(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質などの生体物質が一定の配向性の元で安定に固定化された生体物質固定化チップを提供する。【解決手段】生体物質にハイドロフォビンを結合させ、該生体物質をハイドロフォビンを介して疎水性基材に固定化することにより生体物質固定化チップを製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体物質がハイドロフォビンを介して疎水性基材上に固定化された生体物質固定化チップ。
【請求項２】
前記生体物質がタンパク質である、請求項１に記載の生体物質固定化チップ。
【請求項３】
生体物質にハイドロフォビンを結合させる工程、及び該ハイドロフォビンを介して前記生体物質を疎水性基材上に固定化する工程を含む、生体物質固定化チップの製造方法。
【請求項４】
前記生体物質がタンパク質である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
物質にハイドロフォビンを結合させる工程、及び該ハイドロフォビンを介して前記物質を疎水性基材上に固定化する工程を含む、物質の固定化方法。
【請求項６】
前記物質がタンパク質である、請求項５に記載の固定化方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の生体物質固定化チップに、該チップに固定化された生体物質に特異的に結合し得る物質を含む試料を添加する工程、及びチップに結合した物質を検出する工程を含む、生体物質固定化チップに固定化された生体物質、または、試料中の結合物質の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロテインチップなどの生体物質固定化チップに関する。本発明はまた、生体物質の固定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインチップなどの生体物質が固定化された生体物質固定化チップは医薬のスクリーニングや診断分野において有用であるが、かかる目的を達成するためには生体物質を一定の配向性のもとで安定に固定化することが好ましい。生体物質の固定化方法としては、生体物質に含まれるアミノ基やカルボキシル基を介して基材上に共有結合させる方法が知られていた。しかしながら、このような方法は、固定化される生体物質の配向性を制御できないという問題点を有していた。
【０００３】
配向性を制御するために、生体物質の末端にタグを導入し、タグを介して固定化するする方法も知られていた。例えば、タンパク質に結合させたポリヒスチジン等の金属結合ポリペプチドを用いて、タンパク質と金属イオンとを結合させる技術が知られていた（例えば、特許文献１、参照）。しかしながら、金属結合ポリペプチドと金属イオンとの結合は、競争的な配位結合反応であるため解離しやすく、安定に固定化することはできなかった。
【０００４】
さらに、タンパク質を固定化する技術として、疎水性ペプチドを用いる方法が知られていた（例えば、特許文献２、参照）。この方法では、疎水アミノ酸がランダムに並んだ配列を有するペプチドタグがタンパク質を疎水性基材に結合させるために使用されている。しかし、生体物質を一定の配向性のもと、より安定に固定化するためには、このようなランダムな配列では十分でなく、さらなる固定化技術の開発が望まれていた。
【０００５】
ハイドロフォビンは糸状菌などによって分泌される約100アミノ酸のタンパク質であるが、疎水性アミノ酸を多く含み、さらに、８個のシステイン残基によって分子内ジスルフィド結合を形成することから、細胞表面に疎水性環境を提供することが知られている（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、ハイドロフォビンをタンパク質などの生体物質の固定化に使用することは試みられていなかった。
【特許文献１】特開２００１-０８３１５５号公報
【特許文献２】特公平０７−０５３１０８号公報
【非特許文献１】J. Biol. Chem., 2000，Vol. 275, Issue 37, p28428-28432
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はタンパク質などの生体物質を一定の配向性のもとで安定に固定化する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、タンパク質の末端にハイドロフォビンを結合させた融合タンパク質を作製し、これを疎水性基材上に添加することにより、タンパク質を安定に固定化できることを見出して本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）生体物質がハイドロフォビンを介して疎水性基材上に固定化された生体物質固定化チップ。
（２）  前記生体物質がタンパク質である、（１）の生体物質固定化チップ。
（３）  生体物質にハイドロフォビンを結合させる工程、及び該ハイドロフォビンを介して前記生体物質を疎水性基材上に固定化する工程を含む、生体物質固定化チップの製造方法。
