RNAによるRBCの過ヨウ素酸塩被覆の概略的説明を、図1に示している。
【００２８】
あるいは、RNA又は他の核酸-ベースの生体高分子は、二官能性架橋結合剤を使用し、RBCの外側表面に架橋されても良い。例えば、パン酵母又はトルラ酵母のような都合の良い給源からのRNAが、例えばホウ酸、炭酸、リン酸などの適当な緩衝溶液中に、約0.5％〜20％(w/v)、好ましくは1％〜10％(w/v)の範囲のRNA濃度で溶解され、この溶解反応は、温度範囲約1℃〜100℃、好ましくは10℃〜60℃、最も好ましくは18℃〜40℃、及びpH範囲1〜14、好ましくは4〜12、最も好ましくは9〜11における、緩衝溶液中のRNAの溶解度に左右される。溶解されたRNAは、この架橋結合試薬との反応に利用可能であるヌクレオチド塩基のアミノ基を作成するように、RNAの二次及び三次構造を修飾するのに十分である高温で、架橋結合試薬と反応される。RNAは典型的には、約45℃で変性し始め、約60℃で迅速な変性が生じる。DNAが生体高分子として使用される場合、DNAは典型的には、約70℃又はそれ以上で変性し始め、変性の最適温度は、AT:GC含量により左右される。RNA及び架橋結合試薬の最適比を決定する方法は、当業者に周知である。消費されない架橋結合剤は、核酸の冷エタノールによる透析、透析ろ過、又は沈殿により除去してもよい。
【００２９】
RBC表面上のRNAを被覆するために、大量の活性化されたRNA及び洗浄されたRBCが一緒に混合され、その結果、RNAによるRBC表面タンパク質の好ましい飽和に近づき、非常に有用な対照が提供され、並びにこのカップリング反応は、該反応を完了するのに十分な時間、室温で連続して穏やかに混合することにより進行することができる。好ましい反応時間は、少なくとも約10分〜約24時間、好ましくは20分〜18時間、最も好ましくは1〜5時間である。シッフ塩基の還元が望ましい場合は、1モル過剰な適当な還元剤、例えばβ-メルカプトエタノール、アスコルビン酸又は水素化シアノホウ素ナトリウムが、カップリング混合物に添加され、この反応は必要に応じ進行することができる。例えば、水素化シアノホウ素ナトリウムが使用される場合、この反応は、約20分〜約1時間、室温で進行することができる。他方で、苛酷(harsh)ではないβ-メルカプトエタノール又はアスコルビン酸が使用される場合、この反応は約2℃〜約8℃で一晩進行することができる。RNAのRBCへのグルタルアルデヒド-媒介した架橋結合の概略的説明を、図2に示している。
【００３０】
更に別の態様において、RBCは、生体高分子の第二の生体高分子(例えば、タンパク質)への第一の架橋結合、及びその化合物のRBCへの連結により、間接的に生体高分子で被覆された表面であることもできる。このような例のひとつにおいて、RNAは、例えば、前述の方法を用い、グルタルアルデヒドにより、共有的に連結される。その後アビジンが、適当なリン酸、ホウ酸、又は炭酸緩衝液中に、pH範囲1〜14、好ましくは6〜12、最も好ましくは8.0〜10.5で溶解される。グルタルアルデヒド-活性化されたRNAが、このアビジンに、約1.5〜4-倍モル過剰で添加され、及び該反応を完了するのに十分な時間、反応される。好ましい反応時間は、少なくとも約10分〜約24時間、好ましくは20分〜18時間、最も好ましくは1〜5時間である。シッフ塩基の還元が望ましいならば、1モル過剰な適当な還元剤、例えばβ-メルカプトエタノール、アスコルビン酸又は水素化シアノホウ素ナトリウムが、このカップリング混合物へ添加され、この反応は、約20分〜約1時間、室温で進行することができる。未反応のRNAは、当業者に公知の方法により、クロマトグラフィー、透析又は透析ろ過により、RNA-アビジン複合体から分離することができる。本例の更なる一部として、ビオチンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル(BNHS、ビオチン)が、適量のN,N-ジメチルホルムアミド中に適当な濃度(約50mg/mlまで)で溶解される。哺乳類RBCは、前述のように洗浄され、ホウ酸緩衝された生理食塩水(約270〜約310mOsm、pH約8.5〜約9)に、濃度約0.5〜4.0 X 106個細胞/mLとなるよう再懸濁される。ビオチンが、約20μl／1.0 X 106個細胞の量で添加され、及びこの懸濁液は、室温で穏やかに攪拌しながらインキュベーションされ、及び該反応を完了するのに十分な時間反応させる。