(57)【要約】【課題】本発明は、ＴＭＸ（transmembrane Trx-related protein）の活性を阻害する新規抗腫瘍剤、特にＣＰＡＣ配列に結合することを指標にした新規抗腫瘍剤のスクリーニング法を提供することを目的とする。【解決手段】化合物が複数の混合物であり、その中からＣＰＡＣ配列を有するペプチドに結合する化合物をスクリーニングするときは、化合物の混合物をビオチン化し、ビオチン化化合物とペプチドを、それらが結合できるであろう適当な条件で混合し、抗タグ抗体などを担持させた担持体を用いたアフィニティクロマトグラフィーを用いて、混合溶液中からタグ付きペプチドを回収することにより、そのペプチドに結合した特定のビオチン化化合物が回収できる。このビオチン化化合物の化学構造を質量分析法（ＭＳ）、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）、赤外線吸収スペクトル分析法等を用いて分析し決定する。【選択図】図１
2005323514.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＭＸ（transmembrane Trx-related protein）の活性を阻害する抗腫瘍剤のスクリーニング法。
【請求項２】
前記抗腫瘍剤が前記ＴＭＸが有するＣＰＡＣ配列に結合することを特徴とする請求項１に記載の抗腫瘍剤のスクリーニング法。
【請求項３】
ＣＰＡＣ配列を有するペプチドに結合することを指標にした抗腫瘍剤のスクリーニング法。
【請求項４】
前記ペプチドがチオレドキシンモチーフを有し、
前記ＣＰＡＣ配列が該チオレドキシンモチーフ内に存在することを特徴とする請求項３に記載の抗腫瘍剤のスクリーニング法。
【請求項５】
前記チオレドキシンモチーフが、ＴＭＸ（transmembrane Trx-related protein）由来の配列であることを特徴とする請求項４に記載の抗腫瘍剤のスクリーニング法。
【請求項６】
前記ペプチドが、ＴＭＸ（transmembrane Trx-related protein）またはその一部を含むことを特徴とする請求項５に記載の抗腫瘍剤のスクリーニング法。
【請求項７】
前記ペプチドがタグ（tag）を含むことを特徴とする請求項３〜６に記載の抗腫瘍剤のスクリーニング法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍剤のスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子標的治療薬と呼ばれる新しいタイプの医薬品が開発されてきた。これは、疾病に関与する分子に対して、特異的に働きかける機能を有する医薬品であり、従来の治療薬に比べて、比較的副作用が少ないとされている。特に、癌治療などで最近注目されている。例えば、bcr-ablを標的とする慢性骨髄性白血病治療薬イマチニブ（販売名グリベック、ノヴァルティスファーマ社）、EGF-Rを標的とする非小細胞肺癌治療薬ゲフィチニブ（販売名イレッサ、アストラゼネカ社）、Her-2を標的とする乳癌治療薬トラスツズマブ（販売名ハーセプチン、中外製薬）、CD-20を標的とするＢ細胞性非ホジキンリンパ腫治療薬リツキシマブ（販売名：リツキサン、中外製薬）などが、実用化されている。
【０００３】
ＦＲ９０１４６４は、バクテリアの一種Pseudomonas sp. No.2663株が産生し、ＳＶ４０プロモーターを活性化することを指標に単離された低分子化合物である。構造式を以下に示す。
【０００４】
［化１］
2005323514.tif 000003
【０００５】
ＦＲ９０１４６４は、ＳＶ４０プロモーターの活性化以外に、培養条件下で腫瘍細胞に対し、細胞周期をＧ１期及びＧ２期において停止させ、アポトーシスを誘導する作用を有することから、抗腫瘍医薬組成物として有用であると考えられている（例えば、非特許文献１参照）。
【非特許文献１】J Antibiotics (Tokyo) 1996年49巻12号1196-1203頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＦＲ９０１４６４の特異的な標的分子を明らかにすれば、今度はその標的分子を標的とする化合物を同定することにより、新規抗腫瘍剤を得ることができると考えられる。  
本発明者らは、ＦＲ９０１４６４の分子標的がＴＭＸ（transmembrane Trx-related protein）のチオレドキシンモチーフ内に存在するＣＰＡＣ配列であり、ＴＭＸを不活性化することによりアポトーシス作用を有することを見出した。  
そこで、これらの結果を基にし、本発明は、ＴＭＸの活性を阻害する新規抗腫瘍剤、特にＣＰＡＣ配列に結合することを指標にした新規抗腫瘍剤のスクリーニング法を提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＦＲ９０１４６４は、培養条件下で腫瘍細胞に対し、細胞周期をＧ１期及びＧ２期において停止させ、アポトーシスを誘導する作用を有することから、抗腫瘍医薬組成物として有用であると考えられている。
