(57)【要約】 【課題】  Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体とＬ体・ＬＬ体の混合物の神経筋伝達阻害活性および治療指数を比較検討すること。【解決手段】  Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体は、Ｌ体・ＬＬ体の混合物よりも１）神経筋伝達阻害活性に優れ、２）治療指数が高く、３）抗原性が低く、４）繰り返し投与しても効果が減弱しにくい、といった特徴を有しているので、斜視、眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、痙性斜頚、脳卒中後の麻痺、小児脳性麻痺、痙性発声障害、頭痛、腰痛、頚痛、背中痛、肩こり、パーキンソン病や多発性硬化症などの発症時に起こる筋弛緩不全、筋膜痛症候群、咀嚼筋攣縮、慢性裂肛、尿失禁、歯ぎしり、顔面ミオキミア、チック、局所性ジストニー、皺などの筋緊張亢進に起因する疾患の治療剤として特に有用である。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体（ＨＡ陰性体）を有効成分とする神経筋伝達阻害剤。
【請求項２】
Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体（ＨＡ陰性体）を有効成分とする筋緊張亢進に起因する疾患の治療剤。
【請求項３】
筋緊張亢進に起因する疾患が、斜視、眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、痙性斜頚、脳卒中後の麻痺、小児脳性麻痺、痙性発声障害、頭痛、腰痛、頚痛、背中痛、肩こり、パーキンソン病若しくは多発性硬化症に伴う筋弛緩不全、筋膜痛症候群、咀嚼筋攣縮、慢性裂肛、尿失禁、歯ぎしり、顔面ミオキミア、チック、局所性ジストニーまたは皺である請求項２記載の治療剤。
【請求項４】
Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体の分子量が、２０００００〜４０００００であることを特徴とする請求項２記載の治療剤。
【請求項５】
Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体が、Clostridium botulinum type A 7I03-H、Clostridium botulinum type A Chiba-HまたはClostridium botulinum type A Kyoto-Fの菌株から産生されることを特徴とする請求項２記載の治療剤。
【請求項６】
剤型が、注射剤である請求項２〜５のいずれかに記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体を有効成分とする筋緊張亢進に起因する疾患の治療剤に関し、特に斜視、眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、痙性斜頚、脳卒中後の麻痺、小児脳性麻痺、痙性発声障害、頭痛、腰痛、頚痛、背中痛、肩こり、パーキンソン病若しくは多発性硬化症に伴う筋弛緩不全、筋膜痛症候群、咀嚼筋攣縮、慢性裂肛、尿失禁、歯ぎしり、顔面ミオキミア、チック、局所性ジストニー、皺などの治療剤に関する。
【技術分野】
【０００２】
ボツリヌス菌は、偏性嫌気性のグラム陽性桿菌であり、ボツリヌス菌によって産生される毒素は末梢神経終末部に高い親和性を有し、全身骨格筋の弛緩性麻痺を主症状とするボツリヌス中毒症を惹き起こすことが知られている。
【０００３】
ボツリヌス菌が産生する毒素は、抗原性の違いによりＡ〜Ｇまでの７つに分類され、さらに神経毒素に結合する無毒性タンパク質の構造の相違によってＭ体、Ｌ体およびＬＬ体に分けることができる。特許文献１には、Ｍ体、Ｌ体およびＬＬ体を含むボツリヌス毒素の液を、ラクトースカラムに通すことによって血球凝集活性を示さないＭ体（hemagglutinin陰性体：ＨＡ陰性体）と血球凝集活性を示すＬ体およびＬＬ体（hemagglutinin陽性体：ＨＡ陽性体）に分離できることが記載されている。
【０００４】
Ａ型ボツリヌス毒素には、神経毒素に血球凝集活性を示さない無毒成分が結合した分子量約３０万のＭ体（ＨＡ陰性体）、Ｍ体に血球凝集活性を示す無毒成分が結合した分子量約５０万のＬ体（ＨＡ陽性体）および２つのＬ体が会合した分子量約９０万のＬＬ体（ＨＡ陽性体）の三種類が存在することが知られている。
