(57)【要約】【課題】プローブ支持体への異物の付着がほとんどない生体関連物質の検出方法を提供する。【解決手段】検体溶液投入部３は流路７を介してポンプ接続部４と接続されている。流路７内には支持体５が固定されている。支持体５には、生体関連物質と特異的に反応するプローブが固相化されている。支持体５は、少なくとも部分的に液体透過性を有している。ポンプ接続部４に連結したポンプ８によって検体溶液を吸引して流路７の中を移動させる。これによって、支持体５の中に検体溶液を少なくとも支持体の主平面に垂直でない方向に透過させる。【選択図】      図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体溶液中の生体関連物質を検出する方法であり、生体関連物質と特異的に反応するプローブが固定された少なくとも部分的に液体透過性を有している支持体の中に検体溶液を少なくとも支持体の主平面に垂直でない方向に透過させる、生体関連物質の検出方法。
【請求項２】
請求項１において、支持体に対して検体溶液を往復移動させる、生体関連物質の検出方法。
【請求項３】
請求項１において、支持体に対して検体溶液を間欠的に一方向に移動させる、生体関連物質の検出方法。
【請求項４】
請求項１において、プローブと検体溶液との反応の前に、検体溶液中の被検体を増幅させる前反応を行なう、生体関連物質の検出方法。
【請求項５】
請求項１において、プローブと検体との反応の後に、プローブと反応した検体に酵素反応させる後反応を行なう、生体関連物質の検出方法。
【請求項６】
請求項１において、プローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ペプチド、抗体、抗原、酵素のいずれかである、生体関連物質の検出方法。
【請求項７】
請求項１において、支持体が多孔質体で構成されている、生体関連物質の検出方法。
【請求項８】
請求項１において、支持体が、液体不透過性の基板と、基板上に設けられた液体透過層とから構成されている、生体関連物質の検出方法。
【請求項９】
請求項８において、液体透過層が多孔質体で構成されている、生体関連物質の検出方法。
【請求項１０】
請求項８において、液体透過層がゲル状物質で構成されている、生体関連物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体関連物質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
検体溶液中の生体物質を検出する方法は様々存在するが、近年、支持体となる基材に複数固定させたＤＮＡ断片と検体をハイブリダイゼーションによって小容量で同時に多検体を検出するマイクロアレイの開発が活発になっている。このマイクロアレイはＤＮＡだけでなく、ペプチド、タンパク、細胞などを固定することもできるため、その応用範囲はきわめて広い。
【０００３】
マイクロアレイはその支持体にＤＮＡ断片などをプローブとして固定化するため、検体との反応は固体と液体の界面での反応となり、反応性が悪い欠点がある。
【０００４】
そこで、例えば、特表２０００−５１５２５１号公報は、多孔質体を基板とするＤＮＡチップを開示している。このようなＤＮＡチップでは、基板となる多孔質の陽極酸化アルミニウム薄膜に複数のプローブＤＮＡを固相化しておいて、被検溶液を接触させることによって反応が生じることを利用している。さらに、被検溶液を繰り返し透過させることによって、その反応を著しく加速させることができる。
【特許文献１】特表２０００−５１５２５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特表２０００−５１５２５１号公報に開示されているＤＮＡチップを用いた検出方法では、プローブ支持体である多孔質体の薄膜の膜面に垂直方向に検体溶液を透過させるため、検体溶液中に含まれる異物がプローブ支持体である多孔質体の表面に付着してしまい、洗浄によって除去することが難しくなるという不具合がある。プローブ支持体に異物が付着すると、その部分の検体溶液の透過量が減少してしまう。その結果、プローブとの反応性が場所によって異なってしまう。また、異物が蛍光などを発することによって、検出の精度が低下することもある。
【０００６】