【０００８】
本発明者らは、ビオチン化ＦＲ９０１４６４を用いて、ヒト子宮癌細胞株Hela細胞の抽出液より回収した結合タンパク質を質量分析法にて同定し、結合タンパク質がＴＭＸであることを明らかにした。
【０００９】
ＴＭＸは、小胞体に存在する酸化還元調節酵素であり、チオレドキシンモチーフを有することが知られている。本発明者らは、さらに、ＴＭＸが、チオレドキシンモチーフの中のコア配列であるＣＰＡＣ配列（Cys-Pro-Ala-Cys）のＮ端側のシステインにおいて、ＦＲ９０１４６４と特異的に共有結合することを明らかにした。さらに培養細胞２９３ＴにＦＲ９０１４６４を作用させると、ＴＭＸの活性が阻害され、ＵＰＲ（Unfolded Protein Response）が誘導されることから、ＦＲ９０１４６４が小胞体ストレスシグナルを活性化することが示唆された。この小胞体ストレスシグナルの活性化は、アポトーシス誘導シグナルを活性化することが知られている。従って、ＦＲ９０１４６４は、ＴＭＸの活性阻害を通じて、小胞体ストレスシグナルひいてはアポトーシスを誘導すると考えられた。
【００１０】
そこで、本発明者らは、ＴＭＸのsiRNAをHeLa細胞に導入し、ノックダウン法によりＴＭＸの活性を阻害したところ、小胞体ストレスを誘導することができた。これらの知見から、本発明者らは、ＴＭＸの活性を阻害しアポトーシスを誘導する化合物をスクリーニングする方法を考案し、本発明の抗腫瘍剤のスクリーニング法の完成に至った。
【００１１】
本発明は、ＴＭＸの活性を阻害する抗腫瘍剤のスクリーニング法である。前記抗腫瘍剤が前記ＴＭＸが有するＣＰＡＣ配列に結合することを特徴としてもよい。
【００１２】
また、本発明にかかる抗腫瘍剤のスクリーニング法は、ＣＰＡＣ配列を有するペプチドに結合することを指標にする。前記ペプチドがチオレドキシンモチーフを有し、前記ＣＰＡＣ配列が該チオレドキシンモチーフ内に存在することが好ましい。また、前記チオレドキシンモチーフが、ＴＭＸ由来の配列であることが好ましい。また、前記ペプチドが、ＴＭＸまたはその一部を含むことが好ましい。
【００１３】
上記いずれのスクリーニング法においても、前記ペプチドがタグ（tag）を含んでもよい。
【００１４】
ここで、チオレドキシンモチーフとは、配列番号１のアミノ酸配列、及び配列番号１のアミノ酸において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列、並びに、他の生物種由来のタンパク質の場合、それらモチーフに対応する相同配列のことを意味する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によると、ＴＭＸの活性を阻害する新規抗腫瘍剤、特にＣＰＡＣ配列に結合することを指標にした新規抗腫瘍剤のスクリーニング法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明にかかる抗腫瘍剤のスクリーニング法は、ＴＭＸの活性を阻害する抗腫瘍剤を同定するために行う。例えば、抗腫瘍剤は、ＴＭＸの活性中心であるＣＰＡＣ配列に結合することにより、ＴＭＸの活性を阻害することが考えられる。この抗腫瘍剤の場合、本発明のスクリーニング法は、ＣＰＡＣ配列を有するペプチドに結合することを指標にしたものとなる。しかし、ＴＭＸの活性阻害原理はこれに限らず、例えばＴＭＸに対するsiRNAやＣＰＡＣ配列を特異的に認識する阻害抗体などでもよく、ＴＭＸの活性を阻害する化合物であれば、どんなものでも小胞体ストレス誘導を通じた抗腫瘍剤となり得るので、ＴＭＸの活性を阻害する抗腫瘍剤のスクリーニング法は全て、本発明の技術範囲に属する。
【００１７】
以下、上記知見に基づき完成した本発明のスクリーニング法の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１８】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１９】
＝＝ペプチドの合成＝＝
ＣＰＡＣ配列を有するペプチドは、ＣＰＡＣ配列からなるオリゴペプチドであってもよく、ＣＰＡＣ配列を含むオリゴペプチドまたはポリペプチドであってもよいが、このペプチドがチオレドキシンモチーフを有し、ＣＰＡＣ配列がそのチオレドキシンモチーフ内に存在することが好ましい。このチオレドキシンモチーフはＴＭＸ（transmembrane Trx-related protein）由来の配列であることがより好ましい。さらにチオレドキシンモチーフ周囲の配列もＴＭＸ由来であるように、ペプチドがＴＭＸまたはその一部を含むことが最も好ましい。ＴＭＸの由来は特に限定されず、ヒト、マウスなど、どのような生物のＴＭＸであってもよい。
【００２０】
このＣＰＡＣ配列を有するペプチドを得るためには、化学合成してもよいが、そのペプチドをコードするＤＮＡを原核細胞用発現ベクター、または真核細胞用発現ベクターに組み込み、大腸菌や培養細胞で発現させた後、精製してもよい。また、そのペプチドをコードするＤＮＡをＴ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーターなどを用いたin vitro転写系によって試験管内で合成したmRNAを、原核生物抽出物、小麦胚抽出物、ウサギ網状赤血球抽出物、昆虫培養細胞抽出物などのin vitro翻訳系によって翻訳した後、精製してもよい。
