(57)【要約】【課題】  ＩＤＡＴ法を用いてサンプル中の２種類またはそれ以上の標的蛋白質を検出する方法を提供すること。【解決手段】  サンプル中の第１の標的蛋白質および第２の標的蛋白質を検出する方法であって、サンプルを第１の複合体および第２の複合体と接触させ、ここで、各複合体はそれぞれ、各標的蛋白質に結合しうる抗体と、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列およびその下流に配置されたターゲット配列を有するＤＮＡマーカーとを含み、かつ、第１の複合体中のターゲット配列と第２の複合体中のターゲット配列とはその長さが異なっており；ＲＮＡポリメラーゼにより前記ターゲット配列を有するＲＮＡを生成させ；そして生成されたＲＮＡを検出することにより、サンプル中の第１および第２の標的蛋白質の存在または量を決定する、の各工程を含む方法。【選択図】図１
2005257641.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の第１の標的蛋白質および第２の標的蛋白質を検出する方法であって、
サンプルを第１の複合体および第２の複合体と接触させ、ここで、各複合体はそれぞれ、各標的蛋白質に結合しうる抗体と、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列およびその下流に配置されたターゲット配列を有するＤＮＡマーカーとを含み、かつ、第１の複合体中のターゲット配列と第２の複合体中のターゲット配列とはその長さが異なっており；
ＲＮＡポリメラーゼにより前記ターゲット配列を有するＲＮＡを生成させ；そして
生成されたＲＮＡを検出することにより、サンプル中の第１および第２の標的蛋白質の存在または量を決定する、
の各工程を含む方法。
【請求項２】
サンプル中の第１の標的蛋白質および第２の標的蛋白質を検出する方法であって、
サンプルを、第１の標的蛋白質に結合しうる第１の抗体および第２の標的蛋白質に結合しうる第２の抗体と接触させ；
前記各抗体を第１の複合体および第２の複合体と結合させ、ここで、各複合体はそれぞれ、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列およびその下流に配置されたターゲット配列を有するＤＮＡマーカーと、前記ＤＮＡマーカーと前記抗体とを結合させる手段とを含み、かつ、第１の複合体中のターゲット配列と第２の複合体中のターゲット配列とはその長さが異なっており；
ＲＮＡポリメラーゼにより前記ターゲット配列を有するＲＮＡを生成させ；そして
生成されたＲＮＡを検出することにより、サンプル中の第１および第２の標的蛋白質の存在または量を決定する、
の各工程を含む方法。
【請求項３】
前記結合手段が、抗体、プロテインＡ、ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群より選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
サンプル中の第１の標的蛋白質および第２の標的蛋白質を検出する方法であって、
サンプルを、第１の標的蛋白質に結合しうる第１のビオチン標識抗体および第２の標的蛋白質に結合しうる第２のビオチン標識抗体と接触させ；
前記各ビオチン標識抗体をストレプトアビジンと結合させ；
前記ストレプトアビジンを第１のビオチン標識ＤＮＡマーカーおよび第２のビオチン標識ＤＮＡマーカーと結合させ、ここで、前記ビオチン標識ＤＮＡマーカーはそれぞれ、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列およびその下流に配置されたターゲット配列を有しており、かつ、第１のビオチン標識ＤＮＡマーカー中のターゲット配列と第２のビオチン標識ＤＮＡマーカー中のターゲット配列とはその長さが異なっており；
ＲＮＡポリメラーゼにより前記ターゲット配列を有するＲＮＡを生成させ；そして
生成されたＲＮＡを検出することにより、サンプル中の標的蛋白質の存在または量を決定する、
の各工程を含む方法。
【請求項５】
第１の標的蛋白質および第２の標的蛋白質が固相に固定化される、請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
第１の標的蛋白質および第２の標的蛋白質が、固相に固定化された抗体に結合される、請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＲＮＡポリメラーゼがバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
増幅されたターゲット配列が放射性同位体で標識される、請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
増幅されたターゲット配列が蛍光物質で標識される、請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
増幅されたターゲット配列がリガンドで標識される、請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
