(57)【要約】【課題】  細胞を一つ一つ個別に固定化することのできる、バイオチップの作製方法及びバイオチップ、並びに、プレ・バイオチップの作製方法及びプレ・バイオチップを提供する。【解決手段】  本発明に係るバイオチップ１の作製方法は、基盤１０に、微細穴４０を形成する微細穴形成工程と、この微細穴４０に、ターゲット物質６０を固定化するための固定化物質５０を結合する固定化物質結合工程と、この固定化物質５０にターゲット物質６０を固定化する固定化工程と、を含んでいることを特徴とする。また、本発明に係るバイオチップ１は、基盤１０と、基盤１０に形成した微細穴４０と、微細穴４０に結合した固定化物質５０と、固定化物質５０に固定化されているターゲット物質６０と、を有していることを特徴とする。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基盤に、微細穴を形成する微細穴形成工程と、
この微細穴に、ターゲット物質を固定化するための固定化物質を結合する固定化物質結合工程と、
この固定化物質にターゲット物質を固定化する固定化工程と、
を含んでいることを特徴とするバイオチップの作製方法。
【請求項２】
前記微細穴形成工程が、
（ａ）基盤の表面を修飾する工程と、
（ｂ）表面の修飾を行った基盤に、微細穴を形成する工程と、を含み、かつ、
この（ａ）の工程と（ｂ）の工程とを予め設定された回数繰り返して行うことを特徴とする請求項１に記載のバイオチップの作製方法。
【請求項３】
前記微細穴を、前記ターゲット物質のブラウン運動を抑制する固定化能を有する径と深さに形成したことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のバイオチップの作製方法。
【請求項４】
前記固定化物質が、ポリリシン、コラーゲン、ラミニン、含シアル酸オリゴ糖、マンノース結合性レクチン、インテグリンファミリーリガンド、疎水性ペプチド、抗原、及び、抗体のうち少なくとも一種を含むことを特徴とする請求項１から請求項３のうちいずれか一項に記載のバイオチップの作製方法。
【請求項５】
前記ターゲット物質が、真核細胞、原核細胞、ウイルス、又は、リポソームであることを特徴とする請求項１から請求項４のうちのいずれか一項に記載のバイオチップの作製方法。
【請求項６】
基盤と、
前記基盤に形成した微細穴と、
前記微細穴に結合した固定化物質と、
前記固定化物質に固定化されているターゲット物質と、
を有していることを特徴とするバイオチップ。
【請求項７】
前記微細穴を、前記ターゲット物質のブラウン運動を抑制する固定化能を有する径と深さに形成したことを特徴とする請求項６記載のバイオチップ。
【請求項８】
前記基盤の表面に、前記ターゲット物質の非特異的な付着を防止する性質を付与したことを特徴とする請求項６又は請求項７に記載のバイオチップ。
【請求項９】
基盤に、微細穴を形成する微細穴形成工程と、
この微細穴に、ターゲット物質を固定化するための固定化物質を結合する固定化物質結合工程と、
を含むことを特徴とするプレ・バイオチップの作製方法。
【請求項１０】
前記微細穴形成工程が、
（ａ）基盤の表面を修飾する工程と、
（ｂ）表面の修飾を行った基盤に、微細穴を形成する工程と、を含み、かつ、
この（ａ）の工程と（ｂ）の工程とを予め設定された回数を繰り返して行うことを特徴とする請求項９に記載のプレ・バイオチップの作製方法。
【請求項１１】
前記微細穴を、前記ターゲット物質のブラウン運動を抑制する固定化能を有する径と深さに形成したことを特徴とする請求項８又は請求項９に記載のプレ・バイオチップの作製方法。
【請求項１２】
前記固定化物質が、ポリリシン、コラーゲン、ラミニン、含シアル酸オリゴ糖、マンノース結合性レクチン、インテグリンファミリーリガンド、疎水性ペプチド、抗原、及び、抗体のうち少なくとも一種を含むことを特徴とする請求項８から請求項１１のうちいずれか一項に記載のプレ・バイオチップの作製方法。
【請求項１３】
基盤と、
前記基盤に形成した微細穴と、
前記微細穴に結合した固定化物質と、
を有していることを特徴とするプレ・バイオチップ。
【請求項１４】
前記基盤の表面に、前記ターゲット物質の非特異的な付着を防止する性質を付与したことを特徴とする請求項１３に記載のプレ・バイオチップ。
【請求項１５】
前記微細穴を、ターゲット物質のブラウン運動を抑制する固定化能を有する径と深さに形成したことを特徴とする請求項１３又は請求項１４に記載のプレ・バイオチップ。
【請求項１６】
前記固定化物質が、ポリリシン、コラーゲン、ラミニン、含シアル酸オリゴ糖、マンノース結合性レクチン、インテグリンファミリーリガンド、疎水性ペプチド、抗原、及び、抗体のうち少なくとも一種を含むことを特徴とする請求項１３から請求項１５のうちいずれか一項に記載のプレ・バイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオチップやプレ・バイオチップの作製方法とバイオチップやプレ・バイオチップに係り、より詳しくは、細胞、細菌又はウイルスを、固相上に個別的に固定化したバイオチップの作製方法及びバイオチップ、並びに、プレ・バイオチップの作製方法及びプレ・バイオチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の細胞膜に存在する膜タンパク質のリガンド探索、膜タンパク質に対するアゴニスト及びアンタゴニストの探索、及び、その機能解明、更には、ウイルスと真核細胞（特に、ヒトの細胞）の作用機序に関する分野の研究を行うことは、学術的のみならず医薬品の研究開発において、極めて重要な役割を担うものである。かかる分野の研究を行うことは、より高い効力をもつ医薬品を、より効率的に開発することに資するものである。
【０００３】
通常、かかる分野の研究においては、ターゲットとなる物質（細胞等）を基盤上に固定化し、固定化された物質を走査型プローブ顕微鏡や蛍光顕微鏡等によって動態観察を行っている。しかし、動物細胞は、主に細胞骨格によって立体的な形状を維持しているが、細胞質のまわりは脂質二重膜で覆われているに過ぎず、その形状は流動性が高く、変形し易い。そのために、動物細胞を基盤上に固定化することは非常に難しく、上手く固定化できた場合であっても、動物細胞が扁平状に変形してしまう場合が殆どであり、実験を効率的に行うことができない。
然るに、ターゲットとなる物質を一つ一つ個別的に配列して固定化することができれば、より一層効率的に研究を進めることが可能になると考えられる。
【０００４】
従来、ターゲットとなる細胞を固定化する技術としては、以下のようなものがある。
例えば、特許文献１には、ターゲットとなる細胞を固定化する技術として、特定の細胞を固定化するリガンドを有する基質材を、樹脂製プレートのウェル上に固定化させ、このリガンドと接着する特定の細胞を培養する技術が記載されている。かかる技術は、ポリスチレン製のウェルプレートに滅菌したＰＶＬＡ（ポリ［Ｎ−ビニルベンジル−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコンアミド］）を加え、冷蔵庫に一晩放置後、滅菌水にて洗浄してＰＶＬＡ固定化ウェルプレートを得、そのウェルにヒト肝癌由来株細胞を播種し、一晩培養するものである。
【０００５】
また、例えば、特許文献２には、図１０に示すように、微細孔２１０を有する多孔質プレート２２０の表面側に、受精卵１１０の下部側と適合する形状の凹部３００を複数形成し、当該プレ−ト２２０の表面の凹部３００以外の領域に非透液性膜３１０を形成する。こうして作製した細胞固定用プレ−ト２００の表面側に受精卵浮遊液を供給し、この細胞固定用プレ−ト２００の裏面側から所定の圧力で吸引すると、非透液性膜３１０が形成された領域では受精卵浮遊液の液体成分が弾かれて、当該液体成分が凹部３００に流れ込むような液流が発生する。そのため、浮遊液中の受精卵１１０はこの液流により凹部３００に引き込まれ、凹部３００の内面全面に吸引されて、安定した状態で固定できる旨記載されている。