【００２１】
ペプチド合成が精製を要する場合、ＨＰＬＣ等を用いて、生化学的に精製してもよいが、以下のように精製用タグ（tag）を用いて精製してもよい。まず、ＣＰＡＣ配列を有するペプチドをコードするＤＮＡを、精製用タグ（tag）もコードするように設計する。この際、最終段階でタグを切断できるように、エンテロキナーゼ認識サイトなどがペプチドとタグの間に挿入されるように、ＤＮＡを設計してもよい。タグの例としては、ＧＳＴ（グルタチオン  Ｓ-トランスフェラーゼ）、Hisタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰ、Mycタグ、Flagタグなどがあり、これらのうちの複数からなるタグを用いてもよい。タグ付きペプチドを発現させた細胞の抽出物やin vitro翻訳系の抽出物から、グルタチオン（ＧＳＴに対して）、ニッケル（Hisタグに対して）、特異的抗体（ＨＡタグ、ＧＦＰ、Mycタグ、Flagタグ等に対して）などを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって、タグ付きタンパク質を容易に精製できる。タグ付きタンパク質にエンテロキナーゼ認識サイトなどが挿入されている場合、この後、エンテロキナーゼ等によりタグを切断し、ゲル濾過などにより、タグを除去することができる。
【００２２】
＝＝スクリーニング法＝＝
このようにして合成したペプチドを用いて、ＴＭＸのＣＰＡＣ配列に結合する化合物をスクリーニングする。具体的なスクリーニング方法は無数にあり、例えば、ペプチドと化合物の両者を別々に標識すれば、それらの標識を利用してそれらの結合が同定できる。以下に数例のスクリーニング法をあげるが、本発明はこれらの例に限定されないことは言うまでもない
化合物が単一の種類からなる場合、その化合物に対し、ペプチドが結合するかどうかを各々確認することにより、目的の化合物をスクリーニングする。  
まず、化合物をビオチン化し、ビオチン化化合物とタグ付きペプチドを、それらが結合できるであろう適当な条件（例えば、ＰＢＳ中、４℃、オーバーナイト）で混合する。
【００２３】
次に、アフィニティクロマトグラフィーによって、ストレプトアビジンアガロースなどのアビジンを担持させた担持体に対し、混合溶液中のビオチン化化合物を結合させる。担持体を洗浄後、煮沸してビオチン化化合物を遊離させる。この際、ペプチドがビオチン化化合物に結合していると、その結合が共有結合によるものであれば、ペプチドはビオチン化化合物に結合したまま遊離し、水素結合によるものであれば、ペプチドはビオチン化化合物からも遊離する。これをＳＤＳ-ＰＡＧＥを用いて電気泳動し、ウエスタンブロッティングによりメンブレンにトランスファーする。ペプチドがビオチン化化合物に結合できれば、ペプチドに付加されたタグやペプチド自体に対する抗体を用いて検出できる。ペプチドとビオチン化化合物が共有結合によって結合していれば、抗ビオチン化抗体によっても検出し得る。なお、これらの検出は、ＨＲＰやＡＰなどの酵素を結合した２次抗体などを用いて、常法に従って行うことができる。ペプチドがビオチン化化合物に結合しなければ、ペプチドはブロット上に検出されない。
【００２４】
逆に、担持体に対し、混合溶液中のビオチン化化合物を結合させるかわりに、抗タグ抗体などを担持体に担持させ、混合溶液中からタグ付きペプチドを回収してもよい。例えば、プラスティックシャーレの底に抗タグ抗体を結合させ、混合溶液を添加し、タグ付きペプチドをシャーレに結合させる。シャーレを洗浄後、アビジン-ビオチン標識酵素複合体（ＡＢＣ）を添加する。再びシャーレを洗浄後、酵素の基質による発色反応により、ＡＢＣが結合しているかどうか確認する。ビオチン化化合物がペプチドに結合していると、ビオチン化化合物もシャーレに結合し、そのビオチンにＡＢＣが結合するため発色するが、ビオチン化化合物がペプチドに結合しなければ、ＡＢＣはシャーレに結合せず発色は起こらない。
【００２５】
化合物が複数の混合物であり、その中からペプチドに結合する化合物をスクリーニングするときは、同様に、化合物の混合物をビオチン化し、ビオチン化化合物とペプチドを、それらが結合できるであろう適当な条件で混合する。抗タグ抗体などを担持させた担持体を用いたアフィニティクロマトグラフィーを用いて、混合溶液中からタグ付きペプチドを回収することにより、そのペプチドに結合した特定のビオチン化化合物が回収できる。このビオチン化化合物の化学構造を質量分析法（ＭＳ）、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）、赤外線吸収スペクトル分析法等を用いて分析し決定する。
【００２６】
＝＝細胞に対する作用効果＝＝