好ましい反応時間は、少なくとも約10分〜約24時間、好ましくは20分〜18時間、最も好ましくは90分〜4時間である。未反応のビオチンは、等-浸透圧生理食塩水による細胞懸濁液の洗浄により、除去することができる。RBCの表面上のRNAを被覆するために、大量のアビジン-RNA及びビオチン化されたRBCを一緒に混合し、その結果RBC表面タンパク質のRNAによる好ましくは飽和に近づき、非常に有用な対照品が提供され、並びにこのカップリング反応は、室温で、約120分〜約18時間(一晩)の連続した穏やかな混合で進行することができる。
【００３１】
同様の態様において、生体高分子及びRBCの両方が、ビオチンへ連結され、及びこの架橋結合はアビジンにより媒介される。更に別の態様は、グリコフォリン-A抗原、バンド-3抗原、又はRh抗原のような、哺乳類RBCに特異的な表面タンパク質に対して生じる抗体分子への、活性化された生体高分子の共有結合を利用する。その後この抗体-生体高分子複合体は、RBCに、タンパク質の好ましくは飽和に近づき、非常に有用な対照品が提供されるような濃度で、カップリングすることができ、このカップリング反応は、室温で、約120分〜約18時間の連続した穏やかな混合で進行することができる。
【００３２】
一旦この対照品が製造されたならば、これは、貯蔵及び分析装置における使用のために、適当な安定している懸濁液媒体中に懸濁される。懸濁液媒体の適当な例は、当業者に周知であり、及び好ましくはElliottらの米国特許第6,569,682号及びYoungらの米国特許第5,529,933号に開示されたような媒体を含み、これらの特許はそれらの全体が本願明細書に参照として組入れられている。これらの媒体は、長期安定性を付与するために当業者に公知の他の成分を含んでもよい。適当な媒体の他の例は、米国特許第4,213,876号、第4,299,726号、第4,358,394号、第3,873,467号、第4,704,364号、第5,320,964号及び第5,512,485号においてより詳細に説明されており、これらの特許はその全体が本願明細書に参照として組入れられている。
【００３３】
本発明で特に興味深いのは、Rodriguezらの米国特許第5,125,737号により詳細に開示されたような、Beckman Coulter VCS技術；米国特許第5,874,310号；第5,917,584号；第6,410,330号(Liら)により詳細に説明されている電気及び光学ベースのシステム、並びに／又は古典的フローサイトメトリー(マイクロフルオロメトリー)を使用するものなどの、最新の血液分析装置において測定することができる、網状赤血球及びNRBCの対照品である。このような対照品は、過去には問題が多く、その理由は、これらはひとつのプラットフォームにおいては良く機能するが、他のプラットフォームと共に対照品として利用するそれらの能力は満足できないものであるからである。例えば、現在のBeckman Coulter社のRetic-C(商標)網状赤血球血液学的対照品は、VCS技術の制約内で見事に機能する。しかしRetic-C対照品は、鳥類(有核)RBCからなり、従って有意なDNAを有するので、これは蛍光核酸色素を使用する細胞質RNAの検出に頼る許容されたフローサイトメトリー網状赤血球法では、「非常に明るく」、従ってこれには適していない。同様に米国特許第5,432,089号に開示された網状赤血球アナログは、フローサイトメトリー-ベースの適用のための適当な対照品を提供するが、著しく低いMRVのために、より新しい血液分析装置には適していないことが証明されている。加えて先行する全てではないが一部の網状赤血球及びNRBC対照品は、他の対照品との干渉、特に5部分分画パラメータのために、過去には問題が多い。
【００３４】
加えて、血液学的対照品は、少なくとも3種、好ましくは5種の白血球細胞の亜集団を模倣する、白血球細胞成分の添加を企図している。この血液学的対照は更に、血小板、並びに数、MCV及びRDWなどの赤血球細胞パラメータを提供する安定した赤血球細胞のような、全血中の対応する成分を模倣する他の血液成分の添加を企図している。
【００３５】
