(57)【要約】【課題】          遺伝子内に所望の遺伝子、そのフラグメント又は修飾のみ含み、更にクローニングに用いられる残りのＤＮＡをできるだけわずかしか含まないか又は全く含まない形質転換微生物を提供する。【解決手段】      糸状菌以外の組換え体株であって、その組換え体株がアセトアミダーゼ遺伝子を選択マーカー遺伝子として用いて形質転換された後、前記アセトアミダーゼ遺伝子が欠失されていることを特徴とする上記組換え体株。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌以外の組換え体株であって、その組換え体株がアセトアミダーゼ遺伝子で形質転換されていることを特徴とする上記組換え体株。
【請求項２】
糸状菌以外の組換え体株であって、その組換え体株がアセトアミダーゼ遺伝子及び所望のＤＮＡフラグメントで形質転換されていることを特徴とする上記組換え体株。
【請求項３】
糸状菌以外の組換え体株であって、所望のＤＮＡフラグメントが選択マーカー遺伝子としてアセトアミダーゼ遺伝子を用いて菌株内に導入されていることを特徴とする上記組換え体株。
【請求項４】
アセトアミダーゼ選択マーカー遺伝子が欠失していることを特徴とする請求項３記載の組換え体株。
【請求項５】
アセトアミダーゼ遺伝子が真菌、好ましくはアスペルギルス種由来であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え体株。
【請求項６】
組換え体株が酵母又は細菌である請求項１〜５記載のいずれか１項に記載の組換え体株。
【請求項７】
組換え体株がクルイベロミセス又はサッカロミセス酵母である請求項６記載の組換え体株。
【請求項８】
組換え体株がグラム陽性菌である請求項６記載の組換え体株。
【請求項９】
組換え体株がバシラスである請求項６記載の組換え体株。
【請求項１０】
組換え体株がバシラスリケニホルミス又はバシラスサチリス株である請求項６記載の組換え体株。
【請求項１１】
組換え体株がグラム陰性菌である請求項６記載の組換え体株。
【請求項１２】
組換え体株がエシェリキアコリ株である請求項６記載の組換え体株。
【請求項１３】
少なくとも２つの独立遺伝的修飾を含む組換え体株であって、少なくとも２つの遺伝的修飾が少なくとも２つの独立形質転換で導入されており、各々が選択マーカー遺伝子としてアセトアミダーゼ遺伝子を用いることを特徴とする上記組換え体株。
【請求項１４】
ゲノムに欠失を有する組換え体株であって、欠失が所望のＤＮＡフラグメントの導入の結果でありかつ組換え体株が外来ＤＮＡを含まないことを特徴とする上記組換え体株。
【請求項１５】
所望のＤＮＡフラグメントがキモシン、フィターゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ又はβ−ガラクトシダーゼをコードする配列を含む請求項２〜４のいずれか１項に記載の組換え体株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択マーカー遺伝子を含まない組換え体株、その作製方法及びその使用を開示するものである。更に、本発明の方法は、菌株を改良するのに用いられる。
【背景技術】
【０００２】
組換えＤＮＡ技術の使用について社会的関心が増加している。組換えＤＮＡ技術の有望な適用領域の１つが菌株の改良である。初期の発酵生産法から始まって、生産に用いられる菌株の生産性の改良が必要とされた。工業的に使用された微生物の古典的な菌株改良研究は、主としてランダム突然変異誘発に基づき、その後選択するものである。変異誘発法は多く記載されており、突然変異原として紫外線、ＮＴＧ又はＥＭＳの使用が挙げられている。これらの方法は、“Biotechnology : a comprehensive treatise in 8 vol.”VolumeI, Microbial fundamentals, Chapter 5b, Verlag Chemie GmbH, Weinheim, Germany 等多くに記載されている。
選択法は、一般に適切なアッセイについて開発され、主に野生型と突然変異株との識別において重要である。
これらの古典的な方法は改良の可能性が限定されることが判明している。一般的には、減少している収量を菌株改良すると所望の生産物の収量が増加する。これは、使用された突然変異誘発法のランダム性のために少なくとも部分的なものである。所望の突然変異とは別に、これらの方法は好ましくなくかつ菌株の他の特徴に否定的に影響する突然変異も生じる。
【０００３】
これらの欠点のために、組換えＤＮＡ法を使用すると著しく改良されたことが理解される。一般に、菌株改良研究において用いられる組換えＤＮＡ法は所望の遺伝子産物の発現を増大する。
遺伝子産物はそれ自体興味深いタンパク質であり、一方コードされた遺伝子産物が他の産物の合成において調節タンパク質として働くことも可能である。
所望のタンパク質コーディング遺伝子の多数のコピーを特定の宿主生物に導入することにより、菌株を改良することができる。しかしながら、調節遺伝子を導入することにより発現レベルを増大させることも可能である。
遺伝子は、遺伝子を導入するために伝達体として働くベクターを用いて導入される。かかるベクターは、プラスミド、コスミド又はファージとすることができる。ベクターは遺伝子を発現することができ、その場合、ベクターは通常自己複製することができる。しかしながら、ベクターは組込むことができるだけでもよい。発現産物が改変表現型特性に基づいて容易に選択することができない場合、ベクターのもう１つの特徴は、ベクターが容易に選択することができるマーカーを備えていることである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ベクターを生物内に見ることができないのであるいは他の生物から利用できるベクターをほとんど又は全く修飾せずに用いることができるので、ベクターは既知のすべての微生物から単離されていない。同じことが選択マーカー遺伝子にも当てはまる。
最近、特定のマーカー遺伝子の広範囲な使用及びその後の展開が検討されるようになった。これは特に、抗生物質及び抗生物質選択マーカーを使用すると、抗生物質耐性になった菌株が望ましくない展開を生じるという発見によるものである。これにより、さらに強力な新規な抗生物質を継続して開発することが必要である。
従って、大量生産において、抗生物質耐性遺伝子を全く含まないか又はより一般には外来ＤＮＡをできるだけわずかしか含まない組換え微生物を用いる一般的傾向があることは驚くべきことではない。
形質転換微生物は、遺伝子内に所望の遺伝子、そのフラグメント又は修飾のみ含み、更にクローニングに用いられる残りのＤＮＡをできるだけわずかしか含まないか又は全く含まないことが理想的である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、組換え体宿主微生物から容易に欠失することができる選択マーカー遺伝子を開示するものである。該マーカー遺伝子の欠失は優性選択に基づくものである。
マーカーは、細菌、糸状菌(filamenfous fungi）及び酵母のような異なった種で用いられる。
本明細書で用いられる選択マーカーの有利な活性は、下記２段階原理に基づいている：ａ）遺伝子が宿主生物のゲノムに組込まれ、組換え体細胞が選択される、
ｂ）形質転換細胞が基質上で発育され、マーカー遺伝子がコードした活性によって基質がその細胞に致命的な生産物に変換される。
選択された細胞は組換え体であり、選択マーカー遺伝子を欠失している。
一般的には、本発明は、ゲノムに修飾を有する動物又は植物細胞及び微生物である細胞であって、ａｍｄＳ遺伝子又はそれから誘導されたｃＤＮＡを用いて改変が導入されることを特徴とする上記細胞を開示するものである。
【０００６】
このようにして用いられる選択マーカー遺伝子の例はアセトアミダーゼ遺伝子である。本遺伝子は、好ましくは糸状菌、更に好ましくはコウジカビ属 (Aspergillus)、最も好ましくはアスペルギルスニドゥランス (Aspergillus nidulans)由来である。
本発明は、更にマーカーとしてアセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子を用いて選択する宿主生物における所望の異種又は同種遺伝子又はＤＮＡ分子の導入、欠失又は修飾を示すものである。引き続きａｍｄＳが欠失される。ａｍｄＳ及び所望の遺伝子は部位特異的に導入されることが好ましい。
本発明は、下記のものを含むベクターを開示するものである：
ａ）宿主ゲノムに導入するために予定された所望のＤＮＡフラグメント、
ｂ）場合によってはベクターを宿主株のゲノムに組込む（部位特異的に）ことを可能にするＤＮＡ配列、
ｃ）ＤＮＡ反復間のアセトアミダーゼ（例えばA.ニドゥランス由来のａｍｄＳ）をコードする遺伝子。
【０００７】
本発明は、更に該ベクターで形質転換された宿主生物を開示するものである。
本発明は、更に選択マーカー遺伝子を含まない組換え体微生物を開示するものである。
詳細には、本発明は、外来ＤＮＡを更に存在させずに部位特異的に導入した遺伝子を含む生物を開示するものである。従って、本方法は、宿主ゲノムの反復修飾、例えば所定の遺伝子座に多重遺伝子コピーを連続導入するのにも適する。
本発明は、下記段階を含む選択マーカー遺伝子を含まない組換え体株を作製する方法を提供するものである：
ａ）菌株のゲノムに所望のＤＮＡフラグメント及び選択マーカーを組込む、
ｂ）組換え体を選択する、
ｃ）好ましくは選択マーカーが隣接する反復間に内部組換えを用いて選択マーカーを欠失する、
ｄ）選択マーカーが存在しないことに対して逆選択(counter-selection) する。
【０００８】
これは選択マーカー遺伝子を含まない組換え体株を作製する好ましい方法であるが、本発明はこの方法の変更、例えば：所望のＤＮＡフラグメント及び選択マーカーが２種類のＤＮＡ分子に存在してもよく同時形質転換される。選択マーカーは必ずしも菌株のゲノムに組込まず、キュアされるエピソームＤＮＡ分子に存在してもよい。
本発明は、本マーカー遺伝子が微量、即ちクローニングに用いたＤＮＡを残さずに形質転換された生物のゲノムから欠失されることも説明するものである。
本発明は、「宿主」生物の染色体から所望の遺伝子を欠失するためにａｍｄＳ遺伝子の使用も開示するものである。このような修飾技術は糸状菌、酵母及び細菌にも当てはまる。個々の実施態様においては、次の菌株、アスペルギルス (Aspergillus)、トリコデルマ (Trichoderma)、ペニシリウム (Penicillium)、バシラス (Bacillus) 、E.コリ (E.coli) 、クルイベロミセス (Kluyveromyces)及びサッカロミセス (Saccharomyces)が用いられる。
本発明の方法は、同じ又は他のベクターを用いて手順を反復することにより得られたゲノム修飾を含む組換え体株を提供するものである。
【０００９】
本発明は、形質転換宿主株を選択するマーカーの使用を開示するものである。選択マーカー遺伝子は、エピソームＤＮＡベクター上で用いることができる。しかしながら、本発明においては、マーカー遺伝子を宿主株のゲノムに組込むことが好ましい。本発明の選択マーカーの利点は、優性非抗生物質選択マーカーであることである。本発明の選択マーカーの別の利点は、形質転換宿主生物から容易に欠失することができることである。マーカーの欠失は、優性選択に基づいている。本発明の選択マーカーはそれだけで優性かつ二方向選択マーカーである。知る限りでは、これは二方向及び両方向に優性である唯一の有効な選択マーカーである。
【００１０】
本発明の好ましい態様は以下のとおりである。
（１）所望のＤＮＡフラグメント及び選択マーカー遺伝子を含むベクターで形質転換された糸状菌であって、選択マーカー遺伝子が欠失していることを特徴とする上記糸状菌。
（２）所望のＤＮＡフラグメント及び選択マーカー遺伝子が少なくとも２種類の異なるベクター上に存在する上記（１）記載の糸状菌。
（３）前記所望のＤＮＡフラグメントが部位特異的相同的組換えにより該糸状菌のゲノムに組込まれる上記（１）又は（２）記載の糸状菌。
（４）該選択マーカー遺伝子がアセトアミダーゼ遺伝子である上記（１）、（２）又は（３）記載の糸状菌。
（５）該アセトアミダーゼ遺伝子が真菌由来、好ましくはアスペルギルス種由来である上記（４）記載の糸状菌。
（６）所望のＤＮＡフラグメントが次の遺伝要素：遺伝子、ｃＤＮＡ、プロモーター、ターミネーター、調節要素、イントロン、ＤＮＡ結合タンパク質の認識配列、翻訳開始部位又は制限部位、その一部、修飾型又は組合わせのいずれか１種を含む上記（１）〜（５）のいずれか１に記載の糸状菌。
（７）糸状菌がアスペルギルス、トリコデルマ又はペニシリウム種である上記（１）〜（６）記載のいずれか１に記載の糸状菌。
（８）糸状菌以外の組換え体株であって、その組換え体株がアセトアミダーゼ遺伝子で形質転換されていることを特徴とする上記組換え体株。
（９）糸状菌以外の組換え体株であって、その組換え体株がアセトアミダーゼ遺伝子及び所望のＤＮＡフラグメントで形質転換されていることを特徴とする上記組換え体株。
（１０）糸状菌以外の組換え体株であって、所望のＤＮＡフラグメントが選択マーカー遺伝子としてアセトアミダーゼ遺伝子を用いて菌株内に導入されていることを特徴とする上記組換え体株。
（１１）アセトアミダーゼ選択マーカー遺伝子が欠失していることを特徴とする上記（１０）記載の組換え体株。
（１２）アセトアミダーゼ遺伝子が真菌、好ましくはアスペルギルス種由来であることを特徴とする上記（８）〜（１１）のいずれか１に記載の組換え体株。
（１３）組換え体株が酵母又は細菌である上記（８）〜（１２）記載のいずれか１に記載の組換え体株。
（１４）組換え体株がクルイベロミセス又はサッカロミセス酵母である上記（１３）記載の組換え体株。
（１５）組換え体株がグラム陽性菌である上記（１３）記載の組換え体株。
（１６）組換え体株がバシラスである請上記（１３）記載の組換え体株。
（１７）組換え体株がバシラスリケニホルミス又はバシラスサチリス株である上記（１３）記載の組換え体株。
（１８）組換え体株がグラム陰性菌である上記（１３）記載の組換え体株。
（１９）組換え体株がエシェリキアコリ株である上記（１３）記載の組換え体株。
（２０）少なくとも２つの独立遺伝的修飾を含む組換え体株であって、少なくとも２つの遺伝的修飾が少なくとも２つの独立形質転換で導入されており、各々が選択マーカー遺伝子としてアセトアミダーゼ遺伝子を用いることを特徴とする上記組換え体株。
（２１）ゲノムに欠失を有する組換え体株であって、欠失が所望のＤＮＡフラグメントの導入の結果でありかつ組換え体株が外来ＤＮＡを含まないことを特徴とする上記組換え体株。
（２２）所望のＤＮＡフラグメントがキモシン、フィターゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ又はβ−ガラクトシダーゼをコードする配列を含む請求項１〜３及び９〜１１のいずれか１項に記載の組換え体株。
（２３）選択マーカーを含まない組換え体株の作製方法であって、下記段階を含む上記方法：ａ）菌株のゲノムに所望のＤＮＡフラグメント並びに優性及び二方向選択マーカー遺伝子を組込む、ｂ）形質転換細胞を選択する、ｃ）選択マーカー遺伝子に隣接する反復間の組換えにより選択マーカー遺伝子を欠失する、ｄ）選択マーカー遺伝子が存在しないことに基いて逆選択する。
（２４）ゲノムから欠失されるべき３′又は５′配列である配列で反復を形成する選択マーカー遺伝子配列の５′又は３′配列をクローン化することを特徴とする請求項２３記載の方法。
（２５）所望のＤＮＡフラグメントが次の遺伝要素：遺伝子、ｃＤＮＡ、プロモーター、ターミネーター、調節要素、イントロン、ＤＮＡ結合タンパク質の認識配列、翻訳開始部位又は制限部位、その一部、修飾型又は組合わせのいずれか１種を含む請求項２３又は２４記載の方法。
（２６）段階ａ）〜ｄ）が請求項２５記載の同一か又は異なる所望のＤＮＡフラグメントを用いて得られた組換え体株上で反復される請求項２３又は２４記載の方法。
（２７）選択マーカー遺伝子がアセトアミダーゼ遺伝子である請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（２８）選択マーカー遺伝子が真菌由来、好ましくはアスペルギルス種由来のアセトアミダーゼ遺伝子である請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（２９）ＤＮＡ反復が隣接する優性及び二方向選択マーカー遺伝子を含むベクター。
（３０）所望のＤＮＡフラグメントも含む請求項２９記載のベクター。
（３１）選択マーカー遺伝子がアセトアミダーゼ遺伝子である請求項２９又は３０記載のベクター。
（３２）アセトアミダーゼ遺伝子が真菌由来、好ましくはアスペルギルス種由来である請求項３１記載のベクター。
（３３）糸状菌由来のアセトアミダーゼ遺伝子を含むベクターであって、アセトアミダーゼ遺伝子が糸状菌以外の生物由来のプロモーターの転写調節を受けることを特徴とする上記ベクター。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の説明においては、「選択マーカー遺伝子」という用語が用いられる。この用語は、それが実際の遺伝子かあるいはそれから誘導されたｃＤＮＡであるかに無関係な機能上の形でマーカータンパク質をコードするＤＮＡを意味する。遺伝子又はｃＤＮＡは、宿主生物及びスプライシングの予想される問題点によって用いられる。
【００１２】
本発明においては、「ベクター」という用語が用いられる。これは、ベクターが宿主細胞のゲノムに組込むかあるいはエピソームを維持するかに無関係な選択宿主に導入することができる任意のＤＮＡ分子を意味する。ベクターは、選択宿主において機能する選択性マーカー遺伝子を含むか又はそのような選択マーカー遺伝子を含む別のＤＮＡで同時形質転換することができる。
本発明の説明には、「所望の相同又は非相同遺伝子又はＤＮＡフラグメント」という用語が用いられる。これは、宿主株又は別の種もしくは株から得られるＤＮＡフラグメントを意味する。所望のＤＮＡフラグメントは、遺伝子（一部又は完全な遺伝子座をコードする）、ｃＤＮＡ、プロモーター、ターミネーター、イントロン、シグナル配列、ＤＮＡ結合タンパク質の調節ＤＮＡ配列又は認識配列のような遺伝要素、その一部又はその組合わせを含むことができる。そのフラグメントは、修飾されている、即ち１種以上のヌクレオチド改変（例えば、挿入、欠失、置換）を含むＤＮＡ配列であってもよい。本発明の説明には、更に、所望の遺伝子又はＤＮＡフラグメントの「導入」という用語が用いられる。これは、選択宿主細胞における挿入、欠失、置換を意味する。
【００１３】
本発明で用いられる「遺伝的修飾」という用語は、上記所望のＤＮＡフラグメントのいずれか１種を宿主細胞に、好ましくは形質転換又は同時形質転換によって導入する結果である選択宿主細胞におけるＤＮＡ配列の任意の修飾を意味する。
一般に、これらの遺伝的修飾はすべて本発明の方法を用いて行われ、引き続き選択マーカー遺伝子を欠失することができる。そのような遺伝的修飾を含む組換え体株が選択マーカー遺伝子を含有しない事実のために、本発明の手順を反復することができ、上記で示した修飾が組換え体株に組合わせられる。結局、本発明の手順は、望ましくないすべての活性が対応する遺伝要素の欠失又は不活性化によって除去されておりかつ所望のコピー数、好ましくは所望のかつ特定された遺伝子座の対応する所望のＤＮＡフラグメントを引き続き導入することにより所望レベルの所望活性を含む組換え体株が得られる点まで反復して用いることができる。
【００１４】
A.ニドゥランスアセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子であると、A.ニドゥランスは単独のＮ源としてアセトアミド上で発育する。単独のＮ源としてアセトアミドを用いる可能性がないか又は極めて限定された能力しかない微生物の場合、アセトアミドが細胞によって吸収されるならばアセトアミダーゼ遺伝子は理論上選択マーカーとして用いることができる。ａｍｄＳ遺伝子は、アスペルギルス(Kelly, Hynes (1985) EMBO J. 4, 475-479; Christensenら, (1988) Bio/technology 6, 1419-1422) 、ペニシリウム(Beri and Turner (1987) Curr. Genet. 11, 639-641) 及びトリコデルマ(Pentillaeら (1987) Gene 61, 155-164) においてマーカー遺伝子として巧く用いられている。
【００１５】
本発明は、糸状菌以外の生物において選択マーカーとしてA.ニドゥランス由来のａｍｄＳ遺伝子の使用を初めて開示するものである。この選択マーカーの使用は、細菌及び酵母において開示される。詳細には、S.セレビシエ (S.cerevisiae) 、K.ラクチス (K.lactis) 、B.サチリス (B.subtilis) 、B.リケニホルミス(B.licheniformis)及びE.コリ (E.coli) における使用が示される。真菌、酵母及び細菌のような異なった群より選ばれた種における選択マーカーの適用が開示されているために、マーカーはこれらの群に属する他の種にも適用できることが予想される。従って、本マーカーの使用は、開示されている種に限定されない。
A.ニドゥランス由来のａｍｄＳ遺伝子は、アセトアミドをアンモニア及び酢酸に変換することができる。この特性のため、A.ニドゥランスは単独のＮ源又はＣ源としてアセトアミドを含有する培地上で発育することが可能である。
【００１６】
ａｍｄＳ遺伝子の別の特性は、フルオロアセトアミドをアンモニア及びフルオロ酢酸にも変換することができることである。しかしながら、フルオロ酢酸は、細胞に有毒である。本発明のもう１つの態様、即ちマーカー遺伝子を含まない組換え体株作製の根拠をなすのがこの特性である。フルオロアセトアミド変換特性により、形質転換細胞の逆選択が可能である。ａｍｄＳ遺伝子は宿主株に導入され、相同的組換えによりゲノムに組込まれる。単独のＮ源としてアセトアミドを含有する培地上にこの形質転換菌株が選択される。引き続きこの選択された菌株が単独のＮ源としてフルオロアセタミド及び尿素（又は他の好ましい特定Ｎ源）を含有する培地上で発育される。生存菌株は、ａｍｄＳ遺伝子を欠失している。
【００１７】
本発明は、アセトアミドマーカー遺伝子としてA.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子を使用するものである。A.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子がコードされたアセトアミダーゼによって生じる適切な特性、即ちアセトアミドのアンモニア及び酢酸塩への加水分解能及びフルオロ酢酸のフルオロアセトアミドからの遊離能も他の起源からのアセトアミダーセによって生じる。従って、アセトアミダーゼマーカー遺伝子の使用は、機能アセトアミダーゼをコードするＤＮＡ配列を含む以外はA.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子に限定されない。
マーカー欠失の頻度は、染色体内相同的組換えに対する遺伝子の能力を増加することにより実質的に増加する。本ａｍｄＳ遺伝子を達成するためにはＤＮＡ反復間に配置することが好ましい。これらの反復は、単一交差組込みによって作られる以外は必ずしもベクター内に共に存在しない。また、隣接反復を取り除き、マーカー遺伝子の除去又は不活性化のための他のメカニズムによるものである。しかしながら、その場合結果は予想できなくなり、マーカー遺伝子を除去せずむしろ単に不活性化する結果となる。
【００１８】