上記スクリーニングによって同定された化合物を培養細胞に投与し、アポトーシス誘導活性を確認する。培養細胞は特に限定されず、２９３Ｔ、HeLa、NIH3T3など、どんなものでもよい。それぞれの培養細胞に適した細胞培養用培地を用いて細胞を培養し、その中に、１ng/ml 〜１０μg/mlの濃度で上記化合物を添加し、適当な期間、例えば１〜３日間培養する。その後、この培養細胞がアポトーシスを起こしているかどうか調べる。その方法は特に限定されず、市販のアポトーシス検出キットを用いてもよく、また、ゲノムＤＮＡを単離して電気泳動し、ＤＮＡがラダー状に分解されていることを観察してもよい。
【００２７】
＝＝本発明の産業上の利用可能性＝＝
本発明のスクリーニング法によって同定された化合物は、例えばＣＰＡＣ配列に結合することにより、ＴＭＸを不活性化する。従って、その化合物は、ＴＭＸの不活性化を通じて、小胞体ストレスを誘導し、細胞のアポトーシスを誘導する。このように、本発明のスクリーニング法によって同定された化合物は、アポトーシス誘導活性を有するため、抗腫瘍剤として有用であると考えられる。
【実施例】
【００２８】
＜実施例１＞ビオチン化ＦＲ９０１４６４の合成
（１）ＦＲ９０１４６４-アジドエチルアセタール (ＦＲ２８４３２５)の合成 
(1S,2Z)-4-［((2R,3R,5S,6S)-6-｛(2E,4E)-5-［(3R,4R,5R,7S)-7-(2-azidoethoxy)-4-hydroxy-7-methyl-1,6-dioxaspiro［2.5］oct-5-yl］-3-methylpenta-2,4-dien-1-yl｝-2,5-dimethyltetrahydro-2H-pyran-3-yl)amino]-1-methyl-4-oxobut-2-en-1-yl acetate
【００２９】
［化２］
2005323514.tif 000004
【００３０】
2-アジドエタノール(0.6 mL)に溶解したＦＲ９０１４６４ (30.0 mg, 0.059 mmol)を-10 ℃に冷却し、Amberlyst 15 (5 mg)を加え、室温で6時間撹拌した。その間に、溶液の温度は室温にまで上昇した。攪拌後、反応液を酢酸エチルで希釈し、固形物を濾過して除去した。得られた酢酸エチル溶液を水、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗ったのち、硫酸ナトリウムを用いて脱水した。溶媒を減圧留去して得られた固体をプレパラティブHPLC(水:メタノール=1:2.4)により精製し、最終生成物(20.9 mg, 61%)を得た。なお、IRスペクトルはJASCO FT/IR-230 spectrophotometerを用いて測定した。
【００３１】
IR (CHCl3 solution): υmax 2112, 1732, 1670, 1504, 1372, 1251, 1054 cm-1; 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ(ppm) 1.02 (3H, d, J = 7.2 Hz, H-20), 1.15 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-16), 1.39 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-5'), 1.43 (3H, s, H-17), 1.75-1.80 (1H, m, H-12), 1.76 (1H, d, J = 10.8 Hz, -OH), 1.79 (3H, s, H-19), 1.80 (1H, d, J = 14.6 Hz, H-2a), 1.92-1.97 (2H, m, H-13), 2.04 (3H, s, -OAc), 2.18-2.45 (2H, m, H-10), 2.31 (1H, d, J = 14.6 Hz, H-2b), 2.51 (1H, d, J = 4.5 Hz, H-18a), 2.99 (1H, d, J = 4.5 Hz, H-18b), 3.46 (2H, t, J = 5.0 Hz, -CH2N3), 3.52 (1H, dt, J = 2.7, 7.2 Hz,, H-11), 3.58-3.70 (2H, m, H-4, 15), 3.63 (2H, t, J = 5.0 Hz, acetal -OCH2-), 3.94 (1H, m, H-14), 4.15 (1H, dd, J = 7.5, 9.0 Hz,, H-5), 5.51 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-9), 5.65-5.74 (1H, m, H-6), 5.70 (1H, dd, J = 1.2, 11.6 Hz,, H-2’), 5.89 (1H, dd, J = 7.8, 11.6 Hz, H-3’), 6.01 (1H, d, J = 9.3 Hz, -NH-), 6.26 (1H, m, H-4’), 6.40 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-7); HRMS (FAB): m/z (M++H) calcd 577.3237, obsd 577.3241.
