(57)【要約】【課題】高感度の多環芳香族化合物の分析を可能とする技術の提供を目的とする。【解決手段】前記目的を達成するために、本発明の細胞は、モルモット由来のＡｈＲ（アリールハイドロカーボン受容体）遺伝子およびモルモット由来のＡｒｎｔ（ＡｈＲ核内移行因子）遺伝子を含み、モルモット由来のＡｈＲおよびモルモット由来のＡｒｎｔを発現することを特徴とする組換え細胞である。前記細胞は、多環芳香族化合物とＡｈＲとＡｒｎｔとからなる複合体を間接的に分析可能とするレポーターシステムを有することが好ましい。本発明の細胞は、多環芳香族化合物の分析方法に利用でき、また、多環芳香族化合物の分析用キットに利用できる。多環芳香族化合物としては、例えば、ダイオキシン類、ＰＣＤＦ、ＰＣＢ、β-ナフトフラボン、３−メチルコラントレン、ペンゾピレン、ベンゾイミダゾール、ジベンゾアンスラセン、ペンタクロロフェノール等があげられる。【選択図】図１
2005087077.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モルモット由来のＡｈＲ（アリールハイドロカーボン受容体）遺伝子およびモルモット由来のＡｒｎｔ（ＡｈＲ核内移行因子）遺伝子が導入され、モルモット由来のＡｈＲおよびモルモット由来のＡｒｎｔを発現することを特徴とする遺伝子組換え細胞。
【請求項２】
前記ＡｈＲが、下記（ａ）または（ｂ）のタンパク質であり、前記Ａｒｎｔが、下記（ｃ）または（ｄ）のタンパク質である請求項１に記載の遺伝子組換え細胞。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モルモット由来のＡｈＲとして機能するタンパク質。
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モルモット由来のＡｒｎｔとして機能するタンパク質。
【請求項３】
前記細胞が、多環芳香族化合物、モルモット由来のＡｈＲおよびモルモット由来のＡｒｎｔの前記三者の複合体を間接的に分析可能とするレポーターシステムを有する請求項１または２に記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項４】
前記レポーターシステムが、前記複合体が特異的に認識し結合する塩基配列（異物応答配列；ＸＲＥ）と、レポーター遺伝子と、前記遺伝子が発現するための調節配列とが作動的に連結された塩基配列を含む請求項３に記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項５】
前記細胞が、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、微生物からなる群から選択される一つの細胞に由来する請求項１から４のいずれかに記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項６】
前記細胞が、酵母に由来する請求項１から５のいずれかに記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項７】
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ-１９４９７の形質転換酵母（Saccharomyces cerevisiae）である請求項１から６のいずれかに記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項８】
多環芳香族化合物の分析方法であって、請求項１から７に記載の酵母に被験物を接触させ、多環芳香族化合物、モルモット由来のＡｈＲおよびモルモット由来のＡｒｎｔの前記三者の複合体を形成させ、前記複合体を直接的または間接的に分析することを含む分析方法。
【請求項９】
前記分析が、多環芳香族化合物の検出、定性分析および定量分析の少なくとも一つである請求項８に記載の分析方法。
【請求項１０】
前記多環芳香族化合物が、ダイオキシン類、ポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）、β-ナフトフラボン、３−メチルコラントレン、ペンゾピレン、その誘導体、ベンゾイミダゾール、ジベンゾアンスラセン、ペンタクロロフェノール、ジコホールおよびオクタクロロスチレンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物である請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
発現可能に配置された下記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドを含むモルモット由来ＡｈＲ遺伝子および下記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドを含むモルモット由来Ａｒｎｔ遺伝子を含む細胞導入用ベクター。
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、モルモット由来のＡｈＲとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、モルモット由来のＡｒｎｔとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ-１９４９６の染色体組込み型酵母シャトルベクターである請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項８から１０のいずれかに記載の多環芳香族化合物分析方法のためのキットであって、請求項１から７のいずれかに記載の遺伝子組換え細胞を含む多環芳香族化合物の分析用キット。
