(57)【要約】【課題】  本発明の目的は、末梢血、臍帯血、骨髄液等から造血幹細胞を効率よく分離し、高収率で回収することが可能な細胞分離回収膜及び細胞分離回収方法を提供することにある。【解決手段】  有用細胞と除去細胞とを含む細胞混合物より有用細胞を分離回収するために用いられる細胞分離回収膜に関する。  細胞分離回収膜は、ポリウレタン発泡体にカルボキシル基を導入したものである。【選択図】    図３
2005323534.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有用細胞と除去細胞とを含む細胞混合物より有用細胞を分離回収するために用いられる細胞分離回収膜であって、
該細胞分離回収膜は、ポリウレタン発泡体にカルボキシル基を導入したものであることを特徴とする細胞分離回収膜。
【請求項２】
前記細胞分離回収膜では、前記有用細胞として、ＣＤ３４抗原陽性の造血幹細胞が分離回収されることを特徴とする請求項１に記載の細胞分離回収膜。
【請求項３】
前記細胞分離回収膜には、エポキシ環を有する化合物が導入されており、前記カルボキシル基は、前記エポキシ環を介して導入されることを特徴とする請求項１に記載の細胞分離回収膜。
【請求項４】
前記細胞分離回収膜には、前記除去細胞を通過させる複数の孔が設けられており、該孔の径は、３μｍ以上１００μｍ以下であることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか一つに記載の細胞分離回収膜。
【請求項５】
有用細胞と除去細胞とを含む細胞混合物から有用細胞を分離回収する方法であって、
カルボキシル基が導入されたポリウレタン発泡体膜に、前記細胞混合物を通過させる有用細胞捕捉工程と、
前記カルボキシル基導入ポリウレタン発泡体膜に回収液を通過させて、前記有用細胞を回収する有用細胞回収工程と、を備えることを特徴とする細胞分離回収方法。
【請求項６】
前記有用細胞回収工程では、前記有用細胞として、ＣＤ３４抗原陽性の造血幹細胞が回収されることを特徴とする請求項５に記載の細胞分離回収方法。
【請求項７】
前記有用細胞回収工程では、前記回収液として、生理食塩水、緩衝液、蛋白質を含有する生理食塩水、蛋白質を含有する緩衝液、の少なくとも一つが使用されていることを特徴とする請求項５に記載の細胞分離回収方法。
【請求項８】
前記有用細胞回収工程では、前記回収液として、０．０５重量％以上３重量％以下のアルブミン水溶液が使用されることを特徴とする請求項５に記載の細胞分離回収方法。
【請求項９】
前記有用細胞捕捉工程を行う前に、前記カルボキシル基導入ポリウレタン発泡体膜に、リン酸緩衝液又はアルブミン水溶液を浸潤させる前処理工程を備えたことを特徴とする請求項６記載の細胞分離回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液等に存在する有用細胞のうち特に造血幹細胞を分離可能な細胞分離回収膜及び当該膜を使用した細胞分離回収方法に係り、特に、ポリウレタン膜を官能基で修飾することによって、有用細胞のうち、特に造血幹細胞を高収率で回収することが可能な細胞分離回収膜及び細胞分離回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、自己の再生能力を喪失し、不可逆的に機能不全に陥った細胞、臓器、組織の各機能を外的操作により再生させることが、再生医療の現場において大きな課題となっている。
再生医療とは、遺伝子治療、ＥＳ細胞を用いる臓器創製、幹細胞を機能欠陥組織又は臓器に注入する細胞療法、幹細胞を用いる臓器創製、を主たる手法とするものである。
このうち、幹細胞を用いる臓器創製や、幹細胞の機能欠落組織等への注入を行う場合には、標的とする幹細胞又は組織前駆細胞を高純度に抽出する必要がある。
このような要請から、再生医療の発展のためには、高純度の幹細胞及び組織前駆細胞等の有用細胞を、末梢血、臍帯血、骨髄液等より簡易に分離する技術が必要とされている。
【０００３】
従来より、血液等から各目的成分を分離する技術は知られており、医療現場において治療に役立てられている。
例えば、多くのウイルスは選択的にリンパ球に感染することが報告されている。このため輸血によるウイルス感染を防止するために、全血を輸血するのではなく、白血球除去フィルター等により白血球を除去し、白血球が除去された血液から赤血球製剤、血小板製剤、血漿製剤等を製造し、これらの製剤が一般的に治療に使用される。
このように、これまでは、血球系の分離及び純化を行うことを目的とした研究が行われていた。
しかし、近年の研究で、末梢血、臍帯血、骨髄液中には、造血幹細胞等の各種幹細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、臓器前駆細胞等、有用な細胞が含まれていることが明らかとなり、これらの有用な細胞を、末梢血、臍帯血、骨髄液等より分離回収する技術が望まれるようになった。
【０００４】
そして上記、末梢血、骨髄液、臍帯血から分離される造血幹細胞（hematopoietic  stem  cell）の再生医療の現場での重要度が増している。
造血幹細胞とは、自己複製能を有し、すべての血球細胞に分化する能力を有する細胞である。しかし、近年、造血幹細胞の可塑性（plasticity）を示す報告が多数見られ、血球のみならず様々な細胞の産生に関与している可能性が示唆されている。
現在、再生医療の現場においては、この造血幹細胞が移植され、白血病等の難治性疾患の治療に有効に用いられている。また、造血幹細胞の前記可塑性の示唆により、再生医療における更なる有効性も期待されている。
しかし、骨髄液、末梢血、臍帯血に含有される造血幹細胞の量は微量であり、医療現場で必要とされている量を確保することは非常に困難である。
このため、造血幹細胞を骨髄液、末梢血、臍帯血より分離して、種々のサイトカインと共に増殖させる方法が開発されている。
しかし、造血幹細胞を効率よく増殖させるためには、造血幹細胞を骨髄液、末梢血、臍帯血より高純度及び高収率で分離する必要があった。
【０００５】
そこで、骨髄液、末梢血、臍帯血より造血幹細胞を分離する方法として、例えば、Ficoll  Hypaque法が知られている。
これは、比重により目的成分を分離する遠心分離法である。
しかし、この方法では、何度も遠心分離を行う必要があり、分離操作に長時間を要するという問題があった。
また、操作が煩雑であり、分離操作を行うためには熟練した技術が必要であるという問題があった。
【０００６】
また、他の方法としては、Baxter社が磁気を応用して開発したIsolex  Magnetic  Cell  Separation  Systemが知られている。
これは、造血幹細胞表面に発現する表面マーカーに特異的に結合するモノクローナル抗体によって造血幹細胞を分離し、表面マーカーに結合したモノクローナル抗体を磁気ビーズに結合させて、抗体に結合した造血幹細胞を回収する方法である。
しかし、この方法は、操作が煩雑であり分離に長時間を要するという問題があった。
更に、マウス由来の抗体を用いているために、造血幹細胞を主とする血液製剤中に、異種由来のウイルス並びに抗体が混入することが危惧されており、この血液製剤を臨床に応用することについては、議論のあるところである。
【０００７】
更に、他の方法として、高速ＦＡＣＳ（Fluorescence-activated  cell  sorter）による造血幹細胞分離システムが開発されている。
これは、蛍光抗体で染色した細胞を選択的に分離するシステムであるが、分離操作に長時間を有するという問題があった。
また、特殊な装置が必要であり分離を行うために高額な費用が必要であるという問題があった。
更に、滅菌状態で細胞分離を行えないために、治療用に当該純化された造血幹細胞を用いることは、現状では不可能である。