ベクターは、マーカー遺伝子の欠失後、無関係の外来ＤＮＡ（問題のＤＮＡ以外）が宿主株の染色体内に残らないようにして構築される。本発明は、下記のものを含むベクターを開示するものである：
ａ）宿主ゲノムに導入されることになる所望のＤＮＡ配列、
ｂ）任意によりベクターを宿主株のゲノムに組込ませる（部位特異的）ＤＮＡ配列、
ｃ）ＤＮＡ反復間でアセトアミダーゼ（例えばA.ニドゥランス由来のａｍｄＳ遺伝子）をコードする遺伝子。
宿主ゲノムに導入されることになるＤＮＡフラグメント及び選択可能なマーカー遺伝子（例えばアセトアミダーゼ遺伝子）が同時形質転換される２種類のＤＮＡ分子に存在する場合にも同一の結果が得られ、その場合選択可能なマーカーを含むＤＮＡ分子は必ずしも宿主ゲノムに組込まずキュアすることができるエピソームＤＮＡ分子に存在させてもよい。
【００１９】
ｂ）によって言及される組込みに用いられる配列は、部位特異的（遺伝子座特異的の方が良い）組込みが所望される場合に用いられる。そのような配列が存在しない場合にもベクターはゲノムに組込むことができる。これにより、選択マーカー遺伝子の欠失能に影響されない。
上記の優性逆選択は、種々の方法で工業生産株の開発に用いることができる。優性逆選択を使用すると、これらの菌株がしばしば二倍体又は倍数体であるという事実のために改良された生産株の開発に特に有利である。
ａｍｄＳ遺伝子の組込みに用いられるベクターは問題の他の遺伝子を含むことが好ましい。即ち、本発明は、更にマーカーとしてａｍｄＳ遺伝子を用いて選択する宿主生物において所望の外来もしくは相同遺伝子又はＤＮＡ要素の導入が可能である。引き続きａｍｄＳ遺伝子が欠失される。ａｍｄＳ及び所望の遺伝子又はＤＮＡ要素を部位特異的に導入し、その後ａｍｄＳ遺伝子を欠失させることが好ましい。
【００２０】
詳細には、本発明は、外来ＤＮＡを更に存在させずに部位特異的に導入された遺伝子を含む生物を開示するものである。本発明は、所定のゲノム遺伝子座の所望の遺伝子又はＤＮＡ要素の多重コピーを組込むのに用いられる。
本発明は、下記の段階を含むマーカー遺伝子を含まない組換え体株を選択する方法を提供するものである：
− 所望の遺伝子又はＤＮＡ要素及び選択マーカーを、発現カセットに取込まれた配列と宿主染色体上の配列の間の相同的組換えによって組込む、
− 優性の選択マーカー遺伝子を用いて選択する、
− 選択マーカー遺伝子隣接領域を用いて選択マーカー遺伝子を欠失する、
− 選択マーカー遺伝子が存在しないことに対して選択する（逆選択）。
本発明は、更に、本マーカー遺伝子が微量、即ちクローニングに用いたＤＮＡを残さずに形質転換生物の染色体から欠失することができることを示すものである。更に、本発明は、所望の遺伝子又はＤＮＡ要素及び選択マーカーが同時形質転換される２種類のＤＮＡ分子に存在すると同一の結果を得ることができなくても似ていることを示すものである。
【００２１】
最後に、本発明は、「宿主」生物の染色体から所望の遺伝子を欠失するａｍｄＳ遺伝子の使用を開示するものである。
上記の観点から、本発明は、理想的には、食品、飼料又は医薬用途に用いられるタンパク質をコードする遺伝子又は抗生物質及び他の生活性化合物の生合成、即ち厳密な記載に要求される組換え体タンパク質及び／又は宿主生物に関与する遺伝子のクローニング及び発現に適しているがこれらに限定されない。
このようなタンパク質の例は当該技術において周知であり、キモシン、フィターゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ及びヘミセルラーゼ、サイトカイン及び他の医薬タンパク質等が挙げられる。
【００２２】
同様の方法が、ゲノム内にマーカー遺伝子を残さずに所望のタンパク質の生産レベルに影響するタンパク質をコードする遺伝子の欠失に用いられる。このようなタンパク質としては、宿主株内で高度に発現され、従って所望のタンパク質の生産及び／又は分泌の可能性が減少した所望の生産物を活発に消化するプロテアーゼがある。ある遺伝子を欠失するのに好ましい方法は、５′〜３′の順序の次の要素：欠失されるべき配列５′遺伝子、直接融合された欠失されるべき配列３′遺伝子、下流に続く機能上の選択マーカー遺伝子（好ましくはアセトアミダーゼ遺伝子）、下流に続く欠失されるべき配列３′遺伝子を含有するＤＮＡ構築物を使用する。この場合、欠失されるべき３′遺伝子の両配列を選択して選択マーカー遺伝子に隣接する反復を形成する。このＤＮＡ構築物を形質転換し、引き続き欠失されるべき遺伝子の染色体コピーを欠失されるべき配列５′及び３′遺伝子に交差点を有するＤＮＡ構築物で置き換えると、ある遺伝子を欠失することになる。引き続き選択マーカー遺伝子に隣接する反復間の染色体内組換え及びこれらの組換えに対する逆選択により、最後にある遺伝子が欠失した選択マーカーを含まない菌株を生じる。この欠失に用いられるＤＮＡ構築物は、欠失のある菌株内に外来ＤＮＡ又は他の微量の遺伝的修飾が残らないように構築することができる。
【００２３】
本発明は、選択マーカー遺伝子を含まない組換え体微生物を開示するものである。その微生物は、開示した技術を使用した後、所望の遺伝子（相同あるいは非相同）の過剰コピーを含有する生物とすることができる。同じ技術を連続して用いることにより、その微生物を何度も再形質転換して問題の同じ又は他の遺伝子のコピーを更に挿入又は欠失することができる。
これらの微生物は、また、所定の遺伝子が所望の方法で欠失又は改変されていることを特徴とするものである。
本発明の方法は、所望のタンパク質の生産を微細調整することを可能にするものである。この可能性は、挿入及び欠失を反復することができる容易さに基づくものである。本方法は、所望の遺伝子コピー数の挿入又は欠失を可能にするものである。即ち、タンパク質が所望量及び所望比で生産される。これは、タンパク質又は酵素の混合物の生産に特に有効である。
アセトアミダーゼ遺伝子がアスペルギルスにおいて単独のＮ源としてアセトアミドを変換することができることは既知であるが、アセトアミダーゼ遺伝子が形質転換アスペルギルスのゲノムから容易に欠失されることはここに示されている。これを達成するために、ａｍｄＳ遺伝子を直列反復間でクローン化する。原則として内部組換えができる直列反復を用いることができる。本発明の実施例において、これは３′アミログルコシダーゼ（ｇｌａＡ）非コーディングＤＮＡ配列間でａｍｄＳ遺伝子をクローン化することにより示される。
【００２４】
ａｍｄＳ遺伝子は、Ｎ源としてフルオロアセトアミド及び尿素を含有する培地上のプレーティングで組込み及び欠失されることが示されている。
更に、アミログルコシダーゼ遺伝子をアスペルギルスのゲノムから欠失することができることも証明される。ｇｌａＡプロモーターの一部、全部で３個の読み枠に停止コドンを含む合成ＤＮＡ配列、A.ニドゥランスグリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼプロモーターの調節によるA.ニドゥランス由来の３′ｇｌａＡ非コーディング配列が隣接するａｍｄＳ遺伝子を含む置換ベクターが構築される。A.ニガー (A.niger)の形質転換後、二重交差によりベクターを組込み、そのことによりアミログルコシダーゼ遺伝子が効果的に置換される。ａｍｄＳ活性の選択後、形質転換株をフルオロアセトアミド及び尿素に塗布する。選択によりａｍｄＳ遺伝子が欠失した菌株が得られた。
本実施例は、アスペルギルス株のゲノムから所望の遺伝子を欠失するａｍｄＳ遺伝子を使用する可能性を具体的に説明するものである。他の遺伝子は、同様の方法で除去又は修飾することができる。
【００２５】
更に実施例において、遺伝子がゲノム内の所定部位にマーカーを含まない遺伝子を挿入することができることが示されている。A.ニガーｇｌａＡ遺伝子座及び３′ｇｌａＡ非コーディング２反復が隣接したａｍｄＳ遺伝子を含む組込みベクターが構築される。
この構築物はアミログルコシダーゼ遺伝子座に組込むことが示されている。フルオロアセトアミドで選択した後、ａｍｄＳが欠失される。このようにして、マーカーＤＮＡを残さずに特定の遺伝子座に遺伝子コピーが組込まれる。上記のことから、本明細書に記載される手順により、当業者が後に選択マーカーＤＮＡを残さずに所定の遺伝子座に所望の遺伝子を組込むかあるいは欠失することができることは明らかである。
本方法は、遺伝子増幅及び遺伝子置換に用いることができる。
特に重要な適用は、所望の遺伝子を組込むことである。菌株を古典的に改良した後、古典的菌株改良によって逆に影響する遺伝子を問題の遺伝子の影響されない新しいコピーに発現レベルのロスなしで置き換える。
【００２６】
上記アスペルギルスについて記載した系は、単独のＮ源としてアセトアミド上で発育することができないことが知られている真菌の他の菌株を用いる場合に同様の結果を得ることが予想される。選択マーカーとしてａｍｄＳ遺伝子を使用することが特にペニシリウム及びトリコデルマに記載されている。更に、ａｍｄＳ遺伝子は、不十分にもかかわらず単独のＮ源としてアセトアミドを使用することができる糸状菌においてさえも使用することができる。この場合、選択培地にＣｓＣｌを含めることにより、発育の不十分な形質転換されない細胞の背景を抑制することができる(Tilburn, J.ら (1983) Gene, 26, 205-221)。従って、この系は、一般に糸状菌に適用できることが予想される。
本明細書の１実施態様においては、驚くべきことにA.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子がK.ラクチスにおいて選択マーカーとして用いることができることが示されている。本実施例においては、２種類のK.ラクチス株が単独のＮ源としてのアセトアミド上で発育することができないことが示されている。K.ラクチス２株は、
ａ）Ｎ源を含まない以外は完全である、
ｂ）アセトアミドを含む以外はａ）として、
ｃ）硫酸アンモニウムを含む以外はａ）としてＹＣＢ培地上に塗布される。
【００２７】
これらの菌株はｂ）の培地上で発育しないがｃ）の培地上で発育することが示されている。従って、アセトアミドが酵母細胞によって吸収されかつａｍｄＳ遺伝子がK.ラクチス内で発現することができれば、この系は少なくとも選択マーカーとしても酵母内で適用することができる。フルオロアセトアミドを用いる逆選択に関して、更に若干の要求を満たさねばならない。酵素アセチル−ＣｏＡ−シンテターゼによって活性化される場合、フルオロアセテートは有毒である。従って、ａｍｄＳ+ 酵母に作用するフルオロアセトアミド逆選択に対する必要条件は次のことである：
１）フルオロアセトアミドがａｍｄＳ酵母に有毒であってはならない、
２）酵母細胞壁及び原形質膜がフルオロアセトアミドに対して透過性でなければならない及び
３）酵素アセチル−ＣｏＡ−シンテターゼが活性でなければならない。
【００２８】
これを試験するために、ａｍｄＳ遺伝子をK.ラクチス内でクローン化した。
K.ラクチスにおいてA.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子のスプライシングの問題の可能性を避けるために、A.ニドゥランス由来のａｍｄＳｃＤＮＡを実験の項に示されているようにクローン化した。
引き続き、別のマーカー（ホスホトランスフェラーゼ−Ｇ４１８）を含むベクターの酵母プロモーター（ＬＡＣ４、ＡＤＨ１、Ｋ１ＥＦ）の下流にａｍｄＳをクローン化した。このクローニングは実施例８に記載されている。Ｇ４１８マーカー及びａｍｄＳ遺伝子を共に含有するベクターをＧ４１８マーカーを用いて選択し、次いでａｍｄＳ＋表現型の選択条件を最適化するために用いた。
K.ラクチスの直接選択は、本発明の別の実施態様において示されており、S.セレビシエの場合実施例１１に直接選択が示されている。
【００２９】
引き続き、形質転換酵母菌に逆選択を用いてａｍｄＳ遺伝子を除去することが示されている。
ａｍｄＳ遺伝子系は、酵母内遺伝子のマーカー遺伝子を含まない挿入及びマーカー遺伝子を含まない欠失の双方に用いられる。
更に実施態様においてはラクターゼ遺伝子がK.ラクチスから欠失されるが、実施例１４においてはキモシン遺伝子のコピーがK.ラクチスゲノムに挿入される。
挿入及び欠失にここで用いられる遺伝子は、例として用いられているにすぎない。他の遺伝子又はＤＮＡ要素を用いて同様の技術を当てはめることができる。前述のように挿入又は欠失に用いられるＤＮＡフラグメントは、突然変異遺伝子、プロモーター配列、調節配列等とすることができる。すべての場合において、これらの配列を所望のゲノム部位及び所望の数で後にマーカー遺伝子を残さずに挿入又は欠失することが可能である。
【００３０】
他の酵母菌において本系の使用が可能であることは明らかである。
本発明の系を細菌に使用する第１段階として、バシラスサチリス (Bacillus subtilis)及びE.コリが単独のＮ源としてのアセトアミド上で発育することができないことが実施例１５に示されている。
実施例１６には、バシラス及びE.コリで使用するために構築されているベクターが記載されている。
実施例１７及び１８にはバシラス及びE.コリにおいてａｍｄＳ遺伝子を選択マーカーとして効果的に用いることができることが示され、実施例１９には細菌のａｍｄＳ+ 形質転換細胞のフルオロアセトアミド逆選択が示される。
本発明の系の利点は多数である。最も注目すべき利点を下記に示す：
− ａｍｄＳ系は普遍的に適用でき（植物細胞、動物細胞、酵母、細菌及び糸状菌等）、問題の宿主が単独のＣ又はＮ源としてアセトアミド上で発育することができないか又は十分に発育することができないが単独のＣ又はＮ源として各々酢酸塩あるいはアンモニアを使用することができることだけを必要とすることが示される。
【００３１】
− ａｍｄＳ系は、二方向及び優性選択系のみを表すものである。天然単離物及び／又は工業的菌株によくあるこの特徴は、倍数体又は異数体菌株で用いるのに便利である。
− 菌株を古典的に改良した後、所望の遺伝子が十分に特定された遺伝子座に組込まれている事実により、所望の遺伝子の突然変異コピーを非突然変異コピーに遺伝子置換により容易に置き換えることができる。即ち、それらの遺伝子が非突然変異遺伝子に発現レベルに影響せずに置き換えられる。
− 十分に特定された従って非ランダム遺伝子座に多数の組込みを導入することができる能力のために、好ましくない特徴が遺伝子増幅の際に菌株内に生じないことは確かである。
− 環境における種々の選択マーカーの解離に関する成長は提示した系によって克服される。所望の遺伝子又は他の遺伝的修飾を導入した後、選択マーカー遺伝子又は他の不要な又は所望されないＤＮＡ配列は生産株内に存在させることを必要としない。
【００３２】
実験
一般分子クローニング技術
本明細書に記載される実施例において、核酸の単離及び精製、核酸の電気泳動酵素的修飾、核酸の切断及び／又は増幅、E.コリの形質転換等の分子クローニング標準法を文献 (Sambrookら (1989) "Molecular Cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratories, Cold Spring Harbour, New York; Innisら (eds.)(1990) "PCR Protocols, a guide to methods and applications" Academic Press, San Diego) に記載されているように行った。オリゴデオキシヌクレオチドの合成及びＤＮＡ配列分析は、製造業者によって備えられたユーザーマニュアルに従って各々Applied Biosystems 380B ＤＮＡシンセサイザー及び 373A ＤＮＡシークエンサーで行った。
【００３３】
A.ニガーの形質転換
A.ニガーの形質転換を Tilburn, J.ら (1983) Gene 26, 205-225及び Kelly,J. & Hynes, M. (1985) EMBO J., 4, 475-479 に記載されている方法を下記のように変更して行った：
− 胞子をアスペルギルス最少培地で回転振盪器中３００ rpm，３０℃で１６時間発育させる。アスペルギルス最少培地は、次の成分からなる：１リットル当たり６ｇのＮａＮＯ3 ；0.５２ｇのＫＣｌ；1.５２ｇのＫＨ2 ＰＯ4 ；1.１２mlの４M ＫＯＨ；0.５２ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ；１０ｇのグルコース；１ｇのカザアミノ酸；２２mgのＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ；１１mgのＨ3 ＢＯ3 ；５mgのＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ； 1.７mgのＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ；1.６mgのＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ；５mgのＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ；1.５mgのＮａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ；５０mgのＥＤＴＡ；２mgのリボフラビン；２mgのチアミン・ＨＣｌ；２mgのニコチンアミド；１mgのピリドキシン・ＨＣｌ；0.２mgのパントテン酸；４μg のビオチン；１０mlのペニシリン（５０００IU/ml)／ストレプトマイシン（５０００IU/ml)溶液(Gibco) 。
【００３４】
− Novozym 234(Novo Industri)のみをヘリカーゼなしでプロトプラストの形成に用いた；
− プロトプラスト形成（６０−９０分）後、ＫＣバッファー（0.８M ＫＣｌ，9.５mMクエン酸，ｐＨ6.２）を４５ml量まで加え、プロトプラスト懸濁液をスインギング−バケットローターで２５００ｇ，４℃で１０分間遠心した。プロトプラストを２０mlのＫＣバッファーに再懸濁した。次いで、２５mlのＳＴＣバッファー（1.２M ソルビトール，１０mMトリスＨＣｌｐＨ7.５，５０mMＣａＣｌ2)を加え、次にプロトプラスト懸濁液をスインギング−バケットローターで２５００ｇ，４℃で１０分間遠心し、ＳＴＣバッファーで洗浄し、ＳＴＣバッファーに１０8 プロトプラスト/ml の濃度で再懸濁した；
− ２００μl のプロトプラスト懸濁液にＤＮＡフラグメントをＴＥバッファー（１０mMトリスＨＣｌｐＨ7.５，0.１mMＥＤＴＡ）中１０μl 量で加え、次に１００μl のＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ４０００(Merck),0.８M ソルビトール，１０mMトリスＨＣｌｐＨ7.５，５０mMＣａＣｌ2)を加えた；
【００３５】
− ＤＮＡプロトプラスト懸濁液を室温で１０分間インキュベートした後、1.５mlのＰＥＧ溶液（６０％ＰＥＧ４０００(Merck),１０mMトリスＨＣｌｐＨ7.５，５０mMＣａＣｌ2)を徐々に試験管を繰り返し混合しながら加えた。室温で２０分間インキュベートした後、懸濁液を５mlのＳＴＣバッファーで希釈し、転化により混合し、２０００ｇ，室温で１０分間遠心した。プロトプラストを１mlの1.２M ソルビトールに穏やかに再懸濁し、リボフラビン、チアミン・ＨＣｌ、ニコチンアミド、ピリドキシン・ＨＣｌ、パントテン酸、ビオチン、カザアミノ酸及びグルコースを含まないが単独の窒素源としてアセトアミド、１M スクロースを含む２％細菌学的寒天 #1 (Oxoid, England)で固化したアスペルギルス最少培地からなる再生選択培地に塗布した。３０℃で６−１０日間発育させた後、プレートをスクロースの代わりに２％グルコース及び寒天の代わりに1.５％アガロースを含むアスペルギルス再生選択培地からなるアセトアミド選択プレート上にレプリカ培養した。３０℃で５−１０日間発育させた後、単一形質転換細胞を単離した。
【００３６】
A.オリゼ (A.oryzae) の形質転換
Christensen, T.らの欧州特許出願第0 238 023 A2号に記載されている方法に従って、A.オリゼを形質転換した。
T.リーサイ (T.reesei) の形質転換
Penttillae M., Knowles, J. (1987) Gene 61 155-164 に記載されている方法に従って、T.リーサイを形質転換した。
P.クリソゲナム (P.chrysogenum)の形質転換
Ｃａ−ＰＥＧ仲介プロトプラスト形質転換手順を用いる。プロトプラストの調製及びP.クリソゲナムの形質転換を Goukaら, Journal of Biotechnology 20(1991), 189-200に記載されている方法をを下記のように変更して行った：− 形質転換した後、プロトプラストを単独の窒素源として0.１％アセトアミドを含む1.２M スクロースで浸透的に安定化しかつ1.５％細菌学的寒天 #1 (Oxoid, England)で固化したアスペルギルス最少培地からなる再生選択培地に塗布した。
− ２５℃で５−８日間インキュベートした後、形質転換細胞が出現した。
【００３７】
K.ラクチスの形質転換細胞
Ito H.ら (1983) J. Bacteriol. 153, 163-168に記載されている酢酸リチウム法を次のように変更して酵母K.ラクチスを形質転換した：− 形質転換の場合、K.ラクチス培養物をＯＤ610 0.５〜1.0 で用いた。
− ５分後、熱ショック形質転換細胞懸濁液、１mlのＹＥＰＤ／ＹＮＢ（１％酵母エキス、２％バクトペプトン、２％グルコース及び0.１７％酵母窒素塩基ｗ／ｏアミノ酸（ＹＮＢ；Difco)を加え、細胞懸濁液を振盪インキュベーターで３０℃で１５０−１８０分間インキュベートした。
− 上記のインキュベーション（３０℃で１５０−１８０分間）後、細胞懸濁液を２０００ｇ，室温で５分間遠心し、２％バクト寒天 (Difco)で固化したＹＥＰＤ／Ｇ４１８二重層培地に塗布した。ＹＥＰＤ／Ｇ４１８二重層プレートを次のように調製した：細胞懸濁液を塗布する１０分前に、Ｇ４１８を含まない１５mlのＹＥＰＤ寒天（２％バクト寒天 (Difco)で固化した１％酵母エキス、２％バクトペプトン、２％グルコース）を５０μg のＧ４１８／mlを含めた１５mlのＹＥＰＤ寒天に注ぎ入れた。これにより、抗生物質の拡散後２５μg のＧ４１８／mlを含むＹＥＰＤ／Ｇ４１８二重層プレートを得る。このＹＥＰＤ／Ｇ４１８二重層プレートは、K.ラクチス株 CBS 683又は CBS 2360 の場合各々２５μg Ｇ４１８／ml又は１００μg Ｇ４１８／mlを含有した。
【００３８】
アスペルギルス、トリコデルマ、ペニシリウム及び酵母由来ＤＮＡの単離
アスペルギルス及びトリコデルマ由来ＤＮＡは、Yeltonら (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1470-1474 に記載されている手順に従って単離した。ペニシリウム由来ＤＮＡは、 Kolarら, Gene 62 (1988), 127-134 に記載されている手順に従って単離した。K.ラクチス又はS.セレビシエ由来ＤＮＡは、Fujimura, Sakuma (1993), Biotechniques 14, 538に記載されている手順に従って単離した。
【００３９】
バシラス形質転換及びＤＮＡ単離
Bron (1990)"Plasmids": Molecular Biological Methods for Bacillus, Harwood, CR, Cutting, SM, eds., series Modern Microbiological Methods, JohnWiley & Sons, Chichester, UKに記載されているように、異種バシラス種の形質転換及びこれらの種由来プラスミド又は染色体ＤＮＡの単離を行った。B.サチリス BS-154 (CBS 363.94)の形質転換の場合受容能力をもつ細胞を用い、B.リケニホルミス T5 (CBS 470.83)の形質転換の場合プロトプラスト形質転換を用いた。ネオマイシン選択の場合には、濃度２０μg/mlを用いた。B.サチリス形質転換細胞のアセトアミド選択の場合、カザアミノ酸及び酵母エキスが２０mMアセトアミドに置き換えられた最少培地寒天を用いた。B.リケニホルミス形質転換細胞のアセトアミド選択の場合、硫酸アンモニウムが２０mMアセトアミドに置き換えられたプロトプラスト再生培地を用いた。