異なる態様において、血液細胞成分は、ヒト、動物、又は他の全血のサイズ、形状又は他の測定可能な特徴を示すであろう給源に由来することができる。非限定的例として、米国特許第3,873,467号；第4,198,206号；第4,219,440号；第4,264,470号；第4,299,726号；第4,358,394号；第4,436,821号；第4,390,632号；第4,704,364号；第4,777,139号；第5,008,021号；第5,262,327号；第5,270,208号；第5,320,964号；第5,380,664号；第5,432,089号；第5,460,797号；第5,512,485号；第5,672,474号；第5,677,145号；第5,731,205号；第5,811,099号；第5,981,282号；第6,200,500号；及び、第6,221,668号であり、これらは各々本願明細書に参照として組入れられており、各々血液細胞成分のこれらの型の例を含む。
【００３６】
発明の例証的態様
実施例1−0.001M過ヨウ素酸ナトリウムでの酸化によるRNA活性化及びヒト赤血球へのカップリング
パン酵母RNAを、0.05M酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.6)に1％(w/v)で溶解した。十分な固形過ヨウ素酸ナトリウムを添加し、0.001M過ヨウ素酸ナトリウムを達成した。この反応を、室温で約1時間進行させた。この反応液容量の1/100とほぼ同量のグリセロールを添加し、残留する過ヨウ素酸塩を消費し、及びこの消費反応を、約10〜15分間進行させた。この反応混合物を調製した透析袋に移し、及び0.05M酢酸緩衝生理食塩水(pH5.0)に対し、10倍交換液で3回透析した。透析した活性化されたRNAを、袋から取り出し、冷蔵保存した。
【００３７】
EDTA、CPDA-1又はACDで凝血防止されているヒト血液を、当業者に周知のように、等-浸透圧に緩衝された生理食塩水で洗浄し、バッフィーコート、血小板及び血漿を除去した。その後赤血球細胞を、過ヨウ素酸塩で酸化され活性化されたRNAの透析に使用したものと同じ等-浸透圧生理食塩水中に、約2.0 X 106個細胞／μLの濃度範囲で懸濁した。ヘモグロビンの緩衝能を補償するために、必要ならば少量の酢酸を添加し、望ましいpH範囲約5.0〜5.5に細胞懸濁液を維持した。
【００３８】
等量の過ヨウ素酸塩で酸化され活性化されたRNA及び洗浄されたRBCを一緒に混合し、カップリング反応を、室温で、約18時間連続して穏やかに混合しながら、進行させた。シッフ塩基の還元は、カップリング反応液容量の5％と等しい容量の0.01M水素化シアノホウ素ナトリウムを添加することに実現し、及びこの還元反応を、室温で1時間進行させた。
【００３９】
RNAで被覆されたRBCを、反復遠心により洗浄し、当該技術分野において周知のように、緩衝された生理食塩水中に再懸濁し、生理食塩水又は適当な保存媒体中で冷蔵保存した。このアナログのBeckman Coulter STKS(商標)上での分析は、42％の網状赤血球回収を明らかにし、これらを図3に例示した。
【００４０】
実施例2−0.2M過ヨウ素酸ナトリウムでの酸化によるRNA活性化及びヒト赤血球へのカップリング
パン酵母RNAを、0.05M酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.6)に1％(w/v)で溶解した。十分な固形過ヨウ素酸ナトリウムを添加し、0.2M過ヨウ素酸ナトリウムを達成した。この反応を、室温で約1時間進行させた。この反応液容量の1/100とほぼ同容量のグリセロールを添加し、残留する過ヨウ素酸塩を消費し、及びこの消費反応を、約10〜15分間進行させた。この反応混合物を調製した透析袋に移し、及び0.05M酢酸緩衝生理食塩水(pH5.0)に対し、10倍交換液で3回透析した。透析した活性化されたRNAを、袋から取り出し、冷蔵保存した。
【００４１】
EDTA、CPDA-1又はACDで凝血防止されているヒト血液を、当業者に周知のように、等-浸透圧に緩衝された生理食塩水で洗浄し、バッフィーコート、血小板及び血漿を除去した。その後赤血球細胞を、過ヨウ素酸塩で酸化され活性化されたRNAの透析に使用したものと同じ等-浸透圧生理食塩水中に、約2.0 X 106個細胞／μLの濃度範囲で懸濁した。ヘモグロビンの緩衝能を補償するために、必要ならば少量の酢酸を添加し、望ましいpH範囲約5.0〜5.5に細胞懸濁液を維持した。
【００４２】
