(57)【要約】【課題】生細胞の数を、簡便かつ短時間に計測することが可能な生細胞の計測方法、およびシンプルで小型化を図った生細胞の計測装置を提供する。【解決手段】試料中生細胞としての菌２１を蛍光試薬２１aにより標識することにより、菌の数を計数する方法において、蛍光試薬２１aにより標識された反応層２４における菌２１を、発光ダイオード２５の青色光により励起し、菌から発する蛍光量（緑色光）をフォトダイオード３３で計測し、予め求めた単位面積当たりの菌の個数と蛍光量計測値との相関に基づいて、菌の数を演算して求める。上記装置において、ダイクロイックミラー３１を菌流路２０における反応層２４の上部に設け、同ミラーは２個のプリズムを傾斜面を背中合わせにし、この背中合わせ面を、青色光を反射し、かつ緑色光を透過するものとし、これに菌流路,光学フィルタ,発光ダイオード, フォトダイオード等を一体的に構成する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、
前記蛍光試薬により標識された生細胞を特定の短波長の光により励起し、これにより生細胞から発する前記短波長より相対的に長波長の蛍光量を計測し、予め求めた単位面積当たりの生細胞の個数と前記蛍光量計測値との相関に基づいて、生細胞の数を演算して求めることを特徴とする生細胞の計数方法。
【請求項２】
請求項１に記載の生細胞の計数方法において、前記短波長の光は青色発光ダイオードの発光とし、前記単位面積当たりの生細胞の個数と前記蛍光量計測値との相関は、単位面積当たりの細菌の個数とフォトダイオードによって計測された蛍光出力とすることを特徴とする生細胞の計数方法。
【請求項３】
請求項１に記載の生細胞の計数方法を実施するための装置であって、試料と蛍光試薬とを導入し、前記試料と蛍光試薬とを反応させる反応部を有する生細胞流路と、特定の短波長の光を発する励起用光源と、この特定の短波長の光のみを透過する光フィルタと、励起用光源の出射光強度分布を均一化する照度均一化光学手段と、前記特定の短波長の光を反射して前記生細胞流路の反応部に照射し、かつ生細胞から発する前記短波長より相対的に長波長の蛍光を透過するダイクロイックミラーと、前記長波長の蛍光のみを透過する光フィルタと、透過した蛍光量を計測する蛍光量計測器と、予め求めた単位面積当たりの生細胞の個数と蛍光量計測値との相関に基づいて生細胞の数を演算する演算器とを備えることを特徴とする生細胞の計数装置。
【請求項４】
請求項３に記載の生細胞の計数装置において、前記励起用光源は中心波長４７０ｎｍの青色発光ダイオードとし、前記蛍光のみを透過する光フィルタの透過波長帯域は５１０〜５６０ｎｍとし、前記蛍光量計測器はフォトダイオードとすることを特徴とする生細胞の計数装置。
【請求項５】
請求項３または４に記載の生細胞の計数装置において、前記ダイクロイックミラーは、前記生細胞流路における反応部の上部に設け、２個のプリズムを傾斜面を背中合わせにし、この背中合わせ面を、前記特定の短波長の光を反射し、かつ前記相対的に長波長の蛍光を透過するものとし、さらに、前記ダイクロイックミラーを挟んで、一方のプリズムの前記反応部と対向する面側には、前記蛍光のみを透過する光フィルタおよび蛍光量計測器を設け、さらにまた、前記ダイクロイックミラーを挟んで、他方のプリズムの前記蛍光のみを透過する光フィルタとは直角方向の一方の面側には、前記照度均一化光学手段と、特定の短波長の光のみを透過する光フィルタと、励起用光源とを設けることを特徴とする生細胞の計数装置。
【請求項６】
請求項５に記載の生細胞の計数装置において、前記ダイクロイックミラーを挟んで、前記一方のプリズムの前記蛍光のみを透過する光フィルタとは直角方向であって、かつ前記照度均一化光学手段を設ける側と対向する他方の面側には、前記演算器を設けることを特徴とする生細胞の計数装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中の微生物や動植物等の組織細胞などの生細胞の検出は、例えば、滅菌状態の確認や、細胞の生存状態の異常等を検出する上で、医療，食品製造，上下水道技術分野等において産業上極めて重要な技術である。以下の説明においては、説明の便宜上、主に細菌を対象として述べるが、本発明において、前記微生物には、細菌や放線菌などの原核生物、酵母やカビなどの真核生物、下等藻類、ウイルスなどが含まれ、前記組織細胞には、動植物由来の培養細胞及びスギやヒノキなどの花粉などが含まれる。なお、死菌を計測するなど、生きている物のみに限定されない。
