(57)【要約】【課題】            ＰＮＡのＤＮＡに対する認識機能に基づき、ＤＮＡを所定の部位にて切断し、人工核酸として使用することができるＰＮＡによる特定の化合物、及び当該核酸の製造方法、並びに当該核酸によるＤＮＡ切断方法に関する構成を提供すること。【解決手段】        酸性の触媒物質を使用することによって生成された下記の一般式  【化１】2005087088.tif 000012（式中Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミンの何れかを表し、ｎは、２以上の整数を示し、ｍは、１以上の整数を示す。）による化合物であって、前記各化合物が有している塩基性配列と相補関係にある塩基性配列を有しているＤＮＡの配列部分を、天然酵素の場合と同じように、リン酸ジエステル結合に対する加水分解によって切断することを可能とする人工制限酵素。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
【化１】
2005087088.tif 000010
……（１）
（式中Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミンの何れかを表し、ｎは、２以上の整数を示し、ｍは、１以上の整数を示す。）によって表される化合物。
【請求項２】
ランタノイド金属と請求項１の化合物とによって形成された錯体。
【請求項３】
ランタノイド金属として、セリウム（Ｃｅ）を選択したことを特徴とする請求項２記載の錯体。
【請求項４】
下記一般式（２）
【化２】
2005087088.tif 000011
……（２）
（式中Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミンの何れかを表し、Ｐは、ポリスチレンを表し、ｎは、２以上の整数を示し、ｍは、１以上の整数を示す。）に対し、酸性の触媒物質を使用したうえで、加水分解を行うことによる請求項１記載の化合物の製造方法。
【請求項５】
加水分解を行う際、トリフルオロメタンスルホン酸を触媒として使用することを特徴とする請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１記載の化合物とＤＮＡとを、反応溶液内に共存させることによって、前記各化合物が有している塩基性配列と相補関係にある塩基性配列を有しているＤＮＡの配列部分を切断することによるＤＮＡ切断方法。
【請求項７】
反応溶液のｐＨ値を７以上とすることを特徴とする請求項６記載のＤＮＡ切断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド核酸（Peptide Nucleic Acid：以下「ＰＮＡ」と略称する。）において、特にＮ−メチルヒドロキサム酸との結合構造を採用することによって、人工制限酵素としての機能を発揮することができる化合物、及び当該化合物の製造方法、並びに当該化合物によるＤＮＡ切断方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来遺伝子工学や分子生物学の分野においてＤＮＡに対する切断機能を有している制限酵素は、一般に４〜６塩基対の特異的な配列を認識して切断することを基本原理しているが、ＤＮＡ中の特定遺伝子について解析するためには、少なくとも１３塩基対を認識することを不可欠としている。
【０００３】
このような制限酵素としては、主に遷移金属と錯体を形成し、そこから発生する活性酸素種によるデオキシリボースから水素の引き抜きによる破壊的切断を行うブレオマイシンやビラジカルを形成してデオキシリボースから水素を引き抜いて破壊的切断を行うエンジイン系抗生物質、或いはプリン塩基のアルキル化後の熱処理や化学的処理によってデオキシリボースを破壊的切断するデュオカルマイシンなどが存在する。
【０００４】
しかしながら、これらの制限酵素による切断の基本原理は、デオキシリボースの酸化的破壊による切断であり、天然の制限酵素がリン酸ジエステル結合を加水分解の態様によって切断することによる反応方式とは相違しており、また、リガーゼによる再結合が不可能であった。そのため、人工制限酵素の開発要件として、天然の制限酵素と同様にリン酸ジエステル結合に対する加水分解を行う方式が要請されていた。