【０００６】
【特許文献１】特開平１１−３２６３１１号公報（段落番号０００６、段落番号０００８〜００１０、段落番号００１５及び００１７）
【特許文献２】特開平１０−１６５１６６号公報（段落番号０００８〜００１４、段落番号００１９〜００２４、図１〜４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、特許文献１に記載されている技術は、細胞を樹脂製プレート上に固定化するものではあるが、一つのウェル内でリガンドに接着した特定の細胞を培養し、固定化するものであり、一つ一つの細胞を個別的に配列して固定化するものではない。従って、細胞を個別的に選択し、観察できるものではなかった。
【０００８】
また、特許文献２に記載されている技術では、受精卵を細胞固定用プレート２００上に固定化し、実験操作を容易にすることはできても、細胞やウイルスを固定化することができない。すなわち、受精卵（例えば、ヒトの受精卵の大きさは約１００μｍ程度、ウシの受精卵の大きさは１５０μｍ程度である。）は透明帯という非常に丈夫な組織に覆われているため、吸引された場合であっても当該受精卵が潰れることはないが、このような組織を有しておらず通常の細胞膜（脂質二重膜）しか有していない動物細胞では、吸引力によって細胞が潰れてしまう。また、かかる技術によっては大きさが２０〜３００ｎｍしかない超微小なウイルスを固定化することはできない。
更に、特許文献２では、細胞固定用プレート２００の凹部３００をサンドブラストで形成する旨記載されているが、かかる方法では直径１００μｍ未満の微細な穴を形成するのは困難であるという問題もある。
【０００９】
なお、従来公知のＤＮＡマイクロアレイ等に代表されるバイオチップにおいても、基盤に微細加工を施すことで格子状の区画を設けているものもある。しかし、このようにして設けられた格子状の区画は、検出装置によるセンシングを行うための領域を区切っているに過ぎない。また、この場合の微細加工は、センシング領域をより高密度に配置するために行われているに過ぎない。
【００１０】
このような状況の中、先に説明したように、膜タンパク質を対象とする研究分野、特に、医薬品の研究開発の分野から、研究の一層の能率化を図るべく、前記したような超微細な細胞・ウイルス等の固定化技術の高度化が切望されているところである。
【００１１】
本発明は前記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、微小な細胞を一つ一つ個別に固定化することのできる、バイオチップの作製方法及びバイオチップ、並びに、プレ・バイオチップの作製方法及びプレ・バイオチップを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決し得た本発明に係るバイオチップの作製方法は、基盤に、微細穴を形成する微細穴形成工程と、この微細穴に、ターゲット物質を固定化するための固定化物質を結合する固定化物質結合工程と、この固定化物質にターゲット物質を固定化する固定化工程と、を含んでいることを特徴とする。
【００１３】
このように、本発明に係るバイオチップの作製方法は、微細穴形成工程で形成された微細穴によって、微細穴の径と深さからターゲット物質を一つ一つ個別的に固定化することができ、固定化物質結合工程で微細穴に固定化物質を結合することによって、ターゲット物質を固定化することが可能となる。そして、固定化工程によって、固定化物質が結合された微細穴にターゲット物質を固定化することでバイオチップを具現することができる。
【００１４】
また、本発明に係るバイオチップの作製方法は、微細穴形成工程を、（ａ）基盤の表面を修飾する工程と、（ｂ）表面の修飾を行った基盤に、微細穴を形成する工程と、を含み、かつ、この（ａ）の工程と（ｂ）の工程とを予め設定された回数繰り返して行うのがよい。
【００１５】
（ａ）の工程により基盤の表面を修飾することで、基盤の表面に所定の性質を付与することができる。なお、「所定の性質」としては、例えば、脂質膜（細胞膜）と非特異的な付着を防止する性質を挙げることができ、そのような性質を付与するための化合物としてはエチレンジアミンを例示することができる。そして、微細穴形成工程において（ａ）の工程と（ｂ）の工程とを、予め設定された回数繰り返して行うことで、形成する微細穴の径や深さ、基盤の材質と基盤の表面を修飾する薬品等に応じて適切な微細穴を形成することができる。
【００１６】
すなわち、このようなバイオチップの製造方法とすることで、バイオチップの表面に所定の性質を付加することができ、かつ、形成された微細穴にはターゲット物質を固定化するための固定化物質を結合することができるようになる。
【００１７】
また、本発明に係るバイオチップの作製方法においては、微細穴を、前記ターゲット物質のブラウン運動を抑制する固定化能を有する径と深さに形成するのがよい。
ターゲット物質は、粒径が小さいほどブラウン運動の影響を受けるため、微細穴の大きさに対してターゲット物質の大きさが小さすぎたり、あるいは、大きすぎたりすると、微細穴に固定化し難いことがある。そのため、微細穴は、ターゲット物質との接触面積が大きくなる径と深さに形成することで、ブラウン運動中のターゲット物質であっても収容できるものとしている。従って、固定化物質の作用と協働することでターゲット物質を固定化する能力、すなわち、固定化能を向上させることができる。
【００１８】
また、本発明に係るバイオチップの作製方法において用いる固定化物質としては、ポリリシン、コラーゲン、ラミニン、含シアル酸オリゴ糖、マンノース結合性レクチン、インテグリンファミリーリガンド、疎水性ペプチド、抗原、及び、抗体のうち少なくとも一種を用いるのが好ましい。
そして、本発明に係るバイオチップの作製方法において用いるターゲット物質としては、真核細胞、原核細胞、ウイルス、又は、リポソームとするのがよい。
【００１９】
このように、特定の固定化物質を微細穴に結合することにより、かかる固定化物質に対応するターゲット物質を選択的に固定化することができる。
【００２０】
本発明に係るバイオチップは、基盤と、基盤に形成した微細穴と、微細穴に結合した固定化物質と、固定化物質に固定化されているターゲット物質と、を有していることを特徴としている。
【００２１】
このように、本発明に係るバイオチップは、微細穴の径と深さからターゲット物質を一つ一つ個別的に固定化することが可能である。かかる微細穴により、ウイルスやリポソームのような微細な粒子（微細な粒子は溶液中でブラウン運動を行う）であるターゲット物質や、動物細胞や原核細胞生物のようなブラウン運動を行わず、かつ、流動性を有するようなターゲット物質であっても、微細穴の径や深さに適切に収容することで、一つ一つ個別的に固定化することが可能となる。また、この微細穴には固定化物質が結合されており、この固定化物質によってターゲット物質を安定的に固定化することができる。従って、かかる微細穴にターゲット物質を安定的に固定化させたバイオチップを具現することができる。
【００２２】
そして、微細穴は、ターゲット物質のブラウン運動を抑制する固定化能を有する径と深さに形成するのがよい。ターゲット物質は、粒径が小さいほどブラウン運動の影響を受けるため、微細穴の大きさに対してターゲット物質の大きさが小さすぎたり、あるいは、大きすぎたりすると、微細穴に固定化し難いことがある。そのため、微細穴は、ターゲット物質との接触面積が大きくなる径と深さに形成することで、ブラウン運動の影響を受けても収容できるものとしている。
このような固定化能を有する径と深さの微細穴を形成したことにより、固定化物質と協働することで、より強固にターゲット物質を固定化したバイオチップとなる。
【００２３】
また、本発明に係るバイオチップは、基盤の表面に、ターゲット物質の非特異的な付着を防止する性質を付与するのがよい。
このようにすれば、バイオチップの表面に余分なターゲット物質が付着する虞がなくなることから、ターゲット物質を微細穴に個別的かつ確実に固定化することが可能となる。
【００２４】