【００３２】
（２）ビオチン化ＦＲ９０１４６４（ＦＲ２８４３３０）の合成
(1S,2Z)-4-［((2R,3R,5S,6S)-6-｛(2E,4E)-5-［(3R,4R,5R,7S)-4-hydroxy-7-methyl-7-｛2-［(6-｛［6-(｛5-［(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno［3,4-d］imidazol-4-yl］pentanoyl｝amino)hexanoyl］amino｝hexanoyl)amino］ethoxy｝-1,6-dioxaspiro［2.5］oct-5-yl］-3-methylpenta-2,4-dien-1-yl｝-2,5-dimethyltetrahydro-2H-pyran-3-yl)amino］-1-methyl-4-oxobut-2-en-1-yl acetate
【００３３】
［化３］
2005323514.tif 000005
【００３４】
ＦＲ９０１４６４-アジドエチルアセタール(15.6 mg, 0.027mmol)のＤＭＦ (0.3 mL)溶液を-10 ℃に冷却し、トリ n-ブチルホスフィン(7.2 μL, 0.029 mmol)を加え、室温で3時間撹拌した。その間、溶液の温度は室温まで上昇した。攪拌後、トリエチルアミン(5.5 μL, 0.039 mmol)、および6-｛6-(ビオチノイルアミノ)ヘキサノイルアミノ｝ヘキサン酸 スクシニミジルエステル(20 mg, 0.034 mmol)を加え、室温にて終夜撹拌した。溶媒を減圧留去して得られた固体をプレパラティブHPLC(水:メタノール=1:1.8)により精製し、最終生成物(9.8 mg, 36%)を得た。なお、IRスペクトルはJASCO FT/IR-230 spectrophotometerを用いて測定した。
【００３５】
IR (CHCl3 solution): υmax 1702, 1660, 1507, 1457, 1371, 1250, 1054, 909 cm-1; 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ(ppm) 1.01 (3H, d, J = 6.9 Hz, H-20), 1.15 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-16), 1.2-2.1 (23H, m, H-2a, 12, 13, -OH, methylenes), 1.38 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-5’), 1.39 (3H, s, H-17), 1.76 (3H, s, H-19), 2.04 (3H, s, -OAc), 2.1-2.45 (9H, m, H-2b, 10, three -C(O)CH2), 2.53 (1H, d, J = 4.8 Hz, H-18a), 2.71 (1H, d, J = 12.5 Hz, biotin -S-CH-), 2.90 (1H, dd, J = 4.8, 12.5 Hz, biotin -S-CH-), 3.07 (1H, d, J = 4.8 Hz, H-18b), 3.1-3.35 (5H, m, biotin -S-CH-, two -NCH2-), 3.45-3.75 (7H, m,, H-4,11, 15, acetal -OCH2-, -NCH2-), 3.92 (1H, m, H-14), 4.07 (1H, dd, J = 6.8, 9.5 Hz,, H-5), 4.31 (1H, m, biotin -N-CH-), 4.49 (1H, m, biotin -N-CH-), 5.45-5.55 (2H, m, H-9, two -NH-), 5.66 (1H, dd, J = 6.8, 15.6 Hz,, H-6), 5.74 (1H, d, J = 11.7 Hz,, H-2’), 5.89 (1H, dd, J = 7.8, 11.7 Hz, H-3’), 6.1-6.20 (2H, m, two -NH-), 6.27 (1H, m, H-4’), 6.3-6.37 (1H, m, -NH-), 6.35 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-7). 6.42 (1H, m, -NH-), 6.67 (1H, m, -NH-); LRMS (FAB): m/z (M++H) calcd 1003.5790, obsd 1003.5788.