【０００５】
ＰＮＡは、図１に示すように、核酸の構成要素として塩基配列を基礎付けるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）を有した各構成単位の結合によって分子を形成しており、特に図２に示すように、前記塩基配列における相補性に基づき、特定の塩基配列を有しているＤＮＡを構成している一部の配列部分と結合することによって、該当するＤＮＡを認識する機能を有している。
【０００６】
前記認識機能に基づき、ＰＮＡは、ＤＮＡの一重鎖と高い親和性・特異性を伴って二重鎖を形成したり、ＤＮＡ二重鎖との結合によってＤＮＡの化学上の性格を変化させるなど、特色のある機能を持つため、遺伝子工学用の機能性素材として注目を集めている。
【０００７】
但し、ＰＮＡ自体は、ＤＮＡの認識機能を有するも、切断機能を有していないため、制限酵素として使用することができない。
【０００８】
ＰＮＡに対し、特別の化学結合を行わせることによって、前記認識機能を維持しながら、当該認識機能に基づいて、切断機能を発揮することができるならば、天然の制限酵素と同じように、リン酸ジエステル結合の加水分解を行うことが期待され、しかも従来技術の人工制限酵素に比し、広い範囲の切断及び簡単なプロセスによる切断が可能となることが予測することができる。
【０００９】
然るに、これまでそのような切断機能を有しているＰＮＡは開発されている訳ではない。
【００１０】
【非特許文献１】Komiyama,M.,Shiiba,T.,Takahashi,Y.,Takeda,N.,Uchida,H.,Sumaoka,J.,Kodama,T.,Yashiro,M.:J.Chem.Soc.,Perkin Trans.2,269-274(1995)
【非特許文献２】Egholm,M.;Christensen,L;Dueholm,K;Buchardt,O.;Coull,J.;Nielsen,P.E.:Nucleic Acids Research1,23,217-222(1995)
【非特許文献３】Tsutomu Ishihara,David R.Corey.:J.Am.Chem.Soc,121,2012-2020(1999)
【非特許文献４】Adam Golebiowski.;Sean Klopfenstein.:TetrahedronLetters,39,3397-3400 (1998)
【非特許文献５】Hashimoto, S.; Nakmura, Y.  J. Chem. Soc., Chem. Commun.,(1995),1413-1414.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ＤＮＡに対する認識機能に基づき、ＤＮＡを所定の部位にて切断し、人工核酸として使用することができるＰＮＡを基本とする特定の化合物、及び当該核酸の製造方法、並びに当該核酸によるＤＮＡ切断方法に関する構成を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題に対応し、本発明は、
（１）．下記一般式（１）
【化１】
2005087088.tif 000002
……（１）
（式中Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミンの何れかを表し、ｎは、２以上の整数を示し、ｍは、１以上の整数を示す。）によって表される化合物、
（２）．下記一般式（２）
【化２】
2005087088.tif 000003
……（２）
（式中Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミンの何れかを表し、Ｐは、ポリスチレンを表し、ｎは、２以上の整数を示し、ｍは、１以上の整数を示す。）に対し、酸性の触媒物質を使用したうえで、加水分解を行うことによる前記（１）による化合物の製造方法、
（３）．前記（１）による化合物とＤＮＡとを、反応溶液内に共存させることによって、前記各化合物が有している塩基性配列を相補関係にあるＤＮＡの配列部分を切断することによるＤＮＡの切断方法、
を基本構成としている。
【発明の効果】
【００１３】