また、マウス由来の抗体を用いているために、造血幹細胞を主とする血液製剤中に、異種由来のウイルス並びに抗体が混入することが危惧されており、この血液製剤を臨床に応用することについては、議論のあるところである。
【０００８】
そこで、簡易かつ安価に造血幹細胞を分離するための技術として、分離膜を使用し、幹細胞を分離する技術が開発されている（例えば、特許文献１、特許文献２参照）。
特許文献１には、合成高分子、天然高分子等を材料とするフィルターを使用して、有核細胞を捕捉する技術が開示されている。
この技術では、原細胞液は、Ficoll-Hypaque法（比重遠心分離）により前処理が施され、この原料細胞液をフィルターに通過させることにより、ＣＤ４５抗原陽性、ＣＤ３４抗原陰性、分化抗原陰性のヒト未分化造血幹細胞が分離捕捉される。その後、回収液をフィルターの下流側から導入することにより、フィルター上に捕捉された未分化造血幹細胞を回収するものである。
また、特許文献２には、合成高分子、天然高分子等を材料とした不織布フィルターを複数枚積層し、液密になるようフィルター端面を連続的に高温融着させた濾材を使用して、臍帯血からＣＤ３４陽性細胞を分離捕捉し、回収液をフィルター下流側から導入することによりフィルター上に捕捉されたＣＤ３４陽性細胞を回収する技術が開示されている。
【０００９】
【特許文献１】特開２０００−１６６５４１号公報（第２頁乃至第４頁、図１）
【００１０】
【特許文献２】特開２００１−１３６９５６号公報（第５頁乃至第７頁、図１、図２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、上記特許文献１の技術では、原料細胞液を得るために、採取した臍帯血に対してFicoll-Hypaque比重遠心分離による前処理が必要である。この前処理は、従来技術の項で記載した通り、作業が煩雑であると共に特殊な技術が必要であった。また、この前処理は、完全閉鎖系で行うことは困難であるため、原料細胞液の無菌性を十分に確保できないという問題点があった。
また、造血幹細胞をより高い回収率で回収可能な更なる改善も望まれていた。
【００１２】
上記特許文献２の技術では、１６枚ものフィルターを積層し、この積層されたフィルター端面に高温加熱したステンレス板を押し付けて連続過熱（約２５０℃）して連続的にフィルターを液密に融着する必要があるため、フィルター作成作業が煩雑であり、一定の液密性を有するフィルターを作成するための特別な技術が必要であった。
【００１３】
また、特許文献２の技術は、白血球の回収率とＣＤ３４陽性細胞との回収率に、ほとんど差が認められず、ＣＤ３４陽性細胞を選択的に分離回収する方法ではない。
よって、再生医療の現場において重要な役割を担う造血幹細胞であるＣＤ３４陽性細胞を選択的に効率よく濃縮する方法の開発が望まれていた。
【００１４】
本発明の目的は、末梢血、臍帯血、骨髄液等から造血幹細胞を効率よく分離し、高収率で回収することが可能な細胞分離回収膜及び細胞分離方法を提供することにあり、他の目的は、容易に高純度の造血幹細胞を回収することが可能な造血幹細胞分離回収膜及び造血幹細胞分離方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記課題は、本発明の請求項１に係る細胞分離回収膜によれば、有用細胞と除去細胞とを含む細胞混合物より有用細胞を分離回収するために用いられる細胞分離回収膜であって、該細胞分離回収膜は、ポリウレタン発泡体にカルボキシル基を導入したものであることにより解決される。
ポリウレタンとは、主鎖にウレタン結合をもつ合成高分子の総称であり、ポリウレタン発泡体とは、発泡反応が施されたポリウレタンをさす。
カルボキシル基導入ポリウレタン発泡体膜を使用することにより、細胞混合液を濾過するのみで、官能基を導入されていないポリウレタン発泡体膜よりも高い回収率で、有用細胞である造血幹細胞を分離回収することができる。
また、このカルボキシル基導入ポリウレタン発泡体膜によれば、細胞混合液を遠心分離する等の前処理を行うことなく、高い回収率で有用細胞である造血幹細胞を分離回収することができる。
【００１６】
また、前記細胞分離回収膜では、前記有用細胞として、ＣＤ３４抗原陽性の造血幹細胞が分離回収されると好適である。
すなわち、近年、再生医療の現場においては、未分化で、すべての血球細胞に分化可能なＣＤ３４抗原陽性の造血幹細胞が治療に際して有用であるため、高い収率で回収することが望まれている。
本発明に係る細胞分離回収膜では、細胞混合液の前処理を行うことなく分離でき、官能基が導入されていないポリウレタン発泡体膜より高い回収率で、このＣＤ３４抗原陽性の造血幹細胞を簡易に回収できる。
【００１７】
更に、前記細胞分離回収膜には、エポキシ環を有する化合物が導入されており、前記カルボキシル基は、前記エポキシ環を介して導入されていると好適である。
エポキシ基は各官能基との反応性が高いため、予めエポキシ環を有する化合物を膜に導入しておくと、カルボキシル基を含む様々な官能基をポリウレタン発泡体膜へ効率良く導入することが可能となる。
【００１８】
また、前記細胞分離回収膜には、前記除去細胞を通過させる複数の孔が設けられており、該孔の径は、３μｍ以上１００μｍ以下であると好適である。
このように構成されているので、細胞分離回収膜での、有用細胞の分離と回収が効率よく行われる。
すなわち、この範囲より孔径が小さいものであると、濾過時間が長くなり、有用細胞の回収率も低下する。また、この範囲より孔径が大きいものであると、有用細胞捕捉操作の際に細胞分離回収膜を透過してしまう有用細胞が増加し、有用細胞の回収率が低下する。
【００１９】
また、上記課題は、本発明の請求項５に係る細胞分離回収方法によれば、有用細胞と除去細胞とを含む細胞混合物から有用細胞を分離回収する方法であって、カルボキシル基が導入されたポリウレタン発泡体膜に、前記細胞混合物を通過させる有用細胞捕捉工程と、前記カルボキシル基導入ポリウレタン発泡体膜に回収液を通過させて、前記有用細胞を回収する有用細胞回収工程と、を備えるよう構成されていると好適である。
このように構成されているので、カルボキシル基導入ポリウレタン発泡体膜により、細胞混合液を濾過するのみで、有用細胞である造血幹細胞を分離回収することが可能となる。
また、この分離回収方法は、濾過作業であるため、高価な装置や設備を必要とせず、簡易に高純度の有用細胞を分離回収可能である。
【００２０】
更に、前記有用細胞回収工程では、前記有用細胞として、ＣＤ３４抗原陽性の造血幹細胞が回収されると好適である。
再生医療の現場においては、未分化で、すべての血球細胞に分化可能なＣＤ３４抗原陽性の造血幹細胞が治療に際して有用であるため、高い収率で回収することが望まれている。本発明に係る細胞分離回収方法では、このＣＤ３４抗原陽性の造血幹細胞が簡易に効率よく分離回収できる。
【００２１】
また、前記有用細胞回収工程では、前記回収液として、生理食塩水、緩衝液、蛋白質を含有する生理食塩水、蛋白質を含有する緩衝液、のいずれか一つが使用されると好適である。
更に、前記有用細胞回収工程で使用される前記回収液として、０．０５重量％以上３重量％以下のアルブミン水溶液が使用されると好適である。
【００２２】
更に、前記有用細胞捕捉工程を行う前に、前記カルボキシル基導入ポリウレタン発泡体膜に、リン酸緩衝液又はアルブミン水溶液を浸潤させる前処理工程を備えていると好適である。
このように、カルボキシル基導入ポリウレタン発泡体膜に前処理が施されていると、前処理を施さないカルボキシル基導入ポリウレタン発泡体膜よりも、より高い回収率で有用細胞を回収することができ、分離率にも大きな差異は見られない。
