(57)【要約】【課題】  エチレンを合成し得ないが、それらの代謝の他の局面には影響のない形質転換植物を提供すること。【解決手段】  本発明は、精製されたタンパク質、その発現をコードするDNA配列、および組換えDNA分子を提供し、エチレンの合成に必要な酵素の発現を抑制するための形質転換コーヒー植物のためにそれらで形質転換された宿主を含む。DNA配列および組換えDNA分子は、コーヒー植物におけるエチレンの生合成経路の要素である酵素ACCシンターゼまたはACCオキシダーゼの発現をコードする点で特徴づけられている。コーヒー植物は、ACCシンターゼおよび／またはACCオキシダーゼのmRNAに対してアンチセンスであるそれぞれのmRNAの発現をコードする、ACCシンターゼDNA配列および／またはACCオキシダーゼDNA配列を含むベクターで形質転換される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実施例に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、精製されたタンパク質、組換えDNA配列、それらで形質転換した宿主、およびコーヒー植物の成熟を制御するためのプロセスに関する。より詳細には、本出願は、精製されたタンパク質、ならびにコーヒー果実特異的１-アミノシクロプロパン-1−カルボン酸（ACC）シンターゼおよびACCオキシダーゼ遺伝子の発現を抑制するために使用され得る組換えDNA配列に関する。本出願はさらに、このような配列で形質転換され、それにより成熟に必要なエチレンを合成し得ないようにされたコーヒー植物に関する。本発明によって形質転換された植物への外来性エチレンの適用は、コーヒー植物における果実の成熟の同時発生および制御を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
コーヒーは、Coffea属の植物、一般的には、C.arabica種の焙煎した豆から調製される。豆はコーヒー植物の種子であり、そして果実（その優れた品質に起因して最高の価格で売られている最も理想的な成熟果実）を処理することによって得られる。従来、高品質の「グルメな（gourmet）」コーヒーは手で摘まれた。このことは、コーヒーの木の果実が均一に成熟せず、従って同じ木に成熟した果実と未成熟の果実との両方が存在するので必須であった。従来、ほとんどのコーヒーが、労働力が豊富でありそして高価ではない世界中の地域で栽培されているので、このことは深刻な問題ではなかった。しかしより最近では、豊富で安価な労働力の不足が、コーヒー産業での減少した生産性の主要な原因となっている。生産性を増大させるために、世界中のいくつかの地域（例えば、最大のコーヒー生産国である、ブラジル）では、労働者が、成熟しているかまたは未成熟であるかにかかわらず、枝から全ての果実を迅速に採集するというもぎ取り収穫（stripharvesting）に頼っていた。これは、収穫の速度を増大するが、果実のほとんどが未成熟（緑色）である場合に、最高品質の豆の収量を減少させる。
【０００３】
さらに、均一に成熟しないために、機械収穫の効率は非常に制限されている。木から成熟した果実（桜色 (cherry)）を採集するために必要な力は、緑色の果実を採集するために必要な力と同様である。従って、機械収穫は、緑色と桜色とを十分に区別せず、そして大量の未成熟の果実が、成熟した果実とともに収穫される。このことは、成熟した果実の収量を大きく減少させ、そして生産性を制限する。コーヒー果実の成熟が全ての果実が同時に成熟するように制御され得れば、手摘みのもぎ取り法および機械収穫の両方ともがよりかなり効率的で、そして収穫された果実のより高い割合がより高い品質グレードとなる。このことは、コーヒー産業の収益性を増大させる。
【０００４】
多くの他の果実の場合のように（YangおよびHoffman, Ann. Rev.Plant Physiol. 35:155 (1984)）、植物が産生したエチレンは、コーヒーの果実の成熟の最終段階で重要な役割を果たす。一旦、コーヒーの果実が成熟の特定の段階に達すると、それらはエチレンの外因的な適用によって成熟に誘導され得る（Crisosto,C.H.,P.C. Tausend, M.A. Nagao, L.H. FuchigamiおよびT.H.H. Chen, J. Haw. Pac.Agri.3:13-17(1991)）。このことは、コーヒーの果実の成熟の最終段階についてのエチレンの重要性を示す。
【０００５】
エチレンは、S-アデノシルメチオニン（SAM）から二段階の反応で合成される。第１段階は、ACCシンターゼによる、SAMからの1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸（ACC）の合成である。ほとんどの植物において、この段階が律速段階である。最終段階はACCのエチレンへの変換であり、これはACCオキシダーゼによって触媒される（YangおよびHoffman、前出）。化学的手段（例えば、銀イオンまたは二酸化炭素）またはバイオテクノロジーの手段（Oellerら、Science254:437(1991)）によるエチレンの生合成の阻害は、成熟の最終段階を阻害する。この阻害は、エチレンの適用によって可逆的である。
【０００６】
従って、コーヒー植物の成熟を制御するストラテジーは、エチレンの生合成経路で特異的な酵素の合成を妨げることである。１つの実施態様において、本発明は、ACCシンターゼの合成を排除するためのコーヒー植物の遺伝的変更に関する；別の実施態様において、ACCオキシダーゼ合成が抑制される。本明細書中で好ましい実施態様において、これらの酵素の１つまたは両方の合成は、その合成が抑制される酵素の発現をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)に対してアンチセンスであるmRNAの転写をコードするDNA配列で、コーヒー植物を形質転換することによって抑制される。同様のストラテジーを使用してトマトの成熟を制御することを報告した、Oellerら、Science254:437(1991) を参照のこと。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
組換えDNA技術は、多数のACCシンターゼおよびACCオキシダーゼ遺伝子を単離するために使用されている。しかし、コーヒーのACCシンターゼおよびACCオキシダーゼの遺伝子は、今日まで同定されていないか、または配列決定されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、精製されたタンパク質、その発現をコードするDNA配列、および組換えDNA分子を提供し、エチレンの合成に必要な酵素の発現を抑制するためのコーヒー植物の形質転換のためにそれらで形質転換された宿主を含む。DAN配列および組換えDNA分子は、それらがコーヒー植物におけるエチレンの生合成経路の要素である酵素ACCシンターゼまたはACCオキシダーゼの発現をコードする点で特徴づけられる。
【０００９】
コーヒー植物は、形質転換配列がACCシンターゼおよび/またはACCオキシダーゼのmRMAに対してアンチセンスであるそれぞれのRNAの発現をコードするように挿入された、ACCシンターゼDNA配列および/またはACCオキシダーゼDNA配列を含むベクターで形質転換される。得られるアンチセンスRNAはmRNA（単数または複数）に結合し、それによりエチレンの合成経路の１つ以上の酵素をコードするmRNAを不活化する。記載されるDNA配列はまた、同時抑制を使用してACCシンターゼまたはACCオキシダーゼの合成をブロックするために使用され得る。いずれかの事象における結果は、形質転換された植物はエチレンを合成し得ないが、それらの代謝の他の局面は影響されないことである。
形質転換された植物における成熟は、外因性エチレンによって調節され得る。全ての植物へのエチレンの適用によって、全ての植物は同時に成熟して、コーヒーの機械収穫をより生産的にする。
【００１０】
したがって、本発明は以下を提供する。
１．配列番号10のアミノ酸配列から本質的になる、Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ由来の実質的に純粋なACCシンターゼ。
２．発現の際にＣｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａによって産生されるAACシンターゼをコードし、配列番号11に示されるヌクレオチド配列を含む、実質的に純粋な核酸配列。
３．項目２に記載の発現の際にＣｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａによって産生されるACCシンターゼをコードする、実質的に純粋な核酸配列であって、上記核酸配列は、配列番号11のコード領域に限定される、実質的に純粋な核酸配列。
４．Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａの成熟を制御するための方法であって、上記方法は以下の工程：
ａ）ＤＮＡ配列である配列番号１１に対してアンチセンスであるＤＮＡ配列を用いてコーヒー植物を形質転換する工程；
ｂ）上記ａ）のＤＮＡ配列で形質転換された植物を生育する工程；および
ｃ）コーヒー植物が成熟した後に、上記形質転換された植物に対して外的なエチレンを適用する工程、
を包含する、方法。
５．項目４に記載のＣｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａの成熟を制御するための方法であって、形質転換に使用されるＤＮＡ配列は、配列番号１１のコード領域に対してアンチセンスである配列に限定される、項目４に記載の方法。
６．項目４または５に記載の果実の成熟を制御するための方法であって、気体性エチレンは、上記植物の全体に適用されて、上記果実の実質的にすべての成熟を同時に成熟させる、方法。
７．アミノ酸配列である配列番号１２から本質的になる、Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａからの実質的に純粋なＡＣＣオキシダーゼ。
８．配列番号１３を含み、発現の際にＣｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａのＡＣＣオキシダーゼをコードする、実質的に純粋な核酸配列。
９．項目８に記載される発現の際にＣｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａによって産生されるＡＣＣオキシダーゼをコードする、実質的に純粋な核酸配列であって、上記核酸配列は、配列番号１３のコード領域に限定される、実質的に純粋な核酸配列。
１０．Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａの成熟を制御するための方法であって、上記方法は以下の工程：
ａ）ＤＮＡ配列である配列番号１３に対してアンチセンスであるＤＮＡ配列を用いてコーヒー植物を形質転換する工程；
ｂ）上記ａ）のＤＮＡ配列で形質転換された植物を生育する工程；および
ｃ）コーヒー植物が成熟した後に、上記形質転換された植物に対して外的なエチレンを適用する工程、
を包含する、方法。