等量の過ヨウ素酸塩で酸化され活性化されたRNA及び洗浄されたRBCを一緒に混合し、カップリング反応を、室温で、約18時間連続して穏やかに混合しながら、進行させた。シッフ塩基の還元は、カップリング反応液容量の5％と等しい容量の0.01M水素化シアノホウ素ナトリウムを添加することに実現し、及びこの還元反応を、室温で1時間進行させた。
【００４３】
RNAで被覆されたRBCを、反復遠心により洗浄し、当該技術分野において周知のように、緩衝された生理食塩水中に再懸濁し、生理食塩水又は適当な保存媒体中で冷蔵保存した。このアナログのBeckman Coulter STKS上での分析は、約60％の網状赤血球回収を明らかにした。
【００４４】
実施例3−Beckman Coulter 5C異常II細胞対照製品を伴う網状赤血球対照品
現在利用可能な典型的網状赤血球対照品は、Beckman Coulter Retic-C細胞対照品であり、これはヒト網状赤血球を模倣するために鳥類赤血球を利用する非混入型対照品である。実施例1に説明されたプロセスに従い製造された材料を、Beckman Coulter 5C(登録商標)異常II細胞対照製品にスパイクし、得られた結果を表1に示した。
【００４５】
【表１】
2005233935.tif 000002
【００４６】
実施例4−グルタルアルデヒドとのカップリングによるRNA活性化及び引き続きのヒト赤血球の被覆
パン酵母RNAを、0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10)中に5％(w/v)で溶解した。十分なグルタルアルデヒド(25％溶液)を、グルタルアルデヒドのRNAへの1モル過剰を達成するように添加し、このpHを、約4.5〜6.0、好ましくは4.9〜5.1に調節した。この反応を、60℃±2℃で約2時間進行させた。次に反応混合物を、室温に冷却し、過剰で未反応のグルタルアルデヒドを、当該技術分野において周知のように、100％エタノールを使用するRNA-グルタルアルデヒドの沈殿により除去した。活性化されたRNAの沈殿を、0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10)に再溶解し、冷蔵保存した。
【００４７】
EDTA、CPDA-1又はACDで凝血防止されているヒト血液を、等-浸透圧に緩衝された生理食塩水で洗浄し、バッフィーコート、血小板及び血漿を除去し；赤血球細胞を、細胞の洗浄に使用したものと同じ等-浸透圧生理食塩水中に、約2.0 X 106個細胞／μLの濃度範囲で懸濁した。
【００４８】
大量のグルタルアルデヒド-活性化されたRNA及び洗浄されたRBCを、0.5〜1.5ng RNA／赤血球の比で一緒に混合し、このカップリング反応を、室温で2時間連続して穏やかに混合しながら進行させた。その後RNA-被覆した細胞を、反復遠心により洗浄し、及び当該技術分野において周知のように、等-浸透圧の緩衝生理食塩水で再懸濁し、ダルベッコ改変イーグル培地(「DMEM」)中に再懸濁した。シッフ塩基の還元は、アスコルビン酸を350μMまで添加することにより実現し、及びこの還元反応を、4℃で約18時間進行させた。
【００４９】
RNAで被覆されたRBCを、反復遠心により洗浄し、緩衝された生理食塩水中に再懸濁し、DMEM又はリン酸緩衝生理食塩水溶液及び血漿物質の水溶液のような適当な保存媒体中で冷蔵保存した。本願明細書に定義したように、血漿タンパク質の水溶液である。本願明細書に更に定義したように、血漿タンパク質は、血漿中に含まれる1種又は複数のタンパク質を含む。好ましくは、このような血漿タンパク質は、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン、フィブリノーゲン及びそれらの混合物を含む。これらの媒体は、長期安定性を付与するために、当業者に公知の他の成分を含むことができる。他の適当な媒体の例は、米国特許第4,213,876号、第4,299,726号、第4,358,394号、第3,873,467号、第4,704,364号、第5,320,964号及び第5,512,485号により詳細に開示されており、これらの特許はそれらの全体が本願明細書に参照として組入れられている。
【００５０】
実施例5−グルタルアルデヒドとのカップリングによるRNA活性化及び引き続きのヒト赤血球被覆