また、カルボキシル基導入ポリウレタン発泡体膜の前処理は、当該膜にリン酸緩衝液又はヒトアルブミン水溶液を浸潤させるのみであるため、遠心分離を繰り返す試料の前処理とは異なり、特別な設備を必要とせず、簡易に実施することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、カルボキシル基で修飾されたポリウレタン膜を造血幹細胞分離回収膜として使用することにより、末梢血、臍帯血、骨髄液等より再生医療において使用される造血幹細胞を簡易に効率良く分離回収することが可能となり、造血幹細胞を分離回収する作業の省力化が実現する。
【００２４】
また、本発明によれば、簡易な操作でポリウレタン発泡膜へカルボキシル基を導入することが可能であり、既存のフィルターホルダーに膜をセットするのみで容易に造血幹細胞の分離回収操作を行うことができる。このため、コストも低く、容易に造血幹細胞を分離回収することができる。
【００２５】
また、末梢血、臍帯血、骨髄液に存在する造血幹細胞は微量であるため、再生医療において必要とされる量の造血幹細胞を確保するためには、造血幹細胞を培養して増殖させる必要がある。このため、末梢血、臍帯血、骨髄液に存在する造血幹細胞を高収率及び高純度で分離回収することが必要であるが、本発明に係る造血幹細胞分離回収膜及び造血幹細胞分離方法においては、造血幹細胞を高純度及び高収率で回収することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明の一実施の形態を図面に基づいて説明する。なお、以下に説明する部材、配置等は本発明を限定するものでなく、本発明の趣旨の範囲内で種々改変することができるものである。
【００２７】
図１は本実施形態に係る造血幹細胞分離回収装置Ｓを示す説明図である。
本明細書において、造血幹細胞とは、すべての血球細胞に分化可能な細胞であり、表面マーカーＣＤ３４を発現しており、表面マーカーＣＤ４５が弱陽性（芽球領域）であり、側方散乱が低く、前方散乱が低〜中程度の芽球領域である細胞を指す（以下、単に「ＣＤ３４＋造血幹細胞」と記す）。すなわち、国際血液療法・移植学会（ISHAGEガイドライン）に従って、ＣＤ３４陽性細胞を造血幹細胞と定義し、以下「ＣＤ３４＋造血幹細胞」と記す。
表面マーカーとは、表面抗原とも称し、細胞表面に発現している分子を指す。細胞表面にどのような分子が発現しているかは、細胞の状態・分化・機能を反映していると考えられている。
本実施形態においては、試料として、ヒト上腕の肘静脈より採取したヒト末梢血を使用する。
ただし、ヒト末梢血に限定されるものではなく、臍帯血、骨髄液等からも、本実施形態に係る造血幹細胞分離回収装置Ｓにおいて、ＣＤ３４＋造血幹細胞を分離回収可能である。
また、造血幹細胞分離回収装置Ｓに限らず、採血バッグに注入された末梢血、臍帯血、骨髄液等を自然落下により該ポリウレタン発泡体膜中に透過させ、さらにその後、ヒトアルブミン水溶液等の回収液を該ポリウレタン発泡体膜に透過させてＣＤ３４＋造血幹細胞を分離回収することも可能である。
【００２８】
造血幹細胞分離回収装置Ｓは、ポンプ１、試料充填シリンジ２、押圧シリンジ３、マイクロシリンジフィルタホルダー４、支持台５、濾液回収部材支持ホルダー６、とを備えて構成されている。
ポンプ１は、給水部、吐出部、ポンプ機構を備えた、公知のペリスターポンプであり、給水側にチューブ１１ａの一端が接続され、吐出側にチューブ１１ｂの一端が接続されている。
チューブ１１ａの他端側には、給水部材１１ｃが接続され、純水の充填されたビーカ１１ｄに浸漬されている。給水部材１１ｃは、濾過材であり、吸引される液体に混入した不純物を除去するために用いられる。
ポンプ１は、給水部材１１ｃを介して、チューブ１１ａにより純水を吸引する。吸引された純水は、チューブ１１ａ中を通過し、図示しないポンプ機構によって、定量的にチューブ１１ｂに送り出される。チューブ１１ｂに送り出された純水は、図面Ｙ方向に移送される。
試料充填シリンジ２は、公知の注射器型シリンジであり、吐出口２１、ピストン２２、押圧部２３を備える。試料充填シリンジ２には、試料である末梢血が充填される。
押圧シリンジ３は、試料充填シリンジ２と同様、公知の注射器型シリンジであり、吐出口３１、ピストン３２、押圧部３３を備える。押圧シリンジ３は、ポンプ１から送り込まれる純水を受入れて、ピストン３２に伝わる力を試料充填シリンジ２のピストン２２へ伝達するために使用される。
【００２９】
マイクロシリンジフィルタホルダー４は、公知のフィルターホルダーであり、図示しない造血幹細胞分離回収膜が挟持される。
支持台５は、公知の機器支持台であり、把手５１、５２、５３、基台５４、支持棒５５を備えている。
基台５４には、支持棒５５が、直立した状態で固定されている。
支持棒５５には、把手５１、５２、５３が、夫々固定具５５ａ、５５ｂ、５５ｃによって所定位置に固定されている。把手５１、５２、５３は、夫々固定具５５ａ、５５ｂ、５５ｃと一体となって、支持棒５５に沿って上下動可能であり、固定具５５ａ、５５ｂ、５５ｃ夫々に備えられたネジによって所定位置に固定される。
なお、把手５１、５２、５３は、夫々支持棒５５と直交した状態で、所定位置に固定される。
把手５１は、機器支持側端部５１ａにクリップ５１ｂが固定されて形成される。クリップ５１ｂには、押圧シリンジ３が着脱可能に固定されている。なお、押圧シリンジ３の吐出口３１は、上向きに着脱可能に固定されている。
把手５２は、機器支持側端部５２ａにクリップ５２ｂが固定されて形成される。クリップ５２ｂには、試料充填シリンジ２が着脱可能に固定されている。なお、試料充填シリンジ２の吐出口２１は、下向きに着脱可能に固定されている。
把手５３は、機器支持側端部５３ａにクリップ５３ｂが固定されて形成される。クリップ５３ｂには、マイクロシリンジフィルタホルダー４が着脱可能に固定されている。
把手５１、５２は、ピストン３２の押圧部３３とピストン２２の押圧部２３が接する状態となる位置で、固定具５５ａ及び５５ｂによって、支持棒５５に固定される。
把手５３は、マイクロシリンジフィルタホルダー４の試料導入口４１を試料充填シリンジ２の吐出口２１に接合した状態となる位置で、固定具５５ｃによって、支持棒５５に固定される。
濾液回収部材支持ホルダー６は、公知の試験管ホルダーであり、マイクロシリンジフィルタホルダー４下部に設置される。濾液回収部材支持ホルダー６には、試験管６ａが支持されている。試験管６ａは、マイクロシリンジフィルタホルダー４の濾液流出口直下となる位置に配置される。
【００３０】
押圧シリンジ３の吐出口３１にはポンプ１の図示しない吐出口に接続されたチューブ１１ｂの他端側が接続されている。
よって、ポンプ１を稼動させて図面Ｙの方向へ純水が移送されると、吐出口３１より押圧シリンジ３に水が侵入し、ピストン３２が図面Ｘの方向へ押し下げられる。
押圧シリンジ３のピストン３２が、図面Ｘ方向へ押し下げられると、ピストン３２の押圧部３３と試料充填シリンジ２の押圧部２３とは接しているため、押圧部２３を介してピストン２２も図面Ｘ方向へ押し下げられる。
ピストン２２が、図面Ｘ方向へ押し下げられると、このＸ方向へ作用する圧力が押圧力となり、試料充填シリンジ２に充填されていた試料が、加圧濾過される。
【００３１】
圧力が加えられた試料は、吐出口２１からマイクロシリンジフィルタホルダー４へ導入され、マイクロシリンジフィルタホルダー４に挟持された図示しない造血幹細胞分離回収膜で加圧濾過される。
【００３２】
ここで、マイクロシリンジフィルタホルダー４に挟持される造血幹細胞分離回収膜について説明する。
本実施形態に係る造血幹細胞分離回収膜は、カルボキシル基で化学修飾されたポリウレタン発泡体膜である。
本実施形態に係る造血幹細胞分離回収膜は、基本構造としてグリシジルメタクリレート（以下、単に「ＧＭＡ」と記す）導入ポリウレタン発泡体膜を使用している。
ＧＭＡは、その構造中にエポキシ環を有しており、このエポキシ環に官能基（カルボキシル基）を導入することにより膜修飾を行う。
ポリウレタン発泡体膜へのＧＭＡ導入は、プラズマ照射を用いたグラフト重合により行う。
【００３３】