【０００５】
ところで、斜視は拮抗筋間の緊張バランスが破綻することによって生じ、眼瞼痙攣は眼輪筋の不随意収縮により開眼が困難になる病態である。顔面痙攣は顔面神経の被刺激性亢進により顔面筋が不随意に収縮する疾患であり、また、痙性斜頚は頭頚部の筋緊張異常により頭位に異常を来たす病態である。咀嚼筋攣縮は下顎に不随意運動を生じる病態であり、両側性に下顎を引き上げる（口を閉じる）運動が不随意に生じる。歯ぎしりは咀嚼筋攣縮と類似の症状を示し、睡眠中の現象で一種の睡眠障害と考えられている。痙性発声障害は、声帯の運動筋に不随意収縮を生じ、正常の発声ができなくなる病態であり、顔面ミオキミアにおいては、一部の顔面の筋束に筋線維束攣縮が群発し、皮膚や粘膜表面に揺れるような、あるいは、うねるような持続性の不随意運動が観察される。チックはトゥレット症候群とも呼ばれ、痙攣性、電撃的、突発的に生じる筋攣縮が生じる病態であり、その例としては、瞬目、顔しかめ、首振り、叫び声などが挙げられる。慢性裂肛は、裂肛が繰り返し起こることにより肛門括約筋の過緊張を伴い、肛門の弾力性が失われて肛門狭窄を生じる病態である。切迫性の尿失禁においては、膀胱の一部の筋肉が不随意に過度に緊張することにより強い尿意を感じやすくなり、意思とは無関係に排尿してしまう病態である。筋膜痛症候群は、急性の筋肉の障害や筋肉の反復性の過負荷ストレス（使いすぎ）により、筋肉内に硬いしこりのような部分（緊張帯）ができ、強い痛みを感じる疾患であり、脳卒中後、あるいは、小児性脳性麻痺、パーキンソン病若しくは多発性硬化症の発症に伴い、手や足の筋緊張が過度に亢進することが知られている。さらに、首や肩の筋肉の緊張が異常に亢進することによって慢性的に片頭痛などの頭痛を生じ、また、筋肉の使いすぎや持続的な不良姿勢により筋肉の緊張が異常に亢進し、結果的に、腰痛、頚痛あるいは背中痛などの慢性的な疼痛や肩こりが誘発されることも知られている。皺は、筋肉の収縮により生じ、顔面の皺としては、例えば眉間の皺、目尻の皺、鼻根部の皺などがある。このように、斜視、眼瞼痙攣、顔面痙攣、痙性斜頚、脳卒中後の麻痺、小児脳性麻痺、痙性発声障害、片頭痛などの頭痛、腰痛などの慢性的な疼痛、肩こり、パーキンソン病や多発性硬化症などの発症時に起こる筋弛緩不全、筋膜痛症候群、咀嚼筋攣縮、慢性裂肛、尿失禁、歯ぎしり、顔面ミオキミア、チック、局所性ジストニー、皺などは、いずれも局所性の筋緊張亢進作用が原因となっている。
【０００６】
ボツリヌス毒素を筋緊張亢進に起因する疾患の治療に利用するものとしては、例えば、非特許文献１ではボツリヌス毒素が斜視の治療に用いられ、また、非特許文献２では眼瞼痙攣の治療に用いられている。特許文献２には、ボツリヌス毒素を臨床的応答の低下が生じるまで投与し、その後に、他のボツリヌス毒素を投与して神経筋疾患を処置する方法が開示されている。特許文献３には、Ａ〜Ｇ型のボツリヌス毒素のうちの少なくとも２種を組み合わせて投与することにより神経筋疾患を処置する方法が開示されている。非特許文献３には、ボツリヌス毒素が眉間の皺の治療に有効であることが報告されている。
【０００７】
実際に、眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、痙性斜頚または皺などの治療に有効なボツリヌス毒素として、ボツリヌス毒素のＬＬ体を有効成分とするＢＯＴＯＸ（登録商標）（アラガン社製）が販売されている。
【０００８】
しかしながら、上記いずれの文献にも、Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体（ＨＡ陰性体）を斜視、眼瞼痙攣、皺などの筋緊張亢進に起因する疾患の治療に適用することは、全く記載されておらず、示唆もされていない。
【特許文献１】特開２００３−９８９７号公報
【特許文献２】特表平８−５１１５３６号公報
【特許文献３】特表平８−５１１５３７号公報
【非特許文献１】Ophthalmology, 87, 1044-1049(1980)
【非特許文献２】J. Fr. Ophthalmol., 13, 259-264(1990)