生成されたＲＮＡがノザンブロッティング法により検出される、請求項１−１０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡポリメラーゼを用いて、サンプル中の複数の標的蛋白質を同時に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サンプル中における特定の蛋白質の存在または量を特異的に検出する方法としては、抗体を用いるイムノアッセイ法が広く使用されている。イムノアッセイにおいては、放射性同位体、蛍光物質、酵素等を利用して、特異的な抗原抗体反応を検出することができる。イムノアッセイの検出感度を向上させるために、従来のイムノアッセイ技術とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術とを組み合わせたイムノＰＣＲ法が開発されている（Sano, et al., Science, 258, 120-122 (1992)）。イムノＰＣＲ法では、特定の配列を有するマーカーＤＮＡを抗体に結合させ、抗原−抗体−ＤＮＡのコンジュゲートを形成した後に、ＰＣＲ法によりマーカーＤＮＡを増幅させ、電気泳動ゲルの臭化エチジウム染色やサザンハイブリダイゼーションによりこの増幅産物を検出する。この技術を用いることによって、従来の酵素標識ＥＬＩＳＡと比較して、数桁の感度の上昇が得られている。
【０００３】
さらに、定量的な測定を可能とするために、イムノＰＣＲにおけるマーカーＤＮＡの代わりにＲＮＡプロモーター推進性ｃＤＮＡ配列を用いて、ＲＮＡ増幅により検出シグナルを検出するイムノａＲＮＡ法が開発されている（特表２００１−５０４５８６）。イムノａＲＮＡ法のうち、ＲＮＡの増幅にバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる方法は、特にＩＤＡＴ法（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ増幅による免疫検出法）と称されている。
【特許文献１】特表２００１−５０４５８６
【非特許文献１】Sano, et al., Science, 258, 120-122 (1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、イムノａＲＮＡ法を改良して、サンプル中の複数の標的蛋白質を同時に検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、サンプル中の第１の標的蛋白質および第２の標的蛋白質を検出する方法を提供する。該方法は、
サンプルを、第１の複合体および第２の複合体と接触させ、ここで、各複合体はそれぞれ、各標的蛋白質に結合しうる抗体と、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列およびその下流に配置されたターゲット配列を有するＤＮＡマーカーとを含み、かつ、第１の複合体中のターゲット配列と第２の複合体中のターゲット配列とはその長さが異なっており；
ＲＮＡポリメラーゼにより該ターゲット配列を有するＲＮＡを生成させ；そして
生成されたＲＮＡを検出することにより、サンプル中の第１および第２の標的蛋白質の存在または量を決定する、
の各工程を含む。
【０００６】
別の態様においては、本発明は、サンプル中の第１の標的蛋白質および第２の標的蛋白質を検出する方法を提供する。該方法は、
サンプルを、第１の標的蛋白質に結合しうる第１の抗体および第２の標的蛋白質に結合しうる第２の抗体と接触させ；
該各抗体を第１の複合体および第２の複合体と結合させ、ここで、各複合体はそれぞれ、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列およびその下流に配置されたターゲット配列を有するＤＮＡマーカーと、該ＤＮＡマーカーと該抗体とを結合させる手段とを含み、かつ、第１の複合体中のターゲット配列と第２の複合体中のターゲット配列とはその長さが異なっており；
ＲＮＡポリメラーゼにより該ターゲット配列を有するＲＮＡを生成させ；そして
生成されたＲＮＡを検出することにより、サンプル中の第１および第２の標的蛋白質の存在または量を決定する、
の各工程を含む。好ましくは、該結合手段は、抗体、プロテインＡ、ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群より選択される。
【０００７】
さらに別の態様においては、本発明は、サンプル中の第１の標的蛋白質および第２の標的蛋白質を検出する方法を提供する。該方法は、
サンプルを、第１の標的蛋白質に結合しうる第１のビオチン標識抗体および第２の標的蛋白質に結合しうる第２のビオチン標識抗体と接触させ；
該各ビオチン標識抗体をストレプトアビジンと結合させ；
該ストレプトアビジンを第１のビオチン標識ＤＮＡマーカーおよび第２のビオチン標識ＤＮＡマーカーと結合させ、ここで、該ビオチン標識ＤＮＡマーカーはそれぞれ、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列およびその下流に配置されたターゲット配列を有しており、かつ、第１のビオチン標識ＤＮＡマーカー中のターゲット配列と第２のビオチン標識ＤＮＡマーカー中のターゲット配列とはその長さが異なっており；