１１．項目１０に記載のＣｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａの成熟を制御するための方法であって、形質転換に使用されるＤＮＡ配列は、配列番号１３のコード領域に対してアンチセンスである配列に限定される、方法。
１２．項目９または１０に記載の果実の成熟を制御するための方法であって、気体性エチレンは、上記植物の全体に適用されて、上記果実の実質的にすべての成熟を同時に成熟させる、方法。
１３．ＡＣＣシンターゼの発現が抑制された、コーヒー植物。
１４．ＡＣＣオキシダーゼの発現が抑制された、コーヒー植物。
１５．ＡＣＣシンターゼの発現が抑制され、そしてＡＣＣオキシダーゼの発現が抑制された、コーヒー植物。
１６．発現の際にＡＣＣシンターゼをコードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるｍＲＮＡを転写の際にコードするＤＮＡ配列を含む、コーヒー植物。
１７．項目１６に記載のコーヒー植物からのコーヒー果実。
１８．項目１６に記載のコーヒー植物からのコーヒー豆。
１９．発現の際にＡＣＣオキシダーゼをコードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるｍＲＮＡを転写の際にコードするＤＮＡ配列を含む、コーヒー植物。
２０．項目１９に記載のコーヒー植物からのコーヒー果実。
２１．項目１９に記載のコーヒー植物からのコーヒー豆。
２２．コーヒー植物であって、
ｉ）発現の際にＡＣＣシンターゼをコードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるｍＲＮＡを転写の際にコードする第一のＤＮＡ配列；および
ｉｉ）発現の際にＡＣＣオキシダーゼをコードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるｍＲＮＡを転写の際にコードする第二のＤＮＡ配列、
を含む、コーヒー植物。
２３．項目２２に記載のコーヒー植物からのコーヒー果実。
２４．項目２２に記載のコーヒー植物からのコーヒー豆。
２５．配列番号１１において特定されるＤＮＡ配列の全部または一部に対してアンチセンスであるＤＮＡ配列を含む、コーヒー植物。
２６．配列番号１３において特定されるＤＮＡ配列の全部または一部に対してアンチセンスであるＤＮＡ配列を含む、コーヒー植物。
２７．コーヒー植物であって、
ｉ）配列番号１１において特定されるＤＮＡ配列の全部または一部に対してアンチセンスである第一のＤＮＡ配列；および
ｉｉ）配列番号１３において特定されるＤＮＡ配列の全部または一部に対してアンチセンスである第二のＤＮＡ配列、
を含む、コーヒー植物。
２８．発現の際にＡＣＣシンターゼをコードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるｍＲＮＡを転写の際にコードするＤＮＡ配列を植物ゲノムに挿入するプロセスによって生産される、コーヒー植物。
２９．発現の際にＡＣＣオキシダーゼをコードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるｍＲＮＡを転写の際にコードするＤＮＡ配列を植物ゲノムに挿入するプロセスによって生産される、コーヒー植物。
３０．（ｉ）発現の際にＡＣＣシンターゼをコードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるｍＲＮＡを転写の際にコードするＤＮＡ配列；および
（ｉｉ）発現の際にＡＣＣオキシダーゼをコードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるｍＲＮＡを転写の際にコードするＤＮＡ配列、
を、植物ゲノムに挿入するプロセスによって生産される、コーヒー植物。
３１．発現の際にACCシンターゼをコードするmRNAに対してアンチセンスであるｍRNAを転写の際にコードするＤＮＡ配列でコーヒー植物を形質転換する方法であって、以下の工程：
発現の際にＡＣＣシンターゼをコードするＤＮＡ配列を含む形質転換ベクターを提供する工程であって、上記ＤＮＡ配列は、反転方向で上記形質転換ベクターに挿入されている、工程；および
上記コーヒー植物の組織に上記形質転換ベクターを挿入する工程であって、反転された上記ＤＮＡ配列は、その後、上記コーヒー植物のゲノムに挿入されるようになる、工程、
を包含する、方法。
３２．発現の際にACCオキシダーゼをコードするmRNAに対してアンチセンスであるｍRNAを転写の際にコードするＤＮＡ配列でコーヒー植物を形質転換する方法であって、以下の工程：
発現の際にＡＣＣオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列を含む形質転換ベクターを提供する工程であって、上記ＤＮＡ配列は、反転方向で上記形質転換ベクターに挿入されている、工程；および
上記コーヒー植物の組織に上記形質転換ベクターを挿入する工程であって、反転された上記ＤＮＡ配列は、その後、上記コーヒー植物のゲノムに挿入されるようになる、工程、
を包含する、方法。
３３．（ｉ）発現の際にACCシンターゼをコードするmRNAに対してアンチセンスであるｍRNAを転写の際にコードするＤＮＡ配列；および（ｉｉ）発現の際にACCオキシダーゼをコードするmRNAに対してアンチセンスであるｍRNAを転写の際にコードするＤＮＡ配列でコーヒー植物を形質転換する方法であって、以下の工程：
発現の際にＡＣＣシンターゼをコードするＤＮＡ配列を含む第一の形質転換ベクターを提供する工程であって、上記ＤＮＡ配列は、反転方向で上記形質転換ベクターに挿入されている、工程；
発現の際にＡＣＣオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第二の形質転換ベクターを提供する工程であって、上記ＤＮＡ配列は、反転方向で上記形質転換ベクターに挿入されている、工程；
上記コーヒー植物の組織に上記第一の形質転換ベクターを挿入する工程であって、反転された上記ＤＮＡ配列は、その後、上記コーヒー植物のゲノムに挿入されるようになる、工程；および
上記コーヒー植物の組織に上記第二の形質転換ベクターを挿入する工程であって、反転された上記ＤＮＡ配列は、その後、上記コーヒー植物のゲノムに挿入されるようになる、工程、
を包含する、方法。
【００１１】
（発明の効果）
エチレンを合成し得ないが、それらの代謝の他の局面には影響のない、形質転換された植物が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に記載される本発明がより十分に理解され得るために、以下の詳細な説明を示す。説明において、以下の用語が使用される：
ヌクレオチド：糖部分（ペントース）、リン酸、および窒素複素環塩基からなる、DNAまたはRNAのモノマー単位。塩基は、グリコシド炭素（ペントースの1’炭素）を介して糖部分に連結し、そして塩基および糖のその組合せが、ヌクレオシドと称される。塩基は、ヌクレオチドを特徴づける。4つのDNA塩基は、アデニン（「A」）、グアニン（「G」）、シトシン（「C」）、およびチミン（「T」）である。4つのRNA塩基は、A、G、C、およびウラシル（「U」）である。
【００１３】
DNA配列：隣接したペントースの3’炭素と5’炭素との間のホスホジエステル結合によって、あるヌクレオチドから他のヌクレオチドへと結合したヌクレオチドの直線状配列。
【００１４】
コドン：mRNAを通じて、アミノ酸、転写開始シグナル、または転写終結シグナルをコードする、３つのヌクレオチドのDNA配列（トリプレット）。例えば、ヌクレオチドのトリプレットTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、およびCTGは、アミノ酸ロイシン（「Leu」）をコードし、TAG、TAA、およびTGAは、転写終止シグナルであり、そしてATGは転写開始シグナルであり、また、アミノ酸メチオニン（「MET」）をコードする。
【００１５】
ポリペプチド：隣接したアミノ酸のアミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によってあるアミノ酸から他のアミノ酸へと結合したアミノ酸の直線状配列。
【００１６】
ゲノム：細胞またはウイルスの全体のDNA。これは、特に、物質のポリペプチドをコードする構造遺伝子、ならびにプロモーター、転写および翻訳の開始部位ならびに終結部位を含む。
【００１７】
遺伝子：その鋳型RNAまたはメッセンジャーRNA（「mRNA」）を通じて、特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列をコードする、DNA配列。
【００１８】
転写：遺伝子またはDNA配列からmRNAを産生するプロセス。
【００１９】
翻訳：mRNAからポリペプチドを産生するプロセス。
【００２０】
発現：遺伝子配列またはDNA配列によっておこる、ポリペプチドを産生するプロセス。これは、転写と翻訳とが合わされる。
【００２１】
プラスミド：プラスミド自身が宿主細胞中で複製されるためのインタクトな「レプリコン」を含む、非染色体二本鎖DNA配列。プラスミドが単細胞生物内に配置される場合、その生物の特徴はプラスミドのDNAの結果として、変化または形質転換され得る。例えば、テトラサイクリン耐性についての遺伝子（TETR）を有するプラスミドは、以前にテトラサイクリンに感受性の細胞を、テトラサイクリンに耐性である細胞へと形質転換する。プラスミドによって形質転換された細胞は、「形質転換体」と称される。
【００２２】
ファージまたはバクテリオファージ：タンパク質エンベロープまたはコート（「キャプシド」）中にキャプシド化されたDNA配列からなる多くの細菌ウイルス。
【００２３】
クローニングビヒクル：宿主細胞中で複製され得、１つまたは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴づけられる、プラスミド、ファージDNA、コスミド、または他のDNA配列。その認識部位で、このようなDNA配列は、DNAの本質的な生物学的機能（例えば、複製）の付帯する欠失、コートタンパク質の産生、またはプロモーターもしくは結合部位の欠失を伴わずに決定可能な様式において切除され得、そしてこれは、形質転換された細胞の同定に使用するのに適切なマーカー（例えば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を含む。クローニングビヒクルは、しばしばベクターと称される。
【００２４】
クローニング：生物またはこのような生物に由来あするDNA配列もしくは無性生殖による配列の集団を得るプロセス。
【００２５】
組換えDNA分子またはハイブリッドDNA−生きている細胞の外側の端と端に結合されており、生きている細胞において維持され得る、異なるゲノム由来のDNAのセグメントからなる分子。
【００２６】
cDNA−特定のポリペプチドをコードするmRNAに相補的なDNA鎖。
【００２７】
本発明によるコーヒー植物におけるエチレン生合成を制御するための戦略は、まず、エチレン経路における２つの酵素（ACCシンターゼおよびACCオキシダーゼ）についての発現をコードする遺伝子の決定に関する。野生型コーヒー植物の、正常遺伝子に対してアンチセンスである方向に、一方または両方の遺伝子を含む構築物での形質転換は、それぞれの酵素の合成をブロックすることが予想される。形質転換配列からの指示のもとで転写されたメッセンジャーRNAは、正常配列からの指示のもとで転写されたmRNAに結合し、それによって、正常な伝達を不活化し、そして酵素合成を不可能にする。