次に、ポリウレタン発泡膜へカルボキシル基を導入する方法を説明する。
グリシンを水酸化ナトリウム水溶液中に溶解させて、グリシン溶液を調製する。次いで、秤量瓶にポリウレタン発泡体膜とグリシン溶液を入れ、恒温槽中８０℃で２４時間浸漬させてカルボキシル基導入ポリウレタン発泡体膜（以下、「ＰＵ−ＣＯＯＨ膜」と記す）を調製する。
反応が終了した後、ＰＵ−ＣＯＯＨ膜を秤量瓶から取り出し、超純水で振とう洗浄を行い、造血幹細胞分離回収膜とする。
この造血幹細胞分離回収膜を保存する場合には、超純水中に浸漬した状態で冷蔵保存する。
この造血幹細胞分離回収膜には、細胞混合物から有用細胞を濾別するために、複数の孔が形成されている。この孔は、孔径３μｍ〜１００μｍのものが使用され、好ましくは孔径５μｍ〜１００μｍのものが使用される。これは、造血幹細胞の大きさ及び粘着性との関係より選択された孔径である。
また、ポリウレタン発泡体膜へカルボキシル基を導入した後、ヒトアルブミン水溶液又はリン酸緩衝液をＰＵ−ＣＯＯＨ膜へ浸潤させる前処理を行ってもよい。なお、アルブミンに関しては、ヒトアルブミンに限られることはなく、牛血清アルブミン等の由来の異なるアルブミンを使用しても良い。
この前処理により、造血幹細胞の回収率がより高くなる。
【００３４】
次に、ＰＵ−ＣＯＯＨ膜を造血幹細胞分離回収膜として使用した造血幹細胞分離回収方法の一例を説明する。
まず、末梢血を採取する。
末梢血は、血液抗凝固剤（EDTA2Na）を含んだプラスティック製真空採血管を用いて、ヒト上腕の肘静脈より採取し、採血後、抗凝固剤と血液をゆっくりと混合する。
【００３５】
ポンプ１にチューブ１１端部をセットして、チューブ１１の他端側を支持台５の把手５１に固定した押圧シリンジ３の吐出口３１へ空気が押圧シリンジ３に混入しないよう注意して接続する。
造血幹細胞分離回収膜をマイクロシリンジフィルタホルダー４にセットし、試料導入口４１を試料充填シリンダ２の吐出口２１に接続する。このマイクロシリンジフィルタホルダー４の下に濾液を回収するためのプラスティック遠沈管を設置する。
【００３６】
予め採取し、抗凝固剤と混合した末梢血を試料充填シリンジ２に充填し、吐出口２１をマイクロシリンジフィルタホルダー４の試料導入口４１に接続する。
支持台５の把手５１、５２、５３の位置を調整して、押圧シリンジ３の押圧部３３と試料充填シリンジ２の押圧部２３とが接する位置に、押圧シリンジ３、試料充填シリンジ２、マイクロフィルタホルダー４をそれぞれ固定する。
【００３７】
まず、末梢血中に存在する造血幹細胞を末梢血中から分離する工程を行う。
造血幹細胞分離回収装置Ｓの設置が終了したら、ポンプ１のスイッチをＯＮとし、末梢血の濾過を開始する。ポンプ１が稼動すると、ポンプ１からの圧力が押圧シリンジ３のピストン３２を介して、試料充填シリンジ２のピストン２２に伝導され、試料充填シリンジ２に充填された末梢血に押圧がかかるため、効率よく末梢血の濾過を行うことが可能となる。
この段階で、ＣＤ３４＋造血幹細胞はフィルターに捕捉されている。
しかしながら、本方法に限らず、採血バッグに注入された、末梢血、臍帯血、骨髄液等を自然落下により該ＰＵ−ＣＯＯＨ膜中を透過させる方法も効率の良い方法である。
【００３８】
次に、フィルターに捕捉されたＣＤ３４＋造血幹細胞を回収する工程を行う。
試料充填シリンジ２に充填された末梢血の濾過が終了したら、ポンプ１をＯＦＦとし、マイクロシリンジフィルタホルダー４の上下を逆転させて把手５３で固定する。
次いで、細胞回収液としてヒトアルブミン水溶液を調製し、新たな試料充填シリンジ２に充填し、末梢血の濾過時と同様に、押圧シリンジ３及び試料充填シリンジ２を所定位置に固定する。各機器が固定されていることが確認されれば、ポンプ１を稼動させて、マイクロシリンジフィルタホルダー４にヒトアルブミン水溶液を通液する。
なお、本方法に限らず、分離工程と同様に、採血バッグに注入されたヒトアルブミン水溶液を、自然落下により該ＰＵ−ＣＯＯＨ膜中に透過させる方法も効率の良い方法である。
また、膜を反転させる方法に限らず、膜の下流方向から回収液を導入してもよい。例えば、膜下流方向にチューブと回収液を充填したシリンジを接続し、このシリンジから回収液を膜下流側に導入するように構成することも可能である。膜下流側とは、分離工程で末梢血を導入した側の膜表面と反対側の面を指す。
このヒトアルブミン水溶液の濃度は、０．０５重量％〜３重量％、好ましくは０．５重量％のものを使用するとよい。
この濃度範囲のヒトアルブミン水溶液を回収液として使用すると、後述する実験結果に示されるように、造血幹細胞の回収を効率よく行うことができる。
ただし、細胞回収液としては、純水にヒトアルブミンを溶解させたヒトアルブミン水溶液に限られるものではなく、生理食塩水、各種緩衝液や、ヒトアルブミンの他の蛋白質を含む生理食塩水、各種緩衝液等、細胞に悪影響を及ぼさないものであればよい。
なお、アルブミンに関しては、ヒトアルブミンに限られることはなく、牛血清アルブミン等の由来の異なるアルブミンを使用しても良い。
マイクロシリンジフィルタホルダー４から回収される溶液は、プラスティック遠沈管に回収する。このとき回収される溶液には、分離工程でフィルターに捕捉されていたＣＤ３４＋造血幹細胞が溶出されている。
【実施例１】
【００３９】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
１．造血幹細胞分離回収膜の調製
（１）ポリウレタン発泡体膜へのＧＭＡ導入（ＰＵ−ＧＭＡ膜の調製）
ＰＵ−ＧＭＡ膜とは、ポリウレタン発泡体膜にＧＭＡ（グリシジルメタクリレート）を、プラズマ照射を用いたグラフト重合により導入した膜である。
ＧＭＡは、その構造中にエポキシ環を有しており、このエポキシ環に官能基（カルボキシル基）を導入することにより膜修飾を行う。
ＧＭＡ（東京化成工業株式会社製  Methacrylic  Acid  Glycidyl  Ester）を適量いれたアンプル管（ツクバリカセイキ製  １０ｍｍ（径）×１７０ｍｍ（長））に窒素ガスを充填し、２０分間バブリングを行った。
次いで、真空ラインに装着し、真空ラインとアンプル管をつなぐバルブを閉じた状態で、アンプル管を液体窒素中で凍結させた。
ＧＭＡが完全に凍結したことが確認された後、バルブを開けて酸素を抜き、バルブを閉じた。その後、水浴中でＧＭＡを融解した。
この一連の凍結〜融解操作を３回繰り返し、ＧＭＡ中の酸素を完全に脱気した。
次いで、ポリウレタン発泡体膜をＳＵＳメッシュに固定し、反応容器（ツクバリカセイキ製  １１０ｍｍ（径）×２４０ｍｍ（長））に入れ、真空ラインに装着し、１０−１〜１０−２Ｐａになるまで減圧した。次いで、Ａｒガスを導入して（約３．８〜５．７×１０２Ｐａ）から、１０−１Ｐａまで真空引きした。
この一連の真空操作を３回繰り返し、最終的に０．６５Ｐａ以下になるまで真空引きした。
Ａｒガス気流中で圧力を２６．６Ｐａに保ち、高周波電源（株式会社アドテック製  ＡＸ−３００）を反応容器に接続してプラズマ照射を行った（出力２００Ｗ、３０秒間）。プラズマ照射終了後、Ａｒガス導入を停止し、真空ライン系を９０ｓｅｃ真空引きした（圧力≒６．５×１０−１Ｐａ）。
次いで、反応系は真空状態を保った状態で、真空ポンプと真空ラインを結ぶバルブを閉じ、脱気済みＧＭＡと反応容器の間のバルブを開き、室温で５分間グラフト重合を行った。
グラフト重合が終了すると、真空ポンプと真空ラインを結ぶバルブを開けて、２分間反応容器内のＧＭＡモノマーの真空除去を行った。
次いで、水とメタノールの混合溶液（同体積で混合）で、グラフト重合後の膜を３０分間振とう洗浄（２回）した後、超純水で３０分間洗浄した。
この操作によりＧＭＡ導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−ＧＭＡ膜）へ導入されたＧＭＡは、０．６１％であった。
なお、ＧＭＡ導入率は以下の式で求めた。