前記（１）による化合物は、ＤＮＡに対する認識機能に基づき、二本鎖構造を有しているＤＮＡを、前記（３）記載のように、特異的に切断することが可能であり、しかも当該切断においては、デオキシリボースの酸化的破壊を伴わずに、所望の配列単位によるＤＮＡをリン酸ジエステル結合に対する加水分解を伴って切断することが可能となる。
【００１４】
前記（２）の製造方法によって、前記（１）の化合物を、それぞれ効率的かつ安定した状態にて製造することができる。
【００１５】
前記切断に関する効果については、実施例１によって明らかにするとおりであるが、実施例１記載のように、前記化合物における塩基配列と完全相補性にある塩基配列を有しているＤＮＡの結合部分を切断し得ることは、切断部位において、リン酸ジエステル結合に対する加水分解が行われ、しかも前記各化合物が当該加水分解に対する触媒機能を発揮していることを意味している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
前記（１）の化合物は、ランタノイド金属との間で錯体を形成することによって、更に良好な切断機能を発揮することができる。
【００１７】
前記錯体は、前記（１）のヒドロキサム酸の結合部分において、図３に示すように、ランタノイド移動イオンが、両側の酸素原子と電子を交換することによる錯体結合を生じているものと推定されるが、ランタノイド金属は、ＤＮＡのリン酸ジエステル結合に対する加水分解機能を有していることが知られており、このような機能によって、前記切断の場合には、ＤＮＡに対する切断を助長しているものと推定される。
【００１８】
前記錯体の効果については、実施例２によって明らかにするとおりである。
【００１９】
前記（２）の加水分解において、前記（１）の化合物を安定した状態で効率的に得るには、酸性の触媒として、トリフルオロメタンスルホン酸（Trifluoromethanesulfonic acid：以下「ＴＦＭＳＡ」と略称する。）を採用することが好ましい。
【００２０】
このようなＴＦＭＳＡを採用することによって、前記（２）の化合物から速やかに前記（１）式の化合物を得ることができ、しかも前記（１）式の化合物は、他の化合物に変換されずに、化合物の状態を安定した状態にて維持することができる。
【００２１】
前記（２）の製造方法において、（２）式の化合物は、下記の化学反応式によって得ることができる。
【化３】
2005087088.tif 000004
（上記の式において、Ｐは、ポレスチレンを表す。）
【００２２】
上記化学反応式において、左辺の（ａ）の化合物は、
【化４】
2005087088.tif 000005
と、ＰＮＡとを結合することによって生成することができ、前記化学反応式の左辺の（ｂ）の化合物は、以下の反応式によって得ることができる。
【化５】
2005087088.tif 000006
【００２３】
前記（３）による人工制限酵素としての使用方法においては、反応溶液のｐＨ値を７以上とすることが好ましく、この点については、実施例３によって明らかにするとおりである。
【００２４】
以下実施例に従って説明する。
【実施例１】
【００２５】
１．認識機能の確認に関する実験
前記（１）の化合物において、ｎ＝３とし、ｍ＝１０とし、各Ｂとして、ＴＧＴＣＡＡＴＴＴＡの配列順序を有しているヒドロキサム酸型（Hydroxamic acid type）ＤＮＡ（以下「ＨＰＮＡ」と略称する。）について、以下の配列を有しているＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３、ＤＮＡ４と共存したうえで、各４個のＤＮＡオリゴマーを用いて、融点（Ｔｍ）を測定したところ、各核酸の構成要素が完全相補鎖になっているＤＮＡ１の場合には、融点が２９０．５℃と確定することができたのに対し、ＤＮＡ２、３、４においては、溶解曲線を描くことが不可能であり、このような結果から、ＨＰＮＡが、完全相補鎖のみを正確に認識することが判明した。
ＤＮＡ１            ＡＣＡＧＴＴＡＡＡＴ
ＤＮＡ２            ＡＣＡＧＡＴＡＡＡＴ
ＤＮＡ３            ＡＣＡＧＧＴＡＡＡＴ
ＤＮＡ４            ＡＣＡＧＣＴＡＡＡＴ
【００２６】
上記の認識状況は、通常のＰＮＡの認識状況と同一である以上、ＨＰＮＡの内、ヒドロキサム酸との結合部分は、ＨＰＮＡの完全相補性による認識に関与していないものと考えられる。