【００３６】
＜実施例２＞ＧＳＴ−ＴＭＸ融合タンパク質の合成
HeLa細胞のmRNAより、以下のプライマーペア１を用いたRT-PCR法によってヒトＴＭＸのコーディング領域を増幅させた。  
プライマーペア１：
5’- GGGAATTCATCTGGCGCCCTCCGGGAGTC -3’  （配列番号２）
5’- ATGAATTCTGGGCCCGGATTTATCTGTGGCCAATGA -3’ （配列番号３）
増幅したヒトＴＭＸのコーディング領域を鋳型にし、以下のプライマーペア２を用いたRT-PCR法によって、ＴＭＸの27〜180番目のアミノ酸をコードするcDNAを増幅させた。  
プライマーペア２：
5’- GGGAATTCATCGGCGGAGCAACGTTCGCGTC -3’ （配列番号４）
5’- CCGAATTCTTGATCCCCACACTGGCAATCC -3’ （配列番号５）
その後、これらの増幅cDNAをpGEX-2TベクターのEcoRIサイトへ導入した。
【００３７】
次に、作製したpGEX-2T-TMX(27-180)を鋳型に、以下のプライマーペア３、ペア４、ペア５を用いたPCRによって、それぞれ、点変異体TMX(27-180)/CS変異体、TMX(27-180)/CPAS変異体、TMX(27-180)/SPAC変異体を作製した。  
プライマーペア３：
5’- GTGGTCCCCTGCTTCTCAAAATCTTCAACC -3’ （配列番号６）
5’- AGATTTTGAGAAGCAGGGGACCACGGGGCA -3’ （配列番号７）
プライマーペア４：
5’- GTGGTGCCCTGCTTCTCAAAATCTTCAAC -3’ （配列番号８）
5’- GTTGAAGATTTTGAGAAGCAGGGCACCAC -3’ （配列番号９）
プライマーペア５：
5’- GTGGTCCCCTGCTTGTCAAAATCTTCAAC -3’ （配列番号１０）
5’- GTTGAAGATTTTGACAAGCAGGGGACCAC -3’ （配列番号１１）
【００３８】
作製した、TMX(27-180)、もしくはその変異体をコードするプラスミドを大腸菌DH5a株に導入し、0.1 mMのＩＰＴＧ刺激後４時間培養して各ＧＳＴ融合タンパク質を大腸菌内にて発現させ、大腸菌を界面活性剤を含む可溶化バッファーと超音波破砕機によって破砕し、各ＧＳＴ融合タンパク質を可溶化後GSH-agaroseを用いて精製した。
【００３９】
＜実施例３＞ヒトＴＭＸタンパク質とＦＲ９０１４６４との特異的結合
ＴＭＸ発現ベクターを２９３Ｔ細胞にLipofectAmine（Invitrogen社）を用いてリポフェクトし、一過的（transient）にタンパク質を発現させた。リポフェクション後、２４時間で細胞を回収し、細胞の抽出物を調製した。この２９３Ｔ細胞抽出物２ｍｇに、５nmolのビオチン化ＦＲ９０１４６４を添加し、４℃で１２時間反応させた。反応液に１μｇの抗myc抗体（SantaCruz社、抗体クローン番号９Ｅ１０）と１０μｌのProtein-A/G-agrose（SantaCruz社）を加え、さらに１時間反応させ、免疫沈降した。PBSで免疫沈降物を洗浄し、結合タンパク質を抗体から解離するため、ＳＤＳサンプルバッファーに溶解し、５分間煮沸し、サンプルとした。このようにして調整したサンプル２０μｌを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、ナイロンメンブレンにブロッティングした後、ＨＲＰ標識抗ビオチン抗体（ＮＥＢ社、１０００倍希釈）を結合させた。抗体に結合したＨＲＰに対する基質を加えて発色させることにより、図１に示すように、ヒトＴＭＸタンパク質と結合したビオチン化ＦＲ９０１４６４を、両者が存在する時のみ検出した。
【００４０】
また、ブロットに対し抗myc抗体（SantaCruz社、抗体クローン番号９Ｅ１０、１０００倍希釈）でＴＭＸに付加したmycタグを検出すると、図２に示すように、ＴＭＸ単独分子が検出されるだけでなく、ビオチン化ＦＲ９０１４６４が共存する時のみ、両者が結合することによって分子量の増加した結合物が検出された。
【００４１】