本発明に係るプレ・バイオチップの作製方法は、基盤に、微細穴を形成する微細穴形成工程と、この微細穴に、ターゲット物質を固定化するための固定化物質を結合する固定化物質結合工程と、を含むことを特徴とする。
【００２５】
すなわち、本発明に係るプレ・バイオチップの作製方法は、微細穴形成工程で形成された微細穴によって、微細穴の径と深さからターゲット物質を一つ一つ個別的に固定化することができ、固定化物質結合工程で微細穴に固定化物質を結合することによって、ターゲット物質を固定化することが可能なプレ・バイオチップを具現することができる。
【００２６】
また、本発明に係るプレ・バイオチップの作製方法としては、微細穴形成工程を、（ａ）基盤の表面を修飾する工程と、（ｂ）表面の修飾を行った基盤に、微細穴を形成する工程と、を含み、かつ、この（ａ）の工程と（ｂ）の工程とを予め設定された回数繰り返して行うのがよい。
【００２７】
表面修飾工程により基盤の表面を修飾することで、基盤の表面に所定の性質を付与することができる。そして、微細穴形成工程において（ａ）の工程と（ｂ）の工程とを、必要に応じて繰り返して行うことで、基盤の材質と基盤の表面を修飾する薬品等に応じて適切な微細穴を形成したプレ・バイオチップを具現することができる。
すなわち、このような製造方法とすれば、表面に所定の性質を付加し、かつ、形成された微細穴にはターゲット物質を固定化するための固定化物質を結合したプレ・バイオチップを作製することができるようになる。
【００２８】
さらに、本発明に係るプレ・バイオチップの作製方法においては、微細穴を、ターゲット物質のブラウン運動を抑制する固定化能を有する径と深さに形成するのがよい。
ターゲット物質は、粒径が小さいほどブラウン運動の影響を受けるため、微細穴の大きさに対してターゲット物質の大きさが小さすぎたり、あるいは、大きすぎたりすると、微細穴に固定化し難いことがある。そのため、微細穴は、ターゲット物質との接触面積が大きくなる径と深さに形成することで、ブラウン運動の影響を受けても収容できるものとしている。従って、固定化物質の作用と協働することでターゲット物質を固定化する能力を向上させたプレ・バイオチップを具現することができる。
【００２９】
本発明に係るプレ・バイオチップの作製方法において用いる固定化物質は、ポリリシン、コラーゲン、ラミニン、含シアル酸オリゴ糖、マンノース結合性レクチン、インテグリンファミリーリガンド、疎水性ペプチド、抗原、及び、抗体のうち少なくとも一種を含むようにするのがよい。
【００３０】
このように、特定の固定化物質を微細穴に結合することにより、かかる固定化物質に対応するターゲット物質を選択的に固定化することができるプレ・バイオチップを具現することができる。
【００３１】
本発明に係るプレ・バイオチップは、基盤と、基盤に形成した微細穴と、微細穴に結合した固定化物質とを有していることを特徴としている。
【００３２】
このように、本発明に係るプレ・バイオチップは、微細穴の径と深さからターゲット物質を一つ一つ個別的に固定化することが可能である。すなわち、ウイルスやリポソームのような微細な粒子（微細な粒子は溶液中でブラウン運動を行う）であるターゲット物質や、動物細胞や原核細胞生物のようなブラウン運動を行わず、かつ、流動性を有するようなターゲット物質であっても、微細穴の径や深さに適切に収容することで、一つ一つ個別的に固定化することが可能となる。そして、この微細穴には固定化物質が結合されているので、この固定化物質によってターゲット物質を安定的に固定化させることができる。
【００３３】
また、本発明に係るプレ・バイオチップは、基盤の表面に、ターゲット物質の非特異的な付着を防止する性質を付与するのがよい。
このようにすれば、プレ・バイオチップの表面に余分なターゲット物質が付着する虞がなくなることから、ターゲット物質を微細穴に個別的かつ確実に固定化することが可能となる。
【００３４】
また、本発明に係るプレ・バイオチップの微細穴は、ターゲット物質のブラウン運動を抑制する固定化能を有する径と深さに形成するのがよい。ターゲット物質は、粒径が小さいほどブラウン運動の影響を受けるため、微細穴の大きさに対してターゲット物質の大きさが小さすぎたり、あるいは、大きすぎたりすると、微細穴に固定化し難いことがある。そのため、微細穴は、ターゲット物質との接触面積が大きくなる径と深さに形成することで、ブラウン運動の影響を受けても収容できるものとしている。
このような径と深さを有する微細穴を形成したことにより、固定化物質と協働することで、より強固にターゲット物質を固定化することのできるプレ・バイオチップとすることができる。
【００３５】
さらに、本発明に係るプレ・バイオチップにおいては、固定化物質をポリリシン、コラーゲン、ラミニン、含シアル酸オリゴ糖、マンノース結合性レクチン、インテグリンファミリーリガンド、疎水性ペプチド、抗原、及び、抗体のうち少なくとも一種を含むようにするのがよい。
【００３６】
このように、特定の固定化物質を微細穴に結合することにより、かかる固定化物質に対応するターゲット物質を選択的に固定化することが可能なプレ・バイオチップとすることができる。
従って、本発明のプレ・バイオチップを用意しておけば、ターゲット物質を固定化させるだけで実験に供することができることから、実験における一層の労力の軽減と実験効率の向上を図ることができる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明に係るバイオチップの作製方法によれば、基盤に微細穴を形成し、更に、かかる微細穴には固定化物質を結合してあるので、当該微細穴とほぼ同一の大きさのターゲット物質を、選択的かつ一つ一つ個別的に固定化したバイオチップを具現することができる。
【００３８】
また、本発明のバイオチップによれば、ターゲット物質が一つ一つ個別的に固定化されているので、実験操作や走査型プローブ顕微鏡などを用いた観察を容易に行うことができるようになる。特に、従来と違って、ターゲット物質が細胞である場合において、細胞が基盤に扁平状に固定化してしまうことが無くなり、生体内における立体形状に近い形状を適切に保って固定化することが可能である。従って、細胞膜に存在する膜タンパク質（レセプター）や、それに対応するリガンドの研究、或いは、細胞とウイルスに関する研究を精度良く行うことができる。これは、例えば、本発明に係るバイオチップに固定化された細胞の膜タンパク質にリガンドを作用させて当該細胞の反応を観察する、といった実験を容易に行うことができるようになる。
【００３９】
更に、本発明のプレ・バイオチップの作製方法によれば、ターゲット物質を一つ一つ個別的に固定化可能なプレ・バイオチップを作製することができる。すなわち、ターゲット物質を固定化する前段階のプレ・バイオチップを大量に作製し、ストックしておくことが可能である。
【００４０】
また、本発明のプレ・バイオチップによれば、実験にあたってターゲット物質を固定化するだけで随時新鮮なターゲット物質を固定化し、観察することができるので、当該分野の研究を容易かつ迅速に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明者らは、受容体として機能する膜タンパク質（レセプター）とリガンドにおける相互作用や、ヒト細胞とウイルスにおける相互作用の研究を進めていく中で、細胞等が固定化されていないためにその形態が不安定となり、実験操作や走査型プローブ顕微鏡による観察において不便を覚えるようになった。そこで、本発明者らは、膜タンパク質等の研究をより効率的に研究を行うために、細胞やウイルスを固定化する位置や形状を制御し、かつ、一つ一つ個別的に固定化したバイオチップの作製を思い立った。
【００４２】
かかる着想を具現するため種々検討を重ねた結果、生体分子を結合因子とする特異的相互作用、非特異的な材料・性質と生体膜との相互作用、並びに、細胞やウイルスの立体形状（マクロ形状）と材料形状（形成した微細穴の形状）の作用のいずれの制御も不可欠であることが分かった。すなわち、細胞やウイルスの全体的な形状と材料の表面形状の一致又は不一致からなる吸着作用の制御が必要である。