【００４０】
ａｍｄＳ選択マーカーの除去
アスペルギルス、トリコデルマ及びペニシリウムに関するほとんどの例におけるａｍｄＳマーカーをアミログルコシダーゼ遺伝子の３′非コーディング領域の一部からなる反復間でクローン化する。ａｍｄＳ選択マーカーに隣接する３′ｇｌａＡ非コーディング反復間での内部組換えあるいは単一交差結果による組込みによって生じる反復間での相同的組換えにより、ａｍｄＳ選択マーカーを除去する。ａｍｄＳ選択マーカーを消失した細胞は、フルオロアセトアミドを含有するプレート上で発育させることにより選択する。ａｍｄＳ遺伝子がある細胞は、フルオロアセトアミドを細胞に有毒なアンモニウム及びフルオロアセテートに代謝する。従って、ａｍｄＳ遺伝子を消失した細胞のみがフルオロアセトアミドを含有するプレート上で発育することができる。
【００４１】
アスペルギルス形質転換細胞からａｍｄＳマーカーを除去する場合には、これらの形質転換細胞の胞子を１０mMアセトアミドの代わりに３２mMフルオロアセトアミド及び５mM尿素、１M スクロースの代わりに1.１％グルコース及び２％細菌学的寒天 #1 (Oxoid, England)の代わりに1.１％を含有する再生選択培地（上記）に塗布した。３５℃で７−１０日間発育させた後、単一コロニーを回収し、0.４％ジャガイモデキストロース寒天(Oxoid, England)上に塗布した。トリコデルマ形質転換細胞からａｍｄＳマーカーを除去する場合には、これらの形質転換細胞の胞子を１０mMフルオロアセトアミドで補足した非選択最少培地プレート（１リットル当たり：２０ｇのグルコース、５ｇの（ＮＨ4)2 ＳＯ4 、１５ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、0.６ｇのＭｇＳＯ4 、0.６ｇのＣａＣｌ2 、0.００５ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2 Ｏ、0.００１６ｇのＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ、0.００１４ｇのＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、0.００２ｇのＣｏＣｌ2 ；ｐＨ5.５）に塗布した。３０℃で５−１０日後、コロニーを収集し、0.４％ジャガイモデキストロース寒天(Oxoid, England)に塗布した。
ペニシリウム形質転換細胞からａｍｄＳを除去する場合には、これらの形質転換細胞の胞子を1.５％細菌学的寒天 #1 (Oxoid, England)で固化した１０mMフルオロアセトアミド及び５％グルコースを含むアスペルギルス最少培地からなる選択培地プレート上に塗布した。２５℃で５−１０日発育させた後、耐性コロニーが出現した。
【００４２】
A.ニガー形質転換細胞によるグルコアミラーゼ生産の決定
胞子又は菌糸を製造業者の説明書に従って調製したＰＤＡプレート（ジャガイモデキストロース寒天, Oxoid）上に塗布して、組換え体及び対照A.ニガー株の胞子を集めた。３０℃で３−７日間発育させた後、プレートに0.０１％トリトン X-100を加えて胞子を集めた。滅菌水で洗浄した後、約１０7 胞子の選択形質転換細胞及び対照菌株を１リットル当たり３０ｇのマルトース・Ｈ Ｏ；５ｇの酵母エキス；１０ｇの加水分解カゼイン；１ｇのＫＨ2 ＰＯ4;0.５ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ；３ｇのトゥイーン 80;１０mlのペニシリン（５０００IU/ml）／ストレプトマイシン（５０００UG/ml）；ｐＨ5.５を含有する２０mlの液状予備培養基を含む振盪フラスコに植菌した。これらの培養物を３４℃で２０−２４時間発育させた。５−１０mlのこの培養物を１リットル当たり７０ｇのマルトデキストリン；２５ｇの加水分解カゼイン；１2.５ｇの酵母エキス；１ｇのＫＨ2 ＰＯ4;２ｇのＫ2 ＳＯ4;0.５ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ；0.０３ｇのＺｎＣｌ2;0.０２ｇのＣａＣｌ2;0.０１ｇのＭｎＳＯ4 ・４Ｈ2 Ｏ；0.３ｇのＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ；１０mlのペニシリン（５０００IU/ml）／ストレプトマイシン（５０００UG/ml）を含有し４N Ｈ2 ＳＯ4 でｐＨ5.６に調整した１００mlの発酵培地に植菌した。これらの培養物を３４℃で５−１０日間発育させた。発酵中種々の時点でグルコアミラーゼ生産を分析するために、試料を採取した。この発酵ブイヨン試料を遠心（１０分，１0,０００×ｇ）し、上清を集めた。
【００４３】
0.０３２M ＮａＡＣ／ＨＡＣｐＨ4.０５中１０μl の６倍希釈試料の培養上清を0.０３２M ＮａＡＣ／ＨＡＣｐＨ4.０５中１１５μl の0.２％(w/v) p-ニトロフェニルα−Ｄ−グルコピラノシド (Sigma)とインキュベートすることにより、グルコアミラーゼ活性を求めた。室温で３０分インキュベートした後、５０μlの0.３M Ｎａ2 ＣＯ3 を加え、波長４０５nmの吸収を測定した。Ａ405nm は、ＡＧ生産の尺度である。
【００４４】
ａｍｄＳｃＤＮＡのクローニング
A.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子は、３種の小さなイントロンを含んでいる(Corrickら (1987) Gene 53, 63-71) 。これらのイントロンの酵母内スプライシングの不正確さ又は細菌内スプライシングの欠如に起因する問題を避けるために、酵母及び細菌において発現するａｍｄＳｃＤＮＡを用いた。A.ニドゥランスポリＡ+ ＲＮＡ標品由来ａｍｄＳ遺伝子のクローニングは、 Corrickら((1987), Gene53, 63-71)に記載されている。本実施例においては、A.ニガー NRRLL 3135 形質転換細胞 #4 を用い、プラスミドｐＡＦ２−２Ｓを含むA.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子の多重コピーによって形質転換した (van Hartingsveldら (1993) Gene 127, 87-94)。 Auffrayら((1980) Eur.J.Biochem. 107, 303-314)を変更した方法による直接ＬｉＣｌ沈降で全ＲＮＡを単離した。A.ニガー胞子が発芽し、炭素源としてグルコース及び単独の窒素源としてアセトアミドで補足した最少培地(Cove (1966) Biochim. Biophys. Acta 113, 51-56) 中３７℃で一晩発育させた。
【００４５】
菌糸が得られ、ろ過で乾燥し、次に基礎とされるべき液体窒素で凍結した。この粉末を０℃で３M ＬｉＣｌ、６M 尿素に分散し、４℃で一晩維持した。１6,０００ｇで３０分間遠心しフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（５０：４８：２）で２連続抽出した後、全細胞ＲＮＡを得た。ＲＮＡをエタノールで沈降し、１mlの１０mMトリスＨＣｌ（ｐＨ7.４) 、0.５％ＳＤＳに溶解した。ポリＡ+ 選択の場合、全ＲＮＡ試料を６５℃で５分間加熱し、次にオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに加えた。１０mMトリスＨＣｌｐＨ7.４、0.５％ＳＤＳ及び0.５M ＮａＣｌを含有する溶液で数回洗浄した後、ポリＡ+ ＲＮＡを１０mMトリスＨＣｌｐＨ7.４及び0.５％ＳＤＳで溶離して集め、エタノールで沈降した。約５μg のポリＡ+ ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）プライマーで開始される逆転写の鋳型として用いた。反応混合液（５０mMトリスＨＣｌｐＨ7.６、１０mMＤＴＴ、６mMＭｇＣｌ2 、８０mMＫＣｌ、0.２mM各ｄＮＴＰ及び0.１mgＢＳＡ/ml)を５００単位のマウスＭＬＶ逆転写酵素（ＢＲＬ）及び７５単位のＴＮａｓｅインヒビター(Promega)と１００μl 量で３７℃で３０分間インキュベートした。
【００４６】
別の２００単位の逆転写酵素を加え、この反応を３０分間続けた。この混合液をクロロホルムで抽出し、0.２５M 酢酸アンモニウムの存在下にエタノールで沈降した。この第一鎖ｃＤＮＡの混合物を次のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型として用いてａｍｄＳｃＤＮＡを増幅した。このゲノムａｍｄＳ配列を用いて２合成オリゴヌクレオチドを設計し、このＰＣＲのプライマーとして用いた：
AB3100 (配列番号１）：
5′- CTAATCTAGAATGCCTCAATCCTGAA - 3′（ＸｂａＩ部位が前にあるヌクレオチド−３〜＋１６及び他の４ヌクレオチドのａｍｄＳ特異的配列）。
AB3101 (配列番号２）：
5′- GACAGTCGACAGCTATGGAGTCACCACA - 3′（別のＳａｌＩ部位が隣接したヌクレオチド１９１１〜１８８４のａｍｄＳ停止コドンの下流に位置したａｍｄＳ特異的配列）。
【００４７】
ＰＣＲ反応は、鋳型として１０％のｃＤＮＡ混合液及びプライマーとして各々0.１μg のオリゴ AB3100(配列番号１）及び AB3101(配列番号２）を用いて行った。変性（１００℃で７分）及び1.３単位Ｔａｑポリメラーゼを加えた後、反応混合液を２５増幅サイクル（各サイクル：９４℃で２分、５５℃で２分及び７２℃で３分）に供した。最後のサイクルでは、伸長段階が長く（７分）全長フラグメントを合成した。得られたＤＮＡフラグメントをＸｂａＩ及びＳａｌＩで消化し、ｐＵＣ１８のＸｂａＩ／ＳａｌＩ部位にサブクローン化した。得られたプラスミドをｐａｍｄＳ−１と称した（図１R>１参照）。プラスミドｐａｍｄＳ−１を制限分析すると、ａｍｄＳｃＤＮＡにおいてイントロンの不在及びエキソンの正しい融合が確認された。
【実施例１】
【００４８】
ａｍｄＳ遺伝子を用いることによるA.ニガー遺伝子のマーカー遺伝子を含まない欠失
本実施例においては、二重交差相同的組換えによりA.ニガーゲノムに組込む置換ベクターでA.ニガーを形質転換することにより、A.ニガーにおけるゲノム標的遺伝子を置換する。置換ベクターは、ＤＮＡ反復が隣接した選択可能なマーカー遺伝子によって分断された標的遺伝子座に相同なＤＮＡ領域を含んでいる。本実施例において、プラスミドｐＧＢＤＥＬ４ＬはｇｌａＡコーディング領域及びｇｌａＡプロモーター領域の一部を欠失するために用いられる。本ベクターはA.ニガーｇｌａＡゲノム遺伝子座の一部を含んでおり、ここでｇｌａＡコーディング配列及びｇｌａＡプロモーター配列の一部は直列反復として３′非翻訳ｇｌａＡ配列が隣接した選択マーカーとしてA.ニドゥランスｇｐｄＡプロモーターの調節によってA.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子に置換される。A.ニガーを本ベクターで形質転換すると、ｇｌａＡ遺伝子がａｍｄＳマーカー遺伝子に置き換えられる。実験法で記載されているようにこれらの形質転換細胞でフルオロアセタミド逆選択を行うことにより、ａｍｄＳマーカー遺伝子は３′ｇｌａＡＤＮＡ反復間の内部組換え結果により適切に欠失され、マーカー遺伝子を含まないΔｇｌａＡ組換え体株を生じ、最後には外来ＤＮＡ配列を全く有しない（模式図として図２参照）。
【００４９】
ｇｌａＡ遺伝子置換ベクターｐＧＢＤＥＬ４Ｌの簡単な説明
遺伝子置換ベクターｐＧＢＤＥＬ４Ｌは、５′部分のA.ニガーアミログルコシダーゼ（ｇｌａＡ）プロモーター領域、全部で３種類の読み枠内に停止コドンを生じる１６ｂｐの合成ＤＮＡ配列、A.ニドゥランスグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｇｐｄＡ）プロモーターの調節によるA.ニドゥランスアセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子を含み、両側に３′ｇｌａＡ非コーディング配列が隣接する。
【００５０】
ｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築経路
最終欠失ベクターｐＧＢＤＥＬ４Ｌを得るために、まずｇｌａＡ遺伝子座のサブクローンを誘導した。模式図は図３及び４に示されている。A.ニガーのｇｌａＡ遺伝子座は分子クローン化されており、以前に記載されている（欧州特許第0463 706 A1号）。プラスミドｐＡＢ６−１は、ｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ部位でクローン化された１5.５kbのＨｉｎｄＩＩＩフラグメント上にA.ニガー由来の全ｇｌａＡ遺伝子座を含んでいる (Yanisch-Perronら, Gene 33 (1985) 103-119及び例えばBoehringer Mannheim, Germanyから入手できる）。ｐＡＢ６−１をＥｃｏＲＩで消化し、ｇｌａＡ遺伝子のすぐ上流の1.８kbのＥｃｏＲＩＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、ＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１９に連結し、次にE.コリに移して分子クローン化した。得られたプラスミドはｐＡＢ６−３と称した（図３）。ｐＡＢ６−１の別のサブクローンであるプラスミドｐＡＢ６−４を構築するために、ｐＡＢ６−１をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩで消化した。ｇｌａＡプロモーター及びｇｌａＡコーディング配列の一部を含む4.６kbサイズのＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩで前に消化したｐＵＣ１９に連結した（図４）。結果としてｐＡＢ６−４内のＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩ部位は本クローニング操作で適切に破壊された。
【００５１】
引き続き、プラスミドｐＡＢ６−４をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化しかつE.コリＤＮＡポリメラーゼを用いて５′付着末端を挿入した後、1.８kbのｇｌａＡプロモーターＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、ＥｃｏＲＩで部分的に消化しかつE.コリＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を作成したｐＡＢ６−３に連結し、その連結混合物を分子クローニングのためにE.コリに移した。誘導プラスミド（ｐＡＢ６−３１と称する）は、中間のＥｃｏＲＩ部位が破壊された3.６kbのｇｌａＡプロモーターフラグメントを含むが、ｇｌａＡＡＴＧ開始部位のすぐ上流になお（本ＤＮＡフラグメントにおいてユニークな）ＥｃｏＲＩ部位を有する（図５）。
本明細書で用いられるA.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子は、プラスミドｐＧＷ３２５内の約４kbサイズのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩフラグメント上に位置する(Wernarsら, thesis (1986) Agricultural University, Wageningen, The Netherlands) 。ａｍｄＳ遺伝子を含みそれ自体の調節配列が隣接したこのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩＤＮＡフラグメントを Verdoesら(Transgenic Res. 2 pp 84-92, 1993)に記載されているｐＵＣ１９の適切な部位に分子クローン化して、ｐＡＮ４−１を得る。ｐＡＮ４−１をＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化し、ａｍｄＳ遺伝子を含む４kbサイズのＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化したｐＡＢ６−３１に連結し、連結混合物を分子クローニングのためにE.コリに移した。得られたプラスミドをｐＡＢ６Ｓと称し（図６）、3.８kbｇｌａＡプロモーターＤＮＡフラグメント及び４kbａｍｄＳフラグメントを含んでいる。
【００５２】
プラスミドｐＡＢ６ＳをまずＳａｌＩで部分的に消化し、下記配列を有する合成誘導オリゴヌクレオチド TN0001(配列番号３）に連結し、次いでＥｃｏＲＩで消化した。
TN0001 (配列番号３）: 5′TCGATTAACTAGTTAA 3′
ｐＵＣ１９、ｇｌａＡプロモーター及びａｍｄＳ遺伝子配列を含むＤＮＡフラグメントを精製し、アガロースゲル電気泳動で単離した。ＳａｌＩで消化したプラスミドｐＡＢ６−１から2.２kb３′隣接ｇｌａＡＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で同様に単離し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、次にＥｃｏＲＩで消化し、ｐＡＢ６Ｓの上記単離ＤＮＡフラグメントに連結した上記合成オリゴヌクレオチドに連結した。ＤＮＡ連結混合物をE.コリに移し、分子クローン化した。この誘導プラスミドをｐＧＢＤＥＬ１と称し、図７に示されている。この手順によって同時にＳａｌＩ制限部位が破壊され、全読み枠に停止コドンが導入された。
【００５３】
ｇｌａＡ遺伝子の停止コドンのすぐ下流に位置した３′ｇｌａＡ非コーディングＤＮＡ配列を含み適切な制限部位が隣接した約１kbの大きなＤＮＡフラグメントを得るために、ＰＣＲ増幅を行った。本ＰＣＲ増幅においては、プラスミドｐＡＢ６−１を鋳型として、下記の２種類の合成誘導オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた：
オリゴ AB2154 （配列番号４）：
5′AACCATAGGGTCGACTAGACAATCAATCCATTTCG 3′
(停止コドンのすぐ下流に３′ｇｌａＡ非コーディング配列）及び
オリゴ AB2155 （配列番号５）：
5′GCTATTCGAAAGCTTATTCATCCGGAGATCCTGAT 3′
(停止コドンの約１kb下流ＥｃｏＲＩ部位の前後に３′ｇｌａＡ非コーディング配列）。
【００５４】
Saikiら(Science 239,487-491, 1988) に記載され、ＴＡＱポリメラーゼ(Cetus) の製造業者に従ってＰＣＲを行った。ＤＮＡアンプリファイア(Perkin-Elmer/Cetus)で２５増幅サイクル（各々５５℃で２分；７２℃で３分及び９４℃で２分）を行った。１kb増幅ＤＮＡフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製し、エタノール沈降し、次にｐＧＢＤＥＬ１のＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩ制限部位にクローン化した。このようにして得られたプラスミドをｐＧＢＤＥＬ２と称した（図８及び９）。
【００５５】
最終ｇｌａＡ遺伝子置換ベクターｐＧＢＤＥＬ４Ｌを得るために、ｐＧＢＤＥＬ２のａｍｄＳプロモーター領域を強力なA.ニドゥランスｇｐｄＡプロモーターで交換した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により、ｇｐｄＡプロモーター配列をａｍｄＳ遺伝子のコーディング配列に融合した。本ＰＣＲ融合の場合、２種類の鋳型を用いた：A.ニドゥランスｇｐｄＡプロモーター及びA.ニドゥランスｔｒｐＣターミネーターの調節によってE.コリｈｐｈ遺伝子を含むプラスミドｐＡＮ７−１ (Puntら, Gene 56, 117-124, 1987) 及びそれ自体の調節配列の調節によってA.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子を含むプラスミドｐＡＮ４−１。プライマーとして４種の合成オリゴヌクレオチドを用い、下記配列を有した：オリゴ AB2977 （配列番号６）：
5′TATCAGGAATTCGAGCTCTGTACAGTGACC 3′
(E.コリｈｐｈ遺伝子のＡＴＧ開始コドンの下流約８８０bpに位置した５′ｇｐｄＡプロモーター特定オリゴヌクレオチド）
オリゴ AB2992 （配列番号７）：
5′GCTTGAGCAGACATCACCATGCCTCAATCCTGGGAA 3′
オリゴ AB2993 （配列番号８）：
5′TTCCCAGGATTGAGGCATGGTGATGTCTGCTCAAGC 3′
(両配列は相互に相補的であり、１８bpの３′端のｇｐｄＡプロモーター及び１８bpの５′部分のａｍｄＳコーディング領域を含む）
オリゴ AB2994 （配列番号９）：
5′CTGATAGAATTCAGATCTGCAGCGGAGGCCTCTGTG 3′
(ＡＴＧ開始コドンの約１７５bp下流のＢｇｌＩＩ部位にａｍｄＳ特定配列）
【００５６】
８８０bpｇｐｄＡプロモーター領域にａｍｄＳコーディング配列に融合するために、２つの別個のＰＣＲを行った：鋳型としてｐＡＮ７−１及びプライマーとしてオリゴヌクレオチド AB2977(配列番号６）及び AB2993(配列番号８）を用いた５′端のａｍｄＳ遺伝子に相補的な１８ヌクレオチドが３′周辺に隣接したｇｐｄＡプロモーターを含む８８０bpＤＮＡフラグメントを増幅する第１増幅及び鋳型としてｐＡＮ４−１及びプライマーとしてオリゴヌクレオチド AB2992(配列番号７）及び AB2994(配列番号９）を用いた３′端のｇｐｄＡプロモーターに相補的な１８ヌクレオチドが５′周辺に隣接した５′部分のａｍｄＳ遺伝子を含む２００bpサイズのＤＮＡフラグメントを増幅する第２ＰＣＲ反応。これらの増幅の模式図は図１０に示されている。引き続き作成した２フラグメントをアガロースゲル電気泳動で精製し、エタノール沈降し、プライマーとしてオリゴヌクレオチド AB2977(配列番号６）及び AB2994(配列番号９）を用いた第３ＰＣＲ反応における鋳型として用いた。得られたＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製し、エタノール沈降し、ｐＴＺ１８Ｒ(United States Biochemicals)のＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。得られたプラスミドをｐＧＢＧＬＡ２４と称した（図１１）。
ｐＧＢＤＥＬ２のａｍｄＳプロモーターをｇｐｄＡプロモーター配列に交換するために、適切な制限酵素で消化した後ｐＧＢＧＬＡ２４の約１kbサイズのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、ｐＧＢＤＥＬ２のＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩ部位に連結した。得られたｇｌａＡ遺伝子置換ベクターをｐＧＢＤＥＬ４Ｌと称した（図１２）。
【００５７】
A.ニガーにおけるｇｌａＡプロモーター及びコーディング配列の欠失
