(57)【要約】【課題】  被検試料中に存在するＢ型肝炎ウイルスＰｒｅ−Ｃ領域の遺伝子変異を正確、及び迅速に検出、又は同定する分析方法、並びにそれに用いることのできる新規の標識プライマー及びプライマーセットを提供する。【解決手段】  前記分析方法は、被検試料と前記の新規プライマーセットとを用いてＤＮＡ断片を作製する工程、及び前記工程で得られた反応生成物を分析する工程を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）（ａ）Ｂ型肝炎ウイルスを含む可能性のある被検試料と（ｂ）配列番号１５で表される塩基配列における１８１４番〜１９００番の塩基からなる配列を少なくとも含む領域を増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットとを用いてＤＮＡを増幅させる工程；
（２）前記ＤＮＡ増幅工程（１）で得られた生成物を鋳型とし、配列番号３〜１４のいずれか１つの配列番号で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が第１の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーとし、（ａ）第２の標識物質で標識されているデオキシリボヌクレオシド三リン酸、又は（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が第２の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドセンスプライマーの存在下で、ＤＮＡを合成する工程；及び
（３）前記ＤＮＡ合成工程（２）で得られた生成物を、前記各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いて分析する工程
を含む、Ｂ型肝炎ウイルスＰｒｅ−Ｃ領域における遺伝子の突然変異の分析方法。
【請求項２】
前記分析工程（３）における分析方法が、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、又はサンドイッチ法である、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
配列番号３〜１４のいずれか１つの配列番号で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項４】
（１）配列番号３〜１４のいずれか１つの配列番号で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が第１の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマー；
（２）（ａ）第２の標識物質で標識されているデオキシリボヌクレオシド三リン酸、又は（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が第２の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドセンスプライマー；及び
（３）（ａ）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子を保持し、しかも、もう一方の標識化合物に特異的に結合可能なパートナーが固定されているイムノクロマトグラフ用ストリップ、又は（ｂ）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識化合物に特異的に結合可能なパートナーとを担持したラテックス粒子懸濁液
を含む、Ｂ型肝炎ウイルスＰｒｅ−Ｃ領域における遺伝子変異の分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスＰｒｅ−Ｃ領域における遺伝子の突然変異［特には一塩基多型（single nucleotide polymorphism；以下、ＳＮＰと称する）］の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（Heapatitis B Virus；以下、ＨＢＶの略称を用いることがある）は、ヒトに肝炎を起こす感染症であり、自然寛解する急性肝炎から劇症肝炎、無症候キャリアーから肝硬変、肝癌あるいは急性増悪により肝不全に至る例までさまざまな病態が存在する（非特許文献１）。最近のウイルス遺伝子の研究により、自然寛解する急性肝炎と劇症肝炎、あるいは無症候キャリアーと慢性肝炎患者とでは、ウイルスの遺伝子がやや異なるということが明らかになってきた。
【０００３】
Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡは、約３，２００塩基（非特許文献２）からなる不完全な環状二本鎖ＤＮＡで、４つのＯＲＦ（Open Reading Frame）、すなわち、Ｐｒｅ−Ｓ／Ｓ遺伝子、Ｐｒｅ−Ｃ／Ｃ遺伝子、Ｐ遺伝子、及びＸ遺伝子を有する。このうちＰｒｅ−Ｃ領域は、ＨＢｅ抗原タンパク質の産生に必須であり、その変異によりストップコドンが生じるとＨＢｅ抗原が産生されなくなる（非特許文献３）。一方、ＨＢワクチン接種による感染防御を免れるワクチンエスエープ変異はＳ遺伝子に起こる（非特許文献４）。また、新しく登場したＢ型肝炎ウイルスに対するラミブジン療法中に出現し、治療抵抗性あるいは肝炎の再燃を引き起こすラミブジン耐性ウイルスでは、Ｐ遺伝子がコードするポリメラーゼ／リバーストランスクリプターゼ領域の変異によりＹＭＤＤモチーフと呼ばれる領域のＭがＶ又はＩに置き換わっている（非特許文献５）。
【０００４】
国内のＢ型劇症肝炎では、Ｐｒｅ−Ｃ領域の８３番目の塩基がＧからＡに代わり、２８番目のコドンがストップコドンとなる変異が見られる場合が多い。このＰｒｅ−Ｃ領域の遺伝子変異の検出法には、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（PCR Single Strand Conformation Polymorphism）法、直接塩基配列決定法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（PCR Restriction Fragment Length Polymorphism）法、又はＭＳＳＡ（Mutation Site Specific Assay）などが行われている（非特許文献６）。特に、Ｂ型肝炎ウイルスのＰｒｅ−Ｃ領域を含むＤＮＡ断片のＤＮＡをＰＣＲ法で増幅する方法は小野らにより報告されている（非特許文献７）。しかし、これらの検出法では操作が煩雑であり、再現性の問題も指摘されている。
【０００５】
【非特許文献１】「日本臨床」，１９９３年，第５１巻，第２号，ｐ．２９−３３
【非特許文献２】「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，（英国），１９８３年，第８巻，ｐ．１３
【非特許文献３】「ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（New En  gland of Medicine）」，（米国），１９９１年，第３２４巻，ｐ．１６９９−１７０  ４
【非特許文献４】「ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）」，（英国），１９９０年，第３３６巻，ｐ．３２５−３２９
【非特許文献５】「ガストロエンテロロジー（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）」，（米国），２００１年，第１２０巻，ｐ．１０００−１００８
【非特許文献６】「日本臨床」，１９９５年，第５３巻，増刊号，ｐ．３１０−３２４
【非特許文献７】「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，（英国），１９８３年，第１１巻，ｐ．１７４７−１７５７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の課題は、被検試料（例えば、血液、血漿、又は血清）中に存在するＨＢＶのＰｒｅ−Ｃ領域の非常に限られた領域の変異（特にはＳＮＰ）の有無を、簡易且つ迅速に、しかも正確に分析することができる分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題は、本発明による、（１）（ａ）Ｂ型肝炎ウイルスを含む可能性のある被検試料と（ｂ）配列番号１５で表される塩基配列における１８１４番〜１９００番の塩基からなる配列を少なくとも含む領域を増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットとを用いてＤＮＡを増幅させる工程（以下、ＤＮＡ増幅工程と称する）；
（２）前記ＤＮＡ増幅工程（１）で得られた生成物を鋳型とし、配列番号３〜１４のいずれか１つの配列番号で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が第１の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーとし、（ａ）第２の標識物質で標識されているデオキシリボヌクレオシド三リン酸、又は（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が第２の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドセンスプライマーの存在下で、ＤＮＡを合成する工程（以下、ＤＮＡ合成工程と称する）；及び
（３）前記ＤＮＡ合成工程（２）で得られた生成物を、前記各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いて分析する工程（以下、分析工程と称する）