そこで本発明者らは鋭意研究を行った結果、適切な基盤材料の選択と、微細加工法と、基盤材料表面の表面修飾とを組み合わせることによって前記課題を解決することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００４３】
以下、適宜図面を参照しつつ、細胞、細菌又はウイルスを固定化し得る、本発明に係るバイオチップ及びプレ・バイオチップの作製方法について説明する。なお、参照する図面において、図１は、バイオチップの微細穴形成工程を説明する説明図であり、図２は、ターゲット物質を固定化させた本発明に係るバイオチップの一例を示す斜視図である。また、図３は、微細穴の要部断面図であって、（ａ）は第一実施形態を示す図であり、（ｂ）は第二実施形態を示す図であり、（ｃ）は第三実施形態を示す図であり、（ｄ）は第四実施形態を示す図である。そして、図４はターゲット物質の固定化状態について説明する図であって、（ａ）は微細穴に対してターゲット物質の大きさが丁度良い場合を示す図であり、（ｂ）は微細穴に対してターゲット物質の大きさが小さい場合を示す図であり、（ｃ）は微細穴に対してターゲット物質の大きさが大きい場合を示す図である。
【００４４】
まず、本発明に係るバイオチップの作製方法の好適な態様を例に、順を追って説明する。
［バイオチップの作製方法］
（Ａ）微細穴形成工程：
図１に示すように、本発明に係るバイオチップ及びプレ・バイオチップの製造方法では、微細穴形成工程によって微細穴４０を形成するが、かかる微細穴４０の形成には、以下のステップＳ１〜ステップＳ４を行う。まず、バイオチップ１やプレ・バイオチップ１'の土台となる基盤１０の表面を薬品２０によって処理し（ステップＳ１）、表面修飾部位２１を設ける。表面修飾部位２１に金属イオンを蒸着することで金属の薄膜３０を重層する（ステップＳ２）。金属の薄膜３０を重層した後、微細穴４０を任意の箇所に形成するため、微細加工（ＦＩＢ）を施す（ステップＳ３）。当該ステップＳ２とステップＳ３を予め設定された回数を繰り返して行うことで、基盤１０に所望の形状・大きさの微細穴４０を形成することができる（ステップＳ４）。
そして、固定化物質結合工程により、プレ・バイオチップ１’の微細穴４０に固定化物質５０を結合し（ステップＳ５）、固定化物質５０が結合した微細穴４０にターゲット物質６０を固定化することでバイオチップ１を製造することができる（ステップＳ６）。
【００４５】
ここで、本発明における「基盤」としては、基盤１０の表面に個別的に整然とターゲット物質６０（図２参照）を固定化できるように、平滑な表面であって微細加工を施すことができるものを好適に用いることができる。また、ターゲット物質６０を直接的に固定化することが可能なものであれば更に好適である。そして、このような基盤１０の組成物としては、熱可塑性合成樹脂であるポリエステル系高分子化合物やポリアミド系高分子化合物を用いるのが好ましく、中でも、ポリエステル系高分子化合物であるポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ；polybutylene terephthalate、化１参照）を用いるのが特に好ましい。なお、ポリアミド系高分子化合物としては、例えば、６，６−ナイロン（化２参照）や６−ナイロン（化３参照）を挙げることができ、これらを用いることも可能である。
【００４６】
【化１】
2005214889.tif 000003
【００４７】
【化２】
2005214889.tif 000004
【００４８】
【化３】
2005214889.tif 000005
【００４９】
ここで、化１〜化３に示す各高分子化合物は、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）やアミノ基（−ＮＨ2）といった官能基を有している。このような官能基を有しているために、適切な条件下において、後記する固定化物質５０（図３参照）を化学的に結合することができるからである。
【００５０】
微細穴４０は、ターゲット物質６０のブラウン運動を抑制する径と深さに形成される。すなわち、ターゲット物質６０の体積と当該微細穴４０の容積とをほぼ等しく（１００％）なるよう設定するのが好ましい。このようにすることで、動物細胞などのように流動性を有する動物細胞のような比較的大きなターゲット物質６０や、溶媒中でブラウン運動している微細なターゲット物質６０を固定化することが可能となる。微細穴４０の容積としは、例えば、ターゲット物質６０の体積の５０％以上又は６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％以上の容積を有するよう、径と深さを設定するのがよい。このようにすると、ターゲット物質６０が微細穴４０に接触する面積を適切に保つことができるようになるので、安定してターゲット物質６０を固定化することができるからである。ただし、微細穴４０の容積に比べてターゲット物質６０の体積が小さ過ぎると、ターゲット物質６０のブラウン運動が大き過ぎる（直径が数十ｎｍ〜数μｍの粒子はコロイド粒子として溶液中でブラウン運動を行う）ために微細穴４０に固定化することができない。また、逆に、微細穴４０の容積に比べてターゲット物質６０の体積が大き過ぎると固定化物質５０との接触面積が小さくなり、固定化能が著しく減少してしまう。
ターゲット物質６０は、溶媒を介して微細穴４０に固定化される。ターゲット物質６０はこのとき、溶媒の分子によるブラウン運動の影響を受けるが、その体積の５０％以上が微細穴４０に収容されると、微細穴４０との接触面積が大きくなるので、ブラウン運動の影響を受けた場合であっても微細穴４０から解離し難くなる（ブラウン運動の抑制）。従って、ターゲット物質６０の体積と微細穴４０の容積とが、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％と増加することで、ターゲット物質６０に対して溶媒の分子によって引き起こされるブラウン運動の影響をより受け難くすることができる。なお、かかる溶媒としては、適宜、固定化するターゲット物質６０に適する溶媒を用いることができ、各種バッファーや培養液、水、アルコールなどの各種液体を用いることができる。
【００５１】
また、微細穴４０の形状をターゲット物質６０に応じた形状に形成するのが更に好ましい。「ターゲット物質６０に応じた形状に形成する」とは、ターゲット物質６０の形状や大きさに合わせて微細穴４０の径や深さを設定することをいい、例えば、ターゲット物質６０が球状である場合は微細穴４０の形状を半球状に形成することや、ターゲット物質６０が略直方体であれば、微細穴４０も直方体形状に形成することができる。その他、ターゲット物質６０を微細穴４０に固定化することができればどのような形状の微細穴４０とすることも可能であり、例えば、図１、図２及び図９（ａ）に示すような截頭四角錘形状とするのが好ましいが、図９に示すように、円柱形状（図９（ｂ））、円錐形状（図９（ｃ））、三角錐形状（図９（ｄ））、四角錘形状（図９（ｅ））、直方体形状（図９（ｆ））、立方体形状（図９（ｇ））、截頭円錐形状（図９（ｈ））、截頭三角錐形状（図９（ｉ））などの形状の微細穴４０を形成してもよい。特に、微細穴４０は、開口と穴底面との間に傾斜面（開口からその開口より狭い穴底面に向かう傾斜面）を有することで、当該ターゲット物質６０が流動して微細穴４０内に入り込んできたときに、ターゲット物質６０に対して接触面積が大きく当接できる状態として対応することができ、都合が良い。
【００５２】
このように微細穴４０の形状がターゲット物質６０のブラウン運動を抑制する径と深さに形成することにより、微細穴４０にフィットするように収容された、微細穴４０との接触面積が大きいターゲット物質６０は、これと接する溶媒の分子を減らすことができる。従って、ターゲット物質６０のブラウン運動が抑制され、固定化物質５０の作用と協働することでターゲット物質６０を固定化する能力を更に向上させることができる。