【０００３】
自然環境中には、生きているが通常の方法では培養が困難な状態にある細菌が高い割合で存在する。これらの細菌は、一般的な寒天平板培地上にコロニーを形成せず、また液体培地中でも増殖しないことが多い。このため、従来の培養を基本とする方法では検出できない恐れがある。
【０００４】
こうした問題を解決する方法として、前記生細胞を蛍光試薬により標識する方法以外に、例えばＤＮＡに結合するジアミジノ・フェニル・インドール（ＤＡＰＩ）やアクリジン・オレンジ（ＡＯ）を用いて遺伝子を標識することで細菌を検出する方法や、細菌内で代謝されて蛍光性となるフルオレセイン・ジアセテート（ＦＤＡ）、カルボキシ・フルオレセイン・ジアセテート（ＣＦＤＡ）、5-シアノ-2,3-ジトリル テトラゾリウム クロライド（ＣＴＣ）などを用いて生理活性を維持している細菌を検出する計測方法が提案されている。
【０００５】
前記ＦＤＡやＣＦＤＡは、細菌などの生細胞内にある酵素（エステラーゼ）の働きで加水分解されて蛍光性となる。また、ＣＴＣは、生細胞の呼吸に伴って還元されると蛍光性となる。前記いずれの試薬も、溶液として測定対象となる試料中の生細胞に接触させ、生細胞内に取り込まれて反応することにより、蛍光を発する状態となり、この蛍光によって細菌等の生細胞を検出する。
【０００６】
上記のように、蛍光によって細菌等の生細胞を検出する方法として、蛍光画像を計測する方法が知られており、近年の撮像素子や画像処理技術の進展に伴い、前記画像計測においても、オートフォーカス（ＡＦ）の技術が汎用されるようになってきた。かかる技術に関して本願出願人は、「構成要素の少ないシンプルな構成で、蛍光強度の低い標本についても消光を起こさせることなく、さらに、メンブレンフィルタ表面に補足した標本やコントラストが不鮮明な標本についても、画像情報に基づいてＡＦを可能とすること」を目的とした蛍光画像計測方法および装置について特許出願している（特許文献１参照）。
【０００７】
図６は、特許文献１に開示された蛍光画像計測装置の概略構成図である。図６において、１は標本、２はＡＦ用光源、３はダイクロイックミラー、４はフィルタ、５は対物レンズ、６は結像レンズ、７は撮像素子、８は演算部、９はステージ移動機構、１０は励起用光源、１１は集光レンズ、１３は蛍光フィルタブロックを示す。
【０００８】
図６に示す蛍光画像計測装置によれば、計測試料としての標本１に対して、まず蛍光画像計測波長帯域で発光するオートフォーカス用光を照射し、その結果得た画像情報に基づいて合焦度を判定し、その合焦度に応じて受光光学系または標本の少なくとも一方を駆動して合焦点位置をサーチし、合焦点位置に到達した後オートフォーカス用光の照射を止め、その後に、前記標本に対して励起光を照射し、試料が発する蛍光画像を計測するようにすることにより、構成要素の少ないシンプルな構成で、蛍光強度の低い標本についても消光を起こさせることなく、画像情報に基づくＡＦが可能となり、高精度の計測ができる。
【特許文献１】国際公開  ＷＯ０３／０６７２３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ところで、前記特許文献１に開示された装置は、種々の光学系や画像計測系を含むので、装置の外形寸法が大となる欠点がある。また、蛍光画像計測するに当たって、標本の作成や、オートフォーカス等の手順が必要となるので、生細胞の計数に長時間を要する等の問題がある。
【００１０】