を含む、Ｂ型肝炎ウイルスＰｒｅ−Ｃ領域における遺伝子の突然変異の分析方法により解決することができる。
本発明の分析方法の好ましい態様によれば、前記分析工程（３）における分析方法が、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、又はサンドイッチ法である。
【０００８】
また、本発明は、配列番号３〜１４のいずれか１つの配列番号で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
更に、本発明は、（１）配列番号３〜１４のいずれか１つの配列番号で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が第１の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマー；
（２）（ａ）第２の標識物質で標識されているデオキシリボヌクレオシド三リン酸、又は（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が第２の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドセンスプライマー；及び
（３）（ａ）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子を保持し、しかも、もう一方の標識化合物に特異的に結合可能なパートナーが固定されているイムノクロマトグラフ用ストリップ、又は（ｂ）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識化合物に特異的に結合可能なパートナーとを担持したラテックス粒子懸濁液
を含む、Ｂ型肝炎ウイルスＰｒｅ−Ｃ領域における遺伝子変異の分析用キットに関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の分析方法によれば、被検試料（例えば、血液、血漿、又は血清）中に存在するＨＢＶのＰｒｅ−Ｃ領域の遺伝子変異（好ましくは突然変異、特にはＳＮＰ）を、簡易且つ迅速に、しかも正確に分析することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の分析方法は、（１）ＤＮＡ増幅工程、（２）ＤＮＡ合成工程、及び（３）分析工程を含み、各工程をこの順に実施する。
【００１１】
本発明の分析方法におけるＤＮＡ増幅工程では、Ｂ型肝炎ウイルスを含む可能性のある被検試料と、特定のオリゴヌクレオチドプライマーセットとを用いて、ＰＣＲ反応を実施する。
本発明の分析方法で分析することのできる前記被検試料は、Ｂ型肝炎ウイルスを含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、血液、血漿、血清 などを挙げることができる。
【００１２】
ＤＮＡ増幅工程で用いるオリゴヌクレオチドプライマーセットは、Ｂ型肝炎ウイルスを鋳型として用いるＰＣＲ反応を実施した場合に、配列番号１５で表される塩基配列における１８１４番〜１９００番の塩基からなる配列を少なくとも含む領域を増幅可能であるプライマーセットである限り、特に限定されるものではない。なお、配列番号１５で表される塩基配列は、Ｂ型肝炎ウイルス（野生型）のＤＮＡゲノムの全塩基配列［Okamoto, H. et al., J. Gen Virol. 67 (Pt 11), 2305-2314 (1986)；Gene bank accession NC#003977］の内、その５’側の２０４０塩基の配列であり、配列番号１５で表される塩基配列における１８１４番〜１９００番の塩基からなる配列は、２９アミノ酸からなるプレコア（Ｐｒｅ−Ｃ）領域をコードする塩基配列である。図４に、配列番号１５で表される塩基配列と、プレコア領域及びコア領域（ＨＢｃ）との関係を示す。
【００１３】
ＤＮＡ増幅工程で用いるオリゴヌクレオチドプライマーセットとしては、例えば、配列番号１で表される塩基配列（配列番号１５で表される塩基配列における１７４４番〜１７６１番の塩基からなる配列）からなるオリゴヌクレオチドセンスプライマーと配列番号２で表される塩基配列（配列番号１５で表される塩基配列における１９４０番〜１９５９番の塩基からなる配列に対する相補的配列）からなるオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーとの組み合わせを挙げることができる。
なお、この塩基配列は、小野らの報告（Nucleic Acids Res., 11, 1747-1757, 1983）を参考にした。
【００１４】
ＤＮＡ増幅工程におけるＰＣＲ反応は、ＤＮＡポリメラーゼとして、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、アンプリタック（AmpliTaq）、ジーンタック（Gene Taq；Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エクソヌクレアーゼの欠失酵素）、又はストフェルフラグメント（Stoffel Fragment；AmpliTaqの５’→３’エクソヌクレアーゼの欠失酵素）等の５’→３’エクソヌクレアーゼ活性の無い酵素を使用し、常法により実施することができる。
被検試料中にＢ型肝炎ウイルスが含まれている場合、そのＢ型肝炎ウイルスのＰｒｅ−Ｃ領域を鋳型として、二重鎖ＤＮＡが増幅される。配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドセンスプライマーと配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーとの組み合わせを用いた場合には、２１６ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００１５】
本発明の分析方法におけるＤＮＡ合成工程では、（ａ）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた生成物を鋳型とし、５’末端が第１の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーを用いて、第２の標識物質で標識されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸の存在下で、ＤＮＡ伸長反応を実施する（以下、本発明の第１の分析方法と称する）か、あるいは、（ｂ）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた生成物を鋳型とし、５’末端が第１の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーと、５’末端が第２の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドセンスプライマーとの組み合わせを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅反応を実施する（以下、本発明の第２の分析方法と称する）。
【００１６】
本発明の第１の分析方法におけるＤＮＡ合成工程では、５’標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーとして、配列番号３〜１４のいずれか１つの配列番号で表される塩基配列からなり、且つその５’末端が第１の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドを使用する。
配列番号３〜１４で表される各塩基配列は、Ｂ型肝炎ウイルスＰｒｅ−Ｃ領域及びその近傍領域の塩基配列の部分配列に相補的な配列、あるいは、前記部分配列の相補的配列における一塩基又は二塩基を置換した塩基配列である。各塩基配列と、Ｂ型肝炎ウイルスＰｒｅ−Ｃ領域及びその近傍領域の塩基配列における対応領域及び変異位置との関係を表１に示す。なお、表１における各塩基番号は、Ｂ型肝炎ウイルスのＤＮＡゲノムの塩基配列における塩基番号（すなわち、配列番号１５で表される塩基配列における塩基番号）である。この塩基番号によれば、Ｐｒｅ−Ｃ領域は、１８１４番〜１９００番である。
【００１７】
《表１》
配列番号                対応領域                      変異位置          
３〜６            １８９６番〜１９１０番              １８９６番
７〜１０          １８９９番〜１９１３番              １８９９番
１１〜１４          １８９６番〜１９１０番        １８９６番及び１８９９番
【００１８】
第１の標識物質としては、プライマーの標識化に使用することができ、標識プライマーを用いたＤＮＡ伸長反応を抑制又は阻害することがなく、標識物質に特異的に結合可能なパートナーが存在する限り、特に限定されるものではなく、例えば、蛍光物質ＦＩＴＣ（Fluorescein isothiocyanate）、Ｃｙ３（Cyanine 3）、Ｃｙ５（Cyanine 5）、ローダミン、テキサスレッド、ＨＥＸ（Hexachloro-6-carboxyfluorescein）、ＦＡＭ（6-Carboxyfluorescein）、ＴＥＴ（Tetrachloro-6-carboxyfluorescein）、ＴＡＭＲＡ（6-Carboxytetramethylrhodamine）、ＴＲＩＴＣ（Tetramethylrhodamin）、ＲＯＸ（Carboxy-X-rhodamine）、ＤＮＰ（Dinitrophenol）、ジゴキシゲニン、又はビオチン等を挙げることができる。
【００１９】