次に、GST-TMX(27-180) 発現ベクターを大腸菌DH5a細胞にて発現させた。GSHカラムで部分精製したタンパク質GST-TMX(27-180)の量を変化させて、上記と同様の方法でビオチン化ＦＲ９０１４６４と結合させ、再びGSHカラムによって回収した。回収したタンパク質をSDS-PAGEにて電気泳動し、上記と同様に抗ビオチン抗体及び抗GST抗体（SantaCruz社、抗体番号F-11、1000倍希釈）を用いたイムノブロット法により解析した。図３に示すように、GST-TMX(27-180)のタンパク質量が増加するに従い、抗ビオチン抗体で検出されるビオチン化ＦＲ９０１４６４の量が増加した。このことから、GST-TMX(27-180)とビオチン化ＦＲ９０１４６４は、実際に一定の比率で結合していることが示唆された。
【００４２】
このように、ＴＭＸとＦＲ９０１４６４の両方をラベルすることにより、両者の結合を容易に検出することができる。従って、この検出方法をＴＭＸの結合化合物を得るためのスクリーニング法として応用できる。
【００４３】
＜実施例４＞ＦＲ９０１４６４に対するヒトＴＭＸタンパク質結合部位の決定
ＴＭＸの活性中心であるＣＰＡＣ配列において、両方のシステインをセリンに置換した変異体GST-TMX-CSを２９３Ｔ細胞で発現させ、実施例３と同様の方法でＦＲ９０１４６４に対する結合を解析した。抗ビオチン抗体（図４）及び抗myc抗体（図５）のいずれを用いた場合でも、GST-TMXとビオチン化ＦＲ９０１４６４との結合は検出されたが、GST-TMX-CSとの結合は検出されなかった。
【００４４】
同様に、GST-TMX(27-180)-CSを大腸菌DH5αで発現させた場合も、GST-TMX(27-180)-CSはビオチン化ＦＲ９０１４６４と結合しなかった（図６）。  
従って、ＦＲ９０１４６４は、ＴＭＸのＣＰＡＣ配列に結合すること、特に両側のＣがその結合に重要であることが明らかになった。
【００４５】
次に、Ｎ端側のシステインをセリンに置換した変異体GST-TMX(27-180)/SPAC及びＣ端側のシステインをセリンに置換した変異体GST-TMX(27-180)/CPASを大腸菌DH5αで発現させ、ＦＲ９０１４６４に対する結合を解析したところ、GST-TMX(27-180)/SPACはビオチン化ＦＲ９０１４６４と結合できなかったが、GST-TMX(27-180)/CPASはビオチン化ＦＲ９０１４６４と結合できた（図７）。  
従って、ＣＰＡＣ配列において、Ｎ端側のシステインが、ＦＲ９０１４６４との結合に最も重要なアミノ酸残基であることが明らかとなった。
【００４６】
＜実施例５＞ＦＲ９０１４６４による小胞体ストレス誘導
ＴＭＸは小胞体に局在する酸化還元酵素であるので、小胞体内におけるタンパク質の折り畳み（folding）の調節を受けていることが考えられた。そこで、ＦＲ９０１４６４がＴＭＸに結合することによってＵＰＲが誘導されるかどうかを調べるため、ＦＲ９０１４６４で処理した２９３Ｔ細胞において、ＵＰＲ誘導のマーカーであるBipの発現を調べた。
【００４７】
まず、２９３Ｔ細胞をＦＲ９０１４６４で処理し（０ｈｒ）、一定時間毎に細胞を回収し、抽出物を調製した。抗Bip抗体（SantaCruz社、抗体番号H-129、１０００倍希釈）を用いて、実施例２と同様にイムノブロットを行い、Bipタンパク質を検出したところ、図８に示すように、ＦＲ９０１４６４処理によってBipの発現が増強していた。ＵＲＰ誘導は小胞体ストレスの結果生じることがわかっており、ＦＲ９０１４６４は、ＴＭＸに結合することにより小胞体ストレスを誘導することが明らかとなった。
【００４８】
従って、ＴＭＸの活性中心であるＣＰＡＣ配列に結合する化合物は、小胞体ストレスを通じてアポトーシスを誘導することができるため、抗腫瘍剤として有用であると考えられる。
【００４９】
＜実施例６＞ＴＭＸ siRNAを用いたＴＭＸのノックダウン
ＦＲ９０１４６４の結合がＴＭＸにもたらす効果を明らかにするため、培養細胞においてsiRNAを用いてＴＭＸをノックダウンして不活性化し、その効果と比較した。
【００５０】
まず、ＴＭＸ siRNAの有効性を調べるため、６ nMのＴＭＸ siRNA （配列番号１２：AACUGCUGGAAGGAGACUGGA）をHeLa細胞にトランスフェクトし、２４時間後に１００ng/mlのＦＲ９０１４６４で処理し、さらに１２時間後に細胞を回収して抽出物を得た。その抽出物に対し、抗ＴＭＸ抗体を用いて、イムノブロットを行ったところ、ＴＭＸ siRNAをトランスフェクトした細胞では、完全にＴＭＸの発現が抑制されていた（図９Ａ）。
【００５１】