【請求項１４】
さらに、多環芳香族化合物、モルモット由来のＡｈＲおよびモルモット由来のＡｒｎｔの前記三者の複合体または前記複合体に応答するレポーター遺伝子産物を、直接的もしく間接的に分析するための試薬を含む請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
さらに、標準物質として、定量された多環芳香族化合物を含む請求項１３または１４に記載のキット。
【請求項１６】
下記（ａ）または（ｂ）のモルモット由来のタンパク質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モルモット由来のＡｒｎｔとして機能するタンパク質。
【請求項１７】
下記（ａ）または（ｂ）のモルモット由来のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、モルモット由来のＡｒｎｔとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え細胞、それを用いた多環芳香族化合物の分析方法および多環芳香族化合物の分析用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ダイオキシン類をはじめとする多環芳香族化合物の検出や分析には、高価で大掛かりな分析装置が必要であり、操作も煩雑である。また、機器分析では、被験物中に含まれる多種の多環芳香族化合物を分離して検出することは可能であるが、測定結果から環境中の総合的な生物学的毒性を判断することが難しい場合がある。
【０００３】
ＡｈＲ（アリールハイドロカーボン受容体；aryl hydrocarbon receptor)は、動物にダイオキシン類などの多環芳香族化合物を投与した場合に薬物代謝酵素の誘導を仲介する因子として知られている。また、Ａｒｎｔ（ＡｈＲ核内移行因子；aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator）は、ＡｈＲとヘテロ二量体を形成し、多環芳香族化合物に対するリガンド応答性の遺伝子発現調節に関与する因子として知られている。多環芳香族化合物とＡｈＲとＡｒｎｔとの複合体は、薬剤代謝酵素（例えば、Ｐ４５０やグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ等）の遺伝子の上流にある特異的な塩基配列（異物応答配列；xenobiotic responsive element、ＸＥＲ）を認識して結合し、転写調節因子として機能する。
【０００４】
現在のところ、ラットやハムスター由来のＡｈＲ遺伝子を、レポーター遺伝子とともに昆虫細胞やヒト由来の培養細胞に導入し、得られた形質転換細胞を利用して化学物質等のレポーターアッセイを行う方法や、形質転換細胞を培養して得られるＡｈＲを利用してレセプターバインディングアッセイを行う方法が提案されている（例えば、特許文献１および２参照）。また、ヒト由来のＡｈＲ遺伝子を導入した酵母（Saccharomyces cerevisiae）を用い、数種の多環芳香族化合物に対するリガンド応答性を調査した結果が報告されている（非特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２０００−３５４４９４号公報
【特許文献２】特開２００１−７８７８２号公報
【非特許文献１】Miller, III 「酵母において構成されたヒトアリール炭化水素レセプターシグナル経路はリガンド混合物に対して付加的な応答と示す。（A human aryl hydrocarbon receptor signaling pathway constructed in yeast displays additive responses to ligand mixtures.）」（1998）Toxicology and Applied Pharmacology, 160, 297-303
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、環境中に微量に含まれる多環芳香族化合物を分析するため、より高感度な分析方法の開発が期待されている。そこで、本発明は、高感度の多環芳香族化合物の分析を可能とする技術の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の細胞は、モルモット由来のＡｈＲ（アリールハイドロカーボン受容体）遺伝子およびモルモット由来のＡｒｎｔ（ＡｈＲ核内移行因子）遺伝子を含み、モルモット由来のＡｈＲおよびモルモット由来のＡｒｎｔを発現することを特徴とする組換え細胞である。
【０００７】