第２の標識物質で標識されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸におけるデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸としては、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、又はｄＧＴＰを挙げることができる。また、第２の標識物質としては、デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸の標識化に使用することができ、標識デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸を用いたＤＮＡ伸長反応を抑制又は阻害することがなく、標識物質に特異的に結合可能なパートナーが存在する限り、特に限定されるものではなく、例えば、第１の標識物質として例示した標識物質を使用することができる。
第１の標識物質と第２の標識物質との組み合わせとしては、異なる２種類の標識物質の組み合わせである限り、特に限定されるものではないが、ＦＩＴＣとビオチンとの組み合わせが好ましく、第１の標識物質がＦＩＴＣであり、第２の標識物質がビオチンであることが特に好ましい。
【００２０】
本発明による第１の分析方法のＤＮＡ合成工程におけるＤＮＡ伸長反応は、前記ＤＮＡ増幅工程で得られた生成物（すなわち、二重鎖ＤＮＡ）を鋳型とし、前記５’標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーを用いて、前記標識デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸の存在下で実施すること以外は、ＤＮＡポリメラーゼを用いる常法により、実施することができる。
【００２１】
すなわち、前記ＤＮＡ増幅工程で得られた生成物を鋳型として用いる場合には、反応生成物をそのまま直接、あるいは、適当な処理を行なった処理物（例えば、適当に希釈又は濃縮した希釈物又は濃縮物）として、ＤＮＡ合成工程に用いることができる。
また、前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、アンプリタック（AmpliTaq）、ジーンタック（Gene Taq；Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エクソヌクレアーゼの欠失酵素）、又はストフェルフラグメント（Stoffel Fragment；AmpliTaqの５’→３’エクソヌクレアーゼの欠失酵素）等の５’→３’エクソヌクレアーゼ活性の無い酵素を挙げることができる。
【００２２】
被検試料中にＢ型肝炎ウイルスが含まれており、ＤＮＡ増幅工程で二重鎖ＤＮＡが増幅されている場合であって、しかも、使用する５’標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーとそれに対応するＢ型肝炎ウイルス中の特定ＳＮＰの種類とが一致する場合には、前記ＤＮＡ伸長反応により、鋳型ＤＮＡに相補的な配列を有するｃＤＮＡが合成され、前記鋳型ＤＮＡと一緒になって二重鎖を形成する。形成される二重鎖ＤＮＡは、５’末端が第１の標識物質で標識化され、しかも、ＤＮＡ鎖中に、第２の標識物質で標識されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸を含む二重標識ＤＮＡである。
【００２３】
本発明による第１の分析方法のＤＮＡ合成工程の一態様を、図１に示す。図１に示す態様は、第１の標識物質としてＦＩＴＣを使用し、第２の標識物質で標識されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸としてビオチン標識ｄＣＴＰを使用する態様である。  図１に示す態様では、ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物（２１６ｂｐ  ｃＤＮＡ）に、ＦＩＴＣ標識プライマー、ビオチン標識ｄＣＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼを添加した後、熱変性、アニーリング、及びポリメラーゼ反応を、順次実施することにより、生成物として、ＦＩＴＣ及びビオチンで標識された二重標識ＤＮＡが得られる。
【００２４】
本発明の第２の分析方法におけるＤＮＡ合成工程では、５’標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーとして、本発明の第１の分析方法におけるＤＮＡ合成工程で使用するのと同じプライマー、すなわち、配列番号３〜１４のいずれか１つの配列番号で表される塩基配列からなり、且つその５’末端が第１の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドを使用する。
また、５’標識オリゴヌクレオチドセンスプライマーとして、配列番号１で表される塩基配列からなり、且つその５’末端が第２の標識物質で標識化されているオリゴヌクレオチドを使用する。第２の標識物質としては、プライマーの標識化に使用することができ、標識プライマーを用いたＤＮＡ増幅反応を抑制又は阻害することがなく、標識物質に特異的に結合可能なパートナーが存在する限り、特に限定されるものではなく、例えば、第１の標識物質として例示した標識物質を使用することができる。
【００２５】
本発明による第２の分析方法のＤＮＡ合成工程におけるＤＮＡ増幅反応は、前記ＤＮＡ増幅工程で得られた生成物（すなわち、二重鎖ＤＮＡ）を鋳型とし、前記５’標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーと前記５’標識オリゴヌクレオチドセンスプライマーとの組み合わせを用いること以外は、ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲ法により、実施することができる。
【００２６】
すなわち、前記ＤＮＡ増幅工程で得られた生成物を鋳型として用いる場合には、反応生成物をそのまま直接、あるいは、適当な処理を行なった処理物（例えば、適当に希釈又は濃縮した希釈物又は濃縮物）として、ＤＮＡ合成工程に用いることができる。
また、前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、アンプリタック（AmpliTaq）、ジーンタック（Gene Taq；Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エクソヌクレアーゼの欠失酵素）、又はストフェルフラグメント（Stoffel Fragment；AmpliTaqの５’→３’エクソヌクレアーゼの欠失酵素）等の５’→３’エクソヌクレアーゼ活性の無い酵素を挙げることができる。
【００２７】
被検試料中にＢ型肝炎ウイルスが含まれており、ＤＮＡ増幅工程で二重鎖ＤＮＡが合成されている場合であって、しかも、使用する５’標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーとそれに対応するＳＮＰの種類とが一致する場合、前記ＤＮＡ増幅反応により、使用したプライマーセットに挟まれた領域に相当する二重鎖ＤＮＡが増幅される。合成される前記二重鎖ＤＮＡは、一方の鎖の５’末端が第１の標識物質で標識化され、もう一方の鎖の５’末端が第２の標識物質で標識化されている二重標識ＤＮＡである。
【００２８】
本発明の分析方法における分析工程では、前記ＤＮＡ合成工程で得られた生成物（すなわち、二重標識ＤＮＡ）を、各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いて分析する。各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナー（例えば、抗体）を用いる分析方法としては、これに限定されるものではないが、例えば、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、又はサンドイッチ法を挙げることができる。
【００２９】
標識物質に特異的に結合可能なパートナーとしては、標識物質に対する抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）又はその抗体フラグメント〔例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ等〕を挙げることができる。また、ビオチンに特異的に結合可能なパートナーとしては、抗ビオチン抗体又はそのフラグメント以外にも、例えば、アビジン又はストレプトアビジンを挙げることができる。
【００３０】
前記分析工程では、前記ＤＮＡ合成工程で得られた反応生成物を、前記の各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いて分析する。反応生成物の分析方法としては、前記の各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いる限り、特に限定されるものではなく、例えば、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、又はサンドイッチ法などを挙げることができる。なお、前記ＤＮＡ合成工程で得られた反応生成物は、そのまま直接、あるいは、適当な処理を行なった処理物（例えば、適当に希釈又は濃縮した希釈物又は濃縮物）として、分析工程にかけることができる。
【００３１】
本発明による第１の分析方法のＤＮＡ合成工程で得られた反応生成物を、分析工程にかける場合には、反応系中に未反応の標識デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸が多量に存在することがある。この場合、適当な分離処理によって、反応生成物と未反応の標識デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸とを分離することが好ましい。前記分離処理としては、フィルター濾過又はエタノール沈殿を挙げることができる。