A.ニガーをｐＧＢＤＥＬ４Ｌで形質転換する前に、E.コリ配列をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ消化及びアガロースゲル電気泳動で除去した。A.ニガー株 CBS 513.88(1988年10月10日寄託）を選択プレートにおいて単独のＮ源としてアセトアミドを用いる実験法で記載した手順で2.５、５又は１０μg ＤＮＡフラグメントで形質転換した。A.ニガー単一形質転換細胞をアセトアミド含有選択最少プレート上で数回精製した。個々の形質転換細胞を0.４％ジャガイモデキストロース(Oxoid, England)上３０℃で約５日間発育させることにより胞子を集めた。切断型ｇｌａＡ遺伝子座の存在を証明するためにサザン分析を行った。数個の形質転換細胞の高分子量ＤＮＡを単離し、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化し、次に0.７％アガロースゲル電気泳動で分別した。ニトロセルロースフィルターに移した後、ハイブリッド形成を２種の32Ｐ標識プローブ：プラスミドｐＡＢ６−４（上記図３）から単離したＸｈｏＩ／ＳａｌＩｇｌａＡプロモーターフラグメント及びキシラナーゼ内在配列（欧州特許出願第 0 463 706 A号) を認識するプローブを用いて標準手順に従って行った。４種の形質転換細胞(#19、#23 、#24 、#41)及び対照株A.ニガー CBS 531.88 の結果が例として図１３及び１４に示されている。このオートラジオグラフィーを更に良く理解するために、模式図が図１７に示され、自然型及び切断型ｇｌａＡ遺伝子座におけるハイブリッド形成フラグメントのサイズが示されている。
【００５８】
自然型ｇｌａＡ遺伝子座の特徴はＢａｍＨＩ消化物中3.５kbのハイブリッド形成フラグメント及びＫｐｎＩ消化物中4.５kbのハイブリッド形成フラグメントである（図１５参照）。切断型ｇｌａＡ遺伝子座においては、3.５kbのＢａｍＨＩハイブリッド形成フラグメント及び4.５kbのＫｐｎＩハイブリッド形成フラグメントが存在せず、5.５kbのＢａｍＨＩハイブリッド形成フラグメント及び6.３kbのＫｐｎＩハイブリッド形成フラグメントに置き換えられる。図１３及び１４でわかるように本実施例においては、形質転換細胞 #19が切断型ｇｌａＡ遺伝子座の予想されたパターンを示している（図１６）。本形質転換細胞をＧＢＡ−１０２と称した。
ｇｌａＡ遺伝子の置換は他の形質転換細胞では起きなかった。不十分なハイブリッド形成バンド：ＫｐｎＩ消化物中４、８及び１５kb及びＢａｍＨＩ消化物中７及び１２kbは、内部対照としてのキシラナーゼ配列を意味する。
【００５９】
フルオロアセトアミド含有プレート上逆選択によるA.ニガーＧＢＡ−１０２からａｍｄＳ遺伝子の除去
形質転換細胞A.ニガーＧＢＡ−１０２内ａｍｄＳ遺伝子を実験の項で記載されているように除去した。染色体ＤＮＡのサザン分析により、２生存組換え体株にのみａｍｄＳ選択マーカー遺伝子の除去が証明された。高分子量ＤＮＡを単離し、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化し、次に0.７％アガロースゲル電気泳動で分離した。ニトロセルロースに移した後、前項で記載したプローブを用いて標準手順に従ってハイブリッド形成した。ハイブリッド形成フラグメントの模式図は図１７に示されている。サザン分析の結果は、図１６に示されている。5.２kbのハイブリッド形成ＢａｍＨＩフラグメント及び3.４kbのハイブリッド形成ＫｐｎＩフラグメントの存在及び5.５kbのＢａｍＨＩフラグメント及び6.３kbのハイブリッド形成ＫｐｎＩフラグメントのロスは、ａｍｄＳ選択マーカーが存在しないことに特異的である。ハイブリッド形成の弱いＢａｍＨＩ消化物中７及び１２kbフラグメント及び４、８及び１５kbＫｐｎＩはキシラナーゼ内在遺伝子座を意味する。両株は予想されたパターンを示している。ＧＢＡ−１０７及びＧＢＡ−１０８と称されるこれらの組換え体株においては、好ましいｇｌａＡ配列が正しく除去され、最後に選択マーカー遺伝子を全く有しない。同種のベクターを用いることにより他の遺伝子又はＤＮＡ要素を欠失又は挿入するために両株を用いることもできる。
【実施例２】
【００６０】
A.ニガーＧＢＡ−１０７における切断型ｇｌａＡ遺伝子座の３′ｇｌａＡ非コーディング領域で標的にしたｇｌａＡ遺伝子のマーカー遺伝子を含まない導入
本実施例においては、A.ニガーのゲノムへの遺伝子の導入は、上記実施例で記載されたほぼ同様の方法及び手順を用いて記載される。所望の遺伝子又はＤＮＡ要素の他に、ベクターは単一交差結果によって宿主の予め特定されたゲノム遺伝子座のベクターを標的にする宿主ゲノムに相同なＤＮＡ配列を含んでいる。この種類のベクターは、同様にＤＮＡ反復が隣接した選択マーカー遺伝子を含んでいる。本ベクターで誘導された形質転換細胞内選択マーカー遺伝子は、抵抗選択法を用いることによっても適切に除去することができる。例としてｇｌａＡ遺伝子コピーの導入が記載され、実施例１で誘導した組換え体ΔｇｌａＡA.ニガーＧＢＡ−１０７株における切断型ｇｌａＡ遺伝子座に組込まれる（模式図として図１８及び１９参照）。
【００６１】
ｇｌａＡ組込みベクター：ｐＧＢＧＬＡ３０の説明
組込みベクターｐＧＢＧＬＡ３０は、３′ｇｌａＡ非コーディング配列が隣接した未変性プロモーターの調節によるA.ニガーアミログルコシダーゼ（ｇｌａＡ）遺伝子及びA.ニドゥランスｇｐｄＡプロモーターの調節によるA.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子からなり、３′ｇｌａＡ非コーディング領域に組込みかつ逆選択によりａｍｄＳ選択マーカー遺伝子を除去する。
組込みベクターの構築
ｐＡＢ６−１由来の1.８kbＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩｇｌａＡプロモーターフラグメント（図２０）をｐＴＺ１９Ｒ(United States Biochemicals)のＳｍａＩ及びＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化した。ｇｌａＡプロモーターフラグメントのＸｈｏＩ部位の突出５′端をE.コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて挿入した後、ｐＴＺ１９Ｒでクローン化した。このクローニング操作によってＳｍａＩ部位が破壊され、ＸｈｏＩ部位が回復する。このようにして得られたプラスミドをｐＧＢＧＬＡ５と称した（図２０）。
【００６２】
適切な制限部位（ＡａｔＩＩ、ＳｎａＢＩ、ＡｓｎＩ及びＮｏｔＩ）を導入しかつｇｌａＡプロモーターのＸｈｏＩ部位を破壊するために、下記の２種のオリゴヌクレオチド AB3657(配列番号１０）及び AB3658(配列番号１１）からなる合成フラグメントをｐＧＢＧＬＡ５のＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ部位に挿入した： 
5′AGCTTGACGTCTACGTATTAATGCGGCCGCT      3′ AB3657 
3′    ACTGCAGATGCATAATTACGCCGGCGAAGCT  5′ AB3658
このようにして得られたプラスミドをｐＧＢＧＬＡ２６と称した（図２１）。
【００６３】
次いで、ｇｌａＡプロモーターの残りの３′部分、ｇｌａＡコーディング配列及び３′ｇｌａＡ非コーディング配列の一部を含むｐＡＢ６−１由来の3.４kbのＥｃｏＲＩフラグメントをｐＧＢＧＬＡ２６のＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。この新しいプラスミドをｐＧＢＧＬＡ２７と称した（図１５）。このプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、下記オリゴヌクレオチド AB3779(配列番号１２）及びAB3780(配列番号１３）からなる合成フラグメントをｇｌａＡ遺伝子の３′ｇｌａＡ非コーディング配列の端のＥｃｏＲＩ部位に挿入した：
5′ AATTGGGGCCCATTAACTCGAGC      3′AB3779
3′     CCCCGGGTAATTGAGCTCGTTAA  5′AB3780
本クローニング段階により、ＥｃｏＲＩ部位が破壊され、ＡｐａＩ及びＸｈｏＩ制限部位が導入された。得られたプラスミドをｐＧＢＧＬＡ４２と称した（図１６R>６）。2.２kbの３′ｇｌａＡ非コーディング配列の増幅及び適切な制限部位の付随した調整をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって行った。
【００６４】
これらのＰＣＲ反応においては、鋳型として全ｇｌａＡ遺伝子座を含むプラスミドｐＡＢ６−１を用い、プライマーとして下記配列を有する４種の合成オリゴヌクレオチドが設計された：
オリゴ AB3448 （配列番号１４）：
5′GTGCGAGGTACCACAATCAATCCATTTCGC 3′
(ｇｌａＡ遺伝子の停止コドンのすぐ下流に３′ｇｌａＡ非コーディング特定配列）
オリゴ AB3449 （配列番号１５）：
5′ATGGTTCAAGAACTCGGTAGCCTTTTCCTTGATTCT 3′
(停止コドンの約１kb下流のＫｐｎＩ部位に３′ｇｌａＡ非コーディング特定配列）
オリゴ AB3450 （配列番号１６）：
5′AGAATCAAGGAAAAGGCTACCGAGTTCTTGAACCAT 3′
(停止コドンの約１kb下流のＫｐｎＩ部位に３′ｇｌａＡ非コーディング特定配列）
オリゴ AB3520 （配列番号１７）：
5′ATCAATCAGAAGCTTTCTCTCGAGACGGGCATCGGAGTCCCG 3′
(停止コドンの約2.２kb下流に３′ｇｌａＡ非コーディング特定配列）
【００６５】
ｇｌａＡ遺伝子の停止コドンの約１kb下流のＫｐｎＩ部位を破壊しかつｇｌａＡ遺伝子の停止コドンの約2.２kb下流のＳａｌＩ部位をＸｈｏＩ部位に変えるために、２つの別個のポリメラーゼ連鎖反応を行った：プライマーとしてオリゴヌクレオチド AB3448 （配列番号１４）及び AB3449 （配列番号１５）を用いてｇｌａＡ遺伝子の停止コドンのすぐ下流に約１kbのＤＮＡフラグメントを増幅する第１反応及びプライマーとしてオリゴヌクレオチド AB3450 （配列番号１６）及び AB3520 （配列番号１７）を用いて鋳型としてｐＡＢ６−１を共に用いて３′ｇｌａＡ非コーディング領域のＫｐｎＩ部位のすぐ下流に約1.２kbのＤＮＡフラグメントを増幅する第２反応。これらの増幅の模式図は図２４に示されている。ＰＣＲは実施例１に記載されているように行った。２５増幅サイクル（各々５５℃で１分；７２℃で1.５分及び９４℃で１分）を行った。
【００６６】
２つの作成したＰＣＲＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で精製し、エタノール沈降し、引き続きプライマーとしてオリゴヌクレオチド AB3448 （配列番号１４）及び AB3520 （配列番号１７）を用いる第３ＰＣＲの鋳型として用い融合フラグメントを作成した。ＤＮＡアンプリファイア(Perkin-Elmer/Cetus)において２５増幅サイクル（各々５５℃で２分；７２℃で３分及び９４℃で２分）を行った。増幅したＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で精製し、エタノール沈降し、引き続きｐＴＺ１８ＲのＳｍａＩ部位でサブクローン化した。得られたプラスミドをｐＧＢＧＴＬＡ１７と称した（図２５）。この調整した３′ｇｌａＡ非コーディング領域をａｍｄＳ遺伝子に融合するために、ａｍｄＳ遺伝子の一部をｐＧＢＤＥＬ４ＬからｐＳＰ７３ (Promega)にサブクローン化した。この構築の場合、ｐＧＢＤＥＬ４ＬをＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、3.４kbのａｍｄＳ／３′ｇｌａＡ非コーディングフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、ｐＳＰ７３ (Promega)の適切な部位にサブクローン化した。得られたプラスミドをｐＧＢＧＬＡ２１と称した（図２６）。
【００６７】
このプラスミドの約１kbサイズの３′ｇｌａＡ非コーディング領域をｐＧＢＧＬＡ２１の2.２kbの３′ｇｌａＡ非コーディング領域に交換した。ｐＧＢＧＬＡ１７及びｐＧＢＧＬＡ２１をＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ｐＧＢＧＬＡ１７の2.２kbの３′ｇｌａＡ非コーディング領域ＤＮＡフラグメント及びｐＧＢＧＬＡ２１の4.９kbのＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、連結し、引き続き連結混合物をE.コリに移すことにより分子クローン化した。このようにして誘導されたプラスミドをｐＧＢＧＬＡ２２と称した（図２７）。伸長した３′ｇｌａＡ非コーディング領域を有するａｍｄＳ遺伝子をｇｐｄＡプロモーターで完了し、ａｍｄＳ遺伝子の残りの部分に融合した。ｐＧＢＧＬＡ２２をＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、4.４kbのａｍｄＳ／３′ｇｌａＡ非コーディング領域ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、引き続きＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＧＢＧＬＡ２４で消化し、E.コリに移した。このようにして誘導されたプラスミドをｐＧＢＧＬＡ２５と称した（図２８）。
【００６８】
ｐＧＢＧＬＡ２５をＥｃｏＲＩで部分的に消化し、ｇｐｄＡプロモーターのＥｃｏＲＩ部位において下記の２種のオリゴヌクレオチド AB3781 （配列番号１８）及び AB3782 （配列番号１９）からなる合成フラグメントを挿入した：
5′ AATTGGGGCCCAGCGTCC      3 ′AB3781
3′     CCCCGGGTCGCAGGTTAA  5 ′AB3782
この新しいプラスミドをｐＧＢＧＴＬＡ４３と称した（図２９）。このクローニング段階のために、ｇｐｄＡプロモーターのすぐ前のＥｃｏＲＩ制限部位がＡｐａＩ制限部位の導入によって破壊された。
プラスミドｐＧＢＧＬＡ４３をＡｐａＩ及びＸｈｏＩで消化し、ｇｐｄＡプロモーター／ａｍｄＳ遺伝子／３′ｇｌａＡ非コーディング領域を含む5.３kbのＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、引き続きＡｐａＩ及びＸｈｏＩで消化したｐＧＢＧＬＡ４２と連結し、E.コリに移した。この誘導プラスミドをｐＧＢＧＬＡ２８と称した（図３０）。
【００６９】
クローニングの前に、３′ｇｌａＡ非コーディング領域ＤＮＡフラグメント（ｇｌａＡ遺伝子の停止コドンの約2.２kb下流に位置し、３″ｇｌａＡ非コーディング領域を示す）を増幅し、ＰＣＲ法を用いて適切な制限部位を設けた。このＰＣＲ反応の場合、鋳型としてプラスミドｐＡＢ６−１を用い、プライマーとして下記配列を有する２種のオリゴヌクレオチドを設計した：オリゴ AB3746 （配列番号２０）：
5′TGACCAATAAAGCTTCTCGAGTAGCAAGAAGACCCAGTCAATC 3 ′
(ｇｌａＡ遺伝子の停止コドンの約2.２kb下流に位置したＳａｌＩ部位に部分的３″ｇｌａＡ非コーディング特定配列）
オリゴ AB3747 （配列番号２１）： 
5′CTACAAACGGCCACGCTGGAGATCCGCCGGCGTTCGAAATAACCAGT3′
(ｇｌａＡ遺伝子の停止コドンの約4.４kb下流に位置したＸｈｏＩ部位に部分的３″ｇｌａＡ非コーディング特定配列）
【００７０】
ＤＮＡアンプリファイア(Perkin-Elmer/Cetus)において２５増幅サイクル（各々５５℃１分；７２℃1.５分；９４℃１分）を行った。この増幅の模式図は、図３１に示されている。このようにして得られたＤＮＡフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製し、エタノール沈降し、ｐＴＺ１９ＲのＨｉｎｄＩＩＩ部位に両方向でサブクローン化した。得られたプラスミドをｐＧＢＧＬＡ２９Ａ及びｐＧＢＧＬＡ２９Ｂと称した（図３１及び３２）。最終段階は、ｐＧＢＧＬＡ２９Ａの３″ｇｌａＡ非コーディング配列をプラスミドｐＧＢＧＬＡ２８に挿入することを含んでいる。これを達成するために、ｐＧＢＧＬＡ２９ＡをＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化した。2.２kbサイズの３′ｇｌａＡ非コーディング領域フラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、引き続きＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化したｐＧＢＧＬＡ２８に連結し、E.コリに移した。この誘導組込みベクターをｐＧＢＧＬＡ３０と称した（図３３）。
【００７１】
組込みベクターｐＧＢＧＬＡ３０によるA.ニガー GBA-107の形質転換
形質転換の前に、ＸｈｏＩ消化及びアガロースゲル電気泳動により組込みベクターｐＧＢＧＬＡ３０からE.コリ配列を除去した。A.ニガー株 GBA-107を実験の項で記載された手順により５又は１０μg ＤＮＡフラグメントで形質転換した。A.ニガー単一形質転換細胞をアセトアミド含有選択プレートで数回精製した。個々の形質転換細胞を0.４％ジャガイモデキストロース(Oxoid, England)上３０℃で約５日間発育させることにより胞子を集めた。内在切断型ｇｌａＡ遺伝子座の３′ｇｌａＡ非コーディング領域への組込みが生じたかを証明するためにサザン分析を行った。数個の形質転換細胞の高分子量ＤＮＡを単離し、ＫｐｎＩ又はＢｇｌＩＩで消化し、引き続き0.７％アガロースゲル電気泳動で分別した。ニトロセルロースフィルターに移した後、標準法に従ってハイブリッド形成した。プローブとしてプラスミドｐＡＢ６−４（上記実施例１）から単離した32Ｐ標識約0.７kbのＸｈｏＩ／ＳａｌＩｇｌａＡプロモーターフラグメントを用いた。３種の形質転換細胞(#107-5 、#107-9及び#107-7) 及び対照菌株A.ニガーGBA107及びその祖先A.ニガーCBS 531.88の結果が例として図３４に示されている。このオートラジオグラフィーを更に良く理解するために、模式図が図３５、３６及び３７に示され、自然型ｇｌａＡ遺伝子座、切断型ｇｌａＡ遺伝子座及び単一ｐＧＢＧＬＡ３０コピーが予め特定された３′ｇｌａＡ非コーディング領域に組込まれた切断型ｇｌａＡ遺伝子座のハイブリッド形成フラグメントのサイズが示されている。
【００７２】
自然型ｇｌａＡ遺伝子座の特徴はＫｐｎＩ消化物中4.５kbのハイブリッド形成フラグメント及びＢｇｌＩＩ消化物中１０kbのハイブリッド形成フラグメントである。A.ニガー GBA-107の切断型ｇｌａＡ遺伝子座の特徴は、ＫｐｎＩ消化物中3.４kbのハイブリッド形成フラグメント及びＢｇｌＩＩ消化物中１３kbのハイブリッド形成フラグメントである。ｐＧＢＧＬＡ３０ベクターを切断型ｇｌａＡ遺伝子座の３′領域に組込む場合には、ＫｐｎＩ消化物中3.４kbのハイブリッド形成フラグメントの他に6.７kbのハイブリッド形成フラグメントが予想され、ＢｇｌＩＩ消化物中１３kbのハイブリッド形成フラグメントが存在せず、１4.５kbのハイブリッド形成フラグメントに置き換えられる。図３４でわかるように、形質転換細胞 #107-5 及び #107-9 が切断型ｇｌａＡ遺伝子座の予め特定された３′非コーディング領域に組込まれた単一ｐＧＢＧＬＡ３０コピーの予想されたハイブリッド形成パターンを示している。形質転換細胞 #107-7 のハイブリッド形成パターンは、ｐＧＢＧＬＡ３０コピーを別のA.ニガー GBA-107のゲノムに組込むことを示している。ｐＧＢＧＬＡ３０コピーが正しく組込まれた形質転換細胞をGBA-119及び GBA-122と称し、ａｍｄＳ選択マーカー遺伝子を引き続き適切に除去するために用いた。
【００７３】
フルオロアセトアミド含有プレート上の逆選択によるA.ニガー GBA-119及び GBA-122由来ａｍｄＳ遺伝子の除去
形質転換細胞A.ニガー GBA-119及び GBA-122内ａｍｄＳ選択マーカー遺伝子を実験の項で記載されているように除去した。染色体ＤＮＡのサザン分析により、若干の生存組換え体菌株にａｍｄＳ選択マーカー遺伝子の除去が証明された。高分子量ＤＮＡを単離し、ＫｐｎＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、引き続き0.７％アガロースゲル電気泳動で分離した。ニトロセルロースに移した後、標準手順に従ってハイブリッド形成した。プローブとしてプラスミドｐＧＢＧＬＡ２９Ａ（上記図３３）から単離した32Ｐ標識2.２kbのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ３″ｇｌａＡ非コーディングフラグメントを用いた。
【００７４】
ハイブリッド形成フラグメントの模式図は図３５〜３８に示されている。A.ニガー GBA-119 (#AG5-5、#AG5-6及び#AG5-7) 由来の３生存組換え体菌株及びA.ニガー GBA-122 (#AG9-1、#AG9-2及び#AG9-4) 由来の３生存組換え体菌株及び対照菌株A.ニガー CBS 531.88 及びA.ニガー GBA-107の結果が図３９及び４０に示されている。
菌株A.ニガー CBS 531.88 においては、ＫｐｎＩ消化物中に6.９kbのハイブリッド形成フラグメントが存在し、ＢｇｌＩＩ消化物中に6.９kbのハイブリッド形成フラグメントが存在する。A.ニガー GBA-107株においては、ＫｐｎＩ消化物中に6.９kbのハイブリッド形成フラグメントが存在し、ＢｇｌＩＩ消化物中に１３kbのハイブリッド形成フラグメントが存在する。３′ｇｌａＡ非コーディング領域に組込まれたｐＧＢＧＬＡ３０単コピーを有するA.ニガー株 GBA-119及び GBA-122においては、ＫｐｎＩ消化物中に８kb及び6.７kbのハイブリッド形成バンドが存在し、ＢｇｌＩＩ消化物中には、１4.５kb及び7.６kbのハイブリッド形成バンドが存在する。
【００７５】
ＫｐｎＩ消化物中6.７kb及び8.５kbのハイブリッド形成フラグメントの存在及び８kbのハイブリッド形成フラグメントの付随したロスはａｍｄＳ選択マーカー遺伝子の正しい除去に特異的である。ＢｇｌＩＩ消化物中、１4.５kb及び6.７kbのハイブリッド形成フラグメント及び7.６kbのハイブリッド形成フラグメントの付随したロスはａｍｄＳ選択マーカー遺伝子が存在しないことに特異的である。図３９及び４０でわかるように、#AG5-7、#AG5-5、#AG9-1及び#AG9-4は、正しく除去されたａｍｄＳ選択マーカー遺伝子の予想されたハイブリッド形成パターンを示している。これらの菌株を各々 GBA-120、 GBA-121、 GBA-123及び GBA-124と称した。#AG5-6及び#AG9-2株のハイブリッド形成パターンは全ｐＧＢＧＬＡ３０コピーのロスを示し、切断型ｇｌａＡ遺伝子座のみ有するA.ニガー GBA-107親株を生じる。
振盪フラスコ発酵においてA.ニガー GBA-120、 GBA-121、 GBA-123及び GBA-124株のグルコアミラーゼ生産能を試験した。対照株としてA.ニガー CBS 531.88、GBA-107 、GBA-119 及び GBA-122を試験した。振盪フラスコ発酵及びグルコアミラーゼアッセイを実験の項で記載されているように行った。 GBA-119〜 GBA-124株においては、１５０−２００U/mlで変動するレベルが測定された。これらのグルコアミラーゼレベルは予想され、形質転換されない野生型親株A.ニガー CBS531.88 で得られたレベルに匹敵するものであった。