プラズマ処理、その後、ＧＭＡ導入した後の乾燥（真空乾燥８０℃  ２４時間処理）膜重量（Ｘ  ｇ）を、プラズマ処理する前の乾燥（真空乾燥８０℃  ２４時間処理）膜重量（Ｙ  ｇ）で除した値をＧＭＡ導入率として定義した。
ＧＭＡ導入率（％）＝（Ｘ／Ｙ）×１００
また、プラズマ出力及び照射時間を変化させることにより、ＧＭＡ導入率を変化させることが可能である。しかし、ＧＭＡ導入率０．３％以上０．７％以下の範囲では、ＣＤ３４＋造血幹細胞の回収率には変化がなかった。
（２）カルボキシル基導入ポリウレタン発泡体膜の調製
ＧＭＡ導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−ＧＭＡ）を直径２５ｍｍの円状カッターで切り抜いた（孔径５μｍ）。
グリシン（和光純薬工業株式会社製  特級Glycine）０．６gを水酸化ナトリウム（和光純薬株式会社製  ０．１Ｍ  Sodium  hydroxide  Solution）水溶液中に溶解させて、０．４Ｍグリシン水溶液を調製した。
秤量瓶に切り抜いたＰＵ−ＧＭＡ膜を３枚入れて、調製したグリシン溶液を２０ｍｌ加えた。その後、恒温槽中８０℃で２４時間浸漬させて、カルボキシル基導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−ＣＯＯＨ膜）を調製した。
反応が終了した膜は、秤量瓶より取り出し、超純水１０ｍｌ中で振とうさせながら、１０分間２５℃で、２回の洗浄を行い、使用するまでの間、超純水中で冷蔵保存した。
（３）比較例に使用する造血幹細胞分離回収膜の調製
ａ．スルホン酸基導入ポリウレタン発泡体膜の調製
ＰＵ−ＣＯＯＨ膜と同様に、ＧＭＡ導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−ＧＭＡ）を直径２５ｍｍの円状カッターで切り抜いた。
イソプロピルアルコール（和光純薬工業株式会社製  Isopropyl  Alcohol）と超純水を、超純水：イソプロピルアルコールの比率が、７５：１５（重量比）となるよう調製し、これをＩＰＡ水溶液とした。
このＩＰＡ水溶液を溶媒として、亜硫酸ナトリウム（和光純薬株式会社製  Sodium  Sulfite  Anhydrous）を１０重量％となるように調製した。
秤量瓶に切り抜いたＰＵ−ＧＭＡ膜を３枚入れて、調製した溶液を２０ｍｌ加えた。その後、恒温槽中８０℃で６時間浸漬させて、スルホン酸基導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−ＳＯ３Ｈ膜）を調製した。
反応が終了した膜は、秤量瓶より取り出し、超純水１０ｍｌ中で振とうさせながら、１０分間２５℃で、２回の洗浄を行い、使用するまでの間、超純水中で冷蔵保存した。
ｂ．ヒドロキシル基導入ポリウレタン発泡体膜の調製
ＰＵ−ＣＯＯＨ膜と同様に、ＧＭＡ導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−ＧＭＡ）を直径２５ｍｍの円状カッターで切り抜いた。
濃硫酸（和光純薬工業株式会社製  Sulfuric  Acid）０．９８ｇを超純水１９ｍｌ中に加えて希釈し、０．５Ｍ水溶液とした。
秤量瓶に切り抜いたＰＵ−ＧＭＡ膜を３枚入れて、調製した水溶液を２０ｍｌ加えた。その後、恒温槽中８０℃で２時間浸漬させて、ヒドロキシル基導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−ＯＨ膜）を調製した。
反応が終了した膜は、秤量瓶より取り出し、超純水１０ｍｌ中で振とうさせながら、１０分間２５℃で、２回の洗浄を行い、使用するまでの間、超純水中で冷蔵保存した。
ｃ．アミノ基導入ポリウレタン発泡体膜の調製
ＰＵ−ＣＯＯＨ膜と同様に、ＧＭＡ導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−ＧＭＡ）を直径２５ｍｍの円状カッターで切り抜いた。
水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業株式会社製  ０．１Ｍ  Sodium  hydroxide  Solution）３４．２３ｍｌにアンモニア水溶液（国産化学株式会社製  １級  Ammonia  Solution）１ｍｌを溶解させて、０．５Ｍアンモニア水溶液とした。
秤量瓶に切り抜いたＰＵ−ＧＭＡ膜を３枚入れて、調製したアンモニア水溶液を２０ｍｌ加えた。その後、恒温槽中３０℃で６時間浸漬させて、アミノ基導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−ＮＨ２膜）を調製した。
反応が終了した膜は、秤量瓶より取り出し、超純水１０ｍｌ中で振とうさせながら、１０分間２５℃で、２回の洗浄を行い、使用するまでの間、超純水中で冷蔵保存した。
ｄ．アミン（−Ｎ（Ｃ２Ｈ５）２）導入ポリウレタン発泡体膜の調製
ＰＵ−ＣＯＯＨ膜と同様に、ＧＭＡ導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−ＧＭＡ）を直径２５ｍｍの円状カッターで切り抜いた。
ジエチルアミン（和光純薬工業株式会社製  Diethylamine）を超純水に溶解させて５０体積％ジエチルアミン水溶液を調製した。
秤量瓶に切り抜いたＰＵ−ＧＭＡ膜を３枚入れて、調製したジエチルアミン水溶液を２０ｍｌ加えた。その後、恒温槽中３０℃で３時間浸漬させて、−Ｎ（Ｃ２Ｈ５）２導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−Ｎ（Ｃ２Ｈ５）２膜）を調製した。
反応が終了した膜は、秤量瓶より取り出し、超純水１０ｍｌ中で振とうさせながら、１０分間２５℃で、２回の洗浄を行い、使用するまでの間、超純水中で冷蔵保存した。
ｅ．アミン誘導体（−ＮＨＣ２Ｈ４ＯＨ）導入ポリウレタン発泡体膜の調製
ＰＵ−ＣＯＯＨ膜と同様に、ＧＭＡ導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−ＧＭＡ）を直径２５ｍｍの円状カッターで切り抜いた。
秤量瓶に切り抜いたＰＵ−ＧＭＡ膜を３枚入れて、アミノエタノール（和光純薬工業株式会社製  ２−Aminoethanol）１００％溶液を２０ｍｌ加えた。その後、恒温槽中３０℃で６時間浸漬させて、−ＮＨＣ２Ｈ４ＯＨ導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−ＮＨＣ２Ｈ４ＯＨ膜）を調製した。
反応が終了した膜は、秤量瓶より取り出し、超純水１０ｍｌ中で振とうさせながら、１０分間２５℃で、２回の洗浄を行い、使用するまでの間、超純水中で冷蔵保存した。
【００４０】
２．試料採取
血液抗凝固剤（EDTA2Na）を１０．５ｍｇ充填した７ｍｌプラスティック製真空採血管（テルモ株式会社製  ベノジェクト２真空採血管）を使用して、ヒト上腕の肘静脈より試料となる末梢血を採取した。採取後、抗凝固剤と採取した血液を混和させた。
次いで、１０ｍｌ試料充填シリンジ２（テルモ株式会社製  SS-10ESZ）の吐出口２１にプラスティック製のスポイトを半分に切断して取り付け、真空採血管にこのスポイト部分を挿入し、採取した末梢血を６ｍｌ試料充填シリンジ２に吸引した。
【００４１】
３．造血幹細胞分離操作
図１に示す造血幹細胞分離回収装置Ｓを組み立てた。
使用する造血幹細胞分離回収膜を３枚積層してマイクロシリンジフィルタホルダー４にセットした。
末梢血６ｍｌを充填した試料充填シリンジ２の吐出口２１からスポイト部分を取り外し、吐出口２１をマイクロシリンジフィルタホルダー４（MILLIPORE製  ２５ｍｍ）の試料導入口４１に接続し、支持台５の把手５２、５３で所定位置に固定した。
３０ｍｌ押圧シリンジ３（テルモ株式会社製  SS-30ESZ）の押圧部３３が、末梢血を充填した試料充填シリンジの押圧部２３と接する位置に押圧シリンジ３を支持台５の把手５１で固定した。