次に、小胞体ストレスは、Bipプロモーターを活性化するので、Bip 遺伝子 のプロモーター領域-304〜+7の配列（配列番号１３）を、ルシフェラーゼをマーカーとしてプロモーター活性を測ることができるpGL3-basic vector（Promega社）に導入し、ＵＰＲのレポーターとしてpGL3-Bip(-304/+7)を作製した。一方、小胞体ストレスによるBipプロモーターの活性化は、プロモーター領域に存在する３つのＥＲＳＥ配列を介して引き起こされる。そこで、コントロールとして、in vitro mutagenesisを用いて、３つのＥＲＳＥ配列全てに変異を導入した変異プロモーター（配列番号１４）を作製し、pGL3-basic vector に導入してpGL3-Bip (-304/+7)/ERSEを作製した。これらのプラスミドを、６ nMのＴＭＸ siRNA、non-specific siRNA (配列番号１５：GCGCGCTTTGTAGGATTCG) もしくはGL3 siRNA (配列番号１６：CTTACGCTGAGTACTTCGA) とともに２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、２４時間後にＦＲ９０１４６４を100 ng/mlの濃度で処理し、さらに１２時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図９Ｂに示す。
【００５２】
２９３Ｔ細胞にＴＭＸ siRNAを処理すると、Bipの転写活性が上昇した（レーン１vs２）。また、この転写活性化はBip (-304/+7)/ERSEでは起きなかった（レーン６vs７）ことから、ＴＭＸをノックダウンすると、２９３Ｔ細胞が小胞体ストレスを引き起こすことが明らかとなった。
【００５３】
次に、ＴＭＸsiRNAによりＴＭＸをノックダウンさせた細胞をＦＲ９０１４６４で処理し、Bipの転写が活性化するかどうかを検討した。その結果、ＦＲ９０１４６４処理によるBipの転写活性化は（レーン１vs４）、ＴＭＸをノックダウンした細胞では起こらなかった（レーン２vs５）。一方、Bip (-304/+7)/ERSEの転写活性は、何れの処理においても上昇しない（レーン７〜９）ことから、ＴＭＸsiRNA 及びＦＲ９０１４６４処理によるプロモーター活性の上昇はＥＲＳＥ配列を介して同じメカニズムで起きていることが明らかとなった。
【００５４】
以上より、ＦＲ９０１４６４の標的がＴＭＸであり、その作用メカニズムは、ＴＭＸが不活性化されると誘導される小胞体ストレスを誘導することであることが明らかとなった。従って、ＴＭＸの活性を阻害する化合物は、小胞体ストレスを通じてアポトーシスを誘導するため、抗腫瘍剤として有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明にかかる一実施例において、検出段階で抗ビオチン抗体を用いた、ＴＭＸタンパク質とビオチン化ＦＲ９０１４６４との結合実験の実験結果を示す図である。
【図２】本発明にかかる一実施例において、検出段階で抗myc抗体を用いた、ＴＭＸタンパク質とビオチン化ＦＲ９０１４６４との結合実験の実験結果を示す図である。
【図３】本発明にかかる一実施例において、GST-TMX(27-180)のタンパク質量と、それに結合したビオチン化ＦＲ９０１４６４の検出量の相関関係を調べる実験結果を示す図である。
【図４】本発明にかかる一実施例において、検出段階で抗ビオチン抗体を用いた、GST-TMX-CSタンパク質とビオチン化ＦＲ９０１４６４との結合実験の実験結果を示す図である。
【図５】本発明にかかる一実施例において、検出段階で抗myc抗体を用いた、GST-TMX-CSタンパク質とビオチン化ＦＲ９０１４６４との結合実験の実験結果を示す図である。
【図６】本発明にかかる一実施例において、GST-TMX(27-180)-CSタンパク質とビオチン化ＦＲ９０１４６４との結合実験の実験結果を示す図である。
【図７】本発明にかかる一実施例において、変異体GST-TMX(27-180)/CPASタンパク質またはGST-TMX(27-180)/SPACタンパク質とビオチン化ＦＲ９０１４６４との結合実験の実験結果を示す図である。
【図８】本発明にかかる一実施例において、ＦＲ９０１４６４処理によるBipの発現の変化を調べた結果を示す図である。
【図９】本発明にかかる一実施例において、培養細胞でsiRNAを用いてＴＭＸをノックダウンしたときの、Ａ．ＴＭＸの発現  Ｂ．Bipの転写活性を調べた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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