パン酵母RNAを、0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10)中に5％(w/v)で溶解した。十分なグルタルアルデヒド(25％溶液)を、RNAの0.02％(v/v)となるよう添加し、このpHを、約4.5〜6.0、好ましくは4.9〜5.1に調節した。この反応を、60℃で約2時間進行させた。その後反応混合物を、室温に冷却し、過剰で未反応のグルタルアルデヒドを、4倍量の0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10)に対して透析ろ過することにより除去し、冷蔵又は凍結保存した。
【００５１】
EDTA、CPDA-1又はACDで凝血防止されているヒト血液を、等-浸透圧に緩衝された生理食塩水で洗浄し、バッフィーコート、血小板及び血漿を除去し；並びに、赤血球細胞を、細胞の洗浄に使用したものと同じ等-浸透圧生理食塩水中に、約2.0 X 106個細胞／μLの濃度範囲で懸濁した。
【００５２】
大量のグルタルアルデヒド-活性化されたRNA及び洗浄されたRBCを、0.5ng RNA／赤血球の比で一緒に混合し、このカップリング反応を、室温で2時間連続して穏やかに混合しながら進行させた。その後RNA-被覆した細胞を、反復遠心により洗浄し、及び当該技術分野において周知のように、等-浸透圧の緩衝された生理食塩水で再懸濁し、DMEM中に再懸濁した。シッフ塩基の還元は、アスコルビン酸の350μMまでの添加により実現し、及びこの還元反応を、4℃で約18時間進行させた。
【００５３】
RNA被覆されたRBCを、反復遠心により洗浄し、当該技術分野において周知のように、緩衝された生理食塩水中に再懸濁し、DMEM又は適当な保存媒体中で冷蔵保存した。アクリジンオレンジ染色したアナログの顕微鏡評価を、図5(a)に図示した。網状赤血球アナログのBeckman Coulter GEN*Sでの分析は、網状赤血球の73％の回収を示した。
【００５４】
実施例6−5C正常細胞対照製品を伴う網状赤血球対照品
実施例4に説明されたプロセスに従い作成した材料を、Beckman Coulter 5C正常細胞対照製品にスパイクした。プロトタイプBeckman Coulter LH 750血液用装置による分析は、約6％網状赤血球を示した。白血球細胞数及び5部分の白血球分画との著しい干渉が注目された。結果的にこの材料は、多パラメータ対照製品への封入よりも、非混入型網状赤血球対照品に適しているであろう。
【００５５】
実施例7−5C ES異常II細胞対照製品を伴う網状赤血球対照品
実施例5に説明されたプロセスに従い作成した材料を、Beckman Coulter 5C ES異常II細胞対照製品にスパイクし、Beckman Coulter Gen*S/LH 750プロトタイプ装置において分析した。示されたレベル(約11.5％網状赤血球)で、5部分の白血球分画との最小の干渉が存在した。5部分の分画パラメータとの著しい干渉は存在しなかった。従ってこの材料は、混入型網状赤血球対照製品に適しているであろう。
【００５６】
実施例8−グルタルアルデヒドとのカップリングによるRNA活性化及び引き続きのヒト赤血球被覆
パン酵母RNAを、0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10)中に5％(w/v)で溶解した。十分なグルタルアルデヒド(25％溶液)を、RNAの0.1％(v/v)となるように添加し、このpHを、約4.5〜6.0、好ましくは4.9〜5.1に調節した。この反応を、60℃で約2時間進行させた。その後反応混合物を、室温に冷却し、過剰で未反応のグルタルアルデヒドを、4倍量の0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10)に対して透析ろ過することにより除去し、冷蔵又は凍結保存した。
【００５７】
EDTA、CPDA-1又はACDで凝血防止されているヒト血液を、当該技術分野のいて周知のように、等-浸透圧に緩衝された生理食塩水で洗浄し、バッフィーコート、血小板及び血漿を除去した。その後赤血球細胞を、細胞の洗浄に使用したものと同じ等-浸透圧生理食塩水中に、約2.0 X 106個細胞／μLの濃度範囲で懸濁した。
【００５８】