【非特許文献３】Therapy with botulinum toxin, Marcel Dekker, New York, 1994, p.577-595.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ボツリヌス毒素は、筋緊張を緩和する薬物として知られているが、それ自体毒性の強い薬物である。したがって、ボツリヌス毒素は、その副作用として筋緊張緩和による全身倦怠感などを来すことがあり、とりわけ、使用量を誤ると重篤な副作用を来すので、ボツリヌス毒素の投与量を可能な限り少なくすることが望まれている。また、ボツリヌス毒素を繰り返し投与することにより、その有効性が減弱してくるという問題点が指摘されており、この現象は毒素に対する抗体産生に依存していると考えられている。したがって、抗体産生を誘導せず、繰り返し投与しても効果が減弱しない治療剤が求められている。既にボツリヌス毒素のＬＬ体を有効成分とするＢＯＴＯＸ（登録商標）が販売されているが、効果や副作用の観点から、より優れた製品の開発が待たれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、Ａ型ボツリヌス毒素の構成成分（Ｍ体、Ｌ体、ＬＬ体）に着目して鋭意研究を重ねた結果、神経毒素に血球凝集活性を示さない無毒成分が結合した分子量約３０万のＭ体（ＨＡ陰性体）は、Ｍ体に血球凝集活性を示す無毒成分が結合した分子量約５０万のＬ体および分子量約９０万のＬＬ体の混合物（ＨＡ陽性体）よりも優れた神経筋伝達阻害活性を有し、また、市販のＢＯＴＯＸ（登録商標）の５倍もの治療指数を有し、さらに、抗体を産生しにくく、繰り返し投与しても効果を維持できるので、Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体は筋緊張亢進に起因する種々の疾患の治療剤として特に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体（ＨＡ陰性体）を有効成分とする神経筋伝達阻害剤、すなわち筋緊張亢進に起因する疾患の治療剤である。
【００１２】
本発明のＡ型ボツリヌス毒素のＭ体は、優れた神経筋伝達阻害活性および高い治療指数を有し、また、抗体の産生を誘導しにくく、繰り返し投与しても効果減弱が少ないので、斜視、眼瞼痙攣、顔面痙攣、痙性斜頚、脳卒中後の麻痺、小児脳性麻痺、痙性発声障害、片頭痛などの頭痛、腰痛などの慢性的な疼痛、肩こり、パーキンソン病や多発性硬化症などの発症時に起こる筋弛緩不全、筋膜痛症候群、咀嚼筋攣縮、慢性裂肛、尿失禁、歯ぎしり、顔面ミオキミア、チック、局所性ジストニー、皺などの筋緊張亢進に起因する疾患の治療剤として有用である。皺としては、例えば顔面筋の収縮によって生じる眉間の皺、目尻の皺、鼻根部の皺、おとがい部の皺などの顔面の皺が挙げられる。
【００１３】
詳細は薬理試験の項で述べるが、筋張力試験を実施することにより、Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体（ＨＡ陰性体）の神経伝達阻害活性を評価した。この筋張力試験ではマウスの横隔膜・横隔神経標本を用い、比較対照薬物としてＡ型ボツリヌス毒素のＬ体およびＬＬ体の混合物を用いた。また、マウス後肢握力試験を実施することにより、Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体（ＨＡ陰性体）の治療指数（ＴＤ20／ＥＤ50）を評価した（なお、ＥＤ50は５０％有効量を、また、ＴＤ20は２０％毒性量を表わす。）。さらに抗体価測定試験によりＡ型ボツリヌス毒素のＭ体の抗原性を評価した。これらの後肢握力試験及び抗体価測定試験ではマウスを用い、比較対照薬物としてＡ型ボツリヌス毒素のＬ体およびＬＬ体の混合物および市販品であるＢＯＴＯＸ（登録商標）を用いた。これらの比較対照薬物を用いた試験は同一モル比で実施するのが標準的であるが、Ｌ体およびＬＬ体の混合物の分子量を特定するのが困難であったので、毒素の生物活性（力価）を基準とした。即ち、毒素の力価はi.p.LD５０値（腹腔内投与における５０％致死量）で表すことができ、そのi.p.LD５０値が同一となる量で試験した。
【００１４】