【実施例３】
【００７６】
A.ニガー GBA-107における切断型ｇｌａＡ遺伝子座の３′ｇｌａＡ非コーディング領域で標的にしたフィターゼ遺伝子のマーカー遺伝子を含まない導入
本実施例においては、A.ニガーゲノムへの遺伝子の導入が上記実施例で記載されたほぼ同様の方法及び手順を用いて記載される。主な違いは、問題の遺伝子及び選択マーカー遺伝子が２種類のベクター上に位置しかつこれらのベクターがA.ニガーに同時形質転換することである。問題の遺伝子あるいはマーカー遺伝子の他に、ベクターは単一交差結果によって宿主の予め特定されたゲノム遺伝子座でベクターを標的にする宿主ゲノムに相同なＤＮＡ配列を含んでいる。これらの（同時）形質転換細胞でフルオロアセトアミド逆選択を行うことにより（実験手順に記載されているように）、ａｍｄＳマーカー遺伝子は単一交差結果による組込みで生じるＤＮＡ反復間の内部組換え結果により適切に欠失される。
【００７７】
同時形質転換に用いられるベクターの説明
問題の遺伝子を有するｐＧＢＧＬＡ５３は、３′ｇｌａＡ非コーディング配列が隣接したA.ニガーグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）プロモーターの調節によるA.ficuumフィタ遺伝子からなり、３′ｇｌａＡ非コーディング領域に組込まれる。選択マーカー遺伝子を有するベクターｐＧＢＧＬＡ５０は、３′ｇｌａＡ非コーディング配列が隣接したA.ニドゥランスｇｐｄＡプロモーターの調節によるA.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子からなり、３′ｇｌａＡ非コーディング領域に組込まれる。
ｐＧＢＧＴＬＡ５０の構築経路
ｐＧＢＧＬＡ５０の構築は、１クローニング段階を含んでいる。プラスミドｐＧＢＧＬＡ２９ＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、付着端をE.コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて挿入した。次いで、2.２kbの３″ｇｌａＡ非コーディング領域フラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、次にＡｐａＩで消化しかつＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を作成したｐＧＢＧＬＡ４３に連結し、E.コリに移した。正しい方向の３″ｇｌａＡ非コーディング領域ＤＮＡフラグメントを有するこの誘導プラスミドをｐＧＢＧＬＡ５０と称した（図４１）。
【００７８】
ｐＧＢＧＬＡ５３の構築経路
ｐＧＢＧＬＡ５３の構築経路における第１段階は、A.ficuumフィターゼE.coliのほぼ全コーディング配列に融合したｇｌａＡプロモーターを含む２フラグメントのサブクローニングである。これを達成するために、プラスミドｐＧＢＧＬＡ４２をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、1.８kbのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ５′ｇｌａＡプロモーターフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離した。プラスミドｐＦＹＴ３（欧州特許第0 420 358 A1号) をＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、フィターゼ遺伝子の５′部分に融合したｇｌａＡプロモーターの３′部分を含む1.６kbのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、ｐＧＢＧＬＡ４２から単離した1.８kbのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ５′ｇｌａＡプロモーターフラグメントと共にｐＳｐ７３(Promega) のＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩ部位に連結した。得られたプラスミドをｐＧＢＧＬＡ４９と称した（図４２）。
【００７９】
次の段階は、ｐＧＢＧＬＡ４９への３′ｇｌａＡ非コーディング領域ＤＮＡフラグメントのクローニングである。クローニングの前に、本３′ｇｌａＡ非コーディング領域ＤＮＡフラグメント（ｇｌａＡ遺伝子の停止コドンの約2.２kb下流に位置する）を増幅し、ＰＣＲ法を用いる適切な制限部位を設けた。これらのＰＣＲ反応の場合、鋳型としてプラスミドｐＡＢ６−１を用い、プライマーとして下記配列を有する２種の合成オリゴヌクレオチドが設計された：オリゴ AB4234 （配列番号２２）：
5′GAAGACCCAGTCAAGCTTGCATGAGC 3′
(ｇｌａＡ遺伝子の停止コドンの約2.２kb下流に位置した３′ｇｌａＡ非コーディング配列）
オリゴ AB4235 （配列番号２３）：
5′TGACCAATTAAGCTTGCGGCCGCTCGAGGTCGCACCGGCAAAC 3′
(ｇｌａＡ遺伝子の停止コドンの約4.４kb下流に位置した３′ｇｌａＡ非コーディング配列）
【００８０】
ＤＮＡアンプリファイア(Perkin-Elmer)において２５増幅サイクル（各々９４℃１分；５５℃１分；７２℃1.５分）を行った。この増幅の模式図は、図４３に示されている。このようにして得られたＤＮＡフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製し、ｐＴＺ１９ＲのＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローン化した。得られたプラスミドをｐＧＢＧＬＡ４７と称した（図４４）。プラスミドｐＧＢＧＬＡ４７をＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、2.２kbの３′ｇｌａＡ非コーディングＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、ｐＧＢＧＬＡ４７のＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩ部位にクローン化した。得られたプラスミドをｐＧＢＧＬＡ５１と称した（図４５）。
【００８１】
ｐＧＢＧＬＡ５３の構築経路の最終段階は、ｇｌａＡ遺伝子の停止コドンのすぐ下流に位置する３′ｇｌａＡ非コーディングＤＮＡフラグメントに融合したフィターゼコーディング配列の残りの部分を含むＤＮＡフラグメントのクローニングである。クローニングの前に、フィターゼ遺伝子の残りの部分とｇｌａＡ遺伝子の停止コドンのすぐ下流に位置する３′ｇｌａＡ非コーディングＤＮＡフラグメントを融合し、ＰＣＲ法に用いる適切な制限部位を設けた。ＰＣＲ反応においては、鋳型としてプラスミドｐＡＢ６−１を用い、プライマーとして下記配列を有する２種の合成オリゴヌクレオチドを用いた：
オリゴ AB4235 （配列番号２４）：
5′TGACCAATAAAGCTTAGATCTGGGGGTGATTGGGCGGAGTGTTTTGCTT AGACAATCAATCCATTTCGC 3′
（ＢｇｌＩＩ部位で開始するフィターゼコーディング配列からｇｌａＡ遺伝子の停止コドンのすぐ下流で開始する３′ｇｌａＡ非コーディング領域に融合した停止コドンまでの３６bp）
オリゴ AB4233 （配列番号２５）：
5′TGACCAATAGATCTAAGCTTGACTGGGTCTTCTTGC 3′
(ｇｌａＡ遺伝子の停止コドンの約2.２kb下流に位置した３′ｇｌａＡ非コーディング配列）
【００８２】
ＤＮＡアンプリファイア(Perkin-Elmer)において２５増幅サイクル（各々９４℃１分；５５℃１分；７２℃1.５分）を行った。この増幅の模式図は、図４６に示されている。このようにして得られたＤＮＡフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製し、ｐＴＺ１９ＲのＨｉｎｄＩＩＩ部位に両方向でサブクローン化した。得られたプラスミドをｐＧＢＧＬＡ４８及びｐＧＢＧＬＡ５２と称した（図４４R>４）。プラスミドｐＧＢＧＬＡ５２をＢｇｌＩＩで消化し、ＢａｍＨＩで部分的に消化し、2.２kbのフィターゼ／３′ｇｌａＡ非コーディングＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し、ｐＧＢＧＬＡ５１のＢｇｌＩＩ部位にクローン化した。この正しい方向に2.２kbのフィターゼ／３′ｇｌａＡ非コーディングＤＮＡフラグメントを有する誘導プラスミドをｐＧＢＧＬＡ５３と称した（図４８）。
【００８３】
ベクターｐＧＢＧＬＡ５０及びｐＧＢＧＬＡ５３によるA.ニガー GBA-107の形質転換
形質転換の前に、ＸｈｏＩ又はＨｉｎｄＩＩＩ消化及びアガロースゲル電気泳動によりベクターｐＧＢＧＬＡ５０及びｐＧＢＧＬＡ５３からE.コリ配列を除去した。A.ニガー GBA-107株を実験の項で記載された形質転換手順を用いて１μgｐＧＢＧＬＡ５０フラグメント及び１μg ｐＧＢＧＬＡ５３フラグメント、１μg ｐＧＢＧＬＡ５０フラグメント及び５μg ｐＧＢＧＬＡ５３フラグメント又は１μg ｐＧＢＧＬＡ５０フラグメント及び１０μg ｐＧＢＧＬＡ５３フラグメントで形質転換した。
【００８４】
実施例２と同様の消化物及びプローブを用いて、単一形質転換細胞を単離、精製し、サザン分析を行ってｐＧＢＧＬＡ５０及びｐＧＢＧＬＡ５３の両組込みを証明した。分析した形質転換細胞の約１０−２０％で両ｐＧＢＧＬＡ５０及びｐＧＢＧＬＡ５３がA.ニガー GBA-107宿主株のゲノムに組込まれた。切断型ｇｌａＡ遺伝子座の予め特定された３′ｇｌａＡ非コーディング領域に共に組込まれた単コピーｐＧＢＧＬＡ５０及び単コピーｐＧＢＧＬＡ５３の正しい組込みパターンを示す形質転換細胞を用いて、ａｍｄＳ選択マーカー遺伝子を除去した。
フルオロアセトアミド含有プレート上の逆選択によるａｍｄＳマーカー遺伝子の除去
フルオロアセトアミド逆選択を行うことにより（実験手順に記載されるように）、単一交差結果による組込みによって生じるＤＮＡ反復間の内部組換え結果によってａｍｄＳマーカー遺伝子を欠失した（即ち３′ｇｌａＡ非コーディング配列）。実施例２と同様の消化物及びプローブを用いたサザン分析により、ａｍｄＳマーカー遺伝子のみの適切な除去を証明した。
【実施例４】
【００８５】
A.オリゼにおけるｇｌａＡ遺伝子及びフィターゼ遺伝子のマーカー遺伝子を含まない導入
本実施例は、A.オリゼ NRRL3485 におけるｇｌａＡ遺伝子又はフィターゼ遺伝子のマーカー遺伝子を含まない導入を記載するものである。実施例２及び３と同様のベクター及び方法を用いて実験の項で記載されているように、A.オリゼ NRRL3485 を形質転換した。単一形質転換細胞を単離、精製し、数種の形質転換細胞の染色体ＤＮＡのサザン分析を行ってｐＧＢＧＬＡ３０ベクター又はｐＧＢＧＬＡ５０及びｐＧＢＧＬＡ５３ベクターの各々の組込みを証明した。サザン分析においては、実施例２と同様の消化物及びプローブを用いた。
【００８６】
フルオロアセトアミド含有プレート上の逆選択によるａｍｄＳ遺伝子の除去
ｐＧＢＧＬＡ３０ベクターの組込みの場合、宿主株A.オリゼ NRRL3485 のゲノムに組込まれたｐＧＢＧＬＡ３０の単コピーを有する形質転換細胞を用いてａｍｄＳ遺伝子を適切に除去した。フルオロアセトアミド含有プレート上の逆選択を実験の項で記載されているように行った。数種のフルオロアセトアミド耐性株の染色体ＤＮＡのサザン分析により、ａｍｄＳ遺伝子の正しい除去を証明した。実施例２と同様の消化物及びプローブを用いた。
ｐＧＢＧＬＡ５０及びｐＧＢＧＬＡ５３ベクターの組込みの場合、宿主ゲノムに組込まれたｐＧＢＧＬＡ５０及びｐＧＢＧＬＡ５３の双方の単コピーを有する形質転換細胞を用いてａｍｄＳマーカー遺伝子を適切に除去した。フルオロアセトアミドプレートを用いた逆選択を実験の項で記載されているように行った。実施例２と同様の消化物及びプローブを用いた数種のフルオロアセトアミド耐性株の染色体ＤＮＡのサザン分析により、ａｍｄＳマーカー遺伝子（例えばｐＧＢＧＬＡ５０ベクター）の正しい除去を証明した。。
【実施例５】
【００８７】
T.リーサイにおけるｇｌａＡ遺伝子及びフィターゼ遺伝子のマーカー遺伝子を含まない導入
本実施例は、T.リーサイ株 QM9414 (ATCC 26921)におけるｇｌａＡ遺伝子又はフィターゼ遺伝子のマーカー遺伝子を含まない導入を記載するものである。実施例２及び３と同様のベクター及び方法を用いて実験の項で記載されているように、T.リーサイ QM9414 を形質転換した。単一形質転換細胞を単離、精製し、形質転換細胞の染色体ＤＮＡのサザン分析を行ってｐＧＢＧＬＡ３０ベクター又はｐＧＢＧＬＡ５０及びｐＧＢＧＬＡ５３ベクターが各々組込まれるかを証明した。サザン分析においては、実施例２と同様の消化物及びプローブを用いた。
【００８８】
フルオロアセトアミド含有プレート上の逆選択によるａｍｄＳ遺伝子の除去
ｐＧＢＧＬＡ３０ベクターの組込みの場合、宿主株T.リーサイ QM9414 のゲノムに組込まれたｐＧＢＧＬＡ３０の単コピーを有する形質転換細胞を用いてａｍｄＳ遺伝子を適切に除去した。フルオロアセトアミド含有プレート上の逆選択を実験の項で記載されているように行った。フルオロアセトアミド耐性株の染色体ＤＮＡのサザン分析により、ａｍｄＳ遺伝子の正しい除去を証明した。実施例２と同様の消化物及びプローブを用いた。
ｐＧＢＧＬＡ５０及びｐＧＢＧＬＡ５３ベクターの組込みの場合、宿主ゲノムに組込まれたｐＧＢＧＬＡ５０及びｐＧＢＧＬＡ５３の双方の単コピーを有する形質転換細胞を用いてａｍｄＳマーカー遺伝子を適切に除去した。フルオロアセトアミドプレートを用いた逆選択を実験の項で記載されているように行った。実施例２と同様の消化物及びプローブを用いた数種のフルオロアセトアミド耐性株の染色体ＤＮＡのサザン分析により、ａｍｄＳマーカー遺伝子（例えばｐＧＢＧＬＡ５０ベクター）の正しい除去を証明した。
【実施例６】
【００８９】
選択マーカーとしてａｍｄＳ遺伝子を用いた同時形質転換によるP.クリストゲナム(P.chrysogenum) 遺伝子のP.クリストゲナムへのマーカー遺伝子を含まない導入
本実施例には、同時形質転換によりP.クリストゲナムのゲノムへ遺伝子をマーカー遺伝子を含まずに導入することが記載される。
同時形質転換法においては、２種類のＤＮＡがプロトプラストに与えられ、１つが実験の項で記載されているようにその存在で第１形質転換細胞選択が起こるａｍｄＳ選択マーカーであり、１つは問題の具体的な酵素をコードする別の種類の問題のＤＮＡである。多数の形質転換細胞においては、両種のＤＮＡが染色体に組込み、安定に維持され、発現される。
次いで、実験の項で記載されているように逆選択手順を用いることによりａｍｄＳ選択マーカー遺伝子を精製形質転換細胞から選択的に除去することができ、もう１つのＤＮＡは形質転換細胞の染色体に安定に組込まれたままである。この方法の一般応用性を説明する例として、ｎｉａＤ遺伝子のマーカー遺伝子を含まない導入が記載され、単独窒素源として硝酸塩上でｎｉａＤ宿主を発育させることが可能である。
【００９０】
この同時形質転換用宿主は、硝酸塩レダクターゼがなく従って単独の窒素源として硝酸塩を含有するプレート上で発育させることができないP.クリストゲナムｎｉａＤ株である。これらの菌株は、周知の方法により容易に得ることができる(Goukaら, Journal of Biotechnology 20(1991), 189-200及びその中の参考文献) 。
同時形質転換（実験の項で記載されている手順）で、２種類のＤＮＡが同時にプロトプラストに与えられる：ａｍｄＳ選択マーカー遺伝子を含むｐＧＢＧＬＡ２８の7.６kbのＥｃｏＲＩ制限フラグメント及びP.クリストゲナムｎｉａＤ遺伝子を含むｐＰＣ１−１の6.５kbのＥｃｏＲＩ制限フラグメント。形質転換前に、両フラグメントはアガアロースゲル電気泳動でE.コリベクター配列から分離されており、電子溶離によりアガロースゲルから精製されている。実験の項で記載されているように、単独の窒素源としてアセトアミドを含有する選択プレート上で形質転換細胞の第１選択が起こる。
形質転換細胞の中で、同時形質転換細胞は単独の窒素源として硝酸塩を含有するプレートで精製形質転換細胞の胞子をレプリカ培養することにより見出される。典型的にはレプリカ培養形質転換細胞の約２０−６０％がこの培地上で発育させることができ、これらの形質転換細胞においてａｍｄＳ選択マーカー遺伝子だけでなくｎｉａＤ遺伝子もゲノムに組込まれており、発現される。
【００９１】
フルオロアセトアミド含有プレート上での逆選択によるａｍｄＳ遺伝子の除去
引き続きフルオロアセトアミドの逆選択により同時形質転換細胞からａｍｄＳ選択マーカー遺伝子を除去する。
ａｍｄＳ- ／ｎｉａＤ+ 表現型の直接選択の場合、用いられる培地は１０mMフルオロアセトアミドを含有した。１プレートにつき１０4 胞子の濃度で胞子を塗布した。２５℃で５−７日間インキュベートした後、フルオロアセトアミド耐性コロニーがぼんやりした背景と明らかに異なる固形コロニーとして確認することができた。組換え体のｎｉａＤ+ 表現型は単独の窒素源として硝酸塩を含有するフルオロアセトアミド培地上で発育することにより証明される。組換え体のａｍｄＳ表現型は、単独の窒素源としてアセトアミドを含有するプレート上で組換え体の発育がないことで確認された。典型的には、塗布した胞子の最初の数の0.１−２％が所望の表現型を示した。
フルオロアセトアミド耐性株由来の染色体ＤＮＡのサザン分析により、ａｍｄＳ選択マーカー遺伝子がP.クリソゲナムゲノムから除去されたことを確認した。
【実施例７】
【００９２】
酵母クルイベロミセスラクチスのａｍｄＳマイナス表現型の試験
K.ラクチスにおけるａｍｄＳ選択系使用の必要条件は、本酵母がアセトアミダーゼ活性を含まないことである。これを試験するために、下記の３種類の固形培地にK.ラクチス株 CBS 683及び CBS 2360 を塗布した：
Ｉ 窒素源を除くすべての必須栄養分及びビタミンを含む酵母炭素ベース（ＹＣＢ, Difco)。
ＩＩ ５mMアセトアミドで補足したＹＣＢ。
ＩＩＩ 0.１％(w/v) ＮＨ4(ＳＯ4)2 で補足したＹＣＢ。
３培地はすべて1.２％(w/v) Oxoid 寒天(Agar No.1) 及びｐＨ7.０の３０mMリン酸ナトリウムバッファーを含有した。Difco ＹＣＢは1.１７％(w/v) で用いた。
十分に増殖したK.ラクチスコロニーは窒素源としてアンモニウムを含有する培地にのみ認められた。窒素源なし又は単独の窒素源としてアセトアミドを含むプレートでは、増殖が全く見られないかあるいは時にわずかなバックグラウンド増殖が見られ、これは微量の窒素が混入している寒天又は他の培地成分に起因すると思われる。K.ラクチス株は共に単独の窒素源としてのアセトアミド上で発育を維持する十分なアセトアミド活性がないことが結論される。
【実施例８】
【００９３】
ａｍｄＳ遺伝子を酵母において使用するためのプラスミドの構築ｐＧＢａｍｄＳ１の構築
以前には、K.ラクチスにおけるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の発現にｐＧＢＨＳＡ２０が用いられている (Swinkelsら 1993, Antonie van Leeuwenhoek 64,187-201) 。ｐＧＢＨＳＡ２０において、ＨＳＡｃＤＮＡはK.ラクチスＬＡＣ４プロモーターから誘導される（プラスミドｐＧＢＨＳＡ２０の物理的地図として図４９）。ＨＳＡｃＤＮＡは３′端にＬＡＣ４ターミネーターが隣接される。形質転換細胞の選択の場合、ｐＧＢＨＳＡ２０はS.セレビシエＡＤＨ１プロモーター(Bennetzen, Hall (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025)で誘導された抗生物質Ｇ４１８(Geneticin, BRL)(Reissら (1984) EMBO J. 3, 3317-3322) に対する耐性を付与するＴｎ５ホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含んでいる。ＬＡＣ４プロモーターのユニークなＳｓｔＩＩ部位においては、ｐＧＢＨＳＡ２０はE.コリでの増幅に用いられるE.コリベクターｐＴＺ１９Ｒを含んでいる。K.ラクチスに形質転換する前に、ＳｓｔＩＩ消化及びアガロースゲル精製によりｐＧＢＨＳＡ２０からｐＴＺ１９Ｒを除去する。ＬＡＣ４プロモーターのＳｓｔＩＩ部位で線状のｐＧＢＨＳＡ２０をK.ラクチスに形質転換すると、相同的組換えによりゲノムＬＡＣ４プロモーターに組込まれることになる。ｐＧＢａｍｄＳ１は、ＨＳＡｃＤＮＡをｐａｍｄＳ１のａｍｄＳｃＤＮＡに置き換えることによりｐＧＢＨＳＡ２０誘導される。ＰＣＲを用いて、ａｍｄＳｃＤＮＡの５′及び３′端にＳａｌＩ部位を導入した。このＰＣＲにおいては、鋳型としてｐａｍｄＳ１を用い、プライマーとしてオリゴ AB3514 （配列番号２６）及び AB3515 （配列番号２７）を用いた。
【００９４】
オリゴ AB3514 （配列番号２６）：
5′CTGCGAATTCGTCGACATGCCTCAATCCTGGG 3 ′
（導入したＳａｌＩ部位を有する５′端ａｍｄＳ特定配列）
オリゴ AB3515 （配列番号２７）：
5′ GGCAGTCTAGAGTCGACCTATGGAGTCACCACATTTC 3′
（導入したＳａｌＩ部位を有する３′端ａｍｄＳ特定配列）
このようにして得られたＰＣＲフラグメントをＳａｌＩで消化し、ｐＧＢＨＳＡ２０のＳａｌＩ／ＸｈｏＩ部位にクローン化した。制限分析で判定される２方向のいずれかのａｍｄＳｃＤＮＡを含む数種のクローンを得た。正しい向きのａｍｄＳｃＤＮＡを有するクローンの１種がｐＧＢａｍｄＳ１であり、その物理的地図が図４９に示されている。
【００９５】
ｐＧＢａｍｄＳ３の構築
S.セレビシエ延長因子１−α遺伝子（ＥＦ１−α；Nagataら (1984) EMBO J.3, 1825-1830) から誘導されたプローブを用いて異種ハイブリッド形成することにより、Ｋ１ＥＦ１と呼ばれるＥＦ１−α遺伝子のK.ラクチス相同染色体を含むゲノムクローンを単離した。本実施例においては、Ｋ１ＥＦ１プロモーターを含む８１３bpフラグメントを用いてａｍｄＳｃＤＮＡをK.ラクチスで発現した。オリゴヌクレオチド AB3701 （配列番号２８）及び AB3700 （配列番号２９）を用いて、鋳型としてK.ラクチス株 CBS 683由来のゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲにおいて本フラグメントを増幅した。 AB3700 （配列番号２９）は、Ｋ１ＥＦプロモーターの２１ヌクレオチド及びａｍｄＳ遺伝子のＡＴＧ開始コドンの上流に３８ヌクレオチドを含むように設計される。 AB3701 （配列番号２８）及び AB3700（配列番号２９）の配列を示す：
オリゴ AB3701 （配列番号２８）： 
5′CTGCGAATTCGTCGACACTAGTGGTACCATTATAGCCATAGGACAGCAAG 3′
(プロモーターの５′端に他の制限部位ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｅＩ及びＫｐｎＩを有する５′Ｋ１ＥＦ１特定プロモーター配列）
オリゴ AB3700 （配列番号２９）：
5′GCTCTAGAGCGCGCTTATCAGCTTCCAGTTCTTCCCAGGATT-GAGGCATTTTTAATGTTACTTCTCTTGC 3′
(制限部位ＢｓｓＨ２及び他の部位ＸｂａＩを有するａｍｄＳｃＤＮＡの５′配列に融合した３′Ｋ１ＥＦ１特定プロモーター配列）。