ここで、モルモットが脊椎動物の中でダイオキシンに対し感受性が高いという事実は既に知られていた。しかし、この事実から直ちに本発明が想到されるわけではなく、むしろ当業者において本発明に想到するのは困難であるといえる。すなわち、モルモットがダイオキシン類に対し高感受性であることのメカニズムは種々考えられる。例えば、（１）モルモットの細胞は、細胞膜の透過性が高くダイオキシンを吸収しやすい、（２）モルモットにおけるダイオキシン初期応答に関わるタンパク質（Ｈｓｐ９０、Ａｒａ９、ＡｈＲ、Ａｒｎｔ等）の活性が高い、若しくは、（３）ダイオキシンによって誘導されるＰ４５０タンパク質分子種の少なくとも一種がダイオキシンを代謝でき（ヒト、その他の動物では分解できない）、その代謝中間産物が毒性を示す、などである。このように、いろいろ想定されるメカニズムのなかで、本発明者等は、ＡｈＲ、Ａｒｎｔ、ダイオキシンの三者の複合体形成およびその複合体の転写誘導活性が、モルモットの個体レベルでのダイオキシン高感受性を規定するとの仮説を立て、この仮説に基き、さらに研究を行った結果、この仮説のメカニズムが正しいことを立証し、本発明をするに至ったのである。なお、いろいろ想定されるメカニズムの中から一つの仮説を立てたとしても、それが実証できる可能性が低いことは、生物学のみならず科学の分野では常識である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の細胞は、モルモット由来のＡｈＲおよびモルモット由来のＡｒｎｔを発現しているため、本発明の細胞を使用すれば、高い感度で多環芳香族化合物を分析できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の遺伝子組換え細胞が発現するＡｈＲおよびＡｒｎｔは、モルモット由来のタンパク質である。
【００１０】
前記モルモット由来ＡｈＲとしては、例えば、下記（ａ）または（ｂ）のタンパク質が好ましい。なお、下記配列番号１のアミノ酸配列は、公知であり、例えば、登録番号ＡＹ０２８９４７(GenBank/EMBL/DDBJ）を参照できる。下記（ｂ）のタンパク質は、下記（ａ）のタンパク質との相同性が、例えば、９８％以上であって、好ましくは、９８．５％以上であり、より好ましくは、９９％以上であり、さらに好ましくは、９９．５％以上である。また、下記（ｂ）のタンパク質において、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸残基の数は、例えば、１〜１６であって、好ましくは、１〜１２であり、より好ましくは、１〜８であり、さらに好ましくは、１〜４である。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モルモット由来のＡｈＲとして機能するタンパク質。
【００１１】
一方、前記モルモット由来のＡｒｎｔとしては、例えば、下記（ｃ）または（ｄ）のタンパク質が好ましい。下記（ｄ）のタンパク質は、下記（ｃ）のタンパク質との相同性が、例えば、９８．５％以上であって、好ましくは、９９．０％以上であり、より好ましくは、９９．２％以上であり、さらに好ましくは、９９．５％以上である。また、下記（ｄ）のタンパク質において、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸残基の数は、例えば、１〜１２であって、好ましくは、１〜８であり、より好ましくは、１〜６であり、さらに好ましくは、１〜４である。
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モルモット由来のＡｒｎｔとして機能するタンパク質。
【００１２】
前記ＡｈＲおよびＡｒｎｔを細胞内で発現させるためには、例えば、モルモット由来のＡｈＲ遺伝子およびＡｒｎｔ遺伝子を前記細胞内に導入すればよい。
【００１３】
前記モルモット由来のＡｈｒＲ遺伝子としては、例えば、下記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。なお、下記配列番号３の塩基配列は公知であり、例えば、登録番号ＡＹ０２８９４７(GenBank/EMBL/DDBJ）を参照できる。下記（ｂ）のポリヌクレオチドは、下記（ａ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、例えば、１〜２５０であって、好ましくは、１〜２００であり、より好ましくは、１〜１４０であり、さらに好ましくは、１〜６０である。
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、モルモット由来のＡｈＲとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００１４】
一方、前記モルモット由来のＡｒｎｔ遺伝子としては、例えば、下記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｄ）のポリヌクレオチドは、下記（ｃ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９５％以上であって、好ましくは、９７％以上であり、より好ましくは、９８％以上であり、さらに好ましくは、９９％以上である。また、下記（ｄ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、例えば、１〜１２０であって、好ましくは、１〜７０であり、より好ましくは、１〜４０であり、さらに好ましくは、１〜２０である。