筋張力試験の結果より、Ｍ体は、Ｌ体およびＬＬ体の混合物と同一力価のものを用いたにもかかわらず、Ｌ体およびＬＬ体の混合物に比べて約１０倍もの神経伝達阻害活性を発揮することが判明した。同一力価の毒素では、同一の効果を発揮すると予測されるのが通常であるが、本知見はその予測を全く覆すものである。また、後肢握力試験の結果より、Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体の治療指数（ＴＤ20／ＥＤ50）は、市販品であるＢＯＴＯＸ（登録商標）の約５倍であることが判明した。また、抗体価測定試験の結果より、Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体の抗原性は、ＢＯＴＯＸ（登録商標）よりも低いこと、さらには、Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体は、ＢＯＴＯＸ（登録商標）と比べて、繰り返し投与しても効果減弱が少ないことが判明した。これらの結果から、Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体を用いれば、より高い治療効果が得られると同時に、全身倦怠感などの副作用の発生を効果的に抑制することが可能となると考えられる。
【００１５】
本発明のＡ型ボツリヌス毒素のＭ体は、Clostridium botulinum type Aのうち、7I03-H 、7I05-H 、Chiba-H、Kyoto-F、804-1HなどのＨＡ陽性体を産生しない菌株を用いて培養すれば、Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体だけを産生することができるので、Ｌ体およびＬＬ体を分離する手間を省くことができる。また、Ｍ体、Ｌ体およびＬＬ体を含むボツリヌス毒素液をイオン交換カラム、ゲルろ過カラムに通すことにより、血球凝集活性を示さないＭ体だけをこれらの混合物から単離することもできる。
【００１６】
Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体は、血球凝集活性を示さず（ＨＡ陰性）、その分子量は２０００００〜４０００００の範囲にある。これに対して、Ａ型ボツリヌス毒素のＬ体およびＬＬ体は、血球凝集活性を示し（ＨＡ陽性）、その分子量は５０００００以上である。したがって、Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体は、そのＬ体およびＬＬ体と明確に区別できる。
【００１７】
本発明のＡ型ボツリヌス毒素のＭ体の投与量は、対象疾患により適宜選択することができ特に制限されないが、毒素による副作用に配慮すると、治療一回あたり０．０１〜５００単位／部位であることが好ましく、より好ましくは０．５〜３００単位／部位である。
【００１８】
本発明の筋緊張亢進に起因する疾患の治療剤は、ボツリヌス毒素の作用部位である筋肉に投与することが好ましい。その投与剤型は、主に注射剤であり、汎用されている技術を用いて製剤化することができる。
【００１９】
本発明の注射剤は、塩化ナトリウムなどの浸透圧調整剤、リン酸ナトリウムなどの緩衝剤等の添加剤を加えて、調製することができる。
【００２０】
本発明の注射剤のｐＨは４．０〜７．５に設定することが好ましく、また、浸透圧比を１．０付近に設定することが好ましい。
【００２１】
本発明の筋緊張亢進に起因する疾患の治療剤は、通常行なわれている筋肉内注射を用いればよい。
【発明の効果】
【００２２】
後述する薬理試験の結果から明らかなように、Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体（ＨＡ陰性体）は、Ｌ体及びＬＬ体（ＨＡ陽性体）の混合物よりも優れた神経筋伝達阻害作用を有し、また、Ｌ体及びＬＬ体（ＨＡ陽性体）の混合物あるいは市販されているＢＯＴＯＸ（登録商標）の３〜５倍もの治療指数を有する。さらに、これは、抗体産生を誘導しにくく、繰り返し投与しても効果の減弱が少ないので、斜視、眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、痙性斜頚、脳卒中後の麻痺、小児脳性麻痺、痙性発声障害、片頭痛などの頭痛、腰痛などの慢性的な疼痛、肩こり、パーキンソン病や多発性硬化症などの発症時に起こる筋弛緩不全、筋膜痛症候群、咀嚼筋攣縮、慢性裂肛、尿失禁、歯ぎしり、顔面ミオキミア、チック、局所性ジストニー、皺などの筋緊張亢進に起因する疾患の治療剤として特に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下に製造例、薬理試験および製剤例を示すが、これらの実施例は、本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００２４】