【００９６】
標準条件を用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲフラグメントをＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化し、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ消化ｐＴＺ１９Ｒにサブクローン化した。得られたプラスミドｐＴＺＫ１ＥＦ１の物理的地図は図５０に示されている。ａｍｄＳｃＤＮＡの残りの部分及びＬＡＣ４ターミネーター配列の部分をｐＧＢａｍｄＳ１からＢｓｓＨ２及びＳｐｈＩで消化することにより得た。本ＢｓｓＨ２−ＳｐｈＩフラグメントをＢｓｓＨ２及びＳｐｈＩ消化ｐＴＺＫ１ＥＦ１にクローン化し、得られたプラスミドをｐＧＢａｍｄＳ２と称した（図５０）。最終段階のｐＧＢａｍｄＳ３の構築において、ｐＧＢａｍｄＳ２及びｐＴＹ７５ＬＡＣ４(Das, Hollenberg (1982) Current Genetics 6, 123-128)を共にＳｐｈＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。残りのＬＡＣ４ターミネーター配列を含むｐＧＢａｍｄＳ２の5.７kbＤＮＡフラグメント及びｐＴＹ７５ＬＡＣ４の1.２kbＤＮＡフラグメントをアガロースゲルで精製した後、分別し、次に連結し、E.コリを形質転換するために用いた。ａｍｄＳｃＤＮＡがK.ラクチスＫ１ＥＦ１プロモーターから誘導された得られた発現ベクターをｐＧＢａｍｄＳ３と称した（図５１）。
【００９７】
ｐＧＢａｍｄＳ５の構築鋳型としてｐＧＢＨＳＡ２０を用いるＰＣＲにおいて、S.セレビシエアルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＡＤＨ１）プロモーターをａｍｄＳｃＤＮＡに融合した。プライマーの１つ（AB3703; 配列番号３１）は、ａｍｄＳｃＤＮＡの配列に融合される３′端のＡＤＨ１−プロモーター配列に相補的な配列を含んでいる。もう１つのプライマー（AB3702; 配列番号３０）は、５′端のＡＤＨ１プロモーターを含んでいる：オリゴ AB3702 (配列番号３０）： 
5′CTGCGAATTCGTCGACACTAGTGGTACCATCCTTTTGTTGTTTCCGGGTG 3′
(プロモーターの５′端に他の制限部位ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｅＩ及びＫｐｎＩを有する５′ＡＤＨ１特定プロモーター配列）
オリゴ AB3703 （配列番号３１）：
5′GCTCTAGAGCGCGCTTATCAGCGGCCAGTTCTTCCCAGGAT-TGAGGCATTGTATATGAGATAGTTGATTG 3′
(他の制限部位ＢｓｓＨ２及びＸｂａＩを有する５′ａｍｄＳ配列に融合した３′ＡＤＨ１特定プロモーター配列）。
【００９８】
『タッチダウン』プロトコール(Donら, (1991) Nucleic Acids Res. 19, 4008) を用いてＰＣＲ反応を行った。反応混合物を３０増幅サイクルに供し、アニーリング温度を２サイクル毎に２℃下げ、５５℃を４０℃の『タッチダウン』まで下げ、この温度で１０サイクル以上を行った（サイクル：９４℃で２′、アニーリング２′、７２℃で３′）。得られたＰＣＲフラグメントをＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化し、ｐＴＺ１９Ｒにサブクローンした。得られたプラスミドｐＴＺs.c.ＡＤＨ１は図５２に示されている。ｐＴＺs.c.ＡＤＨ１及びｐＧＢａｍｄＳ３をＫｐｎＩ及びＢｓｓＨ２で消化した。ｐＧＢａｍｄＳ３の6.８kbフラグメント及びｐＴＺs.c.ＡＤＨ１の７５０bpフラグメントをゲル電気泳動で精製し、連結し、E.コリ JM109を形質転換するために用いた。得られた発現ベクターをｐＧＢａｍｄＳ５と称した（図３７）。
【００９９】
ｐＧＢａｍｄＳ５の構築
プラスミドｐＧＢａｍｄＳ３は、Ｋ１ＥＦ１プロモーターの調節による３′端に1.５kbのＬＡＣ４ターミネーター配列が隣接したａｍｄＳｃＤＮＡを含んでいる（図５１R>１）。ｐＧＢａｍｄＳ６は、ＬＡＣ４プロモーターとｐＧＢａｍｄＳ３のａｍｄＳ発現カセットの上流のターミネーター配列の融合を含むフラグメントをクローン化することにより構築される（図５３）。ＬＡＣ４プロモーターとターミネーター配列を融合するために、まずｐＰＴＬＡＣ４を構築した（図５４）。ＰＣＲを用いて、更に６００bpのＬＡＣ４ターミネーターフラグメントの５′及び３′端に導入する。ＰＣＲにおいては、K.ラクチス CBS 683染色体ＤＮＡを用い、プライマーとしてオリゴヌクレオチド AB3704 （配列番号３２）及び AB3705 （配列番号３３）を用いた：
オリゴ AB3704 （配列番号３２）：
5′GCTCTAGAAGTCGAC ACTAGTCTGCTACGTACTCGAGAATTTATACTTAGATAAG 3′
(他の制限部位ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ及びＸｈｏＩを有するＬＡＣ４停止コドンで開始するＬＡＣ４ターミネーター特定配列）
オリゴ AB3705 （配列番号３３）：
5′ TGCTCTAGATCTCAAGCCACAATTC 3′
(他の制限部位ＸｂａＩを有する３′ＬＡＣ４ターミネーター特定配列）。
【０１００】
標準条件を用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲフラグメントをＸｂａＩで消化し、ｐＴＺ１９ＲのＸｂａＩ部位にサブクローン化してｐＴＬＡＣ４を得た（図５４）。ＬＡＣ４プロモーター配列は、ｐＫＳ１０５ (van den Bergら (1990) Bio/Technology 8, 135-139)をＸｂａＩ及びＳｎａＢＩで消化することにより得られる。ＸｂａＩ−ＳｎａＢＩＬＡＣ４プロモーターフラグメントをｐＲＬＡＣ４のＳｐｅＩ／ＳｎａＢＩ部位にクローン化し、ｐＰＴＬＡＣ４と称した（図５４）。最終段階のｐＧＢａｍｄＳ６の構築において、ｐＧＢａｍｄＳ４をＸｂａＩで消化した。ｐＰＴＬＡＣ４の4.１kbのＤＮＡフラグメントをアガロースゲルで精製し、ｐＧＢａｍｄＳ３のＳｐｅＩ部位にクローン化した。得られた遺伝子置換ベクターをｐＧＢａｍｄＳ６と称した（図５３）。
【０１０１】
ｐＧＢａｍｄＳ８の構築プラスミドｐＧＢａｍｄＳ７は、ＬＡＣ４プロモーターの一部及びキモシン発現カセットを含むフラグメントをＬＡＣ４プロモーターとｐＧＢａｍｄＳ６との間にクローン化することにより構築した（図５５）。プラスミドｐＫＳ１０５は、ＬＡＣ４プロモーター (van den Bergら (1990) Bio/Technology 8, 135-139)の調節によるS.セレビシエα因子のプレプロ領域に融合したプロキモシンｃＤＮＡを含んでいる。ＰＣＲを用いて、更に制限部位を融合ＬＡＣ４プロモーターとキモシン発現カセットの５′及び３′端に導入した。ＰＣＲにおいては、鋳型としてｐＫＳ１０５ＤＮＡを用い、プライマーとしてオリゴヌクレオチド AB3965（配列番号３４）及び AB3966 （配列番号３５）を用いた：
オリゴ AB3965 （配列番号３４）：
5′CTGCTACGTAATGTTTTCATTGCTGTTTTAC 3′
(制限部位ＳｎａＢＩで開始するＬＡＣ４プロモーター特定配列）
オリゴ AB3966 （配列番号３５）：
5′ CCGCCCAGTCTCGAGTCAGATGGCTTTGGCCAGCCCC 3′
(他の制限部位ＸｈｏＩを有するキモシン特定配列）。
【０１０２】
標準条件を用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲフラグメントをＳｎａＢ１及びＸｈｏＩで消化した。プラスミドｐＧＢａｍｄＳ６をＸｈｏＩで消化し、次にＳｎａＢＩで消化し、１0.９kbのＤＮＡフラグメントを単離し、ゲル電気泳動で精製した。ＳｎａＢＩ−ＸｈｏＩ融合フラグメントＬＡＣ４プロモーター／キモシン発現カセットをｐＧＢａｍｄＳ６のＳｎａＢＩ／ＸｈｏＩ部位にクローン化した。得られたプラスミドをｐＧＢａｍｄＳ７と称した（図５５）。キモシン遺伝子から開始コドンの約６６bp上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位を破壊するために、ｐＧＢａｍｄＳ７をＨｉｎｄＩＩＩで部分的に消化し、E.コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで処理して平滑末端を作成し、引き続き連結し、分子クローニングのためにE.コリに移した。この誘導プラスミドをｐＧＢａｍｄＳ８と称し、破壊されたＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するＬＡＣ４プロモーターフラグメントを含んでいる。
【実施例９】
【０１０３】
酵母K.ラクチスにおけるＬＡＣ４プロモーターからａｍｄＳｃＤＮＡの発現
発現ベクターｐＧＢａｍｄＳ１は、ａｍｄＳｃＤＮＡとは別に抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する第２選択マーカーを含んでいる。これにより十分に確立された方法であるＧ４１８耐性を用いて形質転換細胞をまず選択することができる(Sreekrishnaら (1984) Gene 28, 73-81) 。このようにして得られた形質転換細胞は引き続きａｍｄＳｃＤＮＡの発現を証明しかつK.ラクチスのａｍｄＳ+選択の条件を最適化するために用いることができる。これらの条件が確立されると、ａｍｄＳ+ 形質転換細胞が例えば発現カセットを用いて選択マーカーなしに直接選択することができる。
【０１０４】
ｐＧＢａｍｄＳ１（図４９）をＳｓｔＩＩ消化によりＬＡＣ４プロモーターで線状にした。分別及びアガロースゲルでの精製によりｐＴＺ１９Ｒ配列を除去した。本ＤＮＡフラグメントの１５μg を用いてIto H.ら (1983) J. Bacteriol.153, 163-168を実験の項で記載された変更をしてK.ラクチス株 CBS 2360 及び CBS 683に形質転換した。形質転換プレートを３０℃で３日間インキュベートした。引き続き両菌株の数個の独立形質転換細胞及び野生型菌株を別の固形培地を含むプレートに線状に塗布した（表１参照）。ＹＥＰＤ及びＹＥＰＤ／Ｇ４１８は実験の項で記載されている。ＹＣＢ、ＹＣＢ／ＮＨ4 及びＹＣＢ／アセトアミドは各々培地Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩとして実施例７に記載されている。ＹＣＢ／ＮＨ4 及びＹＣＢ−ｌａｃ／アセトアミドは各々１％(w/v) ラクトース、ｐＨ7.０の３０mMリン酸ナトリウムバッファー及び0.１％(w/v) ＮＨ4(ＳＯ4)2 あるいは５mMアセトアミドで補足した0.１７％(w/v) 酵母窒素ベース w/oアミノ酸及び硫酸アンモニウム(Difco) を含んでいる。
【０１０５】
CBS 683/ｐＧＢａｍｄＳ１形質転換細胞のａｍｄＳ+ 表現型はＹＣＢ／アセトアミド上で明瞭であった（表１参照）。しかしながら、同様の発現ベクターを含む CBS 2360 形質転換細胞は、ＹＣＢ／アセトアミド上で増殖を示さなかった。種々のK.ラクチス株間のＬＡＣ４プロモーターの調節における炭素源依存差が記載されている(Breunig (1989) Mol.Gen. Genet. 216, 422-427) ので、これはラクトース又はガラクトースが存在しないときのａｍｄＳｃＤＮＡを進めるＬＡＣ４プロモーターの誘導の欠如によるものであると推論された。表１は、実際に単独の炭素源としてラクトース及び単独の窒素源としてアセトアミドを含有する培地上で CBS 2360 形質転換細胞が増殖することができることを示すものである。従って、用いられる炭素源に依存してこれらの形質転換細胞は単独の窒素源としてアセトアミド上で酵母K.ラクチスの増殖を維持するためにA.ニドゥランスａｍｄＳｃＤＮＡを十分に発現することが結論される。
【０１０６】
ＬＡＣ４プロモーターに組込まれたかを証明するためにサザン分析を行った。CBS 2360及び CBS 683形質転換細胞の高分子量ＤＮＡを単離し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次に0.７％アガロースゲルの電気泳動で分別した。ニトロセルロースに移した後、標準手順に従ってハイブリッド形成を行った。プローブとして、プラスミドｐＧＢＨＳＡ２０（図４９）から単離した32Ｐ標識約1.５kbＳａｃＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩＬＡＣ４プロモーターフラグメントを用いた。ＬＡＣ４遺伝子座に組込まれた単一ｐＧＢａｍｄＳ１発現カセットを含む CBS 683及び CBS 2360 形質転換細胞が確認され、各例が図５６R>６に示されており、各々をＫＡＭ−一１及びＫＡＭ−２と称する。ｐＧＢａｍｄＳ１をＬＡＣ４プロモーターに単コピーを組込むと4.２及び8.６kbの２つの新しいＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを作製し、共に形質転換細胞ＫＡＭ−１及びＫＡＭ−２内に存在する。 CBS 683が２ＬＡＣ４遺伝子座を含みかつｐＧＢａｍｄＳ１がＫＡＭ−１でそれらの１つだけに組込まれているので、ＫＡＭ−１の消化物は第２の妨害されないＬＡＣ４遺伝子座から誘導された5.６kbのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントも示している。
【０１０７】
【表１】
2005296019.tif 000002
【実施例１０】
【０１０８】
単独の窒素源としてアセトアミドを用いるK.ラクチス CBS 683及び CBS 2360 形質転換細胞の直接選択
ＳｓｔＩＩ線状ｐＧＢａｍｄＳ１（１５μg ）をIto H.ら((1983) J. Bact. 153, 163-168)に記載されている標準手順を次のように変更してK.ラクチス CBS 683及び CBS 2360 に形質転換した。
− K.ラクチス培養物をＯＤ610 ＝0.５−1.０で形質転換用に収集した。
− ＤＮＡ細胞懸濁液を５分間熱ショック処理した後、平板培養前に３０℃で１５０−１８０分１ml量で表現型発現を行った。種々の培地を両株に用いた。 CBS683の場合、ＹＥＰＤ／ＹＮＢ液（１＊ＹＮＢ（酵母窒素ベース，Difco)、１％バクトペプトン、１％酵母エキス及び２％グルコース）又はＹＮＢ−ｇｌｕ（１％(w/v) グルコース及びｐＨ7.０の３０mMリン酸ナトリウムバッファーで補足した１＊ＹＮＢ（酵母窒素ベース w/oアミノ酸及び硫酸アンモニウム，Difco)) を用いた。このインキュベーション後、細胞を２０００ｇ、室温で５分間遠心し、次にＹＣＢ／アセトアミドに塗布した（実施例７参照）。 CBS 2360 の場合、ＹＮＢ−ｌａｃ（１％(w/v) ラクトース及びｐＨ7.０の３０mMリン酸ナトリウムバッファーで補足した１＊ＹＮＢ（酵母窒素ベース w/oアミノ酸及び硫酸アンモニウム，Difco)) を用いた。このインキュベーション後、細胞を２０００ｇ、室温で５分間遠心し、次にＹＣＢ−ｌａｃ／アセトアミドに塗布した（実施例９参照）。
【０１０９】
３０℃で３日間発育させた。両株にａｍｄＳ+ 形質転換細胞が得られた。見られる形質転換頻度は、Ｇ４１８選択を用いる場合に見られるものに匹敵した。形質転換細胞の正しい同定は、次のＧ４１８を含むＹＥＰＤプレートの平板培養及びサザン分析により確認された。
ａｍｄＳｃＤＮＡがＫ１ＥＦ１プロモーターから進むｐＧＢａｍｄＳ３（図５１）をＸｈｏＩによる消化でＬＡＣ４ターミネーターで線状とし、次に１５μgのゲル単離フラグメントを上記ｐＧＢａｍｄＳ１の CBS 683への形質転換で記載したＹＣＢ／アセトアミドプレートの直接選択を用いてK.ラクチス株 CBS 683に形質転換した。得られた形質転換細胞の若干をサザンブロッティングで分析した。高分子量ＤＮＡを単離し、ＢａｍＨＩで消化し、次に0.７％アガロースゲルの電気泳動で分離した。ニトロセルロースに移した後、標準手順に従ってハイブリッド形成した。プローブとしてプラスミドｐＴＹ７５ＬＡＣ４ターミネーター（実施例８に記載されている）から単離した32Ｐ標識1.２kbＳｐｈＩ／ＨｉｎｄＩＩＩＬＡＣ４ターミネーターフラグメントを用いた。ｐＧＢａｍｄＳ３プラスミドを含む CBS 683形質転換細胞及びｐＧＢａｍｄＳ３プラスミドを含む形質転換細胞の結果は各々図５７及び５８に示されている。対照株 CBS 683は図５８に示されている。 CBS 683形質転換細胞においては、自然型ＬＡＣ４ターミネーターの3.７kbハイブリッド形成フラグメントの他に6.８kbサイズのハイブリッド形成フラグメントが存在する。これは、ＬＡＣ４ターミネーター領域へのプラスミドの正しい組込みを意味する。
【０１１０】
これらの形質転換細胞のすべてにおいて、ＬＡＣ４ターミネーターに１コピー以上で組込まれた（6.８kbのハイブリッド形成フラグメントの強さはベクターの組込まれたコピー数に示される）。構成的Ｋ１ＥＦ１プロモーターが選択マーカーとして有用なａｍｄＳｃＤＮＡを進めることができることも結論される。同様の結果がｐＧＢａｍｄＳ５（図５２）で得られ、ａｍｄＳｃＤＮＡがS.セレビシエＡＤＨ１プロモーターから進められる。
【実施例１１】
【０１１１】
アセトアミド直接選択によるS.セレビシエのｐＧＢａｍｄＳ５による形質転換
本実施例においては、ａｍｄＳｃＤＮＡが他の酵母、例えばS.セレビシエ内で選択マーカーとして用いることができるかを試験した。まず、実施例７のK.ラクチスと同様の培地及び手順を用いて、S.セレビシエ株 D237-10B のａｍｄＳ- 表現型及び単独の窒素源としてアンモニウムの使用能が確立された。K.ラクチスの場合に認められたように、窒素源としてアンモニウムを含むプレートにのみ十分に増殖されたS.セレビシエが見られた。窒素源なし又は単独の窒素源としてアセトアミドを含むプレートにおいては、全く発育しないか又はときどきわずかなバックグラウンド増殖が見られた。ＳｐｈＩで部分的に消化することによりＡＤＨ１プロモーターでプラスミドｐＧＢａｍｄＳ５を線状にした。ｐＧＢａｍｄＳ１をK.ラクチスに形質転換した実施例１０の形質転換手順を用いて、S.セレビシエ株 D273-10B(ATCC 25657) を１５μg のゲル単離線状ｐＧＢａｍｄＳ５フラグメントで形質転換した。形質転換後、この細胞をＹＣＢ／アセトアミドプレート（実施例９参照）に塗布し、３０℃で３日間発育させた。この形質転換でａｍｄＳ+ 形質転換細胞が得られた。引き続きａｍｄＳ形質転換細胞のサザン分析により、ａｍｄＳｃＤＮＡがS.セレビシエゲノムに安定に組込まれたことが確認された。
【０１１２】
高分子量ＤＮＡを単離し、ＢａｍＨＩで消化し、次に0.７％アガロースゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロースでブロットした。プローブとしてｐＧＢａｍｄＳ１から単離した32Ｐ標識７５０bpＥｃｏＲＶａｍｄＳフラグメントを用いた。D273-10B／ｐＧＢａｍｄＳ５形質転換細胞及び対照株D273-10B(ATCC 25657)の結果は図５９に示されている。２ハイブリッド形成フラグメント、各々多コピーフラグメントを表す6.６kbフラグメント及びフランキングを表す不明サイズのハイブリッド形成フラグメントは、D273-10B形質転換細胞内に存在する。予想されるように対照株D273-10B(ATCC 25657)はハイブリッド形成フラグメントを示さない。
【実施例１２】
【０１１３】
フルオロアセタミド逆選択を用いるK.ラクチス及びS.セレビシエａｍｄＳ+ 形質転換細胞からａｍｄＳマーカーの除去
上記実施例においては、単一交差相同的組換えによりａｍｄＳ含有発現カセットがK.ラクチス及びS.セレビシエゲノムに組込まれる。これは、これらのａｍｄＳ酵母形質転換細胞のゲノムの直列反復がａｍｄＳｃＤＮＡに隣接することを意味する。従って、ａｍｄＳｃＤＮＡは、ｃＤＮＡを隣接する直列反復間に低頻度で生じる染色体内有糸分裂組換え結果により形質転換細胞集団の小部分で欠失する。A.ニドゥランスについてHynes, Pateman((1970) Mol. Gen. Genet. 108, 107-116)によって示されているように、ａｍｄＳ+ 細胞に有毒でありａｍｄＳ- に有毒でない化合物、フルオロアセトアミドを含む培地を用いてこれらの結果を選択することが可能でなければならない。ａｍｄＳ+ 細胞においては、フルオロアセトアミドがアンモニア及びフルオロアセテートに変換され、後者は酵素アセチル−ＣｏＡ−シンテターゼによって活性化される。従って、ａｍｄＳ+ 酵母にも作用するフルオロアセタミド逆選択の必要条件は、１）フルオロアセタミドはａｍｄＳ- に有毒であってはならない、２）酵母細胞壁及び原形質膜がフルオロアセタミドに対して透過性でなければならない及び３）酵素アセチル−ＣｏＡ−シンテターゼが活性でなければならないである。
【０１１４】
これを試験するために、ＫＡＭ−１と称するＬＡＣ４プロモーターに組込まれたｐＧＢａｍｄＳ１の単コピーを含むK.ラクチス CBS 683形質転換細胞及びＫＡＭ−２と称するＡＤＨ１プロモーターに組込まれたｐＧＢａｍｄＳ５の単コピーを含むS.セレビシエ D273-10B 形質転換細胞を用いた。ＫＡＭ−１及びＫＡＭ−２双方を選択培地（ＹＣＢ／アセトアミド）で少なくとも３回遺伝的精製に供し、ａｍｄＳ- 親株による混入を排除した。ＫＡＭ−１及びＳＡＭ−１を各々１０mMフルオロアセトアミドで補足したＹＣＢ／ＮＨ4 に１プレート当たり約１０3 CFU の濃度で塗布した。両ＫＡＭ−１及びＳＡＭ−１の場合、３０℃で３〜６日後にフルオロアセトアミド耐性コロニーが現れた。独立したＫＡＭ−１及びＳＡＭ−１誘導ａｍｄＳ- コロニーの染色体ＤＮＡによるサザン分析から、フランキング直列反復間で相同的組換えによりK.ラクチス及びS.セレビシエゲノムからａｍｄＳｃＤＮＡが正しく除去されたことが確認された。事実、ＫＡＭ−１ａｍｄＳ- 組換え体の１種には組換えの交差点が多型性ＨｉｎｄＩＩＩ部位及びａｍｄＳｃＤＮＡ間に位置した。
【０１１５】
この多型性ＨｉｎｄＩＩＩはｐＧＢａｍｄＳ１のＬＡＣ４プロモーターのＬＡＣ４読み枠の９２bp上流に存在するが、この部位はCBS 683 ＬＡＣ４プロモーターに存在しない。組換え結果は、この具体的なＫＡＭ−１組換え体のゲノムにＨｉｎｄＩＩＩ部位が残り、親株 CBS 683と区別することができなかった（図５６、レーン６の4.２kbの余分なフラグメント参照）。従って、このＫＡＭ−１組換え体は、ＫＡＭ−１ａｍｄＳ- 組換え体の代わりにCBS 683 混入物を単離する可能性を排除する。上記のことから、フルオロアセトアミド逆選択を用いて並列反復が隣接した場合の酵母ゲノムからａｍｄＳｃＤＮＡを除去することができることが結論される。本実施例においては、ａｍｄＳ- K.ラクチス及びS.セレビシエ組換え体が約0.１％の頻度で生じる。若干の酵母株の場合、おそらくアセチルＣｏＡ−シンテターゼの強力な炭素カタボライト抑制のために、ＹＣＢ／ＮＨ4 でフルオロアセタミドによる効率のよい逆選択を行うことができないことは特に言及される。これらの場合には、逆選択用に１０mMフルオロアセトアミドで補足したＹＣＢ−ガラクトース／ＮＨ4(この培地は１％ラクトースの代わりに１％ガラクトースを含む以外は実施例９に記載されるＹＣＢ−ｌａｃ／ＮＨ4 と同じものである）が巧く用いられる。
【実施例１３】
【０１１６】
ａｍｄＳマーカーを用いるK.ラクチス遺伝子のマーカー遺伝子を含まない欠失