【００２８】
コーヒーにおけるACCシンターゼおよびACCオキシダーゼについての発現をコードするDNA配列を単離するために、本発明者らは、生じることが予想されるヌクレオチド配列を含む合成DNAプローブを有するコーヒー植物から産生されたcDNAライブラリーをスクリーニングした。これらの予想された配列は、それぞれの酵素をコードする遺伝子において生じるヌクレオチド配列、他のクライマクテリック植物、および他の植物の研究に基づいた。
【００２９】
本発明において、ACCシンターゼまたはACCオキシダーゼをコードする遺伝子に対応するcDNAは、コーヒー植物胚を形質転換するのに使用される。プラスミドpBI−121は、形質転換ベクターとして使用される。ACCシンターゼおよびACCオキシダーゼについての発現をコードするDNAに対応する配列は、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターに結合するプラスミドに逆方向に挿入される。それらから転写されたRNAは、それぞれの酵素のアミノ酸配列をコードするmRNAに相補的である。完全な構造は、細菌宿主中で増幅される。宿主は破壊され、そして増幅ベクターはコロイド状の金粒子に付着される。付着性のベクターを有する金粒子は、米国特許第5,107,065号に記載されるような細胞において、高速で粒を推進することによって、コーヒー植物組織に挿入される。首尾良く形質転換した若い植物は、抗生物質耐性によって同定される。形質転換植物は、植物を形質転換するのに使用した遺伝子に依存して、ACCシンターゼまたはACCオキシダーゼを産生しない。形質転換植物の成熟は、外因性エチレンの適用によって開始される。
【実施例】
【００３０】
実施例１
コーヒー果実特異的ACCシンターゼcDNAの単離
コーヒーの成熟に関与するACCシンターゼ遺伝子配列を単離するために、cDNAライブラリーを、成熟度の異なる段階でのコーヒー果実の果皮および中果皮の組織の混合物から調製した。このライブラリーを、ライブラリーを構築するのに使用したのと同じmRNAから作製される第１鎖cDNAから合成されるPCR産物、および他の生物由来のACCシンターゼ遺伝子に由来するコンセンサス配列に対応する縮重オリゴヌクレオチドプライマーを使用してスクリーニングした。本実施例は主に、mRNAの単離、cDNAライブラリーの構築、および適切なcDNAのクローニングに関与するそれに続く工程を含む。
【００３１】
ａ）mRNAの単離
全RNAを、コーヒー植物（C. arabica L.cv Guatemalan）のいくつかの異なる発生段階からの66gの果皮および中果皮組織から、Leviら[HortScience27(12):1316−1318(1992)]の方法を用いて単離した。凍結コーヒー果実の果皮および中果皮の組織を、少量のドライアイスとともに家庭用コーヒーミル（SaltonModelGC−5；Salton Maxam Housewares Group, Mt. Prospect, IL）で約2分間粉砕することによって粉末化した。粉末化した果実組織を、200μLの200mMトリス[ヒドロキシメチル]アミノメタンヒドロクロリド（Tris−HCl）（pH8.5）、1.5％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、300mMLiCl、10mMエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム（Na2EDTA）、1.5％（w:v）デオキシコレートナトリウム、1.5％（v:v）NonidetP−40（SigmaChemical Co.）、0.5mMチオ尿素、1mM アウリントリカルボキシル酸（aurintricarboxylic acid）、10mMジチオトレイトール（DTT）、75mMＢ−メルカプトエタノール、２％ポリビニルピロリドン（PVP）、および２％ポリビニルポリピロリドン（PVPP）に添加し、そしてPolytron組織ホモジナイザー（Tekmar,Cincinnati,OH）を用いてホモジナイズした。2分間のホモジナイズの後、200μLのクロロホルムを添加し、そしてさらに3分間ホモジナイズを続けた。ホモジネートを、250μLの遠心分離ボトル（Nalgene）に移し、そして2,500×gで15分間遠心分離した。上部の水相を取り出し、そして12μLの５MNaClと混合し、2つの遠心分離ボトルに等しく分割し、そして150μLのエタノールを各ボトルに添加した。混合物を、−20℃で一晩保存した。RNAを、4,000×gで15分間4℃にて遠心分離することによって回収した。RNAを、50μLのTE1（50mMTris−HCL（pH8.0）、10mMNa2EDTA）に溶解し、そして12,000×gで10分間4℃にて遠心分離することによって、明澄化させた。上清を、新たな遠心分離ボトルに移し、そして３μLの５MNaClおよび30μLのイソプロパノールを添加した。内容物を混合し、そして−20℃で一晩保存した。RNAを、14,000×gで10分間遠心分離することによって回収した。RNAを、20μLの70％氷冷エタノールで洗浄し、そして上記のように遠心分離することによって回収した。真空下で10分間乾燥させた後、RNAを、50μLのTE1緩衝液に再懸濁し、そして10μLの12MLiClを添加した。溶液を、4℃にて48時間インキュベートし、そしてRNAを、14,000×gで10分間の遠心分離によって回収し、そして30μLのTE1緩衝液に再懸濁した。15μLの５M酢酸カリウムを添加した後、RNAを0℃にて一晩インキュベートし、14,000×gで10分間遠心分離することによって回収し、そして50μLのTE1緩衝液に再懸濁した。３μLの５MNaClおよび110μLの95％エタノールを添加し、RNAを、−20℃にて一晩インキュベートした。RNAを、14,000×gで10分間遠心分離することによって回収し、20μLの70％氷冷エタノールで洗浄し、上記のように遠心分離することによって回収し、真空下で10分間乾燥させ、そして600μLのTE1緩衝液に再懸濁した。RNAを微量遠心分離管に移し、そして14,000rpmで30分間、４℃で、遠心分離した後、300μLを２つの新たな微小遠心分離管の各々に取り出した。もとの遠心分離した管を、さらなる300μLのTE1緩衝液でリンスした。18μLの５MNaClおよび636μLの100％エタノールを、３つの遠心分離管の各々に添加した。反転することによって混合した後、管を−20℃にて一晩保存した。RNAを、14,000×gで30分間遠心分離することによって回収し、そして１μLの70％氷冷エタノールで洗浄した。上記のように遠心分離および乾燥させた後、RNAを400μLの滅菌水に再懸濁した。全部で1.04mgの全RNAを得た。
【００３２】
メッセンジャーRNA（ポリA＋RNA）を、PolyATtract（登録商標）mRNAIsolation System IV（PromegaCorporation, Madison, WI）を用いて単離した。2つの単離のすべてを、以下のように行った。各単離について、0.48mgの全RNAを、800μLのRNaseを含有しない水に溶解した。65℃にて10分間加熱した後、３μLの50pmol/mLビオチン化オリゴ（dT）および20.7μLの20×SSC（１×SSCは150mMNaClおよび15mMクエン酸ナトリウムを含む）を添加し、そして混合物を、約30分間にわたってゆっくりと室温まで冷却した。ストレプトアビジン常磁性粒子（PolyATtract（登録商標）mRNAIsolationSystem IV中に提供されている）のアリコートを、0.5×SSC中で3回洗浄し、そして0.1mLの0.5×SSCに再懸濁した。ビオチン化オリゴ（dT）を含むmRNA溶液を、洗浄したストレプトアビジン常磁性粒子に添加した。室温にて10分間のインキュベーションの後、捕捉したRNAを含む常磁性粒子を、磁石を用いて管の側面に捕捉した。
【００３３】
上清を除去し、そして粒子を0.3mLの0.1×SSCで４回洗浄した。mRNAを、200μLのRNaseを含まない水中に懸濁することによって、ビオチン化したオリゴ(dT)粒子から除去した。150μLの水を２つのチューブの各々に連続的に添加することによって、さらなる溶出を実施した。溶出画分(550μL)をプールし、そして微量遠心分離機中で４℃にて30分間、14,000rpmにて遠心分離した。上清を２つの微量遠心管中に分け、そして３MのNaClの10分の１の容量および600μLのエタノールの添加後、-20℃にて一晩チューブをインキュベートすることによって、その後上記のような遠心分離によってmRNAを回収した。mRNAを、１mLの氷冷の70％エタノールで１回洗浄し、乾燥し、そして20μLの滅菌H2O中に再懸濁した。１μLを１mLの水に添加し、そしてShimadzuUV160U分光光度計において230nm〜330nmのスペクトルを得た。約６μgのmRNAを1.04mgの全RNAから回収した。
【００３４】
ｂ）cDNAライブラリーの構築
第一および第二鎖のcDNAを、ZAP-cDNA合成キット(Stratagene,La Jolla, CA)を用いて合成した。20μLの水中６マイクログラムのmRNAを、65℃にて５分間インキュベートした。２マイクロリットルのメチル水銀(100mM)を添加し、そして室温にて10分間、インキュベーションを続けた。４マイクロリットルのβ-メルカプトエタノール(700mM)を添加し、そしてさらに５分間、インキュベーションを続けた。変性したmRNAに、５μLの10×第一鎖の緩衝液（キット中に提供される）、５μLの100mMDTT、３μLのヌクレオチド混合物（それぞれ10mMのdATP、dGTP、dTTP、および5-メチル-dCTP）、２μLのリンカー-プライマー(1.4μg/μL):5'-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'  （配列番号１）１μLのRNaseブロック、および５μLの水を添加した。反応物を室温にて10分間インキュベートし、プライマーをmRNAにアニーリングし、次いで３μLのM-MuLV逆転写酵素(20U/μL）を添加した。５マイクロリットルのこの反応混合物を、0.5μL（0.625pmole)の800Ci/mmole[α-32P]dATPを含むチューブに移した。両方の反応物を、37℃にて１時間インキュベートした。放射活性標識した反応物を、その後のゲル分析のために-20℃にて凍結した。45μLの主要反応物に、40MLの第二鎖の緩衝液、15μLの100mMDTT、６μLのヌクレオチド混合物(10mMのdATP、dGTP、dTTP、および26mMのdCTP)、268.3μLの水、および２μL（2.5pmole)の800Ci/mmole[α-32P]dATPを添加した。混合後、4.5μLの１U/μLRNase Hおよび19.2μLの5.2U/μL E.coli DNAポリメラーゼＩを添加し、そして反応物を16℃にて2.5時間インキュベートした。反応物を400μLのフェノール：クロロホルム(１:１)で抽出した。微量遠心分離における５分間の遠心分離によって相を分離し、そして水相を除去し、そしてクロロホルムで再抽出した。上記のような遠心分離によって水相を回収した。
【００３５】