１．試験用毒素の製造
Ａ型ボツリヌス毒素の試験用毒素は、阪口の方法（Sakaguchi,G.(1983) Clostridium botulinum toxins. Pharmac Ther.19,165-94）に一部変更を加えて製造した。
【００２５】
（１）製造例１（Ｍ体毒素の製造）
凍結保存されているClostridium botulinum type A 7I03H株（「Ｍ体毒素」の産生株）の芽胞菌液を前培養培地（Cooked  Meat培地）に接種して、30℃で2日間培養した。この前培養培地をペプトン−酵母抽出物−グルコース培地（PYG培地）に接種して、30℃で3日間培養した。
【００２６】
つぎに、この培養液に3N-H2SO4を加えて酸沈殿を行った後、pHを3.5に調整して一晩室温で静置した。翌日、遠心分離（9200×ｇ、20分、4℃）して得られた沈殿に0.2M-リン酸緩衝液（pH6.0）を加えて溶解させた。
【００２７】
溶解液のpHを6.0に調整し、37℃で１時間混和し毒素を抽出した。抽出液を遠心分離（9200×ｇ、20分、4℃）し、その上清を採取し、２％のプロタミンを含有する0.2M-リン酸緩衝液（pH6.0）を加えて沈殿を得た。これを遠心分離(9200×ｇ、15分、4℃)し、上清を得た。ついで、この上清に飽和硫安(390g/L) が60%（ｗ/ｖ）となるように加え、4℃で一晩静置して塩析を行った。翌日、遠心分離(9200×ｇ、15分、4℃)を行い、沈殿を0.05M-酢酸緩衝液（pH4.2、0.2M-NaCl）に溶解させ、その溶液を透析膜に入れ、0.05M-酢酸緩衝液（pH4.2、0.2M-NaCl）で一晩透析した。透析終了後遠心分離(13700×ｇ、15分、4℃)して、その上清を0.05M-酢酸緩衝液（pH4.2、0.2M-NaCl）で平衡化したイオン交換カラム［SP-Sepharose Fast Flow(アマシャム社)］に供した。最終的に0.05M-酢酸緩衝液（pH4.2、0.7M-NaCl）となるようにリニアグラジエントをかけて不純物及び毒素を溶出させた。
【００２８】
毒素画分は、フラクションコレクターで採取し、毒力測定、OD値、電気泳動像をもとに「Ｍ体毒素」として集める部分を決定した。集められたフラクションは、限外ろ過（アミコンYM30）を用いて濃縮し、純度を上げるために、この濃縮液を0.05M 酢酸緩衝液（pH6.0、0.2M-NaCl）で平衡化したゲルろ過カラム［Sephadex G-200（ファルマシア社）］に通して、毒素フラクションを集め、限外ろ過（アミコンYM30）を用いて濃縮し、薬理試験用のＡ型ボツリヌス毒素である「Ｍ体毒素」の原液（蛋白質濃度1.78mg/ml、生物活性2.0×107i.p.LD50/ml）を得た。なお、生物活性（力価）は、マウスへ腹腔内投与後の50%死亡率（i.p.LD50）を指標とするものである。
【００２９】
（２）製造例２（Ｌ体毒素及びＬＬ体毒素の混合物の製造）
Clostridium botulinum type A 7I03H株の代わりにClostridium botulinum type A 62A株（「Ｍ体毒素、Ｌ体毒素およびＬＬ体毒素の混合物」の産生株）を用いて、製造例１と同様の操作を行って、薬理試験用のＡ型ボツリヌス毒素である「Ｌ体毒素及びＬＬ体毒素の混合物」の原液（蛋白質濃度1.99 mg/ml, 生物活性1.3×107i.p.LD50/ml）を得た。なお、毒素画分は、フラクションコレクターで採取し、毒力測定、OD値、電気泳動像をもとに「Ｌ体毒素及びＬＬ体毒素の混合物」として集める部分を決定した。
【００３０】
２．薬理試験
（１）マウス横隔膜・横隔神経標本の筋張力試験に基づく神経筋伝達阻害活性の比較
「Ｍ体毒素」および「Ｌ体毒素及びＬＬ体毒素の混合物」について、薬理活性を比較するために、マウス（系統：ｄｄＹ、性別：雄性）の横隔膜・横隔神経標本を用いた筋張力試験を実施した。
【００３１】
（被験液の調製）
製造例１のＭ体毒素を0.02%ウシ血清アルブミンを含む20mM-トリス塩酸塩緩衝液（pH7.4、150mM-NaCl）で希釈することによって、被験液（3.4×105i.p.LD50/ml）を調製した。