大量のグルタルアルデヒド-活性化されたRNA及び洗浄されたRBCを、0.5ng RNA／赤血球の比で一緒に混合し、このカップリング反応を、室温で2時間連続して穏やかに混合しながら進行させた。その後RNA-被覆した細胞を、反復遠心により洗浄し、及び当該技術分野において周知のように、等-浸透圧の緩衝された生理食塩水で再懸濁し、DMEM中に再懸濁した。シッフ塩基の還元は、アスコルビン酸の350μMまでの添加により実現し、及びこの還元反応を、4℃で約18時間進行させた。
【００５９】
RNA被覆されたRBCを、反復遠心により洗浄し、当該技術分野において周知のように、緩衝された生理食塩水中に再懸濁し、DMEM又は適当な保存媒体中で冷蔵保存した。アクリジンオレンジ染色したRNA-被覆したアナログの蛍光顕微鏡評価を、図5(b)に図示した。洗浄した対照細胞及び本発明の網状赤血球アナログのVCS分析を使用するBeckman Coulterプロトタイプ装置での分析は、網状赤血球の各19％及び99.4％の回収を示した。
【００６０】
実施例9−グルタルアルデヒドとのカップリングによるRNA活性化及び引き続きのウマ赤血球被覆
パン酵母RNAを、0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10)中に5％(w/v)で溶解した。十分なグルタルアルデヒド(25％溶液)を添加し、RNAの1モル過剰なグルタルアルデヒドを実現し、このpHを、約4.5〜6.0、好ましくは4.9〜5.1に調節した。この反応を、60℃で約2時間進行させた。その後反応混合物を、室温に冷却し、過剰で未反応のグルタルアルデヒドを、当該技術分野において周知のように、100％エタノールを使用するRNA-グルタルアルデヒド沈殿により除去した。活性化されたRNAの沈殿を、0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10)に再溶解し、冷蔵保存した。
【００６１】
当業者に周知のように、クエン酸で凝血防止されている哺乳類血液を、等-浸透圧に緩衝された生理食塩水で洗浄し、バッフィーコート、血小板及び血漿を除去した。その後赤血球を、細胞の洗浄に使用したものと同じ等-浸透圧の生理食塩水中に、約12.0 X 106個細胞／μLの濃度範囲で懸濁した。
【００６２】
洗浄したRBCを、グルタルアルデヒド-活性化されたRNA 25mg/ml及び1.0ng RNA／赤血球の比の溶液に添加し、及びこのカップリング反応を、室温で2時間連続して穏やかに混合しながら進行させた。その後RNA-被覆した細胞を、反復遠心により洗浄し、及び等-浸透圧の緩衝された生理食塩水DMEM中に再懸濁し、保存した。シッフ塩基の還元は、アスコルビン酸の350μMまでの添加により実現した。
【００６３】
実施例10−グルタルアルデヒドとのカップリングによるRNA活性化及び引き続きのウマ赤血球被覆
パン酵母RNAを、0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10)中に5％(w/v)で溶解した。十分なグルタルアルデヒド(25％溶液)を添加し、RNAの1モル過剰なグルタルアルデヒドを実現し、このpHを、約4.5〜6.0、好ましくは4.9〜5.1に調節した。この反応を、60℃で約2時間進行させた。その後反応混合物を、室温に冷却し、過剰で未反応のグルタルアルデヒドを、当該技術分野において周知のように、100％エタノールを使用するRNA-グルタルアルデヒド沈殿により除去した。活性化されたRNAの沈殿を、0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10)に再溶解し、冷蔵保存した。
【００６４】
クエン酸で凝血防止されているウマ血液を、等-浸透圧に緩衝された生理食塩水で洗浄し、バッフィーコート、血小板及び血漿を除去した。その後赤血球を、細胞の洗浄に使用したものと同じ等-浸透圧の生理食塩水中に、約2.5 X 106個細胞／μLの濃度範囲で懸濁した。
【００６５】
洗浄したRBCを、グルタルアルデヒド-活性化されたRNA 25mg/ml及び1.0ng RNA／赤血球の比の溶液に添加し、及びこのカップリング反応を、室温で2時間連続して穏やかに混合しながら進行させた。その後RNA-被覆した細胞を、反復遠心により洗浄し、及び等-浸透圧の緩衝された生理食塩水DMEM中に再懸濁し、保存した。シッフ塩基の還元は、アスコルビン酸の350μMまでの添加により実現した。
【００６６】