【００５３】
すなわち、微細穴４０の形状をターゲット物質６０の形状に応じた形状とするので、微細穴４０の底面４０ｂと側面４０ｗに固定化物質５０（図３（ａ）参照）が結合している場合には、固定化物質５０とターゲット物質６０との接触面積を多くすることができ、また、ターゲット物質のブラウン運動を抑えることができることから、その固定化能を高くすることができる。
【００５４】
更に、微細穴４０の大きさは、図４（ａ）に示すように、ターゲット物質６０の径Ｌ1よりも若干大きい径Ｌ2とし、固定化したいターゲット物質６０一つ分の大きさとするのが最も好ましいが、これに限定されることはなく、ターゲット物質６０二つ分或いはそれ以上の大きさとすることも可能である。なお、非特異的（微細穴４０以外）なターゲット物質６０の固定化を防ぐため、ターゲット物質６０五つ分の大きさまでとすることが望ましい。従って、微細穴４０の所定の大きさとしては、後に詳述するターゲット物質６０がウイルスである場合や受精卵である場合を考慮すると、約２０ｎｍ〜１５０μｍの大きさから、任意に選択することができる。
【００５５】
また、微細穴４０は基盤１０上の任意の箇所に形成することができる。例えば、検出機器で適切に検出できるように、予め設定された間隔で、予め設定された個数の微細穴４０を形成することができ、検出機器の解析能力やターゲット物質６０の大きさなどを勘案した上で、できるだけ規則正しく配列化（アレイ）すること、及び、高密度化を図ることが好ましい。
【００５６】
本発明において「設定された回数繰り返して行い」とは、基盤１０の材質と、微細穴４０の形状や大きさとの関係で、所望する微細穴４０を得ることができるまで繰り返して行うことができることをいう。従って、当該操作を一回〜複数回行うことができる。
【００５７】
そして、このような微細穴４０は、集束イオンビーム（Focused Ion Beam；ＦＩＢ）加工装置を用いた微細加工により好適に形成することができる。ＦＩＢ加工装置（不図示）とは、ガリウムなどのイオン源からイオンビームを取り出し、このイオンビームを５〜１０ｎｍに集束させた上で、対象物の加工したい部分にだけ集束イオンビームを走査させることで、マスクを使わずに自由な形状の加工を可能にした装置である。
【００５８】
このＦＩＢ加工によるイオンスパッタリングでは、機械加工によるマクロ的応力が発生せず、２０〜１００ｎｍ程度の精度で微細穴４０の形成が可能である。また、対象物（基盤１０）に導電性を付与すればどのような材料に対しても適用が可能であり、汎用性のある加工法である。なお、導電性を付与するには、ＦＩＢ加工を施す基盤の表面に金をスパッタリングし、金薄膜３１（図２参照）を形成するのが好適である。
【００５９】
なお、前記の微細穴形成工程では、エチレンジアミンなどの薬品２０で基盤１０の表面を処理することで基盤１０の表面に所定の性質を付与している。このようにすると、作製されたバイオチップ１の表面に非特異的なターゲット物質６０の付着を防止することが可能となる。
【００６０】
（Ｂ）固定化物質結合工程：
（Ａ）の微細穴形成工程で形成された微細穴４０の内側に露出している基盤１０が有する構成分子の官能基に、固定化物質５０が有する官能基を結合する。
【００６１】
本発明における固定化物質５０としては、対応するターゲット物質６０を固定化するために高度な選択性を有しており、かつ、基盤１０に結合することができる物質を好適に用いることができる。対応するターゲット物質６０と高度に選択するのであるから、かかるターゲット物質６０に対応する固定化物質５０としては、表１に示すものを例示することができる。表１において各種抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥやこれらに含まれるあらゆるサブクラスの抗体も用いることができ、さらに、ＦａｂフラグメントやＦｃフラグメントなども用いることが可能である。また、各種抗原としては前記した抗体が認識することができるあらゆる物質を用いることができる。
【００６２】
【表１】
2005214889.tif 000006
【００６３】
この固定化物質５０は、基盤１０に強固に結合するために、基盤１０と化学結合することが望ましい。表１に示すように、固定化物質５０はアミノ酸などの有機物であることが多く、官能基であるアミノ基を有しているものが殆どである。また、基盤も化１〜化３に示すようにカルボキシル基を有している。従って、基盤１０の有するカルボキシル基末端（Ｃ末端）と固定化物質５０の有するアミノ基末端（Ｎ末端）とを用いてペプチド結合することによってこれらを強固に結合することができる。
なお、固定化物質５０がＮ末端を有していない場合は、水酸基（−ＯＨ）などの他の官能基を用いて基盤に化学結合するか、或いは、Ｎ末端を有する他の化合物を固定化物質５０と基盤との間に介在させる態様としてもよい。
なお、固定化物質５０を微細穴４０の内側に結合させるのは、形成した微細穴４０の内側にターゲット物質６０を選択的、かつ、できるだけ長時間の固定化を図るためである。
【００６４】
そして、この固定化物質５０は、図３（ａ）に示すように、微細穴４０の壁部４０ｗと底部４０ｂに一様に結合することもできるが、同図（ｂ）に示すように、壁部４０ｗのみに結合することや、同図（ｃ）に示すように、底部４０ｂのみに結合することとしても良い。
また、同図（ｄ）に示すように、結合する固定化物質５０を壁部４０ｗと底部４０ｂとで異ならせることも可能である。このような場合の一例として、例えば、アニオン性のターゲット物質６０ａを対象とした場合について説明すると、基盤１０の表面には当該ターゲット物質６０ａの非特異的な付着を防ぐ表面修飾を行い、微細穴４０の壁部４０ｗにはカチオン性化合物などの、当該ターゲット物質６０ａとの親和性が高い固定化物質５０Ａを結合し、微細穴４０の底部４０ｂには抗体などのターゲット物質６０ａとの固定化能が高い固定化物質５０Ｂを結合することもできる。すなわち、壁部４０ｗの固定化物質５０Ａでターゲット物質６０ａを引き寄せ、底部４０ｂの固定化物質５０Ｂでしっかりと固定化することができる。このように構成すれば、ターゲット物質を吸着し易く、かつ、固定化したターゲット物質が解離し難いバイオチップやプレ・バイオチップを具現することができる。
【００６５】
（Ｃ）固定化工程：
（Ｂ）の固定化物質結合工程で基盤１０に結合された固定化物質５０に、ターゲット物質６０ａを固定化する。
【００６６】
本発明における「ターゲット物質」とは、実験・観察の対象となる物質をいう。具体的には、リポソームやバキュロウイルスなどの表面電荷陰性（アニオン性）ウイルス、多細胞生物の各種接着性細胞、血管内皮細胞などのセレクチンを含有する細胞、ＨＩＶウイルスなどのｇｐ１２０を含有するウイルス、インテグリン活性化細胞、該当する抗原認識領域を発現させたリンパ球細胞、抗原として提示された各種ウイルスや各種細菌等、その他の各種細胞やウイルスを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
なお、「ターゲット物質を固定化する」とは、厳密な意味での固定や結合を意味するものではなく、実験に供した場合において、観察や操作等した場合に十分な時間、当該微細穴４０に留めておくことを意味する。従って、一度固定化したターゲット物質６０が微細穴４０から解離することもある。例えば、固定化物質５０にポリリシンを用い、ターゲット物質６０にリポソーム６１（図２参照）を用いた場合について説明すると、大きさの異なるリポソーム６１が複数存在した場合、微細穴４０に対して大きさの小さいリポソーム６１は、微細穴４０の大きさにフィットしたリポソーム６１と比較して接触面積が小さくなる。従って、接触面積の小さいリポソーム６１が微細穴４０に固定化されていた場合であっても、微細穴４０と接触面積の大きいフィットしたリポソーム６１に押し出される。
従って、本発明でいうところの「固定化」には、ターゲット物質６０を抗体等により、しっかりと固定するという意味から、固定化と解離との平衡反応において、実験に必要な時間、一定箇所（微細穴４０内）にターゲット物質６０を留めておくといった、比較的緩やかな固定化までを含む広い概念を意味する。