【００３２】
以下、分析工程における分析手法として、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、及びサンドイッチ法を利用する各態様について、この順序に従って説明する。
本発明の分析方法において、分析工程における分析手法として、イムノクロマトグラフ法を用いる場合には、例えば、イムノクロマトグラフ用ストリップとして、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子（すなわち、着色粒子コンジュゲート）を、固相担体に保持し、しかも、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーが、前記固相担体に固定化（すなわち、固相化）されているイムノクロマトグラフ用ストリップを使用することができる。
【００３３】
前記固相担体としては、例えば、ニトロセルロース、セルロースアセテート、又はガラス繊維フィルター等を用いることができる。
前記着色粒子としては、例えば、金属コロイド（例えば、金コロイド等）、非金属コロイド（例えば、ポリスチレンコロイド等）、又はリポゾーム等を用いることができる。
標識物質に特異的に結合可能なパートナーとしては、例えば、標識物質に対する抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）又はその抗体フラグメント〔例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ等〕を用いることができる。また、ビオチンに特異的に結合可能なパートナーとしては、抗ビオチン抗体又はそのフラグメント以外にも、例えば、アビジン又はストレプトアビジンを挙げることができる。以下、固相担体に固定化させる前記パートナーを「固定化用パートナー」と称し、着色粒子に結合させ、着色粒子コンジュゲートとして固相担体に保持させる前記パートナーを「保持用パートナー」と称する。
【００３４】
本発明の分析方法で用いることのできる前記イムノクロマトグラフ用ストリップでは、被検試料の展開方向に関して、上流側に、着色粒子コンジュゲートの保持領域（例えば、塗布領域）を設け、下流側に、固定化用パートナーの固定領域を設ける。固定化用パートナー（例えば、抗体）の固相への結合は、例えば、約１μｇ／ｍＬの抗体溶液を固相担体に加え、室温放置することにより行なうことができる。タンパク質の非特異的吸着をブロックするために、例えば、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でブロッキングすることが好ましい。
なお、陰性コントロールとして、例えば、マウスＩｇＧ又はウサギＩｇＧを固定する領域は、固定化用パートナーの固定領域の更に下流側に設けることもできるし、設けないでおくこともできるが、検査を正確にするためには設ける方が好ましい。
【００３５】
イムノクロマトグラフ法を用いる本発明の分析方法では、固相担体に固定化された固定化用パートナーと、固相担体に保持された着色粒子コンジュゲートとを介して、ＤＮＡ合成工程で増幅した二重標識ＤＮＡ生成物を検出する。担体の役割は、被検出物（二重標識ＤＮＡ生成物）と着色粒子コンジュゲートとを展開し、固定化された固定化用パートナーと反応させ、更に、未反応物を分離することにある。
【００３６】
より具体的には、クロマトグラフ用ストリップの着色粒子コンジュゲートを塗布した側の端に、ＤＮＡ合成工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）が接触すると、この水溶液はクロマトグラフ用ストリップに吸収及び展開され、先端に向かって浸透する。前記接触方法としては、例えば、被検試料滴下部位に滴下する方法、あるいは、容器（例えば、ウェル）内の被検試料を吸着する方法などを挙げることができる。着色粒子コンジュゲートを塗布した領域に達すると、二重標識ＤＮＡ生成物は、保持用パートナーを介して着色粒子コンジュゲートと結合し、更にクロマトグラフ用ストリップ上を移動する。そして、この二重標識ＤＮＡ生成物と着色粒子コンジュゲートとの複合体が、固定化用パートナーを固定した領域に達すると、二重標識ＤＮＡ生成物は、この固定化用パートナーに結合し、トラップされる。その結果、二重標識ＤＮＡ生成物と着色粒子コンジュゲートとの複合体は、この領域で停止し、これ以上移動しない。
【００３７】
イムノクロマトグラフ法を利用する本発明の分析方法では、この着色粒子の担体上での集積を目視により観察することにより、ＤＮＡ合成工程において目的の遺伝子断片が生成したか否かを決定することができる。更には、目的遺伝子断片の生成が確認されれば、被検試料中にＢ型肝炎ウイルスが存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。
【００３８】
なお、このように、着色粒子コンジュゲートを保持し、しかも、固定化用パートナーが固定化されているイムノクロマトグラフ用ストリップを用いる場合には、２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、異種の標識物質を用いることが必要である。仮に、両プライマーが同種の標識物質で標識化されていると、二重標識ＤＮＡ生成物が着色粒子コンジュゲート保持領域を通過し、両者の複合体を形成した際に、二重標識ＤＮＡ生成物におけるパートナー結合部位が、全て、着色粒子コンジュゲートとの結合に使用されてしまい、二重標識ＤＮＡ生成物と着色粒子コンジュゲートとの複合体が、固定化用パートナーを固定した領域に達しても、固定化用パートナーとの結合部位が残っていないことがあるからである。
【００３９】
本発明の分析方法において、分析工程における分析手法として、ラテックス凝集法を用いる場合には、ＤＮＡ合成工程で得られた反応生成物と接触させるラテックス懸濁液として、プライマーを標識化するのに用いた標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液を用いること以外は、通常のラテックス凝集法をそのまま適用して実施することができる。
【００４０】
本発明の分析方法では、標識物質として異種の標識物質を用いるため、それらの２種類の標識物質に、それぞれ、特異的に結合可能な２種類のパートナー（すなわち、一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナー）を担持したラテックス懸濁液を使用する。
【００４１】
ラテックスとしては、通常の免疫分析用試薬に使用可能なラテックスである限り、特に限定されるものではなく、例えば、ポリスチレン、又はスチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体などを挙げることができる。ラテックスの平均粒径は、測定対象物の検出濃度又は測定機器によって適宜選択することができ、例えば、０．０５〜０．５μｍであることができる。
２種類のパートナーをラテックス上に担持させる形態としては、例えば、２種類のパートナーを混合した状態で、同一のラテックス上に担持させることもできるし、あるいは、２種類のパートナーを、それぞれ、別々のラテックス上に担持させることもできる。
パートナーを担持するラテックス懸濁液は、公知方法、例えば、物理的又は化学的結合により感作させることにより、調製することができる。
【００４２】
ＤＮＡ合成工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）と、前記ラテックス懸濁液とを接触させると、前記反応生成物中に二重標識ＤＮＡ生成物が存在する場合には、特異的結合反応（例えば、抗原抗体反応）により凝集が生じる。
例えば、抗原抗体反応の条件は、通常の免疫学的ラテックス比濁分析方法の実施条件と同様であることができ、例えば、反応のｐＨは、６〜８．５で実施することができる。反応温度は０〜５０℃であることが好ましく、２０〜４０℃がより好ましい。反応時間は、適宜決定することができ、例えば、汎用自動分析機では１０〜１５分間で測定を完了することができる。
【００４３】
特異的結合反応（例えば、抗原抗体反応）により生じた凝集の程度は、公知の分析方法、例えば、光学的分析方法により分析することができる。前記光学的分析方法としては、例えば、反応液に光を照射して散乱光又は透過光を分析する方法を挙げることができ、より具体的には、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度を測定する光学機器を用いて分析を行なうことができる。好ましい測定波長は３００〜８００ｎｍである。前記光学機器を用いた分析では、公知の方法に従って、用いるラテックス粒子の大きさ及び／又は濃度の選択、並びに反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度の増加又は減少を測定することにより実施することができる。また、これらの方法を併用することも可能である。
ラテックス凝集法を利用する本発明の分析方法では、ラテックスの凝集の程度を観察することにより、ＤＮＡ合成工程において目的の遺伝子断片が生成したか否かを決定することができる。更には、目的遺伝子断片の生成が確認されれば、被検試料中にＢ型肝炎ウイルスが存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。
【００４４】
本発明の分析方法において、分析工程における分析手法として、サンドイッチ法を用いる場合には、分析対象化合物に対する抗体の代わりに、プライマーを標識化するのに用いた標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いること以外は、通常のサンドイッチ法をそのまま適用して実施することができる。