本発明は、このような実状を考慮して成されたものであり、その目的は、プローブ支持体への異物の付着がほとんどない生体関連物質の検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、検体溶液中の生体関連物質を検出する方法であり、生体関連物質と特異的に反応するプローブが固定された少なくとも部分的に液体透過性を有している支持体の中に検体溶液を少なくとも支持体の主平面に垂直でない方向に透過させる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、プローブ支持体への異物の付着がほとんどない生体関連物質の検出方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。
【００１０】
第一実施形態
図１は、本発明の生体関連物質の検出方法に用いられる生体物質検出デバイスの斜視図である。図２は、図１に示された生体物質検出デバイスの断面構造とそれに適用されるシステムとを概略的に示している。
【００１１】
図１に示されるように、生体物質検出デバイス１は、四つの検出部２と、検体溶液投入部３と、ポンプ接続部４とを備えている。図２に示されるように、検体溶液投入部３とポンプ接続部４は流路７によって接続されている。流路７は検体溶液を一時保管するための貯液部を備えていてもよい。
【００１２】
生体物質検出デバイス１は、さらに、光透過性を有する窓６と、流路７内に固定された支持体５を備えている。窓６と支持体５は共に検出部２に位置している。支持体５と窓６の組み込みは、気密性と水密性を確保する必要がある。このため、接着剤や粘着材またはＯリングなどのシーリング部材を用いた密閉構造が好適である。
【００１３】
窓６の材質は特に制限はないが、ガラス、プラスチック、金属、金属酸化物などがよい。特にガラスは、光透過率が高く、自家蛍光などのノイズ成分が少ないので好適である。
【００１４】
支持体５には、検体溶液中の検体すなわち生体関連物質と特異的に反応するプローブが固相化されている。プローブは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ペプチド、抗体、抗原、酵素のいずれである。
【００１５】
支持体５は、少なくとも部分的に液体透過性を有している。支持体５は平板状をしていて、支持体５の液体透過性の部分は、少なくとも、支持体５の主平面に垂直でない方向に検体溶液を透過し得る。ここで、「支持体５の主平面」は、平板状の支持体５の最も大きい主要な二つの平面を指している。支持体５の液体透過性の部分は、支持体５の主平面に垂直な方向に検体溶液を透過してもよい。
【００１６】
支持体５は、例えば、単体の多孔質体で構成される。好適な多孔質体は、例えば、多孔質の陽極酸化アルミニウム薄膜または有機高分子のフィルター材料である。支持体５が多孔質体である場合、プローブは、多孔質体の孔の内部に固定されている。
【００１７】
生体物質検出デバイス１のポンプ接続部４はポンプ８と接続される。これによって、生体物質検出デバイス１の流路７はポンプ８と流体的に接続される。ポンプ８は、流路７に供給された検体溶液を移動させることができる。生体物質検出デバイス１の流路７には、検体溶液だけではなく、前処理液、洗浄液、後処理液などの様々な溶液を取り替えて供給することができる。ポンプ８は、検体溶液の他に、前処理液、洗浄液、後処理液などの様々な溶液を移動させることができる。
【００１８】
さらに、支持体５の上方には検出器１０が配置される。検出器１０は光源を備えていてもよい。検出器１０は、支持体５のプローブと反応した検体の蛍光、りん光、化学発光、吸光度などを検出することができる。
【００１９】
生体物質検出デバイス１は温度制御部９の上に配置される。温度制御部９は、生体物質検出デバイス１と内部の検体溶液の温度を制御する。例えば、温度制御部９によって生体物質検出デバイス１と内部の検体溶液の温度を一定に保つ。また、検出器１０によってプローブと検体との反応を検出しながら温度制御部９によって温度を変化させて、その様子を観察してよい。
【００２０】
生体物質検出デバイス１は、温度制御部９の上に配置され、ポンプ８と接続され、検出器１０が上方に配置された状態のままで、検体溶液の供給、検体溶液とプローブの反応、洗浄液による洗浄、反応結果の検出までの一連の作業が行なわれる。
【００２１】
これらの作業は例えば以下のように行なわれる。