5C ES異常II細胞対照製品単独を伴うWBC数は3.4であるのに対し、この対照品がNRBCアナログでスパイクされた場合のWBCは、NRBCアナログのより高いレベルのために、7.2であった。しかし、WBC分画百分比の結果は、本質的に変化しなかった。NRBCアナログは、WBCヒストグラムでWBCピークの左側に出現することに加え、5部分分画散布図のDF1視野(view)における非常に低DC及び中間範囲のRLS(回転(rotated)光散乱)で検出された。
【００６７】
実施例11−5C ES異常II細胞対照製品を伴うNRBC対照品
NRBCアナログに関する先行技術は、固定された鳥類赤血球(Streck Laboratories社)を用い、「VCS」装置上にNRBCフラグを作成するか、又は鳥類もしくは魚類の赤血球又は哺乳類白血球からの固定された核(Abbott Laboratories社)を用い、光学検出器及び蛍光検出器と互換性のあるNRBCアナログを作成した。これらの型のNRBCアナログは、Beckman Coulter 5C/5C ES細胞対照製品のような、標準の5-部分対照に混入された場合の使用には適しておらず、その理由は、これらはVCS検出システムのトリプルトランスデューサーモジュール(「TTM」)において測定した5-部分分画とは干渉する傾向があるからである。実施例9及び10に説明されたプロセスに従い作成された材料は、Beckman Coulter 5C ES異常II細胞対照製品にスパイクされ、及びBeckman Coulter LH 750パイロット装置において分析された。5C ES製品にWBC数の約15％〜30％の濃度で混入されたNRBCアナログの安定性プロファイルを、図6に図示した。結果は、150日間よりも長い密封容器安定性が示された。
【００６８】
本発明は、詳細に説明されかつ添付図面に図示されているが、これらは、本発明の範囲を制限するものとしては解釈されず、むしろそれらの好ましい態様の例証である。しかし、本願明細書に説明されたような本発明の精神及び範囲内の並びに添付された「特許請求の範囲」及びそれらの法律的同等物において定義された様々な修飾及び変更を行うことができることは明らかであろう。本願明細書に引用された全ての特許及び特許出願は、それらの全体が本願明細書に参照として組入れられている。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図1は、洗浄したヒトRBCの外側表面を、過ヨウ素酸塩で活性化されたRNAで被覆することの概略である。
【図２】図2は、洗浄した哺乳類RBCの外側表面を、グルタルアルデヒドで活性化されたRNAで被覆することの概略である。
【図３】図3は、Beckman Coulter STKS装置を使用する、実施例1の網状赤血球アナログの分析であり、網状赤血球の42％の回収を明らかにしている。
【図４】図4は、Beckman Coulter LH 750装置を使用する、実施例4に従い調製された網状赤血球アナログの分析であり、単独の製品として＞98％が網状赤血球であることを表している。
【図５】図5(a)は、アクリジンオレンジ染色した実施例5のアナログの明視野を使用する顕微鏡評価であり；及び、図5(b)は、図5(a)に示されている同じアクリジンオレンジ染色した実施例5のアナログの蛍光顕微鏡評価である。
【図６】図6は、NRBCアナログ安定性を示している。NRBCアナログは、本発明実施例10に従い調製され、及び実施例11の方法に従い白血球アナログを含む血液学的対照製品に混入されている。プロット1は、100WBCにつき30NRBCの回収が可能であるように添加されたアナログを示し；プロット2は、100WBCにつき15NRBCの回収が可能であるように添加されたアナログを示し；プロット3は、NRBCを添加しないが、血液学的対照製品中に固有のWBCの2〜3％のデブリバックグラウンドを示している、血液学細胞対照を示している。データは、Beckman Coulter装置において、容積／伝導度／光散乱(「VCS」)及びDCインピーダンス検出パラメータを使用し、収集した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図５】
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【外国語明細書】
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