酵母ゲノムの操作にしばしば用いられる手法は「一段遺伝子破壊」であり、この方法は単一形質転換段階で遺伝子を破壊（又は修飾）することができる(Rothsteinら (1983) Methods Enzymol. 101, 202-211)。本方法においては、酵母選択性マーカーによって破壊された標的遺伝子のコピーを有する形質転換プラスミドが二重交差相同的組換えにより酵母ゲノムに組込み、野生型標的遺伝子が破壊コピーに置き換えられる。実施例１２に記載されている『一段遺伝子破壊』とフルオロアセトアミド逆選択の組合わせは、選択性マーカーを残さずに酵母ゲノムから遺伝子を欠失させなければならない。本実施例においては、K.ラクチス CBS 2360 ゲノムからＬＡＣ４遺伝子を欠失させるためにこの組合わせが用いられる。K.ラクチスＬＡＣ４遺伝子の一段遺伝子交換の場合、ｐＧＢａｍｄＳ６（図５３）が構築され、ＬＡＣ４プロモーター及びターミネーター配列が隣接したａｍｄＳ発現カセットを含んでいる。更にａｍｄＳ発現カセットに並列反復が隣接し、これらの並列反復間の染色体内組換えによりK.ラクチスゲノムからａｍｄＳ配列が除去されるように、ＬＡＣ４ターミネーターフラグメントがａｍｄＳ発現カセットのすぐ上流に存在する。プラスミドｐＧＢａｍｄＳ６をＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ゲル電気泳動後6.６kbのＤＮＡフラグメントを単離した。実施例１０に記載されている形質転換手順を用いてK.ラクチス CBS 2360 を形質転換するために、遺伝子置換ベクターを含むこのＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを用いた。交換されたＬＡＣ４遺伝子を有する形質転換細胞をスクリーンするために、ａｍｄＳ+ 形質転換細胞を0.００８％Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むＹＥＰＤプレートに塗布した。
【０１１７】
ａｍｄＳ+ 形質転換細胞をサザンブロットで分析した。高分子量ＤＮＡを単離し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次に0.７％アガロースゲルによる電気泳動で分離し、ニトロセルロースにブロットした。プローブとしてプラスミドｐＰＴＬＡＣ４（実施例８）から単離した32Ｐ標識６００bpＸｂａＩＬＡＣ４ターミネーターフラグメントを用いた。交換したＬＡＣ４遺伝子及び対照株 CBS 2360 を有するａｍｄＳ+ CBS 2360形質転換細胞の結果は図４４に示されている。ａｍｄＳ+ CBS 2360形質転換細胞の場合には、正しく交換されたＬＡＣ４遺伝子を意味する7.４kbハイブリド形成フラグメントが存在する。対照株CBS 2360は2.０kbハイブリッドフラグメントを示し、これは自然型ＬＡＣ４遺伝子座を表している。
【０１１８】
引き続き、これらのａｍｄＳ+ 形質転換細胞のフルオロアセトアミド逆選択によりａｍｄＳ- 表現型を有する組換え体を得た。ａｍｄＳ- 組換え体の染色体ＤＮＡでサザン分析を行った。高分子量ＤＮＡを単離し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次に0.７％アガロースゲルで分離し、ニトロセルロースにブロットした。上記と同じ32Ｐ標識プローブを用いた。ａｍｄＳ- CBS 2360組換え体の結果は、図６０に示されている。ａｍｄＳ- 組換え体の場合には、5.４kbのハイブリッド形成フラグメントが存在し、ＬＡＣ４遺伝子が存在しないこと及びａｍｄＳマーカーの酵母ゲノムからの除去が確認された。これらのK.ラクチスＬＡＣ４- からａｍｄＳマーカーをなくすと、更に遺伝子の欠失及び／又は修飾にａｍｄＳマーカーを再使用する可能性を与える。
【実施例１４】
【０１１９】
ａｍｄＳマーカーを用いるK.ラクチスゲノムへの遺伝子のマーカー遺伝子を含まない挿入
遺伝子を酵母ゲノムにマーカー遺伝子含まずに挿入するために、モデル遺伝子としてキモシンｃＤＮＡを用いた。本実施例においては、ＬＡＣ４遺伝子を置き換えかつ選択マーカーを残さずにK.ラクチスＬＡＣ４遺伝子座にキモシンｃＤＮＡを挿入した。マーカーのない遺伝子挿入の原理は、この場合には交換ベクターｐＧＢａｍｄＳ８が問題の遺伝子、キモシンｃＤＮＡを含んでいることを除いて実施例１３に記載されている遺伝子のマーカーを含まない欠失と同様である（図５５）。プラスミドｐＧＢａｍｄＳ８をＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、8.０kbＤＮＡフラグメントをゲル単離した。１０μg のこのフラグメントを実施例１０に記載されているようにK.ラクチス CBS 2360 に形質転換した。交換したＬＡＣ４遺伝子及びキモシン活性を有するａｍｄＳ+ 形質転換細胞が得られた。
【０１２０】
キモシン活性を (van den Bergら (1990) Bio/technology 8, 135-139)に記載されているように測定した。これらの形質転換細胞の実施例１２に記載されている次のフルオロアセトアミド逆選択により、なおキモシンを生産するａｍｄＳ- 表現型と組換え体を単離した。ａｍｄＳ- の染色体ＤＮＡのサザン分析により、キモシン+ 組換え体からＬＡＣ４遺伝子がキモシンに置換されかつK.ラクチスゲノムからａｍｄＳマーカーが正しく除去されていることが確認された。これらの組換え体のａｍｄＳ- ／キモシン+ 表現型もＹＣＢ／アセトアミドプレート上で発育しないこと及びキモシン活性の存在（上記参照）によって確認された。これらの組換え体のａｍｄＳ- 表現型は、更にこれらの菌株のａｍｄＳマーカーを用いる操作、例えばキモシン発現カセットの別のコピーの組込み及び／又は実施例１３に記載されているK.ラクチス遺伝子の欠失が可能である。
【実施例１５】
【０１２１】
バシラス及びE.コリのａｍｄＳマイナス表現型の試験
バシラスにおけるａｍｄＳ選択系の使用の必要条件は、これらのグラム陽性菌がアセトアミダーゼ活性を有しないことである。これを試験するために、窒素源を除く必須栄養分及びビタミンすべてを含むバシラス最少培地にB.サチリス株 BS-154(CBS 363.94) を塗布した（２8.７mMＫ2 ＨＰＯ4 、２２mMＫＨ2 ＰＯ4 、1.７mMクエン酸ナトリウム、0.４mMＭｇＳＯ4 、0.７５μM ＭｎＳＯ4 、0.５％(w/v) グルコース及び1.５％寒天）。この培地のままあるいは窒素源として２０mMアセトアミドで補足した場合増殖は全く見られなかった。最少培地を窒素源として２０mM（ＮＨ4)2 ＳＯ4 あるいは２０mMＫＮＯ3 で補足した場合にのみ増殖が見られた。バシラス BS-154(CBS 363.94) は、単独の窒素源としてアセトアミド上で発育を維持するのに十分なアセトアミダーゼ活性がないと結論される。この現象から、A.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子はグラム陽性菌において選択マーカーとして使用しなければならない。
【０１２２】
同様に、グラム陰性菌、この場合E.コリにアセトアミダーゼ活性のないことを試験して、A.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子がこれらの微生物にも選択マーカーとして用いることができるかを確立した。この場合には、0.０２μg(w/v)チアミンで補足したＭ９最少培地 (Sambrookら (1989) “Molecular Cloning: a laboratory manual”, Cold Spring Harbour Laboratories, Cold Spring Harbour, NewYork)を用いた。Ｍ９プレートに塗布した場合にE.コリ JM109の十分発育されたコロニーが見られた。しかしながら、Ｍ９プレートからＮＨ4 Ｃｌが除かれたり２０mMアセトアミドに置き換えられた場合には、全く発育しないかあるいはわずかなバックグラウンド増殖のみ見られた。E.コリ JM109株は、単独の窒素源としてアセトアミド上で増殖を維持するだけの十分なアセトアミダーゼ活性がないと結論される。これにより、A.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子はグラム陰性菌において選択マーカーとして使用しなければならない。
【実施例１６】
【０１２３】
細菌に有用なａｍｄＳ発現ベクターの構築
ｐＧＢａｍｄＳ２２の構築
種々のバシラス種においてA.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子を発現させるために、ｐａｍｄＳ−１のａｍｄＳｃＤＮＡを基礎的なバシラス発現ベクターｐＢＨＡ−１（欧州特許出願第 89201173.5 号; 物理的地図として図６１R>１）にクローン化した。ａｍｄＳｃＤＮＡ遺伝子のＡＴＧ開始コドンで、下記配列を有するオリゴヌクレオチド AB3825 （配列番号３６）及び AB3826 （配列番号３７）を用いてｐａｍｄＳ−１にＮｄｅＩ部位を導入した：
オリゴ AB3825 （配列番号３６）：
5′CGCGCTTATCAGCGGCCAGTTCTTCCCAGGATTGAGGCATATGT 3′
オリゴ AB3826 （配列番号３７）：
5′CTAGACATATGCCTCAATCCTGGGAAGAACTGGCCGCTGATAAG 3′
【０１２４】
これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングは、標準法を用いて行った。得られた二本鎖ＤＮＡフラグメントをＢｓｓＨＩＩ／ＸｂａＩ消化ｐａｍｄＳ−１に連結し、E.コリに移した。形質転換細胞の１つからｐＧＢａｍｄＳ２１を単離し、制限酵素分析によって確認した（図６３）。ｐＧＢａｍｄＳ２１をＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ａｍｄＳｃＤＮＡ含有フラグメントをＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＢＨＡ−１にクローン化した。得られたプラスミドをｐＧＢａｍｄＳ２２と称した（図６４）。
ｐＧＢａｍｄＳ２５の構築
選択マーカーとしてａｍｄＳを用いて所望のＤＮＡ配列のB.リケニホルミスゲノムへの部位特異的組込みを証明するために、ａｍｄＳｃＤＮＡを発現／組込みベクターｐＬＮＦでクローン化した（図６２）。B.リケニホルミスアミラーゼE.coliの５′及び３′非コーディング配列を含むこのベクターは、対応する染色体アミラーゼ遺伝子座において部位特異的組込みを可能にする。ｐＧＢａｍｄＳ２１（上記、図６３）をＮｄｅＩ及びＰｖｕＩＩで消化し、ａｍｄＳｃＤＮＡ含有フラグメントをＮｄｅＩ及びＳｃａＩで消化したｐＬＮＦと連結した。連結混合物をB.サチリス BS-154 (CBS 363.94)に形質転換した。２０μg/mlネオマイシンで補足した最少培地で選択した。形質転換細胞の１つからプラスミドｐＧＢａｍｄＳ２５（図６６）を単離し、ＢＡＡ−１０１と称した。
【０１２５】
ｐＧＢａｍｄＳ４１の構築A.ニドゥランスａｍｄＳｃＤＮＡをE.コリで発現させるために、欧州特許第 0340 878 A1 号に記載されているｐＴＺ１８Ｒの誘導体、ｐＴＺ１８Ｒ／Ｎを用いた。ｐＴＺ１８Ｒ／Ｎは、ＮｄｅＩ部位が試験管内部位特定突然変異誘発を用いてｐＴＺ１８ＲのｌａｃＺ読み枠のＡＴＧ開始コドンで作られる点でｐＴＺ１８Ｒと異なるものである。ｐＧＢａｍｄＳ２１をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ａｍｄＳｃＤＮＡを含むゲル単離フラグメントをＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴＺ１８Ｒ／Ｎに連結した。この連結混合物を用いて、E.コリ JM109を形質転換し、形質転換細胞の１つからｐＧＢａｍｄＳ４１（図６７）を単離した。
【実施例１７】
【０１２６】
選択マーカーとしてａｍｄＳ遺伝子を用いるバシラスの形質転換
E.コリ配列をｐＧＢａｍｄＳ２２から欠失させかつａｍｄＳｃＤＮＡのすぐ上流に“ｈｐａ２”プロモーターを配置するために、ｐＧＢａｍｄＳ２２をＮｄｅＩで消化し、連結により再び環状にし、B.サチリス BS-154 (CBS 363.94)を形質転換するために用いた。形質転換細胞をアセタミド最少プレートで選択し、ネオマイシン耐性をチェックした。これらの形質転換細胞の１つから発現ベクターｐＧＢａｍｄＳ２３（図６５）を単離し、制限酵素分析により確認した。これらの結果は、１）バシラスプロモーター配列の調節によってA.ニドゥランスａｍｄＳｃＤＮＡが十分に発現される及び２）ａｍｄＳ遺伝子がバシラスの形質転換において選択マーカーとして用いることができることを示している。
【０１２７】
B.リケニホルミス T5 (CBS 470.83)をベクターｐＧＢａｍｄＳ２５で形質転換した。実験の項で記載されているように形質転換を行い、単独の窒素源として２０mMアセトアミドで補足した修飾プロトプラスト再生プレート上で直接選択することによりａｍｄＳ+ 形質転換細胞が得られた（実験に記載されている）。形質転換細胞内のｐＧＢａｍｄＳ２５の存在は、ネオマイシン耐性表現型及びプラスミドが形質転換細胞から再単離することができる事実により確認した。ＢＡＡ−１０３と称するこれらの形質転換細胞の１つを用いて、ｐＧＢａｍｄＳ２５をアミラーゼ遺伝子座を標的にしたB.リケニホルミスゲルムに組込ませた。プラスミド組込みは、単独の窒素源としてアセトアミドを含む最少培地寒天上で形質転換細胞を発育させることにより行った。若干のコロニーを新しいプレートに繰り返し（２〜３回）移した後、５０℃でインキュベートした。単離したコロニーを単独の窒素源としてアセトアミド上での増殖能及び１μg/mlのネオマイシンに対する耐性について試験した。自律複製プラスミドＤＮＡが存在しないことは、組込み体から単離されたＤＮＡを宿主株に再び形質転換することにより確立された。ネオマイシン耐性コロニーは得ることができなかった。この結果から、ａｍｄＳ遺伝子単コピーを含むバシラス種を選択するのにａｍｄＳ遺伝子が適切なマーカーであることは明らかである。
【実施例１８】
【０１２８】
選択マーカーとしてａｍｄＳ遺伝子を用いるE.コリの形質転換
標準手順を用いてE.コリ JM109をベクターｐＧＢａｍｄＳ４１で形質転換した。0.０２μg/mlチアミン及び５０μg/mlアンピシリンで補足したＭ９プレートあるいは２０mMアセトアミド、0.０２μg/mlチアミン及び0.０５mMＩＰＴＧで補足したアンモニウムを含まないＭ９プレートで選択した。ａｍｄＳ+ ／アンピシリン耐性形質転換細胞を得、それからｐＧＢａｍｄＳ４１を再単離した。アンピシリン又はアセトアミド上の選択を用いる形質転換頻度は匹敵しうるものであった。これは、A.ニドゥランスａｍｄＳ遺伝子がグラム陰性菌の形質転換に選択マーカーとして同様に機能することを証明するものである。
【実施例１９】
【０１２９】
ａｍｄＳ+ 細菌形質転換細胞のフルオロアセトアミド逆選択
フルオロアセトアミドを用いる細菌ａｍｄＳ+ 形質転換細胞の逆選択には、フルオロアセテートをフルオロアセチル−ＣｏＡに変換する酵素アセチルＣｏＡシンテターゼの活性が必要である。E.コリで見られた(Brownら 1977)アセチルＣｏＡシンテターゼのカタボライト抑制を避けるために、細菌ａｍｄＳ+ 形質転換細胞又は単コピー組込み体を窒素源としてＮＨ4 Ｃｌ並びに炭素及びエネルギー源として酢酸塩を含む特定培地上で発育させた。
【０１３０】
B.サチリス(Freese,E., Fortnagel,P. (1969) J. Bcteriol 90, 745-756)のような多くの生物はグリオキシル酸塩機能分路がなく、従って培地がグルタミン酸塩又はコハク酸塩のようなＴＣＡサイクル中間体源で補足される場合にのみ酢酸塩を代謝する。バシラスａｍｄＳ+ 株をGrundy, F.J.ら (1993) Molecular Microbiology 10, 259-271に記載されている0.０１％グルタミン酸塩及び５０mM酢酸塩を含むＴＳＳ培地で発育させた。寒天で固化したこの培地にフルオロアセトアミドを１〜５０mMの濃度で加えた。B.サチリス BAA-101又はB.リケニホルミス BAA-103（単コピー組込み体）を１プレート当たり１０2 細胞濃度で塗布した。あるフルオロアセトアミド濃度ではわずかなコロニーしか出現しなかった。これらのコロニーにｐＧＢａｍｄＳ２５が存在しないことは、プラスミド及び染色体ＤＮＡ分析、ネオマイシンに対する感受性及び単独の窒素源としてアセトアミド上での増殖不能により証明された。ＢＡＡ−１０３の逆選択の場合には、活性アッセイ及びサザンブロットによって示されるアミラーゼ遺伝子のロスをもたらした。これは、フルオロアセトアミド逆選択を用いて多数のａｍｄＳ+ バシラス細胞及び特定標的遺伝子の同時欠失を含む集団からａｍｄＳ- 細胞を選択することができることを示している。
【０１３１】
同様に、１〜５０mMの濃度のフルオロアセトアミド及び0.０５mMのＩＰＴＧで補足したVanderwinkel E., De Vlieghere M, European J. Biochem, 5 (1968) 81-90に記載されている最少培地 #132 を用いてｐＧＢａｍｄＳ４１形質転換細胞の集団からａｍｄＳ- E.コリ JM109細胞を選択した。細胞を１プレート当たり１０2 細胞の濃度で塗布した。あるフルオロアセトアミド濃度ではわずかなコロニーしか出現しなかった。フルオロアセトアミド選択コロニーからｐＧＢａｍｄＳ４１が存在しないことは、ＤＮＡ単離、アンピシリンに対する感受性及び単独の窒素源としてアセトアミド上での発育不能により確認された。これは、フルオロアセトアミド逆選択を用いて多数のａｍｄＳ+ E.コリ細胞を含む集団からａｍｄＳ- を選択することができることを証明するものである。
【０１３２】
〔配列表〕
配列番号：１
配列の長さ：２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
直接の起源
クローン名：AB3100
配列
CTAATCTAGA ATGCCTCAAT CCTGAA 26
【０１３３】
配列番号：２
配列の長さ：２８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：YES
直接の起源
クローン名：AB3101
配列
GACAGTCGAC AGCTATGGAG TCACCACA 28
【０１３４】
配列番号：３
配列の長さ：１６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
直接の起源
クローン名：TN0001
配列
TCGATTAACT AGTTAA 16
【０１３５】
配列番号：４
配列の長さ：３５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
直接の起源
クローン名：AB2154
配列
AACCATAGGG TCGACTAGAC AATCAATCCA TTTCG 35
【０１３６】
配列番号：５
配列の長さ：３５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：YES
直接の起源
クローン名：AB2155
配列
GCTATTCGAA AGCTTATTCA TCCGGAGATC CTGAT 35
【０１３７】
配列番号：６
配列の長さ：３０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
直接の起源
クローン名：AB2977
配列
TATCAGGAAT TCGAGCTCTG TACAGTGACC 30
【０１３８】
配列番号：７
配列の長さ：３６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：YES
直接の起源
クローン名：AB2992
配列
GCTTGAGCAG ACATCACCAT GCCTCAATCC TGGGAA 36
【０１３９】
配列番号：８
配列の長さ：３６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
直接の起源
クローン名：AB2993
配列
TTCCCAGGAT TGAGGCATGG TGATGTCTGC TCAAGC 36
【０１４０】
配列番号：９
配列の長さ：３６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：YES
直接の起源
クローン名：AB2994
配列
CTGATAGAAT TCAGATCTGC AGCGGAGGCC TCTGTG 36
【０１４１】
配列番号：１０
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
直接の起源
クローン名：AB3657
配列
AGCTTGACGT CTACGTATTA ATGCGGCCGC T 31
【０１４２】
配列番号：１１
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：YES
直接の起源
クローン名：AB3658
配列
TCGAAGCGGC CGCATTAATA CGTAGACGTC A 31
【０１４３】
配列番号：１２
配列の長さ：２３塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
直接の起源
クローン名：AB3779
配列
AATTGGGGCC CATTAACTCG AGC 23
【０１４４】
配列番号：１３
配列の長さ：２３塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：YES
直接の起源
クローン名：AB3780
配列
AATTGCTCGA GTTAATGGGC CCC 23
【０１４５】
配列番号：１４
配列の長さ：３０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
直接の起源
クローン名：AB3448
配列
GTGCGAGGTA CCACAATCAA TCCATTTCGC 30
【０１４６】
配列番号：１５
配列の長さ：３６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：YES
直接の起源
クローン名：AB3449
配列
ATGGTTCAAG AACTCGGTAG CCTTTTCCTT GATTCT 36
【０１４７】
配列番号：１６
配列の長さ：３６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
直接の起源
クローン名：AB3450
配列
AGAATCAAGG AAAAGGCTAC CGAGTTCTTG AACCAT 36
【０１４８】
配列番号：１７
配列の長さ：４２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：YES
直接の起源
クローン名：AB3520
配列
ATCAATCAGA AGCTTTCTCT CGAGACGGGC ATCGGAGTCC CG 42
【０１４９】
配列番号：１８
配列の長さ：１８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
直接の起源
クローン名：AB3781
配列
AATTGGGGCC CAGCGTCC 18
【０１５０】
配列番号：１９
配列の長さ：１８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：YES
直接の起源
クローン名：AB3782
配列
AATTGGACGC TGGGCCCC 18
【０１５１】
配列番号：２０
配列の長さ：４３塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
直接の起源
クローン名：AB3746
配列