二本鎖cDNAを、33.3μLの３M 酢酸ナトリウム(pH 5.2)および867μLの100％エタノールの添加、ならびに-20℃にて一晩のインキュベーションによって沈澱させた。cDNAを、微量遠心分離機中で、４℃にて60分間、14,000×gにての遠心分離によって回収した。cDNAを、１mLの80％エタノールで洗浄し、微量遠心分離機中での室温、14,000×gにての遠心分離によって回収し、真空下で乾燥し、そして45μLの水中に溶解した。３マイクロリットルの再懸濁した二本鎖cDNAを除去し、そしてゲル電気泳動によるその後の分析のために-20℃にて貯蔵した。
【００３６】
残存する42MLの二本鎖cDNAに、５μLの10×Klenow緩衝液（緩衝液#3；Stratageneによって供給される）、2.5μLの2.5mMヌクレオチド（dCTP、dGTP、dATP、およびdTTP)、および0.5μLの５U/μLE.coli DNAポリメラーゼＩKlenowフラグメントを添加した。37℃にて30分後、50μLの水を添加し、そして反応物を等量のフェノール：クロロホルム(１:１）、次いで上記のようなクロロホルムで抽出した。７μLの３M酢酸ナトリウム(pH5.2)および226μLの100％エタノールの添加後、平滑末端二本鎖cDNAを30分間氷上でインキュベートし、そして微量遠心分離機中で４℃にて60分間、14,000rpmにて遠心分離することによって回収した。cDNAを300μLの70％エタノールで洗浄し、上記のように遠心分離し、そして乾燥した。７マイクロリットルの0.4μg/μLEcoRIリンカーを、乾燥したcDNAに添加した。EcoRIリンカーの構造は以下である：
5'-AATTCGGCACGAG-3'  （配列番号２）
3'-GCCGTGCTC-5'
ボルテックスしてcDNAを再懸濁した後、１μLの10×連結緩衝液、１μLの10mMATP、および１μLのT4 DNAリガーゼ（４Weiss U/μL）を添加し、そして反応物を８℃にて一晩インキュベートした。70℃にて30分間加熱することによって、リガーゼを不活化した。この時点でcDNAに付着しているEcoRIリンカーの5'末端を、ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。１マイクロリットルのZAP-cDNA合成キット(Stratagene,LaJolla, CA)の10×緩衝液#3、２μLの10mM ATP、６μLの水、および１μLの10U/μL T4ポリヌクレオチドキナーゼを、連結反応物に添加した。37℃にて30分後、反応物を70℃にて30分間加熱することによって、キナーゼ反応を停止した。XhoI「付着末端」を、リンカー-プライマー中のXhoI部位の消化によって、mRNAの3'末端に対応するcDNAの末端にて生成した。28μLのXhoI緩衝液および３μLの40U/μLXhoIをcDNAに添加し、そして反応物を、37℃にて1.5時間インキュベートした。
【００３７】
5'末端でのEcoRI付着末端および3'末端でのXhoI付着末端（元々のmRNAと比較して）を有するcDNAを、以下のように調製されるSephacrylS-400スピンカラムを通る通過によってサイズ分画した。５μLの10×STE[100mMのTris (pH 7.0)、５mMのEDTA、および100mMのNaCl]をcDNAに添加し、そしてcDNAを、SephacrylS-400
(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)を含む１mLシリンジの頂部(top)に適用した。500μLの微量遠心管をシリンジの底部に置き、そしてカラムを遠心分離管中に置き、そして約400×gにて２分間遠心分離した。60μLの１×STEをシリンジの頂部に添加し、新しい微量遠心管をカラムの底部上に置き、そしてカラムを再度上記のように遠心分離した。６画分が回収されるまで、このプロセスを繰り返した。約10％の各画分を１％アガロースゲル上で電気泳動し、各画分中のcDNAのサイズ分布を決定した。各画分の残りを等容量のフェノール：クロロホルム、次いで上記のようなクロロホルムで抽出し、そして２容量の100％エタノールの添加によって沈澱させた。-20℃にての一晩のインキュベーション後、cDNAを、微量遠心分離機中での、４℃にて60分間、14,000rpmにての遠心分離によって回収した。各cDNA画分を200NLの80％エタノールで洗浄し、そして上記のように乾燥した。cDNA画分１を３μLの滅菌水中に再懸濁し、そしてcDNA画分２を10.5μLの滅菌水中に再懸濁した。0.5μLの２つの画分の各々を使用して、エチジウムブロマイドプレート検出方法を用いてDNAの量を決定した。最も大きなcDNA分子を含む画分１および２を混合した。12.5mLの混合した画分は、約100ngのcDNAを含んだ。この画分をSpeed-Vac中で2.5μLに減少し、そして氷上に貯蔵した。cDNA画分３を10.5μLの滅菌水中に再懸濁し、そしてその後の使用のために-20℃にて保存した。
【００３８】
画分１および２からの100ngのcDNAを、１μgのUni-ZAPTM(Strategene, La Jolla, CA)（EcoRIおよびXhoIで消化したλZAPベクター）中に連結した。画分１および２のcDNA(2.5μL)を、0.5μLの10×連結緩衝液、0.5μLの10mMATP、１μLの１μg/μLUni-Zap XRベクター、および0.5μLの４Weiss U/μL T4 DNAリガーゼに添加した。反応物を８℃にて約44時間インキュベートした。連結反応物の１μLのアリコートを、GigapackIIGoldバクテリオファージλパッケージングキット（Stratagene, La Jolla, CA)からの「Freeze-Thaw」抽出物の１アリコートに添加した。15マイクロリットルのSonic抽出物を添加し、そして内容物を穏やかに混合した。室温にてパッケージングを実施した。２時間後、500μLのSM緩衝液および20μLのクロロホルムを各パッケージング反応物に添加し、そして微量遠心分離機中での短い遠心分離によって細片を除去した。パッケージしたファージを新しい微量遠心管に移動させた。10μLのクロロホルムを添加し、パッケージしたファージを使用するまで４℃にて貯蔵した。この一次ライブラリーの力価は、0.7×106組換えプラークの存在を示した。
【００３９】
ｃ）一次ライブラリーの増幅
O.D.600にて0.5の密度にまで増殖した600μLのE.coliXL1-Blue MRF' (Stratagene, LaJolla, CA)、および32.5μLの一次ライブラリーストックを16のチューブの各々に添加した。37℃にて15分間のインキュベーション後、6.0mLの48℃の上層寒天（５g/LのNaCl、２g/LのMgSO4・7H2O、５g/Lの酵母抽出物、10g/LのNZアミン[pH7.5]、および0.7％アガロース）を各チューブに添加し、そして内容物を、150×15mmのNZYプレート（５g/LのNaCl、２g/LのMgSO4・7H2O、５g/Lの酵母抽出物、10g/LのNZアミン[pH7.5]、および15g/LのDifco寒天）上にプレートした。プレートを37℃にて一晩インキュベートし、次いで10mLのSM緩衝液で重層し、そして穏やかに振盪しながら４℃にてさらに８時間インキュベートした。SM緩衝液を滅菌ピペットで回収し、そして滅菌した250mLの遠心分離ボトル中に貯蔵した。各プレートを、回収したさらなる10mLのSM緩衝液でリンスし、そして先のSM緩衝液に添加した。５％の最終濃度までクロロホルムを添加し、そしてファージ溶液を、室温にて15分間インキュベートし、次いで2,000×gにて10分間遠心分離し、細胞細片を除去した。上清を滅菌したポリプロピレンボトルに回収し、そしてクロロホルムを0.3％の最終濃度まで添加した。増幅したライブラリーを４℃で保存した。
【００４０】
ｄ）特定の遺伝子についてのスクリーニングのための増幅したライブラリーのプレーティング
増幅したライブラリーを上記のように力価決定した。約50,000の組換えプラークを600μLの上記のように増殖したE.coliXL1-Blue MRF'に添加した。37℃にて15分後、6.5mLの48℃の上層寒天を添加し、そして細胞を150×15mmNZYプレート上にプレートした。合計200,000の組換えプラークを含む４つのプレートを調製し、そして37℃にて一晩インキュベートした。次いでプレートを４℃にて４時間冷却し、次いで以下に記載されるようにプラークリフト(plaquelift)を調製するために使用した。
【００４１】
ｅ）コーヒーのACCシンターゼ遺伝子に相同なオリゴヌクレオチドの同定および構築
米国特許出願第08/485,107号（その明細書は、本明細書中において参考として援用される）において記載される以前の研究において、本発明者らは、種々の植物において存在するACCシンターゼについて共通な塩基配列（本明細書中においてコンセンサス配列といわれる）を同定した。これらの研究に基づいて、本発明者らは、コンセンサス配列に対応するコーヒー第一鎖のcDNAの領域のPCR増幅のための、一連の３つ(３)の完全に変性したプライマーを開発した。使用されるプライマーの配列は以下である：
ACS167:  5'-GCCAAGCTTCCRTGRTARTCYTGRAA-3'  （配列番号３）
ACS289:  5'-TTYCARGAYTAYCAYGGHYT-3'        （配列番号４）
ACS885:  5'-CCHGGDARNCCYAWRTCTTT-3'        （配列番号５）。
【００４２】
ｆ）第一鎖のコーヒーcDNAを得るための逆転写酵素反応
第一鎖のcDNAを得るための逆転写酵素反応を、20μLの最終容量中で、GeneAmpRNA PCR Core Kit (Perkin Elmer,Foster City, CA)を用いて実施した。最初、３μLの水中0.9μgのコーヒー果実のmRNAを、微量遠心分離管中１μLの50μMランダム六量体および６μLの滅菌水と混合し、そして65℃にて５分間インキュベートした。混合物を室温にて２分間放置し、そして液体を短時間の遠心分離によってチューブの底部に回収した。この混合物に、２μLのPCR緩衝液II（上記で言及したキットから）、４μLの25mMMgCl2、２μLの10mMdNTP、１μLのRNAsin（20u/μL）、および１μLの逆転写酵素（50u/μL）を添加した。反応物を42℃にて１時間インキュベートし、その後、逆転写酵素を95℃の水浴中で５分間、熱不活化した。
【００４３】
ｇ）コーヒーのACCシンターゼ遺伝子を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) (Saikiら, 1988)を、上記のGeneAmpKitを用いて、10μLの第一鎖のcDNA混合物、４μLのPCR緩衝液II、１μLの25mMMgCl2、2.5μLの20μMAC5167プライマー（配列番号３）、2.5μLの20μM AC5885プライマー（配列番号５）、29.5μLの滅菌H2O、および0.5μLのTagDNAポリメラーゼ（５u/μL)を含む50μLの反応物において実施した。PCR条件は、94℃（１分間）、44℃（１分間）、および72℃（２分間）の35サイクルであった。PCR反応の生成物を、1.5％SeaPlaqueアガロース(FMCBioProducts,Rockland, ME)およびサイズマーカーとしてHae III消化φX174 DNA (Promega Corporation,Madison, WI)を用いて、アガロースゲル電気泳動によって分析した。約650bpの単一のPCR生成物を得た。