（ｃ）配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、モルモット由来のＡｒｎｔとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００１５】
前記ＡｈＲおよびＡｒｎｔ遺伝子は、配列番号３および配列番号４の塩基配列に基づいて、モルモットのトータルＲＮＡ等を使用してクローニングしてもよく、また、ホスホルアミダイト（phosphoramidite）法を利用して化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して行える。また、本発明の受託番号ＦＥＲＭ Ｐ-１９４９６のベクターには、配列番号３のモルモット由来ＡｈＲ遺伝子および配列番号４のモルモット由来Ａｒｎｔ遺伝子がともにクローニングされているので、このベクターＤＮＡを利用すれば、容易に前記ＡｈＲおよびＡｒｎｔ遺伝子をクローニングできる。
【００１６】
本発明の遺伝子組換え細胞の宿主細胞としては、例えば、一般的に遺伝子組換え技術が適用できるものが好ましく、さらに好ましくは、保存、増殖等の取扱いが容易な細胞である。このような宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌等があげあれ、これらの中でも、酵母が好ましい。酵母は、他の培養細胞に比べて取扱い容易であり、増殖速度も速く、この細胞を多環芳香族化合物の分析に用いた場合、分析時間も短くすることが可能となる。さらに、取扱い機器、培地等も安価であり、分析の低コスト化が可能となる。前記酵母としては、例えば、出芽酵母、分裂酵母、糸状酵母等が使用できるが、遺伝子組換え技術が最も確立している点からは、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）が好ましい。
【００１７】
前記宿主細胞内に、前記モルモット由来ＡｈＲおよびＡｒｎｔ遺伝子を導入する方法としては、特に制限されず、前記宿主細胞に適した従来公知の遺伝子導入方法により行うことができる。前記遺伝子導入方法としては、例えば、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポソームを用いた方法、エレクトロポレーション、ウイルスベクターを用いる方法、マイクロピペットインジェクション法等があげられる。本発明の遺伝子組換え細胞における前記モルモット由来ＡｈＲおよびＡｒｎｔ遺伝子導入は、多環芳香族化合物の分析に用いることが可能であれば、一過性型の導入でもよく、または、宿主染色体への組込み型もしくは自律複製・分配可能な人工染色体もしくはプラスミド型の導入でもよい。取扱いや保存の容易性および多環芳香族化合物の分析の迅速性、正確性、簡便性からは、後者の遺伝子導入方法が好ましい。
【００１８】
前記宿主細胞内に導入する前記モルモット由来ＡｈＲおよびＡｒｎｔ遺伝子は、宿主細胞内で恒常的または任意に発現するように、必要な調節配列と作動的に連結されていることが好ましい。前記調節配列とは、宿主細胞内において、作動的に連結された前記遺伝子の発現に必要な塩基配列であって、例えば、真核細胞に適した調節配列としては、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー等があげられる。前記作動的に連結とは、各構成要素が機能を果たすことができるように並置していることを意味する。
【００１９】
本発明の遺伝子組換え細胞はモルモット由来のＡｈＲとＡｒｎｔを発現するから、本発明の遺伝子組換え細胞がＡｈＲのリガンドである多環芳香族化合物と接触すると、細胞内で、前記多環芳香族化合物、ＡｈＲおよびＡｒｎｔの前記三者の複合体が形成される。この複合体は、ＤＮＡ上の特定の認識配列（異物応答配列；xenobiotic responsive element、ＸＲＥともいう）に結合し、さらに前記配列の下流の遺伝子発現を誘導できる。
【００２０】
したがって、例えば、免疫学的測定方法等を利用して前記複合体を直接的に分析する方法、または、前記複合体が誘導する遺伝子発現産物もしくはその酵素活性等を利用して前記複合体を間接的に分析可能とするレポーターシステムによれば、本発明の遺伝子組換え細胞を利用して、多環芳香族化合物の分析が可能である。ここで、多環芳香族化合物の分析とは、検出、定性分析および定量分析の少なくとも一つをすることである。このような分析方法は、ダイオキシン類等の多環芳香族化合物の生体感受性に深く関与するＡｈＲの機能を利用する方法であるため、分析結果は、機器分析と異なり毒性等量（toxic equvalents;ＴＥＱ）を反映しており、生体への影響を知る指標となりうる。
【００２１】
前記多環芳香族化合物の分析に際しては、前記レポーターシステムを利用することが好ましい。前記レポーターシステムにおいては、前記複合体が発現制御する遺伝子をレポーター遺伝子として利用することが好ましい。レポーター遺伝子を利用することで、分析処理操作の簡素化や分析にかかる時間の短縮化が可能となる。前記レポーター遺伝子としては、宿主細胞に前記複合体認識配列（ＸＲＥ）およびその結合により発現制御される遺伝子がある場合、その遺伝子を利用してもよく、また、別個に宿主細胞に前記複合体認識配列（ＸＲＥ）と調節配列と所望のレポーター遺伝子とが作動的に連結されたポリヌクレオチドを導入してもよい。ここで、作動的に連結とは、各構成要素が機能を果たすことができるように並置していることを意味する。また、前記ポリヌクレオチドの導入方法は、特に制限されず、上述のＡｈＲおよびＡｒｎｔ遺伝子の導入と同様にして行うことができる。前記複合体と複合体認識配列の結合によるレポーター遺伝子の発現制御は、発現抑制であってもよく、発現促進であってもよい。