TGACCAATAA AGCTTCTCGA GTAGCAAGAA GACCCAGTCA ATC 43
【０１５２】
配列番号：２１
配列の長さ：４７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：YES
直接の起源
クローン名：AB3747
配列
CTACAAACGG CCACGCTGGA GATCCGCCGG CGTTCGAAAT AACCAGT 47
【０１５３】
配列番号：２２
配列の長さ：２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
直接の起源
クローン名：AB4234
配列
GAAGACCCAG TCAAGCTTGC ATGAGC 26
【０１５４】
配列番号：２３
配列の長さ：４３塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：YES
直接の起源
クローン名：AB4235
配列
TGACCAATTA AGCTTGCGGC CGCTCGAGGT CGCACCGGCA AAC 43
【０１５５】
配列番号：２４
配列の長さ：６９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
直接の起源
クローン名：AB4236
配列
TGACCAATAA AGCTTAGATC TGGGGGTGAT TGGGCGGAGT GTTTTGCTTA GACAATCAAT 60CCATTTCGC 69  
【０１５６】
配列番号：２５
配列の長さ：３６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：YES
直接の起源
クローン名：AB4233
配列
TGACCAATAG ATCTAAGCTT GACTGGGTCT TCTTGC 36
【０１５７】
配列番号：２６
配列の長さ：３２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
直接の起源
クローン名：AB3514
配列
CTGCGAATTC GTCGACATGC CTCAATCCTG GG 32
【０１５８】
配列番号：２７
配列の長さ：３７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：YES
直接の起源
クローン名：AB3515
配列
GGCAGTCTAG AGTCGTACCTA TGGAGTCACC ACATTTC 37
【０１５９】
配列番号：２８
配列の長さ：５０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
直接の起源
クローン名：AB3701
配列
CTGCGAATTC GTCGACACTA GTGGTACCAT TATAGCCATA GGACAGCAAG 50
【０１６０】
配列番号：２９
配列の長さ：７０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：YES
直接の起源
クローン名：AB3700
配列
GCTCTAGAGC GCGCTTATCA GCTTCCAGTT CTTCCCAGGA TTGAGGCATT TTTAATGTTA 60CTTCTCTTGC 70
【０１６１】
配列番号：３０
配列の長さ：５０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
直接の起源
クローン名：AB3702
配列
CTGCGAATTC GTCGACACTA GTGGTACCAT CCTTTTGTTG TTTCCGGGTG 50
【０１６２】
配列番号：３１
配列の長さ：７０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：YES
直接の起源
クローン名：AB3703
配列
GCTCTAGAGC GCGCTTATCA GCGGCCAGTT CTTCCCAGGA TTGAGGCATT GTATATGAGA 60TAGTTGATTG 70
【０１６３】
配列番号：３２
配列の長さ：５５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
直接の起源
クローン名：AB3704
配列
GCTCTAGAAG TCGACACTAG TCTGCTACGT ACTCGAGAAT TTATACTTAG ATAAG 55
【０１６４】
配列番号：３３
配列の長さ：２５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：YES
直接の起源
クローン名：AB3705
配列
TGCTCTAGAT CTCAAGCCAC AATTC 25
【０１６５】
配列番号：３４
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
直接の起源
クローン名：AB3965
配列
CTGCTACGTA ATGTTTTCAT TGCTGTTTTA C 31
【０１６６】
配列番号：３５
配列の長さ：３７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：YES
直接の起源
クローン名：AB3966
配列
CCGCCCAGTC TCGAGTCAGA TGGCTTTGGC CAGCCCC 37
【０１６７】
配列番号：３６
配列の長さ：４４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：NO
直接の起源
クローン名：AB3825
配列
CGCGCTTATC AGCGGCCAGT TCTTCCCAGG ATTGAGGCAT ATGT 44
【０１６８】
配列番号：３７
配列の長さ：４４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA （ゲノム）
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：YES
直接の起源
クローン名：AB3826
配列
CTAGACATAT GCCTCAATCC TGGGAAGAAC TGGCCGCTGA TAAG 44
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】プラスミドＰａｍｄＳ−１の制限地図である。本プラスミドは、A.ニデュランス (A.nidulans) 由来のａｍｄＳのｃＤＮＡを含んでいる。
【図２】遺伝子置換ベクターｐＧＢＤＥＬ４Ｌを用いたA.ニガー由来のｇｌａＡ遺伝子座のマーカー遺伝子を含まない欠失の模式図である。遺伝子置換ベクターｐＧＢＤＥＬ４Ｌの実質部分は、反復（ｇｌａＡ遺伝子の３′非コーディング領域）間にクローン化ｇｐｄＡプロモーターの調節によってａｍｄＳ遺伝子を含んでいる。
【図３】実施例１に示されるｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築経路の模式図である。
【図４】実施例１に示されるｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築経路の模式図である。
【図５】実施例１に示されるｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築経路の模式図である。
【図６】実施例１に示されるｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築経路の模式図である。
【図７】実施例１に示されるｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築経路の模式図である。
【図８】実施例１に示されるｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築経路の模式図である。
【図９】実施例１に示されるｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築経路の模式図である。
【図１０】実施例１に示されるｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築経路の模式図である。
【図１１】実施例１に示されるｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築経路の模式図である。
【図１２】実施例１に示されるｐＧＢＤＥＬ４Ｌの構築経路の模式図である。
【図１３】32Ｐ標識ｇｌａＡプロモーターフラグメント及びキシラノーゼプローブでプローブされたｐＧＢＤＥＬ４Ｌ形質転換細胞 #41（レーン１）、 #24（レーン２）、 #23（レーン３）及び #19（レーン４）及び宿主株 A. ニガー CBS 513.88 （レーン５）のＫｐｎＩ消化物並びにｐＧＢＤＥＬ４Ｌ形質転換細胞 #41（レーン６）、 #24（レーン７）、 #23（レーン８）及び #19（レーン９）及び宿主株 A. ニガー CBS 513.88 （レーン１０）のＢａｍＨＩ消化物のオートラジオグラフである。
【図１４】GBA-102 （レーン１）及びフルオロアセトアミド選択後の GBA-102株： GBA-107（レーン２）及び GBA-108（レーン３）のＫｐｎＩ消化物並びに GBA-102（レーン４）及びフルオロアセトアミド選択後の GBA-102株： GBA-107（レーン５）及び GBA-108（レーン６）のＢａｍＨＩ消化物のオートラジオグラフである。
【図１５】アスペルギルスニガー CBS 513.88 における野生型ｇｌａＡ遺伝子座のＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩフラグメント長の模式図である。
【図１６】形質転換細胞 #19(= GBA-102) における切断型ｇｌａＡ遺伝子座のＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩフラグメント長の模式図である。
【図１７】GBA-102 形質転換細胞におけるａｍｄＳ遺伝子(= GBA-107及び GBA-108）除去後の切断型ｇｌａＡ遺伝子座のＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩフラグメント長の模式図である。
【図１８】A.ニガーの切断型ｇｌａＡ遺伝子座の３′非コーディング領域にｇｌａＡ遺伝子を組込む模式図である。
【図１９】ａｍｄＳ遺伝子に隣接する３′ｇｌａＡ反復間の内部組換えの結果である。
【図２０】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧＬＡ３０の構築経路の模式図である。
【図２１】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧＬＡ３０の構築経路の模式図である。
【図２２】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧＬＡ３０の構築経路の模式図である。
【図２３】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧＬＡ３０の構築経路の模式図である。
【図２４】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧＬＡ３０の構築経路の模式図である。
【図２５】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧＬＡ３０の構築経路の模式図である。
【図２６】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧＬＡ３０の構築経路の模式図である。
【図２７】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧＬＡ３０の構築経路の模式図である。
【図２８】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧＬＡ３０の構築経路の模式図である。
【図２９】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧＬＡ３０の構築経路の模式図である。
【図３０】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧＬＡ３０の構築経路の模式図である。
【図３１】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧＬＡ３０の構築経路の模式図である。
【図３２】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧＬＡ３０の構築経路の模式図である。
【図３３】実施例２に示される組込みベクターｐＧＢＧＬＡ３０の構築経路の模式図である。
【図３４】32Ｐ標識ｇｌａＡプロモーターフラグメントでプローブされたｐＧＢＧＬＡ３０形質転換細胞 #107-9 （レーン１）、 #107-7 （レーン２）及び #107-5 （レーン３）、宿主株 A. ニガー GBA-107（レーン４）及び親株 A. ニガー CBS 513.88 （レーン５）のＢｇｌＩＩ消化物並びにｐＧＢＧＬＡ３０形質転換細胞 #107-9 （レーン６）、 #107-7 （レーン７）及び #107-5 （レーン８）、宿主株 A. ニガー GBA-107（レーン９）及び親株 A. ニガー CBS 513.88 （レーン１０）のＫｐｎＩ消化物のオートラジオグラフである。
【図３５】アスペルギルスニガー CBS 513.88 における野生型ｇｌａＡ遺伝子座のＫｐｎＩ及びＢｇｌＩＩフラグメント長の模式図である。
【図３６】アスペルギルスニガー GBA-107における切断型ｇｌａＡ遺伝子座のＫｐｎＩ及びＢｇｌＩＩフラグメント長の模式図である。
【図３７】形質転換細胞 #107-5(= GBA-119)及び #107-9(= GBA-122)のようにｇｌａＡ３′非コーディング領域に組込まれた単コピーを含む切断型ｇｌａＡ遺伝子座のＫｐｎＩ及びＢｇｌＩＩフラグメント長の模式図である。
【図３８】GBA-119 及び GBA-122形質転換細胞におけるａｍｄＳ遺伝子(= GBA-120、GBA-121 、GBA-123 及びGBA-124)除去後の切断型ｇｌａＡ遺伝子座のＫｐｎＩ及びＢｇｌＩＩフラグメント長の模式図である。
【図３９】32Ｐ標識３″ｇｌａＡ非コーディングフラグメントでプローブされたA.ニガーCBS 513.88 （レーン１０）、GBA-107 （レーン９）、GBA-119 （レーン８）及びフルオロアセトアミド選択後の GBA-119株： #AG5-7 (= GBA-120)(レーン５）、 #AG5-5 (= GBA-121)(レーン６）及び #AG5-6 （レーン７）；GBA-122 （レーン４）及びフルオロアセトアミド選択後の GBA-122株： #AG9-1 (= GBA-123)(レーン３）、 #AG9-2 （レーン２）及び #AG9-4 (= GBA-124)(レーン１）のＢｇｌＩＩ消化物のオートラジオグラフである。
【図４０】32Ｐ標識３″ｇｌａＡ非コーディングフラグメントでプローブされたA.ニガーCBS 513.88 （レーン１０）、GBA-107 （レーン９）、GBA-119 （レーン８）及びフルオロアセトアミド選択後の GBA-119株： #AG5-7 (= GBA-120)(レーン５）、 #AG5-5 (= GBA-121)(レーン６）及び #AG5-6 （レーン６); GBA-122（レーン４）及びフルオロアセトアミド選択後の GBA-122株： #AG9-1 (= GBA-123)(レーン３）、 #AG9-2 （レーン２）及び #AG9-4 (= GBA-124)(レーン１）のＫｐｎＩ消化物のオートラジオグラフである。
【図４１】ｐＧＢＧＬＡ５０の構築経路の模式図である。
【図４２】ｐＧＢＧＬＡ５３の構築経路の模式図である。
【図４３】ｐＧＢＧＬＡ５３の構築経路の模式図である。
【図４４】ｐＧＢＧＬＡ５３の構築経路の模式図である。
【図４５】ｐＧＢＧＬＡ５３の構築経路の模式図である。
【図４６】ｐＧＢＧＬＡ５３の構築経路の模式図である。
【図４７】ｐＧＢＧＬＡ５３の構築経路の模式図である。
【図４８】ｐＧＢＧＬＡ５３の構築経路の模式図である。
【図４９】ｐＧＢａｍｄＳ１の構築経路の模式図である。
【図５０】ｐＧＢａｍｄＳ２の構築経路の模式図である。
【図５１】ｐＧＢａｍｄＳ３の構築経路の模式図である。
【図５２】ｐＧＢａｍｄＳ５の構築経路の模式図である。
【図５３】ｐＧＢａｍｄＳ６の構築経路の模式図である。
【図５４】ｐＧＢａｍｄＳ６構築で用いたｐＰＴＬＡＣ４構築の模式図である。
【図５５】ｐＧＢａｍｄＳ７構築の模式図である。
【図５６】32Ｐ標識ＬＡＣ４プロモーターフラグメントでプローブされたK.ラクチス(K.lactis) CBS 683（レーン１）、K.ラクチス CBS 2360 （レーン２）、K.ラクチスCBS 683／ｐＧＢａｍｄＳ１形質転換細胞 KAM-1（レーン３）、K.ラクチス CBS2360 ／ｐＧＢａｍｄＳ１形質転換細胞 KAM-2（レーン４）及びフルオロアセトアミド選択後の KAM-1株（レーン５、６）のＨｉｎｄＩＩＩ消化物のオートラジオグラフである。
【図５７】32Ｐ標識ＬＡＣ４ターミネーターフラグメントでプローブされたK.ラクチス CBS 683／ｐＧＢａｍｄＳ３形質転換細胞（レーン１−３）のＢａｍＨＩ消化物のオートラジオグラフである。
【図５８】32Ｐ標識ＬＡＣ４ターミネーターフラグメントでプローブされたK.ラクチス CBS 683／ｐＧＢａｍｄＳ５形質転換細胞（レーン１−５）及び宿主株K.ラクチスCBS 683（レーン６）のＢａｍＨＩ消化物のオートラジオグラフである。
【図５９】32Ｐ標識ａｍｄＳフラグメントでプローブされたS.セレビシエ(S.cerevisiae) D273-10B （レーン１）及びS.セレビシエ D273-10B ／ｐＧＢａｍｄＳ５形質転換細胞（レーン２−８）のＢａｍＨＩ消化物のオートラジオグラフである。
【図６０】32Ｐ標識ＬＡＣ４ターミネーターフラグメントでプローブされたK.ラクチス CBS 2360 （レーン１）、K.ラクチス CBS 2360 ／ｐＧＢａｍｄＳ６形質転換細胞（レーン６）及びフルオロアセトアミド選択後のK.ラクチス CBS 2360 ／ｐＧＢａｍｄＳ６形質転換細胞由来株のＢａｍＨＩ消化物のオートラジオグラフである。
【図６１】バシラス(Bacillus)プラスミドｐＢＨＡ１の制限地図である。
【図６２】バシラスプラスミドｐＬＮＦの制限地図である。
【図６３】ｐＧＢａｍｄＳ２１構築の模式図である。
【図６４】ｐＧＢａｍｄＳ２２構築の模式図である。
【図６５】ｐＧＢａｍｄＳ２３構築の模式図である。
【図６６】ｐＧＢａｍｄＳ２５構築の模式図である。
【図６７】ｐＧＢａｍｄＳ４１構築の模式図である。
【符号の説明】
【０１７０】
図面で用いられる略語：
制限酵素及び制限部位：
Ａ＝ＡｐａＩ；
Ｂａ＝ＢａｍＨＩ；
Ｂ＝ＢｇｌＩＩ；
Ｂｓ＝ＢｓｓＨＩＩ；
Ｅ＝ＥｃｏＲＩ；
Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ；
Ｋ＝ＫｐｎＩ；
Ｎ＝ＮｄｅＩ；
Ｎ＝ＮｏｔＩ；
Ｐｓ＝ＰｓｔＩ；
Ｐ＝ＰｖｕＩＩ；
Ｓａ＝ＳａｌＩ；
Ｓｃ＝ＳｃａＩ；
Ｓ＝ＳｍａＩ；
Ｓｎ＝ＳｎａＢＩ；
Ｓｐｅ＝ＳｐｅＩ；
Ｓｐ＝ＳｐｈＩ；
Ｓｓ＝ＳｓｔＩＩ；
Ｘｂ＝ＸｂａＩ；
Ｘ＝ＸｈｏＩ。
その他：
Ｔ．＝ＬＡＣ４ターミネーター配列
【図１】
2005296019.tif 000003
【図２】
2005296019.tif 000004
【図３】
2005296019.tif 000005
【図４】
2005296019.tif 000006
【図５】
2005296019.tif 000007
【図６】
2005296019.tif 000008
【図７】
2005296019.tif 000009
【図８】
2005296019.tif 000010
【図９】
2005296019.tif 000011
【図１０】
2005296019.tif 000012
【図１１】
2005296019.tif 000013
【図１２】
2005296019.tif 000014
【図１３】
2005296019.tif 000015
【図１４】
2005296019.tif 000016
【図１５】
2005296019.tif 000017
【図１６】
2005296019.tif 000018
【図１７】
2005296019.tif 000019
【図１８】
2005296019.tif 000020
【図１９】
2005296019.tif 000021
【図２０】
2005296019.tif 000022
【図２１】
2005296019.tif 000023
【図２２】
2005296019.tif 000024
【図２３】
2005296019.tif 000025
【図２４】
2005296019.tif 000026
【図２５】
2005296019.tif 000027
【図２６】
2005296019.tif 000028
【図２７】
2005296019.tif 000029
【図２８】
2005296019.tif 000030
【図２９】
2005296019.tif 000031
【図３０】
2005296019.tif 000032
【図３１】
2005296019.tif 000033
【図３２】
2005296019.tif 000034
【図３３】
2005296019.tif 000035
【図３４】
2005296019.tif 000036
【図３５】
2005296019.tif 000037
【図３６】
2005296019.tif 000038
【図３７】
2005296019.tif 000039
【図３８】
2005296019.tif 000040
【図３９】
2005296019.tif 000041
【図４０】
2005296019.tif 000042
【図４１】
2005296019.tif 000043
【図４２】
2005296019.tif 000044
【図４３】
2005296019.tif 000045
【図４４】
2005296019.tif 000046
【図４５】
2005296019.tif 000047
【図４６】
2005296019.tif 000048
【図４７】
2005296019.tif 000049
【図４８】
2005296019.tif 000050
【図４９】
2005296019.tif 000051
【図５０】
2005296019.tif 000052
【図５１】
2005296019.tif 000053
【図５２】
2005296019.tif 000054
【図５３】
2005296019.tif 000055
【図５４】
2005296019.tif 000056
【図５５】
2005296019.tif 000057
【図５６】
2005296019.tif 000058
【図５７】
2005296019.tif 000059
【図５８】
2005296019.tif 000060
【図５９】
2005296019.tif 000061
【図６０】
2005296019.tif 000062
【図６１】
2005296019.tif 000063
【図６２】
2005296019.tif 000064
【図６３】
2005296019.tif 000065
【図６４】
2005296019.tif 000066
【図６５】
2005296019.tif 000067
【図６６】
2005296019.tif 000068
【図６７】
2005296019.tif 000069
【配列表】
2005296019000001.app