【００４４】
ｈ）異なるプライマーを用いたPCR生成物の増幅
上記で得られた650bpのフラグメントをゲルから切り取り、そして1.5mLの微量遠心管中に置いた。200μLの滅菌水の添加後、650bpのフラグメントを90℃まで５分間加熱し、室温まで冷却し、そして微量遠心分離機中で５分間、14,000rpmにて遠心分離した。増幅したDNAを含む上清を取り出し、そして新しい1.5mLの微量遠心管中に置いた。25μLのPCR反応を、鋳型として先に増幅した0.4μLのDNA、2.5μLの10×PCR緩衝液（10mMのTris-HCl(pH9.0)、0.1％のtriton X-100)、２μLの25mM MgCl2、５μLの１mM dNTP、１μLの20μMACS289プライマー（配列番号５）、１μLの20μMACS885プライマー（表２）、12.8μLのH2O、および0.3μLのTagDNAポリメラーゼ（５u/μL）（PromegaCorporation, Madison, WI)を用いて実施した。PCRを、94℃（１分間）、45℃（１分間）、および72℃（２分間）の35サイクルを用いて実施した。５μLのこの反応物を、上記のように1.5％アガロースゲル中で電気泳動した。約603bpの単一の生成物が観察された。８μLの滅菌水、10μLの３M酢酸ナトリウム(pH5.2)、および220μLの100％エタノールを、反応物の残りに添加した。-20℃にて一晩のインキュベーション後、４℃にて30分間、14,000rpmの遠心分離によってDNAを回収した。DNAを、400μLの氷冷75％エタノールで洗浄し、そして25μLの滅菌水中に再懸濁した。エチジウムブロマイドプレートアッセイを用いて、DNA濃度を10ng/μLであると決定した。
【００４５】
ｉ）コーヒー果実特異的ACCシンターゼDNAを標識すること
ランダムプライマー化プローブを、PCR生成ACCシンターゼDNAおよびPrime-a-GeneKit (Promega Corporation,Madison, WI)を用いて生成した。２および1.5μLの25ng DNAを27.5μLの滅菌水に添加し、そしてDNAを５分間煮沸することによって変性した。10μLの５×標識化緩衝液、２μLの非標識化dNTP[それぞれ20μM；dCTP,dGTP, dTTP]、２μLの１mg/mL アセチル化BSA、１μLの５u/μL E.coli
DNAポリメラーゼＩKlenowフラグメント、および５μL(50μCi)の3,000Ci/mmole[α-32P]dATP(Dupont-NEN)を添加し、50μLの最終容量を与えた。室温にて１時間後、２μLの0.5M Na2EDTAの添加および２分間の煮沸によって反応を停止する。
【００４６】
ｊ）ACCシンターゼ特異的プローブでの増幅したライブラリーのスクリーニング
それぞれ50,000の組換えクローンを含む４つの150×15mm NZYプレートのプラークリフトを調製した。４つの132mmMagnaナイロン転写メンブレン(MicronSeparations, Incorporated, Westborough, MA)を、それらを５×SSC緩衝液で飽和したクロマトグラフィー用紙上に約10秒間置くことによって湿らせた。メンブレンを、組換えプラークを含むプレート上に５分間置き、除去し、そしてファージ含有側を上向きにして、0.5MのNaOHおよび1.5MのNaClで飽和したクロマトグラフィー用紙上で２分間インキュベートした。次いで、メンブレンを、0.5Mのtris-HCl(pH8.0)および1.5MのNaClで飽和したクロマトグラフィー用紙上に５分間移すことによって中和した。0.2Mのtris-hcl (pH 7.5)を含む２×SCCで飽和したクロマトグラフィーシート上での短期の20秒の処置後、フィルターをブロット乾燥した。１時間の風乾の後、UVStratalinker1800 (Stratagene, La Jolla, CA)中で12,000μジュールの260nm UV光での処置によって、DNAをメンブレンに架橋した。
【００４７】
４つのメンブレンを、100mLの６×SSPE（52.2g/LのNaCl、8.3g/LのNaH2PO4・H2O、2.2g/LのNa2EDTA[pH7.4]）、５×Denhardt溶液（１g/LのFicoll、１g/Lのポリビニルピロリドン、１g/LのBSA [ペンタックス画分Ｖ])、0.5％SDS、および100μg/mLの変性したニシン精子DNAで、65℃にて２時間、HybaidMark IIハイブリダイゼーションオーブン(NationalLabnet Company, Woodbridge, NJ)中で、HB-OV-BLビンを用いてプレハイブリダイズした。
【００４８】
ハイブリダイゼーションを、10mLの６×SSPE（0.5％ SDS、100μg/mLの変性したニシン精子DNA、および52μLの上記のランダムプライム化プローブを含む）中で、65℃にて12時間実施した。ハイブリダイゼーション時間の終わりにて、ハイブリダイゼーション溶液を除去し、そして65℃にて、0.5％SDSを含む100mLの２×SSCでメンブレンを手短に洗浄した。次いで、再度、65℃の等量の新しい緩衝液でそれらをさらに30分間洗浄した。メンブレンを、さらに２回、65℃にて30分間、0.5％SDSを含む100mLの0.2×SSCで洗浄し、セロファン包み中に包み、そして-70℃にて24時間、予め感光したFujiRXGCUＸ線フィルムに曝露した。10個の陽性クローンを得た。同定したプラークに対応するもとのプレートの領域を取り出し、そして20μLのクロロホルムを含む１mLのSM緩衝液中に置いた。これらの10個のうち、５個をより低い密度で再プレートし、そして上記のように再スクリーニングして独立したプラークを得た。
【００４９】
ｋ）コーヒー-果実のACCシンターゼcDNAクローンの特徴づけ
推定のコーヒーのACCシンターゼcDNAクローンのサイズを、クローニングベクター中に存在し、そしてcDNA挿入部位に隣接するT3およびT7プロモーターの一部に相同なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって決定した。プライマーの配列は以下である：
T3:  5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'  （配列番号６）
T7:  5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3'  （配列番号７）。
【００５０】
PCRのための条件は、温度サイクルが95℃（１分間）、50℃（１分間）、および72℃（２分間）であったことを除いて、上記の通りであった。分析は、上記のようにアガロースゲル電気泳動によった。
【００５１】
３つの最も大きいクローンを、インビボ切り出しによってファージミドとして回収した。単一のプラークからの200μLのファージストックを、1.0のO.D.600での密度まで増殖させた200μLのE.coliXL1-BlueMRF'と混合した。１μLのExAssist (Stratagene, La Jolla, CA)ヘルパーファージ（＞１×106pfu/μL)を添加し、そしてチューブを37℃にて15分間インキュベートした。３mLの滅菌LBブロスを添加し、そしてそれらを37℃にて３時間、振盪しながらインキュベートした。70℃にて20分間の加熱および1000×gにて15分間の遠心分離後、繊維状ファージ粒子としてパッケージされた切り出されたpBluescriptファージミドを含む１mLの上清を、滅菌した1.5mLの微量遠心管に移し、そして４℃にて貯蔵した。ファージミドを、O.D.600にて測定した場合、１の密度に増殖させた200μLのE.coliSolar細胞（Stratagene,La Jolla, CA)に、25μLのストック溶液を添加することによって回収した。37℃にて15分間のインキュベーション後、200μLの細胞混合物を、50μg/mLのアンピシリンを含む100×15mmNZY寒天プレート上にプレートした。プレートを37℃にて一晩インキュベートした。個々のコロニーを50μg/mLのアンピシリンを含む10mLのLBブロス中に採取し、そして37℃の振盪インキュベーター中で一晩増殖させた。細胞を、1.5mLの滅菌微量遠心管中で繰り返しの遠心分離によって濃縮し、そしてプラスミドDNAを、QIAGENからのプラスミドミニキットを用いて精製した。細菌性ペレットを水で洗浄し、そして0.3mLの緩衝液P1中に再懸濁した。次に、0.3mLのアルカリ溶解緩衝液P2を添加し、穏やかに混合し、そして室温にて５分未満の間インキュベートした。0.3mLの冷却した緩衝液P3の添加、およびチューブを６回反転することによる混合後、抽出物を氷上で10分間インキュベートし、そして微量遠心分離機中で、14,000rpmにて15分間遠心分離した。上清を除去し、そして予め１mLのQDT緩衝液で平衡化したQIAGEN-チップ20カラムに適用した。抽出物を、重力フローによってカラムの樹脂に入らせた。一旦フローを停止し、カラムを１mLの緩衝液QCで４回洗浄した。QIAGEN-チップ20カラムを0.8mLの緩衝液QFで洗浄することにより、DNAを溶出し、これを1.5mLの微量遠心管中に収集した。0.7容量（560μL）のイソプロパノールの添加によって、DNAを沈澱させた。チューブを、すぐに14,000rpmにて30分間遠心分離し、そして上清を注意深く除去した。DNAを含むペレットを、１mLの氷冷70％エタノールで20回洗浄し、上記のように遠心分離し、そして５分間風乾した。DNAを50μLの滅菌H2O中に再懸濁した。１つのプラスミド単離体からのDNAの濃度は、蛍光定量的分析によって0.1μg/μLであった。
【００５２】
反応物の配列決定を、８μLのファージミドDNA（0.8μg)を、４μLのT3またはT7のいずれかの配列決定プライマー（0.8pmol/μL)と混合することにより実施した。自動化DNA配列決定を、UniversityofHawaii Biotechnology Service Centerにて、これらのサンプルに対して実施した。cDNAの5'および3'の両方の末端由来の約350bpの配列を得た。新しい配列決定プライマーを、以前の配列の末端近くの配列に基づいて合成し、そして同じ様式で用いてcDNAの両方の鎖の配列を完成した。コーヒー果実発現ACCシンターゼcDNAの完全な配列を図１に与える。コーヒー果実発現ACCシンターゼの推定アミノ酸配列を図２に与える。
【００５３】
コーヒーのACCシンターゼcDNAクローンおよび推定タンパク質の配列を、GenBankに存在する他のACCシンターゼ遺伝子と比較した。コーヒー果実から単離したcDNAは、GenBankに存在する他のACCシンターゼに対して、68.3％〜58.1％の同一性を示す。そして、このcDNAから推定したタンパク質配列は、他のACCシンターゼに対して、67.9％〜50.5％の同一性を示す。しかし、このcDNAは、1500bpより大きな他の配列が、それに対して68.3％より大きな同一性を示さなかったという点において独特である。
【００５４】
実施例２
コーヒー果実特異的ACCオキシダーゼの単離