ＲＮＡポリメラーゼにより該ターゲット配列を有するＲＮＡを生成させ；そして
生成されたＲＮＡを検出することにより、サンプル中の標的蛋白質の存在または量を決定する、
の各工程を含む。
【０００８】
本発明の１つの好ましい態様においては、第１の標的蛋白質および第２の標的蛋白質は固相に固定化されている。また別の好ましい態様においては、第１の標的蛋白質および第２の標的蛋白質は、固相に固定化された抗体に結合させる。
【０００９】
本発明の方法において、特に好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼはバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼである。また好ましくは、本発明の方法において、増幅されたターゲット配列は放射性同位体で標識されるか、蛍光物質で標識されるか、またはリガンドで標識される。また好ましくは、生成されたＲＮＡはノザンブロッティング法により検出される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、イムノａＲＮＡ法において、異なる標的蛋白質に対して生成されるＲＮＡの長さが異なるようにＤＮＡマーカー中のターゲット配列を設計することにより、標的蛋白質サンプル中の２種類またはそれ以上の標的蛋白質を同時に検出することを可能とした。以下、図面を参照して本発明の方法をより詳細に説明する。
【００１１】
図１は、標的蛋白質が２種類である場合を例として、本発明の方法の原理を簡単に表したものである。標的蛋白質が３種類以上である場合にも同じ原理でアッセイを行うことが可能であることが明らかであろう。まず、サンプルを固相１に適用することにより、アッセイすべき第１の標的蛋白質１１および第２の標的蛋白質１２を固相に結合させる（ステップａ）。固相としては、プラスチック、ガラス、樹脂、磁気ビーズ等の金属、セルロースおよびその誘導体、Protein A ビーズ等のアガロース担体など、蛋白質を結合することができる任意の材料のものを用いることができ、例えば、ポリスチレンなどのプラスチックからなる汎用のＥＬＩＳＡプレートなどを好適に用いることができる。結合は、吸着等の物理的結合でも共有結合等の化学的結合でもよい。
【００１２】
一方、標的蛋白質に結合しうる抗体３１とＤＮＡマーカー３３との複合体２１を用意する。ＤＮＡマーカーは、抗体結合配列、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列およびその下流に配置されたターゲット配列を有する（図２）。抗体結合配列の上流または下流にスペーサー配列が挿入されていてもよい。また、プロモーター配列およびターゲット配列は、抗体結合配列に対して、図２に示される配置と逆向きに配置されていてもよい。抗体結合配列とは、アミン結合を介して抗体に結合することができるＤＮＡ配列であり、例えば、5'-GAG AGA GGA TCC AAG TAC-3'（配列番号１）を用いることができる。抗体結合配列を有するＤＮＡは、抗体と混合することにより容易に抗体に結合させることができる。ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列とは、ＲＮＡポリメラーゼがその配列を認識して、下流のターゲット配列の転写を推進しうる配列であり、種々のＲＮＡポリメラーゼについてそれぞれ対応するプロモーター配列が知られている。本発明において使用することができるＲＮＡポリメラーゼの例としては、限定されないが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。例えば、ＲＮＡポリメラーゼとしてバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合には、プロモーター配列として5'-TAATACGACTCACTATAG GG-3'（配列番号２）を用いることができる。ターゲット配列とは、ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるテンプレートとなる配列であり、配列およびその長さは、後の検出工程において用いられる検出方法に応じて、適宜選択することができる。本発明においては、２種類の標的蛋白質に対して、それぞれ異なる長さのＲＮＡが生成するようターゲット配列を選択する。
【００１３】
次に、このようにして製造した２種類の複合体２１および２２を、特異的抗原抗体反応により、固相に結合した標的蛋白質１１および１２と結合させる（ステップｂ）。２種類の複合体は同時に固相に加えてもよく、別々に加えてもよい。一方の複合体を標的蛋白質と結合させた後、未結合の複合体を洗浄除去した後に、他方の複合体を加えてもよい。また、非特異的結合を減少させるために、この工程の前に、スキムミルク、ＢＳＡ、サケ精子ＤＮＡなどを用いて固相をブロッキングしてもよい。このようなブロッキングに適した物質およびブロキングの反応条件は、イムノアッセイの技術分野においてよく知られている。