【００２７】
２．切断機能に関する実験
（ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡを使用した実験）
切断の対象となるＤＮＡとして、以下のような構成を有しているｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡを使用し、ＨＰＮＡとして、以下の３種類を使用した（尚、ＢＳは、前記（１）の化合物において、ｎ＝２の場合を示し、ＢＧは、前記（１）において、ｎ＝３の場合を示す。）。
【化６】
2005087088.tif 000007
【化７】
2005087088.tif 000008
【００２８】
前記プラスミドは、反応前ではスーパーコイルになっており、ここにニックが入るとその構造がほどけ、オープンサーキュラーに変形する。さらにそのニックの近傍で反対のＤＮＡ鎖にニックが入るとリニヤー状になる。これらのプラスミドの０．８％アガロースゲル電気泳動による泳動度はスーパーコイル＞リニヤー＞オープンサーキュラーなのでその移動度の差によってＤＮＡの切断が起こっているかどうか判断できる。
【００２９】
（１−１）．最初に、３７℃に設定した４０ｍＭ Tris-HC1 buffer（ｐＨ８）による反応溶液１５μｌ中に０．３μｇのｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ、１−ＢＧによるＨＰＮＡを０．７μＭから５００μＭまで濃度を変化させて１２時間反応を行った。
【００３０】
その結果、ＨＰＮＡの濃度が上昇するにつれて、泳動度が順次減少することによって、切断活性の上昇が見られた。このことから、明らかにＨＰＮＡが単独でＤＮＡを切断していることが示された。
【００３１】
（１−２）．次に、リンカーの長さによって切断活性に影響があるかどうかを調べるため、前記（１−１）と同一の反応溶液を使用したうえで、リンカーの長さが前記１−ＢＧとは別に、１−ＢＳによるＨＰＮＡを用いて同様の切断実験を行った。
【００３２】
その結果、ＨＰＮＡの温度が上昇するにつれて、泳動度が順次減少することによって、切断活性の上昇が見られた。
【００３３】
但し、活性の程度は、１−Ｇの場合に比し若干低くなっている。その理由としては、リンカーの長さがメチレン鎖が２個の場合よりも３個の場合の方がより切断部位に近づけるためだと思われる。
【００３４】
したがって、前記（１）の化合物において、ｎが３以上の場合においても、切断機能を有するものと解される。
【００３５】
（１−３）．更には、本発明のＨＰＮＡが特定の配列しか切断しないかどうかを確認するため、前記（１−１）と同種の反応溶液を使用したうえで、前記１−ＢＧ、１−ＢＳとは異なる配列を認識するＨＰＮＡ（３−ＢＧ）を用いて同様の切断実験を行った。
【００３６】
３−ＢＧを使用した場合においても、ＨＰＮＡの濃度が上昇するにつれて、泳動度が減少し、その結果切断活性の上昇が見られた。
【００３７】
したがって、前記１−ＢＧ、１−ＢＳのような特定の塩基配列の場合のみ、切断が行われるのではなく、任意の相補性の関係にある配列を切断することが示された。
【００３８】
（１−４）．以上３種類のＰＮＡによる切断に対する比較試験として、Ｎ−メチルヒドロキサム酸と結合していない純然たるＰＮＡオリゴマーによって、前記３種類のＨＰＮＡと同種の実験を行ったところ、ＰＮＡオリゴマーの濃度変化に拘らず、電気泳動性に変化がないことから、逆にＮ−メチルヒドロキサム酸による結合部分がＤＮＡによるプラスミド切断に関与していることが判明した。
【００３９】
（ｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡを使用した実験）
切断の対象となるＤＮＡとして、以下のような構成を有しているｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡを使用し、当該プラスミドＤＮＡの３５２番目から３６２番目の配列をターゲットとするＨＰＮＡとして、以下のようなＢ−１１−ＢＳを使用した。
【化８】
2005087088.tif 000009
【００４０】