（４）  前記生体物質がタンパク質である（３）の製造方法。
（５）  物質にハイドロフォビンを結合させる工程、及び該ハイドロフォビンを介して前記物質を疎水性基材上に固定化する工程を含む、物質の固定化方法。
（６）  前記生体物質がタンパク質である、（５）の固定化方法。
（７）  （１）又は（２）の生体物質固定化チップに、該チップに固定化された生体物質に特異的に結合し得る物質を含む試料を添加する工程、及びチップに結合した物質を検出する工程を含む、生体物質固定化チップに固定化された生体物質、または、試料中の結合物質の分析方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のハイドロフォビンをキャリアとして目的生体物質を固定化する技術は、主にプロテインアレイ（プロテインチップ）技術に応用される。ハイドロフォビン配列の後ろに目的タンパク質等の配列を導入することで、ハイドロフォビン分子同士とハイドロフォビンと疎水性基材との間にそれぞれ強い疎水性相互作用が生じる。その結果、分子同士が密度高く均一にドットを形成することが可能で、これにより様々なタンパク質を疎水性基材上へ均一にスポットすることが可能である。活性が変化しやすいタンパク質に関しては、有機溶媒中に添加することで逆ミセルの形態をとり、その活性を保護することも可能である。また、タンパク質以外のアレイ技術の応用として、ハイドロフォビン単体で発現させ、それに化学物質、金属粒子、DNA・RNAなどを架橋することで、疎水性基材上への均一固定化することも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に本方法を詳しく説明する。
【００１１】
本発明のチップは、生体物質がハイドロフォビンを介して疎水性基材上に固定化された生体物質固定化チップである。
【００１２】
ハイドロフォビン（hydrophobin）は、糸状菌などの多くの微生物によって分泌される、疎水性アミノ酸を多く含むタンパク質である。本発明において使用するハイドロフォビンは生体物質を安定に固定化することができる限り特に制限されないが、以下のような微生物由来のハイドロフォビンを例示することができる。
【００１３】
トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei） P52754，P79073
ギベレラ・モニリフォルミス（Gibberella moniliformis） AAO16867−16870
アガリクス・ビスポラス（Agaricus bisporus） CAA61530
プレウロタス・オストレアタス（Pleurotus ostreatus） CAD12829-12834
シゾフィルム・コミュネ（Schizophyllum commune） CAA07545
ヒポクレア・ジェコリナ（Hypocrea jecorina） CAA92208
クラドスポリウム・フルバム（Cladosporium fulvum） CAA67187，CAB39309−39312
アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus） AAC13524
フラムリナ・ヴェルチペス（Flammulina velutipes） BAD08615
レンチヌラ・エドデス（Lentinula edodes） AAG00900-00901
ピソリザス・チンクトリウス（Pisolithus tinctorius） AAC49307-49308
ヒポクレア・リクシイ（Hypocrea lixii） CAA72539
ネオサルトルヤ・アウレオラ（Neosartorya aureola） AAC13528
アスペルギルス・デュリカウリス（Aspergillus duricaulis） AAC13522
ディクチオネマ・グラブラタム（Dictyonema glabratum） CAC86002，86005，86006
【００１４】
ここでは、微生物名とNCBI（National Center for Biotechnology Information）プロテインデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Protein）のAccession No.をそれぞれ示した。なお、ハイドロフォビンはこれら以外にも多く知られており、本発明において使用するハイドロフォビンは上記のものに限定されない。
【００１５】
微生物のハイドロフォビンは、８個のシステインが保存されており、多くの疎水性アミノ酸を含むという点で共通するため、いずれの微生物由来のハイドロフォビンを使用してもよい。また、ハイドロフォビンはサブタイプが存在するが、サブタイプ間でもシステイン残基及び疎水性アミノ酸が保存されているため、いずれのサブタイプであってもよい。本発明においては、ハイドロフォビン（hydrophobin）の全長を使用してもよいし、一部を使用してもよい。ハイドロフォビン（hydrophobin）の一部を使用する場合、用いる部分は生体物質を安定に固定化することができる限り特に制限されないが、８個のシステインを含む領域（例えば、配列番号２のアミノ酸番号２０〜８１又はこれに相当する領域）を用いることが好ましい。