【００２２】
生体物質検出デバイス１の検体溶液投入部３に検体溶液を手動または自動機によって所定量分注する。検体溶液投入部３は支持体５から離れた位置に設けられている。このため、分注の際に、検体溶液を分注するピペットが支持体５に不用意に接触して支持体５に損傷を与える心配がない。
【００２３】
ポンプ接続部４に連結したポンプ８によって検体溶液を吸引して流路７の中を移動させる。これによって、支持体５の中に検体溶液を少なくとも支持体の主平面に垂直でない方向に透過させる。
【００２４】
流路７の中を移動する検体溶液は、流路７内に固定された支持体５に触れて、支持体５の内部への出入りを繰り返す。その際、検体溶液は、支持体５の中を、少なくとも支持体５の主平面に垂直でない方向に透過する。支持体５の内部に染み込んだ検体溶液は、支持体５に固定されているプローブと反応する。
【００２５】
多孔質体は表面積が大きいため、プローブの固相量が非常に大きい。また、新規の検体溶液が繰り返し多孔質体内へ供給される。これによって、反応はより加速され、迅速で高い反応効率を得ることができる。
【００２６】
さらに、検体溶液が支持体５の中を支持体５の主平面に垂直以外の方向から透過するため、検体溶液が支持体５の中を透過する距離が長くなる。その結果、検体溶液内の検体とプローブとの反応効率を大きく向上させることができる。
【００２７】
また、多孔質体の主平面に対しては、検体溶液の移動によって検体溶液内の異物を主平面に押し付けて付着させる圧力は働かず、検体溶液を取り替えることによって、異物のほとんどを取り除くことができる。
【００２８】
所定の反応が終了した後、ポンプ８によって検体溶液を検体溶液投入部３まで押し戻して、手動または自動機によって反応後の検体溶液を除去する。その後、検体溶液投入部３から洗浄液を入れ、ポンプ８によって洗浄液を流路７内で検体溶液と同様に移動させる。これによって、支持体５の中に残留していた検体を効率良く取り除くことができる。つまり、高い効率で洗浄を行なうことができる。
【００２９】
洗浄後、検出器１０によって支持体５に固定されているプローブと検体溶液中の検体との反応を検出する。反応の検出は、検出器１０によって、プローブと検体の反応を行ないながら行なってもよい。その場合、検体溶液と後処理液などの溶液の影響を受けないで検出できるので、より好適である。
【００３０】
本実施形態では、反応と洗浄を通じて、溶液に含まれる異物が支持体５の主平面に付着することがない。その結果、支持体５は検出の精度を低下させる不安定な要因をもたない。従って、プローブと検体との反応を精度良く検出することができる。
【００３１】
図３は、本実施形態の生体物質検出デバイスの変形例を示している。図３において、図２に示された部材と同一の参照符号で指示された部材は同様の部材であり、その詳しい説明は省略する。
【００３２】
この変形例では、図３に示されるように、プローブが固相化された支持体１１は、多孔質体だけで構成され、検出部２に固定されている。つまり、検出部２には、窓はなく、支持体１１が直接固定されており、支持体１１の上面が上方に露出している。検出器１０によって支持体１１の上面が直接検出される。
【００３３】
図４は、本実施形態の生体物質検出デバイスの別の変形例を示している。図４において、図２に示された部材と同一の参照符号で指示された部材は同様の部材であり、その詳しい説明は省略する。
【００３４】
この変形例では、図４に示されるように、支持体１４は、液体不透過性の基板１３と、基板１３上に設けられた液体透過層１２とから構成されている。液体透過層１２は、例えば、多孔質体またはゲル状物質で構成される。プローブは液体透過層１２に固相化されている。基板１３の材質は、特に制限はないが、ガラス、プラスチック、金属、金属酸化物などがよい。特にガラスは、光透過率が高く、自家蛍光などのノイズ成分が少ないので好適である。
【００３５】
この変形例では、検体溶液の移動に伴う液体透過層内の溶液の交換能力は少し低下するが、検体溶液は液体透過層１２の内部に自由に出入りを繰り返すことが可能であり、反応効率を高める効果は依然としてある。
【００３６】
第二実施形態
本実施形態は、検体溶液が支持体の内部に出入りする確率を高める検体溶液の移動方法に向けられている。
【００３７】