タイゴンチューブ１１の端部をペリスターポンプ１（TOKYO  AIKAKIKAI製  MICRO  TUBE  POMP  MP-3）にセットし、タイゴンチューブ１１の他端を押圧シリンジ３の吐出口３１に接続した。
マイクロシリンジフィルタホルダー４の下部には、濾液を回収するために１５ｍｌプラスティック遠沈管（IWAKI製  Centrifuge  Tubes  2325-015）をセットした。
造血幹細胞分離回収装置Ｓの組み立てが終了した後、ペリスターポンプ１のスイッチをＯＮとした。試料となる末梢血の膜透過流量が１ｍｌ／ｍｉｎ（Flux：３．１３４２×１０−７（ｍ／ｓｅｃ））となるようにペリスターポンプ１を調整した。
試料となる末梢血６ｍｌの濾過が終了したことを確認してペリスターポンプ１のスイッチをＯＦＦとした。
【００４２】
４．造血幹細胞回収操作
ヒトアルブミン（和光純薬株式会社  Albumin  from  Human  Serum）０．５重量％水溶液を調製して回収液とし、試料充填シリンジ２と同型のシリンジ（以下「回収液充填シリンジ」と記す）に６ｍｌ充填した。
末梢血が入っていた試料充填シリンジ２を取り外し、マイクロシリンジフィルタホルダー４の上下を反転させた。マイクロシリンジフィルタホルダー４に回収液充填シリンジを接続し、造血幹細胞分離操作時と同様に造血幹細胞分離回収装置Ｓを組み立てた。
マイクロシリンジフィルタホルダー４の下部には、濾液を回収するために１５ｍｌプラスティック遠沈管（IWAKI製  Centrifuge  Tubes  2325-015）をセットした。
造血幹細胞分離回収装置Ｓの組み立てが終了した後、ペリスターポンプ１のスイッチをＯＮとした。回収液の膜透過流量が１ｍｌ／ｍｉｎ（Flux：３．１３４２×１０−７（ｍ／ｓｅｃ））となるようにペリスターポンプ１を調整した。
回収液６ｍｌの濾過が終了したことを確認してペリスターポンプ１のスイッチをＯＦＦとした。
このようにして、１５ｍｌプラスティック遠沈管に、ＣＤ３４＋造血幹細胞が存在すると考えられる濾液を回収した。
【００４３】
５．分析
（１）各官能基の導入分析
各官能基を導入した膜を２４時間乾燥させ、ＸＰＳ（X−ray  Photoelectron  Spectroscopy  島津製作所製  ESCA-3400）により、電子分光解析を行った。
（２）  造血幹細胞表面マーカーのサンプル調製と染色
ＣＤ３４＋造血幹細胞の分析は、市販のＳｔｅｍ−Ｋｉｔ（Beckmancoulter製）を用いて、そのマニュアル（国際血液療法・移植学会  ISHAGEガイドライン）に従って行った。
すなわち、サンプル管（Beckmancoulter製）をサンプルと同数準備し、抗ＣＤ３４抗体（Beckmancoulter製  CD45-FITC／CD34−PE）をマイクロピペット（ニチリョー株式会社製  ２０μｌ）を用いて、各サンプル管に２０μｌずつ加えた。各サンプルを１００μｌずつ各サンプル管に加え、よく撹拌した後、死細胞除去用色素（Beckmancoulter製  7-ADD  Viability  Dye）を２０μｌ添加し、室温暗所で１５分間インキュベートした。
次いで、溶血剤（OptiLyseC）を各サンプル管に５００μｌずつ添加し、よく撹拌した後、室温で１０分間インキュベートした。
次いで、ＰＢＳ（−）粉末（日水製薬株式会社製）９．６ｇを超純水１ｌに溶解させ、ＰＢＳ緩衝液を調製し、このＰＢＳ緩衝液を各サンプル管に５００μｌずつ添加し、よく撹拌して、室温で１０分間インキュベートした。
このように調製したサンプルをフローサイトメトリー（Beckmancoulter製  EPICS  XL）を用いて分析した。
試料として採取した末梢血に含まれるＣＤ３４＋造血幹細胞数を予め分析しておき、造血幹細胞分離操作で遠沈管に回収した濾液及び造血幹細胞回収操作で遠沈管に回収した回収液を分析することによって、ＣＤ３４＋造血幹細胞透過率及び回収率が算出可能である。透過率及び回収率は下記の計算で求められる。
透過率（％）＝（造血幹細胞分離操作で遠沈管に回収した濾液中のＣＤ３４＋造血幹細胞数／試料として採取した末梢血に含まれるＣＤ３４＋造血幹細胞数）×１００
回収率（％）＝（造血幹細胞回収操作で遠沈管に回収した回収液中のＣＤ３４＋造血幹細胞数／試料として採取した末梢血に含まれるＣＤ３４＋造血幹細胞数）×１００
【００４４】
６．結果
（１）各官能基を導入した膜の表面解析結果
表面解析の結果を表１に示す。
なお、本明細書に記載する表内の数値は全て、平均値±標準偏差で示されている。
母集団は、ｎ＝４であり、それぞれ独立した測定値である。
【表１】
2005323534.tif 000003
未修飾のＰＵ膜と比較して、ＧＭＡ導入後の膜のＮの量が減少していることがわかる。ＧＭＡにはＮが入っていないため、この結果よりＧＭＡが導入されていることがわかる。
また、ＧＭＡ導入後の膜とＰＵ−ＳＯＨ３膜を比較すると、ＰＵ−ＳＯＨ３膜にＳが０．８３％入っていることから、スルホン酸基が導入されていることがわかる。
更に、ＧＭＡ導入後の膜とＰＵ−ＣＯＯＨ膜を比較すると、ＰＵ−ＣＯＯＨ膜のＮの量が増加した。これは、カルボキシル基を導入する際にグリシンを用いているためにＮが増加したと考えられる。よって、カルボキシル基が導入されていることがわかる。
また、ＰＵ−ＮＨ２膜、ＰＵ−Ｎ（Ｃ２Ｈ５）２膜、ＰＵ−ＮＨ２Ｃ２Ｈ４ＯＨ膜のアミン系統の膜は、ＧＭＡ導入後の膜と比較して、Ｎが増加していることから、アミン系統の置換基が導入されていることがわかる。
なお、全ての膜にみられたＳｉは、ポリウレタン発泡体膜を発泡させる際に混入したものであると考えられる。
（２）ＣＤ３４＋造血幹細胞の透過率及び回収率
結果を表２及び図２のグラフに示す。
なお、本明細書に添付するグラフは、ｎ＝４の独立した測定の平均値をプロットしたものであり、縦のバーは標準偏差を示す。
【表２】
2005323534.tif 000004
官能基未修飾のＰＵ膜、ＰＵ−ＳＯ３Ｈ膜、ＰＵ−ＯＨ膜、ＰＵ−ＣＯＯＨ膜、ＰＵ−ＮＨ２膜共に、造血幹細胞の透過は、ほとんどなかった。
このことより、試料の末梢血に含まれるＣＤ３４＋造血幹細胞は、造血幹細胞分離操作において、造血幹細胞分離回収膜を透過することなく、全て膜に捕捉されていることがわかる。
このことより、官能基の修飾に関係なく、ポリウレタン発泡体膜には、ＣＤ３４＋造血幹細胞を捕捉することができると考えられる。
次いで、ＣＤ３４＋造血幹細胞の回収率を比較すると、ＰＵ−ＣＯＯＨ膜での回収率が約７５％と、一番高い回収率を示した。
その他、ＰＵ−ＳＯ３Ｈ膜及びＰＵ−ＯＨ膜では、約２０％前後の回収率であり、ＰＵ−ＮＨ２膜では、ＣＤ３４＋造血幹細胞をほとんど回収できなかった。
また、ＰＵ−Ｎ（Ｃ２Ｈ５）２膜及びＰＵ−ＮＨ２Ｃ２Ｈ４ＯＨ膜においても、ＣＤ３４＋造血幹細胞はほとんど回収できず、未修飾のポリウレタン発泡体膜においては、約５％程度の回収率しか示さなかった。
これらの結果より、カルボキシル基を導入したポリウレタン発泡体膜におけるＣＤ３４＋造血幹細胞の回収率が最も高いことが示された。
【実施例２】
【００４５】
実施例１により、グリシンを用いてカルボキシル基を導入したポリウレタン発泡体膜でのＣＤ３４＋造血幹細胞の回収率が高いことが判明したことから、様々な構造のアミノ酸を表面修飾した膜を用いて、ＣＤ３４＋造血幹細胞の分離回収を検討した。
１．造血幹細胞分離回収膜の調製
（１）グリシン導入ポリウレタン発泡体膜の調製
実施例１と同様の方法でＰＵ−ＣＯＯＨ膜（ＰＵ−Ｇｌｙ）を調製し、保存した。
（２）比較例に使用する造血幹細胞分離回収膜の調製
ａ．アスパラギン酸導入ポリウレタン発泡体膜の調製
ＧＭＡ導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−ＧＭＡ）を直径２５ｍｍの円状カッターで切り抜いた。