【００１４】
固相を洗浄して未結合複合体を除去した後、ＲＮＡポリメラーゼを加えて、プロモーターからターゲット配列を有するＲＮＡ４１および４２を生成させる（ステップｃ）。このとき、後の検出工程において用いられる検出方法に応じて、合成中にＲＮＡが標識されるようにしてもよい。標識としては、例えば、放射性標識、ビオチンなどのリガンドによる標識などを用いることができる。このステップにおいては、長さの異なる２種類のＲＮＡ生成物が生ずる。このことにより、生成されたＲＮＡの長さおよび量を検出することによって、２種類の標的蛋白質の存在または量を同時に決定することができる。
【００１５】
検出工程においては、ＲＮＡ生成物を電気泳動により分離し、ＲＮＡの長さおよび量を検出する（ステップｄ）。本発明にしたがえば、長さの異なる２種類のＲＮＡ生成物４１および４２が生ずるため、１つのレーンで電気泳動することによりこれらのＲＮＡ生成物を同時に検出することが可能である。ＲＮＡ生成物が放射性標識されている場合には、電気泳動ゲルをそのままあるいは乾燥して、ホスファーイメージャー、Ｘ線フィルム等により検出するか、あるいは対応するバンドを切り取って放射能を測定することにより検出することができる。ＲＮＡ生成物がビオチン標識されている場合には、ノザンブロットを行い、蛍光標識アビジン、酵素標識アビジン等を用いて検出することができる。また、ＤＩＧ、フルオレセイン、ローダミンなどを用いてＲＮＡを標識して検出してもよい。あるいは、ＲＮＡ６０００ナノアッセイ（Agilent社）、キャピラリーシークエンサー等を用いてＲＮＡ生成物を検出してもよい。
【００１６】
図３はサンドイッチ法を用いる本発明の別の態様を示す。図１のステップａにおいて、標的蛋白質を固相に直接結合させる代わりに、標的蛋白質に結合しうる抗体５１および５２をあらかじめ固相に固定化しておき、サンプルを加えて標的蛋白質１１および１２を抗体に結合させる。サンドイッチ法はイムノアッセイにおいて広く用いられており、一般にアッセイの感度や特異性を高めることができることが知られている。固相に固定化した抗体と複合体中の抗体とは、異なるエピトープを認識するよう選択することが好ましい。ステップｂ以降の工程は図１と同様に行うことができる。
【００１７】
図４は、抗体とＤＮＡマーカーとを直接結合させた複合体を用いる代わりに、結合手段を用いて抗体とＤＮＡマーカーとを結合させることによりシグナルを増幅させる、本発明の別の態様を示す。一例として、結合手段としてビオチン−ストレプトアビジン系を用いる場合、まず、固相に固定化した蛋白質にビオチン化抗体６１を結合させる（ステップｅ）。抗体にビオチンを結合させる方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンなどの架橋試薬を用いて行うことができる。次に、ストレプトアビジン６３を加えて、ビオチンを介してストレプトアビジンを抗体に結合させた後、ビオチン化ＤＮＡマーカー６５を加える（ステップｆ）。ビオチン化ＤＮＡマーカーは、例えばビオチン化ヌクレオチドユニットを用いてＤＮＡ合成を行うか、あるいはビオチン化プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うことにより、容易に製造することができる。ビオチンストレプトアビジンは４個のビオチン結合部位を有するため、１分子の抗体について複数のビオチン化ＤＮＡマーカーを結合させることができる（ステップｇ）。したがって、ＲＮＡポリメラーゼを作用させたときに、図１の態様と比較してより多数のＲＮＡが生成され、より強いシグナルを得ることができる（ステップｈ）。このようなシグナル増幅システムの他の例としては、（１）標的蛋白質に結合した抗体にストレプトアビジン化二次抗体（サンドイッチ法の場合には三次抗体）を結合させ、次にビオチン化ＤＮＡマーカーを結合させる、（２）標的蛋白質に結合した抗体にビオチン化二次抗体（サンドイッチ法の場合には三次抗体）を結合させ、ストレプトアビジンを結合させた後に、さらにビオチン化ＤＮＡマーカーを結合させる、（３）標的蛋白質に結合する抗体にストレプトアビジン化プロテインＡを結合させ、次にビオチン化ＤＮＡマーカーを結合させる、等の方法が挙げられる。当業者は、蛋白質アッセイの技術分野において知られる他の増幅システムの任意のものを容易に本発明の方法と組み合わせることができる。
【００１８】
本発明の方法は、サンプル中の複数の標的蛋白質を同時に検出することができるため、サンプルが少量である場合や、サンプル中の標的蛋白質の濃度が低い場合に特に有用である。本発明の方法は、イムノＰＣＲ法と比較して、定量的な測定が可能であるという利点を有する。また、本発明の方法は、同じサンプル中において、修飾蛋白質と未修飾蛋白質、あるいは正常型蛋白質と異常型蛋白質などを同時に検出する場合に有効である。例えば、１つのサンプル中においてリン酸化された蛋白質の割合を測定する場合、本発明の方法を用いれば、内部標準を用いることなく直接その割合を測定することができる。また、本発明の方法は、蛋白質の修飾（リン酸化、アセチル化、糖鎖修飾）、蛋白質−蛋白質相互作用、および蛋白質の立体構造の変化の検出およびモニターにも有用である。