【００６８】
従って、できるだけ長時間ターゲット物質６０を微細穴４０に固定化するには、微細穴４０の径や深さをターゲット物質６０に応じた径や深さに形成し、更に、かかる微細穴４０にはターゲット物質６０を固定化するための固定化物質５０を有していることが重要となる。
【００６９】
以上説明した本発明に係るバイオチップの具体的な作製方法として、図１を参照しつつ、ＦＩＢ（集束イオンビーム）微細加工によるバイオチップの作製方法を以下に例示する。
［ＦＩＢ微細加工によるバイオチップの作製方法］
（ア）基盤１０の材料となるポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）に、エチレンジアミン（ＥＤＡ；ethylenediamine）を用いてカップリング（表面修飾）させる。
ＥＤＡは化合物の両端にＮ末端を有する化合物である（構造式：ＮＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2）。従って、ＰＢＴのＣ末端に、ＥＤＡが有する一方のＮ末端がペプチド結合することで、ＥＤＡが有する他方のＮ末端が基盤の表面に露出するようになる。また、ＥＤＡが結合することにより、例えば、脂質二重膜に覆われている細胞等の非特異的な吸着・固定化を抑えることが可能となる。
（イ）次に、ＥＤＡを結合させた基盤１０の表面に金を蒸着させ、金属の薄膜３０（具体的には金薄膜３１；図２参照）を重層する。基盤１０に導電性を付加するためである。
（ウ）金薄膜３１を重層した基盤１０に、ＦＩＢ加工装置を用いて集束させたイオンビーム（ＦＩＢ）を照射し、基盤１０上に微細穴４０を形成する。ＦＩＢ微細加工によって形成された微細穴４０は、金薄膜３１とともにＰＢＴを、厚さにして数μｍ程度削り取る。従って、削り取られ、表面に露出したＰＢＴ部分にはＣ末端が存在することになる（（ア）〜（ウ）が一例としての「微細穴形成工程」に相当する）。
（エ）形成した微細穴４０に、固定化物質５０であるポリリシン（不図示）をカップリングさせる。すなわち、ＰＢＴのＣ末端とポリリシンのＮ末端とをペプチド結合させることで、これらを強固に結合させる（（エ）が一例としての「固定化物質結合工程」に相当する）。
（オ）微細穴４０に結合したポリリシンに、ターゲット物質であるリポソーム６１を固定化した（（オ）が一例としての「固定化工程」に相当する）。
【００７０】
前記（ア）〜（オ）の操作を行うことによりバイオチップを作製することで、ＦＩＢ微細加工を用いた、リポソーム固定化バイオチップを作製することができる。
なお、リポソームとは、リン脂質分子を用いて適当な条件下で水と混合させた場合に形成される人口膜小胞をいう。リポソームは、脂質二重膜を有する直径数十ｎｍ〜μｍの細胞のような小胞であり、生体膜の脂質二重層部分の動態を検討する上で有効なモデル系であり、更に、膜タンパク質を組み込み、再構成膜（プロテオリポソーム）とすることで高次の膜機能の再現を図ることも可能である。
また、ポリリシンはアミノ酸の一種であるリシンの重合体であって、細胞膜を吸着する能力を有する。
【００７１】
以下、本発明に係るバイオチップについて説明する。
［バイオチップの構成］
図２に示すように、本発明に係るバイオチップ１は、基盤１０と、ＦＩＢ微細加工によって形成された微細穴４０とを有している。
そして、基盤１０の表面は、ＥＤＡで修飾した結果、疎水性が付与された表面修飾部位２１（図１参照）と、更にその表面修飾部位２１を覆うように導電性を付与するための金薄膜３１とを有している。従って、かかるバイオチップ１の表面は、金薄膜３１とＥＤＡによる表面修飾部位２１により、親水性を示す細胞膜等のターゲット物質６０の非特異的な付着を防止することができる。
【００７２】
また、前記ＦＩＢ微細加工によって形成された微細穴４０は、ターゲット物質６０に応じた所定の径と所定の深さに、所定数、前記基盤１０に形成されており、微細穴４０の内側には基盤１０の表面が一部露出している。そして、基盤１０の表面が露出している部分には、固定化物質５０（図３参照）が基盤１０と化学的に結合しており、この固定化物質５０によってターゲット物質６０（図２参照）が固定化されている。
なお、本発明に係るバイオチップ１としては、微細穴４０に対してターゲット物質６０の大きさが小さ過ぎず、また、大き過ぎない状態、すなわち、図４（ａ）の要部断面図において仮想線で示すように、生体内で存在している形状に近い形状でターゲット物質６０が固定化されていることが最も好ましい状態である。
【００７３】
［プレ・バイオチップの作製方法］
図１に示すプレ・バイオチップ１'の作製方法としては、前記したバイオチップ１の作製方法とほぼ同様の作製方法であるので詳細な説明を省略するが、ターゲット物質６０（図１のステップＳ５参照）を固定化していない点で異なっている。すなわち、前記の（ア）〜（エ）までの工程を行い、前記（オ）の固定化工程を行わないことで、プレ・バイオチップ１'の作製方法を具現することができる。
【００７４】
［プレ・バイオチップの構成］
プレ・バイオチップ１'の構成としては、前記したバイオチップ１の構成とほぼ同様であるので詳細な説明を省略するが、ターゲット物質６０を固定化していない点で異なっている。すなわち、図２のバイオチップ１において、その構成中、微細穴４０の内側にターゲット物質６０を固定化していないものをプレ・バイオチップ１'の具体例として示すことができる。
【実施例】
【００７５】
次に、本発明に係る細胞、細菌又はウイルスを固定化したバイオチップの作製方法及びバイオチップ、並びに、プレ・バイオチップの作製方法及びプレ・バイオチップに関する実施例について説明する。なお、本発明の内容は、本実施例に限定されるものではない。
【００７６】
［Ａ．バイオチップの作製方法］
基盤としてはポリブチレンテレフタレート（polybutylene terephthalate；ＰＢＴ、ジュラネックス２０００、ポリプラスチックス（株）製）を用い、ターゲット物質としてはリポソーム及びオクタデシル化シリカ（ＯＤＳ）粒子を用い、固定化物質としてはポリリシン（平均重合度１８）を用いた。なお、リポソームやＯＤＳ粒子は、ホスファチジルコリン／ホスファチジルセリンを主成分とするが、微細穴に固定化されていることを確認するためにローダミン修飾化脂質を導入することで蛍光修飾を行った。バイオチップの作製中、下記の〔３〕で微細穴形成後のカルボキシル基末端（Ｃ末端）の有無の確認（〔３−１〕参照）と、〔４〕で微細穴にポリリシンを結合した後のポリリシンの確認を行った（〔４−１〕参照）ので、随時説明することとする。
【００７７】
〔１〕用意したＰＢＴ製基盤（７ｍｍ×４ｍｍ、厚さ：１ｍｍ）表面のＣ末端をエチレンジアミンで基盤の表面を修飾し、官能基の分布制御を行った。
ＥＤＡによる表面修飾反応は次のようにして行った。
（i）Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；N,N-dimethylformamide、和光純薬工業（株）製）６ｍｌにジクロロメタン（ＤＣＭ；dichloromethane、和光純薬工業（株）製）を６ｍｌ加えた溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ；diisopropylethylamine、和光純薬工業（株）製）を１７６μｌ（１ｍｍｏｌ）加え、かかる溶液中にＰＢＴ製基盤を浸けた。
（ii）ＰＢＴ製基盤を浸けた溶液に、水溶性カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣＤ−ＨＣｌ；water soluble carbodiimide hydrochloride、ナカライテスク（株）製）を０．１５ｇ（０．８ｍｍｏｌ）と１−ハイドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ；1-hydroxybenzotriazole、国産化学（株）製）を０．１１ｇ（０．８ｍｍｏｌ）加えた後、エチレンジアミン（ＥＤＡ；ethylenediamine、和光純薬工業（株）製）を６７μｌ（１ｍｍｏｌ）加え、表面修飾（カップリング）を行った。