第一実施形態と同様に、生体物質検出デバイス１の検体溶液投入部３に検体溶液を手動または自動機によって所定量分注する。本実施形態では、その後、ポンプ８を引いて検体溶液を流路７内でポンプ接続部４の方に移動させた後、今度はポンプ８を押して検体溶液を流路７内で検体溶液投入部３の方に移動させる。つまり、支持体５に対して検体溶液を流路７内で往復移動させる。その後も、ポンプ８の押し引き動作を必要な回数だけ繰り返し行なう。このようにポンプ８の押し引き動作を繰り返すことによって、検体溶液が支持体５の内部に出入りする確率が高まる。その結果、支持体５に固定されたプローブと検体溶液中の検体との反応性が向上する。従って、反応が短時間で完了する。
【００３８】
所定の反応が終了した後、ポンプ８によって検体溶液を検体溶液投入部３まで押し戻して、手動または自動機によって反応後の検体溶液を除去する。その後、検体溶液投入部３から洗浄液を入れ、ポンプ８によって洗浄液を流路７内で検体溶液と同様に移動させる。つまり、支持体５に対して洗浄液を流路７内で往復移動させる。これによって、支持体５の中に残留していた検体をさらに効率良く取り除くことができる。つまり、さらに高い効率で洗浄を行なうことができる。
【００３９】
洗浄終了後、第一実施形態と同様に、検出器１０によって支持体５に固定されているプローブと検体溶液中の検体との反応を検出する。もちろん、反応の検出は、検出器１０によって、プローブと検体の反応を行ないながら行なってもよい。
【００４０】
本実施形態では、反応と洗浄を通じて、溶液に含まれる異物が支持体５の主平面に付着することがない。その結果、支持体５は検出の精度を低下させる不安定な要因をもたない。従って、プローブと検体との反応を精度良く検出することができる。
【００４１】
第三実施形態
本実施形態は、検体溶液が支持体の内部に出入りする確率を高める検体溶液の別の移動方法に向けられている。
【００４２】
第一実施形態と同様に、生体物質検出デバイス１の検体溶液投入部３に検体溶液を手動または自動機によって所定量分注する。本実施形態では、その後、ポンプ８を引いて検体溶液を流路７内でポンプ接続部４の方に移動させる際、途中でポンプ８の引き動作を一時停止して検体溶液の移動を一時停止させる。これによって、支持体５の周辺の検体溶液は拡散によって支持体５内の検体溶液と交換する。その後、ポンプ８の引き動作を再開して検体溶液を再びポンプ接続部４の方に移動させる。つまり、支持体５に対して検体溶液を間欠的に一方向に移動させる。その後も、ポンプ８の引き動作と一時停止を必要な回数だけ繰り返し行なう。このようにポンプ８の引き動作と一時停止とを繰り返すことによって、検体溶液が支持体５の内部に出入りする確率が高まる。その結果、支持体５に固定されたプローブと検体溶液中の検体との反応性が向上する。従って、反応が短時間で完了する。
【００４３】
所定の反応が終了した後、ポンプ８によって検体溶液を検体溶液投入部３まで押し戻して、手動または自動機によって反応後の検体溶液を除去する。その後、検体溶液投入部３から洗浄液を入れ、ポンプ８によって洗浄液を流路７内で検体溶液と同様に移動させる。つまり、支持体５に対して洗浄液を流路７内で往復移動させる。これによって、支持体５の中に残留していた検体をさらに効率良く取り除くことができる。つまり、さらに高い効率で洗浄を行なうことができる。
【００４４】
所定の反応が終了した後、ポンプ８によって検体溶液をさらに吸引し、流路７内の貯液部まで移動させる。その後、洗浄液を検体溶液投入部３に入れ、ポンプ８によって洗浄液を流路７内で検体溶液と同様に移動させる。つまり、支持体５に対して洗浄液を間欠的に一方向に移動させる。これによって、支持体５の中に残留していた検体をさらに効率良く取り除くことができる。つまり、さらに高い効率で洗浄を行なうことができる。
【００４５】
洗浄終了後、第一実施形態と同様に、検出器１０によって支持体５に固定されているプローブと検体溶液中の検体との反応を検出する。もちろん、反応の検出は、検出器１０によって、プローブと検体の反応を行ないながら行なってもよい。
【００４６】
本実施形態では、反応と洗浄を通じて、溶液に含まれる異物が支持体５の主平面に付着することがない。その結果、支持体５は検出の精度を低下させる不安定な要因をもたない。従って、プローブと検体との反応を精度良く検出することができる。
【００４７】