本発明の分析方法では、標識物質として異種の標識物質を用いるため、それらの２種類の標識物質に、それぞれ、特異的に結合可能な２種類のパートナーを使用する。
【００４５】
具体的には、例えば、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能な第１のパートナーを、適当な不溶性担体に固定化する。次に、不溶性担体と体液試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤〔例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やゼラチン等〕で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、ＤＮＡ合成工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）を加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ、反応させる（１次反応）。続いて、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質の残る一方に特異的に結合可能な第２のパートナーに標識物質を付した標識化第２パートナーを加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ、反応させる（２次反応）。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、不溶性担体上に存在する標識化第２パートナーの量を定量する。その値から、ＤＮＡ合成工程において目的の遺伝子断片が生成したか否かを決定することができる。更には、目的遺伝子断片の生成が確認されれば、被検試料中にＢ型肝炎ウイルスが存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。
【００４６】
前記不溶性担体としては、例えば、高分子（例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、又はポリサッカライド等）、ニトロセルロース、紙、若しくはアガロース、又はこれらの組み合わせ等を例示することができる。
第２パートナーに付す標識物質としては、例えば、酵素、蛍光物質、又は発光物質を挙げることができる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート等、また、発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル又はルシフェリン等を使用することができる。
【００４７】
本発明の分析方法では、ＤＮＡ合成工程で用いる５’標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーの３’末端（又は３’末端側領域）に、Ｂ型肝炎ウイルスＰｒｅ−Ｃ領域中に存在する公知の各ＳＮＰに応じた塩基を導入している。５’標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーの３’末端（又は３’末端側領域）の塩基と、ＳＮＰの塩基とが相補的な関係にある場合には、５’標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーと鋳型ＤＮＡとが完全にハイブリダイズするため、５’標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーから３’方向に向かって、ＤＮＡ合成が進行する。一方、５’標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーの３’末端（又は３’末端側領域）の塩基と、ＳＮＰの塩基とが相補的な関係にない場合には、５’標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーと鋳型ＤＮＡとがハイブリダイズしても、不完全なため、ＤＮＡ合成は進行しない。従って、本発明の分析方法によれば、二重標識ＤＮＡの存在の有無を指標として、Ｂ型肝炎ウイルスＰｒｅ−Ｃ領域中に存在する各ＳＮＰの種類を特定することができる。
【００４８】
５’標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマー及びその３’末端（又は３’末端側領域）の塩基と、そのプライマーにより特定可能なＳＮＰの位置及び種類との関係を、表２に示す。なお、表２において、ＳＮＰの位置は、Ｂ型肝炎ウイルスのＤＮＡゲノムの塩基配列における塩基番号（すなわち、配列番号１５で表される塩基配列における塩基番号）で示す。また、配列番号１１〜１４の塩基配列における３’末端側領域は、１８９６番〜１８９９番の配列を示しており、ＳＮＰの位置の塩基を下線で示す。
例えば、配列番号３で表される塩基配列からなる５’標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマー（３’末端の塩基＝Ｃ）を用いると、Ｂ型肝炎ウイルスのＤＮＡゲノムの１８９６番目の位置の塩基がＧであるか否かを判定することができる。すなわち、二重標識ＤＮＡが検出された場合には、１８９６番目の位置の塩基がＧであると判定することができ、二重標識ＤＮＡが検出されなかった場合には、Ｂ型肝炎ウイルスが存在しないか、あるいは、１８９６番目の位置の塩基がＧでないと判定することができる。
【００４９】
《表２》
配列番号  ３’末端塩基    ＳＮＰの位置      ＳＮＰの種類  
３          Ｃ          １８９６番              Ｇ
４          Ｔ          １８９６番              Ａ
５          Ａ          １８９６番              Ｔ
６          Ｇ          １８９６番              Ｃ
７          Ｃ          １８９９番              Ｇ
８          Ｔ          １８９９番              Ａ
９          Ａ          １８９９番              Ｔ
１０          Ｇ          １８９９番              Ｃ
１１      ＴＣＣＣ    １８９６及び１８９９番    Ａ及びＧ
１２      ＴＣＣＴ    １８９６及び１８９９番    Ａ及びＡ
１３      ＴＣＣＡ    １８９６及び１８９９番    Ａ及びＴ
１４      ＴＣＣＧ    １８９６及び１８９９番    Ａ及びＣ
【００５０】
Ｂ型肝炎ウイルスのプレコアの変異は、肝炎の沈静化とウイルス量の減少を反映している。Ｂ型肝炎ウイルスを保有するキャリアーの人（ＨＢｓ抗体価が高くない）で、この部位に変異［プレコアにおける２８番目のコドン（すなわち、１８９５番〜１８９７番の塩基）が停止コドンとなる］を持つ人から輸血された場合、又は接触感染した場合、劇症肝炎を発症しやすい。
これらのＳＮＰを特定することにより、Ｂ型急性肝炎が慢性肝炎患者の変異型ウイルス(プレコア又はコアプロモーター)の感染による重症化又は劇症化に進展するかどうかの情報を得ることができる。例えば、１８９６番の塩基がＧである場合にはトリプトファン（Ｔｒｐ）であり、Ａである場合には停止コドンであり、Ｔである場合にはロイシン（Ｌｅｕ）であり、Ｃである場合にはセリン（Ｓｅｒ）となる。図２に、停止コドンに関連するＳＮＰを示す。
本発明方法によれば、例えば、１８９６番の塩基がＡの停止コドンかどうかを確認することができる。
【００５１】
本発明の分析用キットは、
（１）配列番号３〜１４のいずれか１つの配列番号で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が第１の標識物質（例えば、ＦＩＴＣ）で標識化されているオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマー；
（２）（２−ａ）第２の標識物質で標識されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸（例えば、ビオチン標識のｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、又はｄＧＴＰ）、又は（２−ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなり、且つ５’末端が第２の標識物質（例えば、ビオチン）で標識化されているオリゴヌクレオチドセンスプライマー；及び
（３）（３−ａ）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子を保持し、しかも、もう一方の標識化合物に特異的に結合可能なパートナーが固定されているイムノクロマトグラフ用ストリップ、又は（３−ｂ）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識化合物に特異的に結合可能なパートナーとを担持したラテックス粒子懸濁液
を含む。
【００５２】
本発明の分析用キットを用いて、本発明の分析方法を実施することにより、Ｂ型肝炎ウイルスＰｒｅ−Ｃ領域における遺伝子変異を分析することができる。
例えば、前記のアンチセンスプライマー（１）、標識デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸（２−ａ）、及びイムノクロマトグラフ用ストリップ（３−ａ）を含む分析用キットは、本発明の第１の分析方法であって、しかも、イムノクロマトグラフ法を用いて分析工程を実施する、本発明の分析方法に用いることができる。