【００３２】
（比較液の調製）
製造例２のＬ体毒素及びＬＬ体毒素の混合物を0.02%ウシ血清アルブミンを含む20mM-トリス塩酸塩緩衝液（pH7.4、150mM-NaCl）で希釈することによって、比較液（5.5×105i.p.LD50/ml）を調製した。
【００３３】
（測定方法）
マウスにペントバルビタール（50mg/kg）を腹腔内投与し、安楽死させた後、胸郭を開いて、左右の横隔神経を胸腺の高さで結紮した。左右の横隔神経を横隔膜に至るまで周囲の結合織から丁寧に剥離した後、腹腔側にも切開を加えて、横隔膜と第十二肋骨を一体として横隔神経が付着したままの状態で摘出した。摘出した横隔膜・横隔神経標本を37℃に保温した水槽中で半切し、各々の横隔膜半片を第十二肋骨に通した絹糸で組織支持装置に固定した。
【００３４】
つぎに、横隔神経を白金電極輪に通した後、横隔膜標本を37℃に保温した組織浴槽に移した。一端を横隔膜中心腱に結紮した絹糸の他端を等尺張力トランスデューサーに接続して、横隔膜・横隔神経標本をKrebs液中に懸垂した。白金電極輪から電圧１Vで持続時間10msecの矩形波を0.25Hzの頻度で横隔神経に加え、神経に対する電気刺激で誘発される横隔膜の収縮張力を張力アンプで増幅し、経時的にペンレコーダーに記録した。横隔膜・横隔神経標本に約4gの安静時負荷をかけ、15〜20分毎に組織浴槽中のKrebs液を交換しながら誘発張力および基線が安定するまで1〜2時間無処理のまま観察した。
【００３５】
基線および張力が安定していることを確認した後、被験液および比較液をそれぞれ組織浴槽のKrebs液に添加し、誘発張力の毒素による減衰を記録した。実験終了後に、各々の横隔膜・横隔神経標本について張力を解析した。毒素作用による張力の減衰の指標として、毒素添加時から、誘発張力が毒素処理直前の誘発張力に対して1/eにまで減衰する時間、即ち、経時的に記録した収縮張力をプロットし、近似曲線を求めることによって、横隔神経・横隔膜標本の収縮張力が、毒素処理前の収縮張力の1/eまで減弱するのに要する毒素処理時間（τ）を求め、これを神経筋伝達阻害活性の指標とした（なお、神経筋伝達阻害活性は、τ値が小さいほどが大きくなる。）。これらの結果から、図1に、被験液、比較液を用いたときのマウス致死作用と神経筋伝達阻害活性の関係を示し、また、表１に、同一マウス致死作用量において被験液の神経筋伝達阻害活性を１とした場合の比較液の阻害活性を示す。なお、図１中の被験液の各プロットは４〜５例の平均値を、また、比較液の各プロットは２〜３例の平均値を示す。
【表１】
2005154407.tif 000002
【００３６】
（結果）
図１および表１より、Ｍ体毒素の神経筋伝達阻害活性は、Ｌ体毒素及びＬＬ体毒素の混合物の約１０倍である。
【００３７】
（２）マウス後肢握力試験に基づく治療指数の比較
「Ｍ体毒素」、「Ｌ体毒素及びＬＬ体毒素の混合物」および「ＢＯＴＯＸ（登録商標）（アラガン社製）」について、薬効（ＥＤ50：５０％有効量）および毒性（ＴＤ20：２０％毒性量）から治療指数（ＴＤ20／ＥＤ50）を比較するために、マウス（系統：ｄｄＹ、性別：雄性）の後肢握力試験を実施した。
【００３８】
(i)薬効（ＥＤ50）の検討
（被験液の調製）
製造例１のＭ体毒素を0.1%ヒト血清アルブミンを含む生理食塩液で希釈することによって、濃度の異なる5種類の被験液（1.2、4、12、40および120 i.p.LD50/ml）を調製した。
【００３９】
（比較液Ａの調製）
製造例２のＬ体毒素及びＬＬ体毒素の混合物を0.1%ヒト血清アルブミンを含む生理食塩液で希釈することによって、被験液の場合と同様に濃度の異なる5種類の被験液（1.2、4、12、40および120 i.p.LD50/ml）を調製した。
【００４０】
（比較液Ｂの調製）
ＢＯＴＯＸ（登録商標）を0.1%ヒト血清アルブミンを含む生理食塩液で希釈することによって、被験液の場合と同様に濃度の異なる5種類の被験液（1.2、4、12、40および120 i.p.LD50/ml）を調製した。
【００４１】
（測定方法）