（２−１）．ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡの切断に使用した実験と同一の反応溶液を使用し、同一条件にて反応溶液１５μｌ中に０．３μｇのｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡ、ＨＰＮＡ（Ｂ−１１−ＢＳ）を１μＭから１００Ｍまで濃度を変化させて４８時間反応を行った。
【００４１】
その結果、ＨＰＮＡの濃度が上昇するにつれて、泳動度が減少し、切断活性の上昇が判明した。
【００４２】
このような切断活性の上昇によって、ＨＰＮＡの切断機能が、更に一般的に証明された。
【００４３】
（２−２）．前記ｐＵＣ１８によるプラスミドＤＮＡを上側の塩基配列部分（５’〜３’による配列部分）と下側の塩基配列部分（３’〜５’による配列部分）を分離したうえで、Ｂ−１１−ＢＳによるＨＰＮＡを使用して切断実験を行ったところ、分離したことによる１本鎖ＤＮＡに対する切断効果は生じなかった。前記（２−１）記載のように、２本鎖の場合のみ、切断効果が生じていることは、当該切断によって、１本鎖のＤＮＡの結合部分、即ち、前記Ｂ−１１−ＢＳの塩基配列と完全相補性塩基配列を有している結合部分が切断され分離されることが判明した。
【００４４】
このような結果は、切断に使用したＨＰＮＡが、新たに切断の対象物となったＤＮＡと一体化し、ＤＮＡ−ＨＰＮＡのハイブリッドが形成しているものと考えられる。
【実施例２】
【００４５】
実施例１と同一の状態にあるTris-HC1 bufferを使用したことによる反応溶液１５μｌ中には０．３μｇの前記ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ、ＨＰＮＡ（１−ＢＧ）を７０μＭを含み、セリウム（Ｃｅ）を前記反応溶液に添加し、０．７μＭから７０μＭまで濃度を変化させて１２時間反応を行った。
【００４６】
その結果、同一のＨＰＮＡの濃度でありながら、セリウム（Ｃｅ）の濃度を上昇させるにつれて、泳動度が減少することが確認された。
【００４７】
しかも前記１−ＢＧ、１−ＢＳ、３−ＢＧによる各実験の場合よりも、泳動度の減少の度合いが著しく、前記錯体の形成によって更に切断活性が上昇していることが判明した。このことから、ＨＰＮＡ（１−ＢＧ）がセリウム（Ｃｅ）と錯体を形成することによって、リン酸ジエステル結合に対する加水分解における触媒機能を更に一層発揮し、一層効率的にＤＮＡを切断していることを示している。
【００４８】
セリウム（Ｃｅ）だけでなく、一般にランタノイド金属がＤＮＡのリン酸ジエステル結合に対し、加水分解機能を有していることが既に判明している以上、セリウム（Ｃｅ）の場合だけでなく、ランタノイド金属との結合による前記錯体は、効率的なＤＮＡの切断に寄与し得るものと解される。
【実施例３】
【００４９】
実施例１のｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡを切断の対象物とし、かつ前記（１）の化合物としてＨＰＮＡ１−ＢＧを選択し、実験１と同一の反応溶液を使用したうえで、０．３μｇのｐＢＲ３２２ＤＮＡと７００μｍｏｌのＨＰＮＡ（１−ＢＧ）をそれぞれ１．５μｌだけ採取し、ｐＨ５から１０の４００ｍＭ  Tris-HC1をそれぞれ加え、ＭｉｌｌｉＱで全体を１５μｌ（１０倍）に希釈することによって、ｐＨを５〜１０の範囲で変化させ、その切断活性を見た。
【００５０】
その結果、ｐＨ値が高いほど、切断活性が強くなる傾向を示すと共に、特にｐＨ値が７以上の場合、良好な切断効果が生ずることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、デオキシリボースの破壊を伴わずに、ＤＮＡを切断することによって、遺伝子工学や分子生物工学分野、更には医療分野に適用できるような産業上の利用可能性を提供している。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ＰＮＡの構成単位を示す化学構造式を示す。
【図２】ＰＮＡがＤＮＡの配列を認識する状況を示す化学構造式である。
【図３】ランタノイド金属とＮ−ヒドロキサム酸部分との錯体結合状況を示す化学構造式の一部に関する模式図である。
【図１】
2005087088.tif 000013
【図２】
2005087088.tif 000014
【図３】
2005087088.tif 000015