前記のアンチセンスプライマー（１）、標識デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸（２−ａ）、及びラテックス粒子懸濁液（３−ｂ）を含む分析用キットは、本発明の第１の分析方法であって、しかも、ラテックス凝集法を用いて分析工程を実施する、本発明の分析方法に用いることができる。
前記のアンチセンスプライマー（１）、標識センスプライマー（２−ｂ）、及びイムノクロマトグラフ用ストリップ（３−ａ）を含む分析用キットは、本発明の第２の分析方法であって、しかも、イムノクロマトグラフ法を用いて分析工程を実施する、本発明の分析方法に用いることができる。
また、前記のアンチセンスプライマー（１）、標識センスプライマー（２−ｂ）、及びラテックス粒子懸濁液（３−ｂ）を含む分析用キットは、本発明の第２の分析方法であって、しかも、ラテックス凝集法を用いて分析工程を実施する、本発明の分析方法に用いることができる。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００５４】
実施例１：オリゴヌクレオチドの合成
３８１型ＤＮＡ自動合成装置（アプライドバイオシステムズ社）を用いて常法により、
配列番号１で表される塩基配列（塩基数１８個）からなるオリゴヌクレオチドセンスプライマー、
配列番号１で表される塩基配列（塩基数１８個）からなる５’−ビオチン標識オリゴヌクレオチドセンスプライマー、
配列番号２で表される塩基配列（塩基数２０個）からなるオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマー、及び
配列番号３〜１４で表される各塩基配列（塩基数１５個）からなる５’ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマー
を合成した。
【００５５】
実施例２：ＨＢＶ遺伝子の単離
ＨＢｓ抗原陽性（ＲＰＨＡ法）で、ＨＢｅ抗原陽性（オクタロニー法）の肝炎患者の血漿を用いた。２０％シュクロース３ｍＬに血漿３ｍＬをのせ、超遠心分離（３７０００ｒｐｍ×１６時間）を４℃で行い、デーン粒子のペレットを集めた。このペレットを１０ｍｍｏｌ／ＬトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）／１５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ（０．５ｍＬ）に懸濁し、プロテナーゼＫ１００μｇを加え、終濃度０．５％ＳＤＳ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ、及び１０ｍｍｏｌ／ＬトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）で６８℃にて２０時間プロテアーゼ処理を行った後、フェノール抽出を３回繰り返し、エタノールで沈殿させてＨＢＶのＤＮＡを単離した。
【００５６】
実施例３：ＰＣＲ反応
配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドセンスプライマーと配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーとの組み合わせと、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Gene Taq；ニッポンジーン）とを用いて、ＰＣＲを行った。１サイクルは、
（ａ）ＤＮＡの変性工程［９５℃で１分］、
（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニーリング工程［５５℃で２分］、及び
（ｃ）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程［７２℃で１分］
からなり、このサイクルを４０回繰り返した。
【００５７】
実施例４：プラスミドの作製
（１）ライゲーション
市販のプラスミドベクターｐＺＥｒＯ−１（Invitrogen社）を制限酵素ＥｃｏＲＶ（３７℃，２時間）で消化して、増幅したＰＣＲ産物がベクターに挿入できるようにした。この制限酵素で切断したベクター２．８ｋｂｐと、ＰＣＲにより合成した２１６ｂｐのＤＮＡとを、ライゲーション・キット（宝酒造）を用いて、１６℃で３０分間反応させた。
【００５８】
（２）大腸菌の形質転換
組み換えプラスミドと、市販の大腸菌ＤＨ５α株（宝酒造）を５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ2で処理して作成したコンピテント細胞とを、氷中で３０分間インキュベートし、４２℃で３０秒間熱処理した後、３７℃でＳＯＣ培地にて１時間培養した。この大腸菌を、５０μｇ／ｍＬゼオシン（Zeocin；Invitrogen社）及び１ｍｍｏｌ／Ｌイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むＹＴ寒天平板上にまき、３７℃で一夜培養を行なった。
【００５９】
（３）形質転換体に含まれる遺伝子の単離
前記工程（２）で得られた形質転換体のコロニーを、５０μｇ／ｍＬゼオシンを含むＹＴ−ブロスに接種し、３７℃で一夜培養を行った。この培養液１．５ｍＬをエッペンドルフチューブに入れ、遠心分離で菌体を集め、アルカリ溶菌法（Molecular Cloning, A Laboratory Mannual 2nd Edition, J.Sambrook, E.F.Fritsch, T.Maniatis; Cold Spring Harbor Laboratory, New York）にてプラスミドＤＮＡを単離した。
【００６０】
（４）塩基配列の決定
前記ＤＮＡを８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にアプライし、１ｘＴＢＥ（0.089mol/L Tris-Borate/0.089mol/L Boric Acid/0.002mol/L EDTA）で泳動後、ＤＮＡマーカー（123bp DNA Ladder；GIBCO BRL製）から判断し、２１６ｂｐバンドに相当するバンドを切り取り、市販のキット（Ultrafree-DA；ミリポア社）を用いてＤＮＡを精製した。このＤＮＡと市販のシークエンスキット（BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit；アプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲ反応を行った。未反応の低分子基質は  スピンカラム（Qick Spin 50；ロシュ社）で除去し、ＤＮＡシークエンサー（３７３Ａ−１８  ＤＮＡシークエンサー装置；アプライドバイオシステムズ社）にアプライし、ジデオキシ法で塩基配列を決めた。
【００６１】
実施例５：二重標識ＤＮＡの生成
（１）検体からＤＮＡの単離
各患者の血清１００μＬを１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ／０．５％ＳＤＳ／プロテナーゼＫ（１００μｇ／ｍＬ）を加え、６８℃で３時間プロテアーゼ処理を行った後、フェノール抽出を３回繰り返し、エタノール沈殿させ、ＨＢＶ  ＤＮＡを単離した。
【００６２】
（２）ＤＮＡ増幅反応
前記工程（１）で調製したＤＮＡに、配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドセンスプライマーと配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを加え、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Gene Taq；ニッポンジーン）を用いて実施例３に記載したＰＣＲ反応を行った。このＤＮＡ生成物をＰＣＲ装置で、９５℃で熱変性し、配列番号３〜１４の塩基配列からなる各５’−ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーのいずれか１つと、ビオチン標識ｄＣＴＰ［１０ｘＰＣＲ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ：１．５ｍｍｏｌ／Ｌ−ビオチン−ｄＣＴＰ，０．５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｄＣＴＰ，２ｍｍｏｌ／Ｌ−ｄＡＴＰ，２ｍｍｏｌ／Ｌ−ｄＧＴＰ，２ｍｍｏｌ／Ｌ−ｄＴＴＰ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ］、又はDetector PCR DNA Biotinylation Kit（ＫＰＬ社）とを添加し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Gene Taq；ニッポンジーン）でＤＮＡの伸長反応を行った。このＤＮＡ生成物に含まれる未反応のビオチン−ｄＣＴＰは、スピンカラム（Mini Elute PCR purification Kit；キアゲン社）で除去した。
【００６３】
実施例６：イムノクロマトグラフ用ストリップの作製
本実施例では、二重標識ＤＮＡ捕捉用抗体として、モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体（ZYMED Laboratories製）又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体（ZYMED Laboratories製）を用い、金コロイド標識物としてストレプトアビジン（TRINA Bioreactives製）を用いて、二重標識ＤＮＡ測定用イムノクロマトグラフ用ストリップを作製した。
【００６４】
（１）イムノクロマトグラフ用メンブレンの作製