マウスの右後肢腓腹筋に、溶媒（0.1%ヒト血清アルブミンを含む生理食塩液）、被験液、比較液Ａおよび比較液Ｂをそれぞれ250 μl/kgの投与量で投与し（被験液、比較液Ａおよび比較液Ｂのそれぞれの毒素の投与用量は0.3、1、3、10および30 i.p.LD50/kgとなる）、投与6時間後、さらに、投与1日、2日、3日、7日、14日および21日後に右後肢の握力を小動物握力測定装置（grip strength meter）を用いて測定した（一群あたり１０例）。各測定時間における溶媒投与群の握力を１００としたときのそれぞれの毒素投与後の握力を求め、各投与群の握力低下が最大になる時点での値を用いて、被験液、比較液Ａおよび比較液ＢのＥＤ50値を算出した（表２）。
【００４２】
(ii)毒性（ＴＤ20）の検討
（被験液の調製）
製造例１のＭ体毒素を0.1%ヒト血清アルブミンを含む生理食塩液で希釈することによって、濃度の異なる4種類の被験液（20、50、100および150 i.p.LD50/ml）を調製した。
【００４３】
（比較液Ａの調製）
製造例２のＬ体毒素及びＬＬ体毒素の混合物を0.1%ヒト血清アルブミンを含む生理食塩液で希釈することによって、被験液の場合と同様に濃度の異なる4種類の被験液（20、50、100および150 i.p.LD50/ml）を調製した。
【００４４】
（比較液Ｂの調製）
ＢＯＴＯＸ（登録商標）を0.1%ヒト血清アルブミンを含む生理食塩液で希釈することによって、被験液の場合と同様に濃度の異なる4種類の被験液（20、50、100および150 i.p.LD50/ml）を調製した。
【００４５】
（測定方法）
マウスの右後肢大腿四頭筋に、溶媒、被験液、比較液Ａおよび比較液Ｂをそれぞれ500 μl/kgの投与量で投与し（被験液、比較液Ａおよび比較液Ｂのそれぞれの毒素の投与用量は10、25、50および75 i.p.LD50/kgとなる）、投与1日、2日、3日、7日および14日後に左後肢の握力をgrip strength meterを用いて測定した（一群あたり６〜１０例）。この方法は、投与部位である右大腿四頭筋から漏れ出した毒素が、他の筋肉である左後肢筋肉で筋弛緩作用を示す程度を測定するものである。各測定時間における溶媒投与群の握力を１００としたときのそれぞれの毒素投与後の握力を求め、各投与群の握力低下が最大になる時点での値を用いて、被験液、比較液Ａおよび比較液ＢのＴＤ20値を算出した（表２）。
【００４６】
(iii)治療指数（ＴＤ20／ＥＤ50）
被験液、比較液Ａおよび比較液Ｂのそれぞれに対して、薬効発現のＥＤ50値に対する毒性発現のＴＤ20値の比を求め、この比を治療指数とした。治療指数は、ＴＤ20／ＥＤ50として示され、治療指数が大きいほど薬効を示す用量と毒性を示す用量の乖離幅が大きくなり、結局、治療指数が大きい薬物ほど薬物としての有用性が高くなることを意味する。これらの結果を表２に示す。
【表２】
2005154407.tif 000003
【００４７】
（結果）
表２から明らかなように、Ｍ体毒素のＥＤ50値は、Ｌ体毒素及びＬＬ体毒素の混合物およびＢＯＴＯＸ（登録商標）よりも小さいので、Ｍ体毒素はＬ体毒素及びＬＬ体毒素の混合物およびＢＯＴＯＸ（登録商標）よりも薬効に優れ、また、Ｍ体毒素のＴＤ20値は、Ｌ体毒素及びＬＬ体毒素の混合物およびＢＯＴＯＸ（登録商標）よりも２倍以上も大きいので、Ｍ体毒素はＬ体毒素及びＬＬ体毒素の混合物およびＢＯＴＯＸ（登録商標）よりも毒性がはるかに低い。Ｍ体毒素（被験液）の治療指数は、Ｌ体毒素及びＬＬ体毒素の混合物（比較液Ａ）の３．４倍、ＢＯＴＯＸ（登録商標）（比較液Ｂ）の５．１倍である。
【００４８】
（３）抗体価測定試験に基づく抗原性の比較
「Ｍ体毒素」、「Ｌ体毒素及びＬＬ体毒素の混合物」および「ＢＯＴＯＸ（登録商標）（アラガン社製）」について、繰り返し投与した後に抗体産生が認められるか否かを比較検討した。
【００４９】
（被験液の調製）
製造例１のＭ体毒素を0.1%ヒト血清アルブミンを含む生理食塩液で希釈することによって、被験液（100 i.p.LD50/ml）を調製した。
【００５０】
（比較液Ａの調製）
製造例２のＬ体毒素及びＬＬ体毒素の混合物を0.1%ヒト血清アルブミンを含む生理食塩液で希釈することによって、被験液の場合と同様に比較液Ａ（100 i.p.LD50/ml）を調製した。
【００５１】
（比較液Ｂの調製）
ＢＯＴＯＸ（登録商標）を0.1%ヒト血清アルブミンを含む生理食塩液で希釈することによって、被験液の場合と同様に比較液Ｂ（100 i.p.LD50/ml）を調製した。
【００５２】
（測定方法）