【００２２】
前記複合体認識配列（ＸＲＥ）としては、本発明の遺伝子組換え細胞内で発現されるモルモット由来の複合体との親和性が高い複合体認識配列（ＸＲＥ）であることが好ましく、より好ましくは、モルモット由来の複合体認識配列（ＸＲＥ）である。前記ＸＲＥのコンセンサス配列としては、例えば、5'-ＧＣＧＴＧ-3'等があげられ、前記レポーター遺伝子の発現制御のために、前記ＸＲＥ配列は、１〜６回の繰り返し配列とすることが好ましく、より好ましくは、２〜５回であって、さらに好ましくは、２〜３回である。
【００２３】
前記レポーター遺伝子としては、宿主細胞内で、その遺伝子産物であるＲＮＡ、タンパク質および酵素活性の少なくとも一つが簡単に定量化でき、測定バックグランドが低いものであれば、特に制限されず、従来公知のレポーター遺伝子を利用できる。酵素活性を測定するのに用いるレポーター遺伝子の具体例としては、β-ガラクトシダーゼ遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等があげられる。
【００２４】
モルモット由来のＡｈＲとＡｒｎｔを発現し、さらに、前述のレポーターシステムを備えている本発明の組換え細胞の一例として、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ-１９４９７である酵母（Saccharomyces cerevisiae）があげられる。この受託番号ＦＥＲＭ Ｐ-１９４９７の酵母には、モルモット由来のＡｈレセプター遺伝子およびモルモット由来のＡｒｎｔ遺伝子が染色体内に発現可能に導入され、多環芳香族化合物、ＡｈＲおよびＡｒｎｔの前記三者の複合体により、β-ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するプラスミドを保持している。
【００２５】
本発明の遺伝子組換え細胞を利用した多環芳香族化合物の分析は、被験物を本発明の遺伝子組換え細胞に接触させ、多環芳香族化合物、モルモット由来のＡｈＲおよびモルモット由来のＡｒｎｔの前記三者の複合体を形成させ、前記複合体を直接的または間接的に分析することで行える。前記被験物としては、特に制限されないが、例えば、ダイオキシン類による汚染が懸念される水、土壌、焼却灰等があげられる。また、前記被験物を本発明の遺伝子組換え細胞に接触させる方法としては、例えば、本発明の遺伝子組換え細胞、または、前記細胞を含む培養液を被験物と混合する方法や、さらに、前記混合状態を前記細胞の培養条件下で所定時間維持して、多環芳香族化合物を前記細胞に十分に作用させる方法等があげられる。
【００２６】
前記多環芳香族化合物としては、ダイオキシン類、ポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）、β-ナフトフラボン、３−メチルコラントレン、ペンゾピレン、その誘導体、ベンゾイミダゾール、ジベンゾアンスラセン、ペンタクロロフェノール、ジコホール、オクタクロロスチレン等があげられる。なお、前記メチルコラントレン等のように、ポリスチレンに吸着しやすい多環芳香族化合物が被験物に含まれるおそれがある場合には、分析処理操作は、ガラス製の容器、器具を用いることが好ましい。
【００２７】
以下に、本発明の遺伝子組換え細胞を用いた多環芳香族化合物分析の実施態様の一例を示す。なお、この例は、前記細胞が、前記モルモット由来ＡｈＲおよびＡｒｎｔ遺伝子で形質転換された酵母であって、さらに、細胞内酵素をコードするレポーター遺伝子が導入され、前記複合体により前記レポーター遺伝子が発現誘導される酵母の場合である。
【００２８】
前記分析に際して、まず、前培養を行って前記形質転換酵母の増殖を図り、十分な菌体量を確保することが好ましい。前培養は、例えば、形質転換酵母として下記表１に示すようなアミノ酸、無機塩、ビタミン類、糖類等からなる培地で継続的に培養された状態のものを利用する場合には、例えば、培養液を５０μｌ分取し、下記表１に示す培地５０００μｌ中に加え、３０℃で１２〜２４時間程度振とう培養することによって行う。一方、形質転換酵母として凍結乾燥菌体を利用して前培養を行う場合には、例えば、ＹＰＤ培地等の栄養培地を加え、３０℃で２４時間培養した培養液を５０μｌ分取し、前記と同様に下記表１に示す培地５０００μｌに加え、３０℃で１２〜２４時間程度振とう培養する。
【００２９】
（表１）
成分                                配合量  
ドロップアウトパウダー  (注１)            １．３ｇ
窒素源                  (注２)            １．７ｇ
(ＮＨ4)2ＳＯ4                             ５ｇ
炭素源（グルコースまたはガラクトース）    ２０ｇ  
(注１)
ドロップアウトパウダー組成
アデニン              ２．５ｇ    Ｌ−メチオニン        １．２ｇ
Ｌ−アルギニン        １．２ｇ    Ｌ−フェニルアラニン  ３    ｇ