【００１６】
本発明のチップにおいてハイドロフォビンを介して固定化される生体物質としては、ペプチドを含むタンパク質（プロテインチップ）、DNAやRNAなどの核酸（核酸チップ）などが挙げられる。ハイドロフォビンは生体物質中のどの部位に結合していてもよいが、タンパク質の場合、そのN末端又はC末端に結合していることが好ましい。
【００１７】
固定化されるタンパク質としては、インシュリン、ＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン）、オキシトシン等のタンパク質ホルモンもしくはペプチドホルモン、コリンエステラーゼ、アミラーゼ、ペプシン等の酵素又はその前駆体、ＨＢｓ抗原、ＨＩＶ抗原等の抗原を認識する抗体、プロテインＡのような抗体結合性タンパク質が挙げられる。また、ランダムな核酸配列から翻訳されるようなランダムペプチドライブラリー又はランダムタンパク質ライブラリーを用いてもよい。なお、本発明において固定化されるタンパク質は化学合成したような非天然のものであってもよい。
【００１８】
本発明のチップにおいては、生体物質がハイドロフォビンを介して疎水性基材上に固定化されている。疎水性基材としては生体物質固定化面が疎水性であるものであれば特に制限されないが、テフロン、シリコン、シランなどを素材とする基材、及びこれらで疎水コートされたプラスチック、ガラス、セラミックなどの基材などが挙げられる。生体物質は、これらの疎水性基材上に全面に連続して固定化されていてもよいし、基材上に一定の間隔で配置されるように固定化されていてもよい。また、ドット状に固定化されていてもよい。上記基材の形状としては、例えば、フィルム、平板、粒子、成型品（ビーズ、ストリップ、マルチウェルプレートのウェルまたはストリップ、チューブ、メッシュ、連続発砲フォーム、膜、紙、針、ファイバー、プレート、スライドおよび細胞培養容器）、ラテックスなどを挙げることができ、またその大きさも特に制限されない。
【００１９】
本発明の生体物質固定化チップは、生体物質にハイドロフォビンを結合させ、該ハイドロフォビンを介して生体物質を疎水性基材上に固定化することによって製造することができる。DNAやRNAなどの核酸を固定化する場合、核酸は生体から抽出したものを用いてもよいし、化学合成したものを用いてもよい。核酸とハイドロフォビンの結合は常法により化学的に行うことができる。
【００２０】
タンパク質を固定化する場合、タンパク質とハイドロフォビンとの結合は、別途調製したタンパク質とハイドロフォビンとを化学的に結合させてもよいが、遺伝子組換えなどにより、ハイドロフォビンが結合した融合タンパク質を作製してもよい。遺伝子組換え法と
しては、例えば、ハイドロフォビンをコードする遺伝子（例えば、配列番号１の塩基番号５４〜２６６番目など）と固定化対象タンパク質をコードする遺伝子がin-frameで連結されたＤＮＡを含むベクターを、網状赤血球破砕物（Reticulocyte Lysate）などのインビトロ、または大腸菌や昆虫細胞等の宿主細胞で発現させ、精製することによって、ハイドロフォビンが結合した融合タンパク質を得る方法を挙げることができる。なお、このような融合タンパク質を化学合成することもできる。さらに、融合タンパク質にはポリヒスチジンタグなどの精製用の配列がさらに含まれていてもよい。
【００２１】
上記のようにして調製したハイドロフォビン結合生体物質を疎水性基材上に固定化する。固定化は、例えば、ハイドロフォビン結合生体物質の溶液を、テフロン、シリコン、シランなどを素材とする基材又はこれらで疎水コートされた基材上に滴下、塗布、あるいは吹き付けることによって行うことができる。水平付着法によって吸着固定化させてもよい。また、ドット状に配置させるためには、インクジェットプリンタ等を用いて疎水性基材上にスポットしてもよい。
【００２２】
このようにして製造される生体物質固定化チップは、様々な分析法に使用することができる。例えば、チップに固定化された生体物質に特異的に結合し得る物質を含む試料を本発明のチップに添加し、チップに結合した物質を検出することによって、生体物質固定化チップに固定化された生体物質、または、試料中の結合物質を分析することができる。ここで、固定化チップとして核酸チップを用いる場合は、固定化核酸に結合する核酸又はその他の核酸結合物質を含む試料を用いて分析することにより、核酸結合物質の探索などを行うことができる。
【００２３】
また、プロテインチップを用いる場合は、固定化タンパク質に特異的に結合しうるタンパク質（ペプチドも含む）、抗原性物質、核酸、医薬化合物を含む試料を用いて分析することにより、タンパク質結合物質の探索などを行うことができる。これらの試料は一種類のタンパク質結合物質を含むものであってもよいが、ランダムなタンパク質の混合物をタンパク質ライブラリーとして含む試料を用いてもよい。また、ランダムな化合物の混合物を化合物ライブラリーとして用いてもよい。さらに、これらのタンパク質結合物質を含む試料としては、これらの物質を適当な緩衝液に溶解させた溶液であってもよいし、血液や細胞抽出液等の生体試料であってもよい。