【実施例１】
【００１９】
以下の実施例により、プリオン蛋白質およびｔａｕ蛋白質の検出を例として本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。実施例において用いた試薬および溶液は以下のとおりである。
1.  PBS：500ml、SIGMA社、Cat.No. #D-8537
2.  Tween 20：100ml、SIGMA社、Cat.No. #P-7942
3.  BSA：25ｇ、SIGMA社、Cat.No. #A-6003
4.  アジ化ナトリウム（NaN3）：100ｇ、Wako社、Cat.No. #197-11091
5.  ssDNA
6.  T7 RNA ポリメラーゼ：Roche社、Cat.No. #881775
7.  Biotin-UTP：Roche社、Cat.No. #1093070
8.  PhototopeTM - Star Detection Kit for Nucleic Acids：第一化学薬品（株）、Cat.No. #240621
9.  First Strand cDNA Synthesis Kit（Rever Tra Ace -α-）：TOYOBO社、Cat.No. #FSK-101
10.  PBS-T：PBS  500 ml＋Tween 20  250μl
11.  ブロッキング溶液：PBS-T  50 ml＋BSA（1 mg/ml）  50μl＋10%-NaN3  100μl
12.  ＤＮＡブロッキング溶液：PBS-T  50 ml＋BSA（1 mg/ml）  50μl＋10%-NaN3  100μl＋ssssDNA (10mg/ml)  50μl
13.  メンブレンブロッキング溶液（検出用）：10％-SDS  500 ml＋5M-NaCl  25 ml＋0.1M Na-PB (pH 7.2)  250 ml＋D2W  225 ml
14.  基質
Recombinant Bovine PrP  :  1 mg、Prionics社、Cat.No. #03-011
Recombinant Human Tau  ：  50μg/25μl、Wako社、Cat.No. #542-01011
15.  抗プリオン抗体
Monoclonal anti-PrP 6H4  :  100μg、Prionics社、Cat.No. #01-010
Monoclonal anti-PrP 34C9  :  100μg、Prionics社、Cat.No. #01-020
Polyclonal anti-PrP RO29  :  100μl、Prionics社、Cat.No. #02-010
Monoclonal anti-PrP SAF-32  :  200μg、Cayman社、Cat.No. #189720
Monoclonal anti-PrP SAF-84  :  200μg、Cayman社、Cat.No. #189775
Polyclonal anti-PrP ab6664  :  100μl、AbCam社、Cat.No. #ab6664
16.  抗タウ抗体
Polyclonal anti-Tau H-150  :  200μｇg、Santa Cruz社、Cat.No. #sc-5587
Polyclonal anti-Tau C-17  :  200μg、Santa Cruz社、Cat.No. #sc-1995
Polyclonal anti-Tau V-20  :  200μg、Santa Cruz社、Cat.No. #sc-1996
Monoclonal anti-PrP ab8739  :  500μl、AbCam社、Cat.No. #ab87394
Polyclonal anti-PrP ab6419  :  100μl、AbCam社、Cat.No. #ab6419
Polyclonal anti-PrP ab8763  :  250μl、AbCam社、Cat.No. #ab8763
【００２０】
１．ビオチン−ｄｓＤＮＡの作製
培養HL60細胞からmRNAを抽出し、リバーストランスクリプターゼを用いてDNAを合成し、このDNAをテンプレートにしてPCRを行って、G3PDH遺伝子を増幅した。このPCR産物をTAクローニングし、クローンを作成し、シークエンスにより挿入物の配列を確認した。各クローンをテンプレートとしてPCRを行い、ターゲット配列の長さの異なる次の２種類のビオチン−ｄｓＤＮＡを作製した。対照であるβ−アクチンについても同様にしてｄｓＤＮＡを調製した。
１．ビオチン-ds-G3PDH 50bp
ビオチン - GAG AGA GGA TCC AAG TAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GGA CTC ATG ACC ACA GTC CAT GCC ATC ACT GCC ACC CAG AAG ACT GT
２．ビオチン-ds-G3PDH 300bp