ａ）ACCオキシダーゼ特異的オリゴヌクレオチドプライマーの合成
全RNAの単離、mRNAの単離、およびコーヒー果実特異的cDNAの合成は、上記の通りであった。
【００５５】
GenBankから得た12のACCオキシダーゼ配列を、GCG (GeneticsComputer Group,
Madison, WI)のPileupプログラムを用いて整列した。転写開始コドンからの約1000bpの領域は、保存的であることが見出され、そしてこの領域に対応する5'-TCATIGCKKCRAKIGGTTC-3'（配列番号８）を合成した。イノシン（I）を、配列保存性を示さない位置に置いた。なぜなら、この位置は、A,T,G, またはCの任意であり得るからである。２倍の多義性を示す位置を、混合した残基（T/GまたはA/G）で調製した。本発明者らはまた、本発明者らの研究室において以前にクローン化したパパイヤ果実発現ACCオキシダーゼcDNAの領域に対して相同な第２のプライマーを調製し、そして以下の転写開始コドンから約372bpに置いた：
5'-GACACTGTGGAGAGGCTGAC-3'  （配列番号９）。
【００５６】
２つのプライマーをPCR反応において使用し、コーヒー果実発現ACCオキシダーゼの一部を増幅した。PCRは、0.2μL（10ng)のcDNA画分３（実施例１において記載される）、５μLの10×PCR緩衝液、３μLのMgCl2(25mM)、１μLの４つのdNTPの各々(10mM)、１μLの各プライマーの20μM溶液、0.3μLのTaq DNAポリメラーゼ (promegaCorporation, Madison, WI)、および38.5μLの水を含んだ。PCR条件は、94℃（１分間）、50℃（１分間）、および72℃（１分間）の35サイクルであった。最後のサイクル後、72℃にて５分のインキュベーションを実施した。生成物の20μLアリコートを、以前に記載のような1.5％アガロースゲル中で電気泳動し、それは約800bp生成物を示した。DNAをゲルから切り出し、そして1.5mLの微量遠心管中で200μLの滅菌水と混合した。５分間の煮沸後、２μLを、同じプライマーを使用する上記のような50μLのPCR反応における鋳型として使用した。20μLのPCR反応を使用する上記のように実施したゲル電気泳動は、単一の800bpの生成物の存在を示した。残りの30μLのPCR反応物に、20μLのクロロホルムおよび100μLの水を添加した。内容物を混合し、そして微量遠心分離機中で、14,000rpmにて２分間遠心分離した。DNAを含む上方の水相を、きれいな微量遠心管に移した。このDNAの一部を、上記のようなランダムプライム化合成によって放射能で標識した。
【００５７】
ｂ）ランダムプライム化プローブでの増幅したライブラリーのスクリーニング
実施例１において記載される増幅したコーヒー果実cDNAを使用して、上記のような４つの150×10mmNZYプレートを調製した。クローンのプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および回収は、PCRによって得たACCオキシダーゼ配列をプローブとして使用することを除いて、上記の通りであった。
【００５８】
ｃ）コーヒー果実のACCオキシダーゼcDNAクローンの特徴づけ
コーヒーのACCオキシダーゼcDNAクローンのサイズを、実施例１において記載されるようなT3およびT7プロモーターに対して相同なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって決定した。
【００５９】
最も大きなコーヒーのACCオキシダーゼcDNAクローンの配列を、実施例１に記載されるように得、そしてGenBankにおいて存在するAccオキシダーゼ遺伝子と比較した。図３は、コーヒー果実特異的ACCオキシダーゼの配列を与える。図４は、このタンパク質の推定アミノ酸配列を与える。cDNAは、ACCオキシダーゼをコードすると決定した。なぜなら、それは、GenBankにおいて存在する他のACCシンターゼ核酸配列に対して50.4％〜82.5％の同一性であるからである。また、推定タンパク質配列は、他のACCオキシダーゼに対して32.5％〜86.5％同一性である。
【００６０】
上記の実施例は、説明の目的のみのためであり、そして本明細書に添付される請求の範囲において示される本出願の発明の範囲を限定するとしてみなされるべきではない。
【００６１】
実施例３
アンチセンスACCシンターゼおよびACCオキシダーゼ転写物の発現のためのベクターの構築
ACCシンターゼおよびACCオキシダーゼcDNAは、例えばアンチセンス発現または同時抑制によってコーヒー中のエチレン含量を改変するために使用され得る。ベクターpKR1を用いるその使用の一例を記載する。これは単なる一つの例に過ぎず、そして多くの他の植物形質転換ベクターが、ACCシンターゼおよびACCオキシダーゼcDNAとの組合せで使用され得る。pKR1を、以下のようにpBI121（ClontechLaboratories)の改変によって作製した。
【００６２】
cre部位特異的リコンビナーゼについてlox認識部位を含む２つの38塩基対の合成配列を、pBI-121のネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（NPTII)選択マーカー遺伝子の周りに挿入した。これらのlox部位は、それが植物ゲノム中に組み込まれた後、構築物からのNPTII遺伝子の除去を可能にするが[DaleおよびOw,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10558 (1991)]、アンチセンス中のACCシンターゼおよびACCオキシダーゼcDNAの機能に関係はない。
【００６３】
これらの合成オリゴヌクレオチドを、DaleおよびOw（前出）によって定義されるloxP配列に基づいて合成した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は以下である：
loxA:  5'-AGCTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3'
loxB:  5'-AGCTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3'、および
loxC:  5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAGCT-3'。
【００６４】
loxBは、loxAおよびloxCの両方に相補的な鎖である。loxAおよびloxBがアニーリングした場合、それらは、HindIII突出に相補的な4-塩基突出を有する二本鎖分子を形成し、これによって、pBI-121中のNPTII遺伝子に隣接するNOS転写末端配列の後ろに見出されるもののような、HindIII部位への二本鎖配列の挿入を可能にする。loxBとloxCのアニーリングは、lox認識部位を含む平滑末端化二本鎖DNAを生成する。
【００６５】
合成lox部位を、以下のようにpBI-121のNPT II遺伝子の周りに挿入した。pBI-121を、製造業者によって提供された反応緩衝液中で、37℃にて２時間、PmeI(NewEngland Biolabs, Beverly, MA)で消化した。pBI-121は、NPT II遺伝子の発現を駆動するNOSプロモーターのすぐ近くに、単一のPmeI部位を有する。合成lox部位を、等モル量のloxBとloxCを、95℃にて加熱し、室温までゆっくりと冷却することによってアニーリングさせ、そしてPmeI消化したpBI-121中に連結することによって生成した。30μLの連結反応は、連結緩衝液(NewEnglandBiolabs, Beverly, MA)、60nmoleのPmeI-消化したpBI-121、３μLのアニーリングしたloxB/loxCの１μMストック溶液、４単位のPmeI、および4,000単位の高濃度T4DNAリガーゼ(NewEngland Biolabs, Beverly, MA)を含んだ。連結は16℃にて一晩であった。１〜４μLの連結反応物を、E.coli XL1-Blue細胞（Stratagene)中で電気穿孔し、そして50μg-mLのカナマイシン、50μLの20mg/mLのX-gal、および10μLの100mMIPTGを含むLBプレート上にプレートした。白色コロニーを、新しいLB-カナマイシンマスタープレートに採取した。
【００６６】
lox部位を含むコロニーを、コロニーハイブリダイゼーションによって同定した。マスタープレートを、37℃にて４時間増殖し、そしてナイロンメンブレン(MSI)にブロッティングした。メンブレンを、新しいLB-カナマイシンプレート上に置き、そして37℃にて一晩増殖させた。メンブレンを、0.5MのNaOH上に10分間浮遊させ、0.5MのNaClを含む0.5MのTris-HCl(pH8.0)上に２分間浮遊させることにより中和し、そして２×SSC中でリンスした。
【００６７】
メンブレンを、20mLの６×SSPE、５×Denhardt溶液、0.5％ SDS、および100μg/mLの断片化したニシン精子DNA中で、55℃にて３時間プレハイブリダイズした。プレハイブリダイゼーション溶液を、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、5'末端にて[32P]で標識した8.4×106cpmのloxCを含む10mLの新しい溶液と置き換えた。50μLの標識化反応物は、50pmoleのloxC、ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液（Promega)、15μLの3,000Ci/mmolの[-32P]ATP(DuPont-NEN)、および20単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ(Promega)を含んだ。反応物を、37℃にて10分間インキュベートし、そして生成物をSephadexG-25スピンカラムを用いて、取り込まれていないATPから分離した。ハイブリダイゼーションは、55℃にて一晩であった。フィルターを、0.5％SDSを含む100mLの２×SSC中で55℃で２回、0.5％SDSを含む100mLの１×SSCで55℃で一回洗浄し、そして上記のようにオートラジオグラフにかけた。いくつかのコロニーが激しくハイブリダイズすることを見出し、そしてさらなる特徴付けのために選択した。プラスミドDNAを、MagicMiniprepsDNA Purification System（登録商標）(Promega)を用いて抽出し、そして上記のようにPmeIで消化した。lox部位を含むプラスミドは、もはやPmeI部位を有さない。PmeIによる消化に耐性であったプラスミドを、UniversityofHawaii Biotechnology Service Centerにて自動化DNA配列決定によってさらに分析し、lox部位の挿入を確認した。
【００６８】