この発明は上記の点に鑑みてなされたもので、本発明の課題は、生細胞の数を、簡便かつ短時間に計測することが可能な生細胞の計測方法、およびシンプルで小型化を図った生細胞の計測装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題は、以下により達成される。即ち、請求項１の発明によれば、試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、前記蛍光試薬により標識された生細胞を特定の短波長の光により励起し、これにより生細胞から発する前記短波長より相対的に長波長の蛍光量を計測し、予め求めた単位面積当たりの生細胞の個数と前記蛍光量計測値との相関に基づいて、生細胞の数を演算して求めることを特徴とする。
【００１２】
また、前記請求項１に記載の生細胞の計数方法において、前記短波長の光は青色発光ダイオードの発光とし、前記単位面積当たりの生細胞の個数と前記蛍光量計測値との相関は、単位面積当たりの細菌の個数とフォトダイオードによって計測された蛍光出力とすることを特徴とする（請求項２）。
【００１３】
前記生細胞の計数方法によれば、蛍光画像により生細胞の数を計測することなく、特定波長の蛍光強度から概略の生細胞の数を前記相関に基づいて計測するようにしたので、生細胞の数を、簡便かつ短時間に計測することができる。特に、請求項２の発明によれば、詳細は後述するが、例えば、単位面積当たりの細菌の個数（菌の個数／ｍｍ2）が、フォトダイオードによって計測された蛍光出力（ｎＷ）として計数でき、これを単位体積当たりに換算して計測できるので、食品製造などにおいて、断続的な細菌の個数計測モニターとして、極めて好適に利用できる。
【００１４】
上記請求項１の発明を実施するための装置としては、下記請求項３ないし６の発明が好ましい。即ち、前記請求項１に記載の生細胞の計数方法を実施するための装置であって、試料と蛍光試薬とを導入し、前記試料と蛍光試薬とを反応させる反応部を有する生細胞流路と、特定の短波長の光を発する励起用光源と、この特定の短波長の光のみを透過する光フィルタと、励起用光源の出射光強度分布を均一化する照度均一化光学手段と、前記特定の短波長の光を反射して前記生細胞流路の反応部に照射し、かつ生細胞から発する前記短波長より相対的に長波長の蛍光を透過するダイクロイックミラーと、前記長波長の蛍光のみを透過する光フィルタと、透過した蛍光量を計測する蛍光量計測器と、予め求めた単位面積当たりの生細胞の個数と蛍光量計測値との相関に基づいて生細胞の数を演算する演算器とを備えることを特徴とする（請求項３）。
【００１５】
また、前記請求項３に記載の生細胞の計数装置において、前記励起用光源は中心波長４７０ｎｍの青色発光ダイオードとし、前記蛍光のみを透過する光フィルタの透過波長帯域は５１０〜５６０ｎｍとし、前記蛍光量計測器はフォトダイオードとすることを特徴とする（請求項４）。
【００１６】
さらに、前記請求項３または４に記載の生細胞の計数装置において、前記ダイクロイックミラーは、前記生細胞流路における反応部の上部に設け、２個のプリズムを傾斜面を背中合わせにし、この背中合わせ面を、前記特定の短波長の光を反射し、かつ前記相対的に長波長の蛍光を透過するものとし、さらに、前記ダイクロイックミラーを挟んで、一方のプリズムの前記反応部と対向する面側には、前記蛍光のみを透過する光フィルタおよび蛍光量計測器を設け、さらにまた、前記ダイクロイックミラーを挟んで、他方のプリズムの前記蛍光のみを透過する光フィルタとは直角方向の一方の面側には、前記照度均一化光学手段と、特定の短波長の光のみを透過する光フィルタと、励起用光源とを設けることを特徴とする（請求項５）。
【００１７】
さらにまた、前記請求項５に記載の生細胞の計数装置において、前記ダイクロイックミラーを挟んで、前記一方のプリズムの前記蛍光のみを透過する光フィルタとは直角方向であって、かつ前記照度均一化光学手段を設ける側と対向する他方の面側には、前記演算器を設けることを特徴とする（請求項６）。
【００１８】
特に、前記請求項５または６の実施態様によれば、生細胞流路上に２個のプリズムを傾斜面を背中合わせにして載置し、これに隣接してその他光学系および蛍光量計測器を一体的に構成できるので、装置がシンプルかつ小型化できる（詳細は後述する）。
【発明の効果】
【００１９】
この発明によれば、生細胞の数を、簡便かつ短時間に計測可能な生細胞計測方法、およびシンプルかつ小型化した簡易型の生細胞計測装置が提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