ポリアミド（ナイロン６６）製メンブレン（Immunodyne ABC，孔径＝３．０μｍ；Pall Corporation製）を５ｍｍ×２０ｍｍのサイズに裁断した。
メンブレンの上流側の一端から８ｍｍの位置に、二重標識ＤＮＡの検出ゾーンとして、モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体溶液又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体溶液［各々濃度０．５ｍｇ／ｍＬ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈］を幅１ｍｍの線状に塗布した。
また、メンブレンの上流側の一端から１３ｍｍの位置に、陰性コントロールゾーンとして、マウスモノクローナルＩｇＧ溶液［各々濃度０．５ｍｇ／ｍＬ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈］を、幅１ｍｍの線状に塗布した。
室温下で１時間、３７℃下で３０分間静置し、各々の抗体を固相化した。メンブレンを０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に浸し、室温及び相対湿度２０％以下の条件下で３０分間緩やかに振とうし、ブロッキングした。メンブレンの過剰のブロッキング液を除き、室温下で一夜静置し、乾燥させ、二重標識ＤＮＡのイムノクロマトグラフ用抗体固相化メンブレンとした。
【００６５】
（２）金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液の作製
ストレプトアビジン（濃度１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを２ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｎａ2Ｂ4Ｏ7緩衝液（ｐＨ６．５）（以下、Ｂｏｒａｘ緩衝液と称する）３，０００ｍＬ中で４℃下で一夜透析した。ストレプトアビジン溶液は、４℃下、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した後、その上清を、１００，０００×ｇで１時間遠心分離したＢｏｒａｘ緩衝液で１００μｇ／ｍＬとなるように希釈した。金コロイド液（GOLD COLLOID 20nm；British BioCell International製）１００ｍＬを、０．２ｍｏｌ／Ｌ−Ｋ2ＣＯ3溶液及び０．２ｍｏｌ／Ｌ−Ｈ3ＰＯ4溶液でｐＨ６．５に調整した。金コロイド液２０ｍＬを撹拌しながら、希釈したストレプトアビジン溶液２ｍＬを徐々に滴下し、室温下で３０分間撹拌した。更に、撹拌しながら１０％ＢＳＡ溶液（ｐＨ９．０；４℃下、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した上清）２．５ｍＬを滴下した後、室温下で３０分間撹拌した。１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）（０．４５μｍフィルター濾過）２０ｍＬに再懸濁させ、１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。更に、沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）（０．４５μｍフィルター濾過）２０ｍＬに再懸濁させ、１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。最後に、沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）（０．４５μｍフィルター濾過）に再懸濁させた後、波長５２０ｎｍにおける吸光度が約１０になるように濃度調整し、表面をシリコン処理したガラス試験管に移し、密栓し、４℃下に保存し、二重標識ＤＮＡのイムノクロマトグラフ法用金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液とした。
【００６６】
金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液は、波長５２０ｎｍにおける吸光度が３．０になるように、５．０％ショ糖を含む２ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で希釈した後、その７μＬを、吸収パッドアキュウィックＡＷ１４−２０Ｔ４（Pall Corporation製）を５ｍｍ×５ｍｍのサイズに裁断したものに塗布し、シリカゲルデシケーター内で室温下、一夜減圧（≦５０ｍｍＨｇ）乾燥したものを、二重標識ＤＮＡのイムノクロマトグラフ法用金コロイド標識ストレプトアビジンパッドとした。
【００６７】
（３）イムノクロマトグラフ法用吸収パッドの作製
グラスファイバーパッド（タイプＡ／Ｂ；Pall Corporation製）を５ｍｍ×１８ｍｍのサイズに裁断したものを、二重標識ＤＮＡのイムノクロマトグラフ法用試料添加パッドとした。グラスファイバーパッド（タイプＡ／Ｅ；Pall Corporation製）を５ｍｍ×２５ｍｍのサイズに裁断したものを、二重標識ＤＮＡのイムノクロマトグラフ法用吸収パッドとした。
【００６８】
（４）イムノクロマトグラフ用ストリップ
５ｍｍ×６０ｍｍのサイズに裁断したプラスティック粘着シート（BioDot製）に、上流側より、試料添加パッド、金コロイド標識ストレプトアビジンパッド、抗体固相化メンブレン、及び吸収パッドの順に、各々その両端を隣接する部材と１ｍｍ重ね合わせて貼付し、二重標識ＤＮＡ測定用イムノクロマトグラフ用ストリップとした。
【００６９】
実施例７：イムノクロマトグラフ法によるＤＮＡ生成物の測定
本実施例では、実施例６で作製したイムノクロマトグラフ用ストリップを用いて、二重標識ＤＮＡのイムノクロマトグラフ法を実施した。
（１）ＰＣＲ産物の希釈溶液を用いた二重標識ＤＮＡの測定
実施例３でＰＣＲを４０回行った反応液を、市販の緩衝液（Gene Taq Universal Buffer；ニッポンジーン）で、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、及び１０００倍希釈を行った。それぞれの希釈溶液に、実施例１で合成した５’−ビオチン標識オリゴヌクレオチドセンスプライマー（配列番号１）、実施例１で合成した３種類の５’ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３〜５）のいずれか１つ、及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Gene Taq；ニッポンジーン）０．５Ｕを加え、７２℃で３０分反応させた。この反応生成物１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、室温下で１０分間展開した。
【００７０】
表３に、モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したメンブレンを組み込んだ  二重標識ＤＮＡ測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでの測定結果を示す。
表４に、ポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したメンブレンを組み込んだ  二重標識ＤＮＡ測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでの測定結果を示す。
表３及び表４において、「−」は陰性、「±」は擬陽性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性、「＋＋＋」は強陽性であることを示す。
ポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化した二重標識ＤＮＡ測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでは、元の被検液を５００倍希釈したものまで検出可能であった。
【００７１】
《表３》
検出ゾーン          ＰＣＲ希釈液を用いたＤＮＡ伸長反応液            リン酸塩
１０    ５０  １００  ２００  ５００  １０００       緩衝液 
二重標識ＤＮＡ   ＋＋＋   ＋＋   ＋＋     ＋      ±       −            −
陰性コントロール   −      −     −      −      −       −            −   
【００７２】
《表４》
検出ゾーン          ＰＣＲ希釈液を用いたＤＮＡ伸長反応液              リン酸塩
１０    ５０    １００  ２００  ５００  １０００       緩衝液 
二重標識ＤＮＡ   ＋＋＋  ＋＋＋   ＋＋＋   ＋＋    ＋＋      ±            −
陰性コントロール   −      −       −      −      −       −            −   
【００７３】
（２）患者試料から得られたＰＣＲ生成物の測定
本実施例で用いた患者試料として、患者血清を用いたＨＢｓ抗原検査で陽性となった血清５サンプルを用いた。