アスパラギン酸（和光純薬工業株式会社製  L-Aspartic  Acid）０．２２７ｇを、水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業株式会社製  ０．１Ｎ  Sodium  hydroxide  Solution）中に溶解させて、０．１Ｍアスパラギン酸水溶液を調製した。
秤量瓶に切り抜いたＰＵ−ＧＭＡ膜を３枚入れて、調製したアスパラギン酸水溶液を２０ｍｌ加えた。その後、恒温槽中８０℃で２４時間浸漬させて、アスパラギン酸導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−Ａｓｐ  ａｃｉｄ膜）を調製した。
反応が終了した膜は、秤量瓶より取り出し、超純水１０ｍｌ中で振とうさせながら、１０分間２５℃で、２回の洗浄を行い、使用するまでの間、超純水中で冷蔵保存した。
ｂ．リシン導入ポリウレタン発泡体膜の調製
ＧＭＡ導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−ＧＭＡ）を直径２５ｍｍの円状カッターで切り抜いた。
Ｌ（＋）−リシン（和光純薬工業株式会社製  L（+）-Lysine）１．１６９ｇを、水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業株式会社製  ０．１Ｎ  Sodium hydroxide Solution）中に溶解させて、０．４Ｍリシン水溶液を調製した。
秤量瓶に切り抜いたＰＵ−ＧＭＡ膜を３枚入れて、調製したリシン水溶液を２０ｍｌ加えた。その後、恒温槽中８０℃で２４時間浸漬させて、リシン導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−Ｌｙｓ膜）を調製した。
反応が終了した膜は、秤量瓶より取り出し、超純水１０ｍｌ中で振とうさせながら、１０分間２５℃で、２回の洗浄を行い、使用するまでの間、超純水中で冷蔵保存した。
ｃ．アルギニン導入ポリウレタン発泡体膜の調製
ＧＭＡ導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−ＧＭＡ）を直径２５ｍｍの円状カッターで切り抜いた。
Ｌ（＋）−アルギニン（和光純薬工業株式会社製  L（+）-Arginine）０．５３２４ｇを、水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業株式会社製  ０．１Ｎ  Sodium  hydroxide  Solution）中に溶解させて、０．４Ｍアルギニン水溶液を調製した。
秤量瓶に切り抜いたＰＵ−ＧＭＡ膜を３枚入れて、調製したアルギニン水溶液を２０ｍｌ加えた。その後、恒温槽中８０℃で２４時間浸漬させて、アルギニン導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−Ａｒｇ膜）を調製した。
反応が終了した膜は、秤量瓶より取り出し、超純水１０ｍｌ中で振とうさせながら、１０分間２５℃で、２回の洗浄を行い、使用するまでの間、超純水中で冷蔵保存した。
ｄ．アスパラギン導入ポリウレタン発泡体膜の調製
ＧＭＡ導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−ＧＭＡ）を直径２５ｍｍの円状カッターで切り抜いた。
Ｌ−アスパラギン（和光純薬工業株式会社製  L-Asparagine）０．６００５ｇを、水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業株式会社製  ０．１Ｎ  Sodium  hydroxide  Solution）中に溶解させて、０．４Ｍアスパラギン水溶液を調製した。
秤量瓶に切り抜いたＰＵ−ＧＭＡ膜を３枚入れて、調製したアスパラギン水溶液を２０ｍｌ加えた。その後、恒温槽中８０℃で２４時間浸漬させて、アスパラギン導入ポリウレタン発泡体膜（ＰＵ−Ａｓｐ膜）を調製した。
反応が終了した膜は、秤量瓶より取り出し、超純水１０ｍｌ中で振とうさせながら、１０分間２５℃で、２回の洗浄を行い、使用するまでの間、超純水中で冷蔵保存した。
【００４６】
２．試料採取、造血幹細胞分離操作、造血幹細胞回収操作、分析
試料採取方法、造血幹細胞分離操作、造血幹細胞回収操作、分析方法は、実施例１と同様である。
【００４７】
３．結果
結果を表３に示す。
【表３】
2005323534.tif 000005
グリシンを導入したＰＵ膜（ＰＵ−Ｇｌｙ膜）、アスパラギン酸を導入したＰＵ膜（ＰＵ−Ａｓｐ  ａｃｉｄ膜）、リシンを導入したＰＵ膜（ＰＵ−Ｌｙｓ膜）、アルギニンを導入したＰＵ膜（ＰＵ−Ａｒｇ膜）、アスパラギンを導入したＰＵ膜（ＰＵ−Ａｓｐ）共に、造血幹細胞の透過は、ほとんどなかった。
このことより、試料の末梢血に含まれるＣＤ３４＋造血幹細胞は、造血幹細胞分離操作において、造血幹細胞分離回収膜を透過することなく、ほとんど全てが膜に捕捉されていることがわかる。
このことより、官能基の修飾に関係なく、ポリウレタン発泡体膜には、ＣＤ３４＋造血幹細胞を捕捉することができると考えられる。
次いで、ＣＤ３４＋造血幹細胞の回収率を比較すると、ＰＵ−Ｇｌｙ膜での回収率が約７０％と、一番高い回収率を示した。
その他、ＰＵ−Ａｓｐ  ａｃｉｄ膜及びＰＵ−Ａｓｐ膜のＣＤ３４＋造血幹細胞回収率は、約３０％程度であり、ＰＵ−Ｌｙｓ膜及びＰＵ−Ａｒｇ膜のＣＤ３４＋造血幹細胞の回収率は、約２０％前後であった。
これらの結果より、グリシンを用いてカルボキシル基を導入した膜のＣＤ３４＋造血幹細胞回収率が最も高いことが示された。
【実施例３】
【００４８】
次いで、造血幹細胞分離回収膜の積層枚数によるＣＤ３４＋造血幹細胞の分離回収を検討した。
１．造血幹細胞分離回収膜の調製
グリシン導入ポリウレタン発泡体膜の調製
実施例１と同様の方法でＰＵ−ＣＯＯＨ膜（ＰＵ−Ｇｌｙ）を調製し、保存した。
【００４９】
２．試料採取、造血幹細胞分離操作、造血幹細胞回収操作、分析方法
試料採取方法、分析方法は、実施例１と同様である。
造血幹細胞分離操作、造血幹細胞回収操作に関しては、比較例として、ＰＵ−ＣＯＯＨ膜を１枚マイクロシリンジフィルタホルダー４にセットした。なお、その他の操作は、実施例１と同様である。
【００５０】
３．結果
結果を表４に示す。
【表４】
2005323534.tif 000006
ＰＵ−ＣＯＯＨ膜を３枚積層して使用した場合には、ＣＤ３４＋造血幹細胞の透過はなく、ＰＵ−ＣＯＯＨ膜にほとんど全てのＣＤ３４＋造血幹細胞が捕捉されていると考えられる。また、回収率も約７０％と高い回収率を示した。
一方、ＰＵ−ＣＯＯＨ膜を１枚使用した場合には、約４５％のＣＤ３４＋造血幹細胞がＰＵ−ＣＯＯＨ膜を通過し、回収率も約４５％程度にとどまった。
このことより、ＰＵ−ＣＯＯＨ膜は複数毎積層して使用することが望ましいと考えられる。
【実施例４】
【００５１】
次いで、回収液の濃度によるＣＤ３４＋造血幹細胞の回収率を検討した。
１．造血幹細胞分離回収膜の調製
グリシン導入ポリウレタン発泡体膜の調製
実施例１と同様の方法でＰＵ−ＣＯＯＨ膜（ＰＵ−Ｇｌｙ）を調製し、保存した。
【００５２】
２．試料採取、造血幹細胞分離操作、造血幹細胞回収操作、分析方法
試料採取方法、造血幹細胞分離操作、分析方法は、実施例１と同様である。
造血幹細胞回収操作に関しては、実施例として、０．５重量％のヒトアルブミン水溶液を回収液に使用し、比較例として、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）、０．０５重量％ヒトアルブミン水溶液、３重量％ヒトアルブミン水溶液を回収液に使用して、回収操作をおこなった。
【００５３】
３．結果
結果を表５に示す。
【表５】
2005323534.tif 000007