（iii）前記（ａ）〜（ｂ）までの操作を終えた後、室温で６時間攪拌し、保持した。
（iv）６時間の攪拌反応後、ＰＢＴ製基盤を溶液中から取り出し、ＤＭＦ８ｍｌ、エタノール８ｍｌ及びＤＣＭ８ｍｌを用いて洗浄し、減圧乾燥した。
【００７８】
〔２〕前記ＥＤＡによる表面修飾を行ったＰＢＴ製基盤の表面にイオンコーター（ＩＢ−３型イオンコーター、エイコー・エンジニアリング（株）製）を用いて金蒸着を行い、厚さ０．１μｍの金薄膜を形成した。
【００７９】
〔３〕集束イオンビーム（ＦＩＢ）加工装置（ＦＢ−２０００Ａ、日立製作所製）を使用し、ＰＢＴ製基盤に一辺が５×５μｍ、深さ２μｍの微細穴を形成した。
〔３−１〕ここで、ＦＩＢ加工によりＰＢＴ製基盤表面のＥＤＡ層が掘削され、ＰＢＴのＣ末端が存在していることの確認を行った。
Ｃ末端の確認は、カルボキシル基の蛍光ラベル剤であるＢｒ−Ｍｍｃ（4-Bromomethyl-7-methoxycoumarin、同仁化学研所製；λex＝３６０ｎｍ、λex＝４１０ｎｍ）を用いて、以下の手順で行った。
（i）５ｍｇのクラウンエーテル（18-crown-6 ether、和光純薬工業（株）製）を１０ｍｌのアセトニトリル（acetonitrile、和光純薬工業（株）製）に溶解し、さらに３０μｌの純水、及び、１００ｍｇの炭酸カリウム（potassium carbonate、和光純薬工業（株）製）を加えた。
（ii）前記（i）で混入したものを超音波処理１５分間行うことで攪拌した後、かかる溶液をろ過して反応溶媒とした。
（iii）ＦＩＢ加工装置により微細穴を形成したＰＢＴ製基盤、及び、Ｂｒ−Ｍｍｃを３．４ｍｇ（１２．６μｍｏｌ）を加え、６０℃で２０分間の還流を行い、室温で保持した。
（iv）溶媒と分離したＰＢＴ製基盤をエタノールと純水で洗浄した。
（v）洗浄したＰＢＴ製基盤を、蛍光顕微鏡（システム生物顕微鏡ＢＸ５１、及び、落射蛍光システム（ミラーユニット名：Ｕ−ＭＮＵ２）、いずれもオリンパス（株）製）やＵＶランプを用いることで蛍光の存在を確認した。
【００８０】
観察の結果を図３に示す。図３は、ＦＩＢ加工後のＢｒ−Ｍｍｃによって修飾された微細穴の蛍光顕微鏡写真を表す図である。図３における微細穴は、ＦＩＢ加工によって１０μｍ四方に形成されているものであるが、Ｂｒ−Ｍｍｃの青色蛍光を確認することができることから、微細穴にＣ末端が存在していることが分かる。
【００８１】
〔４〕ＦＩＢ加工装置によりＰＢＴ製基盤に形成した微細穴を、金薄膜が剥がれないよう注意しつつ、以下の操作を行うことでポリリシン（poly-L-Lysine Hydrobromide、ＳＩＧＭＡ製）を結合した。
（i）溶媒として、２ｍｌの１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ；1-Methyl-2-pyrrolidinone、和光純薬工業（株）製）を用意し、この溶媒中に、添加剤のＨＯＢｔを１ｍｇ、ｏ−ベンゾトリアゾル−１−ｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウルオニウムヘキサフルオロフォスフェイト（ＨＢＴＵ；o-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate、和光純薬工業（株）製）を１ｍｇ、及び、ＤＩＥＡを０．５μｌ加えた。
（ii）前記（i）で作製した溶液にポリリシンを１ｍｇ加え、室温で３０分間攪拌した。
（iii）攪拌反応終了後、ＮＭＰ、アセトニトリル、純水の順にすすぎを行うことで、微細穴にポリリシンを結合したプレ・バイオチップを作製した。
【００８２】
〔４−１〕ここで、プレ・バイオチップの微細穴にポリリシンが結合しているか否かの確認を行った。
ポリリシンの確認は、アミンの蛍光ラベル化剤としてＣＦＳＥ（5-(and-6)-Carboxyfluorescine, Succinimidyl Ester Mixed Isomer、Molecular Probes社製、λex＝４９５ｎｍ、λem＝５１９ｎｍ）を用いて、以下の手順で行った。
（i）ＣＦＳＥ４．７ｍｇをＤＭＦ１ｍｌ中に溶解し、これを９ｍｌのホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．２８）中に加えた。
（ii）ポリリシンを結合させたプレ・バイオチップを前記（i）の反応溶液に浸し、遮光状態で一晩攪拌した。
（iii）一晩反応させたプレ・バイオチップを純水、純水とアセトニトリル（１：１）の混合溶液、アセトニトリルの順序で洗浄を行い、減圧乾燥を行った。
（iv）前記（i）〜（iii）の操作を２、３回繰り返して行った後、蛍光顕微鏡（システム生物顕微鏡ＢＸ５１、及び、落射蛍光システム（ミラーユニット名：Ｕ−ＭＮＩＢＡ２又はＵ−ＭＮＢ２）、いずれもオリンポス製）を用いてＣＦＳＥによる蛍光の存在を確認した。
【００８３】
観察の結果を図６に示す。図６は、ＣＦＳＥを用いたポリリシンの蛍光顕微鏡写真を表す図である。図６から、ＣＦＳＥの黄緑色蛍光を確認することができたので、プレ・バイオチップに形成された微細穴にはポリリシンが結合していることが分かった。
【００８４】
［Ｂ．アニオン性ＯＤＳリポソームの固定化］
次に、微細穴にポリリシンを結合したプレ・バイオチップに、モデル細胞としてのアニオン性ＯＤＳ（オクタデシル化シリカゲル）リポソームを固定化する方法について述べる。リポソームは、定法とされる静置水和法などのリポソーム調製方法によって調製することができるが、当該方法で調製されるリポソームでは、粒径が比較的小さく（約１μｍ）、蛍光顕微鏡による観察を行い難い。そこで、リポソームの調整時にＯＤＳを核として用いることにより、調製するリポソームの粒径を大きくした（径約５μｍ）。また、ＯＤＳリポソームとすることで通常のリポソームよりも形状安定性が良くなるので好適である。
【００８５】
〔１〕アニオン性ＯＤＳリポソームの調製：
まず、０．００７３ｇのホスファチジルコリン（Phosphatidylcholine、和光純薬工業(株)製）を、５０μｌのホスファチジルセリン（Phosphatidylserine、DOOSAN SERDARY RESEARCH LABORATORIES社製）に加え、これに５μｌのジアシルホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−リサアミンローダミンＢスルフォニル（Ｒｈ−ＰＥ；Diacyl Phosphatidylethanolamine-N-Lissamine Rhodamine B Sulfonyl：λex＝５５０ｎｍ、λem＝５９０ｎｍ、AVANTI POLAR LIPIDS社製）と、２μｇのオクタデシル化シリカゲルを加え、クロロホルム溶液とした後に、攪拌し溶媒留去することで、粒子−脂質混合物の薄膜を形成した。その後、緩衝液(ＨＥＰＥＳバッファー（4-(2-Hydroxymethyl)-1-piperazine ethanesulfonic acid；ｐＨ７．０、和光純薬工業（株）製）を加えて粒径約５μｍのローダミン修飾化アニオン性ＯＤＳリポソームを調製した。なお、アニオン性ＯＤＳリポソームをローダミン修飾化したのは、蛍光顕微鏡による検出を可能とするためである。
【００８６】
〔２〕アニオン性ＯＤＳリポソームの固定化：
ローダミン修飾化アニオン性ＯＤＳリポソームの固定化は、以下の手順で行った。
（i）ローダミン修飾化アニオン性ＯＤＳリポソーム（径約５μｍ）の溶液（濃度１ｍｇ／ｍｌ）を５μｌとり、傾斜２０度に傾けたプレ・バイオチップ表面上に数回に分けて滴下した。
（ii）この操作を５回繰り返して行い、プレ・バイオチップの微細穴に当該溶液を十分に浸潤させた後、プレ・バイオチップを傾けたままの状態でＨＥＰＥＳバッファーを滴下して洗浄を行った。その後、水分を加圧空気で除き、２〜３時間放置乾燥を行うことで微細穴にリポソームを固定化したバイオチップを作製した。