患者試料又は実施例５で単離したＤＮＡ（Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を含む）に、配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドセンスプライマーと配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを加え、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Gene Taq；ニッポンジーン）を用いて実施例３に記載したＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ反応生成物に、実施例１で合成した１２種類の標識プライマー［配列番号３〜１４（配列番号３〜６、配列番号７〜１０、配列番号１１〜１４がセットになる）で表される各塩基配列からなる５’ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマー］、実施例１で合成した５’−ビオチン標識オリゴヌクレオチドセンスプライマー（配列番号１）、及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Gene Taq；ニッポンジーン）０．５Ｕを加え、ＤＮＡの伸長反応を行った。これらのＤＮＡ伸長反応液１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを、水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、室温下で１０分間展開した。
【００７４】
メンブレンのモノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化した部分、及び陰性コントロール抗体を固相化した部分の金コロイドの捕捉に基づく赤紫〜紫色の着色の有無を目視観察し、二重標識ＤＮＡの有無を判定した。
実施例５で単離したＤＮＡについて、ポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体固相化イムノクロマトグラフ用ストリップでの１２種類のプライマー（４種類ｘ３セット）を用いた二重標識ＤＮＡの測定結果を表５に示す。患者検体を用いた二重標識ＤＮＡの測定結果を表６に示す。表５及び表６において、「−」は陰性、「±」は擬陽性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性であることを示す。
【００７５】
《表５》

プライマー                      検出ゾーン                  
二重標識ＤＮＡ        陰性コントロール    
配列番号３                ＋＋                −
配列番号４                  −                −
配列番号５                  −                −
配列番号６                  −                −
配列番号７                ＋＋                −
配列番号８                  −                −
配列番号９                  −                −
配列番号１０                −                −
配列番号１１              ＋＋                −
配列番号１２                −                −
配列番号１３                −                −
配列番号１４                −                −            
【００７６】
《表６》

検出ゾーン                    
二重標識ＤＮＡ                  陰性コントロール
検体１    検体２    検体３    検体４    検体５                    
配列番号３    ＋＋      ＋＋        −      ＋＋      ＋＋          −
配列番号４      −        −        −        −        −          −
配列番号５      −        −        −        −        −          −
配列番号６      −        −        −        −        −          −
配列番号７      −        −      ＋＋        −        −          −
配列番号８      −        −        −        −        −          −
配列番号９      −        −        −        −        −          −
配列番号１０    −        −        −        −        −          −
配列番号１１    −        −        −        −        −          −
配列番号１２    −        −        −        −        −          −
配列番号１３    −        −        −        −        −          −
配列番号１４    −        −        −        −        −          −          
【００７７】
実施例８：ＰＣＲ反応生成物の確認
本実施例では、ビオチン−ｄＣＴＰを用いる本発明の第１の分析方法におけるＤＮＡ合成工程、あるいは、ビオチン標識センスプライマーを用いる本発明の第２の分析方法におけるＤＮＡ合成工程により生成されるＰＣＲ反応生成物（すなわち、二重標識ＤＮＡ）が、実際に合成されているか否かを確認するために、ＰＣＲ反応生成物のポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。
【００７８】
結果を図３に示す。図３において、レーン１は、ＤＮＡマーカー（123bp DNA Ladder；GIBCO BRL製）であり、レーン２及び３は、ビオチン−ｄＣＴＰを用いた場合（本発明の第１の分析方法）の結果であり、レーン４及び５は、ビオチン標識センスプライマーを用いた場合（本発明の第２の分析方法）の結果である。レーン３及び５は、ＰＣＲ反応生成物をそのまま泳動した結果であり、レーン２及び４は、ＰＣＲ反応生成物にストレプトアビジンを添加した混合物を泳動した結果である。
【００７９】
ビオチン−ｄＣＴＰを用いた場合（レーン２及び３）、ＦＩＴＣ標識プライマー及びビオチン−ｄＣＴＰを用いて得られたＰＣＲ反応生成物１０μＬにストレプトアビジン溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを加え、３０分間反応後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なうと、ストレプトアビジン（分子量：約６０，０００）と結合するビオチン−ｄＣＴＰが取り込まれたＰＣＲ生成物のバンドが上の方にシフトした（レーン２）。なお、ＰＣＲ生成物にビオチンが数箇所入るため、レーン２のバンドは上の位置に２箇所へシフトするが、ビオチン−ｄＣＴＰが取り込まれていないＰＣＲ生成物（ストレプトアビジンと反応しないＰＣＲ生成物）のバンドも存在した。また、電気泳動バンドでは示すことができないが、未反応のビオチン−ｄＣＴＰが過剰に存在した。
この場合、ＦＩＴＣとビオチンの二重標識ＰＣＲ生成物ができているが、イムノクロマト法で直接検出することができないことがあった。これは、未反応のビオチン−ｄＣＴＰがイムノクロマト片と反応したためと考えられるが、ＰＣＲ生成物に含まれる未反応のビオチン−ｄＣＴＰを、例えば、エタノール沈殿で除去、又はスピンカラムで除去した後、イムノクロマト片と反応させることにより検出が可能であった。
【００８０】
ビオチン標識センスプライマーを用いた場合（レーン４及び５）、ＦＩＴＣ標識プライマー及びビオチン標識プライマーを用いて得られたＰＣＲ反応生成物１０μＬにストレプトアビジン溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを加え、３０分間反応後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なうと、ストレプトアビジンと結合するバンドの大部分が上の方にシフトした（レーン４）。ＰＣＲ生成物にビオチンが入るため、レーン５と比較して、レーン４ではバンド濃度が薄くなり、バンドが上の方にシフトした。
この場合、ＦＩＴＣとビオチンの二重標識ＰＣＲ生成物ができ、イムノクロマト法で直接検出することができた。ビオチン標識プライマーを用いて合成した二重標識ＰＣＲ生成物は、ビオチン標識プライマーの影響を受けず、そのままのＰＣＲ生成物でイムノクロマト片と反応させ、検出することができた。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明の分析方法は、ＨＢＶのＰｒｅ−Ｃ領域の遺伝子変異（特にはＳＮＰ）の分析に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】本発明の第１の分析方法におけるＤＮＡ合成工程において、二重標識ＤＮＡの作製手順を示す説明図である。
【図２】ＨＢｅ抗原産生停止に関係するＰｒｅ−Ｃ領域の変異を示した図である。
【図３】ＰＣＲ反応生成物を電気泳動した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図４】Ｂ型肝炎ウイルスのプレコア領域及びコア領域を示す説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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