次に、この発明の実施形態に関して、図１ないし図５に基いて説明する。図１は、本発明の実施形態に係る細菌を対象とする生細胞計数装置の模式的説明図であり、図１（ａ）は装置を側方から見た模式図、図１（ｂ）は上方から見た模式図である。
【００２１】
図１に示す生細胞計数装置は、菌２１を含む試料と蛍光試薬２１ａとを導入し、試料と蛍光試薬とを反応させる反応層２４を有する菌流路２０と、特定の短波長の光（例えば、青色光）を発する励起用光源としての発光ダイオード２５と、この青色光のみを透過する青フィルタ２６と、発光ダイオード２５の出射光強度分布を均一化する照度均一化光学系２７と、前記青色光を反射して前記反応層２４に照射し、かつ菌から発する前記青色光より相対的に長波長の蛍光（例えば、緑色光）を透過するダイクロイックミラー３１と、前記緑色光のみを透過する緑フィルタ３２と、透過した蛍光量を計測する蛍光量計測器としてのフォトダイオード３３と、予め求めた単位面積当たりの菌の個数と蛍光量計測値との相関に基づいて生細胞の数を演算する演算器としての集積回路４０とを備える。
【００２２】
前記ダイクロイックミラー３１は、例えば、光磁気記録ドライブ装置に利用されるような２個の小型プリズム３１ａおよび３１ｂの傾斜面を背中合わせにし、この背中合わせ面に多層膜コーティングを施すことにより、例えば、青色光を反射し、かつ前記相対的に長波長の蛍光（例えば、緑色光）を透過するものとして構成する。また、このプリズムブロックと一体的に、図示のように、緑フィルタ３２とフォトダイオード３３と、さらには照度均一化光学系２７と青フィルタ２６と発光ダイオード２５とを配設する。
【００２３】
前記発光ダイオードや光学フィルタ等の具体的な諸元の一例を下記に示す。
１）発光ダイオード：中心波長４７０ｎｍの青色ＬＥＤ
２）青フィルタの透過波長帯域：４５０〜４７０ｎｍ
３）ダイクロイックミラーの特性：反射率と透過率の分岐点波長が５０５ｎｍ（即ち、５０５ｎｍで透過率が約５０％であって、５０５ｎｍより短波長側では透過率が低下（反射率が高上）し、５０５ｎｍより長波長側では透過率が高上（反射率が低下）するミラー特性を備える）
４）緑フィルタの透過波長帯域：５１０〜５６０ｎｍ
前記フォトダイオード３３は、緑フィルタ３２の透過光を電気信号に変換する機能を有し、緑フィルタ３２は受光のＳ／Ｎ比の向上機能を果たす。
【００２４】
上記図１に示すような装置により、反応層２４の直前で菌２１と試薬２１ａとを混合して反応層に導入し、発光ダイオード２５からの青色光によって励起することにより菌が発する蛍光（緑色光）のパワーをフォトダイオード３３により計測する。なお、菌は反応層、即ち、観測領域に一旦固定し、蛍光強度を観測した後に、菌の固定部を洗浄するか、もしくは固定部を取替えることにより、反復的に測定を繰り返す。
【００２５】
図２は、菌の個数と蛍光パワーの検量線の一例を示す。図２のような検量線を予め求めておくことにより、単位面積当たりの細菌の個数（菌の個数／ｍｍ2）が、フォトダイオードによって計測された蛍光出力（ｎＷ）として計数できる。なお、単位体積当たりの菌の個数は、菌を固定する際に流した流量に基づいて換算して求めることができる。
【００２６】
ところで、前記菌の固定に関して、図３および図４により、その具体的な方法を述べる。
【００２７】
まず、図３に基づき、生細胞の捕捉固定に静電力を利用する方法の実施形態について、以下に述べる。図３において、菌などの生細胞を含む試料を、静電力発生用の電極２２を備えた生細胞流路（セル流路）２０内に導入し、前記セル流路２０の一部を正に帯電させることにより、自然状態で負に帯電した試料中の生細胞３０を前記正帯電部に捕捉する。その後、蛍光標識試薬をセル流路２０に導入して前記捕捉した生細胞３０を蛍光標識し、捕捉した生細胞を含む試料の蛍光出力を取得する。その後、次の測定に備えて、洗浄液によって、セル流路２０内を洗浄する。
【００２８】
なお、図３において、セル流路２０は、透明なガラスまたはプラスチックにより構成される。また、蛍光標識試薬は、試料と同時にセル流路に導入することもできる。