Ｌ−アスパラギン酸    ６    ｇ    Ｌ−セリン          ２２．５ｇ
Ｌ−グルタミン酸      ６    ｇ    Ｌ−スレオニン      １２    ｇ
Ｌ−ヒスチジン        １．２ｇ    Ｌ−チロシン          １．８ｇ
Ｌ−ロイシン          ３．６ｇ    Ｌ−バリン            ９    ｇ
Ｌ−リジン            １．８ｇ    ウラシル              １．２ｇ
(注２)
Yeast Nitrogen W/O Amino Acid & Ammonium Sulfate (Difco社製）
前培養により菌が十分に増殖したら、レポーター遺伝子のプロモーターの特性に適した培地（例えば、レポーター遺伝子がβ-ガラクトシダーゼである場合には、炭素源としてガラクトースを使用したもの）中に、被験物と前培養液とを適当な割合で混合して培養し、被験物中の多環芳香族化合物を菌体に十分に作用させる。前記培養温度は、例えば、２８〜３０℃であり、前記培養時間は、例えば、１８時間である。前記被験物が固体の場合には、例えば、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)等の菌体に対して毒性を示さない溶媒を用いて前記被験物を溶解または多環芳香族化合物を前記被験物から抽出してから前記培地と混合することが好ましい。
【００３０】
次に、被験物と十分に接触させた前記形質転換酵母を、公知の手法により溶菌させる。この溶菌には、例えば、下記表２に示すような、Ｚバッファーに界面活性剤（サルコシル）を添加したもの等が使用できる。
【００３１】
（表２）
成分                     配合量(最終濃度)
Ｎａ2ＨＰＯ4                      ６０ｍＭ
ＮａＨ2ＳＯ4                      ４０ｍＭ
ＭｇＣｌ2                         １  ｍＭ
ＫＣｌ                            １０ｍＭ
ジチオスレイトール(Dithiothreitol)  ２ｍＭ
サルコシル(Sarcosil)              ０．２０％    
そして、前記用菌液を適量採取し、多環芳香族化合物とＡｈＲとＡｒｎｔとの複合体の結合により活性化されたレポーター遺伝子の産物である酵素活性等を適切な手段により測定する。前記レポーター遺伝子が、例えば、β-ガラクトシダーゼを発現する場合、ＯＮＰＧ（オルソニトロフェニルガラクトピラノシド）等の発色試薬を作用させ、その吸光度を測定すればよい。この測定において、標準物質の多環芳香族化合物を用いて測定し、検量線を作成しておくことが好ましく、前記検量線は、被験物の測定と同時に作成することが好ましい。さらに、測定に際しては、用量作用関係の範囲内に納まるように被験物を適宜希釈することが好ましい。このような多環芳香族化合物の分析方法であれば、吸光度を測定するだけでよく、簡便かつ迅速に分析できる。
【００３２】
本発明の多環芳香族化合物の分析用キットは、本発明の遺伝子組換え細胞を利用した多環芳香族化合物の分析方法を簡単に実施するためのキットであって、本発明の遺伝子組換え細胞を含むキットである。このようなキットには、その他に、例えば、培地用組成物もしくは培地、レポーター遺伝子を選択できるような各種レポーター遺伝子を含むベクター、前記レポーター遺伝子産物を分析するための試薬、標準物質として使用するための既知量の多環芳香族化合物等を含んでいてもよい。また、前記分析用キットにおいては、本発明の遺伝子組換え細胞にかえて、本発明の遺伝子組換え細胞を作製するためのモルモット由来のＡｈＲおよびＡｒｎｔ遺伝子がクローニングされたベクターを含んでいても良い。
【００３３】
前記分析用キットにおいて、本発明の遺伝子組換え細胞としては、酵母であることが好ましい。酵母であれば、凍結乾燥するとができ、培養組成物も粉末化できるから、前記分析用キットの取扱いが簡便化され、低コスト化も可能となる。
【００３４】
以下、実施例および比較例により、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
（モルモットＡｒｎｔ遺伝子のクローニング）
モルモット（ＳＴＤ：Ｈａｒｔｌｅｙ）の肺組織を約３０〜３５ｍｇ採取し、キット(商品名:Rneasy Mini Kit、QIAGEN社製）を用いてＲＮＡを抽出し、このＲＮＡとキット(商品名:RNA PCR kit(AMV) Ver:2.1、TaKaRa社製）を用いてＲＴ-ＰＣＲを下記条件で行った。
フォワードプライマー：配列番号５、リバースプライマー  ：配列番号６
ＲＴ条件    ５５℃  ３０min、９９℃  ５min、５℃  ５min
ＰＣＲ条件  ９４℃  ２min                                      １サイクル
９４℃  ３０sec、４９℃  ３０sec、７２℃  ３min  ５０サイクル
前記ＲＴ-ＰＣＲ後にゲル電気泳動を行い、約２．４ｋｂのＡｒｎｔｃＤＮＡ断片を確認し、前記ＲＴ−ＰＣＲで得られた試料をもとに、さらに、下記条件のＰＣＲを行い、ＡｒｎｔｃＤＮＡ断片を得た。
ＰＣＲ条件  ９４℃  ２min                                      １サイクル
９４℃  ３０sec、４９℃  ３０sec、６８℃  ３min  ３０サイクル