【００２４】
本発明のプロテインチップを用いた分析法は種々の用途に用いることができる。例えば、固定化タンパク質として、特定の疾患に関与する医薬標的タンパク質を用い、タンパク質結合物質として医薬化合物のライブラリーを用いた場合には、標的タンパク質に結合する医薬のスクリーニングに用いることができる。また、特定抗原に対する抗体を固定化タンパク質として、抗原を含む可能性のある血液等の試料をタンパク質結合物質を含む試料に用いた場合には、抗原の有無によって病気を診断するための測定装置にも用いることができる。さらに、ランダムなタンパク質の混合物をタンパク質ライブラリーとして固定化タンパク質に用い、特定タンパク質または特定化合物をタンパク質結合物質に用いた場合には、特定タンパク質または特定化合物に結合するタンパク質を探策するような、タンパク質の機能解析にも用いることができる。
【００２５】
なお、分析対象は、固定化タンパク質であっても、試料中のタンパク質結合物質であってもよい。固定化タンパク質との結合を介して基材に間接的に結合したタンパク質結合物質の検出は、例えば、以下のようにして行うことができる。なお、反応の際、基材へタンパク質結合物質等が非特異的に結合することを防ぐために、タンパク質を固定化した後に、過剰量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、サケ精子ＤＮＡ等を担体に接触させ、基材をブロックしておくことが好ましい。固定化タンパク質とタンパク質結合物質を含む試料とを反応させた後、通常の固相のイムノアッセイなどにより、固定化タンパク質
に結合したタンパク質結合物質を検出する。ここで、固定化タンパク質が測定対象である場合には、標識物質で標識しておいたタンパク質結合物質をプロテインチップと反応させ、チップに結合した標識物質を検出又は定量することにより、タンパク質結合物質を検出又は定量することができ、結果として、目的の固定化タンパク質を検出又は定量することができる。
【００２６】
また、タンパク質結合物質が測定対象である場合には、プロテインチップとタンパク質結合物質とを反応させる際に、反応系に標識物質で標識されたタンパク質結合物質をさらに加え、固定化タンパク質に結合した標識された物質の結合量により、間接的に試料中のタンパク質結合物質の量を定量することができる（阻害法）。
【００２７】
さらに、固定化タンパク質に結合したタンパク質結合物質の検出は、その物質に特異的に結合し得る抗体等を反応させることによっても行うことができる。例えば、タンパク質結合物質が抗原であり、固定化タンパク質がこの抗原に対する抗体（第１抗体）である場合、固定化された第１抗体−抗原複合体に、標識された他の抗体（第２抗体）を反応させて固定化された第１抗体−抗原−第２抗体複合体を形成させ、複合体中の第２抗体を検出することにより、タンパク質結合物質を検出することができる（サンドイッチ法）。また、必ずしも標識物質自体が検出することができないものであってもよい。例えば標識物質としてビオチンを用いた場合には、これに特異的に結合するアビジン又はストレプトアビジンを結合させた酵素等を用いることにより、間接的に検出することができる。
【００２８】
本発明はさらに、「物質の固定化方法」を提供する。ここで、固定化する物質の種類は特に制限されず、タンパク質、核酸などの生体物質であってもよいし、低分子化合物、ポリマー、金属などの非生体物質であってもよい。具体的には、これらの物質にハイドロフォビンを結合させ、ハイドロフォビンを介して該物質を疎水性基材上に固定化する。この方法により、生体物質及び非生体物質のいずれについても疎水結合を介して安定に固定化することができる。
【実施例】
【００２９】
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３０】
（1）ハイドロフォビンII融合プロテインA発現ベクターの構築
目的タンパク質の固定化のためのキャリアタンパク質として、N末端にFLAG-tag、His-tagを有するハイドロフォビンII（Trichoderma reesei）を利用した（アミノ酸配列：配列番号２）。このアミノ酸配列をコードするDNAとして配列番号１のDNAを用いた。この配列はそれぞれの末端に、NcoI、BamHIサイトを有している。また、クローニングベクターはpET81F1+(Tanhauser et al. A T7 expression vector optimized for site-directed mutagenesis using oligodeoxyribonucleotide cassettes, Gene, 117(1992) 113-117)を用い、NcoI−BamHI消化後、Ligation Kit（宝酒造）を用いて上記のハイドロフォビンIIをコードするDNAを導入した。得られたプラスミドをpET81F1+HFBIIと名付けた。
【００３１】