０．０５重量％ヒトアルブミン水溶液及び３重量％ヒトアルブミン水溶液では、ＣＤ３４＋造血幹細胞の回収率は、約６０％であった。
一方、０．５重量％ヒトアルブミン水溶液では、ＣＤ３４＋造血幹細胞回収率は、約７０％と高い回収率を示した。
このことより、回収液としては、０．５重量％のヒトアルブミン水溶液を使用することが望ましいと考えられる。
【実施例５】
【００５４】
次いで、回収液の分画によるＣＤ３４＋造血幹細胞の回収率を検討した。
１．造血幹細胞分離回収膜の調製
グリシン導入ポリウレタン発泡体膜の調製
実施例１と同様の方法でＰＵ−ＣＯＯＨ膜（ＰＵ−Ｇｌｙ）を調製し、保存した。
【００５５】
２．試料採取、造血幹細胞分離操作、造血幹細胞回収操作、分析方法
試料採取方法、分析方法は、実施例１と同様である。
造血幹細胞分離操作、造血幹細胞回収操作に関しては、２ｍｌ毎に試料の濾過を行い、２ｍｌの濾過毎に濾液を回収する以外は、実施例１と同様である。
【００５６】
３．結果
結果を表６に示す。
【表６】
2005323534.tif 000008
どの濾液分画においても、ＣＤ３４＋造血幹細胞の透過は認められなかった。
回収率に関しては、０〜２ｍｌ分画では約５０％の回収率を示し、２〜４ｍｌ分画では約２０％の回収率を示した。一方、４〜６ｍｌ分画では、回収率は０％であった。
このことから、ＰＵ−ＣＯＯＨ膜に捕捉されたＣＤ３４＋造血幹細胞は、初めの４ｍｌでほぼ全て回収できると考えられる。
【実施例６】
【００５７】
次いで、膜の前処理を行うことによるＣＤ３４＋造血幹細胞の分離性及び回収率を検討した。
１．造血幹細胞分離回収膜の調製
グリシン導入ポリウレタン発泡体膜の調製
実施例１と同様の方法でＰＵ−ＣＯＯＨ膜（ＰＵ−Ｇｌｙ）を調製した。
ＰＵ−ＣＯＯＨ膜は、使用前に、水、０．５重量％ヒトアルブミン水溶液（以下、「ＨＳＡ水溶液」と記す）、リン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と記す、ｐＨ７．２）を浸潤させる前処理を行った。
【００５８】
２．試料採取、造血幹細胞分離操作、造血幹細胞回収操作、分析方法
試料採取方法、造血幹細胞分離操作、造血幹細胞回収操作、分析方法は、実施例１と同様である。
【００５９】
３．結果
結果を表７に示す。
【表７】
2005323534.tif 000009
ＰＢＳで前処理したＰＵ−ＣＯＯＨ膜では、約２０％程度のＣＤ３４＋造血幹細胞が分離操作で、透過していた。しかし、水で前処理したＰＵ−ＣＯＯＨ膜では、ＣＤ３４＋造血幹細胞の透過は認められず、ＰＢＳで前処理したＰＵ−ＣＯＯＨ膜では約１０％程度のＣＤ３４＋造血幹細胞が透過したのみであった。
回収率に関しては、水で前処理したＰＵ−ＣＯＯＨ膜では約７０％、０．５重量％ＨＳＡ水溶液で前処理したＰＵ−ＣＯＯＨ膜では約４０％、ＰＢＳ水溶液で前処理したＰＵ−ＣＯＯＨ膜では約８０％であった。
このことから、ＰＢＳで前処理したＰＵ−ＣＯＯＨ膜を使用することが望ましいと考えられる。
【実施例７】
【００６０】
次いで、ＰＵ−ＣＯＯＨ膜における、血液中の各細胞の透過率及び回収率を検討した。
対比例としての細胞は、赤血球、血小板、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単核球とした。
１．造血幹細胞分離回収膜の調製
グリシン導入ポリウレタン発泡体膜の調製
実施例１と同様の方法でＰＵ−ＣＯＯＨ膜（ＰＵ−Ｇｌｙ）を調製し、保存した。
【００６１】
２．試料採取、各細胞の分離操作、各細胞の回収操作
試料採取方法、各細胞の分離操作、各細胞の回収操作は、実施例１と同様である。
【００６２】
３．分析方法
（１）ＣＤ３４＋造血幹細胞の分析  
ＣＤ３４＋造血幹細胞数の分析方法は、実施例１と同様である。
（２）赤血球及び血小板の分析
赤血球数については、グリコホリンＡを細胞表面マーカーとして分析し、血小板数については、ＣＤ４１を細胞表面マーカーとして分析した。
末梢血、濾液、回収液は、１０倍に希釈した。
サンプル管（Beckmancoulter製）をサンプルと同数準備し、各サンプル管に抗グリコホリンＡ抗体２０μｌ及び抗ＣＤ４１抗体２０μｌを加えた。
上記希釈試料を１００μｌずつ各サンプル管に加え、撹拌した後、室温暗所で２０分間インキュベートした後、試料を再び１００倍に希釈した。
次いで、該希釈試料５００μｌに、Flow-Count  Beads  Solutionを１００μｌ加えてサンプルを調製した。
このように調製した各サンプルをフローサイトメトリー（Beckmancoulter製  EPICS  XL）を用いて分析した。
（３）Ｔ細胞及びＢ細胞の分析
Ｔ細胞数については、ＣＤ３を細胞表面マーカーとして分析し、Ｂ細胞数については、ＣＤ１９を細胞表面マーカーとして分析した。
末梢血、濾液、回収液は、希釈せずに試料として使用する。
サンプル管（Beckmancoulter製）をサンプルと同数準備し、各サンプル管に抗ＣＤ３抗体１０μｌ及び抗ＣＤ４１抗体１０μｌを加えた。
試料を１００μｌずつ各サンプル管に加え、撹拌した後、室温暗所で１５分間インキュベートした。
次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）を５００μｌ添加して撹拌し、再び室温暗所で１５分間インキュベートした。
このように調製した各サンプルをフローサイトメトリー（Beckmancoulter製  EPICS  XL）を用いて分析した。
（４）単核球の分析
単核球数は、レーザ光（アルゴンレーザ  ４８８ｎｍ）の前方散乱及び側方散乱の分析による細胞のサイズと形から推定した。
（５）透過率及び回収率の算出
採取した末梢血中の各細胞数、濾液中の各細胞数、回収液中の各細胞数を分析することによって、各細胞の透過率及び回収率が算出可能である。透過率及び回収率は下記の計算で求められる。
透過率（％）＝（分離操作で遠沈管に回収した濾液中の各細胞数／採取した末梢血に含まれる各細胞数）×１００
回収率（％）＝（回収操作で遠沈管に回収した回収液中の各細胞数／採取した末梢血に含まれる各細胞数）×１００
【００６３】
３．結果
結果を表８及び図３のグラフに示す。
【表８】
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透過率については、赤血球、血小板、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単核球ともに、１０〜２０％程度の細胞がＰＵ−ＣＯＯＨ膜を透過していることがわかる。しかし、ＣＤ３４＋造血幹細胞は、ＰＵ−ＣＯＯＨ膜を通過せず、ＰＵ−ＣＯＯＨ膜に完全に捕捉される。
また、回収率に関しては、ＣＤ３４＋造血幹細胞は約７０％もの高収率で回収されており、他の細胞の回収率は２０％以下でしかない。この結果より、本発明にかかるＰＵ−ＣＯＯＨ膜では、末梢血に前処理を施すことなく、ＣＤ３４＋造血幹細胞を選択的に高収率で回収することができることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本実施例に係る造血幹細胞分離回収装置Ｓを示す図である。
【図２】実施例１に係るＣＤ３４＋造血幹細胞の透過率及び回収率を示すグラフである。
【図３】実施例７に係る各細胞の透過率及び回収率を示すグラフである。
【符号の説明】
【００６５】
１  ポンプ、  ２  試料充填シリンジ、  ３  押圧シリンジ、  ４  マイクロシリンジフィルタホルダー、  ５  支持台、  １１  チューブ、  ２１、３１  吐出口  、  ２２、３２  ピストン、  ２３、３３  押圧部、  ４１  試料導入口、  Ｓ  造血幹細胞分離回収装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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