【００２９】
次に、図４に基づき、生細胞の捕捉に抗原抗体反応を利用する方法の実施形態について、以下に述べる。図４において、試料を、セル流路２０内に導入し、セル流路２０の一部に、予め、捕捉すべき生細胞と特異的に結合する抗体２３、例えば抗体ビーズを固定しておくことにより、試料中の生細胞３０を抗体２３との結合によって捕捉する。その後、蛍光出力の測定および洗浄を行う手順は、前記図３の実施形態と同様である。
【００３０】
次に、単位体積当たりの菌の個数を、単位面積当たりの菌の個数の計測値に基づいて、換算して求める方法に関して、２つの例について、以下に述べる。
【００３１】
例えば、所定体積の試料内に含まれる菌を、菌の個数に変動があっても、予測される範囲内で全て捕捉できるような、捕捉能力に十分余裕のある固定床（前記抗体ビーズの数や静電解の強さを大とした固定床）を準備しておき、この固定床に対して、長時間、前記所定体積の試料を繰り返し循環して流し、固定床に菌の捕捉を飽和させた上で、廃液する。その後、単位面積当たりの菌の個数を計測し、前記所定体積当たりの菌の個数に換算する。
【００３２】
上記方法によれば、単位体積当たりの菌の個数に変動があるような試料に対しても、比較的精度の高い計測が可能となる。しかしながら、変動が比較的少ないような試料であって、速い計測応答が要請されるようなモニターの場合には、精度よりも、簡便でかつ早い応答性が要請される。このような場合には、例えば下記の方法による。
【００３３】
単位面積当たりの菌の個数Ｎａ（個／ｍｍ2）から、試料中の単位体積当たりの菌の個数Ｎｖ（個／ｍｌ）への換算に際して、試料液の流速によって変化する菌の補足効率（α）を予め実験的に求めておき、この補足効率（α）に基づいて、下式により演算して求める。但し、下式において、Ｓは菌捕捉領域の面積（ｍｍ2）、Ｖは菌捕捉領域を通過した試料液の流量（ｍｌ）である。
【００３４】
Ｎｖ（個／ｍｌ）＝｛Ｎａ（個／ｍｍ2）×Ｓ（ｍｍ2）｝／｛Ｖ（ｍｌ）×（α）｝
次に、図５について述べる。図５は、図１における照度均一化光学系２７の説明図で、例えば、光ダイオードの出射光強度分布を菌の観測面上で均一にする光学系の一例を示す説明図である。光ダイオード２５は、通常、図５（ｂ）に示すように、発光中心部が明るく周辺部が暗いので、例えば、図５（ａ）に示すように、凹レンズ２７ａを用いることにより、光量分布を均一化できる。
【００３５】
以上のような実施態様によれば、生細胞流路の反応層に固定した単位面積当たりの生細胞の個数（菌の個数／ｍｍ2）を、蛍光出力（ｎＷ）として計数することにより、生細胞が簡便に計数できる。従って、本発明の生細胞計測装置は、医療，食品製造，上下水道技術分野等における簡易型計測モニターとして、好適に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】この発明の実施形態に関わる生細胞計数装置の模式的説明図。
【図２】菌の個数と蛍光パワーの検量線の一例を示す図。
【図３】生細胞の捕捉固定に静電力を利用する方法の説明図。
【図４】生細胞の捕捉に抗原抗体反応を利用する方法の説明図。
【図５】本発明に係る照度均一化光学系の説明図。
【図６】特許文献１に開示された蛍光画像計測装置の概略構成図。
【符号の説明】
【００３７】
２０    菌流路（セル流路）
２１    菌
２１ａ    試薬
２２    電極
２３    抗体
２４    反応層
２５    発光ダイオード
２６    青フィルタ
２７    照度均一化光学系
２７ａ    凹レンズ
３０    生細胞
３１    ダイクロイックミラー
３１ａ，３１ｂ    プリズム
３２    緑フィルタ
３３    フォトダイオード
４０    集積回路
【図１】
2005241435.tif 000003
【図２】
2005241435.tif 000004
【図３】
2005241435.tif 000005
【図４】
2005241435.tif 000006
【図５】
2005241435.tif 000007
【図６】
2005241435.tif 000008