プロテインAのBサブユニット（アミノ酸配列：配列番号３）を5つ連結したものを固定化タンパク質として用いた。プロテインAのBサブユニットをコードするDNAをPCR法にて増幅した。鋳型は化学合成した配列番号４のポリヌクレオチドとその相補鎖である配列番号５のポリヌクレオチドの混合物を用いた。また、プライマーには、プロテインA配列の５´側のプライマー（配列番号６）と３´側プライマー（配列番号７）を用いた。PCR反応は、95℃、60秒  →  60℃、30秒  →  72℃、60秒を30サイクル行った。
【００３２】
得られたPCR産物をAccIで消化し、Ligation Kit（宝酒造）を用いて連結させた。Acc
Iの配列は非回文配列のため一方向にて増幅産物をタンデムに連結することができる。得られた連結DNAをアガロースゲル電気泳動にて分離・精製し、Blunting Kit （宝酒造）を用いて平滑末端化した後、pBluescript II SK (STRATAGENE)のEcoRVサイトに導入した。その後、大腸菌に形質導入し、得られたコロニーからプラスミドを単離し、T3プロモーター側からT7側へ正方向にプロテインAが5つ連結したものが導入されていることをシークエンサーにて確認した。
【００３３】
精製した上記のプラスミドをBamHI、HindIIIで消化して得られたフラグメントを同じくBamHI、HindIIIで消化したpET81F1+HFBIIに導入した。ハイドロフォビンIIのC末端側にプロテインAが融合したタンパク質を発現させるこのベクターをpET81F1+HFBII−ProAと名付けた。
【００３４】
（２）ハイドロフォビン融合プロテインAの発現および精製
ルビジウム塩で処理し作成した大腸菌BL21（DE3）のコンピテントセルにヒートショック法を用いてpET81F1+HFBII−ProAプラスミドを形質導入し、アンピシリン耐性で選択することでその組換え大腸菌を得た。得られた組換え大腸菌は一晩前培養を行い、その後アンピシリン入りのLB培地中において37℃で培養し、菌体濃度として600 nmでの吸光度が0.2になった時点で、Isopropyl-Thio-β-D-Galactopyranosideを最終濃度が0.4mＭとなるように培地中に添加し発現誘導を行った。37℃、4時間培養を行い、目的タンパク質（ハイドロフォビンII‐プロテインA ）の可溶化のため、最終濃度2.5％になるようにTween20を添加した0.1ｍMリン酸緩衝液に菌体を溶解し、超音波破砕することで目的タンパク質を含む可溶性画分を得た。その後、ニッケルカラム（ファルマシア）を用い可溶性画分からハイドロフォビンII融合プロテインAを精製した。
【００３５】
（３）HFBIIをキャリアタンパク質として用いたプロテインAの疎水性基板上へのドットプリンティング
ガラスプレートを、シラン化合物（トリクロロシラン）を用いその表面上を疎水化することで、ハイドロフォビン融合タンパク質を固定化する疎水性基材を作製した。ドットプリンティングを行うドットスポッタは、市販のインクジェットプリンター（Canon社BJ M70）を改良したものを用いた。（1）で得たハイドロフォビン融合プロテインAを純水で0.2
mg/mlに調節し、空のインクカートリッジに充填後、疎水性基板上にドットプリンティングした。コントロールとしてプロテインAのみをドットプリンティングした。ドットスポッタはPCで制御されており、ドットサイズはPC上のイラストソフトウェア（Adobe社）で調節を行っている。また、空気中の埃・塵等のガラス基板上への付着を避けるため、すべての操作はクリーンベンチ内で行った。
【００３６】
（４）ドット評価（免疫染色）
ガラスプレートに固定化されたプロテインAの評価は、標識抗体を用いた免疫染色法にて行った。プロテインAに高い特異性をもつHRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)標識IgG抗体（和光純薬）を、ドットスポットしたプロテインA上に添加し免疫修飾させた。修飾後、0.1ｍMリン酸緩衝液にて過剰なIgGを洗浄した。基質にペルオキシダーゼ発光基質溶液DuoLux（Pierce社）を用い、その発光を高感度発光測定システム（浜松ホトニクス）にて測定した。
【００３７】
発光によるドットスポットの均一化評価に関して、ハイドロフォビンIIをキャリアタンパク質としてスポットしたプロテインAは均一にガラス基盤へ固定化されているのに対し、プロテインAのみ発現させてスポットしたものは均一なものが得られなかった。これは、サンプルであるプロテインAが配向性を持っていなく、疎水性基板上へランダムに結合した為であると考えられる。一方、ハイドロフォビンIIをキャリアとしてプロテインAとの融合タンパク質として用いた場合、その超疎水性なキャリアタンパク質を有することか
ら疎水面へ非常に優れた配向性を示し、均一にスポットしたと考えられる。また、ハイドロフォビンIIは非常に小さい分子量のため、目的タンパク質への立体阻害作用を引き起こしていないこともその光子量から示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の生体物質固定化チップは、タンパク質などの生体物質を一定の配向性のもと、安定に保持することができ、医薬のスクリーニングや診断等に好適に用いることができる。
【配列表】
2005233705000001.app