所望の方向にlox部位を含むプラスミドをHindIIIで消化し、HindIII付着末端を含むが、完全なHindIII制限部位を含まないloxA/loxBヘテロ二重鎖と混合し、上記のようにアニーリングし、そして連結した。連結反応物は、最終容量30μL中に、2.5μgのHindIII消化したプラスミド、1.25pmoleのloxA/loxB、連結緩衝液(Promega)、６単位のT4DNAリガーゼ(Promega)、1.25単位のHindIII(Promega)を含んだ。反応物を、室温にて１時間インキュベートし、80℃にて10分間加熱し、そしてエレクトロポレーション(Stratagene)によってE.coliXL1-Blue細胞中に導入した。ランダムなプラスミドを、上記のようなHindIIIでの消化によるHindIII部位の損失についてスクリーニングした。このプラスミド構造（pKR1と命名する）の最終確認を、上記のようなDNA配列決定によって得た。
【００６９】
pKR1をSacIで消化した。173μLの反応物は、10μgのpKR1、マルチコア(multicore)緩衝液(Promega)、および20単位のSacI(Promega)を含んだ。37℃にて１時間後、0.7μLのdATP、dCTP、dGTP、およびdTTPの25mMストック、ならびに10単位のT4DNAポリメラーゼ(Promega)を添加した。SacI消化生成物を平滑末端化するこの反応物を、15℃にて30分間インキュベートした。75℃にて15分間のインキュベーションによるT4DNAポリメラーゼの不活化後、24単位のSmaIを添加し、そして反応物を、室温にて２時間インキュベートした。反応を、80℃にて15分間の加熱によって停止した。DNAを、17μLの３M酢酸ナトリウムおよび375μLの100％エタノールの添加によって沈澱させた。-70℃にて１時間後、DNAを、微量遠心分離機中でフルスピードにて、４℃にて20分間の遠心分離によって回収した。DNAを、70％エタノールで洗浄し、減圧下で乾燥し、そして88μLの水中に溶解した。10μLの10×子ウシ腸アルカリホスファターゼ緩衝液(Promega)および20単位の子ウシ腸アルカリホスファターゼを添加し、そして反応物を、37℃にて２時間インキュベートした。反応を、４μLの0.5MEDTAの添加および75℃にて10分間の加熱によって停止した。サンプルを、等量の水飽和フェノールで、次いで等量のフェノール：クロロホルム(１:１）、および最後にクロロホルムで抽出した。DNAを、0.1容量の３M酢酸ナトリウムおよび2.5容量の100％エタノールの添加後に、沈澱によって回収した。
【００７０】
コーヒーACCシンターゼおよびACCオキシダーゼcDNA挿入物を、以下のような制限酵素を用いて本来のプラスミド、pACS、およびpACOから放出した。10μgのpACSプラスミドを、10μLの10×Multicore緩衝液(Promega)、40単位のSmaIを含む100μL中で消化した。25℃にて一晩のインキュベーション後、40単位のBsrSIを添加し、そして反応を67℃にて継続した。67℃にて２時間後、反応管を氷中で10分間冷却し、続いて37℃にてインキュベーションした。反応混合物を、１μLの10mMdNTP(dATP、dCTP、dGTP、およびdTTP)、１μLの１mg/mLのアセチル化BSA、および15単位のT4 DNAポリメラーゼ(Promega)で補充した。反応物を、37℃にて５分間インキュベートし、DNAを平滑末端化した。75℃にて30分間のインキュベーションによるT4DNAポリメラーゼの不活化後、容量を、Speed-Vac（登録商標）において50μLに減少した。消化生成物を、１％のSeaPlaqueアガロースゲル上での電気泳動によって分離した。1.6kbのコーヒーACCシンターゼcDNAを、アガロースゲルから切り出し、そしてcDNA挿入物を、1.12単位のAgarace(Promega)でのアガロースの消化によって回収した。45℃にて30分間のインキュベーション後、cDNAを、24μLの３M酢酸ナトリウム(pH5.2)および600μLの95％エタノールを添加することによって沈澱させた。エタノール沈澱したcDNAを、室温にて30分間遠心分離し、上清を廃棄し、そしてペレットを氷冷の70％エタノールで洗浄し、そして上記のように遠心分離した。ペレットを、100μLの水中に溶解し、そして引き続いてpKR1ベクター中の平滑末端連結において使用した。
【００７１】
ACCオキシダーゼcDNA挿入物を、pACS cDNAについての上記の同様の様式で調製した。10μgのpACOプラスミドを、10μLの10×緩衝液Ｃ(Promega)、１μLの１mg/mLのアセチル化BSA、30単位のBali、および30単位のbambooを含む100μL中で消化した。37℃にて２時間のインキュベーション後、反応混合物に、１μLの10mMdNTP(dATP、dCTP、dGTP、およびdTTP)および15単位のT4 DNAポリメラーゼ(Promega)を補充した。反応物を、37℃にて５分間インキュベートし、平滑末端を生成した。75℃にて30分間のインキュベーションによるT4DNAポリメラーゼの不活化後、容量を、Speed-Vac（登録商標）において50μLに減少させた。消化反応物を、１％のSeaPlaqueアガロースゲル上での電気泳動によって分離した。１kbのコーヒーACCオキシダーゼcDNAを、アガロースゲルから切り出し、そしてcDNA挿入物を、1.12単位のAgarace(Promega)でのアガロースの消化によって回収した。アガロースからのcDNA挿入物の精製は、ACCシンターゼ挿入物について記載される通りであった。ペレットを、50μLの水中に溶解し、そして引き続いてpKR1ベクター中の平滑末端連結において使用した。
【００７２】
精製したACCシンターゼおよびACCオキシダーゼ挿入物を、500ngのpKR1ベクター（平滑末端化およびホスファターゼ化したSamI/SacIフラグメント）および150ngのACCシンターゼまたはACCオキシダーゼのいずれかの挿入物を、別々の管中で混合することにより、pKR1ベクター中に連結した。各ベクター／挿入物混合物の容量を、Speed-Vac（登録商標）を用いて８μLに減少させた。ベクター／挿入物管の各々に、１μLの10×リガーゼ緩衝液（Promega)および１μLのT4DNAリガーゼ（10単位）を添加した。内容物を、８℃にて48時間インキュベートした。
【００７３】
１μLの各連結生成物を、40μLのXL-1 Blue細胞（上記で、エレクトロポレーションのために調製し、そして-70℃にて貯蔵した）と混合し、そして「ElectroCellManipulator 600」(ECM 600, BTX Inc., CA)を用いて2.35KVにて５m秒間エレクトロポレートした。エレクトロポレーションの直後、１mLのLB緩衝液を各チューブに添加し、そして回転振盪機中で、250RPMにて１時間インキュベートした。インキュベーション後、細菌を、1400RPMにて２分間の遠心分離によって沈澱させ、そして容量を100μLに減少させた。50μLの混合物を、40μg/mLのカナマイシンを含むLBプレート中にプレートし、そして37℃にて一晩インキュベートした。カナマイシンプレートにおいて増殖するコロニーを、ACCシンターゼまたはACCオキシダーゼ挿入物を含むコロニーを同定するためにさらにスクリーニングした。個々のクローンを滅菌の爪楊枝(toothpick)を用いて収集し、そして新しいLB-カナマイシンプレート上に格子パターンで置いた。各cDNA挿入物（ACCシンターゼおよびACCオキシダーゼ）について３つのプレートが存在した。格子で一晩の増殖後、細菌を、Magnaナイロンメンブレン(MSI,MA)中にレプリカブロッティングした。メンブレンを、10％SDS中で５分間、0.5MのNaOHおよび1.5MのNaClで15分間、0.5MのTris-HClおよび1.5MのNaClで15分間、ならびに２×SSCおよび0.2MのTris-HClで５分間、連続的に処置した。メンブレンを、風乾し、そして80℃にて20分間焼き、そして120,000μジュールのUV照射（StrataLinkerUV crosslinker 1800, Stratagene, CA)によって架橋した。
【００７４】
メンブレンを、６×SSPE、５×Denhardt溶液、0.5％ SDS、および100μg/mLのニシン精子DNA中で、65℃にて２時間、プレハイブリダイズした。ACCシンターゼおよびACCオキシダーゼのためのプローブを、Ready-to-GoDNA標識ビーズ(Pharmacia)を用いて合成した。50ngの各cDNA挿入物を、45μLの水中での煮沸および氷中でのクエンチによって変性させた。45μLの変性したDNAを、Ready-to-GoDNA標識ビーズおよび５μLの[32-P]dCTP (3000Ci/mmol)と混合し、そして37℃にて30分間インキュベートした。プローブ合成後、チューブを、水中で４分間煮沸し、そして氷中でクエンチした。プレハイブリダイゼーション緩衝液を廃棄し、そして10mLの予め加熱したハイブリダイゼーション緩衝液（６×SSPE、0.5％SDS、および100μg/mLのニシン精子DNA）を、各ハイブリダイゼーションボトル中に置き、次いで変性したプローブを添加した。ハイブリダイゼーションを65℃にて一晩実施した。
【００７５】
メンブレンを、２×SSCおよび0.5％ SDSで手短に洗浄した。同じ緩衝液での２回目の洗浄を30分間実施した。メンブレンを、0.2×SSCおよび0.5×SDSで２回洗浄した。各洗浄は30分間であった。次いで、メンブレンをオートラジオグラフした。ACCシンターゼを有する５つのpKR1クローンおよびACCオキシダーゼを有する24のクローンを、オートラジオグラムの展開の際に同定した。各クローンにおける遺伝子の方向を、PCR、制限消化、およびベクター／挿入物結合部の配列決定を使用して同定した。29のクローン（５つのACCシンターゼおよび24のACCオキシダーゼ）の各々からの細菌性コロニーのピンチ(pinch)を、爪楊枝を用いて採取し、そして20μLの滅菌Milli-Q水中に懸濁した（細胞希釈液）。25μLのPCR反応物は、２μLの上記の細胞希釈液、0.5μLの各dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPの10mMストック、1.5μLの25mMMgCl2、2.5μLの10×緩衝液(Promega)、各１μLの以下で与えられる３つの20μMプライマー、0.3μLの５単位／μLTaqDNAポリメラーゼ(Promega)、ならびに16.2μLの滅菌Milli-Q水を含んだ。ACCシンターゼクローンのために使用されるプライマーは、以下であった：35Sプライマー（5'-CCACTATCC TTC GCA AGA CC-3')；ACSR7 (5'-TTG CCA TCT TCG ACA AGA CT-3')；およびACSL4(5'-CTGTTG TCA GCT GTG CTA-3')。同様に、ACCオキシダーゼクローンのために使用されるプライマーは、以下であった：35Sプライマー；ACOR4(5'-GGACTT CTG AGA TGT TGG AA-3')；およびACOL1 (5'-TGG TGG AGA GCA AGGAATTG-3')。熱サイクル条件は、94℃にて10分；94℃にて１分、50℃にて１分、72℃にて１分の35サイクル、および72℃にて５分であった。pKR1/ACCシンターゼ構築物についてPCR生成物の予想されるサイズは、センス方向について320bp(35SおよびACSR7)、そしてアンチセンス方向について850bp(35SおよびACSL4)であった。同様に、pKR1/ACCオキシダーゼ構築物について予想される生成物は、センス方向について400bp(35SおよびACOR4)、そしてアンチセンス方向について800bp(35SおよびACOL1)であった。ACCシンターゼおよびACCオキシダーゼの両方について、センスおよびアンチセンス方向でcDNAをそれぞれ有する１つのプラスミドを、プラスミドとcDNA間の結合部のDNA配列決定によってさらに分析し、方向を確認した。DNA配列決定を上記のように実施した。アンチセンス方向にACCシンターゼ遺伝子(pKRCACS-Aと示される)、センス方向にACCシンターゼ(pKRCACS-S)、アンチセンス方向にACCオキシダーゼ(pKRCACO-A)、およびセンス方向にACCオキシダーゼ(pKRCACO-S)を有するバイナリーベクターを、図１〜４にそれぞれ示し、本明細書に添付する。