６８℃  ５min                                      １サイクル
こうして得られたモルモットＡｒｎｔｃＤＮＡ断片の末端を、T4PolynucleotideKinase(TOYOBO社製）を用いてリン酸化した。この断片を、プラスミドｐBluscript(STRATAGENE社製）のＳｍａＩ部位に挿入し、モルモットＡｒｎｔ遺伝子をクローニングした（pBluscript-ArntcDNAの完成）。このpBluscript-ArntcDNA上のＡｒｎｔ遺伝子の配列は、ＤＮＡシーケンサーにより配列決定した（配列番号４）。なお、クローニングには、大腸菌ＤＨ５α株を使用した。
【００３６】
（両方向プロモーターを有するプラスミドへのモルモットＡｈＲおよびＡｒｎｔ遺伝子のクローニング）
両方向プロモーター領域Ｇａｌ１,１０を持つプラスミドＹＥｐｌａｃ Ｇａｌ１,１０ (GenBank,pMC262)の前記両プロモーターの下流に位置するＢｓｉＷＩ/ＭｆｅＩ部位およびＸｂａＩ/ＳｂｆＩ部位に、それぞれ、ＡｈＲ断片およびＡｒｎｔ断片を挿入し、ＡｈＲおよびＡｒｎｔ遺伝子を有し、それらの間に両方向プロモーターが介在したプラスミドＹＥｐｌａｃを得た。なお、クローニングには、大腸菌ＤＨ５α株を使用した。
【００３７】
前記ＡｈＲ断片は、前記モルモットの肺から抽出したＲＮＡと、キット(商品名：Rever Tra Dash、TOYOBO社製）を用いて、下記条件のＲＴ-ＰＣＲを行い、その増幅産物をＭｆｅＩおよびＢｓｉＷＩにより制限酵素処理して作製した。
フォワードプライマー：配列番号７、リバースプライマー  ：配列番号８
ＲＴ条件    ４２℃  ２０min、９９℃  ５min、４℃  ５min
ＰＣＲ条件  ９８℃  １０sec、６０℃  ２sec、７２℃  ３min  ３０サイクル
一方、前記Ａｒｎｔ断片は、前記pBluscript-ArntcDNAとKOD plusポリメラーゼを用いて、下記条件のＰＣＲを行い、その増幅産物をＸｂａＩおよびＳｂｆＩにより制限酵素処理して作製した。
フォワードプライマー：配列番号９、リバースプライマー  ：配列番号１０
ＰＣＲ条件  ９４℃  ２min                                      １サイクル
９４℃  １５sec、５２℃  ３０sec、６８℃  ３min  ３０サイクル
６８℃  ５min                                      １サイクル
（染色体組込み型シャトルベクターへのクローニング）
前記ＡｈＲおよびＡｒｎｔ遺伝子を有し、それらの間に両方向プロモーターが介在したプラスミドＹＥｐｌａｃのAhR cDNA-Gal1.10promoter-Arnt cDNA 領域を下記条件のＰＣＲにより増幅し、その増幅産物をＳｓｅ８３８７Ｉで処理し、酵母染色体組込み型シャトルベクターｐＡＵＲ１０１（TaKaRa社製）のＳｍａＩ/Ｓｓｅ８３８７Ｉ部位に挿入し、ｐＡＵＲ１０１ｇＡｈＲ／Ａｒｎｔ（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ-１９４９６）を得た。なお、クローニングには、大腸菌ＤＨ５α株を使用した。
フォワードプライマー：配列番号１１、リバースプライマー  ：配列番号１２
ＰＣＲ条件  ９４℃  ２min                                      １サイクル
９４℃  １５sec、５２℃  ３０sec、６８℃  ３min  ３０サイクル
６８℃  ５min                                      １サイクル
（形質転換酵母の作製）
前記ｐＡＵＲ１０１ｇＡｈＲ／Ａｒｎｔ（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ-１９４９６）を、制限酵素ＢｓｉＷＩで処理して直鎖状とし、以下のように酢酸リチウム法にて宿主となる酵母へ導入し、さらに、染色体への組込みを行った。宿主株として、酵母（Saccharomyces cerevisiae）Ｗ３０３ａ株を使用した。
【００３８】
まず、前記宿主となる酵母を、３０℃でＯＤ660が１〜２になるまでＹＰＤ培地中で培養し、ソリューションＡ（0.1 M Lithium acetate, 10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 1 mM EDTA  いずれも最終濃度）で洗浄後、ＯＤ660＝１５０となるようにソリューションＡに再懸濁し、１．５ｍｌマイクロチューブに１００μｌずつ分注して、３０℃で１時間インキュベートした。その後、直鎖状のｐＡＵＲ１０１ｇＡｈＲ／Ａｒｎｔ  ５μｇと、キャリアーＤＮＡ(商品名：SALMON TESTES DNA for hybridization、SIGMA社製)１５０μｇ(合計２０μｌ）を加え、さらに、ソリューションＢ（ソリューションＡ１００ｍｌにポリエチレングリコール４０００を溶解したもの）を８５０μｌ添加し、緩やかに混合した。
【００３９】