ビオチン - GAG AGA GGA TCC AAG TAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC ATC ACT GCC ACC CAG AAG ACT GTG GAT GGC CCC TCC GGG AAA CTG TGG CGT GAT GGC CGC GGG GCT CTC CAG AAC ATC ATC CCT GCC TCT ACT GGC GCT GCC AAG GCT GTG GGC AAG GTC ATC CCT GAG CTG AAC GGG AAG CTC ACT GGC ATG GCC TTC CGT GTC CCC ACT GCC AAC GTG TCA GTG GTG GAC CTG ACC TGC CGT CTA GAA AAA CCT GCC AAA TAT GAT GAC ATC AAG AAG GTG GTG AAG CAG GCG TCG GAG GGC CCC CTC AAG GGC ATC CTG GGC TAC ACT GAG CAC CAG GT
【００２１】
２．抗原の吸着
９６穴平底プレートの各ウエルに、種々の濃度のプリオン蛋白質およびｔａｕ蛋白質を加え、４℃で一晩インキュベートして、プレートに抗原を吸着させた。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回、ＰＢＳで５回洗浄し、ブロッキング溶液を加え、室温で１時間インキュベートしてプレートをブロッキングした。
【００２２】
３．抗プリオン抗体の結合および標識
ビオチン化抗プリオン抗体は、市販品の抗体をタンパク質ビオチン化キット（ELC protein biotinylation module：Amersham Pharmacia社、Cat.No. #RPN 2202）を用いて調製した。抗体をビオチン化後、カラム精製し、抗体の力価を測定することにより抗体の希釈倍率を決定した。ブロッキングしたプレートをＰＢＳ−Ｔで３回、ＰＢＳで５回洗浄し、ビオチン化した抗プリオン抗体を加えて、室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回、ＰＢＳで５回洗浄し、ストレプトアビジンを加えて室温で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回、ＰＢＳで５回洗浄し、ＤＮＡブロッキング溶液を加えて室温で１時間インキュベートした。次に、ビオチン-ds-G3PDH 50bpを加えて室温で１時間インキュベートした。
【００２３】
４．抗ｔａｕ抗体の結合および標識
次に、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回、ＰＢＳで５回洗浄し、上述と同様にしてビオチン化した抗ｔａｕ抗体を加えて、室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回、ＰＢＳで５回洗浄し、ストレプトアビジンを加えて室温で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回、ＰＢＳで５回洗浄し、ＤＮＡブロッキング溶液を加えて室温で１時間インキュベートした。次に、ビオチン-ds-G3PDH 300bpを加えて室温で１時間インキュベートした。
【００２４】
５．ＲＮＡの増幅および検出
プレートをＰＢＳ−Ｔで３回、ＰＢＳで５回洗浄し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
ｄＮＴＰおよびビオチン−ＵＴＰを加えて３７℃で８時間インキュベートした。上清を取り出し、２％アガロースゲルで電気泳動し、メンブレン（Hybond N+）に移した。ビオチン化ＲＮＡはアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを用いて検出した。図５に示されるように、サンプル中のプリオン蛋白質およびｔａｕ蛋白質をそれぞれ５０ｐｇ／ウエルの量で同時に検出することができた。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明は蛋白質の検出方法に関する。本発明の方法は、生物学、生化学、薬学、医学の分野において、研究および診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、本発明の検出方法の原理を示す。
【図２】図２は、本発明の方法において用いられる、抗体とＤＮＡマーカーとの複合体の構造を示す。
【図３】図３は、サンドイッチ法を用いる本発明の態様を示す。
【図４】図４は、シグナル増幅システムを用いる本発明の態様を示す。
【図５】図５は、ノザンブロッティングによるプリオン蛋白質およびｔａｕ蛋白質の検出の結果を示す。
【図１】
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【図２】
2005257641.tif 000004
【図３】
2005257641.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【配列表】
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