【００７６】
実施例４
センスおよびアンチセンス方向にACCシンターゼ(pKRCACS-SおよびpKRCACS-A)およびACCオキシダーゼ(pKRCACO-SおよびpKRCACO-A)cDNA遺伝子を含む、pKR1プラスミドでの、Agrobacteriaのエレクトロポレーション
Agrobacterium株LBA 4404を、単一のコロニーからOD600まで、100mLのYM液体培地（0.4g/LのYeast抽出物、10g/Lのマンニトール、0.1g/LのNaCl、0.2g/LのMgSO4・7H2O、0.5g/LのK2HPO4、pH7.5）中で、回転振盪機中29℃にて48時間増殖させた。4000×gでの遠心分離によって、６×1011細胞／mLまで濃縮した。エレクトロポレーションを「ElectroCellManipulator 600」(ECM 600, BTX Inc., CA)を用いて実施した。200ngのDNAを含むpKRCACS-A、pKRCACO-A、pKRCACS-S、またはpKRCACO-Sのいずれかのプラスミド溶液の3.5μLアリコートを、濃縮した50μLのAgrobacteria細胞と混合し、予め冷却した２mmギャップキュベット(BTXInc.,CA)に移し、そして2.35kVにての５msパルスを適用した。50μg/mLのカナマイシンを含む１mLのYM液体培地を、エレクトロポレートした細胞に添加し、そしてそれらを250RPMにての29℃振盪機中で１時間回収した。細胞を、4000×gにて遠心分離し、そして100μLの新しいYM液体培地中に再懸濁した。形質転換した細菌を、50μg/mLのカナマイシンを補充したYM寒天プレート（15g/LのBacto寒天を含むYM液体培地）上で選択した。
【００７７】
29℃にて48時間のインキュベーションの後、Agarobacterium形質転換の確認を、各形質転換からマークした格子上の新しいYM寒天／カナマイシンプレートに10個のコロニーを採取することによって得た。ACCシンターゼおよびACCオキシダーゼ遺伝子挿入物の存在および方向を、内部遺伝子特異的プライマーのうちの１つを導く35Sプライマーを用いてPCRによって決定した。少量の各コロニーを、滅菌した爪楊枝を用いて、20μLの滅菌Milli-Q水に移した。PCR反応を、上記のように、２μLのこれらの細胞懸濁液を鋳型DNAとして使用して実施した。ACCシンターゼセンス方向については、35SおよびACSR7プライマーを使用し、そして予想されるサイズ（320bp)の生成物を生成した。ACCシンターゼアンチセンスプライマー35SおよびACSL4は、850bpの予想される生成物を生じた。同様に、ACCオキシダーゼセンス方向については、35SおよびACOR4プライマーを使用し、そして予想されるサイズ（400bp)の生成物を生成した。ACCオキシダーゼアンチセンスプライマー35SおよびACOL1は、800bpの予想される生成物を生じた。本発明者らは、コーヒーの葉組織の形質転換のために、各方向の１つのコロニーを選択した。
【００７８】
実施例５
pKRCACS-S、pKRCACO-S、pKRCACS-A、およびpKRCACO-Aプラスミドを含むAgrobacteriaを用いたコーヒーの葉組織の感染
傾斜屈性の苗条からの成熟した若いコーヒーの葉を、30％のClorox中で30分間滅菌し、そして滅菌した蒸留水中で３回リンスした。主脈と縁との間の薄層から約７mm2の切片を、切り出し、そして109細胞/mLのAgrobacteriumスラリーとともにMS液体培地（MurashigeおよびSkoog,1962)中に置き、そして３時間同時培養した。葉組織を、滅菌した紙タオルで乾燥ブロッティングし、そして2.0g/LのPhytagelの添加によって凝固させたMS培地上で３日間、残りのAgrobacteriumとともに同時培養した。
【００７９】
葉組織を、滅菌紙タオルで再度ブロッティングし、残りのAgrobacteriaを除去し、次いで500μg/mLのカルベニシリン、および100〜300μg/mLのカナマイシン一硫酸または10〜20μg/mLのジェネティシン(G418)のいずれかを含むカルス誘導培地（2,4-Dおよびカイネチンを含むMS培地；SondahlおよびSharp,1977)中に移した。暗所中で25℃にて13日間の培養後、初期のカルスが現れ始めた。
【００８０】
実施例６
pKRCACS-S、pKRCACO-S、pKRCACS-A、またはpKRCACO-Aプラスミドを含むコーヒーの葉のカルス組織の継代培養
抗菌耐性カルスを、300μg/mLのカルベニシリンおよび150〜200μg/mLのカナマイシンを含む胚誘導培地MII（基本の塩、半強度MS塩、10mgのチアミンHCl、40mgのシステインHCl、100mgのミヨ-イノシトール、40gのスクロース、２mgのBA、１mgのピリドキシン、１mgのニコチン酸、2.0gのフィタゲル、pH5.65；YasudaおよびFujii、1985）を用いて３ヶ月間、１ヶ月ごとに継代培養した。次いで、これらのカルスを、100μg/mLのカナマイシンを含むMII培地中で30日間、50μg/mLのカナマイシンを含むMII培地中でさらに30日間継代培養した。体細胞胚は、この最後の培地中で形成した。体細胞胚は、蛍光下で、増殖レギュレーターを欠いた発芽培地MIII（基本の塩、完全強度のMS塩、10mgのチアミンHCl、40mgのシステインHCl、100mgのミオ-イノシトール、40gのスクロース、２gのフィタゲル、pH5.65；SondahlおよびSharp,1977）上で小植物へと発達した。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１ａ】図１（図１ａ〜図１ｄ）は、コーヒー果実が発現するACCシンターゼをコードするcDNAの完全な配列である。
【図１ｂ】図１（図１ａ〜図１ｄ）は、コーヒー果実が発現するACCシンターゼをコードするcDNAの完全な配列である。
【図１ｃ】図１（図１ａ〜図１ｄ）は、コーヒー果実が発現するACCシンターゼをコードするcDNAの完全な配列である。
【図１ｄ】図１（図１ａ〜図１ｄ）は、コーヒー果実が発現するACCシンターゼをコードするcDNAの完全な配列である。
【図２ａ】図２（図２ａ〜図２ｃ）は、図１（図１ａ〜図１ｄ）に示されるcDNA配列から推定される、コーヒー果実のACCシンターゼのアミノ酸配列である。
【図２ｂ】図２（図２ａ〜図２ｃ）は、図１（図１ａ〜図１ｄ）に示されるcDNA配列から推定される、コーヒー果実のACCシンターゼのアミノ酸配列である。
【図２ｃ】図２（図２ａ〜図２ｃ）は、図１（図１ａ〜図１ｄ）に示されるcDNA配列から推定される、コーヒー果実のACCシンターゼのアミノ酸配列である。
【図３ａ】図３（図３ａ〜図３ｃ）は、コーヒー果実が発現するACCオキシダーゼをコードするcDNAの配列である。
【図３ｂ】図３（図３ａ〜図３ｃ）は、コーヒー果実が発現するACCオキシダーゼをコードするcDNAの配列である。
【図３ｃ】図３（図３ａ〜図３ｃ）は、コーヒー果実が発現するACCオキシダーゼをコードするcDNAの配列である。
【図４ａ】図４（図４ａ〜図４ｂ）は、図３（図３ａ〜図３ｃ）に示されるcDNA配列から推定される、コーヒー果実のACCオキシダーゼのアミノ酸配列である。
【図４ｂ】図４（図４ａ〜図４ｂ）は、図３（図３ａ〜図３ｃ）に示されるcDNA配列から推定される、コーヒー果実のACCオキシダーゼのアミノ酸配列である。
【図５】図５は、pKR1ベクター中にアンチセンス方向でコーヒー果実が発現するACCシンターゼをコードするcDNAの一部を含む、pKRCACS-Aベクターを示す。
【図６】図６は、pKR1ベクター中にセンス方向でコーヒー果実が発現するACCシンターゼをコードするcDNAの一部を含む、pKRCACS-Sベクターを示す。
【図７】図７は、pKR1ベクター中にアンチセンス方向でコーヒー果実が発現するACCオキシターゼをコードするcDNAの一部を含む、pKRCACO-Aベクターを示す。
【図８】図８は、pKR1ベクター中にセンス方向でコーヒー果実が発現するACCオキシターゼをコードするcDNAの一部を含む、pKRCACO-Sベクターを示す。
【００８２】
（配列表）
【００８３】
【表１】
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【００８４】
【表２】
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【００８５】
【表３】
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【００８６】
【表４】
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【００８７】
【表５】
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【００８８】
【表６】
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【００８９】
【表７】
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【００９０】
【表８】
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【００９１】
【表９】
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【００９２】
【表１０】
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【００９３】
【表１１】
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【００９４】
【表１２】
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【００９５】
【表１３】
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【００９６】
【表１４】
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【００９７】
【表１５】
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【００９８】
【表１６】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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