次に、前記混合液を３０℃で３０分インキュベートして４２℃で１５分熱処理した後、さらに、１０分室温に放置してから、５０００ｒｐｍ１分間の遠心分離で集菌し、それらを５〜１０ｍｌのＹＰＤ培地に懸濁し、３０℃で一晩培養した。そして、培養後集菌して洗浄した酵母を、０．９％ＮａＣｌ溶液に懸濁し、ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ（０．５ｇ/ｍｌ）を含むＹＰＤ選択プレートに１００μずつ塗布して培養した。ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ耐性株をAhR cDNA-Gal1.10promoter-Arnt cDNA 領域が染色体上に組込まれた形質転換酵母として選択した。
【００４０】
（レポータープラスミドの導入）
β-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＲＷ９５−３(Wolf et al. ; Biotechniques 20, 568-573 (1996))のＢａｍＨＩ/ＸｍａＩ部位に、ヒト由来のＸＲＥ配列（配列番号１３）を挿入し、レポータープラスミドを作製した。このプラスミドを酢酸リチウム法により前記形質転換酵母に導入し、AhR cDNA-Gal1.10promoter-Arnt cDNA 領域が染色体上に組込まれ、さらに、前記レポータープラスミドが導入された形質転換酵母を作製した。このようにして作製された形質転換酵母の一例が、ＯＰＵ−Ｇ１１株（受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ-１９４９７）である。
【００４１】
（比較例１）
モルモット由来のＡｈＲ遺伝子およびＡｒｎｔ遺伝子にかえて、ヒト由来のＡｈＲ遺伝子（登録番号ＸＭ００４９８８(GenBank/EMBL/DDBJ））およびヒト由来のＡｒｎｔ遺伝子（登録番号ＮＭ００１６６８(GenBank/EMBL/DDBJ））を用いた以外は、実施例１と同様にして、ヒト由来のＡｈＲおよびＡｒｎｔ遺伝子を有する形質転換酵母を作製した。
【００４２】
（２,３,７,８−ＴＣＤＤに対する応答）
実施例１のＯＰＵ−Ｇ１１株および比較例１の形質転換酵母のコロニーを、それぞれ、ＹＰＤ培地に接種し、３０℃で６００ｎｍの吸光度が２になるまで培養した。その後、培養液５０μｌを表１に示される培地５０００μｌに加え、３０℃で１２時間振とう培養し、前培養を行った。
【００４３】
９６ウェルプレートに、所定濃度となるようにＤＭＳＯに溶かした２,３,７,８−ＴＣＤＤをそれぞれ１μｌずつ添加し、さらに前記表１に培地において炭素源としてガラクトースを使用したものを２００μｌ、および、前培養を行った菌体を６００ｎｍの吸光度が１になるように調製したものを５μｌ加え、３０℃で１８時間培養した。
【００４４】
前記培養後、別の新たなプレートに、培養液をそれぞれ１０μｌずつ移し、さらに、前記表２に記載の組成のＺバッファーを１４０μｌおよび４ｍｇ/ｌのＯＮＰＧを５０μｌを加え、３７℃で１時間培養した。培養後、４１５ｎｍにおける吸光度を測定し、下記式に基づきβ-ガラクトシダーゼ活性を算出した。
【００４５】
(数１）
β-ガラクトシダーゼ活性（Ｕ）＝
[４１５ｎｍの吸光度／５４０ｎｍの吸光度×培養液(ｍｌ)×反応時間(分)]×１０００
図１は、実施例１のレポータープラスミドを導入したＯＰＵ−Ｇ１１（モルモット由来ＡｈＲ,Ａｒｎｔ遺伝子形質転換酵母）と比較例１のヒト由来ＡｈＲ,Ａｒｎｔ遺伝子形質転換酵母とを、それぞれ同じ条件で５ｎＭの２,３,７,８−ＴＣＤＤに接触させた場合の上記β-ガラクトシダーゼ活性を測定した結果を示したグラフである。図１に示すように、モルモット由来ＡｈＲ,Ａｒｎｔ遺伝子を使用した方が、ヒト由来のＡｈＲ,Ａｒｎｔ遺伝子を使用するよりも、より高感度にダイオキシン類の分析が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
以上のように、本発明の遺伝子組換え細胞は、モルモット由来のＡｈＲおよびＡｒｎｔを発現し、簡便かつ高感度に多環芳香族化合物を分析できるから、例えば、環境浄化、廃棄物処理、安全性評価等の分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、実施例１の細胞と比較例１の細胞の２,３,７,８−ＴＣＤＤに対する応答を比較した図である。
【配列表フリーテキスト】
【００４８】
配列番号５    ＲＴ−ＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号６    ＲＴ−ＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号７    ＲＴ−ＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号８    ＲＴ−ＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号９    ＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号１０  ＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号１１  ＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号１２  ＰＣＲ用リバースプライマー
【図１】
2005087077.tif 000003
【配列表】
2005087077000001.app