第二実施形態と第三実施形態では、検体溶液が支持体の内部に出入りする確率を高める検体溶液の移動方法として、それぞれ、支持体５に対して検体溶液を流路７内で往復移動させる方法と、支持体５に対して検体溶液を間欠的に一方向に移動させる方法とを例示したが、検体溶液の移動方法は、これらに限定されるものではなく、他の移動方法であってもよい。例えば、第二実施形態と第三実施形態を組み合わせて、支持体５に対して検体溶液を間欠的に往復移動させてもよい。
【００４８】
第四実施形態
本実施形態は、検体とプローブとの反応の前に、検体溶液中の検体を増幅させる前反応に向けられている。
【００４９】
生体物質検出デバイス１の検体溶液投入部３に、手動または自動機によって、ＤＮＡ検体、ポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰを含む検体溶液を所定量分注する。ポンプ接続部４に連結されたポンプ８によって検体溶液を流路７内で移動させる。検体溶液の移動には、第一実施形態〜第三実施形態のいずれの移動方法が適用されてもよい。このとき、ｄＮＴＰには１０％の蛍光色素標識ｄＴＴＰを含ませておく。その後、温度制御部９によって、加熱と冷却を、例えば、９４℃、５５℃、６５℃を３０回繰り返す。これによって、目的のＤＮＡ検体が増幅される。目的のＤＮＡ検体は、支持体５にあらかじめ固定されている目的のＤＮＡ検体と相補的な配列を有するプローブと反応する。反応した後、第二実施形態と同様に、検体溶液を除去し、洗浄を行なう。その後、プローブと反応した検体に取り込まれている蛍光色素の蛍光輝度を検出器１０によって検出する。これによって、あらかじめ検体溶液に目的の検体がどのくらいの量含まれていたかが測定できる。
【００５０】
本実施形態では、反応と洗浄を通じて、溶液に含まれる異物が支持体５の主平面に付着することがない。その結果、支持体５は検出の精度を低下させる不安定な要因をもたない。従って、プローブと検体との反応を精度良く検出することができる。
【００５１】
第五実施形態
本実施形態は、検体とプローブの反応の後に、プローブと反応した検体に酵素反応させる後反応に向けられている。
【００５２】
生体物質検出デバイス１の検体溶液投入部３に手動または自動機によってビオチン標識を行なったＤＮＡ検体を含む検体溶液を所定量分注する。ポンプ接続部４に連結されたポンプ８によって検体溶液を流路７内で移動させる。検体溶液の移動には、第一実施形態〜第三実施形態のいずれの移動方法が適用されてもよい。検体溶液の移動に伴い、目的のＤＮＡ検体は、支持体５にあらかじめ固定されている目的のＤＮＡ検体と相補的な配列を有するプローブと反応する。反応した後、第二実施形態と同様に検体溶液を除去し、洗浄を行なう。その後、洗浄液も除去した後、プローブと反応した検体に標識されているビオチンと反応するアビジンを標識したペルオキシターゼを含む溶液を流路７内に投入し、プローブと反応した検体に標識されているビオチンと反応させる。この溶液を除去した後、基質を含む溶液を流路内に投入し、基質がペルオキシターゼによって還元されて発色する発色量を検出器１０によって測定する。これによって、高感度に検体の濃度を測定することができる。
【００５３】
本実施形態では、反応と洗浄を通じて、溶液に含まれる異物が支持体５の主平面に付着することがない。その結果、支持体５は検出の精度を低下させる不安定な要因をもたない。従って、プローブと検体との反応を精度良く検出することができる。
【００５４】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明の生体関連物質の検出方法に用いられる生体物質検出デバイスの斜視図である。
【図２】図１に示された生体物質検出デバイスの断面構造とそれに適用されるシステムとを概略的に示している。
【図３】本実施形態の生体物質検出デバイスの変形例を示している。
【図４】本実施形態の生体物質検出デバイスの別の変形例を示している。
【符号の説明】
【００５６】
１…生体物質検出デバイス、２…検出部、３…検体溶液投入部、４…ポンプ接続部、５…支持体、６…窓、７…流路、８…ポンプ、９…温度制御部、１０…検出器、１１…支持体、１２…液体透過層、１３…基板、１４…支持体。
【図１】
2005233813.tif 000003
【図２】
2005233813.tif 000004
【図３】
2005233813.tif 000005
【図４】
2005233813.tif 000006