マウスの右後肢大体四頭筋に、溶媒（0.1%ヒト血清アルブミンを含む生理食塩液）、被験液、比較液Ａおよび比較液Ｂをそれぞれ500 μl/kgの投与量（被験液、比較液Ａおよび比較液Ｂのそれぞれの毒素の投与用量は25 i.p.LD50/kgとなる）を３週間に１回の割合で計３回投与した。３回目の投与を行ってから１４日もしくは１５日後にマウスから血漿を採取し（一群あたり１３〜１９例）、毒素投与前に眼窩静脈より採取しておいた血漿とあわせて、ＥＬＩＳＡ法により抗体価を測定した。毒素投与前に採取した血漿に対する毒素投与後に採取した血漿の吸光度比が１０以上であったマウスに抗体が産生していたとみなし、抗体を産生したマウス数の割合を求めた（表３）。
【表３】
2005154407.tif 000004
【００５３】
（結果）
表３に示すように、Ｍ体毒素投与群での抗体を産生したマウスの割合は、Ｌ体毒素及びＬＬ体毒素の混合物を投与した群あるいはＢＯＴＯＸ（登録商標）を投与した群での割合のおよそ半分であったことから、Ｍ体毒素の抗原性は、Ｌ体毒素、ＬＬ体毒素あるいはＢＯＴＯＸ（登録商標）に含まれる毒素の抗原性に比べ低い。
【００５４】
（４）繰り返し投与による効果減弱率の比較
マウス後肢握力試験において、「Ｍ体毒素」、「Ｌ体毒素及びＬＬ体毒素の混合物」および「ＢＯＴＯＸ（登録商標）（アラガン社製）」を繰り返し投与することにより、その効果が減弱するか否かを比較検討した。
【００５５】
（被験液の調製）
製造例１のＭ体毒素を0.1%ヒト血清アルブミンを含む生理食塩液で希釈することによって被験液（2 i.p.LD50/ml）を調製した。
【００５６】
（比較液Ａの調製）
製造例２のＬ体毒素及びＬＬ体毒素の混合物を0.1%ヒト血清アルブミンを含む生理食塩液で希釈することによって、被験液の場合と同様に比較液Ａ（2 i.p.LD50/ml）を調製した。
【００５７】
（比較液Ｂの調製）
ＢＯＴＯＸ（登録商標）を0.1%ヒト血清アルブミンを含む生理食塩液で希釈することによって、被験液の場合と同様に比較液Ｂ（2 i.p.LD50/ml）を調製した。
【００５８】
（測定方法）
マウスの右後肢腓腹筋に、溶媒（0.1%ヒト血清アルブミンを含む生理食塩液）、被験液、比較液Ａおよび比較液Ｂをそれぞれ7.5 μlの投与量で投与し（被験液、比較液Ａおよび比較液Ｂのそれぞれの毒素の投与用量は0.015 i.p.LD50となる）、投与１日、２日および３日後に右後肢の握力を小動物握力測定装置（grip strength meter）を用いて測定した。１回目の投与後２８日目に２回目の投与を行い（投与法・投与用量は１回目と同じ）、１回目と同様に投与１日、２日および３日後に右後肢の握力を測定した（一群あたり１１または１２例）。各測定時間における溶媒投与群の握力を１００としたときのそれぞれの毒素投与後の握力を求め、１回目投与時および２回目投与時のそれぞれついて、各マウスの３測定日分の総和（投与後１＋２＋３日）を算出した後、それぞれの総和について１回目投与時の値から２回目投与時の差の平均値を求めることにより、効果減弱率を算出した（表４）。なお、この値が大きいほど、２回目投与時に効果がより減弱していることを示す。
【表４】
2005154407.tif 000005
【００５９】
（結果）
表４から明らかなように、Ｍ体毒素の２回目投与時の効果減弱率に比べて、Ｌ体毒素及びＬＬ体毒素の混合物の効果減弱率は約１０倍、また、ＢＯＴＯＸ（登録商標）の効果減弱度は約５倍の値であった。これらの結果から、Ｍ体毒素はＬ体毒素及びＬＬ体毒素やＢＯＴＯＸ（登録商標）に比べて、繰り返し投与したときに効果減弱が起こりにくい事は明らかである。
【００６０】
３．製剤例
注射剤
本発明の注射剤の一般的な製剤例を以下に示す。
【００６１】
処方１（１００ｍＬ中）
Ａ型ボツリヌス毒素のＭ体                          １０００単位
ヒト血清アルブミン                                    ７５ｍｇ
生理食塩水                                                        適量
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、被験液、比較液を用いたときのマウス致死活性と神経筋伝達阻害活性の関係を示す。
【図１】
2005154407.tif 000006