【００８７】
〔３〕アニオン性ＯＤＳリポソームの観察：
前記のようにして作製したバイオチップを、蛍光顕微鏡（システム生物顕微鏡ＢＸ５１、及び、落射蛍光システム（ミラーユニット名：Ｕ−ＭＮＧ２）、いずれもオリンポス製）、及び、走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ−９５００Ｊ３、島津製作所製）を用いて、ローダミン修飾化アニオン性ＯＤＳリポソームの観察を行った。なお、走査型プローブ顕微鏡はコンタクトモードで走査することで観察を行った。その結果、アニオン性ＯＤＳリポソーム（粒径約５μｍ）では、全１６個の微細穴のうち１０個に固定化されていた。
【００８８】
これら顕微鏡で撮影した写真を図７及び図８に示す。図７は、ローダミン修飾化アニオン性ＯＤＳリポソームを固定化したバイオチップの蛍光顕微鏡写真を示す図である。また、図８は、ローダミン修飾化アニオン性ＯＤＳリポソームを固定化したバイオチップの走査型プローブ顕微鏡写真を示す図である。
なお、図７及び図８は同一のバイオチップを撮影したものであり、これらの顕微鏡写真では、９個の微細穴のうちローダミン修飾化アニオン性ＯＤＳリポソームが４つ固定化されている。
【００８９】
また、同様の実験を、ＯＤＳを用いない通常のリポソーム（粒径：約１μｍ）で行ったところ、図示はしないが、全９個の大きさ１μｍの微細穴に、４個の通常のリポソームが固定化されていた。
【００９０】
［結果と考察］
この実施例に係るローダミン修飾化アニオン性ＯＤＳリポソームを固定化したバイオチップを複数枚作製し、その固定化率を調べたところ、全微細穴のうち、平均約７０％の微細穴にターゲット物質が固定化されていることが確認された。なお、かかるリポソームは良好な立体形状を維持しており、扁平状とはならなかった。
【００９１】
このバイオチップは微細穴の大きさ、形状、及び、固定化物質を適切に制御したために微細穴一つ一つ個別的に細胞等を観察することができることから、細胞膜や膜タンパク質に関する研究全般を容易、かつ、確実に行うことが可能であると考えられる。特に、本発明に係るバイオチップによって、ウイルスのような微小胞体の個別固定化や、細胞膜の運動性・相互結合性を抑制した個別固定化が可能になるので、走査型プローブ顕微鏡や表面プラズモン共鳴、電気化学的手法による観察・分析を適用することで、細胞やウイルス上の膜タンパク質の構造研究やリガンド探索に有用な情報を得ることができる。
なお、微細穴に固定化する固定化物質を適宜変更すれば、固定化するターゲット物質を特異的に選択することができるので、幅広い研究に利用できることはいうまでもない（表１参照）。
更に、ＰＢＴの他にも導電性ガラスを用いた場合も同様にリポソーム吸着能を有するバイオチップの作製を行うことができることを付記しておく。
【００９２】
［結論］
リポソームを固定化した本発明に係るバイオチップの一実施例から、ＰＢＴのような高分子材料表面上に、リポソーム固定化物質（ポリリシン）を結合させた微細穴を配列的に形成することで、この微細穴内にリポソームが固定化できることが確認された。ガリウムイオンを打ち込むことで様々な形状や大きさの微細穴の形成が可能になったことで、この微細穴の物理的形状と化学的な固定化作用を組み合わせた小胞体固定化モチーフという手法は、ＦＩＢを加工法として用いることで可能となったものである。今後更に様々な基盤材料に本発明に係るバイオチップ及びプレ・バイオチップの製造方法を適用し、グラフト重合や高分子膜コーティング、インプリント技術を応用することで、多彩なバイオチップを作製することが可能である。
【００９３】
以上、本発明に係る細胞、細菌又はウイルスを固定化したバイオチップの作製方法及びバイオチップ、並びに、プレ・バイオチップの作製方法及びプレ・バイオチップについて、詳細に説明してきたが、本発明の内容は発明を実施するための最良の形態や実施例の内容に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変更改変して用いることができる。
【００９４】
例えば、前記説明中、基盤の材料としては、ＰＢＴや６−ナイロン、６，６−ナイロンを好適に用いることを述べたが、その他にも導電性ガラス、石英、或いは、金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム等の各種金属なども用いることができる。なお、これらを用いる場合は、表１に記載する固定化物質を結合させるため、その表面にカルボキシル基やアミノ基等の官能基を有している物質を結合させるのが望ましい。
【００９５】
また、微細加工を施す方法として、集束イオンビーム（ＦＩＢ）加工装置を挙げたが、フォトリソグラフィー加工法、光造形法、ケミカルエッチング法などを用いることも可能である。
【００９６】
更に、バイオチップ表面への非特異的な吸着を防ぐために本発明の実施例ではエチレンジアミンを用いて表面修飾することとしたが、アセトニトリルやエチレンジアミンなどをモノマーにしたプラズマ重合体によりコーティングすることや、ポリエチレンオキサイド、ヘパリンなどの親水性高分子、生体分子をグラフト化することや、リン脂質などによって自己集積化膜を形成させることとしても良い。
【００９７】
なお、本発明に係るバイオチップやプレ・バイオチップにおいては、一枚のチップ上に同じ形状、同じ大きさの微細穴を形成する態様とする他、異なる形状、異なる大きさの微細穴を形成する態様とすることができることは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】バイオチップの微細穴形成工程を説明する説明図である。
【図２】ターゲット物質を固定化させた本発明に係るバイオチップの一例を示す斜視図である。
【図３】微細穴の要部断面図であって、（ａ）は第一実施形態を示す図であり、（ｂ）は第二実施形態を示す図であり、（ｃ）は第三実施形態を示す図であり、（ｄ）は第四実施形態を示す図である。
【図４】ターゲット物質の固定化状態について説明する図であって、（ａ）は微細穴に対してターゲット物質の大きさが丁度良い場合を示す図であり、（ｂ）は微細穴に対してターゲット物質の大きさが小さい場合を示す図であり、（ｃ）は微細穴に対してターゲット物質の大きさが大きい場合を示す図である。
【図５】ＦＩＢ加工後のＢｒ−Ｍｍｃによって修飾された微細穴の蛍光顕微鏡写真を表す図である。
【図６】ＣＦＳＥを用いたポリリシンの蛍光顕微鏡写真を表す図である。
【図７】ローダミン修飾化アニオン性ＯＤＳリポソームを固定化したバイオチップの蛍光顕微鏡写真を表す図である。
【図８】ローダミン修飾化アニオン性ＯＤＳリポソームを固定化したバイオチップの走査型プローブ顕微鏡写真を表す図である。
【図９】（ａ）〜（ｉ）は、微細穴の形状を模式的に示す説明図である。
【図１０】受精卵を固定するための従来例を示す図である。
【符号の説明】
【００９９】
１      バイオチップ
１'    プレ・バイオチップ
１０    基盤
２１    表面修飾部位
３１    金薄膜
４０    微細穴
５０    固定化物質
６０    ターゲット物質
６１    リポソーム
【図１】
2005214889.tif 000007
【図２】
2005214889.tif 000008
【図３】
2005214889.tif 000009
【図４】
2005214889.tif 000010
【図９】
2005214889.tif 000011
【図１０】
2005214889.tif 000012
【図５】
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【図６】
2005214889.tif 000014
【図７】
2005214889.tif 000015
【図８】
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